(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１（ＭＧＲＴＳＦＤＳＤＳ、ｐＢ２−７とも呼ばれる）、配列番号５（ＥＫＦＤＳＶＨＳＫＹＭ、ペプチドｐＢ２−４とも呼ばれる）および配列番号９（ＤＳＤＳＷＴＬＲ、ペプチドｐＢ２−６とも呼ばれる）で示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなる、単離および精製されたペプチド、
配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＭＧＲＴＳＦＤＳＤＳ（Ｄ−Ａ）からなるペプチド（ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７とも呼ばれる）、配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＥＫＦＤＳＶＨＳＫＹＭ（Ｄ−Ａ）からなるペプチド（ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４とも呼ばれる）および配列番号１０で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＤＳＤＳＷＴＬＲ（Ｄ−Ａ）からなるペプチド（ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６とも呼ばれる）から選択される、前記ペプチドの機能的誘導体、または、
前記ペプチドもしくは前記機能的誘導体の薬学上許容可能な塩。
【請求項２】
請求項１に定義される少なくとも１つの単離および精製されたペプチド、請求項１に定義される少なくとも１つの機能的誘導体、または請求項１に定義される少なくとも１つの薬学上許容可能な塩を有効成分として含んでなり、場合により、薬学上許容可能な担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤をさらに含んでなる、医薬組成物。
【請求項３】
細菌病原体、細菌病原体の混合物および／または毒性細菌成分により誘発される、敗血症、毒性ショック、敗血性ショック、重度敗血症、機能喪失および結果としての死亡のうちの少なくとも１つに対して防御免疫を惹起するための、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ヒト対象において、細菌感染およびそれに関連する急性炎症のうちの少なくとも１つの処置のための、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記細菌感染およびそれに関連する急性炎症のうちの少なくとも１つが、グラム陽性菌、グラム陰性菌および毒性細菌成分のうちの少なくとも１つにより誘発される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記処置が付加的治療薬を投与することをさらに含んでなる、請求項４または５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記グラム陰性菌が、プロテオバクテリア、大腸菌、サルモネラ菌属、赤痢菌属、腸内細菌科、シュードモナス、モラクセラ、ヘリコバクター、ブデロビブリオ属、ステノトロホモナス、酢酸菌、レジオネラ、アルファプロテオバクテリア、ボルバキア、グラム陰性球菌、ナイセリア種、淋菌、髄膜炎菌、モラクセラ・カタラーリス、グラム陰性桿菌、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、レジオネラ・ニューモフィラ、緑膿菌、プロテウス・ミラビリス、エンテロバクター・クロアカ、霊菌、ピロリ菌、腸炎菌、チフス菌、アシネトバクター・バウマニ、野兎病菌、ビブリオ属、バルニフィカス、コレラ菌、フルビアリス、腸炎ビブリオ、アルギノリチカス、フォトバクター・ダムセラ、アエロモナス・ヒドロフィラ、ウェルシュ菌、クロストリジウム・ヒストリチカム、プリフィロモナス／プレボテラ種  プレボテラ・インテルメディア、プレボテラ・ブッケ、プレボテラ種、バクテロイデス・ユニフォルミスおよびＮＤＭ−１細菌株からなる群から選択され、前記グラム陽性菌がＡ群連鎖球菌属、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌属、糞便連鎖球菌、Ｄ群連鎖球菌属、Ｇ群連鎖球菌属、緑色連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミレリ、プロピオニバクテリウム種、エンテロコッカス・フェシウム、ペプトストレプトコッカス種、微好気性連鎖球菌、乳酸菌種、表皮ブドウ球菌および黄色ブドウ球菌からなる群から選択され、前記毒性細菌成分が外毒素、内毒素、スーパー抗原性毒素、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、傷害関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）、リポ多糖、ペプチドグリカンまたはそれらの毒性成分、自然免疫系の細胞により認識される病原体群に関連する分子、およびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）により認識される病原体群に関連する分子からなる群から選択される、請求項３〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つの毒性細菌成分がスーパー抗原性毒素である、請求項３〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
経口投与および非経口投与のうちのいずれか１つのための、請求項２〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記非経口投与が、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、くも膜下腔内、皮下注射のうちのいずれか１つである、または前記投与が吸入である、請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Ｂ７リガンドの二量体界面に由来するペプチドが開示される。具体的には、本開示は、新規な単離された非天然ペプチド、それらを含んでなる組成物およびそれらを使用する処置方法に関する。特定の組成物および方法は、グラム陽性およびグラム陰性菌およびそれらの細菌成分により誘発される感染の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
今般開示される主題の背景として関連があると考えられる参照文献を以下に挙げる。
0006776254.tif 000002
0006776254.tif 000003
【０００３】
これらの刊行物はそれらの上の数字によって以下に参照される。本明細書の上記の参照文献の承認は、これらが今般開示される主題の特許性に何らかの関連があることを意味するものと推断されるべきではない。
【０００４】
背景
主要な補助刺激受容体としてのＣＤ２８は、免疫応答の重要なレギュレーターである（１〜３）。Ｔ細胞上で構成的に発現されるＣＤ２８は、抗原提示細胞上で発現されるそのＢ７補助リガンド、すなわち、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）と相互作用するホモ二量体である。ＣＤ２８／Ｂ７相互作用は、即時Ｔ細胞応答に不可欠なシグナルの伝達をもたらす（２〜４）。ＣＤ２８補助リガンドＢ７−２（ＣＤ８６）は、抗原提示細胞上で構成的に発現されるが、Ｂ７−１（ＣＤ８０）はその後にのみ誘導され（４）；ゆえに、Ｂ７−２／ＣＤ２８相互作用は初期抗原シグナル伝達を調節する（５、６）。
【０００５】
Ｂ７−１およびＢ７−２は糖タンパク質であり、それぞれ単一のＶ様およびＣ様免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインからなる。それらのリガンドＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４もまた構造的に関連があり、細胞表面に単一のＶ様ＩｇＳＦドメインのジスルフィド結合ホモ二量体として発現される。
【０００６】
炎症性サイトカイン応答は防御免疫に不可欠であるが、細菌感染およびウイルス感染は、宿主に有害な過大応答（「サイトカインストーム」）を惹起することも多い。黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)および化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)由来の細菌スーパー抗原は、通常の抗原により惹起されるものを数桁超えて免疫応答を活性化することにより毒性ショックを誘発することが知られている。スーパー抗原は、完全なタンパク質としてほとんどの主要組織適合性クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子と、それらの抗原結合ドメインの外で直接結合し、それらを連結し、一般に＜１％のＴ細胞を活性化する従来の抗原の制限された提示をバイパスし、それにより、最大２０〜３０％のＴ細胞を活性化することによってＴ細胞活性化の主軸を利用することがこれまでに示されている（７〜９）。
【０００７】
さらに、スーパー抗原によるＴ細胞活性化は、Ｔ細胞活性化に必須の第２のシグナル伝達分子であるＣＤ２８へのそれらの直接的結合を必要とする（１０）。この結果、インターロイキン−２（ＩＬ２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む、毒性ショックを媒介する炎症性サイトカインが大量に誘導される。
【０００８】
スーパー抗原の有害な影響に関しては十分な例がある。例えば、経口摂取後に嘔吐および下痢により顕在化するヒト食中毒症例の大部分は、黄色ブドウ球菌により分泌される腸毒素（ＳＥ）ファミリーのスーパー抗原により引き起こされる。ＳＥファミリー内の主要血清型には、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＥおよびＳＥＧがあり、ＳＥＢはまた、外科的または傷害性創傷感染に不随し得る非月経性毒素ショック症候群、ならびに気道のウイルス感染のヒト症例の主因としても認識されている。特に、毒素ショック症候群は、そのほとんどの重症形態でショックおよび死亡を引き起こす。
【０００９】
従って、細菌スーパー抗原はＴｈ１サイトカインストームを誘発し、毒性ショックを引き起こすことが知られている。本発明者らは、マウスがＣＤ２８二量体界面のペプチド模倣物よって、また、ＣＤ２８上のその結合部位をめぐってスーパー抗原と競合するように選択されたペプチドによって致死的スーパー抗原刺激から保護されたことをこれまでに示した（１０、１１）。
【００１０】
具体的には、発散性のスーパー抗原によるヒト炎症性サイトカイン遺伝子発現の誘導は、  スーパー抗原において構造的に保存されておりさらにそれらのＭＨＣ−ＩＩおよびＴＣＲ結合部位から離れている１２−アミノ酸β鎖−ヒンジ−αヘリックススーパー抗原ドメインと相同性を示す短いペプチドによって阻害され得る。スーパー抗原作用に不可欠なこのドメイン（１０、１２）を介して、スーパー抗原は、そのホモ二量体界面においてＣＤ２８と直接会合する（１０）。ＣＤ２８ホモ二量体界面のペプチド模倣物またはβ鎖−ヒンジ−αヘリックススーパー抗原ドメインを用いたスーパー抗原のＣＤ２８への接の遮断は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において炎症性サイトカインの過剰発現に関するシグナル伝達を遮断するのに、また、致死的毒性ショックからマウスを保護するのに十分である（１０、１２、１３）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
概要
本開示は、ヒトＢ７−２の細胞外ドメインの領域内の結晶学的二量体界面の少なくとも１個のアミノ酸残基を含んでなる、単離および精製されたペプチドであって、前記領域は配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなり、前記結晶学的二量体界面は、配列番号１３のアミノ酸残基Ｔｈｒ−１１、Ｌｅｕ−２６、Ｓｅｒ−２７、Ｌｅｕ−４６、Ｇｌｙ−４７、Ｌｙｓ−４８、Ｇｌｕ−４９、Ｐｈｅ−５１、Ｍｅｔ−５９、Ｇｌｙ−６０、Ａｒｇ−６１、Ｔｈｒ−６２、Ｓｅｒ−６３、Ｐｈｅ−６４、Ａｓｐ−６５、Ｓｅｒ−６６、Ａｓｐ−６７、Ａｒｇ−７２、Ｈｉｓ−７４およびＡｓｎ−７５からなり、前記単離および精製されたペプチドは、そのＣ末端および／またはＮ末端に少なくとも２個の付加的アミノ酸残基をさらに含んでなり、前記付加的アミノ酸残基は、配列番号１３内の前記結晶学的二量体界面の前記少なくとも１個のアミノ酸残基にすぐ隣接する配列番号１３の連続するアミノ酸残基であり、前記単離および精製されたペプチドは、３〜約３０個のアミノ酸残基からなる、単離および精製されたペプチド、ならびにその機能的断片および誘導体を提供する。これらのペプチドはまた、本明細書で「ｈＢ７−２模倣物ペプチド」とも呼ばれる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本開示による単離および精製されたペプチドは、前記ヒトＢ７−２の細胞外ドメインの領域内の結晶学的二量体界面の少なくとも１個のアミノ酸残基と、そのＣ末端および／またはＮ末端における２〜約８個の前記付加的アミノ酸残基を含んでなり、ならびにその機能的断片および誘導体である。
【００１３】
他の実施形態では、本開示による単離および精製されたペプチドは、配列番号１１（ＭＧＲＴＳＦＤＳＤＳ、ｐＢ２−７とも呼ばれる）、配列番号５（ＥＫＦＤＳＶＨＳＫＹＭ、ペプチドｐＢ２−４とも呼ばれる）および配列番号９（ＤＳＤＳＷＴＬＲ  ペプチドｐＢ２−６とも呼ばれる）で示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列ならびにその機能的断片および誘導体からなる。
【００１４】
さらなる態様により、本開示は、ヒトＢ７−１の細胞外ドメインの領域内の結晶学的二量体界面の少なくとも１個のアミノ酸残基を含んでなる単離および精製されたペプチドであって、前記領域は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなり、前記結晶学的二量体界面は、配列番号１４のアミノ酸残基Ｖａｌ−１５、Ｌｅｕ−２９、Ａｌａ−３０、Ｓｅｒ−４８、Ｇｌｙ−４９、Ａｓｐ−５０、Ｍｅｔ−５１、Ｌｙｓ−５８、Ａｓｎ−５９、Ａｒｇ−６０、Ｔｈｒ−６１、Ｉｌｅ−６２、Ｐｈｅ−６３、Ａｓｐ−６４、Ｉｌｅ−６５、Ｔｈｒ−６６、Ｖａｌ−７２、Ｌｅｕ−７４およびＡｌａ−７５からなり、前記単離および精製されたペプチドは、そのＣ末端および／またはＮ末端に少なくとも２個の付加的アミノ酸残基をさらに含んでなり、前記付加的アミノ酸残基は、配列番号１４内の前記結晶学的二量体界面の前記少なくとも１個のアミノ酸残基にすぐ隣接する配列番号１４の連続するアミノ酸残基であり、前記単離および精製されたペプチドは、３〜約３０個のアミノ酸残基からなる、単離および精製されたペプチド、ならびにその機能的断片および誘導体を提供する。これらのペプチドはまた、本明細書で「ｈＢ７−１模倣ペプチド」とも呼ばれる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本開示による単離および精製されたペプチドは、前記ヒトＢ７−１の細胞外ドメインの領域内の結晶学的二量体界面少なくとも１個のアミノ酸残基と、そのＣ末端および／またはＮ末端のそれぞれにおける２〜約８個の前記付加的アミノ酸残基を含んでなり、ならびにその機能的断片および誘導体である。
【００１６】
他の実施形態では、本開示による単離および精製されたペプチドは、配列番号３８（ＭＮＩＷＰＥＹＫ、ｐＢ１−４で示される）、配列番号４０（ＫＮＲＴＩＦＤＩＴＮ、ｐＢ１−７で示される）、配列番号４２（ＤＩＴＮＮＬＳＩＶ、ｐＢ１−６で示される）、配列番号４６（ＳＧＤＭＮＩＷＰＥＹＫＮＲＴＩＦＤＩＴＮＮＬＳＩＶＩＬＡ）および配列番号４８（ＹＫＮＲＴＩＦＤ、ｐＢ１−８で示される）で示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、およびそれらの機能的誘導体からなる。
【００１７】
さらなる実施形態では、今般開示される単離および精製されたペプチドの機能的誘導体は、
ｉ．そのＮ末端および／またはＣ末端において、配列番号１３で示されるアミノ酸配列の対応する位置にすぐ隣接して存在する１〜４個の連続するアミノ酸残基だけ延長された前記Ｂ７−２模倣ペプチド；
ｉｉ．そのＮ末端および／またはＣ末端において、
（ａ）システインによりまたはラウリルシステインにより；
（ｂ）非天然有機部分によりまたは合成アミノ酸残基により；
（ｃ）Ｎ−アセチルまたはリシル−パルミトイル残基により；
（ｄ）天然または合成アミノ酸残基であり得る１または複数の疎水性アミノ酸残基により、
延長された前記Ｂ７−２模倣ペプチド；または
ｉｉｉ．（ｉ）および（ｉｉ）のペプチドのいずれかの二量体または多量体；
ｉｖ．前記Ｂ７−２模倣ペプチドの制約立体配座；
ｖ．挿入、欠失、置換から選択される少なくとも１つの合成突然変異により改変された、前記Ｂ７−２模倣ペプチドのいずれかおよび（ｉ）〜（ｉｖ）に定義されるそれらの誘導体であって、改変ペプチドが前記二量体界面の少なくとも１個のアミノ酸残基を含んでなる、前記Ｂ７−２模倣ペプチドのいずれかおよび（ｉ）〜（ｉｖ）に定義されるそれらの誘導体
のうちのいずれか１つであり、前記誘導体は３〜約４０個のアミノ酸残基からなる。
【００１８】
なおさらなる実施形態では、今般開示される単離および精製されたペプチドの機能的誘導体は、
ｉ．そのＮ末端および／またはＣ末端において、配列番号１４で示されるアミノ酸配列の対応する位置にすぐ隣接して存在する１〜４個の連続するアミノ酸残基だけ延長された前記Ｂ７−１模倣ペプチド；
ｉｉ．そのＮ末端および／またはＣ末端において、
（ａ）システインによりまたはラウリルシステインにより；
（ｂ）非天然有機部分によりまたは合成アミノ酸残基により；
（ｃ）Ｎ−アセチルまたはリシル−パルミトイル残基により；
（ｄ）天然または合成アミノ酸残基であり得る１または複数の疎水性アミノ酸残基により、
延長された前記Ｂ７−１模倣ペプチド；または
ｉｉｉ．（ｉ）および（ｉｉ）のペプチドのいずれかの二量体または多量体；
ｉｖ．前記Ｂ７−１模倣ペプチドの制約立体配座；
ｖ．挿入、欠失、置換から選択される少なくとも１つの合成突然変異により改変された、前記Ｂ７−１模倣ペプチドのいずれかおよび（ｉ）〜（ｉｖ）に定義されるそれらの誘導体であって、改変ペプチドが前記二量体界面の少なくとも１個のアミノ酸残基を含んでなる、前記Ｂ７−１模倣ペプチドのいずれかおよび（ｉ）〜（ｉｖ）に定義されるそれらの誘導体
のうちのいずれか１つであり、前記誘導体は３〜約４０個のアミノ酸残基からなる。
【００１９】
いくつかの態様および実施形態において、本明細書で開示される単離および精製されたペプチドは、そのＮ末端および／またはそのＣ末端においてＤ−Ａｌａアミノ酸残基で延長されている。
【００２０】
特定の実施形態では、本開示による単離されたペプチドは、配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＥＫＦＤＳＶＨＳＫＹＭ（Ｄ−Ａ）からなるペプチド（本明細書ではペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４とも呼ばれる）、配列番号１０で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＤＳＤＳＷＴＬＲ（Ｄ−Ａ）からなるペプチド（本明細書ではペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６とも呼ばれる）および配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＭＧＲＴＳＦＤＳＤＳ（Ｄ−Ａ）からなるペプチド（本明細書ではペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７とも呼ばれる）、請求項９に記載の単離されたペプチドのうちのいずれか１つである。
【００２１】
他の特定の実施形態では、本開示による単離および精製されたペプチドは、配列番号３９で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＭＮＩＷＰＥＹＫ（Ｄ−Ａ）からなるペプチド（Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ１−４とも呼ばれる）、配列番号４１で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＫＮＲＴＩＦＤＩＴＮ（Ｄ−Ａ）からなるペプチド（Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ１−７とも呼ばれる）、配列番号４３で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａｌａ）ＤＩＴＮＮＬＳＩＶ（Ｄ−Ａｌａ）からなるペプチド（Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ１−６とも呼ばれる）、および配列番号４９で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａｌａ）ＹＫＮＲＴＩＦＤ（Ｄ−Ａｌａ）からなるペプチド（Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ１−８とも呼ばれる）のうちのいずれか１つである。
【００２２】
本開示はさらに、本明細書に定義される少なくとも１つの単離および精製されたペプチドを有効成分として含んでなり、場合により、薬学上許容可能な担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤をさらに含んでなる医薬組成物を提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本開示による医薬組成物は、細菌病原体、細菌病原体の混合物および／または毒性細菌成分により誘発される敗血症、毒性ショック、敗血性ショック、重度敗血症、機能喪失および結果としての死亡のうちの少なくとも１つに対して防御免疫を惹起するためのものである。
【００２４】
他の実施形態では、本開示による医薬組成物は、ヒト対象において、細菌感染およびそれに関連する急性炎症のうちの少なくとも１つの処置のためのものである。
【００２５】
総ての態様および実施形態において、前記細菌感染およびそれに関連する急性炎症のうちの少なくとも１つは、グラム陽性菌、グラム陰性菌および毒性細菌成分のうちの少なくとも１つにより誘発される。
【００２６】
総ての態様および実施形態において、グラム陰性菌がプロテオバクテリア、大腸菌(Escherichia coli)、サルモネラ菌属(Salmonella)、赤痢菌属(Shigella)、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、シュードモナス(Pseudomonas)、モラクセラ(Moraxella)、ヘリコバクター(Helicobacter)、ブデロビブリオ属(Bdellovibrio)、ステノトロホモナス(Stenotrophomonas)、酢酸菌、レジオネラ(Legionella)、アルファプロテオバクテリア、ボルバキア(Wolbachia)、グラム陰性球菌(Gram-negative cocci)、ナイセリア(Neisseria)種、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、グラム陰性桿菌(Gram-negative bacilli)、インフルエンザ菌(Hemophilus influenzae)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、霊菌(Serratia marcescens)、ピロリ菌(Helicobacter pylori)、腸炎菌(Salmonella enteritidis)、チフス菌(Salmonella typhi)、アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumannii)、野兎病菌(Francisella tularemia)、ビブリオ属(Vibrio)、バルニフィカス(vulnificus)、コレラ菌(cholerae)、フルビアリス(fluvialis)、腸炎ビブリオ(parahemolyticus)、アルギノリチカス(alginolyticus)、フォトバクター・ダムセラ(Photobacter damsela)、アエロモナス・ヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・ヒストリチカム(Clostridium histolyticum)、プリフィロモナス(Porphyromonas)／プレボテラ種(prevotella)  プレボテラ・インテルメディア(Prevotella Intermedia)、プレボテラ・ブッケ(Prevotella Buccae)、プレボテラ(Prevotella)種、バクテロイデス・ユニフォルミス(Bacteroides uniformis)およびＮＤＭ−１細菌株からなる群から選択され、前記グラム陽性菌がＡ群連鎖球菌属(Group A streptococcus)、化膿連鎖球菌(S. pyogenes)、肺炎連鎖球菌(S. pneumonia)、Ｂ群連鎖球菌属(Group B strep)、糞便連鎖球菌(Enterococcus faecalis)、Ｄ群連鎖球菌属(Group D streptococcus)、Ｇ群連鎖球菌属(Group G streptococcus)、緑色連鎖球菌(Streptococcus viridans)、ストレプトコッカス・ミレリ(Streptococcus milleri)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)種、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ペプトストレプトコッカス(Peptostreptococcus)種、微好気性連鎖球菌(Streptococcus Microaerophilic)、乳酸菌(Lactobacillus)種、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus Epidermis)および黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)からなる群から選択され、前記毒性細菌成分が外毒素、内毒素、スーパー抗原性毒素、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、傷害関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）、リポ多糖、ペプチドグリカンまたはそれらの毒性成分、自然免疫系の細胞により認識される病原体群に関連する分子、およびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）により認識される病原体群に関連する分子からなる群から選択される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの毒性細菌成分は、スーパー抗原性毒素である。
【００２８】
他の実施形態では、本開示による医薬組成物は、経口投与および非経口投与のうちのいずれか１つのためのものである。
【００２９】
総ての態様および実施形態において、本明細書に定義される非経口投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、くも膜下腔内、皮下注射のうちのいずれか１つである、または前記投与は吸入である。
【００３０】
本開示はさらに、必要とするヒト対象において、細菌病原体、細菌病原体の混合物および／または毒性細菌成分により誘発される敗血症、毒性ショック、敗血性ショック、重度敗血症、機能喪失および結果としての死亡のうちの少なくとも１つに対する防御免疫を惹起するための方法で使用するための、本明細書で定義されるペプチドをさらに提供する。
【００３１】
もう１つのその態様によれば、本開示は、必要とするヒト対象において、細菌感染およびそれに関連する急性炎症のうちの少なくとも１つを処置する方法で使用するための、本明細書で定義されるペプチドを提供する。
【００３２】
本開示はさらに、必要とするヒト対象において、細菌病原体、細菌病原体の混合物および／または毒性細菌成分により誘発される敗血症、毒性ショック、敗血性ショック、重度敗血症、機能喪失および結果としての死亡のうちの少なくとも１つに対する防御免疫を惹起するための方法で使用するための、本明細書で定義される医薬組成物を提供する。
【００３３】
さらにもう１つのその態様によれば、今般開示される主題は、必要とするヒト対象において、細菌感染およびそれに関連する急性炎症のうちの少なくとも１つを処置する方法で使用するための、本明細書で定義される少なくとも１つの単離および精製されたペプチドを有効成分として含んでなり、場合により、薬学上許容可能な担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤をさらに含んでなる医薬組成物を提供する。
【００３４】
今般開示される主題はさらに、必要とするヒト対象において、細菌病原体、細菌病原体の混合物および／または少なくとも１つの毒性細菌成分により誘発される敗血症、毒性ショック、敗血性ショック、重度敗血症、機能喪失および結果としての死亡のうちの少なくとも１つに対する防御免疫を惹起するための方法であって、前記対象に免疫学的に有効な量の本明細書で定義されるペプチドまたはそれを含んでなる薬学上許容可能な組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、細菌感染およびそれに関連する急性炎症のうちの少なくとも１つを処置する方法は、それを必要とする前記ヒト対象に付加的治療薬を投与することをさらに含んでなる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、免疫学的に有効な量は、約０．１〜約６０μｇ／Ｋｇ前記対象の体重である。
【００３７】
本開示はさらに、必要とするヒト対象において細菌感染およびそれに関連する急性炎症のうちの少なくとも１つを処置する方法であって、前記対象に治療上有効な量の少なくとも１つのペプチドまたは本明細書で定義される、それを含んでなる組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本明細書で定義される治療上有効な量は、約０．１〜約６０μｇ／Ｋｇ前記対象の体重である。
【００３９】
本明細書に開示される手段をより良く理解するため、また、実施の際にどのようにそれを行えばよいかを例示するために、以下、添付の図面を参照して、単に限定されない例として実施形態を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１：Ｂ７−２のホモ二量体界面由来のペプチド。ヒトＢ７−２（ｈＢ７−２）二量体界面断片のアミノ酸配列（（１）、ここで、Ｎ末端のアミノ酸残基プロリン（Ｐ）は、配列番号５０で示されるようにメチオニン（Ｍ）で置換されている）、上にｈＢ７−２ペプチド模倣物が示される。ｈＢ７−２の細胞外ドメインでは、二量体界面の残基を下線で示し、ＣＴＬＡ４と接する残基を太字で示す。ペプチド配列は四角で囲まれている。
【図２Ａ】図２Ａ：Ｂ７−２ホモ二量体界面のペプチド模倣物は、スーパー抗原アンタゴニストである。図２Ａ１〜図２Ａ５は、示されたペプチドの存在下でのＩＦＮ−γのレベルの図を示す。ＰＢＭＣを、示されたように、０．１μｇ／ｍｌのペプチドｐＢ２−２（図２Ａ１）、ｐＢ２−３（図２Ａ２）、ｐＢ２−４（図２Ａ３）、ｐＢ２−５（図２Ａ４）およびｐＢ２−６（図２Ａ５）の不在下（各パネルの白丸）または存在下（黒丸）、ＳＥＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて誘導した。分泌されたＩＦＮ−γを測定した（ｐｇ／ｍｌ×１０−２）（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３）。
【図２Ｂ】図２Ｂ：Ｂ７−２ホモ二量体界面のペプチド模倣物は、スーパー抗原アンタゴニストである。図２Ｂ１〜図２Ｂ１０は、示されたペプチド、すなわち、ｐＢ２−２（図２Ｂ１）、ｐＢ２−３（図２Ｂ２）、ｐＢ２−４（図２Ｂ３）、ｐＢ２−５（図２Ｂ４）およびｐＢ２−６（図２Ｂ５）の存在下でのＩＬ２のレベル、ならびにペプチドｐＢ２−２（図２Ｂ６）、ｐＢ２−３（図２Ｂ７）、ｐＢ２−４（図２Ｂ８）、ｐＢ２−５（図２Ｂ９）およびｐＢ２−６（図２Ｂ１０）の存在下でのＴＮＦ−αのレベルの図を示す。ＰＢＭＣを、０．１μｇ／ｍｌの示されたペプチドの不在下（白丸）または存在下（黒丸）、ＳＥＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）により活性化した。分泌されたＩＬ２およびＴＮＦ−αを測定した（エラーバー、ＳＥＭ；ｎ＝３）。
【図２Ｃ】図２Ｃ：Ｂ７−２ホモ二量体界面のペプチド模倣物は、スーパー抗原アンタゴニストである。図２Ｃ１〜図２Ｃ４は、以下に示されたペプチドの存在下でのＩＬ−２（図２Ｃ１）、ＩＦＮ−γ（図２Ｃ２）、ＴＮＦ−α（図２Ｃ３）およびＩＬ−１０（図２Ｃ４）のレベルの図を示す。ＰＢＭＣを、０．０１μｇ／ｍｌ  ｐＢ２−４（グレーの丸）、ｐＢ２−６（黒丸）または両方（黒四角）の不在下（白丸）または存在下、組換えＳＥＢ（０．１ｎｇ／ｍｌ）を用いて誘導した。分泌されたサイトカインを測定した（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３）。
【図２Ｄ】図２Ｄ：Ｂ７−２ホモ二量体界面のペプチド模倣物は、スーパー抗原アンタゴニストである。図２Ｄ１〜図２Ｄ４は、以下に示されたペプチドの存在下でのＩＬ−２（図２Ｄ１）、ＩＦＮ−γ（図２Ｄ２）、ＴＮＦ−α（図２Ｄ３）およびＩＬ−１０（図２Ｄ４）のレベルの図を示す。ＰＢＭＣを、ＳＥＢ（０．１ｎｇ／ｍｌ）単独（白丸）または０．１μｇ／ｍｌのｐＢ２−７（黒丸）または各０．０１μｇ／ｍｌのｐＢ２−４およびｐＢ２−６（黒四角）とともに用いて誘導した。分泌されたＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０を測定した（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３）。
【図２Ｅ】図２Ｅ：Ｂ７−２ホモ二量体界面のペプチド模倣物は、スーパー抗原アンタゴニストである。図２Ｅ１〜図２Ｅ７は、示されたペプチドおよびＳＭＥＺまたはＴＳＳＴ−１の存在下でのＩＬ−２（図２Ｅ１および図２Ｅ５）、ＩＦＮ−γ（図２Ｅ２および図２Ｅ６）、ＴＮＦ−α（図２Ｅ３および図２Ｅ７）およびＩＬ−１０（図２Ｅ４）のレベルの図を示す。ＰＢＭＣを、０．０１ｎｇ／ｍｌのＳＭＥＺ（図２Ｅ１、図２Ｅ２、図２Ｅ３および図２Ｅ４）またはＴＳＳＴ−１（図２Ｅ５、図２Ｅ６および図２Ｅ７）単独（白丸）または０．１μｇ／ｍｌのｐＢ２−７（黒丸）または各０．０１μｇ／ｍｌのｐＢ２−４およびｐＢ２−６（黒四角）とともに用いてインキュベートした。分泌されたサイトカインを測定した（エラーバー、ＳＥＭ；ｎ＝３）。
【図３】図３Ａ〜図３Ｆ：Ｂ７−２二量体界面のペプチド模倣物はスーパー抗原と結合し、スーパー抗原の細胞表面Ｂ７−２およびＣＤ２８への結合を遮断する。図３Ａ〜図３Ｂは、固定化されたｐＢ２−４（図３Ａ）およびｐＢ２−６（図３Ｂ）に対する、０．７８μＭから２倍刻みでのＳＥＢの結合に関する代表的ＳＰＲ応答図を示す。図３Ｃ〜図３Ｆは、図３Ａ〜３Ｂのチップを用いた、固定化されたペプチドｐＢ２−４（図３Ｃおよび図３Ｅ）またはｐＢ２−６（図３Ｄおよび図３Ｆ）に対する、０．０６２５μＭから２倍刻みで５段階ＴＳＳＴ−１の結合（図３Ｃおよび図３Ｄ）および０．０６２５μＭから２倍刻みで４段階のＳＭＥＺの結合（図３Ｅおよび図３Ｆ）に関する代表的ＳＰＲ応答図を示す。
【図４】図４Ａ〜図４Ｄ：Ｂ７−２ペプチド模倣物はＳＥＢのＢ７−２またはＣＤ２８への結合を阻害する。図４Ａ〜図４Ｃは、Ｂ７−２またはＣＤ２８ホモ二量体界面のペプチド模倣物による、ＳＥＢの細胞表面Ｂ７−２への結合の阻害の代表的ウエスタンブロットを示す。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、Ｂ７−２を発現するように、またはエンプティーベクター（ＥＶ）でトランスフェクトし、３６時間後に、無添加で（Ｂ７−２）、あるいは示されたように５μｇ／ｍｌ  αＢ７−２抗体、αＣＤ２８モノクローナル抗体（１０）または１０μｇ／ｍｌのＢ７−２模倣物ペプチドｐＢ２−２、ｐＢ２−４、ｐＢ２−６もしくはｐＢ２−７、またはＣＤ２８模倣ペプチドｐ１ＴＡまたはｐ２ＴＡ（１０）とともに１時間インキュベートし、その後、１５μｇ／ｍｌの組換えＳＥＢとともにさらに１時間インキュベートした。細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した後、溶解させた。０．１μｇ／ｍｌのαＳＥＢ抗体とその後の０．２μｇ／ｍｌセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ロバ抗マウスＩｇＧ（上）または０．１μｇ／ｍｌのαＢ７−２抗体とその後の０．２μｇ／ｍｌセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ロバ抗ヤギＩｇＧ（下）を用いた、等量の総細胞タンパク質（ブラッドフォードアッセイ）のウエスタンブロット。図４Ｄは、Ｂ７−２またはＣＤ２８ホモ二量体界面のペプチド模倣物による、ＳＥＢの細胞表面ＣＤ２８への結合の阻害の代表的ウエスタンブロットを示す。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、ＣＤ２８（１０）を発現するように、またはエンプティーベクターでトランスフェクトし、その後、上記のようにペプチドおよびＳＥＢとともにインキュベートした。ウエスタンブロットは、ＳＥＢのＣＤ２８（１０）への結合（上）および０．１μｇ／ｍｌのαＣＤ２８抗体でアッセイしたＣＤ２８の発現（下）を示す。
【図５】図５Ａ〜図５Ｂ：Ｂ７−２二量体界面のペプチド模倣物は致死的ＳＥＢ刺激からマウスを保護する。図５Ａは、ＳＥＢ（１０μｇ）単独（白丸）または各１μｇのペプチドｐＢ２−４（黒四角）またはｐＢ２−６（黒三角）とともに注射したマウス（１群当たりｎ＝５）の生存率を示す図である；生存率に関するｐ、０．０２２。図５Ｂは、ＳＥＢ単独（白丸）または０．２μｇのペプチドｐＢ２−７（黒丸）とともに注射したマウス（１群当たりｎ＝６）の生存率を示す図である；生存率に関するｐ、０．００５。ペプチドはＳＥＢ注射の３０分前に投与した。
【図６】図６Ａ〜図６Ｂ：Ｂ７−２二量体界面模倣ペプチドｐＢ２−７は、Ｔ細胞受容体を介するシグナル伝達を阻害しない。ヒトＰＢＭＣを、αＣＤ３単独（白三角）、または１もしくは１０μｇ／ｍｌのｐＢ２−７（黒三角）の存在下（それぞれ図６Ａおよび図６Ｂ）でαＣＤ３を用いて誘導した。ヒトＰＢＭＣはまた、１または１０μｇ／ｍｌのｐＢ２−７単独の存在下（それぞれ図６Ａおよび図６Ｂ、黒丸）でも誘導した。示された時点で、培養培地中に分泌されたＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡにより測定した。
【図７】図７Ａ〜図７Ｂ：Ｂ７−２二量体界面模倣物ペプチドｐＢ２−７は、ＣＤ２８を介するシグナル伝達を減弱する。ヒトＰＢＭＣを、αＣＤ３／αＣＤ２８単独（白丸）、または０．０１μｇ／ｍｌ  ｐＢ２−７（黒三角）もしくは０．００１μｇ／ｍｌ  ｐＢ２−７（黒丸）の存在下、αＣＤ３／αＣＤ２８で誘導した。示された時点で、培養培地中に分泌されたＩＦＮ−γ（図７Ａ）およびＴＮＦ−α（図７Ｂ）をＥＬＩＳＡにより測定した。
【図８】図８Ａ〜図８Ｂ：Ｂ７−２二量体界面模倣ペプチドｐＢ２−４は、ＣＤ２８を介するシグナル伝達を減弱する。ヒトＰＢＭＣを、αＣＤ３／αＣＤ２８単独（白丸）、または０．１μｇ／ｍｌのｐＢ２−４（黒四角）の存在下もしくは１μｇ／ｍｌのｐＢ２−２（黒三角）の存在下、αＣＤ３／αＣＤ２８で誘導した。示された時点で、培養培地中に分泌されたＩＦＮ−γ（図８Ａ）およびＴＮＦ−α（図８Ｂ）をＥＬＩＳＡにより測定した。
【図９】図９Ａ〜図９Ｂ：Ｂ７−２二量体界面模倣ペプチドは、ＬＰＳにより媒介されるＴＮＦ−αの誘導を減弱した。ヒトＰＢＭＣを、２５ｎｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳ単独（白丸）、または０．１μｇ／ｍｌのｐＢ２−４（黒い菱形）、ｐＢ２−６（黒三角）、もしくは両方（黒四角）の存在下のＬＰＳで（図９Ａ）、あるいは０．１μｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳ単独（白丸）、または０．１μｇ／ｍｌのｐＢ２−７の存在下のＬＰＳ（黒丸）で（図９Ｂ）誘導した。示された時点で、培養培地中に分泌されたＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡにより測定した。
【図１０】図１０：Ｂ７−２二量体界面模倣ペプチドは、ＬＰＳにより媒介されるＴＮＦ−αの誘導を減弱する。ヒトＰＢＭＣを、大腸菌ＬＰＳ単独（白丸）、または０．０１μｇ／ｍｌのペプチドｐＢ２−４（黒三角）、ｐＢ２−６（黒丸）、もしくはｐＢ２−７（黒四角）の存在下のＬＰＳで誘導した。示された時点で、培養培地中に分泌されたＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡにより測定した。
【図１１】図１１：ペプチドはＢ７−１のホモ二量体界面に由来する。ヒトＢ７−１（ｈＢ７−１）二量体界面断片のアミノ酸配列、上にｈＢ７−１ペプチド模倣物を示す。ｈＢ７−２とｈＢ７−１の間で保存されている残基を太字で示す。ペプチド配列は四角で囲まれている。
【図１２】図１２：ｈＢ７−２およびｈＢ７−１の二量体界面のセグメントの配列アラインメント。配列アラインメントは、ｈＢ７−２の二量体界面に由来するペプチドｐＢ２−４、ｐＢ２−７およびｐＢ２−６のアミノ酸配列、ならびにｈＢ７−１の二量体界面に由来するペプチド、すなわち、ｐＢ１−４、ｐＢ１−７およびｐＢ１−６の対応するアミノ酸配列を示す。同一のアミノ酸を太字で示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
実施形態の詳細な説明
今般開示される主題は、スーパー抗原は従前に示されるようにＣＤ２８と直接結合するだけでなく、ＣＤ２８補助リガンド、すなわち、Ｂ７−２とも結合するという驚くべき発見に基づく。本明細書では、スーパー抗原によるＢ７−２の結合がスーパー抗原機能に不可欠であることが示される。
【００４２】
また、本明細書では、スーパー抗原はそのホモ二量体界面においてＢ７−２と会合することも示される。以下に示される実施例から明らかなように、Ｂ７−２二量体界面の短いペプチド模倣物は、ヒト末梢血単核細胞において、多様なスーパー抗原と結合し、スーパー抗原により媒介されるＩＬ２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの誘導を阻害し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて致死的スーパー抗原刺激からマウスを保護する有効なアンタゴニストである。
【００４３】
よって、Ｂ７−２二量体界面は、スーパー抗原中毒に対する新規な治療標的として役立つ。この発見は、Ｂ７−２の二量体界面を模倣するペプチドを介して、スーパー抗原とＢ７−２の二量体界面との、またはＣＤ２８の二量体界面との不可欠な相互作用を遮断することを含む、スーパー抗原中毒の後遺症に対する新規な宿主指向治療アプローチを提供する。
【００４４】
これまで、Ｂ７−２は、免疫応答において補助刺激リガンドとして機能するとだけ考えられていた。以下に示す実施例が、スーパー抗原である、あるクラスの微生物病原体に対する受容体としてのＢ７−２の予期しない新規な役割を明らかにする。よって、直接的結合を介して、スーパー抗原は、ＣＤ２８（１０）、ＭＨＣ−ＩＩおよびＴＣＲの使用だけでなく、Ｂ７−２の使用も独創的とする。
【００４５】
Ｂ７−２ホモ二量体界面の短いペプチド模倣物は、例えば、実施例１に示されるように、本明細書では、ヒト末梢血単核細胞においてスーパー抗原により媒介されるＩＬ２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの誘導を阻害できることが示される。さらに、Ｂ７−２ホモ二量体界面のこれらの短いペプチド模倣物はまた、実施例３および図５に示されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて致死的毒素刺激からマウスを保護する有効なＳＥＢアンタゴニストであることも示される。
【００４６】
本開示はまた、ＳＥＢとＢ７−２の二量体界面に由来するペプチドに関して見られる相互作用（図３Ａおよび図３Ｂ）から暗示されるように、スーパー抗原はその二量体界面においてＢ７−２と直接会合することを示す。
【００４７】
よって、Ｂ７−２の二量体界面は、スーパー抗原中毒に対する新規な治療標的として役立つ。特に、例えば、図１に示されるように、Ｂ７−２の二量体界面に由来するペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６（それぞれ配列番号６および配列番号１０で示されるように両末端にＤ−Ａｌａが隣接している）は、マウスにおいて特定のスーパー抗原ＳＥＢの致死性を遮断した。図５に示されるように、１／５の対照マウスだけがＳＥＢ刺激から生残し、ＳＥＢ投与時にＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６をそれぞれ受容した４／５および５／５のマウスが生残を示した。注目すべきは、これらのペプチドはＳＥＢの２〜２．４倍モル過剰が存在するだけで保護を示した。さらに、図１に示されるように、これもまたＢ７−２の二量体界面に由来し、ｐＢ２−４のＣ末端領域とｐＢ２−６のＮ末端領域の両方とオーバーラップするＢ７−２の二量体界面の領域にわたるＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７（配列番号１２で示される）は、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−７（配列番号１２で示される）がＳＥＢとほぼ等モル比で存在する場合であっても、マウスにおいてＳＥＢ刺激に対して保護力があることを示し、６／６のマウスが生残した（図５）。この高い有効性は、Ｂ７−２二量体界面がスーパー抗原に対して有害な応答の媒介に重要な役割を果たすことを示唆する。
【００４８】
ＣＤ２８だけでなくその補助リガンドＢ７−２も、スーパー抗原である、あるクラスの微生物病原体の直接的センサーであるという発見は、病原体パターン認識機構の範囲を拡大する。
【００４９】
本明細書の下記に示される発見の直接的結果は、Ｂ７−２またはＣＤ２８二量体界面のいずれのペプチド模倣物も二重のアンタゴニスト活性を有し、いずれの受容体に対しても相互にスーパー抗原の結合に干渉する。ここで述べられるこの二重の作用は、Ｂ７−２二量体界面のデカペプチド模倣物であるＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７（配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する）、またはＣＤ２８二量体界面のオクタペプチド模倣物（１０）であるｐ２ＴＡが、２３８アミノ酸のタンパク質分子であるスーパー抗原が、Ｂ７−２またはＣＤ２８のいずれかと結合することに加えてＴＣＲおよびＭＨＣ−ＩＩ分子と相互作用するという事実にもかかわらず、なぜＳＥＢによる致死的刺激からマウスを効果的に保護できるかを説明し得る。
【００５０】
スーパー抗原はＴＣＲおよびＭＨＣ−ＩＩ分子と、ならびにＣＤ２８とマイクロモルの親和性で会合することが従前に報告されており（１０）、これは本明細書の以下に示される、Ｂ７−２二量体界面ペプチドも多様なスーパー抗原に対してマイクロモルの親和性を示すという結果（表２参照）と一致する。Ｂ７−２を含むその４つの受容体に対するスーパー抗原の大きいとはいえない親和性は、同様に大きいとはいえない親和性で結合するペプチドがなぜシナプスを乱し、従って、Ｔｈ１サイトカイン応答を減弱することができるかを説明し得る。
【００５１】
また、ＳＥＢによるＴｈ１サイトカイン応答の活性化はＢ７−２に依存するがＢ７−１には依存せず、Ｂ７−２に対するモノクローナル抗体により排除されるということも従前に報告されている（１０）。これらの結果は、ＭＹＰＰＰＹドメインにおけるＢ７−２とＣＤ２８の相互作用を介した補助刺激の必要によって説明できるが、以下に示される本発明者らの発見は、スーパー抗原は異なるドメイン、すなわち、複合二量体界面においてＢ７−２と直接会合することを実証する（１）。この結合はスーパー抗原の作用に重要であるということは、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において以下に示されるように、Ｂ７−２二量体界面ペプチドの強力なスーパー抗原アンタゴニスト活性により強く裏づけられる。
【００５２】
ＣＤ２８およびＢ７−２はアミノ酸配列およびそれらのホモ二量体界面における構造が異なり、ヘテロ二量体を形成しないが、スーパー抗原はこれらの受容体のいずれにもマイクロモル範囲の親和性で結合することができる。
【００５３】
スーパー抗原およびＭＨＣ−ＩＩ、ＴＣＲおよびＣＤ２８またはＢ７−２のいずれかの間の４分子複合体の形成は構造上実現可能である。抗原提示細胞とＴ細胞の間の免疫シナプス内では、複数のＣＤ２８およびＢ７−２分子がＢ７−２／ＣＤ２８ペアとして互いに会合し、それによりネットワークを作っていると仮定されている（１）。よって、理論に縛られるものではないが、両方の受容体が免疫シナプス内で会合されている限り、所与のペア内の両方にではなく一方だけの受容体にスーパー抗原が結合することでＴ細胞の活性化亢進には十分であると考えられる。シナプスでは、ＩＬ１０の誘導ではなく、有害な炎症性サイトカイン誘導のシグナル伝達を達成するには、複数のスーパー抗原分子が共働的にＣＤ２８およびＢ７−２と会合しなければならない。これらの発見は、スーパー抗原作用に関する現在の見解を修正する。
【００５４】
Ｂ７−２二量体界面は、補助刺激における役割は知られておらず、従前に報告されているようにＣＤ２８結合部位から十分に分離されている。スーパー抗原の会合はＢ７−２単量体間の接触に取って代わるはずであり、Ｂ７−２単量体はＣＤ２８とは異なって二量体界面の外側で分子間ジスルフィド結合を介して連結されておらず、従って、再二量体化に二次結合反応を必要とする。以下に示される実施例は、スーパー抗原がおそらくはＢ７−２／ＣＤ２８軸を介してシグナル伝達を活性化するＢ７−２の立体配座変化を誘導するという解釈を裏づける。ＳＥＢは、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカインの活発な発現を誘導するが、ここでＩＬ２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α遺伝子の誘導により定義されるＴｈ１応答のみがＢ７−２の会合に依存する。このことは、これまでのところＩＬ４およびＩＬ１０の誘導ではなく、スーパー抗原によるＩＬ２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α遺伝子の誘導における、ＣＤ２８の選択的要求を反映している（１０）。この応答を減弱することにより、本開示によるアンタゴニストペプチドはこれらのサイトカイン間の相乗作用を軽減し、生存を可能とするであろう。
【００５５】
よって、本発明者らの今般の発見に基づけば、これにより、スーパー抗原とＢ７−２の二量体界面の不可欠な相互作用を、Ｂ７−２の二量体界面を模倣するペプチドによって遮断することを含む、スーパー抗原中毒の後遺症に対する新規な宿主指向治療アプローチが提供される。
【００５６】
従って、ヒトＢ７−２の細胞外ドメインの領域内の結晶学的二量体界面の少なくとも１個のアミノ酸残基を含んでなる、単離および精製されたペプチドであって、前記領域は配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなり、前記結晶学的二量体界面は、配列番号１３のアミノ酸残基Ｔｈｒ−１１、Ｌｅｕ−２６、Ｓｅｒ−２７、Ｌｅｕ−４６、Ｇｌｙ−４７、Ｌｙｓ−４８、Ｇｌｕ−４９、Ｐｈｅ−５１、Ｍｅｔ−５９、Ｇｌｙ−６０、Ａｒｇ−６１、Ｔｈｒ−６２、Ｓｅｒ−６３、Ｐｈｅ−６４、Ａｓｐ−６５、Ｓｅｒ−６６、Ａｓｐ−６７、Ａｒｇ−７２、Ｈｉｓ−７４およびＡｓｎ−７５からなり、前記単離および精製されたペプチドは、そのＣ末端および／またはＮ末端に少なくとも２個の付加的アミノ酸残基をさらに含んでなり、前記付加的アミノ酸残基は、配列番号１３内の前記結晶学的二量体界面の前記少なくとも１個のアミノ酸残基にすぐ隣接する配列番号１３の連続するアミノ酸残基であり、前記単離および精製されたペプチドは、３〜約３０個のアミノ酸残基からなる、単離および精製されたペプチド、ならびにその機能的断片および誘導体が今般開示される。
【００５７】
本明細書に言及されるヒトＢ７−１（ＣＤ８０、受託番号ＮＭ＿００５１９１）およびＢ７−２（ＣＤ８６、受託番号１Ｉ８５＿Ａ）は、（１）に記載の通りである。別段の記載がない限り、用語「Ｂ７−１」および「Ｂ７−２」は、それぞれヒトＢ７−１（「ｈＢ７−１」とも呼ばれる）およびヒトＢ７−２（「ｈＢ７−２」とも呼ばれる）を意味する。
【００５８】
本明細書で使用する場合、用語「結晶学的二量体界面」は、２つの同一の単量体タンパク質分子間に形成される接点を意味する。理論に縛られるものではないが、これらの接点は各単量体タンパク質分子の界面に含まれる特定のアミノ酸残基間で形成される疎水結合、ファンデルワールス力、および塩橋に基づき、それにより、二量体化界面が形成される。当技術分野で公知のように、また、本明細書で以下に示されるように、各単量体タンパク質分子の界面に含まれ、二量体界面形成の際に会合される特定のアミノ酸残基は、一次アミノ酸配列内に必ずしも連続するアミノ酸残基として位置しなくてよい。用語「Ｂ７−１の結晶学的二量体界面」および「Ｂ７−１の二量体界面」は、本明細書では互換的に使用される。用語「Ｂ７−２の結晶学的二量体界面」および「Ｂ７−２の二量体界面」は、本明細書では互換的に使用される。
【００５９】
特に、今般開示される主題は、単量体ｈＢ７−２タンパク質分子間で形成される二量体界面（Ｂ７−２の結晶学的二量体界面とも呼ばれる）に関する。ヒト７−２二量体界面の形成に関与する特定の残基は、Ｓｃｈｗａｒｔｚらにより従前に報告されており（１）、図１に下線で示される。Ｂ７−２の二量体界面は、ヒトＢ７−２およびの細胞外ドメインの領域内に位置し、よって、今般開示される主題は、ヒトＢ７−２の細胞外ドメインの領域内の二量体界面の少なくとも１個のアミノ酸残基からなる単離および精製されたペプチドを提供する。
【００６０】
従って、上記で詳細に示すように、今般開示される主題は、ヒトＢ７−２の細胞外ドメインの領域内の二量体界面の少なくとも１個のアミノ酸残基を含んでなる単離および精製されたペプチドを提供し、前記ヒトＢ７−２の細胞外ドメインの領域は、配列番号１３で示されるアミノ酸配列、すなわち、アミノ酸配列
【化１】
0006776254.tif 000004
からなる。以下のアミノ酸残基が単量体Ｂ７−２タンパク質分子間の二量体界面の形成に関与する：配列番号１３のナンバリングに基づきＴｈｒ−１１、Ｌｅｕ−２６、Ｓｅｒ−２７、Ｌｅｕ−４６、Ｇｌｙ−４７、Ｌｙｓ−４８、Ｇｌｕ−４９、Ｐｈｅ−５１、Ｍｅｔ−５９、Ｇｌｙ−６０、Ａｒｇ−６１、Ｔｈｒ−６２、Ｓｅｒ−６３、Ｐｈｅ−６４、Ａｓｐ−６５、Ｓｅｒ−６６、Ａｓｐ−６７、Ａｒｇ−７２、Ｈｉｓ−７４およびＡｓｎ−７５。
【００６１】
よって、本開示による単離および精製されたペプチドは、上記に列挙された単量体Ｂ７−２タンパク質分子間での二量体界面の形成に関与するアミノ酸残基のうちの少なくとも１個と、そのＣ末端および／またはＮ末端のそれぞれにおける少なくとも２個の付加的アミノ酸残基とからなり、前記付加的アミノ酸残基は、配列番号１３の前記二量体界面の前記少なくとも１個のアミノ酸残基にすぐ隣接する配列番号１３の連続するアミノ酸残基であり、前記単離および精製されたペプチドは、３〜約３０個のアミノ酸残基からなり、ならびにその機能的断片および誘導体である。
【００６２】
よって、上記およびその他の実施形態では、本開示による単離および精製されたペプチドの長さはアミノ酸残基３〜約３０個である。いくつかの実施形態では、本開示による単離および精製されたペプチドの長さは、アミノ酸残基３〜２９、３〜２８、３〜２７、３〜２６、３〜２５、３〜２４、３〜２３、３〜２２、３〜２１、３〜２０、３〜１９、３〜１８、３〜１７、３〜１６、３〜１５、３〜１４、３〜１３、３〜１２、３〜１１、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４個である。特定のペプチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および１４個のアミノ酸残基からなる。本発明によるペプチドの誘導体（このペプチドは１以上のアミノ酸残基で延長される）は、以下に記載されるようにより長くてよい。
【００６３】
今般開示される主題の上記およびその他の実施形態では、本発明による単離および精製されたペプチドは、前記結晶学的二量体界面の前記少なくとも１個のアミノ酸残基と、そのＣ末端および／またはＮ末端における２〜約８個、例えば、２〜８個、３〜８個、４〜８個、５〜８個、６〜８個または７〜８個、より具体的には、２、３、４、５、６、７または８個の前記付加的アミノ酸残基とを含んでなり、ならびにその機能的断片および誘導体である。
【００６４】
本明細書で定義される用語「アミノ酸配列の連続するアミノ酸残基」は、前記二量体界面の前記少なくとも１個のアミノ酸残基にすぐ隣接する位置の、参照アミノ酸配列（すなわち、配列番号１３または配列番号１４）のアミノ酸残基に相当し、参照アミノ酸配列において連続している（順々に位置する）アミノ酸残基を意味する。
【００６５】
用語「アミノ酸配列のアミノ酸にすぐ隣接する」とは、本明細書で使用する場合、相当する位置において／参照アミノ酸残基において、このアミノ酸残基に隣接する、またはすぐ前にある、またはすぐ後ろに続くアミノ酸残基を意味する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、今般開示される主題の単離および精製されたペプチドは、配列番号５（ＥＫＦＤＳＶＨＳＫＹＭ、ペプチドｐＢ２−４とも呼ばれる）、配列番号９（ＤＳＤＳＷＴＬＲ  ペプチドｐＢ２−６とも呼ばれる）、配列番号１１（ＭＧＲＴＳＦＤＳＤＳ、ｐＢ２−７とも呼ばれる）、配列番号１８（ＦＮＥＴＡＤＬＰ）、配列番号２０（ＮＱＳＬＳＥＬＶ）、配列番号２２（ＹＬＧＫＥＫＦＤ）、配列番号２４（ＴＬＲＬＨＮＬＱ）、配列番号２６（ＹＭＧＲＴＳＦＤＳＤ）、および配列番号４４（ＬＧＫＥＫＦＤＳＶＨＳＫＹＭＧＲＴＳＦＤＳＤＳＷＴＬＲＬＨＮ(で示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、ならびにその機能的断片および誘導体からなる。
【００６７】
他の実施形態では、今般開示される主題による単離および精製されたペプチドは、配列番号１１（ＭＧＲＴＳＦＤＳＤＳ、ｐＢ２−７とも呼ばれる）、配列番号５（ＥＫＦＤＳＶＨＳＫＹＭ、ペプチドｐＢ２−４とも呼ばれる）および配列番号９（ＤＳＤＳＷＴＬＲ  ペプチドｐＢ２−６とも呼ばれる）で示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、ならびにその機能的断片および誘導体からなる。
【００６８】
特定の実施形態では、今般開示される主題による単離および精製されたペプチドは、配列番号５（ＥＫＦＤＳＶＨＳＫＹＭ、ペプチドｐＢ２−４とも呼ばれる）で示されるアミノ酸配列である。
【００６９】
他の特定の実施形態では、今般開示される主題による単離および精製されたペプチドは、配列番号９（ＤＳＤＳＷＴＬＲ  ペプチドｐＢ２−６とも呼ばれる）で示されるアミノ酸配列である。
【００７０】
さらなる特定の実施形態では、今般開示される主題による単離および精製されたペプチドは、配列番号１１（ＭＧＲＴＳＦＤＳＤＳ、ｐＢ２−７とも呼ばれる）で示されるアミノ酸配列である。
【００７１】
上記で定義されるようにヒトＢ７−２の細胞外ドメインの二量体界面の少なくとも１個のアミノ酸残基を含んでなる単離および精製されたペプチドだけが、サイトカイン誘導を旺盛に阻害することが示されたことに注目される。例えば図２Ａに示されるように、前記二量体界面のアミノ酸残基を含んでならないペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−２、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−３およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−５（下記の表３に示されるアミノ酸配列を有する）は、ヒトＰＢＭＣにおいてＳＥＢにより媒介されるＩＦＮ−γの誘導を阻害できなかったが、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−４およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６は極めて強い阻害活性を示した。同様に、図２Ｂに示されるように、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−４およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６はＳＥＢによるＩＬ２およびＴＮＦ−αの誘導を阻害したが、他の３つのペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−２、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−３およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−５ペプチドは阻害しなかった。
【００７２】
別の態様によれば、今般開示される主題は、ヒトＢ７−１の細胞外ドメインの領域内の結晶学的二量体界面の少なくとも１個のアミノ酸残基を含んでなる単離および精製されたペプチドであって、前記領域は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなり、前記結晶学的二量体界面は、配列番号１４のアミノ酸残基Ｖａｌ−１５、Ｌｅｕ−２９、Ａｌａ−３０、Ｓｅｒ−４８、Ｇｌｙ−４９、Ａｓｐ−５０、Ｍｅｔ−５１、Ｌｙｓ−５８、Ａｓｎ−５９、Ａｒｇ−６０、Ｔｈｒ−６１、Ｉｌｅ−６２、Ｐｈｅ−６３、Ａｓｐ−６４、Ｉｌｅ−６５、Ｔｈｒ−６６、Ｖａｌ−７２、Ｌｅｕ−７４およびＡｌａ−７５からなり、前記単離および精製されたペプチドは、そのＣ末端および／またはＮ末端に少なくとも２個の付加的アミノ酸残基をさらに含んでなり、前記付加的アミノ酸残基は、配列番号１４内の前記結晶学的二量体界面の前記少なくとも１個のアミノ酸残基にすぐ隣接する配列番号１４の連続するアミノ酸残基であり、前記単離および精製されたペプチドは、３〜約３０個のアミノ酸残基からなる、単離および精製されたペプチド、ならびにその機能的断片および誘導体を提供する。
【００７３】
よって、上記に示されるように、今般開示される主題はまた、ｈＢ７−２と同族のｈＢ７−１の単量体タンパク質分子間で形成される二量体界面にも関する。
【００７４】
Ｂ７−１は、Ｂ７−２と同族であり、両方とも抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面で発現される補助刺激リガンドとして働く。Ｔ細胞補助刺激受容体ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４へのこれらの分子の結合は、Ｔ細胞免疫の活性化および調節に不可欠である。強い構造的類似性にもかかわらず、Ｂ７−１とＢ７−２は、異なる生化学的特徴を示し、それらの補助刺激受容体への結合は、異なるＴ細胞の機能的帰結ともたらす。
【００７５】
ヒトＢ７−１二量体界面の形成に関与する特定の残基は、Schwartz, J.C. et al.（１およびその中の参照文献）にも記載されている。加えて、ヒトＢ７−１二量体界面の形成に関与する特定の残基のいくつかは図１２に下線で示されている。
【００７６】
Ｂ７−１の二量体界面は、ヒトＢ７−１の細胞外ドメインの領域内に位置し、従って、本発明は、ヒトＢ７−１の細胞外ドメインの領域内の二量体界面の少なくとも１個のアミノ酸残基からなる単離および精製されたペプチドを提供する。
【００７７】
従って、今般開示される主題は、ヒトＢ７−１の細胞外ドメインの領域内の二量体界面の少なくとも１個のアミノ酸残基を含んでなる単離および精製されたペプチドに関し、前記領域は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列、すなわち、アミノ酸配列：
【化２】
0006776254.tif 000005
からなる。
【００７８】
以下のアミノ酸残基が単量体Ｂ７−１タンパク質分子間の二量体界面の形成に関与する：配列番号１４のナンバリングに基づきＶａｌ−１５、Ｌｅｕ−２９、Ａｌａ−３０、Ｓｅｒ−４８、Ｇｌｙ−４９、Ａｓｐ−５０、Ｍｅｔ−５１、Ｌｙｓ−５８、Ａｓｎ−５９、Ａｒｇ−６０、Ｔｈｒ−６１、Ｉｌｅ−６２、Ｐｈｅ−６３、Ａｓｐ−６４、Ｉｌｅ−６５、Ｔｈｒ−６６、Ｖａｌ−７２、Ｌｅｕ−７４およびＡｌａ−７５。
【００７９】
よって、本開示によるＢ７−１関連の単離および精製されたペプチドは、上記に列挙された単量体Ｂ７−１タンパク質分子間での二量体界面の形成に関与するアミノ酸残基のうちの少なくとも１個と、そのＣ末端および／またはＮ末端のそれぞれにおける少なくとも２個の付加的アミノ酸残基からなり、前記付加的アミノ酸残基は、配列番号１４の前記二量体界面の前記少なくとも１個のアミノ酸残基にすぐ隣接する配列番号１４の連続するアミノ酸残基であり、前記単離および精製されたペプチドは３〜約３０個のアミノ酸残基からなり、ならびにその機能的断片および誘導体である。
【００８０】
よって、上記およびその他の実施形態では、本開示によるＢ７−１関連の単離および精製されたペプチドは、上記に列挙された単量体Ｂ７−１タンパク質分子間での二量体界面の形成に関与するアミノ酸残基のうちの少なくとも１個と、そのＣ末端および／またはＮ末端のそれぞれにおける、配列番号１４でそれにすぐ隣接する２〜約８個の連続するアミノ酸残基とからなり、およびその機能的誘導体である。
【００８１】
言い換えれば、いくつかの実施形態では、本発明による単離および精製されたペプチド  ば、ヒトＢ７−１の細胞外ドメインの領域内の結晶学的二量体界面の前記少なくとも１個のアミノ酸残基を含んでなり、前記領域は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列と、そのＣ末端および／またはＮ末端における２〜約８個、例えば、２〜８個、３〜８個、４〜８個、５〜８個、６〜８個または７〜８個、より具体的には、２、３、４、５、６、７または８個の付加的アミノ酸残基とからなり、前記付加的アミノ酸残基は、配列番号１４で前記結晶学的二量体界面の前記少なくとも１個のアミノ酸残基にすぐ隣接して位置する配列番号１４の連続するアミノ酸残基であり、ならびにその機能的断片および誘導体である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明によるＢ７−１関連の単離および精製されたペプチドは、配列番号２８（ＶＫＥＶＡＴＬＳ）、配列番号３０（ＶＥＥＬＡＱＴＲ）、配列番号３２（ＭＳＧＤＭＮＩＷ）、配列番号３４（ＳＩＶＩＬＡＬＲ）、配列番号３６（ＹＫＮＲＴＩＦＤＩＴ）、配列番号３８（ＭＮＩＷＰＥＹＫ、ｐＢ１−４で示される）、配列番号４０（ＫＮＲＴＩＦＤＩＴＮ、ｐＢ１−７で示される）および配列番号４２（ＤＩＴＮＮＬＳＩＶ、ｐＢ１−６で示される）、配列番号４６（ＳＧＤＭＮＩＷＰＥＹＫＮＲＴＩＦＤＩＴＮＮＬＳＩＶＩＬＡ）および配列番号４８（ＹＫＮＲＴＩＦＤ、ｐＢ１−８で示される）で示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなる単離および精製されたペプチドおよび機能的誘導体からなる。
【００８３】
さらなる実施形態では、本発明によるＢ７−１関連の単離および精製されたペプチドは、配列番号３８（ＭＮＩＷＰＥＹＫ、ｐＢ１−４で示される）、配列番号４０（ＫＮＲＴＩＦＤＩＴＮ、ｐＢ１−７で示される）、配列番号４２（ＤＩＴＮＮＬＳＩＶ、ｐＢ１−６で示される）、配列番号４６（ＳＧＤＭＮＩＷＰＥＹＫＮＲＴＩＦＤＩＴＮＮＬＳＩＶＩＬＡ）および配列番号４８（ＹＫＮＲＴＩＦＤ、ｐＢ１−８で示される）で示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなる単離および精製されたペプチドおよびその機能的誘導体からなる。
【００８４】
上記で示されるように、今般開示される主題は、ヒトＢ７−２の細胞外ドメインの領域内の二量体界面の少なくとも１個のアミノ酸残基からなる単離および精製されたペプチド、またはヒトＢ７−１の細胞外ドメインの領域内の二量体界面の少なくとも１個のアミノ酸残基からなる単離および精製されたペプチド、およびその機能的誘導体を提供する。用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」または「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基を意味する。
【００８５】
より具体的には、「アミノ酸配列」または「ペプチド配列」は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基がペプチドおよびタンパク質の鎖内にある順序である。配列は一般に、遊離アミノ基を含むＮ末端からアミドを含むＣ末端へと示される。
【００８６】
用語「アミノ酸」は、本明細書で使用する場合、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能し得るアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を意味する。天然アミノ酸は、遺伝コードによりコードされているもの、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物を意味する。このような類似体は、改変されたＲ基または改変されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。「アミノ酸模倣物」は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物を意味する。アミノ酸は、本明細書には、それらの一般に知られている三文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される一文字記号によって言及され得る。
【００８７】
本発明によるポリペプチドは合成により、または組換えＤＮＡ技術により生産可能であることに留意されたい。ポリペプチド、ペプチドの生産方法は当技術分野で周知である。
【００８８】
これらの任意のペプチドに加えて、今般開示される主題にはさらにそのいずれの機能的断片も包含されることに留意されたい。これらの開示の範囲内の「機能的断片」は、開示される新規なペプチドの３〜約２０個のアミノ酸残基断片であり、その少なくとも１個のアミノ酸残基は、本ヒトＢ７−２由来ペプチドの断片としては、ヒトＢ７−２の二量体界面のアミノ酸残基（配列番号１３のＴｈｒ−１１、Ｌｅｕ−２６、Ｓｅｒ−２７、Ｌｅｕ−４６、Ｇｌｙ−４７、Ｌｙｓ−４８、Ｇｌｕ−４９、Ｐｈｅ−５１、Ｍｅｔ−５９、Ｇｌｙ−６０、Ａｒｇ−６１、Ｔｈｒ−６２、Ｓｅｒ−６３、Ｐｈｅ−６４、Ａｓｐ−６５、Ｓｅｒ−６６、Ａｓｐ−６７、Ａｒｇ−７２、Ｈｉｓ−７４およびＡｓｎ−７５）、または本ヒトＢ７−１由来ペプチドの断片としては、ヒトＢ７−１の二量体界面の少なくとも１個のアミノ酸残基（配列番号１４のＶａｌ−１５、Ｌｅｕ−２９、Ａｌａ−３０、Ｓｅｒ−４８、Ｇｌｙ−４９、Ａｓｐ−５０、Ｍｅｔ−５１、Ｌｙｓ−５８、Ａｓｎ−５９、Ａｒｇ−６０、Ｔｈｒ−６１、Ｉｌｅ−６２、Ｐｈｅ−６３、Ａｓｐ−６４、Ｉｌｅ−６５、Ｔｈｒ−６６、Ｖａｌ−７２、Ｌｅｕ−７４およびＡｌａ−７５）である。
【００８９】
本発明の任意のペプチドに加えて、本発明はさらにそのいずれの機能的誘導体も包含することに留意されたい。用語「誘導体」の「機能的誘導体」(functional derivative" of “derivative”)は、元のポリペプチドの活性を変化させないそのアミノ酸配列（ペプチド）に対する任意の挿入、欠失、置換および修飾を有するアミノ酸配列（ペプチド）を定義して使用される。用語「誘導体」とはまた、そのホモログ、変異体および類似体、ならびに本発明に従ってなされるポリペプチドの共有結合的修飾を意味する。
【００９０】
用語「断片」、「誘導体」および「機能的誘導体」は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載されるように、細菌およびその他の感染、ならびにそれらに関連する炎症に治療上影響を与えるそれらの能力に干渉しない、そのペプチドに対する任意の挿入、欠失、置換および修飾を有する、本発明の任意のペプチド、具体的には、本明細書に定義されるｈＢ−１模倣ペプチドまたはｈＢ−２模倣ペプチドを意味する。
【００９１】
いくつかの実施形態では、誘導体は、今般開示される主題において具体的に定義されるペプチドとはアミノ酸残基の挿入または欠失によって異なるペプチドを意味する。用語「挿入」または「欠失」とは、本明細書で使用する場合、本発明により使用されるポリペプチドに対するアミノ酸残基の、１〜５０個の間のアミノ酸残基、１〜１個の間のアミノ酸残基(between 1 to 1 amino acid residues)、特に、１〜１０個のアミノ酸残基の、それぞれいずの付加または欠失も意味すると認識されるべきである。より詳しくは、挿入または欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸のうちのいずれか１つであり得る。本発明により包含される挿入または欠失は、改変ペプチドのいずれの位置ならびにそのＮ末端および／またはＣ末端にあってもよいことに留意されたい。
【００９２】
限定されない例として、用語「改変」は、本明細書で使用する場合、正電荷を有する、負電荷を有する、または中性の、今般開示される主題によるペプチドの誘導体を意味する。加えて、本発明のペプチドは、内部架橋、短距離環化、延長または他の化学修飾によって獲得可能な二量体、多量体または制約立体配座の形態であってよい。
【００９３】
さらに、本ペプチドは、そのＮ末端および／またはＣ末端において、種々の同一または異なるアミノ酸残基で延長されてもよい。このような延長の一例として、ペプチドは、そのＮ末端および／またはＣ末端において、天然または合成アミノ酸残基であり得る同一または異なる疎水性アミノ酸残基で延長されてもよい。ペプチドがそのＮ末端および／またはＣ末端で延長され得る特定の合成アミノ酸残基は、Ｄ−アラニンである。
【００９４】
このような延長のさらなる例は、そのＮ末端および／またはＣ末端の両方においてシステイン残基で延長されたペプチドにより提供され得る。いくつかの実施形態では、今般開示されるペプチドは、それらのＮ末端を介してラウリル−システイン（ＬＣ）残基とおよび／またはそれらのＣ末端を介してシステイン（Ｃ）残基と結合させることができる。本来、このような延長は、ジスルフィド結合の形成からのＣｙｓ−Ｃｙｓ環化のために制約立体配座をもたらし得る。
【００９５】
別の例として、リシンをリンカーとして機能させ、パルミチン酸を疎水性アンカーとして機能させるＮ末端リシル−パルミトイルテールの組み込みが挙げられる。加えて、本ペプチドは、天然または合成アミノ酸残基であり得る芳香族アミノ酸残基で延長されてもよく、例えば、特定の芳香族アミノ酸残基はトリプトファンであり得る。本ペプチドは、そのＮ末端および／またはＣ末端において、非天然または合成アミノ酸である種々の同一または異なる有機部分で延長されてもよい。このような延長の一例として、ペプチドはそのＮ末端および／またはＣ末端において、Ｎ−アセチル基で延長されてもよい。
【００９６】
今般開示される主題において使用され、本明細書に開示されるどの単一のペプチド配列についても、ペプチド鎖の方向が逆転された対応する逆転配列、および総てのアミノ酸がＤ系に属すものも含まれる。
【００９７】
今般開示される主題はまた、本明細書に開示されるペプチドのいずれの置換も包含する。機能的に同等のアミノ酸を示す保存的置換表は当技術分野で周知である。このような保存的修飾変異体は、本発明の多型変異体、種間ホモログ、ならびに対立遺伝子および類似体ペプチドに加えてのものであり、それらを排除するものではない。
【００９８】
例えば、脂肪族アミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、またはＶ）がその群の別のメンバーで置換されるもの、またはある極性残基の別のものでの置換、例えば、アルギニンをリシン、グルタミン酸をアスパラギン酸、またはグルタミンをアスパラギンなどの置換を行うことができる。以下の８群のそれぞれは、互いに保存的置換となる他の例示的アミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
【００９９】
より具体的には、アミノ酸「置換」は、あるアミノ酸を、類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換することの結果、すなわち、保存的アミノ酸置換である。アミノ酸置換は、含まれる残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性「疎水性」アミノ酸は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択され；「極性」アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）からなる群から選択され；「正電荷」アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）およびヒスチジン（Ｈ）から選択され；「酸性」アミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群から選択される。
【０１００】
今般開示される主題はまた、今般開示される主題によるそれらのアミノ酸配列により特に定義される、本明細書に開示されるペプチドのホモログ、変異体および類似体（ヒトＢ７−２の二量体界面に由来するペプチド（本明細書では「ｈＢ７−２模倣ペプチド」とも呼ばれる）またはヒトＢ７−１の二量体界面に由来するペプチド（本明細書では「ｈＢ７−１模倣ペプチド」とも呼ばれる）のいずれか）を包含する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、今般開示される主題による単離および精製されたペプチドの機能的誘導体は、
ｉ．そのＮ末端および／またはＣ末端において、配列番号１３で示されるアミノ酸配列の対応する位置にすぐ隣接して存在する１〜４個の連続するアミノ酸残基だけ延長された前記Ｂ７−２模倣ペプチド；
ｉｉ．そのＮ末端および／またはＣ末端において、
（ａ）システインによりまたはラウリルシステインにより；
（ｂ）非天然有機部分によりまたは合成アミノ酸残基により；
（ｃ）Ｎ−アセチルまたはリシル−パルミトイル残基により；
（ｄ）天然または合成アミノ酸残基であり得る１または複数の疎水性アミノ酸残基により、
延長された前記Ｂ７−２模倣ペプチド；または
ｉｉｉ．（ｉ）および（ｉｉ）のペプチドのいずれかの二量体または多量体；
ｉｖ．前記Ｂ７−２模倣ペプチドの制約立体配座；
ｖ．挿入、欠失、置換から選択される少なくとも１つの合成突然変異により改変された、前記Ｂ７−２模倣ペプチドのいずれかおよび（ｉ）〜（ｉｖ）に定義されるそれらの誘導体であって、改変ペプチドが前記二量体界面の少なくとも１個のアミノ酸残基を含んでなる、前記Ｂ７−２模倣ペプチドのいずれかおよび（ｉ）〜（ｉｖ）に定義されるそれらの誘導体
のうちのいずれか１つであり、前記誘導体は３〜約４０個のアミノ酸残基からなる。
【０１０２】
いくつかの他の実施形態では、今般開示される主題による単離および精製されたペプチドの機能的誘導体は、
ｉ．そのＮ末端および／またはＣ末端において、配列番号１４で示されるアミノ酸配列の対応する位置にすぐ隣接して存在する１〜４個の連続するアミノ酸残基だけ延長された前記Ｂ７−１模倣ペプチド；
ｉｉ．そのＮ末端および／またはＣ末端において、
（ａ）システインによりまたはラウリルシステインにより；
（ｂ）非天然有機部分によりまたは合成アミノ酸残基により；
（ｃ）Ｎ−アセチルまたはリシル−パルミトイル残基により；
（ｄ）天然または合成アミノ酸残基であり得る１または複数の疎水性アミノ酸残基により、
延長された前記Ｂ７−１模倣ペプチド；または
ｉｉｉ．（ｉ）および（ｉｉ）のペプチドのいずれかの二量体または多量体；
ｉｖ．前記Ｂ７−１模倣ペプチドの制約立体配座；
ｖ．挿入、欠失、置換から選択される少なくとも１つの合成突然変異により改変された、前記Ｂ７−１模倣ペプチドのいずれかおよび（ｉ）〜（ｉｖ）に定義されるそれらの誘導体であって、改変ペプチドが前記二量体界面の少なくとも１個のアミノ酸残基を含んでなる、前記Ｂ７−１模倣ペプチドのいずれかおよび（ｉ）〜（ｉｖ）に定義されるそれらの誘導体
のうちのいずれか１つであり、前記誘導体は３〜約４０個のアミノ酸残基からなる。
【０１０３】
いくつかの特定の実施形態では、今般開示される主題による単離されたペプチドは、そのＮ末端および／またはそのＣ末端においてＤ−Ａｌａアミノ酸残基で延長されている。
【０１０４】
さらなる実施形態では、今般開示される主題による単離されたペプチドは、そのＮ末端および／またはそのＣ末端においてアミノ酸Ｄ−Ａｌａで延長され、ｈＢ７−２の二量体界面に由来するペプチドでは、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７および配列番号４５からなる群から、また、ｈＢ７−１の二量体界面に由来するペプチドでは、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４７および配列番号４９からなる群から選択される。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本明細書で定義される単離されたペプチドは、配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＥＫＦＤＳＶＨＳＫＹＭ（Ｄ−Ａ）からなるペプチド（本明細書ではペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４とも呼ばれる）、配列番号１０で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＤＳＤＳＷＴＬＲ（Ｄ−Ａ）からなるペプチド（本明細書ではペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６とも呼ばれる）および配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＭＧＲＴＳＦＤＳＤＳ（Ｄ−Ａ）からなるペプチド（本明細書ではペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７とも呼ばれる）のうちのいずれか１つである。
【０１０６】
特定の実施形態では、本明細書で定義される単離されたペプチドは、配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＥＫＦＤＳＶＨＳＫＹＭ（Ｄ−Ａ）のものである（本明細書ではペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４とも呼ばれる）。
【０１０７】
他の特定の実施形態では、本明細書で定義される単離されたペプチドは、配列番号１０で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＤＳＤＳＷＴＬＲ（Ｄ−Ａ）のものである（本発明ではペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６とも呼ばれる）。
【０１０８】
さらなる特定の実施形態では、本明細書で定義される単離されたペプチドは、配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＭＧＲＴＳＦＤＳＤＳ（Ｄ−Ａ）のものである（本発明ではペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７とも呼ばれる）。
【０１０９】
Ｄ−Ａｌａ残基は、単に生物学的アッセイにおいてより大きなプロテアーゼ耐性を付与するために、本開示のｈＢ７−２模倣ペプチドのＣ末端およびＮ末端に付加された。用語「Ｄ−Ａｌａ−」および「（Ｄ−Ａ）」は、本明細書では互換的に使用される。
【０１１０】
さらなる特定の実施形態では、本明細書で定義される単離されたペプチドは、配列番号３９で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＭＮＩＷＰＥＹＫ（Ｄ−Ａ）からなるペプチド（Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ１−４とも呼ばれる）、配列番号４１で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＫＮＲＴＩＦＤＩＴＮ（Ｄ−Ａ）からなるペプチド（Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ１−７とも呼ばれる）、配列番号４３で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａｌａ）ＤＩＴＮＮＬＳＩＶ（Ｄ−Ａｌａ）からなるペプチド（Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ１−６とも呼ばれる）、および配列番号４９で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａｌａ）ＹＫＮＲＴＩＦＤ（Ｄ−Ａｌａ）からなるペプチド（Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ１−８とも呼ばれる）のうちのいずれか１つである。
【０１１１】
Ｄ−Ａｌａ残基は、単に生物学的アッセイにおいてより大きなプロテアーゼ耐性を付与するために、本開示のｈＢ７−１模倣ペプチドのＣ末端およびＮ末端に付加された。
【０１１２】
本開示の全ての態様および実施形態による単離および精製されたペプチド、およびそれらの機能的断片および誘導体は、合成、非天然、人造ペプチドである。本ペプチドは、それらのアミノ酸のいずれかまたは総てがそれ自体天然である場合でも、合成、非天然、人造ペプチドである。
【０１１３】
用語「合成ペプチド」、「非天然ペプチド」および「人造ペプチド」は、本明細書で使用する場合、それらの特定の長さおよびアミノ酸配列ではそれ自体、自然界に見られないペプチドを意味すると理解されるべきである。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、今般開示される主題に関して用語「単離された」は、天然ペプチドと部分的なまたは完全な相同性を持ち得るアミノ酸配列を意味し、ポリペプチドはタンパク質であるが、限定されない長さであり、そのような天然配列とは少なくとも長さが異なる。例えば、今般開示される主題による単離されたペプチドは、ヒトＢ７−２またはヒトＢ７−１の細胞外ドメインの領域の、それらの自然環境ではそれ自体見られるとは思われない、より短い特定の定義される断片であり得る。単離されたペプチドは一般に、合成により、化学合成により、化学的にまたは酵素的に、天然配列を切断することにより、または場合により組換え技術によって調製される。
【０１１５】
従って、「単離された」とは、アミノ酸分子が精製された程度を必ずしも表さない。しかしながら、ある程度まで生成されたこのような分子は「単離された」と理解されるであろう。前記分子が自然環境中に存在しなければ、すなわち、それらが自然界に存在しなければ、その分子はそれが存在する場所にかかわらず「単離された」ものである。
【０１１６】
さらに、用語「精製された」または「実質的に精製された」は、ペプチドに適用される場合、それらのペプチドが、それらが自然状態で随伴している他の細胞成分を実質的に含まないことを表す。むしろ、これらのペプチドは、乾燥状態でも溶液中にあってもよいが、均質な状態である。純度および均質性は一般に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて決定される。調製物中に存在する優勢種であるペプチド分子は精製されているか、または実質的に精製されている。
【０１１７】
本開示はさらに、有効成分として本明細書で定義される少なくとも１種類の単離および精製されたペプチドを含んでなり、場合によりさらに薬学上許容可能な担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤を含んでなる医薬組成物を提供する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本明細書で定義される医薬組成物は、有効成分として、少なくとも１種類、または少なくとも２種類、または少なくとも３種類またはそれを超える本明細書で定義される単離および精製されたペプチドを含んでなり、場合によりさらに薬学上許容可能な担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤を含んでなる。
【０１１９】
以下の実施例３および図５Ａおよび５Ｂに示されるように、ＳＥＢ刺激の３０分前にペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−６およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７を投与されたＳＥＢ刺激マウスは、ＳＥＢ刺激から生残した（図５Ａ）。特に、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７は、ＳＥＢの２〜３倍モル過剰が存在するだけで保護を示した（図５Ｂ）。この高い有効性は、スーパー抗原に対する有害応答の媒介におけるＢ７−２二量体界面の重要な役割を裏づける。
【０１２０】
従って、その態様の別のもので、本開示は、細菌病原体、細菌病原体の混合物および／または毒性細菌成分により誘発される敗血症、毒性ショック、敗血性ショック、重度敗血症、機能喪失および結果としての死亡のうちの少なくとも１つに対して防御免疫を惹起するための、開示されるペプチドおよび本明細書で定義される、それらを含んでなる医薬組成物を提供する。
【０１２１】
本明細書で定義される用語「防御免疫を惹起する」は、致死的病原性細菌および／または致死的毒性細菌成分に感染した動物を敗血性ショック、敗血症および／または重度敗血症、それらのいずれかからの機能喪失および結果としての死亡を含む、誘発される毒性ショックから保護し、それにより、誘発される毒性ショックからの感染／刺激動物の救済および生残をもたらすことを意味する。
【０１２２】
理論に縛られるものではないが、致死的病原性細菌および／または致死的毒性細菌成分に感染した動物の処置および救済の結果は、致死的細菌病原体／および／または毒性細菌成分により誘発される毒性ショック、敗血性ショック、重度敗血症、機能喪失および結果としての死亡に対しての長期防御免疫の付与であり得、感染／刺激動物は球性ショックから生残するだけでなく、以降のいかなる毒素刺激に対しても防御免疫を獲得することも示唆される。これは毒性ショックをもたらす細胞性免疫応答を誘発する毒素の能力を遮断することによるためであり、本開示のアンタゴニストペプチドは、スーパー抗原に、それ自体に向けられる免疫応答を誘発させることができる。
【０１２３】
もう１つのその態様によれば、本開示は、必要とするヒト対象において、細菌病原体、細菌病原体の混合物および／または毒性細菌成分により誘発される敗血症、毒性ショック、敗血性ショック、重度敗血症、機能喪失および結果としての死亡のうちの少なくとも１つに対する防御免疫を惹起するための方法において使用するための本明細書で定義されるペプチドを提供する。
【０１２４】
その態様のさらに別のものによれば、本開示は、必要とするヒト対象において、細菌病原体、細菌病原体の混合物および／または毒性細菌成分により誘発される敗血症、毒性ショック、敗血性ショック、重度敗血症、機能喪失および結果としての死亡のうちの少なくとも１つに対する防御免疫を惹起するための方法において使用するための、本明細書で定義される医薬組成物を提供する。
【０１２５】
今般開示される主題の医薬組成物は一般に、緩衝剤、その浸透圧を調整する薬剤、および場合により、１以上の薬学上許容可能な担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤および／または当技術分野で公知の添加剤を含んでなる。補助有効成分はも本組成物に配合することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散物の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用によって維持することができる。担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤は、本ペプチドの活性に干渉しない。
【０１２６】
今般開示されるペプチドの塩およびエステルも今般開示される主題に包含される。本明細書で定義される用語「塩」は、薬学上許容可能な塩、例えば、当技術分野で周知の方法によって製造される、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム、およびプロタミン亜鉛塩を含む、製薬工業で慣用される非毒性アルカリ金属、アルカリ土類金属、およびアンモニウム塩を意味する。この用語はまた、本明細書で使用される有効化合物を好適な有機または無機酸と反応させることにより一般に調製される非毒性酸付加塩も含む。特定の酸付加塩は、塩酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩またはマロン酸塩、およびそれらの溶媒和物、例えば、水和物であり得る。
【０１２７】
本明細書で定義される用語「エステル」は、薬学上許容可能なエステル、例えば、エステル結合の加水分解時に、そのカルボン酸またはアルコールの生物学的有効性および特性を保持し、かつ、生物学的にまたはそれ以外の点でも望ましくないものではないエステルを意味する。一般に、エステル形成は、従来の合成技術によって達成することができる。
【０１２８】
特定の実施形態では、前記医薬組成物は、徐放もしくは制御放出形、または徐放／制御放出形と即放形の組合せであり得る。
【０１２９】
開示される主題の上記およびその他の実施形態では、ペプチドは医薬単位投与形に含まれてよく、前記投与形は場合によりさらに、生理学上適合する添加剤、担体、ペプチド安定剤、希釈剤および賦形剤のうちの少なくとも１つを含んでなる。例えば、前記投与形は、場合によりさらにプロテアーゼ阻害剤を含んでなる。
【０１３０】
開示される主題の上記およびその他の態様および実施形態では、医薬組成物は、ヒト対象において細菌感染およびそれに関連する急性炎症のうちの少なくとも１つを処置するために使用することができる。
【０１３１】
ヒトの細菌感染は一般に、グラム陽性菌、グラム陰性菌および毒性細菌成分のうちの少なくとも１つによって誘発される。感染が２種類以上の細菌による場合、それは以下に定義されるように他微生物感染と呼ばれることがある。
【０１３２】
よって、開示される主題の上記およびその他の実施形態では、医薬組成物は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、および少なくとも１つの毒性細菌成分のうちの少なくとも１つによって誘発される細菌感染およびそれに関連する急性炎症のうち少なくとも１つを処置するために市油することができる。
【０１３３】
特定の実施形態では、ペプチドまたは有効成分として少なくとも１つの本明細書で定義される単離および精製されたペプチドを含んでなる医薬組成物は、必要とするヒト対象において細菌感染およびそれに関連する急性炎症のうち少なくとも１つを処置する方法において使用するためのものであり、前記医薬組成物は場合によりさらに、薬学上許容可能な担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤を含んでなる。
【０１３４】
本明細書で定義され、当技術分野で公知のグラム陰性菌は、グラム染色プロトコールにおいて、外膜の存在が染料の浸透を妨げるためにクリスタルバイオレット色素を保持しない細菌である。これに対して、グラム陽性菌は、脱色溶液中で洗浄した際にクリスタルバイオレット色素を保持する。グラム陰性菌の病原能は、多くの場合、グラム陰性細胞エンベロープ、特に、リポ多糖（ＬＰＳ）層の特定の成分に関連する。ヒトでは、ＬＰＳはサイトカインの産生および免疫系の活性化を特徴とする自然免疫応答を誘発し、これが多くの場合炎症に関連する。
【０１３５】
よって、開示される主題の上記およびその他の実施形態では、グラム陰性菌は、限定されるものではないが、プロテオバクテリア、大腸菌、サルモネラ菌属、赤痢菌属、腸内細菌科、シュードモナス、モラクセラ、ヘリコバクター、ブデロビブリオ属、ステノトロホモナス、酢酸菌、レジオネラ、アルファプロテオバクテリア、ボルバキア、グラム陰性球菌、ナイセリア種、淋菌、髄膜炎菌、モラクセラ・カタラーリス、グラム陰性桿菌、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、レジオネラ・ニューモフィラ、緑膿菌、プロテウス・ミラビリス、エンテロバクター・クロアカ、霊菌、ピロリ菌、腸炎菌、チフス菌、アシネトバクター・バウマニ、野兎病菌、ビブリオ属、バルニフィカス、コレラ菌、フルビアリス、腸炎ビブリオ、アルギノリチカス、フォトバクター・ダムセラ、アエロモナス・ヒドロフィラ、ウェルシュ菌、クロストリジウム・ヒストリチカム、プリフィロモナス／プレボテラ種  プレボテラ・インテルメディア、プレボテラ・ブッケ、プレボテラ種、バクテロイデス・ユニフォルミスおよびＮＤＭ−１細菌株のうちのいずれか１つであり得る。
【０１３６】
当技術分野で公知のグラム陽性菌は、本明細書では、上記に列挙されるグラム陰性菌とは対照的にグラム染色によって暗青色または紫色に染まる細菌として定義される。限定されない例として、Ａ群連鎖球菌属（ＧＡＳ）は、侵襲性および非侵襲性感染の両方の広範な原因とあるグラム陽性菌である。ＧＡＳは、連鎖球菌性毒素ショック症候群などの侵襲性連鎖球菌感染症の病因に重要であると考えられている、ある範囲のスーパー抗原性毒素を産生する。
【０１３７】
よって、開示される主題の上記およびその他の実施形態では、グラム陽性菌は、Ａ群連鎖球菌属、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌属、糞便連鎖球菌、Ｄ群連鎖球菌属、Ｇ群連鎖球菌属、緑色連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミレリ、プロピオニバクテリウム種、エンテロコッカス・フェシウム、ペプトストレプトコッカス種、微好気性連鎖球菌、乳酸菌種、表皮ブドウ球菌および黄色ブドウ球菌からなる群から選択される。
【０１３８】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．オーレウスまたはＳｔａｐｈ．オーレウスとも呼ばれる）の細菌は、ヒト気道および皮膚によく見られる条件的嫌気性グラム陽性球菌である。黄色ブドウ球菌は、常に病原性であるわけではなく、皮膚感染（例えば、腫脹）、呼吸器系疾患（例えば、副鼻腔炎）、および食中毒の一般的な原因である。疾患関連系統は、強力なタンパク質毒素を産生することにより感染を促進する場合が多い。病原体性黄色ブドウ球菌の抗生物質耐性形態の出現は、臨床医療における世界的な問題である。
【０１３９】
化膿連鎖球菌は、Ａ群連鎖球菌感染症の原因である球形のグラム陽性菌である。化膿連鎖球菌は、その細胞壁にＡ群連鎖球菌抗原を呈する。世界で毎年７億を超える感染があり、死亡率２５％の６５０，０００症例を超える重度侵襲性感染があると推計される。早期の発見および処置が重要であり、診断し損なうと、敗血症および死に至り得る。
【０１４０】
用語「多微生物感染」は、本明細書で使用する場合、数種の細菌からなる／数種の細菌による感染を意味するものと理解されるべきである。細菌感染は、グラム陽性菌の混合物、グラム陰性菌の混合物またはグラム陽性とグラム陰性菌の両方の混合物によって引き起こされる得る。多微生物感染はまた、好気性細菌、嫌気性細菌または両方の混合物によっても引き起こされ得る。
【０１４１】
よって、開示される主題の上記およびその他の実施形態では、前記多微生物感染は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、またはそれらの組合せによって誘発される。
【０１４２】
細菌毒素およびその他の毒性細菌成分は当技術分野で周知である。細菌は、外毒素または内毒素のいずれかとして分類できる毒素を生成する。外毒素は生成されて活発に分泌されるが、内毒素は細菌の部分に留まる。内毒素に対する宿主の応答は、重篤な炎症を含み得る。一般に炎症プロセスは通常、臨床的には感染宿主に有益であると考えられるが、その反応が重度であれば、敗血症に至り得る。特に、用語「スーパー抗原毒素」または「スーパー抗原」（「ＳＡｇ」とも呼ばれる）は、本明細書で使用する場合、Ｔ細胞の非特異的活性化を生じ、ポリクローナルＴ細胞の活性化および多量のサイトカイン放出をもたらす細菌発熱性外毒素のクラスを意味する。
【０１４３】
ブドウ球菌内毒素Ｂ（ＳＥＢ）は、グラム陽性球菌である黄色ブドウ球菌により産生される腸毒素である。それは多くの場合で経口摂取の数時間以内に始まる重度の下痢、悪心および腸痙攣を伴う食中毒の一般的な原因である。極めて安定であるので、毒素は、混入細菌が死滅した後でも活性を維持し得る。毒素は１００℃で数分の煮沸に耐え得る。ＳＥＢは、免疫系に多量のサイトカインを放出させて多大な炎症をもたらすスーパー抗原と見なされる。
【０１４４】
毒素ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ）は、黄色ブドウ球菌単離株の５〜２５％で産生される２２ＫＤａの大きさのスーパー抗原である。ＴＳＳＴは、多量のインターロイキン−１、インターロイキン−２、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の放出を刺激することによって毒素ショック症候群（ＴＳＳ）を引き起こす。一般に、この毒素は血中で増殖する細菌によって産生されず、感染の局部で産生された後、血中に入る。
【０１４５】
ＴＳＳＴ−１は、感受性宿主内の黄色ブドウ球菌株により分泌される原型のスーパー抗原であり、炎症、発熱、およびショックを引き起こすことにより血管系に作用する。ＴＳＳＴ−１を産生する菌株は、ほとんどが感染女性の膣で棲息する（全ＴＳＳ症例の３分の１が男性に見られる）。
【０１４６】
連鎖球菌有糸分裂促進性外毒素Ｚ（ＳＭＥＺ）は、連鎖球菌ゲノムにより産生される最も強力なスーパー抗原性毒素の１つである。ＳＭＥＺをコードする遺伝子は、調べられた総てのＧＡＳ株に存在している。ＳＭＥＺとＧＡＳ疾患の関連を実証する、これまでに利用可能な臨床データはないが、ＳＭＥＺにより示される有病率、効力、および抗原変異は、このスーパー抗原が連鎖球菌疾患の病因において重要な機能を持ち得ることを示唆する。
【０１４７】
本明細書で使用する場合、用語「リポ多糖」（ＬＰＳ）、または「リポグリカン」は、共有結合によって連結された脂質と多糖からなる大分子を意味し；ＬＰＳは、グラム陰性菌の外膜に見られ、内毒素として作用し、動物において強い免疫応答を惹起する。ＬＰＳは、その構造的完全性に大きく寄与する、グラム陰性菌の細菌細胞壁の主成分である。ＬＰＳは内毒素であり、正常な動物免疫系から強い応答を誘導する。
【０１４８】
よって、開示される主題の総ての態様および実施形態で、前記毒性細菌成分は、外毒素、内毒素、スーパー抗原毒素、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、傷害関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）、リポ多糖またはそれらの毒性成分、自然免疫系の細胞により認識される病原体群に関連する分子、およびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）により認識される病原体群に関連する分子からなる群から選択されるが、これらに限定されない。
【０１４９】
よって、今般開示される主題による医薬組成物は、プロテオバクテリア、大腸菌、サルモネラ菌属、赤痢菌属、腸内細菌科、シュードモナス、モラクセラ、ヘリコバクター、ブデロビブリオ属、ステノトロホモナス、酢酸菌、レジオネラ、アルファプロテオバクテリア、ボルバキア、グラム陰性球菌、ナイセリア種、淋菌、髄膜炎菌、モラクセラ・カタラーリス、グラム陰性桿菌、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、レジオネラ・ニューモフィラ、緑膿菌、プロテウス・ミラビリス、エンテロバクター・クロアカ、霊菌、ピロリ菌、腸炎菌、チフス菌、アシネトバクター・バウマニ、野兎病菌、ビブリオ属、バルニフィカス、コレラ菌、フルビアリス、腸炎ビブリオ、アルギノリチカス、フォトバクター・ダムセラ、アエロモナス・ヒドロフィラ、ウェルシュ菌、クロストリジウム・ヒストリチカム、プリフィロモナス／プレボテラ種  プレボテラ・インテルメディア、プレボテラ・ブッケ、プレボテラ種、バクテロイデス・ユニフォルミスおよびＮＤＭ−１細菌株からなる群から選択されるグラム陰性菌、Ａ群連鎖球菌属、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌属、糞便連鎖球菌、Ｄ群連鎖球菌属、Ｇ群連鎖球菌属、緑色連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミレリ、プロピオニバクテリウム種、エンテロコッカス・フェシウム、ペプトストレプトコッカス種、微好気性連鎖球菌、乳酸菌種、表皮ブドウ球菌および黄色ブドウ球菌、またはそれらの組合せからなる群から選択されるグラム陽性菌、外毒素、内毒素、スーパー抗原性毒素、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、傷害関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）、リポ多糖、ペプチドグリカンまたはそれらの毒性成分、自然免疫系の細胞により認識される病原体群に関連する分子、およびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）により認識される病原体群に関連する分子からなる群から選択される毒性細菌成分により誘発される感染の処置において使用することができる。
【０１５０】
特定の実施形態では、少なくとも１つの毒性細菌成分は、スーパー抗原性毒素である。さらなる特定の実施形態では、本明細書で定義される医薬組成物は、少なくとも１つの毒性細菌成分がスーパー抗原性毒素であるものである。
【０１５１】
開示される主題の上記およびその他の実施形態では、投与は、いかの経路：経口投与、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、くも膜下腔内  皮下注射のいずれによって行ってもよく、または前記投与は吸入による。静脈内投与は持続的投与、具体的には、約１０〜約３０分の時間であり得る。静脈内投与はあるいはプッシュ投与であってもよい。
【０１５２】
開示される主題の上記およびその他の実施形態では、本発明による医薬組成物は、経口投与および非経口投与のいずれか１つのためのものである。
【０１５３】
開示される主題の上記およびその他の実施形態では、本発明による医薬組成物は、経口投与および静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、くも膜下腔内、皮下注射のいずれか１つのためのものであり、または前記投与は吸入による。
【０１５４】
今般開示される主題のさらなる実施形態では、非経口投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内の、くも膜下腔内、皮下注射のいずれか１つであり、または前記投与は吸入による。
【０１５５】
さらに、必要とするヒト対象において細菌感染およびそれに関連する急性炎症のうちの少なくとも１つを処置する方法であって、前記対象に治療上有効な量の本明細書に定義される少なくとも１種類のペプチドまたは本明細書に定義される、前記を含んでなる組成物を投与することを含んでなる方法が開示される。この方法はまた、本明細書では「処置方法」とも呼ばれる。
【０１５６】
本明細書で定義される用語「治療する」または「処置」またはその形態は、それを必要とする対象においてその疾患もしくは病態の悪化を予防すること、またはその疾患もしくは病態を停止させること、または緩和すること、または治癒させることを意味する。
【０１５７】
本明細書で定義される目的でのペプチドの「治療上有効な量」（または複数の量）という用語は、その医学的状態を知立させる、または少なくとも停止させる、または少なくとも緩和するために、当技術分野で公知の考慮事項により決定される。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本明細書で定義される治療上有効な量は、約０．１〜約６０μｇ／Ｋｇ前記対象の体重である。
【０１５９】
さらに、必要とするヒト対象において、細菌病原体、細菌病原体の混合物および／または少なくとも１つの毒性細菌成分により誘発される敗血症、毒性ショック、敗血性ショック、重度敗血症、機能喪失および結果としての死亡のうちの少なくとも１つに対する防御免疫を惹起するための方法が開示され、前記方法は、前記対象に免疫学的に有効な量の本明細書で定義されるペプチドまたはそれを含んでなる薬学上許容可能な組成物を投与することを含んでなる。この方法では、少なくとも１つの毒性細菌成分は、外毒素、内毒素、スーパー抗原性毒素、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、傷害関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）、リポ多糖、ペプチドグリカンまたはそれらの毒性成分、自然免疫系の細胞により認識される病原体群に関連する分子、およびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）により認識される病原体群に関連する分子、具体的には、スーパー抗原性毒素からなる群から選択され得る。特定の実施形態では、毒性細菌成分は、限定されるものではないが、ＳＥＢ、ＳＭＥＺまたはＴＳＳＴ−１である。今般開示されるペプチドの、これらの毒素に対する有効性は、実施例１に示される。この方法はまた、本明細書では「免疫付与の方法」とも呼ばれる。
【０１６０】
ペプチドの「免疫学的に有効な量」（または複数の量）という用語は、原性細菌および／または毒性細菌成分により誘発される敗血症、毒性ショック、敗血性ショック、重度敗血症、機能喪失および結果としての死亡に対して免疫を付与するのに十分ないずれんぼ量も意味し、当技術分野で公知の考慮事項により決定される。
【０１６１】
以下の実施例３に示されるように、本発明によるペプチド、例えば、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−６およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７は、それらのペプチドをマウス当たり０．２〜１μｇの範囲の治療上有効な量で投与した場合にマウスにおいてスーパー抗原致死を遮断ことが示された（図５Ａおよび５Ｂ参照）。体重２５ｇのマウスにおけるこの有効量は約４０μｇ／ｋｇに相当し、そのヒト等価用量（ＨＥＤ）は０．６５〜３．２５μｇ／ｋｇである。
【０１６２】
本明細書で開示される処置の方法および免疫付与の方法によって使用される具体的範囲は、約０．１μｇ〜約６０μｇペプチド／ｋｇ前記対象の体重であり得る。よって、開示される主題の上記およびその他の実施形態では、本開示によるペプチドは、前記ヒト対象に約０．１〜約６０μｇペプチド／ｋｇ前記対象体重の量で投与される。
【０１６３】
よって、その量は、０．１μｇ〜６０μｇペプチド／ｋｇ前記対象の体重、例えば、０．１〜６０．０、０．１〜５５．０、０．１〜４０．０、０．１〜３５．０、０．１〜３０．０、０．１〜２５．０、０．１〜２０．０、０．１〜１５．０、０．１〜１０．０、０．１〜９．０、０．１〜８．０、０．１〜７．０、０．１〜６．０、０．１〜５．０、０．１〜４．０、０．１〜３．０、０．１〜２．０、０．１〜１．０、０．１〜０．７５、０．１〜０．５、０．１〜０．２５であり得る。具体的には、治療上有効な量は、０．２５、０．５、０．６５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０、５．２５、５．５、５．７５、６．０、６．２５、６．５、６．７５、７．０、７．２５、７．５、７．７５、８．０、８．２５、８．５、８．７５、９．０、９．２５、９．５、９．７５、１０．０、１２．５、１５．０、１７．５、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、５０．０、５５．０または６０．０μｇペプチド／ｋｇ前記対象の体重のうちのいずれか１つであり得る。
【０１６４】
投与されるペプチドの量は特定のペプチドの分子量およびその他の特徴の考慮事項において約５〜２５％変動可能であることに留意されたい。よって、本明細書で定義される用語「約」は、本明細書で定義される量の５〜２５％の変動を意味する。
【０１６５】
開示される主題の上記およびその他の実施形態では、本開示による細菌感染および／またはそれに関連する急性炎症の処置において使用するためのペプチドは、前記感染およびそれに関連する急性炎症のうちの少なくとも１つの発症後の好適な時点で投与してもよい。あるいはまたは加えて、本開示による使用のためのペプチドは、前記感染またはそれに関連する急性炎症の発症直後に投与してもよい。本開示によるペプチドは、感染の急性期に、および担当の医師によって決定され得るように、必要に応じてその後にも投与してよい。
【０１６６】
用語「発症」は、前記ヒト対象の感染時またはその臨床発現の開始もしくは前記感染に関連するもしくは前記感染を原因とする急性炎症の発現の時点と、担当の医療スタッフの熟練員による感染および炎症のいずれかの診断時との間のいずれかの時点、ならびに本開示による処置が専門的に前記対象に指定されたその間またはその後のいずれかの時点を意味する。
【０１６７】
本明細書で使用する場合、用語「必要とするヒト対象」は、本明細書で定義される感染およびそれに関連する急性炎症のうちの少なくとも１つに苦しんでいるヒトを意味すると理解されるべきである。「必要とするヒト対象」は、致死的細菌病原体および／または細菌病原体の毒性細菌成分により誘発される敗血症、毒性ショック、敗血性ショック、重度敗血症および／または死をもたらし得る機能喪失に苦しんでいるヒト対象であり得る。「必要とするヒト対象」はまた、細菌感染およびそれに関連する急性炎症が課されるリスクのあるヒトであり得る。
【０１６８】
開示される主題の上記およびその他の実施形態では、本発明による医薬組成物または処置の方法は、場合により、前記必要とするヒト対象に付加的治療薬を投与することをさらに含んでなる。
【０１６９】
開示される主題の上記およびその他の実施形態では、付加的治療薬は、抗菌薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗生物質、静菌薬および殺菌薬、ステロイドおよび抗微生物薬のうちいずれか１つであり得る。
【０１７０】
開示される主題の上記およびその他の実施形態では、前記ペプチドおよび前記の付加的な他の治療上有効な薬剤は、同時に投与される。あるいはまたは加えて、前記ペプチドおよび前記の付加的な他の治療上有効な薬剤は、異なる時点で、異なる投与間隔で、異なる持続時間で、または異なる順序で投与される。
【０１７１】
例えば、処置は、本ペプチドと付加的な他の薬剤の両方の投与で始めてよく、付加的薬剤の投与は、本ペプチドの投与の前または後に止めることができる。
【０１７２】
細菌病原体、細菌病原体の混合物および／または少なくとも１つの毒性細菌成分により誘発される敗血症、毒性ショック、敗血性ショック、重度敗血症、機能喪失および結果としての死亡のうちうの少なくとも１つに対する防御免疫を対象に付与する上記方法において、本開示によるペプチドは、具体的には、前記細菌病原体および／または毒性細菌成分による刺激の前の、または後の好適な時点で投与してよい。刺激前に投与する場合、本ペプチドは約３０、２５、２０、１５分前またはそれ以内に投与してよい。刺激後に投与する場合、本ペプチドは直後または短時間の日に投与する。
【０１７３】
分かりすいように別の実施形態に関して記載されている今般開示される主題の特定の特徴は、単一の実施形態に組み合わせて提供されてもよいと認識される。逆に、また、簡潔にするために単一の実施形態に関して記載される本発明の様々な特徴を、個別にまたは任意の好適な部分組合せでまたは記載される他の任意の本発明の実施形態において好適として提供してもよい。様々な実施形態に関して記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素を用いない場合に無効でない限り、それらの実施形態の不可欠な特徴と見なされるべきでない。
【０１７４】
以上に示され、以下の特許請求の範囲の節で特許請求される本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的裏づけを見出す。
【０１７５】
開示および記載される、本発明は本明細書に開示される特定の例、方法工程、および組成物に限定されないと理解されるべきであり、従って、方法工程および組成物はある程度可変である。また、本明細書で使用される用語は単に特定の実施形態を記載する目的で用いられるに過ぎず、限定を意図するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されると理解されるべきである。
【０１７６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの(a)”、「１つの(an)」、および「その(the）」は、内容がそうではないことを明示しない限り、複数の指示物を含むということに留意されたい。
【実施例】
【０１７７】
さらに詳述しなくても、当業者ならば、以上の記載を用いて本発明を最大限に利用できると考えられる。よって、以下の好ましい特定の実施形態は、単に例示であって、特許請求される発明を何ら限定するものではないと解釈されるべきである。
【０１７８】
本明細書では具体的に記載されない当技術分野で公知の標準的な分子生物学プロトコールは一般にSambrook & Russell, 2001などに本質的に従う。
【０１７９】
本明細書では具体的に記載されない当技術分野で公知の標準的な医薬品化学法は一般に、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓｓが発行している様々な著者および編者による“Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”に本質的に従う。
【０１８０】
試験手順
ペプチド
ペプチドは、フルオロニル−メトキシカルボニル化学を用いて合成し、切断し、トリフルオロ酢酸(triflouroacetic acid)で側鎖を脱保護した。ペプチドは、高速液体クロマトグラフィーにより純度＞９５％であり；分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって確認した。ペプチドは、生物学的アッセイでのプロテアーゼ耐性の増強のために両末端にＤ−Ａｌａ（Ｄ−アラニン）を付加し、かつ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のためにＣｙｓ（システイン）を付加した。Ｂ７−２ペプチドはＲＰＭＩ  １６４０組織培養培地に容易に溶解した。
【０１８１】
抗体
αＳＥＢモノクローナル抗体（Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：クローンＭＢ２Ｂ３３）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧまたはロバ抗ヤギ（ＫＰＬ）、マウスモノクローナルαＣＤ２８（クローン３７４０７）、αＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１）、ヤギポリクローナル抗ＣＤ２８および抗Ｂ７−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）抗体を用いた。固定化したＢ７−２−ＦｃおよびリボヌクレアーゼＡへのＳＥＢの結合を、対応するセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合マウス抗ＳＥＢモノクローナル抗体を用いて酵素結合免疫吸着アッセイでアッセイした。
【０１８２】
サイトカイン遺伝子発現の誘導
健康なヒトドナーからヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコールパーク（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で分離し、５０ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地で２回洗浄し、４×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させ、２％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭ  ＭＥＭ非特異的アミノ酸、１００ｍＭ  Ｎａ−ピルビン酸、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５μｇ／ｍｌナイスタチンを添加したこの培地で培養した。ブドウ球菌内毒素Ｂ（ＳＥＢ、ロット１４３０、米国陸軍感染症研究所毒物学部門）（１０、１２）を終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように加えた。マウス抗ヒトモノクローナル抗体αＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１；１００ｎｇ／ｍｌ）およびαＣＤ２８（クローン３７４０７；２．５μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮ）を誘導物質として使用した。ヒトＰＢＭＣを用いる試験のために大腸菌リポ多糖（ＬＰＳ）０１１１：Ｂ４をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ＭＯ）から入手した。分泌されたサイトカインは、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて３反復で定量し、平均±ＳＥＭとして表す。
【０１８３】
Ｂ７−２発現ベクター
Ｂ７−２を発現するベクターは、Ｖｅｒｓｏ  ＲＴ−ＰＣＲキット（ＡＢｇｅｎｅ）を用い、全ヒトＰＢＭＣ  ＲＮＡからのヒトＣＤ８６（ＮＭ＿１７５８６２）のｃＤＮＡ合成により作出した。ＣＤ８６  ｃＤＮＡは、リン酸化ＰＣＲプライマー５’−ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＧＡＡＧＧＣＴＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴ（配列番号５１で示される）および５’−ＣＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＡＧＧＴＣＡＴＧＡＧＣＣＡＴＴＡＡＧＣ（配列番号５２で示される）とともにＫＯＤポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて作出した。ＰＣＲ産物を、ＳａｌＩＩおよびＮｏｔＩで消化されＧＦＰ領域を欠くｐＥＧＦＰ−Ｎ３  ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に、Ｆａｓｔ−Ｌｉｎｋ  ＤＮＡライゲーションキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて挿入した。
【０１８４】
Ｃ末端でＧＦＰまたはＣｈｅｒｒｙと融合したＢ７−２を発現するベクターは、Ｂ７−２  ｃＤＮＡベクター鋳型から、Ｂ７−２の終止コドンを削除する、リン酸化ＰＣＲプライマー５’−ＴＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＴＡＡＣＡＴＴＣ（配列番号５３で示される）および５’−ＧＴＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＧＣＡＴＧＴＡＣＡＣＴＴＴＴＧＴＣＧ（配列番号５４で示される）を用いて作出した。ＸｈｏＩおよびＳａｃＩＩで消化した際に、ＰＣＲ産物をｐＥＧＦＰ−Ｎ３  ＤＮＡまたはｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｎ１  ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のいずれかに挿入した。Ｂ７−２Ｃ／Ｃｈｅｒｒｙベクターは、Ｂ７−２／Ｃｈｅｒｒｙ鋳型から、プライマー５’−ＧＴＣＴＣＴＣＧＴＣＣＴＴＣＣＧＧ（配列番号５５で示される）および５’−ＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＴＣＡＡＣＣＴＧ（配列番号５６で示される）を用いて作出した。
【０１８５】
【表１】
0006776254.tif 000006
【０１８６】
ＣＤ２８／Ｂ７−２相互作用
細胞上のＣＤ２８に対するＢ７−２の結合に及ぼすＳＥＢの影響をアッセイするために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、細胞表面ＣＤ２８（１０）を発現するように、またはＧＦＰ発現エンプティーベクターでトランスフェクトした。３６時間後、これらの細胞をＳＥＢ不在下または存在下で０．２μｇ／ｍｌの可溶性Ｂ７−２とともに４５分間インキュベートした。冷リン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した後、細胞を溶解させた。Ｂ７−２の結合および細胞によるＣＤ２８の発現を示すために、等量の全細胞タンパク質（ブラッドフォードアッセイ）に対して１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロット法を行った。逆に、細胞上のＢ７−２に対するＣＤ２８の結合に及ぼすＳＥＢの影響は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、細胞表面Ｂ７−２を発現するようにトランスフェクトすることによりアッセイした。３６時間後、細胞をＳＥＢの不在下または存在下で０．２μｇ／ｍｌの可溶性ＣＤ２８とともに４５分間インキュベートした。上記のように３回洗浄した後、細胞を溶解させた。ＣＤ２８の結合および細胞によるＢ７−２の発現を示すために、等量の全細胞タンパク質に対して１０％ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法を行った。
【０１８７】
組換えスーパー抗原
黄色ブドウ球菌ＣＯＬ、黄色ブドウ球菌ＴＳＳＴ−１産生株、および化膿連鎖球菌ＳＭＥＺ産生株から単離された染色体ＤＮＡを用いて、ｗｔ  ＳＥＢ、ＴＳＳＴ−１およびＳＭＥＺ遺伝子をｐＨＴＴ７Ｋ（１４）へクローニングした。上記遺伝子の各個を、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを有する成熟タンパク質として大腸菌で発現させた。挿入配列をＤＮＡシーケンシングにより確認した。全タンパク質をＨｉｓ・Ｂｉｎｄカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ）に載せ、イミダゾールで段階的に溶出した。透析後に回収された組換えタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度＞９８％であり、分子量標準（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で較正した１×３０ｃｍスーパーデックス７５カラムによる分析的ゲル濾過（カラムからタンパク質を１ｍｌ／分の流速で溶出させた）で単量体として＞９８％均質であった。組換えＳＥＢは１０μｇ／ｍｌでマウスに致死的であった。
【０１８８】
表面プラズモン共鳴分光法
タンパク質およびペプチドを１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０で１０〜２００μｇ／ｍｌに希釈し、それぞれアミンカップリングキットおよびアミン−チオールカップリングキット（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いてＣＭ５センサーチップに固定化した。物質移動限界を最小とする低リガンド密度条件下、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．００５％界面活性剤Ｐ２０中、２０μｌ／分でアナライトを注入した。なお、固定化リガンドの最大結合能が５０〜１５０応答単位の範囲であれば、結合動態の測定が可能である。再生は５０ｍＭリン酸で行った。動態分析は、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００装置にて２５℃で行い、結合シグナルから対照フローセルシグナルを差し引いた。アナライト曲線は２反復で実施し、代表的な結果を示す。ＢＩＡａｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１ソフトウエアを用いて直線リガンド濃度域でＫＤを求めた（１：１ラングミュア結合）。複合体のＫＤ決定の基準は、ｋａおよびｋｄのパーセントとしての標準誤差であり；十分に２を下回るχ２値は、理論結合値と観測結合値の間の適合の質を示し、調べたリガンドの純度を証明する。適合残差は±２の範囲内であり、良好な適合度が確認される。ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびリボヌクレアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ）を対照として用いた。
【０１８９】
マウス致死アッセイ
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０〜１２週；Ｈａｒｌａｎ）に、スーパー抗原に感作させるためにＳＥＢおよび２０ｍｇＤ−ガラクトサミンの腹腔内注射により抗原投与した（１２）。アンタゴニストペプチドを抗原投与の３０分前に腹膜内注射した。生存率をモニタリングした。生存率は、モニタリングした限り（２週間）、７２時間以降一定に維持された。マウスを含む試験は、所内動物実験委員会により承認されたものである。
【０１９０】
統計分析
生存曲線は、比較のためのログランク検定とともにカプラン・マイヤー法を用いて分析した。
【０１９１】
構造モデル
タンパク質構造のＣａｒｔｏｏｎモデルをＰｙＭｏｌ(www.pymol.org)で作出した。
【０１９２】
実施例１
Ｂ７−２はＳＥＢと結合するためにそのホモ二量体界面を使用する
Ｂ７−２／ＣＴＬＡ−４複合体（１）において、ＣＤ２８とＣＴＬＡ−４の間で保存されているＭＹＰＰＰＹドメインはＢ７−２と会合し、その結果、Ｂ７−２二量体界面は完全に接近可能な状態で留まる。よって、Ｂ７−２結晶学的ホモ二量体界面の残基をオーバーラップする、本明細書でＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４（配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＥＫＦＤＳＶＨＳＫＹＭ（Ｄ−Ａ）を有する）およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６（配列番号１０で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＤＳＤＳＷＴＬＲ（Ｄ−Ａ）を有する）と呼ばれる短いペプチドを合成した。これらのペプチドを、Ｂ７−２二量体界面領域について図１に示す。図１は、Ｎ末端ＰｒｏがＭｅｔで置換された、配列番号５０で示されるアミノ酸配列を有する配列番号１３の変異体を示す。対照として、本明細書でＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−２（配列番号２で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＤＬＰＣＱＦＡＮＳＱＮ（Ｄ−Ａ）を有する）、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−３（配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＨＨＫＫＰＴＧＭＩＲ（Ｄ−Ａ）を有する）およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−５（配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＭＬＫＩＱＡＹ（Ｄ−Ａ）を有する）と呼ばれるペプチドを合成した。なお、これらのペプチドは二量体界面の外側にある（図１に示される通り）。
【０１９３】
図２Ａに示されるように、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−２、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−３およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−５は、ＰＢＭＣにおいてＳＥＢにより媒介されるＩＦＮ−γの誘導を阻害することができなかったが、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−４およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６には強い阻害性があった。Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−４およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６はまたＩＬ−２およびＴＮＦ−αの誘導も阻害したが、他の２つのペプチドは阻害しなかった  （図２Ｂ）。より低濃度（０．０１μｇ／ｍｌ）では、ｐＢ２−４およびｐＢ２−６はＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの誘導を部分的に阻害したに過ぎなかったが、それらは一緒に著しい相乗的阻害を示した（図２Ｃ）。対照的に、ＩＬ−１０の誘導は、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−４およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６単独または組合せに耐性があった。
【０１９４】
Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−４とＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６の間の相乗作用は、それらがＢ７−２二量体界面の非オーバーラッピング部分をカバーしているという事実からくるものである可能性がある（図１に模式的に示される通り）。従って、次に、それらの活性を、配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｄ−Ａ）ＭＧＲＴＳＦＤＳＤＳ（Ｄ−Ａ）を有する、本明細書でＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７と呼ばれるペプチド（Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−４およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６と部分的にオーバーラップし、アミノ酸９個の連続するホモ二量体界面ドメインをカバーしている）の活性と比較した（図１）。図２Ｄに示されるように、ｐＢ２−７は、ＳＥＢにより媒介されるＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの誘導を、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−４とＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６を組み合わせた場合と同等に阻害し、それらと同様にＩＬ−１０の誘導は阻害しなかった。
【０１９５】
興味深いことに、図２Ｅに示されるように、同様の結果が、ＳＥＢの４０倍の致死性であることが知られている連鎖球菌有糸分裂促進性外毒素Ｚ（ＳＭＥＺ、図２Ｅ１、図２Ｅ２、図２Ｅ３および図２Ｅ４）でも、また、ＳＥＢと６％の配列同一性しか持たないがβ鎖（８）／ヒンジ／αヘリックス（４）ドメイン（１２）の構造が保存されているスーパー抗原としての毒素ショック症候群毒素−１でも（ＴＳＳＴ−１、図２Ｅ５、図２Ｅ６および図２Ｅ７）得られた。
【０１９６】
発散性のスーパー抗原による炎症性サイトカイン誘導に関するシグナル伝達を阻害するＢ７−２二量体界面模倣ペプチドの能力は、これらのペプチドがスーパー抗原の結合においてＢ７−２と競合することを示唆した。実際に、図３Ａおよび図３Ｂに示されるように、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６はそれぞれ、マイクロモル範囲のＫＤで（下記表２）ＳＥＢに直接結合する。Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−４およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６は、同様に、マイクロモルの親和性で（下記表２）ＴＳＳＴ−１およびＳＭＥＺと結合する（ＴＳＳＴ−１の結合については図３Ｃおよび図３Ｄ、ＳＭＥＺの結合については図３Ｅおよび図３Ｆ）。よって、スーパー抗原はＢ７−２のＶドメイン内に位置するホモ二量体界面と会合する。
【０１９７】
下記の表２では、精製した組換えスーパー抗原を用い、ＳＥＢの濃度は０．７８μＭから２倍刻みで６段階の範囲とし、ＴＳＳＴ−１の濃度は０．０６２５μＭから２倍刻みで５段階の範囲とし、ＳＭＥＺの濃度は０．０６２５μＭから２倍刻みで４段階の範囲とした。
【０１９８】
【表２】
0006776254.tif 000007
【０１９９】
上記の表２に示すパラメーターを得るために、精製した組換えスーパー抗原を使用した。ＳＥＢの濃度は０．７８μＭから２倍刻みで６段階の範囲とし；ＴＳＳＴ−１の濃度は０．０６２５μＭから２倍刻みで５段階の範囲とし；ＳＭＥＺの濃度は０．０６２５μＭから２倍刻みで４段階の範囲とした。ｋａ、会合速度；ｋｄ、解離速度。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１ソフトウエア（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて直線リガンド濃度域でＫＤを求めた（１：１ラングミュア結合）。複合体のＫＤ決定の基準はｋａおよびｋｄのパーセントとしての標準誤差であり；十分に２を下回るχ２値は、理論結合値と観測結合値の間の適合の質を示し、調べたリガンドの純度を証明する。適合残差は±２の範囲内であり、良好な適合度が確認される。
【０２００】
実施例２
Ｂ７−２またはＣＤ２８に対するＳＥＢの結合：二量体界面ペプチドによる相互阻害
次に、Ｂ７−２を発現する細胞集団に対するＳＥＢの結合を調べた。図４Ａに示されるように、ＳＥＢの結合は、αＢ７−２抗体によって排除されたが、ＣＤ２８二量体界面エピトープを標的とするモノクローナル抗体であるαＣＤ２８によっては排除されず、特異性を示す。興味深いことに、Ｂ７−２二量体界面模倣ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６の単独または組合せは、Ｂ７−２を発現する細胞に対するＳＥＢの結合を効果的に遮断したが、二量体界面の外側にあるペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−２は結合を阻害しなかった（図４Ａ）。ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７も同様に、単独でもＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４と組み合わせた場合でも、Ｂ７−２を発現する細胞に対するＳＥＢの結合を遮断した（図４Ｂ）。
【０２０１】
Ｂ７−２二量体界面模倣ペプチドが細胞表面Ｂ７−２に対するＳＥＢの結合を特異的に遮断するという発見は、細胞表面Ｂ７−２内のＳＥＢ結合部位は二量体界面であることを示し、これらのペプチドはスーパー抗原と直接結合し、炎症性サイトカインの誘導を阻害することを示すこれらの結果を強く補強する。
【０２０２】
注目すべきは、スーパー抗原と直接結合して炎症性サイトカインの誘導および毒性を阻害する（１０）ＣＤ２８ホモ二量体界面に由来するｐ２ＴＡおよびｐ１ＴＡペプチド（それぞれ本明細書では配列番号１６で示されるコアアミノ酸配列ＳＰＭＬＶＡＹＤおよび本明細書では配列番号１７で示されるＨＶＫＧＫＨＬＣＰを有する）のＤ−Ａｌａ誘導体は、Ｂ７−２を発現する細胞に対するＳＥＢの結合を同等に阻害した（図４Ｂおよび図４Ｃ）。ｐ２ＴＡおよびｐ１ＴＡはそのβ鎖（８）／ヒンジ／αヘリックス（４）ドメイン（１０）においてＳＥＢと結合するので、それらはスーパー抗原においてその結合部位をめぐってＢ７−２と競合する。
【０２０３】
相互試験において、細胞を、細胞表面ＣＤ２８を発現するようにトランスフェクトした。このような細胞に対するＳＥＢの結合はαＣＤ２８、ｐ１ＴＡおよびｐ２ＴＡによって排除されるが、αＢ７−２によっては排除されないことが従前に報告されている（１０）。実際に、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−６およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７は、ＣＤ２８二量体界面模倣物ｐ１ＴＡおよびｐ２ＴＡと同様に細胞表面ＣＤ２８対するＳＥＢの結合を遮断することができるが、対照ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−２は遮断できない（図４Ｄ）。
【０２０４】
よって、スーパー抗原は、それらの二量体界面においてＢ７−２またはＣＤ２８のいずれかと結合するためにその保存されたβ鎖（８）／ヒンジ／αヘリックス（４）ドメインを用いるだけでなく、いずれの二量体界面のペプチド模倣物も二重のアンタゴニスト活性を有し、いずれの受容体に対するスーパー抗原の結合も相互に遮断する。
【０２０５】
実施例３
Ｂ７−２二量体界面ペプチドはＳＥＢ致死から保護する
次に、ＳＥＢ刺激マウスに対するペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−６およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７の効果を実証するためにスーパー抗原致死に関して認知されているモデルであるＤ−ガラクトサミン感作マウスを使用した（１０および１２）。図５Ａに示されるように、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−４およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６は、スーパー抗原致死を遮断した。１／５の対照マウスだけがＳＥＢ刺激から生残し、ＳＥＢ暴露時にＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６をそれぞれ受容した４／５および５／５のマウスが生残した（図５Ａ）。注目すべきは、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７はＳＥＢの２〜３倍モル過剰が存在するだけで保護を示した（図５Ｂ）。この高い有効性は、スーパー抗原に対する有害な応答の媒介におけるＢ７−２二量体界面の重要な役割を裏づける。
【０２０６】
実施例４
Ｂ７−２二量体界面に由来するペプチドによるＣＤ２８シグナル伝達の減弱化
上記のように、αＣＤ３により誘導されたヒトＰＢＭＣにおけるペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７の効果も調べた。図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−７は、ペプチド１μｇ／ｍｌで存在した場合でも（図６Ａ）または１０倍濃度の１０μｇ／ｍｌが存在した場合でも（図６Ｂ）、αＣＤ３によるＩＦＮ−γの誘導を阻害せず、このことはそれがＴ細胞受容体を介したシグナル伝達を遮断しないことを示す。さらに、どちらの濃度でも、すなわち、１または１０μｇ／ｍｌでも、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−７はそれ自体応答を誘導しなかった（それぞれ図６Ａおよび図６Ｂ）。
【０２０７】
しかしながら、図７Ａおよび図７Ｂに示されるように、ｐＢ２−７は、これらのサイトカインの発現がαＣＤ２８を伴うαＣＤ３によって誘導された場合には、ＩＦＮ−γ（図７Ａ）およびＴＮＦ−α（図７Ｂ）の発現を減弱した。興味深いことに、０．０１およびさらには０．００１μｇ／ｍｌといった低いペプチド濃度でもＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αそれぞれの発現の有意な減弱化が見られ、強力な阻害を示した。よって、このペプチドは、ＣＤ２８を介して伝達される場合、炎症性サイトカイン応答のシグナル伝達を阻害する。図８に示されるように、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−７と同様にＢ７−２のホモ二量体界面に由来するペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４によっては、サイトカインＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αに関するＣＤ２８シグナル伝達の阻害もまた示されたが、二量体界面ドメインの外側にあるＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−２によってはその阻害は示されなかった。
【０２０８】
実施例５
ペプチドｐＢ２−４、ｐＢ２−６およびｐＢ２−７によるＬＰＳシグナル伝達の減弱化
リポ多糖（ＬＰＳ）は、グラム陰性菌に特異的な病原性因子であり、より一般に、グラム陰性感染のホールマークである。図９Ａに示されるように、大腸菌ＬＰＳによるヒトＰＢＭＣにおけるＴＮＦ−α発現の誘導は、Ｂ７−２二量体界面模倣ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−６ならびにそれらの組合せによる減弱化に感受性があった。Ｂ７−２二量体界面模倣ペプチドｐＢ２−７の効果を図９Ｂに示す。
【０２０９】
Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−４とＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−６の組合せに関して図９Ａで示されたより大きな程度の阻害（これらのペプチドのそれぞれ単独の効果と比較）は、そのより大きなスーパー抗原アンタゴニスト活性を反映し、上記に示した結果と一致する。
【０２１０】
注目すべきは、図１０に示されるように、大腸菌ＬＰＳにより誘導されたヒトＰＢＭＣにおけるＴＮＦ−α発現の誘導は、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−４、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−６およびＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７のそれぞれにより、それらのペプチドが０．０１μｇ／ｍｌの濃度で存在した場合であっても、低減された。よって、ＬＰＳにより媒介されるＴＮＦ−α誘導を減弱するには低濃度のＢ７−２二量体界面模倣ペプチドで十分である。
【０２１１】
実施例６
Ｂ７−２二量体界面模倣ペプチドの効力
Ｂ７−２二量体界面は、補助刺激において既知の役割を持たず、ＣＤ２８結合部位から構造的に十分に分離されている。受容体ホモ二量体界面内で、弱い、短距離ファンデルワールス相互作用は立体的適合と組み合わさって受容体のホモ二量体形成を可能とし、ヘテロ二量体の生成を妨げる。スーパー抗原の会合はＢ７−２単量体間の接触に取って代わるはずであり、Ｂ７−２単量体はＣＤ２８とは異なって二量体界面の外側で分子間ジスルフィド結合を介して連結されておらず、従って、再二量体化に二次結合反応を必要とする。このことは、上記に示されるように、毒素に対して低モル比であっても致死的ＳＥＢ刺激からマウスを保護するＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７の能力を説明し得る。
【０２１２】
図７、図８および図９に示されるように、Ｂ７−２二量体界面模倣ペプチドは、それらが由来する粘着性のＢ７−２受容体ホモ二量体界面に再び結合し、それにより、スーパー抗原の不在下であってもシグナル伝達を減弱する可能性がある。ペプチドの有効性は、Ｂ７−２単量体間の分子間ジスルフィド結合の欠如（競合する短いペプチドによるそれらの分離を助長する）によって増進される。このことはスーパー抗原の不在下で見られる過度の免疫刺激に対するＢ７−２二量体界面模倣ペプチドの有効性を説明し得る。
【０２１３】
実施例７
Ｂ７−１ホモ二量体界面に由来するペプチド
Ｂ７−１はＢ７−２と同族であり、Ｂ７−１およびＢ７−２は両方とも抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面で発現される補助刺激リガンドとして働く。図１１は、Ｂ７−１ホモ二量体界面に由来するペプチド、すなわち、それぞれ配列番号３８、配列番号４２、配列番号４０および配列番号４８で示されるｐＢ１−４、ｐＢ１−６、ｐＢ１−７およびｐＢ１−８を示す。図１２は、ヒトＢ７−１およびヒトＢ７−２の両方の二量体界面に由来するセグメントのアラインメントを模式的に示し、保存されている残基を太字で示し、Ｂ７−２二量体界面に関与する残基を下線で示す。図１２はまた、ヒトＢ７−２ペプチドｐＢ２−４、ｐＢ２−７およびｐＢ２−６を、Ｂ７−１配列の一部のペプチドｐＢ１−４、ｐＢ１−７およびｐＢ１−６とアラインしたものも示す。例えばスーパー抗原刺激などの種々の誘導の結果としてのサイトカインレベルに対する、ヒトＢ７−１二量体界面に由来するペプチドの効果も調べられる。
【０２１４】
実施例８
多微生物感染モデル：盲腸結紮穿刺(Cecal Ligation and Puncture)（ＣＬＰ）
マウス盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）モデルは、多微生物感染を調べ、腹腔内感染または敗血症に対する治療薬の効果を追跡するために臨床上適切なモデルである。特定病原体不在  ＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１２週）およびＣＤ１非近交系マウス（８〜１２週間）を入手する。総ての動物試験は、試験が開始される前に所内動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committees)（ＩＡＣＵＣ）によって承認される。
【０２１５】
動物を吸入イソフルラン（Ｂａｘｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、ディアフィールド、ＩＬ）（濃度４〜５％＋０．８〜１Ｌ／分で誘導、１〜３％＋０．８〜１Ｌ／分で維持）で麻酔する。
【０２１６】
盲腸を１．５ｃｍ正中切開により体外に出し、回盲部のすぐ遠位のその長さの９０％のところを５−０ナイロンモノフィラメント縫合糸で結紮する。次に、この盲腸を、２３ゲージ針を用い、盲腸の腸間膜反対側(ante-mesenteric side)へ２回穿刺する。穿刺部位をから少量の管腔内容物(laminal contents)を絞り出すことにより開通していることを確認する。この臓器を腹腔に戻し、筋膜および皮膚を閉じ、術部に局所的リドカインおよびバシトラシンを塗布する。各動物に２０ｍｇ／ｋｇ筋肉内用量のモキシフロキサシン（ＬＤ２５の最適以下用量に相当）および１ｍｌの標準生理食塩水の皮下ボーラスを施す。これらの動物を完全に覚醒するまで再び加温し、その後、ケージに戻す。
【０２１７】
供試ペプチドは具体的には、静脈内投与されるＤ−Ａｌａ−ｐＢ２−７（配列番号１２で示される通り）、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−２（配列番号２で示される通り）、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ２−６（配列番号１０で示される通り）、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ１−４（配列番号３９で示される通り）、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ１−７（配列番号４１で示される通り）、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ１−６（配列番号４３で示される通り）、Ｄ−Ａｌａ−ｐＢ１−８（配列番号４９で示される通り）である。
【０２１８】
静脈内投与（ｉ．ｖ．）した場合の本発明によるこれらのペプチドの有効性を試験し、動物を、敗血症の明らかな徴候および生存に関して合計７日間毎日、経過観察する。瀕死の動物（＜３０℃の低体温および正常な姿勢が維持できないことと定義）を安楽死させ、致死的感染動物としてスコア化する。７日の終了時に、生存個体を安楽死させ、器官組織（血液、腹膜、肝臓、肺、および脾臓）の定量的微生物学のために検査する。
【０２１９】
ＣＬＰを受けた動物に投与した場合の本発明のペプチドの用量応答関係を調べる。手術の約２時間後に、動物を種々の用量の本発明のペプチドで処置する。０時点で、最適以下用量のモキシフロキサシン（ＬＤ２５）を一部または全部の動物に与えることができる。動物を数日間経過観察し、生存率を決定する。
【０２２０】
ＣＬＰ後のサイトカインおよびケモカイン産生に対するペプチドの潜在的効果をさらに検討する。
【０２２１】
Ｂａｌｂ／ｃマウスにＣＬＰを施し、抗生物質を添加せずに、術後約２時間で本発明によるペプチドで処置する。マウス（処置動物および対照非処置動物、ならびに付加的対照とする偽手術動物）を術後１２時間および２４時間で安楽死させ、心臓穿刺によりヘパリン処理シリンジに採血する。次に、遠心分離により血漿を得、分析まで−７０℃で保存する。洗浄によりマウスから腹腔液を得、遠心分離により明澄化し、分析まで−７０℃で保存する。ペプチド処置動物の血液（血漿）および局部感染部位（腹腔液）の両方において、Ｔｈ１サイトカインの代表として、ＴＮＦ−αのレベルを測定し、炎症誘発応答に関連するケモカインの代表として、ＲＡＮＴＥＳおよびＫＣのレベルを測定する。
【０２２２】
ＣＬＰ後の腹膜および血液中のさらなるサイトカイン／ケモカインのレベルも評価する。これらには、ＣＬＰの約１２時間後または約２４時間後に採取した腹腔液および血漿中のＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１０、Ｒａｎｔｅｓ、ＭＣＰ−１およびＫＣが含まれる。
【０２２３】
ＣＬＰを施した動物は、血液および腹腔液中に高い細菌量を示す。細菌は通常、腹腔液から血液に侵入し、主要には、マクロファージ表面に結合した細菌要素を認識する循環多形核細胞(polymorph nuclear cell)（ＰＭＮ）によって、また、二次的には、在住マクロファージ自体によって死滅させられる。細菌は血液から肝臓および脾臓（体循環から細菌を排除するための主要部位である）に移行し、そこでそれらは在住マクロファージによって捕捉される。細菌量に対する本発明のペプチドの潜在的効果を調べるため、これらの組織／臓器における細菌の伝播を測定する。マウスにＣＬＰを施し、群に分け（各群ｎ＝６〜８）、ＣＬＰの約２時間後にペプチドで処置するか、またはＰＢＳを注射して対照として用いるか、または偽手術する。動物には抗生物質を施さない。マウスを手術から約１２後および約２４時間後に安楽死させ、各動物の血液、腹腔液、肝臓  腎臓および脾臓から組織サンプルを得る。細菌のレベルをコロニーの計数により測定し、処置群と対照群の間で比較する。
【０２２４】
ケラチノサイトケモカイン（ＫＣ）は、臓器不全をもたらす敗血症時の全身炎症の発生における重要なプロセスと関連付けられている標的臓器への多形核細胞（ＰＭＮ）の動員および蓄積を担う重要な成分である。よって、ＰＭＮのレベルは、ＣＬＰ後の動物の脾臓、肝臓および腎臓で評価され、好中球の存在の間接的マーカーとして機能する、ＰＭＮ活性に関連する重要な酵素ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の活性により測定される。ＭＰＯ活性は、ＣＬＰ後約１２時間および約２４時間でホモジナイズ組織において測定する。読み取りは１分間隔で１０分間、４６０ｎｍで分光光度的に実施する。
【０２２５】
重要な臓器におけるＰＭＮのレベルの低減に関するさらなる裏づけは、好中球流入の評価のための免疫組織化学染色後に、ＣＬＰ後動物の特定の組織から得られる組織学的素スライドでＰＭＮを直接計数することにより例示される。ＣＬＰ後２４時間にＣＬＰ動物から得られるホルマリン固定パラフィン切片をナフトールＡＳ−Ｄクロロ酢酸エステラーゼ（白血球特異的エステラーゼ）で染色し、Ｇｉｌｌｓヘマトキシリン溶液で対比染色し、カバーガラスをかける。肝臓切片中に存在する好中球（エステラーゼで陽性染色された細胞）の数を４００倍の顕微鏡下で無作為にスクリーニングする（５〜７視野／サンプル）。
【０２２６】
本発明のペプチドによる処置がエフェクター細胞上のＣＤ２８の発現に影響を及ぼすかどうかを判定するために、手術約１２時間後および約２４時間後に末梢血細胞および脾細胞を調べる。
【０２２７】
細胞増殖に対する本発明のペプチドの効果を試験するために、抗ＣＤ３抗体単独または抗ＣＤ３抗体＋抗ＣＤ２８抗体で刺激し７２時間培養した、本ペプチドで処置したまたは処置しなかった偽手術、ＣＬＰマウスから採取した単離脾細胞を用いてｅｘ  ｖｉｖｏ試験を行う。脾細胞増殖指数を決定し、偽手術動物から採取した細胞と比較する。
【０２２８】
腎臓、肝臓および脾臓などの重要な臓器におけるアポトーシスプロセスの増加は、臓器不全に寄与する敗血症の転帰に決定的な病原上の役割を果たす。従って、ＣＬＰを施した動物における腎臓および脾臓アポトーシスに対する本発明のペプチドによる処置の潜在的効果を調べる。アポトーシスは、ＣＬＰ後約２４時間に動物から採取した組織学的スライドで、ＴＵＮＥＬ染色を用いて決定する。スライドを蛍光顕微鏡下でアポトーシスのエビデンスに関して観察する。
【０２２９】
ＣＬＰ後に敗血症により誘発されるアポトーシスの程度をペプチド処置マウスとビヒクル処置マウスの間で比較するために、単離した脾細胞も、初期アポトーシスマーカーであるアネキシンＶと細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、Ｇｒ−１）の組合せを用いて染色し、フローサイトメトリーにより分析する。
【０２３０】
【表３】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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