(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者サンプルを、固相に結合した一次ＴＳＨ受容体タンパク質と接触させて、前記患者サンプル中に存在する可能性がある、ＴＳＨ受容体に対する刺激型自己抗体を前記一次ＴＳＨ受容体タンパク質に結合させ、
得られた免疫複合体を二次ＴＳＨ受容体タンパク質と反応させて、前記患者サンプル中に存在する可能性がある、ＴＳＨ受容体に対する刺激型自己抗体を前記二次ＴＳＨ受容体タンパク質にさらに結合させ、そして
前記自己抗体を含有する免疫複合体を検出するための反応を実行する、
診断分析器で実施可能な、ＴＳＨ受容体に対する刺激型自己抗体の検出方法であって、前記ＴＳＨ受容体タンパク質は、ＴＳＨ受容体に対する中間型及び遮断型自己抗体のための結合エピトープを有さず、
常磁性粒子が前記固相として使用されていること、
前記一次及び前記二次ＴＳＨ受容体タンパク質が、ＴＳＨ受容体に対して刺激型の自己抗体に関する結合性エピトープを含み、前記ＴＳＨ受容体タンパク質が配列番号３又は配列番号４と少なくとも９０％以上同一であり、そして、ＴＳＨ受容体の細胞外空間への分泌に適したタンパク質とＮ末端で融合していること、そのタンパク質が、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）及び分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）から選択されていること、並びに
前記二次ＴＳＨ受容体タンパク質が、形成された前記免疫複合体を検出するためのシグナリングアミノ酸配列又は別のシグナリングマーカーを含む、前記検出方法。
【請求項２】
前記シグナリングマーカーが、分泌型アルカリホスファターゼ、ホタル若しくはガウシアルシフェラーゼ、又はペルオキシダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シグナリングマーカーが、アクリジン若しくはルテニウム化合物、又はフルオレセインイソチオシアネート化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）及び分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）から選択されるタンパク質と融合されたＴＳＨ受容体タンパク質の使用であって、
ＴＳＨ受容体タンパク質はＴＳＨ受容体に対する刺激型自己抗体に関する結合性エピトープを含み、そして配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列の１つと少なくとも９０％同一であり、そして前記ＴＳＨ受容体タンパク質はＴＳＨ受容体に対する刺激型自己抗体の検出用二次モノクローナル又はポリクローナル抗体と使用される、前記ＴＳＨ受容体タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺ホルモン受容体に対する自己抗体又は自己免疫抗体の診断分析器上で実行可能な検出方法、ＴＳＨ受容体の細胞外部分を含むタンパク質から少なくとも部分的に形成されそしてブリッジアッセイにおける常磁性粒子上に固定化されたＴＳＨ受容体キメラの、前記方法におけるさらなるＴＳＨ受容体キメラと共にの使用、並びに修飾されたＴＳＨ受容体キメラに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＳＨ受容体（ＴＳＨ−Ｒ）は甲状腺細胞の機能及び増殖において鍵となる役割を果たす。この受容体はＧタンパク質結合糖タンパク質受容体のサブファミリーの一員であり、またそれは黄体形成ホルモン／絨毛性ゴナドトロピン（ＬＨ／ＣＧＲ）及び卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨＲ）の受容体を含む。このサブファミリーの受容体は大きなＮ末端細胞外ドメインを有し、それは、リガンド結合に関して必須の意義を持ち、そしてシグナル伝達に関与していることが示されている。ＴＳＨＲシグナルの伝達は主にアデニル酸シクラーゼの活性化を介してなされ、その結果、細胞内ｃＡＭＰレベルの増加がもたらされる。
【０００３】
ＴＳＨ受容体の主要な興味の一部は、それが、ＴＳＨ受容体に対する自己抗体の出現を伴う甲状腺自己免疫疾患の主要な自己抗原としての役割を果たしていることに帰す。この様な甲状腺自己免疫疾患は、甲状腺機能亢進症をもたらす自己免疫疾患でありそして最も多発するヒトの自己免疫疾患の一つであるバセドー氏病を含む。バセドー氏病はアデニル酸シクラーゼの活性化及びその結果もたらされるｃＡＭＰの増加により引き起こされる。その結果、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫形成、そして時には目の変化がもたらされる。しかしながら、ＴＳＨ受容体に対する自己抗体は遮断型特性を有し、それによりアデニル酸シクラーゼ及びｃＡＭＰを阻害する。この場合には甲状腺の機能亢進が生じる。刺激型及び遮断型の自己抗体が疾患をもつ患者に同時に生じることもまた可能であり、この場合、原則として刺激型自己抗体の寄与が優勢である。
【０００４】
前記自己免疫抗体の検出のために、これまでかなりの期間、ｃＡＭＰ増加を測定するバイオアッセイが使用されてきた。前記測定方法は非常に時間を要する。更に、このバイオアッセイは、擬陽性の結果を生じる可能性があるので、信頼性に欠ける。前記の記載の範囲において、この型の測定方法は、ＴＳＨ受容体に対する自己抗体のｉｎ‐ｖｉｔｒｏ決定方法から、型を判別するためのバイオアッセイであると説明される。市販の自己抗体のｉｎ‐ｖｉｔｒｏ検出方法では、ブタ甲状腺膜から抽出されたＴＳＨ受容体が用いられている（第一世代ｉｎ−ｖｉｔｒｏ方法）。ＴＳＨ受容体に対する自己抗体の検出用の他の試験では、完全なヒト組換えＴＳＨ受容体タンパク質（野生型）が競合試験で使用されている。
【０００５】
Ｔｈｙｒｏｉｄ，Ｖｏｌ．７（１９９７）８６７−８７７は、ＴＳＨ受容体における刺激型及び遮断型自己抗体のエピトープを記載している。刺激型自己抗体に関する機能性エピトープの大部分は受容体タンパク質のアミノ酸８〜１６８に存在し、そして遮断型自己抗体に関する機能性エピトープの大半は受容体タンパク質のアミノ酸２６１〜３７０の範囲に存在している。活性測定には、前記のバイオアッセイが使用される。
【０００６】
ＷＯ０１／２７６３４Ａ１は、異なる特異性を有する自己抗体の同時的な検出に関する定量的方法を最初に提供しており、それは迅速な再現性及び高精度での実行が可能である。この目的のために、ＴＳＨ受容体キメラが使用され、それは自己抗体が結合する個々の配列が、Ｇタンパク質結合受容体のクラスに由来する他の受容体の相当する配列と置換しているという点で野生型受容体とは異なる。ＴＳＨ受容体キメラは、別の点では、完全なＴＳＨ受容体を含む。しかし、測定コストが高い。遠心による分離は、前記方法を通常的に使用するには余りに面倒である。また、ＴＳＨ受容体キメラが非常に安定であることはないことから、前記試験は氷浴又は４℃で行わなければならない。同様の技術はＷＯ０１／６３２９６Ａ１に教示されており、その中で検出用サンドイッチ技術の使用が提案されている。しかし、ここで提案されている試験材料を用いたのでは、原則として、非特異的結合が非常に高いことが明らかになった。前記の二つの特許出願に記載されている知見に基づく自己抗体検出用試験は、市場では入手できない。
【０００７】
ＷＯ００／００５９０Ａ１には、一般的に診断及び治療に適しているＣ末端がトランケートされたＴＳＨ受容体が記載されている。ＷＯ２００７／０３６５１１Ａ１には、ＴＳＨ受容体に対する自己抗体を検出するためのいわゆるブリッジアッセイが記載されており、これは初めて自動装置で実施することができるものである。このブリッジアッセイを行うためには、ＴＳＨ受容体キメラを２種類使用し、シグナル生成受容体キメラはＴＳＨ受容体の細胞外領域のみを含み、そしていわゆるアンカー受容体キメラはホロ酵素である。２０１４年の春から、この方法は、甲状腺ホルモン受容体に対する自己抗体の自動診断のために世界中で提供され、いわゆるＩｍｍｕｌｉｔｅ（登録商標）分析器で行われる。アンカー受容体は、例えば固相としての直径約６ｍｍのプラスチック粒子上に結合する。
【発明の概要】
【０００８】
ＷＯ２００７／０３６５１１Ａ１の方法を、常磁性粒子を固相として作用する全自動分析装置へ適用することもまた望ましい。ＷＯ２００７／０３６５１１Ａ１のＴＳＨ受容体キメラを用いた試験及びＴＳＨ受容体の細胞外ドメインのみを含む２種類のＴＳＨ受容体を用いた試験のいずれを用いても、常磁性粒子を用いて作用する全自動分析装置において、例えばＡＤＶＩＡ  Ｃｅｎｔａｕｒ分析器又はＡＲＣＨＩＴＥＣＴ分析器において、検出方法を実行することを可能にはできない。
【０００９】
ＷＯ２００７／０３６５１１Ａ１に記載されたブリッジアッセイを実施するための２種類の細胞外ＴＳＨ受容体キメラ（トランケートされたＴＳＨ受容体キメラ）をアンカーとして及びシグナル受容体として使用すると、ＴＳＨ受容体に対する自己抗体を検出するための感度及び特異性が低すぎることが示された。このＴＳＨ受容体キメラの群を用いて実施した測定は、実施例３（比較例）に示すように、再現性がないことが判明した。
【００１０】
しかし、ＷＯ２００７／０３６５１１Ａ１に記載されている方法と全く同じ正確さ及び有効性を有する甲状腺ホルモン受容体に対する自己抗体を検出しそしてさらに常磁性粒子を固相として使用する全自動分析器でも可能である方法を提供することが非常に望ましい。
【００１１】
この問題は、診断分析器で実施可能な、ＴＳＨ受容体に対する刺激型自己抗体の検出方法によって解決され、この方法において、患者サンプルを、固相に結合した一次ＴＳＨ受容体キメラと接触させて、患者サンプル中に存在する可能性がある、ＴＳＨ受容体に対する刺激型自己抗体を一次ＴＳＨ受容体キメラに結合させ、得られた免疫複合体を、二次ＴＳＨ受容体キメラと反応させて、患者サンプル中に存在する可能性がある、ＴＳＨ受容体に対する自己抗体を二次ＴＳＨ受容体キメラにさらに結合させ、そして常磁性粒子が固相として使用されている自己抗体含有免疫複合体を検出するための反応を実行し、ここで、一次及び二次ＴＳＨ受容体キメラが、ＴＳＨ受容体に対して、遮断型又は中間型ではなく刺激型の自己抗体に関する結合性エピトープを含み、そして、ＴＳＨ受容体の細胞外空間への分泌に適したタンパク質とＮ末端で融合しており、そして二次ＴＳＨ受容体キメラが、形成された免疫複合体を検出するためのシグナリングアミノ酸配列又は別のシグナリングマーカーを含む。
【００１２】
本発明のさらなる主題は、ＴＳＨ受容体の細胞外空間への分泌に適したタンパク質とＮ末端で融合したＴＳＨ受容体キメラであり、このＴＳＨ受容体キメラは、ＴＳＨ受容体に対する刺激型自己抗体に関する結合性エピトープを含有するが遮断型及び中間型自己抗体に関する結合性エピトープを有しない。前記のアミノ酸配列の例は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号６と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、そして特に好ましくは少なくとも９５％同一であるものである。
【００１３】
また、本発明のさらなる主題は、ＴＳＨ受容体キメラの使用であり、このＴＳＨ受容体キメラは、ＴＳＨ受容体の細胞外空間への分泌に適したタンパク質とＮ末端で融合しており、そして、ＴＳＨ受容体に対する、遮断型又は中間型のものではなく刺激型自己抗体に関する結合性エピトープを含有する。前記アミノ酸配列の例は、甲状腺ホルモン受容体（ＴＳＨ受容体）に対する自己抗体を検出するためのさらなるＴＳＨ受容体キメラと共に、診断分析器上のブリッジアッセイにおいて常磁性粒子上に固定化されており、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号６と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、そして特に好ましくは少なくとも９５％同一であるものである。
【００１４】
本発明のさらなる主題は、ＴＳＨ受容体に対する自己抗体の定量的決定のための方法における、細胞外空間へのＴＳＨ受容体の分泌に適したタンパク質、例えば、血清タンパク質とＮ末端で融合したＴＳＨ受容体の野生型の細胞外ドメインの使用である。
【００１５】
最後に、本発明の主題は、甲状腺ホルモン受容体（ＴＳＨ受容体）に対する自己抗体を決定するためのブリッジアッセイにおける、アルブミン分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）又は別の分泌タンパク質、例えば血清とＮ末端又はＣ末端で融合した野生型ＴＳＨ受容体の細胞外部分を含む、常磁性粒子上に固定化された融合タンパク質の使用である。
【００１６】
驚くべきことに、ＴＳＨ受容体に対する自己抗体検出用のブリッジアッセイにおいて、２種類のトランケートされたＴＳＨ受容体キメラを使用することが初めて可能になった。したがって、初めて、完全ＴＳＨ受容体又は完全ＴＳＨ受容体キメラから、野生型受容体又は受容体キメラの細胞外ドメインのみが、ブリッジアッセイにおいて、本質的に用いられる。驚くべきことに、受容体の細胞外部分がＴＳＨ受容体の細胞外空間への分泌に適したタンパク質と融合している場合、自己抗体のアンカー受容体としての、常磁性粒子上に固定化されたＴＳＨ受容体の細胞外部分を含むタンパク質である結合された一次ＴＳＨ受容体と、シグナル受容体としての、ＴＳＨ受容体の細胞外部分を含むタンパク質である二次ＴＳＨ受容体キメラとが、ＴＳＨ受容体に対する自己抗体を検出するのに適していることが証明された。本発明により使用されるＴＳＨ受容体キメラは、高い貯蔵安定性、輸送安定性、容器安定性、及び高いアッセイ安定性もまた有する。これらの記載は、ＴＳＨ受容体の細胞外空間への分泌に適したタンパク質とＮ末端で融合した野生型ＴＳＨ受容体の細胞外ドメイン由来の融合タンパク質にも適用される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ＴＳＨ受容体は細胞質から細胞膜を経て細胞外空間に伸びている。受容体タンパク質の細胞外の一部分は、ＴＳＨ及び自己抗体に対する結合部位を有する。
【００１８】
ＴＳＨ受容体タンパク質由来の本発明による受容体キメラは、本質的にＴＳＨ受容体の細胞外部分のみを含む。本質的にとは、ＴＳＨ受容体の膜部分のアミノ酸の４０未満、好ましくは３０又は２０未満、特に好ましくは１０未満及び０に至るまでが存在することを意味する。これは、本発明による方法において使用される、いわゆる一次ＴＳＨ受容体キメラ及び付加的に使用されるいわゆる二次ＴＳＨ受容体キメラにも適用される。これは、野生型のＴＳＨ受容体を有するタンパク質を用いた場合にも適用される。ＴＳＨ受容体キメラは、例えば、ＴＳＨ受容体のＮ末端部分から記載して２１〜４１８のアミノ酸、好ましくはＴＳＨ受容体キメラの細胞外ドメインの２１〜３８０、特に好ましくは２１〜３５０又は３３０を含むことができる。しかし、２１〜２６０のアミノ酸のみを含有するＴＳＨ受容体の細胞外ドメインも、本発明に用いることができる。より少ないアミノ酸の細胞外ドメインが使用される場合、エピトープの結合挙動及びＴＳＨ受容体キメラの安定性が変化する。同様に、野生型のＴＳＨ受容体の細胞外ドメインを有するタンパク質にも適用される。この場合、我々は、野生型とは、刺激型、遮断型、又は中間型の自己抗体に結合するためのアミノ酸配列のいずれもが置換されていない、ＴＳＨ受容体の細胞外ドメインを意味すると理解する。
【００１９】
本発明によるＴＳＨ受容体キメラのアミノ酸数が多すぎると、生産の間における、生成に使用される組換え細胞から細胞外空間へのＴＳＨ受容体キメラの分泌が悪くなる。
【００２０】
一次及び場合により二次ＴＳＨ受容体キメラは、受容体の細胞質部分のアミノ酸配列をさらに含むことができる。これに対する好ましい選択肢は、ＴＳＨ受容体の細胞質部分の６９８〜７２５のアミノ酸又はその部分配列である。また、これは、一次ＴＳＨ受容体キメラを常磁性粒子上に固定化するために有利であることが証明された高度に免疫原性のアミノ酸配列である。
【００２１】
本発明の方法を実施するためには、受容体キメラの細胞外部分又は野生型ＴＳＨ受容体の細胞外ドメインが、受容体キメラの分泌を引き起こすタンパク質と融合することが必須であることが判明した。前記のタンパク質は、例えば、哺乳動物の血清タンパク質である。アルブミンが好ましく使用される。融合は、好ましくはＮ末端で行われる。本発明により使用される一次ＴＳＨ受容体キメラは、特に好ましくは、血清タンパク質を含有する。好ましくは、アルブミンが使用され、これは、ＴＳＨ受容体の細胞外ドメインとの融合後にＴＳＨ受容体キメラを安定化させ、そして受容体キメラが生成される細胞から本発明で使用されるＴＳＨ受容体キメラを分泌させる結果となる。野生型ＴＳＨ受容体の細胞外ドメインと血清タンパク質との融合タンパク質についても同様である。本発明により使用される一次ＴＳＨ受容体キメラはまた、ＴＳＨ受容体キメラの安定化及び細胞からの分泌を確実にするものである限り、血清タンパク質、特にアルブミンタンパク質の一部の配列のみを含むこともできる。この手段により、ＴＳＨ受容体に安定性が付与される。
【００２２】
本発明により使用される二次ＴＳＨ受容体キメラは、本発明により使用される一次ＴＳＨ受容体キメラと本質的に同じ構造を有する。本発明の方法における二次ＴＳＨ受容体キメラがシグナルエミッターの機能を有することから、それは、その点に関して、一次ＴＳＨ受容体キメラ（アンカー受容体）とは異なるものでなければならない。このために、それはマーカーを有する。マーカーは、二次ＴＳＨ受容体キメラにＮ末端又はＣ末端で融合させることができる。好ましくは、マーカーは、二次ＴＳＨ受容体キメラにＣ末端で融合される。本発明の好ましい実施態様によれば、シグナルＴＳＨ受容体キメラは、Ｎ末端分泌型アルカリホスファターゼを有する。分泌型アルカリホスファターゼを、検出反応にも使用することができる。検出が別の反応を介して行われない限り。二次ＴＳＨ受容体キメラのＣ末端部分のさらなる検出用修飾を省略することができる。
【００２３】
したがって、好ましくは、本発明によるＴＳＨ受容体キメラは、細胞質部分が完全に又は部分的に存在せず、そしてＴＳＨ野生型受容体の膜部分が好ましくは完全に存在しないものである。本発明のＴＳＨ受容体キメラの細胞外の一部分を、以下に説明するように修飾することがさらに好ましい。
【００２４】
刺激型自己抗体を検出する場合には、好ましくは、ＴＳＨ受容体に対する遮断型又は中間型自己抗体に結合する配列を置換している受容体キメラが用いられる。
【００２５】
置換のために、好ましくは、特定の２つの他のタイプの自己抗体について本質的に結合を示さない別の受容体の相当する配列が使用される。前記の相当する配列は、例えば、ラットのＬＧ−ＣＧ受容体の配列であることができる。結果として、本発明に従って使用されるＴＳＨ受容体キメラにおいて、刺激型、中間型及び／又は遮断型自己抗体が結合するエピトープを置換することができる。これらの受容体キメラは、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｕｎ．（１９９１），１７９：７０−７７又はＷＯ０１／２７６３４Ａ２に従い構築することができる。ＴＳＨ受容体キメラの作製に関する両文献を参照のこと。
【００２６】
刺激型自己抗体の検出の場合、ＴＳＨ受容体タンパク質中の遮断型抗体及び中間型抗体に関する結合配列は、それぞれの他の型の自己抗体の結合を引き起こさない別の受容体の配列に置換される。刺激型自己抗体を検出するために使用されるキメラにおいて、ＴＳＨ受容体のアミノ酸２６１〜３７０は、好ましくは、ラットＬＨ−ＣＧＲの相当するアミノ酸２６１〜３２９によって置換されることができる。
【００２７】
本発明によるＴＳＨ受容体キメラとＴＳＨ受容体タンパク質の野生型の細胞外ドメインを有する相当する融合タンパク質とに特に有利であるのは、それらが細胞由来のＴＳＨ受容体キメラの分泌のためのアミノ酸配列と融合していることであり、従って、組換え細胞におけるそれらの産生の間、それらは細胞外空間に分泌される。ＴＳＨ受容体キメラを得るための細胞の崩壊はもはや必要ではない。このように、本発明により使用されるべきＴＳＨ受容体キメラは、本質的に、タンパク質を得るための細胞崩壊の場合に生じる細胞成分の汚染なく、高純度で得ることができる。
【００２８】
本発明により使用される二次ＴＳＨ受容体キメラ又は野生型ＴＳＨ受容体（シグナル受容体）の細胞外ドメインを有する相当する融合タンパク質を、検出のために修飾することができ、例えば、所望のアッセイ設計に応じて、それをマーカーと融合させることができる。標識は、検出可能なシグナルを直接的又は間接的に提供するような性質を有することができる。本発明の意味における直接標識は、免疫複合体の検出のために検出可能なシグナルを直接提供するマーカーを用いたＴＳＨ受容体キメラの標識である。本発明の意味における間接標識は、例えば、ＴＳＨ受容体キメラと検出に適した二次標識抗体によって認識される免疫原性ペプチド配列との融合であることができる。
【００２９】
マーカーを、融合又は化学結合によって、ＴＳＨ受容体キメラ、又は野生型ＴＳＨ受容体の細胞外ドメインを有する相当する融合タンパク質、又は二次抗体と結合させることができる。適切な標識は、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ホタル若しくはガウシアルシフェラーゼ及びペルオキシダーゼなどの酵素、又はアクリジン色素、蛍光若しくはバイオ／化学発光物質などの色素を介してもたらされる。前記酵素の場合、それらをコードするヌクレオチド配列を、好ましくは、二次ＴＳＨ受容体キメラ（シグナル受容体）のヌクレオチド配列と融合する。適切な標識は、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ビオチン化及びストレプトアビジンを用いてさらにもたらされる。好ましい実施態様では、二次ＴＳＨ受容体キメラは、検出のために分泌型アルカリホスファターゼとＮ末端で融合することができる。
【００３０】
さらに好ましい実施態様では、二次ＴＳＨ受容体キメラは、アクリジン染料を用いてＣ末端で直接標識されている。
【００３１】
本発明による方法において、いわゆる一次ＴＳＨ受容体キメラ、又は野生型ＴＳＨ受容体の細胞外ドメインを有する相当する融合タンパク質は、免疫複合体形成中に常磁性固相に結合される。ＴＳＨ受容体キメラのこの固相への結合は、例えば、ＴＳＨ受容体キメラのＣ末端エピトープに対する固定化抗体を介してもたらすことができる。前記の抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であることができる。例えば、固定化抗体は、一次ＴＳＨ受容体キメラの細胞質部分のアミノ酸６９８−７２５に対するものであることができる。
【００３２】
二次抗体をまた、ＴＳＨ受容体キメラに対する自己抗体の結合を検出するために使用することができる。二次抗体を、固定化抗体に加えて存在させることができる。それは、モノクローナル又はポリクローナル抗体であることができる。
【００３３】
適切な固相は常磁性粒子、例えば、常磁性チューブ、常磁性プレートレット、及び常磁性粒子を含むが、常磁性粒子の他の形態も含む。このような常磁性粒子は当業者に公知であり、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｌ  ＡＳの商標名Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）として市販されている。本発明により固相として使用される常磁性粒子は、例えば０．５μｍ〜５μｍの直径を有することができる。粒子は、常磁性又は超常磁性であることができる。
【００３４】
本発明のＴＳＨ受容体キメラは、凍結乾燥して保存することができる。それらは、モノクローナル又はポリクローナル抗体を介して固相に結合した凍結乾燥形態で保存することができる。検出反応のために、凍結乾燥成分の再構成は、アッセイ緩衝液に溶解することによって行われる。
【００３５】
本発明によるＴＳＨ受容体キメラ、又は野生型ＴＳＨ受容体の細胞外ドメインを有する相当する融合タンパク質（以下、野生型変異体と称する）は、溶解形態（アッセイ及びリザーバ安定性）において高い安定性を有する。４℃では、それらは６〜７日間安定したままであり、そして診断分析器のキャリブレーション後にさらに２〜３週間使用することができる。３７℃の温度で、本発明による溶解されたＴＳＨ受容体キメラは、６時間の間安定したままである。これらの条件は、成分が４℃で保存されている診断分析器において本発明による検出方法の実行のために適している一方で、試験反応は３７℃でも問題なく進行することができ、したがって特にＡｄｖｉａ  Ｃｅｎｔａｕｒ分析器もまた適している。これとは対照的に、ホロ−ＴＳＨ受容体キメラは、４℃で６日まで、２４℃で４８時間まで、そして３７℃で３時間のみ安定したままである。
【００３６】
本発明の方法を実施するためには、いずれの場合にも、患者サンプルを、一次固定化ＴＳＨ受容体キメラ（アンカー受容体）、及び二次ＴＳＨ受容体キメラ（シグナル受容体）又はその野生型変異体で処理し、そして関連する自己抗体について試験する。
【００３７】
本発明による方法の実施態様の例を、図面を参照して以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
図１及び２は、本発明の方法の生成物として常磁性粒子上に固定された免疫複合体を図式的に示す。
【００３９】
図３、特に３．１及び３．２は、本発明による方法において使用可能な一次ＴＳＨ受容体キメラ（アンカー受容体）を図式的に示す。これは、ヒトアルブミン及びｈＴＳＨＲアンカーエピトープの配列と融合したラットＬＨ／ＣＧ受容体による部分配列置換を有する部分配列ｈＴＳＨＲのコンストラクトである。切断部位が記載されている。アミノ酸の番号は、ホロ受容体のそれぞれのアミノ酸又は塩基に関する。
【００４０】
比較例の結果を図４に示す。結果を比較例において説明する。
【００４１】
図５は、振盪なしでの３７℃及び４℃のインキュベーションにおけるアンカー抗体を用いた常磁性粒子上に固定されたアンカー受容体のアッセイ安定性を示す。３時間及び３．７５時間後のそれぞれにおいて、アンカー受容体の約８０％又はそれ以上がまだ損なわれていない。
【００４２】
図６は、６６．５ＩＵ／Ｌによる患者血清の希釈系列の直線性を示す。測定を本発明による方法によって行った。相対光単位ＲＬＵをｙ軸上に設定し、自己抗体の濃度を、ｘ軸上の１リットルあたりの国際単位として測定した。
【００４３】
図７は、ＥＰ１９２９３１１Ｂ１のｓＴＲＡＢ−ＤＥＲＡブリッジアッセイを用いてキャリブレーションした標準シリーズの測定値を示す。キャリブレーションは、マイクロタイタープレート試験における値を用いて行った。この結果は、本発明によるブリッジアッセイにより、高い直線性もまた達成されることを示している。
【００４４】
図８は、本発明による方法の機能的感度を証明するために役立つ。ここでの機能的感度は、アッセイ間変動の２０％の限界に相当する。１１４の血清及び１７の血清プール（多重決定、ｎ＝３〜７）の決定に基づいて、暫定的機能的感度は約１．９ＭＢ（マグネットビーズ）＿Ｕ／Ｌである。手作業により増加したアッセイの変動を考慮に入れると、機能的感度は、代わりに、アッセイ間変動の限界を３０％として評価することができる。この場合、その値は約１．７ＭＢ＿Ｕ／Ｌである。したがって、本発明による方法は非常に良好な感度を有する。
【００４５】
図９は、磁気ビーズアッセイ（ＭＢ値）及びｓＴＲＡｂ値（１１４の血清及び１７の血清プールからの４６３の個々の結果）を用いた結果間の良好な相関を示す。
【００４６】
配列番号１は、ＴＳＨ受容体キメラの細胞外部分、及び非翻訳配列を含むヒト血清アルブミンとＮ末端で融合したＴＳＨ受容体キメラの細胞質アミノ酸配列を有するアンカー受容体のヌクレオチド配列を示す。
【００４７】
配列番号２は、配列番号１のアミノ酸配列を示す。配列番号１及び２（一次ＴＳＨ受容体キメラ又はアンカー受容体）において、ヌクレオチド１〜６１８（アミノ酸１〜２０６）は、ＨＳＡペプチド配列を表し、ヌクレオチド６１９〜１５５３（アミノ酸２０７〜５１６）は、キメラのアミノ酸２１〜３３０のＴＳＨＲ配列を表し、ヌクレオチド１３４５〜１５５３（アミノ酸４４６〜５１６）は、キメラのアミノ酸２６１〜３３０のＬＨＲ配列を表し、そしてヌクレオチド１５５４〜１６３７（アミノ酸５１６〜５４３）は、（ＴＳＨ受容体のヌクレオチド７４３〜７６３によってコードされる）ＴＳＨ受容体の細胞質部分由来の高度に免疫原性のエピトープを表す。
【００４８】
配列番号３は、ＴＳＨ受容体の細胞外部分の一部配列を示す。配列番号５において、アミノ酸１〜２４０は、ＴＳＨ受容体の細胞外部分のアミノ酸２１〜２６０を表す（ＥＣＤ２６０）。
【００４９】
配列番号４は、ＴＳＨ受容体キメラの細胞外部分のさらなる部分配列を示す。配列番号４において、アミノ酸１〜３１０は、ＴＳＨ受容体の細胞外部分のアミノ酸２１〜３３０を表し、ここで、アミノ酸２４１〜３１０は、ラットＬＨ−ＣＧＲの相当するアミノ酸２６１〜３３０で置換されている（ＥＣＤ３３０）。
【００５０】
配列番号５は、野生型ＴＳＨ受容体の細胞外部分由来の融合タンパク質、及び非翻訳配列を含むヒト血清アルブミンとＮ末端で融合した細胞質のアミノ酸配列のヌクレオチド配列を示す。
【００５１】
配列番号６は、野生型ＴＳＨ受容体の細胞外部分由来の融合タンパク質のアミノ酸配列、及び非翻訳配列を含むヒト血清アルブミンとＮ末端で融合した細胞質のアミノ酸配列を示す。
【００５２】
以下、マイクロタイタープレートのマトリックスとしての常磁性マイクロビーズ上の刺激型ＴＳＨ−Ｒ自己抗体の直接決定のための本発明によるインビトロアッセイの実装が記載される。
【００５３】
図３に示すように、融合タンパク質を生産するための遺伝子工学により、固相としての常磁性マイクロビーズ上のアンカー受容体としてコンストラクトを生成し、これは中央にアミノ酸（ＡＡ）２１〜３３０によるＴＳＨＲ  ＥＣＤ（細胞外ドメイン）を含有する。これは、ＡＡ２６１〜３３０を相当するＬＨ／ＣＧ−Ｒ配列によって置換して結果的に遮断型抗体もまた測定されないキメラとして存在する。Ｃ末端では、ＡＡ６９８〜７２５の細胞質ＴＳＨＲ配列が融合しており、これにモノクローナル抗体を結合させ常磁性マイクロビーズ上に固定する。Ｎ末端では、ヒト血清アルブミン（ＡＡ１−２０６）の部分配列が融合される。このＨＳＡ−ＥＣＤ３３０−キメラは、培地中の培養細胞から融合タンパク質全体を放出するための分泌タンパク質として働く。その結果、自己抗体結合のためのアンカー受容体の製造がより容易になる。この分泌された受容体キメラは、細胞からの抽出後に細胞成分による汚染によって汚染された完全な野生型キメラとは、高い純度である点で異なる。分泌の利点と同様に、この融合タンパク質は、常磁性マイクロビーズ上にカップリングすると、緩衝液中及び緩衝液と患者血清の混合物中での安定性が著しく高いことが初めて示されることができる。驚くべきことに、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、常磁性マイクロビーズと抗体を介して結合したＴＳＨＲコンストラクトとからなるカップリング生成物が４℃で数日間溶解した状態で分析装置上で安定（機能性）を維持することから、特に重要である。これらは、固相として常磁性マイクロビーズを使用するアッセイのための必要な前提条件である。これらの溶解条件下では、抽出物として存在する完全なキメラ野生型受容体は非常に迅速にその機能を失い、したがって溶液中における常磁性マイクロビーズに結合した分析装置には適していない。驚いたことに、ＨＳＡは、融合構築物ＨＳＡ−ＥＣＤ３３０−キメラの安定性に関与している。
【００５４】
第二アッセイ工程では、患者の血清を緩衝液中で、記載のカップリング生成物ＨＳＡ−ＥＣＤ３３０−キメラを用いてインキュベートする。次いで、常磁性マイクロビーズを磁石上に結合させ、その結果、測定の感度に影響を及ぼす因子が洗浄によって除去される。
【００５５】
第三アッセイ工程では、組み換え技術により作製された融合タンパク質として存在する検出受容体を反応容器に加える。それは、アミノ酸２６１〜２６６がまた相当するＬＨ／ＣＧ配列によって置換されているキメラとして、中心にＥＣＤを含む。検出受容体は、ＳＥＡＰ（ＡＡ１〜５２０）とＮ末端で融合されている。形成された反応複合体は、図１及び図２に模式的に示すように現れる。液体（試料、試薬、洗浄緩衝液）を反応容器から除去するとき、磁石は常に活性化される。定量化は、ＳＥＡＰ活性化を介した化学発光によって行うことができ、あるいは、検出受容体をアクリジニウムエステルで標識することができる。
【００５６】
本発明の一実施態様によれば、刺激型自己抗体に結合するためのＴＳＨ受容体として、ＴＳＨ受容体キメラの代わりに、野生型受容体の細胞外ドメインを有するＴＳＨ受容体タンパク質をＴＳＨ受容体として用いる測定を行い、刺激型自己抗体の決定を行うこともできる。刺激型自己抗体のＴＳＨ受容体キメラによる測定で決定された値は、それによって決定された測定値から差し引くことができる。このようにして、非刺激型自己抗体、例えば、遮断型及び中間型自己抗体もまた捕捉される。これは、甲状腺自己免疫疾患の臨床診断にとって重要であることができる。
【００５７】
治療を必要とする重度の甲状腺機能低下症を明らかに有している患者由来の遮断型自己抗体を有する血清の分析に本発明による方法を用いる場合、これらは本発明による方法では検出できない。これはまた、本発明による方法の特異性を指摘する。
【００５８】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。
【００５９】
≪実施例１（ＴＳＨ受容体キメラの取得）≫
材料
ＴＳＨ受容体キメラをクローニングするために、Ｄ．Ｌ．Ｓｅｇａｌｏｆｆ博士（アイオワ大学、米国）のプラスミドｐｃＤＮＡ３−ｒＬＨＲ（Ｂ９）を用いた。
【００６０】
部分配列をラットＬＨ−ＣＧＲの相当する配列に置換したＴＳＨ受容体キメラを、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ（１９９１）１７９：７０−７７の記載に従い構築した。この場合、ＴＳＨＲアミノ酸２６１〜３７０を、相当するラットＬＨ−ＣＧＲのアミノ酸２６１〜３２９で置換した。
【００６１】
本発明のＴＳＨ受容体キメラ及びその野生型変異体を、通常の試薬を用いた通常のクローニング法により製造した。
【００６２】
細胞抽出物としての融合タンパク質ＨＳＡ２−ＴＳＨＲ  ＥＣＤ−Ｂ−３３０−ｍＡｂ１又はＴＳＨＲ／ＬＨ−ＣＧＲ−ＳＥＡＰの取得及び発現
コンフルエントで安定したＣＨＯ−Ｋ１及びＨＥＫ２９３細胞をそれぞれプレート中で増殖させる。上清（約８ｍｇ／ｍＬ総タンパク質）を集め、−７０℃に保った。このようにして得られた上清を、それぞれＨＳＡ２−ＴＳＨＲ  ＥＣＤ−Ｂ−３３０−ｍＡｂ１、ＴＳＨＲ−ＳＥＡＰ又はＴＳＨＲ／ＬＨ−ＣＧＲ−ＳＥＡＰとして決定方法に使用することができる。
【００６３】
分泌された細胞外融合ＴＳＨＲキメラの獲得
融合ＴＳＨ−Ｒキメラのトランケートされた細胞外ドメインは、それらを発現する細胞から培養上清中に分泌される。分泌された受容体タンパク質は、アッセイ緩衝液中で規定された希釈の形態で実験に直接使用される。例えば、培養上清５ｍＬ由来の細胞外ＳＥＡＰ−ＴＳＨ−ＲキメラＢ  １０μＬを、１回の測定につき１：１０の最終希釈で使用する。
【００６４】
常磁性粒子へのアンカー抗体のカップリング
トシル化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｌ  ＡＳ）１０ｍｇ（３３０μＬ）を回収し、毎回０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）１ｍｌで２回洗浄し、次いで３０μＬのホウ酸緩衝液に再懸濁する。このために、以下の手順を各々の洗浄工程で使用する：磁石を活性化し、そして溶液を常磁性粒子から除去する。次に磁石を失活させ、そして常磁性粒子に０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）を１ｍL加え、そして数秒間よく振り混ぜる。これに続いて、磁石の活性化及び常磁性粒子からの洗浄溶液の除去が行われる。抗体４．３μｇ（０．４３μｇ抗体／ｍｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））の添加を行う。このために、抗ＴＳＨＲクローン３Ｄ７を回収し、そしてホウ酸緩衝液で３０μＬに希釈する。さらに、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）で処理した３Ｍアンモニウムサルフェート溶液のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）１００μＬ当たり３０μＬを添加し、完全に混合する。これに続いて、室温で２０時間より長く（一晩）インキュベートし、そしてオーバーヘッドシェーカーで振とうする。次に、上記のように毎回ホウ酸緩衝液１ｍＬで２回洗浄し、そして新たに調製した遮断型緩衝液（ホウ酸緩衝液、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）０．５ｍｌを添加する。分散液を振とうしながら３７℃で２時間インキュベートする。次に、新しく調製した洗浄緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）１ｍＬを用いてＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を上記のように２回洗浄する。次いで、上清を除去し、そしてアンカー抗体と結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を洗浄緩衝液５００ｍｇ中に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁する。
【００６５】
常磁性粒子上への一次ＴＳＨ受容体キメラ（アンカー受容体）のカップリング
緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中においてアンカー抗体とカップリングした２０ｍｇ／ｍＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を含む溶液３０μＬを洗浄緩衝液１ｍＬ（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄し、次に、本発明によるアンカー受容体（ＨＳＡとＮ末端で融合しそしてモノクローナル抗体とＣ末端で融合した細胞外ＴＳＨ受容体キメラ）の培養上清１００μＬを添加した。得られた溶液を振とうしながら室温で１時間インキュベートする。次に、上清を除去し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を洗浄バッファー１ｍＬで２回洗浄し、洗浄バッファー３０μＬに再懸濁し、４℃で保存する。
【００６６】
≪実施例２（本発明による試験の性能）≫
血清又は血漿サンプルは、３時間以内に静脈血から産生される。４℃で７日間又は−２０℃で１〜２年間の保存が可能である。二次抗体（上記参照）を−２０℃に保ち、そして試験に使用する前に室温で解凍する。ＴＳＨ受容体キメラをマイクロタイタープレート上に凍結乾燥して保存し、そして使用前にタンパク質安定化剤を含む緩衝液中で再構成する。
【００６７】
２ｍＬの反応容器で、洗浄緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡ）中においてアンカー受容体と結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）２０ｍｇ／ｍＬを含む溶液３０μＬを５０μＬに希釈する。患者サンプルから５０μＬの血清又は血漿を添加した後、反応容器を激しく振とうしながら３７℃で１０分間インキュベートする。次の数回の洗浄工程は、先に記載したように毎回１ｍＬの洗浄緩衝液を用いて磁石の活性化／不活性化と共に行う。洗浄緩衝液で１：５に希釈した本発明のシグナル受容体溶液（分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）とＮ末端で融合させた細胞外ＴＳＨ受容体キメラ）１００μＬを添加した後、３７℃で１０〜２０分激しく振とうさせた。次に、先に記載したように、洗浄緩衝液１ｍＬを用いて数回の洗浄工程を実施した。この後、未希釈の１，２−ジオキセタン含有基質溶液（ＡＰ−ｘ（ＡＢ）ｆｒｏｍ  ｐ・ｊ・ｋ．ＧｍｂＨ、クラインブリッタースドルフ、ドイツ）１００μＬを添加し、反応容器を光から保護して室温で３０分間振とうさせた。生物／化学発光をチューブルミノメーターで計測する。このために、磁石が活性化され、溶液が常磁性粒子から除去され、そして測定チューブに移される。測定管はチューブ照度計に置かれ、チューブ照度計の指示に従って行われる生物／化学発光の測定が行われる。
【００６８】
ｓＴＲＡｂ−ＤＥＲＡ較正標準シリーズの挙動
標準シリーズを作成するために、標準化された濃度の自己抗体を用いたＷＨＯ９０／６７２標準溶液を使用した。標準の出発溶液は１００ＩＵ／Ｌを含み、これを標準曲線を生成するために希釈した。ヌル値として、ＴＸＢＷ緩衝液中の自己抗体を有さないボランティアからの血清を使用した。
【００６９】
刺激型自己抗体に結合するために使用されるＴＳＨ受容体キメラを、抗体を介してＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）上に固定し、凍結乾燥して貯蔵し、使用前にタンパク質安定化剤を含有する緩衝液中で再構成する。トリトンＸ−１００洗浄緩衝液（ＴＸＷＢ）は、０．１％ＴＸ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する。血清希釈緩衝液は、ＴＸＷＢ中に５％のグルコース及び５％の粉乳を含む。
【００７０】
１ウェルあたり５０μＬのサンプル溶液（標準及びヌルサンプルの希釈液）を希釈緩衝液で１：２に希釈し、そしてマイクロタイタープレート上で室温（約２２℃）で９０分間インキュベートする。それらを毎回３００μＬのＴＸＷＢで４回洗浄する。これに続いて、酵素ＳＥＡＰと融合させた細胞外ＴＳＨ受容体キメラの直径１０ｃｍの培養皿からの培養上清５ｍＬの１：１００希釈物１０μＬをＴＸＷＢ  ９０μＬに添加する。これを３７℃で３０分間振とう（３００〜４００ｒｐｍ）しながらインキュベートする。次いで、これを３００μＬのＴＸＷＢで４回洗浄する。生物／化学発光は、Ｔｒｏｐｉｘ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州、米国からのＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）用試薬）を使用して、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＧｍｂＨ（バート・ヴィルトバート、シュヴァルツヴァルト、ドイツ国）のＣｅｎｔｒｏｌ（登録商標）ＩＡ  ＬＢ  ２９６マイクロタイタープレート測定装置で測定する。
【００７１】
検出限界は約０．２ＩＵ／Ｌである。相対光単位（ＲＬＵ＝Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ）と、少なくとも４０ＩＵ／Ｌまで及ぶ刺激型自己抗体の範囲の標準濃度との間に多項式関数が存在する。
【００７２】
≪実施例３（比較例）≫
この実施例では、一方では、トランケートされた２つのＴＳＨ受容体キメラと、他方では純粋なホロ受容体キメラが、ＥＰ１９２９３１１Ｂ１によるシグナル受容体としてのアンカー受容体及びトランケートされた受容体キメラ（ＥＣＤ）として使用された。アンカー受容体キメラをマイクロタイタープレートのプラスチック壁に固定化した。
【００７３】
アンカー抗体（１０．７５ｍＭクエン酸；６９ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；５０％グリセロール；ｐＨ７．０）を、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ９６ウェル）上の１０μｇ／ｍＬのカルボネート緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６））中で４℃で一晩インキュベートした。アッセイ緩衝液（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．）；１００ｍＭ  ＮａＣｌ）で４回洗浄（３００μＬ／ウェル）した後、遊離ＭＴＰ表面のブロッキングを、ブロッキング溶液（５％粉乳；カルボネート緩衝液中５％グルコース）を用いて３７℃で１時間行う。これに続いて、アッセイ緩衝液中でアンカー受容体を用いた固相のコーティングを振とう（３００ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間行う。ホロ受容体キメラを、５００μｇ／ｍＬ（受容体キメラに応じて最大２０００μｇ／ｍＬ）の総タンパク質濃度で使用される細胞抽出物（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）；Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤）として使用する。クローン依存的に規定された上清の生産後に、分泌されたＥＣＤ受容体キメラを、細胞培養上清（ＲＰＭＩ１６４０；１０％ＦＣＳ；１％ペニシリン／ストレプトマイシン［１０，０００Ｕ、１０，０００μｇ／ｍＬ］として、アッセイ緩衝液中で１０〜１００％の濃度で使用する。これに続いて、アッセイ緩衝液で４回洗浄（３００μＬ／ウェル）する。必要に応じて、ＭＴＰの凍結乾燥が可能である。このために、アンカー受容体インキュベーション後の洗浄は、アッセイ緩衝液を用いて２回のみ、次いで凍結乾燥緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）；０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；５％粉ミルク；３％Ｋａｒｉｏｎ）を用いて２回行われる。最後の洗浄工程は、延長されたＭＴＰインキュベーション時間（５〜１０分）で行われる。ＭＴＰは直ちに窒素気相（−１８０℃〜−１３０℃）でショック凍結し（最小インキュベーション３０分）、次に凍結乾燥する（０．０１１ｍｂａｒ／−６０℃、ＭＴＰの数に応じて４〜２４時間）。
【００７４】
（必要に応じて、アッセイ緩衝液中における乾燥ＭＴＰの５〜１０分間の再構成後に）患者血清を、振とう（３００ｒｐｍ）しながらアッセイバッファーで１：２に希釈して９０分間２０〜２４℃でインキュベートする。非結合物質を除去するために、これらをアッセイ緩衝液で４回洗浄する。検出受容体のインキュベーションは、振盪（３００ｒｐｍ）しながら３０分間、分泌型ＥＣＤ受容体キメラを用いて３７℃で、ホロ受容体キメラを用いて２０〜２４℃でアッセイ緩衝液中で行う。使用した濃度は、クローン依存的に規定された上清の生産後に、ホロ受容体キメラの細胞抽出物及びクローンに依存して分泌されたＥＣＤ受容体キメラ１０〜１００％を有する全タンパク質１０００μｇ／ｍＬ（受容体キメラに依存して最大３０００μｇ／ｍＬ）である。これに続いて毎回ウェルあたり３００μＬのアッセイ緩衝液で４回洗浄する。基質（１．０エタノールアミン中１３５μＭ  ＣＤＰ−Ｓｔａｒ又は代替的にＡＰ基質１：１．５〜３（ｐＨ９．８）；０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．０００１％キシレンシアノール）を添加して、振とう（３００ｒｐｍ）しながら２０〜２４℃で３０分間インキュベーションして検出を行い、その後マイクロタイタープレートルミノメーターで定量する。
【００７５】
検出受容体キメラの安定性測定は、様々な時間のプレインキュベーションにより行われ、その後ブリッジアッセイの使用が続き、この検出受容体キメラは、その適用が基礎とされる、すなわち固相上での疑似親和性クロマトグラフィーに結合するブリッジアッセイをする目的で扱われる。
【００７６】
比較の測定結果は、マイクロタイタープレート実験である。結果を図５に示す。マイクロタイタープレートにアンカー受容体キメラ（ホロ受容体キメラ又はＥＣＤ受容体キメラ（比較））が結合した抗体を４℃でコーティングした。患者の血清とのインキュベーションは室温で行った。
【００７７】
最後に、図４で得られた測定値曲線は２つの較正曲線であり、この中で、縦軸にプロットされた商Ｂ／Ｂ０（結合／非結合）を使用して結果において非特異的結合を排除した。標準化されたサンプルの自己抗体単位は、横軸に示されている。
【００７８】
太字で示した曲線は、固相（ホロ受容体キメラ）に結合した一次ＴＳＨ受容体キメラと、第二のトランケートされたＴＳＨ受容体キメラ（ＥＣＤ受容体キメラ）を有する実施態様を示し、これは、シグナル受容体としてのホロ受容体の細胞外部分のみを含有している。通常表示された曲線の場合、固相上に結合された一次ＴＳＨ受容体キメラ（ホロ受容体キメラ）の代わりに、トランケートされた受容体キメラ（ＥＣＤ受容体キメラ）がアンカー受容体キメラとして同様に使用される。
【００７９】
２つの曲線の経過の比較は、ホロ及びトランケートされた受容体キメラに対する自己抗体の結合挙動における著しい差異を示す。２つのＥＣＤ受容体キメラ（アンカー及びシグナル受容体がＥＣＤ受容体キメラである）の試料の測定値の曲線は、「ギザギザ」であり、再現性がなく、必要な感度及び特異性をもたらさない。特に、広い濃度範囲には適していない。したがって、アンカー受容体及びさらなるホロ受容体キメラとしてのホロ受容体キメラの使用は、マイクロタイタープレート実験又は自動装置の測定には適していない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006654580.tif 000008
【図８】
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【図９】
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【配列表】
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