(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1に記載のアミノ酸48までのN末端部分を欠失した糖タンパク質H（gH）若しくは相同性gHの対応する領域のN末端に融合された異種性ポリペプチドリガンド、又は、配列番号1に記載のgHのアミノ酸19から開始してアミノ酸48で終了するN末端領域内若しくは相同性gHの対応する領域内に挿入された異種性ポリペプチドリガンドを含む、組み換え感染性ヘルペスウイルス。
【請求項２】
前記異種性ポリペプチドリガンドが、配列番号1に記載のgHのアミノ酸23と24の間のN末端領域、又は相同性gHの対応する領域に挿入される、請求項1に記載の組み換え感染性ヘルペスウイルス。
【請求項３】
前記異種性ポリペプチドリガンドがgHのH1AドメインのN末端に挿入される、請求項1又は2に記載の組み換え感染性ヘルペスウイルス。
【請求項４】
N末端領域の1以上のgHアミノ酸が欠失される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組み換え感染性ヘルペスウイルス。
【請求項５】
前記ヘルペスウイルスが減少した毒性を有するか、又は疾患細胞において非疾患細胞と異なる複製能力を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組み換え感染性ヘルペスウイルス。
【請求項６】
成熟糖タンパク質H（gH）若しくは配列番号1に記載のアミノ酸48までのN末端部分を欠失した糖タンパク質H（gH）若しくは相同性gHの対応する領域のN末端に融合された異種性ポリペプチドリガンド、又は、配列番号1に記載のgHのアミノ酸19から開始してアミノ酸48で終了するN末端領域内若しくは相同性gHの対応する領域内に挿入された異種性ポリペプチドリガンドを含む、組み換え感染性ヘルペスウイルスであって、
前記組み換え感染性ヘルペスウイルスが改変糖タンパク質D（gD）を含むか若しくはgDを欠き、
前記改変gDが、配列番号4に記載のgDのアミノ酸残基26〜33のいずれかから開始し、アミノ酸残基31〜63のいずれかで終了する、及び／又はアミノ酸残基65〜86のいずれかから開始し、アミノ酸残基235〜243のいずれかで終了するアミノ酸欠失を有し、又は相同性gDの対応する領域のアミノ酸欠失を有し、前記欠失がその細胞のリガンドへのgDの特異的結合の減少又は消失を生じさせるものである、
組み換え感染性ヘルペスウイルス。
【請求項７】
成熟gD若しくはトランケートgDのN末端に融合された、又はgDに挿入された異種性ポリペプチドリガンドを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組み換え感染性ヘルペスウイルス。
【請求項８】
異種性の検出可能なマーカー、及び／又は下記：
i）1以上の治療用タンパク質、
ii）1以上の異種抗原若しくは自己抗原、エピトープ／ネオエピトープ、若しくはエピトープ／ネオエピトープのストリング、又は、
iii）1以上のプロドラッグ変換酵素、
の1以上を発現する1以上の発現カセットを更に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組み換え感染性ヘルペスウイルス。
【請求項９】
gH及び／若しくはgDに融合又は挿入された前記異種性ポリペプチドリガンドが、細胞表面でアクセス可能な分子若しくはその一部に結合し、又は、
gH及び／若しくはgDに融合若しくは挿入された前記異種性ポリペプチドリガンドが、細胞表面でアクセス可能な分子若しくはその一部に結合し、前記細胞が疾患細胞である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組み換え感染性ヘルペスウイルス。
【請求項１０】
医薬における使用に対する請求項1〜9のいずれか一項に記載の組み換え感染性ヘルペスウイルス。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか一項に記載の組み換え感染性ヘルペスウイルス、又は成熟糖タンパク質H（gH）若しくはトランケートgHのN末端に融合された若しくはgHに挿入された少なくとも異種性ポリペプチドリガンドのゲノムを含む、核酸。
【請求項１２】
請求項11に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１３】
請求項1〜9のいずれか一項に記載の組み換え感染性ヘルペスウイルス、請求項11に記載の核酸、又は請求項12に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１４】
請求項1〜9のいずれか一項に記載の組み換え感染性ヘルペスウイルスを使用する細胞を死滅させるin vitro方法。
【請求項１５】
細胞において請求項1〜9のいずれか一項に記載の組み換え感染性ヘルペスウイルスを増殖させるin vitro方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患の治療法の分野に関する。特に、本発明は、糖タンパク質Hに融合された異種性ポリペプチドを有する再標的化されたヘルペスウイルスであって、該ポリペプチドが特定の細胞、特に疾患細胞を標的とする、ヘルペスウイルスに関する。また、本発明は、本発明のヘルペスウイルスのゲノムを含む核酸、この核酸を含むベクター、及び該核酸又は該ベクターを含む細胞に関する。本発明は、更に、本発明のヘルペスウイルスを使用して細胞を死滅させること、及び本発明のヘルペスウイルスをin vitroで増殖させる方法に関する。
【０００２】
本発明に至る研究は、第7次欧州研究開発フレームワークプログラム（FP7/2007-2013）／ERC補助金協定第340060号による欧州研究会議からの資金提供を受けている。
【背景技術】
【０００３】
過去数十年間、治療法又は治癒に移され(translate)、ヒトの健康及び生活の質に対する改善をもたらした発見が数多くあるにもかかわらず、治療することができず、治癒しにくい疾患及び病状の負担は増え続けている。これらの中でも顕著なのは、多数の形態の癌、特に転移形態の癌であり、これらの癌は、放射線化学療法若しくは生物学的医薬、又はそれらの組み合わせにより治療されているが、その成功は極めて限定的である。
【０００４】
過去20年間、癌及び転移を治療するために腫瘍退縮剤（o-HSV）として単純ヘルペスウイルス（HSV）を利用する多くの努力がなされてきた。例として、ウイルスを弱毒化するため、及び或る程度の癌特異性を与えるために、いくつかのウイルス遺伝子の欠失を伴う、遺伝子操作されたHSVがある。HSV1716と名付けられたウイルスによって例示されるこれらのウイルスは、その生成物がPKR（プロテインキナーゼR）の活性化によってもたらされる宿主防御を請け負う（contracts）、γ134.5遺伝子の片方又は両方のコピーの欠失を伴う。ウイルス複製が妨害されるように非癌細胞がウイルスに対する生得的反応を備える（mount）のに対し、癌細胞のうちのいくつかは、生得的反応の欠陥を示すことによって、Δγ134.5 HSVを複製させ、結果的に癌細胞を殺傷することによって、γ134.5遺伝子の欠失を伴うHSVは、部分的な癌特異性を得る。これらのo-HSVの欠点は、癌細胞が異種性であるということであり、Δγ134.5 HSVは、PKR応答を欠く癌細胞の一部を殺傷することができるに過ぎない。安全上の理由で、また癌特異性の改善を達成するため、いくつかの例ではΔγ134.5 HSVは、リボヌクレオチドレダクターゼの大サブユニットをコードするUL 39遺伝子の欠失、ICP 47の欠失等によって例示される、更なる欠失を伴うよう操作されている。これらの追加の欠失は、o-HSVの更なる弱毒化をもたらす。
【０００５】
弱毒化の結果として生ずる腫瘍退縮効果の制限を克服するために、γ134.5遺伝子の欠失又は欠失の組み合わせを伴うo-HSVは、ケモカイン又はサイトカインをコードするため更に修飾された。2つの適切な例は、T-VEC及びM032である。最初はOnco-Vexと名付けられ、その後T-Vecと改名されたo-HSVは、GM-CSFをコードするものであり、単球及び樹状細胞の動員及び成熟を支援することにより治療された患者の患者自身の腫瘍に対する反応を増大する。その作用は、治療された患者の免疫系による腫瘍のクリアランスの増強である。第III相臨床試験では、T-Vecは、転移性黒色腫を伴う患者の転帰を改善した。第2の例は、IL12の配列をコードするように操作されたΔγ134.5 HSVのM032である。このウイルスはTh1応答を支持すると予想される。第I相試験において、M032による治療に対する神経膠芽腫によって冒された患者の募集が行われている。弱毒化ウイルスの主な制限は、（i）in vivoでの、及び効果的な接種菌液を産生するのに十分大規模なウイルスストックの産生の両方に関する障害となる全体的な複製の減少、並びに（ii）正常細胞に侵入する能力及びそれによって隔離される能力に起因する癌特異性の制限の2要素である。これら2つの制限が、治療の臨床上の有効性に不利益であると予想される。
【０００６】
これらの制限を克服する1つのアプローチは、癌細胞に対しては非常に特異的な向性を示すが、他の場合には弱毒化されない、o-HSVの遺伝子操作である。このアプローチは、癌特異的受容体に対するHSV向性の再標的化として定義された。HSVはそのエンベロープと細胞膜（これらは、原形質膜又は細胞内小胞の境界を示す膜のいずれかである）との融合によって細胞に侵入する。後者の場合、細胞表面にウイルスが付着し、続いて細胞によって細胞内小胞中へとウイルスが取り込まれ、その後、ビリオンエンベロープ（virion envelope：ウイルス粒子のエンベロープ）と細胞内小胞の膜とが融合する。ビリオンエンベロープはHSV粒子の最も外部の構造であり、HSVエンベロープと細胞膜との融合を促進するようにカスケード方式で活性化される、多くのウイルスコード糖タンパク質を持つ膜からなる。これらの糖タンパク質は、gC及びgBであり、それらは細胞表面ヘパラン硫酸に対するHSV粒子の最初の付着を媒介する。その後、gDは、Nectin 1及びHVEM又はHVEAという名の少なくとも2つの独立した代替の細胞表面受容体と相互作用する。Nectin 1、又はgD上のHVEMの結合部位は異なる。2つの代替の受容体のうちの1つとのgDの相互作用は、カスケード方式で、下流の糖タンパク質gH/gL（ヘテロダイマーを形成する）及びgBを活性化すると考えられるgDの構造変化を誘導する。gBは、ビリオンエンベロープと細胞膜との融合を実行する。
【０００７】
癌特異的受容体に対するHSVの再標的化は、特定のリガンドをコードする異種性配列を持つように、gDの遺伝子修飾を必要とする。キメラgD−リガンド糖タンパク質をコードする組み換えウイルスの感染によって、wt-gDに代えて、それらのエンベロープ中にキメラgD−リガンド糖タンパク質を持つ子孫ビリオンが形成される。リガンドは、選択された癌細胞、又は一群の癌で特異的に発現された分子と相互作用し、選択された癌細胞における組み換えo-HSVの侵入を可能とする。HSVの再標的化の使用に成功したリガンドの例は、IL13α、uPaR、HER2に対する一本鎖抗体及びEGFRに対する一本鎖抗体である。
【０００８】
先の研究は、いずれもHER2癌受容体に対して再標的化された、R-LM113及びR-LM249という名の2つの組み換え体の構築を開示した。高度の癌特異性を達成するために、gDとその天然受容体Nectin 1及びHVEMとの相互作用を、gD分子の特定の部分の欠失によって消失させた。R-LM113は、アミノ酸6〜38に対応する成熟gD配列の欠失を伴う。R-LM249は、アミノ酸61〜218に対応する成熟gDのコア領域の欠失を伴う。いずれのウイルスでも、欠失された配列は、HER2に対するモノクローナル抗体である、トラスツズマブ由来の一本鎖抗体（sc-Fv）をコードする配列によって置換された。
【０００９】
gD以外の糖タンパク質の修飾による再標的化がgCで試みられた。挿入されたリガンドはEPO及びIL13であった。gC-EPOキメラを伴うウイルスは、EPO受容体を発現する細胞に付着したが、この付着は感染性の侵入をもたらさず、恐らく取り込まれてリソソームで終了したため、ウイルスは分解され、概して、この戦略は生存可能な再標的化されたウイルスを生じなかった。gC-IL13キメラは、gD遺伝子にIL13の二次コピーを有するウイルス中に存在した。ウイルスを再標的化した。全ての生存可能な再標的化されたHSVと同じくらいのHSVがgDにおいて再標的化リガンドを伴い、gC-IL13がIL13アルファ2受容体への再標的化に寄与したか否かは、それらの研究から推論することができない。
【００１０】
HSV gBの遺伝子修飾による再標的化は、本発明者らが知る限り、記載されたことがなかった。
【００１１】
gH/gLの遺伝子修飾による再標的化は、本発明者らが知る限り、記載されたことも、試みられたことさえもなかった。
【００１２】
本発明に関係があるのは、以下に要約される非特許文献1の先の知見である。gLがどの役割をヘテロ二量体gH/gLで果たすのかを理解する試みにおいて、gL遺伝子の欠失を、ヒトHSVに対する相同性が高いブタヘルペスウイルスである仮性狂犬病ウイルス（PrV）という名のヘルペスウイルスに導入した。ΔgL PrVは感染されなかったため、生存せず、複製することができなかった。このウイルスの連続する盲目継代は、PrV-ΔgLPassと名付けられた（named）、gHのN末端に融合されたgD配列で構成されるキメラ糖タンパク質を持つ、自然突然変異体を生じた。また、その後、本質的に同様のキメラを対応するHSV遺伝子を用いて操作した。該キメラは、gDのシグナルペプチド、及び成熟gHのN末端で融合された成熟gD（アミノ酸1〜308）のエクトドメインをコードする配列を保有する。gHが部分的に欠失された例は、いかなる機能性分子も生じなかった。gDの全エクトドメインがgHのN末端に融合されるgD-gH糖タンパク質（上記非特許文献1においてキメラ22と名付けられた）の特性が本明細書に関係する。注目すべきことに、wtウイルスでは、受容体結合gDによって、gH/gLにもたらされた活性化が、分子間のシグナル伝達によって必然的に生じる。本発明者らは該シグナル伝達を、本明細書ではシス−シグナル伝達と呼ばれる分子内で生じるシグナル伝達とは対照的にトランス−シグナル伝達と呼ぶ。gHの活性化がシスで生じる場合があることは、本発明者らの驚くべき発見である。これは、sc-Fvがキメラ自体においてgH部分を活性化する、コンストラクトR-VG803及びR-VG809の場合にも当てはまる。上記非特許文献1によるキメラ22を、相補性アッセイで使用した。具体的には、キメラ22は、gD-/- gH+/+ウイルス、又はgH-/-gD+ウイルスの感染をレスキューした。二重欠損gD-/- gH-/-ウイルスの相補性に関しては試験されなかった。先の報告書及び本知見との間には2つの主な違いがある。第1に相補性アッセイでは（上記非特許文献1）、gH-/- gD+ウイルスのwt-gDは、gD-gHキメラの一部であるgH部分をトランスで活性化し得る。反対に、キメラの一部であるgD部分は、gD-/- gH+ビリオンに存在するwt-gHをトランスで活性化し得る。いずれの場合でも、活性化は、上記非特許文献1によって結論付けられるように、トランスでのみ行われ得る。gD-gHキメラのシス活性化に対する証拠は提供されず、当業者により可能であるとは考えられていなかった。次に、活性化機構にかかわらず、相補系において、gH活性化は、異種性リガンドではなく、gHに対する結合部位を有するgDによって媒介される。これらの結果は、本明細書でリガンドと名付けられた異種性配列（ウイルス配列以外の配列）をgHのN末端に導入することができたこと、ましてや、gHのN末端に導入された異種性リガンドが、操作されたリガンドを結合することができる細胞レセプターに対して、HSV向性を再標的化する機能を果たし得るかどうかについて、確立も示唆もしなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Cairns et al.（Journal of Virology, June2003, Vol. 77, No. 12, p. 6731-6742）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは、これを実際に行うことができ、ヘルペスウイルスを再標的化するためにgHを修飾することが可能であることを示した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第1の態様では、本発明は、成熟糖タンパク質H（gH）若しくはトランケート（truncated：短縮型）gHのN末端に融合された、又はgHに挿入された異種性ポリペプチドリガンドを含む、組み換え感染性ヘルペスウイルスに関する。
【００１６】
第2の態様では、本発明は、疾患の治療における使用に対する第1の態様の組み換え感染性ヘルペスウイルスに関する。
【００１７】
第3の態様では、本発明は、第1の態様の組み換え感染性ヘルペスウイルス、又は成熟gH若しくはトランケートgHのN末端に融合された若しくはgHに挿入された少なくともその異種性ポリペプチドリガンドのゲノムを含む核酸に関する。
【００１８】
第4の態様では、本発明は、第3の態様の核酸を含むベクターに関する。
【００１９】
第5の態様では、本発明は、第1の態様の組み換え感染性ヘルペスウイルス、第3の態様の核酸、又は第4の態様のベクターを含む細胞に関する。
【００２０】
第6の態様では、本発明は、医学用途に対する第1の態様の組み換え感染性ヘルペスウイルスに関する。
【００２１】
第7の態様では、本発明は、第1の態様の組み換え感染性ヘルペスウイルスを使用して細胞を死滅させる方法に関する。
【００２２】
第8の態様では、本発明は、細胞において第1の態様の組み換え感染性ヘルペスウイルスを増殖させるin vitro方法に関する。
【００２３】
本発明の好ましい実施の形態では、上記組み換え感染性ヘルペスウイルスは、修飾されていないgDによって標的化される細胞表面でアクセス可能な分子又はその一部からのヘルペスウイルスの脱標的化をもたらすアミノ酸欠失を含む糖タンパク質D（gD）を有する。加えて、又は代替的には、gDは、成熟gD若しくはトランケートgDのN末端に融合された、又はgDに挿入された異種性ポリペプチドリガンドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−１】組み換え体R-VG803、R-VG811、R-VG809、R-VG805及びR-VG807のゲノム配置を示す図である。HSV-1ゲノムは、内部反復配列（IR）で挟まれた線として表される。Lox-Pで挟まれるBAC配列は、遺伝子間領域UL3-UL4に挿入される。m-Cherry赤色蛍光マーカーは遺伝子間領域UL37及びUL38に挿入される。R-VG803は、gHのアミノ酸23〜24の間にSer-Glyリンカーによって挟まれたscFv-HER2の挿入を伴う。R-VG811は、gHのアミノ酸23〜48の間にSer-Glyリンカーによって挟まれたscFv-HER2の挿入を伴う。R-VG809は、成熟gDに由来するアミノ酸6〜38の欠失を伴うこと以外はR-VG803と同一である。R-VG805は、R-VG805は成熟gDに由来するアミノ酸6〜38に代えてscFv-EGFRの挿入を伴うこと以外はR-VG809と同一である。R-VG807は、成熟gDに由来するアミノ酸6〜38に代えてscFv-HER2の挿入を伴うこと以外はR-VG809と同一である。
【図１−２】同上
【図２】R-VG803及びR-VG 809はキメラscFv-gH糖タンパク質を発現することを示す図である。R-VG803、R-VG809又はR-LM5で感染させたベロ細胞の溶解物をPAGEに供した。gHを免疫ブロット法によって検出した。左側の数は、130 K及び95 Kの分子量のマーカーの泳動位置を表す。
【図３】R-VG803は、天然gD受容体に陽性の細胞と同様、単独の受容体としてHER2を発現する細胞（J-HER2細胞）に感染し、子ウイルスがJ-HER2細胞において細胞から細胞へと広がることを示す図である。J細胞は、wt-HSVに対する受容体を発現しない。J-HER2、J-Nectin1、J-HVEMのみが指定の受容体を発現する。（A）指定の細胞を、R-VG803（J-HER2細胞において滴定された1 PFU/細胞）で感染させ、赤色の蛍光顕微鏡検査についてモニターした。（B）J-HER2細胞をR-VG803（0.01PFU/細胞）で感染させ、MAb 52Sを含む培地で維持し、赤色蛍光について毎日モニターした。プラークサイズの増加は、細胞から細胞への拡散を意味する。
【図４】J-HER2（A〜B）におけるR-VG803侵入経路、及びSK-OV-3（C）細胞におけるR-VG803及びR-VG809の侵入経路の特性評価を示す図である。（A、B）トラスツズマブは、J-HER2細胞のR-VG803感染を阻害する。J-HER2細胞を、トラスツズマブ（trastuz）（28 μg/ml）又は対照IgGの存在下においてR-VG803で感染させた。感染を蛍光顕微鏡検査（A）、又はフローサイトメトリー（B）によってモニターした。（C）R-VG803又はR-VG809によるSK-OV-3細胞の感染に対するトラスツズマブ及びHD1 MAbの効果。R-VG803をHD1（最終濃度1 μg/ml）と共に予めインキュベートした後、三連で（in triplicates）SK-OV-3細胞を感染させた。指定される場合に細胞をトラスツズマブ（最終濃度（concentration）28 μg/ml）で前処理した。感染の程度を24時間後にフローサイトメトリー（BD Accuri C6）によって定量し、未処理のウイルスで感染させた細胞と比較したパーセンテージとして表した。各値は三連の実験の平均を表す。
【図５】R-VG809は、SK-OV-3細胞と同様に単独の受容体としてHER2を発現する細胞（J-HER2、CHO-HER2）に感染し、HER2発現に対して陰性であり、天然gD受容体に対して陽性であるJ-HVEM、J-Nectin、並びにヒト及び動物の細胞に感染しないことを示す図である。細胞を24時間後に3 PFU/細胞で感染させ、感染についてモニターした。
【図６】R-VG805は、J-HER2細胞、J-EGFR細胞、CHO-EGFR細胞、U251-EGFR-vIII細胞に感染し、受容体陰性wt-CHO-KI細胞と同様に、J-Nectin1細胞及びJ-HVEM細胞に感染しないことを示す図である。
【図７】J-HER2、SK-OV-3、並びにJ-Nectin1及びJ-HVEM細胞のR-VG811による感染（A）、並びにウイルス感染の程度の特定（B〜D）を示す図である。（A）R-VG811は、J-HER2、SK-OV-3、並びにJ-Nectin1及びJ-HVEM細胞に感染する。（B）J-HER2細胞又はSK-OV-3細胞においてR-VG811又はR-VG803 DNA-BACの形質移入で得られた感染細胞の量の比較。（C〜D）m-cherry検出によるDNA_BACで形質移入された細胞における感染の定量。
【図８】J-HER2細胞又はSK-OV-3細胞におけるR-LM113、R-LM249及びR-LM5と比較したR-VG803及びR-VG809の複製曲線を示す図である。（A）J-HER2におけるR-VG803及びR-LM113の増殖曲線、（B）J-HER2におけるR-VG803、R-VG809及びR-LM5の増殖曲線。SK-OV-3（C）細胞におけるR-VG803、R-VG809、R-LM113、R-LM249及びR-LM5。同じ細胞株で滴定された0.1 PFU/細胞（A、C）又は0.01 PFU/細胞（B）のウイルスで細胞を感染させ、指定時間に採取した。子ウイルスを、J-HER2細胞（A、B）又はSK-OV-3細胞（C）で滴定した。結果は少なくとも2つの独立した実験の平均である。
【図９】R-LM113、R-LM249及びR-LM5の殺傷能力と比較した、SK-OV-3細胞に対するR-VG803及びR-VG809の殺傷能力を示す図である。結果は、三連の単層においてAlamarBlueによって特定される、2 PFU/細胞の指定のウイルスで感染させたSK-OV-3細胞の生存率として示される。数値は、3つ組の平均を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明を下記に詳細に説明する前に、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬は変更することができるため、本発明がこれらに限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は特定の実施形態を説明することを目的とするものに過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。他に定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２６】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPACRecommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Koelbl, H. eds. (1995),Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載のように定義される。
【００２７】
いくつかの文献が本明細書の文章全体を通して引用される。本明細書に引用される各々の文献（特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、使用説明書等の全てを含む）は、上記又は下記を問わず、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本明細書中のいずれの記載も、本発明が先行発明のためにかかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるものではない。
【００２８】
下記で本発明の要素を記載する。これらの要素は特定の実施形態とともに挙げられているが、更なる実施形態を作成するのに、これらの要素をどのような方法及びどのような数でも組み合わせることができることを理解されたい。多様に記載された実施例及び好ましい実施形態は、本発明を例示的に記載された実施形態のみに限定するものとは解釈されない。本明細書は例示的に記載された実施形態と、あらゆる数の開示された及び／又は好ましい要素とを組み合わせた実施形態を支持及び包含するものであると理解されたい。さらに文脈上他に指定のない限り、本出願において記載された全ての要素のあらゆる並び替え（permutations）及び組合せが本出願の明細書により開示されていると見なされる。
【００２９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲の全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む」という語は（the word "comprise", and variations such as"comprises" and "comprising"）、提示の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外しないことを意味するものと理解される。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、数量を特定していない単数形（thesingular forms "a", "an", and "the"）は、文脈上他に明確に示されていない限り、複数の指示対象を含む。
【００３０】
第1の態様では、本発明は、成熟糖タンパク質H（gH）若しくはトランケートgHのN末端に融合された、又はgH（本明細書では改変gHとも呼ばれる）に挿入された異種性ポリペプチドリガンドを含む、組み換え感染性ヘルペスウイルスに関する。
【００３１】
本明細書で使用される「組み換え」ヘルペスウイルスの用語は、異種性タンパク質を発現するように遺伝子操作されたヘルペスウイルスを指す。組み換えヘルペスウイルスを生成する方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、Sandri-Goldin et al., Alpha Herpesviruses:Molecular and CellularBiology, Caister Academic Press, 2006を参照されたい。
【００３２】
本明細書で使用される「感染性」ヘルペスウイルスの用語は、標的細胞に侵入することができ、そこに含まれる異種性タンパク質を含む、ウイルスゲノムによってコードされたタンパク質を産生することができるヘルペスウイルスを指す。また、好ましい意味では、ヘルペスウイルスは、侵入した入標的細胞において子ウイルスを産生することができる。
【００３３】
本明細書で使用される「ヘルペスウイルス」の用語は、不顕性感染又は溶菌感染を引き起こす、二本鎖DNAウイルスのヘルペスウイルス科のメンバーを指す。ヘルペスウイルスはいずれも共通の構造を共有し、すなわち、全てのヘルペスウイルスは、それ自体が、ウイルスタンパク質及びウイルスmRNAの両方と、エンベロープと呼ばれる脂質二重膜とを含む外皮と呼ばれるタンパク質層で包まれるキャプシドと呼ばれる二十面体のタンパク質ケージに囲まれた、100〜200の遺伝子をコードする比較的大きな二本鎖直線状DNAゲノムで構成される。この粒子全体もビリオンとして知られている。
【００３４】
ヘルペスウイルスに関して本明細書で使用される「異種性」ポリペプチドの用語は、本来ヘルペスウイルスものではないポリペプチドを指す。少なくとも、このポリペプチドは、使用される特定のヘルペスウイルス株に固有ではないが、好ましい意味では、任意の他のヘルペスウイルスにも固有ではない。また、上記用語は、遺伝子改変された、ヘルペスウイルスに由来するタンパク質を除外し、すなわち、かかる遺伝子改変ヘルペスウイルスタンパク質は、上記用語の定義される意味に含まれる異種性ポリペプチドではない。特定の実施形態では、異種性ポリペプチドリガンドは、ヘルペスウイルス糖タンパク質D（gD）又はgDの細胞リガンドに特異的に結合するそのフラグメントではない。
【００３５】
本明細書で使用される「融合させた（融合した）」又は「融合」の用語は、1以上のペプチドリンカーを介する直接的又は間接的のいずれかのペプチド結合による2つの異なるポリペプチドの連結を指す。gHに関する好ましい実施形態では、異種性ポリペプチドリガンドを、成熟gH、又はトランケートな成熟gHのN末端に融合する。gDに関する好ましい実施形態では、異種性ポリペプチドリガンドを、成熟gD、又はトランケートな成熟gDのN末端に融合する。
【００３６】
ペプチドリンカーは、1個〜30個の間のアミノ酸、好ましくは5個〜15個のアミノ酸、より好ましくは8個〜12個のアミノ酸の長さを有し、任意のアミノ酸からなってもよい。好ましくは、ペプチドリンカーは、アミノ酸（複数の場合がある）Gly及び／又はSerを含み、より好ましくは、ペプチドリンカーは、Gly及びSerからなる群から選択される、少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、又は30個のアミノ酸を含む。ペプチドリンカーは、アミノ酸Gly及び／又はSerからなることが最も好ましい。柔軟性、良好な溶解度及びタンパク質分解に対する耐性を提供することから、Gly及びSerをベースとするリンカーが好ましい。
【００３７】
本明細書で使用される「成熟」糖タンパク質の用語は、N末端シグナルペプチドを欠く糖タンパク質を指す。gHに関して、上記用語は、配列番号1によるgHのアミノ酸1〜18、又は相同性gHの対応する領域を欠くgHを指すことが好ましい。gDに関して、上記用語は、配列番号4によるgDのアミノ酸1〜25、又は相同性gDの対応する領域を欠くgDを指すことが好ましい。
【００３８】
本明細書で使用される「トランケート（な）」糖タンパク質の用語は、ヘルペスウイルス糖タンパク質、好ましくはN末端部分を欠く成熟ヘルペスウイルス糖タンパク質を指す。特定の実施形態では、gHは、配列番号1によるgHのアミノ酸18〜88（すなわち18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87又は88）のいずれかまで（すなわち、それを含む短縮）、特にアミノ酸23、24、48、50、又は88まで短縮される（アミノ酸18までの短縮は成熟gHを生じる）。別の特定の実施形態では、gDは、配列番号4によるgDのアミノ酸25〜64（すなわち25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63又は64）のいずれかまで（すなわち、それを含む短縮）、特にアミノ酸64まで短縮される（アミノ酸25までの短縮は成熟gDを生じる）。
【００３９】
本明細書で使用される「糖タンパク質H」又は「gH」の用語は、ヘルペスウイルスの感染力において役割を果たす110 kDaのビリオンエンベロープ糖タンパク質を指す。特に、ヘルペスウイルス糖タンパク質Lとヘテロ二量体を形成する（it forms）。本明細書において、糖タンパク質Hは、配列番号1によるHSV-1のgH（シグナル配列を含むgH前駆体又は全長gH、成熟したgHはこのシグナル配列、すなわち配列番号1の残基1〜18を欠く）によって表される。しかしながら、gH相同体は、ヘルペスウイルス科の全てのメンバーで見られ、そのため相同性の配列は変化し得る（好ましい相同体に関しては以下を参照されたい）。したがって、HSV-1 gH相同体も本発明に包含される。好ましい実施形態では、かかるHSV-1 gH相同体は、配列番号1による配列と少なくとも70 %、80%、85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %又は99%同一であるアミノ酸配列を有し、それらは、好ましくは野生型（すなわち、修飾されていない）として、ヘルペスウイルス糖タンパク質Lとヘテロ二量体を形成する能力を保持する。少なくともヒト及びサルのヘルペスウイルスの間で、gHは保存される。3つのgHタンパク質の細胞外部分の結晶構造は既知であり、1つはアルファヘルペスウイルスのHSV-2 gHに由来し（Chowdary et al., Nat Struct Mol Biol 2010 17:882-888）、1つはこれもアルファヘルペスウイルスであるブタPrVに由来し（Backovic et al., PNAS 2012 107(52) 22635-22640）、1つはガンマヘルペスウイルスであるエプスタイン−バーウイルスに由来する（Matsuuraet al., PNAS, 2010 107(52) 22641-22646）。それらは実質上類似し、例えば、構造上同様のドメインにある編成は全ての結晶構造に存在する。
【００４０】
「gD」又は「糖タンパク質D」の用語は、細胞へのHSV侵入に本質的な役割を果たすヘルペスウイルスのビリオンエンベロープの構成要素を指す。gDは、ヘルペスウイルス糖タンパク質gC及びgBとヘパラン硫酸プロテオグリカンとの初期の相互作用の後、細胞分子、すなわちHVEM及びNectin-1に結合する。本明細書では、糖タンパク質Dは配列番号4によるHSV-1のgDによって表され（gD前駆体又は全長gD）、シグナル配列を含み、成熟gDはこのシグナル配列（すなわち配列番号4の残基1〜25）を欠く。しかしながら、相同性gD（好ましい相同体については下記も参照されたい）はヘルペスウイルス科の他のメンバーで見られ、そのため相同性の配列は変化し得る。したがって、HSV-1 gD相同体も本発明に包含される。好ましい実施形態では、かかるHSV-1 gD相同体は、配列番号4による配列と少なくとも70 %、80%、85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %又は99 %同一であるアミノ酸配列を有し、それらは、野生型（すなわち、修飾されていない）として、HVEM及びNectin-1に結合する能力、又はより一般的には、カスケード様式で、gDホモログにウイルスエンベロープと細胞膜との融合を促進させるため細胞受容体に結合する能力を保持する。
【００４１】
好ましい実施形態では、ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス1（HSV-1）、単純ヘルペスウイルス2（HSV-2）、水痘帯状疱疹ウイルス（ヒトヘルペスウイルス3（HHV-3））、ブタアルファヘルペスウイルス仮性狂犬病ウイルス（PRV）、チンパンジーアルファ1ヘルペスウイルス（ChHV）、ヒヒヘルペスウイルス2（HVP2）、オナガザルヘルペスウイルス2（CeHV2）、マカクヘルペスウイルス1（MHV1）、リスザルヘルペスウイルス1（HVS1）、マーモセットヘルペスウイルス3（CalHV3）、リスザルヘルペスウイルス2（HVS2）、ウシヘルペスウイルス1（BoHV-1）、ウシヘルペスウイルス5（BoHV-5）、ウマヘルペスウイルス1（EHV-1）、ウマヘルペスウイルス2（EHV-2）、ウマヘルペスウイルス5（EHV-5）、イヌヘルペスウイルス1（CHV）、ネコヘルペスウイルス1（FHV-1）、アヒル腸炎ウイルス（DEV）、オオコウモリアルファヘルペスウイルス1（FBAHV1）、ウシヘルペスウイルス2（BoHV-2）、ウサギヘルペスウイルス4（LHV-4）、ウマヘルペスウイルス3（EHV-3）、ウマヘルペスウイルス4（EHV-4）、ウマヘルペスウイルス8（EHV-8）、ウマ（Equid）ヘルペスウイルス9（EHV-9）、オナガザルヘルペスウイルス9（CeHV-9）、ブタ（Suid）ヘルペスウイルス1（SuHV-1）、マレック病ウイルス（MDV）、マレック病ウイルス血清型2（MDV2）、ハヤブサヘルペスウイルス1型（FaHV-1）、トリヘルペスウイルス3（GaHV-3）、トリヘルペスウイルス2（GaHV-2）、肺−眼−気管疾患（Lung-eye-tracheadisease）関連ヘルペスウイルス（LETV）、トリヘルペスウイルス1（GaHV-1）、オウムヘルペスウイルス1（PsHV-1）、ヒトヘルペスウイルス8（HHV-8）、ヒトヘルペスウイルス4（HHV-4）、ウミガメヘルペスウイルス5（ChHV5）、クモザルヘルペスウイルス3（AtHV3）又はシチメンチョウヘルペスウイルス1（MeHV-1）からなる群から選択される。これらのウイルスは、全てHSV-1/-2のgHに対して少なくとも明らかな相同性を伴うgHを有する。より好ましい実施形態では、ヘルペスウイルスはHSV-1又はHSV-2である。
【００４２】
本明細書で使用される「挿入された（挿入した）」又は「挿入」の用語は、1つのポリペプチドの別のポリペプチドのへの組み込みを指し、ここで、組み込まれたポリペプチドは、1以上のペプチドリンカー、より具体的には、挿入物に関してN末端及び／又はC末端のペプチドリンカーを介して直接的又は間接的のいずれかでペプチド結合によって宿主ポリペプチドに連結される。成熟gH/gDに対するペプチドリガンドの融合を、それぞれ配列番号1/4によるgH/gD前駆体への挿入と見なすこともできるが、かかる挿入は、ビリオンが成熟糖タンパク質を持つことから、本明細書ではN末端融合と称される。したがって、「挿入」の用語は、成熟糖タンパク質、特にgH及びgDへの挿入を指すことが好ましい。
【００４３】
好ましい実施形態では、異種性ポリペプチドリガンドは、配列番号1によるgHのアミノ酸19〜23のいずれか1つ（好ましくは19）から開始し、アミノ酸48〜88のいずれか1つ（好ましくは88）で終了する、好ましくはアミノ酸19から開始し、アミノ酸88で終了する、アミノ酸61から開始し、アミノ酸65で終了する、アミノ酸69から開始し、アミノ酸72で終了する、若しくはアミノ酸74から開始し、アミノ酸80で終了する、又はアミノ酸116から開始し、アミノ酸136で終了する、gHのN末端領域内、又は相同性gHの対応する領域内に挿入される。61〜65、69〜72及び74〜80の範囲は、それらがgH H1Aドメインの露出したループの領域を表し、したがって、gH H1Aドメインの構造的完全性を保持する挿入ポイントを表すことから、特に有用であると考えられる。より好ましい実施形態では、配列番号1によるgHのアミノ酸19から開始し、アミノ酸50で終了するgHのN末端領域内、又は相同性gHの対応する領域内に挿入される。より一層好ましい実施形態では、配列番号1によるgHのアミノ酸19から開始し、アミノ酸48で終了するgHのN末端領域内、又は相同性gHの対応する領域内に挿入される。別の更に好ましい実施形態では、配列番号1によるgHのアミノ酸23から開始し、アミノ酸48で終了するgHのN末端領域内、又は相同性gHの対応する領域内に挿入される。これら全ての実施形態では、領域の開始及び終了を定義するアミノ酸は、該領域に含まれ、すなわち、挿入はアミノ酸の開始又は終了のN末端又はC末端のいずれによってもよい。配列番号1の残基19のN末端の挿入の特定の場合では、その挿入もまた成熟gHのN末端への融合と見なすことができる。したがって、「挿入」、「融合」の用語を明確に区別するため、この特定の場合を可能性のある挿入から除外し、記載されるような成熟gHのN末端への融合に含めることが好ましい。
【００４４】
さらに、これらの実施形態のいずれでも、上記領域は、挿入によって置換されてもよい。配列番号1の残基19を含む領域を置換する挿入の特定の場合、その挿入もまたトランケートな成熟gHのN末端への融合と見なすことができる。したがって、「挿入」、「融合」の用語を明確に区別するため、この特定の場合を可能性のある挿入から除外し、記載されるようなトランケートな成熟gHのN末端への融合に含めることが好ましい。
【００４５】
最も好ましい実施形態では、リガンドは、配列番号1によるgHのアミノ酸23とアミノ酸24との間に、又は相同性gHの対応する領域（この場合、上記アミノ酸23及びアミノ酸24に対応する）に挿入される。
【００４６】
特定の実施形態では、上に明示されるN末端領域の1以上のgHアミノ酸が欠失される。関連する実施形態では、上に明示されるようにgHは短縮される。
【００４７】
「相同性gHの対応する領域」の用語は、スミス−ウォーターマンアルゴリズム及び次の整列パラメーター：MATRIX:BLOSUM62, GAP OPEN:10, GAP EXTEND:0.5を使用する場合、配列番号1によるHSV-1 gHの所与の領域（好ましくは上に定義されるような挿入の領域）と整列するgHの領域を指す。上のアルゴリズム及びパラメーターを使用して、HSV-1 gHの所与の領域の一部（単数又は複数）だけが相同性gHの配列と整列する場合、「相同性gHの対応する領域」の用語は、HSV-1 gHの所与の領域の一部（複数の場合がある）と整列する領域を指す。言い換えれば、この場合、リガンドが挿入されるか、リガンドによって置換される相同性gH中の領域は、HSV-1 gHの所与の領域の一部（複数の場合がある）と整列するアミノ酸だけを含む。また、同じ場合、「相同性gHの対応する領域」の用語は、対応するフランキング配列によって挟まれる領域を指してもよく、ここで、対応するフランキング配列は、上のアルゴリズム及びパラメーターを使用して、HSV-1 gHの上の所与の領域（好ましくは上に定義されるような挿入領域）を挟む配列と整列する相同性gHの配列である。HSV-1 gHのこれらのフランキング配列は、少なくとも5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、30個、40個又は50個のアミノ酸長であり（gHのN末端のフランキング配列、すなわち、配列番号1のアミノ酸残基19〜23のいずれかのN末端は、より短くてもよく、すなわち、指定されるが、最長18個、19個、20個、21個、又は22個のアミノ酸残基の長さであってもよい）、上のアルゴリズム及びパラメーターを使用して相同性gHの配列と整列される。
【００４８】
相同gHは、単純ヘルペスウイルス2（HSV-2）、水痘帯状疱疹ウイルス（ヒトヘルペスウイルス3（HHV-3））、ブタアルファヘルペスウイルス仮性狂犬病ウイルス（PRV）、チンパンジーアルファ1ヘルペスウイルス（ChHV）、ヒヒヘルペスウイルス2（HVP2）、オナガザルヘルペスウイルス2（CeHV2）、マカクヘルペスウイルス1（MHV1）、オオコウモリアルファヘルペスウイルス1（FBAHV1）、リスザルヘルペスウイルス1（HVS1）、マーモセットヘルペスウイルス3（CalHV3）、リスザルヘルペスウイルス2（HVS2）、ウシヘルペスウイルス1（BoHV-1）、ウシヘルペスウイルス5（BoHV-5）、ウマヘルペスウイルス1（EHV-1）、ウマヘルペスウイルス2（EHV-2）、ウマヘルペスウイルス5（EHV-5）、イヌヘルペスウイルス1（CHV）、ネコヘルペスウイルス1（FHV-1）、オナガザルヘルペスウイルス9（CeHV-9）、アヒル腸炎ウイルス（DEV、AnHV-1）、ウシヘルペスウイルス2（BoHV-2）、ウサギヘルペスウイルス4（LHV-4）、ウマヘルペスウイルス3（EHV-3）、ウマヘルペスウイルス4（EHV-4）、ウマヘルペスウイルス8（EHV-8）、ウマ（Equid）ヘルペスウイルス9（EHV-9）、マレック病ウイルス（MDV）、マレック病ウイルス血清型2（MDV2）、トリヘルペスウイルス3（GaHV-3）、トリヘルペスウイルス2（GaHV-2）、肺−眼−気管疾患関連ヘルペスウイルス（LETV）、トリヘルペスウイルス1（GaHV-1）、オウムヘルペスウイルス1（PsHV-1）、ヒトヘルペスウイルス8（HHV-8）、ヒトヘルペスウイルス4（HHV-4）、ハヤブサヘルペスウイルス1型（FaHV-1）、ウミガメヘルペスウイルス5（ChHV5）、クモザルヘルペスウイルス3（AtHV3）又はシチメンチョウヘルペスウイルス1（MeHV-1）のgHであることが好ましい。これらのヘルペスウイルス及びHSV-1はHSV-1について高度に保存されたgH配列を有する。相同gHは、単純ヘルペスウイルス2（HSV-2）、チンパンジーアルファ1ヘルペスウイルス（ChHV）、ヒヒヘルペスウイルス2（HVP2）、オナガザルヘルペスウイルス2（CeHV2）、マカクヘルペスウイルス1（MHV1）、オオコウモリアルファヘルペスウイルス1（FBAHV1）、ウシヘルペスウイルス2（BoHV-2）、又はウサギヘルペスウイルス4（LHV-4）のgHであることがより好ましい。相同gHは単純ヘルペスウイルス2（HSV-2）であることが最も好ましい。
【００４９】
別の実施形態では、異種性ポリペプチドリガンドは、gHのH1AドメインのN末端に挿入される。この点でN末端に挿入されたとは、N末端側のH1Aドメインに隣接していることを意味するものではなく、H1AドメインのN末端側のいかなる場所にも存在することを意味する。gHのH1Aドメインは、gHのH1ドメインのサブドメインである。H1ドメインは配列番号1によるgHタンパク質のアミノ酸49から327まで広がり、H1Aドメインは配列番号1によるgHタンパク質のアミノ酸49から115まで広がる（Chowdary et al., 2010）。多くのgHタンパク質は、水痘帯状疱疹ウイルス（ヒトヘルペスウイルス3）に由来するgHの場合と同じように配列番号1との配列アラインメント、又はH1ドメイン内の構造類似性によって確認可能なH1Aドメインを有する。全てのヘルペスウイルスが、配列番号1によるgHタンパク質のアミノ酸1〜48に対応する領域を有するgHを持つとは限らない。しかしながら、成熟gHはいずれも、H1AドメインのN末端に少なくともいくつか、例えば1個、2個又は3個のアミノ酸を有する。例はEBVであり、ここでは、成熟したペプチド中のH1Aドメインの前に1つの残基のみがある（X線構造において可視の最初の残基において、すなわち、gH前駆体のEBVの19位に向けてH1Aドメインが開始すると仮定する）。この先行する領域が非常に短い、例えば10個以下、5個以下又は3個以下のアミノ酸のgHの場合には、挿入がこれらの残基の後ろ（すなわち、C末端に）あることが意図され、また任意に、これらの残基は挿入の後ろ、すなわち、挿入とH1Aドメインとの間で複写される。
【００５０】
本発明の第1の態様の一実施形態では、ヘルペスウイルスは野生型ウイルスの毒性に関して減少された毒性を有するか、又は疾患細胞対非疾患細胞において異なる複製能力を有する。「野生型ウイルスの毒性」の用語は、野生型の、すなわち非組み換えのヘルペスが持つ、細胞に感染する、特に細胞に侵入する能力を指す。特定の実施形態では、減少された毒性は、野生型ウイルスが結合する標的−細胞表面受容体に結合する能力の減少、又は更には除去である。かかる標的−細胞表面受容体として、例えば、gDが結合するHVEM（当該技術分野で使用される同意語：HveA及びTNFRSF14）及びNectin-1（当該技術分野で使用される同意語：HveC及びPVRL1）、gB及びgCが結合するヘパラン硫酸プロテオグリカン、gBが結合するミエリン関連糖タンパク質MAG、ペア型免疫グロブリン（immunoglobulin）様2型受容体アルファ（PILRalpha）、DC-SIGN及び非筋肉ミオシン重鎖9 MYH9/NMHC-IIA、並びにgH-gLが結合するITGB3/αvβ3インテグリン、gHが結合するアルファvベータ6-インテグリン、及びアルファvベータ8-インテグリンが挙げられる（GianniT, Salvioli S, Chesnokova LS, Hutt-Fletcher LM, Campadelli-Fiume G. PLoSPathog. 2013;9(12):e1003806）。減少又は排除された結合は、例えば、標的−細胞表面受容体との相互作用に関与する、ウイルス糖タンパク質（例えばgD、gB又はgC）又はそれらの一部の欠失又は改変によって達成され得る。
【００５１】
「複製能力」の用語は、ヘルペスウイルスが所与の時間で感染細胞においてそれ自体をコピーすることができる回数を指す。複製能力は、疾患細胞対非疾患細胞において異なる場合、非疾患細胞より疾患細胞においてより高い（すなわち、疾患細胞について増加）、又は疾患細胞より非疾患細胞においてより低い（すなわち、非疾患細胞について減少）ことが好ましい。
【００５２】
好ましい実施形態では、組み換え感染性ヘルペスウイルスは、gDの細胞リガンドに対して特異的結合の減少若しくはそれを有しない改変gDを含むか、又はgDを欠く。
【００５３】
より好ましい実施形態では、ヘルペスウイルスは、配列番号4によるgDのアミノ酸残基26〜33のいずれかから開始し、アミノ酸残基31〜63のいずれかで終了する（残基31から開始し、残基63で終了することが好ましい）、及び／又はアミノ酸残基65〜86のいずれかから開始し、アミノ酸残基235〜243のいずれかで終了する（残基86から開始し、残基243で終了することが好ましい）、又は相同性gDの対応する領域のアミノ酸欠失を有するgDを有する。N末端の25個のアミノ酸シグナルペプチドを欠く成熟gDに関し、これは、それぞれ、成熟gDのアミノ酸残基1〜8のいずれかから開始し、アミノ酸残基6〜38のいずれかで終了する（残基6から開始し、残基38で終了することが好ましい）、及び／又はアミノ酸残基40〜61のいずれかから開始し、アミノ酸残基210〜218のいずれかで終了する（残基61から開始し、残基218で終了することが好ましい）アミノ酸欠失を意味する。そこでは、開始及び修了の残基は欠失に含まれる。「相同性gDの対応する領域」の用語は、スミス−ウォーターマンアルゴリズム及び次の整列パラメーター：MATRIX:BLOSUM62, GAP OPEN:10, GAP EXTEND:0.5を使用する場合、配列番号4によるHSV-1 gDの所与の領域（好ましくは上に記載される欠失）と整列するgDの領域を指す。上のアルゴリズム及びパラメーターを使用して、HSV-1 gDの所与の領域の一部（単数又は複数）だけが相同性gDの配列と整列する場合、「相同性gDの対応する領域」の用語は、HSV-1 gDの所与の領域の一部（複数の場合がある）と整列する領域を指す。言い換えれば、この場合、相同性のgD中の欠失は、HSV-1 gDの所与の領域の部分（複数の場合がある）と整列するアミノ酸だけを含む。また、同じ場合では、「相同性gDの対応する領域」の用語は、対応するフランキング配列によって挟まれる領域を指してもよく、ここで、対応するフランキング配列は、上のアルゴリズム及びパラメーターを使用して、HSV-1 gDの上の所与の領域（好ましくは上に記載される欠失）を挟む配列と整列する相同性gDの配列である。HSV-1 gDのこれらのフランキング配列は、少なくとも5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、30個、40個又は50個のアミノ酸長であり（gDのN末端のフランキング配列、すなわち、配列番号4によるアミノ酸残基26〜33のいずれかのN末端は、より短くてもよく、すなわち、指定されるが、最長25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個又は32個のアミノ酸残基長であってもよい）、上のアルゴリズム及びパラメーターを使用して相同性gDの配列と整列される。相同性gDは、HSV-2のgD、チンパンジーアルファ1ヘルペスウイルス（ChHV）のgD、マカクヘルペスウイルス1（MHV1）のgD、ヒヒヘルペスウイルス2（HVP2）のgD、オナガザルヘルペスウイルス1（CeHV1）のgD、オナガザルヘルペスウイルス2（CeHV2）のgD、リスザルヘルペスウイルス1（HVS1）のgD、ウシヘルペスウイルス1（BoHV-1）のgD、ウシヘルペスウイルス5（BoHV-5）のgD、ウマヘルペスウイルス1（EHV-1）のgD、ウマヘルペスウイルス3（EHV-3）のgD、ウマヘルペスウイルス4（EHV-4）のgD、ウマヘルペスウイルス8（EHV-8）のgD、ウマヘルペスウイルス9（EHV-9）のgD、イヌヘルペスウイルス1（CHV）のgD、ネコヘルペスウイルス1（FHV-1）のgD、アヒル腸炎ウイルス（DEV）のgD、Elkヘルペスウイルス（ElkHV）のgD、トナカイヘルペスウイルス（RanHV）のgD、シカヘルペスウイ���ス1（CerHV-1）のgD、ウサギヘルペスウイルス4（LHV-4）のgD、シカヘルペスウイルス2（CerHV-2）のgD、ヤギヘルペスウイルス1（CapHV-1）のgD、スイギュウヘルペスウイルス1（BuHV1）のgD、オオコウモリアルファヘルペスウイルス1（FBAHV1）のgD、パームワラビーヘルペスウイルス1（MaHV-1）のgD、ハヤブサヘルペスウイルス1型（FaHV-1）のgD、パームワラビーヘルペスウイルス1（MaHV-2）のgD、ブタ仮性狂犬病ウイルス（PrV）のgD、アザラシヘルペスウイルス-1（PhHV-1）のgD、マレック病ウイルス（MDV）のgD、シチメンチョウ（Turkey）ヘルペスウイルス（HVT）のgD、シチメンチョウヘルペスウイルス1（MeHV-1）のgD、トリヘルペスウイルス1（GaHV-1）のgD、トリヘルペスウイルス2（GaHV-2）のgD、又はハゲワシヘルペスウイルス（VHV）のgDであることが好ましい。相同性gDは、HSV-2のgD、チンパンジーアルファ1ヘルペスウイルス（ChHV）のgD、ヒヒヘルペスウイルス2（HVP2）のgD、マカクヘルペスウイルス1（MHV1）のgD、オナガザルヘルペスウイルス1（CeHV1）のgD、オオコウモリアルファヘルペスウイルス1（FBAHV1）のgD、オナガザルヘルペスウイルス2（CeHV2）のgD、パームワラビーヘルペスウイルス1（MaHV-2）のgD、又はリスザルヘルペスウイルス1（HVS1）のgDであることがより好ましい。相同性gDはHSV-2のgDであることが最も好ましい。
【００５４】
本発明の第1の態様の別の実施形態では、異種性ポリペプチドリガンドは、gDのN末端と機能的に等価なドメインに融合され、その機能がHSV gDに等価なタンパク質、例えばヒトヘルペスウイルス4（EBV）のgp42、マカクヘルペスウイルスのBZLF2、マーモセットヘルペスウイルス3のORF44又はブタリンパ球向性ヘルペスウイルス1のBZLF2に存在する。
【００５５】
また、ヘルペスウイルスは、例えばウイルス遺伝子γ134.5、UL39及び／又はICP47における欠失又はその改変によって弱毒化され得る。「弱毒化（された）」の用語は、減弱された又はそれほど有毒でないヘルペスウイルスを指す。条件的弱毒化が好ましく、ここで、弱毒化は、本発明によって再標的化することによりヘルペスウイルスによって標的化されない非疾患細胞にだけに影響を及ぼす。したがって、ヘルペスウイルスが再標的化される疾患細胞のみ（例えば癌細胞）が、ヘルペスウイルスの全毒性によって影響を受ける。条件的弱毒化は、例えば、γ134.5のプロモーター領域、UL39及び／又はICP47遺伝子を癌細胞で独占的に発現するヒト遺伝子のプロモーター（例えばサバイビンプロモーター）で置換することによって、達成することができる。条件的弱毒化のための更なる修飾として、ICP-4プロモーター領域のようなIE遺伝子の転写を担う制御領域の、疾患細胞、例えば癌細胞で独占的に発現される遺伝子のプロモーター領域（例えばサバイビンプロモーター）による置換が挙げられ得る。この変更は、正常細胞ではなく癌細胞では複製可能な、複製条件的HSVを生じる。ウイルスの更なる修飾は、正常細胞では豊富であるが、腫瘍細胞ではそうではない、マイクロRNA（miR）に応答する配列要素のICP4のような本質的なHSV遺伝子の3'非翻訳領域への挿入を含んでもよい。結果は、ここでも、正常細胞においてのみ複製能力のないウイルスとなる。
【００５６】
「IE遺伝子」の用語は、細胞刺激に応答して一時的に急速に活性化される遺伝子である、最初期遺伝子を指す。
【００５７】
本発明の第1の態様の別の実施形態では、ヘルペスウイルスは、成熟gD若しくはトランケートなgDのN末端に融合された、又はgDに挿入された異種性ポリペプチドリガンド（本明細書では改変gDとも呼ばれる）を含む。好ましい実施形態では、gDに挿入された異種性ポリペプチドリガンドは、配列番号4によるgDのアミノ酸26〜243（成熟gDの1〜218）のいずれかのC末端に挿入されるか、又は配列番号4によるgDのアミノ酸残基26〜33のいずれかから開始し、アミノ酸残基31〜63のいずれかで終了する（残基31から開始し、残基63で終了することが好ましい）、及び／又はアミノ酸残基65〜86のいずれかから開始し、アミノ酸残基235〜243のいずれかで終了する（残基86から開始し、残基243で終了することが好ましい）、若しくは相同性gDの対応する領域のアミノ酸配列を置換する。ここでも、「相同性gDの対応する領域」の用語は、スミス−ウォーターマンアルゴリズム及び次の整列パラメーター：MATRIX:BLOSUM62, GAP OPEN:10, GAP EXTEND:0.5を使用する場合、配列番号4によるHSV-1 gDの所与の領域（好ましくは上に記載される置換されるアミノ酸配列）と整列するgDの領域を指す。上のアルゴリズム及びパラメーターを使用して、HSV-1 gDの所与の領域の一部（単数又は複数）だけが相同性gDの配列と整列する場合、「相同性gDの対応する領域」の用語は、HSV-1 gDの所与の領域の一部（複数の場合がある）と整列する領域を指す。言い換えれば、この場合、相同性gDにおいて置換される配列は、HSV-1 gDの所与の領域の一部（複数の場合がある）と整列するアミノ酸だけを含む。また、同じ場合では、「相同性gDの対応する領域」の用語は、対応するフランキング配列によって挟まれる領域を指してもよく、ここで、対応するフランキング配列は、上のアルゴリズム及びパラメーターを使用して、HSV-1 gDの上の所与の領域（好ましくは上に記載される置換されるアミノ酸配列）を挟む配列と整列する相同性gDの配列である。これらのHSV-1 gDのフランキング配列は、少なくとも5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、30個、40個又は50個のアミノ酸長であり（gDのN末端のフランキング配列、すなわち、配列番号4によるアミノ酸残基26〜33のいずれかのN末端は、より短くてもよく、すなわち、指定されるが、最長25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個又は32個のアミノ酸残基長であってもよい）、上のアルゴリズム及びパラメーターを使用して相同性gDの配列と整列する。相同性gDはgD欠失に関して上に明示される通りである。
【００５８】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態では、gH及び／又はgDに融合又は挿入された異種性ポリペプチドリガンドは、細胞の表面でアクセス可能な標的分子又はその一部に結合する。上記異種性ポリペプチドリガンドは、細胞の表面でアクセス可能な分子又はその一部に特異的に結合することが好ましい。本明細書で使用される「特異的に結合する」の用語は、生物等、好ましくは人体におけるタンパク質の異種集団、特に細胞において上記分子の存在の決定因である、結合反応を指す。そのため、指定のリガンドは、その特定の標的分子に結合し、細胞上に存在する他の分子に対して又はリガンドが生物において接触し得る他の分子に対して、十分な量では結合しない。一般に、標的分子を「特異的に結合する」リガンドは、その標的分子に対して約105超（例えば106、107、108、109、1010、1011及び1012以上）モル／リットルの平衡結合定数を有する。一般に、gHに融合又は挿入された異種性ポリペプチドリガンドは、gDに融合又は挿入されたポリペプチドリガンドとは異なった／と同じ細胞の表面においてアクセス可能な分子、又はその一部に結合し得る。同じ分子への結合は、1つの分子に結合する程度を増加させるのに対し、異なる分子への結合は二重の特異性を与えて、以下を提供すると考えられる：1）分子のうちの1つにおける細胞特異性の維持は、結果的には、例えば変異された腫瘍細胞の場合、もはや細胞表面には存在しない、2）腫瘍不均一性の対処、すなわち腫瘍は不均一であり、しばしば、腫瘍特異的分子は全ての腫瘍細胞で発現されないため、二重標的化は、第1又は第2の標的化された受容体のいずれかを使用してウイルスが細胞に侵入することを可能とし、そのようにして感染され得る腫瘍細胞の数を増加する。
【００５９】
一実施形態では、異種性ポリペプチドリガンドは、抗体、抗体誘導体及び抗体模倣物からなる群から選択される。抗体、抗体誘導体又は抗体模倣物は、単一特異性（すなわち、細胞表面でアクセス可能な1つの標的分子又はその一部に特異的）であってもよく、多特異性（すなわち、同じ又は異なった細胞の表面でアクセス可能な2以上の標的分子又はその一部に特異的）、例えば、二重特異性又は三重特異性であってもよい（例えば、Castoldi et al., Oncogene. 2013 Dec 12; 32(50):5593-601、Castoldi et al., Protein Eng Des Sel. 2012 Oct;25(10):551-9を参照されたい）。同じ細胞表面でアクセス可能な2以上の標的分子又はその一部の同時標的化は、ウイルスの特異性を増加させる。異なる細胞表面でアクセス可能な2以上の標的分子又はその一部の同時標的化は、上に記載されるような腫瘍不均一性の対処をもたらす（provides）。
【００６０】
本明細書で使用される「抗体誘導体」の用語は、少なくとも1つの抗体可変ドメインを含むが、標的分子を結合することはできてもIgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgY又はIgW等の抗体の全体的な構造を有しない分子を指す。上記誘導体は、限定されないが、Fab、Fab2、scFv、Fv若しくはその一部等の機能性（すなわち標的結合、特に特異的標的結合）抗体フラグメント、又はナノボディ、二重特異性抗体、ミニボディ、ラクダ科単一ドメイン抗体、単一ドメイン若しくはFabフラグメント、可変領域の重鎖及び軽鎖のドメイン（Fd、Vラムダ及びVカッパーを含むVL、VH、VHH等）等の他の誘導体若しくは免疫グロブリンの組み合わせ、また同様に少なくとも2つの構造ループによって接続される免疫グロブリンドメインの2つのβ鎖からなるミニドメインであってもよい。抗体誘導体は1価であることが好ましい。誘導体は一本鎖抗体であることがより好ましく、VL−ペプチドリンカー−VH又はVH−ペプチドリンカー−VLの構造を有することが最も好ましい。
【００６１】
本明細書で使用される「抗体模倣物」の用語は、抗体のように、抗原に特異的に結合することができるが、構造上抗体とは関連しない、有機化合物を指す。抗体模倣物は、通常、約3 kDa〜20 kDaのモル質量を有する人工のペプチド又はタンパク質である。抗体模倣物の非限定的な例は、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アンチカリン、アビマー、DARPins、フィノマー、Kunitzドメインペプチド、モノボディ、プロテインAのZドメイン、ガンマB結晶、ユビキチン、シスタチン、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）由来Sac7D、リポカリン、膜受容体のAドメイン、アンキリンリピートモチーフ（motif）、FynのSH3ドメイン、プロテアーゼ阻害剤のKunitsドメイン、フィブロネクチンの10番目のIII型ドメイン、合成のヘテロ二価リガンド若しくはヘテロ多価リガンド（Josan et al., Bioconjug Chem. 2011 22(7):1270-1278、Xu et al., PNAS 2012 109 (52) 21295-21300、Shallalet al., Bioconjug Chem. 2014 25(2) 393-405）、又は例えば（ランダム）ペプチドライブラリに由来する合成ペプチドリガンドである。合成ペプチドリガンドは、特定の標的分子を結合するように機能する、非天然起源アミノ酸配列を有する。本発明においてペプチドリガンドは、一般的には制限されるか（すなわち、例えば、βターン若しくはβひだ折れシートを開始する、又は、例えばCys残基に結合したジスルフィドの存在によって環化されるアミノ酸の存在としていくつかの構造要素を有する）、又は自由な（直線状の）、約50個未満のアミノ酸残基、好ましくは約40個未満のアミノ酸残基のアミノ酸配列である。約40個未満のアミノ酸残基のペプチドリガンドのうち、約10個〜約30個のアミノ酸残基のペプチドリガンドが好ましい。
【００６２】
一実施形態では、細胞は疾患細胞である。特に、細胞は、腫瘍細胞、慢性感染細胞又は老化細胞であってもよい。
【００６３】
腫瘍細胞の場合、基礎疾患は、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／CNS腫瘍、乳癌、原発不明癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍ファミリー、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（GIST）、妊娠性絨毛疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、咽頭癌及び下咽頭癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、副鼻腔癌及び鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫−成人軟部癌、皮膚癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍からなる群から選択されることが好ましい腫瘍である。
【００６４】
好ましい腫瘍疾患は、HER-2陽性の癌（乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、骨肉腫及び多形神経膠芽腫等）、EGFR陽性の癌（頭頸部癌、多形神経膠芽腫、非小細胞肺癌、乳癌、結腸直腸癌及び膵癌等）、EGFR-vIII陽性の癌（多形神経膠芽腫等）、PSMA陽性の癌（前立腺癌等）、CD20+の陽性のリンパ腫、及びEBV関連腫瘍である。
【００６５】
慢性感染細胞の場合、基礎疾患は慢性感染性疾患、例えば結核、マラリア、慢性ウイルス性肝炎（HBV、D型肝炎ウイルス及びHCV）、後天性免疫不全症候群（AIDS、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）により引き起こされる）、又はEBV関連障害：全身性自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、関節リウマチ及びシェーグレン症候群）、及び多発性硬化症（MS）である。
【００６６】
老化細胞の場合、基礎疾患は、老化関連疾患、例えば（i）早老を特徴とする早老性症候群と呼ばれる希少な遺伝性障害：ウェルナー症候群（WS）、ブルーム症候群（BS）、ロスモンド−トムソン症候群（RTS）、コケイン症候群（CS）、色素性乾皮症（XP）、裂毛症若しくはハッチンソン−ギルフォードプロジェリア症候群（HGPS）、又は（ii）一般的な年齢関連障害：肥満、2型糖尿病、サルコペニア、骨関節炎、特発性肺線維症及び慢性閉塞性肺疾患、白内障、神経変性疾患若しくは癌治療に関連する障害である。
【００６７】
一実施形態では、細胞の表面上にアクセス可能な標的分子又はその一部について、標的分子はタンパク質、糖脂質又はグリコシドである。タンパク質が細胞受容体であることが好ましい。腫瘍細胞の場合、細胞表面タンパク質は癌関連抗原、例えばHER2、EGFR、EGFRvIII、EGFR3（ERBB3）、MET、FAP、PSMA、CXCR4、ITGB3、CEA、CAIX、ムチン、葉酸結合タンパク質、GD2、VEGFR1、VEGFR2、CD20、CD30、CD33、CD52、CTLA4、CD55、インテグリンαVβ3、インテグリンα5β1、IGF1R、EPHA3、RANKL、TRAILR1、TRAILR2、IL13Rアルファ、UPAR、テネイシン、PD-1、PD-L1、腫瘍関連糖タンパク質72、ガングリオシドGM2、A33、ルイスY抗原又はMUC1であることが好ましい。老化細胞の場合は、標的分子は、例えばCXCR2又はIL-1受容体のような老化細胞によって発現される任意の表面タンパク質である。
【００６８】
一実施形態では、疾患細胞の表面でアクセス可能な標的分子又はその一部は、該細胞の表面で本来はアクセス可能ではない、すなわち、同じ種類及び／又は組織の非疾患（すなわち健康な）細胞の表面でアクセス可能ではなく、同じ生物の任意の他の細胞の表面でアクセス可能ではないことが好ましい。慢性感染性疾患に関する関連する実施形態では、標的分子は、細胞に感染した病原体（例えばウイルス、細菌又は寄生生物）に由来する分子であり、感染細胞の表面に発現される（HBVに由来するHBsAg、HIVに由来するgp120、HCVに由来するE1及びE2、EBVに由来するLMP1及びLMP2等）。別の実施形態では、gDに融合又は挿入された異種性ポリペプチドリガンドは、細胞表面でアクセス可能な任意の分子又はその一部に結合しないが、天然HSV受容体に対する結合を消失する。示されるように、この実施形態では、gDに融合又は挿入されたリガンドは、その天然受容体に結合するgDの能力を消失する目的を有する。標的細胞への標的化は、ウイルスの種々の糖タンパク質、特にgHへの融合又は挿入によって遂行される。
【００６９】
別の実施形態では、gH又はgDに融合又は挿入された異種性ポリペプチドリガンドは、細胞の表面でアクセス可能な異種性分子又はその一部に結合する。細胞に関して本明細書で使用される「異種性分子」の用語は、細胞に固有でない分子を指す。特に、異種性分子は、細胞によって天然に（すなわち、非組み換えで）産生されない及び／又は産生され得ない。ポリペプチドの場合、異種性分子は、細胞の固有の（すなわち、組み換え改変されていない）ゲノムにコードされない。この実施形態では、細胞表面でアクセス可能な異種性分子又はその一部に結合するgH又はgDによって標的化された細胞は、ウイルスの増殖、すなわちウイルスの伝播のため使用され得る。伝播の様式は、この細胞に特異的であり、他細胞（このヘルペスウイルスを使用して治療される患者の細胞等）は、異種性分子又はその一部に結合するgH又はgDによって標的化されない。
【００７０】
本発明の第1の態様の更なる実施形態では、組み換え感染性ヘルペスウイルスは、好ましくは発現カセットに異種性の検出可能なマーカーを含む。本明細書で使用される「検出可能なマーカー」の用語は、当該技術分野で一般に使用されるマーカー及び標識、例えばホスファターゼ及びペルオキシダーゼ等の酵素のマーカー、NaI共輸送体等の膜輸送体、PET若しくはSPECの放射性トレーサー、又は蛍光マーカーを指す。蛍光マーカーとして、例えばGFP及びGFPの変異体、例えば、異なる蛍光性のスペクトルを有する突然変異体GFP、RFP（例えばmCherry RFP）及びRFP変異体、例えば、異なる蛍光スペクトルを有する突然変異体GFP、ビリルビン誘導性蛍光タンパク質UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、TagRFP、KFP、EosFP、Dendra、及びIrisFPが挙げられる。腫瘍の視覚化には、膜輸送体であるNaI共輸送体が特に適している。
【００７１】
検出可能なマーカーは、細胞へのウイルス感染、又は細胞でのウイルス増殖、又はウイルスの伝播を妨げない領域に挿入されることが好ましい。特に、該領域は、いかなるオーバーラップ又はいかなる転写単位（センス又はアンチセンス）も中断しない。検出可能なマーカーは、ヘルペスウイルスゲノムの遺伝子間配列に挿入されることが好ましく、UL37とUL38と、UL3とUL4と、又はUS1とUS2との間の遺伝子間配列に挿入されることがより好ましい。
【００７２】
第1の態様の更なる実施形態では、組み換え感染性ヘルペスウイルスは、以下の1以上を発現する、1以上の発現カセットを含む。
i）炎症性促進活性若しくは抗炎症活性を有する免疫調節物質等の1以上の治療用タンパク質（サイトカイン、好ましくはGM-CSF又はIL12のような免疫応答を刺激するサイトカインを含む）、抗体、その誘導体若しくは抗体模倣物、例えば、チェックポイント阻害剤（例えばPDL1、PD1、CTLA4）に対する抗体、その誘導体若しくは抗体模倣物、若しくは疾患微小環境（microenvironment）、特に腫瘍微小環境を修飾することができるタンパク質（例えばコラゲナーゼ）、
ii）1以上の異種抗原若しくは自己抗原、エピトープ／ネオエピトープ若しくはエピトープ／ネオエピトープのストリング、又は、
iii）バラシクロビル及びヒトサイトメガロウイルスのプロテインキナーゼ、CYP2B1、シトシンデアミナーゼ、プリンデオキシヌクレオシドフォスフォリラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、パラオキソナーゼ、マトリクスメタロプロテイナーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、バラシクロビラーゼ、プラスミン、カルボキシペプチダーゼG2、ペニシリンアミダーゼ、β−ラクタマーゼ若しくはβ−ガラクトシダーゼ等の1以上のプロドラッグ変換酵素（Yang et al., Acta Pharmaceutica Sinica B 2011 1(3)143-159による例）。
【００７３】
第1の態様の特定の実施形態では、組み換え感染性ヘルペスウイルスは、いずれもシグナル配列（それぞれ配列番号2及び配列番号3の残基1〜18）を欠く、配列番号2（実施例のコンストラクトR-VG803、R-VG805及びR-VG809にあるようなgH；野生型gHのアミノ酸23〜24の間のscFv-HER2）、又は配列番号3（実施例のコンストラクトR-VG811にあるようなgH；野生型gHのアミノ酸24〜47を置換するscFv-HER2）によるアミノ酸配列を有する修飾されたgH、又は少なくとも80 %、85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %又は99 %の配列同一性を有するそれらの機能性変異体、及び任意に、いずれもシグナル配列（配列番号5〜配列番号9の残基1〜25）を欠く、配列番号5（実施例のコンストラクトR-LM113にあるようなgD、野生型gDのアミノ酸31〜63を置換するscFv HER2）、配列番号6（実施例のコンストラクトR-LM249にあるようなgD、野生型gDのアミノ酸86〜243を置換するscFv HER2）、配列番号7（実施例のコンストラクトR-VG805にあるようなgD、野生型gDのアミノ酸31〜63を置換するscFv EGFR）、配列番号8（実施例のコンストラクトR-VG807にあるようなgD、野生型gDのアミノ酸31〜63を置換するscFv-HER2）、又は配列番号9（実施例のコンストラクトR-VG809にあるようなgD、野生型gDのアミノ酸31〜63の欠失）によるアミノ酸配列を含む修飾されたgD、又は少なくとも80 %、85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %又は99 %の配列同一性を有するそれらの機能性変異体を有する。この点で「機能性」の用語は、配列番号9によるgDとは別に、gH及び／又はgDが、HER2及び／又はEGFRをそれぞれ持つ細胞の感染をその表面で媒介することができることを意味する。配列番号9によるgDに関して、上記用語は、欠失を伴うが挿入の無いgDが、特にHVEM又はNectin-1を介して、任意の細胞の感染を媒介することができないことを意味する。
【００７４】
第1の態様の別の特定の実施形態では、組み換え感染性ヘルペスウイルスは、配列番号2又は配列番号3によるアミノ酸配列を含む修飾されたgHであって、scFv-HER2（特にscFv-HER2ではない）に代えて、上に定義される任意の異種性ペプチドリガンド、又は少なくとも80 %、85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %又は99 %の配列同一性を有するその機能性変異体を含むgHと、任意に配列番号5〜配列番号9のいずれかによるアミノ酸配列を含む修飾されたgDであって、これらの配列に定義されるものに代えて上に定義される任意の異種性ペプチドリガンドを含む配列番号5〜配列番号9のgDとを含む（scFv-HER2及びscFv-EGFRは、それぞれ、これらの配列に定義される異種性ペプチドリガンドを特に意味するものではない）。配列番号9によるgDとは別に、この点で「機能性」の用語は、gH/gDに含まれる異種性ペプチドリガンドが結合する、その表面上の分子を持つ細胞の感染をgH及び／又はgDが媒介することができることを意味する。配列番号9によるgDに関して、上記用語は欠失を有するが、挿入を伴わないgDが、特にHVEM又はNectin-1を介する任意の細胞の感染を媒介することができないことを意味する。
【００７５】
第2の態様では、本発明は、疾患の治療における使用に対する第1の態様の組み換え感染性ヘルペスウイルスに関する。
【００７６】
好ましい実施形態では、上記疾患は、腫瘍疾患、慢性感染性疾患、又は老化関連疾患である。
【００７７】
腫瘍疾患は、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／CNS腫瘍、乳癌、原発不明癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍ファミリー、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（GIST）、妊娠性絨毛疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、咽頭癌及び下咽頭癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、副鼻腔癌及び鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫−成人軟部癌、皮膚癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍からなる群から選択されることが好ましい。
【００７８】
好ましい腫瘍疾患は、HER-2陽性の癌（乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、骨肉腫及び多形神経膠芽腫等）、EGFR陽性の癌（頭頸部癌、多形神経膠芽腫、非小細胞肺癌、乳癌、結腸直腸癌及び膵癌等）、EGFR-vIII陽性の癌（多形神経膠芽腫等）、PSMA陽性の癌（前立腺癌等）、CD20+の陽性のリンパ腫、及びEBV関連腫瘍である。
【００７９】
慢性感染性疾患は、結核、マラリア、慢性ウイルス性肝炎（HBV、D型肝炎ウイルス及びHCV）、後天性免疫不全症候群（AIDS、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）により引き起こされる）、及びEBV関連障害、例えば全身性自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、関節リウマチ及びシェーグレン症候群）、又は多発性硬化症（MS）からなる群から選択されることが好ましい。
【００８０】
老化関連疾患は、（i）早老を特徴とする早老性症候群と呼ばれる希少な遺伝性障害：ウェルナー症候群（WS）、ブルーム症候群（BS）、ロスモンド−トムソン症候群（RTS）、コケイン症候群（CS）、色素性乾皮症（XP）、裂毛症又はハッチンソン−ギルフォードプロジェリア症候群（HGPS）、並びに（ii）一般的な年齢関連障害：肥満、2型糖尿病、サルコペニア、骨関節炎、特発性肺線維症及び慢性閉塞性肺疾患、白内障、神経変性疾患又は癌治療に関連する障害からなる群から選択されることが好ましい。
【００８１】
第3の態様では、本発明は、成熟gH若しくはトランケートgHのN末端に融合された、又はgHに挿入された、第1の態様の組み換え感染性ヘルペスウイルス、又は少なくともその異種性ポリペプチドリガンド、また任意に成熟gD若しくはトランケートgDのN末端に融合された、又はgDに挿入されたその異種性ポリペプチドリガンドのゲノムを含む核酸に関する。核酸、特にゲノムは、修飾されたgH、及び任意に成熟タンパク質であるが、シグナル配列を含む前駆体としての修飾されたgD（配列番号1の残基1〜18及び配列番号4の残基1〜25）をコードしないことが好ましいことを理解されたい。代表例は、配列番号2、配列番号3、及び配列番号5〜配列番号9によるgH及びgDである。
【００８２】
第4の態様では、本発明は、第3の態様の核酸を含むベクターに関する。好適なベクターは当該技術において知られており、例えば、プラスミド、コスミド、人工染色体（例えば、細菌、酵母又はヒト）、バクテリオファージ、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス）、特にバキュロウイルスベクター、又はナノ加工物質（例えばオルモシル）が挙げられる。
【００８３】
一実施形態では、ベクターは、好ましくはウイルスベクターの場合、その毒性が減弱されるように、又は疾患細胞では条件的に複製するが非疾患細胞では複製しないように、特に、1以上の核酸残基の欠失、挿入、及び／又は突然変異によって修飾される。例えば、非癌細胞において弱毒化された表現型、及び癌細胞において弱毒化されていない表現型をもたらす、癌細胞において独占的に発現されるヒト遺伝子のプロモーター（例えばサバイビンプロモーター）によるγ134.5遺伝子のプロモーター領域の置換が含まれる。更なる修飾は、癌細胞において独占的に発現される遺伝子のプロモーター（例えばサバイビンプロモーター）によるICP-4プロモーター領域のようなIE遺伝子の転写を担う制御領域の置換を含んでもよい。この変更は、正常細胞ではなく癌細胞で複製可能な、複製条件的HSVを産生する。ウイルスの子孫の増殖のための細胞培養細胞は、高いウイルス収率の産生を可能とするため、高レベルのタンパク質を活性化する特異的プロモーターを提供する。
【００８４】
第5の態様では、本発明は、第1の態様の組み換え感染性ヘルペスウイルス、第3の態様の核酸、又は第4の態様のベクターを含む細胞に関する。細胞は細胞培養細胞であることが好ましい。好適な細胞培養及び培養技術は、当該技術分野でよく知られており、例えば、 Peterson et al., Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 1988;11(2):93-8を参照されたい。
【００８５】
第6の態様では、本発明は、医薬としての用途に対する第1の態様の組み換え感染性ヘルペスウイルスに関する。
【００８６】
第7の態様では、本発明は、第1の態様の組み換え感染性ヘルペスウイルスを使用して細胞を死滅させる方法に関する。一実施形態では、それらの表面上に標的分子を持つ、細胞培養物中の細胞を、例えば、第1の態様の組み換え感染性ヘルペスウイルスの溶菌効能を試験するために死滅させてもよい。別の実施形態では、細胞は、患者から得られた疾患細胞、例えば癌患者に由来する腫瘍細胞であり、任意に増殖させる。この細胞は感染され、それにより第1の態様の組み換え感染性ヘルペスウイルスで死滅させられた。患者から得られた細胞の死滅の成功は、患者におけるin vivoでの第1の態様の組み換え感染性ヘルペスウイルスの細胞特異性、すなわち治療の成功に対する指標である。更なる実施形態では、また非疾患細胞は、非疾患細胞が組み換え感染性ヘルペスウイルスによる感染に感受性であるかどうかに対する指標として、同じ患者から得られてもよく、又は対照として患者が罹患する疾患に罹患していない被験体から得られてもよい（それらの表面上に標的分子を持たない細胞）。更に別の実施形態では、非疾患細胞を含む細胞（例えば血液等の組織）及び疾患細胞（例えば白血病細胞等の癌細胞）の細胞集団に含まれる疾患細胞は、患者からの細胞集団の単離後に死滅させられる（例えば白血球除去血療法）。これは、特に、患者、好ましくは細胞集団が単離されたのと同じ患者への細胞集団の後の移植のため、疾患細胞を含まない細胞集団、例えば、白血病細胞等の疾患細胞を含まない血液を得るためである。血液及び白血病の場合、例えば、この方法は、腫瘍細胞を含まない血液の自己輸血を提供する。
【００８７】
好ましい実施形態では、列挙された実施形態を含む第7の態様の方法は、in vitroの方法である。
【００８８】
第8の態様では、本発明は、細胞において第1の態様の組み換え感染性ヘルペスウイルスを増殖させるin vitro方法に関する。細胞でヘルペスウイルスを増殖させるのに好適な技術及び条件は当該技術分野においてよく知られており、例えば、Peterson et al.（Comp Immunol MicrobiolInfect Dis. 1988;11(2):93-8）を参照されたい。特定の実施形態では、第1の態様の組み換え感染性ヘルペスウイルスは上に記載される修飾されたgH及びgDを含む。ヘルペスウイルスを増殖させる細胞は、（i）修飾されたgHのリガンド又は（ii）修飾されたgDのリガンドのいずれかが結合する標的分子を持つことが好ましい。（i）の場合、修飾されたgDのリガンドはin vivoで標的化される細胞、好ましくは患者における疾患細胞の分子を結合し、修飾されたgHのリガンドは細胞培養において標的化される細胞の分子を結合し、（ii）の場合、修飾されたgHのリガンドはin vivoで標的化される細胞、好ましくは患者における疾患細胞の分子を結合し、修飾されたgDのリガンドは細胞培養において標的化される細胞の分子を結合する。
【００８９】
本発明を、単に実例であり、本発明の範囲の制限でないものとして解釈される以下の実施例により説明する。実施例において、gHに関するアミノ酸残基の参照は、配列番号1による前駆体タンパク質に関し、gDに関するアミノ酸残基の参照は、成熟タンパク質（残基1〜25を欠く配列番号4）に関する。
【実施例】
【００９０】
実施例1：HSV遺伝子中に欠失を伴わずに又はその欠失を伴って、またレポーター遺伝子としてmCherryを持つ、Her2（scFv-HER2）に対する一本鎖抗体（scFv）を持つ遺伝子組み換えgHsを発現するHSV組み換え体の構築
【００９１】
A）R-VG803:HSV-BAC及びgalKリコンビニアリング（recombineering）によるHSVgHのアミノ酸23〜24の間のscFv-HER2の挿入
本発明者らは、gHのアミノ酸23〜24の間のトラスツズマブscFvをコードする配列の挿入によってR-VG801を操作した。開始ゲノムは、HSV-1ゲノムのUL3とUL4との間に挿入されたLOX−Pに挟まれたpBeloBAC配列を持つpYEBac102であった。操作はgalKリコンビニアリングによって行われた。簡潔には、gHに対するホモロジーアームを含むGalKカセットを、プライマーgH6_galK_fATGCG GTCCATGCCCAGGCCATCCAAAAACCATGGGTCTGTCTGCTCAGTCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA（配列番号10）、及びgH5_galK_rTCGTGGGGGTTATTAT TTTGGGCGTTGCGTGGGGTCAGGTCCACGACTGGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT（配列番号11）によって増幅した。このカセットを、pYEBac102を持つSW102細菌に電気穿孔した。galKカセットを持つ組み換え体クローンを、1 mg/L  D-ビオチン、0.2 %  ガラクトース、45 mg/L  L-ロイシン、1 mM  MgSO4・7H2O、及び12 μg/ml  クロラムフェニコールで補足したM63培地（15mM（NH4)2SO4、100mM KH2PO4、1.8 μg  FeSO4・7H2O、pH7に調整）を含むプレート上で選択した。また、galK偽陽性細菌コロニーを排除するため、上記クローンを1 %ガラクトース及び12 μg/mlクロラムフェニコールで補足したMcConkey寒天ベースプレート上にストリークし（streaked：画線培養し）、プライマーgalK_129_fACAATCTCTGTTTGCCAACGCATTTGG（配列番号28）及びgalK_417_r CATTGCCGCTGATCACCATGTCCACGC（配列番号29）を用いてコロニーPCRにより確認した。次に、以下に記載されるSer-Glyリンカーによって、及びgHに対するホモロジーアームによって挟まれた、トラスツズマブscFvカセットを、pSG-ScFvHER2-SGに由来するフラグメント1番及びフラグメント2番と名付けた2つの別々のフラグメントとして増幅した。pSG-ScFvHER2-SGは、Ser-Glyリンカー（配列番号12）によって挟まれたトラスツズマブscFvカセットを持つ。フラグメント1番を、テンプレートとしてpSG-ScFvHER2を使用して、プライマーgH23_8SG_scFv4D5_fTCGTGGGGGTTATTATTTTGGGCGTTGCGTGGGGTCAGG TCCACGACTGGCATAGTAGTGGCGGTGGCTCTGGATCCG（配列番号13）、及びscFv4D5_358_rGGAAACGGTTCGGATCAGCCATCGG（配列番号14）によって増幅した。フラグメント2番を、テンプレートとしてpSG-ScFvHER2を使用して、gH24_12SG_scFv4D5rATGCGGTCCATGCCCAGGCCATCCAAAAACCATGGGTCTGTCTGCTCAGTACCG GATCCACCGGAACCAGAGCC（配列番号15）、及びscFv4D5_315_fGGAGATCAAATCGGATATGCCGATGG（配列番号16）によって増幅した。フラグメント1番及び2番を、Ser-Glyリンカー及びgHに対するホモロジーアームによって挟まれたscFv-HER2カセットを生成するためアニールして伸長させた。組み換えゲノムは、配列HSSGGGSG（配列番号17）を有する上流のSer-Glyリンカー、及び配列SSGGGSGSGGSG（配列番号18）を有する下流のSer-Glyリンカーによって挟まれたHER2に対するscFvを持つ。VLとVHの間のリンカーはSDMPMADPNRFRGKNLVFHS（配列番号19）である。galKカセットの削除、及びscFv-HER2、又はmCherryによって例示される選択された配列の挿入を持つ組み換えクローンを、1mg/L  Dビオチン、0.2%デオキシ−2−ガラクトース、0.2%グリセロール、45mg/L  L-ロイシン、1mM MgSO4・7H2O、及び12 μg/mlクロラムフェニコールで補足したM63培地（上記参照）を含むプレート上で選択した。また、細菌コロニーを、コロニーPCRによって選択した配列の存在について確認した。
【００９２】
R-VG801において、本発明者らは、その後UL37-UL38遺伝子間領域にmCherry赤色蛍光タンパク質を挿入した。mCherry配列はCMVプロモーターの下にある。最初に、本発明者らは、オリゴヌクレオチドUL37/38_galK_fCCGCAGGCGTTGCGAGTACCCCGCGTCTTCGCGGGGTGTTATACGGCCACCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA（配列番号20）、及びUL37/38_galK_rTCCGGACAATCCCCCGGGCCTGGGTCCGCGAACGGGATGCCGGGACTTAATCAGCACTGTCCTGCTCCTT（配列番号21）によって増幅したgalKカセットを挿入した。その後、本発明者らは、オリゴヌクレオチドUL37/38_CMV_mcherry_fCCGCAGGCGTTGCGAGTACCCCGCGTCTTCGCGGGGTGTTATACGGCCACCGATGTACGGGCCAGATATACG（配列番号22）、及びUL37/38_pA_mcherry_1958_rTCCGGACAATCCCCCGGGCCTGGGTCCGCGAACGGGATGCCGGGACTTAACCATAGAGCCCACCGCATCC（配列番号23）によって増幅したプロモーター-mCherryカセットでgalK配列を置換した。
【００９３】
B）HSV gH(R-VG811)のアミノ酸23〜48のscFv-HER2の挿入
最初に、本発明者らは、gHのアミノ酸23〜48の間のトラスツズマブscFvをコードする配列の挿入によってR-VG799を操作した。その手順は、下記の2つの違いを有する以外は、R-VG803のgH中のscFv-HER2を操作するために上に記載された手順と同じであった。第1に、galKカセットは、プライマーgH29_galK_fCGCGGTGGTTTTTGGGGGTCGGGGGTGTTTGGCAGCCACAGACGCCCGGTCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA（配列番号24）、及びgH5_galK_rTCGTGGGGGTTATTATTTTGGGCGTTGCGTGGGGTCAGGTCCACGACTGGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT（配列番号25）によって増幅した。第2に、フラグメント2番は、gH48_12SG_scFv4D5_rCCGCGCGGTGGTTTTTGGGGGTCGGGGGTGTTTGGCAGCCACAGACGCCCACCGGATCCACCGGAACCAGAGCC（配列番号26）、及びscFv4D5_315_fGGAGATCAAATCGGATATGCCGATGG（配列番号27）によって増幅される点でR-VG803を生成するために使用されたフラグメント2番とは異なった。R-VG803の構築について詳述されるように、mCherry配列を挿入した。
【００９４】
C）R-VG809：R-VG803のgDからのアミノ酸6〜38の欠失
R-VG809は、gD中のアミノ酸6〜38に対応する配列の欠失を持つこと以外はR-VG803と同一である。開始材料はR-VG803 BACゲノムであった。gD中のアミノ酸6〜38の欠失を生成するため、gDに対するホモロジーアームによって挟まれたgalKカセットを、プライマーgD5_galK_fTTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA（配列番号30）、及びgD39_galK_rATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT（配列番号31）で増幅した。次に、本発明者らは、galK配列を合成二本鎖オリゴヌクレオチドgD_aa5_39_f_rTTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCACATCCAGGCGGGCCTACCGGACCCGTTCCAGCCCCCCAGCCTCCCGAT（配列番号32）で置換した。
【００９５】
D）R-VG805：R-VG803 gDのアミノ酸6〜38に代わるscFv-EGFRの挿入
R-VG805に対する開始材料はR-VG803BACゲノムであった。gDにおいてアミノ酸6〜38の欠失を生成するため、gDに対するホモロジーアームによって挟まれたgalKカセットをプライマーgD5_galK_fTTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA（配列番号33）、及びgD39_galK_rATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT（配列番号34）で増幅した。次に、本発明者らは、プライマーBAC_LM611_fTTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGGCCGAGGTGCAACTGCAGCAGTC（配列番号35）、及びgD39_11SAG_EGFR_rATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGACTTGCACTAGATGAAGCACTTCCTGCGGAAGATTTGATCTCGAGTTCTGTCCCCG（配列番号36）を用いて、BACVG804中のgalK配列を、pTNHaa-αEGFR（ロチェスターのMayo ClinicのSteve Russel博士の厚意により提供された）から増幅されたscFv-EGFRカセットで置換した。下流リンカーは配列SSAGSASSSAS（配列番号37）を有し、上流リンカーは存在しない。VHとVLとの間のリンカーはGGGGSGGGGSGGGGS（配列番号38）である。
【００９６】
E）R-VG807：R-VG803 gDのアミノ酸6〜38に代わるscFv-HER2の挿入
R-VG807に対する開始材料はR-VG803BACゲノムであった。gDにおいてアミノ酸6〜38の欠失を生成するため、gDに対するホモロジーアームによって挟まれたgalKカセットをプライマーgD5_galK_fTTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA（配列番号39）、及びgD39_galK_rATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT（配列番号40）で増幅した。次に、本発明者らは、プライマーgD5_scFvHER2_fTTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGTCCGATATCCAGATGACCCAGTCCC（配列番号41）、及びgD39_11SAG_HER2_rATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGACTTGCACTAGATGAAGCACTTCCTGCGGAAGAGGAGACGGTGACTAGTGTTCCTTGACC（配列番号42）を用いて、galK配列を、pSG-ScFvHER2から増幅されたscFv HER2カセットで置換した。下流リンカーは配列SSAGSASSSAS（配列番号43）を有し、上流リンカーは存在しない。VHとVLとの間のリンカーはSDMPMADPNRFRGKNLVFHS（配列番号44）である。
【００９７】
組み換えウイルスを再構成するため、500ngの組み換えBACDNAをLipofectamine2000（LifeTechnologies）を用いてSK-OV-3細胞へ形質移入した。ウイルス増殖を赤色蛍光によってモニターした。組み換え体の構造を、R-VG809、R-VG805及びR-VG807に対するgH、またgD ORFを配列決定することによって確認した。ウイルスストックをSK-OV-3細胞、又はJ-HER2細胞で生成し、滴定した。
【００９８】
実施例2：R-VG803のgHにおけるscFv-HER2挿入の確認
ベロ細胞をR-VG803（3PFU/細胞）、及び比較のためのR-LM5で感染させ、感染の72時間後に採取した。細胞溶解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、PVDF細胞膜に転写し、gHに対するポリクローナル抗体を用いて免疫ブロッティングを行った。図2は、R-VG803に由来するキメラscFv-HER2-gHがR-LM5に由来するwt-gHよりも遅い電気泳動度で移動したこと、及び130Kの明白なMrを示す。
【００９９】
実施例3：単独の受容体としてHER2を発現するJ-HER2細胞のgH中にscFv-HER2を持つR-VG803による感染アッセイ
gD中のscFv-HER2の挿入が、組み換えウイルスR-LM113及びR-LM249に対してHER2受容体を通って細胞に侵入する能力を与えることは以前に示されている。gH中のscFV-HER2の挿入が、R-VG803に対してHER2受容体を通って細胞に侵入する能力を与えるという証拠を提供するため、本発明者らは、単独の受容体としてHER2を発現する細胞を利用した。親J細胞はgDに対する受容体を発現しないことから、gDを活性化することができず、wt-HSVによって感染されない。J-HER2細胞は、遺伝子導入により単独の受容体としてHER2を発現する。対照として、本発明者らは、遺伝子導入によりに受容体としてNectin1又はHVEMを発現し、wt-HSVによって感染される、J-nectin細胞及びJ-HVEM細胞、並びにヒト又は動物のHVEM/Nectin1のオーソログを発現するヒト及び動物の細胞、すなわち、ケラチノサイトの（keratinocytic）HaCaT、ニューロンのSK-N-SH、癌HeLa、MDA-MB-231、ヒト繊維芽細胞のHFF14、ハムスターBHK細胞、また同様にHER2＋HVEM/Nectin 1を発現する卵巣癌SK-OV-3細胞を含んだ。図3Aに示されるように、R-VG803はJ-HER2細胞に感染した。R-VG803によるJ-Nectin1、J-HVEM、並びにヒト及び動物の細胞の感染（図3A）は、R-VG803がwt-gDをコードすることから、驚くことではなかった。本発明者らは、J-HER2細胞においてR-VG803が細胞間拡散を行うことができると更に報告した。細胞を0.01 PFU/細胞で感染させ、毎日モニターした。1日目には、感染は単一細胞を含んだ。翌日、感染は、連続的に大きなサイズの細胞の塊を含んだ（図3B）。
【０１００】
J-HER2細胞へのR-VG803の侵入が細胞受容体としてHER2を通して生じることを証明するため、また、SK-OV-3細胞中へのR-VG803の侵入経路におけるgDの役割を調査するため、本発明者らは、感染がHER2受容体を通して生じることを最初に確認した。トラスツズマブの存在下において、scFv-HER2が由来するHER2に対するMAbである、R-VG803でJ-HER2細胞を感染させた。蛍光顕微鏡検査（図4A）によって検出され、蛍光標示式細胞分取器（FACS）（図4B）によって定量されるように、トラスツズマブはR-VG803によるJ-HER2細胞の感染を妨げた。これにより、再標的化されたR-VG803がJ-HER2細胞では侵入門戸としてHER2を使用するという結論が確認される。R-VG803がHER2を受容体として利用することができるという知見は、gH中の異種性リガンドを操作することによってHSVの向性を変えることができるという証拠を提供する。さらに、J-HER2細胞中へのgH再標的化HSV R-VG803の感染は、その同族の受容体によって活性化することができず、gHに活性化を伝達することができないことから、gD受容体を欠く細胞、すなわちgDがR-VG803ビリオン中に物理的に存在するが、機能的には除去された状態で起こり得る。本発明者らは、R-VG803の感染は、機能性受容体結合部位にgDを必要としないと結論づける。次に、本発明者らは、HER2及びnectin1/HVEMの両方の受容体のセットを発現するSK-OV-3細胞の受容体の使用を分析した。問題は、一方の受容体が他方に関して優先的に使用されたか、又は各々が代替的に使用されたかであった。SK-OV-3細胞は、HER2（トラスツズマブ）、MAb HD1又はそれら両方に対するMAbの存在下においてR-VG803で感染させた。対照は、wt-gD、及びR-VG803、R-LM249及びR-LM113に存在する他のゲノムの修飾、すなわちBAC配列の挿入及びGFPマーカーの挿入を持つR-LM5であった。R-LM249は、gDのアミノ酸61〜218の欠失におけるscFv-HER2挿入によってHER2に再標的化されたHSVである。R-LM113は、成熟gDのアミノ酸6〜38の欠失中のscFv-HER2の挿入によってHER2に再標的化されたHSVである。また、R-VG809を含めた（実施例4を参照されたい）。図4Cは、単独で与えられた場合、HER2又はHD1に対するMAbが、R-VG803にほとんど抑制を及ぼさなかったことを示すが、共に与えられた場合には、実質上感染を消失した。したがって、R-VG803は、SK-OV-3細胞を感染させるため、HER2又はNectin1/HVEMを代替的に使用することができる。R-VG803による一方又は他方の侵入門戸の使用は、細胞によって提示される受容体のスペクトルに依存する。予想通り、完全に再標的化されたR-LM249及びR-LM113は、HER2に依存する侵入経路を示す。また、R-VG809による感染は、トラスツズマブによって単独で又はMAbHD1と組み合わせて阻害され、この組み換え体がgHによってHER2に対して再標的化され、成熟gD中のアミノ酸6〜38の欠失の結果としてnectin1/HVEMから脱標的化されたという結論を導く。
【０１０１】
実施例4：gH中のscFV-HER2の挿入によるHER2に再標的化された、及びアミノ酸6〜38をコードするgD配列の欠失によるgD受容体から脱標的化された、R-VG809組み換え体の遺伝子操作
本発明者らは、gH中のscFv-HER2、及びgDに由来する受容体の結合部位の一部の欠失を持つ組み換え体を操作した。gDの2つの主な受容体は、Nectin1及びHVEMである。gDにおけるHVEMの結合部位はアミノ酸1〜32に存在する。成熟gD中のNectin1の結合部位はより広範囲であり、アミノ酸35〜38、アミノ酸199〜201、アミノ酸214〜217、アミノ酸219〜221の間に位置する、Igフォールド（Ig-folded）コア及び部分を含む。本発明者らは、R-VG803から成熟gDのアミノ酸6〜38領域、すなわち先に、成熟gDのアミノ酸5〜39の間のscFv-HER2の挿入によりHER2に対して再標的化されたHSVである、R-LM113から欠失されたのと同じ領域を欠失させた。該欠失は、アミノ酸35〜38、アミノ酸199〜201、アミノ酸214〜217、アミノ酸219〜221の間に位置する、Igフォールドコア及び部分を含む、Nectin1との相互作用に関係するHVEM結合部位全体及びいくつかの残基を除去する。たとえ、Nectin1との相互作用と関係する少数のアミノ酸が欠失されたとしても、R-LM113は、Nectin1及びHVEMから脱標的化されたことを示し、組み換え体はHVEM及びNectin1の両方から脱標的化される。R-VG809という名の組み換えウイルスは、ヒトHaCaT細胞、SK-N-SH細胞、MDA-MB-231細胞、HeLA細胞、HFF14細胞、ハムスターBHK細胞と同様にJ-HVEM細胞だけでなくJ-Nectin1細胞にも感染することができなかった。R-VG809は、J-HER2細胞及びSK-OV-3細胞を効率的に感染させる能力を維持した（図5）。R-VG809向性は、R-VG803のそれとは著しく異なる（図5を図3Aと比較）。本発明者らは、HER2再標的化gHによるR-VG809感染が、gDにおいてHVEM及びNectin1に対する結合部位、そして結果的には受容体を媒介とするgD活性化を要求しないと結論付けた。要約すると、R-VG809は完全に向け直された（redirected）向性、gHによるHER2受容体への再標的化、及びgD受容体からの脱標的化を示す。SK-OV-3細胞のその侵入経路を図4に示す。R-VG803の侵入とは対照的に、SK-OV-3細胞へのR-VG809の侵入はトラスツズマブ単独で阻害されたことが理解され、完全にHER2受容体によることを示した。
【０１０２】
実施例5：gH中のscFv-HER2の挿入によりHER2に再標的化された、及び成熟gDのアミノ酸6〜38領域に代えてscFv-EGFRの挿入によりEGFRに再標的化された、組み換えR-VG805の遺伝子操作。選択した2つの異なる受容体への二重の再標的化＋gD受容体からの脱標的化。
本発明者らは、HER2に対してはgH中のscFv-HER2の挿入によって、及びEGFRに対しては成熟gDのアミノ酸6〜38領域に代えてscFv-EGFRの挿入によって、同時に再標的化したHSV組み換え体を操作した。簡潔には、R-VG803を、本明細書でscFv-EGFRと名付けられたEGFRに対してscFvで成熟gDの内因性アミノ酸6〜38領域を置換するように修飾した。R-VG805と名付けられた組み換えウイルスを実際にNectin 1及びHVEMから脱標的化したgHを用いて、成熟gD中のアミノ酸6〜38領域の欠失のためにHER2に再標的化し、成熟gDのアミノ酸6〜38に代えてEGFRへのscFvの挿入のためEGFRに再標的化した（図6）。本発明者らは、scFV-EFGRの挿入がR-VG805、また欠失を持つEGFRの変異体であるEGFR-vIIIを再標的化することに注目する（図6）。このEGFR変異体は、ヒト神経膠芽腫で高度に発現される。これらの結果は、選択した2つの異なる受容体への二重の再標的化によりHSV組み換え体を操作することが可能なことを示す。
【０１０３】
実施例6：gH中のscFv-HER2の挿入により、及び成熟gDのアミノ酸6〜38領域に代えてscFv-HER2の挿入によりHER2に二重に再標的化された、組み換えR-VG807の遺伝子操作。選択した同じ受容体への二重の再標的化＋gD受容体からの脱標的化。
本発明者らは、gH中のscFv-HER2の挿入、及び成熟gDのアミノ酸6〜38領域に代えてscFv-HER2の挿入の両方によって、HER2に再標的化したHSV組み換え体を操作した。簡潔には、R-VG803を、scFv-HER2で成熟gDの内因性アミノ酸6〜38領域を置換するように修飾した。R-VG807と名付けられた組み換えウイルスをHER2に二重に再標的化し、成熟gDのアミノ酸6〜38領域の欠失のためNectin1及びHVEMから脱標的化した。
【０１０４】
実施例7：gH中のscFv-HER2に対する挿入部位に関する研究。アミノ酸24〜47をコードする配列の欠失
本発明者らは、gHのN末端部分の欠失とscFv-HER2の挿入とを結び付けることができるかどうか調査した。欠失部分はgHのアミノ酸24〜47をコードする配列であった。この配列をscFv-HER2で置換した。得られた組み換え体をR-VG811と名付けた。図7は、R-VG811がJ-HER2細胞に感染したことを示す。したがって、scFv-HER2の挿入を、少なくともアミノ酸48までgH中の欠失と結び付けて考えることができる。これは、挿入部位が、アミノ酸18に対してはC末端、またアミノ酸19とアミノ酸48との間の任意のアミノ酸のN末端になり得ることを示す。Atanasiuet al.（MBio. 2013 Feb 26;4(2). pii: e00046-13. doi: 10.1128/mBio.00046-13）は、「gHΔ48/gLは完全に調節性の活性化をもたらす経路上の中間構造を有し、融合の経路の重要な工程は受容体結合gDによる活性化状態へのgH/gLの転換であることを示唆し、この活性化gH/gLはgHΔ48/gLに似ている」と提案した。ビリオン−細胞侵入においてではなく、細胞−細胞融合アッセイで得られたAtanasiuによる結果に基づき、当業者は、gH中のアミノ酸24〜47の配列の欠失、及びscFv-HER2によるその置換が、ウイルスが細胞膜と融合しやすくして、R-VG803に関する感染の増強を可能とすると仮定するかもしれない。本発明者らは、R-VG803の比較のためSK-OV-3細胞及びJ-HER2細胞においてR-VG811のDNA-BACを形質移入し、mCherryマーカーを発現する細胞の量によってウイルス感染／形成の程度を決定した。図7B〜図7Dは、J-HER2細胞又はSK-OV-3細胞におけるR-VG811、又はR-VG803DNAの形質移入により得られた感染細胞の量を比較する。実験の定量を図7C及び図7Dで示す。全体として、感染性のウイルス産生の効率は、R-VG803よりもR-VG811を用いる場合に低く、gHのN末端でのアミノ酸48までのアミノ酸の欠失が組み換え体の感染能力を減少させることを示す。したがって、Atanasiuet al. の結果は、欠失したアミノ酸24〜47の内因性gH配列に代えてscFv-HER2の挿入を持つHSV組み換え体の挙動の予測とはならなかった。
【０１０５】
実施例8：組み換え体の複製の程度
本発明者らは、R-VG803及びR-VG809の複製の程度を、gD中のscFv-HER2の挿入によりHER2に再標的化されるR-LM113及びR-LM249の2つの組み換え体の複製の程度と比較した。受容体としてHER2を発現するJ-HER2細胞、並びに受容体としてHER2及びNectin1/HVEMを発現するSK-OV-3細胞において複製を測定した。細胞を0.1PFU/細胞又は0.01PFU/mlで感染させ、感染の3時間、24時間及び48時間後に採取した。図8において、結果は、R-VG803及びR-VG809がR-LM113又はR-LM249と同じくらい効率的に、又はSK-OV-3細胞においてはより一層効率的に複製したことを示す。
【０１０６】
実施例9：R-VG803及びR-VG809のHER2陽性癌細胞を殺傷する能力
R-VG803又はR-VG809が細胞を殺傷する能力の基準として、本発明者らは、HER2陽性SK-OV-3細胞に対してAlamarBlueによる細胞毒性試験を行った。wt HSV R-LM5及び再標的化されたR-LM113及びR-LM249を比較のため含めた。図9は、R-VG803、R-VG809によって引き起こされた細胞毒性が、R-LM113又はR-LM249によって引き起こされたものに非常に類似したことを示す。
【符号の説明】
【０１０７】
図1
linker  リンカー
ScFv-HER2inserted between AA 23 and 24 of gH  gHのアミノ酸23〜24の間に挿入されたscFv-HER2
ScFv-HER2 insertedbetween AA 23 and 48 of gH  gHのアミノ酸23〜48の間に挿入されたscFv-HER2
Identical toR-VG803, with deletion of AA 6-38 in gD  R-VG803と同一、gDのアミノ酸6〜38の欠失を有する
Identical toR-VG809, with insertion of scFv-EGFR in place of AA 6-38 of gD  R-VG809と同一、gDのアミノ酸6〜38に代えてscFv-EGFRの挿入を有する
Identical toR-VG809, with insertion of scFv-HER2 in place of AA 6-38 of gD  R-VG809と同一、gDのアミノ酸6〜38に代えてscFv-HER2の挿入を有する
図3
Day 1  1日目
Day 2  2日目
Day 3  3日目
Day 4  4日目
Day 5  5日目
図4
No Abs  抗体無し
Infection (%)  感染（%）
Infected  感染
図8
h post infection  感染後の時間
図9
Viability (%)  生存率（%）
Days  日
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
0006751721000001.app