(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトフューリンをコードする第１のヌクレオチド配列とヒト第Ｘ因子をコードする第２のヌクレオチド配列とを含む形質転換細胞であって、
前記形質転換細胞は、機能的フューリン及びヒト第Ｘ因子を発現し、培養液上清に分泌しており、
前記フューリンは、３６〜７８時間の培養後、前記培養液上清において５０Ｕ／ｍＬ〜３００Ｕ／ｍＬの濃度で分泌され、少なくとも８５％のヒト第Ｘ因子が完全に処理される、形質転換細胞。
【請求項２】
前記機能的フューリンは、前記培養液上清において６０Ｕ／ｍＬ〜３００Ｕ／ｍＬの濃度で分泌される、請求項１に記載の形質転換細胞。
【請求項３】
前記形質転換細胞により産生される少なくとも９０％の前記第Ｘ因子が完全に処理される、請求項２に記載の形質転換細胞。
【請求項４】
前記機能的フューリンは、前記培養液上清において９０Ｕ／ｍＬ〜３００Ｕ／ｍＬの濃度で分泌される、請求項１に記載の形質転換細胞。
【請求項５】
前記形質転換細胞により産生される少なくとも９５％の前記第Ｘ因子が完全に処理される、請求項４に記載の形質転換細胞。
【請求項６】
前記細胞が、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞、霊長類腎臓細胞、線維芽細胞、およびマウス骨髄腫細胞からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の形質転換細胞。
【請求項７】
ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）をコードする、外因性のヌクレオチド配列を更に含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の形質転換細胞。
【請求項８】
形質転換細胞を産生する方法であって、
哺乳動物タンパク質の発現に適した細胞に、前記細胞によるヒトフューリンの発現に適応する第１の発現ベクター、および前記細胞による第Ｘ因子の発現に適応する第２のベクターでトランスエフェクトすることと、ここで前記第１の発現ベクターはヒトフューリンをコードするヌクレオチド配列を含み、前記第２の発現ベクターは第Ｘ因子をコードするヌクレオチド配列を含んでおり、
前記第１および第２の発現ベクターをトランスフェクトされ、３６〜７８時間の培養後、培養液上清において５０Ｕ／ｍＬ〜３００Ｕ／ｍＬの濃度で機能的ヒトフューリンを発現し、分泌する、少なくとも８５％の第Ｘ因子が完全に処理される細胞を選択することと、
を含む、方法。
【請求項９】
前記選択することが、前記第１および第２の発現ベクターをトランスフェクトされ、４２〜７２時間の培養後、培養液上清において５０Ｕ／ｍＬ〜３００Ｕ／ｍＬの濃度で機能的ヒトフューリンを発現し、分泌する細胞を選択することによって実施される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の発現ベクターおよび／または前記第２の発現ベクターが非ウイルスの発現ベクターである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の発現ベクターおよび／または前記第２の発現ベクターがウイルスの発現ベクターである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞は、前記第１の発現ベクターおよび前記第２の発現ベクターをほぼ同時にトランスフェクトされる、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞は、前記第１の発現ベクターをトランスフェクトされ、前記第２の発現ベクターを前記細胞にトランスフェクトする前に、フューリンを安定したレベルで分泌する細胞が得られるか、または
前記細胞は、前記第２の発現ベクターをトランスフェクトされ、前記第１の発現ベクターを前記細胞にトランスフェクトする前に、タンパク質を安定したレベルで分泌する細胞が得られる、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞、霊長類腎臓細胞、線維芽細胞、およびマウス骨髄腫細胞からなる群から選択される、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）をコードする、ヌクレオチド配列を含む第３の発現ベクターで細胞にトランスフェクトすることを更に含む、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
成熟型で完全に処理された第Ｘ因子を産生する方法であって、
請求項１〜７のいずれか１項に記載される形質転換細胞を培養して、成熟型で完全に処理された第Ｘ因子を産生することと、
培養上清から第Ｘ因子を単離することと、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
フューリンの存在下での、完全に処理され、活性のある組み換え第Ｘ因子の発現のための、発現系、形質転換細胞、およびそれに関連する方法が、本明細書に開示される。
【背景技術】
【０００２】
ヒト凝固第Ｘ因子（ＦＸ）、活性化ＦＸ（ＦＸａ）、およびその変異体は、血友病およびヴォン・ヴィレブランド病を含むがこれらに限定されない血液凝固疾患において治療薬として使用される。ＦＸ、ビタミンＫ依存セリンプロテアーゼは、それに続く、血流への、また、組み換え発現の場合は培地への産生細胞による分泌前に、ゴルジ体における細胞内タンパク質分解フューリン切断を伴う、小胞体における単鎖前駆体タンパク質として合成される。ＦＸにおける３つのフューリン切断部位は、適正なＦＸタンパク質分解処理によるものである。成熟形態のＦＸは、前駆体タンパク質の切断後に形成される重鎖および軽鎖で構成されるジスルフィド結合の２本鎖の分子である。さらに、分子の修飾としては、軽鎖のγ−カルボキシル化と、重鎖に付加する活性化ペプチドのＮ−結合型およびＯ−結合型グリコシル化とを含む。
【０００３】
ＦＸ以外に、さらに、一致する認識部位Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号４）に関連するビタミンＫ依存凝固因子は、塩基性アミノ酸残基対の切断酵素（ＰＡＣＥ）としても知られる、偏在的に発現するエンドプロテアーゼ、フューリンの基質である。凝固カスケードの組換えタンパク質の適切なタンパク質分解処理は、高収率の発現における細胞内の処理の制限に因り、細胞培養発現系において損なわれる。組換え哺乳動物細胞において高い発現率で不十分なタンパク質分解処理を呈する、ヴォン・ヴィレブランド因子および凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）同様、低産生ＣＨＯ細胞クローンにおけるＦＸの分泌は、ＦＸが完全に処理される一方、高産生クローンが、正確に処理されたＦＸ重鎖種と、軽鎖種とに加え、未処理の単鎖ＦＸと、複数の未処理の形態のＦＸ軽鎖とを含むことを特徴とする。未処理のＦＸ軽鎖の種類および程度は、細胞密度などの異なる細胞培養条件下の個別の細胞クローンの間で異なる。内在性フューリンのタンパク質分解の仕組みを援助するため、さらなるｉｎ  ｖｉｖｏでのフューリンの同時発現または細胞培養後のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフューリンのインキュベーションが必要とされ、完全なタンパク質切断を促進する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
フューリンの同時発現は、高収率での完全に処理されたＦＸの発現に欠かすことのできないものである。しかし、現在まで、処理された完全なＦＸを細胞培養系において高い割合で保証するであろう閾値レベルのフューリンは、報告されていない。高レベルのフューリンには毒性があり、したがって、ＦＸを産生する哺乳動物の発現系によるフューリンの発現レベルは、依然として１００％のＦＸ前駆体タンパク質を潜在的に処理する毒性のあるレベルと、低すぎるレベルとの間で均衡を保たなければならず、結果として、処理されたＦＸが最適以下で産生する健常な細胞培養物となる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
同一の細胞株において、フューリンと、ヒト第Ｘ因子（ＦＸ）とを発現し、それにより、培養物における生存率を維持しつつ、完全に処理され、完全に活性化されたＦＸを生成するために重要な培養液上清におけるフューリン濃度を提供するための系が本明細書に開示される。
【０００６】
そのため、ヒトフューリンをコードするヌクレオチド配列を含み、機能的フューリンを発現し、培養液上清に分泌するような形質転換細胞であって、機能的フューリンは、約３６時間乃至約７８時間の培養後、培養液上清において約５０Ｕ／ｍＬ〜約３００Ｕ／ｍＬの濃度で分泌される形質転換細胞が本明細書に開示される。一実施形態において、形質転換細胞は、フューリンにより切断可能で、Ａｒｇ−（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）−Ａｒｇモチーフを呈するタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。別の実施形態において、ヒトフューリンをコードするヌクレオチド配列と、タンパク質をコードするヌクレオチド配列とは、異なる発現ベクターにある。別の実施形態において、ヒトフューリンをコードするヌクレオチド配列と、タンパク質をコードするヌクレオチド配列とは、同一の発現ベクターにある。
【０００７】
哺乳動物タンパク質発現に適した細胞株と、細胞株によるヒトフューリンの発現に適応した第１の発現ベクターであって、ヒトフューリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクターと、細胞株によるタンパク質の発現に適応した第２の発現ベクターであって、フューリンにより切断可能で、Ａｒｇ−（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）−Ａｒｇモチーフを呈するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターとを含む真核生物タンパク質の発現系であって、細胞株は、約３６時間乃至約７８時間の培養後、約５０Ｕ／ｍＬ〜約３００Ｕ／ｍＬの濃度で培養液上清に機能的フューリンを分泌することが可能である真核生物タンパク質の発現系も提供される。
【０００８】
哺乳動物タンパク質の発現に適した細胞株と、ヒトフューリンと、フューリンにより切断可能で、Ａｒｇ−（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）−Ａｒｇモチーフを呈するタンパク質の細胞株による発現に適応した第１発現ベクターとを含む真核生物タンパク質の発現系であって、第１の発現ベクターは、ヒトフューリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、フューリンにより切断可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含み、細胞株は、約３６時間乃至約７８時間の培養後、約５０Ｕ／ｍＬ〜約３００Ｕ／ｍＬの濃度で培養液上清に機能的フューリンを分泌することが可能である、真核生物タンパク質の発現系も提供される。一実施形態において、ヒトフューリンをコードするヌクレオチド配列と、タンパク質をコードするヌクレオチド配列とは、異なる発現ベクターにある。別の実施形態において、ヒトフューリンをコードするヌクレオチド配列と、タンパク質をコードするヌクレオチド配列とは、同一の発現ベクターにある。
【０００９】
ヒトフューリンをコードする第１のヌクレオチド配列と、ヒトＦＸをコードする第２のヌクレオチド配列とを含み、機能的フューリンおよびＦＸを発現し、培養液上清に分泌するような形質転換細胞であって、フューリンは、約３６時間乃至約７８時間の培養後、培養液上清において約５０Ｕ／ｍＬ〜約３００Ｕ／ｍＬの濃度で分泌され、少なくとも８５％のＦＸは、完全に処理される形質転換細胞も提供される。一実施形態において、ヒトフューリンをコードするヌクレオチド配列と、ＦＸをコードするヌクレオチド配列とは、異なる発現ベクターにある。別の実施形態において、ヒトフューリンをコードするヌクレオチド配列と、ＦＸをコードするヌクレオチド配列とは、同一の発現ベクターにある。
【００１０】
哺乳動物タンパク質の発現に適した細胞株と、細胞株によるヒトフューリンの発現に適応した第１の発現ベクターであって、ヒトフューリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクターと、細胞株によるＦＸの発現に適応した第２の発現ベクターであって、ＦＸをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターとを含む真核生物タンパク質の発現系であって、細胞株は、約３６時間乃至約７８時間の培養後、約５０Ｕ／ｍＬ〜約３００Ｕ／ｍＬの濃度で培養液上清に機能的フューリンを分泌することが可能である真核生物タンパク質の発現系も提供される。
【００１１】
哺乳動物タンパク質の発現に適した細胞株と、ヒトフューリンおよびＦＸの発現に適応した第１の発現ベクターとを含む真核生物タンパク質の発現系であって、第１の発現ベクターは、ヒトフューリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、ＦＸをコードするヌクレオチド配列とを含み、細胞株は、約３６時間乃至約７８時間の培養後、約５０Ｕ／ｍＬ〜約３００Ｕ／ｍＬの濃度で培養液上清に機能的フューリンを分泌することが可能である真核生物タンパク質の発現系がさらに提供される。
【００１２】
細胞株によるヒトフューリンの発現に適応し、ヒトフューリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクターを哺乳動物タンパク質の発現に適した細胞株にトランスフェクトすることと、細胞株によるタンパク質の発現に適応し、Ａｒｇ−（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）−Ａｒｇモチーフを呈するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターを細胞株にトランスフェクトすることとを含む組換えタンパク質を調製する方法であって、第１および第２の発現ベクターをトランスフェクトされる細胞株は、約４０乃至約８０時間または約３６乃至約７８時間の培養後、培養液上清において約５０Ｕ／ｍＬ〜約３００Ｕ／ｍＬの濃度で機能的ヒトフューリンを発現し、分泌する組換えタンパク質を調製する方法も提供される。一実施形態において、細胞株は、第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターをほぼ同時にトランスフェクトされる。別の実施形態において、細胞株は、第１の発現ベクターをトランスフェクトされ、第２の発現ベクターを細胞株にトランスフェクトする前に、フューリンを安定したレベルで分泌する細胞が得られる。さらに別の実施形態において、細胞株は、第２の発現ベクターでトランスフェクトされ、第１の発現ベクターを細胞株にトランスフェクトする前に、タンパク質を安定したレベルで分泌する細胞が得られる。
【００１３】
一実施形態において、タンパク質は、ヴォン・ヴィレブランド因子、第ＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、またはプロテインＺである。別の実施形態において、タンパク質は、第Ｘ因子である。
【００１４】
細胞株によるヒトフューリンの発現に適応し、ヒトフューリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、第１の発現ベクターを哺乳動物タンパク質の発現に適した細胞株にトランスフェクトすることと、細胞株によるＦＸの発現に適応し、ＦＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターを細胞株にトランスフェクトすることとを含む組換えタンパク質を調製する方法であって、第１および第２の発現ベクターをトランスフェクトされる細胞株は、約３６時間乃至約７８時間の培養後、培養液上清において約５０Ｕ／ｍＬ〜約３００Ｕ／ｍＬの濃度で機能的フューリンを発現し、分泌する組換えタンパク質を調製する方法も提供される。一実施形態において、細胞株は、第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターをほぼ同時にトランスフェクトされる組換えタンパク質を調製する方法も提供される。別の実施形態において、細胞株は、第１の発現ベクターをトランスフェクトされ、第２の発現ベクターを細胞株にトランスフェクトする前に、フューリンを安定したレベルで分泌する細胞が得られる。さらに別の実施形態において、細胞株は、第２の発現ベクターでトランスフェクトされ、第１の発現ベクターを細胞株にトランスフェクトする前に、タンパク質を安定したレベルで分泌する細胞が得られる。
【００１５】
別の実施形態において、細胞は、約３６時間乃至約７８時間の培養後、少なくとも約５０〜約６０Ｕ／ｍＬの濃度で培養液上清に機能的フューリンを分泌することが可能であり、少なくとも９０％のＦＸが完全に処理される。別の実施形態において、細胞は、約３６時間乃至約７８時間の培養後、少なくとも約９０〜約１００Ｕ／ｍＬの濃度で培養液上清に機能的フューリンを分泌することが可能であり、少なくとも９５％のＦＸが完全に処理される。
【００１６】
本明細書に開示される形質転換細胞により産生される組換えＦＸも提供される。
【００１７】
本明細書に開示される発現系により産生される組換えＦＸがさらに提供される。
【００１８】
本明細書に開示される方法により産生される組換えＦＸも提供される。
【００１９】
約３６時間乃至約７８時間の培養後、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約３００Ｕ／ｍＬの濃度で培養液上清にフューリンを分泌することに適応した組換えＦＸのための発現系も提供される。
【００２０】
約３６時間乃至約７８時間の培養後、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約３００Ｕ／ｍＬの濃度で培養液上清にフューリンを分泌する発現系を含む、成熟型の、完全に処理されたＦＸを産生する方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】ＲＣＬ．０１２−７４．ｐＤ３Ｈ−Ｆｕｒｉｎの発現ベクターを図示する。
【図１Ｂ】ベクターのヌクレオチド配列（配列番号１）を図示する。ヒトフューリン配列に下線を付し、開始コドンおよび終止コドンに二重下線を付す。
【図２】ヒトフューリンのヌクレオチド配列（配列番号２）を図示する。開始コドンおよび終止コドンに二重下線を付す。
【図３】ヒトフューリンのアミノ酸配列（配列番号３）を図示する。
【図４】培養物において、完全に処理された第Ｘ因子（ＦＸ）の程度を図示する。還元条件下で、ポリクローナル抗ＦＸ抗体で染色したウエスタンブロットのＦＸデンシトメトリーによる定量が実施された。クローン（クローン番号４２〜５２）は、未処理のＦＸ単鎖（ボックス１、５、９など）、ＦＸ重鎖（ボックス２、６、１０など）、未処理のプロペプチド含有ＦＸ軽鎖（ボックス３、７、１１など）、および処理されたＦＸ軽鎖（ボックス４、８、１２など）を含み、画素強度が異なる最大４種のＦＸを呈する。バックグラウンド除去のため、ボックス４５〜４８の画素強度を測定した。
【図５】培養物における分泌フューリン濃度および完全に処理されたＦＸ／総ＦＸの割合を図示する。用量反応の関係は、細胞培養液上清における分泌フューリンの濃度（フューリン活性アッセイを用いて測定される）と、完全に処理されたＦＸ／総ＦＸの％（ウエスタンブロットにおける各バンドのデンシトメトリーによる定量により測定される）との間に現れる。
【図６】フューリンの用量および完全に処理されたＦＸの分析を図示する。細胞特異的なもの（暗線）と集団平均（明線）とを有するデータ（円）は、Ｅｍａｘモデルを用いたフューリン濃度の関数として完全に処置されたＦＸ／総ＦＸ（％）を予測した。
【図７Ａ】Ｅｍａｘモデル検証試験の反応量の残差対予測される反応量を図示する。データ点は、ゼロの周囲に対称的に点在し、系統的な傾向を示さない。
【図７Ｂ】Ｅｍａｘモデル検証試験の残差の正規Ｑ−Ｑプロットを図示し、データ点は、同一線の周囲に点在しており、誤差が正規分布するという仮定が有効であることを示す。
【図７Ｃ】Ｅｍａｘモデル検証試験の反応の残差対細胞株を図示し、データ点は、ゼロの周囲に対称的に点在し、系統的な傾向を示さない。
【図７Ｄ】Ｅｍａｘモデル検証試験の相互にプロットされた実測値と予測値を図示し、データ点は同一線の周囲に対称的に点在しており、データの良好な適合を示す。
【図８】ＦＸの処理の程度がフューリン濃度とは独立しているという仮説を試験するためのヌルモデルを図示する。データ（円）および処理されたＦＸがフューリン濃度から独立していることのみを仮定する、切片で適合されたヌルモデル（細胞特異的なものおよび集団平均は、それぞれ暗線および明線として据えられる）。
【図９】用量反応曲線および収率９０％および９５％の処理されたＦＸに対する算出されたフューリンの最小濃度を図示する。フューリン濃度が、適合するモデルの数値最適化により得られる９０％および９５％の完全に処理されたＦＸ／総ＦＸをもたらすことと共に、フューリン濃度の関数として、完全に処理されたＦＸ／総ＦＸ（％）の集団平均（黒線）が予測される。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
組換えタンパク質を産生するための、形質転換細胞、真核生物発現系、および方法、ならびにその方法により作製される組換えタンパク質が本明細書に提供され、それらはすべて、同一の細胞株におけるフューリンおよび第Ｘ因子（ＦＸ）の発現を目的とし、それにより、培養物の生存率を維持しつつ、完全に処理され成熟型のＦＸの生成のために重要な、培養液上清におけるフューリン濃度を提供する。
【００２３】
組換えタンパク質の産生のための、形質転換細胞、真核生物発現系、および方法に共通することは、一貫したレベルで組換えフューリンを産生する宿主細胞の能力である。フューリンは、前駆体タンパク質の形態から成熟型で完全に処理された形態まで、ＦＸを含む、特定の哺乳動物タンパク質の切断に必須である。発現系の培養液上清におけるフューリンの濃度が低いと、プロペプチド含有形態および他の処理されない形態または部分的に処理された形態のタンパク質が蓄積することとなる。高過ぎるフューリンの濃度は、宿主細胞の増殖を損ない、最終的に細胞死となる。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「フューリン」は、一致する認識部位Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇの切断が可能な任意のフューリン断片はもちろん、完全長のフューリンを含む。活性のあるトランケート形態のフューリンは、当技術分野において既知であり、本開示における使用に適し、適したフューリン断片の非限定例は、米国特許第６，２１０，９２６号およびＰｒｅｉｎｉｎｇｅｒら（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０：１−１５，１９９９）で知ることができ、共にトランケート形態の組換えフューリンについてのそれらの開示内容すべてに関し、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２５】
本開示の範囲内にあるものとして、本明細書に開示されるフューリンおよび第Ｘ因子タンパク質の変異体もある。例えば、タンパク質またはペプチドの一次配列が変わるが、その機能は本来変わらない、保存性が高いアミノ酸の変更が行われてもよい。保存性の高いアミノ酸置換は、通常、グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンの群内での置換を含む。
【００２６】
対象への投与後半減期が増加している融合タンパク質もしくは他の修飾体、またはＦＸをも含まれる。そのような例は、免疫グロブリンのＦｃドメイン、アルブミンドメイン、延長（ｅｘｔｅｎｄｅｄ、ＸＴＥＮ）組換えポリペプチド（ＸＴＥＮポリペプチドについてのその開示内容すべてに関し、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６７３，８６０号参照）、ポリＧｌｕもしくはポリＡｓｐ配列、トランスフェリン、またはＦＸ配列に付加したＰＡＳ（Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ）含有ポリペプチドとの融合物であろう。
【００２７】
修飾体（一次配列は本来変わらない）は、例えば、アセチル化またはカルボキシル化などポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの化学的誘導体形成を含む。グリコシル化の修飾体、例えば、その合成および処理またはそのさらなる処理工程中にポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することにより、例えば、グリコシル化に作用する酵素、例えば、哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル化酵素にポリペプチドを晒すことにより、作製されるものをも含まれる。リン酸化したアミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニンを有する配列をも包含される。タンパク質は、水溶性の生体適合性ポリマー、例えば、ポリエチレンギコール（ｇｙｃｏｌ）、ポリシアル酸、またはヒドロキシエチルスターチを用いて精製後化学的に修飾されてもよい。
【００２８】
タンパク質分解への耐性を向上させるため、または溶解特性を最適化するような一般的な分子生物学的技術を使用して修飾されているポリペプチドをも含まれる。そのようなポリペプチドの類似物としては、Ｄアミノ酸または非自然発生の合成アミノ酸などの自然発生のＬアミノ酸以外の残基を含有するものを含む。本発明のペプチドは、本明細書に列挙される特有の例示的な処理のうちいずれかの産生物に限定されない。
【００２９】
本明細書における開示は、全体として、フューリンにより翻訳後に処理される、少なくとも１つの組換え哺乳動物タンパク質（組換えフューリンを要する哺乳動物タンパク質）を産生するための、系、形質転換細胞、発現ベクター、および方法を目的とする。哺乳動物タンパク質は、ヴォン・ヴィレブランド因子、第ＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、またはプロテインＺのうち１つまたは複数である。別の実施形態において、タンパク質は、ＦＸである。
【００３０】
培養液上清におけるフューリンの濃度は、所定期間の培養後に培養物の生存率を維持しつつ、成熟型で完全に処理されたタンパク質の産生に最適な範囲内にあることを目標とする。そのため、成熟型で完全に処理された哺乳動物タンパク質の産生のための培養液上清におけるフューリンの有用な濃度は、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約４００Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約３５０Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約３００Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約２５０Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約２００Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約１７５Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約１５０Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約１２５Ｕ／ｍＬ、または約５０Ｕ／ｍＬ乃至約１００Ｕ／ｍＬである。一実施形態において、培養液上清におけるフューリンの濃度は、５０Ｕ／ｍＬ以上である。
【００３１】
他の実施形態において、所定期間の培養後の成熟型で完全に処理された哺乳動物タンパク質の産生のための培養液上清におけるフューリンの有用な濃度は、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約６０Ｕ／ｍＬ、約５５Ｕ／ｍＬ乃至約６５Ｕ／ｍＬ、約６０Ｕ／ｍＬ乃至約７０Ｕ／ｍＬ、約６５Ｕ／ｍＬ乃至約７５Ｕ／ｍＬ、約７０Ｕ／ｍＬ乃至約８０Ｕ／ｍＬ、約７５Ｕ／ｍＬ乃至約８５Ｕ／ｍＬ、約８０Ｕ／ｍＬ乃至約９０Ｕ／ｍＬ、約８５Ｕ／ｍＬ乃至約９５Ｕ／ｍＬ、約９０Ｕ／ｍＬ乃至約９５Ｕ／ｍＬ、約９５Ｕ／ｍＬ乃至約１０５Ｕ／ｍＬ、約１００Ｕ／ｍＬ乃至約１１０Ｕ／ｍＬ、約１１５Ｕ／ｍＬ乃至約１２５Ｕ／ｍＬ、約１２０Ｕ／ｍＬ乃至約１３０Ｕ／ｍＬ、約１２５Ｕ／ｍＬ乃至約１３５Ｕ／ｍＬ、約１３０Ｕ／ｍＬ乃至約１４０Ｕ／ｍＬ、約１３５Ｕ／ｍＬ乃至約１４５Ｕ／ｍＬ、約１４０Ｕ／ｍＬ乃至約１５０Ｕ／ｍＬ、約１４５Ｕ／ｍＬ乃至約１５５Ｕ／ｍＬ、約１５０Ｕ／ｍＬ乃至約１６０Ｕ／ｍＬ、約１５５Ｕ／ｍＬ乃至約１６５Ｕ／ｍＬ、約１６０Ｕ／ｍＬ乃至約１７０Ｕ／ｍＬ、約１６５Ｕ／ｍＬ乃至約１７５Ｕ／ｍＬ、約１７０Ｕ／ｍＬ乃至約１８０Ｕ／ｍＬ、約１７５Ｕ／ｍＬ乃至約１８５Ｕ／ｍＬ、約１８０Ｕ／ｍＬ乃至約１９０Ｕ／ｍＬ、約１８５Ｕ／ｍＬ乃至約１９５Ｕ／ｍＬ、または約１９０Ｕ／ｍＬ乃至約２００Ｕ／ｍＬである。別の実施形態において、所定期間の培養後の成熟型で完全に処理された哺乳動物タンパク質の産生のための培養液上清におけるフューリンの有用な濃度は、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約６０Ｕ／ｍＬまたは約５７Ｕ／ｍＬである。別の実施形態において、成熟型で完全に処理された哺乳動物タンパク質の産生のための培養液上清におけるフューリンの有用な濃度は、約９０Ｕ／ｍＬ乃至約１００Ｕ／ｍＬまたは約９６Ｕ／ｍＬである。
【００３２】
他の実施形態において、所定期間の培養後の成熟型で完全に処理された哺乳動物タンパク質の産生のための培養液上清におけるフューリンの有用な濃度は、約４００Ｕ／ｍＬ未満、約３７５Ｕ／ｍＬ未満、約３５０Ｕ／ｍＬ未満、約３２５Ｕ／ｍＬ未満、約３００Ｕ／ｍＬ未満、約２７５Ｕ／ｍＬ未満、約２５０Ｕ／ｍＬ未満、約２２５Ｕ／ｍＬ未満、約２００Ｕ／ｍＬ未満、約１７５Ｕ／ｍＬ未満、約１５０Ｕ／ｍＬ未満、約１２５Ｕ／ｍＬ未満、または約１００Ｕ／ｍＬ未満である。
【００３３】
他の実施形態において、所定期間の培養後の成熟型で完全に処理された哺乳動物タンパク質の産生のための培養液上清におけるフューリンの有用な濃度は、約５０Ｕ／ｍＬ超、約６０Ｕ／ｍＬ超、約７０Ｕ／ｍＬ超、約８０Ｕ／ｍＬ超、約９０Ｕ／ｍＬ超、約１００Ｕ／ｍＬ超、約１１０Ｕ／ｍＬ超、約１２０Ｕ／ｍＬ超、約１３０Ｕ／ｍＬ超、約１４０Ｕ／ｍＬ超、約１５０Ｕ／ｍＬ超、約１６０Ｕ／ｍＬ超、約１７０Ｕ／ｍＬ超、約１８０Ｕ／ｍＬ超、約１９０Ｕ／ｍＬ超、または約２００Ｕ／ｍＬである。
【００３４】
本開示の適用上、本明細書に開示される培養液上清におけるフューリンのレベルは、培養開始後約１２時間〜約９６時間（約１２時間〜約９６時間の培養後）の期間内に生成されるもので、この期間中に培養液上清に蓄積するフューリンのレベルを反映するものである。他の実施形態において、培養液上清におけるフューリンは、培養開始後または指示された期間の培養後、約１８時間〜約９０時間、約２４時間〜約８４時間、約３０時間〜約７８時間、約３６〜約７２時間、約４０時間〜約８０時間、約４２時間〜約６８時間、または約４８時間〜約７２時間以内に、所望のレベルに達する。
【００３５】
あるいは、本明細書に開示される培養液上清におけるフューリンのレベルは、１日あたりの培養液上清の容量あたりの細胞量で、分泌されるフューリンの濃度として表現される。非限定例において、フューリンの濃度は、Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙで表現される。他の実施形態において、成熟型で完全に処理された哺乳動物タンパク質の産生のための培養液上清におけるフューリンの有用な濃度は、約２０Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ乃至約７５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ、約２５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ乃至約７５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ、約３０Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ乃至約７５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ、約３５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ乃至約７５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ、約４０Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ乃至約７５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ、約４５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ乃至約７５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ、約５０Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ乃至約７５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ、約５５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ乃至約７５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ、約６０Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ乃至約７５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ、約２０Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ乃至約７０Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ、約２０Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ乃至約６５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ、約２０Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ乃至約６０Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ、約２０Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ乃至約５５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ、約２５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ乃至約５５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ、約２５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ乃至約５０Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ、約２５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ乃至約４５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ、または約２５Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ乃至約４０Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙである。
【００３６】
培養液上清におけるフューリンの濃度は、少なくとも約７５％の哺乳動物前駆体タンパク質を成熟型機能的タンパク質に処理するのに十分である。タンパク質は、前駆体タンパク質として翻訳され、少なくとも一部はフューリンの作用によって、成熟形態に処理される任意のタンパク質である。一実施形態において、タンパク質は、ＦＸである。他の実施形態において、フューリン濃度は、少なくとも約８０％の哺乳動物ＦＸ前駆体タンパク質を成熟型機能的ＦＸタンパク質に処理する、少なくとも約８２％の哺乳動物ＦＸ前駆体タンパク質を成熟型機能的ＦＸタンパク質に処理する、少なくとも約８４％の哺乳動物ＦＸ前駆体タンパク質を成熟型機能的ＦＸタンパク質に処理する、少なくとも約８６％の哺乳動物ＦＸ前駆体タンパク質を成熟型機能的ＦＸタンパク質に処理する、少なくとも約８８％の哺乳動物ＦＸ前駆体タンパク質を成熟型機能的ＦＸタンパク質に処理する、少なくとも約９０％の哺乳動物ＦＸ前駆体タンパク質を成熟型機能的ＦＸタンパク質に処理する、少なくとも約９２％の哺乳動物ＦＸ前駆体タンパク質を成熟型機能的ＦＸタンパク質に処理する、少なくとも約９３％の哺乳動物ＦＸ前駆体タンパク質を成熟型機能的ＦＸタンパク質に処理する、少なくとも約９４％の哺乳動物ＦＸ前駆体タンパク質を成熟型機能的ＦＸタンパク質に処理する、少なくとも約９５％の哺乳動物ＦＸ前駆体タンパク質を成熟型機能的ＦＸタンパク質に処理する、少なくとも約９６％の哺乳動物ＦＸ前駆体タンパク質を成熟型機能的ＦＸタンパク質に処理する、少なくとも約９７％の哺乳動物ＦＸ前駆体タンパク質を成熟型機能的ＦＸタンパク質に処理する、少なくとも約９８％の哺乳動物ＦＸ前駆体タンパク質を成熟型機能的ＦＸタンパク質に処理する、少なくとも約９９％の哺乳動物ＦＸ前駆体タンパク質を成熟型機能的ＦＸタンパク質に処理する、または１００％の哺乳動物ＦＸ前駆体タンパク質を成熟型機能的ＦＸタンパク質に処理するのに十分である。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「前駆体タンパク質」は、不活性で、切断、場合によっては、合成後の細胞における翻訳後の他の修飾により活性型に変化する前駆体タンパク質を指す。
【００３８】
そのため、フューリンと、ＦＸなどの哺乳動物タンパク質の両方の分泌に適応した形質転換細胞が本明細書に提供される。形質転換細胞は、細胞が内在性フューリンを産生するかどうかに関わらず、哺乳動物タンパク質の分泌に適した任意の真核細胞であってもよい。形質転換細胞の生成に適した細胞株は、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞、霊長類腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３）、線維芽細胞（例えば、マウス線維芽細胞）、およびマウス骨髄腫細胞（例えば、ＮＳＯ−ＧＳ）を含むがこれらに限定されない。適した細胞株は、哺乳動物タンパク質を高レベルで発現可能であり、翻訳後の修飾、例えば、グリコシル化、ジスルフィド結合の形成、リン酸化、およびγ−カルボキシル化が可能である。宿主細胞を選択し培養するための、およびポリペプチドを発現するよう宿主細胞を誘導するための方法は、当業者にとって一般的に既知である。
【００３９】
哺乳動物タンパク質の産生に適した細胞と、少なくとも１つの哺乳動物タンパク質の発現に適応した少なくとも１つの発現ベクターとを含む発現系も本明細書に開示される。真核生物の発現ベクターは、一般的に、哺乳動物細胞における発現に利用できる。フューリンおよびＦＸなどの哺乳動物タンパク質を本明細書に開示される方法に従い発現することを可能とするため、タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、発現ベクターによるトランスフェクション、形質転換、または感染によって、真核生物の細胞に取り入れられ、それにより、ポリペプチドを発現する。フューリンおよび／または哺乳動物タンパク質の発現は、一過的または安定的のいずれかであればよい。フューリンおよび哺乳動物のヌクレオチド配列は、プラスミドとして、またはウイルスのもしくは非ウイルスの発現ベクターの一部として存在する。具体的には、適したウイルスベクターは、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、アデノ随伴ウイルス、複製可能なレンチウイルス（ＲＣＬ）、およびヘルペスウイルスを含むがこれらに限定されない。ウイルス性の真核生物の発現ベクターの非限定例としては、Ｒｃ／ＣＭＶ、Ｒｃ／ＲＳＶ、ＲＣＬ、およびＳＶ４０ベクターを含む。例示的な非ウイルス性の真核生物の発現ベクターは、ビロゾーム、リポソーム、カチオン性脂質、プラスミド、およびポリリジン抱合ＤＮＡを含むがこれらに限定されない。例示的なプラスミド発現ベクターは、ｐＳＬＸ、ｐｃＤＮＡ、および当業者にとって既知な他のものを含むがこれらに限定されない。
【００４０】
別の実施形態において、フューリンをコードするヌクレオチド配列、ＦＸをコードするヌクレオチド配列など哺乳動物タンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む発現ベクターが本明細書に開示される。一実施形態において、単一の発現ベクターがフューリンおよびタンパク質の両配列を発現させる。別の実施形態において、異なる発現ベクターがフューリンの配列およびタンパク質の配列を発現させる。一実施形態において、同一の発現ベクターがフューリンとタンパク質のヌクレオチド配列を発現させる場合、フューリンとタンパク質のヌクレオチド配列は、配列内リボソーム進入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ、ＩＲＥＳ）により任意に分離される。１つまたは複数のプロモーターが遺伝子を発現させることができる。さらに、各タンパク質のためにコードされるヌクレオチド配列は、プラスミドにおいて反対の方向に向きを合わせるまたは同一方向に向きを合わせることができる。発現ベクターは、当業者であればわかるように、哺乳動物タンパク質の効率的な産生のため、選択可能要素および他の調節配列をさらに含む。
【００４１】
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅの使用により、フューリンおよび他の哺乳動物タンパク質の発現を可能にする発現ベクターも本明細書に開示される。
【００４２】
異なる発現ベクターがフューリンおよび哺乳動物のタンパク質を発現させる場合、そのとき、ベクターにより形質転換される細胞を選択できるよう、発現ベクターは、異なる選択マーカーを有する。選択されたそのような細胞は、そのとき、単離され、増殖し、モノクローナルな培養物となってもよい。
【００４３】
真核生物の細胞における恒常的な、調節可能な、組織に特異的な、細胞型に特異的な、細胞周期に特異的なまたは代謝に特異的な発現を可能にするプロモーターは、例えば、哺乳動物の細胞における発現に適する。調節可能な要素は、プロモーター、アクチベーター配列、エンハンサー、サイレンサーおよび／またはリプレッサー配列である。真核生物における恒常的発現を可能にする調節可能な要素の例としては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより認識されるプロモーターまたはウイルス性プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたは、例えばＭＭＴＶ（マウス乳癌ウイルス）に由来する長い末端反復（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ、ＬＴＲ）のプロモーター、ならびに、例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、熱ショックプロモーター、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する他のウイルス性プロモーターおよびアクチベーター配列がある。真核生物における誘導発現を可能にする調節可能な要素の例としては、適切なリプレッサーと組み合わせるテトラサイクリンオペレーターがある。フューリンおよび哺乳動物タンパク質のヌクレオチド配列の発現も、組織に特異的なまたはタンパク質に特異的なプロモーターの制御の下で行うことができる。タンパク質に特異的なプロモーターの非限定の例としては、ＦＸ遺伝子プロモーターまたはフューリン遺伝子プロモーターがある。
【００４４】
特定の実施形態において、細胞は、フューリンおよび哺乳動物タンパク質に加え、別のタンパク質により形質転換される。一実施形態において、追加されるタンパク質は、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）である。特定の実施形態において、フューリンおよび哺乳動物タンパク質のうち一方または両方と同一の発現ベクターが追加されるタンパク質を発現させるか、または異なる発現ベクターが追加されるタンパク質を発現させる。
【００４５】
宿主細胞と、フューリンおよび少なくとも１つの追加される哺乳動物タンパク質、例えばＦＸを発現することに適応した１つまたは複数の発現ベクターとを含む発現系も本明細書に開示される。
【００４６】
ＦＸなど完全に処理された組換えフューリンを要する哺乳動物タンパク質を産生する方法も本明細書に開示される。一実施形態において、組換えフューリンを産生する安定的細胞株が産生され、その後、少なくとも１つのフューリンを要する哺乳動物タンパク質のためのヌクレオチド配列を含有する発現ベクターによりトランスフェクトされる。組換えフューリンを産生する安定的細胞株を樹立し、必要に応じて少なくとも１つのフューリンを要する哺乳動物タンパク質のためのヌクレオチド配列を含有する発現ベクターによるトランスフェクションのために保存してもよい。あるいは、フューリンのため、およびＦＸなどフューリンを要する哺乳動物タンパク質のための発現ベクターは、それぞれ、約３０分、約６０分、約２時間、約６時間、約１２時間、または約２４時間以内で宿主細胞にトランスフェクトされてもよい。別の実施形態において、２つまたはそれ以上の発現ベクターがほぼ同時に宿主細胞にトランスフェクトされる。本開示の適用上、ほぼ同時とは、１時間以下の任意の時間間隔を指す。
【００４７】
形質転換細胞は、形質転換細胞の安定的プールを産生するよう、発現ベクター（複数可）に存在する選択マーカーに応じて選択され、その後、プールは、任意に収率が安定的クローンにクローン化される。安定的クローンは、培養開始して約３６〜約７８時間、約３６〜約７２時間、約４０時間〜約７８時間、約４２時間〜約６８時間、もしくは約４８時間〜約７２時間後に、または指示された期間の培養後に培養液上清において約５０Ｕ／ｍＬ乃至約３００Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約４００Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約３５０Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約３００Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約２５０Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約２００Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約１７５Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約１５０Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約１２５Ｕ／ｍＬ、または約５０Ｕ／ｍＬ乃至約１００Ｕ／ｍＬのフューリンを産生する。さらに、安定的クローンは、形質転換細胞により産生される、ＦＸなどの全ての組換えタンパク質のうち、８０％超の、ＦＸなど完全に処理され活性型の組換え哺乳動物タンパク質を産する。
【００４８】
約３６〜約７８時間の培養後、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約３００Ｕ／ｍＬの蓄積濃度で培養液上清にフューリンを分泌する、組換えフューリンおよび組換えＦＸのための発現系も本明細書に開示される。
【００４９】
約３６〜約７８時間の培養後、約５０Ｕ／ｍＬ乃至約３００Ｕ／ｍＬの蓄積濃度で培養液上清にフューリンを分泌する発現系の使用を含む、成熟型で、完全に処理されたＦＸを産生する方法も本明細書に開示される。
【００５０】
特許請求の範囲に記載の方法により産生される組換え哺乳動物タンパク質および任意の完全に処理された哺乳動物組換えＦＸも本明細書に包含される。
【００５１】
実施例
実施例１  所定のレベルのフューリンによる完全に処理され完全に活性型の組換え第Ｘ因子の産生
【００５２】
ＦＸの発現のため、ヒトコドン最適化ＦＸまたはヒトコドン最適化ＦＸおよびヒトコドン最適化ビタミンＫエポキシドレダクターゼの両方（ＦＸ／ＶＫＯＲ）のいずれかを含有し、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により分離される哺乳動物発現プラスミドｐＳＬＸを使用した。チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）−ＳおよびＣＨＯ−ＤＧ４４発現系のための構成物は、ジェネティシンの選択およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）の選択をそれぞれ含んだ。フューリンの発現のため、選択マーカーとしてのハイグロマイシンと組み合わせて、ヒトの完全長のフューリンを含有する哺乳動物発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１を使用した（図１Ａ）。
【００５３】
最初に、ＣＨＯ由来の細胞株（ＣＨＯ−ＳおよびＣＨＯ  ＤＧ４４）をＦＸまたはＦＸ／ＶＫＯＲ構成物でトランスフェクトし、安定的プールを生成し、その後、プールにサブクローニングを施し、安定的クローンを生成した。トランスフェクションおよびサブクローニングの第２ラウンドにおいて、選択された数のＦＸまたはＦＸ／ＶＫＯＲを発現するクローンをそれぞれフューリンでスーパートランスフェクトし、ＦＸ／フューリンまたはＦＸ／ＶＫＯＲ／フューリンを発現する安定的プールおよび安定的クローンとなった。
【００５４】
組換えＦＸを産生する安定的ＣＨＯ−ＳおよびＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株を、動物成分不含培地にて、シェーカーフラスコで約４２〜約７２時間、０．３×１０６または０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの開始細胞数で増殖させた。ＰｏｗｅｒＣＨＯ（登録商標）−ＣＤ培地（Ｌｏｎｚａ  ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）で、４ｍＭのグルタミン、５００μｇ／ｍＬのジェネティシン、５００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン、および５μｇ／ｍＬのビタミンＫ１を補い、ＣＨＯ−Ｓ細胞を維持した。ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）−ＣＤ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、６ｍＭのグルタミン、５００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）、および５μｇ／ｍＬのビタミンＫ１を補い、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を維持した。
【００５５】
収集した細胞培養液上清を還元条件下のウエスタンブロッティングにより分析し、ポリクローナルなヤギ抗ヒトＦＸまたはポリクローナルなヒツジ抗ヒトＦＸ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用して組換えヒトＦＸの量を測定した。ウエスタンブロットの濃度測定分析は、重鎖ＦＸ（ＨＣ）および軽鎖ＦＸ（ＬＣ）といった正確に処理されたＦＸ種と、単鎖ＦＸ（ＳＣ）およびプロペプチド含有軽鎖ＦＸ（ＰＰ−ＬＣ）といった不適切に切断されたＦＸ種の異なる種の定量化を可能にした。
【００５６】
ＦＸの定量化のため、細胞培養液上清をＥＬＩＳＡにより分析し、ＦＸ濃度を測定し、アクチベーターとしてラッセルヘビ毒（Ｒｕｓｓｅｌｌ’ｓ  ｖｉｐｅｒ  ｖｅｎｏｍ、ＲＶＶ）を使用して、ＦＸａクロモジェニックアッセイにより分析し、活性型ＦＸの濃度を測定した。これらアッセイを、血漿由来のＦＸ（Ｈｙｐｈｅｎ  Ｂｉｏｍｅｄ）を使用して較正した。活性型ＦＸの濃度を総ＦＸの濃度で割り、１００を掛けることにより、比活性を％で出した。フューリンの定量化のため、活性型フューリンをフューリン標準物質（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に対して較正したフューリン蛍光発生アッセイで測定した。
【００５７】
統計分析のため、完全に処理されたＦＸ／総ＦＸ（％）をＣＨＯ−ＤＧ４４トランスフェクションプール（Ａ）、ＣＨＯ−Ｓトランスフェクションプール（Ｂ）、およびＣＨＯ−Ｓ単細胞由来のクローン（Ｃ）におけるＥｍａｘモデルを使用してフューリン濃度の関数としてモデル化した。このモデルを容量反応調査の統計学的評価に使用する。Ｅｍａｘモデルは、４つのパラメーター（Ｅ０、Ｅｍａｘ、ＥＤ５０、およびｎ）を使用し、
【数１】
0006793114.tif 000002
（式中、ｙは、完全に処理されたＦＸ／総ＦＸを指し、ｘは、フューリン濃度を指す）のようなフューリンの関数としてＦＸをモデル化する。パラメーターＥ０は、フューリン濃度がゼロのときの反応に対応する基準効果を指し、Ｅｍａｘは、フューリン濃度に起因する最大効果を指し、ＥＤ５０は、Ｅｍａｘの半分を産生するフューリン濃度を指し、パラメーターｎは、曲線の峻度を決める傾き（ヒル係数）を表す。
【００５８】
フューリンが莫大に大きな濃度に近づく場合に、完全に処理されたＦＸ／総ＦＸが１００％に近づくことに鑑み、Ｅｍａｘモデルを
【数２】
0006793114.tif 000003
のような、推定される３つのパラメーターを用いた関数に修正した。
【００５９】
３つの異なる細胞株間の変動性を考慮して、非線形混合効果モデルを使用し、パラメーターＥ０およびｎを異なる細胞株間で変えることを可能とし、また、これら２つのパラメーターをランダム効果としてモデル化することにより、このモデルをデータに適合させた。
【００６０】
モデル診断を行い、適用されるモデルを確認した。尤度比検定を使用したヌルモデルとの適合Ｅｍａｘモデルの比較を行い、フューリン濃度に応じた総ＦＸ中の完全に処理されたＦＸの割合を推定する、Ｅｍａｘモデルのための統計学的証拠を求めた。
【００６１】
結果
ＣＨＯ−ＤＧ４４トランスフェクションプール（Ａ）、ＣＨＯ−Ｓトランスフェクションプール（Ｂ）、およびＣＨＯ−Ｓ単細胞由来のクローン（Ｃ）を含む、ヒトＦＸのためのＣＨＯに基づく異種発現系を基準として使用し、異なるトランスフェクション方針に続く、ヒトＦＸ処理におけるフューリン発現の効果を調査した。クローン同様、トランスフェクションプールは、さらに、調査に影響のないＶＫＯＲを発現した。
【００６２】
培養２〜３日のインキュベーション期間後、細胞培養液上清に、還元条件下でのウエスタンブロット解析、フューリン活性アッセイ、ＥＬＩＳＡ、およびＲＶＶアッセイを含む一連の分析を施した（表１）。平均して、ＦＸを産生するＣＨＯプールおよびクローンは、５０％を超え、部分的に１００％に達するＦＸ比活性を見せた（表１）。ウエスタンブロット解析は、完全に処理されたプロペプチド不含ＦＸ軽鎖およびＦＸ重鎖以外に、２つの不完全に処理された形態のＦＸ（すなわち、プロペプチド含有ＦＸ軽鎖およびＦＸ単鎖）により示されるように、組換えＦＸが異なる程度に不適切にも処理されたことを示した（図４）。それら４種のＦＸの濃度測定分析により、完全に処理されたＦＸの割合、すなわち、総ＦＸに対するＦＸ軽鎖＋ＦＸ重鎖は、細胞培養液上清において、３０％乃至おおよそ１００％の範囲にわたった（表１、図４）。さらに、欠損した活性化ペプチドの大きさだけ短縮された重鎖バンドとして見えるであろう事前の活性化は観察されなかった。分泌フューリンの濃度が処理されたＦＸの程度に影響を及ぼすかどうかも、それら２つのパラメーターをプロットすることにより評価された（図５）。図５に示すように、ＦＸの部分的のみの処理は、低濃度（＜２０Ｕ／ｍＬ）の分泌フューリンで利用可能である一方、高レベルの分泌フューリンは、より処理されたＦＸと相関する。
【表１】
0006793114.tif 000004
0006793114.tif 000005
0006793114.tif 000006
【００６３】
ＦＸ処理におけるフューリンの影響を理解するため、およびデータの統計学的裏付けを得るために、総ＦＸ中の完全に処理されたＦＸ（％）を細胞株Ａ、Ｂ、およびＣにおけるＥｍａｘモデルを使用して    、フューリン濃度の関数としてモデル化した（図６）。モデルのデータへの良好な適合を示す４つのモデル診断用プロットを図７Ａ〜図７Ｄに提供した。尤度比検定を使用したヌルモデルとの適合Ｅｍａｘモデルの比較は、ｐ値＜０．０００１、となり、より高いフューリン濃度に応じて、総ＦＸ中の完全に処理されたＦＸの割合が高いことへの統計学的証拠を提供し（図８）、再度、データの妥当性を提供した。統計学的分析に基づき、細胞培養培地において、総ＦＸ中の完全に処理されたＦＸが９０％以上または９５％以上となるＦＸと共に検出されるような産生細胞株により産生される、推定されるフューリン濃度は、それぞれ、少なくとも５７Ｕ／ｍＬ、および少なくとも９６Ｕ／ｍＬであった（図９）。
【００６４】
概して、データは、十分なＦＸ処理（９０％以上および９５％以上）に要する、細胞培養液上清における最小レベルの分泌フューリン（少なくとも５７Ｕ／ｍＬおよび少なくとも９６Ｕ／ｍＬ）を定義する。
【００６５】
高レベルで組換えタンパク質を発現するバイオ技術処理において、フューリンの過発現は、完全に処理された酵素前駆体を得るために使用されてもよい。本発明では、高ＦＸ処理を保証する最小の分泌フューリンを初めて定義する。（少なくとも９０％の完全に処理されたＦＸを得るためには≧５７Ｕ／ｍＬ、および少なくとも９５％の完全に処理されたＦＸを得るためには≧９６Ｕ／ｍＬのフューリン）。この発見は、フューリンレベルがＦＸ前駆体タンパク質の適切な処理のための指標として、および細胞株および製法開発のための目標として使用されてもよいという、組換えＦＸ、ＦＸａおよびヒトおよび動物種からの変異体を発現する発酵処理に具体的な利益がある。
【００６６】
別段明記しない限り、明細書および特許請求の範囲に使用される成分、分子量などの特性、および反応条件などの量を表現するすべての数は、すべての場合、用語「約」で修飾されていると理解されたい。本明細書で使用される場合、用語「約」および「おおよそ」は、１０〜１５％以内、好ましくは５〜１０％以内を意味する。したがって、特に明記しない限り、明細書および添付の特許請求の範囲で記載される数値的パラメーターは、近似値であり、本発明により得られるよう求められる所望の特性に応じて変えてもよい。最低でも、特許請求の範囲の等価物の原理の適用を限定するような試みでなければ、各数値的パラメーターは、少なくとも、報告される有効数字の数の観点で、一般的な丸め法を適用することにより、構成されるべきである。本発明の広い範囲を記載する数値的範囲およびパラメーターが近似値であるにも関わらず、明確な実施例に記載される数値は、可能な限り精密に報告される。しかし、任意の数値は、必ずそれら各々の試験計測で見られる標準偏差から発生する特定の誤差を本質的に含有する。
【００６７】
本発明の記載する内容（特に、以下の特許請求の範囲の内容）で使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および同様の指示物は、本明細書に別段明記しない限り、または内容により明らかに否定されない限り、単数形と複数形の両方に当てはまるよう解釈されるべきである。本明細書における値範囲の列挙は、単に、ここに範囲内にあるそれぞれの異なる値を個別に参照する簡略表記法として取り扱うことを意図される。本明細書に別段明記しない限り、それぞれの個別の値は、本明細書に個別に列挙されるように、明細書に組み込まれる。本明細書で別段明記されない限り、または内容により明らかに否定されない限り、本明細書に記載のすべての方法は、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書で提供される、任意の実施例およびすべての実施例または例示的言葉（例えば、「など」）の使用は、単に、本発明をより明らかにすることを意図しており、別段特許請求の範囲に記載されない限り、発明の範囲を限定するものではない。明細書における言葉は、本発明の実践に本質的な任意の特許請求の範囲にない要素を示すものと解釈されるべきではない。
【００６８】
本明細書に開示される本発明の代替要素または実施形態のグループ化は、限定と解釈されるべきではない。各グループのメンバーを参照するおよび個別に特許請求の範囲に記載するまたはグループの他のメンバーまたは本明細書にみられる他の要素と組み合わせてもよい。グループの１つまたは複数のメンバーは、便宜上および特許性のため、グループに含まれてもよく、グループから削除されてもよいことが予想される。任意のそのような包括または削除が生じたとき、明細書は修正されたようなグループを含有するとみなされ、そのため、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュグループの明細書の記載が満たされる。
【００６９】
本発明を行う発明者が知る最良の形態を含む、本発明の特定の実施形態を本明細書に記載する。そのような記載される実施形態における変形形態は、前述の記載を理解した当業者にとって明らかであろうことは当然である。発明者は、当業者がそのような変形形態を適切に使用することを望み、発明者は、本発明が本明細書に明確に記載されるものと異なり実践されることを意図する。したがって、本発明は、準拠法により許容されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題のすべての修正形態および等価物を含む。さらに、本明細書で別段記載されない限り、または内容により明らかに否定されない限り、その可能性のあるすべての変形形態での上記要素の任意の組み合わせは、本明細書に包含される。
【００７０】
本明細書に記載の明確な実施形態は、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「本質的に〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」の言葉を使用する特許請求の範囲でさらに限定されてもよい。特許請求の範囲で使用される場合、補正毎に補われたものでも追加されたものでも、接続句「から成る」は、特許請求の範囲で明記されない任意の要素、工程、または成分を除外する。接続句「本質的に〜から成る」は、特許請求の範囲を明記される物質または工程、および基本的で新規な特徴（複数可）に物質的に作用しないものに限定する。特許請求の範囲に記載されるような本発明の実施形態は、内在的または明示的に記載され、本明細書に対応する。
【００７１】
さらに、本明細書全体にわたって多数の参照が特許のために作成され、公報が印刷されている。上記引用文献のそれぞれおよび印刷される公報は、その全体が参照により本明細書に個別に組み込まれる。
【００７２】
終わりに、本明細書に開示される本発明の実施形態が本発明の原理の例証であることを理解されたい。使用され得る他の修正形態は、本発明の範囲内にある。そのため、例えば、本明細書の教示に応じて、本発明の代替構成を利用してもよいが、それに限定されない。したがって、本発明は、示し記載するような精密なものに限定されない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｂ−２】
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【図１Ｂ−３】
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【図１Ｂ−４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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