(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を修飾するための方法であって：
少なくとも１つのリジン残基を有するターゲットタンパク質を提供し；
微生物トランスグルタミナーゼの存在下で、式Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（Ａ−Ｗ−Ｂ−Ｒ２）ｚを有する修飾化合物とターゲットタンパク質を接触させて修飾タンパク質を形成する工程を含む；
式中、ｘは０または１であり；ｙは０または１であり；ｚは０または１であり；
Ｒ１は
【化１】
0006739333.tif 000163
であり；
Ｗは：約４０〜約８０，０００ａｍｕの間の分子量を有するＣ１−Ｃ６直鎖または分枝鎖アルキルまたはポリエチレングリコールより選択され；
Ａは、存在しないか、または−Ｏ−、−ＮＨ−、および−Ｓ−より選択され；
Ｂは、存在しないか、または−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ＝Ｎ（ＯＨ）−、−Ｓ（Ｏ２）−、−ＮＨＳ（Ｏ２）−、−Ｓ（Ｏ２）ＮＨ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＮＨＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ＮＨ−；−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｓ−、＝ＮＨ−Ｏ−、＝ＮＨ−ＮＨ−および＝ＮＨ−Ｎ（Ｃ１−Ｃ２０アルキル）−より選択され；
Ｒ２は：脂肪酸、直鎖または分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル−Ｎ３、シクロオクチニル、多糖、−ＣＨ（ＯＣＨ３）２、
【化２】
0006739333.tif 000164
からなる群より選択され；
各ｎは０〜６より独立に選択される整数であり；
各ＱはＨおよびＮＯ２より選択される
前記方法。
【請求項２】
式Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（Ａ−Ｗ−Ｂ−Ｒ２）ｚの化合物であって、
式中、ｘは０または１であり；ｙは０または１であり；ｚは０または１であり；
Ｒ１は 
【化３】
0006739333.tif 000165
であり；
Ｗは：約４０〜約８０，０００ａｍｕの間の分子量を有するＣ１−Ｃ６直鎖または分枝鎖アルキルまたはポリエチレングリコールより選択され；
Ａは存在しないか、または−Ｏ−、−ＮＨ−、および−Ｓ−より選択され；
Ｂは存在しないか、または−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ＝Ｎ（ＯＨ）−、−Ｓ（Ｏ２）−、−ＮＨＳ（Ｏ２）−、−Ｓ（Ｏ２）ＮＨ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＮＨＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ＮＨ−；−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｓ−、＝ＮＨ−Ｏ−、＝ＮＨ−ＮＨ−および＝ＮＨ−Ｎ（Ｃ１−Ｃ２０アルキル）−より選択され；
Ｒ２は：脂肪酸、直鎖または分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル−Ｎ３、シクロオクチニル、多糖、−ＣＨ（ＯＣＨ３）２、
【化４】
0006739333.tif 000166
からなる群より選択され；
各ｎは、０〜６より独立に選択される整数であり；
そして各ＱはＨおよび−ＮＯ２より選択される
前記化合物。
【請求項３】
Ｗが、約４０〜約８０，０００ａｍｕの間の分子量を有するポリエチレングリコールである、請求項２の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が、シクロオクチニルおよび
【化５】
0006739333.tif 000167
より選択される、請求項２の化合物。
【請求項５】
Ｒ２が脂肪酸である、請求項２の化合物。
【請求項６】
式Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（Ａ−Ｗ−Ｂ−Ｒ２）ｚの化合物であって、
式中、ｘは０または１であり；ｙは０または１であり；ｚは０または１であり；
Ｒ１は
【化６】
0006739333.tif 000168
であり；
Ｗは約４０〜約８０，０００ａｍｕの間の分子量を有するポリエチレングリコールであり；
Ａは存在しないか、または−Ｏ−、−ＮＨ−、および−Ｓ−より選択され；
Ｂは存在しないか、または−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ＝Ｎ（ＯＨ）−、−Ｓ（Ｏ２）−、−ＮＨＳ（Ｏ２）−、−Ｓ（Ｏ２）ＮＨ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＮＨＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ＮＨ−；−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｓ−、＝ＮＨ−Ｏ−、＝ＮＨ−ＮＨ−および＝ＮＨ−Ｎ（Ｃ１−Ｃ２０アルキル）−より選択され；
Ｒ２はフルオロフォアである
前記化合物。 
【請求項７】
フルオロフォアが、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ色素、Ａｌｅｘａ色素、およびクマリンからなる群より選択される、請求項６の化合物。
【請求項８】
【化７】
0006739333.tif 000169
からなる群より選択される化合物。
【請求項９】
請求項２〜８のいずれか一項の化合物のコンジュゲート。
【請求項１０】
コンジュゲートタンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項９のコンジュゲート。
【請求項１１】
コンジュゲートタンパク質がＧＢＳ８０である、請求項９のコンジュゲート。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項のコンジュゲートを含むワクチン。
【請求項１３】
修飾されたタンパク質を含む療法タンパク質であって、該修飾されたタンパク質は請求項２〜８のいずれか一項の化合物のコンジュゲートである、前記療法タンパク質。
【請求項１４】
請求項２〜８のいずれか一項の化合物を含む、画像化剤。
【請求項１５】
請求項２〜８のいずれか一項の化合物を含む、標識ツール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、タンパク質に修飾基を導入する新規方法に関する。特に、本発明は、タンパク質を修飾するために化学酵素的微生物トランスグルタミナーゼ仲介反応を用いた、タンパク質におけるリジン残基の選択的誘導体化、ならびにその調製法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の特性および性質は、タンパク質に基をコンジュゲート化することによって修飾可能であることが周知である。例えば、米国特許第４，１７９，３３７号は、ポリエチレンまたはポリプロピレングリコールにコンジュゲート化されたタンパク質を開示した。一般的に、こうしたコンジュゲート化は、コンジュゲート化基における別の官能基と反応するために、タンパク質中の何らかの官能基を必要とする。アミノ基、例えばＮ末端アミノ基またはリジン残基中のε−アミノ基は、この目的のため、適切なアシル化試薬と組み合わせて用いられてきている。例えばコンジュゲート化化合物がタンパク質に付着する場合、そして付着するコンジュゲート基の数を制御するために、コンジュゲート化反応を制御することが、しばしば、望ましいかまたは必要である。これはしばしば、特異性または選択性と称される。
【０００３】
タンパク質の部位特異的修飾は、薬学業およびバイオテクノロジー業において、年来の難問である。古典的な方法は、しばしば、非特異的標識（例えばＮＨＳ  Ｌｙｓ標識）につながるか、または操作を必要とする（例えばマレイミドＣｙｓ標識または非天然アミノ酸）。さらに、選択的化学反応のレパートリーは、しかし、非常に限定されている。１つの代替法は、組換え法によってユニークな反応性を有する特別な非天然アミノ酸を導入し、そして次いでさらなる誘導体化において、その反応性を利用することである。別の代替法は、修飾しようとするタンパク質の構造的および機能的特徴を認識する酵素を使用することである。この例は、成長ホルモン中のＧｌｎ残基を選択的に修飾する、微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧアーゼ）の使用である。他の文書は、生理学的に活性であるタンパク質の特性を改変するためのトランスグルタミナーゼの使用を開示する。例えば、トランスグルタミナーゼの存在下での、少なくとも１つのＧｌｎを含むタンパク質およびアミン官能化ＰＥＧまたは類似のリガンドの間の直接反応を開示する、ＥＰ  ９５０  ６６５、ＥＰ  ７８５  ２７６およびＳａｔｏ，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，  ５４，  ４８７−５０４（２００２）を参照されたい；また、トランスグルタミナーゼによって、脂肪酸とＰ−ラクトグロビンの直接コンジュゲート化を開示する、Ｗａｄａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｌｅｔｔ．，  ２３，  １３６７−１３７２（２００１）も参照されたい。トランスグルタミナーゼによって触媒される反応は、グルタミン残基の一級アミドを、反応混合物中に存在する一級アミンから二級アミドに変換するトランスアミド化反応である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第４，１７９，３３７号
【特許文献２】ＥＰ  ９５０  ６６５
【特許文献３】ＥＰ  ７８５  ２７６
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓａｔｏ，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，  ５４，  ４８７−５０４（２００２）
【非特許文献２】Ｗａｄａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｌｅｔｔ．，  ２３，  １３６７−１３７２（２００１）
【発明の概要】
【０００６】
タンパク質の選択的誘導体化は、非常に困難な課題のままである；アシル化によるタンパク質中のリジンの誘導体化は、さらにより本質的に、非選択的プロセスである。したがって、現在、リジン残基の選択的誘導体化のための効率的な方法はない。したがって、当該技術分野には、タンパク質またはポリペプチド中のリジンなどのアミノ酸残基を選択的に誘導体化する方法に関する必要性がある。
【０００７】
概要
１つの側面において、タンパク質を修飾するための方法を開示する。該方法は、部位選択的修飾を可能にする。該方法には、少なくとも１つのリジン残基を有するターゲットタンパク質を提供し；微生物トランスグルタミナーゼの存在下で、式Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（Ａ−Ｗ−Ｂ−Ｒ２）ｚを有する修飾化合物とターゲットタンパク質を接触させて修飾タンパク質を形成する工程が含まれる；
式中、ｘは０または１であり；ｙは０または１であり；ｚは０または１であり；
Ｒ１は：アセチル、
【０００８】
【化１】
0006739333.tif 000002
【０００９】
からなる群より選択され；
式中、各Ｒ４は、−Ｈ、−Ｎ３、および
【００１０】
【化２】
0006739333.tif 000003
【００１１】
より選択され；
Ｗは：約４０〜約８０，０００ａｍｕの間の分子量を有するＣ１−Ｃ６直鎖または分枝鎖アルキルまたはポリエチレングリコールより選択され；
Ａは、存在しないか、または−Ｏ−、−ＮＨ−、および−Ｓ−より選択され；
Ｂは、存在しないか、または−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ＝Ｎ（ＯＨ）−、−Ｓ（Ｏ２）−、−ＮＨＳ（Ｏ２）−、−Ｓ（Ｏ２）ＮＨ−、−Ｓ（Ｏ）−、
−ＮＨＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ＮＨ−；−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｓ−、＝ＮＨ−Ｏ−、＝ＮＨ−ＮＨ−および＝ＮＨ−Ｎ（Ｃ１−Ｃ２０アルキル）−より選択され；
Ｒ２は：脂肪酸、直鎖または分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル−Ｎ３、シクロオクチニル、フルオロフォア、多糖、−ＣＨ（ＯＣＨ３）２、
【００１２】
【化３】
0006739333.tif 000004
【００１３】
からなる群より選択され；
各ｎは０〜６より独立に選択される整数であり；
各ＱはＨおよびＮＯ２より選択される。
【００１４】
いくつかの態様において、該方法にはまた、ターゲットタンパク質のｐＨ環境を、７より大きいｐＨに調節し；そしてシステイン残基を有する分子と修飾タンパク質を接触させる工程がさらに含まれる。
【００１５】
いくつかの態様において、システイン残基を有する分子は、Ｎ５−（（Ｒ）−１−（（カルボキシメチル）アミノ）−３−メルカプト−１−オキソプロパン−２−イル）−Ｌ−グルタミンである。
【００１６】
いくつかの態様において、微生物トランスグルタミナーゼは味の素の微生物トランスグルタミナーゼＴＩである。いくつかの態様において、タンパク質はキャリアータンパク質である。いくつかの態様において、タンパク質はＣＲＭ１９７である。いくつかの態様において、タンパク質は：細菌毒素、細菌毒素断片、解毒細菌毒素、抗体、および抗体断片より選択される。
【００１７】
いくつかの態様において、方法には、Ｒ１基を生体相互作用剤または分析剤と反応させる工程がさらに含まれる。
【００１８】
いくつかの態様において、方法には、Ｒ２基を生体相互作用剤または分析剤と反応させる工程がさらに含まれる。いくつかの態様において、分析剤は標識である。いくつかの態様において、方法には、標識を検出する工程がさらに含まれる。
【００１９】
別の側面において、開示するプロセスによって調製されるコンジュゲートもまた開示する。別の側面において、開示するプロセスによって調製される療法タンパク質を開示する。別の側面において、開示するプロセスによって調製される画像化剤を開示する。別の側面において、開示するプロセスによって調製される標識ツールを開示する。
【００２０】
別の側面において、式Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（Ａ−Ｗ−Ｂ−Ｒ２）ｚの化合物が開示され、式中、Ｒ１、ｘ、ｙ、Ａ、Ｗ、Ｂ、Ｒ２およびｚは本明細書に記載する意味を有する。
【００２１】
１つの側面において、タンパク質を修飾するための方法を開示する。該方法には、少なくとも１つのリジン残基を有するターゲットタンパク質を提供し；微生物トランスグルタミナーゼの存在下で、式Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（ＮＨ−Ｗ−Ｒ２）ｚを有する修飾化合物とターゲットタンパク質を接触させる工程が含まれ；式中、ｘは０または１であり；ｙは０または１であり；ｚは０または１であり；Ｒ１は：アセチル、
【００２２】
【化４】
0006739333.tif 000005
【００２３】
からなる群より選択され；
Ｗは：約４０〜約８０，０００ａｍｕの間の分子量を有するＣ１−Ｃ６直鎖または分枝鎖アルキルまたはポリエチレングリコールより選択され；
Ｒ２は：直鎖または分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル−Ｎ３、シクロオクチニル、フルオロフォア、多糖、
【００２４】
【化５】
0006739333.tif 000006
【００２５】
からなる群より選択されて、修飾タンパク質を形成する。
【００２６】
いくつかの態様において、ｘは１である。いくつかの態様において、Ｒ１は、アセチル、
【００２７】
【化６】
0006739333.tif 000007
【００２８】
より選択される。
【００２９】
いくつかの態様において、Ｒ１はアセチルである。いくつかの態様において、Ｒ１は
【００３０】
【化７】
0006739333.tif 000008
【００３１】
である。いくつかの態様において、Ｒ１は
【００３２】
【化８】
0006739333.tif 000009
【００３３】
である。
【００３４】
いくつかの態様において、ｙは１であり、そしてｚは０である。いくつかの態様において、ｙは１であり、そしてｚは１である。
【００３５】
いくつかの態様において、ＷはＣ１−Ｃ６直鎖または分枝鎖アルキルより選択される。いくつかの態様において、ＷはＣ２直鎖アルキルである。いくつかの態様において、Ｒ２は
【００３６】
【化９】
0006739333.tif 000010
【００３７】
である。
【００３８】
いくつかの態様において、ｘは０であり、ｙは１であり、そしてＲ１は
【００３９】
【化１０】
0006739333.tif 000011
【００４０】
である。
【００４１】
いくつかの態様において、ｘは０であり、そしてＲ１は
【００４２】
【化１１】
0006739333.tif 000012
【００４３】
である。
【００４４】
いくつかの態様において、ｙは０であり、そしてｚは１である。いくつかの態様において、ｙは１であり、そしてｚは１である。
【００４５】
いくつかの態様において、ＷはＣ１−Ｃ６直鎖または分枝鎖アルキルより選択される。いくつかの態様において、ＷはＣ２直鎖アルキルである。いくつかの態様において、ＷはＣ５直鎖アルキルである。いくつかの態様において、Ｗは、約４０〜約３０００ａｍｕの間の分子量を有する、直鎖または分枝鎖ポリエチレングリコールである。いくつかの態様において、Ｗは、約４０〜約８０ａｍｕの間の分子量を有する、直鎖ポリエチレングリコールである。
【００４６】
いくつかの態様において、Ｒ２は直鎖または分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル−Ｎ３である。いくつかの態様において、Ｒ２はＣ２−アルキル−Ｎ３である。いくつかの態様において、Ｒ２はシクロオクチニルである。いくつかの態様において、Ｒ２は
【００４７】
【化１２】
0006739333.tif 000013
【００４８】
である。いくつかの態様において、Ｒ２は
【００４９】
【化１３】
0006739333.tif 000014
【００５０】
である。いくつかの態様において、Ｒ２はフルオロフォアである。いくつかの態様において、フルオロフォアは：アレクサ６４７、アレクサ７５０、アレクサ４８８、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ローダミン、およびフルオレセインより選択される。いくつかの態様において、フルオロフォアは、式
【００５１】
【化１４】
0006739333.tif 000015
【００５２】
のものであり、式中、ｎは１〜３であり、そして各ｍは１〜２である。いくつかの態様において、ｎは１である。いくつかの態様において、ｎは２である。いくつかの態様において、ｎは３である。いくつかの態様において、１つのｍは１であり、そしてもう一方のｍは２である。いくつかの態様において、ｍはどちらも１である。いくつかの態様において、ｍはどちらも２である。いくつかの態様において、Ｒ２は
【００５３】
【化１５】
0006739333.tif 000016
【００５４】
である。いくつかの態様において、Ｒ２は多糖である。いくつかの態様において、多糖は、ＧＢＳＩＩ、ＧＢＳＶ、およびＭｅｎＡより選択される。いくつかの態様において、Ｒ２はＧＢＳＩＩである。いくつかの態様において、Ｒ２はＧＢＳＶである。いくつかの態様において、Ｒ２はＭｅｎＡである。
【００５５】
いくつかの態様において、方法には、ターゲットタンパク質のｐＨ環境を、７より大きいｐＨに調節し；そしてシステイン残基を有する分子と修飾タンパク質を接触させる工程が含まれる。いくつかの態様において、システイン残基を有する分子は、Ｎ５−（（Ｒ）−１−（（カルボキシメチル）アミノ）−３−メルカプト−１−オキソプロパン−２−イル）−Ｌ−グルタミンである。
【００５６】
いくつかの態様において、微生物トランスグルタミナーゼは味の素の微生物トランスグルタミナーゼＴＩである。
【００５７】
いくつかの態様において、タンパク質はキャリアータンパク質である。いくつかの態様において、タンパク質はＣＲＭ１９７である。いくつかの態様において、タンパク質は：細菌毒素、細菌毒素断片、解毒細菌毒素、抗体、および抗体断片より選択される。
【００５８】
いくつかの態様において、方法にはまた、Ｒ１基を生体相互作用剤または分析剤と反応させる工程がさらに含まれる。いくつかの態様において、方法には、Ｒ２基を生体相互作用剤または分析剤と反応させる工程が含まれる。いくつかの態様において、分析剤は標識である。いくつかの態様において、方法にはまた、標識を検出する工程がさらに含まれる。
【００５９】
別の側面において、本明細書に開示する方法から調製されるコンジュゲートを開示する。別の側面において、本明細書に開示するコンジュゲートまたは修飾タンパク質で調製される、ワクチンを開示する。別の側面において、本明細書に開示する修飾タンパク質を有する、療法タンパク質を開示する。別の側面において、本明細書に開示する修飾タンパク質を有する、画像化剤を開示する。別の側面において、本明細書に開示する修飾タンパク質を有する、標識ツールを開示する。
【００６０】
別の側面において、式Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（ＮＨ−Ｗ−Ｒ２）ｚの化合物を開示し、式中、ｘは０または１であり；ｙは０または１であり；ｚは０または１であり；Ｒ１は：アセチル、
【００６１】
【化１６】
0006739333.tif 000017
【００６２】
からなる群より選択され；Ｗは、約４０〜約８０，０００ａｍｕの間の分子量を有するＣ１−Ｃ６直鎖または分枝鎖アルキルまたはポリエチレングリコールより選択され；Ｒ２は：直鎖または分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル−Ｎ３、シクロオクチニル、フルオロフォア、多糖、
【００６３】
【化１７】
0006739333.tif 000018
【００６４】
からなる群より選択される。
【００６５】
いくつかの態様において、化合物は：
【００６６】
【化１８−１】
0006739333.tif 000019
【００６７】
【化１８−２】
0006739333.tif 000020
【００６８】
【化１８−３】
0006739333.tif 000021
【００６９】
【化１８−４】
0006739333.tif 000022
【００７０】
【化１８−５】
0006739333.tif 000023
【００７１】
からなる群より選択される。
【００７２】
いくつかの態様において、本明細書に開示するコンジュゲートタンパク質および化合物を含む、化合物のコンジュゲートを開示する。いくつかの態様において、コンジュゲートタンパク質はＣＲＭ１９７である。いくつかの態様において、コンジュゲートタンパク質はＧＢＳ８０である。
【００７３】
いくつかの態様において、本明細書に開示するコンジュゲートを含むワクチンを開示する。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、微生物トランスグルタミナーゼによって触媒される、タンパク質（ＣＲＭ１９７）と反応するタンパク質修飾基の付加を示す合成図である。
【図２】図２は、本発明の化合物を用いた、ＣＲＭ１９７とＭｅｎＡ多糖のコンジュゲート化を特徴付けるＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル電気泳動である。
【図３】図３は、本発明の化合物を用いた、ＣＲＭ１９７とＧＢＳ８０抗原性多糖の部位選択的コンジュゲート化を特徴付けるＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル電気泳動であり、レーン１はＭＷであり、レーン２はＧＢＳ８０−Ｋ−Ｎ３であり、レーン３はＧＢＳ８０−Ｋ−Ｎ３／ＰＳＶ  １ｍｇタンパク質であり、レーン４はＧＢＳ８０−Ｋ−Ｎ３／ＰＳＶ  １ｍｇタンパク質であり、そしてレーン５はＧＢＳ８０−Ｋ−Ｎ３／ＰＳＶ  １ｍｇタンパク質である。
【図４】図４は、本発明の化合物を用いた、ＣＲＭ１９７とのコンジュゲート化ＧＢＳ８０抗原性多糖の生じた反応を特徴付けるＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル電気泳動であり、レーン１はＭＷであり、レーン２はＧＢＳ８０−Ｋ−Ｎ３であり、レーン３はＧＢＳ８０−Ｋ−Ｎ３／ＰＳＩＩ  １ｍｇタンパク質であり、レーン４はＧＢＳ８０−Ｋ−Ｎ３／ＰＳＩＩ  １ｍｇタンパク質であり、そしてレーン５はＧＢＳ８０−Ｋ−Ｎ３／ＰＳＩＩ  １ｍｇタンパク質である。
【図５】図５は、ＧＢＳ  ＩＩ多糖抗原に対するＩｇ力価の決定に関するＥＬＩＳＡイムノアッセイ結果を示し、ここで、ＥＬＩＳＡ抗ＰＳＩＩ  ＩｇＧおよび生存結果は、ＰＳの１．０μｇ用量のものである。
【図６】図６は、ＧＢＳ  Ｖ多糖抗原に対するＩｇ力価の決定に関するＥＬＩＳＡイムノアッセイ結果を示し、ここで、ＥＬＩＳＡ抗ＰＳＶ  ＩｇＧおよび生存結果は、ＰＳの１．０μｇ用量のものである。
【図７】図７は、ＧＢＳ株を用いたオプソニン化貪食作用アッセイ結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
特許、特許公報、および他の文献に対して行われるすべての言及は、法律によって許容されうる度合いまで、これらが本開示に援用されるよう行われる。
【００７６】
本発明は、慣用的な化学法を用いながら、修飾化合物との反応を通じて、選択的方式で、ターゲットタンパク質に修飾化合物を導入する方法を提供することによって、前述の必要性に取り組む。方法を、一般的に、図１に示す。ターゲットタンパク質（例えばＣＲＭ１９７）由来のリジン残基は、式（Ｉ）：Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（Ａ−Ｗ−Ｂ−Ｒ２）ｚまたは式（ＩＩ）：Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（ＮＨ−Ｗ−Ｒ２）ｚの修飾化合物由来のグルタミン残基（Ｇｌｎ）と反応する。生じる産物は、さらなる化学官能化が可能な１またはそれより多い基を有するタンパク質である。
【００７７】
１つの側面において、タンパク質を修飾するためのプロセスには：（ａ）微生物トランスグルタミナーゼの触媒作用によって、補助タンパク質および修飾化合物間で活性化複合体を形成し；（ｂ）修飾化合物を活性化複合体からターゲットタンパク質にトランスファーし、それによって修飾タンパク質を生成する工程が含まれる。こうしたものとして、「修飾タンパク質」は、本明細書において、微生物トランスグルタミナーゼを用いて、修飾化合物を付加することによって選択的に修飾されている、タンパク質またはポリペプチドを指す。
【００７８】
いくつかの態様において、方法には、少なくとも２つのリジン残基を有するターゲットタンパク質と修飾化合物の、トランスグルタミナーゼが触媒する反応が含まれる。修飾化合物は、式（Ｉ）：Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（Ａ−Ｗ−Ｂ−Ｒ２）ｚまたは式（ＩＩ）：Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（ＮＨ−Ｗ−Ｒ２）ｚのグルタミン含有タンパク質である。
【００７９】
このプロセスにおいて、活性化アシル複合体は、修飾化合物を付着させるため、微生物トランスグルタミナーゼとともに、修飾化合物中のグルタミン残基を反応させることによって、形成される。１つの態様において、修飾化合物を、アシル化によって、ターゲットタンパク質中のリジン残基にトランスファーする。１つの態様において、Ｒ１およびＲ１は、これらのうち少なくとも１つが、さらなる修飾に適した化学基を有する場合、望ましい置換基である。したがって、プロセスは、ターゲットタンパク質中のリジン残基を選択的に修飾するため、微生物トランスグルタミナーゼ反応を伴う。
【００８０】
本明細書において、用語「ａｍｕ」は、しばしば、ダルトン単位とも称される原子量単位の略語である。
【００８１】
本明細書において、用語「ポリペプチド」は、天然または合成のいずれで産生される場合であっても、ペプチド結合によって連結されるアミノ酸残基のポリマーを指す。約１０アミノ酸残基未満のポリペプチドは、一般に、「ペプチド」と称される。用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結される２またはそれより多いアミノ酸の配列を示すよう意図され、ここで、前記アミノ酸は、天然であってもまたは非天然であってもよい。該用語は、用語、ポリペプチドおよびタンパク質を含み、これらは、共有相互作用、例えばシステイン架橋、または非共有相互作用によってともに保持される２またはそれより多いペプチドからなることも可能である。
【００８２】
「タンパク質」は、１またはそれより多いポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質はまた、非ペプチド構成要素、例えば炭水化物基も含むことも可能である。炭水化物および他の非ペプチド置換基は、タンパク質が産生される細胞によって、タンパク質に付加されることも可能であり、そしてこれは細胞タイプによって多様であろう。タンパク質は、本明細書において、アミノ酸主鎖構造によって定義され；炭水化物基などの置換基は、一般的に明記されないが、にもかかわらず存在することも可能である。非宿主ＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質またはポリペプチドは、「異種」タンパク質またはポリペプチドである。
【００８３】
「単離ポリペプチド」は、本質的に、天然に該ポリペプチドと関連する細胞構成要素、例えば炭水化物、脂質、または他のタンパク質性不純物を本質的に含まないポリペプチドである。典型的には、単離ポリペプチドの調製物は、非常に純粋な型、すなわち少なくとも約８０％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、９５％より純粋、例えば、９６％、９７％、または９８％もしくはそれよりも純粋、あるいは９９％より純粋なポリペプチドを含有する。特定のタンパク質調製物が単離ポリペプチドを含有することを示す１つの方法は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および該ゲルのクーマシーブリリアントブルー染色後の単一バンドの出現による。しかし、用語「単離」は、別の物理的型にある同じポリペプチド、例えば二量体あるいは別のグリコシル化または誘導体化型の存在を排除しない。
【００８４】
用語「アミノ末端」および「カルボキシル末端」は、本明細書において、ポリペプチド内の位置を示すために用いられる。文脈が許す場合、これらの用語は、特定の配列またはポリペプチドの位に言及した際、近位性または相対的位置を示すように用いられる。例えば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端側に位置する特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、必ずしも全ポリペプチドのカルボキシル末端にある必要はない。
【００８５】
「生体相互作用剤」は、本明細書において、生存組織または細胞内に導入された際、生物学的反応を誘発する、有機部分または化合物を指す。生体相互作用剤の例には、抗原、毒素、療法タンパク質等が含まれる。生体相互作用剤は、小分子および巨大分子であることも可能である。
【００８６】
「分析剤」は、本明細書において、分析剤が結合するかまたは別の方式で関連する物質を、定性的にまたは定量的に性質決定するための機器法によって検出可能な有機部分または化合物を指す。こうした分析剤の例には、例えばフルオロフォアまたは放射標識などの標識が含まれる。
【００８７】
本明細書において、用語「アルキル」は、直鎖または分枝鎖である、Ｃ１−Ｃ４５アルキル基である。いくつかの態様において、アルキルは、Ｃ１−Ｃ２０である。いくつかの態様において、アルキルは、Ｃ１−Ｃ１２である。いくつかの態様において、アルキルは、Ｃ１−Ｃ６である。アルキルが、本明細書に論じる式ＩおよびＩＩのＷのように、基として定義される場合、これはまた、隣接基での１つの置換、または２つの隣接基間の２つの置換があるような、アルキレンとしても知られうることを理解すべきである。
【００８８】
本明細書において、用語「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、約４０〜約８０，０００ａｍｕの間の分子量を有する反復（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎサブユニットを含むポリエーテル化合物を指し、ここで、ｎは、反復エーテルサブユニット数を表す整数である。ポリエチレングリコールが、本明細書に論じる式ＩおよびＩＩのＷのように、基として定義される場合、末端に未結合アルコール基があってもよい、隣接基での１つの置換、または２つの隣接基間の２つの置換があることを理解すべきである。
【００８９】
トランスグルタミナーゼ
上述のように、修飾化合物をターゲットタンパク質に共有結合するためには、触媒を用いなければならない。触媒は、微生物トランスグルタミナーゼ（また、本明細書において、交換可能に「ｍＴＧアーゼ」とも称される）でなければならない。触媒はまた、微生物供給源由来のタンパク質−グルタミン−γ−グルタミルトランスフェラーゼとしても知られ、そしてタンパク質またはタンパク質鎖中のグルタミン（Ｇｌｎ）残基のγ−カルボキシアミド基およびリジン残基（Ｌｙｓ）または多様なアルキルアミンのε−アミノ基の間のアシルトランスファー反応を触媒する。
【００９０】
本発明の方法において使用しようとするトランスグルタミナーゼは、特定の限定なしに、多様な微生物起源から得られうる。有用な微生物トランスグルタミナーゼの例には、例えば、ストレプトミセス・モバラエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）、ストレプトミセス・シナモネウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ）、およびストレプトミセス・グリセオカルネウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｃａｒｎｅｕｍ）（すべて、本明細書に援用されるＵ．Ｓ．  ５，１５６，９５６に開示される）、ならびにストレプトミセス・ラベンデュラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）（本明細書に援用されるＵ．Ｓ．  ５，２５２，４６９に援用される）、ならびにストレプトミセス・ラダカヌム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｄａｋａｎｕｍ）（本明細書に援用されるＪＰ２００３１９９５６９）由来のトランスグルタミナーゼが含まれる。以前のストレプトベルティシリウム属（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）のメンバーが、現在、ストレプトミセス属に含まれることに注目すべきである［Ｋａｅｍｐｆｅｒ，  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １３７，  １８３１−１８９２，  １９９１］。他の有用な微生物トランスグルタミナーゼが、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（本明細書に援用されるＵ．Ｓ．  ５，７３１，１８３に開示される）および多様な粘菌類（Ｍｙｘｏｍｙｃｅｔｅｓ）から単離されてきている。有用な微生物トランスグルタミナーゼの他の例は、ＷＯ  ９６／０６９３１（例えば、バチルス・リディクス（Ｂａｃｉｌｕｓ  ｌｙｄｉｃｕｓ）由来のトランスグルタミナーゼ）およびＷＯ  ９６／２２３６６に開示されるものであり、これらはどちらも本明細書に援用される。
【００９１】
修飾化合物
開示する方法に使用可能である修飾化合物は、一般式：（Ｉ）：Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（Ａ−Ｗ−Ｂ−Ｒ２）ｚまたは式（ＩＩ）：Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（ＮＨ−Ｗ−Ｒ２）ｚのグルタミン含有タンパク質であり、式中、Ｌｅｕは存在するかまたは存在しない（すなわちｘがそれぞれ１または０である場合）アミノ酸ロイシン（例えばＬ−ロイシン）を指し；Ｇｌｎはアミノ酸グルタミン（例えばＬ−グルタミン）を指し；Ｇｌｙは存在するかまたは存在しない（すなわちｙがそれぞれ１または０である場合）アミノ酸残基グリシン（例えばＬ−グリシン）を指す。
【００９２】
いくつかの態様において、ｘは０である。いくつかの態様において、ｘは１である。いくつかの態様において、ｙは０である。いくつかの態様において、ｙは１である。いくつかの態様において、ｚは０である。いくつかの態様において、ｚは１である。
【００９３】
いくつかの態様において、Ｒ１はアセチルである。いくつかの態様において、Ｒ１は
【００９４】
【化１９】
0006739333.tif 000024
【００９５】
である。いくつかの態様において、Ｒ１は
【００９６】
【化２０】
0006739333.tif 000025
【００９７】
である。いくつかの態様において、ＱはＨである。いくつかの態様において、Ｑは−ＮＯ２である。いくつかの態様において、ｎは０である。いくつかの態様において、ｎは１である。いくつかの態様において、ｎは２である。いくつかの態様において、ｎは３である。いくつかの態様において、ｎは４である。いくつかの態様において、ｎは５である。いくつかの態様において、ｎは６である。いくつかの態様において、Ｒ４はＨである。いくつかの態様において、Ｒ４は−Ｎ３である。いくつかの態様において、Ｒ４は
【００９８】
【化２１】
0006739333.tif 000026
【００９９】
である。
【０１００】
いくつかの態様において、Ｒ１は
【０１０１】
【化２２】
0006739333.tif 000027
【０１０２】
である。いくつかの態様において、Ｒ１は
【０１０３】
【化２３】
0006739333.tif 000028
【０１０４】
である。いくつかの態様において、Ｒ１は
【０１０５】
【化２４】
0006739333.tif 000029
【０１０６】
である。いくつかの態様において、Ｒ１は
【０１０７】
【化２５】
0006739333.tif 000030
【０１０８】
である。いくつかの態様において、Ｒ１は
【０１０９】
【化２６】
0006739333.tif 000031
【０１１０】
である。いくつかの態様において、Ｒ１は
【０１１１】
【化２７】
0006739333.tif 000032
【０１１２】
である。
【０１１３】
いくつかの態様において、ＷはＣ１−Ｃ６直鎖または分枝鎖アルキルである。いくつかの態様において、Ｗは、約４０〜約８０，０００ａｍｕの間の分子量を有するポリエチレングリコールである。
【０１１４】
いくつかの態様において、Ａは存在しない。いくつかの態様において、Ａは−Ｏ−である。いくつかの態様において、Ａは−ＮＨ−である。いくつかの態様において、Ａは−Ｓ−である。
【０１１５】
いくつかの態様において、Ｂは存在しない。いくつかの態様において、Ｂは−Ｏ−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｃ（Ｏ）−である。いくつかの態様において、Ｂは−ＮＨ−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。いくつかの態様において、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）−である。いくつかの態様において、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの態様において、Ｂは−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−である。いくつかの態様において、Ｂは−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｃ＝Ｎ（ＯＨ）−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｓ（Ｏ２）−である。いくつかの態様において、Ｂは−ＮＨＳ（Ｏ２）−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｓ（Ｏ２）ＮＨ−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｓ（Ｏ）−である。いくつかの態様において、Ｂは−ＮＨＳ（Ｏ）−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｓ（Ｏ）ＮＨ−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの態様において、Ｂは−ＯＣ（Ｏ）−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｓ−である。いくつかの態様において、Ｂは＝ＮＨ−Ｏ−である。いくつかの態様において、Ｂは＝ＮＨ−ＮＨ−である。いくつかの態様において、Ｂは＝ＮＨ−Ｎ（Ｃ１−Ｃ２０アルキル）−である。
【０１１６】
いくつかの態様において、Ｒ２は脂肪酸である。いくつかの態様において、脂肪酸は、以下の式Ａ１、Ａ２またはＡ３：
【０１１７】
【化２８】
0006739333.tif 000033
【０１１８】
のものであってもよく、式中、Ｒ１１はＣＯ２ＨまたはＨであり；
Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は、互いに独立に、Ｈ、ＯＨ、ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ２または
−Ｃ＝ＣＨであり；
Ａｋは分枝鎖Ｃ６−Ｃ３０アルキレンであり；
ｐ、ｑ、およびｒは、互いに独立に、６〜３０の間の整数である；
あるいはそのアミド、エステルまたは薬学的に許容されうる塩である。
【０１１９】
いくつかの態様において、Ｒ２は、直鎖または分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル−Ｎ３である。いくつかの態様において、Ｒ２はシクロオクチニルである。いくつかの態様において、Ｒ２はフルオロフォアである。いくつかの態様において、フルオロフォアは、式
【０１２０】
【化２９】
0006739333.tif 000034
【０１２１】
のものであり、式中、ｎは１〜３であり、そして各ｍは１〜２である。いくつかの態様において、ｎは１である。いくつかの態様において、ｎは２である。いくつかの態様において、ｎは３である。いくつかの態様において、１つのｍは１であり、そしてもう一方のｍは２である。いくつかの態様において、ｍはどちらも１である。いくつかの態様において、ｍはどちらも２である。いくつかの態様において、Ｒ２は多糖である。いくつかの態様において、Ｒ２は−ＣＨ（ＯＣＨ３）２である。いくつかの態様において、Ｒ２は
【０１２２】
【化３０】
0006739333.tif 000035
【０１２３】
である。いくつかの態様において、Ｒ２は
【０１２４】
【化３１】
0006739333.tif 000036
【０１２５】
である。いくつかの態様において、Ｒ２は
【０１２６】
【化３２】
0006739333.tif 000037
【０１２７】
である。いくつかの態様において、Ｒ２は
【０１２８】
【化３３】
0006739333.tif 000038
【０１２９】
である。いくつかの態様において、Ｒ２は
【０１３０】
【化３４】
0006739333.tif 000039
【０１３１】
である。
【０１３２】
いくつかの態様において、Ｒ２は
【０１３３】
【化３５】
0006739333.tif 000040
【０１３４】
である。いくつかの態様において、ＱはＨである。いくつかの態様において、Ｑは−ＮＯ２である。いくつかの態様において、ｎは０である。いくつかの態様において、ｎは１〜６である。いくつかの態様において、ｎは１である。いくつかの態様において、ｎは２である。いくつかの態様において、ｎは３である。いくつかの態様において、ｎは４である。いくつかの態様において、ｎは５である。いくつかの態様において、ｎは６である。
【０１３５】
いくつかの態様において、Ｒ２は
【０１３６】
【化３６】
0006739333.tif 000041
【０１３７】
である。いくつかの態様において、ｎは０である。いくつかの態様において、ｎは１〜６である。いくつかの態様において、ｎは１である。いくつかの態様において、ｎは２である。いくつかの態様において、ｎは３である。いくつかの態様において、ｎは４である。いくつかの態様において、ｎは５である。いくつかの態様において、ｎは６である。
【０１３８】
いくつかの態様において、Ｒ２は
【０１３９】
【化３７】
0006739333.tif 000042
【０１４０】
である。いくつかの態様において、ｎは０である。いくつかの態様において、ｎは１〜６である。いくつかの態様において、ｎは１である。いくつかの態様において、ｎは２である。いくつかの態様において、ｎは３である。いくつかの態様において、ｎは４である。いくつかの態様において、ｎは５である。いくつかの態様において、ｎは６である。
【０１４１】
いくつかの態様において、Ｒ２は
【０１４２】
【化３８】
0006739333.tif 000043
【０１４３】
である。いくつかの態様において、Ｒ２は
【０１４４】
【化３９】
0006739333.tif 000044
【０１４５】
である。
【０１４６】
式ＩＩの化合物において、以下に示すＲ２基には、すでに、上記式ＩにおけるＢを取り込むいくつかの態様が含まれる。
【０１４７】
いくつかの態様において、ｎは０である。いくつかの態様において、ｎは１である。いくつかの態様において、ｎは２である。いくつかの態様において、ｎは３である。いくつかの態様において、ｎは４である。いくつかの態様において、ｎは５である。いくつかの態様において、ｎは６である。
【０１４８】
いくつかの態様において、Ｒ１は、アセチル、
【０１４９】
【化４０】
0006739333.tif 000045
【０１５０】
より選択される。いくつかの態様において、Ｒ１は、アセチル、
【０１５１】
【化４１】
0006739333.tif 000046
【０１５２】
より選択される。いくつかの態様において、Ｒ１は、アセチル、
【０１５３】
【化４２】
0006739333.tif 000047
【０１５４】
より選択される。いくつかの態様において、Ｒ１は、アセチル、
【０１５５】
【化４３】
0006739333.tif 000048
【０１５６】
より選択される。いくつかの態様において、Ｒ１は、
【０１５７】
【化４４】
0006739333.tif 000049
【０１５８】
より選択される。
【０１５９】
いくつかの態様において、Ｒ１は、アセチルおよび
【０１６０】
【化４５】
0006739333.tif 000050
【０１６１】
より選択される。いくつかの態様において、Ｒ１は、アセチルおよび
【０１６２】
【化４６】
0006739333.tif 000051
【０１６３】
より選択される。いくつかの態様において、Ｒ１は、アセチルおよび
【０１６４】
【化４７】
0006739333.tif 000052
【０１６５】
より選択される。いくつかの態様において、Ｒ１は、
【０１６６】
【化４８】
0006739333.tif 000053
【０１６７】
より選択される。いくつかの態様において、Ｒ１は、アセチル、
【０１６８】
【化４９】
0006739333.tif 000054
【０１６９】
より選択される。いくつかの態様において、Ｒ１は、
【０１７０】
【化５０】
0006739333.tif 000055
【０１７１】
より選択される。
【０１７２】
いくつかの態様において、Ｒ１は、アセチルである。いくつかの態様において、Ｒ１は、
【０１７３】
【化５１】
0006739333.tif 000056
【０１７４】
である。いくつかの態様において、Ｒ１は、
【０１７５】
【化５２】
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【０１７６】
である。いくつかの態様において、Ｒ１は、
【０１７７】
【化５３】
0006739333.tif 000058
【０１７８】
である。
【０１７９】
さらに、多官能基Ａ−Ｗ−Ｂ−Ｒ２またはＮＨ−Ｗ−Ｒ２が存在していてもまたは存在しなくてもよい（すなわちｚがそれぞれ１または０である）。ＮＨ−Ｗ−Ｒ２を有する態様において、Ｗは、約４０〜約８０，０００ａｍｕの間の分子量を有する、Ｃ１−Ｃ６直鎖または分枝鎖アルキルあるいは直鎖または分枝鎖ポリエチレングリコールより選択される。いくつかの態様において、ＷはＣ１−Ｃ６直鎖アルキルより選択される。いくつかの態様において、ＷはＣ１−Ｃ６分枝鎖アルキルより選択される。いくつかの態様において、Ｗは、約４０〜約１０，０００ａｍｕの間の分子量を有する直鎖ポリエチレングリコールより選択される。いくつかの態様において、Ｗは、約４０〜約３，０００ａｍｕの間の分子量を有する直鎖ポリエチレングリコールより選択される。いくつかの態様において、Ｗは、約４０〜約８０ａｍｕの間の分子量を有する直鎖ポリエチレングリコールより選択される。いくつかの態様において、Ｗは、約２，０００〜約８０，０００ａｍｕの間の分子量を有する、直鎖または分枝鎖ポリエチレングリコールより選択される。いくつかの態様において、ポリエチレングリコールは、試薬と反応して、別のヘテロ原子、炭素、カルボニル、スルホニル、チオニル等と結合を形成することが可能なヘテロ原子（例えば酸素、窒素、またはイオウ）で官能化されている。
【０１８０】
Ａ−Ｗ−Ｂ−Ｒ２を有する態様において、Ｗは、約４０〜約８０，０００ａｍｕの間の分子量を有する、Ｃ１−Ｃ６直鎖または分枝鎖アルキルあるいは直鎖または分枝鎖ポリエチレングリコールより選択される。いくつかの態様において、ＷはＣ１−Ｃ６直鎖アルキルより選択される。いくつかの態様において、ＷはＣ１−Ｃ６分枝鎖アルキルより選択される。いくつかの態様において、Ｗは、約４０〜約１０，０００ａｍｕの間の分子量を有する直鎖ポリエチレングリコールより選択される。いくつかの態様において、Ｗは、約４０〜約３，０００ａｍｕの間の分子量を有する直鎖ポリエチレングリコールより選択される。いくつかの態様において、Ｗは、約４０〜約８０ａｍｕの間の分子量を有する直鎖ポリエチレングリコールより選択される。いくつかの態様において、Ｗは、約２，０００〜約８０，０００ａｍｕの間の分子量を有する、直鎖または分枝鎖ポリエチレングリコールより選択される。
【０１８１】
いくつかの態様において、Ａは存在しない。いくつかの態様において、Ａは−Ｏ−である。いくつかの態様において、Ａは−ＮＨ−である。いくつかの態様において、Ａは−Ｓ−である。
【０１８２】
いくつかの態様において、Ｂは存在しない。いくつかの態様において、Ｂは−Ｏ−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｃ（Ｏ）−である。いくつかの態様において、Ｂは−ＮＨ−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。いくつかの態様において、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）−である。いくつかの態様において、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの態様において、Ｂは−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−である。いくつかの態様において、Ｂは−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｃ＝Ｎ（ＯＨ）−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｓ（Ｏ２）−である。いくつかの態様において、Ｂは−ＮＨＳ（Ｏ２）−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｓ（Ｏ２）ＮＨ−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｓ（Ｏ）−である。いくつかの態様において、Ｂは−ＮＨＳ（Ｏ）−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｓ（Ｏ）ＮＨ−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの態様において、Ｂは−ＯＣ（Ｏ）−である。いくつかの態様において、Ｂは−Ｓ−である。いくつかの態様において、Ｂは＝ＮＨ−Ｏ−である。いくつかの態様において、Ｂは＝ＮＨ−ＮＨ−である。いくつかの態様において、Ｂは＝ＮＨ−Ｎ（Ｃ１−Ｃ２０アルキル）−である。
【０１８３】
いくつかの態様において、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ３直鎖または分枝鎖アルキル−Ｎ３、シクロオクチニル、フルオロフォア、
【０１８４】
【化５４】
0006739333.tif 000059
【０１８５】
、および多糖より選択される。
【０１８６】
いくつかの態様において、Ｒ２は分枝鎖または直鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル−Ｎ３である。いくつかの態様において、Ｒ２は分枝鎖Ｃ３アルキル−Ｎ３である。いくつかの態様において、Ｒ２は直鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル−Ｎ３である。いくつかの態様において、Ｒ２はＣ１アルキル−Ｎ３である。いくつかの態様において、Ｒ２はＣ２アルキル−Ｎ３である。いくつかの態様において、Ｒ２は分枝鎖Ｃ３アルキル−Ｎ３である。
【０１８７】
いくつかの態様において、Ｒ２はシクロオクチニルである。アルキレン官能基に対する付着点は、アルキレンが続いて反応または官能化可能である限り、いかなる位であってもよい。例えば、Ｒ２を第３位でＷまたはＢに連結してもよく、すなわち
【０１８８】
【化５５】
0006739333.tif 000060
【０１８９】
でもよく；第４位でＷまたはＢに連結してもよく、すなわち
【０１９０】
【化５６】
0006739333.tif 000061
【０１９１】
でもよく；あるいは第５位でＷまたはＢに連結してもよく、すなわち
【０１９２】
【化５７】
0006739333.tif 000062
【０１９３】
でもよい。
【０１９４】
いくつかの態様において、Ｒ２はフルオロフォアである。適切なフルオロフォアには、光励起に際して、光を再放出可能であるものが含まれる。典型的には、フルオロフォアは、芳香族基に存在するようなコンジュゲート化パイ結合をいくつか含有する。例には、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ色素、例えばＣｙ５およびＣｙ７、Ａｌｅｘａ色素、例えばＡｌｅｘａ  ７５０、Ａｌｅｘａ  ６４７、およびＡｌｅｘａ  ４８８、クマリン等が含まれる。
【０１９５】
いくつかの態様において、Ｒ２は
【０１９６】
【化５８】
0006739333.tif 000063
【０１９７】
である。
【０１９８】
いくつかの態様において、Ｒ２は
【０１９９】
【化５９】
0006739333.tif 000064
【０２００】
である。
【０２０１】
いくつかの態様において、Ｒ２は
【０２０２】
【化６０】
0006739333.tif 000065
【０２０３】
であり、これは、ＮＨ−Ｗ−Ｒ２中のＷにカルボニルを通じて連結された細胞傷害性ＭＭＡＦに対応する。
【０２０４】
多官能基Ａ−Ｗ−Ｂ−Ｒ２またはＮＨ−Ｗ−Ｒ２が存在しない場合、グルタミンまたはグリシンいずれかである隣接するアミノ酸残基は該残基のカルボン酸（修飾化合物のペプチド主鎖のＣ末端）で終結する。
【０２０５】
多糖
いくつかの態様において、Ｒ２は多糖である。多糖は、いかなる抗原性多糖、特に病原性生物由来の多糖であってもよい。これらの多糖のコンジュゲートは、病原性生物によって引き起こされる感染に対して被験体を免疫するために有用である可能性もある。例示的な多糖を以下に記載する。特に、多糖は、細菌多糖、例えば細菌莢膜多糖であることも可能である。代表的な細菌多糖を表１に記載する。
【０２０６】
表Ｉ．
【０２０７】
【表１】
0006739333.tif 000066
【０２０８】
多糖はオリゴ糖の形で使用可能である。これらは好適に、精製多糖の断片化によって（例えば加水分解によって）形成され、これには通常、望ましいサイズの断片化の精製が続くであろう。
【０２０９】
多糖は天然供給源から精製可能である。精製の代替法として、多糖を完全または部分的合成から得ることも可能である。
【０２１０】
髄膜炎菌（Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜多糖
多糖は細菌莢膜多糖であることも可能である。例示的な細菌莢膜多糖には、髄膜炎菌由来のものが含まれる。生物の莢膜多糖に基づいて、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、２９Ｅ、Ｗ１３５、Ｘ、Ｙ、およびＺを含む、髄膜炎菌の多様な血清型が同定されてきている。多糖はこれらの血清型のいずれに由来してもよい。典型的には、多糖は以下の髄膜炎菌血清型：Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの１つに由来する。
【０２１１】
莢膜多糖は、一般的に、オリゴ糖の形で用いられるであろう。これらは好適に、精製莢膜多糖の断片化によって（例えば加水分解によって）形成され、これには通常、望ましいサイズの断片の精製が続くであろう。典型的には、多糖の断片化を行って、３０未満（例えば、血清型Ａに関しては、１０〜２０の間、例えばほぼ１０；血清型Ｗ１３５およびＹに関しては１５〜２５の間、例えば１５〜２０の間；血清型Ｃに関しては１２〜２２の間等）のオリゴ糖の最終平均重合度合い（ＤＰ）を生じる。ＤＰは、好適に、イオン交換クロマトグラフィによって、または比色分析アッセイによって、測定可能である（Ｒａｖｅｎｓｃｒｏｆｔら  Ｖａｃｃｉｎｅ  １７，  ２８０２−２８１６（１９９９））。
【０２１２】
加水分解を行う場合、短い長さのオリゴ糖を除去するため、一般的に、加水分解物をサイズで分けるであろう（Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら  Ｖａｃｃｉｎｅ  １７，  １２５１−１２６３（１９９９））。これは、例えば限外濾過後のイオン交換クロマトグラフィなど、多様な方法で達成可能である。血清型Ａに関しては、約６未満または６に等しい重合度合いのオリゴ糖を除去してもよく、そして血清型Ｗ１３５およびＹに関しては、ほぼ４未満のものを除去してもよい。
【０２１３】
糖の化学的加水分解は、一般的に、当該技術分野において標準的な条件下での、酸または塩基いずれかでの処理を伴う。莢膜多糖の構成要素単糖への脱重合のための条件が当該技術分野に知られる。１つの脱重合法は、過酸化水素の使用を伴う（本明細書に援用されるＷＯ０２／０５８７３７を参照されたい）。
【０２１４】
過酸化水素を糖に添加し（例えば最終１％のＨ２Ｏ２濃度を生じる）、そして次いで、鎖の長さの望ましい減少が達成されるまで、混合物をインキュベーションする（例えばおよそ５５℃で）。長期に渡る減少に続いて、混合物から試料を除去し、そして次いで、試料中の糖の（平均）分子サイズを測定する。次いで、望ましい鎖の長さに到達したら直ちに、迅速な冷却によって脱重合を停止することも可能である。
【０２１５】
血清型Ｃ、Ｗ１３５およびＹ
髄膜炎菌から莢膜多糖を調製するための技術が長年知られてきており、そしてこれは典型的には、多糖沈殿（例えば陽イオン性界面活性剤を用いる）、エタノール分画、冷フェノール抽出（タンパク質を除去するため）および超遠心（ＬＰＳを除去するため）の工程を含むプロセスを伴う（例えばＦｒａｓｈ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｑｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  １３，  １２３−１４５（１９９０）（ＭｉｚｒａｈｉおよびＶａｎ  Ｗｅｚｅｌ監修）を参照されたい）。
【０２１６】
１つのこうしたプロセスは、多糖沈殿後、低次アルコールを用いた沈殿多糖の可溶化を伴う（本明細書に援用されるＷＯ０３／００７９８５を参照されたい）。
【０２１７】
陽イオン性界面活性剤、例えばテトラブチルアンモニウムおよびセチルトリメチルアンモニウム塩（例えば臭化塩）、または臭化ヘキサジメトリンおよびミリスチルトリメチルアンモニウム塩を用いて、沈殿が達成可能である。臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）が特に好ましい（Ｉｎｚａｎａ，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ５５，  １５７３−１５７９（１９８７））。沈殿物質の可溶化は、低次アルコール、例えばメタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオール等を用いて達成可能であるが、ＣＴＡＢ−多糖複合体を可溶化するには、エタノールが特に適している。エタノールを沈殿多糖に添加して、５０％〜９５％の間の最終エタノール濃度（エタノールおよび水の総量に基づく）を生じることも可能である。
【０２１８】
再可溶化後、多糖をさらに処理して、混入物質を取り除くことも可能である。微量の混入物質さえ許容しえない状況では（例えばヒト・ワクチン産生のため）、これは特に重要である。これは、典型的には、濾過、例えば深層濾過、活性炭を通じた濾過、サイズ濾過および／または限外濾過を伴うであろう。混入物質を濾過して除去したら直ちに、さらなる処理および／またはプロセシングのために、多糖を沈殿させてもよい。これは、陽イオン交換することによって（例えばカルシウムまたはナトリウム塩の添加によって）好適に達成可能である。
【０２１９】
精製の代替法として、本発明の莢膜多糖を完全または部分的合成によって得てもよく、例えばＨｉｂ合成は、Ｋａｎｄｉｌら  ＧＩｖｃｏｃｏｎｉ  Ｊ  １４，  １３−１７．（１９９７）に、そしてＭｅｎＡ合成は、Ｂｅｒｋｉｎら  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８，  ４４２４−４４３３（２００２）に開示される。
【０２２０】
多糖を化学的に修飾してもよく、すなわち、これはＯ−アセチル化されてもまたは脱Ｏ−アセチル化されてもよい。任意のこうした脱Ｏ−アセチル化または過剰アセチル化は、多糖の特定の位でありうる。例えば、大部分の血清型Ｃ株は、シアル酸残基のＣ−７および／またはＣ−８位にＯ−アセチル基を有するが、臨床単離体の約１５％は、これらのＯ−アセチル基を欠く（Ｇｌｏｄｅら  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｐｉｓ  １３９，  ５２−５６（１９７９）；また、本明細書に援用される、ＷＯ９４／０５３２５および米国特許第５，４２５，９４６を参照されたい）。アセチル化は防御効果に影響を及ぼさないようである（例えばＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭ製品とは異なり、ｔｈｅ  ＮｅｉｓＶａｃ−ＣＴＭ製品は、脱Ｏ−アセチル化多糖を用いるが、どちらのワクチンも有効である）。血清型Ｗ１３５多糖は、シアル酸−ガラクトース二糖単位のポリマーである。血清型Ｙ多糖は、血清型Ｗ１３５多糖と同様であるが、二糖反復単位には、ガラクトースの代わりにグルコースが含まれる点を除く。血清型Ｃ多糖と同様、ＭｅｎＷ１３５およびＭｅｎＹ多糖は、可変Ｏ−アセチル化を有するが、これはシアル酸７位および９位である（本明細書に援用される、ＷＯ２００５／０３３１４８を参照されたい）。任意のこうした化学的修飾は、好ましくは、コンジュゲート化の前に行われるが、別にまたはさらに、コンジュゲート化中に行われてもよい。
【０２２１】
異なる血清型由来の多糖を別個に精製してもよく、そして次いで、コンジュゲート化の前または後に組み合わせてもよい。
【０２２２】
血清型Ａ
多糖は血清型Ａ由来であってもよい。構造的に異なるが、血清型Ｃ、Ｗ１３５およびＹに関するのと同じ方式で多糖を精製してもよく（上記を参照されたい）、一方、血清型Ｃ、Ｗ１３５およびＹの莢膜は、シアル酸（Ｎ−アセチル−ノイラミン酸、ＮｅｕＡｃ）周囲に基づき、血清型Ａの莢膜は、シアル酸の天然前駆体であるＮ−アセチル−マンノサミンに基づく。血清型Ａ多糖は、加水分解に特に感受性であり、そして水性媒体中のその不安定性は、（ａ）血清型Ａに対する液体ワクチンの免疫原性が長期間の間に低下し、そして（ｂ）ワクチン内への糖加水分解産物の放出のため、品質管理がより困難であることを意味する。
【０２２３】
天然ＭｅｎＡ莢膜多糖は、（ａ１→６）連結Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−リン酸のホモポリマーであり、Ｃ３およびＣ４で部分的Ｏ−アセチル化を伴う。主要なグリコシド結合は、Ｄ−マンノサミンのＣ１のヘミアセタール基およびＣ６のアルコール基を伴う１−６ホスホジエステル結合である。平均鎖長は９３モノマーである。これは以下の式：
【０２２４】
【化６１】
0006739333.tif 000067
【０２２５】
を有する。
【０２２６】
天然血清型Ａ多糖の免疫原活性を保持するが、水中ではるかにより安定である、修飾多糖が調製されてきている。単糖の炭素３および４で付着するヒドロキシル基が、ブロッキング基によって置換されている（ＷＯ０３／０８０６７８およびＷＯ２００８／０８４４１１を参照されたい）。
【０２２７】
ヒドロキシル基の代わりにブロッキング基を有する単糖単位の数は多様でありうる。例えば、すべてのまたは実質的にすべての単糖単位が、ブロッキング基を有することも可能である。あるいは、単糖単位の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％がブロッキング基を有することも可能である。少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０単糖単位がブロッキング基を有することも可能である。
【０２２８】
同様に、単糖単位上のブロッキング基の数もまた多様でありうる。例えば、任意の特定の単糖単位上のブロッキング基の数は１または２であることも可能である。
【０２２９】
末端単糖単位は、天然ヒドロキシルの代わりにブロッキング基を有することもまたは持たないことも可能である。さらなる反応（例えばコンジュゲート化）のためのハンドルを提供するために、末端単糖上に未結合アノマーヒドロキシル基を保持することが好ましい。還元アミン化（例えばＮａＢＨ３ＣＮ／ＮＨ４ＣＩを用いる）によって、アノマーヒドロキシル基をアミノ基（−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｅ、式中、Ｅは窒素保護基である）に変換することも可能であり、そして次いで、他のヒドロキシル基がブロッキング基に変換された後に、再生することも可能である。
【０２３０】
ヒドロキシル基を置換するブロッキング基は、ヒドロキシル基の誘導体化反応を通じて、すなわちヒドロキシル基の水素原子を別の基に置換することによって、直接アクセス可能である。ブロッキング基として作用するヒドロキシル基の適切な誘導体は、例えば、カルバメート、スルホネート、カルボネート、エステル、エーテル（例えばシリルエーテルまたはアルキルエーテル）およびアセタールである。こうしたブロッキング基のいくつかの特定の例は、アリル、アロエ（Ａｌｏｅ）、ベンジル、ＢＯＭ、ｔ−ブチル、トリチル、ＴＢＳ、ＴＢＤＰＳ、ＴＥＳ、ＴＭＳ、ＴＩＰＳ、ＰＭＢ、ＭＥＭ、ＭＯＭ、ＭＴＭ、ＴＨＰ等である。直接アクセス可能でなく、そしてヒドロキシル基を完全に置換する他のブロッキング基には、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ３−１２アルキル、Ｃ５−１２アリール、Ｃ５−１２アリール−Ｃ１−６アルキル、ＮＲ２１Ｒ２２（Ｒ２１およびＲ２２は、続く段落に定義される）、Ｈ、Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３、ＣＣＩ３等が含まれる。
【０２３１】
典型的なブロッキング基は以下の式のものである：−Ｏ−Ｘ’−Ｙ’および−ＯＲ２３、式中：Ｘ’はＣ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）またはＳＯ２であり；ＹはＣ１−１２アルキル、Ｃ１−１２アルコキシ、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ５−１２アリールまたはＣ５−１２アリール−Ｃ１−６アルキルであり、これらは各々、Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３またはＣＣＩ３より独立に選択される１、２または３つの基で場合によって置換されてもよく；あるいは、Ｙ’はＮＲ２１Ｒ２２であり；Ｒ２１およびＲ２２は、独立にＨ、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ５−１２アリール、Ｃ５−１２アリール−Ｃ１−６アルキルより選択され；あるいは、Ｒ２１およびＲ２２は連結されてＣ３−１２飽和複素環基を形成してもよく；Ｒ２３はＣ１−１２アルキルまたはＣ３−１２シクロアルキルであり、これらは各々、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３またはＣＣＩ３より独立に選択される１、２または３つの基で場合によって置換されてもよく；あるいは、Ｒ２３はＣ５−１２アリールまたはＣ５−１２アリール−Ｃ１−６アルキルであり、これらは各々、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３またはＣＣＩ３より選択される１、２、３、４または５つの基で場合によって置換されてもよい。Ｒ２３がＣ１−１２アルキルまたはＣ３−１２シクロアルキルである場合、典型的には、上に定義するような、１、２、または３つの基で置換される。Ｒ２１およびＲ２２が連結されて、Ｃ３−１２飽和複素環基を形成する場合、Ｒ２１およびＲ２２は、窒素原子とともに、３〜１２の間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２）を含有する飽和複素環基を形成することを意味する。複素環基は、窒素原子以外の１または２のヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、またはＳ）を含有してもよい。Ｃ３−１２飽和複素環基の例は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、イミダゾリジニル、アゼチジニルおよびアジリジニルである。
【０２３２】
ブロッキング基−Ｏ−Ｘ−Ｙおよび−ＯＲ２３は、標準的誘導体化法、例えばヒドロキシル基とハロゲン化アシル、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化スルホニル等の反応によって、−ＯＨ基から調製可能である。したがって、−Ｏ−Ｘ’−Ｙ’中の酸素原子は、通常、ヒドロキシル基の酸素原子であり、一方、−Ｏ−Ｘ’−Ｙ’中のＸ’−Ｙ’基は、通常、ヒドロキシル基の水素原子を置換する。
【０２３３】
あるいは、ブロッキング基は、置換反応、例えば光延型置換を通じてアクセス可能でありうる。これらの、そしてヒドロキシル基からブロッキング基を調製する他の方法が周知である。
【０２３４】
本発明で使用するための特異的ブロッキング基は、−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３（ＮｉｌｓｓｏｎおよびＳｖｅｎｓｓｏｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６９，  ２９２−２９６（１９７９））およびカルバメート基、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２１Ｒ２２であり、式中、Ｒ２１およびＲ２２は、Ｃ１−６アルキルより独立に選択される。典型的には、Ｒ２１およびＲ２２は、どちらもメチルであり、すなわちブロッキング基は−ＯＣ（Ｏ）ＮＭｅ２である。カルバメート・ブロッキング基は、グリコシド結合に対して安定化効果を有し、そして穏やかな条件下で調製可能である。
【０２３５】
特に好ましいブロッキング基は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３である（ＷＯ２００８／０８４４１１を参照されたい）。このブロッキング基を有する修飾髄膜炎菌血清型Ａ多糖中の４および／または３位の比率は多様であることも可能である。例えば、ブロッキング基を有する４位の比率は、約０％、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または約１００％であることも可能であり、少なくとも８０％および約１００％が好ましい。同様に、ブロッキング基を有する３位の比率は、約０％、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または約１００％であることも可能であり、少なくとも８０％および約１００％が好ましい。典型的には、ブロッキング基を有する４および３位の比率は、各位に関してほぼ同じである。言い換えると、ブロッキング基を有する３位に対するブロッキング基を有する４位の比率は約１：１である。しかし、いくつかの態様において、ブロッキング基を有する４位の比率は、ブロッキング基を有する３位の比率に対して多様であることも可能である。例えば、ブロッキング基を有する３位に対するブロッキング基を有する４位の比率は、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３または１：２であることも可能である。同様に、ブロッキング基を有する４位に対するブロッキング基を有する３位の比率は、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３または１：２であることも可能である。
【０２３６】
典型的な修飾ＭｅｎＡ多糖はｎの単糖単位を含有し、ここで、単糖単位の少なくともｈ％は、３位および４位の両方に−ＯＨ基を持たない。ｈの値は２４またはそれより多く（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００であり）、そして通常、５０またはそれより多い。存在しない−ＯＨ基は、上に定義するようなブロッキング基である。
【０２３７】
他の典型的な修飾ＭｅｎＡ多糖は、単糖単位の少なくともｓが、３位に−ＯＨを持たず、そして４位に−ＯＨを持たない単糖単位を含む。ｓの値は少なくとも１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０）である。存在しない−ＯＨ基は、上に定義するようなブロッキング基である。
【０２３８】
適切な修飾ＭｅｎＡ多糖は式：
【０２３９】
【化６２】
0006739333.tif 000068
【０２４０】
を有し、式中、ｐは１〜１００の整数（特に５〜２５、通常１５〜２５の整数）であり；Ｔは式（Ａ）または（Ｂ）：
【０２４１】
【化６３】
0006739333.tif 000069
【０２４２】
であり、
各Ｚ基は、ＯＨまたは上に定義するようなブロッキング基より独立に選択され；そして
各Ｑ基は、ＯＨまたは上に定義するようなブロッキング基より独立に選択され；
Ｙは、ＯＨまたは上に定義するようなブロッキング基より独立に選択され；
Ｅは、Ｈまたは窒素保護基であり；そして式中、約７％より多く（約８％、９％、１０％またはそれより多く）のＱ基がブロッキング基である。いくつかの態様において、式（Ａ）中の炭素１に付着するヒドロキシル基を、上に定義するようなブロッキング基によって置換する。いくつかの態様において、式（Ｂ）中のＥはリンカーまたは上に定義するようなキャリアー分子である。Ｅがリンカーである場合、リンカーは、キャリアー分子に共有結合することも可能である。
【０２４３】
ｐ＋２  Ｚ基は各々、互いに同じであってもまたは異なってもよい。同様に、ｎ＋２  Ｑ基は各々、互いに同じであってもまたは異なってもよい。すべてのＺ基はＯＨであってもよい。あるいは、Ｚ基の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％はＯＡｃであってもよい。典型的には、Ｚ基の約７０％はＯＡｃであり、Ｚ基の残りはＯＨまたは上に定義するようなブロッキング基である。Ｑ基の少なくとも約７％がブロッキング基である。典型的には、Ｑ基の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはさらに１００％がブロッキング基である。
【０２４４】
グルカン
多糖はグルカンであることも可能である。グルカンは、とりわけ、真菌細胞壁に見られるグルコース含有多糖である。ｏグルカン（ｏｇｌｕｃａｎ）には、グルコースサブユニット間に１またはそれより多いａ連結が含まれ、一方、β−グルカンには、グルコースサブユニット間に１またはそれより多いβ連結が含まれる。本発明にしたがって用いられるグルカンにはβ連結が含まれ、そしてグルカンはβ連結のみを含有する（すなわちａ連結がない）ことも可能である。
【０２４５】
グルカンは、１またはそれより多いβ−１，３連結および／または１またはそれより多いβ−１，６連結を含むことも可能である。グルカンはまた、１またはそれより多いβ−１，２連結および／またはβ−１，４連結を含むことも可能であるが、通常、そのβ連結は、β−１，３連結および／またはβ−１，６連結のみであろう。グルカンは分枝鎖でもまたは直鎖でもよい。全長天然β−グルカンは不溶性であり、そしてメガダルトン範囲の平均分子量を有する。したがって、コンジュゲートにおいては可溶性グルカンを用いるほうがよい。可溶化は、長い不溶性グルカンを断片化することによって達成可能である。これは、加水分解によって、またはより好適には、グルカナーゼ（例えばβ−１，３−グルカナーゼまたはβ−１，６−グルカナーゼ）での消化によって達成可能である。代替法として、単糖構築ブロックを連結することによって、短いグルカンを合成的に調製してもよい。
【０２４６】
低分子量グルカン、特に１００ｋＤａ未満（例えば８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、または１５ｋＤａ未満）の平均分子量を持つものが好ましい。例えば、６０またはそれより少ない（例えば５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４）グルコース単糖単位を含有するオリゴ糖を用いることもまた可能である。この範囲内で、１０〜５０の間または２０〜４０の間の単糖単位を持つオリゴ糖。グルカンは真菌グルカンであってもよい。真菌グルカンは、一般的に真菌から得られるであろうが、特定のグルカン構造が真菌および非真菌（例えば細菌、低次植物または藻類）に見られる場合、非真菌生物を代替供給源として用いてもよい。したがって、グルカンは、カンジダ属、例えばＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の細胞壁から、またはコクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、トリコフィトン・ベルコスム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、ブラストミセス・デルマティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、またはフィチウム・インシジオスム（Ｐｙｔｈｉｕｍｎ  ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ）から得られてもよい。
【０２４７】
真菌β−グルカンの多様な供給源がある。例えば、純粋なβ−グルカンは商業的に入手可能であり、例えばプスツラン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）は、ウンビリカリア・パプロサ（Ｕｍｂｉｌｉｃａｒｉａ  ｐａｐｕｌｌｏｓａ）から精製された、β−１，６−グルカンである。β−グルカンは、多様な方法で真菌細胞壁から精製可能である。Ｔｏｋｕｎａｋａら  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１６，  １６１−１７２．（１９９９）は、例えば、細胞壁マンナンを含まずに、カンジダ属から水溶性β−グルカン抽出物を調製するための２工程法であって、ＮａＣＩＯ酸化およびＤＭＳＯ抽出を含む前記方法を開示する。生じた産物（「カンジダ可溶性β−Ｄ−グルカン」または「ＣＳＢＧ」）は主に、直鎖β−１，６−グルカン部分を含む直鎖β−１，３−グルカンで構成される。同様に、ＷＯ０３／０９７０９１は、Ｃ．アルビカンスからのＧＧ−ｚｙｍの産生を開示する。Ｃ．アルビカンス由来のこうしたグルカンには、（ａ）β−１，３−グルカン側鎖および約３０の平均重合度合いを含むβ−１，６−グルカン、ならびに（ｂ）β−１，６−グルカン側鎖および約４の平均重合度合いを含むβ−１，３−グルカンが含まれる。
【０２４８】
いくつかの態様において、グルカンは、例えばラミナリンに見られるように、いくつかのβ−１，６分枝鎖を含むβ−１，３グルカンである。ラミナリンは、褐藻および海草に見られる。ラミナリンのβ（１−３）：β（１−６）比は、異なる供給源間で多様であり、例えばアラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ  ｂｉｃｙｃｌｉｓ）ラミナリンでは３：２と低いが、ラミナリア・ディジティタタ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔｉｔａｔａ）ラミナリンでは７：１と高い（Ｐａｎｇら  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６９，  ５５３−８（２００５））。したがって、グルカンは、１．５：１〜７．５：１の間、例えば約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１または７：１のβ（１−３）：β（１−６）比を有してもよい。場合によって、グルカンは、末端マンニトール・サブユニット、例えば１，１−Ｏ連結マンニトール残基を有してもよい（Ｒｅａｄら  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ．  ２８１，  １８７−２０１（１９９６））。グルカンはまた、マンノース・サブユニットを含むことも可能である。
【０２４９】
他の態様において、グルカンは、カードランに見られるように、もっぱらまたは主にβ−１，３連結を有する。これらのグルカンは、他の連結を含むグルカン、特にβ−１，３連結およびより高い比率のβ−１，６連結を含むグルカンよりも、優れた保護を誘発しうる。したがって、グルカンは、もっぱら、β−１，３連結グルコース残基（例えば、もっぱら１，３連結を含む直鎖β−Ｄ−グルコピラノース）で作製されることも可能である。しかし、場合によって、グルカンには、β−１，３連結グルコース残基でない単糖残基が含まれることも可能であり、例えば、これには、β−１，６連結グルコース残基が含まれることも可能である。これらの他の残基に対するβ−１，３連結グルコース残基の比は、少なくとも８：１（例えば、＞９：１、＞１０：１、＞１１：１、＞１２：１、＞１３：１、＞１４：１、＞１５：１、＞１６：１、＞１７：１、＞１８：１、＞１９：１、＞２０：１、＞２５：１、＞３０：１、＞３５：１、＞４０：１、＞４５：１、＞５０：１、＞７５：１、＞１００：１等）でなければならず、そして／またはβ−１，３連結のみによって他の残基に連結された少なくとも５つ（例えば、＞５、＞６、＞７、＞８、＞９、＞１０、＞１１、＞１２、＞１３、＞１４、＞１５、＞１６、＞１７、＞１８、＞１９、＞２０、＞３０、＞４０、＞５０、＞６０等）の隣接非末端残基の１またはそれより多く（例えば、＞１、＞２、＞３、＞４、＞５、＞６、＞７、＞８、＞９、＞１０、＞１１、＞１２等）の配列がある。「非末端」によって、残基がグルカンの未結合端に存在しないことを意味する。いくつかの態様において、隣接非末端残基には、キャリアー分子またはリンカーにカップリングしたいかなる残基も含まれないことも可能である。β−１，３連結によってのみ他の残基に連結された、５つの隣接非末端残基の存在は、例えばＣ．アルビカンスに対する防御抗体反応を提供することも可能である。
【０２５０】
さらなる態様において、コンジュゲートには、２つの異なるグルカン、例えば１．５：１〜７．５：１の間のβ（１−３）：β（１−６）比を有する第一のグルカン、およびもっぱらまたは主に、β−１，３連結を有する第二のグルカンが含まれることも可能である。例えば、コンジュゲートには、ラミナリン・グルカンおよびカードラン・グルカンの両方が含まれることも可能である。β−グルカンが、望ましい比および／または配列で、β−１，３およびβ−１，６連結の両方を含む場合、このグルカンは天然に見られてもよいし（例えばラミナリン）、または人工的に作製されてもよい。例えば、全体としてまたは部分的に、化学合成によって作製されてもよい。
【０２５１】
β−１，３／β−１，６グルカンの化学合成のための方法が知られ、例えばＴａｋｅｏおよびＴｅｉ  Ｃａｒｂｏｈｖｄｒ  Ｒｅｓ．  １４５，  ２９３−３０６（１９８６）、Ｔａｎａｋａら  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４，  ３０５３−３０５７（２００３）、Ｎｉｎｇら  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４３，  ５５４５−５５４９（２００２）、Ｇｅｕｒｔｓｅｎら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６４（２１）：７８２８−７８３５（１９９９）、Ｗｕら  Ｃａｒｂｏｈｖｄｒ  Ｒｅｓ．  ３３８，  ２２０３−１２（２００３）、Ｎｉｃｏｌａｏｕら  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１９，  ４４９−４５０（１９９７）、Ｙａｍａｄａら  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４０，  ４５８１−４５８４（１９９９）、Ｙａｍａｇｏら  Ｏｒｇ．  Ｌｅｔｔ．  ２４，  ３８６７−３８７０（２００１）、Ｙｕｇｕｏら  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ６０，  ６３４５−６３５１（２００４）、Ａｍａｙａら  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４２：９１９１−９１９４（２００１）、Ｍｅｉら  Ｃａｒｂｏｈｖｄｒ  Ｒｅｓ．  ３４０．  ２３４５−２３５１（２００５）に見られる。
【０２５２】
望ましい比でβ−１，３およびβ−１，６連結の両方を含むβ−グルカンはまた、利用可能なグルカンから出発して、そしてこれを、望ましい比および／または配列に到達するまで、β−１，６−グルカナーゼ（グルカン・エンド−１，６−β−グルコシダーゼ、１，６−β−Ｄ−グルカン・グルカノヒドラーゼ等としてもまた知られる；ＥＣ  ３．２．１．７５）またはβ−１，３−グルカナーゼ（例えばエキソ−１，３−グルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５８）またはエンド−１，３−グルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３９）で処理して作製することも可能である。
【０２５３】
もっぱらβ−１，３連結グルコースを含有するグルカンが望ましい場合、β−１，６−グルカナーゼは最終的に、純粋なβ−１，３グルカンを生じるであろうため、β−１，６−グルカナーゼ処理を完了まで続行してもよい。しかしより好適には、純粋なβ−１，３−グルカンを用いてもよい。これらを合成的に、化学的および／または酵素合成によって、例えば（１→３）−β−Ｄ−グルカンシンターゼを用いて合成してもよく、該酵素のうちいくつかは、多くの生物（細菌、酵母、植物および真菌を含む）由来であることが知られる。β−１，３グルカンの化学合成のための方法が知られ、例えば、Ｔａｋｅｏら  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ．  ２４５，  ８１−９６（１９９３）、Ｊａｍｏｉｓら  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５（４），  ３９３−４０７（２００５）、Ｌｅｆｅｂｅｒら  Ｃ  ｅｍ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  ７（２０）：４４１１−４４２１（２００１）およびＨｕａｎｇら  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ．  ３４０，  ６０３−６０８（２００５）から知られる。合成の有用な代替法として、天然β−１，３−グルカン、例えばカードラン（以前アルカリゲネス・フェカリス変種ミクソゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ｖａｒ．  ｍｙｘｏｇｅｎｅｓ）として知られたアグロバクテリウム属由来の直鎖β−１，３−グルカン；例えばＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈカタログＣ７８２１から商業的に入手可能）またはパラミロン（ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）由来のβ−１，３−グルカン）を用いることも可能である。高レベルのβ−１，３−グルカンを産生する生物が当該技術分野に知られ、例えば、米国特許第５５０８１９１号またはＭｉＫｙｏｕｎｇら  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ．  １６，  １６３−８（２００３）のアグロバクテリウム属、あるいはＢａｒｓａｎｔｉら  Ｊ  Ａｐｐ．  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，  １３，  ５９−６５（２００１）のユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）がある。
【０２５４】
ラミナリンおよびカードランは、典型的には、少なくとも１００ｋＤａの平均分子量を持つ高分子量ポリマーとして天然に見出される。これらはしばしば、水性媒体中で不溶性である。したがって、これらは、その天然型では免疫にあまり適していない。したがって、いくつかの態様において、より短いグルカン、例えば６０またはそれより短い（例えば５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４）グルコース単糖単位を含有するものである。２〜６０の範囲のグルコース残基数を有するグルカン、例えば約１０〜５０の間、または約２０〜４０の間のグルコース単位を有するものが使用可能である。約２５〜３０グルコース残基を持つグルカンが特に有用である。天然グルカンの酸加水分解によって、または酵素消化によって、例えばグルカナーゼ、例えばβ−１，３−グルカナーゼを用いて、適切なグルカンを形成することも可能である。１１〜１９、例えば１３〜１９および特に１５または１７のグルコース単糖単位を含むグルカンもまた有用である。特に、以下の構造（Ａ）または（Ｂ）を含むグルカンが、使用のために特に想定される：
【０２５５】
【化６４】
0006739333.tif 000070
【０２５６】
式中、ｓ＋２は２〜６０の範囲、例えば１０〜５０または２〜４０の間の範囲にある。
【０２５７】
いくつかの態様において、ｓ＋２は２５〜３０または１１〜１９、例えば１３〜１７の範囲である。特に、ｓ＋２＝１５が適切である。さらに、ｓ＋２＝６が適切である。
【０２５８】
【化６５】
0006739333.tif 000071
【０２５９】
式中、ｔは０〜９の範囲、例えば１〜７の間、または２〜６の間の範囲である。好ましくは、ｔは３〜４または１〜３の範囲である。特に、ｔ＝２が適切である。＊および＊＊は多糖単位のそれぞれの付着点を示す。
【０２６０】
いくつかの態様において、グルカンは５〜７のグルコース単糖単位（すなわち、５、６または７）を含有する。特に、６グルコース単糖単位を有するグルカンが好ましい可能性もある。例えば、グルカンは、６つのグルコース単糖単位を有するカードランであることも可能である。
【０２６１】
いくつかの態様において、グルカンは単一分子種である。これらの態様において、グルカン分子はすべて、配列に関して同一である。
【０２６２】
したがって、すべてのグルカン分子は、分子量等を含めて、その構造特性に関して同一である。典型的には、グルカンのこの型は、化学合成によって、例えば上述の方法を用いて、得られる。あるいは、他の態様において、グルカンは、天然グルカン、例えば上述のようなＬ．ディジタタ、アグロバクテリウム属またはユーグレナ属由来のグルカンから得られることも可能であり、必要な単一分子種が得られるまで、グルカンは精製される。この方式で精製されている天然グルカンが商業的に入手可能である。グルカン試料の多分散（Ｍｗ／Ｍｎ）を測定することによって、単一分子種であるグルカンを同定することも可能である。このパラメータは、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって、例えばＢａｒｄｏｔｔｉら  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６，  ２２８４−９６（２００８）に記載されるように、好適に測定することも可能である。本発明のこの態様において、使用に適したグルカンは、約１、例えば１．０１またはそれ未満の多分散を有する。
【０２６３】
天然グルカン、例えばカードランの可溶性は、イオン基を導入することによって（例えばカードラン中、特に０〜６での硫酸化によって）増加させることも可能である。こうした修飾を本発明で用いてもよいが、これらはグルカンの抗原性を改変する可能性もあるため、理想的には回避される。
【０２６４】
多糖がグルカンである場合、典型的にはラミナリンである。
【０２６５】
肺炎球菌（Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖
上に論じるように、多糖はまた、細菌莢膜多糖であることも可能である。さらなる例示的な細菌莢膜多糖には、肺炎球菌由来のものが含まれる。多糖が肺炎球菌由来の莢膜多糖である場合、典型的には、以下の肺炎球菌血清型：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆの１つに由来する。いくつかの態様において、これは、１、５、６Ｂ、１４、１９Ｆ、および２３Ｆに由来する。肺炎球菌由来の莢膜多糖は、最大８つの糖残基を含有しうる反復オリゴ糖単位を含む。主な肺炎球菌血清型に関するオリゴ糖単位は、上記表、Ｊｏｎｅｓ  Ａｎ．  Ａｃａｄ．  Ｂｒａｓ．  Ｃｉｅｎｃ，  ７７（２），  ２９３−３２４（２００５）およびＪｏｎｅｓ，  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ  ３８，  ８４０−８５０（２００５）に記載される。
【０２６６】
Ｓ．アガラクチエ（Ｓ．  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）莢膜多糖
さらなる例示的な細菌莢膜多糖には、ストレプトコッカス・アガラクチエ由来のもの（「ＧＢＳ」）が含まれる。莢膜多糖は、ＧＢＳのペプチドグリカン主鎖に共有結合され、そしてペプチドグリカン主鎖に付着した別の多糖であるＢ群抗原とは異なる。
【０２６７】
ＧＢＳ莢膜多糖は化学的に関連するが、抗原的には非常に異なる。すべてのＧＢＳ莢膜多糖は、以下の三糖コア：β−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ（１→３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ（１→４）β−Ｄ−Ｇｌｃｐを共有する。
【０２６８】
多様なＧＢＳ血清型では、このコアが修飾される方式が異なる。血清型ｌａおよびＩＩＩの間の相違は、例えば、連続する三糖コアを連結するための、このコアにおけるＧｌｃＮＡｃ（ｌａ）またはＧａｌ（ＩＩＩ）のいずれかの使用から生じる。
【０２６９】
血清型ｌａおよびｌｂはどちらも、コアにおいて、ＧｌｃＮＡｃに連結された［ａ−Ｄ−ＮｅｕｐＮＡｃ（２→３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→］二糖を有するが、連結は、１→４（ｌａ）または１→３（ｌｂ）のいずれかである。
【０２７０】
ＧＢＳ関連疾患は、主に、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩから生じ、８５％以上が５つの血清型：Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩおよびＶによって引き起こされる。これらの４つの血清型の１つに由来する多糖が使用可能である。これらの４つの血清型各々の莢膜多糖には：（ａ）すべての場合で、ガラクトース残基に２→３で連結される、末端Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）残基（一般的にシアル酸と呼ばれる）；および（ｂ）三糖コア内のＮ−アセチル−グルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）が含まれる。
【０２７１】
４つの多糖すべてには、三糖コア内にガラクトース残基が含まれるが、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩおよびＩＩＩはまた、各反復単位中に、さらなるガラクトース残基も含有する。
【０２７２】
用いる多糖は天然型であってもよいし、または修飾されていてもよい。例えば、多糖は、天然莢膜多糖よりも短くてもよいし、または化学的に修飾されていてもよい。特に、本発明で用いる血清型Ｖ莢膜多糖は、ＷＯ２００６／０５０３４１およびＧｕｔｔｏｒｍｓｅｎら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １０５（１５），  ５９０３−８（２００８）  Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｍａｒ  ３１に記載されるように修飾されてもよい。例えば、実質的に脱シアル化されている血清型Ｖ莢膜多糖。穏やかな酸性条件下（例えば０．１Ｍ硫酸、８０℃６０分間）で、精製ＧＢＳ血清型Ｖ莢膜多糖を処理することによって、またはノイラミニダーゼ処理によって、脱シアル化ＧＢＳ血清型Ｖ莢膜多糖を調製してもよい。したがって、本発明にしたがって用いる多糖は、天然に見られるように、実質的に全長の莢膜多糖でもよいし、または天然長より短くてもよい。例えば穏やかな酸中の加水分解によって、加熱によって、サイズクロマトグラフィーによって等で、全長多糖を脱重合して、本発明で用いるためのより短い断片を生じてもよい。特に、本発明で用いる血清型ＩＩおよび／またはＩＩＩ莢膜多糖は、ＷＯ９６／４０７９５およびＭｉｃｈｏｎら  Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００６）１３（８），  ９３６−４３に記載されるように、脱重合可能である。
【０２７３】
天然に見られるような莢膜多糖に比較して、多糖を化学的に修飾してもよい。例えば、多糖は、脱Ｏ−アセチル化（部分的または完全）、脱Ｎ−アセチル化（部分的または完全）、Ｎ−プロピオン化（部分的または完全）されるなどしてもよい。脱アセチル化は、コンジュゲート化前、中または後に起きてもよいが、好ましくはコンジュゲート化前に起こる。特定の多糖に応じて、脱アセチル化は、免疫原性に影響を及ぼす可能性もまたは及ぼさない可能性もある。多様な血清型のＧＢＳ多糖に対するＯ−アセチル化の関連性は、Ｌｅｗｉｓら  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０１，  １１１２３−８（２００４）に論じられ、そしていくつかの態様において、７、８および／または９位のシアル酸残基のＯ−アセチル化は、例えば保護／脱保護によって、再アセチル化によってなどで、コンジュゲート化前、中および後に保持される。しかし、典型的には、本発明で用いるＧＢＳ多糖は、実質的に、７、８および／または９位でのシアル酸残基のＯ−アセチル化をまったく含まない。特に、ＧＢＳ多糖が、以下に記載するような塩基抽出によって精製されている場合、Ｏ−アセチル化は典型的には失われる。脱アセチル化の影響等は、ルーチンのアッセイによって表化可能である。
【０２７４】
莢膜多糖は、Ｗｅｓｓｅｌｓら  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５７，  １０８９−９４（１９８９）に記載されるように、既知の技術によって精製可能である。典型的なプロセスは、塩基抽出、遠心分離、濾過、ＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ処理、プロテアーゼ処理、濃縮、サイズ排除クロマトグラフィ、限外濾過、陰イオン交換クロマトグラフィ、およびさらなる限外濾過を伴う。細菌細胞壁を切断して、細胞壁構成要素を遊離させる酵素ムタノリシンでのＧＢＳ細胞の処理もまた有用である。
【０２７５】
代替法として、ＷＯ２００６／０８２５２７に記載される精製プロセスが使用可能である。これは、塩基抽出、エタノール／ＣａＣＩ２処理、ＣＴＡＢ沈殿、および再可溶化を伴う。さらなる代替プロセスが、ＷＯ２００９／０８１２７６に記載される。
【０２７６】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖
さらなる例示的な細菌莢膜多糖には、黄色ブドウ球菌由来のもの、特に黄色ブドウ球菌５型および８型の莢膜多糖が含まれる。５型および８型の莢膜多糖の構造は、Ｍｏｒｅａｕら  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．  ３３９（５），  ２８５−９１（１９９０）およびＦｏｕｒｎｉｅｒら  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ４５（１），  ８７−９３（１９８４）に：
５型
→４）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ（３０Ａｃ）−（１→４）−ａ−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１
８型
→３）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ（４０Ａｃ）−（１→３）−ａ−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１
と記載される。
【０２７７】
最近のＮＭＲ分光測定データ（Ｊｏｎｅｓ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．  ３４０（６），  １０９７−１０６（２００５））は、これらの構造の以下への修正を導いている：
５型
→４）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ−（１→４）−ａ−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（３０Ａｃ）−（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１
８型
→３）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ（４０Ａｃ）−（１→３）−ａ−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（１→３）−ａ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ（１→。
【０２７８】
多糖は、天然に見られるような莢膜多糖に比較して、化学的に修飾されていてもよい。
【０２７９】
例えば、多糖は、脱Ｏ−アセチル化（部分的または完全）、脱Ｎ−アセチル化（部分的または完全）、Ｎ−プロピオン化（部分的または完全）されるなどしてもよい。脱アセチル化は、コンジュゲート化前、中、または後に起きてもよいが、典型的には前に起こる。脱アセチル化等の影響は、ルーチンのアッセイによって評価可能である。例えば、黄色ブドウ球菌５型または８型莢膜多糖に対するＯ−アセチル化の関連性は、Ｆａｔｔｏｍら  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ６６（１０）：４５８８−９２（１９９８）に論じられる。天然多糖は、この文書において、７５％Ｏ−アセチル化を有すると言われる。これらの多糖は、多糖主鎖およびＯ−アセチル基両方に対する抗体を誘導した。０％Ｏ−アセチル化を伴う多糖はなお、多糖主鎖に対する抗体を誘発した。両方のタイプの抗体は、Ｏ−アセチル含量が多様である黄色ブドウ球菌株に対して、オプソニン性であった。したがって、本発明で用いる５型または８型莢膜多糖は、０〜１００％の間のＯ−アセチル化を有することも可能である。
【０２８０】
多糖のＯ−アセチル化の度合いは、当該技術分野に知られる任意の方法によって、例えばプロトンＮＭＲによって（例えば、ＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒおよびＪｏｎｅｓ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．  ２９６，  ８３−９６（１９９６）、ＪｏｎｅｓおよびＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒ，  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ＢｉｏｍｅｄＡｎａｌ．  ３０（４），  １２３３−４７（２００２）、ＷＯ０５／０３３１４８またはＷＯ  ００／５６３５７に記載されるように）決定可能である。さらなる方法が、Ｈｅｓｔｒｉｎ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １８０，  ２４９−２６１（１９４９）に記載される。類似の方法を用いて、多糖のＮ−アセチル化の度合いを決定することも可能である。Ｏ−アセチル基を加水分解によって、例えば無水ヒドラジンなどの塩基（Ｋｏｎａｄｕら  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６２，  ５０４８−５０５４（１９９４））またはＮａＯＨ（Ｆａｔｔｏｍら  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ６６（１０）：４５８８−９２（１９９８））での処理によって除去することも可能である。類似の方法を用いて、Ｎ−アセチル基を除去することも可能である。５型および／または８型莢膜多糖上の高レベルのＯ−アセチル化を維持するため、Ｏ−アセチル基の加水分解を導く処理、例えば極端なｐＨでの処理は最小限にされる。
【０２８１】
既知の技術によって、本明細書の参考文献に記載されるように、莢膜多糖を精製してもよい。典型的なプロセスは、黄色ブドウ球菌細胞のフェノール−エタノール不活性化、遠心分離、リゾスタフィン処理、ＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ処理、遠心分離、透析、プロテアーゼ処理、さらなる透析、濾過、エタノール／ＣａＣＩ２での沈殿、透析、凍結乾燥、陰イオン交換クロマトグラフィ、透析、凍結乾燥、サイズ排除クロマトグラフィ、透析および凍結乾燥を伴う（Ｆａｔｔｏｍら  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ５８（７），  ２３６７−７４（１９９０））。代替プロセスは、黄色ブドウ球菌細胞のオートクレーブ、多糖含有上清の限外濾過、濃縮、凍結乾燥、タイコ酸を除去するためのメタ過ヨウ素酸ナトリウムでの処理、さらなる限外濾過、ディアフィルトレーション、高性能サイズ排除液体クロマトグラフィ、透析および凍結乾燥を伴う（Ｇｉｌｂｅｒｔら  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｍｅｔｈ．  ２０，  ３９−４６（１９９４））。しかし、本発明は、天然供給源から精製される多糖に限定されず、他の方法、例えば完全または部分合成によって多糖を得てもよい。
【０２８２】
他の細菌莢膜多糖
さらなる例示的な細菌莢膜多糖には、ｂ型インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、チフス菌Ｖｉ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｖｉ）およびクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来のものが含まれる。
【０２８３】
Ｓ．アガラクチエ炭水化物：非莢膜細菌多糖もまた使用可能である。例示的な非胸膜細菌多糖は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＧＡＳ炭水化物（ＧＡＳ細胞壁多糖、またはＧＡＳＰとしても知られる）である。この多糖は、交互のアルファ−（１→２）およびアルファ−（１→３）連結からなるＬ−ラムノピラノース（Ｒｈａｐ）主鎖、ならびに交互のラムノース環にβ−（１→３）連結されたＤ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃｐＮＡｃ）残基を含む分枝鎖構造を特徴とする（Ｋｒｅｉｓら  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  １７（３−４），  １１７−３０（１９９５））。
【０２８４】
ＧＡＳ炭水化物は、一般的には天然型であろうが、修飾されていてもよい。例えば、多糖は、天然ＧＡＳ炭水化物より短くてもよいし、または化学的に修飾されていてもよい。
【０２８５】
したがって、本発明にしたがって用いる多糖は、天然に見られるような実質的に全長のＧＡＳ炭水化物であってもよいし、または天然長よりも短くてもよい。例えば穏やかな酸中の加水分解によって、加熱によって、サイズクロマトグラフィーによって等で、全長多糖を脱重合して、本発明で用いるためのより短い断片を生じてもよい。ＧＡＳ炭水化物上の末端単位に対応すると考えられる短い断片は、ワクチンの使用に関して提唱されてきている（Ｈｏｏｇら，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ．  ３３７（２１−２３），  ２０２３−３６（２００２））。したがって、短い断片が本発明において想定される。しかし、実質的に全長の多糖を用いることが好ましい。ＧＡＳ炭水化物は、典型的には、約１０ｋＤａ、特に約７．５〜８．５ｋＤａの平均分子量を有する。分子量は、ＨＰＬＣ、例えばＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラム（Ｓｉｇｍａ）を用いたＳＥＣ−ＨＰＬＣによって、プルラン標準、例えばＰｏｌｙｍｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ｗｗｗ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ．ｄｅ）より入手可能なものに比較して、測定可能である。
【０２８６】
天然に見られるようなＧＡＳ炭水化物に比較して、多糖を化学的に修飾してもよい。例えば多糖は、脱Ｎ−アセチル化（部分的または完全）、Ｎ−プロピオン化（部分的または完全）されるなどしてもよい。例えば免疫原性に対する、脱アセチル化等の影響をルーチンのアッセイによって評価してもよい。
【０２８７】
いくつかの態様において、多糖は、以下に示す構造を有する、ＧＢＳＩＩ抗原性多糖である：
【０２８８】
【化６６】
0006739333.tif 000072
【０２８９】
いくつかの態様において、多糖は、以下に示す構造を有する、ＧＢＳＶ抗原性多糖である：
【０２９０】
【化６７】
0006739333.tif 000073
【０２９１】
いくつかの態様において、多糖は、以下に示す構造を有する、ＭｅｎＡ抗原性多糖である：
【０２９２】
【化６８】
0006739333.tif 000074
【０２９３】
別の側面において、式（Ｉ）Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（Ａ−Ｗ−Ｂ−Ｒ２）ｚまたは（ＩＩ）Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（ＮＨ−Ｗ−Ｒ２）ｚの化合物が開示され、式中、ｘ、ｙ、ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ａ、Ｂ、およびＷは上に定義する通りである。いくつかの態様において、化合物は、以下の任意の１つである：
【０２９４】
【化６９−１】
0006739333.tif 000075
【０２９５】
【化６９−２】
0006739333.tif 000076
【０２９６】
【化６９−３】
0006739333.tif 000077
【０２９７】
【化６９−４】
0006739333.tif 000078
【０２９８】
【化６９−５】
0006739333.tif 000079
【０２９９】
八員シクロアルキン基を有する態様において、この基は、共有結合によって修飾基に付着していてもよい。典型的には、八員シクロアルキン基は、スペーサーを介して、そしてスペーサーの末端に付着する。スペーサーのもう一方の端は、ペプチドのアミノまたはカルボン酸末端を通じるが、グルタミンのε−アミノ基を通じない、修飾基への付着のための官能基を有する。例えば、付着が修飾基のアミン部分である場合、スペーサーには、アミンへの付着を可能にする任意の官能基（例えばスクシニミジルエステル）が含まれることも可能である。同様に、付着が修飾基のカルボン酸部分である場合、スペーサーには、カルボン酸への付着を可能にする任意の官能基（例えばアミン）が含まれてもよい。
【０３００】
いくつかの態様において、八員シクロアルキン基には、１またはそれより多い窒素原子、例えば１、２または３つの窒素原子が含まれる。いくつかの態様において、八員シクロアルキン基を１またはそれより多い他の環系、例えばシクロプロパンまたはベンゼンに融合させる。１つの好ましい態様において、八員シクロアルキン基をシクロプロパン基に融合させる。別の好ましい態様において、八員シクロアルキン基を２つのベンゼン基に融合させる。最も好ましい態様において、八員シクロアルキン基はシクロオクチン基である。
【０３０１】
１つの態様において、式Ｘ１−Ｌ−Ｘ２を有する化合物を用いて、付着を行い、式中、Ｘ１は八員シクロアルキン基であり、そしてＸ２−Ｌがスペーサーである。これらの態様において、Ｘ２は、ペプチド上のアミン基上の官能基と反応可能な任意の基であってもよく、そしてＬは、スペーサー中の連結部分である。
【０３０２】
１つの態様において、Ｘ２は、Ｎ−オキシスクシニミドである。この基は、ペプチド上のアミンへの付着に適している。Ｌは、１〜１０の炭素原子（例えばＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０）を持つ直鎖アルキル、例えば（ＣＨ２）４または（ＣＨ２）３であってもよい。Ｌは、典型的には、式−Ｌ３−Ｌ２−Ｌ１を有し、式中、Ｌ１はカルボニルであり、Ｌ２は、１〜１０の炭素原子（例えばＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０）を持つ直鎖アルキル、例えば（ＣＨ２）４または（ＣＨ２）５であるか、あるいはＬ２は存在せず、そしてＬ３は−ＮＨＣ（Ｏ）−、カルボニルまたは−Ｏ（ＣＨ３）−である。
【０３０３】
１つの態様において、Ｌ１はカルボニルであり、Ｌ２は（ＣＨ２）５であり、そしてＬ３は−ＮＨＣ（Ｏ）−である。別の態様において、Ｌ１はカルボニルであり、Ｌ２は（ＣＨ２）４であり、そしてＬ３はカルボニルである。別の態様において、Ｌ１はカルボニルであり、Ｌ２は存在せず、そしてＬ３は−Ｏ（ＣＨ３）−である。
【０３０４】
１つの態様において、Ｘ１は
【０３０５】
【化７０】
0006739333.tif 000080
【０３０６】
である。
【０３０７】
別の態様において、Ｘ１は
【０３０８】
【化７１】
0006739333.tif 000081
【０３０９】
である。
【０３１０】
別の態様において、Ｘ１は
【０３１１】
【化７２】
0006739333.tif 000082
【０３１２】
である。
【０３１３】
１つの態様において、式Ｘ１−Ｌ−Ｘ２を有する化合物は
【０３１４】
【化７３】
0006739333.tif 000083
【０３１５】
である。
【０３１６】
１つの態様において、式Ｘ１−Ｌ−Ｘ２を有する化合物は：
【０３１７】
【化７４】
0006739333.tif 000084
【０３１８】
である。
【０３１９】
１つの態様において、式Ｘ１−Ｌ−Ｘ２を有する化合物は：
【０３２０】
【化７５】
0006739333.tif 000085
【０３２１】
である。
【０３２２】
Ｒ２基にフルオロフォアが含まれる場合、適切なフルオロフォア基を、当該技術分野に周知の技術にしたがって調製してもよい。例えば、スキームＩに示すように、フルオロフォア官能化修飾基を調製するための一般的なプロトコルを例示する。
【０３２３】
スキームＩ
【０３２４】
【化７６】
0006739333.tif 000086
【０３２５】
ターゲットタンパク質
ターゲット化合物は、微生物トランスグルタミナーゼの基質であるもの、例えば、微生物トランスグルタミナーゼの基質であるタンパク質であってもよい。１つの側面において、ターゲット化合物は、少なくとも１つのＬｙｓ残基を含有し、そしていくつかの態様において、少なくとも２つのＬｙｓ残基を含有する。ターゲット化合物が、それ自体、トランスグルタミナーゼ基質でない場合、１またはそれより多いＧｌｎまたはＬｙｓ残基、そして特にＬｙｓ残基を、タンパク質中に挿入して、該タンパク質をトランスグルタミナーゼの基質にすることが可能である。あるいは、リジン残基を含有するペプチド配列（ペプチドタグ）を挿入してもよい。原理的には、こうしたＧｌｎまたはＬｙｓ残基を配列中の任意の位に挿入してもよい。典型的には、挿入は、タンパク質のアクセス可能な部分または柔軟なループ中であるべきである。これはまた、タンパク質の生理学的、例えば療法的活性が、例えば療法介入においてタンパク質が有用でない度合いまでは影響を受けない位で挿入されることも可能である。タンパク質中のアミノ酸残基の挿入は、当業者に知られる標準技術、例えば翻訳後化学修飾またはトランスジェニック技術によって達成可能である。
【０３２６】
トランスグルタミナーゼの基質である任意のターゲット化合物またはタンパク質、例えば酵素、タンパク質ホルモン、増殖因子、抗体および抗体断片、サイトカイン、受容体、リンホカインならびにワクチン抗原などを、本明細書に開示する方法によって修飾することも可能である。いくつかの態様において、ポリペプチドは抗原性ペプチドである。
【０３２７】
いくつかの態様において、特にＲが多糖である場合、ポリペプチドはキャリアー分子である。一般的に、キャリアーへの多糖の共有コンジュゲート化は、これが多糖をＴ非依存性抗原からＴ依存性抗原に変換するため、多糖の免疫原性を増進し、したがって免疫記憶のプライミングを可能にする。コンジュゲート化は、小児科ワクチンに特に有用であり（例えば、Ｒａｍｓａｙら  Ｌａｎｃｅｔ  ３５７（９２５１）：１９５−１９６（２００１）を参照されたい）、そしてこれは周知の技術である（概説には、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  Ｖａｃｃｉｎｅ  １７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ２８−３６（１９９９）、ＢｕｔｔｅｒｙおよびＭｏｘｏｎ，  Ｊ  Ｒ  Ｃｏｌｌ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｌｏｎｄ  ３４，  １６３−１６８（２０００）、ＡｈｍａｄおよびＣｈａｐｎｉｃｋ，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  １３：１１３−３３，  ｖｉｉ（１９９９）、Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４７，  ５６３−５６７（１９９８）、欧州特許４７７  ５０８、米国特許第５，３０６，４９２号、Ｗ０９８／４２７２１、Ｄｉｃｋら  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｃｒｕｓｅら監修）  Ｋａｒｇｅｒ，  Ｂａｓｅｌ，  １０，  ４８−１１４（１９８９）、ならびにＨｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  （１９９６）  ＩＳＢＮ：０１２３４２３３６８を参照されたい）。
【０３２８】
キャリアータンパク質は、細菌毒素、トキソイドであることも可能である。有用なキャリアータンパク質には、細菌毒素またはトキソイド、例えばジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド、ジフテリアおよびコレラ毒素、ならびにそのサブユニット、例えば破傷風トキソイドの断片Ｃおよびジフテリア毒素のＣＲＭ１９７突然変異体が含まれる。他の適切なキャリアータンパク質には、髄膜炎菌外膜タンパク質、合成ペプチド、熱ショックタンパク質、百日咳タンパク質、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、ヒト血清アルブミン（組換え型を含む）、多様な病原体由来抗原由来の多数のヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープ、例えばＮ１９、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｄ、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ、ニューモリシン、鉄取り込みタンパク質、Ｃ．ディフィシレ由来の毒素ＡまたはＢ、組換え緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）、ＧＢＳタンパク質を含む人工的タンパク質等が含まれる。いくつかの態様において、ターゲットタンパク質は、線毛タンパク質、例えばＧＢＳタンパク質、例えばＧＢＳ６７およびＧＢＳ８０である。
【０３２９】
さらなる誘導体化
本発明のターゲットタンパク質（すなわち関心対象のタンパク質）を修飾する必要性は、いかなる数の理由に関して生じてもよく、そしてこれはまた、本発明の方法にしたがって選択的に修飾されうる化合物の種類に反映される。
【０３３０】
一般的に、本発明の方法は、式（Ｉ）Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（Ａ−Ｗ−Ｂ−Ｒ２）ｚまたは（ＩＩ）Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（ＮＨ−Ｗ−Ｒ２）ｚのグルタミン含有ペプチドと、少なくとも２つのリジンを含有するタンパク質の、微生物トランスグルタミナーゼが触媒する反応を含む。
【０３３１】
１つの態様において、方法は、以下の工程からなる：（ａ）式（Ｉ）Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（Ａ−Ｗ−Ｂ−Ｒ２）ｚの化合物のペプチド合成による調製、および当該技術分野に知られるような精製；（ｂ）過剰なこの化合物Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（Ａ−Ｗ−Ｂ−Ｒ２）ｚと、少なくとも１つのリジン、そしていくつかの態様において、１より多いリジンを含有するターゲットタンパク質の、水性緩衝液、場合によって有機溶媒、界面活性剤または他の修飾剤を含有する水性緩衝液中での混合；（ｃ）この混合物への、触媒量の微生物トランスグルタミナーゼの添加；（ｄ）ｍＴＧアーゼ阻害剤を、場合によって混合物に添加してもよく；（ｅ）混合物を精製プロセス、典型的には、限外濾過またはディアフィルトレーションおよび／またはクロマトグラフィ（イオン交換、サイズ排除、疎水性相互作用など）の装置操作を含むプロセスに供する。それによって、選択的に修飾されたタンパク質を得る。タンパク質は、クロマトグラフィ、電気泳動、ペプチドマッピングおよび質量分析を含む、標準タンパク質分析法によって特徴付けられる。
【０３３２】
１つの態様において、方法は、以下の工程からなる：（ａ）式（ＩＩ）Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（ＮＨ−Ｗ−Ｒ２）ｚの化合物のペプチド合成による調製、および当該技術分野に知られるような精製；（ｂ）過剰なこの化合物Ｒ１−（Ｌｅｕ）ｘ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）ｙ−（ＮＨ−Ｗ−Ｒ２）ｚと、少なくとも１つのリジン、そしていくつかの態様において、１より多いリジンを含有するターゲットタンパク質の、水性緩衝液、場合によって有機溶媒、界面活性剤または他の修飾剤を含有する水性緩衝液中での混合；（ｃ）この混合物への、触媒量の微生物トランスグルタミナーゼの添加；（ｄ）ｍＴＧアーゼ阻害剤を、場合によって混合物に添加してもよく；（ｅ）混合物を精製プロセス、典型的には、限外濾過またはディアフィルトレーションおよび／またはクロマトグラフィ（イオン交換、サイズ排除、疎水性相互作用など）の装置操作を含むプロセスに供する。それによって、選択的に修飾されたタンパク質を得る。タンパク質は、クロマトグラフィ、電気泳動、ペプチドマッピングおよび質量分析を含む、標準タンパク質分析法によって特徴付けられる。
【０３３３】
場合によって、工程（ｂ）または（ｃ）の後に、存在する場合、Ｒ１またはＲ２または両方の官能基を通じて、例えばフルオロフォア標識（すでに存在しない場合）でさらに修飾することも可能である。標識を添加する場合、蛍光または放射標識などの標識の性質に応じて、多様な技術を用いて、修飾タンパク質を検出してもよい。
【０３３４】
いくつかの態様において、Ｒ１またはＲ２または両方の官能基を放射標識してもよい。例えばヨウ素放射標識を、スキームＩＩに示すように、リンカーに添加してもよい。
【０３３５】
スキームＩＩ。
【０３３６】
【化７７】
0006739333.tif 000087
【０３３７】
ｍＴＧアーゼ仲介トランスアミド化の機構の一部として、ＭＴＧアーゼの活性部位中のＣｙｓおよびＧｌｎ基質の間の反応によって、分子間チオエステルを形成する。用語「トランスアミド化」は、別の化合物由来の窒素、特に別の窒素含有求核試薬由来の窒素と、グルタミンの側鎖中の窒素を交換する反応を示す。この中間体を活性化Ｇｌｎ残基と見なすことも可能であり、活性種はｍＴＧアーゼ−チオエステルであり、これがアミン、例えばタンパク質リジン残基と反応する。反応の選択性は、１）Ｌｙｓ所持タンパク質基質と相互作用する一方、ｍＴＧアーゼ−チオエステルの剪断立体バルク、ならびに２）ｍＴＧアーゼ−チオエステルおよびＬｙｓ所持タンパク質基質の間のより定義された非共有相互作用の結果である。この直接の結果は、活性化アシル基を所持するタンパク質、アシル−Ｘ−タンパク質が本発明に含まれることであり、式中、Ｘはタンパク質−リジンアミンによる求核攻撃に向けてアシル基を活性化する原子または基である。
【０３３８】
したがって、タンパク質を修飾して、タンパク質の物理化学的特性を改変して、例えば療法タンパク質の可溶性を増加させ（または減少させ）、その生物学的利用能を修飾することが望ましい可能性もある。別の態様において、化合物を血漿タンパク質、例えばアルブミンに結合するタンパク質、または腎臓を通じた排出を防止するかもしくは遅延させるため、タンパク質のサイズを増加させる、タンパク質にコンジュゲート化することによって、体におけるクリアランス速度を修飾することが望ましい可能性もある。コンジュゲート化はまた、タンパク質の加水分解、例えばｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質分解に対する感受性を改変する、そして特に減少させることも可能である。
【０３３９】
別の態様において、標識をコンジュゲート化して、タンパク質の分析を容易にすることが望ましい可能性もある。こうした標識の例には、放射性同位体、蛍光マーカー、例えばすでに記載したフルオロフォアなどの蛍光マーカーおよび酵素基質が含まれる。
【０３４０】
さらに別の態様において、化合物をタンパク質にコンジュゲート化して、タンパク質の単離を容易にする。例えば、特定のカラム物質に特異的アフィニティを持つ化合物を、タンパク質にコンジュゲート化することも可能である。例えばタンパク質の１またはそれより多い免疫原性エピトープを隠すか、マスキングするかまたは覆い隠すように、タンパク質をコンジュゲート化することによって、タンパク質の免疫原性を修飾することが望ましい可能性もまたある。名詞としての用語「コンジュゲート」は、修飾されたペプチド、すなわちペプチドの特性を修飾するように、ペプチドに結合した部分を含むペプチドを示すよう意図される。動詞としては、該用語は、ペプチドの特性を修飾するように、ペプチドに部分を結合させるプロセスを示すよう意図される。
【０３４１】
１つの態様において、本発明は、ターゲットタンパク質の薬理学的特性を改善する方法を提供する。改善は、対応する非修飾タンパク質に関する。こうした薬理学的特性の例には、機能的ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、免疫原性、腎臓濾過、プロテアーゼ保護および任意の特定のタンパク質のアルブミン結合が含まれる。
【０３４２】
１つの側面において、本発明の修飾タンパク質は、Ｒ１、（Ａ−Ｗ−Ｂ−Ｒ２）ｚ、および／またはＮＨ−Ｗ−Ｒ２のさらなる誘導体化を通じて、さらに修飾されてもよい。特に、Ｒ１および／またはＲ２は、さらなる修飾に適した化学基を含んでもよい。こうしたさらなる官能化の例には、Ｒ１またはＲ２にアジドまたはシクロオクチン基が含まれる場合は、アジド−アルキン・ヒュスゲン環付加、より一般的には、クリックケミストリーと知られるものが含まれる。Ｒ２が、脱離してα，β−不飽和ケトンになるトシル・スルホンを含む場合、チオールなどの求核試薬を用いて、さらなる修飾のため、コンジュゲート付加を適用することも可能である。
【０３４３】
いくつかの態様において、すでに上述したように、Ｗは：デンドリマー、酸化ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、分枝鎖ＰＥＧ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ｐｏｌｙｄｈｙｋｎｅ−コ・マレイン酸無水物、ポリスチレンｃ−マキック酸（ｍａｋｉｃ  ａｃｉｄ）無水物、デキストリン、カルボキシメチル−デキストラン；血清タンパク質結合リガンド、例えばアルブミンに結合する化合物、例えば脂肪酸、Ｃ５−Ｃ２４脂肪酸、脂肪族二酸（例えばＣ５−Ｃ２４）、グリカンが受容体（例えばアシアロ糖タンパク質受容体およびマンノース受容体）に結合することを阻害する構造（例えばシアル酸誘導体または模倣体）、生理学的条件を改変し、電荷特性を改変する部分を含有する小分子有機分子、例えばカルボン酸またはアミン、あるいはグリカン特異的認識を防止する中性置換基、例えばより小さいアルキル置換基（例えばＣ１−Ｃ５アルキル）、１またはそれより多いカルボン酸、アミン、スルホン酸、リン酸、またはその組み合わせを含有してもよい低分子量有機荷電ラジカル（例えばＣ１−Ｃ２５）；低分子量中性親水性分子（例えばＣ１−Ｃ２５）、例えばシクロデキストリン、または場合によって分枝していてもよいポリエチレン鎖；２〜４０ｋＤａの平均分子量を持つポリエチレングリコール；７００〜２０，０００Ｄａ、またはより好ましくは７００〜１０，０００Ｄａの間の範囲の正確な分子量を持つ、デンドリマーなどのよく定義された正確なポリマー；ならびに、実質的に非免疫原性のポリペプチド、例えばアルブミン、あるいは抗体または場合によってＦｃドメインを含有する抗体部分より選択可能である。
【０３４４】
１つの態様において、Ｗは、約４０〜約１０，０００ａｍｕの間の分子量を有する直鎖または分枝鎖ポリエチレングリコールであり、「ＰＥＧ」ともまた称される。用語「ＰＥＧ」は、その類似体も含むポリエチレングリコールを示すよう意図され、例えば、分枝末端ＯＨ基がアルコキシ基、例えば、メトキシ基、エトキシ基、またはプロポキシ基によって置換されているものである。
【０３４５】
ｍＰＥＧを産生するためのプロセスによって、これらの分子はしばしば、分子量分布を有する。この分布は、多分散指数によって記載される。用語「多分散指数」は、本明細書において、ポリマー化学業に知られるような、平均分子量および平均分子量の数の間の比を意味する（例えば、”Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ”，  Ｊ．Ａ．  Ｎａｉｒｎ，  ユタ大学，  ２００３を参照されたい）多分散指数は、１より大きいかまたは１に等しい数であり、そしてこれは、ゲル浸透クロマトグラフィデータから概算可能である。多分散指数が１である場合、産物は単分散であり、そしてしたがって、単一の分子量を持つ化合物で構成される。多分散指数が１より大きい場合、これはそのポリマーの多分散性の尺度であり、すなわち異なる分子量を持つポリマー分布の幅である。
【０３４６】
式、化合物名または分子構造における、例えば「ｍＰＥＧ２０００」の使用は、ｍＰＥＧが多分散であり、そしておよそ２，０００Ｄａの分子量を有するｍＰＥＧ残基を示す。
【０３４７】
多分散指数は、典型的には、ＰＥＧまたはｍＰＥＧの分子量を増加させる。２，０００Ｄａ  ＰＥＧ、そして特に２，０００Ｄａ  ｍＰＥＧに言及する場合、これは、１．０６未満、例えば１．０５未満、例えば１．０４未満、例えば１．０３未満、例えば１．０２〜１．０３の間の多分散指数を持つ化合物（または実際、化合物の混合物）を示すよう意図される。３，０００Ｄａ  ＰＥＧ、そして特に３，０００Ｄａ  ｍＰＥＧに言及する場合、これは、１．０６未満、例えば１．０５未満、例えば１．０４未満、例えば１．０３未満、例えば１．０２〜１．０３の間の多分散指数を持つ化合物（または実際、化合物の混合物）を示すよう意図される。
【０３４８】
いくつかの態様において、上記方法には、タンパク質のｐＨ環境を、７より大きいｐＨに調節し、そして部位選択的に標識されたタンパク質と、システイン残基を有するペプチドを接触させる工程もまた含まれる。いくつかの態様において、システイン残基を有するペプチドは、Ｎ５−（（Ｒ）−１−（（カルボキシメチル）アミノ）−３−メルカプト−１−オキソプロパン−２−イル）−Ｌ−グルタミンである。いくつかの態様において、システイン残基を有するペプチドを、任意のチオール含有分子、例えばチオールを含む多糖、チオールを含む細胞毒、チオール官能化ＰＥＧ等で置換することも可能である。
【０３４９】
薬学的組成物
別の側面において、本明細書に開示する方法いずれかによって修飾されたタンパク質を含む薬学的組成物。１つの側面において、こうした薬学的組成物は、１０〜１５ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌ、例えば１０〜１０ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、そして組成物が２．０〜１０．０のｐＨを有する修飾タンパク質、例えば成長ホルモン（ＧＨ）を含む。組成物はさらに、緩衝系、保存剤（単数または複数）、等張剤（単数または複数）、キレート剤（単数または複数）、安定化剤および界面活性剤を含むことも可能である。１つの態様において、薬学的組成物は水性組成物である。こうした組成物は、典型的には、溶液または懸濁物として存在する。さらなる態様において、薬学的組成物は水溶液である。用語「水性組成物」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む組成物と定義される。同様に、用語「水溶液」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液と定義され、そして用語「水性懸濁物」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液と定義される。
【０３５０】
別の態様において、薬学的組成物は、凍結乾燥組成物であり、これに対して、医師、患者、または薬剤師が、使用前に溶媒および／または希釈剤を添加する。別の態様において、薬学的組成物は、いかなるあらかじめの溶解も伴わず、使用する用意ができている乾燥組成物（例えば凍結乾燥またはスプレー乾燥組成物）である。
【０３５１】
さらなる側面において、薬学的組成物は、修飾タンパク質、例えば修飾ＧＨタンパク質、および緩衝剤の水溶液を含み、修飾タンパク質、例えば修飾ＧＨタンパク質は、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌまたはそれより多い濃度で存在し、そして前記組成物は、約２．０〜約１０．０のｐＨを有する。
【０３５２】
別の態様において、組成物のｐＨは、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、および１０．０からなるリストより選択される。
【０３５３】
さらなる態様において、緩衝剤は、重炭酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、ＴＲＩＳ、またはその混合物より選択される。
【０３５４】
さらなる態様において、組成物にはまた、薬学的に許容されうる保存剤も含まれてもよい。例えば、保存剤は、フェノール、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、２−フェノキシエタノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチル、２−フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、およびチオメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン（３ｐ−クロルフェノキシプロパン−１，２−ジオール）、またはその混合物であることも可能である。保存剤は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍまたは０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在することも可能である。さらなる態様において、保存剤は、５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【０３５５】
さらなる態様において、組成物には、等張剤が含まれてもよい。さらなる態様において、等張剤は、塩（例えば塩化ナトリウム）、糖または糖アルコール、アミノ酸（例えばＬ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン）、アルジトール（例えばグリセロール（グリセリン）、１，２−プロパンジオール（プロピレングリコール）、１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール）、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ４００）、またはその混合物より選択される。例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロース−Ｎａを含む、任意の糖、例えば単糖、二糖、または多糖、あるいは水溶性グルカンを用いてもよい。１つの態様において、糖添加物はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも１つの−ＯＨ基を有するＣ４−Ｃ８炭化水素と定義され、そしてこれには、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、デュルシトール、キシリトール、アラビトール、およびこれらの混合物が含まれる。１つの態様において、糖アルコール添加物はマンニトールである。１つの態様において、糖または糖アルコール濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの間、または１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌである。等張剤は、１ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌ、または８ｍｇ／ｍｌ〜２４ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。薬学的組成物中の等張剤の使用は、当業者に周知である。好適には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  第２０版，  ２０００を参照されたい。
【０３５６】
本背景において、用語「薬学的に許容されうる塩」は、患者に有害でない塩を示すよう意図される。こうした塩には、薬学的に許容されうる酸付加塩、薬学的に許容されうる金属塩、アンモニウムおよびアルキル化アンモニウム塩が含まれる。酸付加塩には、無機酸ならびに有機酸の塩が含まれる。適切な無機酸の代表例には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸等が含まれる。適切な有機酸の代表的な例には、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、桂皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモ酸、ビスメチレンサリチル酸、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ＥＤＴＡ、グリコール酸、ｐ−アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が含まれる。薬学的に許容されうる無機または有機酸付加塩のさらなる例には、本明細書に援用される、Ｊ．  Ｐｈａｎｎ．  Ｓｃｉ．  １９７７，  ６６，  ２に列挙される薬学的に許容されうる塩が含まれる。金属塩の例には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム塩等が含まれる。アンモニウムおよびアルキル化アンモニウム塩の例には、アンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、エチルアンモニウム、ヒドロキシエチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、ブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム塩等が含まれる。
【０３５７】
さらなる態様において、組成物には、キレート剤が含まれる。キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、およびアスパラギン酸の塩、ならびにその混合物より選択される。キレート剤は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ、または２ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。薬学的組成物中のキレート剤の使用は、当業者に周知である。好適には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  第２０版，  ２０００を参照されたい。
【０３５８】
さらなる態様において、組成物には安定化剤が含まれる。薬学的組成物における安定化剤の使用は、当業者に周知である。好適には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  第２０版，  ２０００を参照されたい。より具体的には、本発明の組成物は、安定化された液体薬学的組成物であり、その療法活性構成要素には、液体薬学的組成物での保存中におそらく凝集物形成を示すタンパク質が含まれる。「凝集物形成」によって、タンパク質分子間の物理的相互作用が意図され、これはオリゴマーの形成を生じ、オリゴマーは可溶性のままであるか、または溶液から沈殿する大きな可視凝集物である可能性もある。「保存中」によって、ひとたび調製された液体薬学的組成物または組成物が、直ちには被験体に投与されないことが意図される。そうではなく、調製後、これは、液体型、凍結状態、あるいは液体型または被験体への投与に適した他の型に、後に再構築される乾燥型のいずれかで、保存のためパッケージングされる。「乾燥型」によって、液体薬学的組成物または組成物が、フリーズドライ（すなわち凍結乾燥；例えば、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｏｌｌｉ（１９８４）  Ｊ．  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ３８：４８−５９）、スプレー乾燥（Ｍａｓｔｅｒｓ（１９９１）  Ｓｐｒａｙ−Ｄｒｙｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第５版；  Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，  Ｅｓｓｅｚ，  Ｕ．Ｋ．）中，  ｐｐ．４９１−６７６；  Ｂｒｏａｄｈｅａｄら（１９９２）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌ．  Ｉｎｄ．  Ｐｈａｎｎ．  １８：１１６９−１２０６；およびＭｕｍｅｎｔｈａｌｅｒら（１９９４）Ｐｈａｎｎ．  Ｒｅｓ．  １１：１２−２０）、または風乾（ＣａｒｐｅｎｔｅｒおよびＣｒｏｗｅ（１９８８）Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２５：４５９−４７０；ならびにＲｏｓｅｒ（１９９１）Ｂｉｏｐｈａｒｍ．  ４：４７−５３）によってのいずれかで乾燥されることが意図される。液体薬学的組成物の保存中の、タンパク質による凝集物形成は、そのタンパク質の生物学的活性に不都合に影響を及ぼすことも可能であり、薬学的組成物の療法的有効性の喪失を生じる。さらに、凝集物形成は、他の問題、例えば注入系を用いてタンパク質含有薬学的組成物を投与する場合、管系、膜、またはポンプの閉塞を引き起こしうる。
【０３５９】
薬学的組成物にはまた、組成物の保存中の、タンパク質による凝集物形成を減少させるために十分な量のアミノ酸塩基が含まれてもよい。「アミノ酸塩基」によって、任意の所定のアミノ酸が、遊離塩基型またはその塩型のいずれかで存在する、アミノ酸またはアミノ酸の組み合わせが意図される。アミノ酸の組み合わせを用いる場合、すべてのアミノ酸が、遊離塩基型で存在してもよいし、すべてがその塩型で存在してもよいし、またはあるものが遊離塩基型で存在する一方、他のものが塩型で存在してもよい。１つの態様において、本発明の組成物を調製する際に用いるためのアミノ酸は、荷電側鎖を所持するもの、例えば、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸である。特定のアミノ酸（メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニンおよびその混合物）の任意の立体異性体（すなわちＬまたはＤ異性体、あるいはその混合物）あるいはこれらの立体異性体またはグリシンまたは有機塩基の組み合わせ、例えば限定されるわけではないがイミダゾールは、特定のアミノ酸または有機塩基が、遊離塩基型またはその塩型のいずれかで存在する限り、薬学的組成物中に存在することも可能である。１つの態様において、アミノ酸のＬ−立体異性体を用いる。１つの態様において、Ｌ−立体異性体を用いる。本発明の組成物を、これらのアミノ酸の類似体を用いて配合することも可能である。「アミノ酸類似体」によって、本発明の液体薬学的組成物の保存中のタンパク質による凝集物形成を減少させる望ましい効果を達成する、天然存在アミノ酸の誘導体が意図される。適切なアルギニン類似体には、例えば、アミノグアニジン、オルニチンおよびＮ−モノエチルＬ−アルギニンが含まれ、適切なメチオニン類似体には、エチオニンおよびブチオニンが含まれ、そして適切なシステイン類似体には、Ｓ−メチル−Ｌ−システインが含まれる。他のアミノ酸に関しては、アミノ酸類似体は、遊離塩基型またはその塩型のいずれかで組成物内に取り込まれる。さらなる態様において、アミノ酸またはアミノ酸類似体は、タンパク質の凝集を防止するかまたは遅延させるのに十分な濃度で用いられる。
【０３６０】
さらなる態様において、療法剤として作用するタンパク質が、酸化に感受性である少なくとも１つのメチオニン残基を含むタンパク質である場合、メチオニン（また他のイオウアミノ酸）または類似のアミノ酸を添加して、メチオニン残基のメチオニンスルホキシドへの酸化を阻害することも可能である。「阻害する」によって、長期に渡るメチオニン酸化種の最小限の集積が意図される。メチオニン酸化の阻害は、タンパク質の適切な分子型でのより長い保持を生じる。メチオニンの任意の立体異性体（ＬまたはＤ異性体）またはその任意の組み合わせを用いてもよい。添加される量は、メチオニンスルホキシドの量が監督官庁に許容されうるように、メチオニン残基の酸化を阻害するために十分な量でなければならない。典型的には、これは、組成物が、約１０〜約３０％のメチオニンスルホキシドを超えない量を含有することを意味する。一般的に、これは、メチオニン残基に添加されるメチオニンの比が、約１：１〜約１０００：１、例えば１０：１〜約１００：１の範囲であるように、メチオニンを添加することによって得られうる。
【０３６１】
さらなる態様において、組成物には、高分子量ポリマーまたは低分子量化合物の群より選択される安定化剤が含まれることも可能である。安定化剤は、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ３３５０）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、カルボキシ−／ヒドロキシセルロースまたはその誘導体（例えばＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬ、ＨＰＣ−ＬおよびＨＰＭＣ）、シクロデキストリン、モノチオグリセロール、チオグリコール酸および２−メチルチオエタノールなどのイオウ含有物質、および異なる塩（例えば塩化ナトリウム）より選択されうる。
【０３６２】
薬学的組成物にはまた、さらなる安定化剤も含まれてもよく、これは、その療法活性タンパク質の安定性をさらに増進させる。安定化剤には，限定されるわけではないが、メチオニン酸化に対してタンパク質を保護する、メチオニンおよびＥＤＴＡ、ならびに凍結融解または機械的剪断に関連する凝集に対してタンパク質を保護する、非イオン性表面活性剤が含まれる。
【０３６３】
さらなる態様において、組成物にはまた表面活性剤が含まれる。表面活性剤は、界面活性剤、エトキシル化ひまし油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレン・ブロックポリマー（例えばポロキサマー、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、ポロキサマー１８８および４０７、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンおよびポリエチレン誘導体、例えばアルキル化およびアルコキシ化誘導体（Ｔｗｅｅｎ、例えばＴｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｗｅｅｎ−８０およびＢｒｉｊ−３５）、モノグリセリドまたはそのエトキシル化誘導体、ジグリセリドまたはそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レクチンおよびリン脂質（例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロールおよびスフィンゴミエリン）、リン脂質の誘導体（例えばジパルミトイルホスファチジン酸）およびリゾリン脂質（例えばエタノールアミン、コリン、セリンまたはスレオニンのパルミトイル・リゾファチジル−Ｌ−セリンおよび１−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸エステル）、ならびにリゾホスファチジルおよびホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシ（アルキルエステル）、アルコキシ（アルキルエーテル）誘導体、例えばリゾホスファチジルコリンのラウロイルおよびミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ならびに極性頭部の修飾、例えばコリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、スレオニン、グリセロール、イノシトール、および陽性荷電ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣＰ、ＢＩＳＨＯＰ、リゾホスファチジルセリンおよびリゾホスファチジルスレオニンおよびグリセロリン酸（例えばセファリン）、グリセロ糖脂質（例えばガラクトピラノシド）、スフィンゴ糖脂質（例えばセラミド、ガングリオシド）、ドデシルホスホコリン、鶏卵リゾレシチン、フシジン酸誘導体（例えばタウロ−ジヒドロフシジン酸等）、長鎖脂肪酸およびその塩、Ｃ６−Ｃ１２（例えばオレイン酸およびカプリル酸）、アシルカルニチンおよび誘導体、リジン、アルギニンもしくはヒスチジンのＮα−アシル化誘導体、またはリジンもしくはアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニンもしくはヒスチジンおよび中性もしくは酸性アミノ酸の任意の組み合わせを含む二タンパク質のＮα−アシル化誘導体、中性アミノ酸および２つの荷電アミノ酸の任意の組み合わせを含む三タンパク質のＮα−アシル化誘導体、ＤＳＳ（ドクサートナトリウム、ＣＡＳ登録番号［５７７−１１−７］）、ドクサートカルシウム、ＣＡＳ登録番号［１２８−４９−４］、ドクサートカリウム、ＣＡＳ登録番号［７４９１−０９−０］、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウム）、カプリル酸ナトリウム、コール酸またはその誘導体、胆汁酸およびその塩およびグリシンまたはタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グ���ココール酸ナトリウム、Ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸、ａｍｏｍｃ（アルキル−アリールスルホネート）一価界面活性剤、双性イオン界面活性剤（例えばＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸、３−コールアミド−１−プロピルジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸）、陽イオン性界面活性剤（四級アンモニウム塩基）（例えばセチル−トリメチルアンモニウムブロミド、塩化セチルピリジニウム）、非イオン性界面活性剤（例えばドデシルＰ−Ｄ−グルコピラノシド）、酸化プロピレンおよび酸化エチレンのエチレンジアミンへの連続付加に由来する四官能性ブロックコポリマーであるポロキサミン（例えばＴｅｔｒｏｎｉｃのもの）より選択可能であるか、あるいは、界面活性剤は、イミダゾリン誘導体群またはその混合物の群から選択可能である。
【０３６４】
薬学的組成物中の界面活性剤の使用は、当業者に周知である。好適には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  第２０版，  ２０００を参照されたい。
【０３６５】
他の成分が薬学的組成物中に存在していてもよい。こうしたさらなる成分には、湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、充填剤、等張性修飾剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質）および双性イオン（例えばアミノ酸、例えばベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジンおよびヒスチジン）が含まれることも可能である。こうしたさらなる成分はもちろん、薬学的組成物の全体の安定性に不都合に影響を及ぼしてはならない。
【０３６６】
修飾タンパク質、例えば修飾ＧＨタンパク質を含有する薬学的組成物を、こうした治療を必要とする患者に、いくつかの部位で、例えば局所部位、例えば皮膚および粘膜部位で、吸収をバイパスする部位で、例えば動脈中、静脈中、心臓中に、そして吸収を伴う部位で投与してもよく、例えば皮膚中、皮下、筋肉中、または腹部中への投与が可能である。
【０３６７】
薬学的組成物の投与は、こうした治療を必要とする患者への、いくつかの投与経路、例えば舌、舌下、頬側、口内、経口、胃内および腸内、鼻、肺、例えば細気管支および肺胞またはその組み合わせを通じたもの、上皮、皮膚、経皮、膣、直腸、目、例えば結膜を通じたもの、尿管および非経口であることも可能である。
【０３６８】
組成物を、いくつかの投薬型で、例えば、溶液、懸濁物、エマルジョン、マイクロエマルジョン、多数のエマルジョン、泡、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、ペースト、硬膏、軟膏、錠剤、コーティング錠剤、リンス、カプセル、例えば硬ゼラチンカプセルおよび軟ゼラチンカプセル、座薬、直腸カプセル、ドロップ、ジェル、スプレー、粉末、エアロゾル、吸入剤、点眼剤、眼軟膏、眼科リンス、膣ペッサリー、膣リング、膣軟膏、注射溶液、ｉｎ  ｓｉｔｕトランスフォーミング溶液、例えばｉｎ  ｓｉｔｕゲル化剤、ｉｎ  ｓｉｔｕ硬化剤、ｉｎ  ｓｉｔｕ沈殿剤、ｉｎ  ｓｉｔｕ結晶化剤、注入溶液、および移植物として投与してもよい。
【０３６９】
修飾ＧＨタンパク質の安定性をさらに増進し、生物学的利用能を増加させ、可溶性を増加させ、副作用を減少させ、当業者に周知の化学療法を達成し、そして患者コンプライアンスを増加させるかまたはこれらの組み合わせのために、本発明の組成物をさらに、例えば共有、疎水性および静電相互作用を通じて、薬剤キャリアー、薬剤送達系、および先端的薬剤送達系中に配合するかまたはこれらに付着させてもよい。キャリアー、薬剤送達系および先端的薬剤送達系の例には、限定されるわけではないが、ポリマー、例えばセルロースおよび誘導体、多糖、例えばデキストランおよび誘導体、デンプンおよび誘導体、ポリ（ビニルアルコール）、アクリレートおよびメタクリレートポリマー、ポリ乳酸およびポリグリコール酸およびそのブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、キャリアータンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えば感熱ゲル化系、例えば当業者に周知のブロックコポリマー系、ミセル、リポソーム、微小球体、ナノ粒子、液晶およびその分散物、液体−水系における相挙動の当業者に周知のＬ２相およびその分散物、ポリマー性ミセル、多数のエマルジョン、自己乳化剤、自己微小乳化剤、シクロデキストリンおよびその誘導体、ならびにデンドリマーが含まれる。
【０３７０】
組成物は、修飾タンパク質、例えば修飾ＧＨタンパク質の、例えばすべて当業者に周知のデバイスである計測用量吸入器、乾燥粉末吸入器およびネブライザーを用いた、肺投与のための固形、半固形、粉末および溶液の組成物中で有用である。
【０３７１】
修飾タンパク質の療法使用
本発明はまた、非修飾タンパク質が療法タンパク質である度合いまでの、療法における修飾タンパク質、および特に、修飾タンパク質を含む薬学的組成物の使用に関する。したがって、本明細書において、用語「治療」および「治療する」は、状態、例えば疾患または障害と闘う目的のための、患者の管理およびケアを意味する。該用語は、患者が罹患している所定の状態のための全範囲の治療、例えば症状または合併症を軽減し、疾患、障害または状態の進行を遅延させ、症状および合併症を軽減するかまたは緩和し、そして／または疾患、症状または状態を治癒させるかまたは取り除き、ならびに状態を防止するための活性化合物の投与が含まれるよう意図され、防止は、疾患、状態、または障害と闘う目的のための患者の管理およびケアと理解されるものとし、そして症状または合併症の開始を防止するための活性化合物の投与が含まれる。治療される患者は、好ましくは哺乳動物、特にヒトであるが、これにはまた、動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジおよびブタも含まれてもよい。にもかかわらず、療法措置および予防（防止的）措置は、本明細書に開示し、そして治療する医師または獣医師によって意図される使用に関して、別個の側面に相当することを認識すべきである。
【０３７２】
本明細書において、修飾タンパク質の「療法的有効量」は、所定の疾患およびその合併症の臨床的徴候を治癒させるか、軽減するかまたは部分的に抑止するために十分な量を意味する。これを達成するために適した量は、「療法的有効量」と定義される。各目的のための有効量は、例えば疾患または傷害の重症度、ならびに被験体の体重、性別および全身状態に応じるであろう。適切な投薬量の決定は、ルーチンの実験を用いて、値のマトリックスを構築し、そしてマトリックス中の異なる点を試験することによって、達成可能であることが理解されるであろうし、これはすべて、訓練された医師または獣医師の一般的な技術範囲内である。
【０３７３】
本明細書に開示する方法および組成物は、療法において使用するための修飾タンパク質を提供する。こうしたものとして、典型的な非経口用量は、投与あたり１０〜９ｍｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。典型的な投薬用量は、投与あたり約０．００００００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。正確な用量は、例えば、投与の徴候、薬剤、頻度および様式、治療しようとする被験体の性別、年齢および全身状態、治療しようとする疾患または状態の性質および重症度、治療の望ましい効果、ならびに当業者に明らかな他の要因に依存するであろう。典型的な投薬頻度は、１日２回、１日１回、２日に１回、週２回、週１回またはさらにより長い投薬間隔である。対応する非コンジュゲート化タンパク質に比較した、活性化合物の延長された半減期のため、長い投薬間隔の投薬措置、例えば週２回、週１回またはさらに長い投薬間隔が特定の態様である。治療において、１より多い薬剤を用いて、同時投与するかまたは連続投与して、多くの疾患を治療する。したがって、疾患の１つの治療のための療法における修飾タンパク質を、疾患の治療に通常用いられる１またはそれより多い他の療法活性化合物と組み合わせて用いてもよいことが意図される。その疾患のための薬剤製造において、疾患の治療に通常用いられる他の療法活性化合物と組み合わせた、修飾タンパク質の使用もまた、意図される。
【実施例】
【０３７４】
修飾化合物のための一般的な調製法
別に明記しない限り、出発物質は、一般的に、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｉｎｃ．（ニューハンプシャー州ウィンダム）、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（ニュージャージー州フェアローン）などの商業的供給源より入手可能であった。微生物トランスグルタミナーゼは、味の素ノースアメリカ社（イリノイ州イタスカ）によって提供された。ＣＲＭ１９７（ＣＡＳ番号９２０９２−３６−９）は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．（ウィスコンシン州ミルウォーキー）より入手可能である。モノメチルオーリスタチンＦをＣｏｎｃｏｒｔｉｓ（カリフォルニア州サンディエゴ）より購入した。シクロオクチン試薬を、Ｓｙｎａｆｆｉｘ（オランダ・ナイメーヘン）より購入した。ＭｅｎＡ抗原性多糖は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＮＶ＆Ｄより供給された。
【０３７５】
修飾化合物をカラムクロマトグラフィ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ  ｐｕｒｉｆｌａｓｈ  ４３０）によって精製し、そしてＮＭＲ分光計（４００ＭＨｚ  Ｂｒｕｋｅｒ）、ＬＣＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ−ＵＶ−ＣＡＤ−ＭＳ）、およびＬＣＵＶ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズＵＰＬＣ−ＵＶ）によって分析した。標識ＣＲＭ１９７は、ＬＣＭＳ（ＵＰＬＣ−ＵＶ−ＴＯＦ−ＭＳ  ＨＲＭＳ  Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  Ｑｔｏｆ）によって性質決定される。標識ＣＲＭ１９７をアミコン・フィルター（３ｋＤａまたは１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）、および／またはＳＥＣ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ＡＥＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ）によって精製する。
【０３７６】
修飾のタンパク質部位（部位選択性）の同定は、タンパク質マッピングによって特徴付けられた。実施例で用いるｍＴＧアーゼは、味の素ノースアメリカ社（イリノイ州イタスカ）由来の微生物トランスグルタミナーゼである。
【０３７７】
以下の実施例で用いる以下の頭字語は、対応する意味を有する：
ＭＭＡＦ：モノメチルオーリスタチンＦ
ｍＴＧアーゼ：微生物トランスグルタミナーゼ
ＭＷＣＯ：分子量カットオフ
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシニミド
ＢＣＮ−ＮＨＳ：（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノン−４−イン−９−イルメチルＮ−スクシニミジルカーボネート
ＨＡＴＵ：（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸）
ＲＴ：室温
Ｒｔ：保持時間
Ｚ−Ｑ−Ｇ−ＮＨ−（ＰＥＧ）３−Ｎ３：
【０３７８】
【化７８】
0006739333.tif 000088
【０３７９】
商業的に入手可能なＺＱＧ（１ｇ、２．９６ｍｍｏｌ）、アミン−ＰＥＧ−アジド（０．８８２ｍＬ、４．４５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１．５５３ｍＬ、８．８９ｍｍｏｌ）、およびＨＡＴＵ（１．１２７ｇ、２．９６ｍｍｏｌ）を、一緒に、ＤＭＦ中に添加し、そしてＲＴで１６時間攪拌した。溶液を直接、５５ｇのＣ−１８  ＲＰカラム上に装填し、そしてカラムクロマトグラフィ５−８０％ＭｅＣＮ／水によって精製した。試料を装填するために多量のＭｅＯＨが必要であったため、劣ったピーク形状が観察された。望ましいピークの体積を減少させ、そしてカラム上に再装填した。カラムクロマトグラフィ５−８０％ＭｅＣＮ／水によって、産物を再度精製した。収量：３００ｍｇ（１９％収率）。
【０３８０】
【化７９】
0006739333.tif 000089
【０３８１】
ＺＱ−ＮＨ−（ＰＥＧ）３Ｎ３
【０３８２】
【化８０】
0006739333.tif 000090
【０３８３】
商業的に入手可能なＮＨ２−（ＰＥＧ）３−Ｎ３（０．０８７ｍＬ、０．３１８ｍｍｏｌ）、ヒューニッヒ塩基（０．０６９ｍＬ、０．３９８ｍｍｏｌ）、および商業的に入手可能なＺＱ−ＮＨＳ（１００ｍｇ、０．２６５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ中で合わせ、そしてＲＴで１６時間混合した。精製のため、反応を直接、３５ｇ  Ｃ−１８カラム上に装填した。１０−７５％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ。収量９０ｍｇ（７０％収率）。
【０３８４】
【化８１】
0006739333.tif 000091
【０３８５】
シクロオクチン−シクロプロピル−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｑ−Ｇ
【０３８６】
【化８２】
0006739333.tif 000092
【０３８７】
商業的に入手可能なＱＧ（９２ｍｇ、０．３１６ｍｍｏｌ）およびヒューニッヒ塩基（６４．５μＬ、０．３６９ｍｍｏｌ）を、２ｍＬの１：１  水：ＤＭＳＯに溶解し、そして３５℃に温めた。商業的に入手可能なＣｌｉｃｋ−ｅａｓｙＴＭ  ＢＣＮ  Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルＩ（５０ｍｇ、０．２４６ｍｍｏｌ）を２ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解し、そしてゆっくりと反応に添加した。反応を４０℃で１時間混合した。産物をカラムクロマトグラフィ（２０ｇ  Ｃ−１８、０−７０ＭｅＣＮ／水）によって精製した。産物は、ほぼ５０％ＭｅＣＮで溶出する。収量：４６ｍｇ（４９％収率）。
【０３８８】
【化８３】
0006739333.tif 000093
【０３８９】
シクロオクチン−シクロプロピル−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｌ−Ｑ−Ｇ
【０３９０】
【化８４】
0006739333.tif 000094
【０３９１】
ペプチド合成装置を用いて、ロイシン−グルタミン−グリシン・ペプチドを調製した。ロイシン−グルタミン−グリシン配列に関して、合成装置をプログラミングした。樹脂を回収し、そしてペプチドをＴＦＡで取り外した。溶液をゆっくりとエーテル（冷）に添加し、そして産物を沈殿させた。溶液を遠心分離し、そしてエーテルをデカントした。固形物を水に溶解し、そしてカラムクロマトグラフィ（３５ｇ  ＲＰ  Ｃ−１８カラム）によって精製した。産物は、１００％水により、８４％収率で溶出した。
【０３９２】
ロイシン・グルタミン・グリシン・ペプチド（３０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）、ヒューニッヒ塩基（０．０３０ｍＬ、０．１７４ｍｍｏｌ）、および商業的に入手可能なＣｌｉｃｋ−ｅａｓｙＴＭ  ＢＣＮ  Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルＩ（２０ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中で合わせ、そして室温で５時間攪拌した。反応を２０ｇ  Ｃ−１８カラム（０−２０％ＭｅＣＮ／水）上に直接装填し、そして１０  ＣＶに渡って精製して、産物２０ｍｇを得た（５８％収率）。ＨＲＭＳ計算値（Ｃ２１Ｈ３２Ｎ６Ｏ７）４９２．２５８４  観察値：（Ｍ＋１）４９３．２６８２。
【０３９３】
Ｚ−Ｑ−ＮＨ−（ＰＥＧ）２−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−シクロプロピルシクロオクチン
【０３９４】
【化８５】
0006739333.tif 000095
【０３９５】
ＤＭＳＯ中の商業的ＢｏｃＮＨ−（ＰＥＧ）３−アミン（０．３０８ｍＬ、０．９９４ｍｍｏｌ）を、商業的に入手可能なＺＱ−ＮＨＳ（２５０ｍｇ、０．６６３ｍｍｏｌ）に添加し、そしてＲＴで３時間攪拌した。精製のため、反応を直接、３０ｇ  Ｃ−１８カラム上に装填した（０−５０％ＭｅＣＮ／水）。産物は４５％ＭｅＣＮで溶出した。溶媒を除去して、白色残渣を得た（２００ｍｇ、５９．１％収率）。ＬＣＭＳ計算値（Ｃ２１Ｈ３２Ｎ６Ｏ７）５１０．２７  観察値：（Ｍ＋１）５１１．４。
【０３９６】
Ｂｏｃ保護産物（２００ｍｇ、０．３９２ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（３ｍＬ、３８．９ｍｍｏｌ）で処理し、そしてＲＴで１０分間振盪した。反応を高真空で一晩乾燥させ、そして未精製ＺＱ−ＮＨ−（ＰＥＧ）２−ＮＨ２を次の反応に直接用いた。ヒューニッヒ塩基（２ｍＬ、１１．４５ｍｍｏｌ）を１ｍＬ  ＤＭＳＯ中のＺＱ−ＮＨ−（ＰＥＧ）２−ＮＨ２（１５０ｍｇ、０．３６５ｍｍｏｌ）に添加した。次いで、商業的に入手可能なＢＣＮ−ＮＨＳ（１０６ｍｇ、０．３６５ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応を数時間攪拌した。カラムクロマトグラフィ（３５ｇ  Ｃ−１８カラム  １５−７５％ＭｅＣＮ／水）によって産物を精製した。ＤＭＳＯピーク下、ならびに〜６０％ＭｅＣＮで産物が溶出した。分画を合わせ、そして１０ｍＬに濃縮した。第二のカラムを２０−５０％ＭｅＣＮ／水で流した。産物は４５％ＭｅＣＮで溶出した。溶媒を減圧下で除去して、産物５０ｍｇ（２３％収率）を得た。
【０３９７】
【化８６】
0006739333.tif 000096
【０３９８】
Ｚ−Ｑ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ジメチルアセタール
【０３９９】
【化８７】
0006739333.tif 000097
【０４００】
ＺＱＮＨＳ（１００ｍｇ、０．２６５ｍｍｏｌ）、４，４−ジメトキシブタン−１−アミン（０．０４９ｍＬ、０．２９２ｍｍｏｌ）、およびヒューニッヒ塩基（０．０４６ｍＬ、０．２６５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中で溶解し、そしてＲＴで１時間混合した。精製のため、反応を直接、３５ｇ  Ｃ−１８カラムに装填した（０−４０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）。溶媒を減圧下で除去して、産物５０ｍｇ（４８％収率）を得た。
【０４０１】
【化８８】
0006739333.tif 000098
【０４０２】
Ｚ−Ｑ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７
【０４０３】
【化８９】
0006739333.tif 000099
【０４０４】
商業的に入手可能なＺＱ−ＮＨＳ（２８６ｍｇ、０．７５８ｍｍｏｌ）、ヒューニッヒ塩基（０．５ｍＬ、２．８６ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル（２−アミノエチル）カルバメート（０．３ｍＬ、１．４９８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ中で合わせ、そして超音波処理した。溶液を１６時間攪拌した。反応を濾過し、そしてＤＣＭｍで洗浄し、その後、蒸発させた。残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭ  １：１０中に溶解し、そしてＨＣＯ３捕捉および放出カラムを通過させて、酸副産物を除去した。生じた産物をＴＦＡ（１ｍＬ、１２．９８ｍｍｏｌ）で処理し、１５ｍＬ  ＤＣＭを添加した。反応を３０分間混合し、そして次いでｒｏｔｏｖａｐ上で蒸発させた。残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭ  １：１０に溶解し、そしてＨＣＯ３捕捉および放出カラムを通過させて、酸副産物を除去した。溶媒を除去して、産物３００ｍｇ（９１％収率）を得た。
【０４０５】
生じたアミンリンカー（５．１ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）中に溶解し、そしてヒューニッヒ塩基（３．６６μｌ、０．０２１ｍｍｏｌ）を添加し、その後、Ａｌｅｘｆｌｏｕｒ６４７（５ｍｇ、５．２４μｍｏｌ）を添加した。反応を室温でＸの期間、攪拌した。カラムクロマトグラフィ精製のため、反応を直接、３５ｇ  Ｃ−１８カラム上に装填した（５−３５％ＭｅＣＮ／水）。産物は、〜１０％ＭｅＣＮで溶出した。産物を凍結乾燥して、暗紫色粉末を得た。収量：３．５ｍｇ（５７％収率）。ＨＲＭＳ計算値（Ｃ５１Ｈ６７Ｎ６Ｏ１７Ｓ４＋）：予測質量１１６３．３４  観察質量：Ｍ＋１、１１６４。
【０４０６】
Ｚ−Ｑ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−Ｔｏｌ
【０４０７】
【化９０】
0006739333.tif 000100
【０４０８】
３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパン酸（２ｇ）、ＨＡＴＵ（４．４２ｇ）、ヒューニッヒ塩基（４．６２ｍＬ）およびＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（１．１３４ｇ）をＤＣＭ中で合わせ、そしてＲＴで２時間攪拌した。反応を水に注ぎ、そして有機物を抽出した。有機層を蒸発させて、未精製黄色油を得た。産物をカラムクロマトグラフィ（５０ｇ  Ｃ−１８、１０−７０％ＭｅＣＮ／水）によって得た。分画を収集し、そして濃縮して、黄色油を得た。収量：１．３ｇ、５３％収率。予測質量：２３２、観察質量Ｍ＋１：２３３。
【０４０９】
ｔｅｒｔ−ブチル（３−（メトキシ（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）カルバメート（１．３ｇ、５．６０ｍｍｏｌ）を、乾燥ＴＨＦ中に溶解し、そしてフラスコに窒素をパージした。溶液を０℃に冷却し、次いでＴＨＦ中の臭化ビニルマグネシウム（２０ｍｌ、２０．００ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。反応をＲＴに一晩温めた。反応を冷飽和ＮＨ４Ｃｌに注ぎ、そして酢酸エチルで抽出した。有機物を乾燥させ、そして溶媒をｒｏｔｏｖａｐ上で除去した。未精製物質を引き続き用いた。
【０４１０】
ｔｅｒｔ−ブチル（３−オキソペント−４−エン−１−イル）カルバメートおよび４−メチルベンゼンチオールをＭｅＯＨ中で合わせ、そしてＲＴで３日間攪拌した。メタノールをｒｏｔｏｖａｐによって除去して、粘度が高い油性黄色残渣を得た。残渣をＤＣＭ中に溶解し、そして水で２ｘ洗浄した。有機層を乾燥させ、そして溶媒をｒｏｔｏｖａｐ上で除去して、黄色油を得た。この産物（１ｇ、３．０９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ中に溶解し、そして０℃に冷却した。ＴＦＡ（３ｍＬ、３８．９ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加し、次いで、ＲＴに温め、そして１時間攪拌した。溶媒を除去し、そして残渣をＤＣＭ中に溶解し、そしてカーボネート捕捉および放出カラムに通過させ、その後、カルボン酸捕捉および放出カラムに通過させた。産物は両方を通過した。カラムを洗浄し、溶媒を合わせ、そして次いで、溶媒をｒｏｔｏｖａｐによって処理した。産物をカラムクロマトグラフィによって精製した（５０ｇ  Ｃ−１８  １０−７０％ＭｅＣＮ／水）。産物を収集し、溶媒を蒸発によって除去して、黄色油を得た。産物を収集し、そして溶媒を蒸発によって除去して、黄色油を得た。いかなるさらなる精製も伴わずに、産物を続けて用いた。８５０ｍｇ、定量的収量。
【０４１１】
１−アミノ−５−（ｐ−トリルチオ）ペンタン−３−オン（１００ｍｇ、０．４４８ｍｍｏｌ）およびヒューニッヒ塩基（０．１３０ｍＬ、０．７４６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中に溶解し、次いで、商業的に入手可能なＺＱ−ＮＨＳ（１４１ｍｇ、０．３７３ｍｍｏｌ）を添加して、そしてＲＴで混合した。産物をカラムクロマトグラフィによって精製した（２５ｇ  Ｃ−１８カラム  １０−７５％ＭｅＣＮ／水）。産物を収集し、そして有機物をｒｏｔｏｖａｐによって蒸発させた。ＭｅＯＨを水中でスルフィドリンカーに添加した。オキソン（２２９ｍｇ、０．３７３ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応をＲＴで一晩攪拌した。反応を濾過し、そしてカラムクロマトグラフィ（２５ｇ  Ｃ−１８カラム  １０−７５％ＭｅＣＮ／水）によって精製し、そして産物を凍結乾燥して７５ｍｇにした（３９％収率）。
【０４１２】
【化９１】
0006739333.tif 000101
【０４１３】
Ａｃ−Ｌ−Ｑ−Ｇ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−Ｔｏｌ
【０４１４】
【化９２】
0006739333.tif 000102
【０４１５】
１−アミノ−５−（ｐ−トリルチオ）ペンタン−３−オンを、Ｚ−Ｑ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−Ｔｏｌの合成において上述するように調製した。ＬＱＧを、シクロオクチン−シクロプロピル−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｌ−Ｑ−Ｇの合成において上述するように調製した。ＬＱＧは、ＤＣＭ中で、ＬＱＧ（２７ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）、Ａｃ２Ｏ（９．６６μｌ、０．１０２ｍｍｏｌ）およびヒューニッヒ塩基（０．０４５ｍＬ、０．２５６ｍｍｏｌ）を合わせることによって、Ｎ末端でアセル化（ａｃｅｌａｔｅｄ）され、そしてこれをＲＴで数時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、そして水を添加した。産物を凍結乾燥し、そして次の反応に直接用いた。ＬＣＭＳ観察質量：（Ｍ＋１）３５９．２；望ましい質量：３５８．４。
【０４１６】
Ａｃ−ＬＱＧ（３８ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌ）、１−アミノ−５−（ｐ−トリルチオ）ペンタン−３−オン（４７．４ｍｇ、０．２１２ｍｍｏｌ）、およびヒューニッヒ塩基（０．０７４ｍＬ、０．４２４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中で合わせた。ＨＡＴＵ（４０．３ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応をＲＴで一晩攪拌した。カラムクロマトグラフィ（３５ｇ  Ｃ−１８カラム  １０−５０％ＭｅＣＮ／水）によって産物を精製して得た。
【０４１７】
スルフィド（１３．５ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）を、１：１  水：ＭｅＯＨに溶解した。オキソン（４４．２ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応をＲＴで一晩攪拌した。カラムクロマトグラフィ（２５ｇ  Ｃ−１８カラム  １０−６０％ＭｅＣＮ／水）によって産物を精製した。
【０４１８】
【化９３】
0006739333.tif 000103
【０４１９】
Ｚ−Ｑ−ＮＨ−（ＣＨ２）４−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−Ｔｏｌ
【０４２０】
【化９４】
0006739333.tif 000104
【０４２１】
６−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ヘキサン酸（１ｇ、４．３２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ中に溶解し、次いで、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（０．４６４ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．８０８ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）、およびＴＥＡ（０．７２３ｍＬ、５．１９ｍｍｏｌ）を添加した。反応をＲＴで数時間攪拌し、反応が完了しなかったため、さらなるアミン、ＨＡＴＵ、およびＴＥＡを添加した。反応を１６時間攪拌した。反応を濾過し、そして溶媒を蒸発させた。エーテルを添加し、そして反応を再び濾過した。カラムクロマトグラフィ（２５ｇカラム  ０−４５％  ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ）によって産物を精製して、３８５ｍｇ（３２．５％収率）を得た。
【０４２２】
ｔｅｒｔ−ブチル（６−（メトキシ（メチル）アミノ）−６−オキソヘキシル）カルバメート（３８５ｍｇ、１．４０３ｍｍｏｌ）を、乾燥ＴＨＦに溶解し、そして０℃に冷却した。臭化ビニルマグネシウム（４．２１０ｍＬ、４．２１ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。反応をＲＴに一晩温めた。反応を飽和ＮＨ４Ｃｌに注ぎ、そして有機物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を水および塩水で洗浄し、乾燥させ、そして蒸発させた。カラムクロマトグラフィ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  ＲＰ  ＨＰＬＣ  １０−４０％ＭｅＣＮ／水  ０．１％  ＴＦＡ  １０分間  ２２６ｎｍ  ＵＶ）によって産物を精製し、２８０ｍｇ（８３％収率）を得た。
【０４２３】
ｔｅｒｔ−ブチル（６−オキソオクト−７−エン−１−イル）カルバメート（２８０ｍｇ、１．１６０ｍｍｏｌ）および４−メチルベンゼンチオール（１７３ｍｇ、１．３９２ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨに溶解し、そしてＲＴで１６時間時間攪拌した。メタノールを除去し、そしてクロマトグラフィ（２５ｇカラム  ０−３０％  ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ）によって産物を精製し、１６０ｍｇ（３８％収率）を得た。
【０４２４】
ｔｅｒｔ−ブチル（６−オキソ−８−（ｐ−トリルチオ）オクチル）カルバメート（１６０ｍｇ、０．４３８ｍｍｏｌ）およびオキソン（８０７ｍｇ、１．３１３ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ／水  ５０／５０中でともに合わせ、そしてＲＴで１６時間攪拌した。反応を水に注ぎ、そしてＤＣＭで抽出した。有機層を蒸発によって乾燥させ、そしてジオキサン中の４モルＨＣｌを添加し、そしてＲＴで数時間攪拌した。溶媒を蒸発によって除去して、オフホワイト残渣を得た。Ｓｕｎｆｉｒｅ  ＲＰ  ＨＰＬＣ（１０−４０％ＭｅＣＮ／水  ０．１％  ＴＦＡ）によって産物を精製し、３３ｍｇ（２５％収率）を得た。
【０４２５】
８−アミノ−１−トシルオクタン−３−オン（２０ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）および商業的に入手可能なＺＱＮＨＳ（２３．０７ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ中で合わせ、そして３７℃で１時間混合した。反応は完了せず、そして数時間後も進行はまったく観察されなかった。ヒューニッヒ塩基（５．３４μｌ、０．０３１ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応を進めた。精製のため、反応を直接、カラム（６ｇ  Ｃ−１８  ０−７５％ＭｅＣＮ／水）上に装填した。カラムを２回流し、２．４ｍｇ（７％収率）を得た。
【０４２６】
【化９５】
0006739333.tif 000105
【０４２７】
Ｚ−Ｑ−ＮＨ−ＭｅｎＡ多糖
【０４２８】
【化９６】
0006739333.tif 000106
【０４２９】
アミン官能化ＭｅｎＡ抗原性多糖（１０ｍｇ）を、ＤＭＳＯ中、塩基とともに、商業的に入手可能なＺＱＮＨＳ（１０ｍｇ  ２６．４μｍｏｌ）に添加し、そして数時間攪拌した。反応を凍結乾燥し、水中に溶解し、そして１０ＫＤ  Ａｍｉｃｏｎフィルターによって、４ｘ精製した。次いで、フロースルーを３ＫＤ  Ａｍｉｃｏｎに通過させて、さらなる産物を回収した。これを未精製物に対して行い、概算収率は〜５０％であった。
【０４３０】
Ｚ−Ｑ−ＮＨ−（ＣＨ２）５−Ｃ（Ｏ）−モノメチルオーリスタチンＦ
【０４３１】
【化９７】
0006739333.tif 000107
【０４３２】
６−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ヘキサン酸（４６．５ｍｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に溶解し、そしてヒューニッヒ塩基（０．０８ｍＬ、０．４５８ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（７６ｍｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）を添加した。反応をＲＴで３０分間攪拌した後、反応混合物をＭＭＡＦ（５０ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）に添加した。次いで、反応をＲＴで４時間攪拌した。カラムクロマトグラフィによる精製のため、反応混合物を３５ｇ  Ｃ−１８カラム上に装填した（５−７５％ＭｅＣＮ／水  ０．１％ギ酸）。溶媒をｒｏｔｏｖａｐ上で除去し、そして高真空下に一晩置いた。
【０４３３】
生じた産物をＴＦＡ（２ｍＬ）、０℃で処理し、そして室温にして５分間攪拌した。カラム精製のため、３５ｇ  Ｃ−１８カラム上に反応を直接装填した。減圧下で溶媒を除去して、３０ｍｇ（５２％収率）を得た。
【０４３４】
脱保護アミン（２０ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ中で溶解し、次いでＬｉＯＨ（１ｍＬ、４．００ｍｍｏｌ）を添加した。ＲＴで３０分間攪拌した反応を、次いで、精製のため、カラム（３５ｇ  Ｃ−１８カラム）上に直接装填した（０％ＭｅＣＮ、その後、２０−４０％ＭｅＣＮ／水）。産物をＴＨＦで溶出させ、そして上記条件下でカラムを再び流し、５１％収率で１０ｍｇを得た。
【０４３５】
生じた産物（５ｍｇ、５．９２μｍｏｌ）をＤＭＳＯ中に溶解し、商業的に入手可能なＺＱＮＨＳ（４．４ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）に添加し、そして３７℃で２０分間攪拌した。カラムクロマトグラフィ精製のため、反応混合物を２５ｇ  Ｃ−１８カラムに直接装填した（２０−７５％ＭｅＣＮ／水）。溶媒を減圧下で除去し、４６％収率で３ｍｇを得た。ＬＣＭＳ計算値（Ｃ２１Ｈ３２Ｎ６Ｏ７）：１１０６．６６２７  観察値：（Ｍ＋１）１１０７．９。
【０４３６】
フェノール−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−Ｌ−Ｑ−Ｇ
【０４３７】
【化９８】
0006739333.tif 000108
【０４３８】
上記の「シクロオクチン−シクロプロピル−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｌ−Ｑ−Ｇの合成」に記載されるように、ＬＱＧを調製した。商業的に入手可能な２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパノエート（１４．６５ｍｇ、５５．６μｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ中、ヒューニッヒ塩基（１８μＬ、１０１μｍｏｌ）とともにＬＱＧ（１６ｍｇ、５０．６μｍｏｌ）に添加し、そして反応を室温で一晩攪拌した。精製のため、２０ｇカラム（１０−５０％ＭｅＣＮ／水）上に反応を直接装填し、５５％収率で１３ｍｇの産物を得た。ＨＲＭＳ計算値（Ｃ２１Ｈ３２Ｎ６Ｏ７）：４６４．２２７１  観察値：（Ｍ＋１）４６５．２３５６。
【０４３９】
ＺＱ（ＰＥＧ）２アジドベンジルアミド
【０４４０】
【化９９】
0006739333.tif 000109
【０４４１】
４−アジドフェニル酢酸Ｎ−スクシニミドエステル（ＣｈｅｍＰａｃｉｆｉｃ、２６．７ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解し、そしてＤＭＦ（２．３ｍＬ）中のベンジル（５−アミノ−１−（（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−１，５−ジオキソペンタン−２−イル）カルバメート（２０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）の溶液と合わせた。ＤＩＰＥＡ（０．１２１ｍＬ、０．５８５ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応を室温で４時間混合し、この時点で、ＤＩＰＥＡ（６１μＬ、６等量）および４−アジドフェニル酢酸Ｎ−スクシニミドエステル（９ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）を添加した。反応を室温で２日間混合した。４−アジドフェニル酢酸Ｎ−スクシニミドエステル（８９ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応を室温で２時間攪拌した。溶液をＭＳ誘発ＨＰＬＣを通じて精製した（１００−Ｐｒｅｐ３；酸  方法３；  Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５μｍカラム  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分、Ａ：水（０．１％ギ酸）；Ｂ：ＡＣＮ勾配、０分  ５％Ｂ；１．７０分で５％から９５％Ｂ；２．０分で９５％Ｂ；２．１分で５％Ｂ  流速２ｍｌ／分  １．５ｍｌ注入；  Ｔｕｂｅ  Ｔｒｉｇｇｅｒ  Ｍ＝５７０）。望ましい産物を含む分画をプールし、そして凍結乾燥して、３．６ｍｇ（１３％）のＺＱ（ＰＥＧ２）アジド−ベンジルアミド（ベンジル（１７−アミノ−１−（４−アジドフェニル）−２，１３，１７−トリオキソ−６，９−ジオキサ−３，１２−ジアザヘプタデカン−１４−イル）カルバメート）淡黄色粉末を得た。ＬＣＭＳ  ＳＱ２；産物分析−酸性；Ｒｔ＝１．７９：ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］観察値：５７０．３、計算値：５６９．６。
【０４４２】
ＺＱ（ＰＥＧ）２アミドエチルメチルジアジリン
【０４４３】
【化１００】
0006739333.tif 000110
【０４４４】
スルホ−ＮＨＳ−ジアジリン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３．９２ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解し、そしてＤＭＦ（２．３ｍＬ）中のベンジル（５−アミノ−１−（（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−１，５−ジオキソペンタン−２−イル）カルバメート（２０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）と合わせた。反応物を攪拌して合わせ、そしてＤＩＰＥＡ（０．１２１ｍＬ、０．５８５ｍｍｏｌ）を添加した。反応を室温で２時間攪拌し、この時点で、反応は濁り、そして０．５ｍＬ  ＤＭＦを添加した。反応を室温でさらに２時間攪拌し、そしてＤＩＰＥＡ（６１μＬ）およびスルホ−ＮＨＳ−ジアジリン（８ｍｇ）を添加した。反応を室温で１６時間混合し、この時点で、出発物質の消費をＬＣＭＳ分析によって観察した。溶液をＭＨ誘発ＨＰＬＣ（１００−Ｐｒｅｐ３；酸  方法３；  Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５ｕｍカラム  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分、１．５ｍｌ注入；  Ｔｕｂｅ  Ｔｒｉｇｇｅｒ  Ｍ＝５２１）によって精製した。望ましい産物、ＺＱ（ＰＥＧ）２アミドエチルメチルジアジリン（ベンジル（１８−アミノ−１−（３−メチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）−３，１４，１８−トリオキソ−７，１０−ジオキサ−４，１３−ジアザオクタデカン−１５−イル）カルバメート）をプールし、そして凍結乾燥して、白色粉末として、２ｍｇ（８％）の望ましい化合物を得た。ＬＣＭＳ  ＳＱ２；産物分析−酸性；Ｒｔ＝１．４９：ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］観察値：５２１．４、計算値：５２０．６。
【０４４５】
２−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）−２−ウンデシルトリデカン二酸
【０４４６】
【化１０１】
0006739333.tif 000111
【０４４７】
ＤＣＭ（１．５７ｍＬ）中のＤＣＣ（１２６ｍｇ、０．６１０ｍｍｏｌ）の溶液を、ＤＣＭ（５ｍＬ）中の中間体４およびＮ−ヒドロキシスクシニミドの溶液ならびにＴＨＦ（５ｍＬ）に、Ｎ２下で添加した。３．５時間後、溶媒を蒸発させ、そして残渣を、超臨界液体クロマトグラフィ（ＳＦＣ；  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  ２−エチル−ピリジン、２０ｘ１５０ｍｍ、２０−３０％ＭｅＯＨ／ＣＯ２）によって精製し、無色油として表題化合物を得た（１３８ｍｇ、０．２５６ｍｍｏｌ、５０％）：
【０４４８】
【化１０２】
0006739333.tif 000112
【０４４９】
【化１０３】
0006739333.tif 000113
【０４５０】
２−（（２，２−ジメチル−４−オキソ−３，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８−ドデカオキサ−５−アザテトラコンタン−４０−イル）カルバモイル）−２−ウンデシルトリデカン二酸。
【０４５１】
ｔ−Ｂｏｃ−Ｎ−アミド−ｄＰＥＧ（登録商標）１１−アミン（１００ｍｇ、０．１５５ｍｍｏｌ、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）および２−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）−２−ウンデシルトリデカン二酸（８０ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３ｍＬ）中に溶解し、そして窒素下、室温で攪拌した。３０分後、ＤＩＰＥＡ（０．０５ｍＬ、０．２８６ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応混合物を室温で一晩攪拌した。ＬＣＭＳ（酸性溶出液Ａ：水＋０．０５％トリフルオロ酢酸、溶出液Ｂ：ＡＣＮ、カラムＳｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８  ３．５μｍ  ３．０ｘ３０ｍｍ−４０℃、５−９５％勾配２分、保持時間１．９２分）によって、完全変換が観察される。反応混合物を減圧下で濃縮し、次いで、約１．５ｍＬのアセトニトリル中に溶解した。ＭＳ誘発ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５ｕｍカラム  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分  １．５ｍｌ注入、６５−９５％  ＡＣＮ  ３．５分勾配、保持時間３．２３分）上で精製し、そして分画をプールし、そして５４％収率で８５ｍｇの清浄な産物を得た。透明油。
【０４５２】
【化１０４】
0006739333.tif 000114
【０４５３】
２−（（３５−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−ウンデカオキサペンタトリアコンチル）カルバモイル）−２−ウンデシルトリデカン二酸
【０４５４】
【化１０５】
0006739333.tif 000115
【０４５５】
２−（（２，２−ジメチル−４−オキソ−３，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８−ドデカオキサ−５−アザテトラコンタン−４０−イル）カルバモイル）−２−ウンデシルトリデカン二酸（５ｍｇ、４．６８μｍｏｌ）をＤＣＭ（体積：２ｍＬ）中に溶解し、次いで、トリフルオロ酢酸（２５μｌ、０．３２４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を窒素大気下、室温で約２時間攪拌した。ＬＣＭＳ（酸性溶出液Ａ：水＋０．０５％トリフルオロ酢酸、溶出液Ｂ：ＡＣＮ、カラムＳｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８  ３．５μｍ  ３．０ｘ３０ｍｍ  −４０℃、５−９５％勾配２分間、保持時間１．４５分）によって、完全変換が観察された。反応混合物を減圧下で濃縮し、次いで、ＤＣＭでリンスし、そして再び３回濃縮した。アセトニトリルおよびＤＭＳＯの混合物中に溶解した。ＭＳ誘発ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５ｕｍカラム  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分  １．５ｍｌ注入、４５−７０％  ＡＣＮ  ３．５分勾配、保持時間２．５０分）上で精製し、そして分画をプールし、そして凍結乾燥して、５５％収率の２．５ｍｇの清浄な産物を得た。透明な油。
【０４５６】
【化１０６】
0006739333.tif 000116
【０４５７】
２−（（（Ｓ）−５−（３−アミノ−３−オキソプロピル）−３，６−ジオキソ−１−フェニル−２，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，４０−ドデカオキサ−４，７−ジアザドテトラコンタン−４２−イル）カルバモイル）−２−ウンデシルトリデカン二酸（ＺＱ−ＦＡ）
【０４５８】
【化１０７】
0006739333.tif 000117
【０４５９】
ＴＨＦ（体積：２ｍＬ）中の２−（（２，２−ジメチル−４−オキソ−３，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８−ドデカオキサ−５−アザテトラコンタン−４０−イル）カルバモイル）−２−ウンデシルトリデカン二酸（２０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｚ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｏｓｕ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡＳ  ３４０７８−８５−８、１１ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）に添加し、次いで、ＤＩＰＥＡ（７５μｌ、０．４２９ｍｍｏｌ）を添加した。窒素大気下で、週末、室温で攪拌した。ＬＣＭＳ（酸性溶出液Ａ：水＋０．０５％トリフルオロ酢酸、溶出液Ｂ：ＡＣＮ、カラムＳｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８  ３．５μｍ  ３．０ｘ３０ｍｍ−４０℃、５−９５％勾配  ２分間、保持時間１．７７分）によって、完全変換が観察された。減圧下で反応混合物を濃縮し、そして次いで、アセトニトリル中に溶解した。ＭＳ誘発ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５ｕｍカラム  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分  １．５ｍｌ注入、５５−８０％  ＡＣＮ  ３．５分勾配、保持時間２．７０分）上で精製し、そして分画をプールし、そして凍結乾燥して、透明な無色油として、４６％収率で、１０．５ｍｇの清浄な産物ＺＱ−ＦＡを得た。
【０４６０】
【化１０８】
0006739333.tif 000118
【０４６１】
アジド−ニトロフェニル−グルタミン−グリシン
【０４６２】
【化１０９】
0006739333.tif 000119
【０４６３】
ＱＧ（３０ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（体積：１ｍＬ、比：１．０００）に溶解し、そしてナトリウム１−（（４−アジド−２−ニトロベンゾイル）オキシ）−２，５−ジオキソピロリジン−３−スルホネート（６０．１ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（体積：１．０００ｍＬ、比：１．０００）中で添加した後、ＤＩＰＥＡ（０．１７７ｍｍｏｌ）を添加した。反応を１６時間攪拌し、この時点で、産物をＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５ｕｍカラム  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分  １．５ｍｌ注入、ｒｔ＝１．５３）によって精製して、６２％収率で望ましい産物を得た。
【０４６４】
【化１１０】
0006739333.tif 000120
【０４６５】
ジアジリン−ＱＧ
【０４６６】
【化１１１】
0006739333.tif 000121
【０４６７】
ＱＧ（３０ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（体積：１ｍＬ、比：１．０００）中に溶解し、そしてＨ２Ｏ（体積：１．０００ｍＬ、比：１．０００）中のナトリウム１−（（３−（３−メチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）プロパノイル）オキシ）−２，５−ジオキソピロリジン−３−スルホネート（５０ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）を添加し、その後、ＤＩＰＥＡ（０．０３１ｍＬ、０．１７７ｍｍｏｌ）を添加した。反応を１６時間攪拌し、この時点で、産物をＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５ｕｍカラム  １５−２０％勾配  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ    ７５ｍｌ／分  １．５ｍｌ注入、ｒｔ＝２．４６）によって直接精製して、５２％収率で望ましい産物を得た。
【０４６８】
【化１１２】
0006739333.tif 000122
【０４６９】
ＺＱ（ＰＥＧ）３ビオチン
【０４７０】
【化１１３】
0006739333.tif 000123
【０４７１】
ＺＱ  ＮＨＳ（４５．１ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）、ビオチンアミン（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ  ＃  ２１３４７、５０ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（２３ｕＬ、０．１３１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）中で合わせ、そして室温で２時間攪拌し、この時点で、ＬＣＭＳは主要な産物を示す。ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５ｕｍカラム  １５−２０％勾配  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分  １．５ｍｌ注入、ｒｔ＝２．４６）上に反応を装填して、４３％収率で望ましい産物を得た。
【０４７２】
【化１１４】
0006739333.tif 000124
【０４７３】
ＣＲＭ１９７への修飾化合物のコンジュゲート化
Ｚ−Ｑ−Ｇ−ＮＨ−（ＰＥＧ）３−Ｎ３
【０４７４】
【化１１５】
0006739333.tif 000125
【０４７５】
３２μＬのＣＲＭ１９７（３２ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭ  ｐＨ８のＴｒｉｓ緩衝液中の１０００μＬのＺ−Ｑ−Ｇ−ＮＨ−（ＰＥＧ）３−Ｎ３（２ｍｇ／ｍＬ）に添加し、そして１００μＬの微生物トランスグルタミナーゼ（ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｍＬのストック、マルトシクロデキストリン中の商業的な１％ｍＴＧアーゼから１ｘを調製）を添加する。反応を２５℃で３０分間インキュベーションした。１．５  ＣＶに渡って、ＰＢＳ  １ｘの泳動緩衝液を用い、ＳＥＣで反応を精製した。１つのリンカーの付加が、質量スペクトルによって観察される。ＬＣＭＳ計算値：５８９２９；観察値：（Ｍ＋１）５８９３０。収量７００μｇ、６８％収率。
【０４７６】
３２μＬのＣＲＭ１９７（３２ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭ  ｐＨ８のＴｒｉｓ緩衝液中の１０００μＬのＺ−Ｑ−Ｇ−ＮＨ−（ＰＥＧ）３−Ｎ３（２ｍｇ／ｍＬ）に添加し、そして１００μＬの微生物トランスグルタミナーゼ（ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｍＬのストック、マルトシクロデキストリン中の商業的な１％ｍＴＧアーゼから１ｘを調製）を添加する。反応を２５℃で１８時間インキュベーションした。１．５  ＣＶに渡って、ＰＢＳ  １ｘの泳動緩衝液を用い、ＳＥＣで反応を精製した。２つのリンカーの付加が、質量スペクトルによって観察される。ＬＣＭＳ計算値：５９４５０；観察値：（Ｍ＋１）５９４５１。収量７００μｇ、６８％収率。
【０４７７】
３２μＬのＣＲＭ１９７（３２ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭ  ｐＨ６の酢酸ナトリウム緩衝液中の１０００μＬのＺ−Ｑ−Ｇ−ＮＨ−（ＰＥＧ）３−Ｎ３（２ｍｇ／ｍＬ）に添加し、そして１００μＬの微生物トランスグルタミナーゼ（ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｍＬのストック、マルトシクロデキストリン中の商業的な１％ｍＴＧアーゼから１ｘを調製）を添加する。反応を２５℃で３日間インキュベーションした。１．５  ＣＶに渡って、ＰＢＳ  １ｘの泳動緩衝液を用い、ＳＥＣで反応を精製した。３つおよび４つの付加が、質量スペクトルによって観察される。ＬＣＭＳ計算値：５９９７１、６０４９２；観察値（Ｍ＋１）５９９７２、６０４９３．収量：７００μｇ、６８％収率。
【０４７８】
ＺＱ−ＮＨ−（ＰＥＧ）３Ｎ３
【０４７９】
【化１１６】
0006739333.tif 000126
【０４８０】
６３μＬのＣＲＭ１９７（３２ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭ  ｐＨ８  Ｔｒｉｓ緩衝液中の１８００μＬのＺＱ−ＮＨ−（ＰＥＧ）３Ｎ３（２ｍｇ／ｍＬ）に添加し、そして１５０μＬの微生物トランスグルタミナーゼ（ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｍＬのストック、マルトシクロデキストリン中の商業的な１％ｍＴＧアーゼから１ｘを調製）を添加する。反応を２５℃で１時間インキュベーションした。１．５  ＣＶに渡って、ＰＢＳ  １ｘの泳動緩衝液を用い、ＳＥＣで反応を精製した。１つのリンカーの付加が、質量スペクトルによって観察される。ＬＣＭＳ計算値：５８８７２；観察値：（Ｍ＋１）５８８７５。収量  １．３ｍｇ（６７％）。
【０４８１】
シクロオクチン−シクロプロピル−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｑ−Ｇ
【０４８２】
【化１１７】
0006739333.tif 000127
【０４８３】
３２μＬのＣＲＭ１９７（３２ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭ  ｐＨ８のＴｒｉｓ緩衝液中、１０００μＬのシクロオクチン−シクロプロピル−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｑ−Ｇ（２ｍｇ／ｍＬ）に添加し、そして１００μＬの微生物トランスグルタミナーゼ（ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｍＬのストック、マルトシクロデキストリン中の商業的な１％ｍＴＧアーゼから１ｘを調製）を添加する。２５℃で３時間反応をインキュベーションした。１．５  ＣＶに渡って、ＰＢＳ  １ｘの泳動緩衝液を用い、ＳＥＣで反応を精製した。
【０４８４】
１つのリンカーの付加が、質量スペクトルによって観察される。ＬＣＭＳ計算値：５８７７１  観察値：（Ｍ＋１）５８７７１。収量：０．４７５ｍｇ、５０％収率。
【０４８５】
シクロオクチン−シクロプロピル−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｌ−Ｑ−Ｇ
【０４８６】
【化１１８】
0006739333.tif 000128
【０４８７】
１μＬのＣＲＭ１９７（３２ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭ  ｐＨ８のＴｒｉｓ緩衝液中、３０μＬのシクロオクチン−シクロプロピル−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｌ−Ｑ−Ｇ（２ｍｇ／ｍＬ）に添加し、そして３μＬの微生物トランスグルタミナーゼ（ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｍＬのストック、マルトシクロデキストリン中の商業的な１％ｍＴＧアーゼから１ｘを調製）を添加する。反応を２５℃で１時間インキュベーションした。１つのリンカーの付加が、質量スペクトルによって観察される。ＬＣＭＳ計算値：５８８８４  観察値：（Ｍ＋１）５８８８５。
【０４８８】
１μＬのＣＲＭ１９７（３２ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭ  ｐＨ８のＴｒｉｓ緩衝液中、３０μＬのシクロオクチン−シクロプロピル−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｌ−Ｑ−Ｇ（２ｍｇ／ｍＬ）に添加し、そして３μＬの微生物トランスグルタミナーゼ（ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｍＬのストック、マルトシクロデキストリン中の商業的な１％ｍＴＧアーゼから１ｘを調製）を添加する。反応を２５℃で２４時間インキュベーションした。２つのリンカーの付加が、質量スペクトルによって観察される。ＬＣＭＳ計算値：５９３６０  観察値：（Ｍ＋１）５９３６１。
【０４８９】
Ｚ−Ｑ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ジメチルアセタール
【０４９０】
【化１１９】
0006739333.tif 000129
【０４９１】
１μＬのＣＲＭ１９７（３２ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭ  ｐＨ８のＴｒｉｓ緩衝液中、５０μＬのＺ−Ｑ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ジメチルアセタール（８ｍｇ／ｍＬ）に添加し、そして３μＬの微生物トランスグルタミナーゼ（ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｍＬのストック、マルトシクロデキストリン中の商業的な１％ｍＴＧアーゼから１ｘを調製）を添加する。反応を２２℃で１時間インキュベーションした。１つのリンカーの付加が、質量スペクトルによって観察される。ＬＣＭＳ計算値：５８７８７；観察値：（Ｍ＋１）５８７８８。
【０４９２】
Ｚ−Ｑ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７
【０４９３】
【化１２０】
0006739333.tif 000130
【０４９４】
１００μＬのＣＲＭ１９７（３２ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭ  ｐＨ８のＴｒｉｓ緩衝液中、３０００μＬのＺ−Ｑ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７（１ｍｇ／ｍＬ）に添加し、そして３００μＬの微生物トランスグルタミナーゼ（ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｍＬのストック、マルトシクロデキストリン中の商業的な１％ｍＴＧアーゼから１ｘを調製）を添加する。反応を２５℃で１８時間インキュベーションした。１．５  ＣＶに渡って、ＰＢＳ  １ｘの泳動緩衝液を用い、ＳＥＣで反応を精製した。１つのフルオロフォアの付加が、質量スペクトルによって観察される。ＬＣＭＳ計算値：５９５５４；観察値：（Ｍ＋１）５９５５６  収量：２．６ｍｇ、８１％収率。
【０４９５】
Ａｃ−Ｌ−Ｑ−Ｇ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−Ｔｏｌ
【０４９６】
【化１２１】
0006739333.tif 000131
【０４９７】
Ａｃ−Ｌ−Ｑ−Ｇ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−Ｔｏｌ（５０μＬ、０．０８４μｍｏｌ）（ほぼ１ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、ＣＲＭ（０．５μＬ、０．０００２７μｍｏｌ）およびＴＧアーゼ（１．５μＬ、１．９７Ｅ−０５μｍｏｌ）を添加し、そして２５℃で１時間混合した。反応の〜６０％が完了する。ＬＣＭＳ計算値：５８９８７  観察値：（Ｍ＋１）５８９８８。反応を直接、グルタチオンでのさらなる修飾に用いた（以下の方法）。
【０４９８】
Ｚ−Ｑ−ＮＨ−（ＣＨ２）４−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−Ｔｏｌ
【０４９９】
【化１２２】
0006739333.tif 000132
【０５００】
１μＬのＣＲＭ１９７（３２ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭ  ｐＨ６の酢酸ナトリウム緩衝液中、３０μＬのＺ−Ｑ−ＮＨ−（ＣＨ２）４−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−Ｔｏｌ（１ｍｇ／ｍＬ）に添加し、そして３μＬの微生物トランスグルタミナーゼ（ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｍＬのストック、マルトシクロデキストリン中の商業的な１％ｍＴＧアーゼから１ｘを調製）を添加する。反応を２５℃で３時間インキュベーションする。反応を１０ｋＤａ  Ａｍｉｃｏｎフィルターを通じて精製する。１つのリンカーの付加が、質量スペクトルによって観察される。ＬＣＭＳ計算値：５８９５１  観察値：（Ｍ＋１）５８９５３。
【０５０１】
Ｚ−Ｑ−ＮＨ−ＭｅｎＡ多糖
【０５０２】
【化１２３】
0006739333.tif 000133
【０５０３】
１５６μＬのＣＲＭ１９７（３２ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭ  ｐＨ８のＴｒｉｓ緩衝液中、５０００μＬのＺ−Ｑ−ＮＨ−ＭｅｎＡ多糖（１ｍｇ／ｍＬ）に添加し、そして４８８μＬの微生物トランスグルタミナーゼ（ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｍＬのストック、マルトシクロデキストリン中の商業的な１％ｍＴＧアーゼから１ｘを調製）を添加する。反応を２５℃で１８時間インキュベーションした。５０ｋＤａ  Ａｍｉｃｏｎフィルターを通じて、反応を精製して、最終収量２ｍｇの産物（３８％収率）を生じた。産物は、多糖の異種性によって、異種混合物であるため、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（上記図のパラグラフ００６）によって、産物を確認した。
【０５０４】
Ｚ−Ｑ−ＮＨ−（ＣＨ２）５−Ｃ（Ｏ）−モノメチルオーリスタチンＦ
【０５０５】
【化１２４】
0006739333.tif 000134
【０５０６】
５０μＬのＣＲＭ１９７（３２ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭ  ｐＨ８のＴｒｉｓ緩衝液中、１５００μＬのＺ−Ｑ−ＮＨ−（ＣＨ２）５−Ｃ（Ｏ）−モノメチルオーリスタチンＦ  （１ｍｇ／ｍＬ）に添加し、そして１５０μＬの微生物トランスグルタミナーゼ（ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｍＬのストック、マルトシクロデキストリン中の商業的な１％ｍＴＧアーゼから１ｘを調製）を添加する。反応を２５℃で４５分間インキュベーションした。１．５  ＣＶに渡って、ＰＢＳ  １ｘの泳動緩衝液を用い、ＳＥＣで反応を精製した。１つのＭＭＡＦの付加が、質量スペクトル上で観察される。ＬＣＭＳ計算値：５９４９９  観察値：５９４９８  収量：６５９μｇ、３８％収率。
【０５０７】
６０μＬのＣＲＭ１９７（３２ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭ  ｐＨ８のＴｒｉｓ緩衝液中、１５００μＬのＺ−Ｑ−ＮＨ−（ＣＨ２）５−Ｃ（Ｏ）−モノメチルオーリスタチンＦ（１ｍｇ／ｍＬ）に添加し、そして１７０μＬの微生物トランスグルタミナーゼ（ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｍＬのストック、マルトシクロデキストリン中の商業的な１％ｍＴＧアーゼから１ｘを調製）を添加する。反応を２５℃で２４時間でインキュベーションした。さらに６０μＬのｍＴＧアーゼを添加し、そして反応をさらに１８時間インキュベーションした。１．５  ＣＶに渡って、ＰＢＳ  １ｘの泳動緩衝液を用い、ＳＥＣで反応を精製した。２つのＭＭＡＦの付加が、質量スペクトルによって観察される。ＬＣＭＳ計算値：６０５９０  観察値：６０５８９  収量：７００μｇ、３６％収率。
【０５０８】
フェノール−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−Ｌ−Ｑ−Ｇ
【０５０９】
【化１２５】
0006739333.tif 000135
【０５１０】
１μＬのＣＲＭ１９７（３２ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭ  ｐＨ８のＴｒｉｓ緩衝液中、２２μＬのフェノール−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−Ｌ−Ｑ−Ｇ（０．５ｍｇ／ｍＬ）に添加し、そして３μＬの微生物トランスグルタミナーゼ（ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｍＬのストック、マルトシクロデキストリン中の商業的な１％ｍＴＧアーゼから１ｘを調製）を添加する。反応を２５℃で１時間インキュベーションした。１つの小分子の付加が、質量スペクトルによって観察される。予測質量：５８８５６。観察質量：５８８５７。
【０５１１】
Ｚ−Ｑ−Ｇ−ＮＨ−（ＰＥＧ）３−Ｎ３でのＧＢＳ８０の修飾
【０５１２】
【化１２６】
0006739333.tif 000136
【０５１３】
２．３２ｍＬ  ＧＢＳ８０タンパク質（３．４９ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６中、１４ｍＬ  Ｚ−Ｑ−Ｇ−ＮＨ−（ＰＥＧ）３−Ｎ３（８ｍｇ／ｍＬ）に添加し、そして５０μＬのｍＴＧアーゼ（ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。反応を３７℃で一晩インキュベーションした。ＬＣＭＳは、１および２の付属物の付加、ならびに少量の＋３を示す。反応を、０．８ｍＬ  ３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）プロパン酸（１０ｍｇ／ｍＬ）で停止し、そして室温で１時間インキュベーションした。次いで、反応をｚｅｂａスピンカラム３Ｘに通過させた。回収した物質を、ＬＣＭＳによって分析し、７８％総収率で、修飾ＧＢＳ８０を得た。ＬＣＭＳ計算値：５３３５５、５３８８０、５４４０５；観察値：（Ｍ＋１）５３３５５、５３８７７、５４３９８。
【０５１４】
ＣＲＭ１９７＋ＺＱ（ＰＥＧ２）アジドベンジルアミドのｍＴＧアーゼ仲介標識
【０５１５】
【化１２７】
0006739333.tif 000137
【０５１６】
ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８中のＺＱ（ＰＥＧ２）アジドベンジルアミド（ベンジル（１７−アミノ−１−（４−アジドフェニル）−２，１３，１７−トリオキソ−６，９−ジオキサ−３，１２−ジアザヘプタデカン−１４−イル）カルバメート）の溶液（３．５ｍｇ／ｍＬ、８６μＬ、０．５２７μｍｏｌ）に、ＣＲＭ１９７（３３ｍｇ／ｍＬ、７．５５μＬ、０．００４３μｍｏｌ）を添加し、その後、ＰＢＳ中のトランスグルタミナーゼ酵素溶液（５０ｍｇ／ｍＬ、７．６１μＬ、０．０１００μｍｏｌ）を添加した。反応を３７℃で１６時間攪拌し、この時点で、ＬＣＭＳ分析は、＋１、＋２および＋３産物への変換を示した。ＬＣＭＳ  ＱＴ２；タンパク質＿３５−７０ｋＤａ＿３ｍｉｎ：  Ｒｔ＝１．４８ｍｉｎ；ＭＳ［Ｍ＋リンカー］：観察値：５８９５８、計算値：５８９６２；ＭＳ［Ｍ＋（２リンカー）］：観察値：５９５１３、計算値：５９５１４；ＭＳ［Ｍ＋（３リンカー）］：観察値：６００６７、計算値：６００６６。
【０５１７】
【表２】
0006739333.tif 000138
【０５１８】
ＣＲＭ１９７＋ＺＱ（ＰＥＧ）２アミドエチルメチルジアジリンのｍＴＧアーゼ仲介標識
【０５１９】
【化１２８】
0006739333.tif 000139
【０５２０】
ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８中のベンジル（１８−アミノ−１−（３−メチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）−３，１４，１８−トリオキソ−７，１０−ジオキサ−４，１３−ジアザオクタデカン−１５−イル）カルバメートの溶液（３．５ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ、０．３３６μｍｏｌ）に、ＣＲＭ１９７（３３ｍｇ／ｍＬ、４．８２μＬ、０．００２７μｍｏｌ）を添加し、その後、ＰＢＳ中のトランスグルタミナーゼ酵素溶液（５０ｍｇ／ｍＬ、４．８５μＬ、０．００６４μｍｏｌ）を添加した。反応を室温で２日間攪拌し、この時点で、ＬＣＭＳ分析は、＋１、＋２および＋３産物への変換を示した。ＬＣＭＳ  ＱＴ２；タンパク質＿３５−７０ｋＤａ＿３ｍｉｎ：  Ｒｔ＝１．６９ｍｉｎ；ＭＳ［Ｍ＋リンカー］：観察値：５８９１２、計算値：５８９１３；ＭＳ［Ｍ＋（２ｘリンカー）］：観察値：５９４１５、計算値：５９４１６；ＭＳ［Ｍ＋（３ｘリンカー）］：観察値：５９９１８、計算値：５９９１９。
【０５２１】
【表３】
0006739333.tif 000140
【０５２２】
ＣＲＭ１９７＋ＺＱ−ＦＡのｍＴＧアーゼ仲介標識
【０５２３】
【化１２９】
0006739333.tif 000141
【０５２４】
１００ｍＭ  ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８中のＺＱ−ＦＡの溶液（８ｍｇ／ｍＬ、２０３μＬ、１．３１６μｍｏｌ）にＣＲＭ１９７（３３ｍｇ／ｍＬ、１．５１５μＬ、０．０００８６μｍｏｌ）を添加し、その後、ＰＢＳ中のトランスグルタミナーゼ酵素溶液（５０ｍｇ／ｍＬ、０．４５５μＬ、０．０００６０μｍｏｌ）を添加した。反応を室温で１６時間攪拌した。１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターを用いて、反応を５回希釈し、そして濃縮して１００μＬの体積にすることによって、反応混合物を１００ｍＭ  ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８に変換した。ＬＣＭＳ分析は、＋１、＋２、＋３および＋４産物への変換を示した。ＬＣＭＳ  ＱＴ２；タンパク質＿３５−７０ｋＤａ＿３ｍｉｎ：  Ｒｔ＝１．４５ｍｉｎ；ＭＳ［Ｍ＋ＺＱ−ＦＡ］：観察値：５９６２５、計算値：５９６２４；ＭＳ［Ｍ＋（２ｘＺＱ−ＦＡ）］：観察値：６０８３９、計算値：６０８３８；ＭＳ［Ｍ＋（３ｘＺＱ−ＦＡ）］：観察値：６２０５４、計算値：６２０５２；ＭＳ［Ｍ＋（４ｘＺＱ−ＦＡ）］：観察値：６３２７０、計算値：６３２６６。
【０５２５】
【表４】
0006739333.tif 000142
【０５２６】
ＣＲＭ１９７＋アジドニトロフェニルＱＧのｍＴＧアーゼ仲介標識：
１００ｍＭ  ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８中、アジドニトロフェニル−ＱＧの溶液（８ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）に、ＣＲＭ１９７（３３ｍｇ／ｍＬ、１．０μＬ、３３ｕｇ）を添加し、その後、ＰＢＳ中のトランスグルタミナーゼ酵素溶液（５０ｍｇ／ｍＬ、１．０μＬ、マルトシクロデキストリン中の０．１％ＴＧアーゼ）を添加した。反応を室温で１６時間インキュベーションした。ＬＣＭＳ分析は、＋１、＋２、および＋３産物への変換を示した。ＬＣＭＳ  ＱＴ１；タンパク質＿２０−７０ｋＤａ＿３ｍｉｎ：  Ｒｔ＝１．６７ｍｉｎ；ＭＳ［Ｍ＋１アジドニトロフェニルＱＧ］：観察値：５８８１５、計算値：５８８０３；ＭＳ［Ｍ＋２アジドニトロフェニルＱＧ］：観察値：５９１９１、計算値：５９１９６；ＭＳ［Ｍ＋３アジドニトロフェニルＱＧ］：観察値：５９５８５、計算値：５９５８９
【０５２７】
【表５】
0006739333.tif 000143
【０５２８】
ＣＲＭ１９７＋ジアジリン−ＱＧのｍＴＧアーゼ仲介標識：
１００ｍＭ  ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８中のジアジリン−ＱＧ溶液（８ｍｇ／ｍＬ、１００μＬに、ＣＲＭ１９７（３３ｍｇ／ｍＬ、１．０μＬ、３３ｕｇ）を添加し、その後、ＰＢＳ中のトランスグルタミナーゼ酵素溶液（５０ｍｇ／ｍＬ、１．０μＬ、マルトシクロデキストリン中の０．１％ＴＧアーゼ）を添加した。反応を室温で２時間インキュベーションした。ＬＣＭＳ分析は、＋１産物への変換を示した。ＬＣＭＳ  ＱＴ１；タンパク質＿２０−７０ｋＤａ＿３ｍｉｎ：  Ｒｔ＝１．６７ｍｉｎ；ＭＳ［Ｍ＋ジアジリン−ＱＧ］：観察値：５８７０５、計算値：５９７０６。
【０５２９】
【表６】
0006739333.tif 000144
【０５３０】
ＣＲＭ１９７＋ＺＱ（ＰＥＧ）３ビオチンのｍＴＧアーゼ仲介標識
１００ｍＭ  ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８中のＺＱ（ＰＥＧ）３ビオチン溶液（８ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）に、ＣＲＭ１９７（３３ｍｇ／ｍＬ、１．０μＬ、３３ｕｇ）を添加し、その後、ＰＢＳ中のトランスグルタミナーゼ酵素溶液（５０ｍｇ／ｍＬ、１．０μＬ、マルトシクロデキストリン中の０．１％ＴＧアーゼ）を添加した。反応を室温で１６時間インキュベーションした。ＬＣＭＳ分析は、＋１産物への変換を示した。ＬＣＭＳ  ＱＴ１；タンパク質＿２０−７０ｋＤａ＿３ｍｉｎ：  Ｒｔ＝１．６７ｍｉｎ；ＭＳ［Ｍ＋１  ＺＱ（ＰＥＧ）３ビオチン］：観察値：５９０７３、計算値：５９０７４；ＭＳ［Ｍ＋２  ＺＱ（ＰＥＧ）３ビオチン］：観察値：５９７３７、計算値：５９７３８；ＭＳ［Ｍ＋３  ＺＱ（ＰＥＧ）３ビオチン］：観察値：６０４０３、計算値：６０４０２。
【０５３１】
【表７】
0006739333.tif 000145
【０５３２】
タンパク質の標識ｍＴＧアーゼ触媒選択的リジン標識の官能化例：
Ｚ−Ｑ−Ｇ−ＮＨ−（ＰＥＧ）３−Ｎ３
【０５３３】
【化１３０】
0006739333.tif 000146
【０５３４】
３．２ｍｇのアジド標識タンパク質を、ＰＳ／タンパク質６：１  ｗ／ｗのコンジュゲート化比で、多糖と合わせた。産物を２Ｘ  ＨＡカラムで精製した。最初の実行（ＢＬＯＣＫ  １＝ＮａＰｉ  ２ｍＭ  ｐＨ７．２、ＢＬＯＣＫ  ２＝ＮａＰｉ  ４００ｍＭ  ｐＨ７．２）は未結合タンパク質を除去する。第二の実行（ＢＬＯＣＫ  １＝ＮａＰｉ  ２ｍＭ／ＮａＣｌ  ５５０ｍＭ  ｐＨ７．２、ＢＬＯＣＫ  ２＝ＮａＰｉ  １０ｍＭ  ｐＨ７．２、ＢＬＯＣＫ  ３＝ＮａＰｉ  ３５ｍＭ  ｐＨ７．２、ＢＬＯＣＫ  ４＝ＮａＰｉ  ４００ｍＭ  ｐＨ７．２）は、未結合多糖を除去する。
【０５３５】
【化１３１】
0006739333.tif 000147
【０５３６】
３．３ｍｇのアジド標識タンパク質を、ＰＳ／タンパク質６：１  ｗ／ｗのコンジュゲート化比で、多糖と合わせた。産物を２Ｘ  ＨＡカラムで精製した。最初の実行（ＢＬＯＣＫ  １＝ＮａＰｉ  ２ｍＭ  ｐＨ７．２、ＢＬＯＣＫ  ２＝ＮａＰｉ  ４００ｍＭ  ｐＨ７．２）は未結合タンパク質を除去する。第二の実行（ＢＬＯＣＫ  １＝ＮａＰｉ  ２ｍＭ／ＮａＣｌ  ５５０ｍＭ  ｐＨ７．２、ＢＬＯＣＫ  ２＝ＮａＰｉ  １０ｍＭ  ｐＨ７．２、ＢＬＯＣＫ  ３＝ＮａＰｉ  ３５ｍＭ  ｐＨ７．２、ＢＬＯＣＫ  ４＝ＮａＰｉ  ４００ｍＭ  ｐＨ７．２）は、未結合多糖を除去する。
【０５３７】
図２〜４に示すように、これらの実験の産物のＳＤＳ  ｐａｇｅゲル性質決定を得た。それぞれの収量もまた、以下の表３に示す。
【０５３８】
表３．
【０５３９】
【表８】
0006739333.tif 000148
【０５４０】
ｍＴＧアーゼ標識法を通じて得られたこれらのクリックＧＢＳ８０コンジュゲートを各々、以下に論じる生物学的アッセイによって試験した。
【０５４１】
ＧＢＳ  ＩＩまたはＶ多糖抗原に対するＩｇ力価決定のためのＥＬＩＳＡイムノアッセイ
免疫動物由来の血清におけるＧＢＳ多糖ＩＩまたはＶに対するＩｇＧ力価を以下のように測定した。
【０５４２】
マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、１００μｌの１．０μｇ／ｍＬ  ＨＳＡ−ａｄｈ（ヒト血清アルブミン−アジピン酸二ヒドラジド）コンジュゲート化多糖ＩＩまたはＶでコーティングした。プレートを室温で一晩インキュベーションし、そして次いで、洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄した。ウェルあたり２５０μｌのＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を分配した後、プレートを３７℃で９０分間インキュベーションし、そして次いで、吸引して、コーティング後の溶液を除去した。試験血清をＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で１：４００に希釈した。過免疫血清をプールすることによって標準血清を調製し、そして４０５ｎｍで約２．０００の光学密度（ＯＤ）を得るように標準プールの最初の希釈を選択した。プレートを３７℃で１時間インキュベーションし、そして次いで、洗浄緩衝液で洗浄し、そして１００μＬの希釈緩衝液中のアルカリホスファターゼ・コンジュゲート化抗マウスＩｇＧ  １：１０００を各ウェルに分配した。プレートを３７℃で９０分間インキュベーションし、そして次いで、洗浄緩衝液で洗浄した。１００μＬの基質緩衝液中のｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐ−ＮＰＰ）４．０ｍｇ／ｍＬの溶液を各ウェルに分配した。プレートを室温で３０分間インキュベーションし、そして次いで１００μＬのＥＤＴＡ  ７％（ｗ／ｖ）二ナトリウム塩に加えてＮａ２ＨＰＯ４  ３．５％  ｐＨ８．０の溶液を各ウェルに添加して、酵素反応を停止した。４０５ｎｍの光学密度（ＯＤ）を測定した。参照ラインアッセイ法を用いることによって、ＧＢＳ多糖抗原（ＩＩまたはＶ）に対する総ＩｇＧ力価を計算し、そして結果を恣意的ＥＬＩＳＡ単位／ｍＬ（ＥＵ／ｍＬ）と表した。３つの抗原各々に関して、標準血清ＩｇＧ力価に、恣意的に１．０ＥＵ／ｍＬの値を割り当てた。標準プールの力価曲線（バイアスおよび傾斜）を用いて、得たＯＤを内挿することによって、各血清のＩｇＧ力価を概算した。結果を図５および６に示す。
【０５４３】
マウス活性母性免疫モデル
８匹のＣＤ−１メスマウス（６〜８週齢）の群を、ミョウバンアジュバント中に配合した２０μｇの抗原または緩衝剤（ＰＢＳ）で、第１日、２１日、および３５日に免疫した。次いでマウスを交配させ、そしてその子孫を、子の９０％において死を誘導すると計算されるＧＢＳ用量に腹腔内曝露した。保護値を［（対照における死亡％−ワクチンにおける死亡％）／対照における死亡％］ｘ１００として計算した。マウスを毎日監視し、そしてＮｏｖａｒｔｉｓ動物福祉ポリシーのもとで、研究に関してあらかじめ確立されていた、定義される人道的な終点を示した際に屠殺した。Ｆｉｓｈｅｒの直接検定を用いて、統計分析を行った。結果を以下の表４および５に示す。
【０５４４】
表４
【０５４５】
【表９】
0006739333.tif 000149
【０５４６】
表５
【０５４７】
【表１０】
0006739333.tif 000150
【０５４８】
オプソニン化貪食作用アッセイ
１００ｍＭ  Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）を４日間、増殖培地に添加することによって、ターゲット細胞としてＧＢＳ株、および顆粒球様細胞に分化したＨＬ−６０細胞株（ＡＴＣＣ；ＣＣＬ−２４０）を用いて、オプソニン化貪食作用アッセイを行った。中期指数期細菌細胞を、貪食細胞、１０％ウサギベビー補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）、および熱不活化マウス抗血清中、３７℃で１時間インキュベーションした。陰性対照は、免疫前血清を伴うか、ＨＬ−６０を含まないか、または熱不活化補体を含む反応からなった。ゼロ時点でのＣＦＵ数の対数から、１時間アッセイを生き延びたコロニーの数の対数を減じることによって、オプソニン化貪食細胞殺傷の量を決定した。
【０５４９】
実験結果を図７に示す。ＧＢＳ８０−Ｋ−Ｎ３／ＰＳＩＩ  ＯＰＫＡおよびＩｇＧ力価は、ランダムＫコンジュゲート化によって作製されるＧＢＳ８０−ＩＩコンジュゲートに統計的に匹敵する。ＯＰＫＡおよびＩｇＧ力価は、曝露動物モデルにおける生存％と優れた相関を示す。
【０５５０】
Ａｃ−Ｌ−Ｑ−Ｇ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−Ｔｏｌ
【０５５１】
【化１３２】
0006739333.tif 000151
【０５５２】
Ｌ−グルタチオン（５μＬ、０．８１３μｍｏｌ）を添加し、その後、５０μＬの２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８を添加して、反応ｐＨを８に上昇させた。４時間後、質量分析性質決定によって確認されるように、すべてのＣＲＭは１つのリンカーで標識された。２５℃でさらに１６時間インキュベーションした後、すべてのＣＲＭは、Ｌ−グルタチオンで標識された。Ｌ−グルタチオンの付加：予測質量：５９１３８、観察質量：５９１３９。
【０５５３】
ペプチドマッピング実験概要：
ペプチドマッピング消化：５μｇの修飾ＣＲＭ１９７および陽性対照ＣＲＭ１９７を２０ｍＭ  ＤＴＴで還元し、そして１／３０（ｗ／ｗ）酵素／タンパク質で、トリプシンを用い、２６℃で一晩消化した。トリプシン消化したタンパク質のアリコットを、さらに、１／２０酵素／タンパク質比で、ＧｌｕＣ酵素を用い、２６℃で４時間、さらに消化した；すべての酵素をＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｇｍｂｈ、ドイツ）から購入したことに注目されたい。
【０５５４】
逆相ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣａｐＬＣ（カリフォルニア州サンタクララ）とカップリングしたＴｈｅｒｍｏ  ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルサム）上で、液体クロマトグラフィ・エレクトロスプレータンデム質量分析（ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ）によって、生じた消化ペプチドを分析した。〜１０−１５ｐｍｏｌのＣＲＭ対照および修飾ＣＲＭ１９７消化物を、カラム上に４０℃で装填した（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ、１ｘ１００ｍｍカラム）。０〜１分、４％Ｂで始まり、１．１分に７％Ｂに増加させ、５５分に４５％Ｂ、次いで６３分に９５％Ｂ、その後、洗浄およびカラム平衡化で、１０μＬ／ｍｉｎの総勾配８０分間で流した。質量分析パラメータには、ｍ／ｚ  ３００−２０００、３０ｍｓの３００００解像度でのＦＴＭＳ分析装置を用いた、完全スキャン事象が含まれた。イオン捕捉分析装置中、３０ｍｓの５００（すべての事象に関して）シグナル強度閾値カウントで活性化された、上位７つの強度が高いイオン（１＋イオンを除く）に対してＭＳ／ＭＳを行った。
【０５５５】
データ分析およびデータベース検索：Ｑｕａｌ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  Ｖ  ２．０．７（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてすべてのマススペクトルをプロセシングした。ＭＳ  ＤｅｃｏｎＴｏｏｌｓ（Ｒ．Ｄ．  Ｓｍｉｔｈラボ、ＰＰＮＬ）を用いてマスコット汎用ファイル（ｍｇｆ）を生成し、そして混入タンパク質に関して、社内カスタムデータベースおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（Ｖ５７、５１３，８７７配列を含む）に添加された提供されるタンパク質配列に対して、Ｍａｓｃｏｔ  Ｖ２．３．０１（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ボストン）データベース検索を用いて検索した。検索パラメータには：酵素：セミトリプシンまたはトリプシン／Ｇｌｕ−Ｃ、最大３つのミス切断までを許容する；多様な修飾：「ＣＲＭ  Ｔｇａｓｅ＋アルキン３６２Ｄａ  ｍｏｄ（ＣＫＲ）、ＣＲＭ  Ｔｇａｓｅ＋アルキン３６２Ｄａ  ｍｏｄ（Ｎ末端）、ＣＲＭ  Ｔｇａｓｅ＋アジド４６３Ｄａ  ｍｏｄ（ＣＫＲ）、ＣＲＭ  Ｔｇａｓｅ＋アジド４６３Ｄａ  ｍｏｄ（Ｎ末端）」と称されるデータベースへの小分子（３６２．１４７７８７Ｄａおよび４６３．２０６６９８Ｄａ）の付加された予測質量；ペプチド耐性：±２０ｐｐｍ；ＭＳ／ＭＳ耐性：±０．６Ｄａが含まれた。＞９５％信頼で、イオンスコアに対して、配列包含および小分子修飾評価を行った。次いで、Ｑｕａｌ  Ｂｒｏｗｓｅｒを用いた手動ＭＳ／ＭＳ分析のため、高スコアであったペプチドイオンを選択した。
【０５５６】
ＣＲＭ＋シクロオクチン−シクロプロピル−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｑ−Ｇに関する結果
トリプシン消化：８３％配列包含；このイオンスコア閾値では、修飾は検出されなかった。トリプシン／ＧｌｕＣ消化：９７％配列包含；Ｌｙｓ３７またはＬｙｓ３９で修飾が検出された。
【０５５７】
【化１３３】
0006739333.tif 000152
【０５５８】
配列番号１
ＣＲＭ＋ＺＱ−ＮＨ−（ＰＥＧ）３Ｎ３に関する結果
トリプシン消化：６９％配列包含；このイオンスコア閾値では、修飾は検出されなかった。トリプシン／ＧｌｕＣ消化：９１％配列包含；Ｌｙｓ３７またはＬｙｓ３９で修飾が検出された。
【０５５９】
【化１３４】
0006739333.tif 000153
【０５６０】
配列番号２
ＣＲＭ対照
トリプシン消化：８５％配列包含。
【０５６１】
トリプシン／ＧｌｕＣ消化：７９％配列包含。
【０５６２】
本発明は、例示のために本明細書に示す態様に限定されず、上記開示の範囲内に来るような、すべてのそのこうした型を含むことが理解される。
【０５６３】
仮想例
ベンジル（１７−アミノ−１−（４−アジド２−ニトロフェニル）−２，１３，１７−トリオキソ−６，９−ジオキサ−３，１２−ジアザヘプタデカン−１４−イル）カルバメート
【０５６４】
【化１３５】
0006739333.tif 000154
【０５６５】
４−アジド−２−ニトロフェニル酢酸Ｎ−スクシニミドエステル（０．０７３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解し、そしてＤＭＦ（２．３ｍＬ）中のベンジル（５−アミノ−１−（（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−１，５−ジオキソペンタン−２−イル）カルバメート溶液（２０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）と合わせる。ＤＩＰＥＡ（０．１２１ｍＬ、０．５８５ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応を室温で４時間混合する。溶液をＭＳ誘発ＨＰＬＣを通じて精製する（１００−Ｐｒｅｐ３；酸  方法３；  Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５μｍカラム  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分、１．５ｍｌ注入；  Ｔｕｂｅ  Ｔｒｉｇｇｅｒ  Ｍ＝５７０）。望ましい産物を含む分画をプールし、そして凍結乾燥する。
【０５６６】
ＺＱ−（ＰＥＧ２）フェニルトリフルオロメチルジアジリン
【０５６７】
【化１３６】
0006739333.tif 000155
【０５６８】
４−トリフルオロメチルジアジリンフェニル酢酸Ｎ−スクシニミドエステル（０．０７３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解し、そしてＤＭＦ（２．３ｍＬ）中のベンジル（５−アミノ−１−（（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−１，５−ジオキソペンタン−２−イル）カルバメート溶液（２０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）と合わせる。ＤＩＰＥＡ（０．１２１ｍＬ、０．５８５ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応を室温で４時間混合する。溶液をＭＳ誘発ＨＰＬＣを通じて精製する（１００−Ｐｒｅｐ３；酸  方法３；  Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５μｍカラム  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分、１．５ｍｌ注入；  Ｔｕｂｅ  Ｔｒｉｇｇｅｒ  Ｍ＝５７０）。望ましい産物を含む分画をプールし、そして凍結乾燥する。
【０５６９】
ＺＱ−（ＰＥＧ２）−テトラジン
【０５７０】
【化１３７】
0006739333.tif 000156
【０５７１】
ジアジリンＮ−スクシニミドエステル（０．０７３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解し、そしてＤＭＦ（２．３ｍＬ）中のベンジル（５−アミノ−１−（（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−１，５−ジオキソペンタン−２−イル）カルバメート溶液（２０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）と合わせる。ＤＩＰＥＡ（０．１２１ｍＬ、０．５８５ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応を室温で４時間混合する。溶液をＭＳ誘発ＨＰＬＣを通じて精製する（１００−Ｐｒｅｐ３；酸  方法３；  Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５μｍカラム  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分、１．５ｍｌ注入；  Ｔｕｂｅ  Ｔｒｉｇｇｅｒ  Ｍ＝５７０）。望ましい産物を含む分画をプールし、そして凍結乾燥する。
【０５７２】
ＺＱ−（ＰＥＧ２）−テトラジン
【０５７３】
【化１３８】
0006739333.tif 000157
【０５７４】
テトラジン（ＰＥＧ）Ｎ−スクシニミドエステル（０．０７３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解し、そしてＤＭＦ（２．３ｍＬ）中のベンジル（５−アミノ−１−（（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−１，５−ジオキソペンタン−２−イル）カルバメート溶液（２０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）と合わせる。ＤＩＰＥＡ（０．１２１ｍＬ、０．５８５ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応を室温で４時間混合する。溶液をＭＳ誘発ＨＰＬＣを通じて精製する（１００−Ｐｒｅｐ３；酸  方法３；  Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５μｍカラム  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分、１．５ｍｌ注入；  Ｔｕｂｅ  Ｔｒｉｇｇｅｒ  Ｍ＝５７０）。望ましい産物を含む分画をプールし、そして凍結乾燥する。
【０５７５】
ＺＱ（ＰＥＧ２）−（３ａＲ，４Ｓ，７Ｒ）−３ａ，４，７，７ａ−テトラヒドロ−４，７−メタノイソベンゾフラン−１，３−ジオン
【０５７６】
【化１３９】
0006739333.tif 000158
【０５７７】
（３ａＲ，４Ｓ，７Ｒ）−３ａ，４，７，７ａ−テトラヒドロ−４，７−メタノイソベンゾフラン−１，３−ジオン（０．１６２ｍｍｏｌ）（０．０７３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解し、そしてＤＭＦ（２．３ｍＬ）中のベンジル（５−アミノ−１−（（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−１，５−ジオキソペンタン−２−イル）カルバメート溶液（０．０４９ｍｍｏｌ）と合わせる。ＤＩＰＥＡ（０．５８５ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応を室温で４時間混合する。溶液をＭＳ誘発ＨＰＬＣを通じて精製する（１００−Ｐｒｅｐ３；酸  方法３；  Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５μｍカラム  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分、１．５ｍｌ注入；  Ｔｕｂｅ  Ｔｒｉｇｇｅｒ  Ｍ＝５７０）。望ましい産物を含む分画をプールし、そして凍結乾燥する。
【０５７８】
テトラジン−ＱＧ
【０５７９】
【化１４０】
0006739333.tif 000159
【０５８０】
ＱＧ（３０ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（体積：１ｍＬ、比：１．０００）中に溶解し、そしてＨ２Ｏ（体積：１．０００ｍＬ、比：１．０００）中でＮＨＳテトラジン（０．１４８ｍｍｏｌ）を添加し、その後、ＤＩＰＥＡ（０．１７７ｍｍｏｌ）を添加する。反応を１６時間攪拌し、この時点で、産物をＨＰＬＣによって精製して（Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５μｍカラム  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分、１．５ｍｌ注入）、望ましい産物を得る。分画をプールし、そして凍結乾燥する。
【０５８１】
テトラジン（ＰＥＧ）ｎＱＧ
【０５８２】
【化１４１】
0006739333.tif 000160
【０５８３】
ＱＧ（３０ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（体積：１ｍＬ、比：１．０００）中に溶解し、そしてＮＨＳ  ＰＥＧｎテトラジン（０．１４８ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（体積：１．０００ｍＬ、比：１．０００）中で添加し、その後、ＤＩＰＥＡ（０．１７７ｍｍｏｌ）を添加する。反応を１６時間攪拌し、この時点で、産物をＨＰＬＣによって精製して（Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５μｍカラム  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分、１．５ｍｌ注入）、望ましい産物を得る。分画をプールし、そして凍結乾燥する。
【０５８４】
ＱＧ（３０ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（体積：１ｍＬ、比：１．０００）中に溶解し、そしてＮＨＳテトラジン（０．１４８ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（体積：１．０００ｍＬ、比：１．０００）中で添加し、その後、ＤＩＰＥＡ（０．１７７ｍｍｏｌ）を添加する。反応を１６時間攪拌し、この時点で、産物をＨＰＬＣによって精製して（Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５μｍカラム  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分、１．５ｍｌ注入）、望ましい産物を得る。分画をプールし、そして凍結乾燥する。
【０５８５】
４−アジド−フェニル−グルタミン−グリシン
【０５８６】
【化１４２】
0006739333.tif 000161
【０５８７】
ＱＧ（３０ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（体積：１ｍＬ、比：１．０００）中に溶解し、そして４−アジド−フェニル酢酸Ｎ−スクシニミドエステル（０．１４８ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（体積：１．０００ｍＬ、比：１．０００）中で添加し、その後、ＤＩＰＥＡ（０．１７７ｍｍｏｌ）を添加する。反応を１６時間攪拌し、この時点で、産物をＨＰＬＣによって精製して（Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５μｍカラム  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分、１．５ｍｌ注入）、望ましい産物を得る。望ましい分画をプールし、そして凍結乾燥する。
【０５８８】
トリフルオロメチルジアジリン−ベンジル−グルタミン−グリシン
【０５８９】
【化１４３】
0006739333.tif 000162
【０５９０】
ＱＧ（３０ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（体積：１ｍＬ、比：１．０００）中に溶解し、そして４−トリフルオロメチル−ジアジリン−フェニル酢酸Ｎ−スクシニミドエステル（０．１４８ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（体積：１．０００ｍＬ、比：１．０００）中で添加し、その後、ＤＩＰＥＡ（０．１７７ｍｍｏｌ）を添加する。反応を１６時間攪拌し、この時点で、産物をＨＰＬＣによって精製して（Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０ｘ５０ｍｍ  ５μｍカラム  ０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分、１．５ｍｌ注入）、望ましい産物を得る。望ましい分画をプールし、そして凍結乾燥する。
【０５９１】
ＣＲＭ１９７のｍＴＧアーゼ仲介標識のための一般的な方法
ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８（３．５ｍｇ／ｍＬ、０．５２７μｍｏｌまたは上に同定するリンカーに応じた他の量および相対マイクロモル濃度）中のリンカーの溶液に、ＣＲＭ１９７（３３ｍｇ／ｍＬ、７．５５μＬ、０．００４３μｍｏｌ）を添加し、その後、ＰＢＳ中のトランスグルタミナーゼ酵素溶液（５０ｍｇ／ｍＬ、７．６１μＬ、０．０１００μｍｏｌ）を添加する。反応を室温または３７℃で１６時間攪拌する。
【０５９２】
本発明の例示的な態様がこうして記載されているが、一般の当業者は、開示内にあるのは例示のみであり、そして本発明の範囲内で、多様な他の代替法、適応、および修飾が作製可能であることに注目すべきである。したがって、本発明は、本明細書に例示するような特定の態様に限定されない。
【図１】
0006739333.tif 000170
【図２】
0006739333.tif 000171
【図３】
0006739333.tif 000172
【図４】
0006739333.tif 000173
【図５】
0006739333.tif 000174
【図６】
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【図７】
0006739333.tif 000176
【配列表】
0006739333000001.app