(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学系を用いて得られたホログラフィ像のスタックから生物学的粒子を同定するための生物学的粒子同定方法であって、
前記光学系の光軸に沿った、焦点面に対する複数のデフォーカスずれに対して、複数のホログラフィ像を取得し（２１０、６１０）、
ホログラフィ像のスタックから、焦点面に最も近い像として参照像を選択し（２２０、６２０）、
前記参照像から、対象としている生物学的粒子を含む像ブロックを選択し（２３０、６３０）、
前記参照像以外の前記ホログラフィ像から、前記参照像内の前記選択された像ブロックの位置に対応する像ブロックのスタックを抽出し（２４０、６４０）、
抽出された前記像ブロックのスタックから、対象としている生物学的粒子の種類を同定すること（２７０、６８０）を特徴とする生物学的粒子同定方法。
【請求項２】
前記光軸に沿った複数の位置に対して、前記複数のホログラフィ像が前記光学系によって取得されることを特徴とする請求項１に記載の生物学的粒子同定方法。
【請求項３】
第一のホログラフィ像が前記光学系によって所得され、前記ホログラフィ像のスタック中の他のホログラフィ像が、数値的伝播モデルを用いて前記第一のホログラフィ像から計算されることを特徴とする請求項１に記載の生物学的粒子同定方法。
【請求項４】
前記第一のホログラフィ像が、前記焦点面に対してゼロではないデフォーカスずれで取得されることを特徴とする請求項３に記載の生物学的粒子同定方法。
【請求項５】
前記参照像が、所定の対比基準を最大にする像として前記ホログラフィ像のスタックから選択されることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の生物学的粒子同定方法。
【請求項６】
前記像ブロックのスタックから、前記参照像に属する前記対象としている生物学的粒子に中心がある像ブロックとして、参照ブロックが選択され、前記光軸上における前記参照ブロックの位置がデフォーカスずれの原点として選択されることを特徴とする請求項５に記載の生物学的粒子同定方法。
【請求項７】
前記ホログラフィ像のスタックの参照像に隣接する像に属し且つ前記対象としている生物学的粒子に中心がある像ブロックの中から、所定の対比基準を最大にするブロックを探すことによって、前記参照ブロックが更新されることを特徴とする請求項６に記載の生物学的粒子同定方法。
【請求項８】
前記像ブロックのスタックの各ブロックに対して少なくとも一つの特性値が計算され（２６０）、前記特性値のプロファイルが、計算された前記特性値から前記光軸に沿って取得されることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の生物学的粒子同定方法。
【請求項９】
前記特性値のプロファイルが閾値と比較され、該プロファイルが前記閾値を超える場合に前記対象としている生物学的粒子が第一の種類であると推定され、該プロファイルが前記閾値を超えない場合に前記対象としている生物学的粒子が第二の種類であると推定されることを特徴とする請求項８に記載の生物学的粒子同定方法。
【請求項１０】
類似基準を用いて、前記特性値のプロファイルが、異なる複数の既知の種類の生物学的粒子について得られている複数の標準プロファイルと比較され、前記対象としている生物学的粒子の種類が、前記特性値のプロファイルと最も類似している標準プロファイルから推定されることを特徴とする請求項８に記載の生物学的粒子同定方法。
【請求項１１】
前記類似基準が、相互相関と、ピアソン係数と、標準偏差との中から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の生物学的粒子同定方法。
【請求項１２】
前記特性値のプロファイルが、各クラスが所定の種類の生物学的粒子に対応しているプロファイルの複数のクラスの中から、教師あり学習法を用いて分類されることを特徴とする請求項８に記載の生物学的粒子同定方法。
【請求項１３】
前記像ブロックのスタックから、所定のデフォーカスずれに対応する複数のブロックが選択されること（６６０）を特徴とする請求項６に記載の生物学的粒子同定方法。
【請求項１４】
類似基準を用いて、選択された前記複数のブロックが、各標準ブロックが所定の種類の生物学的粒子に対応している同数の標準ブロックと比較され（６７０）、前記対象としている生物学的粒子の種類が、選択された前記複数のブロックと最も類似している標準ブロックから推定されること（６８０）を特徴とする請求項１３に記載の生物学的粒子同定方法。
【請求項１５】
前記類似基準が、相互相関、標準偏差、空間フーリエ変換後の標準偏差、主成分分析に基づく基準であることを特徴とする請求項１４に記載の生物学的粒子同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に生物学的粒子の光学分析の分野に関し、特に微生物診断に応用され、具体的には微生物の同定及び／又はそれらのストレス反応条件に応用され、また、細胞培養の監視にも応用可能である。
【背景技術】
【０００２】
デジタルホログラフィック顕微鏡法（ＤＨＭ，ｄｉｇｉｔａｌ  ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）は、従来の光学顕微鏡法の被写界深度の制約を克服することができるイメージング法として知られている。この方法は、概略的には、観測物体によって回折された光波と空間コヒーレンスを有する参照波との間の干渉によって形成されたホログラムを記録するものである。デジタルホログラフィック顕微鏡法の一般的な紹介については非特許文献１を参照。
【０００３】
最近では、デジタルホログラフィック顕微鏡法を用いた微生物の自動同定が提案されてきている。例えば、非特許文献２には、粒子に対する焦点に対応する平面に向けて数値的伝播を用いて、分析されるボリューム中の多様な種類のバクテリアを同定する方法が記載されている。異なる複数の深度でフォーカスされた（合焦された）像を用いて、微生物の三次元表示を再構築して、次いで、非線形３Ｄフィルタリングを用いて分類する。
【０００４】
同様に、非特許文献３には、分析されるボリューム中のバクテリアの位置を検出する第一ステップと、数値的伝播を用いてボリューム中の異なる複数の深度に焦点を合わせるステップと、バクテリアをそれらの形態学的特性から分類するステップとを備える方法が記載されている。
【０００５】
しかしながら、上記の同定方法は、連続的な複数の焦点面に焦点を合わせることを要するので、複雑である。逆に、単一の焦点面、つまり単一の分析深度に焦点を合わせることは、一般的に、低い誤検出率で微生物の種類を同定するには不十分である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｙｕｎｇ  Ｋ．Ｋｉｍ、“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”、ＳＰＩＥ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｖｏｌ．１、Ｎｏ．１、２０１０年１月
【非特許文献２】Ｎ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ”、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．２０１３、文献番号ＩＤ  １６２１０５
【非特許文献３】Ａｈｍｅｄ  Ｅｌ  Ｍａｌｌａｈｉ、“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｉｎｇ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｈｏｌｏｇｒａｐｈｙ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｗｉｔｈ  ｐａｒｔｉａｌ  ｓｐａｔｉａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ｓｏｕｒｃｅ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｄｒｉｎｋｉｎｇ  ｗａｔｅｒ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ”、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｏｐｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．５２、Ｎｏ．１、２０１３年１月
【非特許文献４】Ｓａｎｇ−Ｈｙｕｋ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃａｌｌｙ  ｔｒａｐｐｅｄ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ”、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｖｏｌ．１５、Ｎｏ．４、ｐ．１５０５−１５１２２００７年２月１９日、
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、単純且つロバストでありながら、低い誤検出率を得ることを可能にするデジタルホログラフィック顕微鏡法による有機粒子同定方法を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、光学系を用いて得られたホログラフィ像のスタックから生物学的粒子を同定するための方法に関し、その方法では、
‐  焦点面に対する複数のデフォーカスずれ（デフォーカスずれは光学系の光軸に沿っている）に対して、複数のホログラフィ像を取得し、
‐  ホログラフィ像のスタックから、焦点面に最も近いものとして参照像を選択し、
‐  対象としている生物学的粒子に対して、ホログラフィ像のスタックから、その対象としている生物学的粒子を有する像ブロックのスタックを抽出し、
‐  抽出された像ブロックのスタックから、対象としている粒子の種類を同定する。
【０００９】
最小デフォーカスずれは、好ましくは、対象としている生物学的粒子の最大厚さよりも大きく、像ブロックが、対象としている生物学的粒子の合焦像を一枚だけ有するようにする。
【００１０】
第一のバリエーションの実施形態によると、複数のホログラフィ像が、光軸に沿った複数の位置に対して光学系によって取得される。
【００１１】
第二のバリエーションの実施形態によると、一つのホログラフィ像が光学系によって取得され、ホログラフィ像のスタックの他のホログラフィ像は、数値的伝播モデルを用いて第一のホログラフィ像から計算される。この場合、第一のホログラフィ像は、有利には、焦点面に対してゼロではないデフォーカスずれで取得される。
【００１２】
参照像は、ホログラフィ像のスタックから、所定の対比基準を最大にする像として選択され得る。
【００１３】
次いで、参照ブロックが、像ブロックのスタックから、参照像が属していて且つ対象としている粒子に中心がある像として選択され、光軸上における参照ブロックの位置が、デフォーカスずれに対する原点として選択される。
【００１４】
また、ホログラフィ像のスタック中の参照像に隣接する像に属し且つ対象としている粒子に中心がある像ブロックの中から、所定の対比基準を最大にする像を探すことによって、参照ブロックを更新することができる。
【００１５】
第一の実施形態によると、像ブロックのスタック中の各ブロックに対して、そのブロックに対する少なくとも一つの特性値が計算され、計算された特性値から、その特性値のプロファイルが、光軸に沿って得られる。
【００１６】
次いで、特性値のプロファイルが閾値と比較され、そのプロファイルがその閾値を超えている場合には対象としている生物学的粒子が第一のタイプであると推定され、その閾値を超えていない場合には第二のタイプであると推定される。
【００１７】
代替的に、類似基準を用いて、特性値のプロファイルが、異なる複数の既知の種類の生物学的粒子に対して得られている複数の標準プロファイルと比較され、生物学的粒子の種類が、特性値のプロファイルに最も類似している標準プロファイルから推定される。
【００１８】
類似基準は、相互相関と、ピアソン係数と、標準偏差との中から選択され得る。
【００１９】
更に代替的には、特性値のプロファイルが、プロファイルの複数のクラス（各クラスは所定の種類の生物学的粒子に対応している）の中から、教師あり学習法を用いて分類される。
【００２０】
第二の実施形態によると、所定のデフォーカスずれに対応する複数のブロックが、像ブロックのスタックから選択される。
【００２１】
次いで、類似基準を用いて、複数の選択されたブロックと同数の標準ブロックとの間の比較が行われ、各標準ブロックは所定の種類の生物学的粒子に対応していて、対象としている生物学的粒子の種類が、複数の選択されたブロックに最も類似している標準ブロックから推定される。
【００２２】
この場合も、類似基準は、相互相関、標準偏差、空間フーリエ変換後の標準偏差、主成分分析に基づいた基準であり得る。
【００２３】
本発明の他の特徴及び利点は、添付図面を参照して好ましい実施形態の説明を読むことで明らかとなるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の生物学的粒子同定方法において使用可能なホログラフィ像記録デバイスを概略的に示す。
【図２】本発明の第一の実施形態に係る生物学的粒子同定方法のフローチャートを概略的に示す。
【図３】像のスタックからの像ブロックのスタックの抽出を概略的に示す。
【図４】ブロックのスタック中から基準ブロックを探すサーチを概略的に示す。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、既知の二種類の生物学的粒子の特性値の軸方向プロファイルをそれぞれ示す。
【図６】本発明の第二の実施形態に係る生物学的粒子同定方法のフローチャートを概略的に示す。
【図７】異なる既知の種類の生物学的粒子についてのＭ組（Ｍタプル）の標準ブロックの一例を与える。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の生物学的粒子同定方法は、図１に関して説明されるようなホログラフィ像記録デバイスを利用する。
【００２６】
このデバイス１００は光源１１０を備え、好ましくは、時間的にコヒーレントで、狭いスペクトル幅（例えば、２００ｎｍ未満、更には１００ｎｍ未満、更には２５ｎｍ未満）のものである。この光源は、特に、レーザーダイオードや発光ダイオードであり得る。光源は、好ましくは空間的にコヒーレントである。光源によって放出される光ビームは、分析されるサンプルの下方にある光ファイバ１２０によって運ばれる。このサンプルは液体、例えば水、緩衝溶液、培養媒体、反応媒体であり、同定される生物学的粒子Ｐを含む。代わりに、サンプルは固体媒体でもあり得て、好ましくは透過性（透明）であり、例えば対象としている粒子を含む寒天である。また、サンプルは気体媒体でもあり得る。生物学的粒子は、媒体内部に含まれるか、サンプルの表面上に存在し得る。
【００２７】
同定される生物学的粒子は微生物、例えば、バクテリアや酵母であり得て、また、細胞、多細胞生物、又は他の種類の汚染粒子やダスト粒子でもあり得る。
【００２８】
観測される粒子のサイズは、１００ｎｍから数百μｍ、更には数ミリメートルまでと様々である。
【００２９】
サンプルは、下部スライド１３１（例えば、従来の顕微鏡スライド）と上部スライド１３２によって垂直に区切られた分析室１３０中に含まれる。分析室は、接着剤１３５又は他の不浸透性物質によって横方向に区切られる。下部スライド及び上部スライドは、光源の波長に対して透過性（透明）である。生物学的粒子は室中に固定されるが、これは、それら粒子を含有する媒体が固体（寒天）であるか、又は、媒体は流体であるが、粒子が上部スライドの内面１３２ｉに付着するからである。粒子は動き得るものであるが、その移動速度が十分に遅ければ、測定時間中においては粒子が固定されているとみなすことができる。
【００３０】
更に、デバイス１００は光学系１４０を備え、例えば、顕微鏡対物レンズ１４５及びチューブレンズ１４１で形成される。任意選択的に、光学系はフィルタ１４３を備え、そのフィルタは、単物レンズの前方に、又は、対物レンズとチューブレンズとの間に配置され得る。
【００３１】
光学系１４０は、特に、その光軸Δ、対物レンズから距離Ｄにある対物面ΠＯ（又は焦点面）、及び、その像面ΠＩ（光学系による対物面と共役）によって特徴付けられる。つまり、物体が対物面ΠＩにある場合、像面ΠＩにはこの物体の対応する鮮明な像が存在する。対物面及び像面は光軸Δに直交している。
【００３２】
像センサ１５０、例えばＣＣＤやＣＭＯＳが像面ΠＩに配置され、又は像面ΠＩの近傍に配置される。従って、センサ１５０は、焦点面の一部の伝達によって像を取得する。
【００３３】
分析室１３０に対する光学系１４０の相対的な位置は垂直方向に調整可能である。例えば、垂直レールに沿って移動可能なレンズホルダに対物レンズが取り付けられる。従って、対象としている一つ以上の生物学的粒子に焦点を合わせることができる。
【００３４】
像センサに形成される像は、生物学的粒子によって回折された波と、生物学的粒子と相互作用せずにサンプルを通過した参照波との間の干渉に起因するものであるので、ホログラフィ像となる。
【００３５】
代わりに、例えば半透過性プレート（図示せず）を用いて、光ビームを二つの成分に分割することができる。第一の成分が参照波として機能し、第二の成分がサンプルによって回折され、光学系の像面における像が、回折波と参照波との間の干渉に起因するものとなる。
【００３６】
このようにして取得されたサンプルの像を、本発明の同定方法を用いて処理する。
【００３７】
図２は、本発明の第一の実施形態に係る生物学的粒子同定方法のフローチャートを概略的に示す。
【００３８】
ステップ２１０では、サンプル中の対象としている生物学的粒子の複数のホログラフィ像（つまり、ホログラフィ像のスタック）を取得する。
【００３９】
第一のバリエーションによると、これらの像は、イメージングシステムによって実験的に得られ、各像は、光軸Δに沿った分析室からの異なる距離に対応している。
【００４０】
第二のバリエーションによると、第一の像が分析室から第一の距離で得られるが、この距離は、粒子に対する合焦条件に必ずしも対応しているものではない。特に、分析される粒子が光源の波長に対して透過性である場合、この第一の像は、合焦条件では得られず、焦点位置から所定の距離において得られる。この距離は、好ましくは２ｍｍ未満、より好ましくは１ｍｍ、更には５００μｍ未満である。このようにして取得された第一の像は、デフォーカスされていると言われる。
【００４１】
下記で説明する数値的伝播モデルを用いて、最初のデフォーカスされた像から、追加の像を計算する。計算された追加の像は、光学系と分析室との間の異なる距離、つまり、イメージングシステムの異なる軸方向位置において観測されるであろうものである。
【００４２】
数値的伝播による像計算方法は、非特許文献４に説明されている。
【００４３】
具体的には、レイリー・ゾンマーフェルトの伝播関数をｈｚ（ｒ）で表すと、
【数１】
0006644073.tif 000002
となり、ここで、ｚはデフォーカス高さ、つまり、焦点面からのずれであり、ｒ＝（ｘ，ｙ）は像面中での位置であり、Ｒ２＝ｒ２＋ｚ２であり、ｋ＝２πｎ／λは伝播媒体に対する波数であり、縦座標ｚの面内の波を以下の形式で表すことができる：
【数２】
0006644073.tif 000003
ここで、Ｂ（ｑ）はｂ（ｒ）（焦点面内の回折波の強度）のフーリエ変換であり（ここでは、参照波の強度は一定としている）、Ｈ−ｚ（ｑ）はｈ−ｚ（ｒ）のフーリエ変換であり、ｑはフーリエ変換におけるｒの双対変数である。
【００４４】
従って、光軸に沿った縦座量ｚ１，…，ｚＮに対する像のスタックＩ１，…，ＩＮを構築することができ、縦軸の原点は軸方向の焦点位置にとられ、各像Ｉｎが複素振幅ａ（ｒ，ｚｎ）によって定義されることを理解されたい。
【００４５】
ステップ２２０では、前ステップにおいて得られた像のスタックＩ１，…，ＩＮの中から、参照像Ｉｒｅｆを選択する。この参照像は、対象としている生物学的粒子に対する理想的合焦条件に最も良く対応しているものである。理想的合焦条件下において、粒子は上部スライド１３２の内面１３２ｉ上に位置し、その内面は光軸Δに垂直である。理想的合焦条件は、焦点面が上記内面と一致している条件である。
【００４６】
実際には、生物学的粒子が透過性ではない場合、参照像の選択を、生物学的粒子を含む領域に適用される最大対比基準に従って行うことができる。この最大対比基準は、例えば、最大標準偏差、又は、この領域内の最大勾配の平均値である。
【００４７】
生物学的粒子が透過性である場合、球面収差を有利に有する光学系を用いて、焦点位置における信号の完全な消失を防止する。
【００４８】
いずれの場合においても、参照像の軸方向位置は、参照位置（ｚ＝０）にあるようにとられ、スタック中の他の像の位置は、この参照位置に対して計算される。
【００４９】
ステップ２３０では、分析される少なくとも一つの粒子が、参照像中から選択される。この選択を、例えば形態学的基準及び／又は測光的基準に基づいて、自動化して行うことができる。
【００５０】
分析される各粒子について、参照像中の位置（ｘ，ｙ）を決定し、その位置に中心がある像ブロックＢｒｅｆとして、関心領域を決定する。このブロックは、分析される粒子よりも大きなサイズのものにも小さなサイズのものにもなり得る点に留意されたい。この像ブロックＢｒｅｆは参照像Ｉｒｅｆから抽出される。
【００５１】
ステップ２４０では、スタックの他の像から、参照像から抽出されたブロックと同じ位置に対応する像ブロックを抽出する。これは、像ブロックのスタックＢ１，…，ＢＮを与え、つまり、分析される粒子に中心がある関心領域に像のスタックを限定する。スタックの各ブロックは、異なる軸方向位置に対応し、つまりは、参照ブロックＢｒｅｆに対する異なるデフォーカス条件に対応することを理解されたい。
【００５２】
図３は、像のスタックＩ１，…，ＩＮ、並びに、座標（ｘ，ｙ）を有する関心粒子Ｐに中心がある像ブロックのスタックＢ１，…，ＢＮを概略的に示す。ブロックは正方形状であるが、本発明の範囲から逸脱せずに他のブロック形状も想定可能であることを理解されたい。
【００５３】
任意選択的なステップ２５０では、分析される粒子に対して、参照像の選択、ひいては参照像ブロックの選択を微調整する。全ての粒子が光軸に直交する同一平面内に存在しない場合（特に、上部スライドの内面が光軸に完全には直行していない場合）、焦点面は粒子毎に異なり得る。そこで、スタックのブロックの中から、有利には、ステップ２２０で選択された参照像Ｉｒｅｆの両側の像ブロックの中から、合焦条件に最も良く対応するものを探すサーチを行う。この選択を、ステップ２２０と同様に、今度はスタックのブロックに対して最大対比基準を用いて、行うことができる。この場合も、最大対比基準は、最大標準偏差、又はブロックに対する最大勾配の平均値であり得る。そして、選択されたブロックが、スタックの新たな参照ブロックＢｒｅｆとなる。
【００５４】
図４は、生物学的粒子の像ブロックのスタック中から参照ブロックを探すサーチの一例を示す。ブロックの下付き添え字がｘ軸に沿って与えられていて、各ブロックＢｎは異なる軸方向位置ｚｎに対応していて、ブロック中のピクセルの強度の標準偏差がｙ軸に沿って与えられている。
【００５５】
ステップ２２０における参照像Ｉｒｅｆのサーチと、ステップ２３０における関心粒子に中心があるブロックの抽出とが、図４にＢ（１）ｒｅｆで示される第一の参照ブロックを与える。任意選択的なステップ２５０におけるより細かな焦点のサーチが、標準偏差の曲線の最大値に対応する第二の参照ブロックＢ（２）ｒｅｆを与える。従って、このステップを行う場合、この第二の参照ブロックが、同法方法の残りの部分において参照ブロックＢｒｅｆとされる。
【００５６】
ステップ２６０では、ブロックのスタック中の各ブロックＢｎについて、少なくとも一つの特性値Ｇ（ｚｎ）を計算し、光軸に沿ったこの特性値の軸方向プロファイルを推定する。具体的には、ブロックＢ１，…，ＢＮが軸方向位置ｚ１，…，ｚＮに対応する場合、ブロックの軸方向プロファイルは、シーケンスＧ（ｚ１），Ｇ（ｚ２），…，Ｇ（ｚｎ）で構成される。
【００５７】
この特性値は、特にブロックに関連する統計値、例えば、ブロック中のピクセルの強度の平均値、中央値、標準偏差であり得る。また、スタックの像が実験的ではなく、数値的伝播によって得られている場合、ブロックの各ピクセルは複素数と関連付け可能である。そこで、特性値が、複素数の実部又は虚部に関係するものとなり得る。例えば、特性値として、ブロックの複素振幅の虚部の平均値の二乗をとることができ、つまり、ブロックＢｎについて以下のようになる：
【数３】
0006644073.tif 000004
ここで、Ｅ（・）は、ｒ∈Ｂｎに対する平均を表す。
【００５８】
任意選択的に、離散的な値Ｇ（ｚ１），Ｇ（ｚ２），…，Ｇ（ｚＮ）に対して内挿を行って、特性値のプロファイルのより細かな分解能を得ることができる。
【００５９】
ステップ２７０では、このようにして得られた軸方向プロファイルから生物学的粒子の種類を同定する。
【００６０】
特に単純な第一のバリエーションによると、軸方向プロファイルＧ（ｚ）を閾値と比較して、二種類の粒子を区別することができる。
【００６１】
図５Ａ及び図５Ｂは、二種類の生物学的粒子、具体的には表皮ブドウ球菌（図５Ａ）と黄色ブドウ球菌（図５Ｂ）についての特性値（ここでは、ブロックの振幅の虚部の平均値の二乗）の軸方向プロファイルを示す。閾値Ｔｈ（例えば０．４）が、二種類の生物学的粒子（ここでは二種類のブドウ球菌）の効率的な区別を可能にしていることが見て取れる。軸方向プロファイルが閾値を超えると、生物学的粒子が表皮ブドウ球菌と同定され、一方、閾値を超えないと、黄色ブドウ球菌と同定される。
【００６２】
この第一のバリエーションは参照ブロックＢｒｅｆの正確な決定を要さないが、ステップ２３０で分析される粒子を選択するために参照像Ｉｒｅｆを探さなければならない点に留意されたい。
【００６３】
第二のバリエーションでは、特性値の軸方向プロファイルを、類似基準を用いて、例えばデータベースに保存されている既知の種類の生物学的粒子について以前に得られた同じ特性値の軸方向プロファイルＧ１（ｚ），…，ＧＫ（ｚ）と比較する。プロファイルＧ１（ｚ），…，ＧＫ（ｚ）は標準プロファイルと称される。共通の原点（参照ブロック）を用いることで、比較が簡単になる。
【００６４】
類似基準は、例えば、相互相関値やピアソン係数である。標準プロファイルＧｋ（ｚ）がプロファイルＧ（ｚ）に最も近い場合の下付き添え字ｋｍａｘ∈｛１，…，Ｋ｝が、生物学的粒子の種類を与える。
【００６５】
同定の第三のバリエーションでは、ステップ２７０において、スタックの各ブロックＢｎについて、複数の特性値Ｇｌ（ｚｎ）、ｌ＝１，…，Ｌが計算される。これは、粒子を特徴付ける複数の軸方向プロファイルＧｌ（ｚ）を与える。類似基準を用いて、複数のプロファイルを、既知のＫ種類の粒子の各々について得られている同数のプロファイル（つまり、Ｇｌｋ（ｚ），ｌ＝１，…，Ｌ、ｋ＝１，…，Ｋ）と比較することができる。類似基準を用いて、測定されたプロファイルに最も近い複数の標準軸方向プロファイルＧｌｋｍａｘ（ｚ）が決定される。第一のバリエーションと同様に、下付き添え字ｋｍａｘが分析された生物学的粒子の種類を与える。
【００６６】
第四のバリエーションでは、粒子の同定に、教師あり学習法を用いる。このバリエーションは、Ｋ種類の生物学的粒子についての軸方向プロファイルを事前に取得しておく。そして、軸方向プロファイルの値、このましくはこのプロファイルの特性値を記述子（ディスクリプタ）として用いて、生物学的粒子がＫ種の分類に分類され、各分類を、Ｌ次元空間における一組のドットによって表すことができる。
【００６７】
分析される生物学的粒子の軸方向プロファイルから、Ｌ次元空間中の対応するドットが決定され、そのドットの組、つまりそのドットが属する分類が探される。
【００６８】
例えば、ブロックの特性値が式（３）で定められるものであるとして、その最大値をプロファイル特性とする場合、以下のバクテリアの効率的な分類を与えることができることがわかった：アシネトバクター・ジョンソニー、エンテロバクター・エロゲネス、大腸菌、表皮ブドウ球菌。そして、既知の個体数のサンプルに対して、以下の混同行列（ｃｏｎｆｕｓｉｏｎ  ｍａｔｒｉｘ，ＣＭ）が得られた：
【数４】
0006644073.tif 000005
ここで、異なる行は異なる種類の個体数に対応し、異なる列は、本同定方法によって予測された分類に対応している。混同行列は対角優位であるので、誤同定率は比較的低い。
【００６９】
当業者は、ベイズ式分類法やサポートベクターマシン等の通常の教師あり学習法を用いて、生物学的粒子をそれらの軸方向プロファイルから分類することができることを理解されたい。
【００７０】
図６は、本発明の第二の実施形態に係る生物学的粒子同定方法のフローチャートを示す。
【００７１】
本発明の第二の同定方法も、関心のある生物学的粒子に中心がある像ブロックのスタックに基づいている。ブロックは、上述のように取得又は計算された像のスタックから抽出される。具体的には、ステップ６１０から６５０は、本発明の第一の実施形態に係る同定方法のステップ２１０から２５０とそれぞれ同じであるので、これ以上説明しない。
【００７２】
一方、ステップ６６０では、特性値が計算されず、ブロックのスタックの中から、参照ブロックＢｒｅｆ（ｚ＝０）に対して所定のずれ（ｅｎｚ）で位置しているブロックのサブグループＭが選択される。実際には、スタックの像は規則的な間隔で取得され又は（数値的伝播によって）計算されるので、ブロックのスタックからの選択は、参照ブロックの下付き添え字に対する所定の下付き添え字に関するものとなる。
【００７３】
ステップ６７０では、類似基準を用いて、Ｍ組（Ｍタプル）の選択されたブロックが、Ｍ組の標準ブロックと比較され、標準ブロックのＭ組の各々は既知の種類の生物学的粒子に関するものであり、Ｍ組の各々のブロックは上記所定の距離において得られたものである。
【００７４】
類似基準は、分析される粒子のブロックのフーリエ変換と標準ブロックの変換との間の標準偏差、ピアソン係数、空間相関であり得て、また、主成分分析（ＰＣＡ，ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）に基づいたものともり得る。後者の場合、分析される粒子のＭ組のブロックの各ブロックと、Ｍ組の標準ブロックの各ブロックとについて、ピクセル分布の主軸を決定することができ、分析される粒子のブロックの主軸の整列を標準ブロックの主軸と比較することができる（例えば、方向ベクトルの内積を用いて）。
【００７５】
選択される類似基準にかかわらず、ステップ６８０において、分析される粒子のＭ組のブロックに最も近いＭ組の標準ブロックが、生物学的粒子の種類を与える。
【００７６】
図７は、多様な生物学的粒子についてＭ組の標準ブロックの一例を与える。
【００７７】
図示されている例では、Ｍ＝３であり、所定のデフォーカスずれはそれぞれ１５μｍ（１列目の像ブロック）、６μｍ（２列目の像ブロック）、０μｍ（焦点面にある３列目の像ブロック）であり、ずれは、ビームの伝播方向を正として計算されている。
【００７８】
１行目の標準ブロックが関連している種は大腸菌であり、２行目の標準ブロックが関連している種はアシネトバクター・ジョンソニーであり、３行目の標準ブロックが関連している種は表皮ブドウ球菌である。
【００７９】
大腸菌の標準ブロックとアシネトバクター・ジョンソニーの標準ブロックが１５μｍにおいてよく似た構造を有している一方で、表皮ブドウ球菌の標準ブロックが大きく異なる構造を有しているのが見て取れる。同様に、アシネトバクター・ジョンソニーの標準ブロックと表皮ブドウ球菌の標準ブロックが０μｍにおいてよく似た構造を有している一方で、大腸菌の標準ブロックが大きく異なる構造を有している。従って、三組の像ブロックを用いることで、同定の不確実性をなくすことができる。
【符号の説明】
【００８０】
１００  ホログラフィ像記録デバイス
１１０  光源
１２０  光ファイバ
１３０  分析室
１４０  光学系
１５０  像センサ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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