(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３次元の器官構築物を製造するための押出し可能なハイドロゲル組成物であって、（ｉ）チオール置換オリゴ糖、チオール置換ヒアルロン酸、チオール置換コラーゲンまたはチオール置換ゼラチンおよび（ｉｉ）第１のチオール反応性架橋剤の反応により形成された架橋性プレポリマーと、アルキンを含む第２のチオール反応性架橋剤と、水とを含む組成物。
【請求項２】
少なくとも１つの成長因子をさらに含み、任意選択的に、前記少なくとも１つの成長因子が、脱細胞化された細胞外基質組成物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
開始剤をさらに含み、任意選択的に、前記開始剤が熱重合開始剤または光重合開始剤を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記第２のチオール反応性架橋剤が、マルチアームチオール反応性架橋剤を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記架橋性プレポリマーが、チオール置換ヒアルロン酸と前記第１のチオール反応性架橋剤との少なくとも部分的な架橋反応から形成される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記架橋性プレポリマーが、チオール置換ゼラチンと前記第１のチオール反応性架橋剤との少なくとも部分的な架橋反応から形成される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、室温および大気圧において、０．０５、０．１もしくは０．５キロパスカルから、１、５もしくは１０キロパスカルまで、またはそれより大きい硬さを有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
生細胞をさらに含み、任意選択的に、前記生細胞が動物組織細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記生細胞が、スフェロイド中にカプセル化されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
３次元の器官構築物を製造する方法であって、
（ａ）生細胞をさらに含む、請求項１に記載の押出し可能なハイドロゲル組成物を含有する貯留容器を用意するステップと、次いで、
（ｂ）前記ハイドロゲル組成物を基体上に堆積させるステップと、次いで、
（ｃ）前記ハイドロゲル組成物の硬さを増大させ、前記３次元の器官構築物を形成させるのに十分な量で、前記架橋性プレポリマーを前記第２のチオール反応性架橋剤と架橋させるステップと
を含む方法。
【請求項１１】
前記架橋ステップが、熱開始または光開始架橋ステップである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記架橋性プレポリマーが、チオール置換ヒアルロン酸と前記第１のチオール反応性架橋剤との少なくとも部分的な架橋反応から形成される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記架橋性プレポリマーが、チオール置換ゼラチンと前記第１のチオール反応性架橋剤との少なくとも部分的な架橋反応から形成される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハイドロゲル組成物が、前記堆積ステップから前記架橋ステップまで前記基体上の堆積の配置を保持できる程度に十分に硬い、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）前記ハイドロゲル組成物が、前記堆積ステップに先立ち、室温および大気圧において、０．０５、０．１もしくは０．５キロパスカルから、１、５もしくは１０キロパスカルまで、もしくはそれより大きい硬さを有する、および／または
（ｉｉ）前記架橋ステップが、前記ハイドロゲル組成物の硬さを、室温および大気圧において、１もしくは５キロパスカルから、１０、２０もしくは５０キロパスカルまで、もしくはそれより大きく増大させる、および／または
（ｉｉｉ）前記ハイドロゲル組成物が、前記架橋ステップ（ｃ）の後、室温および大気圧において、１もしくは５キロパスカルから、１０、２０もしくは５０キロパスカルまでの硬さを有する、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記堆積ステップが、パターン化された堆積ステップである、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
（ｄ）前記基体上の支持ポリマーを、前記ハイドロゲル組成物に隣接する位置において堆積させるステップ
をさらに含む、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記基体が、少なくとも１つのチャンバーを有するマイクロ流体デバイスを備え、前記堆積が、前記少なくとも１つのチャンバーにおいて行われる、または
前記基体が、第１の平面部材を備え、前記堆積ステップが、前記平面部材上で行われ、前記方法が、前記平面部材をマイクロ流体デバイスのチャンバーに挿入するステップをさらに含む、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
細胞機能をインビトロでモデル化するのに有用なデバイスであって、
（ａ）中に形成された少なくとも１つのチャンバーを有する、マイクロ流体デバイス基体、
（ｂ）第１のパターンで前記少なくとも１つのチャンバーにおいて堆積された請求項１に記載のハイドロゲル組成物、
（ｃ）前記ハイドロゲル組成物中の生細胞、および
（ｄ）前記ハイドロゲル組成物に隣接する前記チャンバーにおいて堆積された構造支持体ポリマー
を備えるデバイス。
【請求項２０】
前記生細胞が動物細胞である、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記生細胞が、肝組織細胞、膵細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、またはその組合せである、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記構造支持体がパターン化されている、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記生細胞がスフェロイドに含有され、スフェロイドが前記ハイドロゲル組成物に含有されている、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記ハイドロゲル組成物が、室温および大気圧において、１または５キロパスカルから、１０、２０または５０キロパスカルまでの硬さを有する、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記チャンバー内のゲル状の一時的保護用支持媒体を有する入れ物に梱包される、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記入れ物が冷却要素をさらに含む、請求項２５に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［政府支援］
本発明は、Ｄｅｆｅｎｓｅ  Ｔｈｒｅａｔ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙにより授与された契約番号Ｎ６６０１−１３−Ｃ−２０２７の下、政府支援で成された。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【０００２】
［関連出願］
本出願は、２０１４年１０月２４日付で出願された、米国仮特許出願番号第６２／０６８，２１８号の優先権を主張し、その内容は、全体として参照により本明細書の一部をなすものとする。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、人工組織構築物の製作に有用なハイドロゲル「バイオインク」組成物、それを使用する方法、およびそれから形成された製品に関する。
【背景技術】
【０００４】
バイオファブリケーション技術は、器官およびオルガノイド、または組織構築物を築くための組織工学アプローチとして現れてきた。生体適合性材料とラピッドプロトタイピングの組合せは、生組織において必要とされる複雑さに取り組む方法を提供する。バイオファブリケーションに付随するハードルのひとつには、堆積／製作ハードウェアと堆積される各種の生体材料（または「バイオインク」）との連係がある。標準的なハイドロゲルは、機械的特性が限定される流体溶液としてプリントされるか、または固体ハイドロゲルとしてプリントされ、押出しプロセスの際に崩壊するので、設計問題を引き起こす。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書に記載される材料の実施形態は、押出し可能であることにより、かつ、広範な組織タイプと適合するよう最終製品の硬さを安定化し増大する、堆積後のまたは第２の架橋ステップを有することにより、上で述べられた課題に取り組む。加えて、これらの「バイオインク」組成物は、バイオファブリケーションにより作製された構築物中の細胞が次に経験する、インビボ組織のものに近い生化学的環境において生じる組織からもたらされる生化学的因子を補充され得る。これらの因子は、生化学的および機械的ともに、培養において生細胞を維持し、培養の続く間それらの機能性を増大する能力を高めることができる。
【０００６】
前述のことを考慮して、本発明は、３次元器官構築物を作製するのに有用な押出し可能なハイドロゲル組成物（または「バイオインク」）を提供する。組成物は、
（ａ）架橋性プレポリマー；
（ｂ）堆積後架橋基（第２の架橋基とも称する）；
（ｃ）場合により、いくつかの実施形態で好ましくは、前記プレポリマーと前記堆積後架橋基の間の反応を触媒する開始剤；
（ｄ）生細胞（例えば、動物生細胞）；
（ｅ）場合により、いくつかの実施形態で好ましくは、少なくとも１つの成長因子；および
（ｆ）場合により、総量合わせ用の水
を含む。
【０００７】
前述のものを使用する方法、およびそれから製造される製品も、本明細書において記載される。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態は、以下の通り、利点をもたらす。
【０００９】
生化学的特性の制御。身体中の組織は、複雑な組成を有する。種々の細胞亜集団は、組織における細胞の生存率および機能の維持を助ける、成長因子および他のサイトカインなどのシグナル伝達分子を分泌する。細胞外基質は、組織に構造をもたらし、別種のシグナル伝達として作用する細胞受容体とも相互作用する、タンパク質およびポリマーを含む。加えて、いくつかのＥＣＭ成分は、成長因子（ヘパリン、ヘパラン硫酸）に結合し、それらを細胞に経時的にゆっくり放出する。これらのシグナルの組合せは、組織ごとに異なる。本発明者らは、初代ヒト肝細胞を支持するために、ハイドロゲル内に肝臓に特異的な成分を供給する方法を既に開発した。任意の組織を脱細胞化し、微粉砕し、溶解することにより、本発明者らは、３Ｄハイドロゲル構築物中の細胞に、任意の組織由来の組織特異的な生化学的シグナルを生じることができる。
【００１０】
機械的特性の制御。機械的特性、特に、弾性率は、主に２つの理由のために重要である。第１に、以前の報告において記載された通り、ハイドロゲルバイオインクの硬さの制御は、軟質ゲルを使用した押出方式バイオファブリケーションを可能にし、次にそれは、第２の架橋により後に硬化され、安定性を増大させることができる。第２に、この第２の架橋ステップを使用して、それぞれの個々のオルガノイドについての標的器官タイプと一致する、弾性率レベルに達することができる。例えば、本発明者らは、肝臓バイオインクを、自然な肝臓のような、５〜１０ｋＰａの硬さに達するよう、または心臓バイオインク（もしくは微小環境）を、自然な心臓組織のような、１０〜１５ｋＰａの硬さに達するよう、それらの自然な組織対応物に類似の方法でこれらのオルガノイドの機能する能力を増大させる理論で、カスタマイズすることができる。
【００１１】
本発明は、本出願における図面および以下で説明される明細書においてより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】生化学的因子をハイドロゲルバイオインクに供給するための組織ＥＣＭ由来溶液中の成分の分析の図である。Ａ）肝臓、心臓、および骨格筋ＥＣＭ溶液において測定された成長因子ならびにサイトカイン量（ｐｇ／ｍｌ）を示すパネル。Ｂ）肝臓、心臓、および骨格筋ＥＣＭ溶液中のコラーゲン、ＧＡＧ、およびエラスチンの濃度。
【図２】Ａ）アクリレート系架橋剤（架橋剤１）、アルキン系架橋剤（架橋剤２）、チオール化ＨＡ、チオール化ゼラチン、ならびに無修飾ＨＡおよびゼラチンを含む、プリント可能なバイオインク製剤の戦略の図である。Ｂ）バイオプリント可能なハイドロゲルバイオインクの実行の図である。バイオインク製剤が、調製され、チオール−アクリレート結合を介して自発的に架橋し、押出し可能な軟質材料を生じる。バイオプリントが行われる。最後に、バイオプリントされた構造が融合され、安定化され、標的な硬さがもたらされる。
【図３】バイオインクのバイオプリント試験の図である。Ａ）バイオプリンターにおけるバイオインク堆積試験のため使用される７×７ｍｍパターン。Ｂ）プリント後バイオインクを含有する、ＰＥＧＤＡおよび４−アームＰＥＧアルキンの開始製剤。Ｃ）剪断減粘性、および材料の滑らかさを改善するための無修飾ＨＡならびにゼラチンの添加後の押出し、ならびに最終構造の滑らかさの改善。
【図４】バイオインク硬さ制御、および製剤の範囲の図である。Ａ）このパネルにおいてゲル２番を使用してバイオインクの硬さを制御する能力の証明。段階１の架橋後、ゲルは、比較的軟質であり、滑らかに押し出すことができる。紫外線による段階２の架橋後、硬さは、１桁より多く、増大する。Ｂ）約１００Ｐａ〜約２０ｋＰａに渡る、段階２の架橋後の様々なバイオインク製剤の最終の硬さのレベルの範囲。
【図５】バイオファブリケーションされたオルガノイドの設計の図である。
【図６】本発明の組成物における押出しバイオファブリケーション後のオルガノイドの生死イメージングの図である。
【図７】本発明の組成物における押出しバイオファブリケーション後のオルガノイドのアルブミンおよび尿素分析の図である。
【図８】生死染色により評価された、アセトアミノフェン（パラセタモール；Ｎ−アセチル−ｐ−アミノフェノール；「ＡＰＡＰ」）処理オルガノイドの生存率の図である。
【図９】ＡＰＡＰ処置後のオルガノイドのアルブミンおよび尿素分析の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、本発明の実施形態が示される、添付の図面を参照して本明細書において以下においてより完全に記載される。しかしながら、本発明は、多くの異なる形態で具体化されてもよく、本明細書において説明される実施形態に制限されると解釈されるべきでなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が、詳細かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように、提供される。
【００１４】
本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態のみを記載するという目的のためであり、本発明の制限であることは意図されない。本明細書において使用される通り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別段明確に示さない限り、複数形を同様に含むことが意図される。用語「含む」、または「含むこと」は、本明細書において使用されるとき、定められた特性、整数、ステップ、作業、要素、成分、および／もしくは群またはその組合せの存在を特定するが、１つあるいは複数の他の特性、整数、ステップ、作業、要素、成分、および／もしくは群またはその組合せの存在あるいは追加を除外しないことはさらに理解されるだろう。
【００１５】
別段定義されない限り、本明細書において使用される全ての用語（技術的および科学的用語を含む）は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。通常使用される辞書において定義されるもののような、用語は、明細書および請求の範囲の内容においてそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書においてそのように明確に定義されない限り、理想的または過度に正式に解釈されるべきでないことは、さらに理解されるだろう。周知の機能または構築物は、簡潔さおよび／もしくは明瞭さのため詳細に記載されなくてもよい。
【００１６】
Ａ．組成物
本発明の組成物は、「バイオインク」中に生細胞を含んでもよく、ここで、「バイオインク」は、順に、架橋性ポリマー、堆積後架橋基または剤、および成長因子、開始剤（例えば、架橋の）、水（総量合わせ用）などを含むが、これらに限定されない、他の任意の構成要素を含む。組成物は、好ましくは、ハイドロゲルの形態である。組成物の様々な成分および性質が、以下でさらに考察される。細胞。植物、動物、および微生物細胞（例えば、酵母、細菌など）を含むが、これらに限定されない、任意のタイプの細胞、一般に、生細胞を使用して、本発明を実施してもよい。細胞は、同じ生物または種由来の細胞の組合せ、異なる種の細胞の共生の組合せなどを含む、複数の細胞タイプの組合せであってもよい。一般に、細胞は、好ましくは、動物細胞（例えば、鳥類、爬虫類、両生類など）であり、いくつかの実施形態において、好ましくは、哺乳類細胞（例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、サル、類人猿、ヒト）である。細胞は、分化または未分化細胞であってもよいが、いくつかの実施形態において、組織細胞（例えば、肝細胞のような肝臓細胞、膵細胞、心筋細胞、骨格筋細胞など）である。組織細胞が利用される場合、それらは、その組織についての複数の細胞タイプの１つの細胞タイプとして組み込まれてもよく、別々の細胞として、またはオルガノイドのような細胞凝集体（オルガノイドが、カプセル化されていなくても、またはカプセル化されていてもよい、例えば、スフェロイド）として組み込まれてもよい。
【００１７】
細胞は、カプセル化されていない細胞として、またはスフェロイド中で先にカプセル化された細胞として含むような、任意の適当な形態の組成物に組み込まれてもよい。ポリマースフェロイドにおいてカプセル化され、または含有された動物組織細胞は、公知の技術に従い生産することができるか、またはいくつかの場合において、市販されている（例えば、Ｉｎｓｐｈｅｒｏ  ＡＧ、３Ｄ  Ｈｅｐｇ２  Ｌｉｖｅｒ  Ｍｉｃｒｏｔｉｓｓｕｅ  Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ（２０１２年）；Ｉｎｓｐｈｅｒｉｏ  ＡＧ、３Ｄ  ＩｎＳｉｇｈｔ（商標）Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｍｉｃｒｏｔｉｓｓｕｅｓ、（２０１２年））。
【００１８】
架橋性プレポリマー。任意の適当なプレポリマーは、本明細書において記載される方法において利用されるとき、堆積後のその弾性率を増大させるためにさらに架橋されることができる限り、本発明を実施するために使用することができる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、プレポリマーは、（ｉ）オリゴ糖（例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、それらの組合せ、特にそれらのチオール置換誘導体）、ならびに（ｉｉ）第１の架橋剤（例えば、ポリアルキレングリコールジアクリレート、ポリアルキレングリコールメタクリレートなど、特にポリエチレングリコールジアクリレートなどのような、チオール反応性架橋剤；チオール−チオールジスルフィド結合を生成するためのチオール化架橋剤；チオール−金結合を形成する金ナノ粒子官能化架橋剤など、およびそれらの組合せ）の少なくとも部分的な架橋反応から形成される。
【００２０】
架橋基。いくつかの実施形態において、組成物は、堆積後架橋基を含む。ポリエチレングリコールジアルキンのようなマルチアームチオール反応性架橋剤、他のアルキン官能化された基など、およびそれらの組合せを含むが、これらに限定されない、任意の適当な架橋基を使用することができる。
【００２１】
開始剤。本発明の組成物は、場合によるが、いくつかの実施形態で、開始剤（例えば、熱または光重合開始剤）を好ましくは含んでもよい。前記プレポリマーと第２の（または堆積後）架橋基との反応（例えば、加熱の際、または光への曝露の際）を触媒する任意の適当な開始剤を、利用してもよい。
【００２２】
成長因子。本発明の組成物は、場合によるが、いくつかの実施形態で、少なくとも１つの成長因子（例えば、含まれる特定の細胞、および／または製造中の特定の代用組織に適当な）を好ましくは含んでもよい。例えば、組織細胞に対応する組織由来の脱細胞化された細胞外基質組成物（「ＥＣＭ」）（例えば、動物生細胞が肝臓細胞であるとき、脱細胞化された細胞外肝臓基質、動物生細胞が心筋細胞であるとき、脱細胞化された細胞外心筋基質、動物生細胞が骨格筋細胞であるとき、脱細胞化された骨格筋基質など）である。追加のコラーゲン、グリコサミノグリカン、および／またはエラスチン（例えば、細胞外基質組成物を補うために加えられてもよい）なども含まれてもよい。
【００２３】
弾性率。組成物は、それを操作し、どんな堆積方法が利用されても（例えば、押出し堆積）、基体に堆積することができるように、室温および大気圧において、十分に低い、弾性率を好ましくは有する。さらに、場合によるが、いくつかの実施形態で、組成物は、続く架橋（その架橋が、自発、熱開始または光開始などに関係なく）まで堆積される、形または配置を実質的に保ように、再度室温および大気圧において、十分に高い弾性率を好ましくは有する。いくつかの実施形態において、組成物は、堆積の前、室温および大気圧において、０．０５、０．１もしくは０．５キロパスカルから、１、５もしくは１０キロパスカルまで、または、それ以上の硬さを有する。
【００２４】
Ｂ．方法．
本発明の組成物は、任意の都合の良い方法で使用してもよい。１つの非限定的な好ましい使用方法において、組成物は、３次元の器官構築物を製造する方法において使用される。かかる方法は、
（ａ）上で記載された押出し可能なハイドロゲル組成物を含有する貯留容器を用意するステップと、次に
（ｂ）ハイドロゲル組成物を基体上に（例えば、シリンジを介した押出しにより）堆積させるステップと、次に
（ｃ）前記プレポリマーを前記第２の架橋基と、前記ハイドロゲルの硬さを増大させ、前記３次元の器官構築物を（例えば、ハイドロゲルを加熱したり、ハイドロゲル組成物を光（例えば、環境光、紫外線）で照射したり、ハイドロゲルのｐＨを変化させたりするなどにより）形成させるのに十分な量で架橋させるステップ
を一般に含む。
【００２５】
堆積ステップは、Ｈ．−Ｗ．Ｋａｎｇ、Ｓ．Ｊ．Ｌｅｅ、Ａ．Ａｔａｌａ、およびＪ．Ｊ．Ｙｏｏ、米国特許出願公開第２０１２／００８９２３８号（２０１２年４月１２日）において記載されるものを含むが、これらに限定されない、任意の適当な装置で行ってもよい。いくつかの実施形態において、堆積ステップは、パターン化された堆積ステップであり、すなわち、堆積は、堆積された組成物が、規則的または不規則的な格子、格子状、らせんなどのような、規則的または不規則的なパターンの形態で堆積するように行われる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、架橋ステップは、室温および大気圧において、前記ハイドロゲルの硬さを、１もしくは５キロパスカルから、１０、２０もしくは５０キロパスカルまで、またはそれ以上、増大させる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ハイドロゲルは、前記架橋ステップ（ｃ）後、室温および大気圧において、１もしくは５キロパスカルから、１０、２０もしくは５０キロパスカルまでの硬さを有する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、この方法は、支持ポリマー（例えば、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリ（グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリスチレン、ポリエチレングリコールなど、およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）のようなこれらのコポリマー）を前記基体上の前記ハイドロゲル組成物と隣接する位置に堆積させるステップをさらに含む（例えば、前記ハイドロゲルを堆積させるステップと同時に、その後に、またはそれと交互に反復して、およびいくつかの実施形態において、架橋ステップの前に）。
【００２９】
有機および無機基体を含み、ウェル、チャンバーもしくはチャンネルのような特徴部がその上に形成されている、または形成されていない基体を含む、任意の適当な基体を、堆積のため使用することができる。以下で記載される特定の製品について、基質は、少なくとも１つのチャンバー（場合によるが、好ましくは、流入チャンネル、および／または流出チャンネルと連結するチャンバー）を有するマイクロ流体デバイスを含んでもよく、堆積は、少なくとも１つのチャンバーにおいて行われる。あるいは、基質は、第１の平面部材（例えば、顕微鏡カバーガラス）を含んでもよく、堆積ステップは、その平面部材で行われてもよく、方法は、その平面部材をマイクロ流体デバイスのチャンバーに挿入するステップをさらに含んでもよい。チャンバーの密封、および細胞の生存率の維持のような、処理後ステップは、公知の技術に従い行われてもよい。
【００３０】
Ｃ．製品
異なる各種製品を、上記の方法および組成物で製造し得る。非限定的だが、好ましい例において、製品は、動物組織機能（肝機能のような）をインビトロでモデル化するのに有用なデバイスであってもよい。かかるデバイスは、（ａ）そこに形成された少なくとも１つのチャンバーを有するマイクロ流体デバイスのようなデバイス主要部、（ｂ）第１のパターンにおける前記チャンバーにおいて堆積されたハイドロゲル組成物、（ｃ）前記ハイドロゲル組成物中の動物組織生細胞、および（ｄ）前記ハイドロゲルに隣接する前記チャンバーにおいて堆積された構造支持体ポリマーを含んでもよい。上で示した通り、かかるデバイスのための細胞は、肝臓細胞（例えば、肝細胞）、膵細胞、骨格筋細胞、心筋細胞などのような動物組織細胞を含んでもよい。
【００３１】
デバイス主要部またはマイクロ流体デバイス自体は、任意の適当な材料、または材料の組合せから形成し得る。例は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリアクリルアミド、官能基化されたＰＥＧ（例えば、ＰＥＧジアクリレート、ＰＥＧジアクリルアミド、ＰＥＧジメタクリレートなど、またはマルチアーム形態の任意の前述のＰＥＧなど）を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、架橋もしくは硬化することができる天然のポリマーまたはタンパク質（例えば、架橋を支持するための化学基で官能基化されるその誘導体を含む、ヒアルロン酸、ゼラチン、硫酸コンドロイチン、アルギン酸塩など）、架橋した形態の上で記載された「架橋性プレポリマー」のいずれか、ならびにその組合せを含むものを含むが、これらに限定されない。デバイス主要部は、成型、キャスティング、付加製造（３ｄプリント）、リソグラフィーなどを含み、その組合せも含めた任意の適当なプロセスにより形成し得る。
【００３２】
上の「方法」セクションで述べた通り、構造支持体がデバイスに含まれる場合、ハイドロゲルのようなその構造支持体は、パターン化（例えば、規則的または不規則的な格子、格子状、らせんなどの規則的または不規則的なパターン）してもよい。
【００３３】
いくつかの実施形態において、組織細胞は、スフェロイド（例えば、ポリマースフェロイド）に含有され、このスフェロイドは前記ハイドロゲル中に含有される。
【００３４】
上で述べられた通り、ハイドロゲルは、デバイスに存在するハイドロゲルが、室温および（例えば、好ましくは、細胞がインビボで見出される自然な組織に対応する）大気圧において、１または５キロパスカルから、１０、２０または５０キロパスカルまでの硬さを有するように、好ましくは、堆積後に架橋される。
【００３５】
デバイスは、カートリッジとして供給されてもよいし、以下でさらに考察するようなポンプ、検出器などを含むより大きな装置において「スナップイン」式の取り付けに適当なように構成された、部分的組合せ単位または「ビルディングブロック」として供給されてもよい。
【００３６】
Ｄ．包装、保存、および輸送
一旦製造した後、上記の部分的組合せまたは「カートリッジ」のデバイスは、直ちに使用してもよく、または保存および／もしくは輸送に備えてもよい。
【００３７】
製品を保存し、輸送するために、水と混合されたゼラチンのような、室温（例えば、２５℃）において流動性を有する液体であるが冷蔵温度（例えば、４℃）においてゲルまたは凝結である、一過性の保護支持媒体が、デバイスに加えられて、チャンバー、好ましくは、任意の付随する導管も実質的にまたは完全に満たされる。任意の流入および流出ポートは、適当なキャッピング要素（例えば、プラグ）、またはキャッピング材料（例えば、ワックス）で蓋をされる。次に、デバイスは、冷却要素（例えば、氷、ドライアイス、熱電冷却デバイスなど）と一緒に梱包され、全てが（好ましくは、断熱された）パッケージ内に置かれる。
【００３８】
あるいは、製品を保存し、輸送するための、冷却温度（例えば、４℃）において流動性を有する液体であるが室温（例えば、２０℃）のような温められた温度もしくは体温（例えば、３７℃）においてゲルまたは凝結である、一過性の保護支持媒体、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、およびポリ（エチレングリコール）ブロックコポリマー。
【００３９】
受領の際、エンドユーザーは、付随するパッケージおよび冷却要素からデバイスを単に取り出し、温度を上昇または降下させ（一過性の保護支持媒体の選択に依存する）、任意のポートを外し、一過性の保護支持媒体をシリンジを用いて（例えば、成長培地で流すことにより）取り除く。
【００４０】
本発明は、次の非限定的な実施例において、より詳細に説明される。
【実施例】
【００４１】
［材料および方法］
材料。塩酸（ＨＣｌ）は、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）由来であった。ペプシン（ブタ胃粘液）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）由来であった。ＥＳＩ−ＢＩＯ（Ａｌａｍｅｄａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）のＨｙＳｔｅｍ−ＨＰハイドロゲルキット由来のＨｅｐｒａｓｉｌ（ｅｓｔ．分子量１６０ｋＤａ）、Ｇｅｌｉｎ−Ｓ、およびＥｘｔｒａｌｉｎｋ（ＰＥＧＤＡ、分子量３．４ｋＤａ）を使用した。ＰＥＧ４−アームアクリレート（分子量１０および２０ｋＤａ）、ＰＥＧ４−アームアルキン（分子量１０ｋＤａ）、ならびにＰＥＧ８−アームアルキン（分子量１０ｋＤａ）は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧＷｏｒｋｓ（Ｗｉｎｓｔｏｎ−Ｓａｌｅｍ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡ）由来であった。
【００４２】
組織特異的細胞外基質（ＥＣＭ）消化物の調製。肝臓について前に記載された（Ａ．Ｓｋａｒｄａｌ、Ｌ．Ｓｍｉｔｈ、Ｓ．Ｂｈａｒａｄｗａｊ、Ａ．Ａｔａｌａ、Ｓ．Ｓｏｋｅｒ、およびＹ．Ｚｈａｎｇ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、３３巻、４５６５頁（２０１２年））通り、組織特異的ＥＣＭ消化物溶液を調製した。新鮮な肝臓、心臓、または骨格筋組織を、冷却ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄した。組織を１０ｃｍに０．５〜１．０ｃｍの細片で切り出し、手術用メスで細かく切り刻んだ。細かく切り刻んだ組織を、蒸留水５００ｍｌに移し、ロータリーシェーカー上、２００ｒｐｍにおいて、３日間、４℃で振盪し、その間、１日毎に３回水を交換した。組織を、２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で４日間、続いて、０．１％ＮＨ４ＯＨを含む２％ＴＸ−１００で２４時間処理した。ＴＸ−１００洗浄中、溶液を１日２回交換した。脱細胞化した組織を、さらに２日間蒸留水において洗浄して、ＴＸ−１００のあらゆる痕跡を取り除き、その後、さらなる使用まで、それらを４℃において保存した。
【００４３】
脱細胞化した組織ＥＣＭを凍結し、４８時間凍結乾燥させた。凍結乾燥後、試料を、フリーザーミルで粉末に粉砕した。肝臓組織または肝臓ＥＣＭ粉末１グラムを、ペプシン（ブタ胃粘液、タンパク質３４００単位、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ、ＮＪ）１００ｍｇと混合し、ガンマー照射（１ミリラド）により滅菌した。滅菌後の全ての続く手法を、滅菌条件下で行った。塩酸（０．１Ｎ、１００ｍＬ）を、滅菌した材料に加え、室温で４８時間インキュベーションした。生じた混合物を、５０ｍｌのコニカルチューブに移し、３０００ｒｐｍにおいて１５分間遠心分離した。上清を取り出し、ペレットを捨てた。上清が透明となるまで、これを３回繰り返した。もはや残存する粒子状物質が存在しないことを確実にするために、懸濁液を、０．４５ｍｍのシリンジフィルター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通して濾過した。さらなる使用まで、生じた脱細胞化したＥＣＭ溶液を８０℃において保存した。
【００４４】
ハイドロゲルバイオインク製剤および調製。ハイドロゲル製剤化の前に、光重合開始剤、Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９（４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル−（２−プロピル）ケトン、Ｓｉｇｍａ）を水に０．０５％ｗ／ｖにて溶解した。ハイドロゲルバイオインクを形成させるために、まず、ＨｙＳｔｅｍ−ＨＰハイドロゲルキット（ＥＳＩ−ＢＩＯ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）のベースライン材料成分を、水−光重合開始剤溶液に溶解した。簡単に言うと、Ｈｅｐｒａｓｉｌ、およびＧｅｌｉｎ−Ｓを、水−光重合開始剤溶液に溶解して、２％ｗ／ｖ溶液を製造した。Ｅｘｔｒａｌｉｎｋ、架橋剤を、水−光重合開始剤溶液に溶解して、４％および８％ｗ／ｖ溶液を製造した。加えて、マルチアームＰＥＧ系架橋剤、ＰＥＧ４−アームアクリレート（分子量１０ｋＤａまたは２０ｋＤａ、４％および８％ｗ／ｖ）、ＰＥＧ４−アームアルキン（分子量１０ｋＤａ、４％ｗ／ｖ）、およびＰＥＧ８−アームアルキン（分子量１０ｋＤａ、８％、１０％、１６％、および２０％ｗ／ｖ）を別々に調製した。
【００４５】
全ての材料の溶解後、ハイドロゲルを、２つの一般的なスキームにより製剤化した。第１において、２％Ｈｅｐｒａｓｉｌを４部、２％Ｇｅｌｉｎ−Ｓを４部、架橋剤１を１部、架橋剤２を１部を、組織ＥＣＭ溶液（または一般的な非組織特異的ハイドロゲルとして水）１０部と合わせる。使用前に、生じた混合物をボルテックスして、混合する。押出またはバイオプリント試験のため、混合物をシリンジまたはプリンターカートリッジに移し、３０分間自発的に架橋させる（段階１の架橋）。レオロジー測定のため、混合物を、３５ｍｍのペトリディッシュに移し、架橋させる。第２の製剤化アプローチにおいて、Ｈｅｐｒａｓｉｌ、Ｇｅｌｉｎ−Ｓ、および架橋剤溶液は、増大したポリマー濃度を達成するために、組織ＥＣＭ溶液または水でさらに希釈しない。代わりに、光重合開始剤を、組織ＥＣＭ溶液に０．０５％ｗ／ｖにて溶解し、続いて、それを使用して、Ｈｅｐｒａｓｉｌ、Ｇｅｌｉｎ−Ｓ、および様々な架橋剤を溶解する。次に、これらの成分を、同じ４：４：１：１体積比で合わせる。材料を、シリンジ、プリンターカートリッジ、またはペトリディッシュに移し、実行について上で記載した通り、自発的に架橋（段階１の架橋）させた。第２の架橋（段階２）のため、段階１−架橋ゲルを、紫外線光（３６５ｎｍ、１８ｗ／ｃｍ２）で照射して、チオール−アルキン重合反応を開始させる。
【００４６】
プリンター適合性試験。押出方式バイオプリントを、標準的なシリンジ、および小さなゲージのニードルチップ（２０〜３０ゲージ）を使用した単純な押出し試験で実験室ベンチにおいてまず試験した。次に、バイオインク調製物を、プリンターカートリッジに装填し、自発の段階１架橋を受け、バイオプリントの押出し適合性を、組織構築物プリントに特異的に家庭において設計されたカスタム３Ｄバイオプリントデバイスを使用して評価した（例えば、Ｈ．Ｋａｎｇ、Ｓ．Ｌｅｅ、Ａ．Ａｔａｌａ、およびＪ．Ｙｏｏ、米国特許出願公開第２０１２／００８９２３８号（２０１２年４月１２日））。７×７ｍｍのパターンを、試験目的のため実行した。剪断減粘性および押出し特性を改善するために、無修飾ＨＡならびにゼラチンを、バイオインク（１．５ｍｇ／ｍＬ、および３０ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）に補った。不規則な凝集に対して滑らかに押し出されるバイオインクの傾向を観察した。
【００４７】
レオロジーによるバイオインクの機械的特性の決定。バイオインクの機械的特性の決定のため、ハイドロゲルを上で記載した通り調製し、段階１の自発架橋を受けたハイドロゲルをピペットにより３５ｍｍのペトリディッシュに取った。レオロジー試験を、ＨＲ−２  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  レオメータ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ、ＤＥ）を使用して行った。ハイドロゲルの表面と接触するまで、１２ｍｍの鋼ディスクを下げた。機器上の軸力、またはハイドロゲル由来のディスク上で作用する通常の力が０．４Ｎと等しくなるまで、ディスクをさらに下げた。このポイントにおいて、レオメータにより適用した周波数１Ｈｚにおいて、０．６〜１０Ｐａの範囲にある剪断応力スイープ試験を使用してそれぞれのハイドロゲルについて、Ｇ’を測定した。
【００４８】
第２の段階の架橋の完了後の硬さの決定のため、同一の未試験のハイドロゲルを、ＵＶ光重合作用によりさらに架橋させた後、記載した通りＧ’測定を行った。
【００４９】
バイオインクの生物学的検証のための肝臓オルガノイドのバイオプリント。初代肝細胞系スフェロイドを、懸滴法により形成させた。スフェロイドを回収し、肝臓ＥＣＭ材料を含有する、肝臓特異的バイオインク製剤中に懸濁し、バイオプリントと適合するシリンジ内に引き込み、バイオインクを、チオール−アクリレート結合を介して自発的に架橋させた。３０分後、スフェロイド含有バイオインクを、プラスチッックカバーガラス上のポリカプロラクトン支持体パターン内にバイオプリントした。バイオインク堆積後、紫外線を使用して、第２の架橋ステップを開始させ、バイオインクをさらに安定化させ、バイオインクの硬さを、自然な肝臓に類似の値まで上昇させ、これにより、より大きな肝臓オルガノイドを構成する。対照として、バイオプリンターおいて前に使用されたゼラチン系ハイドロゲルを使用して、スフェロイドを並行してバイオプリントした。プリント後、生死染色を使用して、オルガノイドの生存率を評価し、その後、オルガノイドをパラホルムアルデヒドにおいて固定し、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＬＳＩ巨大共焦点顕微鏡で画像化して、生細胞（緑色蛍光）および死細胞（赤色蛍光）の相対量を決定した。
【００５０】
肝臓オルガノイドおよび毒性侵襲の機能的分析。上で記載した通り、オルガノイドを調製した。９つのオルガノイドを、１４日間の培養時間コースの間マイクロリアクターに置き、その間、培地一定分量を採取し、機能分析のため確保した。マイクロリアクターは、オルガノイド配置のためのチャンバーを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）デバイス、およびこれを介して、マイクロ蠕動ポンプを使用して細胞培養培地を貯留容器から循環することができるチャンネルからなる。ベースラインの機能的測定基準のため３日および６日目に培地一定分量を採取した後、３つのオルガノイドは、通常の培地での培養を継続され；３つのオルガノイドは、１ｍＭのアセトアミノフェンを含有する培地を投与され；３つのオルガノイドは、１０ｍＭのアセトアミノフェンを培地中に投与された。培地一定分量を、１０および１４日目に収集し、その後、尿素およびアルブミン分泌を定量し、生存率を生死イメージングにより評価した。
【００５１】
Ｎ−アセチル−Ｌ−システインでの毒性侵襲および臨床関連の治療介入。上で記載した通り、オルガノイドを再度調製し、マイクロリアクターデバイス中に置き、１４日間培養した。ベースラインの機能的測定基準のため３日および６日目に培地一定分量を採取した後、１つの群のオルガノイドは、通常の培地での培養を継続し、別の群のオルガノイドには、１０ｍＭのアセトアミノフェンを含有する培地を投与し、第３の群のオルガノイドには、１０ｍＭのアセトアミノフェンおよび２０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）を培地中に投与した。培地一定分量を、１０および１４日目に収集し、その後、尿素およびアルブミンの分泌を定量した。
【００５２】
結果：特徴決定。
ＥＣＭ成分分析。肝臓ＥＣＭ溶液を、一連の比色分析アッセイ（Ａ．Ｓｋａｒｄａｌら、上記）により前もって分析した。２つの製剤：１）ＬＥＥ（上で記載した通り調製した脱細胞化した肝臓）、およびＬＴＥ（脱細胞化されないことを除き、同様に調製した新鮮な肝臓組織）を分析した。結果は、明確な傾向を示し、ここで、ＬＥＥ溶液は、より高濃度のコラーゲン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、およびエラスチンを含有していた（図１Ａ）。具体的には、ＬＥＥの総コラーゲン含有量、９１．３３ｍｇ／ｍＬは、４．１７ｍｇ／ｍＬであるＬＴＥのものより有意に多く（ｐ＜０．００１）、ＬＥＥのエラスチン含有量（１８９．３３ｍｇ／ｍＬ）は、３６．００ｍｇ／ｍＬであるＬＴＥのものより有意に多く（ｐ＜０．０５）、ＬＥＥのＧＡＧ含有量（８６．００ｍｇ／ｍＬ）は、４０．６７ｍｇ／ｍＬであるＬＴＥのものより多いが、有意ではなかった（ｐ＞０．０５）。
【００５３】
心臓および骨格筋ＥＣＭ溶液（共に、脱細胞化した調製物）を、同じ方法で評価した。
【００５４】
成長因子分析。肝臓ＥＣＭ溶液を、Ｑｕａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｒｒａｙにより前もって分析した結果、ＬＥＥが、一般的に、より高濃度の成長因子およびサイトカイン（ｐｇ／ｍＬで示す、図１Ｂ）を含有することを明らかにした。特に興味深いのは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ｂＦＧＦ、骨形成タンパク質５（ＢＭＰ−５）、ＦＧＦ−４、インスリン様成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ−２）、およびＴＧＦ−ｂ１が、ＬＥＥとＬＴＥの両方で比較的保存されていたことであった。しかしながら、ＬＥＥは、ＢＭＰ−７、ＥＧＦ、ＦＧＦ−７、成長ホルモン（ＧＨ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ＨＧＦ、およびニューロトロフィン３（ＮＴ−３）も含有し、それらは、ＬＴＥにおいて観察されないか、または無視できる程度であった。他方、ＢＭＰ−４、およびグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は、ＬＴＥに存在したがＬＥＥに存在しなかった（Ａ  Ｓｋａｒｄａｌら、上記）。心臓および骨格筋ＥＣＭ溶液（共に、脱細胞化した調製物）を同じ方法で評価した。
【００５５】
ハイドロゲルバイオインクの調製および押出しバイオプリント試験。ハイドロゲルバイオインクの段階１ならびに段階２の架橋の戦略および実行を、図２ＡおよびＢにおいて記載する。７×７ｍｍのパターンを、試験目的のため実行した（図３Ａ）。最初の試験は、最初の製剤が押出し可能であるが、不規則に見え、押出し中およびその後に凝集することを示した（図３Ｂ）。剪断減粘性および押出し特性を改善するために、無修飾ＨＡならびにゼラチンを、バイオインクに補った（１．５ｍｇ／ｍＬ、および３０ｍｇ／ｍＬ）。改善した滑らかなプリントした構造を、図３Ｃに示す。
【００５６】
レオロジー試験。前記方法において記載した通り、異なる製剤のハイドロゲルを、それらの機械的特性のレオロジー評価のため調製した。図４Ａは、ゲルにおける剪断弾性率（Ｇ’）の増大を示し、ＰＥＧＤＡでの自発架橋後、１１３．６６ＰａのＧ’を有した。これは、ハイドロゲルをバイオインクとして押し出すことができる間の段階である。４−アームＰＥＧアルキン架橋剤でのＵＶ架橋後、Ｇ’値は、１９８１．７９Ｐａまで増大する。図４Ｂは、第２のアルキン依拠架橋ステップを介して達成することができる、身体の多くの組織タイプの模倣を可能にするＧ’値の範囲を示す。表１は、このシステム、製剤、および関連する組織タイプの範囲内のハイドロゲルの硬さの範囲を示す。
【００５７】
【表１】
0006751392.tif 000002
【００５８】
表１．Ａ）肝臓、心臓、および骨格筋特異的ハイドロゲルバイオインクを生成するための製剤。Ｂ）さらなる組織タイプの対象のための製剤。
【００５９】
結果：検証。
バイオプリント法バイオファブリケーション環境における初代オルガノイド生存率のバイオインクによる維持。図５に描写した通り、バイオファブリケーションしたオルガノイドを設計した。ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）およびハイドロゲルの両方をプリントする統合プリントアプローチを使用して、ＰＣＬチャンネル構造をプリントし、その内部に肝臓細胞を有するバイオインクをプリントした。チャンネル構造は、灌流下だけでなく、ハイドロゲルおよび細胞の高さ−幅の縦横比を増大させた場合にも、ハイドロゲルに安定性をもたらす。これらの構造を、マイクロ流体マイクロリアクターチャンバー内部に合うようカスタマイズしたプラスチックカバーガラス上にプリントした。これらの正方形のカバーガラスは、マイクロリアクター内のオルガノイドチャンバーへの流入および流出を供給するマイクロチャンネルの閉塞を予防するために、隅にある２つのさらなる切り欠きを特徴とする。
【００６０】
全体の構築物内の大抵の球状オルガノイドは、プリントプロセス中は球状のままであり、培養中はそれらの本来の形を維持した。ＰＣＬチャンネルのないより早いバッチにおいて、いくつかのオルガノイドは、プリントプロセス中、形状を損ない、圧縮され、または破裂さえすることを観察した。これは、バイオファブリケーション技術における実質的な改善を示す。球状オルガノイド分布および量の均一性が改善した。このバッチにおいて、マイクロリアクター培養に移動したそれぞれのオルガノイド構築物（ｎ＝９）は、４０〜４５個の球状オルガノイドを含有していた。過去のバッチにおいて、この数は、１０〜３０の間で変動した。
【００６１】
複数のバッチのオルガノイドをバイオファブリケーションし、これにより、バイオファブリケーション条件の最適化を可能にした。バイオインク中、およびバイオプリントチャンバーにおいて３７℃近くにとどまるよう、温度を調整した。バイオファブリケーション調製および方法論をより短い時間で行った。肝細胞培養培地をバイオインクに加えて、プリント中に栄養分を細胞にもたらした。生死イメージングは、バイオインク中の押出しバイオファブリケーション後に、オルガノイドの複数の反復の増大した生存率を示す（図６）。ゼラチン対照を、比較としてバッチ４と並行して使用した。単純なゼラチンゲルを、押出しバイオファブリケーションのため一般的に使用する。
【００６２】
肝臓バイオインクを使用してインビトロの初代細胞機能を支持する能力：ベースラインの分泌活性および毒性侵襲。肝臓オルガノイドを、上で記載した通り調製し、バイオファブリケーションし、マイクロ流体マイクロリアクターに置き、１４日間培養した。６日目において、オルガノイドは、通常の培地、または２種の濃度のＡＰＡＰの１つを受け取った。
【００６３】
ヒトアルブミンＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）によるアルブミン分析（図７）は、６日間を通じてバイオプリントした肝臓オルガノイドによる一定のアルブミン産生を明らかにし、これは、平均１２０ｎｇ／ｍＬ近くのままであった。これらの２つのベースラインの時点の間、本発明者らは、大部分を分泌する０ｍＭオルガノイド、続いて１ｍＭオルガノイド群、次に、１０ｍＭ群を伴った、分泌の大小における傾向を観察したことは注意されるべきである。ベースラインのアルブミン産生におけるこの低減は、オルガノイドをプリントした時間に起因すると考えられる。群１におけるオルガノイドを第１にプリントし、それ故、わずかに改善した生存率を有し、それは、改善したアルブミン分泌と解釈する。この傾向に関わらず、これらの２つの時点におけるアルブミンレベルは、互いの比較において統計的に有意でなかった。しかし、将来研究において、オルガノイドは、実験的処置群に無作為に割り当てられるだろう。６日後のＡＰＡＰ投与後、アルブミンレベルを、０ｍＭ対照と比較して、１ｍＭおよび１０ｍＭ群の両方において有意に低減した（ｐ＜０．０５）。加えて、１０ｍＭ群のアルブミンレベルは、１ｍＭ群と比較して有意に低減した（ｐ＜０．０１）。事実、１４日目において、１０ｍＭ群におけるアルブミンレベルは、ほぼ計れなかった。
【００６４】
ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ尿素比色分析アッセイキット（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）による尿素分析（図７）は、アルブミン分析ほど極端でない結果を示したが、その結果は、予想した傾向で依然統計的に有意であった。尿素レベルは、ＡＰＡＰ投与前の時点の間、３群間で有意に異ならなかった。ＡＰＡＰ投与後、測定した尿素レベルは、ＡＰＡＰ濃度と関連した用量依存性の方法で降下するように見えた。１０日目時点において、０ｍＭ対照群アルブミンレベルは、１ｍＭおよび１０ｍＭ群の両方より有意に高かった（ｐ＜０．０５）。１４日目時点において、全３群は、互いに有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。
【００６５】
０ｍＭ、１ｍＭ、および１０ｍＭのＡＰＡＰにより処理したオルガノイドの生存率は、生死染色、および、前に記載した巨大共焦点顕微鏡を使用した画像化により評価した（図８）。生細胞対死細胞の比に基づくと、０ｍＭ対照群が、１４日間の実験を通じて、比較的高いレベルの生存率（１４日目において７０〜９０％）を維持したことが明らかであった。比較において、１ｍＭ群の生存率が減少した（１４日目において３０〜５０％）一方で、０ｍＭ群には、１４日目において生細胞がほとんどないように見えた。
【００６６】
ＡＰＡＰ毒性試験、およびＮ−アセチル−Ｌ−システイン治療介入。前に記載した通り、肝臓オルガノイドを、従前の報告において記載された通り調製し、バイオプリントする。これらのオルガノイドを使用して、３日目および６日目に取っておいた培地一定分量によりベースラインの機能的測定基準を設定した。次に、オルガノイドは、アセトアミノフェン（１０ｍＭ）による毒性侵襲を受けるが、いくつかの群に、臨床的に関連する抵抗手段としてＮ−アセチル−Ｌ−システイン（２０ｍＭ）も投与する。３、６、１０、および１４日目において機能的分析のため、培地一定分量を取りおいた。
【００６７】
ヒトアルブミンＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）によるアルブミン分析（図９）は、６日間を通じてバイオプリントした肝臓オルガノイドによる一定のアルブミン産生を明らかにし、それは、平均１２０ｎｇ／ｍＬ近くのままであり、６月の報告において前に報告した実験と一致した。ＡＰＡＰのみの投与後、本発明者らは、検出したアルブミンにおける低減を観察した。この低減は、１０日目および１５日目において未処理の対照オルガノイドと比較して統計的に有意であった（ｐ＜０．５）。ＡＰＡＰとＮＡＣの同時投与は、検出したアルブミン産生の若干の低減を示し、それは、１４日目までに９８ｎｇ／ｍＬまで低減し、しかしながら、この値は、対照オルガノイドとも、ＡＰＡＰのみのオルガノイドとも有意に異なっていなかった。データの一般的な傾向は適当であり、これは、臨床における患者がそうであり得るように、肝臓オルガノイドが、ＡＰＡＰに正しく応答し、ＮＡＣにより奪回され得ることを示唆している。
【００６８】
ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ尿素比色分析アッセイキット（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）による尿素分析（図９）は、有望な傾向を伴った結果も示した。ＡＰＡＰ投与後、検出した尿素は、予想通り低減した。対照オルガノイドおよびＡＰＡＰ＋ＮＡＣオルガノイドにおいて、検出した尿素産生は経時的に増大した。ＡＰＡＰ尿素産生における降下にかかわらず、３日目および６日目、または１０日目の群間で（予想されるような）統計的有意は存在しなかった。しかしながら、１４日目において、対照オルガノイドおよびＡＰＡＰ＋ＮＡＣオルガノイドの両方が、検出した尿素レベルを増大した（ｐ＜０．０５）。アルブミンデータと同様に、これらの傾向は、適当であり、予想される。
【００６９】
前述のものは、本発明の説明であり、その制限とみなされるべきではない。本発明は、
そこに含まれるべき請求項の均等物と共に、以下の請求項により定義される。
【図１】
0006751392.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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