(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液を収容することが可能な第１のセルと、前記培養液を収容することが可能な第２のセルと、前記第１のセル及び前記第２のセルを接続する第３のセルと、を有する複数の培養容器と、
前記第３のセルを貫通する第１の位置と、前記第３のセルから抜去される第２の位置と、の間を移動可能に構成された複数の針状部材と、
前記複数の培養容器を保持する第１の保持部材と、
前記複数の針状部材各々を前記複数の培養容器のうちの一の培養容器の前記第３のセルに貫通させることが可能に、前記複数の針状部材を保持する第２の保持部材と
を具備し、
前記第３のセルは、
前記第１のセルに隣接する第１の隔壁と、
前記第２のセルに隣接する第２の隔壁と、
前記第１の隔壁及び前記第２の隔壁にそれぞれ対向して形成され前記第１のセル及び前記第２のセルとそれぞれ連通する少なくとも一対の孔を含み、前記培養液の流路を規定することが可能な第１の孔部と、
を有し、前記流路の周囲に細胞足場材が充填されることが可能であり、
前記複数の針状部材各々は、前記第１の位置で前記第１の孔部に挿入される
培養装置。
【請求項２】
請求項１に記載の培養装置であって、
前記複数の針状部材各々を前記第１の位置と前記第２の位置との間で移動させることが可能に、前記第２の保持部材を移動させる移動機構
をさらに具備する培養装置。
【請求項３】
請求項２に記載の培養装置であって、
前記第１の保持部材は、前記少なくとも一対の孔が一軸方向に対向するように前記複数の培養容器を保持し、
前記第２の保持部材は、前記複数の針状部材各々の延在方向を前記一軸方向に一致させるように前記複数の針状部材を保持し、
前記移動機構は、前記第２の保持部材を前記一軸方向に沿って前記第２の保持部材を移動させる
培養装置。
【請求項４】
請求項１から３のうちいずれか一項に記載の培養装置であって、
前記第３のセルは、前記第１の隔壁及び前記第２の隔壁に連接して配置される周面と、前記周面に連接して配置される天面を有する
培養装置。
【請求項５】
培養液を収容することが可能な第１のセルと、前記培養液を収容することが可能な第２のセルと、前記第１のセル及び前記第２のセルを接続する第３のセルと、を有する培養容器を用いた培養方法であって、
下地となる細胞が表面に播種された針状部材を、前記第３のセルを貫通するように前記第３のセルに挿入し、
前記第３のセルの前記針状部材の周囲に細胞足場材を充填し、
前記針状部材から前記細胞足場材に前記細胞を転写し、
前記第１のセルと前記第２のセルの少なくとも一方に培養液を添加し、
前記針状部材を前記第３のセルから抜去し、
前記第１のセルと前記第２のセルとの前記培養液の液頭差に基づいて、前記針状部材を抜去して形成された流路に前記培養液を灌流させる
培養方法。
【請求項６】
請求項５に記載の培養方法であって、
前記培養液を添加する工程は、
前記第１のセルと前記第２のセルの少なくとも一方に緩衝液を添加し、
前記針状部材を前記第３のセルから抜去した後、前記緩衝液を培養液と入れ替える
培養方法。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の培養方法であって、
前記培養容器は、複数の培養容器を有し、
前記針状部材は、複数の針状部材を有し、
前記針状部材を前記第３のセルに挿入する工程では、前記複数の針状部材各々を、前記複数の培養容器のうちの一の培養容器の前記第３のセルに挿入する
培養方法。
【請求項８】
請求項７に記載の培養方法であって、
前記針状部材を前記第３のセルから抜去する工程では、前記第１のセルと前記第２のセルとが一軸方向に対向するようにそれぞれ配置された前記複数の培養容器に対し、延在方向を前記一軸方向に一致させた前記複数の針状部材を、前記一軸方向に沿ってそれぞれ移動させる
培養方法。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の培養方法であって、
前記流路に前記培養液を灌流させる工程では、前記第１のセルと前記第２のセルとが一軸方向に対向するように前記複数の培養容器をそれぞれ配置し、前記一軸方向と直交する軸まわりに前記複数の培養容器を回動させることにより、前記流路に前記培養液を灌流させる
培養方法。
【請求項１０】
請求項５から９のうちいずれか一項に記載の培養方法であって、
前記針状部材には、前記表面に結合することが可能な化合物を介して前記細胞が播種されており、
前記細胞を転写する工程では、前記針状部材に電圧を印加して前記化合物と前記表面とを離間させることで、前記針状部材から前記細胞足場材に前記細胞を転写する
培養方法。
【請求項１１】
請求項５から１０のうちいずれか一項に記載の培養方法であって、
前記針状部材を前記第３のセルに挿入する工程では、前記第１のセルと前記第２のセルとが鉛直方向に対向する第１の姿勢の前記培養容器に、前記針状部材の延在方向が鉛直方向に一致するように前記針状部材を挿入し、
前記培養液を添加する工程では、前記第１のセルと前記第２のセルとが水平方向に対向する第２の姿勢の前記培養容器に、前記培養液を添加する
培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮細胞等を培養して管状の血管様構造を作製することが可能な培養容器、培養装置及び培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞の浸潤や転移には血管新生が深く関わっており、この血管新生を抑制する薬剤等の開発が行われている。薬剤等のスクリーニングにおいて血管新生を評価するために、近年、動物実験等に替わり、管状の血管様細胞をin vitroで人工的に作出する技術が注目されている。
【０００３】
例えば、非特許文献１には、ゲル状の細胞足場材にニードルを刺し、引き抜くことで管構造を作製し、その後細胞足場材に血管内皮細胞を播種する方法が開示されている。
また、特許文献１には、複数のマンドレルを使用して複数のチャネルを作り細胞を播種して血管様構造を作製する方法、及び、細胞をマンドレルに事前播種してから当該マンドレルを引き抜いてチャネル内壁に細胞を播種する方法が開示されている。加えて同文献には、マンドレルを用いて管構造を形成した後、さらにチャネルに播種された細胞を血管様に培養するために、シリンジポンプを用いて細胞に力学的負荷を加え、チャネルに培養液を灌流させる方法が開示されている。
さらに、非特許文献２には、ニッケルチタニウムロッドでコラーゲンゲルに管構造をモールドした後に血管内皮細胞を注入する、癌細胞の浸潤や転移をモニタリングするための人工血管構造デバイスの製造方法が開示されている。また、同文献には、血管内皮細胞に力学的負荷を与える方法として、当該細胞を注入した後、デバイスに流路を取り付け、重力フローにより灌流する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５７２５８５９号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kenneth M. Chrobak他２名、「Formation of perfused, functional microvascular tubes in vitro」、Microvascular Research、２００６年２月、第７１巻、第３号、p.185-196
【非特許文献２】Andrew D. Wong他１名、「Live-Cell Imaging of Invasion and Intravasation in an Artificial Microvessel Platform」、Cancer Research、２０１４年９月１日、第７４巻、第１７号、p.4937
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１に開示の方法では、細胞足場材で管構造を作製してから血管内皮細胞を播種するため、血管内皮細胞自体が密な管状構造を作製することが難しい。
また、特許文献１に開示の方法では、マンドレルの引き抜き方法によっては細胞に損傷を与える可能性がある。また、シリンジポンプを用いた力学的負荷の付与については、複数の薬液サンプルを検討する際にサンプル数と同数のシリンジポンプを用意し接続する必要があり、煩雑である。
また、非特許文献２に開示の方法でも、ゲルに管構造をモールドした後に血管内皮細胞を注入するため、やはり薬剤スクリーニングに用いることができる程度の密な血管様構造を形成することが難しい。また、デバイス作製後に滅菌的に流路とデバイスを接続しなくてはならず、力学的負荷を与える方法についても煩雑である。
このように、いずれの文献に開示された方法であっても、薬剤スクリーニングに用いることができるような所望の血管様構造を形成することが難しい。
【０００７】
以上のような事情に鑑み、本発明の目的は、培養細胞を用いて、血管新生の評価が十分可能な管状の血管様構造を形成することが可能な培養容器、培養装置及び培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明の一形態に係る培養容器は、第１のセルと、第２のセルと、第３のセルとを具備する。
上記第１のセルは、培養液を収容することが可能である。
上記第２のセルは、上記培養液を収容することが可能である。
上記第３のセルは、
上記第１のセルに隣接する第１の隔壁と、
上記第２のセルに隣接する第２の隔壁と、
第１の孔部と、
を有し、上記第１のセル及び上記第２のセルを接続し、上記流路の周囲に細胞足場材が充填されることが可能である。
上記第１の孔部は、上記第１の隔壁及び上記第２の隔壁にそれぞれ対向して形成され上記第１のセル及び上記第２のセルとそれぞれ連通する少なくとも一対の孔を含み、上記培養液の流路を規定することが可能に構成される。
【０００９】
上記構成によれば、第１の孔部によって第１のセルと第２のセルとの間に培養液の流路が規定されることから、当該流路に培養液を灌流することができる。したがって、流路の内面に細胞を播種し、第１のセル及び第２のセルのいずれか一方から他方に向かって培養液を灌流することで、血管様構造を構築するための培養を容易に行うことができる。
【００１０】
上記第３のセルは、上記細胞足場材を注入するための第２の孔部をさらに有していてもよい。
これにより、第３のセルの上記流路の周囲に細胞足場材を充填することができる。
【００１１】
また、上記第３のセルは、透光性材料により形成された周面を含んでいてもよい。
これにより、顕微鏡による血管様構造の観察が容易になる。
【００１２】
また、本発明の他の形態に係る培養装置は、培養容器と、針状部材と、を具備する。
上記培養容器は、培養液を収容することが可能な第１のセルと、上記培養液を収容することが可能な第２のセルと、上記第１のセル及び上記第２のセルを接続する第３のセルと、を有する。
上記第３のセルは、上記第１のセルに隣接する第１の隔壁と、上記第２のセルに隣接する第２の隔壁と、上記第１の隔壁及び上記第２の隔壁にそれぞれ対向して形成され上記第１のセル及び上記第２のセルとそれぞれ連通する少なくとも一対の孔を含み、上記培養液の流路を規定することが可能な第１の孔部と、を有し、上記流路の周囲に細胞足場材が充填されることが可能である。
上記針状部材は、上記第３のセルを貫通する第１の位置と、上記第３のセルから抜去される第２の位置と、の間を移動可能に構成された針状部材であって、上記第１の位置で上記第１の孔部に挿入される。
【００１３】
上記構成によれば、第１の孔部に針状部材が挿入され、その周囲に細胞足場材を充填することができ、針状部材を抜去した空隙に流路を形成することができる。これにより、流路の内面に細胞を播種し、第１のセル及び第２のセルのいずれか一方から他方に向かって培養液を灌流することで、血管様構造を形成するための培養を容易に行うことができる。
【００１４】
上記培養容器は、複数の培養容器を有し、
上記針状部材は、複数の針状部材を有し、
上記複数の針状部材各々は、上記複数の培養容器のうちの一の培養容器の上記第３のセルを貫通することが可能に構成されてもよい。
これにより、複数の血管様細胞を同時に形成することができ、培養効率を高めることができる。
【００１５】
この場合に、上記培養装置は、
上記複数の培養容器を保持する第１の保持部材と、
上記複数の針状部材各々を上記複数の培養容器のうちの一の培養容器の上記第３のセルに貫通させることが可能に、上記複数の針状部材を保持する第２の保持部材と、
をさらに具備してもよい。
これにより、複数の培養容器と複数の針状部材との間の位置合わせを容易に行うことができる。
【００１６】
また、上記培養装置は、
上記複数の針状部材各々を上記第１の位置と上記第２の位置との間で移動させることが可能に、上記第２の保持部材を移動させる移動機構をさらに具備していてもよい。
【００１７】
さらに、上記第１の保持部材は、上記少なくとも一対の孔が一軸方向に対向するように上記複数の培養容器を保持し、
上記第２の保持部材は、上記複数の針状部材各々の延在方向を上記一軸方向に一致させるように上記複数の針状部材を保持し、
上記移動機構は、上記第２の保持部材を上記一軸方向に沿って上記第２の保持部材を移動させてもよい。
これにより、針状部材の延在方向と移動方向とを平行に維持したまま針状部材を抜去することができ、一軸方向に沿った管状の流路を精度よく形成することができる。したがって、流路内面に播種されている細胞の構造を乱さずに、管状の血管様構造を形成することができる。
【００１８】
本発明のさらに他の形態に係る培養方法は、培養液を収容することが可能な第１のセルと、上記培養液を収容することが可能な第２のセルと、上記第１のセル及び上記第２のセルを接続する第３のセルと、を有する培養容器を用いた培養方法であって、下地となる細胞が表面に播種された針状部材を、上記第３のセルを貫通するように上記第３のセルに挿入する工程を含む。
上記第３のセルの上記針状部材の周囲に細胞足場材が充填される。
上記針状部材から上記細胞足場材に上記細胞が転写される。
上記第１のセルと上記第２のセルの少なくとも一方に培養液が添加される。
上記針状部材が上記第３のセルから抜去される。
上記第１のセルと上記第２のセルとの上記培養液の液頭差に基づいて、上記針状部材を抜去して形成された流路に上記培養液が灌流される。
【００１９】
上記方法によれば、針状部材に予め細胞が播種されていることから、周囲に充填された細胞足場材にこの細胞を転写することで、細胞が密に播種された管状の血管様構造を形成することが容易になる。また、針状部材を抜去した後の流路に、２つの容器の液頭差に基づいて培養液を灌流することができ、血管様構造を形成するための培養を容易に行うことができる。
【００２０】
上記培養液を添加する工程は、上記第１のセルと上記第２のセルの少なくとも一方に緩衝液を添加し、上記針状部材を上記第３のセルから抜去した後、上記緩衝液を培養液と入れ替えるようにしてもよい。
【００２１】
上記培養容器は、複数の培養容器を有し、
上記針状部材は、複数の針状部材を有し、
上記針状部材を上記第３のセルに挿入する工程では、上記複数の針状部材各々を、上記複数の培養容器のうちの一の培養容器の上記第３のセルに挿入してもよい。
これにより、培養効率を高めることができる。
【００２２】
この場合、上記針状部材を上記第３のセルから抜去する工程では、上記第１のセルと上記第２のセルとが一軸方向に対向するようにそれぞれ配置された上記複数の培養容器に対し、延在方向を上記一軸方向に一致させた上記複数の針状部材を、上記一軸方向に沿ってそれぞれ移動させてもよい。
【００２３】
また、上記流路に上記培養液を灌流させる工程では、上記第１のセルと上記第２のセルとが一軸方向に対向するように上記複数の培養容器をそれぞれ配置し、上記一軸方向と直交する軸まわりに上記複数の培養容器を回動させることにより、上記流路に上記培養液を灌流させてもよい。
これにより、複数の培養容器を用いる場合であっても、簡易な構成の装置で培養液の灌流が可能となる。
【００２４】
また、上記針状部材には、上記表面に結合することが可能な化合物を介して上記細胞が播種されており、上記細胞を転写する工程では、上記針状部材に電圧を印加して上記化合物と上記表面とを離間させることで、上記針状部材から上記細胞足場材に上記細胞を転写してもよい。
これにより、細胞への力学的な負担を抑えつつ細胞を電気化学的に転写することができ、血管様構造の乱れを防止することができる。
【００２５】
さらに、上記針状部材を上記第３の容器に挿入する工程では、上記第１のセルと上記第２のセルとが鉛直方向に対向する第１の姿勢の上記培養容器に、上記針状部材の延在方向が鉛直方向に一致するように上記針状部材を挿入し、
上記培養液を添加する工程では、上記第１のセルと上記第２のセルとが水平方向に対向する第２の姿勢の上記培養容器に、上記培養液もしくは緩衝液を添加してもよい。
これにより、針状部材の挿入時には、針状部材の撓み等の変形を防止して位置合わせを容易に行うことができるとともに、培養液もしくは緩衝液の添加時には第２の姿勢に転換し、針状部材の引抜後の流路に培養液もしくは緩衝液が浸入することによって流路が大気暴露されることを防ぐとともに、液頭差を形成しやすくすることができる。
【発明の効果】
【００２６】
以上のように、本発明によれば、培養細胞を用いて血管新生の評価が十分可能な管状の血管様構造を形成することが可能な培養容器、培養装置及び培養方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の一実施形態に係る培養装置を示す図である。
【図２】上記培養装置の培養容器を示す斜視図である。
【図３】上記培養装置の培養容器を示す平面図である。
【図４】上記培養装置の培養容器を示す断面図である。
【図５】上記培養装置の複数の培養容器と第１の保持部材とを示す斜視図である。
【図６】上記培養装置の複数の針状部材と第２の保持部材とを示す斜視図である。
【図７】上記針状部材と上記培養容器との相対位置関係を示す側面図である。
【図８】上記針状部材と上記培養容器との相対位置関係を示す側面図である。
【図９】本発明の一実施形態に係る培養方法を説明するフローチャートである。
【図１０】上記培養方法のＳＴ１１を説明するための斜視図である。
【図１１】上記培養方法のＳＴ１１を説明するための斜視図である。
【図１２】上記培養方法のＳＴ１１を説明するための斜視図である。
【図１３】針状部材を用いた細胞の播種と脱離について説明する模式図である。
【図１４】上記培養方法のＳＴ１２を説明するための斜視図である。
【図１５】上記培養方法のＳＴ１３を説明するための斜視図である。
【図１６】上記培養方法のＳＴ１４を説明するための斜視図である。
【図１７】上記培養方法のＳＴ１５を説明するための斜視図である。
【図１８】上記培養方法のＳＴ１６を説明するための斜視図である。
【図１９】上記培養方法のＳＴ１９を説明するための斜視図である。
【図２０】上記培養方法のＳＴ１９を説明するための側面図である。
【図２１】上記実施形態の変形例に係る培養容器の斜視図である。
【図２２】上記実施形態の変形例に係る培養容器に針状部材を挿入する際の模式的な図である。
【図２３】上記実施形態の変形例に係る培養容器を用いて細胞培養する際の模式的な図である。
【図２４】上記実施形態の変形例に係る培養容器を用いて細胞培養する際の模式的な図である。
【図２５】上記実施形態の変形例に係る培養容器を用いて細胞培養する際の模式的な図である。
【図２６】上記実施形態の他の変形例に係る培養容器の斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。なお、図中のＸ軸、Ｙ軸及びＺ軸方向は、相互に直交する３軸方向を示し、Ｘ軸及びＹ軸は水平方向、Ｚ軸は高さ方向にそれぞれ相当する。
【００２９】
［培養装置］
図１は、本発明の一実施形態に係る培養装置を示す図である。
同図に示すように、培養装置１００は、複数の培養容器１０と、容器保持部材（第１の保持部材）２０と、複数の針状部材３０（図６参照）と、針状部材３０を保持するホルダ（第２の保持部材）４０と、移動機構５０と、を備える。
【００３０】
本実施形態の培養装置１００は、血管新生を評価するための血管様構造をin vitroで作製することが可能な装置である。例えば血管内皮細胞（以下、単に「細胞」とも称する）を用いて血管様構造を作製するためには、まず、管状の細胞構造体を作製し、続いて、当該管状の細胞構造体の内部に培養液を灌流する。これにより、管状構造を構成する細胞が増殖し、血管新生を擬似的に再現した血管様構造が形成される。管状の細胞構造体の内部に培養液を灌流する処理を、以下、「灌流培養」とも称する。さらに灌流培養時、当該培養液中にスクリーニング対象の薬剤を加えることにより、当該薬剤の血管新生に対する作用を評価できる。
培養装置１００によれば、細胞を予め播種した針状部材３０を培養容器１０に挿入し、針状部材３０周囲に充填された細胞足場材に細胞を転写することができる。そして、針状部材３０を抜去して形成された流路に培養液を灌流させ、血管様構造を形成させるとともに、血管新生の評価を行うことができる。
【００３１】
「細胞足場材」は、典型的にはゲル化することが可能な細胞足場材であり、加温、化学的架橋、光架橋等により容易にゲル化する材料を用いることができる。このような細胞足場材の例としては、コラーゲンをはじめとしてゼラチン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ペクチン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、アルギン酸、デンプン、ポリエチレングリコール、ポリジメチルシロキサン、ポリ乳酸、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリグルタミン酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリアクリル酸などからなるポリマーゲル及びそれらを適宜修飾させてなるポリマーゲルを用いることができる。
【００３２】
（培養容器）
図２〜４は、培養容器１０を示す図であり、図２は斜視図、図３は平面図、図４は断面図である。なお図中、ｘ軸、ｙ軸及びｚ軸方向は、相互に直交する３軸方向を示している。
これらの図に示すように、培養容器１０は、第１のセル１１と、第２のセル１２と、第３のセル１３とを有する。第１のセル１１及び第２のセル１２は、例えば同一の容積を有していてもよく、第３のセル１３は、例えば第１のセル１１及び第２のセルよりも小さい容積を有していてもよい。
培養容器１０は、本実施形態において、全体として透光性材料で形成される。培養容器１０の材料は特に限定されず、例えばアクリル樹脂等の透光性樹脂材料やガラス等を用いることができる。
【００３３】
第１のセル１１及び第２のセル１２は、いずれも、培養液を収容することが可能に構成され、第３のセル１３を挟んで例えばｙ軸方向に対向して配置される。第１のセル１１及び第２のセル１２は、後述する第１の孔部１３１を介して第３のセル１３と連通し、第３のセル１３に培養液を供給することができる。
第１のセル１１及び第２のセル１２は、例えばｚ軸方向に直交する開口１１ａ，１２ａを含み、略直方体状に構成される。この開口１１ａ，１２ａは、図２Ａ，Ｂにおいて上方側から例えば培養液を添加するために用いられる。
また、図２Ａ，Ｂに示すように、本実施形態において、第１のセル１１は、第３のセル１３に隣接する面に対向する面に、孔１１１と、孔１１１を密閉することが可能なプラグ１１２とを有する。この孔１１１は、後述するように、開放状態において針状部材３０及びそれを保持するホルダ４０を挿入させることが可能に構成される。また、孔１１１は、プラグ１１２によって密閉されることにより、灌流培養時に第１のセル１１内に収容され得る培養液の漏出を防止することができる。
【００３４】
なお、ここでいう「培養液」とは、細胞培養に用いられる液体培地であってもよいし、当該培地にスクリーニング対象の薬剤や成長因子等を適宜添加したものであってもよい。また、第１のセル１１及び第２のセル１２には、必要に応じて、培養液以外の緩衝液、生理食塩水等が収容されてもよい。
【００３５】
第３のセル１３は、第１のセル１１及び第２のセル１２を相互に接続する。第３のセル１３では、図３及び図４において仮想的に示すように細胞足場材によって流路Ｆが形成され、流路Ｆの周囲に配置された細胞を灌流培養することにより、血管様構造が形成される。
図３及び図４に示すように、第３のセル１３は、第１の隔壁１３ａと、第２の隔壁１３ｂと、周面１３ｃと、天面１３ｄと、第１の孔部１３１と、第２の孔部１３２とを有する。
【００３６】
第１の隔壁１３ａは、第１のセル１１に隣接する隔壁（第１のセル１１と第３のセル１３とを区画する画壁）である。
第２の隔壁１３ｂは、第２のセル１２に隣接する隔壁（第２のセル１２と第３のセル１３とを区画する画壁）である。
第１の隔壁１３ａ及び第２の隔壁１３ｂは、相互にｙ軸方向に対向している。
周面１３ｃは、灌流培養時に第３のセル１３の底部を構成する面（底面）と、ｘ軸方向に対向する２側面とを含み、第１の隔壁１３ａ及び第２の隔壁１３ｂに連接して配置される。本実施形態において、第３のセル１３の底面は、第１のセル１１及び第２のセル１２の底面と略同一平面上に形成される。また、周面１３ｃが透光性材料により形成されることにより、光学顕微鏡や蛍光顕微鏡等による血管様構造の観察が容易になる。
天面１３ｄは、周面１３ｃに連接し、第１のセル１１と第２のセル１２とを連結する。天面１３ｄは、ｚ軸方向に関して、開口１１ａ，１２ａの高さよりも低い位置に配置される（図４参照）。
【００３７】
第１の孔部１３１は、第１の隔壁１３ａ及び第２の隔壁１３ｂにそれぞれｙ軸方向に対向して形成された少なくとも一対の孔１３１ａを含む。各孔１３１ａは、第１のセル１１及び第２のセル１２とそれぞれ連通し、第３のセル１３を貫通するように針状部材３０を挿入させることが可能に構成される。
第１の孔部１３１は、本実施形態において、複数対（例えば２対）の孔１３１ａを含む。これにより、１つの第３のセル１３に複数本の針状部材３０が挿入され、かつ複数本の流路Ｆが形成される。したがって、１種類の培養液に対し、複数本の血管様構造の血管新生を評価することができ、効率よく、精度のよい評価を行うことができる。
第１の孔部１３１は、培養液の流路Ｆを規定することが可能に構成される。培養装置１００を用いた培養方法では、後述するように、針状部材３０が第１の孔部１３１に挿入されている間に、針状部材３０の周囲にゲル状の細胞足場材が充填される。すなわち、針状部材３０の抜去後に、針状部材３０が挿入されていた領域は、細胞足場材が充填されていない空隙となる。これにより、針状部材３０抜去後に形成された一対の孔１３１ａ間を結ぶ管状の空隙が、培養液の灌流時の流路Ｆとなり得る。
【００３８】
第２の孔部１３２は、第１の隔壁１３ａに形成され、細胞足場材を注入するための孔として構成される。第２の孔部１３２は、１つの孔を有していてもよいし、本実施形態のように複数の孔１３２ａを有していてもよい。複数の孔１３２ａを有している場合には、各孔１３２ａとも、細胞足場材を注入することが可能であってもよく、また少なくとも一つの孔１３２ａが第３のセル１３内の排気等の機能を担っていてもよい。
また、第２の孔部１３２は、本実施形態において、後述するホルダ４０の細胞足場材注入口４１２と係合可能に構成される。これにより、細胞足場材が第１のセル１１側に漏れることなく、第２の孔部１３２を介して第３のセル１３内に注入され得る。
【００３９】
このような構成の培養容器１０により、第１の孔部１３１によって第１のセル１１と第２のセル１２との間に培養液の流路Ｆが規定され、第１のセル１１及び第２のセル１２の一方から他方に培養液を灌流させることができる。したがって、ポンプ等の構成を用いることなく、簡易な方法で血管様構造を培養することができる。
【００４０】
（容器保持部材（第１の保持部材））
図５は、複数の培養容器１０と容器保持部材２０とを示す斜視図である。
図５及び図１に示すように、容器保持部材２０は、複数の培養容器１０を保持する。
容器保持部材２０は、本実施形態において、少なくとも一対の孔１３１ａがＺ軸方向に対向するように複数の培養容器１０を保持する。これにより、各培養容器１０において、流路Ｆの延在方向を規定することができる。
また、容器保持部材２０は、複数の培養容器１０を例えばＸ軸方向に沿って配列させる。
容器保持部材２０は、上述のような所望の姿勢及び配列で複数の培養容器１０を保持できればよく、その構成は特に限定されない。
【００４１】
本実施形態において容器保持部材２０は、各培養容器１０のうち、第３のセル１３の天面１３ｄ、第１のセル１１及び第２のセル１２にそれぞれ係合する角柱体で構成される。このような構成により、各培養容器１０のＸ軸まわりの姿勢を規定することができる。
【００４２】
（針状部材）
図６は、針状部材３０とホルダ４０とを示す斜視図である。図７及び図８は、針状部材３０を保持するホルダ４０と培養容器１０との相対位置関係を示す側面図である。
【００４３】
針状部材３０は、導電性を有し、複数の培養容器１０のうちの一の培養容器１０の第３のセル１３を貫通することが可能に構成される。具体的には、各針状部材３０は、一対の孔１３１ａに挿入される。
針状部材３０は、導電性材料により形成され、針状部材３０の表面３０ａは、例えば金（Ａｕ）により形成される。これにより、後述するように、表面３０ａに播種された細胞の脱離を円滑に行うことができる。
針状部材３０は、例えば一軸方向（例えばＺ軸方向）に延在する棒状に構成され、針状部材３０の横断面（延在方向に直交する断面）は、典型的には円形で構成される。当該横断面の径は、作製する血管様構造の径に応じて適宜設定することができ、例えば０．１ｍｍ〜１．０ｍｍ程度で構成され得る。
図７及び図８に示すように、針状部材３０は、第３のセル１３を貫通する第１の位置と、第３のセル１３から抜去される第２の位置と、の間を移動可能に構成される。なお、図７は針状部材３０が第１の位置にある状態を示し、図８は針状部材３０が第２の位置にある状態を示す。
【００４４】
（ホルダ）
図６〜図８を参照し、ホルダ４０は、複数の針状部材３０各々を複数の培養容器１０のうちの一の培養容器１０の第３のセル１３に貫通させることが可能に、複数の針状部材２０を保持することができる。
ホルダ４０は、複数の本体４１と、本体保持具４２と、を有する。
【００４５】
本体４１は、各針状部材３０の変形や本体４１に対する変位を防止するように、各針状部材３０を保持する。すなわち本体４１は、各針状部材３０の本体４１に対する相対的な姿勢を規定することが可能に構成される。
各本体４１は、本実施形態において、それぞれ１つの培養容器１０に対応するように構成され、例えば針状部材３０を２本ずつ保持するように構成される。本体４１は、例えば各針状部材３０が挿入される孔を有していてもよい。あるいは、本体４１は、図示はしないが、各針状部材３０を把持することが可能なクリップなどの把持具を有していてもよい。
本体４１は、細胞足場材導入口４１１と、細胞足場材注入口４１２とを有する。
【００４６】
細胞足場材導入口４１１は、第３のセル１３に注入され得る細胞足場材を、本体４１内に導入するための構成である。細胞足場材導入口４１１は、図６に示すような管状の構成であってもよく、あるいは図示はしないが、本体４１に形成された開口であってもよい。
【００４７】
図７及び図８に示すように、細胞足場材注入口４１２は、第３のセル１３に細胞足場材を注入するための構成である。細胞足場材注入口４１２は、細胞足場材導入口４１１から本体４１内に導入された細胞足場材の排出口として構成され、細胞足場材導入口４１１と本体４１内で連通する。
細胞足場材注入口４１２は、例えば第２の孔部１３２を介して第３のセル１３に細胞足場材を注入する。細胞足場材注入口４１２は、例えば、第３のセル１３の第２の孔部１３２と係合可能な突起を有していてもよいが、これに限定されず、本体４１に形成された開口であってもよい。
【００４８】
図６に示すように、本体保持具４２は、それぞれ複数の本体４１を保持することが可能に構成される。本体保持具４２は、各培養容器１０に対応させるように各本体４１の本体保持具４２に対する位置を規定するとともに、各本体４１の本体保持具４２に対する相対的な姿勢を規定する。
【００４９】
上記構成のホルダ４０は、本体４１及び本体保持具４２により、複数の針状部材３０各々の延在方向を規定することができる。これにより、ホルダ４０は、複数の針状部材３０各々の延在方向を孔１３１ａの対向方向であるＺ軸方向に一致させるように、複数の針状部材３０を保持することができる。
【００５０】
（移動機構）
図１を参照し、移動機構５０は、複数の針状部材３０各々を第１の位置と第２の位置との間で移動させることが可能に、ホルダ４０を移動させる。移動機構５０は、本実施形態において、各針状部材３０の延在方向をＺ軸方向に一致させつつ、ホルダ４０の本体保持具４２をＺ軸方向に沿って移動させる。
ここで、ホルダ４０は、複数の針状部材３０が第２の位置のとき、移動機構５０のトップ位置に移動されるものとし、複数の針状部材３０が第１の位置のとき、移動機構５０のボトム位置に移動されるものとする。
移動機構５０は、図１に示すように、例えばボールねじで構成されてもよい。これにより、Ｚ軸方向に沿った精度の高い直進運動が可能となる。また、移動機構５０は、ホルダ４０を上述のように移動させることができれば、構成は限定されない。
例えば、移動機構５０は、本体５１と、可動部材５２と、載台５３とを有する。
可動部材５２は、ホルダ４０を保持し、本体５１内をＺ軸方向に沿って移動することが可能に構成される。
載台５３は、容器保持部材２０等を配置する。本体５１には、載台５３に配置された容器保持部材２０等の位置を固定するための構成が形成されていてもよい。このような構成としては、例えば、容器保持部材２０と係合可能な突起や孔、ネジ等が挙げられる。
【００５１】
以上のように構成された培養装置１００は、以下の培養方法で用いることができる。
【００５２】
［培養方法］
図９は、本実施形態に係る培養方法を説明するフローチャートであり、図１０〜図２０は、培養方法の各工程を説明するための図である。これらの図に沿って培養方法の各工程について説明する。
【００５３】
まず、針状部材３０の表面３０ａに、下地となる細胞を播種する（ＳＴ１１）。
【００５４】
図１０に示すように、まず複数のウェル６１を有する容器６０を準備する。各ウェル６１は、ホルダ４０の各本体４１とＺ軸方向に対向するように配置されており、各ウェル６１には、細胞を含む細胞含有液Ｌ１が収容されている。ここでいう細胞含有液Ｌ１は、例えば、細胞を培養するための液体培地に細胞を含有させた液であってもよい。
なお、ホルダ４０は、複数の針状部材３０を保持した状態で移動機構５０のトップ位置に準備されている。
続いて、図１１に示すように、各ウェル６１が各本体４１に対応するように容器６０を移動機構５０の載台５３に固定する。固定の方法は特に限定されない。
そして、図１２に示すように、ホルダ４０を移動機構５０のボトム位置に移動させ、各針状部材３０を各ウェル６１中の細胞含有液Ｌ１に浸漬させる。
【００５５】
細胞の播種は培養容器１０を移動機構５０に取り付けずに行われてもよい。別途用意した培養容器に細胞含有液Ｌ１を入れておき、針状部材３０を浸漬し、細胞が十分吸着した後、移動機構５０に取り付けてもよい。移動機構５０への取り付けは細胞の乾燥を防止するため、迅速に行われることが好ましく、移動機構５０に仕込まれたクランプ機構でクランプするかホルダ４０と移動機構５０に磁石を取り付けて磁力で取り付けてもよい。
【００５６】
本実施形態において、針状部材３０の表面３０ａに播種された細胞は、電気化学的に表面３０ａから脱離させる。このため、表面３０ａに結合することが可能であり表面３０ａに所定の電圧が印加されることで当該結合が脱離するような化合物を用いて、細胞の播種及び脱離を行う。
図１３は、細胞の播種と脱離について説明する模式図である。
図１０、図１１の播種の準備段階においては、各針状部材３０の表面３０ａには、表面３０ａに結合することが可能な化合物Ｐが結合されている（図１３Ａ参照）。本実施形態において、この化合物は、オリゴペプチド（以下、単に「ペプチド」と称する）Ｐとすることができる。針状部材３０の表面がＡｕで形成される場合、ペプチドＰは含硫アミノ酸（例えばシステイン）を含んでいてもよい。これにより、ペプチドＰのイオウ（Ｓ）と表面３０ａのＡｕとが結合を形成することができる。
そして、各針状部材３０を細胞含有液Ｌ１に浸漬させることにより、各針状部材３０の表面３０ａのペプチドＰと、細胞Ｃとが接着され（図１３Ｂ参照）、針状部材３０の表面３０ａに、ペプチドＰを介して細胞Ｃが播種される。
【００５７】
続いて、培養容器１０を準備する（ＳＴ１２）。なお、本工程において、培養容器１０には、培養液、細胞足場材等が充填されておらず、孔１１１を密閉するためのプラグ１１２は外されている。
図１４に示すように、例えば容器保持部材２０に複数の培養容器１０を保持させ、この容器保持部材２０を移動機構５０の載台５３に固定する。
一方、本工程において、ホルダ４０は、複数の針状部材３０を保持した状態で移動機構５０のトップ位置に準備されている。各針状部材３０は、図８に示す第２の位置に配置されており、Ｚ軸方向に沿って延在するようにホルダ４０にセットされる。
本工程における培養容器１０は、針状部材３０（本体４１）に対して、例えば以下のように配置される。すなわち、各培養容器１０は、移動機構５０にセットされた各本体４１と、Ｚ軸方向に対向するように配置される。具体的には、各培養容器１０は、第３のセル１３の第１の孔部１３１が針状部材３０とＺ軸方向に対向し、かつ、第３のセル１３の第２の孔部１３２が細胞足場材注入口４１２とＺ軸方向に対向するように配置される。
このときの各培養容器１０は、例えば以下の姿勢をとるように配置される。すなわち、各培養容器１０は、第１のセル１１と第２のセル１２とがＺ軸方向に対向するようにそれぞれ配置され、さらに、対になる孔１３１ａがＺ軸方向に対向するように配置される。また、培養容器１０は、第１のセル１１と第２のセル１２とが鉛直方向に対向する第１の姿勢で配置されている。第１の姿勢においては、各容器１０は、図２Ａ，Ｂに示すｘ軸方向がＺ軸方向に向けられる。
【００５８】
続いて、第３のセル１３を貫通するように、針状部材３０を第３のセル１３に挿入する（ＳＴ１３）。本実施形態において、複数の針状部材３０各々を、複数の培養容器１０のうちの一の培養容器１０の第３のセル１３に挿入する。各針状部材３０は、第２の位置から、第３のセル１３を貫通する第１の位置へ移動する（図７参照）。また、本工程においても、培養容器１０は、第１の姿勢に維持されている。
図１５及び図７に示すように、本実施形態において、ホルダ４０を移動機構５０のボトム位置に移動させ、各針状部材３０を一対の孔１３１ａにそれぞれ挿入させる。このとき、各針状部材３０は、ホルダ４０及び移動機構５０により姿勢と移動方向を規定されていることから、延在方向をＺ軸方向に維持したままＺ軸方向に移動される。
また、針状部材３０が第１の位置に移動することで、図７に示すように、細胞足場材注入口４１２が第３のセル１３の第２の孔部１３２に係合される。
【００５９】
続いて、第３のセル１３の針状部材３０の周囲に細胞足場材Ｓを充填する（ＳＴ１４）。
図１６に示すように、本工程では、まず、液状の細胞足場材Ｓを各本体４１の細胞足場材導入口４１１に導入する。これにより、細胞足場材Ｓは、各本体４１の内部を通り、細胞足場材注入口４１２から排出される。排出された細胞足場材Ｓは、第２の孔部１３２を介して第３のセル１３内に充填される。
そして、細胞足場材Ｓをゲル化させる。細胞足場材Ｓをゲル化させる方法は、細胞足場材Ｓの性状に応じて、加温、光の照射、化学反応等、適宜選択することができる。これにより、図１３Ｃに示すように、表面３０ａに播種された細胞Ｃがゲル状の細胞足場材Ｓに被覆される。
なお、本工程においても、第１のセル１１が第１の姿勢に維持されている。
【００６０】
続いて、針状部材３０から細胞足場材Ｓに細胞を転写する（ＳＴ１５）。
本工程では、針状部材３０に電圧を印加してペプチドＰと表面３０ａとを離間させることで、針状部材３０から細胞足場材Ｓに細胞Ｃを転写する。具体的には、図１７に模式的に示すように、針状部材３０の電位と細胞足場材Ｓの電位との間で電位差を生じさせるように電気回路を構築する。
なお図１７では、説明のため、一つの針状部材３０に対して電圧を印加しているが、全ての針状部材３０を並列に接続し、すべての針状部材３０に同時に同一の電圧を印加してもよい。電圧の大きさや時間等の条件も特に限定されず、例えば−１Ｖで５分間の電圧を印加することができる。
これにより、図１３Ｄに示すように、針状部材３０の表面３０ａとペプチドＰとの結合が脱離し、針状部材３０から細胞足場材Ｓに細胞Ｃを転写させることができる。
【００６１】
続いて、図１８に示すように、第１のセル１１と第２のセル１２とが水平方向に対向する第２の姿勢となるように、培養容器１０の姿勢を転換する（ＳＴ１６）。第２の姿勢では、各容器１０は、図２Ａ，Ｂに示すｚ軸方向がＺ軸方向に向けられる。
さらに本実施形態では、培養容器１０のみならず、培養装置１００全体の姿勢が転換される。
【００６２】
続いて、図１８を参照し、第１のセル１１と第２のセル１２の少なくとも一方（好ましくは第２のセル１２）に培養液を添加する（ＳＴ１７）。次の針状部材３０を抜去する工程の前に培養液を添加することで、抜去時に、流路Ｆに気泡が入る等の不具合を防止することができる。
本実施形態において、第１のセル１１と第２のセル１２の一方に培養液を添加すればよく、例えば孔１１１を有さない第２のセル１２に培養液を添加することができる。添加される培養液の量は、例えば第３のセル１３を貫通している針状部材３０を十分被覆する程度の量であればよい。
また、培養容器１０が第２の姿勢であるため、培養液は、開口１１ａ及び開口１２ａの少なくとも一方から添加することができる。
【００６３】
図１８及び図８を参照し、針状部材３０を第３のセル１３から抜去する（ＳＴ１８）。本工程で針状部材３０が抜去されることで、対となる孔１３１ａによって規定される第３のセル１３内の領域に、細胞足場材Ｓが充填されていない空隙が形成される。この空隙が、流路Ｆとなり得る。
本工程では、複数の培養容器１０に対し、延在方向をＹ軸方向に一致させた複数の針状部材３０を、Ｙ軸方向に沿ってそれぞれ移動させる。このとき、複数の培養容器１０は、第１のセル１１と第２のセル１２とがＹ軸方向に対向し、一対の孔１３１ａもＹ軸方向に対向するようにそれぞれ配置されている。このため、Ｙ軸方向に延在する管状の流路Ｆを形成することができる。
本実施形態では、針状部材３０の延在方向及び移動方向がホルダ４０及び移動機構５０によって規定されており、培養容器１０の姿勢及び位置が容器保持部材２０によって規定されている。このため、ホルダ４０を移動機構５０のボトム位置からトップ位置に移動させるだけで、上記動作が可能となる。
【００６４】
最後に、第１のセル１１と第２のセル１２との培養液Ｌ２の液頭差に基づいて、針状部材３０を抜去して形成された流路Ｆに培養液Ｌ２を灌流させる（ＳＴ１９）。ここでいう「液頭差」とは、第１のセル１１と第２のセル１２に収容された培養液の鉛直方向に沿った液面の高さの差を意味する。本工程では、培養容器１０を移動機構５０から灌流装置２００に移し、灌流装置２００を用いて灌流培養する。
【００６５】
図１９及び図２０は、本工程を説明するための図であり、図１９は斜視図、図２０は模式的な側面図である。
これらの図に示すように、灌流装置２００は、支持部材２１０と、駆動機構２２０とを有する。
支持部材２１０は、培養容器１０を配置する。本実施形態において、支持部材２１０は、複数の培養容器１０を配置するトレイ状に構成される。各培養容器１０の第１のセル１１及び第２のセル１２は、水平方向（図示の例ではＸ軸方向）に対向して配置される。
図２０に示すように、駆動機構２２０は、支持部材２１０を配置する載台２２１と、例えばＸ軸方向に沿った軸部２２２と、図示しない駆動部とを有する。軸部２２２は、例えば載台２２１のＸ軸方向に沿った中央部に配置され、載台２２１は、駆動部により、軸部２２２を中心としてＹ軸まわりに回動することが可能に構成される。このような駆動機構２２０により、複数の培養容器１０をＹ軸まわりに回動させ、流路Ｆに培養液Ｌ２を灌流させることができる。
【００６６】
灌流装置２００を用いた灌流培養は、例えば以下のように行われる。
すなわち、まず培養容器１０を、水平状態から所定の回転角となるまでＹ軸まわりに回動させる。各培養容器１０には、第１のセル１１及び第２のセル１２の少なくとも一方に培養液Ｌ２が添加されている。上記回動により、第１のセル１１と第２のセル１２との培養液Ｌ２の液頭差が生じ、高い位置まで培養液Ｌ２が添加されている方のセルから他方のセルに対し、流路Ｆを介して培養液Ｌ２が流入する。培養容器１０が傾斜した状態を維持することにより、流路Ｆに培養液Ｌ２が継続的に灌流される。そして、鉛直方向上方に配置されていたセル内の培養液Ｌ２がなくなるまでに再び培養容器１０を回動させることで、鉛直方向上方に配置されるセルを他方のセルに切り替えることができ、継続的に流路Ｆに培養液Ｌ２を灌流させることができる。
流路Ｆ中の流速は、例えば流路Ｆの断面積や回転角の大きさ、回転の角速度等に相関を有する。このため、主に灌流装置２００の回動に関する条件を検討することで、培養容器１０を用いた場合の流速を制御することができる。
【００６７】
ここで、生体内における血管新生は、血液からの力学的刺激などの様々な因子が関わっていることが知られている。本実施形態によれば、流路Ｆに継続的に培養液Ｌ２が灌流されることで、流路Ｆの内周面に管状に配置された細胞Ｃに適切な力学的刺激を与えることができ、血管新生の状態を擬似的に再現することができる。
【００６８】
灌流培養後、各培養容器１０を第３のセル１３を顕微鏡等で観察することにより、血管様構造を評価することができる。
【００６９】
以上、本実施形態によれば、針状部材３０の周囲に予め播種された細胞Ｃを細胞足場材Ｓに転写することで、細胞Ｃが密に配置された管状の血管様構造を容易に作製することができる。また、針状部材３０抜去時における血管様構造の破損を防止することができる。そして、２つのセル間の培養液Ｌ２の液頭差に基づいて流路Ｆに培養液Ｌ２を灌流することにより、灌流培養における流速を容易に制御することができ、細胞に与える力学的刺激の条件を容易に検討することができる。したがって、より長尺の血管様構造を培養することが可能となり、in vitroにおいて精度の高い血管新生の評価を行うことができる。
また、本実施形態によれば、血管様構造の大量培養が可能となる。したがって、多量の検体の評価を容易に行うことができる。
さらに、上記培養方法によれば、灌流のための煩雑な操作を不要とすることができるとともに、培養容器１０内部に灌流のための装置を設置する必要がないため、コンタミネーションの可能性も低減することができる。また、灌流培養中の培養液の交換も容易になる。
【００７０】
以上説明した培養装置１００及び培養方法は、以下のように適用され得る。
【００７１】
［適用例１：薬剤のスクリーニング］
培養装置１００及び上記培養方法を用いて、薬剤のスクリーニングを実施することができる。
ここでいう薬剤とは、主に、血管新生を抑制又は促進する薬剤であり、具体的には血管新生を抑制する抗癌剤等を挙げることができる。
本適用例では、まずＳＴ１９の灌流培養工程において、培養液にスクリーニング対象の薬剤を添加して、灌流培養を行う。本実施形態によれば、上述のようにin vitroにおいて精度の高い血管新生の評価を行うことができるため、薬剤の血管新生に対する作用を十分に検討することができる。また、大量培養が可能であることから、複数の条件や複数の薬剤を用いて、多量のスクリーニングを効率よく行うことができる。
【００７２】
［適用例２：血管再生治療］
培養装置１００及び上記培養方法は、血管の再生治療の研究に用いられてもよい。
血管の閉塞等に対しては、従来は投薬、バルーンカテーテル又はステント等を用いた血管を拡張する治療、外科的なバイパス手術等が適用されていたが、組織工学の技術を用いて新しい血管を作り出す治療の研究が進められている。
本実施形態に係る培養装置１００及び培養方法は、長尺の血管様構造を培養することができることから、このような治療の研究に用いられることも可能である。
【００７３】
［適用例３］
培養装置１００及び上記培養方法は、再生医療における立体的組織再生の手法として用いられてもよい。細胞を用いた再生医療において立体的な大きさと形を持った組織を作るためには、組織加工と同時に酸素や栄養を供給するための血管構造を付与する必要がある。本法を用いることにより簡便に培養液を潅流可能な立体的な組織を構築することができる。例えば細胞足場材とともに肝細胞を加えることによって肝臓機能を保持した状態で立体的な組織構造を作成することが可能となる。
【００７４】
［変形例］
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上述の実施形態にのみ限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。
【００７５】
図２１Ａ，Ｂは、本実施形態の変形例に係る培養容器１０Ａ，１０Ｂの斜視図である。
上述の実施形態では、培養容器１０の第１のセル１１及び第２のセル１２が同一の容積を有する略直方体状であると説明したが、これに限定されない。
図２１Ａに示すように、例えば、第１のセル１１Ａ及び第２のセル１２Ａが、いずれもチューブ状に構成されてもよい。第１のセル１１Ａ及び第２のセル１２Ａの材料は、例えばシリコーン樹脂等の変形可能な材料で形成されていてもよい。第１のセル１１Ａ及び第２のセル１２Ａの横断面形状も、円形状、楕円形状、矩形状等、特に限定されない。また、第３のセル１３Ａもチューブ状に構成されていてもよく、例えばガラス、透光性を有する樹脂（例えばアクリル樹脂）等の材料で構成されていてもよい。図示はしないが、第３のセル１３Ａは、第１の隔壁、第２の隔壁、第１の孔部等を含む。
また図２１Ｂに示すように、第１のセル１１Ｂ及び第２のセル１２Ｂの容積が異なっていてもよい。図示はしないが、第３のセル１３Ｂは、第１の隔壁、第２の隔壁、第１の孔部等を含む。
【００７６】
図２２Ａ，Ｂは、図２１Ｂに示す培養容器１０Ｂの第３のセル１３Ｂに対して針状部材３０を挿入する際の模式的な図である。
図２２Ａに示すように、第１のセル１１Ｂが第３のセル１３Ｂと着脱自在に構成され、第１のセル１１Ｂを外して第３のセル１３Ｂに針状部材３０を挿入してもよい。
あるいは、図２２Ｂに示すように、第１のセル１１Ｂを接続した状態の第３のセル１３Ｂに針状部材３０を挿入してもよい。
【００７７】
培養容器１０Ｂを用いても、第１のセル１１Ｂと第２のセル１２Ｂの培養液Ｌ２の液頭差に基づいて、灌流培養をすることができる。
図２３〜図２５は、培養容器１０Ｂを灌流培養する際の模式的な図である。
図２３に示すように、灌流装置２００と同様に、第３のセル１３Ｂを挟んで第１のセル１１Ｂと第２のセル１２Ｂとが対向するＺ軸方向に直交する軸まわりに培養容器１０Ｂを回動させる灌流装置２００Ａを用いることができる。灌流装置２００Ａは、載台２２１Ａと、軸部２２２Ａとを有する。この場合、図２４に示すように、培養容器１０Ｂの第３のセル１３Ｂの軸芯が、例えば灌流装置２００Ａの載台２２１Ａの平面に対して直交していてもよいし、あるいは、灌流装置２００Ａの載台２２１Ａの平面に対してＸ軸まわりに所定の角度で傾斜していてもよい。培養容器１０Ｂを上記のように載台２２１Ａに対してＸ軸まわりに傾斜して配置することで、第３のセル１３Ｂ内の静水圧上昇を招くこと無く、セル１３Ｂを流れる培養液の流量も十分確保する事ができる。
【００７８】
あるいは、図２５に示すように、第１の軸部２１０Ｂと、第２の軸部２２０Ｂと、培養容器２０Ｂを把持する把持部材２３０Ｂとを有する灌流装置２００Ｂを用いてもよい。第１の軸部２１０Ｂは、Ｙ軸方向に沿って配置されている。第２の軸部２２０Ｂは、第１の軸部２１０Ｂ上に、Ｘ軸方向に沿って配置されている。把持部材２３０Ｂは、第２の軸部２２０Ｂに取り付けられており、培養容器１０Ｂを把持する。このような構成の灌流装置２００Ｂによっても、第１の軸部２１０Ｂ（Ｙ軸）まわりに培養容器１０Ｂを回動させることで、灌流培養をすることができる。
【００７９】
図２６は、培養容器の他の変形例を示す図である。同図に示すように、培養容器１０Ｃは、第１のセル１１Ｃ、第２のセル１２Ｃ、及び第３のセル１３Ｃを有する。培養容器１０Ｃは、例えば全体が透光性材料により形成され、内部に培養容器１０Ｂと同様の位置関係の各容器１１Ｃ，１２Ｃ，１３Ｃが形成されている。このような構成によっても、培養容器１０と同様の作用効果を得ることができる。
【００８０】
また、上述の培養方法においては、ＳＴ１７で培養液を添加してからＳＴ１８で針状部材３０を抜去すると説明したが、これに限定されない。例えば、針状部材３０を抜去した後、培養液を添加してもよい。あるいは、針状部材抜去前には、培養液ではなく緩衝液や生理食塩水等を添加し、針状部材を抜去し、その後、これらの溶液を培養液と入れ替えてもよい。
【００８１】
また、上述の培養方法においては、ＳＴ１６で姿勢を転換すると説明したが、これに限定されない。例えば、Ｚ軸方向及びＸ軸方向が水平方向を示し、Ｙ軸方向が鉛直方向を示すような姿勢で、ＳＴ１３の針状部材３０を第３のセル１３に挿入する工程を行い、ＳＴ１４以降も、同一の姿勢で各工程を行ってもよい。あるいは、上述のように針状部材３０抜去前に培養液を添加しない場合は、針状部材３０抜去後に姿勢を転換してもよい。
【００８２】
また、培養容器１０の第３のセル１３が、細胞足場材を注入するための第２の孔部１３２を有すると説明したが、第３のセル１３内に細胞足場材を注入できる構成であればこれに限定されない。また、ホルダ４０の本体４１を介して細胞足場材を注入する構成にも限定されず、別途の装置又は器具を用いて細胞足場材を注入してもよい。
【符号の説明】
【００８３】
１０…培養容器
１１…第１のセル
１２…第２のセル
１３…第３のセル
１３ａ…第１の隔壁
１３ｂ…第２の隔壁
１３１…第１の孔部
１３１ａ…孔
１３２…第２の孔部
２０…容器保持部材（第１の保持部材）
３０…針状部材
３０ａ…表面
４０…ホルダ（第２の保持部材）
５０…移動機構
１００…培養装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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