(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンビナトリアルベクターを生成するための、以下を含む方法：
（ａ）以下を含む第１遺伝子構築物を含有するベクターを提供すること：
ＣＲＩＳＰＲガイド配列；
ＣＲＩＳＰＲガイド配列に隣接する第２適合末端要素および第１制限酵素のための第１認識部位；
バーコード要素；および
バーコード要素に隣接する第３適合末端要素および第２制限酵素のための第２認識部位、ここで第１制限酵素のための第１認識部位は、第１遺伝子構築物のバーコード要素側にあり、第２制限酵素のための第２認識部位は、前記遺伝子構築物のＣＲＩＳＰＲガイド側にある；
（ｂ）第１遺伝子構築物を第１認識部位で切断して、第５適合末端要素を生じ、ベクターを第２認識部位で切断して、第６適合末端要素を生じること；
（ｃ）以下を含む足場要素を提供すること：
足場配列；
第１適合末端要素および第４適合末端要素を含む、分離部位；および
足場要素に隣接する第７適合末端要素および第８適合末端要素、ここで第７適合末端要素は、第５適合末端要素にアニーリングすることができ、第８適合末端要素は、第６適合末端要素にアニーリングすることができ、分離部位は、第８適合末端要素の上流かつ足場配列の下流にあり、第７適合要素は、足場配列の上流にあり、第８適合末端要素は、足場配列の下流にある；
（ｄ）足場要素を、切断された第１遺伝子構築物にアニーリングすること、ここでアニーリングは、互いにアニーリングすることができる、ベクターおよび足場要素内の適合末端要素で起こり、アニーリング後、足場要素はＣＲＩＳＰＲガイド配列とバーコード要素の間に組み込まれ、これにより機能性ｓｇＲＮＡが形成され、分離部位は、足場配列とバーコード要素の間に位置し、こうしてコンビナトリアルベクターが作製される；
任意に、ここで、第１認識部位と第２認識部位は、同一の認識部位配列を有し、第１制限酵素と第２制限酵素が、同一の制限酵素である。
【請求項２】
以下をさらに含む、請求項１に記載の方法：
（ａ）ベクターを、足場要素内の分離部位で切断して、第１適合末端要素および第４適合末端要素を生じること；
（ｂ）以下を含む第２遺伝子構築物を提供すること：
ＣＲＩＳＰＲガイド配列；
足場配列；
バーコード要素；および
第２遺伝子構築物に隣接する第２適合末端要素および第３適合末端要素、ここで第２遺伝子構築物の第２適合末端要素は、ベクターの第１適合末端要素にアニーリングすることができ、第２遺伝子構築物の第３適合末端要素は、ベクターの第４適合末端要素にアニーリングすることができ、足場配列は、ＣＲＩＳＰＲガイド配列の下流にあり、ＣＲＩＳＰＲガイド配列に連結されており、これにより機能性ｓｇＲＮＡが形成される；
（ｃ）第２遺伝子構築物を切断ベクターにアニーリングすること、ここでアニーリングは、互いにアニーリングすることができる、第２遺伝子構築物およびベクター内の適合末端要素で起こり、アニーリング後に、第２遺伝子構築物はベクター内に組み込まれて、こうして、連結されたバーコード要素および連結されたＣＲＩＳＰＲガイドと足場配列を含むコンビナトリアルベクターが作製される；
任意に、ここで、方法は反復的である。
【請求項３】
コンビナトリアルベクターが、ＣＲＩＳＰＲガイド配列の上流にプロモーター要素をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
コンビナトリアルベクターを生成するための、以下を含む方法：
（ａ）以下を含むベクターを提供すること：
複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列；
バーコード要素、ここでバーコード要素は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の下流に位置する；
任意に、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の少なくとも１つの上流に位置する、プロモーター配列；および
複数の制限酵素のための複数の認識部位、ここで複数の認識部位の各々は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の１つの下流に位置する；
（ｂ）ベクターを、複数の認識部位の少なくとも１つにおいて、複数の制限酵素の少なくとも１つで切断して、第１適合末端要素および第２適合末端要素を生じること；
（ｃ）以下を含む第１足場要素を提供すること：
足場配列、
任意にプロモーター配列、および
第１足場要素に隣接する第３適合末端要素および第４適合末端要素、ここで第３適合末端要素は、切断されたベクターの第１適合末端要素にアニーリングすることができ、第４適合末端要素は、切断されたベクターの第２適合末端要素にアニーリングすることができる；
（ｄ）第１足場要素を、切断されたベクターにアニーリングすること、ここでアニーリングは、第１足場要素および切断されたベクター内の適合末端要素で起こり、アニーリング後、第１足場要素は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の１つの下流に組み込まれ、これにより機能性ｓｇＲＮＡが形成され、こうしてコンビナトリアルベクターが生成される；
任意に、ここで、方法は反復的である。
【請求項５】
コンビナトリアルベクターを生成するための、以下を含む方法：
（ａ）以下を含むベクターを提供すること：
複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列、
バーコード要素、ここでバーコード要素は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の上流に位置する、
任意に、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の少なくとも１つの上流に位置する、プロモーター配列、および
複数の制限酵素のための複数の認識部位、ここで複数の認識部位の各々は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の１つの上流に位置する；
（ｂ）ベクターを、複数の認識部位の少なくとも１つにおいて、複数の制限酵素の少なくとも１つで切断して、第１適合末端要素および第２適合末端要素を生じること；
（ｃ）以下を含む第１足場要素を提供すること：
足場配列、
足場配列の下流にあるプロモーター配列、および
第１足場要素に隣接する第３適合末端要素および第４適合末端要素、ここで第３適合末端要素は、切断されたベクターの第１適合末端要素にアニーリングすることができ、第４適合末端要素は、切断されたベクターの第２適合末端要素にアニーリングすることができる；
（ｄ）第１足場要素を、切断されたベクターにアニーリングすること、ここでアニーリングは、第１足場要素および切断されたベクター内の適合末端要素で起こり、アニーリング後、第１足場要素は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の１つの上流に組み込まれ、これにより隣接するＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列により機能性ｓｇＲＮＡが形成され、こうしてコンビナトリアルベクターが生成される；
任意に、ここで、方法は反復的である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、35 U.S.C. §119(e)のもとで、２０１４年１０月３１日に提出された米国仮出願第第62/073,126号、および２０１５年５月２６日に提出された米国仮出願第62/166,302号の利益を主張する；これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の財政的支援
本発明は、政府の財政的支援により、国立衛生研究所から付与された助成金番号OD008435のもとで行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列を含む遺伝要素の高次の組合わせを迅速に生成するため、および前記遺伝要素の容易な同定のための、方法および組成物に関する。本発明はまた、エピジェネティック遺伝子を標的として細胞増殖を阻害する阻害剤、および関連する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
The clustered regularly interspaced short palindromic repeats（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステムは、初めに細菌および古細菌種において、外来遺伝物質（例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ）に対する防御機構として発見された。天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、３つの成分、すなわち、標的配列に相補的なガイドＲＮＡ配列、第３成分であるエンドヌクレアーゼの部位へのリクルートを支援する足場ＲＮＡ、の発現に依存する。多くの細菌および古細菌種においては、外来遺伝物質を分解するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが用いられているが、該システムは広範な原核生物および真核生物で使用するために適合され、遺伝子ノックアウト、突然変異誘発および発現活性化または抑制を含む多くの方法のために使用されている（Hsu, et al., Cell(2014) 157(6): 1262-1278）。遺伝子操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、３つの独立した成分の必要性は、標的配列に結合するＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ配列と足場ＲＮＡの両方（これらは、個々のガイドＲＮＡ配列および足場配列によって形成された構造を模倣し、エンドヌクレアーゼを適切な標的部位にリクルートするのに十分である）を含む小さなガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の発現によって、回避することができる（Jinek et al., Science (2012) 337(6096):816-821）。
【発明の概要】
【０００５】
２つ以上のｓｇＲＮＡ（ガイド配列および足場配列）を含む複数のＣＲＩＳＰＲシステムの発現のための、ベクターおよび遺伝要素の生成は非常に面倒であり、伝統的なクローニング法を用いて構築されたＣＲＩＳＰＲシステムのライブラリーの複雑性は非常に限定されている。本明細書に記載の方法は、ＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列をそれぞれが含む複数のｓｇＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲガイド配列の同一性の指標として検出および使用され得る連結されたバーコード要素、を含むベクターの生成を可能にする。本方法はまた、非常に複雑なベクターのライブラリーの簡単かつ迅速な生成を提供する。
【０００６】
本発明の側面は、以下を含む遺伝子構築物を提供する：ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列を含む、第１ＤＮＡ要素；第１ＤＮＡ要素に隣接する第１適合末端（compatible end）要素および第２適合末端要素であって、ここで第１および第２適合末端要素は、互いにアニーリングすることができる、前記適合末端要素；バーコード要素；バーコード要素に隣接する第３適合末端要素および第４適合末端要素であって、ここで第３および第４適合末端要素は、互いにアニーリングすることができるが、しかし第１または第２適合末端要素にアニーリングすることはできない、前記適合末端要素；および、第４適合末端要素と第１適合末端要素の間に位置する分離部位であって、ここで、前記ＤＮＡ要素、第１適合末端要素、および第２適合末端要素は分離部位の一方の側にあり、バーコード要素、第３適合末端要素、および第４適合末端要素は分離部位の反対側にある、前記分離部位。
【０００７】
いくつかの態様において、遺伝子構築物は、第１ＤＮＡ要素の上流にプロモーター要素をさらに含む。
側面は、本明細書に記載の任意の遺伝子構築物を含むベクターを提供する。
他の側面は、以下を含む遺伝子構築物を提供する：複数のＤＮＡ要素であって、ここで該複数のＤＮＡ要素の各ＤＮＡ要素は、ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列を含む、前記複数のＤＮＡ要素；複数のＤＮＡ要素に隣接する第１適合末端要素および第２適合末端要素であって、ここで第１および第２適合末端要素は、互いにアニーリングすることができる、前記適合末端要素；複数のバーコード要素；複数のバーコード要素に隣接する第３適合末端要素および第４適合末端要素であって、ここで第３および第４適合末端要素は、互いにアニーリングすることができるが、しかし第１または第２適合末端要素にアニーリングすることはできない、前記適合末端要素；および、複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置する、分離部位。
他の側面は、本明細書に記載の任意の遺伝子構築物、およびＣＲＩＳＰＲガイド配列の各々の上流に位置するプロモーター配列を含む、ベクターを提供する。
【０００８】
さらに他の側面は、コンビナトリアルベクターを生成するための、以下を含む方法を提供する：（ａ）以下： ＣＲＩＳＰＲガイド配列；ＣＲＩＳＰＲガイド配列に隣接する第２適合末端要素および第１制限酵素のための第１認識部位；バーコード要素；およびバーコード要素に隣接する第３適合末端要素および第２制限酵素のための第２認識部位、を含む第１遺伝子構築物を含有するベクターを提供すること；（ｂ）第１遺伝子構築物を第１認識部位で切断して、第５適合末端要素を生じ、ベクターを第２認識部位で切断して、第６適合末端要素を生じること；（ｃ）以下：足場配列；第１適合末端要素および第４適合末端要素を含む、分離部位；および足場要素に隣接する第７適合末端要素および第８適合末端要素、を含む足場要素を提供すること、ここで第７適合末端要素は、第５適合末端要素にアニーリングすることができ、第８適合末端要素は、第６適合末端要素にアニーリングすることができる；（ｄ）足場要素を、切断された第１遺伝子構築物にアニーリングすること、ここでアニーリングは、互いにアニーリングすることができる、ベクターおよび足場要素内の適合末端要素で起こり、アニーリング後、足場要素はＣＲＩＳＰＲガイド配列とバーコード要素の間に組み込まれ、分離部位は、足場配列とバーコード要素の間に位置し、こうしてコンビナトリアルベクターが作製される。
【０００９】
いくつかの態様において、方法は、以下をさらに含む：（ａ）本明細書に記載の任意のコンビナトリアルベクターを提供すること；（ｂ）ベクターを、足場要素内の分離部位で切断して、第１適合末端要素および第４適合末端要素を生じること；（ｃ）以下：ＣＲＩＳＰＲガイド配列；足場配列；バーコード要素；および第２遺伝子構築物に隣接する第２適合末端要素および第３適合末端要素、を含む第２遺伝子構築物を提供すること、ここで第２遺伝子構築物の第２適合末端要素は、ベクターの第１適合末端要素にアニーリングすることができ、第２遺伝子構築物の第３適合末端要素は、ベクターの第４適合末端要素にアニーリングすることができる；および、（ｄ）第２遺伝子構築物を切断ベクターにアニーリングすること、ここでアニーリングは、互いにアニーリングすることができる、第２遺伝子構築物およびベクター内の適合末端要素で起こり、アニーリング後に、第２遺伝子構築物はベクター内に組み込まれて、こうして連結されたバーコード要素および連結されたＣＲＩＳＰＲガイドと足場配列を含むコンビナトリアルベクターが作製される。
【００１０】
いくつかの態様において、コンビナトリアルベクターは、ＣＲＩＳＰＲガイド配列の上流に１または２以上のプロモーターをさらに含む。いくつかの態様において、方法は反復的である。いくつかの態様において、第１認識部位と第２認識部位は、同一の認識部位配列を有し、第１制限酵素と第２制限酵素は、同一の制限酵素である。
本発明の他の側面は、少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲガイド配列；バーコード要素；ならびに各ＣＲＩＳＰＲガイド配列の間、およびバーコード要素と該バーコード要素に最も近いＣＲＩＳＰＲガイド配列との間に位置する、制限認識部位、を含む、遺伝子構築物を提供する。
他の側面は、複数のＤＮＡ要素であって、各々がＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列を含む、前記複数のＤＮＡ要素；バーコード要素；および前記複数のＤＮＡ要素の各ＤＮＡ要素の上流に位置するプロモーター配列、を含む、遺伝子構築物を提供する。いくつかの態様において、バーコード要素は、遺伝子構築物の５’末端に位置する。いくつかの態様において、バーコード要素は、遺伝子構築物の３’末端に位置する。
他の側面は、本明細書に記載の遺伝子構築物のいずれかを含む、ベクターを提供する。
【００１１】
さらに他の側面は、コンビナトリアルベクターを生成するための、以下を含む方法を提供する：
（ａ）以下を含むベクターを提供すること：複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列；バーコード要素、ここでバーコード要素は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の下流に位置する；任意に、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の少なくとも１つの上流に位置する、プロモーター配列；および複数の制限酵素のための複数の認識部位；ここで複数の認識部位の各々は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の１つの下流に位置する；（ｂ）ベクターを、複数の認識部位の少なくとも１つにおいて、複数の制限酵素の少なくとも１つで切断して、第１適合末端要素および第２適合末端要素を生じること；（ｃ）以下を含む第１足場要素を提供すること：足場配列、任意にプロモーター配列、および第１足場要素に隣接する第３適合末端要素および第４適合末端要素；ここで第３適合末端要素は、切断されたベクターの第１適合末端要素にアニーリングすることができ、第４適合末端要素は、切断されたベクターの第２適合末端要素にアニーリングすることができる；および（ｄ）第１足場要素を、切断されたベクターにアニーリングすること、ここでアニーリングは、第１足場要素および切断されたベクター内の、適合末端要素で起こり、アニーリング後、第１足場要素は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の１つの下流に組み込まれ、こうしてコンビナトリアルベクターが生成される。いくつかの態様において、方法は反復的である。
【００１２】
他の側面は、コンビナトリアルベクターを生成するための、以下を含む方法を提供する：（ａ）以下を含むベクターを提供すること：複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列；バーコード要素、ここでバーコード要素は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の上流に位置する；任意に、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の少なくとも１つの上流に位置する、プロモーター配列；および、複数の制限酵素のための複数の認識部位、ここで複数の認識部位の各々は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の１つの上流に位置する；（ｂ）ベクターを、複数の認識部位の少なくとも１つにおいて、複数の制限酵素の少なくとも１つで切断して、第１適合末端要素および第２適合末端要素を生じること；（ｃ）以下を含む第１足場要素を提供すること：任意に足場配列、プロモーター配列、および第１足場要素に隣接する第３適合末端要素および第４適合末端要素、ここで第３適合末端要素は、切断されたベクターの第１適合末端要素にアニーリングすることができ、第４適合末端要素は、切断されたベクターの第２適合末端要素にアニーリングすることができる；（ｄ）第１足場要素を、切断されたベクターにアニーリングすること、ここでアニーリングは、第１足場要素および切断されたベクター内の適合末端要素で起こり、アニーリング後、第１足場要素は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の１つの上流に組み込まれ、こうしてコンビナトリアルベクターが生成される。いくつかの態様において、方法は反復的である。
【００１３】
本発明の側面は、表２に記載のエピジェネティック遺伝子の組合わせから選択される２または３以上のエピジェネティック遺伝子を標的とする２または３以上の阻害剤を含む、組成物を提供する。いくつかの態様において、２または３以上の阻害剤の各々は、エピジェネティック遺伝子の発現を低減もしくは防止するか、またはエピジェネティック遺伝子がコードするタンパク質の活性を低減もしくは防止する。いくつかの態様において、阻害剤の各々は、ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列；ｓｈＲＮＡ；および小分子からなる群から選択される。いくつかの態様において、阻害剤の少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列であり；組成物はさらに、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含むかまたはコードする。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲガイド配列またはｓｈＲＮＡは、組換え発現ベクターから発現される。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子の組合わせは、BRD4とKDM4CまたはBRD4とKDM6Bを含む。いくつかの態様において、BRD4の阻害剤は、JQ1（（６Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２，３，９−トリメチル−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−酢酸１，１−ジメチルエチルエステル）である。いくつかの態様において、KDM4Cの阻害剤は、SD70（Ｎ−（フラン−２−イル（８−ヒドロキシキノリン−７−イル）メチル）イソブチルアミド）である。いくつかの態様において、KDM6Bの阻害剤は、GSK-J4（エチル３−（（６−（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］アゼピン−３（２Ｈ）−イル）−２−（ピリジン−２−イル）ピリミジン−４−イル）アミノ）プロパノアート、一塩酸塩）である。
【００１４】
他の側面は、細胞の増殖を低減する方法であって、細胞を、表２に記載のエピジェネティック遺伝子の組合わせから選択される２または３以上のエピジェネティック遺伝子を標的とする２または３以上の阻害剤の組合わせと接触させることを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、細胞が癌細胞である。いくつかの態様において、癌細胞が卵巣癌細胞である。いくつかの態様において、２または３以上の阻害剤の各々は、エピジェネティック遺伝子の発現を低減もしくは防止するか、またはエピジェネティック遺伝子がコードするタンパク質の活性を低減もしくは防止する。いくつかの態様において、阻害剤の各々は、ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列；ｓｈＲＮＡ；および小分子からなる群から選択される。いくつかの態様において、阻害剤の少なくとも1つは、ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列であり；組成物はさらに、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含むかまたはコードする。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲガイド配列またはｓｈＲＮＡは、組換え発現ベクターから発現される。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子の組合わせは、BRD4とKDM4CまたはBRD4とKDM6Bを含む。いくつかの態様において、BRD4の阻害剤は、JQ1（（６Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２，３，９−トリメチル−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−酢酸１，１−ジメチルエチルエステル）である。いくつかの態様において、KDM4Cの阻害剤は、SD70（Ｎ−（フラン−２−イル（８−ヒドロキシキノリン−７−イル）メチル）イソブチルアミド）である。いくつかの態様において、KDM6Bの阻害剤は、GSK-J4（エチル３−（（６−（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］アゼピン−３（２Ｈ）−イル）−２−（ピリジン−２−イル）ピリミジン−４−イル）アミノ）プロパノアート、一塩酸塩）である。
【００１５】
他の側面は、対象における癌を処置する方法であって、対象に、表２に記載のエピジェネティック遺伝子の組合わせから選択される２または３以上のエピジェネティック遺伝子を標的とする２または３以上の阻害剤の組合わせを投与することを含み、ここで２または３以上の阻害剤の各々は、有効量で投与される、前記方法が提供される。いくつかの態様において、阻害剤の各々は、ＣＲＩＳＰＲガイド配列、ｓｈＲＮＡ、および小分子からなる群から選択される。いくつかの態様において、組合わせで投与される２または３以上の阻害剤の各々の有効量は、組合わせで投与されない場合の阻害剤の有効量より少ない。いくつかの態様において、２または３以上の阻害剤の各々は、エピジェネティック遺伝子の発現を低減もしくは防止するか、またはエピジェネティック遺伝子がコードするタンパク質の活性を低減もしくは防止する。いくつかの態様において、阻害剤の各々は、ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列；ｓｈＲＮＡ；および小分子からなる群から選択される。いくつかの態様において、阻害剤の少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列であり；組成物はさらに、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含むかまたはコードする。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲガイド配列またはｓｈＲＮＡは、組換え発現ベクターから発現される。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子の組合わせは、BRD4とKDM4CまたはBRD4とKDM6Bを含む。いくつかの態様において、BRD4の阻害剤は、JQ1（（６Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２，３，９−トリメチル−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−酢酸１，１−ジメチルエチルエステル）である。いくつかの態様において、KDM4Cの阻害剤は、SD70（Ｎ−（フラン−２−イル（８−ヒドロキシキノリン−７−イル）メチル）イソブチルアミド）である。いくつかの態様において、KDM6Bの阻害剤は、GSK-J4（エチル３−（（６−（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］アゼピン−３（２Ｈ）−イル）−２−（ピリジン−２−イル）ピリミジン−４−イル）アミノ）プロパノアート、一塩酸塩）である。
【００１６】
他の側面は、細胞の増殖を低減する、エピジェネティック遺伝子の阻害剤の組合わせを同定するための方法であって、以下：第１細胞集団および第２細胞集団を、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼの複数の組合わせと接触させること；第１細胞集団および第２細胞集団を、第２細胞集団が第１細胞集団より長い期間培養されるように、培養すること；第１細胞集団における、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の組合わせ、および第２細胞集団における、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の組合わせを同定すること；第１細胞集団における、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の各組合わせの存在量を、第２細胞集団における、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の各組合わせの存在量と比較すること；および、第２細胞集団においては不在であるかまたは低減された存在量であるが、第１細胞集団においては存在するかまたは増加した存在量である、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の組合わせを、細胞増殖を低減するＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の組合わせとして同定すること；を含む方法を提供する。
【００１７】
さらに他の側面は、細胞の増殖を低減するために阻害すべき遺伝子の組合わせを同定する方法であって、以下：第１細胞集団および第２細胞集団を、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼの複数の組合わせと接触させること；第１細胞集団および第２細胞集団を、第２細胞集団が第１細胞集団より長い期間培養されるように、培養すること；第１細胞集団における、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の組合わせ、および第２細胞集団における、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の組合わせを同定すること；第１細胞集団における、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の各組合わせの存在量を、第２細胞集団における、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の各組合わせの存在量と比較すること；および、第２細胞集団においては不在であるかまたは低減された存在量であるが、第１細胞集団においては存在するかまたは増加した存在量である、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の組合わせを、増殖を低減するために阻害すべき遺伝子として同定すること；を含む方法を提供する。
【００１８】
本発明のこれらおよび他の側面、ならびにその様々な態様は、本発明の図面および詳細な説明を参照してより明らかになるであろう。
本発明の限定の各々は、本発明の様々な態様を包含することができる。したがって、任意の１つの要素または要素の組合わせを含む本発明の各限定は、本発明の各側面に含めることができることが予期される。本発明は、その用途において、以下の説明に記載されるか図面に示される構成の詳細および構成要素の配置に限定されない。本発明は、他の態様が可能であり、様々な方法で実現されるか、実施されることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
添付の図面は、縮尺通りに描くことを意図していない。明確にするために、すべての構成要素がすべての図面でラベル付けされてはいない。図面においては以下である：
【図１】図１は、本発明の非限定的な態様を示す概略図である。ステップ１および２においてオリゴヌクレオチドライブラリーを合成し、対応するオリゴヌクレオチド対を一緒にアニールする。各オリゴヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲガイド配列、２つのBbsI制限認識部位、およびバーコード要素を含む。ステップ３において、オリゴヌクレオチドをワンポットライゲーション反応で保存ベクターにライゲートして、オリゴヌクレオチドを含むベクターを得る。ステップ４において、ベクターをBbsI制限認識部位で消化して、足場配列と、BamHIおよびEcoRI制限認識部位によって形成される分離部位の挿入を可能にする。バーコード化ガイドＲＮＡライブラリーは、ＣＲＩＳＰＲガイド配列、足場配列、分離部位、およびバーコード要素を含む、追加の要素の挿入のために、分離部位で反復的に消化されることができ、連鎖状のバーコード要素を有する複雑なガイドＲＮＡライブラリーをもたらす。配列は、上から下へ、配列番号３６４〜３６６に対応する。
【００２０】
【図２ＡＢ】図２Ａおよび２Ｂは、本発明の非限定的な態様を示す概略図である。図２Ａのステップ１において、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列および該ＣＲＩＳＰＲガイド配列の下流の単一のバーコード要素をそれぞれが含むオリゴヌクレオチドが合成される。制限認識部位（ＲＥ）は、各ＣＲＩＳＰＲガイド配列の後に存在する。ステップ２において、プールされた合成オリゴヌクレオチドをワンポットライゲーション反応でデスティネーションベクターにライゲートする。ステップ３に示すように、ベクターは、各ＣＲＩＳＰＲガイド配列に続く制限認識部位の各々において、異なる制限酵素で順次消化されることができて、足場要素の挿入を可能にし、場合によってはプロモーター要素が下流のＣＲＩＳＰＲガイド配列の発現を駆動することを可能にして、こうして単一のバーコード要素を有する複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列をコードする、バーコード化コンビナトリアルガイドＲＮＡライブラリーがもたらされる。図２Ｂのステップ１において、オリゴヌクレオチドが合成され、それぞれは複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列および該ＣＲＩＳＰＲガイド配列の上流の単一のバーコード要素を含む。制限認識部位（ＲＥ）は、各ＣＲＩＳＰＲガイド配列の後に存在する。ステップ２において、プールされた合成オリゴヌクレオチドをワンポットライゲーション反応でデスティネーションベクターにライゲートする。ステップ３に示すように、ベクターは、各ＣＲＩＳＰＲガイド配列に続く制限認識部位のそれぞれにおいて、異なる制限酵素で順次消化されることができ、足場要素の挿入を可能にし、場合によってはプロモーター要素が下流のＣＲＩＳＰＲガイド配列の発現を駆動することを可能にして、こうして単一のバーコード要素を有する複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列をコードする、バーコード化コンビナトリアルガイドＲＮＡライブラリーをもたらす。
【００２１】
【図３Ａ−３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、高カバレージコンビナトリアルｇＲＮＡライブラリーの生成および、該ライブラリーのヒト細胞への効率的な送達を示す。図３Ａは、大腸菌から抽出されたプラスミドプール内の１ワイズｇＲＮＡライブラリーについてのバーコードリードの累積分布を表し、予想される全ての組合わせについて完全なカバレージを示す。図３Ｂは、プラスミドプールおよびレンチウイルス感染OVCAR8-ADR-Cas9細胞プールの両方における２ワイズｇＲＮＡライブラリーを表し、予想される全ての組合わせについてのほぼ完全なカバレッジを示す。大部分のバーコード化ｇＲＮＡの組合わせは、組合わせ当たりの平均のバーコードリードの５倍の範囲内から検出された（陰影領域によって強調され、矢印によって示される）。図３Ｃは、プラスミドプールと感染OVCAR8-ADR-Cas9細胞プール内のバーコード表示（representation）（正規化されたバーコードカウントのｌｏｇ２値）の間の高い相関を示し、ヒト細胞内への、２ワイズライブラリーの効率的なレンチウイルス送達を示す。図３Ｄは、２ワイズｇＲＮＡライブラリーでの感染後５日間培養したOVCAR8-ADR-Cas9細胞における、２つの生物学的複製間のバーコード表示の高い再現性を示す。Ｒは、ピアソン相関係数である。
【００２２】
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、癌細胞の増殖を阻害するｇＲＮＡの組合わせの、ハイスループットスクリーニングを用いた同定を示す。図４Ａは、OVCAR8-ADR-Cas9細胞をバーコード化２ワイズｇＲＮＡライブラリーに感染させて１５日または２０日間培養した、ハイスループットスクリーニングの概略図を示す。細胞プール内のバーコード表示は、Illumina HiSeqを使用して同定および定量し、２つのプール間で比較した。図４Ｂ（右パネル）は、細胞増殖を調節することが見出された２ワイズｇＲＮＡ組合わせを、２０日対１５日間の培養細胞における正規化されたバーコードカウントの間のｌｏｇ２比でランク付けして示す。図４Ｂ（左パネル）は、同じｇＲＮＡを対照ｇＲＮＡと対にして示す。対照ｇＲＮＡ対との組合わせは、白三角で強調して示されている。別の生物学的複製において確認されたｇＲＮＡの組合わせの抗増殖効果は、白抜きの丸で強調されている（図１２参照）。標識されたｇＲＮＡの組合わせをさらに確認した。図４Ｃは、癌細胞の増殖を調節する２ワイズの組合わせの確認を示す。OVCAR8-ADR-Cas9細胞集団を、示された２ワイズｇＲＮＡ組合わせに感染させ、１５日間培養した。次いで同数の細胞を再プレートし、示されるように追加の期間培養した。ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率を測定し、吸光度測定（ＯＤ５７０−ＯＤ６５０）（ｎ＝３）によって特徴付けた。データは、平均±標準偏差（ＳＤ）を表す。
【００２３】
【図５Ａ−５Ｄ】図５Ａ〜５Ｄは、KDM4CとBRD4またはKDM6BとBRD4のコンビナトリアル阻害が、ヒト卵巣癌細胞の増殖を阻害することを示す。図５Ａは、示された単一またはコンビナトリアルｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染したOVCAR8-ADR-Cas9細胞の、対照ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染した細胞と比較した、細胞生存率の倍率変化を示す。細胞を１５日間培養し、次いで同数の感染細胞を再プレートし、さらに５日間培養した。図５Ｂは、示されたｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスに同時感染したOVCAR8-ADR細胞の、対照ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染した細胞と比較した、細胞生存率の倍率変化を示す。細胞を９日間培養し、次いで同数の感染細胞を再プレートし、さらに４日間培養した。図５Ｃは、SD70とJQ1を用いて、示した濃度で５日間処理したOVCAR8-ADR細胞の、薬剤を投与しなかった対照細胞と比較した、細胞増殖阻害のパーセンテージを示す。予想されるBliss独立性モデルおよびＨＳＡモデルに基づいて計算された超過阻害も、SD70とJQ1の組合わせについて示される（中央パネルおよび右パネル）。図５Ｄは、GSK-J4とJQ1を用いて示した濃度で７日間処理したOVCAR8-ADR細胞の、薬剤を投与しなかった対照細胞と比較した、細胞増殖阻害のパーセンテージを示す。予想されるBliss独立性モデルおよびＨＳＡモデルに基づいて計算された超過阻害も、GSK-J4とJQ1の組合わせについて示される（中央パネルおよび右パネル）。細胞生存率は、ＭＴＴアッセイによって測定した。データは、平均±ＳＤを表す（図５Ａについてｎ＝３、図５Ｂ〜図５Ｄについてｎ＝６）。アスタリスク（＊Ｐ＜０．０５）およびハッシュ（＃Ｐ＜０．０５）は、示された試料の間および薬物処理試料と薬物なしの対照試料の間の、有意差を表す。
【００２４】
【図６Ａ−６Ｅ】図６Ａ〜６Ｅは、コンビナトリアルｇＲＮＡ発現構築物のレンチウイルス送達が、効率的な標的遺伝子抑制を提供することを示す。図６Ａは、ヒト細胞におけるレンチウイルスコンビナトリアルｇＲＮＡ発現構築物を試験するための、戦略の概略図を示す。レンチウイルスが生成され、これは、それぞれＵＢＣおよびＣＭＶプロモーターの制御下でＲＦＰおよびＧＦＰをコードする遺伝子と、ＲＦＰ（ＲＦＰ−ｓｇ１またはＲＦＰ−ｓｇ２）およびＧＦＰ（ＧＦＰ−ｓｇ１）配列を標的とするｇＲＮＡのタンデムＵ６プロモーター駆動発現カセットを含んでいた。レンチウイルスを用いて、OVCAR8-ADRまたはOVCAR8-ADR-Cas9細胞を感染させ、ＧＦＰおよびＲＦＰ発現は、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡を用いて評価した。図６Ｂは、示されたｇＲＮＡ発現構築物をコードするレンチウイルスで４日間感染させた細胞における、ＧＦＰおよびＲＦＰ発現を評価する、フローサイトメトリー散布図を示す。コンビナトリアルｇＲＮＡ発現構築物をコードするレンチウイルスは、ＲＦＰおよびＧＦＰ蛍光に対して陽性である細胞の割合をOVCAR8-ADR-Cas9細胞において減少させたが、OVCAR8-ADR細胞では減少させなかった。図６Ｃは、示されたｇＲＮＡ発現構築物をコードするレンチウイルスによる感染後４日目の、ＧＦＰ陽性細胞（左欄）およびＲＦＰ陽性細胞（右欄）の割合を示す。図６Ｄは、示されたｇＲＮＡ発現構築物をコードするレンチウイルスの感染後８日目の、ＧＦＰ陽性細胞（左欄）およびＲＦＰ陽性細胞（右欄）の割合を示す。ＲＦＰおよびＧＦＰを標的とするｇＲＮＡの間の限定された交差反応性が、検出された。図６Ｂのデータは、４日間感染させた細胞のフローサイトメトリー測定値を表し、図６Ｃおよび６Ｄの定量化は、平均±標準偏差（ｎ＝３）を表す。図６Ｅは、コンビナトリアルｇＲＮＡ発現構築物が、OVCAR8-ADR-Cas9細胞においてＲＦＰおよびＧＦＰ蛍光レベルを効果的に抑制するが、感染後３日目のOVCAR8-ADR細胞においてはそうではないことを実証する、代表的な蛍光顕微鏡写真を示す。
【００２５】
【図７Ａ−７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃは、OVCAR8-ADR-Cas9細胞における標的遺伝子のｇＲＮＡの切断効率を示す。図７Ａは、OVCAR8-ADR-Cas9細胞においてSurveyorアッセイを用いて検出された挿入欠失百分率を示す要約表を表す。細胞を、スクリーニングライブラリーからランダムに選択された８つの異なるｇＲＮＡで、８または１２日間感染させた。Surveyorアッセイで検出された未切断および切断ＰＣＲ産物の予想されるサイズを、塩基対で列挙する。図７Ｂおよび７Ｃは、示されたｇＲＮＡで感染されていないかまたは８日間もしくは１２日間感染されたOVCAR8-ADR-Cas9細胞における、ＤＮＡ切断効率についてのSurveyorアッセイ結果を示すアガロースゲルを表す。
【００２６】
【図８ＡＢ】図８Ａおよび８Ｂは、OVCAR8-ADR-Cas9細胞の標的遺伝子における二重ｇＲＮＡ発現構築物の切断効率を示す。図８Ａは、Surveyorアッセイで検出された未切断および切断ＰＣＲ産物の、塩基対で列挙した予想サイズを示す（上のパネル）。アガロースゲルは、示された単一または二重ｇＲＮＡ発現構築物で１２日間感染させたOVCAR8-ADR-Cas9細胞において、Surveyorアッセイを用いて検出した挿入欠失百分率を示す（下のパネル）。図８Ｂは、ベクター対照、または示された単一もしくは二重ｇＲＮＡ構築物で１５日間感染させたOVCAR8-ADR-Cas9細胞における、タンパク質レベルを示す免疫ブロット分析である。
【００２７】
【図９Ａ−９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、二重ｇＲＮＡ発現構築物に感染した単一細胞由来のOVCAR8-ADR-Cas9クローンについての標的アレルのＤＮＡアライメントを示す。図９Ａは、BMI1およびPHF8を標的とするｓｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染したOVCAR8-ADR-Cas9細胞からの配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、それぞれ配列番号２０３、２０４、２０３、２０３、２０４、２０４、２０３、２０５、２０６、２０６、２０３、２０３、２０４、２０７、２０８、２０９、２０４、２１０、２０８、２０８、２１０、２１０、２０３、２１９、２０６、２０６、２０８、２０８、２２０、２２０、２２１、２２２、２０４、２０４、２２３、２２４、２０４、２０４、２０３、２０３、２０４、および２０４に対応する。図９Ｂは、BRD4およびKDM4Cを標的とするｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染したOVCAR8-ADR-Cas9細胞からの配列のアライメントを示す。OVCAR8-ADR-Cas9細胞をレンチウイルスに１２日間感染させ、単一細胞としてプレートした。各単一細胞拡大クローン（single-cell-expanded clone）のゲノムＤＮＡを抽出した。標的アレルをＰＣＲで増幅し、SangerシーケンシングのためにＴＡクローニングによりＴＯＰＯベクターに挿入した。各クローンの２つのアレルの配列が示されている。ヌクレオチドの変異および挿入は太字で、欠失は「−」で示されている。標的遺伝子の野生型（ＷＴ）配列を参照として示し、２０ｂｐのｇＲＮＡ標的に下線を引き、ＰＡＭ配列を太字斜体で示す。配列は、上から下へ、それぞれ配列番号２１１、２１２、２１１、２１１、２１３、２１３、２１１、２１１、２１４、２１４、２１１、２１５、２１２、２１６、２１１、２１１、２１７、２１８、２１１、２１１、２１２、２１２、２１１、２１１、２２５、２２６、２１１、２１１、２２６、２２７、２１１、２１１、２１２、２１２、２１１、２２８、２２６、２２９、２１１、２１１、２２９、２２６、２１１、２１１、２３０、および２２６に対応する。図９Ｃは、単一および二重遺伝子編集細胞の頻度を示すベン図である。示された二重ｇＲＮＡ発現構築物を有するOVCAR8-ADR-Cas9細胞を、単一細胞としてＦＡＣＳによりプレートした。標的とされたアレルは、全ゲノム増幅単一細胞４０個から、Illumina MiSeqを用いてシーケンシングした。単一細胞の７５％（すなわち３０／４０）および８０％（すなわち３２／４０）は、それぞれ少なくとも１つの変異アレルを、標的BMI1およびPHF8遺伝子座に保持していた。単一細胞の６２．５％（すなわち、２５／４０）は、少なくとも１つの変異アレルを、BMI1とPHF8遺伝子の両方に含んでいた。各単一細胞の２つのアレルの配列を表６に示す。Sangerシーケンシングによる単一細胞由来クローン（図９Ｂ）およびIllumina MiSeqによる全ゲノム増幅された単一細胞(図９Ｃ）から決定された同様の突然変異アレル頻度が観察された。
【００２８】
【図１０ＡＢ】図１０Ａおよび１０Ｂは、コンビナトリアルｇＲＮＡスクリーニングのための生物学的複製の間の、バーコード定量化の高い再現性を示す。図１０Ａは、２ワイズｇＲＮＡライブラリーによる感染後に１５日間培養したOVCAR8-ADR-Cas9細胞についての、２つの生物学的複製の間のバーコード表示（正規化バーコードカウントのｌｏｇ２数値）を比較する散布図を表す。図１０Ｂは、２ワイズｇＲＮＡライブラリーによる感染後に２０日間培養したOVCAR8-ADR-Cas9細胞についての、２つの生物学的複製の間のバーコード表示（正規化バーコードカウントのｌｏｇ２数値）を比較する散布図を表す。Ｒは、ピアソン相関係数である。
【００２９】
【図１１】図１１は、発現構築物内に異なる順序で配置された同一のｇＲＮＡ組合わせの間での、バーコード定量化における一貫した倍数変化を示す。変動係数（ＣＶ；２０日対１５日間培養のOVCAR8-ADR-Cas9細胞についての、正規化バーコードカウントの倍数変化のＳＤ／平均として定義される）は、様々な順序で配置された各２ワイズｇＲＮＡ組合わせについて決定された（すなわち、ｓｇＲＮＡ−Ａ＋ｓｇＲＮＡ−ＢおよびｓｇＲＮＡ−Ｂ＋ｓｇＲＮＡ−Ａ）。細胞増殖スクリーニングにおいて、２ワイズｇＲＮＡの組合わせの８２％より多くはＣＶ＜０．２を有し、２ワイズｇＲＮＡ組合わせの９５％はＣＶ＜０．４を有した。
【００３０】
【図１２Ａ−１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｃは、癌細胞増殖を阻害するｇＲＮＡ対を同定するコンビナトリアルスクリーニングのための、生物学的複製を示す。図１２Ａは、図４Ｂで使用した同じ２ワイズｇＲＮＡライブラリーに感染させたOVCAR8-ADR-Cas9細胞についての、ｌｏｇ２倍数変化を示す。増殖を調節するガイドＲＮＡ対の組合わせ（右パネル）およびそれらのｇＲＮＡ＋対照カウンターの組合わせ（すなわち、遺伝子標的化ｇＲＮＡ＋対照ｇＲＮＡ；左パネル）を、正規化バーコードカウントのｌｏｇ２比で２０日間と１５日間の培養細胞を比較してランク付けした。別の生物学的複製において確認されたｇＲＮＡ組合わせの抗増殖効果は、白抜きの丸で強調されており（図４Ｂ）、対照ｇＲＮＡ対との組合わせは白三角で強調されている。標識されたｇＲＮＡの組合わせは、図４Ｃでさらに確認した。図１２Ｂは、２ワイズｇＲＮＡライブラリーに感染したOVCAR8-ADR-Cas9細胞の２つの生物学的複製間の、２０日対１５日間の培養細胞についての正規化バーコードカウントのｌｏｇ２比を示す、散布図を表す。図１２Ｃは、プールされたスクリーニングにおけるｇＲＮＡの組合わせについてのｌｏｇ２比の頻度分布を示す。示したＬｏｇ２比は、２つの生物学的複製の平均から計算した。
【００３１】
【図１３】図１３は、プールされたスクリーニングと検証データにおける、個々のヒットの間の高い整合性を示す。各２ワイズｇＲＮＡ組合わせについて、プールされたスクリーニングデータ（「スクリーニング表現型」）から得られた２０日対１５日間の培養細胞の正規化バーコードカウントの倍率変化をその相対的細胞生存率に対して、個々の細胞増殖アッセイから決定されたベクター対照（「バリデーション表現型」）と比較してプロットしたものである（Ｒ＝０．９３２）。スクリーニング表現型のデータは、２つの生物学的複製の平均である；個々のバリデーション表現型は、３つの独立した実験の平均を表す。Ｒは、ピアソン相関係数である。
【００３２】
【図１４Ａ−１４Ｆ】図１４Ａ〜１４Ｆは、OVCAR8-ADR細胞における標的遺伝子の、ｓｈＲＮＡ媒介ノックダウンを示す。図１４Ａは、対照ｓｈＲＮＡまたはKDM4Cを標的とするｓｈＲＮＡを発現するOVCAR8-ADR細胞における、KDM4Cの相対的ｍＲＮＡレベルを示す。図１４Ｂは、対照ｓｈＲＮＡまたはBRD4を標的とするｓｈＲＮＡを発現するOVCAR8-ADR細胞における、BRD4の相対的ｍＲＮＡレベルを示す。図１４Ｃは、対照ｓｈＲＮＡまたはKDM6Bを標的とするｓｈＲＮＡを発現するOVCAR8-ADR細胞における、KDM6Bの相対的ｍＲＮＡレベルを示す。ｍＲＮＡレベルはｑＲＴ−ＰＣＲによって定量し、アクチンｍＲＮＡレベルに対して正規化した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。また、図１４Ｄ〜１４Ｆは、対照ｓｈＲＮＡまたはKDM4C、BRD4、もしくはKDM6Bを標的とするｓｈＲＮＡを発現するOVCAR8-ADR細胞における、相対タンパク質レベルのウェスタンブロット分析を示す。測定されたタンパク質レベルは、アクチンレベルに対して正規化し、対照ｓｈＲＮＡ試料に対して正規化し、相対的タンパク質レベルとして下のグラフにプロットした。アスタリスク（＊Ｐ＜０．０５）は、遺伝子標的化ｓｈＲＮＡ対対照ｓｈＲＮＡを発現する細胞間の、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの有意差を表す。
【００３３】
【図１５】図１５は、バーコード化コンビナトリアルｇＲＮＡライブラリーをアセンブルするための戦略を示す。バーコード化ｇＲＮＡオリゴ対を合成し、アニールし、プールされた形式で保存ベクターにクローニングした。ｇＲＮＡ足場配列を有するオリゴを、プールされた保存ベクターライブラリーに挿入して、バーコード化ｓｇＲＮＡライブラリーを作製した。詳細なアセンブリ工程を図１に示す。CombiGEM戦略を用いて、コンビナトリアルｇＲＮＡライブラリーを構築した。ｓｇＲＮＡライブラリーからBglIIおよびMfeI消化により調製されたプールされたバーコード化ｓｇＲＮＡ挿入物を、BamHIおよびEcoRI消化を用いて、デスティネーションベクターで生成された適合するオーバーハングを介してライゲートした。反復ワンポットライゲーションは、一端に連結されたｇＲＮＡに対応するユニークなバーコードを有するｎワイズｇＲＮＡライブラリーを作成し、こうして、プールされた集団内の個々のコンビナトリアルメンバーの、次世代シーケンシングを介した追跡を可能にする。
【００３４】
【図１６Ａ−１６Ｅ】図１６Ａ〜１６Ｅは、OVCAR8-ADR-Cas9細胞の標的ゲノム遺伝子座におけるｇＲＮＡ−での挿入欠失分析についての、ディープシーケンシングからの結果を示す。細胞は、示されたｓｇＲＮＡで１５日間感染させ、次いでディープシーケンシングに供した。図１６Ａは挿入欠失頻度を示す。図１６Ｂはフレームシフト突然変異およびフレーム内突然変異のパーセンテージを示す。図１６Ｃは挿入欠失サイズの分布を示す。図１６Ｄは、単一のｓｇＲＮＡ（KDM4CまたはBRD4）（上のグラフ）、または二重ｇＲＮＡ発現構築物（KDM4またはBRD4）（下のグラフ）で１５日間感染させたOVCAR8-ADR-Cas9細胞における標的ゲノム遺伝子座の、ディープシーケンシングによって分析された挿入欠失の分布を示す。図１６Ｅは、単一のｓｇＲＮＡ（PHF8またはBMI1）（上のグラフ）、または二重ｇＲＮＡ発現構築物（PHF8またはBMI1）（下のグラフ）で１５日間感染させたOVCAR8-ADR-Cas9細胞における標的ゲノム遺伝子座の、ディープシーケンシングによって分析された挿入欠失の分布を示す。
【００３５】
【図１７Ａ−１７Ｃ】図１７Ａ〜１７Ｃは、混合細胞集団内の増殖促進性ｇＲＮＡおよび抗増殖性ｇＲＮＡの頻度の数学的モデリングを示す。図１７Ａは、最初に抗増殖性ｇＲＮＡ（ｆｓ）および増殖促進性（ｆｆ）ｇＲＮＡを含有する細胞の異なる画分（すなわち、２、５または１０％）を有する細胞集団における、増殖促進性ｇＲＮＡおよび抗増殖性ｇＲＮＡの相対頻度のシミュレーションを示す。相対頻度は、最初の時点と比較した、所与の時間におけるバーコード存在量として定義される。この例では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム（ｐ）による遺伝子摂動によって改変された増殖速度を有する細胞の画分を１．０（すなわち１００％）とし、抗増殖性クローンの倍加時間（Ｔdoubling、m）は４８時間である。図１７Ｂおよび１７Ｃは、パラメータ：ｐ、Ｔdoubling、m、ｆｓおよびｆｆの変化に関する、混合細胞集団における抗増殖性ｇＲＮＡのモデル化された相対頻度を示す。図１７Ｂおよび図１７Ｃの各グラフにおいて、線は上から下へ、ｐ＝０．２、ｐ＝０．４、ｐ＝０．６、ｐ＝０．８およびｐ＝１．０を表す。図１７Ａ〜１７Ｃに示すように、増殖促進クローンの倍加時間は１２時間とした。詳細な定義は、例３に記載されている。
【００３６】
【図１８】図１８は、個々のｇＲＮＡ組合わせについてのプールされたスクリーニングデータおよび確認データを示す。各ｇＲＮＡ組合わせについて、プールされたスクリーニングデータから得られた２０日対１５日間の培養細胞（「スクリーニング表現型」）についての正規化されたバーコードカウントの倍数変化を、個々の細胞増殖アッセイから決定されたベクター対照（「バリデーション表現型」）と比較して、その相対的細胞生存率に対してプロットした。各個々のｓｇＲＮＡのスクリーニング表現型は、３つの対照ｓｇＲＮＡのそれぞれと対になった対応するｓｇＲＮＡの倍数変化から平均した。スクリーニングデータのデータは２つの生物学的複製の平均であり、個々の確認データは平均±ＳＤ（ｎ≧３）を表す。
【００３７】
【図１９】図１９は、KDM4C、KDM6B、およびBRD4を標的とするｇＲＮＡの、オンターゲットおよびオフターゲットの挿入欠失生成速度の測定値を示す。各行は、２０ｂｐガイド配列（黒色）に続く３ｂｐのＰＡＭ配列（灰色）に対応するゲノム遺伝子座を表す。太字の黒いフォントの配列は、ｇＲＮＡのオンターゲットゲノム配列を表す。KDM4C-sg1、KDM6B-sg2、およびBRD4-sg3の各破線の下には、ＣＲＩＳＰＲデザイン（Ranra et al., Nature Protocols (2013)8: 2281-2308）およびCCTop（Stemmer、PLoS One(2015)10:e0124633）ツールを用いて同定された、すべての予測されたエキソンオフターゲットゲノム配列が示されている。BRD4-sg2について予測された５つのエキソン／イントロンオフターゲット部位も評価した。下線を付したヌクレオチドは、オフターゲット配列の、オンターゲット配列からの差を強調する。各ゲノム遺伝子座は、〜１０，０００の細胞からＰＣＲ増幅され、＞４２０万回のリードでディープシーケンシングされた。ｎ．ｄ．は、ゲノム配列のＰＣＲがシーケンシングのための特定のアンプリコンを提供できなかったことを示す。上から下への配列は、配列番号３６８〜３９３に対応する。
【００３８】
【図２０ＡＢ】図２０Ａ〜２０Ｂは、KDM4CおよびBRD4フレームシフト突然変異の両方を有するOVCAR8-ADR-Cas9細胞における、減少した増殖を示す。図２０Ａは、KDM4CおよびBRD4フレームシフト突然変異の両方を有する単一細胞拡大OVCAR8-ADR-Cas9突然変異体クローン（すなわち、図９Ｂに示すクローン＃３に由来する）の、細胞増殖アッセイを示す。同数の細胞をプレートし、ＭＴＴアッセイ前に５日間培養した。データは、対照OVCAR8-ADR-Cas9細胞に対する吸光度測定（ＯＤ５７０−ＯＤ６５０）の平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。アスタリスク（＊Ｐ＜０．０１）は、対照細胞と突然変異細胞との間の有意差を表す。図２０Ｂは、図２０Ａの対照および突然変異細胞におけるタンパク質レベルの、イムノブロット分析を表す。
【００３９】
【図２１ＡＢ】図２１Ａ〜２１Ｂは、ｇＲＮＡ発現構築物に感染させたOVCAR8-ADR-Cas9細胞の、ＲＮＡシーケンシング分析を示す。図２１Ａは、それぞれの単一または二重ｇＲＮＡによって標的化されたOVCAR8-ADR-Cas9細胞の各試料（カラム）における、各遺伝子転写物（列）の相対発現レベルを示す、代表的なヒートマップを表す。示されたｇＲＮＡ（単数または複数）に感染したOVCAR8-ADR-Cas9細胞において、ベクター対照と比較して有意に差次的に発現していると同定された転写物は、ヒートマップに含まれる。値は、ｌｏｇ２変換したＦＰＫＭであり、ＲＮＡ−Ｓｅｑを用いて測定し、転写物を中心に平均する。転写物および試料の階層的クラスタリングは、ピアソンの相関に基づいて実施した。図２１Ｂは、ベクター対照と比較した場合、示されたｇＲＮＡで感染させたOVCAR8-ADR-Cas9細胞において同定された、差次的に発現された遺伝子について、生物学的プロセスの上位１０位の豊富な遺伝子セットを示す（Ｑ値＜０．０５）。遺伝子セット（ｙ軸）に関連して差次的に発現された遺伝子のサブセット（ｘ軸）は、表中で灰色に陰影付けされている。
【００４０】
【図２２ＡＢ】図２２Ａ〜２２Ｂは、KDM4CとBRD4、およびKDM6BとBRD4の、さらなる癌細胞系の細胞増殖に対する効果を示す。図２２Ａは、コンビナトリアルｇＲＮＡ発現構築物が、乳癌MDA-MB231-Cas9および膵臓癌Bx-PC3-Cas9細胞において標的蛍光遺伝子を効果的に抑制することを示す。構成的プロモーターから発現されるＲＦＰおよびＧＦＰ遺伝子を含むレンチウイルスベクターを、ＲＦＰおよびＧＦＰ配列を標的とするｇＲＮＡのタンデムＵ６プロモーター駆動発現カセット有りまたは無しで、ＧＦＰおよびＲＦＰ発現の分析のためにフローサイトメトリー下で、MDA-MB231-Cas9およびBx-PC3-Cas9細胞に送達した。詳細な戦略は、図６に記載されている。コンビナトリアルｇＲＮＡ発現構築物をコードするレンチウイルスは、ＲＦＰおよびＧＦＰ蛍光について陽性の細胞の割合を、感染後４日目に減少させた。図２２Ｂは、示された単一またはコンビナトリアルｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染したMDA-MB231-Cas9およびBx-PC3-Cas9細胞を、１４日間培養したことを示す。次いで、同数の感染細胞を再プレートし、さらに５日間培養した。対照ｓｇＲＮＡに対する細胞生存率を、ＭＴＴアッセイによって決定した。データは、生物学的複製からの平均±ＳＤ（ｎ＝６）を表す。アスタリスク（＊Ｐ＜０．０５）は、示された試料間の有意差を表す。これらの結果は、エピジェネティック遺伝子を標的とするコンビナトリアルｇＲＮＡが、細胞の背景に依存して可変表現型を有し得ることを示している。
【００４１】
詳細な説明
２つ以上のｓｇＲＮＡ（ガイド配列および足場配列）を含む複数のＣＲＩＳＰＲシステムの発現のためのベクターおよび遺伝要素の生成は非常に困難であり、伝統的なクローニング法を用いて構築されたＣＲＩＳＰＲシステムのライブラリーの複雑性は、非常に限定されている。本明細書に記載の方法は、連結されたバーコードおよびＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列を有するベクターをもたらす。本方法は、コンビナトリアル遺伝子スクリーニングのための大きなライブラリーを構築するのに、潜在的に高度に効率的であり、多数のオリゴヌクレオチドを容易にプリントすることができ、標的特異性決定領域を有するガイド配列をこれらのオリゴヌクレオチド上にプリントすることができるという事実に影響を及ぼすが、その理由は、ガイド配列およびバーコード要素が短いためである。
【００４２】
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ構築物およびベクターを生成するための超並列コンビナトリアル遺伝学アプローチは、宿主細胞の核酸を標的とすることができるＣＲＩＳＰＲシステムの成分（ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列）を含む遺伝子構築物の、コンビナトリアルセットの迅速な生成を可能にする。この方法はまた、複数の組合わせオーダーのプールされたスクリーニング（例えば、ペアワイズ（２通り）、３ワイズ（３通り）、およびｎワイズ（ｎ通り）の組合わせをプールして同時にスクリーニングすることができる）を可能にし、所定の用途に必要とされる最小限の組合わせを同定する。本明細書に記載の方法を用いて生成されたもの等の遺伝子構築物のコンビナトリアルセットは、細胞プロセスまたは表現型、例えば癌細胞増殖を調節するために相乗的に相互作用する遺伝子および遺伝子経路の同定に、有用であり得る。本明細書にさらに記載されるのは、一緒に阻害された場合に細胞の増殖を減少させるなどの抗癌効果を有する、本明細書に記載のコンビナトリアルＣＲＩＳＰＲ構築物を用いて同定された、エピジェネティック遺伝子の新規な組合わせである。
【００４３】
本開示の側面は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるＰＣＴ公開WO2014/00542に見出すことができる、超並列コンビナトリアル遺伝学アプローチにおいて使用される、遺伝子構築物、遺伝子構築物を含むベクター、コンビナトリアルベクター、およびコンビナトリアルベクターを生成する方法に関する。本明細書において、「遺伝子構築物」は、ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列およびバーコード要素を含む１または２以上のＤＮＡ要素を指し、ここで各ＤＮＡ要素はバーコード要素に関連している。本明細書中で使用する場合、特定のＤＮＡ要素とバーコード要素の間の関連とは、特定のＤＮＡ要素とバーコード要素が、常に同一の遺伝子構築物内に含まれることを意味する。したがって、遺伝子構築物内の特定のバーコード要素の存在または検出は、関連する特定のＤＮＡ要素（単数または複数）もまた、同一の遺伝子構築物内に存在することを示す。
【００４４】
宿主細胞において、ＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列を含むＤＮＡ要素が転写され、宿主細胞内の特定の標的核酸にエンドヌクレアーゼをリクルートするように機能するＣＲＩＳＰＲ小ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成し、その結果、部位特異的ＣＲＩＳＰＲ活性が生じ得る。本明細書において、「ＣＲＩＳＰＲガイド配列」は、宿主細胞中の標的核酸配列に相補的な核酸配列を指す。ＣＲＩＳＰＲガイド配列は、ｓｇＲＮＡを標的核酸配列（標的部位とも呼ばれる）に標的化する。標的核酸に相補的なＣＲＩＳＰＲガイド配列は、１５〜２５ヌクレオチド、１８〜２２ヌクレオチド、または１９〜２１ヌクレオチドの長さであってよい。いくつかの態様において、標的核酸に相補的なＣＲＩＳＰＲガイド配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、標的核酸に相補的なＣＲＩＳＰＲガイド配列は、２０ヌクレオチド長である。
【００４５】
ＣＲＩＳＰＲガイド配列は、ＣＲＩＳＰＲガイド配列が標的核酸にハイブリダイズすることができる場合、宿主細胞中の標的核酸に相補的であることが理解されるであろう。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲガイド配列は、標的核酸に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または少なくとも１００％、相補的である（米国特許第8,697,359号も参照、これはＣＲＩＳＰＲガイド配列と標的ポリヌクレオチド配列の相補性についての教示に関して、参照により組み込まれる）。ＣＲＩＳＰＲガイド配列と標的核酸の３’末端付近の標的核酸との間のミスマッチが、ヌクレアーゼ切断活性を消失させることが実証されている（Upadhyay, et al. Genes Genome Genetics (2013) 3(12):2233-2238）。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲガイド配列は、標的核酸の３’末端（例えば、標的核酸の３’末端の最後の５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド）に、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または少なくとも１００％、相補的である。
【００４６】
ＣＲＩＳＰＲガイド配列は、当分野で知られている任意の供給源から得ることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲガイド配列は、宿主細胞の核酸中に存在する、示された長さの任意の核酸配列であってよい（例えば、ゲノム核酸および／またはゲノム外（extra-genomic）核酸）。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲガイド配列は、転写因子、シグナル伝達タンパク質、トランスポーター等をコードする核酸などの所望の核酸を標的とするように、設計および合成されてもよい。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲガイド配列は、エピジェネティック遺伝子を標的とするよう、設計および合成されてもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲガイド配列は、表２に示されるエピジェネティック遺伝子の任意の組合わせを標的とするように設計されてよい。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲガイド配列は、表１に提供される例示的なＣＲＩＳＰＲガイド配列のいずれかを含む。
【００４７】
本明細書で使用する「足場配列」はtracrＲＮＡとも呼ばれ、相補的なＣＲＩＳＰＲガイド配列に結合（ハイブリダイズ）した標的核酸にエンドヌクレアーゼをリクルートする核酸配列を指す。少なくとも１つのステムループ構造を含み、エンドヌクレアーゼをリクルートする任意の足場配列は、本明細書に記載の遺伝要素およびベクターにおいて使用され得る。例示的な足場配列は当業者に明らかであり、例えば、Jinek, et al. Science (2012) 337(6096):816-821、Ran, et al. Nature Protocols (2013) 8:2281-2308、ＰＣＴ出願WO2014/093694、およびＰＣＴ出願WO2013/176772に見出すことができる。
【００４８】
用語「標的核酸」、「標的部位」および「標的配列」は、本明細書全体で互換的に使用され、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲガイド配列によって標的とされ得る、宿主細胞中の任意の核酸配列をいう。標的核酸には、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が下流（３’側）に隣接し、ＰＡＭは、エンドヌクレアーゼと相互作用し、かつ標的核酸へのエンドヌクレアーゼ活性の標的化にさらに関与し得る。一般に、標的核酸に隣接するＰＡＭ配列は、エンドヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼが由来する供給源に依存すると考えられている。例えば、Streptococcus pyogenesに由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼについては、ＰＡＭ配列はＮＧＧである。Staphylococcus aureus由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼについては、ＰＡＭ配列はＮＮＧＲＲＴである。Neisseria meningitidisに由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼについては、ＰＡＭ配列はＮＮＮＮＧＡＴＴである。Streptococcus thermophilus由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼについては、ＰＡＭ配列はＮＮＡＧＡＡである。Treponema denticola由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼについては、ＰＡＭ配列はＮＡＡＡＡＣである。Cpf1ヌクレアーゼの場合、ＰＡＭ配列はＴＴＮである。
【００４９】
いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列は、別個の転写物として発現される。かかる態様において、ＣＲＩＳＰＲガイド配列はさらに、足場配列の一部に相補的であり、かつ足場配列に結合（ハイブリダイズ）してエンドヌクレアーゼを標的核酸にリクルートするように機能する、さらなる配列を含む。他の態様においてＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列は、単一の転写物として、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれ得るキメラＲＮＡとして、発現される。ｓｇＲＮＡは、標的核酸への結合（ハイブリダイズ）と、標的核酸へのエンドヌクレアーゼのリクルートの両方の、二重の機能を有する。かかる態様において、足場配列は、リンカーループ配列をさらに含んでもよい。
【００５０】
バーコード要素は、遺伝子構築物の識別子として使用することができ、ベクターまたは遺伝要素中の１または２以上の特定のＣＲＩＳＰＲガイド配列の存在を示すことができる。１セットのバーコード要素のメンバーは、各バーコード要素がそのセットの他のバーコード要素と容易に区別できるように、十分にユニークな核酸配列を有する。バーコード要素は、任意の長さのヌクレオチドであり得るが、３０ヌクレオチド未満の長さが好ましい。いくつかの態様において、バーコード要素は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上のヌクレオチドの長さである。バーコード要素の検出および１つのバーコード要素または複数のバーコード要素の核酸配列の決定は、遺伝子構築物の関連するＤＮＡ要素の存在を決定するために使用される。本明細書に記載のバーコード要素は、シーケンシングまたはマイクロアレイ法を含む当技術分野で知られている任意の方法によって、検出することができる。
【００５１】
図１は、本発明に関連する遺伝子構築物の非限定的な例のいくつかの概略図を示す。図１のステップ４において、「ガイド配列」と称されるＣＲＩＳＰＲガイド配列および「足場」と称される足場配列を含むＤＮＡ要素には、「BamHI」で示される第１適合末端要素と、「BglII」で示される第２適合末端要素が隣接しており、これらの末端要素は互いにアニーリングすることができる。遺伝子構築物はまた、「バーコード」と称されるバーコード要素を含み、これには、「EcoRI」で示される第３適合末端要素と、「MfeI」で示される第４適合末端要素が隣接しており、これらの末端要素は互いにアニーリングすることができるが、第１および第２の適合末端要素にアニーリングすることはできない。遺伝子構築物はまた、分離部位を、バーコード要素が分離部位の一方の側に位置し、ＤＮＡ要素が分離部位の他方の側に位置するようにして、含む。図１はまた、ＤＮＡ要素の発現（転写）を可能にする、ＤＮＡ要素の上流（ＤＮＡ要素に対して５’）のプロモーター要素も示す。なお図１は、ＤＮＡ要素がバーコード要素の上流（バーコード要素に対して５’）であるとして示しているが、この配置は逆にすることもできる。
【００５２】
適合末端は、当業者に明らかな様々な方法で作製することができ、種々の異なる配列から構成され得る。本明細書中で使用する場合、「適合末端要素」とは、互いにライゲーションまたはアニーリングすることができるＤＮＡの領域を指す。互いにライゲーションまたはアニーリングすることができる適合末端要素は当業者には明らかであり、互いにヌクレオチド配列が相補的であり、したがって互いに塩基対形成することができる末端要素を指す。いくつかの非限定的な態様において、適合末端要素は、適合オーバーハングを有する制限部位、ギブソンアセンブリ配列、または任意の他のＤＮＡアセンブリ方法の機能性要素であって、以下：リコンビナーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクター／ジンクフィンガーヌクレアーゼ、トランス切断（trans-cleaving）リボザイム／ＤＮＡザイムまたはインテグラーゼなど、を含むものから構成することができる。
【００５３】
いくつかの態様において、ギブソンアセンブリを使用して、適合オーバーハングを生成する。ギブソンアセンブリは、複数のＤＮＡ断片を単一の反応で結合可能な等温ＤＮＡ末端連結技術を指す。この方法は、Gibson et al. (2009) Nature Methods 6:343-5にさらに記載されており、これは参照により組み込まれる。
【００５４】
他の態様において、制限消化を用いて、適合末端を図１に示すように生成する。この方法を使用して、２つのユニークな制限酵素が適合オーバーハングを生成する。これらのオーバーハングをライゲートすると、どちらの酵素によっても認識されない瘢痕（scar）が形成される。適合オーバーハングを生成する任意の制限酵素を使用できることが、理解されるべきである。いくつかの非限定的な態様において、標準的な生物学的部分、例えばBIOBRICKS（登録商標）（The BioBricks Foundation)またはBglBricks（Anderson et al. (2010) Journal of Biological Engineering 4:1）、およびかかる標準的な生物学的部分に関連する酵素が使用される。BIOBRICKS（登録商標）またはBglBricksなどの標準的な生物学的部分の使用は、当業者には日常的である。古典的な制限酵素（Ｉ型、ＩＩまたはＩＩＩ型の制限酵素など）も用いることができるが、他のＤＮＡ切断分子も使用できることが、理解されるべきである。例えば、標的リボザイムは、特定の標的部位の切断に使用することができる。メガヌクレアーゼはまた、挿入されたＤＮＡ要素との干渉の可能性を最小化するために、利用することができる。ＴＡＬＥまたはＺＦヌクレアーゼもまた、長いＤＮＡ部位を標的化して、挿入されたＤＮＡ要素内の内部切断の確率を最小化するために使用することができる。さらに、ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングを用いて、制限消化およびライゲーションを達成することができる。
【００５５】
いくつかの態様において、第１適合末端要素は、制限酵素BamHIによる認識および切断によって生成され、第２適合末端要素は、制限酵素BglIIによる認識および切断によって生成される。いくつかの態様において、第３適合末端要素は、制限酵素MfeIによる認識および切断によって生成され、第４適合末端要素は、制限酵素EcoRIによる認識および切断によって生成される。
【００５６】
本明細書において、遺伝子構築物の「分離部位」は、構築物の線状化を可能にする領域を指す。分離部位は、そこでの切断が構築物を線状化し、追加の遺伝要素の挿入を可能にし得る、構築物の核酸内の部位であることが理解されるべきである。いくつかの態様において、分離部位は、制限酵素認識部位である。例えば図１において、分離部位は、それぞれBamHIおよびEcoRI認識部位によって示される、第１および第４適合末端要素によって形成される。対応する制限酵素（BamHIおよびEcoRI）を用いた構築物の切断は、構築物を線状化し、追加の遺伝子構築物の挿入を可能にする。いくつかの態様において、分離部位は、１つの認識部位によって形成される。いくつかの態様において、分離部位は、２つ以上の認識部位によって形成される。
【００５７】
本発明の側面は、本明細書に記載の遺伝子構築物を含むコンビナトリアルベクターを生成するための方法に関する。図１のステップ３に示すように、この方法は、以下を含有するベクター：「２０ｂｐガイド配列」で示されるＣＲＩＳＰＲガイド配列と、それに隣接する、「BglII」で示される第２適合末端要素、および「BfeI」で示される第１制限酵素に対する第１の認識部位を含む、第１の遺伝子構築物；「バーコード」で示されるバーコード要素と、それに隣接する、「MfeI」で示される第３適合末端要素、および第２制限酵素に対する第２認識部位；を提供することを含む。いくつかの態様において、ベクターは、図２のステップ２に示すように、適合末端を含む第１遺伝子構築物を切断されたベクターにアニーリングおよびライゲートすることによって、生成することができる。いくつかの態様において、第１の遺伝子構築物は、例えばオリゴヌクレオチドアレイ合成によって、合成される。第１遺伝子構築物は、第１認識部位で切断されることができて第５適合末端要素が得られ、第２認識部位で切断されることができて第６適合末端要素が得られる。「BamHI」および「EcoRI」で示される足場配列および分離部位を含む足場要素が提供され、これには、切断されたベクターの第５適合末端要素にアニーリングすることができる第７適合末端要素、および切断されたベクターの第６適合末端要素にアニーリングすることができる第８適合末端要素が隣接する。足場要素は、適合する末端要素を用いて、ベクターの切断された第１遺伝子構築物にアニールされる。アニーリング後、足場要素はＣＲＩＳＰＲガイド配列とバーコード要素の間に組み込まれ、分離部位は足場配列とバーコード要素の間に位置する。
【００５８】
様々な異なる酵素の組合わせを用いて、第１および第２認識部位を切断できることが理解されるべきである。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲガイド配列とバーコード要素の外側に位置する２つの認識部位は、適合末端と足場要素とを生成する同じ制限酵素によって認識される。他の態様において、ＣＲＩＳＰＲガイド配列とバーコード要素の外側に位置する２つの制限部位は、２つの異なる制限酵素によって認識され、その各々は、足場要素を有する適合末端を生成する。
【００５９】
本発明のさらなる側面は、コンビナトリアル構築物、およびコンビナトリアル構築物を生成するための方法に関する。本明細書において、「コンビナトリアル構築物」は、複数のＤＮＡ要素を含む遺伝子構築物を指す。本明細書において、複数のＤＮＡ要素は、１より多くのＤＮＡ要素を指し、各ＤＮＡ要素は、ＣＲＩＳＰＲガイド配列と骨格配列を含む。図１のステップ５に示すように、コンビナトリアル構築物の生成は、本発明に関連する第１遺伝子構築物を含むベクターを、これを遺伝子構築物内の分離部位で切断することにより、線形化することを含むことができる。本発明に関連する第２遺伝子構築物は、切断されたベクターに挿入され、ベクターにアニーリングおよびライゲートされることができる。本明細書において、「挿入物」は、切断されたベクターに挿入されることを意図した遺伝子構築物を指す。いくつかの態様において、挿入物は、ＰＣＲまたは制限消化などによりベクターから精製される。挿入物は、挿入物内の末端の適合末端要素と線状化ベクター内のそれらの適合成分のアニーリングによって、ライゲートすることができる。
【００６０】
図１のステップ５の（ｎ）ワイズガイドＲＮＡライブラリーは、複数のＤＮＡ要素と複数の対応するバーコード要素を含む、組合わせ後のコンビナトリアル構築物を示す。図１のステップ５に示す非限定的な例において、遺伝子構築物は、４つの異なるＤＮＡ要素と４つの対応するバーコード要素を含む。コンビナトリアル構築物はさらに、複数のバーコード要素と複数のＤＮＡ要素との間に位置する分離部位を含む。
【００６１】
コンビナトリアル構築物を生成するための本明細書に記載の方法は、反復的であることができる。例えば、図１に示すコンビナトリアルベクターは、分離部位で再度切断され、さらなる挿入のための分離部位を維持しながら、１または２以上のさらなる挿入物をコンビナトリアル構築物にライゲートすることができる。重要なことに、反復プロセスを通して遺伝子構築物内のＤＮＡ要素の数が増加し続けると、各ＤＮＡ要素に関連するユニークなバーコードは、それらの関連するＤＮＡ要素と同じ遺伝子構築物内に維持される。いくつかの態様において、組合わせプロセスは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１回以上、反復される。いくつかの態様において、プロセスはｎ回反復され、ここでｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０を超える数である。
【００６２】
コンビナトリアル構築物は、任意数のＤＮＡ要素および関連するバーコード要素を含むことができることが、理解されるべきである。いくつかの態様において、コンビナトリアル構築物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、または１００を超えるＤＮＡ要素および関連するバーコード要素を含む。
【００６３】
本発明の別の側面は、単一のバーコード要素に関連する２以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列を含む、遺伝子構築物およびベクターに関する。図２は、本発明に関連する遺伝子構築物の、非限定的な例のいくつかの概略図を示す。図２Ａおよび２Ｂのステップ１は、「２０ｂｐガイド配列Ａ」、「２０ｂｐガイド配列Ｂ」および「２０ｂｐガイド配列Ｃ」と示される３つのＣＲＩＳＰＲガイド配列、「バーコード」によって示されるバーコード要素、および、各ＣＲＩＳＰＲガイド配列の間、およびバーコード要素とバーコード要素に最も近いＣＲＩＳＰＲガイド配列との間に位置する認識部位、を含む遺伝子構築物を示す。いくつかの態様において、バーコード要素は、図２Ａに示すように、ＣＲＩＳＰＲガイド配列の下流に位置してよい。他の態様において、バーコード要素は、図２Ｂに示すように、ＣＲＩＳＰＲガイド配列の上流に位置してよい。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲガイド配列の間およびバーコード要素とバーコード要素に最も近いＣＲＩＳＰＲガイド配列の間に位置する認識部位は、それぞれ異なる制限酵素に対する異なる認識部位である。いくつかの態様において、少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲガイド配列、バーコード要素、および認識部位を含む遺伝子構築物は、オリゴヌクレオチドアレイ合成などの当技術分野で知られた任意の方法によって合成される。
【００６４】
さらに本発明の範囲内であるのは、複数のＤＮＡ要素と１つのバーコード要素を含む、遺伝子構築物である。図２のステップ３において、遺伝子構築物は、それぞれがＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列を含む３つのＤＮＡ要素、バーコード要素、および各ＤＮＡ要素の上流に位置するプロモーター配列、を含む。いくつかの態様において、バーコード要素は、図２Ａに示すように、ＣＲＩＳＰＲガイド配列の下流に位置してよい。他の態様において、バーコード要素は、図２Ｂに示すように、ＣＲＩＳＰＲガイド配列の上流に位置してよい。
【００６５】
本発明の側面は、本明細書に記載の遺伝子構築物を含むコンビナトリアルベクターを生成するための方法に関する。いくつかの態様において、この方法は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列および複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の下流に位置するバーコード要素を含むベクターを、提供することを含む。図２Ａおよび２Ｂのステップ１に見られるように、３つのＣＲＩＳＰＲガイド配列は「２０ｂｐガイド配列Ａ」、「２０ｂｐガイド配列Ｂ」、および「２０ｂｐガイド配列Ｃ」として示し、バーコード要素は「バーコード」で示している。ベクターはまた、複数の制限酵素のための複数の認識部位を含む。図２Ａのステップ１に示すように、各認識部位はＣＲＩＳＰＲガイド配列の下流に位置し、「ＲＥ１」、「ＲＥ２」および「ＲＥ３」によって示される。図２Ｂのステップ１に示すように、各認識部位はＣＲＩＳＰＲガイド配列の上流に位置し、「ＲＥ１」、「ＲＥ２」および「ＲＥ３」によって示される。いくつかの側面において、ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲガイド配列の少なくとも１つの上流に位置する、プロモーター配列を含む。ＣＲＩＳＰＲガイド配列の少なくとも１つの下流の適合末端要素は、当分野で知られている任意の方法によって生成される。いくつかの態様において、ベクターは、認識部位の少なくとも１つにおいて制限酵素で切断されて、第１適合末端要素と第２適合末端要素を生じる。足場要素が提供され、これは足場配列と、任意にプロモーター配列、および切断されたベクターの第１適合末端要素と第２適合末端要素にそれぞれアニーリングすることができる、第３適合末端要素と第４適合末端要素を含む。足場要素は、足場要素内の末端の適合末端要素と、切断されたベクター内のそれらの適合要素のアニーリングによって、切断されたベクターにアニールされる。本明細書に記載の方法は反復的であってよく、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列および１つのバーコード要素を含有する、コンビナトリアルベクターをもたらす。
【００６６】
コンビナトリアルベクターは、１つのバーコード要素に関連する任意の数のＤＮＡ要素を含むことができることが、理解されるべきである。いくつかの態様において、コンビナトリアル構築物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、または１０１以上のＤＮＡ要素および１つのバーコード要素を含む。１つのバーコード要素に関連するＤＮＡ要素の数は、ＣＲＩＳＰＲガイド配列、バーコード、および認識部位を含む、合成可能な遺伝子構築物の長さに依存し得る。
【００６７】
本明細書に記載の構築物またはベクターのいずれかにおいて、１または２以上のＲＮＡドメインを、１または２以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列に挿入することができる。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲガイド配列は、１または２以上のＲＮＡドメインに融合される。いくつかの態様において、ＲＮＡは、非コードＲＮＡまたはその断片である。かかる態様において、ＲＮＡドメインは、ＤＮＡ座に標的化され得る。かかる構築物またはベクターは、ＣＲＩＳＰＲディスプレイのために使用され得る。
【００６８】
本発明のさらなる側面は、遺伝子構築物またはベクター内の１または２以上のＤＮＡ要素を同定するための方法に関する。組合わせ事象の後、特定のＤＮＡ要素（単数または複数）と関連するユニークなバーコードは、特定のＤＮＡ要素と同じ遺伝子構築物内にとどまる。したがって、バーコード要素または複数のバーコード要素の同定は、同じ遺伝子構築物内の関連するＤＮＡ要素または複数のＤＮＡ要素の同定を可能にする。いくつかの態様において、バーコード要素および／またはＤＮＡ要素の配列は、シーケンシングまたはマイクロアレイ分析によって決定される。ＤＮＡ配列を決定する任意の手段は、１または２以上のバーコード要素および対応するＤＮＡ要素の同定に適合可能であることが、理解されるべきである。重要なことに、図１のステップ５に示されるようなコンビナトリアル構築物において、複数のバーコード要素は互いに近接しているので、複数のバーコード要素、したがって複数のＤＮＡ要素を、ＤＮＡシーケンシングなどの方法によって同時に、迅速に同定することが可能である。
【００６９】
本発明のさらなる側面は、超並列コンビナトリアル遺伝学の方法と適合する、本明細書に記載の２または３以上の遺伝子構築物を含むライブラリーに関する。本明細書において、遺伝子構築物のライブラリーは、２または３以上の遺伝子構築物の集合を指す。いくつかの態様において、各ユニークなＤＮＡ要素がプラスミド上に存在する、遺伝子構築物のライブラリーが生成される。このプラスミドライブラリーをプールして、ベクターライブラリーを形成することができる。挿入物ライブラリーは、例えば、ベクターライブラリー上でＰＣＲを行うことによって生成することができる。第１の組合わせ事象において、全てのベクターをすべての挿入物と対にして、ペアワイズ組合わせの完全なコンビナトリアルセットを生成することができる。このペアワイズライブラリーと挿入物ライブラリーとの間のさらなる反応は、単一ベクターライブラリーから生じるトリワイズ、クワッドワイズまたはクワッドワイズより上のライブラリーを導くことができる。コンビナトリアル構築物のライブラリーを使用して、コンビナトリアル構築物の前記ライブラリーを発現する宿主細胞のスクリーニングを行うことができる。いくつかの態様において、コンビナトリアル構築物のライブラリーは、ＤＮＡ要素または、ＤＮＡ要素と、表１に示される例示的なＣＲＩＳＰＲガイド配列などのエピジェネティック遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲガイド配列との組合わせを、含む。
【００７０】
コンビナトリアル工程はin vitroで行われるので、この技術は、ＤＮＡを受容することができる任意の宿主細胞または生物に拡大縮小することができることが、理解されるべきである。いくつかの態様において、宿主細胞は細菌細胞である。いくつかの態様において、生物は細菌であり、構築物はプラスミドまたはファージ上に担持される。いくつかの態様において、宿主細胞は酵母細胞である。他の態様において、生物は酵母であり、構築物はプラスミドまたはシャトルベクター上に担持される。他の態様において、宿主細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である。かかる態様において、本明細書に記載される遺伝子構築物は、プラスミド上に担持され得るか、またはレンチウイルスもしくはアデノウイルスなどのウイルスによって送達されることができる。
【００７１】
本明細書に記載の遺伝子構築物およびベクターは、ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列を含むＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素の発現に関する。ＣＲＩＳＰＲシステムが発現される宿主細胞は、エンドヌクレアーゼなどの１または２以上のさらなるＣＲＩＳＰＲ成分を発現し得る。いくつかの態様において、宿主細胞は、エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓエンドヌクレアーゼも発現する。いくつかの態様において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。いくつかの態様において、宿主細胞は、Streptococcus pyogenes、Staphylococcus aureus、 Neisseria meningitidis、Streptococcus thermophilus、またはTreponema denticola由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを発現する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、宿主細胞または生物における発現のためにコドン最適化されてもよい。いくつかの態様において、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ホモロジーまたはオルソログである。
【００７２】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに修飾して、タンパク質の活性を改変する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ９である。例えば、ｄＣａｓ９は、触媒的に活性な残基（D10およびH840）の変異を含み、ヌクレアーゼ活性を有さない。代替的にまたはさらに、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、別のタンパク質またはその一部に融合されてもよい。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、KRABドメインなどのリプレッサードメインに融合される。いくつかの態様において、かかるｄＣａｓ９融合タンパク質は、多重遺伝子抑制（例えば、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ））のために本明細書に記載の構築物と共に用いられる。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、VP64またはVPRなどのアクチベータードメインに融合される。いくつかの態様において、かかるｄＣａｓ９融合タンパク質は、多重遺伝子活性化（例えば、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ））のために本明細書に記載の構築物と共に使用される。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、ヒストンデメチラーゼドメインまたはヒストンアセチルトランスフェラーゼドメインなどのエピジェネティック調節ドメインに融合される。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、LSD1またはp300、またはその一部に融合される。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９融合物は、ＣＲＩＳＰＲに基づくエピジェネティックな調節のために使用される。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９またはＣａｓ９は、Fok1ヌクレアーゼドメインに融合される。いくつかの態様において、Fok1ヌクレアーゼドメインに融合されたＣａｓ９またはｄＣａｓ９は、多重遺伝子編集に使用される。いくつかの態様において、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９は、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、mCherryなど）に融合される。いくつかの態様において、蛍光タンパク質に融合されたＣａｓ９／ｄＣａｓ９タンパク質は、ゲノム遺伝子座の多重標識および／または可視化のために使用される。
【００７３】
代替的またはさらに、エンドヌクレアーゼはCpf1ヌクレアーゼである。いくつかの態様において、宿主細胞は、Provetella種またはFrancisella種に由来するCpf1ヌクレアーゼを発現する。いくつかの態様において、Cpf1ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、宿主細胞または生物における発現のためにコドン最適化されてもよい。
【００７４】
本発明は、原核細胞および真核細胞を含む、ＤＮＡが導入され得る任意の細胞型を包含する。いくつかの態様において、細胞は細菌細胞であり、例えば、Escherichia種、Streptomyces種、Zymonas種、Acetobacter種、Citrobacter種、Synechocystis種、Rhizobium種、Clostridium種、Corynebacterium種、Streptococcus種、Xanthomonas種、Lactobacillus種、Lactococcus種、Bacillus種、Alcaligenes種、Pseudomonas種、Aeromonas種、Azotobacter種、Comamonas種、Mycobacterium種、Rhodococcus種、Gluconobacter種、Ralstonia種、Acidithiobacillus種、Microlunatus種、Geobacter種、Geobacillus種、Arthrobacter種、Flavobacterium種、Serratia種、Saccharopolyspora種、Thermus種、Stenotrophomonas種、Chromobacterium種、Sinorhizobium種、Saccharopolyspora種、Agrobacterium種、およびPantoea種である。細菌細胞は、Escherichia coli（E. coli）細胞などのグラム陰性細胞、またはBacillus種などのグラム陽性細胞であることができる。
【００７５】
他の態様において、細胞は、酵母細胞などの真菌細胞、例えば、Saccharomyces種、Schizosaccharomyces種、Pichia種、Phaffia種、Kluyveromyces種、Candida種、Talaromyces種、Brettanomyces種、Pachysolen種、Debaryomyces種、Yarrowia種、および工業的ポリポイド酵母株である。好ましくは、酵母株は、S. cerevisiae株である。真菌の他の例としては、Aspergillus種、Penicillium種、Fusarium種、Rhizopus種、Acremonium種、Neurospora種、Sordaria種、Magnaporthe種、Allomyces種、Ustilago種、Botrytis種、およびTrichoderma種が挙げられる。
他の態様において、細胞は、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞、げっ歯類細胞または哺乳動物細胞であり、これは、げっ歯類細胞またはヒト細胞（例えば、ヒト胎児腎臓細胞（例えば、HEK293T細胞））、ヒト真皮線維芽細胞、OVCAR8細胞もしくはOVCAR8-ADR細胞などのヒト癌細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は、ヒト卵巣癌細胞などのヒト癌細胞である。
【００７６】
本明細書でさらに提供されるのは、エピジェネティック遺伝子を標的とする阻害剤を含む組成物である。本明細書において、用語「エピジェネティック遺伝子」は、細胞内の別の分子またはプロセスのエピジェネティックな調節に影響を与える、任意の遺伝子を指す。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子は、エピジェネティックな調節に関与するタンパク質をコードする。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子は、エピジェネティックな調節に影響を与えるＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）などの核酸をコードする。一般にエピジェネティクスは、細胞のゲノムＤＮＡの突然変異を伴わない、分子またはプロセスに対する任意の改変を指す（Jaenisch and Bird Nat。Gene。(2003)33:245-254）。エピジェネティックな調節には、細胞内でのＤＮＡ媒介プロセスが関与し、例えば、転写、ＤＮＡ修復、および、以下の機構を介した複製が関与する：ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、ヌクレオソームリモデリング、およびＲＮＡ媒介標的化（Dawson and Kouzarides Cell（2012）150（1）： 12-27）。エピジェネティック遺伝子の非限定的な例としては、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L、MBD1、MBD2、CREBBP、EP300、HDAC1、HDAC2、SIRT1、CARM1、EZH1、EZH2、MLL、MLL2、NSD1、PRMT1、PRMT2、PRMT3、PRMT5、PRMT6、PRMT7、SETD2、KDM1A、KDM1B、KDM2A、KDM2B、KDM3A、KDM3B、KDM4A、KDM4B、KDM4C、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D、KDM6A、KDM6B、PHF2、PHF8、BMI1、BRD1、BRD3、BRD4、ING1、ING2、ING3、ING4、およびING5が挙げられる。
【００７７】
本明細書において、用語「阻害剤」は、任意の分子、例えばタンパク質、核酸、または小分子であって、エピジェネティック遺伝子の発現を低減または防止する、またはエピジェネティック遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を低減または防止するものを指す。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子の２または３以上の阻害剤の組合わせは、エピジェネティック遺伝子の発現を、阻害剤の組合わせの不在下でのエピジェネティック遺伝子の発現と比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または少なくとも６５％、低減する。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子の２または３以上の阻害剤の組合わせは、エピジェネティック遺伝子がコードするタンパク質の活性を、阻害剤の組合わせの不在下でエピジェネティック遺伝子がコードするタンパク質の活性と比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または少なくとも６５％、低減する。
【００７８】
いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子の阻害剤の組合わせは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または少なくとも１０もしくは１１種以上のエピジェネティック遺伝子の阻害剤を含む。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子の阻害剤の組合わせは、エピジェネティック遺伝子の２つの阻害剤を含む。いくつかの態様において、阻害剤の組合わせは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１以上のエピジェネティック遺伝子を阻害する。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子の阻害剤の組合わせは、２つのエピジェネティック遺伝子を標的として阻害する、２つの阻害剤を含む。
【００７９】
いくつかの態様において、阻害剤の組合わせの少なくとも１つの阻害剤は、直接的または間接的に、エピジェネティック遺伝子の発現を低減もしくは防止するか、またはエピジェネティック遺伝子がコードするタンパク質の活性を低減もしくは防止する、タンパク質である。例えばタンパク質は、エピジェネティック遺伝子の発現を低減または防止するリプレッサー、またはエピジェネティック遺伝子がコードするタンパク質のアロステリック阻害剤であってよい。いくつかの態様において、２または３以上の阻害剤は、２または３以上のエピジェネティック遺伝子を標的とするタンパク質である。いくつかの態様において、２または３以上の阻害剤は、表２に示されるエピジェネティック遺伝子の任意の組合わせを標的とするタンパク質である。
【００８０】
いくつかの態様において、阻害剤の組合わせの少なくとも１つの阻害剤は、エピジェネティック遺伝子の発現を低減もしくは防止するか、またはエピジェネティック遺伝子がコードするタンパク質の活性を低減もしくは防止する、核酸である。いくつかの態様において、核酸は、足場配列とともにエンドヌクレアーゼをエピジェネティック遺伝子にリクルートする、ＣＲＩＳＰＲガイド配列である。いくつかの態様において、２または３以上の阻害剤は、２または３以上のエピジェネティック遺伝子を標的とする、ＣＲＩＳＰＲガイド配列である。いくつかの態様において、２または３以上の阻害剤は、表２に示すエピジェネティック遺伝子の組合わせのいずれかを標的とする、ＣＲＩＳＰＲガイド配列である。いくつかの態様において、２または３以上の阻害剤は、表１に提供されるエピジェネティック遺伝子を標的とする例示的なＣＲＩＳＰＲガイド配列から選択される、ＣＲＩＳＰＲガイド配列である。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子の組合わせは、BRD4とKDM4Cを含む。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子の組合わせは、BRD4とKDM6Bを含む。
【００８１】
いくつかの態様において、核酸は、細胞のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路によって処理されて、標的遺伝子の発現を沈黙させる（例えば、ｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質産生を低減する）、ｓｈＲＮＡである。いくつかの態様において、２または３以上の阻害剤は、２または３以上のエピジェネティック遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡである。いくつかの態様において、２または３以上の阻害剤は、表２に示すエピジェネティック遺伝子の組合わせのいずれかを標的とする、ｓｈＲＮＡである。いくつかの態様において、２または３以上の阻害剤は、表４に提供されるエピジェネティック遺伝子を標的とする例示的なｓｈＲＮＡから選択される、ｓｈＲＮＡである。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子の組合わせは、BRD4とKDM4Cを含む。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子の組合わせは、BRD4とKDM6Bを含む。
【００８２】
いくつかの態様において、阻害剤の組合わせの少なくとも１つの阻害剤は、エピジェネティック遺伝子の発現を低減もしくは防止する、またはエピジェネティック遺伝子がコードするタンパク質の活性を低減もしくは防止する、小分子である。いくつかの態様において、２または３以上の阻害剤は、２または３以上のエピジェネティック遺伝子を標的とする、小分子である。いくつかの態様において、２または３以上の阻害剤は、表２に示すエピジェネティック遺伝子の組合わせのいずれかを標的とする、小分子である。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子の組合わせは、BRD4とKDM4Cを含む。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子の組合わせは、BRD4とKDM6Bを含む。
【００８３】
BRD4の発現を低減もしくは防止するか、またはBRD4によってコードされるタンパク質の活性を低減もしくは防止する任意の小分子は、本明細書に記載の組成物および方法と適合し得る。BRD4阻害剤の例としては、限定はされないが、JQ1（（６Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２，３，９−トリメチル−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−酢酸１，１−ジメチルエチルエステル）、MS417（メチル［（６Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２，３，９−トリメチル−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−イル］アセテート）、またはRVX-208（２−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）−３，５−ジメチルフェニル］−５，７−ジメトキシ−４（３Ｈ）−キナゾリノン）が挙げられる。いくつかの態様において、BRD4阻害剤はJQ1である。さらなるBRD4阻害剤は当業者に明らかであり、例えば、ＰＣＴ公報WO 2014/154760 A1、およびVidler et al. J. Med. Chem. (2013) 56: 8073-8088に見出すことができる。
【００８４】
KDM4C（JMJD2とも呼ばれる）の発現を低減もしくは防止するか、またはKDM4Cによってコードされるタンパク質の活性を低減もしくは防止する任意の小分子は、本明細書に記載の組成物および方法と適合し得る。いくつかの態様において、KDM4C阻害剤は、SD70（Ｎ−（フラン−２−イル（８−ヒドロキシキノリン−７−イル）メチル）イソブチルアミド）またはカフェ酸である。さらなるKDM4C阻害剤は当業者に明らかであり、例えば、Leurs et al. Bioorg. & Med. Chem. Lett. (2012) 22(12): 5811-5813およびHamada et al. Bioorg. & Med. Chem. Lett. (2009) 19: 2852-2855に見出すことができる。
【００８５】
KDM6B（JMJD3とも呼ばれる）の発現を低減もしくは防止するか、またはKDM6Bによってコードされるタンパク質の活性を低減もしくは防止する任意の小分子は、本明細書に記載の組成物および方法と適合し得る。KDM6Ｂ阻害剤の例としては、限定はされないが、GSK-J4（エチル３−（（６−（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］アゼピン−３（２Ｈ）−イル）−２−（ピリジン−２−イル）ピリミジン−４−イル）アミノ）プロパノエート、モノ塩酸塩）、GSK-J1（Ｎ−［２−（２−ピリジニル）−６−（１，２，４，５−テトラヒドロ−３Ｈ−３−ベンズアゼピン−３−イル）−４−ピリミジニル］−β−アラニン）、およびIOX1（８−ヒドロキシ−５−キノリンカルボン酸；８−ヒドロキシ−５−キノリンカルボン酸）が挙げられる。いくつかの態様において、KDM6B阻害剤はGSK-J4である。さらなるKDM4C阻害剤は、当業者に明らかである。
【００８６】
２または３以上の阻害剤の組合わせは、２または３以上のタンパク質阻害剤、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列、２または３以上のｓｈＲＮＡ、または２または３以上の小分子阻害剤を含み得る。いくつかの態様において、２または３以上の阻害剤は、異なる種類の阻害剤（例えば、タンパク質、核酸、小分子）である。いくつかの態様において、組合わせは、タンパク質阻害剤および１または２以上のさらなる阻害剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲガイド配列、ｓｈＲＮＡ、および／または小分子阻害剤）を含む。他の態様において、組合わせは、ＣＲＩＳＰＲガイド配列および１または２以上のさらなる阻害剤（例えば、タンパク質、ｓｈＲＮＡ、および／または小分子阻害剤）を含む。他の態様において、組合わせは、ｓｈＲＮＡおよび１または２以上のさらなる阻害剤（例えば、タンパク質、ＣＲＩＳＰＲガイド配列、および／または小分子阻害剤）を含む。他の態様において、組合わせは、小分子阻害剤および１または２以上のさらなる阻害剤（例えば、タンパク質、ｓｈＲＮＡ、および／またはｓｈＲＮＡ）を含む。
【００８７】
本明細書に記載の方法および組成物は、癌細胞または増殖の低下が望まれる他の細胞などの細胞の増殖を低減するために、有用であり得る。いくつかの態様において、細胞を、エピジェネティック遺伝子の２または３以上の阻害剤の組合わせ（例えば、表２に示されるエピジェネティック遺伝子を標的とする阻害剤の組合わせ）と接触させると、細胞の増殖が部分的または完全に低減される。いくつかの態様において、細胞を、エピジェネティック遺伝子の２または３以上の阻害剤の組合わせと接触させると、阻害剤の組合わせと接触していない細胞と比較して、細胞の増殖が部分的にまたは完全に低減される。いくつかの態様において、細胞をエピジェネティック遺伝子の２または３以上の阻害剤の組合わせと接触させると、阻害剤の組合わせと接触していない細胞と比較して、細胞の増殖が少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または少なくとも６５％、低減される。いくつかの態様において、細胞を、エピジェネティック遺伝子の２または３以上の阻害剤の組合わせと接触させると、癌細胞の増殖は、阻害剤の組合わせと接触している非癌細胞と比較して、部分的または完全に低減される。細胞増殖は、当技術分野で知られている任意の方法によって、例えば細胞生存率アッセイ、ＭＴＴアッセイ、またはＢｒｄＵ細胞増殖アッセイを用いて、評価および定量することができる。
【００８８】
本発明の他の側面は、対象における癌を処置するための方法および組成物に関する。癌は、制御不能または異常に制御された細胞増殖および他の悪性細胞特性を特徴とする疾患である。本明細書において、「癌」という用語は、当技術分野で知られている任意の種類の癌を指し、これには限定なく、乳癌、胆道癌、膀胱癌、脳癌、子宮頸癌、絨毛癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、血液新生物、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、毛状細胞白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、上皮内新生物、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、および腎癌が含まれる。癌細胞は、in vivo（すなわち、生物中）、ex vivo（すなわち、生物から除去され、in vitroで維持される）、またはin vitroにおける癌細胞であってよい。
【００８９】
この方法は、対象に、エピジェネティック遺伝子の２または３以上の阻害剤の組合わせを有効量で投与することを含む。いくつかの態様において、対象は、癌を有するか、有すると疑われるか、または発症するリスクのある対象である。いくつかの態様において、対象は哺乳動物対象であり、限定されないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、げっ歯類または霊長類を含む。いくつかの態様において、対象は、患者などのヒト対象である。ヒト対象は、小児または成人対象であってよい。対象が癌を有する「リスクがある」とみなされるか否かは、熟練した医師が決定することができる。
【００９０】
本明細書において、「処置する」とは、疾患を、改善する、治癒する、悪化を防止する、進行の速度を低下させる、または再発を防止する（すなわち、再発防止）ことが含まれる。組成物の有効量は、組成物の治療効果をもたらす量を指す。例えば、対象における癌を処置するための方法において、エピジェネティック遺伝子を標的とする阻害剤の組合わせの有効量は、例えば癌細胞の増殖を低減もしくは防止する、または癌細胞に細胞毒性であるなどの、抗癌効果を提供する任意の量である。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子を標的とする阻害剤の有効量は、エピジェネティック遺伝子を標的とする１または２以上の追加の阻害剤と同時に、またはこれと組み合わせて投与した場合に、エピジェネティック遺伝子を標的とする１または２以上の追加の阻害剤の不在下で投与した場合の阻害剤の有効量と比べて、低減される。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子を標的とする阻害剤は、エピジェネティック遺伝子を標的とする１または２以上の追加の阻害剤の不在下で投与した場合に、癌細胞の増殖を低減または防止しない。
【００９１】
エピジェネティック遺伝子を標的とする阻害剤またはエピジェネティック遺伝子（例えば、表２に示されるエピジェネティック遺伝子の組合わせ）を標的とする阻害剤の組合わせは、当分野で知られている任意の方法を用いて、対象に投与され得る。いくつかの態様において、阻害剤は、局所、経腸、または非経口の投与経路によって投与される。いくつかの態様において、阻害剤は、静脈内、筋肉内、または皮下に投与される。
【００９２】
本明細書に記載されるエピジェネティック遺伝子の任意の阻害剤は、当分野で知られている任意の方法によって、対象に投与されるか、または細胞に送達されるか、または細胞と接触されてよい。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子の阻害剤は、細胞に、ナノ粒子、細胞透過性ペプチド、ポリマー、リポソーム、または組換え発現ベクターによって、送達される。他の態様において、エピジェネティック遺伝子の阻害剤は、１または２以上のナノ粒子、細胞透過性ペプチド、および／またはポリマーに、コンジュゲートされる。他の態様において、エピジェネティック遺伝子の阻害剤は、リポソーム内に含有される。
【００９３】
さらに提供されるのは、細胞または細胞集団の増殖を低減または防止するエピジェネティック遺伝子の阻害剤の組合わせを同定するための方法である。図４Ａに示すように、方法は、細胞の２つの集団を、エピジェネティック遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列（例えば、バーコード化ＣＲＩＳＰＲライブラリー）およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼのコンビナトリアルライブラリーと、接触させることを含む。細胞の２つの集団は、異なる持続時間の間培養される。例えば、１つの細胞集団を１５日間培養し、他の細胞集団を２０日間培養する。２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列の組合わせの同定は、細胞の各集団について、例えばシーケンシング法によって決定される。例えば、ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列は、ＣＲＩＳＰＲガイド配列のユニークな識別子であるバーコードをシーケンシングすることによって、同定することができる。より長い時間培養された細胞の集団におけるＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の各組合わせの存在量を、より短い時間培養された細胞の集団におけるＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の各組合わせの存在量と比較する。細胞の増殖を低減させたＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の組合わせの存在量は、より長い時間培養された細胞の集団において、より短い時間培養された細胞の集団よりも少ないであろう。かかる組合わせは、細胞増殖を低減するエピジェネティック遺伝子の阻害剤の組合わせとして、同定される。
【００９４】
阻害された場合に細胞または細胞集団の増殖を低減または防止するエピジェネティック遺伝子の組合わせを同定するための、他の方法が提供される。図４Ａに示すように、方法は、細胞の２つの集団を、エピジェネティック遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列（例えば、バーコード化ＣＲＩＳＰＲライブラリー）およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼのコンビナトリアルライブラリーと、接触させることを含む。細胞の２つの集団は、異なる持続時間の間培養される。例えば、１つの細胞集団を１５日間培養し、他の細胞集団を２０日間培養する。２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列の組合わせの同定は、細胞の各集団について、例えばシーケンシング法によって決定される。例えば、ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列は、ＣＲＩＳＰＲガイド配列のユニークな識別子であるバーコードをシーケンシングすることによって、同定することができる。より長い時間培養された細胞の集団におけるＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の各組合わせの存在量を、より短い時間培養された細胞の集団におけるＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の各組合わせの存在量と比較する。細胞の増殖を低減したＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の組合わせの存在量は、より長い時間培養された細胞の集団において少ないであろう。かかる組合わせは、細胞増殖を低減または防止する阻害剤により標的化され得るエピジェネティック遺伝子の組合わせとして、同定される。
【００９５】
いくつかの態様において、本発明に関連するエピジェネティック遺伝子を標的とする１または２以上の遺伝子または阻害剤は、組換え発現ベクターにおいて発現される。本明細書において、「ベクター」は、所望の配列（単数または複数）が、制限およびライゲーション（例えば、CombiGEM法を使用して）により、または異なる遺伝子環境間の輸送のためもしくは宿主細胞（例えば、癌細胞）での発現のための組換えによって挿入され得る、多数の核酸のいずれかであってよい。ベクターは典型的にはＤＮＡからなるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。ベクターには、限定はされないが、プラスミド、フォスミド、ファージミド、ウイルスゲノムおよび人工染色体が含まれる。いくつかの態様において、ベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子を標的とする２または３以上の遺伝子または阻害剤は、同じ組換え発現ベクター上に発現される。いくつかの態様において、エピジェネティック遺伝子を標的とする２または３以上の遺伝子または阻害剤は、２または３以上の組換え発現ベクター上に発現される。
【００９６】
クローニングベクターは、自律的に複製することができるか、または宿主細胞中のゲノムに組み込まれたものであり、ベクターが決定可能な様式で切断され所望のＤＮＡ配列がライゲートされ得る１または２以上のエンドヌクレアーゼ制限部位によって、または適合末端を有する挿入物が組み込まれ得て、新しい組換えベクターが宿主細胞中で複製するその能力を保持する制限部位によって、さらに特徴付けられる。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、宿主細菌などの宿主細胞内でプラスミドのコピー数が増加するにつれて何回でも、または宿主が有糸分裂によって複製する前に宿主あたりわずか１回だけ、起こり得る。ファージの場合、複製は、溶解相の間に能動的に、または溶原相の間に受動的に、起こり得る。
【００９７】
発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列が、制限およびライゲーションまたは組換えによって挿入され得て、これが調節配列に作動可能に連結されて、ＲＮＡ転写物として発現されることができるものである。ベクターはさらに、ベクターで形質転換またはトランスフェクトされているかまたはいない細胞の同定に用いるのに適した、１または２以上のマーカー配列を含むことができる。マーカーは、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性のいずれかを増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、その活性が当分野で知られている標準的なアッセイによって検出可能な酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、および、形質転換されたかトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニー、またはプラークの表現型に、視覚的に影響を与える遺伝子を含む（例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）。好ましいベクターは、それらが作動可能に連結されているＤＮＡセグメント中に存在する構造遺伝子産物の、自己複製および発現が可能なベクターである。
【００９８】
本明細書において、コード配列および調節配列が「作動可能に」連結されると言われるのは、コード配列の発現または転写を制御配列の影響または制御下に置くような様式で、共有結合される場合である。コード配列が機能的タンパク質に翻訳されることが望ましい場合に、２つのＤＮＡ配列が作動可能に連結されていると言われるのは、５’調節配列中のプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、および、２つのＤＮＡ配列の間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入をもたらさず、（２）コード領域の転写を指令するプロモーター領域の能力を妨害せず、または（３）対応するＲＮＡ転写物をタンパク質に翻訳する能力を妨害しない場合である。したがって、プロモーター領域がコード配列に作動可能に連結されるのは、プロモーター領域が、得られる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得るように、そのＤＮＡ配列の転写に影響を及ぼすことができる場合であろう。
【００９９】
核酸分子が細胞内で発現される場合、様々な転写制御配列（例えば、プロモーター／エンハンサー配列）を用いてその発現を指向させることができる。プロモーターは、天然のプロモーター、すなわちその遺伝子の発現の正常な調節を提供する、その内因性の状況における遺伝子のプロモーターであり得る。いくつかの態様において、プロモーターは構成的であり得る、すなわち、プロモーターは調節されておらず、その関連遺伝子の継続的な転写を可能にする。種々の条件付プロモーターも使用することができ、例えば、分子の存在または不在により制御されるプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、例えば哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターはヒトユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣｐ）である。いくつかの態様において、プロモーターはウイルスプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶｐ）である。いくつかの態様において、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーター、マウスＵ６プロモーター、ブタＵ６プロモーターが挙げられる。いくつかの態様において、プロモーターはＵ６プロモーター（Ｕ６ｐ）である
【０１００】
遺伝子発現のために必要とされる調節配列の正確な性質は、種または細胞型によって異なるが、一般に、必要に応じて、転写および翻訳の開始にそれぞれ関与する５’非転写および５ｖ非翻訳配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含む。特に、かかる５’非転写調節配列は、作動可能に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含む、プロモーター領域を含む。調節配列はまた、必要に応じてエンハンサー配列または上流アクチベーター配列を含み得る。本発明のベクターは、５’リーダーまたはシグナル配列を任意に含み得る。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。
【０１０１】
発現に必要な全ての要素を含む発現ベクターは市販されており、当業者に知られている。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012を参照。細胞は、異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）の、細胞への導入によって遺伝子操作される。その異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）は、転写要素の作動可能な制御下に置かれて、宿主細胞における異種ＤＮＡの発現を可能にする。
本発明に関連する核酸分子は、当技術分野で標準的な方法および技術を用いて、細胞（単数または複数）に導入することができる。例えば、核酸分子は、化学的形質転換およびエレクトロポレーション、ウイルス形質導入、粒子衝撃などを含む形質転換などの標準的なプロトコルによって、導入することができる。いくつかの態様において、ウイルス形質導入は、レンチウイルスを用いて達成される。核酸分子の発現はまた、核酸分子をゲノムに組み込むことによって達成され得る。
【０１０２】
本発明は、その用途において、以下の説明に示され図面に描かれた構成要素の構成および配置の詳細に、限定されない。本発明は別の態様でも可能であり、様々な方法で実施または実行されることができる。また、本明細書で使用される表現および用語は、説明目的のためであり、限定とみなされるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」、または「有する」、「含有する」、「伴う」、およびそれらのバリエーションの使用は、その後に列挙される項目およびその均等物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
本発明は、以下の実施例によりさらに例示されるが、これらはさらなる限定として解釈されるべきではない。本出願を通して引用された参考文献（参考文献、発行済み特許、公開特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）は、特に本明細書に引用された教示について、ここに参照によって明示的に組み込まれる。
【実施例】
【０１０３】
例１
図１に示すように、バーコード化ＣＲＩＳＰＲ分子の高複雑性コンビナトリアルライブラリーを、本明細書に記載の方法を用いて作製することができる。ステップ１では、大規模ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）ライブラリーを、各ＣＲＩＳＰＲガイド配列についての順方向および逆方向オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴＦ−ＡおよびオリゴＲ−Ａ；オリゴＦ−ＢおよびオリゴＲ−Ｂ）を含む、アレイベースのオリゴヌクレオチド合成を用いて生成した。合成されたオリゴヌクレオチドの長さは、最終生成物ライブラリーの複雑性とは無関係である。次にステップ２において、ｇＲＮＡについてのオリゴヌクレオチド対を単離してアニールする。各ｇＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドは、２０塩基対のＣＲＩＳＰＲガイド配列、２つのBbsI部位、およびバーコード要素を含む。オリゴヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオチドの保存ベクターへのライゲーションのための５’および３’一本鎖オーバーハング領域を含んでよい。ステップ３において、BbsIおよびMfeIオーバーハングを含むアニールされたオリゴ対を、ｇＲＮＡライブラリーをBbsIとMfeIで消化したAWp28保存ベクターに挿入するためのワンポットライゲーション反応用に、一緒にプールした。これにより、それぞれがＣＲＩＳＰＲガイド配列、２つのBbsI部位、およびバーコード要素を含むAWp28保存ベクターのライブラリーが得られる。
【０１０４】
次いでステップ４において、保存ベクターのプールされたライブラリーは、BbsIを用いてワンポット消化を受け、ＣＲＩＳＰＲガイド配列とバーコード要素との間でベクターを開いて、ＣＲＩＳＰＲガイド配列とバーコードの間にｇＲＮＡ足場要素を挿入できるようにした。ｇＲＮＡ足場要素の挿入物は、足場要素の３’末端の制限認識部位BamHIおよびEcoRIによって形成される分離部位を含むため、ｇＲＮＡ保存ベクターのライブラリーは反復クローニング工程に供されて、ステップ５に示すように、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはエフェクターを用いてコンビナトリアル遺伝子ノックアウト、活性化または抑制を媒介することができる複数のｇＲＮＡ発現カセットを包含する、より複雑なｎワイズバーコード化ライブラリーを生成可能である。簡潔には、バーコード化ガイドＲＮＡライブラリーは、分離部位の制限認識部位に相補的な制限酵素（例えば、BamHIおよびEcoRI）を用いて、消化される。消化は、ＣＲＩＳＰＲガイド配列、足場配列、分離部位、およびバーコード要素をコードする追加のセグメントの挿入を可能にする。同じセットの制限酵素を複数回のクローニングに使用して（ｎ）ワイズライブラリーを構築できるため、この戦略の利点の１つは、（ｎ＋１）ワイズライブラリーが、必要な制限酵素のセットを増加させないことである。
（ｍ）ｇＲＮＡメンバーの（ｎ）ワイズライブラリーを構築するには、（ｎ＋２）回のクローニング工程が必要である。この戦略のさらなる利点は、同じＣＲＩＳＰＲガイドライブラリーを使用して高次複雑性ライブラリーを生成できることである。
【０１０５】
例２：
図２Ａに示すように、バーコード化ＣＲＩＳＰＲ分子の複雑なコンビナトリアルライブラリーを、本明細書に記載の方法を用いて作製することができる。ステップ１において、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列および単一のバーコード要素を単一のオリゴヌクレオチド上に合成して、大規模コンビナトリアルｇＲＮＡライブラリーを生成した。制限認識部位は、各ＣＲＩＳＰＲガイド配列の後に存在した。ガイド配列およびバーコードは、異なる制限酵素部位によって互いに連結されている。図２Ａの遺伝子構築物およびベクターは、３つのＣＲＩＳＰＲガイド配列およびＣＲＩＳＰＲガイド配列の下流に位置するバーコード要素を含む、例示的なオリゴヌクレオチドを示す。
【０１０６】
ステップ２において、プールされた合成オリゴヌクレオチドを、ワンポットアセンブリでデスティネーションベクターにライゲートした。デスティネーションベクターは、ＣＲＩＳＰＲガイド配列の少なくとも１つの発現を駆動するプロモーターを含むことができる。ステップ３に示すように、ベクターを、異なる制限酵素を有する各ＣＲＩＳＰＲガイド配列に続く制限認識部位のそれぞれで、順次消化し、足場要素の、および場合によってはプロモーター要素の挿入を可能にして、下流のＣＲＩＳＰＲ配列の発現を駆動する。この方法は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはエフェクターを用いたコンビナトリアル遺伝子ノックアウト、活性化または抑制のための、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列および単一のバーコード要素をコードする、バーコード化コンビナトリアルガイドＲＮＡライブラリーの生成をもたらした。
【０１０７】
図２Ｂは、バーコード化ＣＲＩＳＰＲ分子の複雑なコンビナトリアルライブラリーを生成するための、別の戦略を示す。ステップ１において、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列および単一のバーコード要素を、単一のオリゴヌクレオチド上に合成して、大規模コンビナトリアルｇＲＮＡライブラリーを生成した。制限認識部位は、ＣＲＩＳＰＲガイド配列の各々の後に存在し、また１つの制限認識部位が第１のＣＲＩＳＰＲガイド配列の上流にも、プロモーター要素の挿入のために存在した。ガイド配列およびバーコードは、異なる制限酵素部位によって互いに連結されている。図２Ｂの遺伝子構築物およびベクターは、３つのＣＲＩＳＰＲガイド配列およびＣＲＩＳＰＲガイド配列の上流に位置するバーコード要素を含む、例示的なオリゴヌクレオチドを示す。
【０１０８】
ステップ２において、プールされた合成オリゴヌクレオチドを、ワンポットアセンブリのデスティネーションベクターにライゲートした。デスティネーションベクターは、ＣＲＩＳＰＲガイド配列の少なくとも１つの発現を駆動するプロモーターを含むことができる。ステップ３に示すように、ベクターを、異なる制限酵素を有する各ＣＲＩＳＰＲガイド配列に続く制限認識部位のそれぞれで、順次消化し、足場要素の、および場合によってはプロモーター要素の挿入を可能にして、下流のＣＲＩＳＰＲ配列の発現を駆動する。この方法は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはエフェクターを用いたコンビナトリアル遺伝子ノックアウト、活性化または抑制のための、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列および単一のバーコード要素をコードする、バーコード化コンビナトリアルガイドＲＮＡライブラリーの生成をもたらした。
【０１０９】
図２Ａおよび２Ｂに示す戦略を使用して、（ｍ）ｇＲＮＡメンバーの（ｎ）ワイズライブラリーを（ｎ＋１）回のクローニング工程で構築することができる。生成されるライブラリーの複雑性は、ステップ１で合成されたオリゴヌクレオチドの長さに依存する。足場配列の挿入を可能にする制限認識部位は、各ＣＲＩＳＰＲガイド配列ならびにプロモーター要素について異なるため、オリゴヌクレオチドの複雑性（すなわち、ＣＲＩＳＰＲガイド配列の数）を増加させると、消化工程に必要な制限酵素の数も増加する。
【０１１０】
例３：
CombiGEMベースのＤＮＡアセンブリ法を、バーコード化コンビナトリアルｇＲＮＡライブラリーの効率的かつスケーラブルなアセンブリに使用した。ライブラリーはレンチウイルスによってヒト細胞に送達され、これにより、プールされたアッセイでバーコードシーケンシングによって追跡され得るユニークなｇＲＮＡの組合わせを有する、遺伝的に超多様性の細胞集団が作製された。CombiGEM−ＣＲＩＳＰＲと呼ばれるこの戦略は、単純なワンポットクローニング工程を使用して、高次コンビナトリアルｇＲＮＡライブラリーのスケーラブルなアセンブリを可能にし、コンビナトリアル遺伝子機能の系統的解析へのワークフローを簡素化および加速する。
【０１１１】
最初のバーコード化ｓｇＲＮＡライブラリーを作製するために、バーコード化ｇＲＮＡ標的配列のライブラリーをコードするオリゴ対のアレイを初めに合成し、アニールし、保存ベクター中のＵ６プロモーターの下流にクローニングするために等しい比率でプールした（図１）。続いて、ｇＲＮＡの足場配列を、保存ベクターライブラリーにワンポットライゲーション反応で挿入した。CombiGEM法を、高次コンビナトリアルｇＲＮＡライブラリーのスケーラブルなアセンブリに適用した（図１）。バーコード化ｓｇＲＮＡ構築物内では、BamHIおよびEcoRI部位はｇＲＮＡ配列とそのバーコードの間に位置し、BglIIおよびMfeI部位は末端に位置した。これらの制限酵素部位の戦略的配置は、酵素消化の際にバーコードのそのｇＲＮＡ配列からの分離、および挿入物のライゲーション時にそれぞれのｇＲＮＡを表すバーコードの連結をもたらす。１ワイズライブラリーを構築するために、バーコード化ｓｇＲＮＡ発現ユニットを、保存ベクターのBglIIおよびMfeIでの制限消化によって調製し、BamHIおよびEcoRIで消化されたレンチウイルスデスティネーションベクター中の、適合するＤＮＡ末端に結合した。次に１ワイズライブラリーは、２ワイズライブラリー（ここでは各ｓｇＲＮＡを表すバーコードが各レンチウイルス構築物の一端に局在している）を生成するため、バーコード化ｓｇＲＮＡ発現ユニットのプールされた挿入の次の回のための、デスティネーションベクターとして機能した。このプロセスは、高次バーコード化コンビナトリアルｇＲＮＡライブラリーを生成するために、反復的に繰り返すことができる。コンビナトリアルｇＲＮＡの同一性は、各組合わせについてユニークな連結されたバーコードの検出によって、追跡することができる（例えばハイスループットシーケンシングなどにより）。
【０１１２】
我々のレンチウイルスコンビナトリアルｇＲＮＡ発現システムの機能性を評価するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をコードする配列を標的とするｇＲＮＡの組合わせを構築した（表１）。コンビナトリアル遺伝子摂動表現型を、フローサイトメトリー（図６Ａおよび６Ｂ）および蛍光顕微鏡（図６Ｅ）を用いて決定した。二重のＲＦＰおよびＧＦＰレポーターをバーコード化コンビナトリアルｇＲＮＡ発現ユニットと共に運ぶレンチウイルスを用いて、ヒトコドン最適化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（OVCAR8-ADR-Cas9）を安定に発現するヒト卵巣癌細胞（OVCAR8-ADR）（Honma, et al.,Nat. Med.(2008)14: 939-948）を感染させた（図６Ａ）。活性なｇＲＮＡは、ＧＦＰおよびＲＦＰをコードする配列を標的とし、ＧＦＰとＲＦＰの発現をノックアウトするための挿入欠失を生成すると予想された。ＧＦＰおよびＲＦＰ蛍光レベルの効率的な抑制が観察されたが、これは、ＧＦＰおよびＲＦＰ二重陰性集団が、ベクター対照における＜０．７％と比較して、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび、ＲＦＰとＧＦＰの両方を標的とするｇＲＮＡ発現単位を有する細胞において、感染後４日目および８日目の両方で観察された主要集団であるからである（〜全集団の８３〜９７％）（図６Ｃおよび６Ｄ）。この抑制は、ＧＦＰおよび／またはＲＦＰを標的とするｇＲＮＡを発現するがＣａｓ９ヌクレアーゼを有さない対照細胞株では、観察されなかった（図６Ｂ）。遺伝子摂動の特異性が確認されたが、これは、ＧＦＰを標的とするｓｇＲＮＡのみを有する細胞はＧＦＰシグナルの消失を示したが、ＲＦＰシグナルは消失しなかったからである。同様に、ＲＦＰを標的とするｓｇＲＮＡを含む細胞はＲＦＰ発現の低下を示したが、ＧＦＰ発現に影響はなかった（図６Ｅ）。これらの結果は、単一のヒト細胞内で複数の遺伝子の発現を同時に抑制し得るコンビナトリアルｇＲＮＡ構築物をコードするレンチウイルスベクターの能力を実証する。
【０１１３】
多様なエピジェネティックな修飾は協同的に作用して、遺伝子発現パターンを調節する傾向があり（Wang, et al. Nat. Genet. (2008) 40:897-903）、コンビナトリアルエピジェネティックモジュレーションが、有効な癌治療のための有望な戦略として出現している（Dawson, et al. Cell (2012) 150: 12-27；Juergens, et al. Cancer Discov. (2011) 1: 598-607）。本明細書に記載のCombiGEM−ＣＲＩＳＰＲ方法および組成物を用いて、エピジェネティック遺伝子摂動の、抗癌表現型に対するコンビナトリアル効果を系統的に評価した。GeCKOv2ライブラリーに基づき、５０のエピジェネティック遺伝子のセット（１遺伝子当たり３個のｓｇＲＮＡ）および３個の対照ｓｇＲＮＡを標的とする、１５３個のバーコード化ｓｇＲＮＡを含むライブラリーを構築した（Shalem, et al. Science (2014) 343:84-87）（表１）。
【０１１４】
【表１−１】
0006788584.tif 000002
【０１１５】
【表１−２】
0006788584.tif 000003
【０１１６】
【表１−３】
0006788584.tif 000004
【０１１７】
【表１−４】
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【０１１８】
これらの５０のエピジェネティック遺伝子の発現を、OVCAR8-ADR細胞でｑＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。２ワイズ（１５３×１５３個のｓｇＲＮＡ＝２３，４０９個の全組合わせ）のプールしたバーコードｇＲＮＡライブラリーを、CombiGEM法を用いて生成した。レンチウイルスプールを生成して、ライブラリーをOVCAR8-ADR-Cas9細胞に送達した。プールした細胞集団からのゲノムＤＮＡの単離を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるバイアスなしの（unbiased）バーコード増幅のために実施した。大腸菌に保存されたプラスミドプールおよび感染したヒト細胞プールにおける、個々のバーコード化組合わせの表示を、Illumina HiSeqシーケンシングを用いて定量した（図３Ａ〜３Ｄ）。２ワイズライブラリーのほぼ完全なカバレッジが、プラスミドおよび感染細胞プールの両方で、試料当たり約２３００万〜３４００万のリードで達成され（図３Ｂ）、バーコード化ｇＲＮＡ組合わせの比較的均一な分布が観察された（図３Ａおよび３Ｂ）。さらに、プラスミドプールおよび感染細胞プールにおけるバーコード表示の間の高い相関（図３Ｃ）と、感染細胞プールについての生物学的複製において表されるバーコードの高い再現性があった（図３Ｄ）。このように、CombiGEM−ＣＲＩＳＰＲを用いて、バーコード化コンビナトリアルｇＲＮＡライブラリーを効率的にアセンブルしてヒト細胞に送達することが可能である。
【０１１９】
OVCAR8-ADR-Cas9細胞における内在性遺伝子を編集するｇＲＮＡの機能を確認するために、Surveyorアッセイを行って、ライブラリーからのｇＲＮＡに標的化された８つの無作為に選択された遺伝子座における、切断効率を推定した。１．９％〜２６．２％の範囲の挿入欠失生成効率が、感染後１２日目に観察された（図７Ａ〜７Ｃ）。感染後１２日目のｇＲＮＡ標的遺伝子座全てについて、ＤＮＡミスマッチの切断が検出された（図７Ａおよび８Ａ）。同時切断効率は、本発明者らの二重ｇＲＮＡシステムにおいて、複数の遺伝子座で決定され、個々のｇＲＮＡまたは二重ｇＲＮＡを発現する細胞において、匹敵するレベルの切断が観察された（図７Ａおよび８Ａ）。個々のｇＲＮＡおよび二重ｇＲＮＡの発現細胞における、標的タンパク質レベルの枯渇も検出された（図８Ｂ）。これらの結果は、多重化システムがｇＲＮＡの活性を妨げないことを示した。単一細胞内の二重ｇＲＮＡによって指向された二重切断事象を、感染集団全体から区別するために、二重ｇＲＮＡに感染した単一細胞由来のクローンを単離し、両方の標的ゲノム遺伝子座に挿入、欠失または突然変異を有する細胞をSangerシーケンシングで検出した（図９Ａおよび９Ｂ）。
【０１２０】
挿入欠失生成効率は、標的ゲノム遺伝子座でディープシーケンシングを行うことによっても推定された。異なるｇＲＮＡの間で、挿入欠失を生成する速度の大きな変動（すなわち、１４〜９３％；図１６Ａ）およびフレームシフト変異（すなわち、すべての挿入欠失のうち５２〜９５％；図１６Ｂ）が観察された。さらに、A375メラノーマ細胞を用いた前の研究（Shalem et al. 2014 Science 343:84-7）で確認されたｇＲＮＡは、OVCAR8-ADR-Cas9細胞において、活性の低下（例えば、NF1-sg4およびMED12-sg1 ｓｇＲＮＡについて）および差異的な挿入欠失生成の選好（例えば、NF1-sg1 ｓｇＲＮＡについて）を示した（図１６Ｃ）。かかる相違は部分的に、標的遺伝子座でのクロマチン接近可能性の変化（(Wu et al. (2014) Nat. Biotechnol. 32: 670-6）および細胞型の間で異なり得るＤＮＡ破損修復機構（(Ghezraoui et al (2014) Mol Cell 55:829-42）による可能性がある。オンターゲット切断速度の改善（Donesch et al (2014) Nat Biotechnol 32:1262-7）およびオフターゲット切断の最小化を含む、ｇＲＮＡ設計最適化における継続的な努力は、広範囲の細胞型における大規模な遺伝子摂動スクリーニングへのそれらの適用性を改善する、より効率的なｇＲＮＡセットの作製を可能にするはずである。挿入欠失生成を、ｇＲＮＡにより多重化システムにおいてさらに評価した。ディープシーケンシング分析により、ｓｇＲＮＡまたは二重ｇＲＮＡシステムの下で発現された同一のｇＲＮＡについて、ほぼ同程度の挿入欠失生成頻度および選好が検出された（図１６Ｄ）。単一細胞内の二重ｇＲＮＡによって指向される二重切断事象を、集団全体に分布する切断事象から区別するために、二重ｇＲＮＡ構築物に感染した単一細胞に由来するクローンを単離した。標的とされた両方のゲノム遺伝子座における挿入、欠失、または突然変異を有する細胞が検出された（図９Ａ〜９Ｃ；表６）。本発明者らの結果は、CombiGEMコンビナトリアルｇＲＮＡライブラリーが、OVCAR8-ADR-Cas9細胞において二重遺伝子変異体を生成するために使用できることを示す。
【０１２１】
OVCAR8-ADR-Cas9細胞を用いたプールされたコンビナトリアル遺伝子スクリーニングを開始して、癌細胞の増殖を調節するｇＲＮＡの組合わせを同定した。数学的モデルを構築し、ある集団内の各ライブラリーメンバーの存在量の相対的変化が、様々なパラメータにどのように依存するかを示した（下の方法の節を参照；図１７Ａおよび１７Ｂ）。異なるｇＲＮＡの組合わせを有する異種亜集団を含む集団をシミュレートした。具体的には、全集団の特定のパーセンテージは、シミュレーションの開始時に、抗増殖性（ｆｓ）および増殖促進性（ｆｆ）ｇＲＮＡの組合わせを有する亜集団を含むと定義された。各亜集団内では、細胞の一部は、シミュレーションの開始時にＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９システム（ｐ）により突然変異させられ、倍化時間が改変された（Ｔdoubling、m）。このモデルは、全細胞集団において抗増殖性ｇＲＮＡセットを有するバーコード化細胞の表示が、シミュレーション条件下（すなわち、ｆｓおよびｆｆ＝２、５、または１０％；ｐ＝０．２、０．４、０．６、０．８または１．０；Ｔdoubling、m＝３６、４８、または６０時間）で、約２３〜９７％枯渇され得ることを示す（図１７Ｂ）。一般に、突然変異効率の増加、抗増殖性細胞の倍加時間の増加、増殖促進性細胞の倍加時間の減少、ならびに集団中の増殖促進性の組合わせの割合の増加（図１７Ｃ）は、全集団における抗増殖性バーコードの、より大きなバーコード枯渇をもたらすことが予想される。
【０１２２】
実験的スクリーニングにおいて、癌細胞の増殖を調節するｇＲＮＡの組合わせを同定するために、２ワイズコンビナトリアルｇＲＮＡライブラリーに感染したOVCAR8-ADR-Cas9細胞集団を１５日および２０日間培養し、次いでゲノムＤＮＡを細胞から単離し、組み込まれたバーコードについてバイアスなしの増幅および定量化に供した（図４Ａ、１０Ａおよび１０Ｂ）。２０日と１５日の群の間のバーコード存在量（百万回のリード当たりで正規化）を比較して、ｌｏｇ２（バーコードカウント比）値を得た（図４Ａ、１０Ａおよび１０Ｂ）。細胞増殖を阻害するガイドＲＮＡの組合わせは、負のｌｏｇ２比をもたらすと予想され、一方、成長利点を与えられた細胞は、正のｌｏｇ２比を有すると予想された。変動性を低減するために、１５日群の〜１００未満の絶対リードを有する組合わせを除外し、各ｇＲＮＡ対（すなわち、ｓｇＲＮＡ−Ａ＋ｓｇＲＮＡ−ＢおよびｓｇＲＮＡ−Ｂ＋ｓｇＲＮＡ−Ａ）の２つの潜在的配列のｌｏｇ２比を平均した（図１１）。各ｇＲＮＡ組合わせのｌｏｇ２比を、２つの生物学的複製について決定し、ランク付けした（図５Ｂおよび１２Ａ）。大部分のｇＲＮＡの組合わせは、１５日群と２０日群の間でバーコード表示に有意な変化を示さず、これには内部対照として、ヒトゲノムにオンターゲット遺伝子座を有さない、GeCKOv2ライブラリー（Shalem et al (2014) Science 343: 84-7）からの３つの対照ｇＲＮＡを含む。６１のｇＲＮＡの組合わせは、両方の生物学的複製物においてかなりの抗増殖効果（ｌｏｇ２比＜−０．９０）を示し（Ｑ値＜０．０１、表２および図１２Ｂ）、癌細胞の増殖を抑制する能力についてさらに検討するための遺伝子の潜在的なセットをもたらした。
【０１２３】
【表２−１】
0006788584.tif 000006
【０１２４】
【表２−２】
0006788584.tif 000007
【０１２５】
スクリーニングからのヒットの確認を、OVCAR8-ADR-Cas9細胞の増殖を阻害するｇＲＮＡ対の能力（すなわち、５日以内に約３３％）を、レンチウイルスを介して送達された対応するｇＲＮＡ対を用いて、個々の（プールされていない）細胞増殖アッセイにおいて評価することにより、実施した（図４Ｃ）。プールされたスクリーニングから集められたデータと、個々の確認アッセイからのデータの間には、高い一貫性があった（図１３）。まとめると、本明細書に記載の方法は、卵巣癌細胞に対して抗増殖効果を発揮することができるバーコード化コンビナトリアルｇＲＮＡの体系的スクリーニングのための、実験的パイプラインを提供する。
【０１２６】
エピジェネティック遺伝子を標的とする多くのｇＲＮＡは、他のエピジェネティック遺伝子標的化ｇＲＮＡと組み合わせて用いると、対照ｇＲＮＡと組み合わせて使用した場合に比べて、より強い抗増殖効果を示した（図４Ｂおよび１２Ａ）。
ｇＲＮＡのオフターゲット活性を、ディープシーケンシングにより評価したところ、ＣＲＩＳＰＲ設計および２つのｇＲＮＡのCCTopツールによって計算上予測されたすべてのエキソンオフターゲットゲノム座位で、低い挿入欠失生成率（すなわち０．１５〜０．３８％）が明らかになった（図１９）。まとめると、卵巣癌細胞に対して抗増殖効果を発揮することができるバーコード化コンビナトリアルｇＲＮＡの体系的スクリーニングのための実験パイプラインが確立され、確認された。
【０１２７】
ｇＲＮＡ対が確認アッセイにより確認され（図５Ａおよび８）、KDM4CおよびBRD4を標的とするｓｈＲＮＡ対（図５Ｂおよび１４）は同時に、ガン細胞増殖の相乗的減少をもたらした。さらに、小分子KDM4C阻害剤SD70（Jin, et al. PNAS (2014) 111:9235-9240)）および小分子BRD4阻害剤JQ1（Asangani, et al. Nature (2014) 510:278-282）（図５Ｃ）は、OVCAR8-ADR細胞の増殖を相乗的に阻害した。同様に、KDM6BとBRD4を同時に標的とするｇＲＮＡ対（図５Ａおよび８）およびｓｈＲＮＡ対（図５Ｂおよび１４）は、KDM6B／6A阻害剤GSK-J4（Kruidenier、et al。 Nature(2012)488:404-408）とJQ1の同時処置の場合のように、相乗作用を示した（図５Ｄ）。小分子薬物のこれらのペアワイズの組合わせの両方の間の相乗効果が、Blissの独立性モデル（Bliss Ann。Appl。Biol。(1939)6:585-615）および最高単一薬剤モデル（Borisy, et al. PNAS (2003) 100: 7977-7982）の両方によって、確認された（図５Ｃおよび５Ｄ）。
【０１２８】
本明細書に記載の方法は、癌細胞の増殖を阻害する新規エピジェネティック標的遺伝子対の同定および、相乗的薬物療法の潜在的開発を可能にする。この方法はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９に基づくシステムの有用性を、ハイスループット容量で全身多重化遺伝子摂動スクリーニングを実施するために拡大する。
これらの方法はまた、観察された表現型の基礎となるメカニズムの研究など、生物学的調査の新しい分野の特定にも役立ち得る。例えば、遺伝子発現パターンを、KDM4CとBRD4、またはKDM6BとBRD4の両方を標的とするｇＲＮＡをコードするレンチウイルスに感染させた細胞集団において、評価した（図２１Ａ）。有意に摂動された遺伝子は、ＴＮＦα／ＮＦκＢシグナル伝達、ｐ５３経路、およびアポトーシスを含む癌関連経路に関与する遺伝子セットと関連していた（図２１Ｂ）。さらに、エピジェネティックな摂動のコンビナトリアル効果は複雑であり、異なる細胞型に応じて変化し得る（図２２Ａおよび２２Ｂ）。
【０１２９】
方法
ベクター構築
ベクターを、制限酵素消化、ライゲーション、ＰＣＲ、およびギブソンアセンブリを含む標準的な分子クローニング技術を用いて構築した（表３）。カスタムオリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologiesから購入した。ベクター構築物を大腸菌ＤＨ５α株に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン（Teknova）を用いて構築物を保有するコロニーを単離した。Plasmid MiniまたはMidiキット（Qiagen）を用いて、ＤＮＡを抽出および精製した。ベクター構築物の配列を、Genewiz ＤＮＡシーケンシングサービスで確認した。
【０１３０】
【表３−１】
0006788584.tif 000008
【０１３１】
【表３−２】
0006788584.tif 000009
【０１３２】
特定の遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスベクターを生成するために、センス配列およびアンチセンス配列を有するオリゴヌクレオチド対を合成し、アニールし、AgeIおよびEcoRIで消化したpLKO.1ベクター29（Addgeneプラスミド#10879）にライゲーションによりクローニングした。ｓｈＲＮＡセンス配列およびアンチセンス配列は、siRNA Selection Program（sirna.wi.mit.edu/）に基づいて設計および構築した（表４）。
【０１３３】
【表４】
0006788584.tif 000010
【０１３４】
Ｃａｓ９タンパク質および選択マーカーとしてゼオシン（Zeocin）耐性をコードするpAWp30レンチウイルス発現ベクターを生成するために、EFSプロモーターおよびＣａｓ９配列をAdgeneプラスミド#49535から増幅し、一方ゼオシン配列は、Adgeneプラスミド#25736から、PhusionＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を、pAWp11レンチウイルスベクター骨格に、Gibson Assembly Master Mix(New England Biolabs)を用いてクローニングした。
【０１３５】
特定の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの、Ｕ６プロモーター（Ｕ６ｐ）駆動発現を含む保存ベクターを構築するために、２０ｂｐのｓｇＲＮＡ標的配列を有するオリゴ対を合成し、アニールし、BbsI消化したpAWp28ベクターにＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を用いてクローニングした。単一またはコンビナトリアルｓｇＲＮＡ（単数または複数）のＵ６ｐ駆動発現のためのレンチウイルスベクターを構築するために、保存ベクターをBglIIおよびMfeI酵素（Thermo Scientific）で消化してＵ６ｐ−ｓｇＲＮＡ発現カセットを調製し、これをpAWp12ベクター骨格または単一ｓｇＲＮＡ発現ベクターに、それぞれ、ベクターをBamHIおよびEcoRI酵素（Thermo Scientific）で消化することによって生成された適合性粘着末端を介したライゲーションを用いて、挿入した。二重ＲＦＰおよびＧＦＰ蛍光タンパク質レポーターと共にｓｇＲＮＡを発現させるために、Ｕ６ｐ駆動ｓｇＲＮＡ発現カセットを、上記と同じ戦略を用いてpAWp12の代わりにpAWp9レンチウイルスベクター骨格に挿入した。pAWp9ベクターは、pAWp7ベクター骨格から、ユニークなBamHIおよびEcoRI部位をベクターに導入してＵ６ｐ−ｓｇＲＮＡ発現カセットの挿入を可能にすることにより、改変した。
【０１３６】
バーコード化コンビナトリアルｓｇＲＮＡライブラリープールのアセンブリ
バーコード化ｓｇＲＮＡ配列を有する１５３のオリゴ対（オリゴＦ−（ｘ）およびオリゴＲ−（ｘ）、ここでｘ＝１〜１５３）を合成し、アニールして、２０ｂｐのｓｇＲＮＡ標的配列、２つのBbsI制限部位、各ｓｇＲＮＡにユニークであるが少なくとも２つの塩基によって互いに異なる８ｂｐのバーコード、およびその末端に５’オーバーハングを有する、二本鎖挿入物を生成した。プールされた保存ベクターライブラリーを生成するために、１５３個のアニールされた挿入物を等しい比率で混合し、適合末端を介したワンポットのライゲーション反応を介して、pAWp28保存ベクター（BbsIおよびMfeIで消化）にクローニングした。バーコード化ｓｇＲＮＡライブラリーを構築するために、別のワンポットライゲーション反応を、BbsIで消化されプールされた保存ベクターライブラリーと、オリゴ対Ｓ１およびＳ２の合成およびアニーリングによって調製された、ｓｇＲＮＡ足場配列、BamHIおよびEcoRI制限部位、およびその末端の５’オーバーハングを含む挿入物とを用いて行った。プールされた保存ベクターおよびバーコード化ｓｇＲＮＡライブラリーは両方ともEnduraコンピテント細胞（Lucigen）において調製され、Plasmid Midiキット（Qiagen）によって精製された。
【０１３７】
単一またはコンビナトリアルｇＲＮＡを有するプールされたレンチウイルスベクターライブラリーを、上記の単一およびコンビナトリアルｓｇＲＮＡ構築物の生成と同じ戦略で、ただし、アセンブリを、個別のものの代わりにプールされた挿入物およびベクターを用いて、構築した。簡単に説明すると、プールされたＵ６ｐ−ｓｇＲＮＡ挿入物は、プールされた保存ベクターライブラリーのBglIIおよびMfeIによるワンポット消化によって生成された。デスティネーションレンチウイルスベクター（pAWp12）をBamHIおよびEcoRIで消化した。消化された挿入物およびベクターを、それらの適合末端（すなわち、BamHI＋BglIIおよびEcoRI＋MfeI）を介してライゲートして、プールされた１ワイズｓｇＲＮＡライブラリー（１５３個のｓｇＲＮＡ）をレンチウイルスベクター中に作製した。１ワイズｓｇＲＮＡベクターライブラリーを再びBamHIおよびEcoRIで消化し、同じＵ６ｐ−ｓｇＲＮＡ挿入物プールにライゲートして、２ワイズｓｇＲＮＡライブラリーをアセンブルした（１５３×１５３のｓｇＲＮＡ＝合計２３，４０９個の組合わせ）。プールされたアセンブリ工程の後、ｓｇＲＮＡはベクター構築物の一端に局在化され、それらのそれぞれのバーコードは他端で連結された。レンチウイルスｓｇＲＮＡライブラリープールをXL10-Goldウルトラコンピテント細胞（Agilent Technologies）に調製し、Plasmid Midiキット（Qiagen）で精製した。
【０１３８】
細胞培養
HEK293T細胞をATCから入手し、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清および１Ｘ抗生物質−抗真菌剤（Life Technologies）を添加したＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。OVCAR8-ADR細胞は、T.Ochiya（日本国立がんセンター研究所）からのギフトであった。OVCAR8-ADR細胞の同一性は認証された（Genetica DNA Laboratories）。Ｃａｓ９タンパク質を安定に発現するOVCAR8-ADR細胞（OVCAR-ADR-Ｃａｓ９）を、OVCAR8-ADR細胞をpAWp30ベクターでレンチウイルス感染させることにより生成し、２００μｇ／ｍｌのZeocin（Life Technologies）の存在下で３週間選択した。OVCAR8-ADRおよびOVCAR8-ADR-Cas9細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清および１Ｘ抗生物質抗真菌剤を添加したＲＰＭＩ中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。薬物処理については、細胞生存率アッセイの前に、SD70（Xcessbio #M60194）、GSK-J4（Cayman Chemical #12073）、および／または（＋）−JQ1（Cayman Chemical #11187）を指定された薬物用量で用いて、OVCAR8-ADR細胞を処理した。
【０１３９】
レンチウイルスの生成と形質導入
レンチウイルスを生成し、６ウェルのフォーマットでHEK283T細胞にパッケージングした。HEK293T細胞を、トランスフェクション前に約７０％のコンフルエンスに維持した。FuGENE HDトランスフェクション試薬（Promega）を、１００μｌのOptiMEM培地（Life Technologies）中の０．５μｇのレンチウイルスベクター、１μｇのｐCMV-dR8.2-dvprベクター、および０．５μｇのpCMV-VSV-Gベクターと混合し、細胞培養物に添加する前に、室温で１５分間インキュベートした。培養培地を翌日交換した。新たに生成されたウイルスを含む上清を、トランスフェクションの４８時間後および９６時間後に回収し、０．４５μｍポリエーテルスルホン膜（Pall）で濾過した。５００μｌの濾過したウイルス上清を使用して、８μｇ／ｍｌのポリブレン（Sigma）の存在下で２５０，０００個の細胞を一晩感染させ、個々のベクター構築物を形質導入した。スクリーニングに用いるプールされたレンチウイルスライブラリー生成のために、レンチウイルス生成および形質導入を、同じ実験手順を用いてスケールアップした。濾過したウイルス上清を、Amicon Ultra Centrifugal Filter Unit（Millipore）を用いて濃縮した。細胞を、８μｇ／ｍｌポリブレンの存在下で、０．３〜０．５の感染多重度で感染させて、多くの細胞での単一コピーの組込みを確実にし、これは、３０〜４０％の感染効率に相当した。スクリーニングで使用された細胞の総数は、ライブラリーのカバレージを維持し、レンチウイルスのゲノムへのランダムな組込みに起因する偽性効果を低減するために、ライブラリーのサイズより約３００倍多かった。細胞培養培地を、感染の翌日に交換し、実験の前に示された時間培養した。
【０１４０】
バーコードシーケンシングのための試料の調製
バーコードシーケンシングのため試料を培養細胞から調製するために、ゲノムＤＮＡの抽出および調製を、DNeasy Blood & Tissueキット(Qiagen)を製造業者のプロトコルに従って用いて実施した。バーコード化ｓｇＲＮＡプラスミドライブラリーについては、大腸菌に形質転換されたプラスミドＤＮＡをPlasmid Midiキット（Qiagen）を用いて抽出した。ＤＮＡ濃度は、Quant-iT PicoGreen dsDNAアッセイキット（Life Technologies）を用いて決定した。
【０１４１】
プールされたベクターおよび感染細胞ライブラリー内の、各組合わせを表すユニークなバーコードを含有する約３６０ｂｐの断片を、プラスミド／ゲノムＤＮＡ試料から、Kapa Hotstart Ready Mix（Kapa Biosystems）を用いてＰＣＲ増幅した。プラスミドＤＮＡについては、１ｎｇのＤＮＡ鋳型を２５μｌのＰＣＲ反応のために添加した。ゲノムＤＮＡについては、８００ｎｇのＤＮＡを５０μｌのＰＣＲ反応のために添加し、各ゲノムＤＮＡ試料について合計６４回のＰＣＲ反応を実施して、増幅される細胞ゲノムの数が、ライブラリーサイズの１００倍を超えることを確実にした。さらに、ＰＣＲパラメータを最適化して、ＰＣＲバイアスを避けるために、ＰＣＲ増幅工程を指数期に維持することを確実にした。Illuminaアンカー配列および８塩基対のインデックスバーコードを、多重シーケンシングのためのＰＣＲの間に加えた。バーコード配列を増幅するために使用するプライマー対配列は：５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＡＣＧＧＡＡＴＴＣ−３’（配列番号１）および５’ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＮＮＮＮＮＮＮＮＧＧＴＴＧＣＧＴＣＡＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号２）であり、ここでＮＮＮＮＮＮＮＮは、各実験試料に割り当てられた特定のインデックスバーコードを示す。
【０１４２】
次いで、バーコード配列を含むＰＣＲ産物を、断片サイズに基づき、１．５％アガロースゲルで泳動させることにより精製し、さらにQIAquick Gel Extractionキット（Qiagen）を用いて抽出した。ＰＣＲ産物濃度は、KAPA SYBR Fast qPCR Master Mix（Kapa Biosystems）およびIllumina Library Quantificationキット（Kapa Biosystems）を用いた定量ＰＣＲにより決定した。定量ＰＣＲに用いたフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ、５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ−３’（配列番号３）および５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ−３’（配列番号４）であった。次に、異なる試料からのＰＣＲ産物を、試料多重シーケンシングのために所望の比率でプールし、CombiGEMバーコードプライマー（５’−ＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＡＣＧＧＡＡＴＴＣ−３’（配列番号５））およびインデックスバーコードプライマー（５’−ＧＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣ−３’（配列番号６））を有するIllumina HiSeqシステムにロードした。
【０１４３】
バーコードシーケンシングデータ解析
各ｓｇＲＮＡ組合わせについてのバーコードリードは、Illuminaシーケンシングデータから処理した。各組合わせを表すバーコードリードは、バーコードをインデックス化することによって分類した各試料について百万回のリードごとに正規化した。細胞増殖の尺度として、２０日目と１５日目の群を比較した、正規化されたバーコードリードのバーコードカウント比を、倍率変化として計算した。増殖促進表現型および抗増殖表現型はそれぞれ、＞１および＜１の正規化バーコードリードの倍率変化を有したが、表現型の変化は倍率変化＝１をもたらさなかった。１５日群の、〜１００未満の絶対リードを与えたバーコードは、データの信頼性向上のためにフィルタリングして除去した。各同一のｓｇＲＮＡ組合わせの異なる可能な次数の倍率変化を平均すると、倍率変化における高い一貫性が観察された（すなわち、８２％および９５％を超える組合わせについて、それぞれ変動係数（ＣＶ）＜０．２および＜０．４）（図１１）。計算された倍率変化を対数変換して、ｌｏｇ２比を得た。同じレンチウイルスライブラリーの独立した感染を有する２つの生物学的複製で、スクリーニングを行った。組合わせをｌｏｇ２比により、全実験条件にわたってランク付けした。トップヒット（白丸）のセットは、両方の生物学的複製において対照ｓｇＲＮＡ（白抜きの三角形）のみを有するｓｇＲＮＡの組合わせの平均から少なくとも３標準偏差であるｌｏｇ２比を有するものとして、定義した（図４Ｂ、１２Ａ、および１２Ｂ）。
【０１４４】
細胞生存率アッセイ
ＭＴＴ比色アッセイを実施して、細胞生存率を評価した。９６ウェルごとに、１００μｌのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）溶液（Sigma）を細胞培養物に添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。生存細胞は、可溶性ＭＴＴ塩を不溶性青ホルマザン結晶に変換する。ホルマザン結晶を１００μｌの可溶化緩衝液で３７℃で溶解した。５７０ｎｍおよび６５０ｎｍ（参照）の光学濃度（ＯＤ）での吸光度読み取りを、Synergy H1マイクロプレートリーダー（BioTek）を用いて測定した。
【０１４５】
薬物相乗効果の定量化
Bliss独立（ＢＩ）モデル（Bliss Ann. Appl. Biol. (1939)26: 585-615）および最高単独薬剤（ＨＳＡ）モデル（Borisy, et al., PNAS(2003)100: 7977-7982）は、薬物の組合わせ間の相乗効果を評価するために一般的に使用される方法である。
ＢＩモデルに基づき、予想される効果（ＥＥｘｐ）は次式で与えられる：
ＥＥｘｐ＝ＥＡ＋ＥＢ−（ＥＡ×ＥＢ）、
式中、ＥＡは、ある濃度の薬物Ａ単独で観察される増殖阻害効果であり、ＥＢは、ある濃度の薬物Ｂ単独で観察される増殖阻害効果である。ＥＯｂｓは、それぞれＥＡおよびＥＢと同じ濃度における、薬物の組合わせ（Ａ＋Ｂ）の観察された増殖阻害効果である。各効果は、０と１との間の分数阻害として表される。ＥＯｂｓ−ＥＥｘｐ＞０の場合、２つの薬物は相乗的に相互作用すると考えられる。
【０１４６】
ＨＳＡモデルはＢＩモデルに類似しているが、ただしＨＳＡモデルによれば、ＥＥｘｐは、組合わせの薬物が単独で、薬物組合わせ（Ａ＋Ｂ）と同じ濃度において作り出す成長阻害効果（ＥＡまたはＥＢ）の大きい方と、等しい。
２つの薬物が相乗的であると考えられるのは、我々の基準の厳密性を増強するために、両方のモデルにおいて少なくとも２つの異なる濃度の組合わせについて、ＥＯｂｓ−ＥＥｘｐ＞０．１（すなわち、図５Ｃおよび５Ｄの予測されたＢＩモデルおよびＨＳＡモデルに対して、＞１０％超の超過阻害）である場合である。
【０１４７】
フローサイトメトリー
細胞は、感染後４日目および８日目に回収した。試料を洗浄し、２％ウシ胎仔血清を補充した１×ＰＢＳに再懸濁した。細胞の塊を除去するために、再懸濁した細胞を細胞ストレーナーに通してから、LSRII Fortessaフローサイトメーター（Becton Dickinson）にロードした。試料あたり少なくとも２０，０００件のイベントを収集した。適切なレーザーセットおよびフィルターを、細胞試料に基づいて選択した。前方散乱および側方散乱を使用して、適切な細胞集団を同定した。データを、製造業者の組込みソフトウェアを使用して分析した。
【０１４８】
蛍光顕微鏡
培養細胞を、倒立蛍光顕微鏡（Zeiss）下で、レンチウイルス感染３日後に直接観察した。画像は、Zeissの組込みソフトウェアを使用して捕捉した。
【０１４９】
イムノブロット解析
細胞を、プロテアーゼ阻害剤を補充した２×ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した。溶解物を乳棒モーターミキサー（Agros）を用いて３０秒間ホモジナイズし、次いで１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。上清を、ＢＣＡアッセイ（Thermo Scientific）を用いて定量した。タンパク質を、９９℃で５分間変性させた後、４〜１５％ポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad）でゲル電気泳動を行った。タンパク質をニトロセルロース膜に、８０Ｖ、４℃で２時間かけて移した。使用した一次抗体は、抗BRD4（１：２，０００、Cell Signaling  #13400）、抗KDM4C（１：１，０００、Abcam ab85454）、抗KDM6B（１：１，０００、Abcam ab85392）、および抗β−アクチン（１：４，０００、Abcam ab6276）であった。使用した二次抗体は、ＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ（１：２，０００、Cell Signaling #7074）およびＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ（１：４，０００、Cell Signaling #7076）であった。膜は、SuperSignal West Pico化学発光基質（Thermo Scientific）で現像し、ChemiDoc Touchイメージングシステム（BioRad）を用いて画像化した。
【０１５０】
ゲノム改変に関するSurveyorアッセイおよびシーケンシング解析
Surveyorアッセイを実施して、ＤＮＡ切断効率を評価した。ゲノムＤＮＡを細胞培養物から、QuickExtractＤＮＡ抽出溶液（Epicentre）を用いて製造業者のプロトコルに従って抽出した。標的遺伝子座を含むアンプリコンを、ＰＣＲにより、PhusionＤＮＡポリメラーゼおよび表５に示すプライマーを用いて生成した。約２００ｎｇのＰＣＲアンプリコンを変性させ、自己アニールし、１．５μｌのSurveyorヌクレアーゼ(Transgenomic）で４２℃で３０分間インキュベートした。次いで、試料を２％アガロースゲル上で分析した。ＤＮＡバンド強度をImageJソフトウェアを用いて定量し、挿入欠失発生を以下の式で推定した（Ran et al., Nat.Protoc. (2013)8: 2281-2308）。
挿入欠失（％）＝１００×（１−（１−ｆｃｕｔ）の平方根）
ここでｆｃｕｔ＝（ｂ＋ｃ）／（ａ＋ｂ＋ｃ）であり、ａは未切断ＰＣＲアンプリコンのバンド強度であり、ｂおよびｃは、各切断バンドの強度である。標的とされたアレルの予想された未切断バンドおよび切断バンドは、図７および８にリストされている。
【０１５１】
Sangerシーケンシングを実施して、コンビナトリアルｓｇＲＮＡの発現によって生成されたゲノム改変を分析した。コンビナトリアルｓｇＲＮＡ構築物を感染させた細胞を１２日間培養し、培養物の連続希釈によって単一細胞として９６ウェルプレートに再プレートした。ゲノムＤＮＡを、５〜２１日間培養した後に単離された単一細胞拡張クローンから、QuickExtractＤＮＡ抽出溶液を用いて抽出し、標的アレルを含むアンプリコンを、ＰＣＲにより上記のように調製した。ＰＣＲアンプリコンをＴＯＰＯベクターに、ＴＡCloningキット（Life Technologies）を用いて製造業者のプロトコルに従ってクローニングし、ヌクレオチド突然変異、挿入および欠失を、Sangerシーケンシングを用いて同定した。
【０１５２】
【表５】
0006788584.tif 000011
【０１５３】
【表６−１】
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【０１５４】
【表６−２】
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【０１５５】
【表６−３】
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【０１５６】
【表６−４】
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【０１５７】
【表６−５】
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【０１５８】
【表６−６】
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【０１５９】
【表６−７】
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【０１６０】
【表６−８】
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【０１６１】
【表６−９】
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【０１６２】
【表６−１０】
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【０１６３】
【表６−１１】
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【０１６４】
【表６−１２】
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【０１６５】
ＲＮＡ抽出および定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＮＡを細胞から、TRIzol Plus RNA精製キット（Life Technologies）を用いて製造業者のプロトコルに従って抽出し、PureLinkオンカラムDNaseキット（Life Technologies）で処理した。ＲＮＡ品質および濃度は、NanoDrop分光光度計を用いて決定した。ＲＮＡ試料を、SuperScript III Reverse Transcriptase（Life Technologies）、Random Primer Mix（New England Biolabs）およびRNAse OUT（Invitrogen）を用いて逆転写した。遺伝子発現レベルを評価するために、定量的ＰＣＲを、LightCycler480システム（Roche）上でSYBR FAST qPCR MasterMix（KAPA）を用いて行った。データを、LifeCyler480 SW 1.1組み込みソフトウェアを使用して、定量し分析した。ＰＣＲプライマーは、PrimerBlast（NCBI）を用いて設計し、評価した。プライマー配列を表７に示す。
【０１６６】
【表７】
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【０１６７】
【表８−１】
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【０１６８】
【表８−２】
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【０１６９】
【表８−３】
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【０１７０】
【表９】
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【０１７１】
ＲＮＡ−Ｓｅｑおよびデータ分析
ＲＮＡを細胞から、TRIzol PlusＲＮＡ精製キット（Life Technologies）を用い製造業者のプロトコルに従って抽出し、PureLinkオンカラムDNaseキット（Life Technologies）で処理した。ＲＮＡ品質および濃度は、NanoDrop分光光度計を用いて決定した。ＲＮＡ試料を、SuperScript III Reverse Transcriptase（Life Technologies）、Random Primer Mix（New England Biolabs）およびRNAse OUT（Invitrogen）を用いて逆転写した。シーケンシングライブラリーは、Illumina Library Prepキットを用いて、１μｇの全ＲＮＡの入力量で開始し、製造業者の推奨に従って調製した。ＰＣＲ増幅後、ライブラリーを２％アガロースゲル（E-Gel EX, Invitrogen）上で３００＋／−２５ｂｐにサイズ選択し、Illumina HiSeq 2000装置でシングルエンドシーケンシングに供した。ＲＮＡ−Ｓｅｑ実験を２つの生物学的複製で実施した。
【０１７２】
ｃＤＮＡ断片の生のシングルエンドリードを、TopHat2（Kim et al., Genome Biol(2013)14: R36）およびBowtie（Langmead, et al.、Genome Biol(2009) 10:R25）を用いて、ヒトトランスクリプトーム（RefSeq、hg19）に整列させた。試料間で差次的に発現された遺伝子は、Cuffdiff2（Trapnell et al., Nat Biotechnol (2013)31: 46-53）とバイアス補正オプションを用いてコールされ、ミトコンドリアおよびリボソームＲＮＡ転写物にマッピングするリードをマスキングする。遺伝子が差次的に発現されたとしてコールされるのは、試験した条件の少なくとも１つにおいて百万回のリード当たりキロベース当たり、最小０．１断片（ＦＰＫＭ）を満たし、絶対ｌｏｇ２倍数変化が少なくとも０．５であり、複数仮説補正後のＰ値（Ｑ値）が０．０５未満である場合である。遺伝子セット濃縮分析は、MSigDBデータベース（broadinstitute.org/gsea/index.jsp）を用いて行った（Subramanian, et al. Proc Natl Acad Sci USA (2005) 102:15545-50）。
【０１７３】
混合集団における細胞増殖の数学的モデリング
異なるパラメータが、我々のプールされたスクリーニングの結果にどのように影響するかを推定するために、細胞増殖を、異なる増殖速度を示すｇＲＮＡの組合わせを有する混合細胞集団においてシミュレートした。所与の時間（ｔ）において、母集団における総細胞数（ＣＮ）は、異なる組合わせ（Ｃｉ；１〜Ｎ、ここでＮは組合わせの総数）を含む個々の細胞数の合計によって表され、
【数１】
0006788584.tif 000029
である。
【０１７４】
各個々のｇＲＮＡの組合わせについて、細胞増殖は、式（１）によって表される。指数関数的な細胞増殖モデルに基づき、各ｇＲＮＡの組合わせを有する細胞は、２つの集団からなる：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムによる遺伝子破壊に起因する、改変された増殖速度（ｋｍ）を有するものと、野生型増殖速度（ｋｗｔ）を有する他のもの（未改変の細胞）。前者の集団は細胞の一部分（ｐ）として定義され、これはＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９システムの切断効率によって制限される。単純化のために、我々は、ｐがアッセイ期間中一定であると仮定した。
【数２】
0006788584.tif 000030
式中、ｐは、改変された増殖速度を有する突然変異細胞の割合を表し、Ｃ０は、同じバーコード化ｇＲＮＡの組合わせを担持する初期細胞数を表す。細胞増殖速度（ｋ）は、式（２）に従って細胞の倍加時間（Ｔdoubling）から評価される。野生型OVCAR8-ADR-Cas9細胞の倍加時間は、約２４時間であると実験的に決定された（データ示さず）。
【数３】
0006788584.tif 000031
【０１７５】
モデリングを簡単にするために、我々は全細胞集団を、式（３）に記載されているように、異なる増殖表現型を有する３つの亜集団に分けた。
【数４】
0006788584.tif 000032
式中、Ｃｉ，ｓｌｏｗ（ｔ）およびＣｉ，ｆａｓｔ（ｔ）はそれぞれ、抗増殖性ｇＲＮＡおよび増殖促進性ｇＲＮＡを有する細胞の、平均増殖プロファイルを表し、これは式（１）により決定される。実験開始時に、野生型として振る舞うか、または抗増殖性ｇＲＮＡおよび増殖促進性ｇＲＮＡを有するように振る舞う集団全体のパーセンテージは、それぞれ、ｆｗｔ、ｆｓおよびｆｆで表される。
【０１７６】
この混合細胞増殖モデルに基づいて、我々は、増殖促進性ｇＲＮＡおよび抗増殖性ｇＲＮＡ表現の全細胞集団における相対頻度（Ｒ．Ｆ．）をモデル化した。相対的頻度は、初期時点と比較した、所与の時点のバーコード存在量として定義される（すなわち、
【数５】
0006788584.tif 000033
）。プール内の組合わせの総数Ｎ、および初期の細胞数Ｃ０は、相対頻度結果に影響を与えない。定義されたパラメータでシミュレーションを実行した後、我々は、集団における増殖促進性ｇＲＮＡおよび抗増殖性ｇＲＮＡの富化および枯渇をそれぞれ観察した（図１７Ａ）。富化度および枯渇度は、抗増殖性（ｆs）応答および増殖促進性（ｆｆ）応答を有すると定義された初期のｇＲＮＡ組合わせの異なるパーセンテージ（すなわち、２、５または１０％）と共に、変化することが観察された（図１７Ａ）。我々はさらに、抗増殖性ｇＲＮＡ表示の相対的頻度を、改変細胞の倍加時間（Ｔdoubling, m）および、抗増殖性ｇＲＮＡの改変された増殖速度（ｐ）を有する細胞の割合を調節することによって、さらに評価した。実験中ｐが一定のままであると仮定すると、全細胞集団における抗増殖性クローンの表示は、図１７Ｂ〜図１７Ｃに示すパラメータ範囲で、〜２３％から〜９７％枯渇する可能性がある。このモデルは、細胞増殖ダイナミクスの単純化されたバージョンを、細胞集団を平均増殖速度の亜集団に分離することによって表し、細胞間の潜在的相互作用は説明しない。本発明者らのモデルに基づき、我々のスクリーニングの感度を、改変された増殖速度を有する細胞の割合を増加するための改良されたｇＲＮＡ効率により、およびアッセイ時間を増加させることにより、高めることができた。
【０１７７】
本発明の少なくとも一態様のいくつかの側面を説明したが、様々な変更、修正、および改良が当業者には容易に想起されることを、理解すべきである。かかる変更、修正および改良は本開示の一部であることが意図され、本発明の精神および範囲内にあることが意図される。したがって、前述の説明および図面は、ほんの一例に過ぎない。
【０１７８】
参考文献
0006788584.tif 000034
0006788584.tif 000035
0006788584.tif 000036
【０１７９】
均等物
本発明のいくつかの態様を本明細書に記述し説明したが、当業者は容易に、本明細書に記載された機能を実施するため、および／または結果および／もしくは１もしくは２以上の利点を得るための、種々の別の手段および／または構造を想定するであろうし、かかる変形および／または修正の各々は、本明細書に記載された本発明の態様の範囲内であると考えられる。より一般的には、当業者には容易に、本明細書に記載された全てのパラメータ、寸法、材料、および構成は例示的であることが意図され、実際のパラメータ、寸法、材料、および/または構成は、本発明の教示が用いられている１または２以上の特定の用途に依存することを理解する。当業者は、日常的な実験以上のものを用いることなく、本明細書に記載された特定の発明の態様に対する多くの均等物を認識し、または確認できるであろう。したがって、前述の態様は例示としてのみ表示されており、また添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内において、本発明の態様は、具体的に記載し特許請求された以外によっても実施できることが、理解されるべきである。本開示の発明の態様は、本明細書に記載の各個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に向けられている。さらに、２または３以上のかかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組合わせは、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が互いに矛盾しない場合には、本開示の発明の範囲内に包含される。
【０１８０】
本明細書において定義され使用される全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文献における定義、および／または定義された用語の通常の意味を、支配すると理解すべきでる。
明細書および特許請求の範囲においてここで使用される、不定冠詞「a」および「an」は、明確に逆が示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解すべきである。
ここで明細書および特許請求の範囲において使用される語句「および／または」は、これにより結合された要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解すべきであり、すなわち、要素はいくつかの場合においては結合的に存在し、別の場合には選択的に存在する。「および／または」を用いてリストされた複数の要素は、同様の様式で解釈すべきであり、すなわち、これにより結合された要素の「１または２以上」を意味する。「および／または」節によって特定して識別された要素以外の他の要素も、具体的に識別された要素に関連するかまたは関連しないかに関わらず、任意に存在してよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」は、「含む」などのオープンエンドの言葉と組み合わせて使用する場合、一態様においては、Ａのみ（Ｂ以外の要素を任意に含む）を指し；別の態様においては、Ｂのみ（Ａ以外の要素を任意に含む）を指し；さらに別の態様においては、ＡとＢの両方（別の要素を任意に含む）を指す、などである。
【０１８１】
ここで明細書および特許請求の範囲において使用される場合、「または」は、上記に定義した「および／または」と同じ意味を有すると理解すべきである。例えば、リスト内の項目を分離する場合、「または」または「および／または」は包括的であると解釈されるべきであり、すなわち、多数のもしくはリストされた要素の、少なくとも１つを含むこと、およびこれの１より多くを含むこと、および任意に、リストにない追加の項目を含むこと、となる。明確に逆を指示する要素、例えば「１つのみ」または「正確に１つ」、または、特許請求の範囲で使用される場合の「〜からなる」は、多数のまたはリストされた要素からの正確に１つの要素の包含を指す。一般的に、本明細書で使用される用語の「または」は、「いずれか」、「１つ」、「１つのみ」または「正確に１つ」などの排他性の用語が先行する場合に、排他的代替物を示す（すなわち、「一方または他方のどちらかであるが両方ではない」）と解釈される。特許請求の範囲で使用される場合、「本質的に〜からなる」は、特許法の分野で用いられるその通常の意味を有するものとする。
【０１８２】
ここで明細書および特許請求の範囲において使用される場合、１または２以上の要素のリストを参照しての「少なくとも１つ」の語句は、要素のリストの任意の１または２以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、しかし必ずしも、要素のリスト中に具体的に挙げられた各および全ての要素の少なくとも１つを含む必要はなく、および、要素のリスト中の要素の任意の組合わせも除外しない。この定義はまた、語句「少なくとも1つ」が参照する要素のリスト内に具体的に特定された要素以外にも、具体的に特定された要素に関連するかまたは関連しないかにかかわらず、任意に要素が存在することを可能とする。したがって、非限定的例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または、同等に、「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）とは、以下を指すことができる：一態様において、少なくとも１つのＡを、任意に１つより多くのＡを含み、Ｂは不在である（および任意に、Ｂ以外の要素を含む）；別の態様において、少なくとも１つのＢを、任意に１つより多くのＢを含み、Ａは不在である（および任意に、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の態様において、少なくとも１つのＡを、任意に１つより多くのＡを含み、および、少なくとも１つのＢを、任意に１つより多くのＢを含む（任意に、別の要素を含む）；など。
【０１８３】
また、明確に別の指示がない限り、１より多くのステップまたは行為を含む本明細書に記載の任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、本方法のステップまたは行為が引用されている順序には必ずしも限定されないことが、理解されるべきである。
本明細書で開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれ、いくつかの場合においては、文書全体を包含することもできる。
特許請求の範囲において、および上記明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「担持する（carrying）」、「有する」、「含有する」、「関与する」、「保持する」、「構成する」などの移行句は、オープンエンドであること、すなわち、それを含むが限定はされないことを意味すると理解すべきである。「〜からなる」および「本質的に〜からなる」のみは、米国特許審査便覧のセクション2111.03に記載されているように、クローズまたは半クローズの移行句とすべきである。
【図１Ａ−１】
0006788584.tif 000037
【図１Ａ−２】
0006788584.tif 000038
【図２Ａ】
0006788584.tif 000039
【図２Ｂ】
0006788584.tif 000040
【図３Ａ】
0006788584.tif 000041
【図３Ｂ】
0006788584.tif 000042
【図３Ｃ−３Ｄ】
0006788584.tif 000043
【図４Ａ】
0006788584.tif 000044
【図４Ｂ−４Ｃ】
0006788584.tif 000045
【図５Ａ−５Ｂ】
0006788584.tif 000046
【図５Ｃ】
0006788584.tif 000047
【図５Ｄ】
0006788584.tif 000048
【図６Ａ】
0006788584.tif 000049
【図６Ｂ】
0006788584.tif 000050
【図６Ｃ−６Ｄ】
0006788584.tif 000051
【図６Ｅ】
0006788584.tif 000052
【図７Ａ】
0006788584.tif 000053
【図７Ｂ】
0006788584.tif 000054
【図７Ｃ】
0006788584.tif 000055
【図８Ａ−８Ｂ】
0006788584.tif 000056
【図９Ａ−１】
0006788584.tif 000057
【図９Ａ−２】
0006788584.tif 000058
【図９Ｂ−１】
0006788584.tif 000059
【図９Ｂ−２】
0006788584.tif 000060
【図９Ｃ】
0006788584.tif 000061
【図１０Ａ−１０Ｂ】
0006788584.tif 000062
【図１１】
0006788584.tif 000063
【図１２Ａ−１２Ｂ】
0006788584.tif 000064
【図１２Ｃ】
0006788584.tif 000065
【図１３】
0006788584.tif 000066
【図１４Ａ−１４Ｅ】
0006788584.tif 000067
【図１４Ｆ】
0006788584.tif 000068
【図１５】
0006788584.tif 000069
【図１６Ａ−１６Ｂ】
0006788584.tif 000070
【図１６Ｃ−１】
0006788584.tif 000071
【図１６Ｃ−２】
0006788584.tif 000072
【図１６Ｄ】
0006788584.tif 000073
【図１６Ｅ】
0006788584.tif 000074
【図１７Ａ】
0006788584.tif 000075
【図１７Ｂ】
0006788584.tif 000076
【図１７Ｃ】
0006788584.tif 000077
【図１８】
0006788584.tif 000078
【図１９】
0006788584.tif 000079
【図２０Ａ−２０Ｂ】
0006788584.tif 000080
【図２１Ａ】
0006788584.tif 000081
【図２１Ｂ】
0006788584.tif 000082
【図２２Ａ】
0006788584.tif 000083
【図２２Ｂ】
0006788584.tif 000084
【配列表】
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