(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的流体からマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を単離するための方法であって、（ａ）前記生物学的流体を界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬と接触させ、ここに、前記界面活性剤は、生物学的流体の成分を分離し、前記抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬は、前記ｍｉＲＮＡと会合するｍｉＲＮＡ結合タンパク質と相互作用して免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体を形成し；及び（ｂ）前記免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体とプロテアーゼを接触させて、精製することなく、前記免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体からｍｉＲＮＡを放出させることを含む、方法。
【請求項２】
前記生物学的流体が、小胞性ｍｉＲＮＡ及び非小胞性ｍｉＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的流体が、血漿または血清である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的流体を、前記界面活性剤及び前記抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬と同時に接触させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的流体、前記界面活性剤、及び前記抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬が、３０分間インキュベートされる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的流体、前記界面活性剤、及び前記抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬が、室温でインキュベートされる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬は、固体支持体に結合した抗Ａｒｇｏｎａｕｔ抗体を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記固体支持体が磁気ビーズである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロテアーゼがプロテアーゼＫである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロテアーゼとの接触が１０分間行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロテアーゼとの接触が室温で行われる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体から放出された前記ｍＲＮＡが、他のタイプのＲＮＡを含まない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生物学的流体からのマイクロＲＮＡを単離するための手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、特定の塩基対形成相互作用を介して、特定のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の標的の転写後調節により遺伝子制御ネットワークに影響を与える小さな非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、無細胞形態で、ヒト生体液中に存在することが示されている。これら無細胞のｍｉＲＮＡは、小胞ではない、ｍｉＲＮＡタンパク質複合体中のタンパク質に結合及び保護され、エキソソームまたはマイクロベシクル、もしくはその両方のような膜結合小胞に封入され得る。疾患に与えるｍｉＲＮＡの重要な機能的役割として核酸分子のこのセットには、容易に入手可能な血清、血漿、尿、または唾液などの生物学的サンプルで、幅広い患者及び疾患が発現する前の対象の、疾患の診断及び予後診断ならびに多種多様な治療応答モニタリングのための候補が含まれる。ｍｉＲＮＡを単離する現在の方法は、細胞及び組織内で比較的豊富なｍｉＲＮＡを対象としており、容易に自動化やスケールアップできないスピンカラムを使用しており、複雑であり、毒性化合物を含有し、または特異的に小胞もしくは非小胞のいずれかのｍｉＲＮＡを分離することができる。さらに、診断または予後診断において、ｍｉＲＮＡは多くの場合、生物流体中に少量で存在し、現行の骨の折れる分離方法を使用して検出される。従って、生物流体中のｍｉＲＮＡのすべて、または、大多数を単離するための簡便、効率的、自動化可能かつスケールアップ可能な方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
本開示の一態様は、生物学的流体からマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡの）を単離するための方法を提供する。この方法は、界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬と生物学的流体を接触させることを含み、ここで、界面活性剤は生物学的流体の成分を分離し、そして、抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬は、ｍｉＲＮＡと結合するｍｉＲＮＡ結合タンパク質と相互作用して免疫沈降されるｍｉＲＮＡ複合体を形成する。この方法は、更に、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体からｍｉＲＮＡを放出することを含む。
【０００４】
本開示の別の態様は、生物学的流体からマイクロＲＮＡを単離するためのキットを包含する。キットは、界面活性剤、抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬、及びｍｉＲＮＡ放出試薬を含む。
【０００５】
他の態様及び開示の繰り返しは、下記により詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】Ｔｒｉ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）ＢＤ、または、ＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）を使用して、０．２ｍｌの血漿からｍｉＲＮＡの単離を比較する２つのグラフを提示する。ＲＩＰにより単離されたｍｉＲＮＡ量は、Ｔｒｉ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）ＢＤを使用して単離されたｍｉＲＮＡ量の発現量の差として提示されている。（Ａ）は、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、２３ａ−３ｐ、及び１９１−５ｐのｍｉＲＮＡのレベルを図示し、及び（Ｂ）は、１４２−３ｐ及び４５１ａのｍｉＲＮＡのレベルを図示する。
【０００７】
【図２】Ａｇｏ−ＲＩＰまたはＱｉａｇｅｎカラム精製キット（Ｑ１、Ｑ２）を使用して、血漿からのｍｉＲＮＡ単離レベルを示す３つのプロットを図示する。単離されたｍｉＲＮＡの量は、ｍｉＲのコピー数／溶出量（μｌ）として）、ｌｅｔ−７ａ、２３ａ、及び１４２のｍｉＲＮＡ（Ａ）、１９１のｍｉＲＮＡ（Ｂ）、及び４５１ａのｍｉＲＮＡ（Ｃ）について示される。
【０００８】
【図３】ビオチン化した抗体（ｂ−Ａｇｏ２またはｂ−Ａｇｏ）とストレプトアビジンでのＲＩＰまたは非ビオチン化（Ａｇｏ２）抗体とプロテインＡビーズでのＲＩＰを使用し、血漿から単離されたｍｉＲＮＡのレベルを示す３つのプロットを図示する。示されている単離されたｍｉＲＮＡ量は、ｌｅｔ−７ａ（Ａ）、２３ａ（Ｂ）、及び１９１（Ｃ）のｍｉＲＮＡについて、ｍｉＲのコピー数／溶出量（μｌ）として表される。使用した抗体（括弧内のクローン）は、ｘ軸上に記述される。
【０００９】
【図４】加熱でのｍｉＲＮＡ放出を伴うＡｇｏ−ＲＩＰを使用して、血漿から単離されたｍｉＲＮＡのレベルを示す２プロットを提示する。Ｑは、Ｑｉａｇｅｎカラム精製を表し；ＲＩＰ−Ｑは、免疫沈降に続くＱｉａｇｅｎカラム精製を表し；ｂＲＲＩＰ−Ｑは、ビオチン化抗体を用いた免疫沈降に続くＱｉａｇｅｎカラム精製を表す。（Ａ）Ｑｉａｇｅｎカラム精製、カラム精製と組み合わせたＲＩＰ、及びプロテアーゼＫ放出を伴うＲＩＰを用いた、合成ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐのレベルを図示する。スパイクのレベルは、単離時にスパイクしたトータルの合成ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐとの比率として表される。（Ｂ）Ｑｉａｇｅｎカラム精製、カラム精製と組み合わせたＲＩＰ及びプロテアーゼＫによるｍｉＲＮＡ放出を伴うＲＩＰを用いて血漿から単離したｌｅｔ７ａ  ｍｉＲＮＡのレベルを図示する。ｌｅｔ７ａのレベルは、回収したサンプル１μｌ中のｌｅｔ７ａのコピー数として表される。
【００１０】
【図５】種々の温度でのプロテアーゼＫによるｍｉＲＮＡ放出を伴うＡｇｏ−ＲＩＰを使用して、血漿から単離したｍｉＲＮＡのレベルを示す２プロットを提示する。（Ａ）は、プロテアーゼＫにより放出されるｌｅｔ７ａ  ｍｉＲＮＡのレベル（各温度での左の棒グラフ）、及びビーズ上で保持されたレベル（各温度での右の棒グラフの棒グラフ）を図示する。ｌｅｔ７ａ  ｍｉＲＮＡのレベルは、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔを用いて単離した、０．２ｍｌの同一血漿中のトータルのｌｅｔ７ａ ｍｉＲＮＡの比率として表される。（Ｂ）は、プロテアーゼＫにより放出されたｍｉＲ４５１ａ  ｍｉＲＮＡのレベル（各温度での左の棒グラフ）、及びビーズ上に保持されたレベル（各温度における右の棒グラフ）を示す。右の棒グラフｍｉＲ４５１ａ  ｍｉＲＮＡのレベルは、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔを用いて単離した、０．２ｍｌの同一血漿中のトータルの、ｍｉＲ４５１ａ  ｍｉＲＮＡとの比率として表される。
【００１１】
【図６】市販入手可能なｍｉＲＮＡの単離法、または、標準的なチューブ内でプロテアーゼＫによるｍｉＲＮＡ放出を伴うＲＩＰを使用する単離法を使用して、血漿から単離したｌｅｔ７ａ（Ａ）またはｍｉＲ４５１ａ（Ｂ）ｍｉＲＮＡのレベルを示す２つのプロットを提示する。Ｅ１及びＥ２は、Ｅｘｉｑｏｎ社からのｍｉＲＣｕｒｙ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ＫｉｔＢｉｏｆｌｕｉｄｓを使用したｍｉＲＮＡの単離を表す。Ｑ１及びＱ２は、Ｑｉａｇｅｎ社からのｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ｋｉｔを使用したｍｉＲＮＡの分離を表す。ＲＩＰ−ｓｔｄ−Ｑは、免疫沈降に続くＱｉａｇｅｎカラム精製を表す。ｍｉＲＮＡのレベルは、０．２ｍｌの血漿から回収されたトータルのコピー数として表される。
【００１２】
【図７】ｍｉＲＮＡ単離を市販の方法を用いて血漿から単離した、または、プロテアーゼＫによる放出を伴うＡｇｏ−ＲＩＰを使用して単離した（ＲＩＰ１〜４）、ｌｅｔ７ａ  ｍｉＲＮＡのレベルを示す２つのプロットを提示する。（Ａ）はトライアル１、及び（Ｂ）はトライアル２を示す。Ｅ１及びＥ２は、Ｅｘｉｑｏｎ社からのｍｉＲＣｕｒｙ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ−ｂｉｏｆｌｕｉｄｓを使用したｍｉＲＮＡ単離を表す。Ｑ１及びＱ２は、Ｑｉａｇｅｎ社からのｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔを使用したｍｉＲＮＡの単離を表す。ｌｅｔ７ａのレベルは、０．２ｍｌの血漿から回収されたｌｅｔ７ａのトータルのコピー数として表される。
【００１３】
【図８】プロテアーゼ、及び、ＲＮａｓｅ阻害剤有り無しで、及び、界面活性剤の事前処理有り無しで、Ａｇｏ−ＲＩＰに続いてプロテアーゼＫによるｍｉＲＮＡ放出を使用して、血漿から単離されたｍｉＲＮＡのレベルを示す２プロットを提示する。＋ｐｒｅ、＋ｉｎｈ；ＩＧＥＰＡＬ及び阻害剤を血漿に加え、Ａｇｏ２−ビーズに添加する前に、〜３０分間インキュベートした。＋ｐｒｅ、−ｉｎｈ；ＩＧＥＰＡＬは、阻害剤なしで血漿に加えられ、Ａｇｏ２−ビーズに添加する前に、〜３０分間インキュベートされた。−ｐｒｅ、＋ｉｎｈ；ＩＧＥＰＡＬ及び阻害剤をＡｇｏ２−ビーズと同時に加えた。−ｐｒｅ、−ｉｎｈ；ＩＧＥＰＡＬを、阻害剤なしで、Ａｇｏ２−ビーズと同時に血漿に加えた。（Ａ）は、回収されたｌｅｔ７ａ  ｍｉＲＮＡのコピー数を、（Ｂ）は、回収されたｍｉＲ４５１ａ  ｍｉＲＮＡのコピー数を示す。
【００１４】
【図９】ＩＧＥＰＡＬ処理されたｍｉＲＮＡをトータルの％として表すｍｉＲＮＡについて、小胞なし（各ｍｉＲＮＡの左の棒グラフ）、及び小胞付き（各ｍｉＲＮＡの右の棒グラフ）のレベルを示すプロットを提示する。
【００１５】
【図１０】Ａｇｏ−ＲＩＰに続いてプロテアーゼＫによる放出（ＲＩＰ）を使用して０．２または０．４ｍｌの血漿から、及びＥｘｉｑｏｎ社（Ｅ）のｍｉＲＣｕｒｙ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ−Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓを使用して０．２ｍｌの血漿から、単離したｍｉＲＮＡのレベルを示す３つのプロットを提示する。（Ａ）は、回収されたｌｅｔ７ａ ｍｉＲＮＡのコピー数を図示し、（Ｂ）は、回収されたｍｉＲ１９１  ｍｉＲＮＡのコピー数を図示し、及び（Ｃ）は、回収されたｍｉＲ４５１ａ  ｍｉＲＮＡのコピー数を図示する。
【００１６】
【図１１】Ａｇｏ−ＲＩＰに続いてプロテアーゼＫによる放出を使用して血漿から単離されたｌｅｔ７ａのレベルを示すプロットを提示する。ＲＩＰのインキュベーションは、室温で、５、１５、３０、または６０分（５′、１５′、３０′、６０′）であった。５、１５、または３０分インキュベーションされたものは、全て、５回洗浄してプロテアーゼＫにより放出させた。６０分インキュベートされたものは５、４、３、２、または１回洗浄した（５ｗ、４ｗ、３ｗ、２ｗ、１ｗ）。０．２ｍｌの血漿から回収されたｌｅｔ７ａの合計収量が示されている。
【００１７】
【図１２Ａ】Ａｇｏ−ＲＩＰまたはカラムベースのｍｉＲＮＡ単離キットを用いて、血漿から単離されたｌｅｔ７ａのｍｉＲＮＡのレベルを示す。３つの異なる実験（Ｅｘｐ）が提示される。Ｓ１及びＳ２は、Ａｇｏ−ＲＩＰを使用した単離を表し；Ｅ１及びＥ２はＥｘｉｑｏｎ社からのｍｉＲＣｕｒｙ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ−ｂｉｏｆｌｕｉｄｓを使用した単離を表し；Ｑ１及びＱ２は、Ｑｉａｇｅｎ社からの、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔを使用した単離を表す。
【００１８】
【図１２Ｂ】Ａｇｏ−ＲＩＰ、または、カラムベースのｍｉＲＮＡ単離キットを使用して、血漿から単離されたＲＮＵ６小核ＲＮＡのレベル及びＳＮＯＲＤ４８小核ＲＮＡを提示する。３つの異なる実験を提示する。Ｓ１及びＳ２は、Ａｇｏ−ＲＩＰを使用した単離を表す；Ｅ１及びＥ２はＥｘｉｑｏｎ社からのｍｉＲＣｕｒｙ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ−ｂｉｏｆｌｕｉｄｓを使用した単離を表し；Ｑ１及びＱ２は、Ｑｉａｇｅｎ社からの、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔを使用した単離を表す。
【００１９】
【図１２Ｃ】Ａｇｏ−ＲＩＰ、または、カラムベースのｍｉＲＮＡ単離キットを用いて、血漿から単離された、ＧＡＰＤＨのメッセンジャーＲＮＡ、ＲＮ１８ＳリボソームＲＮＡ、及び、ＲＮ２８ＳリボソームＲＮＡのレベルを示す。３つの異なる実験が提示される。Ｓ１及びＳ２は、Ａｇｏ−ＲＩＰを使用した単離を表し；Ｅ１及びＥ２は、Ｅｘｉｇｏｎ社のｍｉＲＣｕｒｙ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ−Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓを用いた単離を表し；Ｑ１及びＱ２は、Ｑｉａｇｅｎ社からの、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔを使用した単離を表す。
【００２０】
【図１３】抗Ａｇｏ１抗体、抗Ａｇｏ２抗体、または、抗Ａｇｏ１及び抗Ａｇｏ２抗体の両方の組み合わせを使用したＡｇｏ−ＲＩＰを介して血漿から単離されたｍｉＲＮＡのレベルを示すプロットを提示する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
循環するｍｉＲＮＡを単離するための効率的で迅速な方法が発見された。実施例に示すように、本開示の方法は、小胞に内包される、及び、小胞に内包されていない循環ｍｉＲＮＡを両方同時に単離することができる。都合よく、本開示の方法及びキットは、他の種類のＲＮＡが混入していない純粋なｍｉＲＮＡ調製物の迅速かつ特異的な単離を可能にする。更に、本明細書に開示された方法及びキットは、希釈細胞外液から高収量でのｍｉＲＮＡの単離を可能にする。また、本発明の方法は、スケールアップ可能で、増大した容量の細胞外の生物学的流体から、ｍｉＲＮＡの単離が可能となる。
【００２２】
ｍｉＲＮＡのレベルは、癌、心血管疾患ならびに他の多数の疾患及び発生過程（統合失調症、アルツハイマー病、獲得免疫と自然免疫の双方についての免疫細胞の発生や調節、幹細胞の維持及び多分化能、神経系の発生、糖尿病を含む内分泌疾患、膵臓の発生、脆弱Ｘ症候群、皮膚の創傷治癒、細胞周期の進行、移植組織の拒絶反応、低酸素症、骨格筋分化）と関連している。さらに、ｍｉＲＮＡはウイルスでも発現しており、それらのｍｉＲＮＡの標的遺伝子が同定されている。したがって、本開示の方法及びキットは、血液、血清、または血漿などの容易に入手可能な生物学的サンプルを使用して、疾患または疾患状態を診断するアッセイのためのｍｉＲＮＡ調製に使用することができる。
【００２３】
Ｉ．方法
本開示は、生物学的流体からマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を単離するための方法を包含する。この方法は、界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬を生物学的流体に接触させることを含む。界面活性剤は、生物学的流体の成分を分離し、そして、抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬は、ｍｉＲＮＡと結合するｍｉＲＮＡ結合タンパク質（単数若しくは複数）と相互作用して、免疫沈降されるｍｉＲＮＡ複合体を形成する。この方法は、更に、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体からｍｉＲＮＡを放出することを含む。
【００２４】
本明細書に具体的に開示した方法は、ｍｉＲＮＡを単離する。下記の実施例１２に記載する通り、他のタイプの小さなＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡまたは核小体低分子ＲＮＡなど）は、開示された方法により単離されず、そして、より大きいＲＮＡ分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ、またはリボソームＲＮＡなど）も、開示された方法では単離されない。
【００２５】
（ａ）生物学的流体
本開示の方法は、対象から得られる生物学的流体サンプルの細胞外を循環するｍｉＲＮＡの単離を含む。本明細書で使用する用語「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。対象は、胎児、未成年、または成人であってもよい。対象は、雄又は雌であってもよい。適切な動物としては、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、及び魚類などの脊椎動物が含まれる。適切な哺乳動物の例としては、げっ歯類、愛玩動物、家畜、及び霊長類が挙げられるが、制限はない。げっ歯類の非限定の例としては、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ及びモルモットが挙げられる。適切な愛玩動物としては、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミ、フェレットが挙げられるが、それに限定されない。家畜の非限定的な例としては、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ラマ、及びアルパカが挙げられる。適当な霊長類としては、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカク、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザル、及び、ベルベットモンキーがあげられるが、それに限定されない。鳥類の非限定的な例としては、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル及びガチョウが挙げられる。例示的な対象はヒトである。
【００２６】
用語「生物学的流体」は、任意の対象から単離されたすべての生物学的流体及び排泄物を参照することができる。生物学的流体の非限定の例は、血液及びその画分、血清、血漿、尿、排泄物、精液、精液流体、精漿、前立腺液、プレ射精液（カウパー液）、胸水、涙、唾液、痰、汗、生検液、腹水、脳脊髄液、羊水、リンパ液、骨髄、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜の分泌物、消化管分泌物、気管支分泌物、乳房分泌物、卵巣嚢胞の分泌物、組織液、腫瘍吸引物及び組織液サンプルを挙げることができる。いくつかの実施形態では、生物学的流体は血清である。他の実施形態において、生物学的流体は血漿である。
【００２７】
対象から血漿または血清サンプルを得る方法は、当該分野で公知である。例えば、カテーテルの有り無しでの静脈穿刺は、血液サンプルを採取して血清を調製するために使用することができる。血液サンプルから血漿及び血清を調製する方法は、当該分野で公知である。更に、一般的に血液サンプルは、下記に記載されるように処理される血漿または血清の十分な量を供給するのに十分多い。血漿または血清サンプルは、サンプルを採取した直後に処理してもよい。或いは、血漿または血清サンプルは、後に処理するために凍結することができる。
【００２８】
生物学的流体サンプルは、新たにサンプルを収集することにより、対象から得ることができる。或いは、生物学的流体サンプルは、以前に収集されて保存されたサンプルから得ることができる。例えば、生物学的流体が血漿または血清である場合、貯蔵及び保存された採血サンプルからサンプルを得ることができる。いくつかの実施形態では、サンプルは新たにサンプルを採取することにより得られる。他の実施形態では、サンプルは、以前に収集されて貯蔵されたサンプルから得られる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、生物学的流体サンプルは、希釈されない。他の実施形態では、生物学的流体サンプルは、ｍｉＲＮＡの単離の前に希釈される。希釈の程度は、ｍｉＲＮＡ、サンプル中の生物学的流体のタイプ、対象、対象の疾患状態、ｍｉＲＮＡを測定するために使用されるアッセイのタイプ、及び、ｍｉＲＮＡを測定するために使用されるアッセイで使用される試薬を含むが、それに限定されない多くの因子に依存し得る。一実施形態では、生物学的流体サンプルは、元のサンプル容積の１／２程度から、約５０,０００倍の範囲まで希釈剤量を添加することにより希釈される。希釈剤は、ｍｉＲＮＡの単離、または、後続の処理工程で使用される他の方法を妨害しない任意の流体であってもよい。適切な希釈剤の非限定的な例としては、脱イオン水、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＳＳＣ（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ）、及びＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水を含む。
【００３０】
（ｂ）界面活性剤
生物学的流体は、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）（あるいは、「ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ」または「ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ」と称される）と接触させる。本明細書で使用する用語「界面活性剤」は、循環ｍｉＲＮＡを含むことができる生物学的流体の成分を分離することが可能な任意の薬剤を記載するために使用できる。循環ｍｉＲＮＡを含むことができる生物学的流体成分の非限定的な例としては、リポタンパク質、エキソソーム、微小胞、エクトソーム、アポトーシス小体、及び他の細胞外小胞などの細胞外小胞が挙げられる。
【００３１】
当業者により理解されるように、生物学的流体の成分を分離することができる任意の界面活性剤は、本開示の免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体の形成に干渉しないことを条件として、本開示の方法において使用することができる。例えば、界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、またはそれらの組み合わせであり得る。本発明の界面活性剤の同一性は、循環するｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬、及び単離されたｍｉＲＮＡを含むことが可能な生物学的流体中の生物学的流体成分の同一性に依存して変化し得る。
【００３２】
いくつかの実施形態では、界面活性剤は、アニオン性界面活性剤である。好適なアニオン性界面活性剤としては、アミンドデシルベンゼンスルホネート；カプリレス硫酸アンモニウム；クメンスルホン酸アンモニウム；ジヒドロキシステアリン酸アンモニウム；ドデシルベンゼンスルホン酸アンモニウム；ラウレス硫酸アンモニウム；ラウレス−１２硫酸アンモニウム；ラウレス−３０硫酸アンモニウム；ラウリルサルコシン酸アンモニウム；ラウリル硫酸アンモニウム；スルホコハク酸ラウリルアンモニウム；リグノスルホン酸アンモニウム；ミレス硫酸アンモニウム；ナフタレンスルホン酸アンモニウム；アンモニウムノノキシノール−２０スルフェート；アンモニウムノノキシノール−３０スルフェート；アンモニウムノノキシノール−４スルフェート；アンモニウムノノキシノール−６スルフェート；アンモニウムノノキシノール−９スルフェート；オレイル硫酸アンモニウム；ぺルフルオロオクタン酸アンモニウム；ステアリン酸アンモニウム；キシレンスルホン酸アンモニウム；ナフタレンスルホン酸ブチル；リン酸ブチル；ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム；カルシウムステアロイルラクチレート；カルシウムテトラプロピレンベンゼンスルホネート；カプリルレス−９−カルボン酸；リン酸セチル；クメンスルホン酸；ＤＥＡ−セチルホスフェート；ＤＥＡ−ドデシルベンゼンスルホネート；ＤＥＡ−ラウリルスルフェート；デセス−４ホスフェート；ジアンモニウムラウリルスルホコハク酸；ジアンモニウムステアリルスルホスクシナメート；ジアミルナトリウムスルホコハク酸；ジシクロヘキシルナトリウムスルホコハク酸；ジヘキシルナトリウムスルホコハク酸；ジイソブチルナトリウムスルホコハク酸；ジラウレス−７クエン酸；ジメチコノール；ジノノキシノール−４ホスフェート；ジオクチルアンモニウムスルホコハク酸；ジオクチルナトリウムスルホコハク酸；ジナトリウムセテアリルスルホスクシナメート；ジナトリウムコカミドＭＥＡ−スルホコハク酸；ジナトリウムコカミドＰＥＧ−３スルホコハク酸；ジナトリウムデセス−６スルホコハク酸；ジナトリウムデシルジフェニルエーテルジスルホネート；ジナトリウムドデシルオキシプロピルスルホスクシナメート；ジナトリウムイソデシルスルホコハク酸；ジナトリウムラネス−５スルホコハク酸；ジナトリウムラウラミドＤＥＡ−スルホコハク酸；ジナトリウムラウラミドＭＥＡ−スルホコハク酸；ジナトリウムラウレススルホコハク酸；ジナトリウムラウリルスルホコハク酸；ジナトリウムミリスタミドＭＥＡ−スルホコハク酸；ジナトリウムオレアミドＭＥＡ−スルホコハク酸；ジナトリウムオレアミドＰＥＧ−２スルホコハク酸；ジナトリウムオレス−３スルホコハク酸；ジナトリウムＰＥＧ−４コカミドＭＩＰＡスルホコハク酸；ジナトリウムリシノレアミドＭＥＡ−スルホコハク酸；ジナトリウムステアリルスルホスクシナメート；ジナトリウムウンデシレンアミドＭＥＡ−スルホコハク酸；ジトリデシルナトリウムスルホコハク酸；ドデセニルコハク酸無水物；ドデシルジフェニルエーテルジスルホン酸；ドデシルジフェニルオキシドジスルホン酸；ドデシルベンゼンスルホン酸；グリセリルジオレエートＳＥ；グリセリルジステアレートＳＥ；グリセリルリシノレエートＳＥ；グリセリルステアレートシトレート；グリセリルステアレートＳＥ；グリコールステアレートＳＥ；ヘキシルホスフェート；イソプロピルホスフェート；イソプロピルアミンドデシルベンゼンスルホネート；イソステアレス−２ホスフェート；イソトリデセス−３ホスフェート；イソトリデセス−６ホスフェート；ラウレス−１ホスフェート；ラウレス−１２カルボン酸；ラウレス−３ホスフェート；ラウレス−４ホスフェート；ラウレス−６ホスフェート；ラウレス−７シトレート；ラウレス−９ホスフェート；ラウリルホスフェート；リチウムラウリルスルフェート；マグネシウムラウレススルフェート；マグネシウムＰＥＧ−３コカミドスルフェート；ＭＥＡ−ラウレスホスフェート；ＭＥＡ−ラウリルスルフェート；ＭＩＰＡ−ラウレススルフェート；ＭＩＰＡ−ラウリルスルフェート；ミリストイルサルコシン；ナフタレン−ホルムアルデヒドスルホネート；ノノキシノール−１０ホスフェート；ノノキシノール−１２ホスフェート；ノノキシノール−３ホスフェート；ノノキシノール−４−ホスフェート；ノノキシノール−４スルフェート；ノノキシノール−６−ホスフェート；ノノキシノール−７ホスフェート；ノノキシノール−８ホスフェート；ノノキシノール−９ホスフェート；ノニルノノキシノール−１０ホスフェート；ノニルノノキシノール−１５ホスフェート；ノニルノノキシノール−７ホスフェート；オレス−１０カルボン酸；オレス−１０ホスフェート；オレス−３カルボン酸；オレス−４ホスフェート；オレス−５ホスフェート；オレス−６カルボン酸；オレス−７ホスフェート；ＰＥＧ−２ジラウレートＳＥ；ＰＥＧ−２ジオレエートＳＥ；ＰＥＧ−２ジステアレートＳＥ；ＰＥＧ−２ラウレートＳＥ；ＰＥＧ−２オレエートＳＥ；ＰＥＧ−２ステアレートＳＥ；ＰＥＧ−９ステアラミドカルボン酸；セチルリン酸カリウム；デセス−４リン酸カリウム；カリウムドデシルベンゼンスルホネート；カリウムイソステアレス−２ホスフェート；カリウムラウロイルサルコシネート；カリウムラウリルスルフェート；オレイン酸カリウム；カリウムオレイン酸スルフェート；ペルフルオロオクタン酸カリウム；カリウムリシノール酸スルフェート；ＰＰＧ−２ラウレートＳＥ；ＰＰＧ−２オレエートＳＥ；ＰＰＧ−２ステアレートＳＥ；ＰＰＧ−５−セテス−１０ホスフェート；プロピレングリコールラウレートＳＥ；プロピレングリコールオレエートＳＥ；プロピレングリコールリシノレエートＳＥ；プロピレングリコールステアレートＳＥ；ＰＶＭ／ＭＡコポリマー；ナトリウム２−エチルヘキシルホスフェート；ナトリウム２−エチルヘキシルスルフェート；ナトリウムオレフィンスルホネート；ナトリウムアリルオキシヒドロキシプロピルスルホネート；ナトリウムベヘノイルラクチレート；ブトキシエトキシ酢酸ナトリウム；ブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム；ナトリウムブチルオレエートスルフェート；ナトリウムブチルオレエートスルホネート；；ナトリウムカプロイルラクチレート；ナトリウムカプリリルスルホネート；ナトリウムセチルスルフェート；コール酸ナトリウム；クメンスルホン酸ナトリウム；ナトリウムデセススルフェート；ナトリウムデシルジフェニルエーテルスルホネート；ナトリウムデシルスルフェート；デオキシコール酸ナトリウム；ジブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム；ジドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム；ナトリウムスルホコハク酸ジイソオクチル；ジイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム；ナトリウムジラウレス−７シトレート；ナトリウムスルホコハク酸ジノニル；ナトリウムドデシルジフェニルエーテルジスルホネート；ナトリウムドデシルジフェニルオキシドジスルホネート；ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム；ナトリウムグリセリルトリオレエートスルフェート；ナトリウムヘキサデシルジフェニルジスルホネート；ナトリウムヘキサデシルジフェニルオキシドジスルホネート；ナトリウムヘキシルジフェニルオキシドジスルホネート；ナトリウムイソチオネート；ナトリウムイソデシルスルフェート；ナトリウムイソオクチルスルフェート；ナトリウムイソステアロイルラクチレート；ナトリウムイソトリデセス−１５スルフェート；ナトリウムラクテート；ナトリウムラウラミドＤＥＡ−スルホコハク酸；ナトリウムラウレスホスフェート；ナトリウムラウレススルフェート；ナトリウムラウレススルホコハク酸；ナトリウムラウレス−１０ホスフェート；ナトリウムラウレス−１１カルボキシレート；ナトリウムラウレス−１２−スルフェート；ナトリウムラウレス−１３−アセテート；ナトリウムラウレス−１３−カルボキシレート；ナトリウムラウレス−３−カルボキシレート；ナトリウムラウレス−４カルボキシレート；ナトリウムラウレス−４−ホスフェート；ナトリウムラウレス−６カルボキシレート；ナトリウムラウレス−７−カルボキシレート；ナトリウムラウレス−７−スルフェート；ナトリウムラウレス−８−スルフェート；ナトリウムラウロイルグルタメート；ナトリウムラウロイルラクチレート；ナトリウムラウロイルラクチレート；ナトリウムラウロイルメチルアミノプロピオネート；ナトリウムラウロイルサルコシネート；ナトリウムラウリルホスフェート；ナトリウムラウリルスルフェート；ナトリウムラウリルスルホアセテート；ナトリウムリグネート；ナトリウムリグノスルホネート；ナトリウムメタリルスルホネート；ナトリウムメチルラウロイルタウレート；ナトリウムメチルミリストイルタウレート；ナトリウムメチルオレオイルタウレート；ナトリウムメチルパルミトイルタウレート；ナトリウムメチルステアロイルタウレート；ナトリウムメチルナフタレンスルホネート；ナトリウムｍ−ニトロベンゼンスルホネート；ナトリウムミレススルフェート；ナトリウムミリストイルグルタメート；ナトリウムミリストイルサルコシネート；ナトリウムミリスチルスルフェート；ナトリウムノノキシノールスルフェート；ナトリウムノノキシノール−１０−スルフェート；ナトリウムノノキシノール−１０−スルホコハク酸；ナトリウムノノキシノール−１５−スルフェート；ナトリウムノノキシノール−４スルフェート；ナトリウムノノキシノール−５スルフェート；ナトリウムノノキシノール−６ホスフェート；ナトリウムノノキシノール−６−スルフェート；ナトリウムノノキシノール−８−スルフェート；ナトリウムノノキシノール−９−ホスフェート；ナトリウムノノキシノール−９スルフェート；ナトリウムオクトキシノール−２−エタンスルホネート；ナトリウムオクトキシノール−３スルフェート；ナトリウムオクチルスルフェート；ナトリウムオクチルフェノキシエトキシエチルスルホネート；ナトリウムオレイン酸スルフェート；ナトリウムオレス−７−ホスフェート；ナトリウムオレイルホスフェート；ナトリウムオレイルスルフェート；ナトリウムオレイルスルホスクシナメート；ナトリウムパルミトイルサルコシネート；ナトリウムフェニルスルホネート；ナトリウムプロピルオレエートスルフェート；ナトリウムステアロイルラクチレート；ナトリウムステアリルスルホスクシナメート；ナトリウムトリデセススルフェート；ナトリウムトリデセス−３−カルボキシレート；ナトリウムトリデセス−６−カルボキシレート；ナトリウムトリデセス−７−カルボキシレート；ナトリウムトリデシルスルフェート；ナトリウムトリデシルベンゼンスルホネート；ナトリウムキシレンスルホネート；ステアロイルサルコシン；ＴＥＡ−ラウロイルグルタメート；ＴＥＡ−ラウリルスルフェート；テトラナトリウムジカルボキシエチルステアリルスルホスクシナメート；ＴＩＰＡ−ラウレススルフェート；トリセテアレス−４−ホスフェート；トリセテス−５−ホスフェート；トリデセス−２−ホスフェート；トリデセス−３−ホスフェート；トリデセス−５−ホスフェート；トリデシルホスフェート；及び、トリラウレス−４−ホスフェート；及びトリオクチルホスフェートが挙げらえるが、それに限定されない。
【００３３】
他の実施形態では、界面活性剤は、カチオン性界面活性剤である。好適なカチオン性界面活性剤の例としては、アルキルトリメチルアンモニウムブロミド；ベンザルコニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド；ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロリド；ベンジルドデシルジメチルアンモニウムブロミド；ベンジルトリメチルアンモニウムテトラクロロヨウ素酸塩；セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド；ドデシルエチルジメチルアンモニウムブロミド；ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド；ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド；ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド；エチルヘキサデシルジメチルアンモニウムブロミド；ジラード試薬Ｔ；ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド；ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド；Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−タロウ−１、３−ジアミノプロパン；トンゾニウムブロミド；及び、トリメチル（テトラデシル）アンモニウムブロミドが挙げられるが、それに限定されない。
【００３４】
更に、他の実施形態においては、界面活性剤は、双性イオン性界面活性剤である。好適な双性イオン性界面活性剤としては、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）；３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）；３−（４−ヘプチル）フェニル−３−ヒドロキシプロピル）ジメチルアンモニオプロパンスルホネート（Ｃ７ＢｚＯ）；３−（Ｎ、Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホネート分子内塩（ＳＢ３−８）；３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート分子内塩（ＳＢ３−１０；カプリリルスルホベタイン）；３−（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート分子内塩（ＳＢ３−１２）；３−（Ｎ、Ｎ−ジメチルテトラデシルアンモニオ）プロパンスルホネート（ＳＢ３−１４）；３−（Ｎ、Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホネート（ＳＢ３−１６）；３−（Ｎ、Ｎ−ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホネート（ＳＢ３−１８）；３−［Ｎ、Ｎ−ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ］プロパンスルホネート（ＡＳＢ−１４）が挙げられるが、それに限定されない。実施形態に依存する、他の好適な双性イオン性界面活性剤は、アセチル化レシチン；アプリコットアミドプロピルベタイン；ババスアミドプロピルベタイン；ベヘニルベタイン；ビス２−ヒドロキシエチルタロウグリシネート；Ｃ１２−１４アルキルジメチルベタイン；カノールアミドプロピルベタイン；カプリル／カプリリルアミノプロピルベタイン；カプリロアミドプロピルベタイン；セチルベタイン；コカミドプロピルベタイン；コカミドプロピルジメチルアミノヒドロキシプロピル加水分解コラーゲン；Ｎ−［３−コカミド）−プロピル］−Ｎ、Ｎ−ジメチルベタイン、カリウム塩；コカミドプロピルヒドロキシスルタン；コカミドプロピルスルホベタイン；コカミノ酪酸；コカミノプロピオン酸；ココアンホジプロピオン酸；ココ−ベタイン；ココジメチルアンモニウム−３−スルホプロピルベタイン；ココイミノジグリシネート；ココイミノジプロピオネート；ココ／オレアミドプロピルベタイン；ココイルサルコシンアミドＤＥＡ；ＤＥＡ−ココアンホジプロピオネート；ジヒドロキシエチルタロウグリシネート；ジメチコンプロピルＰＧ−ベタイン；Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−ラウリル酸−アミドプロピル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アンモニウムベタイン；Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−ミリスチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アンモニウムベタイン；Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−パルミチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アンモニウムベタイン；Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−ステアルアミドプロピル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アンモニウムベタイン；Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−ステアリル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アンモニウムベタイン；Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−タロウ−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アンモニウムベタイン；ジナトリウムカプロアンホジアセテート；ジナトリウムカプロアンホジプロピオネート；ジナトリウムカプリロアンホジアセテート；ジナトリウムカプリロアンホジプロピオネート；ジナトリウムココアンホジアセテート；ジナトリウムココアンホジプロピオネート；ジナトリウムイソステアロアンホジプロピオネート；ジナトリウムラウレス−５−カルボキシアンホジアセテート；ジナトリウムラウルイミノジプロピオネート；ジナトリウムラウロアンホジアセテート；ジナトリウムラウロアンホジプロピオネート；ジナトリウムオクチルｂ−イミノジプロピオネート；ジナトリウムオレアンホジアセテート；ジナトリウムオレアンホジプロピオネート；ジナトリウムＰＰＧ−２−イソデセス−７−カルボキシアンホジアセテート；ジナトリウムダイズアンホジアセテート；ジナトリウムステアロアンホジアセテート；ジナトリウムタロウアンホジプロピオネート；ジナトリウムタロウアンホジアセテート；ジナトリウムタロウイミノジプロピオネート；ジナトリウムコムギ胚芽両性ジアセテート；Ｎ、Ｎ−ジステアリル−Ｎ−メチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アンモニウムベタイン；エルカミドプロピルヒドロキシスルタン；エチルヘキシルジプロピオネート；エチルヒドロキシメチルオレイルオキサゾリン；エチルＰＥＧ−１５コカミンスルフェート；水素化レシチン；加水分解タンパク質；イソステアルアミドプロピルベタイン；ラウルアミドプロピルベタイン；ラウルアミドプロピルジメチルベタイン；ラウルアミノプロピオン酸；ラウロアンホジプロピオン酸；ラウロイルリシン；ラウリルベタイン；ラウリルヒドロキシスルタン；ラウリルスルタン；リンオレアミドプロピルベタイン；リソレシチン；乳脂質アミドプロピルベタイン；ミリスタミドプロピルベタイン；オクチルジプロピオネート；オクチルイミノジプロピオネート；オレアミドプロピルベタイン；オレイルベタイン；２−（ヘプタデエセニル）−４、４（５Ｈ）−オキサゾールジメタノール；パリルミトアミドプロピルベタイン；パリルミトアミンオキシド；リシンオレアミドプロピルベタイン；リシンオレアミドプロピルベタイン／ＩＰＤＩコポリマー；セサミドプロピルベタイン；ナトリウムＣ１２−１５アルコキシプロピルイミノジプロピオネート；ナトリウムカプロアンホアセテート；ナトリウムカプリロアンホアセテート；ナトリウムカプリロアンホヒドロキシプロピルスルホネート；ナトリウムカプリロアンホプロピオネート；ナトリウムカルボキシメチルタロウポリプロピルアミン；ナトリウムコカミノプロピオネート；ナトリウムココアンホアセテート；ナトリウムココアンホヒドロキシプロピルスルホネート；ナトリウムココアンホプロピオネート；ナトリウムジカルボキシエチルココホスホエチルイミダゾリン；ナトリウム水素化タロウジメチルグリシネート；ナトリウムイソステアロアンホプロピオネート；ナトリウムラウルイミノジプロピオネート；ナトリウムラウロアンホアセテート；ナトリウムオレアンホヒドロキシプロピルスルホネート；ナトリウムオレアンホプロピオネート；ナトリウムステアロオアンホアセテート；ナトリウムタロウアンホプロピオネート；ダイズアミドプロピルベタイン；ステアリルベタイン；タロウアミドプロピルヒドロキシスルタン；タロウアンホポリカルボキシプロピオン酸；トリナトリウムラウロアンホＰＧ−アセテートホスフェートクロリド；ウンデシレンアミドプロピルベタイン；及びコムギ胚芽アミドプロピルベタインを含む。
【００３５】
他の実施形態において、界面活性剤は、好ましくは、非イオン性界面活性剤である。適切な非イオン性界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレン（１０）セチルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）５６）；ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）５８）；ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）３５）；ポリオキシエチレン（９）ｐ−ｔ−オクチルフェノール（ＮＯＮＩＤＥＴ（登録商標）Ｐ−４０）；ポリオキシエチレン（４−５）ｐ−ｔ−オクチルフェノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−４５）；ポリオキシエチレン（７−８）ｐ−ｔ−オクチルフェノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１１４）；ポリオキシエチレン（９−１０）ｐ−ｔ−オクチルフェノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）；ポリオキシエチレン（９−１０）ノニルフェノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｎ−１０１）；ポリオキシエチレン（２０）ソルビトールモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）；ポリオキシエチレン（２０）ソルビトールモノパルミテート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０）；ポリオキシエチレン（２０）ソルビトールモノオレエート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）；ジメチルデシルホスフィンオキシド（ＡＰＯ−１０）；ジメチルドデシルホスフィンオキシド（ＡＰＯ−１２）；シクロヘキシル−ｎ−エチル−β−Ｄ−マルトシド；シクロヘキシル−ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−マルトシド；シクロヘキシル−ｎ−メチル−β−マルトシド；ｎ−デカノイルスクロース；ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ｎ−デシル−β−マルトピラノシド；ｎ−デシル−β−Ｄ−チオマルトシド；ｎ−ドデカノイルスクロース；デカエチレングリコールモノドデシルエーテル；Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン；ｎ−デシルα−Ｄ−グルコピラノシド；デシルβ−Ｄ−マルトピラノシド；ｎ−ドデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド；ｎ−ドデシルα−Ｄ−マルトシド；ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド；ヘプタン−１、２、３−トリオール；ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル；ヘプタエチレングリコールモノドデシルエーテル；ヘプタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル；ｎ−ヘキサデシルβ−Ｄ−マルトシド；ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル；ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル；ヘキサエチレングリコールモノオクタデシルエーテル；ヘキサエチレングリコールモノテトラデシルエーテル；メチル６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド；ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル；Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン；Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン；オクタエチレングリコールモノデシルエーテル；オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル；オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル；オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル；オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル；オクチルβ−グルコシド；オクチルβ−チオグルコシド；オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド；オクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシド；ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル；ペンタエチレングリコールモノド���シルエーテル；ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル；ペンタエチレングリコールモノヘキシルエーテル；ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル；ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル；ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル；ポリエチレングリコールエーテル；ポリオキシエチレン１０トリデシルエーテル；ポリオキシエチレン（１００）ステアレート；ポリオキシエチレン（２０）イソヘキサデシルエーテル；ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル；ポリオキシエチレン（４０）ステアレート；ポリオキシエチレン（５０）ステアレート；ポリオキシエチレン（８）ステアレート；ポリオキシエチレンビス（イミダゾリルカルボニル）；ポリオキシエチレン（２５）プロピレングリコールステアレート；キラヤ属樹皮からのサポニン；テトラデシルβ−Ｄ−マルトシド；テトラエチレングリコールモノデシルエーテル；テトラエチレングリコールモノドデシルエーテル；テトラエチレングリコールモノテトラデシルエーテル；トリエチレングリコールモノデシルエーテル；トリエチレングリコールモノドデシルエーテル；トリエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル；トリエチレングリコールモノオクチルエーテル；トリエチレングリコールモノテトラデシルエーテル；チロキサポール；ｎ−ウンデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−６３０）；ポリオキシエチレン（５）ノニルフェニルエーテル（ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−５２０）；及びポリオキシエチレン（１５０）ジノニルフェニルエーテル（ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＤＭ−９７０）を含むが、それに限定されない。一実施形態において、界面活性剤は、ポリオキシエチレン（５）ノニルフェニルエーテル（ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−５２０）である。別の実施形態において、界面活性剤は、ポリオキシエチレン（１５０）ジノニルフェニルエーテル（ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＤＭ−９７０）である。一実施形態では、界面活性剤は、好ましくは、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−６３０）である。
【００３６】
当業者に理解されるように、生物学的流体に追加した界面活性剤の量は変更可能であり、循環するｍｉＲＮＡを含むことができる生物学的流体中の生物学的流体成分の同一性により変更する。いくつかの実施形態では、生物学的流体中の界面活性剤の最終濃度は、約０．００１〜約１０％の範囲であり得る。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．００１〜約０．０１％の範囲であり得る。別の実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．０１％〜約０．１％の範囲であり得る。さらに別の実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．１％〜約１％の範囲であり得る。別の実施形態では、界面活性剤の濃度は、約１％から約５％の範囲であり得る。さらなる実施形態では、界面活性剤の濃度は、約５％〜約１０％の範囲とすることができる。
【００３７】
（ｃ）抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬
生物学的流体は抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬と接触させる。抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬は、循環するｍｉＲＮＡと会合したｍｉＲＮＡ結合タンパク質に、結合可能な任意の薬剤であり得る。循環ｍｉＲＮＡと会合するｍｉＲＮＡ結合タンパク質は、ｍｉＲＮＡと直接結合することができ、または、ｍｉＲＮＡを含むＲＮＡ−タンパク質複合体と間接的に会合することができる。循環ｍｉＲＮＡに会合できるｍｉＲＮＡ結合タンパク質の非限定的な例としては、アルゴノート、ダイサー、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）トランス活性化応答ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ：）、インターフェロン誘発性タンパク質キナーゼのタンパク質アクチベーター（ＰＡＣＴ）、ＳＭＮ複合体、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）、チューダーブドウ球菌ヌクレアーゼドメイン含有タンパク質（チューダ−ＳＮ）、推定されるＤＮＡヘリカーゼＭＯＶ１０、及び、ＲＮＡ認識モチーフを含有するタンパク質ＴＮＲＣ６Ｂ、または、ＲＩＳＣ複合体の他の成分、またはＲＩＳＣ複合体と一時的または持続的に会合する他の成分を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、生物学的流体は、好ましくは抗アルゴノート試薬と接触させる。アルゴノートタンパク質の非限定的な例には、Ａｇｏ１、Ａｇｏ２、Ａｇｏ３、及びＡｇｏ４を挙げることができる。一実施形態において、生物学的流体は、抗Ａｇｏ１試薬と接触させる。別の実施形態において、生物学的流体は、抗Ａｇｏ２試薬と接触させる。更に別の実施形態において、生物学的流体は、抗Ａｇｏ３試薬と接触させる。更なる実施形態において、生物学的流体は、抗Ａｇｏ４試薬と接触させる。別の実施形態では、生物学的流体は、好ましくは、複数のアルゴノートタンパク質と結合することができる試薬と接触させる。例えば、生物学的流体は、抗Ａｇｏ１及び抗Ａｇｏ２試薬と接触させることができる。更に別の実施形態では、生物学的流体は、好ましくは、Ａｇｏ１、Ａｇｏ２、Ａｇｏ３、及びＡｇｏ４を結合することができる試薬と接触させる。
【００３９】
抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬は、エピトープ結合剤であってもよい。標的分子に応じて、適切なエピトープ結合剤の非限定的な例は、アプタマー、抗体、抗体フラグメント、二本鎖ＤＮＡ配列、修飾核酸、核酸模倣物、リガンド、リガンドのフラグメント、受容体、受容体断片、ポリペプチド、ペプチド、補酵素、共役因子、アロステリック分子、及びイオンからなるグループから選択される試薬が挙げられる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、エピトープ結合剤は、抗体である。使用することができる抗体の非限定的な例としては、ポリクローナル抗体、腹水、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’の断片、モノクローナル抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、ヒト化抗体、及び抗体のエピトープ結合部位を含む他のフラグメントが挙げられる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、生物学的流体は、抗アルゴノート抗体と接触させる。一実施形態において、生物学的流体は、抗Ａｇｏ１抗体と接触させる。別の実施形態において、生物学的流体は、抗Ａｇｏ２抗体と接触させる。更に別の実施形態において、生物学的流体は、抗Ａｇｏ３抗体と接触させる。別の実施形態において、生物学的流体は、抗Ａｇｏ４抗体と接触させる。更なる実施形態において、生物学的流体は、抗Ａｇｏ１、抗Ａｇｏ２、抗Ａｇｏ３、または抗Ａｇｏ４抗体から選択される２つの抗Ａｇｏ抗体と接触させる。例えば、生物学的流体は、抗Ａｇｏ１及び抗Ａｇｏ２抗体と接触させる。更なる実施形態において、生物学的流体は、抗Ａｇｏ１、抗Ａｇｏ２、抗Ａｇｏ３、または抗Ａｇｏ４から選択される３つの抗Ａｇｏの抗体と接触させる。更に別の実施形態では、生物学的流体は、４つのすべての抗Ａｇｏ抗体と接触させる。更なる実施形態では、生物学的流体は、複数のアルゴノートタンパク質を認識することができる抗体と接触させる。そのような抗体は、１つ、２つ、３つ、または４つのアルゴノートタンパク質を認識することができる。一実施形態では、生物学的流体は、４つ全てのヒトアルゴノートタンパク質を認識することができる抗アルゴノート抗体と接触させる。
【００４２】
生物学的流体を開示の抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬に接触させて、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体を形成する。そのようなとき、生物学的流体が固定された抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬と接触したとき、抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬は、通常、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体を形成するために固体支持体に結合している。固体支持体は、抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬の付着または会合のための適切な別個の個々の部位を含むように改変することができる材料であり得る。固体支持体材料の非限定的な例としては、ガラス、修飾化または機能化ガラス；アクリル樹脂、ポリスチレン、及び、スチレンと他物質とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、又は、テフロンＪ、ナイロン、ニトロセルロース、ポリサッカライドを含むプラスチック；樹脂；シリカ、または、ケイ素、及び修飾ケイ素、炭素、金属、無機ガラス、及びプラスチックを含むシリカを基礎とする物質が挙げられる。固体支持体のサイズ及び形状は、本発明の範囲から逸脱することなく変更することができる。固体支持体は、平面であっても、固体支持体は、ウェル、すなわち、３６４個のウェルを有するプレートであってもよく、或いは、固体支持体は、ビーズまたはスライドであってもよい。いくつかの実施形態では、固体支持体は、複数壁を有するプレートのウェルである。他の実施形態では、固体支持体は、ピペットチップの内面である。更に他の実施形態では、固体支持体は、好ましくは、ビーズである。いくつかの実施形態では、固体支持体は、好ましくは、磁気ビーズである。
【００４３】
当業者により理解されるように、抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬は、様々な方法で固体支持体に結合させることができる。抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬及び固体支持体は、２つのその後の結合のために化学的官能基で誘導体化することができる。例えば、固体支持体は、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、またはチオール基を含む化学官能基で誘導体化することができるが、それに限定されない。これらの官能基を使用して、抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬は直接的に官能基を用いて、または間接的にリンカーを用いて結合させることができる。或いは、抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬は、また、非共有結合的に固体支持体に結合させることができる。例えば、ストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体に共有結合で結合することができるビオチン化した抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬を調製することができ、その結果、結合を生成する。固体支持体に抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬を結合させる更なる方法は、当該技術分野で公知であり、そして、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００３、または、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、第三版、２００１、などに公開された実験室マニュアルに記載されている。いくつかの実施形態では、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズ固体支持体に共有結合で結合することができるビオチン化した抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬が調製され、その結果、結合をもたらす。下記のセクションＩ（ｄ）に記載する通り、抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬は、本開示の方法では、生物学的流体を接触させる前に、固体支持体に結合させることができる。あるいは、本開示の生物学的流体は、抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬と固体支持体を同時に接触させることができ、ここで、抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬は、固体支持体に結合する。本開示の生物学的流体は、また、固体支持体を生物学的流体に接触させる前に、抗ｍｉＲＮＡの結合タンパク質試薬と接触させることができ、ここで、抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬は、固体支持体に結合する。当業者が認識し得る通り、抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬の量及び濃度は、抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬の同一性、使用される生物学的流体の容量、生物学的流体中のｍｉＲＮＡの濃度、及び、他の因子間でのｍｉＲＮＡ結合タンパク質に依存して変更することができ、変化し、そして、実験的に決定することができる。抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬が精製した抗体である場合、約０．５〜約１０μｇの抗体は、各０．２ｍＬの血漿または血清サンプルのために使用することができる。
【００４４】
（ｄ）生物学的流体の接触、及び、ｍｉＲＮＡの単離
本開示の方法では、生物学的流体は、界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬を接触させる。当業者が認識する通り、生物学的流体は、本発明の範囲から逸脱することなく他の種々の薬剤を接触させることができる。例えば、生物学的流体は、ｍｉＲＮＡの単離の間に、ジスルフィド結合の形成を遮断し、リボヌクレアーゼ活性を阻害するチオール還元剤を接触させることができる。好適なチオール還元剤としては、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン、及び、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）が挙げられる。生物学的流体は、また、消泡剤を接触させることができる。消泡剤の例としては、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４、及び、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｏ−３０、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｂ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｃ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｙ−３０、及び、Ｓａｇ  ４７１が挙げられる。生物学的流体は、また、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ−タンパク質複合体を保持するためにＲＮＡ及びタンパク質分解阻害剤と接触させることができる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、緩衝剤は、ｍｉＲＮＡを単離するのに適したｐＨを維持するために使用することができる。非限定的な例として、緩衝剤は、トリズマ酢酸塩、ＥＤＴＡ、トリス、グリシン、及びクエン酸塩が挙げられるが、それに限定されない。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、界面活性剤と生物学的流体を接触させて生物学的流体の成分を分離した後に、抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬と生物学的流体を接触させて、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体を形成することを含む。他の実施形態では、生物学的流体を界面活性剤と抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬に同時に接触させる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、生物学的流体の未希釈サンプルは、界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬を接触させる。他の実施形態では、生物学的流体は、界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬を接触させる前に希釈される。生物学的流体の希釈は、上記セクションI（ａ）で記載される。
【００４８】
生物学的流体、界面活性剤、及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬間の接触は、一般的に、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体の形成を可能にするインキュベート期間を含む。生物学的流体は、界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬と接触させることができ、そして、約１、５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、２４０、４８０分、若しくはそれ以上インキュベートされる。いくつかの実施形態では、生物学的流体は、界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬と接触させ、そして、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または約１５分インキュベートされる。他の実施形態では、生物学的流体は、界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬と接触させ、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または、約３０分間インキュベートされる。更に他の実施形態では、生物学的流体は、界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬と接触させ、そして、約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または、約９０分インキュベートされる。他の実施形態では、生物学的流体は、界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬と接触させ、約９０、１２０、２４０、４８０分若しくはそれ以上インキュベートされる。一実施形態では、生物学的流体は、好ましくは、界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬と接触させ、約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または、約６０分インキュベートされる。
【００４９】
生物学的流体は、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは約３０℃またはそれ以上の温度で、界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬と接触させることができる。いくつかの実施形態では、生物学的流体は、約０、１、２、３、４、５、または約６℃の温度で、界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬と接触される。他の実施形態では、生物学的流体は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または約１５℃の温度で、界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬と接触される。他の実施形態では、生物学的流体は、約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または約２５℃の温度で、界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡの結合タンパク質試薬を接触させる。更に、他の実施形態では、生物学的流体は、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または約３０℃の温度で、界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬と接触される。
【００５０】
一般的には、生物学的流体は、界面活性剤及び抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬を攪拌しながら接触させる。更に、一般的に、複合体を形成した後、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体を単離するために、生物学的流体を除去し、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体を洗浄することができる。
【００５１】
（ｅ）ｍｉＲＮＡの放出
本開示の方法に基づき、ｍｉＲＮＡは、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体から放出される。そのようなタンパク質複合体からｍｉＲＮＡのような核酸を放出する方法は、当該分野で公知であり、核酸−タンパク質複合体におけるプロテアーゼ消化、及びタンパク質の変性を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、タンパク質変性により、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体から放出される。例えば、グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム溶液と免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体を組み合わせることにより、ｍｉＲＮＡを免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体から放出させることができる。放出されたｍｉＲＮＡは、その後、沈殿により、またはスピンカラムクロマトグラフィーを用いて精製することができる。
【００５２】
他の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、好ましくは、プロテアーゼ消化により免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体から放出される。用語「プロテアーゼ」、「プロテイナーゼ」、及び「ペプチダーゼ」は、本明細書中で交換可能に使用され、そして、共有結合であるペプチド結合の加水分解を触媒する酵素群を指す。プロテアーゼ酵素は、当技術分野で公知であり、酸プロテアーゼ及びセリンプロテアーゼを含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の方法におけるｍｉＲＮＡを放出するために使用することができるプロテアーゼは、酸プロテアーゼである。一実施形態では、本開示の方法におけるｍｉＲＮＡを放出するために使用することができる酸プロテアーゼは、ペプシンである。
【００５３】
他の実施形態では、本開示の方法におけるｍｉＲＮＡを放出するために使用することができるプロテアーゼは、酸プロテアーゼである。セリンプロテアーゼの６個の属は同定され、その内最大の２つは、キモトリプシン様、及びサブチリシン様属である。サブチラーゼは、数多く知られている。広く研究されているいくつかのサブチラーゼは、サブチリシンＤＹ、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンＢＰＮ’（また、ナガーゼと呼ばれる）、腸間膜ペプチダーゼ（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を含む様々なバシルス属から、並びに、トリチラチウムアルブムリンバー（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ  Ｌｉｍｂｅｒ）から得られるプロテイナーゼＫ、及びサーモアクチノミセス・ブルガリス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）から得られるテルミターゼを含む。本発明の特定の実施形態では、プロテイナーゼＫは、プロテアーゼ酵素として好ましいものである。しかし、例えば、ナガーゼのような他のプロテアーゼ酵素も、特定の実施形態で使用することができる。プロテアーゼ酵素は、ｍｉＲＮＡが放出されるように、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体中のタンパク質を少なくとも部分的に分解をする多数のプロテアーゼのいずれかとすることができる。いくつかの実施形態では、本開示の方法におけるｍｉＲＮＡを放出するために使用することができるプロテアーゼは、好ましくは、プロテアーゼＫである。
【００５４】
本質的に、ｍｉＲＮＡは、プロテアーゼ酵素と複合体を接触させることにより免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体から放出される。当業者により理解されるように、ｍｉＲＮＡを放出するために使用されるプロテアーゼの量は、プロテアーゼ、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体の量、プロテアーゼ分解中の温度、分解のために使用される緩衝液条件及び分解の期間、その他の要素などに依存して変化し得る。一般的に、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体は、約０．３単位の酵素活性から約３０単位の酵素活性まで接触させることができる。特定の実施形態では、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体と接触させるプロテアーゼの量は、約０．３〜約１単位、約１〜約３単位、約３〜約１０単位、または約１０〜約３０単位の範囲とすることができる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、実施例１に記載の通り、室温でプロテアーゼ部分解を使用する。本明細書で使用する場合、用語「室温」は、約１０℃〜約３０℃の温度を表すために用いられる。
【００５６】
免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体は、約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、もしくは約３０分、またははそれ以上の間プロテアーゼと一緒にインキュベートされることができる。いくつかの実施形態では、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体は、約０．５、１、２、３、４、または約５分間、プロテアーゼと一緒にインキュベートされる。他の実施形態では、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または、約１５分間、プロテアーゼと一緒にインキュベートされる。更に他の実施形態では、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体は、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、もしくは約３０分間、またはそれ以上、プロテアーゼと一緒にインキュベートされる。
【００５７】
放出されたｍｉＲＮＡは、更に精製することなく下流操作での使用に適切であり得る。或いは、放出されたｍｉＲＮＡは、下流操作での使用のために更に精製することができる。スピンカラムクロマトグラフィーまたは濾過技術のような核酸精製の方法は、当技術分野で公知であり、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００３、または、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１などの、公開された実験室マニュアルに記載された方法に従いう。
【００５８】
放出されたｍｉＲＮＡの下流操作の用途は、異なる場合がある。放出されたｍｉＲＮＡの非限定的の用途としては、定量リアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ解析、配列決定、制限断片長の多型（ＲＦＬＰ）分析、単一ヌクレオチドの多型（ＳＮＰ）分析、マイクロサテライト分析、短いタンデム反復（ＳＴＲ）分析、及び比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）が挙げられる。
【００５９】
ＩＩ．キット
本発明は、更に、界面活性剤、抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬、及び本開示の方法において使用することができる他の試薬を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、生物学的流体からｍｉＲＮＡを単離するために提供され、ここに、キットが抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬及び界面活性剤を含む。抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬及び界面活性剤は、上記のセクション（Ｉ）に記載の通りであり得る。いくつかの実施形態において、キットにおける抗ｍｉＲＮＡ結合タンパク質試薬は、固体支持体に結合した抗Ａｇｏ抗体である。特定の実施形態では、固体支持体は、ビーズ、磁気ビーズ、またはマルチウォールを有するプレートのウェルであり得る。更に他の実施形態では、固体支持体は、ピペットチップの内面であってもよい。いくつかの実施形態では、キット内の界面活性剤は、ＩＧＥＰＡＬである。キットは、更に、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体からｍｉＲＮＡを放出するための手段を含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体からｍｉＲＮＡを放出するため、プロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＫを含む。
【００６０】
定義
特に別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語の意味は、一般的に、本発明が属する当業者により理解される意味を有する。下記の参考文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第二版、１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．、１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、５ｔｈ  Ｅｄ．、Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及び、Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ、Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される通り、下記の用語は、特に指示のない限り、それらに属する意味を有する。
【００６１】
それらの本開示または好ましい態様（単数若しくは複数）の要素を導入するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び「ｓａｉｄ」は、１つ若しくはそれ以上の要素が存在することを意味する。用語「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、包括的であり、そして、列挙された要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味することを意図している。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」は、生物学的サンプル中で検出することができ、５〜４０ヌクレオチド長の小さな非コードＲＮＡ配列を意味する。いくつかのｍｉＲＮＡは、ヘアピン構造の前駆体から、例えば酵素ダイサーにより処理されて、例えば約１８〜２５ヌクレオチド、好ましくは２１〜２３ヌクレオチドの成熟ｍｉＲＮＡに誘導される。マイクロＲＮＡの変異体は、例えば、異なる動物種間では一般的である。また、ｍｉＲＮＡの５’及び３’末端での変異は一般的であり、そして、成熟過程の間、ダイサーなどの酵素による不正確な切断の結果であり得る。これらの変異体は、機能またはｍｉＲＮＡ（単数若しくは複数）を検出能が損なわれていない、ｍｉＲＮＡの配列に許容される変異の範囲を示す。別タイプの変異体は、ｍｉＲＮＡ（それらはヒトゲノムと一致しないので、非鋳型である）の３’末端に非鋳型ヌクレオチド（単数若しくは複数）をダイサー処理後に付加したものある。最も一般的な変異体は、３’末端に付加した余分なＡまたはＵを有するｍｉＲＮＡ配列である。
【００６３】
本明細書で使用する用語「生物学的流体」又は「生体流体」は、互換的に使用でき、そして、対象から単離された流体を指す。
【００６４】
用語「生物学的流体」、「生物学的流体サンプル」または、「生物学的サンプル」は、互換的に使用することができ、そして、任意の対象から単離された全ての生物学的流体及び排泄物を指す。本発明の文脈において、そのようなサンプルとしては、血液及びその画分、血清、血漿、尿、排泄物、精液、精液流体、精漿、前立腺液、プレ射精液（カウパー液）、胸水、涙、唾液、痰、汗、生検液、腹水、脳脊髄液、羊水、リンパ液、骨髄液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜の分泌物、消化管分泌物、気管支分泌物、乳房分泌物、卵巣嚢腫の分泌物、及び組織液サンプルを含むが、それに限定されない。
【００６５】
「単離された」ポリヌクレオチドは、本来の供給源に付随している少なくとも１つの夾雑物から同定され、分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、本来見られる形態または状態ではない。単離された核酸分子は、したがって、本来の細胞中に存在する特定の核酸分子とは区別される。
【００６６】
様々な変更が本発明の範囲から逸脱することなく、上記の動物、細胞及び方法において実施できるので、上記の説明及び下記の実施例に含まれる全ての事項は、例示として、かつ限定的な意味で解釈されるべきである。
【実施例】
【００６７】
下記の実施例は、本開示を提示するために含まれる。当業者は、下記の実施例で開示した技術は、本開示の実施において十分に機能するために本発明者らにより発見された技術を表していることを認識すべきである。当業者は、しかしながら、本開示に照らして、多くの変更が本開示で実施され、そして本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様の、または、類似の結果を得ることができることを理解すべきであり、従って、全ての記載された事項は、例示として、かつ限定的な意味で解釈されるべきである。
【００６８】
実施例１：一般的なｍｉＲＮＡ単離手順。
循環するｍｉＲＮＡを単離するために使用する代表的な手順は、小胞会合のｍｉＲＮＡを放出するために、界面活性剤の存在下でＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）を実施することを含む。この手順において、ｍｉＲＮＡは、フェノール、カオトロープ、またはカラム精製を使用することなく他のＲＮＡ、血漿タンパク質などの他の細胞成分から分離され、そして、４０〜７０分間で完了する。
【００６９】
手順は３段階より成る：
１）血漿成分を、界面活性剤で処理する；
２）ｍｉＲＮＡ／タンパク質複合体を免疫沈降し；及び
３）ｍＲＮＡを、免疫沈降したｍｉＲＮＡ複合体から放出する。
【００７０】
プロテインＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＧＥ２８−９６７０−５６）、プロテインＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＧＥ２８−９６７０−６６）、またはストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＧＥ２８−９８５７−３８）ビーズは、２０μＬの磁気ビーズ（１０％スラリー）を、０．１ｍｌのＲＩＰ洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０５％のＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−６３０）に移し、一度ＲＩＰ洗浄緩衝液でビーズを洗浄し、溶液からビーズを分離するための磁気スタンドを用いることにより、抗Ａｇｏ抗体でコートされる。２．５〜１０μｇの非ビオチン化、または、ビオチン化抗Ａｇｏ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＳＡＢ４８０００４８）、抗Ａｇｏ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＳＡＢ４２０００８５）、または、抗Ａｇｏ１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＳＡＢ４２０００８４）抗体を添加する前に、洗浄した磁気ビーズを０．１ｍｌのＲＩＰ洗浄緩衝液に再懸濁した。ビーズ及び抗体を室温で約３０分間回転しながらインキュベートした。次いで、ビーズを、磁気スタンドを用いて溶液から分離した。抗体ビーズは、その後、０．５ｍｌのＲＩＰ洗浄緩衝液で２回洗浄した。
【００７１】
ｍｉＲＮＡの単離方法の第１工程において、０．２ｍｌの血漿、８μｌの２５％ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｉ８８９６；４０μｌの２５％ＩＧＥＰＡＬ／ｍｌの血漿、最終濃度１％にするため）；２μｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩＣ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｐ８３４０；１０μｌ／ｍｌの血漿）：及び０．８μｌのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｒ１１５８；４μｌ／ｍｌ血漿）を、調製したＡｇｏ抗体ビーズに加えた。更に、血漿は、ビーズを調製する間に界面活性剤及び阻害剤で処理してもよく、事前処理された血漿は、その後、抗体ビーズに添加された。
【００７２】
第２工程において、室温で１時間、または、４℃で一晩、サンプルを回転させながらインキュベートすることにより、ｍｉＲＮＡ／タンパク質複合体を免疫沈降させた。ビーズを１ｍｌの洗浄ＲＩＰ緩衝液で５回洗浄し、上清液からビーズを分離するために磁気スタンドを用いて収集した。ビーズは簡単に遠心分離し、磁気スタンドに戻して残余の上清を除去することができる。
【００７３】
第３の工程において、抗体ビーズと会合する沈降したｍｉＲＮＡは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のＩｍｐｒｉｎｔ  ＲＮＡ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＲＩＰ）用の技術書類に記載されている通りに、ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）ＢＤ、または、ＱＩＡｚｏｌ溶解試薬での抽出に続いて酢酸アンモニウム及び線状アクリルアミド（ｌｉｎｅａｒ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）によるイソプロパノール沈殿、により、タンパク質複合体及びビーズから放出され、又は、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ｋｉｔで精製された。或いは、好ましくは、ｍｉＲＮＡは、プロテイナーゼＫ分解により放出された。２０μｌのプロテイナーゼＫミックス（１４μｌの水、２μｌの１０×プロテイナーゼＫ放出緩衝液、及び４μｌのＰ４８５０プロテイナーゼＫ）は、工程２からビーズに添加し、そして、Ｖｏｒｔｅｘ ｇｅｎｉｅ２のミキサーの設定４で、１０分間、室温でインキュベートした。１０×プロテイナーゼＫ放出緩衝液は、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）；１５ｍＭのＭｇＣｌ２；５００ｍＭのＫＣｌ；１００ｍＭのＤＴＴ；及び１％のＩＧＥＰＡＬを含む。インキュベート後、直ちに、ビーズを磁気スタンド上に配置して除去し、新しいチューブに遊離ｍｉＲＮＡを含む上清液を移した。上清液中のプロテイナーゼＫを、５分間、９５℃でサンプルをインキュベートすることにより不活性化した。特定のｍｉＲＮＡは、１０μｌのポリＡテーリング反応当たり、各ｍｉＲＮＡ調製液の５μＬを使用して、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のＭｙｓｔｉＣｑ  ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイで検出した。合成ｍｉＲＮＡ、すなわち、ｍｉＲＢａｓｅに記載されている成熟ｍｉＲＮＡと同じ配列を有する一本鎖のＲＮＡは、０．０２ｍｇ／ｍｌの線状アクリルアミド（ｌｉｎｅａｒ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）中で、２６０ｎｍにおけるストック溶液の吸光度に基づいて既知のコピー数に希釈し、血漿から調製したｍｉＲＮＡと並行してアッセイし、そして、絶対定量のための標準として使用した。
【００７４】
実施例２：血漿からのｍｉＲＮＡの免疫沈降は、Ｔｒｉ試薬単独よりも効率的である。
ＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）を使用して、血漿からのｍｉＲＮＡ分離の効率は、ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）ＢＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用したｍｉＲＮＡの分離と比較した。ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）ＢＤは、血清、血漿又は全血のような血液製剤からＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質を同時に単離するのに使用する試薬である。
【００７５】
ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）ＢＤを用いたｍｉＲＮＡの単離は、製造業者の指示に従い実施した。要するに、０．２ｍｌの血漿をＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）ＢＤと混合し、そしてｍｉＲＮＡを、相分離のためにクロロホルムを用いて抽出した後に、酢酸アンモニウム及び線状アクリルアミド（ｌｉｎｅａｒ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）の存在下でイソプロパノール沈殿させ、及び分析のためＲＮＡを洗浄した。ＲＩＰを使用したｍｉＲＮＡの単離は、２０μｌのプロテインＡ磁気ビーズに結合した２．５μｇの抗Ａｇｏ２抗体を用いて実施した。ｍｉＲＮＡは、直接的な血漿抽出に関しては、ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）ＢＤでの抽出及び酢酸アンモニウム及び線状アクリルアミド（ｌｉｎｅａｒ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）の存在下でのイソプロパノール沈殿により、ビーズから回収した。
【００７６】
調製したサンプル中のｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ１９１−５ｐ、ｍｉＲ１４２−３ｐ、及びｍｉＲ４５１ａのｍｉＲＮＡレベルは、定量的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより決定した。血漿からのｍｉＲＮＡのＲＩＰは、ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）ＢＤよりも、約５〜約６００倍効果的に高かった（図１）。
【００７７】
実施例３．ＲＩＰ収量は市販キットの収量と類似する。
ＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）を用いる血漿からのｍｉＲＮＡ単離の効率は、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いるｍｉＲＮＡの単離と比較した。Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮｅａｓｙは、選択的にＤＮＡまたはＲＮＡに結合するシリカ樹脂を含むスピンカラムを採用しており、≦０．２ｍｌの血清または血漿からのｍｉＲＮＡの単離が推奨されている。
【００７８】
Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔを用いたｍｉＲＮＡの単離は、製造者の指示に従って実施した。要するに、０．２ｍｌ血漿をＱＩＡｚｏｌ試薬と混合させ、そして、ｍｉＲＮＡは、提供されたスピンカラムを使用して水層から精製した。ＲＩＰを使用したｍｉＲＮＡの単離は、２．５μｇの抗Ａｇｏ２抗体が結合した２０μｌのプロテインＡ磁気ビーズで実施した。ｍｉＲＮＡはＱＩＡｚｏｌ試薬を有するビーズから放出され、そして直接的な血漿抽出に関して、Ｑｉａｇｅｎ社のキットを用いて精製した。
【００７９】
調製された試料中のｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ２３ａ、ｍｉＲ１９１、ｍｉＲ１４２、及びｍｉＲ４５１ａのｍｉＲＮＡレベルは、定量リアルタイムのＲＴ−ＰＣＲにより決定した。ＲＩＰを使用するｍｉＲＮＡの収量は、Ｑｉａｇｅｎ社のキットのみ使用したｍｉＲＮＡの収量と同様であった（図２）。
【００８０】
実施例４．ビオチン化及び非ビオチン化抗Ａｇｏ抗体並びにストレプトアビジンビーズを使用したＲＩＰの比較。
プロテインＡ及びプロテインＧビーズの両方は、血漿において非常に豊富にあるヒトＩｇＧを結合する。ＩｇＧとの共単離を避けるために、抗Ａｇｏ（クローン２Ａ８）及び、抗Ａｇｏ２（クローン１１Ａ９）抗体を、ストレプトアビジンビーズでのＲＩＰのために、Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でビオチン化した。Ａｇｏ−ＲＩＰは、２．５μｇのビオチン化抗−Ａｇｏ２（ｂ−Ａｇｏ２）もしくは抗−Ａｇｏ（ｂ−Ａｇｏ）抗体と２０μｌのストレプトアビジンの磁気ビーズ、または２．５μｇの非ビオチン化抗−Ａｇｏ２抗体と２０μｌのプロテインＡビーズを用いて実施した。ビオチン化抗Ａｇｏ２（ｂ−Ａｇｏ２）抗体及びストレプトアビジンビーズでのＲＩＰは、プロテインＡビーズを有する抗Ａｇｏ２抗体によるＲＩＰと同様のｍｉＲＮＡの収量を与えた（図３参照）。ビオチン化抗ＡｇｏでのＲＩＰは、非ビオチン化抗ＡｇｏとプロテインＡビーズと比較して、有意に低いｍｉＲＮＡ収量をもたらした。
【００８１】
実施例５．ＲＩＰを使用して単離したｍｉＲＮＡの加熱は、収量に悪影響を与える。
ＲＩＰの後にｍｉＲＮＡを放出させる手段としてヌクレアーゼフリーの水での加熱を検討した。Ａｇｏ−ＲＩＰは、プロテインＡ磁気ビーズ上で２．５μｇの非ビオチン化抗Ａｇｏ若しくは抗Ａｇｏ２抗体のいずれかと０．２ｍｌの血漿を用いて、または、ストレプトアビジン磁気ビーズ上でビオチン化抗Ａｇｏ若しくは抗Ａｇｏ２抗体のいずれかと０．２ｍｌの血漿を用いて実施した。１４μｌのヌクレアーゼフリーの水をビーズに加え、そして、これらの混合物を４０℃、５０℃、または６０℃で２分間加熱した後にビーズを除去した。ＲＩＰ後の加熱によるｍｉＲＮＡ放出は、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔで精製したｍｉＲＮＡ、及びＱｉａｇｅｎ社のキットで血漿から直接精製したｍｉＲＮＡと比較した。合成ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐ（１．４ｅ８コピー数）は、Ｑｉａｇｅｎ社製品での調製用にＱＩＡｚｏｌを添加した後、または、ＲＩＰ後ビーズに加えられた水にスパイクした。
【００８２】
合成ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐのスパイクは、ビーズ上のＲＩＰ生成物を用いた６０℃、２分後条件では検出されなかった（図４）。内因性ｍｉＲＮＡも、４０℃、５０℃または６０℃、２分後の条件で検出されなかった。同様の結果が、ｍｉＲ２３ａ、ｍｉＲ１４２、ｍｉＲ１９１、及びｍｉＲ４５１ａで観察された。サンプルを５０℃または６０℃に加熱したとき、ｌｅｔ７ａ  ｍｉＲＮＡも失われた。ｍｉＲＮＡの損失は、ＲＮａｓｅのＲＩＰに伴うキャリーオーバー汚染に起因する可能性が高い。何故ならば、血液は、非常に高いレベルのＲＮａｓｅを含むことが知られているからである。
【００８３】
実施例６．プロテアーゼＫ分解を用いたｍｉＲＮＡの放出。
プロテイナーゼＫ分解は、Ａｇｏ−ＲＩＰ後、ｍｉＲＮＡを放出するための手段として試験した。ＲＩＰは、０．２ｍｌの血漿と、２０μｌのストレプトアビジン磁気ビーズに結合した２．５μｇのビオチン化抗Ａｇｏ２抗体を用いて実施した。ＲＩＰ後、ビーズは４μｌのプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社Ｐ４８５０）を含む分解緩衝液（２０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ：８．０、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％のＩＧＥＰＡＬ）で、室温若しくは３７°Cで１０分間撹拌して、または６５°Cで２分間撹拌してインキュベートした。ビーズを除去後、プロテイナーゼＫを９５°C、５分間で不活性化し、そして、５μｌの各々のプロテイナーゼＫの分解物を１０μｌのポリＡ−テーリング反応物に加え、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のＭｙｓｔｉＣｑ  ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイで特定のｍｉＲＮＡを検出した。比較のために、同時調製したＲＩＰ後のビーズをＱＩＡｚｏｌ溶解試薬で抽出し、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａを用いて精製した（「トータル」を１００％に設定）。ＲＩＰ−プロテイナーゼＫからのｍｉＲＮＡレベルを、ＲＩＰからのｍｉＲＮＡレベル（ｍｉＲＮＡはＲＮｅａｓｙキットを用いて放出された）と比較して表した。
【００８４】
室温でのプロテイナーゼＫ分解を使用したｍｉＲＮＡの放出は、より高い温度での放出よりも多くのｍｉＲＮＡをもたらした（図５）。全ての場合において、トータルのｍｉＲＮＡのかなりの量が失われた。損失は、サンプル中の残留ＲＮａｓｅに起因する可能性が最も高いものであった。
【００８５】
同様の実験をプロテイナーゼＫの代わりに、ｐＨ２、３または４の緩衝液中でペプシン消化を用いて実施し、ｍｉＲＮＡを放出させた。ペプシンを用いたｍｉＲＮＡの放出により、１％未満のｍｉＲＮＡを回収した（データは示されていない）。
【００８６】
実施例７．生物流体からのｍｉＲＮＡ抽出のための他の方法とＲＩＰの比較。
ｍｉＲＮＡは、実質的に実施例６に記載する通り、ビオチン化抗Ａｇｏ２及びストレプトアビジン磁気ビーズ並びにプロテイナーゼＫを用いて単離される。比較のために、ｍｉＲＮＡは、また、Ｅｘｉｑｏｎ社からのｍｉＲＣｕｒ（登録商標）ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ−ｂｉｏｆｌｕｉｄｓを用いて、または、Ｑｉａｇｅｎ社からのｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔを用いて、直接的に血漿から精製した（図６）。これらのデータは、Ｅｘｉｑｏｎ社のキットを用いて精製したＲＮＡからの、ｌｅｔ７ａのｍｉＲＮＡ収量が、Ｑｉａｇｅｎ社のキットを用いて精製したものよりも３〜４倍高いことを示した。Ａｇｏ−ＲＩＰとプロテイナーゼＫによる放出を使用して調製したｍｉＲＮＡ収量は、ほとんどの実験においてＥｘｉｑｏｎ社のキット及びＱｉａｇｅｎ社のキットの中間であった。ｌｅｔ７ａの結果を図６及び図７に示すが、ｍｉＲ２３ａ、ｍｉＲ１４２、及びｍｉＲ１９１の結果も同様であった。一方、ｍｉＲ４５１ａの収量は、Ａｇｏ−ＲＩＰ及びＥｘｉｑｏｎ社のキットで同様であった。ｍｉＲ４５１ａは、成熟ｍｉＲＮＡに処理するためのＡｇｏ２スライサー活性を必要とし、従って、Ａｇｏ２複合体でのみ発生することができる。その他のｍｉＲＮＡは、Ａｇｏ２に加えてＡｇｏ１、Ａｇｏ３またはＡｇｏ４に会合することができる。用いられる抗体はＡｇｏ２に特異的であるため、他のすべての成熟したｍｉＲＮＡの単離よりも効率的にｍｉＲ４５１ａは分離する。
【００８７】
実施例８．プロテアーゼ阻害剤及びＲＮＡｓｅ阻害剤有り無しでのＲＩＰ。
Ａｇｏ−ＲＩＰは、プロテアーゼ阻害剤及びＲＮａｓｅ阻害剤の存在下（＋ｉｎｈ）、または、非存在下（−ｉｎｈ）で、ｍｉＲＮＡを単離するために使用され、そしてｍｉＲＮＡは、プロテアーゼＫを用いてビーズから放出された。阻害剤の存在下で行われるＡｇｏ−ＲＩＰは、阻害剤で処理しなかったサンプルよりも多くのｌｅｔ７ａ  ｍｉＲＮＡをもたらした。同様の結果がｍｉＲ１９１について見出された。ｍｉＲ４５１ａには有意な差異はなかった（図８）。
【００８８】
阻害剤の有り無しでのＩＧＥＰＡＬによる血清の前処理も実施し（＋ｐｒｅ）、そして、抗体ビーズの添加と同時に、阻害剤の有り無しでＩＧＥＰＡＬを添加した場合（−ｐｒｅ）と比較した。結果は、プロテアーゼ及びＲＮＡｓｅ阻害剤による血清の前処理は、同時処置の場合と比較して、ｌｅｔ７ａまたは、ｍｉＲ４５１ａのいずれの収量も改善しなかったことを示す（図８）。
【００８９】
実施例９．界面活性剤の有り無しでのｍｉＲＮＡ回収量。
ｍｉＲＮＡの単離に関して界面活性剤の効果を決定するために、Ａｇｏ−ＲＩＰは、ＩＧＥＰＡＬ界面活性剤の存在下または非存在下で、１０μｇのビオチン化抗Ａｇｏ２抗体／ストレプトアビジン磁気ビーズを使用して（０．２ｍｌの血漿を用いて）実施した。これは、界面活性剤の非存在下で単離されたいずれのｍｉＲＮＡも、遊離型であり（即ち、小胞内に存在せず）、そして界面活性剤の存在下で単離されたいずれのものも、小胞性であると仮定した。トータルｍｉＲＮＡは、ＩＧＥＰＡＬで処理した血漿から回収されたｍｉＲＮＡのレベルであり、それを１００％に設定した。（ｍｉＲＮＡが小胞と会合してない）遊離型のｍｉＲＮＡは、ＩＧＥＰＡＬで処理されなかった血漿から回収されたｍｉＲＮＡのレベルであった。小胞会合のｍｉＲＮＡは、全ｍｉＲＮＡサンプル中のｍｉＲＮＡのレベルから遊離型ｍｉＲＮＡサンプル中の該ｍｉＲＮＡのレベルを差し引いたものとして計算された。図９は、ｌｅｔ７ａ、ｍｉＲ２３ａ、ｍｉＲ１４２、及びｍｉＲ４５１ａのｍｉＲＮＡの遊離型、及び、小胞会合のレベルを示す。これらの結果は、界面活性剤処理が、いくつかのｍｉＲＮＡをＲＩＰにより血漿から効果的にを回収するのに望ましい場合があることを示している。
【００９０】
実施例１０．ＲＩＰはスケールアップ可能である。
ＲＩＰは、０．２ｍｌの血漿及び１０μｇのビオチン化抗Ａｇｏ２／ストレプトアビジンビーズまたは、０．４ｍｌの血漿及び２０μｇのビオチン化抗Ａｇｏ２／ストレプトアビジンビーズに続いてプロテイナーゼＫ分解による放出を用いて実施される。比較のために、ｍｉＲＮＡは、Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲＣｕｒy ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ−ｂｉｏｆｌｕｉｄｓにより、０．２ｍｌの同一血漿から単離した。それぞれの調製法で回収したｌｅｔ７ａ、ｍｉＲ１９１、及びｍｉＲ４５１ａのトータルの収量は、図１０に示されている。Ａｇｏ−ＲＩＰにより、２倍の血漿（即ち、０．４ｍｌ対０．２ｍｌ）は、試験されたｍｉＲＮＡの１．５−２倍をもたらしたが、一方カラムベースのキット（Ｅｘｉｑｏｎ社、及び、Ｑｉａｇｅｎ社からのものなど）は、容量が制限されており、せいぜい０．２ｍｌの血漿の使用が推奨される。
【００９１】
実施例１１．ＲＩＰのための最小インキュベート及び洗浄時間。
ＲＩＰは、０．２ｍｌの血漿及び５μｇのビオチン化抗Ａｇｏ２／ストレプトアビジンビーズを用いて実施し、５、１５、３０、または６０分間、室温で回転させながらインキュベートした。５、１５または３０分間インキュベートされたものは、インキュベートが完結した後、全て５回洗浄した。６０分間インキュベートされたものは、ＲＩＰ洗浄緩衝液で、５、４、３、２、１回洗浄した。全て、プロテアーゼＫで放出される。ｌｅｔ７ａの収量は、図１１に示されている。結果は、最大のｍｉＲＮＡ回収のためには使用した条件（例えば、抗体及びビーズの種類及び量）下で、１５分超のインキュベート時間が必要であることを示すが、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のＭｙｓｔｉＣｑアッセイ（ポリＡテーリング、ＲＴ、ｑＰＣＲ）を使用したｍｉＲＮＡ検出の前に、１回のみの洗浄が必要とされる。同様の結果が、ｍｉＲ１２２、ｍｉＲ１９１、及びｍｉＲ４５１ａについて得られた。
【００９２】
実施例１２．ＲＩＰは、ｍｉＲＮＡに特異的である。
次の実施例は、Ａｇｏ−ＲＩＰが、ｍｉＲＮＡに対して特異的であるかどうか、または、Ａｇｏ−ＲＩＰが、また、他のＲＮＡを単離するかどうかを決定するために実施された。単離は、Ａｇｏ−ＲＩＰ（Ｓ）、Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲＣｕｒｙ  ＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ−ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ（Ｅ）、または、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／ＰｌａｓｍａＫｉｔ（Ｑ）を用いて、０．２ｍｌの新鮮な血漿（実験１及び２）、または、０．２ｍｌの冷凍血漿（実験３）から実施した。実験１は、２．５μｇのビオチン化抗Ａｇｏ２抗体／２０μｌのストレプトアビジンビーズを用いて実施した。実験２及び３は、２．５μｇのビオチン化抗Ａｇｏ２抗体／２０μｌのストレプトアビジンビーズを用いて実施した。実施例６で上述したように、プロテイナーゼＫ分解は、実質的にビーズからｍｉＲＮＡを放出するために使用された。特定のｍｉＲＮＡ（例えば、ｌｅｔ７ａ）、及び、特定の小核または核小体のＲＮＡ（例えば、ＲＮＵ６、または、ＳＮＯＲＤ４８）は、ＭｙｓｔｉＣｑ  ＲＴ−ｑＰＣＲのアッセイを用いて検出し、及びより長いｍＲＮＡまたはｒＲＮＡ（例えば、ＧＡＰＤＨ、ＲＮ１８Ｓ、ＲＮ２８Ｓ）は、ＫｉＣｑＳｔａｒｔ（登録商標）ＲＴ−ｑＰＣＲ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）のアッセイを用いて検出した。ＨｅＬａ細胞からのトータルＲＮＡ（ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）ＢＤを用いて単離した）は、定量標準として使用した。
【００９３】
予想されるように、例えば、ｌｅｔ７ａなどのｍｉＲＮＡは、Ａｇｏ−ＲＩＰ、または、いずれかのカラムベースのキットを使用して単離した（図１２Ａ参照）。しかし、他の低分子ＲＮＡ、または、より高分子のＲＮＡは、Ａｇｏ−ＲＩＰにより単離されなかったが、Ｅｘｉｑｏｎ社、及び、Ｑｉａｇｅｎ社のキットにより単離された。図１２Ｂ及び図１２Ｃに示す通り、ＲＮＵ６、ＳＮＯＲＤ４８、ＧＡＰＤＨ、ＲＮ１８Ｓ、または、ＲＮ２８ＳのＲＮＡＳは、ほとんど、或いは全くＡｇｏ−ＲＩＰを使用して単離できなかったが、これら他のタイプのＲＮＡは、Ｅｘｉｑｏｎ社、及び、Ｑｉａｇｅｎ社のキットを用いて単離された。したがって、Ａｇｏ−ＲＩＰは、具体的にはｍｉＲＮＡのみを分離する。
【００９４】
実施例１３．抗Ａｇｏ１及び抗Ａｇｏ２抗体の両方の使用は、ＲＩＰの収量を増加させる。
異なるｍｉＲＮＡは異なるＡｇｏタンパク質に会合するので、特定のｍｉＲＮＡの収量は、異なるＡｇｏタンパク質に対する抗体を併用することにより改善される可能性がある。従って、ｍｉＲＮＡは、１０μｇの抗Ａｇｏ１抗体／２０μｌのプロテインＡビーズ、１０μｇの抗Ａｇｏ２抗体／２０μｌのプロテインＡビーズ、または、各タイプの抗体ビーズの１：１混合物２０μｌを使用して、０．２ｍｌの血漿から単離された。実質的に実施例３で上述した通り、ビーズからのｍｉＲＮＡの放出は、ＱＩＡｚｏｌ溶解試薬を用いて行い、Ｑｉａｇｅｎ社のキットで精製した。特定のｍｉＲＮＡ（例えば、ｌｅｔ７ａ、ｍｉＲ１４２−３ｐ、ｍｉＲ１２２、ｍｉＲ１９１、及びｍｉＲ４５１ａ）は、ＭｙｓｔｉＣｑＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを用いて検出した。
【００９５】
図１３に示すように、抗体を一緒に用いるときの収量は、各抗体を別々に使用したときの合計とほぼ同じであった。ほとんどのｍｉＲＮＡに対しては、抗Ａｇｏ２の使用は、抗Ａｇｏ１の使用よりも大きい収量をもたらした。しかし、抗Ａｇｏ１を使用した場合、より多くのｍｉＲ１２２が回収され、それは、Ｔｕｒｃｈｉｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２、ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ ９（８）：１０６６−７５の報告と一致していた。また、実施例７で前述したように、ｍｉＲ４５１ａは、抗Ａｇｏ２のみを用いて回収された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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