(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列:
Tyr Xaa2 Xaa3 Trp Xaa4 Xaa5 Gly Arg Gly Pro 
(この配列中、
Xaa2は、任意のアミノ酸、好ましくはSer、Ala及びCysからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSer及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSerであり、
Xaa3は、任意のアミノ酸、好ましくは、Asn、Ala及びAspからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくは、Asn及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAsnであり、
Xaa4は、任意のアミノ酸、好ましくは、Thr、Ala及びValからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはThr及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはThrであり、
Xaa5は、任意のアミノ酸、好ましくはPro及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはProである)
を含み、第一のシステインと第２のシステインの間で形成されたループ構造の一部である、セプラーゼ結合ペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列:
Cys Xaa1 Tyr Xaa2 Xaa3 Trp Xaa4 Xaa5 Gly Arg Gly Pro Xaa6 Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa7 Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys
(この配列中、
Xaa1は、任意のアミノ酸、好ましくはPro及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはProであり、
Xaa2は、任意のアミノ酸、好ましくはSer、Ala及びCysからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSer及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSerであり、
Xaa3は、任意のアミノ酸、好ましくは、Asn、Ala及びAspからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくは、Asn及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAsnであり、
Xaa4は、任意のアミノ酸、好ましくは、Thr、Ala及びValからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはThr及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはThrであり、
Xaa5は、任意のアミノ酸、好ましくはPro及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはProであり、
Xaa6は、任意のアミノ酸、好ましくは、Asp、Ala及びAsnからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくは、Asp及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAspであり、
Xaa7は、任意のアミノ酸、好ましくはArg及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはArgである)
を含む、請求項1に記載のセプラーゼ結合ペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列:
Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys
を含む、請求項1または2に記載のセプラーゼ結合ペプチド。
【請求項４】
配列表の配列番号22から79及び88から96から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載のセプラーゼ結合ペプチド。
【請求項５】
シスチンノット構造、好ましくは、阻害剤シスチンノット構造を形成する、及び/又はシスチンノット構造、好ましくは、阻害剤シスチンノット構造の一部である、請求項1から4のいずれか一項に記載のセプラーゼ結合ペプチド。
【請求項６】
少なくとも1つの融合パートナーを更に含み、融合パートナーが、異種アミノ酸配列を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のセプラーゼ結合ペプチド。
【請求項７】
少なくとも1つの更なる部分と共有結合的に及び/又は非共有結合的に、好ましくは共有結合的に会合している、請求項1から6のいずれか一項に記載のセプラーゼ結合ペプチドを含む、セプラーゼ結合剤。
【請求項８】
共有結合的に及び/又は非共有結合的に会合している少なくとも2つのサブユニットを含み、前記サブユニットのそれぞれが、請求項1から6のいずれか一項に記載のセプラーゼ結合ペプチドを含み、セプラーゼ結合ペプチドが、同一であっても異なっていてもよい、請求項7に記載のセプラーゼ結合剤。
【請求項９】
少なくとも1つの検出可能な標識若しくはレポーター及び/又は少なくとも1つの治療エフェクター部分と共有結合的に及び/又は非共有結合的に、好ましくは共有結合的に会合している、請求項1から6のいずれか一項に記載のセプラーゼ結合ペプチドを含む請求項7に記載のセプラーゼ結合剤、又は請求項7または8に記載のセプラーゼ結合剤。
【請求項１０】
請求項1から6のいずれか一項に記載のセプラーゼ結合ペプチドをコードする組換え核酸。
【請求項１１】
請求項1から6のいずれか一項に記載のセプラーゼ結合ペプチド又は請求項7から9のいずれか一項に記載のセプラーゼ結合剤を含み、セプラーゼ結合ペプチド又はセプラーゼ結合剤が、固体支持体上に取り外し可能に又は取り外し不能に固定化される、アッセイデバイス。
【請求項１２】
試料中のセプラーゼの存在及び/又は量についてアッセイするためのin vitroの方法であって、請求項1から6のいずれか一項に記載のセプラーゼ結合ペプチド又は請求項7から9のいずれか一項に記載のセプラーゼ結合剤を使用する工程を含む方法。
【請求項１３】
セプラーゼの存在及び/又は量についてアッセイする工程が、
(i)生体試料を請求項1から6のいずれか一項に記載のセプラーゼ結合ペプチド又は請求項7から9のいずれか一項に記載のセプラーゼ結合剤と接触させることと、
(ii)セプラーゼ結合ペプチド又はセプラーゼ結合剤とセプラーゼとの複合体の形成を検出すること、及び/又は複合体の量を判定することと
を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
セプラーゼ結合ペプチド又はセプラーゼ結合剤が、少なくとも1つの検出可能な標識若しくはレポーターを含む、又は少なくとも1つの検出可能な標識若しくはレポーターにコンジュゲートしている、請求項12または13に記載の方法。
【請求項１５】
セプラーゼ結合ペプチド又はセプラーゼ結合剤が、固体支持体上に取り外し可能に又は取り外し不能に固定化される、請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項1から6のいずれか一項に記載のセプラーゼ結合ペプチド、請求項7から9のいずれか一項に記載のセプラーゼ結合剤、又は請求項10に記載の組換え核酸を含む、患者のがんの標的化に使用するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん性疾患、特に、セプラーゼ(Fap-アルファ;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ)を発現するがん性疾患、例えば、乳がん、肺がん(pulmonary若しくはlung cancer)、例えば非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸がん、結腸がん、食道がん、頭頸部がん、胃がん、胆管がん、膵臓がん、腎臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、子宮内膜がん又は前立腺がんの診断及び処置に関する。より詳細には、本発明は、セプラーゼを標的にするペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、心疾患を凌ぐ、世界で一番多い死亡原因の1つである。2012年には世界人口の820万人ががんで死亡した(WHO)。古典的な抗がん治療、例えば、放射線治療、化学療法及び従来の外科手術手技は、不十分な選択性に悩まされることが多く、それ故、健常組織への重篤な毒性副作用に悩まされることが多い。新規処置形態は、腫瘍関連抗原に対して特異的な結合分子による腫瘍環境への生物活性分子(薬物、サイトカイン、放射性核種等)の標的化送達に存する。これにより、標的陽性腫瘍組織への薬物の選択的指向が可能になり、健常細胞を害さずに悪性細胞が効果的に殺滅される。これは、個々のがん治療に合理的に適合させた戦略を前もって保証するために患者内の標的陽性腫瘍を決定できるようにする、いわゆるコンパニオン診断の開発に追随する。この中で、標的特異的イメージング技術の適用は重要な診断工程になり、過去数十年の間に目をみはる進歩を見せてきた。イメージング技術は、腫瘍関連タンパク質の存在及び量、局在性、早期検出、分布、患者層別化、並びに処置モニタリングについての重要な意味をもつ情報をもたらすことができる(Stern、Caseら、2013)。
【０００３】
目的に合わせた個人向け抗がん治療に向けて非常に重要な工程は、選択的腫瘍関連マーカータンパク質の同定である。セリンプロテアーゼセプラーゼ(Fap-アルファ;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ)は、乳、肺及び結腸直腸がん等のヒト原発性上皮腫瘍の90%より多くのがん関連線維芽細胞(CAF)で選択的に過剰発現されるが、正常線維芽細胞又は他の正常組織では殆ど又は全く発現されない(Rui Liu、2012)ため、がん治療及び診断にとって魅力的なターゲットである。セプラーゼは、ポストプロリンジペプチジルアミノペプチダーゼファミリーに属する170kDa II型膜貫通細胞表面タンパク質である。セプラーゼは、短い膜貫通ドメインによって細胞膜内に固定されており、アミノ末端配列を細胞内露出しているが、カルボキシル末端を有する触媒ドメインは細胞外空間に残存する(Goldstein、Ghersiら、1997; Pineiro-Sanchez、Goldsteinら、1997)。腫瘍成長及び浸潤におけるセプラーゼの正確な役割、この酵素が関与する分子メカニズム、並びにその天然リガンド又は基質は、大部分が依然として不明である。
【０００４】
セプラーゼは腫瘍組織の選択的マーカーであるので、前記タンパク質を標的にする多数の、可能性のある、治療戦略を構想することができる。in vivoで多数の異なるがんモデルにセプラーゼ結合分子を使用することによって、前臨床アプローチで腫瘍進行を効率的に減じることが可能であることが証明されている(Loeffler、Krugerら、2006; Ostermann、Garin-Chesaら、2008; Liao、Luoら、2009; Kraman、Bambroughら、2010; Wen、Wangら、2010)。それとは対照的に、モノクローナル抗体F19、そのヒト化バージョンのシブロツズマブ(Welt、Divgiら、1994; Hofheinz、al-Batranら、2003; Scott、Wisemanら、2003)、又はセプラーゼ酵素阻害剤タラボスタット(Narra、Mullinsら、2007; Eager、Cunninghamら、2009; Eager、Cunninghamら、2009)を使用する、ヒトがん患者の臨床設定でのセプラーゼの標的化は、わずかな臨床有効性しか示していない。セプラーゼを標的にする前臨床研究では有意な毒性は報告されなかった(Welt、Divgiら、1994; Lee、Fassnachtら、2005; Loeffler、Krugerら、2006; Ostermann、Garin-Chesaら、2008; Liao、Luoら、2009; Santos、Jungら、2009; Kraman、Bambroughら、2010; Wen、Wangら、2010)が、興味深いことに、多能性骨髄幹細胞(BMSC)による発現も今は論議されている。要するに、今までに報告された患者におけるセプラーゼ特異的抗体の好適な生体内分布及び転移性疾患部位への選択的取り込み(Welt、Divgiら、1994; Scott、Wisemanら、2003)から、セプラーゼには腫瘍標的アプローチの魅力的候補としての適格性が認められる。セプラーゼが、腫瘍抑制因子として作用するのか(Wesley、Albinoら、1999; Ramirez-Montagut、Blachereら、2004)、又は腫瘍成長を促進するのか(Cheng、Dunbrackら、2002; Goodman、Rozypalら、2003; Huang、Wangら、2004)は、依然として不明であるため、機能に影響を与えず、局在性、早期検出、分布、患者層別化及び処置モニタリングについての情報をもたらすイメージング技術(Stern、Caseら、2013)のためのセプラーゼに対する高選択的リガンドを開発することは、有利でありうる。
【０００５】
血管新生化が不十分な腫瘍の標的化については、大きいサイズの抗体及び更にはそれらの断片は組織透過速度を遅らせることがあり、このことによって効率的送達を妨げることがある。更に、抗体は、血液循環が長いため、診断上の使用には、特に、イメージング概念との関連での診断上の使用には、最適でないように思われる。前述に加えて、複雑なグリコシル化パターン及びジスルフィド架橋を有する抗体の分子構造は、コストのかかる複雑な製造を必要とし、例えばイメージングトレーサーによる、更なる機能化を複雑にする。これらの制限を克服するために、抗体の代替物として、いわゆるタンパク質足場がここ数十年の間に浮上してきた:足場は、所与の標的の厳格で特異的な認識に合わせた相互作用分子を正確に設計するための頑強な構造フレームワークを提供する(Weidle、Auerら、2013)。それらの大部分は、非還元性条件下では正確に折り畳まれており、変性及び再折り畳みを必要とせずに細菌内で発現されうる。化学合成も、一部の形式の産生の選択肢である。最後に、それらは、多機能性結合分子を生成するための更なる機能化(標識付け、オリゴマー化、他のペプチドとの融合等)によく適している。様々な足場ベースのアプローチの中で、シスチン-ノットミニタンパク質(「ノッチン」)は、標的診断及び治療剤の開発への大きな可能性を示している。例えば、Cochran及び共同研究者は、良好なコントラスト、急速な腫瘍標的化、身体からの迅速なクリアランス、及び正常組織への比較的低い取り込みを特徴とする、U87MG腫瘍のインテグリン特異的PETイメージング用の放射標識ミニタンパク質、18F-FP-2.5D及び18F-FP-2.5Fを生成した(Kimura、Chengら、2009; Kimura、Levinら、2009; Kimura、Miaoら、2010; Kimura、Jonesら、2011; Liu、Liuら、2011)。ミニタンパク質は、名祖の結び目構造を形成する3つのジスルフィド結合を含有する、小さい、30〜50アミノ酸ポリペプチドである(Kolmar、2009; Moore及びCochran、2012)。偽ノットシスチントポロジーは、並外れた熱、タンパク質分解及び化学的安定性を担っており、これはin vivoでの生物医学的応用に望ましい(Kolmar 2011)。例えば、構造的及び機能的完全性を失うことなく、ミニタンパク質をアルカリ性又は酸性環境で煮沸することができる(Weidle、Auerら、2013)。ジスルフィド拘束ループ領域は、広範な配列多様性を許容し、様々な生物医学的標的を認識するタンパク質を設計するための頑強な分子フレームワークをもたらす。
【０００６】
セプラーゼを発現する腫瘍についての診断及び治療アプローチに有用であるセプラーゼ結合分子が当技術分野において必要とされている。
【０００７】
ヒトセプラーゼに対して高い特異性及び選択性を示すセプラーゼ結合剤、例えばセプラーゼ結合ペプチドを、本明細書に記載する。本明細書に記載のセプラーゼ結合剤は、診断応用、特に腫瘍イメージングのための、及び腫瘍微小環境の効率的標的化による治療応用のための、卓越したツールである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」、H.G.W.Leuenberger、B. Nagel、及びH. Kolbl編、Helvetica Chimica Acta、CH-4010 Basel、Switzerland、(1995)
【非特許文献２】Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、J. Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、Cold Spring Harbor 1989
【非特許文献３】Berzofskyら、「Antibody-Antigen Interactions」In Fundamental Immunology、Paul, W. E.編、Raven Press社  New York、N Y (1984)
【非特許文献４】Kuby、Janis Immunology、W. H. Freeman and Company社  New York、N Y (1992)
【非特許文献５】Scatchardら、Ann N.Y. Acad. ScL、51:660頁(1949)
【非特許文献６】Smith及びWaterman((1981) Ads App. Math. 2、482頁
【非特許文献７】Neddleman及びWunsch、1970、J. Mol. Biol. 48、443頁
【非特許文献８】Pearson及びLipman、1988、Proc. Natl Acad. Sci. USA 85、2444頁
【非特許文献９】Current Protocols in Molecular Biology、F.M. Ausubelら編、John Wiley & Sons. Inc.社、New York
【非特許文献１０】Goodman及びGilman、「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、第8版、1990、McGraw-Hill Inc.社
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明に従って、ナンバンカラスウリ(Momordica cochinchinensis)からのノッチン型トリプシン阻害剤II(oMCoTI-II)の鎖式バリアントを、腫瘍標的化応用のために、セプラーゼ特異的結合タンパク質を設計するための分子足場として使用した。このために、コンビナトリアルファージライブラリーを、組換えヒトセプラーゼの細胞外ドメインと特異的に相互作用するoMCoTI-IIバリアントの選択に利用した。定義済み標的との結合を示す、同定されたノッチンペプチド(ミニタンパク質)の1つ、MC-FA-010 (aa: GKCPYSNWTPGRGPDCRRDSDCPGRCICRGNGYCG)を、より詳細に特徴付けた。それは、ヒトセプラーゼの特異的複合体化を示すが、関連タンパク質、例えば密接な関連がある相同DPP-IVを認識しない。結合は、MC-FA-010の2つの脂肪族残基及び第1のループ内でのGRGP輸送性に主として依存し、このことをアラニンスキャニング変異導入によって証明することができた。更に、セプラーゼ特異的ミニタンパク質は、標的陽性CHO-K1細胞株を使用するフローサイトメトリー及び全細胞ELISAによって判定して、マウス相同体と交差反応性である。がん関連線維芽細胞(CAF)によって発現されたセプラーゼの特異的標的化を、CT26腫瘍切片の免疫蛍光染色によって証明することができた。新生物組織のin vivo標的化を標的陽性CHO-K1腫瘍を担持しているFox n1 (nu)マウスで立証することができた。
【００１０】
本発明は、一般に、セプラーゼの標的化によるがん疾患の処置及び/又は診断に有用な化合物を提供する。これらの化合物は、セプラーゼを発現する細胞の選択的検出、並びに/又はセプラーゼを発現する細胞の及び/若しくはセプラーゼを発現する細胞に関連する細胞の根絶をもたらし、その結果、セプラーゼを発現しない正常細胞に対する有害効果を最小にする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、アミノ酸配列Gly Arg Gly Proを含むセプラーゼ結合ペプチドを提供する。
【００１２】
第1の実施形態において、本発明のセプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Tyr Xaa1 Xaa2 Trp Xaa3 Xaa4 Gly Arg Gly Pro
(この配列中、
Xaa1は、任意のアミノ酸、好ましくはSer、Ala及びCysからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSer及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSerであり、
Xaa2は、任意のアミノ酸、好ましくはAsn、Ala及びAspからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAsn及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAsnであり、
Xaa3は、任意のアミノ酸、好ましくはThr、Ala及びValからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはThr及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはThrであり、
Xaa4は、任意のアミノ酸、好ましくはPro及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはProである)
を含む。
【００１３】
好ましい実施形態において、セプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Tyr Xaa1 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro
(この配列中、
Xaa1は、任意のアミノ酸、好ましくはSer、Ala及びCysからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSer及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSerである)
を含む。
【００１４】
好ましい実施形態において、セプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro
を含む。
【００１５】
第2の実施形態において、本発明のセプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Xaa1 Tyr Xaa2 Xaa3 Trp Xaa4 Xaa5 Gly Arg Gly Pro
(この配列中、
Xaa1は、任意のアミノ酸、好ましくはPro及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはProであり、
Xaa2は、任意のアミノ酸、好ましくはSer、Ala及びCysからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSer及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSerであり、
Xaa3は、任意のアミノ酸、好ましくは、Asn、Ala及びAspからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくは、Asn及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAsnであり、
Xaa4は、任意のアミノ酸、好ましくは、Thr、Ala及びValからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはThr及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはThrであり、
Xaa5は、任意のアミノ酸、好ましくはPro及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはProである)
を含む。
【００１６】
好ましい実施形態において、セプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Pro Tyr Xaa1 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro
(この配列中、
Xaa1は、任意のアミノ酸、好ましくはSer、Ala及びCysからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSer及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSerである)
を含む。
【００１７】
好ましい実施形態において、セプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro
を含む。
【００１８】
第3の実施形態において、本発明のセプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Xaa1 Xaa2 Cys Xaa3 Tyr Xaa4 Xaa5 Trp Xaa6 Xaa7 Gly Arg Gly Pro Xaa8
(この配列中、
Xaa1は、任意のアミノ酸、好ましくはGly及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはGlyであり、
Xaa2は、任意のアミノ酸、好ましくはLys及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Xaa3は、任意のアミノ酸、好ましくはPro及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはProであり、
Xaa4は、任意のアミノ酸、好ましくはSer、Ala及びCysからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSer及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSerであり、
Xaa5は、任意のアミノ酸、好ましくは、Asn、Ala及びAspからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくは、Asn及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAsnであり、
Xaa6は、任意のアミノ酸、好ましくは、Thr、Ala及びValからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはThr及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはThrであり、
Xaa7は、任意のアミノ酸、好ましくはPro及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはProであり、
Xaa8は、任意のアミノ酸、好ましくは、Asp、Ala及びAsnからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくは、Asp及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAspである)
を含む。
【００１９】
好ましい実施形態において、セプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Xaa1 Xaa2 Cys Pro Tyr Xaa3 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa4
(この配列中、
Xaa1は、任意のアミノ酸、好ましくはGly及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはGlyであり、
Xaa2は、任意のアミノ酸、好ましくはLys及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Xaa3は、任意のアミノ酸、好ましくはSer、Ala及びCysからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSer及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSerであり、
Xaa4は、任意のアミノ酸、好ましくは、Asp、Ala及びAsnからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくは、Asp及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAspである)
を含む。
【００２０】
好ましい実施形態において、セプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Gly Lys Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp
を含む。
【００２１】
好ましい実施形態において、セプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp
を含む。
【００２２】
更なる実施形態において、本発明のセプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Cys Xaa1 Tyr Xaa2 Xaa3 Trp Xaa4 Xaa5 Gly Arg Gly Pro Xaa6 Cys
(この配列中、
Xaa1は、任意のアミノ酸、好ましくはPro及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはProであり、
Xaa2は、任意のアミノ酸、好ましくはSer、Ala及びCysからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSer及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSerであり、
Xaa3は、任意のアミノ酸、好ましくは、Asn、Ala及びAspからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくは、Asn及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAsnであり、
Xaa4は、任意のアミノ酸、好ましくは、Thr、Ala及びValからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはThr及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはThrであり、
Xaa5は、任意のアミノ酸、好ましくはPro及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはProであり、
Xaa6は、任意のアミノ酸、好ましくは、Asp、Ala及びAsnからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくは、Asp及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAspである)
を含む。
【００２３】
一実施形態において、セプラーゼ結合ペプチドは、好ましくはシスチンノット構造の一部であり、システインは、好ましくはシスチンノット構造の第1のシステイン及び第2のシステインであり、並びに/又はシステイン間のアミノ酸配列は、シスチンノット構造の第1のループを形成する。
【００２４】
好ましい実施形態において、セプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Cys Pro Tyr Xaa1 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa2 Cys
(この配列中、
Xaa1は、任意のアミノ酸、好ましくはSer、Ala及びCysからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSer及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSerであり、
Xaa2は、任意のアミノ酸、好ましくは、Asp、Ala及びAsnからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくは、Asp及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAspである)
を含む。
【００２５】
好ましい実施形態において、セプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys
を含む。
【００２６】
更なる実施形態において、本発明のセプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
(Xaa)n1 Cys (Xaa)n2 Gly Arg Gly Pro (Xaa)n3 Cys (Xaa)n4 Cys (Xaa)n5 Cys (Xaa)n6 Cys (Xaa)n7 Cys (Xaa)n8
(この配列中、
Cys残基は、システインノット構造を形成し、
Xaaは、互いに独立して、任意のアミノ酸であり、
n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7及びn8は、それぞれのアミノ酸の数であり、
アミノ酸Xaaの性質並びに/又はアミノ酸n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7及びn8の数は、システインノット構造がCys残基間で形成しうるようなものであり、
好ましくは、
n1は、0〜4、好ましくは1又は2であり、
n2は、3〜10、好ましくは6、7又は8であり、
n3は、0〜4、好ましくは1又は2であり、
n4は、3〜7、好ましくは4、5又は6であり、
n5は、2〜6、好ましくは2、3又は4であり、
n6は、1〜3、好ましくは1又は2であり、
n7は、3〜7、好ましくは4、5又は6であり、
n8は、0〜4、好ましくは1又は2である)
を含む。
【００２７】
更なる実施形態において、本発明のセプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Cys Xaa1 Tyr Xaa2 Xaa3 Trp Xaa4 Xaa5 Gly Arg Gly Pro Xaa6 Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa7 Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys
(この配列中、
Xaa1は、任意のアミノ酸、好ましくはPro及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはProであり、
Xaa2は、任意のアミノ酸、好ましくはSer、Ala及びCysからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSer及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSerであり、
Xaa3は、任意のアミノ酸、好ましくは、Asn、Ala及びAspからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくは、Asn及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAsnであり、
Xaa4は、任意のアミノ酸、好ましくは、Thr、Ala及びValからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはThr及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはThrであり、
Xaa5は、任意のアミノ酸、好ましくはPro及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはProであり、
Xaa6は、任意のアミノ酸、好ましくは、Asp、Ala及びAsnからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくは、Asp及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAspであり、
Xaa7は、任意のアミノ酸、好ましくはArg及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはArgである)
を含む。
【００２８】
好ましい実施形態において、セプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Cys Pro Tyr Xaa1 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa2 Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa3 Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys
(この配列中、
Xaa1は、任意のアミノ酸、好ましくはSer、Ala及びCysからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSer及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSerであり、
Xaa2は、任意のアミノ酸、好ましくは、Asp、Ala及びAsnからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくは、Asp及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAspであり、
Xaa3は、任意のアミノ酸、好ましくはArg及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはArgである)
を含む。
【００２９】
好ましい実施形態において、セプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys
を含む。
【００３０】
更なる実施形態において、本発明のセプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Xaa1 Xaa2 Cys Xaa3 Tyr Xaa4 Xaa5 Trp Xaa6 Xaa7 Gly Arg Gly Pro Xaa8 Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa9 Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys Gly
(この配列中、
Xaa1は、任意のアミノ酸、好ましくはGly及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはGlyであり、
Xaa2は、任意のアミノ酸、好ましくはLys及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Xaa3は、任意のアミノ酸、好ましくはPro及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはProであり、
Xaa4は、任意のアミノ酸、好ましくはSer、Ala及びCysからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSer及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSerであり、
Xaa5は、任意のアミノ酸、好ましくは、Asn、Ala及びAspからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくは、Asn及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAsnであり、
Xaa6は、任意のアミノ酸、好ましくは、Thr、Ala及びValからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはThr及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはThrであり、
Xaa7は、任意のアミノ酸、好ましくはPro及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはProであり、
Xaa8は、任意のアミノ酸、好ましくは、Asp、Ala及びAsnからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくは、Asp及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAspであり、
Xaa9は、任意のアミノ酸、好ましくはArg及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはArgである)
を含む。
【００３１】
好ましい実施形態において、セプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Xaa1 Xaa2 Cys Pro Tyr Xaa3 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa4 Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa5 Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys Gly
(この配列中、
Xaa1は、任意のアミノ酸、好ましくはGly及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはGlyであり、
Xaa2は、任意のアミノ酸、好ましくはLys及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Xaa3は、任意のアミノ酸、好ましくはSer、Ala及びCysからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSer及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはSerであり、
Xaa4は、任意のアミノ酸、好ましくは、Asp、Ala及びAsnからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくは、Asp及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはAspであり、
Xaa5は、任意のアミノ酸、好ましくはArg及びAlaからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはArgである)
を含む。
【００３２】
好ましい実施形態において、セプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Gly Lys Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys Gly
を含む。
【００３３】
好ましい実施形態において、セプラーゼ結合ペプチドは、アミノ酸配列:
Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys Gly
を含む。
【００３４】
一実施形態において、セプラーゼ結合ペプチドは、下記のTable 1(表1)、Table 2(表2)又はTable 4(表4)に示すアミノ酸配列を含む。一実施形態において、セプラーゼ結合ペプチドは、配列表の配列番号5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、又は96で示されるアミノ酸配列を含む。
【００３５】
一実施形態において、本発明のセプラーゼ結合ペプチドは、足場を形成する、又は足場の一部である。用語「足場」は、本明細書に記載のセプラーゼ結合ペプチド又はアミノ酸配列に剛性を付与する構造に関する。
【００３６】
一実施形態において、本発明のセプラーゼ結合ペプチドは、共有結合性修飾によって安定化される。一実施形態において、前記共有結合性修飾は、環化である。一実施形態において、前記環化は、1つ又は複数のジスルフィド架橋によるものである。
【００３７】
一実施形態において、本発明のセプラーゼ結合ペプチドは、シスチンノット構造、好ましくは阻害剤シスチンノット構造を形成する、及び/又はシスチンノット構造、好ましくは阻害剤シスチンノット構造の一部である。一実施形態において、シスチンノット構造は、ナンバンカラスウリからの鎖式トリプシン阻害剤II (MCoTI-II)、テッポウウリ(Ecballium elaterium)のトリプシン阻害剤EETI-II、及び最適化MCoTI-II足場に基づく。
【００３８】
アミノ酸配列Gly Arg Gly Pro、及び/又は本発明の第1若しくは第2の実施形態のセプラーゼ結合ペプチドにおけるアミノ酸配列は、好ましくは、シスチンノット構造の一部であり、アミノ酸配列は、シスチンノット構造の第1のループ内(すなわち、第1のシステインと第2のシステインの間)に位置する。
【００３９】
一実施形態において、本発明のセプラーゼ結合ペプチドは、少なくとも1つの融合パートナーを更に含む。一実施形態において、融合パートナーは、異種アミノ酸配列を含む。
【００４０】
本発明は、本明細書に記載の1つ又は複数の、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又はそれ超のセプラーゼ結合ペプチドを含むセプラーゼ結合剤であって、セプラーゼ結合ペプチドが同一であっても異なっていてもよい、セプラーゼ結合剤も提供する。本発明は、少なくとも1つの更なる部分と共有結合的に及び/又は非共有結合的に、好ましくは共有結合的に会合している本発明のセプラーゼ結合ペプチドを含むセプラーゼ結合剤も提供する。
【００４１】
本発明のセプラーゼ結合ペプチド又は本発明のセプラーゼ結合剤の一実施形態において、融合パートナー又は更なる部分は、担体タンパク質、標識、レポーター又はタグを含む。一実施形態において、レポーターは、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又は蛍光分子からなる群から好ましくは選択される、免疫学的アッセイのためのレポーターである。一実施形態において、融合パートナー又は更なる部分は、His6-カセット、チオレドキシン、Sタグ、ビオチン又はこれらの組合せからなる群から選択される。
【００４２】
一実施形態において、本発明のセプラーゼ結合剤は、共有結合的に及び/又は非共有結合的に会合している少なくとも2つのサブユニットを含み、前記サブユニットのそれぞれは本発明のセプラーゼ結合ペプチドを含み、セプラーゼ結合ペプチドは、同一であってもよく、又は異なっていてもよい。
【００４３】
本発明によると、一実施形態において、非共有結合性会合は、ストレプトアビジンを含む化合物を介したものである。本発明によると、一実施形態において、共有結合性会合は、ペプチドリンカー及び/又は非ペプチドリンカーを介したものである。
【００４４】
したがって、一実施形態において、本発明のセプラーゼ結合ペプチドは、オリゴマー形態又は多量体形態で存在する。この実施形態において、同一であっても異なっていてもよい本発明の2つ以上のセプラーゼ結合ペプチドは、共有結合又は非共有結合によって、例えばビオチン/ストレプトアビジンを介して連結又はカップリングされていることもある。したがって、本発明のセプラーゼ結合ペプチドは、二量体、三量体、四量体等を形成することがある。
【００４５】
一実施形態において、本発明のセプラーゼ結合剤は、非共有結合的に会合している少なくとも4つのサブユニットを含む。
【００４６】
一実施形態において、本発明のセプラーゼ結合剤は、共有結合的に会合している少なくとも3つのサブユニットを含む。
【００４７】
一実施形態において、本発明のセプラーゼ結合剤は、少なくとも1つの検出可能な標識若しくはレポーター及び/又は少なくとも1つの治療エフェクター部分と共有結合的に及び/又は非共有結合的に、好ましくは共有結合的に会合している、本発明のセプラーゼ結合ペプチド又は本発明のセプラーゼ結合剤を含む。
【００４８】
一実施形態において、本発明のセプラーゼ結合ペプチド又は本発明のセプラーゼ結合剤は、セプラーゼの細胞外ドメインと結合する。
【００４９】
本発明のセプラーゼ結合ペプチド又は本発明のセプラーゼ結合剤の一実施形態において、前記セプラーゼは、細胞によって発現される。
【００５０】
一実施形態において、本発明のセプラーゼ結合ペプチド又は本発明のセプラーゼ結合剤は、DPP IVと結合しない。
【００５１】
本発明の一実施形態において、結合は、特異的結合である。
【００５２】
本発明は、本発明のセプラーゼ結合ペプチドをコードする組換え核酸も提供する。一実施形態において、組換え核酸は、ベクターの形態又はRNAの形態である。
【００５３】
本発明は、本発明の組換え核酸を含む宿主細胞も提供する。
【００５４】
本発明の別の目的は、がん疾患の診断、検出又はモニタリング、すなわち、退縮、進行、経過及び/又は発症の判定、のための手段及び方法を提供することである。
【００５５】
本発明は、本発明のセプラーゼ結合ペプチド又は本発明のセプラーゼ結合剤を含む検査キットを提供する。一実施形態において、検査キットは、イムノアッセイを行うための少なくとも1つの追加の試薬及び/又他はイムノアッセイを行うためのキットの使用説明書を更に含む。一実施形態において、本発明の検査キットは、診断検査キットである。
【００５６】
本発明の診断検査キットは、本発明のがんの診断、検出又はモニタリングのための方法に有用でありうる。これらのキットは、情報を提供するパンフレット、例えば、本明細書に開示する方法を実施するための試薬の使用方法についての情報を提供するパンフレットを含むこともある。
【００５７】
本発明は、本発明のセプラーゼ結合ペプチド又は本発明のセプラーゼ結合剤を含むアッセイデバイスを提供する。一実施形態において、アッセイデバイスは、酵素結合免疫吸着アッセイデバイスである。本発明のアッセイデバイスの一実施形態において、セプラーゼ結合ペプチド又はセプラーゼ結合剤は、固体支持体上に取り外し可能に又は取り外し不能に固定化される。
【００５８】
本発明は、試料中のセプラーゼの存在及び/又は量についてアッセイするための方法であって、本発明のセプラーゼ結合ペプチド又は本発明のセプラーゼ結合剤を使用する工程を含む方法を提供する。
【００５９】
本発明は、患者のがんの診断、検出又はモニタリングのための方法であって、本発明のセプラーゼ結合ペプチド又は本発明のセプラーゼ結合剤を使用して前記患者におけるセプラーゼの存在及び/又は量についてアッセイする工程を含む方法を提供する。
【００６０】
特定の態様において、本発明は、がん疾患の検出方法、すなわち、がん疾患の位置又は部位、例えば特定の組織又は器官を決定する方法に関する。一実施形態において、前記方法は、検出可能な標識にカップリングされている本発明のセプラーゼ結合化合物を患者に投与する工程を含む。
【００６１】
前記患者における組織又は器官に標識付けすることで、前記組織又は器官におけるがん疾患の存在又はリスクを示すことができる。
【００６２】
一実施形態において、組織又は器官は、その組織又は器官にがんがない場合には細胞がセプラーゼを実質的に発現しない、組織又は器官である。
【００６３】
本発明の方法の一実施形態において、前記アッセイは、前記患者から単離された生体試料に関して行われる。
【００６４】
一実施形態において、生体試料は、がん疾患に罹患している患者、又はがん疾患に罹患している疑い若しくは罹患する疑いがある患者、又はがん疾患の可能性がある患者から単離される。一実施形態において、生体試料は、その組織又は器官にがんがない場合には細胞がセプラーゼを実質的に発現しない組織又は器官からのものである。
【００６５】
概して、生体試料中のセプラーゼのレベルは基準レベルと比較され、前記基準レベルからの偏差は、患者におけるがん疾患の存在及び/又はステージを示す。基準レベルは、対照試料(例えば、健常組織又は対象からのもの)で決定されるようなレベル、又は健常対象からの中央値レベルでありうる。前記基準レベルからの「偏差」は、あらゆる有意な変化、例えば、少なくとも10%、20%又は30%、好ましくは、少なくとも40%若しくは50%、又は更にはそれを超える、増加又は減少を示す。基準レベルと比較して、例えば、がん疾患のない患者と比較して増加されるセプラーゼの存在及び/又はセプラーゼの量は、前記患者におけるがんの存在又はリスク(すなわち、がんを発症する可能性)を示しうる。
【００６６】
一実施形態において、生体試料及び/又は対照/参照試料は、がん疾患による罹患に関して診断、検出又はモニタリングすべき組織又は器官に相当する組織又は器官からのものであり、例えば、診断、検出又はモニタリングすべきがん疾患は脳がんであり、生体試料及び/又は対照/参照試料は脳組織である。
【００６７】
一実施形態において、生体試料及び/又は対照/参照試料は、その組織又は器官にがんがない場合には細胞がセプラーゼを実質的に発現しない組織又は器官からのものである。本発明の方法による患者におけるがん疾患の存在又はリスクの表示は、がん疾患が前記組織若しくは器官にあること、又は前記組織若しくは器官に前記がん疾患のリスクがあることを示しうる。
【００６８】
診断、検出又はモニタリングのための方法は、定量的及び/又は定性的評価、例えば、標的分子の、例えばセプラーゼの発現レベルの、絶対的及び/又は相対的測定を可能にする。
【００６９】
セプラーゼの存在及び/又は量について前記アッセイする工程を遂行する手段は、本明細書に記載されており、当業者には明らかであろう。概して、本発明の方法におけるアッセイする工程は、セプラーゼと特異的に結合する標識されたリガンド、例えば、検出をもたらす標識、例えば、指示酵素、放射標識、フルオロフォア又は常磁性粒子と直接又は間接的に結合しているセプラーゼと特異的に結合する本発明の化合物の使用を含む。
【００７０】
本発明の方法の一実施形態において、セプラーゼの存在、又はがんのない参照物と比較して多いセプラーゼ量は、患者ががんに罹患していることを示す。
【００７１】
本発明によるモニタリングの方法は、第1の時点で第1の試料中の及び第2の時点で更なる試料中のセプラーゼの存在及び/又は量についてアッセイする工程を好ましくは含み、2つの試料を比較することによってがん疾患の退縮、進行、経過及び/又は発症を判定することができる。
【００７２】
患者から以前に採取した生体試料と比較して生体試料中で減少しているセプラーゼの量は、前記患者におけるがん疾患の退縮、肯定的経過、例えば処置成功、又は発症リスク低下を示しうる。
【００７３】
患者から以前に採取した生体試料と比較して生体試料中で増加しているセプラーゼの量は、前記患者におけるがん疾患の、進行、否定的経過、例えば処置不成功、再発若しくは転移性の挙動、発症、又は発症リスクを示しうる。
【００７４】
本発明の方法の一実施形態において、セプラーゼの存在及び/又は量についてアッセイする工程は、
(i)生体試料を本発明のセプラーゼ結合ペプチド又は本発明のセプラーゼ結合剤と接触させることと、
(ii)セプラーゼ結合ペプチド若しくはセプラーゼ結合剤とセプラーゼとの複合体の形成を検出すること、及び/又は複合体の量を判定することと
を含む。
【００７５】
本発明の方法の一実施形態において、セプラーゼ結合ペプチド又はセプラーゼ結合剤は、少なくとも1つの検出可能な標識若しくはレポーターを含む、又は少なくとも1つの検出可能な標識若しくはレポーターにコンジュゲートしている。
【００７６】
一実施形態において、本発明の方法は、イムノアッセイとの関連で行われる。
【００７７】
本発明の方法の一実施形態において、セプラーゼ結合ペプチド又はセプラーゼ結合剤は、固体支持体上に取り外し可能に又は取り外し不能に固定化される。
【００７８】
本発明によるセプラーゼ結合化合物のセプラーゼとの結合は、例えば触媒活性を阻害することによって、セプラーゼの機能に干渉することができる。更に、セプラーゼ結合化合物を治療エフェクター部分、例えば、放射標識、細胞毒、細胞毒性酵素等に結合させてもよく、化合物のセプラーゼとの結合は、セプラーゼを発現する細胞、又はセプラーゼを発現する細胞に関連する細胞、特にがん細胞を選択的に標的化し、殺滅することができる。一実施形態において、前記化合物は、腫瘍細胞増殖を低減させる及び/又は腫瘍細胞死を誘導するため、腫瘍阻害効果又は腫瘍破壊効果を有する。したがって、本明細書に記載のセプラーゼ結合化合物を治療に、特に、がん疾患の予防的及び/又は治療的処置のために、使用することができる。
【００７９】
本発明の方法を使用する上記のがん疾患の陽性診断は、本明細書に記載の処置方法に適しているがん疾患を示しうる。
【００８０】
したがって、本発明の別の目的は、がん疾患の治療的及び/又は予防的処置のための手段及び方法を提供することである。
【００８１】
本発明は、本発明のセプラーゼ結合ペプチド、本発明のセプラーゼ結合剤、本発明の組換え核酸、又は本発明の宿主細胞を含む、医薬組成物を提供する。
【００８２】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含むことがあり、本明細書に記載の更なる物質を任意選択で含むことがある。
【００８３】
本発明は、治療に使用するための、特に、患者のがんの処置又は予防に使用するための、本発明のセプラーゼ結合ペプチド、本発明のセプラーゼ結合剤、本発明の組換え核酸、本発明の宿主細胞、又は本発明の医薬組成物を提供する。
【００８４】
本発明は、患者のがんの標的化に使用するための、本発明のセプラーゼ結合ペプチド又は本発明のセプラーゼ結合剤を提供する。
【００８５】
本発明は、患者を処置する方法であって、本発明のセプラーゼ結合ペプチド、本発明のセプラーゼ結合剤、本発明の組換え核酸、本発明の宿主細胞、又は本発明の医薬組成物を患者に投与する工程を含み、好ましくは、患者ががんに罹患している又はがんを発症するリスクがある、方法を提供する。
【００８６】
上記態様の一実施形態において、セプラーゼ結合ペプチド又はセプラーゼ結合剤は、少なくとも1つの治療エフェクター部分を含む、又は少なくとも1つの治療エフェクター部分にコンジュゲートしている。
【００８７】
上記態様の一実施形態において、がんは、セプラーゼ陽性である、及び/又はセプラーゼを発現する細胞に関わる。一実施形態において、細胞は、がん関連線維芽細胞である。
【００８８】
本発明の全ての態様によると、がんは、乳がん、肺がん(pulmonary若しくはlung cancer)、例えば非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸がん、結腸がん、食道がん、頭頸部がん、胃がん、胆管がん、膵臓がん、腎臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、子宮内膜がん又は前立腺がんからなる群から好ましくは選択される。
【００８９】
本発明の全ての態様によると、セプラーゼは、好ましくは、配列表の配列番号3若しくは4によるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列のバリアントを含む。
【００９０】
一態様において、本発明は、本明細書に記載の処置方法に使用するための、本明細書に記載の薬剤を提供する。一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の処置方法に使用するための、本明細書に記載の医薬組成物を提供する。
【００９１】
本明細書に記載の処置は、外科的切除及び/又は放射線及び/又は旧来の化学療法と併用することができる。
【００９２】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになる。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
本発明を以下に詳細に説明するが、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬は変わることがあるので、本発明がこれらに限定されないことを理解されたい。本明細書において使用する専門用語が、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定さる本発明の範囲を限定することを意図したものでないことも、理解されたい。別段の定義がない限り、本明細書において使用する全ての技術及び科学用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【００９４】
以下で本発明の要素を説明する。具体的な実施形態を用いてこれらの要素を収載するが、これらを任意の様式及び任意の数で組み合わせて追加の実施形態を創出することができることを理解すべきである。様々に記載する例及び好ましい実施形態が、明示的に記載する実施形態のみに本発明を限定すると、解釈すべきでない。明示的に記載する実施形態を任意の数の開示する及び/又は好ましい要素と組み合わせる実施形態が、この説明によって裏づけられ、包含されると理解すべきである。更に、文脈上別段の指示がない限り、本出願における全ての記載要素のあらゆる順列及び組合せが本出願のこの説明によって開示されていると見なされるべきである。
【００９５】
好ましくは、本明細書において使用する用語は、「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」、H.G.W.Leuenberger、B. Nagel、及びH. Kolbl編、Helvetica Chimica Acta、CH-4010 Basel、Switzerland、(1995)に記載されている通りに定義する。
【００９６】
別段の指示がない限り、本発明の実施には当分野の文献において説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学及び組換えDNA技術の従来の方法を用いる(例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、J. Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、Cold Spring Harbor 1989を参照されたい)。
【００９７】
文脈上別段の要求がない限り、本明細書及び後続の特許請求の範囲全体を通して、単語「含む(comprise)」、並びに「含む(comprises)」及び「含むこと(comprising)」等の変化形は、述べられているメンバー、整数若しくは工程、又はメンバー、整数若しくは工程の群の包含を含意するが、いかなる他のメンバー、整数若しくは工程、又はメンバー、整数若しくは工程の群も除外せず、ただし、一部の実施形態において、そのような他のメンバー、整数若しくは工程、又はメンバー、整数若しくは工程の群を除外することもあり、すなわち、主題は、述べられているメンバー、整数若しくは工程、又はメンバー、整数若しくは工程の群の包含に存すると理解されたい。用語「a」及び「an」及び「the」並びに本発明を記載する文脈で(特に、特許請求の範囲の文脈で)使用する同様の言及は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は文脈上明らかな矛盾がない限り、単数形と複数形の両方を網羅すると解釈されたい。本明細書における値の範囲の列挙は、範囲内のそれぞれの別々の値を個々に言及する省略方法としての役割を果たすことのみを意図する。本明細書中で別段の指示がない限り、それぞれの個々の値は、本明細書中に個々に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれている。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は文脈上別段の明らかな矛盾がない限り、適するいかなる順序で行ってもよい。本明細書中で提供する任意の及び全ての例、又は例示的な言葉(例えば、「等(such as)」)の使用は、本発明をより良好に例示することを意図したものに過ぎず、別様に特許請求の範囲に記載する本発明の範囲に制限を課さない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠な任意の非特許請求要素を示すと解釈されるべきでない。
【００９８】
本明細書の本文全体を通して、幾つかの文献を引用している。本明細書に引用する文献(全ての特許、特許出願、科学的出版物、製造業者の仕様書、説明書等を含む)のそれぞれは、上記であるか下記であるかを問わず、それら全体が参照により本明細書に組み込まれている。本明細書中にいかなるものも、先行発明に基づいて本発明がそのような開示に先行する権利を有さないという承認として解釈されるべきでない。
【００９９】
本発明は、セプラーゼ結合化合物又はセプラーゼ結合剤、例えば、セプラーゼ結合ペプチド、又は1つ若しくは複数のセプラーゼ結合ペプチドを含む薬剤に関する。
【０１００】
線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(FAPα)又は170kDa黒色腫膜結合ゼラチナーゼとしても公知のセプラーゼは、ヒトではFAP遺伝子によってコードされているタンパク質である。このタンパク質は、ゼラチナーゼ活性を有すると証明されている、膜内在性セリンペプチダーゼである。
【０１０１】
セプラーゼは、2つの97kDaサブユニットからなる、タンパク質分解活性170kDaホモ二量体として作用するようである。それは、グループII型膜内在性セリンプロテアーゼのメンバーであり、このグループは、ジペプチジルペプチダーゼIV (DPP IV/CD26)及び関連II型膜貫通プロリルセリンペプチダーゼを含み、細胞表面で作用機序を発揮する。セプラーゼは、S9Bプロリルオリゴペプチダーゼサブファミリーのメンバーである。S9Bサブファミリーの他のメンバーは、DPP IV、DPP8及びDPP9である。
【０１０２】
セプラーゼは、DPP IVと最も密接な関連があり、それらは、それらのアミノ酸の約50%を共有する。DPP IV及びセプラーゼは、互いと複合体を形成する及び他の膜結合分子と相互作用するそれらの能力に起因して、複数の機能を示す。
【０１０３】
セプラーゼは、腫瘍進行において二重の機能を有する。セプラーゼのタンパク質分解活性は、細胞外マトリックスへの細胞侵入性を促進することが証明されており、腫瘍成長及び増殖を支持することも証明されている。それは、上皮がんの反応性間質線維芽細胞、創傷治癒の肉芽組織、並びに骨及び軟部組織肉腫の悪性細胞において選択的に発現される。セプラーゼ発現は、ヒトの全ての癌腫の90%より多くの活性化間質線維芽細胞上で見られる。間質線維芽細胞は、癌腫の発生、成長及び転移に重要な役割を果す。
【０１０４】
本発明によると、用語「セプラーゼ」は、好ましくはヒトセプラーゼに関する。
【０１０５】
好ましくは、用語「セプラーゼ」は、配列表の配列番号1若しくは2の核酸配列又は前記核酸配列のバリアントを含む、好ましくはそれらからなる、核酸、及びこの核酸によってコードされるタンパク質、好ましくは、配列表の配列番号3若しくは4のアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列のバリアントを含む、好ましくはそれらからなる、タンパク質に関する。
【０１０６】
セプラーゼのアミノ酸配列は、6アミノ酸の細胞質側末端に20アミノ酸の膜貫通ドメインそして734アミノ酸の細胞外ドメインが続く、II型膜内在性タンパク質を予示する。カルボキシル末端は、非古典的セリンプロテアーゼジペプチジルペプチダーゼIV (DPP IV)のものと相同(同一性68%)である推定的触媒領域(約200アミノ酸)を含有する。保存セリンプロテアーゼモチーフG-X-S-X-Gは、G-W-S-Y-Gとして存在する。
【０１０７】
セプラーゼは、様々な起源のがん、例えば、乳がん、肺がん(pulmonary若しくはlung cancer)、例えば非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸がん、結腸がん、食道がん、頭頸部がん、胃がん、胆管がん、膵臓がん、腎臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、子宮内膜がん又は前立腺がんにおいて発現される。セプラーゼは、原発性腫瘍及び転移の診断、予防及び/又は処置の有用な標的である。
【０１０８】
本発明のセプラーゼ結合剤は、セプラーゼと結合する能力、すなわち、セプラーゼ中に存在するエピトープと、好ましくは、セプラーゼの細胞外ドメイン内に位置するエピトープと、特に、セプラーゼのアミノ酸27〜760位と、結合する能力を有する。特定の実施形態において、本発明のセプラーゼ結合剤は、DPP IV上に存在しない、セプラーゼ上のエピトープと結合する。
【０１０９】
セプラーゼ結合剤は、好ましくは、セプラーゼと結合するがDPP IVとは結合しない。好ましくは、セプラーゼ結合剤は、セプラーゼに特異的である。好ましくは、セプラーゼ結合剤は、細胞表面で発現されるセプラーゼと結合する。特定の好ましい実施形態において、セプラーゼ結合剤は、生存細胞の表面に存在するセプラーゼのネイティブエピトープと結合する。
【０１１０】
用語「エピトープ」は、結合剤によって認識される分子の一部又は一部分を指す。例えば、エピトープは、結合剤によって認識される、分子上の個々の三次元部位である。エピトープは、アミノ酸又は糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面集団から通常はなり、特異的三次元構造特性はもちろん、特異的電荷特性も通常は有する。高次構造エピトープと非高次構造エピトープは、後者とではなく前者との結合が変性溶媒の存在下で失われることで区別される。タンパク質のエピトープは、好ましくは、前記タンパク質の連続又は不連続部分を含み、長さが好ましくは5〜100アミノ酸の間、好ましくは5〜50アミノ酸の間、より好ましくは8〜30アミノ酸の間、最も好ましくは10〜25アミノ酸の間であり、例えば、エピトープは、好ましくは、長さが8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25アミノ酸でありうる。
【０１１１】
本発明によると、用語「セプラーゼ結合剤」又は「セプラーゼ結合化合物」は、セプラーゼとの結合能力を有する任意の化合物(分子の複合体を含む)を含む。好ましくは、そのような結合剤は、本発明の少なくとも1つのセプラーゼ結合ペプチドである、又は本発明の少なくとも1つのセプラーゼ結合ペプチドを含む。セプラーゼ結合剤が、本発明の少なくとも2つの(同一であっても異なっていてもよい)セプラーゼ結合ペプチドを含む場合、これらのペプチドは、共有結合的に又は非共有結合的に会合している(すなわち、結合している)ことがある。セプラーゼ結合剤は、任意の他の化合物又は部分、例えば、標識又は治療エフェクター部分と、共有結合的に又は非共有結合的に会合している1つ又は複数のセプラーゼ結合ペプチドを含むこともある。
【０１１２】
本発明によると、薬剤は、標準的なアッセイにおいて、所定の標的に対して有意な親和性を有し、前記所定の標的と結合する場合、前記所定の標的、例えばセプラーゼ、と結合することができる。「親和性」又は「結合親和性」は、平衡解離定数(KD)によって測定されることが多い。好ましくは、用語「有意な親和性」は、10-5M以下、10-6M以下、10-7M以下、10-8M以下、10-9M以下、10-10M以下、10-11M以下、又は10-12M以下の解離定数(KD)での所定の標的との結合を指す。
【０１１３】
薬剤は、標準的なアッセイにおいて、標的に対して有意な親和性を有さず、前記標的に有意に結合しない、特に、検出可能に結合しない場合、前記標的と(実質的に)結合することができない。好ましくは、薬剤は、最大で2、好ましくは10、より好ましくは20、特に、50又は100μg/ml又はそれ超の濃度で存在する場合、前記標的と検出可能に結合しない。好ましくは、薬剤は、薬剤が結合することができる所定の標的との結合についてのKDより少なくとも10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、又は106倍高いKDで標的と結合する場合、前記標的に対して有意な親和性を有さない。例えば、薬剤が結合できる標的との薬剤の結合についてのKDが10-7Mである場合、薬剤が有意な親和性を有さない標的との結合についてのKDは、少なくとも10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M、又は10-1Mになる。
【０１１４】
本発明によると、用語「結合(binding)」は、好ましくは、特異的結合に関する。
【０１１５】
「有意な結合」は、薬剤が、特異的である標的と、別の標的との結合と比較して強く結合することを意味する。第2の標的についての解離定数(KD)より低い解離定数で第1の標的と結合する場合、薬剤は、第2の標的と比較して第1の標的と強く結合する。好ましくは、薬剤が特異的に結合する標的についての解離定数(KD)は、薬剤が特異的に結合しない標的についての解離定数(KD)より、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍、又は1010倍を超えて低い。
【０１１６】
好ましくは、薬剤は、所定の標的と結合することができるが、他の標的と結合することができない、すなわち、標準的なアッセイにおいて他の標的に対して有意な親和性を有さず、他の標的と有意に結合しない場合、前記所定の標的に特異的である。本発明によると、薬剤は、セプラーゼと結合することができるが、DPP IV等の他の標的と(実質的に)結合することができない場合、セプラーゼに特異的である。好ましくは、薬剤は、そのような他の標的に対する親和性及び結合が、セプラーゼとは無関係のタンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、ヒト血清アルブミン(HSA)、又は非セプラーゼ膜貫通タンパク質、例えばMHC分子若しくはトランスフェリン受容体、又は任意の他の特定ポリペプチド、との親和性又はそれらとの結合を有意に上回らない場合、セプラーゼに特異的である。好ましくは、薬剤が特異的でない標的との結合についてのKDより少なくとも102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍、又は1010倍低いKDで所定の標的と結合する場合、薬剤は、前記標的に特異的である。
【０１１７】
薬剤の標的との結合は、任意の適する方法を使用して実験により判定することができる。例えば、Berzofskyら、「Antibody-Antigen Interactions」In Fundamental Immunology、Paul, W. E.編、Raven Press社  New York、N Y (1984)、Kuby、Janis Immunology、W. H. Freeman and Company社  New York、N Y (1992)、及び本明細書に記載の方法を参照されたい。親和性は、従来の技術を使用して、例えば、平衡透析によって、製造業者により概説された一般手順を使用して表面プラズモン共鳴分析(例えばBiacore)を使用することによって、放射標識された標的抗原を使用するラジオイムノアッセイによって、又は当業者に公知の別の方法によって、容易に判定することができる。親和性データは、例えば、Scatchardら、Ann N.Y. Acad. ScL、51:660頁(1949)の方法によって分析することができる。特定の相互作用について測定された親和性は、異なる条件、例えば塩濃度、pH下で測定すると、変動しうる。したがって、親和性及び他の結合パラメーター、例えば、KD、IC50の測定は、結合剤及び標的の標準化された溶液、並びに標準化された緩衝液を用いて行うのが好ましい。
【０１１８】
本発明によると、用語「セプラーゼ陽性がん」又は類似の用語は、セプラーゼに関わる又はセプラーゼに関連するがん、特に、セプラーゼを発現する細胞、好ましくは細胞の表面で発現するセプラーゼに関わるがんを意味する。
【０１１９】
本発明によると、がんは、セプラーゼが前記がんに空間的につながっている場合、特に、セプラーゼが前記がん中に存在する場合、セプラーゼに関わる又は関連する。好ましくは、セプラーゼに関わる又は関連するがんは、セプラーゼを発現する細胞、好ましくは前記細胞の表面で発現するセプラーゼを含有する。前記細胞は、がん細胞であってもがんに関連する細胞、例えば、線維芽細胞、特に、がん関連線維芽細胞であってもよい。
【０１２０】
「細胞表面」は、当技術分野におけるその通常の意味に従って使用しており、したがって、タンパク質及び他の分子による結合に利用可能である細胞の外側を含む。
【０１２１】
セプラーゼは、細胞の表面に位置すると前記細胞の表面で発現され、その細胞に添加されるセプラーゼ特異的薬剤による結合に利用可能である。
【０１２２】
本発明に関して用語「細胞外ドメイン」は、細胞の細胞外空間に面している、及び好ましくは、前記細胞の外部から、例えば細胞の外部に位置する抗体等の結合剤が、到達可能である、タンパク質等の分子の一部分を指す。好ましくは、この用語は、1つ若しくは複数の細胞外ループ若しくはドメイン又はそれらの断片を指す。
【０１２３】
用語「一部」又は「断片」は、本明細書では互換的に使用しており、連続要素を指す。タンパク質配列の一部又は断片は、好ましくは、タンパク質配列の連続した少なくとも6、特に、少なくとも8、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも50又は少なくとも100アミノ酸を含む。
【０１２４】
用語「一部分」は、連続及び/又は不連続要素を指す。タンパク質配列の一部分は、好ましくは、タンパク質配列の連続した及び/又は連続していない少なくとも6、特に、少なくとも8、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも50又は少なくとも100アミノ酸を含む。
【０１２５】
本発明によると、セプラーゼは、発現レベルが検出限界より下である場合、及び/又は発現レベルが低すぎて細胞に添加されたセプラーゼ特異的結合剤による結合を可能にしない場合、細胞において(実質的に)発現されない。
【０１２６】
本発明によると、セプラーゼは、発現レベルが検出限界より上である場合、及び/又は発現レベルが、細胞に添加されたセプラーゼ特異的結合剤による結合を可能にするのに十分な高さである場合、細胞において発現される。好ましくは、細胞において発現されるセプラーゼは、前記細胞の表面で発現される、又は前記細胞の表面に露出している。
【０１２７】
シスチンノットは、少なくとも3つのジスルフィド架橋(システイン分子のペアから形成されたもの)を含有するタンパク質構造モチーフである。それは、2つのジスルフィド結合及びそれらの連結主鎖セグメントによって形成された、埋め込まれた環を含み、第3のジスルフィド結合がその環を通り抜けている。この構造は、好ましくは、ベータ-シート構造と会合している。シスチンノットを含有するペプチドは、好ましくは25〜60、好ましくは25〜50又は25〜40アミノ酸残基長である。
【０１２８】
シスチンノットは、多くの種にわたって多くのペプチド又はタンパク質中に存在し、かなりの構造安定性をもたらす。ジスルフィド結合のトポロジーが異なる3タイプのシスチンノットがある:成長因子シスチンノット(GFCK)、阻害剤シスチンノット(ICK)、及び環状シスチンノット、又はシクロチド。
【０１２９】
阻害剤シスチンノット(ICK)又はノッチンは、3つのジスルフィド架橋を含有するタンパク質構造モチーフである。(第1のシステインと第4のシステイン、及び第2のシステインと第5のシステインを、それぞれ連結する)2つのジスルフィドは、それらの間のポリペプチドセクションと共にループを形成し、このループを(配列中、第3のシステインと第6のシステインを連結する)第3のジスルフィド結合が貫通しており、その結果、ノットになる。このモチーフは、クモ類及び軟体動物からのもの等の無脊椎動物毒素によく見られる。このモチーフは、植物に見られる一部の阻害剤タンパク質にも見られる。
【０１３０】
したがって、本発明によると、ICKモチーフは、2つのシステイン間主鎖セグメントと、それらの連結ジスルフィド結合、CysI-CysIV及びCysII-CysVとを含み、これらが環を形成し、その環に第3のジスルフィド結合、CysIII-CysVI、が貫通している。
【０１３１】
ICKモチーフは、環状シスチンノット又はシクロチドに類似しているが、後者ファミリーに存在するポリペプチド主鎖の環化を欠く。成長因子シスチンノット(GFCK)は、モチーフを共有するが、そのトポロジーは、(第2のシステインと第5のシステインの間及び第3のシステインと第6のシステインの間にそれぞれ形成される)ループを通り抜ける、第1のシステインと第4のシステインの間の結合であるようなトポロジーである。
【０１３２】
シクロチドは、2つの主要構造サブファミリーに分類される。メビウス型シクロチド(Moebius cyclotide)、2つのうち頻度が低い方は、局所的な180°の主鎖のねじれを誘導するシス-プロリンをループ5に含有するが、ブレスレット型シクロチド(bracelet cyclotide)は含有しない。トリプシン阻害剤シクロチドは、配列多様性及び天然の活性に基づいて、それらの独自のファミリーに分類される。トリプシン阻害剤シクロチドは、ノッチン又は阻害剤シスチンノットとして公知のカボチャ植物からの非環状トリプシン阻害剤のファミリーとの相同性が、他のシクロチドとの相同性より高い。
【０１３３】
MCoTI-I及びMCoTI-IIは、棘瓢箪(spinal gourd)ナンバンカラスウリの種子からの天然ポリペプチドである。これらのポリペプチドは、トリプシン様プロテアーゼの阻害剤であり、アミノ末端とカルボキシ末端を連結する追加のループと3つの保存ジスルフィド結合の結び目のある配置とを含有する。シスチンノットは、3つの分子内ジスルフィド結合によって規定され、直鎖状ペプチド配列のCysICysIV及びCysII-CysVが環を形成し、この環に第3のジスルフィド結合、CysIII-CysVI、が貫通している。この配置は、並外れた熱及びタンパク質分解安定性を示す、明確に定義されており極めて安定している足場を提供する。構造的類似性及び共通の生物活性、すなわち、トリプシンファミリーのプロテアーゼの阻害に起因して、MCoTI-I及びMCoTI-IIは、低分子プロテアーゼ阻害剤のカボチャ阻害剤シスチン-ノット(ICK)ファミリーに分類されている。このファミリーのメンバーは、シスチン-ノットフレームワークを生じさせるように3つの分子内ジスルフィド結合によって一緒に保持されている、小さい3本鎖β-シート及び短い310ヘリックスを形成する鎖式分子である。MCoTI-I及びMCoTI-IIは、環状であるカボチャ阻害剤の大きいファミリーの唯一の公知メンバーである。環化ループを欠くMCoTI-IIの鎖式バリアントが合成されている。
【０１３４】
本発明によると、本明細書に記載のペプチドを、当技術分野において周知である化学合成方法によって、単離されたペプチドとして、又は別のペプチド若しくはポリペプチドの一部として、合成的に産生させることができる。或いは、ペプチドを産生する微生物においてペプチドを産生させることができ、その後、そのペプチドを単離し、必要に応じて更に精製する。したがって、ペプチドを、微生物、例えば、細菌、酵母若しくは真菌において、真核細胞、例えば、哺乳動物若しくは昆虫細胞において、又は組換えウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルス、若しくはセンダイウイルスにおいて産生させることができる。ペプチドの産生に適する細菌としては、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、又はペプチドを発現することができる任意の他の細菌が挙げられる。ペプチドの発現に適する酵母型としては、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)、カンジダ属(Candida)、又はペプチドを発現することができる任意の他の酵母が挙げられるが、これらに限定されない。上述の細菌、組換えウイルスベクター、真核細胞を使用してペプチドを産生させる方法は、当技術分野において公知である。
【０１３５】
ペプチドを産生させるために、ペプチドをコードする核酸は、好ましくはプラスミド内にあり、核酸は、微生物においてペプチドを発現させるプロモーターに作動可能に連結されている。適するプロモーターとしては、T7ファージプロモーター、T3ファージプロモーター、β-ガラクトシダーゼプロモーター、及びSp6ファージプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドを単離及び精製する方法は当技術分野において周知であり、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又は遠心分離等の方法を含む。
【０１３６】
本発明のペプチドをそれ自体で又は融合ペプチドの一部として、異種ペプチド又はタンパク質にコンジュゲートさせることができる。そのような異種タンパク質としては、ウシ血清アルブミン(BSA)等の担体タンパク質、及びホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼを含むがこれらに限定されないレポーター酵素が挙げられるが、それらに限定されない。更に、ペプチド、又はペプチドを含む融合ペプチドを、蛍光レポーター分子に化学的にコンジュゲートさせることができ、蛍光レポーター分子としては、フルオレセイン又はR-フィコエリトリンが挙げられるが、これらに限定されない。担体タンパク質、酵素及び蛍光レポーター分子をペプチド及び融合ペプチドにコンジュゲートさせる方法は、当技術分野において周知である。
【０１３７】
ペプチドの単離を助長するために、融合ポリペプチドの簡易回収、例えば、アフィニティークロマトグラフィー又は金属アフィニティークロマトグラフィー、好ましくはニッケルアフィニティークロマトグラフィーによるその単離を可能にする異種タグ、例えば、異種ポリペプチド又はポリヒスチジン、好ましくは6ヒスチジン残基、にペプチドが翻訳的に融合されている(共有結合的に連結されている)、融合ポリペプチドを製造することができる。場合によっては、精製後にタグを除去することが望ましいこともある。そのために、融合ポリペプチドがペプチドと異種タグの間の接合部に切断部位を含むことも企図している。切断部位は、その部位においてそのアミノ酸配列に特異的な酵素で切断されるアミノ酸配列からなる。
【０１３８】
本明細書に記載のセプラーゼ結合剤は、セプラーゼ又はセプラーゼ抗体の存在又は量をアッセイするためのアッセイに使用することができる。そのようなアッセイは、免疫検出を含むがこれに限定されない多数の方法で行うことができ、ELISA、特にペプチドELISA、競合結合アッセイ、RIA等を含む。本発明の方法は、セプラーゼ又はセプラーゼ抗体の定量的及び/又は定性的評価、例えば、絶対及び/又は相対評価を可能にする。
【０１３９】
一般に、アッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)実施形態を使用して行われる。
【０１４０】
本明細書において使用する用語「酵素結合免疫吸着アッセイ又はELISA」は、マルチウェルプレート形式(通常は1プレート当り96ウェル)で試料、例えば、血漿、血清又は細胞/組織抽出物からのタンパク質濃度を定量的に又は半定量的に判定する方法に関する。おおまかに言えば、溶液中のタンパク質をELISAプレートに吸着させる。目的のタンパク質に特異的な抗体を使用して、プレートをプローブしてもよい。バックグラウンドを(IHCの場合と同様に)ブロッキング及び洗浄方法の最適化によって最小化し、特異性を陽性及び陰性対照の存在によって保証する。検出方法は、通常は、比色分析又は化学発光に基づく。
【０１４１】
第1のウェル又は一連のウェルが、ウェルの表面に固定化されたセプラーゼに対するモノクローナル抗体を収容している、複数のウェルを含有するマイクロタイタープレートを用意してもよい。結合されたモノクローナル抗体を収容しているウェルに試料を添加してもよい。試料中のセプラーゼは、モノクローナル抗体と結合する。抗体複合体が形成するのに十分な時間、ELISAをインキュベートする。本発明のペプチドを更に添加してもよい。ペプチドは、融合ポリペプチドの一部であってもよい。その後、ウェルを洗浄して一切の未結合材料を除去する。次いで、ウェルを標識された抗体、又は融合ポリペプチドと結合して検出することができる複合体を形成するレポーター分子にコンジュゲートされた抗体と共にインキュベートしてもよい。標識又はレポーターからの検出可能なシグナルは、試料がセプラーゼを含有することを示す一方で、シグナルの不在は、試料がセプラーゼを含有しないことを示しうる。融合ポリペプチドが、標識又はレポーター分子、例えば、レポーター酵素、例えばアルカリホスファターゼを含む場合、標識された抗体を必要とせずに抗体複合体を直接検出することができる。
【０１４２】
或いは、第1のウェル又は一連のウェルが、ウェルの表面に固定化された担体タンパク質又は融合ポリペプチドにコンジュゲートされていてよい本発明のペプチドを収容している、複数のウェルを含有するマイクロタイタープレートを用意してもよい。結合されたペプチドを収容しているウェルに試料を添加してもよい。試料中のセプラーゼ、及びウェル表面と結合しているペプチドを、複合体が形成するのに十分な時間インキュベートする。その後、ウェルを洗浄して一切の未結合材料を除去する。ウェルを標識された抗体、又はセプラーゼと結合して検出することができる複合体を形成するレポーター分子にコンジュゲートされた抗体と共にインキュベートすることによって、ウェル内に固定化されたペプチドと結合しているセプラーゼの量を判定する。レポーターからの検出可能なシグナルは、セプラーゼを含有する試料を示す一方で、シグナルの不在は、試料がセプラーゼを含有しないことを示す。シグナルの強度によって、試料中のセプラーゼの濃度の推定値を得ることができる。
【０１４３】
本発明によると、アッセイすべきセプラーゼを細胞の表面で発現させることができる。
【０１４４】
本発明のペプチドは、セプラーゼに対する抗体の存在を検出する方法にも使用することができる。これらの方法を実施するのに適しているイムノアッセイの設計は多大に変更されることがあり、様々なこれらのイムノアッセイが当技術分野において公知である。適するイムノアッセイプロトコルは、例えば、競合、又は直接反応、又はサンドイッチ型アッセイに基づくことがある。使用するイムノアッセイプロトコルは、例えば、固体支持体を使用することもあり、又は免疫沈降によることもある。アッセイは、標識されたペプチドの使用を含むことがあり、その標識は、例えば、蛍光、化学発光、放射性又は色素分子であってもよい。特定の好ましいアッセイは、酵素標識及び媒介性イムノアッセイ、例えばELISAアッセイである。
【０１４５】
したがって、ペプチドをELISAアッセイ等のアッセイで使用して、試料中のセプラーゼに対する抗体を判定することもできる。このために、ELISAプレートのウェルをペプチドでコーティングしてもよい。セプラーゼ、及びウェル表面に結合されたペプチドを、複合体が形成するのに十分な時間インキュベートしてもよい。その後、血漿等の試料を添加してもよく、セプラーゼ特異的抗体(一次抗体)の検出を、一次抗体に対する標識された二次抗体を用いて行ってもよい。
【０１４６】
本明細書に記載するようにアッセイ試薬として使用する場合、本発明のペプチドを標識にコンジュゲートさせてもよい。
【０１４７】
本発明によると、標識は、その存在を容易に検出することができる任意の実体である。好ましくは、標識は、直接標識である。直接標識は、それらの天然の状態で、肉眼で容易に見える、又は光学フィルター及び/若しくは印加刺激、例えば、蛍光を促進するためのUV線を活用して容易に見える、実体である。例としては、放射性化合物、化学発光化合物、電気活性化合物(例えば、レドックス標識)、及び蛍光化合物が挙げられる。直接微粒子状標識、例えば、染料ゾル、金属ゾル(例えば金)及び着色ラテックス粒子も、非常に適しており、蛍光化合物と共に好ましい。これらの選択肢のうち、着色ラテックス粒子及び蛍光化合物が最も好ましい。小領域又は体積への標識の濃縮は、容易に検出できるシグナル、例えば、極めて色の濃いエリアを生じさせるはずである。間接標識、例えば、酵素、例えばアルカリホスファターゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼも使用することができるが、これらは通常、基質等の1つ又は複数の現像試薬の添加を必要とし、その後、可視シグナルを検出することができる。
【０１４８】
本発明によると、標識は、(i)検出可能なシグナルを提供するように、(ii)第1又は第2の標識、例えば、FRET(蛍光共鳴エネルギー移動)によって提供される検出可能なシグナルを修飾するように第2の標識と相互作用するように、(iii)電荷、疎水性、形状若しくは他の物理的パラメーターによって移動度、例えば、電気泳動移動度に影響を与えるように、又は(iv)捕捉部分、例えば、親和性、抗体/抗原若しくはイオン性複合体化をもたらすように、機能することができる。標識として適しているのは、蛍光標識、発光標識、発色団標識、放射性同位体標識、同位体標識、好ましくは安定した同位体標識、等圧標識、酵素標識、粒子標識、特に金属粒子標識、磁性粒子標識、ポリマー粒子標識、小有機分子、例えばビオチン、受容体のリガンド、又は結合分子、例えば細胞接着タンパク質若しくはレクチン、結合剤の使用によって検出することができる核酸及び/又はアミノ酸残基を含む標識-配列、等のような構造である。標識は、非限定的に、硫酸バリウム、ヨーセタム酸、イオパノ酸、イポダートカルシウム、ジアトリゾ酸ナトリウム、ジアトリゾ酸メグルミン、メトリザミド、チロパノ酸ナトリウム、及び放射性診断用のものを含み、放射性診断用のものとしては、陽電子放射体、例えば、フッ素-18及び炭素-11、ガンマ放射体、例えば、ヨウ素-123、テクネチウム-99m、ヨウ素-131及びインジウム-111、核磁気共鳴用の核種、例えば、フッ素及びガドリニウムが挙げられる。好ましい実施形態において、標識は、セプラーゼ結合剤と結合されたDOTA (1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸)等のリガンドと複合体化することができる放射性核種、例えば、ルテチウム-177又はガリウム-68を含む。
【０１４９】
本発明のペプチドへの標識のコンジュゲーションは、共有結合若しくは非共有結合(疎水性結合を含む)によることも又は吸着によることもある。そのようなコンジュゲーションのための技術は、当技術分野では当たり前のことであり、用いる特定の試薬に容易に適応させることができる。
【０１５０】
本明細書において使用する用語「試料」は、患者から単離して分析のために使用することができる、任意の生体試料を含む。前記試料は、体液試料、組織試料、又は細胞試料であってよい。例えば、本発明によって包含される試料は、組織(例えば、切片又は外植片)試料、単一細胞試料、細胞コロニー試料、細胞培養試料、血液(例えば、全血又は血液画分、例えば血液細胞画分、血漿若しくは血清)試料、尿試料、又は他の末梢源からの試料である。前記試料は、混合又はプールされていてもよく、例えば、試料は、血液試料と尿試料の混合物であってもよい。前記試料を、患者から体液、細胞、細胞コロニー、外植片又は切片を取り出すことによって用意してもよいが、以前に単離された試料を使用することによって用意してもよい。例えば、従来の生検技術によって患者から組織試料を取り出してもよく、又は従来の採血技術によって患者から血液試料を採取してもよい。試料、例えば組織試料又は血液試料は、患者から治療的処置の開始前、治療的処置中、及び/又は治療的処置後に得てもよい。
【０１５１】
一実施形態において、試料は、体液試料である。本明細書において使用する用語「体液試料」は、患者の身体から得た任意の液体試料を指す。前記体液試料は、血液試料、尿試料、痰試料、母乳試料、脳脊髄液(CSF)試料、耳垢(耳くそ)試料、内リンパ試料、外リンパ試料、胃液試料、粘液試料、腹水試料、胸膜液試料、唾液試料、皮脂(皮膚の油)試料、精液試料、汗試料、涙試料、膣分泌液試料又は嘔吐物試料(これらの成分又は画分を含む)でありうる。前記体液試料は、混合又はプールされていてもよい。したがって、体液試料は、血液試料と尿試料の混合物、又は血液試料と脳脊髄液試料の混合物であってよい。前記体液試料を、患者から体液を取り出すことによって用意してもよいが、以前に単離された体液試料物質を使用することによって用意してもよい。好ましい一実施形態において、試料は、全血試料、又は血液画分試料、例えば、血液細胞画分、血清若しくは血漿試料である。
【０１５２】
一実施形態において、生体試料は、がん等の疾患に冒されている疑いがある組織から得た試料である。一実施形態において、生体試料は、腫瘍試料、例えば、腫瘍から得た、腫瘍細胞を含む試料である。本発明によると、用語「生体試料」は、処理された生体試料、例えば、生体試料の画分又は単離物、例えば、核酸及びペプチド/タンパク質単離物も含む。
【０１５３】
本発明によると、参照試料又は参照生物等の「参照物」は、本発明の方法で被検試料又は被検生物、すなわち患者から得た結果を相関させる及び比較するために使用することができる。通常は、参照生物は、健常生物、特に、腫瘍疾患に罹患していない生物である。
【０１５４】
「基準値」又は「基準レベル」は、十分多数の参照物を測定することによって実験により参照物から決定することができる。好ましくは、基準値は、少なくとも2、好ましくは少なくとも3、好ましくは少なくとも5、好ましくは少なくとも8、好ましくは少なくとも12、好ましくは少なくとも20、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも50、又は好ましくは少なくとも100の参照物を測定することによって決定される。
【０１５５】
本明細書において使用する「低減させる」、「減少させる」又は「阻害する」は、レベルの、例えば、発現レベルの又は細胞の増殖レベルの、好ましくは5%以上、10%以上、20%以上、より好ましくは50%以上、及び最も好ましくは75%以上の、総合的減少、又は総合的減少を引き起こす能力を意味する。生体試料等の被検試料中の物質の量は、参照試料中でその物質を検出できるが被検試料中にはない又は検出できない場合も、参照試料と比較して低減されている。
【０１５６】
「増加させる」又は「増強する」等の用語は、好ましくは、約少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、よりいっそう好ましくは少なくとも80%、及び最も好ましくは少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも500%、少なくとも1000%、少なくとも10000%又は更にはそれを超える増加又は増強に関する。生体試料等の被検試料中の物質の量は、被検試料中でその物質を検出できるが参照試料中にはない又は検出できない場合も、参照試料と比較して増加されている。
【０１５７】
本発明のペプチド等のセプラーゼ結合剤を固体支持体、例えば、イムノアッセイウェル若しくは尿試験紙の表面と結合しても、及び/又はキットの適する容器内に適する試薬、対照、説明書等と共に包装してもよい。
【０１５８】
したがって、本発明は、本発明の少なくとも1つのセプラーゼ結合剤を含むキットも提供する。好ましい実施形態において、キットは、少なくとも1つの追加の薬剤、例えば、イムノアッセイを行うための1つ若しくは複数の適する試薬、対照、又はキットの使用説明書を更に含む。
【０１５９】
本発明によると、本発明の少なくとも1つのセプラーゼ結合剤を含むアッセイデバイスが更に提供される。一実施形態において、アッセイデバイスは、酵素結合免疫吸着アッセイデバイスからなる群から選択される。
【０１６０】
そのようなデバイスは様々な形態をとることができ、行われるアッセイのまさにその性質に依存してそれを変更することができる。例えば、本発明のペプチドを固体支持体、典型的には、ニトロセルロース又は他の疎水性多孔質材料上にコーティングしてもよい。或いは、ペプチドを合成プラスチック材料、マイクロタイターアッセイプレート、マイクロアレイチップ、ラテックスビーズ、セルロース系又は合成ポリマー材料を含むフィルター、スライドガラス又はプラスチック製スライド、尿試験紙、毛細管充填デバイス等の上にコーティングしてもよい。これらの表面へのペプチドのコーティングは、当技術分野において公知の方法によって遂行することができる。タンパク質担体は、概して複合体化に使用され、BSA又は接着性ペプチドが最も好ましい。一実施形態において、本発明のペプチドは、固体支持体上に取り外し可能に固定化されている。更なる好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、固体支持体上に取り外し不能に固定化されている。
【０１６１】
本明細書に記載のペプチドを、ペプチドをコードするRNA等の核酸を投与することによって、及び/又はペプチドをコードするRNA等の核酸を含む宿主細胞を投与することによって患者に送達してもよいことを理解されたい。したがって、ペプチドをコードする核酸は、患者に投与されるとき、裸の形態で、又はリポソーム若しくはウイルス粒子の形態等の適する送達ビヒクル中に、又は宿主細胞内に存在することもある。与えられた核酸は、長期間にわたって持続的にペプチドを産生することができる。患者に送達すべき核酸は、組換え手段によって産生させることができる。核酸が宿主細胞内に存在することなく患者に投与される場合、核酸は、好ましくは、核酸によってコードされるペプチドの発現のために患者の細胞によって取り込まれる。宿主細胞内に存在している核酸が患者に投与される場合、核酸は、好ましくは、患者内で宿主細胞によって発現されて、核酸によってコードされるペプチドを産生する。
【０１６２】
本明細書において使用する用語「核酸」は、デオキシリボ核酸(DNA)及びリボ核酸(RNA)、例えば、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、組換えで産生された及び化学的に合成された分子を含むことが意図される。核酸は、一本鎖状であっても二本鎖状であってもよい。RNAは、in vitroで転写されたRNA (IVT RNA)、又は合成RNAを含む。
【０１６３】
本明細書において使用する用語「RNA」は、リボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」は、ベータ-D-リボ-フラノース部分の2'位にヒドロキシル基があるヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖RNA、一本鎖RNA、単離されたRNA、例えば部分的に精製されたRNA、本質的に純粋なRNA、合成RNA、組換えで産生されたRNAはもちろん、1つ又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び/又は変更によって天然起源のRNAとは異なる、変更されたRNAも含む。そのような変更は、例えば、RNAの末端への、又は内部への、例えば、RNAの1つ若しくは複数のヌクレオチドにおける非ヌクレオチド物質の付加を含むことができる。RNA分子中のヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、例えば、非天然起源のヌクレオチド又は化学合成されたヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドも含むことができる。これらの変更されたRNAを、アナログ、又は天然起源のRNAのアナログと呼ぶことができる。
【０１６４】
本発明によると、用語「RNA」は、「メッセンジャーRNA」を意味する「mRNA」を含み、好ましくは「mRNA」に関し、鋳型としてDNAを使用して産生されうる「転写産物」に関し、ペプチド又はタンパク質をコードする。mRNAは5'非翻訳領域(5'-UTR)、タンパク質又はペプチドコード領域、及び3'非翻訳領域(3'-UTR)を通常は含む。本発明の一実施形態において、RNAは、in vitro転写又は化学合成によって得られる。好ましくは、mRNAは、鋳型DNAを使用するin vitro転写によって産生される。in vitro転写方法論は、当業者に公知である。例えば、市販の様々なin vitro転写キットがある。
【０１６５】
本発明に従って使用されるRNAの発現及び/又は安定性を増加させるために、好ましくは、発現されたペプチド又はタンパク質の配列を変更することなく、そのRNAを修飾することができる。
【０１６６】
RNAとの関連で本発明に従って使用する用語「修飾」は、RNA中に天然に存在しない前記RNAのあらゆる修飾を含む。
【０１６７】
本発明の一実施形態において、本発明に従って使用されるRNAは、キャップのない5'-三リン酸を有さない。そのようなキャップのない5'-三リン酸の除去は、RNAをホスファターゼで処理することによって果たすことができる。
【０１６８】
本発明によるRNAは、その安定性を増加させる及び/又は細胞毒性を減少させるために、修飾された天然起源の又は合成リボヌクレオチドを有することもある。例えば、一実施形態において、本発明に従って使用されるRNA中の5-メチルシチジンは、部分的に又は完全に、好ましくは完全に、シチジンに置換される。或いは又は加えて、一実施形態において、本発明に従って使用されるRNA中のプソイドウリジンは、部分的に又は完全に、好ましくは完全に、ウリジンに置換される。
【０１６９】
一実施形態において、用語「修飾」は、RNAに5'キャップ又は5'キャップアナログを提供することに関する。用語「5'キャップ」は、mRNA分子の5'末端に見られるキャップ構造を指し、一般に、異例の5'-5'三リン酸結合によってmRNAに連結されているグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態において、このグアノシンは、7位がメチル化されている。用語「従来の5'キャップ」は、天然起源のRNA 5'キャップ、好ましくは、7-メチルグアノシンキャップ(m7G)を指す。本発明に関して、用語「5'キャップ」は、RNAキャップ構造に似ており、好ましくはin vivo及び/又は細胞内で、RNAに結合するとRNAを安定化する能力を有するように修飾されている5'キャップアナログを含む。
【０１７０】
RNAへの5'キャップ又は5'キャップアナログの提供は、生成されるRNA鎖に前記5'キャップが同時転写的に組み込まれる、前記5'キャップ又は5'キャップアナログの存在下での鋳型DNAのin vitro転写によって果たされてもよく、又はRNAは、in vitro転写によって生成されてもよく、キャッピング酵素、例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して転写後にRNAに5'キャップを結合させてもよい。
【０１７１】
RNAは、更なる修飾を含むこともある。例えば、本発明において使用されるRNAの更なる修飾は、天然起源のポリ(A)尾部の伸長若しくは短縮化、又は5'-若しくは3'-非翻訳領域(UTR)の変更、例えば、前記RNAのコード領域に関係のないUTRの導入、例えば、グロビン遺伝子、例えばアルファ2-グロビン、アルファ1-グロビン、ベータ-グロビン、好ましくはベータ-グロビン、より好ましくはヒトベータ-グロビン、に由来する3'-UTRの1つ若しくは複数、好ましくは2つのコピーの挿入であってもよい。
【０１７２】
本発明に関して、用語「転写」は、DNA配列内の遺伝コードがRNAに転写されるプロセスに関する。その後、RNAは、タンパク質に翻訳されることもある。本発明によると、用語「転写」は、「in vitro転写」を含み、用語「in vitro転写」は、RNA、特にmRNAが無細胞系で、好ましくは適切な細胞抽出物を使用して、in vitroで合成されるプロセスに関する。好ましくは、クローニングベクターが転写産物の生成に適用される。これらのクローニングベクターは、一般に転写ベクターとして指示され、本発明によると用語「ベクター」によって包含される。
【０１７３】
本発明によると、用語「翻訳」は、メッセンジャーRNAの鎖が、ペプチド又はタンパク質になるためのアミノ酸配列の集合を指示する、細胞のリボソームにおけるプロセスに関する。
【０１７４】
用語「発現」は、本発明によると、その最も一般的な意味で使用しており、RNA及び/又はペプチド又はタンパク質の、例えば転写及び/又は翻訳による、産生を含む。RNAに関して、用語「発現」又は「翻訳」は、特に、ペプチド又はタンパク質の産生に関する。この用語は、核酸の部分的発現も含む。更に、発現は、一過的又は安定的でありうる。本発明によると、用語発現は、「異所的発現」又は「異常発現」も含む。
【０１７５】
「異所的発現」又は「異常発現」は、本発明によると、発現が、基準、例えば、ある特定のタンパク質、例えばセプラーゼの異所的又は異常発現に関連する疾患に罹患していない対象における状態と比較して変更される、好ましくは増加されることを意味する。発現の増加は、少なくとも10%、特に、少なくとも20%、少なくとも50%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも500%、少なくとも1000%、少なくとも10000%又はそれ超増加することを指す。一実施形態において、発現が罹病組織でしか見られず、しかも健常組織では発現が抑止される。
【０１７６】
用語「特異的に発現される」は、タンパク質が特異的組織又は器官でしか本質的に発現されないことを意味する。例えば、胃粘膜で特異的に発現されるタンパク質は、前記タンパク質が主として胃粘膜で発現され、他の組織では発現されない、又は他の組織若しくは器官型では有意な程度に発現されないことを意味する。したがって、胃粘膜の細胞で排他的に発現され、精巣等の他のどの組織でも有意に低い程度に発現されるタンパク質は、胃粘膜の細胞で特異的に発現される。
【０１７７】
本発明によると、用語「をコードする核酸」は、核酸が、適切な環境に、好ましくは細胞内に存在すると発現されて、その核酸がコードするタンパク質又はペプチドを産生することができることを意味する。
【０１７８】
本発明に従って記載する核酸は、好ましくは単離されている。用語「単離された核酸」は、本発明によると、核酸が、(i) in vitroで、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、増幅された、(ii)クローニングによって組換えで産生された、(iii)例えば切断及びゲル-電気泳動分画によって、精製された、又は(iv)例えば化学合成によって、合成されたことを意味する。単離された核酸は、組換えDNA技術による操作に利用可能である核酸である。
【０１７９】
本発明によると、例えば核酸及びアミノ酸配列に関して、用語「バリアント」は、あらゆるバリアント、特に、変異体、スプライスバリアント、高次構造、アイソフォーム、アレルバリアント、種バリアント及び種ホモログ、特に、天然に存在するものを含む。アレルバリアントは、正常な遺伝子配列の変更に関し、その重要性は、多くの場合、不明である。完全遺伝子シークエンシングは、所与の遺伝子について多数のアレルバリアントを同定することが多い。種ホモログは、所与の核酸又はアミノ酸配列のものとは起源が異なる種に関する核酸又はアミノ酸配列である。
【０１８０】
核酸分子に関して、用語「バリアント」は、縮重核酸配列を含み、本発明による縮重核酸は、遺伝コードの縮重に起因してコドン配列内の参照核酸とは異なる核酸である。
【０１８１】
更に、本発明による特異的核酸配列の「バリアント」は、単一の又は複数の、例えば、少なくとも2、少なくとも4、少なくとも6の、好ましくは最大3、最大4、最大5、最大6、最大10、最大15若しくは最大20の、ヌクレオチド置換、欠失及び/又は付加を含む、核酸配列を含む。
【０１８２】
好ましくは、所与の核酸配列と前記所与の核酸配列のバリアントである核酸配列との同一性の程度は、少なくとも約60%、65%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%になる。好ましくは、参照核酸配列の全長の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%又は少なくとも約100%である領域について、同一性度が得られる。例えば、参照核酸配列が200ヌクレオチドからなる場合、好ましくは少なくとも約20、少なくとも約40、少なくとも約60、少なくとも約80、少なくとも約100、少なくとも約120、少なくとも約140、少なくとも約160、少なくとも約180、又は約200ヌクレオチド、好ましくは連続ヌクレオチドについて、類似性又は同一性度が得られる。好ましい実施形態において、参照核酸配列の全長について同一性度が得られる。
【０１８３】
2つの核酸配列間の「配列同一性」は、それらの配列間で同一であるヌクレオチドのパーセンテージを示す。
【０１８４】
用語「同一性パーセンテージ」は、最良アラインメント後に得られる、比較すべき2つの配列間で同一である、ヌクレオチドのパーセンテージを示すことを意図し、このパーセンテージは純粋に統計的なものであり、2つの配列間の差はランダムに且つそれらの全長にわたって分布する。2つのヌクレオチド配列間の配列比較は、従来、これらの配列を最適にアラインメントした後に比較することによって行われ、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するために、セグメントごとに又は「比較ウィンドウ」ごとに行われる。比較のための最適な配列アラインメントは、手作業でのほかに、Smith及びWaterman (1981) Ads App. Math. 2、482頁の局所相同性アルゴリズムによって、Neddleman及びWunsch、1970、J. Mol. Biol. 48、443頁の局所相同性アルゴリズムによって、Pearson及びLipman、1988、Proc. Natl Acad. Sci. USA 85、2444頁の類似性検索方法によって、又はこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータープログラム(Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group社、575 Science Drive、Madison、Wis.のGAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N及びTFASTA)によって、生成することができる。
【０１８５】
同一性パーセンテージは、2つの配列間を比較して同一位置の数を決定し、この数を比較した位置の数で割り、得られた結果に100を掛けて、これら2つの配列間の同一性パーセンテージを得ることによって計算される。
【０１８６】
好ましくは、所与の核酸配列と、前記所与の核酸配列のバリアントである核酸配列は、ハイブリダイズすることができる。
【０１８７】
核酸は、別の核酸に、これらの2つの配列が互いに相補的である場合、「ハイブリダイズすることができる」又は「ハイブリダイズする」。核酸は、別の核酸に、これらの2つの配列が互いに安定した二重鎖を形成することができる場合、「相補的」である。本発明によると、ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件(ストリンジェントな条件)下で行われる。ストリンジェントな条件は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、J. Sambrookら編、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory press社、Cold Spring Harbor、New York、1989、又はCurrent Protocols in Molecular Biology、F.M. Ausubelら編、John Wiley & Sons. Inc.社、New Yorkに記載されており、例えば、ハイブリダイゼーション用緩衝液(3.5 x SSC、0.02%フィコール、0.02%ポリビニルピロリドン、0.02%ウシ血清アルブミン、2.5mM NaH2PO4 (pH7)、0.5% SDS、2mM EDTA)中、65℃でのハイブリダイゼーションを指す。SCCは、0.15M塩化ナトリウム/0.15Mクエン酸ナトリウム、pH7である。ハイブリダイゼーション後、DNAが移された膜を、例えば、2 x SSC中、室温で、次いで、0.1〜0.5×SSC/0.1×SDS中、最高68℃の温度で洗浄する。
【０１８８】
相補性パーセントは、核酸分子中の、第2の核酸配列と水素結合(例えば、ワトソン-クリック塩基対合)を形成することができる、連続する残基のパーセンテージを示す(例えば、10のうち5、6、7、8、9、10は、50%、60%、70%、80%、90%及び100%相補的)。「完全に相補的(Perfectly complementary)」又は「完全相補的(fully complementary)」は、核酸配列の連続する残基全てが、第2の核酸配列中の同数の連続する残基と水素結合することを意味する。好ましくは、本発明による相補性度は、少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、よりいっそう好ましくは少なくとも90%、又は最も好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%若しくは99%である。最も好ましくは、本発明による相補性度は、100%である。
【０１８９】
用語「誘導体」は、ヌクレオチド塩基上の、糖上の、又はリン酸塩上の、核酸のあらゆる化学的誘導体化を含む。用語「誘導体」は、天然起源でないヌクレオチド及びヌクレオチドアナログを含有する核酸も含む。好ましくは、核酸の誘導体化は、その安定性を増加させる。
【０１９０】
核酸は、本発明によると、単独で、又は他の核酸、特に異種核酸との組合せで存在することもある。好ましくは、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸は、前記ペプチド又はタンパク質を発現する。好ましい実施形態において、核酸は、前記核酸に対して相同であって非相同であってもよい、発現制御配列又は調節配列に、機能的に連結されている。コード配列と調節配列は、前記コード配列の発現又は転写が前記調節配列の制御下又は影響下にあるように互いに共有結合的に連結されている場合、互いに「機能的に」連結されている。コード配列を機能性タンパク質に翻訳すべき場合には、調節配列を前記コード配列に機能的に連結させることで、前記調節配列を導入することによって、前記コード配列内でフレームシフトを生じさせることも、前記コード配列を所望のタンパク質若しくはペプチドに翻訳することができなくなることもなく、前記コード配列が転写されることになる。
【０１９１】
用語「発現制御配列」又は「調節配列」は、本発明によると、遺伝子の発現を調節する、プロモーター、エンハンサー及び他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態において、発現制御配列を調節することができる。調節配列の正確な構造は、種又は細胞型の関数として変わりうるが、転写及び翻訳の開始にそれぞれ関与する5'非転写及び5'非翻訳配列、例えば、TATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列等を一般に含む。より具体的には、5'非転写調節配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためにプロモーター配列を含む、プロモーター領域を含む。調節配列は、エンハンサー配列又は上流のアクチベーター配列も含むことがある。
【０１９２】
本発明によると、更に、核酸は、前記核酸によってコードされているタンパク質又はペプチドの宿主細胞からの分泌を制御するペプチドをコードする別の核酸との組合せで存在することもある。本発明によると、核酸は、コードされているタンパク質若しくはペプチドを宿主細胞の細胞膜上に固定させる又は前記細胞の特定の細胞小器官に区画化させるペプチドをコードする別の核酸との組合せで存在することもある。同様に、レポーター遺伝子又は任意の「タグ」に相当する核酸との組合せが可能である。
【０１９３】
好ましい実施形態において、組換え核酸分子は、本発明によると、核酸の発現を制御する、必要に応じてプロモーターを伴う、ベクターである。用語「ベクター」は、ここではその最も一般的な意味で使用しており、核酸の、例えば、真核細胞及び/又は原核細胞への導入、並びに必要に応じてゲノムへの組み込みを可能にする、前記核酸用の任意の中間ビヒクルを含む。この種のベクターは、好ましくは、細胞内で複製及び/又は発現される。中間ビヒクルを、例えば、エレクトロポレーションにおける、マイクロインジェクタイルでのボンバードメントにおける、リポソーム投与における、アグロバクテリアを活用する移入における、又はDNA若しくはRNAウイルスによる挿入における使用に適応させることができる。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ又はウイルスゲノムを含む。
【０１９４】
本発明による核酸は、宿主細胞のトランスフェクションに使用することができる。ここでの核酸は、組換えDNAと組換えRNAの両方を意味する。組換えRNAを鋳型DNAのin vitro転写によって調製してもよい。更に、それを適用する前に配列の安定化、キャッピング及びポリアデニル化によって修飾してもよい。
【０１９５】
本発明に関して用語「組換え」は、「遺伝子工学によって作製された」を意味する。好ましくは、本発明に関して組換え核酸等の「組換え物」は天然起源のものではない。
【０１９６】
本明細書において使用する用語「天然起源の」は、物体を自然界で見つけることができることを指す。例えば、生物(ウイルスを含む)内に存在し、天然の源から単離することでき、研究室で人間によって意図的に修飾されていない、ペプチド又は核酸は、天然起源のものである。
【０１９７】
用語「細胞」又は「宿主細胞」は、好ましくは、その正規の細胞内成分、例えば、酵素、細胞小器官又は遺伝物質を放出していない無傷細胞、すなわち、無傷の膜を有する細胞に関する。無傷細胞は、好ましくは、生細胞、すなわち、その正常な代謝機能を行うことができる生存細胞である。好ましくは、前記用語は、本発明によると、外来性核酸をトランスフェクトすることができる任意の細胞に関する。好ましくは、外来性核酸をトランスフェクトすると、細胞は、その核酸を発現することができる。
【０１９８】
用語「宿主細胞」は、本発明によると、原核細胞(例えば、大腸菌(E. coli))又は真核細胞(例えば、樹状細胞、B細胞、CHO細胞、COS細胞、K562細胞、酵母細胞及び昆虫細胞)を含む。哺乳動物細胞、例えば、ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、霊長類からの細胞が、特に好ましい。細胞は、非常に多数の組織型に由来し、初代細胞及び細胞株を含みうる。具体的な例は、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄の幹細胞、及び胚性幹細胞を含む。核酸は、宿主細胞内に単一コピーの、又は2つ以上のコピーの形態で存在することもあり、一部の実施形態において、宿主細胞において発現される。
【０１９９】
用語「ペプチド」は、オリゴペプチド及びポリペプチドを含み、ペプチド結合によって共有結合的に接合されている2つ以上、好ましくは3つ以上、好ましくは4つ以上、好ましくは6つ以上、好ましくは8つ以上、好ましくは10以上、好ましくは13以上、好ましくは16以上、好ましくは21以上、好ましくは最大8、10、20、30、40又は50、特に100のアミノ酸を含む物質を指す。用語「タンパク質」は、大きいペプチド、好ましくは、100を超えるアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般に、用語「ペプチド」及び「タンパク質」は同義語であり、本明細書では互換的に使用している。
【０２００】
本発明によると、ペプチドは、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸を含みうる。一実施形態において、ペプチドは、天然アミノ酸のみを含む。
【０２０１】
本発明によると、用語「非天然アミノ酸」は、20の天然アミノ酸種のものとは異なる構造を有するアミノ酸を指す。非天然アミノ酸は、天然アミノ酸のものに類似した構造を有するので、所与の天然アミノ酸の誘導体又はアナログとして分類されることがある。
【０２０２】
本発明によると、用語「環状ペプチド」は、環を形成しているペプチド又はポリペプチド鎖に関する。ペプチドは、次の4つの異なる方法で環化されうる:頭-尾結合(C末端-N末端結合)、頭-側鎖結合、側鎖-尾結合、又は側鎖-側鎖結合。本発明によると、分子内ジスルフィド架橋を形成して環状ペプチドをもたらすことができるシステイン等のチオール基を含有する2つ以上の残基を含有するペプチドが、特に好ましい。
【０２０３】
本発明によると、ペプチドは、1つ又は複数の他の化合物と共有結合又は非共有結合していることもある。そのような化合物には、ペプチド性化合物、例えばペプチド及びタンパク質、並びに非ペプチド性化合物、例えばポリエチレングリコール(PEG)が含まれる。
【０２０４】
一実施形態において、本明細書に記載のペプチドは、PEG化されている。PEG化は、ポリエチレングリコール(PEG)ポリマー鎖を別の分子、例えばペプチド又はタンパク質、に共有結合させる方法である。PEGの共有結合は、薬剤を宿主の免疫系から「遮蔽」(免疫原性及び抗原性を低減させる)し、薬剤の流体力学的サイズ(溶液中でのサイズ)を増加させることができ、これは、腎クリアランスを低減させることによってその薬剤の循環時間を延長する。PEG化は、疎水性薬物及びタンパク質に水溶性をもたらすこともできる。
【０２０５】
好ましくは、本発明に従って記載するタンパク質及びペプチドは単離されている。用語「単離されたタンパク質」又は「単離されたペプチド」は、タンパク質又はペプチドがその天然環境から分離されていることを意味する。単離されたタンパク質又はペプチドは、本質的に精製された状態でありうる。用語「本質的に精製された」は、そのタンパク質又はペプチドに自然界又はin vivoでは付随している他の物質が本質的にないことを意味する。そのようなタンパク質及びペプチドは、例えば、免疫学的アッセイ若しくは診断アッセイにおいて、又は治療薬として使用することができる。本発明に従って記載するタンパク質又はペプチドを生体試料、例えば、組織又は細胞ホモジネートから単離することができ、非常に多数の原核生物又は真核生物発現系において組換え発現させることもできる。
【０２０６】
用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に連結されている少なくとも2本の重(H)鎖及び2本の軽(L)鎖を含む糖タンパク質、並びにそのような糖タンパク質の抗原結合部分を含む任意の分子を含む。用語「抗体」は、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体の結合断片又は誘導体を含む分子(限定ではないが、一本鎖抗体、例えばscFv、並びに抗原結合抗体断片、例えばFab及びFab'断片を含む)を含み、抗体、例えば、原核細胞において発現される抗体、非グリコシル化抗体、並びに本明細書に記載の任意の抗原結合抗体断片及び誘導体、の全ての組換え形態も含む。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではVHと略記する)及び重鎖定常領域で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではVLと略記する)及び軽鎖定常領域で構成される。VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)と称する、より高度に保存される領域が散在している、相補性決定領域(CDR)と称する超可変性の領域に、更に細分することができる。各VH及びVLは、3つのCDR及び4つのFRで構成され、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端へ次の順序で配置されている:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)と古典的補体系の第1の成分(Clq)と含む宿主組織又は因子との免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【０２０７】
特定のアミノ酸配列、例えば配列表に示すもの、に関して本明細書で与える教示は、前記特定の配列と機能的に等価である配列、例えば、特定のアミノ酸配列のものと同一の又は類似の特性を示すアミノ酸配列、をもたらす前記特定の配列のバリアントにも関するように解釈されたい。1つの重要な特性は、セプラーゼ等の標的との結合の保持である。
【０２０８】
本発明では、アミノ酸配列の「バリアント」は、アミノ酸挿入バリアント、アミノ酸付加バリアント、アミノ酸欠失バリアント、及び/又はアミノ酸置換バリアントを含む。タンパク質のN末端及び/又はC末端部に欠失を含むアミノ酸欠失バリアントは、N末端及び/又はC末端短縮化バリアントとも呼ばれる。
【０２０９】
アミノ酸挿入バリアントは、特定のアミノ酸配列内に単一の又は2つ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列バリアントの場合、1つ又は複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列内の特定の部位に挿入されるが、結果として得られる生成物を適切にスクリーニングすることでランダム挿入も可能である。
【０２１０】
アミノ酸付加バリアントは、1つ又は複数のアミノ酸、例えば1、2、3、5、10、20、30、50又はそれ超のアミノ酸、のアミノ末端融合及び/又はカルボキシ末端融合を含む。
【０２１１】
アミノ酸欠失バリアントは、配列からの1つ又は複数のアミノ酸の除去、例えば1、2、3、5、10、20、30、50又はそれ超のアミノ酸の除去により特徴付けられる。欠失は、ペプチド又はタンパク質の任意の位置にあってもよい。
【０２１２】
アミノ酸置換バリアントは、配列中の少なくとも1つの残基が除去され、その位置に別の残基が挿入されていることにより特徴付けられる。相同タンパク質又はペプチド間で保存されないアミノ酸配列内の位置にある修飾、及び/又はアミノ酸を、類似の特性を有する他のものと置き換えることが好ましい。好ましくは、タンパク質バリアントのアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電している又は非荷電のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、側鎖に関連性があるアミノ酸のファミリーのうちの１つについての置換を含む。天然起源のアミノ酸は、一般に、次の4つのファミリーに分けられる:酸性(アスパルテート、グルタメート)、塩基性(リジン、アルギニン、ヒスチジン)、非極性(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、及び非荷電極性(グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン)アミノ酸。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、一緒に芳香族アミノ酸として分類されることもある。
【０２１３】
好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与の核酸配列のバリアントであるアミノ酸配列との類似性度、好ましくは同一性度は、少なくとも約60%、65%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%になる。好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%又は少なくとも約100%であるアミノ酸領域について、類似性又は同一性度が得られる。例えば、参照アミノ酸配列が200アミノ酸からなる場合、好ましくは少なくとも約20、少なくとも約40、少なくとも約60、少なくとも約80、少なくとも約100、少なくとも約120、少なくとも約140、少なくとも約160、少なくとも約180、又は約200アミノ酸、好ましくは連続アミノ酸について、類似性又は同一性度が得られる。好ましい実施形態において、参照アミノ酸配列の全長について類似性又は同一性度が得られる。配列類似性、好ましくは配列同一性を判定するためのアラインメントは、当技術分野において公知のツールで、好ましくは、最良配列アラインメントを使用して、例えば、標準的な設定、好ましくは、EMBOSS::needle、行列: Blosum62、ギャップ開始10.0、ギャップ伸長0.5を用い、Alignを使用して行うことができる。
【０２１４】
「配列類似性」は、同一である、又は保存的アミノ酸置換を表す、アミノ酸のパーセンテージを示す。2つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、それらの配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。
【０２１５】
用語「同一性パーセンテージ」は、最良アラインメント後に得られる、比較すべき2つの配列間で同一である、アミノ酸残基のパーセンテージを示すことを意図し、このパーセンテージは純粋に統計的なものであり、2つの配列間の差はランダムに且つそれらの全長にわたって分布する。2つのアミノ酸配列間の配列比較は、従来、これらの配列を最適にアラインメントした後に比較することによって行われ、前記比較は、セグメントごと、又は配列類似性の局所領域を同定し、比較するために「比較ウィンドウ」ごとに行われる。比較のための最適な配列アラインメントは、手作業でのほかに、Smith及びWaterman、1981、As App. Math. 2、482頁の局所相同性アルゴリズムによって、Neddleman及びWunsch、1970、J. Mol. Biol. 48、443頁の局所相同性アルゴリズムによって、Pearson及びLipman、1988、Proc. Natl Acad. Sci. USA 85、2444頁の類似性検索方法によって、又はこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータープログラム(Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group社、575 Science Drive、Madison、Wis.のGAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N及びTFASTA)によって、生成することができる。
【０２１６】
同一性パーセンテージは、2つの配列間を比較して同一位置の数を決定し、この数を比較した位置の数で割り、得られた結果に100を掛けて、これら2つの配列間の同一性パーセンテージを得ることによって計算される。
【０２１７】
本明細書に記載のペプチド及びアミノ酸バリアントは、例えば、固相合成(Merrifield、1964)及び類似の方法による技術、又は組換えDNA操作による技術等の、公知のペプチド合成技術を活用して、容易に調製することができる。置換、挿入又は欠失を有するタンパク質及びペプチドを調製するためのDNA配列の操作は、例えば、Sambrookら(1989)に詳細に記載されている。
【０２１８】
本発明によると、用語「ペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド及びタンパク質の「誘導体」を含む。そのような誘導体は、ペプチド及びタンパク質の修飾形態である。そのような修飾は、任意の化学的修飾を含み、炭水化物、資質、タンパク質及び/又はペプチド等のペプチド又はタンパク質と会合しているあらゆる分子についての単一の又は複数の置換、欠失及び/又は付加を含む。用語「誘導体」は、前記ペプチド及びタンパク質の全ての機能的化学的等価物にも及ぶ。好ましくは、修飾ペプチドは、安定性増加及び/又は免疫原性増加を有する。
【０２１９】
本発明のセプラーゼ結合剤は、治療アプローチに使用することができる。このために、本発明のセプラーゼ結合剤を、1つ若しくは複数の治療エフェクター部分と共有結合及び/若しくは非共有結合させてもよく、並びに/又は様々な成分と組み合わせて薬学的に許容される組成物を生成してもよい。本明細書に記載のペプチド等の薬剤は、任意の適する医薬組成物の形態で投与することができる。
【０２２０】
「標的細胞」は、がん細胞等の任意の望ましくない細胞を意味する。好ましい実施形態において、標的細胞はセプラーゼを発現する。
【０２２１】
本発明によると、用語「治療エフェクター部分」は、治療効果を発揮することができる任意の分子を意味する。本発明によると、治療エフェクター部分は、好ましくは、セプラーゼを発現する細胞に選択的に誘導される。がん細胞に対して治療効果を発揮する任意の薬剤をセプラーゼ結合剤とのコンジュゲーション用の薬物として使用することができる。好ましくは、薬物のコンジュゲーションは、本明細書において論じるようなセプラーゼ結合剤の結合特性、特に特異性を変更しない、又は有意に変更しない。
【０２２２】
本発明によると、治療エフェクター部分は、抗がん剤、放射性同位体、例えば放射性ヨウ素標識化合物、毒素、細胞分裂阻害薬又は細胞溶解薬等を含む。抗がん剤は、例えば、アミノグルテチミド、アザチオプリン、ブレオマイシン硫酸塩、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、タキソール、エトポシド、フルオロウラシル、インターフェロン-α、ロムスチン、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトタン、プロカルバジンHCl、チオグアニン、ビンブラスチン硫酸塩、及びビンクリスチン硫酸塩を含む。他の抗がん剤は、例えば、Goodman及びGilman、「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、第8版、1990、McGraw-Hill Inc.社、特に、Chapter 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi及びBruce A. Chabner))に記載されている。毒素は、タンパク質、例えばヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、コレラ毒素、百日咳毒素、リシン、ゲロニン、アブリン、ジフテリア外毒素、又は緑膿菌(Pseudomonas)外毒素でありうる。毒素残基は、コバルト-60等の高エネルギー放出性放射性核種であることもある。
【０２２３】
治療エフェクター部分は、特に、細胞毒又は細胞毒性薬剤を含む。細胞毒又は細胞毒性薬剤は、細胞に有害である、特に細胞を殺滅する、任意の薬剤を含む。
【０２２４】
細胞毒性薬剤の有用なクラスとしては、例えば、抗チューブリン剤、DNA副溝結合剤(例えば、エンジイン類及びレキシトロプシン類)、DNA複製阻害剤、アルキル化剤(例えば、白金錯体、例えばシスプラチン、一(白金)、二(白金)及び三核白金錯体、並びにカルボプラチン)、アントラサイクリン類、抗生物質、葉酸代謝拮抗薬、代謝拮抗薬、化学療法増感剤、デュオカルマイシン類、エトポシド類、フッ化ピリミジン類、イオノフォア、ニトロソ尿素類、プラチノール類、予備形成化合物、プリン代謝拮抗薬、ピューロマイシン類、放射線増感剤、ステロイド類、タキサン類(例えば、パクリタキセル及びドセタキセル)、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド類等が挙げられる。
【０２２５】
個々の細胞毒性薬剤としては、例えば、アンドロゲン、アントラマイシン(AMC)、アスパラギナーゼ、5-アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン(BSNU)、CC-1065、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、サイトカラシンB、ダカルバジン、ダクチノマイシン(旧名アクチノマイシン)、ダウノルビシン、ダカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、5-フルオロデオキシウリジン、5-フルオロウラシル、グラミシジンD、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン(CCNU)、メクロレタミン、メルファラン、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルバジン、ストレプトゾトシン、テニポシド、6-チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、VP-16及びVM-26が挙げられる。
【０２２６】
抗チューブリン剤の例としては、ドラスタチン類(例えば、オーリスタチンE、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)、メイタンシノイド類、タキサン類(例えば、パクリタキセル、ドセタキセル)、T67 (Tularik社)、ビンカアルカロイド類(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びビノレルビン)、バッカチン誘導体、タキサンアナログ(例えば、エポチロンA及びB)、ノコダゾール、コルヒチン及びコルセミド、エストラムスチン、クリプトフィシン類、セマドチン、コンブレタスタチン類、ディスコデルモリド、並びにエリュテロビンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２７】
細胞毒性放射性医薬品を生成するための放射性同位体としては、例えば、ヨウ素-131、イットリウム-90、又はインジウム-111が挙げられる。
【０２２８】
そのような治療エフェクター部分(薬物)をペプチドにコンジュゲートさせる技術は周知である。ペプチド-薬物コンジュゲートの生成は、当業者に公知の任意の技術によって遂行することができる。ペプチドと薬物を、それらの独自のリンカー基によって互いに直接、又はリンカー若しくは他の物質を介して間接的に結合させてもよい。
【０２２９】
ペプチドへの薬物の共有結合には多数の異なる反応が利用可能である。これは、リジンのアミン基、グルタミン酸及びアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システインのスルフヒドリル基、及び芳香族アミノ酸の様々な部分を含む、ペプチド分子のアミノ酸残基の反応によって遂行されることが多い。共有結合の最も一般的に使用される非特異的な方法の1つは、化合物のカルボキシ(又はアミノ)基をペプチドのアミノ(又はカルボキシ)基に連結させるためのカルボジイミド反応である。加えて、ジアルデヒド又はイミドエステル等の二官能性薬剤が、化合物のアミノ基をペプチド分子のアミノ基に連結させるために使用されてきた。シッフ塩基反応も薬物のペプチドへの結合に利用可能である。この方法は、グリコール又はヒドロキシ基を含有する薬物の過ヨウ素酸塩酸化を含み、そのようにしてアルデヒドを形成し、次いでそのアルデヒドをペプチド分子と反応させる。結合は、ペプチド分子のアミノ基とのシッフ塩基の形成によって起こる。薬物をペプチドに共有結合させるためのカップリング剤としてイソチオシアン酸塩も使用することができる。他の技術は当業者に公知であり、本発明の範囲内である。
【０２３０】
ペプチド-薬物コンジュゲートを製造するための多くの連結基が当技術分野において公知である。リンカーは、ペプチド及び薬物のどちらか又は両方と反応する1つ又は複数の官能基を好ましくは含む。官能基の例としては、アミノ、カルボキシル、メルカプト、マレイミド及びピリジニル基が挙げられる。
【０２３１】
本発明の一実施形態において、ペプチドを二官能性架橋試薬によって薬物と連結させる。本明細書において使用する場合、「二官能性架橋試薬」は、2つの反応性基を有し、その一方が、ペプチドと反応することができ、同時にもう一方が、ペプチドを薬物と連結させるように薬物と反応することができ、その結果、コンジュゲートを形成する試薬を指す。任意の適する二官能性架橋試薬を、そのリンカー試薬が薬物、例えば細胞毒性及びペプチドの標的化特性の保持をもたらす限り、本発明に関連して使用することができる。好ましくは、リンカー分子は、薬物をペプチドに化学結合によって接合させ、その結果、薬物とペプチドは、互いに化学的にカップリングする(例えば、共有結合する)。
【０２３２】
一実施形態において、二官能性架橋試薬は、切断不能リンカーを含む。切断不能リンカーは、安定した共有結合様式で薬物をペプチドに連結することができる任意の化学的部分である。好ましくは、切断不能リンカーは、生理条件下で、特に、体内及び/又は細胞内で、切断可能でない。したがって、切断不能リンカーは、薬物又はペプチドが活性のままである条件で、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断、及びジスルフィド結合切断に対して実質的に耐性である。薬物とペプチドとの間に切断不能リンカーを形成する、適する架橋試薬は、当技術分野において周知である。一実施形態において、薬物は、チオエーテル結合によってペプチドに連結される。
【０２３３】
特に好ましい一実施形態において、連結試薬は、切断可能リンカーである。好ましくは、切断可能リンカーは、生理条件下で、特に、体内及び/又は細胞内で、切断可能である。適する切断可能リンカーの例としては、ジスルフィドリンカー、酸不安定性リンカー、光解離性リンカー、ペプチダーゼ不安定性リンカー、及びエステラーゼ不安定性リンカーが挙げられる。
【０２３４】
リンカーの例としては、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)ブチレート(SPDB)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(スルホ-SMCC)、N-スクシンイミジル-4-(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(SMCC)、N-スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-l-カルボキシ-(6-アミドカプロエート)(LC-SMCC)、4-マレイミド酪酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(GMBS)、3-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(EMCS)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、N-(α-マレイミドアセトキシ)-スクシンイミドエステル(AMAS)、スクシンイミジル-6-(β-マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート(SMPH)、N-スクシンイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)-ブチレート(SMPB)、N-(p-マレイミドフェニル)イソシアネート(PMPI)、6-マレイミドカプロイル(MC)、マレイミドプロパノイル(MP)、p-アミドベンジルオキシカルボニル(PAB)、N-スクシンイミジル-4-(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(SPP)、及びN-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドリンカー、例えば、バリン-シトルリン(Val-Cit)又はアラニン-フェニルアラニン(ala-phe)を使用してもよく、上述のリンカーのいずれかを適切な組合せで使用してもよい。
【０２３５】
ジスルフィド含有リンカーは、生理条件下で起こりうるジスルフィド交換によって切断可能なリンカーである。更に他の実施形態において、リンカーは、還元条件下で切断可能である(例えば、ジスルフィドリンカー)。例えば、SATA (N-スクシンイミジル-5-アセチルチオアセテート)、SPDP (N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート)、SPDB (N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)ブチレート)及びSMPT (N-スクシンイミジル-オキシカルボニル-アルファ-メチル-アルファ-(2-ピリジル-ジチオ)トルエン)を使用して形成することができるものを含む、様々なジスルフィドリンカーが、当技術分野において公知である。
【０２３６】
酸不安定性リンカーは、酸性pHで切断可能なリンカーである。例えば、ある特定の細胞内区画、例えば、エンドソーム及びリソソームは、酸性pH (pH4〜5)を有し、酸不安定性リンカーの切断に適する条件を提供する。酸不安定性リンカーは、血液中でのpH条件等の中性pH条件下では比較的安定しているが、pH5.5又は5.0より下では不安定である。例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、cis-アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタール等を使用することができる。
【０２３７】
光解離性リンカーは、体表で、及び光が到達できる多くの体腔において有用である。更に、赤外線は、組織を透過することができる。
【０２３８】
ペプチダーゼ不安定性リンカーは、細胞内又は細胞外の、ある特定のペプチドを切断するために使用することができる。一実施形態において、切断可能リンカーは、穏やかな条件、すなわち、細胞毒性薬剤の活性が影響を受けない細胞内の条件下で切断される。
【０２３９】
リンカーは、例えば、リソソーム又はエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されない細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーでありうる又はペプチジルリンカーを含むことができる。典型的に、ペプチジルリンカーは、少なくとも2アミノ酸長、又は少なくとも3アミノ酸長である。切断剤としては、カテプシンB及びD並びにプラスミンを挙げることができ、これらの全ては、ジペプチド薬誘導体を加水分解し、その結果、標的細胞内で活性薬物の放出をもたらすことが公知である。例えば、がん性組織において高度に発現されるチオール依存性プロテアーゼカテプシン-Bによって切断可能であるペプチジルリンカー(例えば、Phe-Leu又はGly-Phe-Leu-Glyリンカー)を使用することができる。特定の実施形態において、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチジルリンカーは、バリン-シトルリン(Val-Cit; vc)リンカー又はフェニルアラニン-リジン(Phe-Lys)リンカーである。治療剤の細胞内タンパク質分解性放出を使用することの1つの利点は、薬剤が、コンジュゲートすると、通常は減弱されること、及びそのコンジュゲートの血清安定性が通常は高いことである。
【０２４０】
用語「個体」及び「対象」は、本明細書では互換的に使用している。これらの用語は、疾患若しくは障害(例えばがん)を煩っているか、又は疾患若しくは障害に罹患しやすいが罹患していても、していなくてもよい、人間、非ヒト霊長類又は他の哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ又は霊長類)を指す。多くの実施形態において、個体は人間である。別段の記述がない限り、用語「個体」及び「対象」は、特定の年齢を示さず、したがって、成人、老人、小児及び新生児を包含する。本発明の好ましい実施形態において、「個体」又は「対象」は、「患者」である。用語「患者」は、本発明によると、処置の対象、特に、罹病している対象を意味する。
【０２４１】
用語「疾患」は、個体の身体を冒す異常な状態を指す。疾患は、特異的症状及び徴候を伴う医学的状態と解釈されることが多い。疾患は、元々は外部の原因からの因子によって引き起こされることもあり(例えば、感染性疾患)、又は内部の機能不全によって引き起こされることもある(例えば、自己免疫疾患)。ヒトの場合、「疾患」は、煩っている個体に疼痛、機能不全、窮迫、社会的問題、若しくは死をもたらす、又はその個体と接触している者に同様の問題をもたらす、あらゆる状態を指すために、より広く使用されることが多い。このより広い意味で、疾患は、損傷、身体障害、障害、症候群、感染症、単発症状、逸脱行動、並びに構造及び機能の非定型的変化を含むこともあるが、他との関連では、及び他の目的では、これらは、区別可能なカテゴリーと見なされることがある。疾患は、通常、身体的にばかりでなく情動的にも個体に影響を与える。多くの疾患に罹患すること及び多くの疾患と共に生きることは、人の人生観及び人の人格を変えることがあるからである。本発明によると、用語「疾患」は、がん、特に、本明細書に記載の型のがんを含む。がん又は特定の型のがんへの本明細書におけるあらゆる言及はそれらのがん転移も含む。好ましい実施形態において、本出願に従って処置されることになる疾患は、セプラーゼを発現する細胞に関わる。
【０２４２】
「セプラーゼを発現する細胞に関わる疾患」又は類似の表現は、本発明によると、セプラーゼが罹病組織又は器官の細胞において発現されることを意味する。一実施形態において、罹病組織又は器官の細胞におけるセプラーゼの発現は、健常組織又は器官におけるその状態と比較して増加される。一実施形態において、発現は罹病組織でしか見られず、しかも健常組織では発現は抑止される。本発明によると、セプラーゼを発現する細胞に関わる疾患は、がん疾患を含む。更に、本発明によると、がん疾患は、好ましくは、細胞がセプラーゼを発現するものである。
【０２４３】
用語「がん疾患」又は「がん」は、無秩序な細胞増殖を典型的な特徴とする個体における生理状態を指す、又はそのような状態を記述する。がんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。より詳細には、そのようながんの例としては、骨がん、血液のがん、肺がん、肝臓がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、子宮がん、生器及び生殖器の癌腫、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、膀胱がん、腎臓がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系(CNS)の新生物、神経外胚葉がん、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、及び下垂体腺腫が挙げられる。本発明による用語「がん」は、がん転移も含む。好ましくは、「がん疾患」は、セプラーゼを発現する細胞を特徴とする。
【０２４４】
「転移」は、その元の部位から身体の別の部分へのがん細胞の拡散を意味する。転移の形成は、非常に複雑な過程であり、原発性腫瘍からの悪性細胞の脱離、細胞外マトリックスへの侵入、体腔及び血管に入るための内皮基底膜の透過、そしてその後、血液によって輸送された後、標的器官浸潤に依存する。最終的に、その標的部位での新たな腫瘍の成長は、血管新生に依存する。腫瘍転移は、原発性腫瘍の除去後でも、腫瘍細胞又は成分が残存して転移能を発揮することがあるので、起こることが多い。一実施形態において、本発明による用語「転移」は、原発性腫瘍及び局所リンパ節系から遠く離れている転移に関する「遠隔転移」に関する。一実施形態において、本発明による用語「転移」は、リンパ節転移に関する。
【０２４５】
本発明によると、用語「腫瘍」又は「腫瘍疾患」は、腫脹又は病変を好ましくは形成する(新生物細胞、腫瘍形成細胞又は腫瘍細胞と呼ばれる)細胞の異常増殖を指す。「腫瘍細胞」は、急速な無制御細胞増殖によって増殖し、新たな増殖を開始させる刺激が停止した後も増殖し続ける、異常な細胞を意味する。腫瘍は、構造の構成及び正常組織との機能的協調の部分的又は完全欠如を示し、通常は異質の組織塊を形成し、前記組織塊は、良性、前悪性、又は悪性であることもある。本発明によると、「がん疾患」は、好ましくは「腫瘍疾患」である。しかし、一般に、用語「がん」及び「腫瘍」は、本明細書では互換的に使用している。
【０２４６】
好ましくは、本発明による腫瘍疾患は、がん疾患、すなわち悪性疾患であり、腫瘍細胞は、がん細胞である。好ましくは、腫瘍疾患又はがん疾患は、セプラーゼが発現若しくは異常発現される細胞を特徴とし、及び/又は腫瘍細胞若しくはがん細胞は、セプラーゼの発現若しくは異常発現を特徴とする。
【０２４７】
再燃又は再発は、ある人物が過去に冒された状態に再び冒されると起こる。例えば、患者が腫瘍疾患に罹患し、前記疾患の処置成功を経験し、再び前記疾患を発症した場合、新たに発症した前記疾患は、再燃又は再発と見なすことができる。しかし、本発明によると、腫瘍疾患の再燃又は再発は、元の腫瘍疾患部位で起こることもあるが、必ずしもそこで起こるとは限らない。腫瘍の再燃又は再発は、腫瘍が元の腫瘍部位ではもちろん元の腫瘍部位とは異なる部位でも起こる状態も含む。好ましくは、患者が処置を受けた元の腫瘍は、原発性腫瘍であり、元の腫瘍部位とは異なる部位の腫瘍は、続発性又は転移性腫瘍である。
【０２４８】
用語「処置」又は「治療的処置」は、個体の健康状態を向上させる及び/又は寿命を延ばす(増す)あらゆる処置に関する。前記処置は、疾患に現在罹患している又は以前に罹患したことがある、個体の疾患を除去する、個体の疾患の発症を抑止若しくは遅らせる、個体の疾患の発症を阻害若しくは遅らせる、個体の症状の頻度若しくは重症度を低下させる、及び/又は個体における再発を減少させることもある。
【０２４９】
用語「予防的処置」又は「予防処置」は、個体において疾患が起こらないように予防することを意図している、あらゆる処置に関する。用語「予防的処置」又は「予防処置」は、本明細書では互換的に使用している。例えば、がんのリスクがある対象は、がんを予防するための治療の候補となる。
【０２５０】
「リスクがある」は、一般集団と比較して、疾患、特にがんを発症する可能性が通常より高いと同定される対象を意味する。加えて、疾患、特にがんに罹患したことがある又は現在罹患している対象は、疾患を発症するリスクが高い対象であり、したがって、対象は、疾患を発症し続けることがある。がんに現在罹患している、又は罹患したことがある対象は、がん転移のリスクも高い。
【０２５１】
がんの(治療的)処置は、外科手術、化学療法、放射線治療及び標的治療からなる群から選択することができる。
【０２５２】
本明細書において使用する用語「外科手術」は、手術での腫瘍の除去を含む。それは、がんについての一般的な処置である。外科医は、局所切除術を使用して腫瘍を除去することができる。
【０２５３】
本明細書において使用する用語「化学療法」は、細胞を殺滅すること又は細胞分裂を停止させることのどちらかによって、がん細胞の増殖を好ましくは停止させるための、化学療法剤、又は化学療法剤の組合せの使用を指す。化学療法を経口投与する又は静脈若しくは筋肉に注射すると、薬物が血流に入り、体全体のがん細胞に到達することができる(全身性化学療法)。化学療法を脳脊髄液、器官、又は体腔、例えば腹部、に直接投与すると、薬物は、主として、それらの領域内のがん細胞に作用する(局所化学療法)。
【０２５４】
本発明による化学療法剤は、細胞増殖抑制化合物及び細胞毒性化合物を含む。旧来の化学療法剤は、急速に分裂する細胞(殆どのがん細胞の主要な特性の1つ)を殺滅することによって作用する。これは、化学療法が、正常な状況下で急速に分裂する細胞、例えば、骨髄、消化管及び毛包の細胞も害することを意味する。この結果、化学療法の最もよく見られる副作用が生ずる。がんにおいて異常発現されるタンパク質(例えば、セプラーゼ)を標的にし、治療用部分によって作用する薬剤、又はその薬剤にコンジュゲートされている薬剤は、化学療法の一形態と見なすことができる。しかし、最も厳密な意味では、本発明による用語「化学療法」は、標的治療を含まない。
【０２５５】
本発明によると、用語「標的治療」は、がん細胞等の罹病細胞を優先的に標的にするが、非罹病細胞を標的にしない又はより少ない程度に標的するように使用することができる、あらゆる治療に関する。罹病細胞の標的化は、好ましくは、結果として、罹病細胞を殺滅する、及び/又は罹病細胞の増殖若しくは生存率を減じることになる。そのような治療は、i)ある特定の細胞表面標的、例えばセプラーゼ、を標的にする治療用部分に、治療用部分を送達するためにコンジュゲートされている薬剤(例えば、治療用部分にコンジュゲートされているセプラーゼ結合剤)、又はii)ある特定の細胞表面標的、例えばセプラーゼ、を標的にし、それらに単に結合することによって罹病細胞の増殖若しくは生存率を減じる薬剤(例えば、治療用部分にコンジュゲートされている若しくは治療用部分にコンジュゲートされていないセプラーゼ結合剤)を含む。
【０２５６】
本発明に従って記載する医薬組成物及び治療方法は、本明細書に記載の疾患の治療的処置又は予防に使用することができる。がんに対する効果を試験するために動物モデルを使用することが可能である。例えば、ヒトがん細胞をマウスに導入して腫瘍を生じさせることができる。がん細胞に対する効果(例えば、腫瘍サイズの低減)を、動物に投与した薬剤の有効性の尺度として測定することができる。
【０２５７】
ペプチドは、それ自体が公知の手法で投与することができる。一般には、1ng〜1mg、好ましくは10ng〜100μgのペプチド用量が処方され、投与される。
【０２５８】
核酸(DNA及びRNA)の投与が所望される場合、1ng〜0.1mgの用量を処方及び投与することができる。
【０２５９】
一実施形態において、核酸は、ex vivoでの方法によって、すなわち、患者からの細胞の除去、核酸に組み込むための前記細胞の遺伝子修飾、そして変化させた細胞の患者への再導入によって、投与される。これは、一般に、in vitroでの患者の細胞への遺伝子の機能性コピーの導入、及びそれらの遺伝子操作された細胞の患者への再導入を含む。遺伝子の機能性コピーは、遺伝子操作された細胞において遺伝子を発現させる調節エレメントの機能的制御下にある。トランスフェクション及び形質導入方法は、当業者に公知である。
【０２６０】
本発明は、例えば、ウイルス及び標的制御リポソーム等のベクターを使用することによる、in vivoでの核酸の投与も提供する。
【０２６１】
好ましい実施形態において、核酸を投与するためのウイルス又はウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス(ワクシニアウイルス及び弱毒ポックスウイルスを含む)、セムリキ森林ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス及びTyウイルス様粒子からなる群から選択される。アデノウイルス及びレトロウイルスが特に好ましい。レトロウイルスは、通常は複製欠損している(すなわち、それらには感染粒子を生成する能力がない)。
【０２６２】
in vitro又はin vivoで細胞に核酸を導入する方法は、核酸リン酸カルシウム沈殿物のトランスフェクション、DEAEと会合している核酸のトランスフェクション、目的の核酸を保有する上記ウイルスでのトランスフェクション又は感染、リポソーム媒介性トランスフェクション等を含む。特定の実施形態において、核酸を特定の細胞に指向させることが好ましい。そのような実施形態において、核酸を細胞に投与するために使用する担体(例えば、レトロウイルス又はリポソーム)に、標的制御分子が結合していることもある。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体又は標的細胞上の受容体のリガンド等の分子を、核酸担体に組み込む又は結合させることができる。好ましい抗体は、腫瘍抗原に選択的に結合する抗体を含む。リポソームによる核酸の投与が所望される場合、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質と結合するタンパク質をリポソーム製剤に組み込んで、標的を制御及び/又は取り込み可能にすることができる。そのようなタンパク質は、特定の細胞型に特異的であるカプシドタンパク質又はその断片、内在化されるタンパク質に対する抗体、細胞内部位に対処するタンパク質等を含む。
【０２６３】
本発明の治療活性化合物は、注射又は注入によるものを含む、任意の従来の経路によって投与することができる。投与は、例えば、経口的に、静脈内的に、腹腔内的に、筋肉内的に、皮下的に又は経皮的に行うことができる。投与は、局所的に又は全身的に、好ましくは全身的にでありうる。
【０２６４】
用語「全身性投与」は、薬剤が個体の体内に有意な量で広く分配されて所望の効果を発現するような、薬剤の投与を指す。例えば、薬剤は、その所望の効果を血液中で発現することがある、及び/又は血管系経由でその所望の作用部位に到達する。典型的な全身性投与経路は、血管系に直接薬剤を導入することによる投与、又は薬剤が吸収され、血管系に入り、血液によって1つ若しくは複数の所望の部位に運ばれる、経口、肺若しくは筋肉内投与を含む。
【０２６５】
本発明によると、全身性投与は非経口投与によるものであることが好ましい。用語「非経口投与」は、薬剤が腸管を通らないような、薬剤の投与を指す。用語「非経口投与」は、静脈内投与、皮下投与、皮内投与又は動脈内投与を含むが、これらに限定されない。
【０２６６】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、無菌性であり、本明細書に記載の薬剤の有効量を含有し、所望の反応又は所望の効果を生じさせるための本明細書中で論じるような更なる薬剤を任意選択で含有する。
【０２６７】
医薬組成物は、通常、均一な剤形で提供され、それ自体が公知の手法で調製されうる。医薬組成物は、例えば、溶液又は懸濁液の形態でありうる。
【０２６８】
医薬組成物は、塩、緩衝物質、保存薬、担体、希釈剤及び/又は賦形剤を含むことがあり、これらの全ては薬学的に許容されることが好ましい。用語「薬学的に許容される」は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない材料の非毒性を指す。
【０２６９】
薬学的に許容されない塩は、薬学的に許容される塩の調製に使用されることがあり、本発明に含まれる。この種の薬学的に許容される塩は、次の酸から調製されるものを非限定的に含む:塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等。薬学的に許容される塩をアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩として調製してもよい。
【０２７０】
医薬組成物における使用に適する緩衝物質としては、塩での酢酸、塩でのクエン酸、塩でのホウ酸、及び塩でのリン酸が挙げられる。
【０２７１】
医薬組成物における使用に適する保存薬としては、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン及びチメロサールが挙げられる。
【０２７２】
用語「担体」は、適用を助長する、増進する又は可能にするために活性成分と組み合わせられる、天然性又は合成性の、有機又は無機成分を指す。本発明によると、用語「担体」は、患者への投与に適している、1つ又は複数の適合性固体若しくは液体充填剤、希釈剤又は封入物質も含む。
【０２７３】
非経口投与のための可能な担体物質は、例えば、滅菌水、リンゲル、乳酸リンゲル、滅菌塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレングリコール類、水素化ナフタレン類、及び特に、生体適合性ラクチドポリマー類、ラクチド/グリコリドコポリマー類又はポリオキシエチレン/ポリオキシプロピレンコポリマー類である。
【０２７４】
注射用製剤は、乳酸リンゲル等の薬学的に許容される賦形剤を含むことがある。
【０２７５】
本明細書において使用するときの用語「賦形剤」は、医薬組成物中に存在してもよく且つ活性成分ではない、全ての物質、例えば、担体、結合剤、滑沢剤、増粘剤、界面活性剤、保存薬、乳化剤、緩衝剤、着香剤又は着色剤等、を示すことを意図する。
【０２７６】
本明細書に記載の薬剤及び組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、単独で又は更なる用量と一緒に所望の反応又は所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患の又は特定の状態の処置の場合、所望の反応は、好ましくは、その疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行の緩徐化、特に、疾患の進行の中断又は逆転を含む。疾患の又は状態の処置における所望の反応は、前記疾患又は前記状態の発症の遅延又は発症の予防であることもある。
【０２７７】
本明細書に記載の薬剤又は組成物の有効量は、処置すべき状態、疾患の重症度、患者の個々のパラメーター(年齢、生理状態、サイズ及び体重を含む)、処置の継続期間、(もしあれば)付随する処置のタイプ、具体的な投与経路、及び類似の因子に依存する。したがって、本明細書に記載の薬剤の投与用量は、そのような様々なパラメーターに依存しうる。初回用量で患者の反応が不十分である場合、より高い用量(又は異なる、より限局的な投与経路によって達成される、事実上、より高い用量)を使用してもよい。
【０２７８】
本明細書に記載の薬剤及び組成物を患者に、例えばin vivoで、投与して、本明細書に記載のもの等の様々な障害を処置又は予防することができる。好ましい患者は、本明細書に記載の薬剤及び組成物を投与することによって矯正又は改善することができる障害を有するヒト患者を含む。これは、セプラーゼの発現パターンの変化を特徴とする細胞に関わる障害を含む。
【０２７９】
例えば、一実施形態において、本明細書に記載の薬剤を使用して、がん疾患、例えば、セプラーゼを発現する細胞の存在を特徴とする本明細書に記載のもの等のがん疾患を有する患者を処置することができる。
【０２８０】
本発明を下記の図及び実施例によってより詳細に説明するが、これらは、単に例示を目的として使用するものに過ぎず、限定することを意図しない。これらの説明及び実施例のおかげで、同様に本発明に含まれる更なる実施形態が当業者には分かりやすい。
【図面の簡単な説明】
【０２８１】
【図１】MC-FA-010のアミノ酸配列の図である。ジスルフィド架橋が灰色の線として描かれている。シスチンが黄色で強調され、N末端からC末端へと番号(ローマ数字)が付与されている。
【図２】A: MC-FA-010のアラニンスキャンからの結合データの要約の図である。第1の縦列は、位置特異的親配列を示す。第2〜第4の縦列は、1サイト飽和結合モデルによって計算した見掛けのKd、及び計算誤差、及びフィッティングのR2値を示す。保存された/増加した結合(それぞれ弱い結合損失)は緑色で示され、弱い及び中等度の結合はオレンジ色で示され、無結合(完全な結合喪失)は赤色で示されている。B:位置特異的結合が上で説明したように緑色、オレンジ色及び赤色で強調されている、MC-FA-010の野生型配列の図である。
【図３】Trx-MC-FA-010のヒトセプラーゼとの結合分析の図である。A:ヒトセプラーゼとの0.39〜50nMの範囲のTrx-MC-FA-010結合のELISA分析。B:競合ELISA分析。ヒトセプラーゼとの3nM Trx-MC-FA-010の結合を、0.64〜3167nMの範囲の可溶性一価MC-FA-010と競合させた。
【図４Ａ】固定化されたヒトセプラーゼとのMC-FA-010結合のSPR分析の図である。上のプロット:会合及び解離工程のフィットデータ。分析した全ての濃度のオーバーレイ。下のプロット:測定曲線とフィット曲線の残差図。
【図４Ｂ】固定化されたヒトセプラーゼとのMC-FA-010結合のSPR分析の図である。測定及び計算データの要約。
【図５】ヒトFAPαに対するMC-FA-010の選択性の分析の図である。A:青緑色又は灰色で描かれているDPP VIと緑色で描かれているセプラーゼの構造オーバーレイ(Pymol)。B:ヒトセプラーゼ(rhuセプラーゼ、暗灰色バー)及びDPP IV(明灰色バー)とのTrx-MC-FA-010結合のELISA分析。示されているデータセットは、二重反復試験に基づく。
【図６】MC-FA-010特異性の研究のための免疫蛍光の図である。ストレプトアビジン-Cy3コンジュゲートMC-FA-010のセプラーゼ過剰発現CHO-K1細胞(CHO-K1-セプラーゼ)との結合を分析した。細胞とのインキュベーションの前に、MC-FA-010及び対照Microbody(登録商標)をビオチン化し、Cy3コンジュゲートストレプトアビジン上に前もって集合させた。陰性対照として、無関係のMicrobody(商標)(a-ヘプシン-bio)及び標的陰性CHO-K1-MOCK細胞を使用した。Microbody(商標)-ストレプトアビジン-Cy3複合体(赤色)及び核局在化(青色)。
【図７】ex vivoでのコンディショニング後のパラフィン包埋CT26細胞株の染色の図である。移植の14日後、全ての切片をCAFマーカー抗α-SMA(緑色)で、及び核局在化のためにDAPI(青色)で染色した。(A)の場合、ビオチン化してCy3コンジュゲートストレプトアビジン上に前もって集合させたMC-FA-010で、切片を更に処理した。(B)の場合、ストレプトアビジン-Cy3で四量体化もした対照Microbody(商標)MC-Myc-010で、切片を染色した。
【図８】一価及び四価MC-FA-010の結合特性の図である。(A)ヒトセプラーゼ発現細胞(CHO-K1-セプラーゼ)上の(チオレドキシン-His6-カセットからなる)一価MC-FA-010のEC50値の決定のためのFACS。MC-FA-010をHis特異的PEコンジュゲート抗体で検出した。(B)ヒトセプラーゼ発現細胞(CHO-K1-セプラーゼ)上のストレプトアビジン-APC結合四価MC-FA-010のEC50値の決定のためのFACS。測定は、3回の独立した実験で行った。
【図９】A) DOTA-(MC-FA-012)3三量体の概略図。この分子の分子量は下に示されている。FACSベースの競合アッセイ(B)を使用して、単量体MC-FA-012 Microbody(登録商標)(C)との比較で、三量体を機能分析した。
【図１０】セプラーゼ発現CHO-異種移植片におけるIRDyeコンジュゲートMC-FA-012での腫瘍標的化の図である。ヒトセプラーゼ陽性細胞(CHO-K1-huセプラーゼ)をFoxn1(nu)マウスの側腹部に皮下接種した。陰性対照としてhuセプラーゼ陰性細胞(CHO-K1-MOCK)を並行して使用した。3週間後、マウスを陰性対照(MC-CM-010-IRDye800CW)又はMC-FA-010-IRDye800CW処置にランダムに割り当てた。5nmolの各Microboy(商標)を静脈内投与した。注射の0.5時間及び2時間後にマウスを安楽死させ、腫瘍を単離した。Xenogen IVIS光学in vivoイメージングシステムを用いてex vivoでIRシグナルを測定した。
【図１１Ａ】Microbodyの、及びrhuセプラーゼに結合するその三量体の、表面プラズモン共鳴分光測定の図である。MC-FA-010の会合及び解離スペクトログラム、1:1フィッティング。
【図１１Ｂ】Microbodyの、及びrhuセプラーゼに結合するその三量体の、表面プラズモン共鳴分光測定の図である。MC-FA-012の会合及び解離スペクトログラム、1:1フィッティング。
【図１１Ｃ】Microbodyの、及びrhuセプラーゼに結合するその三量体の、表面プラズモン共鳴分光測定の図である。スペクトログラム: DOTA-(MC-FA-012)3の単一サイクル測定及び1:1フィッティング、図:対応する定常状態分析及び1:1フィッティング。
【図１１Ｄ】Microbodyの、及びrhuセプラーゼに結合するその三量体の、表面プラズモン共鳴分光測定の図である。スペクトログラム: AF680-(MC-FA-012)3の単一サイクル測定及び1:1フィッティング、図:対応する定常状態分析及び1:1フィッティング。
【図１２Ａ】rhuセプラーゼに結合するMicrobody(登録商標)MC-FA-012バリアントの表面プラズモン共鳴分光測定の図である。FA8-D06の会合及び解離スペクトログラム、1:1フィッティング。
【図１２Ｂ】rhuセプラーゼに結合するMicrobody(登録商標)MC-FA-012バリアントの表面プラズモン共鳴分光測定の図である。FA7-A05の会合及び解離スペクトログラム、1:1フィッティング。
【図１２Ｃ】rhuセプラーゼに結合するMicrobody(登録商標)MC-FA-012バリアントの表面プラズモン共鳴分光測定の図である。FA8-C09の会合及び解離スペクトログラム、1:1フィッティング。
【図１２Ｄ】rhuセプラーゼに結合するMicrobody(登録商標)MC-FA-012バリアントの表面プラズモン共鳴分光測定の図である。FA8-D03の会合及び解離スペクトログラム、1:1フィッティング。
【図１２Ｅ】rhuセプラーゼに結合するMicrobody(登録商標)MC-FA-012バリアントの表面プラズモン共鳴分光測定の図である。FA8-D05の会合及び解離スペクトログラム、1:1フィッティング。
【図１２Ｆ】rhuセプラーゼに結合するMicrobody(登録商標)MC-FA-012バリアントの表面プラズモン共鳴分光測定の図である。FA8-F04の会合及び解離スペクトログラム、1:1フィッティング。
【図１２Ｇ】rhuセプラーゼに結合するMicrobody(登録商標)MC-FA-012バリアントの表面プラズモン共鳴分光測定の図である。FA8-G12の会合及び解離スペクトログラム、1:1フィッティング。
【図１３】セプラーゼ結合代替足場ET-FA-012及びMO-FA-012の表面プラズモン共鳴分光測定の図である。A: ET-FA-012の会合及び解離スペクトログラム、1:1フィッティング。B: MO-FA-012の会合及び解離スペクトログラム。
【図１４Ａ】AF680-(MC-FA-012)3及びAF680-(MC-FA-0116)3の生体内分布分析の図である。腫瘍標的化及び器官内分布のin vivoイメージング。
【図１４Ｂ】AF680-(MC-FA-012)3及びAF680-(MC-FA-0116)3の生体内分布分析の図である。切除した腫瘍及び器官のex vivoイメージング。矢印:腫瘍取り込み。
【図１５】注射の1、2、4、6、24及び96時間後にex vivoで測定したAF680結合MC-FA-012及びMC-FA-0116三量体の蛍光シグナルの比較の図である。示されているのは、腫瘍、腎臓、肝臓及び肺における質量当りの全放射効率値である。
【図１６】セプラーゼを発現しているTNBC切片の免疫蛍光染色の図である。使用したMicrobodyは、ストレプトアビジン-Cy3コンジュゲート(SA-Cy3)によって四量体化したものであった。活性化線維芽細胞を抗平滑筋アクチン抗体(SMA)で染色した。
【図１７】器官質量当りの注射用量のパーセンテージ[%ID/g]として計算した、177Lu-(MC-FA-012)3の静脈内投与の30分及び24時間後に測定した器官活性の図である。
【図１８】約10MBq 68Ga-(MC-FA-012)3のi.v.投与後の最大強度投影(MIP)を示す図である(上の横列:第1のマウス、下の横列:第2のマウス)。CT26-huセプラーゼ腫瘍の位置が矢印によって示されている。
【図１９】約10MBq 68Ga-(MC-FA-012)3のi.v.投与後の標準取込値(SUV)を示す図である(上の横列:第1のマウス、下の横列:第2のマウス)。CT26-huセプラーゼ腫瘍の位置が矢印によって示されている。
【図２０】小動物PETイメージング:選択器官(マウス1)の標準取込値を示す図である。腎臓lft:左腎、腎臓rt:右腎、腫瘍CT26 wt: CT26腫瘍、腫瘍CT26-FAP: CT26-huセプラーゼ腫瘍。
【図２１】68Ga-(MC-FA-012)3の投与の1及び3時間後の患者1における器官内分布(SUV最大値)の図である(rt=右、lft=左)。
【図２２】68Ga-(MC-FA-012)3の投与の1及び3時間後の患者2における器官内分布(SUV最大値)の図である(rt=右、lft=左)。
【図２３】68Ga-(MC-FA-012)3の投与の1及び2時間後の患者3における器官内分布(SUV最大値)の図である(rt=右、lft=左)。
【図２４】68Ga-(MC-FA-012)3の投与の1及び2.5時間後の患者4における器官内分布(SUV最大値)の図である(rt=右、lft=左)。
【図２５】68Ga-(MC-FA-012)3の投与の1及び3時間後の患者5における器官内分布(SUV最大値)の図である(rt=右、lft=左)。
【図２６】64MBq 68Ga-(MC-FA-012)3の注射の1時間後の例示的なPETスキャン(患者3)の体軸横断、冠状断及び矢状断像の図である。スキャンは、原発性膵臓腫瘍及び肝臓転移における明らかな取り込みを示す。白い円によって示されている腫瘍及び転移の位置。
【図２７】セプラーゼ特異的抗体で染色された膵臓癌及び正常組織の切片の図である。
【図２８】セプラーゼ特異的抗体で染色されたトリプルネガティブ乳癌(TNBC)及び正常組織の切片の図である。
【図２９】セプラーゼ特異的抗体で染色された肺癌及び正常組織の切片の図である。
【実施例】
【０２８２】
ここで使用する技術及び方法は、ここで説明するか、又はそれ自体が公知の手法で、及び例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press社、Cold Spring Harbor、N.Yに記載されているように、実施する。キット及び試薬の使用を含む全ての方法は、具体的な指示がない限り、その製造業者の情報に従って実施する。
【０２８３】
(実施例1)
材料及び方法
プラスミド構築
CHOコドン最適化完全長ヒトセプラーゼ(NCBI寄託番号NP_004451)はGeneart社が合成したものであり、それをpENTRchtベクター(Invitrogen社)にサブクローニングした。そのプラスミドをDNAシークエンシングによって検証し、pENTR-huセプラーゼと命名した。その後、それぞれのインサートをGatewayクローニング(Invitrogen社)によってpiggy Bacトランスポゾンベクター(PB53x EF1シリーズ)にシャトリングして、トランスポゾン発現プラスミドを生成した。これらのプラスミドは、cDNAの発現を駆動するためのEF1アルファプロモーターと、IRES-EGFPカセットと、選択マーカーとしてのハイグロマイシンとを含有する。そのプラスミドを安定したセプラーゼ発現細胞株の生成に使用した。
【０２８４】
pENTR-huセプラーゼプラスミドDNAをPCR鋳型として利用して、セプラーゼ細胞外ドメイン(アミノ酸29〜760)をコードするcDNA断片を、フォワードプライマー(5'-GCGCAAGCTTGCTGCGGCCCTCCCGGGTGCAC-3')及びリバースプライマー(5'-GCGCAGCGGCCGCGTCGGACAGGGAGAAGCACTGC-3')で増幅した。セプラーゼの短い細胞質ドメイン(アミノ酸1〜6)及び疎水性膜貫通ドメイン(アミノ酸7〜29)両方のコード配列を除いて、そのPCR産物を修飾pCEP4ベクター(Invitrogen社)に挿入した。pCEP4と比較して、修飾ベクターは、コザックコンセンサス配列と、ヘキサヒスチジン(H6)融合タグと、組換えタンパク質の効率的分泌のための、マウスIgカッパ鎖のV-J2-C領域からの分泌シグナルのコード配列とを更に含有する。セプラーゼ細胞外ドメインのcDNA配列を、組換えセプラーゼの効率的分泌、(抗His抗体、Invitrogen社、による)容易な検出及び(Ni-キレートアフィニティークロマトグラフィーによる)迅速な精製を可能にするN末端分泌シグナル及びC末端H6タグと共に、インフレームで挿入した。最終構築物をDNAシークエンシングによって検証し、pCEP4-Igカッパ-huセプラーゼ-coCHO_26-760aa-H6と命名し、組換え可溶性ヒトセプラーゼ(rhuセプラーゼ)の生成に使用した。
【０２８５】
細胞株
チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-K1)をATCCから入手し、ペニシリン(100単位/ml)、ストレプトマイシン(100mg/ml)及び10%(v/v)熱不活化ウシ胎仔血清(FBS)(Invitrogen社)を補充したDMEM/F-12培地で増殖させた。細胞を37℃で、5%CO2の加湿空気雰囲気中で維持し、48〜72時間ごとに継代させた。200μg/mLハイグロマイシンB (Invitrogen社)を添加して野生型細胞と同じ条件下でMOCK又はヒトセプラーゼ発現CHO-K1細胞(CHO-K1-MOCK及びCHO-K1-huセプラーゼ)を増殖させた。rhuセプラーゼの産生のために、Invitrogen社からのFreestyle(商標)CHO-S細胞株を使用した。この浮遊細胞株は、一般的なCHO-K1細胞株とは別のサブクローンとして区別されている(D'Anna、1996; D'Annaら、1997; Deaven及びPetersen、1973)。ベント式キャップを備えている、ポリカーボネート製、使い捨て、滅菌エルレンマイヤーフラスコ(125mL又は500mL)において、呼び容積の15〜25%を使用して、標準加湿条件(37℃及び8%CO2)下、120〜135rpm (Minitron Incubator shaker、Infors-HT社)で、細胞を培養した。密度がおおよそ1〜1.5×106生細胞/mlになったら、通常は48〜72時間ごとに、1 X HTサプリメントと4mMグルタミン(Invitrogen社)とを補充したCHO細胞用のタンパク質不含合成培地(CD CHO培地、Invitrogen社)で、細胞を継代培養した。
【０２８６】
組換えヒトセプラーゼの産生
可溶性組換えヒトセプラーゼタンパク質(rhuセプラーゼ)の大規模発現のために、FreeStyle(商標)MAX CHO発現系(Invitrogen社)を、その製造業者の説明書に従って使用した。簡単に言うと、CHO-S細胞を5〜6×105細胞/mlで継代させ、標準加湿条件下、120rpm〜135rpmで一晩、Minitron Incubator shaker (Infors-HT社)でインキュベートした。翌日、トランスフェクション当日に、それらの細胞を150ml中の1×106細胞/mlに希釈して500ml震盪フラスコに入れた。187.5μgのpCEP4-Igカッパ-huセプラーゼ-coCHO_26〜760aa-H6プラスミドDNAを、3mlのOptiPro(商標)SFMに添加し、混合した。187.5μlのFreeStyle(商標)MAXトランスフェクション試薬を3mlのOptiProSFM (Invitrogen社)で希釈し、穏やかに混合した。希釈されたFreeStyle(商標)MAXトランスフェクション試薬を、希釈されたDNA溶液に添加し、穏やかに混合し、10分間、室温でインキュベートした。細胞を含有する500mlフラスコに、そのフラスコをゆっくりと回旋させながら、DNA-FreeStyle(商標)MAX試薬複合体をゆっくりと添加した。その後、トランスフェクト細胞培養物を標準条件下でインキュベートした。トランスフェクションの5〜7日後、上清を回収し、HisTrap HP (GE Healthcare社)及びHiLoad 26/600 Superdex 200 prep grade SECカラム(GE Healthcare社)をそれぞれ使用して従来のNi-キレートアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製されたタンパク質の一部分を、PBS pH8.8中の10倍モル過剰のEZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce社)との氷上での2時間のインキュベーションによってビオチン化した。5%マンニトール(Roth社)と5%トレハロース(Applichem社)とを補充したPBSに緩衝液を交換した後、タンパク質を-20℃で保存した。
【０２８７】
安定したセプラーゼ発現細胞株の生成
ポリエチレンイミン、直鎖状、MW 25000 (PEI)(Polysciences. Inc社)試薬を、トランスフェクション試薬として使用した。安定した細胞株をPiggyBacトランスポゾン系で樹立した。簡単に言うと、この系は、組換え導入遺伝子のための哺乳動物発現カセットを有する人工トランスポゾンを保有するドナーベクターと、PBトランスポサーゼ(PBase)(Invitrogen社)の一過的発現を駆動するヘルパーベクターとからなる。トランスフェクションの前日に、3×105 CHO-K1細胞を6ウェルプレートの1ウェル当り2mLの増殖培地に播種した。CHO-K1細胞に、2μgトランスポゾンベクタープラスミド及び0.8μgのトランスポサーゼベクタープラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、細胞を分割し、200μg/mlハイグロマイシンB (Invitrogen社)を含有する培地に入れた。ハイグロマイシン選択の2週間後、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット及び免疫蛍光分析によってトランスフェクション効率及び標的発現を分析した。機能性は、Z-Gly-Pro-AMC基質(Bachem社)を使用して酵素活性アッセイによって試験した。
【０２８８】
フローサイトメトリー分析
フローサイトメトリーのために、1×106細胞を回収し、FACS緩衝液(PBS + 0.5M EDTA + 5%FBS)で1回洗浄し、ヒトセプラーゼに対する抗体(クローン1E5、Abnova社; 1:50希釈)と共に、又は様々な濃度のチオレドキシン-A (Trx)ミニタンパク質融合体と共に、1時間、氷上でインキュベートした。四量体化ミニタンパク質の結合を分析するために、ビオチン化ミニタンパク質を5倍モル過剰のストレプトアビジン-APC (Affymetrix eBioscience社)と共に10分間、室温でプレインキュベートした。インキュベーション後、細胞をFACS緩衝液で3回洗浄した。四量体化ミニタンパク質で処理した細胞をフローサイトメトリー分析に直接使用した。セプラーゼ発現又は一価ミニタンパク質結合を分析するために、細胞を二次Cy5標識抗マウス抗体(Dianova社)で又はPE-標識抗H6抗体(R&D Systems社、Trx-ミニタンパク質融合体内の内部H6タグを検出する)で染色した。30分後、細胞を再びFACS緩衝液で洗浄し、FACS Canto IIデバイス(Becton Dickinson社)を使用して分析した。前方散乱/側方散乱特性に従って同定した生細胞を用いて分析ゲートを設定した。FlowJoソフトウェア(バージョン10、Tree Star. Inc社)を使用してデータを分析した。
【０２８９】
免疫組織化学
腫瘍を直ちに切除し、包埋カセットに移入し、一晩、4℃で、4% Roti-Histo-Fix (pH7)(Roth社)で固定した。固定後、腫瘍を70%エタノールで洗浄して、過剰な固定溶液を除去した。その後、腫瘍を上昇アルコール系列で脱水し、組織プロセッサーでパラフィン包埋した。包埋された腫瘍の連続切片作製(3μm厚)をミクロトームで行った。切片をスライドガラスにマウントし、脱パラフィンし、下降アルコール系列で再水和した。次いで、切片をマイクロ波照射装置で20分間、10mMクエン酸緩衝液(pH6)と共に沸騰させた。1×PBSTで洗浄した後、非特異的結合をPBST中3%BSAで30分間ブロックした。四量体化のために事前にストレプトアビジン-Cy3 (Rockland社)とプレインキュベートした、1:500ポリクローナル抗SMA抗体(Abcam社)又は1μMビオチン化ミニタンパク質を添加し、一晩、4℃でインキュベートした。切片を1×PBSTで3回洗浄した後、抗SMA抗体結合を、1:200希釈された二次抗体IgG抗ウサギFITC (Dianova社)で検出した。二次抗体を1時間、室温で、暗所でインキュベートした。最後に、切片をPBSで3回洗浄し、その後、Hoechst色素(Sigma-Aldrich社)と共にインキュベートし、10分間、1×PBSで1:5000希釈し、封入剤(Darko社)でマウントした。
【０２９０】
TNBCにおけるセプラーゼの発現レベルを評価するために、肺癌及び膵臓癌の免疫組織化学的分析を行った。セプラーゼの陽性発現レベルを有するCHO-K1-huセプラーゼ組織を陽性対照として、及びヒト結腸切片を陰性対照として使用した。
【０２９１】
パラフィン包埋膵臓組織については、3μm厚の切片を、キシレン及び等級付けされたエタノールで脱パラフィンした。切片を10mMクエン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0 + 0.05% Tween-20中、120℃で加熱することによって、抗原賦活化を行い、10分間、冷却した。試料をPBS + 0.3% H2O2で15分間、失活させた。凍結組織切片(乳房及び肺組織)をクリオスタットで5〜8μmの切片にした。それらの切片を10分間、室温で解凍し、5分間、PBSで再水和し、10分間、BLOXALL (Vectorlabs社)で失活させた。
【０２９２】
全ての切片を10%正常ヤギ血清と共に室温で30分間インキュベートして、非特異的反応をブロックした。この後、0.5μg/mlに希釈したポリクローナルウサギ抗ヒトセプラーゼ抗体(Sigma社)と共に1時間、室温でインキュベートした。PBSでの洗浄後、切片を30分間、二次抗体(Power-Vision HRP抗ウサギ)と共にインキュベートした。Vector NovaRED系(Vector Laboratories社)とのインキュベーションによって免疫染色の局在性を立証した。切片のマイヤーヘマトキシリンでの対比染色及び脱水をMultistainer ST5020 (Leica社)で行った。その後、スライドにXTRA-Kitt Medite封入剤でマウントした。
【０２９３】
rhuセプラーゼに対するファージディスプレイ選択
おおよそ1×1010の個々のバリアントを含むランダム化ノッチンライブラリーを、rhuセプラーゼに対するファージディスプレイ選択に適用した。ライブラリーは、ナンバンカラスウリからの鎖式トリプシン阻害剤II (oMCoTi-II、(Avrutina、Schmoldtら2005))に基づく。Maxisorp(商標)イムノチューブ(Thermo Scientific社)上に固定化されたrhuセプラーゼを使用して、又はストレプトアビジン被覆磁性ビーズ(Dynabeads 280ストレプトアビジン、Life Technologies社)によって、3ラウンドの選択ラウンドを行った。
【０２９４】
ミニタンパク質バリアントの産生
ビオチン化ミニタンパク質バリアントをPepscan社から購入した。これらの場合、ミニタンパク質は、従来の固相ペプチド合成、その後のネイティブシスチン-ノット構造への熱力学的折り畳みによって生成された。他の全ての場合、細菌宿主の細胞質中でジスルフィド結合形成を可能にする大腸菌Shuffle(商標)T7 Express株(NEB社)(Lobstein、Emrichら、2012)とチオレドキシン-A (Trx)ベースの融合系を併用して、ミニタンパク質を組換えで産生させた。半調製的又は分析的組換え合成については、ミニタンパク質バリアントをコードする遺伝子を固有Bam HI及びApa I制限部位によってpET-32-LibExベクターにクローニングして、チオレドキシン-A、Hisタグ(H6)、Sタグ及びミニタンパク質遺伝子からなる、四要素融合体(tetrapartite fusion)を得た。ミニタンパク質の半調製的産生については、1l震盪フラスコにおいて標準溶原性ブロス(LB)培地を使用して発現を行ったが、分析規模の産生(例えば、MC-FA-010アラニン変異体のヒット同定又は分析のためのもの)は、96ウェルプレートにおいて自己誘導培地(MagicMedia(商標)、Life Technology社)を使用して行った。発現後、細胞を回収し、リゾチームで、又は凍結/解凍サイクルと組み合わせた超音波処理によって溶解した。両方の場合、透明細胞溶解物を80℃で10分間の加熱工程に供して、大量の宿主細胞タンパク質を除去した。得られたタンパク質調製物をELISA結合分析に(例えば、ヒット同定を目的として)直接使用した、又はNi-NTAスピンカラム(Qiagen社、分析規模)若しくは5ml HisTrap HPカラム(GE Healthcare社、半調製規模)を使用してNi-キレートアフィニティークロマトグラフィーによって更に精製した。タグのないミニタンパク質の生成については、trx-ミニタンパク質融合体を、トロンビン(Sigma社)で、融合タンパク質1mg当り0.5Uのトロンビンとの37℃での一晩のインキュベーションによって切断した。次いで、TSKgel ODS-120Tカラム(Tosoh Bioscience社)を使用するHPLCによってミニタンパク質を単離することができた。それぞれのHPLC画分の凍結乾燥後に得た最終ミニタンパク質調製物を、質量分析、及びBioSep-SEC-S2000カラム(Phenomenex社)を使用する分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。収率は、計量又はOD (280nm)測定によって計算した。
【０２９５】
ウェスタンブロッティング
1×105細胞を培養皿で培養し、冷1×PBSで1回洗浄し、500μL 4×SDS溶解用緩衝液(250mM Tris-HCl、34%グリセロール、8.2% SDS、5%β-メルカプトエタノール)で溶解した。細胞をセルスクレーパーで掻き取り、細胞片を除去するために溶解物を数分間、14000 x gで、4℃で遠心分離した。その後、溶解物を超音波処理した。溶解物のアリコートを、ブロモフェノールブルーを添加した4X SDS-溶解用緩衝液と共に沸騰させ、SDS-PAGE及びその後のウェスタンブロッティングによって分析した。次の抗体を検出に使用した:一次抗体として:抗セプラーゼ(Abcam社)、抗His(Abcam社)又は抗-β-アクチン、及び二次抗体として、抗マウス-HRP (クローン)。
【０２９６】
ヒット同定
3ラウンドのファージディスプレイ選択後、ファージバックグラウンドとは無関係に推定的rhuセプラーゼ結合剤の同定を可能にするために、得られたプールをpET-32-LibEx発現ベクターにサブクローニングした。このために、それぞれのミニタンパク質遺伝子プールを特異的オリゴヌクレオチドでPCR増幅した。得られたPCR産物を精製し、Bam HI及びApa I制限酵素で切断し、同様に消化された発現ベクターとライゲーションした。大腸菌Shuffle(商標)T7 Expressの形質転換後、個々のクローンを採取し、Trx-融合タンパク質を上で説明したように96ウェル形式で産生させた。結合の分析のために、ELISAアッセイを行った。そのために、MaxiSorp 96ウェルプレート(Nunc/Thermo Fisher Scientific社)を標的タンパク質又はBSA (50mM炭酸Na、pH9.4中の5μg/mlタンパク質溶液、各100μl)でコーティングした。標的タンパク質への結合が「シグナル」に相当し、BSAへの結合が「ノイズ」に相当する。単一プレートの正規化のために、MC-Myc-010 (Myc結合シスチンノットミニタンパク質)及び抗cMyc抗体(クローン9E10)の結合を3回ずつ分析した。4℃で一晩、コーティングを行った。0.1% Tween 20 (pH7.4、PBS-T)を含有する300μlリン酸緩衝食塩水でウェルを3回洗浄した。次いで、ウェルを2時間、ブロッキング溶液(Sigma Aldrich社)でブロックした。洗浄工程(3×PBS-T)後、Trx融合タンパク質含有溶解物を1:5希釈し、コーティングされたタンパク質と共に1時間、4℃でインキュベートした。抗Sタグ抗体(PBS中1:2000、abcam社)を使用して、洗浄及びインキュベーション工程を反復した。検出前に洗浄工程を2回行った(3×PBS-T及び3×PBS)。検出は、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン液体基質(TMB溶液、Sigma-Aldrich社)及び450nmでの吸収増加(Tecan M200 Pro ELISAリーダーで検出)を使用して行った。単一クローンの発現を96ウェルE-PAGE電気泳動(Life Technologies社)によって分析し、タンパク質バンドの定量をImageQuant TLソフトウェアパッケージ(GE Healthcare社)によって行った。タンパク質の順位付けのためにELISAのシグナルのノイズに対する比を計算し、発現値と相関させた。その後、上位30のクローンを更なる分析に使用した。
【０２９７】
ELISAによる結合分析
ELISAを行って、ミニタンパク質バリアントの結合特性及び特異性を評定し、比較した。このために、組換えタンパク質又は全細胞のどちらかを使用した。全細胞ELISA分析のために、5×105細胞を96ウェル平底プレート(Corning社)の各ウェルに播種した。そのために、細胞を20時間、37℃で、5%CO2の加湿空気雰囲気中でインキュベートした。その後、ウェルを5%粉乳/PBSで1時間、室温でブロックした。ブロッキング用緩衝液を除去した後、Trx-ミニタンパク質溶液を各ウェルに添加し、細胞と共に1時間、室温でインキュベートした。その後、ウェルをPBS-T (PBS + 0.1% Tween-20)で6回、十分に洗浄し、結合ミニタンパク質の量をホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗Sタグ抗体(Abcam社)で検出した。3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)(Sigma社)を発色基質として使用した。おおよそ20分後にHRP酵素反応を0.2M HClで停止させ、プレートをVictor V3プレートリーダー(Perkin Elmer社)において450nmで測定した。競合研究のために、0.1μM Trx-MC-FA-010融合タンパク質を様々な濃度の単独MC-FA-010ミニタンパク質(1〜200μM)と予混した後、細胞と共にインキュベートした。
【０２９８】
タンパク質ベースのELISA分析のために、5μgのそれぞれの組換えタンパク質(rhuセプラーゼ;ストレプトアビジン: Sigma社; DPP-IV: R&D Systems社、BSA: Eurobio社)を、コーティング用緩衝液中、4℃での一晩のインキュベーションによって、MaxiSorp(商標)プレート(Nunc社)のウェルごとに固定化した。Hydrospeedプレートウォッシャー(Tecan社)を用いて300μl PBS-T/ウェルで3回洗浄した後、ウェルを1×カゼイン溶液(Sigma社、PBSで希釈されたもの)で2時間、室温でブロックした。その後、上に示したようにウェルを洗浄した。次いで、PBS-Tで希釈した100μlのそれぞれのTrx-ミニタンパク質融合体を添加し、1時間、4℃でインキュベートした。単純に加熱工程で精製したタンパク質を1:5希釈し、アフィニティー精製したタンパク質を0.39〜50nMの範囲の被定義濃度で適用した。競合ELISAのために、固定濃度の3nM Trx-ミニタンパク質融合体を様々な濃度(0.64〜3167nM)の単独ミニタンパク質と混合した後、インキュベートした。PBS-T洗浄手順後、上で説明したようにHRP結合抗Sタグ抗体を使用してTrx-融合体の結合を検出した。データのフィッティングのためにSigmaplot 10及び1サイト飽和結合モデルを使用して、見掛けのKdを計算した。
【０２９９】
SPR分析
動力学的結合特性の見通しを得るために、表面プラズモン共鳴(SPR)分析をBiacore T100デバイス(GE Healthcare社)で行った。そのために、rhuセプラーゼを10μl/分で420秒間、製造業者によって説明された通りのNHS/EDC媒介性カップリングによってCM5チップ上に固定化した。固定化されたrhuセプラーゼとの様々な濃度(37、111.1、333.3、1000及び3000nM)のMC-FA-010の結合を、会合及び解離について90秒の期間にわたって測定した。付属のソフトウェアを使用してKd値を計算した。
【０３００】
表面プラズモン共鳴分光測定(Biacore T-100、GE Healthcare社)を使用して、単量体及びオリゴマーMC-FA-010及びそれらのバリアントの、組換えヒトセプラーゼ(rhuセプラーゼ)に対する動態及び親和性を判定した。Rhuセプラーゼ(BPS中の20μg/ml、5%マンニトール、5%トレハロース)をアミノ反応性SシリーズセンサーチップCM5 (GE Healthcare社)上に固定化した。単量体Microbodyの結合分析については、rhuセプラーゼを最大7500RUまでロードし、オリゴマーMicrobodyについては最大700RUまでロードした。予想解離定数に基づいて3.125〜1000nMの濃度範囲でマルチサイクル動力学的方法を使用して単量体Microbodyを測定した。会合工程を60〜90秒の期間にわたって、解離を420秒にわたって測定した。三量体Microbodyは、0.3125〜5nMの濃度範囲で単一サイクル動力学的方法(90秒間の会合、420秒間の解離)を使用して測定した。結合動態及び定常状態分析は、1:1結合モデル(Biacore T-100 Evaluation Software、GE Healthcare社)を使用して計算した。
【０３０１】
MC-FA-010のアラニンスキャン変異導入
セプラーゼ結合剤MC-FA-010の構造-活性関係の見通しを得るために、アラニンスキャン変異導入を行った。そのために、可変領域のアミノ酸1つ1つをDNAレベルでアラニンによって交換した。変異遺伝子は、Geneart社がDNA Strings(商標)として合成したものであり、それを固有のBam HI及びApa I制限部位によってpET-32-LibEx発現ベクターに直接クローニングした。アラニンバリアントの産生は、上で説明したようにShuffle(商標)T7 Express大腸菌株を使用して96ウェルマイクロタイタープレートで行った。Ni-NTAスピンカラム(Qiagen社)での精製後、バリアントの結合特性をELISAによって分析し、MC-FA-010野生型ミニタンパク質と比較した。
【０３０２】
親和性成熟
アラニンスキャン変異導入から得たデータ及び同定されたMC-FA-010/-012結合モチーフに基づいて、第2のファージライブラリーを生成した。このライブラリーでは、セプラーゼ結合に重要な意味をもつアミノ酸位置を一定に保った(Y、W、及びGRGP配列)が、結合ループの他の全ての位置を、システインを除く全ての可能なアミノ酸を使用してランダム化した。ストリンジェンシーに関して異なる、4つの異なる条件(一価又は多価ディスプレイ、遊離MC-FA-012ミニタンパク質との競合を伴う又は伴わない、異なる洗浄条件)を適用して、このライブラリーを組換え可溶性ヒトセプラーゼに対して再びスクリーニングした。3サイクルの選択サイクル後、全てのプールをpET-32発現ベクターにクローニングした。プールごとに96クローンを発現させ、上で説明したヒット同定プロセスを使用して分析した。最上位クローンの26個を選択し、より大量に産生させ、より詳細に分析した。
【０３０３】
in vivo近赤外光学イメージングを使用するMicrobody(登録商標) AlexaFluor-680コンジュゲートの生体内分布及び腫瘍標的化分析
in vivoイメージングアッセイのために、雌Fox n1 nuマウス(6〜8週齢、Harlan、Envigo社)を使用した。実験は、国家規制に従って行い、地方動物実験倫理委員会によって承認された。亜集密CHO-K1-huセプラーゼ細胞を回収し、PBSに再懸濁させて1×107細胞s/mlの密度にした。接種前に、0.4%トリパンブルー排除アッセイによって細胞生存率を試験した(生細胞>90%)。皮下注射のために100μl PBS中の1×106 CHO-K1-huセプラーゼ細胞を100μl Matrigel (Corning社)と混合し、肢の右側に注射した。腫瘍体積が600〜800mm3に達したら、動物を幾つかの異なる処置群(各群にn=3)にランダムに分けた。次いで、1.67nmol AF680-(MC-FA-012)3又は対照Microbody(登録商標)AF680-(MC-FA-0116)3を静脈内注射した。注射後異なる時点でマウスをイソフルランの吸入によって麻酔した。Xenogen IVIS Spectrum Imaging System (Perkin Elmer社、USA)を使用して、in vivoイメージングを行った。Living Image 2.5 (Xenogen、Perkin Elmer社)画像分析ソフトウェアを使用して最大近赤外シグナル(NIRF)を定量した。ex vivo NIRFイメージングのために、マウスを屠殺し、各マウスの腫瘍及び主要器官を切除し、計量し、Xenogen IVISシステムによって分析した。
【０３０４】
免疫蛍光分析
1μMビオチン化MC-FA-012及び対照MC-FA-0116をストレプトアビジン-Cy3 (Rockland社)と共に(モル比5:1)、30分間、室温でプレインキュベートした。組織の凍結切片(6μm)をアセトンで固定し、3%BSA/PBSでブロックして非特異的結合を防止した。次いで、活性化線維芽細胞を検出するために抗SMA抗体(Abcam社)で、及びMicrobody-ストレプトアビジン混合物で、30分間、37℃で組織を染色した。その後、切片をすすぎ、30分間、Alexa 488コンジュゲート二次抗体(Abcam社)と共に37℃でインキュベートした。最後に、切片を再び洗浄し、核を検出するためにHoechst 33258 (Sigma-Aldrich社)と共にインキュベートし、再び2回洗浄し、蛍光封入剤(Dako社)でマウントした。次いで、切片を倒立蛍光顕微鏡(Zeiss社AxioObserver.Z1)で検査した。
【０３０５】
小動物PETイメージング及び器官内分布
DOTA-(MC-FA-012)3の177Lu標識付け
2.5nmol MC-FA-012三量体を50μlの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0に溶解し、1μlの20%アスコルビン酸水溶液と混合した。0.4M酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0中の2.5μlの177LuCl3 (約25MBq)を添加した。その混合物を15分間、95℃で加熱し、0.9%食塩水を使用して希釈して2.5mlの全量にした。標識された化合物と未標識の化合物を一切分けずに放射標識付けを行った。放射化学収率を分析的RP-HPLCによって決定した。177Lu-(MC-FA-012)3は、177Lu標識DOTA-(MC-FA-012)3に相当する。
【０３０６】
DOTA-(MC-FA-012)3の68Ga標識付け
68Gaは、68Ge/68Gaジェネレーターから0.6M HCl中の[68Ga]GaCl3として得た。5nmol MC-FA-012三量体及び10μlの20%アスコルビン酸水溶液を550μlの68Ga溶出液と混合し、160μlの2.5M酢酸ナトリウム緩衝液(pH8)で中和して3.5の最終pHにした。その混合物を13分間、95℃で加熱し、固相抽出カートリッジ(Agilent Varian社Bond Elut Plexa)を使用して精製し、0.9%食塩水で希釈した。標識された化合物と未標識の化合物を一切分けずに放射標識付けを行った。放射化学収率を分析的RP-HPLCによって決定した。68Ga-(MC-FA-012)3は、68Ga標識DOTA-(MC-FA-012)3に相当する。
【０３０７】
放射標識DOTA-(MC-FA-012)3のin vivo試験
in vivo実験のために、8週齢BALB/c nu/nuマウス(Charles River社)の右体幹に5×106 CT26-huセプラーゼ細胞をそれぞれ皮下接種した。イメージング実験(n=2)のために、5×106 CT26-hu野生型細胞を対照として左体幹に更に注射した。腫瘍サイズがおおよそ1cm3に達したら、放射標識化合物(小動物PETイメージングについては約10MBq、器官内分布については約1MBq)を尾静脈経由で注射した。
【０３０８】
177Lu-(MC-FA-012)3の器官内分布
器官内分布のために、指示時点(30分〜24時間)後に動物(時点ごとにn=3)を屠殺した。切除した全ての器官内に及び血液中に分布している放射活性を、γカウンターを使用して測定した。値を1グラム当たりの注射用量パーセンテージ(%ID/g)として表す。
【０３０９】
68Ga-(MC-FA-012)3を用いる小動物PETイメージング
小動物PETスキャナーInveon PET (Siemens社)を使用してPETイメージングを行った。15分の透過スキャン後、麻酔したマウスにおおよそ2.5nmolの68Ga-(MC-FA-012)3 (約10MBq)を注射した。最初の60分以内にダイナミックスキャンを、続いて注射の120〜140分後にスタティックスキャンを行った。3D-OSEM+MAP法(Siemens社)を使用して画像を反復的に再構築し、標準取込値(SUV)画像に変換した。ROI技術を使用して定量を行いSUV平均値として表した。
【０３１０】
診断及び治療目的
DOTA-(MC-FA-012)3の68Ga標識付け
68Ga (半減期68分、陽電子エネルギー最大1.9MeV [β+ 89%])は、68Ge/68Gaジェネレーターから0.6M HCl中の[68Ga]GaCl3として得た。2.5nmol DOTA-(MC-FA-012)3及び10μlの20%アスコルビン酸水溶液を1mlの68Ga溶出液(約0.8〜1GBq)に添加し、280μlの2.5M酢酸ナトリウム緩衝液(pH8)で希釈して3.5の最終pHにした。その混合物を15分間、95℃でインキュベートし、固相抽出カートリッジ(Agilent Varian社Bond Elut Plexa)を使用して精製し、0.9%食塩水で希釈した。標識された化合物と未標識の化合物を一切分けずに放射標識付けを行った。放射化学収率を分析的RP-HPLCによって決定した。
【０３１１】
DOTA-(MC-FA-012)3の177Lu標識付け
177Lu(半減期6.71日、電子エネルギー最大497keV [β- 79%]、光子エネルギー最大113keV [6%]、208keV [11%])は、ITG GmbH Garching社から0.04M HCl水溶液中の[177Lu]LuCl3として購入した。15nmol DOTA-(MC-FA-012)3を100μlの0.4M酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0に溶解し、10μlの20%アスコルビン酸水溶液と混合した。0.4M酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0中の70μlの177LuCl3(約2.5MBq)を添加した。その混合物を15分間、95℃でインキュベートし、0.9%食塩水を使用して希釈して5mlの全量にした。標識された化合物と未標識の化合物を一切分けずに放射標識付けを行った。放射化学収率を、分析的RP-HPLC、並びに溶媒として10%メタノールを含有する及び含有しない0.5Mクエン酸ナトリウムpH5の溶液でのインスタント薄層クロマトグラフィー(ITLC-SG)によって決定した。
【０３１２】
PETイメージング
静脈内適用した68Ga-(MC-FA-012)3 (2.5nmol、63〜359MBq)を使用して診断用イメージングを行った。注射した放射性トレーサーの活性の変動は、68Gaの短い半減期、及び68Ge/68Gaジェネレーターの寿命中に得られる可変的溶離効率に起因した。68Ga-(MC-FA-012)3の投与の1及びおおよそ3時間後、PET/CTスキャナーSiemens社Biograph-mCT Flowを使用して患者を調査した。減衰補正のためのCTスキャンを行った後、不感時間、散乱及び減衰について補正されたスタティック放射スキャンを獲得した。画像を反復的に再構築し、標準取込値(SUV)画像に変換した。
【０３１３】
177Lu-(MC-FA-012)3の投与後、おおよそ2.5GBqの静脈内注射の翌日に、ガンマカメラGE Millenium VG5 Hawkeyeを使用して医用イメージングを行った。
【０３１４】
(実施例2)
ヒトFAPα結合oMCoTi-II変異体MC-FA-010の設計
FAPα結合シスチンノットミニタンパク質MC-FA-010を高多様性ファージベースのoMCoTi-IIライブラリー(1×1010の個々のバリアントを含有)から単離した。3ラウンドの選択ラウンド後の富化されたクローンの配列分析は、35アミノ酸(aa)長を有するミニタンパク質配列を明示した(図1)。
【０３１５】
同定されたミニタンパク質の構造機能関係を分析するために、アラニンスキャン変異導入を行った(図2A+図2B)。組換え標的タンパク質を使用して直接ELISA設定でMC-FA-010バリアントのヒトセプラーゼとの濃度依存性結合を測定し、1サイト飽和結合モデル(Sigma plot 10)によってEC50値を計算した。図2Aは、全結合データの要約を示す。アラニン変異体の結合を、MC-FA-10の親配列と比較した相対結合として示す。保存された/増加した結合(それぞれ弱い結合損失)を緑色で示し、弱い及び中等度の結合はオレンジ色で示し、無結合(完全な結合喪失)を赤色で示す。
【０３１６】
アラニンスキャン変異導入は、2つの芳香族及び4つの脂肪族アミノ酸からなる結合モチーフ(YXXWXXGRGP、図2B)を明示した。単一アラニン交換がMC-FA-010のヒトセプラーゼとの結合を完全に消失させるような、所与の配列の高い特異性を示す。1つのバリアント、MC-FA-012 (K2A)は、野生型Microbody(商標)MC-FA-010と比較して、セプラーゼに対してよりいっそう高い親和性(160%)を示した。このバリアントも更なる機能化アプローチに含めた。
【０３１７】
(実施例3)
ヒトFAPα結合oMCoTi-II変異体MC-FA-010及びそのバリアントの標的結合
MC-FA-010はナノモル範囲でヒトセプラーゼへの親和性を示す
組換えヒトセプラーゼと結合するMC-FA-010の親和性を、濃度依存性ELISAを使用して測定した。ヒトセプラーゼの可溶性画分でプレートをコーティングし、MC-FA-010をチオレドキシンとの融合タンパク質(Trx-MC-FA-010)として0.39〜50nMの濃度範囲で添加した。結合ミニタンパク質の検出を、抗Sタグ-HRPコンジュゲートタンパク質(Sタグはチオレドキシン融合発現系から提供される、図3A)によって果たした。Sigma plot 10で1サイト飽和結合モデルを使用してEC50値を計算した。加えて、3nM Trx-MC-FA-010の結合を0.64〜3167nMの範囲の可溶性一価MC-FA-010と競合させ(図3B)、その結果、結合の特異的競合が明らかになった。EC50値及びIC50値の両方が、ナノモル範囲でMC-FA-010のヒトセプラーゼとの結合親和性を示す。
【０３１８】
これらの実験は、一般に、MC-FA-010のヒトセプラーゼとの特異的結合を証明する。次の工程として、表面プラズモン共鳴技術(SPR)を使用して結合動態のより詳細な分析を行った。そのために、アミノ反応性表面を有するCM5チップ(GE Healthcare社)上に組換えヒトセプラーゼを固定化した。Biacore T100システムを使用して濃度系列(37、111.1、333.3、1000及び3000nM)で可溶性一価MC-FA-010の会合及び解離を測定した。システムの付属のソフトウェアを使用して、会合及び解離データをフィッティングし、対応する解離定数及び動態値(Kon、Koff及びKd)を計算した(図4A及び図4B)。SPR分析は、おおよそ560nMの解離定数を明示し、したがって、ELISAによって分析したときのナノモル範囲の前に測定した親和性を確証する。
【０３１９】
MC-FA-010はヒトセプラーゼに対して高い選択性を示す
ヒトセプラーゼに対するMC-FA-010の選択性を分析するために、密接な関連があるジペプチジルペプチダーゼIV (DPP IV、CD26)との結合を研究した。DPP IVは、アミノ末端の38 aaを欠く可溶性形態へとタンパク質分解的に切断もされうる、88kDa膜結合糖タンパク質である。図5Aは、緑色で描かれているセプラーゼと青緑色又は灰色で描かれているDPP IVの構造オーバーレイ(Pymol)を示す。セプラーゼ及びDPP IVは、52%配列同一性及び71%類似性を共有する。セプラーゼに対するMC-FA-010の選択性をELISAによって分析した。DPP IVをそれぞれコーティングしたヒトセプラーゼ、及びTrx-MC-FA-010の結合を、0.1〜100nMの濃度系列で測定した。
【０３２０】
予想通り、MC-FA-010は、セプラーゼと強く且つ選択的に結合する。MC-FA-010のDPP IVとの結合については測定した最高濃度で非常に弱いシグナルしか検出することができなかった(図5B)。したがって、MC-FA-010は、セプラーゼに対して強い選択性を示す。
【０３２１】
MC-FA-010はセプラーゼ発現細胞と特異的に結合する
MC-FA-010のヒトセプラーゼ過剰発現CHO-K1細胞(CHO-K1-セプラーゼ)との結合を調査するために、免疫蛍光染色を行った。標的陰性CHO-K1-MOCK細胞及び陰性対照Microboy(商標)を対照として使用して、細胞表面の無関係のタンパク質とのMicrobody(商標)の非特異的結合を排除した。細胞とのインキュベーションの前に、MC-FA-010及び対照Microbody(商標)をビオチン化し、Cy3コンジュゲートストレプトアビジン上に前もって集合させた。CHO-K1-MOCKと比較して、MC-FA-010-bio/SA-Cy3の特異的結合がCHO-K1-セプラーゼで検出された。予想通り、対照Microbody(商標)は、CHO-K1-セプラーゼ細胞と結合しない(図6)。このことは、セプラーゼ発現細胞に対するMC-FA-010の特異的相互作用をはっきりと実証する。
【０３２２】
MC-FA-010はセプラーゼ発現腫瘍と特異的に結合する
MC-FA-010(ストレプトアビジン-Cy3によって四量体化されたもの)のマウスセプラーゼ発現腫瘍細胞との結合を分析するために、BALB/cマウスにCT26細胞を皮下注射した。腫瘍細胞移植の14日後にマウスを屠殺し、腫瘍をパラフィン切片用に単離した。その後、3μm切片を染色した(図7)。セプラーゼ発現CAF(がん関連線維芽細胞)の可視化のために、切片を抗α-SMA抗体(緑色)で染色した。核局在化をDAPIで染色した(青色)。赤色でMC-FA-010及び対照Microbody(商標)MC-Myc-010の特異的結合が検出可能である。ここで、本発明者らは、MC-FA-010がマウス腫瘍切片に由来するCAF上に結合することを証明することができた。予想通り、対照Microbody(商標)は、CT26腫瘍切片と結合しない。要するに、セプラーゼ特異的Microbody(商標)MC-FA-010を用いてセプラーゼ発現腫瘍に対処することが可能である。
【０３２３】
MC-FA-010のオリゴマー化はその親和性を増加させる
可能なアビディティー効果を研究するために、ヒトセプラーゼ過剰発現細胞(CHO-K1-セプラーゼ)に対する一価及び四価MC-FA-010の結合活性を分析した。そのために、一方で、一価Trx-MC-FA-010融合タンパク質(チオレドキシン-His6-カセットからなる)を使用し、もう一方で、ストレプトアビジン-APCを使用してオリゴマー化したビオチンコンジュゲートMicrobody(商標)(MC-FA-010-bio/SA-APC)を使用した。得られたMC-FA-010構築物のヒトセプラーゼに対する結合特性をFACSによって判定し、一価MC-FA-010のEC50値177.6nMを明らかにし、その一方で、四価バリアントは、よりいっそう高い親和性を示し、EC50は2.367nMであった(図8)。考え合わせると、MC-FA-010のオリゴマー化は、アビディティー効果をもたらし、セプラーゼへのMC-FA-010の親和性を増加させる。
【０３２４】
MC-FA-012の化学的オリゴマー化
MC-FA-012 Microbody(商標)のDOTAコンジュゲート三量体化バージョン(DOTA-(MC-FA-012)3)をPepscan社から購入した。その生成は、オキシムライゲーション戦略に基づいた。それ故、アミノ末端アミノオキシ基をN末端に有するMC-FA-012バリアントを化学的に合成した。そのほかに、アミノ末端結合DOTA部分とGSGSリンカー配列によってそれぞれ離隔されている3つのリジン-セリンストレッチとからなるアンカー分子を生成した。反応性アルデヒドを形成するために、セリン残基の末端ヒドロキシル基を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化した。最後に、活性化アンカーとアミノオキシ-MC-FA-012バリアントをオキシムライゲーション反応によってカップリングさせて、DOTA-(MC-FA-012)3三量体(図9A参照)を形成した。
【０３２５】
三量体をFACSベースの競合アッセイで単量体Microbody(商標)と比較して機能分析した(図9B及び図9Cを参照されたい)。このアッセイでは、CHO-K1-huセプラーゼ細胞をTrx-Mc-FA-012融合タンパク質及び抗H6-PE抗体で連続的に染色した。異なる濃度の三量体との並行インキュベーションは、43.32nMのIC50値で有意な阻害をもたらしたが、単量体ではわずかな競合しか見ることができなかった。したがって、三量体足場上のMicrobody(商標)の空間的配向は、膜結合セプラーゼとの効率的結合を可能にする。観察されたアビディティー効果は、化学的オリゴマー化が、リガンドの親和性を有意に増加させるための、並びにそれによって腫瘍部位でのプローブの結合及び保持増進を助長するための、生産的方法でありうることを、更に示す。
【０３２６】
記載したDOTAコンジュゲートDOTA-(MC-FA-012)3に加えて、AlexaFluor(登録商標)680コンジュゲートバリアントをin vivoイメージング用にPepscan社から購入した。AlexaFluor680-(MC-FA-012)3 (AF680-(MC-FA-012)3)アンカー分子を、DOTA-(MC-FA-012)3と同様に生成した。AlexaFluor680部分のカップリングは、溶液中の活性化エステルとして、N末端アミドに対して行った。
【０３２７】
組換えヒトセプラーゼとの単量体MC-FA-010並びに単量体及び三量体MC-FA-012結合の動態分析
単量体及び三量体セプラーゼ結合Microbodyの結合動態を、Biacore T-100システムでの表面プラズモン共鳴分光測定を使用して判定した。単量体MC-FA-010 Microbody(登録商標)については149nMの解離定数が測定された。単一Lys2Ala交換があるMC-FA-012バリアントは、340nMの親和性を示した。三量体バリアントDOTA-(MC-FA-012)3及びAF680-(MC-FA-012)3の両方が、ナノモル未満の範囲で単量体Microbodyと比較して有意に高い親和性及び遅い解離速度を示した。DOTA-(MC-FA-012)3は、12.4pMの解離定数(定常状態分析、249pM)を有する。AF680-(MC-FA-012)3は、61.5pMの解離定数(定常状態分析、669pM)を有する。MC-FA-012と比較して、DOTA-(MC-FA-012)3の解離速度は、約530倍遅く、AF680-(MC-FA-012)3の解離速度は、約134倍遅い。小さいサイズ(約13000Da)及び遅い解離速度のため、両方の三量体構築物は、総バックグラウンドが低い腫瘍のin vivoイメージングに適している。詳細な動態データをTable 3(表3)及び図11(A〜D)に要約する。
【０３２８】
足場交換
Microbody(登録商標)結合剤の物理化学的特性及びそれらに基づく特徴(例えば、正味電荷、安定性、経口アベイラビリティ)を向上させる又は調節するために、結合に関与する配列枝を他の代替足場にグラフトすることができる。この研究では、主として第1のループに位置するMC-FA-012の結合配列を、テッポウウリのトリプシン阻害剤EETI-II (ET-FA-012)及び最適化されたMcoTI-II足場(ナンバンカラスウリ、MO-FA-012)に基づく2つの足場に移入した。対応する配列情報をTable 4 (表4)に収載する。前記タンパク質のDNAコード領域をpET32b-LibExのベクター骨格にクローニングして、チオレドキシンとの融合体としての発現を可能にした。発現及び精製は、上(実施例1)で説明したように行った。SPR分析のために、トロンビン切断、並びにIMAC及びRP-HPLCでの追加の精製によって、チオレドキシンを分離した。正しい合成を確認するために、予想質量を質量分析によって検証した。新たに構築されたMicrobodyの機能性を、SPRを使用して分析した。両方のMicrobodyは、MC-FA-012と比較してわずかに弱い解離定数で固定化rhuセプラーゼへの特異的結合を示した(Table 3(表3)並びに図13A及び図13B)。ET-FA-012については1.4μMのKD、及びMO-FA-012については1.34μMのKDを決定した。
【０３２９】
MC-FA-012はセプラーゼ発現トリプルネガティブ乳がん(TNBC)と特異的に結合する
セプラーゼ発現トリプルネガティブ乳がんへのMC-FA-012の結合を分析するために、腫瘍切片を免疫蛍光染色によって分析した(図16)。がん関連線維芽細胞(CAF)の可視化のために、切片を抗α-SMA抗体で染色した(図16B及び図16F)。並行して核をDAPIで染色した(図16C及び図16G)。同様に処理したMC-FA-0116バリアント(図16E)ではなく、ビオチン化MC-FA-012 Microbody(登録商標)(ストレプトアビジン-Cy3によって四量体化したもの)(図16A)のみが、TNBC切片への特異的結合を示す。MC-FA-012/SA四量体シグナルは高度にSMAと共局在し、これは、CAFに対するセプラーゼの特異的標的化を示す(図16D)。
【０３３０】
(実施例4)
セプラーゼ発現CHO-異種移植片におけるIRDyeコンジュゲートMC-FA-012での腫瘍標的化
MC-FA-012 Microbody(商標)の生体内分布及び腫瘍標的化特性を分析するために、免疫不全マウスFoxn1(nu)においてCHO-K1-huセプラーゼ及びCHO-K1-MOCK細胞株を使用して異種移植片を樹立した。NHSケミストリーを使用してhuセプラーゼリガンド(MC-FA-012)及び対照Microbody(商標) (MC-CM-010)をIRDye800CWにコンジュゲートさせ、担腫瘍マウスにi.v.注射した。0.5及び2時間後、マウスを安楽死させた。器官を採取し、Xenogen IVIS光学in vivoイメージングシステムを用いてex vivoでIRシグナルを測定した(図10)。陰性対照Microbody(登録商標)と比較して、セプラーゼ特異的Microbody(登録商標) MC-FA-012-IRDye800CWは、0.5時間の循環期間中、ヒトセプラーゼ過剰発現組織を標的にした。2時間後、MC-FA-012-IRDye800CWは腫瘍から脱離し、その結果、検出可能な腫瘍標的化がなくなった。したがって、MC-FA-012での腫瘍標的化に関して重要な意味をもつ期間は注射後最初の30分間に存在するようである。更に、MOCK-組織に対するMC-FA-012-IRDye800CWの弱い結合も観察することができた。MOCK-組織がマウスセプラーゼ発現することも除外することができない。要するに、セプラーゼ特異的MC-FA-012-IRDye800CW Microbody(登録商標)による腫瘍標的化を注射後最初の数分間に明らかにすることができた。これらのデータに基づいて、更なるin vivo評価を行うべきである。
【０３３１】
生体内分布及び腫瘍標的化分析
AF680-(MC-FA-012)3三量体の薬物動態特性及び腫瘍標的化特性を分析するために、雌Fox n1 nuマウスにおける生体内分布を注射後6つ(1、2、4、6、24及び96時間)の時点でモニタリングした。AF680-(MC-FA-0116)3及び未処置マウスが対照としての役割を果した。各時点後、Xenogen Imaging systemを使用して生体内分布をin vivo及びex vivoで測定した(図14A+図14B)。注射後24時間までの分析した時間枠を通して、AF680-(MC-FA-012)3の特異的且つ有意な腫瘍取り込みを観察することができた(図14、矢印、及び図15)。対照的に、MC-FA-0116対照三量体は、検出可能な程には腫瘍内に蓄積しなかった(図14及び図15)。全体的に見て、バインダーについて及び非結合対照についてのバックグラウンドシグナルは、同じ範囲内であった。肺、心臓、脾臓及び肝臓におけるシグナルは一般に低かった一方で、強い腎臓シグナルを両方の構築物について1時間後に測定することができたが、それは、2時間後には有意に低下した。
【０３３２】
(実施例5)
結合ループの更なる特徴付け及び親和性成熟の最初の試み
MC-FA-012 Microbody(登録商標)とセプラーゼ間の相互作用をより詳細に分析するために、並びにより多くのアフィン的結合剤(more affine binders)を同定するために、アラニンスキャンデータに基づいて焦点を絞ったライブラリーを生成し、可溶性セプラーゼに対してスクリーニングした。そのために、ストリンジェンシーが違う4つの異なる選択条件を適用した。3ラウンドの選択ラウンド後、4つ全てのプールを発現ベクターにサブクローニングした。1プール当り96クローンを発現させ、発現速度に関してはもちろん、標的及び非特異的結合特性に関しても分析した。s/n (シグナル対ノイズ)値を、ELISAシグナルをhuセプラーゼ及びBSAで割ることによって計算した。このs/n値は、標的特異的結合についてのものを示す。このs/n値に加えて、相対発現値(Ex)をSDS-PAGEデータから計算した。両方の値を考慮に入れてクローンを順位付けした。s/n値の重み付け係数に関して異なる第1位及び第2位の値を計算した。各プールの最上位クローン(第2位の値に従って、プール1:クローン1〜4、プール2: 1〜7、プール3: 1〜4、プール4: 1〜5)、又は第2位の値が5より大きい全てのクローンを、下のTable 1及び2(表1及び表2)に示す。
【０３３３】
【表１】
0006739132.tif 000002
【０３３４】
【表２Ａ】
0006739132.tif 000003
【０３３５】
【表２Ｂ】
0006739132.tif 000004
【０３３６】
【表２Ｃ】
0006739132.tif 000005
【０３３７】
親MC-FA-012バリアントとの比較での特に動態パラメーター(Kd、Kon、Koff)に関する最上位クローンの詳細な特徴付けは、現在進行中である。
【０３３８】
結合配列が変更されたMC-FA-012バリアントの結合分析
上述の順位付け(Table 1及び2(表1及び表2)、実施例5)の7つの選択クローンを、SPR分光測定を使用して更に分析した。これらのバリアントは、MC-FA-010又はMC-FA-012 (149〜340nM)と同じ範囲の解離定数(147〜487nM)と共に、匹敵する解離速度を示した。詳細な動態データ及び配列情報をTable 3及び4(表3及び表4)並びに図12(A〜G)に要約する。7つ全てのバリアントはrhuセプラーゼとの結合を示し、それによって同定結合モチーフCXYXXWXXGRGPXCが確証された。
【０３３９】
(実施例6)
68Ga-(MC-FA-012)3及び177Lu-(MC-FA-012)3を使用する生体内分布及び腫瘍標的化
177Lu-(MC-FA-012)3の器官内分布
CT26-huセプラーゼ担腫瘍マウスにおける177Lu-(MC-FA-012)3の器官内分布を24時間にわたってモニタリングした。6つ(0.5、1、2、4、6及び24時間)の時点でマウスを屠殺し、切除した器官における放射活性を測定した。測定用量を1グラム当たりの注射用量パーセント[%ID/g]として図17及びTable 5(表5)に要約する。分析した三量体は、腎臓における放射活性の高い保持率を持ちながら、特異的腫瘍標的化を示した。しかし、腎臓におけるシグナル(286.8〜213.4%ID/g)及び腫瘍におけるシグナル(9.9〜5.9%ID/g)は、24時間後にまだ測定することができたが、測定期間の経過につれて減少した。
【０３４０】
68Ga-(MC-FA-012)3を使用する小動物PETイメージング
68Ga-(MC-FA-012)3の生体内分布及び腫瘍標的化を140分の期間の間、PETスキャンによって測定した。分析した両方のマウスにおいて、68Ga-(MC-FA-012)3は、特異的腫瘍標的化(図18〜図20)を示し、既に最初の20分以内に高い腫瘍対バックグラウンド比を示し、腎臓において高いシグナルを示した。このデータは、177Lu-(MC-FA-012)3を用いて行った器官内分布研究の結果を確証する。
【０３４１】
(実施例7)
Microbody(登録商標)三量体の診断上の及び治療上の使用
診断目的で2.5nmol 68Ga-(MC-FA-012)3をi.v.注射した。これまでに、進行膵臓がんを有する患者5名を検査した。適用した用量に関する詳細な情報をTable 6(表6)に要約する。68Ga-(MC-FA-012)3は、原発性腫瘍及び転移の高度富化(図21〜図26及びTable 11〜16(表11〜表16))、及び小動物in vivo研究で既に見られたように高い腎臓取り込みを示した。全体的に見て、正常組織では低いバックグラウンドを観察することができた。アルギニン/リジン、Gelofusine若しくは断片化アルブミン(FRALB)注入、又は陰性Microbody(登録商標) MC-FA-0116若しくは三量体バリアント(MC-FA-0116)3の更なる適用によって、例えば、治療応用において、可能な腎臓保護を達成することができるだろう。
【０３４２】
治療目的で10〜15nmol 177Lu-(MC-FA-012)3をi.v.注射した(Table 7 (表7))。患者2名を最近処置した。これらの患者は、急性腎毒性を示さなかった。処置はまだ進行中である。
【０３４３】
(実施例8)
様々な腫瘍実体におけるセプラーゼ発現の免疫組織化学的分析
様々な腫瘍実体におけるセプラーゼ発現の見通しを得るために、免疫組織化学的分析を行った。
【０３４４】
膵臓癌
正常膵臓組織内でのセプラーゼ発現は、ランゲルハンス島、管及び血管に限定される。膵臓癌に関しては、セプラーゼ発現が更に腫瘍細胞及び線維芽細胞上で検出される(Table 8 (表8)及び図27)。17/17の膵臓癌試料に関して、10〜85%腫瘍細胞の細胞質/膜の弱〜強染色が検出される。12/17の組織に関して、5%正常細胞(ランゲルハンス島及び管)の細胞質/膜の弱〜強染色が検出される。10/17の組織に関して、60〜75%血管の膜の弱〜中染色が検出される。11/17の組織に関して、2〜50%線維性組織(線維芽細胞)の細胞質/膜の弱〜強染色が検出される。考え合わせると、本研究のデータは、正常組織(1ケースのみでの線維芽細胞染色、ランゲルハンス島、管及び血管の染色)と比較してヒト膵臓腫瘍間質の線維芽細胞において過剰発現されるセプラーゼを示唆している。
【０３４５】
トリプルネガティブ乳がん(TNBC)
39/39のTNBC試料に関して、膜及び細胞質が弱〜強染色された多くの線維芽細胞(約54%)が、線維性組織内で(ときには腫瘍細胞周囲のより強いシグナルと共に)検出された。1つのケースでは、壊死/前壊死細胞上でシグナルが見られた。3/3の正常ヒト乳房試料に関しては、中染色された多少の線維芽細胞(約3%)が線維性組織内で検出された(Table 9 (表9)及び図28)。正常組織の染色は、病的組織への隣接局在性に起因しうる。考え合わせると、本研究のデータは、正常組織(弱い発現)と比較してヒトTNBC腫瘍間質の線維芽細胞において過剰発現されるセプラーゼを示唆している。
【０３４６】
肺癌
29/31の肺癌に関して、膜及び細胞質が弱〜強染色された多くの線維芽細胞(約55%)が線維性組織内で検出された。5つのケースで、壊死/前壊死細胞上でシグナルが見られた。2/3の正常ヒト肺試料に関して、弱〜強染色された多少の線維芽細胞(約17%)が線維性組織内で検出された(Table 10 (表10)及び図29)。正常組織の染色は、病的組織への隣接局在性に起因しうる。考え合わせると、本研究のデータは、正常組織(弱い発現)と比較してヒト肺腫瘍間質の線維芽細胞において過剰発現されるセプラーゼを示唆している。
【０３４７】
セプラーゼは、膵臓がん、TNBC及び肺癌において過剰発現される標的であるようである。それ故、同定されたセプラーゼリガンドの診断剤及び治療剤としての使用は、記載した臨床応用に限定されない。
【０３４８】
【表３】
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【０３４９】
【表４】
0006739132.tif 000007
【０３５０】
【表５】
0006739132.tif 000008
【０３５１】
【表６】
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【０３５２】
【表７】
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【０３５３】
【表８Ａ】
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【０３５４】
【表８Ｂ】
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【０３５５】
【表８Ｃ】
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【０３５６】
【表８Ｄ】
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【０３５７】
【表８Ｅ】
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【０３５８】
【表９Ａ】
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【０３５９】
【表９Ｂ】
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【０３６０】
【表９Ｃ】
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【０３６１】
【表９Ｄ】
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【０３６２】
【表９Ｅ】
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【０３６３】
【表１０Ａ】
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【０３６４】
【表１０Ｂ】
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【０３６５】
【表１０Ｃ】
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【０３６６】
【表１１】
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【０３６７】
【表１２】
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【０３６８】
【表１３】
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【０３６９】
【表１４】
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【０３７０】
【表１５】
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【０３７１】
(参考文献)
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【０３７２】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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