(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個人の患者のガイド手術における腫瘍マージンの検出および画定のための薬学的診断組成物の製造のための、次式で示される化合物ＤＡ３６４の使用であって、該腫瘍がαｖβ３インテグリン受容体の減少または変化した発現を示す腫瘍である、使用。
【化１】
0006793122.tif 000020
【請求項２】
前記検出および画定が、根治手術下での病理的部分の外科的境界をリアルタイムに同定することを含んでなる、請求項１記載の化合物ＤＡ３６４の使用。
【請求項３】
腫瘍マージンの検出および画定が蛍光下で行われる請求項１または２記載の化合物ＤＡ３６４の使用。
【請求項４】
光の波長が６３０〜６９０ｎｍの範囲である、請求項３記載の化合物ＤＡ３６４の使用。
【請求項５】
前記検出および画定が、
ｉ）有効量のＤＡ３６４が適切に前投与された患者における疑わしい腫瘍を含んでいる目的領域に、化合物ＤＡ３６４を励起することが可能な光源を照射すること；および
ｉｉ）蛍光下で病理的部分または領域のマージンを同定すること
を含んでなる、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物ＤＡ３６４の使用。
【請求項６】
０．０５〜２０ｍｇの量の化合物ＤＡ３６４が個人の患者に前投与される、請求項５記載の化合物ＤＡ３６４の使用。
【請求項７】
ＤＡ３６４の投与がガイド手術の４８時間以内に行われる、請求項５または６記載の化合物ＤＡ３６４の使用。
【請求項８】
化合物ＤＡ３６４を含んでなる、腫瘍マージンをリアルタイムに検出および画定するための術中光学イメージングのための薬学的診断組成物の製造のための化合物ＤＡ３６４の使用であって、該腫瘍がαｖβ３インテグリン受容体の減少または変化した発現を示す腫瘍である、使用。
【請求項９】
前記光学イメージングが、根治切除下で腫瘍部分のマージンをリアルタイムに検出および画定するための個人の患者の腫瘍のガイド手術において行われる、請求項８記載の薬学的診断組成物の製造のための化合物ＤＡ３６４の使用。
【請求項１０】
メラノーマ、神経膠腫、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、肉腫、卵巣癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、結腸癌、頭頚癌および前立腺癌からなる群から選択される腫瘍の検出および画定のための、請求項２〜７のいずれか記載の薬学的診断組成物の製造のための化合物ＤＡ３６４の使用。
【請求項１１】
前記腫瘍が前立腺癌である請求項１０記載の化合物ＤＡ３６４の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボの術中（intra-operative）イメージングの分野に関する。より詳細には、本発明は、腫瘍および病理的な領域のガイド手術においてＣｙ５．５色素部分で標識されたアザビシクロアルカンベースの環式ペプチドを含む近赤外（ＮＩＲ）蛍光プローブＤＡ３６４の使用に関する。本発明はさらに、その外科的切除の間に腫瘍マージンを同定および画定するための、この蛍光プローブを術中イメージングに使用することを含む光学イメージング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的化学療法や放射線療法のような、急性疾患や癌の治療のための改善された治療様式の開発に過去数十年の間かなりの努力が注がれてきた。しかし、根治手術は、多くの癌、特に初期の悪性腫瘍には最適の治療であり、外科的切除は、現在、大多数の癌患者の処置のための標準の治療である（CA Cancer J. Clin. 2012; 62:220-241）。例えば、乳癌の早期（ＩおよびＩＩ）の患者の９３％および後期（ＩＩＩおよびＩＶ）の患者の７５％が外科的に処置される。結腸癌（９４％）および直腸癌（７４％）の初期段階（ステージＩおよびＩＩ）において、癌およびその近傍のリンパ節を除去する手術が最も一般的である。結腸人工肛門造設術は結腸癌（７％）よりも直腸癌（２６％）の方が一般的に用いられる。前立腺全摘出術は、１８〜６４歳の前立腺癌がん患者の５７％、６５歳〜７４歳の患者の３３％が選択する治療法である。
【０００３】
術前イメージング技術および術後関連治療の大きな進歩にもかかわらず、患者の予後は本来の手術の成功、すなわち癌組織および癌細胞の完全な外科的除去と本質的に関連している。したがって、外科的治療および患者の生存のために重要なことは、外科医が健康な組織を除去または傷つけるのを避けることを助ける腫瘍マージンの明確な識別と画定であり、特に、重篤または致命的な影響を与えることが多い局所的再発につながる残存腫瘍細胞を残さないことである（Ann Surg 2005; 241:715-724）。
【０００４】
現在のところ、腫瘍手術の多くは、外科医の直接の視覚検査および触診によってもたらされるガイドの下でのみ行われ、外科医の経験と病理組織を正常組織から区別する能力が、切除すべき組織の選択において唯一利用可能なガイドである。しかしながら、癌組織は、肉眼では腫瘍周辺の浮腫や炎症と区別することが困難であることが多く、手で感じるには小さすぎる。腫瘍のタイプや腫瘍患者の間で異なり、結果として外科的プロトコールが欠如していることからも、さらなる困難が生じている。
【０００５】
従って、外科医が腫瘍マージンを「見る」能力を高め、それによって手術成果を改善することを可能にするイメージング技術およびプローブの開発に関心が高まっている。
【０００６】
ここ数年の間、統合された蛍光と標準白色光が手術室で使用されており、特に病理学的領域を標的とする近赤外（ＮＩＲ）フルオロフォアと組合せた場合に、正常な組織と病理的な組織との区別が可能になることが示されている。７００〜９００ｎｍのＮＩＲウィンドウ内で作用するＮＩＲ蛍光の利点としては、外因的なＮＩＲ造影剤によるバックグラウンドコントラストに対する信号を最大にする、組織へのミリメートルからセンチメートルの浸透、散乱および自己蛍光の低減が挙げられる。さらに、ＮＩＲ蛍光イメージングは、リアルタイムの視覚化、非接触なイメージング、電離放射線がないこと、および外科手術視野が外観上変わらないなど、外科医に利点をもたらす。この点で、実際には、特定の術中イメージングシステムの起動が唯一、ヒトの眼には見えなかった造影剤を外科医が「見る」ことを可能にし、それによって外科医によって観察される臨床画像への悪影響を回避することを可能にしている（Mol Imaging。2010; 9（5）：237-255）。
【０００７】
腫瘍部位に記録されたシグナル対バックグラウンド比（ＳＢＲ）を最大にし、目的の腫瘍領域の同定および画定を可能にする近赤外蛍光イメージングプローブへの関心が高まっている。
【０００８】
インテグリン、特にαvβ3およびαvβ5は、例えばメラノーマ、グリア芽細胞腫、卵巣癌、乳癌、肺癌、肝臓癌および結腸癌を含むいくつかの悪性腫瘍の血管新生の間にアップレギュレートされ活性化されることが知られている多くのタイプの細胞によって発現される膜貫通細胞表面タンパク質であり、それらは、腫瘍血管新生の初期段階、および腫瘍成長や転移を制御するプロセスにおいて重要な役割を果たしている（Mol. Cancer Ther. 2005; 4:1670-1680）。したがって、それらはＮＩＲ蛍光プローブ腫瘍標的の魅力的な標的を構成する。実際、現在研究中の腫瘍標的化プローブの大部分は、標的腫瘍部位に蛍光プローブを蓄積させることを目的としてＲＧＤベースのインテグリン標的化部分をそれらの構造内に含んでいる。
【０００９】
光学イメージングを含む医療用イメージングのためのインテグリン標的診断薬は、例えばＷＯ２００６／０９５２３４に開示されている。
【００１０】
Ｃｙ５．５色素で標識されたアザビシクロアルカンベースの環式ペプチドを含むＮＩＲ蛍光プローブは、ＤＡ３６４と称され、以下の式
【化１】
0006793122.tif 000002
を有し、グリア芽腫異種移植におけるαvβ3インテグリンの光学イメージング検出や乳癌の早期診断のためのその使用が、Contrast Media & Molecular Imaging 2011;6:449-458およびContrast Media & Molecular Imaging 2013; 8,350~360に開示されている。
【００１１】
双性イオン性ＮＩＲフルオロフォアおよびそのインテグリン標的化ＲＧＤ誘導体は、Nature Biotechnology 2013; 31（2）, 148-153および当該文献中の引用文献に開示されており、結腸直腸癌および尿管の両方の近赤外蛍光イメージングにおけるそれらの使用が、最近Ann. Surg. Oncol. 2014年2月11日（出版前にオンラインにて公開）に開示されている。これらの蛍光プローブは、バックグラウンド（非腫瘍）比（ＳＢＲ）に対して最適化されたシグナル、そして顕著なαvβ3インテグリン過剰発現を有するそれら特有の腫瘍の最適な視覚化および画定、を提供するために特異的な処理が加えられている。
【００１２】
前立腺癌標的化ＮＩＲ蛍光剤はまた、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）との結合相互作用を介して蛍光プローブを標的腫瘍部位に蓄積させる、ペプチドまたは小さな標的分子に結合したＮＩＲフルオロフォアを含むことが開示されている（例えば、Mol. Imaging 2005; 4（4）, 448-462および当該文献の引用文献参照）。
【００１３】
腫瘍特異的なＮＩＲＦ造影剤はまた、ＮＩＲフルオロフォアをＦＤＡで承認され臨床的に利用可能なモノクローナル抗体若しくはＦＡＢ（例えば、ベバシズマブまたはセツキシマブ）またはペプチド（例えば、J. Nucl. Med. 211; 52:1778 -1785参照）に結合させることによっても得られている。
【００１４】
近赤外色素と合成ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーとのコンジュゲートを含む光学造影剤は、ＷＯ２０１０／１０６１６９および当該文献の引用文献に開示されている。
【００１５】
しかしながら、これらの巨大分子プローブの術中イメージングにおける使用が制限される可能性は、典型的に血液系から完全に排出される前に循環におけるそれらの持続性が顕著に増大する大きな体積によって表される（Mol. Cancer Ther. 2009; 8:2861-2871およびTrends in Pharmacological Sciences Vol.29 No.2）。
【００１６】
一方の面でαvβ3インテグリン標的化モチーフおよび他方の面でシアニンマーカーにグラフトされた機能化ＲＡＦＴ（Regioselectively Addressable Functionalized Template）足場（ＲＡＦＴ）および腫瘍マージンの術中検出におけるそれらの使用が、ＷＯ２０１０／０７６３３４に開示されている。
【００１７】
しかしながら、近赤外蛍光ガイド手術の開発の主な制限は、蛍光光学イメージング用のＮＩＲ剤を術中臨床への応用に転換する際に直面する確認されている障害、有効なＮＩＲ蛍光プローブのアベイラビリティが低いことにある。
【００１８】
事実、診断イメージングでは、患者のイメージングに適合する時間枠において、蛍光造影剤が病理学的部位に優先的に蓄積し、周囲の健康な組織において観察されるシグナルよりも有意に高いシグナルを局所的に生成する（そして、生きている組織によって減衰または散乱しない）ことが必要である。この目的のために、アップレギュレートされた腫瘍血管新生において、信号が標的化腫瘍部分に結合した、または、少なくとも部分的に、循環している、造影剤によって生成されるかどうかに無関係であることが必要である。したがって、循環からの未結合プローブの完全な排除は、ＮＩＲ蛍光診断イメージングにおいて必要ではない。同様に、診断目的のために、ＳＢＲは手術のような長時間にわたって最適であり続ける必要はない。
【００１９】
ガイド手術の場合、目的の腫瘍部位でのＮＩＲ蛍光プローブの優先的な蓄積は必要条件であるが、十分ではない。
【００２０】
外科的腫瘍切除の全期間にわたり腫瘍マージンを明確かつ鮮明に画定することができるように、ガイド手術に使用するＮＩＲＦ造影剤は、正常組織と病理的な組織との間の蛍光プローブの濃度差を明瞭で正確かつ永続的に表示しなければならない。同時に、出血（手術中に起こる）で放出される残存する造影剤が手術室を汚染し外科医の視野を混乱させることがないように、循環する（結合していない）蛍光プローブが手術前に血液系から完全に除去することが絶対に必要である。
【００２１】
これらの結果を達成するために、画像ガイド手術に使用するのに適したＮＩＲ蛍光剤は、
−血液系における最適な持続時間、薬剤と標的との十分な接触時間を確保するのに十分な長さ（したがって、標的部位での効果的な蓄積）および同時に循環システムからの非結合薬剤の完全な除去；
−病理的な領域への薬剤の選択的取り込みと均一な分布の両方を含む、標的化腫瘍部位における選択的蓄積、および（腫瘍部位において）手術中の腫瘍領域全体の明確な画定を可能にする十分な保持；
−腫瘍マージンの汚染または浸潤組織の認識が損なわれるのを防ぐための、病理的な領域から正常組織に向かっての緩徐な放出速度および無視できる程度の（蛍光剤の）抽出および拡散；
を示し、加えて
−蛍光プローブは、励起光への長期間の暴露で退色しないまたは損なわれずに信号を提供しなければならない。
【００２２】
したがって、ＮＩＲ剤の排出速度および排出経路は、血液中の半減期、したがって目的の標的との接触時間を制御し、さらに排泄器官におけるバックグラウンドシグナルに影響を及ぼすため、極めて重要である。既存の非特異的取り込みとほぼ絶対的または完全に適合しなければならない、標的に対するＮＩＲプローブによって示される親和性は、同様に関連がある。
【００２３】
さらに、そのどちらも、腫瘍のタイプ、患者、および例えば手術前に腫瘍量を減らすために実施される任意の治療的前処置によって促進される効果に強く依存する、目的の腫瘍における標的化された受容体またはエピトープの分布の豊富さおよび均一性の両方の観点から、さらなる困難性が生じる可能性がある。
【００２４】
実際に、いくつかの典型的な腫瘍受容体、例えばインテグリンの過剰発現は、例えば、前処置された腫瘍または転移におけるこれらの受容体に特異的に標的化されたプローブの有効な蓄積が損なわれ、その信頼できる画定を可能にする能力を低下させるような、化学療法的処置の効果によって減少または修飾され得る。
【００２５】
最後に、様々な組織の異なる光学特性によって引き起こされる誤った影響は、特に、フルオレセインや５−ＡＬＡのような組織光学窓（ＮＩＲ）から作動する薬剤について、正常な組織と腫瘍組織の領域とを区別するための造影剤の能力を妨げる。この制限は、特に蛍光シグナルが低い腫瘍マージンで悪化する。
【００２６】
上記の要因の多様性と複雑さは、恐らく、様々な新しいフルオロフォアと腫瘍特異的ＮＩＲ蛍光剤が前臨床試験で開発され試験されているものの、腫瘍レセプターに対する特異性または腫瘍血管新生マーカーに対する特異性を利用することについていずれも臨床で承認を得ていないということの理由である。
【００２７】
実際、ＦＤＡが認可した唯一のＮＩＲ蛍光造影剤は、メチレンブルー（ＭＢ）およびインドシアニングリーン（ＩＣＧ）であり、現在もなお臨床診療における参照製品である。それらのいずれも腫瘍を標的とするものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
したがって、外科医が腫瘍マージンをリアルタイムに検出し病理的な領域を根本的かつ正確に切除することが可能な、腫瘍特異的NIR蛍光プローブおよび術中イメージング様式の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
上記のように、αvβ3インテグリンを高度に過剰発現する腫瘍の光学的イメージングのための、ＤＡ３６４として同定され、上記の式を有するＮＩＲ蛍光剤の使用は、上記引用文献の診断分野で知られている。
【００３０】
本発明者らは、この化合物が、腫瘍のＮＩＲ蛍光イメージングガイド根治手術中に、腫瘍マージンのリアルタイムの検出および画定を提供する術中イメージングにおいて有効に使用されることを見出した。したがって、ＤＡ３６４の使用は、残存する腫瘍組織を残す、または正常な組織を不必要に除去する（局所的な神経支配および血管新生を傷つけるおそれのある関連リスクを伴う）危険性を減少させるのに役立つ。
【００３１】
さらに、この薬剤は、腫瘍部位での最適な蓄積および保持を提供し、インテグリン過剰発現が減少した腫瘍であっても、腫瘍マージンの明確な同定および画定を可能にすることが観察された。
【００３２】
したがって、一般的に、本発明は、術中イメージングにおいて、より詳細には、腫瘍外科手術において、腫瘍マージンのリアルタイムの検出および画定を外科医に提供するための蛍光プローブＤＡ３６４の使用に関する。
【００３３】
より詳細には、一態様において、本発明は、切除すべき病理的な領域または腫瘍領域のマージンの術中検出および画定のための、患者における腫瘍または病理的な領域の手術、特に、ＮＩＲ蛍光ガイド根治手術におけるＤＡ３６４の使用に関する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、腫瘍マージンのリアルタイム同定および画定のために、術中イメージングで使用するための、ＤＡ３６４として知られるＮＩＲ蛍光造影剤を含む組成物に関する。
【００３５】
さらなる態様において、本発明は、根治手術を受ける腫瘍のマージンを特定し画定するための造影剤としてのＤＡ３６４の使用を含む術中イメージング方法を提供する。
【００３６】
さらに別の態様では、本発明は、腫瘍マージンの術中（intraoperative or per-operative）の境界設定および画定のためのＤＡ３６４および蛍光の使用を含む、患者の腫瘍塊、部分（area）または領域（region）の根治手術のためのガイド手術プロトコールに関する。
【００３７】
特定の実施形態では、前記術中（intra- or per-operative）イメージングは、αvβ3インテグリンの減少した過剰発現を有する腫瘍に対して行われる。
【００３８】
他の実施形態では、前記術中（intra- or per-operative）イメージングは、αvβ3インテグリンの可変の過剰発現を有する腫瘍に対して行われる。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
外科医に有用なサポートを提供するために、ガイド手術で使用するための有効な造影剤は、全腫瘍部分を明確に検出し、その境界を正確に画定するために、実質的に均質な様式で目的の病理的な部位に選択的に蓄積することが可能でなければならない。
【００４０】
造影剤ＤＡ３６４は、腫瘍部位に最適な蓄積と保持を確実にすることが証明されており、その後、外科医が根治手術中に切除すべき病理領域をリアルタイムで「見る」こと、そしてその手術マージンを明白に特定することを可能にする持続的な蛍光シグナルを局所的に生じる。興味深いことに、実際、この化合物は、循環系から完全に排除される前に、目的の部位における選択的で実質的に均一な蓄積を保証するのに十分長い時間循環系に留まることを可能にする薬物動態プロファイルと薬力学特性を示す。
【００４１】
化合物ＤＡ３６４は、予想外にも、低下した（例えば、限定されたまたは不均一な）αvβ3インテグリン過剰発現を有する腫瘍の腫瘍部位で有効な蓄積および保持をもたらすことが観察されている。
【００４２】
特定の理論に拘束されるつもりはないが、腫瘍部位での蓄積（特に、αvβ3インテグリンの減少したまたは不均一な過剰発現を伴う）は、インテグリン受容体、特にαvβ3に対する高い特異性、および、例えば損傷を受けた腫瘍脈管構造から漏出した血管外血漿アルブミンを含む、細胞外成分との非特異的結合相互作用によって媒介される非特異的保持の両方の影響の組合せの結果であるという仮説を立てることができる。
【００４３】
腫瘍領域の細胞外（隙間）空間に入り効果的に分布するこの予想外の能力は、一方の側から、腫瘍部位に記録されたシグナルを増幅しより永続的にするのに寄与し、実際には、腫瘍および内皮細胞上に発現したαvβ3インテグリン受容体と結合したＮＩＲ剤（特異的結合）および非特異的な相互作用（非特異的結合）の結果として腫瘍の間質腔に保持された該薬剤の両方によって決まる。
【００４４】
有利なことに、さらに、腫瘍部位における最適な蓄積および保持は、この薬剤が、減少したまたは不均一なインテグリン発現を有する病理的な組織の存在下であっても、腫瘍マージンの改善された持続的な画定を提供することを可能にし、個々の腫瘍および個人の患者におけるインテグリンの発現の変動性から生じる制限が克服される。
【００４５】
実際に、腫瘍の細胞外空間に保持された蛍光プローブによってもたらされる検出されたシグナルへの寄与が有利にも、おそらくは特異的に標的化されたインテグリン受容体の発現の減少または不均一な発現によって引き起こされる、蛍光シグナルの減少または不均一性、およびそれに続く腫瘍マージンの不正確または曖昧な境界の補うことが示された。
【００４６】
したがって、αvβ3インテグリン受容体の顕著な発現を有する腫瘍および病理のリアルタイムで改善されたＮＩＲ蛍光画定を提供することに加えて、ＤＡ３６４は、以前の治療処置によって促進された効果のためにαvβ3インテグリン受容体の限定されたまたは不均一な発現を示すか、または示すであろう血管新生腫瘍や病理的な領域の境界の信頼性のある画定をもたらすことが示された。
【００４７】
その結果、本発明のＮＩＲ剤は、一般的な使用、すなわち、それが示すかもしれないαvβ3インテグリン受容体の可能性のある減少したまたは不均一な発現に関係なく、外科医に切除すべき悪性領域のマージンのリアルタイムの信頼できる識別および画定を提供するための、患者のＮＩＲ蛍光ガイド根治手術に使用することを提案することができる。
【００４８】
したがって、本発明の実施形態は、腫瘍マージンのリアルタイムの検出および画定のための、患者の術中イメージングにおける造影剤ＤＡ３６４の使用に関する。
【００４９】
好ましい態様では、前記術中イメージングは、外科医に、除去すべき腫瘍部分または悪性領域のマージンのリアルタイムの識別を提供するために、根治手術中、特に根治腫瘍手術中に直接記録される。
【００５０】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、削除すべき病理的な部分のマージンのリアルタイムの識別および画定を提供するために、手術における、そして好ましくは腫瘍のガイド手術における造影剤ＤＡ３６４の使用に関する。
【００５１】
目的の腫瘍領域を検出し、画定するために造影剤としてＤＡ３６４を使用することを含む、本発明による根治手術は、例えば約６００〜約７００ｎｍの波長範囲で適切にフィルターにかけられた励起光を使用することによって得られる蛍光下で適切に実施される。特に好ましい実施形態によれば、本発明は、切除すべき病理的な部分の境界の術中のリアルタイムの検出および画定を行うためのＮＩＲ蛍光ガイド腫瘍手術における造影剤ＤＡ３６４の使用に関する。
【００５２】
本明細書および特許請求の範囲では、本明細書で互換的に使用される用語「腫瘍」、「病理的な部分」、「悪性腫瘍」または「悪性部分または領域」は、腫瘍、転移および浸潤した身体領域または組織を含む、それらの量および分布に関係なく腫瘍細胞を含む個人の患者の身体の組織、器官、部分または領域を意味し、「正常な部分、組織または領域」は腫瘍細胞を含まない個人の患者の身体の組織、部分又は領域である。
【００５３】
本明細書中で使用される腫瘍「マージン」または「境界」という用語は、正常な領域から病理的な領域を画定し分離する腫瘍または他の悪性腫瘍の領域を指す。
【００５４】
本明細書で使用される「外科的マージン」または「腫瘍不含マージン」という表現は、（例えば、ＮＩＲ蛍光による）可視境界までの病理的な領域を含む腫瘍の外科的切除において外科医が従う切除マージンを指し、検出可能な腫瘍境界の周囲の、典型的には少なくとも３ｍｍ、好ましくは少なくとも約５ｍｍから約１ｃｍまで、および１ｃｍを超える、追加の非罹患（すなわち、非蛍光の）の外側領域を含む。
【００５５】
本明細書で使用される「患者」または「個人の患者」という用語は、手術によって治療可能な腫瘍または悪性疾患に罹患している、生きている被験者、好ましくは哺乳動物被験者、およびより好ましくはヒトを含む。
【００５６】
「αvβ3インテグリン受容体の発現が減少した腫瘍」という表現は、αvβ3インテグリン受容体の過剰発現を示す腫瘍を指し、正常な組織におけるαvβ3インテグリン受容体の発現よりも高いが、前記受容体の重要な過剰発現を有することが知られている腫瘍におけるαvβ3インテグリン受容体の発現に関して一般に低下している腫瘍を意味する。
【００５７】
減少した過剰発現は、例えばαvβ3インテグリンが新血管新生に関連する内皮細胞によって発現する場合、腫瘍細胞によるαvβ3インテグリンレセプターの効果的なより低い（限定された）発現または腫瘍塊におけるαvβ3インテグリンレセプターの不均一な分布（そうでなければ比較的高い）のいずれか、あるいは両方の組み合わせに起因する。後者の場合、腫瘍塊の全体についてのαvβ3インテグリン発現の量が、腫瘍塊における腫瘍細胞のαvβ3インテグリンの特定の発現から独立して、腫瘍塊において有効なαvβ3インテグリン発現となる。
【００５８】
本出願人が観察したように、腫瘍塊におけるαvβ3インテグリン発現の量は、例えば、実験部分で詳細に記載するように、組織中の特定のタンパク質の含有量の定量化を可能にするウェスタンブロット分析などの既知の分析技術に従って決定することができる  。
【００５９】
この技術によれば、腫瘍塊中１ｍｇあたり、または好ましくは（細胞の数および種類についてより良好な標準化のため）腫瘍塊中の全タンパク質溶解物の１μｇあたりの発現したαvβ3インテグリンの量（ｎｇ）を決定することが可能である。ここでは、減少が腫瘍細胞の効果的なαvβ3インテグリン発現の低下に起因するのか、αvβ3インテグリン高発現細胞が腫瘍塊内で不均一に分布することに起因するのかは関係しない。測定された値は、実際には、腫瘍塊全体におけるαvβ3インテグリン発現として示される。
【００６０】
特に、αvβ3インテグリン過剰発現が高い腫瘍（例えば、悪性メラノーマＩＶ型またはＵ−８７ＭＧ腫瘍）では、αvβ3インテグリンの量が０．２０ｎｇ／μｇ総蛋白より多いことが判った（約０．２４１１４９および０．２２１０００ｎｇ／μｇ蛋白のαvβ3インテグリン）。一方、ＤＡ３６４造影剤は、驚くべきことに、αvβ3インテグリン受容体の発現の減少した腫瘍の視覚化（したがって、術中（intra- or per-operatory surgery）のための方法）にも適していることが観察された。特に、ＤＡ３６４は、０．１５ｎｇのαvβ3インテグリン／μｇ蛋白以下の発現、０．１０ｎｇのαvβ3インテグリン／μｇ蛋白以下の発現または０．０５ｎｇのαvβ3インテグリン／μｇ蛋白以下、例えば０．００５ｎｇのαvβ3インテグリン／μg蛋白、０．０１ｎｇのαvβ3インテグリン／μｇ蛋白、または０．０２ｎｇのαvβ3インテグリン／μｇ蛋白、の発現を示す腫瘍を視覚化するのに適している。別法として、発現比として定義すると、ＤＡ３６４は、悪性メラノーマＩＶ型（OriGeneのCP565523）におけるαvβ3インテグリン発現に対して６０％以下、４０％以下又は２０％以下のαvβ3インテグリンの発現を示す腫瘍；および例えば悪性メラノーマＩＶ型におけるαvβ3インテグリン発現に対して２％、４％または８％のαvβ3インテグリンの発現を示す腫瘍を視覚化するのに適している。
【００６１】
当分野で知られているように、多くの腫瘍（または腫瘍塊中の細胞）は、それらの異なる発達段階の間に、αvβ3インテグリンの発現が変化し、典型的には、腫瘍ステージの早期から後期への進行においてαvβ3インテグリン発現の増加を示す。
【００６２】
本出願人が観察したように、αvβ3インテグリンの発現が比較的低い腫瘍を視覚化するという有利な特性はまた、それらのそれぞれの発達段階または進行段階の間にαvβ3の発現が変化する腫瘍を視覚化（術中（intraoperatory and peroperatory）の視覚化を含む）することにＤＡ３６４剤を使用することを可能する。
【００６３】
特に、比較的早期の発達段階（後期の発達段階でより高い過剰発現に対して相対的に減少したαvβ3インテグリンの過剰発現を有する）の腫瘍は、特に手術中に有利に視覚化され得る。
【００６４】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、αvβ3インテグリンの発現が変化する腫瘍の術中（intra- or per-operatory）視覚化のための方法であって、該腫瘍が、αvβ3インテグリンの発現が０．１５ｎｇ以下のαvβ3インテグリン／μg蛋白、０．１０ｎｇ以下のαvβ3インテグリン／μｇ蛋白、または０．０５ｎｇ以下のαvβ3インテグリン／μg蛋白；例えば０．００５ｎｇのαvβ3インテグリン／μg蛋白、０．０１ｎｇのαvβ3インテグリン／μg蛋白、または０．０２ｎｇのαvβ3インテグリン／μg蛋白である発達段階（development phase）を有する、方法に関する。
【００６５】
別の実施形態によれば、本発明は、αvβ3インテグリンの発現が変化する腫瘍の術中（intra- or per-operatory）視覚化のための方法であって、該腫瘍が悪性メラノーマＩＶ型（OriGeneのCP565523）におけるαvβ3インテグリン発現の６０％以下、または４０％以下または２０％以下；および例えば悪性メラノーマＩＶ型のαvβ3インテグリン発現の２％、４％または８％である発現段階を有する方法に関する。
【００６６】
本発明の一実施形態において、根治手術下の腫瘍または悪性腫瘍は、メラノーマ、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、肉腫、卵巣癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、結腸癌、頭頸部癌および前立腺癌；好ましくは神経膠腫、神経膠芽細胞腫、乳癌、卵巣癌及び前立腺癌から選択され、この最後が特に好ましい。
【００６７】
更なる実施形態では、本発明は、外科的処置の全期間において患者の腫瘍マージンのリアルタイムの検出および画定のために、術中（intraoperative and per-operative）（あるいは、本明細書では、周術期（periopperative）なる語を患者の外科手術が行われている期間を記述する用語として交換可能に用いる）のイメージングに使用するための有効量のＤＡ３６４を含む薬学的診断組成物に関する。
【００６８】
この点で、本発明の術中（intraoperative or per-operative）（あるいは、本明細書では、周術期（periopperative）なる語を患者の外科手術が行われている期間を記述する用語として交換可能に用いる）イメージングは、好ましくは蛍光、より好ましくは近赤外線蛍光の範囲で行われる、光学イメージングに属する。
【００６９】
好ましい実施形態では、本発明は、切除すべき病理的な部分のマージンのリアルタイムの検出および画定のための、ガイド手術、好ましくは個人の患者の腫瘍の近赤外蛍光ガイド手術において使用するための有効量のＤＡ３６４を含む医薬診断組成物に関する。
【００７０】
この点で、特に記載しない限り、本明細書で使用される「有効量」または「有効用量」なる語は、ＮＩＲ剤ＤＡ３６４のその意図された診断目的：すなわち、例えばリアルタイムの、つまり個人の患者の蛍光ガイド手術の間およびその手術の全期間にわたって、切除すべき腫瘍の部位、領域または組織および悪性浸潤の境界の明確な検出および画定、を達成するのに十分な任意の量を指す。例えば、適切な用量は、個人の患者の体重１ｋｇあたり約０．６〜約２５０ｎｍｏｌの蛍光プローブの範囲であり得、好ましくは１〜６０ｎｍ、より好ましくは１．７〜１７ｎｍｏｌ／ｋｇであり、患者あたり約０．０５〜２０．０ｍｇ、好ましくは０．０８〜５．０ｍｇ、および最も好ましくは０．１５〜１．５ｍｇの蛍光プローブの用量に相当する。
【００７１】
本発明の適当な医薬組成物は、一般的に使用される全ての投与経路に適した医薬組成物として、常套の手順に従って製剤化することができる。典型的には、本組成物は有効量のＮＩＲＦ造影剤と少なくとも１つの適当な担体を含む。薬学的に許容される担体の非限定的な例としては、滅菌水、生理食塩水、緩衝食塩水、緩衝塩溶液（リン酸塩または酢酸塩などの緩衝剤を含む）、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、パラフィンなどが挙げられる。組成物はまた、必要に応じて、可溶化剤および局所麻酔剤（例えば、リドカインなど）を含み、注入部位での痛みを緩和することができ；活性化合物と有害な反応を起こさない限り、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、塩類、潤滑剤などをさらに含んでいてもよい。同様に、本組成物は、慣用の賦形剤、すなわち活性化合物と有害な反応を起こさない、非経口、経口または鼻腔内適用に適した薬学的に許容される有機または無機担体物質を含み得る。一般的に、成分は、別々に供給されるか、または、例えば、活性成分の量を活性単位で表示したアンプルまたはサシェのような、密閉容器中の乾燥凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、混合された単位剤形として供給される。組成物が注入投与される場合は、無菌の医薬グレードの「注射用水」または生理食塩水を含む注入瓶にて分配することができる。組成物が注射によって投与される場合、注射のための滅菌水または生理食塩水のアンプルが、投与前に成分が混合され得るように提供され得る。
【００７２】
組成物が経口投与のためのものである場合、例えば、錠剤、カプセルまたは丸薬として、または経口使用のための液体もしくは懸濁液として、適切に処方され得る。
【００７３】
好ましい態様において、本発明のＤＡ３６４の医薬組成物は、所望により緩衝化された、非経口投与のための、そして最も好ましくは静脈内または動脈内投与のための、等張滅菌水溶液として適当に製剤化される。
【００７４】
好ましくは、前記診断用組成物は、少なくとも０．０５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１５〜４０ｍｇ／ｍＬのＮＩＲ剤ＤＡ３６４の濃度を有し、例えばボーラスとして、または時間的に別々の２つ以上の用量として、または一定または非直線的な注入として供給される。
【００７５】
さらに、本発明は病理的な領域のマージン、特に個人の患者の腫瘍のマージンを光学的にイメージングする方法であって、ＤＡ３６４を使用して腫瘍のマージンのイメージングおよび画定を生成することを含む方法に関する。好ましくは、光学イメージングは蛍光ベースであり、より好ましくは、近赤外蛍光ベースの光学イメージングであり、蛍光下で目的の腫瘍の境界を検出し画定することを含む。
【００７６】
一実施形態では、光学イメージングは、切除された腫瘍または腫瘍の一部、例えば、個人の患者の腫瘍を外科的に除去して得られた組織標本に対して、in vitro（ex-vivo）で行われ、切除した腫瘍のマージンを同定しその周囲の非蛍光領域の存在を確認するために、蛍光で励起されたサンプルを調べ、それらが発する蛍光シグナルを検出することを含んでいる。ここで、試験されるex vivo腫瘍のサンプルは、ＤＡ３６４で適当に前処理された個人の患者から切除された腫瘍から得ることができる。あるいは、光学イメージングは、処置していない患者から切除された腫瘍または腫瘍の一部についてin vivo（ex-vivo）で行われ、この場合、本発明の薬剤は腫瘍マージンの組織学的マーカーとして使用される。
【００７７】
より好ましくは、腫瘍マージンの光学イメージングは、目的の腫瘍を含む個人の患者の病理的な身体部分の術中外科検査中に、インビボで実行される。
【００７８】
したがって、本発明の好ましいさらなる態様は、ＤＡ３６４が予め投与された患者における癌が疑われる腫瘍のマージンのインビボでの検出のための方法における造影剤ＤＡ３６４の使用に関し、該方法は、
ｉ）前記癌が疑われる腫瘍を含む目的領域（ＲＯＩ）の術中光学イメージングを生成すること、および
ｉｉ）蛍光下で癌が疑われる腫瘍のマージンを検出すること
を含む。
【００７９】
一実施形態では、上記の方法は、有効量のＤＡ３６４蛍光プローブを患者に投与し、イメージング前に患者の体内を適切な時間循環させることをさらに含む。
【００８０】
好ましい実施形態では、この方法はインビボで実施され、術中イメージング前の適切な時間に適切な量の蛍光造影剤ＤＡ３６４を前投与した患者における腫瘍マージンの術中イメージングおよび腫瘍マージンの画定を含む。
【００８１】
好ましい実施形態によれば、腫瘍領域の術中光学イメージングおよび腫瘍マージンの検出は、ＤＡ３６４造影剤を励起することができる適切にスペクトル分解された（典型的には適切にフィルタリングされた）連続または不連続の励起光源によって目的の領域を照射した後、放出された蛍光信号をフィルタリングして分離することができる適切な蛍光検出器を使用することによって造影剤によって放射された蛍光を検出することによって行われる。ここで、上記の工程を実施するための機器および装置の非限定的な例は、Mol. Imaging, 2010 October; 9(5): 237-255および当該文献の引用文献に開示されている。
【００８２】
このように、関心のある腫瘍部位にＤＡ３６４プローブを選択的に蓄積させることを反映して、蛍光下でＲＯＩの蛍光画像が得られ、腫瘍境界の明瞭で明確な境界が可能になる。
【００８３】
腫瘍領域の術中光学イメージングおよび腫瘍のマージンの検出は、病理的な身体の領域または部分、特に腫瘍、の外科的検査および根治的切除の間にリアルタイムで有利に実施することができ、外科医が目的の腫瘍を「見る」ことができ、切除すべき腫瘍部分のマージンを明確に識別することができるようにし、個人の患者からの腫瘍の切除において外科医を援助することができる。
【００８４】
従って、本発明のさらなる態様は、個人の患者の腫瘍のガイド手術のための方法であって、
ｉ）個人の患者に適切な量の蛍光プローブＤＡ３６４を提供すること；
ｉｉ）根治手術の下で癌が疑われる腫瘍を含む目的の領域の術中蛍光ベースの光学イメージングを生成すること；
ｉｉｉ）蛍光下の腫瘍のマージンを特定すること；および
ｉｖ）腫瘍の根治手術を行うこと
を含む方法に関する。
【００８５】
好ましくは、本発明の手術方法は蛍光によりガイドされる。より好ましくは、本手術方法は、蛍光プローブＤＡ３６４を使用して腫瘍の術中検出を行い、腫瘍の境界の明確で正確な画定によりその根治的切除を可能にすることを含む、患者における目的領域のＮＩＲ蛍光ガイド手術のための方法である。
【００８６】
好ましい一実施形態によれば、目的領域の術中イメージングの実施および腫瘍のマージンの検出を含む、本発明のガイド外科手術方法の工程ｉｉ）およびｉｉｉ）は、蛍光の下で、例えば上に記載したとおりに便利に行なわれる。
【００８７】
実際には、これらの工程は、例えば、腫瘍に蓄積された蛍光プローブを視覚化し、そのマージンを識別することが可能な、励起ランプと適切なフィルタセットとを備えた外科用装置の使用によって実施することができる。ここでは、励起光は、例えば、６００〜７００ｎｍの範囲、好ましくは６３０〜６９４ｎｍの範囲で適切にフィルタリングして使用される。放出された蛍光はこのようにして得られ、６５０〜１０００ｎｍ、好ましくは６９４〜８００ｎｍの範囲に適切にフィルタリングされる。あるいは、蛍光信号が必要とされない場合、手術野は白色光、例えば冷光で適切に照明され得る。これに関しては適切な装置（例えば、手術野を自然光のまま蛍光の検出を可能にし、したがって蛍光励起光をオン／オフする必要がないＦＬＡＲＥシステム）を都合よく使用することができる。
【００８８】
一実施形態では、本発明のガイド外科手術方法は、有効量のＤＡ３６４蛍光プローブを個人の患者に投与し、次いでそれを適切な時間循環させることを含む工程ｉ）を含む。
【００８９】
好ましい実施形態では、本発明のガイド手術は、有効量の蛍光剤ＤＡ３６４で前処理された個人の患者において都合よく実施され；この点に関して、蛍光剤の個人の患者への適切な投与は、静脈内または動脈内、例えば根治手術の１週間以内、好ましくは４８時間以内、およびより好ましくはガイド根治手術前の約２４〜４８時間の枠内で都合よく実施される。
【００９０】
したがって、腫瘍部分の蛍光イメージングは、本発明の方法の工程ｉｉ）に従って、蛍光下で行われ、切除すべき病理的な領域（一般に蛍光が強い腫瘍マージンまでの全ての病理的領域と、腫瘍境界の決定の不正確さを補償する、蛍光シグナルが存在しないかまたは正常な健常組織によって生成されたバックグラウンド（自家蛍光）シグナルと一致する、腫瘍周辺の、例えば少なくとも０．３ｍｍ、好ましくは約０．５ｍｍ〜約１ｃｍおよび１ｃｍを超える、恐らく正常な、さらなる領域（あるいは本明細書では陰性のマージンなる語を交換可能に用いる）を含む）の外科的マージンを外科医が識別するのを助ける。
【００９１】
次いで、腫瘍領域のガイド外科手術は、腫瘍の同定された外科的マージンに従って、本発明の方法の工程ｉｖ）に従い外科医によって行われる。
【００９２】
本発明の蛍光ガイド外科手術方法は、場合により更なる工程ｖ）を含み、該工程は、行った治癒切除術の精度および有効性を蛍光下で検証し、および場合により、陰性のマージン（すなわち蛍光シグナルを有さない切除した腫瘍周辺のマージン）に達するまで、検出された腫瘍領域周囲のより大きなマージンに従って手術を繰り返すことを含む。
【００９３】
特に好ましい実施形態では、本発明は、腫瘍が前立腺腫瘍である個人の患者の腫瘍のＮＩＲ蛍光ガイド外科手術のための方法に関する。
【００９４】
先に議論したように、本発明によって同定された蛍光プローブは、腫瘍の種類またはそれが示すかもしれない減少したまたは不均一なインテグリン発現にかかわらず、蛍光下での腫瘍マージンの改善されたおよび持続的な画定を可能にする。
【００９５】
したがって、腫瘍マージンのＮＩＲ蛍光術中検出、および個人の患者における腫瘍の外科的切除の標準化を可能にする、化合物ＤＡ３６４および蛍光を、根治手術を受けている腫瘍の術中（intraoperative or per-operative）の境界設定と画定に使用することを含むガイド外科手術のプロトコールにおいて有利な用途がある。
【００９６】
したがって、さらなる実施形態では、本発明は、腫瘍マージンの術中イメージングおよび個人の患者における腫瘍のガイド根治手術のための標準化されたプロトコールに関し、該プロトコールは、
ａ）画像ガイド手術の前の、例えば１週間以内、好ましくは少なくとも２４時間以内、より好ましくは２４〜４８時間の時間枠内に、ＤＡ３６４蛍光プローブの有効量を個人の患者に投与すること；
ｂ）場合により切開（関連する身体領域の）し、および場合により介在している皮膚および組織を除去することにより、目的の腫瘍を含む個人の患者の身体領域を外科医の目視検査に曝露すること；
ｃ）蛍光下で前記個人の患者の身体領域の術中イメージングを生成し、腫瘍マージンを検出すること；
ｄ）検出されたマージンに従って腫瘍の治癒的切除を行うこと、
ｅ）切除されたマージンの状態を蛍光下で評価し、切除した腫瘍周辺の陰性マージンの存在を確認するか、
ｆ）腫瘍周囲のより広いマージンに従って切除を繰り返すか、あるいは
ｇ）切除された腫瘍周辺の陰性（非蛍光）マージンに達するまで工程ｅ）およびｆ）を繰り返すこと
を含み、これは本発明の追加の実施形態を構成する。
【００９７】
プロトコールの工程ａ）〜ｅ）はそれぞれ、例えば上に記載したように実行される。この場合、プロトコールの工程ｄ）に従って腫瘍を外科的に除去した後、行った切除の有効性が、プロトコールの工程ｅ）に従い蛍光下で確認され、陰性マージン、すなわち切除された腫瘍周辺の非蛍光性の正常な部分の存在または非存在を評価する。次いで、必要であれば、すなわち摘出した腫瘍周辺の患者の身体領域において蛍光領域が依然として検出されている場合、または摘出した腫瘍周辺に陰性マージンがない場合、プロトコールの工程ｇ）およびｈ）を、蛍光下で陰性腫瘍マージンに達するまで腫瘍部分周辺のより大きなマージンに従って繰り返す。場合により、次いで、切除した腫瘍の周囲の非蛍光組織を収集し、追加の病理検査に使用する。
【００９８】
本発明により提供される解決手段の潜在能力、すなわち個人の患者における腫瘍のマージンの術中検出および画定、特に、減少したまたは不均一なインテグリン発現を有していても、腫瘍の根治的切除において、ＤＡ３６４によって示される有効性は、インビトロおよびインビボ試験によって評価されている。
【００９９】
ここでは、ＤＡ３６４プローブの蛍光特性を最初に評価し、次いでインテグリンに対してＤＡ３６４によって示される親和性を測定した（実施例２〜４）。
【０１００】
ＨＳＡに対するＤＡ３６４の会合定数（ｋａ（Ｍ−１））２．８６７０・１０４±０．１１４０・１０４（実施例５）および血漿動態（実施例６）を決定した。
【０１０１】
腫瘍の術中検査およびガイド切除の間に本発明によって同定されたＮＩＲ剤による蛍光下で得られた腫瘍マージンの視覚的推定値の信頼性およびその外科的有効性を、同所性Mat-Ly-Lu前立腺腫瘍を有するラットモデルを用いて行った。
【０１０２】
ここでは、高いαvβ3発現を有する腫瘍に属さない前立腺癌を意図的に選択して、高いαvβ3インテグリン発現を有する腫瘍における最適な標的化および蓄積特性に加えて、さらに腫瘍領域の術中検査および腫瘍のガイド手術において外科医への効果的な支援を可能にするのに十分適した、これらの受容体の発現が減少または不均一な腫瘍にも優先的な蓄積をもたらすという、ＤＡ３６４によって示される予期せぬ能力を実証した。実際、当分野においては、前立腺癌で発現されるインテグリンの種類とそれらの濃度はいずれも、確実に認識されるところから遠く離れたパラメータであることが知られている。事実、前立腺癌におけるαvβ3インテグリンの発現は、強い場合から全くみられない場合まで、不定で、個人の患者に依存することが知られており（The Prostate 70: 1189-1195 (2010)）、その理由として、前立腺癌の標的化およびその検出は現在のところ、悪性前立腺細胞およびその転移の前立腺上皮によって専ら過剰発現される膜結合糖タンパク質である前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）の活性部位を利用することによって得られる（J. Med. Chem.2009, 52(2) 544-550およびTrans. Androl. Urol. 2013; 2(3): 254-264およびそれらの引用文献）ということがあるようである。
【０１０３】
これに関連して、動物腫瘍モデルについて関連のある文献（例えば、Ann Nucl Med 2011 Dec 31; 25(10): 717-31参照）では、実際に、MAT-Ly-Lu前立腺腫瘍のための適切なターゲティングトレーサからＲＧＤベースのターゲティングトレーサを除外している。
【０１０４】
実施例に詳細に示されているように、驚くべきことに、αvβ3インテグリンの発現が減少した腫瘍として分類され得る、上述したラット同所性のMAT-Ly-Lu前立腺腫瘍モデルの外科的処置におけるＤＡ３６４の有効性を評価した。低インテグリン過剰発現腫瘍に対する術中蛍光ガイド手術に使用されたＤＡ３６４の能力をさらに証明するこの結果は、αvβ3インテグリン受容体の減少したまたは不均一な発現を有する腫瘍を代表する適切なモデルとして前立腺腫瘍の選択を支持するものである。
【０１０５】
さらに、インビボの実施例に示されるように、ＤＡ３６４は、αvβ3インテグリン受容体の過剰発現が減少している他の腫瘍を含む目的の領域の術中または術前（intra- or pre-operative）の視覚化に適している。これらの低αvβ3インテグリン発現腫瘍の代表例（上記のラット同所性MAT-Ly-Lu前立腺腫瘍モデルに加えて）は、実施例に示したＡ４３１腫瘍モデル（インテグリンの発現が低いと報告されているヒト類表皮癌の異種移植マウスモデル）、ならびにヒト卵巣または結腸直腸腺癌である。
【０１０６】
これらの結果は、特に、実施例７の実験において、蛍光下で同定されそして高い強度の蛍光によって、腫瘍領域の切除が、検出された腫瘍マージンの周囲をより大きい容積で含むことなく、例えばより安全な手術戦略のために推奨されているような約０．５ｍｍの健康な（低蛍光の）組織で画定された腫瘍マージンに厳密に従って行われているため、非常に有望である。
【０１０７】
また、最小量の造影剤の注射の２４時間後も前立腺腫瘍の明確な画定を可能する一方、静脈投与から４時間後には循環薬剤はほとんど観察されないように、これらの結果は、本発明によって同定される化合物によって提供される大きな手術時間の枠（４時間から２４時間以上）を確認するものである。
【０１０８】
さらに、実験の画像は、投与された薬剤が、腫瘍細胞の内部および周囲の間質腔の両方で検出可能であることを示している。
【０１０９】
これら全ての結果は、本発明により同定された蛍光プローブによって予想外に示された潜在的な可能性と一致しており、外科医に信頼できるリアルタイムのフィードバックを提供し、蛍光灯下での腫瘍マージンのシャープで持続的な画定を促進することにより、ＤＡ３６４プローブの天然の標的を示すαvβ3インテグリンの減少した、または不足したまたは不均一な発現を有する腫瘍の存在下でさえも、証明された良好な有効性をもって腫瘍の切除を可能にする。
【０１１０】
本発明の蛍光剤ＤＡ３６４およびその使用に関するさらなる詳細は、本発明をなんら限定することなく、本発明をより良く説明することを目的として、以下の実験セクションに記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】蛍光プローブＤＡ３６４のモル吸光係数の評価のための線形回帰を示す。
【図２】ＰＢＳ（左プロット；ex／em：674／694；SS：20nm）およびセロトニン（右プロット；694／704、SS：10nm）におけるＤＡ３６４の励起および発光スペクトルを示す。
【図３】ＤＡ３６４を用いたガイド外科手術中に得られた蛍光画像（パネルＡ、ＢおよびＣ）および白色光下で得られた対応する画像（パネルＤ、ＥおよびＦ）を示す。パネルＡおよびＤは無傷の前立腺を示し、パネルＢおよびＥは、右側葉の被膜（capsule）が除去された前立腺を示し、パネルＣおよびＦは処置終了後の術野を示す。
【図４】切除された組織サンプルを示す。パネルＡでは、組織サンプルを白色光下で画像化し、パネルＢは、対応するＮＩＲ蛍光画像を示す。
【図５】蛍光ベースの視覚分類の組織学的検証の結果を示す。パネルＡは、正常領域（低密度および低蛍光）および病理的領域（高密度および高蛍光）を示す前立腺癌のヘマトキシリン／エオシン染色切片の例を示す。パネルＣはＤＡＰＩによる蛍光染色を示し、白色で自動的に検出された非空領域（NO EMPTY AREA）はパネルＤに示されており、パネルＢは、LOWおよびFLUORESCENTサンプルからの切片で測定された組織パラメータTissue Densityについての組織学的結果と視覚的結果との間の対応のプロットを示す（p値＜０．００１、マン・ホイットニーのＵ検定）。
【図６】実施例６の実験で記録されたＤＡ３６４血漿濃度（循環血液中の遊離薬剤の濃度）時間曲線を示す。循環中のＤＡ３６４プローブの血漿区画からの迅速な排除がプロットに明確に示されている。
【図７】ＤＡ３６４および原形質膜染色ＷＧＡからのシグナルと重複して得られた組織スライド中のMat-Ly／Lu腫瘍細胞の黒白画像を示す。
【図８】ラット前立腺腫瘍Mat-Ly-Lu細胞およびヒト前立腺腫瘍ＰＣ３細胞における、内部参照として使用されるαvβ3インテグリン発現のフローサイトメトリーを示す。αvβ3インテグリンの発現は灰色のヒストグラムで示され、マウスＩｇＧ陰性対照のバックグラウンドはマーカーによって示される。数字は、特異的ｍＡｂで検出されたものからアイソタイプ適合対照Ｉｇで得られた値を差し引いて算出した陽性細胞のパーセンテージを示す。
【図９】（原文に記載なし）
【実施例】
【０１１２】
実験セクション
実施例１  ＮＩＲ剤ＤＡ３６４の調製
ＮＩＲ剤ＤＡ３６４の調製は、上記で引用した文献Contrast  Media  Mol. Imaging  2011, 6, 449-458に記載されているように、上記で例示した合成手順を用いることによって行った。
【化２】
0006793122.tif 000003
１）インテグリン標的化環状ペンタペプチドｃＲＧＤ−ＮＨ２
インテグリン標的化ペプチド模倣体部分ｃＲＧＤ−ＮＨ２の調製は、実質的にＷＯ２００６／０９５２３４に記載されており、より詳細にはAngew. Chem. Int. Ed., 2010, 49, 7111-7115, J. Org. Chem. 2005, 70, 4124-4132およびChem Med. Chem. 2009, 4, 615-632において、それぞれ以下のスキームによる、個々の中間体および環状ｃＲＧＤ−ＮＨ２インテグリン標的骨格の調製が記載されている。
ａ．中間体５の合成
【化３】
0006793122.tif 000004
ｂ．中間体１０の合成
【化４】
0006793122.tif 000005
ｃ．ｃＲＧＤ−ＮＨ２の合成
【化５】
0006793122.tif 000006
【化６】
0006793122.tif 000007
【０１１３】
２）ＮＩＲ剤ＤＡ３６４の調製
ホウ酸塩緩衝液ｐＨ９（４ｍＬ）中のＣｙ５．５−ＮＨＳエステル（１３ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）（GE Healthcareから購入、製品コードPA15602）の溶液に、ホウ酸塩緩衝液ｐＨ９（３．５ｍＬ）中の環状ｃＲＧＤ−ＮＨ２骨格（８．８ｍｇ，０．０１１ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を室温で２４時間撹拌し、光から保護した（ｐＨは８．１になった）。反応終了時（ＨＰＬＣ−ＭＳで評価）、粗反応物を５％ＣＨ３ＣＯＯＨ水溶液（１．５ｍＬ）で希釈し、残留した反応溶媒を凍結乾燥により除去した。
粗生成物を分取ＨＰＬＣ（溶出液Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、溶出液Ｂ：ＣＨ３ＣＮ＋０．１ＴＦＡ、流速：１５ｍＬ／分、固定相：Waters Atlantis Prep T3 OBD5μm、19×100mm、検出 ：UV、λ1：210nm、λ2：254nm）で精製して、凍結乾燥後、所望の生成物を暗青色の固体（１１．８ｍｇ、０．００８２ｍｍｏｌ）として得た。収率：７４．６％、ＨＰＬＣ純度：９２．９６％（面積％として）。
【０１１４】
分析的キャラクタリゼーション
得られたＮＩＲ剤の分析的キャラクタリゼーションは、ＨＰＬＣ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲにより行った。
核磁気共鳴
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ロックチャネルとして重水素を有するBruker Avance-III（1Ｈ、６００．１３ＭＨｚ）を用いて、ＤＭＳＯ−ｄ６またはＤ2Ｏ中で２９８Ｋにて記録した。
記録された1Ｈ−ＮＭＲは、予想された構造と一致した。
ＨＰＬＣ−ＵＶ−ＭＳ分取法
ＬＣカラム：Agilent Zorbax SB-PHENYL - 250mm×4.6mm×5μm（P／N：880975-312）
ＨＰＬＣパラメータ
機器：Triple quadrupole Thermo Fisher LC Accelaに、Accelaポンプ、Accelaオートサンプラー、Accela PDA検出器、およびTSQ Quantum Accessを装備。
注入量：５μＬ（サンプル濃度２００μｇ／ｍｌ）
カラムオーブン：４０℃
トレイ温度：５℃
針洗浄プログラム：メモリ効果を防ぐために針内部の洗浄を実施。
洗浄液：４０：５０：１０−水：メタノール：ｉ−プロパノール
UV-vis取得範囲：200〜790 nm（タングステンランプ必要：最大abs.776 nm）
ＭＳＤ取得範囲：50〜1500 a.m.u.
ＭＳＤモード：ＥＳＩ両方の極性（正と負、負が好ましい）
分析中の化合物をミリＱ水で希釈した。
ポンプ流量：０．５ｍＬ／分；最大圧力：４００バール
溶媒Ａ：水＋酢酸アンモニウム（１ｇ／Ｌ）；溶媒Ｂ：アセトニトリル１００％
停止時間：４２分。
勾配：
【表１】
0006793122.tif 000008
【０１１５】
ＤＡ３６４の蛍光キャラクタリゼーション
実施例２：吸光係数の測定
材料と方法
デュアルビームパーキンエルマーラムダ40 UV-VIS分光光度計を使用して、ＮＩＲ剤ＤＡ３６４の吸光モル係数を測定した。
1000μM（sol I：1.27mg、0.884mL）および1250μM（sol II：7.03mg、3.915mL）のＰＢＳ中でＮＩＲ剤を含む２つの標準ストック溶液を調製した。Table Aに示す希釈標準溶液は、ＰＢＳを用い、ストック溶液を適当なメスフラスコ中で希釈することにより調製した。各標準希釈液の吸光度をさらに希釈することなく測定した。
【表２】
0006793122.tif 000009
結果
各希釈標準溶液の吸光度を測定し、ＤＡ３６４のモル吸光係数を図１に示す線形回帰の傾きから計算した。この条件で測定された吸光係数は、208500M-1・cm-1（Ｃｙ５．５色素に関して報告された理論値250000M-1・cm-1の８３％に相当）。
また、線形回帰の信頼性を検証するために、統計分析も行った（データ示さず）。
【０１１６】
実施例３：蛍光量子収量の評価
材料と方法
蛍光量子収率（Φ％）測定は、積分球アクセサリを備えたFluoroLog-3 1IHR-320（HORIBA-JobinYvon）により行った。
測定は、励起波長６２５ｎｍを用い、４５０Ｗキセノン光源を用いて行った。検出は、６４５〜８５０ｎｍのTBX-04検出器（励起および発光スリットは１．８ｎｍ）で行った。
ＤＡ３６４溶液の蛍光量子収率を、ヒト血清（Seronorm（商標） Human、NycomedPhama、バッチ1109514）およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の両方で測定した。
ＮＩＲ剤の溶液は、ＰＢＳおよびヒト血清中で０．１未満の吸光度で調製した。室温（ＲＴ）で１５分間ＮＩＲ剤をインキュベートした後、蛍光（Φ％）測定を行った。
結果
以下のTable Bに示す、得られたΦ％値は、ＤＡ３６４がＰＢＳで３６．５％（±２．３７）、Seronorm（商標）で５７．５％（±１．２６）の量子収率を示すことを示している。
ＰＢＳ（ex/em：674/694; ストークスシフト：20nm）およびSeronorm（商標）（694/704、ストークスシフト：10nm）におけるＮＩＲ剤の正規化された励起および発光スペクトルを図２に示す。図に示すように、ＤＡ３６４造影剤と血清アルブミンとの相互作用は、６９４ｎｍから７０４ｎｍ（それぞれＰＢＳおよびSeronorm（商標）において）の発光最大のシフトおよびストークスシフトの減少を促進する。
【表３】
0006793122.tif 000010
【０１１７】
ＤＡ３６４の生物学的特徴付け
実施例４：αvβ3、αvβ5およびαvβ1インテグリンに対するin vitro競合結合アッセイ
ＤＡ３６４を、その特異的標的（インテグリンαvβ3）に対する親和性、および他のインテグリン（例えば、αvβ1、αvβ5）に対するその交差反応性について、インビトロ結合試験によって評価した。
材料と方法
９６ウェルマイクロタイタープレート（MediSorp、Nunc）を、試験するインテグリン（0.5μg／mL、コーティング／洗浄緩衝液（20mM Tris HCl pH7.4；150mM NaCl；1mM MnCl2）で希釈）で４℃にて一晩コーティングした。コーティング後、プレートを洗浄緩衝液ですすぎ、次いで、室温（ＲＴ）（サーモミキサー内で２４℃、振とう下）でブロッキング緩衝液（コーティング緩衝液中３％ＢＳＡ）中２時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液ですすぎ、ＤＡ３６４（５０００〜０．００５ｎＭの濃度範囲）で３時間室温でインキュベートした。ＤＡ３６４溶液は、１％ＢＳＡ中ＮＩＲ剤のストック溶液を、ビオチン化ビトロネクチン（１μｇ／ｍＬ、cod HVN-U605、Molecular Innovations）の存在下、コーティング緩衝液中で連続的に希釈することによって調製した。次いでプレートを再びすすぎ、ストレプトアビジン-HRP（cod.EG RPN1051、GE Healthcare）（ＰＢＳ中１：１００００）と共に室温で１時間インキュベートし、ビオチン化ビトロネクチンを結合させた。ＰＢＳでさらに洗浄した後、プレートをＴＭＢ溶液（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）（cod.T-0440、Sigma-Aldrich）と共に５〜１０分間インキュベートした後、２Ｎ硫酸の添加により比色反応を止めた。ＤＡ３６４についてのＩＣ５０の定量は、４５０ｎｍでの吸光度を読み取ることにより競合物（ビオチン化ビトロネクチン）を測定することによって行った。ＩＣ５０値は、最小二乗非線形回帰分析によって決定した。
【０１１８】
結果
αvβ3の天然基質であるビトロネクチンとの競合的結合アッセイは、ＤＡ３６４のその特異的標的、すなわちαvβ3に対する高い親和性、およびアナログαvβ5に対する低い親和性を示し；さらにαvβ1に対する交差反応性が明らかになった。
インテグリンαvβ3、αvβ5およびαvβ1について得られた親和性の結果を以下のTable Cに示す。
【表４】
0006793122.tif 000011
【０１１９】
実施例５：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対するインビトロ結合アッセイ
ＤＡ３６４のＨＳＡに対する親和性は、例えば、Connors、K.A. (1987) Binding Constants The Measurement of Molecular Complex Stability, John Wiley & Sons, New York（特に第４章参照）に開示された手順に従って、吸光度の分光測定によって決定した。
材料と方法
デュアルビームパーキンエルマーラムダ４０  ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計を使用して、ＨＳＡと共にインキュベートしたＤＡ３６４の吸収スペクトルを得た。ＨＳＡを含有する２つの標準溶液を、７５ｍＭおよび５００ｍＭのＰＢＳ中で毎日新たに調製し、それぞれ約３０分および１時間攪拌し続けた。
ＤＡ３６４のストック溶液（８４５±５ｍＭ）を１：２０に希釈し、ＨＳＡ（HSA Sigma Aldrich、バッチ049K7535、項目A1653）と混合して濃度の傾斜を得た（０、１、１０、２０、４０、６０、３０、８０、１００、２００、４００ｍＭ）。０．９９ｍＭのＮＩＲ剤および異なる量のＨＳＡを含む最終溶液を、測定前に室温で１時間インキュベートした。各溶液の吸光度を、同じ濃度のＨＳＡの参照溶液に対して測定した。６８９ｎｍ波長（ＨＳＡに結合したＤＡ３６４の最大吸収に対応する）で測定した吸光度値を、以下の式を用いて当てはめた。
【数１】
0006793122.tif 000012
（ここでΔεは遊離ＤＡ３６４と結合したＤＡ３６４から得られたモル吸光度の差、ΔＡはＤＡ３６４と基準溶液の吸光度の差、ｂは溶液中の光路の長さ、[HSA]はＨＳＡ、ＣDA364はフルオロフォアの濃度であり、kaは会合定数である）。
【０１２０】
結果
ＤＡ３６４について測定したＨＳＡについての会合定数（ka（Ｍ−１））は、２．８６７０・１０４±０．１１４０・１０４（Ｒ２＝０．９９４９）であった。
この結果は、本発明により同定されたＮＩＲ剤によって示される血清アルブミンに対する親和性の存在を示し、これは、それが示すインビボのハイブリッド挙動と一致し、インテグリン受容体に対する高い特異性、および例えば血管外（漏出）アルブミンを含む細胞外成分との非特異的結合によって媒介される非特異的な保持の結果として、腫瘍へのその蓄積および拡散を可能にする。
【０１２１】
実施例６：ＤＡ３６４の血漿動態の評価
ＮＩＲＦプローブＤＡ３６４の血漿動態を、ＣＤ−１（ＩＣＲ）ＢＲマウスにおける単回静脈内投与後に評価した。
プロトコール
蛍光プローブは、イメージング実験で使用される有効用量の約１０倍に相当する、０．４μモル／ｋｇの用量で投与した（平均のマウス体重２５ｇとして１ｎｍｏｌ／マウスに相当）。処置後１４日まで異なる時点で動物を屠殺し、蛍光定量法検出器と組み合わせたＨＰＬＣ法を用いて行うＤＡ３６４含有量測定のために血液サンプルを採取した。
製剤の調製
ＤＡ３６４は、６５５μＭの青色溶液として供給された。動物投与の数日前に解凍後、ＤＡ３６４の６５５μＭ溶液を０．０４μｍｏｌ／ｍＬの最終濃度にまで希釈した。このために、ＤＡ３６４の６５５μＭ溶液０．８ｍＬを、０．９％ＮａＣｌ生理食塩水１２．２ｍＬで希釈した。０．０４μｍｏｌ／ｍＬ製剤を投与まで−８０℃で保存した。
動物
実験は、Charles River Laboratories Italia（Calco (LC), Italy）から購入したＣＤ−１（ＩＣＲ）ＢＲマウス（４０匹の雄；到着時の体重：２２〜３０ｇ；齢：４〜５週齢）を用いて行った。動物を含むすべての手順は、実験動物の保護および使用に関する国内および国際法および政策（L.D. 116/92; Authorization n.19/2008-A、2008年3月6日発行、イタリア保健省；EEC理事会指令86/609CEE、およびEEC理事会指令2010/63/EU）に従って実施された。
【０１２２】
実験計画
薬物動態試験でＤＡ３６４の血漿動態を測定した。動物の到着と治療の間に少なくとも３日間の期間をおいた。投与日に、動物を薬物動態学的時点および較正群とにランダムに割り当てた。動物は、尾部に作られた着色されたマークで識別した。各ケージのラベルには、研究番号、化合物、投与経路、種、投与量、治療日および犠牲の日付および動物番号について一意の番号が付された。
予め室温にしたＮＩＲ剤ＤＡ３６４を、ハーバード注入ポンプを用いて１ｍＬ／分の注入速度で０．４μｍｏｌ／ｋｇの用量で尾静脈を介して静脈内に注射した。投与される用量は、イメージング実験で使用される有効用量の約１０倍に相当する。静脈内投与経路は、ヒトに可能な曝露経路として選択された。
実験スキーム：
ＤＡ３６４の投与前および投与後５分、１０分、２０分、３０分、６０分、４時間、２４時間、４８時間、７日および１４日に動物（各時点で３匹）を犠牲にした。
較正曲線のためのブランク血漿を採取するために、さらに７匹の動物を使用した。
屠殺の日に、誘発時３〜４％、維持時２〜３％の呼気濃度にてセボフルランで麻酔をかけ、次に断頭により犠牲にした。ＨＰＬＣ測定のための血液（少なくとも０．５ｍＬ）を、ヘパリン処理した試験管を用いて採取した。遠心分離（２１００ｇ、１０分間）後に得られた血漿を分析日まで−８０℃で保存した。
【０１２３】
血漿中のＤＡ３６４の評価
血漿サンプル中のＤＡ３６４の量の決定は、以前に用いた蛍光量検出器と組み合わせたＨＰＬＣ法によって行った。
ＤＡ３６４の酢酸緩衝溶液の調製
酢酸緩衝液を、１ｇの酢酸塩緩衝液を１ＬのMilli-Ｑ水に溶解することによって調製した。次いで、適切な量のＮＩＲ剤を、得られた溶液に添加した。
血漿「ＣＡＬ」サンプルの調製
較正標準（ＣＡＬ）を、１０μＬのＤＡ３６４酢酸緩衝液（０．０４〜４ｎｍｏｌ／ｍＬ）、および１００μＬのメタノールおよびアセトニトリル溶液（５０：５０）を９０μＬのブランク血漿に添加することによって調製した。試験管を攪拌し、続いて４℃にて１３０００ｇで１０分間遠心分離した。１０マイクロリットルの透明な上清をＨＰＬＣ装置に注入した。
血漿「ＱＣ」サンプルの調製
１０μＬのＤＡ３６４酢酸緩衝溶液（０．０６〜３ｎｍｏｌ／ｍＬ）、および１００μＬのメタノールおよびアセトニトリル溶液（５０：５０）を９０μＬの血漿に添加することによって、品質管理（ＱＣ）を調製した。試験管を攪拌し、続いて４℃にて１３０００ｇで１０分間遠心分離した。１０マイクロリットルの透明な上清をＨＰＬＣ装置に注入した。
血漿「Ｓ」サンプルの調製
１００μＬの酢酸緩衝液および１００μＬのメタノールアセトニトリル溶液（５０：５０）を１００μＬの希釈した血漿に添加することによって、血漿サンプル（Ｓ）を調製した。試験管を撹拌し、続いて４℃にて１３０００ｇで１０分間遠心分離した。１０マイクロリットルの透明な上清をＨＰＬＣ装置に注入した。血漿サンプルが濃過ぎる場合、適切に希釈を行った。
【０１２４】
クロマトグラフィー条件
クロマトグラフィー：Waters Alliance 2695XC
ＨＰＬＣカラム：Zorbax SB-フェニル、5μm、250×4.6mm
移動相Ａ：１ｇの酢酸塩緩衝液を１ＬのMilli-Q水（0.013M、pH7.0）に溶解
移動相Ｂ：１ｇの酢酸塩緩衝液を１Ｌのメタノールとアセトニトリル（50:50）に溶解
サンプル温度：１０℃
カラム温度：６０℃
注入量：１０μＬ
検出器：FL検出器Waters 2475; 励起波長：670nm; 発光波長：700nm
ランタイム：２３分
溶出：勾配
【表５】
0006793122.tif 000013
ＨＰＬＣ測定は、蛍光剤ＤＡ３６４の較正標準サンプル（ＣＡＬ）（６つの濃度、各濃度について３回実施）をアッセイすることによって調製した、血漿および器官におけるＤＡ３６４の較正曲線を補間することによって行った。
【０１２５】
データ分析
ＨＰＬＣ測定のための血液（少なくとも０．５ｍＬ）をヘパリン処理した試験管に集めた。ＤＡ３６４の血漿濃度は、蛍光検出器と組み合わせたＨＰＬＣ法によって測定した。
全身暴露を評価するために、コンピュータプログラムWIN-NONLIN 6.3（WinNonlin 6.3 SCI Software、Lexington、KE、USA）を用いて、ノンパラメトリック法により、Ｃmaxおよび時間の関数とする血漿ＤＡ３６４濃度曲線下の面積（ＡＵＣ）を計算した。試験した用量については、各時点で３匹の平均血漿濃度を用いて非コンパートメント分析を行った。Ｃmaxおよび対応するｔmaxについて、観察された値が報告された。最後の観察可能な血漿濃度についての血漿濃度−時間曲線の下の面積（ＡＵＣ(0 to t)）を、対数台形法を用いて観測データから計算した。実際には、ｔ1/2、Vd、およびClを計算した。
臓器中のＤａ３６４含量は、μｇ／ｍＬ（血液）またはμｇ／ｇ組織として表される。データは、各臓器の注射された投与量のパーセント（％ＩＤ）に変換される。次に、各サンプリング時間について平均および標準偏差を計算する。
【０１２６】
結果
ＨＰＬＣ分離後の蛍光によって測定されたＤＡ３６４の血漿濃度は、以下のTable Dおよび図６のグラフで示される。得られた結果は、遊離の循環剤の迅速なクリアランスを確認し、試験動物への投与の４時間後には血中濃度が無視できる程度に達し、機器の検出限界未満（ＬＯＤ＝０．００１２ｎｍｏｌ／ｍＬ）となることが確認される。
【表６】
0006793122.tif 000014
注射後５分（ｔmax）で１．６２９ｎｍｏｌ／ｍＬのＣmaxを測定した。最終消失期に関する半減期の値は６４分であった。ＡＵＣ(0 to ∞)値は７７分＊ｎｍｏｌ／ｍＬであった。総血漿クリアランス値は５ｍＬ／分／ｋｇ（０．１５ｍＬ／分）であった。クリアランス値は、肝臓および腎臓の血流（１．８および１．３ｍＬ／分）よりも低く、身体（他の組織）に蓄積していることが示唆される。定常状態での体積分布値（Ｖdss）は３２９ｍＬ／ｋｇ（１０ｍＬ）であり、マウスの体内総水分量（１４．５ｍＬ）よりもわずかに低く、血漿区画からのＤＡ３６４の溢出が示唆される。
【０１２７】
実施例７：ＮＩＲ蛍光プローブとしてＤＡ３６４を用いたラット前立腺腫瘍モデルにおける蛍光ガイド外科手術
本実施例は、ラットの同所性前立腺腫瘍モデルMat Ly-Lu（以下に示すように、αvβ3インテグリンの発現が減少した腫瘍）を用いた腫瘍塊の認識におけるＮＩＲ ＲＧＤ環状プローブＤＡ３６４の感受性を評価することを目的としている。
術中イメージングは、照射およびプローブから放出された信号の選択のための適切なフィルタを含む修正された外科用顕微鏡であるZeissシステムで行った。ラットの腫瘍性MatLyLu前立腺細胞を前立腺の右側葉に接種した。接種の３〜４日後、動物に、ＮＩＲ蛍光プローブのラット５〜２０ｎｍｏｌ／用量の範囲の用量を静脈注射し、２４時間後に画像化した。次いで腫瘍を蛍光シグナルガイドを通して切除した。前立腺左葉由来の組織を含む蛍光領域を取り囲む組織を組織学的比較のために切除した。すべてのサンプルを、通常の組織学的処理（ヘマトキシリンおよびエオシン染色）およびさらなる免疫標識によって分析した。
【０１２８】
腫瘍細胞およびその調製
ラット前立腺腺癌モデルG-Dunning R-3327の亜系である前立腺腫瘍Mat-Ly-Lu細胞株は、European Collection of Cell Culture（ECACC）から供給された。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２５０ｎＭデキサメタゾン（ＤＸＭＴ）を補充したRPMI 1640培地で培養した。トリパンブルー排除試験を用いて、細胞接種前の細胞生存率を評価した。生存率は％（全細胞に対する生存細胞の割合×１００）で表した。生存率＜７０％の細胞培養物を廃棄した。ヒト前立腺腺癌ＰＣ−３細胞株は、American Type Culture Collection（ATCC）から供給された。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／mLペニシリン、１００μg/mLストレプトマイシンを補充したHam's F-12培地で培養した。トリパンブルー排除試験を用いて、細胞接種前の細胞生存率を評価した。生存率は％（全細胞に対する生存細胞の割合×１００）で表した。生存率＜７０％の細胞培養物を廃棄した。ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６は、American Type Culture Collection（ATCC）から供給された。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／mLペニシリン、１００μg/mLストレプトマイシンを補充したEagle最小必須培地で培養した。
【０１２９】
αvβ3発現
MatLyLu細胞系におけるαvβ3インテグリンの発現を、インテグリン過剰発現が高いことが知られているＷＭ２６６メラノーマ細胞株（Anticancer Research 33：871-880（2013））との比較によりウェスタンブロットにより測定した。全タンパク質を抽出するために、細胞ペレットを溶解緩衝液（Tris-HCl pH8 50mM、NaCl 150mM、EDTA 1mM、NaF 100mM、グリセロール10％、MgCl2 1mM、TritonX-100 1％、プロテアーゼインヒビター）中に溶解し、３回の凍結融解（−８０℃／３７℃）を行い、氷中で２０分間放置した。得られた溶液を１０秒間超音波処理し、１４０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。次いで上清のタンパク質含有量をＢＣＡ法で定量した。ここでは、全抽出物を１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、変性条件（２０％ＳＤＳ）において、それらの分子量に基づいてタンパク質を分離するために電気泳動を適用した。次いで、ゲル内のタンパク質をニトロセルロース膜上に移し、続いて抗β3インテグリン抗体でブロットした。特定のシグナルを、化学発光検出法によって単一または複数のバンドとして視覚化した。標識されたニトロセルロースの画像をChemiDoc MPイメージングシステムにより取得し、β3発現レベルに対するバンドの面積をソフトウェアImage Lab v.4.1で定量化した。
MatLyLu細胞におけるαvβ3の発現は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）法によっても測定し、ＰＣ３細胞株の発現と比較した。
ここでは、細胞を回収し、０．２％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを補充したＰＢＳ中で洗浄した。非特異的部位をウサギＩｇＧ（Sigma-Aldrich）でブロックした。次いで、細胞を抗αvβ3インテグリン抗体（希釈率１：１００；クローンLM609、Millipore）またはアイソタイプ適合ネガティブコントロールと共に４℃で３０分間インキュベートし、続いてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を結合したウサギ抗マウスＩｇ（DakoCytomation）とインキュベーションした。サンプルを回収し、CyAn ADPフローサイトメーターおよびSummit 4.3ソフトウェア（DakoCytomation）で分析した。細胞破片を排除するため細胞をその光散乱特性に従って集め、死細胞を排除するためのヨウ化プロピジウム（Sigma-Aldrich）陰性に従って細胞を集めた。
ウエスタンブロット分析の結果、ＷＭ２６６メラノーマ細胞による発現と比較して、MatLyLu細胞によるαvβ3インテグリンの発現は無視できる程度であった。ＦＡＣＳ実験において、ＰＣ３細胞の比較的高いαvβ3発現（４５％の蛍光シグナルを示す細胞）が確認され、引用文献で引用された値と一致しており、Mat-Ly-Lu細胞上のαvβ3の発現は無視できる程度（０．１％）であった（図８）。
【０１３０】
腫瘍モデル
実験は、Harlan Laboratories Srl, S.Pietro al Natisone (UD), Italyから購入した１１週齢のコペンハーゲンラット（雄）１０匹で行った。ラットの前立腺腺癌を、イソフルラン麻酔下でのMatLylu腫瘍細胞の同所性注射によってコペンハーゲンラットにおいて誘導した。腫瘍移植の約１時間前に、鎮痛薬（Rymadil）をラットに皮下投与（５ｍｇ／ｋｇ）した。下腹部を剃毛して消毒した（ベタジン）。腹白線に沿った腹壁の１２ｍｍ切開を、尿口から３〜４ｃｍ上で実施した。動物の両側の脂肪組織を押しのけた後、前立腺を露出させた。
０．５×１０6個の腫瘍細胞を含む細胞懸濁液（３０μＬ）に、２７Ｇ針を前立腺の右腹側葉に注射した。筋肉および皮膚の計画は、滅菌された非吸収性の糸（3-0黒の絹、Distrex S.p.a.）で縫い合わせた。傷口にはベタジン消毒液を塗布した。鎮痛剤は、手術後少なくとも１回（約２４時間後）投与した。動物を含むすべての処置は、実験動物の保護および使用に関する国内および国際法および政策（EEC理事会指令86/609CEE; LD 116/92およびEEC理事会指令2010/63/EU; L.D. 26/2014. イタリア保健省により2006年10月27日に発行されたAuthorization n.149/2006-A）に従って実施した。
【０１３１】
蛍光ガイド手術実験
専用の外科用顕微鏡（Axio Zoom v16, Carl Zeiss Beteiligungs GmbH, Jena, Germany）を用いて腫瘍を取り出した。顕微鏡にPLANAPO Z0,5X/0.125 FWD 114 MM対物レンズを装着した。手術中、約2.5×2.5cm2の領域を可視化した。手術野への照明は、蛍光信号が必要でないときは冷光源（CL 9000 LED CAN（D））によって、腫瘍除去中はフィルター光（照明：HXP 200C（D）、フィルターセット：32 Cy 5.5シフトフリー（E））によって行った。
腫瘍移植後３〜４日に相当する手術前日に、５〜２０ｎｍｏｌ／ラットの範囲の用量でＤＡ３６４試験薬剤を動物に投与した。プローブ注射の２４時間後、動物をイソフルランガス０．５％（Ｏ２ ９９．５％）で麻酔し、手術台に仰向けに固定し、前立腺腫瘍を露出させた。
前立腺被膜を除去した後、前立腺腫瘍をフィルター光に曝露し、原発腫瘍の質量および病理的マージンの概要をみるため蛍光画像を取得した（図３、パネルＡおよびＤ参照）。次いで、蛍光を用いて切除をガイドすることにより、腫瘍塊の除去を腫瘍領域を取り囲む領域に蛍光シグナルがなくなるまで反復して行った（図３、パネルＢ、ＥおよびＣ、Ｆ参照）。蛍光シグナルの大部分は、移植領域、すなわち前立腺右側葉に閉じ込められていた。蛍光シグナルを囲む領域から組織サンプルを切除し、前立腺左葉、背葉および前葉を収集し、エクスビボでの蛍光画像を取得して、フルオロフォアの蓄積の原因となる組織学的パターンを調べた（図４）。注目すべきは、より安全な手術戦略のために少なくとも最小の非蛍光性の、陰性マージンを含むより大きな容積の切除が推奨されるものの、この実験的試験では、組織のサンプルを高強度の蛍光シグナルによって同定された腫瘍マージンに従い厳密に切除した。最終的に、収集した組織サンプルはすべて以下の組織学的分析のために処理した。実験の最後に、動物は過剰用量の麻酔によって犠牲にされた。
【０１３２】
組織学的分析
切り出したサンプルをKillik化合物（クリオスタット包埋媒体）に直接包埋し、液体窒素中で冷却したイソペンタン中で直ちに凍結させた。
切り出した組織ブロックを、パラレルラベリングのために３つの連続する１０μｍの厚さのスライスのグループに切断した。次いで、各組織サンプルを組織病理学的分析のための標準的な手順で処理した。特に、手術による腫瘍の根治的切除を評価および確認するため、収集したサンプルの組織学的染色をヘマトキシリンおよびエオシンで行い、切り出したサンプル中の解剖学的な腫瘍のマージンを検出および特徴付け、周囲の正常な前立腺組織における任意の腫瘍細胞の存在を確認した。
切り出した組織サンプル中の蛍光剤ＤＡ３６４分布の検出は、室温（ＲＴ）で解凍し、ＰＢＳ中で洗浄してKillikを除去した後、組織スライド上で行った。細胞核を４’,６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（DAPI, cod. BML-AP402, Enzo Life Sciences）で染色した（ＰＢＳ中５μg/mL、５分間）。ＤＡ３６４の内在化した画分を同定するために、形質膜を２μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）（cod. W11261 Life Technologies）で染色した。ここでは、染色された切片全体をAperioデジタルスキャナScanScope FL、さらなる詳細についてはLeica DM2500蛍光顕微鏡を用いて、組織を視覚化した。
【０１３３】
腫瘍細胞における内在化
腫瘍細胞におけるＤＡ３６４の内在化を蛍光顕微鏡で観察した。例えば、図７に示されるように、細胞膜および細胞外間隙の同定が可能な原形質膜染色である、２μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）で染色されたMat-Ly/Lu腫瘍組織スライドから得られたシグナルにＤＡ３６４によって生成された蛍光シグナルを重ね合わせた図７に示されるように、Mat-Ly/Lu腫瘍細胞の白黒画像が得られた。
【０１３４】
イメージ分析
手術直後に採取したエクスビボ蛍光画像（図４）を用いて、切除された組織サンプルを２つの蛍光クラス、すなわち蛍光（FLUORESCENT）および非蛍光（NON FLUORESCENT）、に視覚的に分類した。２つの蛍光クラス間の分類は、組織サンプルの解剖学的起源を考慮することなく、蛍光シグナルのみに基づいた。組織サンプルが少なくとも強度が強く明るい蛍光発光によって特徴付けられた領域を含む場合に、蛍光クラスに割り当てた（例えば、図４のサンプル３、４および５参照）。それ以外の組織サンプル、すなわち蛍光を示さない（図４のサンプル１など）または腫瘍領域から離れた正常組織（図４のサンプル２など）で観察される自己蛍光と一致する蛍光を示すサンプル、はすべて非蛍光クラスとした。各画像について、蛍光シグナルを、全ピクセル強度範囲を用いピクセル強度でマッピングした。この分類手順は、外科医が腫瘍除去中に行う必要がある「正常な」（非蛍光）と「病理的な」（蛍光）組織の蛍光ベースの視覚的選択を再現することを意図した。
次に、各組織サンプルからの２つの組織学的切片の、その次元にかかわらず腫瘍領域を含む切片の同定が可能なＨ＆Ｅ染色によって、（ガイド手術中に採取した組織サンプルの）視覚的分類の結果を組織学的に確認した（図５パネルＡ）。腫瘍を含む組織サンプル（すなわち、試験した組織学的切片の少なくとも１つが腫瘍細胞を含んでいる組織サンプル）を陽性と分類し、腫瘍を含まないサンプルを陰性と分類した。次いで、本発明によって同定された化合物により可能な視覚的分類の感度の尺度と、腫瘍を含まない組織と腫瘍を含む組織の同定および分離におけるその信頼性を提供する分割表を用いて組織学的および視覚的分類を比較した。
採取した組織サンプルのさらなる分析もまた、核染色剤４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の蛍光に基づいて行った。一般的に言えば、この分析は、正常な前立腺の形態が腫瘍浸潤によって破壊され、それが自動閾値ベースの画像分析手順で容易に区別できる、正常組織および腫瘍組織の形態に存在する差異に依存している（図５パネルＣ、Ｄ）。正常な前立腺組織は、実際には、線維性間質に埋没した腺および管で主に構成され、組織の空の領域は前立腺の広い内腔を示し、上皮腺細胞および間質は前立腺の実質を示す。それに対し、腫瘍組織は、より典型的には、均一に詰まった細胞で構成される。この自動的な手順は、セクションの面積に対する、組織（非空領域）によって占有されるサンプルの面積の比として定義される組織密度を計算するというものであった。正常な組織は病理的な組織よりも低い組織密度によって特徴付けられる。
【０１３５】
結果
外科手術の有効性の組織学的検証
分割表を用いて、組織学的および視覚的分類の結果を比較した。例えば、下の分割表Table Eに示される比較の結果は、検出された蛍光の強度と試験した組織サンプルにおいて組織学的に確認された病理学的状態との間に有意な相関が存在することを示す。特に、得られた結果は、ＤＡ６３４  ＮＩＲ蛍光プローブが８７％の感度と８３％の特異度で腫瘍組織の視覚的分類を可能にしたことを示す（Table E）。
蛍光サンプルはまた、本質的には病理的組織で確認された前立腺の腺および管の不在に起因する統計的に高い組織密度を示すことによって、正常組織形態の実質的な破壊によっても特徴付けられた（マン・ホイットニーＵ検定、ｐ値＜０．０５、図５、パネルＢ）。
【表７】
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注：試験で記録された３つの偽陰性（非蛍光であるが陽性）のうちの２つは、おそらく被膜の切開によって引き起こされたそれ自身の弾性のうねり（elastic winding）に起因して、外科用顕微鏡で低い蛍光を示し、この特定の前立腺領域が目立たなく、そして蛍光下で適切に画像化することができないものの、腫瘍細胞が部分的に浸潤した前立腺被膜由来の組織サンプルであった。それ以外の偽陰性は、その蛍光によってのみ評価した場合に低い強度を示した、大きな腫瘍から取り除かれた非常に小さな組織片であった。
【０１３６】
実施例８
腫瘍塊に関するαvβ3インテグリン発現の測定
αvβ3インテグリンの発現は、動物モデルからの３つの異なるタイプの腫瘍について、ウエスタンブロットによって測定した：
・Ｕ−８７ＭＧ（ヒト膠芽細胞腫の異種移植マウスモデル）は、αvβ3インテグリンの相対的に高い発現を有することを示した。
・MatLyLu（ラット前立腺癌の同所性ラットモデル）は、αvβ3インテグリンの中〜低度の発現を示した。
・Ａ４３１（ヒト表皮癌の異種移植マウスモデル）は、比較的低いαvβ3インテグリンの発現を示した。
方法
凍結した腫瘍組織をメスを用いて小片に切断し、次いで液体窒素の存在下で乳鉢と乳棒を用いて粉砕した。粉末を秤量し、適切な容量の溶解緩衝液（Tris-HCl pH8 50mM、NaCl 150mM、EDTA 1mM、NaF 100mM、グリセロール１０％、MgCl2 1mM、TritonX-100 １％、プロテアーゼインヒビター）に溶解し、１分間ボルテックスし、氷上に４５分間置いた。その後、溶液を１５秒間超音波処理し、４℃にて１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。
ＢＣＡ法を用いて上清のタンパク質含量を定量した。総抽出物を１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、電気泳動を行い、変性条件（２０％ＳＤＳ）での分子量によってタンパク質を分離した。次いで、ゲル内のタンパク質をニトロセルロース膜上に移し、続いて抗β３インテグリン抗体でブロットした。特定のシグナルを、化学発光検出法によって単一または複数のバンドとして視覚化した。標識されたニトロセルロースの画像をChemiDoc MPイメージングシステムにより取得し、β３発現レベルに対するバンドの面積をソフトウェアImage Lab v.4.1で定量化した。
結果
インテグリンβ３の量は、腫瘍の質量（腫瘍のｍｇ）で標準化した。実験は、腫瘍の種類ごとに少なくとも２つのサンプルを用いて行った。結果（インテグリン発現の平均値）をTable Fに示す。
【表８】
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【０１３７】
実施例９
腫瘍塊中のタンパク質総量に対するαvβ3インテグリン発現の測定
αvβ3インテグリンの発現は、実施例８で上に詳述した３つの異なる動物モデル、およびタンパク質抽出物として購入したさらなるヒト腫瘍について、ウェスタンブロットによって測定した。
腫瘍モデルからのタンパク質抽出物は、前記の抽出方法を用いて組織から得たが、ヒトタンパク質抽出物（以下のTable Gに示す）は、OriGeneより購入した。
【表９】
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以下のTable Hに示されたデータは、Matlylu型腫瘍およびＡ４３１腫瘍におけるαvβ3インテグリンのそれぞれの減少した過剰発現を確認したことに加えて、他のヒト腫瘍も本発明から恩恵を受け得る減少したαvβ3インテグリン発現を示す。
【表１０】
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【０１３８】
実施例１０
αvβ3インテグリン（Ａ４３１）の発現が減少した腫瘍のin vivo視覚化
この実施例は、それぞれ低いおよび高いαvβ3過剰発現によって特徴づけられる、ヒト腫瘍のＡ４３１およびＵ８７−ＭＧマウスモデルにおけるＤＡ３６４の取り込みを示す。
腫瘍モデル
Ａ４３１細胞を集めＰＢＳで２回洗浄した。５百万個の細胞を０．１ｍＬのＤＭＥＭ高グルコース培地に再懸濁し、全てのマウスの右脇腹に皮下注射した。Ａ４３１接種の１１日後、Ｕ−８７ＭＧ細胞を回収しＰＢＳで２回洗浄した。２百万個の細胞を０．１ｍＬのＥＭＥＭ培地に再懸濁し、予めＡ４３１細胞を注射した同じ動物の左脇腹に皮下注射した。
接種後、触診およびキャリパー測定を１週間に１回行ない、腫瘍の発達を追跡した。腫瘍体積は、式：（Ｌ×Ｗ２）／２（ここで、ＬおよびＷは腫瘍の最大長および幅である）に従って計算した。実験期間の終わり、または両方の腫瘍の合計が約２０００ｍｍ3の体積に達したときに、動物を過剰麻酔により犠牲にした。
【０１３９】
蛍光イメージング実験
Ａ４３１腫瘍移植の３週間後、５匹のマウスに１ｎｍｏｌのＤＡ３６４を全投与量０．２ｍＬ（注入速度１ｍＬ／分）で投与した。インビボＯＩ取得は、ＩＶＩＳスペクトル光学イメージングシステム（Perkin Elmer）を用い、蛍光プローブの静脈内投与の５分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後に実施した。ＯＩ実験中、動物を３〜４％セボフルランガス麻酔下（Ｏ２ ９７．０〜９６．０％）に保った。麻酔の間、動物の体温を加熱ベッドを用いて約３７℃に安定化した。
インビボでのＯＩ実験に続いて、プローブ注射から４８時間後、動物を犠牲にした。腫瘍、肝臓、腎臓、心臓および脾臓を、切除した腫瘍または器官全体に対する生体外蛍光シグナル測定のために切除した。
【０１４０】
結果
Ｕ−８７ＭＧおよびＡ４３１腫瘍からの蛍光強度を、正常な組織からのシグナル（バックグラウンド）と共にインビボで測定した。
注射後３時間から２４時間までの時間枠において、Ｕ−８７ＭＧおよびＡ４３１腫瘍は、バックグラウンドに関して安定したシグナル比を示した。図９は、マウスの蛍光イメージングであり、ＤＡ３６４が皮膚下の低インテグリン発現腫瘍Ａ４３１の明確な視覚化を可能にすることを示している。
ＩＶＩＳスペクトル光学イメージングシステム（Perkin Elmer）を用いて、摘出した生体外サンプルについて蛍光シグナルを測定した（放射効率（RE）：p/s/（μW/cm2）として示す、ｐは光子カウント）。
以下のTable Iに示すように、Ｕ−８７ＭＧ腫瘍におけるＤＡ３６４の蛍光シグナルは、Ａ４３１腫瘍で測定されたシグナルの強度の約２倍であった。しかし、Ａ４３１腫瘍で測定された蛍光強度は、肝臓および腎臓（ＤＡ３６４が蓄積する排泄器官）で測定されたものと同等であったが、心臓および脾臓で測定されたシグナル（正常組織、バックグラウンドを代表して）に対して約１０倍高かった。
【表１１】
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これらの結果は、ＤＡ３６４がインテグリン発現の低下した腫瘍のための、特にその術中視覚化に適した造影剤であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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