(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基底上皮腺肺癌細胞または扁平上皮肺癌細胞におけるＮＡＭＰＴ遺伝子の発現レベルを指標とする基底上皮腺肺癌細胞または扁平上皮肺癌細胞の転移性を判定する方法であって、
前記ＮＡＭＰＴ遺伝子の発現レベルを指標とし、
前記基底上皮腺肺癌細胞または扁平上皮肺癌細胞におけるＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量を測定すること、
測定された前記基底上皮腺肺癌細胞または扁平上皮肺癌細胞の発現量と閾値とを比較すること、および
前記比較の結果に基づいて、前記閾値よりも前記基底上皮腺肺癌細胞または扁平上皮肺癌細胞におけるＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量が高い場合に、前記基底上皮腺肺癌細胞または扁平上皮肺癌細胞の転移性が高いと判定し、
前記閾値よりも前記基底上皮腺肺癌細胞または扁平上皮肺癌細胞におけるＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量が低い場合に、前記基底上皮腺肺癌細胞または扁平上皮肺癌細胞の転移性が低いと判定すること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記閾値は、健常細胞からのＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量に基づいて定められることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記健常細胞からのＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量は、
当該の発現量の測定に先駆けて、当該健常細胞においてＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量を測定することにより得られる、
当該基底上皮腺肺癌細胞または扁平上皮肺癌細胞の発現量の測定の後に、当該健常細胞においてＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量を測定することにより得られる、または
当該基底上皮腺肺癌細胞または扁平上皮肺癌細胞の発現量の測定に並行して、当該健常細胞においてＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量を測定することにより得られることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量の測定が、ＮＡＭＰＴ蛋白質量、ＮＡＭＰＴｍＲＮＡ量またはＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター活性量を測定することにより行われることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＡＭＰＴ蛋白質量の測定が、抗ＮＡＭＰＴ抗体を用いた免疫学的測定法により行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫学的測定法が、酵素免疫法（ＥＩＡ）、蛍光免疫法（ＦＩＡ）、細胞自動解析分離装置（ＦＡＣＳ）、免疫細胞染色法（ＩＣＣ）または免疫組織染色法（ＩＨＣ）であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＮＡＭＰＴｍＲＮＡ量の測定が、逆転写ＰＣＲ法により行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記逆転写ＰＣＲ法において、配列番号２またはその相補配列で示される第１のプライマーと、配列番号３またはその相補配列で示される第２のプライマーとを含むプライマーセットを用いて増幅反応を行うことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター活性量の測定が、ＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター配列を含むレポーターベクターを用いて行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記レポーターベクターがレポーター遺伝子発現ユニットを含み、
前記レポーター遺伝子発現ユニットは、
（Ａ−ａ）ＮＡＭＰＴ遺伝子の５’上流プロモーター配列；
（Ａ−ｂ）前記プロモーター配列の下流に機能的に連結された検出可能なレポーター蛋白質をコードするレポーター遺伝子；および
（Ａ−ｃ）前記レポーター遺伝子の下流に機能的に連結された転写終結シグナル配列；
を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記レポーターベクターが、更に、前記レポーター遺伝子発現ユニットと同一核酸上に連結された複製開始ユニットを含み、前記複製開始ユニットは、
（Ｂ）複製開始蛋白質の結合によって当該レポーターベクターの自己複製を開始する複製開始配列；
を含み、前記ＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量の測定が、
（１）前記レポーターベクターを準備することと；
（２）前記レポーターベクターを当該基底上皮腺肺癌細胞または扁平上皮肺癌細胞に導入することと：
（３）当該複製開始蛋白質が発現されている条件下で、前記基底上皮腺肺癌細胞または扁平上皮肺癌細胞を培養することと：
（４）前記基底上皮腺肺癌細胞または扁平上皮肺癌細胞において発現された前記レポーター蛋白質を検出することと：
を含む請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、被検細胞の細胞特性を評価するための遺伝子マーカー、方法、レポーターベクター、プライマーセットおよびアッセイキット、並びに細胞特性評価装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国における死因の１位は癌である。癌は、悪性腫瘍の形成という共通点を持つ疾患群であり、今日までに２００を超える様々な腫瘍が同定されている。悪性腫瘍の共通点は、細胞の無制御の増殖、近隣組織への浸潤能力、および全身組織への転移形成能力である。
【０００３】
癌（悪性腫瘍）の治療では、腫瘍の性質（腫瘍細胞の特性）に応じた適切な治療法の選択が重要である。適切に治療法を選択するためには、できる限り早期に、腫瘍細胞の特性、すなわち腫瘍の良性悪性を評価することが望ましい。悪性腫瘍の場合は、その攻撃性、即ち、浸潤性や転移性などについても評価できることが望ましい。しかしながら現状では、原発巣、即ち、最初に腫瘍が発生した病変から得た腫瘍細胞からその転移性を評価することは困難である。
【０００４】
腫瘍の診断は、ＭＲＩやＣＴなどの画像診断装置を用いた診断、腫瘍から採取した細胞を観察して行う診断などがある。細胞の特性には、形態学的な特徴、すなわち細胞の大きさや形、接着性など、その外見から判別できる特性がある。細胞の形態的特徴を観察する方法としては、パパニコロウ染色法やギムザ染色法などが知られている。このような染色法では、細胞の核や細胞質などを染め分けて、その形態的な特徴から腫瘍細胞の特性を評価する。
【０００５】
一方、形態からは判別できない細胞特性もある。そのような細胞特性は、例えば、遺伝子発現の変化を伴う。遺伝子発現では、遺伝子の５’上流プロモーター配列に特定蛋白質が結合してプロモーターを活性化させる。活性化したプロモーターは、遺伝子の転写を促してｍＲＮＡが合成され、ｍＲＮＡが翻訳されて蛋白質が合成される。遺伝子発現の変化は、当該遺伝子のプロモーター活性、あるいはｍＲＮＡ量や蛋白質量を調べることによって検出される。
【０００６】
例えば、特定遺伝子の発現変化が腫瘍細胞の特性と高い相関を示す場合、その遺伝子は腫瘍マーカーとして利用できる。腫瘍マーカーを検出することにより、遺伝子発現に関連する細胞特性を判別することが可能となる。例えば、血液中や別の体液中、あるいは採取した腫瘍細胞において、特定の腫瘍マーカーが検出されれば、そのマーカーと高い相関をもつ腫瘍細胞の存在が示唆される。
【０００７】
公知の腫瘍マーカーには、腫瘍細胞の増殖性を評価するＫｉ−６７遺伝子などがある。この腫瘍マーカーは、腫瘍細胞の増殖性評価に用いられている。また、腫瘍細胞の浸潤性や転移性の評価のためには、Ａｒｆ−６やＧｌｕｔ１などが腫瘍マーカーの候補として報告されている。しかしながら、その評価精度は十分とはいえない。
【０００８】
このような状況において、悪性腫瘍の治療法をより適切に選択できるようにするために、細胞特性を評価するための更なる技術の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２０１１−５０８６０９号公報
【特許文献２】特表２０１２−５３３５３０号公報
【特許文献３】国際公開第２００４／０５８９９０号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００８年５月、第７巻、第５号、ｐ６６３−６７０
【非特許文献２】Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２０１２年２月、第１５３巻、第２号、ｐ５５４−５６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
実施形態は、被検細胞の細胞特性を評価するための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
実施形態によれば、被検細胞の細胞特性を評価するための遺伝子マーカーが提供される。当該遺伝子マーカーは、ＮＡＭＰＴ遺伝子のｍＲＮＡ、ペプチド若しくは蛋白質、またはＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター配列を含むポリヌクレオチドである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施形態の１例を示す模式図。
【図２】実施形態の１例を示す模式図。
【図３】実施形態の１例を示すブロック図。
【図４】実施形態の１例を示すブロック図。
【図５】実施形態の１例を示すフローチャート。
【図６】実験結果を示す図。
【図７】実験結果を示す図。
【図８】実験結果を示す図。
【図９】実験に使用した実施形態の１例であるベクターの構成を示す模式図。
【図１０】実験結果を示す図。
【図１１】実験結果を示す図。
【図１２】実験結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、実施の形態について、図面を参照して説明する。
【００１５】
実施形態は、ＮＡＭＰＴ遺伝子が、転移性の高い腫瘍細胞株において高発現されることを発見し、腫瘍細胞の転移性と高い相関を示す指標遺伝子であることを明らかにし、被検細胞の細胞特性を評価するための遺伝子マーカーとして使用できることを見出したことに基づく。
【００１６】
ＮＡＭＰＴ遺伝子は、ニコチンアミドホスホリボシル基転移酵素をコードする遺伝子であり、哺乳類のＮＡＤ生合成における律速酵素である。ＮＡＭＰＴ遺伝子は、転移性の高い腫瘍細胞株において高発現される。
【００１７】
一方、細胞の転移性は、被検細胞の細胞特性を評価する上で重要な指標の１つである。従って、ＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量を測定することにより、被検細胞の細胞特性、例えば、転移性若しくは浸潤性の有無または程度、その細胞が正常であるのか異常であるのかなどを評価することが可能である。そして被検細胞が異常である、または異常である可能性がある場合には、その異常性または悪性度の程度などを評価することが可能である。従って。ＮＡＭＰＴ遺伝子に基づく遺伝子マーカーによって、従来よりもより正確に腫瘍細胞の細胞特性を評価することが可能となる。
【００１８】
被検細胞の細胞特性の評価とは、被検細胞の細胞特性、例えば、転移性若しくは浸潤性の有無または程度、その細胞が正常であるのか異常であるのかを評価すること、並びに被検細胞が異常である若しくはその可能性がある場合には、その異常性の程度または悪性度の程度などを評価することを含む。このような細胞特性の評価は、例えば、被検細胞が腫瘍細胞である場合には、腫瘍細胞の細胞特性の評価とは、例えば、腫瘍細胞の転移性若しくは浸潤性の有無、腫瘍細胞の転移性の程度、腫瘍細胞の良性度若しくは悪性度、腫瘍細胞の正常性若しくは異常性の程度を評価することであり得る。
【００１９】
ここで「腫瘍細胞」と記載するとき、「癌細胞」またはそれらを総括して「がん細胞」と解され得る。
【００２０】
検査されるべき被検細胞は、細胞特性が評価されるべき細胞であればよい。
【００２１】
このような被検細胞の細胞特性を評価する方法は、被検細胞におけるＮＡＭＰＴ遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とすればよい。例えば、この方法において、ＮＡＭＰＴ遺伝子の発現レベルを指標とすることは、被検細胞におけるＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量を測定すること、測定された被検細胞の発現量と閾値とを比較すること、その比較の結果に基づいて、およびその判定に基づいて被検細胞の細胞特性を評価することを含んでよい。
【００２２】
この評価は、基準となる細胞のＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量若しくは発現の程度と比較して行われてもよい。或いはこの評価は、基準となる細胞のＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量に加えて、基準となる細胞の細胞特性とを考慮して行われ得る。
【００２３】
基準となる細胞の例は、健常細胞若しくは正常細胞、転移性の有無および／または転移性の程度などの細胞特性が明らかにされている腫瘍細胞などであってもよい。基準細胞のＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量若しくは細胞特性、例えば、転移性の程度などは、予め測定されていてもよく、実施形態の遺伝子マーカーを使用する試験を行う際に同時に測定および評価されてもよい。また、基準細胞から得られた基準となる当該遺伝子の発現量若しくは転移性レベルを閾値としてもよく、このような閾値は、予め定められた閾値であってもよく、被検細胞の細胞特性を評価する際に同時に測定されてもよく、被検細胞の細胞特性を評価する前後に定められてもよい。
【００２４】
被検細胞の細胞特性を評価するための遺伝子マーカーは、ＮＡＭＰＴ遺伝子の発現の有無および／または発現量を測定するために利用できる物質であればよい。例えば、遺伝子マーカーは、ＮＡＭＰＴ遺伝子のｍＲＮＡ、ペプチド若しくは蛋白質、またはＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター配列を含むポリヌクレオチドであってよい。
【００２５】
ＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター配列の例を表１−１および表１−２に示す。
【表１−１】
0006793451.tif 000002
【００２６】
【表１−２】
0006793451.tif 000003
【００２７】
これは配列番号１で示される配列であり、ヒト由来のＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター配列の１例である。しかしながら、ＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター配列はこの配列に限定されるものではなく、ＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター配列活性を示す限りにおいて１〜数個の置換、欠失、付加などの変異を含んでもよい。
【００２８】
更なる実施形態は、このような遺伝子マーカーを利用して、被検細胞の細胞特性を評価する方法である。この方法は、例えば、ＮＡＭＰＴ遺伝子のｍＲＮＡの発現量、ペプチド若しくは蛋白質の発現量、またはＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーターの活性（ＮＡＭＰＴプロモーター活性）を指標として、被検細胞の細胞特性を評価すればよい。実施形態の方法によれば、より早期に、より正確に被検細胞の細胞特性を評価することが可能である。従来の方法では、原発巣、即ち、最初に腫瘍が発生した病変の腫瘍細胞からその転移性を評価することは困難であるが、実施形態によれば、例えば、原発巣からの腫瘍細胞についても、細胞特性を評価することが可能となる。
【００２９】
更なる実施形態は、ＮＡＭＰＴ遺伝子の発現を指標として腫瘍の細胞特性を評価する方法を提供する。具体的には、被験者の腫瘍から採取した被検細胞におけるＮＡＭＰＴ遺伝子の発現を定量的に検出し、当該遺伝子の発現を対照となる健常細胞におけるＮＡＭＰＴ遺伝子の発現と比較すればよい。被検細胞のＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量が、健常細胞のＮＡＭＰＴ遺伝子よりも高い場合に、被検細胞の転移性が高い、または異常性が高いと判定され得る。被検細胞のＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量が、健常細胞のＮＡＭＰＴ遺伝子よりも低いまたは同等である場合に、被検細胞の転移性が低い、または異常性が低いと判定され得る。
【００３０】
被検細胞は、細胞群であってもよいし、単一細胞であってもよい。被検細胞は、被験者の腫瘍からそれ自身公知の採取方法によって採取すればよい。本発明では、上皮性腫瘍から採取した腫瘍細胞が好ましい。また、上皮性腫瘍の中でも、乳腺腫瘍や肺腫瘍から採取した腫瘍細胞が被検細胞としてより好ましい。しかしながら、これらに限定されるものではない。例えば、血液、尿、便、唾液、バイオプシーで得られた組織、口腔内粘膜、体腔液や喀痰などに含まれる細胞、あるいは培養した細胞を被検細胞としてもよい。
【００３１】
実施形態に従う被検細胞の細胞特性評価では、被検細胞におけるＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量と健常細胞におけるＮＡＭＰＴ遺伝子の発現を比較してもよい。健常細胞の平均的なＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量を予め検出しておき、この数値から細胞特性評価における閾値を設定して、この閾値と被検細胞のＮＡＭＰＴ発現量とを比較してもよい。従って、必ずしも健常細胞におけるＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量を検出する必要はない。
【００３２】
ＮＡＭＰＴ遺伝子の発現は、ＮＡＭＰＴ蛋白質、或いはＮＡＭＰＴｍＲＮＡ、或いはＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーターの活性を検出することにより行ってよい。これらを当該遺伝子発現または当該遺伝子の発現量の指標としてよい。
【００３３】
ＮＡＭＰＴ蛋白質を検出する場合は、酵素免疫法（ＥＩＡ）や蛍光免疫法（ＦＩＡ）により定量的に検出すればよい。あるいは免疫細胞染色法（ＩＣＣ）や免疫組織染色法（ＩＨＣ）、あるいは自動細胞解析分離装置（ＦＡＣＳ）を用いて検出してもよい。
【００３４】
ＮＡＭＰＴ遺伝子の発現は、例えば、ＮＡＭＰＴｍＲＮＡを検出してもよい。その場合、何れかの方法によりＮＡＭＰＴｍＲＮＡを検出すればよい。例えば、プライマーセットを使用し、ＰＣＲ増幅法、ＬＡＭＰ増幅法、ＳＭＡＰ増幅法およびＩＣＡＮ増幅法などを利用してサンプルを増幅し、増幅産物について解析を行ってもよい。この場合、好ましくは、ｍＲＮＡを直接に増幅する逆転写ＰＣＲ法、逆転写ＬＡＭＰ増幅法、逆転写ＳＭＡＰ増幅法および逆転写ＩＣＡＮ増幅法などが使用されてよい。増幅産物の解析は、プローブ核酸との結合を検出することにより行ってもよく、直接に増幅産物の塩基配列を特定してもよい。また、増幅せずに被検細胞のＮＡＭＰＴ遺伝子発現産物である核酸の塩基配列を決定することにより検出を行ってもよい。
【００３５】
好ましいプライマーセットの例を表２に示す。
【表２】
0006793451.tif 000004
【００３６】
表２に示すプライマーセットは逆転写ＰＣＲ増幅のためのプライマーセットである。配列番号２と配列番号３とを組み合わせて使用される。配列番号２のプライマーは、フォワードプライマーであり、配列番号３のプライマーはリバースプライマーである。これらのプライマーセットは、好ましくＮＡＭＰＴｍＲＮＡを増幅し、検出するために使用されるが、ＮＡＭＰＴｍＲＮＡを増幅、検出するためのプライマーセットは、これらに限定するものではない。
【００３７】
ＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーターの活性を検出する場合は、ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーターを組込んだレポーターベクターを用いた方法により検出すればよい。レポーターベクターは、通常のレポーターベクター、すなわち哺乳類細胞内で非複製（即ち、非増幅）のレポーターベクターを用いてもよいし、自己増幅型レポーターベクター、すなわち哺乳類細胞内で自立的に複製（即ち、増幅）するレポーターベクターを用いてもよい。
【００３８】
以下に被検細胞の細胞特性を評価する方法について、更に詳細に説明する。
【００３９】
１．ＮＡＭＰＴ蛋白質の検出による被検細胞の細胞特性評価
１−１．検出方法および細胞特性の評価方法
ＮＡＭＰＴ蛋白質の検出は、ＮＡＭＰＴ蛋白質に特異的な抗体（即ち、抗ＮＡＭＰＴ抗体）を用いて検出すればよい。このような抗体は、ＮＡＭＰＴ蛋白質の全長もしくは一部を抗原に用いて新たに作製してもよく、市販の抗体を用いてもよい。
【００４０】
市販の抗体の例としては、例えば、ウサギ抗ＮＡＭＰＴポリクローナル抗体（ａｂ４５８９０、Ａｂｃａｍ）などがあげられるが、これに限定するものではない。新たに抗体を作製する場合には、公知の抗体作製法に従って作製すればよい。
【００４１】
抗ＮＡＭＰＴ抗体を用いたＮＡＭＰＴ蛋白質の検出は、公知の蛋白質検出法で行えばよい。このような蛋白質検出法としては、例えば、酵素免疫法（ＥＩＡ）、蛍光免疫法（ＦＩＡ）、免疫細胞染色法（ＩＣＣ）、免疫組織染色法（ＩＨＣ）または自動細胞解析分離装置（ＦＡＣＳ）があるが、これらに限定するものではない。
【００４２】
ＥＩＡやＦＩＡでは、まず、例えば、腫瘍から採取した被検細胞から抽出された蛋白質と、対照となる健常細胞から抽出された蛋白質とをそれぞれマイクロタイタープレートのウェルに固定化する。その後、抗ＮＡＭＰＴ抗体を添加してＮＡＭＰＴ蛋白質と特異的に反応させてから、余剰な抗体をリン酸緩衝液などで洗浄して取り除く。その後、抗ＮＡＭＰＴ抗体を認識する標識抗体を用いて検出する。
【００４３】
標識抗体には、酵素標識した抗体や蛍光色素で標識した抗体などを用いてよい。酵素標識抗体を用いた場合は、抗ＮＡＭＰＴ抗体と標識抗体を反応させた後、余剰な標識抗体をリン酸緩衝液などで洗浄して取り除く。その後、酵素の基質を添加して酵素反応を行った後、酵素反応の反応産物を検出すればよい。例えば、標識抗体の酵素が基質から発光物質が生成する場合は、ルミノメーターでウェルの発光強度を測定すればよい。これにより、発光物質量を定量的に検出することが可能である。適切な条件下において、発光強度は、標識抗体量と相関し、標識抗体量は抗ＮＡＭＰＴ抗体量と相関し、抗ＮＡＭＰＴ抗体量はＮＡＭＰＴ蛋白質量と相関する。これにより、発光物質の量を定量的に測定することによって、細胞から抽出した蛋白質中のＮＡＭＰＴ蛋白質量の定量化が可能である。同様に、標識抗体の酵素が基質から蛍光物質が生成する場合は、フルオロメーターでウェルの蛍光強度を測定することにより、ＮＡＭＰＴ蛋白質量の定量化が可能である。蛍光強度による検出では、標識抗体を蛍光物質で直接標識してもよい。標識抗体の酵素が基質から発色物質が生成する場合は、吸光度計でウェルの吸光度を測定することにより、ＮＡＭＰＴ蛋白質量の定量化が可能である。ＥＩＡやＦＩＡで、被検細胞と健常細胞におけるＮＡＭＰＴ蛋白質量を検出して両者で蛋白質量の比較を行い、被検細胞のＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量が、健常細胞のＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量よりも高い場合に、被検細胞の異常性が高い、例えば、被検細胞の転移性が高いと判定すればよい。しかしながら、健常細胞におけるＮＡＭＰＴ蛋白質の発現量の測定は、被検細胞のＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量の測定と共に必ずしも行う必要はない。例えば、健常細胞の平均的なＮＡＭＰＴ蛋白質量を予め測定しておき、この数値を細胞特性評価における閾値に設定してもよい。この閾値と被検細胞のＮＡＭＰＴ蛋白質量とを比較することによって細胞特性の評価が行われてもよい。
【００４４】
例えば、ＩＣＣやＩＨＣでは、腫瘍から採取した被検細胞としての腫瘍細胞（組織）と、対照となる健常細胞（組織）を固定化液で固定化した後、リン酸緩衝液などで未反応の固定化液を取り除いてブロッキング処理を行い得る。抗ＮＡＭＰＴ抗体を添加してＮＡＭＰＴ蛋白質と特異的に反応させてから、余剰な抗体をリン酸緩衝液などで洗浄して取り除き、抗ＮＡＭＰＴ抗体を認識する標識抗体を用いて検出し得る。ＩＣＣやＩＨＣに用いる試薬は、公知の試薬から適切に選択され使用されればよい。標識抗体には、酵素標識した抗体や蛍光色素で標識した抗体などを用いることができる。ＩＣＣやＩＨＣでは、ＮＡＭＰＴ蛋白質の発現を光学顕微鏡で検出し得る。例えば、標識抗体の酵素が基質から発光物質が生成する場合は、発光顕微鏡により細胞の発光が検出され得る。標識抗体の酵素が基質から蛍光物質が生成する場合は、蛍光顕微鏡により細胞の蛍光が検出され得る。標識抗体の酵素が基質から発色物質を生成する場合は、光学顕微鏡で細胞の発色が検出され得る。蛍光で検出を行う場合は、標識抗体を蛍光物質で直接標識してもよい。ＩＣＣやＩＨＣでは、被検細胞と健常細胞のＮＡＭＰＴ蛋白質の発現量として、染色強度、すなわち発光、蛍光または発色の強度を顕微鏡で観察または比較すればよい。それにより、例えば、被検細胞のＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量（染色強度）が、健常細胞のＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量（染色強度）よりも高い場合に、例えば、被検細胞の異常性がある、異常性がある可能性がある、異常性が高い、または被検細胞の転移性が高いなどと判定され得る。
【００４５】
ＦＡＣＳでは、腫瘍から採取した被検細胞としての腫瘍細胞と、対照となる健常細胞を固定化液で固定化した後、リン酸緩衝液などで未反応の固定化液を取り除いてブロッキング処理が行われ得る。抗ＮＡＭＰＴ抗体を添加してＮＡＭＰＴ蛋白質と特異的に反応させてから、余剰な抗体をリン酸緩衝液などで洗浄して取り除き、抗ＮＡＭＰＴ抗体を認識する標識抗体を用いて、当該タンパク質が検出され得る。ＦＡＣＳでは、標識抗体は、蛍光物質で標識した抗体を用いることが好ましい。このように調整した細胞がＦＡＣＳで検出され得る。ＦＡＣＳは、ＢＤ社（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）の販売するＦＡＣＳＶｅｒｓｅなどの市販の装置が使用され得る。ＦＡＣＳでは、被検細胞と健常細胞のＮＡＭＰＴ蛋白質の発現量として、細胞の蛍光強度を検出および比較して、被検細胞のＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量（蛍光強度）が、健常細胞のＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量（蛍光強度）よりも高い場合に、例えば、異常性がある、または被検細胞の転移性が高い、などと判定され得る。
【００４６】
１−２．ＮＡＭＰＴ蛋白質検出による被検細胞の細胞特性評価キット
本発明では、更なる実施の形態として、ＮＡＭＰＴ蛋白質検出による被検細胞の細胞特定評価キットが提供される。それは、例えば、ＮＡＭＰＴ蛋白質検出による腫瘍細胞の転移性評価キットであり得る。当該細胞特性評価キットは、少なくとも１種類の抗ＮＡＭＰＴ抗体および緩衝液を含む。当該細胞特性評価キットは、抗ＮＡＭＰＴ抗体を担持する公知のキャリアおよび／またはレポーターベクターを収容する容器を含んでもよい。更に、被検細胞の細胞特性を評価する方法をおこなうために必要な何れかの試薬を含んでもよい。例えば、抗ＮＡＭＰＴ抗体を認識する標識抗体、当該標識抗体を検出するための基質、賦形剤、安定剤および／または他の所望の効果を有する成分などを更に含んでもよい。当該キットの組成物は、容器に含まれて提供されてもよい。
【００４７】
２．ＮＡＭＰＴｍＲＮＡの検出による被検細胞の細胞特性評価
２−１．検出方法および細胞特性の評価方法
ＮＡＭＰＴｍＲＮＡの検出は、ＮＡＭＰＴｍＲＮＡに特異的なプライマーセットを用いて逆転写ＰＣＲ法によって検出すればよい。しかしながら、この方法に限定されるものではなく、当該ｍＲＮＡの検出が可能であれば、それ自身公知のｍＲＮＡ検出法を用いてもよい。このような検出法には、例えば、ＮＡＭＰＴｍＲＮＡを特異的に検出するプローブを用いたノーザンブロット法やＤＮＡ／ＲＮＡチップ法などが挙げられる。
【００４８】
逆転写ＰＣＲ法では、例えば、腫瘍から採取した被検細胞と、対照となる健常細胞から抽出したＲＮＡを鋳型に用いて逆転写反応でｃＤＮＡを合成し、これを鋳型に特異的なプライマーセットを用いたＰＣＲでＮＡＭＰＴｍＲＮＡの一部、もしくは全長を増幅して検出し得る。
【００４９】
逆転写ＰＣＲ法とは、上記の逆転写反応とＰＣＲを組み合わせたｍＲＮＡの検出法をいう。逆転写反応および／またはＰＣＲに用いる、酵素や基質や緩衝液などの試薬は市販のものを用い得る。あるいは、上記試薬が予めパッケージングされたキットを用いてもよい。
【００５０】
逆転写ＰＣＲに用いるプライマーセットは、ＮＡＭＰＴ蛋白質をコーディングするセンス鎖とアンチセンス鎖に対して、それぞれ相補的な塩基配列を持つプライマーの組み合わせを含み得る。プライマーセットは、ＲＮＡに混入したゲノムＤＮＡを増幅しないよう、２つ以上のエキソンに跨るプライマーの組み合わせでなることが好ましい。このようなプライマーセットの例は、配列番号２と配列番号３に記載のプライマーセットであり得る。しなしながら、これに限定されるものではなく、プライマーセットは、ＮＡＭＰＴｍＲＮＡの一部、または全長を特異的に増幅できればよい。ＮＡＭＰＴｍＲＮＡの一部、もしくは全長を、適切な反応条件下、上記プライマーセットを用いた逆転写ＰＣＲで増幅することにより、細胞から抽出したＲＮＡに含まれるＮＡＭＰＴｍＲＮＡの量を定量化してもよい。
【００５１】
例えば、逆転写ＰＣＲ法で、被検細胞と健常細胞におけるＮＡＭＰＴｍＲＮＡ量を検出して両者でｍＲＮＡ量の比較を行い、被検細胞のＮＡＭＰＴｍＲＮＡ量が、健常細胞のＮＡＭＰＴｍＲＮＡの発現量よりも高い場合に、被検細胞に異常性がある、例えば、被検細胞の転移性が高いと判定すればよい。このとき、健常細胞におけるＮＡＭＰＴｍＲＮＡ量の測定は、被検細胞のＮＡＭＰＴｍＲＮＡ量の測定と同時に必ずしも行う必要はない。健常細胞の平均的なＮＡＭＰＴｍＲＮＡ量を予め測定しておき、この数値を細胞特性評価における閾値に設定してもよい。このような閾値と被検細胞のＮＡＭＰＴｍＲＮＡ量とを比較することにより細胞特性の評価を行い得る。
【００５２】
２−２．ＮＡＭＰＴｍＲＮＡ検出による被検細胞の細胞特性評価キット
更なる実施の形態として、ＮＡＭＰＴｍＲＮＡ検出による被検細胞の細胞特性評価キットが提供される。それは、例えば、ＮＡＭＰＴｍＲＮＡ検出による腫瘍細胞の細胞特性評価キットであり得る。当該細胞特性評価キットは、上記１−１に記載のプライマーセットおよび緩衝液を含んでもよい。細胞特性評価キットは、プライマーセット担持する公知のキャリアおよび／またはプライマーセットを収容する容器を含んでもよい。更に、当該細胞特性評価定キットは、被検細胞の細胞特性を評価する方法を行うために必要な何れかの試薬を含んでもよい。例えば、逆転写ＰＣＲを行うための酵素や基質、緩衝液、賦形剤、安定剤および／または他の所望の効果を有する成分などを含んでもよい。当該キットの組成物は、容器に含まれて提供されてもよい。
【００５３】
３．レポーターベクターを用いたＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター活性の検出
３−１．レポーターベクター
ＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター活性の検出で用いることができるレポーターベクターの一例を図１により説明する。図１に示すレポーターベクターは、哺乳類細胞内で自律的に複製（即ち、増幅）しないレポーターベクターの例である。レポーターベクター１は、検出可能な信号を生ずるレポーター遺伝子発現ユニット２を含む。レポーター遺伝子発現ユニット２は、ＮＡＭＰＴプロモーター配列４と、その下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子５と、その下流に機能的に連結された転写終結シグナル配列６とを含む。
【００５４】
ここで、「機能的に連結された」とは、各遺伝子が目的とする機能を発揮することが可能な状態で連結している状態をいう。例えば、蛋白質をコードする配列の場合、それぞれの塩基配列がコードするアミノ酸配列が正しく連結されていることをいう。言い換えれば、それは、アミノ酸コドンのフレームにずれがなく、当該塩基配列が導入された細胞において、目的とする活性が機能するペプチドが合成されることをいう。またここで、「機能的に連結」の語は、「作動可能に連結」の語と交換可能に使用されてもよい。
【００５５】
ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列４は、当該遺伝子のプロモーター活性として、ＮＡＭＰＴ遺伝子からｍＲＮＡへの転写活性を制御する情報が得られるべき核酸配列である。ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列４は、細胞のゲノムにおいて、ＮＡＭＰＴ遺伝子、即ち、ＮＡＭＰＴ蛋白質のアミノ酸配列情報をコードする核酸配列の５’上流領域に位置する配列である。ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列４は、ＮＡＭＰＴ遺伝子からｍＲＮＡへの転写活性を制御する情報が得るに十分な長さの核酸配列であればよい。例えば、ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列４の一例を配列番号１に記載した。しかしながら、当該遺伝子のプロモーター配列は、ＮＡＭＰＴ遺伝子からｍＲＮＡへの転写活性を制御する情報が得られるのであれば、その塩基配列は配列番号１に記載の塩基配列と完全に一致する必要はなく、即ち、相同性を持つ配列であってもよく、また塩基配列も配列番号１よりも短い塩基配列、即ち、配列番号１に記載の配列の一部のみであってもよい。また、配列番号１に記載の核酸配列の一部と他の遺伝子プロモーターの核酸配列を連結した融合核酸配列であってもよい。例えば、ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列は、表２に示す配列番号４および配列番号５をそれぞれ含むフォワードプライマーとリバースプライマーとを含むプライマーセットを用いてヒトゲノムから取得してもよい。
【００５６】
上記の記載に関して「相同性をもつ配列」とは、ゲノム上の特定の配列と同一な配列であるか、またはゲノム上の特定の配列と同一な配列の一部、例えば、１若しくは数個の塩基が置換、欠失または付与された配列であり、且つプロモーター活性を有する配列をいう。例えば、「相同性をもつ」、「相同な」および「相同の」とは、ゲノム配列に対して９０％以上で相同である配列であればよい。また「融合核酸配列」とは、異なるゲノム上または同一ゲノム上の連続しない２つ以上の特定の配列を一体化してなる配列をいう。即ち、ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列４は、ＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター配列の一部と、他の遺伝子プロモーター配列からなる２つ以上のユニットで構成されてもよい。ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列４は、被検細胞のゲノム上の配列に相同性を有する配列に加えて、任意の更なる配列を含んでもよい。任意の更なる配列を含む場合、ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列４がプロモーター活性を有する限り、リンカー配列などと呼ばれる任意の更なる配列を含んでもよい。
【００５７】
レポーター遺伝子５は、検出可能な信号を生ずる蛋白質をコードする何れかの遺伝子であればよい。検出可能な信号は、レポーター蛋白質自身、レポーター蛋白質と何れかの物質との反応、レポーター蛋白質と何れかの物質との結合などから生じる何れかの検出可能な信号であればよい。
【００５８】
レポーター蛋白質をコードするレポーター遺伝子５は、検出可能な信号を生ずるレポーター蛋白質であればよい。レポーター遺伝子５は、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、一酸化窒素合成酵素遺伝子、キサンチンオキシダーゼ遺伝子、青色蛍光蛋白質遺伝子、緑色蛍光蛋白質遺伝子、赤色蛍光蛋白質遺伝子および重金属結合蛋白質遺伝子であってもよい。これらの遺伝子はそれぞれ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、一酸化窒素合成酵素、キサンチンオキシダーゼ、青色蛍光蛋白質、緑色蛍光蛋白質、赤色蛍光蛋白質および重金属結合蛋白質をコードし、レポーターベクターの活性化によりこれらの蛋白質を発現する。１つの実施形態において好ましい例は、発光酵素蛋白質をコードする遺伝子であり、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子などを含む。
【００５９】
重金属結合蛋白質を検出可能な信号として発現するレポーターベクターの１例は、特開２０１２−２００２４５に開示されている。
【００６０】
レポーター遺伝子から得られる信号は、何れかの装置により検出可能な信号であればよい。またそのような信号の検出は、信号の種類に応じて選択された何れかの装置を用いて行えばよい。装置の例は、発光測定装置、蛍光測定装置、Ｘ線測定装置、電子スピン共鳴装置、核医学診断装置、磁気共鳴イメージング装置などであってもよい。また、信号の検出により得られた結果は、信号の有無を示しても、信号の大きさを示しても、或いはその両方を示してもよい。
【００６１】
検出可能な信号の好ましい例は、発光、蛍光および発色などの光学信号である。ここで用いる「発光」とは、化学発光、生物発光または生物化学発光を指す。信号が光学信号である場合、光学検出装置により信号を検出すればよい。例えば、検出可能な信号が発光である場合、発光を検出可能な発光測定装置、例えば、発光顕微鏡などで信号を検出すればよい。
【００６２】
転写終結シグナル配列６は、その上流の遺伝子の転写を終結する配列であればよく、例えば、ポリ（Ａ）付加シグナルであってよい。ポリ（Ａ）付加シグナルは、哺乳動物の遺伝子の転写終結に機能するものであればよい。例としては、ＳＶ４０ウイルスの後期ポリ（Ａ）付加シグナル(配列番号６)や、牛成長ホルモン遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナル（配列番号７）などが挙げられる。転写終結シグナル配列の例を表３に示す。
【００６３】
表３に記載の転写終結シグナルは、ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列４の上流に連結してもよい。転写終結シグナル６をプロモーター配列４の上流に連結することにより、レポーターベクターの任意の配列からの不適切な転写によるレポーター遺伝子５の発現（リーク）を防止することができる。これにより、不適切な転写（発現リーク）によるバックグラウンド（ノイズ）を減少させ、レポーター遺伝子５の発現により生成する信号の検出感度、および検出精度を高めることが可能である。
【表３】
0006793451.tif 000005
【００６４】
ただし、本態様の実施において使用可能なポリ（Ａ）付加シグナルは、これに限定されるものではなく、ポリ（Ａ）付加シグナルとしての機能を損なわない限りにおいては、遺伝子配列を改変したものを用いてもよい。
【００６５】
図２を用いて自己増幅型レポーターベクターの例を説明する。図２（ａ）および図２（ｂ）に自己複製ベクターの２つの例を示す。
【００６６】
図２（ａ）に示す自己複製ベクター２１は、複製開始配列を含むこと以外は、図１に示したレポーターベクターと同じ構成を含む。
【００６７】
自己複製ベクター２１は、レポーター遺伝子発現ユニット２と、その下流に連結された複製開始ユニットを含む。図２に示した例は、複製開始ユニットが複製開始配列３を含む例である。複製開始配列３は、対応する複製開始蛋白質の結合により自己複製ベクター２１が導入された細胞内において自己複製を開始する。
【００６８】
自己複製ベクターは、被検細胞で複製開始蛋白質が発現している条件下において、被検細胞核内で自己複製を行う。複製開始配列３は、例えば、哺乳類細胞で、複製開始蛋白質の結合によって活性化されて自己複製を開始する配列であればよく、それ自身公知の複製開始配列であればよい。複製開始配列３は、例えば、シミアン・ウイルス４０（配列番号８）、エプスタイン・バー・ウイルスまたはマウス・ポリオーマ・ウイルスに由来する複製開始配列であってもよい。複製開始配列３の例を表４に示す。
【表４】
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【００６９】
自己複製ベクターは、例えば、それ自身公知のプラスミドベクターを利用してもよい。例えば、この自己複製ベクターのプラスミドベクターの例は、特開２０１３−４２７２１に開示されている。
【００７０】
自己複製ベクターの自己複製は、複製開始配列３に対して複製開始蛋白質が結合することにより開始される。複製開始蛋白質は、複製開始配列３に結合できるように被検細胞核内に自己複製ベクターと共に存在すればよい。例えば、複製開始蛋白質は、レポーターベクターとして使用される自己複製ベクターから発現されてもよく、更なるベクターから発現されてもよく、被検細胞により発現されてもよい。
【００７１】
例えば、複製開始蛋白質を被検細胞核内に供給するために、複製開始蛋白質ユニットが存在してもよい。複製開始蛋白質ユニットは、例えば、プロモーターと、その下流に機能的に連結された複製開始蛋白質をコードする複製開始蛋白質遺伝子と、その下流に機能的に連結された転写終結シグナル配列を含んでもよい。或いは、複製開始蛋白質ユニットは、これらの配列からなってもよい。
【００７２】
複製開始蛋白質ユニットは、自己複製ベクター２１の核酸上に存在してもよく、自己複製ベクター２１の核酸とは異なる核酸上に存在してもよい。自己複製ベクターとは異なる核酸上に複製開始蛋白質ユニットが存在する場合、複製開始蛋白質ユニットは、被検細胞の染色体上に存在してもよく、被検細胞に含まれる他の核酸上に存在してもよい。
【００７３】
複製開始蛋白質ユニットが、レポーターベクターとしての自己複製ベクターに含まれる場合、そこに含まれるレポーター遺伝子発現ユニット２と、複製開始蛋白質ユニットとが、１つのプロモーター配列４によってそれらの発現が共に制御されていてもよく、独立した２つのプロモーター配列によってそれらの発現がそれぞれ制御されていてもよい。２つのプロモーター配列によってそれらの発現がそれぞれ制御される場合、例えば、複製開始蛋白質ユニットは、自己複製ベクター２１の核酸上に、レポーター遺伝子発現ユニット２とは独立して存在してよい。その場合、複製開始蛋白質遺伝子の発現を制御するプロモーターは、構成的に発現するプロモーターであることが好ましい。
【００７４】
複製開始蛋白質遺伝子は、例えば、シミアン・ウイルス４０のラージＴ抗原遺伝子、エプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子、マウス・ポリオーマ・ウイルスのラージＴ抗原遺伝子などであってもよい。好ましいラージＴ抗原遺伝子の例は、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１１で示される核酸、または配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１１の配列中の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列により示された、ＤＮＡ複製開始機能を有する核酸であってよい。ここで、ＤＮＡ複製開始機能とは、複製を開始できる蛋白質をコードしていることをいう。上記複製開始蛋白質遺伝子の例を表５−１、表５−２、表６−１、表６−２、表７−１および表７−２に示す。
【表５−１】
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【００７５】
【表５−２】
0006793451.tif 000008
【００７６】
【表６−１】
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【００７７】
【表６−２】
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【００７８】
【表７−１】
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【００７９】
【表７−２】
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【００８０】
複製開始蛋白質遺伝子と、複製開始配列との組み合わせは、複製を開始することが可能な組み合わせであればよい。そのような組み合わせの例は次の通りである：
複製開始蛋白質をコードする遺伝子が、シミアン・ウイルス４０のラージＴ抗原遺伝子であり、前記複製開始配列が、シミアン・ウイルス４０からの複製開始配列である組み合わせ；
複製開始蛋白質遺伝子が、エプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子であり、複製開始配列が、エプスタイン・バー・ウイルスからの複製開始配列である組み合わせ；
複製開始蛋白質遺伝子が、マウス・ポリオーマ・ウイルスのラージＴ抗原遺伝子であり、複製開始配列が、マウス・ポリオーマ・ウイルスからの複製開始配列である組み合わせ。これらのような組み合わせは好ましいが、これらに限定するものではない。
【００８１】
自己複製ベクターは、バイシストロニック発現ベクターであってもよい。バイシストロニック発現ベクターでは、バイシストロニック発現用配列を用いることにより、ＮＡＭＰＴプロモーター配列４により、その下流に含まれる２つの遺伝子、即ち、レポーター遺伝子の発現と複製開始蛋白質の発現とが同時に制御される。即ち、このような自己複製ベクターでは、レポーター遺伝子発現ユニット２と複製開始蛋白質ユニットとが、同じプロモーターによって制御されて発現される。そのようなバイシストロニック発現自己複製ベクターの例について図２（ｂ）を参照しながら説明する。自己複製ベクター３１は、ＮＡＭＰＴプロモーター配列４と、レポーター遺伝子５と、ＩＲＥＳ７と、複製開始蛋白質遺伝子８と、転写終結シグナル配列６と、複製開始配列３とを含む。ＮＡＭＰＴプロモーター配列４と、レポーター遺伝子５と、ＩＲＥＳ７と、複製開始蛋白質遺伝子８と、転写終結シグナル配列６とは、上流から下流に向けてこの順番で機能的に連結されている。ＩＲＥＳ７は、内部リボソーム進入部位（internal ribosomal entry site）であり、バイシストロニック発現用配列の１例である。バイシストロニック発現配列の例は、例えば、脳心筋ウイルスの内部リボゾーム進入配列（配列番号１２）などである。ＩＲＥＳ７は、哺乳類細胞において、ｍＲＮＡの５’末端キャップ構造に依存せずに、ｍＲＮＡの内部にリボゾームを結合させて蛋白質の翻訳を開始させる塩基配列である。ＩＲＥＳ７が２つの遺伝子の間に配置されることにより、バイシストロニックなｍＲＮＡが合成される。すなわち、ＩＲＥＳ７が２つの遺伝子の間に組み込まれることで、この２つの遺伝子がコードする２種類の蛋白質を１つのｍＲＮＡで翻訳させることができる。この例を表８に示す。
【表８】
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【００８２】
ＩＲＥＳ７の存在により、ＮＡＭＰＴプロモーター配列４により、レポーター遺伝子５の配列が転写され、それに続いて複製開始蛋白質遺伝子８が転写される。複製開始蛋白質遺伝子８の配列が読まれた後、転写終結シグナル配列６の存在により、転写は停止する。複製開始蛋白質遺伝子８から転写、翻訳されて産生する複製開始蛋白質は、複製開始配列３に結合し、自己複製ベクター３１の複製が開始される。
【００８３】
このようなレポーターベクターから生じた検出可能な信号を検出することにより、ＮＡＭＰＴプロモーター配列の活性化を評価することが可能であり、それによりＮＡＭＰ遺伝子の発現量を評価することが可能である。その結果に基づき、被検細胞の細胞特性を判定することが可能となる。
【００８４】
上記レポーターベクターにおいて、プロモーター活性とは、プロモーター配列の下流に機能的に接続された遺伝子の転写を誘導することを意味する。ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列４がプロモーター活性を有する場合、そのプロモーター活性は、ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列４の配列全体により由来するものであっても、ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列４の一部分の配列に由来するものであってもよい。また例えば、ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列４が最小プロモーターを含んでもよい。ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列４のプロモーター活性化は、ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列４上の一部分の配列に対する転写因子の結合の有無や被修飾塩基の修飾の状態によって制御される。
【００８５】
ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列４は、被検細胞のゲノム上の一部分と同一性を有する配列である標的核酸配列を含む。従って、自己増幅するレポーターベクターの場合、自己増幅の間に、被検細胞が含む標的核酸配列中の官能基の置換の状況をエピジェニックな特性として、当該自己複製ベクターが、標的核酸配列中の塩基上に写し取る（即ち、コピーする）ことができる。即ち、ＮＡＭＰＴプロモーター配列の活性化は、標的核酸配列中の修飾可能な塩基における官能基、例えば、メチル基またはアセチル基の置換の有無または程度に依存して活性化されたり、不活性化されたりしてもよい。
【００８６】
自己複製レポーターベクター３１は、ＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター４が活性化する条件下で、被検細胞内で自己複製を行うことが可能である。すなわち、ＮＡＭＰＴプロモーター４が活性化すると、ＩＲＥＳ７の働きにより、レポーター遺伝子５と複製開始蛋白質遺伝子８は、バイシストロニックなｍＲＮＡとして転写され、当該ｍＲＮＡの翻訳産物であるレポーター蛋白質と複製開始蛋白質が産生される。複製開始蛋白質は、自己複製型レポーターベクターの複製開始配列３に結合し、ＤＮＡ複製に必要な蛋白質と結合することにより、当該レポーターベクターは自己複製する。
【００８７】
自己複製レポーターベクターは、自己複製が可能なベクターであればよく、例えば、プラスミドベクターであってもよい。このような自己複製型プラスミドベクターの例は、特開２０１３−４２７２１などに開示されている。
【００８８】
３−２．ＮＡＭＰＴプロモーター活性の検出
３−１に記載のレポーターベクターを用いて、被検細胞あるいは健常細胞におけるＮＡＭＰＲ遺伝子のプロモーター活性（即ち、ＮＡＭＰＴプロモーター活性）を検出する方法の１例を説明する。ここで、プロモーター活性の検出とは、プロモーター活性の有無の検出またはプロモーター活性化の量的測定であってもよい。
【００８９】
ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター領域（配列番号１）を有するレポーターベクター１または自己増幅レポーターベクター２１若しくは３１を用意する（ａ）。次に、レポーターベクター１、２１または３１を、生きたままの被検細胞および健常細胞に導入する（ｂ）。その後、細胞中でレポーターベクター１、２１または３１のレポーター遺伝子が発現する状態を維持する。レポーターベクター２１または３１を用いる場合は、細胞が分裂して増殖し得る培養条件、すなわちレポーターベクターの自己複製可能な状態に維持する（ｃ）。このような状態において、細胞ゲノムのＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター活性が、レポーターベクターのＮＡＭＰＴプロモーター（配列番号１）の活性に反映される（ｄ）。次に、ＮＡＭＰＴプロモーター活性の指標として、レポーター遺伝子から発現するレポーター蛋白質の量を測定する（ｅ）。最後に、被検細胞と健常細胞とにおけるレポーター蛋白質の量を比較して、被検細胞におけるレポーター蛋白質の量が多い場合に、被検細胞が異常性を有する細胞、例えば、腫瘍細胞であると判定する（ｆ）。このとき、健常細胞におけるＮＡＭＰＴプロモーター活性、すなわち健常細胞へのレポーターベクターの導入、およびレポーター蛋白質発現量の測定は必ずしも必要ではない。例えば、健常細胞の平均的なＮＡＭＰＴプロモーター活性を予め測定しておき、この数値を細胞特性評価における閾値に設定して、この閾値と被検細胞のＮＡＭＰＴプロモーター活性とを比較することにより評価を行ってもよい。
【００９０】
上述のＮＡＭＰＴプロモーター活性の検出は、レポーター蛋白質の発現を検出または定量することにより可能である。レポーター蛋白質は、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、一酸化窒素合成酵素、キサンチンオキシダーゼ、青色蛍光蛋白質、緑色蛍光蛋白質、赤色蛍光蛋白質および重金属結合蛋白質であってよい。選択されたレポーター蛋白質の種類に応じて、適切な検出および／または測定方法を選択することが可能である。
【００９１】
以下に、レポーター蛋白質の検出例を挙げる。レポーター遺伝子が発光遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子の場合、被検細胞からルシフェラーゼ蛋白質を抽出して基質を加えた後に、ルミノメーターを用いて溶液の発光強度が測定され得る。レポーター遺伝子が蛍光蛋白質遺伝子の場合、例えば、被検細胞に特定波長の光を照射し、被検細胞内において蛍光蛋白質から発生される蛍光の強度が蛍光測定装置により測定され得る。あるいは、被検細胞から抽出した蛍光蛋白質を含む抽出液に特定波長の光を照射し、抽出液中の蛍光蛋白質から発生される蛍光の強度が蛍光測定装置により測定され得る。
【００９２】
レポーター遺伝子がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の場合、β−ガラクトシダーゼ蛋白質を抽出して基質を加えた後に、吸光度測定装置を用いて溶液の吸光度が測定され得る。
【００９３】
レポーター遺伝子として、活性酸素生成酵素遺伝子を使用してもよい。活性酸素生成酵素遺伝子は、活性酸素を生成する酵素をコードする遺伝子である。活性酸素生成酵素遺伝子としては、例えば、一酸化窒素合成酵素遺伝子やキサンチンオキシダーゼ遺伝子などが挙げられる。一酸化窒素合成酵素遺伝子の翻訳産物である一酸化窒素合成酵素、およびキサンチンオキシダーゼ遺伝子の翻訳産物であるキサンチンオキシダーゼは、活性酸素を生成する。活性酸素は、電子スピン共鳴装置（ＥＳＲ装置）などで検出され得る。ＥＳＲ装置による方法では、活性酸素の発生量が直接的に測定されてもよく、特異的なスピントラップ剤を利用して、それが測定されてもよい。スピントラップ剤を利用する場合、まず、活性酸素生成酵素をスピントラップ剤でトラップしてから、トラップされた活性酸素生成酵素から発生される活性酸素の発生量を測定する。
【００９４】
レポーター遺伝子として、重金属結合蛋白質遺伝子を用いてもよい。重金属結合蛋白質遺伝子は、重金属に特異的に結合する蛋白質をコードする遺伝子である。重金属に結合された蛋白質の生成量は、磁気共鳴イメージング装置、核医学診断装置またはＸ線コンピュータ断層撮影装置により行われればよい。重金属結合蛋白質の発生量は、例えば、以下のように行われる。まず、測定可能な重金属を予め被検細胞の培養液に加える。次に、必要に応じて被検細胞を洗浄した後に、被検細胞から重金属結合蛋白質を抽出する。次に、抽出された重金属結合蛋白質を、培養液に加えた重金属に対応した画像診断装置で撮像し、重金属結合蛋白質の量を測定する。なお、重金属結合蛋白質は、被検細胞の内部で発現させてもよいし、被検細胞の外表面で発現させてもよい。重金属結合蛋白質遺伝子の例は、金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列であればよい。例えば、金属化合物結合蛋白質は、特定の金属化合物に対して特異的に結合するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドおよび／または蛋白質であればよい。例えば、金属化合物を結合するペプチドをコードする配列は、所望の金属化合物と結合することが知られる抗体遺伝子や一本鎖抗体遺伝子の塩基配列を利用してもよく、そのような塩基配列に基づいてデザインすればよい。そのような塩基配列について、例えば、金属化合物との結合を維持する範囲での１つまたは幾つかの塩基の置換、欠失および付加などの修飾および／または改変、適用する対象に応じた修飾および／または改変することによりデザインしてもよい。一本鎖抗体ペプチドをコードする遺伝子は、金属化合物を結合する抗体のアミノ酸配列からデザインすることができる。例えば、ＭＲＩ撮像では、造影効果が高いためにガドリニウム化合物が好ましく使用される。ガドリニウム化合物は、例えば、ガドリニウム、ガドリニウムイオン、ガドリニウム錯体、それらの塩およびそれらの誘導体、これらの何れかを含む誘導体、またはガドリニウム化合物の類似物などからなる金属化合物であればよい。また、細胞外に金属化合物結合能を提示するレポーター遺伝子であってもよい。そのようなレポーター遺伝子は、細胞外に提示される金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列であってよい。そのような塩基配列は、例えば、細胞において転写され、翻訳され、金属化合物結合ペプチドを産生し、産生された金属化合物結合ペプチドは、細胞膜に移動して、細胞外に金属化合物結合能を提示するように構成されていればよい。このようなレポーター遺伝子の例は、例えば、特開２０１２−２００２４５に開示されている。
【００９５】
例えば、自己複製するレポーターベクターを用いて被検細胞の転移性を評価する方法は、レポーターベクターを準備することと、レポーターベクターを当該被検細胞に導入することと、複製開始蛋白質が発現されている条件下で、被検細胞を培養することと、被検細胞において発現されたレポーター蛋白質を検出することとを含めばよい。
【００９６】
３−３．レポーターベクターを用いた被検細胞の細胞特性評価キット
更なる実施の形態として、レポーターベクターを用いた被検細胞の細胞特性評価キットが提供されてもよい。それは、腫瘍細胞の細胞特性評価キットであってもよい。細胞特性評価キットは、上記３−１に記載のレポーターベクターのうち、少なくとも１種類のレポーターベクターおよび緩衝液を含んでもよい。また、細胞特性評価キットは、更に、レポーターベクターを担持する公知のキャリアおよび／またはレポーターベクターを収容する容器を含んでもよい。更に、細胞特性評価キットは、被検細胞、例えば、腫瘍細胞の細胞特性を評価する方法を行うために必要な何れかの試薬を含んでもよい。そのような試薬は、例えば、レポーター遺伝子から産生されるレポーター蛋白質の基質、賦形剤、安定剤および／または他の所望の効果を有する成分などを含んでもよい。これらの細胞特性評価キットは、容器に含まれて提供されてもよい。
【００９７】
４．薬物のスクリーニング方法
ＮＡＭＰＴ蛋白質の検出による被検細胞の細胞特性評価方法を利用して、被検細胞の転移などの異常を抑制する薬物をスクリーニングしてもよい。ＮＡＭＰＴ蛋白質の検出による腫瘍細胞の異常、例えば、腫瘍細胞の転移などを抑制する薬物をスクリーニングしてもよい。例えば、スクリーニングされるべき薬物で処理した薬物処理細胞群と、薬物を処理しない病態細胞群とを用意し、これらの２つの細胞群についてそれぞれ細胞特性を評価し、得られた結果を比較すればよい。病態細胞群は、スクリーニングされるべき薬物によって治療されるべき異常性を有すればよい。このような病態細胞特性が、薬物処理により治療されたか否かを指標に薬物のスクリーニングを行えばよい。また、薬物処理細胞群および病態細胞群に加えて、正常細胞群を用意し、正常な細胞の細胞特性を評価してもよい。正常な細胞の細胞特性は、薬物のスクリーニングを行う際にコントロールとして使用してもよい。正常な細胞の細胞特性は、薬物のスクリーニングに並行して判定されてもよく、予め判定しておいてもよい。
【００９８】
５．被検細胞の細胞特性評価装置
細胞特性評価装置は、遺伝子導入部、培養部、撮像部および判定部を備える。遺伝子導入部は、ＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター配列を含むレポーターベクターを被検細胞の核内に導入するユニットである。培養部は、遺伝子導入部で処理され、即ち、遺伝子導入された被検細胞を培養するユニットである。撮像部は、培養部で培養された被検細胞について、明視野画像を撮像し、更に、その同じ視野について当該レポーター遺伝子の発現に由来して細胞毎に生じた発光信号からなる発光画像を撮像するユニットである。判定部は、明視野画像と発光画像とに基づいて被検細胞の細胞毎の細胞特性を判定するユニットである。
【００９９】
更なる例においては、遺伝子導入部は、ＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター配列を含むレポーターベクターを被検細胞の核内に導入するユニットである。培養部は、遺伝子導入部で処理され、即ち、遺伝子導入された被検細胞を培養するユニットである。撮像部は、培養部で培養された被検細胞について、レポーター遺伝子の発現に由来して細胞毎に生じた発光信号からなる発光画像を撮像するユニットである。判定部は、発光画像とに基づいて被検細胞の細胞毎の細胞特性を判定するユニットである。
【０１００】
実施形態に従う被検細胞の細胞特性を判定する装置の１例について図３を用いて説明する。図３は、装置７０の概略を示すブロック図である。装置７０は、被検細胞の異常活性を検出し、それに基づいて被検細胞の細胞特性を評価する装置の１例である。
【０１０１】
装置７０は、細胞分離ユニット７１と、ＤＮＡ導入ユニット７２と、測定ユニット７３と、これらの下方に連続して配置されたステージ７４とを含む。細胞分離ユニット７１、ＤＮＡ導入ユニット７２および測定ユニット７３は、１つのステージ７４を共有し、このステージ７４によって、この順番で連絡している。言い換えれば、ステージ７４の上方に細胞分離ユニット７１と、ＤＮＡ導入ユニット７２と、測定ユニット７３とが上流から下流に向けてこの順番で配置される。
【０１０２】
細胞分離ユニット７１は、対象から得た検体から、試験されるべき細胞、即ち、被検細胞を分離するための分離器７５を含む。分離器７５は、対象から得た検体を受ける受容器７６ａと、受容器７６ａで受け取った検体について消化などを行う処理器７６ｂと、処理器７６ｂで処理された処理済み検体から被検細胞を分離するための分離部７７とを備える。受容器７６ａと処理器７６ｂと分離部７７は、互いに内径の異なる３つの中空の筒状体が上から下へと向けてこの順番で積み重なり、互いに液密に一体化されてなる。受容器７６ａと処理器７６ｂと分離部７７との各境界部は、弁により開閉可能に液絡されている。受容器７６ａは上部が開口したテーパのある筒状体であり、開閉可能な蓋を備える。受容器７６ａと処理器７６ｂとの境界は、弁が液密に閉じる。この弁が閉じたときには、これは受容器７６ａの底となる。処理器７６ｂは、受容器７６ａの下端と連続する筒状体である。受容器７６ａとの境界部の弁が液密に閉じたときには、処理器７６ｂは有蓋となる。分離部７７との境界部の弁が閉じたときには、処理器７６ｂは有底となる。分離部７７は、その内壁が処理器７６ｂの内壁から液密に連続している筒状体であり、その下端には弁が設けられている。この弁が液密に閉じて、分離部７７は有底となる。分離部７７内部には、分離材が固定されている。装置７０の使用時には、分離部７７底の下方のステージ７４上に、容器７８が載置される。容器７８は、分離された被検細胞７９を含む試料を分離部７７から受け取り、収容する容器７８である。ここで、処理器７６ｂは、その内部に含む検体に対して消化および生化学反応などの所望の処理を行う加熱および／または恒温機構を備えてもよい。また、分離材は、処理器７６ｂからの下りてきた検体から、被検細胞を含む試料を分離、採取する部材であってもよく、または処理器７６ｂからの下りてきた検体から、夾雑物を取り除く部材であってもよい。分離材は、分離部７７の中心軸に交差する面に沿って広がり分離部７７の内壁の円周に亘って固定されていてよい。分離材は、例えば、フィルター、メンブランおよび／または磁石などであってもよい。
【０１０３】
分離器７５で分離された被検細胞７９を含む試料は、ステージ７４上に載置された容器７８に収容される。被検細胞を収容する容器７８は、ＤＮＡ導入ユニット７２に送られる。
【０１０４】
ＤＮＡ導入ユニット７２は、容器７８に収容された被検細胞に対してレポーターベクターを導入する制御部８０と導入プローブ８１とを備える。被検細胞へのレポーターベクターの導入はそれ自身公知の方法により行われてよい。制御部８０と導入プローブ８１は、選択された導入方法を達成するための何れかの導入機構を利用した装置であればよい。例えば、ＤＮＡ導入ユニット７２はエレクトロポレーションを行う装置であってもよい。その場合、制御部８０はＤＮＡ導入器であり、導入プローブ８１は電極プローブであり、これらによってエレクトロポレーターが構成されていてもよい。更に、ＤＮＡ導入ユニット７２は、レポーターベクターを含む試薬を容器７８に供給するためのノズルを備えてもよい（図示せず）。更にＤＮＡ導入ユニット７２は、ノズルに試薬を送るための送液システム、送液システムに試薬を供給するための試薬収納容器を備えてもよい（図示せず）。
【０１０５】
また、ＤＮＡ導入ユニット７２は、所定の時間に亘り、所定の培養条件下で容器７８内の被検細胞７９を培養する培養器として機能してもよい。ＤＮＡ導入ユニット７２の培養は、制御部８０により制御されればよい。
【０１０６】
ＤＮＡ導入ユニット７２において、レポーターベクターが導入された被検細胞を含む容器７８は、次に測定ユニット７３に送られる。
【０１０７】
測定ユニット７３は、ステージ７４の一部分を上部と下部とから覆う暗箱８２と、暗箱８２内部に配置された光源８３と、光源８３の下方のステージ面に開口する窓と、窓の下方に設置された対物レンズ８７を取り付けられた撮像部８８と、光源８３および撮像部８８に連絡している制御部８５と、制御部８５にそれぞれ連絡した表示部８４および記憶部８６とを備える。例えば、測定ユニット７３の光源８３、対物レンズ８７および撮像部８８は、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラなどを搭載した顕微鏡に含まれて設置されてもよい。また、制御部８５、表示部８４および記憶部８６は、これらを備えたコンピュータであってもよい。
【０１０８】
実施形態に従う被検細胞の細胞特性を評価する装置について図４を用いて説明する。図４は、図３に示した装置７０のうち、ステージについての構成のみが異なる装置の例である。この装置７０では、細胞分離ユニット７１と、ＤＮＡ導入ユニット７２と、測定ユニット７３と、これらのユニットのそれぞれの下方にそれぞれ配置されたステージ７４ａ、７４ｂ、７４ｃとを含む。このように図３の装置７０は、ステージがそれぞれのユニットに対して設けられる。ユニット間、即ち、ステージ間の移動は、手動により行ってもよく、それぞれの移動をロボットアームなどによって自動で行ってもよい。
【０１０９】
このような図３および４に示す装置７０による細胞特性の評価の１例について図５を用いて説明する。まず、細胞分離ユニット７１の分離部７７下方のステージ７４上に容器７８を載置する。次に、上部開口から受容器７６ａ内に、所望により予めミンスやホモジナイズなどの前処理がなされた検体を持ち込む。これと共に、処理器７６ｂでの処理に必要な試薬が添加される。試薬の添加は、処理器７６ｂに開閉可能に設けられた試薬添加口から行われてよい（Ｓ２０）。受容器７６ａの蓋を閉め、処理器７６ｂとの境界の弁を開く。予め設定された条件に従って処理器７６ｂ内で消化処理が行われる。処理器７６ｂは予め設定された条件を満たす環境を作り出すための温度調節器を備えてよい（Ｓ２１）。次に、処理器７６ｂと分離部７７との境界の弁か解放され、処理器７６ｂ内で処理された検体が分離部７７内部に送られる。分離部７７の分離材を通過することにより、検体に含まれる夾雑物が除去される（Ｓ２２）。分離された被検細胞を含む試料は容器７８に送られて収容される。ここで、分離材を通過するのに先駆けて処理器７６ｂ内で進められた反応を止めるための反応停止試薬が検体に対して添加されてもよい。この添加は、予め分離部７７内に反応停止試薬を収容されていてもよく、そのような試薬を添加するための開閉可能な試薬添加口が分離器７５の何れかの位置の壁面に設けられていてもよい（Ｓ２３）。
【０１１０】
被検細胞７９を含む試料を収容したままで、容器７８は、ＤＮＡ導入ユニット７２に送られる（Ｓ２４）。ＤＮＡ導入ユニット７２のノズルからレポーターベクターを含む試薬が容器７８に添加される。導入プローブ８１を容器７８内の試料に接触させ、制御部８０からの制御によりレポーターベクターが被検細胞７９に導入される（Ｓ２５）。制御部８０の制御下で被検細胞７９は、所定の時間に亘り、所定の培養条件下で培養される（Ｓ２６）。
【０１１１】
その後、容器７８は測定ユニット７３に送られる。測定ユニット７３では、容器７８に収容された被検細胞７９におけるレポーター蛋白質量を測定する。測定ユニット７３における全ての手続きは、予め記憶部８６に格納されたプログラムおよび複数の情報が纏められたテーブルに従って制御部８５が制御する。例えば、光源８３からの光照射、照射時間および照射間隔などの照射条件の制御、撮像部８８による撮像および撮像条件の制御、撮像された画像についての画像処理および画像処理などが測定ユニット７３により制御される。また、細胞特性の判定についても、予め記憶部８６に格納されたプログラムに沿って、画像と細胞特性とを対応付けした情報を含むテーブルを参照して、制御部８５が行う。
【０１１２】
ＤＮＡ導入ユニット７２における被検細胞の培養の後、容器７８は測定ユニット７３に送られる。その後、光源８３からの光が容器７８内に照射される。容器７８を通過した光は、対物レンズ８７で集められ、その光から撮像部８８は任意に明視野画像を得る。その後、暗箱８２内において、被検細胞に導入されたレポーター蛋白質からの光学的な信号（ここでは、１例としての発光）を、対物レンズ８７を通して、撮像部８８によって撮像する。光源８３の光照射を止め、被検細胞からの発光が対物レンズ８７で集められ、その光から撮像部８８が発光画像を得る（Ｓ２７）。撮像部８８により得られた任意の明視野画像および発光画像は、制御部８５により画像処理されて任意に重ね合わされて（マージされて）表示部８４に表示される。制御部８５では、画像の表示部８４への表示と同時または表示と前後して、明視野画像および発光画像と、記憶部８６に格納されたテーブルとに基づいて、被検細胞の細胞特性を判定する。この判定の結果は、マージされた画像と共に表示部８４に示される（Ｓ２８）。
【０１１３】
ここでは、レポーター蛋白質からの光学的な信号として発光が生じる例を示したが、発光とは異なるレポーター蛋白質が生じる検出な可能な信号についても、撮像部８８を構成する検出装置を交換することにより同様に測定することが可能である。
【０１１４】
またここで、図には示さないが、測定ユニット７３は、電算的処理および画像処理などを行う処理部あるいは特性判定を行う解析部を更に備えてもよい。これらの処理部および解析部が、上述では制御部８５が行っている電算的処理および画像処理、並びに特性判定を行ってもよい。
【０１１５】
上記実施形態では、被検細胞の培養をＤＮＡ導入ユニット７２が行う例を示したが、被検細胞の培養は、測定ユニット７３において行ってもよい。その場合、装置７０が更に細胞培養を可能にする部材を備えればよい。或いは、ＤＮＡ導入ユニット７２と測定ユニット７３と両方において、被検細胞が培養されてもよい。
【０１１６】
装置７０の各ユニットの動きを制御するために各ユニットがそれぞれに制御部を備えてもよく、装置７０に含まれる全てのユニットが１つの制御部、例えば、制御部８５により行われてもよい。また、ステージ７４上に載置された容器７８のユニット間の移動は、ステージ７４に搭載された容器移動機構により行ってもよい。そのような機構は、例えば、装置７０に備えられ、装置７０に備えられた制御部により動きを制御されたロボットアームによって行われてもよい。或いは、ステージ７４にベルトコンベアが取り付けられていてもよい。
【０１１７】
また、容器７８へのレポーターベクターの添加は、容器７８がＤＮＡ導入ユニット７２の所定の位置に送られる以前の何れかの時期に行われてもよい。その場合、装置７０は、レポーターベクター添加機構をＤＮＡ導入ユニット７２よりも上流の所望の位置に更に備えればよい。
【０１１８】
このような装置によって、被検細胞の細胞特性が評価される。この装置によれば、より高い精度で被検細胞の細胞特性を評価することが可能である。また、検査をスループットで行うことが可能であるので、簡便に検査を行うことが可能であり、試料の取り違えやコンタミネーションを防ぐことが可能である。
【０１１９】
また、明視野画像に基づいて、被検細胞の形態学的特徴を得て、レポーターベクターからの情報と共に被検細胞の細胞特性が評価されてもよい。形態学的特徴は、例えば、被検細胞の面積、被検細胞の面積に対する核の面積の比率、被検細胞の長径に対する短径の比率、被検細胞における核の数または被検細胞の辺縁部の特徴、例えば、辺縁部のコントラスト比などであってもよい。これらは、非侵襲性光学的撮像方法によって得られる。例えば、ハイパースペクトルイメージング法、位相差顕微法または微分干渉法などによってこれらの情報を得てもよい。
【０１２０】
例えば、明視野で形態学的観察を行う場合、近赤外領域の波長を有する光を照射して行うことが好ましい。例えば、近赤外領域の波長を有する光は、７００ｎｍ〜７５０ｎｍの波長を有する近赤外光または３５０ｎｍ〜１０５０ｎｍのマルチスペクトル光が好ましい。例えば、被検細胞に対して近赤外領域の波長の光を照射し、その光の反射または吸収、例えば、反射率または吸収率を指標に被検細胞の形態学的情報を得ればよい。
【０１２１】
例えば、被検細胞の転移性が高い場合には、細胞形態が紡錘形などのアスペクト比が高い細胞形態をしている傾向がある。例えば、そのような被検細胞の形態学的情報についても、測定ユニット７３において取得すればよい。その場合についても、測定ユニット７３は、予め記憶部８６に格納されたプログラムおよび複数の情報が纏められたテーブルに従う制御部８５により制御されればよい。テーブルには、レポーターベクターからの検出可能な信号と細胞特性との関係についての情報が含まれる他、更に、被検細胞の形態学的特徴と細胞特性との関係、検出可能な信号と細胞特性と形態学的特徴との関係を示す情報が含まれればよい。また、例えば、光源８３からの光照射、照射時間および照射間隔などの照射条件の制御、撮像部８８による撮像および撮像条件の制御、撮像された画像についての画像処理および画像処理などが測定ユニット７３により制御される。また、細胞特性の評価は、予め記憶部８６に格納されたプログラムに沿って、形態学的特徴とレポーターベクターからの情報と細胞特性とを対応付けした情報を含むテーブルを参照して、制御部８５が行えばよい。このようにプロモーター活性と形態的特徴との複数の側面から被検細胞の細胞特性を評価することにより、より正確な結果を出すことが可能である。
【０１２２】
［例］
被検細胞の細胞特性を評価する方法の１つの例として、腫瘍細胞株の転移性を評価した。即ち、被検細胞の１例として腫瘍細胞株を用いた。細胞特性の１例として転移性を観察した。
【０１２３】
例１．免疫染色（ＮＡＭＰＴ蛋白質の検出）による腫瘍細胞株の転移性評価
転移性の評価には、ヒト乳腺腫瘍由来の細胞株として、高転移性細胞株であるＢＴ−５４９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１、並びに低転移性細胞株であるＭＣＦ−７およびＴ４７−Ｄを用いた。これらの細胞株を８ウェルチャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。８ウェルチャンバースライドから培地を取り除き、細胞をリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した。その後、４％パラホルムアルデヒド溶液を加えて室温に２０分間インキュベートして細胞を固定化した。パラホルムアルデヒド溶液を取り除き、ＰＢＳで洗浄後、０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳを加え、室温に１０分間インキュベートして膜透過処理を行った。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳを取り除き、ＰＢＳで洗浄後、Ｉｍａｇｅ−ＩＴ  ＦＸ  ｓｉｇｎａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えて室温に３０分間インキュベートしてブロッキング処理を行った。Ｉｍａｇｅ−ＩＴ  ＦＸ  ｓｉｇｎａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒを取り除き、ＰＢＳで洗浄した。その後、５００倍希釈したウサギ抗ＮＡＭＰＴポリクローナル抗体（ａｂ４５８９０、Ａｂｃａｍ）を含むＣａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ（ＴＯＹＯＢＯ）を加えて４℃に一晩インキュベートした。抗体溶液を取り除き、ＰＢＳで洗浄後、２０００倍希釈したＡｌｅｘａ５４６標識ヤギ抗ウサギ抗体を加えて室温に３０分間インキュベートした。抗体溶液を取り除き、ＰＢＳで洗浄後、ＤＡＰＩ溶液を加えて室温に１分間インキュベートして細胞核を染色した。ＰＢＳで洗浄後、Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により染色細胞をスライドグラスに封入した。染色細胞の蛍光像は、顕微鏡Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  ２（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で観察して写真を撮影した。Ａｌｅｘａ５４６の蛍光は、励起波長：５５０ｎｍ、蛍光波長：６０５ｎｍのフィルターセットで観察した。ＤＡＰＩの蛍光は、励起波長：３２０ｎｍ、蛍光波長：４９０ｎｍのフィルターセットで観察した。染色細胞の蛍光画像を図６に示した。
【０１２４】
試験に供した乳腺腫瘍由来細胞株の全てが、抗Ｎａｍｐｔ蛋白質で蛍光染色された。高転移性細胞株：ＢＴ−５４９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１では、低転移性細胞株：ＭＣＦ−７およびＴ４７−Ｄよりも強い染色シグナルが検出された。即ち、高転移性細胞株は、Ｎａｍｐｔ蛋白質を高発現していた。この結果から、同蛋白質量を指標とした腫瘍細胞の細胞特性の１例としての転移性の評価が可能であることが示された。
【０１２５】
例２．逆転写ＰＣＲ（ＮＡＭＰＴｍＲＮＡの検出）による腫瘍細胞株の転移特性評価
（１）乳腺腫瘍細胞株
実験には、ヒト乳腺腫瘍由来の細胞株として、高転移性細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＢＴ−５４９、低転移性細胞株であるＭＣＦ−７およびＴ４７−Ｄ、並びに良性腫瘍細胞株であるＭＣＦ−１０Ａを用いた。これらの細胞株を２４ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。細胞株からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）によりＮａｍｐｔ  ｍＲＮＡ（Ｎａｍｐｔ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）を検出した。
【０１２６】
上述の全ＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。その後、下記プライマーセットを用いたＰＣＲでＮａｍｐｔ  ｍＲＮＡを増幅した。
【０１２７】
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ；５’−ＡＣＣＴＴＡＣＡＡＧＡＧＡＴＴＧＴＡＧ−３’  （配列番号２）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ；５’−ＴＡＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＣＣ−３’  （配列番号３）
ＰＣＲ終了後、増幅産物を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドでゲルを染色した。ＵＶ照射下でゲル中のＰＣＲ増幅産物を可視化して写真を撮影した（図７）。ここで、上記撮影により得られた写真は、何れもバックが黒であり、バンドが白く抜けたものである。その画像をそのまま図面に示すとバンドが見えにくい。バンドをより見やすくするために、上記撮影により得られた写真をコンピュータに取り込み、画像加工ソフトを用いて、バンド強度および他のデータとの相対性を損なわないように白黒色を反転したイメージを示した。ＮＡＭＰＴｍＲＮＡは、試験に供した乳腺腫瘍由来細胞株の全てで検出された。高転移性細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＢＴ−５４９では、低転移性細胞株であるＭＣＦ−７およびＴ４７−Ｄ並びに良性腫瘍細胞株であるＭＣＦ−１０Ａよりも強いＮＡＭＰＴｍＲＮＡの増幅シグナルが検出された。即ち、高転移性細胞株はＮＡＭＰＴｍＲＮＡを高発現していた。この結果から、ＮＡＭＰＴのｍＲＮＡ量を指標として、被検細胞の１例である腫瘍細胞について、その細胞特性の１例である転移性を評価することが可能であることが示された。
【０１２８】
（２）肺腫瘍細胞株
実験には、肺腫瘍由来の細胞株として、基底上皮腺肺癌細胞株であるＡ−５４９、および扁平上皮肺癌細胞株であるＬＵＤＬＵ−１を用いた。これらの細胞株から、上記例（１）と同様の方法で、全ＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲでＮＡＭＰＴｍＲＮＡを検出した。ＰＣＲのプライマーには、配列番号２と３に記載のプライマーセットを用いた。
【０１２９】
ＰＣＲ終了後、増幅産物を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドでゲルを染色した。ＵＶ照射下でゲル中のＰＣＲ増幅産物を可視化して写真を撮影した（図８）。ここで、上記撮影により得られた写真は、何れもバックが黒であり、バンドが白く抜けたものである。その画像をそのまま図面に示すとバンドが見えにくい。バンドをより見やすくするために、上記撮影により得られた写真をコンピュータに取り込み、画像加工ソフトを用いて、バンド強度および他のデータとの相対性を損なわないように白黒色を反転したイメージを示した。ＮＡＭＰＴｍＲＮＡは、基底上皮腺肺癌細胞株であるＡ−５４９、扁平上皮肺癌細胞株であるＬＵＣＬＵ−１の何れの細胞株においても検出された。また、低転移性細胞株であるＡ−５４９ではＮＡＭＰＴｍＲＮＡ量が少ないことが明らかになった。
【０１３０】
例３．レポータージーンアッセイ（ＮＡＭＰＴプロモーター活性の検出）による腫瘍細胞の転移性評価
（１）乳癌細胞株
（ａ）レポーターベクターの構築
ニコチンアミドホスホリボシル転移酵素（Ｎａｍｐｔ）遺伝子のプロモーター領域（−２４２６〜＋２７６ｂｐ、配列番号１）を組込んだレポーターベクターを作製した。Ｎａｍｐｔ遺伝子のプロモーター領域は、ヒトのゲノムを鋳型にＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＬＸ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ  ＢＩＯ）を用いておこなった。ＰＣＲに用いたプライマー配列を以下に示す。
【０１３１】
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ；５’−ＧＧＧＡＣＧＣＧＴＣＣＡＴＧＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＡ−３’（配列番号４）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ；５’−ＣＧＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＣＧＣＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＡＡ−３’（配列番号５）
ＰＣＲで得たプロモーター配列を、ＰＧＶ−Ｂ２（ＴＯＹＯ  Ｂ−Ｎｅｔ）に組込んでレポーターベクター：ｐＮａｍｐｔ−Ｌを作製した。ＰＧＶ−Ｂ２は、ルシフェラーゼ遺伝子（レポーター遺伝子）と転写終結シグナル配列とを上流から下流に向けてこの順番で備えるベクターである。具体的には、ＰＧＶ−Ｂ２のルシフェラーゼ遺伝子の上流に、ＰＣＲで増幅したプロモーター配列であるＣＫ１９プロモーター領域を組込み、レポーターベクター：ｐＮａｍｐｔ−Ｌを作製した（図９）。
【０１３２】
細胞株ごとのレポーターベクターの導入効率の補正用ベクターには、ｐＮＬｕｃ−ｔｋを使用した。ｐＮＬｕｃ−ｔｋは、ｐＲＬ−ｔｋ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のヒト・ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子プロモーターを、ｐＮＬ１．１（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＮａｎｏＬｕｃ遺伝子の上流に組込むことにより作製した。
【０１３３】
（ｂ）リポフェクション（細胞へのレポーターＤＮＡ導入）
４０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、０．１５μｇのレポーターベクター：ｐＮａｍｐｔ−Ｌと０．０５μｇの導入効率補正用ベクター：ｐＮＬｕｃ−ｔｋを加えた。その後、０．２μｇのエンハンサー試薬（Ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えて室温に５分間インキュベートした。この溶液に、０．７μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えてよく縣濁し、室温に２５分間インキュベートした。溶液を４８ウェルプレートに移し、２．０ｍｌのヒト乳腺腫瘍に由来する５種類の細胞縣濁液（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢＴ−５４９、ＭＣＦ−７、Ｔ−４７ＤおよびＭＣＦ−１０Ａ）を加えて穏やかに混合した。その後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で細胞を培養した。
【０１３４】
（ｃ）レポータージーンアッセイ
上記例３（ｂ）のリポフェクションから７２時間後、４８ウェルプレートから培養液を取り除き、ＰＢＳで洗浄した。その後、１５０μｌの細胞溶解液（Ｇｌｏ−Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて−８０℃に３０分以上静置して凍結した。使用時には、細胞溶解液を室温で解凍した後、溶解液を遠心チューブに回収し、遠心により細胞残渣を沈殿させた。上清を新しいサンプルチューブに回収し、上清２５μｌを９６ウェル・プレート（Ｎｕｎｃ）に分注した。ウェルに等量のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ基質溶液（Ｏｎｅ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、またはＮａｎｏＬｕｃ基質溶液（Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた後、ルミノメーター（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で発光強度を測定した。それにより、ｐＮａｍｐｔ−Ｌの活性、および導入効率補正用レポーターＤＮＡ：ｐＮＬｕｃ−ｔｋの活性を測定した。ｐＮａｍｐｔ−Ｌの相対発光強度は、同レポーターＤＮＡの活性値（発光強度：ＲＬＵ）をｐＮＬｕｃ−ｔｋの活性値（発光強度）で除算した値とした。結果を図１０に示した。高転移性細胞株であるＢＴ−５４９は、低転移性細胞株であるＭＣＦ−７およびＴ４７−Ｄ、並びに良性腫瘍細胞株であるＭＣＦ−１０Ａよりも強い発光強度（ＲＬＵ）を示した。すなわち、高転移性細胞株はＮＡＭＰＴプロモーター活性が高いことが明らかになった。これにより、ＮＡＭＰＴプロモーター活性を指標として、被検細胞の１例である腫瘍細胞について、細胞特性の１例である転移性を評価することが可能であることが示された。
【０１３５】
（２）肺癌細胞株
（ａ）レポーターベクター
上記例３（１）（ａ）に記載のｐＮａｍｐｔ−Ｌを用いて以下の実験を行った。
【０１３６】
（ｂ）リポフェクション（細胞へのレポーターＤＮＡ導入）
ヒト肺癌に由来する２種類の細胞株であるＡ−５４９およびＬＵＤＬＵ−１に、上記例３（１）（ｂ）と同様のリポフェクション法により、細胞内にｐＮａｍｐｔ−Ｌを導入した。
【０１３７】
（ｃ）レポータージーンアッセイ
上記例３（１）（ｃ）と同様に、細胞溶解液を調整した。その後、遠心で細胞残渣を沈殿させて上清２５μｌを９６ウェル・プレート（Ｎｕｎｃ）に分注し、等量のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ基質溶液（Ｏｎｅ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｐｒｏｍｅｇａ）、またはＮａｎｏＬｕｃ基質溶液（Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて、ルミノメーター（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で発光強度を測定した。ｐＮａｍｐｔ−Ｌの相対発光強度は、同レポーターＤＮＡの活性値（発光強度）をｐＮＬｕｃ−ｔｋの活性値（発光強度）で除算した値とした。結果を図１１に示した。基底上皮腺肺癌細胞株であるＡ−５４９、扁平上皮肺癌細胞株であるＬＵＣＬＵ−１の何れの細胞株も発光を示された。即ち、両細胞株からＮＡＭＰＴプロモーター活性が検出された。また、低転移性細胞株であるＡ−５４９ではＮＡＭＰＴプロモーター活性が低いことが明らかになった。
【０１３８】
例４．細胞発光イメージングによる転移性乳癌細胞株の検出
（１）レポーターベクター
上記例３（１）で作製したレポーターベクター：ｐＮａｍｐｔ−Ｌを実験に使用した。
【０１３９】
（２）リポフェクション（細胞へのレポーターＤＮＡ導入）
５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、２．５μｇのレポーターベクター：ｐＮａｍｐｔ−Ｌと２．５μｇのエンハンサー試薬（Ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えた。これを室温に５分間インキュベートした。この溶液に、６．２５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えてよく縣濁した。その後、室温に２５分間インキュベートした。溶液を３５ｍｍ培養ディッシュに移し、ヒト乳腺腫瘍由来の高転移性悪性腫瘍細胞株であるＢＴ−５４９、低転移性悪性腫瘍細胞株であるＭＣＦ−７およびヒト乳腺腫瘍由来の良性腫瘍細胞株であるＭＣＦ−１０Ａの縣濁液２．０ｍｌをそれぞれ加えて穏やかに混合した。その後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で細胞をそれぞれ培養した。
【０１４０】
（３）発光イメージング
レポーターベクター導入細胞株の発光イメージングは、ＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ発光イメージングシステム（ＬＶ２００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）で行った。リポフェクションから２４時間後、ｐＮａｍｐｔ−Ｌを導入したＢＴ−５４９、ＭＣＦ−７、およびＭＣＦ−１０Ａの培地に発光基質ＶｉｖｏＧｌｏ  ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した（最終濃度２００μＭ）。培養ディッシュをＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷの所定の位置にセットし、明視野と暗視野（発光）で細胞の顕微鏡画像（×２０倍）を撮影した。暗視野での撮影は、露光時間（発光検出時間）２０分間でおこなった。発光イメージングの結果を図１２に示した。図１２には、明視野画像と暗視野画像（発光画像）を重ね合わせ画像を示した。画像の重ね合わせは、画像処理ソフトウェアＭＥＴＡＭＯＲＰＨでおこなった。高転移性悪性腫瘍細胞ＢＴ−５４９では、強く発光する細胞が観察された（図１２（ａ）、ＢＴ−５４９）。低転移性腫瘍細胞ＭＣＦ−７では発光細胞が観察されたが（図１２（ｂ）、ＭＣＦ−７）、その発光は弱かった。また、良性腫瘍細胞ＭＣＦ−１０Ａでは、発光細胞は観察されなかった（図１２（ｃ）、ＭＣＦ−１０Ａ）。
【０１４１】
これらの実施形態または実施例によれば、細胞特性を評価するための新たな技術を提供することができる。
【０１４２】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
以下に、本願出願の当初の特許請求項の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
被検細胞の細胞特性を評価するための遺伝子マーカーであって、前記遺伝子マーカーが、ＮＡＭＰＴ遺伝子のｍＲＮＡ、ペプチド若しくは蛋白質、またはＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター配列を含むポリヌクレオチドであることを特徴とする遺伝子マーカー。
［２］
前記被検細胞が上皮性腫瘍であることを特徴とする［１］に記載の遺伝子マーカー。
［３］
前記被検細胞が、乳腺組織由来または肺組織由来の腫瘍細胞であることを特徴とする［１］に記載の遺伝子マーカー。
［４］
被検細胞におけるＮＡＭＰＴ遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする被検細胞の細胞特性を評価する方法。
［５］
前記被検細胞が上皮性腫瘍であることを特徴とする［４］に記載の方法。
［６］
前記被検細胞が、乳腺組織由来または肺組織由来の腫瘍細胞であることを特徴とする［４］に記載の方法。
［７］
前記ＮＡＭＰＴ遺伝子の発現レベルを指標とすることが、
前記被検細胞におけるＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量を測定すること、
測定された前記被検細胞の発現量と閾値とを比較すること、
前記比較の結果に基づいて、前記被検細胞におけるＮＡＭＰＴ遺伝子の発現の程度を判定すること、および
前記判定に基づいて前記被検細胞の細胞特性を評価すること
を含むことを特徴とする［４］〜［６］の何れか１つに記載の方法。
［８］
前記閾値は、健常細胞からのＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量に基づいて定められることを特徴とする［７］に記載の方法。
［９］
前記健常細胞からのＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量は、
当該被検細胞の発現量の測定に先駆けて、当該健常細胞においてＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量を測定することにより得られる、
当該被検細胞の発現量の測定の後に、当該健常細胞においてＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量を測定することにより得られる、または
当該被検細胞の発現量の測定に並行して、当該健常細胞においてＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量を測定することにより得られることを特徴とする［８］に記載の方法。
［１０］
前記ＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量の測定が、ＮＡＭＰＴ蛋白質量、ＮＡＭＰＴｍＲＮＡ量またはＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター活性量を測定することにより行われることを特徴とする［７］〜［９］の何れか１つに記載の方法。
［１１］
前記ＮＡＭＰＴ蛋白質量の測定が、抗ＮＡＭＰＴ抗体を用いた免疫学的測定法により行われることを特徴とする［１０］に記載の方法。
［１２］
前記免疫学的測定法が、酵素免疫法（ＥＩＡ）、蛍光免疫法（ＦＩＡ）、細胞自動解析分離装置（ＦＡＣＳ）、免疫細胞染色法（ＩＣＣ）または免疫組織染色法（ＩＨＣ）であることを特徴とする［１１］に記載の方法。
［１３］
前記ＮＡＭＰＴｍＲＮＡ量の測定が、逆転写ＰＣＲ法により行われることを特徴とする［１０］に記載の方法。
［１４］
前記逆転写ＰＣＲ法において、配列番号２またはその相補配列で示される第１のプライマーと、配列番号３またはその相補配列で示される第２のプライマーとを含むプライマーセットを用いて増幅反応を行うことを特徴とする［１３］に記載の方法。
［１５］
前記ＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター活性量の測定が、ＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター配列を含むレポーターベクターを用いて行われることを特徴とする［１０］に記載の方法。
［１６］
前記レポーターベクターがレポーター遺伝子発現ユニットを含み、
前記レポーター遺伝子発現ユニットは、
（Ａ−ａ）ＮＡＭＰＴ遺伝子の５’上流プロモーター配列；
（Ａ−ｂ）前記プロモーター配列の下流に機能的に連結された検出可能なレポーター蛋白質をコードするレポーター遺伝子；および
（Ａ−ｃ）前記レポーター遺伝子の下流に機能的に連結された転写終結シグナル配列；
を含むことを特徴とする［１５］に記載の方法。
［１７］
前記レポーターベクターが、更に、前記レポーター遺伝子発現ユニットと同一核酸上に連結された複製開始ユニットを含み、前記複製開始ユニットは、
（Ｂ）複製開始蛋白質の結合によって当該レポーターベクターの自己複製を開始する複製開始配列；
を含み、前記ＮＡＭＰＴ遺伝子の発現量の測定が、
（１）前記レポーターベクターを準備することと；
（２）前記レポーターベクターを当該被検細胞に導入することと：
（３）当該複製開始蛋白質が発現されている条件下で、前記被検細胞を培養することと：
（４）前記被検細胞において発現された前記レポーター蛋白質を検出することと：
を含む［１６］に記載の方法。
［１８］
被検細胞の細胞特性を評価するためのレポーターベクターであって、前記レポーターベクターは、レポーター遺伝子発現ユニットを含み、前記レポーター遺伝子発現ユニットは、
（Ａ−ａ）ＮＡＭＰＴ遺伝子の５’上流プロモーター配列；
（Ａ−ｂ）前記プロモーター配列の下流に機能的に連結された検出可能なレポーター蛋白質をコードするレポーター遺伝子；および
（Ａ−ｃ）前記レポーター遺伝子の下流に機能的に連結された転写終結シグナル配列；
を含むことを特徴とするレポーターベクター。
［１９］
前記レポーターベクターが、更に、前記レポーター遺伝子発現ユニットと同一核酸上に連結された複製開始ユニットと複製開始蛋白質ユニットとを含み、前記複製開始ユニットは、
（Ｂ）複製開始蛋白質の結合によって当該レポーターベクターの自己複製を開始する複製開始配列；
を含み、前記複製開始蛋白質ユニットは、
（Ｃ−ａ）前記レポーター遺伝子の下流に機能的に連結されたＩＲＥＳ配列；および
（Ｃ−ｂ）前記ＩＲＥＳ配列の下流に機能的に連結された複製開始蛋白質をコードする複製開始蛋白質遺伝子；
を含み、
前記転写終結シグナル配列（Ａ−ｃ）が、前記複製開始蛋白質遺伝子（Ｃ−ｂ）の下流に機能的に連結されていることを特徴とする［１８］に記載のレポーターベクター。
［２０］
前記ＩＲＥＳ配列が、脳心筋炎ウイルスのＩＲＥＳ配列であることを特徴とする［１８］に記載のレポーターベクター。
［２１］
前記レポーターベクターが、更に、前記レポーター遺伝子発現ユニットと同一核酸上に連結された複製開始ユニットと複製開始蛋白質ユニットとを含み、前記複製開始ユニットは、
（Ｂ）複製開始蛋白質の結合によって当該レポーターベクターの自己複製を開始する複製開始配列；
を含み、前記複製開始蛋白質ユニットは、
（Ｄ−ａ）構成的に発現する構成的プロモーター；
（Ｄ−ｂ）前記構成的プロモーターの下流に機能的に連結された前記複製開始蛋白質をコードする複製開始蛋白質遺伝子；および
（Ｄ−ｃ）前記複製開始蛋白質遺伝子の下流に機能的に連結された更なる転写終結シグナル配列；
を含むことを特徴とする［１８］に記載のレポーターベクター。
［２２］
前記複製開始蛋白質遺伝子がシミアン・ウイルス４０のラージＴ抗原遺伝子であり、前記複製開始配列がシミアン・ウイルス４０の複製開始配列であることを特徴とする［１９］または［２１］の何れか１つに記載のレポーターベクター。
［２３］
前記ＮＡＭＰＴ遺伝子の５’上流プロモーター配列が、配列番号１で示される配列を含む［１８］〜［２２］の何れか１つに記載のレポーターベクター。
［２４］
前記レポーター遺伝子が、発光遺伝子、蛍光遺伝子、発色遺伝子、重金属結合遺伝子または一酸化窒素合成遺伝子である［１８］〜［２３］の何れか１つに記載のレポーターベクター。
［２５］
被検細胞の細胞特性を評価するためのプライマーセットであって、配列番号２またはその相補配列で示される第１のプライマーと、配列番号３またはその相補配列で示される第２のプライマーとを含むプライマーセット。
［２６］
被検細胞の細胞特性を評価するためのアッセイキットであって、
（１）［１８］〜［２４］の何れか１つに記載のレポーターベクターおよび緩衝液；または
（２）［２５］に記載のプライマーセットおよび緩衝液；
を含むことを特徴とするアッセイキット。
［２７］
（１）ＮＡＭＰＴ遺伝子プロモーター配列を含むレポーターベクターを、被検細胞の核内に導入する遺伝子導入部と、
（２）前記遺伝子導入部で処理された前記被検細胞を培養する培養部と、
（３）前記培養部で培養された前記被検細胞について明視野画像を撮像し、更に、その同じ視野について当該レポーター遺伝子の発現に由来して細胞毎に生じた発光信号からなる発光画像を撮像する撮像部と、
（４）前記明視野画像と前記発光画像とに基づいて当該被検細胞の細胞毎の細胞特性を判定する判定部と
を具備する細胞特性評価装置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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