(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓症；大腸菌(Escherichia coli)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、及びリステリア
・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)EGD、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、MRSA-メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウスを含むグ
ラム陰性細菌並びにグラム陽性細菌によって引き起こされる感染性疾患およびウイルス性疾患からなる群から選択される疾患の治療および／または狂犬病の予防において、薬理活性化合物の用量関連毒性を排除するため及び治療活性を向上させるための医薬組成物であって、
該医薬組成物が、
グルタチオンジスルフィド又はその医薬的に許容される有機若しくは無機塩、
Ｍｅ−Ｓ−グルタチオン結合を含有する配位化合物として示される金属（Ｍｅ）、及び
以下の構造のグルタチオンジスルフィドＳ−オキシド：
【化１】
0006798047.tif 000011
又はその医薬的に許容される有機若しくは無機塩
を含み、
該金属が、白金族から選択され、
該薬理活性化合物が、アミジン塩酸塩、モキシフロキサシン、インターフェロンアルファ、抗狂犬病ワクチンの抗原性物質およびニフェジピンからなる群から選択される少なくとも一の薬理活性化合物である、医薬組成物。
【請求項２】
グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドの量が、前記全組成物に対して０．０１〜１０重量％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記金属が、白金である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物中の金属の量が、前記組成物の１ｋｇあたり１×１０−１０モル〜１×１０−３モルの範囲内である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物中の金属の量が、前記組成物の１ｋｇあたり１×１０−５モルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
血栓症；大腸菌(Escherichia coli)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、及びリステリア
・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)EGD、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、MRSA-メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウスを含むグ
ラム陰性細菌並びにグラム陽性細菌によって引き起こされる感染性疾患およびウイルス性疾患からなる群から選択される疾患の治療および／または狂犬病の予防において、薬理活性化合物の用量依存性の毒性を排除するため及び治療活性を向上させるための医薬組成物であって、
該医薬組成物が、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物、及びアミジン塩酸塩、モキシフロキサシン、インターフェロンアルファ、抗狂犬病ワクチンの抗原性物質およびニフェジピンからなる群から選択される少なくとも一の薬理活性化合物を含む、医薬組成物。
【請求項７】
前記薬理活性化合物が、アミジン塩酸塩である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記薬理活性化合物が、モキシフロキサシンである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記薬理活性化合物が、インターフェロンアルファである、ウィルス性疾患の治療法のための、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記薬理活性化合物が、抗狂犬病ワクチンの抗原性物質である、狂犬病を予防するための、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
血栓症；大腸菌(Escherichia coli)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、及びリステリア
・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)EGD、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、MRSA-メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウスを含むグ
ラム陰性細菌並びにグラム陽性細菌によって引き起こされる感染性疾患およびウイルス性疾患からなる群から選択される疾患の治療および／または狂犬病の予防において，薬理活性化合物の用量関連毒性を排除するため及び治療活性を向上させるための医薬であって、
該薬理活性化合物が、アミジン塩酸塩、モキシフロキサシン、インターフェロンアルファ、抗狂犬病ワクチンの抗原性物質およびニフェジピンからなる群から選択される少なく
とも一の薬理活性化合物であり、
該医薬が、治療有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの組成物を、医薬的に許容される賦形剤と共に含む、医薬。
【請求項１２】
血栓症；大腸菌(Escherichia coli)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、及びリステリア
・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)EGD、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、MRSA-メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウスを含むグ
ラム陰性細菌並びにグラム陽性細菌によって引き起こされる感染性疾患およびウイルス性疾患からなる群から選択される疾患の治療および／または狂犬病の予防において、薬理活性化合物の用量関連毒性を排除するため及び治療活性を向上させるための医薬であり、
該薬理活性化合物が、アミジン塩酸塩、モキシフロキサシン、インターフェロンアルファ、抗狂犬病ワクチンの抗原性物質およびニフェジピンからなる群から選択される少なくとも一の薬理活性化合物であり、
該医薬が、治療有効量の請求項６〜１０のいずれか一項に記載の少なくとも１つの医薬組成物を、医薬的に許容される賦形剤と共に含む、医薬。
【請求項１３】
前記疾患の治療および／または狂犬病の予防において、薬理活性化合物の用量関連毒性を排除するため及び治療活性を向上させるための、外用、吸入、経腸、又は非経口投与用に製造することができる、請求項１１又は１２に記載の医薬。
【請求項１４】
患者（ヒトを除く）の、血栓症；大腸菌(Escherichia coli)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、及びリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)EGD、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、MRSA-メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウスを含むグラム陰性細菌並びにグラム陽性細菌によって引き起こされる感染性疾患およびウイルス性疾患からなる群から選択される疾患の治療および／または狂犬病の予防において、アミジン塩酸塩、モキシフロキサシン、インターフェロンアルファ、抗狂犬病ワクチンの抗原性物質およびニフェジピンからなる群から選択される少なくとも一の薬理活性化合物の用量関連毒性を排除するため及び治療活性を向上させるための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１５】
該金属（Ｍｅ）が、Ｍｅ−Ｓ−グルタチオン結合を含有する配位化合物の形態で示され、患者（ヒトを除く）に投与される前記配位化合物の量が、１０−３〜１０−１５ｍｏｌ／ｋｇ体重である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
患者（ヒトを除く）の、血栓症；大腸菌(Escherichia coli)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、及びリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)EGD、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、MRSA-メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウスを含むグラム陰性細菌並びにグラム陽性細菌によって引き起こされる感染性疾患およびウイルス性疾患からなる群から選択される疾患の治療および／または狂犬病の予防において、アミジン塩酸塩、モキシフロキサシン、インターフェロンアルファ、抗狂犬病ワクチンの抗原性物質およびニフェジピンからなる群から選択される少なくとも一の薬理活性化合物の用量関連毒性を排除するため及び治療活性を向上させるための、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１７】
前記薬理活性化合物が、アミジン塩酸塩である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記薬理活性化合物が、モキシフロキサシンである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
前記薬理活性化合物が、インターフェロンアルファである、請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
前記薬理活性化合物が、抗狂犬病ワクチンの抗原性物質である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２１】
前記医薬組成物の投与が、吸入、経腸、又は非経口投与によって行われる、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬産業及び医学に関し、すなわち、医薬作製の分野に関し、薬理学、医学、及び獣医学に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
薬物動態及び／若しくは薬物動力学を最適化することによって、並びに／又は薬物分子の化学的修飾を通して及び／若しくは別の化学化合物と合わせてのその使用を通して毒性を低下させることによって、薬理学的分子の治療有効性を増加させることは、生理学的により最適である用量でその活性を呈する新世代薬物の開発のための方向の１つである。
【０００３】
現時点では、酸化グルタチオン（酸化型グルタチオン、グルタチオンジスルフィド、ＧＳＳＧ）という物質が知られており、これは、グルタチオントリペプチド、γ−グルタミルシステイニルグリシンの二量体であり、前記トリペプチドの二分子が、システイン残基間のジスルフィド共有結合を介して互いに連結されている。トリペプチドグルタチオン（還元型グルタチオン、ＧＳＨ）及びその二量体ＧＳＳＧは、いずれも天然の代謝物であり、ヒト及び動物の組織並びに生物体液中に存在する［Isabella Dalle-Donne et al. S-glutathionylation in protein redox regulation/Free Radical Biology & Medicine, 2007, V. 43, pp. 883-898；Калинина Е.В. и др. Роль глутати
она, глутатионтрансферазы и глутаредоксина
в регуляции редокс-зависимых процессов / Успехи биологической химии, 2014, Т. 54, с. 299-348］。
【０００４】
本技術分野において、酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）自体が、様々な薬理活性を有することが知られている。特に、抗ウィルス、抗細菌、抗腫瘍、抗線維化の作用を含む身体の複合的な保護反応を制御する広範なサイトカインの産生を向上させる酸化グルタチオンの能力が示されている。
【０００５】
したがって、ロシア特許第２０８９１７９（Ｃ１）号、１９９７年９月１０日公開］、及び国際公開第９７２１４４４（Ａ１）号、１９９７年６月１９日公開］には、サイトカイン及び造血因子の内因性産生の刺激が適切である腫瘍学的疾患、感染性疾患、免疫性疾患、新生物性疾患、及び血液学的疾患の治療のための、酸化グルタチオン及びその医薬組成物の使用が開示されている。
【０００６】
ロシア特許第２２０６３３４（Ｃ１）号、２００３年６月２０日公開］、ロシア特許第２２０８４５２（Ｃ１）号、２００３年７月２０日公開］、及びロシア特許第２２０８４５３（Ｃ１）号、２００３年７月２０日公開］には、それぞれ、環境の熱効果に対する、呼吸ガス媒体の圧力上昇に対する、及び動揺病に対する耐性（許容度）を高めるための、酸化グルタチオンを含む医薬組成物の使用が開示されている。
【０００７】
酸化グルタチオンの剤形は、使用が認可されており、免疫調節性の肝保護的造血性効果を、さらには体内での酸化還元プロセスを制御する薬理学的効果を呈す［http://www.rlsnet.ru/tn_index_id_10764.htm］。
【０００８】
本技術分野では、サイトカイン及び／又は造血因子の内因性産生の制御、さらには正常細胞及びトランスフォーム細胞における代謝、増殖、分化、及びアポトーシスのプロセスの制御を提供し、癌疾患、感染性疾患、免疫性疾患、血液学的疾患、虚血性疾患、神経異
栄養性（neurodystrophic）疾患、代謝性疾患の治療に用いられる、酸化グルタチオン又
はその医薬的に許容される塩と白金又はパラジウム化合物との複合体（特に、酸化グルタチオンの二ナトリウム塩とシス−ジアミノジクロロ白金から成る複合体）の開発も知られている［ロシア特許第２１４４３７４（Ｃ１）号、２０００年１月２０日公開；ロシア特許第２１５３３５０（Ｃ１）号、２０００年７月２７日公開；米国特許第６，３１２，７３４（Ｂ１）号、２００１年１１月６日公開］。
【０００９】
加えて、グルタチオンジスルフィドを含む混合剤も知られている。
【００１０】
したがって、文書［特許出願国際公開第１９９８０３０２２８（Ａ１）号、１９９８年７月１６日公開］には、インフルエンザウィルス感染症の治療のための、酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）の単独での、又はグルタチオンの還元型（ＧＳＨ）と組み合わせての、又はアスコルベート−２−ホスフェートと組み合わせての、又はＮ−アセチル−Ｌ−システインと組み合わせての使用が開示されている。
【００１１】
ロシア特許第２４８２８６８（Ｃ１）号、２０１３年５月２７日公開］には、二ナトリウム塩の形態のグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）と、ナトリウム塩の形態のリポ酸、並びにパラジウム、銅、及び還元グルタチオン（ＧＳＨ）によって形成された配位化合物との組み合わせが記載されており、これは、血糖降下作用、コレステロール低下作用、脂質低下作用、及び／又は抗酸化作用を有する。
【００１２】
最も近い類似体は、ロシア特許第２１５３３５１（Ｃ２）号、２０００年７月２７日公開、に開示されている薬物である、酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）及びその医薬的に許容される塩を延長剤（prolongator）と組み合わせて含む医薬組成物であり、この組成物は
、サイトカイン及び造血因子の内因性産生を制御する。アスコルビン酸、ジメチルスルホキシド、イノシン（ヒポキサンチン−９−Ｄ−リボフラノシド）、シスタミン（２，２’−ジチオビス［エチルアミン］）、白金化合物（例えば、塩化白金）が、酸化グルタチオンの作用の延長剤として用いられる。
【００１３】
前記既知薬物、さらには上述したすべての剤の欠点は、いくつかの因子に起因する医学における使用の制限である。特に、ＧＳＳＧは、投与後５〜１０秒の範囲内という非常に短い半減期を有しており、このことによって、薬物の所望される治療効果を得るための投与の正確な場所を特定するために、医療関係者にある程度のトレーニング及び適切な資格が必要となる、又は用量及び投与回数を増やすことが必要となる。前記問題は、ロシア特許第２１５３３５１号に記載の数多くの延長化合物を用いることによって部分的に解決されるが、この場合、患者にとってのその剤の潜在的な危険性が増加し、ＧＳＳＧと延長剤との組み合わせを注意深く選択することが必要となる。複合的な治療法におけるＧＳＳＧ及び延長剤の組み合わせと他の薬物との混合による、又は逐次による使用では、さらに、実施される治療法の毒性プロファイルに負の変化を起こすことなく期待される治療効果を得るために、薬物動態の類似性を考慮することが必要となる。ＧＳＳＧといずれかの延長剤との組み合わせの開発では、追加の処理装置の使用、原薬及び対応する剤形の製造プロセスにおいて追加の工程を含めること、並びに賦形剤のリストの拡張が必要となる。酸化グルタチオンベースの薬物の使用における、その生物活性、治療法の有効性及び安全性を低下させ、薬物の治療有効性に悪影響を及ぼす病理過程における代謝の特徴に関連する既存の制限にも関わらず、ＧＳＳＧは、薬理学的ソリューションにおける議論の余地のない興味の対象である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、高い有効性、及び様々な薬物療法剤群からの薬理活性分子に対する増
強作用を有する新規な医薬組成物を提供することである。特に、本目的は、より少ない用量を用いて、必要とされる治療効果を、それを必要とする患者に吸入、経腸、非経口によって、単独及び他の薬理活性物質と組み合わせての単一剤形の両方での外用投与で投与された場合に得ることを可能とする目的で、薬物動力学を最適化し、最終的には、ＧＳＳＧの薬物動力学を最適化することである。薬理活性物質は、薬物動力学及び／若しくは薬物動態の最適化、並びに／又は毒性の低下が実現されることになる、抗微生物薬及び抗ウィルス薬、抗凝固剤、第Ｘａ因子阻害剤；細胞膜イオンチャネルの作用の修飾剤；他の医薬品を含むいかなる薬物療法剤群から選択されてもよい。
【００１５】
医薬組成物及び医薬の組み合わせの両方が、追加の賦形剤を含む医薬として用いられてよい。
【００１６】
本発明の技術的な結果は、単一又は合計用量を減少させ、したがって、薬理活性物質の確立された治療用量での用量関連毒性を低下させること；様々な薬物療法剤群からの治療活性剤の有効性を向上させ、それに応じて、単一又は合計用量を減少させ、したがって、用量関連毒性を低下させることである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
前記技術的結果は、単一又は合計用量の減少が確立され、それに応じて、用量関連毒性が低下される、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）又はその医薬的に許容される有機若しくは無機塩とグルタチオンジスルフィドＳ−オキシド（ＧＳ（Ｏ）ＳＧ）又はその医薬的に許容される有機若しくは無機塩との治療有効量の組み合わせを、医薬的に許容される賦形剤及びいずれかの薬物療法剤群からの薬理活性分子と共に含む薬物である新規な医薬組成物を提供することによって実現される。
【００１８】
典型的には、薬理活性化合物は、薬物動力学及び／若しくは薬物動態の最適化、並びに／又は毒性の低下が実現されることになる以下の薬物療法剤群から選択される：
−  抗凝固剤、第Ｘａ因子阻害剤、特に、アミジン塩酸塩；
−  抗微生物薬及び抗ウィルス薬、特に、モキシフロキサシン、抗狂犬病ワクチンの抗原性物質、インターフェロンα；
−  細胞膜カルシウムチャネルの作用の修飾剤、特に、ニフェジピン。
【００１９】
通常、グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドの量は、全組成物に対して０．０１〜１０重量％である。
【００２０】
また、組成物は、さらに、好ましくは白金族からの、さらにより好ましくは白金であるｄ−金属（Ｍｅ）であって、Ｍｅ−Ｓ−グルタチオン結合を含有する配位化合物の形態で示される、ｄ−金属を含んでいてもよい。
【００２１】
配位化合物として組成物に添加されるｄ−金属の量は、任意のｄ−金属に対する生理学的に許容される値を超えない。しかし、治療効果を実現するために配位化合物の形態で大量の金属を添加する必要がある場合は、この値を超えてもよい。
【００２２】
組成物中のｄ−金属の量は、組成物１ｋｇあたり１×１０−１０モル〜１×１０−３モルまで変動し、好ましくは、組成物１ｋｇあたり１×１０−５モルである。
【００２３】
提供される組成物は、外用、吸入、経腸、又は非経口投与用に調製され得る。
【００２４】
成分の特性
グルタチオンジスルフィド（又は酸化グルタチオン、ＧＳＳＧ）は、トリペプチドグル
タチオン、γ−グルタミルシステイニルグリシンの二量体であり、前記トリペプチドの二分子が、システイン残基間のジスルフィド共有結合を介して互いに連結されている。本発明によると、アルカリ金属又はアルカリ土類金属との塩の形態であるグルタチオンジスルフィドは、本技術分野において公知のいかなる方法によって調製されてもよい［ロシア特許第２１４４３７４（Ｃ１）号、２０００年１月２０日公開］。
【００２５】
グルタチオンジスルフィドＳ−オキシド（グルタチオンチオスルフィネート又はＧＳ（Ｏ）ＳＧとも称される）は、以下の構造を有する：
【００２６】
【化１】
0006798047.tif 000002
【００２７】
グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドは、酸化グルタチオンに類似の薬物動態を特徴とし、したがって、それは、酸化グルタチオン分解酵素の負の制御因子であり、したがって、それは、酸化グルタチオンの薬物動力学を最適化し、酸化グルタチオンの生物学的効果を増強するＧＳＳＧに対する延長剤として作用するものであり、それによって、ＧＳＳＧの薬物動力学が最適化され、所望される治療効果を得るためにより少ない用量のＧＳＳＧを使用することが可能となる。より低いレベルへ移行することは、薬物の活性成分の毒性を低下させるための重要な条件の１つである。したがって、グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドは、薬物動態、薬物動力学を最適化し、ＧＳＳＧ使用の安全性を高めるものであり、これらはすべて、ＧＳＳＧの場合と比較して、実際の治療にグルタチオンジスルフィドＳ−オキシド及びＧＳＳＧを組み合わせて使用する場合の薬剤経済学的基準最適化のための条件である。
【００２８】
グルタチオンジスルフィド及びグルタチオンジスルフィドＳ−オキシドの分子は、薬物の活性成分とファンデルワールス相互作用などの弱い分子間相互作用を形成することができ、薬物動態及び／又は薬物動力学及び／又は毒性に影響を与えることによって、その治療特性を最適化する。
【００２９】
「配位化合物」とは、錯化剤と称される中心原子（イオン）の周りにある特定の順序で配置された（配位された）リガンドと称されるイオン又は中性分子の群を含有する化合物を意味する。
【００３０】
「ｄ−金属」、「遷移金属」、及び「遷移元素」は、同一であり、電子がｄ−サブレベルを満たしている周期系の化学元素を意味する。
【００３１】
「医薬的に許容される賦形剤」は、外用、吸入、経腸、非経口、又は他の投与手段のための本発明の組成物を含む医薬を得るのに適する、当業者に公知の物質である。例えば、賦形剤として、公知の医薬的に許容されるいずれの無機又は有機キャリア、保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、香味剤、浸透圧を制御するための塩、緩衝剤、矯味剤、又は酸化防止剤、及び他の必要な成分が用いられてもよい。
【００３２】
「医薬的に許容される」とは、患者に投与された場合に毒性効果又は他の望ましくない効果を引き起こさない化合物を意味する。
【００３３】
「治療有効剤」とは、治療目的で用いられるいかなる物質をも意味する。
【００３４】
「患者」とは、何らかの方法でその身体に、組成物、又は組成物と公知の薬理活性化合物との、特に、第Ｘａ因子阻害剤のアミジン塩酸塩；抗微生物剤のモキシフロキサシン、抗狂犬病ワクチンの抗原性物質、抗ウィルス剤のインターフェロンα；カルシウムチャネル阻害剤のニフェジピンとの組み合わせが投与される、ヒト若しくは他の哺乳類、鳥類、両生類、又は魚類を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】３７℃の温度で保存された様々な溶液中に溶解されたモノクローナル抗体の製剤の電気泳動図を示す。レーン１−  サイズ標準（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）染色済みタンパク質ラダー）；レーン２−  サンプル２；レーン３−  サンプル３；レーン４−  サンプル４；レーン５−  サンプル１。
【図２】生理学的条件を模倣した条件下での血清サンプル中の保存物から得たモノクローナル抗体の構造中間体に対するＨＰＬＣデータである（（１）−  サンプル１；（２）−  サンプル２；（３）−  サンプル３；（４）−  サンプル４）。
【図３】平均ＩＮＲ（１）−  表１から得たアミジン塩酸塩物質の場合、及び（２）−  表２から得たアミジン塩酸塩物質とアジュバントとの混合物の場合（アジュバントは、グルタチオンジスルフィドとグルタチオンジスルフィドＳ−オキシドとの組み合わせを含む組成物である）。
【図４】Ｃａ２＋イオンを含有する媒体中（１）、（２）、及びカルシウムを含有しない媒体中（３）、（４）での腹腔マクロファージにおける、ＡＴＰ（１）、（３）、及びタプシガルジン（２）、（４）によって誘導されたＣａ２＋シグナル。縦軸−  サイトゾル中のＣａ２＋の濃度（ｎＭ）、横軸−  経過時間（分）。
【図５】生理食塩水中（１）又は公称カルシウム非含有媒体中（２）、（３）でのマクロファージにおける、非刺激時（at rest）の［Ｃａ２＋］ｉ、並びに２００μＭのＡＴＰ（１、２）及び０．５μＭのタプシガルジン（ＴＧ）（３）によって誘導されたＣａ２＋シグナルに対するグルタチオンジスルフィドの効果。
【図６】非刺激時の細胞内カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉ及びＡＴＰによって誘導されたＣａ２＋シグナルに対する例３の組成物（製剤）の効果。製剤は、選択的カルシウムチャネル阻害剤ニフェジピンの阻害効果を打ち消しており（１）、薬物自体の効果は、還元剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）によって抑制されている（２）。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明を、本質的に例示的であり、請求される請求項の範囲をまったく限定するものではない本発明の具体的な実施形態によって説明する。
【００３７】
略語：
ＧＳＨ−  グルタチオン（還元グルタチオン）、
ＧＳＳＧ−  酸化グルタチオン（グルタチオンジスルフィド）、
ＧＳＯ３Ｈ−  グルタチオンスルホン酸、
ＧＳ（Ｏ）ＳＧ−  グルタチオンジスルフィドＳ−オキシド又はスルホキシド；
ＧＳ（Ｏ２）ＳＧ−  グルタチオンジスルフィドＳ−ジオキシド；
ＨＰＬＣ−  高速液体クロマトグラフィ；
ＰＡＡＧ−  ポリアクリルアミドゲル；
ＳＤＳ−  ドデシル硫酸ナトリウム
【００３８】
組成物の作製方法
方法Ａ
Ｌ−グルタチオンから誘導したグルタチオンジスルフィドのナトリウム塩の溶液に（例２）、手順（例１）に従って合成したグルタチオンジスルフィドＳ−オキシドを添加した。グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドの量は、全組成物に対して０．１〜１０重量％であってよい。実際の実施形態では、特に例３及び４では、グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドの量は、全組成物の重量に基づいて、それぞれ２％及び４％であった。提供された方法により、グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドの含有量を高い精度で制御することが可能となる。
【００３９】
方法Ｂ
水酸化ナトリウム水溶液中のグルタチオンジスルフィドナトリウム塩の得られた溶液に、低下された温度で、通常は０〜５℃で、過剰の過酸化水素を添加して、グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドをｉｎ  ｓｉｔｕで生成した。１つの実施形態（例５）では、＋３℃以下の温度で、６％の過酸化水素の１２７ｇを添加した。グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドの量は、全組成物に対して５重量％であった。
【００４０】
方法Ａ又はＢによって得た組成物は、タンパク質のジスルフィド結合の形成及び安定性に影響を与える能力を特徴とし（例５及び１２）、したがって、タンパク質の天然のコンフォメーションの、すなわち、タンパク質が機能活性を保持するコンフォメーションの、特に、ジスルフィド結合を介して連結して治療活性を有する機能的活性分子となっている２つの重鎖及び２つの軽鎖のペプチド鎖から成るモノクローナル抗体であるタンパク質製品に代表される薬物のコンフォメーションの形成及び安定化を可能とするタンパク質のフォールディングに影響を与える能力を特徴とする（例５）。
【００４１】
方法Ａ又はＢによって得た組成物は、生体異物解毒の第２相の酵素発現を増加させる能力を特徴とし（例１３）、それによって、組成物は、単独で毒性修飾剤（toxicomodifying agent）として、すなわち、投与された薬物療法剤の複合的な用量依存性の毒性副作用
を含む様々な化学分子の毒性効果を低下させる剤として使用することが可能となる。
【００４２】
方法Ａ又はＢによって得た組成物は、用量の減少、及びそれに応じた用量関連毒性の低下が確立される他の公知の薬理活性で広く用いられている治療分子、特に、抗凝固剤、第Ｘａ因子阻害剤のアミジン塩酸塩（例８）；抗生物質のモキシフロキサシン；抗ウィルス剤、抗狂犬病ワクチンの抗原性物質、及びインターフェロンα（例９、１０、１４）；カルシウムチャネル阻害剤のニフェジピン（例１１）、と合わせた医薬の作製のために、組み合わせて用いることができる。
【実施例】
【００４３】
例１．グルタチオンジスルフィドＳ−オキシド（ＧＳ（Ｏ）ＳＧ）の作製方法
還元Ｌ−グルタチオン物質（ＧＳＨ）１００ｇの１００ｍｌの水による溶液に、１５０ｍｌの酢酸中３０％過酢酸溶液を、撹拌しながら、０〜５℃の温度で３０〜４０分間かけて滴下した。滴下後、反応物を５℃以下の温度で１時間にわたって撹拌し、その後、凍結し、２４時間にわたって凍結乾燥した。１１０ｇの物質が白色フォームとして得られ、それは、ＨＰＬＣ分析によると、成分の混合物を含有している（４０％  ＧＳＯ３Ｈ、５５
％  ＧＳ（Ｏ）ＳＧ、５％  ＧＳ（Ｏ２）ＳＧ）。
【００４４】
凍結乾燥物を４００ｍｌの水に溶解し、分取用ＨＰＬＣ（カラムＹＭＣ−Ａｃｔｕｓ  Ｔｒｉａｒｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８−Ｓ  ５０×２５０ｍｍ、溶離液は水）を用いて精製し、９５％より高い純度の表題の化合物を含有する画分を１つにまとめ、蒸発させて体積を７００ｍｌとし、凍結乾燥した。４２ｇの所望される化合物グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドを（ジアステレオマー混合物として）、９５＋％の純度（ＨＰＬＣ）で得た。
【００４５】
例２．酸化グルタチオン（グルタチオンジスルフィド）の作製
７Ｌの水による２７６０ｇの還元Ｌ−グルタチオンの懸濁液に、２２４５ｇの１６％水酸化ナトリウム溶液を、１７℃以下の温度で撹拌しながら添加した。グルタチオンが完全に溶解した後、混合物を冷却し、２５４６ｇの６％過酸化水素を、３０〜５０ｍｌ／分の速度で、撹拌しながら＋１５℃以下の反応物温度で添加した。過酸化物の添加後、得られた溶液を、所定の温度でさらに１時間にわたって撹拌した。反応の完了後（ＨＰＬＣで制御）、１１．５Ｌの水に２．９５ｋｇのグルタチオンジスルフィド二ナトリウム塩を含有する溶液が得られ、３℃に冷却した。生成物、グルタチオンジスルフィド二ナトリウム塩の化学純度は、９８．５％超であり（ＨＰＬＣで制御）、生成物単離のための追加の手順の必要はない。
【００４６】
例３．あるグルタチオンジスルフィドＳ−オキシド含有量を有するグルタチオンジスルフィドの組成物（薬物）の作製
例２で作製したグルタチオンジスルフィド二ナトリウム塩（１１．５Ｌの水に２．９５ｋｇ）に、６０ｇの例１に従って得たグルタチオンジスルフィドＳ−オキシドを、３〜５℃の温度で、５分間にわたって充分に混合しながら添加し、この溶液を、１２０分間にわたって５℃の温度で放置し、その後凍結乾燥した。
【００４７】
例４．あるグルタチオンジスルフィドＳ−オキシド含有量を有するグルタチオンジスルフィドの組成物（薬物）の作製
１２０ｇの例１に従って作製したグルタチオンジスルフィドＳ−オキシドを、例２で作製したグルタチオンジスルフィド二ナトリウム塩（１１．５Ｌの水に２．９５ｋｇ）に、５分間にわたって充分に混合しながら添加し、この溶液を、１２０分間にわたって５℃の温度で放置し、その後凍結乾燥した。
【００４８】
例５．あるグルタチオンジスルフィドＳ−オキシド含有量を有するグルタチオンジスルフィド二ナトリウム塩の組成物の作製
７Ｌの水による２７６０ｇの還元Ｌ−グルタチオンの懸濁液に、２２４５ｇの１６％水酸化ナトリウム溶液を、１７℃以下の温度で撹拌しながら添加した。グルタチオンが完全に溶解した後、混合物を冷却し、２５４６ｇの６％過酸化水素を、３０〜５０ｍｌ／分の速度で、撹拌しながら＋１５℃以下の反応物温度で添加した。過酸化物の添加後、得られた溶液を、所定の温度でさらに１時間にわたって撹拌した。反応の完了後（ＨＰＬＣで制御）、反応物を３℃に冷却した。生成物、グルタチオンジスルフィド二ナトリウム塩の化学純度は、９８．５％超であった（ＨＰＬＣで制御）。
【００４９】
次に、追加の１２７ｇの６％過酸化水素を、３０〜５０ｍｌ／分の速度、＋３℃以下の温度で添加した。反応物を、１時間にわたって＋３℃で放置し、次に凍結乾燥した。
【００５０】
得られた組成物は、９５％のグルタチオンジスルフィド二ナトリウム塩、及び４．５〜５．０％のグルタチオンジスルフィドＳ−オキシド二ナトリウム塩（ＨＰＬＣで制御）を含有しており、生成物の追加の精製手順の必要はない。
【００５１】
例６．ある量のグルタチオンジスルフィドＳ−オキシド及びＰｔ−Ｓを含有するグルタチオンジスルフィドの組成物の作製
７Ｌの水による２７６０ｇの還元Ｌ−グルタチオンの懸濁液に、２２４５ｇの１６％水酸化ナトリウム溶液を、１７℃以下の温度で添加した。グルタチオンが完全に溶解した後、混合物を冷却し、０．５ｇのシス−白金を添加し、２５４６ｇの６％過酸化水素を、３０〜５０ｍｌ／分の速度で、撹拌しながら＋１５℃以下の反応物温度で添加した。過酸化物の添加の終了後、得られた溶液を、所定の温度でさらに１時間にわたって撹拌した。反応の完了後（ＨＰＬＣで制御）、１１．５Ｌの水に２．９５ｋｇのグルタチオンジスルフィド二ナトリウム塩を含有する溶液が得られ、３℃に冷却する。生成物、グルタチオンジスルフィド二ナトリウム塩の化学純度は、９８．５％超であり（ＨＰＬＣで制御）、生成物単離のための追加の手順の必要はない。溶液を３℃に冷却し、６０ｇのグルタチオンジスルフィドＳ−オキシドを添加し、５分間にわたって充分に混合し、この溶液を、１２０分間にわたって５℃で放置し、次に凍結乾燥した。
【００５２】
例７．例５で得た組成物のフォールディング活性の分析
モノクローナル抗体製剤の組成：
モノクローナル抗体−  １０ｍｇ／ｍｌ；
グリシン−  ２ｍｇ／ｍｌ；
ポリソルベート８０−  ０．０５ｍｇ／ｍｌ；
塩化ナトリウム−  ７ｍｇ／ｍｌ；
クエン酸一水和物−  ２．１０１ｍｇ／ｍｌ；
注射用水
【００５３】
生理学的条件を再現するために、ヒト血清を、自由意志での同意書と共に得た。血清保存バンクの血清番号は、Ｏ−１７−１００２である。
【００５４】
リフォールディング実験では、以下を用いた：
サンプル１−  ５０μｌの量のモノクローナル抗体の製剤＋１ｍｌの血清Ｏ−１７−１００２の組成物
サンプル２−  ５０μｌの量のモノクローナル抗体の製剤＋０．２ｍＭの例３で得た組成物の＋１ｍｌの血清Ｏ−１７−１００２の組成物
サンプル３−  ５０μｌの量のモノクローナル抗体の製剤＋０．２ｍＭの例４で得た組成物＋１ｍｌの血清Ｏ−１７−１００２の組成物
サンプル４−  ５０μｌの量のモノクローナル抗体の製剤＋０．２ｍＭの例５で得た組成物＋１ｍｌの血清Ｏ−１７−１００２の組成物
【００５５】
サンプル１及び２のバイアルを、３７℃の温度で保存した。２４時間後、バイアルをサーモスタットから取り出し、ヒト体内の生理学的環境を模倣した条件下、異なる温度での保存中のモノクローナル抗体の安定性について分析した。
【００５６】
安定性実験の結果は、まず、還元性条件下、ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＡＧ）中での電気泳動分離によって分析した。
【００５７】
電気泳動は、１５％ＰＡＡＧにおいて、変性条件中、サンプル濃縮工程に等速電気泳動（ＩＴＰ）機構を用いた不連続（段階的）緩衝系（ディスク電気泳動）で行った。サンプルは、以下の方法で調製した：遠心分離によって細胞を沈澱させ、２００μＬの緩衝液（０．２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５；０．２ＭのＮａＣｌ；０．０１Ｍの酢酸ナトリウム；０．０１Ｍのｂ−メルカプトエタノール、及び５％のグリセロール）に再懸濁し、続いて２分間煮沸した。
【００５８】
電気泳動を行うために、いくつかの緩衝溶液の系を用いた：カソード緩衝液は、Ｔｒｉｓベース  ０．１Ｍ；トリシン  ０．１Ｍ；ＳＤＳ  ０．１％（ターミナルアニオン−トリシン）であり；アノード緩衝液は、トリスベース  ０．２Ｍ  ｐＨ８．９（リーディングアニオン−Ｃｌ−）であった。濃縮ゲル  Ｔ＝２．５〜３％、分離ゲル  Ｔ＝５〜１５％及びＣ＝２〜５％（Ｔは、ゲル中のモノマーの相対的含有率であり、Ｃは、合計モノマー中の架橋剤の含有率である）。細胞ライセートの電気泳動は、変性条件下、２％のＳＤＳ中で行った。
【００５９】
タンパク質製剤の電気泳動図（図１）を、ＩｍａｇｅＪプログラムを用いて分析した。このプログラムは、様々な実験からのデータの濃度測定分析用に設計されている。レーンをマニュアルモードでマークし、次に、各レーン内のタンパク質に対応するバンドをマークした。このプログラムは、バックグラウンドを差し引いて各バンドの濃さを評価するものであり、それによって、標的タンパク質の純度を算出することが可能となる。
【００６０】
模擬生理学的条件下での保存から生じたモノクローナル抗体の構造中間体を調べるためのＨＰＬＣ条件
クロマトグラフ  Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−２０「Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ」
カラム  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ「Ｊｕｐｉｔｅｒ」Ｃ１８、５μｍ、３００Ａ、２５０×４．６
検出周波数＝２１０ｎｍ
注入量＝２５μｌ
流速＝１．０ｍｌ／分
カラム温度＝３５℃
セル検出器温度＝３５℃
移動相：
Ｅｌｕｅｎｔ  Ａ．３０％アセトニトリル＋０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
Ｅｌｕｅｎｔ  Ｂ．７０％アセトニトリル＋０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
ランタイム＝４７分
勾配プログラム：
０〜１分間  ４４％アセトニトリル
１〜５分間  ４８%アセトニトリル
５〜２０分間  ５０％アセトニトリル
２０〜３０分間  ５３．４％アセトニトリル
３０〜３５分間  ６０％アセトニトリル
３５〜３７分間  ６０％アセトニトリル
３７〜４０分間  ４４％アセトニトリル
４０〜４７分間  ４４％アセトニトリル
【００６１】
得られたデータを図２に示すが、そこから示唆されることは、例３、４、５に従って得た組成物を含有する血清サンプル（それぞれ、図２（２）、図２（３）、図２（４））中には、前記組成物を含有しないサンプル（図２（１））とは対照的に、抗原を認識することのできない損なわれた構造のモノクローナル抗体の画分が存在しなかったということである。
【００６２】
例８．グルタチオンジスルフィド及びグルタチオンジスルフィドＳ−オキシドを含む組成物と抗凝固剤、第Ｘａ因子阻害剤のアミジン塩酸塩との併用
本出願の例３に従って得た組成物を、抗凝固剤の第Ｘａ因子阻害剤である薬理活性剤アミジン塩酸塩の治療有効性を高める能力について調べた。試験物質のアミジン塩酸塩（例えば、ユーラシア特許第０１５９１８（Ｂ１）号、２０１１年１２月３０日公開の例２に従って得られる）又はアミジン塩酸塩物質とアジュバント（アジュバントは、本出願の例
３で得た組成物であった）との混合物を、尾の基部へ１／３近づいた領域の外側尾静脈に、３０Ｇ針を取り付けた１ｍｌのインスリンシリンジで静脈内投与した。各動物に対する個々の投与量は、体重に基づいて算出し、各々の体重測定後に補正した。物質の投与は１回とした。前記混合物を、アミジン塩酸塩物質とアジュバントとの混合物の動物への静脈内投与用に調製した。この目的のために、アミジン塩酸塩物質及びアジュバントを、別々に蒸留水に溶解し、次にこれらの溶液を混合した。溶液の調製は、動物への投与の直前に行い、調製後の１０分以内に注射した。ラットに対する投与量は、０．３１〜０．４２ｍｌであった。
【００６３】
血液のサンプリングは、４３℃の温度の湯浴で少なくとも１５分間ラットの尾の予備加温を行って、麻酔を用いずに、静脈内投与部位より上の外側尾静脈（尾の長さの１／３〜２／３）から行った。血液量０．３６ｍｌを、０．０４ｍｌの０．１１Ｍクエン酸ナトリウム溶液を入れたプラスチックチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆなど）に２３Ｇ針で採取して０．４ｍｌの体積とし、クエン酸ナトリウム対血液の比を１：９とした。サンプリング後の３０分以内に、血液を８０００ｒｐｍ（７０００ｇ）で１０分間遠心分離し、血漿を別のチューブに移し、２０℃、１２０００ｒｐｍ（１５０００ｇ）で１０分間再度遠心分離して、乏血小板血漿を得た。１１０μｌの量で得られた血漿を、プラスチックチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆなど）に注ぎ入れ、−２０℃で凍結した。サンプリングは、各ラットに対して６回行った。
【００６４】
国際感受性指標（ＩＳＩ）に従って認証されたカルシウムイオンを添加した水溶性の凍結脱水トロンボプラスチン、Ｒｅｎａｍｐｌａｓｔｉｎ（ＮＰＯ「ＲＥＮＡＭ」）を、この実験で用いた。
【００６５】
方法の原理：過剰の組織トロンボプラスチン及びカルシウムイオンがクエン酸血漿に添加されると、フィブリン血栓の形成時間は、外因性及び共通凝固経路の因子、因子Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘの活性にのみ依存する。カルシウムを含むトロンボプラスチンの血漿への添加の瞬間からフィブリン血栓の形成までの時間を測定する。
【００６６】
アッセイ：８ｍｌの蒸留水を、凍結乾燥したＲｅｎａｍｐｌａｓｔｉｎを入れたバイアルに添加し、振とうして溶解する。アッセイの前に、試薬を３７℃で３０分間加熱する。５０μｌのクエン酸血漿を分析器のキュベットに添加し、３７℃で正確に１〜２分間インキュベートする。次に、１００μｌのｒｅｎａｍｐｌａｓｔｉｎを添加し、ＡＢＷ  Ｍｅｄｉｚｉｎ  ｕｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨのＭｅｒｌｉｎ  ＭＣ１  Ｃｏａｇｕｌｏｇｒａｍ  Ａｎａｌｙｚｅｒで凝固時間を秒で記録する。
【００６７】
得られた結果を、国際標準比（ＩＮＲ）：
ＩＮＲ＝ＰＲＩＳＩ、
で表し、ＩＳＩは、Ｒｅｎａｍｐｌａｓｔｉｎの国際感受性指標であり、添付のパスポートに示されているはずである。ＰＲ−プロトロンビン比：
ＰＲ＝ＰＴＢ／ＰＴ１００％、
ＰＴＢは、試験サンプルの血漿のプロトロンビン時間（秒）であり、ＰＴ１００％は、物質を投与する前の任意の動物に対して得られたサンプルの平均プロトロンビン時間である。
【００６８】
実験パラメータの測定結果を、実験群全体で平均し、Ｍ±ｍとして表すが、Ｍは、群平均であり、ｍは、標準偏差である。群間の有意差は、正規分布サンプルに対しては、ｐ＜０．０５でのスチューデントパラメトリックｔ検定を用いて、非正規分布に対しては、ｐ＜０．０５でのマン・ホイットニーのノンパラメトリックＵ検定を用いて判定する。
【００６９】
得られた結果を、表１及び２、並びに図３に示す。表１及び図３（１）は、アミジン塩酸塩物質のみで得られたデータを示し、表２及び図３（２）は、アミジン塩酸塩物質とアジュバントとの混合物で得られたデータを示す。
【００７０】
【表１】
0006798047.tif 000003
【００７１】
【表２】
0006798047.tif 000004
【００７２】
得られた結果は、本発明の組成物が他の治療活性剤の有効性を高めることができることを示している。
【００７３】
例９：グルタチオンジスルフィド及びグルタチオンジスルフィドＳ−オキシドの組成物と組み合わせたモキシフロキサシンを含む組み合わせの抗微生物作用の実験
本出願の例３、４、及び５に従って得た製剤について調べた。
【００７４】
製剤の抗微生物作用を、グラム陰性：大腸菌（Escherichia coli）ＡＴＣＣ２５９２３、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３、臨床分離株アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）、並びにグラム陽性
細菌：リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）ＥＧＤ（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６７９）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ
２５９２２、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウスであるＭＲＳＡ  ＡＴＣＣ
３３５９１、に対して調べた。
【００７５】
微生物を、２．１％ミューラーヒントンブロスＭ３９１（Ｏｘｏｉｄ、ドイツ）中、振とう器上で連続的に振とうしながら３７℃で一晩（１６〜１８時間）培養した。この後、細菌懸濁液のアリコートを、一晩の培養物から取り出し、１５ｍｌの新しい無菌２．１％ミューラーヒントンブロスに移し、次に振とう器上で、３７℃で２．５〜３時間インキュベートした。続いて、得られた懸濁液の光学密度（ＯＤ）を、ＤＵ−５０分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ、米国）上、６２０ｎＭの波長で、無菌２．１％ミューラーヒントンブロスに対して測定し、１ｍｌあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を以下の式によって特定した：１×ＯＤ６２０＝２．５×１０８ｃｆｕ／ｍｌ［Protocols in antimicrobial peptides. W. Shafer Ed. Springer-Verlag New York, LLC, 7/8/1997］。この計算に基づいて、細菌懸濁液を、無菌２．１％ミューラーヒントンブロスを用いて１×１０５ｃｆｕ／ｍｌの濃度に希釈した。
【００７６】
９６ウェルの滅菌Ｕ底プレートを用いた（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、ドイツ）。試験製剤の２倍の段階希釈物を、ミューラーヒントン培地で調製した（各製剤に対して、５０μｌ／サンプルの量で８段階の希釈物）。さらに、５０μｌの細菌懸濁液を、プレートのウェルに添加した（サンプル中の細菌の最終濃度は、０．５×１０５ｃｆｕ／ｍｌであった）。製剤の各希釈物に対して、５つの反復サンプルを調製した。
【００７７】
サンプルを入れたプレートを、サーモスタット中、３７℃で１８時間インキュベートした。
【００７８】
翌日に結果を記録した。プレートの対応するウェルでの微生物の増殖が目視で観察されなかった（完全に阻害された）ものである得られた物質の最低濃度を、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）として認めた。最終結果を、試験した各サンプルの各希釈物に対して５つの反復サンプルを各々で用いた５つの独立した実験からのデータに基づいて算出した。
【００７９】
製剤の抗微生物作用（ＡＭＡ）も、Ｌｅｈｒｅｒ教授、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、米国［Lehrer R.I. et al. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial poly-peptides / Journal of Immunological Methods, 1991, V.137, pp. 167-173］によって開発された、試験微生物を含有するアガロースゲル中での放射状拡散法によって特定した。微生物を、ダイズトリプシン加水分解物の３％溶液である培地中、３７℃で１６時間予備培養した。次に、微生物を含む培地のアリコートを、新しく調製した培地に別々に移し、３７℃で２．５時間インキュベートして、対数増殖期の中間の微生物を得た。各微生物の細胞数を、分光光度計上、６２０ｎｍで懸濁液の光学密度を
測定することによって評価した。４×１０６の微生物細胞を含有する懸濁液のアリコートを、０．１５ＭのＮａＣｌを含有しｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中の滅菌１％アガロース溶液の１０ｍｌと、４２℃で混合する。得られた混合物を、直径９０ｍｍの滅菌プラスチックペトリ皿に注ぎ入れ、固化するまで室温で放置する。ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液による製剤の段階希釈物である５μｌの量の分析サンプルを、アプリケータによって作製したウェル（直径３ｍｍ）に添加し、エアーサーモスタット中、３７℃で３時間インキュベートした。次に、６％ＴＧＳを含有する１％アガロースをプレートに注ぎ入れ、３７℃で１８時間インキュベートする。増殖阻害ゾーン（ウェル周囲の微生物のいないゾーン）の直径を、抗微生物作用の１慣用単位を０．１ｍｍとして取って、測定値からウェル自体の直径に相当する３０慣用単位を差し引くことによって測定する。用いた製剤の濃度は、６４μｇ／ｍｌ、３２μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌであった。
【００８０】
製剤の微生物の増殖を阻害する最小濃度（ＭＩＣ）を、ペプチド濃度に対する抗微生物作用の依存性の直線回帰、ｙ＝ａ＋ｂｘを構築することによって特定し、ｙは、抗微生物作用（ｃ．ｕ．）であり、ｘは、製剤の濃度である。ＭＩＣは、ｙ＝０の場合のｘの値、すなわち、ＭＩＣ＝−ａ／ｂであると見なした。
【００８１】
【表３】
0006798047.tif 000005
＃示した値の各々は、平均±平均の標準誤差である（ｎ＝２５）。
【００８２】
【表４】
0006798047.tif 000006
＃示した値の各々は、平均±平均の標準誤差である（ｎ＝２５）。
＊モキシフロキサシンのＭＩＣ（Ｎｏ．１３）に対して有意差、スチューデントｔ検定。
【００８３】
実施した実験から、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌の両方に対する本発明の組成物の高い抗微生物作用が実証されている。
【００８４】
例１０．グルタチオンジスルフィド及びグルタチオンジスルフィドＳ−オキシドを含有する例３で得た組成物の、ワクチン製剤中のアジュバントとしての使用
乾燥濃縮精製不活化細胞由来抗狂犬病ワクチン及び本出願の例３に従う組成物の組み合わせの調製
ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌの滅菌水酸化アルミニウム溶液を調製した。本出願の例３に従って得た組成物の１２ｇを、得られた溶液の６０ｍｌに添加した。得られた溶液を、細孔径０．４４μｍのフィルターに通すことによって滅菌した。０．５ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム濃度のＰＢＳ中、２０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌの濃度の希釈溶液（ＡＤ）を、得られた溶液から調製した。
【００８５】
得られた溶液を、０．５ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含むＰＢＳ中の例３に従う物質（本出願）の所定の濃度の溶液中、１：２００（マウスの５０％の保護と算出）及び１：１２００（マウスの２０％の保護と算出）に希釈したワクチンの調製に用いた。得られた溶液を、振とう器上（約１５０ｒｐｍ）、発泡しないようにしながら４℃で１時間インキュベートした。
【００８６】
乾燥濃縮精製不活化細胞由来抗狂犬病ワクチンの１：２００及び１：１２００希釈物を、参照サンプルとして用いた。
【００８７】
１回供給（one supply）の体重１３〜１５ｇであるＢＡＬＢ／ｓマウスを本実験の対象として用いた。
【００８８】
０．０３ｍｌ中に２０〜１００ＬＤ５０を含有する作業希釈を、狂犬病ウィルスのＣＶＳ試験株（狂犬病ウィルスで感染させたマウスの１０％脳懸濁液）の滴定の結果に基づい
て算出した。
【００８９】
マウスの最初のワクチン接種は、組成物の各希釈物に対して、１０体の計算から０．５ｍｌの腹腔内投与によって行った。
【００９０】
マウスの２回目のワクチン接種は、７日後、組成物の各希釈物に対して、１０体の計算から０．５ｍｌの腹腔内投与によって行った。
【００９１】
実験で用いる実際のウィルス投与量を決定するための、５６℃で３０分間不活性化した２％ウマ血清を添加したウィルスの作業（許容）希釈物、及び注射用水による３つの連続する１０倍希釈物の調製。
【００９２】
許容投与量の０．０３ｍｌ及びその１０倍希釈物を、一希釈あたり６体のマウスを用いて、ワクチン接種済みマウスと同時にコントロール群のマウスに脳内投与した。
【００９３】
動物のフォローアップ期間は、１４日間とした。実験結果の評価には、５〜１４日間で発症又は死亡したマウスも考慮に入れる。
【００９４】
リード・ミュンヒ法による結果の数値処理。
【００９５】
得られた結果を表５にまとめる。
【００９６】
【表５】
0006798047.tif 000007
【００９７】
示したデータから、グルタチオンジスルフィド及びグルタチオンジスルフィドＳ−オキシドの組み合わせを含有するワクチンが投与された場合に、動物の生存率が高いことが示される。これらの値は、参照サンプルの値と同等であり、ほとんどの場合では、参照サンプルよりも高い（細胞由来抗狂犬病ワクチンにおいて）。
【００９８】
例１１．例３で得たグルタチオンジスルフィド及びグルタチオンジスルフィドＳ−オキシドを含む組成物のカルシウムチャネル阻害剤の作用に対する効果
本実験の目的は、本出願の例３で得た組成物の、細胞膜イオンチャネルの作用及びカルシウムチャネル阻害剤の作用に対する効果を試験することである。
【００９９】
以下の化合物を、試験化合物として用いた：選択的カルシウムチャネル阻害剤ニフェジピン、グルタチオンジスルフィド（本出願の例２で調製）、及び本出願の例３に従う組成物（グルタチオンジスルフィドをグルタチオンジスルフィドＳ−オキシドと共に含む）。
【０１００】
本実験のための製剤の調製：
試験化合物及び組成物を、＋４℃で保存し、これらの物質を、実験の開始直前に脱イオン水（ｓｕｐｅｒ  Ｑ）に溶解した。調製した溶液を、＋４℃で５時間以下にわたって保存した。化合物を、実験すべき最終濃度まで細胞培養培地に添加した。
【０１０１】
製剤を、示した時間に対して１回細胞に添加した。
【０１０２】
用いた細胞株、培養条件：
実験は、培養常在腹腔ラットマクロファージに対して行った。常在マクロファージを、体重２００〜３００ｇのラットの腹膜腔から、既に報告されている方法によって単離した［Conrad R.E. Induction and collection of peritoneal exudate macrophages. Manual
of macrophages methodology/New York: Marcell Dekker pp.5-11;Randriamampita C. et al. Ionic channels in murine macrophages/Cell Biology, 1987, V.105, pp.761-769］。単離の直後、細胞は球形状であり、１０〜２０μｍの直径であった。細胞懸濁液を、１０×１０ｍｍの石英ガラスを含有する培養皿に入れた。ガラス上の細胞を、２０％ウシ血清、ブルタミン溶液（３％）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を添加した培地１９９（ｐＨ７．２）中、３７℃で１〜３日間培養した。α−ナフチルアセテートエステラーゼ染色から［Monahan R.A. et al. Ultrastructural localization of nonspecific esterase activity in guinea pig and human monocytes, macrophages and lymphocytes/Blood, 1981, V.58, pp.1089-1099］、単層中の細胞の少なくとも９６％がマクロファージであることが特定された。実験は、２〜３日間の細胞培養に対して、２０〜２２℃の室温で行った。
【０１０３】
細胞を含む石英ガラスを、以下のイオン組成（ｍＭ）の生理学的溶液で満たした実験チャンバーに入れた：ＮａＣｌ−１４０、ＫＣｌ−５、ＣａＣｌ２−１、ＭｇＣｌ２−１、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ−５；ｐＨ７．３〜７．４（Alonso-Torre, Trautmann, 1993）。
カルシウム非含有培地は、０ｍＭのＣａＣｌ２及び１ｍＭのＥＧＴＡを含有していた。
【０１０４】
本実験では、Ｓｉｇｍａからの試薬を用いた。タプシガルジン（５００μＭ）、ニフェジピン（２０ｍＭ）のストック溶液を、ジメチルスルホキシドで調製した。グルタチオンジスルフィド、及び例３に従う組成物（０．４５μｍｏｌ／ｍｌ）、ＡＴＰ（１００ｍＭ）のストック溶液を、水で調製した。
【０１０５】
実験モード：
細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］）を測定するために、Ｆｕｒａ−２ＡＭ蛍光プローブを用いた。マクロファージを、２μＭのＦｕｒａ−２ＡＭを含有する生理食塩水中、室温で４５分間インキュベートした（３７℃で発生するＦｕｒａ−２ＡＭミセルのエンドサイトーシスを防止するため）［Alonso-Torre S.R. et al. Calcium responses elicited by nucleotides in macrophages. Interaction between two receptor subtypes/The Journal of Biological Chemistry, 1993, V.268, pp.18640-18647］。
【０１０６】
着色した細胞を含むガラスを、生理食塩水で洗浄し、発光顕微鏡「Люмам−КФ」のテーブル上に位置する実験チャンバーに移した。Ｆｕｒａ−２の蛍光は、窒素レーザー
ЛГИ−５０３を用いて３３７ｎｍで励起した。レーザーを、対象に直接レーザービームを指向することができるように、実験チャンバーに対して３０°の角度で顕微鏡に沿って配置した。蛍光の強度を、スペクトロフォトメーダーСФН−１０を用いて５１０ｎｍで記録した。ФЭУ−７９からのシグナルを、特別に設計した増幅器で増幅し、オリジナルのソフトウェアを用いてコンピュータＩＢＭ  ＰＣに記録した。本実験では、１０×０．４０のレンズを用いた。所与の倍率において、４０〜５０の細胞が測光範囲の領域に入る。光焼け（photo-burning）を避けるために、測定は、対象への照射を２．５秒として２
０秒ごとに行う。ＡＴＰ及びＵＴＰが添加されると、細胞は、蛍光の最大値に到達するまで連続的に照射される。［Ｃａ２＋］の値は、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚの式から算出され［Grynkiewicz G. et al. А new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties/The Journal of Biological Chemistry, 1985, V.260, pp.3440-3450］：
［Ｃａ２＋］ｉ＝Ｋｄ×（Ｆ−Ｆｍｉｎ）／（Ｆｍａｘ−Ｆ）、
式中、Ｆは、観察された蛍光強度であり；Ｆｍａｘは、Ｃａ２＋で飽和された状態の染料の蛍光であり；Ｆｍｉｎは、Ｃａ２＋がまったく結合していない染料の蛍光（カルシウム非含有培地中）である。
【０１０７】
Ｆｕｒａ−２ＡＭ：Ｃａ２＋複合体の解離定数Ｋｄは、２０℃及びｐＨ７．１〜７．２において１３５ｎＭであり、Ｆｍａｘは、Ｃａ２＋を含有する培地中の細胞に１０μＭのイオノマイシン又は２５μＭのジギトニンを添加した後に測定した。ジギトニンで細胞を処理することにより、ミトコンドリア膜及び小胞体の透過性に影響を与えることなく、Ｃａ２＋イオンが細胞膜を自由に透過できるようになる。シグナルの安定化後、５ｍＭのＥＧＴＡを添加し、公称カルシウム非含有の培地での染料の蛍光（Ｆｍｉｎ）を特定する。マクロファージにＭｎＣｌ２の溶液（１００μＭ）を添加した後に、固有蛍光のレベルを差し引いた。Ｍｎ２＋は、Ｆｕｒａ−２との複合体からのＣａ２＋と置き換わり、Ｍｎ２＋との染料複合体の蛍光は、Ｃａ２＋とのＦｕｒａ−２複合体の蛍光よりも１００倍低い。Ｆｕｒａ−２の場合、Ｆｍｉｎ＝Ｆｍａｘ／３である。
【０１０８】
本実験では、２つの実験手法を用いた。第一に、生理食塩水中のマクロファージにおけるＡＴＰ、ＵＴＰ、タプシガルジン、又はシクロピアゾン酸（cyclopyasonic acid）（ＣＰＣ）によって引き起こされるＣａ２＋応答に対する薬理剤の効果について調べた。この剤を、外部媒体からのＣａ２＋の流入を反映するＣａ２＋シグナルの定常期の間に、アゴニストの作用の前又は後のいずれかに投与した。実験の第二の変型では、以下の実験スキーム（Ｃａ２＋非含有／Ｃａ２＋再導入プロトコル）を用いて、Ｃａ２＋の細胞内への流入を検出し、促進した。マクロファージを、公称カルシウム非含有媒体中でインキュベートし、次にアゴニストのうちの１つに曝露させて、細胞内貯蔵庫からのＣａ２＋動員を引き起こした。２ｍＭのＣａ２＋を外部媒体へ添加し、Ｃａ２＋濃度の生理学的勾配を復元した後、細胞内へのＣａ２＋の流入を反映する［Ｃａ２＋］の急速な増加が観察された。さらに、アゴニストの投与前に添加した薬理剤の効果を、Ｃａ２＋の投与前、又は外部環境からのＣａ２＋流入の進行中に調べた。
【０１０９】
ラットマクロファージにおけるＣａ２＋の細胞内濃度並びにＡＴＰ及びタプシガルジンによって誘導されるＣａ２＋シグナルに対する試験化合物の効果の結果：
２００μＭのＡＴＰをラット腹膜マクロファージのインキュベーション媒体に添加することによって、Ｐ２ｕ受容体活性化によって引き起こされる貯蔵庫からのＣａ２＋動員に主として伴う初期の短期ピークと、顕著な長期の「定常」フェーズとから成る２フェーズのＣａ２＋シグナルが引き起こされる。この定常フェーズは、外部媒体からのＣａ２＋の流入に起因し、Ｐ２ｕ及びＰ２ｚ受容体が同時に活性化されていることを反映しているものと推定される。図４（１）は、生理食塩水中の４０〜５０のマクロファージの集団における、細胞外ＡＴＰ（２００μＭ）によって誘導された特徴的なＣａ２＋シグナルを示す
。
【０１１０】
細胞外ＡＴＰの添加に応答して、［Ｃａ２＋］ｉは、基底レベル７５±１８ｎＭからピークの８２０±１０５ｎＭまで増加する。そして、ゆっくり減少する定常フェーズがそれに続き、その間において、ＡＴＰ添加の４分後の平均［Ｃａ２＋］ｉは、４６０±１１５ｎＭである。
【０１１１】
内質Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼの特異的阻害剤タプシガルジン（０．５μＭ）も、２フェーズのＣａ２＋シグナルを引き起こし、非常に速い貯蔵庫からのＣａ２＋動員に伴うピークと、外部環境からのＣａ２＋の貯蔵庫依存的流入を反映する長いフェーズとである。図４（２）は、生理食塩水中のマクロファージにおいてタプシガルジンによって誘導された典型的なＣａ２＋シグナルを示す。
【０１１２】
細胞内へのＣａ２＋流入フェーズを識別し、促進するために、カルシウム非含有媒体を用いた実験を行った。公称カルシウム非含有媒体（０ｍＭのＣａＣｌ２及び１ｍＭのＥＧＴＡ）中においてマクロファージを２００μＭのＡＴＰ（図４（３））又は０．５μＭのタプシガルジン（図４（４））で刺激した後、外部環境に２ｍＭのＣａ２＋を添加することによって、Ｃａ２＋流入を誘導した。
【０１１３】
図５は、生理食塩水中（１）又は公称カルシウム非含有媒体中（２）、（３）でのマクロファージにおける、非刺激時の［Ｃａ２＋］ｉ、並びに２００μＭのＡＴＰ（１）、（２）及び０．５μＭのタプシガルジン（３）によって誘導されたＣａ２＋シグナルに対するグルタチオンジスルフィドの効果を示す。
【０１１４】
得られたデータは、グルタチオンジスルフィドが、細胞内貯蔵庫からのカルシウム動員に起因して、［Ｃａ２＋］ｉを１８０±１９ｎＭまで増加させることができることを示している。細胞内カルシウム貯蔵庫の破壊によって、ＡＴＰの効果が低下される。タプシガルジンは、グルタチオンジスルフィドが貯蔵庫からカルシウムを動員する能力の効果を完全に反転させる。
【０１１５】
図６は、非刺激時の細胞内カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉ及びＡＴＰによって誘導されたＣａ２＋シグナルに対する本出願の例３に従う組成物（製剤）の効果を示す。製剤は、選択的カルシウムチャネル阻害剤ニフェジピンの阻害効果を打ち消しており（１）、製剤自体の効果は、還元剤ジチオスレイトールによって抑制されている（２）。
【０１１６】
得られたデータは、グルタチオンジスルフィドが、グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドと一緒になって、細胞内貯蔵庫からのカルシウム動員に起因して、［Ｃａ２＋］ｉを２４０±２８ｎＭまで増加させることができることを示している。細胞内カルシウム貯蔵庫の破壊によって、ＡＴＰの効果が低下される。グルタチオンジスルフィドは、グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドと一緒になって、媒体からの細胞へのカルシウム供給プロセスを安定化しており、このことは、このプロセスに対するカルシウムチャネル阻害剤ニフェジピンの効果の抑制として示されている。ジチオスレイトールは、カルシウムチャネルの働きに対するグルタチオンジスルフィドＳ−オキシドと一緒になったグルタチオンジスルフィドの安定化効果を打ち消した。
【０１１７】
したがって、グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドは、細胞に対するある特定の化合物の効果を高めることができ、実施した実験では、それはグルタチオンジスルフィドであり、グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドは、それに対する相乗効果剤として作用した。グルタチオンジスルフィドと組み合わせたグルタチオンジスルフィドＳ−オキシドは、他の化合物（実施した実験ではニフェジピンであった）の効果を、組成物がニフェジピン
のアンタゴニストとして及びニフェジピンの毒性を中和する対応策として作用する方向へと、低下又は阻害することができる。
【０１１８】
提示した例の結果から、グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドと組み合わせたグルタチオンジスルフィドは、高い生物活性を呈し、このことは、カルシウム動員作用の３０〜５０％の増加によって示される。細胞表面受容体及びカルシウムチャネルの作用を修飾するグルタチオンジスルフィドの能力を考慮すると、それは、細胞外及び細胞内受容体、細胞膜及び細胞内膜のキャリアタンパク質、ペプチド性の細胞外調節分子及び輸送分子、細胞骨格タンパク質、自己免疫反応；抗原の結合及び認識、エキソサイトーシス及びエンドサイトーシスのプロセス、ケモタキシス、ケモキネシス、細胞質分裂；細胞間、マトリックス細胞、及び体液性細胞の相互作用、に影響を与える能力を指し示しており、ジスルフィドＳ−オキシドが、グルタチオンジスルフィドのこれらの効果における相乗効果剤として作用するものと想定することができ、このことは、新規な薬物の開発、治療有効性を失うことなくより少ない用量を用いる可能性、並びに用量依存性の毒性及び副作用の低下に用いることができる。
【０１１９】
例１２．ジスルフィド結合の形成速度による例５で得た組成物の効果
例５に従って得た１ｇのサンプル（グルタチオンジスルフィドＳ−オキシド含有量５％）を、水（９ｍｌ）に溶解した。得られた溶液へ、還元Ｌ−グルタチオンのナトリウム塩の溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）の１ｍｌを撹拌しながら添加した。この反応物を、５分間撹拌し、ＨＰＬＣによって分析した。得られた反応溶液中には、グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドは検出されなかった。
【０１２０】
例１３．例６に従って得たグルタチオンジスルフィド及び金属、白金化合物Ｐｔ−Ｓシスプラチンと共にグルタチオンジスルフィドＳ−オキシドを含む組成物の、生体異物解毒の第２相の酵素発現に対する効果
試験化合物として以下を用いる：
１−  グルタチオンジスルフィドＳ−オキシド（例１で得た化合物）；
２−  グルタチオンジスルフィド（例２で得た化合物）；
３−  グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドとグルタチオンジスルフィドとの組成物（例５で得た組成物）；
４−  グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドとグルタチオンジスルフィド及び金属、白金化合物Ｐｔ−Ｓシスプラチン、との組成物（例６で得た組成物）。
【０１２１】
実験は、飼育所ＲＡＭＳ「Ｒａｐｐｏｌｏｖｏ」からの体重１４０〜１６０ｇの雄のランダム交配白色ラットに対して行い、生理食塩水中のシクロホスファン（ＣＰ）を２０ｍｇ／ｋｇの用量で１０日間にわたって毎日皮下投与することによって肝毒性を引き起こした。
【０１２２】
実験動物の６群を形成した。
Ｎｏ．１−  試験化合物の溶媒（生理食塩水）の注射を受けた未処理動物（溶媒コントロール）；
Ｎｏ．２−  ＣＰを受け、次に治療剤として生理食塩水を受けた動物（コントロール）；
実験群：
Ｎｏ．３−  １０日間にわたって、毒性剤ＣＰを投与した３０分後に、生理食塩水中の試験化合物１を、１０ｍｇ／ｋｇの用量での腹腔内投与で受けた動物；
Ｎｏ．４−  １０日間にわたって、毒性剤ＣＰを投与した３０分後に、生理食塩水中の試験化合物２を、０．１ｍｇ／ｋｇの用量での腹腔内投与で受けた動物；
Ｎｏ．５−  １０日間にわたって、毒性剤ＣＰを投与した３０分後に、生理食塩水中の
試験化合物３を、１０ｍｇ／ｋｇの用量での腹腔内投与で受けた動物；
Ｎｏ．６−  １０日間にわたって、毒性剤ＣＰを投与した３０分後に、生理食塩水中の試験化合物４を、１０ｍｇ／ｋｇの用量での腹腔内投与で受けた動物。
【０１２３】
肝細胞のサイトゾル画分中における生体異物解毒の第２相の酵素：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＸＥ２．５．１．１８）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＸＥ１．１１．１．９）、グルタチオンレダクターゼ（ＸＥ１．６．４．２）、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＸＥ１．１．１．４９）。
【０１２４】
実験結果
毒性物質の作用に対する許容性を与える複合的な分子反応の実験の結果は、グルタチオンジスルフィドＳ−オキシド（１）、グルタチオンジスルフィド（２）、それらの組成物（３及び４）による、生体異物解毒の第２相の酵素であるグルタチオンレダクターゼ（ＸＥ１．６．４．２）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＸＥ１．１１．１．９）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＸＥ２．５．１．１８）の活性、及びそれらに伴う還元グルタチオンの交換を誘導する能力を示している（表６）。
【０１２５】
【表６】
0006798047.tif 000008
＊−  有意差の信頼性ｐ＜０．０５対コントロール群；
＊＊−  有意差の信頼性ｐ＜０．０５対毒性剤投与動物群、未補正；
ＧＲ−  グルタチオンレダクターゼ（ＸＥ１．６．４．２）；
ＧＰ−  グルタチオンペルオキシダーゼ（ＸＥ１．１１．１．９）；
ＧＳＴ−  グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＸＥ２．５．１．１８）；
Ｇ６ＰＤＧ−  グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＸＥ１．１．１．４９）；
ＧＳＨ−  還元グルタチオン
【０１２６】
金属化合物を、特に白金の化合物Ｐｔ−Ｓを組成物に添加することは、グルタチオンジ
スルフィド及びグルタチオンジスルフィドＳ−オキシドの組成物が生体異物解毒の第２相の酵素の活性を誘導する能力を高め、それらに伴う重要な代謝物還元グルタチオンの交換の強度を増加させた。
【０１２７】
したがって、生体異物解毒の第２相の酵素の活性を誘導する能力を有する金属化合物、特に白金Ｐｔの化合物は、グルタチオンジスルフィドＳ−オキシド及びグルタチオンジスルフィドの組成物による生体異物解毒の第２相の酵素の誘導に起因して、その毒性修飾効果を増加させ、その結果として細胞保護効果を増加させる。
【０１２８】
例１４．グルタチオンジスルフィドＳ−オキシド及びその組成物のインターフェロンαの抗ウィルス作用に対する効果
グルタチオンジスルフィドＳ−オキシド及びその組成物（例１、２、５、６）のインターフェロンの抗ウィルス作用に対する効果の実験を、感染細胞の培養物に対して行う。
【０１２９】
インターフェロンの抗ウィルス作用を評価するための方法は、Л−６８株の細胞をウィルスの細胞傷害作用から保護するその最小量を特定することに基づいている。組成物を、インターフェロンを添加する前、インターフェロンと共に、並びにインターフェロン添加の１０分後、３０分後、及び６０分後に、細胞インキュベーション媒体に、０．００１５μｍｏｌ／ｍｌ、０．０１５μｍｏｌ／ｍｌ、及び０．１５μｍｏｌ／ｍｌの濃度まで添加する。この実験におけるインターフェロンの力価は、４×１０−４Ｕ／ｍｌ、８×１０−４Ｕ／ｍｌ、１．６×１０−５Ｕ／ｍｌ、３．２×１０−５Ｕ／ｍｌ、６．４×１０−５Ｕ／ｍｌ、１．２８×１０−６Ｕ／ｍｌ、２．５６×１０−６Ｕ／ｍｌ、５．１２×１０−６Ｕ／ｍｌであった。製剤の抗ウィルス作用は、クリスタルバイオレットを吸収する生細胞の能力によって評価した。吸収されたクリスタルバイオレットの量は、生細胞画分の分離及びメタノールによる染料の抽出の後、５９５ｎｍでの光度測定によって特定した。吸収された染料の量は、生細胞の数に比例し、光学密度として表した。
【０１３０】
この実験用にЛ−６８細胞株を調製する。
【０１３１】
Л−６８細胞株は、Ｒｕｓｓｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＲＡＭＳ）のＭｏｓｃｏｗ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ
Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（ＭＲＩＶＰ）から入手した、腫瘍、性病、肝炎、結核、遺伝的及び先天性異常を有しない２８歳女性からの１１週ヒト中絶胚の肺細胞由来のヒト胚性肺の二倍体細胞株である。
【０１３２】
二倍体細胞株Л−６８のシードバンクは、Ｌ．Ａ  Ｔａｒａｓｅｖｉｃｈ  Ｓｔａｔｅ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（ＳＩＳＣ）と共に、ＭＲＩＶＰ  ＲＡＭＳにおいて、免疫生物学的製剤の調製について認可されている。
【０１３３】
Л−６８株の細胞を、完全増殖培地Ｉ中、３７℃で培養した。培養は、２５０ｍｌのプラスチックバイアル（「Ｃｏｓｔａｒ」型）中で行う。細胞は、バイアルの底を覆い、二倍体線維芽細胞に特徴的な形態を有する単層を形成した。扁平な細胞（flatted cells）
を、等量部の０．０２％Ｖｅｒｓｅｎｅ液及び０．２５％トリプシン溶液から成る特別媒体を用いて懸濁させた。これを行うために、細胞の単層を形成したバイアルから完全増殖培地を排出し、単層を特別媒体（トリプシンを含むＶｅｒｓｅｎｅ液）で２回洗浄し、３７℃で５分間インキュベートした。この間に、線維芽細胞の単層がプラスチックから剥離した。剥離した細胞を、完全増殖培地で希釈し、複数回のピペット操作によって細胞集合体をばらした。滅菌遠心分離チューブに細胞を移し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離
した。上澄を排出し、細胞を完全増殖培地に移した。次に、Ｇｏｒｊａｅｖチャンバーで細胞数を計数し、この実験で用いた。
【０１３４】
活性及び毒性の特定には、２０以上３０以下の継代数で継代培養した細胞培養物を用いることができる。
【０１３５】
水疱性口内炎ウィルスの調製
実験のために、滅菌条件下でガラスアンプルに密封包装された凍結乾燥水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を用いた。
【０１３６】
ウィルスを、Ｌ−９２９細胞株上で増殖させた。これを行うために、予め滴定した用量のウィルスを、完全培地中に細胞の単層を形成したバイアルに添加した（ＶＳＶの感染力価は、３７℃、１日間で細胞の単層の完全な破壊を引き起こしたウィルスの最大希釈とした）。バイアルの内容物を、３７℃で１日間培養し、その後、培地を滅菌５０ｍｌチューブに排出し、２０００ｒｐｍで遠心分離した。さらに、水疱性口内炎ウィルスを含有する得られた上澄の１ｍｌアリコートを、滅菌条件下でアンプルに分配し、凍結乾燥した。
【０１３７】
ウィルスの感染力価の特定
０．２ｍｌの体積中５×１０４細胞／ウェルの濃度の完全培地１に懸濁させて調製したЛ−６８株の細胞を、９６ウェルプレート（「Ｃｏｓｔａｒ」型）に添加した。この後、プレートを、５％ＣＯ２を含有する雰囲気のＣＯ２インキュベータ中、３７℃で１日間インキュベートした。この間に、細胞はウェルを覆い、連続単層を形成した。１日後、培地を滅菌条件下でデカントし、予め調製しておいたウィルスの２倍希釈物を、４つの反復サンプルとしてプレートのウェルに添加した。ＶＳＶウィルスを、０．２ｍｌの体積の完全培地に添加した。次に、上記で述べた条件下でプレートをインキュベートした。インキュベーションの終了後（１日後）、培地をデカントし、２０％メタノール中のクリスタルバイオレットの０．２％溶液０．０５ｍｌを、ウェルに添加した。１０分後、染料を取り除き、プレートを水流下で洗浄し、乾燥した。さらに、染料を溶液中に溶出させるために、０．１ｍｌの溶解緩衝液をプレートに添加した。染色の強度を、マイクロプレートリーダー上、５９５ｎｍで記録した。
【０１３８】
これらの条件下で１日のうちにウェル中の細胞単層の完全な破壊を引き起こすウィルスの最大希釈を、ウィルスの感染力価と見なす。これらのウェル中の溶液の光学密度は、最小限であり、バックグラウンド値に近い。
【０１３９】
活性の特定
完全増殖培地中、標準活性サンプルの２倍希釈物（予測される力価の上及び下）を調製し（４２−２８−１１９−９６Ｐ；Ｌ．Ａ．Ｔａｒａｓｅｖｉｃｈ  ＳＩＳＣ）、その活性は、国際単位ＩＵで表した。標準の希釈は、０．１ｍｌの体積で９６ウェルプレート（「Ｃｏｓｔａｒ」型）中で行い、各希釈に対して少なくとも４つのウェルを用いた。プレートの１つの列は、培地のコントロール（４ウェル）及びＶＳＶウィルスの用量のコントロール（４ウェル）に残した。これらのウェルに、０．１ｍｌを添加した。標準の希釈後、０．１ｍｌの体積中５×−１０４細胞／ウェルの濃度の完全培地１に懸濁させて調製したЛ−６８株の細胞を、プレートに添加した。この後、実験画分：
１−  グルタチオンジスルフィドＳ−オキシド（例１で得た化合物）；
２−  グルタチオンジスルフィド（例２で得た化合物）；
３−  グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドとグルタチオンジスルフィドとの組成物（例５で得た組成物）；
４−  グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドとグルタチオンジスルフィド及び金属、白金化合物Ｐｔ−Ｓシスプラチン、との組成物（例６で得た組成物）
を、希釈標準を含む列の一部に、ある特定の時間間隔で、０．００１５μｍｏｌ／ｍｌ、０．０１５μｍｏｌ／ｍｌ、及び０．１５μｍｏｌ／ｍｌの濃度で添加した。次に、各プレートを、５％ＣＯ２を含有する雰囲気のＣＯ２インキュベータ中、３７℃で１日間インキュベートした。この間に、細胞はウェルを覆い、連続単層を形成する。１日後、完全増殖培地を滅菌条件下でデカントし、所定の感染力価のＶＳＶウィルスを各プレートのウェルに添加した。完全培地中、０．２ｍｌの体積のＶＳＶウィルスを添加した。ＶＳＶウィルスを含まない同じ培地の０．２ｍｌを、培地コントロールとしてウェルに添加した。この後、各プレートを、上記で述べた条件下でインキュベートした。インキュベーションの終了後（１日後）、培地をデカントし、２０％メタノール中のクリスタルバイオレットの０．２％溶液０．０５ｍｌを、ウェルに添加した。１０分後、染料を取り除き、ディッシュを水流下で洗浄し、乾燥した。培地コントロールウェルでは、着色した単層は、破壊の徴候を示していないはずである。さらに、染料を溶液中に溶出させるために、０．１ｍｌの溶解緩衝液をプレートに添加した。染色の強度を、マイクロプレートリーダー上、５９５ｎｍで記録した。
【０１４０】
ウェルの５０％で細胞培養物をウィルスの細胞傷害効果から完全に保護する製剤の希釈率の逆数値を、インターフェロンの力価と見なす。
【０１４１】
実験結果
細胞を各試験化合物と共に予めインキュベートすることは、インターフェロンの抗ウィルス作用に対してまったく影響を与えないことが実験的に確立された。
【０１４２】
インターフェロンの後に各組成物を添加した実験の結果は、細胞のインターフェロンへの曝露後３０分以降に組成物を添加した場合、実質的にすべての試験物質がインターフェロンの有効性を増加させる能力を有することを指し示している。
【０１４３】
試験物質は、６．４×１０−５〜１．２８×１０−６のインターフェロン力価において様々な度合いで有効性を増加させ、このことは、インターフェロンのみが作用した実験と比較して、いずれかの物質と一緒にインターフェロンが作用した実験の方が光学密度の増加が大きいことによって示された。
【０１４４】
いずれかの組成物とのインターフェロンの有効性の増加のより信頼できる値を特定するために、その作用が示されたインターフェロンの希釈物に対するより多数の実験データを得るために、実験を行った。
【０１４５】
【表７】
0006798047.tif 000009
＊  Ｐ＜０．１
＊＊  Ｐ＜０．０５
【０１４６】
得られた結果は、すべての試験組成物が、インターフェロン後に添加される場合、インターフェロンαの抗ウィルス作用を、そのある特定の範囲の濃度において増加させることを示している。インターフェロンの前に投与される場合における、又はインターフェロンと共投与される場合における組成物の効果の類似の性質は、培地中に酸化剤が存在しないこと、又は酸化剤の量が比較的不充分であることに起因する。培地の複雑な組成は、培地から細胞内空間に向かっての少量の活性成分の比較的速い消滅に繋がる。向性細胞（tropic cells）へのインターフェロンの作用は、酸化剤の産生を伴っているが、充分な量のその産生の時間は、金属配位化合物が培地中で費やす時間を超えている。先行するインターフェロンの添加及びその向性細胞への効果は、これらの細胞による酸化剤の産生を促進し、これは、続いて、インターフェロン受容体を含む様々な受容体のスルフヒドリル基への触媒作用に用いられ、最終的には、中でも、インターフェロンと相互作用する細胞の数を増加させることに寄与し、そしてこのことは、その抗ウィルス効果の向上を決定する。
【０１４７】
したがって、すべての試験物質は、インターフェロンαの作用の有効性を増加せることができるが、組成物の製剤中にある金属配位化合物は、その作用を大きく増強し、インターフェロンαとの受容体媒介相互作用を起こすことができる細胞の数を増加させる。ここで、例１及び２に従って得た物質によるインターフェロンαの抗ウィルス作用の増強は、実質的に一致しており、異なる希釈において９〜１０％であることには留意されたい。例５に従う組成物の形態での例１及び２に従う物質の組み合わせた作用により、より低い希釈率におけるインターフェロンαの抗ウィルス効果のさらなる向上（最大１８％）を、インターフェロンαの大きい希釈率では、すなわち、インターフェロンαのより低い用量においては、ほぼ２倍の増幅を得ることが可能となる。例６に従う組成物を用いた場合にも、類似のパターンが見出されており、インターフェロンαの抗ウィルス効果は、より顕著であり、特に、低希釈率では５０％増加し、より大きい希釈率では２．５倍増加した。治療用量でのインターフェロンαの抗ウィルス効果は、インターフェロンαの製剤を受けている患者のうちの７２％での用量依存性の副作用及び毒性効果の発生を伴う。インフルエンザ様症状、胃腸障害及び心因性障害、骨髄抑制の徴候、甲状腺及び副甲状腺の機能障害、患者の内在性インターフェロンαに対する自己抗体のプールの形成が、実施された治療法の負の発現の中でも最も頻繁に報告されている。例５又は６に従う組成物と組み合わせてより低い治療用量でインターフェロンαを用いることの可能性は、インターフェロンαに対する様々な副作用及び毒性の用量依存性の反応を大きく低減することを可能とするものである。
具体的には、以下の実施態様が開示されるが、本発明はこれらの実施態様に限定されるものではない。
［１］
感染性疾患及び非感染性疾患の治療において、薬理活性化合物の用量関連毒性を排除するため及び治療活性を向上させるための医薬組成物であって、該医薬組成物が、グルタチオンジスルフィド又はその医薬的に許容される有機若しくは無機塩、及び以下の構造のグルタチオンジスルフィドＳ−オキシド：
【化２】
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又はその医薬的に許容される有機若しくは無機塩を含む、医薬組成物。
［２］
グルタチオンジスルフィドＳ−オキシドの量が、前記全組成物に対して０．０１〜１０重量％である、［１］に記載の組成物。
［３］
前記組成物が、金属（Ｍｅ）をさらに含み、該金属（Ｍｅ）が、Ｍｅ−Ｓ−グルタチオン結合を含有する配位化合物として示される、［１］に記載の組成物。
［４］
前記金属が、白金族から選択される、［３］に記載の組成物。
［５］
前記金属が、白金である、［３］に記載の組成物。
［６］
前記組成物中のｄ−金属の量が、前記組成物の１ｋｇあたり１×１０−１０モル〜１×１０−３モルの範囲内である、［３］に記載の組成物。
［７］
前記組成物中のｄ−金属の量が、前記組成物の１ｋｇあたり１×１０−５モルである、［３］に記載の組成物。
［８］
感染性疾患及び非感染性疾患の治療において、薬理活性化合物の用量依存性の毒性を排除するため及び治療活性を向上させるための薬理学的組み合わせであって、該薬理学的組み合わせが、［１］〜［７］のいずれか一に記載の組成物、及び抗凝固剤、第Ｘａ因子阻害剤、抗微生物剤又は抗ウィルス剤、カルシウムチャネル阻害剤の群から選択される薬理活性化合物を含む、薬理学的組み合わせ。
［９］
前記組み合わせを、血栓症の治療法に用いることができ、前記薬理活性化合物が、抗凝固剤、第Ｘａ因子阻害剤のアミジン塩酸塩である、［８］に記載の組み合わせ。
［１０］
前記組み合わせを、大腸菌（Escherichia coli）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）
、及びリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）ＥＧＤ、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ＭＲＳＡ−メチシリン耐性スタフィロ
コッカス・アウレウスを含むグラム陰性細菌並びにグラム陽性細菌によって引き起こされる感染性疾患の治療に用いることができ、前記薬理活性化合物が、抗微生物剤のモキシフ
ロキサシンである、［８］に記載の組み合わせ。
［１１］
前記薬理活性化合物が、広範囲の抗ウィルス作用を有する抗ウィルス剤−インターフェロンアルファである、ウィルス性疾患の治療法のための、［８］に記載の組み合わせ。
［１２］
前記薬理活性化合物が、抗狂犬病ワクチンの抗原性物質である、狂犬病を予防するための、［８］に記載の組み合わせ。
［１３］
感染性疾患及び非感染性疾患の治療において，薬理活性化合物の用量関連毒性を排除するため及び治療活性を向上させるための医薬であって、該医薬が、治療有効量の［１］〜［７］のいずれか一に記載の少なくとも１つの組成物を、医薬的に許容される賦形剤と共に含む、医薬。
［１４］
感染性疾患及び非感染性疾患の治療において、薬理活性化合物の用量関連毒性を排除するため及び治療活性を向上させるための医薬であり、該医薬が、治療有効量の［８］〜［１２］のいずれか一に記載の少なくとも１つの組み合わせを、医薬的に許容される賦形剤と共に含む、医薬。
［１５］
感染性疾患及び非感染性疾患の治療において、薬理活性化合物の用量関連毒性を排除するため及び治療活性を向上させるための、外用、吸入、経腸、又は非経口投与用に製造することができる、［１３］又は［１４］に記載の医薬。
［１６］
感染性疾患及び非感染性疾患の治療において、薬理活性化合物の用量関連毒性を排除するため及び治療活性を向上させるための、［１］〜［７］のいずれか一に記載の医薬組成物の使用。
［１７］
前記組成物が、さらに、好ましくは白金族からの、さらにより好ましくは白金であるｄ−金属（Ｍｅ）を含み、該ｄ−金属が、Ｍｅ−Ｓ−グルタチオン結合を含有する配位化合物の形態で示され、患者に投与される前記ｄ−金属配位化合物の量が、１０−３〜１０−１５ｍｏｌ／ｋｇ体重である、［１６］に記載の使用。
［１８］
感染性疾患及び非感染性疾患の治療において、薬理活性化合物の用量関連毒性を排除するため及び治療活性を向上させるための、［８］〜［１２］のいずれか一に記載の薬理学的組み合わせの使用。
［１９］
前記薬理活性化合物が、血栓症の治療法のための、抗凝固剤、第Ｘａ因子阻害剤のアミジン塩酸塩である、［１８］に記載の使用。
［２０］
前記薬理活性化合物が、大腸菌、シュードモナス・エルジノーサ、アシネトバクター・バウマンニ、及びリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤ、スタフィロコッカス・アウレウス、ＭＲＳＡ−メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウスを含むグラム陰性細菌並びにグラム陽性細菌によって引き起こされる感染性疾患の治療のための、抗微生物剤のモキシフロキサシンである、［１８］に記載の使用。
［２１］
前記薬理活性化合物が、ウィルス性疾患の治療のための、抗ウィルス剤のインターフェロンアルファである、［１８］に記載の使用。
［２２］
前記薬理活性化合物が、狂犬病を予防するための抗狂犬病ワクチンの抗原性物質である、［１８］に記載の使用。
［２３］
前記薬理学的組み合わせの投与が、吸入、経腸、又は非経口投与によって行われる、［１８］に記載の使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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