(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｉ）マイクロマニピュレータ及び検出装置に動作可能に接続可能であり、（ｉｉ）その中に作用電極を含み、（ｉｉｉ）水素イオンを選択的に吸収するポリマーコーティングを含有する、支持体上の細胞を貫通するためのナノピペットであって、前記ポリマーコーティングは、キトサンの層を含み、前記キトサンは、約３０，０００〜６０，０００単位のモノマー数を有する、前記ナノピペットと、
（ｂ）溶液中の前記作用電極と参照電極との間に異なる電圧を印加するように構成され、異なる電圧下で前記作用電極と前記参照電極との間のイオン電流を測定するようにさらに構成された増幅回路にさらに接続される前記ナノピペットと、
（ｃ）前記増幅回路によって測定された異なるイオン電流を細胞内のｐＨ値と相関させるための論理手段とを含む、単一細胞内のｐＨを測定する装置。
【請求項２】
前記マイクロマニピュレータ及び検出装置が、ＳＩＣＭ（走査型イオン伝導顕微鏡）及び単一細胞の中へ移動するためのナノピペットを制御するｘｙｚコントローラを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記増幅回路が、利得制御及びイオン電流を検出するためのローパスフィルタを有する検出回路を含む、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
単一の論理手段に接続されたナノピペットのアレイを含む、請求項１または２に記載の装置。
【請求項５】
前記キトサンが、モノマーに結合したヘムタンパク質を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記増幅回路が、前記参照電極に接続され、前記作用電極からの入力を有する増幅器からの入力に応答するポテンショスタットを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記ポテンショスタットが、前記ポテンショスタットの参照電極にも接続されている対極に接続されている、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記作用電極及び前記対極が、Ａｇ／ＡｇＣｌである、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
（ａ）種々の電位におけるイオン電流対電位を測定し、整流値を取得する回路に電気的に接続され、単一細胞内にナノピペットを挿入するための挿入装置に取り付けられた前記ナノピペットと、
（ｂ）前記整流値を周知のｐＨ値に対する整流値と相関させるための論理手段であって、それによって測定されたｐＨ値を同定する出力を提供する、論理手段と、
（ｃ）前記ナノピペットの表面に直接結合するキトサンの層を有する前記ナノピペットであって、前記キトサンは、約３０，０００〜６０，０００単位のモノマー数を有する、前記ナノピペットと、
（ｄ）補助電極としても機能し、ポテンショスタットに接続された参照電極を含む回路とを含む、単一細胞内のｐＨを測定するための装置。
【請求項１０】
前記論理手段が、補助電極における前記電流を測定することによって、前記参照電極に対して所与の電位範囲での作用電極の前記電位を走査するようにプログラムされる、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
フィルタ選択器及び感度選択回路によってブリッジされたｉ／Ｖ増幅器であって、構成要素が、電解液を通過する前記電流に基づいて検出可能な電流範囲を調整するように調整される、請求項９に記載の装置。
【請求項１２】
（ａ）（ｉ）マイクロマニピュレータ及び検出装置に動作可能に接続可能であり、（ｉｉ）その中に作用電極を含み、（ｉｉｉ）水素イオンを選択的に吸収するポリマーコーティングを含有する、支持体上の細胞を貫通するためのナノピペットを調製することであって、前記ポリマーコーティングは、キトサンの層を含み、前記キトサンは、約３０，０００〜６０，０００単位のモノマー数を有することと
（ｂ）溶液中の前記作用電極と参照電極との間に異なる電圧を印加するように構成され、異なる電圧下で前記作用電極と前記参照電極との間のイオン電流を測定するようにさらに構成された増幅回路に前記ナノピペットを接続することと
（ｃ）前記増幅回路によって測定された異なるイオン電流を、細胞内のｐＨ値と相関させるための論理手段に前記ナノピペットを接続することとを含む、単一細胞内のｐＨを測定するための装置を作る方法。
【請求項１３】
前記ナノピペットを通るイオン電流のＩ−Ｖ曲線を導き、測定する増幅器に前記作用電極を接続することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）水素イオンに応答し、約３０，０００〜６０，０００単位のモノマー数を有するキトサンの層を含む内部層を有し、ナノピペットを通るイオン電流と、前記ナノピペット及び参照電極を含む電気化学セル内の様々な電圧における電圧とを測定するように構成されたポテンショスタットを含む回路に作用電極によって電気的に接続される、前記ナノピペットを提供することと、
（ｂ）前記ナノピペットを前記電気化学セル内の生細胞に挿入することと、
（ｃ）前記イオン電流を測定し、測定された前記イオン電流から整流値を取得するために前記回路を使用することと、前記整流値を周知のｐＨ値に対する整流値と相関させることと、それによって測定されたｐＨ値を同定する出力を提供することと、を含む、細胞内のｐＨを測定する方法。
【請求項１５】
前記ナノピペットを挿入することが、ＳＩＣＭ及びｘ−ｙ−ｚコントローラを使用することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記回路が、利得制御及びイオン電流を検出するためのローパスフィルタを有する検出回路を含む増幅回路をさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記キトサンが、モノマーに結合したヘムタンパク質を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記回路が、前記参照電極に接続され、前記作用電極からの入力を有する増幅器からの入力に応答するポテンショスタットを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポテンショスタットが、前記参照電極に接続された対極に接続されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記作用電極及び前記対極が、Ａｇ／ＡｇＣｌである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記電圧が、０．５Ｖ〜０．７Ｖである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
様々な電圧が、前記ポテンショスタット上に設定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｐＨ値が、癌性細胞で取得され、非癌性細胞のｐＨと比較される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年２月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／１２０，６２４号の優先権を主張するものであり、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
政府支援の陳述
本発明は、国立癌研究所により助成を受けた契約番号Ｕ５４ＣＡ１４３８０３号、アメリカ国立衛生研究所により助成を受けた契約番号Ｐ０１−３５ＨＧ０００２０５号、及び国立神経疾患・脳卒中研究所により助成を受けた契約番号Ｒ２１ＮＳ０８２９２７号の下、政府支援を受けなされたものである。政府は本発明に対し一定の権利を有する。
【０００３】
配列表、コンピュータープログラム、コンパクトディスクに関する参照
該当なし。
【背景技術】
【０００４】
本発明はナノポアスケール装置及びセンサーの分野に関し、特に単一細胞内の流体及び溶液のｐＨセンシングに関する。
【０００５】
本発明のいくつかの様態に関する背景情報を以下に記載する。その理由は、これらの背景技術は、本発明の詳細な説明において関連するも、必ずしも詳細に説明していない技術的な特徴に関するものであるためである。つまり、本発明で使用する個別の組成物または方法は、下記に記載する刊行物及び特許において詳細に記載されており、これは、当業者が、特許請求した本発明の特定の態様を構成するまたは使用する際にさらなる手引きとすることができる。下記の考察は、記載する特許または刊行物との関連性、またはその先行技術効果を容認するものとして理解するべきではない。
【０００６】
個別化医療は、従来の化学療法に対する内因性及び獲得性薬剤耐性のために、依然として主要な医療上の課題である、特に癌の治療において大きな可能性を秘めている。過去１０年間で、化学療法の有効性を高めるための個別化された癌治療薬の開発が進歩している。個人に合わせて薬を調整するあらゆる努力にもかかわらず、結果は様々である。このことは、個々の腫瘍内の遺伝的に異なる細胞の存在と相関している。最近の研究では、ゲノム配列決定技術を使用して、多数の細胞集団におけるこれらの遺伝子変化を同定している。癌細胞の不均一性の遺伝的側面及び突然変異と薬剤耐性との関係は広範に研究されているが、不均一性を検出するための、すなわち、大きな細胞集団内で細胞の代謝及び生理機能が異なる癌細胞を発見するためのプレスクリーニング技術の開発が検討されている。
【０００７】
細胞の不均一性の評価は、細胞質のイオン及び分子の測定によって行うことができる。金属イオンの蓄積、反応性酸素（ＲＯＳ）及び窒素種（ＲＮＳ）レベルの変化、及びタンパク質発現は、細胞集団内の癌細胞の重要なマーカーである。あまり認識されていないが、ｐＨも癌細胞の特徴的な因子である。ｐＨは、腫瘍における多剤耐性、タンパク質プロセシング、エンドサイトーシス及びアポトーシスなどの、無数の細胞事象を開始し、調節する際の最も興味深い特徴の１つである。その生命に関する重要性のために、細胞内環境のｐＨは、アルカリ陽イオンＨ＋交換体、炭酸水素塩と酸の負荷輸送体などの、種々のイオンチャネルと細胞内の弱酸及び塩基によって厳密に調節される。哺乳動物細胞では、細胞内区画は、特定の代謝機能のための最適な動作状態を維持するために、異なるｐＨ値を有する。正常な生理学的状態において、哺乳類細胞の安静時細胞内ｐＨは、６．８〜７．３に維持される。一方、細胞外ｐＨ値は、７．２〜７．４の範囲で、わずかにアルカリ性である。細胞内ｐＨの調節不全は、多くの場合、変化した細胞機能、増殖及び薬物耐性と関連しており、癌性腫瘍で観察される。さらに、ｐＨは腫瘍増殖及び癌細胞の遊走ひいては転移の可能性に大きな影響を及ぼす。
【０００８】
発癌性腫瘍は不均一であり、血液供給が不十分であるのに加えて癌細胞の代謝率が高いため、酸性であると広く考えられている。この局所的な高代謝及び灌流の欠如は、細胞外ｐＨレベルを６．０まで低下させる嫌気性代謝を誘発する。さらに、好気性代謝は、二酸化炭素（ＣＯ２）の細胞内濃度を増加させることがあり、局所的なｐＨレベルの低下をもたらす。これらの２つのアシドーシスのメカニズムは、癌研究において一般的に受け入れられている。しかし、細胞内ｐＨレベルが、腫瘍内の不均一性に関与するのか、及び大きな細胞集団内の癌細胞における既存の代謝の不均一性の指標になるのかに関しては、ほとんど分かっていない。ほとんどの新しい薬物送達システムが、ｐＨ感受性ポリマーまたはｐＨ感受性ポリマーナノ粒子の使用を提案しているため、ｐＨデータのより大きな粒度は、新しい抗癌剤及びキャリアの開発にとって重要なだけでなく、抗癌剤がどのように効果的に治療の過程で作用するかを確かめるためにも重要である。したがって、細胞内ｐＨのリアルタイム定量測定は、有効な治療のために腫瘍内細胞の不均一性、薬剤耐性及び薬物送達システムを結合するために重要であり得る。
【０００９】
ｐＨは、腫瘍組織内の癌細胞の変異体の同定のためのマーカーとして使用することができる。同定すると、これらの細胞にタグを付け、薬物治療の過程を追跡することができる。その後、タグ付き細胞から試料を採取してＲＮＡ及びＤＮＡを配列決定し、これらの細胞を薬剤耐性にする何かを解明することができる。
【００１０】
細胞レベルでｐＨを検出することは、腫瘍環境における単一の癌細胞及び細胞の不均一性を調べることだけでなく、神経変性及び老化を理解するためにも重要である。パーキンソン病やアルツハイマー病などの神経変性疾患は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化による不均一な物理化学的環境を作り出す。したがって、ｐＨを測定し、脳の損傷部位での神経回復への影響を理解することが重要である。さらに、脳ｐＨは、脳損傷後の代謝障害及び致死性の主要なマーカーの１つであることが判明している。これらの研究の多くは、適切な分析ツールの不足に悩まされてきた。
【００１１】
細胞内ｐＨ値を測定するために一般的に利用される分析技術には、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、電気化学、共焦点顕微鏡法、ならびに吸光度及び蛍光分光法が含まれる。これらのうち、蛍光分光法及び画像法が最も広く使用されている技術である。しかし、蛍光強度は、直接定量化するのが難しく、色素局在、光退色、励起波長、細胞摂取及び放出速度などの実験的因子の影響を受ける。さらに、蛍光強度は、自己蛍光によって影響され得る。さらに、蛍光プローブは、細胞内ｐＨレベルの連続的かつ部位特異的な検出をすることはできない。
【００１２】
したがって、細胞内ｐＨは、細胞代謝の指標でもあり、多剤耐性、タンパク質プロセッシング及びアポトーシスなどの無数の細胞機能の開始及び調節においても重要な役割を果たす。癌性腫瘍実体のような大きなクローン集団であっても、細胞は同一ではなく、個々の細胞の細胞内ｐＨレベルの差異は、特に個別化医療に移行していくにつれて、臨床診療に関連し得る不均一性の重要な指標となり得る。したがって、単一細胞レベルでの細胞内ｐＨの検出は、外れ値細胞を同定及び研究するために非常に重要である。しかし、細胞集団内の個々の細胞の細胞内ｐＨの定量的かつリアルタイムの測定は、既存の技術では困難であり、新しい方法論を設計する必要がある。
【００１３】
特定の特許及び刊行物
Ｋａｒｈａｎｅｋらによって２０１０年３月２５日に公開された「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｎａｎｏｐｉｐｅｔｔｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ」と題する米国特許出願公開第２０１０／００７２０８０号は、先端開口部を通過するときに検出されるタンパク質生体分子などの検体を含有し得る電解質溶液を保持するのに適した、ナノスケール寸法の円錐先端開口部を有する中空不活性、非生物学的構造体として例示されるナノピペットを含む、生体分子検出のための方法及び装置を開示している。
Ｐｏｕｒｍａｎｄらによって、２０１２年９月６日に公開された「Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ｏｒ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」と題する米国特許出願公開第２０１２／０２２２９５８号は、電気化学的検出回路に使用するのに適したナノピペットを利用して、イオン移動及び結合を検出するための方法及び装置を開示している。キトサンは、最初にナノピペットに付着したＰＡＡ（ポリアクリル酸）層上で使用され、銅などのイオンの結合を測定するために使用される。
Ａｃｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  “Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｎａｎｏｐｉｐｅｔｔｅｓ：  ｔｏｗａｒｄ  ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ，  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，”  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １：１７７−１８５  （２０１０）は、ＤＮＡ及びタンパク質を同定することができる無標識バイオセンサーとしてのナノピペットを開示している。
Ｕｍｅｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  “Ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｎａｎｏｐｉｐｅｔｔｅ  ｐｒｏｂｅｓ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０６（１２）：  ４６１１−４６１６  （２００９）は、官能化されたナノピペット電極を使用した、無標識、リアルタイムタンパク質アッセイを開示している。タンパク質は、プローブ分子で被覆されたナノピペットチップと相互作用する。ナノピペットチップ表面上の静電、ビオチン−ストレプトアビジン、及び抗体−抗原相互作用は、５０ｎｍの細孔を流れるイオン電流に影響することが示されている。
【００１４】
以下の簡単な概要は、本発明のすべての特徴及び態様を含むことを意図するものではなく、本発明が本概要に記載したすべての特徴及び態様を含む必要があることを意味するものでもない。
【００１５】
本発明は、特定の実施形態では、（ａ）（ｉ）支持体上の細胞を貫通するためのマイクロマニピュレータ及び検出装置に動作可能に接続可能であり、（ｉｉ）その中に作用電極を含み、（ｉｉｉ）水素イオンを選択的に吸収するポリマーコーティングを含有する、ナノピペット構造と、（ｂ）溶液中の作用電極と参照電極との間に異なる電圧を印加するように構成され、異なる電圧下で作用電極と参照電極との間のイオン電流を測定するようにさらに構成された増幅回路にさらに接続された、前記ナノピペット構造と、（ｃ）前記増幅回路によって測定された異なるイオン電流を、ナノピペット構造の外側の細胞内のｐＨ値と相関させるための論理手段とを含む、単一細胞内のｐＨを測定するための装置を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、本発明は、マイクロマニピュレータ及び検出装置が、ＳＩＣＭ（走査型イオン伝導顕微鏡）及び単一細胞の中へ移動するためのナノピペットを制御するｘｙｚコントローラを含む装置を含む。特定の実施形態では、本発明は、増幅回路が利得制御及びイオン電流を検出するためのローパスフィルタを有する検出回路を含む装置を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、図１６に示すように、単一の論理手段に接続されたナノピペット構造のアレイを含む装置を含む。特定の実施形態では、キトサンは、約３０，０００〜６０，０００単位のモノマー数を有する。キトサンは、モノマーに結合したヘムタンパク質を含んでもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明は、ポリマーコーティングが、スルホン化テトラフルオロエチレンコポリマー（Ｎａｆｉｏｎ（登録商標））、ポリ‐Ｌ‐リジン、及びアルギン酸塩からなる群から選択される装置を含む。特定の実施形態では、本発明は、増幅回路が、参照電極に接続され、作用電極からの入力を有する増幅器からの入力に応答するポテンショスタットを含む装置を含む。さらなる実施形態では、本発明は、ポテンショスタットが、ポテンショスタットの参照電極にも接続されている対極に接続されている装置を含む。特定の実施形態では、本発明は、作用電極及び対極がＡｇ／ＡｇＣｌである装置を含む。
【００１８】
特定の実施形態では、本発明は、（ａ）種々の電位におけるイオン電流対電位を測定する回路に電気的に接続され、単一細胞内にナノピペットを挿入するための挿入装置に取り付けられたナノピペットと、（ｂ）整流値を周知のｐＨ値と相関させるための論理手段であって、細胞内で取得された整流値を周知の整流値と相関させることができ、それによって測定されたｐＨ値を同定する出力を提供する、論理手段と、（ｃ）ナノピペットの表面に直接結合し、水素イオンに対して多孔性であるキトサン材料の層を有する前記ナノピペットと、（ｄ）補助電極としても機能し、ポテンショスタットに接続された参照電極を含む回路とを含む、単一細胞内のｐＨを測定するための装置を含む。
【００１９】
さらなる実施形態では、本発明は、論理手段が、補助電極における電流を測定することによって、参照電極に対して所与の電位範囲での作用電極の電位を走査するようにプログラムされる装置を含む。装置は、フィルタ選択器及び感度選択回路によってブリッジされたｉ／Ｖ増幅器を含み得、構成要素が、電解液を通過する電流に基づいて検出可能な電流範囲を調整するように調整される。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明は、（ａ）（ｉ）支持体上の細胞を貫通するためのマイクロマニピュレータ及び検出装置に動作可能に接続可能であり、（ｉｉ）その中に作用電極を含み、（ｉｉｉ）水素イオンを選択的に吸収するポリマーコーティングを含有する、ナノピペット構造を調製することと、（ｂ）溶液中の作用電極と参照電極との間に異なる電圧を印加するように構成され、異なる電圧下で作用電極と参照電極との間のイオン電流を測定するようにさらに構成された増幅回路に前記ナノピペット構造を接続することと、（ｃ）前記増幅回路によって測定された異なるイオン電流を、ナノピペット構造の外側の細胞内のｐＨ値と相関させるための論理手段に前記ナノピペット構造を接続することとを含む、単一細胞内のｐＨを測定するための装置を作る方法を含む。
【００２１】
さらなる実施形態では、本発明は、キトサン材料層をナノピペットに結合させることによって前記ポリマーコーティングを適用する、上記の方法を含み、ナノピペットを通るイオン電流のＩ−Ｖ曲線を導き、測定する増幅器に前記作用電極を接続することをさらに含む。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明は、（ａ）ｐＨイオンに応答する内部層を有し、前記ナノピペット構造を通るイオン電流と、前記ナノピペット構造及び参照電極を含む電気化学セル内の様々な電位における電位とを測定するように構成されたポテンショスタットを含む回路に作用電極によって電気的に接続される、ナノピペット構造を提供することと、（ｂ）前記ナノピペット構造を前記電気化学セル内のセルに挿入することと、（ｃ）前記イオン電流を測定するために前記回路を使用することであって、前記電流が周知のｐＨに相関することとを含む、細胞内のｐＨを測定する方法を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本発明は、前記ナノピペットを挿入することが、ＳＩＣＭ及びｘ−ｙ−ｚコントローラを使用することを含む、上記のような方法を含む。特定の実施形態では、本発明は、前記回路が、利得制御及びイオン電流を検出するためのローパスフィルタを有する検出回路を含む増幅回路をさらに含む方法を含む。特定の態様及び実施形態では、本発明は、前記内部層が、５０ｎｍ〜１５０ｎｍの直径の平均細孔径を有するキトサン材料の層を含む方法を含む。キトサンは、約３０，０００〜６０，０００単位のモノマー数を有することができ、モノマーに結合したヘムタンパク質を含んでもよい。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明は、内部層が、スルホン化テトラフルオロエチレンコポリマー（Ｎａｆｉｏｎ（登録商標））、ポリ‐Ｌ‐リジン、及びアルギン酸塩からなる群から選択されるポリマーコーティングを含む、上記のような方法を含む。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明は、回路が、参照電極に接続され、作用電極からの入力を有する増幅器からの入力に応答するポテンショスタットを含む、上記のような方法を含む。さらなる実施形態では、本発明は、ポテンショスタットが、参照電極に接続されている対極に接続されている方法を含む。作用電極及び対極は、Ａｇ／ＡｇＣｌであってもよい。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本発明は、電圧が０．５Ｖ〜０．７Ｖである、上記のような方法を含む。さらなる実施形態では、本発明は、様々な電圧が、ポテンショスタットに設定される方法を含む。
【００２７】
特定の実施形態では、本発明は、ｐＨ値が癌性細胞で取得され、非癌性細胞のｐＨと比較される、上記のような方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明のナノピペットの特性を示すグラフ及び走査型電子顕微鏡写真からなる。図１Ａのグラフは、未修飾の及びキトサン修飾された石英ナノピペットのイオン電流整流の比較である。両方の測定は、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）で満たした石英ナノピペットを使用して行った。キトサン材料がなければ、電流は電位対  Ａｇ／ＡｇＣｌに対して直線的に増減する。図１Ｂは、典型的なナノピペット孔開口を示す走査型電子顕微鏡写真である。ナノピペットの内側表面上のキトサン層を示す集束イオン  ビーム  カットの未修飾のナノピペットチップ（図１Ｃ）及びキトサン修飾ナノピペット（図１Ｄ）のＳＥＭ画像も示されている。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、ナノピペットチップの側面図（図２Ａ）及びキトサン修飾ナノピペットの細孔（図２Ｂ）を示す一対の走査型電子顕微鏡写真である。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、ｐＨの結果としての本発明のナノピペットの表面電荷の可逆的変化を示す概略図（図３Ａ）及び、６．０２〜８．０４の生理学的に関連するｐＨ範囲内のキトサン修飾ナノピペットのキャリブレーションを示すグラフ（図３Ｂ）からなる。すべてのデータポイントは、＋／−０．５Ｖ対Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極での相対的整流比として表される。エラーバーは、ｎ＝４の反復測定値の標準偏差を表す。０．１Ｍ  ＰＢＳを支持電解質として使用した。図に示すように、酸性状態では、キトサン層は負の表面から負イオンと正イオンの混合物に変化する。ｐＨの低下はポリマーのプロトン化を引き起こし、表面電荷の変化は本回路で検出される電流整流を引き起こす。
【図４】図４Ａ、図４Ｂは、キトサン修飾ナノピペットの酸滴定のための典型的なリニアスイープボルタモグラム（図４Ａ）及びキトサン修飾ナノピペットの塩基滴定のための典型的なリニアスイープボルタモグラム（図４Ｂ）を示す一連のグラフである。図４Ｃのグラフは、２．５９〜１０．８３の範囲に対応するキャリブレーションナノｐＨプローブである。トレースは元の色になる。図４Ａの矢印は、測定された最も低いｐＨ６．９６を示している。図の−０．５ポイントの時点では、ｐＨ値が低いほど高い電流であることを示している。図４Ｂの矢印は、最も高いｐＨ１０．８３を示している。
【図５】未修飾のナノピペットのｐＨ応答を示すグラフである。エラーバーは、ｎ＝３の反復測定値の標準偏差を示す。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、細胞培養培地中のキトサン修飾ナノピペットのキャリブレーションを示す一対のグラフである。図６Ａの培地は１Ｘ  ＭＥＭであり、図６Ｂの培地はＤＭＥＭである。電流応答は、０．６Ｖの固定バイアス電位で測定した。エラーバーは、ｎ＝４の反復測定値の標準偏差を表す。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、細胞培養培地（図７Ａ）ＭＥＭ及び（図７Ｂ）ＤＭＥＭにおける酸滴定のためのキトサン修飾ナノピペットの電流電位曲線を示す一対のグラフである。矢印は、ｐＨ値の高い方を示している。
【図８】図８Ａ及び図８Ｂは、キトサン修飾ナノピペットで取得された電流のトレース及びナノピペットの顕微鏡写真である。図８Ａは、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器を使用した細胞浸透前、浸透中及び浸透後に記録された、カスタマイズした走査型イオン伝導顕微鏡電流フィードバックシグナルを示す。ｙ軸の振幅はナノアンペアである。図８Ｂは、挿入されたキトサン修飾ナノピペットに対応する顕微鏡写真である。
【図９】キトサン修飾ナノペットによって決定された個々の細胞の細胞内ｐＨレベルを示す一連のグラフである。ヒト線維芽細胞（図９Ａ）、ＨｅＬａ（図９Ｂ）、ＭＣＦ−７（図９Ｃ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図９Ｄ）細胞のｐＨレベルを記録した。横線は、ナノｐＨプローブで測定した平均細胞内ｐＨを表す。
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、及び図１０Ｄは、ヒト線維芽細胞（図１０Ａ）、ＨｅＬａ（図１０Ｂ）、ＭＣＦ７（図１０Ｃ）、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１０Ｄ）の異なる細胞型のキトサン修飾ナノピペットによる細胞内ｐＨ測定の代表的な電流−電位曲線を示す一連のグラフである。細胞株の各タイプのすべての測定値は、単一のｐＨプローブを使用して取得された。細胞１は、（図１０Ａ）、（図１０Ｃ）及び（図１０Ｄ）において矢印で示されている。
【図１１】図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃは、ナノｐＨプローブの挿入を示す代表的な顕微鏡写真及びナノｐＨプローブを使用して取得された電流−電圧曲線のグラフからなる。顕微鏡写真は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に挿入されたナノｐＨプローブ（図１１Ａ）及びプローブの収縮後の挿入点（図１１Ｂ）を示す。細胞は形態学的変化を示さず、挿入及び測定の過程で無傷のままであり、収縮後も生存した。（図１１Ｃ）は、０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中での細胞の調査後のナノｐＨプローブの再生ベースラインのリニアスイープボルタモグラムである。
【図１２】ナノ−ｐＨプローブを使用したリアルタイムの細胞内ｐＨ測定値を示すグラフである。ｐＨ測定は、１００μＭ  ＮＰＰＢ（Ｃｌ−チャネル遮断薬）の非存在（菱形）及び存在（正方形）のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で行った。図中の矢印は、ＮＰＰＢの添加時期を示している。測定値は、チャネル遮断薬曝露後、７分間で２１秒ごとに取得される。エラーバーは、ｎ＝３の反復値の標準偏差を示す。
【図１３】１００μＭ  ＮＰＰＢ（Ｃｌ−チャネル遮断薬）曝露の結果、３つのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の経時的なｐＨ変化を表すグラフである。測定値は、チャネル遮断薬曝露後、２１秒ごとに取得される。
【図１４Ａ】ナノｐＨプローブがキトサン材料層を含む、本装置の概略図を示す。
【図１４Ｂ】酸性条件により、ポリマー層上にプロトンの存在を増加させるｐＨの変化を示す（上のパネル）。６（約０．７）から８（約１．１）のｐＨ範囲にわたって増加する整流比（ＲｐＨ／Ｒｎｅｕｔｒａｌ）も示す（下のパネル）。
【図１５】図１４Ａに示す構成をさらに明確にする本回路の概略図である。
【図１６】ナノプローブアレイの二次元断面図を示す概略図である。ナノプローブは、それぞれ導電性材料を含むナノピペットを有し、作業電極に接続されており、アレイ上に取り付けられている。各作用電極は、ナノピペットの外側で、作用電極と共通の参照電極の両方からの入力を有する信号増幅器に接続される。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で記載したものと類似または同等の方法及び材料を、本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法及び材料を記載する。一般に、細胞及び分子生物学及び化学に関連して利用される命名法、及びそれらの技術は、当技術分野において周知で一般的に使用されている命名法である。特定の実験技術は、特に定義されていないが、一般に、当該技術分野において周知の従来の方法に従って行われ、本明細書全体を通じて引用され議論されている様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されている。分かりやすくするために、次の用語を以下に定義する。
【００３０】
範囲：簡潔にするために、記載された範囲は、特に明記しない限り、記載された範囲内の任意の部分範囲を含むことを意図している。非限定的な例として、１２０〜２５０の範囲は、１２０〜１２１、１２０〜１３０、２００〜２２５、１２１〜２５０などの範囲を含むことが意図されている。用語「ａｂｏｕｔ（約）」は、およその通常の意味を有し、実験的変動によって文脈において決定されてもよい。疑義がある場合、「ａｂｏｕｔ（約）」という用語は、記載された数値のプラスまたはマイナス５％を意味する。
【００３１】
用語「ｎａｎｏｐｉｐｅｔｔｅ（ナノピペット）」は、０．０５ｎｍ〜約５００ｎｍ、好ましくは約（＋または−２０％）５０ｎｍまたは約８０ｎｍまたは約１００ｎｍの先端開口部を有する、ナノスケールの円錐先端開口部、すなわち、ナノポアを有する中空の自己支持型で不活性の非生物学的な構造体を意味する。中空構造は、例えば、ガラスまたは石英であってもよく、先端開口部を通過する流体を内部に保持するのに適している。ナノピペットの内部は、検体の非特異的結合を最小にするように選択または変更される。ナノピペットの内部は、典型的には、石英または他の生物学的に不活性な材料の単一層の均一な壁厚を有する細長い円錐の形態であり、ナノピペット内の溶液と接触する電極の挿入を可能にする大きさである。本明細書で使用されるナノピペットは、典型的には単一のボアを有するが、複数の同心ボアを有するナノピペットは、デュアルボア毛細管を引っ張ることによって調製することができる。外径は、典型的には、先端領域において約１μｍ未満である。
【００３２】
用語「ｎａｎｏｐｏｒｅ（ナノポア）」は、電気絶縁膜、好ましくは記載されているナノピペットの先端の小さな孔を意味する。ナノポアは、ナノポアに隣接するナノピペットのボアの最後の数ｍｍである先端領域にある。以下に記載されるように、ナノポアは、小さな分子の錯体がナノポアを通るイオン及び分子の移動に影響を及ぼすような大きさである。ナノポアは、膜に電圧を印加したときにナノポアを通過するイオン電流を監視する装置で官能するように設計されている。ナノポアは、ナノピペット本体によって形成されたチャネル領域を有し、好ましくはテーパ状、例えば、円錐台形状である。以下に説明するように、石英毛細管を引っ張ることにより、再現可能で定義されたナノポア形状を得ることができる。
【００３３】
以下に記載するように、用語「ｎａｎｏ−ｐＨ  ｐｒｏｂｅ（ナノｐＨプローブ）」は、内部に電極を含み、官能化された内部を含むナノピペットを含む装置を指し、材料中のｐＨを示す、ナノピペット内のイオン電流の小さな変化を検出するために電極に接続された回路をさらに含む。
【００３４】
用語「ｑｕａｒｔｚ（石英）」は、ナノピペット媒体が、結晶質の石英よりも安価である溶融シリカまたは非晶質の石英であることを意味する。しかし、結晶質の石英を利用することもできる。セラミックス、ガラスセラミックス、及びホウケイ酸ガラスも使用できるが、精度は石英ほど良好ではない。用語「ｑｕａｒｔｚ（石英）」は、特定の材料、ならびに適用可能なセラミックス、ガラスセラミックスまたはホウケイ酸ガラスを包含するように意図され定義される。本発明のナノピペットの製造には、様々なタイプのガラスまたは石英を使用してもよいことに留意されたい。主な考慮点は、材料が狭い直径の開口部に引き込まれる能力である。好ましいナノピペット材料は、様々な種類のガラス及び石英の形態で含まれる二酸化ケイ素からなる。溶融石英及び溶融シリカは、非結晶（非晶質）形態のシリカを主に含むガラスの種類である。
【００３５】
用語「ｃｈｉｔｏｓａｎ（キトサン）」は、本明細書ではその従来の意味で使用され、ランダムに分布したβ−（１−４）結合されたＤ−グルコサミン（脱アセチル化単位）及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（アセチル化単位）からなる線状多糖類を指す。キトサン中のアミノ基は、約６．５のｐＫａ値を有し、これにより、ｐＨ及び％ＤＤ（脱アセチル化度）値に依存する電荷密度を有する、酸性から中性までの溶液中でプロトン化をもたらす。これにより、キトサンを水溶性にし、粘膜などの負に帯電した表面に容易に結合する生体接着剤を作る。キトサンは、上皮表面にわたる極性薬物の輸送を促進するとともに、生体適合性及び生分解性となる。キトサンは、甲殻類（カニ、エビ等）の外骨格及び菌類の細胞壁の構造要素であるキチンの脱アセチル化により市販されるようになっている。脱アセチル化度（％ＤＤ）はＮＭＲ分光法により決定でき、市販のキトサンにおける％ＤＤは６０〜１００％の範囲内にある。市販のキトサンの分子量は、平均で３，８００〜２０，０００ダルトンの範囲内にある。
【００３６】
用語「ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｍａｔｅｒｉａｌ（キトサン材料）」は、上記の天然に存在するキトサン多糖、及び、例えば、Ｒｉｎａｕｄｏ、”Ｃｈｉｔｉｎ  ａｎｄ  ｃｈｉｔｏｓａｎ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”、Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ  ３１：６０３−６３２（２００６）に記載されている、様々な同素体及び誘導体を意味する。そこに記載されているように、キトサンは、様々な溶解度、アセチル化または分子量を有することができる。記載のとおり、キトサン材料または天然のキトサンは、層内にイオンを受け取るナノスケールの孔または微細な孔をもたらすように、薄く希釈された層に形成されていてもよい。
【００３７】
用語「ｈｉｇｈｌｙ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄ（高度にヒドロキシル化された）」は、ヒドロキシル基を有する本ナノポアに使用される石英材料（ＳｉＯ２）に関連して使用される。例えば、α−水晶（０００１）は、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｗａｔｅｒ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｎ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄ  α−ｑｕａｒｔｚ  （０００１）  ｓｕｒｆａｃｅｓ，”  Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖ．  ｂ  ７３：０３５４０６  （２００６）に記載されている。例えば、Ｋｏｎｅｃｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ  ｏｎ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄ  ｑｕａｒｔｚ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ，”    Ｊ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００１；２０  Ｓｕｐｐｌ  １：１１９−３２を参照のこと。
【００３８】
用語「ｈｅｍｅｐｒｏｔｅｉｎ（ヘムタンパク質）」は、タンパク質が単独では行うことができない、いくつかの機能を実行することを可能にする有機化合物であるヘム補欠分子族を含有する金属タンパク質を指す。ヘムは、高疎水性、平面、ポルフィリン環の中心に還元型の鉄原子、Ｆｅ２＋を含む。ヘムタンパク質には、ヘモグロビン、ミオグロビン、ニューログロビン、サイトグロビン及びレグヘモグロビンが含まれる。
【００３９】
用語ｐＨは、一般的に受け入れられている定義があり、すなわち、水溶性物質の酸性度またはアルカリ度の基準（ｐＨは「水素イオン指数」の略）である。ｐＨ値は、１〜１４の数値であり、中間（中性）点は７である。７以下の値は、数が減少するにつれて酸性度の増加を示し、１が最も酸性度が高くなる。７を超える値はアルカリ性度を示し、アルカリ度は数が増加するにつれて増加し、１４が最もアルカリ性度が高くなる。しかし、この基準は、センチメートルまたはインチスケールのような均等目盛（隣接する２つの値の差が同じ）ではない。
【００４０】
用語「ｌｏｇｉｃ  ｍｅａｎｓ（論理手段）」は、一連の電子信号を１つまたは複数の有形の測定可能な値に変換するようにプログラム可能なまたはプログラムされる論理回路を意味する。例えば、Ｂｉｒｋｎｅｒらの米国特許第４，１２４，８９９号では、プログラマブルアレイロジック回路すなわち、ＰＡＬ回路と呼ばれるプログラマブル  ロジック回路を示している。本発明の論理手段は、基準プローブに対して記載されたプローブ（水素イオンに感受性であり、反応し、電極を含有するナノピペットを含む）を介してのイオン電流の所与の変化に基づいてｐＨ値を生成する。理解されるように、必要なコンピュータープログラムは、コンピューターまたは他のプログラム可能な処理装置上で実行されるコンピュータープログラム命令が、その機能を実現するための手段を作成するように、限定されるものではないが、汎用コンピューターまたは専用コンピューター、または機械を製造するための他のプログラム可能処理装置を含む、コンピューターにロードされ得る。したがって、ここで使用される適切な論理手段は、本装置を感知して制御するようにプログラムされた外部のコンピューター上で、ユーザーが使用するために提供されるソフトウェアであってもよい。
【００４１】
本発明の概要と実施形態
本発明は、外因性物質を必要とせずに、単一細胞内のｐＨ及び細胞内のｐＨの変化を測定することができる手段及び装置を提供する。測定はリアルタイムで行われ、ナノピペットが細胞内に挿入されている間にｐＨの変化を追跡することができ、感受性回路は、例えば、細胞質、核、ミトコンドリアなどの細胞内のナノピペットのナノポア開口部でイオン電流を測定する。検出回路は、０．０９ｐＨ単位の検出を示す記載された実施例で、約０．１〜０．０１ｐＨ単位の高感度を提供する。さらに、システムは、約ｐＨ２〜１１の間の大きなダイナミックレンジを有する。
【００４２】
本発明は、細胞内の溶液中のｐＨ変化に応答して変化する電流を測定するための方法及び装置をさらに含む。１つの方法では、装置は、異なる標準ｐＨ溶液を使用してキャリブレーションされる。キャリブレーション曲線は、電流  ｖｓ．  ｐＨを反映して計算され、試料中のｐＨを測定するために使用される。電流測定のための好ましい電圧設定は、０．６Ｖ、または０．５Ｖ〜０．７Ｖの範囲内である。測定された電流（ポテンショスタットで測定）は、試料中のｐＨが低下するにつれて増加する。ポテンショスタットは電流を報告し、様々な応答を決定及び／または最適な動作電圧を決定するために、電圧範囲にわたって掃引される。典型的には、印加電圧は約０．２Ｖから０．６Ｖまで掃引される。現時点で好ましい使用方法では、ポテンショスタットはシステムに選択された電圧を印加し、ｐＨに相関する電流を記録する。
【００４３】
一態様では、本発明は、図１Ａ、図４Ａ、図４Ｂなどのトレースに示されるように、イオン整流を増加させるＨ＋を含むイオンをトラップして、分子スポンジを形成する高多孔質キトサン材料の制御された濃度の使用を含む。高多孔質のコーティング（細孔径約５０〜１５０ｎｍ、平均直径約１００ｎｍ）は、ナノｐＨプローブに存在する水素イオンとの直接相互作用を可能にする。透過性水素イオン（プロトン）は、一般に、約０．０１２オングストロームのイオン半径を有する。平均細孔径は、微視的手段によって決定されてもよく、または気孔率の値から計算されてもよい。例えば、Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｐｏｒｅ  Ｓｉｚｅｓ  ｉｎ  Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ  Ｃｈｉｔｏｓａｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｔｉｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，”  Ｉｎｄ．  Ｅｎｇ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．，  １９９６，  ３５  （１１），  ｐｐ  ４１６９−４１７５を参照のこと。
【００４４】
当技術分野で知られているように、イオン電流整流は、１つの電圧極性についてはイオン伝導が増加するが、反対の極性では同じ電圧振幅に対して減少することによって特徴付けられ、非対称Ｉ−Ｖ曲線を生成する。正及び負の電圧が電極に印加され、イオン電流応答の間の差は、細孔内のｐＨを示すものであり、結果として、細胞内のｐＨを示すものである。
【００４５】
高多孔質キトサン材料は、ナノピペット内部細孔をコーティングする際に、比較的低濃度のキトサン材料を使用することによって調製することができる。いくつかの態様では、キトサン材料は、０．２５％〜１％のキトサン材料の濃度で適用される。キトサン材料は、ナノポアの内部の近傍において、ナノピペットの石英材料上のヒドロキシル基に直接結合している。好ましくは、約３０，０００〜６０，０００のモノマー数を有する短鎖キトサン材料が使用される。石英と化学物質とを反応させて、硫酸、水酸化水素、水酸化アンモニウムなどの表面官能性を高めることによって、結合を強化し得る。これは、汚染物質を低減し、石英をヒドロキシル化するのに役立つ。
【００４６】
別の態様では、本発明は、細胞内の酸化還元電位に敏感な材料を含有するようにキトサン材料層を修飾することを含む。細胞の酸化還元電位は、従来の意味で使用され、電子移動を含む反応の方向及び自由エネルギーコストを推測するために使用される測定値を指す。酸化還元電位、またはより正確には、還元電位は、電子を獲得し、それによって還元される傾向を意味する。
【００４７】
例えば、酸化還元電位を使用して、これら２つの分子の主役を接続し、ＮＡＤＨの酸化（例えば、ＴＣＡサイクルで生成）から生成することができるＡＴＰ分子の数の上限を推定し得る。細胞の酸化還元電位は、様々な疾患によって変動する可能性がある。
【００４８】
別の態様では、本発明は、バルク溶液とナノピペットの内部との間に使用される高感度電子装置及び作動電極と参照電極の配置を含む。参照電極は補助電極としても機能し、ポテンショスタットに接続される。システムは、補助電極における電流を測定することによって、参照電極に対して所与の電位範囲での作用電極の電位を走査することによって機能する。ｉ／Ｖ増幅器は、フィルタ選択と感度選択回路によってブリッジされている。これらは、電解液を通過する電流に基づいて検出可能な電流範囲を調整するために使用される。
【００４９】
ここで図１４Ａを参照すると、本装置は、内部にｐＨ応答性ポリマー（例えば、キトサン）を有するナノピペット１４２を含む。キトサン（応答性ポリマー、図１４Ｂ）はナノピペットの内部表面に直接吸着される。ナノピペットは、ナノピペット（約２００ｎｍ未満、好ましくは１０〜２０ｎｍの開口部）によって注入された細胞内の液体を感知するように構造化された小さな開口部を含む。ナノピペット１４２は、参照電極１５０（図１５にも示されている）も含むシステム内に含まれる。参照電極１５０は、ローパスフィルタ１４６とそこから出力１４８にさらに接続されたポテンショスタットの入力に接続される。後述するように、作用電極はまた、参照電極を介して電気化学セル１５２に電流を注入するポテンショスタットにも接続される。電気化学セル内の作動溶液はまた、ポテンショスタット及び外部電極（図１４Ａには図示せず）に接続された参照電極１５０も含む。ナノピペット１４２は、参照電極１５０が浸漬されている、電気化学セル内の作業溶液（培地）中の細胞に挿入される。
【００５０】
後述するように、ナノピペット（ナノｐＨプローブ）は、ナノピペットを位置決めし、選択された細胞に挿入するための電流フィードバックを検出する走査型イオン伝導顕微鏡などのマイクロマニピュレータ（図示せず）に動作可能に接続される。
【００５１】
図１４Ｂに模式的に示すように、細胞内のｐＨ低下は、プロトンがナノピペット１４２のコーティングと接触するときに、溶液からプロトンを引き抜くことができるキトサンまたはそれと等価なポリマーのプロトン化をもたらす。ナノポア領域におけるキトサン層の表面の変化は、細孔を通過し得るイオン電流に影響を及ぼす。イオン電流の変化は、一般に１４４で示されるフィードバック増幅器からの出力を変化させる。出力は、ローパスフィルタ１４６によってフィルタリングされ、図１５に関連して説明したように、１４８でモニタに出力される。ポテンショスタットは、利得セレクタ１５４、デジタル減衰器１５６にさらに接続されている。
【００５２】
図１５は、本装置に配置されたポテンショスタットがどのように細胞内でｐＨ測定の高感度化を達成するかを示している。ナノピペット（図１４Ａに示す１４２）は、電気化学セル１５２内の作用電極を含み、六角形として示されている。電気化学セル１５２は、上述した単一細胞を含む溶液であり、作用電極と参照電極１５０とを接続する導電性溶液である。参照電極１５０は、補助電極または対極としても機能し、ポテンショスタットにも接続されている。開示され、知られているように（詳細については、米国特許第５，４６６，３５６号を参照）、ポテンショスタットは、電気化学セル内で動作するためのハードウェアを提供する。作用電極（ナノピペット内）は、電位が制御され、電流が測定される電極である。参照電極は、作用電極電位を測定するために使用される。参照電極は、電流が流れない限り、電気化学電位を一定にする必要がある。対極は、作用電極との回路を完成させる。電気化学的環境があまり導電性でない場合（１μＡ未満）、参照電極と対極の両方を同じ電極に取り付けることができる。
【００５３】
図１５に示す２つの回路は、同時に動作する。電気化学セル内の電圧を同定するために、参照電極と作用電極との間の電位差を測定し、作用電極と対極との間で電流を測定する。作用電極と対極との間の電流測定により、ｐＨの変化を感知する。電流が非常に小さく、電極材料がＡｇ／ＡｇＣｌである場合、２つの同時事象がいかなる干渉も受けずに起こり得るので、対極と参照電極は両方とも単一の電極上で機能することができる。
【００５４】
システムは、補助電極における電流を測定することによって、参照電極に対して所与の電位範囲での作用電極の電位を走査することによって機能する。ポテンショスタットは、信号増幅が行われる周波数を制御するために使用される利得セレクタ１５４に接続される。作用電極（ナノピペット内）は、デジタル減衰器１５６に出力するｉ／Ｖ（電流電圧）増幅器１５８の入力に接続され、（上述したように）そこから参照電極に戻り、フィードバック回路を生成する。さらに、ｉ／Ｖ増幅器１５８は、フィルタ選択１６２及び感度選択回路１６４によってブリッジされる。これらは、電解液を通過する電流に基づいて検出可能な電流範囲を調整するために使用される。
【００５５】
増幅器１５８は、ローパスフィルタ１４６に出力する。また、図示された出力接続１４８（円）は、ローパスフィルタに接続される。出力接続及びポテンショスタットは、ナノピペットを通るイオン電流を測定し、記録することができるモニタへの入力端子（円）を提供する。モニタは、上記の構成要素によって生成された信号を監視及び制御するようにプログラムされたコンピューターを含み得る。
【００５６】
コンピューターには、使用中に確立されたキャリブレーションに基づいて、あるいは、装置に組み込まれて、検出された電流をポテンシオスタット回路からｐＨ値に変換する論理手段が含まれる。
【００５７】
ナノピペットが挿入される単一細胞は、液体中の培養中の細胞であってもよいし、基材上に固定化されている細胞でもよい。単一細胞は組織の一部であってもよい。顕微鏡的に同定され、ナノピペットは、細胞に挿入されるｘｙｚコントローラによって制御される。この目的のために走査型イオン伝導顕微鏡（ＳＩＣＭ）を使用してもよい。
【００５８】
本発明のナノｐＨプローブは、ｐＨと様々な疾患との関係を明らかにするための分析ツールとして使用することができる。本発明のナノｐＨプローブは、走査型イオン伝導顕微鏡（ＳＩＣＭ）の原理を利用してもよい。ナノピペットは、ナノポアにおけるイオン電流の差を測定することができる電気装置である。それらの小さなサイズは、高空間分解能及び低侵襲性で直接的、リアルタイムのｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定を可能にし、薬物治療の過程で個々の細胞の細胞内の変化をモニタすることを可能にする。最近、ナノピペットは新しい検出ツールとしての重要性を増しており、タンパク質、金属カチオン、ＤＮＡ及び炭水化物の検出用に研究されている。石英ナノピペットは、様々な認識材料で官能化することができる。本研究では、ナノピペットの内部表面のｐＨ感受性表面コーティングとして、生体ポリマーであるキトサン材料が使用されている。キトサンは生体適合性があり、毒性が低く、生物学的目的に理想的である。キトサンは、特有のフィルム形成能、表面への高い接着性及び顕著な機械的強度を有している。さらに、キトサンは、バイオセンサー製造のための選択的コーティングとして示されている。
【００５９】
ここでは、生理学的緩衝液及び細胞培地におけるｐＨ測定のためのキトサン修飾石英ナノピペットの開発及び特徴付けが実証されている。次いで、キトサン修飾ナノピペットを、ヒト線維芽細胞、ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１を含む４つの異なる細胞型における細胞内ｐＨの直接測定に使用した。記載したように、塩素チャネル遮断薬を使用したキトサン修飾ナノｐＨプローブのｉｎ  ｖｉｔｒｏ特異性を達成することができる。ナノｐＨプローブは、癌性腫瘍を含む様々な病的状態における細胞の不均一性を調べるだけでなく、神経変性状態及び加齢をも調査する強力な候補でもある。
【００６０】
本装置により、単一細胞レベルでの細胞内ｐＨ測定の限界を克服することが示された。細胞内ｐＨの直接測定は、石英ナノピペットへのキトサン材料の単純な物理吸着を介して新しい方法で実証されている。本手法では、ｐＨ応答性キトサンポリマー層及び単一細胞レベルでの細胞内ｐＨ測定のための小さいサイズのナノピペットを利用する。ここに記載されているのは、非常に小さな細孔径（約９７ｎｍ）を有する高度にヒドロキシル化された石英ナノピペット上に、生体適合性のｐＨ応答性ポリマーであるキトサンの物理吸着によって調製されたナノｐＨプローブである。ｐＨの変化は、ナノポアにおけるイオン電流の変化として測定することができるキトサンの表面電荷を変化させる。ナノｐＨプローブの動的ｐＨ範囲は、０．０９ｐＨ単位の感度で２．６〜１０．７であった。単一細胞ナビゲーション用にカスタマイズされた走査型イオン伝導顕微鏡を利用して、ナノｐＨプローブを個々の細胞に挿入することができた。我々は、ナノｐＨプローブで、ヒト線維芽細胞、ＨｅＬａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７を含む非癌性及び癌性の細胞株を使用して、単一細胞の細胞内ｐＨ測定を行った。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果は、キトサン官能化ナノピペットが高い時間分解能で選択的に細胞内ｐＨを測定することを示した。ヒト線維芽細胞、ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１の平均細胞内ｐＨレベルは、それぞれ７．３７±０．２９、６．７５±０．２７、６．９１±０．２０及び６．８５±０．１１であった。これらの結果は、非癌細胞よりも酸性の細胞質環境を有する線維芽細胞と癌細胞との間の良好な分離を示す。さらに、本発明者らの知見は、集団内の個々の細胞は、それらの細胞内ｐＨが異なる可能性があることを明らかにする。我々はさらに、センサーのリアルタイム連続単一細胞ｐＨ測定能力を実証し、医薬操作に対する細胞ｐＨ応答を示した。ＮＰＰＢ曝露実験は、ナノｐＨプローブが、細胞内ｐＨの生化学的に誘導された変化により、単一細胞のリアルタイムの連続的な調査を可能にすることを実証する。
【００６１】
我々のデータは、キトサン修飾ナノピペットセンシング技術が、高選択性及び高感度による高い空間分解能及び時間分解能で単一細胞ｐＨレベルを調べる強力な手法であることを示している。このナノｐＨプローブ技術のさらなる応用は、細胞の不均一性及び薬物耐性のより深い理解を提供し得る。この目的を達成するために、我々は薬物治療の過程で細胞集団のハイスループットスクリーニングのための完全自動化システムの開発に取り組んでいる。さらに、腫瘍性微小環境（例えば、腫瘍組織）におけるｐＨ変化及び差異を調べるために、ナノｐＨプローブを使用する。
【００６２】
一般的な方法及び材料
試薬及び材料。キトサン（低分子量）、５−ニトロ−２−（３−フェニルプロピルアミノ）−安息香酸（ＮＰＰＢ）、二塩基性リン酸ナトリウム及び一塩基性ナトリウムをＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。塩化ナトリウム（ＡＣＳグレード）、塩酸、水酸化ナトリウム及び過酸化水素は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。氷酢酸は、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ−Ｈａｅｎから供給された。２−プロパノールはＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手した。２’、７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（及び−６）−カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ジメチルスルホキシド（無水）はＦｌｕｋａから供給された。イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）及びトリプシンは、ＣｅｌｌＧｒｏから購入し、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）及びペニシリン−ストレプトマイシンはＧｉｂｃｏから購入した。すべての水溶液は、１８．２Ωｃｍの抵抗率を有する脱イオン水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）中で調製される。
【００６３】
ナノｐＨプローブの調製。ナノピペットは、フィラメント（ＱＦ１００−７０．７．５、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を有する石英毛細管から製造された。引っ張る前に、毛細管をピラニア溶液（硫酸：過酸化水素、３：１ｖ／ｖ）で処理し（注意：「ピラニア溶液」は、有機材料と激しく反応し、調製すると非常に熱くなる可能性がある）、蒸留水及び２−プロパノールで十分にすすいだ。処理された毛細管は、汚染を防ぐために使用するまで２−プロパノール中に保存した。毛細血管を、Ｐ−２０００  レーザープラー（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用して、以下のパラメーターを有する２ラインプログラムで引っ張った。ライン１：Ｈｅａｔ  ７００、Ｆｉｌ  ４、Ｖｅｌ  ２０、Ｄｅｌ  １７０、Ｐｕｌｌ  ０及びライン２：Ｈｅａｔ  ６８０、Ｆｉｌ  ４、Ｖｅｌ  ４０、Ｄｅｌ  １７０、Ｐｕｌｌ  ２００。得られたナノピペットは、ＦＥＩ  Ｑｕａｎｔａ  ３Ｄ電界放出顕微鏡によって検出された約９７ｎｍの細孔直径を有していた。ナノピペットは、変更されるまで密閉された箱に保管した。ナノピペットを、０．２５％のキトサン溶液１０μｌを埋め戻すことによって官能化し、４０００ｒｐｍで遠心分離して、キトサンマトリックスによるナノピペットチップの被覆を保証した。遠心分離後、過剰なキトサンを吸引し、ナノピペットを一晩空気乾燥させた。乾燥したナノピペットをｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で再充填し、次いで遠心分離してナノピペットの先端に閉じ込められた残留気泡を除去した。すべてのナノピペットを充填すると、ナノポアの詰まりを防止するためにｐＨ測定まで１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中に保持した。
【００６４】
センシングセットアップ。キトサン修飾ナノピペットセンサーの分析特徴付け実験を行うために、ポテンショスタット（１０３０Ｃ、ＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）に接続された２電極設定をセンシングに使用した。電解質を充填したナノピペットに入れた１２５ｍの白金線（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ社）を作用電極として使用し、バルク溶液（ＰＢＳまたは細胞培地）に入れた疑似Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を参照電極として使用した。リニアスイープボルタンメトリーを、０．１Ｖ／秒の走査速度ですべてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定に利用した。
【００６５】
ポテンショスタットと走査型イオン伝導顕微鏡（ＳＩＣＭ）とを低ノイズ機械的スイッチと組み合わせることにより、細胞内測定を行った。ＳＩＣＭセットアップは、電流フィードバック測定用のＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ナノｐＨプローブの粗位置決め用のＭＰ−２８５電動マイクロマニピュレータ（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、ナノｐＨプローブセンサーの微細位置決め及び挿入のためのピエゾステージ（ＮａｎｏＣｕｂｅ、Ｐｈｙｓｉｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ）、及びセットアップのハードウェア制御のためのプログラム可能なインターフェースからなる。このシステムは、ＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で作成されたカスタムソフトウェアによって実行される。細胞によるすべての実験は、接眼レンズカメラ（Ｄｉｎｏ−Ｅｙｅ、Ｂｉｇ  Ｃ）を備えた倒立蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ  ７０）で行った。
【００６６】
細胞培養。ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びヒト線維芽細胞は、３７℃で５％ＣＯ２及び湿度９０％の条件付けされた環境で培養した。ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を１Ｘ  ＭＥＭで培養し、ヒト線維芽細胞を１Ｘ  ＤＭＥＭで培養した。すべての培地に１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充した。
【００６７】
蛍光顕微鏡。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞培養物を、ｐＨ感受性蛍光指示薬、ＢＣＥＣＦ−ＡＭに曝露した。作業溶液をハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）中で１μＭの濃度に調製し、蛍光イメージングの前に１５分間３７℃でインキュベートした。細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄した後、１μＭのＢＣＥＣＦ−ＡＭ溶液を充填した。インキュベーション後、イメージングのために培養液に装填したＨＢＳＳを使用して過剰な蛍光色素を細胞から洗い流した。
【００６８】
細胞内ｐＨバッファーキャリブレーションのために、細胞培養物を細胞内ｐＨキャリブレーションバッファーキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｐ３５３７９）に付属のプロトコルに従って調製した完全なｐＨキャリブレーションバッファーに露出し、イメージング前に１０分間３７℃でインキュベートした。細胞内ｐＨのキャリブレーションは、３つの複製で行われた。すべての蛍光顕微鏡分析は、Ｌｅｉｃａ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＬＡＳ  ＡＦ  ３）ソフトウェアを使用してＬｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡で実施した。他の画像解析は、Ｆｉｊｉ−ＩｍａｇｅＪソフトウェアで実施した。
【００６９】
実施例
実施例  １：ｐＨ応答性石英ナノピペットセンサーの特性
ナノピペットの測定原理は、先端のイオン電流に基づいている。このイオン電流は、ナノピペットの細孔径及び表面電荷に大きく依存する。石英ナノピペットの表面電荷は、ガラス−液体界面でのシラノール基の解離により負である。石英は極めて酸性のｐＨ値でプロトン化を受ける。石英のこれらの表面特性は、ｐＨセンシング能を低下させるため、未修飾のナノピペットでは非常に小さなｐＨ変化を測定するには適切ではない。未修飾の石英表面の低い感度に関連する制限は、ｐＨ応答性ポリマー実体をナノピペット表面に取り込むことによって克服することができる。ここでは、ｐＨ感受性表面コーティングとしてキトサンを使用した。酸性ｐＨで強い正電荷を有するキトサンは、静電相互作用によって負に帯電した石英表面上のヒドロキシル部分に引き付けられる。表面電荷の変化に加えて、キトサン層の厚さは、ナノピペットの感度を高め得るｐＨによって変化することが示されている。ナノピペット表面上のキトサン層の存在及び影響を評価するために、本発明者らは、表面修飾の結果としての電流応答の変化をモニタした。図１Ａは、−０．５〜０．５Ｖの電位範囲（対Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極）において１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）で充填された未修飾の及びキトサン修飾された石英ナノピペットの電気化学的トレースを示す。記録された電流応答は、キトサン修飾後に有意に減少する。ナノピペットチップの典型的な幾何学的形状は円錐形であり（図２Ａ）、石英ナノピペットの孔径はＳＥＭによって決定され、約９７ｎｍであることが判明した（図１Ｂ）。さらにＳＥＭ顕微鏡写真を撮影し、キトサン層の存在をさらに確認した（図２Ｂ）。キトサン修飾はナノピペットの内部で行われたため、集束イオンビームを使用してナノピペットを垂直にエッチングし、内部表面を露出させた。断面画像は、未修飾のナノピペットのものと比較した場合の、ナノピペット表面の内部のキトサン残基を示す（図１Ｃ及びＤ）。
【００７０】
キトサン層の存在がＳＥＭ及び電気化学で確認されると、リニアスイープボルタンメトリーを使用して官能化ナノピペットの分析的特徴付けを行った。電位範囲は−０．５〜０．５Ｖであり、走査速度は０．１Ｖ／秒であった。ｐＨの調節は、従来の酸塩基滴定法によって達成された。キトサン修飾ナノピペットのキャリブレーションは、第１の１Ｍ  ＮａＯＨの２０μｌ及び第２のＨＣｌを０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．０）に連続添加することによって行った。＋／−０．５Ｖでの修飾されたナノピペットの電流整流は、キトサン層上の電荷の変化から予想されるように、緩衝液のｐＨの変化に応じて変化した。キトサンは、その多糖類骨格（ｐＫａ約６．５）上にグルコサミン残基を含み、キトサンをｐＨ応答性にする。ｐＫａ以下のｐＨ値はキトサン層をプロトン化し、ナノピペット表面を正に帯電させるが、塩基性条件はキトサンのアミン官能基を脱プロトン化し、表面の正味の負電荷を増加させる（図３Ａ）。ｐＨの定量化のために、相対的整流比（ＲＲ）は、ＲＲＲ＝ＲＲｐＨ／ＲＲｎｅｕｔｒａｌとして定義され、ここで、ＲＲｐＨ及びＲＲｎｅｕｔｒａｌは、それぞれ特定のｐＨ及びｐＨ７．０のＲＲである。図３Ｂは、６．０２〜８．０４の生理学的に関連するｐＨ範囲内のキトサン修飾ナノピペットを使用した酸塩基滴定によって得られたキャリブレーション曲線を示す。ｐＨ検量線で観察された傾向は、等電点決定実験の典型である。キトサンの等電点のわずかな変化は、イオンの均一な拡散を妨げる可能性のある、ナノピペットチップのナノスケール円錐形状に起因する可能性がある。キトサン官能化ｐＨナノプローブの感度は０．０９ｐＨ単位であった。ｐＨに対するこの高い感度により、ナノプローブは細胞内ｐＨ測定のための強力なツールとなる。個々のｐＨ及びより広い範囲のｐＨキャリブレーションの電流電位曲線を図４Ａ〜４Ｃに示す。未修飾のナノピペットをｐＨセンシングについて試験した。予想通り、これらのナノピペットはｐＨ変化に対して低い感受性を示した（図５）。
【００７１】
実施例  ２：細胞培養培地中のｐＨセンシング
固体ナノポアｐＨプローブを開発する我々のモチベーションは、単一細胞レベルで細胞内ｐＨを測定し、それらの特徴的な代謝特性を有する癌細胞を同定することである。細胞内ｐＨ測定を行うために、キトサン修飾ナノピペットを細胞培養培地、ＭＥＭ及びＤＭＥＭでさらにキャリブレーションした。細胞培地には様々なアミノ酸、ビタミン、その他の成分が含まれているため、最適な作業パラメーターはＰＢＳに対して決定されたパラメーターとは異なっていた。走査された電位範囲は−０．２〜０．６Ｖであり、走査速度は０．１Ｖ／秒であった。ｐＨ変化に対するキトサン修飾ナノピペットの感度は、０．６Ｖで最も高かった。図６Ａ〜６Ｂは、１Ｘ  ＭＥＭ及びＤＭＥＭ溶液中のナノｐＨプローブのキャリブレーションを示す。培地中のナノｐＨプローブのキャリブレーションは、０．１Ｍ  ＨＣｌの２０μｌの連続添加により実施した。酸溶液を細胞培養培地に添加してから１５秒後に測定を行い、均一溶液を得た。代表的なリニアスイープボルタモグラムを、ＭＥＭ及びＤＭＥＭ培地の酸滴定について図７Ａ〜７Ｂに示す。これらの培地の成分が異なるので、それらの緩衝能はわずかに異なり、ＤＭＥＭはＭＥＭに比べてｐＨ変化に対してより耐性がある。
【００７２】
実施例  ３：癌細胞及び非癌細胞の細胞内ｐＨの測定
細胞内ｐＨの直接測定は、細胞のサイズが小さく、生理学的マトリックスの複雑さのために困難である。生理学的ｐＨレベルはわずかにアルカリ性であるが、大きな集団及び細胞内区画の個々の細胞の細胞内ｐＨレベルは不明である。従来、蛍光色素（例えば、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ、オレゴングリーン）は、細胞内のｐＨの間接的な検出に利用されている。これらのｐＨ指示薬は、大きな細胞集団にわたってｐＨの近似値を示すが、蛍光色素を使用することにはいくつかの欠点がある。ｉ）狭いｐＨ範囲による低感度、ｉｉ）高速光退色、ｉｉｉ）細胞毒性。さらに、特定の細胞小器官におけるこれらの色素の蓄積及びそれらの漏出の速度は、誤った解釈を導く可能性がある。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞内ｐＨを測定するための、従来のｐＨ指示薬である、ＢＣＥＣＦ−ＡＭを使用した我々の研究は、細胞内事象の正確かつ高感度な評価のために蛍光を使用することによる欠点を証明した。蛍光測定の細胞内ｐＨ測定を実施したこれらの研究では、細胞をＢＣＥＣＦ−ＡＭに曝露し、１５分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、１０分間、細胞内ｐＨキャリブレーション緩衝液（ｐＨ７．５、６．５、５．５及び４．５）を含有するニゲリシンに曝露した。ＢＣＥＣＦ−ＡＭは二重励起波長を有する。したがって、画像は４５８及び４８８ｎｍで撮影した。各ｐＨ値の２つの励起波長について、明視野及び蛍光顕微鏡写真を得た。１６〜２３個の個々の細胞の蛍光強度を使用して、レシオメトリックキャリブレーション曲線を得た（データは図示せず）。１つの細胞群は、細胞内自己蛍光の存在を評価する陰性対照（ＢＣＥＣＦ−ＡＭなし）として役立った。ｐＨ色素が存在しない場合、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１について観察可能な蛍光は存在しなかった。ＢＣＥＣＦ−ＡＭに曝露された細胞を使用して、個々の細胞の細胞内ｐＨ値を推定した。１０個の個々の細胞から得られた平均細胞内ｐＨ値は、６．７８（±０．８３）と算出された。しかし、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ曝露後に撮影した顕微鏡写真は、細胞体上の蛍光強度が変化することを明らかにした（データは図示せず）。蛍光強度は細胞が厚くなるほど高かった。さらに、個々の細胞において互いに近接している任意の２つの領域は、ｐＨ値の大きな変動を有することが見出された。これらの変動は、（ｉ）蛍光色素の不均一な分布または蓄積に起因する可能性があるか、（ｉｉ）蛍光色素の他の分子との交差反応性に起因する可能性がある。蛍光測定のもう１つの欠点は、培地に頻繁な変化を必要とする試料調製工程であり、これは細胞にストレスを与え、基底細胞内レベルを変化させる可能性がある。さらに、蛍光色素の使用では、目的の化合物と共にこれらの色素が存在すると、細胞の生理機能を変化させることによって、または試験すべき化合物と交差反応させることによって、誤った実験の結論が生じる可能性があるため、薬物試験、または毒性測定などの治療過程にわたる単一細胞の連続的な調査をすることはできない。言い換えれば、従来の蛍光プローブでは、治療剤、チャネル活性化剤、または毒素の細胞への影響を評価するための時間の経過にわたる単一の細胞の連続的な調査を行うことはできない。
【００７３】
細胞内ｐＨを直接かつ正確に測定するために、培養中の細胞の細胞質にキトサン修飾ナノピペットを挿入した。我々が初めて、ヒト線維芽細胞、ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１を含む、ヒト癌性及び非癌性の細胞株の細胞内ｐＨの直接モニタリングのために、このセンシング技術を使用した。ヒト線維芽細胞は、正常な細胞質条件で細胞内ｐＨレベルを調べるために、非癌モデルとして選択される。ＨｅＬａ細胞株は、細胞培養におけるそれらの急速かつ連続的な成長により、最も一般的に使用されるヒト癌型である。さらに、ＨｅＬａ細胞の汚染及び不均一性の報告により、これらの細胞の細胞内ｐＨレベルの決定は、細胞の不均一性を評価することを可能にし得る。ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、異なる乳癌細胞株である。ＭＣＦ−７はホルモン応答性細胞株であり、その増殖はエストロゲンで刺激される。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、高転移性であることが判明した浸潤性乳癌から得られる。我々は、これらの２つの乳癌細胞株が異なる薬物感受性を示すため、これらの２つの乳癌細胞株を調査することを選択し、これが細胞内ｐＨレベルの差異と相関するかどうかを判定しようと試みた。
【００７４】
ナノピペットを配置するための電流フィードバックを検出するカスタマイズされた走査型イオン伝導顕微鏡を使用して、キトサン修飾ナノピペットを個々の細胞に挿入した。最近、我々は、この特注のプラットフォームがゲノム調査のために単一細胞レベルでナノバイオプシーを実行できることを実証した。図８Ａは、キトサン修飾ナノピペットの接近−浸透−収縮プロセス中に記録された代表的なフィードバック信号を示す。ナノｐＨプローブを細胞に挿入した後、リニアスイープボルタモグラムを記録し、０．６Ｖのバイアス電位での電流応答を使用して単一細胞の細胞内ｐＨレベルを算出した。
【００７５】
０．６Ｖ対Ａｇ／ＡｇＣｌにおけるボルタンメトリー電流応答から、個々の細胞の算出された細胞内ｐＨレベル及びすべての細胞株の平均ｐＨ値を図９Ａ〜９Ｄに示す。７つのヒト線維芽細胞を細胞内ｐＨについて調べ、平均ｐＨは７．３７±０．２９であった（図９Ａ）。これらのヒト線維芽細胞における観察された細胞内ｐＨレベルは、イオン交換体（ＮＨＥ及びＮＢＣ）及び酸輸送体（ＡＥ）のモニタリングを含む間接的及び破壊的な手法によるｐＨレベルを推定する以前の報告と一致する。
【００７６】
我々はまた、非癌細胞と癌細胞との間の代謝の差異を調べるために、ナノｐＨプローブも使用した。癌細胞は非癌細胞と比較して代謝速度が速いため、癌細胞における酸性種及びＣＯ２の生成も高くなる。細胞内ｐＨ測定のための１４個の個々のＨｅＬａ細胞におけるキトサン修飾ナノｐＨプローブを使用して、ＨｅＬａ細胞の平均ｐＨが、６．７５±０．２７であることを見出した（図９Ｂ）。
【００７７】
同様の酸性細胞内環境が他の癌細胞株に存在するかどうかを比較するために、我々は乳癌株についてｐＨ測定を行った。ナノｐＨプローブを使用して、１４個の個々のＭＣＦ−７細胞の平均細胞内ｐＨレベルが、６．９１±０．２０であることが観察された（図９Ｃ）。平均細胞内ｐＨは、１１個の個々の細胞を使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１について６．８５±０．１１であることが判明した（図９Ｄ）。個々の細胞測定の代表的なリニアスイープボルタモグラムを図１０Ａ〜１０Ｄに示す。我々のデータは、細胞内環境がｐＨによって検出可能な方法で細胞ごとに異なることを実証している。これらの差異は、個々の細胞の異なる代謝速度に起因する可能性があり、腫瘍などの大きな集団における不均一細胞の同定に使用され得る。ナノｐＨプローブの小さなチップサイズは、挿入及び測定中の損傷を減少させる（図１１Ａ〜１１Ｃ、１１Ａ及び１１Ｂの顕微鏡写真を比較）。この様態は、医薬操作及び薬物療法の過程にわたり、同じ細胞の連続的または断続的な調査を可能にする（次のセクションを参照）。図１１Ｃは、連続的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定のためのナノｐＨプローブの再生及び再使用可能性を示す。ｐＨプローブを、０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中で細胞の調査後に試験した。さらに、この試験は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定に使用した後のプローブの完全性を制御するために重要である。
【００７８】
本明細書に記載されるｐＨナノプローブをより完全に配置するために、数分の範囲内で何百もの細胞を調査することを可能にする完全自動ハイスループット  ロボット  システムを構築する。一般的な細胞集団と比較して、より低いまたはより高いｐＨ値を有する細胞を同定し、次いで、ＤＮＡ及びＲＮＡ配列決定のためのナノバイオプシーに分子マーカーをタグ付けする。
【００７９】
実施例  ４：細胞内ｐＨの医薬操作
本発明のナノｐＨプローブは、薬物治療中の細胞内ｐＨ変化をモニタするために使用することができる。この目的のために、周知の塩化物チャネル遮断薬、５−ニトロ−２−（３−フェニルプロピルアミノ）−安息香酸（ＮＰＰＢ）の添加の間、単一の細胞での連続モニタリングのために、このナノｐＨプローブを配置した。ＮＰＰＢは、腎上皮細胞及びマクロファージ細胞における塩化物チャネルを遮断することが以前に示されており、結果として細胞内環境の酸性度が上昇する。従来、ｐＨの変化は、蛍光色素（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ）の導入によって間接的に測定されてきた。したがって、この医薬操作試験は、ナノｐＨプローブのリアルタイム測定の能力を実証するだけでなく、ｐＨ検出に対する特異性を実証することにも役立つ。ベースラインを得るために、ナノｐＨプローブをＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に挿入し、連続ｐＨ測定を７分間２１秒ごとに行った。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるこのリアルタイムｐＨモニタリングは、測定中に値７付近で最小のドリフトを示した（図１２、菱形）。ＮＰＰＢの効果を研究するために、ナノｐＨプローブをＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に挿入し、ＮＰＰＢ（無水ＤＭＳＯで新たに調製）の１００μＭを細胞培地に添加する直前に細胞内ｐＨ記録を開始した。図１２の正方形は、７分間のＮＰＰＢ曝露の結果としてのｐＨ変化を示す。細胞内ｐＨレベルは、ＮＰＰＢの導入後、最初の２分以内に有意に低下し、２．５まで低下した。測定されたｐＨレベルは、ＮＰＰＢ導入の４分後に安定化した。このｐＨの上昇は、アポトーシスにより、細胞体の収縮をもたらす可能性があり、ナノｐＨプローブのチップを細胞培地に曝露することになる。ナノｐＨプローブを使用した３つの個々のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞内ｐＨ測定は、ＮＰＰＢ曝露後のリアルタイムｐＨ変化を示しただけでなく、薬物応答に関して細胞間の変動も示した（図１３）。
【００８０】
実施例  ５：細胞の酸化還元変化の検出
上記の装置は、細胞内の成分の酸化または還元に応答するナノピペット上のキトサン層に付着した層でさらに修飾することができる。
【００８１】
上記のキトサン修飾石英ナノピペットは、ヘムタンパク質及び酵素などの固定化タンパク質で修飾することができる。キトサンへのこの固定化は、キトサンがカルボキシル基及びポリマー骨格にランダムに分布したグルコサミン残基を有するので、ペプチド結合形成機構または触媒反応のいずれかによって実現することができる。酸化還元活性小タンパク質をキトサン層上に固定化すると、そのように官能化されたナノピペットは、反応性酸素（ＲＯＳ）、窒素種（ＲＮＳ）及び過酸化水素などの反応性に富むラジカルに敏感になる。ＲＯＳの詳細については、Ｓａｌｅｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｈｅｍｅｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，  ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ，  ｎｅｕｒｏｇｌｏｂｉｎ，  ｃｙｔｏｇｌｏｂｉｎ  ａｎｄ  ｌｅｇｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，”  Ｊ．  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂ：  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３３  １１−１７８  （２０１４）を参照のこと。
【００８２】
これらのラジカル（例えば、活性酸素種）は、癌、老化、脳卒中、パーキンソン病及びアルツハイマー病などの多くの疾患状態に寄与することが知られている。したがって、ＲＯＳ及びＲＮＳの生理学的レベルの測定は非常に重要である。
【００８３】
ＲＯＳまたはＲＮＳの存在下では、ナノピペット内部の酸化還元感受性表面官能基は、酸化状態に応じて還元または酸化のいずれかを受ける。このような酸化状態の変化は、表面電荷の変化をもたらす。表面電荷の変化は、水性環境中に存在するＲＯＳまたはＲＮＳの量と相関している。反応種の検出は、電位差が石英のナノポアに印加されたときに、ナノポアにおけるイオン電流の変動を測定することによって行われる。
【００８４】
実施例  ６：ナノｐＨプローブの多重アレイ
上記の装置は、ナノｐＨプローブの多重アレイでさらに構成することができる。さらに、アレイで使用される様々なナノピペットの内部に、多数の表面認識材料を追加することができる。ナノピペット構造数は様々であってもよく、それらのすべてがキトサンｐＨセンシングコーティングを含むわけではない。
【００８５】
このアレイで使用するための円錐形ナノピペット構造を作製するための１つの可能な方法は、Ｍｅｙｙａｐｐａｎの米国特許第９，１８２，３９４号に記載されている。この特許には、陽極酸化を支持する金属様材料で形成され制御される、ナノピペットチャネルのアレイが記載されている。そこに記載されているように、Ａｌ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｔｉ、Ｔａ及び／またはＮｂなどの陽極酸化可能な金属の薄い基板を、ｐＨ＝４〜６及び電位１〜３００ボルトの化学浴中で温度Ｔ＝２０〜２００℃で陽極酸化し、直径１０〜５０ｎｍ、厚さ５〜２０ｎｍの酸化されたチャネル表面を有する、陽極酸化されたナノピペットチャネルのアレイを生成する。長さ１〜５μｍの隣接するナノピペットチャネル間の露出された非酸化性の陽極酸化可能な金属の一部がエッチング除去され、ナノピペットチャネルの内面及び外面が露出する。
【００８６】
図１６は、ナノプローブアレイの二次元断面図を概略的に示す。図１６は、例示の目的のために、６つのナノピペットプローブを示す。はるかに大きなアレイを使用することができる。個々のナノｐＨプローブは、導電性材料を含有するナノピペットを含み、ナノピペットの内部に延在する作用（検出）電極１６１に接続されている。絶縁層１６６が、上述のように、例えば、結晶質ＳｉＯ２として、構築されたナノピペット１６４のアレイの後部に適用される。不活性支持構造１６３は、絶縁層１６６を含み、絶縁アレイ及び電極アレイを支持する働きをする。アレイ１６４内の各ナノピペットは、絶縁層から図示のようにΔｈの高さまでの距離だけ延在し、直径ｄの先端開口部を有する。ナノポア（ｄ）の直径は５〜２００ｎｍであり、ナノピペットの寸法Δｈの長さは１０〜４００μｍであり得る。各作用電極１６１は、ナノピペット内の導電性材料を含む、アレイ１６４内の個々のプローブからの差動入力を有する、個々の増幅器１７０の入力に接続される。個々の信号増幅器１７０は、各ナノピペットに設けられ、図１５に示すような細胞内の敏感なｐＨ変化を読み取って測定装置に出力する（接続は図示せず）。アレイ１６４内のナノピペットは、例えば、酸化アルミニウムで作られた穿孔絶縁層１６６上に製造される。穿孔は、５〜１２５μｍのサイズ範囲の検出電極を挿入するためのものである。
【００８７】
さらに、磁気構造１６８ａ、１６８ｂは、支持構造１６３と絶縁層１６６との間に取り外し可能なアタッチメントを提供するために設けられている。これにより、アレイ内のナノピペットへのアクセスが実現され、ピペットの修正が可能になるだけではなく、支持電解質でナノピペットを充填することも可能になる。
【００８８】
修飾は、ポリマーまたは認識分子でピペット構造の内面を鋳造することにより、電極（１６１）を挿入する前に行われる。表面コーティングプロセスは、イオン電流の変化はナノポアの最初の０．１〜５μｍ中心に行われるので、必ずしも必要ではないが、内面全体に対して行うことができる。
【００８９】
これらの表面認識材料は、Ｎａｆｉｏｎ（登録商標）、フェニレンジアミン、ポリ‐Ｌ‐リジン、ポリアクリル酸及びポリピロールを含むポリマー、酸化還元酵素及びデヒドロゲナーゼファミリーを含む酵素、アビジン及びプリオンを含むタンパク質、及び抗原、ＲＮＡ断片及びアプタマーを含むポリマーであり得る。これらの物質は、検出目的の対象となるナノプローブの個体またはアレイの官能化のために、単独で、または組み合わせて利用することができる。表面修飾プロトコルは、固定化、濃度、インキュベーション時間及び温度のための表面化学を含む各認識物質に対して最適化する必要がある。各検出アレイのｐＨ、電解質タイプ及び濃度などのナノピペット充填溶液の特性は、最高の検出感度を評価する必要がある。
【００９０】
必要な表面修飾が完了し、充填電解液が導入された後、検出電極を内蔵したカスタマイズされたプリント回路基板（ＰＣＢ）を、電極を穿孔に合わせることによってナノピペットアレイ上に配置する。検出電極は、銀、白金、金、または酸化還元ベース（銀−銀（Ｉ）塩化物）、またはガラス状炭素、グラファイト、及びホウ素ドープダイヤモンドを含む非金属を含む金属である。電子機器がナノピペットアレイに挿入されると、ナノピペットアレイの内部構成要素は完全に密封される。ネオジミウムからなる磁気構造体１６８は、確実に電子機器とナノピペットアレイの両方を相互にロックする。本発明の電子構造体は、個々のチャネルのために必要なすべての回路を含み、同期化またはカスタム化された検出を行うことができる。
【００９１】
結論
上記の具体的な説明は、本発明を例示し説明することを意味し、本発明の範囲を限定するものと見なすべきではなく、添付の特許請求の範囲の文字通りの均等な範囲によって定義される。本明細書で言及されたいずれの特許または刊行物も、本発明の特定の態様を実施するのに有用な方法及び材料の詳細を伝達することを意図しており、明確に述べることはできないが、現場の作業者が理解できるものである。そのような特許または刊行物は、言及された方法または材料を説明及び可能にするために必要に応じて、それぞれが具体的かつ個々に参照によって組み込まれ本明細書に含まれるのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
参考文献
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３４．Ｕｍｅｈａｒａ，  Ｓ．，  Ｋａｒｈａｎｅｋ，  Ｍ．，  Ｄａｖｉｓ，  Ｒ．  Ｗ．  ＆  Ｐｏｕｒｍａｎｄ，  Ｎ．  Ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｎａｎｏｐｉｐｅｔｔｅ  ｐｒｏｂｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０６，  ４６１１−４６１６，  ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９００３０６１０６  （２００９）．
３５．Ｖｉｌｏｚｎｙ，  Ｂ．，  Ａｃｔｉｓ，  Ｐ．，  Ｓｅｇｅｒ，  Ｒ．  Ａ．，  Ｖａｌｌｍａｊｏ−Ｍａｒｔｉｎ，  Ｑ．  ＆  Ｐｏｕｒｍａｎｄ，  Ｎ．  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎａｎｏｐｉｐｅｔｔｅ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８３，  ６１２１−６１２６，  ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃ２０１３２２ｖ  （２０１１）．
３６．Ｋａｒｈａｎｅｋ，  Ｍ．，  Ｋｅｍｐ，  Ｊ．  Ｔ．，  Ｐｏｕｒｍａｎｄ，  Ｎ．，  Ｄａｖｉｓ，  Ｒ．  Ｗ．  ＆  Ｗｅｂｂ，  Ｃ．  Ｄ．  Ｓｉｎｇｌｅ  ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎａｎｏｐｉｐｅｔｔｅｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５，  ４０３−４０７，  ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｌ０４８０４６４  （２００５）．
３７．Ｖｉｌｏｚｎｙ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｕａｔｅｄ  ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｉｏｄｅ：  ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｒｅｃｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｎａｎｏｐｉｐｅｔｔｅ．Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ５，  ９２１４−９２２１  （２０１３）．
３８．Ｏｚｅｌ，  Ｒ．  Ｅ．，  Ｗａｌｌａｃｅ，  Ｋ．  Ｎ．  ＆  Ａｎｄｒｅｅｓｃｕ，  Ｓ．  Ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｃｏａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｎ  ｆｉｂｅｒ  ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｅｍｂｒｙｏｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａ  ｃｈｉｍｉｃａ  ａｃｔａ  ６９５，  ８９−９５，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｃａ．２０１１．０３．０５７  （２０１１）．
３９．Ｏｚｅｌ，  Ｒ．  Ｅ．，  Ｈａｙａｔ，  Ａ．，  Ｗａｌｌａｃｅ，  Ｋ．  Ｎ．  ＆  Ａｎｄｒｅｅｓｃｕ，  Ｓ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｅｒｉｕｍ  ｏｘｉｄｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．ＲＳＣ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ３，  １５２９８−１５３０９，  ｄｏｉ：１０．１０３９／Ｃ３ＲＡ４１７３９Ｅ  （２０１３）．
４０．Ｏｚｅｌ，  Ｒ．  Ｅ．，  Ｉｓｐａｓ，  Ｃ．，  Ｇａｎｅｓａｎａ，  Ｍ．，  Ｌｅｉｔｅｒ，  Ｊ．  Ｃ．  ＆  Ａｎｄｒｅｅｓｃｕ，  Ｓ．  Ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｉｘｅｄ  ｃｅｒｉａ  ａｎｄ  ｔｉｔａｎｉａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｉｎ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ５２，  ３９７−４０２，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｓ．２０１３．０８．０５４  （２０１４）．
４１．Ｂｅｈｒｅｎｓ，  Ｓ．  Ｈ．  ＆  Ｇｒｉｅｒ，  Ｄ．  Ｇ．  Ｔｈｅ  ｃｈａｒｇｅ  ｏｆ  ｇｌａｓｓ  ａｎｄ  ｓｉｌｉｃａ  ｓｕｒｆａｃｅｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １１５，  ６７１６−６７２１，  ｄｏｉ：ｄｏｉ：ｈｔｔｐ  （ｃｏｌｏｎ  ｓｌａｓｈ  ｓｌａｓｈ）  ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０６３／１．１４０４９８８  （２００１）．
４２．Ｃｌａｅｓｓｏｎ，  Ｐ．  Ｍ．  ＆  Ｎｉｎｈａｍ，  Ｂ．  Ｗ．  ｐＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｄｓｏｒｂｅｄ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｌａｙｅｒｓ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ８，  １４０６−１４１２，  ｄｏｉ：１０．１０２１／ｌａ０００４１ａ０２７  （１９９２）．
４３．Ｌｅｅ，  Ｈ．−Ｓ．，  Ｅｃｋｍａｎｎ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｌｅｅ，  Ｄ．，  Ｈｉｃｋｏｋ，  Ｎ．  Ｊ．  ＆  Ｃｏｍｐｏｓｔｏ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｐＨ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｗｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｔｏｓａｎ  Ｂｒｕｓｈｅｓ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２７，  １２４５８−１２４６５，  ｄｏｉ：１０．１０２１／ｌａ２０２６１６ｕ  （２０１１）．
４４．Ｍａｓｔｅｒｓ，  Ｊ．  Ｒ．  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ  ５０  ｙｅａｒｓ  ｏｎ：  ｔｈｅ  ｇｏｏｄ，  ｔｈｅ  ｂａｄ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｕｇｌｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２，  ３１５−３１９  （２００２）．
４５．Ｈｏｌｌｉｄａｙ，  Ｄ．  ＆  Ｓｐｅｉｒｓ，  Ｖ．  Ｃｈｏｏｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｉｇｈｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３，  ２１５  （２０１１）．
４６．Ａｃｔｉｓ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  Ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｎａｎｏｂｉｏｐｓｙ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ８，  ５４６−５５３，  ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｎ４０５０９７ｕ  （２０１３）．
４７．Ｂｒｏｗｎ，  Ｃ．  Ｄ．  Ａ．  ＆  Ｄｕｄｌｅｙ，  Ａ．  Ｊ．  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒｓ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒｅｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ＬＬＣ−ＰＫ１  ｃｅｌｌｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１８，  ４４３−４４４，  ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４７６−５３８１．１９９６．ｔｂ１５４２２．ｘ  （１９９６）．
４８．Ｌｕｋａｃｓ，  Ｇ．  Ｌ．，  Ｎａｎｄａ，  Ａ．，  Ｒｏｔｓｔｅｉｎ，  Ｏ．  Ｄ．  ＆  Ｇｒｉｎｓｔｅｉｎ，  Ｓ．  Ｔｈｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒ  ５−ｎｉｔｒｏ−２−（３−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｙｌ−ａｍｉｎｏ）  ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  （ＮＰＰＢ）  ｕｎｃｏｕｐｌｅｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｏｎ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｎ  ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２８８，  １７−２０，  ｄｏｉ：ｈｔｔｐ  （ｃｏｌｏｎ  ｓｌａｓｈ  ｓｌａｓｈ）  ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／００１４−５７９３（９１）８０９９２−Ｃ  （１９９１）．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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