(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステビオールグリコシドの生成のための全細胞触媒であって、細胞内に
（ａ）発現されるとＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素が宿主細胞の表面に付着するように提示ポリペプチドがＵＧＴ酵素に融合されている融合タンパク質をコードする少なくとも１つの第１のヌクレオチド配列であって、前記融合タンパク質は、ＨＶＩ  ＵＧＴ（配列番号７）が細胞壁タンパク質ＧＣＷ６１（配列番号５）に融合されている配列番号１に記載されるＨＶＩ−ＧＣＷ６１融合タンパク質、または配列番号１の融合タンパク質に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列番号１の融合タンパク質の機能的変異体である、少なくとも１つの第１のヌクレオチド配列と、
（ｂ）細胞内スクロース合成酵素（ＳＵＳ）をコードする少なくとも１つの第２の配列と、
を含むように少なくとも１つの発現カセットによって形質転換された宿主細胞である、全細胞触媒。
【請求項２】
前記ＳＵＳが、シロイヌナズナ由来のＳＵＳ、ヤエナリ由来のＳＵＳおよびそれらの機能的相同体のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の全細胞触媒。
【請求項３】
前記ＳＵＳが、シロイヌナズナスクロース合成酵素１；シロイヌナズナスクロース合成酵素３およびヤエナリスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）のうちの少なくとも１つを含む、請求項２に記載の全細胞触媒。
【請求項４】
前記宿主細胞が、アルクスラ種、カンジダ種、デバリオミセス種、ハンゼヌラ種、クルイベロミセス種、ムコール種、パキソレン種、ファフィア種、ピキア種、ロドスポリジウム種、サッカロマイセス種、サッカロミコプシス種、シュワニオミセス種、トリコスポロン種、トルロプシス種、ヤロウィア種、及びチゴサッカロマイセス種からなる群より選択される酵母細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の全細胞触媒。
【請求項５】
前記酵母細胞が、アルクスラ・アデニニボランス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ボイジニイ、カンジダ・ファマータ、カンジダ・マルトーサ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・ユティリス、カンジダ・シェハタエ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クリベロマイセス・マルキシアヌス、クリベロマイセス・ラクチス、パキソレン・タンノフィラス、ファフィア・ロドチーマ、ピキア・ギリエルモンデイ、ピキア・メタノリカ、ピキア・パストリス、ロドスポリジウム・トルロデス、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・セレビシエの変異体のジアスタチクス、サッカロマイセス・ブラウディ、サッカロマイセス・ピリフォルミス、サッカロマイセス・バヤヌス、サッカロミコプシス・フィブリゲラ、シュワニオミセス・カステリ、シュワニオミセス・オクシデンタリス、トリコスポロン・クタネウム、ヤロウィア・リポリティカ、及びチゴサッカロミセス・ロウキシからなる群より選択される、請求項４に記載の全細胞触媒。
【請求項６】
前記宿主細胞がピキア・パストリス細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の全細胞触媒。
【請求項７】
前記宿主細胞が、前記第１および第２のヌクレオチド配列のそれぞれを２コピー以上含むように形質転換されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の全細胞触媒。
【請求項８】
前記宿主細胞が、５コピーの配列番号２に記載されるＨＶ１−ＧＣＷ６１コード配列及び２コピーの配列番号１２に記載されるｍｂＳＵＳ１コード配列を含む、請求項７に記載の全細胞触媒。
【請求項９】
第１の全細胞触媒と第２の全細胞触媒とを含む全細胞触媒組成物であって、
前記第１の全細胞触媒が、請求項８の全細胞触媒であり、
前記第２の全細胞触媒が、４コピーの配列番号４に記載されるＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１コード配列と２コピーの配列番号１２に記載されるｍｂＳＵＳ１コード配列とを含む形質転換されたピキア・パストリス宿主細胞である、
全細胞触媒組成物。
【請求項１０】
開始ステビオールグリコシド基質から所望のステビオールグリコシドを生成する方法であって、前記開始ステビオールグリコシド基質とスクロースとＵＤＰとＵＤＰ−グルコースとを含む培地中で請求項１〜８のいずれか１項に記載の全細胞触媒または請求項９の全細胞触媒組成物のいずれかを、前記培地中で前記開始ステビオールグリコシド基質が前記所望のステビオールグリコシドに変換されるような時間、インキュベートすることを含む、方法。
【請求項１１】
前記培地から前記所望のステビオールグリコシドを分離することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記所望のステビオールグリコシドが、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＭおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され、
前記方法が、ルブソシド、レバウジオシドＫＡ、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される開始ステビオールグリコシド基質をグリコシル化することを含む、
請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項８の全細胞触媒が以下の変換のうちの１つを実行するために使用される、請求項１２に記載の方法：
（ａ）前記開始ステビオールグリコシド基質がレバウジオシドＡであり、前記方法によって生成される前記所望のステビオールグリコシドがレバウジオシドＤである；
（ｂ）前記開始ステビオールグリコシド基質がステビオシドであり、前記方法によって生成される前記所望のステビオールグリコシドがレバウジオシドＥである；
（ｃ）前記開始ステビオールグリコシド基質がレバウジオシドＫＡであり、前記方法によって生成される前記所望のステビオールグリコシドがレバウジオシドＥである；
（ｄ）前記開始ステビオールグリコシド基質がルブソシドであり、前記方法によって生成される前記所望のステビオールグリコシドがレバウジオシドＫＡである；または
（ｅ）前記開始ステビオールグリコシド基質がルブソシドであり、前記方法によって生成される前記所望のステビオールグリコシドがレバウジオシドＥである。
【請求項１４】
請求項９の全細胞触媒組成物が使用され、前記開始ステビオールグリコシド基質がステビオシド、レバウジオシドＡまたはそれらの任意の組み合わせを含み、前記方法によって生成される前記所望のステビオールグリコシドがレバウジオシドＭである、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表を提出するための支援の声明
配列表の紙コピー及びサイズが３６，２３４バイトである（ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ  ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）ＥＸＰＬＯＲＥＲで測定した場合）「３２５５９＿６３＿１．ｔｘｔ」という名前のファイルを含む配列表のコンピュータ読み取り可能な形態は、本明細書に提供され、参照により本明細書に組み込まれる。この配列表は配列番号１〜１２からなる。
【背景技術】
【０００２】
本開示は、一般的に天然甘味料に関する。より具体的には、本開示は、ノンカロリー甘味料及びノンカロリー甘味料を合成する方法に関する。
【０００３】
ステビオールグリコシドは、ステビアの葉から単離された天然物である。ステビオールグリコシドは、高強度低カロリー甘味料として広く使用されており、スクロースよりも著しく甘い。天然甘味料として、異なるステビオールグリコシドは、異なる程度の甘味及び後味を有する。ステビオールグリコシドの甘さは、スクロースの甘さよりも著しく高い。例えば、ステビオシドは、苦い後味を有するスクロースよりも１００〜１５０倍甘い。レバウジオシドＣは、スクロースよりも４０〜６０倍甘い。ズルコシドＡは、スクロースよりも約３０倍甘い。
【０００４】
天然に存在するステビオールグリコシドは、同じ基本的なステビオール構造を共有するが、Ｃ１３位及びＣ１９位での炭水化物残基（例えば、グルコース、ラムノース及びキシロース残基）の含有量が異なる。既知の構造を有するステビオールグリコシドには、ステビオール、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ及びズルコシドＡ（例えば、表１を参照されたい）が含まれる。他のステビオールグリコシドは、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＮ及びレバウジオシドＯである。
【０００５】
【表１】
0006793957.tif 000002
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【０００６】
乾燥重量ベースで、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、及びズルコシドＡは、それぞれ、葉においてステビオールグリコシドの総重量の９．１、３．８、０．６、及び０．３％を占めているが、他のステビオールグリコシドがもっと少ない量で存在する。ステビア植物からの抽出物は、市販されており、典型的には、一次化合物としてステビオシド及びレバウジオシドＡを含有する。他のステビオールグリコシドは、典型的には、微量成分としてステビア抽出物中に存在する。例えば、市販製剤中のレバウジオシドＡの量は、総ステビオールグリコシド含有量の約２０％〜９０％超と変化し得、レバウジオシドＢの量は、全ステビオールグリコシドの約１〜２％であり得、レバウジオシドＣの量は全ステビオールグリコシドの約７〜１５％であり得、レバウジオシドＤの量は全ステビオールグリコシドの約２％であり得る。
【０００７】
ステビオールグリコシドの大部分は、ステビオールのいくつかのグリコシル化反応により形成され、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、及び１Ｅに示されるように、糖部分のドナーとしてウリジン５’−ジホスホグルコース（ＵＤＰ−グルコース）を用いてＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）によって典型的に触媒される。植物中のＵＧＴは、ＵＤＰ−グルコースからステビオールにグルコース残基を転移する酵素の非常に多様なグループを構成している。例えば、ステビオシドのＣ−１３−Ｏ−グルコースのＣ−３’のグリコシル化はレバウジオシドＡをもたらし、ステビオシドの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’のグリコシル化はレバウジオシドＥをもたらす。レバウジオシドＡ（１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’位）又はレバウジオシドＥ（１３−Ｏ−グルコースのＣ−３’位）のさらなるグリコシル化は、レバウジオシドＤを生成する。レバウジオシドＤのグリコシル化（１９−Ｏ−グルコースのＣ−３’位）は、レバウジオシドＭを生成する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
代替甘味料は、糖分の高い食品と飲料の消費に関連する多くの疾患の認識により、ますます注目を受けている。人工甘味料は利用可能であるが、ズルチン、サイクラミン酸ナトリウム及びサッカリンなどの多くの人工甘味料は、それらの安全性の懸念のためにいくつかの国で禁止又は制限されている。そのため、天然由来のノンカロリー甘味料は、ますます人気が高まっている。ステビア甘味料の普及のための主要な障害の１つは、それらの望ましくない味の属性である。したがって、甘味度と風味プロファイルの最適な組み合わせを提供するために、代替甘味料及びそれらの生産方法を開発する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、一般的に天然甘味料に関する。より具体的には、本開示は、ノンカロリー甘味料及びノンカロリー天然甘味料を合成する方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
全細胞触媒
一態様において、本開示は、少なくとも１種類の全細胞触媒を対象とする。この態様において、少なくとも１種類の全細胞触媒は、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）及びスクロース合成酵素（ＳＵＳ）を含むが、これらに限定されない少なくとも１種類の酵素をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む形質転換宿主細胞である。適切なウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼの非限定的な例としては、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＨＶ１、ＥＵＧＴ１１、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００１１】
この態様において、形質転換宿主細胞は、少なくとも１種類の酵素をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの発現カセットによって形質転換された任意の適切な宿主細胞であり得る。適切な宿主細胞の非限定的な例としては、細菌、酵母、糸状菌、シアノバクテリア藻類、及び植物細胞が挙げられる。一態様において、少なくとも１つの発現カセットは、宿主細胞型との互換性について選択され、少なくとも１種類の酵素をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列内のコドンは、選択された宿主細胞型内での少なくとも１種類の酵素の発現を高めるために、公知の方法を用いてコドン最適化に供され得る。
【００１２】
ステビオールグリコシドの合成方法
別の態様において、少なくとも１種類の全細胞触媒は、本明細書に記載の少なくとも１つのステビオールグリコシドを合成する方法において使用され得る。本方法は、基質を含む培地内で、少なくとも１種類の全細胞触媒をインビトロで培養することを含む。いかなる特定の理論に制限されることなく、形質転換宿主細胞内の少なくとも１つの発現カセットから生成される少なくとも１種類の酵素は、所望の少なくとも１つのステビオールグリコシドを合成するために培地内の基質を酵素的にグリコシル化する。
【００１３】
全細胞触媒ピキア・パストリス株
別の態様において、本開示は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼをコードする第２のヌクレオチドセグメントのＣ末端にインフレームで挿入されたピキア細胞壁タンパク質をコードする第１のヌクレオチドセグメントを含む融合タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びスクロース合成酵素をコードする第２のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を含有する少なくとも１つの発現カセットで形質転換されたピキア・パストリス宿主細胞を含む全細胞触媒を対象とする。形質転換されたピキア・パストリス細胞の少なくとも１つのヌクレオチド配列は発現されて、ピキア・パストリス細胞の細胞表面上に提示されるある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ及びある量の細胞内スクロース合成酵素によって特徴付けられる全細胞触媒を生成し得る。
【００１４】
形質転換されたピキア・パストリスは、一態様において、少なくとも１つのヌクレオチド配列のそれぞれの１以上のコピーを含み得る。第１のピキア・パストリス株（Ｇ／Ｋ４Ｓ２）は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）をコードする第２のヌクレオチドセグメントのＣ末端にインフレームで挿入されたピキア細胞壁タンパク質（ＧＣＷ６１）を含む第１のヌクレオチド配列を含有する発現カセットの４コピー、及びスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）をコードする第２のヌクレオチド配列を含有する発現カセットの２コピーを含む。第２のピキア・パストリス株（Ｇ／Ｈ５Ｓ２）は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＨＶ１）をコードする第２のヌクレオチドセグメントのＣ末端にインフレームで挿入されたピキア細胞壁タンパク質（ＧＣＷ６１）を含む第１のヌクレオチド配列を含有する発現カセットの５コピー、及びスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）をコードする第２のヌクレオチド配列を含有する発現カセットの２コピーを含む。
【００１５】
ステビオシドからレバウジオシドＡを生成する方法
別の態様において、本開示は、ステビオシドからレバウジオシドＡを合成するための方法を対象とする。本方法は、レバウジオシドＡを生成するのに十分な時間、ステビオシド基質を含む培地で全細胞触媒を培養することを含み、ここでグルコースはステビオシドに共有結合してレバウジオシドＡを生成する。全細胞触媒は、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する形質転換宿主細胞である。一態様において、全細胞触媒は、ピキア・パストリスのＧ／Ｋ４Ｓ２株であり得、培地は、リン酸カリウム緩衝液、ＭｇＣｌ２、スクロース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ、及びそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【００１６】
レバウジオシドＤからレバウジオシドＭを生成する方法
別の態様において、本開示は、レバウジオシドＤからレバウジオシドＭを合成するための方法を対象とする。本方法は、レバウジオシドＭを生成するのに十分な時間、レバウジオシドＤ基質を含む培地で全細胞触媒を培養することを含み、ここでグルコースはレバウジオシドＤに共有結合してレバウジオシドＭを生成する。全細胞触媒は、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する形質転換宿主細胞である。一態様において、全細胞触媒は、ピキア・パストリスのＧ／Ｋ４Ｓ２株であり得、培地は、リン酸カリウム緩衝液、ＭｇＣｌ２、スクロース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ、及びそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【００１７】
レバウジオシドＥからレバウジオシドＤを生成する方法
別の態様において、本開示は、レバウジオシドＥからレバウジオシドＤを合成するための方法を対象とする。本方法は、レバウジオシドＤを生成するのに十分な時間、レバウジオシドＥ基質を含む培地で全細胞触媒を培養することを含み、ここでグルコースはレバウジオシドＥに共有結合してレバウジオシドＤを生成する。全細胞触媒は、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する形質転換宿主細胞である。一態様において、全細胞触媒は、ピキア・パストリスのＧ／Ｋ４Ｓ２株であり得、培地は、リン酸カリウム緩衝液、ＭｇＣｌ２、スクロース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ、及びそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【００１８】
レバウジオシドＡからレバウジオシドＤを生成する方法
別の態様において、本開示は、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤを合成するための方法を対象とする。本方法は、レバウジオシドＤを生成するのに十分な時間、レバウジオシドＡ基質を含む培地で全細胞触媒を培養することを含み、ここでグルコースはレバウジオシドＡに共有結合してレバウジオシドＤを生成する。全細胞触媒は、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＨＶ１−ＧＣＷ６１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する形質転換宿主細胞である。一態様において、全細胞触媒は、ピキア・パストリスのＧ／Ｈ５Ｓ２株であり得、培地は、リン酸カリウム緩衝液、ＭｇＣｌ２、スクロース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ、及びそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【００１９】
ステビオシドからレバウジオシドＥを生成する方法
別の態様において、本開示は、ステビオシド基質からレバウジオシドＥを合成するための方法を対象とする。本方法は、レバウジオシドＥを生成するのに十分な時間、ステビオシド基質を含む培地で全細胞触媒を培養することを含み、ここでグルコースはステビオシドに共有結合してレバウジオシドＥを生成する。全細胞触媒は、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＨＶ１−ＧＣＷ６１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する形質転換宿主細胞である。一態様において、全細胞触媒は、ピキア・パストリスのＧ／Ｈ５Ｓ２株であり得、培地は、リン酸カリウム緩衝液、ＭｇＣｌ２、スクロース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ、及びそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【００２０】
ステビオシド及び／又はレバウジオシドＡからレバウジオシドＭを生成する方法
別の態様において、本開示は、ステビオシド及び／又はレバウジオシドＡからレバウジオシドＭを合成するための方法を対象とする。本方法は、レバウジオシドＭを生成するのに十分な時間、ステビオシド及び／又はレバウジオシドＡ基質を含む培地で全細胞触媒を培養することを含む。全細胞触媒は、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する第１の形質転換宿主細胞、及びある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＨＶ１−ＧＣＷ６１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する第２の形質転換宿主細胞を含む。一態様において、全細胞触媒は、ピキア・パストリスのＧ／Ｋ４Ｓ２株及びＧ／Ｈ５Ｓ２株であり得、培地は、リン酸カリウム緩衝液、ＭｇＣｌ２、スクロース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ、及びそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【００２１】
レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＥを生成する方法
別の態様において、本開示は、レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＥを合成するための方法を対象とする。本方法は、レバウジオシドＥを生成するのに十分な時間、レバウジオシドＫＡ基質を含む培地で全細胞触媒を培養することを含み、ここでグルコースはレバウジオシドＫＡに共有結合してレバウジオシドＥを生成する。全細胞触媒は、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＨＶ１−ＧＣＷ６１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する形質転換宿主細胞である。一態様において、全細胞触媒は、ピキア・パストリスのＧ／Ｈ５Ｓ２株であり得、培地は、リン酸カリウム緩衝液、ＭｇＣｌ２、スクロース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ、及びそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【００２２】
ルブソシドからレバウジオシドＫＡ及びレバウジオシドＥを生成する方法
別の態様において、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドＫＡを合成するための方法を対象とする。本方法は、レバウジオシドＫＡを生成するのに十分な時間、ルブソシド基質を含む培地で全細胞触媒を培養することを含み、ここでグルコースはルブソシドに共有結合してレバウジオシドＫＡを生成し、続いて、グルコースはレバウジオシドＫＡに共有結合してレバウジオシドＥを生成する。全細胞触媒は、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＨＶ１−ＧＣＷ６１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する形質転換宿主細胞である。一態様において、全細胞触媒は、ピキア・パストリスのＧ／Ｈ５Ｓ２株であり得、培地は、リン酸カリウム緩衝液、ＭｇＣｌ２、スクロース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ、及びそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【００２３】
本開示は、以下の発明を実施するための形態を考慮すると、よりよく理解され、上述したもの以外の特徴、態様及び利点が明らかになるであろう。そのような発明を実施するための形態は、以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】ステビオールからのステビオールグリコシド生合成経路を示す。
【図１Ｂ】ステビオールからのステビオールグリコシド生合成経路を示す。
【図１Ｃ】ステビオールからのステビオールグリコシド生合成経路を示す。
【図１Ｄ】ステビオールからのステビオールグリコシド生合成経路を示す。
【図１Ｅ】ステビオールからのステビオールグリコシド生合成経路を示す。
【図２】図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃは、Ｇ／Ｋ４Ｓ２培養細胞を用いるステビオシドからのレバウジオシドＡ（「Ｒｅｂ  Ａ」）の生成をまとめたものである。図２Ａ及び図２Ｂは、それぞれ、ステビオシド（図２Ａ）及びレバウジオシドＡ（図２Ｂ）標準物質のＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。図２Ｃは、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞のインビトロ反応系への導入後２４時間の時点でＧ／Ｋ４Ｓ２培地から採取した、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞によって酵素的に生成されたレバウジオシドＡのＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。
【図３】図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃは、Ｇ／Ｋ４Ｓ２培養細胞を用いるレバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）からのレバウジオシドＭ（「Ｒｅｂ  Ｍ」）の生成をまとめたものである。図３Ａ及び図３Ｂは、それぞれ、レバウジオシドＤ（図３Ａ）及びレバウジオシドＭ（図３Ｂ）標準物質のＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。図３Ｃは、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞のインビトロ反応系への導入後２４時間の時点でＧ／Ｋ４Ｓ２培地から採取した、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞によって酵素的に生成されたレバウジオシドＭ及び残存レバウジオシドＤのＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。
【図４】図４Ａ、４Ｂ、及び４Ｃは、Ｇ／Ｋ４Ｓ２培養細胞を用いるレバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）からのレバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）の生成をまとめたものである。図４Ａ及び図４Ｂは、それぞれ、レバウジオシドＥ（図４Ａ）及びレバウジオシドＤ（図４Ｂ）標準物質のＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。図４Ｃは、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞のインビトロ反応系への導入後２４時間の時点でＧ／Ｋ４Ｓ２培地から採取した、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞によって酵素的に生成されたレバウジオシドＤ及び残存レバウジオシドＥのＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。
【図５】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、及び５Ｅは、Ｇ／Ｈ５Ｓ２培養細胞を用いるレバウジオシドＡ（「Ｒｅｂ  Ａ」）からのレバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）の生成をまとめたものである。図５Ａ及び図５Ｂは、それぞれ、レバウジオシドＡ（図５Ａ）及びレバウジオシドＤ（図５Ｂ）標準物質のＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。図５Ｃは、Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞のインビトロ反応系への導入後２４時間の時点で培地から採取した、Ｇ／Ｈ５Ｓ２培養細胞によって酵素的に生成されたレバウジオシドＤ及び残存レバウジオシドＡのＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。図５Ｄは、誘導Ｈ５細胞のインビトロ反応系への導入後２４時間の時点でＨ５培地から採取した、ＨＶ１−ＧＣＷ６１配列のみを含有するベクターを導入した培養ピキア・パストリス株（Ｈ５）によって酵素的に生成されたレバウジオシドＤ及び残存レバウジオシドＡのＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。Ｈ５培地中のレバウジオシドＤの量が減少したことは、ＨＶ１−ＧＣＷ６１とｍｂＳＵＳ１遺伝子の両方がＧ／Ｈ５Ｓ２細胞によるＲｅｂ  ＤへのＲｅｂ  Ａの変換に関与していることを示す。図５Ｅは、誘導ｐＨＫＡ細胞のインビトロ反応系への導入後２４時間の時点でｐＨＫＡ培地から採取した、ＨＶ１−ＧＣＷ６１とｍｂＳＵＳ１配列の両方を欠く空ベクターを導入した培養ピキア・パストリス株（ｐＨＫＡ）によって酵素的に生成されたレバウジオシドＤ及び残存レバウジオシドＡのＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。ｐＨＫＡ培地中のレバウジオシドＤの欠如は、ＨＶ１−ＧＣＷ６１とｍｂＳＵＳ１配列の両方がＧ／Ｈ５Ｓ２細胞によるＲｅｂ  ＤへのＲｅｂ  Ａの変換に関与していることをさらに示す。
【図６】図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、及び６Ｄは、Ｇ／Ｈ５Ｓ２培養細胞を用いるステビオシド（「Ｓｔｅ」）からのレバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）の生成をまとめたものである。図６Ａ及び図６Ｂは、それぞれ、ステビオシド（「Ｓｔｅ」）及びレバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）標準物質のＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。図６Ｃは、誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞のインビトロ反応系への導入後２４時間の時点で培地から採取した、Ｇ／Ｈ５Ｓ２培養細胞によって酵素的に生成されたレバウジオシドＥ及び残存ステビオシドのＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。図６Ｄは、誘導ｐＨＫＡ細胞のインビトロ反応系への導入後２４時間の時点で反応から採取した、ＨＶ１−ＧＣＷ６１とｍｂＳＵＳ１の両方の配列を欠く空ベクターを組み込んだ培養ピキア・パストリス株（ｐＨＫＡ）によって酵素的に生成されたレバウジオシドＥ及び残存ステビオシドのＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。反応中のレバウジオシドＥの欠如は、ＨＶ１−ＧＣＷ６１とｍｂＳＵＳ１の両方の配列がＧ／Ｈ５Ｓ２細胞によるＲｅｂ  ＤへのＲｅｂ  Ａの変換に関与していることをさらに示す。
【図７】図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、及び７Ｅは、共培養されるＧ／Ｋ４Ｓ２及びＧ／Ｈ５Ｓ２細胞を用いるレバウジオシドＡ（「Ｒｅｂ  Ａ」）からのレバウジオシドＭ（「Ｒｅｂ  Ｍ」）の生成をまとめたものである。図７Ａ、図７Ｂ、及び図７Ｃは、それぞれ、レバウジオシドＡ（「Ｒｅｂ  Ａ」）、レバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）、及びレバウジオシドＭ（「Ｒｅｂ  Ｍ」）標準物質のＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。図７Ｄ及び７Ｅは、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２及びＧ／Ｈ５Ｓ２細胞のインビトロ反応系への導入後２４時間（図７Ｄ）及び４８時間（図７Ｅ）の時点で培地から採取した、共培養されるＧ／Ｋ４Ｓ２及びＧ／Ｈ５Ｓ２細胞によって酵素的に生成されたレバウジオシドＭ及びレバウジオシドＤ並びに残存レバウジオシドＡのＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。
【図８Ａ】図８Ａは、インビトロ反応系への誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２及びＧ／Ｈ５Ｓ２細胞の導入後数時間の時点についての、様々なＧ／Ｈ５Ｓ２：Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞密度比で共培養したＧ／Ｋ４Ｓ２細胞及びＧ／Ｈ５Ｓ２細胞を用いるレバウジオシドＡ（「Ｒｅｂ  Ａ」）からのレバウジオシドＤ中間生成物（「Ｒｅｂ  Ｄ」）の生成をまとめたものである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、インビトロ反応系への誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２及びＧ／Ｈ５Ｓ２細胞の導入後１６、２４、及び４８時間の時点での、様々なＧ／Ｈ５Ｓ２：Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞密度比で共培養したＧ／Ｋ４Ｓ２細胞及びＧ／Ｈ５Ｓ２細胞を用いるレバウジオシドＡ（「Ｒｅｂ  Ａ」）からのレバウジオシドＭ（「Ｒｅｂ  Ｍ」）の生成をまとめたものである。
【図９Ａ】ステビオールグリコシドの生合成経路を示す概略図である。
【図９Ｂ】ステビオールグリコシドの生合成経路を示す概略図である。
【図９Ｃ】ステビオールグリコシドの生合成経路を示す概略図である。
【図９Ｄ】ステビオールグリコシドの生合成経路を示す概略図である。
【図９Ｅ】ステビオールグリコシドの生合成経路を示す概略図である。
【図９Ｆ】ステビオールグリコシドの生合成経路を示す概略図である。
【図９Ｇ】ステビオールグリコシドの生合成経路を示す概略図である。
【図９Ｈ】ステビオールグリコシドの生合成経路を示す概略図である。
【図１０】ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（「ＵＧＴ」）及びスクロース合成酵素（「ＳＵＳ」）のカップリング反応システムの概略図である。反応１は、グルコース供与体としてＵＤＰ−グルコースを使用しＵＤＰ生成をもたらす、レバウジオシドＡ（「Ｒｅｂ  Ａ」）をレバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）に変換するＵＧＴ触媒反応を示す。反応２は、グルコース供与体としてスクロースを使用する、ＵＤＰをＵＤＰ−グルコースへ変換するＳＵＳ触媒反応を示す。反応２はまた、ＳＵＳ触媒反応がＵＧＴ触媒反応に連動し得ることを示す。
【図１１】全細胞触媒を使用してステビオールグリコシド化合物を生成する方法を説明するブロック図である。
【図１２】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、及び１２Ｄは、共培養されるＧ／Ｋ４Ｓ２及びＧ／Ｈ５Ｓ２細胞を用いるステビオシド（「Ｓｔｅ」）からのレバウジオシドＭ（「Ｒｅｂ  Ｍ」）の生成をまとめたものである。図１２Ａ及び図１２Ｂは、それぞれ、レバウジオシドＡ（「Ｒｅｂ  Ａ」）、レバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）、レバウジオシドＭ（「Ｒｅｂ  Ｍ」）、及びステビオシド（「Ｓｔｅ」）標準物質のＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。図１２Ｃ及び１２Ｄは、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２及びＧ／Ｈ５Ｓ２細胞のインビトロ反応系への導入後１０時間（図１２Ｃ）及び２４時間（図１２Ｄ）の時点で培地から採取した、共培養されるＧ／Ｋ４Ｓ２及びＧ／Ｈ５Ｓ２細胞によって酵素的に生成されたレバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、及びレバウジオシドＡ、並びに残存ステビオシドのＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。
【図１３】図１３Ａ及び１３Ｂは、Ｇ／Ｈ５Ｓ２培養細胞を用いるレバウジオシドＫＡ（「Ｒｅｂ  ＫＡ」）からのレバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）の生成をまとめたものである。図１３Ａは、それぞれ、レバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）、レバウジオシドＫＡ（「Ｒｅｂ  ＫＡ」）、ルブソシド（「Ｒｕｂ」）標準物質のＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。図１３Ｂは、Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞のインビトロ反応系への導入後２４時間の時点で培地から採取した、Ｇ／Ｈ５Ｓ２培養細胞によって酵素的に生成されたレバウジオシドＥ及び残存レバウジオシドＫＡのＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。
【図１４】図１４Ａ、１４Ｂ、及び１４Ｃは、Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞を用いるルブソシド（「Ｒｕｂ」）からのレバウジオシドＫＡ（「Ｒｅｂ  ＫＡ」）及びレバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）の生成をまとめたものである。図１４Ａは、それぞれ、レバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）、レバウジオシドＫＡ（「Ｒｅｂ  ＫＡ」）、及びルブソシド（「Ｒｕｂ」）標準物質のＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。図１４Ｂ及び１４Ｃは、誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞のインビトロ反応系への導入後１４時間（図１４Ｂ）及び２４時間（図１４Ｃ）の時点で培地から採取した、Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞によって酵素的に生成されたレバウジオシドＫＡ及びレバウジオシドＥのＨＰＬＣ保持時間をまとめたものである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本開示は、様々な変更及び代替形態が可能であるが、その具体的な実施形態は、図面に例として示されており、本明細書で以下に詳細に記載されている。しかしながら、特定の実施形態の記載は、本開示を限定することを意図せず、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本開示の趣旨及び範囲内に入る全ての変更、均等物及び代替物を含むことを理解されたい。
【００２６】
特に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料は、本開示の実施又は試験で使用され得るが、好ましい材料及び方法を以下に記載する。
【００２７】
「相補的」という用語は、当業者によって理解されるようなその通常の慣用的な意味に従って使用され、かつ互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を記載するために制限なく使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本技術はまた、添付の配列表で報告された完全な配列及びそれらの実質的に類似の核酸配列に相補的な単離された核酸断片も含む。
【００２８】
「核酸」及び「ヌクレオチド」という用語は、当業者によって理解されるように、それぞれの通常の慣用的な意味に従って使用され、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及び一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態でのそれらのポリマーを指すために制限なく使用される。具体的に限定しない限り、この用語は、参照核酸に類似の結合特性を有し天然に存在するヌクレオチドと類似の方法で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。特に示さない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に変更された変異体又は縮重変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補配列、並びに明示的に示された配列を潜在的に包含する。
【００２９】
「単離された」という用語は、当業者によって理解されるように、その通常の慣用的な意味に従って使用され、単離核酸又は単離ポリペプチドの文脈で使用される場合、人の手によって、その自然環境から離れて存在し、したがって、天然の生成物ではない核酸又はポリペプチドを指すために制限なく使用される。単離された核酸又はポリペプチドは、精製された形態で存在し得るか、又は例えば、トランスジェニック宿主細胞中などの非天然環境中に存在し得る。
【００３０】
本明細書で使用する「インキュベートする」及び「インキュベーション」という用語は、ステビオールグリコシド組成物を生成するのに有利な条件下で２以上の化学的又は生物学的実体（化学化合物及び酵素など）を混合しそれらを反応させるプロセスを指す。
【００３１】
「縮重変異体」という用語は、１以上の縮重コドン置換により参照核酸配列と異なる残基配列を有する核酸配列を指す。縮重コドン置換は、１以上の選択された（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合された塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換される配列を作製することによって達成できる。核酸配列及びその縮重変異体の全ては、同一のアミノ酸又はポリペプチドを発現する。
【００３２】
「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」という用語は、当業者によって理解されるようにそれぞれの通常の慣用的な意味に従って使用され、３つの用語は、時々、互換的に使用され、そのサイズ又は機能にかかわらず、アミノ酸、又はアミノ酸類似体のポリマーを指すために制限なく使用される。「タンパク質」は比較的大きなポリペプチドに関して使用される場合が多く、「ペプチド」は小さなポリペプチドに関して使用される場合が多いが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は、重複し様々である。特に記載しない限り、本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を指す。「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、ポリヌクレオチド生成物に言及する場合、本明細書で互換的に使用される。そのため、例示的なポリペプチドは、ポリヌクレオチド生成物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片並びに前述のものの他の等価物、変異体、及び類似体を含む。
【００３３】
「ポリペプチド断片」及び「断片」という用語は、参照ポリペプチドに関して使用される場合、当業者にとってそれらの通常の慣用的な意味に従って使用され、参照ポリペプチド自体と比較してアミノ酸残基が除去されているが、残りのアミノ酸配列は、参照ポリペプチドの対応する位置と通常同一であるポリペプチドを指すために制限なく使用される。このような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端で、或いはその両方で生じ得る。
【００３４】
ポリペプチド又はタンパク質の「機能的断片」という用語は、全長ポリペプチド又はタンパク質の一部であり、全長ポリペプチド又はタンパク質と実質的に同一の生物学的活性を有するか、又は実質的に同じ機能を行う（例えば、同じ酵素反応を行う）ペプチド断片を指す。
【００３５】
互換的に使用される「変異体ポリペプチド」、「変更されたアミノ酸配列」又は「変更されたポリペプチド」という用語は、１以上のアミノ酸によって、例えば、１以上のアミノ酸置換、欠失、及び／又は付加によって参照ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を指す。一態様において、変異体は、参照ポリペプチドの能力の一部又は全てを保持する「機能的変異体」である。
【００３６】
「機能的変異体」という用語は、保存的に置換された変異体をさらに含む。「保存的に置換された変異体」という用語は、１以上の保存的アミノ酸置換によって参照ペプチドと異なるアミノ酸配列を有し、参照ペプチドの活性の一部又は全部を維持するペプチドを指す。「保存的アミノ酸置換」は、機能的に類似した残基によるアミノ酸残基の置換である。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンなどの１つの非極性（疎水性）残基と別のものとの置換；アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、トレオニンとセリンの間などの１つの荷電又は極性（親水性）残基と別のものとの置換；リジン若しくはアルギニンなどの１つの塩基性残基と別のものとの置換；又はアスパラギン酸若しくはグルタミン酸などの１つの酸性残基と別のものとの置換；又はフェニルアラニン、チロシン、若しくはトリプトファンなどの１つの芳香族残基と別のものとの置換が挙げられる。そのような置換は、タンパク質若しくはポリペプチドの見かけの分子量又は等電点にほとんど又は全く影響を与えないことが期待される。「保存的に置換された変異体」という語句はまた、生じるペプチドが本明細書に記載の参照ペプチドの活性の一部又は全部を維持するという条件で、残基が化学的に誘導体化された残基で置換されるペプチドも含む。
【００３７】
「変異体」という用語は、本技術のポリペプチドと関連して、参照ポリペプチドのアミノ酸配列に少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％同一のアミノ酸配列を有する機能的に活性なポリペプチドをさらに含む。
【００３８】
その全ての文法の形態及び綴りの変形での「相同な」という用語は、スーパーファミリーからのポリヌクレオチド又はポリペプチド及び異なる種からの相同ポリヌクレオチド又はタンパク質を含む、「共通の進化起源」を有するポリヌクレオチド又はポリペプチド間の関係を指す（Ｒｅｅｃｋら、Ｃｅｌｌ  ５０：６６７、１９８７）。そのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは、保存された位置での特定のアミノ酸若しくはモチーフの％同一性又は存在の点で、それらの配列類似性に反映されるような、配列相同性を有する。例えば、２つの相同なポリペプチドは、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％同一であるアミノ酸配列を有し得る。
【００３９】
本技術の変異体ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を達成するために、配列を並べ必要に応じて、ギャップを導入した後の参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指し、任意の保存的置換を配列同一性の一部として考慮しない。
【００４０】
パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用して、当業者の技量の範囲内にある様々な方法で達成できる。当業者は、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するのに適切なパラメータを決定できる。例えば、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２を用いて決定され得る。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードできる。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ２は、それらの検索パラメータの全てが、例えば、アンマスク（ｕｎｍａｓｋ）イエス（ｙｅｓ）、鎖＝全て、予測される発生１０、最小低複合長（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｌｅｎｇｔｈ）＝１５／５、マルチパスｅ値＝０．０１、マルチパス＝２５のための定数、最終ギャップアラインメントについてのドロップオフ＝２５及びスコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含むデフォルト値に設定される、いくつかの検索パラメータを使用する。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２がアミノ酸配列比較のために用いられる状況において、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、若しくは所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（これは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、若しくは所与のアミノ酸配列Ｂに対する特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａとして代替的に述べることができる）は以下のように計算される：１００×分数Ｘ／Ｙ、式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２によって、Ａ及びＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一マッチとしてスコアされるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが理解される。
【００４１】
この意味で、アミノ酸配列「類似性」を決定するための技術は、当技術分野で周知である。一般的に、「類似性」は、アミノ酸が同一であるか荷電若しくは疎水性などの類似の化学的特性及び／又は物理的特性を有する、適切な場所での２個以上のポリペプチドのアミノ酸対アミノ酸の正確な比較を指す。次いで、いわゆる「％類似性」が、比較されるポリペプチド配列間で決定され得る。核酸及びアミノ酸配列同一性を決定するための技術も当技術分野において周知であり、その遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること（通常はｃＤＮＡ中間体を介して）及びその中にコードされるアミノ酸配列を決定すること、及びこれを第２のアミノ酸配列と比較すること、を含む。一般的に、「同一性」は、それぞれ、２つのポリヌクレオチド若しくはポリペプチド配列のヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の正確な対応を指す。２以上のポリヌクレオチド配列は、２以上のアミノ酸配列でできるように、それらの「パーセント同一性」を決定することにより比較できる。ウィスコンシン配列解析パッケージ、バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州マディソンから入手可能）で利用可能なプログラム、例えば、ＧＡＰプログラムは、２つのポリヌクレオチド間の同一性と、２つのポリペプチド配列間の同一性及び類似性の両方をそれぞれ計算することが可能である。配列間の同一性又は類似性を計算するための他のプログラムは、当業者に知られている。
【００４２】
参照位置「に対応する」アミノ酸位置は、アミノ酸配列を整列することによって同定されるように、参照配列と並ぶ位置を意味する。そのようなアラインメントは、手動で、又はＣｌｕｓｔａｌＷ２、Ｂｌａｓｔ２などの周知の配列アラインメントプログラムを用いることによって行うことができる。
【００４３】
特に断りのない限り、２つのポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の％同一性は、２つの配列の短い方の全長にわたって同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドのパーセンテージを指す。
【００４４】
「コード配列」は、当業者によって理解されるようなその通常の慣用的な意味に従って使用され、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指すために制限なく使用される。
【００４５】
「適切な調節配列」は、当業者によって理解されるようなその通常の慣用的な意味に従って使用され、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列の中、又はコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指すために、制限なく使用される。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、及びポリアデニル化認識配列を含み得る。
【００４６】
「プロモーター」は、当業者によって理解されるようなその通常の慣用的な意味に従って使用され、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指すために制限なく使用される。一般的に、コード配列は、プロモーター配列に対し３’に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来し得るか、又は天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されるか、又はさらに合成ＤＮＡセグメントを含み得る。異なるプロモーターは異なる細胞型において、又は発生の異なる段階で、又は異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を指示し得ることが当業者には理解される。多くの場合、遺伝子をほとんどの時期にほとんどの細胞型で発現させるプロモーターは、「構成的プロモーター」と一般的に呼ばれる。ほとんどの場合調節配列の正確な境界は完全に定義されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることが、さらに認識されている。
【００４７】
「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって影響されるような、単一核酸断片上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現にそれが影響を与えることができる場合、コード配列と作動可能に連結される（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センス又はアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結され得る。
【００４８】
本明細書で使用する「発現」という用語は、当業者によって理解されるようなその通常の慣用的な意味に従って使用され、本技術の核酸断片に由来するセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定な蓄積を指すために制限なく使用される。「過剰発現」は、正常生物又は非形質転換生物における生成レベルを超える、トランスジェニック又は組み換え生物における遺伝子産物の生成を指す。
【００４９】
「形質転換」とは、当業者によって理解されるようなその通常の慣用的な意味に従って使用され、標的細胞中へのポリヌクレオチドの転移を指すために制限なく使用される。転移されたポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノム又は染色体ＤＮＡ中に組み込まれ、遺伝的に安定な遺伝をもたらすか、又は宿主染色体とは独立して複製することができる。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」又は「組み換え」又は「形質転換」生物と呼ばれる。
【００５０】
「形質転換」、「トランスジェニック」及び「組み換え」という用語は、宿主細胞と関連して本明細書で使用する場合、当業者によって理解されるようなそれらの通常の慣用的な意味に従って使用され、その中に異種核酸分子が導入された、植物又は微生物細胞などの宿主生物の細胞を指すために制限なく使用される。核酸分子は宿主細胞のゲノム中に安定して組み込まれるか、又は核酸分子は染色体外分子として存在し得る。このような染色体外分子は、自己複製することができる。形質転換された細胞、組織、又は対象は、形質転換プロセスの最終生成物だけでなく、そのトランスジェニック子孫も包含することが理解される。
【００５１】
「組み換え」、「異種」、及び「外来」という用語は、ポリヌクレオチドに関連して本明細書で使用する場合、当業者によって理解されるようなそれらの通常の慣用的な意味に従って使用され、特定の宿主細胞にとって外来の供給源由来であるか、又は同じ供給源由来である場合は、その元の形態から変更されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列又は遺伝子）を指すために制限なく使用される。したがって、宿主細胞内の異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内在性であるが、例えば、部位特異的変異誘発又は他の組み換え技術を使用して変更された遺伝子を含む。これらの用語はまた、天然に存在するＤＮＡ配列の非天然に生じる複数のコピーも含む。したがって、これらの用語は、細胞にとって外来若しくは異種であるか、又は細胞にとって同種であるがエレメントが通常は見られない宿主細胞内の位置又は形態にあるＤＮＡセグメントを指す。
【００５２】
同様に、「組み換え」、「異種」、及び「外来」という用語は、ポリペプチド又はアミノ酸配列に関連して本明細書で使用する場合、特定の宿主細胞にとって外来の供給源由来であるか、又は同じ供給源由来である場合は、その元の形態から改変されたポリペプチド又はアミノ酸配列を意味する。したがって、組み換えＤＮＡセグメントは、組み換えポリペプチドを生成するために宿主細胞内で発現させることができる。
【００５３】
「プラスミド」、「ベクター」、及び「カセット」という用語は、当業者によって理解されるようなそれらの通常の慣用的な意味に従って使用され、細胞の中心的代謝の一部ではなく、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である遺伝子を運ぶ場合が多い、追加の染色体エレメントを指すために制限なく使用される。このようなエレメントは、任意の供給源由来の、直鎖若しくは環状の、１本鎖若しくは２本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であり得、その中のいくつかのヌクレオチド配列は、適切な３’非翻訳配列と共に、選択した遺伝子産物のプロモーター断片及びＤＮＡ配列を細胞内に導入することができる独特な構造の中に結合されるか組み換えられている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有しこの外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有しこの外来遺伝子に加えて、外来宿主におけるその遺伝子の増強された発現を可能にするエレメントを有する特定のベクターを指す。
【００５４】
本明細書で使用する標準的な組み換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験室マニュアル、第２版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９（以下では、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；並びにＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．及びＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．、遺伝子融合を用いた実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８４；並びにＧｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによって出版された、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．らの分子生物学の現在のプロトコル（Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９８７によって記載されており、これらの各々の全体は、それらが本明細書と矛盾しない程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５５】
本明細書で使用する、「合成」又は「有機的に合成された」又は「化学的に合成された」又は「有機的に合成する」又は「化学的に合成する」又は「有機合成」又は「化学合成」は、一連の化学反応を介して化合物を調製することを指すために使用され、これは、化合物を、例えば、天然供給源から抽出することを含まない。
【００５６】
本明細書で使用する「経口消耗品」という用語は、人又は動物の口と接触される任意の飲料、食品、栄養補助食品、機能性食品、医薬組成物、歯科衛生学的組成物及び化粧品を指し、口の中に取り込まれ、その後口から排出される物質及び飲まれ、食べられ、飲み込まれ、又は他の方法で摂取される物質、並びに、一般的に許容される濃度範囲で使用される場合ヒト又は動物の飲食に安全である物質を含む。
【００５７】
本明細書で使用される「食品」という用語は、果物、野菜、ジュース、ハム、ベーコン及びソーセージなどの肉製品；卵製品、果実濃縮物、ゼラチン及び、ジャム、ゼリー、及び果物の砂糖煮などのゼラチン様製品；アイスクリーム、サワークリーム、ヨーグルト、及びシャーベットなどの乳製品；アイシング、糖蜜を含むシロップ；トウモロコシ、小麦、ライ麦、大豆、オート麦、米及び麦の製品、穀物製品、ナッツ及びナッツ製品、ケーキ、クッキー、キャンディー、ガム、フルーツフレーバーのドロップなどの菓子、及びチョコレート、チューインガム、ミント、クリーム、アイシング、アイスクリーム、パイ及びパンを指す。「食品」はまた、ハーブ、スパイス及び薬味などの調味料、グルタミン酸ナトリウムなどのうま味調味料を指す。「食品」は、ダイエット甘味料、液体甘味料、卓上香料、水で再構成した際に非炭酸飲料をもたらす粒状フレーバーミックス、インスタントプディングミックス、インスタントのコーヒー及び紅茶、コーヒーホワイトナー、麦芽ミルクミックス、ペットフード、家畜飼料、タバコ、並びにパン、クッキー、ケーキ、パンケーキ、及びドーナツなどを調製するための粉末ベーキングミックスなどのベーキング用途のための材料などの調製済み包装製品も含むことをさらに指す。「食品」はまた、ダイエット食品又は低カロリー食品及びスクロースをほとんど又はまったく含まない飲料を指す。
【００５８】
本明細書で使用する「立体異性体」という用語は、空間におけるそれらの原子の配向のみが異なる個々の分子の全ての異性体に対する一般的な用語である。「立体異性体」は、鏡像異性体及び互いの鏡像ではない複数のキラル中心を有する化合物の異性体（ジアステレオマー）を含む。
【００５９】
本明細書で使用する「甘味強度」という用語は、個体、例えば、ヒトが観察し又は経験するような甘い感覚の相対強度、又は、例えば、ブリックススケールで、テイスターによって検出される甘味の程度若しくは量を指す。
【００６０】
本明細書中で使用する「甘味を増強する」という用語は、レバウジオシドＭ及び／又はレバウジオシドＤを含有しない対応する経口消耗品と比較して、その性質又は品質を変更せずに、本開示の飲料製品又は消耗品の１以上の甘味特性の知覚を増大、増強、強化、強調、拡大、及び／又は増強することにおけるレバウジオシドＭ及び／又はレバウジオシドＤの効果を指す。
【００６１】
本明細書中で使用する「オフテイスト（複数可）」という用語は、本開示の飲料製品若しくは消耗品中で特徴的には見られない又は通常には見られない味の量又は程度を指す。例えば、オフテイストは、苦味、甘草様の味、金属味、嫌悪味、渋味、遅れて感じる甘味、及び長引くような甘い後味などの、消費者にとって甘味消耗品の望ましくない味である。
【００６２】
本明細書で使用する「ｗ／ｖ％」という用語は、かかる化合物を含有する本開示の液体経口消耗品の１００ｍｌあたりの（グラムでの）、糖などの化合物の重量を指す。本明細書で使用する「ｗ／ｗ％」という用語は、かかる化合物を含有する本開示の経口消耗品の１グラムあたりの（グラムでの）、糖などの化合物の重量を指す。
【００６３】
本明細書で使用する「ｐｐｍ」という用語は、重量での百万分率、例えば、かかる化合物を含有する本開示の経口消耗品の１キログラムあたりの（ミリグラムでの）レバウジオシドＭ及び／若しくはレバウジオシドＤなどの、化合物の重量（すなわち、ｍｇ／ｋｇ）又はかかる化合物を含有する本開示の経口消耗品の１リットルあたりの（ミリグラムでの）レバウジオシドＭ及び／若しくはレバウジオシドＤなどの、化合物の重量（すなわち、ｍｇ／Ｌ）；又は体積での百万分率、例えば、かかる化合物を含有する本開示の経口消耗品の１リットルあたりの（ミリリットルでの）レバウジオシドＭ及び／若しくはレバウジオシドＤなどの、化合物の体積（すなわち、ｍｌ／Ｌ）を指す。
【００６４】
本開示に従って、ステビオールグリコシドノンカロリー甘味料及びステビオールグリコシドを合成するための方法が開示される。また本開示に従って、１種以上の酵素を生成する１以上の改変された細胞を含む全細胞触媒、全細胞触媒を生成するための方法、及びステビオールグリコシドを調製するために全細胞触媒を使用する方法が開示される。
【００６５】
全細胞触媒
一態様において、少なくとも１種類の全細胞触媒が提供される。この態様において、少なくとも１種類の全細胞触媒は、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ又はＵＧＴ）及びスクロース合成酵素（ＳＵＳ）を含むがこれらに限定されない少なくとも１種類の酵素を発現する、形質転換宿主細胞である。本明細書で以下に説明する様々な態様において、少なくとも１種類の全細胞触媒は、適当な基質と少なくとも１種類の全細胞触媒を混合することを含む、ノンカロリー甘味料を合成する方法において使用され得、少なくとも１種類の全細胞触媒によって生成される酵素は、基質及び任意の生じた中間生成物の少なくとも１つのグリコシル化反応を触媒して、所望のノンカロリー甘味料を生成する。
【００６６】
別の態様において、形質転換宿主細胞により発現されるＵＧＴ酵素は、宿主細胞の表面に提示され得る。この態様において、発現されるＵＧＴ酵素は、提示ポリペプチドと融合されて、形質転換宿主細胞の表面上で発現されるＵＧＴ酵素の提示を促進し得る。発現される酵素と融合される提示ポリペプチドは、提示されるＵＧＴ酵素の酵素機能への非干渉及び宿主細胞の種類との互換性を含むがこれらに限定されない、少なくともいくつかの因子のいずれか１以上に基づいて選択され得る。
【００６７】
様々な態様において、全細胞触媒は、細胞の表面に付着したＵＧＴ酵素を発現し、細胞内でスクロース合成酵素（ＳＵＳ）をさらに発現する、形質転換宿主細胞を含み得る。これらの様々な態様において、宿主細胞は、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ又はＵＧＴ）及びスクロース合成酵素（ＳＵＳ）を含むがこれらに限定されない少なくとも１種類の酵素をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つの発現カセットの組み込みにより形質転換される。加えて、ＵＧＴ酵素をコードするヌクレオチド配列は、提示ポリペプチドをコードする追加のヌクレオチドセグメントをさらに含み得、その結果、宿主細胞は、提示タンパク質と融合したＵＧＴ酵素を含む融合ポリペプチドを発現する。
【００６８】
宿主細胞
この態様において、形質転換宿主細胞は、各全細胞触媒により発現される少なくとも１種類の酵素をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの発現カセットによって形質転換された任意の適切な宿主細胞であり得る。全細胞触媒への軽質変換に適する宿主細胞の非限定的な例として、細菌、酵母、糸状菌、シアノバクテリア藻類、及び植物細胞が挙げられる。
【００６９】
一態様において、宿主細胞は、エシェリキア、サルモネラ、及びクレブシエラなどの腸内細菌；バチルス；アシネトバクター；パントエア；ストレプトミセス及びコリネバクテリウムなどの放線菌；メチロサイナス、メチロモナス、ロドコッカス及びシュードモナスなどのメタノトローフ；クロストリジウム・アセトブチリカムなどのクロストリジウム；並びにロドバクター及びシネコシスティスなどのシアノバクテリアを含むが、これらに限定されない細菌であり得る。別の態様において、宿主細胞は、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）種、カンジダ種、デバリオミセス種、ハンゼヌラ種、クルイベロミセス種、ムコール種、パキソレン種、ファフィア種、ピキア種、ロドスポリジウム種、サッカロマイセス種、サッカロミコプシス種、シュワニオミセス（Ｓｃｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）種、トリコスポロン種、トルロプシス種、ヤロウィア種、及びチゴサッカロマイセス種を含むが、これらに限定されない酵母であり得る。さらに別の態様において、宿主細胞は、アルクスラ・アデニニボランス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ボイジニイ、カンジダ・ファマータ、カンジダ・マルトーサ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・ユティリス、カンジダ・シェハタエ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クリベロマイセス・マルキシアヌス、クリベロマイセス・ラクチス、パキソレン・タンノフィラス、ファフィア・ロドチーマ、ピキア・ギリエルモンデイ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）、ピキア・メタノリカ、ピキア・パストリス、ロドスポリジウム・トルロデス、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・セレビシエの変異体のジアスタチクス、サッカロマイセス・ブラウディ、サッカロマイセス・ピリフォルミス、サッカロマイセス・バヤヌス、サッカロミコプシス・フィブリゲラ、シュワニオミセス・カステリ、シュワニオミセス・オクシデンタリス、トリコスポロン・クタネウム、ヤロウィア・リポリティカ、及びチゴサッカロミセス・ロウキシを含むが、これらに限定されない酵母であり得る。さらなる態様において、宿主細胞は、アスペルギルス及びアルトロボトリスを含むが、これらに限定されない糸状菌であり得る。別のさらなる態様において、宿主細胞は、スピルリナ、ヘマトコッカス、及びドナリエラを含むが、これらに限定されない藻類であり得る。
【００７０】
さらに別の態様において、宿主細胞は、単子葉植物又は双子葉植物由来であり、カルスなどの未分化組織、胚、単子葉植物、単子葉植物の一部若しくは種子などの分化した組織を構成できる任意の細胞を含むが、これらに限定されない植物細胞であり得る。「植物」という用語は、単子葉植物及び双子葉植物を含む、光合成のできる任意の分化した多細胞生物を意味すると理解される。いくつかの実施形態において、植物細胞は、シロイヌナズナ植物細胞、タバコ植物細胞、ダイズ植物細胞、ペチュニア植物細胞、又はキャノーラ植物細胞、ナタネ植物細胞、ヤシ植物細胞、ヒマワリ植物細胞、綿植物細胞、トウモロコシ植物細胞、ピーナッツ植物細胞、亜麻植物細胞、及びゴマ植物細胞を含むが、これらに限定されない別の油糧種子作物からの細胞であり得る。有用な植物宿主は、本技術の組み換えポリペプチド生成を支持する任意の植物を含み得る。宿主として使用するのに適切な緑色植物は、大豆、菜種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、小麦（コムギ種）、大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、カラスムギ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、シロイヌナズナ、アブラナ科野菜（ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、パースニップなど）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、グラスシード作物、テンサイ、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライ麦、アマ、広葉樹、針葉樹、及び飼料草を含むが、これらに限定されない。一態様において、宿主細胞は、シロイヌナズナ、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、オオムギ、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｇｒａｔｕｍ）、ヤマカモジグサ種、アブラナ種、及びクランベアビシニカを含むが、これらに限定されない植物由来の植物細胞であり得る。
【００７１】
様々な態様において、少なくとも１種類の酵素をコードする少なくとも１つのヌクレオシド配列を含む発現カセットは、大規模な商業的に有用な量のステビオールグリコシドを調製するためにこれらの及び他の宿主細胞中に組み込まれ得る。
【００７２】
酵素
様々な態様において、少なくとも１種類の酵素をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含有する少なくとも１つの発現カセットは、宿主細胞を全細胞触媒に形質転換するために宿主細胞中に組み込まれる。典型的には、少なくとも１つの発現カセットは、宿主細胞の種類との互換性について選択され、少なくとも１種類の酵素をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列中のコドンは、選択された宿主細胞型内の少なくとも１種類の酵素の発現を増強するために公知の方法を用いてコドン最適化に供され得る。発現カセットの設計は、形質転換すべき宿主細胞の選択、及び所望の酵素の発現レベルなどの要因に依存する。発現カセットは、宿主細胞中に導入され、それによって、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）及びスクロース合成酵素（ＳＵＳ）を含むが、これらに限定されない組み換えポリペプチド酵素を生成し得る。
【００７３】
一態様において、少なくとも１つの発現カセット中に組み込まれたヌクレオチド配列は、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み得る。ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）は、活性化ドナー分子（典型的にはＵＤＰグルコース）からアクセプター分子へ糖残基を転移する酵素を指す。様々な態様において、ＵＧＴ酵素は、１，２−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性、１，２−１３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性、１，３−１３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性、及び１，３−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化を含むが、これらに限定されないステビオールグリコシドの合成に関連する１以上の活性を有し得る。１，２−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性は、ルブソシド、ステビオシド、レバウジオシドＡ又はレバウジオシドＥを含むが、これらに限定されない基質の１９−Ｏ−グルコース部分のＣ−２’に糖部分を転移する酵素活性を指す（図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈ参照）。１，２−１３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性は、レバウジオシドＫＡとレバウジオシドＥを含むが、これらに限定されない基質の１３−Ｏ−グルコース部分のＣ−２’に糖部分を転移する酵素活性を指す（図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈ参照）。任意の既知のＵＧＴは、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＨＶ１、ＥＵＧＴ１１、及びそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない少なくとも１つの発現カセット中に組み込まれ得る。
【００７４】
ＵＧＴ７６Ｇ１は、それぞれ、ステビオシド及びレバウジオシドＥから関連レバウジオシドＡ並びにＤを生成する１，３−１３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を有するＵＧＴである。加えて、ＵＧＴ７６Ｇ１はまた、レバウジオシドＤからレバウジオシドＭを生成する１，３−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性も有する。ＵＧＴ７６Ｇ１は、レバウジオシドＫＡをＲｅｂ  Ｖに変換し引き続きＲｅｂ  Ｗを形成することもできる（図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈ参照）。一態様において、ＵＧＴ７６Ｇ１酵素は、配列番号９のアミノ酸配列を有する。
【００７５】
この一態様において、少なくとも１つの発現カセットは、配列番号１０に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むＵＧＴ７６Ｇ１酵素をコードするヌクレオチド配列を含み得る。適切には、ＵＧＴ７６Ｇ１酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。より適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＵＧＴ７６Ｇ１酵素をコードし得る。ＵＧＴ７６Ｇ１酵素をコードするヌクレオチド配列は、このように、配列番号９の機能的断片、配列番号９の機能的変異体、又は配列番号９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列同一性を有する他の相同ポリペプチドをコードするそれらのヌクレオチド配列を含む。当業者に知られているように、ＵＧＴ７６Ｇ１酵素をコードする核酸配列は、例えば、細菌又は酵母などの適切な宿主生物中での発現のためにコドン最適化され得る。
【００７６】
ＨＶ１は、それぞれ、ステビオシド、レバウジオシドＡ、及びレバウジオシドＥから関連するレバウジオシドＥ、Ｄ及びＺを生成する１，２−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を有するＵＧＴである。ＨＶ１はまた、ルブソシドからレバウジオシドＫＡを生成する１，２−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性も有する。ＨＶ１はまた、Ｒｅｂ  ＧをＲｅｂ  Ｖへ、及びＲｅｂ  ＫＡをＲｅｂ  Ｅに変換することができる（図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ及び９Ｈ参照）。ＨＶ１は、レバウジオシドＥからレバウジオシドＺ１を生成する１，２−１３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を有する。一態様において、ＨＶ１酵素は、配列番号７のアミノ酸配列を有する。
【００７７】
この一態様において、少なくとも１つの発現カセットは、配列番号８に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むＨＶ１酵素をコードするヌクレオチド配列を含み得る。適切には、ＨＶ１酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。より適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＨＶ１酵素をコードし得る。ＨＶ１酵素をコードするヌクレオチド配列は、このように、配列番号７の機能的断片、配列番号７の機能的変異体、又は配列番号７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列同一性を有する他の相同ポリペプチドをコードするそれらのヌクレオチド配列を含む。当業者に知られているように、ＨＶ１酵素をコードする核酸配列は、例えば、細菌又は酵母などの適切な宿主生物中での発現のためにコドン最適化され得る。
【００７８】
ＥＵＧＴ１１は、少なくとも１，２−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性及び１，２−１３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を有するＵＧＴである。ＥＵＧＴ１１は、レバウジオシドＥへのステビオシドのグリコシル化及びレバウジオシドＤへのレバウジオシドＡのグリコシル化を触媒し得る（図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ及び９Ｈ参照）。ＥＵＧＴ１１はまた、別の酵素活性、β１，６−１３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性によってレバウジオシドＥからレバウジオシドＤ２を合成するためにインビトロで使用され得る。ＥＵＧＴ１１はまた、ルブソシドからレバウジオシドＫＡを生成するための１，２−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性も有する。
【００７９】
様々な態様において、ＵＧＴは、本明細書で上述したように、提示ポリペプチドと融合され得、その結果ＵＧＴは形質転換宿主細胞の表面上に提示され得る。一態様において、少なくとも１つの発現カセットは、本明細書で前述したようにＵＧＴ酵素をコードする配列を含む第１のヌクレオチド部分及び提示ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド部分を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み得る。この一態様において、少なくとも１つのヌクレオチド配列は、提示ポリペプチドに結合されたＵＧＴ酵素を含む融合タンパク質を発現し得、その結果ＵＧＴ酵素は提示ポリペプチドを介して宿主細胞の細胞表面に付着される。
【００８０】
様々な態様において、提示ポリペプチドは、全細胞触媒を生成するために形質転換される宿主細胞の種類に適合するように選択され得る。一態様において、宿主細胞が細菌細胞である場合、ＵＧＴ酵素は、細菌外膜タンパク質又は線毛若しくは鞭毛タンパク質を含むが、これらに限定されない細菌細胞表面タンパク質と融合され得る。別の態様において、宿主細胞が酵母細胞である場合、ＵＧＴ酵素は、ＧＣＷ６１（配列番号５）などの酵母細胞壁タンパク質、アグルチニンなどの酵母接合接着タンパク質のサブユニット、又はビオチン結合ペプチドを含むが、これらに限定されない酵母細胞表面タンパク質と融合され得る。この他の態様において、ＵＧＴ酵素がアグルチニンなどの酵母接合接着タンパク質のサブユニットと融合される場合、酵母宿主細胞は、発現されるＵＧＴアグルチニン融合タンパク質が酵母細胞壁に付着される対応するサブユニットに結合するように、さらに形質転換されて酵母細胞壁に付着される酵母接合接着タンパク質の対応するサブユニットを発現し、細胞壁表面上にＵＧＴ酵素の提示をもたらし得る。この他の態様において、ＵＧＴ酵素がビオチン結合ペプチドと融合される場合、酵母細胞はさらに変更されて、酵母細胞表面上にビオチンを提示し分泌前に融合タンパク質をビオチン化し得る。酵母細胞は、酵母細胞壁内のビオチンに及びビオチン化融合タンパク質に結合する、アビジンと接触される。
【００８１】
一態様において、宿主細胞がピキア・パストリス酵母細胞である場合、ＵＧＴ酵素と融合される提示ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を有するピキア細胞壁タンパク質（ＧＣＷ６１）であり得る。
【００８２】
この一態様において、少なくとも１つの発現カセットは、配列番号６に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むピキア細胞壁タンパク質（ＧＣＷ６１）をコードするヌクレオチド配列を含み得る。適切には、ピキア細胞壁タンパク質（ＧＣＷ６１）をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。より適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するピキア細胞壁タンパク質（ＧＣＷ６１）をコードし得る。ピキア細胞壁タンパク質（ＧＣＷ６１）をコードするヌクレオチド配列は、このように、配列番号５の機能的断片、配列番号５の機能的変異体、又は例えば、配列番号５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列同一性を有する他の相同ポリペプチドをコードするそれらのヌクレオチド配列を含む。当業者に知られているように、ピキア細胞壁タンパク質（ＧＣＷ６１）をコードする核酸配列は、例えば、細菌又は酵母などの適切な宿主生物中での発現のためにコドン最適化され得る。
【００８３】
別の態様において、ピキア細胞壁タンパク質（ＧＣＷ６１）をコードするヌクレオチド配列は、ＵＧＴ酵素をコードするヌクレオチド配列のＣ末端にインフレームで挿入され得る。この他の態様において、該ＵＧＴ酵素をコードするヌクレオチド配列は、ＵＧＴ７６Ｇ１酵素をコードする配列番号１０、ＨＶ１酵素をコードする配列番号８を含むが、これらに限定されない本明細書に前述したヌクレオチド配列のいずれかを含み得る。この他の態様において、ＵＧＴ７６Ｇ１ヌクレオチド配列（配列番号１０）又はＨＶ１ヌクレオチド配列（配列番号８）のＣ末端にインフレームで挿入されたＧＣＷ６１配列（配列番号６）を含む融合ヌクレオチド配列は、それぞれ、融合タンパク質ＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１（配列番号３）又はＨＶ１−ＧＣＷ６１（配列番号１）の１つとして発現する。
【００８４】
この他の態様において、少なくとも１つの発現カセットは、配列番号４に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むＵＧＴ酵素−細胞壁ポリペプチド（ＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１）をコードするヌクレオチド配列を含み得る。適切には、ＵＧＴ酵素−細胞壁ポリペプチド（ＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１）をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。より適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する融合ＵＧＴ酵素−細胞壁ポリペプチド（ＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１）をコードし得る。融合ＵＧＴ酵素−細胞壁ポリペプチド（ＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１）をコードするヌクレオチド配列は、このように、配列番号３の機能的断片、配列番号３の機能的変異体、又は配列番号３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列同一性を有する他の相同ポリペプチドをコードするそれらのヌクレオチド配列を含む。当業者に知られているように、融合ＵＧＴ酵素−細胞壁ポリペプチド（ＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１）をコードする核酸配列は、例えば、細菌又は酵母などの適切な宿主生物中での発現のためにコドン最適化され得る。
【００８５】
この他の態様において、少なくとも１つの発現カセットは、配列番号２に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む融合ＵＧＴ酵素−細胞壁ポリペプチド（ＨＶ１−ＧＣＷ６１）をコードするヌクレオチド配列を含み得る。適切には、融合ＵＧＴ酵素−細胞壁ポリペプチド（ＨＶ１−ＧＣＷ６１）をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。より適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する融合ＵＧＴ酵素−細胞壁ポリペプチド（ＨＶ１−ＧＣＷ６１）をコードし得る。融合ＵＧＴ酵素−細胞壁ポリペプチド（ＨＶ１−ＧＣＷ６１）をコードするヌクレオチド配列は、このように、配列番号１の機能的断片、配列番号１の機能的変異体、又は配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列同一性を有する他の相同ポリペプチドをコードするそれらのヌクレオチド配列を含む。当業者に知られているように、融合ＵＧＴ酵素−細胞壁ポリペプチド（ＨＶ１−ＧＣＷ６１）をコードする核酸配列は、例えば、細菌又は酵母などの適切な宿主生物中での発現のためにコドン最適化され得る。
【００８６】
別の態様において、少なくとも１つの発現カセットに組み込まれたヌクレオチド配列は、スクロース合成酵素（ＳＵＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み得る。スクロース合成酵素（ＳＵＳ）は、スクロースの存在下でＵＤＰのＵＤＰ−グルコースへの変換を触媒する（図１０参照）。したがって、ＵＤＰ−グルコースを利用するグリコシル化反応（ＵＧＴによって触媒されるものなどの）のために、ＳＵＳを用いてＵＤＰからＵＤＰ−グルコースを再び作り、そのような反応の効率を高めることができる。
【００８７】
任意の適切なスクロース合成酵素をコードするヌクレオチド配列は、限定なしに、少なくとも１つの発現カセット中に組み込まれ得る。一般に、スクロース合成酵素は、系統名ＮＤＰ−グルコース：Ｄ−フルクトース２−α−Ｄ−グリコシルトランスフェラーゼを有するグリコシルトランスフェラーゼとして分類される。スクロース合成酵素を記載するために使用される他の名前の非限定的な例として、ＵＤＰグルコース−フルクトースグルコシルトランスフェラーゼ、スクロース合成酵素、スクロース−ＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ、スクロースウリジン二リン酸グルコシルトランスフェラーゼ、及びウリジンジホスホグルコース−フルクトースグルコシルトランスフェラーゼが挙げられる。
【００８８】
一態様において、適切なスクロース合成酵素は、シロイヌナズナ及びヤエナリのＳＵＳ遺伝子由来、又はシロイヌナズナ及びヤエナリＳＵＳ１配列がコードするスクロース合成酵素の機能的相同体をコードする任意の遺伝子由来のもの、又はその機能的相同体を含むが、これらに限定されない。適切なスクロース合成酵素の非限定的な例として、シロイヌナズナスクロース合成酵素１；シロイヌナズナスクロース合成酵素３、及びヤエナリスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）が挙げられる。一態様において、スクロース合成酵素は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するｍｂＳＵＳ１酵素であり得る。
【００８９】
この一態様において、少なくとも１つの発現カセットは、配列番号１２に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むｍｂＳＵＳ１酵素をコードするヌクレオチド配列を含み得る。適切には、ｍｂＳＵＳ１酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。より適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するｍｂＳＵＳ１酵素をコードし得る。ｍｂＳＵＳ１酵素をコードするヌクレオチド配列は、このように、配列番号１１の機能的断片、配列番号１１の機能的変異体、又は配列番号１１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％の配列同一性を有する他の相同ポリペプチドをコードするそれらのヌクレオチド配列を含む。当業者に知られているように、ｍｂＳＵＳ１酵素をコードする核酸配列は、例えば、細菌又は酵母などの適切な宿主生物中での発現のためにコドン最適化され得る。
【００９０】
発現カセット
様々な態様において、上記の少なくとも１種類の酵素をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列は、全細胞触媒として用いられる形質転換宿主細胞を生成するために宿主細胞中に導入される少なくとも１つの発現カセット中に組み込まれる。任意の発現カセット、発現プラスミド、発現ベクター、又は宿主細胞中に外来遺伝物質を導入する任意の他の公知の手段は、少なくとも全細胞触媒の発現カセットとしての使用のために選択され得る。一態様において、発現カセットは、宿主細胞の種類との互換性、発現の効率、使いやすさ、及び任意の他の関連要因を含むが、これらに限定されない少なくともいくつかの要因のいずれか１以上に基づいて選択され得る。
【００９１】
細菌細胞及び酵母細胞を含むが、これらに限定されない微生物宿主細胞について、外来タンパク質の高レベル発現を指示する調節配列を含有する微生物宿主細胞発現系及び発現ベクターは、当業者によく知られている。これらのいずれかを用いて、微生物宿主細胞内で本技術の組み換えポリペプチド発現用ベクターを構築することができる。次いで、これらのベクターは、本技術の組み換えポリペプチドの高レベル発現を可能にするために、形質転換を介して適切な微生物中に導入することができる。
【００９２】
適切な微生物宿主細胞の形質転換に有用なベクター又はカセットは、当技術分野においてよく知られている。典型的には、ベクター又はカセットは、関連ポリヌクレオチドの転写並びに翻訳を指示する配列、選択マーカー、及び自己複製若しくは染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始制御因子を有するポリヌクレオチドの５’領域及び転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含む。両方の制御領域について形質転換宿主細胞に相同な遺伝子に由来することが好ましいが、そのような制御領域が、宿主として選択される特定種に対し天然の遺伝子に由来する必要はないことを理解されたい。
【００９３】
所望の微生物宿主細胞における組み換えポリペプチドの発現を促進するのに有用である開始制御領域又はプロモーターは、多数あり、当業者に知られている。事実上、これらの遺伝子を駆動できる任意のプロモーターが本技術に適しており、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロマイセスでの発現に有用）；ＡＯＸ１（ピキアでの発現に有用）；及びｌａｃ、ｔｒｐ、ＩＰＬ、ＩＰＲ、ｔ７、ｔａｃ、及びｔｒｃ（大腸菌内での発現に有用）を含むが、これらに限定されない。
【００９４】
終結制御領域はまた、微生物宿主に対し天然の様々な遺伝子にも由来し得る。終結部位は、本明細書に記載の微生物宿主のために必要に応じて含まれ得る。
【００９５】
植物細胞において、本技術の発現ベクターは、所望の発達段階で所望の組織中で本技術の組み換えポリペプチドの発現を指示できるプロモーターに作動可能に連結されたコード領域を含んでもよい。便宜上の理由のために、発現されるポリヌクレオチドは、プロモーター配列及び同じポリヌクレオチドに由来する翻訳リーダー配列を含み得る。転写終結シグナルをコードする３’非コード配列も存在しなければならない。発現ベクターは、ポリヌクレオチドの発現を促進するために、１以上のイントロンも含み得る。
【００９６】
植物宿主細胞用に、コード領域の発現を誘導できる任意のプロモーターと任意のターミネーターの任意の組み合わせが、本技術のベクター配列で使用され得る。プロモーター及びターミネーターのいくつかの適切な例として、ノパリン合成酵素（ｎｏｓ）、オクトピン合成酵素（ｏｃｓ）及びカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子由来のものが挙げられる。使用され得る効率的な植物プロモーターの１つの種類は、高レベル植物プロモーターである。そのようなプロモーターは、本技術の発現ベクターと作動可能に連結して、ベクターの発現を促進できなければならない。本技術で使用され得る高レベル植物プロモーターは、例えば、大豆由来のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）のプロモーター（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐ．Ｇｅｎ．，１：４８３  ４９８（１９８２）、その全体は、本明細書に一致する程度まで本明細書に組み込まれる）、及びクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターを含む。これらの２つのプロモーターは、植物細胞において光誘導性であることが知られている（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，ａｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎ．Ｙ．（１９８３）、ページ２９  ３８；Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５８：１３９９（１９８３）、及びＤｕｎｓｍｕｉｒ，Ｐ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２：２８５（１９８３）を参照されたく、これらの各々は、本明細書と一致する程度まで参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９７】
プラスミドベクターの選択は、宿主植物を形質転換するために使用される方法に依存する。当業者は、キメラポリヌクレオチドを含有する宿主細胞をうまく形質転換し、選択し増殖するためにプラスミドベクター上に存在しなければならない遺伝的エレメントをよく知っている。当業者はまた、異なる独立した形質転換事象が発現の異なるレベル及びパターンをもたらし（Ｊｏｎｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１  ２４１８（１９８５）；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８  ８６（１９８９）、これらの各々は、本明細書と一致する程度まで参照により本明細書に組み込まれる）、したがって、所望の発現レベル及びパターンを示す株を取得するために複数の事象をスクリーニングしなければならないことを認識する。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウエスタン分析、又は表現型分析によって達成され得る。
【００９８】
植物細胞中への本技術の発現ベクターの導入は、アグロバクテリウム・リゾゲネスのＲｉプラスミド又はアグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミド中への目的の核酸配列の挿入、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、又は直接沈殿を含む、当業者に公知の様々な方法によって実行することができる。例を提供する目的で、いくつかの実施形態において、目的のポリヌクレオチドの一過的発現は、アグロインフィルトレーション法によって実行することができる。この点において、目的のポリヌクレオチドを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの懸濁液を、培養で増殖させ、次いで、穏やかな逆圧が葉の他方側に印加される一方で、葉の下面に対して注射器の先端を配置することにより植物中に注入できる。次いで、アグロバクテリウム溶液は、気孔を通して葉内部の空隙中に注入される。葉の内側に入ると、アグロバクテリウムは、植物細胞の一部に目的の遺伝子を導入し、次いで、そこで、遺伝子が一過的に発現される。
【００９９】
別の例として、植物細胞中への目的のプラスミドの形質転換は、粒子ガン衝撃法（すなわち、微粒子銃）によって実行できる。この点で、植物胚の懸濁液を、液体培養で増殖させ、次いで、金粒子に付着させたプラスミド又はポリヌクレオチドを照射し、目的のプラスミド又は核酸に結合した金粒子を、胚組織などの植物組織の膜を通して推進させることができる。照射に続き、形質転換した胚を適切な抗生物質を用いて次いで選択して、クローン増殖させた新しい形質転換胚形成懸濁培養物を作製できる。
【０１００】
宿主細胞は、変更されていない細胞若しくは細胞株、又は遺伝的に変更された細胞株であり得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、より低い温度でなどの、所望の条件下で成長できるように変更された細胞株である。
【０１０１】
標準的な組み換えＤＮＡ方法論を用いて、本明細書に記載の組み換えポリペプチドをコードする核酸を取得し、発現ベクター中に核酸を組み込み、及び宿主細胞中にこのベクターを導入でき、このような方法論はＳａｍｂｒｏｏｋら（編）、分子クローニング；実験室マニュアル、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、（２００１）；及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（編）、分子生物学の現在のプロトコル、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９５）に記載のものなどである。ポリペプチドをコードする核酸は、発現ベクター、又は核酸が転写及び翻訳制御配列（プロモーター配列、転写終結配列など）に作動可能に連結されるようなベクター中に挿入され得る。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞に適合するように一般的に選択される。
【０１０２】
本明細書に記載の宿主におけるポリペプチドの発現は、コドン最適化によってさらに改善され得る。例えば、あまり一般的でないコドンをより一般的なコドンで変更することは、ｍＲＮＡの半減期に影響するか、メッセージの翻訳を妨害する二次構造を導入することによりその構造を変え得る。コード領域の全部又は一部は、最適化され得る。場合によって、発現の所望の調節は、本質的に全遺伝子を最適化することによって達成される。他の場合では、所望の調節は、遺伝子の配列の全部ではないが、一部を最適化することによって達成される。
【０１０３】
任意のコード配列のコドン使用は、所望の特性、例えば、特定の細胞型における高レベル発現を達成するように調整できる。そのような最適化のための開始点は、１００％共通コドンを有するコード配列、又は共通コドンと非共通コドンの混合物を含有するコード配列であり得る。
【０１０４】
それらのコドン使用が異なる２以上の候補配列を、それらが所望の特性を有するかどうかを決定するために作製し試験することができる。候補配列はコンピュータを用いることにより評価して、サイレンサー又はエンハンサーなどの調節エレメントの存在を検索し、及びコドン使用の変更によってそのような調節エレメントに変換できる可能性のあるコード配列の領域の存在を検索できる。追加の基準は、特定のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵの濃縮、特定のアミノ酸のコドンバイアス、又は特定のｍＲＮＡの二次若しくは三次構造の有無を含み得る。候補配列への調整は、このような基準のいくつかに基づいて行うことができる。
【０１０５】
特定の実施形態において、コドン最適化された核酸配列は、コドン最適化されていない核酸配列が発現したレベルの約１１０％、約１５０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、又は約５００％であるレベルで、そのタンパク質を発現することができる。
【０１０６】
本技術の組み換えポリペプチドをコードする核酸に加えて、本技術の発現ベクターは、核酸（複数可）の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー又は他の発現制御エレメントなどの、宿主細胞におけるタンパク質の発現を制御する調節配列をさらに保有し得る。このような調節配列は、当技術分野で公知である。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存し得ることは、当業者には理解される。加えて、本技術の組み換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択マーカー遺伝子などの、追加配列を保有し得る。
【０１０７】
様々な態様において、少なくとも１つの発現カセットは、本明細書で上述したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ又はＵＧＴ）及びスクロース合成酵素（ＳＵＳ）を含むが、これらに限定されない少なくとも１種類の酵素をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み得る。一態様において、少なくとも１つの発現カセットは、少なくとも１つのＵＧＴ配列を含む第１の発現カセット及び少なくとも１つのＳＵＳ配列を含む第２の発現カセットを含み得る。別の態様において、少なくとも１つの発現カセットは、少なくとも１つのＵＧＴ配列及び少なくとも１つのＵＳＵ配列の両方を含む１つの発現カセットを含み得る。
【０１０８】
様々な他の態様において、ＵＧＴ及び／又はＳＵＳ配列の発現の程度は、ＵＧＴ配列の複数のコピー及び／又はＳＵＳ配列の複数のコピーを組み込むことによって調節され得る。一態様において、宿主細胞を形質転換するために使用される少なくとも１つの発現カセットは、複数コピーのＵＧＴ配列及び／又は複数コピーのＳＵＳ配列を含む単一の発現カセットを含み得る。別の態様において、少なくとも１つの発現カセットは、単一コピーのＵＧＴ配列を含む複数コピーの第１のカセット及び単一コピーのＳＵＳ配列を含む複数コピーの第２のカセットを含み得る。
【０１０９】
一態様において、少なくとも１つの発現カセットは、ＵＧＴ７６Ｇ１酵素（配列番号９）をコードする１コピーのＵＧＴ７６Ｇ１ヌクレオチド配列（配列番号１０）を含み得る。他の態様において、少なくとも１つの発現カセットは、２コピーのＵＧＴ７６Ｇ１ヌクレオチド配列、３コピーのＵＧＴ７６Ｇ１ヌクレオチド配列、４コピーのＵＧＴ７６Ｇ１ヌクレオチド配列、５コピーのＵＧＴ７６Ｇ１ヌクレオチド配列、６コピーのＵＧＴ７６Ｇ１ヌクレオチド配列、７コピーのＵＧＴ７６Ｇ１ヌクレオチド配列、８コピーのＵＧＴ７６Ｇ１ヌクレオチド配列、９コピーのＵＧＴ７６Ｇ１ヌクレオチド配列、又は１０コピーのＵＧＴ７６Ｇ１ヌクレオチド配列を含み得る。
【０１１０】
一態様において、少なくとも１つの発現カセットは、ＨＶ１酵素（配列番号７）をコードする１コピーのＨＶ１ヌクレオチド配列（配列番号８）を含み得る。他の態様において、少なくとも１つの発現カセットは、２コピーのＨＶ１ヌクレオチド配列、３コピーのＨＶ１ヌクレオチド配列、４コピーのＨＶ１ヌクレオチド配列、５コピーのＨＶ１ヌクレオチド配列、６コピーのＨＶ１ヌクレオチド配列、７コピーのＨＶ１ヌクレオチド配列、８コピーのＨＶ１ヌクレオチド配列、９コピーのＨＶ１ヌクレオチド配列を、又は１０コピーのＨＶ１ヌクレオチド配列を含み得る。
【０１１１】
一態様において、少なくとも１つの発現カセットは、ＧＣＷ６１細胞壁タンパク質（配列番号３）と融合されるＵＧＴ７６Ｇ１酵素をコードする１コピーのＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列（配列番号４）を含み得る。他の態様において、少なくとも１つの発現カセットは、２コピーのＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列、３コピーのＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列、４コピーのＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列、５コピーのＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列、６コピーのＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列、７コピーのＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列、８コピーのＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列、９コピーのＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列を、又は１０コピーのＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列を含み得る。
【０１１２】
一態様において、少なくとも１つの発現カセットは、ＨＶ１−ＧＣＷ６１酵素（配列番号１）をコードする１コピーのＨＶ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列（配列番号２）を含み得る。他の態様において、少なくとも１つの発現カセットは、２コピーのＨＶ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列、３コピーのＨＶ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列、４コピーのＨＶ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列、５コピーのＨＶ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列、６コピーのＨＶ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列、７コピーのＨＶ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列、８コピーのＨＶ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列、９コピーのＨＶ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列、又は１０コピーのＨＶ１−ＧＣＷ６１ヌクレオチド配列を含み得る。
【０１１３】
一態様において、少なくとも１つの発現カセットは、ｍｂＳＵＳ１酵素（配列番号１１）をコードする１コピーのｍｂＳＵＳ１ヌクレオチド配列（配列番号１２）を含み得る。他の態様において、少なくとも１つの発現カセットは、２コピーのｍｂＳＵＳ１ヌクレオチド配列、３コピーのｍｂＳＵＳ１ヌクレオチド配列、４コピーのｍｂＳＵＳ１ヌクレオチド配列、５コピーのｍｂＳＵＳ１ヌクレオチド配列、６コピーのｍｂＳＵＳ１ヌクレオチド配列、７コピーのｍｂＳＵＳ１ヌクレオチド配列、８コピーのｍｂＳＵＳ１ヌクレオチド配列、９コピーのｍｂＳＵＳ１ヌクレオチド配列、又は１０コピーのｍｂＳＵＳ１ヌクレオチド配列を含み得る。
【０１１４】
一態様において、発現カセットは、本明細書で上述したＵＧＴ７６Ｇ１、ＨＶ１、又はＥＵＧＴ１１から選択されるＵＧＴ酵素をコードする単一ＵＧＴ配列をコードするヌクレオチド配列の１以上のコピーを含み得る。別の態様において、発現カセットは、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＨＶ１、ＥＵＧＴ１１、及びそれらの任意の組み合わせから選択される２種以上のＵＧＴ酵素の１以上のコピーを含み得る。この他の態様において、形質転換宿主細胞は、必要に応じて２種以上のＵＧＴ酵素を発現し得る。
【０１１５】
一態様において、発現ベクターは、本明細書で上述したＵＧＴ７６Ｇ１、ＨＶ１、若しくはＥＵＧＴ１１から選択されるＵＧＴ酵素をコードする単一ＵＧＴ配列、又はｍｂＳＵＳ１酵素をコードする単一ｍｂＳＵＳ１配列をコードする１コピーのヌクレオチド配列を含有する複数の発現カセットを含有し得る。形質転換後に、複数の発現カセットは、形質転換宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得る。
【０１１６】
ステビオールグリコシドを生成する方法
様々な態様において、本明細書に上述した全細胞触媒を用いて、本明細書に開示される方法に従って、基質から所望のステビオールグリコシド化合物を生成することができる。図１１は、一態様において、全細胞触媒を用いるステビオールグリコシド化合物の生成方法を説明するブロック図である。図１１に示すように、本方法は、工程１１０２で、形質転換宿主細胞内で少なくとも１つのＵＧＴ酵素（ＵＧＴ７６Ｇ１、ＨＶ１、及び／又はＥＵＧＴ１１）及びＳＵＳ酵素（ｍｂＳＵＳ１）をコードするヌクレオチド配列の発現を誘導することを含む。ＵＧＴ及びＳＵＳ配列の発現は、細胞表面上に提示される複数のＵＧＴ酵素及び全細胞触媒中のある量の細胞内ＳＵＳ酵素によって特徴付けられる全細胞触媒をもたらす。
【０１１７】
再び、図１１に示すように、本方法は、工程１１０４で、ステビオールグリコシド基質、ＵＤＰ又はＵＤＰ−グルコース、及びある量のスクロースを含む培地中で全細胞触媒を培養することをさらに含む。本明細書で前述したように、ＵＧＴ酵素は、基質のグリコシル化を触媒して所望のステビオールグリコシド化合物を生成する。時間が経つにつれて、培地中に含まれる基質は所望のステビオールグリコシド化合物に変換され、これもまた培地中に含有される。
【０１１８】
図１０は、本方法に従って、培地中の全細胞触媒によって触媒され得る例示的な反応を示す。反応１において、培地中の基質（Ｒｅｂ  Ａ）は、ドナー化合物としてＵＤＰ−グルコースを用いてＵＧＴ酵素により触媒されるように、グリコシル化されてＲｅｂ  Ｄを生成し得る。反応２において、反応１のＵＤＰ副生成物は、培地中のスクロースと組み合わされて、反応１に従うＲｅｂ  Ｄの追加生成での使用のための追加のＵＤＰ−グルコースを再び作る。
【０１１９】
再び、図１１に示すように、所望のステビオールグリコシド化合物を生成するのに十分な培地中での滞留時間後に、所望のステビオールグリコシド化合物の少なくとも一部は、工程１１０６で全細胞触媒を含有する細胞培養から分離され得る。水溶液からタンパク質を分離する任意の公知の方法が、制限なく使用され得る。非限定的な一例では、所望のステビオールグリコシド化合物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法を用いて細胞培養物から分離され得る。
【０１２０】
工程１１０２で誘導される形質転換宿主細胞は、本明細書で上述した材料及び方法のいずれかを用いて生成される形質転換宿主細胞のいずれかであり得る。形質転換宿主細胞を誘導する方法は、宿主細胞の種類、宿主細胞中に組み込まれる少なくとも１つの発現カセット中に含まれるプロモーター又は複数のプロモーター、及び任意の他の関連因子を含むが、これらに限定されない少なくともいくつかの因子のいずれか１以上に依存して変化し得る。非限定的な例として、形質転換宿主細胞が形質転換ピキア・パストリス株でありその中に導入された発現カセットがＡＯＸ１プロモーターを含んだ場合、それは、公知の方法に従って、ＡＯＸ１プロモーターを介して発現を誘導するのに十分な量のメタノールによって誘導され得る。形質転換宿主細胞は、十分な量の少なくとも１つのＵＧＴ酵素及びＳＵＳ酵素が生成されることを確実にするために、制限なく、任意の適切な期間、誘導され得る。様々な態様において、形質転換宿主細胞は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４２時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、又は少なくとも７２時間、ＵＧＴ及びＳＵＳ酵素を発現するために誘導され得る。
【０１２１】
一態様において、工程１１０２から得られた全細胞触媒は、グリコシル化される基質を含有する培地中に移されて、本明細書で上述した反応に従って、所望のステビオールグリコシド化合物を生成し得る。一態様において、全細胞触媒は、培地を含有するインビトロ反応系に導入され得る。任意の既知のインビトロの反応系及び培地が、制限なく、本明細書に記載の方法で使用され得る。一態様において、インビトロの反応系及び培地は、宿主細胞の種類、所望のステビオールグリコシド化合物の生成規模、全細胞触媒によって触媒される特定のグリコシル化反応、及び任意の他の関連因子を含むが、これらに限定されない少なくともいくつかの因子のいずれか１以上に基づいて選択され得る。非限定的な例として、全細胞触媒が、本明細書で上述した形質転換ピキア細胞である場合、形質転換されたピキア細胞は、振盪インキュベーター又は発酵槽中で、基質を含有する培地中に懸濁され得る。
【０１２２】
任意の公知の培地を用いて、制限なく、基質と共に全細胞触媒を培養することができる。様々な態様において、培地の組成は、宿主細胞の種類、全細胞触媒によって触媒される特定のグリコシル化反応、及び任意の他の関連因子を含むが、これらに限定されない少なくともいくつかの因子のいずれか１以上に依存して変化し得る。一態様において、培地は、基質、スクロース、ＵＤＰ−グルコース、及びＵＤＰを含み得る。別の態様において、培地は、全細胞触媒の生存能力を維持するか、そうでなければ、所望のステビオールグリコシド化合物の生成を容易にするための追加の化合物を含み得る。適切な追加の化合物の非限定的な例として、リン酸カリウム緩衝液、酸又は塩基などのｐＨ調整化合物、ＭｇＣｌ２、及び任意の他の適切な追加の化合物が挙げられる。
【０１２３】
全細胞触媒は、十分な量の所望のステビオールグリコシド化合物が生成されることを確実にするために、制限なく、任意の適切な期間、基質を含有する培地とインキュベートされ得る。様々な態様において、全細胞触媒は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４２時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、又は少なくとも７２時間、培地中でインキュベートされ得る。
【０１２４】
本方法の工程１１０４で培地中に含まれる基質は、ＵＧＴ酵素の種類及び生成される特定のステビオールグリコシド化合物に応じて選択され得る。一態様において、基質は、ルブソシド、レバウジオシドＫＡ、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、及びレバウジオシドＥの任意の１以上から選択され得る。図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈに示すように、これらの基質は、模式的に示された反応のいずれか１以上に従ってグリコシル化されてレバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、及びレバウジオシドＭを含むが、これらに限定されない所望のステビオールグリコシド化合物を生成し得る。開示された方法で使用され得る基質及び全細胞触媒の特定の組み合わせは、本明細書の以下に、より詳細に記載される。
【０１２５】
ステビオシドからレバウジオシドＡを生成する方法
開示した方法を用いて、ステビオシド基質からレバウジオシドＡを合成できる。本方法は、レバウジオシドＡを生成するのに十分な時間、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する誘導細胞をステビオシド基質と培養することを含み、ここでグルコースは図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応１に従ってステビオシドに共有結合されてレバウジオシドＡを生成する。一態様において、全細胞触媒はピキア・パストリスの誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２株であり得、培地はリン酸カリウム緩衝液、ＭｇＣｌ２、スクロース、ＵＤＰ又はＵＤＰグルコース、及びそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【０１２６】
レバウジオシドＤからレバウジオシドＭを生成する方法
開示した方法を用いて、レバウジオシドＤからレバウジオシドＭを合成できる。本方法は、レバウジオシドＭを生成するのに十分な時間、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する誘導細胞をレバウジオシドＤ基質と培養することを含み、ここでグルコースは図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応３に従ってレバウジオシドＤに共有結合されてレバウジオシドＭを生成する。一態様において、全細胞触媒はピキア・パストリスの誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２株であり得、培地はリン酸カリウム緩衝液、ＭｇＣｌ２、スクロース、ＵＤＰ又はＵＤＰグルコース、及びそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【０１２７】
レバウジオシドＥからレバウジオシドＤを生成する方法
開示した方法を用いて、レバウジオシドＥからレバウジオシドＤを合成できる。本方法は、レバウジオシドＤを生成するのに十分な時間、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する誘導細胞をレバウジオシドＥ基質と培養することを含み、ここでグルコースは図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応２に従ってレバウジオシドＥに共有結合されてレバウジオシドＤを生成する。一態様において、全細胞触媒はピキア・パストリスのＧ／Ｋ４Ｓ２株であり得、培地はリン酸カリウム緩衝液、ＭｇＣｌ２、スクロース、ＵＤＰ又はＵＤＰグルコース、及びそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【０１２８】
レバウジオシドＡからレバウジオシドＤを生成する方法
開示した方法を用いて、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤを合成できる。本方法は、レバウジオシドＤを生成するのに十分な時間、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＨＶ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する誘導細胞をレバウジオシドＡ基質と培養することを含み、ここでグルコースは図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応４に従ってレバウジオシドＡに共有結合されてレバウジオシドＤを生成する。一態様において、全細胞触媒はピキア・パストリスのＧ／Ｈ５Ｓ２株であり得、培地はリン酸カリウム緩衝液、ＭｇＣｌ２、スクロース、ＵＤＰ又はＵＤＰグルコース、及びそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【０１２９】
ステビオシドからレバウジオシドＥを生成する方法
開示した方法を用いて、ステビオシド基質からレバウジオシドＥを合成できる。本方法は、レバウジオシドＥを生成するのに十分な時間、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＨＶ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する誘導細胞をステビオシド基質と培養することを含み、ここでグルコースは図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応５に従ってステビオシドに共有結合されてレバウジオシドＥを生成する。一態様において、全細胞触媒はピキア・パストリスのＧ／Ｈ５Ｓ２株であり得、培地はリン酸カリウム緩衝液、ＭｇＣｌ２、スクロース、ＵＤＰ又はＵＤＰグルコース、及びそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【０１３０】
ステビオシド及び／又はレバウジオシドＡからレバウジオシドＭを生成する方法
開示した方法を用いて、ステビオシド及び／又はレバウジオシドＡ基質からレバウジオシドＭを合成できる。本方法は、レバウジオシドＭを生成するのに十分な時間、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する第１の誘導細胞；並びにある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＨＶ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する第２の誘導細胞を含む誘導細胞をステビオシド及び／又はレバウジオシドＡ基質（複数可）と培養することを含み、ここでグルコースは図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応５、２及び３並びに／又は反応１、４、及び３に従って、ステビオシド及び／又はレバウジオシドＡに共有結合されてレバウジオシドＭを生成する。一態様において、第１の誘導細胞はピキア・パストリスのＧ／Ｋ４Ｓ２株であり得、第２の誘導細胞はピキア・パストリスのＧ／Ｈ５Ｓ２株であり得、培地はリン酸カリウム緩衝液、ＭｇＣｌ２、スクロース、ＵＤＰ又はＵＤＰグルコース、及びそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【０１３１】
レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＥを生成する方法
開示した方法を用いて、レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＥを合成できる。本方法は、レバウジオシドＥを生成するのに十分な時間、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＨＶ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する誘導細胞をレバウジオシドＫＡ基質と培養することを含み、ここでグルコースは図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応６に従ってレバウジオシドＫＡに共有結合されてレバウジオシドＥを生成する。一態様において、全細胞触媒はピキア・パストリスのＧ／Ｈ５Ｓ２株であり得、培地はリン酸カリウム緩衝液、ＭｇＣｌ２、スクロース、ＵＤＰ又はＵＤＰグルコース、及びそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【０１３２】
ルブソシドからレバウジオシドＫＡ及びレバウジオシドＥを生成する方法
開示した方法を用いて、ルブソシド基質からレバウジオシドＫＡ及びレバウジオシドＥを合成できる。本方法は、レバウジオシドＫＡを生成するのに十分な時間、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＨＶ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する誘導細胞をルブソシド基質と培養することを含み、ここでグルコースは図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応７に従ってルブソシドに共有結合されてレバウジオシドＫＡを生成する。さらに、グルコースは図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応６に従ってレバウジオシドＫＡに共有結合されてレバウジオシドＥを生成する。一態様において、全細胞触媒はピキア・パストリスのＧ／Ｈ５Ｓ２株であり得、培地はリン酸カリウム緩衝液、ＭｇＣｌ２、スクロース、ＵＤＰ又はＵＤＰグルコース、及びそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【０１３３】
一態様において、所望のステビオールグリコシド化合物を生成するために実施される反応は、インビトロ反応器中に別々の量の全細胞触媒を導入し、所望のステビオールグリコシド化合物を含有するインビトロ反応器から別々の量の培養物を除去することと本明細書で定義される、バッチ法で実行され得る。この態様において、所望のステビオールグリコシド化合物の少なくとも１つの別々のバッチが生成されるか、又はこのバッチ法を培地の複数回交換によって繰り返して所望のステビオールグリコシド化合物の複数の別々のバッチを生成し得る。別の態様において、所望のステビオールグリコシド化合物を生成するために実施される反応は、インビトロ反応器内で全細胞触媒のコロニーを維持し、かつ所望のステビオールグリコシド化合物を含有するある量の培地を連続除去しながら基質を含有するある量の培地を連続導入することと本明細書で定義される、連続供給方法で実行できる。両方の態様において、バッチ又は連続供給生物生成方法の任意の公知の方法が、制限されることなく使用され得る。
【０１３４】
様々な態様において、ステビオシド及び／又はレバウジオシドＡ基質からのレバウジオシドＭの生成などの、複数のグリコシル化反応を含むそれらの生成方法について、全ての反応は、本明細書で上述したように、同じインビトロ反応器内で実施され得る。別の態様において、複数のグリコシル化反応のそれぞれは、少なくとも２つの相互接続されたインビトロ反応器の一方で実施され得、ここで中間生成物を含有する細胞培養物が第１の反応器から第２反応器に移され得る。
【０１３５】
非限定的な例として、開示した方法を用いて、図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応１、４、及び３に従って、３つの別々のインビトロ反応器内でステビオシド及び／又はレバウジオシドＡ基質からレバウジオシドＭを合成できる。第１の反応器は、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する全細胞触媒を含有し得る。第２の反応器は、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＨＶ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する全細胞触媒を含有し得る。第３の反応器は、レバウジオシドＭを生成するのに十分な時間、ステビオシド及び／又はレバウジオシドＡ基質を含む培地と共に、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する全細胞触媒を含有し得、ここでグルコースは図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応１、４、及び３に従ってステビオシド及び／又はレバウジオシドＡに共有結合されてレバウジオシドＭを生成する。第１の反応器は、図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応１を実施して、ステビオシド基質からレバウジオシドＡを生成できる。第２の反応器は、図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応４を実施して、第１の反応器から移されたレバウジオシドＡからレバウジオシドＤを生成できる。第３の反応器は、図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応３を実施して、第２の反応器から移されたレバウジオシドＤからレバウジオシドＭを生成できる。
【０１３６】
非限定的な例として、開示した方法を用いて、図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応５、２、及び３に従って、３つの別々のインビトロ反応器内でステビオシド及び／又はレバウジオシドＡ基質からレバウジオシドＭを合成できる。第１反応器は、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＨＶ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する全細胞触媒を含有し得る。第２の反応器は、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する全細胞触媒を含有し得る。第３の反応器は、レバウジオシドＭを生成するのに十分な時間、ステビオシド及び／又はレバウジオシドＡ基質を含む培地と共に、ある量のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）及びある量のスクロース合成酵素（ｍｂＳＵＳ１）を発現する全細胞触媒を含有し得、ここでグルコースは図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応５、２、及び３に従ってステビオシドに共有結合されてレバウジオシドＭを生成する。第１の反応器は、図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応５を実施して、ステビオシド基質からレバウジオシドＥを生成できる。第２の反応器は、図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応２を実施して、第１の反応器から移されたレバウジオシドＥからレバウジオシドＤを生成できる。第３の反応器は、図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応３を実施して、第２の反応器から移されたレバウジオシドＤからレバウジオシドＭを生成できる。
【０１３７】
この非限定的な例において、各反応器は、各反応器の生成物の生成を高めるように個々に調整される反応条件を提供し得る。個々に調整され得る反応条件の非限定的な例として、ｐＨ、温度、攪拌、培地の組成、全細胞触媒の密度、及び他の関連する反応条件が挙げられる。加えて、各全細胞触媒の構成は、各反応器の生成物の生成を高めるために個々に調製され得る。各全細胞触媒の構成を調節する方法の非限定的な例として、誘導時間の調節、形質転換宿主細胞の少なくとも１つの発現カセットにおけるＵＧＴ及び／又はＳＵＳ配列のコピー数の変更、宿主細胞の種類の変更、及び任意の他の適切な方法が挙げられる。
【０１３８】
本開示は、以下の非限定的な実施例を考慮することによってより完全に理解されるであろう。
【０１３９】
実施例
以下の実施例は、本開示の様々な態様を実証する。
【０１４０】
実施例１：改変された全細胞触媒株を生成するためのピキア・パストリスの形質転換
全細胞触媒として使用するのに適するいくつかの改変されたピキア株を生成するためのピキア・パストリス細胞の形質転換を実証するために、以下の実験を実施した。
【０１４１】
候補ＵＧＴ遺伝子の全長ＤＮＡ断片を、ピキア・パストリス細胞の形質転換に使用するために合成した。具体的には、ｃＤＮＡをピキア・パストリス発現（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）のためにコドン最適化して、２つのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ配列ＨＶ１（配列番号８）及びＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号１０）を生成した。ＦＬＡＧタグを、α因子シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とＨＶ１（配列番号８）又はＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号１０）をコードするヌクレオチド配列との間にインフレームで挿入した。加えて、ピキア細胞壁タンパク質をコードする遺伝子（ＧＣＷ６１、配列番号６）を、ＨＶ１又はＵＧＴ７６Ｇ１配列のＣ末端にインフレームで挿入し、２つの融合遺伝子：α因子シグナルペプチド−Ｆｌａｇ−ＨＶ１−ＧＣＷ６１及びα因子シグナルペプチド−Ｆｌａｇ−ＵＧＴ７６Ｇ１−ＧＣＷ６１を生成した。合成した融合遺伝子を、変更されたピキア発現ベクター（ｐＰＩＣＺα  Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であるｐＨＫＡベクター中にクローニングした。加えて、コドン最適化したスクロース合成酵素のｃＤＮＡ（ｍｂＳＵＳ１、配列番号１２）をピキア発現ベクターｐＰＩＣＺα  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。このベクターにおいて、各発現カセットは、ＡＯＸ１プロモーター、遺伝子及びＡＯＸ１転写ターミネーターを含有する。
【０１４２】
複数コピーの発現カセットを作製するために、上記の構築物をＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化した。発現カセットを回収し、ＢａｍＨＩ消化プラスミド中に挿入した。消化分析後に、５コピーのＨＶ１発現カセットを有するプラスミド、４コピーのＵＧＴ７６Ｇ１発現カセットを有するプラスミド、及び２コピーのｍｂＳＵＳ発現カセットを有するプラスミドを特定した。
【０１４３】
直鎖状の発現プラスミドを公知の方法を用いてピキア・パストリス（ＧＳ１１５）細胞中に形質転換し、発現カセットをピキアゲノム中に組み込んだ。スクリーニング後に、表２にまとめたように、陽性株を特定した。
【０１４４】
【表２】
0006793957.tif 000007
【０１４５】
実施例２：改変されたピキア・パストリス株Ｇ／Ｋ４Ｓ２を用いてレバウジオシドＡを生成するためのステビオシドのグリコシル化
ステビオシド基質を用いる誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞によるレバウジオシドＡの酵素的生成を実証するために、以下の実験を実施した。ピキア・パストリス株Ｇ／Ｋ４Ｓ２の単一コロニーをバッフル付きフラスコ中のＢＭＧＹ培地中に接種し、培養物が２〜６のＯＤ６００（対数期増殖）に達するまで、振盪インキュベーター（２５０〜３００ｒｐｍ）で２８〜３０℃で増殖させた。Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞を遠心分離により収集し、ＢＭＭＹ培地中で１．０のＯＤ６００に再懸濁して、発現を誘導した。発現の誘導を維持するため２４時間毎に１００％メタノールを、１％メタノールの最終濃度に、ＢＭＭＹ培地に添加した。誘導後７２時間の時点で、Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞を遠心分離により収集し、以下に記載するようにグリコシル化活性分析に供した。
【０１４６】
Ｇ／Ｋ４Ｓ２誘導細胞を、基質としてステビオシドを用いるグリコシル化活性についてアッセイした。誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞（６０  ＯＤ）を、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、３ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍｇ／ｍｌのステビオシド（９５％のステビオシドを含有するステビア抽出物、Ｂｌｕｅ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カリフォルニア州）、１ｍＭのＵＤＰ又はＵＤＰ−グルコース（ＵＤＰＧ）、及び２５０ｍＭのスクロースを含有する２００μｌのインビトロ反応系で試験した。誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞を、２４時間２８〜３０℃で反応系中に維持し、その後、１−ブタノールを添加することによって反応を終了させた。この反応系からの試料を、２００μＬの１−ブタノールで３回抽出した。試料のプールした抽出画分を、乾燥させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析のために８０％メタノール中に溶解した。
【０１４７】
ＨＰＬＣ分析を、四級ポンプ、温度制御カラムコンパートメント、オートサンプラー及びＵＶ吸光度検出器を含むＵＰＬＣ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００システム（Ｄｉｏｎｅｘ、カリフォルニア州サニーベール）を用いて実行した。ガードカラムを有するＳｙｎｅｒｇｉ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を、プールした試料中のステビオールグリコシドの特徴付けのために用いた。水中のアセトニトリルを、ＨＰＬＣ分析でのイソクラティック溶出のために用いた。ＨＰＬＣ分析で使用した検出波長は、２１０ｎｍであった。
【０１４８】
図２Ｃは、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞の導入後２４時間の時点でインビトロ反応系から採取した、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞によって酵素的に生成されたレバウジオシドＡのＨＰＬＣ検出をまとめたグラフである。
【０１４９】
この実験の結果は、レバウジオシドＡを生成するための誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞によるステビオシドの酵素的グリコシル化を実証した。
【０１５０】
実施例３：改変されたピキア・パストリス株Ｇ／Ｋ４Ｓ２を用いてレバウジオシドＭを生成するためのレバウジオシドＤのグリコシル化
レバウジオシドＤ基質を用いる誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞によるレバウジオシドＭの酵素的生成を実証するために、以下の実験を実施した。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、ピキア・パストリス株Ｇ／Ｋ４Ｓ２の培養物中で発現を７２時間誘導し、誘導細胞を収集した。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞をレバウジオシドＤ基質のグリコシル化についてアッセイした。誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞（６０  ＯＤ）を、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍｇ／ｍｌのレバウジオシドＤ（純度９８％、Ｂｌｕｅ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カリフォルニア州）、１ｍＭのＵＤＰ又はＵＤＰＧ、及び２５０ｍＭのスクロースを含有する２００μｌのインビトロ反応系中に導入した。誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞を、２４時間２８〜３０℃で反応系中に維持し、その後、１−ブタノールを添加することによって反応を終了させた。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、この反応系から試料を抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供した。
【０１５１】
図３Ｃは、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞の導入後２４時間の時点でインビトロ反応系から採取した、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞によって酵素的に生成されたレバウジオシドＭのＨＰＬＣ検出をまとめたグラフである。
【０１５２】
この実験の結果は、レバウジオシドＭを生成するための誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞によるレバウジオシドＤの酵素的グリコシル化を実証した。
【０１５３】
実施例４：改変されたピキア・パストリス株Ｇ／Ｋ４Ｓ２を用いてレバウジオシドＤを生成するためのレバウジオシドＥのグリコシル化
レバウジオシドＥ基質を用いる誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞によるレバウジオシドＤの酵素的生成を実証するために、以下の実験を実施した。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、ピキア・パストリス株Ｇ／Ｋ４Ｓ２の培養物中で発現を７２時間誘導し、誘導細胞を収集した。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞をレバウジオシドＥ基質のグリコシル化についてアッセイした。誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞（６０  ＯＤ）を、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、３ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍｇ／ｍｌのレバウジオシドＥ（９５％、Ｂｌｕｅ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カリフォルニア州）、１ｍＭのＵＤＰ又はＵＤＰＧ、及び２５０ｍＭのスクロースを含有する２００μｌのインビトロ反応系で試験した。誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞を、２４時間２８〜３０℃で反応系中に維持し、その後、１−ブタノールを添加することによって反応を終了させた。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、この反応系から試料を抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供した。
【０１５４】
図４Ｃは、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞の導入後２４時間の時点でインビトロ反応系から採取した、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞によって酵素的に生成されたレバウジオシドＤのＨＰＬＣ検出をまとめたグラフである。
【０１５５】
この実験の結果は、レバウジオシドＤを生成するためのＧ／Ｋ４Ｓ２細胞によるレバウジオシドＥの酵素的グリコシル化を実証した。
【０１５６】
実施例５：改変されたピキア・パストリス株Ｇ／Ｈ５Ｓ２を用いてレバウジオシドＤを生成するためのレバウジオシドＡのグリコシル化
レバウジオシドＡ基質を用いる誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞によるレバウジオシドＤの酵素的生成を実証するために、以下の実験を実施した。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、ピキア・パストリス株Ｇ／Ｈ５Ｓ２中で発現を７２時間誘導し、誘導細胞を収集した。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞を、基質としてレバウジオシドＡを用いるグリコシル化活性についてアッセイした。誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞（６０  ＯＤ）を、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、３ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍｇ／ｍｌのレバウジオシドＡ（９９％、Ｂｌｕｅ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カリフォルニア州）、１ｍＭのＵＤＰ又はＵＤＰＧ、及び２５０ｍＭのスクロースを含有する２００μｌのインビトロ反応系で試験した。誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞を、２４時間２８〜３０℃で反応系中に維持し、その後、１−ブタノールを添加することによって反応を終了させた。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、この反応系から試料を抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供した。比較のため、２つの追加の誘導ピキア・パストリス株：ＨＶ１配列のみを導入したＨ５株、及び空ベクターを導入したｐＨＫＡ（対照）株について、類似したアッセイ及びＨＰＬＣ分析を実行した。
【０１５７】
図５Ｃ、５Ｄ、及び５Ｅは、誘導細胞の導入後２４時間の時点でインビトロ反応系から採取した、誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞、誘導Ｈ５細胞、及び誘導ｐＨＫＡ細胞によりそれぞれ酵素的に生成されたレバウジオシドＤのＨＰＬＣ検出をまとめたグラフである。図５Ｃ及び５Ｄに示すように、誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞（図５Ｃ）及び誘導Ｈ５細胞（図５Ｄ）の両方はレバウジオシドＤを酵素的に生成するが、誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞はより高いＧ／Ｈ５Ｓ２誘導活性を示し、誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞におけるＵＧＴ−ＳＵＳ結合システム（図１０参照）の作製を示している。このＵＧＴ−ＳＵＳ結合システムの結果として、誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞は、図１０に示すように、消費したＵＤＰを再利用したが、さらなるレバウジオシドＤの生成を可能にするためにさらなるＵＤＰＧが誘導Ｈ５細胞に添加された。誘導ｐＨＫＡ細胞によりレバウジオシドＤが酵素的に生成されなかったことは、レバウジオシドＤはＨＶ１配列の非存在下で生成されないことを実証する。
【０１５８】
この実験の結果は、レバウジオシドＤを生成するためのＧ／Ｈ５Ｓ２細胞によるレバウジオシドＡの酵素的グリコシル化を実証した。
【０１５９】
実施例６：改変されたピキア・パストリス株Ｇ／Ｈ５Ｓ２を用いてレバウジオシドＥを生成するためのステビオシドのグリコシル化
ステビオシド基質を用いるＧ／Ｈ５Ｓ２細胞によるレバウジオシドＥの酵素的生成を実証するために、以下の実験を実施した。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、ピキア・パストリス株Ｇ／Ｈ５Ｓ２の培養物中で発現を７２時間誘導し、誘導細胞を収集した。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞を、基質としてステビオシドを用いるグリコシル化活性についてアッセイした。誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞（６０  ＯＤ）を、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、３ｍｍのＭｇＣｌ２、３ｍｇ／ｍｌのステビオシド（９５％、Ｂｌｕｅ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カリフォルニア州）、１ｍＭのＵＤＰ又はＵＤＰＧ、及び２５０ｍＭのスクロースを含有する２００μｌのインビトロ反応系で試験した。誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞を、２４時間２８〜３０℃で反応系中に維持し、その後、１−ブタノールを添加することによって反応を終了させた。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、この反応系から試料を抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供した。比較のため、空ベクターを導入したｐＨＫＡ（対照）株について、類似したアッセイ及びＨＰＬＣ分析を実行した。
【０１６０】
図６Ｃ及び６Ｄは、誘導細胞の導入後２４時間の時点でインビトロ反応系から採取した、誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞及び誘導ｐＨＫＡ細胞によりそれぞれ酵素的に生成されたレバウジオシドＥのＨＰＬＣ検出をまとめたグラフである。図６Ｃに示すように、誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞は、レバウジオシドＥを酵素的に生成する。図６Ｄに示すように、誘導ｐＨＫＡ細胞は、レバウジオシドＥを生成できなかった。
【０１６１】
この実験の結果は、レバウジオシドＥを生成するためのＧ／Ｈ５Ｓ２細胞によるステビオシドの酵素的グリコシル化を実証した。
【０１６２】
実施例７：改変されたピキア・パストリス株Ｇ／Ｈ５Ｓ２及びＧ／Ｋ４Ｓ２を用いてレバウジオシドＭを生成するためのレバウジオシドＡのグリコシル化
レバウジオシドＡ基質を用いる誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞と誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞の組み合わせによるレバウジオシドＭ及びレバウジオシドＤの酵素的生成を実証するために、以下の実験を実施した。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、ピキア・パストリス株Ｇ／Ｋ４Ｓ２及びＧ／Ｈ５Ｓ２の培養物中で発現を７２時間誘導し、誘導細胞を収集した。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞及び誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞を、基質としてレバウジオシドＡを用いるグリコシル化活性についてアッセイした。誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞及び誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞（６０  ＯＤ）を、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、３ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍｇ／ｍｌのレバウジオシドＡ（９９％、Ｂｌｕｅ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カリフォルニア州）、１ｍＭのＵＤＰ又はＵＤＰＧ、及び２５０ｍＭのスクロースを含有する２００μｌのインビトロ反応系で試験した。誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞及び誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞を、２４時間２８〜３０℃で反応系中に維持し、その後、１−ブタノールを添加することによって反応を終了させた。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、この反応系から試料を抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供した。
【０１６３】
図７Ｄ及び７Ｅは、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞及び誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞の導入後２４時間（図７Ｄ）及び４８時間（図７Ｅ）の時点でインビトロ反応系から採取した、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞並びに誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞により酵素的に生成されたレバウジオシドＤ並びにレバウジオシドＭのＨＰＬＣ検出をまとめたグラフである。
【０１６４】
この実験の結果は、レバウジオシドＭを生成するための誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞と誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞の組み合わせによるレバウジオシドＡの酵素的グリコシル化を実証した。Ｒｅｂ  Ｄ及びＲｅｂ  Ｍは、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞及び誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞によって生成され、反応に従うこの反応中のＨＶ１及びＵＧＴ７６Ｇ１のグリコシル化活性の両方を示す。図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応４に示すように、Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞はレバウジオシドＡ基質をレバウジオシドＤへと最初に変換し、図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、及び９Ｈの反応３に示すように、Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞はレバウジオシドＤのレバウジオシドＭへの変換を触媒する。
【０１６５】
実施例８：改変されたピキア・パストリス株Ｇ／Ｈ５Ｓ２及びＧ／Ｋ４Ｓ２を用いてレバウジオシドＭを生成するためのレバウジオシドＡのグリコシル化−Ｇ／Ｈ５Ｓ２：Ｇ／Ｋ４Ｓ２比の影響
Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞及びＧ／Ｈ５Ｓ２細胞の異なる比での誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞と誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞の組み合わせによる、レバウジオシドＡ基質を用いるレバウジオシドＭ及びレバウジオシドＤの酵素的生成の感受性を実証するために、以下の実験を実施した。Ｇ／Ｈ５Ｓ２：Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞のいくつかの比：２：１、１：１、１：２及び１：３について、実施例７の方法と類似した方法を使用して、基質としてレバウジオシドＡを用いる誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞と誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞の組み合わせのグリコシル化活性を評価した。加えて、各Ｇ／Ｈ５Ｓ２：Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞比について、１６時間、２４時間、及び４８時間の反応時間後に、この反応系から試料を抽出した。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、全ての試料を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供した。
【０１６６】
図８Ａ及び８Ｂは、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞及び誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞の導入後様々な時点でインビトロ反応系から採取した、様々なＧ／Ｈ５Ｓ２：Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞比で誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞並びに誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞により酵素的に生成されたレバウジオシドＤ並びにレバウジオシドＭそれぞれのＨＰＬＣ検出をまとめたグラフである。図８Ａに示すように、より高いＧ／Ｈ５Ｓ２：Ｇ／Ｋ４Ｓ２比は、より多くのＲｅｂ  Ｄの蓄積をもたらし得る。図８Ｂに示すように、より低いＧ／Ｈ５Ｓ２：Ｇ／Ｋ４Ｓ２比は、Ｒｅｂ  Ｍへのより多くのＲｅｂ  Ｄの変換をもたらし得る。
【０１６７】
この実験の結果は、レバウジオシドＭを生成するためのＧ／Ｋ４Ｓ２細胞とＧ／Ｈ５Ｓ２細胞の組み合わせによるレバウジオシドＡの酵素的グリコシル化が、Ｇ／Ｈ５Ｓ２：Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞比に影響されることを実証した。
【０１６８】
実施例９：改変されたピキア・パストリス株Ｇ／Ｈ５Ｓ２及びＧ／Ｋ４Ｓ２を用いてレバウジオシドＭを生成するためのステビオシドのグリコシル化
ステビオシド基質を用いる誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞と誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞の組み合わせによるレバウジオシドＭの酵素的生成を実証するために、以下の実験を実施した。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、ピキア・パストリス株Ｇ／Ｋ４Ｓ２及びＧ／Ｈ５Ｓ２の培養物中で発現を７２時間誘導し、誘導細胞を収集した。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞及び誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞を、基質としてステビオシドを用いるグリコシル化活性についてアッセイした。誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞及び誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞（６０  ＯＤ）を、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌのステビオシド（純度９５％、Ｂｌｕｅ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カリフォルニア州）、１ｍＭのＵＤＰ又はＵＤＰＧ、及び２５０ｍＭのスクロースを含有する２００μｌのインビトロ反応系で試験した。誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞及び誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞を、１０及び２４時間２８〜３０℃で反応系中に維持し、その後、１−ブタノールを添加することによって反応を終了させた。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、この反応系から試料を抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供した。
【０１６９】
図１２Ｃ及び１２Ｄは、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞及び誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞の導入後１０時間（図１２Ｃ）及び２４時間（図１２Ｄ）の時点でインビトロ反応系から採取した、誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞並びに誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞により酵素的に生成されたレバウジオシドＤ並びにレバウジオシドＭのＨＰＬＣ検出をまとめたグラフである。
【０１７０】
この実験の結果は、レバウジオシドＭを生成するための誘導Ｇ／Ｋ４Ｓ２細胞と誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞の組み合わせによるステビオシドの酵素的グリコシル化を実証した。
【０１７１】
実施例１０：改変されたピキア・パストリス株Ｇ／Ｈ５Ｓ２を用いてレバウジオシドＥを生成するためのレバウジオシドＫＡのグリコシル化
レバウジオシドＫＡ基質を用いるＧ／Ｈ５Ｓ２細胞によるレバウジオシドＥの酵素的生成を実証するために、以下の実験を実施した。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、ピキア・パストリス株Ｇ／Ｈ５Ｓ２の培養物中で発現を７２時間誘導し、誘導細胞を収集した。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞を、基質としてレバウジオシドＫＡを用いるグリコシル化活性についてアッセイした。誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞（６０  ＯＤ）を、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌのレバウジオシドＫＡ（９８％、Ｂｌｕｅ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カリフォルニア州）、１ｍＭのＵＤＰ又はＵＤＰＧ、及び２５０ｍＭのスクロースを含有する２００μｌのインビトロ反応系で試験した。誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞を、２４時間２８〜３０℃で反応系中に維持し、その後、１−ブタノールを添加することによって反応を終了させた。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、この反応系から試料を抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供した。
【０１７２】
図１３Ｂは、誘導細胞の導入後２４時間の時点でインビトロ反応系から採取した、誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞により酵素的に生成されたレバウジオシドＥのＨＰＬＣ検出をまとめたグラフである。図１３Ｂに示すように、誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞は、レバウジオシドＥを酵素的に生成する。
【０１７３】
この実験の結果は、レバウジオシドＥを生成するためのＧ／Ｈ５Ｓ２細胞によるレバウジオシドＫＡの酵素的グリコシル化を実証した。
【０１７４】
実施例１０：改変されたピキア・パストリス株Ｇ／Ｈ５Ｓ２を用いてレバウジオシドＫＡ及びレバウジオシドＥを生成するためのルブソシドのグリコシル化
ルブソシド基質を用いるＧ／Ｈ５Ｓ２細胞によるレバウジオシドＫＡの酵素的生成を実証するために、以下の実験を実施した。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、ピキア・パストリス株Ｇ／Ｈ５Ｓ２の培養物中で発現を７２時間誘導し、誘導細胞を収集した。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞を、基質としてルブソシドを用いるグリコシル化活性についてアッセイした。誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞（６０  ＯＤ）を、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌのルブソシド（９８％、Ｂｌｕｅ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カリフォルニア州）、１ｍＭのＵＤＰ又はＵＤＰＧ、及び２５０ｍＭのスクロースを含有する２００μｌのインビトロ反応系で試験した。誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞を、２４時間２８〜３０℃で反応系中に維持し、その後、１−ブタノールを添加することによって反応を終了させた。実施例２に記載の方法と類似した方法を使用して、この反応系から試料を抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供した。
【０１７５】
図１４Ｂ及び１４Ｃは、誘導細胞の導入後１４及び２４時間の時点でインビトロ反応系から採取した、誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞により酵素的に生成されたレバウジオシドＫＡのＨＰＬＣ検出をまとめたグラフである。図１４Ｂ及び１４Ｃに示すように、誘導Ｇ／Ｈ５Ｓ２細胞は、レバウジオシドＫＡ及びレバウジオシドＥを酵素的に生成する。生成されたレバウジオシドＫＡは、レバウジオシドＥに変換され得る。
【０１７６】
この実験の結果は、レバウジオシドＫＡ及びレバウジオシドＥを生成するためのＧ／Ｈ５Ｓ２細胞によるルブソシドの酵素的グリコシル化を実証した。
【０１７７】
上記を考慮すると、本開示のいくつかの利点が達成され、他の有利な結果が得られることが分かるであろう。本開示の範囲から逸脱することなく、上記の方法及びシステムで様々な変更を行うことができるので、上記の説明に含まれ、添付の図面に示される全ての事項は、限定的な意味ではなく、例示として解釈されることが意図される。
【０１７８】
本開示の要素又はその様々なバージョン、実施形態（複数可）若しくは態様を紹介する場合、冠詞「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、「その」及び「前記」は、１以上の要素が存在することを意味することが意図される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」という用語は、包括的であることが意図され、列挙した要素以外の追加要素が存在し得ることを意味する。
【図１Ａ】
0006793957.tif 000008
【図１Ｂ】
0006793957.tif 000009
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
0006793957.tif 000019
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
0006793957.tif 000021
【図９Ｂ】
0006793957.tif 000022
【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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