(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖及びアンチセンス鎖を有する核酸分子であって、
上記アンチセンス鎖がUUAAAAUGUCUGACUCCUUmUmU（配列番号4103）からなるヌクレオチド又はこれに対して化学的に修飾されたヌクレオチドであり、上記センス鎖がAAGGAGUCAGACAUUUUAAmUmU（配列番号4075）からなるヌクレオチド又はこれに対して化学的に修飾されたヌクレオチドである核酸分子［ここで、大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味し、小文字のa、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及び2'-デオキシ-Tを意味し、mUは2’-メトキシ-Uを意味する］。
【請求項２】
上記アンチセンス鎖がUUAAAAUGUCUGACUCCUUmUmU（配列番号4103）であり、上記センス鎖がAAGGAGUCAGACAUUUUAAmUmU（配列番号4075）である請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
上記センス鎖及び上記アンチセンス鎖が一本鎖として連結され、一端においてループで連結されることで二重鎖領域を形成する、請求項１記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の１つ以上の核酸分子及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項５】
担体が脂質分子又はリポソームである、請求項４記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を基礎とする分子からなる生物医薬品及び治療剤の分野に関する。より詳細には、本発明は、ヒトp21の発現を調節するためのRNA干渉（RNAi）を利用する化合物及び組成物に関する。
【０００２】
この出願は、1,311,243バイトのサイズであるND5123458WO_SL.txtと名付けられた2015年12月23日に作成されたASCIIファイルとして電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
p21は、CDKN1A遺伝子によってコードされ、CIP/KIPファミリーに属する細胞周期調節タンパク質である。このタンパク質は、サイクリン-CDK複合体への結合によるサイクリン-CDK複合体の効果を阻害することにより、G1期及びG2/M期において細胞周期の進行を阻害する機能を有する。具体的には、p21遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子の1つであるp53によって活性化される。DNA損傷等によるp53の活性化により、p53がp21を活性化し、細胞周期がG1期及びG2/M期に停止することが報告されている。
【０００４】
p21は、前立腺癌、子宮頸癌、乳癌及び扁平上皮癌を含む様々なヒト癌において過剰発現しており、多くの場合、p21アップレギュレーションが腫瘍等級、侵襲性及び攻撃性と正に相関している（例えば、Changら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, Vol. 97, No. 8, pp. 4291-96参照）。また、p21のアップレギュレーションは、脳、前立腺、卵巣、乳房及び食道細胞癌を含む多くの形態の癌において、腫瘍原性及び予後不良と関連することが報告されている（例えば、Wintersら、Breast Cancer Research, 2003, Vol. 5, No. 6, pp. R242-R249参照）。また、その疾患は、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、アミロイドーシス及び関節炎を含む加齢性疾患であってもよい（例えばChangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, Vol. 97, No. 8, pp. 4291-96参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
p21発現阻害のための治療剤には、非常に強力なsiRNA配列及び構造を必要とするであろう。
【０００６】
p21発現阻害のためのsiRNA配列、化合物及び構造が必要とされている。 
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、RNA干渉を用いてヒトp21の発現を調節するための化合物、組成物及び方法に関する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明は、p21をサイレンシングするRNA干渉遺伝子のための分子を提供する。
【０００９】
さらなる実施形態において、本発明の構造、分子及び組成物は、悪性腫瘍を含む、p21に関連する疾患を予防又は治療するための方法、若しくはp21に関連する状態又は障害の症状を改善するための方法に使用することができる。
【００１０】
本実施の形態は以下を包含する：
核酸分子であって、a）分子は、ポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し；b）分子の各鎖は15〜30ヌクレオチドの長さであり；c）アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域は、p21をコードするmRNA配列に相補的であり；d）センス鎖の少なくとも一部はアンチセンス鎖の少なくとも一部に相補的であり、分子は15〜30ヌクレオチド長の二重鎖領域を有する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、p21をコードするmRNA配列に相補的な、分子の二重鎖領域に位置するアンチセンス鎖における15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。
【００１２】
さらなる実施形態では、核酸分子は、p21をコードするmRNA配列に相補的な、アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができ、また、配列番号１におけるヒトp21 mRNA配列から選ぶことができる。
【００１３】
本発明の実施形態は、p21をコードするmRNAの配列に相補的であり、ヒトp21の配列から選択される、アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有する核酸分子を提供する。ここで、ヒトp21の配列は、配列番号1の1位〜125位、配列番号1の126位〜620位、及び621位〜2175位から選択される。
【００１４】
特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号2033〜4063から選択される配列を含むアンチセンス鎖を有することができる。さらなる実施形態では、核酸分子は、配列番号4092〜4119から選択される配列を含むアンチセンス鎖を有することができる。
【００１５】
本発明の核酸分子は、配列番号4066及び4094、配列番号4067及び4095、配列番号4068及び4096、配列番号4073及び4101、配列番号4075及び4103、配列番号4080及び4108、配列番号4084及び4112、配列番号4085及び4113、配列番号4088及び4116並びに配列番号4091及び4119の群から選択されるセンス鎖及びアンチセンス鎖のペアからなるものであってもよい。
【００１６】
さらなる態様において、本発明の核酸分子は、当該分子の各鎖を18〜22ヌクレオチド長とすることができる。核酸分子は、19ヌクレオチド長の二重鎖領域を有することができる。
【００１７】
特定の形態では、核酸分子は、一本鎖として連結されたポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し、一端においてループで連結されることで二重鎖領域を形成することができる。
【００１８】
本発明の核酸分子は、平滑末端を有することができ、1つ以上の3’オーバーハングを有することができる。
【００１９】
本発明の核酸分子は、遺伝子サイレンシングに活性であるRNAi分子、例えば、遺伝子サイレンシングに活性であるdsRNA、siRNA、マイクロRNA又は遺伝子サイレンシングに活性なshRNA、並びにDNA指向性RNA（ddRNA）、PiWi相互作用性RNA（piRNA）及び反復関連siRNA（rasiRNA）とすることができる。
【００２０】
本発明は、p21の発現阻害に活性である一連の核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、p21のノックダウンに関するIC50が100pM未満とすることができる。
【００２１】
本発明はさらに、1つ以上の本発明の核酸分子及び薬学的に許容される担体を含む組成物を企図する。担体は、脂質分子又はリポソームとすることができる。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、必要とする被験体に1つ以上の本発明の核酸分子を含有する組成物を投与することによって、p21発現に関連する疾患を治療する方法を含む。当該疾患は、とりわけ、p21発現に関連する癌などの疾患に存在する悪性腫瘍とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図1は、2175ヌクレオチドの長さであるGenBankアクセッション番号NM_000389.4（CDKN1A）に開示されている例示的な標的p21 mRNAの核酸配列である、配列番号１を示している。
【図２】図2は、A549細胞においてp21 mRNAをダウンレギュレートする能力について試験したp21 siRNAを示している。トランスフェクションの24時間前にA549細胞を2000/ウェルで播種した。次いで、0.1、1及び10nMの濃度のp21 siRNAで細胞を24時間トランスフェクトした。p21発現レベルの倍率変化をqRT-PCR（n=3）を用いて測定した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、p21の発現を調節するための核酸に基づく治療剤のための化合物、組成物及び方法に関する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本発明は、RNA干渉において活性な分子、ならびにp21の発現をサイレンシングすることができる構造及び組成物を提供する。
【００２６】
本開示の構造及び組成物は、悪性腫瘍などの様々な疾患の予防又は治療に使用することができる。
【００２７】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の1つ以上の治療用RNAi分子の送達及び摂取のための組成物、ならびにその使用方法を提供する。本発明のRNAに基づく組成物は、悪性腫瘍、例えば癌を予防又は治療するための方法において使用することができる。
【００２８】
本発明の治療用組成物は、RNA干渉において活性である核酸分子を含む。治療用核酸分子は、遺伝子サイレンシングのためにCDKN1A (p21)を標的とすることができる。
【００２９】
種々の実施形態において、本発明は、低分子干渉RNA（siRNA）として活性であり、p21遺伝子発現を調節又はサイレンシングすることができる一連の分子を提供する。
【００３０】
本発明のsiRNAは、悪性腫瘍を予防又は治療するために使用することができる。
【００３１】
本発明の実施形態はさらに、悪性腫瘍の予防又は治療を必要とする被験体に本発明のsiRNAを送達するためのビヒクル、製剤又は脂質ナノ粒子製剤を提供する。本発明はさらに、siRNAを治療剤として哺乳動物に投与するための方法を企図している。
【００３２】
本発明の治療分子及び組成物は、化合物又は組成物を必要とする被験体に投与することによって、p21関連疾患の予防又は治療を目的とするRNA干渉に使用することができる。
【００３３】
本発明の方法は、悪性腫瘍を予防又は治療するための本発明の化合物を利用することができる。悪性腫瘍は、様々な疾患に存在するものとすることができる。例えば、p21を高度に発現する癌、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、癌腫、脳腫瘍、頭頸部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、大腸癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌、白血病、悪性リンパ腫、上皮悪性腫瘍及び非上皮性悪性腫瘍が挙げられる。
【００３４】
特定の実施形態において、本発明の治療用分子の組み合わせは、p21遺伝子発現をサイレンシング又は阻害するために使用することができる。
【００３５】
本発明は、一連のRNAi分子を提供する。ここで各分子はポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し、分子の各鎖は15〜30ヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域は、p21をコードするmRNAの配列に相補的であり、センス鎖の少なくとも一部はアンチセンス鎖の少なくとも一部に相補的であり、分子は15〜30ヌクレオチドの長さの二重鎖領域を有している。
【００３６】
本発明のRNAi分子は、分子の二重鎖領域に位置するp21をコードするmRNAの配列に相補的な、アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、RNAi分子は、p21をコードするmRNAの配列に相補的な、アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。
【００３８】
本発明の実施形態は、悪性腫瘍の1つ以上の症状を予防、治療又は改善する方法、又は悪性腫瘍を発症するリスクを低減する方法、又はそれを必要とする哺乳動物の悪性腫瘍の発症を遅延させる方法をさらに提供することができる。
【００３９】
P21及びRNAi分子
p21は、ヒトを含む様々な動物に存在する。ヒトCDKN1A（p21）の配列情報は、NM_000389.4, NM_078467.2, NM_001291549.1, NM_001220778.1, NM_001220777.1 (NP_001207707.1, NP_001278478.1, NP_001207706.1, NP_510867.1, NP_000380.1)で見つけられる。
【００４０】
図１は、GenBankアクセッション番号NM_000389.4 (CDKN1A)に開示され、長さが2175ヌクレオチドである標的ヒトp21mRNAの核酸配列の例である（配列番号１）。
【００４１】
当業者は、報告された配列が経時的に変化することがあり、それに応じて本明細書中の核酸分子に必要な変化を組み込むことができることを理解するであろう。
【００４２】
本発明の実施形態は、小さい核酸分子を用いたp21発現の遺伝子サイレンシングのための組成物及び方法を提供することができる。核酸分子の例としては、RNA干渉（RNAi分子）、短鎖干渉RNA（siRNA）、マイクロRNA（miRNA）、及び短鎖ヘアピンRNA（shRNA）分子において活性な分子、同様に、DNA指向性RNA（ddRNA）、PiWi相互作用性RNA（piRNA）及びリピート関連性siRNA（rasiRNA）において活性な分子を含む。そのような分子は、p21遺伝子発現に対するRNA干渉を媒介することができる。
【００４３】
本明細書に開示される組成物及び方法はまた、被験体における様々な種類の悪性腫瘍の治療において使用することができる。
【００４４】
本発明の核酸分子及び方法を用いて、p21をコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる。
【００４５】
本発明の組成物及び方法は、独立して又は組み合わせて、p21タンパク質及び/又はp21タンパク質をコードする遺伝子、悪性腫瘍などのp21に関連する疾患、状態又は障害の維持及び/又は発症に関連するタンパク質及び/又は当該タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節又は制御することができる１つ又は複数の核酸分子を含むことができる。
【００４６】
本発明の組成物及び方法は、p21の例示的な配列を参照して記載される。当業者は、本発明の様々な態様及び実施形態が、関連するp21遺伝子、配列、又はホモログ遺伝子及び転写変異体といった変異体、並びにp21遺伝子に関連する一塩基多型（SNP）を含む多型を対象とすることを理解するであろう。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、GST-π遺伝子、例えばヒトCDKN1Aの発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（siRNA）分子を提供することができる。
【００４８】
本発明のRNAi分子は、p21を標的とすることができ、及び、例えば相補的配列を用いて、又は非標準塩基対、例えばミスマッチ及び/又はウォブル塩基対を組み込むことによって更なる標的配列を提供できる任意の相同配列を標的とすることができる。
【００４９】
ミスマッチが同定される場合、非標準的な塩基対、例えば、ミスマッチ及び/又はウォブル塩基を用いて、2つ以上の遺伝子配列を標的とする核酸分子を生成することができる。
【００５０】
例えば、UU及びCC塩基対などの非標準塩基対を使用して、配列相同性を有する異なるp21標的のための配列を標的にできる核酸分子を生成できる。したがって、RNAi分子は、相同遺伝子間で保存されているヌクレオチド配列を標的とすることができ、単一のRNAi分子を用いて2つ以上の遺伝子の発現を阻害することができる。
【００５１】
いくつかの局面では、本発明の組成物及び方法は、p21 mRNAに対して活性なRNAi分子を含み、RNAi分子は、p21配列をコードする任意のmRNAに相補的な配列を含む。
【００５２】
ある実施形態において、本開示のRNAi分子は、p21 RNAに対して活性を有することができる。ここで、RNAi分子は、変異体p21をコードする配列を有するRNA、例えば、悪性腫瘍に関連することが当該分野で公知である変異p21遺伝子に相補的な配列を含む。
【００５３】
さらなる実施形態では、本発明のRNAi分子は、p21遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用し、p21遺伝子発現のサイレンシングを媒介することができるヌクレオチド配列を含むことができる。
【００５４】
p21 mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表1及び表2に示す。
【００５５】
【表１】
0006793649.tif 000002
0006793649.tif 000003
0006793649.tif 000004
0006793649.tif 000005
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0006793649.tif 000056
【００５６】
表1の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを指す。小文字a、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びチミジンを意味する。mUは、2’-メトキシ-Uである。
【００５７】
【表２】
0006793649.tif 000057
【００５８】
表2の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを指す。小文字a、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びチミジンを意味する。mUは、2’-メトキシ-Uである。
【００５９】
例えば、本発明のsiRNAは、配列番号4103のアンチセンス鎖及び配列番号4075のセンス鎖、又はそれらの化学的に修飾された鎖を有するものであってもよい。
【００６０】
例えば、本発明のsiRNAは、配列番号4119のアンチセンス鎖及び配列番号4091のセンス鎖、又はそれらの化学的に修飾された鎖を有するものであってもよい。
【００６１】
化学修飾は、鎖中の任意の位置の任意のヌクレオチド上における2'-OMe置換基、ならびに当該分野で公知の他の修飾を含むことができる。
【００６２】
p21の調節方法及び悪性腫瘍の治療方法
本発明の実施形態は、p21及び/又はp21タンパク質の発現をダウンレギュレート又は阻害するために用いることができるRNAi分子を提供することができる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本発明のRNAi分子は、悪性腫瘍など疾患又は状態に関連し得るCDKN1Aハプロタイプ多型から生じるCDKN1A及び/又はp21タンパク質の発現をダウンレギュレート又は阻害するために使用することができる。
【００６４】
p21タンパク質又はmRNAレベルのモニタリングは、遺伝子サイレンシングを特徴づけるため、及び本発明の化合物及び組成物の有効性を決定するために使用することができる。
【００６５】
本開示のRNAi分子は、1つ以上の遺伝子の発現を調節するために、単独で又は他のsiRNAと組み合わせて使用することができる。
【００６６】
本開示のRNAi分子は、p21に関連する疾患（悪性腫瘍を含む）の予防又は治療、又は症状もしくは症状の改善のために、単独で又は組み合わせて、又は他の既知の薬物と組み合わせて使用することができる。
【００６７】
本発明のRNAi分子は、配列特異的様式でp21の発現を調節又は阻害するために使用することができる。
【００６８】
本開示のRNAi分子は、一連の連続したヌクレオチドがp21 mRNAに少なくとも部分的に相補的であるガイド鎖を含むことができる。
【００６９】
特定の意味において、悪性腫瘍は、本発明のRNAi分子を用いたRNA干渉によって治療されてもよい。
【００７０】
悪性腫瘍の治療は、適切な細胞ベースのモデル、ならびにエクスビボ又はインビボの動物モデルにおいて特徴づけることができる。
【００７１】
悪性腫瘍の治療は、冒された組織の細胞におけるp21 mRNAのレベル又はp21タンパク質のレベルを決定することによって特徴づけることができる。
【００７２】
悪性腫瘍の治療は、冒された臓器又は組織の非侵襲的な医学的走査によって特徴付けることができる。
【００７３】
本発明の実施形態は、それを必要とする被験体におけるp21関連疾患又は状態の症状を予防、治療又は改善するための方法を含むことができる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、被験体における悪性腫瘍の症状を予防、治療又は改善するための方法は、被験体又は生物におけるCDKN1A遺伝子（p21）の発現を調節する本発明のRNAi分子を被験体に投与することを含むことができる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞又は生物を本発明のRNAi分子と接触させることによって、細胞又は生物におけるCDKN1A遺伝子（p21）の発現をダウンレギュレートする方法を企図する。
【００７６】
RNA干渉
RNA干渉（RNAi）は、短い干渉RNA（siRNA）によって媒介される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを意味する。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 101、25〜33頁; Fireら、Nature、1998、Vol. 391、806811頁; Sharp、Genes＆Development、1999、Vol. 13、pp. 139-141参照。
【００７７】
細胞内のRNAi応答は、二本鎖RNA（dsRNA）によって誘発することができるが、メカニズムはまだ完全には理解されていない。細胞内の特定のdsRNAは、ダイサー酵素、リボヌクレアーゼIII酵素の作用を受けることができる。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 101、25〜33頁; Hammondら、Nature、2000、Vol. 404、pp.293-296参照。ダイサーは、dsRNAをsiRNAであるdsRNAのより短い断片に加工することができる。
【００７８】
一般に、siRNAは、約21〜約23ヌクレオチドの長さとすることができ、約19ヌクレオチド長の塩基対二重鎖領域を含むことができる。
【００７９】
RNAiは、RNA誘発サイレンシング複合体（RISC）として知られているエンドヌクレアーゼ複合体に関与する。siRNAは、RISC複合体に入るアンチセンス又はガイド鎖であって、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖RNA標的の切断を媒介するアンチセンス又はガイド鎖を有する。siRNAの他方の鎖はパッセンジャー鎖である。標的RNAの切断は、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる（例えば、Elbashirら、Genes＆Development、2001、Vol. 15、188〜200頁参照）。
【００８０】
本明細書で使用する「センス鎖」という用語は、siRNA分子の対応するアンチセンス鎖の少なくとも一部に部分的又は完全に相補的なsiRNA分子のヌクレオチド配列を指す。siRNA分子のセンス鎖は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含むことができる。
【００８１】
本明細書で使用される「アンチセンス鎖」という用語は、標的核酸配列の少なくとも一部に部分的又は完全に相補的なsiRNA分子のヌクレオチド配列を指す。siRNA分子のアンチセンス鎖は、siRNA分子の対応するセンス鎖の少なくとも一部に相補的な核酸配列を含むことができる。
【００８２】
RNAi分子は、配列特異的様式でRNA干渉を媒介することによって遺伝子発現をダウンレギュレート又はノックダウンすることができる。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 101、25〜33頁; Elbashirら、Nature、2001、Vol. 411、494〜498頁; Kreutzerら、WO2000/044895; Zernicka-Goetzら、WO2001/36646; Fireら、WO1999/032619; Plaetinckら、WO2000/01846; Melloら、WO2001/029058参照。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、遺伝子発現に関して「阻害する」、「ダウンレギュレートする」又は「縮小する」という用語は、遺伝子の発現又は1つ以上のタンパク質をコードするmRNA分子のレベル、若しくは1つ又は複数のコードされたタンパク質の活性が、本発明のRNAi分子又はsiRNAの非存在下で観察される活性よりも低下することを意味している。例えば、発現のレベル、mRNAのレベル又はコードされたタンパク質活性のレベルが、本発明のRNAi分子又はsiRNAの非存在下で観察される活性よりも、少なくとも1％、又は少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも50％、又は少なくとも90％、又はそれ以上で低下すれば良い。
【００８４】
RNAi分子はまた、ウイルス遺伝子発現をノックダウンするために使用することができ、よってウイルス複製に影響を及ぼす。
【００８５】
RNAi分子は、別個のポリヌクレオチド鎖：センス鎖又はパッセンジャー鎖と、アンチセンス鎖又はガイド鎖とから作製することができる。ガイド鎖とパッセンジャー鎖とは、少なくとも部分的に相補的である。ガイド鎖及びパッセンジャー鎖は、約15〜約49塩基対を有する二重鎖領域を形成することができる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、siRNAの二重鎖領域は、17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,又は49個の塩基対を含むことができる。
【００８７】
特定の実施形態において、RNAi分子は、RISC複合体において活性であり、RISCに対して活性な二重鎖領域の長さを有することができる。
【００８８】
さらなる実施形態において、RNAi分子は、RISC複合体において活性であるRNAi分子に変換されるダイサー基質として活性とすることができる。
【００８９】
いくつかの態様では、RNAi分子は、長い分子の対向する末端に相補的なガイドとパッセンジャー配列部分とを有することができ、その結果、分子は相補配列部分において二重鎖領域を形成することができ、各鎖はヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーのいずれかによって当該二重鎖領域の一端で結合する。例えば、ヘアピン配列ステム及びループ配列である。各鎖とリンカー相互作用は、共有結合又は非共有相互作用とすることができる。
【００９０】
本開示のRNAi分子は、核酸のセンス領域を核酸のアンチセンス領域に結合するヌクレオチド、非ヌクレオチド又はヌクレオチド/非ヌクレオチド混合リンカーを含んでいてもよい。ヌクレオチドリンカーは、長さが2ヌクレオチド以上、例えば約3, 4, 5, 6, 7, 8, 9又は10ヌクレオチドのリンカーとすることができる。ヌクレオチドリンカーは、核酸アプタマーとしても良い。本明細書で使用する「アプタマー」又は「核酸アプタマー」は、標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し、ここで核酸分子はその天然の状況において標的分子によって認識される配列を含む配列を有する。あるいは、アプタマーは、標的分子に結合する核酸分子であってもよく、ここで標的分子は核酸に天然に結合しなくてよい。例えば、アプタマーは、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合し、それにより天然に存在するリガンドとタンパク質との相互作用を防止するために使用することができる。例えば、Goldら、Annu Rev Biochem、1995、Vol. 64、763-797頁; Brodyら、J.Biotechnol., 2000、Vol. 74、5〜13頁; Hermannら、Science、2000、Vol. 287、pp. 820-825参照。
【００９１】
非ヌクレオチドリンカーの例は、無塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素又は他の高分子化合物、例えば2〜100個のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコールなどの高分子化合物を挙げることができる。いくつかの例は、Seelaら、Nucleic Acids Research、1987、Vol. 15、3113〜3129頁; Cloadら、J. Am. Chem. Soc., 1991、Vol. 113、6324-6326頁; Jaeschkeら、Tetrahedron Lett.,1993、Vol. 34、301頁; Arnoldら、WO1989/002439; Usmanら、WO1995/006731; Dudyczら、WO1995/011910; 及びFerentzら、J. Am. Chem. Soc., 1991、Vol. 113、pp. 4000-4002に記載されている。
【００９２】
RNAi分子は、二重鎖領域から1つ以上のオーバーハングを有することができる。オーバーハングは、塩基対形成されていない一本鎖領域であり、長さが1〜8ヌクレオチド又はそれ以上としても良い。オーバーハングは、鎖の3'末端が1〜8ヌクレオチドの一本鎖領域を有する3'末端オーバーハングとしても良い。オーバーハングは、鎖の5'末端が1〜8ヌクレオチドの一本鎖領域を有する5'末端オーバーハングとしても良い。
【００９３】
RNAi分子のオーバーハングは、同じ長さを有していても良いし、異なる長さとしても良い。
【００９４】
RNAi分子は、二重鎖領域がオーバーハングなしで終わり、鎖が二重鎖領域の末端まで塩基対合する、一つ以上の平滑末端を有するものとすることができる。
【００９５】
本開示のRNAi分子は、1つ以上の平滑末端を有することができ、又は1つ以上のオーバーハングを有することができ、若しくは平滑末端とオーバーハングとの組み合わせを有することができる。
【００９６】
RNAi分子の鎖の5'末端は、平滑末端にあってもよく又はオーバーハングにあってもよい。RNAi分子の鎖の3'末端は、平滑末端にあってもよく又はオーバーハングにあってもよい。
【００９７】
RNAi分子の鎖の5'末端は平滑末端にあり、3'末端はオーバーハングにあってもよい。RNAi分子鎖の3'末端は平滑末端にあり、5'末端はオーバーハングにあってもよい。
【００９８】
いくつかの実施形態では、RNAi分子の両端は平滑末端である。
【００９９】
さらなる実施形態において、RNAi分子の両端はオーバーハングを有していてもよい。
【０１００】
5'-及び3'-末端のオーバーハングは、異なる長さであってもよい。
【０１０１】
特定の実施形態では、RNAi分子は、アンチセンス鎖の5'末端及びセンス鎖の3'末端がオーバーハングヌクレオチドを有さない平滑末端を有するものでもよい。
【０１０２】
さらなる実施形態では、RNAi分子は、アンチセンス鎖の3'末端及びセンス鎖の5'末端がオーバーハングヌクレオチドを有さない平滑末端を有するものでもよい。
【０１０３】
RNAi分子は、二重鎖領域における塩基対合においてミスマッチを有していてもよい。
【０１０４】
RNAi分子のオーバーハングにおける任意のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドとすることができる。
【０１０５】
1つ以上のデオキシリボヌクレオチドは5'末端に存在してもよい、ここでRNAi分子の他方の鎖の3'末端がオーバーハングを有さなくてもよく、デオキシリボヌクレオチドオーバーハングを有さなくてもよい。
【０１０６】
1つ以上のデオキシリボヌクレオチドは3'末端に存在してもよい、ここでRNAi分子の他の鎖の5'末端がオーバーハングを有さなくてもよく、デオキシリボヌクレオチドオーバーハングを有さなくてもよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、RNAi分子のオーバーハングヌクレオチドの1つ以上又は全てを2'-デオキシリボヌクレオチドとしてもよい。
【０１０８】
ダイサー基質RNAi分子
いくつかの態様において、RNAi分子は、RISC活性RNAi分子を生成するようにプロセシングされるダイサー基質として適した長さにすることができる。例えば、Rossiら、US2005/0244858参照。
【０１０９】
ダイサー基質である二本鎖RNA（dsRNA）は、活性RNAi分子を生成するためにダイサーによって処理されるのに十分な長さとすることができ、さらに以下の特性の1つ以上を含んでいてもよい：（i）ダイサー基質dsRNAは、例えば、アンチセンス鎖上に3'オーバーハングを有するような非対称とすることができ、（ii）ダイサー基質dsRNAは、ダイサー結合の配向を指示し、dsRNAを処理して活性なRNAi分子とするためにセンス鎖上に改変された3'末端を有していてもよい。
【０１１０】
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNA中の最も長い鎖を24〜30ヌクレオチドの長さとすることができる。
【０１１１】
ダイサー基質dsRNAは、対称又は非対称とすることができる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、22〜28ヌクレオチドのセンス鎖及び24〜30ヌクレオチドのアンチセンス鎖を有することができる。
【０１１３】
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、アンチセンス鎖の3’末端にオーバーハングを有していてもよい。
【０１１４】
さらなる実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、長さが25ヌクレオチドのセンス鎖及び2塩基の3’-オーバーハングを含む長さが27ヌクレオチドのアンチセンス鎖を有することができる。オーバーハングは、1、2又は3ヌクレオチドの長さとすることができる。センス鎖はまた5’リン酸を有していてもよい。
【０１１５】
非対称ダイサー基質dsRNAは、2つのリボヌクレオチドの代わりにセンス鎖の3’末端に2つのデオキシリボヌクレオチドを有することができる。
【０１１６】
ダイサー基質dsRNAのセンス鎖は、約22〜約30、又は約22〜約28、又は約24〜約30、又は約25〜約30、又は約26〜約30、又は約26及び29、又は約27〜約28ヌクレオチドの長さとすることができる。
【０１１７】
ダイサー基質dsRNAのセンス鎖は、22、23、24、25、26、27、28、29又は30ヌクレオチドの長さとすることができる。
【０１１８】
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、長さが少なくとも約25ヌクレオチドであり、長さが約30ヌクレオチドを超えないセンス鎖及びアンチセンス鎖を有していてもよい。
【０１１９】
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、26〜29ヌクレオチドの長さのセンス鎖及びアンチセンス鎖を有していてもよい。
【０１２０】
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、長さが27ヌクレオチドであるセンス鎖及びアンチセンス鎖を有していてもよい。
【０１２１】
ダイサー基質dsRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、平滑末端であって同じ長さとすることができ、又はオーバーハングを有するように異なる長さであってもよく、又は平滑末端と突出とを有していてもよい。
【０１２２】
ダイサー基質dsRNAは、長さが19、20、21、22、23、24、25、26又は27ヌクレオチドの二重鎖領域を有していてもよい。
【０１２３】
ダイサー基質dsRNAのアンチセンス鎖は、真核細胞の細胞質内などの生物学的条件下でセンス鎖の配列の少なくとも一部にアニールする任意の配列を有することができる。
【０１２４】
センス鎖及びアンチセンス鎖を有するダイサー基質は、リンカー基又はリンカーオリゴヌクレオチドのような第3の構造によって連結することができる。リンカーは、例えばdsRNAの2つの鎖を連結し、アニーリングの際にヘアピンを形成することができる。
【０１２５】
ダイサー基質のセンス鎖及びアンチセンス鎖は一般に相補的であるが、塩基対形成においてミスマッチを有していてもよい。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、センス鎖が22〜28ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖が24〜30ヌクレオチドを有するように非対称であってもよい。
【０１２７】
ダイサー基質dsRNAの鎖の1つ、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも19ヌクレオチドの配列長を有してもよく、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3’末端に隣接している21塩基領域内であり、標的遺伝子から産生されたRNAのヌクレオチド配列と十分に相補的となる。
【０１２８】
ダイサー基質dsRNAのアンチセンス鎖は、22〜28ヌクレオチドの長さとなるように、5’末端に1〜9個のリボヌクレオチドを有することができる。アンチセンス鎖の長さが21ヌクレオチドである場合、1〜7個のリボヌクレオチド、又は2〜5個のリボヌクレオチド、又は4個のリボヌクレオチドを3’末端に付加することができる。付加されるリボヌクレオチドは、任意の配列とすることができる。
【０１２９】
ダイサー基質dsRNAのセンス鎖は、24〜30ヌクレオチドを有していてもよい。センス鎖は、アンチセンス鎖と実質的に相補的であってもよく、生物学的条件下でアンチセンス鎖にアニールする。
【０１３０】
RNAi分子の使用方法
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、分子の直接的な適用によって、又は担体若しくは希釈剤と組み合わせた分子を用いて、細胞又は組織に送達することができる。
【０１３１】
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、担体又は希釈剤若しくは、ウイルス配列、ウイルス物質又は脂質若しくはリポソーム製剤などの細胞への侵入を補助又は促進するように機能する他の送達ビヒクルを用いた分子の直接的な適用によって、細胞、組織、器官又は被験体に送達又は投与することができる。
【０１３２】
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、カチオン性脂質と複合体を形成するか、リポソーム内にパッケージするか、或いは標的細胞又は組織に送達することができる。核酸又は核酸複合体は、直接皮膚適用、経皮適用又は注射によって生体外又は生体内の関連する組織に局所投与することができる。
【０１３３】
送達系は、例えば、水性及び非水性ゲル、クリーム、エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性及び非水性溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素ベース及び粉末を含んでいても良く、そして可溶化剤及び浸透増強剤等の添加物を含んでいても良い。
【０１３４】
本開示の組成物及び方法は、核酸分子の発現を可能にするように、少なくとも1つの本発明のRNAi分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含むことができる。
【０１３５】
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、DNA又はRNAベクターに挿入された転写単位から発現させることができる。組換えベクターは、DNAプラスミド又はウイルスベクターとすることができる。核酸分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。
【０１３６】
例えば、ベクターは、二重鎖のRNAi分子の両方の鎖をコードする配列、又は自己相補的であってRNAi分子を形成する単一の核酸分子を含んでいても良い。発現ベクターは、2つ以上の核酸分子をコードする核酸配列を含んでいても良い。
【０１３７】
核酸分子は、真核生物のプロモーターから細胞内で発現することができる。当業者は、任意の核酸が、適切なDNA/RNAベクターから真核細胞において発現できることを理解している。
【０１３８】
いくつかの態様では、発現コンストラクトを細胞に導入するためにウイルスコンストラクトを使用することができ、これは当該発現コンストラクトによりコードされるdsRNA構築物の転写のためである。
【０１３９】
脂質製剤は、静脈内、筋肉内又は腹腔内注射によって、若しくは経口的に又は吸入によって、若しくは当該分野で公知の他の方法によって動物に投与することができる。
【０１４０】
オリゴヌクレオチドを投与するための薬学的に許容される製剤は公知であり、使用することができる。
【実施例】
【０１４１】
実施例１：p21 siRNAを用いたインビトロノックダウン。
図2は、A549細胞においてp21 mRNAをダウンレギュレートする能力について試験したp21 siRNAを示している。トランスフェクションの24時間前にA549細胞を2000/ウェルで播種した。次いで、0.1、1及び10nMの濃度のp21 siRNAで細胞を24時間トランスフェクトした。p21発現レベルの倍率変化をqRT-PCR（n=3）を用いて測定した。図2に示した全てのp21 siRNAにより、A549細胞におけるp21 mRNAに対する有意なノックダウンを達成することができた。
【０１４２】
実施例２：インビトロノックダウンのためのプロトコル。
トランスフェクションの1日前に、10％FBSを含む100μlのDMEM（HyCloneカタログ番号SH30243.01）を96ウェルプレートに2×103細胞/ウェルでプレートし、5％CO2の空気中で加湿雰囲気を含む37℃インキュベーターで培養する。トランスフェクションの前に、培地を、2％FBSを含む90μlのOpti-MEM I還元血清培地（Life Technologiesカタログ番号31985-070）に変更する。0.2μlのLipofectamine RNAiMax（Life Technologies Cat。＃13778-100）を4.8μlのOpti-MEM Iと室温で5分間混合する。1μlのsiRNAと4μlのOpti-MEM Iを混合し、LF2000溶液と混合し、ボルテックスせずに静かに混合する。室温で5分間待ち、混合物を室温で10分間インキュベートし、RNA-RNAiMax複合体を形成させる。さらに、10μlのRNA-RNAiMax複合体をウェルに添加し、プレートを手で静かに振盪する。細胞を5％CO2の空気中で加湿雰囲気を含む37℃のインキュベーター中で2時間インキュベートする。2％FBSを含む培地を新鮮な-MEM I Reduced Serum Medium（Life Technologiesカタログ番号31985-070）に交換する。トランスフェクションの24時間後、細胞を氷冷PBSで1回洗浄する。室温で5〜30分間、50μlのCell-to-Ct溶解緩衝液（Life Technologiesカタログ番号4391851C）で細胞を溶解する。停止液5μlを加え、室温で2分間インキュベートする。直ちにTAQMANを用いてRT-qPCRによりmRNAレベルを測定する。あるいは、サンプルを-80℃で凍結させ、後でアッセイすることもできる。
【０１４３】
スクリーニング測定の陽性対照は、配列番号4120及び4121（Ref. Pos.830）（Ambion、Austin）のセンス鎖及びアンチセンス鎖のペアを有する分子とした。
配列番号4120
センス：TCCTAAGAGTGCTGGGCATmUmU
配列番号4121
アンチセンス：AUGCCCAGCACUCUUAGGAmUmU
【０１４４】
実施例３：p21を標的とする本発明のsiRNAは、インビトロにおいて遺伝子サイレンシングに活性であることが見出された。遺伝子ノックダウンのためのp21 siRNAの用量依存的活性は、約3ピコモル（pM）未満のIC50、及び1pM程度の低いIC50を示すことが判明した。
【０１４５】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、siRNAノックダウン効果を決定した。表3に示すように、p21 mRNAの用量依存的ノックダウンが、表1のsiRNAで観察された。
【０１４６】
【表３】
0006793649.tif 000058
【０１４７】
表3に示すように、表1のp21 siRNAの活性は0.3〜10pMの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に適している。
【０１４８】
本明細書に記載された実施形態は限定的ではなく、当業者は、本明細書に記載の修飾の特定の組み合わせを、改善されたRNAi活性を有する核酸分子を同定するための過度の実験なしに試験することができることを容易に理解することができる。
【０１４９】
本明細書中で具体的に言及される全ての刊行物、特許及び文献は、あらゆる目的のためにその全体が参考として援用される。
【０１５０】
本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、材料、及び試薬に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。説明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示された説明に様々な置換及び変更を加えることができ、これらの実施形態はこの説明及び添付の特許請求の範囲内にあることは、当業者にとって極めて明らかである。
【０１５１】
単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈上他に明確に指示されていない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。同様に、用語「a」（又は「an」）、「1つ以上」及び「少なくとも1つの」は、本明細書では交換可能に使用することができる。用語「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（including）」及び「有する」は、互換的に使用することができ、広範かつ制限なしに読まれるべきである。
【０１５２】
本明細書中の値の範囲の記載は、本明細書中に別段の指示がない限り、範囲内の各別個の値を個々に参照する簡略方法として役立つことを意図しており、それぞれの個別値は個々に記載されているかのように組み入れられる。ここで、マーカッシュグループについては、当業者は、この説明が個々のメンバーならびにマーカッシュグループのメンバーのサブグループを含むことを認識するであろう。
【０１５３】
それ以上の詳述なしに、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるものであり、決して本開示の残りの部分を限定するものではない。
【０１５４】
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書で開示された各特徴は、同じ、等価の目的、又は同様の目的を果たす代替の特徴と置き換えることができる。
【図１】
0006793649.tif 000059
【図２】
0006793649.tif 000060
【配列表】
0006793649000001.app