(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも１種のＰＥＧ化重合性脂質を含む重合性脂質、ここで、ＰＥＧポリマー鎖を有するＰＥＧ化重合性脂質がｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡである；及び
非重合性脂質を含む、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子であって、
以下を含む、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子：
（ａ）
ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも１種のＰＥＧ化重合性脂質を含む、約１５〜４０ｍｏｌ％の重合性脂質、ここで、ＰＥＧポリマー鎖を有するＰＥＧ化重合性脂質がｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡである、ならびに
少なくとも約１０ｍｏｌ％の両イオン性荷電（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃａｌｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ）脂質、
約２０〜４５ｍｏｌ％の中性荷電分子、及び
約１〜１５ｍｏｌ％の陰性荷電脂質
を含む非重合性脂質；または
（ｂ）
ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも１種のＰＥＧ化重合性脂質を含む、約１５ｍｏｌ％の重合性脂質、ここで、ＰＥＧポリマー鎖を有するＰＥＧ化重合性脂質がｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡである、ならびに
約５１ｍｏｌ％の両イオン性荷電脂質、
約３２ｍｏｌ％の中性荷電分子、及び
約２ｍｏｌ％の陰性荷電脂質
を含む非重合性脂質。
【請求項２】
ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも１種のＰＥＧ化重合性脂質を含む重合性脂質、ここで、ＰＥＧポリマー鎖を有するＰＥＧ化重合性脂質がｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡである、及び  
非重合性脂質を含む、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子であって、
以下を含む、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子：
（ａ）
ｈ−ＰＥＧ１ＰＣＤＡ 約１４ｍｏｌ％、
水素添加大豆ＰＣ 約５１ｍｏｌ％、
コレステロール 約３２ｍｏｌ％、
ｍ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ 約２ｍｏｌ％、及び
ｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡ 約１ｍｏｌ％；または
（ｂ）
ｈ−ＰＥＧ１ＰＣＤＡ 約１４ｍｏｌ％、
水素添加大豆ＰＣ 約４８ｍｏｌ％、
コレステロール 約３２ｍｏｌ％、
ｍ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ 約２ｍｏｌ％、
ｍａｌ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ 約３ｍｏｌ％、及び
ｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡ 約１ｍｏｌ％；または
（ｃ）
ｈ−ＰＥＧ１ＰＣＤＡ 約２４ｍｏｌ％、
水素添加大豆ＰＣ 約４１ｍｏｌ％、
コレステロール 約３２ｍｏｌ％、
ｍ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ 約２ｍｏｌ％、及び
ｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡ 約１ｍｏｌ％。
【請求項３】
ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも１種のＰＥＧ化重合性脂質を含む重合性脂質と、非重合性脂質とを含むハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程であって、ＰＥＧポリマー鎖を有するＰＥＧ化重合性脂質がｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡである、工程、
該重合リポソームナノ粒子の膜を隔ててイオン勾配を確立する工程、
治療用物質を提供する工程、及び
該治療用物質を該重合リポソームナノ粒子とともにインキュベートし、これにより、該重合リポソームナノ粒子に該治療用物質をローディングする工程
を含む、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子に治療用物質をローディングする方法。
【請求項４】
脂質ミセルを提供する工程、
ターゲティング物質を提供する工程、
該ターゲティング物質を該脂質ミセルに結合させる工程、
ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも１種のＰＥＧ化重合性脂質を含む重合性脂質と、非重合性脂質とを含むハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程であって、ＰＥＧポリマー鎖を有するＰＥＧ化重合性脂質がｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡである、工程、及び
該重合リポソームナノ粒子を、該ターゲティング物質と結合した該脂質ミセルとともにインキュベートし、これにより、該ターゲティング物質を該重合リポソームナノ粒子に移行させる工程
を含む、ターゲティング物質をハイブリッド重合リポソームナノ粒子に結合させる方法。
【請求項５】
遊離チオール基を有するターゲティング物質を提供する工程、
ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも１種のＰＥＧ化重合性脂質、少なくとも１種のマレイミド末端（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）ＰＥＧ化脂質を含む重合性脂質と、非重合性脂質とを含むハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程であって、ＰＥＧポリマー鎖を有するＰＥＧ化重合性脂質がｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡである、工程、及び
該重合リポソームナノ粒子を、該遊離チオールを含有する該ターゲティング物質とともにインキュベートし、これにより、該ターゲティング物質を該重合リポソームナノ粒子に共有結合させる工程
を含む、ターゲティング物質をハイブリッド重合リポソームナノ粒子に結合させる方法。
【請求項６】
前記イオン勾配が硫酸アンモニウム勾配及び／またはｐＨ勾配である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＥＧ化重合性脂質が、約０．１〜１、１〜５、５〜１０、または１０〜１５ｍｏｌ％である、請求項３〜６いずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記治療用物質が、ドキソルビシン、イリノテカン、シスプラチン、トポテカン、ビンクリスチン、マイトマイシン、パキシリタキソール、シタラビン、ミトキサントロン、Ａｒａ−Ｃ（シタラビン）、ＶＰ−１６（エトポシド）、若しくはｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである、請求項３、６および７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ターゲティング物質が、
（ａ）抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１１７抗体、抗ＣＤ１６６抗体、若しくは抗ＣＡ１９−９抗体、またはそれらの組み合わせである、または
（ｂ）癌性細胞上の表面マーカーに特異的に結合できるペプチドである、
請求項４〜５および７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ターゲティング物質上のチオール基と前記脂質ミセル上のマレイミド基との間の反応を介して、該ターゲティング物質を該脂質ミセルに結合させる、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記ターゲティング物質上のチオール基と前記重合リポソームの外側表面上のマレイミド基との間の反応を介して、該ターゲティング物質を該重合リポソームの外側表面に結合させる、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記ハイブリッド重合リポソームナノ粒子が、非凝集性ハイブリッド重合リポソームナノ粒子である、請求項１または２に記載のハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
【請求項１３】
前記ハイブリッド重合リポソームナノ粒子が、非凝集性ハイブリッド重合リポソームナノ粒子である、請求項３〜１１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府支援の研究に関する言明
本発明は、政府支援で全米科学財団より助成金ＩＩＰ−１１４３３４２号の元で実施された。政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ターゲティングされたハイブリッド重合リポソームナノ粒子を新規薬物送達ビヒクルとして用いて病態を治療するための組成物、方法、及びキットに関する。病態にはさまざまな癌が挙げられるが、これらに限定されない。ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は癌細胞を標的にし、癌細胞内へ内部移行され、封入されている薬物を放出して癌細胞を損傷／破壊する。
【背景技術】
【０００３】
背景
本明細書に引用されているすべての刊行物は、個々の刊行物または特許出願についてそれぞれが参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に指示されている場合と同じ程度に、参照によりその全体が組み込まれるものとする。以下の説明は、本発明の理解に有用となり得る情報を含んでいる。本明細書で提供される任意の情報が先行技術である、若しくは本願で請求する発明に関連していること、または具体的若しくは暗黙のうちに参照される任意の刊行物が先行技術であることを承認するものではない。
【０００４】
世界中で、毎年推定３５０，０００人が白血病と診断されており、年間約２５７，０００人が死亡している（国際がん研究機関（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ））。米国だけでも、推定２７４，９３０人が白血病に罹患しており、白血病と診断された全成体の約９０パーセントを占めている（世界保健機関）。２０１２年、新たに４７，１５０人の患者が白血病と診断され、生存が予想されるのはわずか約５０パーセントである（米国対がん協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ））。従来の最先端の治療法は、多くの症例において有効であるものの、白血病患者の生存率の低さから改善が必須であることは明らかである。
【０００５】
白血病は治療が非常に高額であり、多くの患者は治療を受けることができない。白血病患者の大半は化学療法で治療される（オハイオ州立大学総合がんセンター）。化学療法を１回受けるだけで治療費は１５０，０００ドルになることがあり、通常、何回かの治療が必要である。任意選択治療である骨髄移植は２５０，０００ドル以上かかることが知られている（Ｅｄｇａｒ  Ｌａｗ  Ｆｉｒｍ，カリフォルニア州サンタ・ローザ）。Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ'ｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｒｅｐｏｒｔ：２０１１−２０１２  改訂版（非特許文献１）によれば、米国では毎年、５４億ドルが白血病治療に費やされている、すなわち、２０１２年に白血病と診断された４７，１５０人の患者一人あたり１１４，５００ドル超が費やされると予測している。
【０００６】
本明細書において、本発明者らは、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子（ＨＰＬＮ）を利用して抗癌薬を封入し、封入した抗癌薬を癌細胞まで送達するという薬物送達システムを提供する。記載の送達システムは、任意の対象薬物を実質的に封じ込め、かつ既知の特徴的または特異的な細胞マーカーが存在する任意の組織を標的にするために、使用されることができる。したがって、本発明は、用途が非常に広いプラットフォーム技術を提供する。
【０００７】
本明細書に記載のＨＰＬＮは、生体適合性があり、かつ、中に封入されている薬物の生物学的利用能を高める、独自のタイプのナノ粒子材料を用いることにより、他の多くのタイプの送達粒子物質に比して大きな利点を提供する。さらに、かかる技術を、粒子特性を調節してカスタマイズし、多量の薬剤をその内部に収め、実際に固形化して結晶にする。他とは異なるさらに別の特徴は、腫瘍を標的とする分子を粒子表面に取り付けるカスタマイズ化方法であり、これにより健全な組織を避けながら腫瘍細胞へアクセスする際の粒子の選択性が改善される。
【０００８】
ＨＰＬＮ内封入薬物を使用することにより、癌患者を治療する医師には、非癌細胞に対する用量相関的な毒性が最小化され、既存の抗癌化学療法物質の治療濃度域が有意に広がることがわかるかもしれない。こうした治療を受ける患者の場合、本明細書に記載のＨＰＬＮにより、幾つかの重要な特性で達成される、より有効な治療が約束される。すなわち、（ａ）治療時間の短縮、（ｂ）通信回数の減少、（ｃ）正常組織に対する損傷の低下、（ｄ）より短時間の回復、及び（ｅ）生存可能性の増大である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ'ｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｒｅｐｏｒｔ：２０１１−２０１２  改訂版
【発明の概要】
【００１０】
本発明のさまざまな実施形態は、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子（ＨＰＬＮ）を提供する。ＨＰＬＮは、ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも１種のＰＥＧ化重合性脂質を含む重合性脂質、及び非重合性脂質を含んでもよいか、または該重合性脂質及び該非重合性脂質からなってもよい。一実施形態において、ＰＥＧ化重合性脂質はｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡである。
【００１１】
本発明のさまざまな実施形態はＨＰＬＮを提供する。ＨＰＬＮは、ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも１種のＰＥＧ化重合性脂質を含む重合性脂質（約１５〜４０ｍｏｌ％）、及び非重合性脂質を含んでもよいか、または該重合性脂質及び該非重合性脂質からなってもよい。いくつかの実施形態では、非重合性脂質には、両イオン性荷電脂質（少なくとも約１０ｍｏｌ％）、中性荷電分子（約２０〜４５ｍｏｌ％）、陰性荷電脂質（約１〜１５ｍｏｌ％）、及び／またはそれらの組み合わせが含まれる。一実施形態において、ＰＥＧ化重合性脂質はｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、重合性脂質は、ＰＥＧポリマー鎖を有していない（エチレングリコールユニットが１つのみの「ＰＥＧ１」）少なくとも１種の重合性脂質を含み、それらにはｈ−ＰＥＧ１−ＰＣＤＡ、スルホ−ＰＥＧ１−ＰＣＤＡ、ｍ−ＰＥＧ１−ＰＣＤＡ、及びｍａｌ−ＰＥＧ１−ＰＣＤＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
さまざまな実施形態では、ＰＥＧポリマー鎖を有するＰＥＧ化重合性脂質は、ＨＰＬＮの約０．１〜１、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１〜１５、１５〜３０、または３０〜４０ｍｏｌ％である。さまざまな実施形態では、ＰＥＧポリマー鎖は、約１０〜１５０、１０〜５０、５０〜１００、または１００〜１５０個のＰＥＧユニットを含む。さまざまな実施形態では、ＰＥＧポリマー鎖の分子量は約５００〜５０００、５００〜２０００、または２０００〜５０００Ｄａである。さまざまな実施形態では、ＰＥＧ化重合性脂質は、（ＰＥＧ）ｎ−１０，１２−ペンタコサジイン酸（ｈ−（ＰＥＧ）ｎ−ＰＣＤＡ、スルホ−（ＰＥＧ）ｎ−ＰＣＤＡ、ｍ−（ＰＥＧ）ｎ−ＰＣＤＡ、及びｍａｌ−（ＰＥＧ）ｎ−ＰＣＤＡの各種誘導体からなる群から選択され、ｎは、ＰＥＧポリマー鎖内のＰＥＧユニットの数であり、かつ約１０〜１５０、１０〜５０、５０〜１００、または１００〜１５０である。さまざまな実施形態では、ＰＥＧ化重合性脂質は、ＰＥＧ（ｍｗ）−１０，１２−ペンタコサジイン酸ｈ−ＰＥＧ（ｍｗ）−ＰＣＤＡ、スルホ−ＰＥＧ（ｍｗ）−ＰＣＤＡ、ｍ−ＰＥＧ（ｍｗ）−ＰＣＤＡ、及びｍａｌ−ＰＥＧ（ｍｗ）−ＰＣＤＡの各種誘導体からなる群から選択され、ｍｗは、ＰＥＧポリマー鎖の分子量であり、かつ約５００〜５０００、５００〜２０００、または２０００〜５０００Ｄａである。ある実施形態では、ＰＥＧ化重合性脂質はＰＥＧ２０００−１０−１２−ペンタコサジインアミドまたはＰＥＧ２０００−１０−１２−ペンタコサジイノアート（ｐｅｎｔａｃｏｓａｄｉｙｎｏａｔｅ）である。ＰＥＧ化重合性脂質の例には、ＰＥＧ化ジインＰＣ、ＰＥＧ化ジインＰＥ、及びＰＥＧ化１０，１２−ペンタコサジイン酸（ＰＥＧ−ＰＣＤＡ）並びにそれらの機能的な誘導体及び類似体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化重合性脂質は、脂質分子に結合しているＰＥＧ化重合性基を含んで良い。
【００１４】
さまざまな実施形態では、両イオン性荷電（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃａｌｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ）脂質には、Ｌ−α−ジステアロイルホスファチジルコリン、Ｌ−ａ−ホスファチジルコリン水素添加大豆（水素添加大豆ＰＣ）、またはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＤＰＣ）、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、１，２−ジリグノセロイル（ｄｉｌｉｇｎｏｃｅｒｏｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
さまざまな実施形態では、中性荷電分子には、コレステロール、エルゴステロール、ホパノイド、フィトステロール、スタノール、及びステロール、及びそれらの機能的誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
さまざまな実施形態では、陰性荷電脂質には、限定することなく、ｍ−ＰＥＧ２０００−脂質、ｍａｌ−ＰＥＧ２０００−脂質、（ＰＥＧ）ｎ−脂質、ｍ−（ＰＥＧ）ｎ−脂質、ｍａｌ−（ＰＥＧ）ｎ−脂質、ＰＥＧ（ｍｗ）−脂質、ｍ−ＰＥＧ（ｍｗ）−脂質、及びｍａｌ−ＰＥＧ（ｍｗ）−脂質誘導体が含まれ、脂質はＤＳＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＬＰＥ、ＤＣＰＥ、ＤＡＰＥまたはジリグノセロイル（ｄｉｌｉｇｎｏｃｅｒｏｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンであり、かつ、ｎは、ＰＥＧポリマー鎖内のＰＥＧユニットの数であり、かつ約１０〜１５０、１０〜５０、５０〜１００、または１００〜１５０であり、かつ、ｍｗは、ＰＥＧポリマー鎖の分子量であり、かつ約５００〜５０００、５００〜２０００、または２０００〜５０００Ｄａである。
【００１７】
さまざまな実施形態において、本発明は、ｈ−ＰＥＧ１ＰＣＤＡ 約１４ｍｏｌ％、水素添加大豆ＰＣ 約５１ｍｏｌ％、コレステロール 約３２ｍｏｌ％、ｍ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ 約２ｍｏｌ％、及びｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡ 約１ｍｏｌ％を含むハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する。一実施形態において、ＨＰＬＮは、本明細書に記載のようにＨＰＬＮに封入した１種以上の治療用物質をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、本明細書に記載のようにＨＰＬＮに結合された１つ以上の抗体をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、ＨＰＬＮ内に封入した１種以上の治療用物質及びＨＰＬＮに結合された１つ以上の抗体を含む。
【００１８】
さまざまな実施形態において、本発明は、ｈ−ＰＥＧ１ＰＣＤＡ 約１４ｍｏｌ％、水素添加大豆ＰＣ 約４８ｍｏｌ％、コレステロール 約３２ｍｏｌ％、ｍ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ 約２ｍｏｌ％、ｍａｌ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ 約３ｍｏｌ％、及びｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡ 約１ｍｏｌ％を含むハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する。一実施形態において、ＨＰＬＮは、本明細書に記載のようにＨＰＬＮに封入した１種以上の治療用物質をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、本明細書に記載のようにＨＰＬＮに結合された１つ以上の抗体をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、ＨＰＬＮ内に封入した１種以上の治療用物質及びＨＰＬＮに結合された１つ以上の抗体を含む。
【００１９】
本発明のさまざまな実施形態は、対象において病態を治療し、病態を予防し、病態を有する可能性を低下させ、病態の重症度を軽減させ、かつ／または病態の進行を緩徐にさせる方法を提供する。かかる方法は、本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程、及び、治療的有効量のハイブリッド重合リポソームナノ粒子を対象に投与し、これにより、対象において病態を治療し、病態を予防し、病態を有する可能性を低下させ、病態の重症度を軽減させ、かつ／または病態の進行を緩徐にさせる工程を含むか、またはそれらの工程からなる。さまざまな実施形態では、病態は癌である。本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子には、ＨＰＬＮ内部にローディングされた治療用物質がさらに含まれる。さらに、本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、ターゲティング物質を、例えばＨＰＬＮ表面にさらに含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＬＮには治療用物質とターゲティング物質の両方が含まれる。
【００２０】
本発明のさまざまな実施形態は、対象においてユーイング肉腫を治療し、ユーイング肉腫の再発を予防し、ユーイング肉腫の重症度を軽減させ、かつ／またはユーイング肉腫の進行を緩徐にさせる方法を提供する。かかる方法は、本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程、及び、治療的有効量のハイブリッド重合リポソームナノ粒子を対象に投与し、これにより、対象においてユーイング肉腫を治療し、ユーイング肉腫の再発を予防し、ユーイング肉腫の重症度を軽減させ、かつ／またはユーイング肉腫の進行を緩徐にさせる工程を含むか、またはそれらの工程からなる。本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子には、ＨＰＬＮ内部にローディングされた治療用物質がさらに含まれる。さらに、本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、ターゲティング物質を、例えばＨＰＬＮ表面にさらに含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＬＮには治療用物質とターゲティング物質の両方が含まれる。
【００２１】
本発明のさまざまな実施形態は、対象において急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を治療し、ＡＬＬの再発を予防し、ＡＬＬの重症度を軽減させ、かつ／またはＡＬＬの進行を緩徐にさせる方法を提供する。一実施形態において、ＡＬＬは小児ＡＬＬである。かかる方法は、本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程、及び、治療的有効量のハイブリッド重合リポソームナノ粒子を対象に投与し、これにより、対象においてＡＬＬを治療し、ＡＬＬの再発を予防し、ＡＬＬの重症度を軽減させ、かつ／またはＡＬＬの進行を緩徐にさせる工程を含むか、またはそれらの工程からなる。本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子には、ＨＰＬＮ内部にローディングされた治療用物質がさらに含まれる。さらに、本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、例えばＨＰＬＮ表面の、ターゲティング物質をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＬＮには治療用物質とターゲティング物質の両方が含まれる。
【００２２】
本発明のさまざまな実施形態は、対象においてバーキットリンパ腫を治療し、バーキットリンパ腫の再発を予防し、バーキットリンパ腫の重症度を軽減させ、かつ／またはバーキットリンパ腫の進行を緩徐にさせる方法を提供する。かかる方法は、本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程、及び、治療的有効量のハイブリッド重合リポソームナノ粒子を対象に投与し、これにより、対象においてバーキットリンパ腫を治療し、バーキットリンパ腫の再発を予防し、バーキットリンパ腫の重症度を軽減させ、かつ／またはバーキットリンパ腫の進行を緩徐にさせる工程を含むか、またはそれらの工程からなる。本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子には、ＨＰＬＮ内部にローディングされた治療用物質がさらに含まれる。さらに、本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、例えばＨＰＬＮ表面の、ターゲティング物質をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＬＮには治療用物質とターゲティング物質の両方が含まれる。
【００２３】
本発明のさまざまな実施形態は、対象において慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を治療し、ＣＭＬの再発を予防し、ＣＭＬの重症度を軽減させ、かつ／またはＣＭＬの進行を緩徐にさせる方法を提供する。かかる方法は、本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程、及び、治療的有効量のハイブリッド重合リポソームナノ粒子を対象に投与し、これにより、対象においてＣＭＬを治療し、ＣＭＬの再発を予防し、ＣＭＬの重症度を軽減させ、かつ／またはＣＭＬの進行を緩徐にさせる工程を含むか、またはそれらの工程からなる。本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子には、ＨＰＬＮ内部にローディングされた治療用物質がさらに含まれる。さらに、本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、例えばＨＰＬＮ表面の、ターゲティング物質をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＬＮには治療用物質とターゲティング物質の両方が含まれる。
【００２４】
本発明のさまざまな実施形態は、対象において急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療し、ＡＭＬの再発を予防し、ＡＭＬの重症度を軽減させ、かつ／またはＡＭＬの進行を緩徐にさせる方法を提供する。かかる方法は、本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程、及び、治療的有効量のハイブリッド重合リポソームナノ粒子を対象に投与し、これにより、対象においてＡＭＬを治療し、ＡＭＬの再発を予防し、ＡＭＬの重症度を軽減させ、かつ／またはＡＭＬの進行を緩徐にさせる工程を含むか、またはそれらの工程からなる。本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子には、ＨＰＬＮ内部にローディングされた治療用物質がさらに含まれる。さらに、本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、例えばＨＰＬＮ表面の、ターゲティング物質をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＬＮには治療用物質とターゲティング物質の両方が含まれる。
【００２５】
本発明のさまざまな実施形態は、対象において骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を治療し、ＭＤＳの再発を予防し、ＭＤＳの重症度を軽減させ、かつ／またはＭＤＳの進行を緩徐にさせる方法を提供する。かかる方法は、本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程、及び、治療的有効量のハイブリッド重合リポソームナノ粒子を対象に投与し、これにより、対象においてＭＤＳを治療し、ＭＤＳの再発を予防し、ＭＤＳの重症度を軽減させ、かつ／またはＭＤＳの進行を緩徐にさせる工程を含むか、またはそれらの工程からなる。本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子には、ＨＰＬＮ内部にローディングされた治療用物質がさらに含まれる。さらに、本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、例えばＨＰＬＮ表面の、ターゲティング物質をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＬＮには治療用物質とターゲティング物質の両方が含まれる。
【００２６】
本発明のさまざまな実施形態は、対象において骨肉腫、神経芽細胞腫、または神経膠腫のいずれか１つまたはそれ以上を治療し、骨肉腫、神経芽細胞腫、または神経膠腫のいずれか１つまたはそれ以上の再発を予防し、骨肉腫、神経芽細胞腫、または神経膠腫のいずれか１つまたはそれ以上の重症度を軽減させ、かつ／または骨肉腫、神経芽細胞腫、または神経膠腫のいずれか１つまたはそれ以上の進行を緩徐にさせる方法を提供する。かかる方法は、本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程、及び、治療的有効量のハイブリッド重合リポソームナノ粒子を対象に投与し、これにより、対象において骨肉腫、神経芽細胞腫、または神経膠腫のいずれか１つまたはそれ以上を治療し、骨肉腫、神経芽細胞腫、または神経膠腫のいずれか１つまたはそれ以上の再発を予防し、骨肉腫、神経芽細胞腫、または神経膠腫のいずれか１つまたはそれ以上の重症度を軽減させ、かつ／または骨肉腫、神経芽細胞腫、または神経膠腫のいずれか１つまたはそれ以上の進行を緩徐にさせる工程を含むか、またはそれらの工程からなる。本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子には、ＨＰＬＮ内部にローディングされた治療用物質がさらに含まれる。さらに、本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、例えばＨＰＬＮ表面の、ターゲティング物質をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＬＮには治療用物質とターゲティング物質の両方が含まれる。
【００２７】
本発明のさまざまな実施形態は、本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子を含む薬学的組成物を提供する。本発明のさまざまな実施形態は、本明細書に記載される２つ以上のハイブリッド重合リポソームナノ粒子を含む薬学的組成物を提供する。本発明のさまざまな実施形態は、本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子を複数含む薬学的組成物を提供する。本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、その中にローディングした治療用物質、またはそれに結合されたターゲティング物質をさらに含む。本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、その中にローディングした治療用物質と、それに結合されたターゲティング物質とをさらに含む。
【００２８】
本発明のさまざまな実施形態は、対象の病態を治療する、予防する、その重症度を軽減させる、及び／またはその進行を緩徐にさせるためのキットを提供する。かかるキットは、ある量の本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子、並びに対象における病態を治療する、予防する、その重症度を軽減させる、及び／またはその進行を緩徐にさせるためにハイブリッド重合リポソームナノ粒子を使用するための指示書を含む。一実施形態では、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、その中にローディングした治療用物質をさらに含む。別の実施形態では、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、それに結合されたターゲティング物質をさらに含む。さらに別の実施形態では、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、その中にローディングした治療用物質と、それに結合されたターゲティング物質とをさらに含む。
【００２９】
本発明のさまざまな組成物、方法、及びキットは、各種の癌を含むがこれらに限定されない多様な病態の治療において有用である。
[本発明1001]
ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも1種のＰＥＧ化重合性脂質を含む重合性脂質、及び
非重合性脂質
を含む、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1002]
ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも1種のＰＥＧ化重合性脂質を含む重合性脂質（約15〜40ｍｏｌ％）、及び
非重合性脂質
を含み、該非重合性脂質が、
両イオン性荷電（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃａｌｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ）脂質（少なくとも約10ｍｏｌ％）、
中性荷電分子（約20〜45ｍｏｌ％）、及び
陰性荷電脂質（約1〜15ｍｏｌ％）
を含む、本発明1001のハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1003]
ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも1種のＰＥＧ化重合性脂質を含む重合性脂質（約15ｍｏｌ％）、及び
非重合性脂質
を含み、該非重合性脂質が、
両イオン性荷電脂質（約51ｍｏｌ％）、
中性荷電分子（約32ｍｏｌ％）、及び
陰性荷電脂質（約2ｍｏｌ％）
を含む、本発明1001のハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1004]
ポリマー鎖を有する前記ＰＥＧ化重合性脂質がｍ−ＰＥＧ2000−ＰＣＤＡである、本発明1001、1002、または1003のハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1005]
ｈ−ＰＥＧ1ＰＣＤＡ 約14ｍｏｌ％、
水素添加大豆ＰＣ 約51ｍｏｌ％、
コレステロール 約32ｍｏｌ％、
ｍ−ＰＥＧ2000−ＤＳＰＥ 約2ｍｏｌ％、及び
ｍ−ＰＥＧ2000−ＰＣＤＡ 約1ｍｏｌ％
を含む、本発明1001のハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1006]
ｈ−ＰＥＧ1ＰＣＤＡ 約14ｍｏｌ％、
水素添加大豆ＰＣ 約48ｍｏｌ％、
コレステロール 約32ｍｏｌ％、
ｍ−ＰＥＧ2000−ＤＳＰＥ 約2ｍｏｌ％、
ｍａｌ−ＰＥＧ2000−ＤＳＰＥ 約3ｍｏｌ％、及び
ｍ−ＰＥＧ2000−ＰＣＤＡ 約1ｍｏｌ％
を含む、本発明1001のハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1007]
ｈ−ＰＥＧ1ＰＣＤＡ 約24ｍｏｌ％、
水素添加大豆ＰＣ 約41ｍｏｌ％、
コレステロール 約32ｍｏｌ％、
ｍ−ＰＥＧ2000−ＤＳＰＥ 約2ｍｏｌ％、及び
ｍ−ＰＥＧ2000−ＰＣＤＡ 約1ｍｏｌ％
を含む、本発明1001のハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1008]
前記重合リポソームナノ粒子のサイズが約30〜200ｎｍである、本発明1001〜1007のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1009]
前記重合性脂質を重合させるために製造後に約1〜35分間ＵＶ処理されている、本発明1001〜1007のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1010]
押出し成形直後かつ重合前に5〜10℃で一晩冷却することにより調製されている、本発明1001〜1007のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1011]
少なくとも約1時間〜少なくとも約4時間の循環半減期を有する、本発明1001〜1007のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1012]
約30分後に細胞のエンドソームコンパートメントへ内部移行される、本発明1001〜1007のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1013]
中性荷電分子を含み、該中性荷電分子が、コレステロール、エルゴステロール、ホパノイド、フィトステロール、スタノール、及びステロール、並びにそれらの機能的誘導体から選択される、本発明1001〜1007のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1014]
前記ＰＥＧポリマー鎖が、約10〜150、10〜50、50〜100、または100〜150個のＰＥＧユニットを含む、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1015]
前記ＰＥＧポリマー鎖の分子量が、約500〜5000、500〜2000、または2000〜5000Ｄａである、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1016]
前記ＰＥＧ化重合性脂質が、約0．1〜1、1〜5、5〜10、または10〜15ｍｏｌ％である、本発明1001〜1007のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1017]
前記ＰＥＧ化重合性脂質が、（ＰＥＧ）ｎ−10，12−ペンタコサジイン酸（（ＰＥＧ）ｎ−ＰＣＤＡ）誘導体からなる群から選択され、ｎが、前記ＰＥＧポリマー鎖内のＰＥＧユニットの数であり、かつ約10〜150、10〜50、50〜100、または100〜150である、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1018]
前記ＰＥＧ化重合性脂質が、ＰＥＧ（ｍｗ）−10，12−ペンタコサジイン酸（ＰＥＧ（ｍｗ）−ＰＣＤＡ）誘導体からなる群から選択され、ｍｗが、前記ＰＥＧポリマー鎖の分子量であり、かつ約500〜5000、500〜2000、または2000〜5000Ｄａである、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1019]
前記ＰＥＧ化重合性脂質が、ＰＥＧ2000−10−12−ペンタコサジインアミドである、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1020]
前記重合性脂質が約15〜40ｍｏｌ％である、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1021]
前記重合性脂質が不飽和脂質を含む、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1022]
前記重合性脂質がジアセチレン脂質を含む、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1023]
前記重合性脂質が、Ｎ−（5'−ヒドロキシ−3'−オキシペンチル）−10−12−ペンタコサジインアミド（ｈ−ＰＥＧ1−ＰＣＤＡ）、Ｎ−（5'−スルホ−3'−オキシペンチル）−10−12−ペンタコサジインアミド（スルホ−ＰＥＧ1−ＰＣＤＡ）、Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−750］−10−12−ペンタコサジインアミド（ｍ−ＰＥＧ750−ＰＣＤＡ）、若しくはＮ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−1500］−10−12−ペンタコサジインアミド（ｍａｌ−ＰＥＧ1500−ＰＣＤＡ）、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1024]
前記非重合性脂質が約80〜85ｍｏｌ％である、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1025]
前記非重合性脂質が約30〜60ｍｏｌ％である、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1026]
前記非重合性脂質が飽和リン脂質を含む、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1027]
前記非重合性脂質が、ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも1種のＰＥＧ化非重合性脂質を含む、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1028]
前記非重合性脂質が、Ｌ−ａ−ホスファチジルコリン水素添加大豆（水素添加大豆ＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、1，2−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−2000］（ｍ−Ｐｅｇ2000−ＤＳＰＥ）、若しくは1，2−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−2000］（ｍａｌ−Ｐｅｇ2000−ＤＳＰＥ）、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1029]
前記非重合性脂質が、Ｌ−α−ホスファチジルコリン、ＰＥ−ＰＥＧ2000−1，2−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−2000］、若しくはＰＥ−ＰＥＧ2000−ビオチン、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1030]
少なくとも約10ｍｏｌ％の両イオン性荷電脂質を含む、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1031]
約10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、または80〜90ｍｏｌ％の両イオン性荷電脂質を含む、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1032]
約10〜60ｍｏｌ％の両イオン性荷電脂質を含む、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1033]
前記両イオン性荷電脂質がＬ−α−ジステアロイルホスファチジルコリンを含む、本発明1001〜1003のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1034]
前記重合リポソームナノ粒子にローディングされた治療用物質をさらに含み、該治療用物質が、抗腫瘍薬、血液製剤、生体応答調節物質、抗真菌薬、ホルモン、ビタミン、ペプチド、抗結核薬、酵素、抗アレルギー薬、抗凝固剤、循環系作用薬、代謝増強剤、抗ウイルス薬、抗狭心症薬、抗生物質、抗炎症剤、抗原虫薬、抗リウマチ薬、麻薬、アヘン剤、強心配糖体、神経筋遮断薬、鎮静剤、局所麻酔薬、全身麻酔薬、放射性化合物、放射線増感剤、免疫チェックポイント阻害剤、モノクローナル抗体、遺伝物質、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子などのアンチセンス核酸、及びプロドラッグからなる群から選択される、本発明1001〜1007のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1035]
前記重合リポソームナノ粒子にローディングされた化学療法薬をさらに含む、本発明1001〜1007のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1036]
前記重合リポソームナノ粒子にローディングされた2つ以上の化学療法薬をさらに含む、本発明1001〜1007のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1037]
前記化学療法薬が、ドキソルビシン、イリノテカン、シスプラチン、トポテカン、ビンクリスチン、マイトマイシン、パキシリタキソール（ｐａｘｌｉｔａｘｏｌ）、シタラビン、ミトキサントロン、Ａｒａ−Ｃ（シタラビン）、ＶＰ−16（エトポシド）、若しくはｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである、本発明1035または1036のハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1038]
前記重合リポソームナノ粒子の表面に結合されたターゲティング物質をさらに含む、本発明1001〜1007のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1039]
前記重合リポソームナノ粒子の表面に結合された2種以上のターゲティング物質をさらに含む、本発明1001〜1007のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1040]
前記ターゲティング物質が、抗ＣＤ19抗体、抗ＣＤ34抗体、抗ＣＤ99抗体、抗ＣＤ117抗体、抗ＣＤ166抗体、若しくは抗ＣＡ19−9抗体、またはそれらの組み合わせである、本発明1038または1039のハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1041]
前記ターゲティング物質が、細胞表面分子に特異的に結合できるペプチドである、本発明1038または1039のハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1042]
前記細胞表面分子が、構造タンパク質、細胞接着分子、膜受容体、キャリアタンパク質、及びチャネルタンパク質からなる群から選択される細胞膜タンパク質である、本発明1041のハイブリッド重合脂質ナノ粒子。
[本発明1043]
前記細胞表面分子が、活性化白血球接着分子（ＣＤ−166）、糖鎖抗原（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）19−9（ＣＡ19−9）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、卵巣癌抗原（ＣＡ−125）、乳癌抗原（ＭＵＣ−1及び上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ））、チロシナーゼ悪性黒色腫抗原及び黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ｒａｓの抗原性異常産物、ｐ53、ユーイング肉腫抗原（ＣＤ−99）、白血病抗原（ＣＤ−19及びＣＤ−117）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ2／ｎｅｕ、または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である、本発明1041のハイブリッド重合脂質ナノ粒子。
[本発明1044]
前記ターゲティング物質が、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、抗体、リガンド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ビタミン、核酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1038または1039のハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1045]
前記ターゲティング物質が、エンドサイトーシスまたは細胞膜融合を亢進させる、本発明1038または1039のハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1046]
前記表面に結合された作用物質をさらに含み、該作用物質が、癌のための治療として免疫応答を誘発する、本発明1038または1039のハイブリッド重合リポソームナノ粒子。
[本発明1047]
前記細胞表面分子が細胞膜タンパク質であり、該細胞膜タンパク質が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性の前癌性細胞及び癌細胞のすべてにおいて検出可能であるＥ6及びＥ7タンパク質、または、腫瘍関連ＭＵＣ1及びＭＵＣ4糖タンパク質に基づくムチン糖タンパク質からなる群から選択される、本発明1046のハイブリッド重合脂質ナノ粒子。
[本発明1048]
ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも1種のＰＥＧ化重合性脂質を含む重合性脂質と、非重合性脂質とを含むハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程、
該重合リポソームナノ粒子の膜を隔ててイオン勾配を確立する工程、
治療用物質を提供する工程、及び
該治療用物質を該重合リポソームナノ粒子とともにインキュベートし、これにより、該重合リポソームナノ粒子に該治療用物質をローディングする工程
を含む、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子に治療用物質をローディングする方法。
[本発明1049]
前記イオン勾配が硫酸アンモニウム勾配及び／またはｐＨ勾配である、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記ＰＥＧポリマー鎖が、約10〜150、10〜50、50〜100、または100〜150個のＰＥＧユニットを含む、本発明1048の方法。
[本発明1051]
前記ＰＥＧポリマー鎖の分子量が、約500〜5000、500〜2000、または2000〜5000Ｄａである、本発明1048の方法。
[本発明1052]
前記ＰＥＧ化重合性脂質が、約0．1〜1、1〜5、5〜10、または10〜15ｍｏｌ％である、本発明1048の方法。
[本発明1053]
前記ＰＥＧ化重合性脂質が、（ＰＥＧ）ｎ−10，12−ペンタコサジイン酸（（ＰＥＧ）ｎ−ＰＣＤＡ）誘導体からなる群から選択され、ｎが、前記ＰＥＧポリマー鎖内のＰＥＧユニットの数であり、かつ約10〜150、10〜50、50〜100、または100〜150である、本発明1048の方法。
[本発明1054]
前記ＰＥＧ化重合性脂質が、ＰＥＧ（ｍｗ）−10，12−ペンタコサジイン酸（ＰＥＧ（ｍｗ）−ＰＣＤＡ）誘導体からなる群から選択され、ｍｗが、前記ＰＥＧポリマー鎖の分子量であり、かつ約500〜5000、500〜2000、または2000〜5000Ｄａである、本発明1048の方法。
[本発明1055]
前記ＰＥＧ化重合性脂質がＰＥＧ2000−10−12−ペンタコサジインアミドである、本発明1048の方法。
[本発明1056]
前記治療用物質が、ドキソルビシン、イリノテカン、シスプラチン、トポテカン、ビンクリスチン、マイトマイシン、パキシリタキソール、シタラビン、ミトキサントロン、Ａｒａ−Ｃ（シタラビン）、ＶＰ−16（エトポシド）、若しくはｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである、本発明1048の方法。
[本発明1057]
脂質ミセルを提供する工程、
ターゲティング物質を提供する工程、
該ターゲティング物質を該脂質ミセルに結合させる工程、
ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも1種のＰＥＧ化重合性脂質を含む重合性脂質と、非重合性脂質とを含むハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程、及び
該重合リポソームナノ粒子を、該ターゲティング物質と結合した該脂質ミセルとともにインキュベートし、これにより、該ターゲティング物質を該重合リポソームナノ粒子に移行させる工程
を含む、ターゲティング物質をハイブリッド重合リポソームナノ粒子に結合させる方法。
[本発明1058]
遊離チオール基を有するターゲティング物質を提供する工程、
ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも1種のＰＥＧ化重合性脂質、少なくとも1種のマレイミド末端（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）ＰＥＧ化脂質を含む重合性脂質と、非重合性脂質とを含むハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程、及び
該重合リポソームナノ粒子を、該遊離チオールを含有する該ターゲティング物質とともにインキュベートし、これにより、該ターゲティング物質を該重合リポソームナノ粒子に共有結合させる工程
を含む、ターゲティング物質をハイブリッド重合リポソームナノ粒子に結合させる方法。
[本発明1059]
前記ターゲティング物質が、抗ＣＤ19抗体、抗ＣＤ34抗体、抗ＣＤ99抗体、抗ＣＤ117抗体、抗ＣＤ166抗体、若しくは抗ＣＡ19−9抗体、またはそれらの組み合わせである、本発明1057または1058の方法。
[本発明1060]
前記ターゲティング物質が、癌性細胞上の表面マーカーに特異的に結合できるペプチドである、本発明1057または1058の方法。
[本発明1061]
前記ターゲティング物質上のチオール基と前記脂質ミセル上のマレイミド基との間の反応を介して、該ターゲティング物質を該脂質ミセルに結合させる、本発明1057の方法。
[本発明1062]
前記ターゲティング物質上のチオール基と前記重合リポソームの外側表面上のマレイミド基との間の反応を介して、該ターゲティング物質を該重合リポソームの外側表面に結合させる、本発明1058の方法。
[本発明1063]
前記ＰＥＧポリマー鎖が、約10〜150、10〜50、50〜100、または100〜150個のＰＥＧユニットを含む、本発明1057または1058の方法。
[本発明1064]
前記ＰＥＧポリマー鎖の分子量が、約500〜5000、500〜2000、または2000〜5000Ｄａである、本発明1057または1058の方法。
[本発明1065]
前記ＰＥＧ化重合性脂質が、約0．1〜1、1〜5、5〜10、または10〜15ｍｏｌ％である、本発明1057または1058の方法。
[本発明1066]
前記ＰＥＧ化重合性脂質が、（ＰＥＧ）ｎ−10，12−ペンタコサジイン酸（（ＰＥＧ）ｎ−ＰＣＤＡ）誘導体からなる群から選択され、ｎが、前記ＰＥＧポリマー鎖内のＰＥＧユニットの数であり、かつ約10〜150、10〜50、50〜100、または100〜150である、本発明1057または1058の方法。
[本発明1067]
前記ＰＥＧ化重合性脂質が、ＰＥＧ（ｍｗ）−10，12−ペンタコサジイン酸（ＰＥＧ（ｍｗ）−ＰＣＤＡ）誘導体からなる群から選択され、ｍｗが、前記ＰＥＧポリマー鎖の分子量であり、かつ約500〜5000、500〜2000、または2000〜5000Ｄａである、本発明1057または1058の方法。
[本発明1068]
前記ＰＥＧ化重合性脂質がＰＥＧ2000−10−12−ペンタコサジインアミドである、本発明1057または1058の方法。
[本発明1069]
重合性脂質と非重合性脂質とを含むハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程であって、該重合性脂質が、ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも1種のＰＥＧ化重合性脂質を含み、かつ、治療用物質が該重合リポソームナノ粒子にローディングされている、工程、及び
治療的有効量の該ハイブリッド重合リポソームナノ粒子を対象に投与し、これにより、該対象において病態を治療し、該病態を予防し、該病態を有する可能性を低下させ、該病態の重症度を軽減させ、かつ／または該病態の進行を緩徐にさせる工程
を含む、該対象において該病態を治療し、該病態を予防し、該病態を有する可能性を低下させ、該病態の重症度を軽減させ、かつ／または該病態の進行を緩徐にさせる方法。
[本発明1070]
前記病態が癌である、本発明1069の方法。
[本発明1071]
前記病態が、ユーイング肉腫、バーキットリンパ腫、骨肉腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、ＡＬＬ、ＣＭＬ、ＡＭＬ、またはＭＤＳのいずれか1つまたはそれ以上である、本発明1069の方法。
[本発明1072]
前記対象がヒトである、本発明1069の方法。
[本発明1073]
前記ＰＥＧポリマー鎖が、約10〜150、10〜50、50〜100、または100〜150個のＰＥＧユニットを含む、本発明1069の方法。
[本発明1074]
前記ＰＥＧポリマー鎖の分子量が、約500〜5000、500〜2000、または2000〜5000Ｄａである、本発明1069の方法。
[本発明1075]
前記ＰＥＧ化重合性脂質が、約0．1〜1、1〜5、5〜10、または10〜15ｍｏｌ％である、本発明1069の方法。
[本発明1076]
前記重合リポソームナノ粒子が、該重合リポソームナノ粒子の表面に結合されたターゲティング物質をさらに含む、本発明1069の方法。
[本発明1077]
前記治療用物質が、ドキソルビシン、イリノテカン、シスプラチン、トポテカン、ビンクリスチン、マイトマイシン、パキシリタキソール、シタラビン、ミトキサントロン、Ａｒａ−Ｃ（シタラビン）、ＶＰ−16（エトポシド）、若しくはｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである、本発明1069の方法。
[本発明1078]
前記重合リポソームナノ粒子を血管内に、静脈内に、動脈内に、腫瘍内に、筋肉内に、皮下に、鼻腔内に、腹腔内に、または経口で投与する、本発明1069の方法。
[本発明1079]
前記重合リポソームナノ粒子を1回、2回、3回、またはそれ以上の回数投与する、本発明1069の方法。
[本発明1080]
前記重合リポソームナノ粒子を1日に1〜3回、1週間に1〜7回、または1か月間に1〜9回投与する、本発明1069の方法。
[本発明1081]
前記重合リポソームナノ粒子を、約1〜10日、10〜20日、20〜30日、30〜40日、40〜50日、50〜60日、60〜70日、70〜80日、80〜90日、90〜100日、1〜6か月、6〜12か月、または1〜5年の間投与する、本発明1069の方法。
[本発明1082]
前記重合リポソームナノ粒子を投与して、前記治療用物質を前記対象の体重1ｋｇ当たり約0．001〜0．01、0．01〜0．1、0．1〜0．5、0．5〜5、5〜10、10〜20、20〜50、50〜100、100〜200、200〜300、300〜400、400〜500、500〜600、600〜700、700〜800、800〜900、または900〜1000ｍｇ送達する、本発明1069の方法。
[本発明1083]
前記重合リポソームナノ粒子を投与して、前記治療用物質を前記対象の体表面積1ｍ2当たり約0．001〜0．01、0．01〜0．1、0．1〜0．5、0．5〜5、5〜10、10〜20、20〜50、50〜100、100〜200、200〜300、300〜400、400〜500、500〜600、600〜700、700〜800、800〜900、または900〜1000ｍｇ送達する、本発明1069の方法。
[本発明1084]
本発明1001〜1007のいずれかのハイブリッド重合リポソームナノ粒子を含む薬学的組成物。
[本発明1085]
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、本発明1084の薬学的組成物。
[本発明1086]
薬学的に許容される担体をさらに含む、本発明1084の薬学的組成物。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
例示的な実施形態を参照図において説明する。本明細書に開示する実施形態及び図は、限定的ではなくむしろ説明的であることが意図される。
【図１】本発明のさまざまな実施形態による、ＨＰＬＮ薬物送達システムの実施形態、すなわち、（Ａ）ＨＰＬＮ膜内の仮定的ポリマー「アイランド」の概略図、（Ｂ）ＨＰＬＮ内へのドキソルビシンの受動的ローディングと能動的ローディングのプロセスの対比を表す図、（Ｃ）薬物をローディングされ、抗体でターゲティングされたＨＰＬＮについての、動的光散乱法による平均粒径、（Ｄ）２０日間に渡る薬物漏出率に関する粒子安定性を示す。
【図２】本発明のさまざまな実施形態による、ターゲティングされた抗ＣＤ９９結合ＨＰＬＮの特異的結合及び細胞取込みを示す。上のパネルは、ＴＣ３２細胞（ユーイング腫瘍細胞）に対する特異的結合を示すＦＡＣＳ解析を表し、下のパネルは細胞への取込み示す蛍光顕微鏡の画像である。
【図３】本発明のさまざまな実施形態による、ターゲティングされていないＨＰＬＮ−Ｄｏｘ、ターゲティングされたＨＰＬＮ−Ｄｏｘ、ドキシル及び遊離ドキソルビシン「Ｄｏｘｏ」の細胞毒性ＩＣ５０を示す。ＨＰＬＮの各形態、ドキシル及び遊離ドキソルビシンを、ユーイング肉腫細胞（ＴＣ３２）とともにインキュベートした。平均ＩＣ５０から、ターゲティングされたＨＰＬＮは、ターゲティングされていないＨＰＬＮ及びドキシルと比してそれぞれ２０倍及び４０倍高い細胞毒性を有することが示されている。
【図４】本発明のさまざまな実施形態による、Ｘｅｎｏｇｅｎ製カメラで測定した相対的腫瘍成長を示す。ＲＥＨ−Ｌｕｃ白血病腫瘍細胞の移植後１０日目に、群１のマウスにはＩＶ投与による緩衝液処置のみを行い、群２にはターゲティングされていないＨＰＬＮの投与、群３にはターゲティングされていないＨＰＬＮ／Ｄｏｘ（２ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）の投与、群４には（ターゲティングされた）抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ（２ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）の投与、群５にはドキシル（２ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）の投与、及び群６にはドキソルビシン（２ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）の投与を開始した。本データは幾つかの異なる試験を連続して行った結果をまとめたものである。
【図５】本発明のさまざまな実施形態による、腫瘍の大きさ及び量の顕著な減少を示す。ＲＥＨ−Ｌｕｃ白血病腫瘍細胞の移植後１０日目に、対照群マウスにはＩＶ投与による緩衝液処置のみを行い、１週間に１回または１週間に２回の投与群マウスには（ターゲティングされた）抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／ＤＯＸ（２ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）の投与を開始した。上パネル：２８日目の処置群マウスと対照群マウスのＸｅｎｏｇｅｎ製カメラによる画像。赤色（最大腫瘍塊）から紫色（最小腫瘍塊）までのカラーバーで相対的な腫瘍サイズを比較している。下パネル：Ｘｅｎｏｇｅｎ画像から推定した、０日目から２８日目まで経時的に見た相対的腫瘍量のｌｏｇスケール。
【図６】本発明のさまざまな実施形態による、群１〜６において処置されたＲＥＨ白血病腫瘍を有するマウスの生存曲線を示す。群１には緩衝液処置のみを、群２にはターゲティングされていないＨＰＬＮを、群３にはターゲティングされていないＨＰＬＮ／Ｄｏｘ（２ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）を、群４には（ターゲティングされた）抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ（２ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）を、群５にはドキシル（２ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）を、群６にはドキソルビシン（２ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）を与えた。
【図７】本発明のさまざまな実施形態による、未処置対照動物、（ターゲティングされた）抗ＣＤ−１９ドキソルビシンローディングＨＰＬＮ処置動物、及び遊離ドキソルビシン処置動物それぞれの動物間における肝臓及び腎臓の酵素機能の比較を示す。処置動物には被験用量の最高用量であるドキソルビシン２．０ｍｇ／ｋｇの処置を１週間に２回行った。
【図８】本発明のさまざまな実施形態による、ＲＥＨ−Ｌｕｃ白血病腫瘍の異種移植片を有するマウスの処置群と未処置群の３５日目のＸｅｎｏｇｅｎ製カメラによる画像を示す。赤色（最大腫瘍塊）から紫色（最小腫瘍塊）までのカラーバーで相対的な腫瘍サイズを比較している。マウスを８群に分けた。群１には緩衝液処置のみを行い、群２はターゲティングされていない低用量ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ（１ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）で処置し、群３はターゲティングされていない高用量ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ（２ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）で、群４は低用量抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ（０．５ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）で、群５は中間用量の抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ（１ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）で、群６は高用量抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ（２ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）で、群７はドキシル（２ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）で、群８はドキソルビシン（２ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）でそれぞれ処置した。腫瘍の大きさ及び量は群６及び群８で顕著に減少している。
【図９Ａ】本発明のさまざまな実施形態による、１００万個または６００万個のＲＥＨ−Ｌｕｃ細胞の尾静脈注射による異種移植で作製した白血病マウスモデルに抗ＣＤ１９−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘを投与した場合の有効性反応を示す。白血病細胞注射後３日目または１０日目に処置を開始した。（Ａ）は１９日目の結果である。転移性腫瘍量をＸｅｎｏｇｅｎ製カメラによる画像から推定した。マウスを、ドキソルビシン２ｍｇ／ｋｇを含有する抗ＣＤ１９−ＨＰＬＮの１週間に１回または１週間に２回のＩＶ投与により処置した。腫瘍画像は、ルシフェリンの１週間に１回の注射後、背側及び腹側の両方から撮影した。総腫瘍量を両側の総和から計算した。
【図９Ｂ】本発明のさまざまな実施形態による、１００万個または６００万個のＲＥＨ−Ｌｕｃ細胞の尾静脈注射による異種移植で作製した白血病マウスモデルに抗ＣＤ１９−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘを投与した場合の有効性反応を示す。白血病細胞注射後３日目または１０日目に処置を開始した。（Ｂ）は２８日目の結果である。転移性腫瘍量をＸｅｎｏｇｅｎ製カメラによる画像から推定した。マウスを、ドキソルビシン２ｍｇ／ｋｇを含有する抗ＣＤ１９−ＨＰＬＮの１週間に１回または１週間に２回のＩＶ投与により処置した。腫瘍画像は、ルシフェリンの１週間に１回の注射後、背側及び腹側の両方から撮影した。総腫瘍量を両側の総和から計算した。
【図１０】本発明のさまざまな実施形態による、ＴＣ７１−Ｌｕｃ細胞の尾静脈注射により作製した転移性異種移植片を有するユーイング腫瘍マウスモデルに抗ＣＤ９９−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘを投与した場合の有効性反応を示す。転移性腫瘍量をＸｅｎｏｇｅｎ製カメラによる画像から推定した。マウスを、ドキソルビシン２ｍｇ／ｋｇを含有する抗ＣＤ９９−ＨＰＬＮの１週間に２回のＩＶ投与により処置した。腫瘍画像（上のパネル）は、ルシフェリンの１週間に１回の注射後、背側及び腹側の両方から撮影した。総腫瘍量を両側の総和から計算してプロットしたものが下のパネルである。
【図１１】本発明のさまざまな実施形態によれば、ＣＤ−９９を標的としたＨＰＬＮを用いて処置した異種移植したユーイングＴＣ７１腫瘍は、切除した腫瘍組織においてＨＰＬＮ（白色）が局在していることを示している。
【図１２】本発明のさまざまな実施形態による、ＴＣ７１皮下異種移植で作製したユーイング肉腫マウスモデルを、１０日目以降にドキソルビシン２ｍｇ／ｋｇ含有抗ＣＤ−９９−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘの１週間に２回のＩＶ投与により処置した場合の有効性反応を示す。腫瘍量を、図に示す各日に携帯型カリパスを用いて測定した。
【図１３】本発明のさまざまな実施形態によれば、ＥＷＳ−Ｆｌｉ１に対するｓｉＲＮＡを含有するＨＰＬＮは、Ａ６７３ユーイング腫瘍細胞のＥＷＳ−Ｆｌｉ１をノックダウンできることを示す。上のパネルは、ＥＷＳ−Ｆｌｉのノックダウンを示しているウエスタンブロットを図示しており、下のパネルは、ＥＷＳ−Ｆｌｉ１の発現低下を示しているＱＲＴ  ＰＣＲを図示している。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
本明細書に引用されたすべての参照文献は、ここに完全な記載があるかの如く、参照によりその全体が取り込まれるものとする。特に明記しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は、本発明の属する分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を持つ。Ａｌｌｅｎら，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２２版．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １５，２０１２）；Ｈｏｒｎｙａｋら，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００８）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第３版．，ｒｅｖｉｓｅｄｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００６）；Ｓｍｉｔｈ，Ｍａｒｃｈ'ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  第７版．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２０１３）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第３版．，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２８，２０１２）；及びＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第４版．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２０１２）は、本出願で使用する多くの用語に対する一般指針を当業者に提供している。抗体の調製法を参考にするには、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，２０１３）；Ｋoｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６  Ｊｕｌ，６（７）：５１１−９；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｉｃｋ，Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ、米国特許第５，５８５，０８９号（１９９６年１２月）；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８  Ｍａｒ  ２４，３３２（６１６２）：３２３−７を参照にされたい。
【００３２】
当業者は、本明細書に記載する方法及び材料と類似または同等である多くの方法及び材料を本発明を実施する際に使用できるであろうことを認識するであろう。本発明の他の特徴及び利点は、本発明の実施形態のさまざまな特徴を実施例によって例示する、添付図面と併せた以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。事実、本発明は、記載の方法及び材料になんら制限されるものではない。便宜上、明細書、実施例及び添付の請求の範囲など、本明細書内で使用される特定の用語をここに集めている。
【００３３】
特に断らない限り、または文脈から暗示されない限り、以下の用語及び語句には、下記で提供される意味が含まれる。特に断らない限り、または文脈から明らかでない限り、下記の用語及び語句は、それらの用語または語句がその属する技術分野で獲得した意味を除外するものではない。定義は、個々の実施形態を記載する際の一助となるよう提供されているものであり、また、本発明の範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ制限されるため、請求する発明を限定することは意図していない。特に明記しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はいずれも、本発明の属する分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を持つ。
【００３４】
本明細書で使用する用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、実施形態に有用な組成物、方法、及びそれらそれぞれの成分に関して使用され、さらに、有用であるか否かを問わず、特定されていない要素に対する使用も含まれる。一般に、本明細書で使用する用語は「オープン」用語として広く意図されることが当業者には理解されるであろう（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は「〜が挙げられるが、それらに限定されない」として解釈されるべきであり、用語「〜を有する」は「少なくとも〜を有する」として解釈されるべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は「〜が挙げられるが、それらに限定されない」などとして解釈されるべきである）。
【００３５】
特に断らない限り、本願の個々の実施形態を説明する文脈で（特に請求項の文脈において）使用される用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」及び同様の言及は、単数及び複数の両方をカバーすると解釈することができる。本明細書で数値範囲を詳述する場合、その範囲内に該当する別々の値のそれぞれを個々に言及する簡略した方法として使用することを意図するにすぎない。本明細書中で特に明記しない限り、個々のそれぞれの数値は、それが個々に本明細書で引用されているかの如く本明細書に組み込まれるものとする。本明細書に記載する方法はすべて、本明細書で特に明記したり、ほかに文脈と明らかに矛盾したりしない限り、どのような好適順序でも実施可能である。本明細書の特定の実施形態について用いられるすべての例、または例示的な言い回し（例えば、「〜のような」）を使用することで、本願をより明確にすることを意図するにすぎず、ほかに特許請求項される本出願の範囲に制限を設けるものではない。略語「例えば（ｅ．ｇ．）」はラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａが語源であり、本明細書では非限定的な例を指すために使用される。したがって、略語「例えば（ｅ．ｇ．）」は用語「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。明細書内のいかなる言い回しも、特許請求されていない任意の要素について、本出願の実施に不可欠な要素であることを示していると解釈されるべきではない。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」とは、疾患、障害、または医学的状態に関して使用する場合、治療的処置及び予防的または防止的措置の両方を意味し、これにおいて、その目的は、症状または病態の進行または重症度を予防するか、後退させるか、回復させるか、改善するか、阻害するか、減少させるか、緩徐にさせるか、または停止させることである。用語「治療する」には、ある病態の有害な作用または症状の少なくとも１つを低下または緩和させることが含まれる。症状または臨床マーカーの１つ以上を低下させる場合、一般に治療は「有効である」。あるいは、疾患、障害または医学的状態の進行を低下または停止させる場合、治療は「有効である」。すなわち、「治療」には、症状またはマーカーを改善させることだけではなく、未治療の場合に予想される症状の進行または悪化を停止させるかまたは少なくとも緩徐にさせることも含まれる。また、「治療」は、有益な結果を目指す若しくは得ること、または最終的に治療が不成功であったとしても個人に病態が発症する可能性を低下させることを意味し得る。治療を必要としている個人には、すでに病態を有している個人、並びに、病態になりやすい個人または病態が予防されるべき個人が含まれる。
【００３７】
「有益な結果」または「所望の結果」は、疾患状態の重症度の減少または緩和、疾患状態の悪化予防、疾患状態の治癒、疾患状態の発症予防、患者が疾患状態を発症する可能性の低下、罹患率及び死亡率の低下、及び患者の生命または余命の延長を含んで良いが、これらに限定されない。非限定的な例として、「有益な結果」または「所望の結果」は、１つ以上の症状の回復、障害の程度の減弱、白血病状態の安定化（すなわち、悪化させないこと）、白血病の遅延または緩徐化、及び白血病に関連する症状の改善または緩和であって良い。
【００３８】
本明細書で使用する「病態（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」及び「疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」は、悪性腫瘍性の細胞増殖性障害または細胞増殖性疾患のあらゆる形態を含んで良いがこれらに限定されない。このような障害の例には癌及び腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書で使用する「癌」または「腫瘍」とは、身体の臓器及び系が正常に機能することを妨害する制御されない細胞成長、及び／または悪性か良性かを問わないすべての腫瘍性の細胞成長及び細胞増殖、並びにすべての前癌性及び癌性の細胞及び組織をいう。癌または腫瘍を有する対象は、対象体内に存在する、客観的に測定可能な癌細胞を有する対象である。この定義に含まれるのは、良性及び悪性の癌、並びに、休眠腫瘍または微小転移である。発症部位から移動して及び重要臓器に播種する癌は、罹患臓器の機能を低下させて、最終的に対象を死に至らしめる。本明細書で使用する場合、用語「侵襲的」とは、周囲組織に対する浸潤及び破壊する能力をいう。黒色腫は皮膚腫瘍の侵襲型である。本明細書で使用する場合、用語「癌腫」とは、上皮細胞から生じる癌をいう。肉腫は、間葉由来の形質転換細胞から生じる癌である。したがって、癌性の骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織、または造血組織でできている悪性腫瘍は、定義として、肉腫とみなされる。これとは対照的に、上皮細胞に由来する悪性腫瘍は癌腫と呼ばれる。肉腫には、最もよく類似する組織の種類に基づいて、異なる名称が多数付けられている。例えば、骨肉腫は骨に類似し、軟骨肉腫は軟骨に類似し、脂肪肉腫は脂肪に類似し、平滑筋肉腫は平滑筋に類似している。癌の例として、白血病、肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、神経系腫瘍、脳腫瘍、神経鞘腫瘍、乳癌、結腸癌、癌腫、肺癌、肝細胞癌、胃癌、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎癌、腎細胞腫、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、脳腫瘍、並びに、非限定的にアンドロゲン依存性前立腺癌及びアンドロゲン非依存性前立腺癌を含む前立腺癌が挙げられるが、これに限定されるものではない。脳腫瘍の例には、良性脳腫瘍、悪性脳腫瘍、原発性脳腫瘍、続発性脳腫瘍、転移性脳腫瘍、神経膠腫、多形膠芽腫（ＧＢＭ）、髄芽腫、上衣細胞腫、星細胞腫、毛様細胞性星細胞腫、乏突起神経膠腫、脳幹部神経膠腫、視神経膠腫、乏突起星細胞腫のような混合膠腫、低悪性度神経膠腫、高悪性度神経膠腫、テント上神経膠腫、テント下神経膠腫、橋膠腫、髄膜腫、下垂体腺腫、及び神経鞘腫瘍が挙げられるが、これに限定されるものではない。神経系腫瘍または神経系新生物とは、神経系を侵すあらゆる腫瘍をいう。神経系腫瘍は、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、末梢神経系（ＰＮＳ）の腫瘍、またはＣＮＳ及びＰＮＳの両方にある腫瘍であり得る。神経系腫瘍の例には、脳腫瘍、神経鞘腫瘍、及び視神経膠腫が挙げられるが、これらに限定されない。白血病は、「芽球」と呼ばれる未熟白血球が異常に増加することを特徴とする血液または骨髄の癌の一種である。白血病の例には、急性白血病、慢性白血病、リンパ性白血病、骨髄性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、急性前骨髄球性白血病、大顆粒リンパ球性白血病、及び成人Ｔ細胞白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」とは、本明細書に開示する作用物質の少なくとも一部が所望の部位に局在することになる方法または経路で、該作用物質を対象体内に留置することをいう。「投与経路」は、エアロゾル、経鼻、経口、経粘膜、経皮吸収、非経口、経腸、局部（ｔｏｐｉｃａｌ）、または局所（ｌｏｃａｌ）を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の投与経路を意味して良い。「非経口」とは、一般に、眼窩内注射、輸注注射、動脈内注射、嚢内注射、心臓内注射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、肺内注射、脊髄内注射、胸骨内注射、くも膜下腔内注射、子宮内注射、静脈内注射、くも膜下注射、被膜下注射、皮下注射、経粘膜注射、または経気管注射などの注射を伴う投与経路をいう。非経口経路では、組成物は、注射用または注射用の溶液若しくは懸濁液の形態、または凍結乾燥粉末であって良い。経腸経路では、薬学的組成物は、制御放出を可能にする錠剤、ゲルカプセル、糖衣錠、シロップ、懸濁液、溶液、粉末、顆粒、エマルジョン、ミクロ粒子若しくはナノ粒子または脂質小胞若しくはポリマー小胞の形態であり得る。
【００４１】
本明細書で使用する用語「試料」または「生体試料」は、生物学的生物から採取または単離された試料、例えば対象の腫瘍試料を意味する。例示的な生体試料には、生体液試料、血清、血漿、尿、唾液、腫瘍試料、腫瘍生検及び／または組織試料等が挙げられるが、これに限定されるものではない。生体試料という用語には、上述試料の混合物も含まれる。用語「試料」には、未処置または事前処置した（または事前処理した）生体試料も含まれる。いくつかの実施形態では、試料は、対象由来の１つ以上の細胞を含むことができる。いくつかの実施形態では、試料は、腫瘍細胞試料であり得、例えば、試料は癌細胞、腫瘍由来の細胞、及び／または腫瘍生検を含むことができる。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「対象」はヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、飼育動物または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカクザル、例えばアカゲザルが挙げられる。げっ歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターが挙げられる。飼育動物及び狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、水牛、ネコ科、例えば飼い猫、及びイヌ科、例えばイヌ、キツネ、オオカミが挙げられる。用語「患者」、「個体」及び「対象」は、本明細書では同じ意味で使用される。一実施形態において、対象は哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。さらに、本明細書に記載の方法は、飼育動物及び／またはペットの治療に使用できる。
【００４３】
本明細書で使用する「哺乳類」とは、ヒト並びにチンパンジー及び他の類人猿種とサル種のような非ヒト霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマのような家畜；イヌ及びネコのような飼育哺乳類；マウス、ラット及びモルモットのようなげっ歯類を含む実験動物などを制限することなく含む、哺乳綱の任意のメンバーをいう。用語により特定の年齢または性別が示されることはない。したがって、雌雄を問わず、成体対象及び新生対象、並びに胎児は、この用語の範囲内に含まれることが意図される。
【００４４】
対象は、治療を必要とする病態（例えば、白血病）、若しくはその病態に関連した１つ以上の合併症について、以前に診断されたことがある、またはそのような病態に罹患している、若しくはそのような病態にあることが確認されている対象であり得、任意選択で、その病態または該病態に関連する１つ以上の合併症に対する治療をすでに受けている対象であり得る。あるいは、対象は、病態またはその病態に関連する１つ以上の合併症を有するという診断をそれまでに受けたことがない対象でもあり得る。例えば、対象は、病態またはその病態に関連する１つ以上の合併症について１つ以上の危険因子を示す対象または危険因子を示していない対象であり得る。特定の病態について治療を「〜を必要とする対象」は、その病態を有すると疑われる対象、その病態を有するという診断を受けた対象、その病態についてすでに治療を受けたか若しくは治療を受けている対象、その病態について治療を受けていない対象、またはその病態を発症するリスクのある対象であり得る。
【００４５】
用語「統計的に有意な」または「有意に」とは、差が認められる統計的な証拠をいう。それは、帰無仮説が実際に真である場合に、その帰無仮説を棄却する決定が為される確率として定義される。かかる決定はｐ値を用いてなされることが多い。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」には、保存的アミノ酸変異を含む変異体、ＳＮＰ変異体、スプライシング変異体、縮重変異体、及び遺伝子の生物学的に活性な部分を挙げることができるが、これに限定されるものではない。本明細書で使用する「縮重変異体（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｖａｒｉａｎｔ）」とは、変異核酸配列を有するが、遺伝暗号の冗長性により依然として同じポリペプチドをコードする変異体をいう。本発明によれば、抗体タンパク質（例えば、抗ＣＤ１９抗体）は、例えば、同定、発現、単離、保管及び／または投与を促進または改善するために修飾されて良いが、このような修飾により抗体タンパク質の機能を許容できないレベルまで低下させてはならない。さまざまな実施形態では、抗体タンパク質の変異体は、野生型抗体タンパク質の機能の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を有する。
【００４７】
用語「機能的」を「同等物」、「類似体」、「誘導体」、「変異体」または「断片」と併用する場合、ある実体若しくは分子の同等物、類似体、誘導体、変異体または断片が有する生物学的、物理的、及び／または化学的活性が、その同等物、類似体、誘導体、変異体若しくはその断片である実体若しくは分子の生物学的、物理的、及び／または化学的活性と実質的に類似していることをいう。
【００４８】
本明細書中で特に明記しない限り、本出願との関連で使用される科学的および技術的用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般的に理解する意味を持つものとする。本発明は、本明細書に記載する特定の方法、プロトコール、及び試薬等に制限されるものではなく、したがって、これらは異なり得ることを理解されるべきである。本明細書で使用する用語はあくまでも個々の実施形態を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定することは意図されず、かかる範囲は添付の請求の範囲によってのみ限定される。
【００４９】
標的ナノ送達システムは、治療濃度域を広げ毒性に関する全身治療を最小化する上で有益となり得る。このことは、大部分の癌患者を最終的に死亡させてしまう転移性疾患の治療において特に重要である。外科手術、放射線、及び従来治療が選択肢である充実性腫瘍とは異なり、白血病は血液の癌であり、発症時から播種性の疾患であるため、予後が非常に不良である。これらの疾患では、殺滅される正常組織が多くなり過ぎないよう殺腫瘍用量に達することは不可能である。したがって、充実性腫瘍の治療の場合よりも、腫瘍と正常組織との間の薬物送達の区別を大きくするための革新的技術による解決法が一層強く必要とされている。特定経路を阻害できる薬物を使用して現在成功を収めている癌治療法により患者の生存率は改善されてはいるが、残念なことに、すべての癌に当てはまるわけではなく、依然として多種多様な多くの癌で予後は不良なままである。さらに、癌治療法が不完全であるために続発性癌、心臓または肺の損傷、不妊または慢性肝炎といったさまざまな副作用が引き起こされる。したがって、癌患者を治療するために、一刻も早い確実な腫瘍特異的治療が必要とされている。近年の化学療法は、より高用量を特異的に腫瘍まで送達し、正常組織には送達されないようにできれば、より一層有効な療法であり得たと広く認識されている。
【００５０】
したがって、本明細書では、重合性脂質及び非重合性脂質が含まれるかまたは該重合性脂質及び該非重合性脂質からなるハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する。さまざまな実施形態では、重合性脂は、ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも１種のＰＥＧ化重合性脂質を含むかまたは該ＰＥＧ化重合性脂質からなる。本明細書に記載のＨＰＬＮの利点は、ＰＥＧポリマー鎖を有するＰＥＧ化重合性脂質を存在させることにより、ＨＰＬＮの安定性が有意に高まることである。例えば、初期のＰＬＮ製剤は１０，１２−ペンタコサジイン酸（ＰＣＤＡ）誘導体（すなわち、ジアセチレン含有脂質）のみで構成されたもので、重合してから５０℃超に加熱すると、容易に検出できる非常に蛍光な粒子を形成した。しかし、これらのナノ粒子は、治療用物質の送達用に適合させようとすると問題となることがわかった。これらを、予め重合したリポソームを使用してイオン間の勾配により封入することにより細胞毒性化学療法薬とともに効果的にローディングすることを試みたが、低濃度の薬物さえもローディングすることができなかった。本明細書に記載するハイブリッドＰＬＮは、ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも１種のＰＥＧ化重合性脂質を有する重合性脂質を含むもので、前述の問題を克服し、また、標的細胞に治療用物質を送達するために有効に使用できる。
【００５１】
いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、発明者らは、脂質成分はＰＬＮ表面で相分離するのかもしれないと仮定している（例えば、ポリマーパッチでできたアイランドが複数あるように見えるＰＬＮ表面を、非重合性脂質膜の海が囲んでいる）。これらのアイランドが一旦形成されると、粒子と粒子の間にある粘着性のポイントとして作用し、これがナノ粒子の凝集に寄与し、製剤不安定性をもたらし得ると考えられる。この問題を解決するため、本明細書に記載するように、発明者らは、ＰＥＧ２０００−１０，１２−ペンタコサジイン酸誘導体（ＰＥＧ２０００基を含有する重合性脂質）を重合性脂質成分に導入することにより、粒子表面にＰＥＧ基を組み込ませ、それによりサイズが不安定になるという問題の解決を図った。対照的に、初期のＰＬＮ製剤（例えば、ＷＯ２０１２１５５０２１に記載）では、「ポリマーアイランド」を形成する脂質は、それに結合しているＰＥＧ基がないか、または最小量しかなく、このことが粒子のサイズ不安定性（例えば、凝集）に寄与しているのかもしれない。
【００５２】
ＨＰＬＮ製剤中の重合性脂質の量またはポリマー量を増量させると、腫瘍死という点で粒子の有効性が改善されるようである。同様に、重合性脂質の量またはポリマー量を増量させると、粒子にローディングできる薬物量は減少する。したがって、両曲線（良好な有効性、及び高い薬物ローディング量）は、細胞ベース実験及び動物実験で測定した場合に、特定数値において最大となるであろう。本明細書において、本発明者らは、Ｌ−α−ジステアロイルホスホチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）脂質は１０モル％〜６０モル％でなければならないことを示す。
【００５３】
ミセル脂質挿入方法は、ターゲティング分子をＨＰＬＮ表面に付加するための一つの可能な手段である。別の方法は、マレイミド末端（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）ＰＥＧ２０００脂質（例えば、Ｍａｌ−ＰＥＧ２０００−Ｌ−α−ジステアロイルホスホチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）：ｍａｌ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥまたはＭａｌ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡ）を初めに含めてＨＰＬＮ脂質混合物を製剤化することである。一旦ＨＰＬＮが形成されたら、ターゲティング分子を、表面のマレイミド基に直接結合させることができる。ミセル挿入方法はそれ自体に制約がある、つまり、ＨＰＬＮ表面上ではＰＥＧ濃度はある特定濃度（約５ｍｏｌ％）で限界になるため、それ以上のＰＥＧ化脂質をそこに挿入することはできない。約５％を超えるＰＥＧ２０００表面濃度にしたい場合、ミセル挿入方法は適用できないであろう。５ｍｏｌ％超のＰＥＧ２０００脂質成分を初めに含むリポソームを製剤化する方法しか、こうしたＨＰＬＮの構築に使用できないであろう。
【００５４】
ハイブリッド重合リポソームナノ粒子（ＨＰＬＮ）
さまざまな実施形態において、本発明は、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子（ＨＰＬＮ）を提供する。ＨＰＬＮは、重合性脂質及び非重合性脂質を含んでも良いかまたは該重合性脂質及び該非重合性脂質からなっても良い。重合性脂質は、ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも１種のＰＥＧ化重合性脂質を含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、本明細書に記載のようにＨＰＬＮに封入した１種以上の治療用物質をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、ＨＰＬＮに結合された１つ以上の抗体をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、ＨＰＬＮ内に封入した１種以上の治療用物質、及びＨＰＬＮに結合された１つ以上の抗体を含む。
【００５５】
さまざまな実施形態において、本発明は、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子（ＨＰＬＮ）を提供する。ＰＬＮは、重合性脂質（約１５〜４０ｍｏｌ％）及び非重合性脂質を含んでも良いかまたは該重合性脂質（約１５〜４０ｍｏｌ％）及び該非重合性脂質からなっても良い。重合性脂質は、ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも１種のＰＥＧ化重合性脂質を含む。非重合性脂質は、両イオン性荷電脂質（少なくとも約１０ｍｏｌ％）、中性荷電分子（約２０〜４５ｍｏｌ％）、及び陰性荷電脂質（約１〜１５ｍｏｌ％）を含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、本明細書に記載のようにＨＰＬＮ内に封入した１種以上の治療用物質をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、ＨＰＬＮに結合された１つ以上の抗体をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、ＨＰＬＮ内に封入した１種以上の治療用物質、及びＨＰＬＮに結合された１つ以上の抗体を含む。
【００５６】
さまざまな実施形態において、本発明は、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子（ＨＰＬＮ）を提供する。ＨＰＬＮは、重合性脂質（約１５ｍｏｌ％）及び非重合性脂質を含んでも良いかまたは該重合性脂質（約１５ｍｏｌ％）及び該非重合性脂質からなっても良い。重合性脂質は、ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも１種のＰＥＧ化重合性脂質を含む。非重合性脂質は、両イオン性荷電脂質（約４７ｍｏｌ％）、中性荷電分子（約３２ｍｏｌ％）及び陰性荷電脂質（約６ｍｏｌ％）を含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、本明細書に記載のようにＨＰＬＮに封入した１種以上の治療用物質をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、ＨＰＬＮに結合された１つ以上の抗体をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、ＨＰＬＮ内に封入した１種以上の治療用物質、及びＨＰＬＮに結合されせた１つ以上の抗体を含む。
【００５７】
さまざまな実施形態において、本発明は、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子（ＨＰＬＮ）を提供する。ＨＰＬＮは、重合性脂質（約１５ｍｏｌ％）及び非重合性脂質を含んでも良いかまたは該重合性脂質（約１５ｍｏｌ％）及び該非重合性脂質からなっても良い。重合性脂質は、ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも１種のＰＥＧ化重合性脂質を含む（約１ｍｏｌ％）。非重合性脂質は、両イオン性荷電脂質（約５１ｍｏｌ％）、中性荷電分子（約３２ｍｏｌ％）、及び陰性荷電脂質（約２ｍｏｌ％）を含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、本明細書に記載のようにＨＰＬＮに封入した１種以上の治療用物質をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、ＨＰＬＮに結合された１つ以上の抗体をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、ＨＰＬＮ内に封入した１種以上の治療用物質、及びＨＰＬＮに結合された１つ以上の抗体を含む。
【００５８】
さまざまな実施形態において、本発明は、ｈ−ＰＥＧ１ＰＣＤＡ 約１４ｍｏｌ％、水素添加大豆ＰＣ 約５１ｍｏｌ％、コレステロール 約３２ｍｏｌ％、ｍ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ 約２ｍｏｌ％、及びｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡ 約１ｍｏｌ％を含むハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する。一実施形態において、ＨＰＬＮは、本明細書に記載のようにＨＰＬＮに封入した１種以上の治療用物質をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、ＨＰＬＮに結合された１つ以上の抗体をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、ＨＰＬＮ内に封入した１種以上の治療用物質、及びＨＰＬＮに結合された１つ以上の抗体を含む。いくつかの実施形態では、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子を使用して、ユーイング肉腫、バーキットリンパ腫、骨肉腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、ＡＬＬ、ＣＭＬ、ＡＭＬ、またはＭＤＳのいずれか１つまたはそれ以上を治療して良い。
【００５９】
さまざまな実施形態において、本発明は、ｈ−ＰＥＧ１ＰＣＤＡ 約１４ｍｏｌ％、水素添加大豆ＰＣ 約４８ｍｏｌ％、コレステロール 約３２ｍｏｌ％、ｍ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ 約２ｍｏｌ％、ｍａｌ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ 約３ｍｏｌ％、及びｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡ 約１ｍｏｌ％を含むハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する。一実施形態において、ＨＰＬＮは、本明細書に記載のようにＨＰＬＮに封入した１種以上の治療用物質をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、ＨＰＬＮに結合されせた１つ以上の抗体をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、ＨＰＬＮ内に封入した１種以上の治療用物質及びＨＰＬＮに結合された１つ以上の抗体を含む。いくつかの実施形態では、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子を使用して、ユーイング肉腫、バーキットリンパ腫、骨肉腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、ＡＬＬ、ＣＭＬ、ＡＭＬ、またはＭＤＳのいずれか１つまたはそれ以上を治療して良い。
【００６０】
さまざまな実施形態において、本発明は、ｈ−ＰＥＧ１ＰＣＤＡ 約２４ｍｏｌ％、水素添加大豆ＰＣ 約４１ｍｏｌ％、コレステロール 約３２ｍｏｌ％、ｍ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ 約２ｍｏｌ％、及びｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡ 約１ｍｏｌ％を含むハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する。一実施形態において、ＨＰＬＮは、本明細書に記載のようにＨＰＬＮに封入した１種以上の治療用物質をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、ＨＰＬＮに結合された１つ以上の抗体をさらに含む。一実施形態において、ＨＰＬＮは、ＨＰＬＮ内に封入した１種以上の治療用物質及びＨＰＬＮに結合された１つ以上の抗体を含む。いくつかの実施形態では、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子を使用して、ユーイング肉腫、バーキットリンパ腫、骨肉腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、ＡＬＬ、ＣＭＬ、ＡＭＬ、またはＭＤＳのいずれか１つまたはそれ以上を治療して良い。
【００６１】
さまざまな実施形態では、中性荷電分子は、コレステロール、エルゴステロール、ホパノイド、フィトステロール、スタノール、及びステロール、並びにそれらの機能的誘導体である。
【００６２】
さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、大きさが約３０〜２００ｎｍである。さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、重合性脂質を重合させるために、製造後に約１〜３５分間ＵＶ処理される。さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、押出し成形直後かつ重合前に５〜１０℃で一晩冷却することにより調製されている。
【００６３】
さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、循環半減期が少なくとも約３時間〜少なくとも約４時間である。さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、細胞のエンドソームコンパートメントへ約３０分後に内部移行される。
【００６４】
さまざまな実施形態では、ＰＥＧポリマー鎖を有するＰＥＧ化重合性脂質は、ＰＬＮの約０．１〜１、１〜５、５〜１０、または１０〜１５ｍｏｌ％である。さまざまな実施形態では、ＰＥＧポリマー鎖は、約１０〜１５０、１０〜５０、５０〜１００、または１００〜１５０個のＰＥＧユニットを含む。さまざまな実施形態では、ＰＥＧポリマー鎖の分子量は約５００〜５０００、５００〜２０００、または２０００〜５０００Ｄａである。さまざまな実施形態では、ＰＥＧ化重合性脂質は、（ＰＥＧ）ｎ−１０，１２−ペンタコサジイン酸（（ＰＥＧ）ｎ−ＰＣＤＡ）の各種誘導体からなる群から選択され、ｎは、ＰＥＧポリマー鎖内のＰＥＧユニットの数であり、かつ約１０〜１５０、１０〜５０、５０〜１００、または１００〜１５０である。さまざまな実施形態では、ＰＥＧ化重合性脂質は、ＰＥＧ（ｍｗ）−１０，１２−ペンタコサジイン酸（ＰＥＧ（ｍｗ）−ＰＣＤＡ）の各種誘導体からなる群から選択され、ｍｗは、ＰＥＧポリマー鎖の分子量であり、かつ約５００〜５０００、５００〜２０００、または２０００〜５０００Ｄａである。ある実施形態では、ＰＥＧ化重合性脂質はＰＥＧ２０００−１０−１２−ペンタコサジインアミドまたはＰＥＧ２０００−１０−１２−ペンタコサジイン酸である。ＰＥＧ化重合性脂質の例には、ＰＥＧ化ジインＰＣ、ＰＥＧ化ジインＰＥ、及びＰＥＧ化１０，１２−ペンタコサジイン酸（ＰＥＧ−ＰＣＤＡ）並びにそれらの機能的な誘導体及び類似体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化重合性脂質は、脂質分子に結合しているＰＥＧ化重合性基を含んで良い。
【００６５】
さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、少なくとも０．１、０．５、１、５、または１０ｍｏｌ％のＰＥＧ化重合性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、少なくとも１ｍｏｌ％のＰＥＧ化重合性脂質を含む。その他の実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、少なくとも１０ｍｏｌ％のＰＥＧ化重合性脂質を含む。
【００６６】
さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、機能的部分に結合した脂質を含んで良い。機能的部分の例には、ターゲティング物質、造影剤、及び治療用物質、並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、陽性、陰性、または中性の荷電の脂質を含んで良い。
【００６７】
さまざまな実施形態では、重合性脂質はＰＬＮの約１５〜４０ｍｏｌ％である。さまざまな実施形態では、重合性脂質は、不飽和脂質を含む。さまざまな実施形態では、重合性脂質はジアセチレン脂質を含む。さまざまな実施形態では、重合性脂質は、Ｎ−（５'−ヒドロキシ−３'−オキシペンチル）−１０−１２−ペンタコサジインアミド（ｈ−ＰＥＧ１−ＰＣＤＡ）、Ｎ−（５'−スルホ−３'−オキシペンチル）−１０−１２−ペンタコサジインアミド（スルホ−ＰＥＧ１−ＰＣＤＡ）、Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−７５０］−１０−１２−ペンタコサジインアミド（ｍ−ＰＥＧ７５０−ＰＣＤＡ）、若しくはＮ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−１５００］−１０−１２−ペンタコサジインアミド（ｍａｌ−ＰＥＧ１５００−ＰＣＤＡ）、またはそれらの組み合わせを含む。さまざまな実施形態では、重合性脂質は尾部がＣ２５の脂質である。
【００６８】
さまざまな実施形態では、非重合性脂質はＨＰＬＮの約８０〜８５ｍｏｌ％である。さまざまな実施形態では、非重合性脂質はＨＰＬＮの約７５〜８５ｍｏｌ％である。さまざまな実施形態では、非重合性脂質はＨＰＬＮの約３０〜６０ｍｏｌ％である。さまざまな実施形態では、非重合性脂質は飽和リン脂質を含む。さまざまな実施形態では、非重合性脂質は、ＰＥＧポリマー鎖を有する少なくとも１種のＰＥＧ化非重合性脂質を含む。さまざまな実施形態では、非重合性脂質は、Ｌ−ａ−ホスファチジルコリン水素添加大豆（水素添加大豆ＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ｍ−Ｐｅｇ２０００−ＤＳＰＥ）、若しくは１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］（ｍａｌ−Ｐｅｇ２０００−ＤＳＰＥ）、またはそれらの組み合わせを含む。さまざまな実施形態では、非重合性脂質は、Ｌ−α−ホスファチジルコリン、ＰＥ−ＰＥＧ２０００−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］、若しくはＰＥ−ＰＥＧ２０００−ビオチン、またはそれらの組み合わせを含む。さまざまな実施形態では、非重合性脂質は尾部がＣ１８の脂質である。
【００６９】
さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、少なくとも約１０ｍｏｌ％の両イオン性荷電脂質を含む。さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、約１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、または８０〜９０ｍｏｌ％の両イオン性荷電脂質を含む。さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、約１０〜３０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、または２５〜３０ｍｏｌ％の両イオン性荷電脂質を含む。本発明のさまざまな実施形態によれば、両イオン性荷電脂質は、Ｌ−α−ジステアロイルホスファチジルコリン、Ｌ−ａ−ホスファチジルコリン水素添加大豆（水素添加大豆ＰＣ）、またはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含むことができる。本発明のさらにさまざまな実施形態によれば、両イオン性荷電脂質は尾部がＣ１８の脂質である。
【００７０】
さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子にローディングされた治療用物質をさらに含む。本発明によれば、非限定的な治療用物質の例には、抗腫瘍薬、血液製剤、生体応答調節物質、抗真菌薬、ホルモン、ビタミン、ペプチド、抗結核薬、酵素、抗アレルギー薬、抗凝固剤、循環系作用薬、代謝増強剤、抗ウイルス薬、抗狭心症薬、抗生物質、抗炎症剤、抗原虫薬、抗リウマチ薬、麻薬、アヘン剤、強心配糖体、神経筋遮断薬、鎮静剤、局所麻酔薬、全身麻酔薬、放射性化合物、放射線増感剤、免疫チェックポイント阻害剤、モノクローナル抗体、遺伝物質、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子などのアンチセンス核酸、及びプロドラッグが挙げられる。
【００７１】
さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子にローディングされた化学療法薬をさらに含む。さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子にローディングされた２種以上の化学療法薬をさらに含む。さまざまな実施形態では、化学療法薬は、ドキソルビシン、イリノテカン、シスプラチン、トポテカン、ビンクリスチン、マイトマイシン、パキシリタキソール（ｐａｘｌｉｔａｘｏｌ）、シタラビン、ミトキサントロン、Ａｒａ−Ｃ（シタラビン）、ＶＰ−１６（エトポシド）、若しくはｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００７２】
さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子の表面に結合されたターゲティング物質をさらに含む。さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子の表面に結合された２種以上のターゲティング物質をさらに含む。さまざまな実施形態では、ターゲティング物質は、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、抗体、リガンド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ビタミン、核酸、及びそれらの組み合わせであり得る。さまざまな実施形態では、ターゲティング物質は、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１１７抗体、抗ＣＤ１６６抗体、若しくは抗ＣＡ１９−９抗体、またはそれらの組み合わせである。さまざまな実施形態では、ターゲティング物質は、細胞表面分子に特異的に結合できるペプチドである。本発明によれば、細胞表面分子は、構造タンパク質、細胞接着分子、膜受容体、キャリアタンパク質、及びチャネルタンパク質からなる群から選択される細胞膜タンパク質であり得る。細胞表面分子の例には、活性化白血球接着分子（ＣＤ−１６６）、糖鎖抗原（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）１９−９（ＣＡ１９−９）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、卵巣癌抗原（ＣＡ−１２５）、乳癌抗原（ＭＵＣ−１及び上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ））、チロシナーゼ悪性黒色腫抗原及び黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ｒａｓの抗原性異常産物、ｐ５３、ユーイング肉腫抗原（ＣＤ−９９）、白血病抗原（ＣＤ−１９及びＣＤ−１１７）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明によれば、ターゲティング物質（例えば、抗体またはペプチド）は、合成のものであっても、またはいかなる供給源、例えば、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ロバ若しくはヒトに由来するものであっても可能である。さまざまな実施形態では、ターゲティング物質はエンドサイトーシスまたは細胞膜融合を亢進させる。
【００７３】
さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、癌のための治療として免疫応答を誘発することになる、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子の表面に結合された作用物質をさらに含む。本発明によれば、細胞表面分子は細胞膜タンパク質であり得、該細胞膜タンパク質が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性の前癌性細胞及び癌細胞のすべてにおいて検出可能であるＥ６タンパク質及びＥ７タンパク質からなる群から選択される。あるいは、ムチン糖タンパク質は、癌治療のための重要な診断用また治療用標的である。肺癌に過剰発現する重要な腫瘍マーカーである腫瘍関連ＭＵＣ１糖タンパク質及び膵管腺癌に固有に発現する重要な腫瘍マーカーである腫瘍関連ＭＵＣ４糖タンパク質に基づくワクチンは、腫瘍細胞の異常なグリコシル化により得られるが、これはそのペプチド骨格が曝露され、腫瘍関連グリコペプチド抗原が形成されることにより起こるものである。さまざまな実施形態では、本明細書で提供するハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子の表面に結合された２つ以上の抗原をさらに含む。
【００７４】
さまざまな実施形態において、本発明は、本明細書に記載のハイブリッド重合リポソームナノ粒子に治療用物質をローディングする方法を提供する。かかる方法は、本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程、かかるハイブリッド重合リポソームナノ粒子の膜を隔ててイオン勾配を確立する工程、治療用物質を提供する工程、及びかかる治療用物質をハイブリッド重合リポソームナノ粒子とともにインキュベートし、これにより、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子に治療用物質をローディングする工程を含む。さまざまな実施形態では、イオン勾配は硫酸アンモニウム勾配及び／またはｐＨ勾配である。本発明によれば、非限定的な治療用物質の例には、抗腫瘍薬、血液製剤、生体応答調節物質、抗真菌薬、ホルモン、ビタミン、ペプチド、抗結核薬、酵素、抗アレルギー薬、抗凝固剤、循環系作用薬、代謝増強剤、抗ウイルス薬、抗狭心症薬、抗生物質、抗炎症剤、抗原虫薬、抗リウマチ薬、麻薬、アヘン剤、強心配糖体、神経筋遮断薬、鎮静剤、局所麻酔薬、全身麻酔薬、放射性化合物、放射線増感剤、免疫チェックポイント阻害剤、モノクローナル抗体、遺伝物質、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子などのアンチセンス核酸、及びプロドラッグが挙げられる。さまざまな実施形態では、治療用物質は化学療法薬である。さまざまな実施形態では、化学療法薬は、ドキソルビシン、イリノテカン、シスプラチン、トポテカン、ビンクリスチン、マイトマイシン、パキシリタキソール、シタラビン、ミトキサントロン、Ａｒａ−Ｃ（シタラビン）、ＶＰ−１６（エトポシド）、若しくはｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００７５】
化学療法薬のさらなる例には、アクチノマイシン、アリトレチノイン、全トランス型レチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ベバシズマブ、ベキサトテン（Ｂｅｘａｔｏｔｅｎｅ）、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、セツキシマブ、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オクレリズマブ、オファツムマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツマブ（Ｐａｎｉｔｕｍａｂ）、ペメトレキセド、リツキシマブ、タフルポシド（Ｔａｆｌｕｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド、チオグアニン（Ｔｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、トポテカン、トレチノイン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、ロミデプシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、クラドリビン、クロファラビン、フロキシウリジン、フルダラビン、ペントスタチン、マイトマイシン、イキサベピロン、エストラムスチン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
さまざまな実施形態において、本発明は、ターゲティング物質を、本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子に結合させる方法を提供する。かかる方法は、脂質ミセルを提供する工程、ターゲティング物質を提供する工程、かかるターゲティング物質を脂質ミセルに結合させる工程、本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程、及びかかるハイブリッド重合リポソームナノ粒子を、標的物質と結合した脂質ミセルとともにインキュベートし、これにより、ターゲティング物質をハイブリッド重合リポソームナノ粒子に移行させる工程を含む。ある実施形態では、ターゲティング物質上のチオール基と脂質ミセル上のマレイミド基との間の反応によって、ターゲティング物質を脂質ミセルに結合させる。さまざまな実施形態では、ターゲティング物質は、ダイアボディ、抗体、リガンド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ビタミン、核酸、及びそれらの組み合わせであり得る。さまざまな実施形態では、ターゲティング物質は、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１１７抗体、抗ＣＤ１６６抗体、若しくは抗ＣＡ１９−９抗体、またはそれらの組み合わせである。さまざまな実施形態では、ターゲティング物質は、細胞表面分子に特異的に結合できるペプチドである。本発明によれば、細胞表面分子は、構造タンパク質、細胞接着分子、膜受容体、キャリアタンパク質、及びチャネルタンパク質からなる群から選択される細胞膜タンパク質であり得る。細胞表面分子の例には、活性化白血球接着分子（ＣＤ−１６６）、糖鎖抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、卵巣癌抗原（ＣＡ−１２５）、乳癌抗原（ＭＵＣ−１及び上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ））、チロシナーゼ悪性黒色腫抗原及び黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ｒａｓの抗原性異常産物、ｐ５３、ユーイング肉腫抗原（ＣＤ−９９）、白血病抗原（ＣＤ−１９及びＣＤ−１１７）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明によれば、ターゲティング物質剤（例えば、抗体またはペプチド）は、合成のものであっても、またはいかなる供給源、例えば、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ロバ、若しくはヒトに由来するものであっても可能である。
【００７７】
一実施形態において、本明細書は、ヒト白血病細胞（ＲＥＨ細胞）上のＣＤ−１９細胞表面マーカーを本明細書に記載のＨＰＬＮの標的にするモノクローナル抗体を結合させることにより調製されるＨＰＬＮ／Ｄｏｘ粒子を提供する。化学的に還元させた抗ＣＤ−１９抗体を、マレイミド末端ＰＥＧ２０００リン脂質及びメトキシ末端（ｍｅｔｈｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）ＰＥＧ２０００リン脂質で構成されるミセルに結合させた［Ｉｄｅｎ及びＡｌｌｅｎ、２００１年］。抗ＣＤ−１９抗体で標識した部分を有するＰＥＧ２０００リン脂質ミセルを、ＨＰＬＮ／Ｄｏｘに曝露させた時に、ＨＰＬＮ膜内に挿入して抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ粒子を得る。結合しなかった抗体及び他の小分子量不純物を除去するため、ターゲティングされた粒子をサイズでろ過して精製した。本発明者らに先立ち、ポリマー含有リポソーム、特に、ＰＥＧ２０００ポリマーアイランドを有する本明細書に記載のＨＰＬＮ内には、粒子間の粘着性が妨げとなり、ＰＥＧ化ミセル脂質を挿入できることは誰にも実証すらされていない。事実、ポリマーの存在がそのプロセスの妨げとなると考えるかもしれない。ポリマーの量が増す程、挿入プロセスの妨げが大きくなると考えるかもしれない。しかし、本願に記載のポリマー成分の範囲内では、このような影響がないことを本発明者らの結果は示している。
【００７８】
ターゲティングされたナノ粒子は、抗がん剤を癌細胞に選択的に送達し、正常細胞に非選択的に送達されることによる予期せぬ細胞毒性及び化学療法の制限的な有効性を克服する可能性を示した。本明細書では、小児及び成人のＡＬＬ及びユーイング肉腫を治療するために新規ナノ粒子（ＨＰＬＮ）を使用した。ＡＬＬ及びユーイング腫瘍を標的にするため、それぞれに、抗ＣＤ１９抗体及び抗ＣＤ９９抗体を使用した。これらの腫瘍特異的ＨＰＬＮは、マウスモデルでの腫瘍成長を有効に阻害する。ターゲティング抗体または薬物を除去するとそのような抗腫瘍作用が消失することから、ＨＰＬＮのこの抗がん作用は、標的癌細胞に対して非常に特異的であり、かつ薬物に依存することを証明している。尾静脈投与では、肝機能及び腎機能検査、全血球数計数または主要臓器の病態において異常は認められなかった。これらのターゲティングされたＨＰＬＮは、従来の非ターゲティングＰＥＧ−リポソームドキソルビシン製剤（ドキシル（登録商標））よりも優れた細胞毒性を示した。さらに、ターゲティングされたＨＰＬＮは、マウスモデルの腫瘍細胞内にみとめられた。したがって、このことは、例えば、小児及び成人のＡＬＬ及びユーイング肉腫の対象にとって、抗がん剤の安全かつ効率的なターゲティングＨＰＬＮ送達システムであることを指している。
【００７９】
治療方法
さまざまな実施形態において、本発明は、対象において病態を治療し、病態を予防し、病態を有する可能性を低下させ、病態の重症度を軽減させ、かつ／または病態の進行を緩徐にさせる方法を提供する。かかる方法は、本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子を提供する工程、及び治療的有効量のハイブリッド重合リポソームナノ粒子を対象に投与し、これにより、対象において病態を治療し、病態を予防し、病態を有する可能性を低下させ、病態の重症度を軽減させ、かつ／または病態の進行を緩徐にさせる工程を含んで良いか、またはそれらの工程からなって良い。さまざまな実施形態では、病態はユーイング肉腫、バーキットリンパ腫、骨肉腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、ＡＬＬ、ＣＭＬ、ＡＭＬまたはＭＤＳである。いくつかの実施形態では、方法は、化学療法、放射線照射、またはそれらの組み合わせを含むがそれらに制限されない追加治療法を同時または順次に提供することをさらに含んで良い。
【００８０】
さまざまな実施形態では、病態は癌である。癌の例には、乳腺の管組織における乳管癌、髄様癌、膠様癌、管状癌、及び炎症性乳癌のような乳癌；卵巣の腺癌及び卵巣から腹腔内へ遊走した腺癌のような上皮性卵巣腫瘍を含む卵巣癌；扁平上皮癌及び腺癌を含む頚部上皮の腺癌のような子宮頸癌；腺癌または骨へ遊走した腺癌から選択される前立腺癌のような前立腺癌；膵管組織の類上皮癌及び膵管の腺癌のような膵癌；膀胱の移行上皮癌、尿路上皮癌（移行上皮癌）、膀胱を覆う粘膜の尿路上皮細胞の腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、及び小細胞癌のような膀胱癌；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、好ましくは末梢血の急性前骨髄球性白血病；扁平上皮癌、腺癌、及び大細胞未分化癌に分類される非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）並びに小細胞肺癌のような肺癌；基底細胞癌、黒色腫、扁平上皮癌及び扁平上皮癌に発展することがある皮膚病態である日光角化症のような皮膚癌；眼網膜芽腫；眼内（眼）黒色腫；原発性肝癌（肝臓に端を発する癌）；腎臓癌；甲状腺乳頭癌、甲状腺濾胞癌、甲状腺髄様癌及び甲状腺未分化癌のような甲状腺癌；びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ−細胞免疫芽球性リンパ腫及び小型非切れ込み核細胞性リンパ腫のようなＡＩＤＳ関連リンパ腫；カポジ肉腫；ユーイング肉腫；、神経膠腫（星細胞腫、未分化星細胞腫、または多形膠芽腫）を含む原発性脳腫瘍、乏突起神経膠腫、上衣細胞腫、髄膜腫、リンパ腫、シュワン細胞腫、及び髄芽腫のような中枢神経系癌；聴神経腫及び神経線維腫とシュワン細胞腫とを含む悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）のような末梢神経系（ＰＮＳ）癌；口腔及び口腔咽頭の癌；胃癌のようなリンパ腫、胃間質腫瘍、及びカルチノイド腫瘍；セミノーマ及び非セミノーマを含む胚細胞腫瘍（ＧＣＴ）、及びライデイッヒ細胞腫及びセルトリ細胞腫を含む性腺間質腫瘍のような精巣癌、及び胸腺腫、胸腺がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫カルチノイドまたはカルチノイド腫瘍のような胸腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。また、上述の方法は、ウイルス誘発性癌の治療に使用できる。主なウイルス−悪性疾患の系には、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と肝細胞癌；ヒトリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）と成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）と子宮頸癌が挙げられる。
【００８１】
さまざまな実施形態では、対象はヒトである。さまざまな実施形態では、対象は、ヒト、サル、類人猿、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウス、及びラットを含むが、これらに限定されない哺乳類の対象である。いくつかの実施形態では、対象は、細菌性、ウイルス性、真菌性、及び寄生虫性の感染症を含むがこれらに限定されない持続的な微生物感染症に罹患している。
【００８２】
本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、内部にローディングされた治療用物質を含む。本発明によれば、非限定的な治療用物質の例には、抗腫瘍薬、血液製剤、生体応答調節物質、抗真菌薬、ホルモン、ビタミン、ペプチド、抗結核薬、酵素、抗アレルギー薬、抗凝固剤、循環系作用薬、代謝増強剤、抗ウイルス薬、抗狭心症薬、抗生物質、抗炎症剤、抗原虫薬、抗リウマチ薬、麻薬、アヘン剤、強心配糖体、神経筋遮断薬、鎮静剤、局所麻酔薬、全身麻酔薬、放射性化合物、放射線増感剤、免疫チェックポイント阻害剤、モノクローナル抗体、遺伝物質、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子などのアンチセンス核酸、及びプロドラッグが挙げられる。さまざまな実施形態では、治療用物質は化学療法薬である。さまざまな実施形態では、化学療法薬は、ドキソルビシン、イリノテカン、シスプラチン、トポテカン、ビンクリスチン、マイトマイシン、パキシリタキソール、シタラビン、ミトキサントロン、Ａｒａ−Ｃ（シタラビン）、ＶＰ−１６（エトポシド）、若しくはｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００８３】
化学療法薬のさらなる例には、アクチノマイシン、アリトレチノイン、全トランス型レチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ベバシズマブ、ベキサトテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、セツキシマブ、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オクレリズマブ、オファツムマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツマブ、ペメトレキセド、リツキシマブ、タフルポシド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、トレチノイン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、ロミデプシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、クラドリビン、クロファラビン、フロキシウリジン、フルダラビン、ペントスタチン、マイトマイシン、イキサベピロン、エストラムスチン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
さらに本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、その表面に結合されたターゲティング物質を含む。さまざまな実施形態では、ターゲティング物質は、ダイアボディ、抗体、リガンド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ビタミン、核酸、及びそれらの組み合わせであり得る。さまざまな実施形態では、ターゲティング物質は、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１１７抗体、抗ＣＤ１６６抗体、若しくは抗ＣＡ１９−９抗体、またはそれらの組み合わせである。さまざまな実施形態では、ターゲティング物質は、細胞表面分子に特異的に結合できるペプチドである。本発明によれば、細胞表面分子は、構造タンパク質、細胞接着分子、膜受容体、キャリアタンパク質、及びチャネルタンパク質からなる群から選択される細胞膜タンパク質であり得る。細胞表面分子の例には、活性化白血球接着分子（ＣＤ−１６６）、糖鎖抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、卵巣癌抗原（ＣＡ−１２５）、乳癌抗原（ＭＵＣ−１及び上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ））、チロシナーゼ悪性黒色腫抗原及び黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ｒａｓの抗原性異常産物、ｐ５３、ユーイング肉腫抗原（ＣＤ−１９）、白血病抗原（ＣＤ−９９及びＣＤ−１１７）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
さまざまな実施形態では、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子を１回、２回、３回、またはそれ以上の回数投与する。さまざまな実施形態では、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子を１日に１〜３回、１週間に１〜７回、または１か月間に１〜９回投与する。さまざまな実施形態では、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子を約１〜１０日、１０〜２０日、２０〜３０日、３０〜４０日、４０〜５０日、５０〜６０日、６０〜７０日、７０〜８０日、８０〜９０日、９０〜１００日、１〜６か月、６〜１２か月、または１〜５年の間投与する。
【００８６】
さまざまな実施形態では、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子を投与して、治療用物質を対象の体重１ｋｇ当たり約０．００１〜０．０１、０．０１〜０．１、０．１〜０．５、０．５〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、または９００〜１０００ｍｇ送達する。さまざまな実施形態では、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子を投与して、治療用物質を対象の体表面積１ｍ２当たり約０．００１〜０．０１、０．０１〜０．１、０．１〜０．５、０．５〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、または９００〜１０００ｍｇ送達する。一実施形態では、治療用物質はドキソルビシン、またはドキソルビシンの機能的同等物、類似体、誘導体若しくは塩である。ある実施形態では、治療用物質をヒトに投与する。
【００８７】
有効量の治療用物質の典型的用量は、既知の治療用化合物を使用している製造者が推奨する範囲の用量であり得、また、細胞でのインビトロ反応または動物モデルでのインビボ反応により当業者に指示されている用量であり得る。そのような用量は典型的に、関連する生物学的活性を失わせることなく約１桁まで濃度または量を減らすことが可能である。実際の用量は、医師の判断、患者の病態、及び治療方法、例えば、関連する培養細胞試料若しくは組織培養組織試料のインビトロでの反応性、または適切な動物モデルで観察された反応に基づく有効性に応じて決定され得る。さまざまな実施形態では、本明細書に記載する用量のいずれか１つまたはそれ以上の有効量の治療用物質が対象に投与されるよう、重合リポソームナノ粒子を１日１回（ＳＩＤ／ＱＤ）、１日２回（ＢＩＤ）、１日３回（ＴＩＤ）、１日４回（ＱＩＤ）、またはそれ以上の回数投与して良い。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ある病態の予防段階（すなわち、対象が、かかる病態を発症してはいないが、その病態を発症する可能性が高いかまたは発症する過程にある場合）においてハイブリッド重合リポソームナノ粒子を投与して良い。その他の実施形態では、ある病態の治療段階（すなわち、対象がすでにその病態を発症している場合）においてハイブリッド重合リポソームナノ粒子を投与して良い。非限定的な一例として、標的病態は癌である。
【００８９】
本発明によれば、適切な投与方法、例えば、製造者が推奨する投与方法を用いてハイブリッド重合リポソームナノ粒子を投与して良い。本発明によれば、請求の範囲に記載の方法のハイブリッド重合リポソームナノ粒子をさまざまな経路を利用して投与して良く、これらには、エアロゾル、経鼻、経口、経粘膜、経皮吸収、非経口、埋込み型ポンプ、持続注射、局所適用、カプセル、及び／または注射を含むが、これらに限定されない。さまざまな実施形態では、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子を血管内に、静脈内に、動脈内に、腫瘍内に、筋肉内に、皮下に、鼻腔内に、腹腔内に、または経口で投与する。
【００９０】
薬学的組成物
本発明は、本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子をさまざまな薬学的製剤の形態でも提供する。これらの薬学的組成物を、対象の病態を治療する、予防する、罹患する可能性を低下させる、病態の重症度を軽減させる、及び／またはその進行を緩徐にさせるために使用して良い。本発明によれば、病態は癌であり得る。ある実施形態では、病態は白血病または肉腫である。
【００９１】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子を含む薬学的組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される２つ以上のハイブリッド重合リポソームナノ粒子を含む薬学的組成物を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子を複数含む薬学的組成物を提供する。本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、その中にローディングされた治療用物質、及び／またはそれに結合されたターゲティング物質を含む。好ましい薬学的組成物はまた、哺乳類に投与した場合に示す毒性が最小限でもある。
【００９２】
さまざまな実施形態では、本発明による薬学的組成物は、いかなる薬学的に許容される賦形剤も含有することができる。「薬学的に許容される賦形剤」とは、一般に安全、非毒性であり、かつ望ましい薬学的組成物の調製に有用な賦形剤を意味し、これには、獣医学的使用のため並びにヒトの薬学的使用のために許容される賦形剤が含まれる。このような賦形剤は、固形、液体、半固形、またはエアロゾル組成物の場合は気体であって良い。賦形剤の例には、デンプン、糖、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、矯味剤、香料、防腐剤、抗酸化剤、可塑剤、ゲル化剤、増粘剤、硬化剤、凝固剤（ｓｅｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、懸濁剤、界面活性剤、保湿剤、担体、安定化剤、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
さまざまな実施形態では、本発明による薬学的組成物を、任意の投与経路を介した送達用に製剤化して良い。「投与経路」は、当技術分野で公知のいかなる投与経路を意味しても良く、これらには、エアロゾル、経鼻、経口、経粘膜、経皮吸収、非経口、経腸、局部または局所が挙げられるが、これらに限定されない。「非経口」とは、一般に、眼窩内、輸注、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、くも膜下腔内、子宮内、静脈内、くも膜下、被膜下、皮下、経粘膜、または経気管などの、注射を伴う投与経路をいう。非経口経路では、組成物は、注射または注射用に溶液または懸濁液の形態、または凍結乾燥粉末の形態であって良い。非経口経路では、組成物は、注射または注射用に溶液または懸濁液の形態であって良い。経腸経路では、薬学的組成物は、制御放出を可能にする錠剤、ゲルカプセル、糖衣錠、シロップ、懸濁液、溶液、粉末、顆粒、エマルジョン、ミクロ粒子若しくはナノ粒子または脂質小胞若しくはポリマー小胞の形態であり得る。典型的には、組成物を注射により投与する。こうした投与のための方法は当業者に公知である。ある実施形態では、薬学的組成物を、血管内投与用、静脈内投与用、動脈内投与用、腫瘍内投与用、筋肉内投与用、皮下投与用、鼻腔内投与用、腹腔内投与用、または経口投与用に製剤化する。
【００９４】
さまざまな実施形態では、薬学的組成物を１回、２回、３回、またはそれ以上の回数投与する。さまざまな実施形態では、薬学的組成物を１日に１〜３回、１週間に１〜７回、または１か月間に１〜９回投与する。さまざまな実施形態では、薬学的組成物を約１〜１０日、１０〜２０日、２０〜３０日、３０〜４０日、４０〜５０日、５０〜６０日、６０〜７０日、７０〜８０日、８０〜９０日、９０〜１００日、１〜６か月、６〜１２か月、または１〜５年の間投与する。さまざまな実施形態では、本明細書に記載する用量または当業者に公知の用量のいずれか１つまたはそれ以上である有効量の治療用物質が対象に投与されるように、薬学的組成物を１日１回（ＳＩＤ／ＱＤ）、１日２回（ＢＩＤ）、１日３回（ＴＩＤ）、１日４回（ＱＩＤ）、またはそれ以上の回数投与して良い。
【００９５】
さまざまな実施形態では、本発明による薬学的組成物は、いかなる薬学的に許容される担体も含有することができる。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体）」とは、対象化合物を、体のある組織、器官、または部分から体の別の組織、器官、または部分へ運搬または輸送する際に使用される薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルをいう。例えば、かかる担体は、液体または固体の賦形剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、若しくは封じ込め物質、またはそれらの組み合わせであって良い。担体の各成分は「薬学的に許容され」なければならず、これにおいて各成分は製剤の他の成分と適合性がなければならない。また、担体の各成分は、接触し得るあらゆる組織または臓器と接触させての使用に好適でなければならず、すなわち、毒性リスク、刺激作用、アレルギー性反応、免疫原性、またはその治療利益を過度に上回る他の合併症をなんら有していてはならない。
【００９６】
本発明による薬学的組成物を、経口投与用にカプセル化すること、錠剤化すること、またはエマルジョン若しくはシロップに調製することも可能である。固体または液体の薬学的に許容される担体を、組成物を改善または安定させるため、または組成物の調製を容易にするために加えて良い。液体担体には、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、グリセリン、生理食塩水、アルコール及び水が挙げられる。固体担体には、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム、二水和物、白土（ｔｅｒｒａ  ａｌｂａ）、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸、タルク、ペクチン、アラビアゴム、寒天またはゼラチンが挙げられる。担体には、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのような徐放性材料の単材またはワックスと併用したものも含まれて良い。
【００９７】
粉砕、混合、造粒、及び、錠剤形態では必要に応じて圧縮を含むか、または硬ゼラチンカプセルでは粉砕、混合、及び充填を含む従来の製薬技術に従い、薬学的調製物を作製する。液体担体を使用する場合、調製物はシロップ、エリキシル剤、エマルジョンまたは水溶性若しくは非水溶性懸濁液の形態となるであおる。そのような液体製剤を、直接経口投与して良いかまたは軟ゼラチンカプセル内に充填して良い。
【００９８】
本発明による薬学的組成物を、治療的有効量で送達して良い。正確な治療的有効量は、所与の対象における治療有効性の点で最も有効な結果をもたらす組成物量である。この量は多種多様な因子により異なってくるが、これらには、限定することなく、治療用化合物の特徴（活性、薬物動態、薬動力学、及び生物学的利用能など）、対象の生理学的状態（年齢、性、疾患の種類と段階、一般身体疾患、所与の用量に対する反応性、及び投薬の種類など）、製剤中の薬学的に許容される１つ以上の担体の性質、及び投与経路が含まれる。臨床及び薬理学の分野の当業者は、例えば、化合物投与に対する対象の反応を監視し、それにしたがって用量を調節することによる日常的な試みによって治療的有効量を決定できるであろう。さらなる指針については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏｅｄ．、第２０版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ、ＵＳＡ）（２０００）を参照にされたい。
【００９９】
患者に投与する前に、配合成分（ｆｏｒｍｕｌａｎｔ）を組成物に加えて良い。好ましくは液体製剤であって良い。例えば、これらの配合成分として、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝剤、アルブミン、界面活性剤、増量剤、またはそれらの組み合わせを挙げて良い。
【０１００】
炭水化物配合成分には、単糖類、二糖類、若しくは多糖類のような糖若しくは糖アルコール、または水溶性のグルカンが挙げられる。糖類またはグルカンには、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、αシクロデキストリンとβシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン及びカルボキシメチルセルロース、またはその混合物が挙げられる。「糖アルコール（Ｓｕｇａｒ  ａｌｃｏｈｏｌ）」は、-ＯＨ基を有するＣ４〜Ｃ８の炭化水素として定義され、これには、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセリン、及びアラビトールが挙げられる。上掲したこれらの糖または糖アルコールは、個々別々に使用しても、または組み合わせて使用しても良い。使用する量は、糖または糖アルコールが水溶性調製物に可溶である限り定められた限度はない。一実施形態では、糖または糖アルコールの濃度は１．０ｗ／ｖ％〜７．０ｗ／ｖ％であり、より好ましくは２．０〜６．０ｗ／ｖ％である。
【０１０１】
アミノ酸配合成分には、左旋性（Ｌ）形態のカルニチン、アルギニン、及びベタインが挙げられるが、これ以外のアミノ酸を加えて良い。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、配合成分としてのポリマーには、平均分子量が２，０００〜３，０００のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、または平均分子量が３，０００〜５，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０１０３】
凍結乾燥前または再調製後の溶液のｐＨ変化を最小限にするため、組成物中に緩衝剤を使用することも好ましい。クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、及びグルタミン酸塩を含むがこれらに限定されない大半の任意の生理的緩衝剤を使用して良い。いくつかの実施形態では、濃度は０．０１〜０．３モル濃度である。製剤に加えることができる界面活性剤は、ＥＰ２７０，７９９及び同２６８，１１０に示されている。
【０１０４】
循環半減期を延長させるための別の薬物送達システムはリポソームである。リポソーム送達システムを調製する方法は、Ｇａｂｉｚｏｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）４２：４７３４；Ｃａｆｉｓｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（１９８１）６４９：１２９；及びＳｚｏｋａ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｅｎｇ（１９８０）９：４６７で考察されている。他の薬物送達システムは、当技術分野で公知であり、例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら，ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ（Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．１９８０），ｐｐ．２５３−３１５；Ｍ．Ｌ．Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｖｓ（１９８４）３６：２７７に記載されている。
【０１０５】
液体薬学的組成物を調製した後は、分解を予防し無菌性を保つために凍結乾燥して良い。液体組成物の凍結乾燥方法は当業者に公知である。組成物は、使用直前に、滅菌済み希釈剤（例えば、リンゲル溶液、蒸留水、または滅菌生理食塩水）を用いて再調製して良く、これに、さらなる成分を含めて良い。再調製したら、かかる組成物を当業者に公知の方法を用いて対象に投与する。
【０１０６】
本発明の組成物は、慣例的な、周知の滅菌技術で滅菌して良い。得られた溶液は、使用のために包装されても良いか、または無菌条件下でろ過して凍結乾燥させて良く、凍結乾燥した調製物は投与前に滅菌済み溶液と合わせる。組成物は、生理的条件に近づけるために必要に応じ、ｐＨ調節および緩衝剤、等張化剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び安定化剤（例えば、１〜２０％マルトースなど）のような薬学的に−許容される助剤を含有して良い。
【０１０７】
本発明のキット
さまざまな実施形態において、本発明は、対象の病態を治療する、予防する、その重症度を軽減させる、及び／またはその進行を緩徐にさせるためのキットを提供する。かかるキットは、ある量の本明細書に記載するハイブリッド重合リポソームナノ粒子、並びにかかるハイブリッド重合リポソームナノ粒子を使用して対象における病態を治療する、予防する、その重症度を軽減させる、及び／またはその進行を緩徐にさせるための指示書を含む。本発明によれば、ハイブリッド重合リポソームナノ粒子は、その中にローディングされた治療用物質、及び／または、それに結合されたターゲティング物質を含む。
【０１０８】
キットは、本発明の組成物を少なくとも１つ含む、材料または成分の集合である。本発明キット内の構成成分の正確な特性は、その意図される目的により異なる。一実施形態では、キットは、特に哺乳類の対象の治療を目的として構成される。別の実施形態では、キットは、特にヒト対象の治療を目的として構成される。さらなる実施形態では、キットは、限定されることなく、家畜、飼育動物、及び実験動物のような対象を治療する獣医学的適用のために構成される。
【０１０９】
使用説明書をキットに含めて良い。「使用説明書」には典型的に、所望の転帰を得るために、キットの構成成分の使用に際して使用すべき手法を記載した明確な表現が含まれる。必要に応じ、キットには、他の有用な構成成分、例えば、希釈剤、緩衝剤、薬学的に許容される担体、シリンジ、カテーテル、アプリケーター、ピペット採取または計測用ツール、包帯材料または当業者により容易に認識されるであろう他の有用な備品一式も含有される。
【０１１０】
キット内で組み合わせられた材料または構成成分は、それらの操作性及び有用性が保たれる、任意の好都合かつ好適な方法で保存して医師に提供され得る。例えば、かかる構成成分は、溶解形態、脱水形態、または凍結乾燥形態が可能であり、それらを室温、冷蔵温度または凍結温度で提供可能である。構成成分を、典型的には好適な包装材料に収容する。本明細書で使用する場合、語句「包装材料（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌ）」とは、発明組成物等のような、キットの内容物を収容するために使用する１つ以上の物理的構造物をいう。かかる包装材料は、好ましくは無菌で汚染物質が存在しない環境を提供するための周知の方法により作製される。本明細書で使用する場合、用語「包装容器（ｐａｃｋａｇｅ）」とは、個々のキット構成成分を保持できる、ガラス、プラスチック、紙、フォイル等のような好適な固体のマトリックスまたは材料をいう。したがって、例えば、包装容器は、好適量の本明細書に記載する組成物を収容するために使用されるガラス製容器であり得る。包装材料には一般に、キットの内容物及び／または目的及び／またはその構成成分を示す外部ラベルが付いている。
【実施例】
【０１１１】
以下の実施例は、説明のみのために提供されるが、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【０１１２】
実施例１：薬物標的送達のためのハイブリッド重合リポソームナノ粒子（ＨＰＬＮ）
本明細書で提案されているＨＰＬＮ送達システムを図１に例示する。これらのナノ粒子は、ほぼどのようなサイズ及び組成にでも、広範囲で合成可能である。これらの粒子は、従来のリポソームを模倣しているかまたは正常細胞膜さえも模倣しているが、大きく異なる点を有し、すなわち、壁は所望の任意の架橋度まで架橋されることができ、内容物の経時的損失を防ぎ、かつ、ナノ粒子内での所与の細胞傷害性物質の結晶化をもたらす濃度までイオン勾配を介して該細胞傷害性物質を能動的にローディングすることを可能にすることができる（Ｆｅｄｅｒｍａｎら  "Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ｂｙ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｌｃａｍ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ"，Ｓａｒｃｏｍａ，２０１２，１２６９０６）。最も重要なことには、粒子表面は、自在に修飾されてほぼすべての種類のターゲティング物質で共有結合により標識されることができる。本発明者らのアプローチでは、白血病または肉腫細胞に選択的に送達される従来剤を極めて高濃度で使用することによる殺腫瘍の改善に焦点を当てているが、今後、実施を重ねることにより多くの異なる腫瘍細胞種を標的にできるようになるであろう。
【０１１３】
多量の（非重合性）リン脂質（水素添加大豆ＰＣ）を重合性脂質に含めることにより、新規のハイブリッド−ＰＬＮ、「ＨＰＬＮ」を作製した。以下はＨＰＬＮ調製物の非限定的な例である。ＨＰＬＮを、先に記載の方法（Ｂｒｕｅｈｌら，"Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ：ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｌｉｇａｎｄｓ，」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．  ４０，ｎｏ．  ２０，ｐｐ．５９６４-５９７４，２００１）にしたがって、モル比１４：５１：３２：２：１のｈ−ＰＥＧ１ＰＣＤＡ、水素添加大豆ＰＣ、コレステロール、並びにｍ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ及びｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡから調製した。手短に言えば、脂質を混合し、フィルムに減圧蒸着させた。１５ｍＭ（総脂質及びコレステロール）の懸濁液になるようフィルムに硫酸アンモニウム１５５ｍＭを加えた。懸濁液を、バス型超音波発生装置内で６５〜８０℃まで３０分加熱した。得られた乳状溶液を、ホモジナイザー／押出し機（Ｃ５、Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．、カナダ、オンタリオ州オタワ）を使用して積層ポリカーボネートメンブレン（８０ｎｍ）に１０回に通して押し出した、約７５℃まで加熱した。ほぼ澄明なリポソーム溶液を５℃まで１２時間冷却した。室温まで加温した後、Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｋｅｒ  ＸＬ−１０００  ＵＶ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いて１分間ＵＶ光照射（２５４ｎｍ）してリポソームを重合させた。得られる青色ＨＰＬＮを５分間６５℃まで加熱し、それらを赤色（蛍光）形態へ変換させた。微量の不溶性汚染物質を除去するため、呈色した溶液を０．２ｕｍ酢酸セルロースフィルターに通してシリンジろ過した。
【０１１４】
ドキソルビシンローディングＨＰＬＮを作製するため、硫酸アンモニウム含有ＨＰＬＮをＧ５０  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１×ＰＢＳで洗浄）に通して外部緩衝液を交換した。次いで、リポソームをドキソルビシン−ＨＣｌ（Ｓｈａｎｄｏｎｇ  Ｔｉａｎｙｕ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）とともに、ＨＰＬＮ２ｍｇに対しドキソルビシン１ｍｇの濃度で、４０分間６０℃まで加熱しながらインキュベートした。（図１Ｂ、能動的ローディング）。溶液をＧ５０  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１×ＰＢＳで洗浄）に通すことによって、封入されなかったドキソルビシンを除去した。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−Ｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔ．）で１０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中の平均粒径測定値を得た（図１Ｃ）。
【０１１５】
抗体標識したミセルを得るため、抗体を部分的に還元させて遊離チオール基に曝露し、その後、ｍ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ及びマレイミド−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（モル比４：１）で構成されるミセルとともにインキュベートし、溶液をＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラム（１×ＰＢＳで洗浄）に通すことによって精製した。抗体でターゲティングされたＨＰＬＮを作製するため、ｄｏｘ（またはｄｏｘなし）ＨＰＬＮ溶液を、抗体標識したミセルとともに２４時間インキュベートした。溶液をＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラム（１×ＰＢＳで洗浄）に通すことによって過剰のミセルを除去して、抗体でターゲティングされたＨＰＬＮを得た。
【０１１６】
あるいは、先に記載の方法（Ｂｒｕｅｈｌら，"Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ：ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｌｉｇａｎｄｓ，」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．  ４０，ｎｏ．  ２０，ｐｐ．  ５９６４-５９７４，２００１）にしたがい、ｍａｌ−ＨＰＬＮを、モル比１４：４８：３２：２：３：１のｈ−ＰＥＧ１ＰＣＤＡ、水素添加大豆ＰＣ、コレステロール、並びにｍ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ、ｍａｌ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ及びｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡから調製した。手短に言えば、脂質を混合し、フィルムに減圧蒸着させた。１５ｍＭ（総脂質及びコレステロール）の懸濁液になるようフィルムに硫酸アンモニウム１５５ｍＭを加えた。懸濁液を、バス型超音波発生装置内で６５〜８０℃まで３０分加熱した。得られた乳状溶液を、ホモジナイザー／押出し機（Ｃ５、Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．、カナダ、オンタリオ州オタワ）を使用して積層ポリカーボネートメンブレン（８０ｎｍ）に１０回通して押し出し、約６５℃まで加熱した。ほぼ澄明なリポソーム溶液を５℃まで１２時間冷却した。室温まで加温した後、Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｋｅｒ  ＸＬ−１０００  ＵＶ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いて１分間ＵＶ光照射（２５４ｎｍ）してリポソームを重合させた。得られる青色ＨＰＬＮを５分間６５℃まで加熱し、それらを赤色（蛍光）形態へ変換させた。微量の不溶性汚染物質を除去するため、呈色した溶液を０．２ｕｍ酢酸セルロースフィルターに通してシリンジろ過した。
【０１１７】
ドキソルビシンローディングｍａｌ−ＨＰＬＮを作製するため、硫酸アンモニウム含有ＨＰＬＮをＧ５０  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１×ＰＢＳで洗浄）に通して外部緩衝液を交換した。次いで、リポソームを、４０分間６０℃まで加熱しながら、ドキソルビシン−ＨＣｌ（Ｓｈａｎｄｏｎｇ  Ｔｉａｎｙｕ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）とともに、ＨＰＬＮ２ｍｇに対しドキソルビシン１ｍｇの濃度でインキュベートした。溶液をＧ５０  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１×ＰＢＳで洗浄）に通すことによって、封入されなかったドキソルビシンを除去した。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−Ｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔ．）で１０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中の平均粒径測定値を得た。
【０１１８】
抗体でターゲティングされたＨＰＬＮを作製するため、ｄｏｘ（またはｄｏｘなし）ｍａｌ−ＨＰＬＮ溶液を、抗体（部分的に還元させて遊離チオール基に曝露）とともに２４時間インキュベートし、その溶液をＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラム（１×ＰＢＳで洗浄）に通すことによって精製した。
【０１１９】
実施例２
本発明者らは、標的とする癌を治療できるようにしたＨＰＬＮナノ粒子を白血病について詳細に試験した。本発明者らは、再発性及び難治性の癌患者を治療するための新規のナノスケール技術を提供する。ターゲティングされた送達ビヒクルにより、ヒト治療抵抗性白血病の異種移植片を有するマウスを首尾よく治療することができる。従来の細胞毒性物質（ビンクリスチンまたはドキソルビシン）などのペイロードで一種類の腫瘍特異的なターゲティングリガンド（ＣＤ−１９抗体またはＣＤ−１１７抗体、Ｆａｂ断片またはダイアボディ）を用いて抗体標識ナノ粒子を合成し、成人白血病に確立されているインビボ方法を用いて腫瘍細胞ターゲティングをマウスモデルで検証し、連続血清化学に続き剖検を行って全身毒性を評価し、さらに、ＡＬＬ及び／またはＡＭＬマウスについて低用量でのＤＭＥＴ式試験を行った。最適化したＨＰＬＮの全身送達及び腫瘍による取り込みを記録して臨床的変換能力について調べ、ＨＰＬＮが腫瘍に局在することを確認した。
【０１２０】
表１は、ＣＤ−１９に対するヒト抗体をＨＰＬＮ上に提示することにより、ナノ粒子のＣＤ−１９発現細胞に対する強い認識結合が促進されること；ＣＤ−１９陰性細胞への非特異的細胞結合が非常に少ないこと（無抗体の対照ＨＰＬＮと同様）；また、これにより、ヒト患者由来の分離したばかりのＡＬＬ白血病細胞（ＣＨＬＡ３及びＵＳ７Ｒ）は、新たに作製した抗ｈＣＤ−１９／ＨＰＬＮにより積極的に強く認識されやすいことが確認されることを示している。
【０１２１】
（表１）各種細胞に対するヒト抗ＣＤ１９抗体結合ＨＰＬＮの特異的結合
0006776223.tif 000002
【０１２２】
Ｉ．ターゲティングされ薬物をローディングされたハイブリッド重合リポソームナノ粒子の構築
製剤最適化：本発明者らは、このアプローチを成功させるためには、極少数のナノ粒子が、それら自体を結合させるのに必要であり、細胞へ内部移行させて細胞を死滅させるように、高用量の細胞毒性薬物を腫瘍細胞に送達することが重要であるということを認識した。そのため、薬物濃度を可能最高レベルにしてＰＬＮに封入することを試みた。能動的ローディングにより、受動的ローディングに比べてより多量の薬物をリポソーム内に組み込むことができた（Ｈａｒａｎ、１９９３）。能動的ローディングは、低ｐＨシンク（ｓｉｎｋ）（「ｐＨ勾配」）をリポソーム内側に確立させる方法を使用し、ドキソルビシンのようなアミン担持薬物は、酸性内部を中和するように膜を通り抜ける。薬物は、内部で大部分が晶出するほど、リポソーム内に自由に流入する。公開されているｐＨ勾配による能動的ドキソルビシンローディング法（Ｈａｒａｎ、１９９３）をＰＬＮで用いるために、脂質製剤をナノ粒子に調整する必要があった。従来のステルスリポソーム（例えば、「ドキシル（商標）」）と比較して、本発明者らが独自に作製した完全重合ＰＬＮ製剤では、インキュベーション時間を延長して使用温度を上げた後でさえも、ほんの一部のドキソルビシンしかローディングされないことが示された。多量の（非架橋性または非重合性）リン脂質（水素添加大豆ＰＣ）を含めることによって製剤化し直し、ハイブリッド−ＰＬＮである「ＨＰＬＮ」を作製した。さらに、重合性脂質部分を修飾して新規ＨＰＬＮを作製する。すなわち、ＰＥＧ鎖（例えば、ｍ−ＰＥＧ２０００−ＰＣＤＡ）を有する重合性脂質を、ＰＥＧ鎖を有していない重合性脂質（例えば、ｈ−ＰＥＧ１−ＰＣＤＡ）と混合する。
【０１２３】
ここで、ドキシルで報告されているレベル（０．１６ｕｍｏｌ  Ｄｏｘ／ｕｍｏｌリポソーム構成成分）と同様のレベルのドキソルビシン（０．１５ｕｍｏｌ  Ｄｏｘ／ｕｍｏｌリポソーム構成成分）をＨＰＬＮに組み込むことができた。中心となるイノベーションは、脂質系ナノ粒子の製剤化し直しにあり、少量の光重合性ジアセチレン脂質を含有するが、なおもＵＶ照射で確実に重合される脂質系ナノ粒子にしたことであった。本発明者らは、ＨＰＬＮ内への薬物のローディングが、完全重合ＰＬＮリポソーム（Ｆｅｄｅｒｍａｎ、２０１２）より約１０倍高いことを見出した。マウス試験を全て実施するため、５００ｍｇのＨＰＬＮ／Ｄｏｘ及び約２０ｍｇのＣＤ−１９（ターゲティング）モノクローナル抗体を調製した。
【０１２４】
抗体でターゲティングされ、薬物をローディングされたナノ粒子の調製：ナノ粒子の標的をＡＬＬ型ヒト白血病細胞（ＲＥＨ細胞）上のＣＤ−１９細胞表面マーカーにするモノクローナル抗体を結合させることにより、最終ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ粒子を調製した。化学的に還元させた抗ＣＤ−１９抗体を、マレイミド末端Ｐｅｇ２０００リン脂質及びメトキシ末端Ｐｅｇ２０００リン脂質で構成されるミセルに結合させた（Ｉｄｅｎ  ２００１）。抗体標識ミセルを予め形成しておいたＨＰＬＮ／Ｄｏｘナノ粒子に曝露させると同時に、ＨＰＬＮ膜内へのミセル脂質挿入プロセスが発生し、抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ粒子が得られる。結合しなかった抗体及び他の小分子量不純物を除去するため、ターゲティングされた粒子をサイズ排除ろ過により精製した。
【０１２５】
ＩＩ．マウスモデルにおける成人白血病について確立されたインビボ方法を用いた腫瘍細胞ターゲティングの検証
マウス処置：マウスを用いた有効性及び安全性の試験を完全に実施するため、ルシフェラーゼをトランスフェクションしたヒト急性リンパ芽球性白血病（ＲＥＨ細胞）６×１０６個をＮＯＧマウスに注射した。このトランスジェニック型特殊マウスは、インターロイキン２受容体γ（ＩＬ２Ｒγ）をコードする遺伝子が欠失しており、また、ヒトのｉＬ３、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを発現させる遺伝子が付加されている。注射したヒト白血病細胞が拒絶されないよう、ＮＯＧマウスは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞の完全な欠失と、サイトカインシグナル伝達の欠損を有する。マウスを６群に分けた。群１には緩衝液処置のみを行い、群２にはターゲティングされていない非ローディングＨＰＬＮを処置し、群３にはターゲティングされていないＨＰＬＮ／Ｄｏｘ（２ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）を処置し、群４には（ターゲティングされた）抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ（２ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）を処置し、群５にはドキシル（２ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）を処置し、群６には（遊離）ドキソルビシン（２ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇ）を処置した。
【０１２６】
白血病細胞の注射後に、１週間に１回Ｘｅｎｏｇｅｎ製カメラで撮像し、腫瘍細胞分布と腫瘍量の定量化の両評価に使用した。白血病細胞の注射から１０日後、本発明者らのターゲティングされたナノ粒子薬物（抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ）または対照粒子若しくは薬物を１週間に１回の用量でマウスに投与した。投与した薬物量は、各製剤中の総ナノ粒子質量ではなく、活性物質（ドキソルビシン）量に基づいた（ただし、群２を除き、これらのマウスには非ローディング形態のＨＰＬＮの同等用量を与えた）。
【０１２７】
有効性の結果：急性毒性反応はまったく観察されなかったため、ＨＰＬＮ、及び薬物ローディングＨＰＬＮは、マウスにおいて耐容性が非常に良好であった。遊離ドキソルビシンの処置を受けた群６の動物は、上記に該当しなかった。これらの動物では、体重減少が観察され、薬物処置の結果として病気のような様子であった。処置を受けた群２、３及び群５のマウスでは、腫瘍成長の着実な進行が見られ、群１の未処置マウスと同様であった（図４）。抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ（群４）または遊離薬物（群６）で処置されたマウスでのみ、腫瘍の有意な縮小が認められた。３５日目、対照群と比較して、抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ（群４）処置動物ではほぼ２ｌｏｇの差が、ドキシル（群６）処置動物では約４分の３ｌｏｇの差があった（図４）。
【０１２８】
本発明者らは、ターゲティングされた抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘのより高用量の週用量によって対照と比較して腫瘍量が大きく減少されるかどうかを測定したいと考えた。次に行った試験では、抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ処置動物と未処置対照動物のみを比較した。ここでもやはり、ＲＥＨ細胞６×１０６個をマウスに投与し、ターゲティングされたナノ粒子中２ｍｇ／ｋｇ Ｄｏｘの用量を１週間に１回または１週間に２回投与した（１週間に２回の用量は、先の試験の週用量の２倍である）。
【０１２９】
２８日目のＸｅｎｏｇｅｎ画像には、１週間に２回の投与において、腫瘍の大きさと腫瘍量が、未処置対照または１週間に１回投与よりも顕著に減少していることが明確に示されている（図５及び９）。Ｘｅｎｏｇｅｎの腫瘍画像の線量測定から、１週間に１回投与に対する１週間に２回投与の腫瘍量を計算したところ、腫瘍量が２．５ｌｏｇ減少していた。
【０１３０】
ＩＩＩ．全身毒性の評価
マウスの生存率：開始当初の（１週間に１回の投与）試験のマウスを５０日目までの生存について調べた。群４及び群６のマウスは腫瘍量減少を示したものの、遊離薬物ドキソルビシンによる処置（群６）では重篤な副作用が誘導され、これらの動物に体重減少及び不健康な外見をもたらした（体重減少、緩慢な運動、脱毛）。このオフターゲット毒性は、群４（抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ中Ｄｏｘ  ２ｍｇ／ｋｇ）では観察されず、これらの動物の１００％が、健康な外見を呈し、５０日目の屠殺まで生存した（図６）。
【０１３１】
血清化学毒性結果：抗ＣＤ−１９−ＨＰＬＮ−Ｄｏｘを２．０ｍｇ  Ｄｏｘ／ｋｇを１週間に２回処置し、４週間後に臨床化学検査を分析したところ、肝臓及び腎臓の機能に軽度の変化が示されたが有意な変化ではなかった（図７）。処置動物のクレアチニン、ＡＳＴ及びＡＬＴの各値は未処置対照動物の誤差許容範囲内であった。処置動物で尿素窒素のわずかな上昇がみとめられたが、この変化は有意な変化とはみなされない。
【０１３２】
細胞培養において、単純な（ターゲティングされていない）ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ製剤の有効性が従来の（ターゲティングされていない）リポソームドキソルビシン製剤（ドキシル（商標））に対して予期せず優っていたことは、腫瘍細胞に対する封入薬物の生物学的利用能がＨＰＬＮ形態において高くなると考えられることから、このＨＰＬＮ薬物送達アプローチを説得力のあるものにしている（図３）。腫瘍細胞を標的とする物質を含めることにより、インビトロでの殺腫瘍効果がさらに１０〜１２倍増大する。ヒト白血病細胞を担持するトランスジェニックマウスにおいて、唯一生存し健康に見えたマウス（５０日目の屠殺まで）は、抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘナノ粒子中のドキソルビシン２ｍｇ／ｋｇ用量の処置を受けたマウスであった。この生存応答には、１週間に１回の投与の場合で腫瘍量測定値のほぼ２ｌｏｇの減少が認められた。抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘの週用量を単純に２倍にすることで、腫瘍量は約２．５ｌｏｇ減少し、オフターゲット毒性の顕著な増加は全くなかった。最高用量のＨＰＬＮ／Ｄｏｘで処置した動物の肝臓酵素機能及び腎臓機能を分析したところ、未処置対照動物と比較して、これらの値に有意な変化は認められなかった。さらなる試験では、ポリジアセチレン含有ナノ粒子は、正常組織に対して細胞毒性をほとんどまたは全く示さず、免疫原性が最小限であることが示された。これらすべてのデータを合わせると、ＨＰＬＮは、ヒト成人白血病、及び他の悪性腫瘍を治療するための非常に重要な薬物送達ビヒクルとして機能し得ることが強く示唆される。
【０１３３】
実施例３：新規の合成ペプチド親和性物質を用いて、癌細胞を標的とするＨＰＬＮを実証する
本発明者らは、ＨＰＬＮをヒトＡＬＬ腫瘍細胞に選択的に結合させるモノクローナル抗体（抗ＣＤ−１９）を使用した。ターゲティング抗体はマウス由来であるため、ヒト患者への投与の場合に、反復投与で免疫により異種タンパク質が認識されると問題が生じ得る。したがって、高親和性で高度に安定性であるペプチド親和性物質を作製し使用する。非ヒト由来であるマウスのモノクローナル抗体を使用しなくてすむペプチドベースの親和性物質は、予後不良の癌再発患者において初期に使用するこの新規の標的療法を著しく改善する。
【０１３４】
典型的には、固有の腫瘍細胞表面受容体を発現する細胞に対して、ランダムペプチド配列のファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより、遺伝子改変ペプチド物質が見出される。ファージライブラリーは、腫瘍受容体発現を欠失している点のみが異なる、同様の細胞株（陰性細胞株）に対し事前にスクリーニングを行う。この方法により、特異的または非特異的に陰性細胞株に付着するファージをライブラリーから除去する。今度は、新規サブライブラリーは陽性細胞株に対して判断が下され、結合するファージはいずれも、受容体に特異的に認識された結果付着していると考えられる。この方法により、標的は、最良モノクローナル抗体の多くが示す値と同様の低いｎＭ範囲に近いＫｉを有する、非常に高い親和性で結合されることになる。遺伝子改変ペプチドを同定するためのこの設計方法は一般的であり、特定の構造（例えば、αヘリックス、βシート、ターン）または構造に関する先験的知識さえも作業を行うためには必要としない。これらすべての特徴により、白血病細胞をＨＰＬＮの標的とさせるために現在使用されている抗体に取って代わることができる、安定なペプチド作製へ向けた本発明者らの取組みが可能になる。
【０１３５】
選別を用いて１つ以上の結合ペプチド配列が分離されたら、検証用及びナノ粒子への組込み用に２〜３個の最高のペプチドを合成する。ナノ粒子を、細胞毒性薬物ペイロード（ドキソルビシン）を用いて合成し、精製してＨＰＬＮ／Ｄｏｘ粒子を得る。脂質挿入方法により、ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ粒子をペプチド標識脂質ミセルに曝露させて遺伝子改変親和性ペプチドを組み込む。最初に、培養ヒトＡＬＬ細胞（ＣＤ−１９及びＣＤ−１１７陽性）及びヒトＡＭＬ細胞（ＣＤ−３４陽性）を使用して腫瘍細胞ターゲティングを評価し、その後、ヒト白血病ＡＬＬ及びＡＭＬ細胞を注射した異種移植片マウスモデルでインビボでの殺腫瘍を検証する。
【０１３６】
ｐｅｐ−ＨＰＬＮの作製：小さな粒径分布を得るため押出し成形を介してリポソームナノ粒子を合成し、その後、能動的（ｐＨ勾配）ドキソルビシンローディングを行い、ＨＰＬＮ／ｄｏｘ粒子を作製するための殻の最終重合を行う。チオール含有ペプチド類似体をマレイミド末端Ｐｅｇ脂質とともにインキュベートすることにより、ペプチド末端（ｐｅｐｔｉｄｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）Ｐｅｇ脂質を調製する（本明細書内で還元モノクローナル抗体について実証した通り）。これらのペプチド末端Ｐｅｇ脂質を他のメトキシ末端Ｐｅｇ脂質と共に混合し、混合ミセルを作製する（Ｉｄｅｎ  ２００１）。モノクローナル抗体ミセルの場合と同様に、ペプチド末端Ｐｅｇ脂質ミセルをＨＰＬＮ／ｄｏｘ粒子とともにインキュベートし、ペプチド脂質をＨＰＬＮ／ｄｏｘ粒子内に挿入し、ｐｅｐ−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘを作製する。
【０１３７】
腫瘍ターゲティング及び殺腫瘍についてのｐｅｐ−ＨＰＬＮ／ｄｏｘのアッセイ：従来の診断用フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ解析）を使用して、ペプチド標識ＨＰＬＮ（ｐｅｐ−ＨＰＬＮ）と、抗体標識ＨＰＬＮとを、ＡＬＬ細胞及びＡＭＬ細胞に対する親和性結合について比較する。細胞を、ターゲティングされたＨＰＬＮに曝露した後、洗浄工程を行い、未結合粒子をすべて除去する。ＨＰＬＮポリマーの固有の蛍光を利用するＦＡＣＳでは、ｐｅｐ−ＨＰＬＮと抗ＣＤ（−１９、−１１７、−９９または−３４）−ＨＰＬＮとを比較して、細胞結合の相対的な有効性について良好な指標が得られる。ＨＰＬＮ／ペプチド−ミセル比をさまざまに変えて、ターゲティングペプチドの粒子単位でのレベルを最適化した後、インビトロ結合アッセイ法及びインビトロ殺腫瘍試験の両方を実施し、ペプチド誘導性の局在及び取り込みを検証した。
【０１３８】
ＣＤ−１９、ＣＤ−１１７、ＣＤ−９９、またはＣＤ−３４の陽性腫瘍細胞を標的とするようにｐｅｐ−ＨＰＬＮを最適化した後、マウスにおけるインビボ殺腫瘍活性アッセイ法を実施する。前述同様、ＮＯＧマウスにルシフェラーゼをトランスフェクションした６×１０６個の白血病細胞を注射する。ｐｅｐ−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘによる全身分布及び殺細胞を、ルシフェラーゼをトランスフェクションした白血病細胞の外部Ｘｅｎｏｇｅｎ製カメラ画像により継続的に評価する。確立された腫瘍を形成させた後、後続追加試験を引き続き行う。この方法では、ｐｅｐ−ＨＰＬＮによる腫瘍量減少を、その治療上の有効性について分析する。この研究により、抗ＣＤ−１９、−９９、−１１７、または−３４モノクローナル抗体によってターゲティングされたＨＰＬＮと少なくとも同様に白血病細胞に結合できる合成ペプチドＨＰＬＮ複合体の首尾良い同定がもたらされ、かつ新規製剤が提供され、該新規製剤は、抗体でターゲティングされたＨＰＬＮ／Ｄｏｘに匹敵する殺腫瘍活性を有してインビボで機能する、薬物をローディングされ、遺伝子改変ペプチドでターゲティングされたＨＰＬＮ（ｐｅｐ−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ）から構成される。
【０１３９】
合成小ペプチドによるＨＰＬＮの腫瘍ターゲティングにより、潜在的に免疫原性であるマウス由来抗体のヒトでの使用を回避する、力強い解決法が提供され得る。さらに、マウス由来のモノクローナル抗体を「ヒト化」するための、より伝統的な方法に目を向けることができる。ＣＤＲ移植、「表面再建（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」、「超ヒト化（ｓｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）」またはヒトストリング含有量最適化のような合理的設計法、及び濃縮またはハイスループット選別を用いた経験的方法が考えられるであろう（Ａｌｍａｇｒｏ  ２００８）。これにより、マウス抗体の親和性と特異性を保持しつつ、ヒトに適用した場合に免疫原性が最小限である分子ができる可能性がある。別のアプローチは、ヒト抗体のファージディスプレイライブラリーを使用する方法である。この商業的に利用可能な技術は、何十億もの各種抗体のライブラリーからの、完全ヒト細胞表面標的特異的リードの迅速単離に基づくものである（ｗｗｗ．ｄｙａｘ．ｃｏｍ）。ＣＤ−１９、ＣＤ−９９、ＣＤ−１１７、及びＣＤ−３４タンパク質に対するヒト−ファージ抗体構築物の商用ライブラリーの連続パニングを外部委託することで、高親和性の高特異性ヒト抗体がＨＰＬＮへの結合から同定されるであろう。
【０１４０】
実施例４：多種のターゲティング物質を単一粒子上に有する、ＨＰＬＮの優れたターゲティングの実証
ＡＬＬ細胞上で同定された高レベルのＣＤに一致する、２種以上のターゲティング物質を使用すると、正常細胞に対してではなく白血病細胞に対してＨＰＬＮの選択的親和性が高まる。まず、抗ＣＤ−１９及び抗ＣＤ−１１７をＨＰＬＮ／ｄｏｘ粒子上に同時提示（ｃｏ−ｄｉｓｐｌａｙ）させ、結合及び細胞毒性について検査する。また、ＣＤ−１９及びＣＤ−１１７に対する小ペプチドターゲティング物質を同時提示するＨＰＬＮ／Ｄｏｘ製剤を結合性及び細胞毒性について検査する。これらの特徴により、このＨＰＬＮ薬物送達技術における、全身毒性に対する治療有効域が広がる。
【０１４１】
ＨＰＬＮ／Ｄｏｘナノ粒子を、異なる２種の抗体またはペプチドを収容するミセルで処理する。ターゲティング物質を組み合わせたＨＰＬＮの親和性を、成人白血病培養細胞を用いて腫瘍結合性を評価することにより経験的に決定し、最適化する。優れた結合親和性（単一物質ＨＰＬＮそれぞれとの比較）を有する組み合わせＨＰＬＮを同定し、最良の細胞殺傷をインビトロで確認した後、インビボでの造腫瘍性の優良性について免疫不全マウスモデルで検証する。
【０１４２】
マルチターゲティング物質ＨＰＬＮ／ｄｏｘの調製並びに腫瘍ターゲティング及び殺腫瘍についてのマルチターゲティング物質ＨＰＬＮ／ｄｏｘのアッセイ：新規ターゲティングＨＰＬＮを調製し、細胞結合性及び抗腫瘍特性について試験する。抗ＣＤ−１９抗体及び抗ＣＤ−１１７抗体を用いて、これらの脂質結合モノクローナル抗体の各々からミセルを調製する。また、ＣＤ−１９及びＣＤ−１１７に対する小ペプチドターゲティング物質もミセル形成脂質に化学的に結合させる。やはり、脂質挿入によって、抗体（Ａｂ）またはペプチドで標識したＨＰＬＮを作製する。Ａｂ１（またはペプチド１）型ミセルとＡｂ２（またはペプチド２）型ミセルの比は、同一ＨＰＬＮ／ｄｏｘ粒子上でのＡｂ１及び２（またはペプチド１及び２）の相対的レベルが異なるようにするために異なり得る。親和性腫瘍結合をＦＡＣＳ解析で分析し、かつ、マルチターゲティング物質ＨＰＬＮを、単一物質で標識したＨＰＬＮと比較する。粒子単位でのレベルと、ターゲティング物質の比とを最適化した後、インビトロでの殺腫瘍を検査して、ターゲティング物質を組み合わせることが細胞内部移行及び細胞毒性薬物の生物学的利用能に有害とはならないことを確認する。最後に、マウスにおいて、殺腫瘍活性アッセイ法のためにインビボで最適化したＡｂ−ＨＰＬＮまたはｐｅｐ−ＨＰＬＮの組み合わせを試験する。ここでもやはり、マルチ物質ＨＰＬＮによる全身分布及び殺細胞について、ルシフェラーゼをトランスフェクションしたＡＬＬ細胞を注射した異種移植マウスの外部Ｘｅｎｏｇｅｎ製カメラ画像により継続的に評価する。腫瘍量減少を定量化し、対照動物と比較する。
【０１４３】
この研究により、単一物質でターゲティングされたＨＰＬＮに比して少なくとも２倍優れた結合性を白血病細胞に対して示す、マルチターゲティング物質ＨＰＬＮの首尾良い同定がもたらされ、かつ、単一物質でターゲティングされたＨＰＬＮより優れた殺腫瘍活性を有してインビボで機能する、組み合わせ抗体または組み合わせペプチドでターゲティングされた新規ＨＰＬＮが提供される。
【０１４４】
単一ターゲティング物質によるＨＰＬＮのターゲティングは、薬物を腫瘍細胞に選択的に送達する強力な方法であり、二重物質によるターゲティングは、親和性及び／または選択性が有意に促進され得る。すべてのＨＰＬＮで二重物質が同様に分布されることを保証するのは、ＨＰＬＮと２種の異なるミセル母集団とを単に混合するだけでは困難かもしれない。脂質挿入の動力学によって、特定の粒子に一方のターゲティング物質が濃縮されるかもしれず、異種母集団のマルチターゲティングＨＰＬＮとなり得る。このことは、一方のターゲティング物質を初めに活性マレイミド基を介してＨＰＬＮ上で粒子表面に結合させてから、次に、第２のターゲティング物質の脂質挿入を行うことで十分に回避できるであろう。二重物質は、結合に関して互いに拮抗する、または標的細胞内への粒子の内部移行を遅延させ、このために、薬物の有効性が低下するかもしれない。このことは、単一表面タンパク質で支配される内部移行を促進させつつ、２種の異なる表面タンパク質を認識するというさらなる利点を最初の結合イベントから得るために、二重ターゲティング物質の相対的分布を調節することで改善できるであろう。
【０１４５】
実施例５：同一のＨＰＬＮにおけるまたは異なる単剤ＨＬＰＮのカクテルにおける複数の治療用物質の送達について調べる
本発明者らは、細胞毒性薬物（ドキソルビシン、ビンクリスチン、イリノテカン、シスプラチン、シタラビンなど）の混合物を同一ＨＰＬＮに収容させて用いた併用療法について調べる。あるいは、上記と同種の薬物を、それぞれの単剤ＨＰＬＮとして調製するが、異なる種類のＨＰＬＮ薬物の混合物として投与する。成人白血病（ＡＬＬ）の現在の治療は、ビンクリスチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、及びデキサメタゾンまたはプレドニゾンを、ドキソルビシンと共に、予後が良好な任意のサブセットで用いるカクテルに依存する。薬物のこの組み合わせは、ターゲティングされたＨＰＬＮ製剤で優先度が高い。
【０１４６】
選択した低分子細胞毒性物質を含有するターゲティングされたＨＰＬＮは、能動的薬物ローディング、及び能動的ローディングを適用できない場合は受動的封入を行うための本明細書に記載の方法を使用して調製されるであろう。インビトロ試験の後、ＨＰＬＮ薬物すべての組み合わせを用いてインビボアッセイ法を行う。
【０１４７】
ターゲティングされた多剤ＨＰＬＮの調製及びアッセイ：新規ターゲティングＨＰＬＮを調製し、細胞結合性及び抗腫瘍特性について試験する。被験薬物（ドキソルビシン、ビンクリスチン、トポテカン、シスプラチン、デキサメタゾン、シタラビンなど）を、ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔｏｃｒｉｓ及びＤｅｓａｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓなどの商用供給業者から入手する。
【０１４８】
抗癌薬のトポテカン及びビンクリスチンの両方について、ｐＨ勾配を介したリポソーム内への能動的ローディング手順が公開されている（Ｚｕｃｋｅｒ  ２０１０）。この手順により、本発明者らがドキソルビシンで得た濃度と同様の高濃度をＨＰＬＮ内部に確立することができる。他の被験薬物については、公開されている文献には能動的リポソームローディングの記載はない。これらの薬物について、リポソーム形成緩衝液中の初期濃度を可能な限り高濃度にし、最初の粒子アセンブリ時に薬物を受動的に封入させる。薬物ローディングレベルを、ＨＰＬＮの破裂及びＨＰＬＣ分析での定量により決定する。新規薬物それぞれをＡＬＬ細胞に対して試験する。まず、ＣＤ−１９を標的としたＨＰＬＮ中の単一物質として、インビトロ腫瘍細胞培養アッセイ法で試験し、次いで、有望であることを示す新規抗ＣＤ−１９−ＨＰＬＮ／薬物それぞれについて、それらの薬物組み合わせ少数を可能な限り高い相対濃度で、または現在使用されている（非封入）カクテルに従った比で共封入する。再度インビトロ試験を使用して、組み合わせのいずれかが、等用量の単剤ＨＰＬＮよりも殺腫瘍に関して優れた有効性を示すかどうかを決定する。標的導入療法と標準的導入療法とが相対するように、標準用量導入プロトコール（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｏｓｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を反映する組み合わせを作製する。封入した薬物材料量で有効性の改善を示す組み合わせ薬物ＨＰＬＮを、ヒトＡＬＬ腫瘍を注射した異種移植マウスに投与する。薬物組み合わせの最良のものを、できれば１つ以上の標的特徴を用いて、ペプチドでターゲティングされたＨＰＬＮにおいて再度試験する。
【０１４９】
この研究により、ＡＬＬ細胞に対して、ターゲティングされた単剤ＨＰＬＮより優れた有効性を有する、ターゲティングされた多剤含有ＨＰＬＮの首尾良い同定がもたらされ、かつ、ターゲティングされた単剤ＨＰＬＮより優れた殺腫瘍活性を有してインビボで機能する、新規のターゲティングされた多剤ＨＰＬＮが提供される。
【０１５０】
ターゲティングされた単剤含有ＨＰＬＮは、全身型と転移型の両形態の白血病に強力な効果を示す一方で、薬物カクテルは、オフターゲット安全域をさらに押し広げ得る。考えられる欠点は、薬物の組み合わせによっては、相手薬物またはＨＰＬＮ脂質に不適合となり得ることである。これについては、化学的に適合性がありながら、互いの有効性が相乗効果をもたらすと思われる組み合わせを同定することに目を向けて、より広範囲の薬物組み合わせをスクリーニングすることで是正され得るだろう。有望であることを示すが保管または安定性に問題があるいくつかの組み合わせでは、そのアプローチに焦点を当てることができ、異なる薬物の組み合わせを２つ（またはそれ以上）の異なるターゲティングされたＨＰＬＮの母集団に分けて同時投与する。こうした変形は、既存の導入プロトコールと同様に、異なる薬物を、化学療法期間中の異なる時期に投与できるようになるため、実際さらに有利となり得る。
【０１５１】
実施例６：ＨＰＬＮ粒子パラメータ最適化
インビボでの多くの薬物動態学的／薬力学的プロセスは、ＨＰＬＮで送達される薬物の有効性に重要な役割を果たすと考えられる。本発明者らは、ＨＰＬＮ製剤が良好な有効性を有することを動物モデルで実証した。しかし、インビボ用粒子の最適化には依然かなり広範な行数にわたるＨＰＬＮ粒子パラメータが存在する。特定の理論に束縛されることは望まないが、以下の重要パラメータを最適化することができる。（１）ＨＰＬＮ中のポリマーの割合は、薬物放出の有効性、ひいては殺腫瘍有効性を左右し、また正常細胞への粒子毒性にも影響する。（２）ＰＥＧ化のレベルは、ＨＰＬＮの循環時間に影響を与えるため、腫瘍内の局在化／腫瘍による取り込み／殺腫瘍速度論も影響される。（３）ＨＰＬＮサイズは、腫瘍内の局在化及び殺腫瘍における有効性に影響を与える。（４）粒子単位でのターゲティング物質量は腫瘍内の局在化及び殺腫瘍における有効性に影響を与える。
【０１５２】
上述パラメータを最適化するため、製剤に修飾を行って、ポリマーの割合の変更、粒径変更及びＨＰＬＮ上のＰＥＧ及びターゲティング分子の量の変更を行う。新規ターゲティングＨＰＬＮの調製及び特徴決定を行い、細胞結合及び抗腫瘍特性の試験を実施する。
【０１５３】
ポリマー内容物。本発明者らは、ＨＰＬＮ／ｄｏｘ製剤中の架橋脂質（ｈ−ＰＥＧ１−ＰＣＤＡ）のレベルを上げると、癌細胞に対する細胞毒性が増加する（Ｆｅｄｅｒｍａｎ  ２０１２）という、確かな観察を行った。封入細胞毒性薬物を用いていないＰＬＮは、正常細胞に対して非常に低い毒性を示すことから、上記が脂質それ自体または高分子形態であることから生じる毒性ではないことは明らかである。特定の理論に束縛されることは望まないが、従来のリポソームと比較して、ポリマーが一旦腫瘍細胞内部へ入るとナノ粒子膜を修正して薬物放出を促進すると本発明者らは考える。ｈ−ＰＥＧ１−ＰＣＤＡ脂質を増量させるとＨＰＬＮがさらに高度に重合されることから、重合度を重ねていった場合にペイロード粒子を用いたインビボでの有効性及び正常細胞毒性（薬物非ローディング粒子）に与える影響を調べる。ポリマー内容物の各種変形は、ｈ−ＰＥＧ１−ＰＣＤＡ（重合性脂質）と非架橋脂質成分（水素添加大豆ＰＣ）のモル比を変えて達成する。この変更で、ＨＰＬＮ中に形成し得るポリマーの量が再現可能に制御される。特定の理論に束縛されることは望まないが、ジアセチレン脂質は、水素添加大豆ＰＣ尾部より炭化水素尾部のほうが著しく長く、これが重合性脂質のアイランドをもたらす相分離（Ｇａｂｏｒｉａｕｄ  ２００１）を促進すると本発明者らは考える。ｈ−ＰＥＧ１−ＰＣＤＡ脂質の相対量を増大させると、ポリマードメインのサイズ及び／または数が粒子単位で大きくなるであろう。本明細書に記載する製剤は、ｈ−ＰＥＧ１−ＰＣＤＡ脂質と水素添加大豆ＰＣ脂質のモル比以外は一定に保たれる。薬物ドキソルビシンをこれまで同様ｐＨ勾配により能動的にローディングし、新規類似体をＵＶ重合させる。ポリマー形成の重合度を、６４０ｎｍでの吸光度により検査する。本発明者らが早期に気づいた問題の一つは、ｈ−ＰＥＧ１−ＰＣＤＡ脂質のレベルが高いほど、確立され得る薬物ローディングレベルが低くなること（Ｆｅｄｅｒｍａｎ  ２０１２）であった。各製剤における薬物ローディングをリポソームの破裂により測定し、各製剤の投与では動物に同等量の薬物を与える。有望な製剤を調べるため、ポリマー内容物に関連するＨＰＬＮ／Ｄｏｘ殺腫瘍効果を最初に細胞培養で決定し、その後、インビボで決定する。別々の実験で、ポリマー重合度をあげることで予期しなかった正常細胞毒性があるかどうか、各種の薬物非ローディング類似体を急性毒性アッセイ法で調べる。
【０１５４】
ＰＥＧ化レベル。投与方法が静注（ＩＶ）であるため、ターゲティングリガンドと組み合わせるＰＥＧ「ステルス」の量を変更する場合、治療転帰を最適化するために循環半減期を保証する必要があるかもしれない。一般に、ある点までは、ＰＥＧ分子の表面密度を高めると、ＨＰＬＮ表面の免疫系による認識を部分的に妨げるか、またはＲＥＳによる非特異的な粒子取込みを低下させ、循環時間を延長をもたらす（Ｊｏｈｎ  ２００３）。循環時間が長くなると、ＨＰＬＮの腫瘍細胞「発見」及び腫瘍細胞への付着が優良になるだろうという仮定を、各ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ製剤の有効性を粒子単位でのＰＥＧ量の関数として評価することにより検証する。本明細書に記載する製剤は、リポソーム形成混合物に導入されるＰｅｇ脂質の相対量を除いては、一定に保たれるであろう。薬物ローディング、及び不均一ローディングのために必要となる標準化をした後、ターゲティング物質を添加する。文献に示されているように、ＰＥＧ化が比較的低レベルであっても、ミセル導入方法を介したターゲティング脂質の挿入を有意に遅らせるかもしれない（Ｉｄｅｎ  ２００１）。したがって、最初のリポソーム形成混合物にマレイミド末端Ｐｅｇ脂質を含める従来方法を実施し、メトキシ末端ＰＥＧ成分を増量させていくにより全体的なＰｅｇ含有量を制御する。その後、Ｐｅｇレベルがさまざまに異なる抗ＣＤ−１９−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ製剤の有効性を動物で試験する。
【０１５５】
ＨＰＬＮのζ電位測定は製剤の改善に不可欠である。粒子表面に対する変更はコロイド安定性に影響を与える。一般に、特定範囲内のζ電位（約＋３０〜−３０ｍＶ）はコロイド安定性（非凝集）をもたらすが、その範囲外の電位は望ましくない凝集沈殿が起こり得る。ζ電位を測定することで、候補製剤数が減少してＨＰＬＮの安定性試験が短縮され、有効期間の延長につながる。ζ電位はまた、受動的な（望ましくない）薬物放出及び安定性に影響を与える可能性のある、粒子表面の（荷電）薬物分子の程度も示す。
【０１５６】
粒径。次に、粒径の影響を調べる。５０〜２００ｎｍの限られた粒径範囲内であれば、肝臓ろ過またはＲＥＳの捕捉によって循環から除去される可能性は最小限に抑えられる。リポソーム押出し成形で得られる粒径に対する微細な制御で、平均粒径が５０、８０、１００、及び２００ｎｍに集中するＨＰＬＮ／薬物バッチを調製することができる。これまでの経験を通じて、ＨＰＬＮのサイズの下限は約３０〜４０ｎｍであることがわかった。このサイズを下回ると、粒子の曲率は明らかに厳しく脂質充填に影響を与え、重合プロセスが著しく抑制される。
【０１５７】
初めに、このサイズ試験を抗ＣＤ−１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ製剤に行う。さまざまなサイズの、薬物をローディングされ、ターゲティングされたナノ粒子を、安定性について分析し、その後、動物に投与する。有効性、及び粒径で誘導される血栓性イベントにより生じる異常毒性の両方について調べる。
【０１５８】
他のパラメータ（ＰＥＧ化、ポリマー内容物、ターゲティング物質量等）への改善、並びにターゲティング物質の種類及び薬物カクテルの組み合わせが同定されたので、本明細書で経験的に同定したＨＰＬＮサイズ範囲で、循環半減期が最長の至適製剤を構築する。
【０１５９】
ターゲティング物質レベルの最適化。最後に、ターゲティング物質の量の関数として有効性を検討する。ナノ粒子のインビボターゲティングに関する文献で見られるレベルは、一般に、５〜１０モルパーセントの範囲であるが、このパラメータをＨＰＬＮ用に最適化する必要がある。粒子上のターゲティングタンパク質レベルを高くすると、腫瘍結合性は高くなるが、同時に非特異的にオプソニン作用をするタンパク質の付着も促進される。
【０１６０】
最初にこのターゲティング物質の量を抗ＣＤ−１９−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ製剤で試験する。マレイミド末端ＰＥＧ脂質を最初のリポソーム形成混合物に含める従来方法を、ｍａｌ−脂質量を増量させつつ実施する。低レベル（０．５モル％）のｍａｌ−脂質から開始し、最高の約２０モル％まで徐々に％レベルを上げてバッチを作製する。抗ＣＤ−１９−ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ製剤の有効性を、まず培養における細胞結合で最初に分析し、細胞結合を全く示さない、または極めて最小限の結合しか示さない製剤は処分する。特定の理論に束縛されることは望まないが、本発明者らは、ターゲティング物質を増量すると、結合レベルのプラトーに達し、おそらくは上限においていくらかの結合低下があると予想している。次いで、インビトロでの結合レベルが同様の、表面量の範囲に対してターゲティング物質をさまざまに変えた製剤を殺腫瘍効果について動物で試験する。
【０１６１】
この試験を、インビトロ及びインビボ両試験を使用し連動させて実施する。これらのパラメータを変更したので、結合及び殺細胞をインビトロ試験で確認し、有望な製剤をマウスに取り入れる。これらの最適化により新規ＨＰＬＮ製剤は、長期循環、最大細胞結合性、及び正常組織に対する低毒性のために最適化されたナノ粒子特性を有する製剤であると特定される。
【０１６２】
実施例７：ヒトＡＭＬ細胞の異種移植マウスモデルにおける、ＣＤ−３４をターゲティングするＨＰＬＮの試験
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は予後が特に不良であり、成人で最もよく見られる形態である。ヒト患者由来の新鮮なヒトＡＭＬ細胞を調達し、それらを本発明者らのＮＯＧマウスモデルで試験する。この試験では、患者由来の白血病細胞の異種移植片における同様の有効性を記録する。
【０１６３】
ＨＰＬＮをまず抗ＣＤ−３４モノクローナル抗体で機能化させ、新鮮なヒトＡＭＬ細胞に対する陽性結合についてインビトロで確認する。結合が実証されたら、抗ＣＤ−３４／ＨＰＬＮにドキソルビシンを用いて薬物ローディングする（抗ＣＤ１９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ作製時と同様）。最初に、インビトロでの有効性をＡＭＬ細胞死により評価し、ＬＤ５０を測定する。抗体に代えてＣＤ−３４親和性ペプチドも可能であり、新規ＣＤ−３４ｐｅｐ／ＨＰＬＮ／ＤｏｘをＡＭＬ細胞の結合及び殺レベルについて試験する。最後に、確立されているＡＭＬ治療プロトコールを反映する細胞毒性物質を含有する薬物ローディングＨＰＬＮを調製し、試験する。ＮＯＧマウスに新鮮なヒトＡＭＬ細胞を注射し、ヒトＡＭＬ細胞の末梢血カウントの実施により、腫瘍殺細胞を１週間に２回、８週間にわたり評価する。
【０１６４】
ＣＤ３４をターゲティングし薬物をローディングされたＨＰＬＮの取得：上述のように、ターゲティング抗体またはＣＤ−３４に対する遺伝子改変ペプチドのいずれかを、標識ミセルの組み込みによりＨＰＬＮ膜内に組み込む。ここでもやはり先に記載したドキソルビシンローディング方法を用いて、ＣＤ−３４を標的にするＨＰＬＮ／Ｄｏｘ粒子を得る。さらに、上記方法を用いて、ＡＭＬ患者の治療に現在使用されている薬物の組み合わせを、ターゲティングされたＨＰＬＮ製剤中で試験する。このカクテル内の作用物質は、ミトキサントロン、Ａｒａ−Ｃ（シタラビン）、及びＶＰ−１６（エトポシド）であり得る。ＨＰＬＮ内への薬物ローディングを、先に記載した能動的ローディング（ドキソルビシン）または受動的ローディングにより行う。ＨＰＬＮ薬物含有量を、ドキソルビシンについてはＦｅｄｅｒｍａｎ  ２０１２に記載の通り、または他の薬物については粒子破裂とその後のＨＰＬＣでの定量を行って、再度アッセイする。
【０１６５】
腫瘍ターゲティング及び殺腫瘍についてのＣＤ−３４をターゲティングするＨＰＬＮ／薬物のアッセイ：新鮮なＡＭＬ細胞をヒト患者から得て、やはり診断用フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ解析）を用いてＨＰＬＮ結合を実証する。抗ＣＤ−３４抗体またはＣＤ−３４ペプチドいずれかにより、ＡＭＬ細胞に対するターゲティングを比較する。ターゲティングペプチド若しくは抗体の粒子単位でのレベルを最適化した後、インビトロ殺腫瘍試験を行い、局在及び取り込みを検証する。インビトロでの殺細胞をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（ＲＬＵ）により分析する。
【０１６６】
ＣＤ−３４をターゲティングするＨＰＬＮをインビトロで最適化した後、インビボ殺腫瘍活性アッセイ法をマウスで実施する。先にＡＬＬ細胞で実施した通り、ＮＯＧマウスにＡＭＬ細胞６×１０６個を注射する。ＣＤ−３４標的型ＨＰＬＮ／薬物による全身分布及び殺細胞を、ヒトＡＭＬ細胞の末梢血球数により１週間に２回評価する。治療レジメン完了後、剖検を実施し、肝臓、脾臓、骨髄、及びＣＮＳの残存疾患を評価し、定量化する。
【０１６７】
この試験により、異種移植マウスモデルにおいてＡＭＬ白血病細胞に結合し死滅させることができる、ＣＤ−３４を標的にするＨＰＬＮの首尾良い実証がもたらされ、かつ、殺腫瘍活性を有してインビボで機能する、薬物をローディングされＣＤ−３４をターゲティングするＨＰＬＮで構成されている、新規製剤が提供される。
【０１６８】
実施例８：ヒトのユーイング肉腫異種移植マウスモデルにおける、ＣＤ−９９をターゲティングするＨＰＬＮの試験
本発明者らは、ドキソルビシンをローディングされかつＣＤ−９９に対する抗体を用いてターゲティングされたＨＰＬＮ（抗ＣＤ−９９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘ）の有効性を、ＮＯＧマウスにおいて試験した。皮下モデルでは、ルシフェラーゼをトランスフェクションしたユーイング腫瘍を６匹のマウスに移植した。３匹のマウスに緩衝液を与え、別の３匹のマウスに抗ＣＤ−９９／ＨＰＬＮ／ｄｏｘ（ｄｏｘ２ｍｇ／ｋｇ、１週間に２回）を与えた。移植後１０日の時点で薬物投与を開始し、腫瘍サイズをカリパス測定で推定した（図１２）。転移モデルで、６匹のマウスにＴＣ７１−Ｌｕｃユーイング腫瘍細胞５×１０６を尾静脈を介して注射し、移植から３日後に薬物投与を開始した。マウス３匹に抗ＣＤ−９９／ＨＰＬＮ／ｄｏｘ（ｄｏｘ２ｍｇ／ｋｇ、１週間に２回）を与え、別のマウス３匹にはビヒクルのみを与えた（図１０）。腫瘍サイズをＸｅｎｏｇｅｎ製カメラによる画像により推定した。
【０１６９】
有効性結果：急性毒性反応はまったく観察されなかったため薬物ローディングＨＰＬＮはマウスにおいて耐容性が非常に良好であった。前述の試験で、本発明者らは、ＨＰＬＮは動物に有害作用がないことを示した。体容量は対照群のものと一致し、また、肝臓、腎臓、及び骨髄機能の試験は正常を維持した。しかし、抗ＣＤ−９９／ＨＰＬＮ／Ｄｏｘを投与されたマウスは、腫瘍成長の有意な遅延を示した。２４日目、皮下モデルにおいて、ターゲティングされたＨＰＬＮで処置された動物では未処置対照群に比べてほぼ２．５倍の差があった（図１２）。未処置対照マウスの腫瘍成長は２４日目までには非常に大きくなり、動物管理プロトコールにより安楽死させなければならなかった。特に期待できるのは、ＨＰＬＮで処置したマウスで観察された腫瘍成長曲線であった。腫瘍成長は、処置開始後約２０日で明らかにプラトーに達した。転移モデルもまた、対照と比較して有意な腫瘍量減少を示した。３５日目までには、腫瘍サイズは約４．５倍の縮小になると推定される（図１０）。Ｘｅｎｏｇｅｎ写真は、処置動物と対照動物の間の腫瘍サイズの差を劇的に示している（図１０）。ＨＰＬＮで処置したマウスから切除した腫瘍では、ＨＰＬＮの局在が強く存在することが示された（図１１）。
【０１７０】
実施例９：一般アッセイ方法
最初に細胞ベースの結合アッセイ法及び細胞毒性アッセイ法で製剤を試験することで、新規ＨＰＬＮの試験を行う。最も有望な類似体を、腫瘍結合性、腫瘍内部移行、及び殺腫瘍の試験用に、ヒトＡＬＬまたはＡＭＬ細胞を担持するマウスに投与する。
【０１７１】
細胞ベース試験。まず、細胞ターゲティングまたはＰＥＧ化構成成分に対して特定の変更を行った場合は、腫瘍細胞結合レベルを測定する。細胞に結合しているＨＰＬＮは、ジアセチレンポリマー骨格により固有の蛍光特性を与えられているため視覚化が可能である（Ｈｅｎｄｒｉｋｘ  ２００５）。結合の定量化は、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターのローダミンチャネルで蛍光シグナルを測定して行う。結合は、陽性対照、ターゲティングされたＨＰＬＮ、及び陰性未処置細胞と比較した相対的パーセンテージで表される。
【０１７２】
細胞結合アッセイ法。白血病細胞株を、４ウェルＬａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種し、一晩かけて８０％コンフルエントな状態に達するようにする。細胞をウェルあたり５０μｇ／ｍＬのターゲティングされたＨＰＬＮで処理し、３７℃で４時間インキュベートする。培地を除去し、ウェルを１ｍＬの新鮮培地で洗浄する。細胞固定を、３．７％ホルムアルデヒド含有リン酸緩衝食塩水を用いて４℃で１５分間行う。細胞を、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ封入剤を使用してＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに標本にし、次いで、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｄ１蛍光顕微鏡を用いて観察する。ＤＡＰＩを用いて細胞をブルー／シアンのフィルターで視覚化し、ローダミンフィルターを１秒曝露で使用して、結合したＨＰＬＮを視覚化する。あるいは、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホセ）で結合を定量できる。細胞を固定する前に、プレートを穏やかに撹拌して細胞を脱離させ、溶液をＦＡＣＳ内に注射する。ＨＰＬＮ定量は、ローダミンフィルターを通るシグナルを測定して行う。
【０１７３】
ＭＴＴ細胞毒性アッセイ法。白血病細胞株を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３００２２．０１）に懸濁させる。細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する容量１００μＬの培地で５Å約１０３個の細胞／ウェルの濃度で９６ウェルフォーマットに播種し、一晩インキュベートする。翌日、ウェルを、ターゲティングされたＨＰＬＮ／薬物、ターゲティングされていないＨＰＬＮ、従来のリポソーム、または遊離薬物で４時間処理し、次いで、新鮮培地で洗浄する。用量は、ｌｏｇスケールで０．０１〜１００μＭの範囲及び０ｎＭの薬物濃度に基づいて加える。０ｎＭウェルはＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で処理する。各処理を３つ組で実施する。細胞を、標準的なＣＯ２条件下で３７℃にて７２時間インキュベートする。７２時間目、すべてのウェルは、リン酸緩衝食塩水中の初期濃度が５μｇ／μＬの１０μＬのチアゾリルブルー臭化テトラゾリウム（Ｓｉｇｍａ）溶液で処理され、４時間インキュベートされる。反応は停止し、１００μＬの１５％ドデシル硫酸ナトリウム／１５ｍＭ  ＨＣｌ溶液を加えて細胞を溶解させ、暗所にて室温で一晩インキュベートする。Ｂｉｏ−Ｒａｄマイクロプレートリーダーを使用して、５７０ｎｍのプレート吸光度を読み取る。
【０１７４】
アポトーシスアッセイ法。薬物処理後（各薬物につきＩＣ８０）、浮游細胞及び結合細胞両方を採取し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）を製造者提供のプロトコールにしたがって使用するアネキシンＶ／ＰＩ染色に供する。アポトーシスが起きている細胞では、アネキシンＶは、細胞質膜の内葉（ｉｎｎｅｒ  ｌｅａｆｌｅｔ）から外葉（ｏｕｔｅｒ  ｌｅａｆｌｅｔ）へ移動するホスファチジルセリンに結合する。ＰＩは、生存細胞、初期アポトーシス細胞及び壊死細胞または後期アポトーシス細胞の区別に使用される。ＨＰＬＮ処置細胞及び未処理細胞から得られる蛍光をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーで測定する。
【０１７５】
動物試験。インビトロアッセイ法の限界を克服するため、原発性患者の試料及び細胞株の生着が可能なマウス異種移植モデルを作製した。ヒト癌細胞が生着したばかりの異種移植モデルには、インビボでのヒト細胞特異的生物学を検索できるという特有の利点があり、一般に、患者の応答をよりよく模倣すると考えられている。このモデルで、得たばかりのヒト癌細胞を免疫不全マウスに移植し、新規ＨＰＬＮ製剤をインビボで試験する機会を得る。
【０１７６】
ＮＯＧマウス試験。本発明者ら及び他の研究者は、典型的な非肥満糖尿病（ＮＯＤ）／ＳＣＩＤマウスには、ヒト白血病癌細胞の生着を拒絶するＮＫ細胞活性が残存していることを見出した。このことを解決するため、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスでさらなる免疫不全を確立し、このマウスは、インターロイキン２−受容体γ（ＩＬ２Ｒγ）をコードする遺伝子の欠失を有する。さらに、これらのマウスには、ヒトｉＬ３、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを発現する遺伝子が付加されている。これにより、これらのマウス（ＮＯＧ）はＢ細胞、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞が完全に欠失し、サイトカインシグナル伝達欠損症となった。試験において、ＮＯＧマウスはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスよりも異種移植成功率が高いこと、生存期間が延長されること、及び注射された癌細胞の転移率が高いことが認められた。ＮＯＧマウスにより長期研究用の優れたモデルが提供される。
【０１７７】
本発明者らが使用したＡＬＬ細胞株に対するＨＰＬＮ製剤の試験に加え、患者由来の分離したばかりのＡＭＬ細胞を用いてさらなる試験を行う。ルシフェラーゼをトランスフェクションしたＡＬＬ腫瘍細胞をＮＯＧマウスに注射すると、全身分布を有する白血病の異種移植マウスモデルが作製され、ターゲティングされたＨＰＬＮによる殺細胞をＸｅｎｏｇｅｎ製カメラ画像で評価できるようになる。ＡＭＬ細胞の場合、これらは分離したばかりの細胞であり、ルシフェラーゼのトランスフェクションを実施できないため、殺腫瘍及び寛解誘導については患者で、末梢血カウントにより評価することになる。
【０１７８】
具体的なプロトコールは以下のとおりである。０．５ｍｌの全血を尾静脈から小児用の紫色トップチューブ内に採取し、臨床試験室へ送る。自動血液分析装置で、総赤血球数及び総白血球数、並びに白血球及びリンパ球の自動鑑別された計数が得られる。骨髄芽球数は自動的に生成されるが、顕微鏡分析及び同一採取血液から調製した末梢血塗抹標本計数によって、白血病患者材料で実施したように正確に手動で確認される。生きている動物で骨髄病変を無理なく測定することは、サイズに制約があるため不可能であるが、剖検時に記録に取る（肝臓、脾臓、及びＣＮＳ病変も同様）。
【０１７９】
動物管理に関するＮＩＨガイドラインにしたがい、かつＣＨＬＡまたはＵＳＣ動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認されているように、マウスを処置する。雄無胸腺ヌード（ＮＯＧ）マウスはインビボ試験実験に使用され、ＢＡＬｂ／ｃヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスはＰＫ試験に使用されるであろう。動物に自由に摂食させ、明暗周期が１２時間の２０±２℃に空調した部屋で飼育する。全マウスとも、注射時は６〜８週齢である。各マウスに、ＲＰＭＩ（ｗｉｔｈｏｕｔ  ＦＢＳまたは抗生物質）０．２ｍＬに懸濁させたトランスフェクション白血病細胞６×１０６を、２７ゲージ針を用いて尾静脈から注射する。マウスを用いたすべての実験操作は、層流式フードの無菌条件下で実施する。
【０１８０】
最大耐用量。ＭＴＤとは、許容されかつ十分に確立されている毒性ベースのエンドポイントアッセイ法である。安全に投与できる薬物の最高用量は、その毒性及び耐容性をマウスで調べる非盲検、用量漸増実験で決定される。遊離（非封入）薬物とナノ粒子に封入した形態とでは薬物動態パラメータは非常に異なると考えられるため、従来の毒性／耐容性対照比較は適用できない場合がある。この技術の強みは標的送達にあるので、骨髄毒性などの測定が容易なパラメータが初期評価に選択されることになる。用量（１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ）が５群のマウス（ｎ＝６）にＩＶ注射で投与される。検定力分析（ｐｏｗｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ）は、１群あたり最低５匹のマウスが必要であるとしている。用量制限毒性（ＤＬＴ）が観察されなければ、ＭＴＤが確立されるまで用量は漸増される。ＭＴＤは、群内の任意のマウス２匹にＤＬＴをもたらす用量を下回る１用量として定義される。血液、及び腎臓、肝臓、心臓、肺、卵巣、腸、並びに骨髄などのさまざまな臓器が組織病理学用に採取される。これらのＨＰＬＮ封入化合物のＭＴＤを投与された動物と、遊離薬物をそのＭＴＤで投与した場合とを、上述の成人白血病モデルにおける全試験について、持続する、用量に相関した腫瘍成長阻害を示す単回投与に関して比較する。
【０１８１】
メトロノミック投与。従来、癌の化学療法薬は、ＭＴＤまたはほぼそれに近い用量の薬物を間隔の短いボーラス注入で投与され、その後、十分な休薬期間がある。これにより腫瘍量は一時的に改善され延命されるが、憂慮すべき副作用が伴い、最終的には再発するという結果が最も一般的であった。新規メトロノミック投与計画では、休薬期間を設けずに一定間隔で投与を行う（Ｈａｎａｈａｎ  ２０００）。理論的には低用量の使用により毒性副作用が最小化されるはずである。メトロノミック投与と併用投与戦略により、腫瘍内皮細胞並びに顕性の癌細胞及び、おそらくは腫瘍の他の細胞成分も死滅させることができ、正真正銘の有効性が期待される。真の有効性は、新規細胞毒性投与計画を他の薬物または放射線照射と併せて使用する併用療法でしかもたらされないかもしれない。最良の投与経路及びＭＴＤを確立した後、極低用量のメトロノミック投与計画を用いて、単剤及び併用剤としてのこれらの化合物のインビボでの有効性を比較する。用量（０．２ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ）を、先に決定した実験時間（６０日）５群のマウス（ｎ＝６）に投与する。これらの化合物は、４匹のマウスに用量０、４、１０、及び２０ｍｇ／ｋｇ／日にて投与する。７日間の投与の後、投与後０、０．５、１、２、４、８、１２及び２４時間目に血漿試料を採取する。血漿濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して監視する。ノンコンパートメント解析を用いてＡＵＣ、ｔ１／２、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ＣＬ、及び％Ｆを測定する。
【０１８２】
統計解析。アッセイ法は３つ組で設定し、その結果を平均±ＳＤで表す。治療群間の有意性を測定するために、９５％信頼区間をつけた対応のある両側ｔ検定により統計解析及びＰ値測定を行う。Ｐ＜０．０５を有意とみなす。群間有意性の検定にはＡＮＯＶＡを使用する。統計解析にはＳＡＳ統計ソフトウェアパッケージ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用する。
【０１８３】
異種移植デルでは、癌細胞を、正常な能力のある免疫系に曝露しない。免疫系が正常な能力を有するマウスでの試験は、野生型マウスの化学発癌物質／放射線照射、または発癌遺伝子送達／挿入変異による処置で実施され得る。白血病誘発に関する及びさまざまな治療に対する応答に関する試験用に、こうしたトランスジェニックマウスを作製するための方法は幾つかある（Ｚｕｂｅｒ  ２００９）。これらの既知の方法を用いて白血病を担持するマウスを我々は作製することができる。
【０１８４】
参照文献：
0006776223.tif 000003
0006776223.tif 000004
【０１８５】
上述のさまざまな方法及び技術により、本願を実施するための多数の方法が提供される。もちろん、必ずしも記載のすべての目的または利点を本明細書に記載する任意の特定の実施形態に従って達成できるわけではないことを理解されるべきである。したがって、例えば、当業者は、方法が、本明細書で教示される一利点または一群の利点を達成または最適化するようにして実施可能であり、必ずしも本明細書で教示または示唆されている他の目的または利点を達成する必要はないことを認識するであろう。本明細書では多種多様な代替物が言及されている。いくつかの好ましい実施形態では、１つ、別、または幾つかの特徴が具体的に含まれる一方、他の好ましい実施形態では、１つ、別、または幾つかの特徴が具体的に除外され、さらに別の好ましい実施形態では、１つ、別、または幾つかの有利な特徴を含めることによって、特定の一特徴を軽減することを理解されるべきである。
【０１８６】
さらに、当業者は、異なる実施形態からさまざまな特徴を適用可能であることを認識するであろう。同様に、上記で考察したさまざまな要素、特徴及び工程、並びに、かかる要素、特徴または工程それぞれに対する公知の他の同等物は、当技術分野の当業者が多種多様な組み合わせで採用して、本明細書に記載する原則に従って各種方法を実施することができる。さまざまな要素、特徴、及び工程のうち、別種の実施形態において、あるものは具体的に含まれ、またあるものは具体的に除外されるであろう。
【０１８７】
本願は、特定の実施形態及び実施例の文脈で開示されてはいるが、本願の実施形態が、具体的に開示されている実施形態以外に、他の代替の実施形態及び／または使用並びにその変更及び等価物にまで及ぶことを当業者は理解するであろう。
【０１８８】
本願の好ましい実施形態は、本発明者らが知る本願を実施するための最良の形態を含めて、本明細書に記載されている。それらの好ましい実施形態の変形は、上述の説明を読むと、当業者に明らかとなるであろう。当業者は、そのような変形を適宜採用することができること、また、本願は本明細書で具体的に記載した以外の方法で実施可能であることが意図される。したがって、本願の多くの実施形態には、適用法令によって許可されているように、本明細書に添付の特許請求の範囲で引用される主題のあらゆる変更及び等価物が含まれる。さらに、本明細書で特に明記したり、明らかに文脈と矛盾したりしない限り、上記要素について、その考えられるすべての変形のいかなる組み合わせも本願に包含される。
【０１８９】
本明細書で参照した特許、特許出願、特許出願公開、並びに、論文、書籍、明細書、刊行物、資料、物などの他の資料はいずれも、あらゆる目的のために、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ただし、同出願に関連する処理経過書類、本願文献と矛盾する、若しくは抵触するもの、または現在若しくは今後において本願文献に関するクレームの最も広い範囲に対し制限的な影響を与え得るものを除く。例示のため、説明、定義、及び／または、用語の使用について、組み込まれる任意の資料と本願文献との間に矛盾または抵触がある場合、かかる説明、定義、及び／または用語の使用は、本願文献内のものが優先されるものとする。
【０１９０】
本明細書に開示する本願の実施形態は本願の実施形態の原則を例示するものであることを理解されるべきである。使用可能な他の変更は、本願の範囲内で可能である。そのため、例として、本願実施形態の代替構成を本明細書の教示に従って用いることができるが、これに限定されない。したがって、本出願の実施形態は、正確に記載され示されているものに限られることはない。
【０１９１】
本発明のさまざまな実施形態は、上述の詳細な説明に記載されている。これらの説明は上記実施形態を直接説明するが、本明細書に示され記載される具体的な実施形態に対する変更及び／または変形を当業者は考案して良いことが理解される。この記載の範囲となる、そのような変更または変形はいかなるものも、記載内容に含まれることが意図される。特に断りがない限り、明細書及び特許請求の範囲における単語及び語句は、適用可能な技術分野の当業者に通常用いられる慣用的な意味で提供されることを本発明者らは意図する。
【０１９２】
本願提出の時点でその出願人に既知である、本発明のさまざまな実施形態に関する上述の説明はすでに提出されているもので、これは例示及び説明のために意図される。本記載は、網羅することも、また開示される正確な形式に本発明を限定することも意図するものではなく、上記の教示に鑑みて多くの変更及び変形が可能である。記載の実施形態は、本発明の原則及びその実際の応用を説明し、かつ、他の当業者らが本発明をさまざまな実施形態で、意図される特定の使用に適したさまざまな変更を行って、利用できるようにするためのものである。したがって、本発明を実施するために、開示される個々の実施形態に本発明を制限することは意図しない。
【０１９３】
本発明の特定の実施形態を示しかつ記載してきたが、本明細書の教示に基づき、本発明及びその広範な態様から逸脱することなく変形及び変更を行って良く、そのため、添付の請求の範囲は、そのような変形及び変更のすべてを包含し、本発明の真の趣旨および範囲内であることは、当業者には明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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