(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される化合物又は式（１）で表される化合物の製薬上許容される塩を含む核医学画像診断薬。
【化１】
0006739987.tif 000040
［式（１）中、
Ｌ1は、炭素数１以上５以下のアルカンジイル基、又は炭素数３以上８以下のアルケンジイルカルボニル基であり、
Ｒ1は、放射性ハロゲン原子、又は１個の置換基を有していてもよい５〜７員の単環式窒素含有ヘテロシクロアルキルであり、
Ｒ2は、１個の置換基を有する６〜８員のアリール基又は窒素含有ヘテロアリール基であり、
Ｒ1及びＲ2の置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、炭素数１以上５以下のアルキル基、炭素数１以上５以下のハロゲン化アルキル基又は−（ＣＨ2）l−（Ｏ−Ｃ2Ｈ4）m−Ｘ1基であり、ｌは０以上５以下であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０以上５以下であり、Ｘ1は放射性ハロゲン原子又は−［11Ｃ］ＣＨ3であり、
Ｒ1又はＲ2は、放射性ハロゲン原子又は放射性炭素原子（11Ｃ）を含み、
Ｙは、−ＮＨ−又は−Ｏ−である。］
【請求項２】
Ｌ1は、−（ＣＨ2）2−又は−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−である、請求項１記載の核医学画像診断薬。
【請求項３】
Ｒ1は、
【化２】
0006739987.tif 000041
であり、
ｌは０又は２であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０以上５以下であり、Ｘ1は、放射性ハロゲン原子又は−［11Ｃ］ＣＨ3である、請求項１又は２に記載の核医学画像診断薬。
【請求項４】
Ｒ2は、
【化３】
0006739987.tif 000042
であり、
ｌは０又は２であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０以上５以下であり、Ｘ1は、放射性ハロゲン原子又は−［11Ｃ］ＣＨ3であり、Ｘ2は、ハロゲン原子である、
請求項１から３のいずれかに記載の核医学画像診断薬。
【請求項５】
下記式（１）で表される化合物又は式（１）で表される化合物の製薬上許容される塩。
【化４】
0006739987.tif 000043
［式（１）中、
Ｌ1は、炭素数１以上５以下のアルカンジイル基、又は炭素数３以上８以下のアルケンジイルカルボニル基であり、
Ｒ1は、放射性ハロゲン原子、又は１個の置換基を有していてもよい５〜７員の単環式窒素含有ヘテロシクロアルキルであり、
Ｒ2は、１個の置換基を有する６〜８員のアリール基又は窒素含有ヘテロアリール基であり、
Ｒ1及びＲ2の置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、炭素数１以上５以下のアルキル基、炭素数１以上５以下のハロゲン化アルキル基又は−（ＣＨ2）l−（Ｏ−Ｃ2Ｈ4）m−Ｘ1基であり、ｌは０以上５以下であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０以上５以下であり、Ｘ1は放射性ハロゲン原子又は−［11Ｃ］ＣＨ3であり、
Ｒ1又はＲ2は、放射性ハロゲン原子又は放射性炭素原子（11Ｃ）を含み、
Ｙは、−ＮＨ−又は−Ｏ−である。］
【請求項６】
上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による非小細胞肺癌の治療が行われる被検体における上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による治療の有効性を評価するための情報を得る方法であって、
請求項１から４のいずれかに記載の核医学画像診断薬又は請求項５記載の化合物若しくはその製薬上許容される塩が投与された被検体の肺癌腫瘍から前記核医学画像診断薬又は前記化合物の放射性シグナルを検出することを含む、方法。
【請求項７】
前記被検体の肺癌腫瘍からの放射性シグナルの検出を上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬の治療期間中に繰り返し行うことを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
肺癌腫瘍における上皮成長因子受容体をコードする遺伝子におけるＴ７９０Ｍ変異の発生を評価する方法であって、
請求項１から４のいずれかに記載の核医学画像診断薬又は請求項５記載の化合物若しくはその製薬上許容される塩が投与された被検体の肺癌腫瘍から前記核医学画像診断薬又は前記化合物の放射性シグナルを検出すること、
前記被検体の肺癌腫瘍からの放射性シグナルの検出を上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬の治療期間中に繰り返し行うこと、
前記検出された放射性シグナルを比較すること、及び
前記比較によりシグナルの変動に基づき、肺癌腫瘍における上皮成長因子受容体をコードする遺伝子におけるＴ７９０Ｍ変異の発生の有無を決定することを含む、方法。
【請求項９】
上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による非小細胞肺癌の治療が行われる被検体における上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による治療の有効性を評価する方法であって、
上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬の投与開始前、投与開始後及び投与開始から一定期間経過後からなる群から選択される２以上のタイミングで請求項７又は８に記載の方法により得られた情報を比較することを含む、方法。
【請求項１０】
前記比較によりシグナルの変動に基づき、肺癌腫瘍における上皮成長因子受容体をコードする遺伝子が、Ｔ７９０Ｍ変異を有している否かを決定することを含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記比較によりシグナルの減少が観察される場合は、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による治療の薬理有効性の可能性が低下すると判断され、前記比較によりシグナルの減少が観察されない場合は、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による治療の薬理有効性の可能性があると判断される、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍の大きさが増加又は維持され、かつ前記シグナルの減少が観察される場合は、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による治療の薬理有効性の可能性が低下すると判断される、請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記被検体のＣＴ又はＭＲＩを撮像すること、及び
前記ＣＴ又はＭＲＩ画像と、前記検出した放射性シグナルから構築したイメージング画像とを融合又は比較することを含み、
前記融合又は比較に基づき、腫瘍の大きさが増加又は維持され、かつシグナルの減少が観察される場合は、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による治療の薬理有効性の可能性が低下すると判断される、請求項９から１２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン骨格を有する放射性標識化合物に関し、一態様において、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の二次変異を判別するための情報を取得可能な放射性標識化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、世界における癌による死因第１位である。肺癌は、その組織型によって小細胞肺癌と非小細胞肺癌とに大別されるが、肺癌の８０％を占める非小細胞肺癌に罹患する患者の１０〜３０％において膜貫通型のチロシンキナーゼ受容体であるＥＧＦＲを構成するＥＧＦＲ遺伝子が変異していることが知られている。ＥＧＦＲは変異が生じると活性化され、この活性化が癌の増殖等に関与するとされている。また、ＥＧＦＲ遺伝子の変異が確認されると、一般的な抗がん剤よりも分子標的治療薬であるＥＧＦＲ−ＴＫＩ（上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤）が有効であると考えられている。このため、近年、肺癌と診断されると遺伝子検査によって患者の遺伝子の変異の有無の確認が行われている（例えば、非特許文献１）。これらの遺伝子検査は、生検によって採取された癌組織を用いて行われる場合が多い。しかしながら、癌患者に侵襲的な生検を試みるのは様々なリスクがあり、身体的な負担も大きい。このため、生検に伴う様々なリスクを回避しつつ、遺伝子検査にかわる新たな方法が求められている。その一つとして、癌におけるＥＧＦＲを検出可能な核医学診断用放射性イメージングプローブの検討が行われている(例えば、非特許文献２及び３)。
【０００３】
また、ＥＧＦＲ−ＴＫＩによって奏功しても、１年以内に耐性を獲得し、その結果、ＥＧＦＲ−ＴＫＩでは十分な治療効果が得られなくなる場合がある。耐性獲得の約半数に二次変異が関与していると考えられていることから、ＥＧＦＲ−ＴＫＩの治療開始後、再度遺伝子検査を行う必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】肺癌患者におけるEGFR遺伝子変異検査の手引き  第2.1版(2014年) 日本肺癌学会
【非特許文献２】M. A. Pantaleo et al., Annals of Oncology 2009; 20: 213-226
【非特許文献３】Emily B. Corcoran et al., Medicinal Research Reviews 2014; 34: 596-643
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のとおり、ＥＧＦＲを検出するためのイメージングプローブの検討は行われているが、ＥＧＦＲの二次変異を非侵襲的に判別可能な方法は未だ開発されていない。そこで、本開示は、ＥＧＦＲの二次変異を判別可能な放射性標識化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、一態様において、下記式（１）で表される化合物又は式（１）で表される化合物の製薬上許容される塩を含む核医学画像診断薬に関する。
【化１】
0006739987.tif 000002
［式（１）中、
Ｌ1は、炭素数１以上５以下のアルカンジイル基、又は炭素数３以上８以下のアルケンジイルカルボニル基であり、
Ｒ1は、放射性ハロゲン原子、又は１個の置換基を有していてもよい５〜７員の単環式窒素含有ヘテロシクロアルキルであり、
Ｒ2は、１個の置換基を有する６〜８員のアリール基又は窒素含有ヘテロアリール基であり、
Ｒ1及びＲ2の置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、炭素数１以上５以下のアルキル基、炭素数１以上５以下のハロゲン化アルキル基又は−（ＣＨ2）l−（Ｏ−Ｃ2Ｈ4）m−Ｘ1基であり、ｌは０以上５以下であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０以上５以下であり、Ｘ1は放射性ハロゲン原子又は−［11Ｃ］ＣＨ3であり、
Ｒ1又はＲ2は、放射性ハロゲン原子又は放射性炭素原子（11Ｃ）を含み、
Ｙは、−ＮＨ−又は−Ｏ−である。］
【０００７】
本開示は、一態様において、下記式（１）で表される化合物又は式（１）で表される化合物の製薬上許容される塩に関する。
【化２】
0006739987.tif 000003
［式（１）中、
Ｌ1は、炭素数１以上５以下のアルカンジイル基、又は炭素数３以上８以下のアルケンジイルカルボニル基であり、
Ｒ1は、放射性ハロゲン原子、又は１個の置換基を有していてもよい５〜７員の単環式窒素含有ヘテロシクロアルキルであり、
Ｒ2は、１個の置換基を有する６〜８員のアリール基又は窒素含有ヘテロアリール基であり、
Ｒ1及びＲ2の置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、炭素数１以上５以下のアルキル基、炭素数１以上５以下のハロゲン化アルキル基又は−（ＣＨ2）l−（Ｏ−Ｃ2Ｈ4）m−Ｘ1基であり、ｌは０以上５以下であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０以上５以下であり、Ｘ1は放射性ハロゲン原子又は−［11Ｃ］ＣＨ3であり、
Ｒ1又はＲ2は、放射性ハロゲン原子又は放射性炭素原子（11Ｃ）を含み、
Ｙは、−ＮＨ−又は−Ｏ−である。］
【０００８】
本開示は、一態様において、下記式（２）で表される化合物又は式（２）で表される化合物の製薬上許容される塩を含む標識前駆体組成物に関する。
【化３】
0006739987.tif 000004
［式（２）中、
Ｌ1は、炭素数１以上５以下のアルカンジイル基、又は炭素数３以上８以下のアルケンジイルカルボニル基であり、
Ｒ11は、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、又は１個の置換基を有していてもよい５〜７員の単環式窒素含有ヘテロシクロアルキルであり、
Ｒ12は、１個の置換基を有する６〜８員のアリール基又は窒素含有ヘテロアリール基であり、
Ｒ11及びＲ12の置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、炭素数１以上５以下のアルキル基、炭素数１以上５以下のハロゲン化アルキル基又は−（ＣＨ2）l−（Ｏ−Ｃ2Ｈ4）m−Ｘ11基であり、ｌは０以上５以下であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０以上５以下であり、Ｘ11は、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基であり、
Ｙは、−ＮＨ−又は−Ｏ−である。］
【０００９】
本開示は、一態様において、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による非小細胞肺癌の治療が行われる被検体における上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による治療の有効性を評価するための情報を得る方法であって、
本開示の核医学画像診断薬、又は本開示の式（１）で表される化合物若しくは式（１）で表される化合物の製薬上許容される塩が投与された被検体の肺癌腫瘍から前記核医学画像診断薬又は前記化合物の放射性シグナルを検出することを含む方法に関する。
【００１０】
本開示は、一態様において、肺癌腫瘍における上皮成長因子受容体をコードする遺伝子におけるＴ７９０Ｍ変異の発生を評価する方法であって、
本開示の核医学画像診断薬、又は本開示の式（１）で表される化合物若しくは式（１）で表される化合物の製薬上許容される塩が投与された被検体の肺癌腫瘍から前記核医学画像診断薬又は前記化合物の放射性シグナルを検出すること、
前記被検体の肺癌腫瘍からの放射性シグナルの検出を上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬の治療期間中に繰り返し行うこと、
前記得られた情報又は検出された放射性シグナルを比較すること、及び
前記比較により情報又はシグナルの変動に基づき、肺癌腫瘍における上皮成長因子受容体をコードする遺伝子における、Ｔ７９０Ｍ変異の発生の有無を決定することを含む方法に関する。
【００１１】
本開示は、一態様において、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による非小細胞肺癌の治療が行われる被検体における上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による治療の有効性を評価する方法であって、
上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬の投与開始前、投与開始後及び投与開始から一定期間経過後からなる群から選択される２以上のタイミングで本開示の情報を得る方法により得られた情報を比較することを含む方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本開示は、一態様において、ＥＧＦＲの二次変異を判別可能な放射性標識化合物及びそれを用いたＥＧＦＲ−ＴＫＩの治療効果の有効性を評価する方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、Ｈ３２５５細胞及びＨ１９７５細胞を用いた［18Ｆ］Ｈ４の細胞取り込み実験１の結果の一例を示すグラフである。
【図２】図２は、Ｈ３２５５細胞及びＨ１９７５細胞を用いた［18Ｆ］Ｈ４の細胞取り込み実験２の結果の一例を示すグラフである。
【図３】図３は、［18Ｆ］Ｈ４を用いた体内分布の経時変化の一例を示すグラフである。
【図４】図４は、Ｈ３２５５担がんマウス及びＨ１９７５担がんマウスを用いた［18Ｆ］Ｈ４の体内分布（ブロッキング実験）の結果の一例を示すグラフである。
【図５】図５は、［18Ｆ］Ｈ４を用いたＨ３２５５担がんマウスのＰＥＴ／ＣＴ撮像の結果の一例を示す画像である。
【図６】図６は、［18Ｆ］Ｈ４を用いたＨ１９７５担がんマウスのＰＥＴ／ＣＴ撮像の結果の一例を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本開示は、一態様において、後述する実施例で合成した式Ｈ１〜Ｈ４（実施例表１）で表されるピリド［３，４−ｄ］ピリミジン骨格を有する化合物であれば、ＥＧＦＲ、中でもＬ８５８Ｒ変異型ＥＧＦＲに対する結合親和性と比較して、Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ変異型（二重変異体：ＤＭ）ＥＧＦＲに対して結合親和性が低い、との知見に基づく。
また、本開示は、一態様において、化合物［18Ｆ］Ｈ４（(E)-N-(4-((3-bromophenyl)amino)pyrido[3,4-d]pyrimidin-6-yl)-4-(4-(2-[18F]fluoroethyl)piperazin-1-yl)but-2-enamide）といったテトラヒドロピリドチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン骨格を有する放射性ハロゲン標識化合物であれば、Ｌ８５８Ｒ変異型ＥＧＦＲを有するＨ３２５５担がんマウスのＰＥＴ撮像において高い近接臓器比を示し、かつＬ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲを有するＨ１９７５担がんマウスのＰＥＴ撮像においてＨ３２５５担がんマウスと比較して有意に低い近接臓器比を示す、との知見に基づく。
また、本開示は、一態様において、化合物Ｈ２（N4-(3-(2-fluoroethoxy)phenyl)-N6-(2-morpholinoethyl)pyrido[3,4-d]pyrimidine-4, 6-diamine）（実施例表１）であれば、Ｌ８５８Ｒ変異型ＥＧＦＲに対する結合親和性が、野生型ＥＧＦＲに対する結合親和性及びＬ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲと比較して結合親和性が低い、との知見に基づく。
【００１５】
上記式（１）で表される放射性標識化合物によれば、一又は複数の実施形態において、ＥＧＦＲ遺伝子においてＬ８５８Ｒ変異等のＥＧＦＲ−ＴＫＩの感受性を高める変異が発現した肺癌腫瘍において、二次変異であるＴ７９０Ｍ変異が発現しているか否かを非侵襲的に判別できるという効果を奏しうる。また、式（１）で表される放射性標識化合物によれば、一又は複数の実施形態において、Ｌ８５８Ｒ変異等のＥＧＦＲ−ＴＫＩの感受性を高める変異が発現した肺癌腫瘍において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性を獲得したか否かの判定を非侵襲的に行うことができうるという効果を奏しうる。さらに、式（１）で表される放射性標識化合物によれば、一又は複数の実施形態において、ＥＧＦＲ遺伝子においてＬ８５８Ｒ変異等といったＥＧＦＲ−ＴＫＩの感受性を高める変異が発現した肺癌腫瘍を有する患者において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩによる治療の有効性を評価することができるという効果を奏しうる。
【００１６】
化合物Ｈ２（N4-(3-(2-fluoroethoxy)phenyl)-N6-(2-morpholinoethyl)pyrido[3,4-d]pyrimidine-4, 6-diamine）によれば、一又は複数の実施形態において、ＥＧＦＲ遺伝子においてＬ８５８Ｒ変異が発現しているか否かを非侵襲的に判別できるという効果を奏しうる。
【００１７】
本明細書における「ＥＧＦＲの二次変異を判別可能」としては、一又は複数の実施形態において、Ｌ８５８Ｒ変異（一次変異）が生じたＥＧＦＲと、Ｌ８５８Ｒ変異に加えてＴ７９０Ｍ変異（二次変異）が生じたＥＧＦＲとを判別できることが挙げられる。
【００１８】
本明細書において「核医学画像診断薬」とは、放射性同位体（ＲＩ）を結合させた化合物を体内に投与し、体内から放出される放射線（放射性シグナル）を体外から計測・画像化し、臓器又は組織の生体機能の評価又は検査や、疾病の診断等を行うインビボ核医学検査に用いられる放射性標識化合物を含む薬剤、又は体内から採取した組織や血液等の試料と試験管内で反応させ、臓器又は組織の生体機能の評価又は検査や、疾病の診断等を行うインビトロ核医学検査に用いられる放射性標識化合物を含む薬剤をいう。インビボ核医学検査としては、一又は複数の実施形態において、ＳＰＥＣＴ（Single Photon Emission Computed Tomography）や、ＰＥＴ（Positron Emission Tomography）等といった核医学イメージングプローブを用いた方法が挙げられる。
【００１９】
本明細書において「製薬上許容される塩」とは、薬理上及び／又は医薬上許容される塩を含有し、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性又は塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。本開示において「化合物の塩」には、化合物が大気中に放置されることにより、水分を吸収して形成されうる水和物が包含され得る。また、本開示において「化合物の塩」には、化合物が他のある種の溶媒を吸収して形成されうる溶媒和物も包含され得る。
【００２０】
本明細書において「放射性ハロゲン原子」とは、ハロゲン原子の放射性同位体をいう。放射性ハロゲン原子としては、18Ｆ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、及び77Ｂｒが挙げられる。本明細書において「ハロゲン原子」とは、ハロゲン原子の非放射性同位体をいう。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が挙げられる。
【００２１】
本明細書において「炭素数１以上５以下のアルカンジイル基」とは、飽和脂肪族の分枝鎖又は直鎖を有し、かつ、直鎖又は分枝鎖の構造内に１個以上５個以下の炭素原子を有する二価の炭化水素基をいう。炭素数１以上５以下のアルカンジイル基としては、一又は複数の実施形態において、メタンジイル基、エタンジイル基、プロパンジイル基、ブタンジイル基又はペンタンジイル基等が挙げられる。
【００２２】
本明細書において「炭素数３以上８以下のアルケンジイルカルボニル基」とは、少なくとも１個の炭素−炭素間の二重結合を有する不飽和脂肪族の分枝鎖又は直鎖と１個のカルボニル基とを有し、かつ、直鎖又は分枝鎖の構造内に２個以上７個以下の炭素原子を有する二価の炭化水素基をいう。炭素数３以上８以下のアルケンジイルカルボニル基としては、一又は複数の実施形態において、−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ2Ｈ4−、又は−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ3Ｈ6−等が挙げられる。
【００２３】
本明細書において「５〜７員の単環式窒素含有ヘテロシクロアルキル基」とは、５個以上７個以下の環原子と、環原子を構成するヘテロ原子として１個又は２個以上の窒素原子と、必要に応じて１個又は２個以上の酸素原子とを含む、単環式の飽和ヘテロ環基をいう。５〜７員の単環式窒素含有ヘテロシクロアルキル基としては、一又は複数の実施形態において、モルホリニル基、ピペラジニル基、ピペリジニル基等が挙げられる。本明細書において、「１個の置換基を有していてもよい５〜７員の単環式窒素含有ヘテロシクロアルキル基」とは、置換基を有さない５〜７員の単環式窒素含有ヘテロシクロアルキル基、又は、５〜７員の単環式窒素含有ヘテロシクロアルキル基の１個又は２個以上の炭素原子又はヘテロ原子が置換されたものをいう。
【００２４】
本明細書において「６〜８員のアリール基」とは、６個以上８個以下の炭素原子を有する芳香族炭化水素の環炭素原子から１個の水素原子を除去することにより生成された基をいう。６〜８員のアリール基としては、一又は複数の実施形態において、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。本明細書において「６〜８員の窒素含有ヘテロアリール基」とは、６個以上８個以下の環原子と、環原子を構成するヘテロ原子として１個又は２個以上の窒素原子とを少なくとも含む不飽和の複素環式基をいう。６〜８員の窒素含有ヘテロアリール基としては、一又は複数の実施形態において、ピリジニル基、ピラジニル基等が挙げられる。本明細書において「１個の置換基を有する６〜８員のアリール基又は窒素含有ヘテロアリール基」とは、６〜８員のアリール又は６〜８員の窒素含有ヘテロアリール基の炭素原子又はヘテロ原子が、１個の置換基で置換されたものをいう。
【００２５】
本明細書において「炭素数１以上５以下のアルキル基」とは、飽和脂肪族の分枝鎖又は直鎖を有し、かつ、直鎖又は分枝鎖の構造内に１個以上５個以下の炭素原子を有する一価の炭化水素基をいう。炭素数１以上５以下のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基又はブチル基等が挙げられる。
【００２６】
本明細書において「炭素数１以上５以下のハロゲン化アルキル基」とは、ハロゲン置換された炭素数１以上５以下のアルキル基をいう。「ハロゲン置換された炭素数１以上５以下のアルキル基」とは、１又は２以上の水素原子がハロゲン原子によって置換されている炭素数１以上５以下のアルキル基をいう。ハロゲン置換された炭素数１以上５以下のアルキル基としては、モノフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、トリフルオロエチル基、又はジフルオロメチレン基等が挙げられる。
【００２７】
［式（１）で表される化合物］
本開示は、一又は複数の実施形態において、下記式（１）で表される化合物又は式（１）で表される化合物の製薬上許容される塩（以下、「本開示の化合物（１）」という）に関する。本開示の化合物（１）は、一又は複数の実施形態において、Ｌ８５８Ｒ変異型ＥＧＦＲに対して比較的高い結合親和性を示すが、ＥＧＦＲの二次変異の一つであるＴ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲ及び二重変異体（ＤＭ）であるＬ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲに対して結合親和性を示さないという効果を奏しうる。
【化４】
0006739987.tif 000005
【００２８】
式（１）中、Ｙは、−ＮＨ−又は−Ｏ−である。
【００２９】
式（１）中、Ｌ1は、炭素数１以上５以下のアルカンジイル基、又は炭素数３以上８以下のアルケンジイルカルボニル基である。Ｌ1としては、一又は複数の実施形態において、−（ＣＨ2）2−又は−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−が挙げられる。
【００３０】
式（１）中、Ｒ1は、放射性ハロゲン原子、又は１個の置換基を有していてもよい５〜７員の単環式窒素含有ヘテロシクロアルキルであり、Ｒ2は、１個の置換基を有する６〜８員のアリール基又は窒素含有ヘテロアリール基であり、Ｒ1及びＲ2の置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、炭素数１以上５以下のアルキル基、炭素数１以上５以下のハロゲン化アルキル基又は−（ＣＨ2）l−（Ｏ−Ｃ2Ｈ4）m−Ｘ1基であって、Ｒ1又はＲ2は、放射性ハロゲン原子又は放射性炭素原子（11Ｃ）を含む。ここで、ｌは０、１、２、３、４、又は５であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０、１、２、３、４又は５であり、Ｘ1は放射性ハロゲン原子又は−［11Ｃ］ＣＨ3である。
【００３１】
Ｒ1としては、一又は複数の実施形態において、放射性ハロゲン原子、
【化５】
0006739987.tif 000006
等が挙げられる。Ｒ1としては、Ｌ８５８Ｒ変異型ＥＧＦＲに対して結合するが、Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲに対しては非常に低い結合親和性を示す化合物が得られる点からは、
【化６】
0006739987.tif 000007
が好ましい。Ｒ1としては、ＥＧＦＲの二次変異の判別を向上させる点から、好ましくはＬ８５８Ｒ変異型ＥＧＦＲに対する結合親和性が高くＬ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ変異型に対する結合親和性の低い化合物が得られる点からは、
【化７】
0006739987.tif 000008
が好ましい。ｌ、ｍ及びＸ1は上述の通りである。すなわち、ｌは０、１、２、３、４、又は５であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０、１、２、３、４又は５であり、Ｘ1は放射性ハロゲン原子又は−［11Ｃ］ＣＨ3である。
【００３２】
Ｒ2としては、一又は複数の実施形態において、
【化８】
0006739987.tif 000009
である。ここで、ｌは０又は２であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０、１、２、３、４又は５である。Ｘ1は、放射性ハロゲン原子又は−［11Ｃ］ＣＨ3であり、中でも、ＰＥＴ製剤として利用でき、適度な半減期を有し、かつ原子サイズが比較的小さいことから、一又は複数の実施形態において、18Ｆが好ましい。Ｘ2は、ハロゲン原子であり、一又は複数の実施形態において、臭素原子が挙げられる。
【００３３】
Ｒ1とＲ2との組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、下記表に示す組み合わせが挙げられる。
【表１】
0006739987.tif 000010
【００３４】
Ｒ1とＬ1とＲ2との組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、下記表に示す組み合わせが挙げられる。
【表２】
0006739987.tif 000011
【００３５】
式（１）で表される化合物としては、一又は複数の実施形態において、下記式（１−１）〜（１−４）で表される化合物又はそれらの化合物の製薬上許容される塩等が挙げられ、ＥＧＦＲの二次変異の判別を向上させる点から、好ましくはＬ８５８Ｒ変異型ＥＧＦＲに対する結合親和性が高くＬ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ変異型に対する結合親和性を低い化合物が得られる点から、式（１−１）又は（１−４）で表される化合物が好ましい。Ｌ８５８Ｒ変異型ＥＧＦＲに対して結合するが、Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲに対しては非常に低い結合親和性を示す化合物が得られる点からは、式（１−２）又は（１−３）で表される化合物が好ましい。野生型ＥＧＦＲに対して結合親和性が低い一方で、Ｌ８５８Ｒ変異型ＥＧＦＲに対して結合し、またＬ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲに対しては非常に低い結合親和性を示す化合物が得られる点からは、式（１−２）で表される化合物が好ましい。式（１−１）〜（１−４）において、Ｘ1は、放射性ハロゲン原子又は−［11Ｃ］ＣＨ3であり、好ましくは［18Ｆ］フッ素原子である。Ｘ2は、ハロゲン原子であり、好ましくは臭素原子である。
【化９】
0006739987.tif 000012
【００３６】
本開示の化合物（１）は、一又は複数の実施形態において、Ｌ８５８Ｒ変異等のＥＧＦＲ−ＴＫＩの感受性を高める変異が発現した肺癌腫瘍又は該腫瘍を有する患者において、ＥＧＦＲの二次変異の発現を判別するためのイメージングプローブ、イメージング用組成物、核医学画像診断薬、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性獲得の評価用診断薬、又はＥＧＦＲ−ＴＫＩによる治療の有効性の評価用診断薬として用いることができる。したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、式（１）で表される化合物又は式（１）で表される化合物の製薬上許容される塩を含むイメージングプローブ、イメージング用組成物、核医学画像診断薬、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性獲得の評価用診断薬、又はＥＧＦＲ−ＴＫＩによる治療の有効性の評価用診断薬に関する。本開示は、一又は複数の実施形態において、有効成分として式（１）で表される化合物又は式（１）で表される化合物の製薬上許容される塩を含むイメージングプローブ、イメージング用組成物、核医学画像診断薬、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性獲得の評価用診断薬、又はＥＧＦＲ−ＴＫＩによる治療の有効性の評価用診断薬に関する。
【００３７】
本開示において、イメージング用組成物及び各種診断薬の形態は、特に限定されるものではないが、一又は複数の実施形態において、溶液又は粉末が挙げられる。これらは、担体等の医薬品添加物を含んでいてもよい。
【００３８】
［式（１）で表される化合物の製造方法］
本開示の化合物（１）は、一又は複数の実施形態において、下記式（２）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を放射性標識することにより製造できる。したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、式（２）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を放射性標識することを含む、放射性化合物の製造方法に関する。また、本開示は、一又は複数の実施形態において、式（２）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を放射性標識することを含む、式（１）で表される化合物の製造方法に関する。
【化１０】
0006739987.tif 000013
【００３９】
式（２）中、Ｙは、−ＮＨ−又は−Ｏ−である。
【００４０】
式（２）中、Ｌ1は、炭素数１以上５以下のアルカンジイル基、又は炭素数３以上８以下のアルケンジイルカルボニル基である。Ｌ1としては、上記のものが挙げられる。
【００４１】
式（２）中、Ｒ11は、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、又は１個の置換基を有していてもよい５〜７員の単環式窒素含有ヘテロシクロアルキルである。
【００４２】
式（２）中、Ｒ12は、１個の置換基を有する６〜８員のアリール基又は窒素含有ヘテロアリール基である。
【００４３】
Ｒ11及びＲ12の置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、炭素数１以上５以下のアルキル基、炭素数１以上５以下のハロゲン化アルキル基又は−（ＣＨ2）l−（Ｏ−Ｃ2Ｈ4）m−Ｘ11基であり、ｌは０以上５以下であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０以上５以下であり、Ｘ11は、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基である。
【００４４】
Ｒ11は、一又は複数の実施形態において、
【化１１】
0006739987.tif 000014
等が挙げられる。Ｒ11としては、Ｌ８５８Ｒ変異型ＥＧＦＲに対して結合するが、Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲに対しては非常に低い結合親和性を示す化合物が得られる点からは、
【化１２】
0006739987.tif 000015
が好ましい。Ｒ11としては、Ｌ８５８Ｒ変異型ＥＧＦＲに対する結合親和性が高い化合物が得られる点からは、
【化１３】
0006739987.tif 000016
が好ましい。ｌ、ｍ及びＸ11は上述の通りである。すなわち、ｌは０以上５以下であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０以上５以下であり、Ｘ11は、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基である。
【００４５】
Ｒ12は、一又は複数の実施形態において、
【化１４】
0006739987.tif 000017
である。ｌは０又は２であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０、１、２、３、４又は５である。Ｘ11は、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基であり、Ｘ12は、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子である。
【００４６】
Ｒ11とＲ12との組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、下記表に示す組み合わせが挙げられる。
【表３】
0006739987.tif 000018
【００４７】
Ｒ11とＬ1とＲ12との組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、下記表に示す組み合わせが挙げられる。
【表４】
0006739987.tif 000019
【００４８】
式（２）で表される化合物としては、一又は複数の実施形態において、下記式（２−１）〜（２−５）で表される化合物又はそれらの化合物の製薬上許容される塩等が挙げられ、ＥＧＦＲの二次変異の判別を向上させる点から、好ましくはＬ８５８Ｒ変異型ＥＧＦＲに対する結合親和性が高くＬ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ変異型に対する結合親和性を低い化合物が得られる点から、式（２−１）、（２−４）又は（２−５）で表される化合物が好ましい。Ｌ８５８Ｒ変異型ＥＧＦＲに対して結合するが、Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲに対しては非常に低い結合親和性を示す化合物が得られる点からは、式（２−２）又は（２−３）で表される化合物が好ましい。式（２−１）〜（２−５）において、Ｘ11は、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基である。Ｘ12は、ハロゲン原子であり、好ましくは臭素原子である。
【化１５】
0006739987.tif 000020
【００４９】
式（２）で表される化合物の放射性標識を行う方法は、式（２）で表される化合物に応じて適宜決定できる。式（２）においてＸ11を含む場合、一又は複数の実施形態において、直接標識法を用いて標識することができる。式（２−４）のようにＲ11が
【化１６】
0006739987.tif 000021
である場合、Ｘ11−（ＣＨ2）l−（Ｏ−Ｃ2Ｈ4）m−Ｘ1等を用いて間接標識法を用いて標識することができる。Ｘ1、Ｘ11、ｌ及びｍは上述の通りである。すなわち、Ｘ1は放射性ハロゲン原子又は−［11Ｃ］ＣＨ3であり、Ｘ11は、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基であり、ｌは０以上５以下であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０以上５以下である。
【００５０】
式（２）で表される化合物は、上述のとおり、標識前駆体（放射性標識化合物の製造に用いる非標識化合物）として使用することができる。したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、式（２）で表される化合物又は式（２）で表される化合物の製薬上許容される塩（以下、「本開示の化合物（２）」という）に関する。また、本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の化合物（１）を合成するための標識前駆体として使用する本開示の化合物（２）を含む組成物に関する。また、本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の化合物（２）を含む本開示の化合物（１）を調製するためのキットに関する。本開示のキットは、一又は複数の実施形態において、放射性ハロゲン原子を含む標識試薬をさらに含んでいてもよい。
【００５１】
［ＥＧＦＲ−ＴＫＩによる治療の有効性評価のための情報を得る方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩによる非小細胞肺癌の治療が行われる被検体におけるＥＧＦＲ−ＴＫＩによる治療の有効性を評価するための情報を得る方法（以下、「本開示の情報を得る方法」ともいう）に関する。被検体は、特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、ヒト、ヒト以外の哺乳類、培養細胞、及びＥＧＦＲが存在しうる対象から選択される。
【００５２】
本開示の情報を得る方法は、一又は複数の実施形態において、本開示の化合物（１）、又は本開示の化合物（１）を含む核医学画像診断薬が投与された被検体の肺癌腫瘍から本開示の化合物（１）又は前記核医学画像診断薬の放射性シグナルを検出することを含む。シグナルの検出は、使用する本開示の化合物に含まれる放射性同位元素の種類に応じて適宜決定でき、例えば、PET及びSPECT等を用いて行うことができる。情報としては、一又は複数の実施形態において、検出された放射性シグナル等が挙げられる。
【００５３】
本開示の情報を得る方法は、一又は複数の実施形態において、前記被検体の肺癌腫瘍からの放射性シグナルの検出をＥＧＦＲ−ＴＫＩの治療期間中に繰り返し行うことを含む。
【００５４】
治療に使用されるＥＧＦＲ−ＴＫＩとしては、一又は複数の実施形態において、可逆型ＥＧＦＲ−ＴＫＩが挙げられる。可逆型ＥＧＦＲ−ＴＫＩとしては、一又は複数の実施形態において、ゲフィチニブ又はエルロチニブ等が挙げられる。
【００５５】
［ＥＧＦＲ−ＴＫＩによる治療の有効性評価方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩによる非小細胞肺癌の治療が行われる被検体におけるＥＧＦＲ−ＴＫＩによる治療の有効性を評価する方法（以下、「本開示の評価方法」ともいう）に関する。
【００５６】
本開示の評価方法は、一又は複数の実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩの投与開始前、投与開始後、及び投与開始から一定期間経過後からなる群から選択される２以上のタイミングで本開示の情報を得る方法により得られた情報を比較することを含む。
【００５７】
本開示の評価方法は、一又は複数の実施形態において、前記比較によりシグナルの変動に基づき、肺癌腫瘍における上皮成長因子受容体をコードする遺伝子に、Ｔ７９０Ｍ変異が発現しているか否かを決定することを含んでいてもよい。また、本開示の評価方法の一又は複数の実施形態において、前記比較によりシグナルの減少が観察される場合は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩによる治療の薬効の可能性が低下すると判断され、前記比較によりシグナルの減少が観察されない場合は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩによる治療の薬理有効性の可能性があると判断されうる。また、本開示の評価方法の一又は複数の実施形態において、腫瘍の大きさが増加又は維持され、かつ前記シグナルの減少が観察される場合は、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による治療の薬理有効性の可能性が低下すると判断されうる。
【００５８】
本開示の評価方法は、一又は複数の実施形態において、前記被検体のＣＴ又はＭＲＩを撮像すること、及び前記ＣＴ又はＭＲＩ画像と、前記検出した放射性シグナルから構築したイメージング画像とを融合又は比較することを含んでいてもよい。また、本開示の評価方法の一又は複数の実施形態において、前記融合又は比較に基づき、腫瘍の大きさが増加又は維持され、かつシグナルの減少が観察される場合は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩによる治療の薬理有効性の可能性が低下すると判断されうる。
【００５９】
［ＥＧＦＲ陽性肺癌腫瘍のイメージング方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の化合物（１）を投与された被検体から前記化合物の放射性シグナルを検出することを含むイメージング方法に関する。
【００６０】
［式（３）で表される化合物］
本開示は、一又は複数の実施形態において、下記式（３−１）〜（３−５）で表される化合物又は式（３−１）〜（３−５）で表される化合物の製薬上許容される塩に関する。
【化１７】
0006739987.tif 000022
上記式において、Ｘ21は、ハロゲン原子であり、好ましくはフッ素原子である。Ｘ2は、ハロゲン原子であり、好ましくは臭素原子である。ｌは０、１、２、３、４又は５であり、好ましくは０又は２である。ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって、０、１、２、３、４又は５であり、好ましくは０又は３である。
【００６１】
本開示は、以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
〔１〕  下記式（１）で表される化合物又は式（１）で表される化合物の製薬上許容される塩を含む核医学画像診断薬。
【化１８】
0006739987.tif 000023
［式（１）中、
Ｌ1は、炭素数１以上５以下のアルカンジイル基、又は炭素数３以上８以下のアルケンジイルカルボニル基であり、
Ｒ1は、放射性ハロゲン原子、又は１個の置換基を有していてもよい５〜７員の単環式窒素含有ヘテロシクロアルキルであり、
Ｒ2は、１個の置換基を有する６〜８員のアリール基又は窒素含有ヘテロアリール基であり、
Ｒ1及びＲ2の置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、炭素数１以上５以下のアルキル基、炭素数１以上５以下のハロゲン化アルキル基又は−（ＣＨ2）l−（Ｏ−Ｃ2Ｈ4）m−Ｘ1基であり、ｌは０以上５以下であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０以上５以下であり、Ｘ1は放射性ハロゲン原子又は−［11Ｃ］ＣＨ3であり、
Ｒ1又はＲ2は、放射性ハロゲン原子又は放射性炭素原子（11Ｃ）を含み、
Ｙは、−ＮＨ−又は−Ｏ−である。］
〔２〕  Ｌ1は、−（ＣＨ2）2−又は−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−である、〔１〕記載の核医学画像診断薬。
〔３〕  Ｒ1は、
【化１９】
0006739987.tif 000024
であり、
ｌは０又は２であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０以上５以下であり、Ｘ1は、放射性ハロゲン原子又は−［11Ｃ］ＣＨ3である、〔１〕又は〔２〕に記載の核医学画像診断薬。
〔４〕  Ｒ2は、
【化２０】
0006739987.tif 000025
であり、
ｌは０又は２であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０以上５以下であり、Ｘ1は、放射性ハロゲン原子又は−［11Ｃ］ＣＨ3であり、Ｘ2は、ハロゲン原子である、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の核医学画像診断薬。
〔５〕  下記式（１）で表される化合物又は式（１）で表される化合物の製薬上許容される塩。
【化２１】
0006739987.tif 000026
［式（１）中、
Ｌ1は、炭素数１以上５以下のアルカンジイル基、又は炭素数３以上８以下のアルケンジイルカルボニル基であり、
Ｒ1は、放射性ハロゲン原子、又は１個の置換基を有していてもよい５〜７員の単環式窒素含有ヘテロシクロアルキルであり、
Ｒ2は、１個の置換基を有する６〜８員のアリール基又は窒素含有ヘテロアリール基であり、
Ｒ1及びＲ2の置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、炭素数１以上５以下のアルキル基、炭素数１以上５以下のハロゲン化アルキル基又は−（ＣＨ2）l−（Ｏ−Ｃ2Ｈ4）m−Ｘ1基であり、ｌは０以上５以下であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０以上５以下であり、Ｘ1は放射性ハロゲン原子又は−［11Ｃ］ＣＨ3であり、
Ｒ1又はＲ2は、放射性ハロゲン原子又は放射性炭素原子（11Ｃ）を含み、
Ｙは、−ＮＨ−又は−Ｏ−である。］
〔６〕  下記式（２）で表される化合物又は式（２）で表される化合物の製薬上許容される塩を含む標識前駆体組成物。
【化２２】
0006739987.tif 000027
［式（２）中、
Ｌ1は、炭素数１以上５以下のアルカンジイル基、又は炭素数３以上８以下のアルケンジイルカルボニル基であり、
Ｒ11は、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、又は１個の置換基を有していてもよい５〜７員の単環式窒素含有ヘテロシクロアルキルであり、
Ｒ12は、１個の置換基を有する６〜８員のアリール基又は窒素含有ヘテロアリール基であり、
Ｒ11及びＲ12の置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、炭素数１以上５以下のアルキル基、炭素数１以上５以下のハロゲン化アルキル基又は−（ＣＨ2）l−（Ｏ−Ｃ2Ｈ4）m−Ｘ11基であり、ｌは０以上５以下であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０以上５以下であり、Ｘ11は、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基であり、
Ｙは、−ＮＨ−又は−Ｏ−である。］
〔７〕  Ｌ1は、−（ＣＨ2）2−又は−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−である、〔６〕記載の組成物。
〔８〕  Ｒ11は、
【化２３】
0006739987.tif 000028
であり、
ｌは０以上５以下であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって０以上５以下であり、Ｘ11は、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基である、〔６〕又は〔７〕に記載の組成物。
〔９〕  Ｒ12は、
【化２４】
0006739987.tif 000029
であり、
ｌは０又は２であり、ｍはエチレンオキシ基の繰り返し数であって１以上５以下であり、Ｘ11は、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基であり、Ｘ12は、ハロゲン原子である、〔６〕から〔８〕のいずれかに記載の組成物。
〔１０〕  上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による非小細胞肺癌の治療が行われる被検体における上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による治療の有効性を評価するための情報を得る方法であって、
〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の核医学画像診断薬又は〔５〕記載の化合物若しくはその製薬上許容される塩が投与された被検体の肺癌腫瘍から前記核医学画像診断薬又は前記化合物の放射性シグナルを検出することを含む、方法。
〔１１〕  前記被検体の肺癌腫瘍からの放射性シグナルの検出を上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬の治療期間中に繰り返し行うことを含む、〔１０〕記載の方法。
〔１２〕  肺癌腫瘍における上皮成長因子受容体をコードする遺伝子におけるＴ７９０Ｍ変異の発生を評価する方法であって、
〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の核医学画像診断薬又は〔５〕記載の化合物若しくはその製薬上許容される塩が投与された被検体の肺癌腫瘍から前記核医学画像診断薬又は前記化合物の放射性シグナルを検出すること、
前記被検体の肺癌腫瘍からの放射性シグナルの検出を上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬の治療期間中に繰り返し行うこと、
前記得られた情報を比較すること、及び
前記比較によりシグナルの変動に基づき、肺癌腫瘍における上皮成長因子受容体をコードする遺伝子における、Ｔ７９０Ｍ変異の発生の有無を決定することを含む、方法。
〔１３〕  上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による非小細胞肺癌の治療が行われる被検体における上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による治療の有効性を評価する方法であって、
上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬の投与開始前、投与開始後及び投与開始から一定期間経過後からなる群から選択される２以上のタイミングで〔１０〕又は〔１１〕に記載の方法により得られた情報を比較することを含む、方法。
〔１４〕  前記比較によりシグナルの変動に基づき、肺癌腫瘍における上皮成長因子受容体をコードする遺伝子が、Ｔ７９０Ｍ変異を有している否かを決定することを含む、〔１３〕記載の方法。
〔１５〕  前記比較によりシグナルの減少が観察される場合は、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による治療の薬理有効性の可能性が低下すると判断され、前記比較によりシグナルの減少が観察されない場合は、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による治療の薬理有効性の可能性があると判断される、〔１３〕記載の方法。
〔１６〕  腫瘍の大きさが増加又は維持され、かつ前記シグナルの減少が観察される場合は、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による治療の薬理有効性の可能性が低下すると判断される、〔１３〕から〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕  前記被検体のＣＴ又はＭＲＩを撮像すること、及び
前記ＣＴ又はＭＲＩ画像と、前記検出した放射性シグナルから構築したイメージング画像とを融合又は比較することを含み、
前記融合又は比較に基づき、腫瘍の大きさが増加又は維持され、かつシグナルの減少が観察される場合は、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬による治療の薬理有効性の可能性が低下すると判断される、〔１３〕から〔１６〕のいずれかに記載の方法。
【実施例】
【００６２】
以下に、実施例を用いて本開示をさらに説明するが、これらは例示的なものであって、本開示は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
【００６３】
［機器及び試薬］
質量分析（ESI-MS）はLCMS-2010 EV（株式会社  島津製作所）にて測定した。
1H (400 MHz) NMRスペクトルはLNM-AL 400（日本電子株式会社）にて測定し、内部標準物質としてテトラメチルシランを用いた。
逆相HPLCはLC-20AD（株式会社  島津製作所）を用い、検出器としてSPD-20A UV（株式会社  島津製作所）を使用した。逆相HPLC用カラムにはCOSMOSIL C18-AR-II (4.6 x 250 mm)及びCOSMOSIL C18-AR-II (10 x 250 mm)（ナカライテスク株式会社）を用い、移動相には (A) 0.1% TFA水溶液及び (B) 0.1% TFAアセトニトリル溶液、(C) 0.01Mクエン酸緩衝液（pH 4.6）、(D) メタノールを使用した。TLCにはsilica gel 60 F254（メルク株式会社）を用いた。PTLCにはアミノシリカゲルpreparative TLCを用いた。
カラムクロマトグラフィーによる精製には中圧カラムW-Prep 2XY（株式会社  山善）を用い、シリカゲルはHi Flash silica gel 40 mm, 60Å（株式会社  山善）を使用した。
[18F]fluorideは京都大学医学部付属病院設置の[18O]H2O（太陽日酸株式会社）及び CYPRIS HM-18 サイクロトロン（住友重機械工業株式会社）を用いて製造した。
放射性化合物合成にはマイクロ波反応装置（サイダ社）を用いた。放射能はキュリーメーターIGC-7（ALOKA社）、オートウェルガンマカウンターWallac 1480 WIZARD 3（PerkinElmer社）を用いて測定した。
PET装置による画像収集は、GMI FX-3300 Pre-Clinical Imaging Systemを用いて行った。
【００６４】
［化合物の合成］
Ｈ１〜Ｈ４を合成した。なお、化合物１、６及び１０は、G. W. Rewcastle, D. K. Murray, W. L. Elliott, D. W. Fry, C. T. Howard, J. M. Nelson, B. J. Roberts, P. W. Vincent, H. D. H. Showalter, R. T. Winters, W. A. Denny, J. Med. Chem. 1998, 41, 742-751に準じて合成した。
【００６５】
（製造例１）
4-[(3-Bromophenyl)amino]-6-(2-fluoroethylamino)pyrido[3,4-d]pyrimidine (H1)の合成
下記スキームに従ってＨ１を合成した。
【化２５】
0006739987.tif 000030
化合物1 (79.8 mg, 0.250 mmol) をDMSO (3 mL)に溶解し、Et3N (697 μL, 5.00 mmol)及び2-fluoroethylamine hydrochloride (498 mg, 5.00 mmol) を加え、80℃で16時間撹拌した。反応終了後、反応液を水に注ぎこみ、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を水、brineで順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルpreparative TLC（CHCl3/MeOH = 10/1）にて精製した。収量 7.9 mg (9 %), 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.69 (1H, s), 8.77 (1H, s), 8.41 (1H, s), 8.19 (1H, t, J = 2.2 Hz), 7.90 (1H, br d, J = 8.8 Hz), 7.37 (1H, t, J = 8.1 Hz), 7.32-7.30 (1H, m), 7.19 (1H, s), 6.96 (1H, t, J = 6.1 Hz), 4.64 (2H, dt, J = 47.6, 5.5 Hz), 3.66 (2H, dq, J = 24.9, 5.5 Hz)
【００６６】
（製造例２）
N4-(3-(2-fluoroethoxy)phenyl)-N6-(2-morpholinoethyl)pyrido[3,4-d]pyrimidine-4, 6-diamine (H2)の合成
下記スキームに従ってＨ２を合成した。
【化２６】
0006739987.tif 000031
【００６７】
3-(2-fluoroethoxy)aniline (化合物5)
化合物4（1.375 mmol, 1.0 eq）をDMF（2.0 mL）に溶解し、K2CO3（2.749 mmol, 2.0 eq）及び2-fluoroethyl-4-toluene sulfonate（1.649 mmol, 1.2 eq）を加えて70℃で一晩加熱した。反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層を回収して硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物5を得た。
収量140.1 mg（65.7%）, 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.06 (1H, t, J = 8.0 Hz), 6.32 (2H, m), 6.27 (1H, t, J = 2.0 Hz), 6.27 (1H, t, J = 2.0 Hz), 4.73 (2H, dt, J = 47.6, 4.0 Hz), 4.17 (2H, dt, J = 28.0, 4.0 Hz), 3.67 (2H, br).
【００６８】
N-(3-(2-fluoroethoxy)phenyl)-6-fluoropyrido[3, 4-d]pyrimidin-4-amine (化合物7)
化合物6 (0.303 mmol, 1.0 eq) に化合物5（0.363 mmol, 1.2 eq）を加え2-propanol（2.0 mL）中105℃で2時間加熱還流した。反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層を回収して硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物7を得た。
収量 4.6 mg (5.0 %), 1H NMR (400 MHz, CD3OD) 8.87 (1H, s), 8.64 (1H, s), 8.03 (1H, br), 7.59 (1H, t, J = 2.0 Hz), 7.40 (1H, dd, J = 8.1 Hz), 7.33 (1H, t, J = 8.1 Hz), 6.82 (1H, dd, J = 8.1Hz), 4.81 (H, t, J = 3.8Hz), 4.69 (1H, t, J = 4.1Hz), 4.29 (1H, t, J = 4.1 Hz), 4.22 (1H, t, J = 4.1 Hz).
【００６９】
N4-(3-(2-fluoroethoxy)phenyl)-N6-(2-morpholinoethyl)pyrido[3,4-d]pyrimidine-4,6-diamine (H2)
化合物7（4.1 mg, 0.014 mmol）をDMSO（900 μL）に溶解し、4-(2-amioethyl)morphorine（ALDRICH）（100 μL, 0.762 mmol）を加えて95℃で20hr加熱した。反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層を回収して硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。残渣を逆相HPLCにて精製し、H2を得た。MHz, CDCl3 8.93 (1H, s), 8.59 (1H, s), 7.64 (1H, s), 7.32 (1H, t, J = 8.4 Hz), 7.29 (1H, d, J = 7.6 Hz), 6.75 (1H, d, J = 7.6 Hz), 6.53 (1H, s), 4.79 (2H, dt, J = 47.2, 4.0 Hz), 4.28 (2H, dt, J = 28.0, 4.0 Hz), 3.78 (4H, t, J = 4.4 Hz), 3.48 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.77 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.60 (4H, t, J = 4.4 Hz).
【００７０】
（製造例３）
N4-(6-fluoropyridin-3-yl)-N6-(2-morpholinoethyl)pyrido[3,4-d]pyrimidin-4,6-diamine (H3)の合成
下記スキームに従ってＨ３を合成した。
【化２７】
0006739987.tif 000032
【００７１】
N-(6-fluoropyridin-3-yl)-6-fluoropyrido[3, 4-d]pyrimidin-4-amine (化合物8)
化合物6（0.303 mmol）と5-Amino-2-fluoropyridine（ALDRICH）（0.363 mmol）を2-propanol（2.0 mL）溶媒中105℃で2 時間加熱還流した。反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層を回収して硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物8を得た。収量 20.0 mg (25.5 %), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 9.09 (1H, s), 8.81 (1H, s), 8.47 (1H, s), 8.44 (1H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz), 7.41 (1H, s), 7.06 (1H, dd, J = 8.8, 3.2 Hz).
【００７２】
N4-(6-fluoropyridin-3-yl)-N6-(2-morpholinoethyl)pyrido[3,4-d]pyrimidin-4,6-diamine (H3)
化合物8（20.0 mg, 0.077 mmol）をDMSO（900 μL）に溶解し、4-(2-amioethyl)morphorine（ALDRICH）（100μL, 0.762 mmol）を加えて95℃で20hr加熱した。反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層を回収して硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。残渣を逆相HPLCにて精製し、H3を得た。収量 14 mg (49.1 %), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 8.92 (1H,s), 8.61 (1H, s), 8.56 (1H, s), 8.47 (1H, m), 7.03 (1H, s), 6.99 (1H, dd, J = 8.8, 3.6 Hz), 3.94 (4H, t, J = 4.8 Hz), 3.74 (2H, t, J = 4.8 Hz), 3.10 (2H, t, J = 4.8 Hz), 3.01 (2H, m).
【００７３】
（製造例４）
(E)-N-(4-((3-bromophenyl)amino)pyrido[3,4-d]pyrimidin-6-yl)-4-(4-(2-fluoroethyl)piperazin-1-yl)but-2-enamide (H4)の合成
下記スキームに従ってＨ４を合成した。
【化２８】
0006739987.tif 000033
【００７４】
(2Z)-N-[4-[(3-Bromophenyl)amino]pyrido[3,4-d]pyrimidin-6-yl]-4-bromo-2-butenamide (化合物16)
4-Bromo-2-butenoic acid (33 mg, 0.20 mmol) をCH2Cl2 (0.5 mL)に溶解し、塩化オキザリル（40 mL, 0.457 mmol）とDMF（1滴）を加えて、室温下で1時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、残渣をTHF（0.3 mL）で溶解した後、化合物10（63.2 mg, 0.100 mmol）のTHF溶液（0.7 mL）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミンのTHF溶液（0.1 mL）を加え、室温下で一晩撹拌した。反応終了後、反応液を水に注ぎこみ、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層をbrineで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3/MeOH = 20/1）及びpreparative TLC（CHCl3/MeOH = 10/1）にて精製した。収量 14.2 mg (15%), 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ11.08 (1H, br), 10.30 (1H, br), 9.01 (1H, d, J = 16.8 Hz), 8.66 (1H, s), 8.16 (1H, br), 7.89 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.39 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.34 (1H, dt, J = 8.0, 1.8 Hz), 6.98 (1H, dt, J = 15.0, 6.3 Hz), 6.68 (1H, d, J = 15.0 Hz), 4.66 (2H, dd, J = 6.3, 1.5 Hz).
【００７５】
(2Z)-N-[4-[(3-Bromophenyl)amino]pyrido[3,4-d]pyrimidin-6-yl]-4-[(4-tert-butoxycarbonyl)piperazin-1-yl]2-butenamide (化合物17)
N-Boc-piperazine（158 mg, 0.848 mmol）のTHF（2 mL）溶液に、化合物16（19.6 mg, 0.0423 mmol）のTHF-DMF混合溶液（2:1、1.5 mL）を加え、室温下で3.5時間撹拌した。反応終了後、反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎこみ、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を水、brineで順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルpreparative TLC（CHCl3/MeOH = 10/1）にて精製した。収量19.4 mg (81%), 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ10.91 (1H, s), 10.26 (1H, br), 9.02 (1H, s), 8.98 (1H, s), 8.64 (1H, s), 8.16 (1H, br s), 7.89 (1H, br d, J = 7.7 Hz), 7.39-7.32 (2H, m), 6.87 (1H, dt, J = 15.4, 5.8 Hz), 6.54 (1H, d, J = 15.4 Hz), 3.18 (2H, d, J = 5.8 Hz), 2.50 (4H, m), 2.37 (4H, br t, J = 4.8 Hz), 1.40 (9H, s).
【００７６】
(2Z)-N-[4-[(3-Bromophenyl)amino]pyrido[3,4-d]pyrimidin-6-yl]-4-(piperazin-1-yl)2-butenamide (H4 precursor)
化合物17（19.4 mg, 0.0341 mmol）の塩化メチレン（1 mL）溶液に、TFA（500 mL）を加え、室温下で30分間撹拌した。反応終了後、反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和し、クロロホルムで抽出した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣をアミノシリカゲルpreparative TLC（CHCl3/MeOH = 20/1）にて精製した。収量12.1 mg (76%), 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ10.90 (1H, s), 10.28 (1H, br), 9.01 (1H, s), 8.98 (1H, s), 8.63 (1H, s), 8.15 (1H, s), 7.87 (1H, br d, J =7.4 Hz), 7.37 (1H, t, J = 8.1 Hz), 7.35-7.32 (1H, m), 6.87 (1H, dt, J = 15.4, 5.8 Hz), 6.53 (1H, d, J = 15.4 Hz), 3.12 (2H, br d, J = 5.8 Hz), 2.72 (4H, t, J = 4.8 Hz), 2.33 (4H, br).
得られた化合物(H4 precursor)は、標識前駆体として使用できる。
【００７７】
(E)-N-(4-((3-bromophenyl)amino)pyrido[3,4-d]pyrimidin-6-yl)-4-(4-(2-fluoroethyl)piperazin-1-yl)but-2-enamide (H4)
H4 precursor（17.5 mg, 0.0374 mmol）を無水DMF（0.75 mL）に溶解した後、Et3N（16μL, 0.115 mmol）と2-fluoroethyl 4-toluene sulfonate（16.8 mg, 0.0770 mmol）を加え、室温で5日間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎこみ、クロロホルムで抽出した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣をアミノシリカゲルpreparative TLC（CHCl3/MeOH = 20/1）にて精製した。収量8.2 mg (42.7%), 1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）10.91 (1H, s), 10.27 (1H, br s), 9.02 (1H, s), 8.99 (1H, s), 8.64 (1H, br s), 8.16 (1H, br s), 7.89 (1H, br d, J = 7.4 Hz), 7.34-7.37 (2H, m), 6.86 (1H, dt, J = 5.9, 15.4 Hz), 6.53 (1H, d, J = 15.4 Hz), 4.52 (2H, dt, J = 4.4, 48.0 Hz), 3.15 (2H, d, J = 5.9 Hz), 2.61 (2H, dt, J = 4.4, 28.6 Hz), 2.44 (8H, m); MS(EI+) m/z: 515 (M+2+, 5), 513 (M+, 5), 495 (3), 493 (3), 432 (15), 383 (100), 381 (96), 354 (40), 352 (38); HRMS (EI+) m/z: 513.1286 (Calcd for C23H25BrFN7O: 513.1288).
【００７８】
［標識前駆体合成］
標識前駆体となるＨ２ precursorを合成した。
【００７９】
（製造例５）
2-(3-((6-((2-morpholinoethyl)amino)pyrido[3,4-d]pyrimidin-4-yl)amino)phenoxy)ethyl4-methylbenzenesulfonate (H2 precursor)の合成
下記スキームに従ってＨ２ precursorを合成した。
【化２９】
0006739987.tif 000034
【００８０】
tert-butyldimethyl(2-(3-nitrophenoxy)ethoxy)silane (化合物12)
化合物11（600mg, 4.31 mmol）をDMF（8.0 mL）に溶解し、K2CO3（1192 mg, 8.62mmol）及び(2-bromoethoxy)(tert-butyl)dimethylsilane（1118 μL, 5.17 mmol）を加えて80℃で2.5時間加熱した。反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層を回収して硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物12を得た。収量1007.3 mg（78.5%）, 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 7.81 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.75 (1H, s), 7.42 (1H, t, J = 8.4 Hz), 7.25 (1H, d, J = 8.4 Hz), 4.13 (2H, t, J = 4.8 Hz), 4.00 (2H, t, J = 4.8 Hz), 0.91 (9H, s).
【００８１】
3-(2-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)ethoxy)aniline (化合物13)
化合物12（1007mg, 3.386 mmol）をMeOH（15 mL）に溶解し、Pd/C（150 mg）を加えてArガス下室温で12時間反応させた。その後Arガスを水素に置換し2時間撹拌した。Hyflo Super-Celでろ過後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物13を得た。収量776.3 mg（85.7%）, 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 6.94 (1H, t, J = 8.0 Hz), 6.22 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.18 (1H, d, J = 8.0Hz), 6.15 (1H, s), 3.88 (2H, d, J = 4.8 Hz), 3.85 (2H, d, J = 4.8 Hz), 3.54 (2H, br), 0.81 (9H, s).
【００８２】
2-(3-((6-fluoropyrido[3, 4-d]pyrimidin-4-yl)amino)phenoxy)ethan-1-ol (化合物14)
化合物6 (111mg, 0.606 mmol) に化合物13（243 mg, 0.908 mmol）を加え2-propanol（4.0 mL）中105℃で2時間加熱還流した。反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層を回収して硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物14を得た。収量 52.8 mg (29.0 %), 1H NMR (400 MHz, CD3OD) 8.86 (1H, s), 8.63 (1H, s), 8.02 (1H, s), 7.57 (1H, s), 7.39 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.31 (1H, t,J = 8.0 Hz), 6.83 (1H, d, J = 8.0 Hz), 4.10 (2H, t, J = 4.8Hz), 3.90 (2H, t, J = 4.8 Hz).
【００８３】
2-(3-((6-((2-morpholinoethyl)amino)pyrido[3,4-d]pyrimidin-4-yl)amino)phenoxy)ethan-1-ol (化合物15)
化合物14（13 mg, 0.043 mmol）をDMSO（900 μL）に溶解し、4-(2-Aminoethyl)morpholine（100 μL, 0.762 mmol）を加えて95℃で20時間加熱した。反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層を回収して硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物15を得た。収量 7.6 mg (42.8 %), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 8.94 (1H, s), 8.59 (1H, s), 7.64 (1H, s), 7.31 (1H, t, J = 8.0 Hz), 7.23 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.75 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.43 (1H, s), 5.52 (1H, br), 4.15(2H, t, J = 4.0 Hz), 4.00 (2H, t, J = 4.0 Hz), 3.77 (4H, m), 3.44 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.74 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.56 (4H, m).
【００８４】
2-(3-((6-((2-morpholinoethyl)amino)pyrido[3,4-d]pyrimidin-4-yl)amino)phenoxy)ethyl4-methylbenzenesulfonate (H2 precursor)
化合物15 (17.8 mg, 0.043 mmol)をCH2Cl2 (2.0 mL)に溶解し、氷冷下Et3N (12.09 μL, 0.087 mmol)、4-toluenesulfonylchloride (9.09 mg, 0.048 mmol) 及びDMAP触媒量を加え、室温で一晩反応した反応終了後、反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層を回収して硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、H2 precursorを得た。収量 2.3 mg (22.0 %), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 8.93 (1H, s), 8.58 (1H, s), 7.83 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.52 (1H, s), 7.35 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.32-7.26 (2H, m), 6.62 (1H, d, J = 6.4 Hz), 6.50 (1H, s), 5.54 (1H, br), 4.39 (2H, t, J = 4.0 Hz), 4.22 (2H, t, J = 4.0 Hz), 3.77 (4H, m), 3.47 (2H, t, J = 5.6 Hz), 2.76 (2H, t, J = 5.6 Hz), 2.59 (4H, m), 2.44 (3H, s).
【００８５】
［放射化学合成］
放射性標識化合物である［18Ｆ］Ｈ２及び［18Ｆ］Ｈ４を合成した。
【００８６】
（製造例６）
下記スキームに従って［18Ｆ］Ｈ２を合成した。
【化３０】
0006739987.tif 000035
【００８７】
N4-(3-(2-[18F]fluoroethoxy)phenyl)-N6-(2-morpholinoethyl)pyrido[3,4-d]pyrimidine-4, 6-diamine ([18F]H2)
[18F]fluoride溶液(3700 MBq)にKryptofix 2.2.2. (5.0 mg)及びMeCN(0.5 mL)を加え、N2気流下120℃で加熱し共沸脱水した。再度MeCNを加え、共沸脱水を繰り返し行った。これを無水MeCN (1.0 mL)に溶解し、H2 precursor (1.77 μmol, 1.0 mg)を加えマイクロウェーブを用いて120℃で1分間反応した。反応液を逆相HPLCにて分取精製した [COSMOSIL 5C18-AR-II, 10 x 250 mm, eluent 45% (C) and 55% (D), flow rate 5.0 mL/min, λ = 280 nm, Rt = 7.6 min]。得られた目的物のフラクションの溶媒を留去後、生理食塩水に溶解し、生物学的評価に用いた。放射化学的収率は50 %であり、放射化学的純度は>95 %であった。
【００８８】
（製造例７）
下記スキームに従って［18Ｆ］Ｈ４を合成した。
【化３１】
0006739987.tif 000036
【００８９】
2-[18F]fluoroethyl-4-toluene sulfonate (化合物19)
[18F]fluoride溶液(3700 MBq)にKryptofix 2.2.2. (4.50 mg)及びMeCN (0.5 mL)を加え、N2気流下120℃で加熱し共沸脱水した。再度MeCNを加え、共沸脱水を繰り返し行った。これを無水MeCN (0.25 mL)に溶解し、ethylenglycol-1,2-ditosylate (18) (6.75 μmol, 2.50 mg)を加え90℃で5分間反応した。反応液に水(0.15 mL)を加え、逆相HPLCにて分取精製した [COSMOSIL 5C18-AR-II, 10 x 250 mm, eluent 50% (A) and (B), flow rate 4.0 mL/min, λ = 280 nm, Rt = 10-11 min]。得られた目的物のフラクションに水を加えて希釈し、Sep-Pak C18 Light Cartridge (日本ウォーターズ株式会社)にアプライ後、水を通してTFAを除去した。N2気流下カートリッジを乾燥し、DMFを通して目的物を溶出した。
【００９０】
(E)-N-(4-((3-bromophenyl)amino)pyrido[3,4-d]pyrimidin-6-yl)-4-(4-(2-[18F]fluoroethyl)piperazin-1-yl)but-2-enamide ([18F]H4)
H4 precursor (1.07 μmol, 0.50 mg) を無水DMF (20 μL)に溶解し、化合物19のDMF溶液(100 μL)に加えた。さらにEt3N (1.45 μL)を加え、110℃で20分間反応した。反応液を逆相HPLCにて分取精製した [COSMOSIL 5C18-AR-II , 10 x 250 mm, gradient of 80:20(0 min)→60:40 (20 min) by (A) and (B), flow rate 5.0 mL/min, λ = 280 nm]。得られた目的物のフラクションに水を加えて希釈し、Sep-Pak C18 Light Cartridgeにアプライ後、水を通してTFAを除去した。溶媒を留去後、1% Tween生理食塩水に溶解し、生物学的評価に用いた。放射化学的収率は3.8 %であり、放射化学的純度は>95 %であった。
【００９１】
［EGFRチロシンキナーゼ阻害活性の測定１］
各化合物（Ｈ１〜Ｈ４）及びゲフィチニブ（Gefitinib）のEGFRチロシンキナーゼに対する阻害活性をEGFR Kinase Enzyme System (Promega)及びADP-GloTM Kinase assay Kit (Promega, Catalog No. V9101)を用いて測定した。
EGFR Kinase Enzyme Systemは、EGFR Kinase Enzyme System(Catalog No. V3831)、EGFR (L858R) Kinase Enzyme System(Catalog No. V5322)、EGFR (T790M) Kinase Enzyme System(Catalog No. V4506)及びEGFR (T790M, L858R) Kinase Enzyme System(Catalog No. V5324)の４種類を用いて行った（いずれもPromega製）。
測定は、Promega protocol applications guideに準じて行った。すなわち、希釈溶液は、緩衝液（40 mM Tris-HCl, pH7.5, 20 mM MgCl2, 50 μM DTT and 0.1 mg/mL BSA）を使用した。化合物濃度は、100 μM（1% DMSOを含む最終濃度）を始めとし、緩衝液で5倍ずつ希釈し、10種類の濃度を調製した。PD158780のみ、初期濃度を10 μM（1% DMSOを含む最終濃度）とし、化合物群と同様に調製した。得られた各濃度の化合物を384ウェルプレートの各ウェルに2 μLずつ添加した。さらに、各EGFR Kinase Enzyme Systemに付属のEGFR Kinase Bufferを各ウェルに4 μL (20 ng)ずつ添加し、室温で10分インキュベートした。続いて、ATP (10 μM) と Poly(Glu, Tyr) (2 μg)基質の混合溶液を各ウェルに4 μLずつ添加し、室温で一時間インキュベートした。ADP-GloTM Reagent (ADP-GloTM Kinase Assay, Promega)を各ウェルに10 μLずつ添加し、室温で40分間反応した。さらに、Kinase Detection Reagent (ADP-GloTM Kinase Assay, Promega)を各ウェルに20 μLずつ添加し、室温で一時間反応した後、Luminescence Counter 1420 ARVOTM Light (株式会社  パーキンエルマー)を用いて発光量を測定した。得られたデータから、GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.)を用いて、用量反応曲線及びIC50を算出した。その結果を下記表１に示す。下記表１において、WTはEGFR Kinase Enzyme Systemでの測定結果、L858RはEGFR (L858R) Kinase Enzyme Systemでの測定結果、T790MはEGFR (T790M) Kinase Enzyme Systemでの測定結果、及びDMはEGFR (T790M, L858R) Kinase Enzyme Systemでの測定結果を示す。
【００９２】
【表５】
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【００９３】
表１に示すように、H1〜H4は、いずれも、L858R変異型EGFRに対して比較的高い結合親和性を示すが、L858R/T790M変異型EGFR（表１のDM）に対して結合親和性を示さなかった。また、H2はL858R変異型EGFRに対して比較的高い結合親和性を示すが、野生型EGFRに対する結合親和性が低く、またL858R/T790M変異型EGFRに対して結合親和性を示さなかった。
【００９４】
［EGFRチロシンキナーゼ阻害活性の測定２］
化合物Ｈ４、エルロチニブ(Erlotinib)及びAZD9291を用い、ATP及びPoly(Glu, Tyr)基質添加後のインキュベートを２時間にした以外は、［EGFRチロシンキナーゼ阻害活性の測定１］と同様に行った。その結果を下記表２に示す。なお、AZD9291は、L858R変異型EGFR-TK及びL858R/T790M変異型EGFR-TKの両方の阻害作用するとされている化合物である。
【表６】
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【００９５】
表２に示すように、H4は、L858R変異型EGFRに対して比較的高い結合親和性を示した。H4のL858R変異型EGFRに対する結合親和性は、Erlotinib及びAZD9291と同程度であった。一方、H4のL858R/T790M変異型EGFRに対する結合親和性は、AZD9291よりも低く、Erlotinibよりも高かった。これにより、H4は、L858R変異型EGFRを特異的に結合すること示唆された。
【００９６】
［細胞培養・モデルマウス］
2種類のEGFR変異陽性ヒト非小細胞肺癌細胞H3255（L858R変異）、H1975（L858R/T790M変異）をグルタミン、抗生物質（ペニシリン・ストレプトマイシン）とウシ胎児血清20%を含むDMEM/Ham's F-12培地（ナカライテスク）中で培養した。
オスのBALB/c nu/nu マウス5週齢（清水実験材料）の右肩にBD MatrigelTM Basement Membrane Matrixに懸濁させたH3255細胞を1×107 cells/mouse移植し、担がんマウスを作製した。腫瘍径は1cm以下で実験に使用した。
【００９７】
［細胞取り込み阻害実験１］
H4の各変異型EGFR-TKに対する結合の特異性を、L858R変異細胞であるH3255細胞、及びL858R/T790M変異細胞であるH1975細胞を用いた細胞取り込み阻害実験にて評価した。12ウェルプレートにてH3255、H1975（4×105 cells/well）を48時間培養した。培地を除去後、各ウェルをPBS(-)で1回洗浄した。各ウェルに[18F]H4(0.15 MBq/mL)とgefitinib（0, 0.5, 1, 2.5μM）を加えたウシ胎児血清非含有のDMEM/Ham's F-12培地を加え、CO2インキュベーター中で2時間インキュベートした。各ウェルを0.1% Tween 80 / 1% DMSO / PBS(-)で3回洗浄し、0.2 N NaOHで細胞を溶解させた。溶液の放射能をガンマカンターで計測し、BCA Protein Assay Kit（Pierce, Rockford, IL）を用いてタンパク濃度を定量して、測定結果を解析した。その結果を図１に示す。
【００９８】
図１に示すように、[18F]H4のH3255細胞への取り込みは、EGFR-TKIであるgefitinibにより阻害された。これに対し、[18F]H4のH1975細胞への取り込みは、gefitinibの添加の有無及びその添加濃度にかかわらず、50%ID/mg protein程度であった。これにより、[18F]H4によれば、一次変異であるL858R変異が導入されたL858R変異型EGFRと、一次変異に続いて出現した二次変異T790M変異が導入されたL858R/T790M変異型EGFRとを判別できる可能性が示唆された。
【００９９】
［細胞取り込み阻害実験２］
12ウェルプレートにてH3255、H1975（4×105 cells/well）を24時間培養した。培地を除去後、各ウェルをPBS(-)で1回洗浄した。各ウェルにAZD9291（0, 1, 5μM）を加えたウシ胎児血清非含有のDMEM/Ham's F-12培地を加え、5%CO2インキュベーター中で37℃で30分間インキュベートした。各ウェルに[18F]H4(148kBq/well)を加え、5%CO2インキュベーター中で37℃で2時間インキュベートした。各ウェルを0.1% Tween 80 / 1% DMSO / PBS(-)で3回洗浄し、0.2 N NaOHで細胞を溶解させた。溶液の放射能をガンマカンターで計測し、BCA Protein Assay Kit（Pierce, Rockford, IL）を用いてタンパク濃度を定量して、測定結果を解析した。その結果を図２に示す。
【０１００】
図２に示すように、[18F]H4のH3255細胞への取り込みは、EGFR-TKIであるAZD9291により阻害された。これに対し、[18F]H4のH1975細胞への取り込みは、AZD9291の添加の有無及びその添加濃度にかかわらず、50%ID/mg protein程度であった。これにより、[18F]H4は、L858R変異型EGFRに特異的に結合し、[18F]H4によれば、L858R変異型EGFRと、L858R/T790M変異型EGFRとを判別できる可能性が示唆された。
【０１０１】
［体内分布実験］
[18F]H4を6μCi/100μLとなるように0.1% Tween 80生理食塩水に溶解させ、担がんマウスに100μLずつ尾静脈投与した。マウスは所定のタイムポイント（投与後30分、1時間、2時間、3時間）において断頭屠殺した。血液を回収及び組織を摘出して質量と集積した放射能を測定し、単位重量あたりの放射能から集積量（%dose/g）を算出して組織への集積を評価した。その結果を図３及び下記表３に示す。図３は、各臓器への[18F]H4の集積の経時変化の一例を示すグラフである。下記表３は、腫瘍／血液比（腫瘍の集積量／血液の集積量）及び腫瘍／筋肉比（腫瘍の集積量／筋肉の集積量）を示す。
【０１０２】
【表７】
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【０１０３】
各臓器における[18F]H4の集積を、投与後３０分から１８０分まで確認したところ、表３に示す通り、腫瘍／血液比は３前後、腫瘍／筋肉比はばらつきがあるものの５を超える値となっており、良好な結果が得られた。この結果より、[18F]H4を用いてL858R変異型EGFRをイメージングできる可能性が示唆された。また、肝臓から腸への速やかな移行が確認され、代謝及び排泄が速いことが分かった。
【０１０４】
［体内分布実験（ブロッキング実験）］
H3255担がんマウスへ[18F]H4（222kBq）及びAZD9291（17μg）をマウス尾静脈より投与した。投与後180分に屠殺してH3255腫瘍組織を摘出した。質量と集積した放射能を測定し、単位重量あたりの放射能から集積量（%dose/g）を算出した。また、AZD9291を投与しない以外は、上記と同様に行った。
また、H1975担がんマウスを使用した以外は、上記と同様に行った。
これらの結果を図４に示す。
【０１０５】
図４において左がH3255担がんマウスの結果、右がH1975担がんマウスの結果を示す。図４に示すように、H1975腫瘍（L858R/T790M変異）では、AZD9291の投与の有無にかかわらず[18F]H4の集積はほとんど変化しなかった。これに対し、H3255腫瘍（L858R変異）では、AZD9291を同時投与することにより、[18F]H4の集積が半分以上(54%)減少した。これにより、[18F]H4は、L858R変異型EGFRに特異的に結合し、[18F]H4によれば、L858R変異型EGFRと、L858R/T790M変異型EGFRとを判別できる可能性が示唆された。
【０１０６】
［PET/CT撮像１］
H3255担がんマウスへ[18F]H4(9.8 MBq/150μL)をマウス尾静脈より投与した。投与後175分からイソフルラン(2.0%)吸引麻酔し投与後180分からPET/CT装置(FX-3300)を用いて20分間撮像した。その後、CT撮像(60 kV, 320 μA)を行った。画像再構成は、3D-OSEMを用いて行った。
＜撮像条件＞
Animal : Balb/c nu/nu mouse, 10 w, male, 22.2 g
Cell : H3255 (1×107 cells / 100 μL)
Injection dose : 264 μCi / 150 μL
PET/CT : FX-3300 (GMI)
Image acquisition : 180 - 200 min after administration
Reconstruction : 3D-OSEM
Condition of CT : 60kV, 320 μA
【０１０７】
撮像により得られた画像を図５に示す。図５における左図が冠状断像（coronal view）であり、右図が横断像（transverse view）である。図５において丸で囲った部分が、H3255が移植された部分である。図５に示すように、[18F]H4はH3255が移植された部分に特異的に集積し、[18F]H4によってL858R変異EGFRをイメージングすることができた。
【０１０８】
［PET/CT撮像２］
Ｈ1975担がんマウスを使用し、下記撮像条件とした以外は、［PET/CT撮像１］と同様に行った。
＜撮像条件＞
Animal : Balb/c nu/nu mouse, 9 w, male, 20.9 g
Cell : H1975 (3×106 cells) 
Injection dose : 486 μCi / 150 μL
PET/CT : FX-3300 (GMI)
Image acquisition : 180 - 200 min after administration
Reconstruction : 3D-OSEM
Condition of CT : 60 kV, 320 μA
【０１０９】
撮像により得られた画像を図６に示す。図６における左図が冠状断像（coronal view）であり、右図が横断像（transverse view）である。図６において丸で囲った部分が、H1975が移植された部分である。図６に示すように、H1975が移植された部分には、[18F]H4の特異的な集積を確認することができなかった。
【０１１０】
以上のPET/CT撮像の結果により、[18F]H4を用いたイメージングによってがん組織（腫瘍）におけるEGFR遺伝子がL858R変異型かL858R/T790M変異型かを確認できることが示された。これにより、イメージングによって、二次変異の発現の有無や、EGFR-TKI耐性を有するか否かを確認することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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