(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
1〜10μモル/Lのミリセチンを含有する培地にて正常ヒト肝細胞を培養することで前記正常ヒト肝細胞のアンモニア除去能を50〜100fmol/hr/cellにすることを特徴とする、正常ヒト肝細胞のアンモニア除去能の向上方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培地で培養した移植用のヒト肝細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓移植は肝不全に対して極めて有効な治療法であるが、ドナー不足は深刻で現状では解決の糸口は見いだせない。そこで肝臓移植に代わり肝細胞移植が考慮されるが、ヒト肝細胞移植の臨床研究プロトコール作成はまだ十分に解明されておらず、骨髄細胞移植のプロトコールをそのままあてはめることはできない。
【０００３】
肝臓は生体内では高い再生能力を持っていることが知られており、生体部分肝移植はこの高い再生能力を応用した治療といえるが、その一方で分離培養した肝細胞は例え正常肝から分離された肝細胞であってもその増殖能がin vivoと比較して劣っている。また更には分離後において、細胞のアンモニア除去能が低下することもある。
【０００４】
特許文献１には、免疫不全マウスに単離したヒト肝細胞を注入するステップと、該肝細胞を増大させるステップと、該ヒト肝細胞を採取するステップと、を含む移植用のヒト肝細胞を増殖させる方法が記載されている。
【０００５】
また非特許文献１には、肝幹前駆細胞をラミニン含有培地にて培養するヒトiPS細胞からの肝細胞への分化誘導・培養方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１０−５２８６６１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Takayama K., Nagamoto Y., Mimura N., Tashiro K., Sakurai F., Tachibana M., Hayakawa T., Kawabata K., Mizuguchi H. Long-term self-renewal of human ES/iPS-derived hepatoblast-like cells on human Laminin 111-coated dishes. Stem Cell Rep.,1，322-335 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上述の技術は、移植用のヒト肝細胞数を十分に増大させるものではなく、また培養後における肝細胞の機能維持面においても十分であるとはいえない。
【０００９】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、効率的に増殖可能であるとともに、培養後においても肝細胞機能が十分に担保されたヒト肝細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明にかかるヒト肝細胞は、ミリセチンを含有する培地にて培養したヒト肝細胞である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、効率的に増殖可能であるとともに、培養後においても肝細胞機能が十分に担保されたヒト肝細胞が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａは、ミリセチン存在下で培養する前のヒト肝実質細胞の形態であり、図１Ｂは、ミリセチン存在下で７日間培養したときのヒト肝実質細胞の形態である。
【図２】細胞のアンモニア除去能を示す図である。
【図３】肝関連遺伝子の発現を示す図である。
【図４】図４Ａは、免疫不全かつヒトの尿素回路異常症を模するマウス肝にヒト肝細胞を移植した場合のマウス外観の変化を示す図であり、図４Ｂは、肝組織内ヒト肝細胞生着像を示す図である。
【図５】図５Ａは免疫不全マウス肝組織内の移植ヒト肝細胞であり、図５Ｂはそのマウスの血清中のヒトアルブミン量である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１４】
本実施形態にかかるヒト肝細胞は、ミリセチンを含有する培地にて培養したヒト肝細胞である。
【００１５】
ミリセチン(myricetin)は3,5,7-Trihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)- 4-chromenoneであり、下記式1で示される構造を有しており、フラボノイドである天然フラボノールの一種である。
【００１６】
【化１】
0006644395.tif 000002

【００１７】
培地は特に限定されるものではないが、例えばウシ胎児血清、インスリン、デキサメタゾン、ペニシリン、及び、ストレプトマイシを含有する培地であり、例えばWilliam’s E培地を用いることが可能である。
【００１８】
培地中におけるミリセチンの濃度は特に限定されるものではないが、例えば１〜３０μモル／Ｌである。
【００１９】
ミリセチンを含有する培地にて培養するヒト肝細胞の種類は特に限定されるものではなく、例えば肝実質細胞、全肝細胞、間葉系幹細胞やiPS細胞を分化させた肝細胞等を使用することが可能であるが、好ましくは肝実質細胞である。
【００２０】
細胞採取源として、自己細胞又は他己細胞の何れであっても好適に用いることが可能であり、また保存状態においても新鮮又は凍結の何れであっても好適に用いることが可能である。凍結肝細胞を使用する場合は、保存臍帯血移植、保存自己幹細胞移植のように解凍後保存液ごと輸注するか、遠心洗浄の後に輸液に懸濁して輸注するか何れであっても好適に用いることが可能である。凍結肝細胞の方が、いつでも使用することが出来また凍結している間に細菌汚染などの品質チェックができるので利点がある。
【００２１】
本実施形態にかかるヒト肝細胞は移植用であり、移植先としては特に限定されるものではないが例えば先天代謝異常症、慢性肝不全症、又は、急性肝不全症の患者に対する移植とすることが可能である。先天代謝異常症は、家族性高コレステロール血症、α1-アンチトリプシン欠損症、クリグラー・ナジャール症候群、第７因子欠損症、糖原病、レフサム病（パーオキシゾーム病）、進行性家族性肝内胆汁鬱滞症等である。慢性肝不全症例はウィルス性肝炎等である。急性肝不全症は、薬剤性、ウィルス性等の肝不全症である。移植の場は、先天代謝異常では門脈経由であるが、慢性肝不全及び急性肝不全では脾内に移植されることも可能である。
【００２２】
移植細胞数は、特に限定されるものではなく病型、患者の年齢等によって異なるが、例えば１回投与量において４ｘ１０７個〜３．９ｘ１０１０個とすることが可能である。
【００２３】
本実施形態にかかるヒト肝細胞の製造方法は、当初からミリセチンを含有する培地にて例えば肝実質細胞を培養することも可能であるが、ミリセチンを含有しない培地で例えば肝実質細胞を１８〜２２時間培養後、その培地にミリセチンを添加して、ミリセチンを含有する培地にて培養することも可能である。ミリセチンを含有する培地における培養日数は特に限定されるものではなく、例えば５〜１０日である。
【００２４】
本発明にかかるヒト肝細胞はミリセチンを含有する培地にて培養したヒト肝細胞であるが、このような実施形態に限定されるものではなく、ミリセチン誘導体を含有する培地にて培養したヒト肝細胞とすることも可能である。
【００２５】
ミリセチン誘導体はミリセチンを基本骨格としてそこから誘導される化合物であり、特に限定されるものではないが具体的には下記式２で表される。
【００２６】
【化２】
0006644395.tif 000003
【００２７】
ここで、Ｘａ、Ｘｂ、Ｘｃ、Ｘｄ、Ｘｅ、Ｘｆ、Ｘ１及び２は、それぞれ独立してＯ又はＳであり、
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ及びＲｆは、それぞれ独立してＨ、１〜５つのＲｙで置換された炭素数１〜１０のアルキル基、又は、炭素数２〜２０のジアルキルエーテル基であり、ただし該ジアルキルエーテル基の各炭素数１〜１０のアルキルは１〜５つのＲｙで置換されており、
Ｒｙは、Ｒｑ、あるいは、炭素数２〜１０のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基アルキル基、炭素数８〜１４のトリシクロアルキル基アルキル基、フェニル基、ナフチル基又は炭素数１４の芳香族基であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立してＨ又は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、フェニル基、ナフチル基、炭素数１４の芳香族基であり、
Ｒｑは、ＣＮ、ＯＨ又はハロゲン原子である。
【実施例】
【００２８】
１．ヒト肝細胞培養
正常ヒト凍結肝細胞（Lot# FLO, EJW）はCelsis、In Vitro Technologies（Baltimore, MD）から購入した。常法に従い解凍後、肝細胞1×106個を1 micro-mol/L dexamethasone, 1 micro-mol/L insulin, 2 mmol/L L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 U/ml streptomycin, 10％ウシ胎児血清を含むWilliam’s E培地（Sigma、W1878）2 mLに懸濁し、6穴培養プレート（BD Biocoat、type I collagen-coated 6-well plate、Becton Dickinson、Cat code 2352227）に播種、5％CO2、37℃で培養した。20時間培養後、20mmoL/Lの濃度でdimethylsulfoxideに溶かしたミリセチン（Sigma-Aldrich、M6760）を、最終濃度で1、3、10、30micro-mol/Lとなるように培地に添加し、7日間培養した（図１Ａ、Ｂ）。図１Ａは、ミリセチン存在下で培養する前のヒト肝実質細胞の形態であり、Ctrl；対照1（ミリセチン無添加）、DMSO；対照2（ミリセチン添加時の溶媒であるDMSOのみを添加）、1μM；ミリセチン1micro-mol/L添加、3μM；ミリセチン3micro-mol/L添加、10μM；ミリセチン10micro-mol/L添加、30μM；ミリセチン30micro-mol/L添加である。図１Ｂは、ミリセチン存在下で７日間培養したときのヒト肝実質細胞の形態であり、Ctrl；対照1（ミリセチン無添加）、DMSO；対照2（ミリセチン添加時の溶媒であるDMSOのみを添加）、1μM；ミリセチン1micro-mol/L添加、3μM；ミリセチン3micro-mol/L添加、10μM；ミリセチン10micro-mol/L添加、30μM；ミリセチン30micro-mol/L添加である。
【００２９】
２．細胞の特性解析
２−１．アンモニア除去能
上記培地に最終濃度で2mmol/LとなるようにNH4Clを加え、1時間おきに4時間まで培地中のアンモニア濃度を測定（ブロモクレゾールグリーン法）し、濃度の減少直線の傾きから細胞のアンモニア除去能（fmol/hr/cell）を求めた（図２）。
【００３０】
２−２．遺伝子発現
培養プレートから細胞を回収しRNAを抽出、逆転写によりcDNAを調製した。このcDNAを用い、肝関連遺伝子（アルブミン、CYP3A4、α1アンチトリプシン、チロシンアミノトランスフェラーゼ、トリプトファン2,3ジオキシゲナーゼ、HNF4a、サイトケラチン18、クレアチンリン酸合成酵素1、オルニチントランスカルバミラーゼ）および内部標準としてGAPDH遺伝子の発現を定量PCRによって調べた（図３）。
【００３１】
３．マウス肝への移植実験
免疫不全SCIDマウス（C.B-17/IcrHsd-Prkdcscid、日本エスエルシー）オスとSCIDマウス化したオルニチントランスカルバミラーゼ欠損マウス（spf-ash、熊本大学、国立成育医療研究センター）メスを交配し、産仔を得た。ポリメラーゼチェーンリアクション（PCR）法によってオルニチントランスカルバミラーゼ欠損を確認した後、生後4日齢の新生仔肝に、ミリセチン5 micro-mol/L存在下で10日間培養したヒト肝細胞2×105個（生理的食塩水懸濁液として20 micro-L）を直接穿針して移植した（27ゲージ注射針使用）。対照として、生理的食塩水のみ、あるいはミリセチンを加えない培地で10日間培養したヒト肝細胞を投与した。その後、マウスの生存日数を調べた。結果を表１に示す。
【００３２】
【表１】
0006644395.tif 000004
【００３３】
図４Ａは、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損免疫不全マウス（OTCD-C.B-17/IcrHsd-Prkdcscid）肝にヒト肝細胞を移植した場合のマウス外観の変化を示す図であり、ヒト肝細胞移植後３週間目における状態を示す。図４Ｂは、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損免疫不全マウス肝にヒト肝細胞を移植した場合の肝組織内ヒト肝細胞生着像を示す図であり、肝組織写真内の四角はそれぞれ右側の視野を示す。ここで、Ctrl；無処置マウス（陰性対照）、Non treated hHPCs；ミリセチン無添加培養ヒト肝細胞の移植、Treated hHPCs；ミリセチン添加培養ヒト肝細胞の移植である。
【００３４】
また、免疫不全SCIDマウス新生仔肝にミリセチン5 micro-mol/L存在下で10日間培養したヒト肝細胞あるいはミリセチン非存在下で10日間培養したヒト肝細胞2×105個を移植し、経日的に犠死させ血清および肝を採取、肝組織内のヒト肝細胞（図５Ａ）と血清中のヒトアルブミン量（図５Ｂ）を調べた。図５Ａは、免疫不全マウス（C.B-17/IcrHsd-Prkdcscid）肝内に移植したヒト肝細胞の生着評価を示す図であり、写真内の四角はそれぞれ右側の視野を示す。ここで、Ctrl；無処置マウス肝組織（陰性対照）、hLiver；ヒト肝組織（陽性対照）、Non treated hHPCs；ミリセチン無添加培養ヒト肝細胞の移植、Treated hHPCs；ミリセチン添加培養ヒト肝細胞の移植である。免疫組織染色の手法は、肝組織を10％中性ホルマリンで固定したのち切片を作成し、ウサギ抗ヒトアルブミン抗体（Inter-Cell Technologies, Jupiter, FL）と反応させ、horseradish peroxidase (HRP)-conjugated二次抗体で検出するものであった。図５Ｂは、免疫不全マウス（C.B-17/IcrHsd-Prkdcscid）肝内にヒト肝細胞を移植した場合のマウス血中ヒトアルブミン量を示す。ヒトアルブミン量の測定は、Albumin ELISA Quantitation Kit, Human（Bethyl, E80-129）によった。図５Ａに示すように、ミリセチン添加培養ヒト肝細胞は移植後の生着が優れていた。また図５Ｂに示すように、ミリセチン添加培養ヒト肝細胞は移植後においてアルブミン量の増加において優れていた。
【図１】
0006644395.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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