(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式：
Ａｂ−（ＰＭＬ−ａｂｘ）ｐ
を有し、式中、
Ａｂは、抗セリン−アスパラギン酸ジペプチドリピート（ＳＤＲ）抗体であり、
ＰＭＬは、下式：
−Ｓｔｒ−ＰＭ−Ｙ−
（式中、Ｓｔｒはストレッチャー単位であり、ＰＭはペプチド模倣単位であり、Ｙはスペーサー単位である）を有するプロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカーであり、
ａｂｘが、リファマイシン型抗生物質であり、
ｐが１〜８の整数であり、
ＰＭは、下式：
0006751393.tif 000062
を有し、
Ｒ７及びＲ８が一緒にＣ３−Ｃ７シクロアルキル環を形成し、かつ
ＡＡが、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２から選択されるアミノ酸側鎖である、
抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項２】
前記リファマイシン型抗生物質が、リファラジル型抗生物質である、請求項１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項３】
前記リファマイシン型抗生物質が、前記プロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカーに結合される第４級アミンを含む、請求項１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項４】
式Ｉ：
0006751393.tif 000063
Ｉ
を有し、式中、
破線が、任意選択の結合を示し、
Ｒが、Ｈ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、またはＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、
Ｒ１がＯＨであり、
Ｒ２がＣＨ＝Ｎ-（ヘテロシクリル）であり、前記ヘテロシクリルが、任意選択で、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、Ｃ１-Ｃ１２ヘテロアリール、Ｃ２-Ｃ２０ヘテロシクリル、Ｃ６-Ｃ２０アリール、及びＣ３-Ｃ１２カルボシクリルから独立して選択される１つ以上の基で置換されるか、
あるいはＲ１及びＲ２が、５員若しくは６員縮合ヘテロアリールまたはヘテロシクリルを形成し、任意選択で、スピロ若しくは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環を形成し、前記スピロ若しくは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環が、任意選択で、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、またはＯＨによって置換されており、
ＰＭＬが、Ｒ２に結合された前記プロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカー、またはＲ１及びＲ２により形成された前記縮合ヘテロアリール若しくはヘテロシクリルであり、
Ａｂが前記抗ＳＤＲ抗体である、請求項１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項５】
下式：
0006751393.tif 000064
を有し、式中、
Ｒ３が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから独立して選択され、
ｎが、１または２であり、
Ｒ４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、及びＯＨから選択され、
Ｚが、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１-Ｃ１２アルキル）、Ｏ、及びＳから選択される、請求項４に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項６】
下式：
0006751393.tif 000065
を有し、式中、
Ｒ５が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから選択され、
ｎが、０または１である、請求項１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項７】
下式：
0006751393.tif 000066
を有し、式中、
Ｒ５が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから選択され、
ｎが、０または１である、請求項１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項８】
下式：
0006751393.tif 000067
を有し、式中、
Ｒ５が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから独立して選択され、
ｎが、０または１である、請求項１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項９】
下式：
0006751393.tif 000068
を有し、式中、
Ｒ３が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから独立して選択され、
ｎが、１または２である、請求項１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項１０】
下式：
0006751393.tif 000069
を有する、請求項９に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項１１】
Ｓｔｒが、下式：
0006751393.tif 000070
を有し、式中、Ｒ６が、Ｃ１−Ｃ１２アルキレン、Ｃ１−Ｃ１２アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ１−Ｃ１２アルキレン−ＮＨ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−Ｃ（＝Ｏ）、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２、及びＣ１−Ｃ１２アルキレン−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ（チオフェン−３−イル）からなる群から選択され、式中、ｒが１〜１０の範囲の整数である、請求項１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項１２】
Ｒ６が、（ＣＨ２）５である、請求項１１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項１３】
Ｙが、パラ−アミノベンジルまたはパラ−アミノベンジルオキシカルボニルを含む、請求項１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項１４】
下式：
ｉ）
0006751393.tif 000071
；
ｉｉ）
0006751393.tif 000072
；
ｉｉｉ）
0006751393.tif 000073
；
ｉｖ）
0006751393.tif 000074
；
ｖ）
0006751393.tif 000075
；
ｖｉ）
0006751393.tif 000076
；
ｖｉｉ）
0006751393.tif 000077
；
ｖｉｉｉ）
0006751393.tif 000078
；
ｉｘ）
0006751393.tif 000079
；
ｘ）
0006751393.tif 000080
；
ｘｉ）
0006751393.tif 000081
；及び
ｘｉｉ）
0006751393.tif 000082
から選択される、請求項１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項１５】
前記抗ＳＤＲ抗体が、軽（Ｌ）鎖及び重（Ｈ）鎖を含み、かつ
ｉ）前記Ｌ鎖が、配列番号４を含むＣＤＲ  Ｌ１、配列番号５を含むＣＤＲ  Ｌ２、及び配列番号６を含むＣＤＲ  Ｌ３を含み、前記Ｈ鎖が、配列番号１を含むＣＤＲ  Ｈ１、配列番号２を含むＣＤＲ  Ｈ２、及び配列番号３を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む；
ｉｉ）前記Ｌ鎖が、配列番号４を含むＣＤＲ  Ｌ１、配列番号５を含むＣＤＲ  Ｌ２、及び配列番号７を含むＣＤＲ  Ｌ３を含み、前記Ｈ鎖が、配列番号１を含むＣＤＲ  Ｈ１、配列番号２を含むＣＤＲ  Ｈ２、及び配列番号３を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む；または
ｉｉｉ）前記Ｌ鎖が、配列番号４を含むＣＤＲ  Ｌ１、配列番号５を含むＣＤＲ  Ｌ２、及び配列番号６を含むＣＤＲ  Ｌ３を含み、前記Ｈ鎖が、配列番号１を含むＣＤＲ  Ｈ１、配列番号８を含むＣＤＲ  Ｈ２、及び配列番号３を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む、
請求項１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項１６】
前記抗ＳＤＲ抗体が重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、前記ＶＨが、配列番号１３の前記ＶＨの領域の長さにわたって少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項１７】
前記抗ＳＤＲ抗体が、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＬが、配列番号１４または配列番号１５の前記ＶＬの領域の長さにわたって少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項１８】
前記抗ＳＤＲ抗体が、インビボでＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ及び／またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに結合する、請求項１または請求項１５に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項１９】
前記抗体が、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ’）２である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物。
【請求項２０】
請求項１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物、薬学的に許容される担体、滑剤、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項２１】
治療有効量の請求項１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物を含む、患者におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ細菌感染を治療するための医薬。
【請求項２２】
前記患者がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに感染している、請求項２１に記載の医薬。
【請求項２３】
前記患者がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに感染している、請求項２１に記載の医薬。
【請求項２４】
前記抗体−抗生物質抱合体化合物が、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で前記患者に投与される、請求項２１に記載の医薬。
【請求項２５】
前記患者が、第２の抗生物質による治療と併せて前記抗体−抗生物質抱合体化合物を投与される、請求項２１に記載の医薬。
【請求項２６】
請求項１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物を含む、宿主細胞を死滅させることなく、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染患者の細胞における細胞内Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを死滅させるための医薬。
【請求項２７】
請求項１に記載の抗体−抗生物質抱合体化合物の作製プロセスであって、リファマイシン型抗生物質を抗ＳＤＲ抗体に抱合することを含む、プロセス。
【請求項２８】
細菌感染症を治療するためのキットであって、
ａ）請求項２０に記載の薬学的組成物と、
ｂ）使用説明書と、を含む、キット。
【請求項２９】
式ＩＩ：
0006751393.tif 000083
ＩＩ
を有する抗生物質−リンカー中間体であって、式中、
破線が、任意選択の結合を示し、
Ｒが、Ｈ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、またはＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、
Ｒ１がＯＨであり、
Ｒ２がＣＨ＝Ｎ-（ヘテロシクリル）であり、前記ヘテロシクリルが、任意選択で、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、Ｃ１-Ｃ１２ヘテロアリール、Ｃ２-Ｃ２０ヘテロシクリル、Ｃ６-Ｃ２０アリール、及びＣ３-Ｃ１２カルボシクリルから独立して選択される１つ以上の基で置換されるか、
あるいはＲ１及びＲ２が、５員若しくは６員縮合ヘテロアリールまたはヘテロシクリルを形成し、任意選択で、スピロ若しくは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環を形成し、前記スピロ若しくは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環が、任意選択で、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、またはＯＨによって置換されており、
ＰＭＬが、Ｒ２に結合されたプロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカー、またはＲ１及びＲ２によって形成された前記縮合ヘテロアリール若しくはヘテロシクリルであり、下式：
−Ｓｔｒ−ＰＭ−Ｙ−
（式中Ｓｔｒはストレッチャー単位であり、ＰＭはペプチド模倣単位であり、Ｙはスペーサー単位である）を有し、
Ｘが、マレイミド、チオール、アミノ、ブロミド、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、ｐ−トルエンスルホネート、ヨウ化物、ヒドロキシル、カルボキシル、ピリジルジスルフィド、及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミドから選択される反応性官能基であり、ＰＭは、下式：
0006751393.tif 000084
ｚ
を有し、
Ｒ７及びＲ８が一緒にＣ３−Ｃ７シクロアルキル環を形成し、かつ
ＡＡが、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２から選択されるアミノ酸側鎖である
抗生物質−リンカー中間体。
【請求項３０】
Ｘが、
0006751393.tif 000085
または
0006751393.tif 000086
である、請求項２９に記載の抗生物質−リンカー中間体。
【請求項３１】
下式：
0006751393.tif 000087
を有し、式中、
Ｒ３が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから独立して選択され、
ｎが、１または２であり、
Ｒ４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、及びＯＨから選択され、
Ｚが、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１-Ｃ１２アルキル）、Ｏ、及びＳから選択される、請求項２９に記載の抗生物質−リンカー中間体。
【請求項３２】
下式：
0006751393.tif 000088
を有する、請求項２９に記載の抗生物質−リンカー中間体。
【請求項３３】
下式：
0006751393.tif 000089
、
0006751393.tif 000090
、
0006751393.tif 000091
、
0006751393.tif 000092
、
0006751393.tif 000093
、及び
0006751393.tif 000094
から選択される、請求項２９に記載の抗生物質−リンカー中間体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６２／０８７，２１３号の利益を主張し、全ての目的においてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１５年１２月１日に作成され、Ｐ３２３５０ＷＯ＿ＰＣＴＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、２６，７４７バイトの大きさである。
【０００３】
本発明は、リファマイシン型抗生物質に抱合された抗Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ抗体、及び得られた抗体−抗生物質抱合体の、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染症の治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、主に鼻孔及び皮膚にコロニー形成する成功裏のヒト共生生物である。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ；ＳＡ）は様々な組織にも浸潤し、致命的な感染症を引き起こす場合があり、世界的にヒトにおける細菌感染症の主要な原因である。最近出現したＳ．ａｕｒｅｕｓ株は、さもなければ健康な個体に疾患をもたらす増加した病原性及び増強した能力を示す。過去数十年にわたって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの感染は、既知の全てのベータラクタム系抗生物質に耐性であるメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の出現及びその急速な伝播により、治療が増々困難になっている（Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｈ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ４８，１−１２）。現在、最も流行性で、最も病原性のメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）臨床株はＵＳＡ３００であり、これは大量の病原性因子を産生する能力を有し、感染した個体を死亡させる（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，ＨＦ  ａｎｄ  Ｄｅｌｅｏ  ＦＲ（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７：６２９−６４１）。心内膜炎、骨髄炎、壊死性肺炎、及び敗血症などの最も重篤な感染症は、細菌の血流内への拡散後に生じる（Ｌｏｗｙ，Ｆ．Ｄ．（１９９８）Ｎ  ＥＮＧＬ  Ｊ  ＭＥＤ  ３３９，５２０−５３２）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓに近縁であるＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、院内感染と関係することが多く、留置医療装置の最も一般的な感染源を表している。
【０００５】
宿主組織へのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌの付着及びその成功裏のコロニー形成に重要なのは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉに存在する付着性Ａドメインに隣接するセリン−アスパラギン酸ジペプチド（ＳＤＲ）リピートの大きな広がりを特徴とする細胞壁タンパク質のファミリーである（Ｆｏｓｔｅｒ  ＴＪ，Ｈｏｏｋ  Ｍ（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６：４８４−４８８）。付着に重要なこのようなタンパク質は、クランピング因子（Ｃｌｆ）Ａ及びＣｌｆＢ（Ｆｏｓｔｅｒ  ＴＪ、上記）を含む。ＣｌｆＡ及びＣｌｆＢに加えて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓはＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、及びＳｄｒＥの３つのＳＤＲタンパク質も発現し、これはゲノムにおいてタンデムに組織される。これらのタンパク質は組織コロニー形成にも関与し、それらのうちのいずれかの排除が細菌の病原性を低下させると考えられている（Ｃｈｅｎｇ  ＡＧ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２３：３３９３−３４０４）。このファミリーの３つの追加のメンバーであるＳｒｄＦ、ＳｄｒＧ、及びＳｄｒＨは大半のＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株に存在する（ＭｃＣｒｅａ  ＫＷ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｈｅ  ｓｅｒｉｎｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｒｅｐｅａｔ  （Ｓｄｒ）ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６（Ｐｔ  ７）：１５３５−１５４６）。これらのタンパク質の各々において、２５〜２７５ＳＤジペプチドリピートを含有するＳＤＲ領域（配列番号２４）は、Ｎ末端リガンド結合ＡドメインとＣ末端ＬＰＸＴＧモチーフ（配列番号２５）との間に位置し、これはトランスペプチダーゼソルターゼＡによる細胞壁への固着を媒介する。ＳＤＲドメインの機能は未知のままであるが、これらのタンパク質のＮ末端リガンド結合部位の露出を可能にする細胞壁貫通ドメインとして作用することが提案されている（Ｈａｒｔｆｏｒｄ  Ｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２５：１０６５−１０７６）。
【０００６】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの全てのＳＤＲタンパク質のＳＤＲドメインが、２段階でグリコシル化に関与する２つの新しい糖転移酵素であるＳｄｇＡ及びＳｄｇＢにより高度にグリコシル化されることが分かった（Ｈａｚｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ９（１０）：１−１８）。これらのグリコシル化事象は宿主プロテアーゼによるこれらのタンパク質の分解を阻止し、それにより細菌と宿主組織との相互作用を保つ。Ｈａｚｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）はまた、ＳｄｇＢ媒介グリコシル化がヒトにおいて高オプソニン性抗体の免疫優性エピトープを生成することも示した。これらの抗体は、総抗ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌＩｇＧ応答のかなりの割合を占める。
【０００７】
侵襲性ＭＲＳＡ感染症は治療が難しく、死亡率は約２０％であり、米国において感染体による死亡の主要な原因である。バンコマイシン、リネゾリド、及びダプトマイシンは、よって、侵襲性ＭＲＳＡ感染症を治療するための少ない選択抗生物質となった（Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｈ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｇ．＆Ｒａｚｏｎａｂｌｅ，Ｒ．Ｒ．（２０１０）Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ５１  Ｓｕｐｐｌ  ２，Ｓ１８３−１９７）。しかしながら、バンコマイシンに対する感受性の低下ならびにリネゾリド及びダプトマイシンに対する交差耐性がＭＲＳＡ臨床株において既に報告されている（Ｎａｎｎｉｎｉ，Ｅ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｂ．Ｅ．＆Ａｒｉａｓ，Ｃ．Ａ．（２０１０）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １０，５１６−５２１）。徐々に、耐性を克服するために必要なバンコマイシン用量が腎毒性が生じるレベルまで上昇している。よって、これらの抗生物質にも関わらず、侵襲性ＭＲＳＡ感染症の死亡率及び罹患率は高いままである。
【０００８】
研究により、Ｓ．ａｕｒｅｕｓが細菌クリアランスに関与する貪食細胞を含む哺乳類細胞内に浸潤し、その中で生存できることが明らかになった。（Ｔｈｗａｉｔｅｓ，Ｇ．Ｅ．＆Ｇａｎｔ，Ｖ．（２０１１）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９，２１５−２２２）；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｄ．Ｅ．，Ｔｏｍｐｓｅｔｔ，Ｒ．（１９５２）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  ９５，２０９−２３０）；Ｇｒｅｓｈａｍ，Ｈ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４，３７１３−３７２２）；Ｋａｐｒａｌ，Ｆ．Ａ．＆Ｓｈａｙｅｇａｎｉ，Ｍ．Ｇ．（１９５９）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １１０，１２３−１３８；Ａｎｗａｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７，２１６−２２４）；Ｆｒａｕｎｈｏｌｚ，Ｍ．＆Ｓｉｎｈａ，Ｂ．（２０１２）  Ｆｒｏｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２，４３）；Ｇａｒｚｏｎｉ，Ｃ．＆Ｋｅｌｌｅｙ，Ｗ．Ｌ．（２０１１）  ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ３，１１５−１１７）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、静脈内感染後数分以内に宿主貪食細胞、主に好中球及びマクロファージに取り込まれる（ＲＯＧＥＲＳ，Ｄ．Ｅ．（１９５６）ＪＥＭ  １０３，７１３）。大部分の細菌はこれらの細胞によって効果的に死滅するが、血液媒介貪食細胞内のＳ．ａｕｒｅｕｓの不完全なクリアランスにより、これらの感染した細胞が初期の感染部位から離れた細菌の拡散のための「トロイの木馬」のように作用することが可能となり得る。実際、正常な好中球数を有する患者は、減少した好中球数を有する患者よりも拡散性疾患になり易い場合がある（ＴＨＷＡＩＴＥＳ，Ｇ．Ｅ．＆ＧＡＮＴ，Ｖ．（２０１１）、上記）。一旦組織に送達されると、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは様々な非貪食細胞型を浸潤することができ、組織中の細胞内Ｓ．ａｕｒｅｕｓは慢性または再発感染と関係する。さらに、細胞内細菌を最適以下の抗生物質濃度に曝すことにより、抗生物質耐性株の出現を促し、よってこの臨床問題がより深刻なものとする。これらの知見と一致して、バンコマイシンまたはダプトマイシンを用いた菌血症または心内膜炎などの侵襲性ＭＲＳＡを有する患者の治療は、５０％を超える失敗率と関係する（Ｋｕｌｌａｒ，Ｒ．，Ｄａｖｉｓ，Ｓ．Ｌ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｄ．Ｐ．＆Ｒｙｂａｋ，Ｍ．Ｊ．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｎ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ：  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ５２，９７５−９８１  （２０１１）；Ｆｏｗｌｅｒ，Ｖ．Ｇ．，Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ��ｕｒｅｕｓ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５５，６５３−６６５  （２００６）；Ｙｏｏｎ，Ｙ．Ｋ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｙ．，Ｐａｒｋ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｏｈｎ，Ｊ．Ｗ．＆Ｋｉｍ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｂａｃｔｅｒａｅｍｉａ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５：１０１５−１０１８  （２０１０））。したがって、より成功裏の抗Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ療法は細胞内細菌の排除を含むべきである。
【０００９】
アンサマイシンは、リファマイシン、リファンピン、リファンピシン、リファブチン、リファペンチン、リファラジル、ＡＢＩ−１６５７、及びこれらの類似体を含む、細菌ＲＮＡポリメラーゼを阻害し、グラム陽性及び選択的グラム陰性細菌に対して例外的な効力を有する抗体のクラスである（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  １２（２）：２５５−２７１、ＵＳ７３４２０１１、ＵＳ７２７１１６５）。
【００１０】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡを含む）感染を防止及び治療するための免疫療法が報告された。ＵＳ２０１１／０２６２４７７は、ＭＲＳＡに対する免疫応答を刺激するために、ワクチンとして細菌付着タンパク質であるＥａｐ、Ｅｍｐ、及びＡｄｓＡの使用を示している。ＷＯ２００００７１５８５は、特定のＳ．ａｕｒｅｕｓ株の分離株に対して反応性である単離したモノクローナル抗体を説明している。ＵＳ２０１１００５９０８５Ａ１は、１つ以上のＳＡ莢膜抗原に特異的なＩｇＭ  Ａｂを利用するＡｂに基づいた戦略を提案するが、実際の抗体は説明されていない。
【００１１】
免疫複合体としても知られる抗体−薬物抱合体（ＡＤＣ）は、強力な細胞傷害性薬物を抗原発現腫瘍細胞に標的指向し（Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｂ．Ａ．（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ９：９８２−１００４）、それにより、有効性を最大化し、オフターゲット毒性を最小化することにより治療指数を増強することで、抗体と細胞傷害性薬物の両方の理想的な特性を組み合わせる標的化学療法分子である（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｅｎｔｅｒ  Ｐ．Ｄ．（２００８）Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．．１４（３）：１５４−１６９、Ｃｈａｒｉ，Ｒ．Ｖ．（２００８）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：９８−１０７。ＡＤＣは、リンカー単位を通して細胞傷害性薬物部分に共有結合されるターゲティング抗体を含む。免疫複合体は、非抱合型薬物の全身投与が正常な細胞ならびに排除されることが求められる腫瘍細胞に対して許容できないレベルの毒性をもたらし得る、薬物部分の腫瘍への標的送達、及びその中での細胞内蓄積を可能にする（Ｐｏｌａｋｉｓ  Ｐ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３８２−３８７）。
【００１２】
敗血症を治療するための、抗生物質を介した標的細菌の表面に結合する非特異的免疫グロブリン−抗生物質複合体が説明されている（ＵＳ５５４５７２１、ＵＳ６６６０２６７）。細菌抗原に特異的な抗原結合部分（ＳＡ莢膜多糖など）を有するが、細菌Ｆｃ結合タンパク質、例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌプロテインＡと反応する定常領域を欠く抗生物質抱合型抗体が説明されている（ＵＳ７５６９６７７）。
【００１３】
従来の抗生物質に対するＭＲＳＡの驚くべき速さの耐性、ならびに侵襲性ＭＲＳＡ感染症により結果として生じる死亡率及び罹患率を考慮すると、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症を治療するための新規治療薬の大きな未解決課題が存在する。本発明は、現在の治療組成物の限界を克服し、以下の詳細な説明から明らかである追加の利点を提供する組成物及び使用を提供することによりこの必要性を満たす。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、細胞内細菌の排除を含む独特な療法を提供する。本発明は、このような療法がバンコマイシンのような従来の抗生物質が機能しないインビボで有効であることを示す。
【００１５】
本発明は、１つ以上のリファマイシン型抗生物質部分への共有結合により抱合された抗体を含む、「抗体−抗生物質抱合体」または「ＡＡＣ」）と称される組成物を提供する。
【００１６】
本発明の態様は、プロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカーによってリファマイシン型抗生物質に共有結合されるｒＦ１抗体を含む抗体−抗生物質抱合体化合物である。
【００１７】
本発明の例示的な実施形態は、下式：
Ａｂ−（ＰＭＬ−ａｂｘ）ｐ
を有し、式中、
Ａｂは、ｒＦ１抗体であり、
ＰＭＬは、下式：
−Ｓｔｒ−ＰＭ−Ｙ−
（式中、Ｓｔｒはストレッチャー単位であり、ＰＭはペプチド模倣単位であり、Ｙはスペーサー単位である）を有するプロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカーであり、
ａｂｘが、リファマイシン型抗生物質であり、
ｐが１〜８の整数である、抗体−抗生物質抱合体である。
【００１８】
先行実施形態のいずれかの抗体−抗生物質抱合体化合物は、本明細書に記載される抗ＳＤＲ  Ａｂのうちのいずれか１つ、及び具体的にはｒＦ１抗体を含み得る。これらのｒＦ１抗体はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに結合する。例示的なｒＦ１抗体において、Ａｂは、軽（Ｌ）鎖及び重（Ｈ）鎖を含むモノクローナル抗体であり、Ｌ鎖は、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、及びＣＤＲ  Ｌ３を含み、Ｈ鎖は、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、及びＣＤＲ  Ｈ３を含み、このＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、及びＣＤＲ  Ｈ３、ならびにＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、及びＣＤＲ  Ｌ３は、表４Ａ及び４Ｂに示されるように、それぞれ、Ａｂ  Ｆ１（配列番号１〜６）、ｒＦ１（配列番号１〜５、７）、ｒＦ１．ｖ１（配列番号１、８、３、４〜６）の各々のＣＤＲのアミノ酸配列を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ｒＦ１抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、このＶＨは、配列番号１３のＶＨ配列から選択されるＶＨ領域の長さにわたって少なくとも９５％の配列同一性を有する。本抗体はＬ鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含んでも良く、このＶＬは、それぞれ、抗体ｒＦ１及びｒＦ１．ｖ６の配列番号１４及び配列番号１５のＶＬ配列から選択されるＶＬ領域の長さにわたって少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００２０】
特定の実施形態では、ｒＦ１抗体は次のＬとＨ鎖の対を含む：配列番号１０の配列を含むＨ鎖と対合される配列番号９の配列を含むＬ鎖、配列番号１０の配列を含むＨ鎖と対合される配列番号１１の配列を含むＬ鎖、配列番号１２の配列を含むＨ鎖と対合される配列番号１１の配列を含むＬ鎖。
【００２１】
先行実施形態のいずれか１つにおいて、本抗体はＦｃ領域を欠く抗原結合断片であって良い。いくつかの実施形態では、本抗体はＦ（ａｂ）またはＦ（ａｂ’）２である。いくつかの実施形態では、本抗体は重鎖定常領域及び／または軽鎖定常領域をさらに含み、この重鎖定常領域及び／または軽鎖定常領域は、システイン残基で置換される１つ以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域はアミノ酸置換Ａ１１８Ｃ及び／若しくはＳ４００Ｃを含み、ならびに／または軽鎖定常領域はアミノ酸置換Ｖ２０５Ｃを含み、この番付システムはＥＵ番付に従う。
【００２２】
上述の抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、抗体はＩｇＭアイソタイプではない。上述の抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、本抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）アイソタイプである。
【００２３】
本発明の例示的な実施形態は、抗体−抗生物質抱合体化合物、及び薬学的に許容される担体、滑走剤、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物である。
【００２４】
本発明の別の態様は、治療有効量の、先行実施形態のいずれかの抗体−抗生物質抱合体を感染患者に投与することを含む、細菌感染症の治療方法である。本発明の別の態様は、治療有効量の本発明の抗体−抗生物質抱合体を患者に投与することを含む、患者におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ感染症の治療方法である。一実施形態では、患者はヒトである。一実施形態では、患者は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ及び／またはＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染症に感染している。いくつかの実施形態では、患者はＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症と診断された。いくつかの実施形態では、細菌感染症の治療は細菌負荷または細菌数を減少させることを含む。
【００２５】
本発明の別の態様は、治療有効量の、先行実施形態のいずれか１つの抗体−抗生物質抱合体を患者に投与することを含む、感染患者におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ感染症の治療方法である。一実施形態では、患者はヒトである。一実施形態では、細菌感染症はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症である。いくつかの実施形態では、患者はＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症と診断された。いくつかの実施形態では、細菌感染症の治療は細菌負荷または細菌数を減少させることを含む。
【００２６】
先行治療方法のいずれかの一実施形態では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含む細菌感染症が菌血症を引き起こした患者に投与される。特定の実施形態では、本方法は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ心内膜炎または骨髄炎を治療するために使用される。一実施形態では、抗体−抗生物質抱合体化合物は、約５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で感染患者に投与される。
【００２７】
上記実施形態のいずれかのｒＦ１抗生物質抱合体化合物を投与することによる、宿主細胞を死滅させることのない、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染患者の細胞における細胞内Ｓ．ａｕｒｅｕｓの死滅方法も提供する。生残菌細菌を先行実施形態のいずれかのＡＡＣと接触させることにより、インビボで生残菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ細菌細胞（例えばＳ．ａｕｒｅｕｓ）を死滅させるための別の方法が提供される。
【００２８】
別の実施形態では、治療方法は、第２の治療薬を投与することをさらに含む。さらなる実施形態では、第２の治療薬は、一般にＳｔａｐｈ  ａｕｒｅｕｓ、または特にＭＲＳＡに対する抗生物質を含む抗生物質である。
【００２９】
一実施形態では、本発明の抗体−抗生物質抱合体化合物と併用して投与される第２の抗生物質は、（ｉ）アミノグリコシド、（ｉｉ）ベータ−ラクタム、（ｉｉｉ）マクロライド／環状ペプチド、（ｉｖ）テトラサイクリン、（ｖ）フルオロキノリン／フルオロキノロン、（ｖｉ）及びオキサゾリジノンの構造クラスから選択される。
【００３０】
一実施形態では、本発明の抗体−抗生物質抱合体化合物と併用して投与される第２の抗生物質は、クリンダマイシン、ノボビオシン、レタパムリン、ダプトマイシン、ＧＳＫ−２１４０９４４、ＣＧ−４００５４９、シタフロキサシン、テイコプラニン、トリクロサン、ナフチリドン、ラデゾリド、ドキソルビシン、アンピシリン、バンコマイシン、イミペネム、ドリペネム、ゲムシタビン、ダルババンシン、及びアジスロマイシンから選択される。
【００３１】
本明細書のいくつかの実施形態では、感染患者における細菌負荷は治療後に検出不可能なレベルまで低下した。一実施形態では、治療前の陽性血液培養物と比較して、治療後の患者の血液培養物は陰性である。本明細書のいくつかの実施形態では、対象における細菌耐性は検出不可能であるか、または低い。本明細書のいくつかの実施形態では、患者はメチシリンまたはバンコマイシンを用いた治療に応答しない。
【００３２】
本発明の例示的な実施形態は、リファマイシン型抗生物質をｒＦ１抗体に抱合することを含む、抗体−抗生物質抱合体の作製プロセスである。
【００３３】
本発明の例示的な実施形態は、
ａ）抗体−抗生物質抱合体化合物、及び薬学的に許容される担体、滑走剤、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物と、
ｂ）使用説明書と、を含む、細菌感染症の治療キットである。
【００３４】
本発明の態様は、式ＩＩ：
0006751393.tif 000002
ＩＩ
を有する抗生物質−リンカー中間体であり、式中、
破線が、任意選択の結合を示し、
Ｒが、Ｈ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、またはＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、
Ｒ１がＯＨであり、
Ｒ２がＣＨ＝Ｎ-（ヘテロシクリル）であり、ヘテロシクリルが、任意選択で、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、Ｃ１-Ｃ１２ヘテロアリール、Ｃ２-Ｃ２０ヘテロシクリル、Ｃ６-Ｃ２０アリール、及びＣ３-Ｃ１２カルボシクリルから独立して選択される１つ以上の基で置換されるか、
あるいはＲ１及びＲ２が、５員若しくは６員縮合ヘテロアリールまたはヘテロシクリルを形成し、任意選択で、スピロ若しくは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環を形成し、このスピロまたは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環は、任意選択で、置換Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、またはＯＨであり、
ＰＭＬが、Ｒ２に結合されたプロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカー、またはＲ１及びＲ２によって形成された縮合ヘテロアリール若しくはヘテロシクリルであり、下式：
−Ｓｔｒ−ＰＭ−Ｙ−
（式中Ｓｔｒはストレッチャー単位であり、ＰＭはペプチド模倣単位であり、Ｙはスペーサー単位である）を有し、
Ｘが、マレイミド、チオール、アミノ、ブロミド、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、ｐ−トルエンスルホネート、ヨウ化物、ヒドロキシル、カルボキシル、ピリジルジスルフィド、及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミドから選択される反応性官能基である。
【００３５】
本明細書に記載される様々な実施形態の特性のうちの１つ、いくつか、または全てを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成しても良いことを理解されたい。本発明のこれら及び他の態様は、当業者には明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１Ａ〜１Ｆは、ＭＲＳＡの細胞内貯蔵は、インビボ及びインビトロにおいてバンコマイシンから保護される。
【図１Ａ】遊離細菌（プランクトン）対細胞内細菌を生成するための実験設計の概略図を示す。静脈内注射により、４つのマウスコホートをほぼ等用量の生存可能遊離細菌または細胞内細菌に感染させ、感染直後、次いで１日１回、選択群をバンコマイシンで治療した（実施例２を参照されたい）。
【図１Ｂ】感染４日後の感染マウスの腎臓及び脳における細菌負荷を示す。破線はアッセイの検出限界を示す。
【図１Ｃ】感染４日後の感染マウスの腎臓及び脳における細菌負荷を示す。破線はアッセイの検出限界を示す。
【図１Ｄ】感染可能細胞の単層上で培養されたとき、ＭＲＳＡがバンコマイシンから保護されることを示す。（ＮＤ＝検出なし）。
【図１Ｅ】感染可能細胞の単層上で培養されたとき、ＭＲＳＡがバンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｉｃｎ）の存在下で成長可能であることを示す。ＭＲＳＡ（遊離細菌）を、培地、培地＋バンコマイシン、または培地＋バンコマイシン中に播種し、ＭＧ６３骨芽細胞（図１Ｅ）またはヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ、図１Ｆ）の単層上で平板培養した。細胞外細菌（遊離細菌）は培地単独中で良好に成長したが、バンコマイシンによって死滅した。哺乳類細胞の単層を含有するウェル（細胞内＋バンコマイシン）では、感染から８時間の間、わずかな細菌がバンコマイシンから保護され、２４時間にわたって細胞内区画内に広がることができた。エラーバーは、３連ウェルの標準偏差を示す。
【図１Ｆ】感染可能細胞の単層上で培養されたとき、ＭＲＳＡがバンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｉｃｎ）の存在下で成長可能であることを示す。ＭＲＳＡ（遊離細菌）を、培地、培地＋バンコマイシン、または培地＋バンコマイシン中に播種し、ＭＧ６３骨芽細胞（図１Ｅ）またはヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ、図１Ｆ）の単層上で平板培養した。細胞外細菌（遊離細菌）は培地単独中で良好に成長したが、バンコマイシンによって死滅した。哺乳類細胞の単層を含有するウェル（細胞内＋バンコマイシン）では、感染から８時間の間、わずかな細菌がバンコマイシンから保護され、２４時間にわたって細胞内区画内に広がることができた。エラーバーは、３連ウェルの標準偏差を示す。
【図２】抗体抗生物質抱合体（ＡＡＣ）の概念を示す。一実施例では、ＡＡＣは、リソソームプロテアーゼによって切断されるリンカーを介して強力なリファマイシン型抗生物質（例えばＲｉｆａｌｏｇ）に結合されたＳ．ａｕｒｅｕｓの表面上のエピトープに指向される抗体からなる。
【図３】抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）の薬物活性化の可能な機構を示す。ＡＡＣは抗体の抗原結合ドメイン（Ｆａｂ）を介して細胞外細菌に結合し、Ｆｃ媒介貪食作用を介したオプソニン化細菌の取り込みを促進する。リンカーは、カテプシンＢなどのリソソームプロテアーゼによって切断される。リンカーの切断後、リンカーは加水分解され、ファゴリソソーム内に遊離抗生物質を放出する。遊離抗生物質は、同じ区画に存在する任意の予め内在化した細菌と共にオプソニン化及び貪食化細菌を死滅させる。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、セリン−アスパラギン酸（ＳＤＲ）タンパク質の態様を示す。
【図４Ａ】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓからの質量分析により明らかになったＳＤＲタンパク質のアライメントを示す。ＳＤＲ領域はハッチング線で示される。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ上に複数のＳＤＲタンパク質及びタンパク質当たり複数のエピトープが存在するため、ｒＦ１エピトープは存在量で表される。図４Ａは、配列番号２７として「ＳＤＳＤＳＤＳＤ」を開示する。
【図４Ｂ】ＳｄｇＡ及びＳｄｇＢによるＳＤＲタンパク質の段階的グリコシル化を示すモデルである。最初に、ＳｄｇＢはＧｌｃＮＡｃ部分をＳＤＲタンパク質上のＳＤ領域上に付加し、その後、ＳｄｇＡによりさらにＧｌｃＮＡｃ修飾を行う。ｍＡｂ  ｒＦ１のエピトープは、ＳｄｇＢ依存ＧｌｃＮＡｃ部分を含む。データは、ｒＦ１がＧｌｃＮａｃ及びＳＤ骨格の部分に結合することを示唆する。図４Ｂは、配列番号２８として「ＳＤＳＤＳＤ」を開示する。
【図５】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、ｍＡｂ  ｒＦ１がＳ．ａｕｒｅｕｓ細菌への確実な結合及びその死滅を呈することを示す。（図Ａ〜Ｃ）細菌は、ｈｕＩｇＧ１  ｍＡｂｓ  ｒＦ１（四角）、４６７５抗ＣｌｆＡ（三角）、または抗ヘルペスウイルスｇＤ（丸）でプレオプソニン化された。
【図５Ａ】ｍＡｂのＷＴ（ＵＳＡ３００−Δｓｐａ）細菌への結合はフローサイトメトリーで評価され、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表される。
【図５Ｂ】ＣＦＳＥ標識されたプレオプソニン化ＷＴ（ＵＳＡ３００−Δｓｐａ）細菌をヒトＰＭＮと共にインキュベートした。細菌取り込みは、フローサイトメトリーによるＣＤ１１ｂ陽性細胞のゲーティング後のＣＦＳＥ陽性ＰＭＮの％として表された。
【図５Ｃ】細菌死滅を評価するために、プレオプソニン化ＷＴ（ＵＳＡ３００−Δｓｐａ）細菌をＰＭＮと共にインキュベートした。１ｍＬ当たりの生存可能なＣＦＵの数は、少なくとも３つの実験を代表する。
【図６】様々な感染組織からのｒＦ１のＳ．ａｕｒｅｕｓへの結合のフローサイトメトリー分析を示す。均質化組織をｍＡｂ  ｒＦ１（Ｘ軸）及び抗ペプチドグリカンｍＡｂ  ７０２で２重染色し、組織破片（Ｙ軸）と細菌を区別し（左側のバネル；ゲートは矢印で示される）、その後、ヒストグラム図を生成するために細菌をゲーティングする（Ｈａｚｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ９（１０）：１−１８、図１Ｄも参照されたい）。
【図７】フローサイトメトリーによるｒＦ１の様々なＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ及び非Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌグラム陽性細菌種への結合を示す（Ｈａｚｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ９（１０）：１−１８、図１Ｅも参照されたい）。
【図８】非複製ＭＲＳＡを死滅させるその能力に対する強力なリファマイシン型抗生物質（ｒｉｆａｌｏｇ）ジメチルピペＢＯＲの選択を示す。
【図９】成長阻害アッセイは、抗生物質がカテプシンＢを用いた処理によって放出されない限り、インタクトなＴＡＣ（ＡＡＣの形態）がプランクトン細菌を死滅させないことを示す。ＴＡＣを、緩衝剤のみと共にインキュベートする（白丸）か、またはカテプシンＢで処理した（黒丸）。インタクトなＴＡＣは、一晩インキュベートした後、細菌の成長を阻止できなかった。カテプシンＢでＴＡＣを予め処理することにより、０．００６ｕｇ／ｍＬの抗生物質を含有することが予想される０．６ｕｇ／ｍＬのＴＡＣで、細菌の成長を阻止するための十分な抗生物質活性が放出された。
【図１０】実施例１９に記載されるインビトロマクロファージアッセイにおけるｒＦ１−ＡＡＣの有効性を示す。
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂは、実施例２０に記載されるインビボでのｒＦ１−ＡＡＣの有効性を示す。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染マウスをｒＦ１−ＡＡＣで処置することにより、裸抗体と比較して、感染臓器における細菌数を大幅に減少または根絶した。
【図１１Ａ】抗体当たり２つの抗生物質分子を含有するＡＡＣ（ＡＡＲ２）で処置することにより、腎臓における細菌負荷が約３０倍減少し、抗体当たり４つの抗生物質分子を含有するＡＡＣ（ＡＡＲ４）で処置することにより、細胞負荷が３０，０００倍超減少したことを示す。
【図１１Ｂ】ＡＡＣ  ＡＡＲ２で処置することにより、心臓における細菌負荷が約７０倍減少し、８匹のマウス中６匹が心臓において検出不可能な細菌レベルを有し、ＡＡＣ  ＡＡＲ４で処置することにより、心臓における感染を完全に根絶し、結果として８匹のマウス中８匹が検出不可能な細菌レベルを有したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
ここで本発明のある特定の実施形態を詳細に参照するが、それらの例は、添付の構造及び式に例示される。本発明は、方法、材料、及び実施例を含む、列挙される実施形態と共に説明されるが、このような説明は非限定的であり、本発明は、それらが一般的に既知であるか、または本明細書に組み込まれるかに関わらず、全ての代替物、修正、及び等価物を網羅することが意図される。組み込まれる文献、特許、及び同様の資料のうちの１つ以上が、本出願（定義される用語、用語の用法、記載される技法等を含むがそれらに限定されない）と異なるか、または矛盾する場合は、本出願が優先される。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。当業者であれば、本発明の実施に使用することができる、本明細書に記載されるものに類似または同等である多数の方法及び材料を認識するであろう。本発明は、決して記載される方法及び材料に限定されるものではない。
【００３８】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
【００３９】
Ｉ．一般的な技法
本明細書に記載の、または参照される技法及び手順は、一般的に当業者に十分に理解され、従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））、シリーズのＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），ｅｄ．，１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、及びＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）に記載される広く利用されている方法論などを用いて通常使用されている。
【００４０】
本出願に使用される命名法は、別途示されない限り、ＩＵＰＡＣシステム命名法に基づく。別途定義されない限り、本明細書に使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有し、それらは、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、及びＪａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋと一致する。
【００４１】
ＩＩ．定義
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、本明細書において、手短にＳｔａｐｈ  ＡまたはＳ．ａｕｒｅｕｓとも称される。同様に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、本明細書において、Ｓｔａｐｈ  ＥまたはＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとも称される。
【００４２】
「抗体抗生物質抱合体」またはＡＡＣは、リンカーによって抗生物質に化学結合される抗体から構成される化合物である。抗体は、細菌表面、例えば細菌細胞壁構成成分上の抗原またはエピトープに結合する。本明細書で使用されるとき、リンカーは、大半の哺乳類細胞型に見られるリソソームプロテアーゼであるカテプシンＢを含む、プロテアーゼによって切断されるように設計されるプロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカーである（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１３：８５５−８６９）。その３つの構成成分を有するＡＡＣのダイヤグラムを図２に描写する。「ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗生物質抱合体」または「ＴＡＣ」は、抗体が、１つ以上のシステイン、一般的に、抗原結合機能に干渉しないように、抗体上の特定の部位（複数可）で抗体内に組換え操作されるシステインを介して、リンカー−抗生物質単位に化学的に抱合される、ＡＡＣの形態である。
【００４３】
置換基の数を示すとき、用語「１つ以上」は、１つの置換基から可能な限り高い数の置換の範囲、すなわち、１個の水素の置換から置換基による最大全ての水素の置換を指す。用語「置換基」は、親分子上の水素原子を置換する原子または原子の基を示す。用語「置換された」は、指定された基が１つ以上の置換基を有することを示す。任意の基が複数の置換基を有し、様々な可能な置換基が提供される場合、置換基は独立して選択され、同じである必要はない。用語「置換されない」は、指定された基が置換基を有しないことを意味する。用語「任意選択で置換される」は、指定された基が置換されないか、または１つ以上の置換基により置換され、可能な置換基の群から独立して選択されることを意味する。置換基の数を示すとき、用語「１つ以上」は、１つの置換基から可能な限り高い数の置換、すなわち、１個の水素の置換から置換基による最大全ての水素の置換を意味する。
【００４４】
用語「抗生物質」（ａｂｘまたはＡｂｘ）は、具体的には、細菌などの微生物の成長を阻害する、またはそれを死滅させるが、投与される濃度及び投薬間隔で宿主に非致死性である、任意の分子を含む。特定の態様では、抗生物質は、投与される濃度及び投薬間隔で宿主に非毒性である。細菌に対して有効な抗生物質は、殺菌（すなわち、直接死滅させる）または静菌（すなわち、分裂を阻止する）のいずれかとして広く分類することができる。抗菌性抗生物質は、狭域または広域としてさらに分類することができる。広域抗生物質は、グラム陽性及びグラム陰性細菌の両方を含む広範囲の細菌に対して有効なものであり、対照的に、狭域抗生物質は、小さい範囲または特定のファミリーの細菌に対して有効である。抗生物質の例としては、（ｉ）アミノグリコシド、例えば、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、パロマイシン、（ｉｉ）アンサマイシン、例えば、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、（ｉｉｉ）カルバセフェム、例えば、ロラカルベフ、（ｉｖ）カルバペネム、例えば、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム、（ｖ）セファロスポリン（第１世代）、例えば、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファレキシン、（ｖｉ）セファロスポリン（第２世代）、例えば、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、（ｖｉ）セファロスポリン（第３世代）、例えば、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチドキシム、セフトリアキソン、（ｖｉｉ）セファロスポリン（第４世代）、例えば、セフェピム、（ｖｉｉｉ）セファロスポリン（第５世代）、例えば、セフトビプロール、（ｉｘ）糖ペプチド、例えば、テイコプラニン、バンコマイシン、（ｘ）マクロライド、例えば、アキシスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スペクチノマイシン、（ｘｉ）モノバクタム、例えば、アクストレオナム、（ｘｉｉ）ペニシリン、例えば、アモキシシリン、アンピシリン、アキシロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン、ペペラシリン、チカルシリン、（ｘｉｉｉ）抗生物質ポリペプチド、例えば、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、（ｘｉｖ）キノロン、例えば、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、レメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、（ｘｖ）スルホンアミド、例えば、マフェニド、プロントジル、スルファセタミド、スルファメチゾール、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（ＴＭＰ−ＳＭＸ）、（ｘｖｉ）テトラサイクリン、例えば、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、及び（ｘｖｉｉ）アルスペナミン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、エタンブトール、ホスホマイシン、フシジン酸、フラゾリドン、イソニアジド、リネゾリド、メトロニダゾール、ムピロシン、ニトロフラントイン、プラテンシマイシン、ピラジナミド、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、リファンピン／リファンピシン、またはチニダゾールなどのその他が挙げられる。
【００４５】
あるいは多剤耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓまたはオキサシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＯＲＳＡ）として知られる、用語「メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ」（ＭＲＳＡ）は、ペニシリン（例えば、メチシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、オキサシリン等）及びセファロスポリンを含む、ベータ−ラクタム系抗生物質に耐性である任意のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株を指す。「メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ」（ＭＳＳＡ）は、ベータ−ラクタム系抗生物質に感受性である任意のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株を指す。
【００４６】
用語「最小発育阻止濃度」（「ＭＩＣ」）は、一晩インキュベートした後の微生物の視認できる成長を阻害する抗菌の最小濃度を指す。ＭＩＣを決定するためのアッセイは既知である。方法の１つが以下の実施例のセクションにおいて説明される。
【００４７】
用語「抗Ｓｔａｐｈ抗体」及び「Ｓｔａｐｈに結合する抗体」は、抗体が標的Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ」）における診断及び／または治療薬として有用であるように、十分な親和性でＳ．ａｕｒｅｕｓ上の抗原に結合することが可能な抗体を指す。一実施形態では、抗Ｓｔａｐｈ抗体の無関係の非Ｓｔａｐｈタンパク質への結合の程度は、例えば放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）により測定されたとき、抗体のＭＲＳＡへの結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、Ｓｔａｐｈに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５Ｎｍ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗Ｓｔａｐｈ抗体は、異なる種からのＳｔａｐｈ間で保存されているＳｔａｐｈのエピトープに結合する。本明細書の抗Ｓｔａｐｈ抗体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに加えて、少なくとも１つ以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ種に結合する抗体を指す。
【００４８】
「ＳＤＲ」はセリン−アスパラギン酸リピートを指し、ＳＤＲは、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉに存在する付着性Ａドメインに隣接するセリン−アスパラギン酸ジペプチドリピートの大きな広がりを特徴とする、細胞壁タンパク質のファミリーに存在する（Ｆｏｓｔｅｒ  ＴＪ，Ｈｏｏｋ  Ｍ（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６：４８４−４８８）。付着に関与するこのようなタンパク質は、クリンピング因子である（Ｃｌｆ）Ａ及びＣｌｆＢを含む。ＣｌｆＡ及びＣｌｆＢに加えて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓはＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、及びＳｄｒＥの３つのＳＤＲタンパク質も発現する。このファミリーの追加の３つのメンバーであるＳｒｄＦ、ＳｄｒＧ、及びＳｄｒＨは、大半のＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株に存在する（ＭｃＣｒｅａ  ＫＷ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｈｅ  ｓｅｒｉｎｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｒｅｐｅａｔ  （Ｓｄｒ）ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６（Ｐｔ  ７）：１５３５−１５４６）。これらのタンパク質の各々において、２５〜２７５ＳＤジペプチドリピートを含有するＳＤＲ領域（配列番号２４）は、Ｎ末端リガンド結合ＡドメインとＣ末端ＬＰＸＴＧモチーフ（配列番号２５）との間に位置する。
【００４９】
「Ｆ１」と呼ばれる抗体は、ＵＳ８，６１７，５５６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図１に描写される重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列を有する。特にＦ１の抗原結合特性に寄与するＦ１のＣＤＲ配列も図１に描写される。抗体Ｆ１は、完全ヒトであり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓなどのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種に特異的に結合することができる。重要なことには、抗体Ｆ１はインビボならびにインビトロで全細菌に結合することができる。さらに、抗体Ｆ１は、例えば動物の感染組織において成長した細菌に結合することができる。組換え産生されたＦ１は、本明細書において「ｒＦ１」とも呼ばれる。ｒＦ１（及びＦ１）抗体は抗ＳＤＲモノクローナルＡｂである。ｍＡｂ  ｒＦ１のエピトープは、ＳｄｇＢ依存ＧｌｃＮＡｃ部分を含む。データは、ｒＦ１がＧｌｃＮａｃ及びＳＤ骨格の一部に結合することを示唆する。本明細書において使用される「ｒＦ１抗体」は、Ｆ１抗体、ｒＦ１抗体、ならびにｒＦ１に対するｒＦ１含有アミノ酸改変の全ての変異形を包含する。ｒＦ１及びバリアンド抗体のアミノ酸配列は以下に提供される。
【００５０】
本明細書において、用語「抗体」は、最も広義に使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及びこれらの抗原結合抗体断片を網羅する（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７０：４８５４−４８６１）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラ、または他の種に由来するものであっても良い。抗体は、特定の抗原を認識し、それに結合することができる免疫系により生成されたタンパク質である（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。標的抗原は一般に、複数の抗体のＣＤＲによって認識される多数の結合部位（エピトープとも呼ばれる）を有する。異なるエピトープに特異的に結合する各抗体は異なる構造を有する。よって、１つの抗原は２つ以上の対応する抗体によって認識され、結合され得る。抗体には、完全長免疫グロブリン分子、または完全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、対象の標的抗原またはその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子が含まれ、そのような標的には、癌細胞、または自己免疫疾患、感染細胞、若しくは細菌などの微生物と関連する自己免疫抗体を産生する細胞が含まれるがこれらに限定されない。本明細書に開示される免疫グロブリン（Ｉｇ）は、ＩｇＭ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）及びサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２を除く任意のイソ型のものであってよい。免疫グロブリンは、任意の種に由来し得る。一態様では、Ｉｇは、ヒト、マウス、またはウサギ起源のものである。特定の実施形態では、Ｉｇはヒト起源のものである。
【００５１】
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つの主要な抗体クラスがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。免役グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００５２】
「未変性抗体」は、様々な構造を有する、自然発生免役グロブリン分子を指す。例えば、未変性ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｄｏｍａｉｎ）または重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｄｏｍａｉｎ）または軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて定常軽（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの型うちの１つに割り付けられ得る。
【００５３】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書において、未変性抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように互換的に使用される。
【００５４】
抗体の「抗原結合断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、１本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書に使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は同一であり、かつ／または同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生の変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、可能な変異形抗体は例外であり、このような変異形は、通常少量で存在する。ＩｇＧ１抗体のこのような可能な変異形の１つは重鎖定常領域のＣ末端リジン（Ｋ）の切断である。異なる決定基（エピトープ）に指向される異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物中の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に指向される。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に同種の抗体の集団から得られるときの抗体の特徴を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技法によって作製することができ、このような方法及びモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法が本明細書に記載される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体が混入することなく合成することができるという点で、有利である。
【００５６】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／または軽鎖の一部分が特定の源または種に由来する一方で、重鎖及び／または軽鎖の残りの部分は異なる源または種に由来する抗体を指す。
【００５７】
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生された、またはヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体に対応するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に除外する。
【００５８】
「ヒト化抗体」は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、そのＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでも良い。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【００５９】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原に結合することに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。未変性抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は一般に、同様の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照されたい。）抗原結合特異性を付与するためには、単一のＶＨまたはＶＬドメインで十分であり得る。さらに、抗原に結合する抗体のＶＨまたはＶＬドメインを使用して、それぞれ、相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングして、特定の抗原に結合する抗体を単離しても良い。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７  （１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８  （１９９１）を参照されたい。
【００６０】
用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」または「ＨＶ」は、本明細書で使用されるとき、配列中で超可変（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）であり、かつ／または構造的に定義されたループを形成し、かつ／または抗原接触残基（「抗原接触体」）を含有する、抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、このうち３つがＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にあり、３つがＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。未変性抗体では、Ｈ３及びＬ３は、６つのＨＶＲの中で最大の多様性を示し、特にＨ３は、抗体に微細特異性を付与することにおいて固有の役割を果たすと考えられる。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５（２０００）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１−２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）を参照されたい。実際に、重鎖のみからなる自然発生ラクダ抗体は、軽鎖の不在下で機能的であり安定している（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８、Ｓｈｅｒｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３−７３６）。
【００６１】
いくつかのＨＶＲ描写が本明細書において使用され、ここに包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づくものであり、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造的ループの位置に言及する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）。抗原接触体に関しては、ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）を参照されたい。ＡｂＭ  ＨＶＲは、ＫａｂａｔのＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａの構造的ループとの間の妥協点を示し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲの各々からの残基を以下に記載する。
0006751393.tif 000003
【００６２】
ＨＶＲは、次の「拡張型ＨＶＲ」を含み得る：ＶＬ内の２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７または８９〜９６（Ｌ３）、ならびにＶＨ内の２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５若しくは４９〜６５（Ｈ２）、及び９３〜１０２、９４〜１０２、または９５〜１０２（Ｈ３）。別途示されない限り、可変ドメインにおけるＨＶＲ残基、ＣＤＲ残基、及び他の残基（例えばＦＲ残基）は、本明細書において、Ｋａｂａｔら（上記）に従い番付される。
【００６３】
「Ｋａｂａｔにあるような可変ドメイン残基番付」または「Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置番付」という表現、及びそれらの変形形態は、Ｋａｂａｔら（上記）における抗体の編成において重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用されている番付方式を指す。この番付システムを用いると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲの短縮またはそこへの挿入に対応して、より少ないかまたは追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）、及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、及び，８２ｃ等）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番付は、抗体の配列と「標準的な」Ｋａｂａｔ番付配列との相同性の領域でアライメントすることによって、所与の抗体に関して決定され得る。
【００６４】
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは一般に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲの配列は一般に、ＶＨ（またはＶＬ）の次の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００６５】
本明細書における目的に関して、「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、またはそれはアミノ酸配列変化を含有しても良い。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。いくつかの実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００６６】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンのＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において、最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンのＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の下位集団からである。一般に、配列の下位集団は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３にあるような下位集団である。一実施形態では、ＶＬに関して、下位集団は、Ｋａｂａｔら（上記）にあるような下位集団カッパＩである。一実施形態では、ＶＨに関して、下位集団は、Ｋａｂａｔら（上記）にあるような下位集団ＩＩＩである。
【００６７】
本明細書における用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、未変性配列のＦｃ領域及び変異形Ｆｃ領域を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１）に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番付システムに従う残基４４７）は、例えば、抗体の産生若しくは精製の間に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組換え操作することによって、除去され得る。したがって、インタクトな抗体の組成物は、全Ｋ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されない抗体集団、及びＫ４４７残基を有する抗体と有しない抗体との混合物を有する抗体集団を含み得る。用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」はまた、胎児への母体ＩｇＧの移入に関与する、新生児型受容体であるＦｃＲｎも含む。Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４）。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は既知である（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：（１２）：５９２−８（１９９７）、Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５（７）：６３７−４０（１９９７）、Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３−６（２００４）、ＷＯ第２００４／９２２１９号（Ｈｉｎｔｏｎら）を参照されたい）。インビボでのＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス若しくは形質移入されたヒト細胞系において、または変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチドが投与される霊長類においてアッセイすることができる。ＷＯ２００４／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）は、ＦｃＲへの結合を向上または減少させた抗体変異形を記載している。また、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）も参照されたい。
【００６８】
「親和性成熟」抗体は、変化を保有しない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）において１つ以上の変化を有し、このような変化によって抗原に対する抗体の親和性が改善される、抗体を指す。
【００６９】
用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原分子上の特定の部位を指す。
【００７０】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断する抗体、及び逆に、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断する参照抗体を指す。例示的な競合アッセイは、本明細書に提供される。
【００７１】
「裸抗体」は、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）または放射標識に抱合されない抗体を指す。裸抗体は、薬学的製剤中に存在し得る。
【００７２】
「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプにより異なる抗体のＦｃ領域に起因し得るそれらの生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、貪食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
【００７３】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用」またはＡＤＣＣは、ある特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に分泌型Ｉｇが結合することにより、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞に特異的に結合し、次いで細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする、細胞傷害性の形態を指す。抗体は細胞障害性細胞を「備え」ており、この機構による標的細胞の死滅に必要である。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、Ｆｃγ（ガンマ）ＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、Ｆｃγ（ガンマ）ＲＩ、Ｆｃγ（ガンマ）ＲＩＩ、及びＦｃγ（ガンマ）ＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２  （１９９１）の頁４６４の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、ＵＳ５，５００，３６２またはＵＳ５，８２１，３３７に記載されるものなどのインビトロＡＤＣＣアッセイを行っても良い。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的に、または追加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるものなどの動物モデルにおいて評価されても良い。
【００７４】
「貪食作用」は、病原体が宿主細胞（例えば、マクロファージまたは好中球）によって貪食または内在化されるプロセスを指す。貪食細胞は、（ｉ）直接細胞表面受容体（例えば、レクチン、インテグリン、及びスカベンジャー受容体）、（ｉｉ）補体オプソニン化病原体に結合し、それを摂取するために補体受容体（Ｃ３ｂ、ＣＲ３、及びＣＲ４の受容体であるＣＲＩを含む）を使用する、強化された補体、及び（ｉｉｉ）後に内在化され、リソソームと縮合してファゴリソソームとなる抗体オプソニン化粒子に結合するためにＦｃ受容体（ＦｃγｇａｍｍａＲＩ、ＦｃγｇａｍｍａＲＩＩＡ、及びＦｃγｇａｍｍａＲＩＩＩＡ）を使用する、強化された抗体の３つの経路により貪食作用を媒介する。本発明において、経路（ｉｉｉ）が抗ＭＲＳＡ  ＡＡＣ治療薬を感染白血球、例えば、好中球及びマクロファージに送達する際に重要な役割を果たすと考えられている（Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ：ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｉｎ  Ａｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｄ．Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ａ  Ｏｚｉｎｓｋｙ．（２００２）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  ２０：８２５）。
【００７５】
「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下における標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の構成成分が、同種抗原に結合した（適切なサブクラスの）抗体に結合することによって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されるＣＤＣアッセイを行っても良い。
【００７６】
ＦＣ領域に結合された炭水化物を変化させても良い。哺乳類細胞によって産生される未変性抗体は、典型的に、一般的にＮ−結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に結合される、分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２を参照されたい。オリゴ糖には、種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」においてＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＩｇＧにおけるオリゴ糖の修飾は、ある特定のさらに改善された特性を有するＩｇＧを作製するために行われ得る。例えば、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合したフコースを欠いている炭水化物構造を有する、抗体修飾が提供される。このような修飾は改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、ＵＳ２００３／０１５７１０８（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、ＵＳ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体修飾に関連する刊行物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞系の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｅ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、Ａｌ，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、及びＷＯ２００４／０５６３１２  Ａｌ、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．、特に実施例１１）、及びアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞系（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）、及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照されたい）が挙げられる。
【００７７】
「単離された抗体」は、その天然環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ法（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％超または９９％超の純度まで精製される。抗体の純度の評価のための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。
【００７８】
「単離された核酸」は、核酸分子がその天然環境の構成成分から分離されたものを指す。単離された核酸には、核酸分子が、その核酸分子を通常含有する細胞内に含有されたものが含まれるが、この核酸分子は、染色体外に、またはその天然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００７９】
「ｒＦ１抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする１つ以上の核酸分子を指し、それには単一のベクターまたは別個のベクターにおいてこのような核酸分子（複数可）が含まれ、このような核酸分子（複数可）は、宿主細胞内の１つ以上の場所に存在する。
【００８０】
本明細書で使用されるとき、用語「に特異的に結合する」または「に対して特異的」であるは、生体分子を含む分子の異種集団の存在下で標的の存在を決定する、標的と抗体との間の結合などの測定可能かつ再現可能な相互作用を指す。例えば、標的（これはエピトープであり得る）に特異的に結合する抗体は、他の標的に結合するよりも高い親和性、結合力で、より容易に、及び／またはより長い持続時間でこの標的に結合する抗体である。一実施形態では、ｒＦ１に無関係の標的への抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定されたとき、抗体の標的への結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ｒＦ１に特異的に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗体は、異なる種から保存されるエピトープに特異的に結合する。別の実施形態では、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、それを必要としない。
【００８１】
「結合親和性」は一般に、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合相互作用の総計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する、本来の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般に、抗原をゆっくり結合し、容易に解離する傾向にあるが、高親和性抗体は一般に、抗原により速く結合し、より長く結合を維持する傾向にある。結合親和性の様々な測定方法は当該技術分野において既知であり、それらのいずれかが本発明の目的ために使用することができる。結合親和性を測定するための具体的な例証的及び例示的な実施形態が、以下に記載される。
【００８２】
一実施形態では、本発明による「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、以下のアッセイに記載されるように、対象の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて行われる放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、Ｆａｂを、未標識抗原の一連の滴定の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と平衡化し、次いで抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートと結合した抗原を捕捉することによって、測定される（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１を参照されたい）。アッセイの条件を確立するために、マイクロタイタープレート（ＤＹＮＥＸ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、室温（約２３℃）で、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンにより２〜５時間遮断する。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ  ＃２６９６２０）中で、１００ｐＭまたは２６ｐＭ［１２５Ｉ］−抗原を、対象のＦａｂの段階希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。対象のＦａｂを次いで一晩インキュベートするが、インキュベーションは、平衡が確実に達成されるようにより長い期間（例えば、約６５時間）継続しても良い。その後、混合物を、室温でインキュベーションするために（例えば１時間）捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、プレートを、ＰＢＳ中０．１％のＴＷＥＥＮ−２０（商標）界面活性剤で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計測する。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイで使用するために選択する。
【００８３】
別の実施形態によると、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用した表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、２５℃で、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて測定される。簡潔に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示に従いＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈した後、結合したタンパク質が約１０応答単位（ＲＵ）を達成するように、５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して、未反応基を遮断する。速度論的測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、２５℃で、約２５μｌ／分の流速で、０．０５％ＴＷＥＥＮ  ２０（商標）界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合センサグラムと解離センサグラムとを同時に当てはめることによって計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによるオン速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、このオン速度は、ストップフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを備える８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計において測定される、漸増濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または低下を測定する、蛍光消光技法を使用することによって決定することができる。
【００８４】
本発明による「オン速度」、「会合の速度」、「会合速度」、または「ｋｏｎ」も、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、上述のように決定され得る。
【００８５】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞系」、及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外来性の核酸が導入された細胞を指し、これにはこのような細胞の子孫が含まれる。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、一次形質転換細胞、及び継代の数に関係なくそれに由来する子孫が含まれる。子孫は核酸含量において親細胞と完全に同一でなくてもよいが、変異を含み得る。元々形質転換された細胞においてスクリーニング若しくは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する変異体子孫が、本明細書に含まれる。
【００８６】
本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、それが結合されている別の核酸を増殖することが可能な核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクターならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。ある特定のベクターは、それらが動作可能に結合された核酸の発現を指向することが可能である。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
【００８７】
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントし、配列同一性最大パーセントを得るために、必要な場合、ギャップを導入した後に、及びいかなる保存的置換も配列同一性の部分として考慮せずに、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、当該技術分野における技術の範囲内の様々な方式で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大のアライメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントするために適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のため、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成され、ソースコードは、ユーザ文書と共に米国著作権局（Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９に提出されており、米国著作権番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に利用可能であるか、またはソースコードから編集されてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するために編集すべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、変更はない。
【００８８】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に使用される場合、所与のアミノ酸配Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対するアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有する、または含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することができる）は、次のように計算される：分率Ｘ／Ｙの１００倍、ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて完全一致として評価されたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの総アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なることが理解されるであろう。別途指定のない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％の値は、記載されるように得られる。
【００８９】
用語「リファマイシン型抗生物質」は、リファマイシンの構造、またはそれに類似する構造を有する抗生物質のクラスまたは群を意味する。
【００９０】
用語「リファラジル型抗生物質」は、リファラジルの構造、またはそれに類似する構造を有する抗生物質のクラスまたは群を意味する。
【００９１】
置換基の数を示すとき、用語「１つ以上」は、１つの置換基から可能な限り高い数の置換の範囲、すなわち、１個の水素の置換から置換基による最大全ての水素の置換を指す。用語「置換基」は、親分子上の水素原子を置換する原子または原子の基を示す。用語「置換された」は、指定された基が１つ以上の置換基を有することを示す。任意の基が複数の置換基を有し、様々な可能な置換基が提供される場合、置換基は独立して選択され、同じである必要はない。用語「置換されない」は、指定された基が置換基を有しないことを意味する。用語「任意選択で置換される」は、指定された基が置換されないか、または１つ以上の置換基により置換され、可能な置換基の群から独立して選択されることを意味する。置換基の数を示すとき、用語「１つ以上」は、１つの置換基から可能な限り高い数の置換、すなわち、１個の水素の置換から置換基による最大全ての水素の置換を意味する。
【００９２】
本明細書で使用されるとき、用語「アルキル」は、１〜１２個の炭素原子（Ｃ１-Ｃ１２）の飽和直鎖状または分岐鎖の一価の炭化水素ラジカルを指し、このアルキルラジカルは、任意選択で、独立して以下に記載される１つ以上の置換基で置換され得る。別の実施形態では、アルキルラジカルは、１〜８個の炭素原子（Ｃ１-Ｃ８）、または１〜６個の炭素原子（Ｃ１-Ｃ６）である。アルキル基の例としては、メチル（Ｍｅ、−ＣＨ３）、エチル（Ｅｔ、−ＣＨ２ＣＨ３）、１−プロピル（ｎ−Ｐｒ、ｎ−プロピル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−プロピル（ｉ−Ｐｒ、ｉ−プロピル、−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１−ブチル（ｎ−Ｂｕ、ｎ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−１−プロピル（ｉ−Ｂｕ、ｉ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−ブチル（ｓ−Ｂｕ、ｓ−ブチル、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−Ｂｕ、ｔ−ブチル、−Ｃ（ＣＨ３）３）、１−ペンチル（ｎ−ペンチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、１−ヘキシル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３））、２−メチル−２−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、４−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−３−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、２，３−ジメチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３，３−ジメチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（ＣＨ３）３、１−ヘプチル、１−オクチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
本明細書で使用されるとき、用語「アルキレン」は、１〜１２個の炭素原子（Ｃ１-Ｃ１２）の飽和直鎖状または分岐鎖の二価の炭化水素ラジカルを指し、このアルキレンラジカルは、任意選択で、独立して以下に記載される１つ以上の置換基で置換され得る。別の実施形態では、アルキレンラジカルは、１〜８個の炭素原子（Ｃ１-Ｃ８）、または１〜６個の炭素原子（Ｃ１-Ｃ６）である。アルキレン基の例としては、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（-ＣＨ２ＣＨ２-）、プロピレン（-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２-）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
用語「アルケニル」は、少なくとも１つの不飽和部位、すなわち、炭素−炭素のｓｐ２２重結合を有する２〜８個の炭素原子（Ｃ２-Ｃ８）の直鎖状または分岐鎖の一価の炭化水素ラジカルを指し、このアルケニルラジカルは、任意選択で、独立して、本明細書に記載される１つ以上の置換基で置換され得、「シス」及び「トランス」配向、ないしは別の方法で「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有するラジカルを含む。例としては、エチレニルまたはビニル（-ＣＨ=ＣＨ２）、アリル（-ＣＨ２ＣＨ=ＣＨ２）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
用語「アルケニレン」は、少なくとも１つの不飽和部位、すなわち、炭素−炭素のｓｐ２２重結合を有する２〜８個の炭素原子（Ｃ２-Ｃ８）の直鎖状または分岐鎖の二価の炭化水素ラジカルを指し、このアルケニレンラジカルは、任意選択で、独立して、本明細書に記載される１つ以上の置換基で置換され得、「シス」及び「トランス」配向、ないしは別の方法で「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有するラジカルを含む。例としては、エチレニレンまたはビニレン（-ＣＨ=ＣＨ-）、アリル（-ＣＨ２ＣＨ=ＣＨ-）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
用語「アルキニル」は、少なくとも１つの不飽和部位、すなわち、炭素−炭素のｓｐ３重結合を有する２〜８個の炭素原子（Ｃ２-Ｃ８）の直鎖状または分岐の一価の炭化水素ラジカルを指し、このアルキニルラジカルは、任意選択で、独立して、本明細書に記載される１つ以上の置換基で置換され得る。例としては、エチニル（−Ｃ≡
ＣＨ）、プロピニル（プロパルギル、−ＣＨ２Ｃ≡
ＣＨ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
用語「アルキニレン」は、少なくとも１つの不飽和部位、すなわち、炭素−炭素のｓｐ３重結合を有する２〜８個の炭素原子（Ｃ２-Ｃ８）の直鎖状または分岐の二価の炭化水素ラジカルを指し、このアルキニレンラジカルは、任意選択で、独立して、本明細書に記載される１つ以上の置換基で置換され得る。例としては、エチニレン（−Ｃ≡
Ｃ−）、プロピニレン（プロパルギレン、−ＣＨ２Ｃ≡
Ｃ−）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
用語「炭素環」、「カルボシクリル」、「炭素環式環」、及び「シクロアルキル」は、単環式環として３〜１２個の炭素原子（Ｃ３-Ｃ１２）、または二環式環として７〜１２個の炭素原子を有する、一価の非芳香族の飽和若しくは部分不飽和環を指す。７〜１２個の原子を有する二環式炭素環は、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］、または［６，６］系として配置され得、９〜１０個の環原子を有する二環式炭素環は、ビシクロ［５，６］若しくは［６，６］系として、またはビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［２．２．２］オクタン、及びビシクロ［３．２．２］ノナンなどの架橋系として配置され得る。スピロ部分もこの定義の範囲内に含まれる。単環式炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペント−１−エニル、１−シクロペント−２−エニル、１−シクロペント−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロへクス−１−エニル、１−シクロへクス−２−エニル、１−シクロへクス−３−エニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロウンデシル、シクロドデシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。カルボシクリル基は、任意選択で、独立して、本明細書に記載される１つ以上の置換基で置換される。
【００９９】
「アリール」は、親芳香族環系の１個の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって生じる６〜２０個の炭素原子（Ｃ６-Ｃ２０）の一価の芳香族炭化水素ラジカルを意味する。いくつかのアリール基は、例示的な構造において「Ａｒ」と表される。アリールは、飽和、部分不飽和環、または芳香族の炭素環式環に縮合された芳香族環を含む二環式ラジカルを含む。典型的なアリール基は、ベンゼン（フェニル）、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル、インデニル、インダニル、１，２−ジヒドロナフタレン、１，２，３，４−テトラヒドロナフチルに由来するラジカルを含むが、これらに限定されない。アリール基は、任意選択で、独立して、本明細書に記載される１つ以上の置換基で置換される。
【０１００】
「アリーレン」は、親芳香族環系の２個の炭素原子から２個の水素原子を除去することによって生じる６〜２０個の炭素原子（Ｃ６-Ｃ２０）の二価の芳香族炭化水素ラジカルを意味する。いくつかのアリーレン基は、例示的な構造において「Ａｒ」と表される。アリーレンは、飽和、部分不飽和環、または芳香族の炭素環式環に縮合された芳香族環を含む二環式ラジカルを含む。典型的なアリーレン基は、ベンゼン（フェニレン）、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニレン、インデニレン、インダニレン、１，２−ジヒドロナフタレン、１，２，３，４−テトラヒドロナフチルなどに由来するラジカルを含むが、これらに限定されない。アリーレン基は、任意選択で、本明細書に記載される１つ以上の置換基で置換される。
【０１０１】
用語「複素環」、「ヘテロシクリル」、及び「複素環式環」は、本明細書において、互換的に使用され、少なくとも１つの環原子が窒素、酸素、リン、及び硫黄から選択されるヘテロ原子であり、残りの環原子がＣである（ここで、１つ以上の環原子は、任意選択で、独立して、以下に記載される１つ以上の置換基で置換される）、３〜約２０個の環原子の飽和または部分不飽和（すなわち、環内に１つ以上の２重及び／または３重結合を有する）炭素環式環ラジカルを指す。複素環は、３〜７環員（２〜６個の炭素原子、ならびにＮ、Ｏ、Ｐ、及びＳから選択される１〜４個のヘテロ原子）を有する単環、または７〜１０環員（４〜９個の炭素原子、ならびにＮ、Ｏ、Ｐ、及びＳから選択される１〜６個のヘテロ原子）を有する二環、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］、または［６，６］系であり得る。複素環は、Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｌｅｏ  Ａ．；“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６８）、特に１、３、４、６、７、及び９章、“Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ”（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９５０  ｔｏ  ｐｒｅｓｅｎｔ）、特に、１３、１４、１６、１９、及び２８巻、ならびにＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６０）８２：５５６６に記載されている。「ヘテロシクリル」は、複素環ラジカルが飽和、部分不飽和環、または芳香族炭素環式若しくは複素環式の環と縮合するラジカルも含む。複素環式環の例としては、モルホリン−４−イル、ピペリジン−１−イル、ピペラジニル、ピペラジン−４−イル−２−オン、ピペラジン−４−イル−３−オン、ピロリジン−１−イル、チオモルホリン−４−イル、Ｓ−ジオキソチオモルホリン−４−イル、アゾカン−１−イル、アゼチジン−１−イル、オクタヒドロピリド［１，２−ａ］ピラジン−２−イル、［１，４］ジアゼパン−１−イル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チオキサニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、インドリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリジニルイミダゾリニル、イミダゾリジニル、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニル、アザビシクロ［２．２．２］ヘキサニル、３Ｈ−インドリル  キノリジニル、及びＮ−ピリジル尿素が挙げられるが、これらに限定されない。スピロ部分もこの定義の範囲内に含まれる。２個の環原子がオキソ（＝Ｏ）部分で置換される複素環式基の例は、ピリミジノニル及び１，１−ジオキソ−チオモルホリニルである。本明細書において、複素環基は、任意選択で、独立して、本明細書に記載される１つ以上の置換基で置換される。
【０１０２】
用語「ヘテロアリール」は、５、６、または７員環の一価の芳香族ラジカルを指し、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される１つ以上のヘテロ原子を含有する、５〜２０個の原子の縮合環系（そのうちの少なくとも１つは芳香族である）を含む。ヘテロアリール基の例は、ピリジニル（例えば２−ヒドロキシピリジニルを含む）、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、ピリミジニル（例えば４−ヒドロキシピリミジニル）、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソキサゾリル、チアゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、シンノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンズオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、及びフロピリジニルである。ヘテロアリール基は、任意選択で、独立して、本明細書に記載される１つ以上の置換基で置換される。
【０１０３】
複素環またはヘテロアリール基は、可能な場合、炭素（炭素結合）または窒素（窒素連結）結合され得る。例として、及び限定されないが、炭素結合複素環またはヘテロアリールは、ピリジンの２、３、４、５、または６位で、ピリダジンの３、４、５、または６位で、ピリミジンの２、４、５、または６位で、ピラジンの２、３、５、または６位で、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロール、若しくはテトラヒドロピロールの２、３、４、または５位で、オキサゾール、イミダゾール、若しくはチアゾールの２、４、または５位で、イソキサゾール、ピラゾール、若しくはイソチアゾールの３、４、または５位で、アジリジンの２または３位で、アゼチジンの２、３、または４位で、キノリンの２、３、４、５、６、７、または８位で、あるいはイソキノリンの１、３、４、５、６、７、または８位で結合される。
【０１０４】
例として、及び限定されないが、窒素結合複素環またはヘテロアリールは、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２−ピロリン、３−ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２−イミダゾリン、３−イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２−ピラゾリン、３−ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、１Ｈ−インダゾールの１位で、イソインドールまたはイソインドリンの２位で、モルホリンの４位で、及びカルバゾールまたはβ−カルボリンの９位で結合される。
【０１０５】
「代謝産物」は、特定の化合物またはその塩の体部において代謝により産生される産物を指す。化合物の代謝産物は、当該技術分野において既知の慣用的な技法を用いて特定することができ、それらの活性は、本明細書に記載されるものなどの試験を用いて決定することができる。このような産物は、例えば、投与される化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、脱アミド化、エステル化、脱エステル化、酵素的切断などから生じ得る。したがって、本発明は、その代謝産物を生じるのに十分な期間の間、本発明の式Ｉの化合物を哺乳動物と接触させることを含むプロセスによって産生された化合物を含む、本発明の化合物の代謝産物を含む。
【０１０６】
用語「薬学的製剤」は、その中に含有される活性成分の生物活性が有効になる様な形態であり、製剤が投与されるであろう対象に許容できないほど毒性である追加構成成分を含有しない調製物を指す。
【０１０７】
「減菌」製剤は、無菌であるか、または全ての生存微生物及びそれらの胞子を含まない。
【０１０８】
「安定した」製剤は、本明細書のタンパク質が本質的に保管時にその物理的及び化学的安定性ならびに完全性を維持するものである。タンパク質の安定性を測定するための様々な分析技法は当該技術分野において利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）に概説されている。安定性は、選択された時間期間の間、選択された温度で測定され得る。迅速なスクリーニングにおいて、製剤は、４０℃で、２週間〜１ヶ月間維持され得、その時間安定性が測定される。製剤が２〜８℃で保管される場合、一般的に、製剤は、３０℃または４０℃で少なくとも１ヶ月間安定している、及び／または２〜８℃で少なくとも２年間安定しているべきである。製剤が３０℃で保管される場合、一般的に、製剤は、３０℃で少なくとも２年間安定している、及び／または４０℃で少なくとも６ヶ月間安定しているべきである。例えば、保管中の凝集の程度は、タンパク質の安定性の指標として使用することができる。よって、「安定している」製剤は、約１０％未満、好ましくは約５％未満のタンパク質が製剤中に凝集体として存在するものであって良い。他の実施形態では、製剤の保管中の凝集体の形成における任意の増加を決定することができる。
【０１０９】
「等張性」製剤は、本質的にヒトの血液と同じ浸透圧を有するものである。等張性製剤は一般に、約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。用語「低張性」は、ヒトの血液よりも低い浸透圧を有する製剤を説明するものである。対応して、用語「高張性」は、ヒトの血液よりも高い浸透圧を有する製剤を説明するものである。等張性は、例えば、蒸気圧または製氷型浸透圧計を用いて測定することができる。本発明の製剤は、塩及び／または緩衝剤の添加の結果として高張性である。
【０１１０】
本明細書で使用されるとき、「担体」は、使用される投薬量及び濃度でそれに曝される細胞または哺乳動物に非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。多くの場合、生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１１１】
「薬学的に許容される担体」は、対象に非毒性である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。「薬学的に許容される酸」は、それらが製剤化される濃度及び様式で非毒性である無機酸及び有機酸を含む。例えば、好適な無機酸は、塩酸、過塩素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、スルホン酸、スルフィン酸、スルファニル酸、リン酸、炭酸などを含む。好適な有機酸は、直鎖状及び分岐鎖アルキル、芳香族、環状脂環式、アリール脂肪族、複素環式、飽和、不飽和、モノ、ジ−、及びトリカルボン酸を含み、例えば、ギ酸、酢酸、２−ヒドロキシ酢酸、トリフルオロ酢酸、フェニル酢酸、トリメチル酢酸、ｔ−ブチル酢酸、アントラニル酸、プロパン酸、２−ヒドロキシプロパン酸、２−オキソプロパン酸、プロパン二酸、シクロペンタンプロピオン酸、シクロペンタンプロピオン酸、３−フェニルプロピオン酸、ブタン酸、ブタン二酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、２−アセトキシ−安息香酸、アスコルビン酸、桂皮酸、ラウリル硫酸、ステアリン酸、ムコン酸、マンデル酸、コハク酸、エンボン酸、フマル酸、リンゴ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、マロン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、グリコール酸、グルコン酸、ピルビン酸、グリオキサル酸、シュウ酸、メシル酸、コハク酸、サリチル酸、フタル酸、パモ酸、パルモイン酸、パルメイン酸、チオシアン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼン（ｃｈｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ）スルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ［２．２．２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、４，４’−メチレンビス−３−（ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、ヒドロキシナフトエ酸を含む。
【０１１２】
「薬学的に許容される塩基」は、それらが製剤化される濃度及び様式で非毒性である無機塩基及び有機塩基を含む。例えば、好適な塩基は、無機塩基形成金属、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム、Ｎ−メチルグルカミン、モルホリン、ピペリジン、ならびに第１級、第２級、及び第３級アミンを含む有機非毒性塩基、置換アミン、環状アミン、ならびにイオン交換樹脂［例えば、Ｎ（Ｒ’）４＋（ここで、Ｒ’は独立してＨまたはＣ１−４アルキル、例えばアンモニウム、トリスである）］、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などから形成されたものを含む。特に好ましい有機非毒性塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、及びカフェインである。
【０１１３】
本発明と共に使用可能な追加の薬学的に許容される酸及び塩基は、アミノ酸に由来するもの、例えば、ヒスチジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、及びアスパラギンを含む。
【０１１４】
「薬学的に許容される」緩衝剤及び塩は、上記の酸及び塩基の酸及び塩基添加塩両方に由来するものを含む。具体的な緩衝剤及び／または塩は、ヒスチジン、コハク酸塩、及び酢酸塩を含む。
【０１１５】
「薬学的に許容される糖」は、対象のタンパク質と組み合わされるとき、保管時にタンパク質の化学的及び／または物理的不安定性を大幅に阻止または減少させる分子である。製剤が凍結乾燥され、後に再構築される場合、「薬学的に許容される糖」は、「凍結乾燥防止剤」として知られる場合もある。例示的な糖及びそれらの対応する糖アルコールは、グルタミン酸ナトリウムまたはヒスチジンなどのアミノ酸；ベタインなどのメチルアミン；硫酸マグネシウムなどの離液塩；三価以上の分子量の糖アルコール、例えば、グリセリン、デキストラン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールなどのポリオール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）；ならびにこれらの組み合わせを含む。追加の例示的な凍結乾燥防止剤は、グリセリン及びゼラチン、ならびに糖類（メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオース、及びスタキオース）を含む。還元糖の例としては、グルコース、マルトース、ラクトース、マルツロース、イソ−マルツロース、及びラクツロースが挙げられる。非還元糖の例としては、糖アルコール及び他の直鎖ポリアルコールから選択されるポリヒドロキシ化合物の非還元グリコシドが挙げられる。好ましい糖アルコールは、モノグリコシド、特にラクトース、マルトース、ラクツロース、及びマルツロースなどの二糖の還元により得られたそれらの化合物である。グリコシド側基は、グリコシドまたはガラクトシドのいずれかであり得る。糖アルコールの追加の例は、グルシトール、マルチトース、ラクチトース、及びイソ−マルツロースである。好ましい薬学的に許容される糖は、非還元糖のトレハロースまたはスクロースである。薬学的に許容される糖は、タンパク質が保管中（例えば、再構築後及び保管）に本質的にその物理的及び化学的安定性ならびに完全性を維持することを意味する「保護量」（例えば凍結乾燥前）で製剤に添加される。
【０１１６】
本明細書の対象の「希釈剤」は、薬学的に許容される（ヒトへの投与に安全で非毒性）であり、凍結乾燥後に再構築される製剤などの液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な希釈剤としては、減菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、減菌生理食塩溶液、リンゲル液、またはデキストロース溶液が挙げられる。代替の実施形態では、希釈剤は、塩及び／または緩衝剤の水溶液を含み得る。
【０１１７】
「防腐剤」は、細菌の活性を減少させるために、本明細書の製剤に添加され得る化合物である。防腐剤の添加は、例えば、多用途（多用量）製剤の生産を容易にし得る。可能性のある防腐剤の例としては、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が直鎖化合物である塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）、及び塩化ベンゼトニウムが挙げられる。防腐剤の他の種類には、フェノール、ブチル、及びベンジルアルコールなどの芳香族アルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが含まれる。本明細書において最も好ましい防腐剤はベンジルアルコールである。
【０１１８】
「個体」、「対象」、または「患者」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びゲッパ類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、個体または対象は、ヒトである。
【０１１９】
本明細書で使用されるとき、「治療」（及び「治療する」または「治療すること」など、その文法上の変化形）は、臨床病理過程中に治療される個体、組織、または細胞の自然経過を変化させるように設計された臨床介入を指す。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患進行速度の低下、疾患状態の回復または緩和、及び寛解または予後の改善が含まれ、全て医師などの当業者によって測定可能である。一実施形態では、治療は、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、感染疾患の進行速度の低下、疾患状態の回復または緩和、及び寛解または予後の改善を意味し得る。いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＣ及びＴＡＣは、疾患の発達を遅延する、または感染疾患の進行を緩徐する、または血流ならびに／若しくは感染組織及び臓器における細菌負荷を減少させるために使用される。
【０１２０】
本明細書で使用されるとき、「と共に」は、１つの治療様式を別の治療様式に加えて施すことを指す。そのため、「と共に」は、１つの治療様式を、他方の治療様式を施す前に、施している間に、または施した後に、個体に施すことを指す。
【０１２１】
用語「菌血症」は、血液培養を通して最も一般的に検出される血流中の細菌の存在を指す。細菌は、重度の感染の合併症として（肺炎または髄膜炎）、外科手術中（特に消化管などの粘膜を伴う場合）、または動脈若しくは静脈に入るカテーテル及び他の異物により、血流に入る場合がある。いくつかの結果が菌血症によりもたらされる場合がある。細菌に対する免疫応答が敗血症及び敗血症性ショックをもたらす場合があり、これは比較的高い死亡率を有する。細菌は、身体の他の部分に拡散するのに血液を使用することもでき、感染の元の部位から離れて感染を引き起こす。例としては心内膜炎または骨髄炎が挙げられる。
【０１２２】
「治療有効量」は、特定の障害の測定可能な改善をもたらすのに必要とされる最低限の濃度である。本明細書における治療有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに個体において所望の応答を誘起する抗体の能力などの要因によって変動し得る。治療有効量は、治療上有益な効果が、抗体の任意の毒性または悪影響を上回るものでもある。一実施形態では、治療有効量は、インビボ感染における菌血症を減少させるのに有効な量である。一態様では、「治療有効量」は、血液などの患者の試料から単離された細菌負荷またはコロニー形成単位（ＣＦＵ）を、薬物の投与前と比べて少なくとも１対数分減少させるのに少なくとも有効な量である。より具体的な態様では、減少は少なくとも２対数である。別の態様では、減少は、少なくとも３、４、５対数である。また別の態様では、減少は、本明細書において例示されるアッセイを含む、当該技術分野において既知のアッセイを使用して検出可能レベルより下である。別の実施形態では、治療有効量は、感染患者の治療前または治療の開始時の陽性血液培養と比較して、陰性血液培養（すなわち、ＡＡＣの標的である細胞が成長しない）を達成する、治療期間の過程にわたって与えられる１回以上の用量のＡＡＣの量である。
【０１２３】
「予防的有効量」は、所望の予防結果を達成するために必要な投薬量及び時間期間に有効な量を指す。典型的であって、必ずしもそうではないが、予防量は、疾患の前、その早期段階で、またはさらには感染のリスクが上昇する状態に曝される前に対象に使用されるため、予防的有効量は、治療有効量より少なくてもよい。一実施形態では、予防的有効量は、感染を減少させる、その発生、または１つの細胞から別の細胞への感染の拡散を阻止するのに少なくとも有効な量である。
【０１２４】
「長期」投与は、長期間の間、初期の治療効果（活性）を維持するために、短期モードとは対照的に連続して薬剤（複数可）を投与することを指す。「断続的」投与は、中断しないが、むしろ実際には周期的である、連続的に行われない治療である。
【０１２５】
用語「添付文書」は、治療用製品の市販のパッケーに慣例的に含まれる指示書を指して使用され、これにはこのような治療用製品の適応症、使用、投薬量、投与、併用療法、禁忌、及び／またはその使用に関する注意事項についての情報が含まれる。
【０１２６】
用語「キラル」は、鏡像パートナーの重ね合せできない（ｎｏｎ−ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓａｂｉｌｉｔｙ）特性を有する分子を指す一方で、用語「アキラル」は、それらの鏡像パートナーと重ね合せできる（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓａｂａｂｌｅ）分子を指す。
【０１２７】
用語「立体異性体」は、同一の化学構成を有するが、空間内の原子または基の配置に関して異なる化合物を指す。
【０１２８】
「ジアステレオマー」は、２つ以上のキラル性の中心を有し、それらの分子が互いの鏡像ではない、立体異性体を指す。ジアステレオマーは、異なる物理特性、例えば、融点、沸点、スペクトル特性、及び反応性を有する。ジアステレオマーの混合物は、電気泳動法及びクロマトグラフィーなどの高分解能分析手順の下で分離され得る。
【０１２９】
「鏡像異性体」は、互いに重ね合せできない鏡像である、化合物の２つの立体異性体を指す。
【０１３０】
本明細書で使用される立体化学的な定義及び慣例は、一般に、Ｓ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（１９８４）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＥｌｉｅｌ，Ｅ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（１９９４）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに従う。多くの有機化合物は、光学活性形態で存在し、すなわち、それらは、平面偏光の平面を回転させる能力を有する。光学活性化合物を説明する際、接頭辞Ｄ及びＬ、またはＲ及びＳは、そのキラル中心（複数可）の周りの分子の絶対配置を表すように使用される。接頭辞ｄ及びｌまたは（＋）及び（−）は、化合物による平面偏光の回転の徴候を表記するために使用され、このうち（−）または１は、化合物が左旋性であることを意味する。（＋）またはｄの接頭辞を有する化合物は、右旋性である。所与の化学構造について、これらの立体異性体は、それらが互いの鏡像であることを除いて同一である。特定の立体異性体はまた、鏡像異性体とも称され得、このような異性体の混合物は、しばしば鏡像異性体混合物と呼ばれる。鏡像異性体の５０：５０混合物は、ラセミ混合物またはラセミ体と称され、それらは、化学反応またはプロセスにおいて立体選択または立体特異性が存在していない場合に生じ得る。用語「ラセミ混合物」及び「ラセミ体」は、光学活性を欠く２つの鏡像異性体種の等モル混合物を指す。
【０１３１】
用語「保護基」は、特定の官能性を、化合物上の他の官能基を反応させながら、遮断するまたは保護するために一般的に使用される置換基を指す。例えば、「アミノ保護基」は、化合物中のアミノ官能性を遮断するまたは保護する、アミノ基に結合した置換基である。好適なアミノ保護基には、アセチル、トリフルオロアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、及び９−フルオレニルメチレンオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）が含まれるが、これらに限定されない。保護基の一般的な説明及びそれらの使用については、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１、またはより新しい版を参照されたい。
【０１３２】
本明細書で使用されるとき、用語「約」は、当業者であれば容易に分かるそれぞれの値に対する通常の誤差範囲を指す。本明細書において「約（ａｂｏｕｔ）」ある値またはパラメータへの参照は、その値またはパラメータ自体を対象とした実施形態を含む（及び記載する）。
【０１３３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈により別様に明確に示されない限り、複数形を含む。例えば、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」への参照は、モル量などの１つの抗体から多くの抗体に対する参照であり、当業者に既知のその同等物を含む。
【０１３４】
ＩＩＩ．組成物及び方法
抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）
本明細書において、実験結果は、細胞内細菌の排除を目的とした療法が臨床的成功を改善することを強く示している。この目的に向かって、本発明は、宿主細胞の細胞内区画を浸潤したＳ．ａｕｒｅｕｓ生物を選択的に死滅させる独特な療法を提供する。本発明は、このような療法がバンコマイシンのような従来の抗生物質が機能しないインビボモデルにおいて有効であることを示す。
【０１３５】
本発明は、従来の抗生物質療法を逃れる細菌集団を標的とすることにより、抗生物質回避を阻止することを目的とする抗菌療法を提供する。新規抗菌療法は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡを含む）に見られる細胞壁構成成分に特異的なｒＦ１抗体が強力なリファマイシン型抗生物質（リファマイシンの誘導体）に化学結合される抗体抗生物質抱合体（ＡＡＣ）を用いて達成される。リファマイシン型抗生物質は、大半の哺乳類細胞型に見られるリソソームプロテアーゼであるカテプシンＢを含む、プロテアーゼによって切断されるように設計されるプロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカーを介して抗体に結合される（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１３：８５５−８６９）。その３つの構成成分を有するＡＡＣのダイヤグラムを図２に描写する。いずれか１つの理論に限定されるものではないが、ＡＡＣの一作用機構を図３に図示する。ＡＡＣは、リンカーが切断されるまでリファマイシン型抗生物質が不活性である（抗体のサイズが大きいため）という点でプロドラッグとして機能する。自然感染に見られるかなりの割合のＳ．ａｕｒｅｕｓが宿主における感染の経過中のある時点で宿主細胞、主に好中球及びマクロファージによって取り込まれるため、宿主細胞内で過ごす時間が抗生物質活性を逃れる大きな機会を細菌に提供する。本発明のＡＡＣは、Ｓｔａｐｈ細菌に結合し、細菌が宿主細胞によって取り込まれた後にファゴリソソーム内で抗生物質を放出するように設計される。この機構により、ＡＡＣは、特にＳ．ａｕｒｅｕｓが従来の抗生物質によって十分に治療されなかった場所で活性抗生物質を濃縮することができる。本発明は特定の作用機構により限定または定義されないが、ＡＡＣは、以下の３つの可能な機構を介して抗生物質の活性を改善する：（１）ＡＡＣは細菌を取り込む哺乳類細胞内に抗生物質を送達し、それにより細菌が隔離されるファゴリソソーム内に十分に拡散しない抗生物質の効力を増加させる。（２）ＡＡＣは細菌をオプソニン化し、それにより貪食細胞による遊離細菌の取り込みを増加させ、細菌がファゴリソソーム内に隔離されている間に、それらを死滅させるために局所的に抗生物質を放出する。数千のＡＡＣが単一の細菌に結合することができるため、このプラットホームは、最大抗菌死滅を持続するために、これらの細胞内環境に十分な抗生物質を放出する。さらに、より多くの細菌が既存細胞内貯蔵所から放出されるため、この抗体に基づく療法の迅速なオン速度は、細菌が隣接するまたは遠隔の細胞に逃れる前にこれらの細菌への即時「タグ付け」を確実にし、よって感染のさらなる拡散を軽減する。（３）ＡＡＣは、血清から迅速に排除される抗生物質と比較して、抗生物質を抗体に結合することによりインビボにおける抗生物質の半減期を改善する（改善された薬物動態）。改善されたＡＡＣの薬物動態は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓが濃縮される領域への十分な抗生物質の送達を可能にする一方で、全身投与される必要がある全体的な抗生物質の用量を制限する。この特性は、抗生物質の副作用を最小限に抑えながら、持続感染を標的とするＡＡＣでの長期療法を可能にするはずである。
【０１３６】
本発明の抗体−抗生物質抱合体化合物は、組換えによって導入されたシステインを介して、プロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカーによってリファマイシン型抗生物質に共有結合された抗ＳＤＲ抗体を含む。
【０１３７】
例示的な実施形態では、抗ＳＤＲ抗体（例えばｒＦ１抗体）は、組換えにより導入されたシステインアミノ酸を含むシステイン改変抗体である。
【０１３８】
例示的な実施形態では、プロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカーは、ｒＦ１の抗ＳＤＲ抗体上の組換えにより導入されたシステインを介してリファマイシン型抗生物質に共有結合される。
【０１３９】
例示的な実施形態は、下式：
Ａｂ−（ＰＭＬ−ａｂｘ）ｐ
を有し、式中、
Ａｂは、ｒＦ１抗体であり、
ＰＭＬは、下式：
−Ｓｔｒ−ＰＭ−Ｙ−
（式中、Ｓｔｒはストレッチャー単位であり、ＰＭはペプチド模倣単位であり、Ｙはスペーサー単位である）を有するプロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカーであり、
ａｂｘが、リファマイシン型抗生物質であり、
ｐが１〜８の整数である、抗体−抗生物質抱合体である。
【０１４０】
リファマイシン型抗生物質はリファラジル型抗生物質であり得る。
【０１４１】
リファマイシン型抗生物質は、プロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカーに結合される第４級アミンを含み得る。
【０１４２】
抗体−抗生物質抱合体の例示的な実施形態は、式Ｉ：
0006751393.tif 000004
Ｉ
を有し、式中、
破線が、任意選択の結合を示し、
Ｒが、Ｈ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、またはＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、
Ｒ１がＯＨであり、
Ｒ２がＣＨ＝Ｎ-（ヘテロシクリル）であり、ヘテロシクリルが、任意選択で、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、Ｃ１-Ｃ１２ヘテロアリール、Ｃ２-Ｃ２０ヘテロシクリル、Ｃ６-Ｃ２０アリール、及びＣ３-Ｃ１２カルボシクリルから独立して選択される１つ以上の基で置換されるか、
あるいはＲ１及びＲ２が、５員若しくは６員縮合ヘテロアリールまたはヘテロシクリルを形成し、任意選択で、スピロ若しくは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環を形成し、スピロ若しくは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環が、任意選択で、置換Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、またはＯＨであり、
ＰＭＬが、Ｒ２に結合されたプロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカー、またはＲ１及びＲ２により形成された縮合ヘテロアリール若しくはヘテロシクリルであり、
ＡｂがｒＦ１抗体である。
【０１４３】
反応性リンカー部分を介して抗体分子に抱合され得る抗生物質部分の数は、本明細書に記載される方法によって導入される遊離システイン残基の数によって制限される。例示的なＡＡＣは、１、２、３、または４個の改変システインアミノ酸を有する抗体を含む（Ｌｙｏｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．５０２：１２３−１３８）。
【０１４４】
ＭＲＳＡに対して効果的な標的であるように、エピトープは、好ましくは、大量に存在し、感染中に安定して発現され、全ての臨床ＭＲＳＡ株において高度に保存されている。ｒＦ１抗体は、これらの要件を満たし、加えて、Ｓｔａｐｈ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにも結合する。
【０１４５】
抗ＳＤＲ及びｒＦ１抗体
抗ＳＤＲ抗体は、Ｆ１抗体の生成に関して以下に記載されるように産生することができる。ｒＦ１、ＳＤ２、ＳＤ３、及びＳＤ４を含む抗ＳＤＲ抗体のいくつかの例が本明細書に提供される。
【０１４６】
ここではｒＦ１  Ａｂが詳細に記載される。
【０１４７】
ｒＦ１抗体は完全にヒトであり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓなどのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種に特異的に結合することができる。重要なことには、ｒＦ１はインビボならびにインビトロで全細菌に結合することができる。さらに、抗体ｒＦ１は、例えば動物の感染組織において成長した細菌に結合することができる。本明細書に提供されるｒＦ１  Ａｂまたはその機能的等価物は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ表面タンパク質ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、及びＳｄｒＥに結合することができる。
【０１４８】
表４Ａ及び表４Ｂは、親抗体Ｆ１、ｒＦ１抗体、及びその変異形のＨ鎖及びＬ鎖のＣＤＲ配列のアライメントを示す。Ｆ１及びｒＦ１は、ＦＷ１及びＬＣ  ＣＤＲ３の配列において異なる（ＱＨＹＸＲＦＰＹＴ、ここで、ＸはＩまたはＭ（配列番号２６）であり得る。Ｆ１はＩ（配列番号６）であり、ｒＦ１はＭ（配列番号７）である）。
表４Ａ：重鎖ＣＤＲ配列
0006751393.tif 000005
表４Ｂ：軽鎖ＣＤＲ配列
0006751393.tif 000006
【０１４９】
一実施形態では、Ｈ及びＬ鎖フレームワーク（ＦＲ）配列は以下の通りである：
0006751393.tif 000007
【０１５０】
安定性及び機能性を改善するために、様々なアミノ酸修飾がｒＦ１に対して行われた。ＨＣ  ＣＤＲ２において、第４残基ＮをＳに変更することによってＮＧ脱アミン化部位が排除され、よって抗体の安定性を改善する。ＴＶの修復は、ｒＦ１に存在する重度の抗体凝集を排除するためにＬＣ骨格に対して行われた。
【０１５１】
本発明の治療用ＡＡＣを形成するための抱合に関して、完全四量体抗体を形成するために以下のＨ鎖及びＬ鎖の対合を行うことができる。囲み部分は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列である。導入されたシステイン（Ｃ）は下線が引かれている。太字の残基は、親Ｆ１に対するアミノ酸の変更である。Ｌ鎖において、太字「ＲＴＶ」の後のＡは、定常領域の第１残基である。Ｈ鎖におけるＫａｂａｔ１１４位の下線が引かれたＣから定常領域が始まる。
【０１５２】
１Ａ及び２Ａにおいて、Ｃカッパの末端近くのａａ  ２０５に改変Ｃｙｓを有する配列番号９の完全長（ＦＬ）Ｌ鎖は、配列番号１０（Ｃｙｓなし）のＦＬ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖と対合される。この抗体は、リンカー−抗生物質単位に抱合してＡＡＣを形成するために、各Ｌ鎖上に１つずつ、２つのＣｙｓ部位を有する。
１Ａ．ｒＦ１−Ｖ２０５Ｃ  ＦＬ軽鎖
0006751393.tif 000008
２Ａ．ｒＦ１．ｖ１  ＦＬ重鎖（Ｃｙｓなし）、ｒＦ１−Ｖ２０５Ｃ軽鎖とＣｙｓ２０５の対
0006751393.tif 000009
【０１５３】
２Ａを有する１Ｂにおいて、改変Ｃｙｓ  ２０５を有する配列番号１１のｒＦ１．ｖ６  Ｌ鎖は、配列番号１０（Ｃｙｓなし）のＦＬ  ＩｇＧ１  Ｈ鎖と対合される。この抗体は、リンカー−抗生物質単位に抱合するために、各Ｌ鎖上に１つずつ、２つのＣｙｓ部位を有する。
１Ｂ．ｒＦ１．ｖ６−Ｖ２０５Ｃ軽鎖
0006751393.tif 000010
【０１５４】
２Ｂを有する１Ｂにおいて、Ｌ鎖及びＨ鎖の各々は改変Ｃｙｓを有し、よって、四量体抗体は最大４つのＡＡＲ（抗生物質：抗体比）を有し得る。
２Ｂ．Ｃｙｓ１１４（１１４  Ｋａｂａｔ番付または１１８−Ｅｕ番付）を有するｒＦ１．ｖ１  ＦＬ重鎖
0006751393.tif 000011
ｒＦ１．ｖ１  Ｈ鎖可変領域
0006751393.tif 000012
ｒＦ１  Ｌ鎖可変領域
0006751393.tif 000013
ｒＦ１．ｖ６  Ｌ鎖可変領域
0006751393.tif 000014
【０１５５】
ｒＦ１を含む抗ＳＤＲ  Ａｂは、システインに置き換えられたシステイン以外の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、システイン以外の少なくとも１つのアミノ酸は、軽鎖２０５位でバリンであり、かつ／または軽鎖１１０位でバリンであり、かつ／または重鎖１１４位でアラニンであり、ここで、アミノ酸番付はＫａｂａｔ  （１９９１）に従い、これはＥＵ番付変換によると１１８位と同じである。
【０１５６】
リファマイシン型抗生物質部分
本発明の抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）の抗生物質部分（ａｂｘ）は、リファマイシン型抗生物質または細胞傷害性若しくは細胞分裂抑制作用を有する基である。リファマイシンは、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉの細菌により自然に、または人工的のいずれかにより得られる抗生物質の群である。それらは、細菌ＲＮＡポリメラーゼを阻害し（Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１４８９−１４９２、Ｆｅｋｌｉｓｔｏｖ，ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０５（３９）：１４８２０−５）、グラム陽性及び選択的グラム陰性細菌に対して効力を有する、より大きなアンサマイシンファミリーのサブクラスである。リファマイシンは、マイコバクテリアに対して特に有効であり、したがって、結核、ハンセン病、及びマイコバクテリウム・アビウムコンプレックス（ＭＡＣ）感染症を治療するために使用される。リファマイシン型の群には、「古典的な」リファマイシン薬物ならびにリファマイシン誘導体であるリファンピシン（リファンピン，ＣＡ  Ｒｅｇ．Ｎｏ．１３２９２−４６−１）、リファブチン（ＣＡ  Ｒｅｇ．Ｎｏ．７２５５９−０６−９；ＵＳ２０１１／０１７８００１）、リファペンチン、及びリファラジル（ＣＡ  Ｒｅｇ．Ｎｏ．１２９７９１−９２−０，Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  １２（２）：２５５−２７１、Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８：１１１８−１１２２が含まれる。多くのリファマイシン型抗生物質は、耐性の発現という好ましくない特性を共有する（Ｗｉｃｈｅｌｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４７：１５３−１５６）。リファマイシンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉの発酵培養物から１９５７年に最初に単離された。約７つのリファマイシンが発見され、リファマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、及びＳＶ（ＵＳ  ３１５００４６）と命名された。リファマイシンＢは、１９６０年代に最初に商業的に導入され、薬物耐性結核の治療に有用であった。リファマイシンは、多くの疾患の治療に使用されてきたが、最も重要なものはＨＩＶ関連結核である。多数の利用可能な類似体及び誘導体のため、リファマイシンは一般的に使用される抗生物質に耐性となった病原菌の排除に広く利用されてきた。例えば、リファンピシンは、薬物耐性を阻止するその強い作用及び能力に関して知られている。これは、急速に分裂する桿菌株、ならびにそれらが抗生物質の活性を逃れることを可能にする長期間の間生物学的に不活性のままである「生残菌」細胞を迅速に死滅させる。加えて、リファブチン及びリファペンチンは両方とも、ＨＩＶ陽性患者が獲得した結核に対して使用されてきた。
【０１５７】
式Ｉの抗体−抗生物質抱合体の抗生物質部分（ａｂｘ）はリファマイシン型部分であり、下式：
0006751393.tif 000015
を有するリファマイシン型部分であり、式中、
破線が、任意選択の結合を示し、
Ｒが、Ｈ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、またはＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、
Ｒ１がＯＨであり、
Ｒ２はＣＨ＝Ｎ-（ヘテロシクリル）であり、ヘテロシクリルは、任意選択で、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、Ｃ１-Ｃ１２ヘテロアリール、Ｃ２-Ｃ２０ヘテロシクリル、Ｃ６-Ｃ２０アリール、及びＣ３-Ｃ１２カルボシクリルから独立して選択される１つ以上の基で置換されるか、
あるいはＲ１及びＲ２が、５員若しくは６員縮合ヘテロアリールまたはヘテロシクリルを形成し、任意選択で、スピロ若しくは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環を形成し、このスピロ若しくは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環が、任意選択で、置換Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、またはＯＨであり、
非ペプチド性リンカーＰＭＬがＲ２に共有結合される。
【０１５８】
リファマイシン型部分の実施形態は、
0006751393.tif 000016
であり、式中、
Ｒ３が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから独立して選択され、Ｒ４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、及びＯＨから選択され、Ｚが、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１-Ｃ１２アルキル）、Ｏ、及びＳから選択され、非ペプチド性リンカーＰＭＬが、Ｎ（Ｒ３）２の窒素原子に共有結合される。
【０１５９】
リファンピシン型部分の実施形態は、
0006751393.tif 000017
であり、式中、
Ｒ５が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから選択され、非ペプチド性リンカーＰＭＬが、ＮＲ５の窒素原子に共有結合される。
【０１６０】
リファブチン型部分の実施形態は、
0006751393.tif 000018
であり、式中、Ｒ５が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから選択され、非ペプチド性リンカーＰＭＬが、ＮＲ５の窒素原子に共有結合される。
【０１６１】
ベンゾオキサジノリファマイシン型部分の実施形態は、
0006751393.tif 000019
であり、式中、Ｒ５が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから選択され、非ペプチド性リンカーＰＭＬが、ＮＲ５の窒素原子に共有結合される。
【０１６２】
本明細書においてピペＢＯＲ（ｐｉｐＢＯＲ）と称されるベンゾオキサジノリファマイシン型部分の実施形態は、
0006751393.tif 000020
であり、式中、Ｒ３が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから独立して選択され、非ペプチド性リンカーＰＭＬが、Ｎ（Ｒ３）２の窒素原子に共有結合される。
【０１６３】
本明細書においてジメチルピペＢＯＲと称されるベンゾオキサジノリファマイシン型部分の実施形態は、
0006751393.tif 000021
であり、式中、非ペプチド性リンカーＰＭＬが、Ｎ（ＣＨ３）２の窒素原子に共有結合される。
【０１６４】
半合成誘導体リファマイシンＳ、または還元ナトリウム塩形態リファマイシンＳＶは、いくつかのステップにおいてリファラジル型抗生物質に変換され、式中、Ｒが、ＨまたはＡｃであり、Ｒ３が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから独立して選択され、Ｒ４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、及びＯＨから選択され、Ｚが、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１-Ｃ１２アルキル）、Ｏ、及びＳから選択される（例えば、ＷＯ２０１４／１９４２４７の図２３Ａ及びＢならびに図２５Ａ及びＢを参照されたい）。ベンゾオキサジノ（Ｚ＝Ｏ）、ベンズチアジノ（Ｚ＝Ｓ）、ベンズジアジノ（Ｚ＝ＮＨ、Ｎ（Ｃ１-Ｃ１２アルキル）リファマイシンは、繰り返され得る（ＵＳ７２７１１６５）。置換基を含有するベンゾオキサジノリファマイシン（ＢＯＲ）、ベンズチアジノリファマイシン（ＢＴＲ）、及びベンズジアジノリファマイシン（ＢＤＲ）類似体は、ＵＳ７２７１１６５（この目的のため、参照により組み込まれる）の２８列目の式Ａに提供される番付スキームに従い番付される。「２５−Ｏ−脱アセチル」リファマイシンとは、２５位のアセチル基が除去されたリファマイシン類似体を意味する。この位置がさらに誘導体化される類似体は「２５−Ｏ−脱アセチル−２５−（置換基）リファマイシン」と称され、誘導体化基のこの命名法は完全な化合物名において「置換基」を置き換える。
【０１６５】
リファマイシン型抗生物質部分は、ＵＳ４６１０９１９、ＵＳ４９８３６０２、ＵＳ５７８６３４９、ＵＳ５９８１５２２、ＵＳ４８５９６６１、ＵＳ７２７１１６５、ＵＳ  ２０１１／０１７８００１、Ｓｅｌｉｇｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  １２：３０５−１３、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，（１９９３）４１：１４８、及びＷＯ２０１４／１９４２４７（その各々は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものに類似する方法によって合成することができる。リファマイシン型抗生物質部分は、標準的なＭＩＣインビトロアッセイを使用して、それらの最小阻害濃度（ＭＩＣ）を測定することにより、抗菌活性に関してスクリーニングされ得る（Ｔｏｍｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３７：６７）。
0006751393.tif 000022
【０１６６】
プロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカー
「プロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカー」（ＰＭＬ）は、１つ以上の抗生物質部分（ａｂｘ）及び抗体単位（Ａｂ）に共有結合して、式Ｉの抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）を形成する二官能性または多官能性部分である。ＡＡＣにおけるプロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカーは、リソソーム条件下を含む、細胞内プロテアーゼによる切断のための基材である。プロテアーゼは様々なカテプシン及びカスパーゼを含む。ＡＡＣの非ペプチド性リンカーの細胞内での切断は、抗細菌作用を有するリファマイシン型抗生物質を放出し得る。
【０１６７】
抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）は、抗生物質（ａｂｘ）及び抗体（Ａｂ）に結合するための反応性官能基を有するリンカー試薬またはリンカー抗生物質中間体を使用して便宜的に調製され得る。例示的な一実施形態では、システキン改変抗体（Ａｂ）のシステインチオールは、リンカー試薬、抗生物質部分、または抗生物質−リンカー中間体の官能基と結合を形成することができる。
【０１６８】
ＡＡＣのＰＭＬ部分は、１つのアミノ酸残基を含み得る。
【０１６９】
ＡＡＣのＰＭＬ部分は、ペプチド模倣単位を含む。
【０１７０】
一態様では、リンカー試薬またはリンカー抗生物質中間体は、抗体上に存在する求核性システインに反応性である求電子性基を有する反応部位を有する。抗体のシステインチオールは、リンカー試薬またはリンカー−抗生物質上の求電子性基と反応性であり、共有結合を形成する。有用な求電子性基としては、マレイミド及びハロアセトアミド基が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７１】
システイン改変抗体は、Ｋｌｕｓｓｍａｎ，ｅｔ  ａｌ（２００４），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５（４）：７６５−７７３の７６６頁の抱合方法及び実施例１８のプロトコルに従い、マレイミド若しくはα−ハロカルボニルなどの求電子性官能基を有するリンカー試薬またはリンカー−抗生物質中間体と反応する。
【０１７２】
別の実施形態では、リンカー試薬またはリンカー−抗生物質中間体の反応基は、抗体の遊離システインチオールと結合を形成することができるチオール−反応性官能基を含有する。チオール反応性官能基の例としては、マレイミド、α−ハロアセチル、活性化エステル、例えばスクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネート、及びイソチオシアネートが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７３】
別の実施形態では、リンカー試薬または抗生物質−リンカー中間体は、抗体上に存在する求電子基に反応性である求核基を有する反応性官能基を有する。抗体上の有用な求電子基には、ピリジルジスルフィド、アルデヒド及びケトンカルボニル基が含まれるが、これらに限定されない。リンカー試薬または抗生物質−リンカー中間体の求核基のヘテロ原子は、抗体上の求電子基と反応し、抗体単位と共有結合を形成することができる。リンカー試薬または抗生物質−リンカー中間体上の有用な求核基には、ヒドラジド、オキシム、アミノ、チオール、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジドが含まれるが、これらに限定されない。抗体上の求電子基は、リンカー試薬または抗生物質−リンカー中間体への結合のための都合のよい部位を提供する。
【０１７４】
ＰＭＬ部分は１つ以上のリンカー構成成分を含み得る。例示的なリンカー構成成分としては、シトルリン（「ｃｉｔ」）などの単一アミノ酸、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、及びｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（「（ＳＰＰ」）、及び４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（「ＭＣＣ」）が挙げられるが、これらに限定されない。様々なリンカー構成成分が当該技術分野において既知であり、このうちのいくつかを以下に記載する。
【０１７５】
別の実施形態では、リンカーは、溶解度または反応性を調節する基で置換されても良い。例えば、スルホネート（−ＳＯ３−）またはアンモニウムなどの荷電置換基は、試薬の水溶性を増加させ、リンカー試薬と抗体若しくは抗体部分とのカップリング反応を促進するか、またはＡＡＣを調製するために使用される合成経路により、Ａｂ−Ｌ（抗体−リンカー中間体）とａｂｘとのカップリング反応若しくはａｂｘ−Ｌ（抗生物質−リンカー中間体）とＡｂとのカップリング反応を促進しても良い。
【０１７６】
本発明のＡＡＣは、限定されないが、リンカー試薬：ＢＭＰＥＯ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）、及びビス−マレイミド試薬、例えば、ＤＴＭＥ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＭ（ＰＥＧ）２、及びＢＭ（ＰＥＧ）３を用いて調製されたものを明示的に想定する。ビス−マレイミド試薬は、連続または集中様式で、システイン改変抗体のチオール基の、チオール含有抗生物質部分、標識、またはリンカー中間体への結合を可能にする。システイン改変抗体、抗生物質部分、またはリンカー−抗生物質中間体のチオール基と反応性である、マレイミド以外の他の官能基には、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、及びイソチオシアネートが含まれる。
0006751393.tif 000023
【０１７７】
有用なリンカー試薬は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）などの他の商業的供給源から得るか、またはＴｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：１８６６−１８７２、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３８：５２５７−６０、Ｗａｌｋｅｒ，Ｍ．Ａ．（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：５３５２−５３５５、Ｆｒｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．７：１８０−１８６、ＵＳ６２１４３４５、ＷＯ０２／０８８１７２、ＵＳ２００３１３０１８９、ＵＳ２００３０９６７４３、ＷＯ０３／０２６５７７、ＷＯ０３／０４３５８３、及びＷＯ０４／０３２８２８に記載される手順に従って合成することもできる。
【０１７８】
別の実施形態では、ＡＡＣのＰＭＬ部分は、分岐した多官能性リンカー部分を通して２つ以上の抗生物質部分を抗体に共有結合するための樹状型リンカーを含む（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：２２１３−２２１５、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：１７６１−１７６８）。樹状リンカーは、ＡＡＣの効力に関連する、抗生物質の抗体に対するモル比、すなわち、負荷を増加させることができる。よって、システイン改変抗体が１つの反応性システインチオール基しか有さない場合、多数の抗生物質部分が樹状リンカーを通して結合されても良い。
【０１７９】
式ＩのＡＡＣのある特定の実施形態では、プロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカーＰＭＬは、下式：
−Ｓｔｒ−ＰＭ−Ｙ−
（式中、Ｓｔｒはストレッチャー単位であり、ＰＭはペプチド模倣単位であり、Ｙはスペーサー単位である）を有し、
ａｂｘが、リファマイシン型抗生物質であり、
ｐが１〜８の整数である。
【０１８０】
一実施形態では、ストレッチャー単位「Ｓｔｒ」は、下式：
0006751393.tif 000024
を有し、式中、Ｒ６が、Ｃ１−Ｃ１２アルキレン、Ｃ１−Ｃ１２アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ１−Ｃ１２アルキレン−ＮＨ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−Ｃ（＝Ｏ）、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２、及びＣ１−Ｃ１２アルキレン−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ（チオフェン−３−イル）からなる群から選択され、式中、ｒが１〜１０の範囲の整数である。
【０１８１】
例示的なストレッチャー単位は、以下に示される（式中、波線は抗体への共有結合の部位を示す）。
0006751393.tif 000025
【０１８２】
一実施形態では、ＰＭは、下式：
0006751393.tif 000026
を有し、式中、Ｒ７及びＲ８が一緒にＣ３−Ｃ７シクロアルキル環を形成し、
ＡＡが、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２から選択されるアミノ酸側鎖である。
【０１８３】
一実施形態では、スペーサー単位Ｙは、パラ−アミノベンジル（ＰＡＢ）またはパラ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）を含む。
【０１８４】
スペーサー単位は、別個に加水分解ステップを行うことなく、抗生物質部分の放出を可能にする。スペーサー単位は、「自壊型（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）」または「非自壊型」であり得る。ある特定の実施形態では、リンカーのスペーサー単位はｐ−アミノベンジル単位（ＰＡＢ）を含む。このような一実施形態では、ｐ−アミノベンジルアルコールは、ｐ−アミノベンジル基と抗生物質部分との間のアミド結合、カルバメート、メチルカルバメート、またはカーボネートを介してアミノ酸単位に結合される（Ｈａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ（２００５）１５：１０８７−１１０３）。一実施形態では、スペーサー単位は、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）である。
【０１８５】
一実施形態では、抗生物質は、非ペプチド性リンカーのＰＡＢスペーサー単位に結合されるとき、ジメチルアミノピペリジル基などの第４級アミンを含む。このような第４級アミンの例は、リンカー−抗生物質中間体（ＰＬＡ）（表２のＰＬＡ−１〜４）である。第４級アミン基は、抗生物質部分の切断を調節して、ＡＡＣの抗菌作用を最適化しても良い。別の実施形態では、抗生物質は、非ペプチド性リンカーのＰＡＢＣスペーサー単位に結合され、ＡＡＣにおいてカルバメート官能基を形成する。このようなカルバメート官能基はまた、ＡＡＣの抗菌作用を最適化しても良い。ＰＡＢＣカルバメートリンカー−抗生物質中間体（ＰＬＡ）の例は、表２のＰＬＡ−５及びＰＬＡ−６である。
【０１８６】
自壊性スペーサーの他の例としては、ＰＡＢ基に電子的に類似する芳香族化合物、例えば、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体（ＵＳ７３７５０７８、Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２３７）及びオルト−またはパラ−アミノベンジルアセタールが挙げられる、これらに限定されない。置換及び非置換４−アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２２３）、適切に置換されたビシクロ［２．２．１］及びビシクロ［２．２．２］環系（Ｓｔｏｒｍ  ｅｔ  ａｌ（１９７２）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：５８１５）、ならびに２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：５８６７）などの、アミド結合加水分解時に環化を受けるスペーサーを使用することができる。グリシンで置換されるアミン含有薬物の排除（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：１４４７）もまた、ＡＡＣに有用な自壊性スペーサーの例である。
【０１８７】
ＡＡＣの切断から放出される活性抗生物質の量は、カスパーゼ放出アッセイにより測定することができる。
【０１８８】
ＡＡＣに有用なリンカー−抗生物質中間体
式ＩＩ及び表２のＰＭＬリンカー−抗生物質中間体（ＰＬＡ）は、リファマイシン型抗生物質部分をリンカー試薬とカップリングすることによって調製された（実施例７〜１７）。リンカー試薬は、ＷＯ２０１２／１１３８４７、ＵＳ７６５９２４１、ＵＳ７４９８２９８、ＵＳ２００９０１１１７５６、ＵＳ２００９／００１８０８６、ＵＳ６２１４３４５、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３（４）：８５５−８６９に記載される方法により調製された。
表２  ＰＭＬリンカー−抗生物質中間体
0006751393.tif 000027
0006751393.tif 000028
【０１８９】
抗体−抗生物質抱合体の実施形態
システイン改変ｒＦ１抗体を、遊離システインチオール基を介して（ピペＢＯＲと称される）、他はプロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカーを介してリファマイシンの誘導体に結合して、表３の抗体−抗生物質抱合体化合物（ＡＡＣ）を形成した。リンカーは、カテプシンＢ、Ｄ、及びその他を含むリソソームプロテアーゼにより切断されるように設計される。抗生物質及びＰＭＬリンカーならびにその他からなるリンカー−抗生物質中間体の生成は、実施例７〜１７に詳細に記載される。リンカーは、ＰＡＢ部分でのアミド結合の切断が活性状態で抗生物質から抗体を分離するように設計される。
【０１９０】
「ジメチルピペＢＯＲ」と称されるＡＡＣは、抗生物質上のジメチル化アミノ及びリンカー上のオキシカルボニル基を除き、「ピペＢＯＲ」ＡＡＣと同じである。
【０１９１】
図３は、抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）の薬物活性の可能な機構を示す。活性抗生物質（Ａｂ）は、ＡＡＣが哺乳類細胞内で内在化された後にのみ放出される。ＡＡＣにおける抗体のＦａｂ部分はＳ．ａｕｒｅｕｓに結合するが、ＡＡＣのＦｃ部分は、好中球及びマクロファージを含む貪食細胞へのＦｃ受容体媒介結合により細菌の取り込みを増強する。ファゴリソソーム内に内在化された後、リンカーがリソソームプロテアーゼによって切断されて、活性抗生物質をファゴリソソーム内に放出し得る。
【０１９２】
本発明の抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）化合物の実施形態は、式Ｉ：
0006751393.tif 000029
Ｉ
を含み、式中、
破線が、任意選択の結合を示し、
Ｒが、Ｈ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、またはＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、
Ｒ１がＯＨであり、
Ｒ２がＣＨ＝Ｎ-（ヘテロシクリル）であり、ヘテロシクリルが、任意選択で、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、Ｃ１-Ｃ１２ヘテロアリール、Ｃ２-Ｃ２０ヘテロシクリル、Ｃ６-Ｃ２０アリール、及びＣ３-Ｃ１２カルボシクリルから独立して選択される１つ以上の基で置換されるか、
あるいはＲ１及びＲ２が、５員若しくは６員縮合ヘテロアリールまたはヘテロシクリルを形成し、任意選択で、スピロ若しくは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環を形成し、スピロ若しくは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環が、任意選択で、置換Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、またはＯＨであり、
ＰＭＬが、Ｒ２に結合されたプロテアーゼ切断可能な非ペプチド性リンカー、またはＲ１及びＲ２により形成された縮合ヘテロアリール若しくはヘテロシクリルであり、
Ａｂが、ｒＦ１抗体であり、
ｐが１〜８の整数である。
【０１９３】
本発明の抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、下式：
0006751393.tif 000030
を含み、式中、
Ｒ３が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから独立して選択され、
ｎが、１または２であり、
Ｒ４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、及びＯＨから選択され、
Ｚが、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１-Ｃ１２アルキル）、Ｏ、及びＳから選択される。
【０１９４】
本発明の抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、下式：
0006751393.tif 000031
を含み、式中、
Ｒ５が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから選択され、
ｎが、０または１である。
【０１９５】
本発明の抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、下式：
0006751393.tif 000032
を含み、式中、
Ｒ５が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから選択され、
ｎが、０または１である。
【０１９６】
本発明の抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、下式：
0006751393.tif 000033
を含み、式中、
Ｒ５が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから独立して選択され、
ｎが、０または１である。
【０１９７】
本発明の抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、下式：
0006751393.tif 000034
を含み、式中、
Ｒ３が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから独立して選択され、
ｎが、１または２である。
【０１９８】
本発明の抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、下式：
0006751393.tif 000035
を含む。
【０１９９】
本発明の抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、下式：
0006751393.tif 000036
を含む。
【０２００】
本発明の抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、下式：
0006751393.tif 000037
を含む。
【０２０１】
本発明の抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、下式：
0006751393.tif 000038
を含む。
【０２０２】
本発明の抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、下式：
0006751393.tif 000039
を含む。
【０２０３】
本発明の抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、下式：
0006751393.tif 000040
及び
0006751393.tif 000041
を含む。
【０２０４】
本発明の抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、下式：
0006751393.tif 000042
、
0006751393.tif 000043
、
0006751393.tif 000044
、
0006751393.tif 000045
、
0006751393.tif 000046
、
及び
0006751393.tif 000047
を含む。
【０２０５】
ＡＡＣの抗生物質負荷
抗生物質負荷は、式Ｉの分子中の抗体当たりの抗生物質部分（ａｂｘ）の平均数であるｐによって表される。抗生物質負荷は、抗体当たり１〜２０の抗生物質部分（Ｄ）の範囲であり得る。式ＩのＡＡＣは、１〜２０の範囲の抗生物質部分と抱合する抗体の集まりまたはプールを含む。抱合反応からのＡＡＣの調製物中の抗体当たりの抗生物質部分の平均数は、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、及びＨＰＬＣなどの従来の手段によって特徴付けされても良い。また、ｐを単位としてＡＡＣの定量分布が決定されてもよい。いくつかの場合では、ｐがある特定の値である同種のＡＡＣを他の抗生物質負荷を有するＡＡＣから分離、精製、及び特徴付けることは、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動などの手段によって達成されても良い。
【０２０６】
いくつかの抗体−抗生物質抱合体に関して、ｐは、抗体上の結合部位の数によって制限され得る。例えば、上記の例示的な実施形態にあるように、結合がシステインチオール基である場合、抗体は、１個のみまたはいくつかのシステインチオール基を有し得るか、またはリンカーが結合される１個のみまたはいくつかの十分に反応性のチオール基を有し得る。ある特定の実施形態では、より高い抗生物質負荷、例えばｐ＞５は、ある特定の抗体−抗生物質抱合体の凝集、不溶性、毒性、または細胞透過性の損失をもたらす場合がある。ある特定の実施形態では、本発明のＡＡＣの抗生物質負荷は、１〜約８、約２〜約６、約２〜約４、または約３〜約５、約４、または約２の範囲である。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、理論上の最大数よりも少ない抗生物質部分が抱合反応中に抗体に抱合される。抗体は、以下に論じられるように、例えば、抗生物質−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応しないリジン残基を含有し得る。一般に、抗体は、抗生物質部分に結合し得る多くの遊離及び反応性システインチオール基を含有せず、実際、抗体における大半のシステインチオール残基はジスルフィド架橋として存在する。ある特定の実施形態において、抗体は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤により、部分または完全還元条件下で還元されて、反応性システインチオール基を生成し得る。ある特定の実施形態において、抗体は、リジンまたはシステインなどの反応性求核基を明らかにするために、変性条件に置かれる。
【０２０８】
ＡＡＣの負荷（抗生物質／抗体比、「ＡＡＲ」）は、異なる方法で、例えば、（ｉ）抗体に対する抗生物質−リンカー中間体またはリンカー試薬のモル過剰を制限すること、（ｉｉ）抱合反応時間または温度を制限すること、及び（ｉｉｉ）システインチオール修飾のための部分的または制限的還元条件により制御されても良い。本明細書において、または図において言及される場合、「ＤＡＲ」は、「ＡＡＲ」と同じ意味であるものとする。
【０２０９】
２個以上の求核基が抗生物質−リンカー中間体またはリンカー試薬、続いて抗生物質部分試薬と反応する場合、得られる産物は、抗体に結合した１つ以上の抗生物質部分が分布するＡＡＣ化合物の混合物であることを理解されたい。抗体当たりの抗生物質の平均数は、抗体特異的及び抗生物質特異的である２重ＥＬＩＳＡ抗体アッセイにより混合物から計算され得る。個々のＡＡＣ分子は、質量分析によって混合物中で特定され、ＨＰＬＣ、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分離されても良い（例えば、ＭｃＤｏｎａｇｈ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｒ．Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  １９（７）：２９９−３０７、Ｈａｍｂｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：７０６３−７０７０、Ｈａｍｂｌｅｔｔ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ３０  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，”Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．６２４，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ  ２７−３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４５，Ｍａｒｃｈ  ２００４、Ａｌｌｅｙ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．６２７，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ  ２７−３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４５，Ｍａｒｃｈ  ２００４を参照されたい）。ある特定の実施形態では、単一の負荷値を有する同種のＡＡＣが、電気泳動またはクロマトグラフィーによって抱合混合物から単離されても良い。本発明のシステイン改変抗体は、抗体上の反応部位が主に改変されたシステインチオールに限定されるため、より均質な調製を可能にする。一実施形態では、抗体当たりの抗生物質部分の平均数は、約１〜約２０の範囲である。いくつかの実施形態では、この範囲は約１〜４で選択され、制御される。
【０２１０】
抗体−抗生物質抱合体の調製方法
式ＩのＡＡＣは、（１）抗体の求核基と二価のリンカー試薬とを反応させて共有結合を介してＡｂ−Ｌを形成し、続いて抗生物質部分（ａｂｘ）と反応させることと、（２）抗生物質部分の求核基と二価リンカー試薬とを反応させて、共有結合を介してＬ−ａｂｘを形成し、続いて抗体の求核基と反応させることとを含む、当業者に既知の有機化学反応、条件、及び試薬を使用するいくつかの経路によって調製されても良い。後者の経路を介して式ＩのＡＡＣを調製するための例示的な方法は、ＵＳ７４９８２９８に記載され、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０２１１】
抗体上の求核基には、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖ヒドロキシルまたはアミノ基が含まれるが、これらに限定されない。アミン、チオール、及びヒドロキシル基は、求核性であり、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート（ｈａｌｏｆｏｒｍａｔｅ）、及び酸ハロゲン化物などの活性エステル、（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのアルキル及びベンジルハロゲン化物、（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含む、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と反応して、共有結合を形成することが可能である。ある特定の抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体が完全にまたは部分的に還元されるように、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤での処理によって、リンカー試薬との抱合のために抗体を反応性にしても良い。よって、各システイン架橋は、理論上、２つの反応性のチオール求核剤を形成する。追加の求核基は、リジン残基の修飾を通して、例えば、リジン残基と２−イミノチオラン（トラウト試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ））とを反応させて、アミンをチオールへと変換させることによって抗体内に導入することができる。反応性チオール基は、１、２、３、４個以上のシステイン残基を導入することにより（例えば、１個以上の非天然システインアミノ酸残基を含む変異形抗体を調製することにより）抗体内に導入され得る。
【０２１２】
本発明の抗体−抗生物質抱合体は、アルデヒドまたはケトンカルボニル基などの抗体上の求電子基と、リンカー試薬または抗生物質上の求核基との間の反応によって産生されても良い。リンカー試薬上の有用な求核基には、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジドが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、抗体は、リンカー試薬または抗生物質上の求核置換基と反応することが可能である求電子部分を導入するように修飾される。別の実施形態では、グリコシル化抗体の糖を、例えば過ヨウ素酸塩酸化試薬で酸化させて、リンカー試薬または抗生物質部分のアミン基と反応し得るアルデヒドまたはケトン基を形成しても良い。得られるイミンシッフ塩基群は、安定した結合を形成し得るか、または例えば、水素化ホウ素試薬によって還元されて、安定したアミン結合を形成し得る。一実施形態では、グリコシル化抗体の炭水化物部分と、ガラクトースオキシダーゼまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとを反応させることにより、抗体において、抗生物質上の適切な基と反応することができるカルボニル（アルデヒド及びケトン）基がもたらされ得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。別の実施形態において、Ｎ末端セリンまたはスレオニン残基を含有する抗体は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応して、第１のアミノ酸の代わりにアルデヒドが産生され得る（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ＆Ｓｔｒｏｈ，（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６、ＵＳ  ５３６２８５２）。このようなアルデヒドは、抗生物質部分またはリンカー求核剤と反応し得る。
【０２１３】
抗生物質部分上の求核基には、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物などの活性エステル、（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのアルキル及びベンジルハロゲン化物、（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含む、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と反応して、共有結合を形成することが可能なアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジド基が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１４】
表３の抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）は、実施例１８に記載の方法に従い、記載のｒＦ１抗体及び表２のリンカー−抗生物質中間体を抱合することにより調製された。インビトロマクロファージアッセイ（実施例１９）及びインビボマウス腎臓モデル（実施例２０）により、ＡＡＣの有効性を試験した。
表３  ｒＦ１抗体−ＰＭＬ−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）
0006751393.tif 000048
＊  ＡＡＲ＝抗生物質／抗体比平均
野生型（「ＷＴ」）、システイン改変変異抗体（「チオ」）、軽鎖（「ＬＣ」）、重鎖（「ＨＣ」）、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、シクロブチルジケト（「ＣＢＤＫ」）、シトルリン（「ｃｉｔ」）、システイン（「ｃｙｓ」）、ｐ−アミノベンジル（「ＰＡＢ」）、及びｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢＣ」）
【０２１５】
抗体−抗生物質抱合体を用いた感染症の治療及び阻止方法
本発明のｒＦ１−ＡＡＣは、ヒト及び獣医Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、腐生Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、及びＳ．ｓｉｍｕｌａｎｓに対して有効な抗菌剤として有用である。特定の態様では、本発明のＡＡＣは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症を治療するのに有用である。
【０２１６】
血流に入った後、Ｓ．ａｕｒｅｕｓはほぼ全ての臓器に転移性感染引き起こし得る。二次感染は、療法開始前の症例の約３分の１（Ｆｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１６３：２０６６−２０７２）、及び療法の開始後の患者の１０％に生じる（Ｋｈａｔｉｂ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，３８：７−１４）。感染の特徴は、大きな膿の蓄積、組織破壊、及び膿瘍の形成（その全てが大量の好中球を含む）である。菌血症が３日以上持続する場合、約４０％の患者が合併症を発症する。
【０２１７】
ＡＡＣの提案される作用機構は上述された（抗体−抗生物質抱合体の小見出し下）。本発明のｒＦ１抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）は、細胞内病原体の治療に多大な治療利点を有する。ＡＡＣリンカーは、ファゴリソソーム酵素に曝すことによって切断され、活性抗生物質を放出する。閉鎖された空間及び比較的高い局所抗生物質濃度（細菌当たり約１０４）により、ファゴリソソームがもはや細胞内病原体の生存を支持しないという結果になる。ＡＡＣは本質的に不活性プロドラッグであるため、抗生物質の治療指数は、遊離（非抱合）形態に対して拡大し得る。本抗体は病原体特異的標的を提供するが、切断可能なリンカーは病原体の細胞内位置に特異的な条件下で切断される。この作用は、オプソニン化病原体ならびにファゴリソソーム内に共存する他の病原体の両方に対して直接的であり得る。抗生物質抵抗性は、疾患を引き起こす病原体が抗生物質及び他の抗菌剤による死滅に抵抗する能力であり、多剤耐性とは機構的に異なる（Ｌｅｗｉｓ  Ｋ（２００７）．’’Ｐｅｒｓｉｓｔｅｒ  ｃｅｌｌｓ，ｄｏｒｍａｎｃｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ’’．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５（１）：４８−５６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍｉｃｒｏ１５５７）。むしろ、この抵抗性の形態は、生残菌と呼ばれる微生物細胞の小さな亜集団によって引き起こされる（Ｂｉｇｇｅｒ  ＪＷ（１４  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９４４）．’’Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ  ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ’’．Ｌａｎｃｅｔ  ２４４（６３２０）：４９７−５００）。これらの細胞は、古典的な意味では多剤耐性ではないが、むしろそれらの遺伝的に同型同胞を死滅させることができる抗生物質治療に対して耐性である休眠細胞である。この抗生物質抵抗性は、非分裂または非常に緩徐に分裂する生理学的状態により誘導される。抗菌治療がこれらの生残菌細胞を根絶できない場合、それらは再発する慢性感染の貯蔵所となる。本発明の抗体−抗生物質抱合体は、これらの生残菌細胞を死滅させるための独特な特性を有し、多剤耐性細菌集団の出現を抑制する。
【０２１８】
別の実施形態では、本発明のｒＦ１−ＡＡＣは、病原体が生存する細胞内区画に関わらず感染症を治療するために使用され得る。
【０２１９】
別の実施形態では、本発明のｒＦ１−ＡＡＣは、プランクトンまたはバイオフィルム形態のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉの細菌を標的とするためにも使用され得る。本発明の抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）で治療可能な細菌感染症は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ肺炎などの細菌性肺感染症、骨髄炎、再発性副鼻腔炎、細菌性心内膜炎、細菌性眼感染症（トラコーマ及び結膜炎など）、心臓、脳、または皮膚の感染症、旅行者下痢、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、クローン病、及び一般的なＩＢＤ（炎症性腸疾患）などの消化管の感染症、細菌性髄膜炎、及び筋肉、肝臓、髄膜、または肺などの任意の臓器における膿瘍の治療を含む。細菌感染症は、尿路、血流、創傷、またはカテーテル挿入部位などの身体の他の部分であり得る。本発明のＡＡＣは、バイオフィルム、インプラント、または聖域部位（例えば、骨髄炎及び人工関節の感染）、ならびに院内感染の肺炎及び菌血症などの高死亡率感染症を伴う治療が困難な感染症に有用である。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ａｕｒｅｕｓ感染を阻止するために治療され得る脆弱な患者群は、血液透析患者、免疫力が低下している患者、集中治療室にいる患者、及びある特定の手術患者を含む。別の態様では、本発明は、動物にｒＦ１  ＡＡＣまたは本発明のＡＡＣの薬学的製剤を投与することを含む、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおける微生物感染を死滅させる、治療する、または阻止する方法を提供する。本発明は、このような微生物感染に関連する疾患、またはそれに日和見的に起因する疾患を治療または阻止することをさらに特徴とする。このような治療または阻止方法は、本発明の組成物の経口、局所、静脈内、筋肉内、または皮下投与を含み得る。例えば、手術またはＩＶカテーテルの挿入前、ＩＣＵにおいて、移植医療において、癌化学療法と共に若しくはその後、または高い感染リスクを有する他の行為において、感染の発症または拡散を阻止するために本発明のＡＡＣが投与されても良い。
【０２２０】
細菌感染症は、活性及び不活性形態の細菌によって引き起こされる場合があり、ＡＡＣは、活性及び不活性の両方の潜在型形態の細菌感染症を治療するのに十分な量及び期間投与され、この治療期間は、細菌感染症の活性形態を治療するのに必要な期間よりも長い。
【０２２１】
本発明の態様は、治療有効量の本発明のｒＦ１−ＡＡＣを投与することによる、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及び／またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに感染した患者の治療方法である。本発明は、手術、火傷患者、及び臓器移植などの病院環境において治療有効量の本発明のｒＦ１−ＡＡＣを投与することによって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ若しくはＳ．ＥｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓまたはＳ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ若しくはＳ．ＳＩＭＵＬＡＮＳのうちの１つ以上による感染を阻止する方法も想定する。
【０２２２】
当該技術分野の医師によって決定される細菌感染症の治療を必要とする患者は、患者が感染している細菌の種類を既に診断されていてもよいが、それと診断される必要はない。細菌感染症の患者は非常に急速に、ほんの数時間で急変する可能性があるため、病院に入院したときに患者は、バンコマイシンまたはシプロフロキサシンなどの１つ以上の標準的な治療Ａｂｘと共に、本発明のｒＦ１−ＡＡＣを投与され得る。診断結果が利用可能になり、感染において、例えばＳ．ａｕｒｅｕｓの存在を示す場合、患者はｒＦ１  ＡＡＣを用いた治療を継続することができる。したがって、細菌感染症または具体的にはＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症の治療方法の一実施形態では、患者は、治療有効量のｒＦ１  ＡＡＣを投与される。本発明の治療または阻止方法において、本発明のＡＡＣは、唯一の治療薬として、または以下に記載される他の薬剤と共に投与され得る。本発明のＡＡＣは、前臨床モデルのＭＲＳＡの治療において、バンコマイシンよりも優れていることを示す。ＡＡＣとＳＯＣとの比較は、例えば、死亡率の減少により測定され得る。治療された患者は、様々な測定可能な因子によってＡＡＣ治療に対する応答性に関して評価されるだろう。臨床医が彼らの患者における改善を評価するために使用し得る徴候及び症状の例としては、診断時に上昇していた場合、白血球数の正常化、診断時に上昇していた場合（発熱）、体温の正常化、血液培養物のクリアランス、より少ない紅斑及び排膿を含む創傷における視覚的改善、酸素をあまり必要としない、または人工呼吸されている患者における人口呼吸速度減少などの人工呼吸器の必要性の減少、患者が診断時に人工呼吸されていた場合、人工呼吸器の完全な取り外し、安定した血圧を支持するための薬剤が診断時に必要であった場合、その薬剤の使用低下、診断時に異常であった場合、クレアチニンの上昇または肝臓機能試験などの末端臓器不全を示唆する検査異常の正常化、ならびに放射線画像における改善（例えば、消散を示す、以前に肺炎を示唆した胸部ｘ線）が挙げられる。ＩＣＵ中の患者において、これらの因子は少なくとも毎日測定され得る。発熱は、絶対好中球数ならびに「左方移動」（活性感染に応答して好中球産生の増加を示すブラストの出現）が消散したエビデンスを含む、白血球数と同様に厳密に監視される。
【０２２３】
本発明の治療方法の文脈において、細菌感染症の患者は、治療の開始前若しくは開始時、または診断時の値、徴候、若しくは症状と比較して、先行因子のうちの少なくとも２つ以上において、当該技術分野の医師によって評価されるときに大幅な測定可能な改善がある場合、治療されたと考えられる。いくつかの実施形態では、前述の因子のうちの３、４、５、６以上において、測定可能な改善がある。いくつかの実施形態では、測定可能な因子の改善は、治療前の値と比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％である。典型的には、患者の測定可能な改善が、ｉ）本来特定された細菌が成長しない再度の血液または組織培養物（典型的には数回）、ｉｉ）発熱が正常化する、ｉｉｉ）ＷＢＣが正常化する、及びｉｖ）患者が有していた既存の共存症を所与として、末端臓器不全（心臓、肺、肝臓、腎臓、血管虚脱）が完全にまたは部分的のいずれかで消散したエビデンスを含む場合、患者は、細菌感染症（例えばＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症）が完全に治療されたと考えられ得る。
【０２２４】
投薬。前述の態様のいずれかにおいて、感染患者を治療する際のＡＡＣ投薬量は通常約０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日である。一実施形態では、細菌感染症の患者は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ、典型的には約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ、より具体的には２５ｍｇ／ｋｇ〜１２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜１２５ｍｇ／ｋｇ、さらにより具体的には約５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲のＡＡＣ用量で治療される。ＡＡＣは、毎日（例えば、５〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の単回量）または少ない頻度（例えば、５、１０、２５、または５０ｍｇ／ｋｇ／週）で与えられても良い。１用量は、２日にわたって、例えば、１日目に２５ｍｇ／ｋｇ、そして次の日に２５ｍｇ／ｋｇに分割されても良い。患者は、１〜８週の期間の間、３日に１回（ｑ３Ｄ）、１週間に１回から２週間に１回（ｑＯＷ）、ある用量を投与され得る。一実施形態では、患者は、Ｓｔａｐｈ  Ａ感染症などの細菌感染症を治療するために、標準的な治療（ＳＯＣ）と共に、２〜６週間の間、１週間に１回、ＩＶを介して本発明のＡＡＣを投与される。治療の長さは、患者の状態または感染症の程度、例えば、無併発の菌血症に関しては２週間の期間、または心内膜炎を伴う菌血症に関しては６週間の期間指示されるだろう。
【０２２５】
一実施形態では、ＡＡＣは、１〜７日間連続で２．５〜１００ｍｇ／ｋｇの初期用量で、続いて１ヶ月間１〜７日に１回、０．００５〜１０ｍｇ／ｋｇの維持用量で投与された。
【０２２６】
投与経路。細菌感染症の治療に関して、本発明のＡＡＣは、先行の投薬量のいずれかで、静脈内（ｉ．ｖ．）または皮下投与され得る。一実施形態では、ｒＦ１−ＡＡＣが静脈内投与される。特定の実施形態では、ｒＦ１−ＡＡＣはｉ．ｖ．を介して投与され、このｒＦ１抗体は、ＳＤＲ及びｒＦ１Ａｂならびに表４Ａ及び４Ｂ下で開示されるアミノ酸配列を有するＡｂ群から選択されたものである。
【０２２７】
併用療法。ＡＡＣは、１つ以上の追加の、例えば、患者を治療する医師により判断されるとき、必要に応じて第２の治療薬または予防薬と共に投与されても良い。
【０２２８】
一実施形態では、本発明の抗体−抗生物質抱合体化合物と併用して投与される第２の抗生物質は、（ｉ）アミノグリコシド、（ｉｉ）ベータ−ラクタム、（ｉｉｉ）マクロライド／環状ペプチド、（ｉｖ）テトラサイクリン、（ｖ）フルオロキノリン／フルオロキノロン、（ｖｉ）及びオキサゾリジノンの構造クラスから選択される。Ｓｈａｗ，Ｋ．ａｎｄ  Ｂａｒｂａｃｈｙｎ，Ｍ．（２０１１）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２４１：４８−７０、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．（２０１１）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２４１：１２２−１５２を参照されたい。
【０２２９】
一実施形態では、本発明の抗体−抗生物質抱合体化合物と併用して投与される第２の抗生物質は、クリンダマイシン、ノボビオシン、レタパムリン、ダプトマイシン、ＧＳＫ−２１４０９４４、ＣＧ−４００５４９、シタフロキサシン、テイコプラニン、トリクロサン、ナフチリドン、ラデゾリド、ドキソルビシン、アンピシリン、バンコマイシン、イミペネム、ドリペネム、ゲムシタビン、ダルババンシン、及びアジスロマイシンから選択される。
【０２３０】
これらの追加の治療薬または予防薬のさらなる例は、抗炎症剤（例えば、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ、例えば、デトプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナメエート（ｍｅｃｌｏｆｅｎａｍｅａｔｅ）、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメオン（ｎａｂｕｍｅｏｎｅ）、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダック、トルメチン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、アスピリン、サリチル酸コリン、サルサルテ（ｓａｌｓａｌｔｅ）、ならびにサリチル酸ナトリウム及びサリチル酸マグネシウム）及びステロイド（例えば、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン））抗菌剤（例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、アモキシシリン、メトロニダゾール、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン、ピペラシリン、アゾシリン、テモシリン、セファロチン、セファピリン、セフラジン、セフアロリジン、セファゾリン、セファマンドール、セフロキシム、セファレキシン、セフプロジル、セファクロル、ロラカルベフ、セフォキシチン、セフマトゾール（ｃｅｆｍａｔｏｚｏｌｅ）、セフォタキシム、セフチドキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジム、セフィキシム、セフポドキシム、セフチブテン、セフジニル、セフピロム、セフェピム、ＢＡＬ５７８８、ＢＡＬ９１４１、イミペネム、エルタペネム、メロペネム、アストレオナム、クラブラネート、スルバクタム、タゾバクタム、ストレプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、スペクチノマイシン、シソマイシン、ジベカリン、イセパマイシン、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、テリスロマイシン、ＡＢＴ−７７３、リンコマイシン、クリンダマイシン、バンコマイシン、オリタバンシン、ダルババンシン、テイコプラニン、キヌプリスチン、及びダルホプリスチン、スルファニルアミド、パラ−アミノ安息香酸、スルファジアジン、スルフイソキサゾール、スルファメトキサゾール、スルファサリディン、リネゾリド、ナリジクス酸、オキソリニン酸、ノルフロキサシン、ペフロキサシン、エノキサシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、テマフロキサシン、ロメフロキサシン、フレロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、トロバフロキサシン、クリナフロキサシン、モキシフロキサシン、ゲミフロキサシン、シタフロキサシン、ダプトマイシン、ガレノキサシン、ラモプラニン、ファロペネム、ポリミキシン、チゲサイクリン、ＡＺＤ２５６３、またはトリメトプリム）、ＡＡＣ標的Ａｇからの同じ若しくは異なる抗原に対する抗体を含む抗菌抗体、血小板凝集阻害剤（例えば、アブシキシマブ、アスピリン、シロスタゾール、クロピドグレル、ジピリダモール、エプチフィバチド、チクロピジン、またはチロフィバン）抗凝固薬（例えば、ダルテパリン、ダナパロイド、エノキサパリン、ヘパリン、チンザパリン、またはワルファリン）、解熱剤（例えば、アセトアミノフェン）、または脂質低下薬（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、ニコチン酸、ゲムフィブロジル、プロブコール、エゼチミブ、またはアトルバスタチン、ロスバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、セリバスタチン、及びフルバスタチンなどのスタチン）である。一実施形態では、本発明のＡＡＣは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（メチシリン耐性及びメチシリン感受性株を含む）に対する標準的な治療（ＳＯＣ）と併用して投与される。ＭＳＳＡは通常、典型的には、ナフシリンまたはオキサシリンを用いて治療され、ＭＲＳＡは、典型的には、バンコマイシンまたはセファゾリンを用いて治療される。
【０２３１】
これらの追加の薬剤は、ＡＡＣの投与１４日、７日、１日、１２時間、若しくは１時間以内、またはそれと同時に投与されても良い。追加の治療薬は、ＡＡＣと同じまたは異なる薬学的組成物中に存在しても良い。異なる薬学的組成物中に存在する場合、異なる投与経路が使用され得る。例えば、ＡＡＣは静脈内または皮下投与され得る一方で、第２の薬剤は経口投与され得る。
【０２３２】
薬学的製剤
本発明は、ｒＦ１−ＡＡＣを含有する薬学的組成物、及びＡＡＣを含有する薬学的組成物を使用した細菌感染症の治療方法も提供する。このような組成物は、好適な賦形剤、例えば、当該技術分野において周知であり、本明細書に記載される緩衝剤、酸、塩基、糖、希釈剤、滑走剤、防腐剤などを含む、薬学的に許容される賦形剤（担体）をさらに含み得る。本方法及び組成物は、単独で、または感染疾患の治療のための他の従来の方法及び／若しくは薬剤と併用して使用されても良い。いくつかの実施形態では、薬学的製剤は、１）本発明のｒＦ１−ＡＡＣ、及び２）薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、薬学的製剤は、１）本発明のＡＡＣ、及び任意選択で。２）少なくとも１つの追加の治療薬を含む。
【０２３３】
本発明のＡＡＣを含む薬学的製剤は、水溶液または凍結乾燥若しくは他の乾燥製剤の形態で、所望の純度を有するＡＡＣを、任意選択の生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することにより保管用に調製される。許容可能な担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウムなど）；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。インビボ投与に使用される薬学的製剤は一般に、減菌であり、減菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０２３４】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技法により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に封入されても良い。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０２３５】
徐放性調製物が調製されても良い。徐放性調製物の好適な例としては、抗体または本発明のＡＡＣを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられ、そのマトリクスは、有形製品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間にわたって分子を放出できる一方で、ある特定のヒドロゲルは、より短い時間期間の間タンパク質を放出する。被包された抗体またはＡＡＣが長時間体内にとどまる場合、それらは３７℃の水分に曝された結果として変性または凝集する場合があり、生物活性の喪失及び免疫原性の変更をもたらす可能性がある。合理的な戦略は、関わる機構により安定化のために考案され得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド相互交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが分かった場合、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸溶液からの凍結乾燥、水含量の制御、適切な添加剤の使用、及び特定のポリマーマトリクス組成の開発により達成され得る。
【０２３６】
ＡＡＣは、標的細胞／組織に送達するための、任意の好適な形態で製剤化され得る。例えば、ＡＡＣは、薬物を哺乳動物に送達するのに有用である、様々な種類の脂質、リン脂質、及び／または界面活性剤から構成される小胞であるリポソームとして製剤化されても良い。リポソームの構成成分は一般に、生体膜の脂質配置に類似する二層構成に配置される。抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０、ＵＳ４４８５０４５、ＵＳ４５４４５４５、ＷＯ９７／３８７３１、ＵＳ５０１３５５６などに記載される、当該技術分野において既知の方法により調製される。
【０２３７】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法により生成され得る。画定された孔径のフィルタを通してリポソームを押出して、所望の直径を有するリポソームを得る。
【０２３８】
材料及び方法
細菌株及び培養物：
全ての実験は、別途記載されない限り、ＮＡＲＳＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｒｓａ．ｎｅｔ／ｃｏｎｔｒｏｌ／ｍｅｍｂｅｒ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）から得たＭＲＳＡ−ＵＳＡ３００  ＮＲＳ３８４を用いて行われた。
【０２３９】
５％ヒツジ血液で補足したトリプシンダイズ寒天プレート（ＴＳＡプレート）上で、３７℃で１８時間、細胞を成長させた。液体培養に関して、ＴＳＡプレートからの単一コロニーを、トリプシンダイズブロス（ＴＳＢ）中に播種し、２００ｒｐｍで振盪させながら３７℃で１８時間インキュベートし、新しいＴＳＢ中でこれらの培養物の１００倍希釈物を、様々な時間、さらに継代した。
【０２４０】
細胞外細菌のＭＩＣの決定
細胞外細菌のＭＩＣは、トリプシンダイズブロス中で抗生物質の段階２倍希釈物を調製することにより決定された。抗生物質の希釈物は、９６ウェル培養皿中で４連で作製された。ＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００のＮＲＳ３８４株）を、指数関数的に成長する培養物から取り、１×１０４ＣＦＵ／ｍＬに希釈した。３７℃で振盪しながら細菌を抗生物質の存在下で１８〜２４時間培養し、６３０ｎＭで光学密度（ＯＤ）を読み取ることにより細菌成長を決定した。ＭＩＣは、細菌の成長を＞９０％阻害した抗生物質の用量であると決定された。
【０２４１】
細胞内細菌のＭＩＣの決定
細胞内ＭＩＣは、マウスの腹膜マクロファージ内に隔離された細菌に対して決定された（マウス腹膜マクロファージの生成に関しては以下を参照されたい）。マクロファージを４×１０５細胞／ｍＬの密度で２４ウェル培養皿で平板培養し、マクロファージ当たり１０〜２０細菌の割合でＭＲＳＡに感染させた。マクロファージ培養物を、細胞外細菌の成長を阻害するために５０ｕｇ／ｍＬのゲンタマイシン（細胞外細菌上でのみ活性である抗生物質）で補足された成長培地中で維持し、感染の１日後に試験抗生物質を成長培地に添加した。細胞内細菌の生存は、抗生物質の添加２４時間後に評価された。マクロファージを、０．１％ウシ血清アルブミン、及び０．１％トリトン−Ｘで補足されたハンクス緩衝生理食塩溶液で溶解し、可溶化液の段階希釈物は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝生理食塩溶液中で作製された。生存細胞内細菌の数は、５％脱線維素ヒツジ血液を含むトリプシンダイズ寒天プレート上で平板培養することにより決定された。
【０２４２】
細菌細胞壁調製物（ＣＷＰ）、免疫ブロット、及びＥＬＩＳＡ
３０％ラフィノース、１００μｇ／ｍｌのリゾスタフィン（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）、及びＥＤＴＡを含まないプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）で補足された、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の１ｍＬ当たり４０ｍｇのペレット化Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたはＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを、３７℃で３０分間インキュベートすることによりＣＷＰを生成した。可溶化液を１１，６００×ｇで５分間遠心分離し、細胞壁構成成分を含有する上清を回収した。免疫沈降に関して、ＣＷＰを、１μｇ／ｍＬの示される一次抗体を含有するＮＰ−４０緩衝液（１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１％ＮＰ−４０、コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）、及び２ｍＭジチオスレイトール）中に４回希釈し、４℃で２時間インキュベートし、続いてプロテインＡ／Ｇアガロース（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）と共に１時間インキュベートした。２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌのリゾスタフィン、１％トリトン−Ｘ１００（Ｔｈｅｒｍｏ）、及びＥＤＴＡを含まないプロテアーゼインヒビターカクテル中で、３７℃で３０分間インキュベートすることにより、全細胞可溶化液（ＷＣＬ）を生成した。免疫ブロット分析に関して、４〜１２％トリス−グリシンゲル上でタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に移し、続いて示される一次抗体（１μｇ／ｍＬ）でブロットした。使用された抗体は、表１に列挙される。レクチン研究は、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．０１ｍＭ  ＭｎＣｌ２で補足されたコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）−またはｓＷＧＡ−アガロースビーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で、一晩濾過した（０．２ミクロン）培養上清を免疫沈降することによって行われた。
【０２４３】
ＥＬＩＳＡ実験は、標準的なプロトコルを用いて行われた。簡潔に、ＣＷＰで予めコーティングされたプレートを、ヒトＩｇＧ調製物、すなわち、精製したヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）、静脈内免疫グロブリンＧａｍｍａｇａｒｄ  Ｌｉｑｕｉｄ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｗｅｓｔｌａｋｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＣＡ）、健康なドナーまたはＭＲＳＡ患者からプールした血清（両方とも社内で生成された）と反応させた。血清または精製したＩｇＧに存在する抗ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌＩｇＧの濃度は、ペプチドグリカンに対して既知の濃度のｍＡｂ  ２８．９．９で生成された較正曲線を用いて計算された。
【０２４４】
ヒト好中球プロテアーゼまたはヒト好中球及び培養した細胞からのリソソーム抽出物を用いた細菌の処理
Ｌｙｓｏｓｏｍｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔキット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、リソソーム抽出物を、ヒト好中球、ＴＨＰ−１細胞、及びＲＡＷ細胞から単離した。合計５×１０７細胞を使用して、リソソーム中３００〜５００マイクログラムの総タンパク質を得た。リソソームにおけるプロテアーゼ活性を維持するために、プロテアーゼインヒビターは全ステップから省かれた。ダウンス型ホモジナイザー（Ｗｈｅａｔｏｎ，Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ，ＮＪ）を使用して３０回ストロークすることにより細胞の形質膜を破壊した。破砕物を５００×ｇで５分間遠心分離して、核除去後上清を得、これを８％、２０％、２３％、２７％、及び３０％（上から下）のイオジキサノールの勾配の上に充填した。４℃で２時間、１４５，０００×ｇで超遠心分離した後、８％と２０％との間のイオジキサノールに層状に形成されたリソソームを得た。このリソソームの分画をＰＢＳ中に希釈し、４℃で３０分間、１８，０００×ｇで遠心分離してペレット化した。リソソームペレットをＰＢＳで洗浄し、トリス緩衝生理食塩水と共に２％ＣＨＡＰＳに溶解して、リソソーム抽出物を得た。
【０２４５】
宿主プロテアーゼによるＳＤＲタンパク質の切断を分析するために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの細菌を、５０ｎＭの精製したヒト好中球セリンプロテアーゼ若しくは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中の０．１ｍｇ／ｍｌの好中球リソソーム抽出物、または０．１ｍｇ／ｍｌのＲＡＷ若しくは１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び２ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ５．５）を含む５０ｍＭ  ＮａＣｉｔｒａｔｅ中のＴＨＰ−１リソソーム抽出物で処理した。カテプシンＧ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を１００ｇ／ｍｌで添加した。これらの混合物を３７℃で、精製したプロテアーゼを使用したときには３０分間、リソソーム可溶化物を使用したときには１時間インキュベートし、ペレット細菌に遠心分離した。切断産物を検出するために、免疫ブロットにより上清を分析した。いくつかの実験では、細胞壁調製物は残りの細菌ペレットから得て、同様に免疫ブロットにより分析された。
【実施例】
【０２４６】
実施例１  細胞内ＭＲＳＡは従来の抗生物質から保護される
哺乳類細胞は抗生物質療法の存在下でＳ．ａｕｒｅｕｓに保護的環境を提供するという仮説を確認するために、細胞外プランクトン細菌対マウスマクロファージ内に隔離された細菌に対する、侵襲性ＭＲＳＡ感染症の標準的な治療（ＳＯＣ）として現在使用されている３つの主要な抗生物質（バンコマイシン、ダプトマイシン、及びリネゾリド）の有効性を比較した（表１）。
【０２４７】
細胞外細菌に関して、ＭＲＳＡをトリプシンダイズブロス中で一晩培養し、ＭＩＣが成長を阻止した最小抗生物質用量であることを決定した。細胞内細菌に関して、マウス腹膜マクロファージをＭＲＳＡに感染させ、細胞外細菌を死滅させるためにゲンタマイシンの存在下で培養した。感染１日後に試験抗生物質を培養培地に添加し、生存細胞内細菌の総数を２４時間後に決定した。臨床上適切な抗生物質の予想された血清濃度はＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ，Ａｎｄｒｅ  Ｂｒｙｓｋｉｅｒ．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ（２００５）に報告された。
表１：液体培養物中の細胞外細菌成長ｖｓ．マウスマクロファージ内に隔離された細胞内細菌に対するいくつかの抗生物質の最小阻害濃度（ＭＩＣ）
0006751393.tif 000049
【０２４８】
非常に病原性の市中感染ＭＲＳＡ株ＵＳＡ３００を用いたこの分析により、細胞外ＭＲＳＡは液体培養物中で低濃度のバンコマイシン、ダプトマイシン、及びリネゾリドによる成長阻害に非常に感受性であるが、３つ全ての抗生物質が臨床的に達成可能な濃度の抗生物質に曝された、マクロファージ内に隔離された同じＭＲＳＡ株を死滅させることができなかったことが明らかとなった。細胞内病原体の排除に比較的有効であると考えられるリファンピシンでさえ（Ｖａｎｄｅｎｂｒｏｅｋ，Ｐ．Ｖ．（１９８９）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇｓ，Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １１，２１３−２４５）、プランクトン細菌の成長を阻害するのに必要とされる用量（ＭＩＣ）と比較して、細胞内ＭＲＳＡを排除するために６，０００倍高い用量を必要とし（表１）、大部分の既存の抗生物質がインビトロ及びインビボの両方において細胞内Ｓ．ａｕｒｅｕｓの死滅に不十分であることを示す他の研究と一致した（Ｓａｎｄｂｅｒｇ，Ａ．，Ｈｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｓｋｏｖ，Ｒ．Ｌ．，Ｂｌｏｍ，Ｊ．＆Ｆｒｉｍｏｄｔ−Ｍｏｌｌｅｒ，Ｎ．（２００９）’’Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ  ｍｏｄｅｌ’’  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５３，１８７４−１８８３）。
【０２４９】
実施例２  細胞内ＭＲＳＡによる感染の拡散
これらの実験は、細胞内細菌の病原性対等用量の自由生活プランクトン細菌を比較し、細胞内細菌がインビボでバンコマイシンの存在下で感染を確立することができるかを決定した。４つのマウスのコホートを、静脈内注射により、ブロス培養物から直接採取した、ほぼ等用量のＳ．ａｕｒｅｕｓの生存可能な遊離細菌（２．９×１０６）、またはドナーマウスの腹膜感染により生成された宿主マクロファージ及び好中球内に隔離された細胞内細菌（１．８×１０６）に感染させ（図１Ａ）、選択群を、感染直後、次に、１日１回、バンコマイシンで処置した。マウスにおいてＳ．ａｕｒｅｕｓが一貫してコロニー形成される臓器である腎臓における細菌のコロニー形成に関して、感染４日後にマウスを検査した２３。３つの独立した実験において、等用量のプランクトン細菌に感染させたものと比較して、細胞内細菌に感染させたマウスの腎臓において、当量またはより高い細菌負荷が観察された（図１Ｂ）。意外にも、細胞内細菌での感染は、このモデルにおいて、プランクトン細菌に感染させた後、効率的にコロニー形成されない臓器である脳により一貫したコロニー形成をもたらしたことが分かった（図１Ｃ）。さらに、このモデルにおいて、プランクトン細菌ではなく、細胞内細菌がバンコマイシン療法に対して感染を確立することができた（図１Ｂ、図１Ｃ）。
【０２５０】
さらにインビトロにおける分析は、細胞内生存が抗生物質の回避を容易にする程度をより定量的にすることに取り組んだ。この目的のために、ＭＧ６３骨芽細胞を、バンコマイシンの存在下で、プランクトンＭＲＳＡまたは細胞内ＭＲＳＡのいずれかに感染させた。
【０２５１】
骨芽細胞またはＨＢＭＥＣの感染。ＭＧ６３細胞系をＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１４２７）から入手し、１０ｍＭヘペス及び１０％ウシ胎仔血清（ＲＰＭＩ−１０）で補足されたＲＰＭＩ  １６４０組織培養培地中で維持した。ＨＢＭＥＣ細胞（カタログ＃１０００）及びＥＣＭ培地（カタログ＃１００１）をＳｃｉｅｎｃＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。細胞を２４ウェル組織培養プレートで平板培養し、培養して融合層を得た。実験日に、細胞をＲＰＭＩ（補足なし）で１回洗浄した。ＭＲＳＡまたは感染腹膜細胞をコンプリートＲＰＭＩ−１０中に希釈し、感染直前にバンコマイシンを５ｕｇ／ｍＬで添加した。１×１０６腹膜細胞／ｍＬで腹膜細胞を骨芽細胞に添加した。細胞の試料を０．１％トリトン−ｘで溶解し、感染時の生の細胞内細菌の実際の濃度を決定した。全ての感染に対する実際の力価は、細菌の段階希釈物を、５％脱線維素ヒツジ血液を含むトリプシンダイズ寒天プレート上で平板培養することにより決定された。
【０２５２】
ＭＲＳＡ（遊離細菌）を、培地、培地＋バンコマイシン、または培地＋バンコマイシンに播種し、ＭＧ６３骨芽細胞（図１Ｅ）またはヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ、図１Ｆ）の単層上で平板培養した。プレートを遠心分離して、細菌と単層の接触を促進した。各時間点で、培養上清を採取して細胞外細菌を回収するか、または付着細胞を溶解して細胞内細菌を開放した。
【０２５３】
バンコマイシン単独に曝されたプランクトン細菌は効率的に死滅した。生存細菌は、培養物において１日後に回収されなかった（図１Ｄ）。同様の数のプランクトン細菌をＭＧ６３骨芽細胞上で平板培養した際、感染１日後に、骨芽細胞の浸潤によりバンコマイシンから保護された、ＭＧ６３細胞と結合した少数の生存細菌（インプットの約０．０６％）が回収された。
【０２５４】
腹膜細胞内に隔離されたＭＲＳＡは、バンコマイシンの存在下で、生存及び感染効率の両方で劇的な増加を示した。白血球中の約１５％の細胞内ＭＲＳＡが、バンコマイシンがプランクトン細菌の培養物を減菌した同じ条件下で生存した。細胞内細菌はまた、バンコマイシンの存在下で、ＭＧ６３骨芽細胞の単層をより良く感染させることができ、バンコマイシンに曝された１日後に回収された細菌を倍増した（図１Ｄ）。さらに、細胞内Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、遊離生細菌を死滅させたバンコマイシンの濃度に一定して曝された、ＭＧ６３細胞（図１Ｅ）、一次ヒト脳内皮細胞（図１Ｆ）、及びＡ５４９気管支上皮細胞（図示せず）において、２４時間の期間にわたってほぼ１０倍増加することができた。抗生物質による死滅から保護されるが、感染腹膜マクロファージ及び好中球の培養物において細菌の成長は生じなかった（図示せず）。共にこれらのデータは、骨髄細胞におけるＭＲＳＡの細胞内貯蔵所が活性抗生物質治療の存在下でも感染の新しい部位への拡散を促進することができ、細胞内成長が定期的な抗生物質療法の条件下でも内皮及び上皮細胞において生じ得ることを支持する。
【０２５５】
実施例３  抗ＳＤＲ及び他の抗体の生成
ｍＡｂ  ｒＦ１を生成するために、ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞選別機（ＢＤ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、ＣＤ１９＋ＣＤ３−ＣＤ２７＋ＩｇＤ−ＩｇＡ−メモリーＢ細胞をＭＲＳＡ感染ドナーの末梢血から単離した。Ｂ細胞リンパ腫（Ｂｃｌ）−ｘＬ及びＢｃｌ−６遺伝子によるウイルス形質導入前に、Ｋｗａｋｋｅｎｂｏｓ  ＭＪ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １６：１２３−１２８に前に記載されるように、インターロイキン２１の存在下で、メモリー細胞をＣＤ４０Ｌ−発現マウスＬ線維芽細胞上で活性化した。形質導入したＢ細胞を同じ培養系中で維持した。ドナー血液の使用は、施設内審査委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。ＥＬＩＳＡにより、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ｒＦ１を、ＭＳＳＡ株Ｎｅｗｍａｎの可溶化物との反応性により培養上清から選択し、陽性ウェルをサブクローニングし、ＥＬＩＳＡにより２回再検査した。ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ヒトＩｇＧ１カッパ定常領域を有する重鎖及び軽鎖可変領域をクローニングすることにより、組換えｒＦ１を生成し、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）内に形質移入した。プロテインＡ結合ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、精製したＩｇＧを培養上清から得た。ｍＡｂ  ｒＦ１及びその変異形の生成は、ＵＳ８，６１７，５５６（Ｂｅａｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．）及びＨａｚｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２１０３）ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ９（１０）：１−１８（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２５６】
抗体重鎖及び軽鎖の同族対合を保存するＳｙｍｐｌｅｘ（商標）技術を用いて、ヒトＩｇＧ１  ｍＡｂｓ  ＳＤ２、ＳＤ３、及びＳＤ４（全てグリコシル化ＳＤＲタンパク質に対して）、ならびに４６７５（ヒトＩｇＧ１及び抗ＣｌｆＡ）を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染後患者からの末梢Ｂ細胞からクローニングした［３４］。組換え完全長ＩｇＧレパートリーの遺伝源として、血漿及びメモリーＢ細胞の両方を使用した（投稿準備中）。個々の抗体クローンは哺乳類細胞の形質移入により発現された［３５］。７日後に完全長ＩｇＧ１抗体を含有する上清を採取し、ＥＬＩＳＡによる抗原結合のスクリーニングに使用した。抗体４６７５、ＳＤ２、ＳＤ３、及びＳＤ４は、ＵＳＡ３００またはＮｅｗｍａｎ  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株からの細胞壁調製物への結合に陽性であった。その後、抗体を２００−ｍｌの一過性の形質移入物において産生し、さらなる試験のためにプロテインＡクロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ，ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で精製した。これらの抗体の単離及び使用は倫理審査委員会（ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｅｔｈｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｂｏａｒｄ）により承認された。ｒＦ１変異形を生成した。
【０２５７】
それぞれの組換えタンパク質でマウスを免疫化することにより、ＣｌｆＡ（９Ｅ１０）、ＣｌｆＢ（１０Ｄ２）、ＳｄｒＤ（１７Ｈ４）、ＩｓｄＡ（２Ｄ３）及び未修飾ＳＤＲタンパク質（９Ｇ４）に対するマウスｍＡｂを生成し、これは、標準的なプロトコルを用いて大腸菌において発現した後に精製され、ハイブリドーマ上清はプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製された。ペプチドグリカン（ＰＧＮ）由来ペプチドＣＫＫＧＧＧ−（Ｌ−Ａｌａ）−（Ｄ−ガンマ−Ｇｌｕ）−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｄ−Ａｌａ）−Ｄ−Ａｌａ）でウサギを免疫化することにより、ウサギｍＡｂ  ２８．９．９を生成し、続いてＩｇＧをクローニングした。
【０２５８】
実施例４  ＭＲＳＡ感染ドナーから単離した非常にオプソニンのモノクローナル抗体（ｒＦ１）の特徴付け
上述のように、いくつかのＳ．ａｕｒｅｕｓ反応性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をＭＲＳＡ感染ドナーの末梢血からのメモリーＢ細胞から単離した。これらの抗体を特徴付けする際、１つのＩｇＧ１  ｍＡｂ（以後、ｒＦ１と称する）は、ヒト多形核白血球（ＰＭＮ）により強いオプソニン化死滅（ＯＰＫ）を誘発したＳ．ａｕｒｅｕｓ株のパネルに広く反応性であると特定された。
【０２５９】
ｍＡｂ  ｒＦ１の、臨床ＭＲＳＡ株ＵＳＡ３００からの細菌に対する最大結合はアイソタイプ一致抗ＣｌｆＡ  ｍＡｂよりも約１０倍高かった（図５Ａ）。結合の増加と一致して、ｒＦ１によるオプソニン化により、ＰＭＮによるＵＳＡ３００の取り込み（図５Ｂ）及び死滅（図５Ｃ）が増加した。対照的に、ヒト抗ＣｌｆＡによるプレオプソニン化は、細菌の生存率に対して作用はなかった（図５Ｃ）。ｒＦ１抗体は、ＰＭＮの不在化で、ＵＳＡ３００の生存率に影響を及ぼさなかった。よって、ｒＦ１は、ＭＲＳＡに結合する能力を有するｍＡｂであり、ＰＭＮによるＭＲＳＡの強力な死滅を誘発する。
【０２６０】
実施例５  ｒＦ１のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ株への結合
培養物または感染組織からの全細菌に対するｒＦ１結合のＦＡＣＳ分析
全細菌をＴＳＡプレートまたはＴＳＢ培養物から採取し、０．１％ＩｇＧ無ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）及び１０ｍＭへペス（ｐＨ７．４）（ＨＢ緩衝剤）で補足されたフェノールレッドを含まないＨＢＳＳで洗浄した。細菌（２０×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）を、ＨＢ緩衝剤中の３００μｇ／ｍＬのウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と共に１時間室温（ＲＴ）でインキュベートし、非特異的ＩｇＧ結合を遮断した。細菌を、ｒＦ１またはアイソタイプ対照ＩｇＧ１  ｍＡｂ  ｇＤ：５２３７を含む２μｇ／ｍＬの一次抗体で染色し（Ｎａｋａｍｕｒａ  ＧＲ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７：６１７９−６１９１）、次に、蛍光抗ヒトＩｇＧ二次抗体で染色した（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）。細菌を洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）（ＢＤ）で分析した。
【０２６１】
感染マウス組織からの細菌の抗体染色に関して、６〜８週齢の雌のＣ５７Ｂｌ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）にＰＢＳ中１０８ＣＦＵの対数期成長ＵＳＡ３００を静脈内注射した。マウスの臓器を感染２日後に採取した。ウサギ感染性心内膜炎（ＩＥ）は、Ｔａｔｔｅｖｉｎ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５４：６１０−６１３に記載されるように確立された。ウサギに５×１０７ＣＦＵの静止期成長ＭＲＳＡ株ＣＯＬを静脈内注射し、心臓疣贅を１８時間後に採取した。３０ｍｇ／ｋｇのバンコマイシンでの治療は、７×１０７ＣＦＵの静止期ＣＯＬで感染させた１８時間後にｂ．ｉ．ｄ．で静脈内投与された。
【０２６２】
マウスまたはウサギの細胞を溶解するために、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（登録商標）細胞分散装置（ｃｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、組織をＭチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）中で均質化し、続いて、０．１％トリトン−Ｘ１００（Ｔｈｅｒｍｏ）、１０μｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）、及びＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＰＢＳ中で、室温で１０分間インキュベートした。懸濁液を４０ミクロンフィルタ（ＢＤ）に通し、上述のように細菌をｍＡｂで染色した。２０μｇ／ｍＬのマウスｍＡｂ  ７０２抗Ｓ．ａｕｒｅｕｓペプチドグリカン（ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）及び蛍光色素標識抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で２重染色することにより、細菌をマウス臓器破片と区別した。フローサイトメトリー分析中に、２重蛍光プロットからのｍＡｂ  ７０２を用いた陽性染色に対して細菌をゲーティングした。全ての動物実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏにより承認された。
【０２６３】
フローサイトメトリー（ＦＣＭ）分析は、試験した１５全てのＳ．ａｕｒｅｕｓ株に対するｒＦ１の強い結合活性を示した（図７）。これらの株はＳ．ａｕｒｅｕｓ系統樹にわたって広く分布した［８］。細菌細胞表面抗原の発現レベルはインビトロとインビボ成長との間で異なる場合があるため、我々は、ｒＦ１が全身感染後の様々なマウス組織から単離したＵＳＡ３００を認識する能力も試験した。ｒＦ１  ｍＡｂは、感染マウスの腎臓、肝臓、及び肺に由来するＵＳＡ３００に強く結合した（図６）。マウスの腎臓からのＵＳＡ３００に対するｒＦ１の結合は、感染後少なくとも８日間持続し（図示せず）、感染中のｒＦ１エピトープの強い長期発現を示唆する。加えて、ｒＦ１は、感染性心内膜炎のウサギモデルの心臓疣贅からのＭＲＳＡ  ＣＯＬ細菌に強く結合した。バンコマイシンでの治療は、ｒＦ１のＭＲＳＡとの反応性に影響を及ぼさなかった（図６）。よって、ｒＦ１により認識された抗原は、様々な株にわたって保存され、様々な成長及び感染条件において安定して発現された。
【０２６４】
全てのＳ．ａｕｒｅｕｓ株にわたるｒＦ１反応性の遍在的性質を所与として、実験は、このような反応性が他のグラム陽性細菌に及ぶかを見るために行われた。とりわけ、ｒＦ１結合は、コアグラーゼ陰性ヒト病原体のＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに対してのみ検出可能であった（図７）。ｒＦ１  ｍＡｂは、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ及びＳ．ｃａｒｎｏｓｕｓ、または他のグラム陽性種、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、及びＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含む、試験した任意の他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ種に結合しなかった（図７）。よって、ｒＦ１は、ヒト適合Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ病原体上で安定して発現した表面抗原（複数可）に結合するヒト抗体であり、ヒトＰＭＮによる細菌死滅を促進する。
【０２６５】
実施例６  ｒＦ１抗体のアミノ酸修飾
要約すると、ｒＦ１  Ａｂの各々のＶＨ領域が省かれ（ｃｌｏｎｅｄ  ｏｕｔ）、ヒトＨ鎖ガンマ１定常領域に結合され、ＶＬがカッパ定常領域に結合されて、ＩｇＧ１としてＡｂを発現する。野生型配列はある特定の位置で変更され、以下に記載されるように抗原結合を維持しながら、抗体の安定性を改善する。次に、システイン改変Ａｂ（ＴｈｉｏＭａｂ、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）とも称される）を生成した。
【０２６６】
ｉ．安定性変異形の生成
ある特定の特性を改善するためにｒＦ１  Ａｂを改変し（脱アミド化、アスパラギン酸異性化、酸化、またはＮ結合グリコシル化を回避するため）、アミノ酸置換後の抗原結合ならびに化学安定性の維持に関して試験した。行われたアミノ酸改変はＵＳ８，６１７，５５６に記載される通りであった。
【０２６７】
ｉｉｉ．Ｃｙｓ改変変異体（ＴｈｉｏＭａｂ）の生成
抗体をリンカー−抗生物質中間体に抱合させるために、前に教示されるように、既定の位置で、例えばＬ鎖のカッパ定常領域のＶ２０５で、及びヒトガンマ１Ｈ鎖のＡ１１８位で（Ｅｕ変換に従うアミノ酸位置番号）、システインをＨ鎖（ＣＨ１の）またはＬ鎖（Ｃκ）に導入することにより、完全長ＴｈｉｏＭａｂを産生した。次に、Ｈ鎖及びＬ鎖を別個のプラスミドにクローニングし、Ｈ及びＬコードプラスミドを２９３細胞内に同時導入し、そこで、それらが発現され、インタクトなＡｂ内にアセンブルされる。Ｈ鎖及びＬ鎖の両方とも同じ発現プラスミド内にクローニングされ得る。Ｈ鎖の各々に１つずつ、２つの改変Ｃｙｓ、またはＬ鎖の各々に１つずつ、２つの改変Ｃｙｓ、または抗体四量体当たりに４つの改変ＣｙｓをもたらすＨ鎖及びＬ鎖の各々における改変Ｃｙｓの組み合わせ（ＨＣ  ＬＣ  Ｃｙｓ）を有するＩｇＧ１は、ｃｙｓ変異体鎖及び野生型鎖の所望の組み合わせを発現することにより生成された。
【０２６８】
実施例７  ピペリジルベンゾオキサジノリファマイシン（ピぺＢＯＲ）５
0006751393.tif 000050
２−ニトロベンゼン−１，３−ジオール１を、エタノール溶媒中のパラジウム／炭素触媒を含む水素ガス下で水素化し、塩酸塩として単離した２−アミノベンゼン−１，３−ジオール２を得た。ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド及びジクロロメタン／テトラヒドロフラン中のトリエチルアミンを用いた２の単一保護により、２−アミノ−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）フェノール３を得た。室温で、酸化マンガンまたはトルエン中の酸素ガスとの酸化縮合により、リファマイシンＳ（ＣｈｅｍＳｈｕｔｔｌｅ  Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳ７３４２０１１、ＵＳ７２７１１６５、ＵＳ７５４７６９２）を３と反応させ、ＴＢＳ保護されたベンゾオキサジノリファマイシン４を得た。ＬＣＭＳ  （ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝９１５．４１。４をピペリジン−４−アミン及び酸化マンガンと反応させて、ピペリジルベンゾオキサジノリファマイシン（ピぺＢＯＲ）５を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝８９９．４０
【０２６９】
実施例８  ジメチルピぺＢＯＲ６
0006751393.tif 000051
Ｎ，Ｎ−ジメチルピペリジン−４−アミンをＴＢＳ保護されたベンゾオキサジノリファマイシン４と反応させて、ジメチルピペリジルベンゾオキサジノリファマイシン（ジメチルピペＢＯＲ）６を得た。
0006751393.tif 000052
【０２７０】
あるいは、（５−フルオロ−２−ニトロ−１，３−フェニレン）ビス（オキシ）ビス（メチレン）ジベンゼン７を、テトラヒドロフラン／メタノール溶媒中のパラジウム／炭素触媒を含む水素ガス下で水素化して、ベンジル基を除去し、２−アミノ−５−フルオロベンゼン−１，３−ジオール８を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝１４４．０４。６０℃で、空気中または酢酸エチル中のフェリシアン化カリウム中での酸化縮合により、市販のリファマイシンＳまたはリファマイシンＳＶナトリウム塩（ＣｈｅｍＳｈｕｔｔｌｅ  Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を、２−アミノ−５−フルオロベンゼン−１，３−ジオール８と反応させて、フルオロベンゾオキサジノリファマイシン９を得た。フッ化物をＮ，Ｎ−ジメチルピペリジン−４−アミンで置換することにより、ジメチルピぺＢＯＲ６を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝９２７．４３
【０２７１】
実施例９  （Ｓ）−Ｎ−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチル）−Ｎ−（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１０
ステップ１：１−（５−アミノペンチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン塩酸塩１０ａの調製
0006751393.tif 000053
【０２７２】
無水マレイン酸、フラン−２，５−ジオン（１５０ｇ，１．５３ｍｏｌ）を、ＨＯＡｃ（１０００ｍＬ）中の６−アミノヘキサン酸（２０１ｇ，１．５３ｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。混合物を室温で２時間攪拌した後、還流で８時間加熱した。有機溶媒を減圧下で除去し、残渣をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ×３）で抽出し、Ｈ２Ｏで洗浄した。混合有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、粗産物を得た。これを石油エーテルで洗浄し、白色の固体として６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸を得た（２５０ｇ，７７．４％）。ＤＰＰＡ（１３０ｇ，４７３ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（４７．９ｇ，４７３ｍｍｏｌ）を、ｔ−ＢｕＯＨ（２００ｍＬ）中の６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸（１００ｇ，４７３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を、還流で８時間、Ｎ２下で加熱した。混合物を濃縮し、残渣をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝３：１）により精製し、ｔｅｒｔ−ブチル  ５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチルカルバメート（１３ｇ，１０％）を得た。無水ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル  ５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチルカルバメート（２８ｇ，９９２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）を液滴添加した。混合物を室温で５時間攪拌した後、濾過し、固体を乾燥させて、１−（５−アミノペンチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン塩酸塩１０ａ（１６ｇ，７３．７％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．０２（ｓ，２Ｈ），６．９９（ｓ，２Ｈ），３．３７−３．３４（ｍ，２Ｈ），２．７１−２．６４（ｍ，２Ｈ），１．５６−１．４３（ｍ，４Ｈ），１．２３−１．２０（ｍ，２Ｈ）。
【０２７３】
ステップ２：（Ｓ）−１−（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イルカルバモイル）シクロブタンカルボン酸１０ｂの調製
0006751393.tif 000054
【０２７４】
ジオキサン及びＨ２Ｏ（５０ｍＬ／７５ｍＬ）の混合物中の（Ｓ）−２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸１０ｇ（１７．５０ｇ，０．１０ｍｏｌ）の混合物に、Ｋ２ＣＯ３（３４．５５ｇ，０．２５ｍｏｌ）を添加した。Ｆｍｏｃ−Ｃｌ（３０．９６ｇ，０．１２ｍｏｌ）を０℃でゆっくり添加した。反応混合物を２時間にわたって室温に温めた。有機溶媒を減圧下で除去し、水スラリーを６Ｍ  ＨＣｌ溶液でｐＨ＝３に調節し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×３）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−ウレイドペンタン酸１０ｆ（３８．０ｇ，９５．６％）を得た。１０ｆは市販されている。
【０２７５】
ＤＣＭ及びＭｅＯＨ（１００ｍＬ／５０ｍＬ）の混合物中の１０ｆ（４ｇ，１０ｍｍｏｌ）の溶液に、（４−アミノフェニル）メタノール（１．６ｇ，１３ｍｍｏｌ，１．３ｅｑ）及び２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン，ＥＥＤＱ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＣＡＳ  Ｒｅｇ．Ｎｏ．１６３５７−５９−８（３．２ｇ，１３ｍｍｏｌ，１．３ｅｑ）を添加した。混合物を室温で１６時間、Ｎ２下で攪拌した後、これを濃縮して、褐色の固体を得た。ＭＴＢＥ（２００ｍＬ）を添加し、１５℃で２時間攪拌した。濾過により固体を回収し、ＭＴＢＥ（５０ｍＬ×２）で洗浄して、橙色の固体として（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（１−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）カルバメート１０ｅ（４．２ｇ，８４％）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ５０３．０［Ｍ＋１］。
【０２７６】
乾燥ＤＭＦ（２０ｍｌ）中の１０ｅ（４．２ｇ，８．３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ピペリジン（１．６５ｍＬ，１７ｍｍｏｌ，２ｅｑ）を室温で液滴添加した。混合物を室温で３０分間攪拌し、固体の沈殿物が形成された。乾燥ＤＣＭ（５０ｍＬ）を添加し、混合物は直ぐに透明になった。混合物を室温でさらに３０分間攪拌し、ＬＣＭＳは１０ｅが消費されたことを示した。これを、減圧下で乾燥状態まで濃縮し（ピペリジンが残っていないことを確実にする）、残渣をＥｔＯＡｃとＨ２Ｏ（５０ｍＬ／２０ｍＬ）との間に分配した。水相をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ×２）で洗浄し、濃縮して、油状の残留物として（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）−５−ウレイドペンタンアミド１０ｄ（２．２ｇ，９４％）（少量のＤＭＦを含有した）を得た。
【０２７７】
市販の１，１−シクロブタンジカルボン酸，１，１−ジエチル  エステル（ＣＡＳ  Ｒｅｇ．Ｎｏ．３７７９−２９−１）を、水性塩基で半酸／エステル  １，１−シクロブタンジカルボン酸，１−エチルエステル（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．５４４５０−８４−９）にけん化を制限し、ＴＢＴＵ（Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、これはＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムテトラフルオロボレート、ＣＡＳ  Ｎｏ．１２５７００−６７−６，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｂ−２９０３とも呼ばれる）などのカップリング試薬、及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミドで活性化することにより、ＮＨＳエステル，１−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）１−エチル  シクロブタン−１，１−ジカルボキシレートに変換した。
【０２７８】
ＤＭＥ（５０ｍＬ）中の１−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）１−エチル  シクロブタン−１，１−ジカルボキシレート（８ｇ，２９．７ｍｍｏｌ）の溶液に、１０ｄ（６．０ｇ，２１．４ｍｍｏｌ）の溶液及び水（３０ｍＬ）中のＮａＨＣＯ３（７．４８ｇ，８９．０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１６時間攪拌した後、減圧下で乾燥状態に濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）により精製して、白色の固体として（Ｓ）−エチル  １−（（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）−２−オキソ−６−ウレイドヘキサン−３−イル）カルバモイル）シクロブタンカルボキシレート１０ｃ（６．４ｇ，６８．７％）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ４３５．０［Ｍ＋１］
【０２７９】
ＴＨＦ及びＭｅＯＨ（２０ｍＬ／１０ｍＬ）の混合物中の１０ｃ（６．４ｇ，１４．７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、室温のＨ２Ｏ（２０ｍＬ）中のＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（１．２ｇ，２８．６ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した後、溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣をｐｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製して、（Ｓ）−１−（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イルカルバモイル）シクロブタンカルボン酸１０ｂ（３．５ｇ、収率５８．５％）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ４０６．９［Ｍ＋１］。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．８６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），８．５１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），５．８８−５．８５（ｍ，１Ｈ），５．７８（ｓ，２Ｈ），４．５４−４．４９（ｍ，３Ｈ），４．３８−４．３２（ｍ，１Ｈ），３．８６−３．７５（ｍ，１Ｈ），３．８４−３．８０（ｍ，２Ｈ），３．２８−３．２１（ｍ，１Ｈ），３．３０−３．２４（ｍ，１Ｈ），３．００−２．８０（ｍ，１Ｈ），２．３７−２．２８（ｍ，２Ｈ）。
【０２８０】
ステップ３：Ｓ）−Ｎ−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチル）−Ｎ−（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１０の調製
0006751393.tif 000055
【０２８１】
ジイソプロピルエチルアミン、ＤＩＰＥＡ（１．５９ｇ，１２．３ｍｍｏｌ）、及びビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド、ＢＯＰ−Ｃｌ（ＣＡＳ  Ｒｅｇ．Ｎｏ．６８６４１−４９−６，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，６９２ｍｇ，２．７１ｍｍｏｌ）を、０℃のＤＭＦ（１０ｍＬ）中の（Ｓ）−１−（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イルカルバモイル）シクロブタンカルボン酸１０ｂ（１ｇ，２．４６ｍｍｏｌ）の溶液、続いて１−（５−アミノペンチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン塩酸塩１０ａ（５９２ｍｇ，２．７１ｍｍｏｌ）に添加した。混合物を０℃で０．５時間撹拌した。反応混合物をクエン酸溶液（１０ｍＬ）でクエンチし、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０：１）で抽出した。有機層を乾燥させ、濃縮し、残渣をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）により精製して、Ｓ）−Ｎ−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチル）−Ｎ−（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１０（１．０ｇ，７１％）を得、これはＭＣ−ＣＢＤＫ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨとも称される。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝５７１．２８。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．００（ｓ，１Ｈ），７．８２−７．７７（ｍ，２Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．９６（ｓ，２Ｈ），５．９５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），５．３９（ｓ，２Ｈ），５．０８（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．４０−４．３５（ｍ，３Ｈ），４．０９（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．０１（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，２Ｈ），３．０５−２．７２（ｍ，４Ｈ），２．６８−２．５８（ｍ，３Ｈ），２．４０−２．３６（ｍ，４Ｈ），１．７２−１．７０（ｍ，３Ｈ），１．４４−１．４２（ｍ，１Ｈ），１．４０−１．２３（ｍ，６Ｈ），１．２１−１．１６（ｍ，４Ｈ）。
【０２８２】
実施例１０  （Ｓ）−Ｎ−（１−（４−（クロロメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）−Ｎ−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１１
0006751393.tif 000056
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の（Ｓ）−Ｎ−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチル）−Ｎ−（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１０（２．０ｇ，３．５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦまたはＮ−メチルピロリドン、ＮＭＰ（５０ｍＬ）の溶液を、０℃で、滴下して少しずつ塩化チオニル、ＳＯＣｌ２（１．２５ｇ，１０．５ｍｍｏｌ）で処理した。反応物は黄色のままであった。反応物を＞９０％変換を示すＬＣ／ＭＳにより監視した。反応混合物を２０℃で３０分間または数時間攪拌した後、水（５０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ×３）で抽出した。有機相を乾燥させ、濃縮し、フラッシュカラム（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝２０：１）により精製して、灰色の固体として１１を形成し、これはＭＣ−ＣＢＤＫ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−Ｃｌとも称される。ＬＣＭＳ：（５−９５，ＡＢ，１．５ｍｉｎ），０．６９６ｍｉｎ，ｍ／ｚ＝５８９．０［Ｍ＋１］＋。
【０２８３】
実施例１１  （Ｓ）−４−（２−（１−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチルカルバモイル）シクロブタンカルボキサミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル４−ニトロフェニル  カーボネート１２
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無水ＤＭＦ中の（Ｓ）−Ｎ−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチル）−Ｎ−（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１０の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、続いてＰＮＰカーボネート（ビス（４−ニトロフェニル）カーボネート）を添加した。反応溶液を室温（ｒ．ｔ．）で４時間攪拌し、混合物をｐｒｅｐ−ＨＰＬＣにより精製して、１２を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝７３６．２９。
【０２８４】
実施例１２  ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチル，フルオロピぺＢＯＲ）−ＰＬＡ−１の調製
0006751393.tif 000058
ＰＬＡ−２の手順後、（Ｓ）−Ｎ−（１−（４−（クロロメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）−Ｎ−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１１及びフッ化リファマイシン誘導体のジメチルフルオロピぺＢＯＲ１３（ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝９４５．４３）を反応させて、ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチル，フルオロピぺＢＯＲ）−ＰＬＡ−１を形成した（表２）。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝１４９９．７
【０２８５】
実施例１３  ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチルピぺＢＯＲ）−ＰＬＡ−２の調製
ＤＭＦ中の（Ｓ）−Ｎ−（１−（４−（クロロメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）−Ｎ−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１１（０．０３５ｍｍｏｌ）を０℃に冷却し、ジメチルピぺＢＯＲ６（１０ｍｇ，０．０１１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をさらに０．５ｍＬのＤＭＦで希釈した。空気中で３０分間攪拌した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ，１０μＬ，０．０５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を空気中で一晩攪拌した。ＬＣ／ＭＳにより、５０％の所望の産物が認められた。反応の進行が停止したと思われるまで、反応物を空気中でさらに６時間攪拌しながら、追加の０．２ｅｑ  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン塩基を添加した。反応混合物をＤＭＦで希釈し、ＨＰＬＣ（．Ｈ２Ｏ中２０〜６０％ＡＣＮ／ＨＣＯＯＨ）で精製して、ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチルピペＢＯＲ）−ＰＬＡ−２を得た（表２）。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝１４８１．８、収率３１％。
【０２８６】
実施例１４  ＭＣ−（（Ｒ）−チオフェン−３−イル−ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチルピぺＢＯＲ）（ＰＬＡ−３）の調製
0006751393.tif 000059
ＰＬＡ−２の手順後、（Ｎ−（（Ｓ）−１−（４−（クロロメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）−Ｎ−（（Ｒ）−３−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチルアミノ）−３−オキソ−１−（チオフェン−３−イル）プロピル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１４（ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝７４２．３）及びジメチルピペＢＯＲ６を反応させて、ＭＣ−（（Ｒ）−チオフェン−３−イル−ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチルピペＢＯＲ）（ＰＬＡ−３、表２）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝１６３３．９
【０２８７】
実施例１５  ＭＣ−（（Ｓ）−チオフェン−３−イル−ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチルピペＢＯＲ）（ＰＬＡ−４）の調製
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ＰＬＡ−２の手順後、（Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（クロロメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）−Ｎ−（（Ｒ）−３−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチルアミノ）−３−オキソ−１−（チオフェン−３−イル）プロピル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１５（ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝７４２．３）及びジメチルピペＢＯＲ６を反応させて、ＭＣ−（（Ｒ）−チオフェン−３−イル−ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチルピペＢＯＲ）（ＰＬＡ−４、表２）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝１６３３．９
【０２８８】
実施例１６  ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢＣ−（ピペＢＯＲ）（ＰＬＡ−５）の調製
ピペリジルベンゾオキサジノリファマイシン（ピペＢＯＲ）５（１５ｍｇ，０．０１６７ｍｍｏｌ）、そして次に（Ｓ）−４−（２−（１−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチルカルバモイル）シクロブタンカルボキサミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル  ４−ニトロフェニル  カーボネート１２（１２ｍｇ，０．０１６７ｍｍｏｌ）をバイアルに量り入れた。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（０．３ｍＬ）、続いてジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０．００６ｍＬ，０．０３３４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で２時間攪拌した。ＨＰＬＣ（３０〜７０％ＭｅＣＮ／水＋１％ギ酸）により、反応溶液を直接精製して、ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢＣ−（ピペＢＯＲ）（ＰＬＡ−５、表２）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝１４９６．５
【０２８９】
実施例１７  ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢＣ−（ピぺラジＢＴＲ）（ＰＬＡ−６）の調製
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ＰＬＡ−５の手順後、ピペリジンリファマイシン誘導体、ピぺラジＢＯＲ１６（ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝８８５．４）、及び（Ｓ）−４−（２−（１−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチルカルバモイル）シクロブタンカルボキサミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル  ４−ニトロフェニル  カーボネート１２を反応させて、ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢＣ−（ピぺラジＢＴＲ）（ＰＬＡ−６、表２）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝１４８２．５
【０２９０】
実施例１８  ｒＦ１抗体−抗生物質抱合体の調製
表３の抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）は、ｒＦ１抗体をＰＭＬリンカー−抗生物質中間体（表２のものを含む）に抱合することにより調製された。抱合前に、ＷＯ２００４／０１０９５７（その教示はこの目的のため参照により組み込まれる）に記載される方法論に従う標準的な方法を用いて、ｒＦ１抗体をＴＣＥＰで部分的に還元した。例えば、Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８−７８４及びＵＳ２００５／０２３８６４９  Ａ１に記載される方法論に従う標準的な方法を用いて、部分的に還元した抗体をリンカー−抗生物質中間体に抱合した。簡潔に、部分的に還元した抗体をリンカー−抗生物質中間体と組み合わせて、リンカー−抗生物質中間体を抗体の還元システイン残基に抱合させた。抱合反応をクエンチし、ＡＡＣを精製した。各ＡＡＣの抗生物質負荷（抗体当たりの抗生物質部分の平均数）が決定され、単一のシステイン変異部位で改変されたｒＦ１抗体に関して約１〜約２であった。
【０２９１】
抱合のためのＴｈｉｏＭａｂの還元／酸化：ＣＨＯ細胞において発現された完全長のシステイン改変モノクローナル抗体（ＴｈｉｏＭａｂｓ−Ｊｕｎｕｔｕｌａ，ｅｔ  ａｌ．，２００８ｂ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６（８）：９２５−９３２、Ｄｏｒｎａｎ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１４（１３）：２７２１−２７２９、ＵＳ７５２１５４１、ＵＳ７７２３４８５、ＷＯ２００９／０５２２４９、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３０（２）：１８４−１９１、Ｊｕｎｕｔｕｌａ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３３２：４１−５２）を、３７℃で３時間、または室温で一晩、約２０〜４０倍過剰のＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩または２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）中のＤＴＴ  （ジチオスレイトール）で還元した（Ｇｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ  ２７３：７３−８０、Ｓｏｌｔｅｃ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）。還元されたＴｈｉｏＭａｂを希釈して、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）でＨｉＴｒａｐ  Ｓカラムに充填し、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有するＰＢＳで溶出した。あるいは、１／２０の容積の１０％酢酸を添加することにより、抗体を酸性化し、１０ｍＭスクシネート（ｐＨ５）で希釈し、カラム上に充填し、次いで１０カラム容積のスクシネート緩衝剤で洗浄した。カラムを５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、２ｍＭ  ＥＤＴＡで溶出した。
【０２９２】
溶出した還元ＴｈｉｏＭａｂを１５倍モル過剰のＤＨＡＡ（デヒドロアスコルビン酸）または２００ｎＭ水性硫酸銅（ＣｕＳＯ４）で処理した。鎖間ジスルフィド結合の酸化は、約３時間以上で完了した。周囲空気による酸化もまた有効である。再酸化された抗体を２０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡに透析し、−２０°Ｃで凍結保管した。
【０２９３】
リンカー−抗生物質中間体を用いたＴｈｉｏＭａｂの抱合：反応混合物のＬＣ−ＭＳ分析により決定される、反応が完了するまで（１６〜２４時間）、脱遮断され、再酸化されたチオ−抗体（ＴｈｉｏＭａｂ）を、５０ｍＭトリス（ｐＨ８）中６〜８倍モル過剰の表２のリンカー−抗生物質中間体（２０ｍＭの濃度のＤＭＳＯストックから）と反応させた。
【０２９４】
次に、２０ｍＭのコハク酸ナトリウム（ｐＨ５）で希釈した後、粗抗体−抗生物質抱合体（ＡＡＣ）をカチオン交換カラムに適用した。このカラムを少なくとも１０カラム容積の２０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ５）で洗浄し、抗体をＰＢＳで溶出した。ゲル濾過カラムを使用して、２４０ｍＭスクロースと共にＡＡＣを２０ｍＭ  Ｈｉｓ／アセテート（ｐＨ５）に製剤化した。タンパク質濃度を決定するためにＵＶ分光測定、凝集分析のために分析ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、ならびにリジンＣエンドペプチダーゼを用いた処理前及び処理後のＬＣ−ＭＳにより、ＡＡＣを特徴付けした。
【０２９５】
Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＷ８０２．５カラムを使用して、０．７５ｍｌ／分の流速で、０．２５ｍＭ塩化カリウムを含む０．２Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．２）及び１５％ＩＰＡにおいて、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。ＡＡＣの凝集状態は、２８０ｎｍでの溶出されたピーク面積吸光度の積分により決定された。
【０２９６】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＱＴＯＦ  ６５２０  ＥＳＩ機器を使用してＬＣ−ＭＳ分析を行った。例として、この化学を使用して生成されたＡＡＣを、３７℃で３０分間、トリス（ｐＨ７．５）中１：５００ｗ／ｗエンドプロテアーゼＬｙｓＣ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理した。得られた切断断片を、８０℃に加熱した１０００Ａ、８ｕｍ  ＰＬＲＰ−Ｓカラム上に充填し、３０％Ｂ〜４０％Ｂの勾配で５分で溶出した。移動相Ａ：０．０５％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ。固定相Ｂ：０．０４％ＴＦＡを含むアセトニトリル。流速：０．５ｍｌ／分。タンパク質の溶出は、エレクトロスプレーイオン化及びＭＳ分析の前に、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度検出により監視された。未抱合Ｆｃ断面、残留未抱合Ｆａｂ、及び抗生物質−Ｆａｂのクロマトグラフ分解能が通常達成される。得られたｍ／ｚスペクトルは、抗体断片の質量を計算するために、Ｍａｓｓ  Ｈｕｎｔｅｒ（商標）ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して解析（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）された。
【０２９７】
改変Ｃｙｓ２０５を含有する配列番号９のｒＦ１Ｌ鎖及び配列番号１０を含むｒＦ１  Ｈ鎖を使用して、ＡＡＣ１０３（ＡＡＲ＝１．９）チオ−ｒＦ１−ＨＣ−１２１Ｃ，ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチルピペＢＯＲ）を作製した。改変Ｃｙｓ２０５を含有する先行の配列番号９のｒＦ１Ｌ鎖、及び改変Ｃｙｓ１１４（１１４  Ｋａｂａｔ番付は１１８  Ｅｕ番付及び１２１連番と同じである）を含有する配列番号１２を含むｒＦ１  Ｈ鎖を使用して、ＡＡＣ１０２（ＡＡＲ＝３．９）チオ−ｒＦ１−ＨＣ−１２１Ｃ，ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチルピペＢＯＲ）を作製した。Ｃｙｓ改変Ｌ鎖及び／またはＨ鎖は、表２に示されるように、ＰＭＬリンカー及びリファマイシン型抗生物質に抱合された。
【０２９８】
実施例１９  ｒＦ１−ＡＡＣのインビトロでの有効性
様々な用量（１００ｕｇ／ｍＬ、１０ｕｇ／ｍＬ、１ｕｇ／ｍＬ、または０．１ｕｇ／ｍＬ）の抗Ｓ．ａｕｒｅｕｓ未抱合抗体である、抗体当たり平均１．９の抗生物質分子（ＡＡＲ２）を負荷した１０３ＡＡＣ、または抗体当たり平均３．９の抗生物質分子（ＡＡＲ４）を負荷した１０２ＡＡＣと共に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＵＳＡ３００  ＮＲＳ３８４株）を１時間インキュベートし、抗体を細菌に結合させた。得られたオプソニン化細菌をマウスマクロファージに与え、３７℃でインキュベートし、貪食作用を可能にした（インビトロマクロファージアッセイ）。２時間後、感染ミックスを除去し、任意の残留細胞外細菌を死滅させるために５０ｕｇ／ｍＬのゲンタマイシンで補足された通常の成長培地と交換した。生存細胞内細菌の総数は、トリプシンダイズ寒天プレート上でマクロファージ可溶化液の段階希釈を平板培養することにより、２日後に決定された。
【０２９９】
結果は図１０に示される。試験した両方のＡＡＣ（ＡＡＲ２ｖｓ．ＡＡＲ４）は類似する用量応答を示し、１０ｕｇ／ｍＬ以上の用量で最大死滅をもたらし、１ｕｇ／ｍＬ以下では一部の死滅から死滅がなく、ＡＡＣの用量応答は細菌上の抗体結合部位の数により制限されることを示唆する。抗体当たり４つの抗生物質分子を負荷することにより、ＡＡＣによる細菌死滅及び全体的な細菌の死滅は、試験した全用量でＡＡＲ４  ＡＡＣで優れていた。試験した最高用量で、２ＤＡＲ  ＡＡＣは、細菌負荷を３５０倍減少させた一方で、４ＡＡＲ  ＡＡＣは、細菌負荷を４，０００倍超減少させた（破線は示されるアッセイの検出限界を示す）。
【０３００】
この例は、表３のｒＦ１−ＡＡＣ１０２（ＡＡＲ＝３．９）及び１０３（ＡＡＲ＝１．９）チオ−ｒＦ１−ＨＣ−１２１Ｃ，ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチルピペＢＯＲ）がインビトロマクロファージアッセイにおいて細胞内ＭＲＳＡを死滅させたことを示す。結果は図１０に示される。
【０３０１】
実施例２０  ｒＦ１−ＡＡＣのインビボでの有効性
この例は、ｒＦ１−ＡＡＣがマウス静脈内感染モデルにおいて細胞内Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染の大幅な減少または根絶に有効であったことを示す。
【０３０２】
腹膜炎モデル。７週齢の雌のＡ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を腹膜注射により５×１０７ＣＦＵのＵＳＡ３００で感染させた。感染２日後にマウスを屠殺し、腹膜を５ｍＬの冷リン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）で洗い流した。静脈内感染モデル用に、以下に記載されるように、５ｍＬのＰＢＳ中で腎臓を均質化した。卓上遠心機で、４℃で、１，０００ｒｐｍで５分間、腹膜洗浄物を遠心分離した。細胞外細菌として上清を回収し、細胞内分画として腹膜細胞を含有する細胞ペレットを回収した。３７℃で２０分間、細胞を５０μｇ／ｍＬのリゾスタフィンで処理して、混入細胞外細菌を死滅させた。腹膜細胞を氷冷ＰＢＳで３×洗浄して、分析前にリゾスタフィンを除去した。細胞内ＣＦＵの数を計測するために、腹膜細胞を、０．１％トリトン−Ｘを含むＨＢ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び０．１％ウシ血清アルブミンで補足されたハンクス平衡塩溶液）中に溶解し、０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で可溶化液の段階希釈物を作製した。
【０３０３】
マウス静脈内感染モデル。競合ヒトＩｇＧ（ＳＣＩＤ  ＩＶＩＧモデル）に関する研究に関して、血清中少なくとも１０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧの一定の血清レベルを達成するように最適化された投薬レジメンを使用して、ＣＢ１７．ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）をＧａｍｍａＧａｒｄ  Ｓ／Ｄ  ＩＧＩＶ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＡＳＤ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｒｏｏｋｓ  ＫＹ）で再調整した。マウス当たり３０ｍｇの初期静脈内投与量、続いて６時間後に腹腔内注射により１５ｍｇ／マウスの第２投薬量、その後３日間連続して、腹腔内注射によりマウス当たり１５ｍｇの日用量で、ＩＧＩＶを投与した。
【０３０４】
最初のＩＧＩＶ投薬４時間後に、マウス（各抗体またはＡＡＣにｎ＝８）を、静脈内注射によりリン酸緩衝生理食塩水で希釈した１×１０７ＣＦＵのＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００  ＮＲＳ３８４株）で感染させた。感染マウスを５０ｍｇ／ｋｇのｒＦ１裸抗体１０３  ＡＡＣ  ＤＡＲ２または１０２  ＡＡＣ  ＤＡＲ４で処置した。静脈内注射により、感染２６時間後に単回量のＡＡＣをマウスに与え、感染４日後に屠殺し、腎臓及び心臓を５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水中に採取した。ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して、組織試料を均質化した。臓器当たり回収された細菌の総数は、ＰＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ中の組織破砕物の段階希釈物を、５％脱線維素ヒツジ血液を含むトリプシンダイズ寒天上で平板培養することにより決定された。
【０３０５】
図１１Ａは、感染マウスの腎臓における細菌負荷に対するＡＡＣでのインビボ処置の結果を示す。抗体当たり２つの抗生物質分子（ＤＡＲ２）を含有するＡＡＣで処置することにより、細菌負荷が約３０倍減少し、抗体当たり４つの抗生物質分子（ＡＡＲ４）を含有するＡＡＣで処置することにより、細胞負荷が３０，０００倍超減少したことを示す。
【０３０６】
図１１Ｂは、心臓における細菌数に対するＡＡＣでのインビボ処置の結果を示す。ＡＡＣ  ＡＡＲ２で処置することにより、細菌負荷が約７０倍減少し、８匹のマウス中６匹が心臓において検出不可能な細菌レベルを有し、ＡＡＣ  ＤＡＲ４で処置することにより、心臓における感染を完全に根絶し、結果として８匹のマウス中８匹が検出不可能な細菌レベルを有した。
【０３０７】
上述の発明は、明確な理解の目的のために図示説明及び例としてある程度詳細に記載されてきたが、これらの説明及び例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書全体通して引用されている全ての特許、特許出願、及び参考文献は、参照により明示的に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
0006751393.tif 000097
【図１Ｄ】
0006751393.tif 000098
【図１Ｅ】
0006751393.tif 000099
【図１Ｆ】
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【図２】
0006751393.tif 000101
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0006751393.tif 000109
【図１０】
0006751393.tif 000110
【図１１Ａ】
0006751393.tif 000111
【図１１Ｂ】
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【配列表】
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