(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
角膜又は結膜疾患の罹患の有無を検査する方法であって、下記工程：
（ｉ）被験動物から得られた涙液中のミトコンドリアＤＮＡを測定する工程；及び、
（ｉｉ）正常対照について得られる前記工程（ｉ）の結果と対比して、ミトコンドリアＤＮＡ量が増加していることを指標として角膜又は結膜疾患の罹患の有無を検出する工程、
を含む、検査方法。
【請求項２】
前記ミトコンドリアＤＮＡが涙液中の細胞外膜小胞内に含まれる、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
前記ミトコンドリアＤＮＡが涙液中のエキソソーム内に含まれる、請求項１又は２に記載の検査方法。
【請求項４】
前記角膜又は結膜疾患が、円錐角膜、角膜輪部疲弊症、又はドライアイである、請求項１〜３のいずれかに記載の検査方法。
【請求項５】
前記（ｉ）工程において、シトクロムｂ、ＣＯＸＩ、ＣＯＸＩＩ、ＣＯＸＩＩＩ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット１、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット２、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット３、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４Ｌ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６、ＡＴＰａｓｅ第６サブユニット及びＡＴＰａｓｅ第８サブユニットからなる群より選択される少なくとも１種を検出することが可能な試薬を用いて前記ミトコンドリアＤＮＡを測定する、請求項１〜４のいずれかに記載の検査方法。
【請求項６】
ミトコンドリアＤＮＡを検出可能な試薬を含む、中心性漿液性脈絡網膜症の診断キット。
【請求項７】
前記ミトコンドリアＤＮＡを検出可能な試薬が、シトクロムｂ、ＣＯＸＩ、ＣＯＸＩＩ、ＣＯＸＩＩＩ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット１、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット２、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット３、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４Ｌ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６、ＡＴＰａｓｅ第６サブユニット及びＡＴＰａｓｅ第８サブユニットからなる群より選択される少なくとも１種を検出することが可能な試薬である、請求項６に記載の診断キット。
【請求項８】
中心性漿液性脈絡網膜症の罹患の有無を検査する方法であって、下記工程：
（ｉ）被験動物から得られた血清中のミトコンドリアＤＮＡを測定する工程；及び、
（ｉｉ）正常対照について得られる前記工程（ｉ）の結果と対比して、ミトコンドリアＤＮＡ量が増加していることを指標として中心性漿液性脈絡網膜症の罹患の有無を検出する工程、
を含む、検査方法。
【請求項９】
前記ミトコンドリアＤＮＡが涙液中の細胞外膜小胞内に含まれる、請求項８に記載の検査方法。
【請求項１０】
前記ミトコンドリアＤＮＡが涙液中のエキソソーム内に含まれる、請求項８又は９に記載の検査方法。
【請求項１１】
前記（ｉ）工程において、シトクロムｂ、ＣＯＸＩ、ＣＯＸＩＩ、ＣＯＸＩＩＩ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット１、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット２、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット３、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４Ｌ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６、ＡＴＰａｓｅ第６サブユニット及びＡＴＰａｓｅ第８サブユニットからなる群より選択される少なくとも１種を検出することが可能な試薬を用いて前記ミトコンドリアＤＮＡを測定する、請求項８〜１０のいずれかに記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、角膜疾患、結膜疾患又は中心性漿液性脈絡網膜症の正確な評価が可能な眼科疾患のバイオマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ある疾患の易罹患性、罹患の有無、又は進行度等を評価する方法として、バイオマーカーを利用する方法が知られている。バイオマーカーは、血液や尿などの生体体液中に測定されるタンパク質等の物質を標識とするものであり、特定の疾病の存在や進行度をバイオマーカーの濃度に反映させることができる。【０００３】
バイオマーカーを利用した特定の疾患を評価する方法としては、これまでに種々検討されている。
例えば、引用文献１には、血清や尿等の生体体液中に含まれるミトコンドリアＤＮＡからなる自己免疫疾患のバイオマーカーが開示されている。この自己免疫疾患のバイオマーカーは、本発明者らが、自己免疫疾患患者の生体体液中にミトコンドリアＤＮＡが高濃度で存在するとの知見を得て完成させたものである。【０００４】
ところで、ヒトの涙液は、９８％が水分からなり、残りはアルブミンやグロブリン等のタンパク質を含み、眼表面の水分保持、恒常性の維持に重要な役割を果たしている。涙液には、様々な眼疾患において、浸透圧変化やタンパク質の含量変化などの組成変化が認められる。そのため、涙液は、眼表面のみならず全身の病態を鋭敏に反映すると考えられている。これまでの研究においては、サイトカイン、ケモカインタンパクなどが眼表面の炎症に関与することが知られ、実際涙液で検出された報告がある。【０００５】
しかしながら、眼表面の炎症の結果として検出されるこれらの物質以外に、眼組織において炎症や何らかの疾患に関連する物質は同定されていない。また、眼科疾患のバイオマーカーとして同定されている物質もこれまでにない。眼表面においては、角膜上皮細胞、結膜上皮細胞などが常に細胞分裂・脱落を繰り返しており、これらの細胞由来成分が眼表面に分布することにより、自然免疫センサーを刺激して様々な炎症反応を起こす。このため、炎症の原因となる物質を特定するのが困難であった。【０００６】
また、涙液は、被検試料として、採取に際し侵襲性が低い点で好適であると考えられるが、涙液から物質を検出する場合、サンプル量が微量であり、従来のシステムでは、当該物質の同定・定量が困難であった。このように、眼科疾患のバイオマーカーについては、研究が充分に進んでいなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開公報第２０１４／０３８６２２号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、涙液をサンプルとして適用でき、角膜疾患又は結膜疾患を簡便かつ正確に評価することができるバイオマーカーを提供することを主な目的とする。また、本発明は、中心性漿液性脈絡網膜症を簡便かつ正確に評価することができるバイオマーカーを提供することを主な目的とする。また、本発明は、当該バイオマーカーを演出することが可能な試薬を含む診断キット、及び、当該バイオマーカーを利用した検査方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、角膜又は結膜疾患患者は、健常人と比較して、涙液中のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）量が有意に増加することを見出した。また、ｍｔＤＮＡを利用するので、従来技術では微量で適用が困難であった涙液をサンプルとして利用することができることを見出した。更に、本発明者らは、中心性漿液性脈絡網膜症患者は、健常人と比較して、血清中のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）量が有意に増加することを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に研究を重ねた結果完成されたものである。【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．涙液中に含まれるミトコンドリアＤＮＡからなる角膜又は結膜疾患のバイオマーカー。
項２．ミトコンドリアＤＮＡが涙液中の細胞外膜小胞内に含まれる、項１に記載の角膜又は結膜疾患のバイオマーカー。
項３．ミトコンドリアＤＮＡが涙液中のエキソソーム内に含まれる、項１又は２に記載の角膜又は結膜疾患のバイオマーカー。
項４．角膜又は結膜疾患が、円錐角膜、角膜輪部疲弊症、又は、ドライアイである、項１〜３のいずれかに記載の角膜又は結膜疾患のバイオマーカー。
項５．ミトコンドリアＤＮＡを検出可能な試薬を含む、角膜又は結膜疾患の診断キット。項６．前記ミトコンドリアＤＮＡを検出可能な試薬が、シトクロムｂ、ＣＯＸＩ、ＣＯＸＩＩ、ＣＯＸＩＩＩ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット１、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット２、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット３、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４Ｌ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６、ＡＴＰａｓｅ第６サブユニット及びＡＴＰａｓｅ第８サブユニットからなる群より選択される少なくとも１種を検出することが可能な試薬である、項５に記載の診断キット。
項７．角膜又は結膜疾患の罹患の有無を検査する方法であって、下記工程：
（ｉ）被験動物から得られた涙液中のミトコンドリアＤＮＡを測定する工程；及び、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）の結果に基づいて角膜又は結膜疾患の罹患の有無を検出する工程、を含む、検査方法。
項８．前記工程（ｉｉ）が、被験動物について得られる工程（ｉ）の結果を、正常対照について得られる工程（ｉ）の結果と対比して、ミトコンドリアＤＮＡ量が増加していることを指標として行われる、項７に記載の検査方法。
項９．血清中に含まれるミトコンドリアＤＮＡからなる中心性漿液性脈絡網膜症のバイオマーカー。
項１０．ミトコンドリアＤＮＡを検出可能な試薬を含む、中心性漿液性脈絡網膜症の診断キット。
項１１．中心性漿液性脈絡網膜症の罹患の有無を検査する方法であって、下記工程：
（ｉ）被験動物から得られた血清中のミトコンドリアＤＮＡを測定する工程；及び、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）の結果に基づいて中心性漿液性脈絡網膜症の罹患の有無を検出する工程、を含む、検査方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のバイオマーカーによれば、角膜又は結膜疾患を正確に評価することができる。また、本発明では、サンプルとして涙液を適用することができ、より簡便に定量性をもって角膜又は結膜疾患を評価できるシステムを提供することができる。本発明のバイオマーカーに基づいて得られた結果は、患者個々の病変に応じた治療法の最適化に資するものである。また、本発明によれば、前記バイオマーカーを含む角膜又は結膜疾患の診断キットが提供され得る。
また、本発明のバイオマーカーによれば、中心性漿液性脈絡網膜症を正確に評価することができる。更に、本発明によれば、前記バイオマーカーを含む中心性漿液性脈絡網膜症の診断キットが提供され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】エキソソームの分泌、代謝経路を示す概略図である。
【図２】実験例１の結果、即ち、眼炎症、角膜疾患、又は網膜疾患の患者群と正常対照群の涙液中のｍｔＤＮＡ値を示したグラフである。
【図３】実験例２の結果、即ち、ドライアイ患者群と正常対照群の涙液中のｍｔＤＮＡ値を示したグラフである。
【図４】実験例３の結果、即ち、円錐角膜、角膜輪部疲弊症、又はドライアイの患者群と正常対照群の涙液中のｍｔＤＮＡ量を示したグラフである。
【図５】実験例４の結果、即ち、中心性漿液性脈絡網膜症患者群と正常対照群の血清中のｍｔＤＮＡ値を示したグラフである。
【図６】実験例５の結果、即ち、臨床所見（網膜のＯＣＴ(光干渉断層計）像）と血清中ミトコンドリアＤＮＡ濃度との関係（左図）、並びに中心性漿液性脈絡網膜症の患者群と正常対照群の血清中のｍｔＤＮＡ値（右図）を示すグラフである。
【図７】実験例６の結果、即ち、中心性漿液性脈絡網膜症に罹患した患者の臨床データ（視力、眼圧、年齢、経過観察期間、中心窩脈絡膜厚、漿液性剥離等）と血清中ミトコンドリアＤＮＡ濃度について多変量解析した結果を示す図である。
【図８】実験例７の結果、即ち、円錐角膜患者群、ドライアイ患者群、角膜輪部疲弊症群、及び正常対照群の血清中のｍｔＤＮＡ値を示したグラフである。
【図９】実験例８の結果、即ち、健常人由来のＣＤ１４陽性単球に、円錐角膜患者、角膜輪部疲弊症患者、ドライアイ患者、及び健常人の涙液を添加して培養し、培養上清中のＩＬ−８濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】実験例９の結果、即ち、ヒト網膜色素上皮細に、中心性漿液性脈絡網膜症患者、及び健常人の涙液を添加して培養し、培養上清中のＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡの各濃度を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜１．角膜又は結膜疾患のバイオマーカー＞
バイオマーカー
第１の本発明の角膜又は結膜疾患のバイオマーカーは、涙液中に含まれるミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）からなることを特徴とする。本発明においては、ｍｔＤＮＡが角膜又は結膜疾患の患者の涙液中に高濃度で存在することに基づき、これを角膜又は結膜疾患の評価指標として用いる。
【００１４】
ｍｔＤＮＡは、細胞小器官であるミトコンドリアのマトリクス中に存在する環状二本鎖ＤＮＡである。ｍｔＤＮＡには、シトクロムｂ、シトクロムｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）サブユニットＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩ；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＨ）のサブユニット１、２、３、４、４Ｌ、５、６；ＡＴＰ合成酵素（ＡＴＰａｓｅ）第６サブユニット及び第８サブユニットがコードされている。本発明のバイオマーカーとしてのｍｔＤＮＡの検出は、ｍｔＤＮＡにコードされるこれらの遺伝子のＤＮＡを検出することにより行うことができる。前記具体的な遺伝子のいずれか１種を角膜又は結膜疾患のバイオマーカーとして検出してもよく、２種以上を組合せて検出し、角膜又は結膜疾患の評価に利用することもできる。例えば、本発明の角膜又は結膜疾患のバイオマーカーであるｍｔＤＮＡの検出には、ＣＯＸＩＩＩ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、シトクロムｂ等を好適に利用することができる。
【００１５】
また、上記一連のタンパク質は環状のｍｔＤＮＡ上にコードされていることから、いずれのタンパク質をコードするＤＮＡを指標として使用してもｍｔＤＮＡの挙動を正確に検出することが可能である。
【００１６】
涙液の由来は特に限定されず、任意の動物とすることができる。より具体的には、ヒト及びヒトを除く哺乳動物が挙げられる。ヒトを除く哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類が挙げられる。本発明において涙液の由来として、好ましくは霊長類、更に好ましくはヒトである。
【００１７】
本発明の角膜又は結膜疾患のバイオマーカーにおいて使用する生体体液は、涙液である。涙液中にはｍｔＤＮＡが含まれる。本発明の角膜又は結膜疾患のバイオマーカーは、ｍｔＤＮＡを標識とするので、涙液のような微量のサンプルであっても、ｍｔＤＮＡを定量することができる。また、涙液は、採取に際し侵襲性が低い。このように、本発明のバイオマーカーは、涙液を使用するので、従来技術と比較して、より簡便でかつ正確に評価することができるものである。
【００１８】
本発明において涙液は、眼から直接スポイトやガラスキャピラリー等で採取して得られる。また、本発明における涙液は、溶液で眼を洗浄し、洗浄後の溶液を回収したものであってもよい。眼を洗浄した後の溶液としては、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）を用いて下眼瞼結膜のぬぐい液として回収したものが挙げられる。具体的には、３０μＬのＰＢＳをマイクロピペットで採り、細隙灯顕微で観察しながら、被検者には上方視してもらい下眼瞼結膜にＰＢＳを滴下しすぐに結膜上のｍｔＤＮＡを結膜ぬぐい液として回収したものである。
【００１９】
本発明のバイオマーカーとしては、涙液中の細胞外膜小胞画分に局在するｍｔＤＮＡを使用することがより好ましい。細胞外膜小胞は、エキソソームと、エクトソームと呼ばれるマイクロベジクルとを含んでいるが、エキソソーム画分に局在するｍｔＤＮＡを本発明のバイオマーカーとして使用することがより好ましい。エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）は、直径５０〜２００ｎｍの脂質二重膜からなる小胞であり、ｍＲＮＡやｍｉｃｒｏＲＮＡ、細胞質内に存在する様々なタンパク質を内包し、ドナー細胞に依存して様々な生物活性を有することが知られている。エキソソームは、後期エンドソームから発生する分泌小胞に向かって出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）し、ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｂｏｄｙ（ＭＶＢ）を形成して細胞表面まで運ばれる。そしてＭＶＢが細胞膜と膜融合することにより内容物であるエキソソームが細胞外へ放出される。ＭＶＢは通常、細胞表面に運ばれる以外にｌｙｓｏｓｏｍｅにも輸送され、ｌｙｓｏｓｏｍｅと融合してその内容物が分解される（以上について、図１を参照）。
【００２０】
ｍｔＤＮＡは、このような脂質二重膜を有する細胞外膜小胞、特にエキソソーム中に存在することによって、細胞外に存在するＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）による分解から保護され、安定に存在していると考えられる。そのため、エキソソーム中に存在するｍｔＤＮＡをバイオマーカーとして利用することにより、より一層正確な角膜又は結膜疾患の評価が可能である。また、エキソソームは、涙液にも含まれていることが知られており、涙液からエキソソームを単離し、その中に含まれているｍｔＤＮＡを測定することにより、低侵襲的又は非侵襲的な評価系の樹立への可能性が開かれる。
【００２１】
エキソソームの分離方法は、ｍｔＤＮＡの検出用の試料として使用可能なものが得られる限り特に限定されず、従来公知の方法から適宜選択して行うことができる。エキソソームの分離は超遠心により行うことができるが、より簡便には、商業的に入手可能なキットを用いてエキソソームの分離を行うことができ、具体的にはＥｘｏＱｕｉｃｋＴＭ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ溶液、Ｅｘｏｑｕｉｃｋ−ＴＣ等（いずれもＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）が例示される。
【００２２】
また涙液中のｍｔＤＮＡは、エキソソーム以外の画分にも含まれており、核酸が露出したフリーの状態で存在又はタンパク質と結合して存在しているものもある。
【００２３】
ｍｔＤＮＡの検出は、前記涙液又はエキソソーム画分からポリヌクレオチドを調製し、これを鋳型としてプライマーにより増幅反応を行うか、または当該ポリヌクレオチドにプローブを用いてハイブリダイゼーション反応を行うことで実施される。調製されるポリヌクレオチドは、安定性や評価の正確性の観点からはＤＮＡが好ましいものとして挙げられる。涙液又はエキソソーム画分からのポリヌクレオチドの調製は、公知の方法を適宜使用して実施することができ、例えば、フェノール抽出及びエタノール沈殿による方法、ガラスビーズを用いる方法等が挙げられる。より簡便には、市販のＤＮＡ抽出試薬又はＤＮＡ抽出キットを使用して調製することが可能である。例えば、ＤＮＡ抽出キットとして具体的にはＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  ＳＰ  Ｋｉｔ（和光純薬工業（株）製）が挙げられる。
【００２４】
ｍｔＤＮＡにコードされる前述のタンパク質に対応するＤＮＡの検出は、従来公知の方法から適宜選択して行うことができる。検出には、通常、その発現量の測定や増幅を行うためにプローブとなるポリヌクレオチド又はプライマーとなるオリゴヌクレオチドを使用する。プライマーとしては、標的の遺伝子の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズして当該遺伝子を増幅することが可能な特有の配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。また、プローブとしては、標的の遺伝子の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする特有の配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２５】
これらのプライマー又はプローブは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等のプログラム及びデータベースを利用して標的とする遺伝子の配列情報を取得し、これに基づいて従来公知の方法に従って設計、合成することができる。プライマーの塩基配列長としては、通常１６〜３２ｂｐ、好ましくは１８〜３０ｂｐ、更に好ましくは２０〜２４ｂｐが挙げられる。例えば、シトクロムｂ遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットとして、具体的には後述する実施例において使用される配列番号１及び２で表されるプライマーセットが挙げられる。また、ＣＯＸＩＩＩ遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーセットとしては、具体的には、５’−ＡＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＡＴＣＡＣＡＴＧＣ−３’（フォワードプライマー：配列番号３）；５’−ＡＴＣＡＣＡＴＧＧＣＴＡＧＧＣＣＧＧＡＧ−３’（リバースプライマー：配列番号４）が例示される。また、ＮＡＤＨ遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットとしては、具体的には、５’−ＡＴＡＣＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＣＴＣＣＴ−３’（フォワードプライマー：配列番号５）；５’−ＧＧＧＣＣＴＴＴＧＣＧＴＡＧＴＴＧＴＡＴ−３’（リバースプライマー：配列番号６）が例示される。
【００２６】
ｍｔＤＮＡの検出は、前述のようなプライマーを用いた遺伝子の増幅反応によって得られる増幅産物、又はプローブを用いたハイブリダイゼーション反応により得られるハイブリッド産物に基づいて行うことができる。
【００２７】
標的遺伝子の増幅については、従来公知の方法を採用することができ、特に限定されないが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ／ＲＮＡの増幅が挙げられ、より具体的にはＲＴ−ＰＣＲ、ネスティッドＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、競合ＰＣＲ、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ、Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ等が例示される。また、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等のＰＣＲの変法を利用してもよい。
【００２８】
増幅産物の検出は、所望のポリヌクレオチドであるか否かが判別できる方法であれば特に限定されないが、例えば、アガロースゲル泳動法により所定のサイズのポリヌクレオチドが増幅されているか否かを確認することができる。また、増幅反応の過程で増幅産物に取り込まれるデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を標識化しておき、増幅産物中に取り込まれたｄＮＴＰの標識物質を測定することにより検出することができる。標識物としては、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＳＲ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）等の蛍光物質；ルシフェリン等の発光物質；３２Ｐ、３５Ｓ、１２１Ｉ等の放射性同位体が例示される。あるいは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ等を用いたインターカレーター法等により定量的に検出を行ってもよい。
【００２９】
また、ｍｔＤＮＡの検出に使用されるプローブの塩基配列長としては、通常２０〜２５０ｂｐ、好ましくは２０〜１００ｂｐ、更に好ましくは２０〜５０ｂｐが挙げられる。また、前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブは、当該ポリヌクレオチドの少なくとも一部にハイブリダイズし、検出され得るものであればよく、完全な相補的配列を有するものでなくてもよい。
【００３０】
前述のプローブを用いたハイブリダイゼーション反応についても従来公知の条件に基づいて、標的のポリヌクレオチドに特異的にプローブがハイブリダイズする条件（ストリンジェントな条件）、例えば９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件を適宜設定することが可能である。ストリンジェントな条件としては、例えば、温度４０℃〜７０℃において、ナトリウム濃度１５０〜９００ｍＭ、ｐＨ６〜８により洗浄する条件が挙げられ、より具体的には５０℃、２×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸）、０．１容量％ＳＤＳにより洗浄する条件が挙げられる。
【００３１】
また、必要に応じてプローブを、フルオロセイン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＳＲ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）等の蛍光物質；ルシフェリン等の発光物質；３２Ｐ、３５Ｓ、１２１Ｉ等の放射性同位体；アルカリホスファターゼ、ホースラディシュパーオキシダーゼ等の酵素；ビオチン等の標識物質を用いて標識化しておいてもよい。ハイブリダイゼーション反応後にこれらの標的物質を各標識物質の種類に基づいて従来公知の方法に従って検出することにより、ハイブリダイゼーション産物を検出することができる。
【００３２】
角膜又は結膜疾患に罹患している動物（好ましくはヒト）では、本発明のバイオマーカーである涙液中（又はエキソソーム中）に含まれるｍｔＤＮＡ量が正常対照群と比較して有意に増加する。ここで、正常対照群とは、角膜又は結膜疾患に罹患しておらず、かつ、炎症症状の認められない健康な被検動物（好ましくはヒト）を指す。
【００３３】
本発明において角膜疾患とは、角膜が損傷、変形したり、細菌やウイルスが角膜に感染して炎症を起こして、発症する疾患である。角膜疾患としては、例えば、円錐角膜、角膜輪部疲弊症、乾性角結膜炎（ドライアイ）、びまん性表層性角膜炎、角膜上皮びらん、細菌性角膜感染症、角膜潰瘍、角膜実質炎、角膜軟化症、角膜混濁、角膜変性症等が挙げられる。
また、結膜疾患は、結膜で炎症が起こり、発症する疾患であり、結膜疾患としては、例えば、結膜炎、アレルギー性結膜炎、流行性角結膜炎、咽頭結膜熱、結膜下出血、結膜結石、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡等が挙げられる。なかでも、本発明のバイオマーカーは、円錐角膜、乾性角結膜炎（ドライアイ）、又は、角膜輪部疲弊症のバイオマーカーとして好適に使用される。
【００３４】
以上のとおり、本発明のバイオマーカーは、角膜又は結膜疾患を簡便かつ正確に評価することができる。
【００３５】
診断キット
本発明の角膜又は結膜疾患の診断キットは、前記ｍｔＤＮＡを検出可能な試薬を含む。ｍｔＤＮＡを検出することが可能な試薬としては、ｍｔＤＮＡの検出をｍｔＤＮＡにコードされる遺伝子又は遺伝子断片に基づいて行う場合であれば、当該遺伝子又は遺伝子断片を特異的に増幅するプライマー、又は当該遺伝子又は遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブが試薬として含まれる。本発明のキットに含まれる試薬として具体的には、配列番号１〜６に示されるプライマーが例示される。これらのプライマー及びプローブについては、前述の角膜又は結膜疾患の「バイオマーカー」の欄に記載の通りである。
【００３６】
更に、ｍｔＤＮＡを検出可能な試薬は、緩衝液、塩、安定化剤、防腐剤等を含んでいてもよく、従来公知の方法に従い、製剤化されていてもよい。また、本発明の診断キットには、前記試薬の他に、ｍｔＤＮＡの検出を実施するために必要とされ得る、標識物質、標識物質の検出剤、反応希釈液、標準抗体、緩衝液、溶解剤、洗浄剤、反応停止液、コントロール試料等を含んでいてもよい。
【００３７】
本発明のキットにおいて、例えばｍｔＤＮＡを検出するためのプローブを不溶化担体上に固定化して用いることもできる。従って、本発明の診断キットには、不溶化担体も包含され得る。不溶化担体の素材としては、ｍｔＤＮＡの検出を妨げない限り特に限定されないが、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリルニトリル、ポリビニルクロライド、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド、紙、シリコン、ガラス、金属、アガロース等を例示することができる。また、これらの材料を２種以上組合せて用いてもよい。不溶化担体の形状としては、例えばマイクロプレート、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等のいずれの形状であってもよい。
【００３８】
例えば、前述の不溶化担体上にｍｔＤＮＡにコードされる遺伝子と特異的にハイブリダイズし得るプローブを固定化することにより、角膜又は結膜疾患の検出に使用されるＤＮＡチップとすることもできる。プローブの不溶化担体への固定化は従来公知の方法に従って行うことができる。また、ｍｔＤＮＡに対するプローブを異なる濃度で等間隔に担体へ固定化して、ｍｔＤＮＡとハイブリダイズさせることにより半定量的にｍｔＤＮＡを検出することができる。
【００３９】
涙液中のｍｔＤＮＡ量に基づく評価方法
本発明は、前述のバイオマーカーである涙液中のｍｔＤＮＡを利用した、下記工程を含む角膜又は結膜疾患の罹患の有無を検査する方法を提供する。
（ｉ）被験動物から得られた涙液中のミトコンドリアＤＮＡを測定する工程；及び、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）の結果に基づいて角膜又は結膜疾患の罹患の有無を検出する工程。
【００４０】
前記工程（ｉ）に記載される、涙液中のｍｔＤＮＡの測定については、前記「バイオマーカー」欄の記載に従って実施することができる。また、前記工程（ｉｉ）に記載される検出工程は、被験動物について得られる工程（ｉ）の結果を、正常対照群について得られる工程（ｉ）の結果と対比して、ミトコンドリアＤＮＡ量が増加していることを指標として行うことができる。ここで、正常対照群については、前記「バイオマーカー」の欄に記載の通りである。
【００４１】
前記工程（ｉｉ）に記載される検出工程では、被験動物から得られた涙液中のミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて多い場合には、角膜又は結膜疾患に罹患している可能性が高いと判定される。更に、被験動物から得られた涙液中のミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて著しく多い場合には、被験動物は角膜又は結膜疾患に罹患している可能性が極めて高いと判定される。なお、本発明において、「ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて多い」とは、正常対照群の涙液中のミトコンドリアＤＮＡ量の平均値＋２×ＳＤ（標準偏差、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）の値以上であることを指し、「ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照に比べて著しく多い」とは、正常対照群の涙液中のミトコンドリアＤＮＡ量の平均値＋４×ＳＤの値以上であることを指す。正常対照群の涙液中のミトコンドリアＤＮＡ量の平均値及びＳＤは、例えば、２４名以上の正常対照群の涙液中のミトコンドリアＤＮＡ量を測定することによって求めることができる。また、本発明者によって、正常対照（ヒト）群の涙液中のミトコンドリアＤＮＡ量について、平均値＋２×ＳＤの値が６４８．１ｐｇ（ピコグラム）／３０μＬ、平均値＋４×ＳＤの値が８５４．５ｐｇ／３０μＬであることが確認されているので、涙液中のミトコンドリア量が６４８．１ｐｇ／３０μＬ以上であれば「ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照に比べて多い」、涙液中のミトコンドリア量が８５４．５ｐｇ／３０μＬ以上であれば「ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照に比べて著しく多い」と判断することができる。
【００４２】
また、被検動物としては、ヒト及びヒトを除く哺乳動物が挙げられる。ヒトを除く哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類が挙げられる。本発明において被検動物として、好ましくは霊長類、更に好ましくはヒトである。
【００４３】
更に、本発明のバイオマーカーに基づく評価は、角膜又は結膜疾患の罹患の有無の検査以外にも、角膜又は結膜疾患の易罹患性の予測方法、重症度の検出方法、予後の予測方法、治療薬のスクリーニング方法、角膜又は結膜疾患の鑑別診断に利用することができる。
【００４４】
本発明のバイオマーカーに基づいて角膜又は結膜疾患に対する易罹患性を評価する場合（角膜又は結膜疾患に対する易罹患性の予測方法）、前記角膜又は結膜疾患の罹患の有無を検査する方法と同様に、被検動物から得られた涙液中のミトコンドリアＤＮＡを測定した結果に基づき、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて多い場合には角膜又は結膜疾患を罹患しやすい、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて著しく多い場合には角膜又は結膜疾患を特に罹患しやすい、という基準に従って易罹患性の予測が行われる。
【００４５】
本発明のバイオマーカーに基づいて角膜又は結膜疾患の重症度を評価する場合（角膜又は結膜疾患の重症度の検出方法）、前記角膜又は結膜疾患の罹患の有無を検査する方法と同様に、被検動物から得られた涙液中のミトコンドリアＤＮＡを測定した結果に基づき、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて多い場合には角膜又は結膜疾患が重症である可能性がある、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて著しく多い場合には角膜又は結膜疾患が特に重症である可能性が特に高い、という基準に従って重症度の検出が行われる。あるいは、当該角膜又は結膜疾患におけるバイオマーカーの標準値に対して、被検動物より検出されたバイオマーカー値が高い場合には角膜又は結膜疾患が重症であるという基準に基づいて重症度の検出が行われる。
【００４６】
本発明のバイオマーカーに基づいて角膜又は結膜疾患の予後を評価する場合（角膜又は結膜疾患の予後の予測方法）、前記角膜又は結膜疾患の罹患の有無を検査する方法と同様に、被検動物から得られた涙液中のミトコンドリアＤＮＡを測定した結果に基づき、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて多い場合には角膜又は結膜疾患の予後が不良である可能性がある、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて著しく多い場合には角膜又は結膜疾患の予後が不良である可能性が高い、という基準に基従って予後の予測が行われる。あるいは、当該角膜又は結膜疾患における標準値に対して、被検動物より検出されたバイオマーカー値が高い場合には当該疾患の予後が不良であるという基準に基づいて予後の評価が行われる。
【００４７】
本発明のバイオマーカーに基づいて角膜又は結膜疾患に有効な治療薬をスクリーニングする場合、前記角膜又は結膜疾患の罹患の有無を検査する方法と同様に、治療薬を摂取した角膜又は結膜疾患に罹患した被検動物から得られた涙液中のミトコンドリアＤＮＡを測定した結果に基づき、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が治療薬を投与されていない角膜又は結膜疾患に罹患した被検動物に比べて少ない場合、当該治療薬が有効であるという基準に基づいてスクリーニングが行われる。
【００４８】
本発明のバイオマーカーに基づいて角膜又は結膜疾患における鑑別診断、即ち類似の疾患の区別を行う場合、前記角膜又は結膜疾患の有無を検査する方法と同様に、被検動物から得られた涙液中のミトコンドリアＤＮＡを測定した結果に基づき、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が比較対照となる疾患におけるバイオマーカーの標準値に比べて多い場合には、角膜又は結膜疾患に罹患している可能性があるという基準に基づいて類似する疾患との区別が行われる。
【００４９】
いずれの方法においても、涙液中のｍｔＤＮＡ量と角膜又は結膜疾患の罹患の有無、重症度、易罹患性、予後等について予め相関図を作成しておき、被検動物における涙液中のｍｔＤＮＡ量をその相関図に当てはめて評価を行ってもよい。
【００５０】
これらの評価方法に基づいて疾患を個体レベルで評価することができ、個々の病態に応じて治療法を最適化することができる。
【００５１】
＜２．中心性漿液性脈絡網膜症のバイオマーカー＞
バイオマーカー
第２の本発明は、血清中のミトコンドリアＤＮＡからなる中心性漿液性脈絡網膜症のバイオマーカーである。
本発明の中心性漿液性脈絡網膜症のバイオマーカーは、血清中のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）からなることを特徴とする。本発明のバイオマーカーは、血清中に含まれるミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）が中心性漿液性脈絡網膜症患者の血清中に高濃度で存在することに基づき、これを中心性漿液性脈絡網膜症の評価指標として用いる。
【００５２】
ｍｔＤＮＡについては、前述の「角膜又は結膜疾患のバイオマーカー」の欄に記載の通りである。
【００５３】
血清の由来は、特に限定されず、任意の動物とすることができる。より具体的には、ヒト及びヒトを除く哺乳動物が挙げられる。ヒトを除く哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類が挙げられる。本発明において血清の由来として、好ましくは霊長類、更に好ましくはヒトである。
【００５４】
本発明において血清は、血液（全血）から血球と、フィブリノーゲン（Ｉ因子）、プロトロンビン（ＩＩ因子）、Ｖ因子、ＶＩＩＩ因子等の血液凝固因子を除去して得られる。血清の取得については臨床検査等で採用されている方法に従って行うことができ、特に限定されないが、例えば、血液を静置した後に得られる上清、あるいは血液を遠心分離に供して得られる上清として得ることができる。また、本発明の中心性漿液性脈絡網膜症のバイオマーカーの検出に先立ち、必要に応じて血清タンパク質等の夾雑物を除去するため、フィルター濾過やカラムを利用した前処理を行ってもよい。血清タンパク質としては、例えばアルブミン、トランスフェリン、ハプトグロビン、トランスサイレチン、α１アンチトリプシン、α２マクログロブリン、α１−アシドグリコプロテイン、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、補体Ｃ３、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩ等が挙げられる。
【００５５】
本発明のバイオマーカーとしては、血清中の細胞外膜小胞画分に局在するｍｔＤＮＡを使用することがより好ましい。細胞外膜小胞は、エキソソームと、エクトソームと呼ばれるマイクロベジクルとを含んでいるが、エキソソーム画分に局在するｍｔＤＮＡを本発明のバイオマーカーとして使用することがより好ましい。本発明における細胞外膜小胞画分に局在するｍｔＤＮＡ、エキソソームについては、前述の「角膜又は結膜疾患のバイオマーカー」の欄に記載の通りである。
【００５６】
ｍｔＤＮＡは、このような脂質二重膜を有する細胞外膜小胞、特にエキソソーム中に存在することによって、細胞外に存在するＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）による分解から保護され、安定に存在していると考えられる。そのため、エキソソーム中に存在するｍｔＤＮＡをバイオマーカーとして利用することにより、より一層正確な中心性漿液性脈絡網膜症の評価が可能である。また、エキソソームは、血清中にも多く含まれていることが知られており、血清からエキソソームを単離し、その中に含まれているｍｔＤＮＡを測定することにより、低侵襲的又は非侵襲的な評価系の樹立への可能性が開かれる。
【００５７】
本発明における、エキソソームの分離方法、ｍｔＤＮＡの検出方法については、生体体液として涙液の代わりに血清を使用すること以外は、前述の「角膜又は結膜疾患のバイオマーカー」の欄に記載の通りである。
【００５８】
中心性漿液性脈絡網膜症に罹患している動物（好ましくはヒト）では、本発明のバイオマーカーである血清中（又はエキソソーム中）に含まれるｍｔＤＮＡ量が正常対照群に比較して有意に増加している。ここで、正常対照群とは、中心性漿液性脈絡網膜症に罹患しておらず、かつ、炎症症状の認められない健康な被験動物（好ましくはヒト）を指す。
以上のとおり、本発明のバイオマーカーは、中心性漿液性脈絡網膜症を簡便かつ正確に評価することができる。
【００５９】
診断キット
本発明の中心性漿液性脈絡網膜症の診断キットは、前記ｍｔＤＮＡを検出可能な試薬を含む。ｍｔＤＮＡを検出することが可能な試薬としては、ｍｔＤＮＡの検出をｍｔＤＮＡにコードされる遺伝子又は遺伝子断片に基づいて行う場合であれば、当該遺伝子又は遺伝子断片を特異的に増幅するプライマー、又は当該遺伝子又は遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブが試薬として含まれる。本発明のキットに含まれる試薬として具体的には、配列番号１〜６に示されるプライマーが例示される。これらのプライマー及びプローブについては、前述の角膜又は結膜疾患及び中心性漿液性脈絡網膜症の「バイオマーカー」の欄に記載の通りである。
【００６０】
また、ｍｔＤＮＡを検出可能な試薬に含まれていてもよい他の試薬については、前述の角膜又は結膜疾患の「診断キット」の欄に記載の通りである。更に、本発明のキットにおいて、例えばｍｔＤＮＡを検出するためのプローブを不溶化担体上に固定化して用いてもよい。当該プローブを不溶化担体上に固定化することについては、前述の角膜又は結膜疾患の「診断キット」の欄に記載の通りである。
【００６１】
血清中のｍｔＤＮＡ量に基づく評価方法
本発明は、前述のバイオマーカーである血清中のミトコンドリアＤＮＡを利用した、下記工程を含む中心性漿液性脈絡網膜症の罹患の有無を検査する方法を提供する。
（ｉ）被験動物から得られた血清中のミトコンドリアＤＮＡを測定する工程；及び、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）の結果に基づいて中心性漿液性脈絡網膜症の罹患の有無を検出する工程。
【００６２】
前記工程（ｉ）に記載される、被験動物から得られた血清中のミトコンドリアＤＮＡの測定については、前記「バイオマーカー」欄の記載に従って実施することができる。また、前記工程（ｉｉ）に記載される検出工程は、被験動物について得られる工程（ｉ）の結果を、正常対照について得られる工程（ｉ）の結果と対比して、ミトコンドリアＤＮＡ量が増加していることを指標として行うことができる。ここで、正常対照群については、前記「バイオマーカー」の欄に記載の通りである。
【００６３】
前記工程（ｉｉ）に記載される検出工程では、被験動物から得られた血清中中のミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて多い場合には、中心性漿液性脈絡網膜症に罹患している可能性が高いと判定される。更に、被験動物から得られた血清中のミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて著しく多い場合には、被験動物は中心性漿液性脈絡網膜症に罹患している可能性が極めて高いと判定される。なお、本発明において、「ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて多い」とは、正常対照群の血清中のミトコンドリアＤＮＡ量の平均値＋２×ＳＤ（標準偏差、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）の値以上であることを指し、「ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照に比べて著しく多い」とは、正常対照群の血清中のミトコンドリアＤＮＡ量の平均値＋４×ＳＤの値以上であることを指す。正常対照群の血清中のミトコンドリアＤＮＡ量の平均値及びＳＤは、例えば、２４名以上の正常対照群の血清中のミトコンドリアＤＮＡ量を測定することによって求めることができる。また、本発明者によって、正常対照（ヒト）群の血清中のミトコンドリアＤＮＡ量について、平均値＋２×ＳＤの値が１３．１ｎｇ／ｍＬ、平均値＋４×ＳＤの値が１６．９ｎｇ／ｍＬであることが確認されているので、血清中のミトコンドリア量が１３．１ｎｇ／ｍＬ以上であれば「ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照に比べて多い」、血清中のミトコンドリア量が１６．９ｎｇ／ｍＬ以上であれば「ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照に比べて著しく多い」と判断することができる。
【００６４】
また、被検動物としては、ヒト及びヒトを除く哺乳動物が挙げられる。ヒトを除く哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類が挙げられる。本発明において被検動物として、好ましくは霊長類、更に好ましくはヒトである。
【００６５】
更に、本発明のバイオマーカーに基づく評価は、中心性漿液性脈絡網膜症の罹患の有無の検査以外にも、中心性漿液性脈絡網膜症の易罹患性の予測方法、重症度の検出方法、予後の予測方法、治療薬のスクリーニング方法、中心性漿液性脈絡網膜症の鑑別診断に利用することができる。
【００６６】
本発明のバイオマーカーに基づいて中心性漿液性脈絡網膜症に対する易罹患性を評価する場合（中心性漿液性脈絡網膜症に対する易罹患性の予測方法）、前記中心性漿液性脈絡網膜症の罹患の有無を検査する方法と同様に、被検動物から得られた血清中のミトコンドリアＤＮＡを測定した結果に基づき、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて多い場合には中心性漿液性脈絡網膜症を罹患しやすい、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて著しく多い場合には中心性漿液性脈絡網膜症を特に罹患しやすい、という基準に従って易罹患性の予測が行われる。
【００６７】
本発明のバイオマーカーに基づいて中心性漿液性脈絡網膜症の重症度を評価する場合（中心性漿液性脈絡網膜症の重症度の検出方法）、前記中心性漿液性脈絡網膜症の罹患の有無を検査する方法と同様に、被検動物から得られた血清中のミトコンドリアＤＮＡを測定した結果に基づき、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて多い場合には中心性漿液性脈絡網膜症が重症である可能性がある、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて著しく多い場合には中心性漿液性脈絡網膜症が重症である可能性が高い、という基準に従って重症度の検出が行われる。あるいは、当該疾患におけるバイオマーカーの標準値に対して、被検動物より検出されたバイオマーカー値が高い場合には当該疾患が重症であるという基準に基づいて重症度の検出が行われる。
【００６８】
本発明のバイオマーカーに基づいて中心性漿液性脈絡網膜症の予後を評価する場合（中心性漿液性脈絡網膜症の予後の予測方法）、前記中心性漿液性脈絡網膜症の罹患の有無を検査する方法と同様に、被検動物から得られた血清中のミトコンドリアＤＮＡを測定した結果に基づき、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて多い場合には中心性漿液性脈絡網膜症の予後が不良になる可能性がある、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて著しく多い場合には中心性漿液性脈絡網膜症の予後が不良になる可能性が高い、という基準に従って予後の予測が行われる。あるいは、当該疾患における標準値に対して、被検動物より検出されたバイオマーカー値が高い場合には当該疾患の予後が不良であるという基準に基づいて予後の評価が行われる。
【００６９】
本発明のバイオマーカーに基づいて中心性漿液性脈絡網膜症に有効な治療薬をスクリーニングする場合、前記中心性漿液性脈絡網膜症の罹患の有無を検査する方法と同様に、治療薬を摂取した中心性漿液性脈絡網膜症に罹患した被検動物から得られた血清中のミトコンドリアＤＮＡを測定した結果に基づき、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が治療薬を投与されていない中心性漿液性脈絡網膜症に罹患した被検動物に比べて少ない場合、当該治療薬が有効であるという基準に基づいてスクリーニングが行われる。
【００７０】
本発明のバイオマーカーに基づいて中心性漿液性脈絡網膜症における鑑別診断、即ち類似の疾患の区別を行う場合、前記中心性漿液性脈絡網膜症の有無を検査する方法と同様に、被検動物から得られた血清中のミトコンドリアＤＮＡを測定した結果に基づき、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が比較対照となる疾患におけるバイオマーカーの標準値に比べて多い場合には、中心性漿液性脈絡網膜症に罹患しているであるという基準に基づいて類似する疾患との区別が行われる。
【００７１】
いずれの方法においても、血清中のｍｔＤＮＡ量と中心性漿液性脈絡網膜症の罹患の有無、重症度、易罹患性、予後等について予め相関図を作成しておき、被検動物における血清中のｍｔＤＮＡ量をその相関図に当てはめて評価を行ってもよい。
【００７２】
これらの評価方法に基づいて疾患を個体レベルで評価することができ、個々の病態に応じて治療法を最適化することができる。
【実施例】
【００７３】
以下、試験例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれらの試験例に限定されるものではない。【００７４】
全ての試験は、大阪大学医学部附属病院倫理委員会の承認を得て行われた。【００７５】
（実験例１）
眼炎症（ぶどう膜炎）、角膜疾患、又は、網膜疾患（加齢黄斑変性）に罹患する患者を被検者とし、被検者の涙液中のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）量を下記の方法で測定して評価した。正常対照群として健常人の涙液中のｍｔＤＮＡ量を同条件で測定した。なお被検者数は、眼炎症８４名、角膜疾患９０名、網膜疾患５７名、正常対照（健常人）３４名であった。【００７６】
涙液試料の調製
涙液試料として、３０μＬのＰＢＳ（リン酸緩衝液）を用いて下眼瞼結膜のぬぐい液として回収したものを使用した。具体的には、３０μＬのＰＢＳをピペットマンでとり、細隙灯顕微で観察しながら、被検者には上方視してもらい下眼瞼結膜にＰＢＳを滴下し、すぐに結膜上のｍｔＤＮＡを結膜ぬぐい液として回収したものを涙液試料とした。【００７７】
涙液中のＤＮＡの分離
Ｑｉａｇｅｎ社のＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて、添付のプロトコルに従って、上記で得られた涙液（５μｌ）から涙液ＤＮＡを調製した。具体的には、５μｌの涙液試料を４１５μｌのタンパク質分解酵素で消化（５６℃、１０分間）し、１００容量％エタノールを用いてＤＮＡを沈殿させ、前記Ｋｉｔ付属の精製カラムでＤＮＡを精製した。得られた涙液ＤＮＡを、ＤＮａｓｅを含まない水（２０μｌ）に再度懸濁した。【００７８】
リアルタイムＰＣＲ
ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ（株）製）を使用し、添付のプロトコルに従ってＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ）により、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ
Ｉを用いたインターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は以下の通りである。
Ｓｔａｇｅ  １（１サイクル）：９５℃  ３０秒；
Ｓｔａｇｅ  ２（４０サイクル）：９５℃  ５秒、６０℃  ３０秒；
Ｓｔａｇｅ  ３（１サイクル）：９５℃  １５秒、６０℃  １分、９５℃  １５秒【００７９】
ｍｔＤＮＡ濃度を定量するため、健常者の涙液に由来する精製ＤＮＡを用いて、リアルタイム標準曲線を作成した。また、上記ＰＣＲ反応を４０サイクル終了後でもＰＣＲ産物が産生されなかった試料（即ち、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎによる蛍光発光が認められなかった試料）については、「検出不可」と判断した。【００８０】
ミトコンドリアＤＮＡの検出のため使用したプライマーを以下に示す。
（シトクロムｂ）
フォワードプライマー（配列番号１）：
５’−ＡＴＧＡＣＣＣＣＡＡＴＡＣＧＣＡＡＡＡＴ−３’
リバースプライマー（配列番号２）：
５’−ＣＧＡＡＧＴＴＴＣＡＴＣＡＴＧＣＧＧＡＧ−３’【００８１】
なお、涙液中のｍｔＤＮＡ総量は、あらかじめ既知濃度のフルオレセインＮａを眼表面に滴下し、回収された涙嚢洗浄液のフルオレセインＮａの蛍光量を回収前後で測定することにより希釈率を求め、眼表面全体の涙液量を推定して求めた。得られたｍｔＤＮＡ値については、Ｓｔｅｅｌ検定法で統計学的に検討した。結果を図２のグラフに示す。【００８２】
図２は、各種眼科疾患に罹患する患者群と正常対照群の涙液中のｍｔＤＮＡ値を示したグラフである。図２のグラフから、涙液中のｍｔＤＮＡ値について、正常対照群に対して、眼炎症群と網膜疾患群については有意な増加は認められないが、角膜疾患群については有意な増加が認められる（Ｐ＜０．００１）。このことから、角膜疾患に罹患すると涙液中のｍｔＤＮＡ値が増加することがわかり、涙液中のｍｔＤＮＡは角膜疾患のバイオマーカーとなり得ることがわかる。【００８３】
（実験例２）
ドライアイの患者（１０名）の涙液中のｍｔＤＮＡ量を、実施例１と同様の方法を用いて評価した。正常対照群として、健常人（２０名）の涙液中のｍｔＤＮＡ量を同条件で測定した。得られたｍｔＤＮＡ値について、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定法で統計学的に解析した。結果を図３に示す。【００８４】
図３は、ドライアイ患者群と正常対照群の涙液中のｍｔＤＮＡ値を示したグラフである。図３のグラフから、涙液中のｍｔＤＮＡ値について、ドライアイ患者群は正常対照群に対して有意に高い（Ｐ＜０．００１）ことが認められる。このことから、ドライアイ患者は涙液中のｍｔＤＮＡ値が正常対照群（健常人）と比べて増加することがわかり、涙液中のｍｔＤＮＡはドライアイ疾患のバイオマーカーとなり得ることがわかる。【００８５】
（実験例３）
円錐角膜、角膜輪部疲弊症、又は、ドライアイのいずれかに罹患する被検者の涙液中のｍｔＤＮＡ発現量を、実施例１と同様の方法にて測定し評価した。正常対照群として、健常人の涙液中のｍｔＤＮＡ発現量を同条件で測定した。なお、被検者数は、円錐角膜が３９名、角膜輪部疲弊症が２９名、ドライアイが２０名、健常人が３４名である。ｍｔＤＮＡ発現量について、検量線に基づいて得られた相対値を対数処理した後、Ｓｔｅｅｌ検定法で統計学的に検討した統計学的に検討した。結果を図４に示す。【００８６】
図４は、円錐角膜、角膜輪部疲弊症、又はドライアイに罹患する患者群と正常対照群の涙液中のｍｔＤＮＡの発現量を示したグラフである。図４のグラフから、涙液中のｍｔＤＮＡの発現量について、円錐角膜、角膜輪部疲弊症、又はドライアイのいずれの疾患患者群も、正常対照群と比べて有意に高い（Ｐ＜０．００１）ことが認められる。このことから、円錐角膜、角膜輪部疲弊症、又はドライアイに罹患すると、涙液中のｍｔＤＮＡ値が増加することがわかり、涙液中のｍｔＤＮＡは、円錐角膜、角膜輪部疲弊症、又はドライアイのバイオマーカーとなり得ることがわかる。【００８７】
（実験例４）
中心性漿液性脈絡網膜症に罹患した患者（２１名）の血清を採取し、血清中のｍｔＤＮＡ量を下記に示す方法で測定し評価した。正常対照群として、健常人（２４名）の血清を同様に採取し、血清中のｍｔＤＮＡ量を同条件で測定した。結果を図５のグラフに示す。【００８８】
血清ＤＮＡの分離
Ｑｉａｇｅｎ社  ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて、添付のプロトコルに従って血清（１００μｌ）から血清ＤＮＡを調製した。具体的には、１００μｌの血清試料を３２０μｌのタンパク質分解酵素で消化（５６℃、１０分間）し、ＤＮＡを１００容量％エタノールを用いて沈殿させ、前記Ｋｉｔ付属の精製カラムでＤＮＡを精製した。得られた血清ＤＮＡを、ＤＮａｓｅを含まない水（２０μｌ）に再度懸濁した。【００８９】
リアルタイムＰＣＲ
ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ（株）製）を使用し、添付のプロトコルに従ってＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ）により、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ
Ｉを用いたインターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は以下の通りである。
Ｓｔａｇｅ  １（１サイクル）：９５℃  ３０秒；
Ｓｔａｇｅ  ２（４０サイクル）：９５℃  ５秒、６０℃  ３０秒；
Ｓｔａｇｅ  ３（１サイクル）：９５℃  １５秒、６０℃  １分、９５℃  １５秒【００９０】
ｍｔＤＮＡ濃度を定量するため、健常者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）全細胞溶解液に由来する精製ＤＮＡを用いて、リアルタイム標準曲線を作成した。また、上記ＰＣＲ反応を４０サイクル終了後でもＰＣＲ産物が産生されなかった試料（即ち、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎによる蛍光発光が認められなかった試料）については、「検出不可」と判断した。【００９１】
ミトコンドリアＤＮＡの検出のため使用したプライマーを以下に示す。
（シトクロムｂ）
フォワードプライマー（配列番号１）：
５’−ＡＴＧＡＣＣＣＣＡＡＴＡＣＧＣＡＡＡＡＴ−３’
リバースプライマー（配列番号２）：
５’−ＣＧＡＡＧＴＴＴＣＡＴＣＡＴＧＣＧＧＡＧ−３’【００９２】
得られたｍｔＤＮＡ値について、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定法で統計学的に検討した。結果を図５のグラフに示す。【００９３】
図５は、中心性漿液性脈絡網膜症患者群と正常対照群の血清中のｍｔＤＮＡ濃度を示したグラフである。図５のグラフから、血清中のｍｔＤＮＡ濃度について、中心性漿液性脈絡網膜症に罹患した患者群の方が、正常対照群に比べ有意に高い（Ｐ＜０．０１）ことが認められる。中心性漿液性脈絡網膜症に罹患した患者群は、血清中におけるｍｔＤＮＡ濃度が正常対照群よりも増大することから、血清中のｍｔＤＮＡが中心性漿液性脈絡網膜症のバイオマーカーとして利用できることがわかる。【００９４】
（実験例５）
本実験例では、前記実験例４における試験のｎ数を増やして同様の分析を行った。具体的には、中心性漿液性脈絡網膜症に罹患した患者（２３名）の血清を採取し、血清中のｍｔＤＮＡ量を実験例４と同様の方法で測定した。正常対照群として、健常人（２４名）の血清を同様に採取し、血清中のｍｔＤＮＡ量を同条件で測定した。得られた値について、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定法により、統計学的に検討した。【００９５】
結果を図６に示す。図６の左図には、中心性漿液性脈絡網膜症に罹患した患者６名について、臨床所見（網膜のＯＣＴ(光干渉断層計）像）と血清中ミトコンドリアＤＮＡ濃度の結果を示す。図６の右図には、患者群（ＣＳＣ）と正常対照群（Ｈｅａｌｔｈｙ）の血清ｍｔＤＮＡ量の測定結果を示す。この結果からも、中心性漿液性脈絡網膜症に罹患した患者群は血清中におけるｍｔＤＮＡ濃度が正常対照群よりも高くなっていた。また、図６の左図から明らかなように、漿液性網膜剥離が進行している（網膜下液が多い）ほど、血清中におけるｍｔＤＮＡ量が高い傾向が認められた。この結果からも血清中のｍｔＤＮＡが中心性漿液性脈絡網膜症のバイオマーカーとして利用できることがわかった。【００９６】
（実験例６）
実験例５でミトコンドリアＤＮＡ濃度を測定した中心性漿液性脈絡網膜症に罹患した患者（２３名）の視力、眼圧、年齢、経過観察期間、中心窩脈絡膜厚、漿液性剥離等の臨床データと、血清中ミトコンドリアＤＮＡ濃度との相関を調べるために、統計解析ソフトウェアＪＭＰ１３（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ.）を用いて多変量解析を行った。【００９７】
結果を図７に示す。図７中の漿液性剥離の高さは、高いほど、病状が進行していることを意味している。漿液性剥離の高さと血清中ミトコンドリアＤＮＡ濃度との間に正の相関が認められたことから、病状が重篤なほど、血中ミトコンドリアＤＮＡ濃度が高いことが明らかとなった。また、図７中の経過観察期間は、長くなればストレス状態からの解除もあり、病状が安定していることを意味している。経過観察期間と血清中ミトコンドリアＤＮＡ濃度との間に負の相関が認められたことから、病状が安定している場合には、血中ミトコンドリアＤＮＡ濃度が低くなることが確認された。即ち、本結果から、中心性漿液性脈絡網膜症と血清中ミトコンドリアＤＮＡ濃度は、単なる相関が認められるだけでなく、コンドリアＤＮＡ濃度の高低は、その疾患活動性と有意に相関していることが明らかなった。【００９８】
（実験例７）
円錐角膜（３３名、４２眼；ＫＣ）、ドライアイ（１０名、２０眼；Ｄｒｙ ｅｙｅ）、又は角膜輪部疲弊症（１９名、３９眼；ＬＳＣＤ）に罹患する被検者の涙液中のミトコンドリアＤＮＡ発現量を、実施例１と同様の方法にて測定し評価した。また、当該被験者の血清を採取し、血清中のミトコンドリアＤＮＡ量を実験例４と同様の方法で測定した。正常対照群として、健常人（２０名、４０眼）の涙液及び血清を同様に採取し、血清中のミトコンドリアＤＮＡ量を同条件で測定した。得られた値について、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定法により、統計学的に検討した。【００９９】
結果を図８に示す。血清中のｍｔＤＮＡ量については、角膜疾患の患者と健常人との間に有意差は認められなかったが、円錐角膜、角膜輪部疲弊症及びドライアイの患者では、健常人に比べて有意に涙液中のミトコンドリアＤＮＡ量が上昇していた。これらの疾患は、もちろん全身の異常では生じず、眼のみに病変があり、眼局所のイベントが、涙液中のミトコンドリアＤＮＡ濃度を上昇させることが明らかになった。【０１００】
（実験例８）
健常人由来のＣＤ１４陽性単球を１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で含む細胞懸濁液６０μｌをマイクロプレートに入れて１．５時間培養した後に、円錐角膜（１８名；ＫＣ）、角膜輪部疲弊症（１４名；ＬＳＣＤ）、又はドライアイ（１０名；Ｄｒｙ ｅｙｅ）の患者から採取した涙液１０μｌを添加し、４時間培養を行った。培養後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって培養上清中のＩＬ−８濃度の測定を行った。コントロールとして涙液を添加せずに同様の試験を行い、また、正常対照群として健常人（１３名；Ｈｅａｌｔｈｙ）から採取した涙液を使用して同様の試験を行った。なお、涙液の採取方法は、実験例１に示す方法で行った。【０１０１】
本試験では、涙液中に炎症細胞を刺激する物質が含まれていれば、培養上清にはサイトカインが分泌されて濃度が上昇することになる。
結果を図９に示す。円錐角膜の患者の涙液のみで、炎症細胞の真浸潤に関与するＩＬ−８の濃度が上昇していた。本来、炎症が関与すると言われていなかった円錐角膜において涙液中ミトコンドリアＤＮＡが上昇しており、且つ、円錐角膜では、炎症細胞をリクルートするＩＬ−８を介して炎症細胞を呼び寄せて病態に涵養することが明らかとなった。【０１０２】
（実験例９）
ヒト網膜色素上皮細胞（ロンザジャパン株式会社）を１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で含む細胞懸濁液６０μｌをマイクロプレートに入れて１．５時間培養した後に、中心性漿液性脈絡網膜症患者（２３名；ＣＳＣ）の患者から採取した血清１０μｌを添加し、４時間培養を行った。培養後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって培養上清中のＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡの各濃度の測定を行った。コントロールとして涙液の代わりにＰＢＳを使用して同様の試験を行い、また、正常対照群として健常人（２４名；Ｈｅａｌｔｈｙ）から採取した涙液を使用して同様の試験を行った。【０１０３】
結果を図１０に示す。心性漿液性脈絡網膜症患者の血清を添加した場合には、炎症に関与するＩＬ−６、ＩＬ−８、及びＭＣＰ−１の濃度は上昇していなかったことから、心性漿液性脈絡網膜症は炎症ではないことが確認された。一方、心性漿液性脈絡網膜症患者の血清を添加した場合に、血管透過性の亢進に関与するＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ−ＡＡの濃度が上昇していた。即ち、心性漿液性脈絡網膜症において生じる因子は、ＶＥＧＦやＰＤＧＦ−ＡＡを上昇させることによって血管透過性亢進を起こし、病態形成に関与することが分かった。
【配列表フリーテキスト】
【０１０４】
配列番号１はシトクロムｂに対するフォワードプライマーである。
配列番号２はシトクロムｂに対するリバースプライマーである。
配列番号３はＣＯＸＩＩＩに対するフォワードプライマーである。
配列番号４はＣＯＸＩＩＩに対するリバースプライマーである。
配列番号５はＮＡＤＨデヒドロゲナーゼに対するフォワードプライマーである。
配列番号６はＮＡＤＨデヒドロゲナーゼに対するリバースプライマーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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