(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
病理学的状態の診断のために、生物学的試料において、抗ＢＡＧ３抗体または可溶性ＢＡＧ３と結合して免疫複合体を形成した抗ＢＡＧ３抗体の存在を検出する方法であって、
ｂ．血清、血漿、尿、または唾液からなる生物学的試料における抗ＢＡＧ３抗体または可溶性ＢＡＧ３と結合して免疫複合体を形成した抗ＢＡＧ３抗体の存在を決定するステップを含み、
前記病理学的状態は、狭心症、梗塞前狭心症、心筋梗塞、心不全、急性冠疾患、虚血、急性心不全、慢性心不全、または医原性心疾患から選択される心臓疾患、および、膵癌から選択され、および、
前記診断は、インビトロまたはエキソビボである、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
ｃ．生物学的試料から得た値を、基準値または健康な提供者から得た値と比較するステップ、
をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記決定ステップｂは、ＥＬＩＳＡ検査により実施されることを特徴とする請求項１に
記載の方法。
【請求項４】
前記血清、血漿、尿、または唾液は、哺乳類、好ましくはヒト由来であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＥＬＩＳＡキットの使用であって、
前記ＥＬＩＳＡキットは、ＢＡＧ３組換えタンパク質または可溶性ＢＡＧ３を捕捉するＢＡＧ３特異的マウスモノクローナル抗体ＡＣ−１、ならびに、ヒト免疫グロブリンを認識することができる抗体を含み、
前記キットは、狭心症、梗塞前狭心症、心筋梗塞、心不全、急性冠疾患、虚血、急性心不全、慢性心不全、または医原性心疾患から選択される心臓疾患、および、膵癌、から選択される病理学的状態の診断のために、生物学的試料において可溶性ＢＡＧ３と結合して免疫複合体を形成した抗ＢＡＧ３抗体または抗ＢＡＧ３抗体の検出をするために用いられるものであることを特徴とするＥＬＩＳＡキットの使用。
【請求項６】
前記生物学的試料は、血清、血漿、尿、または唾液試料であることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記血清、血漿、尿、または唾液試料は、哺乳類、好ましくはヒト由来であることを特徴とする請求項６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病理学的状態の診断における生化学的マーカーとしての使用のための抗ＢＡＧ３抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢＡＧ３（基準配列：ＮＰ＿００４２７２；遺伝子ＩＤ９５３１）は、粗面小胞体に特に集中している７４ｋＤａの細胞質タンパク質である。ＢＡＧ３タンパク質は、ＢＡＧドメイン（１１０〜１２４アミノ酸）として知られている構造ドメインを介して熱ショックタンパク質ＨＳＰ７０のＡＴＰアーゼドメインと相互作用する、コシャペロンのファミリーに属する。ＢＡＧドメインに加えて、ＢＡＧ３は、ＷＷドメインおよびプロリン豊富反復（ＰＸＸＰ）を含有し、これらは他のタンパク質への結合を仲介することができる。さらに、２つの保存ＩＰＶ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）モチーフが、ＷＷ領域とＰＸＸＰ領域の間に配置されており、分子シャペロンのＨｓｐＢファミリーのメンバーである、ＨｓｐＢ８へのＢＡＧ３の結合を仲介する。したがって、ＢＡＧ３は、そのマルチドメイン構造のアダプター性質に起因して、異なるパートナータンパク質と相互作用することができる。ｂａｇ３遺伝子発現は、筋細胞を含む少数の正常な細胞型および幾つかの原発性腫瘍または腫瘍細胞系から構成される。さらに、ｂａｇ３遺伝子発現は、多様なストレッサーにより誘発されうる。事実、ストレス性の刺激は、ｂａｇ３を含むストレス活性化遺伝子の発現の原因である、熱ショック転写因子（ＨＳＦ）１を活性化する（非特許文献１参照）。証拠は、ＢＡＧ３が、細胞状況に応じてＩＫＫγ、ＢａｘまたはＢＲＡＦなどのアポトーシス調節タンパク質のレベルまたは局在化を、Ｈｓｐ７０依存または非依存様式のいずれかにより調節することによって、細胞生存の維持において役割を有することを示している。
【０００３】
ＢＡＧ３タンパク質は、心筋芽細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｂｌａｓｔ）分化の際に発現し、ミオゲニン発現を維持すると思われる。これらの知見は、後期心臓発生におけるＢＡＧ３の関与を示している（非特許文献２参照）。さらに、心筋細胞におけるＢＡＧ３は、Ｚ板に局在化して、アクチンキャッピングタンパク質ＣａｐＺβ１と相互作用すること、筋原線維構造を安定化すること、および機械的ストレスの間、筋原線維の完全性をおそらく保存することを示している。ＢＡＧ３突然変異は、Ｚ板会合を損ない、ストレス誘発性アポトーシスに対する感受性を増加する可能性がある。心筋細胞における、一般には筋肉細胞における生存および筋原線維完全性についてのＢＡＧ３の役割を踏まえると、ｂａｇ３遺伝子の突然変異は、筋原線維性ミオパチーおよび拡張型心筋症の幾つかの形態と関連している。現在まで、細胞質ＢＡＧ３およびＢＡＧ３の可溶性セリカル（ｓｅｒｉｃａｌ）形態の両方が、検出されており、異なる病状はもとより、より一般的には細胞生存に関連することが見出されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｒｏｓａｔｉ  Ａ，Ｇｒａｚｉａｎｏ  Ｖ，Ｄｅ  Ｌａｕｒｅｎｚｉ  Ｖ，Ｐａｓｃａｌｅ  Ｍ，Ｔｕｒｃｏ  ＭＣ．ＢＡＧ３：ａ  ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍａｊｏｒ  ｃｅｌｌ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ．２０１１；２：ｅ１４１
【非特許文献２】Ｄｅ  Ｍａｒｃｏ  Ｍ，Ｔｕｒｃｏ  ＭＣ，Ｒｏｓａｔｉ  Ａ．ＢＡＧ３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｂｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｍｙｏｇｅｎｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ．２０１１；１０：８５０−８５２
【非特許文献３】Ｍｅｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＪ，３３７：ａ２０７９，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
驚くほど特異的であり繊細な方法による侵襲的な診断に関連する欠点を有することなく、そのような病状の迅速な同定を可能にする、および／または病状の早期検出、療法の効果のモニター、合併症の危険性の予測、情報提供性追跡の実施を可能にすることができる、生物学的マーカーの同定についての必要性および重要性が、ますます感じられている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、病理学的状態の診断における生化学的マーカーとしての使用のための抗ＢＡＧ３抗体に関する。
【０００７】
好ましくは、前記抗ＢＡＧ３抗体は、可溶性ＢＡＧ３に結合して、免疫複合体を形成する。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態によると、前記診断は、インビトロまたはエキソビボである。
【０００９】
本発明のさらなる態様は、前記診断の受容個体が、哺乳類、好ましくはヒトであるということである。
【００１０】
発明を実施するための形態においてさらに記載されているように、本発明の抗ＢＡＧ３抗体の使用は、心臓疾患、癌、糖尿病、皮膚、神経、骨、血管および結合組織の炎症および炎症性関連疾患からなる群から選択される病理学的状態に特異的であるという利点を有する。
【００１１】
本発明の実施形態によると、前記心臓疾患は、狭心症、梗塞前狭心症、心筋梗塞、心不全、虚血、急性冠疾患、急性心不全、慢性心不全および医原性心疾患から選択される。
【００１２】
本発明の別の実施形態によると、前記癌は、膵癌、膀胱癌および前立腺癌から選択される。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態は、生物学的試料における、抗ＢＡＧ３抗体または抗ＢＡＧ３抗体が可溶性ＢＡＧ３に結合して形成された免疫複合体の存在を検出する方法であって、
ａ．血清、血漿、尿または唾液からなる生物学的試料を得るステップと、
ｂ．生物学的試料における抗ＢＡＧ３またはＢＡＧ３関連抗体の存在を決定するステップと
を含む方法である。
【００１４】
好ましい実施形態によると、本発明の方法は、
ｃ．生物学的試料から得た値を、基準値または健康な提供者から得た値と比較する追加のステップをさらに含む。
【００１５】
好ましい実施形態において、前記決定ステップｂは、ＥＬＩＳＡ検査により実施される。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態によると、前記血清、血漿、尿または唾液は、哺乳類、好ましくはヒト由来である。
【００１７】
本発明の方法における好ましい実施形態によると、前記抗ＢＡＧ３抗体または前記免疫複合体の存在は、病態に関連する。
【００１８】
好ましくは、前記病態は、心臓疾患、癌、糖尿病、皮膚、神経、骨、血管および結合組織の炎症および炎症性関連疾患からなる群から選択される。
【００１９】
好ましくは、前記心臓疾患は、狭心症、梗塞前狭心症、心筋梗塞、心不全、虚血、急性冠疾患、急性心不全、慢性心不全および医原性心疾患から選択される。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態によると、前記癌は、膵癌、膀胱癌および前立腺癌から選択される。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態は、ＢＡＧ３組換えタンパク質または可溶性ＢＡＧ３を捕捉するＢＡＧ３特異的マウスモノクローナル抗体ＡＣ−１、ＡＣ−２、ＡＣ−３、ＡＣ−４、ＡＣ−５、ＡＣ−ｒｂ１ａ、ＡＣ−ｒｂ１ｂ、ＡＣ−ｒｂ２ａ、ＡＣ−ｒｂ２ｂ、ＡＣ−ｒｂ３ａ、ＡＣ−ｒｂ３ｂ、ＡＣ−ｒｂ４ａおよびＡＣ−ｒｂ４ｂと、ヒト免疫グロブリンを認識することができる抗体とを含むＥＬＩＳＡキット、ならびに生物学的試料における抗ＢＡＧ３抗体または抗ＢＡＧ３抗体が可溶性ＢＡＧ３に結合して形成された免疫複合体の検出のためのその使用である。
【００２２】
好ましくは、前記生物学的試料は、血清、血漿、尿または唾液試料である。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、前記血清、血漿、尿または唾液試料は、哺乳類、好ましくはヒト由来である。
【００２４】
本発明は、生物学的試料中のＢＡＧ３タンパク質の検出のための免疫組織化学（ＩＨＣ）キットになおさらに関し、ここで前記生物学的試料は、好ましくは、ＢＡＧ３特異的抗体および染色に必要なプローブを含む試薬を含む組織試料である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
本発明の特徴および利点は、下記に報告されている発明を実施するための形態、例示および非限定目的のために提示されている実施例、ならびに添付した図１〜１０によって明らかとなる。
【図１Ａ】培養した心筋細胞の上清におけるＢＡＧ３タンパク質の検出を示す図である。８０％集密度のヒト（ＨＣＭａ）およびラット（Ｈ９ｃ２）心筋細胞を、１０％のＦＡＢと共に、または伴わず、５％のＣＯ2分雰囲気により３７℃で１６時間インキュベートした。上清を、５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．０５％のＩＧＥＰＡＬを含有する緩衝液で透析し、凍結乾燥し、１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＬのＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．６、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、４ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１％のＮＰ−４０、０．１％のデオキシオコール酸ナトリウム）に再懸濁し、ウエスタンブロットにより抗ＢＡＧ３または抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いて分析した。
【図１Ｂ】開口放出小胞におけるＢＡＧ３タンパク質の検出を示す図である。Ｈ９ｃ２細胞から得た上清を、連続遠心分離：（ｉ）細胞除去のために２，０００×ｇで１５分間、（ｉｉ）細胞片の除去のために１０，０００×ｇで３０分間、（ｉｉｉ）開口放出小胞のペレット化のために１５０，０００×ｇで９０分間、に付した。ペレットをＰＢＳ中に１５０，０００×ｇにより９０分間で１回洗浄し、ウエスタンブロットにより、抗ＢＡＧ３  ＴＯＳ−２ポリクローナル抗体を用いて総細胞溶解産物と比較して分析した。Ｒａｂ−４を開口放出小胞のマーカーとして分析した。細胞質タンパク質であるＧＡＰＤＨを、対照として分析した。
【図１Ｃ】２人の健康な提供者および２人の慢性心不全を罹患している患者由来の血清を、ウエスタンブロットにより抗ＢＡＧ３抗体ＴＯＳ−２ポリクローナル抗体を用いて分析したことを示す図である。
【図１Ｄ】２人の慢性心不全を罹患している患者から得たバンドをゲルから切り取り、その同一性を、プログラムＭＡＳＣＯＴを使用して質量分析により分析したことを示す図である。
【図２Ａ】ＣＨＦ患者の血清におけるＢＡＧ３タンパク質の検出を示す図である。ＨＣＭａ細胞のＢＡＧ３組換えタンパク質および総細胞溶解産物を、心不全の患者から得た血清（１：４０）を用いて、ウエスタンブロットにより分析した。健康な提供者由来の血清での分析は、陰性対照として実施した。
【図２Ｂ】ＥＬＩＳＡ検査による抗ＢＡＧ３抗体の検出を示す図である。５０人のＣＨＦ患者（駆出率＜６０％）の血清を、特異的ＥＬＩＳＡ検査により抗ＢＡＧ３抗体の存在について５０人の健康な提供者由来の血清と比較した。結果を任意単位としてプロットする。
【図２Ｃ】ＥＬＩＳＡ検査結果のＲＯＣ分析を示す図である。任意単位０．０８３でのカットオフは、７４％の感受性および６８％の特異性をもたらす。
【図３Ａ】ＨＣＭａ細胞（ａ、ｂ、ｃ）およびＪ７７４Ａ１細胞（ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ）へのｒＢＡＧ３−ＦＩＴＣ結合の検出のために実施された直接蛍光の共焦点顕微鏡法分析を示す図である。ＢＡＧ３組換えタンパク質および精製ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡから購入したウシ血清のアルブミン）を、製造会社の説明書に従って、ＳＩＧＭＡから購入したＦｌｕｏｒｏＴａｇ  ＦＩＴＣ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してＦＩＴＣにコンジュゲートした。製造会社の説明書に従って計算した等量のｒＢＡＧ３−ＦＩＴＣ（ｂ、ｅ）およびＢＳＡ−ＦＩＴＣ（ｈ）タンパク質を、０．１％のＮａＮ３を有するＨＣＭおよびＪ７７４Ａ１培養培地に１時間加えた。β−インテグリンを対照として分析した（ａ、ｄ、ｇ）。細胞をＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ共焦点顕微鏡により分析した。統合画像をｃ、ｆおよびｉに示す。
【図３Ｂ】ＢＡＧ３はマクロファージに結合することを示す図である。Ｊ７７４Ａ１マクロファージ（１×１０6個の細胞／ｍｌ）を、異なる濃度のＦＩＴＣ−ＢＡＧ３タンパク質（７、１４および７０ｎｍ）と共にインキュベートした。ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（７０ｎＭ）を陰性対照（灰色）として使用した。細胞の蛍光を、フローサイトメトリーにより分析した。
【図３Ｃａ】ＢＡＧ３と共にインキュベートしたＪ７７４Ａ１マクロファージのＣｏｘ−２およびｉＮＯＳレベルの分析を示す図である。集密度８０％のＪ７７４Ａ１細胞を、対照培地、ＢＳＡ、ＬＰＳまたはｒＢＡＧ３と共に２０時間インキュベートした。ポリミキシンを、示された場所に添加して、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）に由来するｒＢＡＧ３の効果が、汚染内毒素の存在と無関係であることを確認した。Ｃｏｘ−２およびｉＮＯＳ発現を、ウエスタンブロットにより細胞溶解産物において分析した。
【図３Ｃｂ】ＢＡＧ３と共にインキュベートしたＪ７７４Ａ１マクロファージの亜硝酸塩放出の分析を示す図である。集密度８０％のＪ７７４Ａ１細胞を、対照培地、ＢＳＡ、ＬＰＳまたはｒＢＡＧ３と共に２４時間インキュベートした。各試料の１００μｌの上清を、１００μｌのグリース試薬と共にインキュベートし、５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ５５０）をＢｅｃｋｍａｎ  ＤＵ６２分光光度計により測定した。亜硝酸塩濃度は、試料のＯＤ５５０を亜硝酸ナトリウムの標準曲線と比較することによって評価した。
【図３Ｃｃ】ＢＡＧ３と共にインキュベートしたＪ７７４Ａ１マクロファージのＩＬ−６放出の分析を示す図である。集密度８０％のＪ７７４Ａ１細胞のマクロファージを、対照培地、ＢＳＡ、ＬＰＳまたは組換えＢＡＧ３と共に５時間インキュベートした。ＢＡＧ３ペプチド（ペプチド１、ペプチド２、ペプチド３、ペプチド４またはスクランブルペプチド（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ））の６２５ｎＭを、示された場所に加えて、ＢＡＧ３活性を遮断するこれらの能力を確認した。ＩＬ−６産生は、ＥＬＩＳＡ検査を使用して細胞培養培地において測定した。ＩＬ−６濃度は、試料のＯＤを組換えＩＬ−６の標準曲線と比較することによって評価した。
【図４Ａ】正常な膵臓組織におけるモノクローナル抗ＢＡＧ３抗体ＡＣ−１の使用によるＢＡＧ３染色の代表的な画像である。切片をヘマトキシリンで対比染色した。染色は、ランゲルハンス島の中程度の陽性を明らかにしたが、正常な膵管および膵腺房細胞は、ＢＡＧ３発現を有さなかった。
【図４Ｂ】ビオチン化二次抗体により現れたモノクローナル抗ＢＡＧ３抗体の使用により染色した、ＢＡＧ３低陽性およびＢＡＧ３高陽性腫瘍試料の代表的な画像である。切片をヘマトキシリンで対比染色した。２つの異なる倍率が示されている。１００×（左側パネル）および４００×（右側パネル）。本発明者らは、４００×倍率を使用して、１０個の非重複視野において総癌細胞に対する陽性細胞の数を計数することにより、試料中の陽性癌細胞の割合に基づいてスコアを指定した。記載されたように計算したＢＡＧ３陽性細胞の割合の中央値は、４０％であり、この値を、低および高陽性試料を分けるカットオフとして使用した。
【図４Ｃ】低ＢＡＧ３染色（陽性細胞≦４０％）を有する３９人の患者および高ＢＡＧ染色（陽性細胞＞４０％）を有する２７人の患者を比較して作製した生存曲線を示す図である。分析した全ての患者は、膵臓腺癌のＲＯ切除を受けた。生存中央値は、高陽性群の１２か月から低陽性群の２３か月に増加した。ログランク検定ｐ値＝０．００１３。
【図５】数人の関節リウマチ由来の滑膜組織におけるＢＡＧ３染色の代表的な画像である。ＢＡＧ３陽性は、滑膜線維芽細胞および炎症性浸潤において観察される。切片をヘマトキシリンで対比染色した。
【図６】腫瘍細胞の細胞質におけるＢＡＧ３に陰性をもたらした正常な膀胱および高い陽性をもたらした移行細胞膀胱癌によるＢＡＧ３染色の代表的な画像である。切片をヘマトキシリンで対比染色した。
【図７Ａ】ｑＲＴ−ＰＣＲにより評価されるｂａｇ３  ｍＲＮＡ相対的発現を示すグラフであり、値は、平均±ＳＤで報告されている。青色線は、計算された中央値を表す。
【図７Ｂ】ｑＲＴ−ＰＣＲにより分析された全ての患者において行った生存分析を示す図である。高いｂａｇ３発現を有する１３人の患者は、低いｂａｇ３発現を有する１２人の患者（生存中央値＝３２．０か月）と比較して、短い生存（生存中央値＝１９．０か月）を有した。ログランク検定ｐ値＝０．０１９８。
【図８Ａ】膵癌細胞系（ＰＳＮ１、Ｃａｐａｎ−１、ＡｓＰＣ−１、ＰＡＮＣ−１およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２）を、グラフにより示されているように異なる濃度のゲムシタビンで処理したことを示す図である。４８時間後、アポトーシス細胞死を分析した。グラフは、サブＧ０／Ｇ１細胞（±Ｓ．Ｄ．）の割合の平均値を描いている。データは、３つの独立した実験の代表値である。
【図８Ｂ】膵癌細胞系におけるＢＡＧ３のウエスタンブロット分析を示す図であり、ＧＡＰＤＨハウスキーピングタンパク質含有量を、等しい負荷状態をモニターするために使用した。
【図８Ｃ】ＭＩＡ  ＰａＣａ−２およびＰＡＮＣ−１細胞系を、２μＭのゲムシタビン（ＧＥＭ）により指定された時間にわたって処理したことを示す図である。ＢＡＧ３タンパク質発現レベルを、ウエスタンブロットによりモニターした。
【図８Ｄ】ｂａｇ３  ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲにより分析したことを示す図であり、グラフは、相対的なｂａｇ３  ｍＲＮＡレベル（±Ｓ．Ｄ．）を描き、データは、３つの独立した実験の代表値である。
【図８Ｅ】ＭＩＡ  ＰａＣａ−２およびＰＡＮＣ−１細胞系を、ＢＡＧ３  ｓｉＲＮＡまたは非標的化ｓｉＲＮＡ（ＮＴｓｉＲＮＡ）により７２時間かけて形質移入し、次に２μＭのゲムシタビン（ＧＥＭ）により２４時間処理したことを示す図である。ＢＡＧ３レベルをウエスタンブロットにより分析し、ＧＡＰＤＨレベルを、等しい負荷状態をモニターするために検出した。
【図８Ｆ】ＭＩＡ  ＰａＣａ−２およびＰＡＮＣ−１細胞を上記に記載されたように形質移入し、２μＭのゲムシタビン（ＧＥＭ）により２４時間または４８時間処理したことを示す図である。アポトーシス細胞死を記載されたように分析した。グラフは、サブＧ０／Ｇ１細胞（±Ｓ．Ｄ．）の割合の平均値を描いている。データは、３つの独立した実験の代表値である。
【図９Ａ】ＥＬＩＳＡ検査によるＢＡＧ３特異的免疫複合体の検出である。５５人の膵臓腺癌患者由来の血清を、特異的ＥＬＩＳＡ検査によりＢＡＧ３特異的免疫複合体の存在について、５１人の健康な提供者由来の血清と比較したことを示す図である。結果を任意単位±Ｓ．Ｅ．としてプロットする。
【図９Ｂ】ＥＬＩＳＡ検査結果のＲＯＣ分析を示す図である。任意単位０．１８３でのカットオフは、６５％の感受性および７８％の特異性をもたらす。
【図１０】膵臓腺癌の０〜１年の前診断を有する４９人の女性対象由来の患者血清におけるＢＡＧ３特異的抗体の検出を、特異的ＥＬＩＳＡ検査により、ＢＡＧ３特異的抗体の存在について２３５人の女性対照対象由来の血清と比較した図である。対照血清は、各症例対象に対して約５つあり、年齢を対応する症例と適合させた。他の時点には、２５１人の対照と比較した、ＰＤＡＣの１〜２年の前診断を有する５３人の対象、２１２人の対照と比較した、ＰＤＡＣの２〜３年の前診断を有する４４人の対象、１８７人の対照と比較した、ＰＤＡＣの３〜４年の前診断を有する４２人の対象が含まれた。
【００２６】
結果を任意単位としてプロットする。±Ｓ．Ｐ．値は、スチューデントｔ検定により計算した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、病理学的状態の診断における生化学的マーカーとしての使用のための抗ＢＡＧ３抗体に関する。
【００２８】
本発明における用語「診断」では、本発明者らは、ありうる疾患または障害を決定または同定することを試みる過程を意味する医療診断（多くの場合に単に診断と呼ばれる）を意味する。本発明の診断は、早期診断も包含する。
【００２９】
用語「早期診断」では、本発明者らは、特異的または非特異的症状の前に病理学的状態を決定する検査能力を意味する。
【００３０】
抗ＢＡＧ３抗体は、現在、好都合なことに血清、血漿、尿または唾液において検出されている。現在まで、そのような抗体は、生理学的状態または病態のいずれにおいても血清中に見出されていない。血清における抗ＢＡＧ３抗体の検出は、診断、早期診断および予後の目的で利用される迅速な非侵襲的技術、危険性層別化、同定のため、および療法のモニタリングのためのツールとしての利点を有する。
【００３１】
抗体の検出のさらなる利点は、検出のために非常に少量の血清が必要であることである。事実、可溶性ＢＡＧ３タンパク質も、幾つかの病状に罹患している患者の血清において検出されうるが、可溶性タンパク質の検出に必要な血清の量は、抗体の検出に必要な量よりはるかに多い。さらに、可溶性ＢＡＧ３タンパク質レベルは、抗体のレベルよりはるかに低いことがありうる、ならびに／または可溶性ＢＡＧ３タンパク質に関して、抗体は、特異的病状の初期相において検出可能でありうる、および／もしくは合併症の危険性をより効率的に予測しうる、もしくは療法の効果をモニターしうることが可能である。
【００３２】
本発明のさらなる実施形態は、抗ＢＡＧ３抗体が、血清、血漿、尿または唾液から選択される異なる生物学的試料において都合よく検出されうることである。
【００３３】
本発明において、血清とは、血球でもなく凝固因子でもない血液の成分が意図され、線維素原が除去された血漿である。血清は、凝血（凝固）に使用されない全てのタンパク質、全ての電解質、抗体、抗原、ホルモンおよび任意の外来性物質を含む。
【００３４】
本発明において、血漿とは、通常は全血中に血球を懸濁して保持する血液のわら色／淡黄色液体成分が意図される。線維素原などの凝固因子を含有する。
【００３５】
さらなる実施形態において、本発明は、生化学的マーカーとしての抗ＢＡＧ３抗体の使用を提供し、抗ＢＡＧ３抗体は、可溶性ＢＡＧ３と結合して、免疫複合体を形成する。
【００３６】
遊離している、または可溶性ＢＡＧ３と結合して免疫複合体を形成する抗ＢＡＧ３抗体は、現在、生物学的条件下で都合よく検出されており、病態の診断にマーカーとして使用することができる。生物学的試料におけるそのような抗体および／または免疫複合体の検出も、診断および／または予後の目的の迅速な非侵襲的技術としての利点を有する。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態によると、診断は、インビボまたはエキソビボである。
【００３８】
本発明のさらなる実施形態は、診断の受容個体が、哺乳類、好ましくはヒトであるということである。
【００３９】
本発明において、免疫複合体またはタンパク質／抗体複合体は、可溶性抗原への抗体の一体型結合が意図され、結合した抗原は、特異的エピトープとして作用し、抗体と結合したものは、単一免疫複合体と呼ばれる。
【００４０】
そのような免疫複合体は、同様に非常に少量の血清が免疫複合体の検出のために必要であるので、抗体の検出において見られる同じ利点を有する。可溶性ＢＡＧ３の検出に必要な血清の量も、タンパク質／抗体（免疫）複合体の検出に必要な量よりもはるかに多い。免疫複合体、ならびに遊離抗体は、特異的病状の初期相において検出可能であり、合併症の危険性をより効率的に予測する、または療法の効果をモニターすることができる。
【００４１】
本発明のなおさらなる実施形態は、病理学的状態の生物学的マーカーとしての抗ＢＡＧ３抗体または免疫複合体（可溶性ＢＡＧ３と結合した抗ＢＡＧ３抗体により形成される）の使用であり、病理学的状態は、心臓疾患、癌、糖尿病、皮膚、神経、骨、血管および結合組織の炎症および炎症性関連疾患である。
【００４２】
好ましくは、心臓疾患は、狭心症、梗塞前狭心症、虚血、心筋梗塞、心不全、急性冠疾患、急性心不全、慢性心不全および医原性心疾患からなる群から選択される。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態によると、癌は、膵癌、膀胱癌および前立腺癌から選択される。
【００４４】
本発明のさらなる実施形態は、生物学的試料における、抗ＢＡＧ３抗体または抗ＢＡＧ３抗体が可溶性ＢＡＧ３に結合して形成された免疫複合体の存在を検出する方法であって、
ａ．血清、血漿、尿または唾液からなる生物学的試料を得るステップと、
ｂ．生物学的試料における抗ＢＡＧ３またはＢＡＧ３関連抗体の存在を決定するステップと
を含む方法である。
【００４５】
本発明による方法は、健康な個人とＢＡＧ３関連病状に罹患している患者との間の抗ＢＡＧ３抗体および／またはＢＡＧ３／抗体複合体の有意な差を検出できるという利点を有する。提案されたアッセイ方法は、心臓病患者の群と健康な人の群との統計的に有意な分離を可能にする。危険性が増加した患者の下位集団において、心臓疾患を有するような患者（心不全、ＨＦ）を層別化することもできる。
【００４６】
なおさらなる態様において、本発明は、生物学的試料における抗ＢＡＧ３抗体または抗ＢＡＧ３抗体が可溶性ＢＡＧ３に結合して形成された免疫複合体の存在を検出する方法であって、
ｃ．生物学的試料から得た値を、基準値または健康な提供者から得た値と比較するステップ
をさらに含む。
【００４７】
好ましい態様において、本発明による方法は、決定ステップｂがＥＬＩＳＡ検査により実施される方法である。
【００４８】
本発明の方法の好ましい実施形態によると、血清、血漿、尿または唾液試料は、哺乳類、好ましくはヒト由来である。
【００４９】
本発明による方法は、病状、疾患および／またはこれらの合併症の危険性、ならびに療法のモニタリングの評価を可能にする生物学的マーカーの、迅速な非侵襲的検出を可能にする利点を有する。
【００５０】
さらなる態様によると、本発明は、抗ＢＡＧ３抗体または抗ＢＡＧ３抗体が可溶性ＢＡＧ３に結合して形成された免疫複合体の存在が病態と関連する、検出方法に関する。
【００５１】
好ましい実施形態において、病態は、心臓疾患、癌、糖尿病、ならびに、炎症および炎症性関連疾患であって、皮膚、神経、骨、血管および結合組織の炎症および炎症性関連疾患からなる群から選択される。特に、心臓疾患は、狭心症、梗塞前狭心症、心筋梗塞、虚血、心不全、急性冠疾患、急性心不全、慢性心不全または医原性心疾患からなる群から選択される。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態によると、癌は、膵癌、膀胱癌および前立腺癌から選択される。
【００５３】
本発明は、さらに、生物学的試料における、抗ＢＡＧ３抗体または抗ＢＡＧ３抗体が可溶性ＢＡＧ３に結合して形成された免疫複合体を検出するＥＬＩＳＡキットに関する。
【００５４】
本発明によるＥＬＩＳＡキットは、抗ＢＡＧ３抗体を捕捉するＢＡＧ３組換えタンパク質または可溶性ＢＡＧ３を捕捉するＢＡＧ３特異的マウスモノクローナル抗体ＡＣ−１、ＡＣ−２、ＡＣ−３、ＡＣ−４、ＡＣ−５、ＡＣ−ｒｂ１ａ、ＡＣ−ｒｂ１ｂ、ＡＣ−ｒｂ２ａ、ＡＣ−ｒｂ２ｂ、ＡＣ−ｒｂ３ａ、ＡＣ−ｒｂ３ｂ、ＡＣ−ｒｂ４ａおよびＡＣ−ｒｂ４ｂならびにヒト免疫グロブリンを認識することができる抗体を含む。
【００５５】
そのような抗体は、ヒト免疫グロブリンを認識することができる酵素結合抗体でありうる。
【００５６】
本発明は、また、生物学的試料におけるＢＡＧ３関連抗体を検出するためのキットに関し、可溶性ＢＡＧ３を捕捉するＢＡＧ３特異的マウスモノクローナル抗体ＡＣ−１、ＡＣ−２、ＡＣ−３、ＡＣ−４、ＡＣ−５、ＡＣ−ｒｂ１ａ、ＡＣ−ｒｂ１ｂ、ＡＣ−ｒｂ２ａ、ＡＣ−ｒｂ２ｂ、ＡＣ−ｒｂ３ａ、ＡＣ−ｒｂ３ｂ、ＡＣ−ｒｂ４およびＡＣ−ｒｂ４ｂならびにヒト免疫グロブリンを認識することができる検出用の酵素結合抗体を用いるＥＬＩＳＡにより実施される。
【００５７】
好ましくは、生物学的試料は、血清、血漿、尿または唾液試料である。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態において、血清、血漿、尿または唾液試料は、哺乳類、好ましくはヒト由来である。
【００５９】
本発明は、さらに生物学的試料中のＢＡＧ３タンパク質の検出のための免疫組織化学（ＩＨＣ）キットに関連し、前記生物学的試料は、好ましくは組織試料である。組織試料は、生検、凍結組織、パラフィン埋め込み組織でありうる。
【００６０】
本発明によるＩＨＣキットは、ＢＡＧ３特異的抗体および染色に必要なプローブを含む試薬を含む。
【００６１】
ＢＡＧ３特異的抗体は、マウス免疫グロブリンを認識することができる検出用のマウスモノクローナル抗体ＡＣ−１、ＡＣ−２およびＡＣ−３、ならびに／または酵素結合抗体でありうる。
【００６２】
特に、ＩＨＣキットは、有利には、膵臓切除を受けた患者の膵癌組織試料の１００％にあり、かつ大部分の膀胱癌試料に発現しているＢＡＧ３タンパク質を明らかにすることができる。さらに、ＢＡＧ３タンパク質を、ランゲルハンス島の正常な膵臓組織におけるＩＨＣによるＢＡＧ３検出用キットによっても明らかにすることができ、一方、他の正常組織は、陰性である（例えば、正常な膀胱）。ＢＡＧ３陽性は、関節リウマチ組織試料の滑膜線維芽細胞および炎症性浸潤においても観察されうる。
【００６３】
ＰＤＡＣにより影響を受ける患者の長期生存は、非常に不十分であり、約４％の患者のみが、診断の５年後に生存している。事実、外科的切除が、現在、治癒の唯一の機会であるが、およそ２０％の患者のみが切除可能な疾患を診断され、さらに、そのような患者の下位集団の大きな割合（約８０％）において、転移過程がすでに診断時に生じており、事実、遠位転移が外科的切除後に現れる。したがって、本発明者らは、膵癌の発生の初期段階をより良く理解し、これらの検出を可能にしうる分子を同定する必要性がある。また、より良好な予後を可能にすること、および療法の選択を助けることができるマーカーが、大いに求められている。
【００６４】
有利なことに、ＢＡＧ３  ＩＨＣキットは、ＰＤＡＣ患者の予後の同定を可能にする。ＩＨＣにより同定されたＢＡＧ３発現の強度は、患者の生存と相関することが分かった。したがって、これを予後のため、および療法の選択を行うことのための両方に使用することができる。
【００６５】
本発明のさらなる態様は、増幅プライマーのセットを含む、生物学的試料におけるＢＡＧ３遺伝子発現を検出するためのキットである。好ましくは、増幅プライマーは、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる検出に適している。
【００６６】
下記に記載され、配列番号１から配列番号１０により同定されているプライマーセット１から５の特異的プライマーｂａｇ３プライマーは、定量的リアルタイムＰＣＲによるＢＡＧ３発現の検出および定量化を可能にする。
【００６７】
プライマーセット１
順方向：配列番号１：ＡＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＣＧＡＣＣＣＴＴＴ
逆方向：配列番号２：ＣＣＴＴＣＣＣＴＡＧＣＡＧＧＣＧＧＣＡＧ
プライマーセット２
順方向：配列番号３：ＣＣＧＧＣＴＧＧＣＣＣＴＴＣＴＴＣＧＴＧ
逆方向：配列番号４：ＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧ
プライマーセット３
順方向：配列番号５：ＧＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣＧＧＧＧＣＡＴＧＣ
逆方向：配列番号６：ＧＧＴＧＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣ
プライマーセット４
順方向：配列番号７：ＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＣＧＧＡＣＣＴＧＡ
逆方向：配列番号８：ＣＴＧＧＴＧＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＣ
プライマーセット５
順方向：配列番号９：ＣＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＣＧＣＣＡＣＴＣＣ
逆方向：配列番号１０：ＴＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴ
生物学的試料におけるｂａｇ３  ｍＲＮＡ検出用のＲＴ−ＰＣＲキットは、ｂａｇ３遺伝子発現のレベルを、患者の生存と相関させることができ、予後および療法の選択に使用することができる。好ましくは、生物学的試料は、組織試料である。
【００６８】
本発明のさらなる態様は、マクロファージ活性を遮断することができ、したがってマクロファージ活性化を伴う炎症性、腫瘍学的または他の疾患の療法に使用されうる、ＢＡＧ３タンパク質に特異的なアミノ酸配列に対応する抗ＢＡＧ３モノクローナル抗体、これらのフラグメントおよびペプチドによって表される。特に図３および表１を参照されたい。本発明は、ＢＡＧ３特異的マウスモノクローナル抗体ＡＣ−１、ＡＣ−２およびＡＣ−３、もしくはＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆ（ａｂ）として修飾されたもの、もしくはヒト化されたもの、または可溶性ＢＡＧ３の作用に結合することができる、および／もしくは可溶性ＢＡＧ３の作用を遮断することができる分子としての、以下の配列を含むペプチド：
ペプチド１：ＤＲＤＰＬＰＰＧＷＥＩＫＩＤＰＱ（配列番号１１）
ペプチド２：ＳＳＰＫＳＶＡＴＥＥＲＡＡＰＳ（配列番号１２）
ペプチド３：ＤＫＧＫＫＮＡＧＮＡＥＤＰＨＴ（配列番号１３）
ペプチド４：ＮＰＳＳＭＴＤＴＰＧＮＰＡＡＰ（配列番号１４）
の使用に関する。
【００６９】
［実施例］
（実施例１）
培養ヒト一次心筋細胞およびラット心筋細胞細胞系Ｈ９ｃ２における血清枯渇誘発性ストレス
心筋細胞は、ストレス性作用物質に対する応答を開始する保護因子を放出することが知られている。Ｈｓｐ７０、Ｈｐ２７、Ｈｓｐ９０および他などのストレス誘発性タンパク質は、細胞内活性を発揮するが、ストレスに応答して分泌もされうるので、心筋細胞によるＢＡＧ３放出を、ストレス条件下で分析した。この目的のため、培養ヒト一次心筋細胞またはラット心筋細胞細胞系Ｈ９ｃ２における血清枯渇誘発性ストレスの作用を分析した。図１に示されているように、本発明者らは、血清枯渇に１６時間曝露された心筋細胞の上清にＢＡＧ３タンパク質を検出することができた（図１Ａ）。この時点で、細胞生存は、血清枯渇により影響を受けなかったので（結果は示されず）、ＢＡＧ３放出が細胞壊死に起因するという仮説を放棄した。したがって本発明者らは、ＢＡＧ３が開口放出小胞に存在するかを確認した。事実、分画遠心分離手順（１６）を介して細胞外小胞を単離することによって、これらがＢＡＧ３タンパク質を含有することを見出した（図１Ｂ）。
【００７０】
ＢＡＧ３の可溶形態の存在をさらに確認するため、慢性心疾患（ＣＨＦ）に罹患している患者由来の２つの血清におけるその存在を調査した。ウエスタンブロット分析を介して、抗ＢＡＧ３抗体により認識されたバンドを同定することができた。バンドを切り取り、質量分析に付し、その同一性を確認した（図１Ｃ）。この証拠は、タンパク質が細胞外形態で検出されうることを確認した。健康な提供者由来の血清では、タンパク質を検出することができなかった（図１Ｃ）。
【００７１】
全ＢＡＧタンパク質配列に対する質量分析により認識され、適合されたペプチドを太字で示す。
【００７２】
0006654432.tif 000002
【００７３】
(配列番号15)。
【００７４】
ヒトＢＡＧ３タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を有する。
【００７５】
（実施例２）
ＣＨＦ患者の血清における抗ＢＡＧ３抗体
本発明者らは、ＣＨＦ患者の血清が、二次抗体として抗ヒトｇＧを使用したウエスタンブロットによりＢＡＧ３タンパク質を認識したことを見出した（３つの異なる患者由来の血清を用いた実験の代表的な結果を図２Ａに示す）。この結果は、ＣＨＦ患者の血清に抗ＢＡＧ３抗体の存在を示した。この知見を確認するため、特異的ＥＬＩＳＡ検査により抗ＢＡＧ３抗体の存在について５０人の健康な提供者由来の血清と比較した、５０人のＣＨＦ患者（駆出率＜６０％）由来の血清を分析した。図２Ｂに示されているように、対照血清と比較して有意に高い値の抗ＢＡＧ３抗体を患者のものにおいて検出した。ＥＬＩＳＡ検査のＲＯＣ分析は、任意単位０．０８３のカットオフを使用して、７４％の感受性および６８％の特異性をもたらす（図２Ｃ）。
【００７６】
（実施例３）
マクロファージへのＢＡＧ３結合
本発明者らは、心筋細胞によるＢＡＧ３放出の機能的有意性について検討した。タンパク質がオートクリン経路に関与しうることを除外し、それは、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）コンジュゲートＢＡＧ３を使用した実験で評価したように、心筋細胞表面に結合しないと思われたからである（図３Ａ）。したがって、本発明者らは、ＢＡＧ３が血球と相互作用しうるか調査した。事実、ＦＩＴＣ−ＢＡＳＧ３が細胞系Ｊ７７４のマクロファージに結合したことを見出した（図３Ｂ）。マクロファージへのＢＡＧ３結合は、競合性ＢＡＧ３ペプチドにより、または抗ＢＡＧ３モノクローナル抗体のＢＡＧ３配列決定Ｆ（ａｂ’）２フラグメントにより特異的に損なわれた（表Ｉ）。特に、Ｊ７７４細胞を、１４ｎＭのＦＩＴＣ−ＢＡＧ３タンパク質および６２５ｎＭのＢＡＧ３ペプチド（ペプチド１、ペプチド２、ペプチド３、ペプチド４もしくはスクランブルペプチド）と共に、または抗ＢＡＧ３モノクローナルおよびポリクローナル抗体（マウスモノクローナルＡＣ１、ＡＣ２およびウサギポリクローナルＴＯＳ２）の４２０ｎＭのＦ（ａｂ’）２フラグメントと共にインキュベートした。マウスＩｇＧのＦ（ａｂ’）２フラグメントまたはウサギＩｇＧのＦ（ａｂ’）２フラグメントを陰性対照として使用した。
【００７７】
【表１】
0006654432.tif 000003
【００７８】
マクロファージへのＢＡＧ３結合の機能的意義を探求するため、細胞における誘発性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）およびシクロオシキゲナーゼ（Ｃｏｘ）−２に発現に対する組換えＢＡＧ３の効果を試験した。図３Ｃａに示されているように、これらの酵素のレベルは、ＢＡＧ３処理マクロファージにおいて増強された。さらに、ＢＡＧ３は、亜硝酸塩およびインターロイキン（ＩＬ）−６の放出を誘発し（図３Ｃｂおよびｃ）、マクロファージが、タンパク質へのこれらの結合に応答して活性化されたことが確認された。
【００７９】
ＣＨＦ患者の血清において、有意な量の抗ＢＡＧ３抗体を検出することができた（図２Ａ、Ｂ）自己抗体産生は、例えば、抗トロポニン自己抗体を産生する慢性虚血患者において生じるように、正常な細胞内タンパク質の細胞外放出に関係する可能性がある。ＣＨＦ患者の血清における抗ＢＡＧ３抗体のＥＬＩＳＡ値は、健康な対照の血清において検出されるものより有意に高い。
【００８０】
したがって、ＥＬＩＳＡにより検出される抗ＢＡＧ３抗体の産生は、慢性心不全のバイオマーカーであると思われる。危険性層別化および療法のモニタリングにおける有用性は、調査する価値がある。ストレスを受けた心筋細胞によるＢＡＧ３放出、続くマクロファージの活性化は、ＮＯの局所放出をもたらし、心臓虚血の保護回路を構成しうる。事実、血管拡張、血管新生および再構築が標的になりうる。ＢＡＧ３放出およびその一過性または慢性の効果は調査に値し、虚血および他の心臓ストレス状態の理解に寄与しうる。
【００８１】
さらに、ＢＡＧ３特異的マウスモノクローナル抗体ＡＣ−１、ＡＣ−２およびＡＣ−３、および／もしくは他、またはＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆ（ａｂ）として修飾されたもの、またはヒト化されたもの、または配列ペプチド１から４および／もしくは他を含むペプチドは、マクロファージ活性化を伴う炎症性、腫瘍学的または他の疾患の療法に使用される可溶性ＢＡＧ３の作用に結合することができる、および／または可溶性ＢＡＧの作用を遮断することができる分子である。
【００８２】
（実施例４）
免疫組織化学によるＰＤＡＣにおけるＢＡＧ３発現
本発明者らは、抗ＢＡＧ３モノクローナル抗体を含み、かつ免疫組織化学（ＩＨＣ）によりＢＡＧ３タンパク質を検出することができる、免疫組織化学キット（ＩＨＣ）を開発した。このキットは、分析した３４６全て（１００％）のＰＤＡＣ生検において、ＢＡＧ３発現を明らかにした。ＢＡＧ３染色は、ランゲルハンス島の中程度の陽性を明らかにしたが、正常な膵管および膵腺房細胞は、ＢＡＧ３発現を有さなかった。このことは、正常な膵臓および腫瘍塊に隣接した非新生物膵臓組織のどちらにもあてはまった。ＢＡＧ３染色は、腫瘍細胞の細胞質において主に観察された。ＢＡＧ３染色の強度は、陽性癌細胞の数と同様に様々であった。さらに、ランゲルハンス島は、陽性であり、ＩＨＣの良好な内部対照を構成した（図４Ａ）。したがって、キットはＩＨＣによるＰＤＡＣにおけるＢＡＧ３タンパク質の検出を可能にする。さらに、他の腫瘍または正常な組織においても、ＩＨＣによるＢＡＧ３タンパク質の検出を可能にする。
【００８３】
本発明者らは、患者の生存および療法への応答と相関するＢＡＧ３の発現についても調査した。免疫組織化学により分析された全ての腫瘍試料のデータおよび生存データにより分析されたＲ０患者の下位集団のデータを記載する、同じ数の患者由来の３４６のＰＤＡＣ試料のコホートを分析した（表ＩＩ）；本発明者らは、４００×倍率を使用して、１０個の非重複視野において総癌細胞に対する陽性細胞の数を計数することにより、試料中の陽性癌細胞の割合に基づいてスコアを指定した。
【００８４】
【表２】
0006654432.tif 000004
【００８５】
記載されたように計算したＢＡＧ３陽性細胞の割合の中央値は、４０％であり、この値を、低および高陽性試料を分けるカットオフとして使用した。この分類に基づいて、１９０の患者試料（５５％）を低陽性（陽性細胞≦４０％）と分類し、１５６（４５％）を高陽性（陽性細胞＞４０％）と分類した（図４パネルＢ）。生存分析は、検査した全ての病変が腫瘍細胞のない切除周縁部を有し（Ｒ０）、３．７％のみが遠位臓器に転移の存在を示した、６６人の患者のコホートで実施した（表ＩＩ）。得られたデータは、高ＢＡＧ３発現を有する患者が、低ＢＡＧ３発現を有する患者（生存中央値＝２３．０か月）よりも有意に短い生存（生存中央値＝１２．０か月）を有したことを示した（ｐ＝０．００１３）（図４、パネルＣ）。Ｃｏｘ割合分析に基づくと、高ＢＡＧ３発現は、２倍を越える高さの死亡危険性と関連した（表ＩＩＩ）。
【００８６】
【表３】
0006654432.tif 000005
【００８７】
（実施例５）
療法に応答するＢＡＧ３タンパク質
膵癌の治療のための第一次化学療法は、ゲムシタビンである。療法への応答におけるＢＡＧ３タンパク質の役割を調査するため、本発明者らは、ヒトＰＤＡＣ細胞におけるＢＡＧ３の下方調節の効果を分析した。細胞に、特異的ｓｉＲＮＡ標的ｂａｇ３  ｍＲＮＡまたは非特異的（ＮＴ）ｓｉＲＮＡを形質移入し、細胞をゲムシタビンにより、指示された時間にわたって処理した。ＢＡＧ３のサイレンシングは、薬剤に応答した細胞アポトーシスを増強した（図８）。
【００８８】
これらの結果は、膵臓腺癌におけるＢＡＧ３タンパク質およびｍＲＮＡの過剰発現、ならびに高い発現レベルと、高い死亡の危険性との関係性を実証し、予後および療法の選択に有用なマーカーの役割がＢＡＧ３に与えられる。さらに、ＢＡＧ３の下方調節がＰＤＡＣ細胞のアポトーシスを増強することを示している。試験された全ての病変における広範囲の発現および膵癌細胞生存の維持における関与に起因して、ＢＡＧ３は、ＰＤＡＣにおける革新的な療法のための重要な標的を表す。
【００８９】
（実施例６）
膵癌患者の血清におけるＢＡＧ３タンパク質
膵癌患者における広範囲の発現のため、ＢＡＧ３が膵癌患者の血清に存在するかを調査した。事実、ＢＡＧ３は検出可能であることが見出された。抗ＢＡＧ３抗体も検出可能であったが、ＢＡＧ３と複合して広がっていた。したがって、ＢＡＧ３／抗体複合体を検出するＥＬＩＳＡ検査を開発した。５１人の健康な提供者および５５人のＰＤＡＣに罹患している患者の血清を分析した（表ＩＶ）。
【００９０】
【表４】
0006654432.tif 000006
【００９１】
図９Ａに示されているように、免疫複合体（任意単位で測定）は、健康な提供者よりも患者の血清において有意に高かった。さらに、ＥＬＩＳＡ検査のＲＯＣ分析は、任意単位０．１８３のカットオフを使用して６５％の感受性および７８％の特異性をもたらす（図９Ｂ）。
【００９２】
（実施例７）
定量的リアルタイムＰＣＲによるＢＡＧ３発現
ＢＡＧ３発現の免疫組織化学データも、２５個のＰＤＡＣ組織試料におけるｂａｇ３  ｍＲＮＡレベルの測定を確認した（表Ｖ）。
【００９３】
【表５】
0006654432.tif 000007
【００９４】
特に、分析時には、２５人の患者のうち１６人が生存し、一方、９人の患者が膵癌進行のために死亡した。分析した腫瘍におけるｂａｇ３  ｍＲＮＡの発現の中央値を、０．００６８（Ｑ１−０．００４、Ｑ３＝０．０１０）に設定した（図７パネルＡ）。ＰＤＡＣ患者の考慮された人口統計学および臨床的特徴は、全て、ｂａｇ３  ｍＲＮＡレベルと無関係であった。したがって、生存との相関関係を評価し、ＰＤＡＣ試料におけるｂａｇ３発現レベルの中央値を、高ｂａｇ３発現を有する患者から低い患者を分けるカットオフとして使用した。このようにして、１３個の試料（５２％）を高ｂａｇ３陽性と分類し、１２個の試料（４８％）を低ｂａｇ３陽性と分類した。高ＢＡＧ３発現を有する患者が、低ｂａｇ３発現を有する患者（生存中央値＝３２．０か月）よりも短い生存（生存中央値＝１９．０か月）を有した。ｐ値＝０．０１９８（図７パネルＢ）。Ｃｏｘ割合分析に基づくと、高ｂａｇ３発現は、６倍を越える高さの死亡危険性と関連した（単変量：ＨＲ＝６．０９４，９５％ＣＩ＝１．１０５〜３３．５９７、ｐ＝０．０３８）。
【００９５】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりＢＡＧ３発現を検出するｂａｇ３プライマー。本発明者らは、ｂａｇ３  ｍＲＮＡ検出および定量化のために特異的プライマーを含有するＲＴ−ＰＣＲキットを開発した。
【００９６】
（実施例８）
本発明者らは、ＵＫＣＴＯＣＳから派生したプロスペクティブバイオバンク内の症例対照研究セットによるＰＤＡＣの診断の前に、ＢＡＧ３抗体レベルを評価した（非特許文献３）。試験コホートの２０２，０００人の閉経後の女性が募集時に一回血清を提供し、５０，０００人の女性が毎年継続的に血清試料を提供した。任意化後に膵癌を診断された女性を、癌登録データおよび郵送追跡質問表により同定した。
【００９７】
ＰＤＡＣが診断された女性では、ＰＤＡＣの診断前の異なる時点で血清試料を得た。対照血清を健康な対象から得て、ＢＡＧ３抗体力価を、各ＰＤＡＣ症例に対して約５人の対照対象で測定する。さらに対照血清を、対応するＰＤＡＣ症例と年齢を適合させた対象から得た。この対照血清適合を、各時点で使用した。
【００９８】
膵臓腺癌の０〜１年の前診断を有する４９人の女性対象由来の患者血清におけるＢＡＧ３特異的抗体の検出を、特異的ＥＬＩＳＡ検査により、ＢＡＧ３特異的抗体の存在について２３５人の女性対照対象由来の血清と比較した。
【００９９】
ＢＡＧ３抗体濃度を、特異的ＥＬＩＳＡアッセイにより検出した。
【０１００】
図１０に示されているように、ＢＡＧ３抗体は、対照対象と比べて３〜４年の前診断の症例のおいて有意に高かった。
【０１０１】
他の時点には、２５１人の対照と比較した、ＰＤＡＣの１〜２年の前診断を有する５３人の対象、２１２人の対照と比較した、ＰＤＡＣの２〜３年の前診断を有する４４人の対象、１８７人の対照と比較した、ＰＤＡＣの３〜４年の前診断を有する４２人の対象が含まれた。
【０１０２】
図１０に示されているように、ＢＡＧ３抗体は、対照対象に関して少なくとも３〜４年の前診断の症例において有意に高かった。
【０１０３】
方法
細胞培養
ＨＣＭａ（ヒト心筋細胞−成人）を、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入し、Ｃａｒｄｉａｃ  Ｍｙｏｃｙｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＣＭＭ、ＦＢＳ  ５％、Ｃａｒｄｉａｃ  Ｍｙｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １％、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液１％）（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で増殖させた。全ての実験は、低継代細胞培養物により実施した。胎児ラット心筋芽細胞（Ｈ９ｃ２系）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入し、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖させた。ネズミ単球マクロファージ細胞系のＪ７７４Ａ．１（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのグルタミン、１００ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭで増殖させた。
【０１０４】
膵癌細胞系（ＭＩＡ  ＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１、ＰＳＮＩ、Ｃａｐａｎ−１およびＰＡＮＣ−１）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，）細胞バンクから受け取った。ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、１０％ＦＢＳおよび２．５％のウマ血清を補充して、培養した。ＡｓＰＣ−１およびＰＳＮＩ細胞を、１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で増殖させた。Ｃａｐａｎ−１を、２０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０で培養し、一方、ＰＡＮＣ−１を、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭで培養した。上記の細胞系のための全ての培地は、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ−Ｌｏｎｚａ（Ｂｅｒｇａｍｏ，Ｉｔａｌｙ）ＭｅｄｉａＴｅｃｈ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、１００単位のペニシリン／ｍＬおよび２μｇのストレプトマイシン／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充した。細胞を、５％ＣＯ2の雰囲気において３７℃でインキュベートした。細胞を、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ（Ｓｅｓｔｏ  Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ，Ｉｔａｌｙ）から提供されたゲムシタビン（２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン、ＧＥＭ、Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））により示された濃度で処理した。
【０１０５】
ヒト血清におけるＢＡＧ３抗体の解離
血清を、解離緩衝液（１．５％のＢＳＡおよび０．２Ｍのグリシンアセテートを有するＰＢＳ、ｐＨ２．５）により１：４０に希釈して、５００μｌの最終容量にし、室温で２０分間インキュベートした。次に血清をＭｉｃｒｏｃｏｎ遠心分離フィルター装置ＹＭ−１００（１００，０００ＭＷカットオフ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）の試料レザバーにピペットで移し、１４，１００ｒｐｍにより室温で２０分間遠心分離した。次に試料レザバーをフロースルーから取り外し、第２の管に逆向きで配置し、５，０００ｒｐｍにより室温で３分間遠心分離した。解離した抗体を含有する収集溶液を、１ＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ９．０によりｐＨ７．０に調整した。濃縮水量を、希釈緩衝液（１．５％のＢＳＡおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ）により初期量（５００ｕｌ）に再構築した。１４免疫ブロットによるＢＡＧ３タンパク質の検出では、解離抗体を、５％のウシ血清アルブミンを含有するＴＢＳＴにおいて、４℃で一晩かけて１：２００に希釈した。
【０１０６】
ウエスタンブロット分析
細胞を採取し、プロテアーゼインヒビターカクテル（１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、２ｍｇ／ｍｌのアプロチニン）を補充した、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（ＴＮＮ緩衝液）を含有する緩衝液において、３サイクルの凍結解凍により溶解した。可溶性タンパク質を１０，０００ｇにより１５分間遠心分離した後に収集し、これらの量をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により決定した。２５μｇの総タンパク質および血清試料（ＰＢＳ−Ｔ  ０．０５％中１：２）を、８％または１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流し、電気泳動的にニトロセルロース膜に移動させた。ニトロセルロースブロットを、ＴＢＳＴ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０）中１０％の脱脂粉乳によりブロッキングし、５％のウシ血清アルブミンまたは５％の脱脂粉乳を含有するＴＢＳＴ中の一次抗体と共に、４℃で一晩かけてインキュベートした。免疫反応性を、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入したホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体およびＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ  ＵＳＡ）から購入したＥＣＬ検出試薬を伴う連続インキュベーションにより検出した。
【０１０７】
バンドの走査濃度測定を、Ｉｍａｇｅ  Ｓｃａｎ（ＳｎａｐＳｃａｎ  １２１２；Ａｇｆａ−Ｇｅｖａｅｒｔ  ＮＶ）により実施した。各バンドに関連する曲線下の面積を、Ｇｉｍｐ２ソフトウエアの使用により決定した。バックグラウンドを、計算した値から差し引いた。
【０１０８】
質量分析
タンパク質バンドを切り取り、続いてゲル片をＭｉｌｌｉＱ水およびアセトニトリルで洗浄し、タンパク質をＳｈｅｖｃｈｅｎｋｏプロトコールに記載されているようにｉｎ  ｓｉｔｕで消化した。簡潔には、ゲル片を１，４−ジチオトレイトール（１０ｍＭ）で還元し、ヨードアセトアミド（５０ｍＭ）でアルキル化し、次に洗浄し、トリプシン溶液（１２ｎｇ／μＬ）により氷上で１時間かけて再水和した。３０μＬの重炭酸アンモニウム（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）を加えた後、試料を２５℃で一晩かけて消化した。５μＬの得られたペプチド混合物を、ナノＡｃｑｕｉｔｙ  ＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）に注入した。ペプチドを１．７μｍのＢＥＨ  Ｃ-１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）により２００ｎｌ／分の流速で分離した。勾配（溶液Ａ：０．１％のギ酸、溶液Ｂ：０．１％のギ酸、１００％のＡＣＮ）は、５％で出発し、５５分後に５０％のＢで終了した。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳデータは、Ｑ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して得た。二重および三重に投入したペプチドイオンを、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウエアにより自動的に選択し、フラグメント化した。ＭＳデータを自動的に処理し、データベース検索によるタンパク質同定のピークリストを、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘソフトウエアにより作製した。データベース検索は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔタンパク質データベースを使用するＭＡＳＣＯＴサーバーにより実施した。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔヒトデータベース（４０５５０６配列；１４６１６６９８４残基）を検索し、固定修飾として１つの欠損切断、カルバミドメチル（Ｃ）が許容された。ペプチド耐性を６０ｐｐｍに設定し、ＭＳ／ＭＳ耐性を０．８Ｄａに設定した。
【０１０９】
分画超遠心分離による開口放出小胞の精製
Ｈ９ｃ２の無血清培地から、４℃での連続遠心分離（２０００×ｇで１５分間、１０，０００×ｇで３０分間）により細胞および大型の壊死組織片を排除した。最初の２つの遠心分離のそれぞれの終了時に、ペレットを廃棄し、上清を次のステップのために保持する。次に最終上清を１５０，０００×ｇにより４℃で９０分間超遠心分離して（ＳＷ５０．１ローターおよびＯｐｔｉｍａ  Ｌ−９０Ｋ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒにより）、エキソソームをペレット化する。ペレットをＰＢＳで洗浄して、汚染タンパク質を排除し、最後に１５０，０００×ｇにより４℃で９０分間遠心分離した。１６洗浄した後、ペレット（エキソソーム）を２０μｌのＰＢＳに再懸濁し、ウエスタンブロットにより、抗ＢＡＧ３  ＴＯＳ−２ポリクローナル抗体を用いて総細胞溶解産物と比較して分析した。Ｒａｂ−４を開口放出小胞のマーカーとして分析した。
【０１１０】
ＦＡＣＳ分析
ｒＢＡＧ３結合−Ｊ７７４Ａ．１細胞を、ＰＢＳ中の２％のＦＢＳ＋０．１％のＮａＮ３により氷上で１５分間ブロッキングし、異なる濃度のＦＩＴＣ−ｒＢＡＧ３タンパク質（７、１４および７０ｎｍ）または２％のＦＢＳ＋０．１％のＮａＮ３を含有するＰＢＳ中のＦＩＴＣ−ＢＳＡ（７０ｎＭ）と共に、暗黒中において４℃で３０分間インキュベートした（２．５％、１０5／１００μｌ）。ＰＢＳにより洗浄した後、細胞をＰＢＳ＋２％のＦＢＳ＋０．１％のＮａＮ３に再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターにより分析した。
【０１１１】
競合−Ｊ７７４Ａ．１細胞（２．５×１０５／１００μｌ）を、２％のＦＢＳ＋０．１％のＮａＮ３を含有するＰＢＳ中、６２５ｎＭのＢＡＧ３ペプチド（ペプチド１、ペプチド２、ペプチド３、ペプチド４またはスクランブルペプチド）と共に、または４２０ｎＭの抗ＢＡＧ３モノクローナルおよびポリクローナル抗体（マウスモノクローナルＡＣ１、ＡＣ２およびウサギポリクローナルＴＯＳ２）のＦ（ａｂ’）２フラグメントもしくはマウスＩｇＧのＦ（ａｂ’）２フラグメントもしくはウサギＩｇＧのＦ（ａｂ’）２フラグメントと共に氷上で３０分間インキュベートした。インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次に２％のＦＢＳ＋０．１％のＮａＮ3を含有するＰＢＳ中、ＦＩＴＣ−ｒＢＡＧ３タンパク質（１４ｎＭ）と共に暗黒中において４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳにより洗浄した後、細胞をＰＢＳ＋２％のＦＢＳ＋０．１％のＮａＮ３に再懸濁し、フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。
【０１１２】
ＥＬＩＳＡによるＩＬ６検出
ポリミキシンＢスルフェート（５μｇ／ｍｌ）の不在下または存在下でＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）により、またはｒＢＡＧ３（１４ｎＭ）もしくはＢＳＡ（１４ｎＭ）により１０または２０時間処理したＪ７７４Ａ．１細胞（５×１０4／９６ウエルマイクロプレート中）の上清において、ＩＬ６を測定した。処理した後、５０μＬの細胞培養培地を収集し、マウスＩＬ６  Ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により三重に分析した。
【０１１３】
蛍光
細胞を６ウエルプレートにおいてカバーガラス上で６０〜７０％の集密度に培養し、等量のｒＢＡＧ３−ＦＩＴＣおよびＢＳＡ−ＦＩＴＣタンパク質をＨＣＭａに加え、０．１％のＮａＮ3を有するＪ７７４Ａ１培養培地に１時間加えた。カバーガラスを１×ＰＢＳで洗浄し、１×ＰＢＳ中３．７％のホルムアルデヒドにより室温で３０分間固定し、次に１×ＰＢＳ  ０．１Ｍグリシンと共に５分間インキュベートした。１：１００希釈の抗β−インテグリンモノクローナル抗体と共に４℃でインキュベートした後、カバーガラスを１×ＰＢＳにより３回洗浄した。１：５００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧＤｙＬｉｇｈｔ  ５９４コンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）と共に室温で４５分間インキュベートした後、カバーガラスを再び１×ＰＢＳにより３回洗浄した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、２ｇ／ｍｌ）と共に室温で１０分間インキュベートした後、カバーガラスを再びＰＢＳにより３回、次に蒸留水で洗浄した。次にカバーガラスを、間に４７％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含有するスライドに載せた。試料を共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ共焦点顕微鏡、Ｇｅｒｍａｎｙ）の使用により分析した。画像は、実験および対照材料を比較するとき、同じ取得パラメーター（レーザー強度、光電子倍増管、ピンホール口径、対物レンズ６３×、ズーム２）を使用して連続走査モードにより取得した。図の生成では、最低蛍光強度の特徴の視感のために明るい細胞蛍光バックグラウンドを残すこと、および異なる実験群間の比較を助けることに注意しながら、画像の明度およびコントラストを調整した。最終的な図は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ７およびＡｄｏｂｅ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ  １０を使用して組み立てた。Ｌｅｉｃａ  Ｑ９  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ＳｏｆｔｗａｒｅおよびＩｍａｇｅＪをデータ分析に使用した。
【０１１４】
ＥＬＩＳＡによる抗体力価の測定
ＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを、組換えＢＡＧ３タンパク質の、ＰＢＳ、ｐＨ７中の１μｇ／ｍｌ（５０μｌ／ウエル）により被覆し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）により２回洗浄し、次にＰＢＳ中０．５％の魚肉ゼラチンにより室温で１時間ブロッキング（１５０μｌ／ウエル）した。ブロッキングした後、プレートを洗浄緩衝液により２回洗浄し、血清を洗浄緩衝液中０．５％の魚肉ゼラチンにより１：７０に希釈し、次に三重に適用し（５０μｌ／ウエル）、室温で２時間インキュベートした。次にプレートを洗浄緩衝液により６回洗浄した。抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、洗浄緩衝液中０．５％の魚肉ゼラチンにより１：２０，０００に希釈し、５０μｌ／ウエルで加え、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベートした後、プレートを６回洗浄し、ＴＭＢ（５０μｌ／ウエル）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により現像し、反応を４．５Ｍの硫酸（２５μｌ／ウエル）により停止させ、プレートを４５０ｎｍで分光光度的に分析した。
【０１１５】
ＮＯ2-アッセイ
培養上清中の細胞から放出されたＮＯの安定した代謝産物である亜硝酸塩含有量（ＮＯ2-）を、ポリミキシンＢスルフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）５μｇ／ｍｌの不在下または存在下でＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）により、またはｒＢＡＧ３（７、１４および２８ｎＭ）もしくはＢＳＡ（２５ｎＭ）により２４時間処理した、Ｊ７７４Ａ．１細胞（５×１０４／９６ウエルマイクロプレート）において測定した。ＮＯ２-の量をグリース反応により測定した。簡潔には、１００μＬの細胞培養培地を、１００μＬのグリース試薬、等量の、５％（ｖ：ｖ）のリン酸中１％（ｗ：ｖ）のスルファニルアミドおよび０．１％（ｗ：ｖ）のナフチルエチレンジアミン−ＨＣｌと混合し、室温で１０分間インキュベートし、次に吸光度をマイクロプレート読み取り機Ｔｉｔｅｒｔｅｋ（Ｄａｓｉｔ，Ｃｏｒｎａｒｅｄｏ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）により５５０ｎｍで測定した。試料中のＮＯ２−の量（μＭ）を、亜硝酸ナトリウム標準曲線から計算した。
【０１１６】
ＥＬＩＳＡによるＢＡＧ３／抗体免疫複合体の測定
ＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ、ｐＨ７中の抗ＢＡＧ３モノクローナル抗体ＡＣ−１、ＡＣ−２またはＡＣ−３により被覆し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）により２回洗浄し、次にＰＢＳ中０．５％の魚肉ゼラチンにより室温で１時間ブロッキング（１５０μｌ／ウエル）した。ブロッキングした後、プレートを洗浄緩衝液により２回洗浄し、血清を洗浄緩衝液中０．５％の魚肉ゼラチンにより１：７０に希釈し、次に三重に適用し（５０μｌ／ウエル）、室温で２時間インキュベートした。次にプレートを洗浄緩衝液により６回洗浄した。抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、洗浄緩衝液中０．５％の魚肉ゼラチンにより１：２０，０００に希釈し、５０μｌ／ウエルで加え、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベートした後、プレートを６回洗浄し、ＴＭＢ（５０μｌ／ウエル）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により現像し、反応を４．５Ｍの硫酸（２５μｌ／ウエル）により停止させ、プレートを４５０ｎｍで分光光度的に分析した。
【０１１７】
免疫組織化学
免疫組織化学プロトコールには、キシレンによる脱パラフィン化（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎａｔｉｏｎ）、純水までアルコールの濃度を下降させることによる再水和、クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０による９５℃での３０分間の非酵素的抗原回復およびメタノール中のＨ２Ｏ２による２０分間の内在性ペルオキシダーゼ消光が含まれる。ＰＢＳによりすすいだ後、試料を、０．１％のＰＢＳ／ＢＳＡ中５％の正常なウマ血清によりブロッキングした。ＢＡＧ３を検出するため、試料を、３マイクログラム／ｍｌの濃度のＢＡＧ３モノクローナル抗体ＡＣ−１、ＡＣ−２またはＡＣ−３と共に室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳにより十分に洗浄した後、切片をビオチン化二次抗マウスＩｇＧと共に２０分間インキュベートし、次にすすぎ、アビジン−ビオチン複合体ペルオキシダーゼ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ−Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｌａｎｏ，ＩＴから購入した）と共にインキュベートし、ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により現像した。最後に、切片をヘマトキシリンで対比染色し、アルコールで脱水し、キシレンで清浄化し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍｉｌａｎ，ＩＴ）により装填した。
【０１１８】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
切除膵癌の組織試験片を取り出し、直ぐに液体窒素により凍結し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。全ＲＮＡをフェノール抽出により凍結組織および膵癌細胞系から単離した（ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）。組織試料において、癌細胞充実性は、大部分の細胞領域のクリオスタット切片作製および切開により濃縮された。ＲＮＡ濃度および純度（Ａ２６０：Ａ２８０＞２．０、Ａ２６０／Ａ２３０＞１．８）は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）により確認した。１．０μｇの全ＲＮＡを、製造会社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｅｒａ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）の説明書に従って、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔの使用により逆転写した。定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを使用して、腫瘍組織試料におけるＢＡＧ３の発現差異を評価した。ヒトｂａｇ３遺伝子のプライマーを、Ｐｒｉｍｍ  ｓｒｌ（Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）（順方向プリマ−：（配列番号１６）ＣＣＴＧＴＴＡＧＣＴＧＴＧＧＴＴＧ、逆方向プライマー：（配列番号１７）ＡＡＣＡＴＡＣＡＧＡＴＡＴＴＣＣＴＡＴＧＧＣ）により合成した。全てのｑＰＣＲは、２５μｌの最終容量において、以下の条件：９５℃で５分間、４０サイクルの９５℃で１０秒間および６０℃で３０秒間に従って、ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｅｒａ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を稼働して、試料あたり３回繰り返して実施した。データは、Ｓ．Ｄ．Ｓソフトウエアｖ２．１を使用して、閾サイクル（Ｃｔ）値として取得した。それぞれの試料において、ｂａｇ３  ｍＲＮＡの相対的発現レベルを、内在性ＧＡＰＤＨの発現に正規化した後、比較法の使用により得た。
【０１１９】
上記の記載および上記に示された実施例から、本発明により記載され、得られる生物学的マーカーによって得られる利点が、明らかである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
0006654432.tif 000009
【図１Ｃ】
0006654432.tif 000010
【図１Ｄ】
0006654432.tif 000011
【図２Ａ】
0006654432.tif 000012
【図２Ｂ】
0006654432.tif 000013
【図２Ｃ】
0006654432.tif 000014
【図３Ａ】
0006654432.tif 000015
【図３Ｂ】
0006654432.tif 000016
【図３Ｃａ】
0006654432.tif 000017
【図３Ｃｂ】
0006654432.tif 000018
【図３Ｃｃ】
0006654432.tif 000019
【図４Ａ】
0006654432.tif 000020
【図４Ｂ】
0006654432.tif 000021
【図４Ｃ】
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【図５】
0006654432.tif 000023
【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
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