(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シネオールを含む、線虫の嗅覚の感受性を増強させることに用いるための組成物。
【請求項２】
シネオールを含む、線虫の嗅覚に基づく走性行動を増強させることに用いるための組成物。
【請求項３】
走性行動が、遊走行動および／または忌避行動である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
線虫の嗅覚の感受性を増強させる方法であって、
シネオールまたはシネオールを含む組成物と線虫とを接触させることを含む、方法。
【請求項５】
線虫の嗅覚に基づく走性行動を増強させる方法であって、
シネオールまたはシネオールを含む組成物と線虫とを接触させることを含む、方法。
【請求項６】
走性行動が、遊走行動および／または忌避行動である、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線虫の嗅覚の感度を向上させる化合物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
線虫は、がん患者の尿に対して誘引行動を示し、健常者の尿に対して忌避行動を示す。従って、線虫の走性行動に基づいて尿が由来する対象が、がん患者であるのか、健常者であるのかを判別することができる（特許文献１）。より具体的には、特許文献１には、２４２検体の中規模試験により、がん患者を１００％の感度および９５％の特異度で検出することができたことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２０１５／０８８０３９
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、走性行動評価において、走性行動をより増強させる方法を模索した。その結果、本発明者らは、シネオールが、線虫の嗅覚の感受性を向上させること、および線虫の走性行動を増強することを明らかにした。本発明はこのような知見に基づく発明である。
【０００５】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）シネオールを含む、線虫の嗅覚の感受性を増強させることに用いるための組成物。
（２）シネオールを含む、線虫の嗅覚に基づく走性行動を増強させることに用いるための組成物。
（３）走性行動が、遊走行動および／または忌避行動である、上記（２）に記載の組成物。
（４）線虫の嗅覚の感受性を増強させる方法であって、
シネオール、またはシネオールを含む組成物と線虫とを接触させることを含む、方法。
（５）線虫の嗅覚に基づく走性行動を増強させる方法であって、
シネオール、またはシネオールを含む組成物と線虫とを接触させることを含む、方法。
（６）走性行動が、遊走行動および／または忌避行動である、上記（５）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、線虫の走性行動評価に用いたシャーレ１の平面図を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、１，８−シネオールによる線虫の嗅覚の感受性、および線虫の走性行動の増強効果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、１，４−シネオールによる線虫の嗅覚の感受性、および線虫の走性行動の増強効果を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、塩学習による線虫の誘引行動の低下（または忌避行動の増強）が、１，８−シネオールによって増強されることを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、塩学習による線虫の誘引行動の低下（または忌避行動の増強）に対する１，８−シネオールによる増強効果が、ｏｄｒ−３変異体では消失することを示す。
【発明の具体的な説明】
【０００７】
本明細書では、「対象」とは、哺乳動物を意味し、例えば、霊長類（例えば、サル、チンパンジー、ゴリラ、ボノボ、オランウータン、マーモセット、およびヒト）、例えば、ヒトを意味する。本明細書では、対象は好ましくはヒトである。また、本明細書では、「対象」には、健常者、がんであると疑われる対象およびがんに罹患している対象が含まれる意味で用いられる。
【０００８】
本明細書では、「がん」は、悪性腫瘍を意味する。がんには、造血器腫瘍、上皮癌（カルシノーマ）、および非上皮性の肉腫（サルコーマ）に大きく分類され得る。造血器腫瘍としては、白血病、悪性リンパ腫、および骨髄腫などが挙げられる。上皮癌としては、肺がん、乳がん、胃がん、大腸がん、子宮がん、卵巣がん、頭頸部がん、および舌がんが挙げられる。肉腫としては、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫、および血管肉腫が挙げられる。本明細書では、「がん」は、ステージ０の早期がん、およびステージ１の早期がんなどの早期がんを含む。
【０００９】
本明細書では、「がん診断に用いるための組成物」を単に「がんの診断薬」ということがある。
【００１０】
本明細書では、「線虫」とは、カエノラブディチス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）を意味する。線虫は、米国ミネソタ大学の生物科学部のCaenorhabditis Genetics Center (CGC)に様々な環境から単離された株が登録および公開され、分譲可能である。従って、当業者であれば、知られているほとんどの株をCGCから入手することができる。自家受精により繁殖できるという観点では、雌雄同体が好ましく用いられ得る。
【００１１】
本明細書では、「走性行動」とは、誘引行動または忌避行動を意味する。誘引行動とは、ある物質からの物理的距離を縮める行動を意味し、忌避行動とは、ある物質からの物理的距離を広げる行動を意味する。誘引行動を誘発する物質を誘引物質といい、忌避行動を誘発する物質を忌避物質という。線虫は嗅覚により誘引物質に対して誘引し、忌避物質から忌避するという性質を有している。誘引物質に対して誘引する行動を誘引行動（本明細書では「陽性」ということがある）といい、忌避物質から忌避する行動を忌避行動（本明細書では「陰性」ということがある）という。また、誘引行動と忌避行動とを合わせて走性行動という。
【００１２】
本明細書では、「野生株」とは、線虫の野生株であり、例えば、一般的な野生株であるＮ２  Ｂｒｉｓｔｏｌ株が挙げられる。本明細書における野生株は、がんを有する対象から得られた尿には誘引行動を示し、がんを有しない対象から得られた尿には忌避行動を示す株とすることができる。
【００１３】
線虫の走性行動評価系を用いた尿の分析方法
線虫の走性行動評価系を用いた尿の分析方法は、対象から得られた被検試料（例えば、尿）と線虫とを一定距離離して配置し、線虫が被検試料に対して誘引行動を示すか、忌避行動を示すかを観察することによって行うことができる。そして、誘引行動を示した場合には、対象は、がんに罹患している、またはその可能性があると評価することができる。このようにして、ＷＯ２０１５／０８８０３９では、２４２検体の中規模試験により、がん患者を１００％の感度および９５％の特異度で検出することができた。
【００１４】
より詳細には、線虫の走性行動評価系を用いた尿の分析方法は例えば、
シャーレ（例えば、固形培地を導入したシャーレ）に対象から得られた被検試料（例えば、尿）を配置することと、
被検試料が配置されたシャーレに、被検試料と一定距離離れた位置に線虫を配置することと、
配置後、線虫に行動させることと、
線虫が被検試料に対して走性行動を示した場合には、対象ががんに罹患している、またはがんに罹患している可能性があると評価することと、
を含みうる。
【００１５】
線虫の走性行動は、被検試料に近づいた線虫数と被検試料から遠のいた線虫数の差や比により評価することができる。線虫数の差に基づく評価の場合には、差が正の値である場合には、全体として被検試料は、誘引行動を誘発するものであり、がん患者に由来するものであると評価することができ、負の値である場合には、全体として被検試料は、忌避行動を誘発するものであり、健常者に由来するものであると評価することができる。また、線虫の走性行動は、例えば、以下のように走性インデックスを指標として評価することができる。
【数１】
0006788921.tif 000002
｛式中、Ａは、被検試料に対して誘引行動を示した線虫の数であり、Ｂは、被検試料に対して忌避行動を示した線虫の数である。｝
【００１６】
走性インデックスが正の値である場合には、全体として被検試料は、誘引行動を誘発するものであり、がん患者に由来するものであると評価することができ、負の値である場合には、全体として被検試料は、忌避行動を誘発するものであり、健常者に由来するものであると評価することができる。
【００１７】
走性インデックスは、１に近いほど線虫が誘引行動を示す比率が大きいことを意味し、−１に近いほど線虫が忌避行動を示す比率が大きいことを意味し、０に近いほど線虫は誘引行動も忌避行動も示さないことを意味する。走性インデックスの絶対値が大きいほど、行動評価結果は明確になる。
【００１８】
本発明者らは、シネオール（例えば、１，８−シネオールおよび／または１，４−シネオール）が線虫の嗅覚に影響し、走性インデックスの絶対値を増大させることを発見した。
【００１９】
本発明によれば、線虫の嗅覚の感度を増強させることに用いるための組成物であって、シネオール（例えば、１，８−シネオールおよび／または１，４−シネオール）を含む組成物が提供される。本発明によれば、線虫の嗅覚の感度を増強させる方法であって、線虫を前記シネオール存在下で培養することを含む、方法が提供される。
【００２０】
本発明によればまた、線虫の嗅覚に基づく走性行動評価において誘引行動を強めることに用いるための組成物であって、シネオール（例えば、１，８−シネオールおよび／または１，４−シネオール）を含む組成物が提供される。本発明によればまた、線虫の嗅覚に基づく走性行動評価において誘引行動を強める方法であって、線虫を前記シネオール存在下で培養することを含む、方法が提供される。
【００２１】
シネオール（例えば、１，８−シネオールおよび／または１，４−シネオール）は、線虫に直接接触させる必要は無い。シネオール（例えば、１，８−シネオールおよび／または１，４−シネオール）は揮発性であり、離れたところから線虫の嗅覚神経を刺激して線虫の嗅覚の感度を高めることができる。従って、シネオール（例えば、１，８−シネオールおよび／または１，４−シネオール）は、培養容器の内壁のどこかに塗布し、そこで線虫を繁殖させることで、線虫の嗅覚の感度を高めることができる。例えば、培養容器の蓋などの内壁に付着させることができる。また、シネオール（例えば、１，８−シネオールおよび／または１，４−シネオール）は、培地に添加してもよいのである。
【００２２】
本発明では、シネオール（例えば、１，８−シネオールおよび／または１，４−シネオール）は、原液または水で希釈したものを用いることができる。例えば、希釈倍率は、１００万倍〜１万倍として用いることができる。本発明では、線虫を例えば、２〜４日、１〜２日、および１〜２４時間のいずれかの期間、シネオール（例えば、１，８−シネオールおよび／または１，４−シネオール）存在下で培養することができる。シネオール（例えば、１，８−シネオールおよび／または１，４−シネオール）は、検査時に評価系に導入されてもよいであろう。例えば、シネオール（例えば、１，８−シネオールおよび／または１，４−シネオール）は、走性行動評価系に用いるシャーレの内壁、その蓋の内壁、固形培地の表面および固形培地中から選択されるいずれか１以上に付着または含有させることができる。
【００２３】
本発明では、がん患者の尿に対する走性行動の評価にシネオール（例えば、１，８−シネオールおよび／または１，４−シネオール）を用いることもできる。
【００２４】
以下、実施例に基づいて本発明を説明する。
【実施例】
【００２５】
実施例１：シネオールを嗅がせた線虫による走性行動の評価
本実施例では、シネオールが線虫の嗅覚の感受性を向上させることを示す。【００２６】
線虫の野生株にシネオールとして１，８−シネオールを嗅がせ、その後、ベンズアルデヒド（ＢＺ）またはイソアミルアルコール（ＩＡＡ）に対する線虫の走性行動を評価した。
具体的には、１，８−シネオールを１０万倍に希釈し、培養容器の蓋の内側に付着させた。付着後、線虫の培養培地に線虫の卵を載せて、成虫になるまで成長させた。線虫を回収し、常法に従ってＢＺまたはＩＡＡに対する走性を観察した。【００２７】
実施例で用いたプレートを図１に示す。図１における、プレートのサンプル配置部位５の箇所に上記匂い物質を塗布し、プレートの線虫配置部位３に線虫を配置して、その後２３℃において線虫の行動観察を行った。線虫を配置した３０分後に領域２および領域４に存在する線虫数をカウントし、以下式により走性インデックスを求めた。
（走性インデックス）＝｛Ｎ（２）−Ｎ（４）｝／｛Ｎ（２）＋Ｎ（４）｝
｛式中、Ｎ（２）は、図１の領域２に分布した線虫の数であり、Ｎ（４）は、図１の領域４に分布した線虫の数である。｝【００２８】
走性インデックスは、１に近いほど線虫の誘引行動が強く表われたことを意味する。結果は、図２Ａに示される通りであった。【００２９】
図２Ａに示されるように、１，８−シネオール存在下で培養した線虫は、上記走性インデックスが、ＢＺに対しては約０．２から約０．７５へと飛躍的に増加し、ＩＡＡに対しては、約０．３から約０．７５へと飛躍的に増加した。全く異なる種類の匂い物質の両方に対して嗅覚感度が向上したものであり、１，８−シネオールは、線虫の嗅覚の高感度化を起こすこと、線虫の走性行動（誘引行動）の感受性を向上させることが明らかになった。【００３０】
次に、シネオールとして、１，４-シネオールを用いて同様の実験を行った。具体的には、１，４−シネオールを１０万倍に希釈し、培養容器の蓋の内側に付着させた。付着後、線虫の培養培地に線虫の卵を載せて、成虫になるまで成長させた。線虫を回収し、常法に従ってＩＡＡおよび２−ノナノンに対する走性を観察した。実験は２回行った。
その結果、図２Ｂに示されるように、１，４−シネオール存在下で培養した線虫は、誘引物質であるＩＡＡに対しては、走性インデックスが向上させたのに対して、忌避物質である２−ノナノンに対する走性インデックスを変化させることは無かった。このことから、１，４-シネオールは、１，８−シネオールと同様に、線虫の嗅覚の高感度化を起こすこと、走性行動（誘引行動）の感受性を向上させることが明らかになった。【００３１】
なお、酢酸ボルニル、D-カンファー、カンフェン、リナロール、酢酸リナリル、グラニオール、フェニルエチルアルコール、シトロネロール、ピネン、リモネン、酢酸ベンジル、バニリン、オイゲノール、およびミルセンそれぞれについて、同様に線虫の走性行動に与える影響を調べたが、これらについては有意な効果は観察されなかった。【００３２】
実施例２：ｏｄｒ−３変異体を用いた分析
上記実施例で観察された匂い物質に対する応答性が、嗅覚に基づくことを確かめるため、誘引行動に関わる嗅覚神経であるAWC神経に異常があるｏｄｒ−３変異体の走性行動に対するシネオールの効果を確認した。【００３３】
線虫は、餌が存在する箇所の塩濃度（NaCl）を学習し、その塩濃度の箇所対して走性を示す。線虫に対して塩濃度（濃度50 mM）を１，８−シネオール存在下若しくは非存在下で学習させ、または学習させずに繁殖させた。【００３４】
その後に、常法に基づいて塩濃度（100 ｍM）に対する塩走性を評価した。結果は図３Ａおよび３Ｂに示される通りであった。【００３５】
図３Ａに示されるように、塩走性は、シネオールによって塩走性の走性インデックスがより大きく低下することが明らかになった。一方で、図３Ｂに示されるように、塩走性に関する走性インデックスは、ｏｄｒ−３変異体では変化がなかった。従って、シネオールは、嗅覚に基づいて線虫の走性行動を変化させるモデュレータ−であることが明らかとなった。
【図１】
0006788921.tif 000003
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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