(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料の対象粒子を分析するためのシステム（２００、３００）であって、
分析光ビームを放出する第１の光源（１７０）と、前記分析光ビームをその光軸（Ｄ）に対して直交する平面、すなわち集束面（Π０）に集束するように配置された第１の光学系（１４０）と、を含む分析パスウェイであって、前記第１の光学系（１４０）が、前記第１の光源（１７０）と、前記対象粒子を含む前記生物学的試料を受容するための支持部との間に、前記第１の光源（１７０）によって放出された光の光学経路に沿って配置された、分析パスウェイと、
第２の光源（１１０）と、画像センサ（１６０）と、前記第１の光学系と少なくとも部分的に統合された第２の光学系（１５０、１４０）と、を含み、前記第１の光学系及び前記第２の光学系が、同じいわゆる共有光学系（１４０）を含む、位置制御パスウェイと、を含み、
前記画像センサ（１６０）が、前記第２の光学系（１５０、１４０）による前記集束面の画像（Π０）に対してオフセットされ、
前記システム（２００、３００）が、数値伝搬によって、前記画像センサから得られた画像から再構成された、前記生物学的試料の少なくとも１つの再構成画像を計算するように構成された計算手段（２０１、３０１）を含み、
前記計算手段（３０１）が入力において前記画像センサ（１６０）によって提供された画像を受け取り、前記画像センサによって提供された画像に基づいて、数値伝搬により、再構成平面内の一連の再構成画像を計算するように構成され、前記一連の再構成平面のそれぞれが、前記画像センサ（１６０）の平面に対してオフセットされ、
前記計算手段（３０１）が前記一連の再構成画像に基づいて、前記画像センサの平面と、前記第２の光学系による前記対象粒子の画像を受容する平面に対して最小のオフセットを有する再構成平面との間の距離であるオフセットである、最適化オフセットと呼ばれる前記画像センサの平面に対するオフセットを決定する手段を含むたことを特徴とする、生物学的試料の対象粒子を分析するためのシステム（２００、３００）。
【請求項２】
前記位置制御パスウェイ及び前記分析パスウェイを、前記共有光学系（１４０）の入力部において結合するように配置された、部分的な及び/または選択的な偏向手段（１４７）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の分析システム（２００、３００）。
【請求項３】
前記第１の光源（１７０）及び前記第２の光源（１１０）が異なる波長を有し、前記偏向手段（１４７）が波長選択性手段であることを特徴とする、請求項２に記載の分析システム（２００、３００）。
【請求項４】
前記計算手段（２０１）が入力において前記画像センサ（１６０）によって提供された画像を受け取り、前記画像センサによって提供された画像に基づいて、数値伝搬により、前記集束面（Π０）の画像（Π１）における前記対象粒子の再構成画像を計算するように構成されたことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の分析システム（２００）。
【請求項５】
前記計算手段（３０１）が、前記最適オフセットを、前記画像センサの平面と前記第２の光学系（１４０、１５０）による集束面の画像（Π１）との間の距離と比較するための手段を含み、比較の結果が軸方向の変位命令を決定し、前記システム（３００）が、前記試料を受容するための支持部（３１１）を、前記軸方向の変位命令に応じて移動させるように構成された変位手段（３１２）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の分析システム（３００）。
【請求項６】
前記計算手段（３０１）が、各粒子がその目標位置において表される画像である制御画像を、前記計算手段によって数値伝搬により再構成された試料の再構成画像であり、対応する再構成平面の位置と、前記第２の光学系による前記対象粒子の画像を受容する平面との間の最小オフセットを有するように選択される集束画像と比較するための手段を含むことを特徴とする、請求項２から５のいずれか一項に記載の分析システム（３００）。
【請求項７】
閾値に基づいて再構成画像のフィルタリングを行うための手段を含み、前記閾値が、ｉｔｈ＝ｉａｖ＋３σで定義され、ｉａｖが前記再構成画像の画素強度の平均値であり、σが前記再構成画像の画素強度の標準偏差であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の分析システム。
【請求項８】
前記制御画像と前記集束画像との間の比較の結果が並進変位命令を決定し、前記並進変位命令に応じて、前記試料を受容するための支持部（３１１）を移動させることができるように適合された変位手段（３１２）を含むことを特徴とする、請求項６に記載の分析システム（３００）。
【請求項９】
生物学的試料の対象粒子を分析するための方法であって、請求項１から８のいずれか一項に記載のシステム（２００、３００）で実施され、
前記分析パスウェイを用いて前記対象粒子の分析を行う段階と、
前記位置制御パスウェイを用いて前記対象粒子の位置を制御する段階と、を含み、
これら２つの段階の実施が、前記分析パスウェイ及び前記位置制御パスウェイに対して前記試料を移動させるための中間段階によって分離されておらず、
前記位置を制御する段階が、
−前記位置制御パスウェイの前記画像センサ（１６０）を用いて前記対象粒子の画像を取得するサブ段階と、
−前記画像を使用して、前記画像センサ（１６０）の平面に対してオフセットされた再構成平面において、数値伝搬によって少なくとも１つの再構成画像を構築するサブ段階と、を含み、
前記方法がさらに、再構成平面における一連の再構成画像の計算を含み、前記再構成平面のそれぞれが前記画像センサの平面に対してオフセットされ、前記再構成画像の選択が、対応する前記再構成平面と前記第２の光学系（１５０、１４０）による前記粒子の画像を受容する平面との間の最小オフセットを有するように実行されることを特徴とする、生物学的試料の対象粒子を分析するための方法。
【請求項１０】
前記分析を行う段階及び位置を制御する段階が同時に実行されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記集束面の画像（Π１）における前記対象粒子の再構成画像の計算を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、対象となる特定の点を含む透明試料の光学分析の分野に関する。この対象点は、特に生物学的粒子とすることができ、そのため、試料は、生物学的試料である。
【０００２】
本発明は、特に、微小生物学的診断に適用可能であり、より具体的には、分光分析（特にラマン分光分析または蛍光分光分析）、またさらには回折もしくは拡散による微生物の分析に適用可能である。
【０００３】
しかし、本発明は、より具体的には、非限定的に、分析光ビームの波長において透明な粒子の分析を対象とする。
【背景技術】
【０００４】
生物学的粒子、より具体的には微生物などの小さな粒子の分析は、従来、分析パスウェイとして知られる、光学プローブを用いて行うことができる。この光学プローブは、分析される粒子上に分析光ビームを集束し、粒子との相互作用後のビームの物理的特性、例えばそのラマンまたは蛍光スペクトルを測定する。粒子の分析は、その同定または特性決定のために使用可能である。分析光ビームはレーザービームとすることができ、そのウェスト部が粒子上に位置し、またはビームが粒子上に集束される。「集束スポット」との用語は、以下、レーザービームのウェスト部またはビームの集束スポットを表すものとして使用され、どちらの場合も分析ビームの集束を指す。
【０００５】
分析される粒子上への分析ビームの集束スポットの位置決めは、特に正確でなければならず、この集束スポットの大きさは、一般に分析される粒子の大きさとほぼ同じである。
【０００６】
粒子上の分析ビーム、より具体的にはその集束スポットの位置決めは、一般に顕微鏡下で視覚的に行われる。この目的のために、システムは、前述の分析パスウェイに加えて、位置制御パスウェイを含む。位置制御パスウェイは、対象点の位置、具体的には粒子の位置を、分析パスウェイに対して制御するために使用される。測定に先立つフェーズにおいて、分析パスウェイは、粒子が分析パスウェイの焦点に配置されたときに、その画像が鮮明になり、制御パスウェイのセンサ上で特定される位置にあるように構成される。
【０００７】
図１は、そのような分析システム１００の一例を示している。この例において、対象点は粒子である。
【０００８】
分析パスウェイは、対象粒子を照射するために使用される第１の光源、例えばレーザー１７０を含む。レーザー１７０によって放出されたビームは、分析光ビームと呼ばれる。分析パスウェイはさらに、この場合には顕微鏡対物レンズからなる第１の光学系１４０を含む。第１の光学系１４０の光軸は、Ｄで表される。
【０００９】
図示された例において、分析パスウェイはさらに、粒子Ｐと相互作用した後にビームの物理的特性を測定するための測定手段１８０を含む。
【００１０】
顕微鏡対物レンズは、レーザービームのウェスト部を集束面Π０に集束する。ビーム分割板１７５（例えばダイクロイック平板）は、レーザー光源によって放出されたビームと粒子Ｐと相互作用したビームとを分離する。
【００１１】
位置制御パスウェイは、粒子Ｐを照射するための光源１１０と、顕微鏡対物レンズ１４０と、チューブレンズ１５０と、画像センサ１６０と、を含む。対物レンズ１４０の出力において、光源１１０によって形成された粒子の画像は無限大に拡大され、次いでチューブレンズ１５０によってセンサ１６０の平面上に投影される。
【００１２】
分析パスウェイ及び位置制御パスウェイは、偏向ミラー１４９によって同じ顕微鏡対物レンズ及び同じ集束面Π０を共有する。パスウェイのいずれかは代替的に使用される。
【００１３】
２つのパスウェイの対応は、測定前に調整フェーズにおいてなされる。例えば、これは、測定手段１８０において得られた信号を最大化することによって、最大焦点において分析ビームを制御するための制御体（例えば不透明構造の集束パターン）を配置することにある。次いで、制御パスウェイのセンサ１６０の位置が、制御パスウェイのセンサの特定の位置において、制御対象の鮮明な像を得られるように調整される。
【００１４】
試料の粒子の測定を行う時点において、この粒子の分析ビームの焦点への配置は、以下の２つの段階に従って行われる。
【００１５】
第１の段階において、レーザー１７０がスイッチオフされ、光源１１０がスイッチオンされ、偏向ミラー１４９が配置され、集束面の画像が、画像センサを用いて得られる。粒子がこの画像内で鮮明である場合、この粒子は集束面に位置する。次いで、前述の装置調整フェーズにおいて決定された特定点上への粒子の配置は、横方向に終了する。
【００１６】
第２の段階において、光源１１０がスイッチオフされ、レーザー１７０がスイッチオンされ、偏向ミラー１４９が除去される。粒子が動いていなければ、分析ビームの焦点は、この粒子上に位置する。
【００１７】
しかし、粒子が可視スペクトルにおいて透明である場合には、位置決定は困難であり、または不可能でさえある。以下の説明において、透明粒子との用語は、非常に低い可視光吸収率（すなわち、可視スペクトルまたはより一般的には３００ｎｍから１０００ｎｍのスペクトル帯域において７０％以上の透過係数）及び周囲の環境と比較して小さな屈折率の差（例えば屈折率の差が０．１未満である）を有する粒子を意味することとする。従って、特定の細胞（標識されていない真核細胞及び原核細胞）並びに誘電体材料からなる特定の粒子は透明であると分類されうる。
【００１８】
１つのよく知られた解決手段は、粒子Ｐを時間的に移動させることにある。そのため、生物学的粒子を受容する基板は、対物レンズ１４０の光軸に対して平行である軸に沿って並進する並進ステージ上に搭載される。
【００１９】
これは、前述の第２の段階を２つのサブ段階に分割することにある。
【００２０】
第１のサブ段階では、位置制御パスウェイは、焦点をぼかした状態で使用される。換言すれば、粒子は、顕微鏡対物レンズの光軸に沿ってオフセットされ、その集束面にないようにする。
【００２１】
このように焦点をぼかすことで、粒子Ｐの鮮明でない画像を得ることができ、それでも透明粒子は周囲の環境から区別することが可能である。そのため、粒子Ｐの横方向の位置は、対物レンズの光軸に対して垂直な平面内にあることが分かる。
【００２２】
第２のサブ段階において、粒子は顕微鏡対物レンズの集束面に再配置される。粒子の画像は位置制御パスウェイ上から失われるが、分析ビームの焦点は粒子上にある。
【００２３】
この解決手段の欠点の１つは、粒子が第１のサブ段階と測定との間にその基板から移動し、遊走し、または分離してしまった場合（例えば基板上に捕捉された細菌の場合）、粒子は測定の時点では分析ビームの焦点にいないことである。そのため、分析の品質を保証することができず、粒子の位置における分析ビームのフィードバックを伴う動的制御も困難になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】仏国特許出願第１４６０９４７号
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Sang-Hyuk Leeら著、"Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures" published in the Optics Express, Vol. 15; No. 4,２００７年２月１９日, pp. 1505-1512
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
従って、本発明の目的は、特に分析光ビームを用いたその分析の信頼性を保証することができるように、粒子、特に透明粒子の位置をリアルタイムで制御することを可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明は、試料の対象粒子を分析するためのシステムであって、分析光ビームを放出する第１の光源と、分析光ビームをその光軸に対して直交する平面、すなわち集束面に集束するように配置された第１の光学系と、を含む分析パスウェイと、第２の光源と、画像センサと、第１の光学系と少なくとも部分的に統合された第２の光学系と、を含み、第１の光学系及び第２の光学系が、同じいわゆる共有光学系を含む、位置制御パスウェイと、を含むシステムに関する。本発明によれば、画像センサが、第２の光学系による集束面の画像に対してオフセットされる。
【００２８】
画像センサによって得られた焦点をぼかされた画像は、粒子が予測される位置に正確に位置することをチェックするために使用される。このチェックは、粒子がこの目標位置に位置する場合に得られる焦点をぼかされた画像と単純比較して行うことができる。
【００２９】
本発明は、顕微鏡対物レンズまたは試料を動かすことを伴ういかなる中間段階も必要としない。
【００３０】
焦点をぼかされた画像及び焦点のポインティングは同時に、または連続的であるが非常に短い時間間隔内で得ることができる。粒子の変位は、この粒子が位置しなければならない位置に焦点をポインティングする各動作の前に検出されるため、これは分析の信頼性を保証する。
【００３１】
さらに、粒子への分析レーザービームのポインティングは、接合される基板から粒子を分離可能なエネルギーを提供する。本発明に従うシステムにより、粒子上への焦点の位置決定は、粒子の移動を引き起こさないことを容易にチェックすることができる。
【００３２】
好適には、本発明に従う分析システムは、数値伝搬によって、画像センサから得られた画像から再構成された少なくとも１つの画像を計算するように構成された計算手段を含む。
【００３３】
そのため、画像センサによって得られた焦点をぼかされた画像により、計算によって、実際の位置とは異なる画像センサの仮想的な位置に関連する画像を得ることができる。実際には画像センサは移動不可能な状態のままであり、その変位はデジタル的にシミュレーションされるのみであるため、「仮想的な位置」との用語が使用される。そのため、後述するように、対象粒子は正確に配置可能である。
【００３４】
分析システムは、位置制御パスウェイ及び分析パスウェイを、共有光学系の入力部において結合するように配置された、部分的な及び/または選択的な偏向手段を含むことができる。
【００３５】
代替的に、第１の光源及び第２の光源が異なる波長を有し、偏向手段が波長選択性手段である。
【００３６】
１つの有利な実施形態によれば、計算手段が入力において画像センサによって提供された画像を受け取り、画像センサによって提供された画像に基づいて、数値伝搬により、集束面Π０の画像Π１における対象粒子の再構成画像を計算するように構成される。
【００３７】
計算手段が入力において画像センサによって提供された画像を受け取ることができ、画像センサによって提供された画像に基づいて、数値伝搬により、再構成平面内の一連の再構成画像を計算するように構成可能であり、一連の再構成平面のそれぞれが、画像センサの平面に対してオフセットされる。
【００３８】
計算手段が、有利には一連の再構成画像に基づいて、再構成平面と第２の光学系による対象粒子の画像を受容する平面との間の最小オフセットに関連する、画像センサの平面に対するオフセット、すなわち最適オフセットを決定するための手段を含む。
【００３９】
計算手段が、好適には、最適オフセットを、画像センサの平面と第２の光学系による集束面の画像との間の距離と比較するための手段を含み、比較の結果が軸方向の変位命令を決定し、分析システムが、試料を受容するための支持部を、軸変位命令に応じて移動させるように構成された変位手段を含む。
【００４０】
計算手段が、制御画像をいわゆる集束画像と呼ばれる再構成画像と比較するための手段を含むことができ、集束画像が、対応する再構成平面の位置と、第２の光学系による対象粒子の画像を受容する平面との間の最小オフセットに関連する。
【００４１】
分析システムが、有利には再構成画像の閾値化を行うための手段を含み、閾値が、ｉｔｈ＝ｉａｖ＋３σで定義され、ｉａｖが再構成画像の画素強度の平均値であり、σが再構成画像の画素強度の標準偏差である。
【００４２】
１つの有利な実施形態によれば、制御画像と集束画像との比較の結果が並進変位命令を決定し、分析システムが、並進変位命令に応じて、試料を受容するための支持部を移動させるように構成された変位手段を含む。
【００４３】
本発明はさらに、生物学的試料の対象粒子を分析するための方法であって、本発明のシステムで実施され、分析パスウェイを用いて対象粒子の分析を行う段階と、位置制御パスウェイを用いて対象粒子の位置を制御する段階と、を含む、生物学的試料の対象粒子を分析するための方法に関する。本発明によれば、これら２つの段階の実施が、分析パスウェイ及び位置制御パスウェイに対して試料を移動させるための中間段階によって分離されていない。
【００４４】
好適には、分析を行う段階及び位置を制御する段階が同時に実行される。
【００４５】
１つの好適な実施形態によれば、位置を制御する段階が、位置制御パスウェイの画像センサを用いて対象粒子の画像を取得するサブ段階と、画像を使用して、画像センサの平面に対してオフセットされた再構成平面において、数値伝搬によって少なくとも１つの再構成画像を構築するサブ段階と、を含む。
【００４６】
本発明に従う方法は、再構成平面における一連の再構成画像の計算を含むことができ、再構成平面のそれぞれが画像センサの平面に対してオフセットされ、再構成画像の選択が、対応する再構成平面と第２の光学系による粒子の画像を受容する平面との間の最小オフセットに関連する。
【００４７】
本発明に従う方法は、好適には、集束面の画像における対象粒子の再構成画像の計算を含む。
【００４８】
本発明のその他の特徴及び利点は、添付した図面を参照して得られる以下の好適な実施形態を読むことにより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】従来技術に従う分析システムを、概略的に示す。
【図２】本発明に従う分析システムの第１の実施形態を、概略的に示す。
【図３】本発明に従う分析システムの第２の実施形態を、概略的に示す。
【図４Ａ】粒子の位置を決定するために、閾値を設定して再構成した画像を概略的に示す。
【図４Ｂ】粒子の位置を決定するために、閾値を設定し、処理して再構成した画像を概略的に示す。
【図５】本発明に従う一連の再構成された画像の取得を示す。
【図６】一連の再構成された画像について、この画像に関するオフセットの関数として、画像の標準偏差を与える曲線を示す。
【図７】試料の一連の再構成された画像からの、目的の領域の一連の再構成された画像の抽出を概略的に示す。
【図８】各画像に関するオフセットの関数として、目的の領域の一連の再構成された画像における標準偏差の曲線を概略的に示す。
【図９】分析光ビームの焦点の正確な位置決定を確実に行うために、本発明に従う方法で実行される段階を概略的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
まず、本発明に従う分析システムが説明され、さらにそのようなシステムにおいて実行される分析方法が説明される。
【００５１】
図２は、粒子、特に透明な粒子の位置の視覚的制御に関する本発明に従う分析システムの第１の実施形態を示す。
【００５２】
この分析システム２００は、第１のいわゆる分析パスウェイ及び第２のいわゆる位置制御パスウェイを含む。システム２００は、図１のシステムとの相違に関してのみ説明される。
【００５３】
試料は、水、緩衝溶液、培養基、または粒子を含む反応媒体などの液体媒体の形態で存在しうる。粒子は、有利には顕微鏡スライドなどの基板に固定される。
【００５４】
代替的に、試料は、問題となる粒子を含む寒天培地などの固体媒体の形態で存在しうる。粒子は、媒体内または試料の表面上に位置しうる。
【００５５】
代替的に、試料は、気体媒体の形態で存在しうる。粒子は、この媒体内に位置し、または好適には顕微鏡スライドなどの基板に固定される。
【００５６】
分析される粒子Ｐは、生物学的粒子、粉塵（例えば汚染物質）または誘電体材料の粒子であってもよい。本発明は特に、これらの粒子が前述のように透明である場合に有利である。
【００５７】
液体試料の場合、試料は、例えば従来の顕微鏡スライドなどの下部平板１３１及び上部平板１３２（例えば顕微鏡のカバースライド）によって垂直方向に境界を定められた分析チャンバー１３０内に収容されうる。分析チャンバーは、タイトシール１３５によって横方向に境界を定められる。下部平板及び上部平板は、第１及び第２の光源（後述）の波長に対して透明である。
【００５８】
有利には、本発明に従う分析システムは、対象粒子を含む試料を受容するための電動支持部（図示されない）を含む。
【００５９】
レーザー１７０によって放出された分析ビームは、第１のビーム分割板１７５によって試料の方へ反射される。平板１７５上の反射の後、分析ビームは、光軸Ｄに沿って揃えられる。分析ビームは、その利点が前述された第２のダイクロイック平板１４７、次いで第１の光学系１４０を通過し、最終的に試料、特に対象粒子Ｐ＊に到達する。第１の光学系１４０の上流側で、分析ビームはコリメートされたレーザービームである。
【００６０】
集束面Π０は、光軸Ｄに対して直交する平面であり、第１の光学系１４０によって形成された分析レーザービームのウェスト部が位置する。この平面Π０は、この場合には第１の光学系１４０の対物集束面に対応する。図２に示された実施形態において、粒子及び特に対象粒子は、集束面Π０に発見されると仮定する。
【００６１】
対象粒子Ｐ＊と相互作用した分析ビームの少なくとも一部は、第１の光学系１４０に戻る。この後方散乱した分析ビームは、測定手段１８０によって分析することができるように、第１の光学系１４０、第２のビーム分割板１４７、次いで第１のビーム分割板１７５を通って戻る。
【００６２】
これらの測定手段１８０は、対象粒子と相互作用した分析ビームの特性の測定を実行する。これらの測定手段１８０は、ラマン分光分析または蛍光測定を行うことができるように、特に分光器または画像検出器を含むことができる。測定手段は、対象粒子と相互作用した分析ビームをセンサ上に集束することができるように、図示されない集束手段を含むことができる。
【００６３】
位置制御パスウェイは、好適には空間的にコヒーレントであり、可能であれば時間的にコヒーレントである第２の光源１１０を含む。好適には、第１の光源は、例えば２００ｎｍ未満、または１００ｎｍもしくは２５ｎｍ未満でさえある低スペクトル帯域を有する。この光源は、特に、レーザーダイオードまたは発光ダイオードとすることができる。便宜上、光源から放出された光のビームは、（第１の光学系１４０とは反対側の）分析される試料の直下の光ファイバー１２０によって提供することができる。必要な場合、ファイバーによって放出されるビームは、ダイアフラム１２５によって制限される。第２の光源から放出されたビームは、制御光ビームと呼ばれる。
【００６４】
位置制御パスウェイはさらに、顕微鏡対物レンズ１４０及びチューブレンズと呼ぶレンズ１５０を含む第２の光学系を含む。
【００６５】
第２の光学系は、顕微鏡対物レンズ１４０を第１の光学系と共有する。第１の光学系及び第２の光学系は、部分的に統合される。顕微鏡対物レンズ１４０は、分析パスウェイ及び位置制御パスウェイの両方に属する、いわゆる共有光学系を形成する。この共有は恒久的なものであり、そのため、取り外し可能な偏向ミラー１４９が部分的及び／または選択的偏向手段、この場合には波長選択偏向を実行する第２のダイクロイック平板１４７によって置き換えられる。
【００６６】
第２の光学系は、対物レンズの前方または後方に配置可能な光学フィルター（図示されない）を任意選択的に含む。
【００６７】
対象粒子Ｐ＊によって回折した後、制御光ビームは、共有光学系（顕微鏡対物レンズ１４０）を通過し、次いでダイクロイック平板１４７によって反射される。次いで、このビームは、例えばカメラのＣＣＤまたはＣＭＯＳセンサなどの画像センサ１６０に到達する前に、チューブレンズ１５０を通過する。
【００６８】
対象粒子Ｐ＊は、集束面Π０、この場合には顕微鏡対物レンズ１４０の対物集束面に位置する。そのため、対象粒子Ｐ＊によって回折されたビームは、顕微鏡対物レンズによって無限大まで拡大される。チューブレンズ１５０は、このビームを平面Π１に集束するために使用される。平面Π１は、第２の光学系（対物レンズ１４０及びレンズ１５０）による集束面Π０の画像である。これら２つの平面は、対物レンズ及びレンズ１５０によって共役となっている。
【００６９】
本発明によれば、画像センサ１６０は、この画像平面Π１に位置しないが、この平面に対してオフセットされる。これは、第２の光学系の光軸に沿ってオフセットされる。このオフセットは、例えば、＋１μｍから＋２００ｍｍ、または−１μｍから−２００ｍｍの間、例えば＋１０μｍから＋５ｍｍ、または−１０μｍから−５ｍｍの間、または＋５μｍから＋１０００μｍ、または−５μｍから−１０００μｍの間、好適には＋１０μｍから＋２０００μｍ、または−１０μｍから−２０００μｍの間である。
【００７０】
チューブレンズ１５０の光軸及び対物レンズ１４０の光軸は統合され、それによって、平板１４７は単にこの軸が直線に延設しないようにすることを可能にする。センサは、この光軸に対して直交する平面に位置する。Ｚがこの光軸に沿った座標である場合、その原点は平面Π１に位置し、Ｚ＝ｚは、画像センサ１６０の焦点をぼかした距離を表す。Ｘ軸及びＹ軸は、Ｚと共に直交座標系を画定する。
【００７１】
画像センサ１６０は、対象粒子の透過画像を取得する。画像センサに形成された像は、粒子によって回折された波と、相互作用せずに試料を通過した反射波との間の干渉の結果である限りにおいて、ホログラフィック像である。
【００７２】
画像センサ１６０によって取得された像は、間接的に、対象粒子の位置を、例え透明粒子であっても制御することを可能にする。異なる制御の例を以下に開示する。
【００７３】
図２に示された実施形態において、制御パスウェイ及び分析パスウェイは、ダイクロイック平板１４７によって波長分割多重化を受ける。第１及び第２の光源は互いに非同一なスペクトルを有する。例えば、第２の光源は、約４５０ｎｍを中心とするスペクトルを有するＧａＩｎＮレーザーダイオードであり、第１の光源は、５３２ｎｍで放出する周波数逓倍されたＹＡＧレーザーである。ダイクロイック平板１４７は、４５０ｎｍの光を画像センサ１６０の方向へ反射し、５３２ｎｍの光を通過させる（測定手段１８０がラマン分光器から形成されている場合、ビーム分割板１７５は、５３２ｎｍの光を反射し、より長い波長を通過させるように選択される）。
【００７４】
波長分割多重化は、対象粒子の位置をリアルタイムで、分析と同時に決定することを可能にするという利点を有する。これにより、対象粒子への分析レーザービームの位置を、非常に低い時定数のフィードバックで制御することが可能になる。
【００７５】
代替的に、位置制御パスウェイ及び分析パスウェイは時間多重化される。第１の時間間隔において、対象粒子の位置は、光源１１０によって制御され、そのため光源１７０はスイッチオフされる。第２の時間間隔において、光源１１０はスイッチオフされ、光源１７０はスイッチオンされ、粒子が分析される。
【００７６】
平板１４７は、半反射板でありえ、より具体的には、しかし排他的でなく時間多重化に適合したものでありうる。
【００７７】
全ての場合において、対象粒子は位置制御と分析との間で、第１及び第２の光学系に対して移動しない。そのため、これら２つの段階は同時に、または少なくとも非常に短い時間間隔の間に実行可能である。この目的は、位置制御パスウェイ及び分析パスウェイが互いに対して固定されたときに達成される。
【００７８】
図示されない代替的な実施形態によれば、画像センサは、対物レンズ１４０の光学特性及びチューブレンズ１５０の光学特性に依存する最適な焦点をぼかした距離に位置させることができるように、第２の光学系の光軸に沿って並進するための並進デバイス上に固定される。
【００７９】
図示されない他の代替的な実施形態によれば、第１の光源１７０は、コリメートされていないビームを放出する。第１の光学系は、必ずしも対物レンズ１４０の対物集束面ではない集束面Π０に焦点を位置させることができるように、対物レンズ１４０と協働するレンズを含む。そのような場合、チューブレンズ１５０の特性が適合可能である。
【００８０】
制御パスウェイ及び分析パスウェイは反転可能であり、それによって、ビーム分割板１４７は、位置制御光ビームを偏向し、対象粒子と相互作用した分析光ビームを反射する。
【００８１】
チューブレンズ１５０は、図２に示されるように位置制御パスウェイのセンサ１６０とビーム分割板１４７との間、またはビーム分割板１４７と顕微鏡対物レンズ１４０との間に配置可能である。そのような場合、チューブレンズ１５０及び対物レンズ１４０は、第１及び第２の光学系によって共有され、第１の光学系の残りを適合させる必要がある。
【００８２】
この場合、試料の粒子の相対的な位置についての前提情報が利用可能であると仮定する。粒子の位置を決定した後、対象粒子Ｐ＊は、そこから分析のために選択される。以下、対象粒子は、通常光軸上かつ集束面にとられた目標位置に配置されているものと仮定する。対象粒子の位置は、時間とともにシフトしうる。本発明は、粒子の位置が変化したかどうかを決定し、必要であれば、対象粒子をその目標位置に戻すように設計される。ＸＹ平面に沿った粒子の移動が、最初に調べられることとなる。
【００８３】
計算手段２０１（例えばプロセッサ）は、画像センサ１６０に形成された像を受け取る。
【００８４】
計算手段２０１は、この画像を数値伝搬によって、画像センサの検出表面の平面からオフセットされた再構成平面に、試料、より具体的には対象粒子の再構成された像を計算するために使用する。以下の説明は、画像センサの平面に対するオフセットに関する再構成平面をより単純に示す。換言すれば、その有効位置に対するセンサのオフセットは、この再構成された画像の計算によってシミュレートされる。
【００８５】
センサによって得られた画像は、伝搬演算の適用前に標準化することができる。そのＤＣ成分もまた、それから抽出することができる。
【００８６】
数値伝搬による画像計算法の説明は、非特許文献１に開示されている。
【００８７】
例えば、レイリー・ゾンマーフェルト伝搬関数がｈｚ（ｒ）、すなわち、
【００８８】
【数１】
0006644074.tif 000002
【００８９】
として記載され、ｚは画像センサの「仮想的な」位置とその有効位置との間の距離、換言すれば再構成平面と画像センサの平面との間のオフセットであり、
ｒ＝（ｘ、ｙ）はセンサによって得られた画像の平面における位置であり、
Ｒ２＝ｒ２＋ｚ２であり、
ｋ＝２πｎ／λは、伝搬媒体に対する波数である。
【００９０】
本明細書では、距離ｚは、再構成平面が平面Π１、または実質的にその平面（例えば、センサの最小並進ステップの関数として）に位置するように選択される。どのような場合でも、再構成画像に関連する再構成平面は、画像センサの平面よりも平面Π１に近い。
【００９１】
座標平面ｚにおける波は、以下のように表すことができ、
【００９２】
【数２】
0006644074.tif 000003
【００９３】
【数３】
0006644074.tif 000004
【００９４】
Ｂ（ｑ）は、センサの有効位置における回折波の強度ｂ（ｒ）のフーリエ変換であり（反射波の強度は本明細書では一定であると仮定する）、
Ｈ−ｚ（ｑ）は、ｈ−ｚ（ｒ）のフーリエ変換であり、
ｑは、フーリエ変換におけるｒの双対変数である。
【００９５】
中間再構成画像が計算され、その各画素の値は、複素振幅ａ（ｒ，ｚｎ）で定義される。この画像は複素画像であり、そのため各画素は実部及び虚部を有する複素数値と関連付けられる。
【００９６】
再構成画像は、この中間再構成画像から、使用者への表示のために構築される。再構成画像は、複素振幅ａ（ｒ，ｚｎ）に基づいて定義される。再構成画像の各画素は、｜ａ（ｒ，ｚｎ）｜２、すなわち複素振幅の２乗絶対値によって定義することができる。代替的に、各画素は
【００９７】
【数４】
0006644074.tif 000005
【００９８】
すなわち複素振幅の虚部の２乗によって定義可能である。
【００９９】
粒子は、例えそれらが透明であったとしても、再構成画像内で容易に特定可能である。これは、実際の画像の場合ではないが、平面Π１の画像センサの配置をシミュレートすることによって得られたのではなく、その平面内にセンサを有効に配置することによって得られたものである。
【０１００】
再構成画像は、ディスプレイスクリーン２０２に供給される。
【０１０１】
プロセッサ２０１は、再構成画像の閾値化を実行することができ、閾値は、例えば、
【０１０２】
【数５】
0006644074.tif 000006
【０１０３】
によって定義され、ｉａｖ及びσはそれぞれ、再構成画像の強度の平均値及び標準偏差である。画像は図４Ａに示されるように得られる。目標位置における粒子の存在は、この点における再構成画像の強度を、前述の閾値と比較することによってチェック可能である。
【０１０４】
閾値化は、輪郭検出処理及び形態学的フィルタリング操作（開、閉）によって行うことができる。これらの操作によって、粒子に対応しない物体は画像から排除される。さらに、そのため、再構成画像は点の分布の形態で存在可能であり、そのそれぞれは粒子の中心に対応する。この点の分布は図４Ｂに示されている。
【０１０５】
そのため、再構成画像の表示により、使用者は粒子が予測される位置に存在することを容易にチェックすることができる。目標位置の近くに粒子が全く存在しないことは、その基板から分離されたという事実に起因しうる。ディスプレイスクリーンは、Ｘ及びＹ軸に沿った対象粒子の位置を目標と素早く比較することができるように、集束パターンなどのシンボルを表示することができる。
【０１０６】
対象粒子の位置制御は、本明細書のような場合、画像平面Π１に関連する再構成画像の表示にあることができる。さらに、または代替的に、この制御は、予測される位置に対象粒子が存在することまたはしないことについての情報の供給、及び／もしくはその予測された位置に対する対象粒子の変位の情報の供給を含む。
【０１０７】
図３は、本発明に従う分析システム３００の第２の実施形態を概略的に示す。図３は、図２に対するその差についてのみ説明される。
【０１０８】
計算手段２０１及びスクリーン２０２は、プロセッサなどの計算手段３０１及び試料を受容する支持部３１１を移動させるための変位手段３１２と置き換えられる。
【０１０９】
変位手段３１２は、例えば、Ｘ軸及びＹ軸に沿った並進のための並進ステージ及び関連する場合にはＺ軸に沿った並進のための並進ステージからなる。
【０１１０】
センサ１６０によって検出された画像は、変位命令を計算するためのプロセッサ３０１形成手段に提供される。変位命令は、変位手段３１２に供給される。変位命令は、目標位置に対する対象粒子の測定された変位に従って決定され、この粒子を目標位置に再配置するように意図される。
【０１１１】
プロセッサ３０１は、一連の再構成画像の計算を実行し、そのそれぞれは、画像センサの「仮想的な」位置とその有効位置との間、換言すれば再構成平面と画像センサの平面との間の所定のオフセットに関連する。再構成平面は、第２の光学系によれば、対象粒子を受容する平面の画像の予測位置のいずれかの側（この場合、画像平面Π１のいずれかの側）に分布する。例えば、一連の再構成平面は、１００の横方向倍率を使用する場合には、平面Π０の周りに０．２５μｍのステップで、±５μｍの対象の間隔におけるセンサの画像の変位に対応する、平面Π１の周りに±５０μｍの間隔で、２．５μｍのステップで走査する。
【０１１２】
各再構成画像は、前述のアルゴリズムに従って、画像センサによって取得された同じ画像に基づいて計算される。この再構成画像は、画像センサの異なる位置ｚ１、…、ｚＮに関して観察されるものである。一連の再構成画像Ｉ１、…、ＩＮが得られる。
【０１１３】
図５は、画像センサによって取得された画像Ｉ０に基づいて得られた一連の再構成画像Ｉ１、…、ＩＮを示している。
【０１１４】
プロセッサは、この再構成画像を用いて、対象粒子の目標位置に対するＺ軸に沿った変位、続いてＸ及びＹ軸に沿った変位を決定する。目標位置は、例えば、分析レーザービームの焦点に対応する。
【０１１５】
まず、目標粒子のＺ軸に沿ったこの変位を決定するための段階を説明する。
【０１１６】
関数の特異点が求められ、Ｚ軸に沿った再構成平面の位置に応じて、再構成画像のパラメータの発展を説明する。代替的に、関数は、第２の光学系の対物平面に持ち込まれた再構成平面の位置に依存する。
【０１１７】
このパラメータは、有利には再構成画像の定数、例えば所定の領域内の勾配の標準偏差または平均値を表す。特異点は有利には最大値であるが、これは変曲点であってもよい。この特異点は、粒子、より具体的には対象粒子を受容する平面の平面画像に配置された再構成平面に対応する。そのため、Ｚ軸に沿った粒子の変位が、この粒子を受容する平面の画像の変位を測定することによって決定される。
【０１１８】
目標位置に対してＺ軸に沿った対象粒子の変位は、有利には、第２の光学系の物理パラメータ、例えばその倍率を導入することによって、対象空間内で直接計算される。
【０１１９】
図６は、対象空間内に持ち込まれた、画像センサの平面と再構成平面との間のオフセットの関数として、一連の画像中の１つの画像の標準偏差を与える曲線を示す。
【０１２０】
目標位置の平面は、この場合には平面Π１であり、第２の光学系の対象空間における平面Π０に対応する。この平面は、おおよそｚ’=４０μｍに位置し、ｚ’は、対象空間に持ち込まれた、画像センサの平面と再構成平面との間のオフセットである。
【０１２１】
標準偏差の値は、個別のオフセット値ｚ’ｎに関して得られ、この標準偏差の値は、例えばスプライン関数を用いて挿入され、オフセットｚ’の関数として標準偏差曲線Ｃ（ｚ’）を得る。ｚ’ｆｏｃ＝ａｒｇｍａｘ（Ｃ（ｚ））が決定され、次いでｚ’ｆｏｃの設定点の値と比較され、第２の光学系の対象空間における変位を計算する。
【０１２２】
代替的に、画像空間内の変位が最初に決定され、次いで第２の光学系の対象空間内の対応する変位が計算される。
【０１２３】
ｚ’ｆｏｃの値は、必ずしも有効に再構成された画像に対応しない。これは、単に再構成平面の比較的粗いサンプリング間隔であり得、これは再構成される画像の数が少ないことにより、必要とする計算が少ない。
【０１２４】
代替的に、挿入が実施されず、そのためｚ’ｆｏｃの決定が、一連の再構成画像において、集束条件に最も近い画像の選択に対応する。この画像は、どれが第２の光学系による粒子の画像の平面に最も近いかということである。この画像は、集束画像Ｉｆｏｃと呼ばれる。
【０１２５】
代替的に、第１のサンプリング間隔及び第１の一連の再構成画像を用いてＺ軸に沿った位置の第１の近似的決定が実行され、次いで、この決定は、より狭いサンプリング間隔及び以前に決定されたおおよその位置に中心を有する第２の一連の再構成画像を用いて更新される。
【０１２６】
好適には、対象粒子の位置は、対象粒子に中心を有する対象の領域の一連の再構成画像を用いてＺ軸に沿って決定される。実際には、粒子は必ずしも光軸に対して直交する同じ平面内に全てある必要はない。この目的のために、第１の一連の画像が計算可能であり、集束画像Ｉｆｏｃは、Ｘ及びＹ軸に沿って対象粒子のおおよその位置を決定するために選択され、使用され、次いで、Ｚ軸に沿った対象粒子の位置の正確な決定が、対象粒子に中心を有する一連の再構成画像を用いて行われうる。
【０１２７】
対象の領域の大きさは、分析される粒子の大きさより大きくても小さくてもよい。
【０１２８】
図７は、一連の画像Ｉ１、…、ＩＮ及び対象粒子Ｐに中心を有する対象の領域の一連の再構成画像Ｂ１、…、ＢＮを概略的に示す。
【０１２９】
図８は、対象の領域の一連の再構成画像における標準偏差を与える曲線を、一連の画像のランクの関数として示す。Ｂ（１）ｒｅｆは、集束画像Ｉｆｏｃ、全試料に関連する集束画像上の対象の領域に関する。Ｂ（２）ｒｅｆは、最大標準偏差を有する対象の領域の再構成画像に対応する。集束画像上で最適であった第１の選択Ｂ（１）ｒｅｆは、コントラスト測定が対象の領域に限定されると、もはや最適でないことが理解される。
【０１３０】
当業者であれば、この局所化について、特許文献１から詳細を得るであろう。対象空間内のオフセット及び画像空間内のオフセットは、単純な倍率の比によって接続される。
【０１３１】
Ｚ軸に沿った変位が計算されると、ＸＹ平面に沿った対象粒子の変位が推定される。
【０１３２】
これを達成するために、予め決定されたＺ軸に沿った変位の修正された平面Π１の位置に対応する座標における再構成平面に関する再構成画像が使用される。この画像は、予め再構成された一連の画像の中から選択可能であり、またはすぐに再構成可能である（例えば、Ｚ軸に沿った変位が挿入を用いて決定された場合）。
【０１３３】
プロセッサ３０１は、この再構成画像（図２を参照して説明されたように閾値化及びフィルタリングを潜在的に受けたもの）を制御画像と比較し、各粒子は、目標位置において表される。制御画像は、試料内の粒子の分布平面を形成する。制御画像は、再構成画像と同様に予め決定されたものでありえ、次いでこの再構成画像と比較される。
【０１３４】
変位の推定は、例えば、制御画像と再構成画像との間の相互相関、各画像間の標準偏差の最小化、または各画像間の相互情報量の最小化などの画像レジストレーション法を実施することができる。
【０１３５】
従って、Ｚ軸に沿った軸方向変位及び、ＸＹ平面に沿った横方向変位が最終的に得られる。この変位を用いて、プロセッサ３０１は、対象粒子を目標位置に移動させることができるように、変位手段３１２に供給する変位命令を計算する。
【０１３６】
そのため、対象粒子の分析レーザービームの焦点は、フィードバックで制御可能である。
【０１３７】
従って、本発明は、単純な画像比較が粒子の横方向変位を決定するために使用されるため、粒子の位置の明示的な決定を省略する。
【０１３８】
代替的に、対象粒子の位置は、目標位置との比較のために明示的に決定可能である。
【０１３９】
好適には、再構成画像は、対象粒子を含む複数の粒子を含む。対象粒子の周囲の複数の粒子の位置は、対象の正確な粒子が確実に観察されるようにチェックされる。
【０１４０】
この説明は、ここで、図９を参照して、時間領域の２つの瞬間の間の粒子の変位を、画像センサによって取得された焦点をぼかされた画像から直接決定するための方法のステップを開示することとする。この方法は、Ｘ軸及びＹ軸に沿った並進のための並進ステージを有して提供される本発明に従う分析システムにおいて実施される。
【０１４１】
段階９１０において、試料の初期画像Ｉ０が、時間領域の第１の瞬間において、制御パスウェイによって取得される。次いで、複数の再構成画像Ｉ１、…、ＩＮが画像Ｉ０に基づいて再構成され（段階９２０）、集束画像Ｉｆｏｃが選択され、この集束画像は、第２の光学系を通して、対象粒子を受容する平面の画像の位置に対応する（段階９３０）。次いで、閾値化操作が、集束画像Ｉｆｏｃにおいて前述のように実行され、関連する場合には形態学的フィルターが適用される（段階９４０）。段階９４０の最後に、光軸上に中心を有し、対象粒子及び複数の隣接する粒子を含む試料の第１の特性画像が得られる。この画像は、一時メモリに保存される。
【０１４２】
その後、図では参照符号９１０’から９４０’を有する段階９１０から９４０が繰り返され、試料の第２の特性画像が得られる。
【０１４３】
従って、時間領域の第１の瞬間と第２の瞬間との間の対象粒子の変位が、段階９５０において、第１の特性画像と第２の特性画像とを比較することによって推定される。
【０１４４】
第１の特性画像は、前述のように制御画像を形成する。
【０１４５】
変位の実行の推定、例えば相互相関の計算、及び警告は、相関関数の最大値が所定の閾値より低い場合に行われうる。実際には、これは対象粒子の近傍にある、試料内の粒子の分布が顕著にかく乱されていることを意味しうる。
【０１４６】
段階９６０において、試料は、これまでの段階で決定された変位ベクトルに比例するベクトルに沿って並進される。
【０１４７】
新しい第２の特性画像を用いて、新しい変位ベクトルがゼロベクトルであることをチェックすることができる（段階９７０）。あらかじめ計算された変位ベクトルが有効であると認証され、またはエラー信号が発生されると、作業者は新しい対象粒子を選択するかどうかを質問される。
【０１４８】
従って、有効であると認証された変位ベクトルは、対象粒子の位置の制御、特に並進ステージを制御することによるＸＹ平面の位置のフィードバックを有する制御に使用される。
【０１４９】
換言すれば、本発明はさらに、本発明に従う分析システムにおける対象粒子の位置を制御するための方法を含み、
時間領域の第１の瞬間において、試料の第１の画像が取得され、この第１の画像から数値伝搬によって、画像平面に対する再構成平面の異なるオフセット値に対応する試料の第１の一連の再構成平面が推定され、最も大きなコントラストを有する画像が試料の第１の特性画像として第１の一連の画像から選択され、
時間領域の第２の瞬間において、試料の第２の画像が取得され、この第２の画像から数値伝搬によって、画像平面に対する再構成平面の異なるオフセット値に対応する試料の第２の一連の再構成画像が推定され、最も大きなコントラストを有する画像が試料の第２の特性画像として第２の一連の画像から選択され、
時間領域の第１の瞬間と第２の瞬間との間の対象粒子の変位が、第１の特性画像及び第２の特性画像に基づいて推定される。
【０１５０】
従って、本発明に従う分析システムは、
数値伝搬によって、第１の（及び第２の）取得画像に基づいて、画像平面に対する再構成平面の異なるオフセット値に対応する試料の第１の（及び第２の）一連の再構成画像を計算するための計算手段と、
試料の第１の（及び第２の）特性画像として第１の（及び第２の）一連の再構成画像から最も大きなコントラストを有する画像を選択するための手段と、
時間領域の第１の瞬間と第２の瞬間との間の対象粒子の変位を、第１の特性画像及び第２の特性画像に基づいて推定するための手段と、を含む。
【０１５１】
図示されない最後の実施形態によれば、少なくとも１つの再構成画像を計算する段階は省略される。
【０１５２】
実際には、透明な粒子の変位は、画像センサによって取得された焦点をぼかされた画像を参照画像と比較することにより、簡単に特定することができる。この比較は、計算手段を用いて行うことができる。代替的に、画像センサから直接取得された画像はスクリーン上に表示され、使用者は、透明な粒子が変位したときに、表示される画像の改善を特定する。そのため、確実に、透明な試料の対象点が、正確かつ予測される位置にあり、この位置は、具体的には分析ビームの焦点である。この検証は、好適には分析デバイスによる測定に必要な期間後に行われる。
【０１５３】
この実施形態により、再構成画像の計算段階を省略することが可能になる。画像センサによって取得された焦点をぼかされた画像の、例えば対象点上に分析ビームを配置する前及び配置後の単純な比較は、これが移動したか、または分析ビームによって損傷を受けたかどうかを検出するのに使用される。これは、分析ビームの焦点に配置された平面の焦点をぼかされた画像を提供する検出器を単純に用いることによって、容易に実行が可能な測定検証試験を構成する。
【０１５４】
本発明は、開示された例に限定されない。多数の代替例が、本発明の範囲を逸脱することなく着想可能である。具体的には、図２及び３の実施形態は結合可能である。図２の分析システムはさらに、目標位置における対象粒子を手動で再配置することができるように、手動ハンドルで移動することが可能な試料の支持部を含むことができる。
【符号の説明】
【０１５５】
１００  分析システム
１１０  光源
１２０  光ファイバー
１２５  ダイアフラム
１３０  分析チャンバー
１３１  下部平板
１３２  上部平板
１３５  タイトシール
１４０  第１の光学系、顕微鏡対物レンズ
１４７  第２のダイクロイック平板
１４９  偏向ミラー
１５０  チューブレンズ
１６０  画像センサ
１７０  レーザー
１７５  ビーム分割板
１８０  測定手段
２００、３００  分析システム
２０１、３０１  計算手段、プロセッサ
２０２  ディスプレイスクリーン
３１１  支持部
３１２  変位手段
【図１】
0006644074.tif 000007
【図２】
0006644074.tif 000008
【図３】
0006644074.tif 000009
【図４Ａ】
0006644074.tif 000010
【図４Ｂ】
0006644074.tif 000011
【図５】
0006644074.tif 000012
【図６】
0006644074.tif 000013
【図７】
0006644074.tif 000014
【図８】
0006644074.tif 000015
【図９】
0006644074.tif 000016