(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物を含む組成物でコーティングされた植物又は植物部分。
【請求項２】
花、種子、根、果実、塊茎、球根、根茎、シュート、芽、葉、苗及び移植体からなる群から選択される、請求項１に記載の植物又は植物部分。
【請求項３】
前記細菌芽胞がバチルス・アグリ、バチルス・アイザワイ、バチルス・アルボラクチス、バチルス・アルティチュジニス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブタノリボランス、バチルス・セレウス、バチルス・コアグランス、バチルス・エンドパラシチカス、バチルス・エンドリスモス、バチルス・フィルムス、バチルス・クルスターキ、バチルス・ラクチコラ、バチルス・ラクチモルバス、バチルス・ラクチス、バチルス・ラテロスポラス、バチルス・レンチモルブス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・メデューサ、バチルス・メチエンス、バチルス・モジャベンシス、バチルス・ミコイデス、バチルス・ナットー、バチルス・ニグリフィカンス、バチルス・ポピリエ、バチルス・プミルス、バチルス・シアメンシス、バチルス・シンプレックス、バチルス・スファエリクス、バチルス属の種、バチルス・サブチリス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ウニファゲラツス、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ及びストレプトミセス属の一種からなる群から選択される、請求項１に記載の植物又は植物部分。
【請求項４】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−フェニルアラニン及びそれらの類似体からなる群から選択される、請求項１に記載の植物又は植物部分。
【請求項５】
前記細菌芽胞がＢ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム及びＢ．プミルスからなる群から選択され、前記Ｌ−アミノ酸がＬ−アラニン、Ｌ−バリン及びＬ−アスパラギンからなる群から選択される、請求項１に記載の植物又は植物部分。
【請求項６】
植物又は植物部分における収量関連形質を向上させる方法であって、該植物又は植物部分を、乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物を含む組成物で処理することを含み、前記植物又は植物部分の収量関連形質が前記組成物でコーティングされていない対応する植物又は植物部分の収量関連形質と比べて向上する、方法。
【請求項７】
前記植物又は植物部分が種子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記植物又は植物部分が花、種子、根、果実、塊茎、球根、根茎、シュート、芽、葉、苗及び移植体からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記植物又は植物部分を発芽後に又は土壌から出現した後に前記組成物で処理することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記植物又は植物部分を発芽前に又は土壌から出現する前に前記組成物で処理することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌芽胞がバチルス・アグリ、バチルス・アイザワイ、バチルス・アルボラクチス、バチルス・アルティチュジニス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブタノリボランス、バチルス・セレウス、バチルス・コアグランス、バチルス・エンドパラシチカス、バチルス・エンドリスモス、バチルス・フィルムス、バチルス・クルスターキ、バチルス・ラクチコラ、バチルス・ラクチモルバス、バチルス・ラクチス、バチルス・ラテロスポラス、バチルス・レンチモルブス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・メデューサ、バチルス・メチエンス、バチルス・モジャベンシス、バチルス・ミコイデス、バチルス・ナットー、バチルス・ニグリフィカンス、バチルス・ポピリエ、バチルス・プミルス、バチルス・シアメンシス、バチルス・シンプレックス、バチルス・スファエリクス、バチルス属の種、バチルス・サブチリス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ウニファゲラツス、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ及びストレプトミセス種からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−フェニルアラニン及びそれらの類似体からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌芽胞がＢ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム及びＢ．プミルスからなる群から選択され、前記Ｌ−アミノ酸がＬ−アラニン、Ｌ−バリン及びＬ−アスパラギンからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
廃水を処理する方法であって、乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物を含む組成物を廃水に添加することを含む、方法。
【請求項１５】
環境修復の方法であって、乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物を含む組成物を土壌又は水に適用することを含む、方法。
【請求項１６】
水産養殖システム内の水を処理する方法であって、乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物を含む組成物と水産養殖システム内の水とを接触させることを含む、方法。
【請求項１７】
水産養殖システム内の動物に給餌する方法であって、乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物を含む組成物を含む動物飼料を該水産養殖システム内の該動物に投与することを含む、方法。
【請求項１８】
乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物と許容可能な担体とを含む組成物を含むプロバイオティクス。
【請求項１９】
前記許容可能な担体が動物飼料、牛乳、ヨーグルト、チーズ、発酵乳、穀物、発酵穀物、ジュース、アイスクリーム、又は乳児若しくは小児用の配合物からなる群から選択される、請求項１８に記載のプロバイオティクス。
【請求項２０】
プロバイオティクスを作製する方法であって、乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物を含む組成物と許容可能な担体とを混合することを含む、方法。
【請求項２１】
動物に給餌する方法であって、乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物を含む組成物を動物に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物と許容可能な担体とを含む組成物を含む直接給与生菌。
【請求項２３】
直接給与生菌を作製する方法であって、乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物を含む組成物と許容可能な担体とを混合することを含む、方法。
【請求項２４】
乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物と許容可能な担体とを含む組成物を含むクリーニング製品。
【請求項２５】
クリーニング製品を作製する方法であって、乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物を含む組成物と許容可能な担体とを混合することを含む、方法。
【請求項２６】
廃棄物からメタンを製造する方法であって、乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物を含む組成物を廃棄物に適用することを含む、方法。
【請求項２７】
動物排泄物、床敷又は敷料を処理する方法であって、乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物を含む組成物を動物排泄物、床敷又は敷料に適用することを含む、方法。
【請求項２８】
サイレージを作製する方法であって、乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物を含む組成物をサイレージに適用することを含む、方法。
【請求項２９】
微生物石油増進回収（ＭＥＯＲ）の方法であって、乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物を含む組成物を油井に適用することを含む、方法。
【請求項３０】
疾患を治療又は予防するための組成物であって、乾燥した密接混合物における細菌芽胞及びＬ−アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又吸収され、該乾燥した密接混合物における該細菌芽胞が該Ｌ−アミノ酸と乾燥していない細菌芽胞よりもより迅速に発芽するように、一緒に乾燥される、該細菌芽胞と該Ｌ−アミノ酸との該乾燥した密接混合物を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１４年８月６日付で出願された米国仮出願第６２／０３３，８２５号、２０１５年８月６日付で出願された米国特許出願第１４／８１９，５７７号、２０１５年８月６日付で出願された米国特許出願第１４／８１９，５８３号（それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は概して、農業、環境修復、堆肥化、メタン製造、クリーニング用品、石油回収及び直接給与生菌等の産業的使用のための細菌芽胞組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
芽胞形成細菌種は農業、環境修復、堆肥化、メタン製造、石油回収及びクリーニング用品への使用を含む広範な産業的用途を有する。用いられる特定の細菌種に応じて、細菌を含む組成物は特に農業、園芸、環境、プロバイオティクス、水産、産業及び公衆衛生への使用に好適であり得る。幾つかの芽胞形成細菌種が多くの産業にわたって有用性を有する。例えば、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis：枯草菌）及びバチルス・プミルス（Bacillus pumilus）が農業用殺真菌剤として、また廃水処理、クリーニング製品及び直接給与生菌に使用される。
【０００４】
農業的用途に関して、植物の健康を向上させるための芽胞形成細菌の使用が当該技術分野で既知である。例えば非特許文献１は、植物成長促進細菌バチルス・サブチリスＧＢ０３が植物による鉄獲得及び光合成能力を増大することを教示している。非特許文献２は、この同じバチルス・サブチリス株によって産生される揮発性物質が植物成長及び種子数を増大したことを教示している。非特許文献３は、バチルス・サブチリスＧＢ０３を接種した土壌中で成長させたシロツメクサ植物が芽高、根長、植物バイオマス、葉面積及びクロロフィル含量に関して非接種対照よりも顕著に大きかったと報告している。播種した又は植え付けた後に種子の発芽、植物成長の刺激、又は種子及び生じる植物の生物学的保護を支持する環境の向上が確立され得るように、かかる細菌の芽胞を種子又は他の植物繁殖材料にコーティングすることもできる。例えば、マメ科植物における窒素固定を可能にするリゾビウム属及びブラディリゾビウム属のような共生細菌を用いて、根粒形成を助長するためにマメ科植物に接種することができる。接種は種子をコーティングするか、種子若しくは作物に農場で散布するか、又は接種材料（inoculate）を植付け時に畝間に配置することによって達成することができる。
【０００５】
芽胞形成細菌はバイオレメディエーション等の環境修復方法に使用することもできる。バイオレメディエーションは、化学化合物を無害の又は害が少ない化学化合物へと変換する微生物の使用を伴う。バイオレメディエーション技術は概して、競合する物理的技術よりもコストが低く、より広範な汚染問題及び畑条件の変動に適合させることができる。特許文献１を参照されたい。
【０００６】
汚染された媒体は水、土壌及び産業廃棄物中の有機汚染物質の生分解を促進する細菌で処理することができる。例えば特許文献２は、Ｃｒ（ＶＩ）をＣｒ（ＩＩＩ）へと還元し、固体として沈降する不溶性水酸化物としてＣｒ（ＩＩＩ）を固定化する嫌気性細菌を用いて可溶性Ｃｒ（ＶＩ）を除去する方法を論考している。特許文献２は、連続バイオリアクター内の望ましくない量のＣｒ（ＶＩ）を含有する水性残渣の処理も記載している。特許文献３は、Ｃｒ（ＶＩ）還元細菌を準備する工程と、液体水性残渣と栄養媒体（例えば糖蜜、酢酸、アミノ酸、カザミノ酸、尿素）とを混合する工程と、混合物と嫌気性細菌とを接触させて、Ｃｒ（ＶＩ）からＣｒ（ＩＩＩ）への還元を向上させる工程とを含む、液体水性残渣中のＣｒ（ＶＩ）の濃度を低減する方法を記載している。このプロセスは、六価クロムで汚染された土壌及び／又は地下水のバイオレメディエーションに用いることができる。
【０００７】
かかる細菌の使用と関連する問題点の一つは、かかる利益をもたらすためには細菌は栄養型の状態でなければならないが、適切な保存寿命を有するように栄養型のバチルス種及び他の芽胞形成細菌を配合することが困難であることである。加えて、栄養型のバチルス種は、種子発芽に好適な条件が生じる前に種子又は他の植物繁殖材料が曝される条件のような産業的使用に必要とされる苛酷な条件を生き延びることが可能でない場合もある。これに対して、このような種の芽胞型の配合物は商業的用途及び実用的用途にはるかに適している。例えば、非特許文献４に言及されているように、「細菌芽胞は代謝的に休止状態であり、環境ストレスに対する回復力が高いことから、生きた微生物製品としての使用に特に適している。これらの固有の特性は商業上非常に望ましいものであり、芽胞系製品は保存寿命が長く、流通及び保管の間、生存能力が保持されることを意味する。」
【０００８】
バチルス芽胞の発芽を刺激するのに幾つかの化合物、特に幾つかのＬ−アミノ酸を使用することが文献にて報告されている。例えば、非特許文献５に、水溶液中の芽胞懸濁液へのＬ−アラニンの添加により、多くのバチルス種の発芽が引き起こされることが開示されている。しかしながら、産業的使用において細菌芽胞と発芽性化合物との組合せを使用する際の課題の一つは、芽胞の発芽が必要とされるまで芽胞を発芽性化合物の存在下で不活性形態に維持することである。例えば、細菌芽胞組成物で処理した種子等の植物繁殖材料は植付け前に数ヶ月間の保存期間におかれる場合がある。このため、好ましい条件下で細菌芽胞の迅速な発芽を刺激することができるが、同時に芽胞の発芽が必要とされるまで芽胞の尚早な発芽を防ぐ細菌芽胞配合物が必要である。
【０００９】
加えて、農業的又は産業的使用のための細菌は、細菌芽胞の発芽に好ましくない低土壌ｐＨ、高塩濃度（例えばＮａＣｌ）及び高金属濃度（例えば銅及びアルミニウム）等の様々な環境条件に曝される場合もある。このため、これらの悪条件下で発芽することが可能な細菌芽胞の配合物を開発することが必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／００９０６９７号
【特許文献２】Lupton et al.（米国特許第５，０６２，９５６号）
【特許文献３】Turick et al.（米国特許第５，６８１，７３９号）
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Zhang et al. (2009, Plant J 58: 568-577)
【非特許文献２】Xie et al. (2009, Plant Signaling and Behavior 4(10): 948-953)
【非特許文献３】Han et al. (2014, Frontiers in Plant Science 5(525): 1-8)
【非特許文献４】Cartman et al. (2008, Applied and Environmental Microbiology, Aug., p. 5254-5258)
【非特許文献５】Foerster et al. (1996, Journal of Bacteriology 91(3): 1168-1177)
【発明の概要】
【００１２】
一態様では、本発明は細菌芽胞と発芽性化合物とを含む組成物でコーティングされた植物繁殖材料に関する。或る特定の実施の形態では、上記芽胞及び上記発芽性化合物は、上記組成物が活性化環境に曝されるまで該発芽性化合物が該芽胞の発芽を誘導しないような不活性形態で維持される。上記組成物は、該組成物が活性化環境に曝されるまで上記細菌芽胞及び上記発芽性化合物が相互作用するのを妨げる物質を更に含むことができる。或る特定の実施の形態では、上記物質は界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤、染料、増白剤、乳化剤、流動剤、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、殺菌剤、充填剤、ポリマー、湿潤剤及び凍結防止剤からなる群から選択される。幾つかの実施の形態では、上記組成物は、上記細菌芽胞及び上記発芽性化合物が発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持される該細菌芽胞と該発芽性化合物との密接混合物を含む。
【００１３】
或る特定の実施の形態では、植物繁殖材料は、花、種子、根、果実、塊茎、球根、根茎、シュート、芽、種子、葉、苗及び移植体（transplants）からなる群から選択される。或定の実施の形態では、植物繁殖材料は種子である。植物繁殖材料は発芽後に又は土壌から出現した後に移植することができる。
【００１４】
上述の植物繁殖材料の或る特定の実施の形態では、上記細菌芽胞はバチルス・アグリ（Bacillus agri）、バチルス・アイザワイ（Bacillus aizawai）、バチルス・アルボラクチス（Bacillus albolactis）、バチルス・アルティチュジニス（Bacillus altitudinis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブタノリボランス（Bacillus butanolivorans）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・エンドパラシチカス（Bacillus endoparasiticus）、バチルス・エンドリスモス（Bacillus endorhythmos）、バチルス・フィルムス（Bacillus firmus）、バチルス・クルスターキ（Bacillus kurstaki）、バチルス・ラクチコラ（Bacillus lacticola）、バチルス・ラクチモルバス（Bacillus lactimorbus）、バチルス・ラクチス（Bacillus lactis）、バチルス・ラテロスポラス（Bacillus laterosporus）、バチルス・レンチモルブス（Bacillus lentimorbus）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・メデューサ（Bacillus medusa）、バチルス・メチエンス（Bacillus metiens）、バチルス・モジャベンシス（Bacillus mojavensis）、バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）、バチルス・ナットー（Bacillus natto：納豆菌）、バチルス・ニグリフィカンス（Bacillus nigrificans）、バチルス・ポピリエ（Bacillus popillae）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・シアメンシス（Bacillus siamensis）、バチルス・シンプレックス（Bacillus simplex）、バチルス・スファエリクス（Bacillus sphaericus）、バチルス属の種、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・ウニファゲラツス（Bacillus unifagellatus）、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）、パスツーリア・ペネトランス（Pasteuria penetrans）、パスツーリア・トルネイ（Pasteuria thornei）、パスツーリア・ニシザワエ（Pasteuria nishizawae）及びストレプトミセス属の一種からなる群から選択される。
【００１５】
上述の植物繁殖材料の或る特定の実施の形態では、上記発芽性化合物はＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−フェニルアラニン及びそれらの類似体からなる群から選択される。特定の実施の形態では、上記細菌芽胞はＢ．サブチリス（B. subtilis）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．フィルムス（B. firmus）、Ｂ．リケニホルミス（B. licheniformis）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）及びＢ．プミルス（B. pumilus）からなる群から選択され、上記発芽性化合物はＬ−アラニン、Ｌ−バリン及びＬ−アスパラギンからなる群から選択される。上記組成物は種子コーティングポリマーを更に含むことができる。或る特定の実施の形態では、上記組成物は界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤、染料、増白剤、乳化剤、流動剤、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、殺菌剤、充填剤、ポリマー、湿潤剤及び凍結防止剤からなる群から選択される物質を更に含む。
【００１６】
別の態様では、本発明は植物繁殖材料の成長又は収量を向上させる方法であって、該方法が植物繁殖材料を細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物でコーティングすることを含み、植物繁殖材料の成長又は収量が上記組成物でコーティングされていない対応する植物繁殖材料と比べて向上する、方法に関する。或る特定の実施の形態では、上記芽胞及び上記発芽性化合物は、上記組成物が活性化環境に曝されるまで該発芽性化合物が該芽胞の発芽を誘導しないような不活性形態で維持される。幾つかの実施の形態では、上記組成物は、該組成物が活性化環境に曝されるまで上記細菌芽胞及び上記発芽性化合物が相互作用するのを妨げる物質を更に含む。幾つかの実施の形態では、上記物質は界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤、染料、増白剤、乳化剤、流動剤、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、殺菌剤、充填剤、ポリマー、湿潤剤及び凍結防止剤からなる群から選択される。
【００１７】
上述の方法のいずれかの或る特定の実施の形態では、上記組成物は、上記細菌芽胞及び上記発芽性化合物が発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持される該細菌芽胞と該発芽性化合物との密接混合物を含む。幾つかの実施の形態では、植物繁殖材料は、花、種子、根、果実、塊茎、球根、根茎、シュート、芽、種子、葉、苗及び移植体からなる群から選択される。特定の実施の形態では、植物繁殖材料は種子である。幾つかの実施の形態では、上記方法は植物繁殖材料を発芽後に又は土壌から出現した後に移植することを更に含む。
【００１８】
或る特定の実施の形態では、上記細菌芽胞はバチルス・アグリ、バチルス・アイザワイ、バチルス・アルボラクチス、バチルス・アルティチュジニス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブタノリボランス、バチルス・セレウス、バチルス・コアグランス、バチルス・エンドパラシチカス、バチルス・エンドリスモス、バチルス・フィルムス、バチルス・クルスターキ、バチルス・ラクチコラ、バチルス・ラクチモルバス、バチルス・ラクチス、バチルス・ラテロスポラス、バチルス・レンチモルブス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・メデューサ、バチルス・メチエンス、バチルス・モジャベンシス、バチルス・ミコイデス、バチルス・ナットー、バチルス・ニグリフィカンス、バチルス・ポピリエ、バチルス・プミルス、バチルス・シアメンシス、バチルス・シンプレックス、バチルス・スファエリクス、バチルス属の種、バチルス・サブチリス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ウニファゲラツス、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ及びストレプトミセス種からなる群から選択される。
【００１９】
上述の方法の或る特定の実施の形態では、上記発芽性化合物はＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−フェニルアラニン及びそれらの類似体からなる群から選択される。幾つかの実施の形態では、上記細菌芽胞はＢ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム及びＢ．プミルスからなる群から選択され、上記発芽性化合物はＬ−アラニン、Ｌ−バリン及びＬ−アスパラギンからなる群から選択される。上述の方法に使用される組成物は種子コーティングポリマーを更に含むことができる。特定の実施の形態では、上記組成物は界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤、染料、増白剤、乳化剤、流動剤、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、殺菌剤、充填剤、ポリマー、湿潤剤及び凍結防止剤からなる群の１つ又は複数の成員を含む。
【００２０】
別の態様では、本発明は細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物であって、細菌芽胞及び発芽性化合物が、組成物が活性化環境に曝されるまで発芽性化合物が芽胞の発芽を誘導しないような不活性形態で維持される、組成物に関する。幾つかの実施の形態では、上記組成物は、該組成物が活性化環境に曝されるまで上記細菌芽胞及び上記発芽性化合物が相互作用するのを妨げる物質を更に含む。幾つかの実施の形態では、上記物質は界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤、染料、増白剤、乳化剤、流動剤、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、殺菌剤、充填剤、ポリマー、湿潤剤及び凍結防止剤からなる群から選択される。
【００２１】
上述の組成物の或る特定の実施の形態では、上記細菌芽胞はバチルス・アグリ、バチルス・アイザワイ、バチルス・アルボラクチス、バチルス・アルティチュジニス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブタノリボランス、バチルス・セレウス、バチルス・コアグランス、バチルス・エンドパラシチカス、バチルス・エンドリスモス、バチルス・フィルムス、バチルス・クルスターキ、バチルス・ラクチコラ、バチルス・ラクチモルバス、バチルス・ラクチス、バチルス・ラテロスポラス、バチルス・レンチモルブス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・メデューサ、バチルス・メチエンス、バチルス・モジャベンシス、バチルス・ミコイデス、バチルス・ナットー、バチルス・ニグリフィカンス、バチルス・ポピリエ、バチルス・プミルス、バチルス・シアメンシス、バチルス・シンプレックス、バチルス・スファエリクス、バチルス属の種、バチルス・サブチリス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ウニファゲラツス、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ及びストレプトミセス種からなる群から選択される。
【００２２】
上述の組成物の幾つかの実施の形態では、上記発芽性化合物はＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−フェニルアラニン及びそれらの類似体からなる群から選択される。特定の実施の形態では、上記細菌芽胞はＢ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム及びＢ．プミルスからなる群から選択され、上記発芽性化合物はＬ−アラニン、Ｌ−バリン及びＬ−アスパラギンからなる群から選択される。幾つかの実施の形態では、組成物は乾燥粉末の形態である。幾つかの実施の形態では、組成物は、組成物が活性化環境に曝されるまで細菌芽胞及び発芽性化合物が相互作用するのを妨げる物質を含む。或る特定の実施の形態では、組成物はエマルジョンの形態である。
【００２３】
別の態様では、本発明はａ）細菌芽胞と、ｂ）発芽性化合物とを含む組成物でコーティングされた植物又は植物部分に関する。別の態様では、本発明はａ）細菌芽胞と、ｂ）発芽性化合物とを含む組成物でコーティングされた植物又は植物部分を作製する方法であって、植物又は植物部分を組成物で処理することを含む、方法に関する。或る特定の実施の形態では、上記芽胞及び上記発芽性化合物は、上記組成物が活性化環境に曝されるまで該発芽性化合物が該芽胞の発芽を誘導しないような不活性形態で維持される。或る特定の実施の形態では、上記組成物は、該組成物が活性化環境に曝されるまで上記細菌芽胞及び上記発芽性化合物が相互作用するのを妨げる物質を更に含む。或る特定の実施の形態では、上記物質は界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤、染料、増白剤、乳化剤、流動剤、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、殺菌剤、充填剤、ポリマー、湿潤剤及び凍結防止剤からなる群から選択される。或る特定の実施の形態では、上記組成物は、上記細菌芽胞及び上記発芽性化合物が発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持される該細菌芽胞と該発芽性化合物との密接混合物を含む。
【００２４】
或る特定の実施の形態では、植物又は植物部分は花、種子、根、果実、塊茎、球根、根茎、シュート、芽、種子、葉、苗及び移植体からなる群から選択される。或る特定の実施の形態では、植物又は植物部分は種子である。或る特定の実施の形態では、植物又は植物部分は発芽後に又は土壌から出現した後に上記組成物でコーティングされる。或る特定の実施の形態では、植物又は植物部分は発芽前に又は土壌から出現する前に上記組成物でコーティングされる。或る特定の実施の形態では、植物又は植物部分は植物繁殖材料である。
【００２５】
或る特定の実施の形態では、上記細菌芽胞はバチルス・アグリ、バチルス・アイザワイ、バチルス・アルボラクチス、バチルス・アルティチュジニス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブタノリボランス、バチルス・セレウス、バチルス・コアグランス、バチルス・エンドパラシチカス、バチルス・エンドリスモス、バチルス・フィルムス、バチルス・クルスターキ、バチルス・ラクチコラ、バチルス・ラクチモルバス、バチルス・ラクチス、バチルス・ラテロスポラス、バチルス・レンチモルブス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・メデューサ、バチルス・メチエンス、バチルス・モジャベンシス、バチルス・ミコイデス、バチルス・ナットー、バチルス・ニグリフィカンス、バチルス・ポピリエ、バチルス・プミルス、バチルス・シアメンシス、バチルス・シンプレックス、バチルス・スファエリクス、バチルス属の種、バチルス・サブチリス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ウニファゲラツス、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ及びストレプトミセス属の一種からなる群から選択される。
【００２６】
或る特定の実施の形態では、上記発芽性化合物はフルクトース、グルコース、カリウム、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−フェニルアラニン及びそれらの類似体からなる群から選択される。或る特定の実施の形態では、上記細菌芽胞はＢ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム及びＢ．プミルスからなる群から選択され、上記発芽性化合物はＬ−アラニン、Ｌ−バリン及びＬ−アスパラギンからなる群から選択される。
【００２７】
或る特定の実施の形態では、上記組成物は種子コーティングポリマーを更に含む。或る特定の実施の形態では、上記組成物は界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤、染料、増白剤、乳化剤、流動剤、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、殺菌剤、充填剤、ポリマー、湿潤剤及び凍結防止剤からなる群から選択される物質を更に含む。
【００２８】
別の態様では、本発明は、植物又は植物部分における収量関連形質を向上させる方法であって、該植物又は植物部分を、ａ）細菌芽胞と、ｂ）発芽性化合物とを含む組成物で処理することを含み、上記植物又は植物部分の収量関連形質が上記組成物でコーティングされていない対応する植物又は植物部分の収量関連形質と比べて向上する、方法に関する。或る特定の実施の形態では、上記芽胞及び上記発芽性化合物は、上記組成物が活性化環境に曝されるまで該発芽性化合物が該芽胞の発芽を誘導しないような不活性形態で維持される。或る特定の実施の形態では、上記組成物は、該組成物が活性化環境に曝されるまで上記細菌芽胞及び上記発芽性化合物が相互作用するのを妨げる物質を更に含む。或る特定の実施の形態では、上記物質は界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤、染料、増白剤、乳化剤、流動剤、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、殺菌剤、充填剤、ポリマー、湿潤剤及び凍結防止剤からなる群から選択される。或る特定の実施の形態では、上記組成物は、上記細菌芽胞及び上記発芽性化合物が発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持される該細菌芽胞と該発芽性化合物との密接混合物を含む。
【００２９】
上述の方法の或る特定の実施の形態では、上記植物又は植物部分は植物繁殖材料である。或る特定の実施の形態では、上記植物又は植物部分は種子である。或る特定の実施の形態では、上記植物又は植物部分は花、種子、根、果実、塊茎、球根、根茎、シュート、芽、種子、葉、苗及び移植体からなる群から選択される。或る特定の実施の形態では、上記方法は上記植物又は植物部分を発芽後に又は土壌から出現した後に上記組成物で処理することを含む。或る特定の実施の形態では、上記方法は上記植物又は植物部分を発芽前に又は土壌から出現する前に上記組成物で処理することを含む。
【００３０】
或る特定の実施の形態では、上記細菌芽胞はバチルス・アグリ、バチルス・アイザワイ、バチルス・アルボラクチス、バチルス・アルティチュジニス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブタノリボランス、バチルス・セレウス、バチルス・コアグランス、バチルス・エンドパラシチカス、バチルス・エンドリスモス、バチルス・フィルムス、バチルス・クルスターキ、バチルス・ラクチコラ、バチルス・ラクチモルバス、バチルス・ラクチス、バチルス・ラテロスポラス、バチルス・レンチモルブス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・メデューサ、バチルス・メチエンス、バチルス・モジャベンシス、バチルス・ミコイデス、バチルス・ナットー、バチルス・ニグリフィカンス、バチルス・ポピリエ、バチルス・プミルス、バチルス・シアメンシス、バチルス・シンプレックス、バチルス・スファエリクス、バチルス属の種、バチルス・サブチリス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ウニファゲラツス、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ及びストレプトミセス種からなる群から選択される。
【００３１】
或る特定の実施の形態では、上記発芽性化合物はフルクトース、グルコース、カリウム、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−フェニルアラニン及びそれらの類似体からなる群から選択される。或る特定の実施の形態では、上記細菌芽胞はＢ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム及びＢ．プミルスからなる群から選択され、上記発芽性化合物はＬ−アラニン、Ｌ−バリン及びＬ−アスパラギンからなる群から選択される。或る特定の実施の形態では、上記組成物は種子コーティングポリマーを更に含む。或る特定の実施の形態では、上記組成物は界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤、染料、増白剤、乳化剤、流動剤、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、殺菌剤、充填剤、ポリマー、湿潤剤及び凍結防止剤からなる群の１つ又は複数の成員を更に含む。
【００３２】
別の態様では、本発明は、廃水を処理する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を廃水に添加することを含む、方法に関する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、環境修復の方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を土壌又は水に適用することを含む、方法に関する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、水産養殖システム内の水を処理する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と水産養殖システム内の水とを接触させることを含む、方法に関する。或る特定の実施の形態では、上記水産養殖システムは動物を含む。
【００３５】
別の態様では、本発明は、水産養殖システム内の動物に給餌する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を含む動物飼料を該水産養殖システム内の該動物に投与することを含む、方法に関する。
【００３６】
上述の方法の或る特定の実施の形態では、上記動物は魚類、エビ又は軟体動物からなる群から選択される。或る特定の実施の形態では、上記水産養殖システムはビブリオ種、アエロモナス種及びフラボバクテリウム種からなる群から選択される病原体を含む。或る特定の実施の形態では、上記動物の成長が上記組成物で処理していない水産養殖システム内の動物と比べて増大する。或る特定の実施の形態では、上記組成物は顆粒、ブリケット、ペレット、錠剤又はカプセルの形態である。
【００３７】
別の態様では、本発明は、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と許容可能な担体とを含むプロバイオティクスに関する。或る特定の実施の形態では、上記許容可能な担体は動物飼料、牛乳、ヨーグルト、チーズ、発酵乳、穀物、発酵穀物、ジュース、アイスクリーム、又は乳児若しくは小児用の配合物からなる群から選択される。
【００３８】
別の態様では、本発明は、プロバイオティクスを作製する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と許容可能な担体とを混合することを含む、方法に関する。或る特定の実施の形態では、上記許容可能な担体は動物飼料、牛乳、ヨーグルト、チーズ、発酵乳、穀物、発酵穀物、ジュース、アイスクリーム、又は乳児若しくは小児用の配合物からなる群から選択される。
【００３９】
別の態様では、本発明は、動物に給餌する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を動物に投与することを含む、方法に関する。或る特定の実施の形態では、上記動物は家禽、反芻動物、仔ウシ、ブタ、ウサギ、ウマ、甲殻類、軟体動物、魚類及び愛玩動物からなる群から選択される。
【００４０】
別の態様では、本発明は、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と許容可能な担体とを含む直接給与生菌に関する。或る特定の実施の形態では、上記担体は動物飼料、代用乳、乳清、植物油、スクロース、二酸化ケイ素、ポリソルベート８０、プロピレングリコール、ブチルヒドロキシアニソール、クエン酸、エトキシキン、石灰石、籾殻、酵母培養液、マルトデキストリン、スクロース、デキストロース、乾燥デンプン及びアルミノケイ酸ナトリウムからなる群から選択される。
【００４１】
別の態様では、本発明は、直接給与生菌を作製する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と許容可能な担体とを混合することを含む、方法に関する。或る特定の実施の形態では、上記担体は動物飼料、代用乳、乳清、植物油、スクロース、二酸化ケイ素、ポリソルベート８０、プロピレングリコール、ブチルヒドロキシアニソール、クエン酸、エトキシキン、石灰石、籾殻、酵母培養液、マルトデキストリン、スクロース、デキストロース、乾燥デンプン及びアルミノケイ酸ナトリウムからなる群から選択される。
【００４２】
別の態様では、本発明は、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と許容可能な担体とを含むクリーニング製品に関する。或る特定の実施の形態では、上記許容可能な担体は洗剤、石鹸及び芳香剤からなる群から選択される。
【００４３】
別の態様では、本発明は、クリーニング製品を作製する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と許容可能な担体とを混合することを含む、方法に関する。或る特定の実施の形態では、上記許容可能な担体は洗剤、石鹸及び芳香剤からなる群から選択される。
【００４４】
別の態様では、本発明は、廃棄物からメタンを製造する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を廃棄物に適用することを含む、方法に関する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、動物排泄物、床敷又は敷料を処理する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を動物排泄物、床敷又は敷料に適用することを含む、方法に関する。
【００４６】
別の態様では、本発明は、サイレージを作製する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物をサイレージに適用することを含む、方法に関する。
【００４７】
別の態様では、本発明は、微生物石油増進回収（ＭＥＯＲ）の方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を油井に適用することを含む、方法に関する。或る特定の実施の形態では、上記細菌芽胞はバチルス・サブチリス、バチルス・リケニホルミス及びバチルス・モジャベンシスからなる群から選択される。
【００４８】
別の態様では、本発明は、疾患に罹りやすい又は疾患を患う被験体において疾患を治療又は予防する方法であって、該被験体に細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を有効量投与し、それにより該被験体において上記疾患を治療又は予防することを含む、方法に関する。或る特定の実施の形態では、上記疾患は細菌性疾患、真菌性疾患又はウイルス性疾患である。或る特定の実施の形態では、上記疾患は壊死性腸炎である。或る特定の実施の形態では、上記被験体はニワトリ、シチメンチョウ又はカモである。或る特定の実施の形態では、上記被験体はクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に感染している。或る特定の実施の形態では、上記疾患の治療又は予防が、上記組成物を投与していない被験体と比較して死亡率の低減、病変数の低減及び体重増加の増大の１つ又は複数をもたらす。
【００４９】
上述の方法のいずれかの或る特定の実施の形態では、上記芽胞及び上記発芽性化合物は、上記組成物が活性化環境に曝されるまで該発芽性化合物が該芽胞の発芽を誘導しないような不活性形態で維持される。
【００５０】
上述の方法のいずれかの或る特定の実施の形態では、上記組成物は、該組成物が活性化環境に曝されるまで上記細菌芽胞及び上記発芽性化合物が相互作用するのを妨げる物質を更に含む。上述の方法のいずれかの或る特定の実施の形態では、上記物質は界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤、染料、増白剤、乳化剤、流動剤、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、殺菌剤、充填剤、ポリマー、湿潤剤及び凍結防止剤からなる群から選択される。
【００５１】
上述の方法のいずれかの或る特定の実施の形態では、上記組成物は、上記細菌芽胞及び上記発芽性化合物が発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持される該細菌芽胞と該発芽性化合物との密接混合物を含む。
【００５２】
上述の方法のいずれかの或る特定の実施の形態では、上記細菌芽胞はバチルス・アグリ、バチルス・アイザワイ、バチルス・アルボラクチス、バチルス・アルティチュジニス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブタノリボランス、バチルス・セレウス、バチルス・コアグランス、バチルス・エンドパラシチカス、バチルス・エンドリスモス、バチルス・フィルムス、バチルス・クルスターキ、バチルス・ラクチコラ、バチルス・ラクチモルバス、バチルス・ラクチス、バチルス・ラテロスポラス、バチルス・レンチモルブス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・メデューサ、バチルス・メチエンス、バチルス・モジャベンシス、バチルス・ミコイデス、バチルス・ナットー、バチルス・ニグリフィカンス、バチルス・ポピリエ、バチルス・プミルス、バチルス・シアメンシス、バチルス・シンプレックス、バチルス・スファエリクス、バチルス属の種、バチルス・サブチリス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ウニファゲラツス、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ及びストレプトミセス種からなる群から選択される。
【００５３】
上述の方法のいずれかの或る特定の実施の形態では、上記発芽性化合物はフルクトース、グルコース、カリウム、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−フェニルアラニン及びそれらの類似体からなる群から選択される。
【００５４】
上述の方法のいずれかの或る特定の実施の形態では、上記細菌芽胞はＢ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム及びＢ．プミルスからなる群から選択され、上記発芽性化合物はＬ−アラニン、Ｌ−バリン及びＬ−アスパラギンからなる群から選択される。
【００５５】
上述の方法のいずれかの或る特定の実施の形態では、組成物は乾燥粉末の形態である。
【００５６】
上述の方法のいずれかの或る特定の実施の形態では、組成物はエマルジョンの形態である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
一態様では、本発明の混合物は細菌芽胞と発芽性化合物とで構成されている。用いられる細菌種は芽胞を形成する任意の種とすることができ、通例ヒト又は動物において所望のプロバイオティクス活性を示すものである。しかしながら、農業、環境修復、堆肥化又はメタン生産、クリーニング用品（cleaning supplies）等に有用なものを含む他の産業的用途を有する細菌種も利用することができる。例えば、複数の酵素を合成する能力及び環境適合性のために、バチルス種は多数の商業的用途に用いられる。用いられる特定の細菌種に応じて、細菌の組成物は特に農業、園芸、環境、プロバイオティクス、水産、産業及び公衆衛生への使用に好適であり得る。任意の特定の芽胞／発芽性化合物の密接混合物に用いられる特定の組成物は、かかる混合物が意図する使用によって決まる。
【００５８】
或る特定の実施形態では、本発明は（ａ）細菌芽胞と、（ｂ）発芽性化合物とを含む組成物でコーティングされた植物又は植物部分に関する。細菌芽胞は通例、農薬（例えば殺真菌剤、殺線虫剤又は殺虫剤）として働くか、又は（例えば、窒素等の利用可能な栄養素の量を増大することで）成長のために繁殖材料の周囲の環境を向上させることによって、植物の成長を向上させる種を含む。発芽性化合物は芽胞から栄養型の状態への細菌の迅速な転換を助長し、それにより細菌がより迅速に植物の成長を向上させることを可能にする。
【００５９】
植物部分としては、葉、茎、根、花、蕾、果実、種子、塊茎、球根及び根茎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
或る特定の実施形態では、植物又は植物部分は植物繁殖材料である。本明細書で用いられる場合、「植物繁殖材料」という用語は、植物の増殖に使用することができる種子等の植物の全ての生殖部分、並びに挿し木及び塊茎（例えばジャガイモ）等の栄養繁殖（vegetative）植物材料を含むことを意図したものである。これには、種子、根、果実、塊茎、球根、根茎、シュート、芽、苗及び移植体、すなわち発芽後に又は土壌から出現した後に移植される幼植物が含まれる。これらの移植体は、移植前に浸漬又は注入による完全又は部分処理によって保護することもできる。植物繁殖材料は種子であるのが好ましい。
【００６１】
本発明において特に有用な植物として、限定されないが、アセル種（Acer spp.）、アリウム種（Allium spp.）、アマランサス種（Amaranthus spp.）、アナナス・コモスス（Ananas comosus）、アピウム・グラウェオレーンス（Apium graveolens）、アラキス種（Arachis spp）、アスパラガス・オフィシナリス（Asparagus officinalis）、ベータ・ブルガリス（Beta vulgaris）、ブラシカ種（Brassica spp.）（例えば、ブラシカ・ナプス（Brassica napus）、ブラシカ・ラパ亜種（Brassica rapa ssp.）［キャノーラ、アブラナ（oilseed rape, turnip rape）］）、カメリア・シネンシス（Camellia sinensis）、カンナ・インディカ（Canna indica）、カンナビス・サティバ、カプシクム種（Capsicum spp.）、カスタニア種（Castanea spp.）、チコリウム・エンディヴィア（Cichorium endivia）、シトルラス・ラナタス（Citrullus lanatus）、シトラス種（Citrus spp.）、ココス種（Cocos spp.）、コフィア種（Coffea spp.）、コリアンドラム・サティヴァム（Coriandrum sativum）、コリラス種（Corylus spp.）、クラタエグス種（Crataegus spp.）、ククルビタ種（Cucurbita spp.）、ククミス種（Cucumis spp.）、ダウクス・カロタ（Daucus carota）、ファグス種（Fagus spp.）、フィクス・カリカ（Ficus carica）、フラガリア種（Fragaria spp.）、ギンクゴ・ビロバ（Ginkgo biloba）、グリシン種（Glycine spp.）（例えば、グリシン・マックス（Glycine max）、ソーヤ・ヒスピダ（Soja hispida）、又はソーヤ・マックス（Soja max））、ゴシピウム・ヒルスツム（Gossypium hirsutum）、ヘリアンタス種（Helianthus spp.）（例えば、ヘリアンタス・アンヌス（Helianthus annuus））、ハイビスカス種（Hibiscus spp.）、ホルデウム種（Hordeum spp.）（例えば、ホルデウム・ウルガレ（Hordeum vulgare））、イポメア・バタタス（Ipomoea batatas）、ジュグランス種（Juglans spp.）、ラクツカ・サティバ（Lactuca sativa）、リナム・ウシタチシム（Linum usitatissimum）、リッチ・チネンシス（Litchi chinensis）、ロータス種（Lotus spp.）、ルッファ・アクタングラ（Luffa acutangula）、ルピナス種（Lupinus spp.）、リコペルシコン種（Lycopersicon spp.）（例えば、リコペルシコン・エスクレンタム（Lycopersicon esculenturn）、リコペルシコン・リコペルシカム（Lycopersicon lycopersicum）、リコペルシコン・ピリフォルメ（Lycopersicon pyriforme））、マルス種（Malus spp.）、メディカゴ・サティバ（Medicago sativa）、メンタ種（Mentha spp.）、ミスカンサス・シネンシス（Miscanthus sinensis）、モルス・ニグラ（Morus nigra）、ムサ種（Musa spp.）、ニコチアナ種（Nicotiana spp.）、オレア種（Olea spp.）、オリザ種（Oryza spp.）（例えば、オリザ・サティバ（Oryza sativa）、オリザ・ラチフォリア（Oryza latifolia）、パニカム・ミリアセウム（Panicum miliaceum）、パニカム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、パッシフロラ・エドゥリス（Passiflora edulis）、ペトローズリヌム・クリスプム（Petroselinum crispum）、ファセオルス種（Phaseolus spp.）、ピヌス種（Pinus spp.）、ピスタシア・ヴェラ（Pistacia vera）、ピスム種（Pisum spp.）、ポア種（Poa spp.）、ポプルス種（Populus spp.）、プルヌス種（Prunus spp.）、ピルス・コムニス（Pyrus communis）、ケルクス種（Quercus spp.）、ラファヌス・サティバス（Raphanus sativus）、レウム・ラバルバルム（Rheum rhabarbarum）、リベス種（Ribes spp.）、リシナス・コムニス（Ricinus communis）、ルブス種（Rubus spp.）、サッカルム種（Saccharum spp.）、サリクス種（Salix sp.）、サンブクス種（Sambucus spp.）、セカレ・セレアレ（Secale cereale）、セサマム種（Sesamum spp.）、シナピス種（Sinapis sp.）、ソラナム種（Solanum spp.）（例えば、ソラナム・トゥーベロースム（Solanum tuberosum）、ソラナム・インテグリフォリウム（Solanum integrifolium）又はソラナム・リコペルシコン（Solanum lycopersicum））、ソルガム・バイカラー（Sorghum bicolor）、ソルガム・ハレペンス（Sorghum halepense）、スピナシア種（Spinacia spp.）、タマリンヅス・インディカ（Tamarindus indica）、テオブロマ・カカオ（Theobroma cacao）、トリフォリウム種（Trifolium spp.）、トリチコセケル・リンパウイ（Triticosecale rimpaui）、トリチカム種（Triticum spp.）（例えば、トリチカム・エスチバム（Triticum aestivum）、トリチカム・デュラム（Triticum durum）、トリチカム・ツルギダム（Triticum turgidum）、トリチカム・ハイベルナム（Triticum hybernum）、トリチカム・マチャ（Triticum macha）、トリチカム・サティヴァム（Triticum sativum）又はトリチカム・バルガレ（Triticum vulgare））、バクシニウム種（Vaccinium spp.）、ビキア種（Vicia spp.）、ビグナ種（Vigna spp.）、ビオラ・オドラータ（Viola odorata）、ビチス種（Vitis spp.）及びゼア・マイス（Zea mays）から選択される飼料若しくはマメ科牧草、観賞用植物、食用作物、樹木、又は低木を含む単子葉植物及び双子葉植物が挙げられる。コメ、アブラナ、カノーラ、ダイズ、トウモロコシ（corn）（トウモロコシ（maize））、綿、サトウキビ、アルファルファ、モロコシ、及びコムギが特に好ましい。
【００６２】
本発明の組成物に用いられる細菌には、植物の成長の向上、環境修復、廃水処理、又は水産養殖システムにおける使用等の産業的用途を有する任意の芽胞形成細菌が含まれる。例えば植物成長の向上は、例えば根定着細菌（根圏細菌等）によってもたらされるような窒素利用効率の向上のように付加的な供給源を成長する植物に利用可能にすること、又はアミノ酸、有機酸若しくはホルモン等の植物成長促進物質を与えることによって行われ得る。代替的には、細菌は植物（例えば植物繁殖材料）を植物病原真菌若しくは細菌、及び／又は線形動物門若しくは袋形動物門に属するような土壌介在性動物の悪影響から保護することができる。植物寄生線虫及び寄生微生物に対する保護は、これらの土壌介在性動物にとって有害な及び／又は微生物群にとって有害なキチン分解活性、タンパク分解活性、コラーゲン分解活性又は他の活性によってもたらされ得る。これらの殺線虫特性、殺真菌特性及び殺菌特性を示す細菌としては、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition (2009)（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に挙げられている、ファーミキューテス門の芽胞形成成員及びアクチノバクテリア門の芽胞形成成員を含む種を挙げることができるが、これらに限定されない。例示的な種としては、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alcalophilus）、バチルス・アルティチュジニス（Bacillus altitudinis）、バチルス・アルベイ（Bacillus alvei）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・アネウリノリチクス（Bacillus aneurinolyticus）、バチルス・アンシラシス（Bacillus anthracis）、バチルス・アクエマリス（Bacillus aquaemaris）、バチルス・アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）、バチルス・ボロノフィルス（Bacillus boronophilus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・カルドリイカス（Bacillus caldolyyicus）、バチルス・セントロスポラス（Bacillus centrosporus）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・フィルムス（Bacillus firmus）、バチルス・フラボサーマス（Bacillus flavothermus）、バチルス・フシホルミス（Bacillus fusiformis）、バチルス・グロビジ（Bacillus globigii）、バチルス・インフェルナス（Bacillus infernus）、バチルス・ラルヴェ（Bacillus larvae）、バチルス・ラテロスポラス（Bacillus laterosporus）、バチルス・レンチモルブス（Bacillus lentimorbus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・メセンテリカス（Bacillus mesentericus）、バチルス・モジャベンシス（Bacillus mojavensis）、バチルス・ムシラギノサス（Bacillus mucilaginosus）、バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）、バチルス・ナットー（Bacillus natto）、バチルス・パントテンチカス（Bacillus pantothenticus）、バチルス・ポピリエ（Bacillus popilliae）、バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymyxa）、バチルス・シュードアンシラシス（Bacillus pseudoanthracis：疑似炭疽菌）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・シュリジェリー（Bacillus schlegelii）、バチルス・シンプレックス（Bacillus simplex）、バチルス・スファエリクス（Bacillus sphaericus）、バチルス・スポロサーモデュランス（Bacillus sporothermodurans）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・サーモグルコシダシウス（Bacillus thermoglucosidasius）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・ブルガチス（Bacillus vulgatis）、バチルス・ウェイヘンステファネンシス（Bacillus weihenstephanensis）、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）及びクロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）が挙げられる。好ましい種としては、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・セレウス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウシイ、バチルス・コアグランス、バチルス・フィルムス、バチルス・ラテロスポラス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ポリミキサ、バチルス・プミルス、バチルス・シンプレックス、バチルス・スファエリクス、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・サブチリス、バチルス・チューリンゲンシス、クロストリジウム・ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ及びストレプトミセス種が挙げられる。
【００６３】
特に好ましい細菌種としては、Ｂ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム及びＢ．プミルスが挙げられる。
【００６４】
発芽性化合物は、用いられる特定の芽胞形成細菌種の発芽を引き起こすのに有効である任意の化合物を含むことができる。通例、このような発芽性化合物は、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−フェニルアラニン及びそれらの類似体を含むＬ−アミノ酸である。このような類似体は、当業者であれば基礎となる化学基に又は化学基内で置換を行うことにより作製することができる。そのようなものとして例えば、Ｌ−アラニンの類似体としては、Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ、ａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｎ４２−メチルスルホニル）エチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニンジシクロヘキシルアンモニウム塩（Ｎ−ＭＳＯＣ−Ｌ−Ａｌａ）、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニン（Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−Ａｌａ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン（Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ａｌａ）、Ｎ−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−アラニン（Ｎ−ＤＮＰ−Ｌ−Ａｌａ）、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−アラニン（Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−Ａｌａ）、５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニル−Ｌ−アラニンシクロヘキシルアミン塩（Ｎ−ダンシル−Ｌ−Ａｌａ）、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アラニン（Ｎ−Ｂｚ−Ｌ−Ａｌａ）、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩、Ｌ−アラニンｔ−ブチルエステル塩酸塩、Ｌ−アラニンベンジルエステル塩酸塩、Ｌ−アラニンアミド、Ｌ−アラニンｐ−ニトロアニリド塩酸塩及びＬ−アラニノールが挙げられる。好ましい発芽性化合物としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン及びＬ−アスパラギンが挙げられる。最も好ましくは、かかる発芽性化合物はＬ−アラニンである。
【００６５】
かかるアミノ酸は個々の化合物として、又はタンパク質加水分解物、例えばカゼイン加水分解物等のポリペプチドの形態で用いることができる。有用なポリペプチドは通例、発芽剤（germinants）として機能するアミノ酸を少なくとも５０パーセント、及び阻害剤として機能するアミノ酸を２０％以下含む。かかる百分率はポリペプチドにおけるアミノ酸の数に基づくものである。
【００６６】
或る特定の実施形態では、Ｌ−アミノ酸に加えて更なる発芽性化合物を用いて、細菌芽胞の発芽及び成長応答を最適化することもできる。例えば、或る特定の実施形態では、組成物は少なくとも１つのＬ−アミノ酸と、フルクトース、グルコース及びカリウムイオンからなる群から選択される付加的な発芽性化合物とを含む。
【００６７】
特に好ましいバチルス／発芽性化合物の組合せとしては、Ｌ−アラニン＋バチルス・サブチリス、Ｌ−アラニン＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−アラニン＋バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、Ｌ−アラニン＋バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、Ｌ−アラニン＋バチルス・コアグランス、Ｌ−アラニン＋バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、Ｌ−アラニン＋バチルス・クラウシイ（Bacillus clausii）、Ｌ−アラニン＋クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）、Ｌ−バリン＋バチルス・サブチリス、Ｌ−バリン＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−バリン＋バチルス・プミルス、Ｌ−バリン＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−バリン＋バチルス・コアグランス、Ｌ−バリン＋バチルス・セレウス、Ｌ−バリン＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−バリン＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・サブチリス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・プミルス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・コアグランス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・セレウス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・サブチリス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・プミルス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・コアグランス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・セレウス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・サブチリス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・プミルス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・コアグランス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・セレウス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−アラニン＋イノシン＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−プロリン＋グルコース＋バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、Ｌ−プロリン＋バチルス・メガテリウム、及びＬ−乳酸���＋クロストリジウム・ブチリカムが挙げられる。
【００６８】
発芽性化合物は用いる細菌芽胞が発芽を引き起こすのに十分な量で存在する。この量は任意の特定の細菌芽胞／発芽性化合物の混合物について日常実験により容易に決定することができるが、このような発芽性化合物は通例、乾燥前に０．０００１ｍｇ／ｍＬ〜１７０ｍｇ／ｍＬの濃度で配合される。幾つかの実施形態では、発芽性化合物は、乾燥前に０．０００３ｍｇ／ｍＬ〜１７０ｍｇ／ｍＬ、０．０００３ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬ、０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、又は０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で配合される。好ましい実施形態では、発芽性化合物は乾燥前に０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で配合される。
【００６９】
発芽を更に向上させるために、芽胞にショックを与えることが好ましい。芽胞には多様な標準方法、例えば浸透圧ショック、熱ショック、圧力ショック、栄養素の欠乏、及び／又は或る特定の酸への曝露にてショックを与えることができる。熱ショックは熱ショックタンパク質の生成を誘導するのに十分な温度で十分な期間、芽胞を加熱することを伴うものである。細菌芽胞にショックを与える方法は当該技術分野で既知である。例えば、Atluri et al. (2006, Journal of Bacteriology 188(1): 28-36)には、バチルス・サブチリスに対するそのような熱ショック処理の一つが記載されている。
【００７０】
本発明の組成物は（ａ）細菌芽胞と、（ｂ）発芽性化合物とを含み、かかる芽胞及び発芽性化合物が、かかる組成物が活性化環境に曝されるまで発芽性化合物が芽胞の発芽を誘導しないような不活性形態で維持されることを特徴とする。かかる組成物は本発明のコーティングされた植物又は植物部分（例えば植物繁殖材料）の製造、及び環境修復、廃水処理、疾患の予防若しくは治療、石油回収、又は水産養殖システムにおける使用等の本明細書に記載される他の使用に有用である。
【００７１】
本明細書で用いられる場合、「活性化環境」という用語は、芽胞が栄養型の状態へと誘導されるように発芽性化合物と芽胞とが相互作用することが可能な環境を表す。かかる活性化環境は水の添加（雨、土壌中の水分、又は植付け前のコーティングされた植物繁殖材料に添加される水による）を伴うか、又は温度、湿度、ｐＨ若しくは塩分濃度等の因子の組合せを必要とし得る。
【００７２】
したがって、かかる組成物は芽胞と発芽性化合物との乾燥混合物を含んでいてもよく、又は所要の環境基準に達するまで芽胞及び発芽性化合物が相互作用するのを妨げる他の材料（例えば低温融解ワックス）を含んでいてもよい。芽胞及び発芽性化合物が相互作用するのを防ぐために組成物に使用することができる付加的な材料としては、界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤及び染料、増白剤、乳化剤、流動剤（flow agents）、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、充填剤、ポリマー、湿潤剤、並びに凍結防止剤が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、かかる組成物は芽胞及び発芽性化合物が異なる相中に存在するために相互作用しないエマルジョンの形態を取っていてもよい。
【００７３】
或る特定の実施形態では、芽胞及び発芽性化合物は密接混合物である。
【００７４】
本明細書で用いられる場合、「密接混合物」という用語は芽胞及び発芽性化合物が発芽を促す環境、すなわち活性化環境に達するまで近接位置に維持される混合物を表す。
【００７５】
このような密接混合物は噴霧乾燥、凍結乾燥、空気乾燥又はドラム乾燥等のプロセスを用いて得ることができる。好ましい実施形態では、密接混合物は噴霧乾燥又は凍結乾燥により作製される。このような密接混合物を形成する場合、芽胞及び発芽性化合物は、発芽性化合物により芽胞の発芽が引き起こされる条件下において混合しないことが重要であり、これはこの混合により混合物の保存寿命中に有害作用を伴う未熟な発芽が引き起こされる可能性があるためである。このことは２つのノズル若しくは２つの別々の流れの同時噴霧を可能にする単一ノズルのいずれかを使用することによる噴霧乾燥機における別々の流れを利用することにより、又は発芽を促さない条件（例えば温度）下における凍結乾燥により避けることができる。未熟な発芽は、乾燥の直前に芽胞の塊を、発芽性化合物を含有する溶液に導入することによっても避けることができる。
【００７６】
好ましい実施形態では、発芽性化合物は密接混合物における細菌芽胞に吸着されるか又は細菌芽胞によって吸収される。更なる実施形態では、細菌芽胞及び発芽性化合物は密接混合物全体に亘って微細に分散している。また更なる実施形態では、細菌芽胞及び発芽性化合物は、細菌芽胞から本質的になる個々の粒子と発芽性化合物から本質的になる個々の粒子とを肉眼では視認することができないように密接混合物全体に亘って微視的に分散している。
【００７７】
一実施形態では、密接混合物は乾燥前に溶液中で細菌芽胞と発芽性化合物とを混ぜ合わせることにより調製される。細菌芽胞と発芽性化合物とを乾燥の直前に溶液中で混ぜ合わせるのが好ましい。
【００７８】
何ら理論に束縛されることを望むものではないが、密接混合物の形成により、該混合物が発芽に適切な環境に達したら、より好ましくは発芽性化合物を芽胞の発芽開始部位に結合することができる近接位置に発芽性化合物が置かれると考えられる。このような近接位置のために、発芽性化合物が、存在し得る発芽干渉化合物（Ｄ−アミノ酸等）を競合的に上回る（outcompete）ことが可能となり、結果としてより多くの割合（percentage）の芽胞が発芽することになる。細菌が栄養期に入ると対数増殖することから、このような割合の増大は培養物の形成において幾らかの対数増大を速やかにもたらすことができる。
【００７９】
かかる組成物は共発芽剤、栄養素及び配合助剤を含む付加的な成分を、かかる添加剤が芽胞及び発芽性化合物の尚早な相互作用を誘導しない限りにおいて更に含んでいてもよい。
【００８０】
本発明によりコーティングされる植物又は植物部分（例えば植物繁殖材料）は、接種剤又は植物成長促進微生物若しくは殺虫微生物の存在によって利益を受けることができる任意の植物種であり得る。
【００８１】
植物又は植物部分（例えば植物繁殖材料）は細菌及び発芽性化合物で、植物材料（例えば種子又は他の発芽性材料）をコーティングするために通例用いられる任意の従来の手段によって、かかる手段が芽胞の生存能力に悪影響を及ぼさず、かかる手段が細菌をその栄養型の状態へと尚早に変換させる発芽性化合物を生じない限りにおいてコーティングすることができる。採用され得る従来の手段として、噴霧処理、滴下処理、浸漬処理、塗装処理、フィルムコート処理、ペレットコート処理等が挙げられる。種子を被覆する方法は当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第７，９８９，３９１号、及び米国特許第５，８４９，３２０号に記載される。
【００８２】
或る特定の実施形態では、植物又は植物部分（例えば種子）は、発芽前に又はそれを植え付けた成長媒体（例えば土壌）から出現する前に組成物でコーティングされる。他の実施形態では、植物又は植物部分は発芽後に又はそれを植え付けた成長媒体（例えば土壌）から出現した後に、例えば組成物を畑又は温室において成長する植物に噴霧することによって組成物でコーティングされる。
【００８３】
かかるコーティングを適用する場合、芽胞及び発芽性化合物は、発芽性化合物により芽胞の発芽が引き起こされる条件下において混合しないことが重要であり、これはこの混合により混合物の保存寿命中に有害作用を伴う尚早な発芽が引き起こされる可能性があるためである。これを回避することができる方法の一つは、２つのノズル若しくは２つの別々の流れの同時噴霧を可能にする単一ノズルのいずれかを使用することによる噴霧乾燥機における別々の流れを利用すること、又は発芽を促さない条件（例えば温度）下における凍結乾燥である。
【００８４】
生物学的有効成分に加えて、種子コーティング組成物は、有効成分の処方の一部であるか、又は種子コーティングの取り扱い性若しくは種子に対するその機能性及び耐久性に寄与するいずれかである多くの材料及び添加剤を含んでもよい。コーティング添加剤の例は、種子に有効成分を結合するコーティングポリマーである。種子コーティングポリマーとして、限定されないが、例えばタンパク質、多糖、ポリエステル、ポリウレタン、不飽和モノマーから調製されたポリマー、及びそれらの組合せが挙げられる。
【００８５】
種子コーティングの取り扱い性又は種子に対するその機能性及び耐久性に寄与する他の添加剤として、限定されないが、界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤及び染料、光沢剤、乳化剤、フロー剤、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、殺菌剤、充填剤、ポリマー、湿潤剤及び凍結防止剤が挙げられる。かかる添加剤の特徴及び作用は配合分野の当業者によく知られている。添加剤は、細菌の作用を干渉してはならない。
【００８６】
本発明において有用な結合剤は、天然であっても合成であってもよく、被覆される種子に対して植物毒性を有しない接着性ポリマーを含むことが好ましい。上記結合剤は、ポリ酢酸ビニル；ポリ酢酸ビニルコポリマー；エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）コポリマー；ポリビニルアルコール；ポリビニルアルコールコポリマー；エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含むセルロース；ポリビニルピロリドン；デンプン、修飾デンプン、デキストリン、マルトデキストリン、アルギン酸塩及びキトサンを含む多糖；脂肪；油；ゼラチン及びゼインを含むタンパク質；アラビアガム；シェラック；塩化ビニリデン及び塩化ビニリデンコポリマー；リグノスルホン酸カルシウム；アクリルコポリマー；ポリビニルアクリレート；ポリエチレンオキシド；アクリルアミドポリマー及びコポリマー；ポリヒドロキシエチルアクリレート、メチルアクリルアミドモノマー；並びにポリクロロプレンから選択されてもよい。
【００８７】
コーティング中の結合剤の量は変化してもよいが、種子の重量の約０．０１％〜約２５％、より好ましくは約０．０５％〜約１５％、更に好ましくは約０．１％〜約１０％の範囲である。
【００８８】
繁殖材料のコーティングは、任意に充填剤を含んでもよい。充填剤は、当該技術分野で知られているような吸収剤又は不活性な充填剤であってもよく、木粉、クレイ、活性炭、糖、珪藻土、穀粉、微粒子無機固体、炭酸カルシウム等が挙げられる。使用され得るクレイ及び無機固体として、カルシウムベントナイト、カオリン、陶土、タルク、パーライト、雲母、バーミキュライト、シリカ、石英粉末、モンモリロナイト、及びそれらの混合物が挙げられる。糖は有用な場合があり、デキストラン及びマルトデキストリンが挙げられる。穀粉として小麦粉、オート麦粉及び大麦粉が挙げられる。
【００８９】
種子に適切な微小環境を提供するように充填剤を選択し、例えば、充填剤を有効成分の負荷速度を増すため、また有効成分の制御放出を調整するために使用される。充填剤は種子の生産又は被覆過程を補助し得る。充填剤の量は変化し得るが、一般的に充填剤成分の重量は種子重量の約０．０５％〜約７５％、より好ましくは約０．１％〜約５０％、更に好ましくは約０．５％〜１５％の範囲である。
【００９０】
任意に、コーティング配合物に可塑剤を使用してもよい。可塑剤は、典型的には、コーティング層によって形成されるフィルムをより柔軟にして接着及び延展性を改善し、加工速度を改善するため使用される。改善されたフィルム柔軟性は、保存、作業又は播種の過程の間チッピング、破損、又は剥離を最小化すために重要である。多くの可塑剤が使用され得るが、有用な可塑剤として、ポリエチレングリコール、グリセロール、ブチルベンジルフタレート、安息香酸グリコール、及び関連する化合物が挙げられる。コーティング層における可塑剤の範囲は、約０．１重量％〜約２０重量％の範囲である。
【００９１】
また、処理した種子は、有効成分のコーティングを保護するためフィルムオーバーコートで覆われてもよい。かかるオーバーコートは当該技術分野で知られており、従来の流動床及びドラムフィルムコーティング法を使用して適用されてもよい。
【００９２】
本発明は、植物又は植物部分（例えば植物繁殖材料）の収量関連形質を向上させる方法であって、該方法が植物をａ）細菌芽胞と、ｂ）発芽性化合物とを含む組成物でコーティングすることを含み、植物の収量関連形質が上記組成物でコーティングされていない対応する植物の収量関連形質と比べて向上する、方法にも関する。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「収量関連形質」という用語は植物の収量の増大に寄与し得る任意の形質を表す。本発明の方法によって向上し得る収量関連形質としては、全種子発芽率、種子発芽速度（例えば種子発芽に必要とされる日数）、植物バイオマス、耐病性、耐虫性、耐乾性、耐熱性、耐寒性、耐塩性、重金属耐性、全収量、種子収量、開花期（例えば早期開花）、根成長、早期強勢（early vigor）、植物バイオマス、植物サイズ、全植物乾燥重量、地上部乾燥重量、地上部生体重量、葉面積、茎体積、草高、ロゼット径、葉長、根長、根量、分蘖数及び葉数が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
特定の実施形態では、収量関連形質は全収量、全種子発芽率、種子発芽率、植物バイオマス、耐虫性、早期開花及び耐乾性からなる群から選択される。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「全種子発芽率」という用語は植付け後に発芽する種子の割合を表す。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「バイオマス」という用語は植物の総重量を表す。バイオマスの定義においては、以下のいずれか１つ又は複数を含み得る植物の１つ又は複数の部分のバイオマスを区別することができる：芽バイオマス、種子バイオマス、葉バイオマスを含むが、これらに限定されない地上部；芽バイオマス、種子バイオマス、葉バイオマスを含むが、これらに限定されない地上収穫可能部；根バイオマス、塊茎、球根を含むが、これらに限定されない地下部；根バイオマス、塊茎、球根を含むが、これらに限定されない地下収穫可能部；ビート及び植物の他の胚軸部位、根茎、匍匐茎又は横走根茎を含むが、これらに限定されない部分地下収穫可能部；根バイオマス、芽バイオマスを含むが、これらに限定されない栄養繁殖バイオマス；生殖器官；並びに種子を含むが、これに限定されない栄養繁殖体。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「早期開花」という用語は、対照植物よりも早期に開花し始める植物を表す。このため、この用語はより早期の開花の開始を示す植物を表す。植物の開花期は、播種と最初の花序の出現との間の日数（「開花までの時間」）を計数することによって判断することができる。植物の「開花期」は、例えば国際公開第０７／０９３４４４号（その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載の方法を用いて決定することができる。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「渇水条件」という用語は植物の水分量の欠如、植物の水利用効率の欠如、植物の吸水能の欠如、又は植物への給水の低減をもたらす任意のストレスを表す。具体的には、「渇水」は短期的又は長期的な天候パターンに起因する降水量の不足を表す。渇水条件は当業者により容易に決定される。例えば、土壌水分の尺度であるパルマ−渇水指数（ＰＤＳＩ）、作物水分指数（Crop Moisture Index：ＣＭＩ）及びＺ指数を用いて渇水条件を決定することができる。
【００９９】
収量関連形質は本発明の方法を用いて向上させることができる。例えば幾つかの実施形態では、本明細書に記載される収量関連形質のいずれかを、本発明の組成物を適用した植物（例えば植物繁殖材料）において、本発明の組成物を適用していない対照植物繁殖材料と比べて少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％又は１０００％増大することができる。
【０１００】
例えば幾つかの実施形態では、全種子発芽率を、本発明の組成物を適用した植物繁殖材料（例えば種子）において、本発明の組成物を適用していない対照植物繁殖材料（例えば種子）と比べて少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％増大することができる。これらの値のいずれかを用いて全種子発芽率の増大の範囲を規定することができる。例えば幾つかの実施形態では、種子発芽を５％〜１０％、５％〜２０％又は５％〜５０％増大することができる。別の実施形態では、種子発芽に必要される日数を、本発明の組成物を適用した植物繁殖材料（例えば種子）において、本発明の組成物を適用していない対照植物繁殖材料（例えば種子）と比較して１日減少させることができる。一実施形態では、種子発芽に必要とされる日数を、本発明の組成物を適用した植物繁殖材料（例えば種子）において、本発明の組成物を適用していない対照植物繁殖材料（例えば種子）と比較して０．５日、１日、１．５日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日又は１４日減少させることができる。これらの値のいずれかを用いて種子発芽に必要とされる日数の減少の範囲を規定することができる。例えば、種子発芽に必要とされる日数は１日〜２日、１日〜５日又は２日〜５日減少させることができる。
【０１０１】
別の実施形態では、植物バイオマスを、本発明の組成物を適用した植物（例えば植物繁殖材料）において、本発明の組成物を適用していない対照植物（例えば植物繁殖材料）と比較して少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％向上させることができる。これらの値のいずれかを用いて植物バイオマスの増大の範囲を規定することができる。例えば幾つかの実施形態では、植物バイオマスは５％〜１０％、５％〜２０％又は５％〜５０％増大する。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、耐虫性を、本発明の組成物を適用した植物（例えば植物繁殖材料）において、本発明の組成物を適用していない対照植物（例えば植物繁殖材料）と比較して少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％向上させることができる。例えば幾つかの実施形態では、耐虫性は５％〜１０％、５％〜２０％又は５％〜３０％増大する。
【０１０３】
耐虫性、耐病性及び環境ストレス耐性（例えば耐乾性）は、生物的又は非生物的ストレス条件下で本明細書に記載される収量関連形質のいずれかを測定することによって測定することができる。例えば、耐乾性は渇水条件下での発芽率、発芽速度、植物バイオマス、収量又は種子収量を測定することによって決定することができる。耐虫性、耐病性又は環境ストレス耐性は適切な条件下で収量関連形質を測定することによって定量化することができる。例えば、組成物で処理していない植物繁殖材料と比べて収量の１０％の増大を示した、本発明の組成物で処理した植物（例えば植物繁殖材料）は、耐乾性の１０％の増大を示すと決定される。別の例としては、組成物で処理していない植物（例えば植物繁殖材料）と比較して出葉速度の１０％の増大を示した、本発明の組成物で処理した植物（例えば植物繁殖材料）は、耐虫性の１０％の増大を示すと決定される。出葉速度が増大した植物は昆虫の侵入又は攻撃に対してより抵抗性を示す。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、耐病性又は耐植食性（herbivore tolerance）を、本発明の組成物を適用した植物（例えば植物繁殖材料）において、本発明の組成物を適用していない対照植物（例えば植物繁殖材料）と比べて少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％増大することができる。幾つかの実施形態では、耐乾性を、本発明の組成物を適用した植物（例えば植物繁殖材料）において、本発明の組成物を適用していない対照植物（例えば植物繁殖材料）と比べて少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％増大することができる。これらの値のいずれかを用いて耐病性又は耐植食性の増大の範囲を規定することができる。例えば幾つかの実施形態では、耐病性又は耐植食性の増大は５％〜１０％、５％〜２０％又は５％〜３０％である。
【０１０５】
幾つかの実施形態では、耐熱性又は耐寒性を、本発明の組成物を適用した植物（例えば植物繁殖材料）において、本発明の組成物を適用していない対照植物（例えば植物繁殖材料）と比べて少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％増大することができる。これらの値のいずれかを用いて耐熱性又は耐寒性の増大の範囲を規定することができる。例えば幾つかの実施形態では、耐熱性又は耐寒性の増大は５％〜１０％、５％〜２０％又は５％〜３０％である。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、耐塩性又は重金属耐性を、本発明の組成物を適用した植物（例えば植物繁殖材料）において、本発明の組成物を適用していない対照植物（例えば植物繁殖材料）と比べて少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％増大することができる。耐塩性又は重金属耐性は当該技術分野の標準方法を用いて決定することができる。例えば塩分濃度は、例えばカルシウムからナトリウムへの陽イオンの交換を測定することによって決定することができる。これらの値のいずれかを用いて耐塩性又は重金属耐性の増大の範囲を規定することができる。例えば幾つかの実施形態では、耐塩性又は重金属耐性の増大は５％〜１０％、５％〜２０％又は５％〜３０％であり得る。
【０１０７】
幾つかの実施形態では、全収量を、本発明の組成物を適用した植物（例えば植物繁殖材料）において、本発明の組成物を適用していない対照植物（例えば植物繁殖材料）と比べて少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％増大することができる。これらの値のいずれかを用いて全収量の増大の範囲を規定することができる。例えば幾つかの実施形態では、全収量は１％〜５％、１％〜１０％又は１％〜１５％増大する。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、根成長、早期強勢、植物サイズ、全植物乾燥重量、地上部乾燥重量、地上部生体重量、葉面積、茎体積、草高、ロゼット径、葉長、根長、根量、分蘖数又は葉数を、本発明の組成物を適用した植物（例えば植物繁殖材料）において、本発明の組成物を適用していない対照植物（例えば植物繁殖材料）と比べて少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％増大することができる。これらの値のいずれかを用いて根成長、早期強勢、植物サイズ、全植物乾燥重量、地上部乾燥重量、地上部生体重量、葉面積、茎体積、草高、ロゼット径、葉長、根長、根量、分蘖数又は葉数の増大の範囲を規定することができる。例えば幾つかの実施形態では、根成長、早期強勢、植物サイズ、全植物乾燥重量、地上部乾燥重量、地上部生体重量、葉面積、茎体積、草高、ロゼット径、葉長、根長、根量、分蘖数又は葉数を１％〜５％、５％〜１０％又は５％〜２０％増大することができる。
【０１０９】
概して、「収量関連形質の向上」又は「収量関連形質の増大」は、形質のレベルを判断するために用いられるアッセイの標準誤差を上回る、好ましくは対照サンプル（例えば、本発明の組成物と接触させていない植物繁殖材料のサンプル）における形質のレベル、好ましくは幾つかの対照サンプルにおける形質の平均発現レベルの少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍又は１０倍の試験植物（例えば植物繁殖材料）における形質のレベルを表す。
【０１１０】
本明細書に記載される範囲内に含まれる及び／又は介在する値及び範囲は、同様に本開示の範囲に含まれることが意図される。上限又は下限として本明細書に列挙される値を有する範囲も本開示の範囲に含まれることが意図される。
【０１１１】
本発明は、廃水を処理する方法であって、本明細書に記載される細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を廃水に添加することを含む、方法も提供する。上記組成物は、都市下水、工業廃水、又は農業廃水、ポンプ場、パルプ及び紙の廃水、食品加工廃水、石油化学廃水、及び動物排泄物の廃水を含む任意の廃水の処理に使用され得る。また、上記組成物は、浄化槽、グリーストラップ、及び汚物集合タンクにおける現地での廃水処理に使用されてもよい。幾つかの実施形態では、上記組成物は、レストラン及び業務用厨房により生じた廃水中の脂肪、油、及びグリースの分解に使用されてもよい。また、上記組成物は、ボート、ポータブルトイレ及び他の小型の汚物収集装置において廃棄物を分解するため、小規模の汚物収集タンクに添加されてもよい。
【０１１２】
また、本発明の廃水処理方法は、様々な反応器システムにおいて行われてもよい。例えば、廃水処理が典型的にはタンク内で行われるのに対し、反応は、上記組成物中の細菌の成長及び生物学的活性を支持するのに適した環境を維持するため好適な条件が提供される限り、廃水の保存に使用される任意の容器又は貯水槽において行われてもよい。好適な廃水処理反応器システムとして、限定されないが、懸濁成長バイオリアクター及び付着成長バイオリアクターが挙げられる。懸濁成長バイオリアクターでは、上記組成物は液体の撹拌によって廃水と混合されてもよい。付着成長バイオリアクターでは、様々な固体支持媒体が提供され、上記組成物中の細菌がその表面に付着することを可能とする。好適な媒体として、限定されないが、散水濾床、回転生物接触装置、充填床反応器、及びその他当該技術分野で既知のものが挙げられる。本明細書における使用に適した更に別の付着成長バイオリアクターは、流動床及び移動床の反応器である。このシステムでは、細菌を含むバイオキャリアは処理されている廃水中に懸濁されたままであり、その水の混合と関連する抗力によって流動化される。上記細菌は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の粒子、又はアルギン酸カルシウム等の他のポリマーゲルの粒子等の高分子多孔質材料中に捕捉され得る。上記細菌は付着して、Ｋ１、Ｋ３、ＭｉｎｉＣｈｉｐ、及びＢｉｏｆｉｌｍＣｈｉｐプラスチックキャリア（スウェーデンのAnoxKaldnes）等の懸濁された担体中でバイオフィルムを形成し得る。流動床反応器は、微生物集団が急速に増加することを可能とし、それによって廃水処理に要する時間を減少する。細菌株を使用する廃水処理の方法は当該技術分野で知られており、例えば、米国特許出願公開第２０１２／００００８４９号、及び同第２０１１／０１８０４７６号に記載される。
【０１１３】
或る特定の実施形態では、廃水処理に使用される組成物はバチルス・メガテリウム、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・サブチリス及びバチルス・プミルスからなる群から選択される細菌芽胞を含む。
【０１１４】
また、本発明は、細菌芽胞と発芽性化合物とを含む上述の細菌単離株のいずれかを土壌又は水に適用することを含む、環境修復方法を提供する。バチルス種を水及び土壌の両方の環境修復に使用してもよい。土壌修復の作用様式は、廃水処理について上記に記載されるものとほぼ同じである。上記細菌は、汚染物質を更に分解するか、又はより反応性のない形態にそれを結合する酵素及び酸の発生を介して化学物質及び汚染物質を分解する。
【０１１５】
本明細書に記載される組成物は、ハロゲン化有機化合物（例えばトリクロロエテン、テトラクロロエテン、フレオン）、並びにヒ素系農薬、シアン化物、クロム（ＶＩ）、ウラン（ＶＩ）及び他の有毒金属の酸化型等の無機汚染物質を含む広範な汚染物質で汚染された環境媒体及び廃棄物のバイオレメディエーション及び生物媒介化学的還元に使用することができる。組成物は、これらの汚染物質のバイオアベイラビリティ及び生物地球化学的反応性を増大するプロセスを促進することによって、他の疎水性の、ひいては厄介な有機塩素農薬、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）及び多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）等の有機汚染物質の処理に使用することもできる。組成物によって向上し得るバイオレメディエーションプロセスとしては、細菌によって無害な鉱物形態及び／又は毒性の低い副生成物へと変換されるハロゲン化溶媒、有機塩素農薬及び塩素化炭化水素等の有機汚染物質の生分解及び生物媒介化学的還元が挙げられる。加えて、組成物はヒ素系農薬、シアン化物、クロム（ＶＩ）、ウラン（ＶＩ）及び他の有毒金属の酸化型等の無機汚染物質の生物媒介化学的還元を促進することができる。
【０１１６】
或る特定の実施形態では、組成物は顆粒、ブリケット、ペレット、錠剤又はカプセルの形態で作製することができる。組成物は、汚染された廃棄物（例えば汚泥、固体及び／又は液体廃棄物等）又は土壌、堆積物若しくは水域等の他の汚染された媒体に適用し、任意に混合してもよい。汚染された地下水及び含水媒体の処理を伴う用途については、組成物（例えば顆粒）は汚染区域に設置された井戸内のフィルターソックス、キャニスター又はカートリッジに適用することができる。
【０１１７】
別の態様では、本発明は、廃棄物からのメタン製造の方法であって、本明細書に記載される細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を廃棄物に適用することを含む、方法に関する。或る特定の実施形態では、廃棄物は都市廃棄物処理場からのものである。細菌による廃棄物の分解は、エネルギー源として捕捉されるメタンを産生する他の細菌の共同活動を活発にすることができる。
【０１１８】
メタンはスラリー又は汚泥、例えば廃水処理、浄水で生じる汚泥の処理又は粒状の生分解性有機廃棄物の処理による汚泥の形態の有機物を含む廃棄物から製造することができる。或る特定の実施形態では、廃棄物は廃水処理のバイオソリッドである。メタンを製造する方法は、熱加水分解を用いた液体及び残留固体画分の両方の複合有機材料の処理を伴う場合がある。次いで、細菌による嫌気性消化を用いてメタンを製造することができる。廃棄物からのメタンの製造は当該技術分野で、例えば米国特許第８，４７０，５６７号、米国特許第７，３１１，８３４号、米国特許第７，１０１，４８２号、米国特許第６，９６６，９８９号及び米国特許第７，３３２，０９５号に記載されている。
【０１１９】
本発明は、水産養殖システム内の水を処理する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む上述の組成物のいずれかと水産養殖システム内の水とを接触させることを含む、方法も提供する。組成物は水に直接添加するか、又は例えば米国特許第７，０８２，８９３号に記載されるような生物濾過システムに使用することができる。組成物はエビ、魚類又は軟体動物（例えば二枚貝）等の食品用に養殖される水生動物種によって生じる排泄物を浄化し（remediate）、分解するために水産養殖システムにおいて使用することができる。特定の実施形態では、水産養殖システムは孵化場である。組成物は水産養殖において栄養素を循環させ、脂質、タンパク質、デンプンを分解し、アミノ酸及び酵素を生じさせ、飼料効率を向上させるために利用することもできる。組成物は、環境及び動物の胃腸管において天然抗生物質を生成し、病原体を防御する競争的排除をもたらすために使用することもできる。特定の実施形態では、水産養殖システム内の病原体はビブリオ種、例えば、ビブリオ・チャガシイ（Vibrio chagasii）又はビブリオ・コラリイリティカス（Vibrio coralliilyticus）である。或る特定の実施形態では、水産養殖システム内の病原体は下記表１Ａに挙げられる病原体の一つである。この天然抗生物質の生成及び病原体に対する競争的排除は、ヒト用プロバイオティクス又は生産動物及びコンパニオンアニマル用の直接給与生菌に利用することもできる。
【０１２０】
或る特定の実施形態では、組成物は組成物を水に懸濁させた後、懸濁液を毎日の水交換後に即座にタンクに添加することによって水産養殖システムに添加される。或る特定の実施形態では、組成物は水産養殖システム内の水１ｍｌ当たり１×１０３ｃｆｕ、１×１０４ｃｆｕ、１×１０５ｃｆｕ、１×１０６ｃｆｕ、１×１０７ｃｆｕ、１×１０８ｃｆｕ又は１×１０９ｃｆｕの細菌という割合で水産養殖システムに添加される。これらの値のいずれかを用いて水産養殖システム内の組成物の細菌濃度の範囲を規定することができる。例えば、細菌の濃度は水１ｍｌ当たり１×１０５ｃｆｕ〜１×１０６ｃｆｕ又は１×１０４ｃｆｕ〜１×１０６ｃｆｕであり得る。
【０１２１】
病原体に感染している水産養殖システム内の水を本明細書に記載される組成物で処理することで、水産養殖システム内の動物の生存率を、組成物で処理していない感染水産養殖システム内の動物と比べて増大することができる。幾つかの実施形態では、水産養殖システム内の水の処理は、動物の生存率を、組成物で処理していない感染水産養殖システム内の動物と比べて少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％又は５００％増大することができる。特定の実施形態では、生存率は少なくとも４００％増大する。
【０１２２】
本発明は、水産養殖システム内の動物に給餌する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む上述の組成物のいずれかを含む動物飼料を水産養殖システム内の動物に投与することを含む、方法にも関する。或る特定の実施形態では、動物は魚類、エビ又は軟体動物からなる群から選択される。或る特定の実施形態では、水産養殖システム内の動物の成長（例えば体重）は、組成物を含まない動物飼料が投与された対照動物と比べて増大する。或る特定の実施形態では、動物は下記表１Ａに提示される病原体の少なくとも１つに感染している。
【０１２３】
例えば幾つかの実施形態では、体重を、本発明の組成物を含む動物飼料を投与した動物において、本発明の組成物を含む動物飼料を投与していない対照動物と比べて少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％増大することができる。これらの値のいずれかを用いて体重の増大の範囲を規定することができる。例えば幾つかの実施形態では、体重を５％〜１０％、５％〜２０％又は５％〜５０％増大することができる。
【０１２４】
上述の方法のいずれかの或る特定の実施の形態では、細菌芽胞はバチルス・リケニホルミス、バチルス・サブチリス及びバチルス・プミルス（Bacillus pumilus）からなる群から選択される。
【０１２５】
本発明は、ヒト食用の食品又は動物飼料に使用される細菌芽胞と発芽性化合物との混合物も提供する。或る特定の実施形態では、ヒト食用の食品はプロバイオティクスである。或る特定の実施形態では、動物飼料は直接給与生菌である。本明細書で使用される場合、「プロバイオティクス」という用語は生存微生物、すなわち細菌芽胞等の繁殖することが可能な微生物を含有するヒト食用の食料製品を表す。本明細書で使用される場合、「直接給与生菌」という用語は生存微生物、すなわち細菌芽胞等の繁殖することが可能な微生物を含有する動物食用の飼料（すなわち動物飼料）を表す。例えば、米国特許第８，４２０，０７４号を参照されたい。プロバイオティクス又は直接給与生菌は、本明細書に記載される細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物のいずれかを含み得る。ヒト及び動物の両方のプロバイオティクスとして幾つかのバチルス株を含む芽胞形成細菌の使用が近年普及してきている。国際公開第２０１０／０７０００５号において言及されているように、バチルス・サブチリス及びバチルス・リケニホルミス等の種が、動物飼料からの栄養素の消化及び利用能を増大させることにより成長を促進させるための動物飼料における栄養補助食品として使用されている。バチルス・コアグランスはタンパク質、ラクトース及びフルクトースの消化を助ける、市販の食用プロバイオティクス製品における有効成分である。
【０１２６】
或る特定の実施形態では、食品又は動物飼料はバチルス・プミルス、バチルス・レンタス、バチルス・サブチリス、バチルス・リケニホルミス及びバチルス・コアグランスからなる群から選択される細菌芽胞を含む。
【０１２７】
細菌を含む直接給与生菌の有益な効果としては、病原体の競争的排除、より効率的な変換のための細菌酵素及び酸による飼料の分解、免疫系の刺激、並びに細菌による抗生物質及びバクテリオシンの産生が挙げられる。細菌芽胞及び芽胞の発芽後の栄養型の状態の細菌は、アンモニア臭の低減及びより容易な取扱いのための肥料の分解によって動物の環境も改善する。
【０１２８】
許容可能な担体を直接給与生菌に添加してもよい。許容可能な担体は液体担体、固体担体、水溶性担体又は任意の他の好適な担体であり得る。好ましい液体担体は代用乳である。代用乳は通例、水と混合して乳に似た組成物を形成する粉末状の人工乳（milk substitutes）である。別の好ましい液体担体は水である。乾燥担体としては、動物飼料、乳清、石灰石（炭酸カルシウム）、籾殻、酵母培養液、乾燥デンプン及びアルミノケイ酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。或る特定の実施形態では、水溶性担体は乳清、マルトデキストリン、スクロース、デキストロース、乾燥デンプン及びアルミノケイ酸ナトリウムからなる群から選択される。他の実施形態では、直接給与生菌に許容可能な担体は植物油、スクロース、二酸化ケイ素、ポリソルベート８０、プロピレングリコール、ブチルヒドロキシアニソール、クエン酸及びエトキシキンからなる群から選択される。
【０１２９】
或る特定の実施形態では、直接給与生菌はバチルス・サブチリス、バチルス・リケニホルミス及びバチルス・コアグランスからなる群から選択される細菌芽胞を含む。他の実施形態では、直接給与生菌はバチルス・メガテリウム、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・サブチリス及びバチルス・プミルスからなる群から選択される細菌芽胞を含む。
【０１３０】
或る特定の実施形態では、直接給与生菌は離乳の７日〜１９日前の授乳中に供給される母乳補助剤（milk supplement）（代用乳）、離乳の１日〜２日前に与えられるゲルペースト若しくは飲薬（drench）の単回投与に続く保育場で７日間の水系中での投与、又は離乳の１日〜２日前に与えられるゲルペースト若しくは飲薬の単回投与に続く保育場で２日〜３日間の粥状飼料中での投与として供給される。直接給与生菌は他の形態で、様々な期間にわたって異なる動物成長段階で供給することができる。
【０１３１】
或る特定の実施形態では、動物に与えられる細菌株の量が１日当たり少なくとも１×１０７コロニー形成単位（ＣＦＵ）、１×１０８ＣＦＵ、１×１０９ＣＦＵ又は１×１０１０ＣＦＵとなるように動物に直接給与生菌を供給する。しかしながら、より高い及び低い用量の細菌株を動物に供給してもよいことに留意されたい。
【０１３２】
或る特定の実施形態では、動物飼料（例えばプロバイオティクス又は直接給与生菌）は、動物飼料１グラム当たり少なくとも約１×１０３ＣＦＵ、１×１０４ＣＦＵ、１×１０５ＣＦＵ、１×１０６ＣＦＵ、１×１０７ＣＦＵ、１×１０８ＣＦＵ又は１×１０９ＣＦＵの動物に与えられる細菌株を含む。これらの値のいずれかを用いて動物飼料中の細菌株の濃度の範囲を規定することができる。例えば幾つかの実施形態では、動物飼料は動物飼料１グラム当たり少なくとも約１×１０５ＣＦＵ〜１×１０７ＣＦＵ、５×１０５ＣＦＵ〜５×１０６ＣＦＵ又は１×１０６ＣＦＵ〜５×１０６ＣＦＵの細菌株を含む。
【０１３３】
或る特定の実施形態では、ヒト食用の食品（例えばプロバイオティクス）は、ヒト食用の食品１グラム当たり少なくとも約１×１０３ＣＦＵ、１×１０４ＣＦＵ、１×１０５ＣＦＵ、１×１０６ＣＦＵ、１×１０７ＣＦＵ、１×１０８ＣＦＵ又は１×１０９ＣＦＵのヒトに与えられる細菌株を含む。これらの値のいずれかを用いてヒト食用の食品中の細菌株の濃度の範囲を規定することができる。例えば幾つかの実施形態では、ヒト食用の食品は動物飼料１グラム当たり少なくとも約１×１０５ＣＦＵ〜１×１０７ＣＦＵ、５×１０５ＣＦＵ〜５×１０６ＣＦＵ又は１×１０６ＣＦＵ〜５×１０６ＣＦＵの細菌株を含む。
【０１３４】
別の態様では、本発明は直接給与生菌を作製する方法であって、本明細書に記載される細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と上記の直接給与生菌に許容可能な担体とを混合することを含む、方法にも関する。
【０１３５】
別の態様では、本発明は動物に給餌する方法であって、本明細書に記載される細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を動物に投与することを含む、方法に関する。或る特定の実施形態では、動物飼料は他の動物飼料成分と共に動物に投与してもよい。動物は対象の任意の動物であり得る。或る特定の実施形態では、動物は家禽、反芻動物、仔ウシ、ブタ、ウサギ、ウマ、魚類及び愛玩動物からなる群から選択される動物である。組成物は飼料１グラム当たり少なくとも１０３コロニー形成単位（ＣＦＵ）、１０４ＣＦＵ、１０５ＣＦＵ、１０６ＣＦＵ、１０７ＣＦＵ、１０８ＣＦＵ又は１０９ＣＦＵの細菌という用量で投与することができる。組成物は組成物を動物用の飲料水に添加するか、組成物を動物に噴霧するか、又はペースト、ゲル若しくは大丸薬によって適用することによって動物に投与することもできる。
【０１３６】
或る特定の実施形態では、プロバイオティクスは本明細書に記載される細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と許容可能な担体とを含む。或る特定の実施形態では、プロバイオティクスに許容可能な担体は牛乳、ヨーグルト、チーズ、発酵乳、穀物、発酵穀物、ジュース、アイスクリーム、又は乳児若しくは小児用の配合物からなる群から選択される。本発明は、プロバイオティクスを作製する方法であって、本明細書に記載される細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と上記のプロバイオティクスに許容可能な担体とを混合することを含む、方法にも関する。
【０１３７】
別の態様では、本発明は土壌、成長媒体又は堆肥を処理する方法であって、土壌、成長媒体又は堆肥に本明細書に記載される細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を適用することを含む、方法に関する。細菌芽胞は任意の好適な担体と混合し、土壌、成長媒体又は堆肥に噴霧又は散布することができる。発芽し、栄養型の状態になった後、細菌芽胞は周囲媒体を利用し始め、続いて植物に有益な物質を栄養素循環（物質を植物に取り込まれ得るより単純な形態へと分解する）又は結合物質の放出によって産生する。栄養素循環に利用可能な物質としては、窒素、リン、カリウム、亜鉛、鉄、マンガン及び他の微量栄養素が挙げられる。細菌は、植物によって利用され得る又は周囲根圏と共に作用して植物に利益をもたらす抗生物質、抗真菌化合物、バクテリオシン、有機酸、アミノ酸、酵素及びシデロホアも産生する。
【０１３８】
別の態様では、本発明は植物における病原体耐性又は耐虫性を増大する方法であって、該方法が植物に本明細書に記載される細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を適用することを含み、病原体耐性又は耐虫性が組成物で処理していない対応する植物と比べて増大する、方法に関する。細菌は植物における病原体耐性又は耐虫性を、病原体及び昆虫に対する耐性、例えば全身誘導抵抗性（Induced Systemic Resistance：ＩＳＲ）を誘導することによって増大することができる。細菌は植物における病原体耐性を、バイオフィルムを形成し、栄養素及び空間に関する競争的排除により他の細菌又は真菌の成長を遮断することによって増大することもできる。
【０１３９】
或る特定の実施形態では、病原体は真菌病原体、細菌病原体又はウイルス病原体である。或る特定の実施形態では、真菌病原体に対する耐性を増大するために使用される組成物は、バチルス・メガテリウム、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・サブチリス及びバチルス・プミルスからなる群から選択される細菌芽胞を含む。
【０１４０】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と許容可能な担体とを含むクリーニング製品に関する。或る特定の実施形態では、クリーニング製品はバチルス・メガテリウム、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・サブチリス及びバチルス・プミルスからなる群から選択される細菌芽胞を含む。或る特定の実施形態では、クリーニング製品に許容可能な担体は洗剤、石鹸及び芳香剤からなる群から選択される。或る特定の実施形態では、クリーニング化合物は浴室及びトランジットエリアに使用される。細菌がクリーニング製品の有効性を改善し得る方法の一つは、尿素をエネルギー源として使用し、それにより尿素を分解し、アンモニア等の臭気を低減することによるものである。細菌芽胞が発芽すると、栄養型の状態の細菌がタイル間のグラウト及びカーペットのパッドで成長し、不要な物質の分解をもたらすことができる。
【０１４１】
或る特定の実施形態では、クリーニング製品はクリーニング製品１グラム当たり少なくとも約１×１０３ＣＦＵ、１×１０４ＣＦＵ、１×１０５ＣＦＵ、１×１０６ＣＦＵ、１×１０７ＣＦＵ、１×１０８ＣＦＵ又は１×１０９ＣＦＵの細菌芽胞を含む。これらの値のいずれかを用いてクリーニング製品中の細菌芽胞の量の範囲を規定することができる。例えば幾つかの実施形態では、クリーニング製品はクリーニング製品１グラム当たり少なくとも約１×１０５ＣＦＵ〜１×１０７ＣＦＵ、５×１０５ＣＦＵ〜５×１０６ＣＦＵ又は１×１０６ＣＦＵ〜５×１０６ＣＦＵの細菌株を含む。
【０１４２】
本発明は、クリーニング製品を作製する方法であって、本明細書に記載される細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物と許容可能な担体とを混合することを含む、方法にも関する。或る特定の実施形態では、上記方法に使用される許容可能な担体は洗剤、石鹸及び芳香剤からなる群から選択される。
【０１４３】
本発明は動物排泄物、床敷又は敷料を処理する方法であって、本明細書に記載される細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を動物排泄物、床敷又は敷料に適用することを含む、方法にも関する。
【０１４４】
別の態様では、本発明は本明細書に記載される細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を含むサイレージに関する。本発明はサイレージを作製する方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物をサイレージに適用することを含む、方法にも関する。サイレージはサイロ又は他の密閉容器内で牧草、乾草、禾穀類又はトウモロコシ等の植物バイオマスを発酵させることによって製造される動物飼料の一種である。サイレージの製造のために農業原料を処理する場合、牧草又はトウモロコシ等の植物バイオマスを乳酸菌と混合して、エンシレージを形成する。サイレージの製造は動物飼料の安定性を増大し、原料の特性を改善する既知の方法である。サイレージの製造については、トウモロコシ及び牧草、雑穀、穀粒を含む又は含まない穀物、並びにマメ科植物が原料として好適である。サイレージを製造するために、化学添加剤及び微生物添加剤の両方を含むサイレージ助剤（silaging aids）、いわゆるサイレージスターターが頻繁に使用される。微生物添加剤はサイレージに、例えば汚染生物の成長を阻害するため、マイコトキシンを低減するため又は反芻動物のメタン排出を低減するためにも添加することができる。微生物添加剤を含有するサイレージを作製する方法は当該技術分野で既知であり、例えば米国特許出願公開第２０１１／０１４２９９１号に記載されている。
【０１４５】
或る特定の実施形態では、サイレージはサイレージ１グラム当たり少なくとも約１×１０３ＣＦＵ、１×１０４ＣＦＵ、１×１０５ＣＦＵ、１×１０６ＣＦＵ、１×１０７ＣＦＵ、１×１０８ＣＦＵ又は１×１０９ＣＦＵの細菌を含む。これらの値のいずれかを用いてサイレージ中の細菌株の濃度の範囲を規定することができる。例えば幾つかの実施形態では、サイレージはサイレージ１グラム当たり少なくとも約１×１０５ＣＦＵ〜１×１０７ＣＦＵ、５×１０５ＣＦＵ〜５×１０６ＣＦＵ又は１×１０６ＣＦＵ〜５×１０６ＣＦＵの細菌株を含む。
【０１４６】
本発明は微生物石油増進回収（ＭＥＯＲ）の方法であって、細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を油井に適用することを含む、方法にも関する。或る特定の実施形態では、組成物は油井のボーリング孔又は油井の貯留層に適用される。ＭＥＯＲは、微生物を成熟油（mature oil）の形で捕捉された原油の動員に使用する三次石油回収プロセスである。ＭＥＯＲは石油、水若しくは岩石の界面特性の変更、又はバイオクロッギング（bioclogging）に起因した流動挙動の変化によって石油回収を改善することができる。ＭＥＯＲの方法は、例えば米国特許第８，７４６，３３４号及び同第８，８２６，９７５号、並びにAl-Sulaimani et al., 2011, Biotechnol. Bioinf. Bioeng. 1(2): 147-158に記載されている。ＭＥＯＲを用いて、油井の排油部を標的圧力まで再加圧するか又は標的量のガスをガス産生細菌株によって生成させることで石油回収を向上させることができる。細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物は、油井を通して油井の貯留層に投入され得る。次いで、油井内の圧力が標的圧力に達するか又は標的量のガスが生成するまで油井を封鎖し、油井からの石油製造を増大することができる。
【０１４７】
地下石油貯留層には、貯留層が大幅に枯渇した後に石油回収を補助する付加的な圧力を供給するために頻繁に水が注入される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される組成物はこの注入水と共に油井に投入される。注入水はこの場合、水性液体担体として働く。代替的には、本発明の組成物は注入水とは別に油井に投入してもよい。この後者の場合、別の水性液体、すなわち注入水以外の液体を供給して担体とすることができる。微生物を注入水によって油井に投入する方法は、例えば米国特許第５，０４４，４３５号に記載されている。
【０１４８】
或る特定の実施形態では、バチルス種又はクロストリジウム種をＭＥＯＲに使用することができる。特定の実施形態では、ＭＥＯＲに使用される細菌種はバチルス・サブチリス、バチルス・リケニホルミス及びバチルス・モジャベンシスからなる群から選択される。
【０１４９】
本発明は、被験体において疾患を治療又は予防する方法であって、被験体に本明細書に記載される細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を有効量投与し、それにより被験体において疾患を治療又は予防することを含む、方法にも関する。「有効量」は被験体において疾患を治療するのに十分な量である。有効量は１回又は複数回の投与で投与することができる。或る特定の実施形態では、組成物は組成物を飼料、例えば動物飼料に添加することによって被験体に投与される。
【０１５０】
或る特定の実施形態では、本発明の組成物によって治療又は予防される疾患は細菌性疾患、真菌性疾患及びウイルス性疾患からなる群から選択される。本明細書で使用される場合、「細菌性疾患」、「真菌性疾患」及び「ウイルス性疾患」という用語はそれぞれ細菌病原体、真菌病原体又はウイルス病原体によって引き起こされる疾患を表す。特定の実施形態では、疾患は細菌性疾患である。幾つかの病原体が細菌組成物の投与、例えばバチルス種の投与によって制御されることが当該技術分野で知られている。例えば、Baron (2009, Postgraduate Medicine 121(2): 1-5)は、Ａ型インフルエンザウイルス又はアデノウイルスに感染しているヒト被験体へのバチルス・コアグランスを含むプロバイオティクスの投与が、被験体の免疫応答を顕著に増大したことを教示している。Bastos et al. (2013, Viruses 5: 1219-1230)。
【０１５１】
バチルス種によって制御されることが知られる病原体、及びこれらの病原体によって引き起こされる対応する疾患の例を下記表１Ａに示す。
【０１５２】
【表１】
0006793633.tif 000002
【０１５３】
本発明は、病原体により感染しやすい被験体において病原体による感染を予防又は低減する方法であって、被験体に本明細書に記載される細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物を有効量投与し、それにより被験体における感染を予防又は低減することを含む、方法にも関する。或る特定の実施形態では、病原体は細菌、真菌又はウイルスである。或る特定の実施形態では、病原体は表１Ａに挙げられる病原体からなる群から選択される。
【０１５４】
特定の実施形態では、本発明の組成物によって治療又は予防される疾患は壊死性腸炎である。壊死性腸炎は、クロストリジウム・パーフリンジェンスによって引き起こされ、通常は小腸中央部の線維素性（fibrino-）壊死性腸炎を特徴とするニワトリ、シチメンチョウ及びカモに見られる急性又は慢性の腸性毒血症である。死亡率は５％〜５０％、通常はおよそ１０％であり得る。感染は糞口感染によって生じる。原因生物の芽胞は高度耐性である。素因としては、コクシジウム症（coccidiosis/coccidiasis）、食餌（高タンパク質）、高粘度食餌（食餌中の高いライ麦及び小麦含有率と関連することが多い）、汚染された飼料及び／又は水、並びに他の消耗性疾患が挙げられる。壊死性腸炎の兆候としては、鬱状態、羽の逆立て（ruffled feathers）、食欲不振、閉眼、不動状態、黒ずんだ下痢及び突然死が挙げられる。症状としては、病変、小腸（通常は中央部から末端部）の肥厚及び膨満、ジフテリア膜を有する腸粘膜、壊死物質を有する暗褐色の腸内容物、上部小腸が罹患している場合の素嚢における胆汁色の液体の逆流も挙げられる。罹患した鳥類は脱水状態になり、急速に腐敗する傾向がある。
【０１５５】
推定診断は集団病歴及び肉眼的病変に基づいて行うことができる。確認は罹患組織からの塗抹標本における大量の桿菌の観察、及び特定の薬物治療に対する通常４８時間未満の良好な応答による。標準治療としては、飲料水中のペニシリン（例えばフェノキシメチルペニシリン、アモキシリン）又は飼料中のバシトラシン（例えば１００ｐｐｍ）が挙げられる。
【０１５６】
上述の方法のいずれかの或る特定の実施形態では、被験体はヒトである。上述の方法のいずれかの或る特定の実施形態では、被験体は非ヒト動物である。或る特定の実施形態では、被験体はニワトリ、シチメンチョウ及びカモからなる群から選択される。或る特定の実施形態では、被験体は魚類、エビ又は軟体動物からなる群から選択される。或る特定の実施形態では、魚類はサケ、マス、コイ、カワカマス、スズキ、ブルヘッド（bullheads）、ターボット及びハリバットからなる群から選択される。
【実施例】
【０１５７】
以下の実施例は本発明の原理に従って本発明を説明するために提示されるが、本発明を限定するとは何ら解釈されない。
【０１５８】
下記実施例では、「ＧＯＳＤ（発芽最適化噴霧乾燥（Germination Optimized Spray Drying））」及び「ＧＯ＋」という用語は、発芽性最適化物質（optimizer）（特に指定がなければＬ−アラニン）を示される特定のバチルス種とともに噴霧乾燥した組成物を表す。Ｌ−アラニンを蒸留水１ミリリットル当たり０．０４４グラムのアラニンを含有する溶液として噴霧乾燥の直前に芽胞の塊に導入し、バチルス種の芽胞を噴霧乾燥した。
【０１５９】
「ＧＯ−」という用語は発芽性化合物が存在していないバチルス種を同じように噴霧乾燥した組成物を表す。
【０１６０】
さらに特に指定がなければ、実施例において芽胞の発芽を判断するのに、下記方法を用いた。芽胞を栄養溶液に入れ、発芽が開始すると、芽胞はジピコリン酸及びイオンを放出し、これにより暗化（darkening）が起こる。発芽のこの指標が芽胞懸濁液による可視光の光減衰の低減をもたらす。したがって発芽率は暗期の芽胞／明期の芽胞の割合をカウントし、紫外線可視分光光度計下にて発芽する芽胞懸濁液の６００ｎｍでの光学密度（Ｏ．Ｄ．６００）の低減をモニタリングすることにより求めた。次いでこの比を発芽パーセントへと変換する。
【０１６１】
実施例１：Ｌ−アラニンとの密接混合物におけるＢ．サブチリスＥＮＶ  ９２３の発芽の増大
本発明の密接混合物の芽胞の発芽率を発芽剤の非存在下にて従来的に用いられた芽胞の発芽率と比較するために、下記の処理を行った。
【０１６２】
Ａ．  密接混合物の形成：Ｌ−アラニンを蒸留水１ミリリットル当たり０．０４４グラムのアラニンを含有する溶液として噴霧乾燥の直前に芽胞の塊に導入し、Ｂ．サブチリスＥＮＶ  ９２３の芽胞を噴霧乾燥した。生成された密接混合物を、続いてｐＨ７をもたらす蒸留水中の０．０１Ｍ  リン酸緩衝液からなる溶液に導入することにより発芽させた。
【０１６３】
Ｂ．  芽胞と発芽剤との従来的な混合：Ｂ．サブチリスＥＮＶ  ９２３の芽胞を噴霧乾燥した後、ｐＨ７をもたらす蒸留水中の０．０１Ｍ  リン酸緩衝液からなる溶液に導入した。かかる芽胞を、ｐＨ７をもたらす蒸留水中の０．０１Ｍ  リン酸緩衝液と溶液１ミリリットル当たり０．０００１グラムのアラニンとからなる溶液に導入することにより発芽させた。
【０１６４】
Ｃ．  芽胞単独の発芽：Ｂ．サブチリスＥＮＶ  ９２３の芽胞を噴霧乾燥した後、ｐＨ７をもたらす蒸留水中の０．０１Ｍ  リン酸緩衝液からなる溶液に導入した。
【０１６５】
このような処理をそれぞれ２回反復して行った。下記表１Ｂに、光学密度の低下パーセントにより測定される、Ｂ．サブチリスＥＮＶ  ９２３の発芽に影響するこのような処理の平均結果を示す。光学密度の低下は発芽の進行を示すものである。光学密度（ＯＤ）は６００ｎｍの波長でＪｅｎｗａｙ  Ｍｏｄｅｌ  ６３２０Ｄ  Ｖｉｓｉｂｌｅ  Ｒａｎｇｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。用いたＬ−アラニンは純度が９９％であり、Alfa Aeser（英国、ランカシャー州、ヒーシャム）から供給された。
【０１６６】
【表２】
0006793633.tif 000003
【０１６７】
上記の結果から、噴霧乾燥等のプロセスによって発芽性化合物との密接混合物中に配合した芽胞が、従来法により同じ発芽剤と混合した芽胞よりも急速に発芽することが示される。このため、本発明の組成物でコーティングされた植物繁殖材料は、それらがコーティングされる特定の細菌と関連する利益を、かかる細菌が大幅に増加した量で存在するためにより迅速かつ効率的に受ける。
【０１６８】
実施例２：ＧＯＳＤで処理したバチルス・サブチリス株ＥＮＶ９２３の発芽の増大
バチルス・サブチリス芽胞を、Ｌ−アラニン溶液の存在下における芽胞の噴霧乾燥を介してＧＯＳＤ（発芽最適化噴霧乾燥）で処理し、発芽のレベルを光学密度（ＯＤ）の読み取りにより求めた。
【０１６９】
０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）
０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液を、１Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４（８７．０９ｇが０．５Ｌの蒸留水に溶解されている）及び１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４（６８．０４５ｇが０．５Ｌの蒸留水に溶解されている）溶液を用いて調製した。６１．５ｍｌの１Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４と３８．５ｍｌの１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４とを混ぜ合わせ、蒸留水にて１０００ｍｌへと希釈することで、ｐＨ７．０の０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液を作製した。０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液を蒸留水にて１：１０の比で更に希釈して、０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を得た。緩衝液を１２１℃にて６０分間オートクレーブで処理することにより滅菌した。
【０１７０】
バチルス・サブチリス芽胞懸濁液を、０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中にて１．７×１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度で調製し、３７℃に予め加熱しておいた水浴内でインキュベートして、発芽のパーセントについて５分間隔で４５分間に亘って評価した。
【０１７１】
【表３】
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【０１７２】
結論：ＧＯＳＤ処理はバチルス・サブチリス芽胞の発芽パーセント及び発芽速度を著しく高めた。
【０１７３】
実施例３：ＧＯＳＤで処理したバチルス・リケニホルミス株ＥＮＶ１００の発芽の増大
バチルス・リケニホルミス芽胞を、実施例１に記載のように、蒸留水１ｍＬ当たり０．０４４グラムのＬ−アラニンの存在下における芽胞の噴霧乾燥を介してＧＯＳＤで処理した。発芽のレベルは、芽胞懸濁液の調製に０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて上記のように光学密度（ＯＤ）の読み取りにより求めた。
【０１７４】
バチルス・リケニホルミス芽胞懸濁液を０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中にて１．２９×１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度で調製し、３７℃に予め加熱しておいた水浴内でインキュベートして、発芽のパーセントについて５分間隔で４５分間に亘って評価した。
【０１７５】
【表４】
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【０１７６】
結論：ＧＯＳＤ処理はバチルス・リケニホルミス芽胞の発芽パーセント及び発芽速度を著しく高めた。
【０１７７】
実施例４：ＧＯＳＤで処理したバチルス・サブチリス株ＥＮＶ９２３についての様々なｐＨレベルでの発芽の増大
バチルス・サブチリス株ＥＮＶ９２３  ＧＯ＋芽胞及びＧＯ−芽胞を上記のように調製し、様々なｐＨレベルで０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液に再懸濁した。ＯＤ６００の測定は上記のように行った。
【０１７８】
ｐＨ３．０〜７．０での０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液
０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０緩衝液）を実施例１に記載のように調製した。
ｐＨ範囲が３．０〜６．０である０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液を調製するために、１３．２ｍｌの１Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４と８６．８ｍｌの１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４溶液（実施例１に記載されている）とを混合して、蒸留水で容量を１Ｌにすることにより作製された０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を基となる緩衝液として使用した。
ｐＨ５．０〜ｐＨ３．０の０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液を得るために、０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を蒸留水で希釈し、緩衝液のｐＨを、１Ｍ  Ｈ２ＰＯ４を用いてｐＨ５．０、ｐＨ４．０及びｐＨ３．０に下げ、０．１Ｍ  緩衝液と蒸留水との比を１：１０に保ちながら、蒸留水を用いて最終容量にした。
【０１７９】
調製した緩衝液を４℃にて保管し、各実験の前に緩衝液のｐＨを、１Ｍ  ＮａＯＨ又は１Ｍ  Ｈ２ＰＯ４を用いて再調整した。
【０１８０】
【表５】
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【０１８１】
結論：ＧＯＳＤによる処理により、バチルス・サブチリス芽胞をより急速に発芽させ、より低いｐＨレベルの影響を克服することが可能となる。
【０１８２】
実施例５：ＧＯＳＤで処理したバチルス・サブチリス株ＥＮＶ９２３の発芽の増大。芽胞の発芽応答は様々な温度レベルの影響を受ける。表には１０分間隔で測定された発芽パーセントを示す。
バチルス・サブチリス株ＥＮＶ  ９２３  ＧＯＳＤ芽胞及び対照芽胞を上記のように調製した。芽胞の発芽を上記のように光学密度（ＯＤ）の測定により調べた。ＯＤ６００の測定のために芽胞懸濁液を調製し、１．７×１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度で０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）（リン酸緩衝液、ｐＨ７．０調製物）中で４℃に冷却した。各芽胞懸濁液について、３ｍｌ容量まで満たした３つの培養管を準備した。撹拌及び初期のＯＤ６００測定の後、培養管を２５℃、３０℃及び３７℃に予め加熱しておいた水浴内において１２０分間インキュベートした。１０分間隔で培養管を撹拌し、ＯＤ６００測定を行った。
【０１８３】
【表６】
0006793633.tif 000007
【０１８４】
結論：ＧＯＳＤによる処理（ＧＯ＋）により、バチルス・サブチリス芽胞をより急速に発芽させ、より低い温度状況の影響を克服することが可能となる。
【０１８５】
実施例６：異なるモル濃度のＮａＣｌ溶液の存在下におけるＧＯＳＤを用いた及びＧＯＳＤを用いないバチルス・リケニホルミスの発芽パーセント
培地：
培地は希薄トリプチックソイブロス（ｍＴＳＢ）（BD、２１１８２２）とした。培地は、５０ｍｇのトリプチックソイブロス粉末を、完全に溶解するまで加熱及び撹拌しながら１Ｌの水に懸濁させることにより調製した。次いで培地をボトルに等しく分配し（aliquoted）、１２１℃にて３０分間オートクレーブで処理した。製造業者の報告にある粉末含量に基づくと、ｍＴＳＢ培地には１リットル当たり、
カゼインの膵消化物：２８．３ｍｇ
ダイズのパパイン（Papic）消化物：５．０ｍｇ
デキストロース：４．２ｍｇ
塩化ナトリウム：８．３ｍｇ
リン酸二カリウム：４．２ｍｇ
が含有されていた。培地を加熱し、オートクレーブで処理する前に、最終濃度が０．５Ｍ又は１．５Ｍ（それぞれ、２９．２２ｇ／Ｌ及び８７．６６ｇ／Ｌ）になるように、必要に応じて塩化ナトリウム（Amresco、Ｘ１９０）を添加することで、浸透圧ストレスを誘導した。
【０１８６】
芽胞懸濁液：
ＧＯＳＤで処理した又は処理していないバチルス・リケニホルミス株ＥＮＶ１００の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において０．１％  Ｏｃｔｏｓｏｌ  ＳＬＳ（ＦＴ−ＳＬＳ−２４６ＤＲＵＭ、Tiarco Chemical（ジョージア州ドールトン））を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を５秒間隔で少なくとも合計１５秒間、又は芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させた。これはブレンダージャー内の最終濃度が１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌとなるように行った。この芽胞懸濁液から２５０μｌを４．７５ｍｌのｍＴＳＢが入った培養管に移し、５×１０８ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度を得た。これらの濃度は、およそ０．６の開始ＯＤ６００を達成するために芽胞の各バッチについて行った最適化により求める。
【０１８７】
ＯＤ発芽アッセイ：
懸濁した芽胞が入った培養管を速やかにボルテックスし、ゼロ時点にてＯＤ６００を測定し、３７℃の水浴内においてインキュベートした。各時間間隔において、時間を記録し、培養管を取り出し、ボルテックスして、ＯＤ６００を測定し、水浴に戻した。ＯＤ６００の減少パーセントは、ゼロ時点の値から測定値を減算し、ゼロ時点の値で除算して、１００％を乗算することにより求めた。完全な発芽は６０％のＯＤ６００の減少パーセントに相当するものであることが以前に報告されている。そのため発芽パーセントはＯＤ６００の減少パーセントに１．６７を乗算することにより求めた。
【０１８８】
【表７】
0006793633.tif 000008
【０１８９】
結論：ＧＯＳＤによる処理により、バチルス・リケニホルミス芽胞をより急速に発芽させ、様々な塩（ＮａＣｌ）レベルの浸透圧ストレスの影響を克服することが可能となる。
【０１９０】
実施例７：異なるパーツパーミリオンの銅溶液の存在下におけるＧＯＳＤを用いた及びＧＯＳＤを用いないバチルス・リケニホルミスの発芽パーセント
培地：
ｍＴＳＢ培地は上記のように調製したが、最終濃度が５０ｍＭとなるまでＮａＣｌを添加することで、浸透圧が平衡状態の培地を作製した。１×１０５ｐｐｍの硝酸銅（ＩＩ）ヘミ（五水和物）（Alfa Aesar、１２５２３）ストック溶液を、２ｇを２０ｍｌの水に懸濁させ、０．２２μｍのフィルターに通すことにより作製した。これを一定分量のｍＴＳＢに添加することで、０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ及び２００ｐｐｍの最終濃度を達成した。
【０１９１】
芽胞懸濁液：
ＧＯＳＤで処理した又は処理していないバチルス・リケニホルミス株ＥＮＶ１００の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において０．１％  Ｏｃｔｏｓｏｌ  ＳＬＳ（ＦＴ−ＳＬＳ−２４６ＤＲＵＭ、Tiarco Chemical（ジョージア州ドールトン））を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を５秒間隔で少なくとも合計１５秒間、又は芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させた。これはブレンダージャー内の最終濃度が２×１０９ｃｆｕ／ｍｌとなるように行った。この芽胞懸濁液から２５０μｌを４．７５ｍｌのｍＴＳＢが入った培養管に移し、１×１０８ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度を得た。これらの濃度は、およそ０．６の開始ＯＤ６００を達成するために芽胞の各バッチについて行った最適化により求めた。
【０１９２】
ＯＤ発芽アッセイ：実施例６に示されるように行い、算出した。
【０１９３】
【表８】
0006793633.tif 000009
【０１９４】
結論：ＧＯＳＤによる処理により、バチルス・リケニホルミス芽胞をより急速に発芽させ、様々な銅イオンレベルのストレスの影響を克服することが可能となる。
【０１９５】
実施例８：異なるパーツパーミリオンのアルミニウム溶液の存在下におけるＧＯＳＤを用いた及びＧＯＳＤを用いないバチルス・リケニホルミスの発芽パーセント
培地：
ｍＴＳＢ培地は上記のように調製したが、最終濃度が５０ｍＭとなるまでＮａＣｌを添加することで、浸透圧が平衡状態の培地を作製した。１０００ｐｐｍのＡｌ３＋ストック溶液を、０．６２ｇのＡｌ２（ＳＯ４）３・１４Ｈ２Ｏ（Alfa Aesar、１２３６２）を５０ｍｌの水に懸濁させ、０．２２μｍのフィルターに通すことにより作製した。これを一定分量のｍＴＳＢに添加することで、０ｐｐｍ、０．２５ｐｐｍ、０．５０ｐｐｍ及び１．０ｐｐｍの最終濃度を達成した。培地のｐＨをＨＣｌの添加によりｐＨ４．５へと下げ、Ａｌ３＋イオンの完全な分離を可能にした。
【０１９６】
芽胞懸濁液：
ＧＯＳＤで処理した又は処理していないバチルス・リケニホルミス株ＥＮＶ１００の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において０．１％  Ｏｃｔｏｓｏｌ  ＳＬＳ（ＦＴ−ＳＬＳ−２４６ＤＲＵＭ、Tiarco Chemical（ジョージア州ドールトン））を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を５秒間隔で少なくとも合計１５秒間、又は芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させた。これはブレンダージャー内の最終濃度が１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌとなるように行った。この芽胞懸濁液から２５０μｌを４．７５ｍｌのｍＴＳＢが入った培養管に移し、５×１０８ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度を得た。これらの濃度は、およそ０．６の開始ＯＤ６００を達成するために芽胞の各バッチについて行った最適化により求めた。
【０１９７】
ＯＤ発芽アッセイ：実施例６と同様に行い、算出した。
【０１９８】
【表９】
0006793633.tif 000010
【０１９９】
結論：ＧＯＳＤによる処理により、バチルス・リケニホルミス芽胞をより急速に発芽させ、様々なアルミニウムイオンレベルのストレスの影響を克服することが可能となる。
【０２００】
実施例９：異なるミリモル濃度の胆汁酸塩溶液の存在下におけるＧＯＳＤを用いた及びＧＯＳＤを用いないバチルス・リケニホルミスの発芽パーセント
培地：
ｍＴＳＢ培地は上記のように調製したが、最終濃度が５０ｍＭとなるまでＮａＣｌを添加することで、浸透圧が平衡状態の培地を作製した。８０ｍＭ  胆汁酸塩ストック溶液を、２．５ｇのタウロデオキシコール酸ナトリウム（Sigma、Ｔ０８７５）、１．１ｇのグリコデオキシコール酸ナトリウム（Sigma、Ｇ９９１０）及び０．３４６ｇのデオキシコール酸ナトリウム（Sigma、Ｄ５６７０）を１００ｍｌの水に懸濁させ、０．２２μｍのフィルターに通すことにより作製した。これを一定分量のｍＴＳＢに添加することで、０ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ及び８ｍＭの最終濃度を達成した。
【０２０１】
芽胞懸濁液：
ＧＯＳＤで処理した又は処理していないバチルス・リケニホルミス株ＥＮＶ１００の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において０．１％  Ｏｃｔｏｓｏｌ  ＳＬＳ（ＦＴ−ＳＬＳ−２４６ＤＲＵＭ、Tiarco Chemical（ジョージア州ドールトン））を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を５秒間隔で少なくとも合計１５秒間、又は芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させた。これはブレンダージャー内の最終濃度が１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌとなるように行った。この芽胞懸濁液から２５０μｌを４．７５ｍｌのｍＴＳＢが入った培養管に移し、５×１０８ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度を得た。これらの濃度は、およそ０．６の開始ＯＤ６００を達成するために芽胞の各バッチについて行った最適化により求めた。
【０２０２】
ＯＤ発芽アッセイ：
上記のように行い、算出した。
【０２０３】
【表１０】
0006793633.tif 000011
【０２０４】
結論：ＧＯＳＤによる処理により、バチルス・リケニホルミス芽胞をより急速に発芽させ、胃腸管において遭遇し得る様々な胆汁酸塩レベルのストレスの影響を克服することが可能となる。
【０２０５】
実施例１０：規定のリン酸カリウム培地及び２％  グルコースにおけるＧＯＳＤを用いた又はＧＯＳＤを用いないバチルス・リケニホルミスの３つの反復物の平均増殖
バチルス・リケニホルミス株ＥＮＶ  ４３１  ＧＯ＋芽胞をＧＯＳＤ（先に記載された手法）で処理した。対照として、ＧＯＳＤを用いずに噴霧乾燥した同じ培養物由来のＧＯ−芽胞を使用した。増殖試験を、２％  グルコースを添加した最小塩培地において行った。
【０２０６】
培地
培地を、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１．２６ｇ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２（０．８１ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２（０．１５ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（０．０５ｇ／Ｌ）を蒸留水に溶解し、１ｍｌ／Ｌ  １０００×Ｔｒａｃｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｍｉｘ（ＭｎＳＯ４（０．８５ｇ／５０ｍｌ）、ＺｎＳＯ４（０．１５ｇ／５０ｍｌ）、ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ（０．１５ｇ／５０ｍｌ）、塩酸チアミン（０．０５ｇ／５０ｍｌ）を添加することにより調製した。好ましい溶液をフラスコに注ぎ（９０ｍｌ／フラスコ）、１２１℃にて４０分間オートクレーブで処理した。接種前に培地に４ｍｌの滅菌濾過した２５×リン酸カリウム溶液（Ｋ２ＨＰＯ４（３．４４ｇ／５０ｍｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（２．８１ｇ／５０ｍｌ））、及び２ｍｌの５０×グルコース（１００ｇ／２００ｍｌ）を添加することで、最終濃度を２％にした。
【０２０７】
バチルス・リケニホルミス細胞の増殖
接種に用いた芽胞の量は、ＧＯ−及びＧＯ＋芽胞粉末の菌数を用いて決定した。濃（１０００×）バチルス・リケニホルミス株ＥＮＶ  ４３１の芽胞懸濁液は、滅菌ブレンダージャー内の芽胞を、滅菌水を用いてブレンドすることにより調製し、培地が入ったフラスコに下記表の０時間に示されている濃度まで添加した。初期培養物のカウントはブレンドされた芽胞懸濁液の希釈及びプレートカウント（plate counts：平板計数）を行うことにより得た。各芽胞サンプルについて３つのフラスコを準備した。
【０２０８】
フラスコを３０℃、１５０ｒｐｍでインキュベートし、サンプルを４８時間増殖させた。サンプルを採取し、プレートカウントを２４時間及び４８時間で行った。
【０２０９】
【表１１】
0006793633.tif 000012
【０２１０】
結論：ＧＯＳＤ処理はバチルス・リケニホルミスの発芽及び増殖速度を著しく高めた。
【０２１１】
実施例１１：異なる濃度のＮａＣｌの存在下におけるＧＯＳＤを用いた又はＧＯＳＤを用いない処理を比較する２日間に亘るバチルス・リケニホルミスの増殖
培地：
ｍＴＳＢは上記のように調製したが、最終濃度が０Ｍ、０．５Ｍ、１．０Ｍ、又は１．５Ｍ（それぞれ０ｇ／Ｌ、２９．２２ｇ／Ｌ、５８．４４ｇ／Ｌ、又は８７．６６ｇ／Ｌ）となるように必要に応じて塩化ナトリウム（Amresco、Ｘ１９０）を添加することで、浸透圧ストレスを誘導した。培地を加熱し、フラスコに等しく分配し、オートクレーブで処理した。
【０２１２】
プレートカウントアガー（ＰＣＡ）（BD、２４７９１０）を、製造業者の取扱説明書に従って、２３．５ｇの粉末を１Ｌの水に懸濁させ、頻繁に撹拌しながら沸騰させ、ガラスジャーに等しく分配し、オートクレーブで処理した。必要となるまで培地ジャーを４５℃の水浴に冷却させておいた。粉末の製造業者は、ＰＣＡについて１リットル当たり下記の含量であると報告している：
カゼインの膵消化物：５．０ｇ
酵母抽出物：２．５ｇ
デキストロース：１．０ｇ
寒天：１５．０ｇ
【０２１３】
芽胞懸濁液：
ＧＯＳＤで処理した又は処理していないバチルス・リケニホルミス株ＥＮＶ１００の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において０．１％  Ｏｃｔｏｓｏｌ  ＳＬＳ（ＦＴ−ＳＬＳ−２４６ＤＲＵＭ、Tiarco Chemical（ジョージア州ドールトン））を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を５秒間隔で少なくとも合計１５秒間、又は芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させ、その後滅菌水で段階希釈を行った。これは培養フラスコ内の最終濃度が１×１０２ｃｆｕ／ｍｌとなるように行った。
【０２１４】
定量化：
フラスコを１５０ｒｐｍで２８時間（「１日」）又は５０時間（「２日」）振盪させながら３７℃にてインキュベートした。一定分量を各フラスコからペトリ皿へと４５℃未満に冷却したＰＣＡを上から注ぐことで段階希釈し、かき混ぜ（swirled）、固化させた。プレートを反転し、３７℃でおよそ２４時間インキュベートした。コロニーをカウントし、希釈率に基づき濃度を算出した。また各フラスコからおよそ１０μｌのサンプルをＰＣＡプレート上で画線培養し、純度を調べた。
【０２１５】
【表１２】
0006793633.tif 000013
【０２１６】
結論：ＧＯＳＤ処理は浸透圧塩ストレス下においてバチルス・リケニホルミスの発芽及び増殖を著しく高めた。
【０２１７】
実施例１２：バチルス・サブチリス株ＥＮＶ  ９２３のプロテアーゼ活性
先に記載されたようにＧＯＳＤで処理した（ＧＯ＋）、及び非処理の（ＧＯ−）バチルス・サブチリス株ＥＮＶ  ９２３の芽胞をプロテアーゼ活性試験に使用した。
【０２１８】
培地
化学的に組成が明確である培地（ＣＤＳＭ：Chemically Defined Salt Medium）をプロテアーゼ試験における細胞増殖に使用した。培地は基となる溶液成分（ｇ／Ｌ）：（ＮＨ４）ＳＯ４、１．２６ｇ；Ｌ−グルタミン酸、１．１８ｇ；ＭｇＣｌ２、０．８１；ＣａＣｌ２、０．１５５及び８５％  Ｌ−乳酸（０．５３０ｍｌ／Ｌ）を蒸留水に溶解し、１ｍｌ／Ｌの１０００×Ｔｒａｃｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｍｉｘ（ｇ／５０ｍｌ）を添加することにより調製した。基となる溶液の入ったフラスコ（４８ｍｌ／フラスコ）を４０分間オートクレーブで処理した。接種前にグルコースを含む２ｍｌの別々に調製した滅菌濾過済み２５×緩衝溶液（ｇ／５０ｍｌ）：ＭＯＰＳ、１１．６；ＫＨ２ＰＯ４、０．６；グルコース、４．５を添加した。
【０２１９】
バチルス・サブチリスＥＮＶ９２３細胞の増殖
接種に用いた芽胞の量は、ＧＯ−及びＧＯ＋芽胞粉末の菌数を用いて決定した。濃（１０００×）バチルス・サブチリス株ＥＮＶ９２３の芽胞懸濁液は、滅菌ブレンダージャー内の芽胞を、滅菌済みの０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いてブレンドすることにより調製し、約１×１０４ｃｆｕ／ｍｌの濃度でフラスコに添加した。初期培養物の菌数はブレンドされた芽胞懸濁液の希釈及びプレートカウントを行うことにより確認した。各芽胞サンプルについて３つのフラスコを準備した。フラスコを３０℃、１５０ｒｐｍでインキュベートし、サンプルを４８時間で採取した。
【０２２０】
プロテアーゼ活性アッセイ
プロテアーゼ活性アッセイを、基質としてカゼインと、チロシンと反応し、青色の発現を促すフォーリン−チオカルト法のフェノール試薬とを用いて細胞上清にて行った。プロテアーゼ活性単位は１分に付き１μｇのチロシンを遊離させる酵素の量として定義された。試験管内のチロシンの量は、Jenwayの７３０５分光光度計にてＯＤ６５０を測定し、検量線を用いて遊離されたチロシンを算出することにより決定した。
【０２２１】
試薬
試薬１：０．０５Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）（実施例１に記載のように調製した）を１：１の比で蒸留水にて希釈することで、０．０５Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を得た。
試薬２：０．６５％  カゼイン溶液
０．６５ｇのカゼインを８０ｍｌの０．０５Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、加熱することでカゼインを溶液にし、最終容量を、０．０５Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて１００ｍｌにした。
試薬３：１５％  トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）
１５ｇのＴＣＡを蒸留水に溶解し、最終容量を１００ｍｌにした。
試薬４：２０％  Ｎａ２ＣＯ３
２０ｇのＮａ２ＣＯ３を蒸留水に溶解し、最終容量を１００ｍｌにした。
【０２２２】
プロテアーゼアッセイ
１０ｍｌの培養物を遠心分離し、上清を０．２μｍのフィルターに通して滅菌管へと濾過した。
３ｍｌの濾過した上清を３ｍｌの０．６５％  カゼイン溶液と混合して、３７℃の水浴に１時間入れた。
反応を６ｍｌの１５％  ＴＣＡを添加することにより停止させ、サンプルを５分間遠心分離した。
０．５ｍｌの各サンプルを１ｍｌの２０％  Ｎａ２ＣＯ３と混合し、その後０．５ｍｌのフォーリン−チオカルト法のフェノール試薬の添加及び室温での２０分間のインキュベーションを行うことで、青色を発現させた。
３ｍｌの蒸留水を各サンプルに添加し、混合後にＯＤ６５０を測定した。
プロテアーゼ活性を算出するために、チロシン用の検量線を、蒸留水に溶解したチロシンの希釈系列を得て、それらの希釈系列を培養サンプルと同じ条件にて処理し、ＯＤ６５０を測定することにより作成した。
【０２２３】
【表１３】
0006793633.tif 000014
【０２２４】
結論：バチルス・サブチリス芽胞のＧＯＳＤによる処理により、プロテアーゼ等の酵素のより大量の産生が可能となる。
【０２２５】
実施例１３：発芽性化合物の存在下におけるストレプトミセス・ビリドクロモゲネスの発芽
ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス芽胞は、１０ｍｌのＴＸ緩衝液（０．００１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０を含む０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．３））を注ぎ、滅菌綿棒を用いて芽胞を取り出すことによりプレートから回収した。プレートからの芽胞懸濁液を５０ｍｌ容の滅菌管に注いだ。全てのサンプルの芽胞懸濁液を得たら、熱ショックを、芽胞懸濁液の入った滅菌管をヒートブロックに入れ、温度を５５℃に到達させ、５５℃の温度を１０分間維持することにより行った。熱ショック後、芽胞懸濁液を氷水中で５分間冷却し、３０分間遠沈した。上清を捨て、芽胞を４℃の２５ｍｌの０．０２Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁させ、１５分間遠沈した。上清を捨てた後、芽胞を２０ｍｌの０．０２Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁させ、激しく混合することで芽胞懸濁液を得て、これを実験に使用した。
【０２２６】
サンプルは、１．５ｍｌの２×発芽剤ブレンドを１．５ｍｌの芽胞懸濁液と混合することにより調製した。全ての発芽剤ブレンドは２×５０ｍｌの溶液として蒸留水中にて調製した。塩化カルシウムを１００×溶液（０．４ｇ／１０ｍｌ）として調製し、２０μｌを１０ｍｌの２×発芽剤ブレンドに添加した。発芽性化合物の最終濃度は下記の通りであった：０．８９ｍｇ／ｍｌのＬ−アラニン；１．１７ｍｇ／ｍｌのＬ−バリン、１３．２ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン；２．２５ｍｇ／ｍｌのグルコース；及び２．２５ｍｇ／ｍｌのフルクトース。初期ＯＤ６００を測定した後、サンプルを３０℃の水浴に移し、ＯＤ６００を１５分間隔で９０分間測定し、発芽率を求めた。
【０２２７】
【表１４】
0006793633.tif 000015
【０２２８】
結論：ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス芽胞の発芽性化合物による処理が発芽を高めた。
【０２２９】
実施例１４：細菌芽胞及び発芽性化合物の密接混合物と従来混合との発芽率の比較
密接混合物の芽胞の発芽率を発芽剤と従来的に混合した芽胞の発芽率と比較するために、下記の処理を行った。
【０２３０】
Ａ．  密接混合物の形成：Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン又はＬ−フェニルアラニンを蒸留水１ミリリットル当たり０．０４４グラムのアミノ酸を含有する溶液として乾燥の直前に芽胞の塊に導入し、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．セレウス（B. cereus）、Ｂ．コアグランス（B. coagulans）、Ｂ．フィルムス（B. firmus）、Ｂ．ラテロスポラス（B. laterosporus）、Ｂ．リケニホルミス（B. licheniformis）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．ミコイデス（B. mycoides）、Ｂ．ポピリエ（B. popilliae）、Ｂ．ポリミキサ（B. polymyxa）、Ｂ．プミルス（B. pumilus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、パスツーリア・ペネトランス（Pasteuria penetrans）、パスツーリア・トルネイ（Pasteuria thornei）、パスツーリア・ニシザワエ（Pasteuria nishizawae）、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトミセス・グリセオビリディス（Streptomyces griseoviridis）、ストレプトミセス・リディクス（Streptomyces lydicus）、ストレプトミセス・プリカツス（Streptomyces plicatus）、ストレプトミセス・シンデネウシス（Streptomyces sindeneusis）、ストレプトミセス・ロチェイ（Streptomyces rochei）、ストレプトミセス・アルニ（Streptomyces alni）、ストレプトミセス・ビリディス（Streptomyces viridis）、ストレプトミセス・サーモブルガリス（Streptomyces thermovulgaris）、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトミセス・アシディスキャビエス（Streptomyces acidiscabies）、ストレプトミセス・オーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens）、ストレプトミセス・ガルブス（Streptomyces galbus）、ストレプトミセス・ミクロフラバス（Streptomyces microflavus）、及びストレプトミセス・オーレオファシエン（Streptomyces aureofacien）の芽胞を乾燥させる。生成された密接混合物を、続いてｐＨ７をもたらす蒸留水中の０．０１Ｍ  リン酸緩衝液からなる溶液に導入することにより発芽させる。
【０２３１】
Ｂ．  芽胞と発芽剤との従来的な混合：Ｂ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．セレウス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．ラテロスポラス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．ミコイデス、Ｂ．ポピリエ、Ｂ．ポリミキサ、Ｂ．プミルス、Ｂ．チューリンゲンシス、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトミセス・グリセオビリディス、ストレプトミセス・リディクス、ストレプトミセス・プリカツス、ストレプトミセス・シンデネウシス、ストレプトミセス・ロチェイ、ストレプトミセス・アルニ、ストレプトミセス・ビリディス、ストレプトミセス・サーモブルガリス、ストレプトミセス・グリセウス、ストレプトミセス・アシディスキャビエス、ストレプトミセス・オーレオファシエンス、ストレプトミセス・ガルブス、ストレプトミセス・ミクロフラバス、及びストレプトミセス・オーレオファシエンの芽胞を水和及び乾燥させる。このような芽胞を、ｐＨ７をもたらす蒸留水中の０．０１Ｍ  リン酸緩衝液と溶液１ミリリットル当たり０．０００１グラムのＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン又はＬ−フェニルアラニンとからなる溶液に導入することにより発芽させる。
【０２３２】
Ｃ．  芽胞単独の発芽：Ｂ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．セレウス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．ラテロスポラス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．ミコイデス、Ｂ．ポピリエ、Ｂ．ポリミキサ、Ｂ．プミルス、Ｂ．チューリンゲンシス、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトミセス・グリセオビリディス、ストレプトミセス・リディクス、ストレプトミセス・プリカツス、ストレプトミセス・シンデネウシス、ストレプトミセス・ロチェイ、ストレプトミセス・アルニ、ストレプトミセス・ビリディス、ストレプトミセス・サーモブルガリス、ストレプトミセス・グリセウス、ストレプトミセス・アシディスキャビエス、ストレプトミセス・オーレオファシエンス、ストレプトミセス・ガルブス、ストレプトミセス・ミクロフラバス、及びストレプトミセス・オーレオファシエンの芽胞を水和及び乾燥させる。芽胞を、続いてｐＨ７をもたらす蒸留水中の０．０１Ｍ  リン酸緩衝液からなる溶液に導入する。
【０２３３】
このような処理それぞれについて得られる芽胞の発芽を、光学密度の低下パーセントにより、又は顕微鏡下で発芽した芽胞の数をカウントすることにより測定する。密接に混合した組成物が、対応する従来的に混合した同等物よりも迅速に発芽することが見出される。
【０２３４】
実施例１５：バチルス・リケニホルミス芽胞と発芽性化合物との混合物によるトウモロコシ葉、ニンジン根及びジャガイモ塊茎の処理
バチルス・リケニホルミス芽胞と発芽性化合物との混合物を作製するために、蒸留水１ｍｌ当たり０．０４４ｇのＬ−アラニンの溶液をバチルス・リケニホルミス芽胞塊に導入し、混合物を即座に噴霧乾燥した。バチルス芽胞とＬ−アラニンとの密接混合物を含有する得られた噴霧乾燥粉末は、下記処理において「ＧＯ＋」と称する。バチルス芽胞を、対照として使用するためにＬ−アラニンを添加せずに同様に噴霧乾燥した。Ｌ−アラニンを添加していない噴霧乾燥バチルス芽胞は、下記処理において「ＧＯ−」と記載する。
【０２３５】
噴霧乾燥バチルス・リケニホルミス芽胞を再懸濁する前に、ＧＯ＋及びＧＯ−配合物の細菌数を決定して、下記表１４に示されるように芽胞濃度の差を調整した。
【０２３６】
【表１５】
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【０２３７】
噴霧乾燥芽胞を、芽胞を添加するまで４℃に冷却したｐＨ７．０の０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液に懸濁させた。表１４に示されるように、ＧＯ＋及びＧＯ−噴霧乾燥配合物は、各配合物中の芽胞濃度の差を調整するためにそれぞれ０．０１８ｇ／ｍｌ及び０．００９ｇ／ｍｌの濃度で緩衝液に添加した。
【０２３８】
トウモロコシ（ズィー・メイス（Zea mays））葉を畑で成長する植物から得た。各葉をおよそ２．５ｃｍの切片に切断した。ニンジン（ダウクス・カロタ（Daucus carota））根及びジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム（Solanum tuberosum））塊茎は、外皮を残して切片に切断した。植物サンプルを、ペトリ皿内の濡らした濾紙上にペトリ皿１枚当たり１つの植物サンプルで置いた。およそ１５０μｌの芽胞懸濁液を各植物サンプルに添加した。ニンジン及びジャガイモのサンプルについては、芽胞懸濁液を皮表面、すなわち根又は塊茎の外表面に適用した。植物サンプルを入れたペトリ皿に蓋をし、３７℃でインキュベートした。０分の細胞計数のためのサンプルは芽胞懸濁液の試験管から採取した。後続のサンプルは処理した葉切片から指定の時点（１５分、３０分及び６０分）で採取し、位相差顕微鏡下で観察した。明位相（Phase bright）及び暗位相の芽胞数は数個の観察視野の写真を撮影し、暗い及び明るい細胞を計数することによって得た。芽胞発芽レベルを、位相差顕微鏡下での明位相（発芽していない）及び暗位相（発芽している）の芽胞の数に基づいて決定した。
【０２３９】
下記表１５に示されるように、Ｌ−アラニン（ＧＯ＋）を含有する配合物で処理したトウモロコシ葉上で発芽する芽胞の割合は、Ｌ−アラニン（ＧＯ−）を含まない配合物よりもはるかに高かった。例えば、９４％のＧＯ＋芽胞が３０分で発芽したが、ＧＯ−芽胞は６０分後であっても２０％未満しか発芽しなかった。同様の結果がニンジン根（表１６）及びジャガイモ塊茎（表１７）についても観察された。これらの結果から、噴霧乾燥配合物へのＬ−アラニンの添加が植物表面でのより速い芽胞の発芽をもたらしたことが示される。
【０２４０】
【表１６】
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【０２４１】
【表１７】
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【０２４２】
【表１８】
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【０２４３】
実施例１６：細菌芽胞及び発芽性化合物を含む組成物でコーティングされたトウモロコシ種子についての発芽、植物成長及び収量の評価
トウモロコシ種子を、実施例１４に挙げられる細菌芽胞と発芽性化合物との多様な組合せを含む組成物でコーティングする。種子コーティングは、米国特許第７，９８９，３９１号及び米国特許第５，８４９，３２０号に記載されるような従来の手段によって行う。以下の処理を評価する：
Ａ．  細菌芽胞と発芽性化合物との密接混合物でコーティングされた種子
Ｂ．  細菌芽胞と発芽性化合物との従来の混合物でコーティングされた種子
Ｃ．  細菌芽胞単独でコーティングされた種子
Ｄ．  コーティングされていない種子
【０２４４】
種子発芽速度を、植物出現の１日目から始めて毎日苗の出現を測定し、出現初日から３週間継続することによって温室及び野外試験で測定する。収量は成熟穂を採取し、３７℃の炉内で３日間乾燥させることによって測定する。次いで、穂を脱穀し、種子を収集し、計数する。総種子重量も各植物から採取した種子を秤量することによって測定する。
【０２４５】
実施例１７：アイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）及びクロストリジウム・パーフリンジェンスに感染させたニワトリにおけるバチルスプロバイオティクスの効果
２８日間のバッテリー試験をＣｏｂｂ  ５００ニワトリ雛（ガッルス・ガッルス・ドメスティクス（Gallus gallus domesticus））に対して行い、アイメリア・マキシマ（家禽におけるコクシジウム症の原因物質）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（壊死性腸炎の原因物質）に感染させたニワトリに対するバチルスプロバイオティクス剤又は標準抗生物質処理（バシトラシン）を有する補助飼料の効果を決定した。バチルスプロバイオティクスは同率のバチルス・サブチリス、バチルス・リケニホルミス及びバチルス・プミルスを含有するものであった。ＧＯ＋バチルスプロバイオティクスは、Ｌ−アラニンを用いたバチルス種の芽胞の噴霧乾燥によって作製した。Ｌ−アラニンは、上記のように噴霧乾燥の直前に蒸留水１ミリリットル当たり０．０４４グラムのアラニンを含有する溶液として芽胞塊に導入した。ＧＯ−バチルスプロバイオティクスは、上記のようにバチルス種の芽胞をＬ−アラニンを添加せずに噴霧乾燥することによって形成した。本研究には、各処理群について８羽のニワトリ雛を１つのケージにした８つの反復試験ケージが含まれる（１処理群につき６４羽）。以下の処理群を評価した。処理群２〜５は、アイメリア・マキシマ及びクロストリジウム・パーフリンジェンスに感染させた（感染）。処理群１はアイメリア・マキシマ又はクロストリジウム・パーフリンジェンスに感染させず、非感染陰性対照とした。
１）飼料添加剤なし、感染なし（非感染陰性対照）
２）飼料添加剤なし、感染（感染陰性対照）
３）ＧＯ−バチルスプロバイオティクス、飼料１ｇ当たり２×１０６ｃｆｕ、感染
４）ＧＯ＋バチルスプロバイオティクス、飼料１ｇ当たり２×１０６ｃｆｕ、感染
５）抗生物質バシトラシン、飼料１トン当たり５０ｇ、感染（陽性対照）
【０２４６】
ニワトリに０日目から開始して処理した又は非処理の飼料を供給した。１４日目に、処理群２〜５のニワトリ（birds）にアイメリア・マキシマの感染、続いて壊死性腸炎の原因物質であるクロストリジウム・パーフリンジェンスの感染によるストレスを与えた。ニワトリを２８日目に飼料効率、体重増加、病変スコア及び死亡率％について評価した。飼料効率は、０日目から２８日目までに１ｋｇの体重をもたらすのに必要とされる食品のｋｇ量の比率として算出した。例えば、１．６という飼料効率は１ｋｇの体重をもたらすのに１．６ｋｇの食品が必要とされることを意味する。体重増加は、０日目から２８日目までの体重の増大として測定した。病変スコアは病変の目視観察に基づき、０を正常、３を最も重症とした。ＧＯ−及びＧＯ＋バチルスプロバイオティクスはどちらも、感染陰性対照（処理群２）に比べて死亡率％を低減した。表１８を参照されたい。ＧＯ＋プロバイオティクス処理により処置したニワトリ雛における死亡率％は、バシトラシンで処置したニワトリ雛と比較して低かったが、この差は統計的に有意ではなかった。ＧＯ＋プロバイオティクス処理群及び抗生物質処理群はどちらも、感染陰性対照に比べて体重増加の有意な増大を示した。これらの結果から、ＧＯ＋プロバイオティクスによるニワトリ飼料の処理が、病原体チャレンジ中に標準抗生物質処理と比較して同じか又はより良好な結果を達成したことが示される。
【０２４７】
【表１９】
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【０２４８】
実施例１８：ビブリオ種に感染させた二枚貝に対するプロバイオティクスの効果
幼生個体激減事象が生じたフロリダ州の双殻類孵化場を、個体激減の原因について孵化場における細菌負荷を単離し、定量化することによって評価した。ビブリオ種が源水中に見られる好気性菌数（４×１０４ｃｆｕ／ｍｌ）の１００％、孵化場の好気性菌数（２×１０４ｃｆｕ／ｍｌ）のおよそ５０％を占めることが決定された。この大きなビブリオ集団のうち、異なる培地にわたる２つの優勢コロニー形態が見られ、同定に出した。観察された２つの優勢ビブリオ株は、ビブリオ・チャガシイ及びビブリオ・コラリイリティカスであった。ビブリオ・コラリイリティカスは双殻類に対して毒性であることが示されている。
【０２４９】
バチルス・リケニホルミス、バチルス・サブチリス及びバチルス・プミルスの個々の株についてのビブリオ成長に対する排他域の測定及びバイオフィルム形成の制限から、これらのバチルス株が試験したビブリオ株の殆どに対して中程度から良好な活性を有することが見出されることが示された。これらの結果は、バチルス株が孵化場から単離されたビブリオ種の株よりもバイオフィルム形成において優れており、ビブリオバイオフィルムに対する直接効果を有することを示す。
【０２５０】
ビブリオ株に感染させた二枚貝幼生タンクを、２つのバチルス・リケニホルミス株、１つのバチルス・サブチリス株及び１つのバチルス・プミルス株を同率で含有する４株プロバイオティクスブレンドで処理した。バチルス株を、上記のようにＧＯ＋（Ｌ−アラニンを用いる）又はＧＯ−（Ｌ−アラニンを用いない）として噴霧乾燥することによって配合した。プロバイオティクスは、噴霧乾燥配合物を１リットルの水に懸濁させた後、懸濁液を５×１０５ｃｆｕ／ｍｌの用量で毎日の水交換後に即座にタンクに添加することによってタンクに添加した。二枚貝幼生を、処理期間の開始時及び毎日の処理の開始後１２日目に種々のサイズのメッシュフィルター（１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ又は３００μｍ）で篩分した。１２日目に、各スクリーンサイズで見られる生二枚貝幼生の数を幼生の開始数に対して記録した。表１９を参照されたい。二枚貝の個体激減事象中に、非処理タンクは約１０％の生存率しか有しなかったが、ＧＯ−処理タンクは約２０％の生存率を有し、ＧＯ＋処理タンクは約４０％の生存率を有していた。さらに、プロバイオティクス処理は成長速度を増大し（より多くの幼生がより大きなスクリーンで回収される）、ＧＯ＋処理タンクが最も速く成長した。
【０２５１】
【表２０】
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【０２５２】
実施例１９：胆汁酸塩を含むニワトリ飼料抽出物中のバチルス・リケニホルミスの配合物を評価する閉鎖系における生物学的酸素要求量（ＢＯＤ）の決定
バチルス・リケニホルミスの細菌酸素要求量（ＢＯＤ）を、胆汁酸塩を添加したニワトリ飼料抽出物中で測定し、胆汁酸塩ストレス下で成長する細菌の能力を決定した。ニワトリ飼料を、４ｍＭ  胆汁酸塩（６０％タウロデオキシコール酸塩、３０％グリコデオキシコール酸塩、１０％デオキシコール酸塩）と組み合わせてエネルギー源として使用した。
【０２５３】
培地：胆汁酸塩を添加したニワトリ飼料抽出物の作製
４２．４４ｇのニワトリ飼料（Ｃｈｉｃｋ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｇｒｏｗｅｒ）をビーカーに量り入れた後、コーヒーグラインダーを用いて粉末へと粉砕した。容量を温かい水道水と合計して１リットルとし、混合物を撹拌プレート上で６０分間混合した。１００ｍｌの溶液を２本の「予備試験フラスコ」を含む２５０ｍＬ容バッフル付き振盪フラスコに分注し、オートクレーブにかけた。
【０２５４】
胆汁酸塩ストック溶液（ＢＳＳＳ）：
１．  １．８ｇのタウロデオキシコール酸塩
２．  ０．９ｇのグリコデオキシコール酸塩
３．  ０．３ｇのデオキシコール酸塩
各成分を少量の水道水中で溶解するまで別個に混合した後、溶液を合わせて混合し、３０ｍＬにし、濾過滅菌した。
【０２５５】
１．０Ｎ  ＨＣｌ溶液を作製し、上記の予備試験フラスコに添加してｐＨを２．２５まで低下させた。ｐＨの低下に使用されるＨＣｌの容量を記録した。正確に９０分後にｐＨを記録した（この間にｐＨが上昇した）。１．６ｍｌのＢＳＳＳを各フラスコに添加した。１５分後に、１．０Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７．５まで増大させた。使用されるＮａＯＨの容量を記録した。１５分後にｐＨを記録した（この期間中にｐＨが降下した）。結果を平均し、この量を用いてニワトリ飼料抽出物を含有する残りのフラスコを処理した。
【０２５６】
芽胞懸濁液：
ＧＯ＋（上記のようにＬ−アラニンを用いて噴霧乾燥した）又はＧＯ−（上記のようにＬ−アラニンを用いずに噴霧乾燥した）配合物として作製されるバチルス・リケニホルミス株ＥＮＶ１００の芽胞粉末を作製した。配合物を、滅菌ブレンダージャー内で０．１％Ｏｃｔｏｓｏｌ  ＳＬＳ（ＦＴ−ＳＬＳ−２４６ＤＲＵＭ、Tiarco Chemical，Dalton，GA）を含む滅菌水に懸濁させた。芽胞は、５秒間隔で少なくとも合計１５秒間又は芽胞が完全に懸濁したと視認されるまでブレンドすることによって懸濁させ、続いて滅菌水中で段階希釈した。これをＢＯＤボトル中の最終濃度が５×１０７ｃｆｕ／ｍｌ又は５×１０３ｃｆｕ／ｍｌとなるように行った。
【０２５７】
ＢＯＤアッセイ：
生物学的酸素要求量（ＢＯＤ）を、ＢＯＤＴＲＡＫＩＩ機器（Hach  ２９５２４５０）で取扱説明書に従って測定した。上記の胆汁酸塩を含有する作製したニワトリ飼料抽出物２ｍｌを、ＢＯＤボトル内の９８ｍｌの水に添加し、オートクレーブにかけ、室温まで冷却した。ＢＯＤＴＲＡＫＩＩ機器及びボトルは接種前に３７℃でプレインキュベートした。ボトルに上記のように接種し、取扱説明書に従って即座に密閉し、３７℃でインキュベートした。アッセイが完了した後、データを機器からダウンロードし、およそ１０μｌの培養物をＰＣＡプレートに画線し、純度を試験した。
【０２５８】
表２０に示されるように、バチルス・リケニホルミス芽胞のＧＯ＋配合物は胆汁酸塩ストレス条件での成長を可能にし、対照処理に対して代謝（生物学的酸素要求量によって測定される）の増大をもたらした。これらのデータから、ＧＯ＋配合物が胆汁ストレス条件下でのバチルス・リケニホルミス成長を改善することが実証される。
【０２５９】
【表２１】
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