(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、
（ａ）配列番号：７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：７３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：７４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；（ｆ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び（ｇ）Ｋａｂａｔの番号付けによる７１、７２及び７３の位置に（ＲＤＮの）配列番号：７７のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３
を含む、抗体。
【請求項２】
請求項１に記載のヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、
Ａ）
ｉ）配列番号：７のＶＨ配列と配列番号：８のＶＬ配列を含み；又は
ｉｉ）ｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＢ）
ｉ）配列番号：５７のＶＨ配列と配列番号：５８のＶＬ配列を含み
ｉｉ）配列番号：５７のＶＨ配列と配列番号：５９のＶＬ配列を含み
ｉｉｉ）配列番号：５７のＶＨ配列と配列番号：６０のＶＬ配列を含み
ｉｖ）配列番号：５７のＶＨ配列と配列番号：６１のＶＬ配列を含む、抗体。
【請求項３】
ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、抗体。
【請求項４】
ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、
（ａ）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む、抗体。
【請求項５】
ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、
Ａ）
ｉ）配列番号：７のＶＨ配列及び配列番号：８のＶＬ配列を含み、又は
ｉｉ）ｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む；
又はＢ）
ｉ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：５９のＶＬ配列を含み、
ｉｉｉ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：６０のＶＬ配列を含み、
ｉｖ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：６１のＶＬ配列を含む、
抗体。
【請求項６】
ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、
ｉ）配列番号：７のＶＨ配列及び配列番号：８のＶＬ配列を含み、又は
ｉｉ）ｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む、
抗体。
【請求項７】
ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：５８のＶＬ配列を含む抗体。
【請求項８】
ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：５９のＶＬ配列を含む抗体。
【請求項９】
ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：６０のＶＬ配列を含む抗体。
【請求項１０】
ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：６１のＶＬ配列を含む抗体。
【請求項１１】
変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する全長ＩｇＧ１抗体である、請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１から１１の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１４】
抗体が産生されるように請求項１３に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体の製造方法。
【請求項１５】
宿主細胞から抗体を回収することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体と薬学的に許容可能な担体とを含有する薬学的製剤。
【請求項１７】
医薬として使用するための、請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
がんの治療に使用するための、請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
医薬の製造における請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２０】
医薬ががんの治療のためのものである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
請求項１に記載の抗体の有効量を含む、がんを有する個体を治療するための医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗ＰＤ−１抗体と同抗体を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
［ＰＤ−１］
Ｔ細胞に対する同時刺激又は２つの別々のシグナルの提供は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による休止Ｔリンパ球のリンパ球活性化の広く受け入れられたモデルである（Lafferty等, Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 53: 27-42 (1975)）。
【０００３】
このモデルは、さらに、非自己からの自己の識別と免疫寛容をもたらす（Bretscher等, Science 169: 1042-1049 (1970)；Bretscher, P. A., P. N. A. S. USA 96: 185-190 (1999)；Jenkins等, J. Exp. Med. 165: 302-319 (1987)）。一次シグナル、又は抗原特異的シグナルが、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に関連して提示される外来抗原ペプチドの認識に続いてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を通じて伝達される。二次又は同時刺激シグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現される同時刺激分子によりＴ細胞に送達され、Ｔ細胞のクローン増殖、サイトカイン分泌及びエフェクター機能の促進を誘導する（Lenschow等, Ann. Rev. Immunol. 14: 233 (1996)）。同時刺激がない場合、Ｔ細胞は抗原刺激に不応性になり得、効果的な免疫応答を開始せず、更に外来抗原に対する消耗又は寛容を生じうる。
【０００４】
ＴＣＲシグナルの強度はＴ細胞の活性化及び分化に対して実際に量的な影響を有しているため、簡単な２シグナルモデルは過度の単純化でありうる（Viola等, Science 273: 104-106 (1996)；Sloan-Lancaster, Nature 363: 156-159 (1993)）。更に、ＴＣＲシグナル強度が高い場合、同時刺激シグナルを欠く場合においてさえＴ細胞活性化が生じうる。より重要なことには、Ｔ細胞は、ポジティブ及びネガティブ双方の二次同時刺激シグナルを受ける。そのようなポジティブ及びネガティブシグナルの調節は、免疫寛容を維持し、自己免疫を防ぎながら、宿主の保護免疫応答を最大限にするために決定的である。
【０００５】
ネガティブな二次シグナルはＴ細胞寛容の誘導に必要と思われる一方、ポジティブなシグナルはＴ細胞活性化を促進する。簡単な２シグナルモデルが依然としてナイーブリンパ球についての妥当な説明を提供する一方、宿主の免疫応答は動的なプロセスであり、同時刺激シグナルは抗原に暴露されたＴ細胞に対しても提供されうる。
【０００６】
同時刺激シグナルの操作が細胞ベースの免疫応答を増強又は終結させるための手段を提供することが示されているので、同時刺激の機構には治療上の興味がある。最近、Ｔ細胞機能障害又はアネルギーが、抑制性受容体のプログラム死１ポリペプチド（ＰＤ−１）の発現の誘導及び持続と同時に生じることが発見されている。その結果、ＰＤ−１の治療的標的化が、強く関心のある分野である。
【０００７】
タンパク質プログラム死１（ＰＤ−１）は、受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーであり、このファミリーは、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ及びＢＴＬＡもまた含む。ＰＤ−１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞及び骨髄系細胞上に発現する（上掲のAgata等；Okazaki等(2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82；Bennett等 (2003) J Immunol 170:711-8）。ファミリーの初期のメンバーであるＣＤ２８及びＩＣＯＳは、モノクローナル抗体添加後のＴ細胞増殖の増大化に対する機能的影響によって発見された（Hutloff等(1999) Nature 397:263-266；Hansen等(1980) Immunogenics 10:247-260）。ＰＤ−１は、アポトーシス細胞における差次的発現のスクリーニングにより発見された（Ishida等 (1992) EMBO J 11 :3887-95）。ファミリーの他のメンバーのＣＴＬＡ−４とＢＴＬＡは、それぞれ、細胞傷害性Ｔリンパ球とＴＨ１細胞における差次的発現のスクリーニングにより発見された。ＣＤ２８、ＩＣＯＳ及びＣＴＬＡ−４は全て、対形成していないシステイン残基を有し、ホモ二量体化を可能にする。対照的に、ＰＤ−１は単量体として存在することが示唆され、他のＣＤ２８ファミリーメンバーに特徴的な対形成していないシステイン残基を欠く。
【０００８】
ＰＤ−１遺伝子は、Ｉｇ遺伝子スーパーファミリーの一部である５５ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質である（Agata等 (1996) bit Immunol 8:765-72）。ＰＤ−１は、膜近位免疫受容体チロシン阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）及び膜遠位チロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む（Thomas, MX. (＼995) J Exp A4edW,: 1953-6；Vivier, E及びDaeron, M (1997) Immunol Today 18:286-91）。ＰＤ−１は、ＣＴＬＡ−４に構造的に類似しているが、Ｂ７−１及びＢ７−２結合に決定的なＭＹＰＰＰＹモチーフを欠く。ＰＤ−１への結合時にＴ細胞活性化を下方調節することが示された、ＰＤ−１の２種のリガンド、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２が同定されている（Freeman等(2000) J Exp Med 192: 1027-34；Latchman等(2001) Nat Immunol 2:261-8；Carter等 (2002) Eur J Immunol 32:634-43）。ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２は両者共に、ＰＤ−１に結合するが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しないＢ７ホモログである。ＰＤ−１の一つのリガンドであるＰＤ−Ｌ１は、様々なヒトがんにおいて豊富に存在する（Dong等(2002) Nat. Med 8:787-9）。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間の相互作用は、腫瘍浸潤性リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体媒介性増殖の低下、及びがん性細胞による免疫回避をもたらす（Dong等(2003) J. MoI. Med. 81:281-7；Blank等(2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314；Konishi等(2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100）。免疫抑制は、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との局所的相互作用の阻害によって逆転させることができ、ＰＤ−Ｌ２とＰＤ−１との相互作用も同様に遮断される場合、その効果は相加的である（Iwai等(2002) Proc. Nat 7. Acad. ScL USA 99: 12293-7；Brown等(2003) J. Immunol. 170:1257-66）。
【０００９】
ＰＤ−１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び骨髄系細胞上に発現するＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである（上掲のAgata等；Okazaki等(2002) Curr Opin Immunol 14: 391779-82；Bennett等(2003) J Immunol YWJl 1-8）。ＰＤ−１欠損動物は、自己免疫性心筋症並びに関節炎及び腎炎を伴うループス様症候群を含む様々な自己免疫性表現型を発症する（Nishimura等(1999) Immunity H: 141-51；Nishimura等(2001) Science 291:319-22）。加えて、ＰＤ−１は、自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、Ｉ型糖尿病及び関節リウマチにおいて役割を果たすことが見出された（Salama等(2003) J Exp Med 198:71-78: Prokunina及びAlarcon-Riquelme (2004) Hum MoI Genet 13_:R143；Nielsen等(2004) Lupus 11:510）。マウスＢ細胞腫瘍株において、ＰＤ−１のＩＴＳＭは、ＢＣＲ媒介性Ｃａ<２＋>フラックス及び下流エフェクター分子のチロシンリン酸化の遮断に必須であることが示された（Okazaki等(2001) PNAS 98: 13866-71）。
【００１０】
次のものを含む様々な特許出願が、抗ＰＤ−１抗体の生産及び／又はＰＤ−Ｌ１結合及び／又はＰＤ−１シグナル伝達を妨げる薬剤（抗ＰＤ−１抗体を含む）を用いた免疫応答の増強方法を開示している：米国特許出願公開第２００３／００３９６５３号、米国特許出願公開第２００４／０２１３７９５号、米国特許出願公開第２００６／０１１０３８３号、米国特許出願公開第２００７／００６５４２７号、米国特許出願公開第２００７／０１２２３７８号、米国特許出願公開第２０１２／２３７５２２号、国際公開第２００４／０７２２８６号、国際公開第２００６／１２１１６８号、国際公開第２００６／１３３３９６号、国際公開第２００７／００５８７４号、国際公開第２００８／０８３１７４号、国際公開第２００８／１５６７１２号、国際公開第２００９／０２４５３１号、国際公開第２００９／０１４７０８号、国際公開第２００９／１１４３３５号、国際公開第２０１０／０２７８２８号、国際公開第２０１０／０２７４２３号、国際公開第２０１０／０３６９５９号、国際公開第２０１０／０２９４３５号、国際公開第２０１０／０２９４３４号、国際公開第２０１０／０６３０１１号、国際公開第２０１０／０８９４１１号、国際公開第２０１１／０６６３４２号、国際公開第２０１１／１１０６０４号、国際公開第２０１１／１１０６２１号、及び国際公開第２０１２／１４５４９３号。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、抗ＰＤ１抗体と同抗体を使用する方法を提供する。
【００１２】
本発明の一態様は、そのようなＰＤ−１抗体であって、
ｉ）ＰＤ１−０１０３のＶＨとＶＬを含む抗ＰＤ−１抗体とＰＤ−１への結合について競合し、及び／又は
ｉｉ）ヒト及びカニクイザルＰＤ−１に結合し；及び／又は
ｉｉｉ）１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で同種異系の刺激されたＴ細胞によるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）分泌を８５％以上増強し；及び／又は
ｉｖ）１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で同種異系の刺激されたＴ細胞による腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）分泌を２００％以上増強する、抗体である。
【００１３】
本発明の他の態様は、ヒトＰＤ１に結合する抗体であって、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で同種異系の刺激されたＴ細胞によるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）分泌を８５％以上増強する抗体である。
【００１４】
本発明の他の態様は、ヒトＰＤ１に結合する抗体であって、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で同種異系の刺激されたＴ細胞による腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）分泌を２００％以上増強する抗体である。
【００１５】
本発明は、ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、
Ａ）（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｂ）（ａ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｃ）（ａ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｄ）（ａ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｅ）（ａ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｆ）（ａ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｇ）（ａ）配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、抗体を提供する。
【００１６】
本発明は、ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：３から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：１１から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：１９から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：２７から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：３５から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｆ）（ａ）（ｉ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：４３から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｇ）（ａ）（ｉ）配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：５１から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む、抗体を更に提供する。
【００１７】
本発明は、ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、
Ａ）
ｉ）配列番号：７のＶＨ配列及び配列番号：８のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＢ）
ｉ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：５９のＶＬ配列を含み、
ｉｉｉ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：６０のＶＬ配列を含み、
ｉｖ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：６１のＶＬ配列を含み、
又はＣ）
ｉ）配列番号：１５のＶＨ配列及び配列番号：１６のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＤ）
ｉ）配列番号：２３のＶＨ配列及び配列番号：２４のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＥ）
ｉ）配列番号：３１のＶＨ配列及び配列番号：３２のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＦ）
ｉ）配列番号：３９のＶＨ配列及び配列番号：４０のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＧ）
ｉ）配列番号：４７のＶＨ配列及び配列番号：４８のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＨ）
ｉ）配列番号：５５のＶＨ配列及び配列番号：５６のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む、
抗体を更に提供する。
【００１８】
一実施態様では、本発明に係る抗ＰＤ１抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１９】
一実施態様では、本発明に係る抗ＰＤ１抗体は、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体である。
【００２０】
一実施態様では、本発明に係る抗ＰＤ１抗体は、ＰＤ１に結合する抗体断片である。
【００２１】
一実施態様では、本発明に係る抗ＰＤ１抗体は、Ｆａｂ断片である。
【００２２】
本発明は、先の請求項の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸を提供する。
【００２３】
本発明は、そのような核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００２４】
本発明は、抗体が産生されるように宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法を提供する。
【００２５】
本発明は、抗体を宿主細胞から回収することを更に含む、抗体を産生するそのような方法を提供する。
【００２６】
本発明は、ここに記載の抗体と薬学的に許容可能な担体とを含有する薬学的製剤を提供する。
【００２７】
本発明は、医薬としての使用のためのここに記載の抗体を提供する。
【００２８】
本発明は、がんの治療に使用するためのここに記載の抗体を提供する。
【００２９】
本発明は、医薬の製造におけるここに記載の抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬はがんの治療のためのものである。
【００３０】
本発明は、ここに記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】キメラＰＤ１−０１０３でのＰＤ１の遮断は、同種異系の刺激された初代ヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を強く増強する。
【図２】キメラＰＤ１−０１０３でのＰＤ１の遮断は、同種異系の刺激された初代ヒトＴ細胞によるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−ｇ）分泌を強く増強する。
【図３】キメラＰＤ１−０１０３でのＰＤ１の遮断は、同種異系の刺激された初代ヒトＴ細胞による腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ）分泌を強く増強する。
【図４Ａ】グランザイムＢを産生するＣＤ４Ｔ細胞の頻度。
【図４Ｂ】増加濃度の異なる抗ＰＤ−１抗体の存在下でのＭＬＲの上清中の吸光度（光学密度、Ｏ．Ｄ．）によって検出されたＩＦＮ−γの量。
【図５】５Ａ）異なる抗ＰＤ−１抗体の存在下での抑制されたＴ細胞受容体シグナル伝達の再活性化に対するＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１遮断の影響；５Ｂ）異なる抗ＰＤ−１抗体の存在下での抑制されたＴ細胞受容体シグナル伝達の再活性化に対するＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１遮断の影響。
【図６】ＰＤ１−０１０３のＦａｂと複合体化されたＰＤ１−ＥＣＤの構造。
【図７】Ｆａｂ ＰＤ１−０１０３を含むＰＤ１−ＥＣＤ複合体の構造：ＰＤ１のＡＳＮ５８でのグリコシル化が相互作用に関与する。
【図８】ＰＤ１−ＥＣＤ複合体の構造，Ｆａｂ ＰＤ１−０１０３を含むＰＤ１−ＥＣＤ複合体の構造：エピトープ／パラトープの図。
【図９】Ａｓｎ５８にコア糖側鎖のＰＤ１−Ｆａｂ ＰＤ１−０１０３重鎖の接触：５Åの距離カットオフにより同定された接触。
【図１０】抗体と相互作用するＰＤ１−ＥＣＤの残基−詳細な接触特性を含む配列図−ＰＤ−１。
【図１１】ＰＤ１−ＥＣＤと相互作用する抗体の残基−詳細な接触特性を含む配列図−重鎖。
【図１２】ＰＤ１−ＥＣＤと相互作用する抗体の残基−詳細な接触特性を含む配列図−軽鎖。
【図１３Ａ】Ａｓｎ５８がアグリコシル化のＰＤ１（左）及びＡｓｎ５８でグリコシル化されたＰＤ１（右）に対する異なる抗体の結合（Ｂｉａｃｏｒｅセンサーグラム）
【図１３Ｂ】：Ａｓｎ５８がアグリコシル化のＰＤ１及びＡｓｎ５８でグリコシル化されたＰＤ１に対する異なる抗体の結合−Ｂｉａｃｏｒｅによって決定されたオンオフ速度ｍａｂ。
【図１４Ａ】二重特異性ＣＥＡ−ＣＤ３抗体と組み合わせたニボルマブと比較した、ＰＤ１−０１０３−０３１２（ａＰＤ−１）のインビボ腫瘍増殖阻害−高用量。
【図１４Ｂ】二重特異性ＣＥＡ−ＣＤ３抗体と組み合わせたニボルマブと比較した、ＰＤ１−０１０３−０３１２（ａＰＤ−１）のインビボ腫瘍増殖阻害−高用量。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
ここでの目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はそれはアミノ酸配列変化を含んでいてもよい。幾つかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００３３】
ここで使用される場合、「ＰＤ１」、「ヒトＰＤ１」、「ＰＤ−１」又は「ヒトＰＤ−１」は、ヒトタンパク質ＰＤ１（配列番号：６８）（シグナル配列を持たないタンパク質）／（配列番号：７０）（シグナル配列を有するタンパク質）を指す。ここで使用される場合、「ヒトＰＤ１に結合する」、「ヒトＰＤ１に特異的に結合する」、「ヒトＰＤ１に結合する」抗体又は「抗ＰＤ１抗体」は、１．０×１０−８モル／ｌ以下のＫＤ値、一実施態様では１．０×１０−９モル／ｌ以下のＫＤ値、一実施態様では１．０×１０−９モル／ｌ〜１．０×１０−１３モル／ｌのＫＤ値の結合親和性でヒトＰＤ１抗原又はその細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、例えばＰＤ１細胞外ドメインを使用し表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標），ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）などの標準的な結合アッセイを用いて決定する。
【００３４】
ヒトＰＤ１は、配列番号７０のＰＤ−１残基４９、５８、７４にＮ結合グリコシル化部位を有する（例えば、D.Y. Lin等, PNAS 105 (2008) 3011-3016を参照））。ＰＤ−１のＡｓｎ５８位のコア糖鎖（Ｎ結合グリコシル化）樹は、単糖に関して次の構造を有している。一実施態様では、ＰＤ１のＡｓｎ５８におけるコア糖鎖は、Ａｓｎ５８でＰＤ１に結合した最初の５つの糖（単糖）を意味する。
Ａｓｎ５８−Ｎ−ＧｌｃＮＡｃ（ＦＵＣ）−ＧｌｃＮＡｃ−−ＢＭＡ−ＭＡＮ（図９参照）（ここで、次の略語が使用される）。
［ＧｌｃＮＡｃ］＝ＮＧＡ＝Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミン＝２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノース
［ＦＵＣ］＝α−Ｌ−フコース
［ＢＭＡ］＝β−Ｄ−マンノピラノース
［ＭＡＮ］＝α−Ｄ−マンノピラノース
糖鎖中の最初のＧｌｃＮＡｃは、フコシル化されており、ＧｌｃＮＡｃ（ＦＵＣ）と略記される。
【００３５】
一実施態様では、ＰＤ１のＡｓｎ５８におけるコア糖鎖は、Ａｓｎ５８でＰＤ１に結合する最初の５つの糖（単糖）ＧｌｃＮＡｃ、ＦＵＣ、ＧｌｃＮＡｃ、ＢＭＡ、ＭＡＮを指す。
【００３６】
ここでの「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む、様々な抗体構造を包含する。
【００３７】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【００３８】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原に対する結合を５０％以上遮断する抗体を指し、逆に参照抗体は、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原に対する結合を５０％以上遮断する。例示的な競合アッセイはここに提供される。
【００３９】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の起源又は種に由来する一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【００４０】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００４１】
ここで使用される「細胞傷害性剤」という用語は、細胞機能を抑制もしくは防止し、及び／又は細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性剤には、限定されるものではないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は薬物（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；増殖阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；毒素、例えば小分子毒素又は細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又は変異体を含む）；及び以下に開示される様々な抗腫瘍又は抗がん剤が含まれる。
【００４２】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」は、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な投薬量及び期間での有効な量を指す。
【００４３】
ここでの「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していても存在していなくともよい。ここで特に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat, E.A.等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242に記載のように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００４４】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に四つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般にＶＨ（又はＶＬ）の次の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００４５】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、ここでは互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又はここで定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００４６】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには、初代形質転換細胞と、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではない場合があるが、変異を含みうる。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされ又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異型子孫がここには含まれる。
【００４７】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００４８】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般には、配列のサブグループは、Kabat, E.A.等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔ等にあるサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔ等にあるサブグループＩＩＩである。
【００４９】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基とヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合によっては、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【００５０】
ここで使用される「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変である抗体可変ドメインの領域（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）及び／又は構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域及び／又は抗原接触残基（「抗原接触」）を含む抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、抗体は、ＶＨに三つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに三つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の計六つのＨＶＲを含む。ここでの例示的なＨＶＲには、
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Chothia及びLesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）に生じる抗原接触（MacCallum等 J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、及び９４〜１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ
が含まれる。
【００５１】
特に示されない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、ここでは上掲のＫａｂａｔ等に従って番号付けされる。
【００５２】
「イムノコンジュゲート」は、限定されないが細胞傷害性剤を含む、一又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
【００５３】
「個体」又は「対象」は哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。所定の実施態様では、個体又は対象はヒトである。
【００５４】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により定量して、９５％又は９９％を上回る純度まで精製される。抗体純度の評価法の概説としては、例えばFlatman, S.等, J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87を参照のこと。
【００５５】
「単離された」核酸とは、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、その核酸分子は染色体外に存在しているか又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００５６】
「抗ＰＤ１抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一又は複数の核酸分子を指し、単一のベクター内又は別々のベクター内のそのような核酸分子と、宿主細胞内の一又は複数の位置に存在しているそのような核酸分子を含む。
【００５７】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、例えば、天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造中に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異抗体を除き、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対するものである。従って、「モノクローナル」との修飾語は、実質的に均質な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の生産を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む、様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法はここに記載されている。
【００５８】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、薬学的製剤中に存在していてもよい（先行技術がイムノコンジュゲートを有する場合を含む）。
【００５９】
「天然抗体」は、天然に生じる様々な構造を持つ免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している二つの同一の軽鎖と二つの同一の重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、それに三つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、それに定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、二つの種類のうちの一つに割り当てることができる。
【００６０】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に常套的に含められ、適応症、用法、用量、投与方法、併用療法、禁忌及び／又はそのような治療製品の使用に関する注意事項についての情報を含む説明書を指すために使用される。
【００６１】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないこととしたときの、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のアラインメントは、当該技術分野における技量の範囲内にある様々な方法で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的では、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して作成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社によって著作され、そのソースコードは米国著作権庁（ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９）に使用者用書類と共に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ジェネンテック社（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変動しない。
【００６２】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、又はそれとの、又はそれに対するアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、又はそれとの、又はそれに対するアミノ酸配列同一性％を有するか又は含む所与のアミノ酸配列Ａということもできる）は、次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、そのプログラムのＡ及びＢのアラインメントにおいて完全な一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢ中のアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％と等しくないことが理解されるであろう。特に断らない限り、ここで使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で記載した通りに得られる。
【００６３】
「薬学的製剤」という用語は、その中に含まれている活性成分の生物学的活性が有効になることを可能にする形態であり、かつ製剤が投与される対象に許容できない程度に毒性のある追加の成分を含んでいない調製物を指す。
【００６４】
「薬学的に許容可能な担体」は、活性成分以外の薬学的製剤中の成分であって、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容可能な担体は、限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定剤、又は保存料を含む。
【００６５】
ここで使用される場合、「治療」（及び「治療する」又は「治療すること」など、その文法上の派生語）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床的病理の過程において実施されうる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発の防止、症状の軽減、疾患の直接的又は間接的な病理的帰結の減弱、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後を含む。幾つかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせるか、又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００６６】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に、各ドメインが四つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と三つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む類似構造を有する。（例えば、Kindt, T.J.等 Kuby Immunology, 6版, W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), p91を参照）。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分でありうる。更に、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体に由来するＶＨ又はＶＬドメインを使用しそれぞれ相補的なＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングして、単離されうる。例えば、Portolano, S.等, J. Immunol. 150 (1993) 880-887；Clackson, T.等, Nature 352 (1991) 624-628)を参照。
【００６７】
ここで使用される「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を増やすことができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノム中に組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが作用可能に連結されている核酸の発現をもたらすことができる。そのようなベクターはここでは「発現ベクター」と称される。
【００６８】
Ｉ．組成物及び方法
一態様では、本発明は、本発明の選択された抗ＰＤ１抗体が、ＰＤ１の所定のエピトープに結合し、異なる免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、単球及びマクロファージ）の活性化を増加させる能力を有するという知見に部分的に基づいている。例えば、それらは、免疫調節サイトカイン（例えば、インターフェロンγ及びグランザイムＢ）の放出（分泌）を増加させる。増加するか又は増加されうる他の免疫調節サイトカインは、例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）分泌及びＩＬ−１２である。ここで使用される場合、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）分泌、ＩＬ−１２等という用語はヒトサイトカインを指す。
【００６９】
所定の実施態様では、ＰＤ１に結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、がんの診断又は治療に有用である。
【００７０】
Ａ．例示的抗ＰＤ１抗体
一態様では、本発明はヒトＰＤ１に結合する単離された抗体を提供する。
【００７１】
所定の実施態様では、抗ＰＤ−１抗体が提供され、その抗体は、
ｉ）ＰＤ１−０１０３のＶＨとＶＬを含む抗ＰＤ−１抗体とＰＤ−１への結合について競合し、及び
ｉｉ）ヒト及びカニクイザルＰＤ−１に結合し；及び
ｉｉｉ）１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で同種異系の刺激されたＴ細胞によるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）分泌を８５％以上（好ましい一実施態様では９０％以上、好ましい一実施態様では９５％以上）増強し（抗体を用いない分泌が０％（ＩＦＮγの基底レベル）として設定され、２０ＥＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を用いた分泌が（実施例３による（同種異系）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて）１００％として設定される）；及び／又は
ｉｖ）１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で同種異系の刺激されたＴ細胞による腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）分泌を２００％以上（好ましい一実施態様では２５０％以上）増強する（抗体を用いない分泌が０％（ＩＦＮγの基底レベル）として設定され、２０ＥＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を用いた分泌が（実施例３による（同種異系）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて）１００％として設定される）。
【００７２】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＰＤ１抗体を提供する。
【００７３】
他の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【００７４】
一実施態様では、そのような抗ＰＤ１抗体は、
ｉ）配列番号：７のＶＨ配列及び配列番号：８のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体である。
【００７５】
一実施態様では、そのような抗ＰＤ１抗体は、
ｉ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列を含み；又は
ｉｉ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：５９のＶＬ配列を含み；又は
ｉｉｉ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：６０のＶＬ配列を含み；又は
ｉｖ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：６１のＶＬ配列を含む。
【００７６】
一実施態様では、そのような抗ＰＤ１抗体は、配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列を含む。
【００７７】
一実施態様では、そのような抗ＰＤ１抗体は、配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：５９のＶＬ配列を含む。
【００７８】
一実施態様では、そのような抗ＰＤ１抗体は、配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：６０のＶＬ配列を含む。
【００７９】
一実施態様では、そのような抗ＰＤ１抗体は、配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：６１のＶＬ配列を含む。
【００８０】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ＰＤ１抗体を提供する。
【００８１】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＰＤ１抗体を提供する。
【００８２】
他の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインとを含む。
【００８３】
他の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【００８４】
一実施態様では、そのような抗ＰＤ１抗体は、
ｉ）配列番号：１５のＶＨ配列と配列番号：１６のＶＬ配列を含む；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む。
【００８５】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ＰＤ１抗体を提供する。
【００８６】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＰＤ１抗体を提供する。
【００８７】
他の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインとを含む。
【００８８】
他の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【００８９】
一実施態様では、そのような抗ＰＤ１抗体は、
ｉ）配列番号：２３のＶＨ配列と配列番号：２４のＶＬ配列を含む；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む。
【００９０】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ＰＤ１抗体を提供する。
【００９１】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＰＤ１抗体を提供する。
【００９２】
他の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインとを含む。
【００９３】
他の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【００９４】
一実施態様では、そのような抗ＰＤ１抗体は、
ｉ）配列番号：３１のＶＨ配列と配列番号：３２のＶＬ配列を含む；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む。
【００９５】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ＰＤ１抗体を提供する。
【００９６】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＰＤ１抗体を提供する。
【００９７】
他の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：３５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインとを含む。
【００９８】
他の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：３５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【００９９】
一実施態様では、そのような抗ＰＤ１抗体は、
ｉ）配列番号：３９のＶＨ配列と配列番号：４０のＶＬ配列を含む；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む。
【０１００】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ＰＤ１抗体を提供する。
【０１０１】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＰＤ１抗体を提供する。
【０１０２】
他の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：４３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインとを含む。
【０１０３】
他の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：４３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【０１０４】
一実施態様では、そのような抗ＰＤ１抗体は、
ｉ）配列番号：４７のＶＨ配列と配列番号：４８のＶＬ配列を含む；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む。
【０１０５】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ＰＤ１抗体を提供する。
【０１０６】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＰＤ１抗体を提供する。
【０１０７】
他の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：５１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号：５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインとを含む。
【０１０８】
他の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：５１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号：５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【０１０９】
一実施態様では、そのような抗ＰＤ１抗体は、
ｉ）配列番号：４７のＶＨ配列と配列番号：４８のＶＬ配列を含む；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む。
【０１１０】
好ましい一実施態様では、配列番号：７のＶＨ配列と配列番号：８のＶＬ配列を含む抗ＰＤ１抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。
【０１１１】
好ましい一実施態様では、配列番号：７のＶＨ配列と配列番号：８のＶＬ配列を含む抗ＰＤ１抗体とヒトＰＤ１への結合について競合する（実施例２（エピトープマッピングＥＬＩＳＡ／結合競合アッセイ）に記載の競合アッセイで決定）抗体が提供される。
【０１１２】
一態様では、本発明は、
Ａ）（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む抗ＰＤ１抗体（例えばヒトＰＤ１に結合する抗体）を提供し；又は
他の態様では、本発明は、
（ａ）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号：３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む抗ＰＤ１抗体（例えばヒトＰＤ１に結合する抗体）を提供する。
【０１１３】
一態様では、本発明は、ヒトＰＤ１に結合する抗体であって、
Ａ）
ｉ）配列番号：７のＶＨ配列及び配列番号：８のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＢ）
ｉ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：５９のＶＬ配列を含み、
ｉｉｉ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：６０のＶＬ配列を含み、
ｉｖ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：６１のＶＬ配列を含み、
又はＣ）
ｉ）配列番号：１５のＶＨ配列及び配列番号：１６のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＤ）
ｉ）配列番号：２３のＶＨ配列及び配列番号：２４のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＥ）
ｉ）配列番号：３１のＶＨ配列及び配列番号：３２のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＦ）
ｉ）配列番号：３９のＶＨ配列及び配列番号：４０のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＧ）
ｉ）配列番号：４７のＶＨ配列及び配列番号：４８のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＨ）
ｉ）配列番号：５５のＶＨ配列及び配列番号：５６のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む、
抗体を提供する。
【０１１４】
一態様では、本発明は、
ｉ）配列番号：７のＶＨ配列及び配列番号：８のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む、
ヒトＰＤ１に結合する抗体を提供する。
【０１１５】
一態様では、、本発明は、配列番号：５７のＶＨ配列と配列番号：５８のＶＬ配列を含む、ヒトＰＤ１に結合する抗体を提供する。
【０１１６】
一態様では、、本発明は、配列番号：５７のＶＨ配列と配列番号：５９のＶＬ配列を含む、ヒトＰＤ１に結合する抗体を提供する。
【０１１７】
一態様では、、本発明は、配列番号：５７のＶＨ配列と配列番号：６０のＶＬ配列を含む、ヒトＰＤ１に結合する抗体を提供する。
【０１１８】
一態様では、、本発明は、配列番号：５７のＶＨ配列と配列番号：６１のＶＬ配列を含む、ヒトＰＤ１に結合する抗体を提供する。
【０１１９】
他の態様では、本発明は、
Ａ）（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｂ）（ａ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｃ）（ａ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｄ）（ａ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｅ）（ａ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｆ）（ａ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｇ）（ａ）配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、抗ＰＤ１抗体（例えば、ヒトＰＤ１に結合する抗体）を提供し、ここで、抗体は次の性質の一又は複数によって独立して特徴付けられる：抗ＰＤ−１抗体が、
ｉ）ＰＤ１−０１０３のＶＨとＶＬを含む抗ＰＤ−１抗体とＰＤ−１への結合について競合し、及び／又は
ｉｉ）ヒト及びカニクイザルＰＤ−１に結合し；及び／又は
ｉｉｉ）１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で同種異系の刺激されたＴ細胞によるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）分泌を８５％以上（好ましい一実施態様では９０％以上、好ましい一実施態様では９５％以上）増強し（抗体を用いない分泌が０％（ＩＦＮγの基底レベル）として設定され、２０ＥＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を用いた分泌が（実施例３による（同種異系）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて）１００％として設定される）；及び／又は
ｉｖ）１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で同種異系の刺激されたＴ細胞による腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）分泌を２００％以上（好ましい一実施態様では２５０％以上）増強する（抗体を用いない分泌が０％（ＩＦＮγの基底レベル）として設定され、２０ＥＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を用いた分泌が（実施例３による（同種異系）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて）１００％として設定される）。
【０１２０】
他の態様では、本発明は、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：３から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：１１から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：１９から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：２７から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：３５から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｆ）（ａ）（ｉ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：４３から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｇ）（ａ）（ｉ）配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：５１から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む、抗ＰＤ１抗体（例えば、ヒトＰＤ１に結合する抗体）を提供し、ここで、抗体は次の性質の一又は複数によって独立して特徴付けられる：抗ＰＤ−１抗体が、
ｉ）ＰＤ１−０１０３のＶＨとＶＬを含む抗ＰＤ−１抗体とＰＤ−１への結合について競合し、及び／又は
ｉｉ）ヒト及びカニクイザルＰＤ−１に結合し；及び／又は
ｉｉｉ）１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で同種異系の刺激されたＴ細胞によるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）分泌を８５％以上（好ましい一実施態様では９０％以上、好ましい一実施態様では９５％以上）増強し（抗体を用いない分泌が０％（ＩＦＮγの基底レベル）として設定され、２０ＥＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を用いた分泌が（実施例３による（同種異系）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて）１００％として設定される）；及び／又は
ｉｖ）１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で同種異系の刺激されたＴ細胞による腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）分泌を２００％以上（好ましい一実施態様では２５０％以上）増強する（抗体を用いない分泌が０％（ＩＦＮγの基底レベル）として設定され、２０ＥＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を用いた分泌が（実施例３による（同種異系）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて）１００％として設定される）。
【０１２１】
本発明の更なる態様では、上記実施態様の何れかに記載の抗ＰＤ１抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様では、抗ＰＤ１抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施態様では、抗体は全長抗体、例えばインタクトなＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体又はここで定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。
【０１２２】
更なる態様では、上記の実施態様の何れかに記載の抗ＰＤ１抗体は、以下のセクション１〜７に記載される通りに、特徴の何れかを単独で又は組み合わせて取り込みうる。
【０１２３】
１．抗体親和性
所定の実施態様では、ここで提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数ＫＤを有する。
【０１２４】
好ましい一実施態様では、ＫＤは、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。簡潔に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）が、供給者の説明書に従い、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈した後、結合したタンパク質のおよそ１０応答単位（ＲＵ）を達成するように５μｌ／分の流量で注入する。抗原の注入後、未反応基をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動態測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭから５００ｎＭ））を、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ）界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中、およそ２５ｕｌ／分の流量で２５℃で注入する。会合速度（ｋｏｎ又はｋａ）と解離速度（ｋｏｆｆ又はｋｄ）を、単純な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングさせることにより算出する。平衡解離定数ＫＤは比率ｋｄ／ｋａ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として算出される。例えば、Chen, Y.等, J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによるオン速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、オン速度は、分光計、例えば、ストップフロー式分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを用いる８０００シリーズのＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下でのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を使用することによって決定されうる。
【０１２５】
２．抗体断片
所定の実施態様では、ここに提供される抗体は抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び以下に記載される他の断片を含む。所定の抗体断片の概説については、Hudson, P.J.等, Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg及びMoore (編), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号もまた参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の検討については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【０１２６】
ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許出願公開第０４７４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson, P.J.等, Nat. Med. 9 (2003) 129-134；及びHolliger, P.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照。トリアボディやテトラボディもまたHudson, P.J.等, Nat. Med. 9 (20039 129-134)に記載されている。
【０１２７】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む抗体断片である。所定の実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照）。
【０１２８】
抗体断片は、限定されないが、ここに記載のように、インタクトな抗体のタンパク質消化、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む様々な技術によって作製されうる。
【０１２９】
３．キメラ及びヒト化抗体
所定の実施態様では、ここで提供される抗体はキメラ抗体である。所定のキメラ抗体が、例えば米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison, S.L.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類に由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが、親抗体のものから変化させられている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１３０】
所定の実施態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しつつ、ヒトへの免疫原性を低下させるためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト定常領域の少なくとも一部をまた含むであろう。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０１３１】
ヒト化抗体とそれらの作製方法は、例えば、Almagro, J.C.及びFransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633に概説され、Riechmann, I.等, Nature 332 (1988) 323-329；Queen, C.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号、及び第７０８７４０９号；Kashmiri, S.V.等, Methods 36 (2005) 25-34 （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記載）；Padlan, E.A.等, Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498（「リサーフェシング」を記載）；Dall'Acqua, W.F.等, Methods 36 (2005) 43-60（「ＦＲシャッフリング」を記載）；及びOsbourn, J.等, Methods 36 (2005) 61-68及びKlimka, A.等, Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260（ＦＲシャッフリングへの「ガイドセレクション」アプローチを記載）に更に記載されている。
【０１３２】
ヒト化に使用されうるヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims, M.J.等, J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308）；軽鎖又は重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter, P.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及びPresta, L.G.等, J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C.及びFransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照）；及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca, M.等, J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684及びRosok, M.J.等, J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)を参照）を含む。
【０１３３】
４．ヒト抗体
所定の実施態様では、ここで提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において知られている様々な技術を使用して生産されうる。ヒト抗体は一般にvan Dijk, M.A.及びvan de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374及びLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459に記載されている。
【０１３４】
ヒト抗体は、抗原投与に応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物へ免疫原を投与することにより、調製されうる。そのような動物は、典型的にはヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てもしくは一部を含み、これが内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、又は染色体外にもしくは該動物の染色体内に無作為に取り込まれて存在する。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、通常は不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している米国特許第６０７５１８１号及び６１５０５８４号；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号、及びＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）もまた参照のこと。そのような動物により生成されるインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変されうる。
【０１３５】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によってもまた作製されうる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は記載されている。（例えば、Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005；Brodeur, B.R.等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63；及びBoerner, P.等, J. Immunol. 147 (1991) 86-95を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって作製されたヒト抗体はまたLi, J.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562にも記載されている。更なる方法は、例えば米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載）及びNi, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 （ヒト−ヒトハイブリドーマを記載）に記載されているものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまたVollmers, H.P.及びBrandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937及びVollmers, H.P.及びBrandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191に記載されている。
【０１３６】
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても作製されうる。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。
【０１３７】
５．ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、一又は複数の所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離されうる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための、様々な方法が当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R.等, Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37に概説され、例えば、McCafferty, J.等, Nature 348 (1990) 552-554；Clackson, T.等, Nature 352 (1991) 624-628；Marks, J.D.等, J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597；Marks, J.D.及びBradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175；Sidhu, S.S.等, J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310；Lee, C.V.等, J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093；Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472；及びLee, C.V.等, J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132に更に記載されている。
【０１３８】
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリー中で無作為に組換えられ、ついでこれが、Winter, G.等, Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455に記載されるようにして、抗原結合ファージについてスクリーニングされうる。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として又はＦａｂ断片としての何れかで、抗体断片を提示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要がなく、免疫原に対して高親和性の抗体を提供する。あるいは、Griffiths, A.D.等, EMBO J. 12 (1993) 725-734により記載されるように、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングすることができ、如何なる免疫化も伴わず、広範囲の非自己抗原とまた自己抗原への抗体の単一供給源を提供する。最後に、ナイーブライブラリーは、Hoogenboom, H.R.及びWinter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388に記載されるように、幹細胞から再編成されていないＶ−遺伝子セグメントをクローニングし、無作為配列を含むＰＣＲプライマーを使用して超可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再編成を達成することにより、合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号、及び第２００９／０００２３６０号を含む。
【０１３９】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、ここでのヒト抗体又はヒト抗体断片と考えられる。
【０１４０】
６．多重特異性抗体
所定の実施態様では、ここで提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。所定の実施態様では、結合特異性のうちの一つはＰＤ１に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。所定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＰＤ１の二つの異なるエピトープに結合しうる。二重特異性抗体はまたＰＤ１を発現する細胞に細胞傷害性剤を局在化させるために使用することもできる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製されうる。
【０１４１】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein, C.及びCuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker, A.等, EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照）及び「ノブ−イン−ホール」（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）操作（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号）；二つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号；及びBrennan, M.等, Science 229 (1985) 81-83を参照）；ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を生成すること（例えば、Kostelny, S.A.等, J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照）；二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Holliger, P.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber, M等, J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照）；及び例えば、Tutt, A.等, J. Immunol. 147 (1991) 60-69に記載されるように三重特異性抗体を調製することによって、作製されうる。
【０１４２】
「オクトパス抗体」を含む、三つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体もまたここに含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号を参照）。
【０１４３】
ここでの抗体又は断片はまたＰＤ１並びに別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）。
【０１４４】
ここでの抗体又は断片はまた国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、及び国際公開第２０１０／１４５７９３号、国際公開第２０１１／１１７３３０号、国際公開第２０１２／０２５５２５号、国際公開第２０１２／０２５５３０号、国際公開第２０１３／０２６８３５号、国際公開第２０１３／０２６８３１号、国際公開第２０１３／１６４３２５号、又は国際公開第２０１３／１７４８７３号に記載される多重特異性抗体を含む。
【０１４５】
７．抗体変異体
所定の実施態様では、ここに提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的性質を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により、調製することができる。そのような修飾は、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はそれの置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば抗原結合性を有していることを条件として、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行うことにより、最終コンストラクトに到達することができる。
【０１４６】
ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
所定の実施態様では、一又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。例示的な変化が、「例示的置換」の見出しの下で表１に提供され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下に更に記載される。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しの下で表１に示す。アミノ酸置換を、目的の抗体に導入することができ、その産物が、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合性、減少した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングされる。
0006654694.tif 000002
【０１４７】
アミノ酸は、共通の側鎖特性によってグループ化されうる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１４８】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの一つのメンバーを別のクラスのものと交換することを必要とするであろう。
【０１４９】
置換変異体の一つの種類は、親抗体（例えばヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、更なる研究のために選択される得られた変
異体は、親抗体と比較して、所定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の減少）を有し、及び／又は親抗体の所定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、これは、例えばここに記載されるもののようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して、簡便に作製されうる。簡潔に言えば、一又は複数のＨＶＲ残基を変異させ、変異抗体がファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０１５０】
改変（例えば、置換）は、例えば抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて行うことができる。そのような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち体細胞成熟過程の間に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）において行われ得、得られる変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築しそこから再選択することによる親和性成熟が、例えば、Hoogenboom, H.R.等 in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様では、多様性が、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。ついで、二次ライブラリーが作製される。ついで、ライブラリーが、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するための別の方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）が無作為化されるＨＶＲ指向アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用して、特異的に同定することができる。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的化される。
【０１５１】
所定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、一又は複数のＨＶＲ内で生じうる。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えばここで提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。そのような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」又はＳＤＲの外にある場合がある。上で提供された変異体ＶＨ及びＶＬ配列の所定の実施態様では、各ＨＶＲは改変されていないか、又はわずか一つ、二つもしくは三つのアミノ酸置換を含む。
【０１５２】
変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham, B.C.及びWells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、一残基又は標的残基群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されうる。あるいは、又は加えて、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原の間の接触点を同定する。そのような接触残基と隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除されうる。変異体は、それらが所望の性質を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされうる。
【０１５３】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含むポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えばＡＤＥＰＴのための）又はポリペプチドに対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合物を含む。
【０１５４】
ｂ）Ｆｃ領域変異体
所定の実施態様では、一又は複数のアミノ酸修飾を、ここに提供される抗体のＦｃ領域に導入することにより、Ｆｃ領域変異体が作製される。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含みうる。
【０１５５】
エフェクター機能が低下した抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの一又は複数の置換を伴うものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の二以上に置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０１５６】
ＦｃＲへの改善又は減少した結合を有する所定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L.等, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照）。
【０１５７】
一実施態様では、本発明のそのような抗体は、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するか、又は変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１である。別の実施態様では、変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ又はＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ又は及びＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ４である（Ｋａｂａｔ等のＥＵインデックスに従う番号付け，Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991）。
【０１５８】
半減期が延長され、胎児への母性ＩｇＧの移送を担う（Guyer, R.L.等, J. Immunol. 117 (1976) 587-593、及びKim, J.K.等, J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合性が改善された抗体が米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。その抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換を伴うＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの一又は複数に置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を含むものを含む（米国特許第７３７１８２６号）。
【０１５９】
また、Ｆｃ領域変異体の他の例に関する、Duncan, A.R.及びWinter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０１６０】
ｃ）システイン操作抗体変異体
所定の実施態様では、抗体の一又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施態様では、置換された残基は抗体の接近可能な部位で生じる。ここに更に記載されるように、その残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基がそれにより抗体の接近可能な部位に位置させ、抗体を、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分のような他の部分にコンジュゲートするために使用して、イムノコンジュゲートを作製してもよい。所定の実施態様では、次の残基のうちの何れかの一又は複数がシステインで置換される：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載されているようにして作製されうる。
【０１６１】
ｄ）抗体誘導体
所定の実施態様では、ここで提供される抗体は、当該技術分野で知られており、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むように更に修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーの何れか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造上の利点を有しうる。ポリマーは、任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合されるポリマーの数は変動しうるが、一を超えるポリマーが結合される場合、それらは同じか又は異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、限定されるものではないが、改善されるべき抗体の特定の性質又は機能、抗体誘導体が定まった条件下で治療に使用されるかどうか等々を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
【０１６２】
別の実施態様では、放射線への曝露によって選択的に加熱されうる非タンパク質部分と抗体とのコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質部分は、カーボンナノチューブである（Kam, N.W.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は任意の波長のものであり得、限定されないが、通常の細胞を害さないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅する温度まで非タンパク質部分を加熱する波長を含む。
【０１６３】
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているような組換え方法及び組成物を使用して製造されうる。一実施態様では、ここに記載の抗ＰＤ１抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードしうる。更なる実施態様では、そのような核酸を含む一又は複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施態様では、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換されている）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列と抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクターと、抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様では、抗ＰＤ１抗体を作製する方法であって、抗体の発現に適した条件下で、上で提供された抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、場合によっては宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することとを含む方法が提供される。
【０１６４】
抗ＰＤ１抗体の組換え生産のために、例えば上述のような、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクター中に挿入される。そのような核酸は、容易に単離することができ、一般的な手順を使用して（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定されうる。
【０１６５】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞は、ここに記載の原核生物細胞又は真核生物細胞を含む。例えば、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌内で産生されうる。細菌中での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、同第５７８９１９９号及び同第５８４０５２３号を参照のこと。（また、大腸菌における抗体断片の発現について記載している、Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (編), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254も参照のこと）。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。
【０１６６】
原核生物に加えて、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されていて、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす真菌株及び酵母株を含む、糸状菌又は酵母などの真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及びLi, H.等, Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照のこと。
【０１６７】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からまた得られる。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫細胞を含む。特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用されうる多数のバキュロウイルス株が同定されている。
【０１６８】
植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号、及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物において抗体を生産するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照のこと。
【０１６９】
脊椎動物細胞もまた宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合化された哺乳動物細胞株が有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚性腎株（例えば、Graham, F.L.等, J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74）に記載された２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather, J.P.等, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub, G.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した所定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki, P.及びWu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (編), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照のこと。
【０１７０】
Ｃ．アッセイ
ここで提供される抗ＰＤ１抗体は、当該技術分野で知られている様々なアッセイによって同定され、その物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴付けされうる。
【０１７１】
１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、本発明の抗体を、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどの既知の方法によって、その抗原結合活性について試験する。
【０１７２】
別の態様では、競合アッセイを使用して、ＰＤ１への結合についてＰＤ１−０１０３（配列番号：７のＶＨ配列及び配列番号：８のＶＬ配列を含む）と（又は、同一の５つから６つのＨＶＲを有するヒト化ＰＤ１−０１０３変異抗体ＰＤ１−０１０３−０３１２、ＰＤ１−０１０３−０３１３、ＰＤ１−０１０３−０３１４、ＰＤ１−０１０３−０３１５と）競合する抗体を同定することができる。本発明の一実施態様は、配列番号：７のＶＨ配列の３つ全てのＨＶＲ及び配列番号：８のＶＬ配列の３つ全てのＨＶＲを含む抗ＰＤ１抗体と、ヒトＰＤ１への結合について競合する抗体である。本発明の一実施態様は、配列番号：５７のＶＨ配列の３つ全てのＨＶＲ及び配列番号：５８のＶＬ配列の３つ全てのＨＶＲを含む抗ＰＤ１抗体と、ヒトＰＤ１への結合について競合する抗体である。所定の実施態様では、そのような競合する抗体は、抗ＰＤ１抗体ＰＤ１−０１０３が結合する同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Morris, G.E. (編), Epitope Mapping Protocols, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996)に提供される。
【０１７３】
例示的競合アッセイでは、固定化ＰＤ１（−ＥＣＤ）が、ＰＤ１に結合する第一標識抗体（例えば、抗ＰＤ１抗体ＰＤ１−０１０３又はヒト化抗体ＰＤ１−０１０３−０３１２）及びＰＤ１への結合について第一抗体と競合するその能力について試験されている第二非標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化したＰＤ１を、第一標識抗体を含むが第二非標識抗体は含まない溶液中でインキュベートする。ＰＤ１への第一抗体の結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体を除去し、固定化したＰＤ１に結合した標識の量を測定する。固定化したＰＤ１に結合した標識の量が対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体がＰＤ１への結合に関して第一抗体と競合していることを示している。Harlow, E.及びLane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)を参照のこと。別の例示的な競合アッセイについては、実施例２（エピトープマッピングＥＬＩＳＡ／結合競合アッセイ）を参照のこと。
【０１７４】
２．活性アッセイ
一態様では、生物学的活性を有するその抗ＰＤ１抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、異なる免疫細胞、特にＴ細胞の活性化及び／又は増殖を増強する能力を含みうる。例えば、それらは、免疫調節サイトカイン（例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）及び／又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα））の分泌を増強する。増強され又は増強されうる他の免疫調節サイトカインは、例えば、ＩＬ１２、グランザイムＢ等である。生物学的活性は、カニクイザル結合交差反応性、並びに異なる細胞型への結合もまた含みうる。インビボ及び／又はインビトロでそのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
【０１７５】
所定の実施態様では、本発明の抗体は、例えば以下の実施例に記載のように、そのような生物学的活性について試験される。
【０１７６】
Ｄ．イムノコンジュゲート（がんのみ又は標的用に改変）
本発明はまた一又は複数の細胞傷害性剤、例えば化学療法剤もしくは薬物、増殖阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、又はその断片）又は放射性同位体にコンジュゲートしたここでの抗ＰＤ１抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０１７７】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、抗体が、限定されないがメイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号、及び欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号を参照）；アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号、第５７８０５８８号、及び第７４９８２９８号を参照）；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、米国特許第５７１４５８６号、米国特許第５７３９１１６号、米国特許第５７６７２８５号、米国特許第５７７０７０１号、米国特許第５７７０７１０号、米国特許第５７７３００１号、及び米国特許第５８７７２９６号；Hinman, L.M.等, Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342；及びLode, H.N.等, Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928を参照）；アントラサイクリン、例えばダウノマイシン又はドキソルビシン（Kratz, F.等, Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523；Jeffrey, S.C.等, Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362；Torgov, M.Y.等, Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721；Nagy, A.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834；Dubowchik, G.M.等, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532；King, H.D.等, J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343；及び米国特許第６６３０５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル；トリコテセン；及びＣＣ１０６５を含む、一又は複数の薬物にコンジュゲートしている抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
【０１７８】
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌由来）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリアコン阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、及びトリコテセン（tricothecenes）を含む、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートしているここに記載の抗体を含む。
【０１７９】
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートしたここに記載の抗体を含み、放射性コンジュゲートを形成する。放射性コンジュゲートの製造には、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートを検出に使用する場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフ検査用の放射性原子、例えばＴＣ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含む。
【０１８０】
抗体と細胞傷害性剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン ２，６−ジイソシアネート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta, E.S.等, Science 238 (1987) 1098-1104に記載のようにして調製することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞内で細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」でありうる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari, R.V.等, Cancer Res. 52 (1992) 127-131；米国特許第５２０８０２０号）が使用されうる。
【０１８１】
ここでのイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されるものではないが、（例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aから）市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を限定しないが含む架橋試薬を用いて調製されたコンジュゲートが明示的に考えられる。
【０１８２】
Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
所定の実施態様では、ここで提供される抗ＰＤ１抗体の何れも、生物学的試料中のＰＤ１の存在を検出するために有用である。ここで使用される「検出する」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。所定の実施態様では、生物学的試料は、免疫細胞又はＴ細胞浸潤物などの細胞又は組織を含む。
【０１８３】
一実施態様では、診断又は検出の方法で使用される抗ＰＤ１抗体が提供される。更なる態様では、生物学的試料中のＰＤ１の存在を検出する方法が提供される。所定の実施態様では、その方法は、抗ＰＤ１抗体のＰＤ１への結合を許容する条件下で、ここに記載される抗ＰＤ１抗体に生物学的試料を接触させ、抗ＰＤ１抗体とＰＤ１との間に複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボの方法でありうる。一実施態様では、抗ＰＤ１抗体は、例えばＰＤ１が患者の選択のためのバイオマーカーである場合に、抗ＰＤ１抗体を用いた治療法に適格な対象を選択するために使用される。
【０１８４】
所定の実施態様では、標識された抗ＰＤ１抗体が提供される。標識には、限定されないが、直接検出される標識又は部分（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、及び放射性標識）並びに、例えば酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。例示的な標識には、限定されないが、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＲＰなどの色素前駆体を酸化するために過酸化水素を用いる酵素に結合した複素環式オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル等々が含まれる。
【０１８５】
Ｆ．薬学的製剤
ここに記載される抗ＰＤ１抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するこのような抗体を、一又は複数の任意選択的な薬学的に許容可能な担体と混合することによって（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16版, Osol, A. (編) (1980)）、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態に調製される。薬学的に許容可能な担体は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して一般に非毒性であり、限定されるものではないが、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール、レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリ（ビニルピロリドン）等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及びその他の糖質；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。ここでの例示的な薬学的に許容可能な担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）等の介在性薬物分散剤、例えばｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。ｒｈｕＰＨ２０を含む、所定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼ等の一又は複数の更なるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０１８６】
例示的な凍結乾燥抗体製剤が米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものを含み、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０１８７】
ここでの製剤は治療されている特定の適応症に必要な一を超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものをまた含みうる。例えば、更に提供することが望ましい場合がある。そのような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０１８８】
活性成分は、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョン中において、例えばコアセルベーション技術又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルのそれぞれに封入されうる。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16版, Osol, A. (編) (1980)に開示されている。
【０１８９】
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の好適な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。
【０１９０】
インビボ投与に使用される製剤は、一般に無菌である。無菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通して濾過することにより、容易に達成される。
【０１９１】
Ｇ．治療方法及び組成物
ここで提供される抗ＰＤ１抗体（又は抗原結合タンパク質）の何れも治療方法において使用されうる。
【０１９２】
一態様では、医薬として使用される抗ＰＤ１抗体が提供される。更なる態様では、がんの治療に使用される抗ＰＤ１抗体が提供される。所定の実施態様では、治療方法において使用される抗ＰＤ１抗体が提供される。所定の実施態様では、本発明は、有効量の抗ＰＤ１抗体を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法において使用される抗ＰＤ１抗体を提供する。
【０１９３】
更なる実施態様では、本発明は、免疫刺激剤としての使用のため／又はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）分泌を刺激するための抗ＰＤ１抗体を提供する。所定の実施態様では、本発明は、免疫刺激のため／又はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）分泌を刺激するために有効量の抗ＰＤ１抗体を個体に投与することを含む、個体における免疫刺激の／又はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）分泌を刺激する方法における使用のための抗ＰＤ１抗体を提供する。
【０１９４】
更なる実施態様では、本発明は、免疫賦活剤としての使用のため／又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）分泌を刺激するための抗ＰＤ１抗体を提供する。所定の実施態様では、本発明は、免疫刺激のため／又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）分泌を刺激するために有効量の抗ＰＤ１抗体を個体に投与することを含む、個体における免疫刺激の／又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）分泌を刺激する方法における使用のための抗ＰＤ１抗体を提供する。
【０１９５】
上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における、抗ＰＤ１抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬はがんの治療のためのものである。更なる実施態様では、医薬は、がんを有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、がんを治療する方法における使用のためのものである。更なる実施態様では、医薬は、がん細胞の細胞媒介溶解を誘導するためのものである。更なる実施態様では、がん細胞においてアポトーシスを誘導するため／又はがん細胞増殖を阻害するために有効量の医薬を個体に投与することを含む、がんに罹患している個体におけるがん細胞の細胞媒介溶解を誘導する方法に使用するためのものである。上記実施態様の何れかに記載の「個体」はヒトでありうる。
【０１９６】
更なる態様では、本発明はがんを治療する方法を提供する。一実施態様では、該方法は、がんを有する個体に有効量の抗ＰＤ１を投与することを含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」はヒトでありうる。
【０１９７】
更なる態様では、本発明は、がんに罹患している個体において、がん細胞の細胞媒介溶解を誘導する方法を提供する。一実施態様では、該方法は、がんに罹患している個体においてがん細胞の細胞媒介溶解を誘導するために有効量の抗ＰＤ１を個体に投与することを含む。一実施態様では、「個体」はヒトである。
【０１９８】
更なる態様では、本発明は、例えば上記治療方法の何れかにおいて使用される、ここで提供される抗ＰＤ１抗体の何れかを含有する薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は、ここで提供される抗ＰＤ１抗体の何れかと薬学的に許容可能な担体とを含有する。
【０１９９】
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療が望まれるのであれば、病巣内投与を含む、任意の適切な手段により投与することができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により、なされうる。限定されないが、単一又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投薬スケジュールがここで考慮される。
【０２００】
本発明の抗体は、適正な医療行為に一致した様式で製剤化され、用量決定され、投与される。こうした観点において考慮すべき因子として、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画、及び医師に既知のその他の因子が挙げられる。抗体は、必要ではないが任意で、当該疾患の予防又は治療のために現在使用されている一又は複数の薬剤と共に製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患又は治療の種類、及び上で検討された他の因子に依存する。これらは一般には、ここに記載されているものと同じ投薬量及び投与経路で、又はここに記載の投薬量の約１から９９％で、又は経験的に／臨床的に適切であると決定された任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
【０２０１】
疾患の予防又は治療に対して、本発明の抗体の適切な投薬量は、（単独で又は一もしくは複数の追加の治療剤との併用で使用される場合）治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体の投与が予防目的か治療目的か、治療歴、患者の臨床歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。抗体は、一回又は一連の治療にわたって患者へ適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数回の別個の投与によるか、又は連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が患者への投与のための初期候補投薬量となりうる。一つの典型的な１日投薬量は、上記の因子に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であるかもしれない。数日以上にわたる反復投与に関しては、状態に応じて、治療は一般に疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続されるであろう。抗体の例示的な一投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであろう。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）が患者に投与されうる。このような用量は断続的に、例えば毎週又は三週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば約６用量の抗体を受けるように）投与されうる。初期の高負荷用量の後、一又は複数の低用量を投与してもよい。例示的な投薬レジメンは、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量、続いて約２ｍｇ／ｋｇの抗体の毎週の維持用量を投与することを含む。しかしながら、他の投薬量レジメンが有用でありうる。この治療の進行は、一般的な技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０２０２】
上記の製剤又は治療方法の何れも、抗ＰＤ１抗体の代わりに又はそれに加えて本発明のイムノコンジュゲートを使用して実施することができることが理解される。
上記の製剤又は治療方法の何れも、抗ＰＤ１抗体の代わりに又はそれに加えて本発明のイムノコンジュゲートを使用して実施することができることが理解される。
【０２０３】
ＩＩ．製造品
本発明の別の態様では、上述した疾患の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、単独の又は疾患の治療、予防、及び／又は診断に効果的である別の組成物と併用の組成物を収容し、滅菌のアクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内溶液バッグでありうる）。該組成物中の少なくとも一種の活性剤は本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、該組成物が選択される疾患の治療のために使用されることを示す。更に、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物を中に収容する第一容器と、（ｂ）更なる細胞傷害性剤又はその他の治療剤を含む組成物を中に収容する第二容器とを含みうる。本発明のこの実施態様の製造品は、組成物が特定の疾患を治療するために使用できることを示す添付文書を更に含みうる。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含みうる。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望ましいその他の材料を更に含みうる。
【０２０４】
上記製造品の何れも、抗ＰＤ１抗体の代わりに又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含んでいてもよいことが理解される。
【０２０５】
［アミノ酸配列の説明］
配列番号：１      重鎖ＨＶＲ−Ｈ１，ＰＤ１−０１０３
配列番号：２      重鎖ＨＶＲ−Ｈ２，ＰＤ１−０１０３
配列番号：３      重鎖ＨＶＲ−Ｈ３，ＰＤ１−０１０３
配列番号：４      軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１，ＰＤ１−０１０３
配列番号：５      軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２，ＰＤ１−０１０３
配列番号：６      軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３，ＰＤ１−０１０３
配列番号：７      重鎖可変ドメインＶＨ，ＰＤ１−０１０３
配列番号：８      軽鎖可変ドメインＶＬ，ＰＤ１−０１０３
配列番号：９      重鎖ＨＶＲ−Ｈ１，ＰＤ１−００９８
配列番号：１０    重鎖ＨＶＲ−Ｈ２，ＰＤ１−００９８
配列番号：１１    重鎖ＨＶＲ−Ｈ３，ＰＤ１−００９８
配列番号：１２    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１，ＰＤ１−００９８
配列番号：１３    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２，ＰＤ１−００９８
配列番号：１４    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３，ＰＤ１−００９８
配列番号：１５    重鎖可変ドメインＶＨ，ＰＤ１−００９８
配列番号：１６    軽鎖可変ドメインＶＬ，ＰＤ１−００９８
配列番号：１７    重鎖ＨＶＲ−Ｈ１，ＰＤ１−００５０
配列番号：１８    重鎖ＨＶＲ−Ｈ２，ＰＤ１−００５０
配列番号：１９    重鎖ＨＶＲ−Ｈ３，ＰＤ１−００５０
配列番号：２０    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１，ＰＤ１−００５０
配列番号：２１    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２，ＰＤ１−００５０
配列番号：２２    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３，ＰＤ１−００５０
配列番号：２３    重鎖可変ドメインＶＨ，ＰＤ１−００５０
配列番号：２４    軽鎖可変ドメインＶＬ，ＰＤ１−００５０
配列番号：２５    重鎖ＨＶＲ−Ｈ１，ＰＤ１−００６９
配列番号：２６    重鎖ＨＶＲ−Ｈ２，ＰＤ１−００６９
配列番号：２７    重鎖ＨＶＲ−Ｈ３，ＰＤ１−００６９
配列番号：２８    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１，ＰＤ１−００６９
配列番号：２９    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２，ＰＤ１−００６９
配列番号：３０    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３，ＰＤ１−００６９
配列番号：３１    重鎖可変ドメインＶＨ，ＰＤ１−００６９
配列番号：３２    軽鎖可変ドメインＶＬ，ＰＤ１−００６９
配列番号：３３    重鎖ＨＶＲ−Ｈ１，ＰＤ１−００７３
配列番号：３４    重鎖ＨＶＲ−Ｈ２，ＰＤ１−００７３
配列番号：３５    重鎖ＨＶＲ−Ｈ３，ＰＤ１−００７３
配列番号：３６    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１，ＰＤ１−００７３
配列番号：３７    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２，ＰＤ１−００７３
配列番号：３８    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３，ＰＤ１−００７３
配列番号：３９    重鎖可変ドメインＶＨ，ＰＤ１−００７３
配列番号：４０    軽鎖可変ドメインＶＬ，ＰＤ１−００７３
配列番号：４１    重鎖ＨＶＲ−Ｈ１，ＰＤ１−００７８
配列番号：４２    重鎖ＨＶＲ−Ｈ２，ＰＤ１−００７８
配列番号：４３    重鎖ＨＶＲ−Ｈ３，ＰＤ１−００７８
配列番号：４４    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１，ＰＤ１−００７８
配列番号：４５    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２，ＰＤ１−００７８
配列番号：４６    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３，ＰＤ１−００７８
配列番号：４７    重鎖可変ドメインＶＨ，ＰＤ１−００７８
配列番号：４８    軽鎖可変ドメインＶＬ，ＰＤ１−００７８
配列番号：４９    重鎖ＨＶＲ−Ｈ１，ＰＤ１−０１０２
配列番号：５０    重鎖ＨＶＲ−Ｈ２，ＰＤ１−０１０２
配列番号：５１    重鎖ＨＶＲ−Ｈ３，ＰＤ１−０１０２
配列番号：５２    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１，ＰＤ１−０１０２
配列番号：５３    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２，ＰＤ１−０１０２
配列番号：５４    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３，ＰＤ１−０１０２
配列番号：５５    重鎖可変ドメインＶＨ，ＰＤ１−０１０２
配列番号：５６    軽鎖可変ドメインＶＬ，ＰＤ１−０１０２
配列番号：５７    ＰＤ１−０１０３＿０１のヒト化変異体−重鎖可変ドメインＶＨ
配列番号：５８    ＰＤ１−０１０３＿０１のヒト化変異体−軽鎖可変ドメインＶＬ
配列番号：５９    ＰＤ１−０１０３＿０２のヒト化変異体−軽鎖可変ドメインＶＬ
配列番号：６０    ＰＤ１−０１０３＿０３のヒト化変異体−軽鎖可変ドメインＶＬ
配列番号：６１    ＰＤ１−０１０３＿０４のヒト化変異体−軽鎖可変ドメインＶＬ
配列番号：６２    ヒトカッパ軽鎖定常領域
配列番号：６３    ヒトラムダ軽鎖定常領域
配列番号：６４    ＩｇＧ１由来のヒト重鎖定常領域
配列番号：６５    変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを持つＩｇＧ１由来のヒト重鎖定常領域
配列番号：６６    変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを持つＩｇＧ１由来のヒト重鎖定常領域
配列番号：６７    ＩｇＧ４由来のヒト重鎖定常領域
配列番号：６８    例示的ヒトＰＤ１配列（シグナル配列なし）
配列番号：６９    ヒトＰＤ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
配列番号：７０    例示的ヒトＰＤ１配列（シグナル配列を含む）
配列番号：７１：  ＰＤ１−０１０３及びＰＤ１−０１０３ヒト化変異体ＰＤ１−０１０３−０３１２、ＰＤ１−０１０３−０３１３、ＰＤ１−０１０３−０３１４、及びＰＤ１−０１０３−０３１５の最小ＨＶＲ１
配列番号：７２：  ＰＤ１−０１０３及びＰＤ１−０１０３ヒト化変異体ＰＤ１−０１０３−０３１２、ＰＤ１−０１０３−０３１３、ＰＤ１−０１０３−０３１４、及びＰＤ１−０１０３−０３１５の最小ＨＶＲ２
配列番号：７３：  ＰＤ１−０１０３及びＰＤ１−０１０３ヒト化変異体ＰＤ１−０１０３−０３１２、ＰＤ１−０１０３−０３１３、ＰＤ１−０１０３−０３１４、及びＰＤ１−０１０３−０３１５の最小ＨＶＲ３
配列番号：７４：  ＰＤ１−０１０３及びＰＤ１−０１０３ヒト化変異体ＰＤ１−０１０３−０３１２、ＰＤ１−０１０３−０３１３、ＰＤ１−０１０３−０３１４、及びＰＤ１−０１０３−０３１５の最小ＬＶＲ１
配列番号：７５：  ＰＤ１−０１０３及びＰＤ１−０１０３ヒト化変異体ＰＤ１−０１０３−０３１２、ＰＤ１−０１０３−０３１３、ＰＤ１−０１０３−０３１４、及びＰＤ１−０１０３−０３１５の最小ＬＶＲ２
配列番号：７６：  ＰＤ１−０１０３及びＰＤ１−０１０３ヒト化変異体ＰＤ１−０１０３−０３１２、ＰＤ１−０１０３−０３１３、ＰＤ１−０１０３−０３１４、及びＰＤ１−０１０３−０３１５の最小ＬＶＲ３
配列番号：７７：  Ｋａｂａｔの番号付けによる７１、７２、７３の位置にアミノ酸配列ＲＤＮを含むＦＲ−Ｈ３の断片
【０２０６】
次に、抗ＰＤ１抗体ＰＤ１−００１６（及びそのヒト化型ＰＤ１−０１０３−０３１２、ＰＤ１−０１０３−０３１３、ＰＤ１−０１０３−０３１４及びＰＤ１−０１０３−０３１５）、ＰＤ１−００９８、ＰＤ１−００５０、ＰＤ１−００６９、ＰＤ１−００７３、ＰＤ１−００７８及びＰＤ１−０１０２のマークされたＨＶＲ（太線、下線文字のＨＶＲ）を含むＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列を列挙する：
【０２０７】
0006654694.tif 000003
0006654694.tif 000004
0006654694.tif 000005
0006654694.tif 000006
【０２０８】
次に本発明の特定の実施態様を列挙する：
１．ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、Ａｓｎ５８でグリコシル化されている配列番号：７０のグリコシル化ヒトＰＤ１のＡｓｎ５８で（コア）糖鎖に結合する、抗体。
２．クレーム１に記載の抗体であって、ヒトＰＤ１の位置６０〜６４、６８、７８〜８４、１２６〜１３４の一又は複数のアミノ酸に更に結合する、抗体。
３．クレーム１又は２の何れか一項に記載の抗体であって、その重鎖がＡｓｎ５８で糖鎖に結合する、抗体。
４．クレーム２から３の何れか一項に記載の抗体であって、ヒトＰＤ１の位置６１、６２、６４、８３、１２６、１２８、１３２、１３４の一又は複数のアミノ酸に結合する、抗体。
５．クレーム２から３の何れか一項に記載の抗体であって、ヒトＰＤ１の位置６１、６２、６４、８３、１２６、１２８、１３２、１３４のアミノ酸に結合する、抗体。
６．クレーム２から３の何れか一項に記載の抗体であって、ヒトＰＤ１の位置６０、６１、６２、６３、６４、６８、７８、８２、８３、８４、１２６、１２７、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４の酸に結合する、抗体。
７．クレーム１から６の何れか一項に記載の抗体であって、ヒトＰＤ１に結合し、Ａｓｎ５８でグリコシル化されている配列番号：７０のグリコシル化ヒトＰＤ１のＡｓｎ５８で（コア）糖鎖内の第一及び第二のＧｌＮａｃ、ＦＵＣ、ＢＭＡ及びＭＡＮに結合する、抗体。
８．クレーム１から７の何れか一項に記載の抗体であって、Ａｓｎ５８でグリコシル化されているヒトＰＤ１への結合と比較して、Ａｓｎ５８でグリコシル化されていない配列番号：７０のヒトＰＤ１への結合の減少を示す、抗体。
９．ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、
（ａ）配列番号：７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：７３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：７４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；（ｆ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び（ｇ）Ｋａｂａｔの番号付けによる７１、７２及び７３の位置に（ＲＤＮの）配列番号：７７のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３
を含む、抗体。
１０．クレーム９に記載のヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、
Ａ）
ｉ）配列番号：７のＶＨ配列と配列番号：８のＶＬ配列を含み；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＢ）
ｉ）配列番号：５７のＶＨ配列と配列番号：５８のＶＬ配列を含み
ｉｉ）配列番号：５７のＶＨ配列と配列番号：５９のＶＬ配列を含み
ｉｉｉ）配列番号：５７のＶＨ配列と配列番号：６０のＶＬ配列を含み
ｉｖ）配列番号：５７のＶＨ配列と配列番号：６１のＶＬ配列を含む、抗体。
【０２０９】
次に本発明の特定の実施態様を列挙する：
１．ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、
Ａ）（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｂ）（ａ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｃ）（ａ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｄ）（ａ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｅ）（ａ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｆ）（ａ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｇ）（ａ）配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、抗体。
２．ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：３から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：１１から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：１９から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：２７から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：３５から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｆ）（ａ）（ｉ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：４３から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｇ）（ａ）（ｉ）配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：５１から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む、抗体。
３．ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、
Ａ）
ｉ）配列番号：７のＶＨ配列及び配列番号：８のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＢ）
ｉ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：５９のＶＬ配列を含み、
ｉｉｉ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：６０のＶＬ配列を含み、
ｉｖ）配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：６１のＶＬ配列を含み、
又はＣ）
ｉ）配列番号：１５のＶＨ配列及び配列番号：１６のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＤ）
ｉ）配列番号：２３のＶＨ配列及び配列番号：２４のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＥ）
ｉ）配列番号：３１のＶＨ配列及び配列番号：３２のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＦ）
ｉ）配列番号：３９のＶＨ配列及び配列番号：４０のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＧ）
ｉ）配列番号：４７のＶＨ配列及び配列番号：４８のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＨ）
ｉ）配列番号：５５のＶＨ配列及び配列番号：５６のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む、
抗体。
４．ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、
ｉ）配列番号：７のＶＨ配列及び配列番号：８のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む、
抗体。
５．ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：５８のＶＬ配列を含む抗体。
６．ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：５９のＶＬ配列を含む抗体。
７．ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：６０のＶＬ配列を含む抗体。
８．ヒトＰＤ１に結合する単離された抗体であって、配列番号：５７のＶＨ配列及び配列番号：６１のＶＬ配列を含む抗体。
９．前記実施態様の何れか一項に記載の抗ＰＤ１抗体であって、
次の性質の一又は複数によって独立して特徴付けられる抗体：
抗ＰＤ−１抗体が、
ｉ）配列番号：７のアミノ酸配列を有するＶＨと配列番号：８のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗ＰＤ−１抗体とＰＤ−１への結合について競合する、及び／又は
ｉｉ）ヒト及びカニクイザルＰＤ−１に結合する；及び／又は
ｉｉｉ）１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で同種異系の刺激されたＴ細胞によるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）分泌を８５％以上増強する；及び／又は
ｉｖ）１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で同種異系の刺激されたＴ細胞による腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）分泌を２００％以上増強する。
１０．混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で同種異系の刺激されたＴ細胞による腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）分泌を２００％以上（好ましい一実施態様では２５０％以上）増強する、ＰＤ１に結合する単離された抗体。
１１．混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で同種異系の刺激されたＴ細胞によるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）分泌を８５％以上（好ましい一実施態様では９０％以上、好ましい一実施態様では９５％以上）増強する、ＰＤ１に結合する単離された抗体。
１２．ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体であって、
ｉ）配列番号：７のアミノ酸配列を有するＶＨと配列番号：８のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗ＰＤ−１抗体とＰＤ−１への結合について競合し、及び／又は
ｉｉ）ヒト及びカニクイザルＰＤ−１に結合し；及び
ｉｉｉ）１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で同種異系の刺激されたＴ細胞によるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）分泌を８５％以上増強し；及び
ｉｖ）１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で同種異系の刺激されたＴ細胞による腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）分泌を２００％以上増強する、抗体。
１３．モノクローナル抗体である、前記実施態様の何れかに記載の抗体。
１４．ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である、前記実施態様の何れかに記載の抗体。
１５．ＰＤ１に結合する抗体断片である、前記実施態様の何れかに記載の抗体。
１６．全長ＩｇＧ１抗体である、前記実施態様の何れか一項に記載の抗体。
１７．変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する全長ＩｇＧ１抗体である、前記実施態様の何れか一項に記載の抗体。
１８．前記実施態様の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
１９．実施態様１９の核酸を含む宿主細胞。
２０．抗体が産生されるように実施態様２０の宿主細胞を培養することを含む、抗体の製造方法。
２１．宿主細胞から抗体を回収することを更に含む、実施態様２１の方法。
２２．実施態様１から１８の何れか一項に記載の抗体と薬学的に許容可能な担体とを含有する薬学的製剤。
２３．医薬として使用するための、実施態様１から１８の何れか一項に記載の抗体。
２４．がんの治療に使用するための、実施態様１から１８の何れか一項に記載の抗体。
２５．医薬の製造における実施態様１から１８の何れか一項に記載の抗体の使用。
２６．医薬ががんの治療のためのものである、実施態様２６に記載の使用。
２７．実施態様１の抗体の有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法。
【０２１０】
ＩＩＩ．実施例
次は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、様々な他の実施態様が実施されうることが理解される。
【０２１１】
上記の発明は、理解を明確にするために、例示及び実施例によって幾らか詳細に記載されているが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。ここで引用された全ての特許及び科学文献の開示は、その全体が出典明示により明示的に援用される。
【０２１２】
実施例１：
抗ＰＤ−１抗体の作製
（マウスの免疫化）
ＮＭＲＩマウスを、全長ヒトＰＤ−１をコードするプラスミド発現ベクターを使用して、１００ｕｇのベクターＤＮＡ（プラスミド１５３００＿ｈＰＤ１−ｆｌ）を皮内適用し、続いてエレクトロポレーション（１０００Ｖ／ｃｍの２平方パルス、持続時間０．１ｍｓ、間隔０．１２５ｓ；続いて２８７．５Ｖ／ｃｍの４平方パルス、持続時間１０ｍｓ、間隔０．１２５ｓ）により遺伝的に免疫化した。マウスは、０、１４、２８、４２、５６、７０、及び８４日目に何れか６回の連続した免疫化を受けた。血液を３６日目、７８日目及び９２日目に採取し、血清を調製し、これをＥＬＩＳＡによる力価決定のために使用した（以下を参照）。最も高い力価を有する動物を、５０ｕｇの組換えヒトＰＤ１ヒトＦｃキメラの静脈内注射によって９６日目に追加免疫のために選択し、追加免疫の３日後に脾臓細胞と骨髄腫細胞株との融合により、モノクローナル抗体をハイブリドーマ技術により単離した。
血清力価の決定（ＥＬＩＳＡ）
【０２１３】
ヒト組換えＰＤ１ヒトＦｃキメラを、ＰＢＳ中０．３ｕｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルで９６ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに固定し、続いて、ＰＢＳ中２％Ｃｒｏｔｅｉｎ Ｃ、２００ｕｌ／ウェルを用いてプレートをブロッキングし；抗血清の段階希釈をＰＢＳ中０．５％Ｃｒｏｔｅｉｎ Ｃ、１００ｕｌ／ウェルで二通り適用し；ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｄｉａｎｏｖａ １１５−０３６−０７１；１／１６０００）により検出した。全ての工程について、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。全ての工程の間に、プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ＢＭ Ｂｌｕｅ ＰＯＤ基質可溶性（Ｒｏｃｈｅ）、１００ｕｌ／ウェルの添加によりシグナルを発生させ；１ＭのＨＣｌ、１００ｕｌ／ウェルの添加により停止させた。参照として６９０ｎｍに対して吸光度を４５０ｎｍで読み取った。力価は、最大値の半分のシグナルをもたらす抗血清の希釈として定義された。
【０２１４】
実施例２：
抗ＰＤ１抗体の特徴付け
ヒトＰＤ１への抗ＰＤ１抗体の結合
（ｈｕＰＤ１のＥＬＩＳＡ）
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐストレプトアビジン被覆プレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を２５μｌ／ウェルのビオチン化ＰＤ１−ＥＣＤ−ＡｖｉＨｉｓでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗ＰＤ１試料又は参照抗体（ヒト抗ＰＤ１；Ｒｏｃｈｅ／マウス抗ＰＤ１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ：３２９９１２）を添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヒツジ抗ヒトＨ＋Ｌ−ＰＯＤ（ＪＩＲ，ＪＩＲ１０９−０３６−０８８）／ヒツジ抗マウスＰＯＤ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＮＡ９３１０）を１：２０００／１：１０００希釈で添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１８３５０３３００１）を添加し、ＯＤ２〜３までインキュベートした。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。
【０２１５】
ＥＬＩＳＡの結果は、下記の概要の表２及び３に、ＥＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］として列挙する。
【０２１６】
（ＰＤ１の細胞ＥＬＩＳＡ）
全長ヒトＰＤ１をコードするプラスミド１５３１１＿ｈＰＤ１−ｆｌ＿ｐＵＣ＿Ｎｅｏで安定にトランスフェクトされ、Ｇ４１８（プラスミド上のネオマイシン耐性マーカー）により選択された接着性ＣＨＯ−Ｋ１細胞株を、３８４ウェル平底プレートに０．０１×１０Ｅ６細胞／ウェルの濃度で播種し、一晩増殖させた。
【０２１７】
翌日、２５μｌ／ウェルのＰＤ１試料又はヒト抗ＰＤ１（Ｒｏｃｈｅ）／マウス抗ＰＤ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ：３２９９１２）参照抗体を添加し、４℃で２時間インキュベートした（内部移行を避けるため）。注意深く洗浄した後（１×９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ）細胞を、１×ＰＢＳ緩衝液で希釈した３０μｌ／ウェルの０．０５％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号：Ｇ５８８２，２５％）を添加することにより固定し、室温で１０分間インキュベートした。洗浄後（３×９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ）、２５μｌ／ウェルの二次抗体：ヒツジ抗ヒトＨ＋Ｌ−ＰＯＤ（ＪＩＲ，ＪＩＲ１０９−０３６−０８８）／ヒツジ抗マウスＰＯＤ（ＧＥ ＮＡ９３１０）を検出のために加え、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（３×９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｒｏｃｈｅ １１８３５０３３００１）を添加し、ＯＤ１．０−２．０までインキュベートした。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。
【０２１８】
細胞ＥＬＩＳＡの結果は、下記の概要表の表３に、「ＥＣ５０ ＣＨＯ−ＰＤ１」値［ｎｇ／ｍｌ］として列挙する。
【０２１９】
（ｃｙｎｏＰＤ１のＥＬＩＳＡ）
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐストレプトアビジン被覆プレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を２５μｌ／ウェルのビオチン化ｃｙｎｏＰＤ１−ＥＣＤ−Ｂｉｏｔｉｎでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗ＰＤ１試料又は参照抗体（ヒト抗ＰＤ１；Ｒｏｃｈｅ）を添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヒツジ抗ヒトＨ＋Ｌ−ＰＯＤ（ＪＩＲ，ＪＩＲ１０９−０３６−０８８）を１：１０００希釈で添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ，１１８３５０３３００１）を添加し、ＯＤ２〜３までインキュベートした。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。
【０２２０】
ＥＬＩＳＡの結果は、下記の概要の表２及び３に、ＥＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］として列挙する。
【０２２１】
（ＰＤリガンド１置換アッセイ）
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐストレプトアビジン被覆プレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を２５μｌ／ウェルのビオチン化ＰＤ１−ＥＣＤ−ＡｖｉＨｉｓでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗ＰＤ１試料又は参照抗体（マウス抗ＰＤ１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ：３２９９１２）を添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＰＤ−Ｌ１（組換えヒトＢ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１ Ｆｃキメラ；１５６−Ｂ７，Ｒ＆Ｄ）を添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヒツジ抗ヒトＨ＋Ｌ−ＰＯＤ（ＪＩＲ，１０９−０３６−０８８）を１：１０００希釈で添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ，１１８３５０３３００１）を添加し、ＯＤ２〜３までインキュベートした。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。
【０２２２】
ＥＬＩＳＡの結果は、下記の概要の表２に、ＩＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］として列挙する。
【０２２３】
（ＰＤリガンド２置換アッセイ）
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐストレプトアビジン被覆プレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を２５μｌ／ウェルのビオチン化ＰＤ１−ＥＣＤ−ＡｖｉＨｉｓでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗ＰＤ１試料又は参照抗体（マウス抗ｈｕＰＤ１；Ｒｏｃｈｅ）を添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＰＤ−Ｌ２（組換えヒトＢ７−ＤＣ／ＰＤ−Ｌ２ Ｆｃキメラ；１２２４−ＰＬ−１００，Ｒ＆Ｄ）を添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヒツジ抗ヒトＨ＋Ｌ−ＰＯＤ（ＪＩＲ，１０９−０３６−０８８）を１：２０００希釈で添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ，１１８３５０３３００１）を添加し、ＯＤ２〜３までインキュベートした。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。
【０２２４】
ＥＬＩＳＡの結果は、下記の概要の表２に、ＩＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］として列挙する。
【０２２５】
（エピトープマッピングＥＬＩＳＡ／結合競合アッセイ）
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ＃４６４７１８）を２５μｌ／ウェルの捕捉抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ；ＪＩＲ；１１５−００６−０７１）でコーティングし、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、プレートを、振盪機上で室温において、２％のＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で１時間ブロックした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌのマウス抗ＰＤ１試料を添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、捕獲抗体を３０μｌ／ウェルのマウスＩｇＧ（ＪＩＲ；０１５−０００−００３）により、振盪機上で室温において１時間ブロックした。同時に、ビオチン化ＰＤ１−ＥＣＤ−ＡｖｉＨｉｓを、振盪機上でＲＴで１時間、第二サンプル抗体と共にプレインキュベートした。アッセイプレートを洗浄した後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、ＰＤ１抗体混合物をアッセイプレートに移し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのストレプトアビジンＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ，＃１１０８９１５３００１）を１：４０００希釈で添加し、室温で１時間振盪機でインキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ，＃１１０８９１５３００１）を添加し、ＯＤ１．５〜２．５までインキュベートした。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。エピトープ群は、参照抗体に対する階層的クラスタリングによって定義された。
【０２２６】
0006654694.tif 000007
0006654694.tif 000008
【０２２７】
（ヒト化抗ＰＤ−１抗体のＢｉａｃｏｒｅ特徴付け）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイは、幾つかのマウスＰＤ１結合剤並びに市販のヒトＰＤ１結合参照物間の結合の動態パラメータを決定するために使用されている。従って、抗ヒトＩｇＧは、（Ｂｉａｃｏｒｅ）ＣＭ５センサーチップの表面にアミンカップリングによって固定された。ついで、試料を捕獲し、ｈｕＰＤ１−ＥＣＤをそれらに結合させた。センサーチップ表面は、各分析サイクルの後に再生された。１：１ラングミュア相互作用モデルにデータを適合させることによって、平衡定数及び速度定数が最終的に得られた。
【０２２８】
約２０００応答単位（ＲＵ）の２０μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃ＢＲ−１００８−３９）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用して、ｐＨ５．０でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００においてＣＭ５センサーチップのフローセル１及び２（あるいは、３及び４）に結合させた。
【０２２９】
試料及びランニング緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０，ｐＨ７．４）であった。フローセル温度は２５℃に、試料コンパートメント温度は１２℃に設定した。システムは、ランニング緩衝液でプライミングした。
【０２３０】
試料を１０ｎＭの濃度で２０秒間注入し、第二のフローセルに結合させた。ついで、各試料にわたって、ヒトＰＤ１−ＥＣＤ濃度（１４４ｎＭ、４８ｎＭ、１６ｎＭ、５．３３ｎＭ、１．７８ｎＭ、０．５９ｎＭ、０．２０ｎＭ及び０ｎＭ）の完全なセットを１２０ｓ間注入した後、３０／３００ｓの解離時間及び３ＭのＭｇＣｌ２を用いた２回の２０ｓの再生工程を続け、その最後のものは、ランニング緩衝液を用いた「注入後の追加の洗浄」を含んでいた。
【０２３１】
最後に、二重参照データを、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させた。得られたＫＤ、ｋａ及びｋｄ値を表４に示す。
【０２３２】
0006654694.tif 000009
表４に示されるように、キメラＰＤ１−０１０３の全てのヒト化型（作製は実施例６を参照）は、親抗体（キメラＰＤ１−０１０３）と同様の動態特性を示す。
【０２３３】
（動態）
ＣＭ５センサーシリーズＳをＢｉａｃｏｒｅ４０００システムに取り付け、検出スポットを製造者の説明書に従って流体力学的にアドレス指定した。
【０２３４】
ポリクローナルウサギＩｇＧ抗体＜ＩｇＧＦＣγＭ＞Ｒ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）をフローセル１、２、３及び４中の検出スポット１及び５に１００００Ｒｕで固定した。結合は、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学によって製造者の説明書に従ってなされた。フローセル中の残りのスポットは参照となった。試料緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルデキストランを補充したシステム緩衝液であった。
【０２３５】
一実施態様では、アッセイは２５℃でなされた。別の実施態様では、アッセイは３７℃でなされた。５０ｎＭの各マウスモノクローナル抗体を、１０μｌ／分で１分間の注入によってセンサー表面上に捕捉した。続いて、それぞれの抗原を、４分の結合相時間、１００ｎＭ、２×３３ｎＭ、１１ｎＭ、４ｎＭ、１ｎＭ及びシステム緩衝液０ｎＭの濃度系列で３０μｌ／分で注入した。解離を更に４分間モニターした。３０μｌ／分で１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５を３分間注入して、捕捉系を再生した。関連する動態データは、製造者の説明書に従ってＢｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを使用して、計算した。
【０２３６】
（エピトープマッピング）
Ｂｉａｃｏｒｅ４０００機器は、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＡＰセンサーを取り付け、製造者により推奨されるようにして準備した。機器の緩衝液はＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０）であった。機器は２５℃で操作した。
【０２３７】
全ての試料をシステム緩衝液で希釈した。３５ｋＤａのビオチン化抗原ＰＤ１−ＥＣＤ−ＡｖｉＨｉｓを、スポット１及び５のフローセル１、２、３及び４への３０μｌ／分での１分間の注入によってＣＡＰセンサー表面上２００ＲＵで捕捉した。スポット２、３及び４は参照となった。別の実施態様では、３５ｋＤａのビオチン化抗原ＰＤ１−ＥＣＤ−ＡｖｉＨｉｓをＣＡＰセンサー上に同じ様式で２００ＲＵで捕捉した。
【０２３８】
その後、一次抗体を１００ｎＭで３分間３０μｌ／分で注入し、続いて二次抗体を１００ｎＭで３分間３０μｌ／分で注入した。一次抗体は、表面提示抗原が完全に飽和するまで注入した。一次抗体及び二次抗体の注入段階の終わりに、各抗体の結合応答をモニターするために、レポート点「結合後期」（ＢＬ）を設定した。二次抗体結合応答「ＢＬ２」と一次抗体応答「ＢＬ１」との間の商であるモル比を計算した。抗原が既に一次抗体によって複合体化されている場合、モル比を二次抗体の抗原接近可能性の指標として使用した。
【０２３９】
製造者によって推奨されるように、３０μｌ／分の２Ｍのグアニジン−ＨＣＬ、２５０ｍＭのＮａＯＨ再生緩衝液を２分間注入し、その後、３０μｌ／分のシステム緩衝液を１分間注入することにより、複合体をセンサー表面から完全に除去した。
【０２４０】
実施例３：
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるサイトカイン産生に対する異なる抗ＰＤ−１抗体の効果
３Ａ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）は、ある個体（ドナーＸ）由来のリンパ球の別の個体（ドナーＹ）由来のリンパ球への活性化を測定する免疫細胞アッセイである。混合リンパ球反応を使用して、リンパ球エフェクター細胞に対するＰＤ１経路を遮断する効果を実証した。アッセイにおけるＴ細胞を、抗ＰＤ１ ｍＡｂの存在下又は非存在下での活性化及びそれらのＩＦＮ−γ分泌について試験した。
【０２４１】
同種異系ＭＬＲを実施するために、Ｌｅｕｋｏｓｅｐ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ，２２７２８８）を使用する密度勾配遠心分離によって、未知のＨＬＡ型の少なくとも４人の健康なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。簡潔に述べると、ヘパリン処理した血液試料を３倍容量のＰＢＳで希釈し、希釈した血液の２５ｍｌアリコートを５０ｍｌのＬｅｕｋｏｓｅｐチューブに層化した。室温で８００×ｇで１５分間遠心分離した後（中断なし）、リンパ球含有画分を回収し、ＰＢＳで洗浄し、機能アッセイで直接使用するか、又は１．０Ｅ＋０７細胞／ｍｌで凍結培地（１０％ＤＭＳＯ、９０％ＦＣＳ）中に再懸濁させ、液体窒素で保存した。個々の２方向ＭＬＲ反応を、１：１の刺激／応答細胞比で二つの異なるドナーからのＰＢＭＣを混合することによってセットアップし、異なる濃度範囲の精製された抗ＰＤ１モノクローナル抗体ＰＤ１−００５０、ＰＤ１−００６９、ＰＤ１−００７３、ＰＤ１−００７８、ＰＤ１−００９８、ＰＤ１−０１０２、ＰＤ１−０１０３の存在下又は非存在下、平底９６ウェルプレートで少なくとも２連で３７℃、５％ＣＯ２で６日間、共培養を行った。参照抗ＰＤ１抗体として、ニボルマブ（ＭＤＸ−５Ｃ４又はＭＤＸ−１１０６としても知られている）又はペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５又はＯｒｇ １．０９Ａとしても知られている）の何れかのＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体を合成し、ヒトＩｇＧ１（変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス）を有する））の骨格でクローニングした。抗体なしか又はアイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用し、ｒｅｃ ｈｕ ＩＬ−２（２０ＥＵ／ｍｌ）を陽性対照として使用した。６日後、サイトカイン測定のために各培養物から１００μｌの培地を採取した。ＩＦＮ−γのレベルを、ＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
【０２４２】
結果を表５に示す（ＩＦＮ−ｇ分泌／放出）。抗ＰＤ１モノクローナル抗体は、濃度依存的な形でＴ細胞活性化及びＩＦＮ−γ分泌を促進した。ＩＦＮｇ分泌の増加％値は、如何なる遮断ｍＡｂ（基底同種異系刺激誘発ＩＦＮｇ値をＥ−ｃとして）も添加しないＭＬＲ及び２０ＥＵ／ｍｌのｒｅｃ ｈｕ ＩＬ−２（陽性対照＝１００％ＩＦＮｇ値をＥ＋ｃとして）を添加したＭＬＲのＩＦＮ−ｇ産生に関して計算し、式：Ｒｅｌ.Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ［％］＝((Ｅｓａｍｐｅｌ−Ｅ-ｃ)／(Ｅ+ｃ−Ｅ-ｃ)×１００に従って計算した。
0006654694.tif 000010
【０２４３】
幾つかのＰＤ１遮断抗体ＰＤ１−００５０、ＰＤ１−００６９、ＰＤ１−００７３、ＰＤ１−００７８、ＰＤ１−００９８、ＰＤ１−０１０２、ＰＤ１−０１０３は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ｇ）の分泌を増強することによって強力な免疫調節活性を示した（データは全抗体については示さず）。
【０２４４】
３Ｂ）更なる実験では、キメラＰＤ１−０１０３（変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス）を有するヒトＩｇＧ１アイソタイプ）を評価した。キメラＰＤ１−０１０３を用いたＰＤ１の遮断は、同種異系刺激初代ヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を強く増強する。キメラＰＤ１−０１０３は、参照抗ＰＤ１抗体よりも強力である（図１参照）。
【０２４５】
比較のために、ニボルマブ（ＭＤＸ５Ｃ４又はＭＤＸ−１１０６としても知られる）及びペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５又はＯｒｇ１．０９Ａとしても知られる）の何れかのＶＨ及びＶＬドメインを含む参照抗ＰＤ１抗体を合成し、ヒトＩｇＧ１の骨格（変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス）を有する）でクローニングしたものを使用した。
【０２４６】
３Ｃ）更なる実験において、抗ＰＤ−１抗体ＰＤ１−０１０３のヒト化変異体（図２及び３のヒト化抗体ＰＤ１−０１０３−０３１２、ＰＤ１−０１０３−０３１４、以下の実施例９も参照のこと）の免疫調節活性、ａ）ＩＦＮ放出（分泌）ｂ）ＴＮＦ−α放出（分泌）を、上述のＭＬＲで評価した。キメラＰＤ１−０１０３抗体とそのヒト化型の効果を、ヒトＩｇＧ１の骨格（変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス）を有する）ニボルマブ（ＭＤＸ５Ｃ４又はＭＤＸ−１１０６としても知られている）及びペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５又はＯｒｇ１．０９Ａとしても知られている）何れかのＶＨ及びＶＬドメインを含む参照抗ＰＤ１抗体と比較した。ＭＬＲ培養の６日後、５０μｌの上清を採取し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ ＰｒｏＴＭヒトサイトカインＴｈ１／Ｔｈ２アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して単一培養で複数のサイトカインを測定した。（データは全てのサイトカインについては示さず）。
【０２４７】
キメラＰＤ１−０１０３抗体とそのヒト化型（ＰＤ１−０１０３＿０３１２及びＰＤ１−０１０３＿０３１４）は、Ｔ細胞活性化及びＩＦＮ−γ分泌の増強において参照抗ＰＤ１抗体と比較してより強力であった（図２参照）。
【０２４８】
更に、キメラＰＤ１−０１０３抗体とそのヒト化変異体は、抗原提示細胞による腫瘍壊死因子α（ＴＮＦアルファ）（図３参照）及びＩＬ−１２（データは示さず）の分泌を増加させ、単球／マクロファージ又は抗原提示細胞のＴ細胞を刺激する能力を増強する。
【０２４９】
実施例４：
同種異系成熟樹状細胞と共培養したヒトＣＤ４ Ｔ細胞による細胞傷害性グランザイムＢ放出及びＩＦＮ−γ分泌に対する抗ＰＤ−１遮断の効果
同種異系設定での抗ＰＤ−１処理の効果を更に調べるために、我々は、新しく精製したＣＤ４ Ｔ細胞を単球由来同種異系成熟樹状細胞（ｍＤＣ）の存在下で５日間共培養するアッセイを開発した。１週間前に新鮮なＰＢＭＣから単球をプラスチック付着により単離し、続いて非付着細胞を除去した。ついで、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地中で５日間それらを培養することにより、単球から未成熟ＤＣを作製した。ｉＤＣ成熟を誘導するために、我々は、更に２日間、培養培地にＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）を加えた。ついで、我々は、主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６のその表面発現をフローフローメトリーにより測定することによりＤＣ成熟を評価した（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０２５０】
最小混合リンパ球反応（ｍＭＬＲ）の日に、無関係のドナーから得られた１０８個のＰＢＭＣから、マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によってＣＤ４ Ｔ細胞を濃縮した。前培養では、ＣＤ４ Ｔ細胞を５ｍＭのカルボキシ−フルオレセイン−スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。ついで、１０５個のＣＤ４ Ｔ細胞を、遮断抗ＰＤ１抗体（ＰＤ１−０１０３、キメラＰＤ１−０１０３、又は図４Ａ及び４Ｂにおいて０３１２、０１３１３、０１４１、０３１５と略記されるヒト化抗体ＰＤ１−０１０３−０３１２、ＰＤ１−０１０３−０３１３、ＰＤ１−０１０３−０３１４、ＰＤ１−０１０３−０３１５の何れか）の存在下又は非存在下で、図に別の表示がなされていないならば１０μｇ／ｍｌの濃度で、成熟アロ−ＤＣ（５：１）と共に９６ウェルプレートに播種した。
【０２５１】
５日後、我々は、細胞培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）によりＩＦＮ−γレベルを測定するために後で使用し、ゴルジプラグ（ブレフェルジンＡ）及びゴルジストップ（モネンシン）の存在下で更に５時間３７℃に細胞を放置した。ついで、細胞を洗浄し、抗ヒトＣＤ４抗体及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ固定色素Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で表面に染色した後、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定／透過処理した。我々は、グランザイムＢ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２（双方ともｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）の細胞内染色を実施した。結果を図４Ａ及び４Ｂに示す。
【０２５２】
我々はまた異なる濃度のヒト化変異体ＰＤ１−０１０３（図において０３１２、０１３１３、０３１４、０３１５と略記されるヒト化抗体ＰＤ１−０１０３−０３１２、ＰＤ１−０１０３−０３１３、ＰＤ１−０１０３−０３１４、ＰＤ１−０１０３−０３１５、以下の実施例６もまた参照のこと）を試験し、それらがグランザイムＢ及びインターフェロンガンマの増強において等しく良好であることを見出した。ＤＰ４７は、ＦｃγＲによる認識を回避するためにＦｃ部分にＬＡＬＡ変異を有する非結合ヒトＩｇＧであり、陰性対照として使用した。
【０２５３】
実施例５：
キメラ抗体誘導体
キメラＰＤ１抗体を、抗ＰＤ１マウス抗体ＰＤ１−００９８、ＰＤ１−０１０３の可変重鎖及び軽鎖領域をＰＣＲによって増幅し、エフェクター機能を抑止する変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス））（ロイシン２３４からアラニン、ロイシン２３５からアラニン、プロリン３２９からグリシン）を有するヒトＩｇＧ１骨格／ヒトＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３との融合タンパク質として重鎖発現ベクター中に、またヒトＣ−カッパに対する融合タンパク質として軽鎖発現ベクター中にそれらをクローニングすることによって作製した。ついで、ＬＣ及びＨＣプラスミドをＨＥＫ２９３にコトランスフェクトし、７日後に、抗体精製のための標準的な方法によって上清から精製した。キメラＰＤ１抗体をキメラｃｈｉＰＤ１−００９８（ｃｈｉＰＤ１−００９８）及びキメラＰＤ１−０１０３（ｃｈｉＰＤ１−０１０３）と命名し直した。比較のために、ニボルマブ（ＭＤＸ−５Ｃ４又はＭＤＸ−１１０６としても知られている）及びペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５又はＯｒｇ１．０９Ａとしても知られている）の何れかのＶＨ及びＶＬドメインを含む参照抗ＰＤ１抗体を合成し、ヒトＩｇＧ１（変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス）を有する）の骨格と共にクローニングしたものを使用した。
【０２５４】
実施例６：
抗ＰＤ１抗体ＰＤ−０１０３のヒト化変異体（ｈｕＭａｂ ＰＤ−０１０３）の作製、発現及び精製と特徴付け
（マウス抗ＰＤ１抗体０１０３のＶＨ及びＶＬドメインのヒト化）
マウス抗ＰＤ１抗体０１０３のマウスＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号：７及び８）に基づいて、ヒト化抗抗ＰＤ１抗体変異体を作製した。
【０２５５】
ヒト化ＶＨ−変異体は、幾つかの変異を有するヒトＪ−エレメント生殖系列ＩＧＨＪ５−０１と組み合わせた、ヒト生殖系列ＩＭＧＴ＿ｈＶＨ＿３＿２３に基づいている。（配列番号：５７となる）。
【０２５６】
ＶＬのヒト化変異体は、ヒトＪ−生殖系列ＩＧＫＪ１−０１と組み合わせたヒト生殖系列ＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿４＿１、ＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿２＿３０、ＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿３＿１１及びＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿１＿３９に基づく。異なる変異により、配列番号：５８〜配列番号：６１のヒト化変異体が得られた。
【０２５７】
ＰＤ１−０１０３の重鎖及び軽鎖可変領域のヒト化アミノ酸配列をＤＮＡに逆翻訳し、得られたｃＮＤＡを合成し（ＧｅｎＡｒｔ）、ついでエフェクター機能を抑止するＬＡＬＡ及びＰＧ変異（ロイシン２３４からアラニン、ロイシン２３５からアラニン、プロリン３２９からグリシン）を有するヒトＩｇＧ１骨格／ヒトＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３との融合タンパク質として重鎖発現ベクター中に、またヒトＣ−カッパに対する融合タンパク質として軽鎖発現ベクター中にクローニングした。ついで、ＬＣ及びＨＣプラスミドをＨＥＫ２９３にコトランスフェクトし、７日後に、抗体精製のための標準的な方法によって上清から精製した。得られたヒト化ＰＤ１抗体は、以下のように命名される：
0006654694.tif 000011
0006654694.tif 000012
【０２５８】
ヒト化ＰＤ１−０１０３抗体変異体及び親キメラＰＤ１−０１０３を上に記載のようにして特徴付けた。結果を表８に示す。
0006654694.tif 000013
【０２５９】
実施例７：
ＰＤ−１抗体の中和効力
インビトロでの抑制されたＴ細胞応答の回復の模倣において社内で作製したＰＤ−１抗体の中和効力を試験するために、市販のＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１レポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。このシステムはＰＤ１＋ＮＦＡＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞と、活性化シグナルをまた与えるＰＤ−Ｌ１＋ＣＨＯカウンターパートで構成される。原理的には、レポーター系は、（１）ＴＣＲ媒介ＮＦＡＴ活性化、（２）ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸による活性化時のＮＦＡＴシグナルの抑制、及び（３）ＰＤ−１遮断抗体によるＮＦＡＴシグナルの回復の三工程に基づく。
【０２６０】
材料と方法：
・ＰＤ−Ｌ１培地：ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ（＃Ｐ０４−０３６０９）；ＦＢＳ（１０％）及びＬ−Ｇｌｎ（４ｍＭ）
・アッセイ培地：ＲＰＭＩ１６４０（＃３１８７０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−Ｇｌｎ、ＦＢＳ（２％）
・このアッセイに使用した細胞（両方ともＰｒｏｍｅｇａによる購入細胞型）：
ＰＤ−Ｌ１＋ＣＨＯ細胞（バッチ番号＃１３９１４７）：２−３×１０４細胞／９６ウェル
ＰＤ−１＋ＮＦＡＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞（バッチ番号＃１３３０２４：３．５×１０４細胞／ウェル
【０２６１】
１日目に、ＰＤ−Ｌ１＋細胞を解凍し、上述した培地中の示された細胞濃度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。次の日に、培地を除去し、ＰＤ−Ｌ１＋細胞を、指示された濃度（アッセイ培地中）で、調製した抗体と共にインキュベートした。並行して、ＰＤ−１＋ＮＦＡＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞を解凍し、上記の細胞数を移してＰＤ−Ｌ１＋細胞と共に共培養した。３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートした後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ基質を室温まで温めた（添加前１−２時間）。細胞培養プレートをインキュベーターから取り出し、室温（１０分間）に調整した後、１ウェル当たり８０μｌのＢｉｏ−Ｇｌｏ溶液を添加し、５〜１０分間インキュベートした後、ルミネセンスをＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅリーダーでキットの製造者の推奨に従って測定した。結果は、図５Ａ及び５Ｂに見ることができ、ＴＣＲ刺激時の異なるＰＤ−１抗体によるＮＦＡＴシグナルのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１媒介抑制の回復が示されている：図５Ａ：キメラＰＤ１＿０１０３は、参照抗体と比較した場合、再現性良く優れた効果を示した。参照として、ＶＨ及びＶＬドメインを含む抗ＰＤ１抗体ニボルマブ（ＭＤＸ−５Ｃ４又はＭＤＸ−１１０６としても知られている）を合成し、ヒトＩｇＧ１の骨格（変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス）を有する）を用いてクローン化した。図５Ｂ：ＰＤ１＿０１０３の４つのヒト化変異体は、リード抗体と同様のインビトロ効力を示し、また参照抗体より僅かに優れていた。
【０２６２】
実施例８：
ＰＤ−１外部ドメインを伴うＦａｂ ＰＤ１−０１０３の結晶化：
複合体形成のために、Ｆａｂ ＰＤ１−０１０３を１．１モル過剰でＰＤ−１外部ドメインと混合した。氷上で１時間インキュベートした後、ＰＮＧａｓｅ工程により複合体を脱グリコシル化し、複合体形成に関与しないグリカンを除去した。ＰＤ−１ ＥＣＤを伴うＦａｂ断片ＰＤ１−０１０３（ヒトＣＨ１及びＣＬを含む）の複合体結晶の結晶化スクリーニングを１５ｍｇ／ｍｌの濃度で実施した。蒸気拡散シッティングドロップ実験において０．１μｌのタンパク質溶液を０．１μｌのリザーバー溶液と混合することによって、結晶化ドロップを２１℃でセットアップした。沈殿剤としてＰＥＧを含む様々な条件から結晶が出現した。構造を決定するために使用した結晶は３０％ＰＥＧ１５００から４日以内に現れ、７日以内に最終サイズ０．０３×０．０６×０．０２μｍまで成長した。
【０２６３】
凍結保護物質として２０％グリセロールを補充したリザーバー溶液中に結晶を移し、ついで液体Ｎ２中でフラッシュ冷却した。スイス光源のビームラインＸ１０ＳＡでＰｉｌａｔｕｓ ６Ｍ検出器を用いて１００Ｋの温度で回折像を収集し、ＸＤＳパッケージで処理した［Kabsch, W. Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. J. Appl. Cryst. 26, 795-800 (1993)］。一つの結晶からのデータを併合して、結晶学的非対称単位当たり２個の複合分子を有する空間群Ｐ１に１．９Åの分解能データセットを得た（表１参照）。
【０２６４】
構造は、検索モデルとしてＰＤＢ−ＩＤ ３ＵＴＺからのＦａｂ断片の座標を使用して分子置換によって決定した。ＰＤ−１ ＥＣＤの検索座標として、ＰＤＢ−ＩＤ ３ＲＲＱを使用した。Ｆａｂを定常ドメインと可変ドメインに分け、双方についてＣＣＰ４プログラムＰＨＡＳＥＲ ＣＣＰ４での別個の検索を、肘角度の可能な変化を考慮するために実施した［CCP4 (Collaborative Computational Project, N. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr. D, 760-763 (1994)］。モデルをＣＯＯＴで再構築し（Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, WG. & Cowtan, K. Features and development of COOT. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 486-501 (2010)）、ＣＣＰプログラムＲＥＦＭＡＣを用いて精密化した。最終精密化段階は、プログラムＢＵＳＴＥＲ（Bricogne G., Blanc E., Brandl M., Flensburg C., Keller P., Paciorek W.,Roversi P, Sharff A., Smart O.S., Vonrhein C., Womack T.O. (2016). BUSTER version 2.11.6. Cambridge, United Kingdom: Global Phasing Ltd.）を用いて実施した。
【０２６５】
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【０２６６】
（ＰＤ−１外部ドメインと複合体化したＦａｂ ＰＤ１−０１０３の構造決定）
エピトープとパラトープを詳細に特徴付けるために、我々はＦａｂ ＰＤ１−０１０３と複合体化したＰＤ−１外部ドメインの結晶構造を１．９Åの分解能で決定した。この構造は、ＢＣ及びＦＧループ領域とＰＤ−１ Ｖ型Ｉｇドメインの前βシートのβ鎖ＣＣ’ＦＧの残基によって形成されるエピトープを認識するＦａｂ ＰＤ１−０１０３を明らかにする。加えて、エピトープは、ＰＤ−１のＢＣループの一部であるＡｓｎ５８位にＮ結合型グリコシル化ツリーを含む。Ｆａｂ ＰＤ１−０１０３の軽鎖のＣＤＲ２を除く全てのＣＤＲがパラトープに寄与する。
【０２６７】
ＰＤ−１の１０６３Å２の表面積は、重鎖が寄与する７４３Å２と軽鎖が寄与する３２０Å２を含むＦａｂ ＰＤ１−０１０３によってカバーされる。プログラムＰＩＳＡを用いた結合界面の解析は、６つの水素結合とファンデルワールス力によるＰＤ−１ ＥＣＤとのＦａｂ ＰＤ１−０１０３の相互作用パターンを明らかにする。重鎖ＣＤＲ１（Ｔｈｒ３３）及びＣＤＲ２（Ｓｅｒ５２、Ａｒｇ５６、Ａｓｐ５７）の残基とＰＤ−１のＢＣループのＧｌｕ６１及びＳｅｒ６２との間に側鎖水素結合が形成される。ファンデルワールス接触は、軽鎖及び重鎖のＣＤＲ３、特にＢＣループの残基Ｖａｌ６４に近接し、ＦＧループのＰｒｏ８３と、Ｉｌｅ１２６及びＬｅｕ１２８に近接するＨＣＤＲ３のＰｈｅ１０５とＨＣＤＲ１のＴｙｒ３２によって、主に駆動される。更なるファンデルワールス接触が、Ｆａｂ ＰＤ１−０１０３の重鎖のＣＤＲ２及び軽鎖のＣＤＲ３とＦＧループ残基Ｐｒｏ１３０、Ａｌａ１３２、Ｉｌｅ１３４との間で観察される。Ｆａｂ ＰＤ１−０１０３の軽鎖は、ＰＤ−１のＦＧループと排他的に接触する。複合体の形成では、軽鎖のＣＤＲ２による接触は提供されない。
【０２６８】
ＰＤ−１のＡｓｎ５８位のＮ結合グリコシル化ツリーはエピトープの一部であり、Ｆａｂ ＰＤ１−０１０３の重鎖の残基とだけ相互作用する。
【０２６９】
ＰＤ−１のＡｓｎ５８位のコア糖鎖（Ｎ結合グリコシル化）ツリーは、単糖類に関して次の構造を有する
Ａｓｎ５８−Ｎ−ＧｌｃＮＡｃ（ＦＵＣ）−ＧｌｃＮＡｃ−−ＢＭＡ−ＭＡＮ（図９を参照）、ここで次の略語が使用される。
［ＧｌｃＮＡｃ］＝ＮＧＡ＝Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミン＝２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノース
［ＦＵＣ］＝α−Ｌ−フコース
［ＢＭＡ］＝β−Ｄ−マンノピラノース
［ＭＡＮ］＝アルファ−Ｄ−マンノピラノース
糖鎖の最初のＧｌｃＮＡＣは、ＧｌｃＮＡｃ（ＦＵＣ）として略されるフコシル化される。
【０２７０】
この構造において、コアグリカンは、一マンノース単位を除いて、電子密度において明確に定義されている。フコース部分は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有するＰＤ−１により形成された親水性ポケットを指す。フコースの結合は、ＰＤ−１のＧｌｕ６１及びＧｌｎ９９と共に、ＣＤＲ１のＳｅｒ３０及びＳｅｒ３１との水素結合ネットワークによって配位される。更なる接触は、第一のＧｌｃＮＡｃのＡｒｇ５６への及びフレームワーク残基Ａｒｇ７２、Ａｓｐ７３、Ａｓｎ７４からＭａｎへの水素結合によって提供される。
【０２７１】
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0006654694.tif 000016
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【０２７２】
概要
・ＰＤ１上のエピトープは平面に似ている
-> ＰＤ１の主に前のｂシートとＣＤＲ３による結合
・相互作用は極性及びファンデルワールス接触を含む
・Ｆａｂの重鎖とのＰＤ１の大きな相互作用表面積
・Ａｓｎ５８位のグリコシル化がＰＤ１のＦａｂ断片への結合に関与する
・フコース単位はＰＤ１及びＦａｂ ＰＤ１−０１０３の重鎖により形成されたポケットを占有する
【０２７３】
実施例９：
Ａｓｎ５８でグリコシル化されたヒトＰＤ１への結合と比較して、Ａｓｎ５８でグリコシル化されていないヒトＰＤ１への抗体結合の減少（グリコシル化及び非グリコシル化組換えＰＤ１に対する抗ＰＤ−１抗体のＢｉａｃｏｒｅ特徴付け）
グリコシル化ＰＤ１と非グリコシル化組換えヒトＰＤ１との間の結合の動態パラメータを決定するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくアッセイが使用されている。それ故、（Ｂｉａｃｏｒｅ）ＣＭ５センサーチップの表面にアミンカップリングによって抗ヒトＩｇＧを固定化した。ついで、試料を捕捉し、ｈｕ ＰＤ１−ＥＣＤをそれらに結合させた。各分析サイクルの後にセンサーチップ表面を再生した。１：１ラングミュア相互作用モデルにデータをフィッティングすることによって、平衡定数及び動態速度定数が最終的に得られた。
【０２７４】
約２０００反応単位（ＲＵ）の２０μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃ＢＲ−１００８−３９）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから供給されるアミンカップリングキットを使用して、ｐＨ５．０のＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００においてＣＭ５センサーチップのフローセル１及び２（あるいは、３及び４）上で結合させた。
【０２７５】
試料及びランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０，ｐＨ７．４）であった。フローセル温度は２５℃に、試料コンパートメント温度は１２℃に設定した。システムをランニング緩衝液でプライミングした。
【０２７６】
試料を１０ｎＭの濃度で２０秒間注入し、第二のフローセルに結合させた。ついで、ヒトＰＤ１−ＥＣＤグリコシル化又は非グリコシル化）濃度の完全なセット（２００ｎＭ、６６．６ｎＭ、２２．２ｎＭ、７．４ｎＭ、２．４６ｎＭ及び０ｎＭ）を２００ｓの間、各試料に注入し、０／２０００ｓの解離時間（６６．６ｎＭ及び２２．２ｎＭ）と３ＭのＭｇＣｌ２での２回の２０ｓの再生工程を続け、その最後のものはランニング緩衝液での「注入後の追加の洗浄」を含んでいた。
【０２７７】
最後に、二重参照データを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させた。得られたＫＤ、ｋａ及びｋｄ値を表１３に示す。
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【０２７８】
ペンブロリズマブ及びヌボルマブとは対照的に、アグリコシル化及びグリコシル化ＰＤ−１に対するＰＤ−１０３−０３１２の結合には明確な差異がある（図１３Ａ及び１３Ｂも参照）。
【０２７９】
実施例１０：
ＣＥＡに対するＴ細胞二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ１抗体のインビボ抗腫瘍効力
ＮＯＧマウスを順化させ、続いてヒト造血幹細胞を養子移入してヒト化動物を作製した。得られたマウスは２０〜８５％のヒト由来細胞範囲のヒト及びマウス白血球間のキメラ比を示す。そのようなモデルでは、Ｔ細胞は機能的であり、ＣＥＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体（国際公開第２０１４／１３１７１２号に記載）によって腫瘍細胞を死滅させるように活性化されうる。ついで、そのようなヒト化動物に、ＭＫＮ４５胃癌の１００万個のＣＥＡ陽性腫瘍細胞を側方位置に皮下注射した。腫瘍増殖を、オペレーター決定式キャリパーによって、週３回、腫瘍の３次元軸を測定することによって評価することができた（図１４Ａ及びＢ）。腫瘍注射後９日目に、マウスを腫瘍サイズに基づいて無作為化して均一な動物群とし、治療処置を開始した。ビヒクル群（図ｘＡ及びＸＢ、円）を除いて、全てのマウス群に、ＣＥＡＣＤ３ＴＣＢを２．５ｍｈ／Ｋｇの用量で週２回、静脈内投与した。加えて、各マウス群を、週１回０．１５ｍｇ／Ｋｇ（図１４Ａ、四角）又は１．５ｍｇ／Ｋｇ（図１４Ｂ、四角）の何れかの抗ＰＤ１（ＰＤ１−０１０３−０３１２）で腹腔内；週１回０．１５ｍｇ／Ｋｇ（図１４Ａ、菱形）又は１．５ｍｇ／Ｋｇ（図１４Ｂ、菱形）の何れかのニボルマブで腹腔内の、一つの組合せパートナーでまた処置した。一処置群内の腫瘍サイズの平均が経時的に表示される。群はそれぞれ９〜１０匹のマウスから構成され、測定は１群当たりに少なくとも３匹のマウスが存在するまで継続する。曲線下の標準化された面積（ｓＡＵＣ）を計算し、統計的有意性を計算するために一元配置ＡＮＯＶＡ分析を使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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