(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５５、５８、５９及び６１〜６５のいずれかを含む、抗菌ペプチド。
【請求項２】
真菌又は酵母に対する活性を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
細菌に対する活性を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
治療における使用、特に抗菌剤としての使用のための、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドで微生物を処理する工程を含む、微生物の殺滅又は増殖阻害のインビトロ方法。
【請求項６】
前記ペプチドが、細菌若しくは真菌に対して、又は細菌及び真菌の両方に対して活性を示す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
医薬、飼料添加物、防腐剤又は界面活性剤としての請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドのインビトロでの使用。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドを含む、医薬、飼料添加物、防腐剤又は界面活性剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌ペプチド又はその変異体、微生物の殺滅又は増殖阻害方法、及び医薬、飼料添加物、防腐剤又は界面活性剤としての本明細書に記載のペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬化合物の中で、抗生物質は人類の平均余命に大きな影響を与えている。しかし、微生物が耐性を創り出す能力はほとんど無制限である。多剤耐性は、多くのヒト病原体の非常に一般的で危険な特徴となってきており、薬剤耐性は世界中に広がっている。
【０００３】
エンドファイト（内生寄生菌）は、生物医学、製薬及びヘルスケア産業における潜在的な用途を有する、おびただしい数の二次代謝産物の有望な生産者である。エンドファイトの機能の多様性を研究するために典型的に用いられる方法論は、急速に増殖する菌株に重点を置いた単離に基づいており、従って、完全な生物多様性が表わされていない。変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）又はクローニング及び直接配列決定等の方法が、植物における培養できない真菌群の多様性を分析するために用いられているが、そのような方法は機能の研究には適していない。エンドファイトに頻繁に生じる問題は、インビトロで特定の期間のみ代謝産物を生産し、その後、不活性になって、生存能力を失い、又は生物活性を有する二次代謝産物を生産する能力を失うことである。以前から、このような培養上の問題が他の微生物にあったことが、微生物から得られる広大な貴重な産物を入手するための新しい方法を開発する原動力の１つであった。
【０００４】
抗菌ペプチド（ＡＭＰ）は、進化的に保存され、全ての複雑な生物において先天性免疫系によって産生される。これら抗菌ペプチドは、人間や哺乳動物の防衛の第一線としての役割を果たす。ＡＭＰは、≧３０％の疎水性比と正電荷を有する１０〜５０アミノ酸からなるポリペプチドである。一般に、ＡＭＰは、細菌、真菌及び酵母に対して広域抗菌スペクトルの抗菌活性を有する。
【０００５】
ＷＯ２０１１／１１３９９９は、セイヨウガンコウラン（Empetrum nigrum）のエンドファイト由来のトリプシンポリペプチド及びそれらを得るための方法を開示する。in silico分析に基づいて、ペプチドが抗菌活性を有することが予測されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／１１３９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
様々な病原性微生物に対して活性を有する新規分子が緊急に必要とされている。本発明は、以下に説明するように、この要求を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
クロウベリー（セイヨウガンコウラン，Empetrum nigrum）は、北半球で生育する多年生の低木であり、従来、感染性疾患を治療するために用いられ、上記の研究のための適した候補と考えられた。本発明は、種々の微生物に対して改善された活性を有する、セイヨウガンコウラン（Empetrum nigrum）のエンドファイト由来の新規な抗菌（ポリ）ペプチド及びその変異体を提供する。
【０００９】
本発明の第１の側面は、抗菌ペプチド又はその変異体を提供することである。本発明に従って、前記ポリペプチドは配列番号５を含むか、又は配列番号５と少なくとも３７％の同一性を有する。
【００１０】
本発明の第２の側面は、微生物の殺滅又は増殖阻害方法である。本発明に従って、前記方法は、本明細書に記載されたペプチド又はその変異体で前記微生物を処理する工程を含む。
【００１１】
本発明の第３の側面は、医薬、飼料添加物、防腐剤又は界面活性剤としての本明細書に記載のペプチド又はその変異体の使用である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、かなりの利点が得られる。ＡＭＰは、真菌及びグラム陽性細菌とグラム陰性細菌の両方を含む広域スペクトルの微生物に対して活性であることが知られている。小さなＡＭＰは、合成が容易であり、合成コストが最小限であるために商業的に実現性がある。ＡＭＰは細菌において耐性を創り出すことは知られていない。本発明は、新規な抗菌ペプチド、その変異体及び種々の用途における使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ベースのエンドファイトメタゲノムライブラリーで同定された、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）に対して抗細菌活性を有するサブクローン（ａ）及び抗細菌活性を有さないサブクローン（ｓ）を示す寒天重層アッセイである。
【図２】セイヨウガンコウラン（Empetrum nigrum）メタゲノム抗細菌タンパク質１の予測されるアミノ酸配列である。予測されるタンパク質は５４９残基を有する。高度に保存されたＰＰＲ配列（ペンタトリコペプチドリピート）に下線が引かれている。
【図３】エシェリヒア・コリ（Ａ）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｂ）に対して試験した、合成ペプチドMet1〜Met12それぞれ１００μｇ、NC＝ネガティブコントロールと、ゲンタマイシン１０μｇの代表的な放射拡散アッセイ（ＲＤＡ）である。
【図４ａ】配列番号４で定義される「Met10」ペプチド（鎖１００）の２５個の変異体の配列を示す。
【図４ｂ】配列番号５で定義される「Met11」ペプチド（鎖２００）の２３個の変異体の配列を示す。
【図４ｃ】配列番号６で定義される「Met12」ペプチド（鎖３００）の２５個の変異体の配列を示す。
【図５ａ】配列番号４で定義される「Met10」ペプチド（鎖１００）の９個の変異体の配列を示す。
【図５ｂ】配列番号５で定義される「Met11」ペプチド（鎖２００）の１０個の変異体の配列を示す。
【図５ｃ】配列番号６で定義される「Met12」ペプチド（鎖３００）の１３個の変異体の配列を示す。
【図６ａ】エシェリヒア・コリ（ATCC 25922）、スタフィロコッカス・アウレウス（ATCC 25923）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae，ATCC 10031）及びシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa，ATCC 27853）に対して試験した、合成ペプチド変異体鎖１００〜１０９それぞれ５０μｇ、NC＝ネガティブコントロールと、ゲンタマイシン５μｇの放射拡散アッセイ（ＲＤＡ）である。
【図６ｂ】エシェリヒア・コリ（ATCC 25922）、スタフィロコッカス・アウレウス（ATCC 25923）、クレブシエラ・ニューモニエ（ATCC 10031）及びシュードモナス・エルギノーサ（ATCC 27853）に対して試験した、合成ペプチド変異体鎖２００〜２１０それぞれ５０μｇ、NC＝ネガティブコントロールと、ゲンタマイシン５μｇの放射拡散アッセイ（ＲＤＡ）である。
【図６ｃ】エシェリヒア・コリ（ATCC 25922）、スタフィロコッカス・アウレウス（ATCC 25923）、クレブシエラ・ニューモニエ（ATCC 10031）及びシュードモナス・エルギノーサ（ATCC 27853）に対して試験した、合成ペプチド変異体鎖３００〜３１３それぞれ５０μｇ、NC＝ネガティブコントロールと、ゲンタマイシン５μｇの放射拡散アッセイ（ＲＤＡ）である。
【図７ａ】アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus，DSM 1959）に対して試験した、合成ペプチド変異体鎖１０９、１０５、１０４、２０１、２０４、３１０、３０８、３０７及び３０６それぞれ２０μｇ、NC＝ネガティブコントロールと、アンホテリシンＢ ２０μｇの放射拡散アッセイ（ＲＤＡ）である。
【図７ｂ】ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum，DSM 1075）に対して試験した、合成ペプチド変異体鎖１０９、１０５、１０４、２０１、２０４、３１０、３０８、３０７及び３０６それぞれ２０μｇ、NC＝ネガティブコントロールと、アンホテリシンＢ ２０μｇの放射拡散アッセイ（ＲＤＡ）である。
【図８ａ】放射拡散アッセイで、１４日間にわたって様々な温度で試験した鎖ペプチド１０４（Ａ〜Ｄ）及び１０５（Ｅ〜Ｈ）の熱安定性である。異なる温度でインキュベートしたペプチドを２０μｇ分取することで抗細菌活性を試験し、阻止域で活性を測定した。−２０℃のペプチドをコントロールとした。
【図８ｂ】放射拡散アッセイで、１４日間にわたって様々な温度で試験した鎖ペプチド２０１（Ａ〜Ｄ）及び２０４（Ｅ〜Ｈ）の熱安定性である。異なる温度でインキュベートしたペプチドを２０μｇ分取することで抗細菌活性を試験し、阻止域で活性を測定した。−２０℃のペプチドをコントロールとした。
【図８ｃ】放射拡散アッセイで、１４日間にわたって様々な温度で試験した鎖ペプチド３０６（Ａ〜Ｄ）及び３０８（Ｅ〜Ｈ）の熱安定性である。異なる温度でインキュベートしたペプチドを２０μｇ分取することで抗細菌活性を試験し、阻止域で活性を測定した。−２０℃のペプチドをコントロールとした。
【図９ａ】鎖ペプチド１０４及び１０５のｐＨ安定性は、放射拡散アッセイ（ＲＤＡ）で決定した。４〜９の範囲の異なるｐＨを用いて阻止域を確認した。
【図９ｂ】鎖ペプチド２０１及び２０４のｐＨ安定性は、放射拡散アッセイ（ＲＤＡ）で決定した。４〜９の範囲の異なるｐＨを用いて阻止域を確認した。
【図９ｃ】鎖ペプチド３０６及び３０８のｐＨ安定性は、放射拡散アッセイ（ＲＤＡ）で決定した。４〜９の範囲の異なるｐＨを用いて阻止域を確認した。
【図１０ｃ】鎖ペプチド３０６の狭いスペクトルの抗菌活性を示す。
【図１１ａ】１０μｇ／ｍｌの鎖１０５に３７℃で１時間曝露したエシェリヒア・コリ（Ａ〜Ｃ）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｄ〜Ｇ）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。コントロール（Ａ及びＤ）。鎖１０５（Ｂ〜Ｃ及びＥ〜Ｇ）で処理した。
【図１１ｂ】１０μｇ／ｍｌの鎖２０１に３７℃で１時間曝露したエシェリヒア・コリ（Ａ〜Ｃ）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｄ〜Ｇ）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。コントロール（Ａ及びＤ）。鎖２０１（Ｂ〜Ｃ及びＥ〜Ｇ）で処理した。
【図１１ｃ】１０μｇ／ｍｌの鎖３０８に３７℃で１時間曝露したエシェリヒア・コリ（Ａ〜Ｃ）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｄ〜Ｇ）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。コントロール（Ａ及びＤ）。鎖３０８（Ｂ〜Ｃ及びＥ〜Ｇ）で処理した。
【図１２】鎖１０５及び２０１固定化カテーテルの抗細菌活性である。シリコンカテーテルをコントロールとして用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
エンドファイトは、そのライフサイクルのすべて又はその一部を宿主植物の健康な組織の内部で過ごす微生物であり、すべての植物種で見出される。エンドファイトの大部分は培養できないが、植物から単離された化学構造が実際に微生物の起源を有していることは驚くべきことではない。メタゲノミクスは、培養できない微生物由来の生物活性を有する化合物の資源を入手するための貴重なツールを提供する。
【００１５】
本研究では、エンドファイトからメタゲノムライブラリーを構築し、抗細菌活性についてスクリーニングした。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）を標的微生物としてライブラリーを二重寒天層法によってスクリーニングして、抗菌クローンを選択した。メタゲノムライブラリーから、抗細菌活性を示す１個の特異なクローンを選択した。二次ライブラリーを生成して、抗細菌活性を担う遺伝子の特徴付けのためのインサートサイズを減少させた抗細菌サブクローンを得た。
【００１６】
サブクローンの核酸配列を、GenBankデータベースに存在する配列に対してBLAST分析に供したが、既知の配列との類似性は同定されなかった。ＷＯ２０１１／１１３９９９に開示されたタンパク質をコードする単離された遺伝子は、セイヨウガンコウラン（Empetrum nigrum）メタゲノム抗細菌タンパク質１（En-MAP1、GenBankアクセッション番号KC466596）と命名されている。推測されたアミノ酸配列（配列番号１）を分析することで、En-MAP1が、シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）由来の推定タンパク質と最も高い３２％の類似性を共有する５４９アミノ酸のタンパク質をコードしており、既知の機能のタンパク質のいずれとも類似性がないことが明らかとなった。
【００１７】
単離されたエンドファイトのタンパク質が発現され、単離されたが、抗菌活性は観察されなかった。次に、in silicoで消化されたペプチドの抗菌活性を、実験の部に記載されたアルゴリズムを用いて予測した。ペプチドはまた、スタフィロコッカス・アウレウス、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）及びバーティシリウム・ダリアエ（Verticillium dahliae）に対する抗菌活性について試験した。予備試験において、抗菌活性を有すると予測されたペプチドのいくつかは、インビトロ試験でも活性を示した。最も良い候補ペプチドが後の研究のために選ばれた。
【００１８】
抗菌ペプチドは、細菌膜と相互作用して、最適濃度で効率的に殺菌する。ＡＭＰは、生体適合性、耐塩性及び広域抗菌スペクトルの抗菌活性も有するべきである。合理的な設計技術を用いることによって、様々なアミノ酸を付加するか又は置換することで、ペプチドの抗菌活性を改善することができた。本発明者らは、抗細菌活性を改善するために、様々な位置にトリプトファン（Ｗ）、アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）を有する、Met10（配列番号４で定義される鎖１００）、Met11（配列番号５で定義される鎖２００）及びMet12（配列番号６で定義される鎖３００）ペプチドを設計し、改変した。
【００１９】
APD2データベースを利用して、本ペプチドの既知の抗菌剤との相同性及び同一性を確認した（Wangら，2009）。
【００２０】
本発明の一実施態様は、配列番号４（Met10、鎖１００）、配列番号５（Met11、鎖２００）、配列番号６（Met12、鎖３００）を含む抗菌ペプチド、又は配列番号４、配列番号５若しくは配列番号６と少なくとも３７％の同一性を有するその変異体である。驚くべきことに、比較的小さい断片が所望の活性を有し得ることが見出された。
【００２１】
一実施態様では、本ペプチド又はその変異体は、配列番号４、配列番号５若しくは配列番号６のいずれかを含むか、又は前記配列番号のいずれかと少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％の同一性、より好ましくは前記配列番号のいずれかと少なくとも８０％の同一性、最も好ましくは前記配列番号４、配列番号５若しくは配列番号６と９０％若しくは更に９５％の同一性を有するペプチドを含む。
【００２２】
これに関連して、用語「同一性」は、最初のアミノ酸から最後の対応するアミノ酸まで互いに比較された、２つのアミノ酸配列間の全体的な同一性を表す。従って、断片は、成熟（ポリ）ペプチドのそれぞれのアミノ酸（本質的に等しい数のアミノ酸）としか比較できない。
【００２３】
本発明の一実施態様では、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のいずれかを含むペプチドは、抗菌活性を向上させるために改変されている。
【００２４】
一実施態様に従って、本ペプチドは、Ｗ、Ｒ、Ｋ、Ｌ、Ｃ、Ｉ、Ｆ及びＡの１個以上の置換で、より好ましくはＷ、Ｒ及びＡの１個以上の置換で改変されている。これらの置換によって、微生物膜との相互作用が増加し、それによって抗菌活性が改善される。
【００２５】
一実施態様では、配列番号４（鎖１００）で定義されるペプチドは、Ｖ１６Ｋ／Ｌ／Ｗ／Ｒ、Ｑ１５Ｒ／Ｌ／Ｗ／Ｉ／Ｆ／Ｃ、Ｎ１４Ｌ／Ｋ／Ｒ／Ｗ、／Ｗ、Ａ１１Ｗ、Ｍ６Ｗ及びＩ７Ｗからなる群から選択される１個以上、好ましくは５、６又はさらには７個の置換を含む。
【００２６】
好ましくは、配列番号４のアミノ酸残基Ｒ８、Ｌ９及びＨ１０は改変されていない。
【００２７】
一実施態様に従って、本ペプチドは、配列番号４（鎖１００）において、
ａ．  Ｄ１−／Ｒ
ｂ．  Ｃ２−／Ｋ
ｃ．  Ｗ３−
ｄ．  Ｓ４−／Ｒ
ｅ．  Ａ５−
ｆ．  Ｍ６Ｗ
ｇ．  Ｉ７Ｗ
ｈ．  Ａ１１Ｗ
ｉ．  Ｙ１３Ｗ／Ｒ
ｊ．  Ｎ１４Ｌ／Ｋ
ｋ．  Ｑ１５Ｒ／Ｌ
ｌ．  Ｖ１６Ｋ／Ｗ
（式中、「−」はアミノ酸の欠失を示す。）
からなる群から選択される１個以上の置換又は欠失を含む。
【００２８】
本発明の一実施態様では、本ペプチドは、配列番号４（鎖１００）で定義される元のペプチドと比較して、１〜５個、好ましくは５個のＮ末端アミノ酸を欠失している。より短いペプチドはその抗菌活性を維持することができることが見出された。さらに、より短いペプチドでは合成コストが低下する。
【００２９】
さらなる実施態様では、Ｎ末端が欠失した配列番号４のペプチド変異体は、Ｖ１６Ｋ／Ｗ、Ｑ１５Ｒ／Ｌ、Ｎ１４Ｌ／Ｋ、Ｙ１３Ｒ／Ｗ、Ａ１１Ｗ、Ｉ７Ｗ及びＭ６Ｗからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７個又はすべてのアミノ酸の改変をさらに含む。
【００３０】
一実施態様に従って、配列番号５で定義されるペプチドは、Ｗ、Ｒ、Ｋ、Ｆ、Ｉ及びＬの１個以上の置換で、より好ましくはＷ、Ｋ及びＲの１個以上の置換で改変される。これらの置換は、微生物の膜との相互作用を増加させ、それによって抗菌活性を改善する。
【００３１】
一実施態様では、配列番号５（鎖２００）で定義されるペプチドは、Ｎ１Ｒ／Ｋ／Ｗ、Ｒ２Ｗ、Ｉ３Ｌ、Ｖ４Ｉ／Ｌ、Ｑ５Ｗ／Ｋ／Ｒ、Ｑ６Ｒ／Ｌ／Ｗ、Ｒ７Ｗ、Ｔ８Ｒ／Ｗ／Ｆ、Ｓ９Ｆ／Ｗ／Ｒ／Ｌ及びＳ１０Ｋ／Ｌからなる群から選択される１個以上、好ましくは少なくとも６、７、８、９又はさらには１０個の置換を含む。
【００３２】
代替的又は付加的に、配列番号５で定義されるペプチドは、ＫのＣ末端付加（例えば、配列番号１５で定義される鎖２０７）で改変することができる。
【００３３】
一実施態様では、配列番号５で定義されるペプチドのアミノ酸残基Ｒ１１は改変されていない。
【００３４】
一実施態様に従って、本ペプチドは、配列番号５（鎖２００）において、
ａ．  Ｎ１Ｋ／Ｒ／Ｗ
ｂ．  Ｒ２Ｗ
ｃ．  Ｉ３Ｌ
ｄ．  Ｖ４Ｉ／Ｌ
ｅ．  Ｑ５Ｗ／Ｋ／Ｒ
ｆ．  Ｑ６Ｒ／Ｌ／Ｗ
ｇ．  Ｒ７Ｗ／Ｒ
ｈ．  Ｔ８Ｒ／Ｗ／Ｆ／Ｋ
ｉ．  Ｓ９Ｆ／Ｗ／Ｒ／Ｌ
ｊ．  Ｓ１０Ｋ／Ｌ
からなる群から選択される１個以上の置換又は欠失を含む。
【００３５】
一実施態様に従って、配列番号６で定義されるペプチドは、Ｗ、Ｒ、Ｋ、Ｌ及びＩの１個以上の置換で、より好ましくはＷ及びＲの１個以上の置換で改変される。これらの置換は、微生物の膜との相互作用を増加させ、それによって抗菌活性を改善する。
【００３６】
一実施態様では、配列番号６（鎖３００）で定義されるペプチドは、Ｙ１Ｉ／Ｒ／Ｗ／Ｋ、Ｄ２Ｉ／Ｌ／Ｗ／Ｒ、Ｇ４Ｒ／Ｗ、Ｆ５Ｗ／Ｒ、Ｇ６Ｒ／Ｗ／Ｌ、Ｆ８Ｒ、Ｋ９Ｒ、Ｋ１０Ｒ及びＭ１１Ｌ／Ｒ／Ｗ／Ｋからなる群から選択される１個以上、好ましくは少なくとも４、５、６、７、８又はさらには９個の置換を含む。
【００３７】
好ましくは、配列番号６で定義されるペプチドのアミノ酸残基Ｋ３及びＬ７は改変されていない。 
【００３８】
代替的又は付加的に、配列番号６で定義されるペプチドは、アミノ酸残基９と１０の間にＫの付加で改変することができる（例えば、配列番号３２で定義される鎖３１３）。
【００３９】
一実施態様に従って、本ペプチドは、配列番号６（鎖３００）において、
ａ．  Ｙ１Ｉ／Ｒ／Ｗ／Ｋ
ｂ．  Ｄ２Ｉ／Ｌ／Ｗ／Ｒ
ｄ．  Ｇ４Ｒ／Ｗ
ｅ．  Ｆ５Ｗ／Ｒ
ｆ．  Ｇ６Ｒ／Ｗ／Ｌ
ｈ．  Ｆ８Ｒ
ｉ．  Ｋ９Ｒ
ｊ．  Ｋ１０Ｒ
ｋ．  Ｍ１１Ｌ／Ｒ／Ｗ／Ｋ
からなる群から選択される１個以上の置換又は欠失を含む。
【００４０】
一実施態様では、本ペプチド又はその変異体は、配列番号４（鎖１００）若しくは配列番号７〜３１（鎖１０１〜１２５）の１個から選択される配列を含むか、又はその配列からなる。
【００４１】
一実施態様では、本ペプチド変異体（ペプチド）は、配列番号７〜１５（鎖１０１〜１０９）から選択される配列を含むか、又はそこの配列からなる。一実施態様では、ペプチド変異体は、配列番号１０〜１５（鎖１０４〜１０９）から選択される配列を含むか、又はその配列からなる。一実施態様では、ペプチド変異体は、配列番号１０、１１及び１５（鎖１０４，１０５及び１０９）から選択される配列を含むか、又はその配列からなる。
【００４２】
一実施態様では、本ペプチドは配列番号４（鎖１００）を含む。一実施態様では、ペプチドは配列番号４（鎖１００）からなる。
【００４３】
一実施態様では、本ペプチド又はその変異体は、配列番号５（鎖２００）若しくは配列番号３２〜５４（鎖２０１〜２２３）の１個から選択される配列を含むか、又はその配列からなる。
【００４４】
一実施態様では、本ペプチド変異体は、配列番号３２〜４１（鎖２０１〜２１０）から選択される配列を含むか、又はその配列からなる。一実施態様では、本ペプチド変異体は、配列番号３２、３４、３５及び３９（鎖２０１，２０３，２０４又は２０８）から選択される配列を含むか、又はその配列からなる。
【００４５】
一実施態様では、本ペプチドは配列番号５（鎖２００）を含む。一実施態様では、本ペプチドは配列番号５（鎖２００）からなる。
【００４６】
一実施態様では、本ペプチド又はその変異体は、配列番号６（鎖３００）若しくは配列番号５５〜７９（鎖３０１〜３２５）の１個から選択される配列を含むか、又はその配列からなる。
【００４７】
一実施態様では、本ペプチド変異体は、配列番号５５〜６７（鎖３０１〜３１３）から選択される配列を含むか、又はその配列からなる。一実施態様では、本ペプチド変異体は、配列番号５５、５８、５９及び６１〜６５（鎖３０１，３０４，３０５又は３０７〜３１１）から選択される配列を含むか、又はその配列からなる。
【００４８】
一実施態様では、本ペプチド変異体は、配列番号６１及び６２（鎖３０７及び３０８）から選択される配列を含むか、又はその配列からなる。 
【００４９】
一実施態様では、本ペプチドは配列番号６（鎖３００）を含む。一実施態様では、本ペプチドは配列番号６（鎖３００）からなる。
【００５０】
本ペプチド及びその変異体は、異なる微生物に対して異なる抗菌活性を有することは明らかである。本研究では、細菌と真菌の両方に対して抗菌活性を試験した。
【００５１】
選択されたペプチド（ペプチド変異体）の抗細菌活性を、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli，ATCC 25922）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae，ATCC 10031）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa，ATCC 27853）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus，ATCC 25923）に対して試験した。本ペプチド変異体の抗細菌活性を、放射状拡散アッセイ及び最小阻止濃度を用いて測定した。また、本ペプチド変異体の抗真菌活性を、放射状拡散アッセイを用いて評価した。
【００５２】
抗真菌活性を、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus，DSM 1959）及びペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum，DSM 1075）に対して試験した。
【００５３】
一実施態様では、本ペプチド又はその断片は化学的に合成される（合成ペプチド）。別の実施態様では、本ペプチドは組換法で製造される。一実施態様では、本ペプチド又は複数のペプチドは、組換ペプチド製造の増殖培地又は合成培地から単離される。
【００５４】
一実施態様では、本抗菌ペプチドは、場合によってリンカーペプチドを用いて、医療機器、食品パッケージ、担体物質、又は例えばバイオセンサーの表面に付着される。代替的又は付加的に、別の実施態様では、例えば、本抗菌ペプチドをバイオセンサーに用いる場合、本ペプチドは蛍光剤又は酵素基質等の検出可能な物質に結合される。一実施態様では、前記ペプチドは、医薬品又はコーティング剤として使用するために、シリコン、ポリエチレン及び他の材料に固定化される。
【００５５】
溶血アッセイでは、ヒト赤血球を溶解してヘモグロビンを放出する１２８μg／ｍｌ濃度での本ペプチドの能力を測定した。本明細書に記載のペプチドは、好ましくは、哺乳類の体内で低い溶血活性（０．２〜３．８％溶血）を有する。試験した溶血濃度（１２８μg／ｍｌ）は、鎖１０５、２０１及び３０８の最小阻止濃度（ＭＩＣ）の５０倍を超え、溶血はそれぞれ０．２〜０．５％で無視できる。これらのペプチドは、細菌の殺滅に必要な濃度で副作用をほとんど又は全く示さないので、抗菌剤として有用である。
【００５６】
一実施態様では、本ペプチド又はその変異体は、微生物、特にグラム陽性及びグラム陰性細菌、特にスタフィロコッカス科（Staphylococcaceae）及びエンテロバクター科（Enterobacteriaceae）に対して活性を示す。一実施態様では、本ペプチドは、酵母及び／又は真菌に対して活性を示す。
【００５７】
一実施態様では、本ペプチド又はその変異体は、細菌に対して活性を示す。一実施態様では、本ペプチド又はその変異体は、真菌に対して活性を示す。一実施態様では、本ペプチド又はその変異体は、細菌及び真菌に対して活性を示す。細菌及び／又は真菌に対する活性は、例えば、前記微生物の繁殖若しくは増殖の抑制又は殺滅であり得る。
【００５８】
一実施態様では、本ペプチド又はその変異体は、グラム陽性細菌、特にスタフィロコッカス科の微生物、特にスタフィロコッカス・アウレウスの微生物に対して活性を示す。
【００５９】
配列番号１０〜１５（鎖１０４〜１０９）、配列番号３２、３４〜３６、３９〜４１（鎖２０１，２０３〜２０５，２０８〜２１０）並びに配列番号５５〜６５及び６７（鎖３０１〜３１１及び３１３）のいずれかを本質的に含むペプチドは、スタフィロコッカス科、特にスタフィロコッカス・アウレウスに対して特に活性である。スタフィロコッカス・アウレウスは、市販の抗生物質のほとんどに対して耐性を持つようになっている。本発明者らが本明細書で述べる抗菌ペプチドは、微生物に耐性を誘導しないため、有望で新規な種類の抗生物質である。
【００６０】
一実施態様では、本ペプチドは、グラム陰性菌、特にエシェリヒア・コリに対して活性を示す。配列番号１０〜１５（鎖１０４〜１０９）、配列番号３２、３４〜３６、３９〜４１（鎖２０１，２０３〜２０６，２０８〜２１０）並びに配列番号５５〜６５及び６７（鎖３０１〜３１１及び３１３）のいずれかを本質的に含むペプチドは、エシェリヒア・コリに対して特に活性である。
【００６１】
一実施態様では、本ペプチドは、クレブシエラ属（Klebsiella）、特にクレブシエラ・ニューモニエに対して活性を示す。配列番号１０〜１５（鎖１０４〜１０９）、配列番号３２、３４、３５、３９〜４１（鎖２０１，２０３，２０４，２０８〜２１０）並びに配列番号５５、５８、５９、６１〜６５及び６７（鎖３０１，３０４，３０５，３０７〜３１１及び３１３）のいずれかを本質的に含むペプチドは、クレブシエラ属に対して特に活性である。
【００６２】
一実施態様では、本ペプチドは、シュードモナス属（Pseudomonas）、特にシュードモナス・エルギノーサに対して活性を示す。配列番号１０〜１２及び１５（鎖１０４〜１０６，１０９）、配列番号３２、３４、３５及び３９（鎖２０１，２０３，２０４，２０８）並びに配列番号５５〜６５及び６７（鎖３０１〜３１１及び３１３）のいずれかを本質的に含むペプチドは、シュードモナス属に対して特に活性である。
【００６３】
一実施態様では、本ペプチドはアスペルギルス属（Aspergilli）、特にアスペルギルス・フラバスに対して活性を示す。配列番号１０、１１又は１５（鎖１０４，１０５又は１０９）、配列番号３２又は３５（鎖２０１又は２０４）並びに配列番号６０、６１、６２及び６４（鎖３０６，３０７，３０８及び３１０）のいずれかを本質的に含むペプチドは、アスペルギルス属に対して特に活性である。
【００６４】
一実施態様では、本ペプチドはペニシリウム属（Penicillium）、特にペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）に対して活性を示す。配列番号１０、１１又は１５（鎖１０４，１０５又は１０９）、配列番号３２又は３５（鎖２０１又は２０４）並びに配列番号６０、６１、６２及び６４（鎖３０６，３０７，３０８及び３１０）のいずれかを本質的に含むペプチドは、ペニシリウム属に対して特に活性である。
【００６５】
一実施態様では、本ペプチドは、エシェリヒア・コリ、クレブシエラ・ニューモニエ、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、シュードモナス・エルギノーサ、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、アシネトバクター・バウマンニー（Acinetobacter baumannii）、アシネトバクター・ジョンソニイ（Acinetobacter johnsonii）、スタフィロコッカス・アウレウス、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）及びカンジダ・キルエルモンディエ（Candida quillermondiae）の臨床に関する菌株に対して活性を示す。配列番号１０、１１又は１５（鎖１０４，１０５又は１０９）、配列番号３２又は３５（鎖２０１又は２０４）並びに配列番号５８、６０、６１、６２、６３、６４及び６５（鎖３０４，３０６，３０７，３０８，３０９，３１０及び３１１）のいずれかを本質的に含むペプチド。
【００６６】
鎖１０４、鎖１０５、鎖１０９、鎖２０１、鎖２０４、鎖３０７、鎖３０８及び鎖３１０は、明らかに広域スペクトル抗菌ペプチドであり、グラム陽性及び陰性細菌に対して０．５〜３２μｇ／ｍｌの範囲で活性があり、溶血アッセイの試験でヒトへの副作用がほぼない。
【００６７】
本発明はまた、本明細書に記載の抗菌ペプチド又は複数のペプチドを含む抗菌組成物に関する。一実施態様では、この組成物は、薬学上許容される担体及び場合により他の従来の成分をさらに含む。
【００６８】
治療における使用、特に抗菌剤としての使用のための、配列番号４（鎖１００）、配列番号５（鎖２００）又は配列番号６（鎖３００）を有するペプチド、又は前記配列と少なくとも３７％、好ましくは少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する本ペプチドの変異体、又は本明細書に開示されたいずれかのペプチド。
【００６９】
抗菌活性は、細菌若しくは真菌に対して、又は細菌及び真菌に対して活性を示すことができる。細菌は、グラム陽性細菌又はグラム陰性細菌であり得る。特に、本ペプチドは、スタフィロコッカス属若しくはエシェリヒア・コリ属の微生物、又はスタフィロコッカス属及びエシェリヒア・コリ属の両方に対して活性を有する。本ペプチドの種々の抗菌活性及び溶血特性は上記にて議論されている。
【００７０】
本発明のさらなる一実施態様は、医薬、飼料添加物、保存剤又は界面活性剤としての本明細書に開示されたペプチドの使用である。
【００７１】
一実施態様では、配列番号４、５又は６のいずれかを有するペプチド、又は前記配列と少なくとも３７％、好ましくは少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する本ペプチドの変異体、又は本明細書に開示されたいずれかのペプチドが、医薬として、特に前記のスタフィロコッカス・アウレウスを含む混入する微生物に対する医薬として使用される。
【００７２】
本発明はまた、医薬、飼料添加物、防腐剤又は界面活性剤としての、本明細書に記載された本ペプチド及びその変異体の使用に関する。種々の微生物によって産生される毒素はヒトの食物及び動物飼料を汚染する。防腐剤として用いられる本ペプチドは、この汚染物の増加を減少させることができる。本ペプチドの活性及び他の特性は、他の実施態様に関連して上記にて議論されている。
【００７３】
ペプチド鎖１０４、鎖１０５、鎖１０９、鎖２０１、鎖２０４、鎖３０７、鎖３０８及び鎖３１０のペプチドは、明白に広域スペクトル抗菌ペプチドであり、０．５〜３２μｇ／ｍｌの範囲でグラム陽性及び陰性細菌に対して活性であり、溶血アッセイの試験でヒトへの副作用はほぼない。これらのペプチドは、エシェリヒア・コリ（ATCC 25922）、クレブシエラ・ニューモニエ（ATCC 10031）、シュードモナス・エルギノーサ（ATCC 27853）及びグラム陽性スタフィロコッカス・アウレウス（ATCC 25923）によって引き起こされるグラム陰性感染症に対する治療の可能性を有する。
【００７４】
本発明はまた、本明細書に記載のペプチド又はその変異体で微生物を処理する工程を含む、前記微生物の殺滅又は増殖阻害方法に関する。一実施態様では、本ペプチド又はその変異体は、微生物、特にグラム陽性細菌及び／又はグラム陰性細菌、特にスタフィロコッカス科及びエンテロバクター科、特にスタフィロコッカス・アウレウス及び／又はエシェリヒア・コリの微生物に対して活性を示す。一実施態様では、本ペプチド又はその変異体は、真菌に対して活性を示す。さらなる実施態様では、本ペプチド又はその変異体は、真菌及び細菌の両方に対して活性を示す。本ペプチドの活性及び他の特性は、他の実施態様を参照して上記にて議論されている。
【００７５】
カテーテルは、その表面に付着した後、尿道の内腔に付着することによって細菌のキャリアとして働く。大部分のカテーテルはシリコーンゴム製であり、微生物が容易にカテーテルに付着して、バイオフィルムを形成し、感染を引き起こす。これらの問題を克服するために、リファンピン及びミノサイクリン等の抗生物質、又はカテーテル表面の銀被覆を用いることによるいくつかの戦略が開発されている。しかし、抗生物質を用いることで、臨床適用で細菌の耐性が発現し、抗生物質の効力を危険にさらすことは、よく知られていない。銀被覆カテーテルは、インビトロ研究で効果がないことが判明している。
【００７６】
カテーテル関連尿路感染症（CAUTI）は、抗菌ペプチド（ＡＭＰ）被覆尿路カテーテルを使用することによって防止することができ、抗生物質の耐性の広がりも防止する。
【００７７】
本発明のペプチド又はその変異体は、抗菌活性を必要とする様々な用途で用いることができることも理解されるべきである。
【００７８】
本明細書で用いられる用語は、説明のためのものであり、限定的に捉えられるべきではないことを理解されたい。
【００７９】
本明細書に別々の実施態様として記載される本発明の特徴は、組み合わせて、又は単一の実施態様で提供されてもよい。また、単一の実施態様の文脈で本明細書に記載される本発明の様々な特徴は、別々に又は任意の適切なサブコンビネーションで提供されてもよい。上記の説明で与えられた実施態様は例示の目的のみのためであり、本開示の範囲内で様々な変更及び改変が可能であることを理解されたい。
【００８０】
引用文献のリストを以下に示す。すべての引用文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８１】
以下の非限定的な実施例で、本発明を説明する。
【実施例】
【００８２】
実施例１：全植物ＤＮＡの単離
セイヨウガンコウラン（Empetrum nigrum L.）の新鮮な若葉を７０％エタノール（ｖ／ｖ）で１分間、及び次亜塩素酸ナトリウム（３．５％ｖ／ｖ）で５分間、表面滅菌し、ゲノムＤＮＡの単離に用いたの（Pirttilaら，2001）。
【００８３】
実施例２：メタゲノムライブラリーの構築及び抗細菌活性のスクリーニング
セイヨウガンコウラン（Empetrum nigrum）から単離した植物ＤＮＡを滅菌水に溶解して、０．１μｇ／μlの濃度にした。次に、ＤＮＡをCHEF-DRII（Bio-Rad）システムで分取パルスフィールドゲル電気泳動に供した。電気泳動条件（パルス間隔及び時間）は、６Ｖ／ｃｍの電圧及び１２０°固定角で、０．１５×トリス／ホウ酸／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液を用いて、それぞれＮ／Ｓ ６０秒及びＥ／Ｗ ６０秒で６時間、Ｎ／Ｓ ９０秒及びＥ／Ｗ ９０秒で６時間;Ｎ／Ｓ ９９秒及びＥ／Ｗ ９９秒で６時間であった。電気泳動の間、温度を１０℃に維持した。電気泳動後、ゲルの両側からストリップを切り取り、臭化エチジウムで染色してＤＮＡを可視化した。その後、高分子量のＤＮＡを、染色されていない残存するゲルの部分から切り取り、０．１５×ＴＢＥを含む透析バッグ中で１００Ｖで１時間電気溶出した。従来の方法（Koskimakiら，2010、Tejesviら，2010）に従って、真菌及び細菌に特異的なプライマーによる増幅を行い、微生物ＤＮＡの分離を確認した。クローニングのために、約２５〜３０ｋｂのＤＮＡを末端修復して５’−リン酸化ＤＮＡを生成し、平滑末端脱リン酸化pCC1FOS（商標）ベクターに連結した。MaxPlax Lambda Packaging Extracts（Epicenter）を用いて、連結混合物をラムダファージにパッケージングした。パッケージされたライブラリーをエシェリヒア・コリEPI-300に形質導入し、クロラムフェニコールを補充したＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。スクリーニングするまで、パッケージされたフォスミッドライブラリーを、プール当たり約１０３個のクローンを含むクローンプールとしてクライオチューブ中で保存した。
【００８４】
フォスミッドライブラリースクリーニングを以下のように行った。クローンプールを解凍し、クロラムフェニコールを補充した１５０ｍｍのＬＢ寒天プレート上に広げてプレート当たり約１０００個のコロニーを得た。ライブラリープレートを３０℃で一晩インキュベートし、続いてさらに３〜５日間、室温でインキュベートした。指数関数的に増殖するスタフィロコッカス・アウレウスを含むプレートを上部寒天で覆い、３７℃で一晩インキュベートし、続いてさらに３〜５日間、室温でインキュベートした。抗細菌活性を有するコロニーを、スタフィロコッカス・アウレウスの増殖の阻止域で同定した。このコロニーを上部寒天を通して採取し、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含有するＬＢプレート上に縞を付けることで、クロラムフェニコール感受性アッセイ菌株（スタフィロコッカス・アウレウス）から分離した。BamHIでの消化および電気泳動によって、選択された抗細菌性フォスミドクローンの制限分析を行った。
【００８５】
実施例３：菌株、プラスミド及び増殖条件
EPI-300（商標）−Ｔ１（登録商標）ファージＴ１耐性エシェリヒア・コリ培養物を、適切な抗生物質を補充したLuria-Bertani（ＬＢ）寒天又はＬＢブロス＋１０ｍＭ ＭｇＳＯ４上で３７℃で増殖させた。以下の抗生物質濃度をエシェリヒア・コリ株に用いた。クロラムフェニコール１２．５μｇ／ｍｌ及びアンピシリン１００μｇ／ｍｌ。セイヨウガンコウラン（Empetrum nigrum）のエンドファイトからメタゲノムライブラリーを構築するために、またこのような抗細菌活性を与える遺伝子をサブクローニングするために、２つの複製起点：単一コピー起点（ori2）及び誘導性高コピー起点（oriV）を有するプラスミドpCC1FOS（商標）（Epicentre，マディソン，米国）を用いた。pET11-cベクターを用いて、宿主株エシェリヒア・コリBL21（DE3）金中、抗細菌活性を担う遺伝子を発現させた。
【００８６】
実施例４：クローンpFosS1Aのサブクローニング及び配列決定
寒天重層アッセイから選択した抗細菌性フォスミドクローンをpFosS1と命名した。プラスミドMidiprep Kit（Qiagen）を用いてメタゲノムフォスミドを単離し、Sau3AI（０．１Ｕ／μｌのＤＮＡ，３７℃，１５分間）で部分消化し、ＤＮＡのサイズ選択及びサブクローニングのために、電気泳動に付した。１．５ｋｂより大きな断片をゲルから抽出し、末端修復し、平滑末端脱リン酸化pCC1FOS（商標）に連結した。連結混合物をエシェリヒア・コリに形質転換し、組換えクローンを寒天重層アッセイでスクリーニングし、クロラムフェニコールを補充したＬＢプレート上に広げた。BamHIで消化した後、ゲル電気泳動でスタフィロコッカス・アウレウスの明確な阻止域を示すサブクローンを分析し、約１．８ｋｂの最小挿入物を有するサブクローンを選択した。このサブクローンをpFosS1Aと命名し、製造者の指示（Abi 3730 DNA Analyzer，Abi Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit，Applied Biosystems，ウォリントン，英国）に従ってプライマーpCC1フォアードプライマー及びpCC1リバースプライマーを用いて配列決定した。サブクローンpFosS1A内に含まれるオープンリーディングフレームをEn-MAP1と命名し、GenbankのBLASTプログラム並びにSignalP及びPfamで分析した。
【００８７】
実施例５：メタゲノムライブラリーの構築およびスクリーニング
パルスフィールドゲル電気泳動後、アガロースゲルのウェルに残存したセイヨウガンコウラン（Empetrum nigrum）ゲノムＤＮＡから、エンドファイトＤＮＡに対応するバンドを分離した。バンド中のエンドファイトＤＮＡの存在は、真菌及び細菌に特異的なプライマーを用いたＰＣＲ産物の増幅によって確認された。２０μｇのＤＮＡから約８，０００個のメタゲノムクローンを得た。寒天重層アッセイ法でメタゲノムライブラリーをスクリーニングすることで、スタフィロコッカス・アウレウスの阻止域を示す１個の抗細菌クローンを同定した。しかし、宿主エシェリヒア・コリの増殖阻害は観察されなかった。制限断片分析によって、クローンは３０ｋｂ以上の挿入ＤＮＡを保持していることが示された。抗細菌性クローンから二次ライブラリーを作製して、抗細菌性サブクローンを選択し、抗細菌活性を担う個々の遺伝子を特徴付けた。抗細菌性サブクローンの制限断片分析によって、依然として寒天重層アッセイでスタフィロコッカス・アウレウスの増殖阻害を示したサブクローンpFosS1Aにおいて、最小１．８ｋｂの挿入物が同定された（図１）。
【００８８】
実施例６：クローン上清の分画及び分析
サブクローンpFosS1A及びコントロール（空ベクター）を担持するエシェリヒア・コリ細胞を、クロラムフェニコールを含有するＬＢブロス中、３７℃で一晩増殖させた。これらの培養物をコピー数増幅手順のための接種材料として用いた。これらの培養物の１容量を１０倍量の新鮮なＬＢ＋クロラムフェニコールに添加し、１／１００のCopyControl Induction Solution（Epicenter）を培地に加えてクローンを高コピー数に誘導した。培養物を３７℃で２０時間激しく振盪した後、４℃で、３０４０×ｇで２０分間遠心分離することにより、上清を細菌細胞から分離した。上清をHeto PowerDry LL1500凍結乾燥機（ThermoElectron，ムカジョフ，チェコ共和国）で凍結乾燥させた。凍結乾燥したブロスを秤量し、５０ｍｇを蒸留水２ｍｌに溶解させた。材料を超音波処理器で２０分間保持し、１０分間遠心分離し、濾過（GHP Bulk Acrodisc 13，Pall Life Sciences）し、セミ分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分画した。次いで、９６ウェルプレート標準法で試験菌株としてスタフィロコッカス・アウレウスを用いて、この画分の抗細菌活性を試験した。Micromass LCT Time-of-flight質量分析法（TOFMS）（Micromass，オルトリナム，英国）と組み合わせたAlliance 2690 ＨＰＬＣ（Waters，ミルフォード，マサチューセッツ，米国）で、サブクローンpFosS1Aの上清及びコントロールを分析した。
【００８９】
実施例７：抗細菌性サブクローンの配列解析
サブクローンpFosS1Aの挿入部は、両方向で完全に配列決定され、約１６５０ｂｐの特有のオープンリーディングフレームを含んでいた。推定のリボソーム結合部位及びプロモーター配列は、開始コドンから−３５／−１０上流領域に存在する。核酸配列をGenbankデータベースに存在する配列に対してBLAST分析に供したが、既知の配列との類似性は同定されなかった。これは、単離された遺伝子が新規な構造のタンパク質をコードしていることを示している。従って、このタンパク質を、セイヨウガンコウラン（Empetrum nigrum）メタゲノム抗菌タンパク質１（En-MAP1）と命名した。推定アミノ酸配列の解析から、En-MAP1が５４９アミノ酸のタンパク質（図２）をコードしており、シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）由来の推定タンパク質と最も高い３２％の類似性を有し、既知の機能を有するタンパク質と類似性を共有していないことが明らかになった。SignalP分析によって、En-MAP1のアミノ酸配列が、分泌又は転座のための推定上のアミノ末端シグナル配列を有さないことが示された。推定されたアミノ酸配列を、Pfamタンパク質ファミリーデータベースを用いて保存モチーフについて分析したところ、７７〜１０７，１２６〜１５３及び３９２〜４２０ＡＡの位置（図２）で３個のペンタトリコペプチドリピートモチーフが同定された。En-MAP1は、TMpred及びPSORTで分析したところ、膜貫通領域を有さない可溶性タンパク質であると推測された。残基１４７〜１７６はまた、PSORTで分析したところ、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質に典型的な推測コイル−コイル領域、及び残基４９０で開始する可能性のあるロイシンジッパーを有していた。
【００９０】
実施例８：pET23(b)におけるタンパク質発現
遺伝子En-MAP1を、Nde1及びSal1制限部位を有するプライマーpFosS1F（CATATGAGACTAGTAGCTCATCCTGTTCCTGATGC；配列番号２）及びpFosS1R（GTCGACTTATTAACGAGATGACGTCCTCTGCTGTACG；配列番号３）を用いて増幅した。増幅産物をpET23(b)ベクターにクローニングし、XL1コンピテント細胞に形質転換し、遺伝子同一性を配列決定により確認した。発現研究を、エシェリヒア・コリ株BL21 pLysS及びBL21 pRAREを宿主として用いて行った。タンパク質を封入体として両方の菌株で発現し、単離した（van Lithら，2007）。封入体を５Ｍグアニジン塩酸塩／０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。AKTA FPLC中で４時間かけて３Ｍグアニジン／０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）から０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に線状緩衝液交換を用いて、HisTrapカラム（GE Healthcare Life Sciences）でタンパク質をリフォールディングし、最後に５０ｍＭＥＤＴＡ／２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した。En-MAP1の核酸配列は、受託番号KC466596でGenBankに寄託されている。
【００９１】
実施例９：タンパク質の抗細菌活性分析
１０μｇのタンパク質をＬＢプレート上のスタフィロコッカス・アウレウス培養物上にピペットで入れることによって、リフォールディングされたタンパク質及びリフォールディングされていないタンパク質の両方のスタフィロコッカス・アウレウスに対する抗細菌活性を試験した。０．０１％酢酸中、トリプシンで消化したリフォールディングされたタンパク質及びリフォールディングされていないタンパク質の活性を、３０及び６０μｇ/ｍｌの濃度で試験した。
【００９２】
実施例１０：抗菌ペプチドの予測及びペプチド合成
タンパク質En-MAP1は、in silicoトリプシン消化され（http://au.expasy.org）、１２個のペプチド（Met1〜Met12）が３つの異なるアルゴリズム（サポートベクターマシン（SVM）分類、ランダムフォレスト分類及び判別分析分類）によって、並びにAPD2（http：//aps.unmc.edu/AP/prediction/prediction_main.php）によって、抗菌性であることが推測された（http://www.bicnirrh.res.in/antimicrobial）。合成ペプチドは、GenScript（米国）から購入した。
【００９３】
実施例１１：合成ペプチドの抗菌活性
Andersenら(2010)の記載に従って、放射拡散アッセイ（ＲＤＡ）を行った。簡潔には、１％アガロース、及び５．０×１０５ＣＦＵ／ｍｌのスタフィロコッカス・アウレウス、エシェリヒア・コリ、クレブシエラ・ニューモニエ又はシュードモナス・エルギノーサの細胞を補充した１／１０ミューラー・ヒントン・ブロス（ＭＨＢ）３０ｍｌを、１つのウェルのオムニトレイ（omnitray，Nunc）に移し、ＴＳＰ９６ウェルプレートを重ねた。１００μｇの各合成ペプチドを試験した。また、１／３ポテトデキストロースアガロースを用いて、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）及びバーティシリウム・ダーリエ（Verticillium dahliae）に対してペプチドを試験した。ペプチドの相乗効果を試験するために、各ペプチドを等モル濃度で混合した。Mix1（Met1〜12）、Mix2（Met3，4及び5）、Mix3（Met8，9及び10）、Mix4（Met11，12）及びMix5（8，9，10，11，12）を調製し、エシェリヒア・コリ及びスタフィロコッカス・アウレウスに対して試験した。ゲンタマイシン及びバンコマイシンを細菌に対するポジティブコントロールとして含め、アンホテリシンＢを真菌に対するコントロールとして用いた。
【００９４】
エシェリヒア・コリ（ATCC 25922）、スタフィロコッカス・アウレウス（ATCC 25923）、クレブシエラ・ニューモニエ（ATCC 10031）及びシュードモナス・エルギノーサ（ATCC 27853）に対して最小阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。また、エシェリヒア・コリ、クレブシエラ・ニューモニエ、エンテロバクター・クロアカ、シュードモナス・エルギノーサ、セラチア・マルセッセンス、プロテウス・ミラビリス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニー、アシネトバクター・ジョンソニイ及びスタフィロコッカス・アウレウスの臨床株もＭＩＣアッセイに用いた。さらに、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・パラプシローシス及びカンジダ・キルエルモンディエを含む酵母の臨床株を用いた。マイクロブロス希釈アッセイを用いて、これらの微生物の鎖ペプチドに対する感受性を測定した。一晩インキュベートしたミューラー・ヒントン（ＭＨ）寒天プレートからの各微生物のコロニーをＭＨブロス培地中で懸濁させ、微生物の最終濃度を５．０×１０５ＣＦＵ／ｍｌに調整した。各鎖ペプチド又は参照抗生物質としてゲンタマイシン若しくはテトラサイクリンの１０μｌのアリコートを異なる濃度で、９０μｌの細菌懸濁液とともに９６ウェルのポリプロピレンプレートに加えて、３７℃で２０〜２４時間インキュベートした。鎖ペプチド及び参照抗生物質の濃度は０．１２５〜１２８μｇ／ｍｌの範囲であり、ＭＩＣは細菌の視覚的増殖がない最低濃度として記録した。同様に、抗真菌ＭＩＣをポテトデキストロースブロスで試験した。
【００９５】
実施例１２：抗細菌性クローンの発現分析
液体培地中の小さな抗菌分子の可能な生成について、pFosS1Aを発現するサブクローンをＨＰＬＣ−ＭＳで分析し、コントロール（空ベクター）と比較した。抗細菌クローン及びコントロールのピークのクロマトグラム及びスペクトルは同一であった。培地を分画し、スタフィロコッカス・アウレウスに対する抗細菌活性を試験したが、活性は検出されなかった。これによって、スタフィロコッカス・アウレウスに対する抗細菌活性が、En-MAP1活性によって生成された代謝産物に由来しないことが示唆された。
【００９６】
次いで、En-MAP1遺伝子を発現プラスミドpET23(b)にクローン化し、抗細菌活性がタンパク質それ自体に起因するものであったかどうかを分析した。得られた構築物pET23(b)-FosS1Aは、En-MAP1遺伝子をインフレームに含有していた。エシェリヒア・コリ発現株BL21（DE3）pLyseS及びBL21（DE3）pRAREに形質転換したところ、約６３ｋＤａ（推定質量６３．３ｋＤａ）のタンパク質が、誘導された培養物の細胞抽出物中に産生されたが、誘導されていない培養物では産生されなかった。得られたタンパク質は、タンパク質の配列の最初のアミノ酸の前にアミノ酸配列ＭＨＨＨＨＨＨＭ−を含む。タンパク質を封入体として両菌株で発現し、封入体をHis-Trapカラムで精製し、フォールドし、約１ｍｇの純粋なフォールドされたタンパク質を得た。フォールドされたタンパク質のスタフィロコッカス・アウレウスに対する抗細菌活性を試験したが、活性は観察されなかった。代わりの翻訳開始部位によるより短い断片が抗細菌活性に関与するかを試験するために、En-MAP1の短い断片をコードする３つの構築物を設計し、発現させたが、活性は認められなかった。しかし、フォールドされた完全なEn-MAP1タンパク質（配列番号１）をトリプシンで消化した場合、消化後２時間まで抗細菌活性が観察された（データ示さず）。フォールドされていないタンパク質のトリプシン消化物には活性が検出されなかった。この結果から、抗菌活性が、フォールドされた構造で保護された内部のトリプシン切断部位を含む、ペプチドを産生するタンパク質の断片化に起因することが示唆された。
【００９７】
抗菌活性に関与するペプチドをさらに同定するために、En-MAP1タンパク質をin silicoで消化し、抗菌剤であると予測されたペプチドを合成した。ArgCプロテイナーゼ、Asp-Nエンドペプチダーゼ（EC 3.4.24.33）、キモトリプシン-HS30（EC 3.4.21.1）、クロストリパイン、ＣＮＢｒ（EC 208-051-2）、ギ酸、Lys-C、ヨードソ安息香酸、プロリンエンドペプチダーゼ及びトリプシン等のいくつかの制限酵素、プロテアーゼ及び化学物質の切断部位をin-silico分析に含めた。ペプチド断片の抗菌活性は４つの異なるアルゴリズム（サポートベクターマシン（SVM）分類、ランダムフォレスト分類、判別分析分類及びAPD2）を用いて予測された。
【００９８】
これらのペプチドの大部分はトリプシン消化の予測に由来した。３個のペプチド（図３でMet10、Met11及びMet12として示され、それぞれ表１、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、３ｂ及び３ｃ並びに配列表に示される、配列番号４で定義される鎖１００、配列番号５で定義される鎖２００、及び配列番号６で定義される鎖３００）はそれぞれ、Asp-Nエンドペプチダーゼ16、キモトリプシン-HS30及びＣＮＢｒの消化に由来した。これらのペプチドのうち８個は、内部のトリプシン切断部位を含んでいた。
【００９９】
実施例１３：塩、ｐＨ及び熱安定性
ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中、２ｍｇ／ｍｌの濃度にペプチドを希釈し、＋４℃、２５℃（ＲＴ）、３７℃及び４５℃等の異なる温度でインキュベートすることで、熱安定性を評価した。また、−２０℃で保存したペプチドをコントロールとして使用した。各々の時間間隔の後、１００μｌ（２ｍｇ／ｍｌ）のペプチドを採取し、放射拡散アッセイのために−２０℃で保存して、抗細菌活性を測定した（図８）。ペプチドはまた、それらをｐＨ４〜９の異なるｐＨ値で希釈することで試験した。異なる濃度（５０，１００及び２００ｍＭ）のＮａＣｌをＭＨ培地に添加することで抗菌活性に対するＮａＣｌの効果を試験し、４個のATCC細菌株に対する最小阻止濃度を試験した。
【０１００】
実施例１５：被覆シリコンカテーテル及び非被覆シリコンカテーテルの細菌付着
被覆（鎖１０５又は鎖２０１）及び非被覆シリコンカテーテルを０．５ｃｍ片に切断し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、５×１０５ＣＦＵ／ｍｌの細菌（エシェリヒア・コリ及びスタフィロコッカス・アウレウス）培養物１ｍｌで懸濁した２４ウェルプレートに入れた。サンプルを３７℃で６時間、１５０ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーション後、新鮮なＰＢＳを用いて各カテーテル片を１ｍｌのＰＢＳで２回すすいだ。カテーテル片をエッペンドルフチューブに移し、５００μｌのＰＢＳを加え、水浴中で２分間超音波処理し、５秒間ボルテックスし、連続希釈し、ＣＦＵを測定した。
【０１０１】
実施例１４：透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）のための細胞の調製
エシェリヒア・コリ及びスタフィロコッカス・アウレウスを等比級数増殖期（mid-exponential phase）まで増殖させ、６００ｎｍでの吸光度を測定することでミューラー・ヒントン・ブロス（ＭＨＢ）培地で０．１の細胞密度に希釈し、１０μｇ／ｍｌの鎖ペプチドと共に３７℃で１時間、インキュベートした。インキュベーション後、等容量の０．１Ｍリン酸緩衝液中の２％グルタルアルデヒドを添加し、２分間、５０００ｒｐｍで遠心分離することで細胞をペレット化し、細胞ペレットを０．１Ｍリン酸塩中の１％グルタルアルデヒドで固定した。細胞を四酸化オスミウムで後固定し、アセトン又はアルコールの濃度を漸増させて脱水し、プラスチック樹脂（Epon）に包埋した。超薄切片（７０〜８０ｎｍ）を、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で後染色し、ＴＥＭで観察した。Veleta及びQuemesaＣＣＤカメラを備えたTecnai G2 Spirit 120kV TEMを用いて顕微鏡撮影をした。
【０１０２】
【表１−１】
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【０１０３】
【表１−２】
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【０１０４】
【表１−３】
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【０１０５】
【表１−４】
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【０１０６】
スタフィロコッカス・アウレウス、エシェリヒア・コリ及びバチルス・ダリアに対する１２個のペプチド（Met1〜Met12）の抗菌活性を試験した。最初のスクリーニングは、放射拡散アッセイによって行い、抗菌活性を確認した。ペプチドMet1、Met3、Met4、Met5、Met10、Met11及びMet12はそれぞれ１００μｇ／ウェルの濃度でエシェリヒア・コリに対して活性であった（図３）。Met3、Met10及びMet11はそれぞれ１００μｇ／ウェルの濃度でスタフィロコッカス・アウレウスに対して活性を示した。等モル濃度のペプチドを混合することによって、ペプチドの相乗効果を試験したが、活性に有意差は見られなかった。Met8にバチルス・ダリアに対する中程度の抗真菌活性が観察された（データは示さず）。すべてのサンプルについてエシェリヒア・コリ及びスタフィロコッカス・アウレウスに対する最小抑制濃度（ＭＩＣ）アッセイを行った。Met11は９５μＭの濃度で活性であり、残りのペプチドは＞１９０μＭのＭＩＣを有していた。Met12以外のすべてのペプチドはα−ヘリックス構造を有すると予測された。
【０１０７】
合理的な設計技術を用いて、元のペプチドに様々なアミノ酸を組み込むか置換することによって、ペプチドの変異体を設計した。従って、抗菌活性を改善するために様々な位置でトリプトファン（Ｗ）、アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）で鎖１００、鎖２００及び鎖３００を設計及び改変した（図４ａ〜ｃ及び図５ａ〜ｃ）。一部のペプチドでは、ロイシン（Ｌ）、システイン（Ｃ）、イソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）及びアラニン（Ａ）等の他のアミノ酸も用いた。正電荷、脂肪族指標及び不安定性指標等の種々のパラメータに基づいて、３２個の変異体及び３個の元のペプチドを合成のために選択した。エシェリヒア・コリ（ATCC 25922）、スタフィロコッカス・アウレウス（ATCC 25923）、クレブシエラ・ニューモニエ（ATCC 10031）及びシュードモナス・エルギノーサ（ATCC 27853）に対して放射拡散アッセイを用いてペプチド変異体を試験した（図６ａ〜ｃ）。阻止域は、エシェリヒア・コリ及びスタフィロコッカス・アウレウスについては１０〜１８ｍｍ、シュードモナス・エルギノーサ及びクレブシエラ・ニューモニエについては６〜１８ｍｍ及び８〜１８ｍｍの範囲であった（表２）。ゲンタマイシンについては２２〜２４ｍｍであった。アスペルギルス・フラバス（DSM 1959）及びペニシリウム・クリソゲナム（DSM 1075）に対して有望な抗細菌ペプチド（鎖１０４，１０５，１０９，２０１，２０４，３０６，３０７，３０８，３１０）について抗真菌活性を試験した。これらのすべてのペプチドは、２０μｇの濃度で活性を有し、アンフォテリシンＢを２０μｇでポジティブコントロールとして用いた（図７）。
【０１０８】
最小阻止濃度（ＭＩＣ）をマイクロブロス希釈法により試験した。そして、鎖１０４、１０５及び１０９は、それぞれエシェリヒア・コリ（ATCC 25922）、スタフィロコッカス・アウレウス（ATCC 25923）、クレブシエラ・ニューモニエ（ATCC 10031）及びシュードモナス・エルギノーサ（ATCC 27853）の増殖を１〜８μｇ／ｍｌで抑制した（表３ａ、３ｂ及び３ｃ）。ボランティアから寄付された新鮮な血液の赤血球からのヘモグロビンの放出を測定することによって、ペプチドの膜溶解活性を試験した。Schmidtchenら，2011のプロトコルに従って５４０ｎｍでＯＤを取ることで、分光測定的にヘモグロビンレベルを測定した。溶血％は０．１〜９％の範囲であり、これらのペプチドの大部分が１２８μｇ／ｍｌの濃度では宿主に何の影響も及ぼさないことが示された（表３）。
【０１０９】
１２個のペプチド鎖１０４、鎖１０５、鎖１０９、鎖２０１、鎖２０４、鎖３０４、鎖３０６、鎖３０７、鎖３０８、鎖３０９、鎖３１０及び鎖３１１は、４つのATCC株に対して非常に活性であることが見出された。従って、これら１２個のペプチドをＤ型アミノ酸として合成し、エシェリヒア・コリ、クレブシエラ・ニューモニエ、エンテロバクター・クロアカ、シュードモナス・エルギノーサ、セラチア・マルセッセンス、プロテウス・ミラビリス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマニ、アシネトバクター・ジョンソニイ及びスタフィロコッカス・アウレウスの臨床株に対して試験した。カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・パラプシローシス及びカンジダ・キルエルモンディエを含む酵母の臨床株も、１２個の鎖ペプチドについて試験した。最小阻止濃度（ＭＩＣ）はこれらのペプチド間で異なり、表４ａ、４ｂ、４ｃ及び５ａ、５ｂ、５ｃに示されている。ペプチド鎖１０５、２０１及び３０８は、セラチア・マルセッセンス及びプロテウス・ミラビリスを除いて、すべての細菌及び酵母に対して０．５〜３２μｇ／ｍｌの間のＭＩＣを有する広域スペクトル抗菌剤であり、セラチア・マルセッセンス及びプロテウス・ミラビリスに対するＭＩＣは６４〜１２８μｇ／ｍｌの間であった。ペプチド鎖３０６は、エシェリヒア・コリに対して１μｇ／ｍｌであり、残りの細菌株で＞３２μｇ／ｍｌである狭いスペクトル活性を有する（図１０ｃ）。
【０１１０】
スタフィロコッカス・アウレウスRN4220の抗生物質感受性株及びスタフィロコッカス・アウレウスCOL（ＭＲＳＡ）のメチシリン耐性株に対して、ペプチド鎖１０４、鎖１０５、鎖２０１、鎖３０８及び鎖３１０を試験した。Ｌ型又はＤ型アミノ酸のいずれかを含む鎖ペプチドをこれらの細菌に対して試験した。Ｄ型ペプチドはＬ型と比較してより良好な活性を有することが見出された（表６）。鎖ペプチドとエルタペネム（４μｇ／ｍｌ）との相乗的活性を、ＭＲＳＡ株に対する活性に影響するかを知るために試験した。すべての鎖ペプチドは、０．０３〜４μｇ／ｍｌの範囲のＭＩＣでＭＲＳＡ株に対して抗細菌活性を有することが見出された。鎖３１０は、Ｌ型及びＤ型の両方の態様について、エルタペネム（４μｇ／ｍｌ）とともに０．０６及び０．０３μｇ／ｍｌのＭＩＣでＭＲＳＡ株に対して最良の抗菌活性を有する（表６）。
【０１１１】
多くの抗菌ペプチド（ＡＭＰ）は、細菌及び真菌の臨床菌株に対して広範囲の抗菌活性を有する。抗菌ペプチドは、塩感受性ステップによって細菌膜との静電相互作用によって二次構造を形成する。従って、ヒト体液中の高い塩濃度が多くのＡＭＰを失活させる可能性があり、医療における適用のためには耐塩性ＡＭＰを開発することが不可欠である。しかし、生理学的状態、ｐＨ、温度及び高い塩濃度がこれらのペプチドの活性に影響を及ぼすことはよく知られている。本発明者らは、鎖１０４、１０５、２０１、２０４、３０６及び３０８のｐＨ、塩及び熱安定性を評価し、これらのペプチドが１４日間にわたって４５℃まででもｐＨ又は温度によって妨げられないことを見出した（図８及び９）。しかし、２００ｍＭのＮａＣｌ濃度を用いた場合、鎖１０４、１０５、２０１、２０４、３０６及び３０８のＭＩＣ値は２倍に増加する。
【０１１２】
細胞表面上の５×ＭＩＣでの処置時の細胞に対するＡＭＰ作用メカニズム及び細胞内変化を知るために、電子顕微鏡研究が必要とされた。一般的にＡＭＰは低濃度でも細胞膜に多数のストレスを引き起こす。エシェリヒア・コリは、細胞質膜（７ｎｍ）、ペプチドグリカン層（７〜８ｎｍ）及び外膜（１０〜１５ｎｍ）を有する複雑な細胞構造を有する。エシェリヒア・コリの抗生物質耐性は、外膜と一緒にある内部ペプチドグリカンの存在に起因する。鎖ペプチド（１０５，２０１，３０８）とインキュベーションすると、エシェリヒア・コリ細胞のほぼすべてが棒状の構造的完全性を失い、顆粒構造の蓄積、細胞表面から突出した泡様構造及び歪みが細胞に見られた（図１１）。スタフィロコッカス・アウレウス脂質二重層と鎖ペプチドの相互作用は、膜面積の拡大とともに見ることができる。本発明者らはまた、細胞質膜、及び細胞内二重層膜としての球状メソソーム、及び細胞内に形成されたメソゾーム様構造が拡大することを認めた。
【０１１３】
カテーテル関連感染は、生体材料表面への浮遊細菌細胞の付着、並びにコロニー形成及びバイオフィルム形成によって開始された。鎖２０１又は鎖１０５で固定されたカテーテルは、エシェリヒア・コリ及びスタフィロコッカス・アウレウスに対して優れた抗菌活性を示した。スタフィロコッカス・アウレウス及びエシェリヒア・コリの生存細胞がそれぞれ７０％及び３０％を超えて減少することが観察された（図１２）。
【０１１４】
【表２ａ】
0006788173.tif 000006
【０１１５】
【表２ｂ】
0006788173.tif 000007
【０１１６】
【表２ｃ】
0006788173.tif 000008
【０１１７】
【表３ａ】
0006788173.tif 000009
【０１１８】
【表３ｂ】
0006788173.tif 000010
【０１１９】
【表３ｃ】
0006788173.tif 000011
【０１２０】
【表４ａ−１】
0006788173.tif 000012
【０１２１】
【表４ａ−２】
0006788173.tif 000013
【０１２２】
【表４ｂ−１】
0006788173.tif 000014
【０１２３】
【表４ｂ−２】
0006788173.tif 000015
【０１２４】
【表４ｃ−１】
0006788173.tif 000016
【０１２５】
【表４ｃ−２】
0006788173.tif 000017
【０１２６】
【表５ａ】
0006788173.tif 000018
【０１２７】
【表５ｂ】
0006788173.tif 000019
【０１２８】
【表５ｃ】
0006788173.tif 000020
【０１２９】
【表６】
0006788173.tif 000021
【０１３０】
参考文献
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Wang, G.S., Li, X., and Wang, Z. (2009) APD2: The updated antimicrobial peptide database and its application in peptide design. Nucleic Acids Res. 37, D933-D937.
【図１】
0006788173.tif 000022
【図２】
0006788173.tif 000023
【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
0006788173.tif 000026
【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
0006788173.tif 000029
【図５ｃ】
0006788173.tif 000030
【図６ａ】
0006788173.tif 000031
【図６ｂ】
0006788173.tif 000032
【図６ｃ】
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【図７ａ】
0006788173.tif 000034
【図７ｂ】
0006788173.tif 000035
【図８ａ】
0006788173.tif 000036
【図８ｂ】
0006788173.tif 000037
【図８ｃ】
0006788173.tif 000038
【図９ａ】
0006788173.tif 000039
【図９ｂ】
0006788173.tif 000040
【図９ｃ】
0006788173.tif 000041
【図１０ｃ】
0006788173.tif 000042
【図１１ａ】
0006788173.tif 000043
【図１１ｂ】
0006788173.tif 000044
【図１１ｃ】
0006788173.tif 000045
【図１２】
0006788173.tif 000046
【配列表】
0006788173000001.app