(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩：
【化１】
0006654771.tif 000010
［式中：
Ｘは、−ＣＯＯＨまたはＮＨ２であり；
Ｒは、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ１０アルキレン鎖であり；かつ
Ｒ１は、Ｈ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ１０アルキル、アリール、またはＲ２ＣＯ−であり、ここで、Ｒ２は、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ１０アルキルである］。
【請求項２】
Ｘは−ＣＯＯＨである、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩。
【請求項３】
アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属、有機アミンまたはアミノ酸との、請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物の塩。
【請求項４】
ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウムまたはマグネシウムとの、請求項３に記載の式（Ｉ）の化合物の塩。
【請求項５】
ＸはＮＨ２である、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩。
【請求項６】
Ｒは直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ６アルキレン鎖である、請求項１〜５のうちいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩。
【請求項７】
Ｒ１はＨである、請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩。
【請求項８】
ナトリウム２−［３−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−９−（４−ヒドロキシアニリノ）−３，７−ジメチル−９−オキソ−ノナ−１，３，５，７−テトラエニル］−２，４，４−トリメチル−シクロヘキサ−２−エン−１−イリデン］アミノ］オキシアセテート（化合物１ａ）；
ナトリウム２−［３−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−９−（４−ヒドロキシアニリノ）−３，７−ジメチル−９−オキソ−ノナ−１，３，５，７−テトラエニル］−２，４，４−トリメチル−シクロヘキサ−２−エン−１−イリデン］アミノ］オキシブチレート（化合物１ｂ）；
ナトリウム２−［３−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−９−（４−ヒドロキシアニリノ）−３，７−ジメチル−９−オキソ−ノナ−１，３，５，７−テトラエニル］−２，４，４−トリメチル−シクロヘキサ−２−エン−１−イリデン］アミノ］オキシヘキサノエート（化合物１ｃ）
からなる群から選択される、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項９】
医薬としての使用のための、請求項１〜８のうちいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩。
【請求項１０】
抗腫瘍薬としての使用のための、請求項１〜８のうちいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩。
【請求項１１】
固形または血液系の（転移性および非転移性）腫瘍の治療における、請求項１０に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩。
【請求項１２】
乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、中皮腫および他の肉腫、神経芽腫、リンパ腫、白血病および黒色腫の治療における、請求項１１に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学上許容される塩。
【請求項１３】
請求項１〜８のうちいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物と、抗有糸分裂薬、標準的な化学療法に使用される化合物、天然もしくは合成のレチノイド類、エピジェネティック薬、または（腫瘍性もしくは非腫瘍性）標的特異的医薬からなる群から選択される１種以上の医薬との組合せ医薬。
【請求項１４】
式（Ｉ）の化合物および前記のさらなる医薬は、同時にまたは任意の順序で逐次的に投与される、請求項１３に記載の組合せ医薬。
【請求項１５】
有効成分としての請求項１〜８のうちいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の少なくとも１つ、および薬学上許容される担体および／または溶出剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−オキソ−フェンレチニド誘導体、それらを含有する処方物、ならびに癌の予防および治療における、単独でまたは他の化合物と組み合わせてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
レチノイド類は、ビタミンＡ（レチノール）の天然および合成の誘導体であり、増殖、分化およびアポトーシスなどの様々な細胞プロセスを調節する。合成レチノイドであるフェンレチニド、すなわち、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミド（４−ＨＰＲ）（非特許文献１）は、新生物発生前障害（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）および新生物性障害（非特許文献５；非特許文献６）に対して有望な結果を与えた全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）の非毒性類似体である（非特許文献７）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われた研究では、４−ＨＰＲは、増殖を阻害し、様々な組織型の腫瘍細胞株においてアポトーシスを誘導することが示され、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成およびその結果としての酸化ストレスなどの様々な機構が提案されている（非特許文献８；非特許文献９）。
【０００３】
４−オキソ−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミドまたは４−オキソ−４−ＨＰＲは、４−ＨＰＲの天然極性代謝産物であり、４−ＨＰＲ治療を受けた患者の血漿サンプル中および４−ＨＰＲ処理した癌細胞の培地中で同定された（非特許文献１０）。４−オキソ−４−ＨＰＲは、様々な癌細胞株（すなわち、神経芽腫、卵巣癌および乳癌細胞株）において抗増殖作用およびアポトーシス作用を誘発し、細胞増殖の阻害において４−ＨＰＲよりも２〜４倍効果的である。興味深いことに、４−オキソ−４−ＨＰＲはまた、４−ＨＰＲ耐性癌細胞においても効果的であり、４−ＨＰＲと組み合わせると相乗作用を示す（非特許文献１１）。分子研究では、４−オキソ−４−ＨＰＲの抗腫瘍作用は少なくとも２つの独立した作用機序によるものであることが示されている：１）４−オキソ−４−ＨＰＲは、４−ＨＰＲおよび他のレチノイド類とは異なり、チューブリン重合を阻害し、異常な紡錘体形成（すなわち、中心体複製が欠如した多極組織化）と組み合わさって有糸分裂期に著しい細胞蓄積を引き起こす。２）一方、４−ＨＰＲと同様に、４−オキソ−４−ＨＰＲは、小胞体（ＥＲ）ストレス応答、Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化および胎盤骨形成タンパク質（ＰＬＡＢ）のアップレギュレーションを含むＲＯＳ関連シグナル伝達カスケードを介してアポトーシスを引き起こす（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。
【０００４】
４−オキソ−４−ＨＰＲが少なくとも２つの無関係の機構を介して作用するこの能力は、レチノイドが親薬物よりも強力であり得ることを説明することができ、おそらく薬剤耐性の発生を妨げることを可能とした。さらに、この特有の作用様式は、４−オキソ−４−ＨＰＲが、４−ＨＰＲよりも効率的に、種々のタイプのヒト腫瘍を標的とすることを可能にし得る。加えて、４−オキソ−４−ＨＰＲと他の抗微小管薬（ビンカアルカロイドおよびタキサンなど、これらは高い毒性を有し、耐性は容易に発生する）または従来の化学療法薬との併用療法は、これらの薬剤の用量の低減、従って、それらの副作用の軽減を可能とした。
【０００５】
しかしながら、４−オキソ−４−ＨＰＲは溶解度が極めて低く、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われた実験では、極めて低い、しかも変動の大きいレチノイドの血漿濃度が見出され、結果の再現性およびその臨床使用の可能性は低い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎａｇｙ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  ５：１１−１９；１９９８年
【非特許文献２】Ｃｈｉｅｓａ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １１５：６２５−６２９；２００５年
【非特許文献３】Ｍｏｇｌｉａ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  １１０：８７−９１；１９９６年
【非特許文献４】Ｔｒａｄａｔｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４年
【非特許文献５】Ｖｅｒｏｎｅｓｉ  Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  １７：１０６−１７１；２００６年
【非特許文献６】Ｄｅ  Ｐａｌｏ  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ８６：２４−２７；２００２年
【非特許文献７】Ｖｅｒｏｎｅｓｉ  Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９１：１８４７−１８５６；１９９９年
【非特許文献８】Ｈａｉｌ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  １１：１６７７−１６９４；２００６年
【非特許文献９】Ａｐｐｉｅｒｔｏ  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３０：８２４−８３１；２００９年
【非特許文献１０】Ｖｉｌｌａｎｉ  Ｍ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：６２６５−７５；２００４年
【非特許文献１１】Ｖｉｌｌａｎｉ  Ｍ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：３２３８−４７；２００６年
【非特許文献１２】Ａｐｐｉｅｒｔｏ  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ；２６：３９５２−６２；２００７年
【非特許文献１３】Ａｐｐｉｅｒｔｏ  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３０：８２４−３１；２００９年
【非特許文献１４】Ｔｉｂｅｒｉｏ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ；５（１０）：ｅｌ３３６２；２０１０年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明による誘導体は、４−オキソ−４−ＨＰＲの細胞傷害活性および作用機序を維持しながら、生液中での高い溶解度、従って、より良好なバイオアベイラビリティを有する。
【０００８】
本発明は、下記の式（Ｉ）を有する化合物およびその薬学上許容される塩に関し
【０００９】
【化１】
0006654771.tif 000002
【００１０】
式中：
Ｘは、−ＣＯＯＨまたはＮＨ２、好ましくは、−ＣＯＯＨであり；
Ｒは、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ１０アルキレン鎖、好ましくは、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ６アルキレン鎖、より好ましくは、−ＣＨ２であり；
Ｒ１は、Ｈ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ１０アルキル、好ましくは、Ｃ１−Ｃ６、アリール、またはＲ２ＣＯ−であり、ここで、Ｒ２は、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ１０アルキル、好ましくは、Ｃ１−Ｃ６、またはアリールである。
【００１１】
「直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ１０アルキレン鎖」とは、１〜１０個の炭素原子を有する二価のアルキル鎖、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜１０の整数である）、または分枝鎖、例えば、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−などを意味する。
【００１２】
前記「アルキレン鎖」は、１つ以上の置換基、例えば、ヒドロキシル、ハロゲン、アミノなどで置換されていてよい。
【００１３】
Ｒは、好ましくは、Ｃ１−Ｃ６アルキレン直鎖、より好ましくは、−ＣＨ２−である。
【００１４】
用語「直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ１０アルキル」とは、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基を指す。
【００１５】
用語「直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ６アルキル」とは、１〜６個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシルなどを指す。
【００１６】
前記「アルキル」は、ヒドロキシル、ハロゲン、アミノなどの１つ以上の置換基で置換されていてよい。
【００１７】
用語「アリール」とは、６〜１４個の炭素原子および単一の環（フェニルなど）、または複数の環、例えば、ナフチル、フェナントレニル、ビフェニルなどを有する芳香族炭素環式基を指す。前記「アリール」は、ヒドロキシル、ハロゲン、ハロアルキル、シアノ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシなどから選択される１〜３つの置換基を有することができる。
【００１８】
Ｒ１は好ましくは、Ｈである。
【００１９】
Ｘが−ＣＯＯＨである式（Ｉ）の化合物の薬学上許容される塩は、無機塩基との塩、例えば、水酸化物ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウムもしくはマグネシウム、または適当な有機アミンもしくはアミノ酸との塩、例えば、アルギニンもしくはプロカインの塩などのいずれかである。ナトリウム塩が特に好ましい。
【００２０】
Ｘが−ＮＨ２である式（Ｉ）の化合物の薬学上許容される塩は、適当な酸、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、マレイン酸、フマル酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、酢酸またはｐ−トルエンスルホン酸との塩である。
【００２１】
好ましい化合物は以下である：
化合物１ａ：
ナトリウム２−［３−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−９−（４−ヒドロキシアニリノ）−３，７−ジメチル−９−オキソ−ノナ−１，３，５，７−テトラエニル］−２，４，４−トリメチル−シクロヘキサ−２−エン−１−イリデン］アミノ］オキシアセテート（ナトリウム４−アミノオキシアセテート−４−ＨＰＲ）；
化合物１ｂ（ＬＯＭ１０９８）：
ナトリウム２−［３−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−９−（４−ヒドロキシアニリノ）−３，７−ジメチル−９−オキソ−ノナ−１，３，５，７−テトラエニル］−２，４，４−トリメチル−シクロヘキサ−２−エン−１−イリデン］アミノ］オキシブチレートまたはブタノエート（ナトリウム４−アミノオキシブチレート−４−ＨＰＲ）；
化合物１ｃ（ＬＯＭ１１３３）：
ナトリウム２−［３−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−９−（４−ヒドロキシアニリノ）−３，７−ジメチル−９−オキソ−ノナ−１，３，５，７−テトラエニル］−２，４，４−トリメチル−シクロヘキサ−２−エン−１−イリデン］アミノ］オキシヘキサノエート（ナトリウム４−アミノオキシヘキサノエート−４−ＨＰＲ）；
【００２２】
本発明は、全ての可能な立体異性体およびそれらのラセミ混合物または光学活性混合物を含む。
【００２３】
本発明による化合物は、増殖性の高い腫瘍の治療のために特に興味深い抗有糸分裂活性を示す。さらに、本発明による化合物は、４−オキソ−４−ＨＰＲの二重作用機序を維持し、従って、薬剤耐性の腫瘍を治療するために使用することができる。
【００２４】
本発明による化合物は、種々の腫瘍に対して、具体的には、限定されるものではないが、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、中皮腫および他の肉腫、神経芽腫、リンパ腫、白血病ならびに黒色腫を含む、活発に増殖する固形および血液系の（転移性もしくは非転移性）腫瘍ならびに／または薬剤耐性腫瘍に対して抗腫瘍薬として使用することができる。
【００２５】
臨床試験では、レチノール誘導体（フェンレチニドなど）は従来の化学療法薬よりも毒性が低いことが見出されており、ナトリウム４−アミノオキシアセテート−４−ＨＰＲ塩（１ａ）を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで得られた予備データも、この化合物の毒性が重篤でないことを示していると思われる。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、本発明による化合物と、他の化合物との、例えば、他の抗有糸分裂薬（チューブリン脱重合または安定化）との、標準的な化学療法に使用される化合物（白金誘導体など）との、他のレチノイド類（特に、４−ＨＰＲ）との、エピジェネティック薬（特に、ＨＤＡＣ阻害剤）との、（腫瘍性または非腫瘍性の）特異的標的に対する薬物（ＨＥＲ２陽性乳癌に対するトラスツズマブなど）との組合せである。
【００２７】
本発明のさらなる目的は、有効成分としての式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物と、少なくとも１つの薬学上許容される担体および／または希釈剤とを含む医薬組成物である。この薬学上許容される担体または希釈剤は、推奨される投与方法および当業者に利用可能な標準的な製薬技術ノウハウに基づいて選択される。
【００２８】
本発明による組成物は、動物への投与に好適な生体適合性のある担体、例えば、生理食塩水などと、場合により、賦形剤、安定剤または希釈剤などの補助剤とを含むことができる。
【００２９】
このような医薬組成物は、好ましくは、経口投与、直腸投与、経皮投与または非経口投与用の単位用量の形態で調製される。本発明による化合物は、患者の体重、年齢および健康状態、治療の頻度および任意の付随する治療に基づいて、当業者によって決定可能な治療上有効な量で投与される。
【００３０】
他の薬剤と併用する場合、本発明による化合物は、同時にまたは任意の順序で逐次的に投与することができる。
【００３１】
ナトリウム４−アミノオキシアセテート−４−ＨＰＲ（塩１ａ）は、腫瘍細胞（固形および血液系腫瘍の両方に由来する）の増殖を阻害する十分な能力を有し、これは、卵巣癌および乳癌細胞株においてならびに腹膜中皮腫、神経芽腫およびリンパ腫の細胞において、親薬物である４−オキソ−４−ＨＰＲと同等であることを実証した（表１）。作用機序の分析は、塩１ａが、２つの独立した経路：ＲＯＳの生成（アポトーシス促進作用）および有糸分裂期での細胞周期停止（抗チューブリン活性）を活性化することによって細胞死を誘導する、４−オキソ−４−ＨＰＲの固有の特徴を保持することを示した（図１）。さらに、併用療法を用いた予備実験は、塩１ａが、種々の組織型の腫瘍細胞株において、パクリタキセル、シスプラチンおよび４−ＨＰＲとの相乗活性を有することを示している（図２）。
【００３２】
塩１ａが、親化合物よりも高い溶解度／バイオアベイラビリティを有するかどうかを確かめるために、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験をマウスモデルで行った。結果は、この塩が、親化合物よりもはるかに溶解しやすく、４−オキソ−４−ＨＰＲよりも最大６０倍高い血漿レベルに達し、変動が少ないことを示している（表２）。さらに、４−オキソ−４−ＨＰＲで処置したマウスで観察された接種部位の近位での化合物の蓄積は、この塩で処置したマウスでは見られなかった。塩１ａの血漿レベルを決定するための実験の際に、この化合物は６０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇの１日用量で投与した場合、動物に対して高い毒性を有さないことも見出された。
【００３３】
ヒト中皮腫（ＳＴＯ）、卵巣癌（ＩＧＲＯＶ−１）および乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の細胞を異種移植したマウスにおいて、塩１ａの抗腫瘍活性をｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。中皮腫細胞に対する塩１ａの活性を第１の実験で評価した：この実験は、（おそらく、対照群のマウスにおける腫瘍増殖の変動性が高いことにより）統計学的有意には達しなかったが、この化合物の活性傾向を示した（図３ａ）。卵巣モデルに関しては、６０ｍｇ／ｋｇおよび９０ｍｇ／ｋｇの用量で、塩１ａは、重篤な毒性の明らかな徴候が一切なく、ＩＧＲＯＶ−１細胞を接種したマウスの生存を有意に高めた（ｐ＜０．０１）、（図３ｂ）。最後に、乳癌モデルに関しては、重篤な毒性の明らかな徴候がなく、塩１ａの９０ｍｇ／ｋｇの用量が腫瘍増殖を減少させたことが見出された（ｐ＝０．０１）（図３ｃ）。
【００３４】
化合物１ｂ（ナトリウム４−アミノオキシブチレート−４−ＨＰＲ）および１ｃ（ナトリウム４−アミノオキシヘキサノエート−４−ＨＰＲ）(sodium 4-aminoooxyhexanoate-4-HPR)もまた、抗腫瘍活性についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験し：腫瘍増殖を阻害する両化合物の能力はナトリウム４−アミノオキシアセテート−４−ＨＰＲの能力と同様であった（表３）。
【００３５】
化合物９−［３−（２−アミノ−エトキシイミノ）−２，６，６−トリメチル−シクロヘキサ−１−エニル］−３，７−ジメチルノナ−２，４，６，８−テトラエン酸（４−ヒドロキシ−フェニル）アミド（１ｄ）もまた、抗腫瘍活性についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。卵巣癌細胞（Ａ２７８０）では、化合物１ｄは、Ｇ２−Ｍ期での周期停止と、抗増殖活性（７２時間の処理後のＩＣ５０＝０．９５４８μΜ）およびアポトーシス（ｓｕｂ−Ｇ１ピーク）活性とを誘導した。
【００３６】
Ｘが−ＣＯＯＨである本発明による化合物は、例えば、反応スキームに示されるように、化合物２（４−オキソ−４−ＨＰＲ）と、好適なアミノオキシ酸、典型的には、３ａ〜ｃ、および酢酸ナトリウムとを、エタノール水溶液などの溶媒中で反応させることにより調製することができる（文献に記載のとおりである：Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２００４年、４７、６７１６−６７２９）。このようにして得られた化合物を次に塩基の水溶液、典型的には、０．１Ｍ重炭酸ナトリウムと反応させ、水を除去した後に塩１ａ〜ｃが得られる（スキーム１）。
スキーム１：
【００３７】
【化２】
0006654771.tif 000003
【００３８】
アミノオキシ酸３ｂおよび３ｃは、それぞれスキーム２および３に報告される手順によって調製することができる。
スキーム２：
【００３９】
【化３】
0006654771.tif 000004
スキーム３
【００４０】
【化４】
0006654771.tif 000005
【００４１】
ＸがＮＨ２である式（Ｉ）の化合物は、例えば、反応スキーム４に例示されるように、化合物２（４−オキソ−４−ＨＰ）と、２−アミノエトキシアミンなどの２−アミノアルコキシアミン二塩酸塩および酢酸ナトリウムとを、エタノール水溶液などの溶媒中で反応させることにより調製することができる。
スキーム４
【００４２】
【化５】
0006654771.tif 000006
【００４３】
式（Ｉ）の全ての化合物は、試薬および出発化合物を適宜変更することによって、上記の反応スキームに従って得ることができる。出発化合物は、既知のものであるか、または当業者に公知の反応によって市販の化合物から得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、塩１ａの作用機序である。
【図２】図２ａは、塩１ａとパクリタキセル（ＰＴＸ）との併用療法の抗増殖活性である。図２ｂは、塩１ａとシスプラチン（ＤＤＰ）との併用療法の抗増殖活性である。図２ｃは、塩１ａとフェンレチニド（４−ＨＰＲ）との併用療法の抗増殖活性である。
【図３】図３ａは、中皮腫細胞（ＳＴＯ）における塩１ａのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性である。図３ｂは、卵巣癌細胞（ＩＧＲＯＶ−１）における塩１ａのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性である。図３ｃは、乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）における塩１ａのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００４５】
実施例１−化合物１ａの調製：
５０％ＥｔＯＨ水溶液中、ＮＨ２ＯＣＨ２ＣＯＯＨ・１／２ＨＣｌ（３ａ、４１０ｍｇ、３．７５ミリモル）およびＣＨ３ＣＯＯＮａ（１６６ｍｇ、２．３９ミリモル）の溶液１７ｍＬを、ＥｔＯＨ（１１ｍＬ）中、化合物２（４−オキソ−４−ＨＰＲ、７００ｍｇ、１．７３ミリモル）の懸濁液に加えた。この反応物を室温で２４時間、撹拌下で維持した。その後、溶媒を低圧で除去し、残渣を冷Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）で希釈し、粉砕し、最後に、真空下で濾過した。７３９ｍｇ（１．５４ミリモル）の化合物４ａ（４−（カルボキシメトキシイミノ）フェンレチニド）を得た。収率：８９％。
【００４６】
融点：１２１．８℃
【００４７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ：７．４３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；７，０８（１Ｈ，ｓ）；６．９９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．６０；１４．６Ｈｚ）；６．８２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；６．４４−６．１６（４Ｈ，ｍ）；５．８２（１Ｈ，ｓ）；５．３２（２Ｈ，ｓ）；２．７２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）；２．４４（３Ｈ，ｓ）；２．０４（３Ｈ，ｓ）；１．９１（３Ｈ，ｓ）；１．６５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４）；１，１２（６Ｈ．ｓ）。
【００４８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ：９．７８（１Ｈ，ｓ）；９．１６（１Ｈ，ｂｓ）；７．４２（２Ｈ，Ｊ＝８．２４Ｈｚ）；７．０５−６．８９（１Ｈ，ｍ）；６．６８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２４）；６．４７−６．２４（４Ｈ，ｍ）；６．００（１Ｈ，ｓ）；４．５７（２Ｈ，ｓ）；２．６７−２．５５（２Ｈ，ｍ）；２．３３（３Ｈ，ｓ）；２．００（３Ｈ，ｓ）；１．８２（３Ｈ，ｓ）；１．８２（３Ｈ，ｓ）；１．６３−１．４９（２Ｈ，ｍ）；１，０７（６Ｈ，ｓ）。
【００４９】
１５．４ｍＬの０．１Ｎ  ＮａＨＣＯ３溶液を、１０ｍＬのＨ２Ｏ中、４ａ（７３９ｍｇ、１．５４ミリモル）の懸濁液に加えた。この反応物を約２２時間撹拌下に置いた。その後、溶媒を低圧で除去した。７６０ｍｇ（１．５２ミリモル）の化合物１ａを得た。収率：９９％
【００５０】
融点：１８８．６℃（熱分解を伴う）
【００５１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ：９．８（１Ｈ，ｓ）；９．３８（１Ｈ，ｂｓ）；７．４２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；６．９７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．３；１１．６０Ｈｚ）；６．６８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；６．４４−６．２４（４Ｈ，ｍ）；６．０１（１Ｈ，ｓ）；４．１２（２Ｈ，ｓ）；２．６１−２．５３（２Ｈ，ｍ）；２．３２（３Ｈ，ｓ）；２．００（３Ｈ，ｓ）；１．８２（３Ｈ，ｓ）；１．５８−１．４７（２Ｈ，ｍ）；１．０５（６Ｈ，ｓ）。
【実施例２】
【００５２】
実施例２−化合物１ｂの調製：
５０％ＥｔＯＨ水溶液中、３ｂ（１７ｍｇ、０．１１ミリモル）およびＣＨ３ＣＯＯＮａ（５ｍｇ、０．０７ミリモル）の溶液０．５ｍＬを、ＥｔＯＨ（０．５ｍＬ）中、化合物２（２０ｍｇ、０．０５ミリモル）の懸濁液に加えた。この反応物を室温で２４時間、撹拌下で維持した。溶媒を低圧で除去し、残渣を酢酸エチルで溶解し、溶液をＨ２Ｏで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。次いで、粗生成物を、ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ  ９５：５での分取クロマトグラフィーにより精製した。２０ｍｇ（０．０４ミリモル）の
化合物４ｂを得た。
【００５３】
（４−（カルボキシプロポキシイミノ）フェンレチニド）（黄色ガラス状物）。収率：８０％
【００５４】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ：７．３９（２Ｈ，ｍ）；７．１２（１Ｈ，ｓ）；６．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．６，１４．４）；６．７８（２Ｈ，ｍ）；６．３７−６．１４（４Ｈ，ｍ）；５．８０（１Ｈ，ｓ）；４．１８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０）  ２．６０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６）；２．５０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３）；２．４１（３Ｈ，ｓ）；２．０７−１．９７（２Ｈ，ｍ）；２．０２（３Ｈ，ｓ）；１．９０（３Ｈ，ｓ）；１．８９−１．７６（２Ｈ，ｍ）；１．０７（６Ｈ，ｓ）。
【００５５】
２８０μＬの０．１Ｎ  ＮａＨＣＯ３溶液を、０．５ｍＬのＨ２Ｏ中、４ｂ（１８ｍｇ、０．０３５ミリモル）の懸濁液に加えた。この反応物を約２０時間撹拌下に置いた。その後、溶媒を低圧で除去した。１５ｍｇ（０．０２８ミリモル）の化合物１ｂ（４−（カルボキシプロポキシイミノ）フェンレチニドナトリウム塩）を得た。収率：８１％。
【００５６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ：９．８０（１Ｈ，ｓ）；７．４０（２Ｈ，ｍ）；６．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．４，１４．４）；６−６６（２Ｈ，ｍ）；６．４２−６．２４（４Ｈ，ｍ）；５．９９（１Ｈ，ｓ）；３．９７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５）；２．３１（３Ｈ，ｓ）；１．９８（３Ｈ，ｓ）；１．９２−１．７９（２Ｈ，ｍ）；１．８３（３Ｈ，ｓ）；１．７９−１．６３（２Ｈ，ｍ）；１．５１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２）；１．０４（６Ｈ，ｓ）。
【００５７】
化合物３ｂ（４−アミノオキシ酪酸塩酸塩）の調製：
エチル４−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロイソインドール−２−イルオキシ）ブチレート。
Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（１．１１ｇ、６．６４ミリモル）およびＫ２ＣＯ３（１．８４ｇ、１３．２８ミリモル）を、無水ＤＭＦ（６．５ｍＬ）中、４−ブロモ酪酸エチル（１ｍＬ、６．６４ミリモル）の溶液に加えた。この溶液を室温で一晩撹拌下に置いた。溶媒を蒸発させた後、反応混合物を酢酸エチルで溶解し、ＮａＣｌ飽和溶液で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。生成物をイソプロパノールから結晶化させた（１．６７ｇ）。収率：９１％。
【００５８】
融点：４８．５℃
【００５９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ：７．８６（４Ｈ，ｍ）；４．１６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４）；４．０７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０）；２．５３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３）；１．９７−１．８４（２Ｈ，ｍ）；１−１９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０）。
【００６０】
４−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロイソインドール−２−イルオキシ）酪酸。
エタノール（５．８ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５．８ｍＬ）中、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（０．８ｇ、１９．１ミリモル）の溶液を、ＴＨＦ（１８ｍＬ）中、４−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロイソインドール−２−イルオキシ）−酪酸エチル（１．６５ｇ、５．９７ミリモル）の溶液に加え、この溶液を室温で一晩反応させた。溶媒を蒸発させた後、６Ｎ  ＨＣｌ溶液（６ｍＬ）を加え、粗生成物を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相をＮａＣｌ飽和溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その後、生成物を酢酸エチルから結晶化させた。１．１ｇの生成物を得た。収率：７４％。
【００６１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ：１１．２５（１Ｈ，ｂｓ）；７．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０）；７．６５−７．４８（２Ｈ，ｍ）；７．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３）；３．８９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３）；２．４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３）；１．８９−１．７４（２Ｈ，ｍ）。
【００６２】
４−アミノオキシ−酪酸塩酸塩。３Ｎ  ＨＣｌ溶液（２ｍＬ）中、４−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イルオキシルオキシ）−酪酸（４００ｍｇ、１．６１ミリモル）の懸濁液を２時間加熱還流した。このフタル酸を濾過し、濾液を蒸発させ、生成物をメタノールから結晶化させた。生成物３ｂを１６６ｍｇ得た。収率：６６％。
【００６３】
融点：１４０℃
【００６４】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ：１０．８９（３Ｈ，ｂｓ）；４．００（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４）；２．３１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３）；１．８８−１．７３（２Ｈ，ｍ）。
【００６５】
参照文献：Ｃｙｃｌｉｃ  ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅｓ，  ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｙ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ［ｌ，２］ｏｘａｚｉｎａｎ−３−ｏｎｅｓ、Ｗｏｌｆｅ、Ｓａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、８１（８）、９３７−９６０；２００３年；Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｘａｚｉｎｏｎｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、Ｗｏｌｆｅ、Ｓａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＣＴ国際出願、第２００３０１８５６５号、２００３年３月６日。
【実施例３】
【００６６】
実施例３−化合物１ｃの調製：
５０％ＥｔＯＨ水溶液中、３ｃ（２７ｍｇ、０．１５ミリモル）およびＣＨ３ＣＯＯＮａ（７ｍｇ、０．１ミリモル）の溶液０．６５ｍＬを、ＥｔＯＨ（０．５６ｍＬ）中、化合物２（３０ｍｇ、０．０７ミリモル）の懸濁液に加えた。この反応物を室温で２４時間撹拌下に置いた。溶媒を低圧で除去し、残渣を酢酸エチルで溶解し、溶液をＨ２Ｏで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた、次いで、粗生成物を、ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ  ９５：５での分取クロマトグラフィーにより精製した。１６ｍｇ（０．０３ミリモル）の化合物４ｃ（４−（カルボキシペントキシイミノ）フェンレチニド）を得た。収率：４３％
【００６７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ：７．４１（２Ｈ，ｍ）；７．１４（１Ｈ，ｓ）；７．０７−６．９０（１Ｈ，ｍ）；６．８０（２Ｈ，ｍ）；６．４１−６．１３（４Ｈ，ｍ）；５．８２（１Ｈ，ｓ）；４．１２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１）；２．６２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４）；２．４９−２．３（２Ｈ，ｍ）；２．４３（３Ｈ，ｓ）；２．０３（３Ｈ，ｓ）；１．９２（３Ｈ，ｓ）；１．８２−１．４０（８Ｈ，ｍ）；１．０９（６Ｈ，ｓ）。
【００６８】
２８０μＬの０．１Ｎ  ＮａＨＣＯ３溶液を、０．５ｍＬのＨ２Ｏ中、化合物４ｃ（１５ｍｇ、０．０２８ミリモル）の懸濁液に加えた。こｍの反応物を約２０時間撹拌下に置いた。その後、溶媒を低圧で除去した。１１ｍｇ（０．０２ミリモル）の化合物１ｃを得た。収率：７１％。
【００６９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ：９．８４（１Ｈ，ｓ）；７．４０（２Ｈ，ｍ）；７．０２−６．８６（１Ｈ，ｍ）；６．６６（２Ｈ，ｍ）；６．４４−６．２３（４Ｈ，ｍ）；６．００（１Ｈ，ｓ）；３．９８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０）；２．３１（３Ｈ，ｓ）；２．１１−２．０３（２Ｈ，ｍ）；１．９８（３Ｈ，ｓ）；１．８３（３Ｈ，ｓ）；１．８３（３Ｈ，ｓ）；１．８８−１．７４（２Ｈ，ｍ）；１．６４−１．３４（２Ｈ，ｍ）；１．３２−１．１７（２Ｈ，ｍ）  １．０３（６Ｈ，ｓ）。
【００７０】
化合物２ｃ（６−アミノオキシヘキサン酸）の調製：
６−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イルオキシ）−ヘキサン酸。  Ｎ−ヒドロキシ−フタルイミド（２．４４ｇ、１５ミリモル）およびトリエチルアミン（６．３ｍｌ、４５ミリモル）を、無水ＤＭＦ（３０ｍＬ）中、６−ブロモヘキサン酸（３ｇ、１５ミリモル）の溶液に加えた。この溶液を周囲温度で４８時間、撹拌下に置いた。生成した沈殿物を濾過し、溶媒を蒸発させた後、粗生成物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０でヘキサン：アセトン：エチルエーテルの３：１：１混合物を用いて精製した。２．２ｇの生成物を得た。収率：５３％。
【００７１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ：７．９５−７．６８（４Ｈ，ｍ）；４．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４）；２．４３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０）；１．９３−１．６８（４Ｈ，ｍ）；１．６７−１．５１（２Ｈ，ｍ）。
【００７２】
６−アミノオキシ−ヘキサン酸。  ３Ｎ  ＨＣｌ溶液（２ｍＬ）中、６−（１、３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イルオキシ）−ヘキサン酸（１２０ｍｇ、０．４３ミリモル）の懸濁液を３時間加熱還流した。沈殿を濾去し、水を蒸発させ、メタノールから生成物を結晶化させた。生成物３ｂを６６ｍｇ得た。収率：８４％。
【００７３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ：１０．８８（３Ｈ，ｂｓ）；３．９５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３）；２．１８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３）；１．６２−１．４１（４Ｈ，ｍ）；１．３６−１．２０（２Ｈ，ｍ）。
【実施例４】
【００７４】
実施例４−化合物１ｄの調製：
エタノール（５００μＬ）中、化合物２（２３ｍｇ、０．０５ミリモル(mmoli)）の懸濁液を、５０％エタノール水溶液（５００μＬ）中、２−アミノエトキシアミン二塩酸塩（１６ｍｇ、０．１１ミリモル）および無水酢酸ナトリウム（６ｍｇ、０．０７ミリモル）の溶液で処理した。得られた混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ  ９：１での分取ＲＰ−１８クロマトグラフィーにより精製し、１８ｍｇの化合物１ｄを得た。収率：７６％。融点１３４℃。
【００７５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＨ３ＯＨ−ｄ４）  δ：７．３７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．３，１４．６），６．７４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５），６．４８−６．２０（４Ｈ，ｍ），５．９９（１Ｈ，ｓ），４．３３−４．２５（２Ｈ，ｍ），３．２８−３．２２（２Ｈ，ｍ），２．７０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４１Ｈｚ），２．３７（３Ｈ，ｓ），２．０４（ｓ，３Ｈ），１．９１（３Ｈ，ｓ），１．６２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４）。
【実施例５】
【００７６】
実施例５−薬理学的実験
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
種々の腫瘍細胞株に対する様々な化合物１ａ〜ｃの（単独療法および併用療法の両方の）抗増殖活性を、７２時間の処理後にスルホローダミンＢアッセイにより評価し、単独療法については、増殖を５０％阻害することができる用量（ＩＣ５０）を算出し（結果は表１および表３にまとめる）、併用療法については、相乗作用／拮抗作用屈折率としてケルン指数（Ｋｅｒｎ  Ｉｎｄｅｘ）（ＫＩ）を決定した（結果は図２に示している）。
【００７７】
作用機序の評価に関しては、５−（および−６）−クロロメチル−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ）プローブの使用による５時間の処理後にＲＯＳの生成を判定し、一方で、プロピジウムヨージド染色によって細胞周期を評価した。両方の場合において、細胞蛍光分析（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＦＡＣＳ）を行った。
【００７８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
塩１ａの血漿レベルを評価するために、４−オキソ−４−ＨＰＲ（１２０ｍｇ／ｋｇ）および塩１ａ（ナトリウム４−アミノオキシアセテート−４−ＨＰＲ）（６０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ）を、ヌードマウスに連続４日間（１日１回）ｉ．ｐ．投与し、最後の投与から５時間後にＨＰＬＣにより血漿レベルを評価した（結果は表２にまとめる）。
【００７９】
中皮腫に関しては、マウスにＳＴＯ細胞をｓ．ｃ．接種し、腫瘍細胞接種から１日後に塩１ａでの処置を開始した（用量：ｉ．ｐ．で３０ｍｇ／ｋｇおよび６０ｍｇ／ｋｇ；５日／週で４週間）。対照マウスは、塩を溶解するのに使用したものと同じ溶媒で処置した。動物を週２回検査し、それらの体重および毒性の徴候を調べた。様々な群（対照群および処置群）における腫瘍増殖を評価し、それらの差を統計的に分析した（結果は図３ａに示す）。
【００８０】
卵巣モデルでは、ヌードマウスにＩＧＲＯＶ−１細胞をｉ．ｐ．接種し、腫瘍細胞接種から１日後に塩１ａでの処置を開始した（用量：ｉ．ｐ．で３０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇおよび９０ｍｇ／ｋｇ；５日／週で４週間）。対照マウスは、塩を溶解するのに使用したものと同じ溶媒で処置した。動物を週２回検査し、それらの体重および毒性の徴候を調べた。様々な群（対照群および処置群）の生存時間を評価し、それらの差を統計的に分析した。実験は二反復で行い、同等の結果を得た（結果は図３ｂに示す）。
【００８１】
乳癌モデルに関しては、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）をＮＯＤ／ＳＣＩＤ−γマウスの乳房脂肪体に接種し、腫瘍細胞接種から１週間後に塩１ａでの処置を開始した（用量：９０ｍｇ／ｋｇ；４日／週で５週間）。動物を週２回検査し、それらの体重および毒性の徴候を調べた。様々な群（対照群および処置群）における腫瘍増殖を評価し、それらの差を統計的に分析した。実験は二反復で行い、同等の結果を得た（結果は図３ｃに示す）。
【００８２】
【表１】
0006654771.tif 000007
【００８３】
【表２】
0006654771.tif 000008
４−オキソ−４−ＨＰＲ：５％ＤＭＳＯ、５％クレモフォール、Ｈ２Ｏ。
塩１ａ：５％ＤＭＳＯ、Ｈ２Ｏ。
【００８４】
【表３】
0006654771.tif 000009
【図１】
0006654771.tif 000011
【図２】
0006654771.tif 000012
【図３】
0006654771.tif 000013