(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖と軽鎖とを含み、ＰＤ−１に特異的に結合することができる抗体であって、
（ｉ）前記重鎖は、それぞれ配列番号７、８および１１に記載のアミノ酸配列、または配列番号９、１０および１１に記載のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３を含み、
（ｉｉ）前記軽鎖は、それぞれ配列番号１２、１３および１４に記載のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３を含む、
抗体。
【請求項２】
（ｉ）前記重鎖が、配列番号１、２、４または５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、
（ｉｉ）前記軽鎖が、配列番号３または６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、
請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
（ｉ）前記重鎖が、配列番号４または５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、
（ｉｉ）前記軽鎖が、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、
請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、１０Ｆ８、１５Ｈ６、ＢＡ０８−１、およびＢＡ０８−２から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体をコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体の前記軽鎖をコードするポリヌクレオチドと、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体の前記重鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む、単離ポリヌクレオチドの組み合わせ。
【請求項７】
請求項５に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６に記載のポリヌクレオチドの組み合わせを含む発現ベクターであって、
前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞または無細胞発現系において、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの発現を可能にする制御配列に効果的に連結する、
発現ベクター。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体、請求項５に記載のポリヌクレオチド、請求項６に記載のポリヌクレオチドの組み合わせ、請求項７に記載の発現ベクター、および／または請求項８に記載の医薬組成物を含む、がんまたは感染症の治療または予防を必要とする対象の、がんまたは感染症の治療または予防をするための医薬。
【請求項１０】
前記がんが、肺がんまたはメラノーマであり、前記感染症が、ＨＩＶ感染またはＢ型肝炎ウイルス感染である、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体、請求項５に記載のポリヌクレオチド、請求項６に記載のポリヌクレオチドの組み合わせ、請求項７に記載の発現ベクター、および／または請求項８に記載の医薬組成物を含む、Ｔ細胞免疫応答の増強を必要とする対象の、Ｔ細胞免疫応答の増強をするための医薬。
【請求項１２】
Ｔ細胞免疫応答の増強が、Ｔ細胞のサイトカイン産生の増強を含み、好ましくは、前記サイトカインが、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γを含む、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
前記Ｔ細胞のサイトカイン産生が、抗ＣＤ３抗体に刺激されたＴ細胞のサイトカイン産生を含む、請求項１２に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たな抗ＰＤ−１抗体またはその機能性フラグメントを提供する。特に、本発明はさらに、腫瘍治療のための医薬の調製における、抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞コレセプターシグナル伝達は、免疫応答を緻密に制御するための重要なメカニズムである。共シグナル伝達（共刺激および共抑制を含む）のための細胞表面分子は、主要な２つのファミリー、すなわち、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）スーパーファミリー、に分けることができる。一般に、Ｔ細胞の活性化は、ＨＬＡクラスＩまたはＩＩ分子によって提示される抗原ペプチドに依存する。コレセプターシグナル伝達は、この活性化を促進することになるか、または抑制することになる。例えば、アゴニストによるＣＤ２８または４−１ＢＢの活性化によって、固有の共刺激経路を介して、末梢リンパ系器官内のリンパ球のイニシエーションおよび成熟が促進され得、または生物におけるリンパ球の応答効果が増強され得る。免疫活性化は、アンタゴニストによって、共抑制シグナル伝達経路、例えば、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、Ｂ７ホモログ１（Ｂ７−Ｈ１、別名ＰＤＬ１）経路、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、Ｂ／Ｔリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）、および他の経路を阻止することによっても実現し得る。これらの共抑制シグナル伝達経路は、免疫寛容の制御において重要な役割を果たし、この共抑制シグナル伝達経路は、免疫応答を制限し、終結させ、および／または減衰させる負のシグナルをもたらす。共刺激レセプターによって媒介される免疫活性化は、膜近傍キナーゼを刺激することによって活性化され、リン酸化カスケード増幅を引き起こし、一方でＣＴＬＡ４、ＰＤ１、およびＢ／Ｔリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）などの共抑制レセプターは、ホスファターゼを動員し、免疫活性化によって誘発されたリン酸化を逆転させる。免疫調節生物学的製剤は、免疫関連疾患の治療において、移植拒絶反応、自己免疫疾患、もしくは炎症性疾患による免疫機能亢進を抑制するために、またはがん、慢性細菌感染、およびウイルス感染などの免疫機能不全に対する免疫応答を刺激するために広く使用することができる。モノクローナル抗体および組換え融合タンパク質に基づく、すなわち標的抗原または標的陽性細胞の中和または消耗による、主流の療法とは異なり、免疫調節生物学的製剤は、主に宿主免疫細胞表面のシグナル伝達分子と結合し、制御することによって、リンパ球応答の方向および強度を調節するように、抗原特異的Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）およびＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）に対するシグナルを制御する。
【０００３】
ＰＤ−１遺伝子は、Ｔ細胞ハイブリドーマがアポトーシスを起こす際に上方制御され、プログラム細胞死タンパク質１と命名されている。ＰＤ−１（ＣＤ２７９）は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、および活性化骨髄性細胞で発現し（非特許文献１）、また活性化マクロファージ、ＤＣ、および単球でも発現しているが、それらの未成熟細胞中には存在しない（非特許文献２、非特許文献３）。細胞表面上における、これらの上方制御されたＰＤ−１の発現によって、生物の後天性免疫応答および自然免疫応答が抑制され得る。ＰＤ−１細胞内ドメインは２つのチロシン部位を含み、その一方は免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）であり、他方は免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）である。ＩＴＳＭ上のチロシンのリン酸化によって、チロシンホスファターゼであるＳＨＰ２および／またはＳＨＰ１が動員される。これらのホスファターゼは、ＺＡＰ７０、ＣＤ３、およびＰＫＣを脱リン酸化し、それによってＴ細胞シグナルを減衰させることになる。ＰＤ−１は、細胞をＧ０／Ｇ１期で停止させることによって、主にＴ細胞増殖およびＢ細胞増殖を阻害し、Ｔ細胞におけるサイトカイン産生を阻害する。ＰＤ−１発現が欠損した動物には、自己免疫性心筋症、関節炎および腎炎を伴うループス様症候群を含む、種々の自己免疫表現型が生じる（非特許文献４、非特許文献５）。さらに、ＰＤ−１は、自己免疫性の脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、Ｉ型糖尿病、およびリウマチ様関節炎などにおいても、重要な役割を果たす（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。
【０００４】
２種類のＰＤ−１リガンド、すなわちＰＤ−Ｌ１／Ｂ７Ｈ１／ＣＤ２７４およびＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ／ＣＤ２７３、が現在報告されている（非特許文献９、非特許文献１０）。ＰＤ−Ｌ１は、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、およびＴ細胞などの免疫細胞において低レベルで発現しており、細胞活性化に際して上方制御される。ＰＤ−Ｌ１は、血管内皮細胞、心臓、肺、膵臓、筋肉、ケラチノサイト、および胎盤などの非リンパ系器官においても発現している。非リンパ系組織におけるＰＤ−Ｌ１の発現によって、ＰＤ−Ｌ１は、末梢組織において、自己反応性Ｔ細胞、Ｂ細胞、および骨髄性細胞の機能を制御することができ、標的器官の炎症反応に関与することもできることが明らかとなった。ＰＤ−Ｌ１の発現は、主にインターフェロン１または２によって制御され、インターフェロン１および２は、血管内皮細胞および上皮細胞におけるＰＤ−Ｌ１レベルの主要な制御因子でもある。ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍細胞においても発現しており、予後不良と密接な関係がある。種々のウイルス感染によって、宿主組織におけるＰＤ−Ｌ１発現が、高レベルで誘導され得る。心臓、肝臓、および膵臓などの非造血組織においてもＰＤ−Ｌ２転写物が見つかっているが、細胞表面上のＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣの発現は、マクロファージおよび樹状細胞だけに限定されており、ＩＦＮγおよびＴｈ２サイトカインの産生に依存している。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現は、種々の刺激による影響も受ける。マクロファージ上のＰＤ−Ｌ１は、ＩＮＦγによって誘導されるが、ＰＤ−Ｌ２は、ＩＬ−４によって制御される。同様の現象は、樹状細胞でも見られる。この研究によって、ＰＤ−Ｌ１は、Ｔｈ１応答を優先的に制御する一方、ＰＤ−Ｌ２は、Ｔｈ２細胞応答を制御するであろうことが明らかとなった。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、いずれも、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、およびβ１／β２インテグリンが媒介する接着を抑制し得る。ＰＤ−Ｌ２は、樹状細胞の逆シグナル伝達を誘発し、それによってＩＬ−１２産生およびＴ細胞活性化を引き起こすこともできる。
【０００５】
ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１制御軸は、ヒトＴ細胞活性化の調節、および生物の免疫寛容の維持に重要な役割を果たし、腫瘍細胞、ならびに慢性ウイルス感染においてウイルスにも利用される（非特許文献１１、非特許文献１２）。ＰＤ−Ｌ１は、多様なヒトがん組織において高発現している（非特許文献１３）。ＰＤ−Ｌ１の発現は、ある種の悪性腫瘍の進行および予後不良に関係する（非特許文献１４）。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ１経路は、Ｔ細胞枯渇を促進することも確証されている（非特許文献１５）。腫瘍またはウイルスに起因するＰＤ−Ｌ１／ＰＤ１経路によって、Ｔ細胞の不活性化、疲弊、不応答性、およびアポトーシスの促進、制御性Ｔ細胞増幅の誘発、ならびに腫瘍の死滅およびアポトーシスに抵抗する内在的能力の増強を含む、多様なメカニズムによる、宿主の免疫監視からの逃避を実現することができる。がん細胞が媒介するＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用によって、腫瘍浸潤性リンパ球の減少、Ｔ細胞レセプターによって媒介されるＴ細胞増殖の阻害、および免疫逃避の増大が引き起こされる（非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８）。
【０００６】
今日まで、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１制御軸を特異的に阻止し、抗腫瘍および抗ウイルス免疫応答の活性化をもたらす、がん患者のために効果的な免疫応答を誘導することができる、満足できる方法は依然として存在していない。したがって、がんまたは慢性感染症を患っている患者のＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１制御軸を特異的に阻止し、免疫抑制を克服する治療法を開発および設計する差し迫った必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｄａ  Ｙ．、Ａｇａｔａ  Ｙ．、Ｓｈｉｂａｈａｒａ  Ｋ．、Ｈｏｎｊｏ  Ｔ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９２、１：３８８７〜３８９５
【非特許文献２】Ａｇａｔａ  Ｙ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、８：７６５〜７７２
【非特許文献３】Ｓａｉｄ  Ｅ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、２０１０、１６：４５２〜４５９
【非特許文献４】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９９、Ｈ：１４１〜５１
【非特許文献５】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１、２９１：３１９〜２２
【非特許文献６】Ｓａｌａｍａら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．、２００３、１９８：７１〜７８
【非特許文献７】Ｐｒｏｋｕｎｉｎａ  ａｎｄ  Ａｌａｒｃｏｎ−Ｒｉｑｕｅｌｍｅ、Ｈｕｍ  ＭｏＩ  Ｇｅｎｅｔ．、１９９２、１３：Ｒ１４３
【非特許文献８】Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｌｕｐｕｓ．、２００４、１１：５１０
【非特許文献９】Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｇ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０００、１９２：１０２７〜１０３４
【非特許文献１０】Ｌａｔｃｈｍａｎ  Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１、２：２６１〜２６８
【非特許文献１１】Ｙａｏ  Ｓ．、Ｃｈｅｎ  Ｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００６、１２：２４４〜２４６
【非特許文献１２】Ｚｏｕ  Ｗ．、Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００８、８：４６７〜４７７
【非特許文献１３】Ｄｏｎｇら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２００２、８：７８７〜９
【非特許文献１４】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｒ．Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００６、６６：３３８１〜３３８５
【非特許文献１５】Ｚａｊａｃ  Ａ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９８、１８８：２２０５〜２２１３
【非特許文献１６】Ｄｏｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、２００３、８１：２８１〜７
【非特許文献１７】Ｂｌａｎｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２００５、５４：３０７〜３１４
【非特許文献１８】Ｋｏｎｉｓｈｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００４、１０：５０９４〜１００
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一般に、本発明は、新たなＰＤ−１抗体またはその機能性フラグメントを提供する。特に、本発明の抗体は、ヒト化抗体である。
【０００９】
一態様において、本発明は、ＰＤ−１に特異的に結合することができる抗体またはその機能性フラグメントを提供し、前記抗体は、重鎖と軽鎖とを含み、（ｉ）前記重鎖は、それぞれ配列番号７、８、および１１に記載のアミノ酸配列、または、配列番号９、１０、および１１に記載のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３を含み、（ｉｉ）前記軽鎖は、それぞれ配列番号１２、１３、および１４に記載のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３を含む。
【００１０】
一態様において、本発明は、ＰＤ−１に特異的に結合することができる抗体またはその機能性フラグメントを提供し、（ｉ）前記重鎖は、配列番号１、２、４、または５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、（ｉｉ）前記軽鎖は、配列番号３または６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００１１】
別の態様において、本発明は、ＰＤ−１に特異的に結合することができる抗体またはその機能性フラグメントを提供し、（ｉ）前記重鎖は、配列番号４または５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、（ｉｉ）前記軽鎖は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００１２】
好ましくは、本発明の抗ＰＤ−１抗体は、１０Ｆ８、１５Ｈ６、ＢＡ０８−１、およびＢＡ０８−２から選択される。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその機能性フラグメントをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその機能性フラグメントの軽鎖をコードするポリヌクレオチドと、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその機能性フラグメントの重鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む、単離ポリヌクレオチドの組み合わせを提供する。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドの組み合わせを含む発現ベクターを提供し、前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞または無細胞発現系において、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの発現を可能にする制御配列に効果的に連結する。好ましくは、前記発現ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその機能性フラグメントと、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその機能性フラグメント、本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドの組み合わせ、本発明の発現ベクター、および／または本発明の医薬組成物を、対象に投与することを含む、がんまたは感染症の治療または予防を必要とする対象の、がんまたは感染症の治療または予防方法を提供する。いくつかのある実施形態において、前記対象は、抗ＣＤ３抗体療法を受けているか、受けることを予定している。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその機能性フラグメント、本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドの組み合わせ、本発明の発現ベクター、および／または本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、Ｔ細胞免疫応答の増強を必要とする対象の、Ｔ細胞免疫応答の増強方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞免疫応答の増強は、Ｔ細胞のサイトカイン産生の増強を含み、好ましくは、前記サイトカインは、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γを含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記Ｔ細胞のサイトカイン産生の増強は、抗ＣＤ３抗体に刺激されたＴ細胞のサイトカイン産生を含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記対象は、がんを患っている患者、例えば、ＰＤ−Ｌ１陽性がんを患っている患者、好ましくは肺がんおよびメラノーマを患っている患者である。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその機能性フラグメント、本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドの組み合わせ、本発明の発現ベクター、および／または本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、Ｔ細胞活性化の促進を必要とする対象の、Ｔ細胞活性化の促進方法を提供する。好ましくは、前記方法は、前記対象に抗ＣＤ３抗体を投与することをさらに含む。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその機能性フラグメント、本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドの組み合わせ、本発明の発現ベクター、および／または本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、Ｔ細胞活性化に対するＰＤ−Ｌ１阻害の除去を必要とする対象の、Ｔ細胞活性化に対するＰＤ−Ｌ１阻害の除去方法を提供する。好ましくは、前記方法は、前記対象に抗ＣＤ３抗体を投与することをさらに含む。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその機能性フラグメント、本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドの組み合わせ、本発明の発現ベクター、および／または本発明の医薬組成物をＴ細胞と接触させることを含む、Ｔ細胞活性化の促進方法（好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を提供する。好ましくは、前記方法は、抗ＣＤ３抗体をＴ細胞と接触させることをさらに含む。
【００２２】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその機能性フラグメント、本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドの組み合わせ、本発明の発現ベクター、および／または本発明の医薬組成物をＴ細胞と接触させることを含む、Ｔ細胞活性化に対するＰＤ−Ｌ１阻害の除去方法（好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を提供する。好ましくは、前記方法は、抗ＣＤ３抗体をＴ細胞と接触させることをさらに含む。
【００２３】
さらに別の態様において、本発明の方法は、本発明の抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＤ３抗体の投与を必要とする対象に、本発明の抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＤ３抗体を投与することを含む、併用療法をさらに提供する。
【００２４】
さらに別の態様において、本発明は、がんまたは感染症の治療または予防のための医薬の調製における、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその機能性フラグメントの使用を提供する。
【００２５】
さらに別の態様において、本発明は、Ｔ細胞免疫応答を増強するための医薬の調製における、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその機能性フラグメントの使用を提供する。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞免疫応答の増強は、Ｔ細胞のサイトカイン産生の増強を含み、好ましくは、前記サイトカインは、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γを含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記Ｔ細胞のサイトカイン産生の増強は、抗ＣＤ３抗体に刺激されたＴ細胞のサイトカイン産生を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその機能性フラグメントは、ＰＤ−Ｌ１陽性がんおよびＰＤ−１陰性がんを治療するために使用することができる。いくつかのある実施形態において、前記がんは肺がんまたはメラノーマ（例えば、ＰＤ−Ｌ１陽性肺がんもしくはメラノーマおよび／またはＰＤ−Ｌ１陰性肺がんもしくはメラノーマ）であり、前記感染症はＨＩＶ感染またはＢ型肝炎ウイルス感染である。
【００２７】
いくつかのある実施形態において、本発明による抗ＰＤ−１抗体またはその機能性フラグメントは、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用、および／またはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との間の相互作用を阻止する。
【００２８】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその機能性フラグメントは、ヒトＩｇＧ４またはＩｇＧ１重鎖定常領域と、ヒトκ軽鎖定常領域とをさらに含む。
【００２９】
本発明は、ＢＬＡＣ／ＣマウスをヒトＰＤ−１タンパク質で免疫し、フローサイトメーターで高力価のマウス抗原特異的Ｂ細胞をスクリーニングし、ＲＴ−ＰＣＲ法で抗体重鎖および軽鎖可変領域の遺伝子をクローニングし、次いで２９３細胞を用いて組換え抗体を発現させる、上記ヒト化抗体をスクリーニングおよび調製する方法にも関する。プロテインＡで精製した後、親和性およびＰＤ−Ｌ１との結合活性の阻止に関するスクリーニングにより、予期せぬ高いＰＤ−１親和性およびＴ細胞活性化能力を有する抗体１０Ｆ８および１５Ｈ６を最終的に選択する。抗体１０Ｆ８および１５Ｈ６の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および２に示され、これら２つの抗体は、配列番号３に示すように、同じアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。抗体１０Ｆ８の重鎖ＣＤＲ（Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７、８、および１１に示し、１５Ｈ６の重鎖ＣＤＲ（Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９、１０、および１１に示し、抗体１０Ｆ８および１５Ｈ６の軽鎖ＣＤＲ（Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１２、１３、および１４に示す。これらの重鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４配列に基づき、ヒト抗体遺伝子配列ライブラリーとの比較を行い、重鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４配列と類似した、ヒト生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）抗体可変領域の、一連の対応する候補配列を見つける。一連の候補配列のＨＬＡ−ＤＲ分子との結合親和性を、コンピューターシミュレーション（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏｎ）法によって解析し、親和性が最も低いフレーム配列を選択し、それによって重鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のヒト化配列を最終的に確立する。これらのフレーム配列に基づき、コンピューター分子モデル解析を利用して、マウス抗体で保存され、ＣＤＲ構造を支えるために必要とされる、対応するフレームアミノ酸残基を解析する。１０Ｆ８に対応するヒト化抗体ＢＡ０８−１、および１５Ｈ６に対応するヒト化抗体ＢＡ０８−２の重鎖可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４および５に示す。マウス抗体の軽鎖可変領域の配列に対し、同じ解析を行う。軽鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４配列に基づき、ヒト抗体遺伝子配列ライブラリー（ＮＣＢＩ  Ｉｇ  ＢＬＡＳＴ）との比較を行い、軽鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４配列と類似した、ヒト生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）抗体可変領域の、対応する候補配列を見つける。配列のＨＬＡ−ＤＲ分子との結合親和性を、コンピューター（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏｎ）解析によって解析し、親和性が最も低いフレーム配列を選択し、それによって軽鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のヒト化配列を最終的に確立する。これらのフレーム配列に基づき、コンピューター分子モデル解析を利用して、マウス抗体の空間立体構造を解析し、マウス抗体軽鎖で保存され、ＣＤＲ構造を支えるために必要とされる、対応するフレームアミノ酸残基を解析する。１０Ｆ���および１５Ｈ６に対応する、ヒト化抗体ＢＡ０８−１およびヒト化抗体ＢＡ０８−２の軽鎖可変領域を、配列番号６に示す。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】抗体ＢＡ０８−１およびＢＡ−０８−２が、ＰＤ−１タンパク質に高い親和性で結合することを示す。
【図２】抗体ＢＡ０８−１およびＢＡ−０８−２が、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻止することを示す。
【図３】抗体ＢＡ０８−１およびＢＡ−０８−２による、Ｔ細胞のＩＬ−２産生の著しい増強を示す。カラムは、図下部の凡例に記載されているように、左から右に、抗体を含まない陰性対照、陽性対照（抗ＣＤ３抗体単独）、抗ＣＤ３抗体刺激によるＩＬ−２発現に対するＰＤ−Ｌ１阻害（ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＤ３抗体を添加）、本発明の抗体ＢＡ０８−１によるＰＤ−Ｌ１の阻害効果に関する拮抗作用（ＢＡ０８−１、ＰＤ−Ｌ１、および抗ＣＤ３抗体を添加）、本発明の抗体ＢＡ０８−２によるＰＤ−Ｌ１の阻害効果に関する拮抗作用（ＢＡ０８−２、ＰＤ−Ｌ１、および抗ＣＤ３抗体を添加）、およびＭＫ３４７５によるＰＤ−Ｌ１の阻害効果に関する拮抗作用（ＭＫ３４７５、ＰＤ−Ｌ１、および抗ＣＤ３抗体を添加）を示す。
【図４】抗体ＢＡ０８−１およびＢＡ−０８−２による、Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生の著しい増強を示す。カラムは、図下部の凡例に記載されているように、左から右に、ＣＤ３抗体を含まない対照、陽性対照（抗ＣＤ３抗体単独）、抗ＣＤ３抗体刺激によるＩＦＮ−γ発現に対するＰＤ−Ｌ１阻害（ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＤ３抗体を添加）、本発明の抗体ＢＡ０８−１によるＰＤ−Ｌ１の阻害効果に関する拮抗作用（ＢＡ０８−１、ＰＤ−Ｌ１、および抗ＣＤ３抗体を添加）、本発明の抗体ＢＡ０８−２によるＰＤ−Ｌ１の阻害効果に関する拮抗作用（ＢＡ０８−２、ＰＤ−Ｌ１、および抗ＣＤ３抗体を添加）、およびＭＫ３４７５によるＰＤ−Ｌ１の阻害効果に関する拮抗作用（ＭＫ３４７５、ＰＤ−Ｌ１、および抗ＣＤ３抗体を添加）を示す。
【図５】リンパ球のサイトカイン産生に対する、抗体ＢＡ０８−１およびＢＡ−０８−２の効果を示す。
【図６】ＰＤ−Ｌ１が固定化ＰＤ−Ｌ１である場合の、腫瘍細胞（メラノーマ細胞および肺がん細胞を含む）による活性化Ｔ細胞のＩＬ−２産生の阻害に対する、抗体ＢＡ０８−１およびＢＡ−０８−２の効果を示す。
【図７】ヒト肺がんを有するＨｕ−ＰＢＬ  ＳＣＩＤマウスを用いた、ヒト化抗ＰＤ−１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果に関する評価を示す。
【図８】ヒト化抗ＰＤ−１抗体のメラノーマに対するｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果に関する評価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
別段の定めがないかぎり、本明細書で用いられる全ての専門用語および科学用語は、当業者が理解する意味と同じ意味を有する。当技術分野における定義および技術用語に関し、専門家は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ）を具体的に参照することができる。アミノ酸残基の略号は、２０種のいずれのＬ−アミノ酸についても、当技術分野で一般に用いられる、標準的な３文字および／または１文字表記である。
【００３２】
本発明は、プログラム死因子１（ＰＤ−１）に結合することができる、抗ＰＤ−１抗体およびその機能性フラグメントを提供する。本発明の抗体またはその機能性フラグメントは、以下の特性、すなわち、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を高い親和性で阻止することができる特性、ＰＤ−１に高い特異性で結合することができる特性、腫瘍特異的Ｔ細胞を活性化し、それによって腫瘍細胞を死滅させる特性、Ｔ細胞免疫応答を著しく増強する（例えば、Ｔ細胞のサイトカイン（ＩＦＮγおよびＩＬ−２を含む）産生を増強する）特性、および免疫エフェクターレベルを大幅に増大させる特性、の少なくとも１つを有する。
【００３３】
本発明は、ヒト化抗ＰＤ−１抗体およびその機能性フラグメントも提供する。例えば、ヒト化抗体は、酵母ディスプレイ技術と、免疫化マウスによって産生されるマウス由来抗体のコンピューターシミュレーション設計との組み合わせによって得られる。
【００３４】
抗体の活性に実質的に影響を与えないという前提で、当業者は、抗体またはその機能性フラグメントの配列のバリアントを得るために、本発明の配列において、１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上）のアミノ酸を置換、付加、および／または欠失させることができる。これらは、本発明の保護範囲に含まれるとみなされる。例えば、可変領域内のアミノ酸は、類似の性質を持つアミノ酸によって置換されてもよい。本発明のバリアントの配列は、もととなる配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。本発明の配列同一性は、配列解析ソフトウェアによって測定することができる。例えば、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮを、デフォルトパラメーターで使用することができる。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、用語「抗体」には、全長抗体（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）、その種々の機能性フラグメント（例えば、前記機能性フラグメントは、抗原結合部、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖフラグメントだけを含んでもよい）、および改変抗体（例えば、ヒト化抗体、グリコシル化抗体など）が含まれる。本発明は、改変されたグリコシル化パターンを有する抗ＰＤ−１抗体を含む。ある用途において、望ましくないグリコシル化部位を除去する改変は有用であり得、または抗体のオリゴ糖鎖上にフコース部位が存在しないことによって、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）機能が増強される。他の用途において、ガラクトシル化改変は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を変化させるために行われ得る。
【００３６】
本明細書で用いられる場合、用語「機能性フラグメント」は、全長抗体の機能を保持するフラグメント、例えば、抗原結合フラグメント、特に以下の抗体フラグメント、すなわち、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは、一本鎖を指す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントもしくは二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、または半減期を延長するために化学修飾されるかリポソーム中に組み入れられたあらゆるフラグメントを示すことを意図し、化学修飾は、例えばポリ（アルキレン）グリコール、例えばポリエチレングリコール（「ペグ化、ＰＥＧ化」）（ペグ化フラグメントは、Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧ、またはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれる）（「ＰＥＧ」はポリエチレングリコールである）などの付加である。
【００３７】
本発明の抗ＰＤ−１抗体をコードするＤＮＡ分子を、当業者は、ベクターにクローニングすることができ、次いで宿主細胞にトランスフォームすることができる。したがって、本発明は、本発明の抗ＰＤ−１抗体をコードするＤＮＡ分子を含む、組換えＤＮＡベクターも提供する。
【００３８】
好ましくは、組換えＤＮＡベクターは、発現ベクターであり、当業者は、抗体のＤＮＡ分子を発現ベクターにクローニングし、それを宿主細胞にトランスフォームして、誘導発現によって抗体を得ることができる。本発明の発現ベクターは、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、および／または抗ＰＤ−１抗体の定常領域をコードするＤＮＡ配列を含む。しかしながら、２つの発現ベクターを、一方が重鎖可変領域および定常領域を含み、他方が軽鎖可変領域および定常領域を含むように別々に構築してもよく、それらは一緒に哺乳動物にトランスフェクトされる。一つの好ましい実施形態において、発現ベクターは、プロモーター、および分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、ならびにスクリーニングのための少なくとも１つの薬剤耐性遺伝子をさらに含む。
【００３９】
本発明の宿主細胞は、原核生物宿主細胞、真核生物宿主細胞、またはバクテリオファージであってもよい。原核生物宿主細胞は、大腸菌、枯草菌、ストレプトマイセス属、またはプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓｅｔｃ）などであってもよい。真核生物宿主細胞は、真菌、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、トリコデルマなど、昆虫細胞、例えばアワヨトウ（Ｍｙｔｈｉｍｎａ  ｓｅｐａｒａｔｅ）など、植物細胞、例えばタバコなど、および哺乳動物細胞、例えばＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞など、であってもよい。いくつかの実施形態において、本発明の宿主細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、またはＣＯＳ細胞である。
【００４０】
本明細書で用いられる場合、用語「医薬組成物」は、少なくとも１つの薬物と、任意選択の医薬的に許容される担体または添加剤との組み合わせを指し、これらは、ある特定の目的を達するために、互いに組み合わされる。ある実施形態において、医薬組成物には、成分が全体として本発明の目的を実現する機能を果たすかぎり、時間的および／または空間的に独立した構成成分の組み合わせが含まれる。例えば、医薬組成物（例えば、本発明による抗体、核酸分子、核酸分子の組み合わせ、および／またはコンジュゲート）に含まれる成分は、全体として対象に投与してもよく、別々に対象に投与してもよい。医薬組成物に含まれる成分を別々に対象に投与する場合、前記成分は、対象に同時に投与してもよく、逐次的に投与してもよい。好ましくは、医薬的に許容される担体は、水、バッファー溶液、等張塩溶液、例えばＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、グルコース、マンニトール、デキストロース、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセロール、ヒアルロン酸、エタノール、またはポリアルキレングリコール、例えばポリプロピレングリコール、トリグリセリド、などである。医薬的に許容される担体の種類は、例えば、経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内または静脈内投与など、特定の投与経路（その投与経路のために本発明の組成物が製剤化される）に依存する。本発明の組成物は、添加物として、湿潤剤、乳化剤、または緩衝物質を含んでもよい。
【００４１】
本発明による医薬組成物は、任意の適当な経路、例えば、経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内、または静脈内投与で投与することができる。
【００４２】
関連する態様において、本発明は、抗ＰＤ−１抗体と第２の治療剤との組み合わせである医薬組成物を提供する。一実施形態において、第２の治療剤は、抗ＰＤ−１抗体と有利に組み合わされる任意の薬剤である。抗ＰＤ−１抗体と有利に組み合わされる例示的な薬剤としては、これらに限定されないが、ＰＤ−１活性を阻害する他の薬剤（他の抗体またはその抗原結合フラグメント、ペプチド阻害剤、小分子アンタゴニストなどを含む）、および／またはＰＤ−１の上流または下流シグナル伝達を妨げる薬剤があげられる。好ましくは、第２の治療剤は、抗ＣＤ３抗体である。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、用語「ＰＤ−Ｌ１陽性がんまたは感染症」は、ＰＤ−１発現の結果として生じるがんもしくは感染症、またはＰＤ−１発現の症状／特性を有するがんもしくは感染症を意図する。がんとしては、これらに限定されないが、肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、大腸がん、乳がん、神経膠腫、腎臓がん、胃がん、食道がん、口腔扁平上皮癌、頭頸部がんがあげられる。感染症としては、これらに限定されないが、ＨＩＶウイルス感染およびＢ型肝炎ウイルス感染があげられる。
【００４４】
「治療有効量」は、本明細書で用いられる場合、投与を受ける対象に利益をもたらすために十分な用量を指す。実際の投与量、ならびに投与の速度および時間的経過は、治療を受ける対象の状態および重症度に依存することになる。治療の処方（例えば、用量決定など）は、最終的には一般医および他の医師の責任であり、一般的に治療する疾患、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、および医師に知られているその他の因子を考慮した、医師の判断次第ということになる。
【００４５】
用語「対象」は、本明細書で用いられる場合、ヒトなどの哺乳動物を指すが、他の動物、例えば野生動物（例えば、サギ、コウノトリ、ツルなど）、家禽（例えば、アヒル、ガチョウなど）、または実験動物（例えば、オランウータン、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）であってもよい。
【００４６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態および態様を以下の実施例によって実証し、さらに説明するが、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００４７】
実施例１．マウス抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の作製
６〜１０週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスを、ＰＤ−１細胞外部分（２５μｇ）（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ社、Ｃａｔ  ｌｏｔ：１０３７７−Ｈ０８Ｈ）を含む、ＰＤ−１−ｍＦｃ抗原組換え融合タンパク質で皮下（ＳＣ）免疫した。マウスを、まずフロイント完全アジュバント（Ｆ５８８１、Ｓｉｇｍａ）と混合した抗原の接種により免疫し、次いでフロイント不完全アジュバント抗原（Ｆ５５０６、Ｓｉｇｍａ）と混合した抗原を皮下免疫接種した（それぞれ第１、７、１４、２８、６０、および６４日に、計６回免疫化）。免疫応答を、眼窩静脈叢からの採血によってモニターした。抗血清をＥＬＩＳＡでスクリーニングし、精製組換えＰＤ−１融合タンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ社、Ｃａｔ  ｌｏｔ：１０３７７−Ｈ０８Ｈ）をＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルでマイクロウェルプレートにコートし、４℃で終夜インキュベートした。次いで、ウェルを、２００μｌ／ウェルの、５％ウシ胎仔血清および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液でブロックした。グラジエント希釈した後、ＰＤ−１免疫化マウスの血清を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０溶液で洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ社、カタログ番号１１５−０３５−０４４）を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、プレートをＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３４０２１）で可視化し、ＯＤ４５０で検出した。力価の比較により、抗ＰＤ−１免疫グロブリンの力価が高いマウスを、ＰＤ−１特異的Ｂ細胞の単離に用いた。各マウスのＢ系列細胞を、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により、ビオチン標識化ＰＤ−１の結合に応じて分離し、全長のＩｇ重鎖（Ｈ）可変領域およびＩｇ軽（Ｌ）鎖可変領域に対応する遺伝子転写物を、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。製造者の手順に従い、増幅産物を２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）にクローニングした。得られたモノクローナル抗体の精製にはプロテインＡカラムを用い、前記抗体をＰＤ−１と結合させ、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻止する能力に関してさらに分析した。抗体の、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との結合を阻止する能力に従い、１０Ｆ８および１５Ｈ６を、ヒト化抗体のさらなる研究および開発のための候補クローンとして選択した。
【００４８】
実施例２．ヒト化モノクローナル抗ＰＤ−１レセプター抗体の重鎖可変領域配列の設計
１０Ｆ８モノクローナル抗体および１５Ｈ６モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および配列番号２で示す。免疫原性が低いヒト生殖系列フレーム配列を、ヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖の既知の配列との比較によって選択し、最終的に、ヒト生殖系列ＶＨ３−６６セグメント、未決定Ｄセグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ４セグメントが、ヒト化１０Ｆ８重鎖およびヒト化１５Ｈ６重鎖として使用できることが確認された。ヒト化１０Ｆ８（すなわち、ＢＡ０８−１）重鎖可変領域およびヒト化１５Ｈ６（すなわち、ＢＡ０８−２）重鎖可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４および配列番号５で示した。
【００４９】
【表１】
0006654186.tif 000002
【００５０】
実施例３．ヒト化モノクローナル抗ＰＤ−１レセプター抗体の軽鎖可変領域配列の設計
１０Ｆ８軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、１５Ｈ６軽鎖可変領域のアミノ酸配列は同一である（配列番号３）。免疫原性が低いヒト生殖系列フレーム配列を、ヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖の既知の配列との比較によって選択し、最終的に、ヒト生殖系列ＶＫ３−１１セグメントおよびヒト生殖系列ＪＫ４セグメントが、ヒト化１０Ｆ８軽鎖およびヒト化１５Ｈ６軽鎖として使用できることが確認された。ヒト化１０Ｆ８（ＢＡ０８−１）とヒト化１５Ｈ６（ＢＡ０８−２）が共有する軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６である。
【００５１】
【表２】
0006654186.tif 000003
【００５２】
実施例４．ヒト化抗ＰＤ−１レセプターモノクローナル抗体の発現および調製
ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域のＩｇＧ４Ｆｃフラグメント配列（Ｊ．Ｅｌｌｉｓｏｎ、Ｊ．Ｂｕｘｂａｕｍ、Ｌ  Ｈｏｏｄ−ＤＮＡ、１９８１）、および軽鎖定常領域のκフラグメント配列（Ｈｉｅｔｅｒ，Ｐ．Ａ．、Ｍａｘ，Ｅ．Ｅ．、Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｍａｉｚｅｌ，Ｊ．Ｖ．Ｊｒ．、およびＬｅｄｅｒ，Ｐ．、Ｃｅｌｌ．１９８０；２２：１９７〜２０７）は、どちらもＩＤＴ  Ｉｎｃ．社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、アイオワ州）によって合成された。本発明のベクターであるｐＢＡ−Ｈ４およびｐＢＡ−Ｃｋは、バックボーンとしてｐｃＤＮＡ３を用いて構築され、ｐＢＡ−Ｈ４（ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域ＩｇＧ４Ｆｃを含む）ベクター、およびｐＢＡ−Ｃｋ（ヒト軽鎖定常領域κフラグメントを含む）ベクターは、Ｂｉｏａｂｓ  Ｉｎｃ．社によって構築された。ｐＢＡ−Ｈ４において、ＣＭＶプロモーターをＶＨおよびＣＨのために使用し、ＰＧＫプロモーターをピューロマイシン耐性遺伝子のために使用し、一方でｐＢＡ−Ｃｋにおいて、ＣＭＶプロモーターをＶＬのために使用し、ＳＶ４０プロモーターをネオマイシン耐性遺伝子のために使用した。抗体の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域のタンパク質の配列に従い、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列を設計し、その配列を、さらに、ＣＨＯ細胞における最適発現のために最適化し、本発明のヒト化抗ＰＤ−１抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号１５（ＢＡ０８−１）および配列番号１６（ＢＡ０８−２）で示し、本発明のヒト化抗ＰＤ−１抗体の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列を、配列番号１７で示す。最適化された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡは、ＩＤＴ  Ｉｎｃ．社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、アイオワ州）によって合成された。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  ｃｌｏｎｅ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３８９１０）を使用して、ＢＡ０８−１重鎖およびＢＡ０８−２重鎖を含む合成ＤＮＡフラグメントを、Ｎｈｅ  Ｉ酵素を用いて直線化したｐＢＡ−Ｈ４ベクターに直接クローニングし、ＢＡ０８−１軽鎖およびＢＡ０８−２軽鎖を含む合成ＤＮＡフラグメントを、ＢｓｉＷＩ酵素を用いて直線化したｐＢＡ−Ｃｋベクターに直接クローニングし、次いでＤＨ５α細菌にトランスフォームし、プラスミドを抽出し、配列決定したところ、配列決定結果は設計したヒト化抗体をコードするＤＮＡ配列と一致した。ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）を、１×ＣＤ−ＣＨＯ（ＧＩＢＣＯから入手可能）、１×ＨＴ（ＧＩＢＣＯから入手可能）、８ｍＭグルタミン（ＧＩＢＣＯから入手可能）を用いて、インキュベーター中、３７℃、８％ＣＯ２で培養した。ＣＨＯ−Ｓ細胞に、トランスフェクション方法はＤＭＲＩＥ−Ｃトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した）の指示書に従い、抗体ＢＡ０８−１およびＢＡ０８−２の重鎖を含むプラスミドおよび軽鎖を含むプラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、細胞を上記の培養基で培養し、選択圧スク���ーニングのために５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯから入手可能）および１２．５μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｓｉｇｍａから入手可能）を添加した。選択圧をかけた１４日後、陽性クローンを選択し、６ウェルプレートで培養し、抗体発現量について直接ＥＬＩＳＡ法で検出した。種々の研究のために、最大の発現率を持つ陽性クローンを選択し、ラージスケールで１０日間培養し、次いで遠心分離して培養上清を集め、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥから入手可能）で精製し、ＰＢＳに透析し、０．２２μｍメンブレンでろ過した。
【００５３】
実施例５．抗体とＰＤ−１との間の結合特異性および相対的親和性
本発明の抗体のヒトＰＤ−１との相対的な結合性を、タンパク質に基づくＥＬＩＳＡ法によって決定した。簡潔に言えば、精製組換えＰＤ−１融合タンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ社、カタログ番号１０３７７−Ｈ０８Ｈ）をＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルでマイクロウェルプレートにコートし、４℃で終夜インキュベートした。 次いで、ウェルを、２００μｌ／ウェルの、５％ウシ胎仔血清および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液でブロックした。グラジエント希釈した後、本発明の抗ＰＤ−１抗体、ＭＫ３４７５（本発明者らが、本発明の発現ベクターを用いて、開示されたＭＫ３４７５配列に基づいて構築したＭＫ−３４７５アナログ対照（以下ＭＫ３４７５と略記する）であり、具体的な構築手順は本発明と同様である）、およびＩｇＧ対照を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０溶液で洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、カタログ番号１０９−０３５−０８８）を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、プレートをＴＭＢ基質（カタログ番号３４０２１、Ｐｉｅｒｃｅ）で可視化し、ＯＤ４５０で検出した。ＥＬＩＳＡ結果を図１に示す。Ｂｌｉｔｚ装置（Ｐａｌｌ  ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で測定した親和性を表３に示す。
【００５４】
本発明の抗体は、ＰＤ−１に対して、予期せぬ高い結合親和性および結合特異性を示す。
【００５５】
【表３】
0006654186.tif 000004
【００５６】
実施例６．抗ＰＤ−１抗体による、ＰＤ−Ｌ１リガンドのＰＤ−１レセプターとの結合の阻止
本発明のヒト化抗ＰＤ−１抗体を、ＰＤ−１のリガンドとの結合の阻止様式について試験した。具体的には、９６ウェルプレートを、１μｇ／ｍｌ未標識ｈＰＤ−Ｌ１／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５６−Ｂ７−１００）で、１６時間コートした。０．５μｇ／ｍｌ  ＰＤ−１タンパク質を、種々の濃度の組換え抗ＰＤ−１抗体と、３７℃で３０分間プレインキュベートし、次いで、反応のためにマイクロウェルプレートに加えた。コートしたＰＤ−Ｌ１に結合したＰＤ−１タンパク質を、マウス抗ヒトＰＤ−１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号１４−９９８９−８２１４）と複合体形成させ、さらに西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体に基づく方法で検出した。プレートを洗浄した後、プレートをＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３４０２１）で可視化し、ＯＤ４５０で検出した。図２に示すように、本発明の抗ＰＤ−１ＢＡ０８−１抗体およびＢＡ０８−２抗体は、ＰＤ−１の、リガンドであるＰＤ−Ｌ１との結合を特異的に阻止し（図２）、その阻止効果は、ＭＫ−３４７５の効果よりも著しく優れていた。よって、本発明の抗体は、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との結合に対する、驚くほど強い阻止を実現する。
【００５７】
実施例７．ＰＤ−Ｌ１によって媒介されるヒトＴ細胞活性の阻害に対する抗ＰＤ−１抗体の効果
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、フィコール法によって健常ドナーから単離した。ヒトの休止末梢血Ｔ細胞を、ＣＤ３＋  Ｔ細胞富化カラム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を通したネガティブセレクションによって得た。９６ウェルプレートを、５００ｎｇ／ｍＬ抗ＣＤ３抗体および１μｇ／ｍｌ組換えヒトＰＤ−Ｌ１／Ｆｃによって、４℃で終夜コートした。各ウェルに、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはＭＫ３４７５を１μｇ加え、３７℃で４時間インキュベートした。単離Ｔ細胞（２×１０４）のＲＭＰＩ懸濁液を加え、２日間培養した後、上清を集めた。ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの発現を、それぞれＩＬ−２ＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号８８−７０２５−８８）およびＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、使用説明書に従って検出した。図３および図４に示すように、カラムは、左から右に、ＣＤ３抗体を含まない対照、陽性対照（抗ＣＤ３抗体を単独で使用）、抗ＣＤ３抗体刺激によるＩＬ−２発現またはＩＦＮ−γ発現に対するＰＤ−Ｌ１阻害（ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＤ３抗体を添加）、ＰＤ−Ｌ１の阻害効果に対する本発明の抗体ＢＡ０８−１の拮抗作用（ＢＡ０８−１、ＰＤ−Ｌ１、および抗ＣＤ３抗体を添加）、ＰＤ−Ｌ１の阻害効果に対する本発明の抗体ＢＡ０８−２の拮抗作用（ＢＡ０８−２、ＰＤ−Ｌ１、および抗ＣＤ３抗体を添加）、およびＰＤ−Ｌ１の阻害効果に対するＭＫ３４７５の拮抗作用（ＭＫ３４７５、ＰＤ−Ｌ１、および抗ＣＤ３抗体を添加）を示す。抗ＰＤ−１ＢＡ０８−１抗体およびＢＡ０８−２抗体は、いずれも、ＣＤ３刺激Ｔ細胞のＩＬ−２産生およびＩＦＮ−γ産生に対するＰＤ−Ｌ１の阻害効果を大幅に除去し（＊＊ｐ＜０．０１）、ＭＫ−３４７５アナログよりも著しく高い免疫増強効果も有する（＊ｐ＜０．０５）。
【００５８】
実施例８．混合リンパ球反応における、サイトカイン発現に対する抗ＰＤ−１抗体の効果
エフェクターリンパ球に対する、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１経路の阻止効果を、異系混合リンパ球（ＭＬＲ）反応を用いて検出した。Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌に対する、抗ＰＤ−１ヒトモノクローナル抗体の存在または不存在による効果を確定した。ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＣＤ４＋  ネガティブセレクションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、ＰＢＭＣから精製して得た。樹状細胞を、１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−４および５００Ｕ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）存在下で７日間培養した精製単球から誘導した。各ＭＬＲ反応には、全体積２００μｌ中、１０５の精製Ｔ細胞および１０４の同種異系（アロジェネイック）樹状細胞が含まれる。ヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体を、種々の濃度で培養プレートに加え、細胞を３７℃で５日間培養した後、培養上清１００μｌを採取してサイトカイン含量を測定した。ＩＬ−２の測定は、実施例７と同じ方法で行い、図５に示すような結果が得られた。抗ＰＤ−１ＢＡ０８−１抗体およびＢＡ０８−２抗体は、Ｔ細胞活性化を著しく促進し、用量依存的にＩＬ−２発現を増大させ、これらの効果はＭＫ−３４７５よりも著しく優れていた。
【００５９】
実施例９．腫瘍細胞による活性化Ｔ細胞のＩＬ−２産生の阻害に対する、抗ＰＤ−１抗体の効果
ヒトメラノーマ細胞株Ａ２０５８およびヒト肺がん細胞株ＨＣＣ８２７由来の細胞を、ＡＴＣＣ（マナッサス、バージニア州）から購入した。組換えヒトインターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。メラノーマ細胞および肺がん細胞を、完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で８０％コンフルエントまで増殖させ、次いで、５００Ｕ／ｍＬ組換えヒトＩＦＮ−γを加えて４８時間より長く処理してＰＤ−Ｌ１発現を上方制御し、マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５７９２４）を用いてフローサイトメーターで確認した。ヒトの休止末梢血Ｔ細胞を、ＣＤ３＋  Ｔ細胞富化カラム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を通したネガティブセレクションによって得た。得られたＴ細胞を、１μｇ／ｍＬ  ＰＨＡおよび５０ｎｇ／ｍＬ  ＰＭＡで終夜処理し、次いで、１μｇ／ｍｌの組換えＰＤ−Ｌ１−Ｆｃタンパク質（コーニング社、ニューヨーク州）でプレコートした９６ウェルプレートに加え（図６中、ＰＤ−Ｌ１で示す）、または３μｇ／ｍｌの抗体（ＩｇＧ対照、本発明の抗ＰＤ−１である抗体ＢＡ０８−２もしくはＢＡ０８−１、またはＭＫ３４７５）存在下、ＩＦＮ−γ処理した腫瘍細胞に６：１（腫瘍細胞：Ｔ細胞）の比率で加えて４８時間インキュベートし（図６中、Ａ２０５８およびＨＣＣ８２７で示す）、またはさらなる処理を何もしなかった（対照、図６中、ＰＭＡ＋ＰＨＡで示す）。上清を集め、ＥＬＩＳＡでＩＬ−２発現を検出した。図６に示すように、固定化ＰＤ−Ｌ１は、活性化Ｔ細胞のＩＬ−２産生活性を阻害することができ、本発明の抗ＰＤ−１ＢＡ０８−１抗体およびＢＡ０８−２抗体は、ＰＤ−Ｌ１の阻害効果を大幅に除去する。同様に、ＩＦＮ−γで前処理した腫瘍細胞も、活性化Ｔ細胞によって媒介されるＩＬ−２発現を阻害し、この阻害効果も、本発明の抗ＰＤ−１ＢＡ０８−１抗体およびＢＡ０８−２抗体によって阻止することができ（＊ｐ＜０．０５）、本発明の抗体の効果は、ＭＫ−３４７５の効果よりも著しく優れていた。
【００６０】
実施例１０．肺がん治療に関する本発明の抗ＰＤ−１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ実験
ヒト化抗ＰＤ−１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を評価するため、実験の第１日に、組織培養から得た１×１０７個のＨＣＣ８２７ヒト肺がん細胞を６週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに皮下接種した。平均腫瘍体積が１００ｍｍ３（５５〜１５０ｍｍ３）に達する第８日に、群ごとに動物６匹で治療を開始し、全ての動物に同じバッチのヒトＰＢＭＣを腹腔内注射した。ヒトＰＢＭＣの調製方法は、上記した通りである。ＰＢＭＣは、フィコール精製法によって３時間以内に得られる。各マウスに、１×１０７個のヒトＰＢＭＣを含むＲＰＭＩ懸濁液を腹腔内注射によって接種し、その同じ日に抗体を腹腔内注射し、５ｍｇ／ｋｇの用量で、週２回、計４回投与した。マウスの腫瘍体積を、ノギスで週２回測定し、次式、体積＝（長さ×幅２）／２、を用いて計算した。図７に示すように、ヒト化抗ＰＤ−１抗体は、有効で持続的な抗腫瘍活性を示し、本発明の抗体の効果は、ＭＫ−３４７５の効果よりも著しく優れていた。対照群に対して、第３２日における本発明の抗ＰＤ−１ＢＡ０８−１抗体およびＢＡ０８−２抗体の腫瘍抑制率は、それぞれ８４．５％および７７．８％（ｐ＜０．０１）であり、これは、腫瘍抑制率が６６％（ｐ＜０．０５）であるＭＫ３４７５サンプルよりも著しく高かった。
【００６１】
実施例１１．メラノーマ治療に関する本発明の抗ＰＤ−１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ実験
６週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、２×１０６個のＡ３７５ヒトメラノーマ細胞と、組織培養から得た、前記腫瘍細胞で刺激された１×１０６個のヒトＴ細胞の両方を皮下接種した。腫瘍細胞で刺激されたヒトＴ細胞は、以下のようにして得た。すなわち、健常人の末梢血単核球からＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）でネガティブセレクションしたＴ細胞を、５０Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−２を含む１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ培養基中で２μｇマイトマイシンＣによって１６時間処理したＡ３７５ヒトメラノーマ細胞と共に、７日間共培養し、使用するために集めた。その同じ日に、群ごとに動物６匹で治療を開始し、動物に抗ＰＤ−１抗体を、３ｍｇ／ｋｇの用量で、週２回、計４回腹腔内注射した。マウスの腫瘍体積を、ノギスで週２回測定し、次式、体積＝（長さ×幅２）／２、を用いて計算した。図８に示すように、対照群に対して、第３５日における本発明の抗ＰＤ−１ＢＡ０８−１抗体およびＢＡ０８−２抗体の腫瘍抑制率は、それぞれ８２％および７２％（ｐ＜０．０１）であり、これは、腫瘍抑制率が５８％（ｐ＜０．０５）であるＭＫ３４７５サンプルよりも著しく高かった。
【００６２】
上記の好ましい実施形態は、単に本発明を実施するための本質的な特徴の組み合わせに関する例として記載されており、限定として記載されているのではない。記載されている表題は、本発明の種々の実施形態を限定することを意図するものではない。「含む」、「および」（“包含”、“含”“和”“包括”）などの用語は、限定することを意図するものではない。また、別段の定めがないかぎり、名詞は、数字で修飾されていない場合、複数も含み、「または」、「もしくは」（“或”、“或者”）は、「および／または」（“和／或”）を意味する。別段の定めがないかぎり、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解している通りの意味を有する。
【００６３】
本出願で言及する全ての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、本発明で説明される方法および構成の種々の改変および変化は、当業者に明白である。本発明は、特定の好ましい実施形態によって説明されるが、特許請求の範囲に記載される発明は、このような特定の実施形態に不適切に限定されるべきではないことが理解されるであろう。実際に、説明された本発明の様式を実施するにあたり当業者に明白な多くの変形は、添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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