(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0006793040.tif 000087
（式中、
Ｘ２＝ＯまたはＳ；
Ｘ１が酸素であり、かつＳＥがエステラーゼ、グリコシダーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、もしくはグルクロニダーゼの基質であるか、あるいは、
Ｘ１がＮＨを表し、かつＳＥがプロテアーゼまたはトランスフェラーゼの基質であり；
Ａが、水溶液中でのＣ（Ｘ２）−Ｏ結合の開裂後、発色団または蛍光団の形成を可能にする芳香族基であり、
前記発色団は、パラニトロフェノールおよびその誘導体、インジゴイド、シクロヘキセノエスクレチン、アリザリンならびにヒドロキシフラボンから選択され、
前記蛍光団を形成する−ＯＡ基は
【化２】
0006793040.tif 000088
【化３】
0006793040.tif 000089
から選択され； 
Ｒが、水素原子または−（Ｌ）ｎ−ＧＰを表し、ｎは０または１に等しく；
Ｌが、リンカーアームであり；
ＧＰが、第一級、第二級および第三級のアミン、アミジン、グアニジン、テトラゾールから選択される官能基Ｆ１；カルボキシレート、スルホネートまたはホスフェート型のアニオン性官能基Ｆ２；前記の官能基Ｆ１および／またはＦ２の１つまたは複数を含む基；ポリエチレングリコール；糖または多糖；またはペプチド基である）
のプローブ。
【請求項２】
ＳＥが、そのアノマー炭素を介して分子の残部に結合しているグリコシル基、および末端炭素または側鎖に保有されるアシル官能基を介して分子の残部に結合しているペプチジル基から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
ＳＥが、グリコシダーゼの基質であり、かつそのアノマー炭素を介して分子の残部に結合しているグリコシル基に相当することを特徴とする、請求項１または２に記載のプローブ。
【請求項４】
ＳＥが、ガラクトシダーゼの基質であり；かつそのアノマー炭素を介して分子の残部に結合しているグリコシル化基に相当することを特徴とする、請求項１または２に記載のプローブ。
【請求項５】
ＳＥが、
プロテアーゼまたはペプチダーゼの基質であるか；
あるいは、トランスフェラーゼの基質である；
ことを特徴とする、請求項１または２に記載のプローブ。
【請求項６】
Ｒが、−（Ｌ）ｎ−ＧＰを表し、ｎ＝１であり、かつＬが、（Ｌ１）ｍ１−（Ｌ２）ｍ２−（Ｌ’１）ｍ’１−アーム（ピペラジン→ＧＰ基の方向に定義される）であり：
式中、
Ｌ１およびＬ’１が、同一でも異なってもよく、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１〜６）アルキル−、−Ｎ（フェニル）−、−Ｎ（アリール）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、および−ＣＯＮＨ−から選択され；
Ｌ２が、以下の２価の基：（Ｃ１〜２０）アルキレン、（Ｃ１〜２０）アルケニレン、（Ｃ１〜２０）アルキニレン、（Ｃ６〜２４）アリーレン、（Ｃ７〜４４）アルキルアリーレン、（Ｃ７〜４４）アルケニルアリーレン、（Ｃ７〜４４）アルキニルアリーレン、（Ｃ７〜４４）アルキルシクロアルキレン、（Ｃ７〜４４）アルケニルシクロアルキレン、（Ｃ７〜４４）アルキニルシクロアルキレン、（Ｃ７〜４４）アルキルヘテロシクロアルキレン、（Ｃ７〜４４）アルケニルヘテロシクロアルキレン、（Ｃ７〜４４）アルキニルヘテロシクロアルキレンから選択され；前記の基は、トリアゾール基により中断されるかまたはトリアゾール基内で終結してもよく、非置換であるかまたは（Ｃ１〜１０）アルコキシ、（Ｃ１〜１０）アルキル、（Ｃ６〜１０）アリール、アミド、イミド、ホスフィド、ニトリド、（Ｃ１〜１０）アルケニル、（Ｃ１〜１０）アルキニルおよび−ＯＨから選択される１つもしくは複数の置換基で置換されていてもよく；
ｍ１、ｍ’１およびｍ２が、同一でも異なってもよく、０または１に等しく；
ＧＰが、請求項１に定義された通りである
ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項７】
Ｌが、−（Ｌ１）ｍ１−（Ｌ２）ｍ２−（Ｌ’１）ｍ’１を表し、Ｌ１＝−Ｃ（Ｏ）−であり、ｍ１＝ｍ２＝１であり、ｍ’１＝１または０であり、Ｌ２およびＬ’１が請求項６に定義された通りであることを特徴とする、請求項６に記載のプローブ。
【請求項８】
Ｘ２が、酸素原子であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項９】
Ｘ２が酸素原子であり；
Ｘ１が酸素原子であり、かつ、ＳＥが、グリコシダーゼの基質もしくはグルクロニダーゼの基質であり、そのアノマー炭素を介して分子の残部に結合しているグリコシル基に相当するか、またはＳＥが、エステラーゼの基質であり、−Ｃ（Ｏ）Ｒｉ基に相当し、Ｒｉが、１〜２０個の炭素原子を含有するアルキル基、１〜２０個の炭素原子を含有するアルケニル基、ベンジル、アリール、もしくはヘテロアリール基を表すか、
あるいは、Ｘ１がＮＨを表し、かつＳＥが、プロテアーゼもしくはペプチダーゼの基質であり、末端炭素もしくは側鎖に保有されるアシル官能基を介して分子の残部に結合しているペプチジル基に相当し；
Ｒが、−Ｌ−ＧＰを表し：
Ｌが、−（Ｌ１）ｍ１−（Ｌ２）ｍ２−（Ｌ’１）ｍ’１を表し、Ｌ１＝−Ｃ（Ｏ）−であり、ｍ１＝ｍ２＝１であり、ｍ’１＝１または０であり、Ｌ２およびＬ’１が請求項６に定義された通りであり；
ＧＰが、請求項１に定義された通りである；
ことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１０】
４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート塩酸塩（化合物１２）：
【化４】
0006793040.tif 000090
４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル２−（（オクタノイルオキシ）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート塩酸塩（化合物２１）
【化５】
0006793040.tif 000091
４−（４−（（（４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル）オキシ）カルボニル）−３−（（オクタノイルオキシ）メチル）ピペラジン−１−イル）ブタン−１−スルホン酸（化合物２２）
【化６】
0006793040.tif 000092
４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル４−（３−（１−（２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）プロパノイル）−２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート（化合物３１）
【化７】
0006793040.tif 000093
４−ニトロフェニル４−（３−（１−（２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）プロパノイル）−２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート（化合物３６）
【化８】
0006793040.tif 000094
４−クロロ−２−（６−クロロ−４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）フェニル４−（３−（１−（２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）プロパノイル）−２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート（化合物３９）
【化９】
0006793040.tif 000095
から選択される、請求項１に記載のプローブ。
【請求項１１】
式：
【化１０】
0006793040.tif 000096
（式中、
Ａ、Ｘ１、Ｘ２、およびＳＥが、請求項１において（Ｉ）に関して定義した通りであり；
Ｌ１、Ｌ’１、Ｌ２、ｍ１、ｍ’１、およびｍ２が、請求項６において定義した通りであり；
Ｚが、Ｃ≡ＣＨ、Ｎ３、Ｎ−オキシスクシンイミドまたはマレイミド官能基を表し；
Ｒ’ｐが、アミン官能基に対する保護基を表す）
から選択される中間体。
【請求項１２】
その存在によりＳＥ−Ｘ１結合の開裂が起きる酵素を、ヒトもしくは動物においてインビボ検出するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１３】
その存在によりＳＥ−Ｘ１結合の開裂が起きる酵素の存在を検出するインビトロの方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプローブによる方法。
【請求項１４】
前記酵素を含有すると思われる試料と、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプローブとを接触させる工程と；
適切な条件を適用し、酵素の作用下で、Ｘ１とＳＥとの間の共有結合を開裂させ、それに続き、Ｃ（Ｘ２）と−ＯＡ基との間の結合を開裂させ、次に式（Ｉ）のプローブ内に存在するリンカーの環化を可能にする工程と；
遊離した発色団または蛍光団を定量的または定性的に分析する工程と
を連続して含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
生理学的条件下で実行することを特徴とする、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
蛍光団が遊離し、その分析は、以下の工程：
前記蛍光団を、その蛍光団の吸収波長の光を発生できる光源に暴露する工程と；
得られた蛍光を検出する工程と
を含むことを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
発色団が遊離し、その分析は、以下の工程：
前記発色団を、その発色団の吸収波長の光を発生できる光源に暴露する工程と；
色変化に相当する、発色団により吸収された光を検出する工程と
を含むことを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記遊離した蛍光団または発色団が、水溶液中で沈殿を形成することを特徴とする、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光団または発色団型の検出可能な実体を遊離するために、刺激、特に、酵素、化学物質またはプローブの環境の物理化学的特性の存在であり得る刺激に応答して自己切断する（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｅ）リンカーアームを組み込んだ、診断分野で使用される活性化可能な分子プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素活性を検出することは、生体試料または化学的試料の分析において極めて有用な場合がある。全生体、細胞もしくは細胞抽出物、生体液、または化学的混合物は、酵素活性が検出され得る生体試料または化学的試料の例である。さまざまな疾患の多くのバイオマーカーは酵素から成る。酵素はまた多数の細胞プロセスにも関与し、したがって、細胞生物学者による無数の研究の的となってきた。したがって、酵素の検出により、例えば特定の代謝状態または病的状態に関する情報を提供することができる。こうした理由から、酵素活性を検出可能なプローブは極めて有用であり、多くの研究の的となってきた。
【０００３】
特に、本特許出願の発明者らの１人の研究を挙げることができ、その研究はペプチダーゼ基質に関する出願ＷＯ２０１３／０４５８５４、およびグリコシダーゼ基質に関する出願ＷＯ２０１４／０２０２８５に対応し、その両方とも、対象とする酵素基質をアリール基に結合し、その基質の開裂に続いて、結果としてリンカーの環化および励起状態分子内プロトン移動（ＥＳＩＰＴ）蛍光団の放出をもたらす自己切断リンカーを使用する。
【０００４】
しかしながら、酵素活性に応答する分子プローブの水中における良好な溶解性が、分子プローブがもたらす結果が信頼できるものであることを保証する本質的な判断基準の１つである。特に、疎水性分子を溶解するために有機共溶媒を添加することは、一般に酵素活性を著しく低減させる。加えて、低濃度の溶液を使用することはインビトロ試験で許容されることがあるが、インビボでは溶液はいったん注入されるとかなり希釈されるため、細胞インキュベートへの移行または全身注入には、より高濃度の溶液を使用することが必要とされる。さらに、共溶媒はインビボでは使用できない。最後に、過度に疎水性の分子は、標的組織ではなく脂肪組織に蓄積する恐れがある。
【０００５】
したがって、化学者らは溶解性という問題に長らく興味を持ち、多くの解決策が開発されてきた。最初は、酵素基質として、塩類の特徴を有する基を組み込むことであった。例えば、ホスファターゼプローブ（Ｈａｕｇｌａｎｄら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２年、２０７、３２）またはカスパーゼ３プローブ（Ｌｉｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４、１７９７２）において見られるようなこの解決策は、良好に機能するが、無極性基質を認識する酵素は標的にできないため、標的となる酵素の選択を制限する。加えて、負電荷を有する分子は細胞膜を通過するのに困難を伴い、したがって細胞外酵素を標的とする用途は制限される。第二の解決策は、使用するシグナル体（ｓｉｇｎａｌｏｐｈｏｒｅ）に、水溶性基（ｈｙｄｒｏｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）、多くはスルホン酸基を結び付けることである（Ｔｕｎｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００６年、６２、５７８；Ｓｈａｂａｔら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１年、１３３、１０９６０）。繰り返しとなるが、これらの特色によりもたらされる水溶性化は優れているが、酵素活性に続き最初のプローブから一度放出されたシグナル体の性能を低減する恐れがあるため、この方策は興味が持たれるものではない。加えて、この型の解決策は、固体のシグナル体が使用される場合、単に考えられない。したがって、これら２つの可能性を、酵素活性に応答する多くの分子プローブに普及させることはできない。
【０００６】
現時点で、光学活性分子を放出する目的で、水溶性種と酵素基質とを結び付けて広範な用途を提供できるシステムはわずかしか存在しない。これらは一般に置換された脱離リンカー（Ｓｈａｂａｔら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８年、１３０、５４３４）か、または環化リンカーと脱離リンカーの組み合わせ（Ｓｈａｂａｔら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００７年、１５、７３１８）に基づいている。問題は、置換された脱離リンカーは高毒性の反応中間体を生成することが知られている点である（Ｒｏｋｉｔａ、Ｑｕｉｎｏｎｅ  Ｍｅｔｈｉｄｅｓ、第１版、２００９年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｔｏｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９５年、８、３２３；Ｔｈａｔｃｈｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９７年、６２、１８２０）。その上、環化／脱離の組み合わせは、満足するには程遠い切断動態（Ｗｕら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１２年、２０、３４６５）、または自発的な加水分解に直面した際の無視できない不安定性（Ｒｏｍｉｅｕら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００８年、１０、１５１７）を示しつつ、多大な複雑性（２つのリンカーを順次使用しなければならない）をもたらすため、理想とは程遠い。ある構成物質は、活性分子を送達するのに数十時間超かかり（Ｓｈａｂａｔら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００６年、１７、１４３２）、そのため所与の試料内の特定の分析物の有無を迅速に検出するために使用することが困難となる。
【０００７】
したがって、用途が広く溶解性の必要条件を満足する手法で、任意の酵素基質を、その基質が極性であるか無極性であるかに関係なく組み込むために使用することができる新世代の環化リンカーを開発することが望ましい。しかしながら、このリンカーは、迅速な切断動態（ｉｍｍｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を保持しなければならず、かつ効率的な酵素認識を可能にしなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０４５８５４号
【特許文献２】国際公開第２０１４／０２０２８５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈａｕｇｌａｎｄら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２年、２０７、３２
【非特許文献２】Ｌｉｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４、１７９７２
【非特許文献３】Ｔｕｎｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００６年、６２、５７８
【非特許文献４】Ｓｈａｂａｔら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１年、１３３、１０９６０
【非特許文献５】Ｓｈａｂａｔら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８年、１３０、５４３４
【非特許文献６】Ｓｈａｂａｔら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００７年、１５、７３１８
【非特許文献７】Ｒｏｋｉｔａ、Ｑｕｉｎｏｎｅ  Ｍｅｔｈｉｄｅｓ、第１版、２００９年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．
【非特許文献８】Ｂｏｌｔｏｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９５年、８、３２３
【非特許文献９】Ｔｈａｔｃｈｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９７年、６２、１８２０
【非特許文献１０】Ｗｕら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１２年、２０、３４６５
【非特許文献１１】Ｒｏｍｉｅｕら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００８年、１０、１５１７
【非特許文献１２】Ｓｈａｂａｔら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００６年、１７、１４３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明において、本発明者らは、水中での満足のいく溶解性を提供すると共に、ピペラジン基の存在により、その内の窒素原子の１つがさまざまな水溶性基を保有することができるため、合成および修飾が容易でもある新世代のプローブを提案する。本発明者らは、プローブの第３成分に、すなわちシグナル体と基質とを連結するリンカー内に、水溶性部分を組み込むという解決策を提案することを選択し、これは任意の所望の酵素基質および任意の所望のレポーター分子を選択することができることを意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係るプローブは、式（Ｉ）：
【００１２】
【化１】
0006793040.tif 000002
【００１３】
（式中、
Ｘ１＝ＮＨ、Ｏ、またはＳ；
Ｘ２＝ＯまたはＳ；
ＳＥが、脱離基、特に酵素基質であり；
Ａが、水溶液中でのＣ（Ｘ２）−Ｏ結合の開裂後、発色団または蛍光団の遊離を導く芳香族基であり；
Ｒが、水素原子または−（Ｌ）ｎ−ＧＰを表し、ｎは０または１に等しく；
Ｌが、リンカーアームであり；
ＧＰが、水溶性基である）
および、その生理学的に許容される塩、溶媒和物、または水和物である。
【００１４】
本発明は、式：
【００１５】
【化２】
0006793040.tif 000003
【００１６】
を有するピペラジニル型リンカーの環化に続き遊離する発色団または蛍光団を検出することにより、Ｘ１−ＳＥ結合を開裂することができる化学的または酵素分析物を検出するために利用することができる。
【００１７】
本発明によれば、基質は、酵素、化学物質、またはプローブが位置する媒体の物理化学的特性（特にｐＨ変化）などの、刺激の存在を明らかにすることができる分子プローブとして作用する。このプローブが前記刺激により化学的に修飾された場合、検出可能な発色団または蛍光団を遊離するために、カスケード反応により断片化する。Ａ基が式（Ｉ）のプローブ内の分子の残部に結合している場合にＡ基が発色団または蛍光団として挙動することも可能である。「レシオメトリック」プローブに関しては、スペクトル特性、特に吸光特性および／または蛍光特性は、酵素、化学物質、またはプローブが位置する媒体の物理化学的特性などの刺激の作用下で遊離する実体とは異なる。Ａ基は、式（Ｉ）を有するプローブが、刺激、特に酵素、化学物質、またはプローブが位置する媒体の物理化学的特性の形態の刺激に直面する前に、吸光または発光により検出されない（すなわち、このプローブは「隠れている（ｆｕｒｔｉｖｅ）」と称される）ように、有利に選択され得るが、必ずしもそれに限定されない。
【００１８】
脱離基ＳＥは、例えば、酵素経路による、または、純粋な化学反応（ｐＨ変化または還元剤の存在など）に続くその脱離が、自己切断リンカーの分子内転位により、特にＡ−ＯＨもしくはＡ−Ｏ−またはＡ’＝Ｏの形態（Ａ’＝Ｏは、Ａ−ＯＨの転位後に得られる形態、Ａ−ＯＨの互変異性体または重合体である）の蛍光団または発色団の遊離を確実にする基である。ＳＥ−Ｘ１結合の開裂は、以下の図式１：
【００１９】
【化３】
0006793040.tif 000004
【００２０】
に示すように、リンカーの環化により、特にＡ−ＯＨもしくはＡ−Ｏ−またはＡ’＝Ｏ（Ａ’＝Ｏは、Ａ−ＯＨもしくはＡ−Ｏ−の転位後に得られた形態、Ａ−ＯＨの互変異性体または重合体である）として、蛍光団または発色団の遊離を誘発する。
【００２１】
このプローブは、４つの分子構成要素から成る：ｉ）一端に保有される判断機能を有するリンカー、ｉｉ）他端に保有される脱離基ＳＥ、ｉｉｉ）リンカーのカルバメート基またはチオカルバメート基を介して結合する有機基Ａ−Ｏであり、リンカー−Ａ−Ｏ複合体の断片化により遊離して、対応するエノールまたはエノレート化合物を提供するとき、検出可能な発色団または蛍光団の形成をもたらす有機基Ａ−Ｏ、およびｉｖ）水溶性基。
【００２２】
本発明において、脱離基ＳＥおよびＡ基は、ＳＥ基の脱離およびリンカーの環化後に検出可能な発色団または蛍光団の遊離をもたらすと共に、Ｒ基を保有する窒素原子の存在は、プローブ特性の改変や第３の官能基の導入を可能にする。
【００２３】
実際に、本発明に係る式（Ｉ）のプローブは、広範囲の酵素基質、および、その性質に応じて、分子をより水溶性にするために使用することができる付随基Ｒを組み込むことができる多官能基化可能なピペラジン型のリンカーを含む。窒素原子の存在は、同一の合成中間体から出発して、さまざまな水溶性の官能基Ｒが導入可能であることを意味する。
【００２４】
加えて、本発明に係るプローブは、出願ＷＯ２０１３／０４５８５４およびＷＯ２０１４／０２０２８５に例示されるピペリジニル型リンカーを含む対照物や、例えば：
【００２５】
【化４】
0006793040.tif 000005
【００２６】
４−メチル−７−（フェニルアセトアミド）クマリンまたは４−メチルウンベリフェリルアセテートなどの、リンカーを全く含有しない市販試薬と比較して、改善された溶解性を有する。
【００２７】
さらに、出願ＷＯ２０１３／０４５８５４およびＷＯ２０１４／０２０２８５と同様に、このプローブは、ＳＥ−Ｘ１結合の開裂に続く環化のために予め構造化してあるリンカーを含み、このリンカーが良好な酵素認識を確実にしながら、リンカーの自己切断プロセスを促進する。しかしながら、水溶性を増大させるための基を導入する、本発明において実行されるリンカーの修飾に関して、プローブのレポーター活性に影響がないかどうかが決して明らかではなかった。しかしながら、本発明において、Ｒ基において、したがって刺激（すなわち、ＳＥ基の性質に応じた、酵素、化学物質またはプローブが位置する媒体の物理化学的特性の変化）の作用部位に近い位置において、電荷を導入するかまたは立体障害を増大させることにより、対応する刺激の作用下で得られる反応は改変されないことが実証されている。
【００２８】
したがって、本発明は、本特許出願に記載されるその多様さに関係なく、式（Ｉ）の化合物に関するものであり、該化合物は、その存在によりＳＥ−Ｘ１結合の開裂が起きる刺激、例えば、酵素、化学物質またはプローブが位置する媒体の物理化学的特性などの刺激を、ヒトもしくは動物におけるインビボ検出や、インビトロ、インセルロ（ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏ）またはエクスビボ検出するためのものである。
【００２９】
別の態様によれば、本発明は、その存在によりＳＥ−Ｘ１結合の開裂が起きる刺激、例えば、酵素、化学物質またはプローブが位置する媒体の物理化学的特性などの刺激の存在を、本発明に係る式（Ｉ）を有するプローブにより検出するインビトロ方法を提供する。より正確には、本発明は、その存在によりＳＥ−Ｘ１結合の開裂が起きる刺激、例えば、酵素、化学物質またはプローブが位置する媒体の物理化学的特性などの刺激の存在を検出する方法を提供し、該方法は：
・前記化学物質もしくは前記酵素を含有するかまたは前記物理化学的特性を有すると思われる試料と、本発明に係る式（Ｉ）を有するプローブとを接触させる工程と；
・適切な条件を適用し、前記刺激の作用下で、Ｘ１とＳＥとの間の共有結合を開裂させ、それに続き、原子（Ｘ２）を保有する炭素原子とＡ基を保有する酸素原子との間のＣ−Ｏ結合を開裂させ、次に式（Ｉ）を有するプローブ内に存在するリンカーの環化を可能にする工程と；
・遊離した発色団または蛍光団を定量的または定性的に分析する工程と
を含む。
【００３０】
試料は、任意の適切な生体試料であってもよい。特に、試料は、生体液試料、特に全血、血清、血漿、尿の試料、組織試料、または単離細胞、および特に細胞培地であり得る。この試料をそのままの状態で使用してもよく、またはこの試料をプローブの存在下にもたらす前に、当業者に周知の濃縮型または培養型の調製を実施してもよい。
【００３１】
有利なことに、式（Ｉ）を有する化合物は、オン／オフモードで機能するプローブとして挙動し、すなわち、プローブは刺激（すなわち、ＳＥ基の性質に応じた、酵素、化学物質またはプローブが位置する媒体の物理化学的特性の変化）による開裂の前には「不可視」である。ｉ）原子（Ｘ２）を保有する炭素原子とＡ基を保有する酸素原子との間のＣ−Ｏ結合の開裂の後に遊離した基、およびｉｉ）式（Ｉ）を有するプローブとの間の異なるスペクトル特性を得るように、Ａ基を選択することも可能である。
【００３２】
特に、本発明に係る検出方法は、生理学的条件下で、特に、ｐＨ４〜９の範囲、特にｐＨ約７．４に緩衝した水性媒体内で、実行してもよい。
【００３３】
本発明の一実施形態では、蛍光団が遊離し、その分析は、以下の工程：
・蛍光団の吸収波長の光を発生できる光源に、蛍光団を暴露する工程と；
・得られた蛍光を検出する工程と
を含む。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、発色団が遊離し、その分析には、以下の：
・発色団の吸収波長の光を発生できる光源に、発色団を暴露する工程と；
・発色団により吸収された光を検出する工程と
を含む。
【００３５】
発色団が遊離した場合、刺激（すなわち、ＳＥ基の性質に応じた、酵素、化学物質またはプローブが位置する媒体の物理化学的特性の変化）の作用後に色変化が検出される。
【００３６】
遊離した蛍光団または発色団は、特に、Ａ−ＯＨもしくはＡ−Ｏ−またはＡ’＝Ｏ（Ａ’＝Ｏは、Ａ−ＯＨまたはＡ−Ｏ−の転位後に得られた形態、Ａ−ＯＨの互変異性体または重合体である）の形態である遊離した蛍光団または発色団は、水溶液中で沈殿を形成することが好ましいが、必ずしもそれに限定されない。
【００３７】
本発明について、より詳細に以下に説明する。
【００３８】
脱離基ＳＥの定義
ＳＥは、刺激の作用、特に、酵素、化学物質またはプローブが位置する媒体の物理化学的特性の存在であり得る刺激の作用下で、水溶液中で脱離することができる脱離基である。ＳＥは、特に、水性媒体中で脱離してもよい。物理化学的特性の例として挙げられるものには、ｐＨの変化、または酸化還元電位の変化があり、酸化還元電位の変化により、特にＸ１＝Ｓの場合に存在するジスルフィド架橋が開裂する。特に、Ｘ１＝ＮＨまたはＯの場合、脱離基ＳＥは、化学物質（標的試薬）または酵素の影響を受けやすいことが好ましい。酵素は化学反応を触媒する天然のタンパク質と定義される。
【００３９】
脱離基ＳＥは、標的（化学的または酵素的化合物、媒体の物理化学的パラメータ）、特に、組織または標的細胞型内に選択的に局在する酵素の認識を確実にすることが好ましい。
【００４０】
ＳＥ基は、刺激の作用、特に、酵素、化学物質またはプローブが位置する媒体の物理化学的特性の存在であり得る刺激の作用下で、分子の残部から開裂することができるという特徴を有する。ＳＥが酵素基質である場合、ここで酵素はＳＥと、ＳＥが結合している原子Ｘ１との間の開裂のための触媒として作用する。この型の切断は、酵素が触媒として作用する水性媒体中での加水分解の結果である。この切断は同様に加水分解を伴うが、加水分解反応に触媒的に活性である酵素の作用によるものを開裂と呼ぶ。
【００４１】
Ｘ１の選択は、ＳＥ基、特に、選択された酵素基質に応じて、所望の開裂を得るように調整しなければならない。特に、ＳＥがエステラーゼ、グリコシダーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼまたはグルクロニダーゼの基質である場合、Ｘ１は酸素でなければならず、ＳＥがプロテアーゼの基質、特にアミダーゼまたはトランスフェラーゼの基質である場合、Ｘ１はＮＨでなければならず、Ｘ１−ＳＥが、還元剤によって開裂するジスルフィド結合である場合、Ｘ１は硫黄でなければならない。
【００４２】
特に、本発明のプローブが想定する用途に応じて、当業者は、カルボキシルエステラーゼまたはリパーゼなどのエステラーゼ；アルカリンホスファターゼ；β−グルクロニダーゼなどのグルクロニダーゼ；グリコシダーゼ；メタロプロテアーゼなどのプロテアーゼ；ペプチダーゼおよびアミダーゼから選択される少なくとも１つの酵素に対する基質を選択し得る。
【００４３】
ＳＥ基は、対象とする酵素に対して特異的であるように選択することが好ましい。一方、異なる組のＳＥ基の組み合わせを開裂する能力を有する酵素もあり、そのような酵素としてヘキソサミニダーゼおよびエステラーゼが挙げられる。
【００４４】
この型の酵素は、特に、そのアノマー炭素を介して分子の残部に結合しているグリコシル基、そのアシル基を介して分子の残部に結合している脂肪酸、末端炭素もしくは側鎖に保有されるアシル官能基を介して分子の残部に結合しているペプチジル基、またはここでＮＨを表すＸ１とスルホンアミドを形成するスルホニル基から選択されなければならない。
【００４５】
特に、ＳＥは、グリコシダーゼ基質、特にガラクトシダーゼ基質であってもよく、そのアノマー炭素を介して分子の残部に結合しているグリコシル基に相当する。
【００４６】
用語「グリコシダーゼ」とは、少なくとも１つの等化合物を遊離するように、グリコシド結合の加水分解を触媒する能力を有するグリコシド加水分解酵素を意味する。
【００４７】
用語「グリコシル」基とは、グリコシル結合を介して、すなわち、そのアノマー炭素を介して分子の残部に結合している任意の糖、単糖または多糖を意味する。アノマー炭素は、アルファ構造またはベータ構造をとってもよい。ＳＥ基の例として挙げられるものには、モノグリコシル基、すなわち単一の糖単位から形成されるグリコシル基、およびポリグリコシル基すなわち、複数の同一のまたは異なる糖単位により形成されるグリコシル基がある。糖単位は、特にヘキソース型またはペントース型のものであってもよく、例えば、ガラクトース、グルコース、マンノース、グロース、アロース、アルトロース、イドース、タロース、フコース、フルクトース、アラビノース、リキソース、リボース、およびキシロースから選択される。糖単位は、ＬまたはＤの立体化学構造を有してもよい。グリコシダーゼ基質を構成する全ての可能なグリコシル基は、ＳＥとして使用されてもよい。グリコシル単位は、特にアセチル基またはアミノ基で、任意に官能基化されていてもよい。Ｎ−アセチルヘキソサミンは、グリコシル基の例である。通例、ＳＥ基は１〜５０個の糖単位を含む。ポリグリコシルに関しては、ホモポリマーまたはランダム、交互、もしくはブロック構造を有するコポリマーであってもよい。
【００４８】
グリコシダーゼ基質として挙動するこの型のＳＥ基の例として、以下の、ガラクトシル、グルコシル、マンノシル、グロシル、アロシル、アルトロシル、イドシル、タロシル、フコシル、フルクトシル、アラビノシル、リキソシル、リボシル、キシロシル、グルクロニルおよびＮ−アセチル−ヘキソサミニルから選択されるモノグリコシル基、ならびに複数の（特に２〜２０個、好ましくは３〜１０個、とりわけ４〜６個）同一のまたは異なるこれらのモノグリコシル基から成るポリグリコシル基が挙げられる。
【００４９】
本発明に基づくプローブの標的とされ得るグリコシダーゼ酵素の例として挙げられるものには、Ｎ−アセチル−β−ガラクトサミニダーゼ、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ、α−アミラーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、α−アラビノシダーゼ、β−セロビオシダーゼ、β−キトビオシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、α−マルトシダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−キシロシダーゼ、β−Ｄ−フコシダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、β−Ｌ−フコシダーゼ、Ｌ−イズロニダーゼ、またはセルラーゼ（Ｏｒｅｎｇａ，Ｓ．，Ｊａｍｅｓ，Ａ．Ｌ．，Ｍａｎａｆｉ，Ｍ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｊ．Ｄ．，＆Ｐｉｎｃｕｓ，Ｄ．Ｈ．（２００９年）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、７９（２）、１３９−１５５）がある。
【００５０】
ＳＥはまた、ガラクトシダーゼ、特にβ−ガラクトシダーゼ、インズロニダーゼ、グルコシダーゼ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼ、またはグルクロニダーゼ、特にβ−グルクロニダーゼの基質であってもよい。
【００５１】
ガラクトシダーゼ基質として挙動するこの型のＳＥ基の例として、以下の、Ｄ−グルクロニル、Ｌ−イズロニル、Ｄ−グルコピラノシル、Ｄ−ガラクトピラノシル、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニル、Ｄ−マンノピラノシル、Ｌ−フコピラノシルから選択されるモノグリコシル基、または複数の（特に２〜２０個、好ましくは３〜１０個、とりわけ４〜６個）同一でも異なってもよいこれらのモノグリコシル基から成るポリグリコシル基が挙げられる。
【００５２】
ＳＥはまた、エステラーゼ基質、特にリパーゼ基質であってもよい。その場合、ＳＥは、そのＣ（Ｏ）官能基を介して分子の残部に結合しているアシル基である。特に、ＳＥは、−Ｃ（Ｏ）Ｒｉであってもよく、Ｒｉは例えば、好ましくは１〜２０個の炭素原子を含有するアルキル基、好ましくは１〜２０個の炭素原子を含有するアルケニル基、ベンジル、アリール、またはヘテロアリール基を表す。
【００５３】
ＳＥはまた、プロテアーゼまたはペプチダーゼの基質、特にカテプシンまたはメタロプロテアーゼの基質、特に前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）であってもよい。
【００５４】
その場合、ＳＥは、末端炭素または側鎖に保有されるアシル官能基を介して分子の残部に結合しているペプチジル基またはアミノ酸基である。
【００５５】
用語「ペプチジル」基とは、ペプチド結合を介して互いに結合する少なくとも２つのアミノ酸の鎖状体を意味する。本発明において、ＳＥ中に存在するアミノ酸またはアミノ酸類は、天然でも非天然でもよいが、好ましくは２０の天然アミノ酸（すなわちタンパク質を構成するもの）から選択されるべきであり、塩または保護された形態であってもよい。末端アミノ酸のＮ−末端官能基は、任意に塩の形態または官能基を有する形態であってもよい。塩の形態の例として挙げられるものには、塩酸塩、トシル酸塩、またはトリフルオロ酢酸塩がある。
【００５６】
ペプチダーゼ基質を構成する任意の可能なペプチジル基またはアミノ酸基を、ＳＥ基として使用してもよい。このアミノ酸は、特にＳＥのＮ−末端で、官能基を有していてもいなくてもよい。特定の実施形態では、ペプチジル残基ＳＥは、同一でも異なってもよい１０個までのアミノ酸を有する。ペプチジル残基ＳＥのアミノ酸は、天然アミノ酸から選択されるのが好ましい。しかしながら、アミノ酸またはペプチジル基のＮ末端は、アシル基−ＣＯＲ０で官能基化されていてもよく、Ｒ０は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基または−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基である。所与のプローブのＮ末端の、アシル基（Ｒ０ＣＯ−）による可能な官能基化は、その末端に遊離アミノ基を有する基質とは相互作用しないエンドプロテアーゼがあるという事実に由来する。加えて、このＮ末端官能基化は、ＳＥがペプチジル基を表す場合に好ましく、一方、ＳＥがアミノ酸を表す場合は、そのＮ末端官能基は遊離してもよいか、または好ましくはアンモニウム化合物として塩の形態である。カルバメート保護基（これもまた「アシル」基を構成する）を使用する固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、このＮ末端にカルバメートを有するプローブのより簡単な合成を可能にすることが多い。アミノ−ペプチダーゼに関しては、アミノ酸を表すＳＥ基を使用することが好ましく、一方エンドペプチダーゼに関しては、ペプチジル基を表すＳＥ基を使用することが好ましい。
【００５７】
以下のペプチジル基：Ｌｅｕ（ロイシンアミノペプチダーゼを表す）、Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ＨＩＶ−１のペプチダーゼの好ましい開裂配列のＮ末端部分）、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−（カスパーゼ３を表す）、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（プロステート特異抗原、「ＰＳＡ」を表す）を例として挙げてもよく、ここでＮ末端は遊離しても、またはアシル基−ＣＯＲ０で置換されてもよく、Ｒ０は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基または−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基（例えば−ＣＯＭｅ基）である。
【００５８】
ペプチジル基またはアミノ酸基は、それを認識する標的ペプチダーゼの公知の配列選択性との適合性によって選択される。ペプチジルまたはアミノ酸基は、特定の疾患に関与するペプチダーゼが有する好ましい作用のために選択されてもよく、詳細を表１に示す。
【００５９】
【表１】
0006793040.tif 000006
【００６０】
ＳＥはまた、非ペプチドアミド結合の加水分解を触媒するアミダーゼ基質、特にペニシリンアミダーゼ、脂肪酸アミド加水分解酵素、またはマロンアミダーゼの基質であってもよい。
【００６１】
ＳＥはまた、１つの基質から別の基質への官能基の転移を触媒するトランスフェラーゼ基質、特に、アミノ基転移酵素基質、またはグルタチオントランスフェラーゼ基質もしくはガンマグルタミル／トランスフェラーゼ基質であってもよい。この場合、ＳＥは、末端炭素もしくは側鎖に保有されるアシル官能基を介して結合するペプチジル基もしくはアミノ酸基、またはここでＮＨを表すＸ１とスルホンアミドを形成するスルホニル基に相当する。
【００６２】
プロテアーゼ基質は周知であり、特に「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ」（ＲａｌｉｎｇｓおよびＳａｌｖｅｓｅｎ、２０１３年、第３版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｌｔｄ）およびオンラインＭＥＲＯＰＳデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ，Ｂａｔｅｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｓ．２０１４年、４２、Ｄ５０３）に記載されており、これらを参照することにより、さらに詳細が得られる。
【００６３】
ＳＥはまた、化学物質と反応する基質、特に、硫黄原子であるＸ１と、還元剤により、特にジチオトレイトールにより、もしくは分析される試料中に存在するシステインにより還元／開裂するジスルフィド架橋を形成する基、または酸性媒体中で分析される試料の酸性化中に不安定結合の開裂により反応する基質、特に、酸素原子であるＸ１とアセタール結合を形成する基であってもよく、このＳＥ基はメチルオキシメチル（−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３）、メチルオキシエチル（−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３）、メチルオキシフェニル（−ＣＨ２−Ｏ−ＰＨ）、メチルオキシアリル（−ＣＨ２−Ｏ−アリル）などに相当する。
【００６４】
Ａ基の定義
Ａは、ＣＸ２−Ｏ結合の開裂後、発色団または蛍光団の形成を可能にする芳香族基である。この発色団または蛍光団は、遊離した化合物Ａ−ＯＨもしくは水溶液中で形成されるそのＡ−Ｏ−形態、または遊離した化合物Ａ−ＯＨもしくはＡ−Ｏ−の二量体化などの開裂後の反応により得られた化合物、または例えば結果的に互変異性体となるような、化合物Ａ−ＯＨもしくはＡ−Ｏ−の開裂後の転位により得られた化合物に直接的に相当してもよい。この型の化合物は、Ａ’＝Ｏと示される。
【００６５】
用語「芳香族基」とは、任意に置換されてもよい１つまたは複数の芳香環を含む基を意味し、前記環は場合により、窒素、酸素または硫黄原子から選択される１つまたは複数のヘテロ原子および／またはカルボニル、Ｃ＝Ｏの形態の１つまたは複数の炭素原子を含む。Ａは、例えば、好ましくは４〜４０個の炭素原子および窒素、酸素または硫黄原子から選択される０〜１０個のヘテロ原子を含む。特に、芳香族基Ａは、単環式炭素環、二環式炭素環または３個以上の環を有する多環式炭素環であってもよく、好ましくは５〜４０員環、より好ましくは６〜１５員環を含有し、少なくとも１個の芳香環を含み、前記炭素環は、炭素環に組み込まれた酸素、窒素または硫黄原子から選択される少なくとも１個のヘテロ原子および／またはカルボニル、Ｃ＝Ｏの形態で炭素環を形成する１つまたは複数の炭素原子を任意に含み、この型の炭素環は場合により非置換であるかまたは１つまたは複数の置換基を保有している。芳香族基は、特に置換または非置換であってもよいアリールおよびヘテロアリール基を含む。この型の非置換形態の炭素環の例として挙げられるものには、フェニル、ナフチル、２−、３−または４−ピリジニル、２−または３−フロイル、２−または３−チオフェニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、テトラゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、ピリダジニル、インドリル、およびピロニルがある。
【００６６】
発色団は、可視光の一部のスペクトルを吸収することができる分子である。発色団の例として挙げられるものには、パラニトロフェノールおよびその誘導体、対応するエノール誘導体の二量体化後に得られ、水性有酸素媒体中で沈殿を形成するインジゴイド型色素（したがって、Ａ’＝Ｏに相当する）、または、特定の金属の存在下で着色沈殿を形成するシクロヘキセノエスクレチン（ＣＨＥ）、アリザリンもしくはヒドロキシフラボンなどの化合物がある。
【００６７】
【化５】
0006793040.tif 000007
【００６８】
ヒドロキシインドリルは、塩素、臭素、ヨウ素、またはフッ素原子から選択され、ベンゼン環の任意の部位に位置する、同一でも異なってもよい１つまたは複数のＸ３で置換されてもよい。
【００６９】
蛍光団は、好適な波長の光により励起を受けた場合、蛍光を発することができる分子である。「蛍光」は、所与の波長の光で励起された分子が、より長波長の光を放出する特性である。蛍光は、蛍光団と入射光子との相互作用に起因する現象である。このプロセスは励起として知られている。光子の吸収により、蛍光団中の電子がその基底状態から高エネルギーレベルへと移動する。次に、この電子は光子を放出することにより、元のレベルに戻る。このプロセスは、蛍光放出として知られている。ここで、蛍光団は吸収光子より長波長の光を放出する。これは単に、励起状態の期間にエネルギーが放散することにより、放出された光子のエネルギーが吸収された光子のエネルギーより低いという事実による。この定義は特許出願ＷＯ２００４／０５８７８７に示されている。
【００７０】
この型の蛍光団を遊離することができる−ＯＡ基の例として、以下のものが挙げられる。
【００７１】
【化６】
0006793040.tif 000008
【００７２】
遊離した分子Ａ−ＯＨまたはＡ−Ｏ−の転位後に、蛍光団の遊離を可能にする−ＯＡ基の例として挙げられるものには、以下の蛍光団（２番目のものは：ＳｈａｂａｔらＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４、２０４１２に記載されている）がある。
【００７３】
【化７】
0006793040.tif 000009
【００７４】
特定の実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物中の、原子（Ｘ２）を保有する炭素原子とＡ基を保有する酸素原子との間のＣ−Ｏ結合の開裂の後に、水溶液中で任意に沈殿し得るＥＳＩＰＴ蛍光団に相当する化合物ＡＯＨを得るように、−ＯＡ基が選択される。ＥＳＩＰＴ蛍光団は、プロトンの分子間移動に関与し、蛍光団分子の互変異性化および蛍光の放出を可能にする少なくとも１個のヒドロキシル基を含む化合物である。この型の−ＯＡ基の例は、式（ＡＡ）：
【００７５】
【化８】
0006793040.tif 000010
【００７６】
（式中、
Ｘ５が酸素原子であり、かつＸ４が−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、アルキル、アリール、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−フェニル、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−フェニル、−Ｓ−アルキル、もしくは−Ｓ−アリール基であり、前記アルキルおよびフェニル基が場合により置換もしくは非置換であるか；または
Ｘ５が窒素原子を表しかつＸ４に結合しており、Ｘ４が、置換もしくは非置換のヘテロアリールを形成するためにＣＨ、Ｏ、Ｓ、ＮもしくはＮＨを表し、前記の置換もしくは非置換のヘテロアリールは、好ましくは、キナゾール、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、オキサゾール、ベンゾオキサゾール、ピリジンおよびキノリンから選択され；
【００７７】
【化９】
0006793040.tif 000011
【００７８】
は置換または非置換であってもよいアリールまたはヘテロアリールを表し、例えば、場合により置換または非置換であるフェニル、ナフチル基および：
【００７９】
【化１０】
0006793040.tif 000012
【００８０】
から選択され；
Ｘ６はＳ、Ｏ、またはＮＲ”を表し、Ｒ”は水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表す）
を有する。
【００８１】
ＡＯＨの形態でＥＳＩＰＴ蛍光団を表す−ＯＡ基が複数のヒドロキシル基を含む場合、−ＯＡ基の酸素原子は、分子間のプロトン移動に関与するヒドロキシル基の酸素原子である。式（Ｉ）の化合物のカルバメート基にこのヒドロキシル基を組み込むと、内部水素結合の形成および蛍光団の互変異性化の妨げとなる。
【００８２】
ＥＳＩＰＴ蛍光団は、１００ナノメートル（ｎｍ）を超え、２００ｎｍに到達することが多いストークスシフトを示す。全てのＥＳＩＰＴ蛍光団は、そのフェノール型ＯＨ基がアルキル化、アシル化または別の基で官能基化されている場合、照射による励起中に、それが式（ＡＡ）に図示されるヘテロ原子Ｘ５への水素原子の移動を妨げ、したがってプロトン移動プロセスに特徴的な蛍光放出を妨げ、１００ｎｍ超のストークスシフトに相当するこの蛍光放出を失う。
【００８３】
この場合、Ａ基は通例、非置換または置換の、および／または窒素などのヘテロ原子を任意に含む、１つまたは複数の不飽和炭素環と縮合するフェニル基に相当する。フェノキシ形態−ＯＡであるこの基は、基質に結合していない場合、ＥＳＩＰＴ蛍光団分類に属するプロトン化形態のフェノール型化合物ＨＯ−Ａに相当する。
【００８４】
フェノキシ型の−ＯＡ基は、例えば以下の好ましい構造（ＢＢ）または（ＣＣ）：
【００８５】
【化１１】
0006793040.tif 000013
【００８６】
（式中、
Ｔが、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ、Ｎ−アルキル、またはＮ−アリールであり；
Ｒａが、水素または−ＣＮもしくは−ＣＯＯＲｄなどの電子求引性の炭素含有置換基であり、Ｒｄが（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表すか、または、Ｒａが−ＣＯＮＲｅＲｆであり、ＲｅおよびＲｆは同一でも異なってもよく水素もしくは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表すか、または、Ｒａが−ＣＦ３、もしくは２−オキサゾリル、２−チアゾリル、２−イミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ピリミジノン−２−イルもしくはキナゾリノン−２−イル基であり；
Ｒｂが水素、塩素、臭素、ヨウ素もしくはフッ素原子、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＲｇＲｈ、−ＮＨＲｇ、または−ＯＲｇであり、ＲｇおよびＲｈがそれぞれ独立して（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルを表すか；
または、ＲａおよびＲｂが互いに結合して、４または５員の炭化水素鎖を形成し、これは飽和でも不飽和であっても、置換でも非置換であってもよく、Ｎ、ＳおよびＯから選択される１つまたは複数のヘテロ原子により任意に中断されてもよく；
Ｒｃが、水素、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、またはＦである）
【００８７】
【化１２】
0006793040.tif 000014
【００８８】
（式中、
Ｔ’ が、ＮＨ２、ＯＨ、アリール基、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基、ＳＨ、ＮＨＲ’ｃ、ＯＲ’ｃ、ＮＲ’ｃＲ’ｄ、またはＳＲ’ｃであり、Ｒ’ｃおよびＲ’ｄが同一でも異なってもよい（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたはアリール基を表し；
Ｒ’ａが、水素または−ＣＮもしくは−ＣＯＯＲ’ｅなどの電子求引性の炭素含有置換基であり、Ｒ’ｅは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表すか、またはＲ’ａが−ＣＯＮＲ’ｆＲ’ｇであり、Ｒ’ｆおよびＲ’ｇが同一でも異なってもよく水素もしくは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表すか、または、Ｒ’ａが−ＣＦ３、もしくは２−オキサゾリル、２−チアゾリル、２−イミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ピリミジノン−２−イルもしくはキナゾリノン−２−イルであり；
Ｒ’ｂが、水素、塩素、臭素、ヨウ素もしくはフッ素原子、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＲ’ｈＲ’Ｉ、または−ＯＲ’ｈであり、Ｒ’ｈおよびＲ’ｉが同一でも異なってもよい（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表すか；
または、Ｒ’ａおよびＲ’ｂが互いに結合して、４または５員の炭化水素鎖を形成し、これは飽和でも不飽和であっても、置換でも非置換であってもよく、Ｎ、ＳおよびＯから選択される１つまたは複数のヘテロ原子により任意に中断されてもよい）
に相当する。
【００８９】
特に、この型のＥＳＩＰＴ蛍光団の例を提供している出願ＷＯ２０１３／０４５８５４およびＷＯ２０１４／０２０２８５Ａを参照することにより、さらに詳細が得られる。
【００９０】
ＥＳＩＰＴ型の蛍光団に相当するＯＡ基のより詳細な例として挙げられるものには、以下のものがある。
【００９１】
【化１３】
0006793040.tif 000015
【００９２】
この型の蛍光団の非常に大きいストークスシフト（右側に示すＨＰＱ（ヒドロキシフェニルキナゾリノン）または任意のＨＰＱ類似体に関しておよそ１７０ｎｍ）は、プローブの優れた感度に寄与し、遊離した蛍光団と、分析を行っている生体試料から生じ得る自然の蛍光との識別を容易にする。
【００９３】
Ｒ基の定義
Ｒは、水素原子または−（Ｌ）ｎ−ＧＰを表してもよく、ｎは０または１に等しい。
【００９４】
高い頻度で、合成上の理由のため、ｎ＝１であり、かつＬはリンカーアーム、特に（Ｌ１）ｍ１−（Ｌ２）ｍ２−（Ｌ’１）ｍ’１−アーム（ピペラジン→ＧＰ基の方向）であり：
Ｌ１およびＬ’１が、同一でも異なってもよく、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１〜６）アルキル−、−Ｎ（フェニル）−、−Ｎ（アリール）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、および−ＣＯＮＨ−から選択され；
Ｌ２が、以下の２価の基：（Ｃ１〜２０）アルキル、（Ｃ１〜２０）アルケニル、（Ｃ１〜２０）アルキニル、（Ｃ６〜２４）アリール、（Ｃ７〜４４）アルキルアリール、（Ｃ７〜４４）アルケニルアリール、（Ｃ７〜４４）アルキニルアリール、（Ｃ７〜４４）アルキルシクロアルキル、（Ｃ７〜４４）アルケニルシクロアルキル、（Ｃ７〜４４）アルキニルシクロアルキル、（Ｃ７〜４４）アルキルヘテロシクロアルキル、（Ｃ７〜４４）アルケニルヘテロシクロアルキル、（Ｃ７〜４４）アルキニルヘテロシクロアルキルから選択され；前記の基は、場合によりトリアゾール基により中断されるかまたはトリアゾール基内で終結し、場合により非置換であるかまたは特に（Ｃ１〜１０）アルコキシ、（Ｃ１〜１０）アルキル、（Ｃ６〜１０）アリール、アミド、イミド、ホスフィド、ニトリド、（Ｃ１〜１０）アルケニル、（Ｃ１〜１０）アルキニルおよび−ＯＨから選択される１つもしくは複数の置換基で置換され；
ｍ１、ｍ’１およびｍ２が、同一でも異なってもよく、０または１に等しい。
【００９５】
アームＬは、存在する場合、ＧＰ基をピペラジンから遠ざけるためか、または合成上の理由から選択される。好ましい実施形態によれば、Ｌは−（Ｌ１）ｍ１−（Ｌ２）ｍ２−（Ｌ’１）ｍ’１を表し、Ｌ１＝−Ｃ（Ｏ）−であり、ｍ１＝ｍ２＝１であり、ｍ’１＝１または０であり、Ｌ２およびＬ’１は、上に定義された通りであり、特に、Ｌは−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｌ３−を表し、ｐは１、２、３または４に等しく、Ｌ３はトリアゾール基、特に１Ｈ−１，２，３−トリアゾール基である。
【００９６】
ＧＰは水溶性基である。
【００９７】
用語「水溶性基」とは、出願ＷＯ２０１３／０４５８５４およびＷＯ２０１４／０２０２８５に記載されるようにピペリジンを得るために、特にＬ−ＧＰを保有する窒素原子をＣＨ２と交換することにより異なるだけのプローブと比較して、プローブの溶解性を改善するために使用することができる親水性基を意味する。水溶性基の例として挙げられるものには、水溶液中で荷電種を形成することができる基がある。水溶性基ＧＰの例として挙げられるものには、アミン（第一級、第二級、または第三級）、アミジン、グアニジンまたはテトラゾールから選択される官能基Ｆ１；カルボキシレート、スルホネート、またはホスフェート型のアニオン性官能基から選択される官能基Ｆ２；これらの官能基Ｆ１および／またはＦ２の１つまたは複数を含む基；ポリエチレングリコール；グルコース、ガラクトース、およびマンノースなどの糖または多糖；ポリリジン、ポリアルギニン、ＴＡＴペプチドなどのペプチド基、などがある。アミン官能基の例として挙げられるものには、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１〜４）アルキル、およびジアルキルアミンがあり、該アルキル基は同一または異なっており、１〜４個の炭素原子を含有する。用語「これらの官能基Ｆ１および／またはＦ２の１つまたは複数を含む基」とは、アルキル基（（Ｃ３〜６）アルキルなど）、アリール基（６個の炭素原子を含有するアリール基など）、ヘテロアリール基（６個の炭素原子を含有するヘテロアリール基など）を意味し、これらの基の１つまたは複数の水素原子は、１つまたは複数の官能基Ｆ１か、１つまたは複数の官能基Ｆ２で置換されているか、あるいは、少なくとも１個の水素原子が官能基Ｆ１で置換され、別の１個の水素原子が官能基Ｆ２で置換されている。
【００９８】
プローブの定義において使用される用語の定義
用語「アシル官能基」とは、下記官能基を意味する。
【００９９】
【化１４】
0006793040.tif 000016
【０１００】
用語「アルキル」基とは、特に指示がない限り、飽和の、直鎖または分岐の炭化水素鎖を意味する。１〜６個の炭素原子を含有するアルキル基が好ましい。Ｃ１〜６アルキルまたは（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルと示された、１〜６個の炭素原子を含有するアルキル基の詳細な例として挙げられるものには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、およびｎ−へキシル基がある。
【０１０１】
用語「アリール」基とは、少なくとも１つの芳香族基、例えば、フェニル、シンナミル、またはナフチル基を含む単環式、二環式または多環式炭素環を意味する。６〜１２個の炭素原子を含有するアリール基が好ましい。フェニルは、特に好ましいアリール基である。
【０１０２】
「置換」基が示された場合、これは１つまたは複数の置換基、特に、塩素、臭素、ヨウ素またはフッ素原子、シアノ、アルキル、フルオロアルキル、トリフルオロメチル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、−ＣＯＯＨ、ならびにニトロ基、アシル基、芳香族基（特にアリールおよびヘテロアリール）から選択される置換基で置換されていることを意味し、前記アルケニル、アルキニル、シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキル基、アシル基ならびに芳香族基自体は非置換でも置換されていてもよい。これらの置換基の定義のために使用される用語は、通例、当業者に認識されているものである。
【０１０３】
従来通りに、用語「アルケニル」は、直鎖でも分岐でもよく、少なくとも１つの二重結合を含有し、好ましくは２〜２０個の炭素原子、かつ好ましくは２〜６個の炭素原子を含有する炭化水素鎖を示し、用語「アルキニル」は、直鎖または分岐の、少なくとも１つの三重結合を含有し、好ましくは２〜１２個の炭素原子、より好ましくは２〜６個の炭素原子を含有する炭化水素鎖を示し、用語「フルオロアルキル」は、飽和でも、直鎖でも分岐でもよく、少なくとも１個の水素原子がフッ素原子により置き換えられており、好ましくは２〜１２個の炭素原子、好ましくは２〜６個の炭素原子を含有する炭化水素鎖を示し、用語「アルコキシ」および「アリールオキシ」はそれぞれＯ−アルキル、およびＯ−アリールを示す。
【０１０４】
用語「シクロアルキル」とは、少なくとも１個の環で構成される飽和炭化水素基を意味し、架橋されていてもよい。３〜１２個の炭素原子を含有するアルキル基が好ましい。例として挙げられるものには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびアダマンチル基がある。
【０１０５】
用語「ヘテロシクロアルキル」とは、少なくとも１個の炭素原子がＯ、Ｓ、またはＮから選択されるヘテロ原子により置き換えられている、上に定義されるシクロアルキル基を意味する。ヘテロシクロアルキルの例として挙げられるものには、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、テトラヒドロピラニルなどの基がある。
【０１０６】
用語「ヘテロアリール」基とは、好ましくは６〜１２員環で、少なくとも１つの芳香族基および炭素環に組み込まれた酸素、窒素または硫黄原子から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する、単環式、二環式または多環式の炭素環を意味する。ヘテロアリール基の例として挙げられるものには、２−、３−または４−ピリジニル、２−または３−フロイル、２−または３−チオフェニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、テトラゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、ピリダジニル、およびインドリルがある。ヘテロアリールはまた、炭素環の１つまたは複数の炭素原子がカルボニル官能基Ｃ＝Ｏの形態である型の基も含有する。
【０１０７】
用語「アシル基」とは、アシル官能基Ｃ＝Ｏの炭素を介して結合する基を意味し、特にＣＯＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯアリール、−ＣＯ（Ｃ１〜４）アルキル、−ＣＯＳＨ、−ＣＯＮＨＲ”ａ、−ＣＯＮＲ”ａＲ”ｂ、または−ＣＯＳＲ”ａ基であり、Ｒ”ａおよびＲ”ｂは同一でも異なってもよく、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたはアリール基を表す。
【０１０８】
用語「（Ｃ７〜４４）アルキルアリール」、「（Ｃ７〜４４）アルケニルアリール」、「（Ｃ７〜４４）アルキニルアリール」とは、アリール基から開始する、または、アリール基で中断されるか終結する、それぞれアルキル、アルケニルまたはアルキニル鎖を意味する。７〜２２個、好ましくは７〜１６個の炭素原子を含有するアルキルアリール、アルケニルアリール、およびアルキニルアリール基が好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】ＰＧＡによる化合物１２の活性化に続く蛍光度の変化を示す。
【図２】ＰＧＡによる化合物１５の活性化に続く蛍光度の変化を示す。
【図３】ＰＧＡによる化合物３１の活性化に続く蛍光度の変化を示す。
【図４】本発明に係る化合物１２および３１ならびに比較として使用した化合物１５の、ＰＧＡによる活性化に続く応答率の比較を示す。
【図５】ＰＧＡによる化合物３６の活性化に続く吸光度の変化を示す。
【図６】ＰＧＡによる化合物３９の活性化に続く蛍光度の変化を示す。
【図７】リパーゼによる化合物２１の活性化に続く蛍光度の変化を示す。
【図８】本発明に係る化合物２１および比較として使用した化合物２７の、リパーゼによる活性化に続く応答率の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
本発明に係るプローブの調製
本発明において使用される化合物は、従来の技術に基づいて調製される。これらの化合物は、特に実施例で使用されるものと類似の方法を使用して得てもよい。
【０１１１】
本発明に基づく化合物は、以下の図式２に基づいて得てもよく、Ａ、Ｘ１、Ｘ２およびＳＥは式（Ｉ）のプローブの定義の通りであり、Ｐ１およびＰ２は、特に、利用される反応条件下での、アミン官能基に対する一時的な保護基であり、ＹはＣｌ、パラニトロフェノール、イミダゾールもしくはＮ−メチルイミダゾリウムまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド型の脱離基であり、Ｒｐは、特に、利用される反応条件下での、Ｒもしくはアミン官能基に対する一時的な保護基を表すか、またはＲｐはＲ基の前駆体基である。
【０１１２】
【化１５】
0006793040.tif 000017
【０１１３】
用語「アミンに対する保護基」とは、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｔ．Ｗ．およびＷｕｔｓ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．、ｅｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００６年ならびにＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ、Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ  Ｐ．Ｊ．、１９９４年、Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇに記載されるものなどの保護基を意味する。これらの型の基の例として挙げられるものには、ベンジル基（Ｂｎ）、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’１基があり、Ｒ’１は１〜１２個の炭素原子を含有するアルキルもしくはアルケニル基または−（ＣＨ２）ｍ３Ｒ”１を表し、Ｒ”１はアリール、シクロアルキルもしくはフルオレニル基を表し、ｍ３は０、１、２、または３に等しく、特にカルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｔｅｒ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基である。
【０１１４】
化合物（Ｖ）は、特に市販のピペラジンから得てもよい。Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１０年、１２、４１７６に記載される、同様ではあるが変更された手順に従い、１つの基がブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基である二重に保護されたピペラジンから化合物（Ｖ）を形成することが可能であり、オルトリチオ化反応、次にパラホルムアルデヒドとの反応により、Ｘ１＝Ｏである化合物（Ｖ）を形成する。Ｘ１＝ＮＨであるアミン誘導体（Ｖ）を、次に例えばガブリエル合成により得てもよく、一方、Ｘ１＝Ｓである化合物（Ｖ）を求核置換により得てもよい。
【０１１５】
好ましくは、式（ＶＩＩ）を有する化合物を調製するために、Ｘ１＝０またはＮＨである場合、必要とされる工程数がより少ない、図式３および４に示す方法を使用することも可能である。図式３および４では、Ａ、Ｘ１、Ｘ２およびＳＥは式（Ｉ）のプローブの定義の通りであり、Ｒ２は１〜４個の炭素原子を含有するアルキル基であり、Ｒ３は、特に、利用される反応条件下での、アミン官能基に対する一時的な保護基であり、ＹはＣｌ、パラニトロフェノール、イミダゾールもしくはＮ−メチルイミダゾリウムまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド型の脱離基であり、Ｒｐは、特に、利用される反応条件下での、Ｒもしくはアミン官能基に対する一時的な保護基を表すか、またはＲｐはＲ基の前駆体基である。
【０１１６】
【化１６】
0006793040.tif 000018
【０１１７】
【化１７】
0006793040.tif 000019
【０１１８】
図式３に記載される手順では、エチレンジアミン（Ｘ）型の化合物を（ＸＩ）型の市販の出発物質の誘導体に二重求核置換することで、ピペラジン環を得る。
【０１１９】
図式４に記載される手順では、ブロモマロネート（ＸＩＶ）およびエチレンジアミン（Ｘ）型の化合物から合成されるピペラジノン環（ＸＩＩＩ）の還元により、ピペラジン環を得る。
【０１２０】
Ｌ−ＧＰ基に相当する、Ｈ以外のＲ基は、求核型置換、還元アミノ化またはアミド結合形成型反応により導入してもよい。Ｌ基とＧＰ基との結合は、リンカーアームＬに存在する化学官能基に応じて、多数の合成経路を使用して得ることができる。例として挙げられるものには、求核置換、ペプチド結合、ヒュスゲン環化付加もしくはディールス−アルダー環化付加などの環化付加反応、または薗頭カップリングもしくはヘックカップリングなどのパラド触媒カップリングなどの連結反応がある。
【０１２１】
ＲｐがＲ基の前駆体基であるか、またはＲｐがアミンの一時的な保護基である式（Ｉ’）の中間体化合物を中間的に形成することが可能である。特に、以下の式：
【０１２２】
【化１８】
0006793040.tif 000020
【０１２３】
（式中、
Ａ、Ｘ１、Ｘ２、ＳＥ、Ｌ１、Ｌ’１、Ｌ２、ｍ１、ｍ’１、およびｍ２が、（Ｉ）に関する定義の通りであり；
Ｚが、Ｃ≡ＣＨ、Ｎ３、Ｎ−オキシスクシンイミドまたはマレイミド官能基を表し；
Ｒ’ｐが、アミン官能基の保護基を表し、好ましくは、ベンジル基、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’１基（Ｒ’１が１〜１２個の炭素原子を含有するアルキルもしくはアルケニル基を表す）、または−（ＣＨ２）ｍ３Ｒ”１基（Ｒ”１がアリール、シクロアルキルもしくはフルオレニル基を表し、ｍ３が０、１、２もしくは３に等しい）から選択される）
である中間体；およびその塩、溶媒和物または水和物は、本発明の不可欠な部分を成す。好ましいＲ’ｐ基の例として挙げられるものには、カルボベンジルオキシ、ｔｅｒ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、およびアリルオキシカルボニルがある。
【０１２４】
さらに、場合によっては、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ）の別の化合物の調製において中間体として作用し得る。これは、特にＬ’１＝−ＣＯＮＨ−または−ＮＨＣＯ−およびｍ’１＝１である化合物を形成するために使用することができる、特にＧＰ＝−ＣＯＯＨまたは−ＮＨ２である式（Ｉ）の化合物における場合である。
【０１２５】
出発試薬は市販されているか、容易に入手できる。したがって、式（Ｉ）の分子は、化学的に比較的容易に入手でき、考慮している技術分野では比較的低い調製コストで得られる。
【０１２６】
本発明に係る化合物の塩は、当業者に周知の技術に基づいて調製する。本発明に係る式（Ｉ）の化合物の塩は、存在する置換基に応じた、酸または塩基を有するものを含む。これらの酸または塩基は、式（Ｉ）の化合物および生理学的に許容される塩、すなわちインビボおよびインビトロの用途に適合する塩、の好適な分離または結晶化をもたらすために使用することができる無機および有機の酸および塩基から選択され得る。好適な酸として挙げられるものには、シュウ酸または光学活性な酸、例えば酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸もしくはショウノウスルホン酸があり、および塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸二水素塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、メシル酸塩、ベシル酸塩、またイソチオン酸塩などの生理学的に許容される塩を形成するものがある。適切な塩基の例として挙げられるものには、リジン、アルギニン、メグルミン、ベネタミン、ベンザチンがあり、および生理学的に許容される塩、例えばナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を形成するものがある。
【０１２７】
水和物形態の化合物の例として挙げられるものには、半水和物、一水和物および多水和物がある。
【０１２８】
用語「溶媒和物」とは、１つまたは複数の溶媒分子、特にその合成中または精製中に使用される溶媒分子と結び付いた形態の化合物を意味し、その溶液中にあることは決してない。
【０１２９】
本発明に係る式（Ｉ）の種々の化合物は、任意の可能な光学異性体であってもよく、特に指示がない限り、必要に応じて任意の割合で混合されていてもよい。特定の実施形態によれば、不斉炭素を含む本発明に係る化合物はラセミ体であり、Ｒ体およびＳ体は実質的に等しい割合である。別の実施形態によれば、本発明の式（Ｉ）の化合物は、１つのジアステレオマーまたはエナンチオマーが多い形態であってもよく、ジアステレオマーまたはエナンチオマー過剰率が８０％超もしくは９５％超であってもよく、または純粋な異性体であっても、すなわちジアステレオマーまたはエナンチオマーの過剰率が９９％超の形態であってもよい。
【０１３０】
化合物（Ｉ）は、従来の分離技術を使用して、１つのジアステレオマーまたはエナンチオマーが多い形態で単離され得る。１例として、周知の原理に基づいた、光学活性な酸または塩基とのラセミ塩の分別再結晶の使用、あるいは、最も多くは、従来のキラルまたは非キラル相クロマトグラフフィー技術の使用が可能である。
【０１３１】
本発明において、Ａ、Ｒ、Ｘ１、Ｘ２およびＳＥに関する全ての定義および好ましい実施形態を組み合わせ得る。
【０１３２】
特に、本発明に基づくプローブは、以下のいずれかの特徴を有するか、または以下の全ての特徴を有する：
−  Ｘ２＝Ｏ；
−  Ｘ１＝Ｏ、かつ、ＳＥは、グリコシダーゼ基質もしくはグルクロニダーゼ基質であり、そのアノマー炭素を介して分子の残部に結合しているグリコシル基に相当するか、またはＳＥは、エステラーゼ基質であり、−Ｃ（Ｏ）Ｒｉ基に相当し、Ｒｉは、例えば１〜２０個の炭素原子を好ましくは含有するアルキル基、１〜２０個の炭素原子を好ましくは含有するアルケニル基、ベンジル、アリール、もしくはヘテロアリール基を表すか、あるいはＸ１＝ＮＨ、かつＳＥは、プロテアーゼまたはペプチダーゼの基質であり、末端炭素または側鎖に保有されるアシル官能基を介して結合しているペプチジル基に相当する、のいずれかであり；
−  Ｒは−Ｌ−ＧＰを表し：
Ｌは好ましくは−（Ｌ１）ｍ１−（Ｌ２）ｍ２−（Ｌ’１）ｍ’１を表し、Ｌ１＝−Ｃ（Ｏ）−であり、ｍ１＝ｍ２＝１であり、ｍ’１＝１または０であり、Ｌ２およびＬ’１は上に定義された通りであり、特に、Ｌは−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｌ３−を表し、ｐは１、２、３または４に等しく、Ｌ３はトリアゾール基、特に１Ｈ−１，２，３−トリアゾール基であり；
ＧＰは、好ましくは、アンモニウム、カルボキシレート、スルホネート、およびホスフェートの官能基からならびにポリエチレングリコールから選択される官能基Ｆ１であり；
−Ａは本特許出願に詳細に記載される基の１つである。
【０１３３】
本発明に基づくプローブは、生命科学における多数の高感度用途にとって魅力的であり、特に：（１）ゲルプレート上で細菌コロニーにより発現される活性（特に酵素活性）のハイスループットスクリーニング（コロニー分析）；（２）生体液中の活性（特に酵素活性）のインビトロ検出（血液学など）；（３）フローサイトメトリーによる単一細胞における活性（特に酵素活性）の検出、（４）培養下の細胞内での活性（特に酵素活性）の可視化（蛍光顕微鏡法および共焦点顕微鏡法）；（５）酵素の組織化学的検出（組織スケールでの）；また、（６）インビボの分子イメージングもある。
【０１３４】
したがって、本発明に係るプローブには、多くの有望な用途がある。この型の用途の例として、細菌コロニーの分析の設計が挙げられる。これらは、現時点でゲルプレート（ペトリ皿）上で実施されており、マルチウェルプレートに含まれるウェルなどの分離区画内に積極的にコロニーを分離する必要がなく、３０００コロニーまで識別できる。例えば、一連の細菌系統から対象の病原系統を特定するために使用することができる、臨床試料に関する試験を設計することが可能である。
【０１３５】
本発明に基づくプローブはまた、巨視的蛍光イメージング、すなわち全生体の規模でのイメージングにおいて使用することができる。この場合、プローブは、対象の活性（酵素、化学物質またはプローブが位置する媒体の物理化学的特性などの刺激）に到達するために、細胞壁内に浸透する。
【０１３６】
以下の実施例は、本発明を例証するが、何ら制限するものではない。
【０１３７】
【表２】
0006793040.tif 000021
【０１３８】
特性評価に使用される機器
ＢｒｕｋｅｒＡＶＡＮＣＥ３００分光計（１Ｈおよび１３Ｃに対して、それぞれ３００ＭＨｚおよび７５ＭＨｚ）またはＢｒｕｋｅｒＡＶＡＮＣＥ５００分光計（１Ｈおよび１３Ｃに対して、それぞれ５００ＭＨｚおよび１２５ＭＨｚ）を使用して、２９７ＫにおけるＮＭＲスペクトルを得た。
【０１３９】
ＡＧＩＬＥＮＴ１１００ＳＬ質量分析計を液体クロマトグラフィーと組み合わせて使用して、低分解能質量測定を行った。
【０１４０】
アルミニウム上に塗布した６０オングストローム（Å）シリカゲルプレート（Ａｌｄｒｉｃｈ）で、薄層クロマトグラフィー分析（ＴＬＣ）を実行した。
【０１４１】
Ｂｒｕｋｅｒ  ＭｉｃｒＯＴＯＦＱＩＩ質量分析計を使用して、高分解能質量測定を行った。
【０１４２】
Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒからのＥｎＳｐｉｒｅプレート蛍光光度計を使用して、蛍光または吸光度測定を行った。
【実施例】
【０１４３】
Ａ−合成：
Ｉ−中間体８の調製、トリフルオロ酢酸塩の形態のＮ−（（４−ベンジルピペラジン−２−イル）メチル）−２−フェニルアセトアミド
ａ）化合物２の調製：Ｎ−Ｂｏｃ−ピペラジン
【０１４４】
【化１９】
0006793040.tif 000022
【０１４５】
Ｂｏｃ２Ｏ（８．０７グラム（ｇ）、５０ミリモル（ｍｍｏｌ）、１．０当量（ｅｑ））のＤＣＭ（１５０ミリリットル（ｍＬ））溶液を、ピペラジン１（１０．０ｇ、１００ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）のＤＣＭ（３００ｍＬ）溶液に、３時間（ｈ）にわたり周囲温度（ＡＴ）で滴下添加した。添加の最後に、反応混合物をＡＴで１８時間撹拌した。次に、混合物を、およそ１００ｍＬの最終体積を得るために、蒸発により濃縮した。次に、この溶液を、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１００ｍＬで２回）およびブラインで１回（１００ｍＬ）洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去し、化合物２を無色油状物の形態で得た（７．５７ｇ、４０ｍｍｏｌ、収率：８１％）。これはゆっくり結晶化した。
【０１４６】
【数１】
0006793040.tif 000023
【０１４７】
ｂ）化合物３の調製：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ’−ベンジル−ピペラジン
【０１４８】
【化２０】
0006793040.tif 000024
【０１４９】
ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（１７．６ｇ、８０．６ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を、０℃まで冷却した、化合物２（１０．０ｇ、５．７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、ベンズアルデヒド（５．５ｍＬ、５３．７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）および４ÅモレキュラーシーブのＤＣＭ（２００ｍＬ）溶液に数回に分けて添加した。反応媒体を０℃で１時間、次にＡＴで２時間撹拌した。反応の最後に、混合物を濾過し、濾液をＮａＨＣＯ３飽和水溶液で３回（３×１５０ｍＬ）洗浄した。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去した。未精製の反応生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：最初は純粋なＤＣＭ、次にＤＣＭ：ＭｅＯＨ／９５：５／ｖ：ｖ）を使用して精製し、化合物３を無色油状物の形態で得た（１２．８ｇ、４６ｍｍｏｌ、収率：８６％）。これはゆっくり結晶化した。
【０１５０】
【数２】
0006793040.tif 000025
【０１５１】
ｃ）化合物４の調製：ｔｅｒｔ−ブチル４−ベンジル−２−（ヒドロキシメチル）ピペラジン−１−カルボキシレート
【０１５２】
【化２１】
0006793040.tif 000026
【０１５３】
化合物３（１．０ｇ、３．６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を、予乾燥したドラム内で無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、アルゴンの不活性雰囲気下に置いた。この溶液を−３０℃まで冷却し、ｓＢｕＬｉ（シクロヘキサン中１．３モーラー（Ｍ）、４．２ｍＬ、１．５ｅｑ）を滴下添加した。反応混合物を、パラホルムアルデヒド（３５０ミリグラム（ｍｇ）、１１．６ｍｍｏｌ、３．２ｅｑ）を迅速に一度に導入する前に、−３０℃で６分間（ｍｉｎ）撹拌した。この懸濁液を、ＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液（２０ｍＬ）を用いて反応を終了する前に、−３０℃で３０分間、およびＡＴで１時間３０分撹拌した。有機相を分離し、水相をＥｔ２Ｏで２回（２×２０ｍＬ）洗浄した。有機相を合わせて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去した。未精製の反応生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：石油エーテル：酢酸エチル／７：３／ｖ：ｖ）を使用して精製し、化合物４を黄色油状物の形態で得た（６２５ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ、収率：５７％）。
【０１５４】
【数３】
0006793040.tif 000027
【０１５５】
ｄ）化合物５の調製：ｔｅｒｔ−ブチル４−ベンジル−２−（（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート
【０１５６】
【化２２】
0006793040.tif 000028
【０１５７】
ＤＩＡＤ（８４５μＬ、４．０３ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）を、０℃まで冷却した、化合物４（１．０３ｇ、３．３６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、トリフェニルホスフィン（１．０７ｇ、４．０３ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）、およびフタルイミド（６００ｍｇ、４．０３ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）の無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に滴下添加した。反応混合物を０℃で３０分間、次にＡＴで１８時間撹拌した。揮発性の化合物を留去し、得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：石油エーテル：酢酸エチル／８：２／ｖ：ｖ）を使用して精製し、化合物５を白色固体の形態で得た（１．２０ｇ、２．７６ｍｍｏｌ、収率：８２％）。
【０１５８】
【数４】
0006793040.tif 000029
【０１５９】
ｅ）化合物６の調製：ｔｅｒｔ−ブチル２−（アミノメチル）−４−ベンジルピペラジン−１−カルボキシレート
【０１６０】
【化２３】
0006793040.tif 000030
【０１６１】
ヒドラジン一水和物（６２０ｍｇ、１２ｍｍｏｌ、４．０ｅｑ）を、化合物５（１．２０ｇ、２．７６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＥｔＯＨ（３０ｍＬ）溶液に添加し、反応混合物を１８時間還流下で加熱した。反応の最後に、懸濁液をＡＴまで冷却し、濾過した。濾液を減圧下で溶媒留去し、固体を得て、ＤＣＭ（５０ｍＬ）中で再懸濁し、再び濾過し、濾液をＮａＨＣＯ３飽和水溶液で２回（２×５０ｍＬ）、ブラインで１回（５０ｍＬ）洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去し、化合物６（６１０ｍｇ）を油状物の形態で得た。この生成物をさらに精製することなく次の反応工程で使用した。
【０１６２】
【数５】
0006793040.tif 000031
【０１６３】
ｆ）化合物７の調製：ｔｅｒｔ−ブチル４−ベンジル−２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート
【０１６４】
【化２４】
0006793040.tif 000032
【０１６５】
フェニルアセチルクロリド（３１８μＬ、２．３５ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）の無水ＤＣＭ（５ｍＬ）溶液を、０℃まで冷却した、化合物６（６００ｍｇ、１．９６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（５３０μＬ、３．０ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）の無水ＤＣＭ（１５ｍＬ）溶液に滴下添加した。反応混合物を０℃で３０分間、次にＡＴで１時間３０分撹拌した。反応の最後に、混合物をＮａＨＣＯ３飽和水溶液で３回（３×２０ｍＬ）洗浄した。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去した。未精製の反応生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：石油エーテル：酢酸エチル／５５：４５／ｖ：ｖ）を使用して精製し、化合物７を粘稠性固体の形態で得た（５００ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ、収率：２段階で４６％）。
【０１６６】
【数６】
0006793040.tif 000033
【０１６７】
ｇ）化合物８の調製：トリフルオロ酢酸塩の形態のＮ−（（４−ベンジルピペラジン−２−イル）メチル）−２−フェニルアセトアミド
【０１６８】
【化２５】
0006793040.tif 000034
【０１６９】
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（４ｍＬ）を、化合物７（５００ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＤＣＭ（４ｍＬ）溶液に添加し、反応混合物をＡＴで３時間撹拌した。反応の最後に、反応混合物を減圧下で溶媒留去し、ＤＣＭに再溶解し、再び溶媒留去した。この操作をさらに２回繰り返した。得られた油状物をＭｅＯＨに溶解し、生成物をＥｔ２Ｏから沈殿させた。懸濁液を濾過し、空気中で乾燥させ、化合物８を白色粉末の形態で得た（４０１ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ、収率：７８％）。
【０１７０】
【数７】
0006793040.tif 000035
【０１７１】
ＩＩ−中間体１０の調製：４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イルカルボノクロリデート
【０１７２】
【化２６】
0006793040.tif 000036
【０１７３】
４−メチルウンベリフェロン９（３６０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、０℃まで冷却した、トリホスゲン（４２０ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、０．７ｅｑ）のＤＣＭ（１０ｍＬ）溶液に一度に添加した。ＮａＯＨ水溶液（２Ｍ、１．１ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を、この懸濁液に滴下して添加し、反応混合物を０℃で１時間、次にＡＴで１８時間撹拌した。次に懸濁液を濾過し、得られた固体をＤＣＭで２回洗浄し、空気中で乾燥させ、化合物１０の予想された質量のおよそ半分を得た（２０２ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）。次に濾液を水で２回洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去して、もう１度化合物１０を白色粉末の形態で得た（２４０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）。この反応の全収率は９３％であった。
【０１７４】
【数８】
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【０１７５】
ＩＩＩ−化合物１２の調製、４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレートの塩酸塩（実施例１）
ａ）化合物１１の調製：４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル−４−ベンジル−２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート
【０１７６】
【化２７】
0006793040.tif 000038
【０１７７】
化合物８（４００ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（４８０μＬ、２．７３ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ）の無水ＤＣＭ（５ｍＬ）溶液を、０℃まで冷却した、化合物１０（２３０ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ、１．０５ｅｑ）の無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）溶液に、アルゴンの不活性雰囲気下で滴下添加した。次に反応混合物を０℃で３０分間、次にＡＴで４時間撹拌した。反応の最後に、反応混合物をＮａＨＣＯ３飽和水溶液で３回（３×２０ｍＬ）洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去した。未精製の反応生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ／９９：１、９８：２、９７：３／ｖ：ｖの勾配）を使用して精製し、化合物１１を無色油状物の形態で得た（１６０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ、収率：３３％）。
【０１７８】
【数９】
0006793040.tif 000039
【０１７９】
ｂ）化合物１２の調製：４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレートの塩酸塩
【０１８０】
【化２８】
0006793040.tif 000040
【０１８１】
化合物１１（１２０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）および１，１，２−トリクロロエタン（２５μＬ、０．２５ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）のＭｅＯＨ（５ｍＬ）溶液を含むフラスコを、水素で５分間パージした。Ｐｄ／Ｃ（１０％、２４ｍｇ）を添加し、フラスコを水素で５分間再びパージした。次に反応混合物を、ＡＴで１８時間、水素の雰囲気下で撹拌した。反応の最後に、混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）で濾過し、濾液を減圧下でおよそ２ｍＬの体積まで溶媒留去した。次にＥｔ２Ｏを添加し、生成物を沈殿させた。得られた懸濁液を濾過し、空気中で乾燥させ、化合物１２を白色粉末の形態で得た（８５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、収率：７８％）。
【０１８２】
【数１０】
0006793040.tif 000041
【０１８３】
ＩＶ−中間体１４の調製、２−フェニル−Ｎ−（ピペリジン−２−イルメチル）アセトアミド
【０１８４】
【化２９】
0006793040.tif 000042
【０１８５】
ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のジシクロヘキシルカルボジイミド（２．５６ｇ、１２．３ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）の溶液を、ＤＣＭ（３０ｍＬ）中のフェニル酢酸（１．５４ｇ、１１．２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）およびＨＯＢｔ（１．６６ｇ、１２．３ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）の懸濁液に添加した。得られた混合物を、２−（アミノメチル）ピペリジン１３（１．４ｍＬ、１１．２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を添加する前に、ＡＴで３０分間撹拌した。次に反応混合物をＡＴで２時間撹拌した。得られた懸濁液を濾過し、濾液をＮａＨＣＯ３飽和水溶液で２回（２×５０ｍＬ）洗浄した。次に有機相を、水相のｐＨが約ｐＨ３で安定するまで、１０％ＫＨ２ＰＯ４水溶液で数回抽出した。次に、合わせた水相にＤＣＭ（１５０ｍＬ）を添加し、水相のｐＨがｐＨ１２に達するまで、ＮａＯＨ水溶液（２Ｍ）を添加した。有機相を抽出し、塩基性水相をＤＣＭで２回（２×１００ｍＬ）抽出した。有機相を合わせて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去して、化合物１４を白色固体の形態で得た（２．０７ｇ、８．９ｍｍｏｌ、収率：８０％）。
【０１８６】
【数１１】
0006793040.tif 000043
【０１８７】
Ｖ−化合物１５の調製、４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート（比較例１）
【０１８８】
【化３０】
0006793040.tif 000044
【０１８９】
化合物１４（２５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、次にＤＩＰＥＡ（５５μＬ、０．３０ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）を、０℃まで冷却した、無水ＤＣＭ（５ｍＬ）中の化合物１０（３９ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、１．０５ｅｑ）の懸濁液に、アルゴンの不活性雰囲気下で添加した。反応混合物を０℃で３０分間、ＡＴで４時間撹拌した。反応の最後に、反応混合物をＮａＨＣＯ３飽和水溶液で３回（３×２０ｍＬ）洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去した。未精製の反応生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ／９９：１、９８：２、９７：３／ｖ：ｖの勾配）を使用して精製し、化合物１５を無色油状物の形態で得た（３５ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ、収率：５４％）。
【０１９０】
【数１２】
0006793040.tif 000045
【０１９１】
ＶＩ−中間体１９の調製、トリフルオロ酢酸塩の形態の（４−ベンジルピペラジン−２−イル）メチルオクタン酸
ａ）化合物１７の調製：塩化オクタノイル
【０１９２】
【化３１】
0006793040.tif 000046
【０１９３】
塩化チオニル（３０ｍＬ、４１０ｍｍｏｌ、６．０ｅｑ）を、オクタン酸１６（１０．０ｇ、６９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）に滴下した。次にこの反応混合物を還流下で２時間加熱し、次にＡＴまで冷却し、揮発性の化合物を減圧下で溶媒留去した。得られた油状物をＤＣＭ中に入れ、この溶液をもう１回溶媒留去した。化合物１７を強い匂いのする黄色液体の形態で得るために、この手順をさらに２回実行した（１１．０ｇ、６６．７ｍｍｏｌ、収率：９７％）。
【０１９４】
【数１３】
0006793040.tif 000047
【０１９５】
ｂ）化合物１８の調製：ｔｅｒｔ−ブチル４−ベンジル−２−（（オクタノイルオキシ）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート
【０１９６】
【化３２】
0006793040.tif 000048
【０１９７】
化合物１７（６６７ｍｇ、４．１ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）の無水ＤＣＭ（５ｍＬ）溶液を、０℃まで冷却した、化合物４（８００ｍｇ、３．７２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）およびトリエチルアミン（７８０μＬ、５．６ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）の無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）溶液に滴下した。反応混合物を０℃で３０分間、次にＡＴで２時間３０分撹拌した。次にその反応混合物をＤＣＭ（３５ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液で１回（５０ｍＬ）、水で１回（５０ｍＬ）、ＨＣｌ水溶液で１回（１Ｍ−５０ｍＬ）、およびブラインで１回（５０ｍＬ）洗浄した。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去した。未精製の反応生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（純粋なＤＣＭ、次にＤＣＭ：酢酸エチル／９０：１０）を使用して精製して、１８を黄色油状物の形態で得た（７１０ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ、収率：４４％）。
【０１９８】
【数１４】
0006793040.tif 000049
【０１９９】
ｃ）化合物１９の調製：トリフルオロ酢酸塩の形態の（４−ベンジルピペラジン−２−イル）メチルオクタン酸
【０２００】
【化３３】
0006793040.tif 000050
【０２０１】
使用した手順は、化合物８の合成に関して記載したものと同一であるが、ＤＣＭ（５ｍＬ）およびＴＦＡ（５ｍＬ）中の化合物１８（７００ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ、、．０ｅｑ）を使用し、化合物１９を白色粉末の形態で得た（７７５ｍｇ、収率：定量的）。
【０２０２】
【数１５】
0006793040.tif 000051
【０２０３】
ＶＩＩ−化合物２１の調製、４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル２−（（オクタノイルオキシ）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレートの塩酸塩（実施例２）
ａ）化合物２０の調製：４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル４−ベンジル−２−（（オクタノイルオキシ）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート
【０２０４】
【化３４】
0006793040.tif 000052
【０２０５】
使用した手順は、化合物１１の合成に関して記載したものと同一であり、無水ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の化合物１０（４００ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、化合物１９（７５０ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（８８０μＬ、５．０２ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ）を用いた。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル／７：３／ｖ：ｖ）の後、化合物２０を無色固体の形態で得た（１９０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ、収率：２２％）。
【０２０６】
【数１６】
0006793040.tif 000053
【０２０７】
ｂ）化合物２１の調製：４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル２−（（オクタノイルオキシ）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレートの塩酸塩
【０２０８】
【化３５】
0006793040.tif 000054
【０２０９】
使用した手順は、化合物１２の合成に関して記載したものと同一であり、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中の化合物２０（１８０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、１，１，２−トリクロロエタン（３７μＬ、０．３９ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）、Ｐｄ／Ｃ（３８ｍｇ、２０％ｗ）を用いて、化合物２１を白色粉末の形態で得た（９５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、収率：６１％）。
【０２１０】
【数１７】
0006793040.tif 000055
【０２１１】
ＶＩＩＩ−化合物２２の調製、４−（４−（（（４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル）オキシ）カルボニル）−３−（（オクタノイルオキシ）メチル）ピペラジン−１−イル）ブタン−１−スルホン酸（実施例３）
【０２１２】
【化３６】
0006793040.tif 000056
【０２１３】
ＮａＨＣＯ水溶液（１Ｍ、１０ｍＬ）を、酢酸エチル（１０ｍＬ）中の化合物２１の懸濁液（２５ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）に添加した。有機相を抽出し、水相を酢酸エチルで３回（３×１０ｍＬ）洗浄した。合わせた有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去して、無色油状物を得た。この油状物を無水ＴＨＦ（２．５ｍＬ）に溶解し、ブタンスルトン（２滴）を添加し、反応混合物を還流下で４８時間加熱した。反応の最後に、反応混合物をＴＨＦ（２．５ｍＬ）およびＥｔ２Ｏ（５ｍＬ）で希釈し、水（１０ｍＬ）を添加した。水相を分離し、凍結乾燥し、化合物２２を高吸湿性白色固体の形態で得た（１３ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、収率：４３％）。
【０２１４】
【数１８】
0006793040.tif 000057
【０２１５】
ＩＸ−化合物２７の調製、４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル２−（（オクタノイルオキシ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート（比較例２）
ａ）化合物２４の調製：Ｎ−Ｂｏｃ−２−（ヒドロキシメチル）ピペリジン
【０２１６】
【化３７】
0006793040.tif 000058
【０２１７】
Ｂｏｃ２Ｏ（６．６ｇ、４７ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）のＤＣＭ（１０ｍＬ）溶液を、０℃まで冷却した、化合物２３（５ｇ、４３ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＤＣＭ（２０ｍＬ）溶液に滴下添加した。反応混合物を０℃で３０分間、次にＡＴで３時間撹拌した。次に反応混合物をＤＣＭ（３０ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液で１回洗浄した（３×６０ｍＬ）。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去し、化合物２４を黄色固体の形態で得た（６．０２ｇ、２８ｍｍｏｌ、収率：６５％）。
【０２１８】
【数１９】
0006793040.tif 000059
【０２１９】
ｂ）化合物２５の調製：Ｎ−Ｂｏｃ−２−（（オクタノイルオキシ）メチル）ピペリジン
【０２２０】
【化３８】
0006793040.tif 000060
【０２２１】
化合物２４（５．０ｇ、３０．６ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）の脱水ＤＣＭ（２０ｍＬ）溶液を、０℃まで冷却した、化合物１７（６．０ｇ、２７．８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）およびトリエチルアミン（６ｍＬ、４２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）の脱水ＤＣＭ（４０ｍＬ）溶液に滴下添加した。反応混合物を０℃で３０分間、およびＡＴで３時間撹拌した。次に反応混合物をＤＣＭ（４０ｍＬ）で希釈し、１ＭのＨＣｌで１回（１００ｍＬ）、水で１回（５０ｍＬ）、１ＭのＮａＯＨで１回（１００ｍＬ）、およびブラインで１回（１００ｍＬ）洗浄した。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、乾燥するまで溶媒留去し、化合物２５を黄色液体の形態で得て、更なる精製を行うことなく使用した（９．８２ｇ、定量的収率）。
【０２２２】
【数２０】
0006793040.tif 000061
【０２２３】
ｃ）化合物２６の調製：トリフルオロ酢酸塩の形態のピペリジン−２−イルメチルオクタン酸
【０２２４】
【化３９】
0006793040.tif 000062
【０２２５】
使用した手順は、化合物８の合成に関して記載したものと同一であるが、ＤＣＭ（３ｍＬ）およびＴＦＡ（３ｍＬ）中の化合物２５（７００ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を使用し、化合物２６を白色粉末の形態で得た（９１０ｍｇ、２．５６ｍｍｏｌ、収率：８８％）。
【０２２６】
【数２１】
0006793040.tif 000063
【０２２７】
ｄ）化合物２７の調製：４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル２−（（オクタノイルオキシ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート
【０２２８】
【化４０】
0006793040.tif 000064
【０２２９】
使用した手順は、化合物１１の合成に関して記載したものと同一であり、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の化合物１０（１９０ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、化合物２６（２８５ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（７００μＬ、３．９５ｍｍｏｌ、４．０ｅｑ）を用いた。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル／７５：２５／ｖ：ｖ）の後、化合物２７を無色油状物の形態で得た（１５０ｍｇ、０．３４ｍｏｌ、収率：４３％）。
【０２３０】
【数２２】
0006793040.tif 000065
【０２３１】
Ｘ−化合物３１の調製、４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル４−（３−（１−（２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）プロパノイル）−２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート（実施例４）
ａ）化合物２９の調製、１−アジド−２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エタン
【０２３２】
【化４１】
0006793040.tif 000066
【０２３３】
ＮａＮ３（２．０４ｇ、３１．４０ｍｍｏｌ、５．０ｅｑ）を、ＤＭＦ（１５ｍＬ）と水（８ｍＬ）の混合物中の化合物２８（２．０ｇ、６．２８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の溶液に一度に添加した。次にこの反応混合物を７０℃まで１８時間加熱した。次に揮発性の化合物を溶媒留去し、得られた固体を酢酸エチル（５０ｍＬ）中に入れた。懸濁液を濾過し、濾液をＮａＨＣＯ３飽和水溶液で２回（２×５０ｍＬ）、ブラインで１回（５０ｍＬ）洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去して、化合物２９を無色油状物の形態で得た（８２０ｍｇ、４．３３ｍｍｏｌ、収率：６９％）。
【０２３４】
【数２３】
0006793040.tif 000067
【０２３５】
ｂ）化合物３０の調製、４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル４−（ペンタ−４−イノイル）−２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート
【０２３６】
【化４２】
0006793040.tif 000068
【０２３７】
ＤＩＰＥＡ（４２μＬ、０．２４０ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ）を、無水ＤＣＭ（５ｍＬ）中の化合物１２（５０ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、ペンチン酸（１２ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）およびＨＡＴＵ（４６ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）の懸濁液に、アルゴンの不活性雰囲気下で添加し、反応混合物をＡＴで２時間３０分撹拌した。反応の最後に、反応混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液で２回（２×２０ｍＬ）、およびブラインで１回（２０ｍＬ）洗浄した。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去した。未精製の反応生成物を、中性アルミナのカラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル／１：９／ｖ：ｖ）で精製し、化合物３０を無色油状物の形態で得た（６０ｍｇ、収率：定量的）。
【０２３８】
【数２４】
0006793040.tif 000069
【０２３９】
ｃ）化合物３１の調製、４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル４−（３−（１−（２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）プロパノイル）−２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート
【０２４０】
【化４３】
0006793040.tif 000070
【０２４１】
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（９ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、０．６ｅｑ）およびアスコルビン酸ナトリウム（１６ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）を、ＤＣＭ（１ｍＬ）と水（１ｍＬ）の混合物中の化合物３０（３０ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）および混合物２８（２４ｍｇ、０．１２８ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ）の溶液に一度に添加した。次にこの反応混合物をＡＴで２時間撹拌した。反応の最後に、反応混合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）で希釈した。有機相を抽出し、水相をＤＣＭで３回（３×１０ｍＬ）洗浄した。合わせた有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去した。未精製の反応生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ／１００：０、９９：１、９８：２、９７：３、９６：４、９５：５／ｖ：ｖの勾配）を使用して精製し、化合物３１を白色粉末の形態で得た（１９ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ、収率：４６％）。
【０２４２】
【数２５】
0006793040.tif 000071
【０２４３】
ＸＩ−中間体３４の調製、トリフルオロ酢酸塩の形態のＮ−（（４−（ペンタ−４−イノイル）ピペラジン−２−イル）メチル）−２−フェニルアセトアミド
ａ）化合物３２の調製、ｔｅｒｔ−ブチル２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート塩酸塩
【０２４４】
【化４４】
0006793040.tif 000072
【０２４５】
使用した手順は、化合物１２の合成に関して記載したものと同一であり、ＭｅＯＨ（３０ｍＬ）中の化合物７（６０５ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、１，１，２−トリクロロエタン（１６１μＬ、１．７０ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）、Ｐｄ／Ｃ（１２１ｍｇ、２０重量％）を用いて、化合物３２を白色粉末の形態で得た（４３０ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ、収率：７６％）。
【０２４６】
【数２６】
0006793040.tif 000073
【０２４７】
ｂ）化合物３３の調製、ｔｅｒｔ−ブチル４−（ペンタ−４−イノイル）−２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート
【０２４８】
【化４５】
0006793040.tif 000074
【０２４９】
ＤＩＰＥＡ（３９５μＬ、２．２５ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ）を、０℃まで冷却した、無水ＤＣＭ（３０ｍＬ）中の化合物３２（４１０ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、ペンチン酸（１２２ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）およびＨＡＴＵ（４７３ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）の懸濁液に、アルゴンの不活性雰囲気下で添加し、反応混合物を０℃で１５分間、次にＡＴで２時間１５分撹拌した。反応の最後に、反応混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液で２回（２×５０ｍＬ）、およびブラインで１回（５０ｍＬ）洗浄した。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去した。未精製の反応生成物を、中性アルミナのカラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル／１５：８５／ｖ：ｖ）により精製し、化合物３３を淡黄色固体の形態で得た（５５２ｍｇ、収率：定量的）。
【０２５０】
【数２７】
0006793040.tif 000075
【０２５１】
ｃ）化合物３４の調製、トリフルオロ酢酸塩の形態のＮ−（（４−（ペンタ−４−イノイル）ピペラジン−２−イル）メチル）−２−フェニルアセトアミド
【０２５２】
【化４６】
0006793040.tif 000076
【０２５３】
使用した手順は、化合物８の合成に関して記載したものと同一であるが、ＤＣＭ（５ｍＬ）およびＴＦＡ（５ｍＬ）中の化合物３３（５５０ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を使用し、化合物３４を白色粉末の形態で得た（５００ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ、収率：８８％）。
【０２５４】
【数２８】
0006793040.tif 000077
【０２５５】
ＸＩＩ−化合物３６の調製、４−ニトロフェニル４−（３−（１−（２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）プロパノイル）−２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート（実施例５）
ａ）化合物３５の調製、４−ニトロフェニル４−（ペンタ−４−イノイル）−２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート
【０２５６】
【化４７】
0006793040.tif 000078
【０２５７】
クロロギ酸ｐ−ニトロフェノール（２８ｍｇ、０．１３０ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を、０℃まで冷却した、化合物３４（５０ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（５５μＬ、０．３０ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）の無水ＤＣＭ（２ｍＬ）溶液に、アルゴンの不活性雰囲気下で一度に添加した。反応混合物を０℃で３０分間、次にＡＴで２時間撹拌した。反応の最後に、反応混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液で２回（２×２５ｍＬ）、およびブラインで１回（２５ｍＬ）洗浄した。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去した。未精製の反応生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル／２：８／ｖ：ｖ）を使用して精製し、化合物３５を無色固体の形態で得た（６０ｍｇ、収率：定量的）。
【０２５８】
【数２９】
0006793040.tif 000079
【０２５９】
ｂ）化合物３６の調製、４−ニトロフェニル４−（３−（１−（２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）プロパノイル）−２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート
【０２６０】
【化４８】
0006793040.tif 000080
【０２６１】
使用した手順は、化合物３１の合成に関して記載したものと同一であり、ＤＣＭ（１ｍＬ）と水（１ｍＬ）の混合物中の化合物３５（３０ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、化合物２８（２６ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（９ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、０．６ｅｑ）およびアスコルビン酸ナトリウム（１６ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）を用いた。精製後、化合物３６を淡黄色油状物の形態で得た（３９ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ、収率：９３％）。
【０２６２】
【数３０】
0006793040.tif 000081
【０２６３】
ＸＩＩＩ−化合物３９の調製、４−クロロ−２−（６−クロロ−４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）フェニル４−（３−（１−（２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）プロパノイル）−２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート（実施例６）
ａ）化合物３８の調製、４−クロロ−２−（６−クロロ−４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）フェニル４−（ペンタ−４−イノイル）−２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート
【０２６４】
【化４９】
0006793040.tif 000082
【０２６５】
トリホスゲン（１３０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ、３．３ｅｑ）の無水ＤＣＭ（２ｍＬ）溶液、続いてＤＩＰＥＡ（８０μＬ、０．４３ｍｍｏｌ、３．３ｅｑ）を、０℃まで冷却した、無水ＤＣＭ（５ｍＬ）中の化合物３７（４０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）の懸濁液に、アルゴンの不活性雰囲気下で添加した。この反応混合物を０℃で３０分間、次にＡＴで１８時間撹拌した。次に揮発性の化合物を、減圧下で蒸発により除去し、得られた固体を無水ＤＣＭ（５ｍＬ）中に入れた。無水ＤＣＭ（２ｍＬ）中の化合物３４（５０ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の溶液、続いてＤＩＰＥＡ（８５μＬ、０．４７ｍｍｏｌ、４．０ｅｑ）を、この新しい懸濁液に添加し、この反応混合物をＡＴで１８時間撹拌した。反応の最後に、反応混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液で２回（２×２５ｍＬ）、およびブラインで１回（２５ｍＬ）洗浄した。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過および溶媒留去した。未精製の反応生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを２回連続して使用して精製し（石油エーテル：酢酸エチル／２：８／ｖ：ｖ、およびＤＣＭ：ＭｅＯＨ／９９：１、９８：２、９７：３／ｖ：ｖの勾配）、化合物３８を白色固体の形態で得た（５２ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ、収率：６９％）。
【０２６６】
【数３１】
0006793040.tif 000083
【０２６７】
ｂ）化合物３９の調製、４−クロロ−２−（６−クロロ−４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）フェニル４−（３−（１−（２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）プロパノイル）−２−（（２−フェニルアセトアミド）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレート
【０２６８】
【化５０】
0006793040.tif 000084
【０２６９】
使用した手順は、化合物３１の合成に関して記載したものと同一であり、ＤＣＭ（２ｍＬ）と水（２ｍＬ）の混合物中の化合物３８（５０ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、化合物２８（３１ｍｇ、０．１７０ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（１２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、０．６ｅｑ）およびアスコルビン酸ナトリウム（２０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）を用いた。精製後、化合物３９を淡黄色油状物の形態で得た（５０ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ、収率：７８％）。
【０２７０】
【数３２】
0006793040.tif 000085
【０２７１】
Ｂ−化合物の水溶性の評価：
化合物の水溶性は、対象化合物の、異なる濃度での緩衝溶液中の沈殿物の有無の関数として評価した。これらの溶液を以下のように調製した：
【０２７２】
ＤＭＳＯ中の濃度１００ｍＭの透明原液を得るために、既知量の物質を適切な量のＤＭＳＯに溶解した（市販のＡＭＣ−ロイシン（ＡＭＣ−Ｌｅｕと示される）は、これらの条件下で濁った溶液を生じ、ＤＭＳＯ中の原液の濃度を５０ｍＭに低減しなければならなかったので除く）。次にこれらの原液を、１ｍＭ〜５０μＭの範囲の最終濃度を得るために、市販のＰＢＳ緩衝液中で希釈した。沈殿が生じ、希釈後に残った場合、化合物は不溶性であると示した。
【０２７３】
以下の表２はこの溶解性試験の結果を示す。
【０２７４】
【表３】
0006793040.tif 000086
【０２７５】
結論：提示された全ての場合において、本発明に基づく化合物は、リンカーアームを有していない市販の基質と比較して、または出願ＷＯ２０１３／０４５８５４およびＷＯ２０１４／０２０２８５に記載されるリンカーアームを組み込んだ基質と比較して、水溶液中でより良好な溶解性を有した。
【０２７６】
酵素活性化：
酵素活性下で検出される蛍光を評価するために、いくつかの化合物の試験を行った。
【０２７７】
ＰＢＳ緩衝液中のＰＧＡ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）からのペニシリンＧアミダーゼ、Ｗａｔｅｒｓｔｏｎｅ  Ｔｅｃｈ．）の溶液またはＰＢＳ緩衝液中のリパーゼ（カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ｒｕｇｏｓａ）からのリパーゼ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液を、９６−ウェルプレート（蛍光度用には黒、吸光度用には透明）中の本発明に係るプローブのＰＢＳ溶液に添加した。
プローブの最終濃度：１０μＭ〜５０μＭ
ＰＧＡの最終濃度：５Ｕ
またはリパーゼの最終濃度：４Ｕ
【０２７８】
次に、プレートを３７℃でインキュベートし、マルチプレートリーダー（ＥｎＳｐｉｒｅ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、蛍光度または吸光度を経時的に記録した。得られたグラフは、３回の結果である。
【０２７９】
４−メチルウンベリフェロン（化合物１２、１５、３１、２１および２７）に関して：蛍光度：λｅｘ＝３７０ｎｍ、λｅｍ＝４４５ｎｍ。
【０２８０】
６−クロロ−２−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）キナゾリン−４（３Ｈ）−オン（化合物３９）に関して：蛍光度：λｅｘ＝３６５ｎｍ、λｅｍ＝５３０ｎｍ。
【０２８１】
パラニトロフェノレート（化合物３６）に関して：吸光度：λａｂｓ＝４０５ｎｍ。
【０２８２】
結果を添付の図１〜８に示す。
【０２８３】
結論：本発明に係る化合物は、蛍光度または吸光度の測定により、酵素活性の存在を検出するために効果的に使用することができる。リンカーアーム上に、電荷または比較的立体的障害のある基を組み込むにもかかわらず、酵素認識は依然として良好である。
【図１】
0006793040.tif 000097
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0006793040.tif 000102
【図７】
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【図８】
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