(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセトバクター・パストリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）由来の野生型と比べて改変されたタンパク質ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇにおける４６８位のアミノ酸イソロイシンが、イソロイシンよりも嵩高さが低いアミノ酸によって置き換えられているリアーゼであって、
配列番号１、２または３のうちの一つのアミノ酸配列を有することを特徴とする、リアーゼ。
【請求項２】
５４３位のアミノ酸が、トリプトファンより小さい嵩高さを有するアミノ酸によってさらに置換されている請求項１に記載のリアーゼであって、配列番号２３のアミノ酸配列を有することを特徴とする、リアーゼ。
【請求項３】
酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体をコードし、専ら１４０２〜１４０４位のコドンが、イソロイシンよりも嵩高さが低いアミノ酸をコードするコドンによって置換されている、請求項１に記載のリアーゼをコードするデオキシリボ核酸であって、
配列番号４のヌクレオチド配列を有することを特徴とする、デオキシリボ核酸。
【請求項４】
酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体をコードし、専ら１４０２〜１４０４位のコドンが、イソロイシンよりも嵩高さが低いアミノ酸をコードするコドンによって置換されており、さらに、１６２７〜１６２９位のコドンが、トリプトファンよりも嵩高さが低いアミノ酸をコードするコドンによって置換されている、請求項２に記載のリアーゼをコードするデオキシリボ核酸であって、
配列番号４８のヌクレオチド配列を有することを特徴とする、デオキシリボ核酸。
【請求項５】
配列番号４または４８のデオキシリボ核酸を含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項６】
プラスミドであることを特徴とする、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項５に記載の配列が、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２４ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａ（＋）、ｐＥＴ−２９ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３４ｂ（＋）、ｐＥＴ−３５ｂ（＋）、ｐＥＴ−３６ｂ（＋）、ｐＥＴ−３７ｂ（＋）、ｐＥＴ−３８ｂ（＋）の群からの空のベクターに連結されていることを特徴とする、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
ベンズアルデヒドが、式（１）
【化１】
0006752207.tif 000015
に従って、ピルビン酸またはアセトアルデヒドと共に変換される（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールの製造方法であって、
変換が、請求項１または２に記載のリアーゼを用いて行われることを特徴とする、製造方法。
【請求項９】
ｐＨ値５〜９で行われることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
緩衝液としてＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＡまたはＴＲＩＳ−ＨＣｌが使用されることを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
補因子としてチアミン二リン酸および硫酸マグネシウムが使用されることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
変換が、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われることを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールの産生が、大腸菌、コリネバクテリウム、コリネバクテリウム・グルタミカム、または酵母、サッカロミセス・セレビシエの群からの産生生物において行われることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記産生生物が配列番号４もしくは４８のうちの少なくとも一つのＤＮＡで形質転換され、かつ／または配列番号４もしくは４８のＤＮＡがゲノムに組み込まれることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
形質転換のために、請求項５〜７のいずれか一つに記載のベクターが使用されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
変換が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われることを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１７】
配列番号１〜３または２３のいずれか一つの単離された酵素が使用されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
産生生物からの粗製細胞抽出物が使用されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアーゼおよび（Ｓ）−フェニルアセチル−カルビノールの不斉合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールは、有機合成における貴重なキラル構成要素であり、ファインケミカルおよび医薬品を合成するために利用することができる。従来の技術水準によると、アキラルで安価な化合物から不斉合成により（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノール、すなわち（Ｓ）−ＰＡＣを光学純度＞８９％ｅｅで生成することができる方法は全く知られていない。しかしながら、高い光学純度は、ファインケミカルまたは医薬品を製造する場合に断然重要である。
【０００３】
従来技術によると、（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールを製造する目的で、多様な方法が公知である。
【０００４】
一つには、化学合成が公知である。
不斉化学合成に基づく（Ｓ）−ＰＡＣの製造方法は、６８％または８６％のｅｅを生じる。これらの方法は、刊行物Ｄａｖｉｓ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ａ．；Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  Ａｕｒｅｌｉａ  Ｃ．；Ｌａｌ，  Ｇ．  Ｓａｎｋａｒ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８９年、３０巻、７  ７７９〜７８２頁（非特許文献１）およびＡｄａｍ，  Ｗａｌｄｅｍａｒ；Ｆｅｌｌ，  Ｒａｉｎｅｒ  Ｔ．；Ｓｔｅｇｍａｎｎ，  Ｖｅｉｔ  Ｒ．；Ｓａｈａ−Ｍｏｅｌｌｅｒ，  Ｃｈａｎｔｕ  Ｒ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９８年、１２０巻、４  ７０８〜７１４頁（非特許文献２）に記載されている。加えて、例えば以下の反応、例えば刊行物Ｔｏｕｋｏｎｉｉｔｔｙ，  Ｅｓａ；Ｍａｅｋｉ−Ａｒｖｅｌａ，  Ｐａｅｉｖｉ；Ｋｕｚｍａ，  Ｍａｒｅｋ；Ｖｉｌｌｅｌａ，  Ａｌｅｘａｎｄｒｅ；Ｋａｌａｎｔａｒ  Ｎｅｙｅｓｔａｎａｋｉ，  Ａｈｍａｄ；Ｓａｌｍｉ，  Ｔａｐｉｏ；Ｓｊｏｅｈｏｌｍ，  Ｒａｉｎｅｒ；Ｌｅｉｎｏ，  Ｒｅｋｏ；Ｌａｉｎｅ，  Ｅｎｓｉｏ；Ｍｕｒｚｉｎ，  Ｄｍｉｔｒｙ  Ｙｕ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ、２００１年、２０４巻、２  ２８１〜２９１頁（非特許文献３）に記載されている１−フェニルプロパン−１，２−ジオンの還元およびＦｌｅｍｉｎｇ，  Ｓｔｅｖｅｎ  Ａ．；Ｃａｒｒｏｌｌ，  Ｓｅａｎ  Ｍ．；Ｈｉｒｓｃｈｉ，  Ｊｅｎｎｉｆｅｒ；Ｌｉｕ，  Ｒｅｎｍａｏ；Ｐａｃｅ，  Ｊ．  Ｌｅｅ；Ｒｅｄｄ，  Ｊ．  Ｔｙ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００４年、４５巻、１７  ３３４１〜３３４３頁（非特許文献４）によって記載されているベンズアルデヒドに基づく合成およびＢｒｕｓｓｅｅ，  Ｊ．；Ｒｏｏｓ，  Ｅ．  Ｃ．；Ｇｅｎ，  Ａ．  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８８年、２９巻、３５  ４４８５〜４４８８頁（非特許文献５）によって記載されている２−ヒドロキシ−２−フェニルアセトニトリルの反応におけるように、（Ｓ）−ＰＡＣが副生成物としてだけ生成し、（Ｒ）−ＰＡＣが鏡像体過剰で存在する方法がある。
【０００５】
さらにまた、キラル構成要素１−フェニルプロパン−１，２−ジオールを（Ｓ）−ＰＡＣに酸化することができる合成が記載されている。（Ｓ）−ＰＡＣは、Ｚｉ−Ｑｉａｎｇ  Ｒｏｎｇ、Ｈｕｉ−Ｊｉｅ  Ｐａｎ、Ｈａｉ−Ｌｏｎｇ  Ｙａｎ、およびＹｕ  Ｚｈａｏ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０１４年１６（１）、２０８〜２１１頁（非特許文献６）によって記載されたように鏡像体過剰率９１％で、またはＷａｌｄｅｍａｒ  Ａｄａｍ、Ｃｈａｎｔｕ  Ｒ．  Ｓａｈａ−Ｍｏｅｌｌｅｒ、およびＣｏｎｇ−Ｇｕｉ  Ｚｈａｏ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６４（２０）、７４９２〜７４９７頁；１９９９年（非特許文献７）によって記載されたように６９％で生成するが、加えて、手間をかけて除去しなければならない位置異性体が混入する。
【０００６】
さらに、２０１３年のＡｌｖａｒｏ  Ｇｏｍｅｚ  Ｂａｒａｉｂａｒによる標題「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  （Ｓ）−ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙ  ｋｅｔｏｎｅｓ」（非特許文献８）の論文に記載されている酵素的不斉合成が公知である。この論文に従って、細胞全体で合成させるために大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に異種発現させたこの酵素を使用すると、（Ｓ）−ＰＡＣの光学純度は、約４３％ｅｅになる。
【０００７】
（Ｓ）−ＰＡＣのこの唯一の酵素的不斉合成は、ベンズアルデヒドおよびアセトアルデヒド、またはベンズアルデヒドおよびピルビン酸に基づく炭素連結反応において記載された。この反応は、４６９位のグルタミン酸がグリシンによって置換されている、アセトバクター・パストリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）由来酵素ピルビン酸デカルボキシラーゼ変異体であるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇによって触媒される。その際、単離された酵素を用いて達成された最高の鏡像体過剰率は、Ｒｏｔｈｅｒ  Ｎｅｅ  Ｇｏｃｋｅ，  Ｄｏｅｒｔｅ；Ｋｏｌｔｅｒ，  Ｇｅｒａｌｄｉｎｅ；Ｇｅｒｈａｒｄｓ，  Ｔｉｎａ；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，  Ｃａｔｒｉｎｅ  Ｌ．；Ｇａｕｃｈｅｎｏｖａ，  Ｅｋａｔｅｒｉｎａ；Ｋｎｏｌｌ，  Ｍｉｃｈａｅｌ；Ｐｌｅｉｓｓ，  Ｊｕｅｒｇｅｎ；Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｍｉｃｈａｅｌ；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｇｕｎｔｅｒ；Ｐｏｈｌ，  ＭａｒｔｉｎａによってＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ、２０１１年、３巻、１０  １５８７〜１５９６頁（非特許文献９）での公表に記載されるように、８９％である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄａｖｉｓ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ａ．；Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  Ａｕｒｅｌｉａ  Ｃ．；Ｌａｌ，  Ｇ．  Ｓａｎｋａｒ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８９年、３０巻、７  ７７９〜７８２頁
【非特許文献２】Ａｄａｍ，  Ｗａｌｄｅｍａｒ；Ｆｅｌｌ，  Ｒａｉｎｅｒ  Ｔ．；Ｓｔｅｇｍａｎｎ，  Ｖｅｉｔ  Ｒ．；Ｓａｈａ−Ｍｏｅｌｌｅｒ，  Ｃｈａｎｔｕ  Ｒ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９８年、１２０巻、４  ７０８〜７１４頁
【非特許文献３】Ｔｏｕｋｏｎｉｉｔｔｙ，  Ｅｓａ；Ｍａｅｋｉ−Ａｒｖｅｌａ，  Ｐａｅｉｖｉ；Ｋｕｚｍａ，  Ｍａｒｅｋ；Ｖｉｌｌｅｌａ，  Ａｌｅｘａｎｄｒｅ；Ｋａｌａｎｔａｒ  Ｎｅｙｅｓｔａｎａｋｉ，  Ａｈｍａｄ；Ｓａｌｍｉ，  Ｔａｐｉｏ；Ｓｊｏｅｈｏｌｍ，  Ｒａｉｎｅｒ；Ｌｅｉｎｏ，  Ｒｅｋｏ；Ｌａｉｎｅ，  Ｅｎｓｉｏ；Ｍｕｒｚｉｎ，  Ｄｍｉｔｒｙ  Ｙｕ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ、２００１年、２０４巻、２  ２８１〜２９１頁
【非特許文献４】Ｆｌｅｍｉｎｇ，  Ｓｔｅｖｅｎ  Ａ．；Ｃａｒｒｏｌｌ，  Ｓｅａｎ  Ｍ．；Ｈｉｒｓｃｈｉ，  Ｊｅｎｎｉｆｅｒ；Ｌｉｕ，  Ｒｅｎｍａｏ；Ｐａｃｅ，  Ｊ．  Ｌｅｅ；Ｒｅｄｄ，  Ｊ．  Ｔｙ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００４年、４５巻、１７  ３３４１〜３３４３頁
【非特許文献５】Ｂｒｕｓｓｅｅ，  Ｊ．；Ｒｏｏｓ，  Ｅ．  Ｃ．；Ｇｅｎ，  Ａ．  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８８年、２９巻、３５  ４４８５〜４４８８頁
【非特許文献６】Ｚｉ−Ｑｉａｎｇ  Ｒｏｎｇ、Ｈｕｉ−Ｊｉｅ  Ｐａｎ、Ｈａｉ−Ｌｏｎｇ  Ｙａｎ、およびＹｕ  Ｚｈａｏ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０１４年１６（１）、２０８〜２１１頁
【非特許文献７】Ｗａｌｄｅｍａｒ  Ａｄａｍ、Ｃｈａｎｔｕ  Ｒ．  Ｓａｈａ−Ｍｏｅｌｌｅｒ、およびＣｏｎｇ−Ｇｕｉ  Ｚｈａｏ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６４（２０）、７４９２〜７４９７頁；１９９９年
【非特許文献８】Ａｌｖａｒｏ  Ｇｏｍｅｚ  Ｂａｒａｉｂａｒ、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  （Ｓ）−ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙ  ｋｅｔｏｎｅｓ」、２０１３年
【非特許文献９】Ｒｏｔｈｅｒ  Ｎｅｅ  Ｇｏｃｋｅ，  Ｄｏｅｒｔｅ；Ｋｏｌｔｅｒ，  Ｇｅｒａｌｄｉｎｅ；Ｇｅｒｈａｒｄｓ，  Ｔｉｎａ；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，  Ｃａｔｒｉｎｅ  Ｌ．；Ｇａｕｃｈｅｎｏｖａ，  Ｅｋａｔｅｒｉｎａ；Ｋｎｏｌｌ，  Ｍｉｃｈａｅｌ；Ｐｌｅｉｓｓ，  Ｊｕｅｒｇｅｎ；Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｍｉｃｈａｅｌ；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｇｕｎｔｅｒ；Ｐｏｈｌ，  Ｍａｒｔｉｎａ、ＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ、２０１１年、３巻、１０  １５８７〜１５９６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来技術から出発して、本発明の課題は、（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールを不斉合成するための代替的酵素方法であって、（Ｓ）−フェニルアセチル−カルビノールの高い鏡像体過剰率を可能にする代替的酵素方法を提供することである。細胞全体を用いて製造する場合、鏡像体過剰率は４３％を超えるべきである。
さらに、副生成物も、位置異性体も形成すべきでない。その際、キラルではない安価な出発材料を使用できるべきである。（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールの不斉合成が可能になるべきである。キラル生成混合物の高価な分離は回避すべきである。
（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールをベンズアルデヒドおよびピルビン酸またはアセトアルデヒドから製造できる酵素ならびにその酵素をコードするＤＮＡが提供されるべきである。
さらに、その酵素の製造方法が提供されるべきである。従来技術による目下の欠点および問題が、克服されるべきである。
粗製細胞抽出物または細胞全体を使用した場合にも高い鏡像体過剰率を可能にする、（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールの製造方法が提供されるべきである。
従来技術の欠点が、累積的に克服されるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この課題は、請求項１および他の独立請求項の前提部に基づき、本発明により、これらの請求項の特徴部分に示した特徴によって解決される。本発明によると、この課題は、４６８位のイソロイシンが、イソロイシンと比べて減少した嵩高さ（Ｒａｕｍｅｒｆｕｅｌｌｕｎｇ）を有するアミノ酸によって置換されているリアーゼＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体によって解決される。さらに、この課題は、独立請求項に従い、ベンズアルデヒドをピルビン酸またはアセトアルデヒドと共に変換して（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールにするためにこのリアーゼが使用されることによって解決される。
【００１１】
本発明によるリアーゼおよび（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールの製造方法を用いると、今や、細胞全体を使用した場合に９３％ｅｅ、および粗製細胞抽出物を使用した場合に８５％ｅｅの（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールを製造することが可能である。副生成物、特に位置異性体は形成しない。合成をアキラル出発材料で済ませることによって、合成は格安になる。鏡像体の分割を省略することができる。（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールを製造する場合、粗製細胞抽出物または細胞全体を用いて高い鏡像体過剰率を達成することもできる。従来技術により記載されている全ての欠点が、累積的に取り除かれる。
【００１２】
本発明の有利なさらなる発展形態は、従属請求項に記載される。
【００１３】
本発明によると、アセトバクター・パストリアヌス由来の野生型と比べて改変されたタンパク質ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇにおける４６８位のイソロイシンが、イソロイシンよりも嵩高さが低い（ｗｅｎｉｇｅｒ  ｒａｕｍｅｒｆｕｅｌｌｅｎｄ）アミノ酸によって置き換えられているリアーゼが提供される。
【００１４】
このリアーゼは、（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールを製造する場合に立体選択性の増大にプラスの影響を及ぼす。
【００１５】
好ましくは、この要件を満たす、以下のリアーゼを挙げることができる：
−  ４６８位にグリシンを有する、配列番号１によるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇ
−  ４６８位にアラニンを有する、配列番号２によるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ
−  ４６８位にバリンを有する、配列番号３によるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｖ
【００１６】
（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールを製造する場合に、鏡像体過剰率を改善するために、酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｌ、ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｔ、ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８ＣまたはＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｓも使用することができる。
【００１７】
さらに、本発明によると、前記酵素をコードするデオキシリボ核酸が提供される。
【００１８】
本発明によると、酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体をコードするデオキシリボ核酸であって、１４０２〜１４０４位にイソロイシンと比べて嵩高さが低いアミノ酸をコードするデオキシリボ核酸が対象となる。
【００１９】
この位置にアミノ酸グリシンをコードする、配列番号１による例について、１４０２〜１４０４位に例えば核酸ＧＧＴがあることができる。
【００２０】
例として、配列番号１による４６８位にグリシンを有する酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇをコードする、配列番号４によるデオキシリボ核酸が記載されている。
【００２１】
４６８位にアラニンを有する、配列番号２に従う本発明による酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ、および位置４６８にバリンを有する、配列番号３に従うＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｖのために、１４０２〜１４０４位において対応するヌクレオチドを置換することによって、それをコードするデオキシリボ核酸を提供することができる。
【００２２】
本発明による酵素をコードするＤＮＡは、当業者に公知の方法に従って定方向または非定方向変異誘発によって産生することができる。その際、定方向変異誘発が好ましい。これらの方法は、当業者に公知である。特定の明細書部分に、本発明の一実施形態についての一製造例を具体的に開示する。このアプローチは、基本的に全ての他の開示されたデオキシリボ核酸および酵素のためにも使用することができ、その結果、本発明による全ての酵素およびデオキシリボ核酸を類似の方法で製造することができる。
【００２３】
デオキシリボ核酸は、ベクター、好ましくはプラスミドに連結されていることができる。
【００２４】
空のベクターとして、例えばｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２４ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａ（＋）、ｐＥＴ−２９ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３４ｂ（＋）、ｐＥＴ−３５ｂ（＋）、ｐＥＴ−３６ｂ（＋）、ｐＥＴ−３７ｂ（＋）、ｐＥＴ−３８ｂ（＋）を使用することができ、対応する本発明によるＤＮＡがそれらのベクターに連結される。
【００２５】
あるいは、デオキシリボ核酸をゲノムに連結することもできる。
【００２６】
連結したデオキシリボ核酸は、酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体をコードするＤＮＡ配列であって、１４０２〜１４０４位にイソロイシンと比べて減少した嵩高さをもつアミノ酸をコードするＤＮＡ配列である。デオキシリボ核酸は、酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｌ、ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｔ、ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８ＣまたはＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｓもコードすることができる。
【００２７】
好ましくは、連結されたデオキシリボ核酸は、配列１、２および３によるタンパク質をコードする。
【００２８】
本発明によると、酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体をコードするデオキシリボ核酸であって、１４０２〜１４０４位にイソロイシンと比べて減少したまたは等しい嵩高さをもつアミノ酸をコードするデオキシリボ核酸を含むベクターを提供することができる。
【００２９】
好ましくは、ベクターは、配列番号４によるデオキシリボ核酸を含む。
【００３０】
好ましくは、ベクターはプラスミドである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明によるプラスミド（ｐＥＴ−２１ａ（＋）のベクターマップ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
配列番号５に、例として、配列番号４によるＤＮＡを含む本発明によるプラスミドについてのＤＮＡ配列を記載する。
【００３３】
本発明によると、式（１）に従って、４６８位にイソロイシンと比べて減少した嵩高さをもつアミノ酸をもつ酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体、好ましくは配列番号１、２または３による群からの酵素を用いて、ベンズアルデヒドがピルビン酸またはアセトアルデヒドと共に変換されて、（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールにされる。
【００３４】
【化１】
0006752207.tif 000002
【００３５】
変換は、好ましくは水溶液中で行われる。
【００３６】
ｐＨ値は、５〜９、好ましくは６．５〜８、特に好ましくは６．５〜７の範囲である。
【００３７】
そのために、緩衝液として例えばリン酸カリウム緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＡまたはＴＲＩＳ−ＨＣｌを使用することができる。
【００３８】
さらに、補因子としてチアミン二リン酸および硫酸マグネシウムを使用することができる。
【００３９】
反応は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。
【００４０】
（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールのｉｎ  ｖｉｖｏ産生のために、産生生物として例えば大腸菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｋｔｅｒｉｕｍ）、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｋｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈｅｒｏｍｙｃｉｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母を使用することができる。
【００４１】
その際に、産生生物は、本発明によるＤＮＡまたはそのＤＮＡを含むベクターで形質転換される。
【００４２】
ＤＮＡは、産生生物のゲノム内に導入することもできる。
【００４３】
その際、組み込まれた遺伝子は、異種発現される。
【００４４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生のために、単離された酵素または産生生物の細胞抽出物のいずれかを使用することができる。
【００４５】
典型的な温度は、２０℃〜４０℃であり、好ましくは２０℃〜３０℃であり、特に好ましくは、温度２０℃〜２５℃である。
【００４６】
反応時間は、２ｈ〜４８ｈ、好ましくは６ｈ〜２４ｈ、特に好ましくは１２ｈとし得る。
【００４７】
以下にいくつかの例を紹介するが、これらの例を限定的に解釈すべきではない。
【００４８】
反応は、古典的な手法で反応フラスコ中で撹拌しながら行うことができる。
【００４９】
（Ｓ）−ＰＡＣを高い鏡像体過剰率で製造できるために、酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体が変異誘発により産生された。変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇは、粗製細胞抽出物の酵素を使用して、８５％ｅｅの（Ｓ）−ＰＡＣを産生する。大腸菌で異種発現され、安価な細胞全体の触媒として使用されるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇを使用して、９３％ｅｅの（Ｓ）−ＰＡＣを生成することができる。
【００５０】
実施例１：
２０ｍＭベンズアルデヒド、４００ｍＭピルビン酸、２．５ｍＭ硫酸マグネシウム、１００μＭチアミン二リン酸、２０ｍｇ／ｍＬ（湿重量）、ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇ（ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇが発現されて存在した大腸菌の細胞全体）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、２５℃、反応時間：４８時間。
【００５１】
（Ｓ）−ＰＡＣの鏡像体純度：ｅｅ９３％。
収率：６７％。
【００５２】
実施例２：
２０ｍＭベンズアルデヒド、４００ｍＭピルビン酸、２．５ｍＭ硫酸マグネシウム、１００μＭチアミン二リン酸、１ｍｇ／ｍＬ  ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇ（ＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇが発現されて存在した大腸菌細胞の粗製細胞抽出物）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、２５℃、反応時間：４８時間。
【００５３】
（Ｓ）−ＰＡＣの鏡像体純度：ｅｅ８５％。
【００５４】
以下に、本発明による酵素およびそれをコードするデオキシリボ核酸の製造を例示的に説明する。記載した方法は、基本的に他の本発明によるリアーゼおよびそれをコードするデオキシリボ核酸の製造のためにも同様に使用することができる。
【００５５】
酵素変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８ＧのＤＮＡの製造
「部位飽和変異誘発」
遺伝子配列ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ（テンプレートＤＮＡ）に基づきＩ４６８位でアミノ酸置換を受けるために、Ｒｅｅｔｓら（Ｒｅｅｔｚ、Ｋａｈａｋｅａｗら、２００８年）の変法によるいわゆる「部位飽和変異誘発」の方法を実施した。この方法の場合、２０種の天然アミノ酸のうち１２種をコードするＮＤＴコドンを使用する。
【００５６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
最初の段階で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりテンプレートＤＮＡを増幅し、その際、同時にいわゆる縮重プライマーおよびＮＤＴコドンの使用により突然変異を挿入する。使用するプライマーは、「Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ」社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｏｆｉｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｅｕ）に注文したものであり、以下の配列を有した：
【００５７】
ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８ＮＤＴを製造するための部位飽和変異誘発用プライマー
順方向：  ５’  ＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＧＴＣＮＤＴＧＧＣＡＴＣＧＣＣＡＴＴＣ  ３’（配列番号６）
逆方向：  ５’  ＧＡＡＴＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＨＮＧＡＣＡＴＡＧＣＣＡＣＧＧ  ３’（配列番号７）
【００５８】
まず、マスター溶液を製造し、続いて４つの開始液にそれぞれ５０μｌずつ分配した。反応を開始するために、「ＫＯＤホットスタートポリメラーゼ」１μｌを添加した。
【００５９】
ＰＣＲ反応開始液：
【００６０】
【表１】
0006752207.tif 000003
【００６１】
反応を以下の条件で行った：
【００６２】
【表２】
0006752207.tif 000004
【００６３】
テンプレートＤＮＡを消化するために、酵素ＤｐｎＩ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）１μｌを溶液に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、さらに形質転換する前に混合物全体を「ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎｌｉｓｔｅ）で精製した。
【００６４】
大腸菌ＢＬ２１−ＤＥ３および大腸菌ＤＨ５αの形質転換
大腸菌株ＢＬ２１−ＤＥ３および大腸菌株ＤＨ５αを、「部位飽和変異誘発」によって製造したＤＮＡで形質転換した。このために、コンピテント細胞５０μｌにＤＮＡ  １００ｎｇを添加し、氷上で３０分間インキュベートした。続いて、４２℃で９０秒間、熱ショックを行った。３分後に、氷上でＳＯＣ培地５００μｌを添加し、溶液をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ中のポートで３５０ＲＰＭおよび３７℃で４５分間インキュベートした。インキュベーションを行った後、細胞懸濁物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ組織遠心分離機に入れて１３，０００ＲＰＭで３０秒間遠心分離し、続いてペレットを上清１００μｌ中に再懸濁した。１００μｌに濃縮した細胞懸濁物をＬＢ寒天プレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリン入り）上に播種し、３７℃で１６時間、逆さにしてインキュベートした。
【００６５】
酵素変異体の発現
形質転換した個別のコロニー４６個を爪楊枝でプレートから釣り上げ、４８  Ｎｅｒｂｅプレート（Ｎｅｒｂｅ  Ｐｌｕｓ  ＧｍｂＨ）のそれぞれのウェルの中でＬＢ培地１ｍｌと共に８５０ＲＰＭおよび２０℃で２４時間インキュベートした（「マスタープレート」）。別のウェルに、予め同様にＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９ＧテンプレートＤＮＡで形質転換した大腸菌ＢＬ２１−ＤＥ３細胞を接種した。インキュベートした後、４８ウェルＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅ（登録商標）（ｍ２ｐ−ｌａｂｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の中の自己誘導培地１．５ｍｌにつき細胞懸濁物１０μｌを入れた。ＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅを２０℃および８５０ＲＰＭで４８時間インキュベートした。「マスタープレート」の残りの体積（９９０μｌ）をグリセリン３００μｌと混合し、−８０℃で保存した。
【００６６】
細胞破壊および炭素連結
ＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅ（登録商標）中に発現された変異体を凍結（４８ｈ、４℃）によって可溶化した。再解凍後、９６ウェルプレートの２つのウェルに細胞懸濁物を５００μｌずつ移した（二重の測定）。プレートを４，０００ＲＰＭで３分間遠心分離し、１ｍｇ／ｍｌリゾチームを有するＫＰｉ緩衝液４２０μｌ中にペレットを再懸濁した。プレートを２０℃および４００ＲＰＭで１時間インキュベートし、続いて再度４，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。それぞれ上清２５０μｌをそれぞれ２ｍｌ−Ｎｅｒｂｅプレートのウェル一つにピペットで入れ、４０ｍＭベンズアルデヒド、４００ｍＭピルビン酸、４ｍＭ硫酸マグネシウムおよび４００μＭチアミン二リン酸からの反応溶液２５０μｌを添加した。プレートを再度２４時間インキュベートし、続いて反応溶液を分析した（ＨＰＬＣ分析を参照されたい）。
【００６７】
ＨＰＬＣ分析
炭素連結反応溶液２００μｌをそれぞれヘプタン２００μｌと混合し、ボルテックス撹拌し、続いて上相１５０μｌをそれぞれＨＰＬＣバイアル中に移した。Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＣ−３カラム（Ｃｈｉｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて、以下の方法を使用して試料の分析を行った。
【００６８】
ＨＰＬＣのプログラム
【００６９】
【表３】
0006752207.tif 000005
【００７０】
定量のための典型的な保持時間および使用波長
【００７１】
【表４】
0006752207.tif 000006
【００７２】
ＤＮＡの単離およびＤＮＡ配列決定による最良の酵素変異体の同定
炭素連結反応において（Ｓ）−ＰＡＣについて最高のｅｅ値をもたらした酵素のＤＮＡを、マスタープレートに基づき突然変異を同定するために配列決定した。そのために、まず、グリセリンと混合したマスタープレートから細胞を白金耳でＬＢ培地（＋５０μｇ／ｍｌアンピシリン）５０ｍＬ中に移植し、２５０ｍＬ三角フラスコ中に入れて３７℃でインキュベートした。１２時間インキュベーション後に、細胞懸濁物２０ｍＬを遠心分離した（４，０００ＲＰＭ、５分、４℃）。ペレット中の細胞のＤＮＡを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ  Ｎ．Ｖ．）の指示と同様に、「ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ」の方法に従い単離した。その際、ＤＮＡの濃度を１００ｎｇ／μｌに調整し、ＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社がそのＤＮＡを配列決定した。
【００７３】
ＬＢ（溶原性ブロス）培地
【００７４】
【表５】
0006752207.tif 000007
【００７５】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）を用いて変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇを製造する代替的な定方向方法
酵素変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ／Ｉ４６８Ｇを製造する別の方法は、例えばいわゆるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）−ＰＣＲ法（米国特許第５，７８９，１６６号、同第５，９３２，４１９号、同第６，３９１，５４８号）であろう。ＰＣＲのこの変法では、置換すべきＤＮＡトリプレットコードの位置に、対応する配列変化を有するプライマー対が使用される。酵素変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ／Ｉ４６８Ｇを製造するために、変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇをコードする遺伝子を使用することができる。このいわゆるＤＮＡテンプレートは、ベクター（例えばｐＥＴ２２ａ）中にクローニングされて存在すべきであろう。位置Ｉ４６８にアミノ酸トリプトファンをコードするトリプレットコードの代わりに、この位置にグリシンをコードする突然変異（すなわち：ＧＧＡ、ＧＧＴ、ＧＧＣまたはＧＧＧ）を有するプライマーを使用しなければならない。このＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）−ＰＣＲ法の全ての他のパラメータおよび必要なプライマーの選択は、製造業者（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）の指示と同様に、「ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ」の使用説明書を用いて実施することができる。
【００７６】
変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇを製造するためのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）−ＰＣＲ法のＤＮＡ−テンプレート（ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ）
ＡＴＧＡＣＣＴＡＴＡＣＴＧＴＴＧＧＣＡＴＧＴＡＴＣＴＴＧＣＡＧＡＡＣＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＧＡＴＣＧＧＧＣＴＧＡＡＧＣＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＣＧＴＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＴＣＴＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＴＴＧＣＴＣＣＴＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＡＴＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＧＴＴＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＧＣＧＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＣＣＣＧＴＴＣＴＡＡＣＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＧＴＴＧＧＣＧＣＣＡＴＴＴＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣＧＣＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＴＡＴＧＣＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧＣＣＧＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡＴＴＴＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＡＡＣＡＧＣＡＡＴＧＡＴＣＡＧＧＧＣＡＣＡＧＧＴＣＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＴＣＡＣＡＣＡＡＴＣＧＧＣＡＡＧＡＣＧＧＡＴＴＡＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＴＴＧＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＴＣＡＧＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＧＡＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＧＡＣＧＣＴＣＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＧＡＣＣＡＣＧＴＣＡＴＴＣＧＣＡＣＧＧＣＧＣＴＧＣＧＣＧＡＧＣＧＴＡＡＧＣＣＧＧＣＣＴＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴＣＧＣＧＴＧＣＡＡＣＡＴＴＧＣＣＴＣＣＧＡＧＣＣＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＧＡＧＣＣＴＧＡＡＡＴＣＧＡＣＣＡＣＡＣＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＧＡＣＧＣＣＡＣＧＧＴＴＧＣＣＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＴＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧＣＣＡＡＣＧＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＡＡＣＣＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＡＴＧＣＧＣＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＡＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＧＧＧＴＴＴＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＧＡＡＧＴＣＴＣＧＡＡＣＣＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＣＣＴＣＣＧＡＣＧＣＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣＡＴＣＧＣＣＣＣＣＧＴＡＴＴＣＡＡＣＧＡＣＴＡＴＴＣＡＡＣＡＧＴＣＧＧＣＴＧＧＴＣＧＧＣＡＴＧＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＧＴＡＡＣＧＧＴＣＧＡＴＧＧＣＣＧＣＧＣＣＴＡＴＧＡＣＧＧＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＣＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＧＣＡＧＣＧＴＣＣＣＧＡＣＧＴＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＣＧＣＧＡＣＡＴＣＣＧＡＴＧＡＡＧＣＣＧＧＴＣＴＧＡＣＧＡＡＴＧＡＣＧＡＡＡＴＣＧＴＣＣＧＴＣＡＴＡＴＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＣＡＡＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＧＧＴＧＧＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＣＧＡＴＴＣＡＴＧＧＴＴＣＡＡＴＧＣＣＡＴＧＣＧＣＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＴＧＣＧＣＧＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＴＡＴＣＧＧＣＴＧＧＴＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＧＣＣＴＴＣＧＧＣＡＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＣＧＣＡＧＧＡＣＣＧＣＣＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＡＧＧＣＧＡＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧＣＴＴＡＣＣＧＣＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＧＣＴＡＣＧＡＡＣＴＧＣＣＣＧＴＣＡＴＴＡＴＣＴＴＴＣＴＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＧＴＣＡＴＴＧＧＣＡＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＴＧＡＣＧＧＣＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＡＡＣＧＣＣＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＴＧＧＣＣＴＧＡＡＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡＣＴＧＡＣＡＧＡＡＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＴＡＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＡＣＧＣＴＧＡＴＣＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡＴＣＧＡＣＣＧＣＡＣＧＧＡＣＴＧＣＡＣＧＧＡＴＡＴＧＣＴＧＧＴＴＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＴＴＧＣＣＴＣＡＡＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＣＡＡＧＡＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧ
【００７７】
配列リストに配列番号８を有する配列を記載する。ここで配列番号８は、配列番号５３による、改変されるべきタンパク質ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９ＧをコードするＤＮＡを例示的に開示するものである。しかし本発明によると、改変されるべき酵素を製造するために、改変されるべき出発タンパク質をコードする全ての他のデオキシリボ核酸を使用することができる。それをコードするヌクレオチドは、当業者に公知である。
【００７８】
「細胞全体」の形態での変異体の製造
細胞全体での１Ｌ規模での酵素の発現のために、まず、グリセリンと混合したマスタープレートから細胞を白金耳でＬＢ培地（＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン）５０ｍＬ中に移植し、２５０ｍＬ三角フラスコ中で１２０ＲＰＭおよび３７℃でインキュベートした。１６時間インキュベーション後に、培養物１０ｍＬを自己誘導培地１Ｌに入れ、５Ｌ三角フラスコ中で９０ＲＰＭおよび２０℃で７２時間インキュベートした。続いて細胞を遠心分離（４℃、６，０００ＲＰＭ、３０分）によって回収し、その後の使用まで−２０℃で保存した。
【００７９】
自己誘導培地
【００８０】
【表６】
0006752207.tif 000008
【００８１】
「細胞抽出物」の形態での変異体の製造
１Ｌ規模で培養した細胞１０ｇ（「「細胞全体」の形態での変異体の製造」参照）を、４℃に冷却した破壊緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、１００μＭチアミン二リン酸、２ｍＭ硫酸マグネシウム）２５ｍＬと共に氷上で再懸濁した。続いて、再懸濁した細胞を超音波（ＳＤ１４−Ｓｏｎｏｔｒｏｄｅ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ＧｍｂＨ）、２分処理を４回、それぞれ氷から１分冷却する）を用いて破壊した。細胞の破片を分離するために溶液を遠心分離し（４５分、１８，０００ＲＰＭ、４℃）、上清（「細胞抽出物」）を新しい容器に移した。
【００８２】
「単離された酵素」の形態での変異体の製造
固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを用いてＡｐＰＤＣ変異体を精製するために、とりわけタンパク質のＵＶ吸収（２８０ｎｍ）および電気伝導率を検出し、流速を調整する目的で、「Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ」社の「ＡＥＫＴＡ（商標）精製装置」を使用した。精製するために、予めローディング緩衝液１８０ｍＬで平衡化しておいた体積６０ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ−Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｎ．Ｖ．）を有するカラムに、製造した細胞抽出物（「「細胞抽出物」の形態での変異体の製造」参照）２５ｍＬを流速３ｍＬ／ｍｉｎでロードした。続いて、カラム材料と結合していないまたは非常に弱く結合しているタンパク質を除去するために、流速５ｍｌ／ｍｉｎのローディング緩衝液でさらに洗浄した。ＵＶ吸収（２８０ｎｍ）が安定なベースラインに再び達した後、カラム材料と弱く結合しているタンパク質を溶出するために洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、１００μＭチアミン二リン酸、２ｍＭ硫酸マグネシウム、５０ｍＭイミダゾール）を流速５ｍＬ／ｍｉｎで使用した。ＵＶ吸収（２８０ｎｍ）が再び安定化した後、目的タンパク質を溶出するために、溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、１００μＭチアミン二リン酸、２ｍＭ硫酸マグネシウム、２５０ｍＭイミダゾール）を流速５ｍＬ／ｍｉｎで使用した。
【００８３】
緩衝液交換のために、予め緩衝液交換用緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、１００μＭチアミン二リン酸、２ｍＭ硫酸マグネシウム）２Ｌで洗浄したサイズ排除クロマトグラフィーカラム（カラム体積１Ｌ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にＩＭＡＣの溶出液を流速１０ｍＬ／ｍｉｎでロードした。高められたＵＶ吸収（２８０ｎｍ）を有する画分を合わせ、結晶皿中で凍結させた（−２０℃）。凍結乾燥するために、凍結したタンパク質溶液を０．２２ｍＢａｒの減圧下に３日間置いた。
【００８４】
本発明の別の好都合な一形態では、本発明による酵素において、４６８位での本発明による置換に加えて、５４３位のアミノ酸トリプトファンが、トリプトファンよりも小さな嵩高さをもつアミノ酸によって置換されている。
【００８５】
これらのリアーゼはその上さらに、（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールを製造する場合に立体選択性の増大にプラスの影響を有する。
【００８６】
本発明のこの好ましい実施形態を用いて、９８％ｅｅの鏡像体過剰率を達成ことができる。
【００８７】
好ましくは、この要件を満たす以下のリアーゼを挙げることができる：
−  ５４３位にヒスチジンを有する、配列番号９に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇ−Ｗ５４３Ｈ。
−  ５４３位にフェニルアラニンを有する、配列番号１０に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇ−Ｗ５４３Ｆ。
−  ５４３位にプロリンを有する、配列番号１１に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇ−Ｗ５４３Ｐ。
−  ５４３位にイソロイシンを有する、配列番号１２に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇ−Ｗ５４３Ｉ。
−  ５４３位にロイシンを有する、配列番号１３に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇ−Ｗ５４３Ｌ。
−  ５４３位にメチオニンを有する、配列番号１４に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇ−Ｗ５４３Ｍ。
−  ５４３位にバリンを有する、配列番号１５に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇ−Ｗ５４３Ｖ。
−  ５４３位にアラニンを有する、配列番号１６に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇ−Ｗ５４３Ａ。
−  ５４３位にチロシンを有する、配列番号１７に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇ−Ｗ５４３Ｙ。
−  ５４３位にトレオニンを有する、配列番号１８に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇ−Ｗ５４３Ｔ。
−  ５４３位にグリシンを有する、配列番号１９に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇ−Ｗ５４３Ｇ。
−  ５４３位にセリンを有する、配列番号２０に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇ−Ｗ５４３Ｓ。
−  ５４３位にシステインを有する、配列番号２１に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇ−Ｗ５４３Ｃ。
ならびに
−  ５４３位にヒスチジンを有する、配列番号２２に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｈ。
−  ５４３位にフェニルアラニンを有する、配列番号２３に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｆ。
−  ５４３位にプロリンを有する、配列番号２４に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｐ。
−  ５４３位にイソロイシンを有する、配列番号２５に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｉ。
−  ５４３位にロイシンを有する、配列番号２６に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｌ。
−  ５４３位にメチオニンを有する、配列番号２７に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｍ。
−  位置５４３にバリンを有する、配列番号２８に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｖ。
−  ５４３位にアラニンを有する、配列番号２９に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ａ。
−  ５４３位にチロシンを有する、配列番号３０に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｙ。
−  ５４３位にトレオニンを有する、配列番号３１に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｔ。
−  ５４３位にグリシンを有する、配列番号３２に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｇ。
−  ５４３位にセリンを有する、配列番号３３に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｓ。
−  ５４３位にシステインを有する配列番号３４に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｃ。
および
−  ５４３位にヒスチジンを有する、配列番号３５に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｖ−Ｗ５４３Ｈ。
−  ５４３位にフェニルアラニンを有する、配列番号３６に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｖ−Ｗ５４３Ｆ。
−  ５４３位にプロリンを有する、配列番号３７に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｖ−Ｗ５４３Ｐ。
−  ５４３位にイソロイシンを有する、配列番号３８に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｖ−Ｗ５４３Ｉ。
−  ５４３位にロイシンを有する、配列番号３９に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｖ−Ｗ５４３Ｌ。
−  ５４３位にメチオニンを有する、配列番号４０に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｖ−Ｗ５４３Ｍ。
−  ５４３位にバリンを有する、配列番号４１に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｖ−Ｗ５４３Ｖ。
−  ５４３位にアラニンを有する、配列番号４２に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｖ−Ｗ５４３Ａ。
−  ５４３位にチロシンを有する、配列番号４３に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｖ−Ｗ５４３Ｙ。
−  ５４３位にトレオニンを有する、配列番号４４に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｖ−Ｗ５４３Ｔ。
−  ５４３位にグリシンを有する、配列番号４５に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｖ−Ｗ５４３Ｇ。
−  ５４３位にセリンを有する、配列番号４６に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｖ−Ｗ５４３Ｓ。
−  ５４３位にシステインを有する、配列番号４７に従うＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｖ−Ｗ５４３Ｃ。
【００８８】
本発明によると、記載された酵素をコードする、デオキシリボ核酸がさらに提供される。
【００８９】
本発明によると、酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体をコードするデオキシリボ核酸であって、１４０２〜１４０４位にイソロイシンと比べて減少した嵩高さをもつアミノ酸をコードし、さらに、１６２７〜１６２９位にトリプトファンよりも小さな嵩高さをもつアミノ酸をコードするデオキシリボ核酸が対象となる。
【００９０】
配列番号２３によるタンパク質の例として、対応するデオキシリボ核酸の１４０２〜１４０４位に例えば核酸ＧＣＣが存在し、１６２７〜１６２９位に核酸ＴＴＴが存在することができる。対応するヌクレオチド配列は、配列リストの番号４８に載っている。
【００９１】
配列９〜４７による本発明による酵素をコードするＤＮＡは、当業者に公知の方法により、定方向または非定方向変異誘発によって産生することができる。その際、定方向変異誘発が好ましい。これらの方法は、当業者に公知である。詳細な説明の部に、本発明の一実施形態のための一製造例が具体的に開示されている。このアプローチは、基本的に全ての他の開示されたデオキシリボ核酸および酵素のためにも使用でき、そのため、全ての本発明による酵素およびデオキシリボ核酸を類似の方法で製造することができる。
【００９２】
デオキシリボ核酸は、ベクター、好ましくはプラスミド中に連結することができる。
【００９３】
空のベクターとして、例えばｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２４ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａ（＋）、ｐＥＴ−２９ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３４ｂ（＋）、ｐＥＴ−３５ｂ（＋）、ｐＥＴ−３６ｂ（＋）、ｐＥＴ−３７ｂ（＋）、ｐＥＴ−３８ｂ（＋）を使用することができ、これらのベクターに、対応する本発明のＤＮＡが連結される。
【００９４】
代替的に、デオキシリボ核酸をゲノムに連結することもできる。
【００９５】
連結されたデオキシリボ核酸は、酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体をコードするＤＮＡであって、１４０２〜１４０４位にイソロイシンと比べて減少した嵩高さをもつアミノ酸をコードし、１６２７〜１６２９位にトリプトファンと比べて減少した嵩高さをもつアミノ酸をコードするＤＮＡである。
【００９６】
好ましくは、連結されたデオキシリボ核酸は、配列９〜４７によるタンパク質をコードする。
【００９７】
本発明によると、酵素変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇをコードし、１４０２〜１４０４位にイソロイシンと比べて減少した嵩高さをもつアミノ酸をコードし、１６２７〜１６２９位にトリプトファンと比べて減少した嵩高さをもつアミノ酸をコードするデオキシリボ核酸を含むベクターを提供することができる。
【００９８】
好ましくは、ベクターは、配列番号４８によるデオキシリボ核酸を含む。
【００９９】
好ましくは、ベクターはプラスミドである。
【０１００】
例として、配列番号４９に、配列番号４８によるＤＮＡを含む、本発明によるプラスミドについての配列が記載されている。
【０１０１】
本発明によると、本発明の好都合な形態では、また、４６８位にイソロイシンと比べて減少した嵩高さをもつアミノ酸をもち、５４３位にトリプトファンと比べて減少した嵩高さを有するアミノ酸をもつ、酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体、好ましくは配列番号９〜４７の群からの酵素を用いて、式（１）に従ってベンズアルデヒドがピルビン酸またはアセトアルデヒドと共に変換されて、（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールにされる。
【０１０２】
【化２】
0006752207.tif 000009
【０１０３】
変換は、好ましくは水溶液中で行われる。
【０１０４】
ｐＨ値は、５〜９、好ましくは６．５〜８、特に好ましくは６．５〜７の範囲である。
【０１０５】
その際、緩衝液として、例えばリン酸カリウム緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＡまたはＴＲＩＳ−ＨＣｌを使用することができる。
【０１０６】
さらに、補因子として、チアミン二リン酸および硫酸マグネシウムを使用することができる。
【０１０７】
反応は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施することができる。
【０１０８】
（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールのｉｎ  ｖｉｖｏ産生のために、産生生物として例えば大腸菌、コリネバクテリウム、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム、またはサッカロミセス・セレビシエのような酵母を使用することができる。
【０１０９】
その際、産生生物は、本発明によるＤＮＡまたはそのＤＮＡを含むベクターで形質転換される。
【０１１０】
ＤＮＡは、産生生物のゲノムに導入することもできる。
【０１１１】
その際、組み込まれた遺伝子は、異種発現される。
【０１１２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生のために、単離された酵素または産生生物の細胞抽出物のいずれかを使用することができる。
【０１１３】
典型的な温度は、２０℃〜４０℃であり、好ましくは２０℃〜３０℃であり、特に好ましくは、温度２０℃〜２５℃である。
【０１１４】
反応時間は、２ｈ〜４８ｈ、好ましくは６ｈ〜２４ｈ、特に好ましくは１２ｈとし得る。
【０１１５】
以下にいくつかの例を紹介するが、それらの例を限定的に解釈すべきではない。
【０１１６】
反応は、古典的な手法で反応フラスコ中で撹拌しながら行うことができる。
【０１１７】
（Ｓ）−ＰＡＣを高い鏡像体過剰率で製造できるように、酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体が変異誘発により産生された。変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｆは、単離した酵素を使用して、９８％ｅｅの（Ｓ）−ＰＡＣを産生する。大腸菌に異種発現され、安価な細胞全体の触媒として使用されるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｆを使用して、９６％ｅｅの（Ｓ）−ＰＡＣを生成することができる。
【０１１８】
実施例３：
２０ｍＭベンズアルデヒド、４００ｍＭピルビン酸、２．５ｍＭ硫酸マグネシウム、１００μＭチアミン二リン酸、２０ｍｇ／ｍＬ（湿重量）ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｆ（ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｆが発現されて存在する大腸菌の細胞全体）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、２５℃、反応時間：４８時間。
【０１１９】
（Ｓ）−ＰＡＣの鏡像体純度：ｅｅ９６％
収率：７３％。
【０１２０】
実施例４：
２０ｍＭベンズアルデヒド、４００ｍＭピルビン酸、２．５ｍＭ硫酸マグネシウム、１００μＭチアミン二リン酸、１ｍｇ／ｍＬ  ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｆ、２０ｍＭベンズアルデヒド、４００ｍＭピルビン酸、２．５ｍＭ硫酸マグネシウム、１００μＭチアミン二リン酸、１ｍｇ／ｍＬ  ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ｇ（単離した酵素）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、２５℃、反応時間：４８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、２５℃、反応時間：４８時間。
【０１２１】
（Ｓ）−ＰＡＣの鏡像体純度：ｅｅ９８％。
収率：４５％。
【０１２２】
ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３からのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）を用いた変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｆの定方向製造方法
酵素変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｆを製造するために、いわゆるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）−ＰＣＲ法（米国特許第５，７８９，１６６、同第５，９３２，４１９号、同第６，３９１，５４８号）を使用した。ＰＣＲのこの変法では、置換すべきＤＮＡトリプレットコードの位置に、対応する配列変化を有するプライマー対が利用される。酵素変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｆを製造するために、変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３をコードする遺伝子を使用した。このいわゆるＤＮＡテンプレートは、ベクター（例えばｐＥＴ２２ａ）中にクローニングされて存在した。位置Ｗ５４３にアミノ酸トリプトファンをコードするトリプレットコードの代わりに、この位置にフェニルアラニンをコードする突然変異を有するプライマーを使用しなければならない（すなわち例えばＴＴＣまたはＴＴＴ）。
【０１２３】
ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３から酵素変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｆを製造するためのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）−ＰＣＲ法のプライマー
順方向：  ５’  ＡＣＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＡＡＴＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＴＡＴＣＣＧＴＧＣ  ３’  （配列番号５０）
逆方向：  ５’  ＧＣＡＣＧＧＡＴＡＴＧＣＴＧＧＴＴＣＡＡＴＴＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＴ  ３’  （配列番号５１）
まず、マスター溶液を製造し、続いて４つの開始液にそれぞれ５０μｌずつ分配した。反応を開始するために、「ＰｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ」１μｌを添加した。
【０１２４】
ＰＣＲ反応開始液：
【０１２５】
【表７】
0006752207.tif 000010
【０１２６】
反応を以下の条件で実施した：
【０１２７】
【表８】
0006752207.tif 000011
【０１２８】
テンプレートＤＮＡを消化するために、酵素ＤｐｎＩ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）１μｌを溶液に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、さらに形質転換する前に、混合物全体を「ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎｌｉｓｔｅ）で精製した。
【０１２９】
このＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）−ＰＣＲ法の全ての他のパラメータおよびその他の酵素変異体に必要なプライマーの選択は、製造業者（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）の指示と同様に、「ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ」の使用説明書を用いて使用することができる。
【０１３０】
変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ−Ｗ５４３Ｆを製造するためのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）−ＰＣＲ法のＤＮＡテンプレート（ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８Ａ）
ＡＴＧＡＣＣＴＡＴＡＣＴＧＴＴＧＧＣＡＴＧＴＡＴＣＴＴＧＣＡＧＡＡＣＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＧＡＴＣＧＧＧＣＴＧＡＡＧＣＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＣＧＴＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＴＣＴＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＴＴＧＣＴＣＣＴＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＡＴＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＧＴＴＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＧＣＧＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＣＣＣＧＴＴＣＴＡＡＣＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＧＴＴＧＧＣＧＣＣＡＴＴＴＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣＧＣＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＴＡＴＧＣＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧＣＣＧＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡＴＴＴＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＡＡＣＡＧＣＡＡＴＧＡＴＣＡＧＧＧＣＡＣＡＧＧＴＣＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＴＣＡＣＡＣＡＡＴＣＧＧＣＡＡＧＡＣＧＧＡＴＴＡＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＴＴＧＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＴＣＡＧＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＧＡＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＧＡＣＧＣＴＣＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＧＡＣＣＡＣＧＴＣＡＴＴＣＧＣＡＣＧＧＣＧＣＴＧＣＧＣＧＡＧＣＧＴＡＡＧＣＣＧＧＣＣＴＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴＣＧＣＧＴＧＣＡＡＣＡＴＴＧＣＣＴＣＣＧＡＧＣＣＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＧＡＧＣＣＴＧＡＡＡＴＣＧＡＣＣＡＣＡＣＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＧＡＣＧＣＣＡＣＧＧＴＴＧＣＣＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＴＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧＣＣＡＡＣＧＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＡＡＣＣＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＡＴＧＣＧＣＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＡＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＧＧＧＴＴＴＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＧＡＡＧＴＣＴＣＧＡＡＣＣＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＣＣＴＣＣＧＡＣＧＣＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣＡＴＣＧＣＣＣＣＣＧＴＡＴＴＣＡＡＣＧＡＣＴＡＴＴＣＡＡＣＡＧＴＣＧＧＣＴＧＧＴＣＧＧＣＡＴＧＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＧＴＡＡＣＧＧＴＣＧＡＴＧＧＣＣＧＣＧＣＣＴＡＴＧＡＣＧＧＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＣＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＧＣＡＧＣＧＴＣＣＣＧＡＣＧＴＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＣＧＣＧＡＣＡＴＣＣＧＡＴＧＡＡＧＣＣＧＧＴＣＴＧＡＣＧＡＡＴＧＡＣＧＡＡＡＴＣＧＴＣＣＧＴＣＡＴＡＴＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＣＡＡＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＧＧＴＧＧＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＣＧＡＴＴＣＡＴＧＧＴＴＣＡＡＴＧＣＣＡＴＧＣＧＣＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＴＧＣＧＣＧＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＴＡＴＣＧＧＣＴＧＧＴＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＧＣＣＴＴＣＧＧＣＡＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＣＧＣＡＧＧＡＣＣＧＣＣＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＡＧＧＣＧＡＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧＣＴＴＡＣＣＧＣＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＧＣＴＡＣＧＡＡＣＴＧＣＣＣＧＴＣＡＴＴＡＴＣＴＴＴＣＴＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＧＴＣＧＣＣＧＧＣＡＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＴＧＡＣＧＧＣＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＡＡＣＧＣＣＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＴＧＧＣＣＴＧＡＡＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡＣＴＧＡＣＡＧＡＡＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＴＡＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＡＣＧＣＴＧＡＴＣＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡＴＣＧＡＣＣＧＣＡＣＧＧＡＣＴＧＣＡＣＧＧＡＴＡＴＧＣＴＧＧＴＴＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＴＴＧＣＣＴＣＡＡＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＣＡＡＧＡＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧ
【０１３１】
ここで配列番号５２は、配列番号２の改変されるべきタンパク質ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｉ４６８ＡをコードするＤＮＡの例として開示されている。しかし本発明によると、改変されるべき酵素を製造するために、改変されるべき出発タンパク質をコードする全ての他のデオキシリボ核酸を使用することができる。それをコードするヌクレオチドは、当業者に公知である。
【０１３２】
大腸菌ＢＬ２１−ＤＥ３および大腸菌ＤＨ５αの形質転換
大腸菌株ＢＬ２１−ＤＥ３および大腸菌株ＤＨ５αを、「部位飽和変異誘発」によって製造されたＤＮＡで形質転換した。このために、コンピテント細胞５０μｌにＤＮＡ  １００ｎｇを添加し、氷上で３０分間インキュベートした。続いて、４２℃で９０秒間熱ショックを行った。３分後に、氷上でＳＯＣ培地５００μｌを添加し、溶液をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ中のポートで３５０ＲＰＭおよび３７℃で４５分間インキュベートした。インキュベーションを行った後、細胞懸濁物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ組織遠心分離機に入れて１３，０００ＲＰＭで３０秒間遠心分離し、続いてペレットを上清１００μｌ中に再懸濁した。１００μｌに濃縮した細胞懸濁物をＬＢ寒天プレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリン入り）上に播種し、３７℃で１６時間、逆さにしてインキュベートした。
【０１３３】
ＤＮＡの単離およびＤＮＡ配列決定による最良の酵素変異体の同定
突然変異の同定のために、炭素連結反応において（Ｓ）−ＰＡＣについて最高のｅｅ値をもたらした酵素のＤＮＡをマスタープレートに基づき配列決定した。そのために、まず、グリセリンと混合したマスタープレートから細胞を白金耳でＬＢ培地（＋５０μｇ／ｍｌアンピシリン）５０ｍＬ中に移植し、２５０ｍＬ三角フラスコ中に入れて３７℃でインキュベートした。１２時間インキュベーション後に、細胞懸濁物２０ｍＬを遠心分離した（４，０００ＲＰＭ、５分、４℃）。ペレット中の細胞のＤＮＡを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ  Ｎ．Ｖ．）の指示と同様に、「ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ」の方法に従い単離した。その際、ＤＮＡの濃度を１００ｎｇ／μｌに調整し、ＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社がそのＤＮＡを配列決定した。
【０１３４】
ＬＢ（溶原性ブロス）培地
【０１３５】
【表９】
0006752207.tif 000012
【０１３６】
「細胞全体」の形態での変異体の製造
細胞全体に１Ｌ規模で酵素を発現させるために、まず、グリセリンと混合したマスタープレートから細胞を白金耳でＬＢ培地（＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン）５０ｍＬ中に移植し、２５０ｍＬ三角フラスコ中で１２０ＲＰＭおよび３７℃でインキュベートした。１６時間インキュベーション後に、培養物１０ｍＬを自己誘導培地１Ｌに入れ、５Ｌ三角フラスコ中で９０ＲＰＭおよび２０℃で７２時間インキュベートした。続いて細胞を遠心分離（４℃、６，０００ＲＰＭ、３０分）によって回収し、その後の使用まで−２０℃で保存した。
【０１３７】
自己誘導培地
【０１３８】
【表１０】
0006752207.tif 000013
【０１３９】
単離した酵素の形態での変異体の製造
１Ｌ規模で培養した細胞１０ｇを、４℃に冷却した破壊緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、１００μＭチアミン二リン酸、２ｍＭ硫酸マグネシウム）２５ｍＬと共に氷上で再懸濁した。続いて、再懸濁した細胞を超音波ＳＤ１４−Ｓｏｎｏｔｒｏｄｅ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ＧｍｂＨ）、２分処理を４回、それぞれ氷から１分冷却する）を用いて破壊した。細胞の破片を分離するために溶液を遠心分離し（４５分、１８，０００ＲＰＭ、４℃）、上清（「細胞抽出物」）を新しい容器に移した。
【０１４０】
固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを用いてＡｐＰＤＣ変異体を精製するために、とりわけタンパク質のＵＶ吸収（２８０ｎｍ）および電気伝導率を検出し、流速を調整する目的で「Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ」社の「ＡＥＫＴＡ（商標）精製装置」を使用した。精製するために、予めローディング緩衝液１８０ｍＬで平衡化しておいた体積６０ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ−Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｎ．Ｖ．）を有するカラムに、製造した細胞抽出物（約２５ｍＬ）を流速３ｍＬ／ｍｉｎでロードした。続いて、カラム材料と結合していないまたは非常に弱く結合しているタンパク質を除去するために、流速５ｍｌ／ｍｉｎのローディング緩衝液でさらに洗浄した。ＵＶ吸収（２８０ｎｍ）が安定なベースラインに再び達した後、カラム材料と弱く結合しているタンパク質を溶出するために洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、１００μＭチアミン二リン酸、２ｍＭ硫酸マグネシウム、５０ｍＭイミダゾール）を流速５ｍＬ／ｍｉｎで使用した。ＵＶ吸収（２８０ｎｍ）が再び安定化した後、目的タンパク質を溶出するために、溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、１００μＭチアミン二リン酸、２ｍＭ硫酸マグネシウム、２５０ｍＭイミダゾール）を流速５ｍＬ／ｍｉｎで使用した。
緩衝液交換のために、予め緩衝液交換用緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、１００μＭチアミン二リン酸、２ｍＭ硫酸マグネシウム）２Ｌで洗浄したサイズ排除クロマトグラフィーカラム（カラム体積１Ｌ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈ−ｃａｒｅ）にＩＭＡＣの溶出液を流速１０ｍＬ／ｍｉｎでロードした。高められたＵＶ吸収（２８０ｎｍ）を有する画分を合わせ、結晶皿中で凍結させた（−２０℃）。凍結乾燥するために、凍結したタンパク質溶液を０．２２ｍＢａｒの減圧下に３日間置いた。生成した粉末のタンパク質含量は２０％であった。純度（外来タンパク質に関する目的タンパク質の割合）は、＞９０％であった。
なお、本願は、特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．アセトバクター・パストリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）由来の野生型と比べて改変されたタンパク質ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇにおける４６８位のアミノ酸イソロイシンが、イソロイシンよりも嵩高さが低いアミノ酸によって置き換えられていることを特徴とする、リアーゼ。
２．配列１、２または３のうちの一つのアミノ酸配列を有することを特徴とする、上記１に記載のリアーゼ。
３．５４３位のアミノ酸が、トリプトファンより小さい嵩高さを有するアミノ酸によってさらに置換されていることを特徴とする、上記１または２に記載のリアーゼ。
４．配列９〜４７のうちの一つのアミノ酸配列を有することを特徴とする、上記３に記載のリアーゼ。
５．酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体をコードし、１４０２〜１４０４位のコドンが、イソロイシンよりも嵩高さが低いアミノ酸をコードするコドンによって置換されていることを特徴とする、上記１または２に記載のリアーゼをコードするデオキシリボ核酸。
６．酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体をコードし、１４０２〜１４０４位のコドンが、イソロイシンよりも嵩高さが低いアミノ酸をコードするコドンによって置換されており、さらに、１６２７〜１６２９位のコドンが、トリプトファンよりも嵩高さが低いアミノ酸をコードするコドンによって置換されていることを特徴とする、上記３または４に記載のリアーゼをコードするデオキシリボ核酸。
７．配列４または４８のヌクレオチド配列を有することを特徴とする、上記５または６に記載のデオキシリボ核酸。
８．配列４または４８のデオキシリボ核酸を含むことを特徴とする、ベクター。
９．プラスミドであることを特徴とする、上記８に記載のベクター。
１０．上記８に記載の配列が、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２４ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａ（＋）、ｐＥＴ−２９ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３４ｂ（＋）、ｐＥＴ−３５ｂ（＋）、ｐＥＴ−３６ｂ（＋）、ｐＥＴ−３７ｂ（＋）、ｐＥＴ−３８ｂ（＋）の群からの空のベクターに連結されていることを特徴とする、上記９に記載のベクター。
１１．ベンズアルデヒドが、式（１）
【化３】
0006752207.tif 000014
に従って、ピルビン酸またはアセトアルデヒドと共に変換される（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールの製造方法であって、変換が、上記１〜４のいずれか一つに記載のリアーゼを用いて行われることを特徴とする、製造方法。
１２．ｐＨ値５〜９で行われることを特徴とする、上記１１に記載の方法。
１３．緩衝液としてＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＡまたはＴＲＩＳ−ＨＣｌが使用されることを特徴とする、上記１１または１２に記載の方法。
１４．補因子としてチアミンリン酸および硫酸マグネシウムが使用されることを特徴とする、上記１１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
１５．変換が、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われることを特徴とする、上記１１〜１４のいずれか一つに記載の方法。
１６．（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールの産生が、大腸菌、コリネバクテリウム、コリネバクテリウム・グルタミカム、または酵母、サッカロミセス・セレビシエの群からの産生生物において行われることを特徴とする、上記１５に記載の方法。
１７．前記生物が配列４もしくは４８のうちの少なくとも一つのＤＮＡで形質転換され、かつ／または配列４もしくは４８のＤＮＡがゲノムに組み込まれることを特徴とする、上記１５または１６に記載の方法。
１８．形質転換のために、上記８〜１０のいずれか一つに記載のベクターが使用されることを特徴とする、上記１７に記載の方法。
１９．変換が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われることを特徴とする、上記１１〜１４のいずれか一つに記載の方法。
２０．配列１〜３または９〜４７のいずれか一つの単離された酵素が使用されることを特徴とする、上記１９に記載の方法。
２１．産生生物からの粗製細胞抽出物が使用されることを特徴とする、上記１９に記載の方法。
【図１】
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【配列表】
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