(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式１〜４
［式１］
【化１】
0006776360.tif 000016
［式２］
【化２】
0006776360.tif 000017
［式３］
【化３】
0006776360.tif 000018
［式４］
【化４】
0006776360.tif 000019
（式中、Ｒ1およびＲ2は、互いに独立にＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ6〜Ｃ12アリールＣ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル、Ｃ3〜Ｃ8ヘテロアルキル、−（ＣＨ2）mＮＨＲ’、−（ＣＨ2）lＣＯ2Ｒ’’，−ＣＯＲ’’’または−ＳＯ2Ｒ’’’’であり、ここでＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は互いに独立にＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ6〜Ｃ12アリールＣ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキルまたはＣ3〜Ｃ8ヘテロアルキルであり、ｍは２〜５の整数であり、１は１〜５の整数であり、
Ｒ3は、
【化５】
0006776360.tif 000020
であり、
Ｒ4は、
【化６】
0006776360.tif 000021
であり、
Ｒ5は、
【化７】
0006776360.tif 000022
であり、
ｎは１〜８の整数である）
で表されるいずれか１つのカチオン性化合物とタンパク質とがイオン結合しているイオン複合体を含む、タンパク質を皮膚に送達するための皮膚浸透用組成物。
【請求項２】
前記カチオン性化合物と前記タンパク質とが、電荷で１：１〜２０：１の比で結合している、請求項１に記載の皮膚浸透用組成物。
【請求項３】
前記カチオン性化合物と前記タンパク質とが、電荷で７．５：１〜１０：１の比で結合している、請求項２に記載の皮膚浸透用組成物。
【請求項４】
前記カチオン性化合物と前記タンパク質とが、モル比で１０：１〜５０：１の比で結合している、請求項１に記載の皮膚浸透用組成物。
【請求項５】
前記カチオン性化合物と前記タンパク質とが、モル比で２０：１〜４０：１の比で結合している、請求項４に記載の皮膚浸透用組成物。
【請求項６】
前記タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、抗体（治療用モノクローナル抗体を含む）、レクチン、インスリン、成長ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、副甲状腺ホルモン、アルブミン、ストレプトアビジン、コンカナバリンおよび免疫グロブリンからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１に記載の皮膚浸透用組成物。
【請求項７】
前記タンパク質の重量平均分子量が２００ｋＤａ以下である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の皮膚浸透用組成物。
【請求項８】
表皮と真皮との間の皮膚に浸透する、請求項１に記載の皮膚浸透用組成物。
【請求項９】
前記皮膚に５０〜１００μｍの深さまで浸透する、請求項８に記載の皮膚浸透用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カチオン性分子輸送体およびタンパク質を含み、タンパク質を皮膚に、特に表皮および真皮の一部に送達することを目的とする、皮膚浸透用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、すべての生物の基本構造単位であり、細胞内小器官が存在する細胞質、および細胞質を保護し、また細胞質を細胞外環境から分離する細胞膜からなる。物質の選択的透過性を有する細胞膜は、モザイク状のリン脂質二重層に分布する流体状態にタンパク質を有するため、有用な治療活性を有する物質が細胞膜を貫通するには多くの制限がある。特に、親水性分子、低分子量の高荷電分子、ならびに高分子、例えば、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド（例えば、核酸および遺伝子）が、細胞膜を通過するのは困難であるため、これらの分子を細胞に送達する方法がいくつか開発されている（Ｓ．  Ｆｕｔａｋｉ，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  ２００５，  ５７，  ５４７−５５８およびＰ．  Ａ．  Ｗｅｎｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  ２００８，  ６０，  ４５２−４７２参照）。しかし、実際には、細胞毒性を引き起こすなど、多くの問題が提起されている。
【０００３】
細胞膜は、多くの生体膜の一つである。様々な種類の生体膜の中で、浸透が困難であることが周知である生体膜の例としては、血液脳関門、皮膚／角質層関門などが挙げられる。ある種の物質は、細胞膜を容易に通過できるが、核膜およびミトコンドリア膜を容易に通過できないことも周知である。さらに、細胞膜を通過する物質すべてが、他の生体膜に取り囲まれた様々な細胞小器官に容易に浸透できるとは限らない。様々な生体膜の性質およびこれらの間の透過性の違いを考えると、生体内細胞膜を通過する物質が、同様に皮膚関門を通過すると予想できない。
【０００４】
皮膚は、外部刺激または化学物質からの身体の保護に関与しているので、ほとんどの物質は皮膚を通過するのが非常に困難である。適当な脂溶性および水溶性を有する、低分子量の物質は、皮膚に浸透できることが知られている。一般に、物質が皮膚に浸透するためには、分子の種類に関わらず、分子量が約５００Ｄａ以下でなくてはならない（Ｔｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  （２００７）  ｐ．  ２９２；  Ｎａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＳＴＴ  Ｖｏｌ．  ３，  Ｎｏ．  ９  Ｓｅｐｔ．  （２０００）  ｐ．  ３１９参照）。
【０００５】
その一方で、生理活性分子を送達でき、ペプチド系構造または非ペプチド系構造を有する様々な分子輸送体が、開発されている（Ｓ．  Ｋ．  Ｃｈｕｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  ２００８，  ３５４，  １６−２２］；  Ｋ．  Ｋ．  Ｍａｉｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．，  ２００７，  ４６，  ５８８０−５８８４；  Ｋ．  Ｋ．  Ｍａｉｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．，  ２００６，  ４５，  ２９０７−２９１２ならびに韓国特許第０５７８７３２号、第０６９９２７９号、第０８４９０３３号および第１０２１０７８号参照）。
【０００６】
これらの様々な構造の分子輸送体は、様々な小分子またはタンパク質のような高分子を細胞または皮膚組織に送達するために適用されている。例えば、共有結合、ナノデバイス、例えば、リポソームでのカプセル化、およびタンパク質とタンパク質との間の複合体相互作用（complex interaction）は、分子輸送体とカーゴとの結合に用いられている（Ｓ．  Ａ．  Ｎａｓｒｏｌｌａｈｉ，  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  Ｄｒｕｇ．  Ｄｅｓ．  ２０１２，  ８０，  ６３９−６４６；  Ｗ．  Ｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｆ．  Ｄｏｗｄｙ，  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｅｄ．  Ｕ．  Ｌａｎｇｅｌ，  ２００７，  ｐ２０１−２１７；およびＹ．  Ｈｏｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２００７，  １６，  ９９９−１００６参照）。
【０００７】
しかし、分子輸送体およびタンパク質が、これらの間で単純なイオン相互作用を形成する、イオン複合体（ionic complex）の形態でのタンパク質の皮膚への送達はいまだ成功していない。
【発明の開示】
【０００８】
技術的問題
本発明者らは、タンパク質を皮膚に送達するために、先に報告した分子輸送体とタンパク質とを所定の比率までイオン結合することにより、イオン複合体を調製し、このようにして調製したイオン複合体が、タンパク質の皮膚透過性を向上できることを確認し、本発明を完成した。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、タンパク質を皮膚に送達するための皮膚浸透用組成物を提供することである。
【００１０】
問題の解決策
本発明の目的を達成するために、以下の式１〜４
［式１］
【００１１】
【化１】
0006776360.tif 000002
【００１２】
［式２］
【００１３】
【化２】
0006776360.tif 000003
【００１４】
［式３］
【００１５】
【化３】
0006776360.tif 000004
【００１６】
［式４］
【００１７】
【化４】
0006776360.tif 000005
【００１８】
（式中、Ｒ1およびＲ2は、互いに独立にＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ6〜Ｃ12アリールＣ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル、Ｃ3〜Ｃ8ヘテロアルキル、−（ＣＨ2）mＮＨＲ’、−（ＣＨ2）lＣＯ2Ｒ’’，−ＣＯＲ’’’または−ＳＯ2Ｒ’’’’であり、ここでＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は互いに独立にＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ6〜Ｃ12アリールＣ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキルまたはＣ3〜Ｃ8ヘテロアルキルであり、ｍは２〜５の整数であり、１は１〜５の整数であり、
Ｒ3は、
【００１９】
【化５】
0006776360.tif 000006
【００２０】
であり、
Ｒ4は、
【００２１】
【化６】
0006776360.tif 000007
【００２２】
であり、
Ｒ5は、
【００２３】
【化７】
0006776360.tif 000008
【００２４】
であり、
ｎは１〜８の整数である）
で表されるいずれか１つのカチオン性化合物とタンパク質とがイオン結合しているイオン複合体を含む、タンパク質を皮膚に送達するための皮膚浸透用組成物を提供する。
【発明の有利な効果】
【００２５】
本発明による組成物は、細胞膜または皮膚層を通過するのが困難なタンパク質を皮膚に浸透させる優れた効果を示す。したがって、該組成物は、タンパク質を皮膚に送達するために効果的に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本発明の態様に従って緑色蛍光タンパク質を用いて調製したイオン複合体の細胞膜透過性を示す、蛍光画像（Ａ）および細胞形態画像（Ｂ）を示す。
【図２】図２は、本発明の態様に従ってタンパク質としてアルブミン−ＦＩＴＣ（例４）、コンカナバリンＡ−ＦＩＴＣ（例５）および免疫グロブリンＧ−ＦＩＴＣ（例６）各々を用いて調製したイオン複合体の細胞膜透過性を示す、蛍光画像（Ａ）および細胞形態画像（Ｂ）を示す。
【図３】図３は、本発明の態様に従って緑色蛍光タンパク質を用いて調製したイオン複合体をマウスの後肢大腿部（hind leg femur）の皮膚に塗布したときの、マウスの皮膚表面から３３μｍ（Ａ）および６３μｍ（Ｂ）各々の深さで観察したマウス皮膚の蛍光写真を示す。
【図４】図４は、本発明の態様に従ってタンパク質としてアルブミン−ＦＩＴＣ（例４）、コンカナバリンＡ−ＦＩＴＣ（例５）および免疫グロブリンＧ−ＦＩＴＣ（例６）各々を用いて調製したイオン複合体をマウスの後肢大腿部の皮膚に塗布したときの、マウスの皮膚表面から３３μｍ（Ａ）および６３μｍ（Ｂ）各々の深さで観察したマウス皮膚の蛍光写真を示す。
【発明を実施するための最良の態様】
【００２７】
本発明を以下でより詳細に説明する。
【００２８】
本発明は、以下の式１〜４
［式１］
【００２９】
【化８】
0006776360.tif 000009
【００３０】
［式２］
【００３１】
【化９】
0006776360.tif 000010
【００３２】
［式３］
【００３３】
【化１０】
0006776360.tif 000011
【００３４】
［式４］
【００３５】
【化１１】
0006776360.tif 000012
【００３６】
（式中、Ｒ1およびＲ2は、互いに独立にＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ6〜Ｃ12アリールＣ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル、Ｃ3〜Ｃ8ヘテロアルキル、−（ＣＨ2）mＮＨＲ’、−（ＣＨ2）lＣＯ2Ｒ’’，−ＣＯＲ’’’または−ＳＯ2Ｒ’’’’であり、ここでＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は互いに独立にＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ6〜Ｃ12アリールＣ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキルまたはＣ3〜Ｃ8ヘテロアルキルであり、ｍは２〜５の整数であり、１は１〜５の整数であり、
Ｒ3は、
【００３７】
【化１２】
0006776360.tif 000013
【００３８】
であり、
Ｒ4は、
【００３９】
【化１３】
0006776360.tif 000014
【００４０】
であり、
Ｒ5は、
【００４１】
【化１４】
0006776360.tif 000015
【００４２】
であり、
ｎは１〜８の整数である）
で表されるいずれか１つのカチオン性化合物とタンパク質とがイオン結合しているイオン複合体を含む、タンパク質を皮膚に送達するための皮膚浸透用組成物を提供する。
【００４３】
本発明において、イオン複合体は、カチオン性化合物を含む。カチオン性化合物は、上の式１〜４で表されるいずれか１つであってよく、分子輸送体として用いられる（韓国特許第０５７８７３２号、第０６９９２７９号、第０８４９０３３号および第１０２１０７８号参照）。式１〜４に示すように、カチオン性化合物は、様々な側鎖長を有するグアニジン基またはアルギニン基が、直鎖状または分枝状の形態で糖または糖類似体骨格に導入されている構造を有する。カチオン性化合物は水溶性であり、生体膜透過性に優れているため、アニオン性タンパク質と結合したイオン複合体の形態で細胞膜および皮膚層を容易に通過できる。
【００４４】
式１による化合物は、１〜８個のグアニジン基が、分枝状形態の側鎖構造を用いて、所望の官能基を骨格構造に高密度で導入できる糖アルコール誘導体に導入されている構造を有する。本発明の一態様によれば、例えば、式１の化合物は、ソルビトール、マンニトールまたはガラクチトールの立体配座を有するアルジトール誘導体またはその塩であってよい。
【００４５】
より具体的には、式２の化合物は、８個のグアニジン基が導入されているソルビトール誘導体またはその塩であってよい。
【００４６】
より具体的には、式３の化合物は、６個のグアニジン基が導入されているソルビトール誘導体またはその塩であってよい。
【００４７】
式４の化合物は、アルギニン（ｎが１の場合）またはアルギニンオリゴマー（ｎが２〜８のいずれか１つである場合）であってよい。具体的には、ｎが６または８である場合、式４の化合物はアルギニンオリゴマーであってよい。
【００４８】
本発明のイオン複合体に含まれるタンパク質は、それがアニオンであり、カチオン性化合物と結合して、イオン複合体を形成することができる限り、特に限定されない。この例としては、ホルモン、酵素、酵素阻害剤、抗体、サイトカイン、蛍光体などが挙げられる。
【００４９】
とりわけ、ある種の物質が皮膚層を貫通し、真皮に到達するには、分子量が約５００Ｄａ以下でなくてはならないことは当技術分野において常識であるが、本発明の皮膚浸透用組成物は、タンパク質の分子量が５００Ｄａをはるかに超える場合でも、タンパク質が、上に記載したようにカチオン性化合物とイオン複合体を形成することにより、効果的に皮膚に送達できるという点で利点を有する。
【００５０】
例えば、タンパク質の重量平均分子量は、２００ｋＤａ以下、１８０ｋＤａ以下、１５０ｋＤａ以下、１１５ｋＤａ以下、１００ｋＤａ以下、８０ｋＤａ以下、６５ｋＤａ以下、２７ｋＤａ以下または１０ｋＤａ以下であってよい。
【００５１】
タンパク質の具体的な例としては、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、抗体（治療用モノクローナル抗体を含む）、レクチン、インスリン、成長ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、副甲状腺ホルモン、アルブミン、ストレプトアビジン、コンカナバリン、免疫グロブリン等が挙げられる。
【００５２】
本発明のイオン複合体において、カチオン性化合物とタンパク質とは、電荷で１：１〜２０：１、２：１〜１８：１、４：１〜１６：１、５：１〜１５：１、８：１〜１３：１または７．５：１〜１０：１の比でイオン結合していてもよい。
【００５３】
本発明のイオン複合体において、カチオン性化合物とタンパク質とは、モル比で１０：１〜５０：１、２０：１〜４０：１、１２：１〜３０：１または１５：１〜２５：１の比でイオン結合していてもよい。
【００５４】
カチオン性分子輸送体とタンパク質との結合比が、イオン複合体の調製において上の範囲内である場合、イオン複合体１分子当たりのグアニジン基の数が適当であり、したがって細胞透過性が向上し、イオン複合体の形成に関与していない遊離形態の余剰分子輸送体が細胞膜に競争的に浸透する現象を防ぐことができる。その結果、イオン複合体の細胞膜への浸透率を高め、タンパク質（または基質）の送達効率を改善することができる。
【００５５】
本発明による皮膚浸透用組成物は、５０〜１００μｍ、５５〜８０μｍまたは６０〜６５μｍの深さまで皮膚に浸透する。したがって、本発明による皮膚浸透用組成物は、細胞内または皮下、例えば、表皮と真皮との間に浸透し、タンパク質を送達することができる（試験例２ならびに図３および４参照）。したがって、これは、タンパク質を含有する機能性化粧品および皮膚疾患用治療剤（therapeutic agent for skin disorders）の送達を著しく改善できる。さらに、これは、皮下投与を必要とする、タンパク質を含む、様々な治療または診断剤を送達するのに有利に使用できる。
【００５６】
以下で本発明を以下の例によりさらに詳細に説明する。しかし、以下の例は、本発明をさらに例示することを意図している。本発明の範囲はそれにより限定されない。
【００５７】
例１：８個のグアニジン基を有するソルビトール骨格のカチオン性化合物および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むイオン複合体の調製
本発明の式２で表される、ソルビトール骨格および８個のグアニジン基（＋８；グアニジン基１個あたり正電荷１つ）を有するカチオン性化合物（以下、「ソルビトールベースのＧ８分子輸送体」または「ＳＧ８」と称する）を韓国特許第０６９９２７９号の例１に記載の方法に従って調製した。次いで、上で調製したＳＧ８  ３．５μｇ（２．４５ｎｍｏｌ）を３回蒸留水（triple distilled water）１６．７６μｌに溶解し、カチオン性ＳＧ８を含有する溶液を調製した。
【００５８】
その一方で、ＧＦＰ（活性ＡビクトリアＧＦＰ−Ａｂ８４１９１、２７ｋＤａ、Ａｂｃａｍ、−８；ＧＦＰ１つあたり負電荷８つ）１３．８μｇ（０．６８ｎｍｏｌ）を３回蒸留水６．７６μｌに溶解し、アニオン性ＧＦＰを含有する溶液を調製した。
【００５９】
上で調製したアニオン性ＧＦＰを含有する溶液を、カチオン性ＳＧ８を含有する溶液に徐々に滴下し、混合した後、濁った混合溶液が透明になるまで０℃で約３０分間撹拌した。次いで、混合溶液を−２０℃で冷凍貯蔵し、カチオン性化合物とＧＦＰとが１０：１の電荷比でイオン結合しているイオン複合体を得た。
【００６０】
例２：６個のグアニジン基を有するソルビトール骨格のカチオン性化合物およびＧＦＰを含むイオン複合体の調製
本発明の式３で表される、ソルビトール骨格および６個のグアニジン基（＋６；グアニジン基１個あたり正電荷１つ）を有するカチオン性化合物（以下、「ソルビトールベースのＧ６分子輸送体」または「ＳＧ６」と称する）を、韓国特許第０６９９２７９号の例８に記載の方法に従って調製した。次いで、上で調製したＳＧ６  ２．７μｇ（２．４５ｎｍｏｌ）を３回蒸留水１６．７６μｌに溶解し、カチオン性ＳＧ６を含有する溶液を調製した。
【００６１】
その一方で、ＧＦＰ（−８；ＧＦＰ１つあたり負電荷８つ）１３．８μｇ（０．６８ｎｍｏｌ）を３回蒸留水６．７６μｌに溶解し、アニオン性ＧＦＰを含有する溶液を調製した。
【００６２】
上で調製したアニオン性ＧＦＰを含有する溶液を、カチオン性ＳＧ６を含有する溶液に徐々に滴下し、混合した後、濁った混合溶液が透明になるまで０℃で約３０分間撹拌した。次いで、混合溶液を−２０℃で冷凍貯蔵し、カチオン性化合物とＧＦＰとが７．５：１の電荷比でイオン結合しているイオン複合体を得た。
【００６３】
例３：８個のグアニジン基を有するアルギニン８量体およびＧＦＰを含むイオン複合体の調製
本発明の式４で表されるアルギニン８量体（ｎ＝８、＋８）のカチオン性化合物（以下、「ＡＲＧ８」と称する）は、Ｐｅｐｔｒｏｎ  Ｉｎｃ．から供給を受けた。次いで、ＡＲＧ８  ３．１１μｇ（２．４５ｎｍｏｌ）を３回蒸留水１６．７６μｌに溶解し、カチオン性ＡＲＧ８を含有する溶液を調製した。
【００６４】
その一方で、ＧＦＰ（−８；ＧＦＰ１つあたり負電荷８つ）１３．８μｇ（０．６８ｎｍｏｌ）を３回蒸留水６．７６μｌに溶解し、アニオン性ＧＦＰを含有する溶液を調製した。
【００６５】
上で調製したアニオン性ＧＦＰを含有する溶液を、カチオン性ＡＲＧ８を含有する溶液に徐々に滴下し、混合した後、濁った混合溶液が透明になるまで０℃で約３０分間撹拌した。次いで、混合溶液を−２０℃で冷凍貯蔵し、カチオン性化合物とＧＦＰとが１０：１の電荷比でイオン結合しているイオン複合体を得た。
【００６６】
例４：６個のグアニジン基を有するソルビトール骨格のカチオン性化合物および蛍光標識アルブミンを含むイオン複合体の調製
例２に記載の方法で得たカチオン性化合物ＳＧ６  ２９．５μｇ（２６．６ｎｍｏｌ）を３回蒸留水２０．０μｌに溶解し、カチオン性ＳＧ６を含有する溶液を調製した。
【００６７】
その一方で、アルブミン−ＦＩＴＣ（分子量６６ｋＤａ）８８μｇ（０．６８ｎｍｏｌ）を３回蒸留水１０．０μｌに溶解し、アニオン性アルブミン−ＦＩＴＣを含有する溶液を調製した。
【００６８】
上で調製したアニオン性アルブミン−ＦＩＴＣを含有する溶液を、カチオン性ＳＧ６を含有する溶液に徐々に滴下し、混合した後、濁った混合溶液が透明になるまで０℃で約３０分間撹拌した。次いで、混合溶液を−２０℃で冷凍貯蔵し、カチオン性化合物と蛍光標識アルブミンとが約４０：１のモル比でイオン結合しているイオン複合体を得た。
【００６９】
例５：６個のグアニジン基を有するソルビトール骨格のカチオン性化合物および蛍光標識コンカナバリンを含むイオン複合体の調製
例２に記載の方法で得たカチオン性化合物ＳＧ６  ２９．５μｇ（２６．６ｎｍｏｌ）を３回蒸留水２０．０μｌに溶解し、カチオン性ＳＧ６を含有する溶液を調製した。
【００７０】
その一方で、コンカナバリンＡ−ＦＩＴＣ（分子量１０２ｋＤａ）１３５μｇ（０．６８ｎｍｏｌ）を３回蒸留水１０．０μｌに溶解し、アニオン性コンカナバリンＡ−ＦＩＴＣを含有する溶液を調製した。
【００７１】
上で調製したアニオン性コンカナバリンＡ−ＦＩＴＣを含有する溶液を、カチオン性ＳＧ６を含有する溶液に徐々に滴下し、混合した後、濁った混合溶液が透明になるまで０℃で約３０分間撹拌した。次いで、混合溶液を−２０℃で冷凍貯蔵し、カチオン性化合物と蛍光標識コンカナバリンＡとが約４０：１のモル比でイオン結合しているイオン複合体を得た。
【００７２】
例６：６個のグアニジン基を有するソルビトール骨格のカチオン性化合物および蛍光標識免疫グロブリンを含むイオン複合体の調製
例２に記載の方法で得たカチオン性化合物ＳＧ６  ２９．５μｇ（２６．６ｎｍｏｌ）を３回蒸留水２０．０μｌに溶解し、カチオン性ＳＧ６を含有する溶液を調製した。
【００７３】
その一方で、免疫グロブリンＧ−ＦＩＴＣ（分子量１５０ｋＤａ）１９９μｇ（０．６８ｎｍｏｌ）を３回蒸留水１０．０μｌに溶解し、アニオン性免疫グロブリンＧ−ＦＩＴＣを含有する溶液を調製した。
【００７４】
上で調製したアニオン性免疫グロブリンＧ−ＦＩＴＣを含有する溶液を、カチオン性ＳＧ６を含有する溶液に徐々に滴下し、混合した後、濁った混合溶液が透明になるまで０℃で約３０分間撹拌した。次いで、混合溶液を−２０℃で冷凍貯蔵し、カチオン性化合物と蛍光標識免疫グロブリンＧとが約４０：１のモル比でイオン結合しているイオン複合体を得た。
【００７５】
試験例１：細胞膜透過性の測定
上の例で調製したイオン複合体の細胞膜透過性を確認するために、ＧＦＰ基質自体から放出される蛍光を共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００）で測定した。
【００７６】
最初に、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２（商標））を、ディッシュプレート（dish plate）中の培養培地として１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）で培養した。次いで、イオン複合体中のＧＦＰの最終濃度が１μＭになるように、血清を含まない培地を、例１〜３で調製したイオン複合体に添加した。ＨｅＬａ細胞をイオン複合体で処理し、３７℃で１時間培養した。その後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、細胞膜への透過性を、共焦点顕微鏡で直ちに観察した。その一方で、イオン複合体の代わりに、ＧＦＰのみを対照群に使用した。
【００７７】
Ａｒレーザー（４８８ｎｍ）をＧＦＰの励起に使用し、細胞を４０倍率で観察した。結果を図１に示す。図１において、Ａ列は、イオン複合体で処理した細胞の蛍光画像を示し、Ｂ列はイオン複合体で処理した細胞の形態画像（ＤＩＣ）を示している。
【００７８】
図１に示すように、本発明の例１〜３の各イオン複合体で処理した細胞は、ＧＦＰのみで処理した対照群よりも非常に強い蛍光シグナルを示した。
【００７９】
さらに、上記の方法により調製した例４〜６で調製したイオン複合体を用いて、ＨｅＬａ細胞の細胞膜透過性を共焦点顕微鏡で観察した。結果を図２に示す。図２において、Ａ列は、イオン複合体で処理した細胞の蛍光画像を示し、Ｂ列はイオン複合体で処理した細胞の形態画像（ＤＩＣ）を示している。
【００８０】
図２に示すように、本発明の例４〜６の各イオン複合体で処理した細胞は、細胞に浸透したタンパク質の強い蛍光シグナルを示した。
【００８１】
試験例２：マウス皮膚への浸透およびその中の分布の測定
上の例で調製したイオン複合体のマウス皮膚への透過性を確認するために、ＧＦＰ基質自体から放出される蛍光を、２光子レーザー走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で測定した。
【００８２】
最初に、例２および３で調製したイオン複合体を、ＧＦＰの最終濃度が２４．７μｌになるように３回蒸留水で各々希釈した。その後、イオン複合体の水溶液１５μｌをＰＥＧ４００  ５０μｌと混合し、ＧＦＰを１５．４重量％有する試料溶液を調製した。
【００８３】
生後７週間のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを各々ガスで麻酔し、上で調製した試料溶液６５μｌを、後肢大腿部の皮膚に１ｃｍ×１ｃｍの面積で塗布した。次いで、麻酔状態下でマウスを暗室に３時間放置した。３時間後、脚の試料を蒸留水および７０％エタノールで洗浄し、マウスを二酸化炭素で安楽死させた。その後、大腿部の皮膚組織を剥がし、スライドガラス上に置き、カバースリップで固定した。各スライド試料の経皮透過性を、２光子レーザー顕微鏡で観察した。フェムト秒レーザー（波長９００ｎｍ）を使用して、蛍光体を励起し、皮膚表面から３μｍの深さ間隔で皮下層を連続撮影した。代表的な特定の深さ（３３μｍおよび６３μｍ）の画像を観察した。結果を図３に示す。図３において、Ａ行は、深さ３３μｍから観察したマウス皮膚の蛍光写真を示し、Ｂ行は深さ６３μｍで観察したものを示している。
【００８４】
図３に示すように、例２および３のイオン複合体は、ＧＦＰのみで処理した対照群と比較してマウスの皮下層に良好に浸透していることが確認された。さらに、撮影深さが増すと、タンパク質の量は徐々に減少し、蛍光強度が弱くなった。２光子レーザー走査顕微鏡で測定した経皮透過性の結果によれば、蛍光を有するタンパク質は、少なくとも６３μｍの深さまで浸透したことが観察された。
【００８５】
さらに、上で記載したように例４〜６で調製したイオン複合体を用いて、基質としての蛍光標識タンパク質から放出される蛍光を２光子レーザー走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で測定した。結果を図４に示す。図４において、Ａ行は、深さ３３μｍから観察したマウス皮膚の蛍光写真を示し、Ｂ行は、深さ６３μｍで観察したものを示している。
【００８６】
図４に示すように、例４〜６で調製したタンパク質のイオン複合体は、マウスの皮下層に十分に浸透した。
【００８７】
上の結果から、本発明に従って調製したイオン複合体は、細胞膜および皮膚への高い透過性を示すことが確認された。さらに、分子量が非常に高いタンパク質を、従来の方法により皮膚表面から皮下層に送達するのは困難である。しかし、カチオン性化合物と結合し、それにより本発明による単純なイオン複合体を形成するようなタンパク質は、皮膚層および真皮層に十分に送達されることが確認された。
【００８８】
したがって、本発明によるイオン複合体は、タンパク質を細胞または皮下層（すなわち、表皮または真皮）に送達するのに有利に使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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