(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸管微生物メタゲノム特徴がバクテロイデス属腸型であることをスクリーニングマーカーとして、２型糖尿病患者のアカルボース治療効果をスクリーニングする方法。
【請求項２】
前記腸管微生物メタゲノム特徴が前記バクテロイデス属腸型であることは、生体外糞便内の寄生菌のＤＮＡに対してシーケンシングまたはＰＣＲ増幅を行うことによって確定される、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＣＲ増幅は、生体外糞便内の寄生菌ＤＮＡを抽出し、特異に増加させる菌属に対して１６Ｓｒｎａ  ＰＣＲ増幅を行うことを含む、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記腸管微生物メタゲノム特徴が前記バクテロイデス属腸型であることは、生体外血液サンプル内の二次胆汁酸を測定することによって確定される、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記二次胆汁酸の測定は、
７５μＬの血液サンプルにつき、３００μＬの内部標準含有メタノールを加え、ターゲット化合物を抽出し且つタンパク質を沈殿させ、ボルテックスし、遠心分離して、上澄み液を吸い取り、凍結乾燥し、５０μＬの２５％（容積）アセトニトリル含有水溶液で再び溶解し、サンプル注入を待つ、サンプル事前処理工程Ｓ１と、
１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ液相及び６４６０Ａトリプル四重極型質量分析計用システムを使用してサンプル分析を行う測定工程Ｓ２と、
を含み、
液相分離では、１００ｍｍ×２．１ｍｍのＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｃ８クロマトグラフカラム、粒子径１．７μｍが使用され、Ａ相が１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液であり、Ｂ相が純粋なアセトニトリルであり、初期時２５％（容積）Ｂ相で、０．５分保留し、その後１２．５分内に４０％（容積）Ｂ相まで直線的に上昇し、次に、１分内に９０％（容積）Ｂ相まで上昇し、且つシステムを３分リンスし、０．５分内に２５％（容積）Ｂ相まで復帰し、２．５分平衡化し、流速が０．３５ｍｌ／分であり、カラム温度が３５℃であり、注入サンプルの容積が５μＬであり、
質量分析スペクトルがＥＳＩの負イオンモードを使用して測定され、メインパラメータは、Ｇａｓ  Ｔｅｍｐ：３５０℃、Ｇａｓ  Ｆｌｏｗ：８ｌ／分、Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ：４０ｐｓｉ、Ｓｈｅａｔｈ  Ｇａｓ  Ｔｅｍｐ：４００℃、Ｓｈｅａｔｈ  Ｇａｓ  Ｆｌｏｗ：８ｌ／分、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ：３５００Ｖ、Ｎｏｚｚｌｅ  ｖｏｌｔａｇｅ：４００Ｖである、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
バクテロイデス属腸型の２型糖尿病患者のアカルボース治療効果は、血糖降下以外に、インスリン抵抗性の改善、二次胆汁酸の降下、心血管リスク低減の促進を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記二次胆汁酸の降下の指標は、ＧＤＣＡ、ＴＤＣＡ、ＴＬＣＡを含み、タウリン結合胆汁酸の降下の指標は、ＴＣＡ、ＴＤＣＡ、ＴＬＣＡ、ＴＵＤＣＡを含む、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記インスリン抵抗性の改善の指標は、空腹時血糖の降下、空腹時Ｃペプチド及びインスリンレベルの降下、ウエストヒップ比の下方制御、ＨＯＭＡインスリン抵抗性指数の下方制御、アディポネクチンの上方制御を含む、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記心血管リスク低減の促進の指標は、ＰＤＧＦＡＡ、ＰＤＧＦＡＡＢＢ、エンドセリン、ＶｅｇｆＣ血漿因子の降下を含む、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
２型糖尿病患者のアカルボース治療効果をスクリーニングするための試薬キットであって、
前記試薬キットは、
（ｉ）生体外糞便サンプルまたは生体外血液サンプルを収集する試薬と、
（ｉｉ）生体外糞便サンプル内の寄生菌のＤＮＡに対してシーケンシングまたはＰＣＲ増幅を行うことによって前記２型糖尿病患者の腸管微生物メタゲノム特徴がバクテロイデス属腸型であることを確定する試薬、または、生体外血液サンプル内の二次胆汁酸を測定することによって前記２型糖尿病患者の腸管微生物メタゲノム特徴がバクテロイデス属腸型であることを確定する試薬と、
を含む、
ことを特徴とする試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は具体的に、腸管微生物メタゲノム特徴の２型糖尿病のアカルボース治療効果のスクリーニングマーカーとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、２型糖尿病の治療分野において、薬物治療効果に対する判断、及び治療前の分型診断はまだ揃っていない。２型糖尿病の病理生理メカニズムに基づき、主にインスリン抵抗性及びインスリン分泌欠陥に分けられる。２型糖尿病の治療分野では、インスリン抵抗性及びインスリン分泌欠陥に対する薬物がそれぞれ存在するが、患者本人に対してインスリン抵抗性をメインとするか分泌欠陥をメインとするかについての分型診断については、まだ科学的な簡素な方法がなかった。
【０００３】
現有の臨床上実行可能な手段は、患者のＢＭＩ、ウェストサイズ及びインスリンレベルを測定することである。ＢＭＩ、ウェストサイズが中国人の標準を超え、または患者の空腹時血糖及びインスリンレベルを通じてＨＯＭＡＩＲ値を計算すれば、インスリン抵抗性が存在するか否かを判断できるが、インスリンレベルの国際または国内汎用標準がなく、普通患者の血糖及びインスリンによってＨＯＭＡβ指数を計算して得て代表しているが、インスリン抵抗性及びインスリン分泌欠陥の程度を判断する指標とすることができないため、正確な医療のニーズを満足できない。
【０００４】
臨床上で現在インスリン抵抗性及びβ細胞機能を正確に評価できる試験がグルコースクランプ試験である。インスリン抵抗性レベルを評価するには高インスリン正常血糖クランプ法を使用するが、β細胞インスリン分泌機能を評価するには高血糖クランプ法を使用する。前記二つの方法は時間が長く、患者は４〜５時間寝ていなければならなく、経験を有する医療人員が操作する必要があり、患者に対して複数箇所から採血を行い、リアルタイムに血糖をモニタリングし、同時にインスリンレベルを測定しなければならない。コストが高く、患者のコンプライアンスが悪く、臨床に展開しにくい。
【０００５】
いわゆる正確な医学は臨床個体化診療の訴求を一定の高さにまで向上させる。腫瘍標的薬物はすでに臨床までに応用されている。しかし今までも現在も、２型糖尿病の標的治療の有効手段は一つもなかった。２型糖尿病の治療案が多く、患者の反応が様々であることは、２型糖尿病の血糖制御率の低いことに至る１つの原因である。２型糖尿病の主要発病メカニズムに対し、インスリン分泌欠陥及びインスリン抵抗性の薬物の種類は少なくはないが、患者本人のインスリン抵抗性をメインとするか、インスリン分泌欠陥をメインとするかについては簡単・正確な臨床診断方法がなかった。
【０００６】
現在の研究では、肝臓、脂肪（インスリン抵抗性）及び膵島β細胞（膵島機能）を２型糖尿病の発病の主要器官としている。但し最近、腸管微生物群落及び腸管粘膜上皮吸収、遮断並びに内分泌機能の病理生理の２型糖尿病の発病メカニズム及び治療策略における地位がますます重視されている。例えば腸管菌群メタゲノムの研究は、腸管菌群は２型糖尿病患者及び正常患者にて顕著な差が存在し（非特許文献１）、腸管変更術のダイエット手術が肥満患者の体重を減らしたと同時に、意外にも肥満型２型糖尿病患者の血糖を手術後、薬物の治療から脱離しても良好に制御させ、ひいては徹底に治癒したことを発見した（非特許文献２、３）。一方、腸管ホルモンの作用を模擬する薬物、例えばＧＬＰ―１アゴニスト及びＤＰＰＩＶ阻害薬等もすでに世界的に処方量の最大な経口投与の血糖降下薬になっており、且つ少なくない心血管の受益になっている。
【０００７】
腸型（非特許文献４）の概念が Ｐｅｅｒ Ｂｏｒｋによって初めて提出され、その意味はすなわち腸管寄生菌の組成成分が集団において比較的固定的であるモードを有する。集団はほぼ２〜３に分類されることができ、サンプルの増加及びシーケンス測定技術の向上、特に二世代シーケンス測定の推進に伴って、現在の腸型分型が２種類を有し、１つはプレボテラ属をメインとするプレボテラ腸型、他１つはバクテロイデス属をメインとするバクテロイデス腸型である。現在、腸型と人体の様々な医療健康指標とは直接関連する根拠がなく、対応する遺伝子機能研究は、異なる腸型ではビタミンに対する代謝能力が異なっており、且つ宿主が生臭物を食べるか否かの飲食習慣に関わることを提示した。腸管寄生菌群も薬物の人体内代謝に参与する１つの重要な媒体として認められたが（非特許文献５）、現在、証明可能な臨床試験根拠はまだない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｑｉｎ, Ｊ., ｅｔ ａｌ., Ａ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ. Ｎａｔｕｒｅ, ２０１２.
【非特許文献２】Ｃａｒｌｓｓｏｎ, Ｌ.Ｍ.Ｓ., ｅｔ ａｌ., Ｂａｒｉａｔｒｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ ２ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｏｂｅｓｅ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ. Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ, ２０１２. ３６７（８）： ｐ. ６９５−７０４
【非特許文献３】Ｓｃｈａｕｅｒ, Ｐ.Ｒ., ｅｔ ａｌ., Ｂａｒｉａｔｒｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ ｖｅｒｓｕｓ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｍｅｄｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｄｉａｂｅｔｅｓ−３−ｙｅａｒ ｏｕｔｃｏｍｅｓ. Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ, ２０１４. ３７０（２１）： ｐ. ２００２−１３）
【非特許文献４】Ａｒｕｍｕｇａｍ, Ｍ., ｅｔ ａｌ., Ｅｎｔｅｒｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ. Ｎａｔｕｒｅ, ２０１１. ４７３（７３４６）： ｐ. １７４−８０
【非特許文献５】Ｈａｉｓｅｒ, Ｈ.Ｊ. ａｎｄ Ｐ.Ｊ. Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ, Ｉｓ ｉｔ ｔｉｍｅ ｆｏｒ ａ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ？ Ｓｃｉｅｎｃｅ, ２０１２. ３３６（６０８６）： ｐ. １２５３−５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、前記従来の技術に存在する腸型と人体の様々な医療健康指標との直接関係根拠が欠乏している欠陥に対し、腸管メタゲノム特徴を２型糖尿病のアカルボース治療効果のスクリーニングマーカーとすることを提供し、具体的には腸管微生物マクロジェン特徴の２型糖尿病のアカルボース治療効果のスクリーニングマーカーにおける用途を供給する。本発明では最初に、異なる腸管寄生菌群を有する２型糖尿病患者では、糖尿病の血糖降下薬、アカルボースに対する治療反応において差が顕著であることを発見したため、バクテロイデス属をメインとするバクテロイデス腸型を２型糖尿病患者のアカルボース治療効果のスクリーニングマーカーとすることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は以下の技術的な解決手段によって実現される。
本発明は、２型糖尿病のアカルボース治療効果のスクリーニングマーカーとしての腸管微生物メタゲノム特徴の使用であって、前記腸管微生物メタゲノム特徴がバクテロイデス属腸型である使用に関する。
【００１１】
好ましくは、前記バクテロイデス属腸型は、生体外糞便内の寄生菌のＤＮＡに対してシーケンシングまたはＰＣＲ増幅を行うことによって確定される。
【００１２】
好ましくは、前記ＰＣＲ増幅は具体的に、生体外糞便内の寄生菌ＤＮＡを抽出し、特異に富ませる菌属に対して、１６Ｓｒｎａ  ＰＣＲ増幅を行うことを含む。
【００１３】
好ましくは、前記バクテロイデス属腸型は、生体外血液サンプル内の二次胆汁酸を測定することによって確定され、前記二次胆汁酸はＵＤＣＡ、ＴＵＤＣＡ、ＧＵＤＣＡ、ＤＣＡ、ＴＤＣＡ、ＧＤＣＡ、ＬＣＡ、ＴＬＣＡ、ＧＬＣＡを含む。本発明の研究対象では、主に２種類の腸型を発見しており、１つはプレボテラをメインとするプレボテラ腸型、他１つはバクテロイデスをメインとするバクテロイデス腸型である。バクテロイデス腸型において、二次胆汁酸におけるデオキシコール酸及びリトコール酸レベルがプレボテラ腸型より顕著に低く、一方、保護作用を有するウルソデオキシコール酸がプレボテラ腸型より高い。さらに、腸管メタゲノムの分析の結果、ウルソデオキシコール酸をさらにリトコール酸に分解するＫＯがプレボテラ腸型内に豊富であることを発見した。２種類の腸型の患者、それらの腸管菌群の胆汁酸を代謝する能力が顕著に異なっていることを示している。
【００１４】
好ましくは、前記二次胆汁酸の測定は、
７５μＬの血液サンプルにつき、３００μＬの内部標準含有メタノールを加え、ターゲット化合物を抽出し且つタンパク質を沈殿させ、ボルテックスし、遠心分離して、上澄み液を吸い取り、凍結乾燥し、５０μＬの２５％（容積）アセトニトリル含有水溶液で再び溶解し、サンプル注入を待つ、サンプル事前処理工程Ｓ１と、
１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ液相及び６４６０Ａトリプル四重極型質量分析計用システムを使用してサンプル分析を行う測定工程Ｓ２と、
を含み、
液相分離では、１００ｍｍ×２．１ｍｍのＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｃ８クロマトグラフカラム、粒子径１．７μｍが使用され、Ａ相が１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液であり、Ｂ相が純粋なアセトニトリルであり、初期時２５％（容積）Ｂ相で、０．５分保留し、その後１２．５分内に４０％（容積）Ｂ相まで直接的に上昇し、次に、１分内に９０％（容積）Ｂ相まで上昇し、且つシステムを３分リンスし、０．５分内に２５％（容積）Ｂ相まで復帰し、２．５分平衡化し、流速が０．３５ｍｌ／分であり、カラム温度が３５℃であり、注入サンプルの容積が５μＬであり、
質量分析スペクトルがＥＳＩの負イオンモードを使用して測定され、メインパラメータは、Ｇａｓ  Ｔｅｍｐ：３５０℃、Ｇａｓ  Ｆｌｏｗ：８ｌ／分、Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ：４０ｐｓｉ、Ｓｈｅａｔｈ  Ｇａｓ  Ｔｅｍｐ：４００℃、Ｓｈｅａｔｈ  Ｇａｓ  Ｆｌｏｗ：８ｌ／分、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ：３５００Ｖ、Ｎｏｚｚｌｅ  ｖｏｌｔａｇｅ：４００Ｖである。
【００１５】
好ましくは、バクテロイデス属腸型の２型糖尿病患者のアカルボース治療効果は、血糖降下以外に、インスリン抵抗性の改善、二次胆汁酸の降下、心血管リスク低減の促進を含む。
【００１６】
好ましくは、前記有害な二次胆汁酸の降下の指標は、ＧＤＣＡ、ＴＤＣＡ、ＴＬＣＡを含み、タウリン結合胆汁酸の降下の指標は、ＴＣＡ、ＴＤＣＡ、ＴＬＣＡ、ＴＵＤＣＡを含む。
【００１７】
好ましくは、前記インスリン抵抗性の改善の指標は、空腹時血糖の降下、空腹時Ｃペプチド及びインスリンレベルの降下、ウエストヒップ比の下方制御、ＨＯＭＡインスリン抵抗性指数の下方制御、アディポネクチンの上方制御を含む。
【００１８】
好ましくは、前記心血管リスク低減の促進の指標は、ＰＤＧＦＡＡ、ＰＤＧＦＡＡＢＢ、エンドセリン、ＶｅｇｆＣ血漿因子の降下を含む。
【００１９】
本発明はさらに、２型糖尿病のアカルボース治療効果のスクリーニングに用いられる試薬キットであって、前記試薬キットは、
生体外糞便サンプルまたは生体外血液サンプルを収集する試薬と、
生体外糞便サンプル内の寄生菌のＤＮＡに対してシーケンシングまたはＰＣＲ増幅を行うことによって腸型を確定する試薬、または、生体外血液サンプル内の二次胆汁酸を測定することによって腸型を確定する試薬と、
を含む。
【００２０】
検出された腸型は主に２種類の腸型を有し、１つはプレボテラをメインとするプレボテラ腸型で、他１つがバクテロイデスをメインとするバクテロイデス腸型である。異なる腸型は患者のアカルボースを受け入れて糖尿病を治療する受益、特に血糖降下以外のインスリン抵抗性の改善、二次胆汁酸の降下、心血管リスク低減の促進に関する作用を予測できる。具体的に言うと、バクテロイデス属腸型は、血糖降下以外のインスリン抵抗性の改善、二次胆汁酸の降下、心血管リスク低減の促進に関する作用をよりよく有する。
【発明の効果】
【００２１】
従来の技術と比べ、本発明は以下の有益な効果を有する。
１）本発明は、まず、異なる腸管寄生菌群を有する２型糖尿病患者では、糖尿病の血糖降下薬であるアカルボースに対する治療効果が顕著に異なっているという腸型の概念を発見したことを利用するものである。そのため、前記薬を使用する前に、患者に対して腸型の区分けを行うことによって、最適の治療効果群を選択し、個体の２型糖尿病患者がアカルボースを使用して糖尿病治療の行うことの適否を判断できる。
２）腸型の普通の分類では糞便内の寄生菌のＤＮＡを使用してシーケンシングまたはＰＣＲ増幅を行うが、ベースライン状況下で、胆汁酸成分、特に、二次胆汁酸が腸型に対して良好な分類の役割を有するので、血液におけるマーカー（すなわち血漿における二次胆汁酸のレベル）を通じて腸管寄生菌群落の分型（すなわち腸型）の鑑別を実現し、診断に用いるマーカーとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】腸型分型説明図であり、（Ａ）はバクテロイデス腸型生物属レベルクラスタ及び相関関係、（Ｂ）はプレボテラ腸型生物属レベルクラスタ及び相関関係、（Ｃ）はバクテロイデス属生物存在量の２つの腸型における比較、（Ｄ）はプレボテラ属生物存在量の２つの腸型における比較である（ＥｎｔＢ：バクテロイデス腸型、ＥｎｔＰ：プレボテラ腸型）。
【図２】２種類の腸型における、各種類の臨床治療効果指標のアカルボースの治療後の変化の説明図であり、黒色は治療後の顕著な降下を表し、白色は治療後の顕著な上昇を表し、灰色は治療後顕著な変化がないことを表す（Ｐ＜０．０５）。
【図３】胆汁酸スペクトルの２種類の腸型における差異及びアカルボースの治療後の変化説明図であり、（Ａ）は２種類の腸型のベースラインレベルに差異を有する胆汁酸、（Ｂ）は２種類の腸型の胆汁酸スペクトルの２つの腸型ベースラインにおける差異、（Ｃ）は二次胆汁酸の代謝関連のＫＯの２つの腸型ベースラインレベルにおける差異、（Ｄ）は２種類の腸型のアカルボースの治療後レベルに変化を有する胆汁酸成分及びその信号図である。黒色は治療後の顕著な降下を表し、白色は治療後の顕著の上昇を表し、灰色は治療後顕著な変化がなかったことを表す（Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、実施例に合わせて本発明を詳細に説明する。以下の実施例は当業者の本発明に対する理解に寄与することを目的とするが、いかなる形式でも本発明を制限するものではない。指摘すべきであるのは、当業者にとって、本発明の構想から離脱しない限りに、若干の調整及び改善を行うことができるが、それらは共に本発明の保護範囲内に属する。
【００２４】
（実施例）
初発の２型糖尿病患者に対して薬投与前の肝臓・腎臓機能、血糖・血中脂質指標、腸管ホルモン、炎症因子、および心血管リスク相関因子を評価する。且つ大便、尿、及び血のサンプルを採取する。診断が明確で、評価が完了した後、３ヵ月間毎日アカルボース３００ｍｇ用量で治療を行う。３ヵ月内に月ごとに血糖の訪問観察を行い、血糖に基づいて薬の投与量を調整する。３ヵ月後、薬投与前の評価を再び行い、それと同時に尿、大便及び血液のサンプルを採取する。
【００２５】
具体的なステップを以下に示す。
【００２６】
１．臨床標本の収集
ａ）まず、ランダム開放、陽性対照の方法で、初発の２型糖尿病群及びその正常配偶対照群を収集し、糖尿病患者のアカルボースを服用する前後時期の臨床及び生物化学的資料、胃腸運動状況を比較し、それと同時に血液サンプル及び糞便標本を収集する。初診の、薬投与しなかった２型糖尿病患者に対してルーチン検査を行い、糞便及び血液サンプルを採取する。
糞便サンプルの採集
ｂ）糞便
ｉ．試験器材：プラスチック小皿（直径は家庭用の水洗便所の口径より小さい）
ｉｉ．ポリバッグ、無菌細長柄小匙
ｉｉｉ．無菌５０ｍｌ遠心分離チューブ
ｉｖ．プラスチック小皿（直径は家庭用の水洗便所の口径より小さい）を水洗便所内に入れ、ポリバッグ（ポリバッグの辺縁を便所の水内に浸入させない）を被せて、病院でサンプリングする場合は直接清浄便所内にポリバッグを被せて、糞便サンプルを採取し、
ｖ．細長柄小匙で新鮮な糞便サンプルの上層を均一に混合し、少量を取って無菌の５０ｍｌ遠心分離チューブ内に入れ、チューブ毎に少なくとも１０ｇのサンプルを取り、チューブの蓋を回し締める（遠心分離チューブの壁にはサンプリング時間、サンプリング個体の群別、番号を記載する）。試験対象者の毎回の採取大便を、３チューブのサンプル（ＲＮＡｌａｔｅｒ処理チューブ、グリセリンチューブ、及び無処理チューブ）に取る。
ｖｉ．採集したサンプルを直ちに−８０℃で冷凍保存する。
ｃ）血清標本の留置
ｉ．空腹時で静脈血１５ｍｌを抜き取り、そのうち１．５ｍｌは血漿糖を測定し、残り６．５ｍｌは普通チューブ（トリプシン阻害剤、ＤＰＰＶ阻害薬含有）、６．５ｍｌは抗凝固チューブ（ヘパリヌス及びＲＮＡｌａｔｅｒ含有）に入れ、
ｉｉ．普通チューブ血液を４℃で遠心分離し、血清を析出させた後約３ｍｌを吸い取り、均等に３つの１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ内に分け入れ、チューブの蓋を閉め、
ｉｉｉ．抗凝血チューブは直ちに４℃で遠心分離して、血漿を約３ｍｌ析出させ、均等に３つの１．５ｍｌの輸入ＲＮＡａｓｅ  ｆｒｅｅエッペンドルフチューブ内に入れ、
ｉｖ．チューブに標本姓名、中心番号及びランダム番号を詳細に記載し、
ｖ．シールテープでチューブ蓋を１週間密封し、
ｖｉ．−２０℃で保存（条件が有れば−８０℃）し、分注血漿は直ちに−２０℃またはドライアイス内に置く。
【００２７】
２．胆汁酸測定
試薬：Ｓｏｄｉｕｍ  ｔａｕｒｏｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ（ＴＣＤＣＡ）、Ｓｏｄｉｕｍ  ｇｌｙｃｏｃｈｏｌａｔｅ  ｈｙｄｒａｔｅ（ＧＣＡ）、Ｓｏｄｉｕｍ  ｔａｕｒｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ（ＴＤＣＡ）、Ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＤＣＡ）、Ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＵＤＣＡ）、Ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＣＡ）、Ｓｏｄｉｕｍ  ｇｌｙｃｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ（ＧＤＣＡ）、Ｇｌｙｃｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＧＵＤＣＡ）、Ｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＡ）、Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＣＡ）、Ｓｏｄｉｕｍ  ｇｌｙｃｏｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ（ＧＣＤＣＡ）、Ｓｏｄｉｕｍ  ｔａｕｒｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ（ＴＵＤＣＡ）、Ｓｏｄｉｕｍ  ｔａｕｒｏｌｉｔｈｏｃｈｏｌａｔｅ（ＴＬＣＡ）、Ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＬＣＡ）、ＮＨ４ＨＣＯ３はいずれも米国Ｓｉｇｍａ社から購入。Ｇｌｙｃｏｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ３―Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｄｉｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔ（ＧＣＤＣＳ）は浙江大学試験室で合成。Ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ―ｄ４（ＣＤＣＡ―ｄ４）、Ｇｌｙｃｏｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ―ｄ５  ３―Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｄｉｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔ（ＧＣＤＣＳ―ｄ５）、Ｔａｕｒｏｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ―ｄ５  （ＴＣＤＣＡ―ｄ５）、Ｃｈｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ―ｄ５（ＣＡ―ｄ５）、Ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ―ｄ５（ＧＣＡ―ｄ５）、Ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｙｌｇｌｙｃｉｎｅ（ＧＬＣＡ）はいずれもカナダＴＲＣ社から購入。Ｔａｕｒｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ―ｄ５（ＴＤＣＡ―ｄ５）、Ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ―ｄ５（ＴＣＡ―ｄ５）は米国ＣＩＬ社から購入。アセトニトリル、メタノールはＭｅｒｋ社から購入。
【００２８】
サンプルの事前処理：血液サンプル７５μＬを取り、内部標準含有メタノール３００μＬを加え、ターゲット化合物を抽出し且つタンパク質を沈殿し、３０秒間ボルテックスして、回転速度１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液２００μＬを吸い取り、凍結乾燥し、５０μＬの２５％アセトニトリル含有水溶液で再び溶解し、サンプル注入を待つ。機器の方法：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ液相（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）及び６４６０Ａトリプル四重極型質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）システムでサンプル分析を行う。液相分離は１００ｍｍ×２．１ｍｍのＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｃ８クロマトグラフカラム、粒子径１．７μｍ（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）を使用する。Ａ相が１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液、Ｂ相が純粋なアセトニトリルである。初期時２５％Ｂ相で、０．５分保留する。その後１２．５分内に４０％Ｂまで直線的に上昇する。次に、１分内に９０％Ｂまで上昇し、且つシステムを３分リンスし、０．５分内に２５％Ｂまで復帰し、２．５分平衡化する。流速が０．３５ｍｌ／分、カラム温度が３５℃、注入サンプルの容積が５μＬである。質量スペクトルはＥＳＩの負イオンモードを使用して測定する。主要パラメータは、Ｇａｓ  Ｔｅｍｐ：３５０℃、Ｇａｓ  Ｆｌｏｗ：８ｌ／分、Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ：４０ｐｓｉ、Ｓｈｅａｔｈ  Ｇａｓ  Ｔｅｍｐ：４００℃、Ｓｈｅａｔｈ  Ｇａｓ  Ｆｌｏｗ：８ｌ／分、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ：３５００Ｖ、Ｎｏｚｚｌｅ  ｖｏｌｔａｇｅ：４００Ｖである。各胆汁酸の測定は反応モニタリングモード（ＭＲＭ）を使用する。内部標準の調製濃度及び主要な質量スペクトルパラメータを表１に示し、胆汁酸分析の質量スペクトルパラメータの設置を表２に示す。
【００２９】
【表１】
0006644133.tif 000002
【００３０】
【表２−１】
0006644133.tif 000003
【００３１】
【表２−２】
0006644133.tif 000004
【００３２】
３．腸管菌群ＤＮＡシーケンシング
ＨｉＳｅｑ２５００でシーケンシングを行い、いずれのサンプルも３５０ｂｐ長さのセクションでデータベース構築し、９．９Ｍヒト腸管遺伝子集と比較する。ＩＭＧの門、種、属の生物系統（門レベルが７０％のカバー率及び６５％識別率、属レベルが８５％識別率、及び種レベルが９５％の識別率）を得る。主成分分析の方法（ＰＣＡ）を使用して腸管寄生菌クラスタに対して分析判断を行う。
【００３３】
本発明は患者糞便に対して腸管微生物コロニーＤＮＡ抜出し及びメタゲノム二世代シーケンシングを行い、且つすでに発表された９．９Ｍヒト腸管メタゲノム遺伝子集と比較することを通じ、比較率が約７７％に達する。クラスタ分析の方法によって注釈情報を有する腸管微生物のうち薬投与前後に差異の存在するもの約１４３種を見つけた。属レベルの情報に基づき分析した結果、２型糖尿病患者のベースラインの腸管菌群が異なる密集を有する状況を発見し、それによって特徴性腸管菌群密集の状況に基づき、いわゆる腸型（Ｅｎｔｅｒｏｔｙｐｅ）を得る。本発明の研究対象において、主に２種類の腸型を発見し、１つがプレボテラをメインとするプレボテラ腸型で、他一つがバクテロイデスをメインとするバクテロイデス腸型である（図１）。
【００３４】
腸型に基づいて分型した後、２種類の２型糖尿病患者、性別年齢の分布には顕著な差異がない。ベースライン血糖、体重及び各項の肝臓・腎臓機能等の健康指標には共に顕著な差異がない。赤血球、ヘモグロビン及びインターロイキン６のみがプレボテラ腸型においてやや高くなっている（Ｐ＜０．０５）（表３）。
【００３５】
治療後ベースライン状況下２群の集団の前記薬物の糖尿病の治療に対する治療効果を観察する。
【００３６】
まず、アカルボースの最も主要な治療効果が食後２時間の血糖及び糖化ヘモグロビンの降下程度にある。前記２つの指標は２種類の腸型において差異がなかった（図２、表４）。
【００３７】
第二に、２種類の腸型で空腹時血糖レベルの制御に差異が発生し、治療後の治療前に対する改善であれ、治療後の治療前に対する改善程度であれ、バクテロイデス腸型においてはすべて顕著になっており、一方、プレボテラ腸型の２型糖尿病患者は顕著な空腹時血糖改善がなかった。インスリン、体重、体重指数、ウェストサイズ、心血管リスク因子及び腸管ホルモン等を含むその他の代謝関係指標は、共に顕著な差異が認められた。
【００３８】
空腹時Ｃペプチド及びインスリンレベルが共にバクテロイデス腸型において治療後顕著に降下し、計算の結果、インスリン抵抗性を表すＨＯＭＡＩＲ指数がアカルボースの治療後降下するが、前記受益がバクテロイデス腸型にのみ顕著であり、プレボテラ腸型には降下が顕著ではなかった。バクテロイデス腸型の２型糖尿病患者がアカルボースを投与した後そのインスリン抵抗性の状態をより改善しやすいことを示した。インスリン抵抗性に関し、標準料理に誘導されたインスリン放出曲線、ウエストヒップ比及びアディポネクチンレベルは、共にバクテロイデス腸型のＴ２ＤＭ患者がアカルボースの治療を受けた後顕著に降下し、プレボテラ腸型においては前記治療効果が顕著ではなかった。
【００３９】
アカルボースは血清トリグリセリン、ＡＰＯＡ及び拡張期血圧の降下をもたらし、２つの腸型における治療後の変化には顕著な差異がなかったが、ＰＤＧＦＡＡとＰＤＧＦＡＡＢＢ、エンドセリン、ＶｅｇｆＣ等の一部の糖尿病血管合併症に関する血漿因子がバクテロイデス腸型にて顕著に降下し、より良い血糖降下、大血管病変リスクの降下以外に、バクテロイデス腸型がアカルボースを使用した後より多くの血管合併症を降下させる有益な効果も取得できることを示した。
【００４０】
腸管ホルモンは最近２型糖尿病の治療分野におけるホットターゲットとされ、そのレベルのアカルボースにおける応用も顕著に変わる。測定された複数の腸管ホルモンにおいて、薬投与後上昇したＧＬＰ１、グルカゴン、ＰＹＹ、及び各時間帯のグヘレリン及びＧＩＰは共にバクテロイデス腸型にて顕著であるが、プレボテラ腸型にて顕著ではなかった。アカルボースのいかなる腸管ホルモンをも通じてもたらされた代謝有益な効果は、おそらく共にバクテロイデス腸型においてより顕著であることが示された。
【００４１】
第三に、２種類の腸型はベースラインレベルにおいてすでに胆汁酸スペクトルの差異を表した（図３（Ａ）、（Ｂ））。バクテロイデス腸型において、二次胆汁酸におけるデオキシコール酸及びリトコール酸レベルが顕著にプレボテラ腸型より低く、一方、保護作用の有するウルソデオキシコール酸がプレボテラ腸型より高い。さらに腸管メタゲノム分析は、ウルソデオキシコール酸をさらに分解してリトコール酸にするＫＯが顕著にプレボテラ腸型において豊富であることを発見した（図３（Ｃ））。２種類の腸型の患者、その腸管菌群の胆汁酸を代謝する能力には顕著な差異が存在することが示された。アカルボースで治療した後、胆汁酸の組成差異が２種類の腸型においてより顕著になる（図３（Ｄ））。２種類の一次胆汁酸がアカルボースの治療後２種類の腸型において共に顕著に上昇したが、腸型の特異な変化は発生せず、アカルボースはおそらく全体的に胆汁酸の小腸における再吸収に影響していることが示された。
【００４２】
そのため、前記研究は、異なる腸型は患者のアカルボースの糖尿病治療の受益を予測でき、特に血糖降下以外ではそれはインスリン抵抗性の改善、二次胆汁酸の降下、心血管リスク降下の促進の作用である。腸型の診断は、普通にＤＮＡ  ＰＣＲ増幅した特徴菌属の１６ｓＲＮＡを使用すれば完成でき、便利で経済的である。２型糖尿病の正確な医療に対して新しい可能性をもたらす。
【００４３】
【表３−１】
0006644133.tif 000005
【００４４】
【表３−２】
0006644133.tif 000006
【００４５】
【表３−３】
0006644133.tif 000007
【００４６】
【表３−４】
0006644133.tif 000008
【００４７】
【表３−５】
0006644133.tif 000009
【００４８】
【表３−６】
0006644133.tif 000010
【００４９】
【表３−７】
0006644133.tif 000011
【００５０】
【表４−１】
0006644133.tif 000012
【００５１】
【表４−２】
0006644133.tif 000013
【００５２】
【表４−３】
0006644133.tif 000014
【００５３】
【表４−４】
0006644133.tif 000015
【００５４】
【表４−５】
0006644133.tif 000016
【００５５】
【表４−６】
0006644133.tif 000017
【００５６】
【表４−７】
0006644133.tif 000018
【００５７】
【表４−８】
0006644133.tif 000019
【００５８】
【表４−９】
0006644133.tif 000020
【００５９】
【表４−１０】
0006644133.tif 000021
【００６０】
【表４−１１】
0006644133.tif 000022
【００６１】
（付記）
（付記１）
２型糖尿病のアカルボース治療効果のスクリーニングマーカーとしての腸管微生物メタゲノム特徴の用途であって、
前記腸管微生物メタゲノム特徴がバクテロイデス属腸型である、
ことを特徴とする用途。
【００６２】
（付記２）
前記バクテロイデス属腸型は、生体外糞便内の寄生菌のＤＮＡに対してシーケンシングまたはＰＣＲ増幅を行うことによって確定される、
ことを特徴とする付記１に記載の用途。
【００６３】
（付記３）
前記ＰＣＲ増幅は、具体的に、生体外糞便内の寄生菌ＤＮＡを抽出し、特異に増加させる菌属に対して、１６Ｓｒｎａ  ＰＣＲ増幅を行うことを含む、
ことを特徴とする付記２に記載の用途。
【００６４】
（付記４）
前記バクテロイデス属腸型は、生体外血液サンプル内の二次胆汁酸を測定することによって確定される、
ことを特徴とする付記１に記載の用途。
【００６５】
（付記５）
前記二次胆汁酸の測定は、
７５μＬの血液サンプルにつき、３００μＬの内部標準含有メタノールを加え、ターゲット化合物を抽出し且つタンパク質を沈殿させ、ボルテックスし、遠心分離して、上澄み液を吸い取り、凍結乾燥し、５０μＬの２５％（容積）アセトニトリル含有水溶液で再び溶解し、サンプル注入を待つ、サンプル事前処理工程Ｓ１と、
１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ液相及び６４６０Ａトリプル四重極型質量分析計用システムを使用してサンプル分析を行う測定工程Ｓ２と、
を含み、
液相分離では、１００ｍｍ×２．１ｍｍのＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｃ８クロマトグラフカラム、粒子径１．７μｍが使用され、Ａ相が１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液であり、Ｂ相が純粋なアセトニトリルであり、初期時２５％（容積）Ｂ相で、０．５分保留し、その後１２．５分内に４０％（容積）Ｂ相まで直線的に上昇し、次に、１分内に９０％（容積）Ｂ相まで上昇し、且つシステムを３分リンスし、０．５分内に２５％（容積）Ｂ相まで復帰し、２．５分平衡化し、流速が０．３５ｍｌ／分であり、カラム温度が３５℃であり、注入サンプルの容積が５μＬであり、
質量分析スペクトルがＥＳＩの負イオンモードを使用して測定され、メインパラメータは、Ｇａｓ  Ｔｅｍｐ：３５０℃、Ｇａｓ  Ｆｌｏｗ：８ｌ／分、Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ：４０ｐｓｉ、Ｓｈｅａｔｈ  Ｇａｓ  Ｔｅｍｐ：４００℃、Ｓｈｅａｔｈ  Ｇａｓ  Ｆｌｏｗ：８ｌ／分、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ：３５００Ｖ、Ｎｏｚｚｌｅ  ｖｏｌｔａｇｅ：４００Ｖである、
ことを特徴とする付記４に記載の用途。
【００６６】
（付記６）
バクテロイデス属腸型の２型糖尿病患者のアカルボース治療効果は、血糖降下以外に、インスリン抵抗性の改善、二次胆汁酸の降下、心血管リスク低減の促進を含む、
ことを特徴とする付記１に記載の用途。
【００６７】
（付記７）
前記二次胆汁酸の降下の指標は、ＧＤＣＡ、ＴＤＣＡ、ＴＬＣＡを含み、タウリン結合胆汁酸の降下の指標は、ＴＣＡ、ＴＤＣＡ、ＴＬＣＡ、ＴＵＤＣＡを含む、
ことを特徴とする付記６に記載の用途。
【００６８】
（付記８）
前記インスリン抵抗性の改善の指標は、空腹時血糖の降下、空腹時Ｃペプチド及びインスリンレベルの降下、ウエストヒップ比の下方制御、ＨＯＭＡインスリン抵抗性指数の下方制御、アディポネクチンの上方制御を含む、
ことを特徴とする付記６に記載の用途。
【００６９】
（付記９）
前記心血管リスク低減の促進の指標は、ＰＤＧＦＡＡ、ＰＤＧＦＡＡＢＢ、エンドセリン、ＶｅｇｆＣ血漿因子の降下を含む、
ことを特徴とする付記６に記載の用途。
【００７０】
（付記１０）
２型糖尿病のアカルボース治療効果をスクリーニングするための試薬キットであって、
前記試薬キットは、
生体外糞便サンプルまたは生体外血液サンプルを収集する試薬と、
生体外糞便サンプル内の寄生菌のＤＮＡに対してシーケンシングまたはＰＣＲ増幅を行うことによって腸型を確定する試薬、または、生体外血液サンプル内の二次胆汁酸を測定することによって腸型を確定する試薬と、
を含む、
ことを特徴とする試薬キット。
【図１】
0006644133.tif 000023
【図２】
0006644133.tif 000024
【図３】
0006644133.tif 000025