(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節可能キメラ抗原受容体（ＲＣＡＲ）であって、
（ａ）細胞内シグナル伝達ドメインおよびＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；
（ｂ）抗原結合ドメインおよびＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバー；ならびに
（ｃ）膜貫通ドメイン
を含み、
ここで、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、
（ｉ）配列番号１または配列番号１４１のＦＫＢＰ配列と少なくとも９０％の同一性を有するＦＲＢ結合フラグメントまたはＦＫＢＰの類似体を含むスイッチドメイン、および
（ｉｉ）配列番号２のＦＲＢ配列と少なくとも９０％の同一性を有し、Ｅ２０３２変異を含むか、またはＥ２０３２変異およびＴ２０９８変異を含むＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体を含むスイッチドメインから選択され、ここで、配列番号２の最初のアミノ酸は位置２０２１であり、
ここで、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは二量体化分子の存在下で結合する、
ＲＣＡＲ。
【請求項２】
調節可能キメラ抗原受容体（ＲＣＡＲ）であって、
（ａ）表４から選択される阻害細胞外ドメイン、膜貫通領域およびＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの第一スイッチドメインを含む阻害細胞外ドメインメンバー；ならびに
（ｂ）細胞内シグナル伝達ドメインおよびＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの第二スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー
を含み、
ここで、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、
（ｉ）配列番号１または配列番号１４１のＦＫＢＰ配列と少なくとも９０％の同一性を有するＦＲＢ結合フラグメントまたはＦＫＢＰの類似体を含むスイッチドメイン、および
（ｉｉ）配列番号２のＦＲＢ配列と少なくとも９０％の同一性を有するＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体を含むスイッチドメインから選択され、
ここで、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは二量体化分子の存在下で結合する、
ＲＣＡＲ。
【請求項３】
調節可能キメラ抗原受容体（ＲＣＡＲ）であって、
（ａ）ＣＤ２７のもの以外の表５から選択される共刺激ＥＣＤドメイン、膜貫通領域およびＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの第一スイッチドメインを含む共刺激細胞外ドメイン（ＥＣＤ）メンバー；ならびに
（ｂ）細胞内シグナル伝達ドメインおよびＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの第二スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー
を含み、
ここで、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、
（ｉ）配列番号１または配列番号１４１のＦＫＢＰ配列と少なくとも９０％の同一性を有するＦＲＢ結合フラグメントまたはＦＫＢＰの類似体を含むスイッチドメイン、および
（ｉｉ）配列番号２のＦＲＢ配列と少なくとも９０％の同一性を有するＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体を含むスイッチドメインから選択され、
ここで、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは二量体化分子の存在下で結合する、
ＲＣＡＲ。
【請求項４】
ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体が、Ｅ２０３２変異、Ｔ２０９８変異、またはＥ２０３２変異およびＴ２０９８変異を含み、ここで、配列番号２の最初のアミノ酸は位置２０２１である、請求項２または３に記載のＲＣＡＲ。
【請求項５】
Ｅ２０３２変異がＥ２０３２ＩまたはＥ２０３２Ｌから選択され、Ｔ２０９８変異がＴ２０９８Ｌである、請求項１または４に記載のＲＣＡＲ。
【請求項６】
抗原結合メンバーが表２から選択される複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含み、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含まない、請求項１または５に記載のＲＣＡＲ。
【請求項７】
細胞内シグナル伝達メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインが表１に挙げたものから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである、請求項１から６のいずれか一項に記載のＲＣＡＲ。
【請求項８】
細胞内シグナル伝達メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインが表２から選択される共刺激シグナル伝達ドメインである、請求項１から６のいずれか一項に記載のＲＣＡＲ。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載のＲＣＡＲをコードする核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含む、ベクター系。
【請求項１１】
請求項１から８のいずれか一項に記載のＲＣＡＲ、請求項９に記載の核酸または請求項１０に記載のベクター系を含む、細胞。
【請求項１２】
請求項９に記載の核酸または請求項１０に記載のベクター系を細胞に導入することを含む、ＲＣＡＲを含む細胞を製造する方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の核酸または請求項１０に記載のベクター系を導入することにより産生された細胞を含む、対象において癌を処置するための医薬組成物。
【請求項１４】
対象がヒトである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項９に記載の核酸または請求項１０に記載のベクター系を導入することにより産生された細胞を含み、二量体化分子と組み合わせて用いられる、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
対象において癌を処置するための、ＲＣＡＲまたはＲＣＡＲをコードする核酸を含む細胞を含む医薬組成物であって、ここで、ＲＣＡＲは、
Ａ）細胞内シグナル伝達ドメインおよびＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；
Ｂ）抗原結合ドメインおよびＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバー；ならびに
Ｃ）膜貫通ドメイン、
を含み、
ここで、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、
（ｉ）配列番号１または配列番号１４１のＦＫＢＰ配列と少なくとも９０％の同一性を有するＦＲＢ結合フラグメントまたはＦＫＢＰの類似体を含むスイッチドメイン、および
（ｉｉ）配列番号２のＦＲＢ配列と少なくとも９０％の同一性を有し、Ｅ２０３２変異を含むか、またはＥ２０３２変異およびＴ２０９８変異を含むＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体を含むスイッチドメインから選択され、ここで、配列番号２の最初のアミノ酸は位置２０２１であり、
ここで、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは二量体化分子の存在下で結合し、
ここで、該医薬組成物は、
（ｉ）ＲＡＤ００１である二量体化分子；または（ｉｉ）免疫増強用量のアロステリックｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて用いられる、医薬組成物。
【請求項１７】
細胞が自己Ｔ細胞、同種Ｔ細胞、自己ＮＫ細胞または同種ＮＫ細胞である、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ＲＣＡＲＸ細胞を提供する方法であって、
免疫エフェクター細胞をエンティティから受け取り；請求項１から８のいずれか一項に記載のＲＣＡＲをコードする核酸を該免疫エフェクター細胞またはその娘細胞に挿入し、ＲＣＡＲＸ細胞を形成し；そして、該ＲＣＡＲＸ細胞を該エンティティに提供することを含み、該エンティティが研究室、病院または医療提供者である、方法。
【請求項１９】
（ｉ）第二抗原に結合する抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインまたは膜アンカリングドメインを含む補助的抗原結合メンバー；
（ｉｉ）表４からの阻害カウンターリガンド結合ドメインおよび膜貫通ドメインまたは膜アンカリングドメインを含む阻害カウンターリガンド結合メンバー；
（ｉｉｉ）阻害ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）メンバー、ここで、ｉＣＡＲメンバーは、非標的細胞上の抗原を認識する抗原結合ドメイン（または他の細胞外ドメイン）、膜貫通ドメインならびにＢ７−Ｈｌ、Ｂ７−ｌ、ＣＤ１６０、ＰｌＨ、２Ｂ４、ＰＤｌ、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲｌおよびＴＧＦ−ベータ受容体からなる群より選択される阻害分子由来のドメインを含む；
（ｉｖ）第二ＲＣＡＲまたは第二抗原結合メンバー、ここで、ＲＣＡＲまたは抗原結合メンバーの一方の抗原結合ドメインは、可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含まず、他方はｓｃＦｖではない；または
（ｖ）表３から選択される阻害分子の阻害剤
をさらに含む、請求項１１に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国出願番号６１／９１９,５８８号(２０１３年１２月２０日出願)、米国出願番号６１／９５３,８１８号(２０１４年３月１５日出願)、国際出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０８２６１５号(２０１４年７月２１日出願)および国際出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９０４９４号(２０１４年１１月６日出願)に基づく優先権を主張し、これらの出願の内容全体を引用により本明細書に包含させる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、全般的に、調節可能なキメラ抗原受容体(ＲＣＡＲ)およびＲＣＡＲを発現する細胞、例えば、標的細胞、例えば、癌を標的とする細胞、ならびにこれを製造し、不活化または死滅させるために、使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
自己Ｔ細胞、特にキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を形質導入したＴ細胞を用いる養子細胞移入(ＡＣＴ)療法は、血液癌パイロット治験で有望であることが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
要約
本発明の態様は、免疫応答を提供するためのＲＣＡＲＸ細胞の使用における、安全性および有効性の最適化に取り組む。本発明の態様は、部分的には、ＣＡＲ分子が、“結合ドメイン”および“シグナル伝達ドメイン”の各々が２個の別々の“スイッチドメイン”に連結するように仕切られるとの発見に基づく。このような態様において、ＣＡＲを介するシグナル伝達の活性化は、これらのスイッチドメインおよびゆえに結合ドメインとシグナル伝達ドメインが、二量体化分子によりまとめられる、すなわちＣＡＲを介するシグナル伝達のスイッチが“オン”されたときのみ生じる。本発明の態様は、とりわけ、ＲＣＡＲを含む細胞が介在する免疫エフェクター応答に対する外部的な、例えば、一過性制御を可能にするための、シグナルの活性化を“オン”にする二量体化スイッチの使用を含む。より詳細に後で述べるとおり、態様において、ＲＣＡＲは、二量体化分子の存在下、細胞内シグナル伝達ドメインを細胞外認識成分、例えば、抗原結合ドメイン、阻害カウンターリガンド結合ドメインまたは共刺激ＥＣＤドメインに連結できる、二量体化スイッチを含む。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第一の面において、本発明は、調節可能キメラ抗原受容体(ＲＣＡＲ)、例えば、単離ＲＣＡＲに関し、本明細書で、該ＲＣＡＲは
ａ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび
第一スイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；
ｂ) 抗原結合ドメイン、
第二スイッチドメイン；および
所望により、１個または複数個の共刺激シグナル伝達ドメイン
を含む抗原結合メンバー：
および
ｃ) 所望により、膜貫通ドメイン
を含む。例えば、図２および５参照。
(特に断らない限り、ＲＣＡＲのメンバーまたは成分が本明細書に記載されているとき、順番は示したとおりであり得るが、他の順番も同様に包含される。換言すると、ある態様において、順番は本書に記載のとおりであるが、他の態様において、順番は異なり得る。)
【０００６】
ある態様において、膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達メンバーまたは抗原結合メンバー上に配置できる。ある態様において、膜貫通ドメインは細胞内シグナル伝達メンバーおよび膜貫通ドメインまたは膜アンカー(膜アンカーおよび膜アンカリングドメインを本明細書では交換可能に使用する)を抗原結合メンバー上に配置できる。
【０００７】
ある態様において、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは細胞内または細胞外二量体化スイッチを形成できる。
【０００８】
ある態様において、二量体化スイッチはホモ二量体化スイッチまたはヘテロ二量体化スイッチであり得る。
【０００９】
本明細書に記載するとおり、ＲＣＡＲの態様は、例えば、上記のような、１個以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むメンバー、例えば、細胞内シグナル伝達メンバーを含み得る。ある態様において、抗原結合メンバーは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。このようなメンバーおよび細胞内シグナル伝達ドメインの態様は、この直ぐ後に記載されており、ここでは細胞内シグナル伝達ドメインモジュールと呼ぶこともある。
【００１０】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される、一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【００１１】
ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ゼータドメインを含む。
【００１２】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【００１３】
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは４−１ＢＢドメインを含む。
【００１４】
ある態様において、ＲＣＡＲは第二細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００１５】
ある態様において、第二細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される、一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【００１６】
ある態様において、第二細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【００１７】
ある態様において、第一および第二細胞内シグナル伝達ドメインは
４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメイン；または
ＣＤ２８ドメインおよび４−１ＢＢドメイン
を含む。
【００１８】
ある態様において、ＲＣＡＲは、第三細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００１９】
ある態様において、第三細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される、一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【００２０】
ある態様において、第三細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【００２１】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインの１個は、例えば、表１のリストから選択される、一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り２個は、例えば、表２から選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【００２２】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインの２個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残りは、例えば、表２から選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【００２３】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【００２４】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【００２５】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ドメイン；４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインを含む。
【００２６】
ある態様において、ＲＣＡＲは、第四細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００２７】
ある態様において、第四細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【００２８】
ある態様において、第四細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【００２９】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの１個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り３個は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【００３０】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの２個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り２個は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【００３１】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの３個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残りは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【００３２】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【００３３】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【００３４】
ある態様において、スイッチドメインおよび１個以上の細胞内シグナル伝達ドメイン(ｉｓｄ)の順番は、アミノ末端から開始して、次のとおりである。
スイッチ／ｉｓｄ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３／スイッチ；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；および
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ／ｉｓｄ３。
【００３５】
ある態様において、スイッチドメインおよび１個以上の細胞内シグナル伝達ドメイン(ｉｓｄ)の順番は、カルボキシ末端から開始して、次のとおりである。
スイッチ／ｉｓｄ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３／スイッチ；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；および
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ／ｉｓｄ３。
【００３６】
ある態様において、本発明は、ＲＣＡＲ、例えば、単離ＲＣＡＲに関し、本明細書で、該ＲＣＡＲは
ａ) 抗原結合ドメイン、
第一膜貫通ドメインおよび
第一スイッチドメイン
を含む抗原結合メンバー；ならびに
ｂ) 第二膜貫通ドメインまたは膜アンカー、
第二スイッチドメイン
および細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー
を含む。
例えば、図５４を参照のこと。
【００３７】
ある態様において、抗原結合メンバーは、所望により１個以上の本明細書に記載する共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、さらに、１個以上の本明細書に記載する共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【００３８】
ある態様において、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは細胞内または細胞外二量体化スイッチを形成できる。
【００３９】
ある態様において、二量体化スイッチはホモ二量体化スイッチまたはヘテロ二量体化スイッチであり得る。
【００４０】
ある態様において、第一および／または第二膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８(例えば、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ)、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Tactile)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐの膜貫通領域を含む。抗原結合メンバー上に配置された第一膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達メンバー上に配置された第二膜貫通ドメインは、例えば、同じ配列を有する同じ膜貫通ドメインであってよく、または、例えば、異なる配列を有する異なる膜貫通ドメインであってよい。
【００４１】
本明細書に記載するとおり、ＲＣＡＲは多様な二量体化スイッチのいずれか、例えば、本明細書で二量体化スイッチモジュールと呼ぶこともある、この直ぐあとに記載する二量体化スイッチを含み得る。
【００４２】
ある態様において、スイッチドメインは、ヘテロ二量体化スイッチの成分である。
【００４３】
ある態様において、スイッチドメインは、ホモ二量体化スイッチの成分である。
【００４４】
ある態様において、二量体化スイッチは、細胞内である。
【００４５】
ある態様において、二量体化スイッチは、細胞外である。
【００４６】
ある態様において、抗原結合メンバー上に配置された膜貫通ドメインおよび二量体化スイッチ、例えば、ヘテロ二量体化スイッチまたはホモ二量体化スイッチは、細胞内である。
【００４７】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバー上に配置された膜貫通ドメインおよび二量体化スイッチ、例えば、ヘテロ二量体化またはホモ二量体化スイッチは、細胞外である。
【００４８】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含む。
【００４９】
ある態様において、二量体化スイッチは
ＦＫＢＰと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインを含む。
【００５０】
ある態様において、二量体化スイッチは、本明細書に記載するＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含む。
【００５１】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰの対応する配列と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢの対応する配列と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインを含む。
【００５２】
ある態様において、二量体化スイッチはＦＲＢ結合フラグメントまたはＦＫＢＰの類似体およびＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体を含み、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は１個以上のＦＫＢＰスイッチドメイン、ＦＲＢスイッチドメインおよび二量体化分子の間の複合体の形成を増強する変異または「修飾ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチ」なる表題を付した後記段落に記載する変異を含む。例えば、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、Ｅ２０３２変異、例えば、Ｅ２０３２Ｉ変異またはＥ２０３２Ｌ変異；Ｔ２０９８変異、例えば、Ｔ２０９８Ｌ変異；またはＥ２０３２およびＴ２０９８変異、例えば、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８ＬまたはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含む。
【００５３】
スイッチがＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチである、ある態様において、二量体化分子は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
【００５４】
ある態様において、低い、免疫増強用量のアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１についての後記段落で記載するアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の投与レジメまたは製剤のいずれも、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの二量体化のために投与できる。
【００５５】
ある態様において、スイッチはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチであり、二量体化分子はＲＡＤ００１である。
【００５６】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【００５７】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【００５８】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【００５９】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、徐放製剤中０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【００６０】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのＲＡＤ００１を投与する。
【００６１】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含むスイッチドメインを含む。
【００６２】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰからのラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢからのラパマイシン類似体結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含むスイッチドメインを含む。
【００６３】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含むスイッチドメインを含む。
【００６４】
ある態様において：
第一スイッチドメインは
ＦＫＢＰからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＫＢＰからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列
を含み、
第二スイッチドメインは
ＦＲＢからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＲＢからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列
を含む。
【００６５】
ある態様において：
第一スイッチドメインは
ＦＲＢからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＲＢからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列
を含み、
第二スイッチドメインは
ＦＫＢＰからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＫＢＰからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列
を含む。
【００６６】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列を含み、
第二スイッチドメインは、ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含む。
【００６７】
ある態様において、第一スイッチドメインは、ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含み、
第二スイッチドメインは、ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列を含む。
【００６８】
ある態様において、二量体化分子はラパマイシン類似体、例えば、ＡＰ２１９６７である。
【００６９】
ある態様において、二量体化スイッチはＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチを含む。
【００７０】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するクーママイシン結合配列を含むスイッチドメインを含む。
【００７１】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインと１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないクーママイシン結合配列を含むスイッチドメインを含む。
【００７２】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインからのクーママイシン結合配列を含むスイッチドメインを含む。
【００７３】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインを含む。
【００７４】
ある態様において、二量体化分子は、クーママイシンである。
【００７５】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチを含む。
【００７６】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧＩＤ１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するジベレリンまたはジベレリン類似体、例えば、ＧＡ３、結合配列を含むＧＩＤ１スイッチドメインおよびＧＡＩと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するＧＡＩスイッチドメインを含むスイッチドメインを含む。
【００７７】
ある態様において、二量体化スイッチは、
本明細書に記載するＧＩＤ１の対応する配列と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないジベレリンまたはジベレリン類似体、例えば、ＧＡ３、結合配列を含むＧＩＤ１スイッチドメインおよび本明細書に記載するＧＡＩの対応する配列と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないＧＡＩスイッチドメインを含む。
【００７８】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＧＩＤ１スイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ＧＡＩスイッチドメインを含む。
【００７９】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＧＡＩスイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ＧＩＤ１スイッチドメインを含む。
【００８０】
ある態様において、二量体化分子は、ＧＡ３−ＡＭである。
【００８１】
ある態様において、二量体化分子は、ＧＡ３である。
【００８２】
ある態様において、二量体化分子は、小分子、例えば、ポリペプチド以外である。
【００８３】
ある態様において、二量体化分子は、ポリペプチド、例えば、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインの一方または両方に特異的親和性を有するポリペプチド、例えば、ポリペプチド、例えば、抗体分子または非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチンまたはアドネクチンである。
【００８４】
ある態様において、二量体化分子、例えば、ポリペプチドは、抗体分子である。
【００８５】
ある態様において、二量体化スイッチは、ハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチを含む。
【００８６】
ある態様において、二量体化スイッチは、
配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するハロタグスイッチドメインおよび配列番号１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するＳＮＡＰタグスイッチドメインを含む。
【００８７】
ある態様において、二量体化スイッチは、
配列番号１４と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないハロタグスイッチドメインおよび配列番号１５と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないＳＮＡＰタグスイッチドメインを含む。
【００８８】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ハロタグスイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ＳＮＡＰタグスイッチドメインを含む。
【００８９】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＳＮＡＰタグスイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ハロタグスイッチドメインを含む。
【００９０】
ある態様において、二量体化分子は、構造５を含む。
【００９１】
ある態様において、二量体化分子は、３個以上のドメイン、例えば、スイッチドメインと結合するタンパク質タグ、例えば、ポリペプチド、例えば、該ドメインに親和性を有する抗体分子または非抗体スキャフォールドを含む。
【００９２】
ある態様において、二量体化分子は、非共有結合性二量体化分子である。
【００９３】
ある態様において、二量体化分子は、共有結合性二量体化分子である。
【００９４】
ある態様において、二量体化スイッチ、例えば、ホモ二量体化スイッチ、例えば、細胞外ホモ二量体化スイッチは、タグ分子、例えば、ｃ−ｍｙｃペプチドタグ、ｆｌａｇペプチドタグ、ＨＡペプチドタグまたはＶ５ペプチドタグを含むスイッチドメインおよびスイッチドメイン、例えば、抗体分子および非抗体スキャフォールドに親和性を有するポリペプチドを含む二量体化スイッチを含む。
【００９５】
ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに、二次二量体化スイッチを含む。
【００９６】
ある態様において、二量体化分子は２を超える結合価を有し、例えば、それは多価であり、２個を超えるスイッチドメインと結合し、それゆえにクラスター化または二量体化する。
【００９７】
本明細書に記載する二量体化スイッチの態様は、複数スイッチドメインを備えてよく、本明細書ではマルチスイッチということもある。マルチスイッチは、本明細書で複数スイッチドメインなる表題の段落に記載するとおり、複数の、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のスイッチドメインを、第一メンバー、例えば、抗原結合メンバーおよび第二メンバー、例えば、細胞内シグナル伝達メンバーと独立して含む。
【００９８】
ある態様において、第一メンバー、例えば、抗原結合メンバーは、複数の第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインを含み、第二メンバー、例えば、細胞内シグナル伝達メンバーは、複数の第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢベースのスイッチドメインを含む。例えば、図５５Ａを参照のこと。ある態様において、第一メンバーは、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含み、第二メンバーは、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含む。例えば、図５５Ｂを参照のこと。
【００９９】
ある態様において、第一メンバーおよび第二メンバーは、複数のホモ二量体化スイッチドメイン、例えば、ＧｙｒＢベースのスイッチドメインを含む。
【０１００】
本明細書に記載するとおり、ＲＣＡＲの態様は、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメインを含むメンバー、例えば、抗原結合メンバーを含み得る。理論に縛られることを望まないが、このようなドメインの存在が、ＲＣＡＲのメンバーの二量体化スイッチ介在結合の非存在下で、顕著な活性化なく、細胞におけるメンバーの残留性を促進する。このようなメンバーの態様は、直ぐ後の段落に記載し、本明細書では残留性モジュールと呼ぶこともある。
【０１０１】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
ａ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表１から選択される、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインおよび
例えば、第一スイッチドメインおよびＦＫＢＰスイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；および
ｂ) 抗原結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、４−１ＢＢドメインおよび
第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢスイッチドメイン
を含む、抗原結合メンバー
を含む。
例えば、図２６、４２Ａおよび４４Ａを参照のこと。
【０１０２】
ある態様において、抗原結合メンバーは、例えば、表２から選択される、複数の、例えば、２個または３個の共刺激シグナル伝達ドメインを含み、いくつかの態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。
【０１０３】
ある態様において、抗原結合メンバーは、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択される、複数の、例えば、２個または３個の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０１０４】
ある態様において、２個以上の共刺激ドメインは、同じ共刺激シグナル伝達ドメインでも、異なる共刺激シグナル伝達ドメインでもよい。
【０１０５】
ある態様において、抗原結合メンバーは、細胞外から細胞内方向で、次の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
４１ＢＢ−ＣＤ２７；
ＣＤ２７−４１ＢＢ；
４１ＢＢ−ＣＤ２８；
ＣＤ２８−４１ＢＢ；
ＯＸ４０−ＣＤ２８；
ＣＤ２８−ＯＸ４０；
ＣＤ２８−４１ＢＢ；または
４１ＢＢ−ＣＤ２８。
【０１０６】
ある態様において、抗原結合メンバーは、ＣＤ２８−４１ＢＢを共刺激シグナル伝達ドメインとして含む。
【０１０７】
ある態様において、抗原結合メンバーは、ＣＤ２８−ＯＸ４０を共刺激シグナル伝達ドメインとして含む。
【０１０８】
ある態様において、抗原結合メンバーは、例えば、表２から選択される、複数の、例えば、２個または３個の共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載する共刺激シグナル伝達ドメインの組み合わせを含み、細胞内結合ドメインは、ＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０１０９】
ある態様において、２個以上の共刺激シグナル伝達ドメインを有する抗原結合メンバーは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。
【０１１０】
ある態様において、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含み、これはＦＲＢ結合フラグメントまたはＦＫＢＰの類似体を含むスイッチドメインおよびＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体を含むスイッチドメインを含み、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、１個以上のＦＫＢＰスイッチドメイン、ＦＲＢスイッチドメインおよび二量体化分子の間の複合体の形成を増強する変異または修飾ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチなる表題の段落に記載する変異を含む。例えば、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、Ｅ２０３２変異、例えば、Ｅ２０３２Ｉ変異またはＥ２０３２Ｌ変異；Ｔ２０９８変異、例えば、Ｔ２０９８Ｌ変異；またはＥ２０３２およびＴ２０９８変異、例えば、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８ＬまたはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含む。
【０１１１】
このような態様において、ＲＣＡＲは、本明細書で複数スイッチドメインなる表題の段落に記載するとおり、第一メンバー、例えば、抗原結合メンバーおよび第二メンバー、例えば、細胞内シグナル伝達メンバーと独立して、複数の、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のスイッチドメインを含む、マルチスイッチを含む。ある態様において、第一メンバーは複数の第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインを含み、第二メンバーは複数の第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢベースのスイッチドメインを含む。ある態様において、第一メンバーは、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含み、第二メンバーは、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含む。
【０１１２】
抗原結合メンバーが複数の抗原結合ドメインを含む、ＲＣＡＲもここで提供される。ある態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、２個、３個、４個または５個の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖｓを含み、ここで、各抗原結合ドメインは標的抗原に結合する。ある態様において、抗原結合ドメインの２個以上は、異なる抗原に結合できる。ある態様において、抗原結合ドメインの２個以上は、同じ抗原、例えば、同じ抗原上の同じまたは異なるエピトープに結合できる。ある態様において、リンカーまたはヒンジ領域は、所望により２個の抗原結合ドメインの間または各抗原結合ドメインに配置される。
【０１１３】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
ａ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表１から選択される、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインおよび
ＦＫＢＰスイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；および
ｂ)
(ｉ) 抗原結合ドメイン、例えば、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメイン、例えば、本明細書に記載する抗ＣＤ１９抗原結合ドメイン、
(ii) 膜貫通ドメイン、
(iii)
(Ａ)ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメイン；または
(Ｂ)ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインおよびＯＸ−４０共刺激シグナル伝達ドメイン
の１個および
(iv) １個以上の修飾ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチなる表題の段落に本明細書に記載した変異、例えば、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８ＬまたはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含むＦＲＢスイッチドメイン
を含む抗原結合メンバー
を含む。
【０１１４】
ある態様において、抗原結合メンバーの成分の順番は、アミノ末端から開始して、次のとおりである。
抗原結合ドメイン／膜貫通ドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン／スイッチドメイン；または
抗原結合ドメイン／膜貫通ドメイン／スイッチドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン。
【０１１５】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーの成分の順番は、アミノ末端から開始して、次のとおりである。
スイッチドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表１から選択される、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン；または
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表１から選択される、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン／スイッチドメイン。
【０１１６】
ある態様において、抗原結合メンバーの成分の順番は、カルボキシ末端から開始して、次のとおりである。
抗原結合ドメイン／膜貫通ドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン／スイッチドメイン；または
抗原結合ドメイン／膜貫通ドメイン／スイッチドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン。
【０１１７】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーの成分の順番は、カルボキシ末端から開始して、次のとおりである。
スイッチドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表１から選択される、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン；または
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表１から選択される、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン／スイッチドメイン。
【０１１８】
ある態様において、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを形成する。
【０１１９】
ある態様において、第一二量体化スイッチおよび第二二量体化スイッチの一方は、ＦＫＢＰと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインを含み、他方は、ＦＲＢと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列結合配列を含むスイッチドメインを含む。
【０１２０】
スイッチがＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチである、ある態様において、二量体化分子は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
【０１２１】
ある態様において、低い、免疫増強用量のアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１についての段落で、ここで記載するアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の投与レジメまたは製剤のいずれも、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの二量体化のために投与できる。
【０１２２】
ある態様において、スイッチはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチであり、二量体化分子はＲＡＤ００１である。
【０１２３】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０１２４】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０１２５】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０１２６】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、徐放製剤中０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０１２７】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０１２８】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチ、例えば、本明細書に記載するＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、本明細書に記載するＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチを含む。
【０１２９】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチ、例えば、本明細書に記載するＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、本明細書に記載するＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチを含む。
【０１３０】
ある態様において、二量体化スイッチは、ハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチ、例えば、本明細書に記載するハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、本明細書に記載するハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチを含む。
【０１３１】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
ａ) アミノ末端から開始して、次のものを含む細胞内シグナル伝達メンバー：
ＣＤ３ゼータドメインおよび
第一スイッチドメイン；および
ｂ) アミノ末端から開始して、次のものを含む抗原結合メンバー：
抗原結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、
４−１ＢＢドメインおよび
第二スイッチドメイン
を含み、ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを形成する。
【０１３２】
ある態様において、ＲＣＡＲは、補助的抗原結合メンバーを含む。このような態様は下記段落に記載し、ここでは補助的結合ドメインモジュールと呼ぶこともある。
【０１３３】
ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに
ｃ) 第二抗原に結合する抗原結合ドメイン；および
膜貫通ドメインまたは膜アンカリングドメイン
を含む、補助的抗原結合メンバーを含む。
【０１３４】
ある態様において、補助的抗原結合ドメインは、抗原結合メンバーまたは細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化スイッチを形成できるスイッチドメインを含まない。
【０１３５】
ある態様において、補助的抗原結合メンバーは、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。
【０１３６】
ある態様において、該第二抗原は癌細胞表面抗原である。
【０１３７】
ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに
ｄ) 第三抗原に結合する抗原結合ドメイン；および
膜貫通ドメインまたは膜アンカリングドメイン
を含む、第二補助的抗原結合メンバーを含む。
【０１３８】
ある態様において、該第三抗原は、抗原結合メンバーの抗原結合ドメインにより認識される抗原と異なり、かつ補助的抗原結合メンバーの抗原結合ドメインにより認識される抗原と異なる。
【０１３９】
ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに、
ヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメインと連結した膜貫通ドメインである第一標的に結合する抗原結合ドメイン、
ヘテロ二量体化スイッチの第二スイッチドメインと連結した細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび
第一標的および膜貫通ドメインと異なる第二標的と結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、該ヘテロ二量体化スイッチは、細胞の内側に存在し、細胞の内側のヘテロ二量体化分子の存在下、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインが互いに相互作用して複合体を形成する。
【０１４０】
ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに、
例えば、第二抗原と結合する、抗原結合ドメイン、
膜貫通ドメインおよび
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内
シグナル伝達ドメイン
を含む、スイッチ非連動補助的抗原結合メンバーを含む。
例えば、図９を参照のこと。
【０１４１】
ある態様において、スイッチ非連動補助的抗原結合メンバーは、さらに、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０１４２】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバースイッチ非連動補助的抗原結合メンバーは、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０１４３】
ある態様において、スイッチ非連動補助的抗原結合メンバーは、４−１ＢＢドメインを含む。
【０１４４】
ある態様において、スイッチ非連動補助的抗原結合メンバーは、ＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０１４５】
ある態様において、スイッチ非連動補助的抗原結合メンバーは、ＣＤ３ゼータドメインおよび４−１ＢＢドメインを含む。
【０１４６】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
阻害分子の阻害剤、例えば、表３の阻害分子の阻害剤と結合し、例えば、同じ細胞内に、
提供される。
【０１４７】
ある態様において、ＲＣＡＲは、阻害分子、例えば表３からの共阻害分子を標的とするｓｈＲＮＡと結合し、例えば、同じ細胞内に、
提供される。
【０１４８】
ある態様において、ｓｈＲＮＡはＰＤ１を標的とする。
【０１４９】
ある態様において、抗原結合ドメインは、癌細胞上の標的抗原と結合するが、二量体化分子を投与するまで、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を活性化しない。
【０１５０】
ある態様において、抗原結合ドメインは、標的細胞、例えば、癌細胞上の標的抗原と結合するが、二量体化分子、例えば、ヘテロ二量体化分子またはホモ二量体化分子を投与するまで、免疫エフェクター応答、例えば、Ｔ細胞活性化を促進しない。
【０１５１】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０１５２】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、４−１ＢＢドメインを含む。
【０１５３】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０１５４】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ＣＤ３ゼータドメインおよび４−１ＢＢドメインを含む。
【０１５５】
ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに
阻害カウンターリガンド結合ドメインおよび
膜貫通ドメインまたは膜アンカー
を含む、阻害カウンターリガンド結合メンバーを含む。
【０１５６】
ある態様において、阻害カウンターリガンド結合メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化スイッチを形成できるスイッチドメインを含む。
【０１５７】
ある態様において、阻害カウンターリガンド結合メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化スイッチを形成できるスイッチドメインを含まない。
【０１５８】
ある態様において、阻害カウンターリガンド結合ドメインは、表４から選択される。
【０１５９】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
ａ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび
第一スイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；
ｂ) 抗原結合ドメイン、
第二スイッチドメイン；および
膜貫通ドメイン
を含む抗原結合メンバー
を含み、ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは細胞内である。
【０１６０】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
ここで、抗原結合ドメインは、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインを含む二量体化スイッチにより一次細胞内シグナル伝達ドメインから離され、
ここで、該第二スイッチドメインは、抗原結合ドメインに連結され、第一スイッチドメインは細胞内シグナル伝達ドメインに連結され、ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、二量体化分子存在下で互いに相互作用して、複合体を形成する。
【０１６１】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
ここで、抗原結合ドメインは、細胞の内側に存在するヘテロ二量体化スイッチにより細胞内シグナル伝達ドメインから離され、
ここで、該ヘテロ二量体化スイッチは第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインを含み、ここで、該第一スイッチドメインは膜貫通ドメインに連結され、第二スイッチドメインは細胞内シグナル伝達ドメインに連結され、
ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、細胞の内側のヘテロ二量体化分子の存在下、互いに相互作用して、複合体を形成する。
【０１６２】
ある態様において、膜貫通ドメインは、第二スイッチドメインと抗原結合ドメインの間に配置される。
【０１６３】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、膜貫通ドメインを含まない。
【０１６４】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
ａ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、
第一スイッチドメイン、
膜貫通ドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；および
ｂ) 抗原結合ドメインおよび
第二スイッチドメイン
を含む抗原結合メンバー
を含み、ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは細胞外である。
【０１６５】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達を含み、
ここで、抗原結合ドメインは、細胞の外側に存在する二量体化スイッチにより細胞内シグナル伝達ドメインと離され、
ここで、該二量体化スイッチは第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインを含み、
ここで、該第二スイッチドメインは膜アンカーに繋がれた抗原結合ドメインと連結し、第一スイッチドメインは膜貫通ドメインと連結し、
ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、細胞の外側の二量体化分子存在下で互いに相互作用して、複合体を形成する。
【０１６６】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達を含み、
ここで、抗原結合ドメインは細胞の外側に存在するホモ二量体化スイッチにより細胞内シグナル伝達ドメインから離され、
ここで、該ホモ二量体化スイッチは第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインを含み、
ここで、該第二スイッチドメインは膜アンカーに繋がれた抗原結合ドメインと連結し、第一スイッチドメインは膜貫通ドメインと連結し、
ここで、細胞の外側のホモ二量体化分子の存在下、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメイン互いに相互作用して、複合体を形成する。
【０１６７】
ある態様において、第二スイッチドメインは、抗原結合ドメインと膜アンカーまたは膜貫通ドメインの間に配置される。
【０１６８】
ある態様において、抗原結合メンバーは、膜貫通ドメインを含まない。
【０１６９】
ある態様において、第二スイッチドメインは膜アンカーに繋がれた抗原結合ドメインと連結し、第一スイッチドメインは膜貫通ドメインと連結する。
【０１７０】
ある態様において、二量体化分子は、抗体分子、二重特異性抗体、単特異性抗体、非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチンまたはアドネクチンおよびペプチドから選択される。
【０１７１】
ある態様において、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインが異なり、ヘテロ二量体化分子が第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインと結合する二重特異性抗体分子である。
【０１７２】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
ａ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび
第一スイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；
ｂ) 抗原結合ドメイン、
第二スイッチドメイン
を含む抗原結合メンバー；および
ｃ) 所望により、膜貫通ドメイン
を含み、ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを形成する。
【０１７３】
ある態様において、二量体化スイッチは、例えば、上記スイッチドメインモジュールにおいて、本明細書に記載する第一および第二ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチドメインを含む。
【０１７４】
ある態様において、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチＦＲＢ結合フラグメントまたはＦＫＢＰの類似体を含むスイッチドメインおよびＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体を含むスイッチドメインを含み、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、１個以上のＦＫＢＰスイッチドメイン、ＦＲＢスイッチドメインおよび二量体化分子の間の複合体の形成を増強する変異または修飾ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチなる表題の段落に記載する変異を含む。例えば、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、Ｅ２０３２変異、例えば、Ｅ２０３２Ｉ変異またはＥ２０３２Ｌ変異；Ｔ２０９８変異、例えば、Ｔ２０９８Ｌ変異；またはＥ２０３２およびＴ２０９８変異、例えば、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８ＬまたはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含む。
【０１７５】
ある態様において、ＲＣＡＲは細胞外ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含み、例えば、ＲＣＡＲは
ａ) 第一スイッチドメイン、
膜貫通ドメインおよび
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む(細胞の膜に配置されたとき、細胞外から細胞質の方向で)細胞内シグナル伝達メンバー；
ｂ) 抗原結合ドメイン、
第二スイッチドメインおよび
膜貫通ドメインまたは膜アンカリングドメイン
を含む(細胞の膜に配置されたとき、細胞外から細胞質の方向で)抗原結合メンバー
を含み、ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは細胞外ＦＫＰＢ−ＦＲＢベースのスイッチを形成する。
【０１７６】
ある態様において、二量体化スイッチは、例えば、上記スイッチドメインモジュールにおいて、本明細書に記載する第一および第二ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチドメインを含む。
【０１７７】
スイッチがＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチである、ある態様において、二量体化分子は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
【０１７８】
ある態様において、低い、免疫増強用量のアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１についての段落で、ここで記載するアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の投与レジメまたは製剤のいずれも、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの二量体化のために投与できる。
【０１７９】
ある態様において、スイッチはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチであり、二量体化分子はＲＡＤ００１である。
【０１８０】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０１８１】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０１８２】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０１８３】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、徐放製剤中０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０１８４】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０１８５】
ある態様において、ＲＣＡＲは細胞内ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含み、例えば、ＲＣＡＲは
ａ) 第一スイッチドメインおよび
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む(例えば、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で)細胞内シグナル伝達メンバー；
ｂ) 抗原結合ドメイン、
膜貫通ドメインおよび
第二スイッチドメイン
を含む(細胞の膜に配置されたとき、細胞外から細胞質の方向で)抗原結合メンバー
を含み、ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、細胞内ＦＫＰＢ−ＦＲＢベースのスイッチを形成する。
【０１８６】
ある態様において、二量体化スイッチは、例えば、上記スイッチドメインモジュールにおいて、本明細書に記載する第一および第二ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチドメインを含む。
【０１８７】
スイッチがＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチである、ある態様において、二量体化分子は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
【０１８８】
ある態様において、低い、免疫増強用量のアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１についての段落で、ここで記載するアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の投与レジメまたは製剤のいずれも、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの二量体化のために投与できる。
【０１８９】
ある態様において、スイッチはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチであり、二量体化分子はＲＡＤ００１である。
【０１９０】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０１９１】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０１９２】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０１９３】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、徐放製剤中０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０１９４】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０１９５】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
ａ) 第一スイッチドメインおよび
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む(例えば、アミノ末端からカルボキシ末端方向で)細胞内シグナル伝達メンバー；
ｂ) 抗原結合ドメイン、
膜貫通ドメインおよび
第二スイッチドメイン
を含む(細胞の膜に配置されたとき、細胞外から細胞質の方向で)抗原結合メンバー
を含み、ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、細胞内スイッチを形成する。
【０１９６】
ある態様において、スイッチドメインは、ヘテロ二量体化スイッチの成分である。
【０１９７】
ある態様において、スイッチドメインは、ホモ二量体化スイッチの成分である。
【０１９８】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチ、例えば、本明細書に記載するＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、本明細書に記載するＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含む。
【０１９９】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチ、例えば、本明細書に記載するＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、本明細書に記載するＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチを含む。
【０２００】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチ、例えば、本明細書に記載するＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、本明細書に記載するＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチを含む。
【０２０１】
ある態様において、二量体化スイッチは、ハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチ、例えば、本明細書に記載するハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、本明細書に記載するハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチを含む。
【０２０２】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
ａ) 第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰスイッチドメイン、
膜貫通ドメインおよび
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む(細胞の膜に配置されたとき、細胞外から細胞質の方向で)細胞外シグナル伝達メンバー；
ｂ) 抗原結合ドメイン
第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢスイッチドメインおよび
膜貫通ドメインまたは膜アンカリングドメイン
を含む(細胞の膜に挿入されたとき、細胞外から細胞内の方向で)抗原結合メンバー
を含み、ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、細胞外スイッチを形成する。
【０２０３】
ある態様において、スイッチドメインは、ヘテロ二量体化スイッチの成分である。
【０２０４】
ある態様において、スイッチドメインは、ホモ二量体化スイッチの成分である。
【０２０５】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチ、例えば、本明細書に記載するＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、本明細書に記載するＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含む。
【０２０６】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチ、例えば、本明細書に記載するＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、本明細書に記載するＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチを含む。
【０２０７】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチ、例えば、本明細書に記載するＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、本明細書に記載するＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチを含む。
【０２０８】
ある態様において、二量体化スイッチは、ハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチ、例えば、本明細書に記載するハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、本明細書に記載するハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチを含む。
【０２０９】
ある態様は、抗原結合メンバーがＣＡＲ細胞の表面に繋がれていないＲＣＡＲを提供する。これにより、細胞内シグナル伝達メンバーを有する細胞が、普遍的ＲＣＡＲＳなる表題の段落で本明細書に記載するように、抗原結合メンバーをコードする配列で細胞を形質転換することなく、好都合に１個以上の抗原結合ドメインと対形成することが可能となる。これらは、ここでは普遍的ＲＣＡＲと呼ぶことがある。
【０２１０】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
ａ) 膜貫通ドメイン、
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび
第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＰＢスイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；および
ｂ) 抗原結合ドメインおよび
第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢスイッチドメイン
を含む抗原結合メンバー
を含み、ここで、抗原結合メンバーは膜貫通ドメインまたは膜アンカリングドメインを含まず、所望により、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。
【０２１１】
ある態様において、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチを含む。
【０２１２】
ある態様において、第一スイッチドメインは、ＦＫＢＰのＦＲＢ結合フラグメントを含む。
【０２１３】
ある態様において、第二スイッチドメインは、ＦＲＢのＦＫＢＰ結合フラグメントを含む。
【０２１４】
ある態様において、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチＦＲＢ結合フラグメントまたはＦＫＢＰの類似体を含むスイッチドメインおよびＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体を含むスイッチドメインを含み、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、１個以上のＦＫＢＰスイッチドメイン、ＦＲＢスイッチドメインおよび二量体化分子の間の複合体の形成を増強する変異または修飾ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチなる表題の段落に記載する変異を含む。例えば、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、Ｅ２０３２変異、例えば、Ｅ２０３２Ｉ変異またはＥ２０３２Ｌ変異；Ｔ２０９８変異、例えば、Ｔ２０９８Ｌ変異；またはＥ２０３２およびＴ２０９８変異、例えば、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８ＬまたはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含む。
【０２１５】
このような態様において、ＲＣＡＲは、ここで複数スイッチドメインなる表題の段落に記載するとおり、第一メンバー、例えば、抗原結合メンバーおよび第二メンバー、例えば、細胞内シグナル伝達メンバーと独立して、複数の、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のスイッチドメインを含む、マルチスイッチを含む。ある態様において、第一メンバーは複数の第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインを含み、第二メンバーは複数の第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢベースのスイッチドメインを含む。ある態様において、第一メンバーは、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含み、第二メンバーは、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含む。
【０２１６】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、例えば、表１からの一次シグナル伝達ドメインおよび例えば、表２からの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０２１７】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、例えば、表１からの一次シグナル伝達ドメインおよび複数の、例えば、２個または３個の例えば、表２からの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０２１８】
ある態様において、２個以上の共刺激ドメインは、同じ共刺激シグナル伝達ドメインでも、異なる共刺激シグナル伝達ドメインでもよい。
【０２１９】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ＣＤ３ゼータを含む。
【０２２０】
ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに
ｃ) 第二抗原結合ドメイン、例えば、抗原結合ドメインにより結合されるのと異なる抗原に結合する第二抗原結合ドメイン；および
第二スイッチドメイン
を含む第二抗原結合メンバーを含む。
【０２２１】
ある態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、２個、３個、４個または５個の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖｓを含み、ここで、各抗原結合ドメインは標的抗原に結合する。ある態様において、抗原結合ドメインの２個以上は、異なる抗原に結合できる。ある態様において、抗原結合ドメインの２個以上は、同じ抗原、例えば、同じ抗原上の同じまたは異なるエピトープに結合できる。ある態様において、リンカーまたはヒンジ領域は、所望により２個の抗原結合ドメインの間または各抗原結合ドメインに配置される。
【０２２２】
第二の面において、本発明は、
ａ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、
第一スイッチドメインおよび
膜貫通ドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；および
ｂ) 抗原結合ドメインおよび
膜アンカーまたは第二膜貫通ドメイン
を含む抗原結合メンバー
を含む、ＲＣＡＲ、例えば、単離ＲＣＡＲに関する。
例えば、図６右パネルを参照のこと。
【０２２３】
ある態様において、抗原結合メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバースイッチと二量体化スイッチを形成するスイッチドメインを含まない。
【０２２４】
ある態様において、抗原結合メンバーは、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。
【０２２５】
ある態様において、第一スイッチドメインの２個のコピーは、ホモ二量体化スイッチの成分である。
【０２２６】
ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび
第二スイッチドメイン
を含む第二細胞内シグナル伝達メンバーを含み、
ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、ヘテロ二量体化スイッチの成分である。
【０２２７】
ある態様において、スイッチドメインの二量体化は、細胞内シグナル伝達メンバーのクラスター化をもたらす。
【０２２８】
ある態様において、スイッチドメインの二量体化は、細胞内シグナル伝達ドメインによるシグナル伝達の増加をもたらす。
【０２２９】
ある態様において、二量体化スイッチは、細胞外である。
【０２３０】
ある態様において、二量体化スイッチは、細胞内である。
【０２３１】
ある態様において：
二量体化スイッチは細胞外ホモ二量体化スイッチであり、
抗原結合メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化できるスイッチドメインを含まない。
【０２３２】
ある態様において：
二量体化スイッチは細胞内ホモ二量体化スイッチであり、
抗原結合メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化できるスイッチドメインを含まない。
【０２３３】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
細胞内シグナル伝達ドメインおよび第二スイッチドメインを含む第二細胞内シグナル伝達メンバーを含み、これは、第一スイッチドメインと一緒になって細胞外ヘテロ二量体化スイッチを形成し、
抗原結合メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化できるスイッチドメインを含まない。
【０２３４】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
細胞内シグナル伝達ドメインおよび第二スイッチドメインを含む第二細胞内シグナル伝達メンバーを含み、これは、第一スイッチドメインと一緒になって、細胞内ヘテロ二量体化スイッチを形成し、
抗原結合メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化できるスイッチドメインを含まない。
【０２３５】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
細胞内シグナル伝達ドメインおよび第二スイッチドメインを含む第二細胞内シグナル伝達メンバーを含み、これは、第一スイッチドメインと一緒になって、細胞外ホモ二量体化スイッチを形成し、
抗原結合メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化できるスイッチドメインを含まない。
【０２３６】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
細胞内シグナル伝達ドメインおよび第二スイッチドメインを含む第二細胞内シグナル伝達メンバーを含み、これは、第一スイッチドメインと一緒になって、細胞内ホモ二量体化スイッチを形成し、
抗原結合メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化できるスイッチドメインを含まない。
【０２３７】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１から選択される、一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０２３８】
ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０２３９】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０２４０】
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含む。
【０２４１】
ある態様において、ＲＣＡＲは、第二細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０２４２】
ある態様において、第二細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０２４３】
ある態様において、第二細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０２４４】
ある態様において、第一および第二細胞内シグナル伝達ドメインは、
４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメイン；または
ＣＤ２８ドメインおよび４−１ＢＢドメイン
を含む。
【０２４５】
ある態様において、ＲＣＡＲは、第三細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０２４６】
ある態様において、第三細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０２４７】
ある態様において、第三細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０２４８】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインの１個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り２個は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０２４９】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインの２個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残りは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０２５０】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０２５１】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０２５２】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ドメイン、４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０２５３】
ある態様において、ＲＣＡＲは、第四細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０２５４】
ある態様において、第四細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０２５５】
ある態様において、第四細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０２５６】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの１個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り３個は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０２５７】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの２個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り２個は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０２５８】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの３個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残りは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０２５９】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０２６０】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０２６１】
ある態様において、スイッチドメインおよび１個以上の細胞内シグナル伝達ドメイン(ｉｓｄ)の順番は、アミノ末端から開始して、次のとおりである。
スイッチ／ｉｓｄ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３／スイッチ；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；および
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ／ｉｓｄ３。
【０２６２】
ある態様において、スイッチドメインおよび１個以上の細胞内シグナル伝達ドメイン(ｉｓｄ)の順番は、カルボキシ末端から開始して、次のとおりである。
スイッチ／ｉｓｄ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３／スイッチ；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；および
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ／ｉｓｄ３。
【０２６３】
ある態様において、二量体化分子、例えば、ポリペプチド、例えば、抗体分子は、第一スイッチドメインに特異的に結合する第一部分、例えば、第一可変領域および第二スイッチドメインに特異的に結合する第二部分、例えば、第二可変領域を含み、ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、ヘテロ二量体化スイッチの成分である。
【０２６４】
ある態様において、二量体化分子は、スイッチドメインに結合するポリペプチド、例えば、抗体分子である。
【０２６５】
ある態様において、二量体化分子、例えば、ポリペプチド、例えば、抗体分子は、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインに特異的に結合し、ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、ホモ二量体化スイッチの成分である。
【０２６６】
ある態様において、ヘテロ二量体化分子は、抗体分子、非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチンまたはアドネクチン、分子スイッチおよびペプチドからなる群から選択される。
【０２６７】
ある態様において、ホモ二量体化分子は、単特異性抗体分子である。
【０２６８】
ある態様において、二量体化分子は、二重特異性抗体分子である。
【０２６９】
ある態様において、抗原結合ドメインは、癌細胞上の標的抗原に結合するが、二量体化分子を投与するまで、Ｔ細胞の免疫エフェクター応答を促進しない。
【０２７０】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含む。
【０２７１】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインを含む。
【０２７２】
ある態様において、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチＦＲＢ結合フラグメントまたはＦＫＢＰの類似体を含むスイッチドメインおよびＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体を含むスイッチドメインを含み、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、１個以上のＦＫＢＰスイッチドメイン、ＦＲＢスイッチドメインおよび二量体化分子の間の複合体の形成を増強する変異または修飾ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチなる表題の段落に記載する変異を含む。例えば、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、Ｅ２０３２変異、例えば、Ｅ２０３２Ｉ変異またはＥ２０３２Ｌ変異；Ｔ２０９８変異、例えば、Ｔ２０９８Ｌ変異；またはＥ２０３２およびＴ２０９８変異、例えば、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８ＬまたはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含む。
【０２７３】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰの対応する配列と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢの対応する配列と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０２７４】
スイッチがＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチである、ある態様において、二量体化分子は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
【０２７５】
ある態様において、低い、免疫増強用量のアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１についての段落で、ここで記載するアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の投与レジメまたは製剤のいずれも、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの二量体化のために投与できる。
【０２７６】
ある態様において、スイッチはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチであり、二量体化分子はＲＡＤ００１である。
【０２７７】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０２７８】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０２７９】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０２８０】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、徐放製剤中０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０２８１】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０２８２】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０２８３】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰからのラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢからのラパマイシン類似体結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０２８４】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列を含むスイッチドメイン、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列
を含む。
【０２８５】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、
ＦＫＢＰからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＫＢＰからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列
を含み；
第二スイッチドメインは、
ＦＲＢからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＲＢからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列
を含む。
【０２８６】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、
ＦＲＢからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＲＢからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列
を含み；
第二スイッチドメインは、
ＦＫＢＰからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＫＢＰからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列
を含む。
【０２８７】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列を含み、
第二スイッチドメインは、ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含む。
【０２８８】
ある態様において、第一スイッチドメインは、ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含み、
第二スイッチドメインは、ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列を含む。
【０２８９】
ある態様において、二量体化分子はラパマイシン類似体、例えば、ＡＰ２１９６７である。
【０２９０】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチを含む。
【０２９１】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するクーママイシン結合配列を含むスイッチドメインを含む。
【０２９２】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインと１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないクーママイシン結合配列を含むスイッチドメインを含む。
【０２９３】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインからのクーママイシン結合配列を含むスイッチドメインを含む。
【０２９４】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインを含む。
【０２９５】
ある態様において、二量体化分子は、クーママイシンである。
【０２９６】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチを含む。
【０２９７】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧＩＤ１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するジベレリンまたはジベレリン類似体、例えば、ＧＡ３、結合配列を含むＧＩＤ１スイッチドメインおよびＧＡＩと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するＧＡＩスイッチドメインを含むスイッチドメイン
を含む。
【０２９８】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰの対応する配列から１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないジベレリンまたはジベレリン類似体、例えば、ＧＡ３、結合配列を含むＧＩＤ１スイッチドメインおよびＦＲＢの対応する配列から１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないＧＡＩスイッチドメイン
を含む。
【０２９９】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＧＩＤ１スイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ＧＡＩスイッチドメインを含む。
【０３００】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＧＡＩスイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ＧＩＤ１スイッチドメインを含む。
【０３０１】
ある態様において、二量体化分子は、ＧＡ３−ＡＭである。
【０３０２】
ある態様において、二量体化分子は、ＧＡ３である。
【０３０３】
ある態様において、二量体化分子は、小分子、例えば、ポリペプチド以外である。
【０３０４】
ある態様において、二量体化分子は、ポリペプチド、例えば、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインの一方または両方に特異的親和性を有するポリペプチド、例えば、ポリペプチド、例えば、抗体分子または非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチンまたはアドネクチンである。
【０３０５】
ある態様において、二量体化分子、例えば、ポリペプチドは、抗体分子である。
【０３０６】
ある態様において、二量体化スイッチは、ハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチを含む。
【０３０７】
ある態様において、二量体化スイッチは、
配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するハロタグスイッチドメインおよび配列番号１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するＳＮＡＰタグスイッチドメインを含む。
【０３０８】
ある態様において、二量体化スイッチは、
配列番号１４と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないハロタグスイッチドメインおよび配列番号１５と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないＳＮＡＰタグスイッチドメインを含む。
【０３０９】
ある態様において：
第一スイッチドメインはハロタグスイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ＳＮＡＰタグスイッチドメインを含む。
【０３１０】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＳＮＡＰタグスイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ハロタグスイッチドメインを含む。
【０３１１】
ある態様において、二量体化分子は、構造５を含む。
【０３１２】
ある態様において、二量体化分子は、スイッチドメイン、例えば、ポリペプチドに結合する３個以上のドメイン、例えば、タンパク質タグ、例えば、該ドメインに親和性を有する抗体分子または非抗体スキャフォールドを含む。
【０３１３】
ある態様において、二量体化分子は、非共有結合性二量体化分子である。
【０３１４】
ある態様において、二量体化分子は、共有結合性二量体化分子である。
【０３１５】
ある態様において、二量体化スイッチ、例えば、ホモ二量体化スイッチ、例えば、細胞外ホモ二量体化スイッチは、タグ分子、例えば、ｃ−ｍｙｃペプチドタグ、ｆｌａｇペプチドタグ、ＨＡペプチドタグまたはＶ５ペプチドタグを含むスイッチドメインおよびスイッチドメイン、例えば、抗体分子および非抗体スキャフォールドに親和性を有するポリペプチドを含む二量体化スイッチを含む。
【０３１６】
ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに、二次二量体化スイッチを含む。
【０３１７】
ある態様において、二量体化分子は２を超える結合価を有し、例えば、それは多価であり、２個を超えるスイッチドメインと結合し、それゆえにクラスター化または二量体化する。
【０３１８】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
第一膜貫通ドメインおよび第一細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび
第二膜貫通ドメインおよび第二細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび
膜アンカーに繋がれた抗原結合ドメイン
を含み、ここで、該第一および第二膜貫通ドメインは、細胞の外側に存在するヘテロ二量体化スイッチにより互いに分離され、
ここで、該ヘテロ二量体化スイッチは第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインを含み、ここで、ヘテロ二量体化スイッチの該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、細胞の内側または外側いずれかのヘテロ二量体化分子の存在下、互いに相互作用して、複合体を形成する。
【０３１９】
ある態様において、抗原結合メンバーは、
抗原結合ドメイン、
第二膜貫通ドメインおよび
共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、表２からの共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン
を含む。
【０３２０】
ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに、
例えば、第二抗原と結合する、抗原結合ドメイン、
膜貫通ドメインおよび
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内
シグナル伝達ドメイン
を含むスイッチ非連動補助的抗原結合メンバーを含む。
【０３２１】
ある態様において、スイッチ非連動補助的抗原結合メンバーは、さらに、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０３２２】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバースイッチ非連動補助的抗原結合メンバーは、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０３２３】
ある態様において、スイッチ非連動補助的抗原結合メンバーは、４−１ＢＢドメインを含む。
【０３２４】
ある態様において、スイッチ非連動補助的抗原結合メンバーは、ＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０３２５】
ある態様において、スイッチ非連動補助的抗原結合メンバーは、ＣＤ３ゼータドメインおよび４−１ＢＢドメインを含む。
【０３２６】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
阻害分子の阻害剤、例えば、表３の阻害分子の阻害剤
と結合する、例えば、同じ細胞に提供される。
【０３２７】
ある態様において、ＲＣＡＲは、阻害分子、例えば表３からの共阻害分子を標的とするｓｈＲＮＡと結合する、例えば、同じ細胞に提供される。
【０３２８】
ある態様において、ｓｈＲＮＡはＰＤ１を標的とする。
【０３２９】
ある態様において、抗原結合ドメインは、癌細胞上の標的抗原と結合するが、二量体化分子を投与するまで、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を活性化しない。
【０３３０】
ある態様において、抗原結合ドメインは、標的細胞、例えば、癌細胞上の標的抗原と結合するが、二量体化分子、例えば、ヘテロ二量体化分子またはホモ二量体化分子を投与するまで、免疫エフェクター応答、例えば、Ｔ細胞活性化を促進しない。
【０３３１】
本明細書に開示するＲＣＡＲは、例えば、ｓｃＦｖベースの抗原結合ドメインの代わりに、阻害受容体の細胞外ドメイン、例えば、ＰＤ１を含み得る。理論に縛られることを望まないが、阻害細胞外ドメインとそのカウンターリガンドの結合は(これは通常免疫応答を下方制御する)、免疫応答を活性化すると考えられる。これは直ぐあとに記載する。
【０３３２】
第三の面において、本発明は、
ａ) 阻害細胞外ドメイン、
膜貫通領域および
スイッチドメイン
を含む阻害細胞外ドメインメンバー；
ｂ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび
スイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；および所望により
ｃ) 抗原結合ドメインおよび
膜アンカリングドメインまたは膜貫通ドメイン
を含む抗原結合メンバー
を含む、ＲＣＡＲ、例えば、単離ＲＣＡＲに関する。
例えば、図１０参照。
【０３３３】
ある態様において：
抗原結合メンバーは細胞内シグナル伝達ドメインを含まず、阻害細胞外ドメインメンバー上のスイッチドメインまたは細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化スイッチを形成するスイッチドメインを含まない。例えば、図１０、最も右パネルを参照のこと。
【０３３４】
ある態様において、抗原結合メンバーは、
抗原結合ドメイン、
第二膜貫通ドメインおよび
共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、表２からの共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン
を含む。
【０３３５】
ある態様において、阻害細胞外ドメインは、表４から選択される。
【０３３６】
ある態様において、第一スイッチドメインは細胞内シグナル伝達ドメインに連結され、そして第二スイッチドメインは膜貫通ドメインに連結されている。
【０３３７】
ある態様において、ヘテロ二量体化分子の存在下、阻害細胞外ドメインは標的細胞上のそのリガンドと結合し、シグナル活性化を再指向する。
【０３３８】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１から選択される、一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０３３９】
ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０３４０】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０３４１】
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含む。
【０３４２】
ある態様において、ＲＣＡＲは、第二細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０３４３】
ある態様において、第二細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０３４４】
ある態様において、第二細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０３４５】
ある態様において、第一および第二細胞内シグナル伝達ドメインは、
４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメイン；または
ＣＤ２８ドメインおよび４−１ＢＢドメイン
を含む。
【０３４６】
ある態様において、ＲＣＡＲは、第三細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０３４７】
ある態様において、第三細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０３４８】
ある態様において、第三細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０３４９】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインの１個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび残り２個は、例えば、表２から選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０３５０】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインの２個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残りは、例えば、表２から選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０３５１】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０３５２】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０３５３】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ドメイン、４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０３５４】
ある態様において、ＲＣＡＲは、第四細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０３５５】
ある態様において、第四細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０３５６】
ある態様において、第四細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０３５７】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの１個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り３個は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０３５８】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの２個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り２個は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０３５９】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの３個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残りは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０３６０】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０３６１】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０３６２】
ある態様において、スイッチドメインおよび１個以上の細胞内シグナル伝達ドメイン(ｉｓｄ)の順番は、アミノ末端から開始して、次のとおりである。
スイッチ／ｉｓｄ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３／スイッチ；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；および
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ／ｉｓｄ３。
【０３６３】
ある態様において、スイッチドメインおよび１個以上の細胞内シグナル伝達ドメイン(ｉｓｄ)の順番は、カルボキシ末端から開始して、次のとおりである。
スイッチ／ｉｓｄ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３／スイッチ；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；および
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ／ｉｓｄ３。
【０３６４】
ある態様において、スイッチドメインは、ヘテロ二量体化スイッチの成分である。
【０３６５】
ある態様において、スイッチドメインは、ホモ二量体化スイッチの成分である。
【０３６６】
ある態様において、二量体化スイッチは、細胞内である。
【０３６７】
ある態様において、二量体化スイッチは、細胞外である。
【０３６８】
ある態様において、抗原結合メンバー上に配置された膜貫通ドメインおよび二量体化スイッチ、例えば、ヘテロ二量体化スイッチまたはホモ二量体化スイッチは、細胞内である。
【０３６９】
ある態様において、膜貫通ドメインは細胞内シグナル伝達メンバー上に配置され、二量体化スイッチ、例えば、ヘテロ二量体化またはホモ二量体化スイッチは、細胞外である。
【０３７０】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含む。
【０３７１】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０３７２】
ある態様において、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチＦＲＢ結合フラグメントまたはＦＫＢＰの類似体を含むスイッチドメインおよびＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体を含むスイッチドメインを含み、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、１個以上のＦＫＢＰスイッチドメイン、ＦＲＢスイッチドメインおよび二量体化分子の間の複合体の形成を増強する変異または修飾ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチなる表題の段落に記載する変異を含む。例えば、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、Ｅ２０３２変異、例えば、Ｅ２０３２Ｉ変異またはＥ２０３２Ｌ変異；Ｔ２０９８変異、例えば、Ｔ２０９８Ｌ変異；またはＥ２０３２およびＴ２０９８変異、例えば、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８ＬまたはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含む。
【０３７３】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰの対応する配列と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢの対応する配列と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０３７４】
スイッチがＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチである、ある態様において、二量体化分子は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
【０３７５】
ある態様において、低い、免疫増強用量のアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１についての段落で、ここで記載するアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の投与レジメまたは製剤のいずれも、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの二量体化のために投与できる。
【０３７６】
ある態様において、スイッチはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチであり、二量体化分子はＲＡＤ００１である。
【０３７７】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０３７８】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０３７９】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０３８０】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、徐放製剤中０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０３８１】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０３８２】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０３８３】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰからのラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢからのラパマイシン類似体結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０３８４】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列を含むスイッチドメイン、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含む。
【０３８５】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、
ＦＫＢＰからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＫＢＰからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列
を含み、
第二スイッチドメインは、
ＦＲＢからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＲＢからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列
を含む。
【０３８６】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、
ＦＲＢからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＲＢからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列
を含み、
第二スイッチドメインは、
ＦＫＢＰからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＫＢＰからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列
を含む。
【０３８７】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列を含み、
第二スイッチドメインは、ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含む。
【０３８８】
ある態様において、第一スイッチドメインは、ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含み、
第二スイッチドメインは、ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列を含む。
【０３８９】
ある態様において、二量体化分子はラパマイシン類似体、例えば、ＡＰ２１９６７である。
【０３９０】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチを含む。
【０３９１】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するクーママイシン結合配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０３９２】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインと１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないクーママイシン結合配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０３９３】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインからのクーママイシン結合配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０３９４】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメイン
を含む。
【０３９５】
ある態様において、二量体化分子は、クーママイシンである。
【０３９６】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチを含む。
【０３９７】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧＩＤ１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するジベレリンまたはジベレリン類似体、例えば、ＧＡ３結合配列を含むＧＩＤ１スイッチドメインおよびＧＡＩと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するＧＡＩスイッチドメインを含むスイッチドメイン
を含む。
【０３９８】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧＩＤ１の対応する配列と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないジベレリンまたはジベレリン類似体、例えば、ＧＡ３結合配列を含むＧＩＤ１スイッチドメインおよびＧＡＩの対応する配列と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないＧＡＩスイッチドメインを含む。
【０３９９】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＧＩＤ１スイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ＧＡＩスイッチドメインを含む。
【０４００】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＧＡＩスイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ＧＩＤ１スイッチドメインを含む。
【０４０１】
ある態様において、二量体化分子は、ＧＡ３−ＡＭである。
【０４０２】
ある態様において、二量体化分子は、ＧＡ３である。
【０４０３】
ある態様において、二量体化分子は、小分子、例えば、ポリペプチド以外である。
【０４０４】
ある態様において、二量体化分子は、ポリペプチド、例えば、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインの一方または両方に特異的親和性を有するポリペプチド、例えば、ポリペプチド、例えば、抗体分子または非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチンまたはアドネクチンである。
【０４０５】
ある態様において、二量体化分子、例えば、ポリペプチドは、抗体分子である。
【０４０６】
ある態様において、二量体化スイッチは、ハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチを含む。
【０４０７】
ある態様において、二量体化スイッチは、
配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するハロタグスイッチドメインおよび配列番号１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するＳＮＡＰタグスイッチドメイン
を含む。
【０４０８】
ある態様において、二量体化スイッチは、
配列番号１４と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないハロタグスイッチドメインおよび配列番号１５と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないＳＮＡＰタグスイッチドメイン
を含む。
【０４０９】
ある態様において：
第一スイッチドメインはハロタグスイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ＳＮＡＰタグスイッチドメインを含む。
【０４１０】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＳＮＡＰタグスイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ハロタグスイッチドメインを含む。
【０４１１】
ある態様において、二量体化分子は、構造５を含む。
【０４１２】
ある態様において、二量体化分子は、スイッチドメイン、例えば、ポリペプチドに結合する３個以上のドメイン、例えば、タンパク質タグ、例えば、該ドメインに親和性を有する抗体分子または非抗体スキャフォールドを含む。
【０４１３】
ある態様において、二量体化分子は、非共有結合性二量体化分子である。
【０４１４】
ある態様において、二量体化分子は、共有結合性二量体化分子である。
【０４１５】
ある態様において、二量体化スイッチ、例えば、ホモ二量体化スイッチ、例えば、細胞外ホモ二量体化スイッチは、タグ分子、例えば、ｃ−ｍｙｃペプチドタグ、ｆｌａｇペプチドタグ、ＨＡペプチドタグまたはＶ５ペプチドタグを含むスイッチドメインおよびスイッチドメイン、例えば、抗体分子および非抗体スキャフォールドに親和性を有するポリペプチドを含む二量体化スイッチを含む。
【０４１６】
ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに、二次二量体化スイッチを含む。
【０４１７】
ある態様において、二量体化分子は２を超える結合価を有し、例えば、それは多価であり、２個を超えるスイッチドメインと結合し、それゆえにクラスター化または二量体化する。
【０４１８】
本明細書に記載するとおり、ＲＣＡＲの態様は、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメインを含む、メンバー、例えば、阻害細胞外ドメインメンバーを含み得る。理論に縛られることを望まないが、このようなドメインの存在は、ＲＣＡＲのメンバーの二量体化スイッチ介在結合の非存在下で、顕著な活性化なく、細胞におけるメンバーの残留性を促進すると考えられる。このようなメンバーの態様は、この直ぐ後の段落に記載する。
【０４１９】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
ａ) 阻害細胞外ドメイン、
膜貫通領域、
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、４−１ＢＢドメインおよび
スイッチドメイン
を含む阻害細胞外ドメインメンバー；
ｂ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表１から選択される、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインおよび
スイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；および所望により
ｃ) 抗原結合ドメイン、
膜アンカリングドメインまたは膜貫通ドメインおよび
所望により、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、４−１ＢＢドメイン
を含む抗原結合メンバーを含む。
例えば、図１１参照。
【０４２０】
ある態様において、阻害細胞外ドメインメンバーの成分の順番は、アミノ末端から開始して、次のとおりである。
阻害細胞外ドメイン／膜貫通ドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン／スイッチドメイン；または
阻害細胞外ドメイン／膜貫通ドメイン／スイッチドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン。
【０４２１】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーの成分の順番は、アミノ末端から開始して、次のとおりである。
スイッチドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表１から選択される、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン；または
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表１から選択される、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン／スイッチドメイン。
【０４２２】
ある態様において、阻害細胞外ドメインメンバーの成分の順番は、カルボキシ末端から開始して、次のとおりである。
阻害細胞外ドメイン／膜貫通ドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン／スイッチドメイン；または
阻害細胞外ドメイン／膜貫通ドメイン／スイッチドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン。
【０４２３】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーの成分の順番は、カルボキシ末端から開始して、次のとおりである。
スイッチドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表１から選択される、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン；または
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表１から選択される、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン／スイッチドメイン。
【０４２４】
ある態様において、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを形成する。
【０４２５】
ある態様において、第一二量体化スイッチおよび第二二量体化スイッチの一方は、ＦＫＢＰと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインを含み、他方は、ＦＲＢと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列結合配列を含むスイッチドメインを含む。
【０４２６】
ある態様において、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチＦＲＢ結合フラグメントまたはＦＫＢＰの類似体を含むスイッチドメインおよびＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体を含むスイッチドメインを含み、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、１個以上のＦＫＢＰスイッチドメイン、ＦＲＢスイッチドメインおよび二量体化分子の間の複合体の形成を増強する変異または修飾ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチなる表題の段落に記載する変異を含む。例えば、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、Ｅ２０３２変異、例えば、Ｅ２０３２Ｉ変異またはＥ２０３２Ｌ変異；Ｔ２０９８変異、例えば、Ｔ２０９８Ｌ変異；またはＥ２０３２およびＴ２０９８変異、例えば、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８ＬまたはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含む。
【０４２７】
スイッチがＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチである、ある態様において、二量体化分子は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
【０４２８】
ある態様において、低い、免疫増強用量のアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１についての段落で、ここで記載するアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の投与レジメまたは製剤のいずれも、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの二量体化のために投与できる。
【０４２９】
ある態様において、スイッチはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチであり、二量体化分子はＲＡＤ００１である。
【０４３０】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０４３１】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０４３２】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０４３３】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、徐放製剤中０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０４３４】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０４３５】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチ、例えば、本明細書に記載するＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、本明細書に記載するＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチを含む。
【０４３６】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチ、例えば、本明細書に記載するＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、本明細書に記載するＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチを含む。
【０４３７】
ある態様において、二量体化スイッチは、ハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチ、例えば、本明細書に記載するハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、本明細書に記載するハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチを含む。
【０４３８】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
ａ) アミノ末端から開始して、次のものを含む細胞内シグナル伝達メンバー：
ＣＤ３ゼータドメインおよび
第一スイッチドメイン；および
ｂ) アミノ末端から開始して、次のものを含む阻害細胞外ドメインメンバー：
阻害細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
４−１ＢＢドメインおよび
第二スイッチドメイン
を含み、ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを形成する。
【０４３９】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
阻害分子の阻害剤、例えば、表３の阻害分子の阻害剤
と結合する、例えば、同じ細胞に提供される。
【０４４０】
ある態様において、ＲＣＡＲは、阻害分子、例えば表３からの共阻害分子を標的とするｓｈＲＮＡと結合する、例えば、同じ細胞に提供される。
【０４４１】
ある態様において、ＲＣＡＲは、ＰＤ１を標的とするｓｈＲＮＡを含む。
【０４４２】
ある態様において、抗原結合ドメインは、癌細胞上の標的抗原と結合するが、二量体化分子を投与するまで、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を活性化しない。
【０４４３】
ある態様において、抗原結合ドメインは、標的細胞、例えば、癌細胞上の標的抗原と結合するが、二量体化分子、例えば、ヘテロ二量体化分子またはホモ二量体化分子を投与するまで、免疫エフェクター応答、例えば、Ｔ細胞活性化を促進しない。
【０４４４】
ある態様において：
抗原結合メンバーは、
抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；および
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、表２からの共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン
を含む。
例えば、図１１を参照のこと。
【０４４５】
ある態様において：
抗原結合メンバーは、阻害カウンターリガンド結合メンバー上のスイッチまたは細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチと二量体化スイッチを形成するスイッチドメインを含まない。
【０４４６】
ある態様において、阻害カウンターリガンド結合ドメインは、表４から選択される。
【０４４７】
上の態様に記載するとおり、抗原結合メンバーは細胞内シグナル伝達ドメインを含み、そのさらなる態様をすぐ下に記載する。
【０４４８】
ある態様において、抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１から選択される、一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０４４９】
ある態様において、一次抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０４５０】
ある態様において、抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４５１】
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含む。
【０４５２】
ある態様において、抗原結合メンバーは、第二細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０４５３】
ある態様において、第二抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０４５４】
ある態様において、第二抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４５５】
ある態様において、第一および第二抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、
４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメイン；または
ＣＤ２８ドメインおよび４−１ＢＢドメイン
を含む。
【０４５６】
ある態様において、抗原結合メンバーは、第三細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０４５７】
ある態様において、第三抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０４５８】
ある態様において、第三抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４５９】
ある態様において、第一、第二および第三抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインの１個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り２個は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４６０】
ある態様において、第一、第二および第三抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインの２個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残りは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４６１】
ある態様において、第一、第二および第三抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０４６２】
ある態様において、第一、第二および第三抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４６３】
ある態様において、第一、第二および第三抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ドメイン、４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０４６４】
ある態様において、抗原結合メンバーは、第四細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０４６５】
ある態様において、第四抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０４６６】
ある態様において、第四抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４６７】
ある態様において、抗原結合メンバーの第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの１個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り３個は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４６８】
ある態様において、第一、第二、第三および第四抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインの２個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り２個は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４６９】
ある態様において、抗原結合メンバーの第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの３個は表１におけるリストから選択され、残りは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４７０】
ある態様において、第一、第二、第三および第四抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０４７１】
ある態様において、第一、第二、第三および第四抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４７２】
ある態様において、２個以上の共刺激ドメインは、同じ、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインまたは異なる、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインであってよい。
【０４７３】
ある態様において、抗原結合メンバーのスイッチドメインおよび１個以上の細胞内シグナル伝達ドメイン(ｉｓｄ)の順番は、アミノから開始して、次のとおりである。
スイッチ／ｉｓｄ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３／スイッチ；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；および
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ／ｉｓｄ３。
【０４７４】
ある態様において、抗原結合メンバーのスイッチドメインおよび１個以上の細胞内シグナル伝達ドメイン(ｉｓｄ)の順番は、カルボキシ末端から開始して、次のとおりである。
スイッチ／ｉｓｄ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３／スイッチ；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；および
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ／ｉｓｄ３。
【０４７５】
ある態様において：
抗原結合メンバーは、
抗原結合ドメイン；
スイッチドメイン；および
膜貫通ドメイン
を含む。
【０４７６】
ある態様において：
細胞内結合メンバースイッチドメインは、
阻害細胞外ドメインメンバースイッチおよび
抗原結合ドメインスイッチ
の一方または両方とヘテロ二量体化スイッチを形成する。
【０４７７】
上記のとおり、スイッチ型抗原結合メンバーは細胞内シグナル伝達ドメインを含み、そのさらなる態様をすぐ下に記載する。
【０４７８】
ある態様において、スイッチ型抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０４７９】
ある態様において、スイッチ型抗原結合メンバーの一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０４８０】
ある態様において、スイッチ型抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４８１】
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含む。
【０４８２】
ある態様において、スイッチ型抗原結合メンバーは、第二細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０４８３】
ある態様において、第二スイッチ型抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０４８４】
ある態様において、第二スイッチ型抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４８５】
ある態様において、第一および第二スイッチ型抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、
４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメイン；または
ＣＤ２８ドメインおよび４−１ＢＢドメイン
を含む。
【０４８６】
ある態様において、抗原結合メンバーは、第三細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０４８７】
ある態様において、第三スイッチ型抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０４８８】
ある態様において、第三スイッチ型抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４８９】
ある態様において、第一、第二および第三スイッチ型抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインの１個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り２個は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４９０】
ある態様において、第一、第二および第三スイッチ型抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインの２個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残りは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４９１】
ある態様において、第一、第二および第三スイッチ型抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０４９２】
ある態様において、第一、第二および第三スイッチ型抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４９３】
ある態様において、第一、第二および第三スイッチ型抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ドメイン、４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０４９４】
ある態様において、スイッチ型抗原結合メンバーは、第四細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０４９５】
ある態様において、第四スイッチ型抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０４９６】
ある態様において、第四スイッチ型抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４９７】
ある態様において、スイッチ型抗原結合メンバーの第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの１個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り３個は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４９８】
ある態様において、第一、第二、第三および第四スイッチ型抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインの２個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り２個は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０４９９】
ある態様において、スイッチ型抗原結合メンバーの第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの３個は表１におけるリストから選択され、残りは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０５００】
ある態様において、第一、第二、第三および第四スイッチ型抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０５０１】
ある態様において、第一、第二、第三および第四スイッチ型抗原結合メンバーの細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０５０２】
ある態様において、２個以上の共刺激ドメインは、同じ、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインまたは異なる、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインであり得る
【０５０３】
ある態様において、スイッチ型抗原結合メンバーのスイッチドメインおよび１個以上の細胞内シグナル伝達ドメイン(ｉｓｄ)の順番は、アミノ末端から開始して、次のとおりである。
スイッチ／ｉｓｄ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３／スイッチ；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；および
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ／ｉｓｄ３。
【０５０４】
ある態様において、スイッチ型抗原結合メンバーのスイッチドメインおよび１個以上の細胞内シグナル伝達ドメイン(ｉｓｄ)の順番は、カルボキシ末端から開始して、次のとおりである。
スイッチ／ｉｓｄ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３／スイッチ；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；および
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ／ｉｓｄ３。
【０５０５】
スイッチ型抗原結合ドメインの態様において、ＲＣＡＲは、阻害分子の阻害剤、例えば、表３の阻害分子の阻害剤と結合する、例えば、同じ細胞に提供される。
【０５０６】
スイッチ型抗原結合ドメインの態様において、ＲＣＡＲは、阻害分子、例えば表３からの共阻害分子を標的とするｓｈＲＮＡと結合する、例えば、同じ細胞に提供される。
【０５０７】
スイッチ型抗原結合ドメインの態様において、ＲＣＡＲは、ＰＤ１を標的とするｓｈＲＮＡをさらに含む。
【０５０８】
スイッチ型抗原結合ドメインの態様において、抗原結合ドメインは、癌細胞上の標的抗原と結合するが、二量体化分子を投与するまで、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を活性化しない。
【０５０９】
スイッチ型抗原結合ドメインの態様において、抗原結合ドメインは、標的細胞、例えば、癌細胞上の標的抗原と結合するが、二量体化分子、例えば、ヘテロ二量体化分子またはホモ二量体化分子を投与するまで、免疫エフェクター応答、例えば、Ｔ細胞活性化を促進しない。
【０５１０】
本明細書に開示するＲＣＡＲは、例えば、ｓｃＦｖベースの抗原結合ドメインの代わりに、共刺激ＥＣＤドメインの細胞外ドメインを含み得る。理論に縛られることを望まないが、ＥＣＤとそのカウンターリガンドの結合が、ＲＣＡＲを介して免疫応答を活性化すると考えられる。これは直ぐ下に記載する。
【０５１１】
第四の面において、本発明は、
ａ) 共刺激ＥＣＤドメイン；
膜貫通領域および
スイッチドメイン
を含む共刺激ＥＣＤメンバー；
ｂ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび
スイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；および所望により、
ｃ) 抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；および
スイッチドメイン
を含む抗原結合メンバー
を含む、ＲＣＡＲ、例えば、単離ＲＣＡＲに関する。
例えば、図１１を参照のこと。
【０５１２】
ある態様において：
細胞内結合メンバースイッチドメインは、
共刺激ＥＣＤメンバースイッチおよび
抗原結合メンバースイッチ
の一方または両方とヘテロ二量体化スイッチを形成する。
【０５１３】
ある態様において、共刺激ＥＣＤドメインは表５から選択される。
【０５１４】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１から選択される、一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０５１５】
ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０５１６】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０５１７】
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含む。
【０５１８】
ある態様において、ＲＣＡＲは、第二細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０５１９】
ある態様において、第二細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０５２０】
ある態様において、第二細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０５２１】
ある態様において、第一および第二細胞内シグナル伝達ドメインは、
４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメイン；または
ＣＤ２８ドメインおよび４−１ＢＢドメイン
を含む。
【０５２２】
ある態様において、ＲＣＡＲは、第三細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０５２３】
ある態様において、第三細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０５２４】
ある態様において、第三細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０５２５】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインの１個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り２個は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０５２６】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインの２個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残りは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０５２７】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０５２８】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０５２９】
ある態様において、第一、第二および第三細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ドメイン、４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０５３０】
ある態様において、ＲＣＡＲは、第四細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０５３１】
ある態様において、第四細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０５３２】
ある態様において、第四細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０５３３】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの１個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り３個は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０５３４】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの２個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り２個は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０５３５】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの３個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残りは、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０５３６】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０５３７】
ある態様において、第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの各々は、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０５３８】
ある態様において、２個以上の共刺激ドメインは、同じ、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインまたは異なる、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインであり得る。
【０５３９】
ある態様において、スイッチドメインおよび１個以上の細胞内シグナル伝達ドメイン(ｉｓｄ)の順番は、アミノ末端から開始して、次のとおりである
スイッチ／ｉｓｄ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３／スイッチ；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；および
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ／ｉｓｄ３。
【０５４０】
ある態様において、スイッチドメインおよび１個以上の細胞内シグナル伝達ドメイン(ｉｓｄ)の順番は、カルボキシ末端から開始して、次のとおりである。
スイッチ／ｉｓｄ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ；
スイッチ／ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３／スイッチ；
ｉｓｄ１／スイッチ／ｉｓｄ２／ｉｓｄ３；および
ｉｓｄ１／ｉｓｄ２／スイッチ／ｉｓｄ３。
【０５４１】
ある態様において、スイッチドメインは、ヘテロ二量体化スイッチの成分である。
【０５４２】
ある態様において、スイッチドメインは、ホモ二量体化スイッチの成分である。
【０５４３】
ある態様において、二量体化スイッチは、細胞内である。
【０５４４】
ある態様において、二量体化スイッチは、細胞外である。
【０５４５】
ある態様において、抗原結合メンバー上に配置された膜貫通ドメインおよび二量体化スイッチ、例えば、ヘテロ二量体化スイッチまたはホモ二量体化スイッチは、細胞内である。
【０５４６】
ある態様において、膜貫通ドメインは細胞内シグナル伝達メンバー上に配置され、二量体化スイッチ、例えば、ヘテロ二量体化またはホモ二量体化スイッチは、細胞外である。
【０５４７】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含む。
【０５４８】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０５４９】
ある態様において、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチＦＲＢ結合フラグメントまたはＦＫＢＰの類似体を含むスイッチドメインおよびＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体を含むスイッチドメインを含み、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、１個以上のＦＫＢＰスイッチドメイン、ＦＲＢスイッチドメインおよび二量体化分子の間の複合体の形成を増強する変異または修飾ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチなる表題の段落に記載する変異を含む。例えば、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、Ｅ２０３２変異、例えば、Ｅ２０３２Ｉ変異またはＥ２０３２Ｌ変異；Ｔ２０９８変異、例えば、Ｔ２０９８Ｌ変異；またはＥ２０３２およびＴ２０９８変異、例えば、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８ＬまたはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含む。
【０５５０】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰの対応する配列と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢの対応する配列と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０５５１】
スイッチがＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチである、ある態様において、二量体化分子は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
【０５５２】
ある態様において、低い、免疫増強用量のアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１についての段落で、ここで記載するアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の投与レジメまたは製剤のいずれも、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの二量体化のために投与できる。
【０５５３】
ある態様において、スイッチはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチであり、二量体化分子はＲＡＤ００１である。
【０５５４】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０５５５】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０５５６】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０５５７】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、徐放製剤中０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０５５８】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０５５９】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０５６０】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰからのラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢからのラパマイシン類似体結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０５６１】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列を含むスイッチドメイン、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列
を含む。
【０５６２】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、
ＦＫＢＰからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＫＢＰからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列
を含み、
第二スイッチドメインは、
ＦＲＢからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＲＢからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列
を含む。
【０５６３】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、
ＦＲＢからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＲＢからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列
を含み、
第二スイッチドメインは、
ＦＫＢＰからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＫＢＰからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列
を含む。
【０５６４】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列を含み、
第二スイッチドメインは、ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含む。
【０５６５】
ある態様において、第一スイッチドメインは、ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含み、
第二スイッチドメインは、ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列を含む。
【０５６６】
ある態様において、二量体化分子はラパマイシン類似体、例えば、ＡＰ２１９６７である。
【０５６７】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチを含む。
【０５６８】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するクーママイシン結合配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０５６９】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインと１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないクーママイシン結合配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０５７０】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインからのクーママイシン結合配列を含むスイッチドメイン
を不空。
【０５７１】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメイン
を含む。
【０５７２】
ある態様において、二量体化分子は、クーママイシンである。
【０５７３】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチを含む。
【０５７４】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧＩＤ１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するジベレリンまたはジベレリン類似体、例えば、ＧＡ３結合配列を含むＧＩＤ１スイッチドメインおよびＧＡＩと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するＧＡＩスイッチドメインを含むスイッチドメイン
を含む。
【０５７５】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰの対応する配列から１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないジベレリンまたはジベレリン類似体、例えば、ＧＡ３結合配列を含むＧＩＤ１スイッチドメインおよびＦＲＢの対応する配列から１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないＧＡＩスイッチドメイン
を含む。
【０５７６】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＧＩＤ１スイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ＧＡＩスイッチドメインを含む。
【０５７７】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＧＡＩスイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ＧＩＤ１スイッチドメインを含む。
【０５７８】
ある態様において、二量体化分子は、ＧＡ３−ＡＭである。
【０５７９】
ある態様において、二量体化分子は、ＧＡ３である。
【０５８０】
ある態様において、二量体化分子は、小分子、例えば、ポリペプチド以外である。
【０５８１】
ある態様において、二量体化分子は、ポリペプチド、例えば、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインの一方または両方に特異的親和性を有するポリペプチド、例えば、ポリペプチド、例えば、抗体分子または非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチンまたはアドネクチンである。
【０５８２】
ある態様において、二量体化分子、例えば、ポリペプチドは、抗体分子である。
【０５８３】
ある態様において、二量体化スイッチは、ハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチを含む。
【０５８４】
ある態様において、二量体化スイッチは、
配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するハロタグスイッチドメインおよび配列番号１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するＳＮＡＰタグスイッチドメインを含む。
【０５８５】
ある態様において、二量体化スイッチは、
配列番号１４と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないハロタグスイッチドメインおよび配列番号１５と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないＳＮＡＰタグスイッチドメインを含む。
【０５８６】
ある態様において：
第一スイッチドメインはハロタグスイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ＳＮＡＰタグスイッチドメインを含む。
【０５８７】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＳＮＡＰタグスイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ハロタグスイッチドメインを含む。
【０５８８】
ある態様において、二量体化分子は、構造５を含む。
【０５８９】
ある態様において、二量体化分子は、３個以上のドメイン、例えば、スイッチドメインと結合するタンパク質タグ、例えば、ポリペプチド、例えば、該ドメインに親和性を有する抗体分子または非抗体スキャフォールドを含む。
【０５９０】
ある態様において、二量体化分子は、非共有結合性二量体化分子である。
【０５９１】
ある態様において、二量体化分子は、共有結合性二量体化分子である。
【０５９２】
ある態様において、二量体化スイッチ、例えば、ホモ二量体化スイッチ、例えば、細胞外ホモ二量体化スイッチは、タグ分子、例えば、ｃ−ｍｙｃペプチドタグ、ｆｌａｇペプチドタグ、ＨＡペプチドタグまたはＶ５ペプチドタグを含むスイッチドメインおよびスイッチドメイン、例えば、抗体分子および非抗体スキャフォールドに親和性を有するポリペプチドを含む二量体化スイッチを含む。
【０５９３】
ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに、二次二量体化スイッチを含む。
【０５９４】
ある態様において、二量体化分子は２を超える結合価を有し、例えば、それは多価であり、２個を超えるスイッチドメインと結合し、それゆえにクラスター化または二量体化する。
【０５９５】
ある態様において、抗原結合メンバーは、
抗原結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、
スイッチドメインおよび
共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、表２からの共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン
を含む。
【０５９６】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
ａ) 共刺激ＥＣＤドメイン；
膜貫通領域、
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、４−１ＢＢドメインおよび
スイッチドメイン
を含む共刺激ＥＣＤメンバー；
ｂ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表１から選択される、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインおよび
スイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；および所望により、
ｃ) 抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；
スイッチドメインおよび
所望により、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン
を含む抗原結合メンバー
を含む。
【０５９７】
ある態様において、共刺激ＥＣＤメンバーの成分の順番は、アミノ末端から開始して、次のとおりである。
共刺激ＥＣＤドメイン／膜貫通ドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン／スイッチドメイン；または
共刺激ＥＣＤドメイン／膜貫通ドメイン／スイッチドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン。
【０５９８】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーの成分の順番は、アミノ末端から開始して、次のとおりである。
スイッチドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表１から選択される、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン；または
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表１から選択される、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン／スイッチドメイン。
【０５９９】
ある態様において、共刺激ＥＣＤメンバー上の成分の順番は、カルボキシ末端から開始して、次のとおりである。
共刺激ＥＣＤドメイン／膜貫通ドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン／スイッチドメイン；または
共刺激ＥＣＤドメイン／膜貫通ドメイン／スイッチドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン。
【０６００】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーの成分の順番は、カルボキシ末端から開始して、次のとおりである。
スイッチドメイン／細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表１から選択される、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン；または
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表１から選択される、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン／スイッチドメイン。
【０６０１】
ある態様において、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを形成する。
【０６０２】
ある態様において、第一二量体化スイッチおよび第二二量体化スイッチの一方は、ＦＫＢＰと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインを含み、他方はＦＲＢと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列結合配列を含むスイッチドメインを含む。
【０６０３】
スイッチがＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチである、ある態様において、二量体化分子は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
【０６０４】
ある態様において、低い、免疫増強用量のアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１についての段落で、ここで記載するアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の投与レジメまたは製剤のいずれも、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの二量体化のために投与できる。
【０６０５】
ある態様において、スイッチはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチであり、二量体化分子はＲＡＤ００１である。
【０６０６】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０６０７】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０６０８】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０６０９】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、徐放製剤中０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０６１０】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０６１１】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチ、例えば、本明細書に記載するＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、本明細書に記載するＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチを含む。
【０６１２】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチ、例えば、本明細書に記載するＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、本明細書に記載するＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチを含む。
【０６１３】
ある態様において、二量体化スイッチは、ハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチ、例えば、本明細書に記載するハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、本明細書に記載するハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチを含む。
【０６１４】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
ａ) アミノ末端から開始して、次のものを含む細胞内シグナル伝達メンバー：
ＣＤ３ゼータドメインおよび
第一スイッチドメイン；および
ｂ) アミノ末端から開始して、次のものを含む共刺激ＥＣＤドメインメンバー：
共刺激ＥＣＤドメイン、
膜貫通ドメイン、
４−１ＢＢドメインおよび
第二スイッチドメイン
を含み、ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを形成する。
【０６１５】
ある態様において、ＲＣＡＲは、
阻害分子の阻害剤、例えば、表３の阻害分子の阻害剤
と結合する、例えば、同じ細胞に提供される。
【０６１６】
ある態様において、ＲＣＡＲは、阻害分子、例えば表３からの共阻害分子を標的とするｓｈＲＮＡと結合する、例えば、同じ細胞に提供される。
【０６１７】
ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに、ＰＤ１を標的とするｓｈＲＮＡを含む。
【０６１８】
ある態様において、抗原結合ドメインは、癌細胞上の標的抗原と結合するが、二量体化分子を投与するまで、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を活性化しない。
【０６１９】
ある態様において、抗原結合ドメインは、標的細胞、例えば、癌細胞上の標的抗原と結合するが、二量体化分子、例えば、ヘテロ二量体化分子またはホモ二量体化分子を投与するまで、免疫エフェクター応答、例えば、Ｔ細胞活性化を促進しない。
【０６２０】
本発明はまた、増殖のスイッチングを可能とする配置を有するＲＣＡＲを提供する。例えば、抗原との遭遇により、ＲＣＡＲは、構成一次シグナル、例えば、標的細胞死滅を示し、第二シグナル、例えば、増殖、生存およびサイトカイン分泌の制御を可能とする。
【０６２１】
したがって、他の面において、本発明は、調節可能キメラ抗原受容体(ＲＣＡＲ)、例えば、単離ＲＣＡＲに関し、ここで、該ＲＣＡＲは、
ａ) 所望により、膜貫通ドメインまたは膜係留ドメイン；
例えば、表２から選択される、共刺激シグナル伝達ドメインおよび
スイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；および
ｂ) 抗原結合ドメイン、
膜貫通ドメインおよび
例えば、表１から選択される、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン
を含む抗原結合メンバー
を含み、ここで、抗原結合メンバーは、スイッチドメインを含まず、または細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化するスイッチドメインを含まない。
【０６２２】
ある態様において、抗原結合メンバーは、共刺激シグナル伝達ドメインを含まない。
【０６２３】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、例えば、表２から選択される、第二共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、２個以上の共刺激ドメインは、同じ、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインまたは異なる、例えば、表２のリストから選択される、共刺激シグナル伝達ドメインであり得るある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択される複数の、例えば、２個または３個の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０６２４】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、細胞外から細胞内の方向で、次の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
４１ＢＢ−ＣＤ２７；
ＣＤ２７−４１ＢＢ；
４１ＢＢ−ＣＤ２８；
ＣＤ２８−４１ＢＢ；
ＯＸ４０−ＣＤ２８；
ＣＤ２８−ＯＸ４０；
ＣＤ２８−４１ＢＢ；または
４１ＢＢ−ＣＤ２８。
【０６２５】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、次の共刺激シグナル伝達ドメインを含む：ＣＤ２８−４１ＢＢ。
【０６２６】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、次の共刺激シグナル伝達ドメインを含む：ＣＤ２８−ＯＸ４０。
【０６２７】
ある態様において、１個または複数の共刺激シグナル伝達ドメインに加えて、細胞内シグナル伝達メンバーは、例えば、表１から選択される、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０６２８】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０６２９】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０共刺激シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０６３０】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、膜貫通ドメインまたは膜係留ドメインを含まない。このような態様において、スイッチドメインは、細胞内である。このような態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは２個の共刺激シグナル伝達ドメインを含み、該２個の共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＩＣＯＳから選択される。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーの成分の順番は、細胞外から細胞内方向で、次のとおりである。
第一共刺激シグナル伝達ドメイン／第二共刺激シグナル伝達ドメインおよび任意のシグナル伝達成分間に配置された、または、細胞外から細胞内方向で、全ての他のシグナル伝達成分の後ろに配置された、スイッチドメイン。例えば、図５６Ｄを参照のこと。
【０６３１】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、膜貫通ドメインを含む。このような態様において、スイッチドメインは、細胞内でも細胞外でもよい。このような態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは２個の共刺激シグナル伝達ドメインを含み、該２個の共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＩＣＯＳから選択される。
【０６３２】
スイッチドメインが細胞外である、ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーの成分の順番は、細胞外から細胞内方向で、次のとおりである。
スイッチドメイン／膜貫通ドメイン／第一共刺激シグナル伝達ドメイン／第二共刺激シグナル伝達ドメイン。例えば、図５６Ｃを参照のこと。
【０６３３】
スイッチドメインが細胞内である、ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーの成分の順番は、細胞外から細胞内方向で、次のとおりである。
膜貫通ドメイン／第一共刺激シグナル伝達ドメイン／第二共刺激シグナル伝達ドメインおよび細胞内に、任意のシグナル伝達成分の間に配置された、または、細胞外から細胞内で、全ての他のシグナル伝達成分の後ろに配置されたスイッチドメイン。例えば、図５６Ａを参照のこと。
【０６３４】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、膜係留ドメインを含む。一つのこのような態様において、スイッチドメインは、細胞内である。このような態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは２個の共刺激シグナル伝達ドメインを含み、該２個の共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＩＣＯＳから選択される。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーの成分の順番は、細胞外から細胞内方向で、次のとおりである。
膜係留ドメイン／第一共刺激シグナル伝達ドメイン／第二共刺激シグナル伝達ドメインおよび細胞外に任意のシグナル伝達成分の間に配置された、または、細胞外から細胞内で、全ての他のシグナル伝達成分の後ろに配置された、スイッチドメイン。例えば、図５６Ｂ参照。
【０６３５】
ある態様において、スイッチドメインは、細胞外であり、膜貫通ドメインまたは膜係留ドメインと共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、膜に最も近い共刺激シグナル伝達ドメインの間；第一刺激シグナル伝達ドメインと第二共刺激シグナル伝達ドメインの間；共刺激シグナル伝達ドメインと一次細胞内シグナル伝達ドメインの間；または、細胞外から細胞内で、全ての細胞内シグナル伝達ドメインの後ろに配置される。
【０６３６】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーの成分の順番は、細胞外から細胞内で、次のとおりである。
膜貫通ドメインまたは膜係留ドメイン／第一共刺激シグナル伝達ドメイン／所望により第二共刺激シグナル伝達ドメイン／および所望により一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび細胞外に、任意の成分の間に、または、細胞外から細胞内で、全ての他の成分の後ろに配置されたスイッチドメイン。
【０６３７】
ある態様において、抗原結合メンバーの成分の順番は、細胞外から細胞内で、次のとおりである。
抗原結合ドメイン／膜貫通ドメイン／例えば、表１から選択される、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン。
【０６３８】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ホモ二量体化スイッチからのスイッチドメインを含む。
【０６３９】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーはヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメインを含み、ＲＣＡＲは、ヘテロ二量体化スイッチの第二スイッチドメインを含む第二細胞内シグナル伝達メンバーを含む。ある態様において、第二細胞内シグナル伝達メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバーと同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０６４０】
ある態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、２個、３個、４個または５個の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖｓを含み、ここで、各抗原結合ドメインは標的抗原に結合する。ある態様において、抗原結合ドメインの２個以上は、異なる抗原に結合できる。ある態様において、抗原結合ドメインの２個以上は、同じ抗原、例えば、同じ抗原上の同じまたは異なるエピトープに結合できる。ある態様において、リンカーまたはヒンジ領域は、所望により２個の抗原結合ドメインの間または各抗原結合ドメインに配置される。
【０６４１】
ある態様において、二量体化スイッチは、細胞内である。
【０６４２】
ある態様において、二量体化スイッチは、細胞外である。
【０６４３】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含む。
【０６４４】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０６４５】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰの対応する配列と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢの対応する配列と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０６４６】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＦＲＢ結合フラグメントまたはＦＫＢＰの類似体およびＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体を含み、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１との結合の親和性を増加させる１個以上の変異または修飾ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチなる表題の段落に記載する変異を含む。例えば、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、Ｅ２０３２変異、例えば、Ｅ２０３２Ｉ変異またはＥ２０３２Ｌ変異；Ｔ２０９８変異、例えば、Ｔ２０９８Ｌ変異；またはＥ２０３２およびＴ２０９８変異、例えば、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８ＬまたはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含む。
【０６４７】
ある態様において、二量体化スイッチは、細胞内シグナル伝達メンバーと独立して、複数の、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のスイッチドメインを含む、マルチスイッチである。細胞内シグナル伝達メンバーが複数のヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインを含む態様において、ＲＣＡＲは、さらに、ヘテロ二量体化スイッチの複数の第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢベースのスイッチドメインを含む、第二細胞内シグナル伝達メンバーを含む。細胞内シグナル伝達メンバーが第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含む態様において、ＲＣＡＲは、さらに、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含む、第二細胞内シグナル伝達メンバーを含む。
【０６４８】
スイッチがＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチである、ある態様において、二量体化分子は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
【０６４９】
ある態様において、低い、免疫増強用量のアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１についての段落で、ここで記載するアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の投与レジメまたは製剤のいずれも、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの二量体化のために投与できる。
【０６５０】
ある態様において、スイッチはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチであり、二量体化分子はＲＡＤ００１である。
【０６５１】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０６５２】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０６５３】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０６５４】
ある態様において、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、徐放製剤中０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０６５５】
ある態様において、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０６５６】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含むスイッチドメインを含む。
【０６５７】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰからのラパマイシン類似体結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢからのラパマイシン類似体結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含むスイッチドメインを含む。
【０６５８】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列を含むスイッチドメインおよびＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含むスイッチドメインを含む。
【０６５９】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、
ＦＫＢＰからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＫＢＰからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列
を含み、
第二スイッチドメインは、
ＦＲＢからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＲＢからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列
を含む。
【０６６０】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、
ＦＲＢからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＲＢからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列
を含み、
第二スイッチドメインは、
ＦＫＢＰからのラパマイシンまたはラパマイシン類似体結合配列；
ＦＫＢＰからのラパマイシン類似体結合配列；または
ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列
を含む。
【０６６１】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列を含み、
第二スイッチドメインは、ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含む。
【０６６２】
ある態様において、第一スイッチドメインは、ＦＲＢからのＡＰ２１９６７結合配列、例えば、残基２０９８にリシンを含む配列を含み、
第二スイッチドメインは、ＦＫＢＰからのＡＰ２１９６７結合配列を含む。
【０６６３】
ある態様において、二量体化分子はラパマイシン類似体、例えば、ＡＰ２１９６７である。
【０６６４】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチを含む。
【０６６５】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するクーママイシン結合配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０６６６】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインと１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないクーママイシン結合配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０６６７】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインからのクーママイシン結合配列を含むスイッチドメイン
を含む。
【０６６８】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメイン
を含む。
【０６６９】
ある態様において、二量体化分子は、クーママイシンである。
【０６７０】
ある態様において、二量体化スイッチは、ＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチを含む。
【０６７１】
ある態様において、二量体化スイッチは、
ＧＩＤ１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するジベレリンまたはジベレリン類似体、例えば、ＧＡ３結合配列を含むＧＩＤ１スイッチドメインおよびＧＡＩと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するＧＡＩスイッチドメインを含むスイッチドメイン
を含む。
【０６７２】
ある態様において、二量体化スイッチは、
Ｇ１Ｄ１の対応する配列と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないジベレリンまたはジベレリン類似体、例えば、ＧＡ３結合配列を含むＧＩＤ１スイッチドメインおよびＧＡＩの対応する配列と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないＧＡＩスイッチドメイン
を含む。
【０６７３】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＧＩＤ１スイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ＧＡＩスイッチドメインを含む。
【０６７４】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＧＡＩスイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ＧＩＤ１スイッチドメインを含む。
【０６７５】
ある態様において、二量体化分子は、ＧＡ３−ＡＭである。
【０６７６】
ある態様において、二量体化分子は、ＧＡ３である。
【０６７７】
ある態様において、二量体化分子は、小分子、例えば、ポリペプチド以外である。
【０６７８】
ある態様において、二量体化分子は、ポリペプチド、例えば、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインの一方または両方に特異的親和性を有するポリペプチド、例えば、ポリペプチド、例えば、抗体分子または非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチンまたはアドネクチンである。
【０６７９】
ある態様において、二量体化分子、例えば、ポリペプチドは、抗体分子である。
【０６８０】
ある態様において、二量体化スイッチは、ハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチを含む。
【０６８１】
ある態様において、二量体化スイッチは、
配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するハロタグスイッチドメインおよび配列番号１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するＳＮＡＰタグスイッチドメイン
を含む。
【０６８２】
ある態様において、二量体化スイッチは、
配列番号１４と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないハロタグスイッチドメインおよび配列番号１５と１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個を超えるアミノ酸残基が異ならないＳＮＡＰタグスイッチドメイン
を含む。
【０６８３】
ある態様において：
第一スイッチドメインはハロタグスイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ＳＮＡＰタグスイッチドメインを含む。
【０６８４】
ある態様において：
第一スイッチドメインは、ＳＮＡＰタグスイッチドメインを含み、
第二スイッチドメインは、ハロタグスイッチドメインを含む。
【０６８５】
ある態様において、二量体化分子は、構造５を含む。
【０６８６】
ある態様において、二量体化分子は、３個以上のドメイン、例えば、スイッチドメインと結合するタンパク質タグ、例えば、ポリペプチド、例えば、該ドメインに親和性を有する抗体分子または非抗体スキャフォールドを含む。
【０６８７】
ある態様において、二量体化分子は、非共有結合性二量体化分子である。
【０６８８】
ある態様において、二量体化分子は、共有結合性二量体化分子である。
【０６８９】
ある態様において、二量体化スイッチ、例えば、ホモ二量体化スイッチ、例えば、細胞外ホモ二量体化スイッチは、タグ分子、例えば、ｃ−ｍｙｃペプチドタグ、ｆｌａｇペプチドタグ、ＨＡペプチドタグまたはＶ５ペプチドタグを含むスイッチドメインおよびスイッチドメイン、例えば、抗体分子および非抗体スキャフォールドに親和性を有するポリペプチドを含む二量体化スイッチを含む。
【０６９０】
ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに、二次二量体化スイッチを含む。
【０６９１】
ある態様において、二量体化分子は２を超える結合価を有し、例えば、それは多価であり、２個を超えるスイッチドメインと結合し、それゆえにクラスター化または二量体化する。
【０６９２】
ある態様において、ＲＣＡＲと結合する、例えば、同じ細胞に提供される
阻害分子の阻害剤、例えば、表３の阻害分子の阻害剤。
【０６９３】
ある態様において、ＲＣＡＲは、阻害分子、例えば表３からの共阻害分子を標的とする核酸阻害剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンス分子と結合する、例えば、同じ細胞に提供される。
【０６９４】
ある態様において、ｓｈＲＮＡはＰＤ１を標的とする。
【０６９５】
ある態様において、二量体化は、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞の増殖または残留性のレベルを増加させる。
【０６９６】
ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに、
例えば、表４から選択される、阻害カウンターリガンド結合ドメインおよび
膜貫通ドメインまたは膜アンカー
を含む阻害カウンターリガンド結合メンバー
を含む。
【０６９７】
第五の面において、本発明は、本明細書に記載するＲＣＡＲをコードする核酸、例えば、単離核酸に関する。
【０６９８】
ある態様において、抗原結合メンバーおよび細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は、単一核酸分子に存在する。
【０６９９】
ある態様において、抗原結合メンバーをコードする配列は第一制御領域に操作可能に（operatively）連結し、細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は第二制御領域に操作可能に連結する。
【０７００】
ある態様において、抗原結合メンバーをコードする配列は第一ＲＮＡとして転写され、細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は第二ＲＮＡとして翻訳される。
【０７０１】
ある態様において、抗原結合メンバーをコードする配列は第一核酸分子に存在し、細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は第二核酸分子に存在する。
【０７０２】
ある態様において、抗原結合メンバーおよび細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は、単一核酸分子に存在する。
【０７０３】
ある態様において、核酸は、さらに、共阻害ドメインを標的とするｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。
【０７０４】
ある態様において、抗原結合メンバーをコードする配列、細胞内シグナル伝達メンバーおよび共阻害ドメインを標的とするｓｈＲＮＡをコードする配列は、単一核酸分子に存在する。
【０７０５】
ある態様において、抗原結合メンバーをコードする配列は第一核酸分子に存在し、細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は第二核酸分子に存在し、共阻害ドメインを標的とするｓｈＲＮＡをコードする配列は、第一および第二核酸分子の一方または両方に存在する。
【０７０６】
ある態様において、抗原結合メンバーをコードする配列は第一核酸分子に存在し、細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は第二核酸分子に存在し、共阻害ドメインを標的とするｓｈＲＮＡをコードする配列は第三核酸分子に存在する。
【０７０７】
ある態様において、核酸は、表６、７、８、９、１０または１１のいずれかに記載のＲＣＡＲをコードする。
【０７０８】
ある態様において、核酸は、
ａ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび
第一スイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；
ｂ) 抗原結合ドメイン、
第二スイッチドメイン；および
所望により、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン
を含む抗原結合メンバー；および
ｃ) 膜貫通ドメイン
を含む、ＲＣＡＲをコードし、ここで、
ｉ) ａおよびｂをコードする配列は、単一核酸分子、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に配置され；または
ii) ａをコードする配列は第一核酸分子、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に配置され、ｂをコードする配列は、第二核酸分子、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に配置される。
【０７０９】
ある態様において、核酸は、
ａ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび
第一スイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；
ｂ) 抗原結合ドメイン、
第二スイッチドメイン；
を含む抗原結合メンバー；
ａまたはｂにおける膜貫通ドメイン；および
ｃ) 第二抗原に結合する抗原結合ドメイン；および
膜貫通ドメインまたは膜アンカリングドメイン
を含む補助的抗原結合メンバー
を含むＲＣＡＲをコードし、ここで、
ｉ) ａ、ｂおよびｃをコードする配列は単一核酸分子、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に配置され；
ii) ａおよびｂをコードする配列は第一核酸分子、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に配置され、ｃをコードする配列は、第二核酸分子、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に配置され
iii) ａおよびｃをコードする配列は第一核酸分子、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に配置され、ｂをコードする配列は、第二核酸分子、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に配置され
iv) ｂおよびｃをコードする配列は第一核酸分子、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に配置され、ｃをコードする配列は、第二核酸分子、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に配置され；または
ｖ) ａ、ｂおよびｃの各々をコードする配列は３つの異なる核酸分子、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターの各々に提供される。
【０７１０】
ある態様において、核酸は、
第一膜貫通ドメインおよび第一細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインをコードする第一核酸分子および
第二膜貫通ドメインおよび第二細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインをコードする第二核酸分子および
膜アンカーに繋がれた抗原結合ドメインをコードする第三核酸分子
を含み、ここで、該第一および第二膜貫通ドメインは、細胞の外側に存在するヘテロ二量体化スイッチにより互いに分離され、
ここで、該ヘテロ二量体化スイッチは第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインを含み、ここで、ヘテロ二量体化スイッチの該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、細胞の内側または外側いずれかのヘテロ二量体化分子の存在下、互いに相互作用して、複合体を形成する。
【０７１１】
ある態様において、核酸は、
膜アンカーに連結した抗原結合ドメインをコードする第一核酸分子、
阻害細胞外ドメインおよびヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメインに連結した膜貫通ドメインをコードする第二核酸分子；および
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインに連結したヘテロ二量体化スイッチの第二スイッチドメインをコードする第三核酸分子
を含み、ここで、該阻害細胞外ドメインはヘテロ二量体化スイッチにより細胞内シグナル伝達ドメインから離され、
ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、細胞の内側または外側のヘテロ二量体化分子の存在下、互いに相互作用して、複合体を形成する。
【０７１２】
ある態様において、核酸は、
ヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメインと連結した膜貫通ドメインである第一標的に結合する抗原結合ドメインをコードする第一核酸分子、
ヘテロ二量体化スイッチの第二スイッチドメインと連結した細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインをコードする第二核酸分子および
第一標的および膜貫通ドメインと異なる第二標的と結合する抗原結合ドメインをコードする第三核酸分子
を含み、ここで、該ヘテロ二量体化スイッチは、細胞の内側に存在し、細胞の内側のヘテロ二量体化分子の存在下、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインが互いに相互作用して複合体を形成する
【０７１３】
ある態様において、核酸は、
ａ) 細胞内シグナル伝達メンバー；
ｂ) 抗原結合メンバー；
ｃ) 第二細胞内シグナル伝達メンバー
を含むＲＣＡＲをコードし、
ここで、
ｉ) ａ、ｂおよびｃをコードする配列は単一核酸分子上に提供され；
ii) ａ、ｂおよびｃの２個をコードする配列は第一核酸分子上に提供され、残りをコードする配列は第二核酸分子上に提供され；または
iii) ａをコードする配列は第一核酸分子上に提供され、ｂをコードする配列は第二核酸分子上に提供され、ｃをコードする配列は第三核酸分子上に提供される。
【０７１４】
ある態様において、核酸は、
ａ) 細胞内シグナル伝達メンバー；
ｂ) 抗原結合メンバー；
ｃ) 第二細胞内シグナル伝達メンバー
を含むＲＣＡＲをコードし、
ここで、
ａおよびｂをコードする配列は第一核酸分子上に提供され、そして
ｃをコードする配列は第二核酸分子上に提供され；
ａおよびｃをコードする配列は第一核酸分子上に提供され、そして
ｂをコードする配列は第二核酸分子上に提供され；または
ｂおよびｃをコードする配列は第一核酸分子上に提供され、そして
ａをコードする配列は第二核酸分子上に提供される。
【０７１５】
ある態様において、核酸は、
ａ) 細胞内シグナル伝達メンバー；
ｂ) 抗原結合メンバー；
ｃ) 補助的抗原結合メンバー
を含むＲＣＡＲをコードし、
ここで、
ｉ) ａ、ｂおよびｃをコードする配列は単一核酸分子上に提供され；
ii) ａ、ｂおよびｃの２個をコードする配列は第一核酸分子上に提供され、残りをコードする配列は第二核酸分子上に提供され；または
iii) ａをコードする配列は第一核酸分子上に提供され、ｂをコードする配列は第二核酸分子上に提供され、ｃをコードする配列は第三核酸分子上に提供される。
【０７１６】
ある態様において、核酸は、
ａ) 細胞内シグナル伝達メンバー；
ｂ) 抗原結合メンバー；
ｃ) 第二細胞内シグナル伝達メンバー
を含むＲＣＡＲをコードし、
ここで、
ａおよびｂをコードする配列は第一核酸分子上に提供され、そして
ｃをコードする配列は第二核酸分子上に提供され；
ａおよびｃをコードする配列は第一核酸分子上に提供され、そして
ｂをコードする配列は第二核酸分子上に提供され；または
ｂおよびｃをコードする配列は第一核酸分子上に提供され、そして
ａをコードする配列は第二核酸分子上に提供される。
【０７１７】
ある態様において、核酸は、抗原結合ドメインが第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインを含む二量体化スイッチにより細胞内シグナル伝達ドメインから離されているＲＣＡＲをコードし、ここで、該第一スイッチドメインは、抗原結合ドメインに連結され、第二スイッチドメインは細胞内シグナル伝達ドメインに連結され、ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、二量体化分子存在下で互いに相互作用して、複合体を形成する。
【０７１８】
第六の面において、本発明は、本明細書に記載するＲＣＡＲをコードする核酸を含む、ベクター系、例えば、１個以上のベクターを含むベクター系に関する。
【０７１９】
ある態様において、ＲＣＡＲの成分の全ては単一ベクター上にコードされる。
【０７２０】
ある態様において、ＲＣＡＲのある成分は第一ベクター上にコードされ、ＲＣＡＲの他の成分は、ベクター系の第二ベクター上にコードされる。
【０７２１】
ある態様において、ベクター系は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを含む。
【０７２２】
ある態様において、ベクター系は、バイシストロニックまたはトリシストロニックレンチウイルスベクターを含む。
【０７２３】
ある態様において、ベクター系は、バイシストロニックまたはトリシストロニックプロモーターを含む。
【０７２４】
第七の面において、本発明は、本明細書に記載するベクター系を含む、細胞に関する。
【０７２５】
ある態様において、細胞は、ヒト細胞である。
【０７２６】
ある態様において、細胞は、Ｔ細胞である。
【０７２７】
ある態様において、細胞は、ＮＫ細胞である。
【０７２８】
第八の面において、本発明は、本明細書に記載するＲＣＡＲＸ細胞の製造法であって、該細胞に本明細書に記載するベクター系を導入することを含む、方法に関する。
【０７２９】
第九の面において、本発明は、哺乳動物を処置する方法、例えば、哺乳動物に抗腫瘍免疫を提供する方法であって、哺乳動物に本明細書に記載するＲＣＡＲＸ細胞の有効量を投与することを含む、方法に関する。
【０７３０】
ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞は、自己Ｔ細胞である。
【０７３１】
ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞は、同種Ｔ細胞である。
【０７３２】
ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞は、自己ＮＫ細胞である。
【０７３３】
ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞は、同種ＮＫ細胞である。
【０７３４】
ある態様において、哺乳動物は、ヒトである。
【０７３５】
ある態様において、本方法は、ＥＧＦＲｖIIIの発現と関係する疾患を有する哺乳動物、例えば、ヒトの処置を含む。
【０７３６】
ある態様において、ＥＧＦＲｖIII発現と関係する疾患は、増殖性疾患、癌、前癌状態またはＥＧＦＲｖIIIの発現と関係する非癌関連適応症である。
【０７３７】
ある態様において、増殖性疾患は、神経膠芽腫である。
【０７３８】
ある態様において、増殖性疾患は、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)である。
【０７３９】
ある態様において、増殖性疾患はＣＬＬであり、ＲＣＡＲの抗原結合ドメインはＣＤ１９を標的とする。
【０７４０】
ある態様において、癌は、多形神経膠芽腫(ＧＢＭ)、未分化星状細胞腫、巨細胞神経膠芽腫、膠肉腫、未分化乏突起神経膠腫、未分化上衣腫、脈絡叢癌、未分化神経節膠腫、松果体芽腫、髄上皮腫、上衣芽腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および非定型奇形様／ラブドイド腫瘍、非小細胞肺癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌および膀胱癌から選択される。
【０７４１】
ある態様において、該ヒトにおいて該処置の副作用を評価することをさらに含む。
【０７４２】
ある態様において、副作用は、急性呼吸促迫症候群、発熱性好中球減少症、低血圧、脳症、肝臓高トランスアミナーゼ血症、発作またはマクロファージ活性化症候群を含む。
【０７４３】
ある態様において、本方法は、該ヒト、例えば、副作用を有するヒトを、抗サイトカイン剤、例えば、腫瘍壊死因子アンタゴニスト、例えば、ＴＮＦ−Ｉｇ融合、例えば、エタネルセプト、ＩＬ−６アンタゴニスト、例えば、ＩＬ−６受容体アンタゴニスト、例えば、抗ＩＬ６受容体抗体、例えば、トシリズマブまたはコルチコステロイドで処置することを含む。
【０７４４】
ある態様において、本方法は、該ヒトに抗ＩＬ６受容体抗体を投与することを含む。
【０７４５】
スイッチがＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチである、ある態様において、二量体化分子は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
【０７４６】
ある態様において、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチＦＲＢ結合フラグメントまたはＦＫＢＰの類似体を含むスイッチドメインおよびＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体を含むスイッチドメインを含み、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、１個以上のＦＫＢＰスイッチドメイン、ＦＲＢスイッチドメインおよび二量体化分子の間の複合体の形成を増強する変異または修飾ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチなる表題の段落に記載する変異を含む。例えば、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、Ｅ２０３２変異、例えば、Ｅ２０３２Ｉ変異またはＥ２０３２Ｌ変異；Ｔ２０９８変異、例えば、Ｔ２０９８Ｌ変異；またはＥ２０３２およびＴ２０９８変異、例えば、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８ＬまたはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含む。
【０７４７】
ある態様において、低い、免疫増強用量のアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１についての段落で、ここで記載するアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の投与レジメまたは製剤のいずれも、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの二量体化のために投与できる。
【０７４８】
ある態様において、スイッチはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチであり、二量体化分子はＲＡＤ００１である。
【０７４９】
ある態様において、スイッチはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチであり、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０７５０】
ある態様において、スイッチはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチであり、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０７５１】
ある態様において、スイッチはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチであり、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０７５２】
ある態様において、スイッチはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチであり、１日あたり、例えば、１日１回の送達で、徐放製剤中０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０７５３】
ある態様において、スイッチはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチであり、１週間あたり、例えば、１週間に１回の送達で、徐放製剤中０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのＲＡＤ００１を投与する。
【０７５４】
例えば、ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の比の最適化のための、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の使用は、本明細書に記載する(“低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤での補助的処置”なる表題の段落を参照)。ある態様において、その段落のアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１投薬レジメまたは製剤を、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化スイッチを有する二量体化分子として使用できる。
【０７５５】
ある態様において、本方法は、対象に、例えば、ＰＤ１陰性Ｔ細胞／ＰＤ１陽性Ｔ細胞比を最適化するために、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを投与することを含む。
【０７５６】
ある態様において、投与は、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、触媒的ｍＴＯＲ阻害剤または両者を含む。
【０７５７】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を、対象の末梢血または対象から単離したＴ細胞の調製物におけるＰＤ−１陽性Ｔ細胞の比率の減少、ＰＤ−１陰性Ｔ細胞の比率の増加またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比の増加に十分な時間投与する。
【０７５８】
ある態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤をＲＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の投与前に(例えば、免疫エフェクター細胞の回収前または後)に、次の１つ以上が生じるのに十分な時間投与する。
ｉ) ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞数の減少；
ii) ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞数の増加；
iii) ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の比の増加；
iv) ナイーブＴ細胞数の増加；
ｖ) 次のマーカーの、例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上の１個以上の発現の増加：ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
vi) 例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上のＫＬＲＧ１の発現減少；または
vii) 記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次の特徴の任意の１個または組み合わせを有する細胞の数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、ｉ)、ii)、iii)、iv)、ｖ)、vi)またはvii)は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
【０７５９】
ある態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を、ＲＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の回収前に、次の１個以上が生じる、例えば、回収細胞または操作した細胞(または非回収細胞または両者)で生じるのに十分な時間投与する。
ｉ) ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞数の減少；
ii) ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞数の増加；
iii) ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の比の増加；
iv) ナイーブＴ細胞数の増加；
ｖ) 次のマーカーの、例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上の１個以上の発現の増加：ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
vi) 例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上のＫＬＲＧ１の発現減少；または
vii) 記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次の特徴の任意の１個または組み合わせを有する細胞の数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、ｉ)、ii)、iii)、iv)、ｖ)、vi)またはvii)は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
【０７６０】
ある態様において、ＲＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投薬の開始または完了後少なくとも５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日または６０日に回収する。
【０７６１】
ある態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を、ＲＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の回収後、次の一つ以上が生じるのに十分な時間、投与する。
ｉ) ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞数の減少；
ii) ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞数の増加；
iii) ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の比の増加；
iv) ナイーブＴ細胞数の増加；
ｖ) 次のマーカーの、例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上の１個以上の発現の増加：ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
vi) 例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上のＫＬＲＧ１の発現減少；または
vii) 記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次の特徴の任意の１個または組み合わせを有する細胞の数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、ｉ)、ii)、iii)、iv)、ｖ)、vi)またはvii)は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
【０７６２】
ある態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を、ＲＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の投与後、次の一つ以上が生じるのに十分な時間、投与する。
ｉ) ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞数の減少；
ii) ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞数の増加；
iii) ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の比の増加；
iv) ナイーブＴ細胞数の増加；
ｖ) 次のマーカーの、例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上の１個以上の発現の増加：ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
vi) 例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上のＫＬＲＧ１の発現減少；または
vii) 記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次の特徴の任意の１個または組み合わせを有する細胞の数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、ｉ)、ii)、iii)、iv)、ｖ)、vi)またはvii)は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
【０７６３】
他の態様において、ＲＣＡＲを発現するように操作されたまたは操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、性能を最適化する量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処理する。理論に縛られることを望まないが、ある態様において、次の一つ以上が生じると考えられる。
ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞数の減少；
ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞数の増加；
ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の比の増加；
ナイーブＴ細胞数の増加；
次のマーカーの１個以上の、例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上の発現の増加：ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上のＫＬＲＧ１の発現減少；または
記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次の特徴の任意の１個または組み換えを有する細胞の数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、上記変化は、例えば、未処置細胞と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
【０７６４】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、例えばｐ７０  Ｓ６Ｋ阻害で測定した場合、ｍＴＯＲ阻害の少なくとも５％と関連するが、９０％を超えることはない。
【０７６５】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、例えばｐ７０  Ｓ６Ｋ阻害で測定した場合、ｍＴＯＲ阻害の少なくとも１０％と関連するが、４０％を超えることはない。
【０７６６】
ある態様において、投与は、例えば、週に１回、例えば、即時放出投与形で、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１または週に１回の即時放出投与形で０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１と生物学的に同等であるＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の投与を含む。
【０７６７】
ある態様において、投与は、例えば、週に１回、例えば、徐放投与形で、０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１または週に１回の徐放投与形の０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１と生物学的に同等であるＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の投与を含む。
【０７６８】
ある態様において、投与は、例えば、１日１回、例えば、即時放出投与形で、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１または１日１回の即時放出投与形の０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１と生物学的に同等であるＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の投与を含む。
【０７６９】
ある態様において、投与は、例えば、１日１回、例えば、徐放投与形で、０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのＲＡＤ００１または１日１回の徐放投与形の０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのＲＡＤ００１と生物学的に同等であるＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の投与を含む。
【０７７０】
他の低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、ならびに投薬レジメおよび製剤は、“低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤での補助的処置”なる表題の段落に提供する、
【０７７１】
第十の面において、本発明は、ＲＣＡＲＸ細胞で処置されているヒトで該処置の副作用を評価する方法に関する。
【０７７２】
ある態様において、該副作用は、急性呼吸促迫症候群、発熱性好中球減少症、低血圧、脳症、肝臓高トランスアミナーゼ血症、発作またはマクロファージ活性化症候群を含む。
【０７７３】
ある態様において、方法は、該ヒト、例えば、副作用を有するヒトを、抗サイトカイン剤、例えば、腫瘍壊死因子アンタゴニスト、例えば、ＴＮＦ−Ｉｇ融合、例えば、エタネルセプト、ＩＬ−６アンタゴニスト、例えば、ＩＬ−６受容体アンタゴニスト、例えば、抗ＩＬ６受容体抗体、例えば、トシリズマブまたはコルチコステロイドで処置することをさらに含む。
【０７７４】
ある態様において、本方法は、該ヒトに抗ＩＬ６受容体抗体を投与することを含む。
【０７７５】
第十一の面において、本発明は、ＲＣＡＲＸ細胞を提供する方法であって、
ヒトからの免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞をレシピエント・エンティティ、例えば、研究室または病院に提供し；そして、該エンティティから、該免疫エフェクター細胞またはその娘細胞由来のＲＣＡＲＸ細胞を受け取る
ことを含む、方法に関する。
【０７７６】
ある態様において、該エンティティは、ＲＣＡＲをコードする核酸を該免疫エフェクター細胞またはその娘細胞に挿入した。
【０７７７】
ある態様において、本方法は、さらに、該ＲＣＡＲＸを該ヒトに投与することを含む。
【０７７８】
第十二の面において、本発明は、ＲＣＡＲＸ細胞を提供する方法であって、
エンティティ、例えば、医療提供者から、ヒトからの免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を受け取り；ＲＣＡＲをコードする核酸を該免疫エフェクター細胞またはその娘細胞に挿入してＲＣＡＲＸ細胞を形成し；そして、所望により、該ＲＣＡＲＸ細胞を該エンティティに提供する
ことを含む、方法に関する。
【０７７９】
第十三の面において、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載する核酸、本明細書に記載するＲＣＡＲ、本明細書に記載するベクター系または本明細書に記載するＲＣＡＲＸ細胞に関する。
【０７８０】
他の面において、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載する核酸に関する。
【０７８１】
他の面において、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載するＲＣＡＲに関する。
【０７８２】
他の面において、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載するベクター系に関する。
【０７８３】
他の面において、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載するＲＣＡＲＸ細胞に関する。
【０７８４】
第十四の面において、本発明は、免疫応答の増強が必要であることを特徴とする疾患の処置に使用するための、本明細書に記載する核酸、本明細書に記載するＲＣＡＲ、本明細書に記載するベクター系または本明細書に記載するＲＣＡＲＸ細胞に関する。
【０７８５】
他の面において、本発明は、免疫応答の増強が必要であることを特徴とする疾患の処置に使用するための、本明細書に記載する核酸に関する。
【０７８６】
他の面において、本発明は、ＥＧＦＲｖIIIの望まない発現により特徴付けられる疾患の処置に使用するための、本明細書に記載する核酸に関する。
【０７８７】
他の面において、本発明は、ＥＧＦＲｖIIIの望まない発現により特徴付けられる疾患の処置に使用するための本明細書に記載する核酸に関し、該疾患は、増殖性疾患、癌、前癌状態またはＥＧＦＲｖIIIの発現と関係する非癌関連適応症である。
【０７８８】
他の面において、本発明は、最適以下の抗腫瘍免疫により特徴付けられる疾患の処置に使用するための、本明細書に記載する核酸に関する。
【０７８９】
他の面において、本発明は、疾患の処置に使用するための、本明細書に記載する核酸に関し、ここで、該疾患は癌である。
【０７９０】
他の面において、本発明は、疾患の処置に使用するための、本明細書に記載する核酸に関し、ここで、該疾患は神経膠芽腫である。
【０７９１】
他の面において、本発明は、疾患の処置に使用するための、本明細書に記載する核酸に関し、ここで、該疾患は、多形神経膠芽腫(ＧＢＭ)、未分化星状細胞腫、巨細胞神経膠芽腫、膠肉腫、未分化乏突起神経膠腫、未分化上衣腫、脈絡叢癌、未分化神経節膠腫、松果体芽腫、髄上皮腫、上衣芽腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および非定型奇形様／ラブドイド腫瘍、非小細胞肺癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌または膀胱癌である。
【０７９２】
他の面において、本発明は、免疫応答の増強が必要であることを特徴とする疾患の処置に使用するための、本明細書に記載するＲＣＡＲに関する。
【０７９３】
他の面において、本発明は、ＥＧＦＲｖIIIの望まない発現により特徴付けられる疾患の処置に使用するための、本明細書に記載するＲＣＡＲに関する。
【０７９４】
他の面において、本発明は、ＥＧＦＲｖIIIの望まない発現により特徴付けられる疾患の処置に使用するための、本明細書に記載するＲＣＡＲに関し、ここで、該疾患は、増殖性疾患、癌、前癌状態またはＥＧＦＲｖIIIの発現と関係する非癌関連適応症である。
【０７９５】
他の面において、本発明は、最適以下の抗腫瘍免疫により特徴付けられる疾患の処置に使用するための、本明細書に記載するＲＣＡＲに関する。
【０７９６】
他の面において、本発明は、癌の処置に使用するための、本明細書に記載するＲＣＡＲに関する。
【０７９７】
他の面において、本発明は、神経膠芽腫の処置に使用するための、本明細書に記載するＲＣＡＲに関する。
【０７９８】
他の面において、本発明は、多形神経膠芽腫(ＧＢＭ)、未分化星状細胞腫、巨細胞神経膠芽腫、膠肉腫、未分化乏突起神経膠腫、未分化上衣腫、脈絡叢癌、未分化神経節膠腫、松果体芽腫、髄上皮腫、上衣芽腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および非定型奇形様／ラブドイド腫瘍、非小細胞肺癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌または膀胱癌の処置に使用するための、本明細書に記載するＲＣＡＲに関する。
【０７９９】
他の面において、本発明は、免疫応答の増強が必要であることを特徴とする疾患の処置に使用するための、本明細書に記載するベクター系に関する。
【０８００】
他の面において、本発明は、ＥＧＦＲｖIIIの望まない発現により特徴付けられる疾患の処置に使用するための、本明細書に記載するベクター系に関する。
【０８０１】
他の面において、本発明は、ＥＧＦＲｖIIIの望まない発現により特徴付けられる疾患の処置に使用するための、本明細書に記載するベクター系に関し、ここで、該疾患は、増殖性疾患、癌、前癌状態またはＥＧＦＲｖIIIの発現と関係する非癌関連適応症である。
【０８０２】
他の面において、本発明は、最適以下の抗腫瘍免疫により特徴付けられる疾患の処置に使用するための、本明細書に記載するベクター系に関する。
【０８０３】
他の面において、本発明は、癌の処置に使用するための、本明細書に記載するベクター系に関する。
【０８０４】
他の面において、本発明は、疾患の処置に使用するための、本明細書に記載するベクター系に関し、ここで、該疾患は神経膠芽腫である。
【０８０５】
他の面において、本発明は、疾患の処置に使用するための、本明細書に記載するベクター系に関し、ここで、該疾患は、多形神経膠芽腫(ＧＢＭ)、未分化星状細胞腫、巨細胞神経膠芽腫、膠肉腫、未分化乏突起神経膠腫、未分化上衣腫、脈絡叢癌、未分化神経節膠腫、松果体芽腫、髄上皮腫、上衣芽腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および非定型奇形様／ラブドイド腫瘍、非小細胞肺癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌または膀胱癌である。
【０８０６】
他の面において、本発明は、免疫応答の増強が必要であることを特徴とする疾患の処置に使用するための、本明細書に記載するＲＣＡＲＸ細胞に関する。
【０８０７】
他の面において、本発明は、ＥＧＦＲｖIIIの望まない発現により特徴付けられる疾患の処置に使用するための、本明細書に記載するＲＣＡＲＸ細胞に関する。
【０８０８】
他の面において、本発明は、ＥＧＦＲｖIIIの望まない発現により特徴付けられる疾患の処置に使用するための、本明細書に記載するＲＣＡＲＸ細胞に関し、ここで、該疾患は、増殖性疾患、癌、前癌状態またはＥＧＦＲｖIIIの発現と関係する非癌関連適応症である。
【０８０９】
他の面において、本発明は、最適以下の抗腫瘍免疫により特徴付けられる疾患の処置に使用するための、本明細書に記載するＲＣＡＲＸ細胞に関する。
【０８１０】
他の面において、本発明は、癌の処置に使用するための、本明細書に記載するＲＣＡＲＸ細胞に関する。
【０８１１】
他の面において、本発明は、神経膠芽腫の処置に使用するための、本明細書に記載するＲＣＡＲＸ細胞に関する。
【０８１２】
他の面において、本発明は、多形神経膠芽腫(ＧＢＭ)、未分化星状細胞腫、巨細胞神経膠芽腫、膠肉腫、未分化乏突起神経膠腫、未分化上衣腫、脈絡叢癌、未分化神経節膠腫、松果体芽腫、髄上皮腫、上衣芽腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および非定型奇形様／ラブドイド腫瘍、非小細胞肺癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌または膀胱癌の処置に使用するための、本明細書に記載するＲＣＡＲＸ細胞に関する。
【０８１３】
ある面において、本発明は、調節可能キメラ抗原受容体(ＲＣＡＲ)、例えば、単離ＲＣＡＲに関し、ここで、該ＲＣＡＲは、
ａ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび
第一スイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；
ｂ) 抗原結合ドメインおよび
第二スイッチドメイン
を含む抗原結合メンバー；および
ｃ) 膜貫通ドメイン
を含み、ここで、
(ｉ) 該抗原結合メンバーは１個を超える細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、２個の共刺激ドメインを含み；
(ii) 第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含み、これはＦＲＢ結合フラグメントまたはＦＫＢＰの類似体を含むスイッチドメインおよびＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体を含むスイッチドメインを含み、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１との結合の親和性を増加させる１個以上の変異を含み；
(iii) ＲＣＡＲは４個の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、例えば、
(Ａ)第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの１個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインであり、残り３個は共刺激ドメイン、例えば、表２のリストから選択されるか、または
(Ｂ)第一、第二、第三および第四細胞内シグナル伝達ドメインの２個は、例えば、表１のリストから選択される一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび残り２個は、共刺激ドメイン、例えば、表２のリストから選択され；
(iv) 抗原結合ドメインは膜貫通ドメインまたは膜係留ドメインを含まず；
(ｖ) ＲＣＡＲは、さらに
ｄ) 第二抗原に結合する抗原結合ドメイン；および
膜貫通ドメインまたは膜アンカリングドメイン
を含む補助的抗原結合メンバーを含み；
(vi) ＲＣＡＲは、さらに
例えば、表４からの、阻害カウンターリガンド結合ドメインおよび
膜貫通ドメインまたは膜アンカー
を含む阻害カウンターリガンド結合メンバー
を含み；
(vii) ＲＣＡＲは、さらに阻害ＣＡＲ(ｉＣＡＲ)メンバーを含み、ここで、該ｉＣＡＲメンバーは、
非標的細胞、例えば、非癌細胞上の抗原を認識する抗原結合ドメイン(または他の細胞外ドメイン)；
膜貫通ドメイン；および、
阻害分子からのドメイン、例えば、阻害分子、例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４または表１２に挙げたタンパク質からのからの細胞内ドメイン
を含み；
(viii) ＲＣＡＲはさらに第二ＲＣＡＲまたは第二抗原結合メンバーを含み、ここで、ＲＣＡＲまたは抗原結合メンバーの一方の抗原結合ドメインは可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含まず、例えば、一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方のはｓｃＦｖではなく、例えば、一方の抗原結合ドメインは単一ＶＨドメインを含み；
(ix) 抗原結合メンバーは、抗原結合ドメイン；膜貫通ドメイン；第一細胞内スイッチドメイン；および細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインまたは共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインを含み；
(ｘ) 第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは細胞外二量体化スイッチを形成でき；または
(xi) ＲＣＡＲは、阻害分子の阻害剤、例えば、表３の阻害分子の阻害剤を含む。
【０８１４】
ある態様において、抗原結合メンバーは例えば、表２から選択される複数の共刺激ドメインを含み、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、複数の共刺激ドメインは、例えば、表２から選択される、同じ共刺激ドメインである。
【０８１５】
ある態様において、複数は、次の共刺激シグナル伝達ドメインを含む：ＣＤ２８−４１ＢＢ。
【０８１６】
ある態様において、複数は、次の共刺激シグナル伝達ドメインを含む：ＣＤ２８−ＯＸ４０。
【０８１７】
ある態様において、抗原結合ドメインは膜貫通ドメインを含まず、細胞内シグナル伝達ドメインは一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０８１８】
ある態様において、二量体化スイッチはホモ二量体化スイッチまたはヘテロ二量体化スイッチであり得る。
【０８１９】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバー上の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表１から選択される、一次細胞内シグナル伝達ドメインである。
【０８２０】
ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータドメインを含む。
【０８２１】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバー上の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０８２２】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、表２から選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０８２３】
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含む。
【０８２４】
ある態様において、ＲＣＡＲは、第二細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０８２５】
ある態様において、第二細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、表２から選択される、共刺激シグナル伝達ドメインである。
【０８２６】
ある態様において、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインの一方はＦＫＢＰベースのスイッチドメインを含み、他方はＦＲＢベースのスイッチドメインを含む。
【０８２７】
ある態様において、スイッチドメインはＲＡＤ００１により二量体化する。
【０８２８】
ある態様において、スイッチドメインは、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＥ２０３２変異、例えば、Ｅ２０３２Ｉ変異またはＥ２０３２Ｌ変異；Ｔ２０９８変異、例えば、Ｔ２０９８Ｌ変異；またはＥ２０３２およびＴ２０９８変異、例えば、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８ＬまたはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含むＦＲＢの類似体を含む。
【０８２９】
ある態様において、ＲＣＡＲは阻害分子の阻害剤を含み、ここで、該阻害剤は阻害核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。
【０８３０】
ある態様において、抗原結合ドメインは癌細胞上の標的抗原、例えば、本明細書に記載する腫瘍抗原に結合するが、二量体化分子を投与するまで、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を活性化しない。
【０８３１】
ある面において、本発明は、
ａ) 例えば、表４から選択される、阻害細胞外ドメイン、
膜貫通領域および
スイッチドメイン
を含む阻害細胞外ドメインメンバー；
ｂ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび
スイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー
を含む、ＲＣＡＲ、例えば、単離ＲＣＡＲに関する。
【０８３２】
ある態様において、ヘテロ二量体化分子の存在下、阻害細胞外ドメインは標的細胞上のそのリガンドと結合し、シグナル活性化を再指向する。
【０８３３】
他の面において、本発明は、
ａ) ＣＤ２７のもの以外の共刺激ＥＣＤドメイン；
膜貫通領域および
スイッチドメイン
を含む共刺激ＥＣＤメンバー；
ｂ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび
スイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー
を含む、ＲＣＡＲ、例えば、単離ＲＣＡＲに関する。
【０８３４】
ある態様において、共刺激ＥＣＤドメインは表５から選択される。
【０８３５】
他の面において、本発明は、
ａ) 膜貫通ドメインまたは膜アンカリングドメイン；
例えば、表２から選択される、共刺激シグナル伝達ドメインおよび
スイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；および
ｂ) 抗原結合ドメイン、
膜貫通ドメインおよび
例えば、表１から選択される、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン
を含む抗原結合メンバー
を含み、ここで、該抗原結合メンバーはスイッチドメインを含まず、または細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化するスイッチドメインを含まない、ＲＣＡＲ、例えば、単離ＲＣＡＲ、ここで、該ＲＣＡＲに関する。
【０８３６】
ある面において、本発明は、ＲＣＡＲまたは本明細書に記載するＲＣＡＲの成分をコードする核酸、例えば、単離核酸に関する。
【０８３７】
ある態様において、核酸は本明細書に記載するＲＣＡＲをコードし、ここで、
ｉ) 抗原結合メンバーをコードする配列および細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は単一核酸分子、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に配置され；または
ii) 抗原結合メンバーをコードする配列は第一核酸分子、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に配置され、細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は第二核酸分子、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に配置される。
【０８３８】
ある態様において、核酸は、さらに、表３からの阻害分子の阻害剤、例えば、ＰＤ１をコードする配列を含み、例えば、ここで、該阻害剤は阻害核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。
【０８３９】
ある面において、本発明は、
ａ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、
第一スイッチドメインおよび
所望により、膜貫通ドメインまたは膜アンカリングドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；
ｂ) 抗原結合ドメイン、
第二スイッチドメインおよび
所望により、膜貫通ドメイン
を含む抗原結合メンバー
を含み、ここで、
ｉ) 抗原結合メンバーをコードする配列(ａ)および細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列(ｂ)が単一核酸分子上に存在し、単一転写産物として転写され、次のとおり構築される：
プロモーター、例えば、本明細書に記載するプロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターが(ａ)、(ｂ)および(ｃ)に操作可能に連結され、ここで、(ｃ)はペプチド、例えば、開裂可能ペプチド、例えば、Ｐ２ＡまたはＦ２Ａ配列をコードし、成分(ｃ)は(ａ)と(ｂ)の間に配置される；または
ii) 抗原結合メンバーをコードする配列(ａ)および細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列(ｂ)が単一核酸分子上に存在し、単一転写産物として転写され、次のとおり構築される：
プロモーター、例えば、本明細書に記載するプロモーターが(ａ)、(ｂ)および(ｃ)に操作可能に連結され、ここで、成分(ｃ)はＩＲＥＳ、例えば、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳをコードし、成分(ｃ)は(ａ)と(ｂ)の間に配置される、
ＲＣＡＲをコードする単離核酸に関する。
【０８４０】
ある面において、本発明は、本明細書に記載する核酸を含む、ベクター系、例えば、１個以上のベクターに関する。
【０８４１】
ある態様において、ベクター系は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを含む。
【０８４２】
ある面において、本発明は、本明細書に記載するＲＣＡＲ、本明細書に記載する核酸または本明細書に記載するベクター系を含む細胞に関する。
【０８４３】
他の面において、本開示は、本明細書に記載する細胞を製造する方法であって、該細胞に本明細書に記載する核酸または本明細書に記載するベクター系を導入することを含む、方法に関する。
【０８４４】
本明細書に記載する面のいずれかのある態様において、細胞は、ヒト細胞である。
【０８４５】
本明細書に記載する面のいずれかのある態様において、細胞は、Ｔ細胞である。
【０８４６】
本明細書に記載する面のいずれかのある態様において、細胞は、ＮＫ細胞である。
【０８４７】
ある面において、本発明は、対象、例えば、哺乳動物を処置する方法、例えば、対象に抗腫瘍免疫を提供する方法であって、対象に本明細書に記載するＲＣＡＲＸ細胞の有効量、例えば、前記の細胞を投与するかまたは該細胞を含む対象を提供することを含む、方法。
【０８４８】
ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞は、自己Ｔ細胞である。
【０８４９】
ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞は、同種Ｔ細胞である。
【０８５０】
ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞は自己ＮＫ細胞；および同種ＮＫ細胞から選択される。
【０８５１】
ある態様において、対象は、ヒトである。
【０８５２】
ある態様において、本方法は、対象を癌に対して処置することを含む。
【０８５３】
ある態様において、本方法は、さらに、二量体化分子を対象に投与することを含む。
【０８５４】
ある態様において、ＲＣＡＲはＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含み、方法は、さらに、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１を含む二量体化分子を投与することを含む。
【０８５５】
ある態様において、本方法は、さらに、低い、免疫増強用量のアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を投与することを含む。
【０８５６】
ある面において、本発明は、対象、例えば、哺乳動物を処置する方法、例えば、対象に抗腫瘍免疫を提供する方法であって、
(ａ) 対象にＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞の有効量を投与するかまたはＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を含む対象を投与し、ここで、細胞はＲＣＡＲ、ＲＣＡＲをコードする核酸またはＲＣＡＲをコードする核酸を含み；および
(ｂ)
(ｉ) ＲＡＤ００１を含む二量体化分子；または
(ii) 低い、免疫増強用量のアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１
を投与することを含み、
ここで、該ＲＣＡＲは、
Ａ) 細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび
第一スイッチドメイン
を含む細胞内シグナル伝達メンバー；
Ｂ) 抗原結合ドメインおよび
第二スイッチドメイン
を含む抗原結合メンバー；および
Ｃ) 膜貫通ドメイン
を含み、ここで、該第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含む、方法に関する。
【０８５７】
ある態様において、細胞は、自己Ｔ細胞である。
【０８５８】
ある態様において、細胞は、同種Ｔ細胞である。
【０８５９】
ある態様において、細胞は自己ＮＫ細胞；および同種ＮＫ細胞から選択される。
【０８６０】
ある態様において、対象は、ヒトである。
【０８６１】
ある態様において、本方法は、対象を癌に対して処置することを含む。
【０８６２】
ある態様において、本方法は、対象にＲＡＤ００１二量体化分子を投与することをさらに含む。
【０８６３】
ある態様において、本方法は、低い、免疫増強用量のアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を投与することをさらに含む
【０８６４】
ある面において、本発明は、ＲＣＡＲＸ細胞を提供する方法であって、
ヒトからの免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞をレシピエント・エンティティ、例えば、研究室または病院に提供し；そして
該エンティティから、該免疫エフェクター細胞またはその娘細胞由来のＲＣＡＲＸ細胞を受領し、ここで、該ＲＣＡＲＸは、本明細書に記載するＲＣＡＲまたは本明細書に記載するＲＣＡＲをコードする核酸またはベクターを含む、方法に関する。
【０８６５】
ある態様において、エンティティは、ＲＣＡＲをコードする核酸を該免疫エフェクター細胞またはその娘細胞に挿入した。
【０８６６】
ある態様において、本方法は、さらに、該ＲＣＡＲＸを該ヒトに投与することを含む。
【０８６７】
他の面において、本発明は、ＲＣＡＲＸ細胞を提供する方法であって、
エンティティ、例えば、医療提供者から、ヒトからの免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を受け取り；前記のＲＣＡＲをコードする核酸を該免疫エフェクター細胞またはその娘細胞に挿入し、ＲＣＡＲＸ細胞を形成し；そして、所望により、該ＲＣＡＲＸ細胞を該エンティティに提供することを含む、方法に関する。
【０８６８】
ある面において、本発明は、医薬として使用するための本明細書に記載する核酸に関する。
【０８６９】
ある面において、本発明は、医薬として使用するための本明細書に記載するＲＣＡＲに関する。
【０８７０】
ある面において、本発明は、医薬として使用するための本明細書に記載するベクター系に関する。
【０８７１】
ある面において、本発明は、医薬として使用するための本明細書に記載するＲＣＡＲＸ細胞、例えば、本明細書に記載する細胞、例えば、本明細書に記載するＲＣＡＲ、本明細書に記載する核酸または本明細書に記載するベクター系を含む細胞に関する。
【０８７２】
ある面において、本発明は、疾患の処置に使用するための、本明細書に記載する核酸に関し、ここで、該疾患は、免疫応答の増強が必要であることを特徴とする。
【０８７３】
ある面において、本発明は、疾患の処置に使用するための、本明細書に記載するＲＣＡＲに関し、ここで、該疾患は、免疫応答の増強が必要であることを特徴とする。
【０８７４】
ある面において、本発明は、疾患の処置に使用するための、本明細書に記載するベクター系に関し、ここで、該疾患は、免疫応答の増強が必要であることを特徴とする。
【０８７５】
前記面のいずれかのある態様において、疾患は最適以下の抗腫瘍免疫を特徴とする。
【０８７６】
前記面のいずれかのある態様において、疾患は癌である。
【０８７７】
全ての引用文献、刊行物、特許明細書、特許などは、引用により本明細書に包含する。
【０８７８】
図面の簡単な説明
図面をまず簡単に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０８７９】
【図１】図１は調節可能ＣＡＲ(ＲＣＡＲ)と比較した、標準ＣＡＲの構造を示す。
【０８８０】
【図２】図２はラパマイシン類似体により誘発されるＦＫＢＰ／ＦＲＢヘテロ二量体化をしたＲＣＡＲを示す。抗原結合ドメインは、例えば、ＥＧＦＲｖIIIを標的とするｓｃＦｖであり得る。スイッチＡおよびスイッチＢは、抗原結合メンバーおよび細胞内シグナル伝達メンバーに対して異なる配向のＦＫＢＰおよびＦＲＢスイッチドメインを示す
【０８８１】
【図３】図３はクーママイシンにより誘発されるＧｙｒＢ二量体化スイッチを有するＲＣＡＲを示す。抗原結合ドメインは、例えば、ＥＧＦＲｖIIIを標的とするｓｃＦｖであり得る。スイッチドメインは、ＧｙｒＢサブユニットである。
【０８８２】
【図４】図４はジベレリンにより誘発されるＧＡＩ／ＧＩＤ１二量体化スイッチを有するＲＣＡＲを示す。抗原結合ドメインは、例えば、ＥＧＦＲｖIIIを標的とするｓｃＦｖであり得る。スイッチＡおよびスイッチＢは、抗原結合メンバーおよび細胞内シグナル伝達メンバーに対して異なる配向のＧＡＩおよびＧ１Ｄ１スイッチドメインを示す
【０８８３】
【図５】図５は小分子薬物により誘発される細胞外スイッチを有するＲＣＡＲを示す。細胞外二量体化スイッチはＦＫＢＰ／ＦＲＢスイッチ、ＧｙｒＢ／ＧｙｒＢスイッチまたはＧＡＩ／Ｇ１Ｄ１スイッチであり得る。
【０８８４】
【図６】図６は抗体分子、非抗体スキャフォールドまたはポリペプチドにより誘発される細胞外スイッチを有するＲＣＡＲを示す。左側のＲＣＡＲ系において、２個のヘテロ二量体化スイッチドメインは、二重特異性抗体により集められる。右側のＲＣＡＲ系において、２個の細胞内シグナル伝達メンバーは単特異性抗体により集められて、ＣＡＲシグナル伝達を開始できる。
【０８８５】
【図７】図７は２個の異なる標的(標的Ａおよび標的Ｂ)を標的化できる二重ＲＣＡＲ系を示す。
【０８８６】
【図８】図８はＲＣＡＲを発現するように操作できる免疫エフェクター細胞を提供する。
【０８８７】
【図９】図９はスイッチドメインを含む抗原結合メンバーが標的する抗原(例えば、標的Ａ)と異なる第二抗原(例えば、標的Ｂ)を標的とする、補助的抗原結合メンバーを含むＲＣＡＲを記載する。補助的抗原結合メンバーはスイッチドメインを含まず、ＲＣＡＲの細胞内シグナル伝達メンバーと二量体化しない。
【０８８８】
【図１０】図１０は阻害経路を再指向するＲＣＡＲを示す。
【０８８９】
【図１１】図１１はスイッチ切り替え可能な受容体が再指向されたスイッチ切り替え可能な共阻害受容体、例えば、表４に挙げたいずれか一つまたは共刺激受容体、例えば、表５に挙げたいずれか一つであり得る、コンテキスト依存性成分を有するＲＣＡＲを示す。共阻害受容体または共刺激受容体と標的の最適対は、癌のタイプ、癌のステージ、ドナーのタイプなどにより得る。
【０８９０】
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは図２に示すＲＣＡＲ  ＲＣＡＲを発現する細胞構築物で見られるような活性化を示す。標準ＥＧＦＲｖIII  ＣＡＲＴを、陽性対照として使用した。ＲＣＡＲをヘテロ二量体化分子非存在下(ＨＤなし)または５００nMヘテロ二量体化分子存在下(ＨＤ)インキュベートし、ここで、ヘテロ二量体化分子はＡＰ２１９６７であった(図１２Ａ)。用量−応答アッセイを、種々の濃度のヘテロ二量体化分子Ａ／Ｃヘテロ二量化剤を使用して実施した(図１２Ｂ)。試験したＲＣＡＲは、ＥＧＦＲｖIII標的化ｓｃＦｖドメイン(各セットの左の棒)または対照としてのＩｇＧ１(各セットの右の棒)を含んだ。
【０８９１】
【図１３】図１３はハロ／ｓｎａｐタグ二量体化スイッチを有するＲＣＡＲを示す。抗原結合ドメインは、例えば、ＥＧＦＲｖIIIを標的とするｓｃＦｖであり得る。スイッチＡおよびスイッチＢは、抗原結合メンバーおよび細胞内シグナル伝達メンバーに対して異なる配向のハロタグおよびＳｎａｐタグスイッチドメインを示す。
【０８９２】
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは可溶性抗体による活性化および可溶性抗体＋第二抗体(二次二量体化スイッチ)による活性化を示す。
【０８９３】
【図１５】図１５は細胞外スイッチおよび多価二量体化分子を有するＲＣＡＲを示す。
【０８９４】
【図１６】図１６はＲＣＡＲを発現するためのベクターを示す。
【０８９５】
【図１７】図１７Ａおよび１７ＢＰＤ１  ＣＡＲおよびＰＤ１  ＲＣＡＲの活性化を示す。図１７Ａは、ＩｇＧ１−Ｆｃによる対照処理と比較した、ＰＤ１  ＣＡＲのＮＦＡＴ誘導性プロモーター駆動ルシフェラーゼ活性からの結果を示す。図１７Ｂは、ＩｇＧ１−Ｆｃによる対照処理と比較した、ＰＤ１−ＥＣＤ−ＴＭ−ＦＲＢおよびＦＫＢＰ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータを含むＰＤ１  ＲＣＡＲのＮＦＡＴ誘導性プロモーター駆動ルシフェラーゼ活性からの結果を示す。
【０８９６】
【図１８】図１８はＡＰ２１９６７処理での用量応答を示す。各試験用量の左側の棒はＰＤ１  ＲＣＡＲであり、各試験用量の右側の棒はＰＤ１  ＣＡＲ対照である。
【０８９７】
【図１９】図１９は例えば、図５に示すような、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースの細胞外スイッチを有するＲＣＡＲの活性を示す。
【０８９８】
【図２０】図２０は例えば、図３に示すような、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースの細胞内スイッチを有するＲＣＡＲの活性を示す。
【０８９９】
【図２１】図２１は例えば、図４に示すような、ＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースの細胞内スイッチを有するＲＣＡＲの活性を示す。
【０９００】
【図２２】図２２は単一核酸ベクター上のＲＣＡＲ成分の配置を示す。構築物１４３７７４および１４３７７５は、抗原結合メンバー(例えば、ＦＫＢＰと連結したｓｃＦｖ)および細胞内結合メンバー(例えば、４１ＢＢ／ＣＤ３ゼータと連結したＦＲＢ)の間に異なるＩＲＥＳ(例えば、ＩＲＥＳ  ＥＶ７１またはＩＲＥＳ  ＥＭＣＶ)を利用する。構築物１４３７７６および１４３７７７は、抗原結合メンバー(例えば、ＦＫＢＰと連結したｓｃＦｖ)および細胞内結合メンバー(例えば、４１ＢＢ／ＣＤ３ゼータと連結したＦＲＢ)の間に２個の異なるプロモーター(例えば、ＣＭＶ  ｍｉｎまたはＥＦ１  ｍｉｎ)を利用する。
【０９０１】
【図２３】図２３は単一ベクターコード化ＲＣＡＲからのＲＣＡＲ活性を示し、ここで、該単一ベクターの配置は図２２に示す。
【０９０２】
【図２４】図２４Ａおよび２４Ｂは記載したnM濃度の異なるヘテロ二量体化分子、ＲＡＤ００１(図２４Ａ)またはラパマイシン(図２４Ｂ)によるＣＤ１９  ＲＣＡＲの活性化を示す。ＲＣＡＲは、図２２に示すように、構築物１４３７７５によりコードされる。
【０９０３】
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂ記載したnM濃度の異なるヘテロ二量体化分子、ＲＡＤ００１(図２４Ａ)またはラパマイシン(図２４Ｂ)によるＣＤ１９  ＲＣＡＲの活性化を示す。ＲＣＡＲは、図２２に示すように、構築物１４３７７５によりコードされる。
【０９０４】
【図２６】図２６は抗原結合メンバー上に共刺激シグナル伝達ドメインを有する半ＲＣＡＲ構造を示す。共刺激シグナル伝達ドメインは、表２に挙げたまたは由来のいずれでもよい。
【０９０５】
【図２７】図２７Ａおよび２７Ｂは、プラセボと比較した、インフルエンザワクチン株に対する力価の増加を示すグラフである。図２７Ａにおいて、治療企図集団におけるＲＡＤ００１投与コホートの各々について、ワクチン接種４週間後プラセボコホートの増加と比較して、３種のインフルエンザワクチン株(Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ｈ３Ｎ２  Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８)の各々に対するインフルエンザ幾何平均力価のベースラインを超える上昇が示される。太黒線は、本治験の主要評価項目を満たすための３種のインフルエンザワクチン株中２種で満たすべき基準である、プラセボに比した力価の１.２倍増加を示す。星印“＊”は、プラセボに対するＧＭＴ力価が１を超え、少なくとも８０％の事後確率を有することを示す。図２７Ｂは、ベースラインインフルエンザ力価≦１：４０を有する対象のサブセットでの図２７Ａと同じデータのグラフである。
【０９０６】
【図２８】図２８はワクチン接種４週間後のＲＡＤ００１濃度対各インフルエンザワクチン株に対する幾何平均力価の増加倍率の散布図を示す。ＲＡＤ００１濃度(投与１時間後)を、対象が４週間投与を受けた後に測定した。薬物動態測定を受けた全対象を解析対象集団に入れた。ベースラインと比較したワクチン接種４週間後の幾何平均力価の増加倍率をｙ軸に示す。
【０９０７】
【図２９】図２９はプラセボと比較した、異種インフルエンザ株に対する力価の増加を示すグラフである。ワクチン接種４週間後、治療企図集団におけるＲＡＤ００１投与コホートの各々について、プラセボコホートにおける増加に対して、インフルエンザワクチンに含まれない２種の異種インフルエンザ株(Ａ／Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ／８／７６およびＡ／Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／１１)に対するインフルエンザ幾何平均力価のベースラインを超える上昇が示される。＊はプラセボに対する力価が１を超え、少なくとも８０％の事後確率を有することを示す。
【０９０８】
【図３０】図３０Ａおよび３０Ｂはインフルエンザワクチン接種前後のＩｇＧおよびＩｇＭレベルのグラフである。抗Ａ／Ｈ１Ｎ１／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９インフルエンザＩｇＧおよびＩｇＭのレベルを、インフルエンザワクチン接種前および４週間後に対象から得た血清で測定した。ＲＡＤ００１およびプラセボコホートで、抗Ｈ１Ｎ１インフルエンザＩｇＧおよびＩｇＭレベルのベースラインからワクチン接種４週間後の変化の有意差は検出されなかった(クラスカル・ウォリス順位和検定で全ｐ値＞０.０５)。
【０９０９】
【図３１】図３１Ａ、３１Ｂおよび３１ＣはＲＡＤ００１処置後のＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８の減少およびＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞の増加を示すグラフである。ＰＤ−１陽性ＣＤ４、ＣＤ８およびＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞のパーセントを、ベースライン、治験薬処置６週間後(６週目)および治験薬中止６週間後でかつインフルエンザワクチン接種４種間後(１２週目)のＰＢＭＣサンプルのＦＡＣＳ解析により決定した。図３１Ａは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、０.５mg／日(ｎ＝２５)、５mg／週(ｎ＝２９)および２０mg／週(ｎ＝３０)の用量レベルでＲＡＤ００１を投与されたコホートにおいて、１２週目でＰＤ−１陽性ＣＤ４  Ｔ細胞の有意な減少(−３７.１〜−２８.５％)があり、それぞれｐ＝０.００２(０.０２)、ｐ＝０.００３(ｑ＝０.０３)およびｐ＝０.０１(ｑ＝０.０５)であることを示す。図３１Ｂは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、０.５mg／日(ｎ＝２５)、５mg／週(ｎ＝２９)および２０mg／週(ｎ＝３０)の用量レベルでＲＡＤ００１(ｎ＝１０９)を投与されたコホートにおいて、１２週目でＰＤ−１陽性ＣＤ８  Ｔ細胞の有意な減少(−４３.３〜−３８.５％)があることを示し、それぞれ、ｐ＝０.０１(０.０５)、ｐ＝０.００７(ｑ＝０.０４)およびｐ＝０.０１(ｑ＝０.０５)であることを示す。図３１Ｃは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、０.５mg／日(ｎ＝２５)、５mg／週(ｎ＝２９)および２０mg／週(ｎ＝３０)の用量レベルでＲＡＤ００１(ｎ＝１０９)を投与されたコホートで１２週目にＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞の有意な増加(３.０〜４.９％)があり、それぞれｐ＝０.０００７(０.０２)、ｐ＝０.０３(ｑ＝０.０７)およびｐ＝０.０３(ｑ＝０.０８)であることを示す。
【０９１０】
【図３２】図３２Ａおよび３２ＢはベースラインＰＤ−１発現の差異で調節したＲＡＤ００１処置後のＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８のパーセントの減少およびＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞の増加を示すグラフである。ＰＤ−１陽性ＣＤ４、ＣＤ８およびＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞のパーセントは、ベースライン、治験薬処置６週間後(６週目)および治験薬中止６週間後でかつインフルエンザワクチン接種４種間後(１２週目)のＰＢＭＣサンプルのＦＡＣＳ解析により決定した。図３２Ａは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、プールしたＲＡＤコホート(ｎ＝８４)において６週目でＰＤ−１＋ＣＤ４  Ｔ細胞の３０.２％の有意な減少があり、ｐ＝０.０３(ｑ＝０.１３)であることを示す。プラセボコホートと比較したプールしたＲＡＤにおける１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ４  Ｔ細胞減少は３２.７％であり、ｐ＝０.０５(ｑ＝０.１９)である。図３２Ｂは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、プールしたＲＡＤ００１コホート(ｎ＝８４)において６週目でＰＤ−１陽性ＣＤ８  Ｔ細胞の３７.４％の有意な減少があり、ｐ＝０.００８(ｑ＝０.０７)であることを示す。プラセボコホートと比較したプールしたＲＡＤ００１における１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ８  Ｔ細胞減少は４１.４％であり、ｐ＝０.０６６(ｑ＝０.２１)である。図３２Ａおよび３８Ｂは、図３１Ａ、３１Ｂおよび３１Ｃのデータを示すが、図３１Ａ、３１Ｂおよび３１Ｃの異なるＲＡＤ００１用量群を、図３２Ａおよび３８Ｂにおいて単一ＲＡＤ００１処置群にプールした。
【０９１１】
【図３３】図３３はＲＡＤ００１に応答した高齢対象における運動およびエネルギーの増加を示す。
【０９１２】
【図３４】図３４Ａおよび３４Ｂは細胞におけるＰ７０  Ｓ６Ｋ活性に対するＲＡＤ００１の予測効果を示す。図４０ＡはＲＡＤ００１の毎週および連日の高用量で阻害したＰ７０  Ｓ６キナーゼを示し、図４０ＢはＲＡＤ００１の毎週の低用量で阻害したＰ７０  Ｓ６キナーゼを示す。
【０９１３】
【図３５】図３５は、ＲＡＤ００１と結合したＦＲＡＰのグラフ表示である。点線領域は、ＲＡＤ００１と結合するポケットを示す。ＲＡＤ００１に近位のまたはＲＡＤ００１との相互作用を媒介する残基を円で囲み、アミノ酸はＦＲＡＰ上に配置する。
【０９１４】
【図３６】図３６は、ＦＲＢ変異体のライブラリーの産生に使用したＮＫＫライブラリーのアミノ酸分布を示す。異なるアミノ酸をｘ軸に示し、ライブラリー中に表示されるパーセントをｙ軸に示す。
【０９１５】
【図３７】図３７Ａおよび３７Ｂは、異なる変異体ＦＲＢライブラリーの各々に由来するタンパク質発現を示す。１１種の異なる変異体ＦＲＢライブラリーをｘ軸に挙げる。図３７Ａにおいて、ｙ軸は変異体ＦＲＢを示すウェルのパーセントを示す。図３７Ｂにおいて、ｙ軸は、各ライブラリーについて決定した平均タンパク質濃度を示す。
【０９１６】
【図３８】図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ、３８Ｄおよび３８Ｅは、ＦＲＢ変異体：Ｅ２０３２Ｌ(図３８Ａ)、Ｅ２０３２Ｉ(図３８Ｂ)、Ｔ２０９８Ｌ(図３８Ｃ)、Ｅ２０３２Ｌ、Ｔ２０９８Ｌ(図３８Ｄ)およびＥ２０３２Ｉ、Ｔ２０９８Ｌ(図３８Ｅ)に対するＥＣ５０競合結合アッセイの結合曲線を示す。
【０９１７】
【図３９】図３９Ａ、３９Ｂおよび３９Ｃは、ＦＲＢ変異体：Ｅ２０３２Ｌ(図３９Ａ)、Ｅ２０３２Ｉ(図３９Ｂ)およびＴ２０９８Ｌ(図３９Ｃ)に対するＥＣ５０指示結合アッセイの結合曲線を示す。
【０９１８】
【図４０】図４０は、ｘ軸に示すヒトＰＤ１  ｓｈＲＮＡ配列による、２４時間、４８時間および７２時間のヒトＰＤ１ノックダウンを示す。ノックダウンは、残存するＰＤ１転写物のパーセンテージにより表す(ｙ軸)。ヒトＰＤ１  ｓｈＲＮＡ配列は表１９に提供する。
【０９１９】
【図４１】図４１は、ｘ軸に示すマウスＰＤ１  ｓｈＲＮＡ配列による、２４時間および４８時間のマウスＰＤ１ノックダウンを示す。ノックダウンは、残存するＰＤ１転写物のパーセンテージにより表す(ｙ軸)。マウスＰＤ１  ｓｈＲＮＡ配列は表１８に提供する。
【０９２０】
【図４２】図４２Ａおよび４２Ｂは、図４３で評価する細胞外スイッチを有する種々のＲＣＡＲ構築物の略図である。細胞外スイッチを有する半ＲＣＡＲを図４２Ａに示し、ＦＫＢＰおよびＦＲＢスイッチドメインを二つの異なる配向で有する。細胞外スイッチを有する完全ＲＣＡＲ完全スイッチを図４２Ｂに示し、ＦＫＢＰおよびＦＲＢスイッチドメインを二つの異なる配向で有する。
【０９２１】
【図４３】図４３Ａ、４３Ｂ、４３Ｃおよび４３Ｄは、種々の濃度のＲＡＤ００１を用いる、図４２Ａおよび４２ＢのＲＣＡＲ半スイッチ構築物の活性化を示す。図４３Ａおよび４３Ｂは、両配向のスイッチドメインを有するＲＣＡＲ半スイッチの活性化の結果を示す。図４３Ｃおよび４３Ｄは、両配向のスイッチドメインを有するＲＣＡＲ完全スイッチの活性化の結果を示す。ＮＦＡＴ活性化をLuciferase One Glo(ｙ軸)により検出される発光で表し、異なるＲＡＤ００１濃度をｘ軸に挙げる。
【０９２２】
【図４４】図４４Ａおよび４４Ｂは、細胞内スイッチを有する半ＲＣＡＲ構築物を示す。図４４Ａは、半ＲＣＡＲ構築物の略図を示す。図４４Ｂは、ＲＡＤ００１の存在下または非存在下の異なる共刺激シグナル伝達ドメインでの半ＲＣＡＲの活性化を示す。
【０９２３】
【図４５】図４５Ａおよび４５Ｂは、種々の濃度のＲＡＤ００１を用いる、２個の半ＲＣＡＲ構築物の活性化を示す。ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインでの半ＲＣＡＲの活性化を図４５Ａに示す。４１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインでの半ＲＣＡＲの活性化を図４５Ｂに示す。ＮＦＡＴ活性化をLuciferase One Glo(ｙ軸)により検出される発光で表し、異なるＲＡＤ００１濃度をｘ軸に挙げる。
【０９２４】
【図４６】図４６は、形質導入した一次Ｔ細胞上の半ＲＣＡＲの発現を示す。数字は半ＲＣＡＲ陽性Ｔ細胞のパーセンテージ(％)およびＣＡＲ陽性集団の平均蛍光強度(１０３ GeoMean)を示す。
【０９２５】
【図４７】図４７は形質導入したＴ細胞を発現する半ＲＣＡＲの細胞毒性を示す。ＲＣＡＲＴを、異なる濃度のＲＡＤ００１存在下、ルシフェラーゼを発現するＮａｌｍ６細胞と共培養した。
【０９２６】
【図４８】図４８は、形質導入したＴ細胞を発現する半ＲＣＡＲの増殖を示す。ＲＣＡＲＴを、異なる濃度のＲＡＤ００１の存在下、Ｎａｌｍ６細胞と共培養した。ＲＣＡＲ陽性ＣＤ３陽性Ｔ細胞の数を共培養４日後に評価した。
【０９２７】
【図４９】図４９は、形質導入したＴ細胞を発現するＣＡＲによる、ＩＦＮγの分泌を示す。ＣＡＲＴを、異なる濃度のＲＡＤ００１の存在下、Ｎａｌｍ６細胞と共培養した。細胞培養上清のＩＦＮγの濃度を、共培養２０時間後に決定した。
【０９２８】
【図５０】図５０は、共有結合性ハロ／ｓｎａｐタグスイッチを有するＲＣＡＲの活性化を示す。ＮＦＡＴ活性化をLuciferase One Glo(ｙ軸)により検出される発光で表し、異なるＮＶＰ−ＨＡＬ４２１濃度をｘ軸に挙げる。
【０９２９】
【図５１】図５１は、記載するＮＶＰ−ＨＡＬ４２１濃度の存在下、共有結合性ハロ／ｓｎａｐタグスイッチを有するＲＣＡＲの活性化を示す。ＮＦＡＴ活性化をLuciferase One Glo(ｙ軸)により検出される発光で表し、異なるＮＶＰ−ＨＡＬ４２１濃度をｘ軸に挙げる。
【０９３０】
【図５２】図５２は、２個の共刺激シグナル伝達ドメインが抗原結合メンバー上に存在する、二重半ＲＣＡＲ構築物を示す。
【０９３１】
【図５３】図５３は、抗原結合メンバーはスイッチドメインを含むが、膜貫通ドメインまたは膜アンカーを含まない、細胞外二量体化スイッチを含む普遍的ＣＡＲ構築物を含む。
【０９３２】
【図５４】図５４は、抗原結合ドメイン(ｓｃＦｖ)、膜貫通ドメイン(Ｔｍ)および第一スイッチドメインを含む抗原結合メンバーおよび膜貫通ドメイン(Ｔｍ)、第二スイッチドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン(４１ＢＢ)および一次細胞内シグナル伝達ドメイン(ＣＤ３ゼータ)を含む細胞内シグナル伝達メンバーを含むＲＣＡＲの構造を示す。
【０９３３】
【図５５】図５５Ａおよび５５Ｂは、マルチスイッチを含むＲＣＡＲの２個の構造を示す。図５５Ａにおいて、抗原結合メンバーは複数の第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰスイッチドメインを含み、一方細胞内シグナル伝達メンバーは複数の第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢスイッチドメインを含む。括弧内のスイッチドメインは、マルチスイッチを構成する１個以上のさらなるスイッチドメインを表す。図５５Ｂにおいて、抗原結合メンバーは第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰスイッチドメインおよび第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢスイッチドメインを含み、細胞内結合メンバーは第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢスイッチドメインおよび第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰスイッチドメインを含む。
【０９３４】
【図５６】図５６Ａ、５６Ｂ、５６Ｃおよび５６Ｄは、増殖能を制御できるＲＣＡＲ構築物の４つの配置を示す。ＲＣＡＲは、抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)、膜貫通ドメインおよび一次細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータ)を含む抗原結合メンバーを含む。２個の細胞内シグナル伝達メンバーは、いずれの少なくとも１個のスイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰおよびＦＲＢスイッチドメインおよび２個の共刺激ドメイン、例えば、２個の共刺激シグナル伝達ドメイン１または共刺激シグナル伝達ドメイン１と共刺激シグナル伝達ドメイン２を含み、ここで、害共刺激ドメイン１および２は４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＩＣＯＳから選択される。括弧内のスイッチドメインは、マルチスイッチを構成する１個以上のさらなるスイッチドメインを表す。図５６Ａにおいて、２個の細胞内シグナル伝達メンバーは、膜貫通ドメインおよび１個以上の細胞内スイッチドメインを含む。図５６Ｂにおいて、２個の細胞内シグナル伝達メンバーは、膜アンカー、例えば、ミリストイル化および１個以上の細胞内スイッチドメインを含む。図５６Ｃにおいて、２個の細胞内シグナル伝達メンバーは、１個以上の細胞外スイッチドメインおよび膜貫通ドメインを含む。図５６Ｄにおいて、２個の細胞内シグナル伝達メンバーは１個以上の細胞内スイッチドメインを含み、膜貫通ドメインまたは膜アンカーを含まない。
【０９３５】
【図５７】図５７は、ｍｙｃタグ多量体二量体化分子を有する９Ｅ１０ｓｃＦｖ含有細胞内メンバーのＮＦＡＴ活性化を示すグラフである。単ｍｙｃタグ(モノｍｙｃ)、二量体ｍｙｃタグ(ジｍｙｃ)、三量体ｍｙｃタグ(トリｍｙｃ)、四量体ｍｙｃタグ(テトラｍｙｃ)および対照(ＩｇＧ１  Ｆｃ)を１００nmおよび１μMで投与した。
【発明を実施するための形態】
【０９３６】
詳細な記載
定義
他に定義しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解されているのと同じ意味を有する。
【０９３７】
ここで使用する単数表現は、冠詞の文法的目的語が１個または１個を超えること(すなわち、少なくとも１個)を意味する。例として、“成分”は１個の成分または１個を超える成分を意味する。
【０９３８】
ここで使用する用語としての“約”は、量、期間などのような測定可能な値を記載するとき、特定値からの±２０％またはいくつかの態様においては±１０％またはいくつかの態様においては±５％またはいくつかの例においては±１％またはいくつかの態様においては±０.１％の変動を、このような変動が開示する方法の実施に適切である限り、包含することを意図する。
【０９３９】
ここで使用する用語としての“自己”は、後に個体に再導入するのと同じ個体に由来する何らかの物質をいう。
【０９４０】
ここで使用する用語としての“同種”は、物質を導入する個体と同じ種の異なる動物由来の何らかの物質をいう。一箇所以上の座位の遺伝子が同一でない場合、２以上の個体は互いに同種であるというべきである。いくつかの面において、同じ種の個体由来の同種物質は、抗原性に相互作用するには、遺伝的に十分に異なっている可能性がある。
【０９４１】
ここで使用する用語としての“抗原結合ドメイン”は、標的抗原、概して標的細胞、例えば、癌細胞上の抗原に親和性を有する分子をいう。代表的抗原結合ドメインは、ポリペプチド、例えば、抗体分子(抗体およびその抗原結合フラグメント、例えば、免疫グロブリン、単一ドメイン抗体(ｓｄＡｂ、例えば、ナノボディおよびｓｃＦｖ))または非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチンなどを含む。ある態様において、抗原結合ドメインは単一ポリペプチドである。ある態様において、抗原結合ドメインは、１個、２個またはそれ以上の、ポリペプチドを含む。ある態様において、抗原結合ドメインは、標的抗原の認識および特異的結合に寄与するのに十分な抗体のフラグメントを含む。用語“抗体フラグメント”は、抗原のエピトープと(例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間的分布により)特異的に相互作用する能力を保持する、抗体の少なくとも一つの部分をいう。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２またはＦｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ(ｓｄＦｖ)、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、線状抗体、ｓｄＡｂのような単一ドメイン抗体、例えば、ナノボディ(ＶＬまたはＶＨのいずれか)、ラクダ類ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントのような抗体フラグメントから形成された多特異性抗体および単離ＣＤＲまたは抗体の他のエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。抗原結合フラグメントはまた単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、細胞内抗体、二重特異性抗体、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖにも取り込まれ得る(例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005参照)。抗原結合フラグメントはまたフィブロネクチンIII型(Ｆｎ３)のようなポリペプチドに基づくスキャフォールドに移植もできる(フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許６,７０３,１９９号参照)。
【０９４２】
ある態様において、抗原結合ドメインは“ｓｃＦｖ”であり、これは、抗体のＶＬ鎖およびＶＨ鎖を含む融合タンパク質を含んでよく、ここで、ＶＨおよびＶＬは、短可動性ポリペプチドリンカーを介して連結されている。ｓｃＦｖは単一鎖ポリペプチドとして発現されることが可能であり、それが由来する完全な抗体の特異性を保持する。さらに、ＶＬ可変鎖およびＶＨ可変鎖は、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端について任意の順番で連結でき、ｓｃＦｖはＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでよく、またはＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでよい。ある態様において、抗原結合ドメインは、非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、アンキリン、ドメイン抗体、例えば、ナノボディ、リポカリン、小型モジュラー型免疫薬、マキシボディ、プロテインＡまたはアフィリンを含む。非抗体スキャフォールドは、細胞上の標的抗原に結合する能力を有する。ある態様において、抗原結合ドメインは、細胞上に発現される天然に存在するタンパク質のポリペプチドまたはそのフラグメントである。ある態様において、抗原結合ドメインは増殖因子またはホルモン受容体に結合する。理論に縛られることを望まないが、抗原結合ドメインは、標的細胞に対する特異性を提供するために作用し、ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバー上の細胞内シグナル伝達ドメインによるシグナル産生と、抗原結合を連結させることにより、免疫エフェクター機能を最適化する。
【０９４３】
ここで使用する用語としての“抗原結合メンバー”は、抗原結合ドメインおよび所望により、膜貫通ドメインまたは膜アンカーを含む。抗原結合メンバーはまたスイッチドメインも含み得る。ある態様において、抗原結合メンバー上のスイッチドメインは、細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化スイッチを形成できる。これら２個のスイッチドメインにより形成された二量体化スイッチは、抗原結合を細胞内シグナル産生とさせ、それにより細胞の免疫エフェクター機能を最適化する。ある態様において、抗原結合メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバー上の細胞内シグナル伝達ドメインが由来する分子の天然細胞外ドメイン以外である、抗原結合ドメインを含む。ある態様において、抗原結合メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバー上の細胞内シグナル伝達ドメインが由来する分子の天然細胞外ドメインのリガンドではない抗原と結合する、抗原結合ドメインを含む。
【０９４４】
ここで使用する用語としての“抗癌効果””は、例えば、腫瘍体積の減少、癌細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、癌細胞増殖の減少、癌細胞生存の減少または癌状態に付随する種々の生理学的症状の改善を含むが、これらに限定されない種々の手段により顕在化し得る、生物学的効果をいう。“抗癌効果”はまたそもそも癌の発生の予防におけるペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても顕在化され得る。用語“抗腫瘍効果”は、例えば、腫瘍体積の減少、癌細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の減少または腫瘍細胞生存の減少を含むが、これらに限定されない種々の手段により顕在化し得る、生物学的効果をいう。
【０９４５】
ここで使用する用語としての“補助的抗原結合メンバー”は、ＲＣＡＲの他の抗原結合ドメインに結合される抗原以外、例えば、抗原結合メンバーの抗原結合ドメイン以外の抗原と結合する抗原結合ドメインを含む、分子をいう。ある態様において、これは膜貫通ドメインまたは膜アンカリングドメインを含む。
【０９４６】
ここで使用する用語としての“癌”は、異常細胞の無制御の増殖により特徴づけられる疾患である。癌細胞は、局所的にまたは血流およびリンパ系を介して体の他の部分に拡散し得る。種々の癌の例は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳の癌、リンパ腫、白血病、肺癌などを含むが、これらに限定されない。
【０９４７】
ここで使用する用語としての“共刺激シグナル伝達ドメイン”は、標的細胞上のその同族カウンターリガンドとの結合により、免疫エフェクター応答を増強、例えば、増加させる、ＲＣＡＲＸ細胞の分子、例えば、内因性分子をいう。
【０９４８】
ここで使用する用語としての“由来する”は第一分子と第二分子の間の関係を示す。一般に、第一分子と第二分子の構造類似性をいい、第二分子から由来する第一分子の方法または源の制限を含意または包含しない。例えば、ＣＤ３ゼータ分子由来の細胞内シグナル伝達ドメインの場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、必要な機能、すなわち、適切な条件下でシグナルを産生する能力を有するように、十分なＣＤ３ゼータ構造を保持する。細胞内シグナル伝達ドメインを製造する特定の方法の制限を含意または包含せず、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインを提供するために、ＣＤ３ゼータ配列から開始し、望まない配列を削除するかまたは変異を付加し、細胞内シグナル伝達ドメインに到達しなければならないことを意味しない。
【０９４９】
ここで使用する用語としての“二量体化分子”は、第一スイッチドメインと第二スイッチドメインの結合を促進する分子をいう。例えば、二量体化スイッチが細胞内に配置された態様において、二量体化分子は原形質膜を通過できる。例えば、二量体化スイッチが細胞外に配置された態様において、二量体化分子は原形質膜を通過する必要はない。ある態様において、二量体化分子は対象に自然に生じず、または顕著な二量体化をもたらす濃度で生じない。ある態様において、二量体化分子は小分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログである。ある態様において、二量体化分子はポリペプチドである。ある態様において、二量体化分子は抗体分子、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある態様において、ホモ二量体化スイッチまたはヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、小分子二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ存在下で互いに結合する。ある態様において、ホモ二量体化スイッチまたはヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、ポリペプチド二量体化分子の存在下で互いに結合する。ある態様において、ホモ二量体化スイッチまたはヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、多量体ペプチド二量体化分子存在下で互いに結合する。ある態様において、ホモ二量体化スイッチまたはヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、抗体分子二量体化分子存在下で互いに結合する。ある態様において、抗体分子は単特異性抗体分子を含む。ある態様において、抗体分子は二重特異性抗体分子である。
【０９５０】
一般に、二量体化分子は、少なくとも２個のスイッチ分子の結合(そしてそれによりスイッチドメインに連結した細胞内ドメインの結合)を促進する。ある態様において、二量体化分子は２を超える結合価を有し、例えば、それは多価であり、２個を超えるスイッチドメインと結合し、それゆえにクラスター化または二量体化する。例えば、二量体化分子は複数の、例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の結合ドメインを含んでよく、その各々はスイッチドメインと結合できる。
【０９５１】
ここで使用する用語としての“ｄｓＲＮＡ”は、標的遺伝子の発現の配列特異的阻害を仲介できる、少なくとも二本鎖構造の領域を有する核酸分子をいう。ｄｓＲＮＡは、短干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)および短ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)を含む。ある態様において、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと構造は類似するが、センスおよびアンチセンス配列の二本鎖領域を接続する部分、概して１個以上のＲＮＡモノマーを含む。ある態様において、ｓｈＲＮＡが、細胞内プロセシング(例えば、Dicerによる)後、２ヌクレオチド３’オーバーハングを有する１９〜２３ヌクレオチド二本鎖ｓｉＲＮＡを生じる。
【０９５２】
ここで使用する用語としての“内因性”は、生物、細胞、組織または系内に由来するまたは産生されるあらゆる物質、例えば、ポリペプチドをいう。
【０９５３】
ここで使用する用語としての“外来性”は、生物、細胞、組織または系の外から導入されたまたは産生されたあらゆる物質、例えば、ポリペプチドまたは二量体化分子をいう。
【０９５４】
ここで使用する用語としての“免疫エフェクター細胞”は、例えば、免疫エフェクター応答の促進において、免疫応答に関係する細胞をいう。免疫エフェクター細胞の例は、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、ナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞、肥満細胞および骨髄由来貪食細胞をいう。
【０９５５】
ここで使用する用語としての“免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答”は、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する、例えば、免疫エフェクター細胞の機能または応答をいう。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の死滅を促進するまたは増殖または拡大を阻害するＴ細胞またはＮＫ細胞の特性をいう。Ｔ細胞の場合、一次刺激および共刺激が免疫エフェクター機能または応答の例である。免疫エフェクター機能または応答はＲＣＡＲにより促進でき、例えば、増殖、サイトカイン産生、細胞毒性またはＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１０７ａのような細胞表面マーカーの上方制御により有効なＲＣＡＲＸ細胞を生じ得る。
【０９５６】
ここで使用する用語としての“阻害細胞外ドメイン”は、阻害分子の細胞外ドメインを含むポリペプチドをいう。通常、そのカウンターリガンドへの結合は、免疫エフェクター応答の産生に対する阻害効果を有する。二量体化スイッチにより、細胞内シグナル伝達ドメインに結合、例えば、融合またはしたとき、通常免疫エフェクター応答の産生を阻害する相互作用を、免疫エフェクター応答を促進するものに再指向する。
【０９５７】
ここで使用する用語としての“阻害結合メンバー”は、阻害細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびスイッチドメインを含むポリペプチドをいう。
【０９５８】
ここで使用する用語としての“阻害分子”は、標的細胞上のその同族カウンターリガンドとの結合により、免疫エフェクター応答を最小化する、例えば、抑制または阻害する、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞上の分子、例えば、内因性分子をいう。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１およびＴＧＦＲベータを含む。
【０９５９】
ここで使用する用語としての“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、分子の細胞内部分をいう。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能を増強するシグナルを産生する。例えば、ＲＣＡＲＴ細胞における、免疫エフェクター機能の例は、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解性活性およびヘルパー活性を含む。
【０９６０】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。代表的一次細胞内シグナル伝達ドメインは、一次刺激または抗原依存性刺激を担う分子由来のものを含み得る。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。代表的共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナルまたは抗原非依存性刺激を担う分子由来のものを含み得る。例えば、ＲＣＡＲＴの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞受容体の細胞質配列を含みえて、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは共受容体または共刺激分子からの細胞質配列を含み得る。
【０９６１】
刺激方式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列(“一次シグナル伝達ドメイン”とも呼ぶ)は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明で特に有用な細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲIIａ、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものを含むが、これらに限定されない。本発明の特定のＲＣＡＲにおいて、本発明のＲＣＡＲＳの任意の１個以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えば、ＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。
【０９６２】
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分に由来し得る。共刺激分子は、次のタンパク質ファミリーにより表され得る：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)および活性化ＮＫ細胞受容体。このような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ−１、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む。このような共刺激分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Tactile)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６およびＰＡＧ／Ｃｂｐを含む。
【０９６３】
細胞内シグナル伝達ドメインは、由来する分子の全細胞内部分または全天然細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能的フラグメントもしくは誘導体を含み得る。
【０９６４】
ここで使用する用語としての“細胞内シグナル伝達メンバー”は、細胞内シグナル伝達ドメインおよびスイッチドメインを含むポリペプチドをいう。ある態様において、それは一次細胞内シグナルドメインおよび所望により、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。１個を超える細胞内シグナル伝達ドメインのある態様において、このようなドメインは、互いに無作為のまたは特定の順番で連結し得る。所望により、短オリゴまたはポリペプチドリンカー、例えば、２〜１０アミノ酸長を、細胞内シグナル伝達ドメイン間に配置し得る。グリシン−セリンダブレットは、特に適当なリンカーを提供する。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１３８からのシグナル伝達ドメインである。ある態様において、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号１３９からのシグナル伝達ドメインである。
【０９６５】
核酸またはポリペプチドについてここで使用する用語としての“単離された”は、少なくとも１個の共存化合物が除かれていることを意味する。天然に存在する核酸またはポリペプチドに関して、“単離された”は、天然において共存して生じる化合物が除かれていることを意味し、ある態様において、不純化合物はポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。合成により製造した核酸またはポリペプチドでは、“単離された”は、製造に使用した粗製物質または化合物、例えば、溶媒または出発物質が除かれていることを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在している核酸またはペプチドは“単離されて”いないが、その天然状態の共存物質の一部または全部が除かれている同じ核酸またはペプチドは“単離されて”いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に純粋な形態でも存在でき、また、例えば、宿主細胞のような非天然環境でも存在できる。
【０９６６】
ここで使用する用語としての“膜アンカー”、“膜アンカリングドメイン”または“膜係留ドメイン”は、細胞外ドメインを原形質膜に係留するのに十分な部分またはポリペプチドをいう。非ポリペプチド部分の例は、グリコホスファチジルイノシトール(ＧＰＩアンカー)またはミリストイル基(ミリストイル化)を含む。
【０９６７】
ここで使用する用語としての“核酸ベースの阻害剤”は、標的遺伝子、例えば、阻害分子の発現を阻害できる核酸分子をいう。これは短ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)および短干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)を含む二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)、アンチセンスＲＮＡおよびミクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)を含む。ある態様において、核酸ベースの阻害剤は標的ｍＲＮＡに結合し、例えば、標的ｍＲＮＡの開裂により、そこからのタンパク質の産生を阻害する。
【０９６８】
ここで使用する用語としての“調節可能キメラ抗原受容体(ＲＣＡＲ)”は、概して最も単純な態様においては２個の、ポリペプチドのセットをいい、これは、ＲＣＡＲＸ細胞にあるとき、ＲＣＡＲＸ細胞に、標的細胞、概して癌細胞に対する特異性、および、ＲＣＡＲＸ細胞の免疫エフェクター特性、例えば、細胞溶解性活性、サイトカイン分泌、細胞生存または増殖を最適化できる調節可能細胞内シグナル産生を提供する。ＲＣＡＲＸ細胞は、少なくとも一部、抗原結合ドメインにより結合される抗原を含む標的細胞への特異性を提供することを、抗原結合ドメインに依存する。ある態様において、ＲＣＡＲは、二量体化分子の存在により、細胞内シグナル伝達ドメインを細胞外認識成分と連結できる、二量体化スイッチを含む。細胞外認識成分は抗原結合ドメイン、阻害カウンターリガンド結合ドメインまたは共刺激ＥＣＤドメインであり得る。ある態様において、ＲＣＡＲは、二量体化分子の存在により、細胞内シグナル伝達ドメインを、ＲＣＡＲＸ細胞により発現されないが、外来性に提供される、細胞外認識成分と連結できる、二量体化スイッチを含む。
【０９６９】
ここで使用する用語としての“ＲＣＡＲＸ細胞”は、ＲＣＡＲを含む細胞をいう。ＲＣＡＲを発現するように操作されたあらゆる細胞を、ＲＣＡＲＸ細胞として使用できる。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＴ細胞であり、ＲＣＡＲＴ細胞と呼ぶ。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＮＫ細胞であり、ＲＣＡＲＮ細胞と呼ぶ。
【０９７０】
ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞は、患者に対して自己である。ある態様において、ＲＣＡＲＸは、患者に対して同種である。ある態様において、患者は、１種を超えるＲＣＡＲＸ細胞を受け、例えば、患者はＲＣＡＲＴ細胞およびＲＣＡＲＮ細胞を受ける。
【０９７１】
ここで使用する用語としての“特異的に結合する”は、サンプルに存在する結合パートナー(例えば、腫瘍抗原)タンパク質を認識し、これと結合する抗体またはリガンドをいうが、この抗体またはリガンドは、サンプル中の他の分子を実質的に認識せず、これと結合しない。
【０９７２】
ここで使用する用語としての“スイッチドメイン”は、二量体化分子の存在下、他のスイッチドメインと結合する物質(entity)をいい、概してポリペプチドベースの物質をいう。この結合は、第一スイッチドメインに連結した、例えば、融合した第一の物質と、第二スイッチドメインに連結した、例えば、融合した第二の物質との機能的結合を生じる。第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、集合的に二量体化スイッチと呼ぶ。ある態様においてある態様において、第一スイッチドメインと第二スイッチドメインは、互いに同一であり、例えば、これらは、同一の一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にホモ二量体化スイッチと呼ぶ。ある態様において、第一スイッチドメインと第二スイッチドメインは互いに異なり、例えば、これらは、異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にヘテロ二量体化スイッチと呼ぶ。ある態様において、スイッチは、細胞内である。ある態様において、スイッチは、細胞外である。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースの物質であり、例えば、ＦＫＢＰ−ＦＲＢであり、二量体化分子は小分子、例えば、ラパログである。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースの物質、例えば、ｍｙｃペプチドと結合するｓｃＦｖであり、二量体化分子はポリペプチド、そのフラグメントまたはポリペプチドの多量体、例えば、ｍｙｃリガンドまたは１個以上のｍｙｃ  ｓｃＦｖｓと結合するｍｙｃリガンドの多量体である。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースの物質、例えば、ｍｙｃ受容体であり、二量体化分子は抗体またはそのフラグメント、例えば、ｍｙｃ抗体である。
【０９７３】
ここで使用する用語としての“膜貫通ドメイン”は、原形質膜を貫くポリペプチドである。ある態様において、それは、細胞外配列、例えば、スイッチドメイン、細胞外認識成分、例えば、抗原結合ドメイン、阻害カウンターリガンド結合ドメインまたは共刺激ＥＣＤドメインを、細胞内配列、例えば、スイッチドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインと連結する。本発明で特に有用な膜貫通ドメインは、少なくとも例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８(例えば、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ)、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域を含み得る。ある態様において、膜貫通ドメインは、少なくとも、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Tactile)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐの膜貫通領域を含み得る。
【０９７４】
ここで交換可能に使用されている用語“処置”および“処置する”は、１種以上の治療剤(例えば、本発明のＣＡＲのような１種以上の治療剤)の投与によりもたらされる、増殖性障害の進行、重症度および／または期間の減少または改善または増殖性障害の症状の１つ以上(好ましくは、認識できる症状の１つ以上)の改善をいう。特定の態様において、用語“処置”および“処置する”は、必ずしも患者により認識できるものではない、腫瘍の増殖のような増殖性障害の測定可能な物理的パラメータの少なくとも１個の改善をいう。他の態様において、用語“処置”および“処置する”は、例えば、認識できる症状の安定化により、身体的に、例えば、物理的パラメータの安定化により、生理学的にまたはその両者により増殖性障害進行を阻止することをいう。他の態様において、用語“処置”および“処置する”は、腫瘍サイズまたは癌性細胞数の減少または安定化をいう。
【０９７５】
ここで交換可能に使用されている用語“腫瘍抗原”または“癌関連抗原”は、完全にまたはフラグメントとして(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)癌細胞の表面上に発現され、癌細胞への薬物の優先的ターゲティングに有用である分子(概してタンパク質、炭水化物または脂質)を交換可能にいう。ある態様において、腫瘍抗原は、正常細胞と癌細胞の両者により発現されるマーカー、例えば、細胞系譜マーカー、例えば、Ｂ細胞上のＣＤ１９である。ある態様において、腫瘍抗原は、正常細胞と比較して癌細胞で過発現している、例えば、正常細胞と比較して、１倍過発現、２倍過発現、３倍またはそれ以上過発現している、細胞表面分子である。ある態様において、腫瘍抗原は、癌細胞において適切に合成されない細胞表面分子、例えば、正常細胞で発現される分子と比較して欠失、付加または変異を含む分子である。ある態様において、腫瘍抗原は、完全にまたはフラグメント(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)として、癌細胞の細胞表面に排他的に合成され、正常細胞の表面に合成または発現されない。ある態様において、本発明のＲＣＡＲは、ＭＨＣ提示ペプチドに結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント)を含むＲＣＡＲを含む。通常、内在性タンパク質由来ペプチドが主要組織適合抗原複合体(ＭＨＣ)Ｉ型分子のポケットを満たし、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)により認識される。ＭＨＣＩ型複合体は、全有核細胞により構成的に発現される。癌において、ウイルス特異的および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法のための細胞表面標的の独特なクラスを表す。ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２の状況でのウイルスまたは腫瘍抗原に由来するＴＣＲ様抗体ターゲティングペプチドが記載されている(例えば、Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100参照)。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｃＦｖファージディスプレイライブラリーのようなライブラリーのスクリーニングにより同定できる。
【０９７６】
ここで使用する用語としての“スイッチ非連動補助的抗原結合メンバー”は、ＲＣＡＲの他の抗原結合ドメインにより結合される抗原以外の抗原に結合する抗原結合ドメイン；膜貫通ドメイン；および細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ポリペプチドをいう。概して、ＲＣＡＲの他の成分上のスイッチドメインと二量体化スイッチを形成できるスイッチドメインを含まない。
【０９７７】
ここで使用する用語としての“単位用量形態”は、一投与に適する用量をいう。例として、単位用量形態は錠剤、カプセル剤または送達デバイス、例えば、シリンジまたは静脈内点滴バッグに分配された量の治療剤をいう。ある態様において、単位用量形態を一投与で投与する。ある態様において、１個を超える単位用量形態、例えば、２個の錠剤を同時に投与できる。
【０９７８】
ここで使用する用語としての“異種”は、異なる種の動物由来の移植片をいう。
【０９７９】
ここで使用する用語としての“生物学的同等”は、対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)の対照用量または対照量により生じる効果と同等の効果を生じるのに必要な対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)以外の薬剤の量である。ある態様において、効果は、例えば、インビボまたはインビトロアッセイにおいて評価される、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Boulayアッセイにより測定される、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ阻害により測定される、ｍＴＯＲ阻害のレベルまたはウェスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定値である。ある態様において、効果は、細胞選別により測定した、ＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞比の変更である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同レベルのＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害を達成する量または用量である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同レベルのＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞比の変更を達成する量または用量である。
【０９８０】
用語“低い、免疫増強用量”は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンまたは触媒的ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて使用するとき、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の阻害により測定して、ｍＴＯＲ活性を、完全にではないが、一部阻害する、ｍＴＯＲ阻害剤の用量である。例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼの阻害により、ｍＴＯＲ活性を評価する方法をここに記載する。本用量は、完全な免疫抑制を生じるには不十分であるが、免疫応答の増強には十分である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い、免疫増強用量は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞数の減少および／またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞数の増加またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比の増加を生じる。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い、免疫増強用量は、ナイーブＴ細胞数増加を生じる。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い、免疫増強用量は、次の１個以上を生じる。
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体における、次のマーカー、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２の１個以上の発現の増加；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体における、ＫＬＲＧ１発現の減少；および
記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次の特徴の１個または組み合わせを有する細胞の数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、上記変化のいずれかは、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
【０９８１】
抗原結合ドメイン
ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＲＣＡＲは、抗原結合メンバーの細胞外領域に抗原結合ドメインを含む。ここで使用する用語としての“抗原結合ドメイン”は、標的抗原、概して標的細胞、例えば、癌細胞上の抗原に親和性を有する分子をいう。代表的抗原結合ドメインは、ポリペプチド、例えば、抗体分子(抗体およびその抗原結合フラグメント、例えば、免疫グロブリン、単一ドメイン抗体(ｓｄＡｂ)およびｓｃＦｖを含む)または非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチンなどを含む。ある態様において、抗原結合ドメインは単一ポリペプチドである。ある態様において、抗原結合ドメインは、１個、２個またはそれ以上の、ポリペプチドを含む。
【０９８２】
抗原結合ドメインは、標的細胞の表面を規定するリガンドまたは受容体のタイプおよび数による。例えば、抗原結合ドメインを、特定の疾患状態と関係する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドまたは受容体を認識するように選択し得る。リガンドまたは受容体として作用し得る細胞表面マーカーの例は、特定の疾患状態と関係する細胞表面マーカー、例えば、ウイルス疾患、細菌疾患、寄生虫感染症、自己免疫性疾患および望まない細胞増殖と関係する障害、例えば、癌、例えば、ここに記載する癌の細胞表面マーカーを含む。
【０９８３】
本開示の文脈の中で、“腫瘍抗原”または“増殖性障害抗原”または“増殖性障害と関係する抗原”は、特異的増殖性障害に共通する抗原をいう。ある面において、本発明の増殖性障害抗原は、原発性または転移黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌(例えば、ＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣ)、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、神経膠芽腫、神経芽腫、子宮癌、子宮頸癌、腎臓癌、甲状腺癌、膀胱癌、腎臓癌、中皮腫および乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌などのような腺癌を含むが、これらに限定されない癌に由来する。ある態様において、癌は、Ｂ細胞急性リンパ系白血病(“ＢＡＬＬ”)、Ｔ細胞急性リンパ系白血病(“ＴＡＬＬ”)、急性リンパ系白血病(ＡＬＬ)、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)；慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)を含むが、これらに限定されない１種以上の慢性白血病；Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞−または大細胞−濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、血漿芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含むが、これらに限定されないさらなる造血器癌または造血器状態である。
【０９８４】
一つの態様において、腫瘍抗原は、哺乳動物の癌腫瘍由来の腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)により免疫学的に認識される１個以上の抗原性癌エピトープを含む。
【０９８５】
腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞介在免疫応答を誘発する腫瘍細胞により産生される、タンパク質である。本発明の抗原結合ドメインの選択は、処置する特定のタイプの癌による。腫瘍抗原は当分野で周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)、ＥＧＦＲｖIII、ＩＬ−１１Ｒａ、ＩＬ−１３Ｒａ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、Ｂ７Ｈ３、Ｋｉｔ、ＣＡ−ＩＸ、ＣＳ−１、ＭＵＣ１、ＢＣＭＡ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ＨＥＲ２、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン(ＡＦＰ)、ＡＬＫ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、サイクリンＢ１、レクチン反応性ＡＦＰ、Ｆｏｓ関連抗原１、ＡＤＲＢ３、ｔｈｙｒｏグロブリン、ＥｐｈＡ２、ＲＡＧＥ−１、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＳＸ２、ＡＫＡＰ−４、ＬＣＫ、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＰＡＸ５、ＳＡＲＴ３、ＣＬＬ−１、フコシルＧＭ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ＥＰＣＡＭ、ＥＶＴ６−ＡＭＬ、ＴＧＳ５、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＲＵ１、ＲＵ２(ＡＳ)、腸カルボキシルエステラーゼ、ルイスＹ、ｓＬｅ、ＬＹ６Ｋ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原(ＰＳＡ)、ＰＡＸ３、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ＬＭＰ２、ＮＣＡＭ、ｐ５３、ｐ５３変異体、Ｒａｓ変異体、ｇｐ１００、プロステイン、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＡＮＸ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ＨＭＷＭＡＡ、ＨＡＶＣＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ−ベータ、サバイビンおよびテロメラーゼ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６,Ｅ７、精子タンパク質１７、ＳＳＥＡ−４、チロシナーゼ、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、前立腺−癌腫瘍抗原−１(ＰＣＴＡ−１)、ＭＬ−ＩＡＰ、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１,ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、ＸＡＧＥ１、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、好中球エラスターゼ、肉腫転座切断点、ＮＹ−ＢＲ−１、エフリンＢ２、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ９７、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、アンドロゲン受容体、ＦＡＰ、インスリン増殖因子(ＩＧＦ)−Ｉ、ＩＧＦ−II、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＧＤ２、ｏ−アセチル−ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＰＲ２０、ＣＸＯＲＦ６１、葉酸受容体(ＦＲａ)、葉酸受容体ベータ、ＲＯＲ１、Ｆｌｔ３、ＴＡＧ７２、ＴＮ  Ａｇ、Ｔｉｅ  ２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＵＰＫ２およびメソテリンを含む。好ましい態様において、腫瘍抗原は、葉酸受容体(ＦＲａ)、メソテリン、ＥＧＦＲｖIII、ＩＬ−１３Ｒａ、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、ＣＡ−ＩＸ、ＭＵＣ１、ＨＥＲ２およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０９８６】
一つの態様において、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関係する１個以上の抗原性癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として役立ち得る多数のタンパク質を発現する。これらの分子は、黒色腫におけるＭＡＲＴ−１、チロシナーゼおよびＧＰ  １００ならびに前立腺癌における前立腺酸ホスファターゼ(ＰＡＰ)および前立腺特異的抗原(ＰＳＡ)のような組織特異的抗原を含む。他の標的抗原は、癌遺伝子ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２のような形質転換関連分子を含む。標的抗原のさらに別の群は、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)のような癌胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に独特な真に腫瘍特異的免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３７のようなＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。
【０９８７】
腫瘍抗原の非限定的例は、次のものを含む：分化抗原、例えばＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ(ＭＡＲＴ−Ｉ)、ｇｐ１００(Ｐｍｅｌ  １７)、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２および腫瘍特異的多系列抗原、例えばＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５；過発現胚性抗原、例えばＣＥＡ；過発現癌遺伝子および変異腫瘍サプレッサー遺伝子、例えばｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；染色体転座に由来する独特な腫瘍抗原；例えばＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ；およびウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ)抗原Ｅ６およびＥ７。他の大きな、タンパク質ベースの抗原は、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７.１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ベータ−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ  １５、ｐ  １６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ−フェトプロテイン、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３／ＣＡ  ２７.２９／ＢＣＡＡ、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３／ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０／Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰおよびＴＰＳを含む。
【０９８８】
標的とする所望の抗原によって、本発明のＲＣＡＲは、所望の抗原標的に特異的な適切な抗原結合ドメインを含むように操作できる。
【０９８９】
ここに記載するＲＣＡＲは、ＭＨＣ提示ペプチドに結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント)を含むＣＡＲを含む。通常、内因性タンパク質由来のペプチドは、主要組織適合抗原(ＭＨＣ)クラスＩ分子のポケットを満たし、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)により認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、全有核細胞により構成的に発現される。癌において、ウイルス特異的および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法のための細胞表面標的の独特なクラスを代表する。ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２の状況におけるウイルスまたは腫瘍抗原由来のＴＣＲ様抗体ターゲティングペプチドは記載されている(例えば、Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Bood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21) :1601-1608 ; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176) :176ra33 ; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100参照)。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｃＦｖファージディスプレイライブラリーのようなライブラリーからのスクリーニングにより同定できる。したがって、本発明は、細胞内に発現される上記腫瘍抗原のいずれか、例えば、ｐ５３、ＢＣＲ−Ａｂｌ、Ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびｃ−ｍｅｔから選択される分子のＭＨＣ提示ペプチドに結合する、抗原結合ドメインを含む、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＲＣＡＲを提供する。
【０９９０】
ここでまた提供されるのは、抗原結合メンバーが複数の抗原結合ドメインを含むＲＣＡＲである。理論に縛られることを望まないが、２個以上の抗原結合ドメインを含む抗原結合メンバーは、２個以上の対応する抗原が遭遇したとき、活性化およびエフェクター機能の相加的または相乗的増強を生じ得ると考えられる。理論に縛られることを望まないが、２個以上の抗原結合ドメインを含む抗原結合メンバーは、正常細胞に対して癌細胞に対するエフェクター細胞の特異性を増加でき、抗原エスケープを相殺できまたは癌細胞および癌微小環境へのターゲティングを可能にできるとも考えられる。
【０９９１】
この態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、２個、３個、４個または５個の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖｓを含むことができ、ここで、各抗原結合ドメインは標的抗原に結合する。ある態様において、抗原結合ドメインの２個以上は、異なる抗原に結合できる。ある態様において、抗原結合ドメインの２個以上は、同じ抗原、例えば、同じ抗原上の同じまたは異なるエピトープに結合できる。ある態様において、複数の抗原結合ドメインは互いに連結し、例えば、第一抗原結合ドメインのＣ末端は第二抗原結合ドメインのＮ末端に連結する。ある態様において、第一抗原結合ドメインのＣ末端は、第二抗原結合ドメインのＮ末端に共有結合、例えば、ペプチド結合により結合する。抗原結合ドメインの順番は例えば、対応する標的抗原の相対的サイズにより、同時に標的抗原の結合を増加するために最適化できる。例えば、標的抗原が大きくなると、対応する抗原結合ドメインは、抗原結合メンバーの膜貫通ドメインの近くに配置され；標的抗原が小さくなると、対応する抗原結合ドメインは抗原結合メンバーの膜貫通ドメインから遠くに、例えば、より細胞外に配置される(例えば、Grada et al., 2013, Mol Ther, 2:e105参照)。
【０９９２】
ある態様において、リンカーまたはヒンジ領域が、抗原結合ドメインの各々の間に配置され、例えば、リンカーまたはヒンジ領域は第一抗原結合ドメインのＣ末端と第二抗原結合ドメインのＮ末端の間に配置される。例として、２個の抗原結合ドメイン(例えば、ＡＢＤ１およびＡＢＤ２)を含む抗原結合メンバーを、次の配置で配置できる：[ＡＢＤ１]−[リンカー／ヒンジ]−[ＡＢＤ２]。さらなる抗原結合ドメインを同様の方法で付加でき、所望によりリンカーまたはヒンジ領域を抗原結合ドメインのＣ末端と次の抗原結合ドメインのＮ末端の間に配置させる。複数の抗原結合メンバーの連結に使用するのに適するリンカーまたはヒンジ領域は可動性であり、非開裂可能であり、同時に複数標的抗原との結合を促進するために、他の抗原結合ドメインと独立して、各抗原結合ドメインのほぼ自由な運動を可能にする。当分野で知られるあらゆる可動性リンカーまたはヒンジ領域を使用できる。リンカーの例は、グリシン残基およびセリン残基を含むペプチドリンカー、例えば、(ＧＧＧＳ)ｎ(ここで、ｎは１以上の性の整数であり、例えば、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である)(配列番号３２７)を含む。ヒンジ領域の例は、配列番号１３６を含む。
【０９９３】
抗体分子由来の抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗体分子、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン(ＶＨ)、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)および、例えば、ヒトまたはラクダ類起源の可変ドメイン(ＶＨＨ)の１個以上に由来し得る。ある例において、ＲＣＡＲを最終的に使用するのと同じ種由来の抗原結合ドメインであることが有利であり、例えば、ヒトで使用するために、例えば、ここに記載する、ＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲの抗原結合ドメインが、ヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを含むことが有利であり得る。抗体は、当分野で知られる技術を使用して得ることができる。
【０９９４】
ここで使用する用語“抗体”は、標的抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子をいう。抗体は、天然源由来または組み換え源の完全な免疫グロブリンであってよく、完全な免疫グロブリンの免疫反応性部分であってよい。抗体は、概して免疫グロブリン分子の四量体である。ここに記載する抗体分子は、抗体の抗原結合部分が、例えば、ここに記載する、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(ｓｄＡｂ)、一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)およびヒト化またはヒト抗体を含む、隣接ポリペプチド鎖の一部として発現される、多様な形態で存在し得る。
【０９９５】
用語“抗体フラグメント”は、完全な抗体の一部をいい、完全な抗体の抗原性決定可変領域をいう。抗体フラグメントの例は、一本鎖ドメイン抗体(ｓｄＡｂ)、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２およびＦｖフラグメント、線状抗体、ｓｃＦｖ抗体、線状抗体、ｓｄＡｂのような単一ドメイン抗体(ＶＬまたはＶＨのいずれか)、ラクダ類ＶＨＨドメインおよび抗体フラグメントから形成された多特異性抗体を含むが、これらに限定されない。
【０９９６】
ここで使用する“抗体重鎖”は、天然に生じる高次構造で抗体分子に存在する２タイプのポリペプチド鎖の大きいほうをいう。
【０９９７】
用語“抗体軽鎖”は、天然に生じる高次構造で抗体分子に存在する２タイプのポリペプチド鎖の小さいほうをいう。κおよびλ軽鎖は、２個の主要な抗体軽鎖アイソタイプをいう。
【０９９８】
ここで使用する用語“合成抗体”は、例えば、ここに記載するバクテリオファージにより発現された抗体分子のような、組み換えＤＮＡテクノロジーを使用して産生される抗体分子を意味する。本用語はまた抗体分子をコードするＤＮＡ分子の合成により産生された抗体分子であって、該ＤＮＡ分子が抗体を特定する抗体タンパク質またはアミノ酸配列を発現し、ここで、該ＤＮＡまたはアミノ酸配列が、当分野で利用可能であり、周知の合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列テクノロジーにより得られている、抗体分子も意味する。
【０９９９】
ある態様において、抗原結合ドメインは、標的抗原の認識および特異的結合に寄与するのに十分な抗体のフラグメントを含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２またはＦｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、線状抗体、ｓｄＡｂのような単一ドメイン抗体(ＶＬまたはＶＨのいずれか)、ラクダ類ＶＨＨドメインおよび抗体フラグメントから形成された多特異性抗体を含むが、これらに限定されない。
【１０００】
ある態様において、抗原結合ドメインは“ｓｃＦｖ”であり、これは、抗体のＶＬ鎖およびＶＨ鎖を含む融合タンパク質を含んでよく、ここで、ＶＨおよびＶＬは、例えば、短可動性ポリペプチドリンカー、例えば、ここに記載するリンカーにより連結されている。ｓｃＦｖは単一鎖ポリペプチドとして発現されることが可能であり、該ｓｃＦｖはそれが由来する完全な抗体の特異性を保持する。さらに、ＶＬ可変鎖およびＶＨ可変鎖は、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関していずれの順序で連結されてもよく、ｓｃＦｖはＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでよく、またはＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでよい。ｓｃＦｖは、当分野で知られる方法により製造できる(例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。
【１００１】
上におよび他の場所に記載するとおり、ｓｃＦｖ分子は、可動性ポリペプチドリンカーを使用するＶＨ鎖およびＶＬ鎖の連結により産生できる。ある態様において、ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成のリンカー(例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー)を含み得る。リンカー長は、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短ポリペプチドリンカー(例えば、５〜１０アミノ酸)を用いたとき、鎖内折りたたみは阻止される。鎖間折りたたみも、２個の可変領域が一緒になって機能的エピトープ結合部位を形成することを必要とする。リンカー配向およびサイズの例について、例えば、例えば、Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開２００５／０１００５４３号、２００５／０１７５６０６号、２００７／００１４７９４号およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２０２５８号を参照し、ＷＯ２００７／０２４７１５号を引用により本明細書に包含させる。一つの態様において、ｓｃＦｖのペプチドリンカーは、可変重鎖および可変軽鎖領域を一緒に連結するために、単独でまたは組み合わせで使用するグリシンおよび／またはセリン残基のようなアミノ酸を含む。一つの態様において、可動性ポリペプチドリンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、例えば、アミノ酸配列(Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎ(ここで、ｎは１以上の整数である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３。ｎ＝４、ｎ＝５およびｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０である)(配列番号３２７)を含む。一つの態様において、可動性ポリペプチドリンカーは、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号３２８)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号３２９)を含む。他の態様において、リンカーは、(Ｇｌｙ２Ｓｅｒ)、(ＧｌｙＳｅｒ)または(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)(配列番号３３０)の複数反復を含む。
【１００２】
ある態様において、抗原結合ドメインは単一ドメイン抗原結合(ＳＤＡＢ)分子である。ＳＤＡＢ分子は、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である、分子を含む。例は、重鎖可変ドメイン、軽鎖を自然に欠く結合分子、従来の４鎖抗体由来の単一ドメイン、操作されたドメインおよび抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャフォールドを含む(例えば、下により詳細に記載)を含むが、これらに限定されない。ＳＤＡＢ分子は現在または将来の単一ドメイン分子であり得る。ＳＤＡＢ分子は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含むが、これらに限定されないあらゆる種由来であり得る。この用語はまたラクダ科動物およびサメ以外の種からの天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含む。
【１００３】
一つの面において、ＳＤＡＢ分子は、例えば、サメの血清で発見された新規抗原受容体(ＮＡＲ)として知られる免疫グロブリンアイソタイプ由来のもののような、魚に見られる免疫グロブリンの可変領域由来であり得る。ＮＡＲの可変領域由来の単ドメイン分子(“ＩｇＮＡＲ”)を製造する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１号およびStreltsov (2005) Protein Sci.14:2901-2909に記載されている。
【１００４】
他の面によって、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠く重鎖として知られる天然に存在する単ドメイン抗原結合分子である。このような単ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４０４６７８号およびHamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448に開示されている。明瞭化のために、天然に軽鎖を欠く重鎖分子由来のこの可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するために、ここでは、ＶＨＨまたはナノボディとして知られる。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコに由来し得る。ラクダ科以外の種は、天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生する可能性があり、このようなＶＨＨは本発明の範囲内である。
【１００５】
ラマ種(Lama paccos, Lama glamaおよびLama vicugna)のような新世界メンバーを含むラクダおよびヒトコブラクダ(Camelus bactrianusおよびCalelus dromaderius)ファミリーのメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑さおよびヒト対象に対する抗原性について特徴付けされている。自然に見られるこの哺乳動物のファミリー由来のある種のＩｇＧ抗は、本質的に軽鎖を欠き、それゆえに、他の動物からの抗体の、２個の重鎖および２個の軽鎖を有する典型的４鎖四次構造と構造的に区別される。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４参照(ＷＯ９４／０４６７８号は１９９４年３月３日公開)。
【１００６】
ＶＨＨとして同定される小単可変ドメインであるラクダ類抗体の領域は、標的に対する高親和性を有する小タンパク質を産生するための遺伝子操作により得ることができ、“ラクダ類ナノボディ”として知られる低分子量抗体由来タンパク質を生じる。米国特許５,７５９,８０８号(１９９８年６月２日発行)参照；またStijlemans et al., (2004) J Biol Chem 279:1256-1261; Dumoulin et al., (2003) Nature 424:783-788; Pleschberger et al., (2003) Bioconjugate Chem 14:440-448; Cortez-Retamozo et al., (2002) Int J Cancer 89:456-62; and Lauwereys et al., (1998) EMBO J 17:3512-3520も参照のこと。ラクダ類抗体および抗体フラグメントの操作したライブラリーは、例えば、Ablynx、Ghent, Belgium(例えば、ＵＳ２００６０１１５４７０号；Domantis(ＵＳ２００７００６５４４０号、ＵＳ２００９０１４８４３４号)から購入できる。他の非ヒト起源の抗体と同様、ラクダ類抗体のアミノ酸配列を組み換えにより変更して、ヒト配列をより模倣した配列を得ることができ、すなわち、ナノボディは“ヒト化”され得る。それゆえに、ラクダ類抗体のヒトに対して本質的に低い抗原性をさらに下げ得る。
【１００７】
ラクダ類ナノボディは、ヒトＩｇＧ分子の１／１０の分子量を有し、タンパク質は、数ナノメートルしかない物理的径を有する。サイズが小さいことによる結果の一つは、ラクダ類ナノボディの、大型抗体タンパク質では機能的に不可視である抗原性部位に結合する能力であり、すなわち、ラクダ類ナノボディは、そうでなければ古典的免疫学的技術を使用しては隠れている抗原を検出するための試薬および可能性のある治療剤抗原として有用である。それゆえに、サイズが小さいことによる他の結果は、ラクダ類ナノボディが標的タンパク質の溝または狭い間隙の特異的部位との結合の結果阻害でき、それゆえに、古典的抗体よりも古典的低分子量薬物の機能をより近似して模倣する性能で役立ち得ることである。
【１００８】
低分子量および小型は、さらに、ラクダ類ナノボディを極めて熱安定性とし、厳しいｐＨおよびタンパク質消化に安定性とし、抗原性を乏しくする。他の結果は、ラクダ類ナノボディが、循環系から組織に容易に移動することであり、血液脳関門さえ通過し、神経組織を冒す障害を処置できることである。ナノボディは、さらに、血液脳関門を通過する薬物輸送を促進できる。米国特許出願２００４０１６１７３８号(２００４年８月１９日公開)参照。ヒトに対する低抗原性と合わさったこれらの特性は、大きな治療的可能性を示す。さらに、これらの分子は、大腸菌のような原核生物細胞で完全に発現でき、バクテリオファージを用いて融合タンパク質として発現され、機能的である。
【１００９】
抗原結合ドメインは、ラクダ類抗体またはナノボディまたは抗原結合そのフラグメントを含み得る。このような抗体は、その同族抗原に高親和性を有し得る。ここでのある態様において、ラクダ類抗体またはナノボディはラクダ類動物で自然に産生され、すなわち、抗原またはペプチドそのフラグメントでの免疫化後にラクダ類で産生される。あるいは、ラクダ類ナノボディは操作され、すなわち、例えば標的抗原でのパニング法を使用する、適切に変異誘発されたラクダ類ナノボディタンパク質をディスプレイするファージのライブラリーから選択される。操作したナノボディを、レシピエント対象内で４５分〜２週間の半減期を有するように遺伝子操作することにより、さらにカスタマイズできる。特定の態様において、ラクダ類抗体またはナノボディを、例えばＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４に記載のように、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列をナノボディまたは単一ドメイン抗体フレームワーク配列にグラフティングすることにより得る。
【１０１０】
抗原結合ドメインは、例えば、結合を重鎖可変領域のみに依存する単一ドメイン抗体、例えば、ナノボディを含み得る。ここで使用するのに適するナノボディは、ＵＳ２０１０／００２８３４１号、ＷＯ２００９／０３０２８５号およびＷＯ２０１０／００７３７６号に記載の方法により製造できる。
【１０１１】
ある態様において、ＳＤＡＢ分子は、１個以上の標的抗原に結合する、相補性可変ドメインまたは免疫グロブリン定常領域、例えば、Ｆｃ領域を欠く、１個以上の単一ドメイン分子(例えば、ナノボディ)を含む単一鎖融合ポリペプチドである。
【１０１２】
ＳＤＡＢ分子は組み換え、組み換え、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化および／またはインビトロ産生(例えば、ファージディスプレイにより選択)され得る。
【１０１３】
一つの態様において、抗原結合ドメイン部分はヒト抗体またはそのフラグメントを含む。
【１０１４】
ある態様において、非ヒト抗体は、抗体の特異的配列または領域がヒトで天然に産生される抗体との類似性を増加するために修飾されている、ヒト化である。ある態様において、抗原結合ドメインはヒト化である。
【１０１５】
非ヒト抗体は、多様な当分野で知られる技術、例えば、ＣＤＲ移植(例えば、その各々を引用によりその全体を本発明に包含させる欧州特許ＥＰ２３９,４００号；国際公開ＷＯ９１／０９９６７号；および米国特許５,２２５,５３９号、５,５３０,１０１号および５,５８５,０８９号参照)、ベニアリングまたはリサーフェシング(例えば、その各々を引用によりその全体を本発明に包含させる欧州特許ＥＰ５９２,１０６号およびＥＰ５１９,５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; and Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973参照)、鎖シャフリング(例えば、引用によりその全体を本発明に包含させる米国特許５,５６５,３３２参照)および、例えば、その各々を引用によりその全体を本発明に包含させる米国特許出願公開ＵＳ２００５／００４２６６４号、米国特許出願公開ＵＳ２００５／００４８６１７号、米国特許６,４０７,２１３号、米国特許５,７６６,８８６号、国際公開ＷＯ９３１７１０５号、Tan et al., 2002, J. Immunol., 169:1119-25; Caldas et al., 2000, Protein Eng., 13(5):353-60; Morea et al., 2000, Methods, 20:267-79; Baca et al.,  1997, J. Biol. Chem., 272:10678-84;  Roguska et al., 1996, Protein Eng., 9(10):895-904;  Couto et al., 1995, Cancer Res., 55 :5973s-5977; Couto et al., 1995, Cancer Res., 55(8):1717-22;  Sandhu  1994 Gene, 150(2):409-10; and Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol., 235(3):959-73に開示の技術を使用してヒト化できる。しばしば、フレームワーク領域のフレームワーク残基を、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換し、抗原結合を変更する、例えば、改善する。これらのフレームワーク置換は、当分野で周知の方法により、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定し、特定の位置の異常フレームワーク残基を同定するための配列比較するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリングにより同定する(例えば、引用によりその全体を本発明に包含させるQueen et al.、米国特許５,５８５,０８９；およびRiechmann et al., 1988, Nature, 332:323参照)。好ましい態様において、ヒト化抗体分子は、ここに記載する配列、例えば、ここに記載する可変軽鎖および／または可変重鎖、例えば、表Ｘに記載するヒト化可変軽鎖および／または可変重鎖を含む。
【１０１６】
ヒト化抗体は、非ヒトである源から導入された１個以上のアミノ酸残基を含む。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば“移入”残基と呼ばれ、これは、概して“移入”可変ドメインから取られる。それゆえに、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリン分子からの１個以上のＣＤＲおよびヒトからのフレームワーク領域を含む。抗体のヒト化は当分野で周知であり、本質的にWinterおよび共同研究者の方法に従い(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列に置換し、すなわち、ＣＤＲ移植して実施できる(その内容を、引用によりその全体を本明細書に包含させるＥＰ２３９,４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７号；および米国特許４,８１６,５６７号；６,３３１,４１５号；５,２２５,５３９号；５,５３０,１０１号；５,５８５,０８９号；６,５４８,６４０号参照)。このようなヒト化キメラ抗体において、完全より実質的に少ないヒト可変ドメインが、非ヒト種の対応する配列で置換されている。実際には、ヒト化抗体は、概していくつかのＣＤＲ残基および恐らくいくつかのフレームワーク(ＦＲ)残基が、齧歯類抗体の類似部位の残基で置換されている、ヒト抗体である。抗体のヒト化は、その内容を引用により全体を本明細書に包含させる、ベニアリングまたはリサーフェシング(ＥＰ５９２,１０６号；ＥＰ５１９,５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); and Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994))または鎖シャフリング(米国特許５,５６５,３３２号)によっても達成できる。
【１０１７】
ある態様において、本発明の抗体を、さらにここに開示するＶＨおよび／またはＶＬ配列の１個以上を有する抗体を出発物質として使用して、修飾抗体を操作することにより製造でき、この修飾抗体は、出発抗体と比較して改変された特性を有し得る。多様な態様において、抗体は、可変領域の一方または両方(すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ)内、例えば１個以上のＣＤＲ領域内および／または１個以上のフレームワーク領域内の１個以上のアミノ酸の修飾により、操作する。
【１０１８】
他の面において、抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体(“ＴＣＲ”)またはそのフラグメント、例えば、一本鎖ＴＣＲ(ｓｃＴＣＲ)である。このようなＴＣＲを製造する方法は、当分野で知られる。例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000); Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen et al, Gene Ther. 19(4):365-74 (2012)参照(引用文献は、その全体を本明細書に包含させる)。例えば、ｓｃＴＣＲを、リンカー(例えば、可動性ペプチド)と連結したＴ細胞クローン由来のＶα遺伝子およびＶβ遺伝子を含むように操作する。この方法は、癌関連標的に極めて有用であり、これは、それ自体細胞内であるが、しかしながら、このような抗原(ペプチド)のフラグメントはＭＨＣにより癌細胞表面に提示される。ＴＣＲ配列は、天然に存在しても、天然に存在しない合成配列でもよい。
【１０１９】
抗原結合ドメインは、表１１の表を含み得る。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【１０２０】
【表４】
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【表５】
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【１０２１】
【表６】
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【表７】
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【１０２２】
【表８】
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【表９】
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【１０２３】
【表１０】
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【表１１】
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【１０２４】
【表１２】
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【表１３】
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【１０２５】
【表１４】
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【表１５】
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【１０２６】
【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【１０２７】
ある態様において、抗原結合ドメインは、抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント、例えば、ｓｃＦｖを含む。例えば、抗原結合ドメインは、表１２に挙げる可変重鎖および可変軽鎖を含む。可変重鎖と可変軽鎖を連結するリンカー配列は、ここに記載する任意のリンカー配列であってよく、あるいは、
【化１】
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であってよい。
【１０２８】
【表１９】
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【１０２９】
当分野で知られる任意のＣＤ１９  ＣＡＲ由来のＣＤ１９抗原結合ドメインを、本発明に従い使用できる。例えば、ＬＧ−７４０；米国特許８,３９９,６４５号；米国特許７,４４６,１９０号；Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260(2012); Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013); Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011); Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010); Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39(2013); and 16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10に記載のＣＤ１９  ＣＡＲ。
【１０３０】
非抗体スキャフォールド
ある態様において、抗原結合ドメインは、非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、アンキリン、ドメイン抗体、リポカリン、小型モジュラー型免疫薬、マキシボディ、プロテインＡまたはアフィリンを含む。非抗体スキャフォールドは、細胞上の標的抗原と結合する能力を有する。ある態様において、抗原結合ドメインは、細胞上に発現される天然に存在するタンパク質のポリペプチドまたはそのフラグメントである。ある態様において、抗原結合ドメインは非抗体スキャフォールドを含む。得られたポリペプチドが標的細胞上の標的抗原に特異的に結合する少なくとも１個の結合領域を含む限り、広範な非抗体スキャフォールドを使用できる。
【１０３１】
非抗体スキャフォールドは、フィブロネクチン(Novartis, MA)、アンキリン(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd., Cambridge, MAおよびAblynx nv, Zwijnaarde, Belgium)、リポカリン(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、小型モジュラー型免疫薬(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、マキシボディ(Avidia, Inc., Mountain View, CA)、プロテインＡ(Affibody AG, Sweden)およびアフィリン(ガンマ結晶またはユビキチン)(Scil Proteins GmbH, Halle, Germany)を含む。
【１０３２】
フィブロネクチンスキャフォールドは、フィブロネクチンタイプIIIドメイン(例えば、フィブロネクチンタイプIIIの第十モジュール(１０Ｆｎ３ドメイン))に基づき得る。フィブロネクチンタイプIIIドメインは、７個または８個のベータ鎖を有し、これは２個のベータシート間に分散され、これらのシート自体、タンパク質のコアを形成するように互いに対して包装され、さらにループを含み(ＣＤＲに類似)、これはベータ鎖を互いに連結し、溶媒暴露されている。ベータシートサンドイッチの各端に少なくとも３種のこのようなループが存在し、該端はベータ鎖の方向に垂直なタンパク質の境界である(ＵＳ６,８１８,４１８号参照)。この構造のため、この非抗体スキャフォールドは、このような抗体の性質および親和性が似ている、抗原結合特性を模倣する。これらのスキャフォールドは、インビボの抗体親和性成熟過程に類する、インビトロのループ無作為化およびシャフリング戦略に使用できる。
【１０３３】
アンキリンテクノロジーは、異なる標的への結合のために使用できる、可変領域を担持するためのスキャフォールドとしてのアンキリン由来反復モジュールを有するタンパク質の使用に基づく。アンキリン反復モジュールは、２個の逆平行α螺旋およびβターンからなる３３アミノ酸ポリペプチドだる。可変領域の結合は、リボソームディスプレイを使用して、ほとんど最適化される。
【１０３４】
アビマーは、ＨＥＲ３のような天然Ａ−ドメイン含有タンパク質由来である。これらのドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用のために天然で使用され、ヒトにおいて、２５０を超えるタンパク質が、構造上Ａ−ドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーにより連結された多数の異なる“Ａ−ドメイン”モノマー(２〜１０)からなる。アビマーは、例えば、米国特許出願公開２００４０１７５７５６号；２００５００５３９７３号；２００５００４８５１２号；および２００６０００８８４４号に記載の方法を使用して、標的抗原に結合できるように製造できる。
【１０３５】
アフィボディ親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの一つのスキャフォールドを基礎とする３螺旋束からなる、小さい、単純タンパク質である。プロテインＡは、細菌スタフィロコッカス・アウレウスからの表面タンパク質である。このスキャフォールドドメインは５８アミノ酸からなり、そのうち１３個は、多数のリガンドバリアントを含むアフィボディライブラリーの製造のために無作為化される(例えば、ＵＳ５,８３１,０１２号参照)。アフィボディ分子は抗体を模倣し、１５０kDaである抗体分子量と比較して、６kDaの分子量を有する。その小さいサイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は抗体のものに類似する。
【１０３６】
タンパク質エピトープ模倣物(ＰＥＭ)は、タンパク質−タンパク質相互作用に関係する主要二次構造である、タンパク質のベータ−ヘアピン二次構造を模倣する中程度のサイズの、環状、ペプチド様分子(ＭＷ１〜２kDa)である。抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体またはラクダ類抗体を含むものは、ここに記載するあらゆる標的受容体／リガンド、例えば、ＰＤ１受容体、ＰＤ１−Ｌ１またはＰＤ１−Ｌ２を指向できる。
【１０３７】
不適合抗原結合ドメイン
各々抗原結合ドメイン(ＣＭＥＲ)を含む複数のキメラ膜包埋受容体を有する細胞で、ＣＭＥＲの抗原結合ドメイン間の相互作用は、例えば、抗原結合ドメインがその同族抗原と結合する１個以上の能力を阻止するため、望ましくない可能性が発見されている。したがって、ここに開示されるのは、同じ細胞で発現したときこのような相互作用を最小化する抗原結合ドメインを含む、第一および第二の天然に存在しないＣＭＥＲであり、ここで、該第一ＣＭＥＲはＲＣＡＲである。ある態様において、複数のＣＭＥＲは２個のＲＣＡＲを含む。ある態様において、複数のＣＭＥＲは１個のＣＡＲおよび１個の他のＲＣＡＲを含む。
【１０３８】
ある態様において、本願発明は第一および第二ＣＭＥＲを含み、ここで、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの一方の抗原結合ドメインは可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含まず、該第一および第二ＣＭＥＲの一方はＲＣＡＲである。ある態様において、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖではなく、ここで、該第一および第二ＣＭＥＲの一方はＲＣＡＲである。ある態様において、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトまたはマウス配列または非抗体スキャフォールド由来の単一ＶＨドメインを含み、ここで、該第一および第二ＣＭＥＲの一方はＲＣＡＲである。ある態様において、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの一方の抗原結合ドメインはナノボディを含み、ここで、該第一および第二ＣＭＥＲの一方はＲＣＡＲである。ある態様において、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの一方の抗原結合ドメインはラクダ類ＶＨＨドメインを含み、ここで、該第一および第二ＣＭＥＲの一方はＲＣＡＲである。
【１０３９】
ある態様において、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含み、ここで、該第一および第二ＣＭＥＲの一方はＲＣＡＲである。ある態様において、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はナノボディを含み、ここで、該第一および第二ＣＭＥＲの一方はＲＣＡＲである。ある態様において、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はラクダ類ＶＨＨドメインを含み、ここで、該第一および第二ＣＭＥＲの一方はＲＣＡＲである。
【１０４０】
ある態様において、細胞の表面に存在するとき、該第一ＣＭＥＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は該第二ＣＭＥＲの存在により実質的に減少せず、ここで、該第一および第二ＣＭＥＲの一方はＲＣＡＲである。ある態様において、該第二ＣＭＥＲ存在下の該第一ＣＭＥＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＣＭＥＲ非存在下の該第一ＣＭＥＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合の８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であり、ここで、該第一および第二ＣＭＥＲの一方はＲＣＡＲである。
【１０４１】
ある態様において、細胞の表面に存在するとき、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの抗原結合ドメインは、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるときより互いに弱く結合し、ここで、該第一および第二ＣＭＥＲの一方はＲＣＡＲである。ある態様において、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの抗原結合ドメインは、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるときより８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％弱く互いに結合し、ここで、該第一および第二ＣＭＥＲの一方はＲＣＡＲである。
【１０４２】
二量体化スイッチ
二量体化スイッチは、スイッチドメイン間の相互作用の形によって、非共有結合または共有結合であり得る。
【１０４３】
非共有結合性二量体化スイッチ
非共有結合性二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の非共有結合性相互作用を促進する。非共有結合性二量体化スイッチの例は、ここに記載する、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰベースの二量体化スイッチ、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースの二量体化スイッチおよびジベレリンベースの二量体化スイッチを含む。
【１０４４】
ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチ
ＦＫＢＰ１２(ＦＫＢＰまたはＦＫ５０６結合タンパク質)は、天然産物免疫抑制性剤であるラパマイシンの初期細胞内標的として働く、豊富な細胞質タンパク質である。ラパマイシンは、ＦＫＢＰおよび大ＰＩ３ＫホモログＦＲＡＰ(ＲＡＦＴ、ｍＴＯＲ)と結合し、そうして、これらの分子の二量体化に作用する。
【１０４５】
ある態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰベースのスイッチは、ここでは、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチとも呼ぶが、ヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体を使用できる。ＦＲＢは、ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体の結合に十分なＦＲＡＰの９３アミノ酸部分である(Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51)。
【１０４６】
ＦＫＢＰの配列は次のとおりである。
【化２】
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【１０４７】
ある態様において、ＦＫＢＰスイッチドメインは、ＦＫＢＰのＦＲＢ結合フラグメント、例えば、配列番号１の下線部分を含むことができ、それは次のとおりである。
【化３】
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【１０４８】
ＦＲＢの配列は次のとおりである。
【化４】
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【１０４９】
ある態様において、１個のスイッチドメインは、配列番号１に開示するアミノ酸残基またはそのＦＲＢ結合フラグメントまたは類似体、例えば、配列番号１４１を含み、１個のスイッチドメインは、配列番号２に開示するアミノ酸残基またはそのＦＫＰＢ結合フラグメントまたは類似体を含む。ある態様において、ＦＫＢＰのＦＲＢ結合フラグメントは、ＦＫＢＰの配列、配列番号１または配列番号１４１の３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５または９０アミノ酸を含む。ある態様において、ＦＫＢＰのＦＲＢ結合フラグメントは、ＦＫＢＰの配列、配列番号１または配列番号１４１より少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０アミノ酸短い。ある態様において、ＦＲＢのＦＫＢＰ結合フラグメントは、ＦＲＢの配列、配列番号２の３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５または９０アミノ酸を含む。ある態様において、ＦＲＢのＦＫＢＰ結合フラグメントは、ＦＲＢの配列、配列番号２より少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０アミノ酸短い。ある態様において、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、１個以上のＦＫＢＰスイッチドメイン、ＦＲＢスイッチドメインおよび二量体化分子の間の複合体の形成を増強する変異、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１または修飾ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチなる表題の章に記載する変異を含む。例えば、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、Ｅ２０３２変異、例えば、Ｅ２０３２Ｉ変異またはＥ２０３２Ｌ変異；Ｔ２０９８変異、例えば、Ｔ２０９８Ｌ変異；またはＥ２０３２およびＴ２０９８変異、例えば、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８ＬまたはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含む。
【１０５０】
ある態様において、１個のスイッチドメインは、配列番号１に開示するアミノ酸残基(または配列番号１４１)を含み、１個のスイッチドメインは、配列番号２に開示するアミノ酸残基を含む。
【１０５１】
ある態様において、スイッチドメインまたはそのラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１結合配列は、配列番号１のＦＫＢＰ配列(または配列番号１４１)と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。ある態様において、スイッチドメインまたはそのラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１結合配列は、対応する配列番号１の配列(または配列番号１４１)と３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない。
【１０５２】
ある態様において、１個のスイッチドメインはＦＲＢ(またはＦＲＢおよびラパマイシンまたはラパマイシン類似体)と結合し、配列番号１のＦＫＢＰ配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するか、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて、異ならない。
【１０５３】
ある態様において、スイッチドメインまたはそのラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１結合配列は、配列番号２のＦＲＢ配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。ある態様において、スイッチドメインまたはそのラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１結合配列は、対応する配列番号２の配列と３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて、異ならない。
【１０５４】
ある態様において、他のスイッチドメインはＦＫＢＰ(またはＦＫＢＰおよびラパマイシンまたはラパマイシン類似体)と結合し、配列番号２のＦＲＢ配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するか、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて、異ならない。例えば、図２参照。
【１０５５】
ある態様において、スイッチドメインまたはそのラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１結合配列は、非ヒト、例えば、哺乳動物、例えば、齧歯類、例えば、マウス、ラットまたはハムスター、ＦＫＢＰ配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。ある態様において、スイッチドメインまたはそのラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１結合配列は、非ヒト、例えば、哺乳動物、例えば、齧歯類、例えば、マウス、ラットまたはハムスターＦＫＢＰと、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない。
【１０５６】
ある態様において、１個のスイッチドメインはＦＲＢ(またはＦＲＢおよびラパマイシンまたはラパマイシン類似体)と結合し、非ヒト、例えば、哺乳動物、例えば、齧歯類、例えば、マウス、ラットまたはハムスターＦＫＢＰと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するかまたは３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない。
【１０５７】
ある態様において、スイッチドメインまたはそのラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１結合配列は、非ヒト、例えば、哺乳動物、例えば、齧歯類、例えば、マウス、ラットまたはハムスターＦＲＢ配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。ある態様において、スイッチドメインまたはそのラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１結合配列は、非ヒト、例えば、哺乳動物、例えば、齧歯類、例えば、マウス、ラットまたはハムスターＦＲＢ配列と、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない。
【１０５８】
ある態様において、他のスイッチドメインはＦＫＢＰ(またはＦＫＢＰおよびラパマイシンまたはラパマイシン類似体)と結合し、非ヒト、例えば、哺乳動物、例えば、齧歯類、例えば、マウス、ラットまたはハムスターＦＲＢと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するかまたは３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない。
【１０５９】
ここで使用する用語としての“ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチ”は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体と結合し、配列番号１または配列番号１４１のＦＫＢＰ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するかまたは３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えては異ならない第一スイッチドメイン；およびラパマイシンまたはラパマイシン類似体と結合し、配列番号２のＦＲＢ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するかまたは３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えては異ならない第二スイッチドメインを含む、二量体化スイッチをいう。例えば、図２参照。
【１０６０】
ある態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチは、ラパマイシンの望ましくない特性を欠くヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシン類似体を使用でき、例えば、免疫抑制性活性を欠くかまたは低い。
【１０６１】
修飾ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチ
ここでまた提供されるのは、ＦＲＢベースのスイッチドメインが、性能を最適化し、例えば、ＦＫＢＰスイッチドメイン、ＦＲＢスイッチドメインと二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の複合体形成を変え、例えば、増強する、１個以上の変異を含む改善されたＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化スイッチである。ある態様において、１個以上の変異を含むＦＲＢベースのスイッチドメインを、ここでは、“変異体ＦＲＢ”とも呼び、例えば、二量体化分子について野生型ＦＲＢベースのスイッチドメインの親和性と比較して、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログに対する親和性の増強を含む。
【１０６２】
理論に縛られることを望まないが、ここに記載する変異は、ＲＣＡＲの集合のために低濃度の二量体化分子の使用を可能にすると考えられる。ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化スイッチを二量体化するある二量体化分子は免疫抑制性効果を示し、それゆえに、ＲＣＡＲ療法の有利な効果を阻止または軽減する。それゆえに、ＲＣＡＲを集合させるために低濃度の二量体化分子の使用をする能力は、ＲＣＡＲ発現細胞活性の治療域を広げ、例えば、免疫抑制を誘発せずに使用できる二量体化分子の用量範囲を増やし、それゆえにＲＣＡＲ発現細胞の治療効果の増加に至る。これとは別にまたはこれに加えて、理論に縛られることを望まないが、ここに記載する変異は、内因性ＦＲＡＰ／ｍＴＯＲの結合および阻害の代わりに、二量体化分子の変異体ＦＲＢへの優先的結合を生じ得ると考えられる。内因性ＦＲＡＰ／ｍＴＯＲ阻害の阻止は、内因性ＦＲＡＰ／ｍＴＯＲ阻害と関連する有害作用、例えば、毒性または免疫抑制を減少または阻止する。
【１０６３】
変異体ＦＲＢは、ここに使用するスクリーニング法を使用して同定できる。先ず、天然に折りたたまれた野生型ＦＲＢの二量体化分子結合ポケットに存在するまたは、二量体化分子との相互作用に、例えば、直接的または間接的に寄与する野生型ＦＲＢにおける領域またはアミノ酸残基を、構造データ、例えば、ｘ線結晶構造またはコンピューターモデリング、例えば、二量体化分子またはその誘導体に結合する相同タンパク質の相同性または比較モデリングから決定できる。候補変異体ＦＲＢを、例えば、ＰＣＲ部位特異的変異誘発による、標的領域または標的残基の変異により産生できる。ある態様において、１個以上の点変異を含む候補ＦＲＢ変異体のライブラリーを、標的残基を、標的残基をコードするコドンの無作為化により全ての他の可能なアミノ酸に変異させる、飽和突然変異誘発アプローチを使用して産生できる。標的残基に対応する各コドンの無作為化は、全２０アミノ酸を表すコドンライブラリー、例えば、ＮＮＫライブラリー(ここで、Ｎはｂｅアデニン(Ａ)、シトシン(Ｃ)、グアニン(Ｇ)またはチミン(Ｔ)であってよく、Ｋはグアニン(Ｇ)またはチミン(Ｔ)であってよい)を使用して達成できる。表１３は、代表的ＮＮＫライブラリーのコドン分布および対応するアミノ酸を示す。ＮＮＫライブラリー内の各コドンは標的残基位置に取り込まれ、それにより、標的残基位置が全ての他の可能なアミノ酸に変異している、各標的残基位置についての候補ＦＲＢ変異体のライブラリーを産生する。候補ＦＲＢ変異体のライブラリーを、次いで、スクリーニングして、ここに記載するＦＲＢ変異体を同定する。
【１０６４】
【表２０】
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【１０６５】
種々のスクリーニングアッセイを使用して、各候補変異体ＦＲＢを評価して、ＦＫＢＰスイッチドメイン、ＦＲＢスイッチドメインと二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の間の複合体の形成を増強する変異体ＦＲＢを同定する。直接結合アッセイにおいて、非標識候補変異体ＦＲＢを、溶液中、タグ付野生型ＦＫＢＰと二量体化分子の存在下で、例えば、ＦＲＢの二量体化分子への結合およびＦＲＢとＦＫＢＰの二量体化に適する条件下インキュベートする。タグ付ＦＫＢＰを親和性精製により反応から除去でき、二量体化分子を結合し、タグ付ＦＫＢＰと二量体化できる候補変異体ＦＲＢも除去される。タグ付野生型ＦＫＢＰと二量体化しない遊離候補変異体ＦＲＢの量を、反応中のタンパク質濃度の決定により計算できる。直接結合親和性のＥＣ５０値を、続いて、当分野で知られる方法を使用して計算できる。
【１０６６】
上記直接結合アッセイとは別にまたはこれに加えて、競合結合アッセイも変異体ＦＲＢの同定のために実施できる。このアッセイにおいて、非タグ付候補変異体ＦＲＢを、溶液中、：１)第一標識と連結した野生型ＦＫＢＰ、例えば、ビオチニル化野生型ＦＫＢＰ；２)第二ｔ標識と連結した野生型ＦＲＢ、例えば、ＦＬＡＧタグ付野生型ＦＲＢ；および３)二量体化分子と、ＦＲＢの二量体化分子への結合およびＦＲＢとＦＫＢＰの二量体化に適する条件下インキュベートする。タグ付野生型ＦＫＢＰおよびタグ付野生型ＦＲＢを親和性精製により反応から除去できる。野生型ＦＲＢ存在下でタグ付野生型ＦＫＢＰと二量体化しなかった遊離候補変異体ＦＲＢの量を、反応中のタンパク質濃度の決定により計算できる。競合結合親和性のＥＣ５０値を、続いて、当分野で知られる方法を使用して計算できる。
【１０６７】
ある態様において、変異体ＦＲＢは、野生型ＦＲＢのアミノ酸配列、例えば、配列番号２を含むＦＲＢに、１個以上の、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の変異を含む。変異体ＦＲＢは、例えば、二量体化分子に対する野生型ＦＲＢの親和性と比較して、二量体化分子への親和性が増加している。ここでいう野生型または変異体ＦＲＢのアミノ酸位置ナンバリングは配列番号２から決定でき、配列番号２の最初のアミノ酸が２０２１位であり、配列番号２の最後のアミノ酸が２１１３位である。
【１０６８】
ある態様において、変異体ＦＲＢは、２０３１位のロイシン(Ｌ２０３１)、２０３２位のグルタミン酸(Ｅ２０３２)、２０３５位のセリン(Ｓ２０３５)、２０３６位のアルギニン(Ｒ２０３６)、２０３９位のフェニルアラニン(Ｆ２０３９)、２０４０位のグリシン(Ｇ２０４０)、２０９８位のスレオニン(Ｔ２０９８)、２１０１位のトリプトファン(Ｗ２１０１)、２１０２位のアスパラギン酸(Ｄ２１０２)、２１０５位のチロシン(Ｙ２１０５)および２１０８位のフェニルアラニン(Ｆ２１０８)から選択されるアミノ酸に１個以上の変異を有し、ここで、Ｌ２０３１、Ｅ２０３２、Ｓ２０３５、Ｒ２０３６、Ｆ２０３９、Ｇ２０４０、Ｔ２０９８、Ｗ２１０１、Ｄ２１０２、Ｙ２１０５および／またはＦ２１０８は、任意の他の天然に存在するアミノ酸に対する変異である。ある態様において、変異体ＦＲＢは、配列番号２７６〜２８６から選択されるアミノ酸配列を有し、ここでｈ、Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸であり得る。ＲＡＤ００１に対する親和性が増加した代表的変異体ＦＲＢスイッチドメインのアミノ酸配列を、下の表１４に示す。ここに記載するスクリーニングを実施して、変異体ＦＲＢを同定できる。
【１０６９】
【表２１】
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【１０７０】
さらに実施例２１に記載するように、スクリーニングを実施して、候補変異体ＦＲＢを評価できる。
【１０７１】
ある態様において、変異体ＦＲＢは、例えば、Ｌ２０３１、Ｅ２０３２、Ｓ２０３５、Ｒ２０３６、Ｆ２０３９、Ｇ２０４０、Ｔ２０９８、Ｗ２１０１、Ｄ２１０２、Ｙ２１０５およびＦ２１０８から選択されるアミノ酸に１個以上の変異を含み、ここで、野生型アミノ酸は、任意の他の天然に存在するアミノ酸に対して変異する。ある態様において、変異体ＦＲＢは、Ｅ２０３２に変異を含み、Ｅ２０３２はフェニルアラニン(Ｅ２０３２Ｆ)、メチオニン(Ｅ２０３２Ｍ)、アルギニン(Ｅ２０３２Ｒ)、バリン(Ｅ２０３２Ｖ)、チロシン(Ｅ２０３２Ｙ)、イソロイシン(Ｅ２０３２Ｉ)、例えば、配列番号２８７またはロイシン(Ｅ２０３２Ｌ)に変異され、例えば、配列番号２８８である。ある態様において、変異体ＦＲＢはＴ２０９８に変異を含み、ここで、Ｔ２０９８はフェニルアラニン(Ｔ２０９８Ｆ)またはロイシン(Ｔ２０９８Ｌ)に変異され、例えば、配列番号２８９である。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２およびＴ２０９８に変異を含み、ここで、Ｅ２０３２は任意のアミノ酸に変異され、Ｔ２０９８は任意のアミノ酸に変異され、例えば、配列番号２９０である。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２ＩおよびＴ２０９８Ｌ変異を含み、例えば、配列番号２９１である。ある態様において、変異体ＦＲＢは、Ｅ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含み、例えば、配列番号２９２である。代表的変異体ＦＲＢスイッチドメインのアミノ酸配列を下の表１５に示す。
【１０７２】
【表２２】
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【１０７３】
変異体ＦＲＢは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの二量体化のために、現在臨床の現場で使用されている用量より低いまたは対象における免疫抑制を誘発する用量より低いＲＡＤ００１用量の使用を可能とする。ある態様において、例えば、ここに記載する変異体ＦＲＢを含む、修飾ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの二量体化を刺激するＲＡＤ００１の用量は、癌の処置に現在使用される用量より低く、例えば、ＲＡＤ００１の用量は、１日あたり１０mg未満、例えば、１日あたり１０mg、９mg、８mg、７mg、６mg、５mg、４mg、３mg、２mg、１mg未満を含む。ある態様において、例えば、ここに記載する変異体ＦＲＢを含む、修飾ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの二量体化を刺激するＲＡＤ００１の用量は、１日あたり１mg未満、例えば、１日あたり０.５mgを含む。ある態様において、例えば、ここに記載する変異体ＦＲＢを含む、修飾ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチの二量体化を刺激するＲＡＤ００１の用量の量は、１週間あたり１０mg未満、例えば、１週間あたり５mgを含む。修飾ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチで使用するのに適する二量体化分子のさらなる用量は、ここの“医薬組成物および処置”なる表題の章に記載する。
【１０７４】
ＡＰ２１９６７およびＡＰ２１９６７結合ＦＲＢ
ある態様において、二量体化分子は、野生型内因性ＦＲＡＰ、例えば、ＦＲＢと結合しないが、修飾ＦＲＢと結合する、ラパマイシン類似体、例えば、ＡＰ２１９６７である。理論に縛られることを望まないが、内因性ＦＲＢへの結合の欠如は、免疫抑制性活性を減少させると考えられる。代表的修飾ＦＲＢは、一アミノ酸変化(Ｔ２０９８Ｌ)を含む。この変異の二量体化スイッチのＦＲＢ成分への取り込みは、ＡＰ２１９６７を二量体化分子として使用することを可能とする。
【１０７５】
ある態様において、１個のスイッチドメインは、ラパマイシン類似体、例えば、ＡＰ２１９６７と結合するＦＫＢＰからの配列を含み、他のスイッチドメインは、ラパマイシン類似体、例えば、ＡＰ２１９６７結合と結合する、ＦＲＢからの配列を含む。
【１０７６】
【化５】
0006793902.tif 000028
【化６】
0006793902.tif 000029
【１０７７】
ある態様において、１個のスイッチドメインは配列番号１に開示するアミノ酸残基を含み、１個のスイッチドメインは、配列番号２に開示するアミノ酸残基を含む。
【１０７８】
ある態様において、スイッチドメインまたはそのラパマイシン類似体、例えば、ＡＰ２１９６７結合配列は、配列番号１のＦＫＢＰ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。ある態様において、スイッチドメインまたはそのラパマイシン類似体、例えば、ＡＰ２１９６７結合配列は、対応する配列番号１の配列と、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない。
【１０７９】
ある態様において、スイッチドメインまたはそのラパマイシン類似体、例えば、ＡＰ２１９６７結合配列は、配列番号１４２のＦＲＢ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。ある態様において、スイッチドメインまたはそのラパマイシン類似体、例えば、ＡＰ２１９６７結合配列は、対応する配列番号１４２のＦＲＢ配列と、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない。
【１０８０】
構造１：ＡＰ２１９６７
【化７】
0006793902.tif 000030
【１０８１】
類似のスイッチが、上記のようにシグナル伝達ドメインの局在性および活性を制御するために使用されている(例えば、Graef, I. A., Holsinger, L. J., Diver, S., Schreiber, S. L. & Crabtree, G. R. (1997) Proximity and orientation underlie signaling by the non-receptor tyrosine kinase ZAP70. Embo J 16: 5618-28参照)。
【１０８２】
ＦＫＢＰからのラパマイシン類似体、例えば、ＡＰ２１９６７結合配列またはＦＲＢからのラパマイシン類似体、例えば、ＡＰ２１９６７結合配列を含むスイッチドメインとして使用するための候補配列は、候補を、ここに記載するような系に導入することにより評価できる。
【１０８３】
ＦＫＰＢ／ＦＲＢベースのスイッチのための二量体化分子
ラパマイシンおよびラパマイシン類似体(ラパログと呼ぶこともある)を、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースの二量体化スイッチにおける二量体化分子として使用できる。ある態様において、二量体化分子は、ラパマイシン(シロリムス)、ＲＡＤ００１(エベロリムス)、ゾタロリムス、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３(リダフォロリムス)、バイオリムスおよびＡＰ２１９６７から選択される。
【１０８４】
ラパマイシンは、式Ａに示す構造を有する、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスにより産生される既知マクロライド抗生物質である。
【化８】
0006793902.tif 000031
【１０８５】
例えば、McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44:688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113:7433；米国特許３,９２９,９９２号参照。ラパマイシンについて多様な番号付けスキームが提唱されている。混乱を避けるために、特定のラパマイシン類似体をここで名づけるとき、式Ａの番号付けスキームを使用したラパマイシンを参照して名づける。
【１０８６】
多くのラパマイシン類似体を、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰベースの二量体化スイッチにおけるヘテロ二量体化分子として使用できる。例えば、ラパマイシンのシクロヘキシル環上のヒドロキシル基がＯＲ１(ここで、Ｒ１はヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたはアミノアルキルである)で置換されているＯ−置換類似体であり、例えばその内容を引用して本明細書に包含させるＵＳ５,６６５,７７２号およびＷＯ９４／０９０１０号に記載された、エベロリムスとしても知られるＲＡＤ００１である。他の適当なラパマイシン類似体は、２６位または２８位が置換されているものを含む。ラパマイシン類似体は、上記類似体のエピマーであってよく、特に、例えば、その内容を引用して本明細書に包含させるＵＳ６,０１５,８１５、ＷＯ９５／１４０２３およびＷＯ９９／１５５３０に記載のとおり、４０位、２８位または２６位が置換され、所望によりさらに水素化されていてよい類似体のエピマー、例えばゾタロリムスとして知られるABT578またはその内容を引用して本明細書に包含させるＵＳ７,０９１,２１３号、ＷＯ９８／０２４４１号およびＷＯ０１／１４３８７号に記載のラパマイシン類似体、例えばリダフォロリムスとしても知られるAP23573を含む。
【１０８７】
ＵＳ５,６６５,７７２号からの本発明における使用に適するラパマイシン類似体の例は、４０−Ｏ−ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(４’−ヒドロキシメチル)ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[４’−(１,２−ジヒドロキシエチル)]ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−アリル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[３’−(２,２−ジメチル−１,３−ジオキソラン−４(Ｓ)−イル)−プロプ−２’−エン−１’−イル]−ラパマイシン、(２’Ｅ,４’Ｓ)−４０−Ｏ−(４’,５’−ジヒドロキシペント−２’−エン−１’−イル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エトキシカルボニルメチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(３−ヒドロキシ)プロピル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(６−ヒドロキシ)ヘキシル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(２−ヒドロキシ)エトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(３Ｓ)−２,２−ジメチルジオキソラン−３−イル]メチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(２Ｓ)−２,３−ジヒドロキシプロプ−１−イル]−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチノイルオキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−モルホリノ)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−Ｎ−イミダゾリルアセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−メチル−Ｎ’−ピペラジニル)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、３９−Ｏ−デスメチル−３９,４０−Ｏ,Ｏ−エチレン−ラパマイシン、(２６Ｒ)−２６−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチンアミドエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−(Ｎ−メチル−イミダゾ−２’−イルカルベトキサミド)エチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−エトキシカルボニルアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−トリルスルホンアミドエチル)−ラパマイシンおよび４０−Ｏ−[２−(４’,５’−ジカルボエトキシ−１’,２’,３’−トリアゾール−１’−イル)−エチル]−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【１０８８】
本発明において有用な他のラパマイシン類似体は、ラパマイシンのシクロヘキシル環におけるヒドロキシル基および／または２８位のヒドロキシ基がヒドロキシエステル基で置換されている類似体を含み、例えば、ＵＳＲＥ４４,７６８号に見られるラパマイシン類似体、例えばテムシロリムスが知られる。
【１０８９】
他のラパマイシン類似体は、１６位のメトキシ基が他の置換基、好ましくは(所望によりヒドロキシ−置換)アルキニルオキシ、ベンジル、オルトメトキシベンジルまたはクロロベンジルで置換されているおよび／または３９位のメトキシ基が、３９番炭素と共に欠失しており、ラパマイシンのシクロヘキシル環が３９位メトキシ基を欠くシクロペンチル環となるものを含み、例えば、引用によりその内容を本明細書に包含させるＷＯ９５／１６６９１号およびＷＯ９６／４１８０７号記載されている。ラパマイシンの４０位のヒドロキシがアルキル化されるおよび／または３２−カルボニルが還元されるように、類似体をさらに修飾できる。
【１０９０】
ＷＯ９５／１６６９１からのラパマイシン類似体は、１６−デメトキシ−１６−(ペント−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(ブト−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(プロパルギル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−オルト−メトキシベンジル−ラパマイシン、１６−デメトキシ−４０−Ｏ−(２−メトキシエチル)−１６−ペント−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ホルミル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ヒドロキシメチル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−カルボキシ−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(モルホリン−４−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−[Ｎ−メチル、Ｎ−(２−ピリジン−２−イル−エチル)]カルバモイル−４２−ノル−ラパマイシンおよび３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(ｐ−トルエンスルホニルヒドラゾノメチル)−４２−ノル−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【１０９１】
ＷＯ９６／４１８０７号からのラパマイシン類似体は、３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ−エチル)−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−メトキシ)エチル−ラパマイシンおよび３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【１０９２】
他の適当なラパマイシン類似体は、その内容を引用により本明細書に包含させるＵＳ２００５／０１０１６２４号に記載のバイオリムスである。
【１０９３】
エベロリムス(Afinitor(登録商標))としても知られるＲＡＤ００１は、化学名(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ,２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｅ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１２−{(１Ｒ)−２−[(１Ｓ,３Ｒ,４Ｒ)−４−(２−ヒドロキシエトキシ)−３−メトキシシクロヘキシル]−１−メチルエチル}−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３,２９,３５−ヘキサメチル−１１,３６−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−２,３,１０,１４,２０−ペンタオン(４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシンとしても知られる)を有し、次の化学構造を有する。
【化９】
0006793902.tif 000032
【１０９４】
ＧＹＲＢ−ＧＹＲＢベースの二量体化スイッチ
ストレプトマイセス属の産物であるクーママイシンは、細菌ＤＮＡギラーゼのＢサブユニット、ＧｙｒＢのアミノ末端２４Ｋサブドメインを結合する。クーママイシンは、２個のＧｙｒＢサブユニットを結合する(例えば、 Rarrar et al., (1996) Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin induced dimerization, Nature 383: 178; Gilbert et al. (1994) The 24 kDa N-terminal sub-domain of the DNA gyrase B protein binds coumarin drugs, Molecular Microbiology 12: 365参照)。それゆえに、クーママイシンは、ＧｙｒＢのクーママイシン結合配列を含むスイッチドメインを含むホモ二量体化スイッチにおける、二量体化分子として使用できる。
【１０９５】
ある態様において、スイッチドメインは、ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインからのクーママイシン結合配列を含む。
【１０９６】
ある態様において、スイッチドメインまたはそのスイッチドメインのクーママイシン結合配列は、Rarrar et al., (1996)のＧｙｒＢ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。ある態様において、スイッチドメインまたはそのクーママイシン結合配列は、Rarrar et al., (1996)の対応する配列と、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない。例えば、図３参照。
【１０９７】
ＧｙｒＢの２４KDaアミノ末端サブドメインからのクーママイシン結合配列を含むスイッチドメインとして使用するための候補配列は、Rarrar et al., (1996)に記載のもののような系に候補を取り込むことにより評価できる。
構造２：クーママイシン
【化１０】
0006793902.tif 000033
【１０９８】
ジベレリンベースの二量体化スイッチ
ジベレリンは、植物の増殖および発育を制御する植物ホルモンである。ジベレリンは、その受容体、ジベレリン不感受性矮性変異体１(ＧＩＤ１)と結合し、ＧＩＤ１における立体構造変化を誘発する。新規立体構造は、ＧＩＤ１を他のタンパク質、ジベレリン不感受性(ＧＡＩ)と結合させる。ジベレリンまたはジベレリン類似体、例えば、ＧＡ３−ＡＭ／ＧＡ３を使用して、ＧＩＤ１からのＧＡ３結合配列を含むスイッチドメイン(ＧＩＤＩスイッチドメイン)およびＧＡ３結合ＧＩＤ１と結合するのに十分なＧＡＩからの配列を含むスイッチドメインを二量体化できる。ＧＡ３−ＡＭは、標的細胞の原形質膜を通過できる。細胞に入ったら、ＧＡ３−ＡＭはエステラーゼにより開裂して、ＧＡ３を産生する。Miyamoto et al. (2010) Rapid and orthogonal logic gating with a gibberellins-induced dimerization system, Nat. Chem. Biol. 8:465参照。
【１０９９】
ある態様において、１個のスイッチドメイン(ＧＡＩスイッチドメイン)は、ジベレリン類似体、例えば、ＧＡ３と結合するのに十分なＧＡＩの配列を含み、類似体、例えば、ＧＡ３と結合したら、ＧＩＤ１と結合し、１個のスイッチドメイン(ＧＩＤ１スイッチドメイン)は、ジベレリン類似体、例えば、ＧＡ３と結合するＧＡＩスイッチドメインと結合するのに十分なＧＩＤ１の配列を含む。
【１１００】
ある態様において、ＧＡＩスイッチドメインまたはＧＡＩの配列は、ジベレリン類似体、例えば、ＧＡ３と結合するのに十分な十分な配列を含み、類似体、例えば、ＧＡ３と結合したら、ＧＩＤ１と結合し、Miyamoto et al. (2010)のＧＡＩ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する；または対応するMiyamoto et al. (2010)の配列と、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えては異ならない。例えば、図４参照。
【１１０１】
ある態様において、ＧＩＤ１スイッチドメインまたはＧＩＤ１の配列は、ＧＡＩスイッチドメインと結合するのに十分であり、Miyamoto et al. (2010)のＧＩＤ１配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する；またはMiyamoto et al. (2010)の対応物と、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えては異ならない。
【１１０２】
ＧＡＩまたはＧＩＤ１スイッチドメインとして使用するための候補配列は、Miyamoto et al. (2010)に記載のような系に候補を挿入することにより評価できる。
構造３：ＧＡ３−ＡＭおよびＧＡ３
【化１１】
0006793902.tif 000034
【１１０３】
タグ／結合剤スイッチ
ある態様において、二量体化スイッチ、例えば、ホモ二量体化スイッチ、例えば、細胞外ホモ二量体化スイッチは、タグ分子、例えば、ｃ−ｍｙｃペプチドタグ、ｆｌａｇペプチドタグ、ＨＡペプチドタグまたはＶ５ペプチドタグを含むスイッチドメインを含む。適当な二量体化スイッチは、スイッチドメインに対する親和性を有するポリペプチド、例えば、抗体分子および非抗体スキャフォールドを含む。例えば、図６参照。
【１１０４】
共有結合性二量体化スイッチ
共有結合性二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の共有結合性相互作用を促進する。ある態様において、二量体化スイッチは、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインを含む、これは、二量体化分子との接触により、互いに共有結合的に連結する。ある態様において、共有結合性二量体化スイッチはホモ二量体化スイッチであり、ここで、該二量体化分子は、同じ構造を有する第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインを共有結合的に連結する。共有結合性ホモ二量体化スイッチの態様において、連結分子は第一部分および第二部分を含み、その各々はスイッチドメインを結合でき、それによりスイッチドメインを共有結合的に連結する。第一部分および第二部分は同じ構造でも異なる構造でもよい。ある態様において、共有結合性二量体化スイッチはヘテロ二量体化スイッチであり、ここで、該二量体化分子は、互いに異なる構造を有する第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインを共有結合的に結合する。共有結合性ヘテロ二量体化スイッチの態様において、連結分子は、第一スイッチドメインと共有結合的に結合するが、第二スイッチドメインとはしない第一部分および第二スイッチドメインと共有結合的に結合するが、第一スイッチドメインとはしない第二部分を含む。ある態様において、二量体化分子は、その溶解度または細胞透過性を変えるさらなる部分を含む。例えば、細胞内共有結合性ヘテロ二量体化スイッチの場合、二量体化分子は、二量体化分子の細胞透過性を最適化する部分を含み得る。
【１１０５】
ハロタグ／ＳＮＡＰタグスイッチは、共有結合性ヘテロ二量体化スイッチの例である。ある態様において、二量体化分子は、ＳＮＡＰタグドメインと共有結合手的に反応する第一部分、例えば、Ｏ６−ベンジルグアニン部分、ハロタグドメインと反応する第二部分、例えば、クロロアルカン部分および二量体化分子を細胞透過性とする部分を含む。
【１１０６】
共有結合性二量体化スイッチは、Erhart et al., 2013 Chem Biol 20(4): 549-557に記載されている。ここに記載するＨａＸＳ種は、ハロタグ／ＳＮＡＰタグスイッチにおける二量体化分子として有用である。ある態様において、共有結合性二量体化分子は、オフ速度と関係する可能性のある動力学的限界および例えば、Ｔ細胞介在死滅のための必要なシグナルカスケードの活性化の必要条件としての細胞における非共有結合性二量体化分子の蓄積の必要性を最小化する。
【１１０７】
ある態様において、ハロタグＳＮＡＰタグ二量体化は、ハロタグ部分、例えば、配列番号１４またはその機能的誘導体またはフラグメントを含む第一スイッチドメインおよびＳＮＡＰタグ、例えば、配列番号１５またはその機能的誘導体またはフラグメントを含む第二スイッチドメインを含む。ある態様において、二量体化分子は、細胞浸透性コアとともに、ＳＮＡＰタグとハロタグを連結する官能基を有する。構造５は、この系で使用するのに適する二量体化分子を示す。例えば、図１３参照。
【１１０８】
ハロタグドメイン(配列番号１４)
【化１２】
0006793902.tif 000035
【１１０９】
ＳＮＡＰタグドメイン(配列番号１５)
【化１３】
0006793902.tif 000036
【１１１０】
構造５；ＨａＸＳ
【化１４】
0006793902.tif 000037
【１１１１】
ある態様において、１個のスイッチドメインは配列番号１４に開示するアミノ酸残基を含み、１個のスイッチドメインは配列番号１５に開示するアミノ酸残基を含む。
【１１１２】
ある態様において、第一スイッチドメインは、配列番号１４の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。ある態様において、第一スイッチドメインは、対応する配列番号１４の配列と、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない。
【１１１３】
ある態様において、第二スイッチドメインは、配列番号１５の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。ある態様において、第二スイッチドメインは、対応する配列番号１５の配列と、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない。
【１１１４】
スイッチドメインとして使用するための候補配列は、ここに記載するような系に候補を導入することにより評価できる。
【１１１５】
複数スイッチドメイン
ある態様において、ここに記載する二量体化スイッチは複数スイッチドメインを含み、ここでは、マルチスイッチと呼ぶことがある。マルチスイッチは、複数の、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のスイッチドメインを、第一メンバー、例えば、抗原結合メンバーおよび第二メンバー、例えば、細胞内シグナル伝達メンバーとは無関係に含む。所望により、例えば、ここに記載の、リンカー、スペーサーまたはヒンジ領域を、メンバー、例えば、抗原結合メンバーまたは細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインに配置する。
【１１１６】
ある態様において、第一メンバーは複数の第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインを含み、第二メンバーは複数の第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢベースのスイッチドメインを含み得る。例えば、抗原結合メンバーは複数の第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインを含み、細胞内シグナル伝達メンバーは複数の第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢベースのスイッチドメインを含む。例えば、図５５Ａ参照。
【１１１７】
ある態様において、第一メンバーは、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含み、第二メンバーは第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含む。例えば、抗原結合メンバーは、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含み、細胞内シグナル伝達メンバーは、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含む。例えば、図５５Ｂ参照。
【１１１８】
ある態様において、二量体化スイッチ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチは、第一メンバーおよび第二メンバー上のスイッチドメインの非対称的な分布を含み、ここで、第一メンバー上のスイッチドメインの数は、第二メンバー上のスイッチドメインの数と等しくない。ある態様において、一方のメンバーは少なくともＸスイッチドメインを含み、ここで、Ｘは多数性、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個であり、他のメンバーは少ないスイッチドメイン、例えば、最初に記載したメンバーより１個、２個、３個、４個または５個少ないスイッチドメインを含む。ある態様において、メンバーは、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースの二量体化スイッチについて２個のスイッチドメインを含み、他のメンバーは、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチについて２個より少ないスイッチドメインを含む。例えば、図５５Ａ参照。
【１１１９】
ある態様において、二量体化スイッチ、例えば、ＦＫＢＰ−ＦＲＢベースの二量体化スイッチは、スイッチドメインの対称的な分布を含み、ここで、一方のメンバー上のスイッチドメインの数は、他方のメンバー上のスイッチドメインの数と等しい。例えば、図５５Ａおよび５５Ｂ参照。
【１１２０】
ある態様において、第一メンバーおよび第二メンバーは、複数のホモ二量体化スイッチドメイン、例えば、ジベレリンベースのスイッチドメインを含む。例えば、抗原結合メンバーは、複数のホモ二量体化スイッチドメイン、例えば、ＧｙｒＢベースのスイッチドメインを含むおよび細胞内シグナル伝達メンバーは、複数のホモ二量体化スイッチドメイン、例えば、ＧｙｒＢベースのスイッチドメインを含む。
【１１２１】
二次二量体化スイッチ
ある態様において、ＲＣＡＲは、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインを含む一次二量体化スイッチを含む。一次二量体化スイッチの二量体化分子は、第一スイッチドメインと第二スイッチドメインの結合を促進する。この二量体化スイッチは、一次二量体化スイッチと呼び得る。ある態様において、二次二量体化スイッチもまた存在する。二次二量体化スイッチにおいて、一次二量体化分子は二次スイッチドメインとして役立つ。二次二量体化分子は、２個以上の二次スイッチドメインの結合を促進する(その各々は一次二量体化分子を含む)。二量体化またはクラスター形成は二次スイッチにより誘発され、さらに細胞内ドメインのクラスター形成のレベルを増加させる  −−  このような態様において、ｍ二次二量体化分子は、一次スイッチしか使用しないときに見られるより多いクラスター形成を生じる。一次二量体化分子は、一次スイッチドメイン、例えば、ホモ二量体化スイッチドメイン(およびそれに結合する細胞内シグナル伝達ドメイン)の結合(またはクラスター形成)を促進する。このような一次スイッチドメインは、ｃ−ｍｙｃペプチドタグ、ｆｌａｇペプチドタグ、ＨＡペプチドタグまたはＶ５ペプチドタグのようなタグ分子を含み得る。このような態様において、一次二量体化分子は、スイッチドメインに配向する抗体または他の結合剤を含み得る。二次で、二次二量体化分子は、一次二量体化分子の結合またはクラスター形成を促進する。換言すると、二次スイッチは、一次二量体化分子および二次スイッチドメインの結合を生じる、一次二量体化分子に対する二量体化分子、例えば、抗体を含む、スイッチドメインを含む。第一および二次は、第一および二次二量体化分子への何らかの配列の付加を含意しない。ある態様において、二次二量体化分子の投与または一次二量体化分子との接触前に、一次二量体化分子を最初に投与するかまたはそのスイッチドメインと最初に接触させる。ある態様において、一次二量体化分子の投与またはそのスイッチドメインとの接触前に、二次二量体化分子を最初に投与するかまたはそのスイッチドメインと最初に接触させる。
例えば、図１４参照。
【１１２２】
三次およびより高次のスイッチドメインも使用できる。
【１１２３】
二量体化分子
理論に縛られることを望まないが、ここでバイドメイン結合二量体化分子と呼ぶある態様において、二量体化分子は、第一スイッチドメインと結合するまたは相互作用する第一ドメイン結合部分および第二スイッチドメインと結合するまたは相互作用する第二ドメイン結合部分を含むと考えられる。理論に縛られることを望まないが、ここで高次構造依存性二量体化分子と呼ぶある態様において、二量体化分子はスイッチドメインの一つと結合または相互作用し、他のスイッチドメインと結合するようにそのスイッチドメインの高次構造を変える。また、理論に縛られることを望まないが、ある二量体化分子は、これらのまたは他の、機構の組み合わせにより作動すると考えられる。
【１１２４】
スイッチドメイン間の結合は二量体化分子により促進される。二量体化分子の存在下、スイッチドメイン間の相互作用または結合は、第一スイッチドメインに結合、例えば、融合したポリペプチドと第二スイッチドメインに結合、例えば、融合したポリペプチドの間のシグナル伝達を促進する。非限定的レベルの二量体化分子存在下、シグナル伝達は、例えば、ここに記載する系で測定して、１.１倍、１.２倍、１.３倍、１.４倍、１.５倍、１.６倍、１.７倍、１.８倍、１.９倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍増加する。
【１１２５】
ある態様において、二量体化分子は、小分子、例えば、ＡＰ２１９６７である。
【１１２６】
ある態様において、二量体化分子は、小分子、例えば、ポリペプチド以外である。
【１１２７】
ある態様において、二量体化分子は、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインの一方または両方に特異的親和性を有する、ポリペプチド、例えば、ポリペプチド、例えば、抗体分子または非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチンまたはアドネクチンである。ある態様において、二量体化分子は、リンカー、例えば、ＧＳリンカーにより互いに連結された少なくとも１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上のタンパク質ドメインを含む多量体ポリペプチド、例えば、ポリペプチドである。ある態様において、二量体化分子は、抗体またはそのフラグメントである。ある態様において、ヘテロ二量体化分子は抗体、例えば、単特異性抗体またはそのフラグメントまたは二重特異性抗体またはそのフラグメントである。
【１１２８】
ある態様において、二量体化スイッチは、ヘテロ二量体化スイッチであり、すなわち、互いに異なる第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインを有し、二量体化分子はヘテロ二量体化分子である。ある態様において、ヘテロ二量体化分子は、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインの一方または両方に結合する小分子である。ある態様において、ヘテロ二量体化分子は、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインの一方または両方に特異的親和性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントである。ある態様において、ヘテロ二量体化分子は、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインに特異的親和性を有する量体ポリペプチドまたはそのフラグメントである。ある態様において、ヘテロ二量体化分子は、複数スイッチドメインに特異的親和性を有する多量体ポリペプチドまたはそのフラグメントである、例えば、図１５参照。ある態様において、ヘテロ二量体化分子は、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインの一方または両方に特異的親和性を有する抗体またはそのフラグメントである。
【１１２９】
ある態様において、二量体化スイッチは、ホモ二量体化スイッチであり、すなわち、互いに同じである第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインを有し、二量体化分子はホモ二量体化分子である。ある態様において、ホモ二量体化分子は、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインの一方または両方に結合する小分子である。ある態様において、ホモ二量体化分子は、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインの一方または両方に特異的親和性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントである。ある態様において、ホモ二量体化分子は、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインに特異的親和性を有する量体ポリペプチドまたはそのフラグメントである。ある態様において、ホモ二量体化分子は、複数スイッチドメインに特異的親和性を有する多量体ポリペプチドまたはそのフラグメントである、５.１７参照。ある態様において、ホモ二量体化分子は、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインの一方または両方に特異的親和性を有する抗体またはそのフラグメントである。二量体化分子は、スイッチドメイン間の相互作用の形態によって、非共有結合でも、共有結合でもよい。
【１１３０】
ある態様において、二量体化分子は、原形質膜をほとんど透過しない。ある態様において、二量体化分子は細胞への侵入を阻止する部分、例えば、荷電部分を含む。例えば、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体を、細胞への侵入を阻止するように修飾できる。このような二量体化分子を、細胞外スイッチを有するＲＣＡＲと使用できる。それらがあまり細胞に侵入できないことは、二量体化を誘発する能力を損なわないが(スイッチが細胞外であるため)、毒性を減らし得る。細胞に容易に透過しないＧＡ３を、外部ＧＩＤ１−ＧＡＩベースのスイッチとともに使用できる。ある態様において、修飾されている二量体化分子は、細胞内に非修飾二量体化分子の５０％、４０％、２０％または１０％程度しか蓄積されない。
【１１３１】
多価二量体化分子
一般に、二量体化分子は、少なくとも２個のスイッチ分子の結合を促進する。ある態様において、スイッチドメインのこの結合は、スイッチドメインと連結した細胞内ドメインの結合を促進する。ある態様において、二量体化分子は２を超える結合価を有し、例えば、それは多価であり、２個を超えるスイッチドメインと結合し、それゆえにクラスター化または二量体化する。例えば、二量体化分子は、多数の、例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の結合ドメインを含み、その各々はスイッチドメインと結合できる。ある態様において、スイッチドメインは、二量体化分子に親和性を有する抗体分子、非抗体スキャフォールド、リガンドまたは他のポリペプチドである。代表的多価二量体化分子は、２個を超えるドメイン、例えば、各々ｃ−ｍｙｃペプチドタグ、ｆｌａｇペプチドタグ、ＨＡペプチドタグまたはＶ５ペプチドタグドメインを含む２個を超えるドメインを含む、分子を含む。多価二量体化分子は一次二量体化分子でも二次二量体化分子でもよい。例えば、図１４参照。
【１１３２】
細胞内シグナル伝達ドメイン
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、二量体化スイッチが融合または結合している細胞外ドメイン、例えば、抗原結合ドメインがカウンターリガンドに結合したとき、細胞内シグナルを産生する。細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。ある態様において、ＲＣＡＲ分子は、ＲＣＡＲ分子が、概して免疫細胞と関係しているポリペプチド由来のドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、阻害ドメインなどを含むように、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞での発現のために構築され得る。例えば、Ｔ細胞内で発現するためのＲＣＡＲは４１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインを含み得る。この場合、４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータドメインの両者は、Ｔ細胞と関係するポリペプチド由来である。他の態様において、ＲＣＡＲ分子は、ＲＣＡＲ分子が、概して免疫細胞と関係しないポリペプチ由来であるドメインを含むように、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞での発現のために構築され得る。例えば、Ｔ細胞内で発現するためのＲＣＡＲは、ＮＫ細胞由来のＫＩＲドメインを含み得る。あるいは、ＮＫ細胞内で発現するためのＲＣＡＲは、Ｔ細胞由来の４１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインを含み得る(例えば、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１３／０３３６２６号参照)。
【１１３３】
一次細胞内シグナル伝達ドメイン
ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、二量体化スイッチが融合または結合している細胞外ドメイン、例えば、抗原結合ドメインが同族抗原と結合したとき、細胞内シグナルを生じる。これは一次刺激性分子由来であり、例えば、一次刺激性分子の細胞内配列を含む。これは、例えば、二量体化スイッチが融合または結合している抗原結合ドメインが同族抗原に結合したとき、細胞内シグナルの産生に十分な一次刺激性分子配列を含む。
【１１３４】
一次刺激性分子は、同族リガンドと結合したとき、例えば、それが発現される細胞で、免疫エフェクター応答を媒介する分子である。概して、抗原を含む同族リガンドへの結合に依存的な細胞内シグナルを産生する。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、代表的一次刺激性分子を含み、複合体は、同族リガンド、例えば、ペプチドと共に負荷されたＭＨＣ分子への結合により、細胞内シグナルを産生する。概して、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３一次刺激性分子の場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインによる細胞内シグナルの産生は、一次刺激性分子のそのリガンド、例えば、抗原への結合に依存する。
【１１３５】
一次刺激は、ＴＧＦ−βの下方制御および／または細胞骨格構造の再構築などのような、ある分子の発現を変更できる。刺激は、例えば、共刺激存在下、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能の最適化、例えば、増加を生じ得る。刺激は、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞の状況において、Ｔ細胞応答、例えば、増殖、サイトカイン分泌、死滅、活性化、分化などを介在する。
【１１３６】
ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナル伝達モチーフ、例えば、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭを含む。一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲゼータ(ＣＤ３ゼータ)、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂからの細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭを含み得る。
【１１３７】
代表的一次細胞内シグナル伝達ドメインを表１に提供する。
【表２３】
0006793902.tif 000038
【１１３８】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、一次刺激性分子(例えば、ＣＤ３ゼータ  −  GenBank accno. BAG36664.1)の機能的フラグメントまたは類似体を含む。これは、二量体化スイッチが融合または結合している抗原結合ドメインが同族抗原に結合したとき、細胞内シグナルの産生に十分な細胞内領域全体または細胞内領域のフラグメントを含む。ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、天然に存在する一次刺激性分子、例えば、ヒトＣＤ３ゼータ(GenBank Acc No. AAY57330.1)または他の哺乳動物、例えば、非ヒト種、例えば、齧歯類、サル、類人猿またはマウス細胞内一次刺激性分子と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％配列同一性を有する。ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１３９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％配列同一性を有する。ある態様において、一次刺激性分子は、例えば、配列番号１３９に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の変異を含み得る。
【１１３９】
ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、天然に存在するヒト一次刺激性分子、例えば、ここに開示する天然に存在するヒト一次刺激性分子、例えば、配列番号１３９の対応する残基と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するか、または３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない。
【１１４０】
共刺激シグナル伝達ドメイン
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、細胞外ドメイン、例えば、二量体化スイッチが融合または結合している抗原結合ドメインが同族リガンドと結合したとき、細胞内シグナルを生じる。これは共刺激分子由来である。これは、例えば、二量体化スイッチが融合または結合している細胞外ドメイン、例えば、抗原結合ドメインが同族リガンドと結合したとき、細胞内シグナルを産生するのに十分な共刺激分子配列を含む。
【１１４１】
共刺激分子は、免疫エフェクター応答を促進する、抗原受容体またはそのカウンターリガンド以外の細胞表面分子である。ある場合、これらは効率的なまたは増強された免疫応答に必要である。概して、共刺激分子は、ある態様において、抗原、例えば、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞の抗原結合ドメインにより認識される抗原以外である、同族リガンドへの結合に依存する、細胞内シグナルを産生する。概して一次刺激性分子および共刺激分子からの、シグナル伝達は免疫エフェクター応答に貢献し、ある場合両者は、免疫エフェクター応答の効率的なまたは増強された産生に必要である。
【１１４２】
共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子(例えば、４−１ＢＢ)の機能的フラグメントまたは類似体を含む。これは、例えば、二量体化スイッチが融合または結合している抗原結合ドメインが同族抗原に結合したとき、細胞内シグナルの産生に十分な細胞内領域全体または細胞内領域のフラグメントを含み得る。ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、天然に存在する共刺激分子、例えば、ヒトまたは他の哺乳動物、例えば、非ヒト種、例えば、齧歯類、サル、類人猿またはマウス細胞内共刺激分子と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％配列同一性を有する。ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１３８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％配列同一性を有する。
【１１４３】
代表的共刺激シグナル伝達ドメイン(細胞内シグナル伝達ドメイン)を表２に提供する。
【表２４】
0006793902.tif 000039
【表２５】
0006793902.tif 000040
【表２６】
0006793902.tif 000041
【１１４４】
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、天然に存在するヒト一次刺激性分子、例えば、ここに開示する天然に存在するヒト共刺激分子の対応する残基と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するか、または３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない。
【１１４５】
補助的抗原結合メンバー
補助的抗原結合メンバーは、ＲＣＡＲに含まれ得る。ある態様において、その包含は、例えば、さらなる、例えば、第二標的細胞抗原への結合による特異性の増加により、ＲＣＡＲＸ細胞の安全性および有効性を増加できる。ある態様において、抗原結合メンバーおよび補助的抗原結合メンバー両者の結合は、いずれか単独で見られるよりも大きな特異性を生じ得る。ある態様において、ＲＣＡＲは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の補助的抗原結合メンバーを含み、その全て異なる抗原と結合する。
【１１４６】
ある態様において、補助的抗原結合ドメインは、抗原結合メンバーまたは細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化スイッチを形成できるスイッチドメインを含まない。ある態様において、補助的抗原結合ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、抗原結合ドメインは、メソテリン受容体に対し、補助的抗原結合ドメインは、葉酸受容体に対する。ある態様において、抗原結合ドメインは、葉酸受容体に対し、補助的抗原結合ドメインは、メソテリン受容体に対する。
【１１４７】
阻害分子：阻害
一つの態様において、対象に、ＣＡＲ発現細胞の活性または適応度を増強する薬剤を投与できる。例えば、一つの態様において、薬剤は、Ｔ細胞機能を調節または制御する、例えば、阻害する分子を阻害する薬剤であり得る。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御する分子は阻害分子である。阻害分子、例えば、ＰＤ１は、ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少できる。阻害分子の例を表３に提供する。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による、Ｔ細胞機能を調節または制御する、例えば阻害する阻害分子の阻害は、ＲＣＡＲＸ細胞性能を最適化できる。ある態様において、例えばのような、薬剤、例えば、阻害核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡまたは例えば、阻害タンパク質または系、例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用して、ＲＣＡＲＸ細胞における細胞機能を調節または制御する、例えば阻害する分子の発現を阻害できる。ある態様において、阻害剤はｓｈＲＮＡである。ある態様において、阻害分子は、ＲＣＡＲＸ細胞内で阻害される。これらの態様において、阻害分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を、ＲＣＡＲの成分、例えば、成分の全てをコードする核酸と連結する。
【１１４８】
例えば、ｓｈＲＮ標的として有用な代表的阻害分子を表３に提供する。
【表２７】
0006793902.tif 000042
【１１４９】
ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子を、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子が発現される、例えば、ＲＣＡＲ発現細胞内で発現されるように、プロモーター、例えば、Ｈ１−またはＵ６由来プロモーターに操作性に結合する。例えば、Tiscornia G., “Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA”, Chapter 3, in Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (eds. Friedmann and Rossi). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007; Brummelkamp TR, et al. (2002) Science 296: 550-553;  Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol. 19: 497-500参照。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＲＣＡＲの成分、例えば、成分の全てをコードする核酸分子を含む同じベクター、例えば、レンチウイルスベクターに存在する。このような態様において、、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に、ＲＣＡＲのある成分、例えば、全成分をコードする核酸に対して５’または３’に位置する。Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＲＣＡＲのある成分、例えば、全成分をコードする核酸と同じまたは異なる方向で転写され得る。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＲＣＡＲの成分、例えば、成分の全てをコードする核酸分子を含むベクター以外のベクターに存在する。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＲＣＡＲ発現細胞で一過性に発現される。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＲＣＡＲ発現細胞のゲノムに安定に統合される。図１６は、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を伴う、ＲＣＡＲの成分、例えば成分の全てを含むベクターの例を記載する。
【１１５０】
Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子がＰＤ−１である、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現の阻害に有用なｄｓＲＮＡ分子の例を実施例１０および表１８および１９に提供する。
【１１５１】
再指向スイッチ切り替え可能阻害受容体：阻害細胞外ドメイン
阻害受容体の細胞外ドメインは、免疫エフェクター応答を促進する細胞内シグナル伝達ドメインに例えば、二量体化スイッチにより結合させる。それゆえに、共阻害分子のカウンターリガンドとの結合は、免疫エフェクター応答の最適化に再指向される。
【１１５２】
一つの態様において、例えば、プログラム死１(ＰＤ１)のような阻害分子、例えば、ここに記載する阻害分子の、細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を、ここに記載の膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、４１ＢＢ  ＯＸ４０、Ｃｄ２８、ＣＤ２７および／または例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインのような、共刺激シグナル伝達ドメインを含む、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインと融合できる。一つの態様において、阻害分子ＲＣＡＲ、例えば、ＰＤ１  ＲＣＡＲを単独で使用できる。一つの態様において、阻害分子ＣＡＲ、例えば、阻害分子ＲＣＡＲ、例えば、ＰＤ１  ＲＣＡＲ、を他のＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ(例えば、ＣＤ１９ＲＣＡＲ)と組み合わせて使用できる。一つの態様において、ＰＤ１  ＲＣＡＲ(またはＰＤ１  ＣＡＲ)は、Ｔ細胞の残留性を改善する。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。一つの態様において、阻害分子ＲＣＡＲは、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、２Ｂ４およびＴＩＧＩＴまたはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの少なくとも細胞外ドメインの一部)のような、例えば、阻害分子の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達メンバー(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載する例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８を含む)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む)である第二ポリペプチドを含む。
【１１５３】
一つの態様において、ＰＤ１  ＲＣＡＲは、細胞ＲＣＡＲ発現細胞の残留性を改善する。一つの態様において、ＰＤ１  ＲＣＡＲは、配列番号３３５において下線で示すＰＤ１の細胞外ドメインを含む。一つの態様において、ＰＤ１  ＲＣＡＲは、配列番号３３５のアミノ酸配列を含む。
【化１５】
0006793902.tif 000043
【１１５４】
一つの態様において、ＰＤ１  ＲＣＡＲは、下に提供するアミノ酸配列を含む。
【化１６】
0006793902.tif 000044
【１１５５】
一つの態様において、ＰＤ１  ＲＣＡＲ、例えば、ここに記載するＰＤ１  ＲＣＡＲは、下に示す核酸配列によりコードされるかまたは少なくともＰＤ１の細胞外ドメインをコードする核酸配列を含む(下に下線で示す)。
【化１７】
0006793902.tif 000045
【１１５６】
代表的阻害細胞外ドメインを表４に提供する。
【表２８】
0006793902.tif 000046
【１１５７】
ある態様において、阻害細胞外ドメインは、天然に存在するヒト阻害分子、例えば、ここに開示する天然に存在するヒト一次刺激性分子の対応する残基と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するか、または３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない。
【１１５８】
共刺激分子リガンド結合ドメイン
共刺激ＥＣＤドメインと呼ぶ、共刺激分子の細胞外リガンド結合ドメインは、免疫エフェクター応答を促進する細胞内シグナル伝達ドメインに、例えば、ｙ二量体化スイッチにより結合される。それゆえに、共刺激分子のカウンターリガンドの結合は、免疫エフェクター応答の最適化を生じる。
【１１５９】
代表的共刺激ＥＣＤドメインを表５に提供する。
【表２９】
0006793902.tif 000047
【１１６０】
ある態様において、共刺激ＥＣＤドメインは、天然に存在するヒト阻害分子、例えば、ここに開示する天然に存在するヒト共刺激分子の対応する残基と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するか、または３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない。
【１１６１】
膜貫通ドメイン
ある態様において、ＲＣＡＲは、抗原結合ドメイン、阻害カウンターリガンド結合ドメインまたは共刺激ＥＣＤドメインを含み得る、細胞外配列、例えば、細胞外認識成分に融合した膜貫通ドメインを含む。ある態様において、ＲＣＡＲは、細胞内配列、例えば一次細胞内シグナル伝達ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインまたは二量体化スイッチと融合した膜貫通ドメインを含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、ＲＣＡＲにおけるドメインの１個と天然で結合しているものである。ある態様において、膜貫通ドメインは、ＲＣＡＲにおけるドメインの１個と天然で結合していないものである。
【１１６２】
ある態様において、膜貫通ドメインは、他の成分、例えば、他の膜貫通ドメインとの相互作用を最小化するものである。ある例において、膜貫通ドメインは、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのこのようなドメインの結合を最小化する。適当な例は、既知膜貫通ドメインのアミノ酸置換の選択または修飾によりもたらされ得る。ある態様において、膜貫通ドメインは、細胞表面上の他のＲＣＡＲとのホモ二量体化を促進できる。
【１１６３】
膜貫通ドメインは、天然に存在するまたは天然に存在しない合成配列を含み得る。天然に存在するとき、膜貫通ドメインはあらゆる膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。ある態様において、膜貫通領域は、ＲＣＡＲが標的に結合しているときは、二量体化スイッチを経て、細胞内ドメインにシグナル伝達できる。
【１１６４】
ここに記載する分子における使用に適する膜貫通領域は、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の任意の１個以上に由来し得る。ある態様において、膜貫通ドメイは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Tactile)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐの少なくとも膜貫通領域を含む。ある態様において、膜貫通ドメインはＣＤ８に由来する。ある態様において、膜貫通ドメインはＣＤ２８に由来する。一つの面において、膜貫通ドメインは、配列番号１３７として提供される配列由来の膜貫通ドメインである。
【１１６５】
ある態様において、配列、例えば、ヒンジまたはスペーサー配列を、膜貫通ドメインと、それが融合する他の配列またはドメインの間に配置できる。ある態様において、例えば、ヒトＩｇ(免疫グロブリン)ヒンジを含むが、これに限定されない、多様なヒトヒンジ(別名“スペーサー”)を同様に用いることができる。所望により、２〜１０アミノ酸長の短オリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＲＣＡＲの膜貫通ドメインと他のドメイン、例えば、スイッチまたは細胞内シグナル伝達ドメインの間の結合を形成し得る。グリシン−セリンダブレットは、特に適当なリンカーを提供する。一つの面において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号１３６として提供されるアミノ酸配列である。一つの面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
【１１６６】
ある態様において、膜貫通ドメインは天然に存在しない配列であってよく、この場合、優勢にロイシンおよびバリンのような疎水性残基を含み得る。ある態様において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが膜貫通ドメインの各末端に見られる。
【１１６７】
ドメイン配置
ある態様において、ＲＣＡＲは、多様な配置で配置できるドメインを含む。
【１１６８】
ある態様において、一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインの両者は、抗原結合ドメインからスイッチにより分離される。
【１１６９】
したがって、一つの態様において、ＲＣＡＲ配置は、第一キメラ構築物および第二キメラ構築物を含み、ここで、
(１)第一キメラ構築物、例えば、抗原結合メンバーは抗原結合ドメイン；膜貫通ドメイン；および第一細胞内スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢを含み(この態様において、第一キメラ構築物は細胞内シグナル伝達ドメインを含まない)；
(２)第二キメラ構築物、例えば、細胞内シグナル伝達ドメイン(これは、この態様において、膜貫通ドメインまたは膜アンカーを含まない)は、第二細胞内スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰ；およびシグナル伝達ドメイン、例えば、一次シグナル伝達ドメインまたは二次シグナル伝達ドメインを含む。
【１１７０】
ある態様において、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインの両者は第二キメラ構築物に存在する。ある態様において、第二キメラ構築物上の順番は、第二スイッチドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインである。ある態様において、第二キメラ構築物上の順番は、第二スイッチドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインおよび一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインである。ある態様において、第二キメラ構築物上の順番は、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、第二スイッチドメインおよび一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインである。ある態様において、第二キメラ構築物上の順番は、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン、第二スイッチドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインである。
【１１７１】
本態様は、第一キメラ構築物上のＦＲＢおよび第二キメラ構築物上のＦＫＢＰをいうが、配置を逆にできる。
【１１７２】
ある態様におけるドメインの順番は、Ｎ末端からＣ末端方向で示すが、特に細胞内キメラ構築物に関して、順番はＣ末端からＮ末端であり得る。
【１１７３】
ある態様において、一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインの両方ではなく、一方は、スイッチにより抗原結合ドメインから離される。
【１１７４】
したがって、他の態様において、ＲＣＡＲ配置は、
(１)抗原結合ドメイン；膜貫通ドメイン；第一細胞内スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢ；および細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインまたは共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインを含む第一キメラ構築物、例えば、抗原結合メンバー；および
(２)第二細胞内スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰ；および細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインまたは共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインを含む第二キメラ構築物、例えば、細胞内シグナル伝達メンバー(これはこの態様において、膜貫通ドメインまたは膜アンカーを含まない)
を含む。
【１１７５】
ある態様において、第一キメラ構築物上の順番は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、第一細胞内スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢおよび細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインまたは共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインである。
【１１７６】
ある態様において、第一キメラ構築物上の順番は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインまたは共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインおよび第一細胞内スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢである。
【１１７７】
ある態様において、第一キメラ構築物は、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインの両方ではなく、一方を含む。
【１１７８】
ある態様において、第二キメラ構築物上の順番は、第二細胞内スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰおよび一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインの両方ではなく一方である。
【１１７９】
ある態様において、第二キメラ構築物上の順番は、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインの両方ではなく一方および第二細胞内スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰ。
【１１８０】
ある態様において：
(１)第一キメラ構築物、例えば、抗原結合メンバーは、抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ；膜貫通ドメイン；共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン；および第一スイッチドメインを含み；
(２)第二キメラ構築物、例えば、細胞内シグナル伝達メンバーは、第二スイッチドメイン；および一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン(そして、ある態様において、膜貫通ドメインまたは膜アンカーを含まない)を含む。
【１１８１】
ある態様において：
(１)第一キメラ構築物、例えば、抗原結合メンバーは、抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ；膜貫通ドメイン；一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン；および第一スイッチドメインを含み；
(２)第二キメラ構築物、例えば、細胞内シグナル伝達メンバーは、第二スイッチドメイン；および共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン(そして、ある態様において、膜貫通ドメインまたは膜アンカーを含まない)を含む。
【１１８２】
一つの態様において、ＲＣＡＲ配置は、第一キメラ構築物および第二キメラ構築物を含み、ここで、
(１)第一キメラ構築物、例えば、抗原結合メンバーは、抗原結合ドメイン；膜貫通ドメイン；第一細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一細胞内スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢを含み；
(２)第二キメラ構築物、例えば、細胞内シグナル伝達メンバー(これはこの態様において、膜貫通ドメインまたは膜アンカーを含まない)は、第二細胞内スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰ；および細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次または共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【１１８３】
本態様は、第一キメラ構築物上のＦＲＢおよび第二キメラ構築物上のＦＫＢＰをいうが、配置を逆にできる。
【１１８４】
ある態様において、順番はＮ末端からＣ末端方向で示すが、特に細胞内キメラ構築物に関して、順番はＣ末端からＮ末端であり得る。
【１１８５】
共刺激シグナル伝達ドメインを有するＲＣＡＲメンバー、例えば、抗原結合ドメインまたは他の細胞外結合ドメイン
表面上にキメラ抗原受容体を発現するＴリンパ球の残留性および拡張は、膜結合受容体に融合する多様な細胞内ドメインの包含が介在する。例えば、標的細胞、例えば、癌細胞上の標的リガンドと結合する細胞外ドメインを有するＲＣＡＲの成分は、共刺激細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、表２から選択される共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。
【１１８６】
ある態様において、共刺激細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢの、第二スイッチドメイン上のＣＤ３ゼータからの第一スイッチドメイン上への配置は、インビボでＲＣＡＲ活性を正に調節し、一方、二量体化スイッチ分子非存在下のＣＡＲの活性を制限する。
【１１８７】
細胞上の標的リガンドと結合する細胞外ドメイン、例えば、抗原結合ドメインを有するＲＣＡＲメンバーは、例えば、表２から選択される、複数の、例えば、２個または３個の共刺激細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。ある態様において、ＲＣＡＲメンバーは、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択される複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。例として、メンバー、例えば、抗原結合メンバーは、細胞外から細胞内方向で、次のものを含む。
４１ＢＢ−ＣＤ２７；
ＣＤ２７−４１ＢＢ；
４１ＢＢ−ＣＤ２８；
ＣＤ２８−４１ＢＢ；
ＯＸ４０−ＣＤ２８；
ＣＤ２８−ＯＸ４０；
ＣＤ２８−４１ＢＢ；または
４１ＢＢ−ＣＤ２８。
【１１８８】
抗原結合メンバーは、例えば、表２から選択される、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択される、多数の、例えば、２個または３個の共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順番で配置できるが、代表的配置は次のものを含む(細胞外から細胞内の方向で)。
４１ＢＢ−ＣＤ２７；
ＣＤ２７−４１ＢＢ；
４１ＢＢ−ＣＤ２８；
ＣＤ２８−４１ＢＢ；
ＯＸ４０−ＣＤ２８；
ＣＤ２８−ＯＸ４０；
ＣＤ２８−４１ＢＢ；または
４１ＢＢ−ＣＤ２８。
【１１８９】
ある態様において、抗原結合メンバーは、次の共刺激シグナル伝達ドメインを含む：ＣＤ２８−４１ＢＢ。
【１１９０】
ある態様において、抗原結合メンバーは、次の共刺激シグナル伝達ドメインを含む：ＣＤ２８−ＯＸ４０。
【１１９１】
ある態様において、抗原結合メンバーは、
(ａ)[抗原結合ドメイン]−[膜貫通ドメイン]−[第一共刺激シグナル伝達ドメイン]−[第二共刺激シグナル伝達ドメイン]を含み、
ここで、該第一および第二共刺激シグナル伝達ドメイン：
(ｉ)は各々表２から独立して選択され；
(ii)は各々独立して４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択され；
(iii)共刺激シグナル伝達ドメインの次のペアの一個を含み(細胞外から細胞内方向で)：
４１ＢＢ−ＣＤ２７；
ＣＤ２７−４１ＢＢ；
４１ＢＢ−ＣＤ２８；
ＣＤ２８−４１ＢＢ；
ＯＸ４０−ＣＤ２８；
ＣＤ２８−ＯＸ４０；
ＣＤ２８−４１ＢＢ；または
４１ＢＢ−ＣＤ２８
(iv)共刺激シグナル伝達ドメインの次のペアを含み：ＣＤ２８−４１ＢＢ；または
(ｖ)共刺激シグナル伝達ドメインの次のペアを含み：ＣＤ２８−ＯＸ４０；および
(ｂ)[スイッチドメイン]、
ここで、該スイッチドメインは：
(ｉ)膜貫通ドメインと第一共刺激シグナル伝達ドメインの間；
(ii)第一共刺激シグナル伝達ドメインと第二共刺激シグナル伝達ドメインの間；または
(iii)第二共刺激シグナル伝達ドメインの後
に配置され、
そして、所望により、スイッチドメインはＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体を含み、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、１個以上のＦＫＢＰスイッチドメイン、ＦＲＢスイッチドメインおよび二量体化分子の間の複合体の形成を増強する変異または修飾ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチなる表題の章に記載する変異を含む。例えば、ＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢの類似体は、Ｅ２０３２変異、例えば、Ｅ２０３２Ｉ変異またはＥ２０３２Ｌ変異；Ｔ２０９８変異、例えば、Ｔ２０９８Ｌ変異；またはＥ２０３２およびＴ２０９８変異、例えば、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８ＬまたはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含み；
そして、所望により、抗原結合メンバーは一次細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。
【１１９２】
ある態様において、抗原結合メンバーは、例えば、表２から選択される、複数の、例えば、２個または３個の共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する共刺激シグナル伝達ドメインの組み合わせを含み、細胞内シグナル伝達メンバーは、ＣＤ３ゼータドメインを含む。
【１１９３】
下に提供するのは、次の構造を含む抗原結合メンバーを含む代表的ＲＣＡＲメンバーのアミノ酸配列である：[抗原結合ドメイン]−[膜貫通ドメイン]−[第一共刺激シグナル伝達ドメイン]−[第二共刺激シグナル伝達ドメイン]−[スイッチドメイン]。下記代表的ＲＣＡＲについて、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９  ｓｃＦｖ(配列は下線)、第一共刺激シグナル伝達ドメイン(配列は斜体)、第二共刺激シグナル伝達ドメイン(配列は斜体および太字)およびスイッチドメイン(配列は下線および太字)。
【１１９４】
【表３０】
0006793902.tif 000048
【表３１】
0006793902.tif 000049
【１１９５】
下に提供するのは、スイッチドメイン(配列は太字および下線)および一次シグナル伝達ドメイン(配列は斜体)を含む細胞内シグナル伝達メンバーのアミノ酸配列である。
【表３２】
0006793902.tif 000050
【１１９６】
ＩＣＡＲ
ここに開示するＲＣＡＲは、阻害ＣＡＲ(ｉＣＡＲ)メンバーを含み得る。ｉＣＡＲメンバーは、非標的細胞、例えば、非癌細胞上の抗原を認識する抗原結合ドメイン(または他の細胞外ドメイン)；膜貫通ドメイン；および、阻害分子からのドメイン、例えば、阻害分子、例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４または表１２に挙げたタンパク質からのからの細胞内ドメインを含む。ある態様において、ｉＣＡＲメンバーは、例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４または表１２に挙げたタンパク質からの、第二阻害細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【１１９７】
ｉＣＡＲメンバーの抗原結合ドメイン(または他の細胞外ドメイン)とその標的抗原(またはカウンター−リガンド)の結合により、ｉＣＡＲは、ｉＣＡＲを含む細胞の活性化の阻止、例えば、可逆的阻止または最小化に貢献する。つまり、ＲＣＡＲ、例えばＲＣＡＲＴ、細胞への、ｉＣＡＲメンバーの包含は、非標的細胞、例えば、バイスタンダー細胞への損傷を制限し得る。理論に縛られることを望まないが、ｉＣＡＲメンバーは、その抗原(またはカウンター−リガンド)との結合により、サイトカイン分泌、細胞毒性および増殖の１個以上を制限すると考えられる。ある態様において、効果は一過性であり、続く標的細胞との結合により、ＲＣＡＲ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞は、活性化され、標的細胞を攻撃する。
【１１９８】
ｉＣＡＲメンバーに対する標的抗原は、標的細胞への許容可能な高レベルの攻撃および非標的細胞への許容可能な低レベルの攻撃が達成されるように、標的細胞および非標的細胞上に発現プロファイルを有する抗原である。抗原の選択だけではなく、その抗原(またはカウンター−リガンド)へのｉＣＡＲ親和性、その抗原へのＣＡＲ親和性、ｉＣＡＲの発現レベルまたはＣＡＲの発現レベルも、標的上／標的外応答比の最適化に使用できる。
【１１９９】
ある態様において、抗原は腫瘍細胞に存在しないかまたは下方制御されている。ある態様において、抗原はＨＬＡ分子を含む。ある態様において、抗原は細胞表面腫瘍サプレッサー抗原を含む。ある態様において、抗原はＰＣＭＬ(またはリンパ腫、乳癌または前立腺癌で下方制御される他の抗原)、ＨＹＡＬ２、ＤＣＣまたはＳＭＡＲ１を含む。
【１２００】
ある態様において、抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質または細胞表面部分の翻訳後修飾、例えば、ムチン−タイプＯ−グリカン(コア３  Ｏ−グリカン)を含む。
【１２０１】
ある態様において、抗原は、上皮性から間葉性への移行を受けている腫瘍細胞により下方制御される部分を含む。
【１２０２】
ある態様において、抗原は、Ｅ−カドヘリンを含む。
【１２０３】
ある態様において、阻害分子からのドメイン、例えば、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ４からの細胞内シグナル伝達ドメインは、融合する細胞外ドメイン、例えば、抗原結合ドメインが同族抗原(またはカウンターリガンド)に結合したとき、細胞内シグナルを生じる。阻害細胞内シグナル伝達ドメインは阻害分子由来であり、例えば、それは阻害分子の細胞内配列を含む。それは、例えば、融合する抗原結合ドメインが同族抗原に結合したとき、細胞内シグナルの産生に十分な阻害分子配列を含む。
【１２０４】
ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナル伝達モチーフ、例えば、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＩＭを含む。
【１２０５】
阻害分子からのドメインは、阻害分子細胞内ドメインの機能的フラグメントまたは類似体を含む。それは、融合する抗原結合ドメインが同族抗原に結合したとき、細胞内シグナルの産生に十分な細胞内領域全体または細胞内領域のフラグメントを含む。ある態様において、阻害細胞内シグナル伝達ドメインは、天然に存在する阻害分子、例えば、表１２からの分子の対応する残基と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％配列同一性を有するかまたは３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない。
【１２０６】
細胞内シグナル伝達ドメインを提供できる代表的阻害分子を、表１２に提供する。
【表３３】
0006793902.tif 000051
【１２０７】
それゆえに、一つの面において、ここに開示されるのは、ｉＣＡＲメンバーを含むＲＣＡＲである。ｉＣＡＲメンバーは、
非標的細胞、例えば、非癌細胞上の抗原を認識する抗原結合ドメイン(または他の細胞外ドメイン)；
膜貫通ドメイン；および
阻害分子、例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４または表４に挙げるタンパク質からのドメイン
を含む。
【１２０８】
ある態様において、ｉＣＡＲメンバーは、例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４または表１２に挙げたタンパク質からの第二阻害細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【１２０９】
他の面において、本発明は、ｉＣＡＲメンバーを含むＲＣＡＲをコードする核酸、例えば、単離核酸に関する。
【１２１０】
ある態様において、ｉＣＡＲメンバーおよびＲＣＡＲの第二メンバーをコードする配列は、単一核酸分子に存在する。
【１２１１】
ある態様において、ｉＣＡＲメンバーをコードする配列は第一制御領域に操作性に連結し、ＲＣＡＲの第二メンバーをコードする配列は第二制御領域に操作性に連結する。
【１２１２】
ある態様において、ｉＣＡＲメンバーをコードする配列は第一ＲＮＡとして翻訳され、ＲＣＡＲの第二メンバーをコードする配列は第二ＲＮＡとして翻訳される。
【１２１３】
他の面において、本発は、ｉＣＡＲメンバーを含むＲＣＡＲをコードする核酸を含む、ベクター系、例えば、１個以上のベクターを含むベクター系に関する。
【１２１４】
ある態様において、ＲＣＡＲの成分の全ては単一ベクター上にコードされる。
【１２１５】
ある態様において、ｉＣＡＲメンバーは第一ベクター上にコードされ、ＲＣＡＲの他のメンバーは、ベクター系の第二ベクターにコードされる。
【１２１６】
ある態様において、ベクター系は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを含む。
【１２１７】
ある態様において、ベクター系は、バイシストロニックまたはトリシストロニックレンチウイルスベクターを含む。
【１２１８】
ある態様において、ベクター系は、バイシストロニックまたはトリシストロニックプロモーターを含む。
【１２１９】
他の面において、本発明は、ここに記載するベクター系を含む、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に関する。
【１２２０】
他の面において、本発明は、ｉＣＡＲメンバーを含むＲＣＡＲを含む、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に関する。
【１２２１】
ｉＣＡＲメンバー含有細胞をここに記載する方法において使用できる。それゆえに、他の面において、本発明は、哺乳動物を処置する方法、例えば、哺乳動物に抗腫瘍免疫を提供する方法であって、ｉＣＡＲメンバーを含むＲＣＡＲＸ細胞の有効量を哺乳動物に投与することを含む、方法に関する。
【１２２２】
ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞は、自己Ｔ細胞である。
【１２２３】
ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞は、同種Ｔ細胞である。
【１２２４】
ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞は、自己ＮＫ細胞である。
【１２２５】
ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞は、同種ＮＫ細胞である。
【１２２６】
ある態様において、哺乳動物は、ヒトである。
【１２２７】
他の面において、本発明は、ｉＣＡＲを含むＲＣＡＲＸ細胞で処置されているヒトを、該処置の副作用について評価する方法を含む。
【１２２８】
普遍的ＲＣＡＲＳ
ある態様は、抗原結合メンバーがＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞の表面に係留されていない、ＲＣＡＲに関する。概して、このようなＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞は、外部または細胞外第一スイッチドメインを有する細胞内シグナル伝達ドメインが増加する。細胞を、抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む(および膜貫通ドメインまたは膜係留ドメインを含まない)抗原結合メンバーで構築できる。これにより、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞内シグナル伝達メンバーを有する細胞が、抗原結合メンバーをコードする配列で細胞を形質転換することなく、１個以上の抗原結合ドメインと好都合に対形成することが可能となる。ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、細胞内シグナル伝達メンバーを含むが、抗原結合メンバーを含まないＲＣＡＲＴ細胞のアリコートを提供できる。必要に応じて、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、選択した抗原結合特性を有する、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を、抗原結合メンバーの付加により提供できる。このようなＲＣＡＲを、ここでは、普遍的ＲＣＡＲと呼ぶことがある。例えば、図５３参照。例えば、細胞内結合ドメインを含むＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を、例えば、エクスビボで、普遍的ＲＣＡＲの抗原結合メンバーおよび所望により二量体化分子で構築できる。抗原結合メンバーを、例えば、異なる抗原と結合する、異なる抗原結合ドメインを含む、一連の抗原結合メンバーから選択できる。ある態様において、対象または対象腫瘍の遺伝子型または表現型、例えば、腫瘍攻撃性、腫瘍タイプ、疾患ステージ、先の処置などに基づき、抗原結合ドメインを選択する。ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を対象から得て、普遍的ＲＣＡＲＴ細胞をそこから製造できる。ＲＣＡＲＸ細胞の第一アリコートを第一抗原結合ドメインと組み合わせ得る。第二アリコートを第二抗原結合ドメインと組み合わせ得る。例えば、第一抗原結合ドメインを有する普遍的ＲＣＡＲＸを初回の処置で使用でき、第二抗原結合ドメインを有する普遍的ＲＣＡＲＸを２回目の処置として使用でき、例えば、初回の処置の開始後に投与する。ある態様において、１個を超える抗原結合ドメイン、例えば、２、３または４、抗原結合ドメインをＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞と連結し、１個を超える抗原特異性を有するＲＣＡＲを有する細胞を得る。
【１２２９】
ある態様において、ＲＣＡＲＸはナチュラルキラー細胞である。これらの細胞は対象から単離できる。ある態様において、細胞は、ナチュラルキラー細胞の安定な細胞株、例えば、Conkwestから入手可能な安定な同種ＮＫ−９２細胞株である。これらの安定なＮＫ−９２細胞株は、Gong et al  (April 1994), Leukemia Macmillan Press, Ltd, 8: 652-658に記載され、本明細書に引用により包含させるＥＰ１００７６３０に開示された方法を使用して、得て、遺伝子導入し、培養したＮＫ−９２細胞に由来した。ＮＫ−９２細胞またはＮＫ−９２細胞株に類似する特性を有するＮＫ細胞株からの細胞も使用できる。
【１２３０】
ＲＣＡＲスクリーニング
モジュラースクリーニング
ここに記載する方法および組成物は、ＣＡＲ成分、例えば、ＲＣＡＲ成分の便利なスクリーニングおよび試験を可能とする。例として、各々１個以上の成分が異なる複数のＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲの一団を有効性について評価できる。これは、予め選択したパラメータ、例えば、癌タイプ、癌ステージ、患者治療歴またはドナーについて最適化した、ＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲの選択を可能とする。
【１２３１】
例えば、ある態様において、一団の複数のＲＣＡＲの各々は、細胞内シグナル伝達メンバー上に配置された異なる共刺激シグナル伝達ドメインを含む。この例において、複数のＲＣＡＲは他の点では同一である。それゆえに、唯一の多様性は共刺激シグナル伝達ドメインで見られる。一団からのＲＣＡＲの評価は、異なる共刺激シグナル伝達ドメインを有するＲＣＡＲの特性の比較を可能とする。他の態様において、多様性を、他の成分、例えば、一次刺激ドメイン、膜貫通ドメイン、リンカー、スイッチドメインまたは抗原結合ドメインに導入できる。これは同時の評価および選択を可能とする。
【１２３２】
それゆえに、スクリーニングおよび評価の“モジュラー”法は、ドメイン、例えば、一次シグナル伝達ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、膜貫通領域、スイッチドメインまたは細胞外ドメイン、例えば、抗原結合ドメイン、共刺激細胞外ドメインまたは阻害細胞外ドメインの異なる変異体を有するＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲの比較を可能とする。ある態様において、例えば、表２から選択した、共刺激シグナル伝達ドメインを比較できる。ある態様において、例えば、表３から選択した、一次シグナル伝達ドメインを比較できる。
【１２３３】
このような評価は、ＲＣＡＲメンバーの成分の異なる設置または配置、例えば、異なる順番の比較を可能とする。
【１２３４】
ここに記載するとおり、ＲＣＡＲの一団を使用して、細胞内シグナル伝達ドメインが異なるメンバー上に存在する、細胞内シグナル伝達ドメインの異なる組み合わせを評価できる、例えば、図４４Ａおよび４４Ｂ参照。下記のとおり、ＲＣＡＲにおける一箇所以上の位置への多様性の便利な挿入を可能とするベクターがここで提供される。
【１２３５】
ある態様において、ＣＡＲ、例えば、ＲＣＡは、各々異なる抗原結合ドメインを有する第一メンバーおよび第二メンバーを含む。多様性を一方または両方に導入できる。ある態様において、多様性は親和性の差である。ある態様において、同族抗原に対する親和性の観点での多様性を一方の抗原結合ドメインに導入する。ある態様において、同族抗原に対する親和性の観点での多様性を両方の抗原結合ドメインに導入する。これらの方法は、パラメータ、例えば、標的細胞に対する特異性または標的外結合または死滅の最小化を最適化する親和性の組み合わせの選択を可能とする。
【１２３６】
図１１は、左から、阻害細胞外ドメイン(ＥＣＤ)または共刺激細胞外ドメインを含むメンバー、細胞内シグナル伝達メンバー、抗原結合メンバーおよび細胞内シグナル伝達メンバーの他の分子の３メンバーを含む、ＲＣＡＲを記載する。抗原結合メンバーは標的細胞と結合し、二量体化分子存在下、細胞内シグナル伝達メンバーと結合し、ＲＣＡＲ細胞の活性化に貢献する。阻害細胞外ドメインメンバーは、標的細胞上の阻害リガンドと結合し、二量体化分子存在下、また細胞内シグナル伝達メンバーと結合し、ＲＣＡＲ細胞の活性化に貢献する。この系を使用して、多様な源、例えば、表４からの共阻害細胞外ドメインまたは多様な源、例えば、表５からの共刺激受容体ドメインをスクリーニングできる。ある態様は、共阻害細胞外ドメインまたは共阻害細胞外ドメインと抗原結合ドメインの組み合わせの最適化または選択を可能とする。共阻害細胞外ドメインまたは共阻害細胞外ドメインと抗原結合ドメインの組み合わせを、予め選択したパラメータ、例えば、癌タイプ、癌ステージ、患者治療歴またはドナーについて選択または最適化できる。
【１２３７】
また、多様なＲＣＡＲの一団の効率的スクリーニングを可能とするベクターも提供される。例として、ベクターは、ＲＣＡＲメンバーの成分および候補配列の挿入を可能とする部位をコードする配列位を含み得る。例えば、ベクターは、抗原結合メンバー、例えば、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよびスイッチドメインの１個以上の成分および成分をコードする配列の挿入のための部位をコードする配列を含み得る。例として、ベクターは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび他の成分、例えば、共刺激シグナル伝達ドメインの挿入のための部位をコードする配列を含み得る。異なる共刺激シグナル伝達ドメインを含む複数の配列を評価できる。ベクターは、さらに細胞内シグナル伝達メンバーをコードし得る。ある態様において、第二ベクターは細胞内シグナル伝達メンバーを提供する。各々変異体抗原結合ドメインメンバーの一つを有し、各々同じ細胞内シグナル伝達メンバーを有する細胞の集団を評価して、最適化抗原結合メンバーを同定する。
【１２３８】
他の態様において、ベクターまたはベクターは、１個を超える成分、例えば、抗原結合メンバーの全てまたは一部をコードする配列における挿入部位および細胞内シグナル伝達メンバーの全てまたは一部をコードする配列の各々における挿入部位および挿入部位のために提供される。
【１２３９】
評価は、例えば、ここに記載するアッセイまたはインビボモデルで実施例できる。
【１２４０】
他の面において、ここに開示されるのは、ＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲの多様な一団である。
【１２４１】
ここで使用する用語としてのＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲの多様な一団は、複数のＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲを含む。多数のＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲの各々は、ＣＡＲの成分が態様である(ここで使用する用語としてのＣＡＲまたはＲＣＡＲの成分は、機能的または構造ドメイン、例えば、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、スペーサー、リンカー、共刺激シグナル伝達ドメインまたは一次刺激ドメインである)。例えば、複数のＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲの各々は、多様な成分(すなわち、複数の中の他のＣＡＲの対応する成分とＣＡＲまたはＲＣＡＲにおける、例えば、構造または位置が異なる成分)を含むメンバーを有する。例として、多様な成分は、細胞外結合ドメイン、例えば、抗原結合ドメイン、共阻害細胞外ドメインまたは共刺激細胞外ドメインであり得る。ある態様において、ＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲの多様な一団は、複数の成分、例えば、２成分に多様性を含む。ある態様において、多様性は、多様な成分における構造、例えば、アミノ酸配列の差異を含む。ある態様において、多様性は、ＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲのメンバー上の成分の設置における差異を含む。
【１２４２】
他の面において、ここに開示されるのは、集合的に、ＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲの多様な一団をコードする複数の核酸配列である。
【１２４３】
他の面において、ここに提供されるのは、複数の細胞、例えば、Ｔ細胞を含む一団またはその製造であり、ここで、複数における各細胞または細胞の製造は、ＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲの多様な一団からの、異なるＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲを含む。
【１２４４】
他の面において、ここに記載するのは、ＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲを評価、選択または最適化する方法であって、
ＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲの多様な一団を提供し；
例えば、活性化における有効性、残留性、ターゲティング特異性または細胞死滅における有効性について多用なパネルの各ＣＡＲを評価し、
それによりＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲを評価、選択または最適化する
ことを含む、方法である。
【１２４５】
ある態様において、方法は、予め選択したパラメータ、例えば、癌タイプ、癌ステージまたは患者治療歴についてＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲを最適化する。
【１２４６】
ある態様において、ＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲは、
ａ)細胞外ドメイン、例えば、抗原結合ドメイン、共阻害細胞外ドメインまたは共刺激細胞外ドメイン；
ｂ)膜貫通ドメイン、例えば、抗原結合メンバー上の膜貫通ドメイン；
ｃ)スイッチドメイン、例えば、抗原結合メンバー上のスイッチドメイン；
ｄ)第二スイッチドメイン、例えば、細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメイン；
ｅ)例えば、細胞内シグナル伝達メンバー上に配置された共刺激シグナル伝達ドメイン；
ｆ)例えば、細胞内シグナル伝達メンバー上に配置された一次シグナル伝達ドメイン；および
ｇ)抗原結合メンバー上に配置された共刺激シグナル伝達ドメイン
から選択される成分が多様である。
【１２４７】
ある態様において、多様性は、成分の構造多様性を含む。
【１２４８】
ある態様において、多様性は、成分の位置(例えば、ＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲの他の成分に対する設置)を含む。
【１２４９】
ある態様において、ＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲは、複数の成分、例えば、２成分、例えば、ａ)〜ｇ)から選択される成分が多様性である。
【１２５０】
ある態様において、本方法は、複数の細胞、例えば、Ｔ細胞を含む一団またはその製造を提供し、ここで、複数の各細胞または細胞の製造は、複数のＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲを含むＣＡＲパネルからの異なるＣＡＲ、例えば、ＲＣＡＲを含み、各ＣＡＲは異なる成分、例えば、異なる細胞外結合ドメイン、例えば、異なる共阻害細胞外ドメインまたは異なる共刺激細胞外ドメインを含むメンバーを有する。
【１２５１】
有効性の評価
候補ＲＣＡＲを、ここに記載する成分および方法を使用して産生できる。このような候補ＲＣＡＲを、候補ＲＣＡＲを癌のマウスモデルに投与し、抗癌または抗腫瘍効果およびマウスの全体的生存をモニターおよび評価することにより、インビボで有効性を試験できる。
【１２５２】
例として、抗ヒトＣＤ１９抗体を含む抗原結合ドメインを有するＲＣＡＲの有効性を、癌のマウスモデル、例えば、ＣＤ１９／ＡＬＬマウスモデルでアッセイできる。初代ヒト急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)細胞を、免疫無防備状態マウス、例えば、ＮＯＤ.Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ(ＮＳＧまたはＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ)マウスに、例えば、静脈内にインプラントする。ＡＬＬの確立に十分な時間、例えば、２〜３週間後、候補ＲＣＡＲ発現細胞を投与できる。候補ＲＣＡＲ発現細胞での処置後、マウスを、例えば、毎週、疾患進行、腫瘍負荷、浸潤および／またはＲＣＡＲ発現細胞の残留性について、当分野で知られる種々の方法を使用して分析する。例えば、血中のヒトＡＬＬ細胞、例えば、ヒトＣＤ１９＋細胞のパーセンテージは疾患負荷を示す。処置の血のマウスの全体的生存、例えば罹病率も評価できる。
【１２５３】
ベクター
本発明はまた、ＲＣＡＲコード化配列を含むベクターを提供する。ウイルス、例えば、レンチウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期の、安定な組込みおよび娘細胞におけるその伝播を可能にするため、長期遺伝子導入の達成に適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞のような非増殖性細胞に形質導入できる点で、レトロウイルス、例えば、マウス白血病ウイルス由来のベクターを超える利点を有する。それらは低免疫原性のさらなる利益を有する。
【１２５４】
ある態様において、ＲＣＡＲコードする核酸の発現を、発現ベクターに取り込まれたプロモーターに操作性に連結した、ＲＣＡＲをコードする核酸ポリペプチドまたはその一部または成分により達成する。ベクターは、複製および真核生物への組込みに適し得る。典型的ベクターは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列および所望の核酸配列の発現の制御に有用なプロモーターを含む。
【１２５５】
ある態様において、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターテクノロジーは当分野で知られ、例えば、Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-4,  Cold Spring Harbor Press, NY)および他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ある態様において、ベクターとして有用であるウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスである。ある態様において、ベクターはレンチウイルスベクターである。一般に、適当なベクターは、少なくとも１個の生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位および１個以上の選択可能マーカーを含む(例えば、ＷＯ０１／９６５８４号；ＷＯ０１／２９０５８号；および米国特許６,３２６,１９３号)。
【１２５６】
ある態様において、２個以上の遺伝子を発現するベクターにおいて、各遺伝子は、例えば、ビシストロニックプロモーターまたはトリシストロニックプロモーターの使用により、異なるプロモーター領域の制御下に発現される。同じベクターからの２個以上の遺伝子の発現は、複数プロモータープラスミド、例えば、ビシストロニックプロモーターまたはトリシストロニックプロモーターの使用により達成できる。複数プロモーター含有レンチウイルスベクターの例は文献から知られる。例えばベクターpLENTI−バイシストロニックは、逆方向のＰＫＧプロモーターおよびミニＣＭＶプロモーターを使用する２遺伝子の発現を駆動する(Applied Biological Material Inc., Richmond, BC, Canada)。同様に、トリシストロニックベクターpLENTI−トリシストロニックは、３遺伝子の発現を駆動する。この配置で、１個の遺伝はミニ−ＣＭＶプロモーターにより誘導でき、第二および第三遺伝子は、Ｔ２Ａペプチド開裂部位で２遺伝子を分けるＰＧＫプロモーターにより誘発できる。
【１２５７】
他の態様において、ビシストロニックベクターまたはトリシストロニックベクターはまた、例えば２個以上のオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)の翻訳のための脳心筋炎ウイルス(ＥＭＣＶ)からの成分のような、配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)を使用しても構築し得る。このようなベクターは、強ヒトプロモーター制御領域、例えばＣＭＶまたはＥＦ１アルファの制御下、ビシストロニックメッセージまたはトリシストロニックメッセージの転写を駆動するように設計する。ＩＲＥＳは、５’キャップ非依存的形式でＲＮＡ翻訳を開始できる、比較的短いＤＮＡ配列である。第一シストロンは、強哺乳動物プロモーターにより駆動されるキャップ依存的方式で翻訳されるが、その後のものは、ポリオウイルスの配列内リボソーム進入部位または翻訳増強のための脳心筋炎ウイルスのキャップ非依存的翻訳エンハンサーのような、ウイルス起源のシストロン間領域を利用する(N Chinnasamy et al. (2009), Production of Multicistronic HIV-1 Based Lentiviral Vectors; Methods Mol Biol 515: 1-14)。
【１２５８】
さらなるプロモーター成分、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。概して、これらは、開始部位の３０〜１１０bp上流の領域に位置するが、多くのプロモーターが、開始部位の下流に同様に機能的成分を含むことが示されている。プロモーター成分の間の間隙は、成分が互いに逆または移動したときに、プロモーター機能が保持されるように、しばしば可動性である。チミジンキナーゼ(ｔｋ)プロモーターにおいて、、プロモーター成分間の間隔は、活性が低下し始める前、５０bp離れるまで増加していてよい。プロモーターによって、個々の成分が転写を活性化するのに協同的または非依存的に機能し得る。
【１２５９】
プロモーターの他の例は、最初期サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに操作性に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる強い構成的プロモーター配列である。しかしながら、他の構成的プロモーター配列は、サルウイルス４０(ＳＶ４０)初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス(ＭＭＴＶ)、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)末端反復配列(ＬＴＲ)プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター(ＥＦｌα)、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターのような、しかしこれらに限定されないヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない。さらに、ある態様は、構成的プロモーターの使用に限定されない。ある態様は、誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターの使用は、それが操作性に連結しているポリヌクレオチド配列の発現を、このような発現が望まれるときに、オンにし、発現が望まれないときに発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【１２６０】
ＲＣＡＲの多様な成分をコードする配列は、同じ核酸分子、例えば、同じプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置できる。例えば、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列の両者を、同じ核酸、例えば、ベクター上に提示できる。対応するタンパク質の産生は、例えば、別のプロモーターの使用によりまたはバイシストロニック転写産物(これは、単一翻訳産物の開裂により２個のタンパク質の産生をもたらし得て、１個の転写産物からの翻訳中のリボソームスキップまたは１個の別々のタンパク質産物の翻訳による２個のタンパク質産生もたらし得る)の使用により達成できる。
【１２６１】
したがって、ある態様において、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列が単一核酸分子上に存在し、単一転写産物として転写され、次のとおり構築される：
プロモーター、例えば、ここに記載するプロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターが、(ｉ)、(ii)および(iii)ペプチド、例えば、開裂可能ペプチドをコードする配列、例えば、Ｐ２ＡまたはＦ２Ａ配列に操作性に連結する。成分(iii)は(ｉ)と(ii)の間に配置される。ある態様において、(ｉ)、(ii)および(iii)は単一ＲＮＡとして転写される。ある態様において、核酸上の順番は(ｉ)−(iii)−(ii)である。ある態様において、核酸上の順番は(ii)−(iii)−(ｉ)である。
【１２６２】
ある態様において、成分(iii)は、Ｐ２ＡまたはＦ２Ａ配列またはその有効なフラグメントを含む。
【１２６３】
Ｐ２ＡおよびＦ２Ａのアミノ酸および核酸配列を下に提供する。
Ｐ２Ａ：
【化１８】
0006793902.tif 000052
Ｆ２Ａ：
【化１９】
0006793902.tif 000053
【１２６４】
ある態様において、(ｉ)および(ii)は、細胞内スイッチを有するＲＣＡＲを形成する。
【１２６５】
ある態様において、(ｉ)および(ii)は、細胞外スイッチを有するＲＣＡＲを形成する。
【１２６６】
ある態様において、(ii)は、４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインをコードする配列を含む。
【１２６７】
ある態様において、(ｉ)は、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインをコードする配列を含む。
【１２６８】
ある態様において、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列が単一核酸分子上に存在し、単一転写産物として転写され、次のとおり構築される：
プロモーター、例えば、ここに記載するプロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターは、(ｉ)、(ii)および(iii)ＩＲＥＳ、例えば、ＥＭＣＶまたはＥＶ７１  ＩＲＥＳをコードする配列に操作性に連結される。ある態様において、(iii)は(ｉ)と(ii)の間に配置される。ある態様において、(ｉ)、(ii)および(iii)は単一ＲＮＡとして転写される。ある態様において、核酸上の順番は(ｉ)−(iii)−(ii)である。ある態様において、核酸上の順番は(ii)−(iii)−(ｉ)である。
【１２６９】
ある態様において、(ｉ)および(ii)は、細胞内スイッチを有するＲＣＡＲを形成する。
【１２７０】
ある態様において、(ｉ)および(ii)は、細胞外スイッチを有するＲＣＡＲを形成する。
【１２７１】
ある態様において、(ii)は、４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインをコードする配列を含む。
【１２７２】
ある態様において、(ｉ)は、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインをコードする配列を含む。
【１２７３】
他の態様において、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は別の転写産物として転写され、単一核酸分子上に存在し、次のとおり構成される。
プロモーター、例えば、ここに記載するプロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターは、(ｉ)に連結し、第二プロモーター、例えば、ここに記載するプロモーターは、(ii)に操作性に連結できる。ある態様において、(ｉ)および(ii)は別のｍＲＮＡとして転写される。ある態様において、核酸上の順番は第一プロモーター−(ｉ)−第二プロモーター−(ii)である。ある態様において、核酸上の順番は第一プロモーター−(ii)−第二プロモーター−(ｉ)である。ある態様において、第一プロモーターは、ここに記載するプロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターである。ある態様において、第二プロモーターは、ここに記載するプロモーター、例えば、ＣＭＶまたはＥＦ１アルファプロモーターである。ある態様において、第二プロモーターは最小プロモーターである。
【１２７４】
ある態様において、(ｉ)および(ii)は、細胞内スイッチを有するＲＣＡＲを形成する。
【１２７５】
ある態様において、(ｉ)および(ii)は、細胞外スイッチを有するＲＣＡＲを形成する。
【１２７６】
ある態様において、(ii)は、４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインをコードする配列を含む。
【１２７７】
ある態様において、(ｉ)は、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインをコードする配列を含む。
【１２７８】
(ｉ)阻害細胞外ドメインメンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列を、同じ核酸、例えば、ベクター上に提示できる。
【１２７９】
したがって、ある態様において、(ｉ)阻害細胞外ドメインメンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列が単一核酸分子上に存在し、単一転写産物として転写され、次のとおり構築される：
プロモーター、例えば、ここに記載するプロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターは、(ｉ)、(ii)および(iii)ペプチド、例えば、開裂可能ペプチドをコードする配列、例えば、Ｐ２ＡまたはＦ２Ａ配列に操作性に連結される。成分(iii)は(ｉ)と(ii)の間に配置される。ある態様において、(ｉ)、(ii)および(iii)は単一ＲＮＡとして転写される。ある態様において、核酸上の順番は(ｉ)−(iii)−(ii)である。ある態様において、核酸上の順番は(ii)−(iii)−(ｉ)である。
【１２８０】
ある態様において、成分(iii)は、Ｐ２ＡまたはＰ３Ａ配列またはその有効なフラグメントを含む。
【１２８１】
ある態様において、(ｉ)阻害細胞外メンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列が単一核酸分子上に存在し、単一転写産物として転写され、次のとおり構築される：
プロモーター、例えば、ここに記載するプロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターは、(ｉ)、(ii)および(iii)ＩＲＥＳ、例えば、ＥＭＣＶまたはＥＶ７１  ＩＲＥＳをコードする配列に操作性に連結する。ある態様において、(iii)は(ｉ)と(ii)の間に配置される。ある態様において、(ｉ)、(ii)および(iii)は単一ＲＮＡとして転写される。ある態様において、核酸上の順番は(ｉ)−(iii)−(ii)である。ある態様において、核酸上の順番は(ii)−(iii)−(ｉ)である。
【１２８２】
ある態様において、(ｉ)および(ii)は、細胞内スイッチを有するＲＣＡＲを形成する。
【１２８３】
ある態様において、(ｉ)および(ii)は、細胞外スイッチを有するＲＣＡＲを形成する。
【１２８４】
ある態様において、(ii)は、４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインをコードする配列を含む。
【１２８５】
ある態様において、(ｉ)は、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインをコードする配列を含む。
【１２８６】
他の態様において、(ｉ)阻害細胞外メンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は別の転写産物として転写され、単一核酸分子上に存在し、次のとおり構成される。
プロモーター、例えば、ここに記載するプロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターは(ｉ)に操作性に連結し、第二プロモーター、例えば、ここに記載するプロモーターは、(ii)に操作性に連結できる。ある態様において、(ｉ)および(ii)は別のｍＲＮＡとして転写される。ある態様において、核酸上の順番は第一プロモーター−(ｉ)−第二プロモーター−(ii)である。ある態様において、核酸上の順番は第一プロモーター−(ii)−第二プロモーター−(ｉ)である。ある態様において、第一プロモーターはここに記載するプロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターである。ある態様において、第二プロモーターはここに記載するプロモーター、例えば、ＣＭＶまたはＥＦ１プロモーターである。ある態様において、第二プロモーターは最小プロモーターである。
【１２８７】
ある態様において、(ｉ)および(ii)は、細胞内スイッチを有するＲＣＡＲを形成する。
【１２８８】
ある態様において、(ｉ)および(ii)は、細胞外スイッチを有するＲＣＡＲを形成する。
【１２８９】
ある態様において、(ii)は、４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインをコードする配列を含む。
【１２９０】
ある態様において、(ｉ)は、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインをコードする配列を含む。
【１２９１】
(ｉ)共刺激ＥＣＤメンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列を、同じ核酸、例えば、ベクター上に提示できる。
【１２９２】
したがって、ある態様において、(ｉａ)共刺激ＥＣＤメンバーをコードする配列および(ｉａｉ)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列が単一核酸分子上に存在し、単一転写産物として転写され、次のとおり構築される：
プロモーター、例えば、ここに記載するプロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターは、(ｉ)、(ii)および(iii)ペプチド、例えば、開裂可能ペプチドをコードする配列、例えば、Ｐ２ＡまたはＦ２Ａ配列に操作性に連結される。成分(iii)は(ｉ)と(ii)の間に配置される。ある態様において、(ｉ)、(ii)および(iii)は単一ＲＮＡとして転写される。ある態様において、核酸上の順番は(ｉ)−(iii)−(ii)である。ある態様において、核酸上の順番は(ii)−(iii)−(ｉ)である。
【１２９３】
ある態様において、成分(iii)は、Ｐ２ＡまたはＰ３Ａ配列またはその有効なフラグメントを含む。
【１２９４】
ある態様において、(ｉｂ)共刺激ＥＣＤメンバーをコードする配列および(iiｂ)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列が単一核酸分子上に存在し、単一転写産物として転写され、次のとおり構築される：
プロモーター、例えば、ここに記載するプロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターは、(ｉｂ)、(iiｂ)および(iii)ＩＲＥＳ、例えば、ＥＭＣＶまたはＥＶ７１  ＩＲＥＳをコードする配列に操作性に連結する。ある態様において、(iii)は(ｉｂ)と(iiｂ)の間に配置される。ある態様において、(ｉｂ)、(iiｂ)および(iii)は単一ＲＮＡとして転写される。ある態様において、核酸上の順番は(ｉｂ)−(iii)−(iiｂ)である。ある態様において、核酸上の順番は(iiｂ)−(iii)−(ｉｂ)である。
【１２９５】
ある態様において、(ｉｂ)および(iiｂ)は、細胞内スイッチを有するＲＣＡＲを形成する。
【１２９６】
ある態様において、(ｉｂ)および(iiｂ)は、細胞外スイッチを有するＲＣＡＲを形成する。
【１２９７】
ある態様において、(iiｂ)は、４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインをコードする配列を含む。
【１２９８】
ある態様において、(ｉｂ)は、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインをコードする配列を含む。
【１２９９】
他の態様において、(ｉｂ)共刺激ＥＣＤメンバーをコードする配列および(iiｂ)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は別の転写産物として転写され、単一核酸分子上に存在し、次のとおり構成される。
プロモーター、例えば、ここに記載するプロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターは(ｉｂ)に操作性に連結し、第二プロモーター、例えば、ここに記載するプロモーターは、(iiｂ)に操作性に連結できる。ある態様において、(ｉｂ)および(iiｂ)は別のｍＲＮＡとして転写される。ある態様において、核酸上の順番は第一プロモーター−(ｉｂ)−第二プロモーター−(iiｂ)である。ある態様において、核酸上の順番は第一プロモーター−(iiｂ)−第二プロモーター−(ｉｂ)である。ある態様において、第一プロモーターはここに記載するプロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターである。ある態様において、第二プロモーターはここに記載するプロモーター、例えば、ＣＭＶまたはＥＦ１プロモーターである。ある態様において、第二プロモーターは最小プロモーターである。
【１３００】
ある態様において、(ｉｂ)および(iiｂ)は、細胞内スイッチを有するＲＣＡＲを形成する。
【１３０１】
ある態様において、(ｉｂ)および(iiｂ)は、細胞外スイッチを有するＲＣＡＲを形成する。
【１３０２】
ある態様において、(iiｂ)は、４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインをコードする配列を含む。
【１３０３】
ある態様において、(ｉｂ)は、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメインをコードする配列を含む。
【１３０４】
単一分子構築物の態様は、図２２に記載のものを含む。
【１３０５】
レンチウイルスベクター１４３７７４は、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ／ＣＤ８  ＴＭ／ＦＫＢＰスイッチドメイン、ＥＶ７１  ＩＲＥＳおよびＦＲＢスイッチドメイン／４−１ＢＢドメイン／ＣＤ３ゼータスイッチドメインをコードする配列に操作性に連結したＥＦ１アルファプロモーターを含む。
【１３０６】
レンチウイルスベクター１４３７７５は、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ／ＣＤ８  ＴＭ／ＦＫＢＰスイッチドメイン、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳおよびＦＲＢスイッチドメイン／４−１ＢＢドメイン／ＣＤ３ゼータスイッチドメインをコードする配列に操作性に連結したＥＦ１アルファプロモーターを含む。
【１３０７】
レンチウイルスベクター１４３７７６は、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ／ＣＤ８  ＴＭ／ＦＫＢＰスイッチドメインをコードする配列に操作性に連結したＥＦ１アルファプロモーター；およびＦＲＢスイッチドメイン／４−１ＢＢドメイン／ＣＤ３ゼータスイッチドメインをコードする配列に操作性に連結したＣＭＶ最小プロモーターを含む。
【１３０８】
レンチウイルスベクター１４３７７７は、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ／ＣＤ８  ＴＭ／ＦＫＢＰスイッチドメインをコードする配列に操作性に連結したＥＦ１アルファプロモーター；およびＦＲＢスイッチドメイン／４−１ＢＢドメイン／ＣＤ３ゼータスイッチドメインをコードする配列に操作性に連結したＥＦ１最小プロモーターを含む。
【１３０９】
ある態様において、哺乳動物Ｔ細胞でＲＣＡＲ導入遺伝子を発現できるプロモーターはＥＦ１アルファプロモーター(ＥＦｌα)である。天然のＥＦ１αプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素送達を担う、伸長因子−１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１αプロモーターは哺乳動物発現プラスミドで使用されており、レンチウイルスベクターからクローン化された導入遺伝子からのＲＣＡＲ発現の駆動に有効であることが示されている。例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17(8):1453-1464 (2009)参照。ある態様において、ＥＦ１αプロモーターは、配列番号１４０として提供する配列を含む。
【１３１０】
ＲＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入するベクターはまた、ウイルスベクターによる遺伝子導入または感染が探索されている細胞の集団から、発現細胞を同定し、選択することを容易にするために、選択可能マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子または両者も含み得る。ある態様において、選択可能マーカーは、別のＤＮＡの一部で運搬され、共遺伝子導入手順で使用され得る。有用な選択可能マーカーは、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子を含む。
【１３１１】
レポーター遺伝子を、遺伝子導入された可能性のある細胞の同定および制御配列の機能性の評価のために使用する。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在せず、またはこれらにより発現されず、ある容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により発現が顕在化するポリペプチドをコードする、遺伝子である。レポーター遺伝子の発現を、レシピエント細胞にＤＮＡが導入された後適当な時にアッセイする。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479:79-82)。適当な発現系は知られ、既知技術を使用して製造できるかまたは商業的に得られる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物を、プロモーターとして同定する。このようなプロモーター領域をレポーター遺伝子と連結し、プロモーター駆動転写を調節する薬剤の能力の評価に使用し得る。
【１３１２】
細胞に遺伝子を導入し、発現させる方法は当分野で知られる。発現ベクターとの関連で、該ベクターは、当分野における任意の方法により宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に容易に導入できる。例えば、発現ベクターを、物理的、化学的または生物学的手段により宿主細胞に導入できる。
【１３１３】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび／または外来核酸を含む細胞を産生する方法は当分野で周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY参照。
【１３１４】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法は、上記ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含む。宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する化学的手段は巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系のようなコロイド分散系を含む。インビトロおよびインビボで送達媒体として使用される代表的コロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。標的化ナノ粒子または他の適当なサブミクロンサイズの送達系でのポリヌクレオチドの送達のような、最新式の核酸標的化送達の他の方法が利用可能である。
【１３１５】
ある態様において、ｍＲＮＡを、非ウイルス送達系で細胞または患者に導入でき、患者に直接注入する。非ウイルス送達系を利用する場合、代表的送達媒体はリポソームである。脂質製剤の使用が、核酸の宿主細胞への導入(インビトロ、エクスビボまたはインビボ)のために企図される。ある態様において、核酸は脂質と結合し得る。脂質と結合する核酸を、リポソームの水性内部に封入し、リポソームの脂質二重層内に点在させ、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両者と結合した連結分子を介してリポソームに結合し、リポソーム内に捕捉され、リポソームと複合体化し、脂質を含む溶液内に分散し、脂質と混合し、脂質と合わせ、脂質における懸濁液として包含させ、ミセルに包含させまたは複合体化させまたは他に脂質と結合させることができる。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中の何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造で、ミセルとしてまたは“崩壊”構造で存在し得る。また、単に溶液中に分散し、恐らくサイズまたは形が均一ではない凝集体を形成していてよい。脂質は、天然に存在するまたは合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質で自然に生じる脂肪滴ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドのような長鎖脂肪族炭化水素を有する化合物群およびそれらの誘導体を含む。
【１３１６】
使用に適する脂質は業者から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(“ＤＭＰＣ”)はSigma, St. Louis, MOから得ることができ、リン酸ジセチル(“ＤＣＰ”)はK & K Laboratories(Plainview, NY)から得ることができ、コレステロール(“Ｃｈｏｉ”)はCalbiochem-Behringから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(“ＤＭＰＧ”)および他の脂質はAvanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL.)から得られ得る。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質の保存溶液は、約−２０℃で保存できる。クロロホルムを、メタノールよりもはるかに容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用する。“リポソーム”は、封入された脂質二重層または凝集体の産生により形成される多様な単および多重膜脂質媒体を包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を有する小胞構造を有するとして特徴づけることができる。多重膜リポソームは、水性媒体により分離された複数脂質層を有する。リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたとき、自然に形成される。脂質成分は、自己再編成を受け、その後閉構造を形成し、脂質二重層間に水を捕捉し、溶質を溶解する(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5:505-10)。しかしながら、溶液で通常の小胞構造と異なる構造を取る組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造または単に脂質分子の不均一性凝集体として存在することが想定され得る。また考慮されるのは、リポフェクタミン−核酸複合体である。
【１３１７】
ＲＣＡＲ成分は、１個以上の核酸分子上にコードされ得る。代表的核酸分子は、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどを含む。ある態様において、成分は、単一核酸分子、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどに提供され、または１個を超える核酸分子、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどに配置され得る。
【１３１８】
下記表６〜１１は、ＲＣＡＲ上の二量体化スイッチの代表的配置を提供する。
【表３４】
0006793902.tif 000054
【１３１９】
【表３５】
0006793902.tif 000055
【１３２０】
【表３６】
0006793902.tif 000056
【１３２１】
【表３７】
0006793902.tif 000057
【１３２２】
【表３８】
0006793902.tif 000058
【１３２３】
【表３９】
0006793902.tif 000059
【１３２４】
核酸ベースの阻害剤
二本鎖ＲＮＡ(ＤＳＲＮＡ)
標的遺伝子、例えば、阻害分子遺伝子の発現の減少に有用な核酸ベースの阻害剤は、ｓｈＲＮＡのようなｄｓＲＮＡを含む。理論に縛られることを望まないが、ｄｓＲＮＡはＲＮＡｉ機構により作用すると考えられる。ＲＮＡｉは、短干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)が介在する動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングの過程である。ここで使用するｄｓＲＮＡはｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを含む。
【１３２５】
ｄｓＲＮＡは化学的に合成しても、ベクターから発現させても、または酵素的に合成してもよい。ｄｓＲＮＡは非修飾であるかまたは、例えば、ＲＮＡとして投与されるｄｓＲＮＡの場合、化学修飾されてもよい。酵素的に合成されたｄｓＲＮＡは、インビボでのヌクレアーゼ分解に対する抵抗性増加および／または細胞取り込み改善を介するような、天然のｄｓＲＮＡ分子の種々の特性が改善されるように化学的修飾され得る。
【１３２６】
ｄｓＲＮＡターゲティング核酸は、ここでは、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡ分子の一方と呼ぶ、２個の別のＲＮＡ分子からなり、これは折りたたまれて、ｓｈＲＮＡと呼ばれるヘアピン構造を形成する。ある態様において、標的遺伝子の発現阻害に適当なｄｓＲＮＡは、アデノウイルスまたはレンチウイルスｓｉＲＮＡライブラリーのようなｓｉＲＮＡライブラリーのスクリーニングにより同定できる。ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡとしてまたはｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡを提供するように転写されるＤＮＡの形で細胞に提供できる。ｄｓＲＮＡ遺伝子、例えば、ｓｈＲＮＡ遺伝子は、ベクター、例えば、レンチウイルスまたはアデノウイルスベクターのようなウイルスベクターから発現できる。ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡは、ポリメラーゼIIIプロモーター、例えばＵ６またはＨ１プロモーターまたはポリメラーゼIIプロモーターにより発現できる。ｓｈＲＮＡは、スタッファーまたはリンカーフラグメントで離され、ＲＮＡ分子がそれ自体に折りたたまれて戻り、ヘアピンループを有するｄｓＲＮＡ分子を作るのを可能にする、一本鎖ＲＮＡおよびその相補体の配列をコードするＤＮＡ構築物から細胞で発現される。理論に縛られることを望まないが、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列から発現されるｓｈＲＮＡは、DicerによりｓｉＲＮＡに処理され、これは、ＲＮＡｉ経路に沿って、ＲＩＳＣから標的遺伝子のサイレン酢まで続く。
【１３２７】
ある態様において、阻害剤は、約１５〜約３０塩基対長(例えば、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９塩基対長)である二本鎖領域を含む、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡである。ある態様において、阻害剤は、約１５〜約３０塩基対長(例えば、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９塩基対長)である二本鎖領域を含む、ｓｈＲＮＡである。ある態様において、ｄｓＲＮＡは、約１〜約３(例えば、約１、２または３)ヌクレオチドの突出末端を含む。“突出”は、ｄｓＲＮＡの一つの鎖の３’末端が、他方の鎖の５’末端を越えて伸びているまたはその逆を意味する。ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ分子の一端または両端に突出を有し得る。ある態様において、一本鎖突出は、アンチセンス鎖の３’末端に存在するか、あるいは、センス鎖の３‘末端に存在する。ある態様において、突出はＴＴまたはＵＵジヌクレオチド突出、例えば、ＴＴまたはＵＵジヌクレオチド突出である。例えば、ある態様において、ｄｓＲＮＡは２１−ヌクレオチドアンチセンス鎖、１９塩基対二本鎖領域および３’末端ジヌクレオチドを含む。さらに他の態様において、ｄｓＲＮＡは、両端が平滑であるかあるいは一方の末端が平滑である、二本鎖核酸を含む。
【１３２８】
ある態様において、ｓｈＲＮＡは、細胞内プロセシング(例えば、Dicerによる)後、２ヌクレオチド３’オーバーハングを伴う１９〜２３ヌクレオチド二本鎖ｓｉＲＮＡを生じる。
【１３２９】
ある態様において、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡは、第一および第二配列を含み、各配列は約１８〜約２８ヌクレオチド長、例えば、約１９〜約２３ヌクレオチド長であり、ここで、ｄｓＲＮＡの該第一配列は、ｄｓＲＮＡがＲＮＡ干渉により標的の開裂を指示するために標的ＲＮＡに十分な相補性を有するヌクレオチド配列であり、ｄｓＲＮＡの第二配列は、第一鎖に相補性であるヌクレオチド配列を含む。
【１３３０】
ある態様において、ｄｓＲＮＡは、二本鎖領域を形成する第一および第二配列を含み、ここで、二本鎖領域の各配列は約１８〜約２８ヌクレオチド長、例えば、約１９〜約２３ヌクレオチド長である。ｈｓＲＮＡの第一配列は、ｈｓＲＮＡがＲＮＡ干渉により標的の開裂を指示するために標的ＲＮＡに十分な相補性を有するヌクレオチド配列であり、ｈｓＲＮＡの第二鎖は、第一鎖に相補性であるヌクレオチド配列を含む。
【１３３１】
ある態様において、ｄｓＲＮＡ(例えば、ｓｈＲＮＡの二本鎖領域の配列または鎖)は、標的遺伝子またはその一部のヌクレオチド配列と相補性であるヌクレオチド配列を有するアンチセンス配列および標的遺伝子またはその一部のヌクレオチド配列と実質的に類似するヌクレオチド配列を有するセンス配列を含む。ある態様において、アンチセンス配列およびセンス配列は、独立して、約１５〜約３０(例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０)ヌクレオチドを含み、ここで、アンチセンス配列は、センス配列のヌクレオチドと相補性である約１５〜約３０(例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０)ヌクレオチド含む。
【１３３２】
ある態様において、ｄｓＲＮＡはＲＮＡとして提供され(転写されてｄｓＲＮＡを提供するＤＮＡとしてではない)、１個以上の化学修飾を含む。このような化学修飾の非限定的例は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、“ユニバーサル塩基”ヌクレオチド、“非環式”ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチドおよび末端グリセリルおよび／または逆デオキシ脱塩基残基取り込みを含むが、これらに限定されない。このような化学修飾は、細胞におけるＲＮＡｉ活性を保持し、同時に、これらの化合物の血清安定性を劇的に増加させることが示されている。さらに、１個以上のホスホロチオエート置換は十分に耐容性であり、修飾ｄｓＲＮＡ構築物の血清安定性の相当な増加に寄与することが示されている。ｄｓＲＮＡは、分子に存在するヌクレオチドの総数のパーセンテージとして修飾ヌクレオチドを含み得る。つまり、ｄｓＲＮＡは、一般に約５％〜約１００％修飾ヌクレオチド(例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％修飾ヌクレオチド)を含む。
【１３３３】
アンチセンス
適当な核酸ベースの阻害剤は、アンチセンス核酸を含む。理論に縛られないが、アンチセンス阻害は、概して少なくとも１個の鎖またはセグメントが開裂され、分解され、または他に操作不能であるように、オリゴヌクレオチド鎖またはセグメントの水素結合ベースのハイブリダイゼーションに基づく。
【１３３４】
アンチセンス剤は、ｄｓＲＮＡで適すると上に記載した化学修飾を有し得る。
【１３３５】
アンチセンス剤は、例えば、約８〜約８０核酸塩基(すなわち、約８〜約８０ヌクレオチド)、例えば、約８〜約５０核酸塩基または約１２〜約３０核酸塩基を含み得る。アンチセンス化合物はリボザイム、外部ガイド配列(ＥＧＳ)オリゴヌクレオチド(オリゴザイム)および標的核酸とハイブリダイズし、その発現を修飾する他の短触媒的ＲＮＡまたは触媒的オリゴヌクレオチドを含む。抗センス化合物は、標的遺伝子における配列と相補性である一続きの少なくとも８連続核酸塩基を含み得る。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸配列と１００％相補性である必要はない。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの標的への結合が標的分子の正常機能を妨害し、有用性の喪失を引き起こすとき特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的結合が望まれる条件下、すなわち、インビボアッセイまたは治療的処置の場合生理学的条件下、またはインビトロアッセイの場合、アッセイを実施する条件下、オリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性がある。
【１３３６】
理論に縛られないが、ｍＲＮＡの妨害すべき機能は、例えば、ＲＮＡのタンパク質翻訳の部位への転位、ＲＮＡからのタンパク質翻訳、１個以上のｍＲＮＡ種を生じるためのＲＮＡのスプライシングおよびＲＮＡにより従事され得る触媒的活性のような、全ての重要な機能を含む。特異的タンパク質のＲＮＡへの結合は、ＲＮＡへのアンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによっても妨害し得る。
【１３３７】
配列同一性
２個以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈での同一性パーセントは、同じである２個以上の配列をいう。２個の配列が、次の配列比較アルゴリズムの一つを使用して、比較ウィンドウまたは指定領域にわたり比較し、最大一致のために配列したとき、または手動アラインメントおよび目視検査により、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定のパーセンテージ(すなわち、特定の領域、または、特定されていないとき、例えば、比較配列の短い方の、全配列をとおして６０％同一性、所望により７０％、７１％。７２％。７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性)有するならば、２個の配列は“実質的に同一”である。所望により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド(または１０アミノ酸)長である領域にわたりまたはより好ましくは１００〜５００または１０００またはそれ以上のヌクレオチド(または２０、５０、２００またはそれ以上のアミノ酸)長である領域にわたり存在する。
【１３３８】
配列比較のために、概して一つの配列が対照配列として作用し、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列および対照配列をコンピューターに入力し、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用できまたは代替パラメータを指定できる。配列比較アルゴリズムは、その後、プログラムパラメータに基づき、対照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のために配列をアラインメントする方法は当分野で知られる。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局地的相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピューター制御履行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ)または手動アラインメントおよび目視検査により(例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology参照)、実施できる。
【１３３９】
配列同一性パーセントおよび配列類似性の決定に適するアルゴリズムの二つの例はＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ  ２.０アルゴリズムであり、これはそれぞれAltschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402；およびAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationから公的に利用可能である。
【１３４０】
２個のアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に組み込まれているE. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用しても決定できる。さらに、２個のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(www.gcg.comから利用可能)におけるＧＡＰプログラムに取り込まれているNeedleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453アルゴリズムを使用して、Blossom 62マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ加重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ加重１、２、３、４、５または６を使用しても決定できる。
【１３４１】
ある態様において、本発明は、機能的に等価な分子を産生する抗原結合ドメイン(例えば、ｓｖＦｖ)アミノ酸配列の修飾を企図する。例えば、ＲＣＡＲのｓｃＦｖのＶＨまたはＶＬは、ｓｃＦｖの出発ＶＨまたはＶＬ配列と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を保持するように修飾できる。
【１３４２】
ある態様において、核酸配列によりコードされるポリペプチド配列は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基での１個以上のアミノ酸残基の置き換え、すなわち、保存的置換により修飾する。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。
【１３４３】
標的遺伝子、例えば、ここに記載する阻害分子遺伝子の発現を減少させるために有用な別法は、例えば、ここに記載するとおり、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を含む。
【１３４４】
細胞の源
ある態様において、増殖および遺伝子修飾または他の修飾前に、細胞、例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー(ＮＫ)細胞の源を対象から得ることができる。用語“対象”は、免疫応答を誘発できる生存生物(例えば、哺乳動物)を含むことを意図する。対象の例はヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびおよびそれらのトランスジェニック種を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む、多数の源から得ることができる。
【１３４５】
Ｔ細胞
ある態様において、細胞はＴ細胞である。当分野で入手可能なＴ細胞株を使用し得る。ある態様において、Ｔ細胞Ｔ細胞は、FicollTM分離のような当業者に知られる方法をいくらでも使用して、対象から採取した血液のユニットから得ることができる。ある態様において、個体の循環血からの細胞をアフェレシスにより得る。アフェレシス産物は、概してＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含むリンパ球、赤血球および血小板を含む。ある態様において、アフェレシスにより採取した細胞を洗浄して血漿フラクションを除去し、細胞を次の処理工程のために適切な緩衝液または媒体に入れることができる。ある態様において、細胞をリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で洗浄する。別の態様において、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてよくまたは全てではないにしても多くの二価カチオンを欠いてよい。驚くべきことに、カルシウム非存在下の初期活性化工程は、シグナル活性化の増幅に至る。洗浄工程は、製造業者の指示に従う半自動化“フロースルー”遠心分離(例えば、Cobe 2991 cell processor、Baxter CytoMateまたはHaemonetics Cell Saver 5)を使用するような当業者に知られる方法により達成し得る。洗浄後、細胞を、例えば、無Ｃａ、無ＭｇのＰＢＳ、PlasmaLyte Aまたは他の緩衝剤を含むもしくは含まない食塩水溶液のような、多様な生体適合性緩衝液に再懸濁し得る。あるいは、アフェレシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁し得る。
【１３４６】
ある態様において、Ｔ細胞を、赤血球を溶解し、単球を、例えば、PERCOLLTM勾配を介する遠心分離または向流遠心水簸により枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離する。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のようなＴ細胞の特定の亜集団を、陽性または陰性選択技術によりさらに単離できる。例えば、ある態様において、Ｔ細胞を、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 Tのような抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８(すなわち、３×２８)結合ビーズと、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な期間インキュベーションすることにより単離する。ある態様において、期間は約３０分である。さらなる態様において、期間は３０分〜３６時間またはそれより長いおよびその間の全整数値である範囲である。さらなる態様において、期間は少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間である。さらに他の態様において、期間は１０〜２４時間である。ある態様において、インキュベーション期間は２４時間である。白血病を有する患者からのＴ細胞の単離のために、２４時間のような長いインキュベーション時間の使用が細胞収率を上げ得る。長いインキュベーション時間を、腫瘍組織からの腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)の単離または免疫無防備状態個体からの単離のような、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ない、あらゆる状況においてＴ細胞を単離するために使用し得る。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の捕獲効率を上げ得る。それゆえに、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと結合させる時間を単純に短くまたは長くすることによりおよび／またはビーズ対Ｔ細胞比(ここにさらに記載する)を増加または減少することにより、Ｔ細胞の亜集団を、培養開始時または処理中の他の時点に優先的に選択または排除できる。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少することにより、Ｔ細胞の亜集団を、培養開始時にまたは他の所望の時点で優先的に選択または排除できる。当業者は、複数回の選択も使用できることを認識する。ある面において、選択手順を使用し、活性化および増殖過程において“未選択”細胞を使用することが望ましいことがある。“未選択”細胞もまたさらなる選択に付し得る。
【１３４７】
陰性選択によるＴ細胞集団の富化は、陰性に選択した細胞に特有の表面マーカーを指向する抗体の組み合わせにより達成できる。一つの方法は、陰性に選択した細胞上に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、陰性磁気免疫粘着またはフローサイトメトリーを介する細胞選別および／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、概してＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含む。ある態様において、概してＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋およびＦｏｘＰ３＋を発現する制御性Ｔ細胞を富化するまたは陽性に選択することが望ましいことがある。あるいは、ある態様において、Ｔ制御性細胞を、抗Ｃ２５結合ビーズまたは他の類似選択法により枯渇させる。
【１３４８】
陽性または陰性選択により所望の細胞集団を単離するために、細胞および表面(例えば、ビーズのような粒子)の濃度は変わり得る。ある態様において、細胞とビーズの最大の接触を確実にするために、ビーズと細胞を混ぜ合わせる体積を顕著に低下させる(例えば、細胞の濃度を増加させる)ことが望ましいことがある。ある態様において、２０億細胞／mlの濃度を使用する。ある態様において、１０億細胞／mlを使用する。さらなる態様において、１億細胞／ml超を使用する。さらなる態様において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらに別の態様において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの細胞の濃度を使用する。さらなる態様において、１億２５００万または１億５０００万細胞／mlの濃度を使用できる。高濃度の使用は細胞収率、細胞活性化および細胞増殖の増加をもたらし得る。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような興味ある標的抗原を弱く発現し得る細胞の、または多くの腫瘍細胞が存在するサンプル(すなわち、白血病血液、腫瘍組織など)からの細胞の、より効率的な捕獲を可能とする。このような細胞の集団は治療価値を有し得て、得ることが望まれる。例えば、高い細胞濃度の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋  Ｔ細胞のより効率的な選択を可能とする。
【１３４９】
関連する態様において、細胞の低濃度を使用することが望ましいことがある。Ｔ細胞と表面(例えば、ビーズのような粒子)の混合物を顕著に希釈することにより、粒子と細胞の相互作用が最小化される。粒子に結合する所望の抗原を高量発現する細胞でこれを選択する。例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でＣＤ８＋  Ｔ細胞よりも効率的に捕獲される。ある態様において、５×１０６／mlである。他の態様において、使用する濃度は約１×１０５／ml〜１×１０６／mlおよびその間の任意の整数値であり得る。他の態様において、細胞を、種々の長さの時間、種々の速度で、２〜１０℃または室温で、回転子上でインキュベートし得る。
【１３５０】
刺激用Ｔ細胞はまた洗浄工程後凍結し得る。理論に縛られることを望まないが、凍結と続く解凍工程は、細胞集団中の顆粒球をおよびある程度の単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程後、細胞を凍結溶液に懸濁し得る。多くの凍結溶液およびパラメータが当分野で知られ、この状況で有用であるが、一つの方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳまたは１０％デキストラン４０および５％デキストロースを含む、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯを含む、または３１.２５％Plasmalyte-A、３１.２５％デキストロース５％、０.４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロースを含む、または２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯを含む培養培地または例えば、HespanおよびPlasmaLyte Aを含む、他の適当な細胞凍結媒体の使用を含み、次いで細胞を、−８０℃で１°／分の速度で凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの気相に貯蔵する。制御凍結の他の方法ならびに即時に−２０℃でのまたは液体窒素中の未制御凍結を使用できる。
【１３５１】
ある態様において、凍結保存細胞をここに記載するとおり回答および洗浄して、ここに記載する方法を使用する活性化の前に１時間、室温で休息させる。
【１３５２】
ある態様において、血液サンプルまたはアフェレシス産物の対象からの採取を、ここに記載した拡大させた細胞が必要となる前の時点で行う。つまり、拡大させる細胞の源を必要なあらゆる時点で採取し、Ｔ細胞のような所望の細胞を、例えば、Ｔ細胞療法のために、そのようなＴ細胞療法から利益を得るであろう様々な疾患または状態のためにその後使用するために、単離および凍結できる。ある態様において、血液サンプルまたはまたはアフェレシスを、一般に健常な対象から採る。ある態様において、血液サンプルまたはアフェレシスを、疾患を発症するリスクがあるが、疾患をまだ発症していない一般に健常な対象から採り、興味ある細胞をその後の使用のために単離し、凍結する。ある態様において、Ｔ細胞を増殖させ、凍結し、後に使用し得る。ある態様において、サンプルを、ここに記載する特定の疾患と診断された直ぐ後に、しかし処置前に患者から単離する。さらなる態様において、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸およびFK506のような免疫抑制性剤、抗体または他のCAMPATH、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228および照射のような他の免疫除去剤のような手段での処置を含むが、これらに限定されない、任意の数の適切な処置モダリティーの前に、対象からの血液サンプルまたはアフェレシスから単離する。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン(シクロスポリンおよびFK506)を阻害するか、または増殖因子誘発シグナル伝達(ラパマイシン)に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)。さらなる態様において、細胞を患者から単離し、骨髄または幹細胞移植、フルダラビンのような化学療法剤、外部ビーム放射線療法(ＸＲＴ)、シクロホスファミドまたはOKT3またはCAMPATHのような抗体を使用するＴ細胞除去療法と組み合わせた(例えば、前、同時または後)その後の使用のために凍結する。ある態様において細胞を前もって単離し、その後の、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなＢ細胞除去療法後の処置のために凍結できる。
【１３５３】
さらなる態様において、Ｔ細胞を、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置後、患者から直接得る。これに関して、ある種の癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、処置の直ぐ後に、患者が通常処置から回復段階にある期間に、得られたＴ細胞の品質は、恐らくエクスビボで拡大する能力が最適であるかまたは改善していることが観察された。同様に、ここに記載する方法を使用したエクスビボ操作後、これらの細胞は、生着およびインビボ増殖の強化に好ましい状態であり得る。それゆえに、本発明の状況において、Ｔ細胞、樹状細胞または造血液細胞系譜の他の細胞を含む血液細胞をこの回復期の間に採取することが意図される。さらに、ある態様において、可動化(例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの可動化)および前処置レジメンを使用して、特に治療後定義された時間枠の間、対象における特定の細胞型の再増殖、再循環、再生および／または増殖に好都合である条件を作ることができる。
【１３５４】
同種ＣＡＲ
ここに記載する態様において、免疫エフェクター細胞は同種免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。例えば、細胞は、同種Ｔ細胞、例えば、機能的Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)および／またはヒト白血球抗原(ＨＬＡ)、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIの発現を欠く同種Ｔ細胞であり得る。
【１３５５】
機能的ＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、その表面に機能的ＴＣＲを何も発現しないように操作されるか、機能的ＴＣＲを含む１個以上のサブユニットを発現しないように操作されるかまたはその表面にごくわずかな機能的ＴＣＲしか産生しないように操作され得る。あるいは、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１個以上の変異型または切断型の発現により、実質的に障害されたＴＣＲを発現できる。用語“実質的に障害されたＴＣＲ”は、このＴＣＲが、宿主に有害免疫反応を誘発しないことを意味する。
【１３５６】
ここに記載するＴ細胞は、例えば、その表面に機能的ＨＬＡを発現しないように操作できる。例えば、ここに記載するＴ細胞は、細胞表面発現ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIが下方制御されるように操作される。
【１３５７】
ある態様において、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲおよび機能的ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIを欠き得る。
【１３５８】
機能的ＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を欠く修飾Ｔ細胞は、ＴＣＲまたはＨＬＡの１個以上のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンを含む、あらゆる適当な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用する、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡのノックダウンを含み得る。ある態様において、同種細胞は、例えばここに記載するいずれかの方法により、阻害分子を発現しないまたは低レベルで発現する細胞である。例えば、細胞は、例えば、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下させ得る、阻害分子を発現しないまたは低レベルで発現する細胞である。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害分子の阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。いくつかの態様において、例えば、ここに記載する、阻害核酸、例えば、阻害核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用できる。
【１３５９】
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
ある態様において、ＴＣＲ発現および／またはＨＬＡ発現を、Ｔ細胞におけるＴＣＲおよび／またはＨＬＡをコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用して阻害できる。
【１３６０】
Ｔ細胞におけるｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現は、例えば、レンチウイルス発現系のような、任意の慣用の発現系を使用して達成できる。
【１３６１】
ＴＣＲの成分の発現を下方制御する代表的ｓｈＲＮＡは、例えば、米国公開公報２０１２／０３２１６６７号に記載されている。ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスII遺伝子の発現を下方制御する代表的ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、例えば、米国公開公報２００７／００３６７７３号に記載されている。
【１３６２】
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ
ここで使用する“ＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ”は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートのセットまたはこのようなセットの反復を含む系をいう。ここで使用する“Ｃａｓ”は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をいう。“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ”系は、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子の発現抑制または変異に使用できるＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓ由来の系である。
【１３６３】
天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、配列決定された真正細菌ゲノムの約４０％および配列決定された古細菌の９０％で見られる。Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8:172。この系は、プラスミドおよびファージのような外来性遺伝成分に対する抵抗性を付与し、獲得免疫の一形態を提供する、原核生物免疫系の一タイプである。Barrangou et al. (2007) Science 315:1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322:1843-1845。
【１３６４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、マウスまたは霊長類のような真核生物における遺伝子編集(特異的遺伝子のサイレンシング、促進または変更)に使用するために修飾されている。Wiedenheft et al. (2012) Nature 482:331-8。これは、真核細胞に、特別に設計されたＣＲＩＳＰＲおよび１個以上の適切なＣａｓを含むプラスミドを導入することにより達成される。
【１３６５】
ＣＲＩＳＰＲ座位と呼ばれることもあるＣＲＩＳＰＲ配列は、交互の反復およびスペーサーを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲにおいて、スペーサーは、通常プラスミドまたはファージ配列のような細菌に外来性の配列を含み、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において、スペーサーはＴＣＲまたはＨＬＡ遺伝子配列に由来する。
【１３６６】
ＣＲＩＳＰＲ座位からのＲＮＡは、構成的に発現され、Ｃａｓタンパク質により小ＲＮＡに加工される。これらは、反復配列が隣接したスペーサーを含む。ＲＮＡは、他のＣａｓタンパク質が、ＲＮＡまたはＤＮＡレベルで外来性遺伝成分を発現抑制するよう導く。Horvath et al. (2010) Science 327:167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1:7。スペーサーは、それゆえに、ｓｉＲＮＡと類似して、ＲＮＡ分子の鋳型として働く。Pennisi (2013) Science 341:833-836。
【１３６７】
これらが多くの異なるタイプの細菌で天然に存在するため、ＣＲＩＳＰＲの正確な配置ならびにＣａｓ遺伝子およびその産物の構造、機能および数は種毎にいくぶん異なる。Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663；およびStern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340。例えば、Ｃｓｅ(Ｃａｓサブタイプ、大腸菌)タンパク質(例えば、ＣａｓＡ)は機能的複合体であるＣａｓｃａｄｅを形成し、これは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ転写物を、Ｃａｓｃａｄｅを保持するスペーサー反復単位に加工する。Brouns et al. (2008) Science 321:960-964。他の原核生物において、Ｃａｓ６はＣＲＩＳＰＲ転写物を処理する。大腸菌におけるＣＲＩＳＰＲベースのファージ不活性化はＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３を必要とするが、Ｃａｓ１またはＣａｓ２はひつようとしない。パイロコッカス・フリオサスおよび他の原核生物におけるＣｍｒ(Cas RAMPモジュール)タンパク質は、小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと機能的複合体を形成し、これは相補的標的ＲＮＡを認識し、切断する。より単純なＣＲＩＳＰＲ系はタンパク質Ｃａｓ９に依存し、これは、二重らせんの各鎖それぞれに対する２個の活性切断部位を有するヌクレアーゼである。Ｃａｓ９と修飾ＣＲＩＳＰＲ座位ＲＮＡの組み合わせは、遺伝子編集のための系において使用できる。Pennisi (2013) Science 341:833-836。
【１３６８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、それゆえに、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子の編集(塩基対の付加または除去)または未成熟終止の導入に使用でき、こうしてＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を減少させる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、あるいはＲＮＡ干渉のように使用でき、可逆性様式でＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子を遮断する。哺乳動物細胞において、例えば、ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質をＴＣＲおよび／またはＨＬプロモーターに誘導し、ＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断できる。
【１３６９】
当分野で知られるテクノロジー、例えば、米国公開公報２０１４００６８７９７号に記載のものを使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を産生できる。
【１３７０】
ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＴＡＬＥＮ
“ＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＴＡＬＥＮ”は、ＨＬＡ遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼをいう。
【１３７１】
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ切断ドメインへの融合により人為的に産生される。転写アクティベーター様効果(ＴＡＬＥ)は、ＨＬＡ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子の一部を含む任意の所望のＤＮＡ配列と結合するよう操作できる。操作したＴＡＬＥとＤＮＡ切断ドメインを合わせることにより、ＨＬＡまたはＴＣＲ配列を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的な制限酵素が産生できる。次いで、これらを細胞に導入でき、ここで、それらをゲノム編集のために使用できる。Boch (2011) Nature Biotech. 29:135-6;およびBoch et al. (2009) Science 326:1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326:3501。
【１３７２】
ＴＡＬＥは、キサントモナス細菌により分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、反復した、１２番目および１３番目のアミノ酸以外、高度に保存された３３〜３４アミノ酸配列を含む。これらの２箇所は高度に可変であり、特定のヌクレオチド認識と強い相関を示す。こうして、これらを所望のＤＮＡ配列と結合するように操作できる。
【１３７３】
ＴＡＬＥＮを産生するために、ＴＡＬＥタンパク質を、野生型または変異ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼであるヌクレアーゼ(Ｎ)と融合させる。ＦｏｋＩの数個の変異がＴＡＬＥＮにおけるその使用のために行われており、これらは、例えば、切断特異性または活性を改善する。Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793；およびGuo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96。
【１３７４】
ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、正確な配向および間隔を有する標的ゲノム内の部位のための独特のＤＮＡ結合ドメインを有する２個の構築物を必要とする。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインの間のアミノ酸残基数および２個の個々のＴＡＬＥＮ結合部位間の塩基数の両者が、高レベルの活性を達成するための重要なパラメータであると考えられる。Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29:143-8。
【１３７５】
ＨＬＡまたはＴＣＲ  ＴＡＬＥＮは、二本鎖切断(ＤＳＢ)を産生するために細胞内で使用できる。修復機構が、非相同末端連結により切断を不適切に修復するならば、切断部位に変異を導入できる。例えば、不適当な修復は、フレームシフト変異を導入し得る。あるいは、外来ＤＮＡを、ＴＡＬＥＮと共に細胞に導入でき、外来ＤＮＡの配列および染色体配列によって、この過程を、ＨＬＡ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子における欠損を矯正するかまたはｗｔ  ＨＬＡ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子へこのような欠損を導入し、そうしてＨＬＡまたはＴＣＲの発現を減少させるのに使用できる。
【１３７６】
ＨＬＡまたはＴＣＲにおける配列に特異的なＴＡＬＥＮを、モジュラー成分を使用する多様なスキームを含む、当分野で知られる任意の方法を使用して構築できる。Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29:149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6:e19509。
【１３７７】
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
“ＺＦＮ”または“亜鉛フィンガーヌクレアーゼ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＺＦＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＺＦＮ”は、ＨＬＡ遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである亜鉛フィンガーヌクレアーゼである。
【１３７８】
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(またはその誘導体)を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１個以上の亜鉛フィンガーを含む。Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782；およびKim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160。
【１３７９】
亜鉛フィンガーは、１個以上の亜鉛イオンにより安定化された小タンパク質構造モチーフである。亜鉛フィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含み、約３bp配列を認識できる。既知特異性の多様な亜鉛フィンガーを組み合わせて、約６bp、９bp、１２bp、１５bpまたは１８bp配列を認識する多フィンガーポリペプチドを産生できる。ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッド系、細菌ワンハイブリッドおよびツーハイブリッド系および哺乳動物細胞を含む、特異的配列を認識する亜鉛フィンガー(およびこれらの組み合わせ)を産生する多様な選択およびモジュラー組立技術が入手可能である。
【１３８０】
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡを切断するために二量体化しなければならない。それゆえに、非パリンドロームＤＮＡ部位を標的とするためにＺＦＮの対が必要である。２個の個々のＺＦＮは、適切な間隔のそれらのヌクレアーゼにより、ＤＮＡの逆鎖に結合するはずである。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10570-5。
【１３８１】
またＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮはＤＮＡに二本鎖切断を作ることができ、これは、不適切に修復されたらフレームシフト変異を作り、細胞におけるＨＬＡおよび／またはＴＣＲの発現および量を減少させる。ＺＦＮはまたＨＬＡ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子を変異するための相同組換えと共に使用できる。
【１３８２】
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲの配列に特異的なＺＦＮは、当分野で知られる任意の方法を使用して構築できる。Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16:1200-7;およびGuo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400:96.
【１３８３】
ＮＫ細胞
ある態様において、細胞はナチュラルキラー細胞である。これらの細胞を患者から単離できる。ある態様において、細胞は、ナチュラルキラー細胞の安定な細胞株、例えば、Conkwestから入手可能な安定な同種ＮＫ−９２細胞株である。これらの安定なＮＫ−９２細胞株は、Gong et al  (April 1994), Leukemia Macmillan Press, Ltd, 8: 652-658に記載され、本明細書に引用により包含させるＥＰ１００７６３０に開示された方法を使用して、得て、遺伝子導入し、培養したＮＫ−９２細胞に由来した。ＮＫ−９２細胞株と類似する特性を有するＮＫ細胞株も使用できる。ある態様において、個体の循環血からのＮＫ細胞をアフェレシスにより得る。ある態様において、ＮＫ細胞をＲＣＡＲを発現するように操作し、これらの操作したＲＣＡＲＮ細胞を、ＮＫ細胞を単離した患者以外の患者の処置に使用できる。それゆえに、これらのＲＣＡＲＮ細胞は、有害作用なしに複数患者に投与できる点で、“普遍的”細胞である。すなわち、ＮＫ細胞を、ある患者から単離し、ＲＣＡＲを発現するように操作し、それにより産生したＲＣＡＲＮ細胞およびこれらのＲＣＡＲＮ細胞を同じまたは異なる患者に投与できるというべきである。ＮＫ細胞、例えば、ＮＫ−９２細胞はキラー阻害受容体を発現せず、それゆえに回避している癌細胞により不活性化され得ない。ＮＫ細胞(例えば、非ホジキンリンパ腫を有する患者からの末梢血単核細胞由来のＮＫ−９２細胞株または類似のＮＫ細胞株)の単離方法および使用方法は記載されている(Zhang et al (2013) Retargeting NK-92 for anti-melanoma activity by a TCR-like single domain antibody; Immunol Cell Biol. 91: 615-624; Tonn et al. (2013) Treatment of patients with advanced cancer with the natural killer cell-line NK-92, Cytotherapy, 15: 1563-1570参照)。
【１３８４】
ＮＫ−９２細胞株は、ＣＤ５６高、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ１  ｌａ、ＣＤ２８、ＣＤ４５およびＣＤ５４表面マーカーを発現することが判明した。さらにＣＤ１、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ  １６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３およびＣＤ３４マーカーを提示しない。培養におけるＮＫ−９２細胞の増殖は組み換えインターロイキン２(ｒＩＬ−２)依存性であり、１０IU／mLほどの低用量が増殖維持に十分である。類似の特性を有するＮＫ細胞株も使用できる。
【１３８５】
ＮＫ−９２細胞は、ウシ胎児血清(例えば、１２  ５％で、Sigma Chemical Co.,St Louis, MO)およびウマ血清(例えば、１２.５％、(Sigma Chemical Co.,St Louis,MO)添加富化アルファ最小必須培地(ＭＥＭ、Sigma Chemical Co. St Louis,MO)のような培養培地で容易に維持できる。先ず、１０Ｍヒドロコルチゾンが必要であるが、その後の継代で、ヒドロコルチゾンを省き得る。さらに、組み換えヒトＩＬ−２(５００Ｕ／mL、Chiron,Emeryville,CA)のようなＩＬ−２が長期増殖に必要である。懸濁培養をこの方式で半週毎に培地を交換して維持したとき、細胞は約２４時間の倍加時間を示す。
【１３８６】
インビトロでＮＫ−９２細胞は広範な悪性標的細胞に対する溶解性活性を示す。これらは、急性および慢性リンパ芽球性および骨髄性白血病、リンパ腫、骨髄腫、黒色腫のような循環標的細胞ならびに前立腺癌、神経芽腫および乳癌細胞株のような固形腫瘍からの細胞由来の細胞株を含む。
【１３８７】
他の免疫エフェクター細胞
他の態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｂ細胞、肥満細胞をいくらでも単離し、ＲＣＡＲを発現するように操作し得る。骨髄球性由来貪食細胞、ＮＫＴ細胞またはγδＴ細胞。代表的免疫エフェクター細胞を図８に挙げる。
【１３８８】
Ｔ細胞の活性化および拡張
ある態様において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞、例えば、米国特許６,３５２,６９４号；６,５３４,０５５号；６,９０５,６８０号；６,６９２,９６４号；５,８５８,３５８号；６,８８７,４６６号；６,９０５,６８１号；７,１４４,５７５号；７,０６７,３１８号；７,１７２,８６９号；７,２３２,５６６号；７,１７５,８４３号；５,８８３,２２３号；６,９０５,８７４号；６,７９７,５１４号；６,８６７,０４１号；および米国出願公開公報２００６０１２１００５号に記載の方法を使用して、一般に活性化および増殖できる。
【１３８９】
ある態様において、Ｔ細胞を、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激する、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルおよびリガンドを刺激する薬剤が結合した表面と接触させることにより、増殖させ得る。Ｔ細胞において、共刺激分子は、共刺激リガンドと結合し、Ｔ細胞における共刺激応答を仲介する、Ｔ細胞上の結合パートナー、すなわち、ＭＨＣクラスＩ分子、例えば、ＣＤ２８である。特に、Ｔ細胞集団を、ここに記載するように、例えば、表面上に固定化された抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントまたは抗ＣＤ２抗体と接触させることによるまたはカルシウムイオノフォアと合わせたタンパク質キナーゼＣアクティベーター(例えば、ブリオスタチン)と接触させることにより刺激し得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子(例えば、ＣＤ３)の刺激のために、アクセサリー分子と結合するリガンドを使用する。Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の刺激性増殖に適する条件下、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で増殖できる。ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ８＋  Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用する。抗ＣＤ２８抗体の例は９.３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８を含む(Diaclone, Besancon, France(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。
【１３９０】
ある態様において、Ｔ細胞のための一次活性化シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコールにより提供され得る。例えば、例えば、各シグナルを提供する薬剤は溶液中にあるかまたは表面に結合する。表面に結合するとき、これらの薬剤は、同じ表面(すなわち、“ｃｉｓ”形態)または別の表面(すなわち、“ｔｒａｎｓ”形態)に結合し得る。あるいは、一方の薬剤が表面に結合し、他方の薬剤が溶液中にあってよい。ある態様において、共刺激シグナルを提供する薬剤が細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤が溶液中にあるかまたは表面に結合する。ある態様において、いずれの薬剤も溶液中にあり得る。一つの面において、薬剤は可溶性形態であってよく、そうしてＦｃ受容体または抗体または薬剤に結合するであろう他の結合剤を発現する細胞のような表面と架橋する。これに関して、例えば、例えば、Ｔ細胞の活性化および増殖への使用が考慮される、人工抗原提示細胞(ａＡＰＣ)について、米国特許出願公開２００４０１０１５１９号および２００６００３４８１０号を参照。
【１３９１】
ある態様において、２個の薬剤は、ビーズに、同じビーズに、すなわち、“ｃｉｓ”にまたは別のビーズに、すなわち、“ｔｒａｎｓ”に固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合フラグメントであり、両薬剤が、当分子量で同じビーズに共固定化される。ある態様において、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖およびＴ細胞増殖のためのビーズに結合した各抗体の１：１比を使用する。ある態様において、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１：１比の使用で見られる増殖と比較して、Ｔ細胞増殖の増加が見られるように使用する。ある態様において、１：１の比を使用して見られる増殖と比較して、約１〜約３倍の増加が観察される。ある態様において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１〜１：１００およびその間の全整数値の範囲である。ある態様において、抗ＣＤ３抗体より多い抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合しており、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比は１未満である。ある態様において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体の比は２：１より大きい。ある態様において、ビーズに結合した１：１００  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある態様において、ビーズに結合した１：７５  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。さらなる態様において、ビーズに結合した１：５０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある態様において、ビーズに結合した１：３０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある態様において、ビーズに結合した１：１０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。他の態様において、ビーズに結合した１：３  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。さらに他の態様においてビーズに結合した３：１  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。
【１３９２】
１：５００〜５００：１およびその間の任意の整数値の粒子対細胞比を使用して、Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激できる。当業者は容易に認識できるように、粒子対細胞の比は、標的細胞に対する粒子径に依存し得る。例えば、小型ビーズは数個の細胞しか結合できないが、大型ビーズは多数結合できる。ある態様において、粒子対細胞の比は、１：１００〜１００：１およびその間の任意の整数値の範囲であり、さらなる態様において該比は１：９〜９：１を含み、その間の任意の整数値もＴ細胞の刺激に使用できる。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合粒子対Ｔ細胞の比は上記のとおり変わり得るが、しかしながらある好ましい値は１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１および１５：１を含み、一つの好ましい比は、少なくとも１：１粒子対Ｔ細胞である。ある態様において、１：１以下の粒子対細胞の比を使用する。ある特定の態様において、好ましい粒子：細胞比は１：５である。さらなる態様において、粒子対細胞の比は、刺激の日により変わり得る。例えば、ある態様において、粒子対細胞の比は、一日目は１：１〜１０：１であり、１：１〜１：１０の最終比まで、さらなる粒子を、その後１０日目まで連日または隔日に細胞に添加する(添加日の細胞数に基づく)。ある特定の態様において、粒子対細胞の比は、刺激一日目は１：１であり、刺激３日目および４日目に１：５に調節する。ある態様において、粒子を、刺激一日目の１：１から３日目および４日目１：５の最終比まで、連日または隔日で添加する。ある態様において、粒子対細胞の比は、刺激一日目に２：１であり、刺激３日目および４日目は１：１０である。ある態様において、粒子を、一日目の１：１から刺激３日目および４日目の１：１０の最終比まで、連日または隔日で添加する。多様な他の比が、本発明における使用に適当であり得ることを当業者は認識する。特に、比は、粒子径ならびに細胞のサイズおよびタイプに依存する。ある態様において、使用するための最も典型的な比は、一日目の１：１、２：１および３：１の付近である。
【１３９３】
さらなる態様において、細胞、例えば、Ｔ細胞を薬剤被覆ビーズと組み合わせ、ビーズと細胞を続いて離し、その後細胞を培養する。別の態様において、培養前に、薬剤被覆ビーズおよび細胞を離さず、一緒に培養する。さらなる態様において、ビーズおよび細胞を、磁力のような力の適用によりまず濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘発する。
【１３９４】
例として、細胞表面タンパク質を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合した常磁性ビーズ(３×２８ビーズ)をＴ細胞と接触させることにより、ライゲートさせ得る。ある態様において、細胞(例えば、１０４〜１０９Ｔ細胞)およびビーズ(例えば、DYNABEADS(登録商標)Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズ、１：１比)  を緩衝液中、例えばＰＢＳ(カルシウムおよびマグネシウムのような二価カチオンを含まない)中で合わせる。再び、当業者は、任意の細胞濃度を使用し得ることを認識する。例えば、標的細胞はサンプルに非常に稀であり、サンプルの０.０１％しか含まれないかもしれないし、全サンプル(すなわち、１００％)が興味ある標的細胞で構成されているかもしれない。ある態様において、細胞と粒子の最大接触を確実にするために、粒子および細胞を混ぜ合わせる体積を顕著に減少させる(すなわち、細胞の濃度を増加させる)ことが望ましいことがある。例えば、ある態様において、約２０億細胞／mlの濃度を使用する。ある態様において、１億細胞／ml超を使用する。さらなる態様において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万細胞／mlの細胞の濃度を使用する。さらに別の態様において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの細胞の濃度を使用する。さらなる態様において、１億２５００万または１億５０００万細胞／mlの濃度を使用できる。高濃度の使用は、細胞収率、細胞活性化および細胞増殖の増加をもたらし得る。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような興味ある標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕獲を可能とする。このような細胞の集団は治療価値を有し得て、ある態様において得ることが望まれる。例えば、高細胞濃度を使用して、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋  Ｔ細胞のより効率的な選択を可能とする。
【１３９５】
ある態様において、混合物を数時間(約３時間)〜約１４日またはその間に入る任意の整数値の時間単位、培養し得る。ある態様において、混合物を２１日培養し得る。ある態様において、ビーズおよびＴ細胞を、約８日共培養する。ある態様において、ビーズおよびＴ細胞を２〜３日一緒に培養する。Ｔ細胞の培養時間を６０日以上にできるように、数サイクルの刺激も望まれ得る。Ｔ細胞培養に適する条件は、適切な媒体(例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ  １５(Lonza))を含み、これは、血清(例えば、ウシ胎児またはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦ−βおよびＴＮＦ−αまたは当業者に知られる細胞増殖のための任意の他の添加物を含む、増殖および生存能に必要な因子を含み得る。細胞増殖のための他の添加物は、界面活性剤、プラスマネートならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールのような還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−ｖｉｖｏ  １５およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得て、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミン類が添加され、無血清であるか、または適切な量の血清(または血漿)または定義されたセットのホルモンおよび／またはＴ細胞の増殖および拡大に十分な量のサイトカインが添加されている。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは実験的培養にしか添加せず、対象に注入する細胞の培養には添加しない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件下、例えば、適切な温度(例えば、３７℃)および雰囲気(例えば、空気＋５％ＣＯ２)に維持する。
【１３９６】
様々な回数刺激に曝されたＴ細胞は異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレシスした末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団(ＴＣ、ＣＤ８＋)より大きなヘルパーＴ細胞集団(ＴＨ、ＣＤ４＋)を有する。ＣＤ３およびＣＤ２８受容体刺激によるＴ細胞のエクスビボ増殖は、約８〜９日目の前までは主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を生じるが、約８〜９日目の後、Ｔ細胞の集団は、大きくなり続けるＴＣ細胞の集団を含む。したがって、処置の目的によって、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することは有益であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されていたら、このサブセットをよりいっそう拡大することが有益であり得る。
【１３９７】
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、細胞増殖過程の経過中に他の表現型マーカーが顕著に、しかし大部分、再生可能に変わる。それゆえに、このような再現性は、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物を仕立てる能力を可能とする。
【１３９８】
適切なインビトロおよび動物モデルで、多様なアッセイを使用して、抗原刺激後Ｔ細胞を拡大させる能力、再刺激非存在下にＴ細胞増殖を持続する能力および抗癌活性のような、しかし、これらに限定されない、ＲＣＡＲ分子の活性を評価できる。ＲＣＡＲ、例えば、ＥＧＦＲｖIII  ＲＣＡＲの効果を評価するためのアッセイを下にさらに詳述する。
【１３９９】
一次Ｔ細胞におけるＲＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析を、ＣＡＲについて公開された方法を使用してその存在の検出できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。極めて簡単にいうと、ＲＣＡＲを発現するＴ細胞(ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の１：１混合物)を、１０日を超えてインビトロで拡大させ、続いて溶解し、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。完全長ＴＣＲ−ζ細胞質ドメインおよび内在性ＴＣＲ−ζ鎖を含むＲＣＡＲを、ＴＣＲ−ζ鎖に対する抗体を使用するウェスタンブロッティングにより検出する。同じＴ細胞サブセットを、共有結合二量体形態の評価を可能とするために、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に使用する。
【１４００】
抗原刺激後のＲＣＡＲ＋  Ｔ細胞(すなわち、ＲＣＡＲＴ細胞)のインビトロ増幅増殖を、フローサイトメトリーで測定できる。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の混合物をαＣＤ３／αＣＤ２８  ａＡＰＣで刺激し、続いて解析するプロモーターの制御下にＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを形質導入する。代表的プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。ＧＦＰ蛍光を、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットの培養６日目にフローサイトメトリーにより評価する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009参照)。
【１４０１】
あるいは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の混合物を、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、２Ａリボソームスキッピング配列を使用して、ＲＣＡＲをｅＧＦＰと共に発現するバイシストロン性レンチウイルスベクターを使用して１日目にＲＣＡＲで形質導入する。培養を、例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の存在下、ＲＣＡＲ構築物で再刺激し、洗浄する。外来ＩＬ−２を、１００ＩＵ／mlで隔日に培養に添加する。ＧＦＰ＋  Ｔ細胞を、ビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーにより数え上げる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。
【１４０２】
再刺激非存在下の持続したＲＣＡＲ＋  Ｔ細胞増殖も測定できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡単にいうと、平均Ｔ細胞体積(ｆｌ)を、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、記載するＲＣＡＲを１日目に形質導入後、Coulter Multisizer III粒子カウンターを使用して培養８日目に測定する。
【１４０３】
細胞増殖およびサイトカイン産生の評価は、先に、例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)に記載されている。簡単にいうと、ＲＣＡＲ増殖の評価を、洗浄したＴ細胞と、腫瘍抗原、例えば、ＥＧＦＲｖIIIまたはＥＧＦＲ野生型(ｗｔ)を発現するＵ８７ＭＧ、ＢＨＫまたはＣＨＯ細胞またはＣＤ３２およびＣＤ１３７(ＫＴ３２−ＢＢＬ)のような標的細胞を、最終Ｔ細胞：標的細胞比が１：１となるように混合することにより、マイクロタイタープレートで実施する。抗ＣＤ３(クローンＯＫＴ３)および抗ＣＤ２８(クローン９.３)モノクローナル抗体を、ＫＴ３２−ＢＢＬ細胞の培養に添加し、これらのシグナルがエクスビボでの長期ＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖を支持するため、Ｔ細胞増殖の陽性対照として役立たせる。製造業者が記載するとおりにCountBrightTM蛍光ビーズ(Invitrogen, Carlsbad, CA)およびフローサイトメトリーを使用して、Ｔ細胞を培養において数え上げる。ＲＣＡＲ＋  Ｔ細胞を、ｅＧＦＰ−２Ａ連結ＲＣＡＲ発現発現レンチウイルスベクターで操作したＴ細胞を使用して、ＧＦＰ発現により同定する。ＧＦＰを発現しないＲＣＡＲ＋  Ｔ細胞について、ＲＣＡＲ＋  Ｔ細胞をビオチニル化組み換えタンパク質、例えば、ＥＧＦＲｖIIIおよび二次アビジン−ＰＥコンジュゲートにより検出する。Ｔ細胞上のＣＤ４＋およびＣＤ８＋発現も、特異的モノクローナル抗体(BD Biosciences)により同時に検出する。サイトカイン測定を、製造業者の指示に従い、ヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカイン細胞数測定ビーズアレイキット(BD Biosciences, San Diego, CA)を使用して、再刺激２４時間後に回収した上清で実施する。蛍光をFACScaliburフローサイトメーターを使用して評価し、製造業者の指示に従いデータを解析する。
【１４０４】
標準５１Ｃｒ放出アッセイにより、細胞毒性を評価できる。例えば、ilone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡単にいうと、標的細胞(例えば、Ｕ８７ＭＧ、ＢＨＫまたはＣＨＯ  ＲＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＥＧＦＲｖIIIまたはＥＧＦＲ野生型(ｗｔ))に、５１Ｃｒ(ＮａＣｒＯ４として、New England Nuclear, Boston, MA)を、３７℃で２時間、頻繁に撹拌しながら充填し、完全ＲＰＭＩで洗浄し、マイクロタイタープレートに播種する。エフェクターＴ細胞を、標的細胞と、ウェル中、完全ＲＰＭＩ中で、種々のエフェクター細胞：標的細胞(Ｅ：Ｔ)比で混合する。さらに培地のみ(自然放出、ＳＲ)またはｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００洗剤１％溶液(総放出、ＴＲ)を含むウェルも調製する。３７℃で４時間インキュベーション後、各ウェルからの上清を回収する。次いで、ガンマ粒子カウンター(Packard Instrument Co., Waltham, MA)を使用して、遊離５１Ｃｒを測定する。各条件を少なくとも３回実施し、溶解パーセンテージを式：溶解％＝(ＥＲ−ＳＲ)／(ＴＲ−ＳＲ)(式中、ＥＲは各実験条件で放出した平均５１Ｃｒである)を使用して計算する。フローベースの細胞毒性アッセイのような代替細胞毒性アッセイも使用し得る。ここの実施例セクションに記載するものならびに当分野で知られるものを含む他のアッセイも、ＲＣＡＲ構築物の評価に使用できる。
【１４０５】
標的発現疾患および障害の治療的適用
癌抗原発現細胞集団、例えば、ＥＧＦＲｖIII発現細胞集団における癌の増殖を阻止するまたは減少する方法をここに提供する。ある態様において、ＲＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(すなわち、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞、ＲＣＡＲＮ細胞など)は、細胞および／または癌細胞の分量、数、量またはパーセンテージを、陰性対照と比較して、抗原発現細胞と関係する癌を有する対象において少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％または少なくとも９９％減少させる。ある態様において、対象は、ヒトである。
【１４０６】
ここに開示する方法は、ＲＣＡＲを発現するように遺伝子修飾したＴ細胞および得られたＣＡＲＸ細胞(すなわち、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞、ＲＣＡＲＮ細胞など)を、それを必要とするレシピエントに注入する、一種の細胞療法を含む。注入したＲＣＡＲＸ細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を殺すかまたは阻害することができる。抗体療法と異なり、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴはインビボで複製でき、持続した腫瘍制御に至り得る長期残留性を生じる。多様な態様において、患者に投与したＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞またはその子孫は、患者へのＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞投与後、患者に少なくとも４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年または５年残留する。
【１４０７】
何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞により誘発される抗癌免疫応答は、能動性または受動性免疫応答であってよく、あるいは直接対間接免疫応答によるものであり得ると考えられる。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞は、標的抗原を発現するヒト癌細胞に応答して特異的炎症誘発性サイトカイン分泌および強力な細胞溶解性活性を示し、可溶性ＲＣＡＲ阻害に提供し、バイスタンダー致死を仲介し、そして確立されたヒト腫瘍の退行を仲介する。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞は、エクスビボ免疫化および／または哺乳動物におけるインビボ療法のための１種のワクチンであり得る。ある態様において、哺乳動物は、ヒトである。
【１４０８】
ある態様において、エクスビボ免疫化に関し、哺乳動物に細胞を投与する前に、インビトロで次のｉ)細胞の増殖、ii)ＲＣＡＲをコードする核酸の細胞への導入またはiii)ＲＣＡＲＸ細胞の凍結保存の少なくとも１つが起こる。エクスビボ手順は当分野で周知であり、下により詳細に記載する。簡単にいうと、細胞を哺乳動物(例えば、ヒト)から単離し、ここに開示されるＲＣＡＲを発現するベクターで遺伝的に修飾(すなわち、インビトロ形質導入または遺伝子導入)する。得られたＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を、哺乳動物レシピエントに投与して、治療効果を提供できる。哺乳動物レシピエントはヒトであってよく、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞に関して自己であり得る。あるいは、細胞は、レシピエントに関して同種、同系または異種であり得る。
【１４０９】
造血幹細胞および前駆細胞のエクスビボ増殖手順は、本明細書に引用により包含させる米国特許５,１９９,９４２号に記載され、本発明の細胞に適用できる。他の適当な方法が当分野で知られ、それゆえにここに開示される方法、細胞のエクスビボ増殖の何らかの特定の方法に限定されない。簡単にいうと、Ｔ細胞のエクスビボ培養および増殖は、(１)哺乳動物からの末梢血収集物または骨髄外植体からのＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞の回収；および(２)このような細胞のエクスビボでの増殖を含む。米国特許５,１９９,９４２号に記載されている細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドのような他の因子を細胞の培養および増殖に使用できる。
【１４１０】
エクスビボ免疫化の点で、細胞ベースのワクチンの使用に加えて、本発明はまた、患者における抗原に向けられた免疫応答を惹起するための、インビボ免疫化のための組成物および方法も提供する。
【１４１１】
一般に、ここに記載のように活性化および増殖させた細胞を、免疫無防備状態である個体で生じる疾患の処置および予防に使用できる。特に、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を、腫瘍抗原の発現と関係する疾患、障害および状態の処置に使用できる。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を、腫瘍抗原の発現と関係する疾患、障害および状態を発症するリスクのある患者の処置に使用する。それゆえに、本開示は、腫瘍抗原の発現と関係する疾患、障害および状態を処置または予防する方法であって、それを必要とする対象に、ＲＣＡＲＸ修飾細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。
【１４１２】
ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞は単独でまたは希釈剤および／またはＩＬ−２または他のサイトカインもしくは細胞集団のような他の成分と組み合わせて医薬組成物として投与し得る。。
【１４１３】
再指示スイッチ切り替え可能な阻害剤受容体での処置のための適応症
一つの面において、本発明は、癌性腫瘍の増殖が阻止されるように、ＰＤ１  ＣＡＲを使用するインビボでの対象の処置に関する。ＰＤ１  ＣＡＲを単独で使用して、癌性腫瘍の増殖を阻止し得る。あるいは、ＰＤ１  ＣＡＲを、他のＣＡＲ、免疫原剤、標準癌処置または他の抗体と組み合わせて使用し得る。
【１４１４】
他の面において、対象を処置する、例えば、対象における過増殖性状態または障害(例えば、癌)、例えば、固形腫瘍、軟組織腫瘍または転移病変を減少または改善する方法を提供する。ここで使用する用語“癌”は、病理組織学的タイプまたは侵襲性と無関係に、癌性増殖または発癌性過程、転移組織または悪性に形質転換した細胞、組織または臓器の全タイプを含む。固形腫瘍の例は、肝臓、肺、乳房、リンパ系、消化器(例えば、結腸)、尿生殖器管(例えば、腎臓、尿路上皮細胞)、前立腺および咽頭を冒すもののような、種々の臓器系の悪性腫瘍、例えば、肉腫、腺癌および癌を含む。腺癌は、ほとんどの結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌、肝臓癌、肺非小細胞癌、小腸癌および食道癌のような、悪性腫瘍である。一つの態様において、癌は黒色腫、例えば、進行期黒色腫である。前記癌の転移病変も、本発明の方法および組成物を使用して処置または予防できる。処置できる他の癌の例は、骨の癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、ファロピウス管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸の癌、膣の癌、外陰の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、急性骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む慢性または急性白血病、小児の固形腫瘍、リンパ性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓または輸尿管の癌、腎盂の癌、中枢神経系(ＣＮＳ)の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄の腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘発されるものを含む環境誘発癌および該癌の組み合わせを含む。転移癌、例えば、ＰＤ−Ｌ１を発現する転移癌(Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144)は、ここに記載する抗体分子を使用して有効であり得る。
【１４１５】
増殖を阻害できる代表的癌は、概して免疫療法に応答性の癌を含む。処置のための癌の非限定的例は、黒色腫(例えば、転移悪性黒色腫)、腎臓癌(例えば明細胞癌)、前立腺癌(例えばホルモン難治性前立腺腺癌)、乳癌、結腸癌および肺癌(例えば非小細胞性肺癌)を含む。さらに、難治性または再発性性腫瘍をここに記載する分子を使用して処置できる。一つの態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞の投与と関係する副作用を軽減または改善する薬剤を投与され得る。ＣＡＲ発現細胞の投与と関係する副作用は、ＣＲＳおよびマクロファージ活性化症候群(ＭＡＳ)とも呼ぶ血球貪食性リンパ組織球症(ＨＬＨ)である。ＣＲＳの症状は、高熱、悪心、一過性低血圧、低酸素症などを含む。ＣＲＳは、発熱、疲労、摂食障害、筋肉痛、関節痛(arthalgias)、悪心、嘔吐および頭痛のような臨床構成上の徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、発疹のような臨床的皮膚徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、悪心、嘔吐および下痢のような臨床的消化器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頻呼吸および低酸素血症のような臨床的呼吸器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頻脈、脈圧拡大、低血圧、心拍出量増加(早期)および潜在的心拍出量低下(後期)のような臨床的心血管徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、高ｄ−二量体、出血を伴うまたは伴わない低フィブリノーゲン血症のような、臨床的凝固徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、高窒素血症のような臨床的腎臓徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、高トランスアミナーゼ血症および高ビリルビン血症のような臨床的肝臓徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頭痛、精神状態変化、混乱、譫妄、換語困難または明らかな失語症、幻覚、振戦、測定障害(dymetria)、歩調変化および発作のような臨床的神経徴候および症状を含み得る。
【１４１６】
したがって、ここに記載する方法は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を対象に投与し、さらにＣＡＲ発現細胞での処置の結果としての可溶性因子レベル上昇を管理する１個以上の薬剤を投与することを含む。一つの態様において、対象で上昇する可溶性因子は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２およびＩＬ−６の１個以上である。ある態様において、対象で上昇する因子は、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびフラクタルカイン(fraktalkine)の１個以上である。それゆえに、この副作用を処置するために投与する薬剤は、これらの可溶性因子の１個以上を中和する薬剤である。一つの態様において、これらの可溶性形態の１個以上を中和する薬剤は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。このような薬剤の例は、ステロイド(例えば、コルチコステロイド)、ＴＮＦ−α阻害剤およびＩＬ−６阻害剤である。ＴＮＦ−α阻害剤の例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴールおよびゴリムマブのような抗ＴＮＦ−α抗体分子である。ＴＮＦ−α阻害剤の他の例は、エタネルセプト(entanercept)のような融合タンパク質である。小分子ＴＮＦ−α阻害剤は、キサンチン誘導体(例えばペントキシフィリン)およびブプロピオンを含むが、これらに限定されない。ＩＬ−６阻害剤の例は、トシリズマブ(toc)、サリルマブ、エルシリモマブ、CNTO 328、ALD518/BMS-945429、CNTO 136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301およびFM101のような抗ＩＬ−６抗体である。一つの態様において、抗ＩＬ−６抗体分子はトシリズマブである。ＩＬ−１Ｒベースの阻害剤の例はアナキンラである。
【１４１７】
医薬組成物および処置
医薬組成物は、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞またはＲＣＡＲＮ細胞を、１個以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または添加物とともに含み得る。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などのような緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールのような炭水化物；タンパク質；グリシンのようなポリペプチドまたはアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート剤；アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)；および防腐剤を含み得る。ある態様において、医薬組成物は静脈内投与用に製剤される。
【１４１８】
医薬組成物は、処置(または予防)する疾患に適する方法で投与し得る。投与の量および頻度は患者の状態および患者の疾患のタイプおよび重症度のような因子により決定するが、適切な投与量は臨床試験により決定し得る。
【１４１９】
“免疫学的有効量”、“抗癌有効量”、“癌阻止有効量”または“治療量”が示されるとき、投与すべき本発明の組成物の厳密な量は、年齢、体重、疾患状態、例えば、腫瘍サイズ、感染または転移の程度および患者(対象)の状態の個々の差異を考慮して、医師が決定できる。ある態様において、ここに記載するＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を含む医薬組成物は、範囲内の全整数値を含み、１０４〜１０９細胞／kg体重、ある例において１０５〜１０６細胞／kg体重の投与量で投与し得る。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与し得る。
【１４２０】
ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴを、治療レベルまで活性化および増殖し、免疫療法において通常知られる注入法を使用して投与できる(例えば、Rosenberg et al.,New Eng. J. of Med. 319:1676,1988参照)。特定の患者のための最適投与量および処置レジメは、医薬の当業者により、患者を疾患の徴候についてモニタリングし、それに応じて処置を調節することにより決定できる。
【１４２１】
ある態様において、１個以上のスイッチドメインを含むＲＣＡＲを有するＲＣＡＲＸ細胞は、二量体化分子、例えば、小分子ヘテロ二量体化分子、例えば、ＲＡＤ００１またはＡＰ２１９６７の存在下、免疫エフェクター応答を促進する細胞内シグナルを産生する。
【１４２２】
二量体化分子の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注または移植を含む、任意の好都合な方法で実施できる。ある態様において、二量体化分子を、患者に経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内(ｉ.ｖ.)注射によりまたは腹腔内に投与し得る。ある態様において、二量体化分子を経口で、例えば、錠剤の形で投与する。ある態様において、二量体化分子を皮内または皮下注射により投与する。ある態様において、二量体化分子をｉ.ｖ.注射により投与する. 
【１４２３】
ある態様において、二量体化分子をＲＣＡＲＸ細胞後に投与する、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞は、患者に注入されている。一つの態様において、二量体化分子を、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を患者に注入した１日後に投与する。一つの態様において、二量体化分子を、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を患者に注入した、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１,２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日または３０日後に投与する。ある態様において、二量体化分子を、ＲＣＡＲＸ細胞の投与後、例えば、１時間目または後、２時間目または後、３時間目または後、４時間目または後、５時間目または後、６時間目または後、７時間目または後、８時間目または後、９時間目または後、１０時間目または後、１１時間目または後、１２時間目または後、１６時間目または後、１７時間目または後、１８時間目または後、１９時間目または後、２０時間目または後、２１時間目または後、２２時間または２３時間目または後またはＲＣＡＲＸ細胞投与後１日目または後、２日目または後、３日目または後、４日目または後、５日目または後、６日目または後、７日目または後または８日日目または後に投与する。一つの態様において、二量体化分子を、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞が患者に注入された後、例えば、患者のために合わせた投薬スケジュールに基づき１回を超えて投与し、例えば、週に２回、毎週、毎月、６月毎、毎年基本の二量体化分子の投与に基づき１回を超えて投与する。ある態様において、二量体化分子の投与は連日、隔日、週に２回または毎週であるが、ある態様において、毎週、５mg、１０mg、１５mg、２０mg、３０mg、４０mgまたは５０mgを超えない。ある態様において、二量体化分子を連続的に、例えばポンプ、例えば、装着可能ポンプの使用により投与する。ある態様において、連続的投与は、少なくとも４時間、１２時間、２４時間、２日、３日、４日または５日続く。ある態様において、ＦＫＢＰ−ＦＲＢヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、２４時間期間で約０.５mgを超えない用量で投与する。
【１４２４】
ある態様において、二量体化分子を、ＲＣＡＲＸ細胞の投与と同じとき、例えば、同じ日に投与する。
【１４２５】
ある態様において、二量体化分子投与後、癌の減少についての患者をモニターする。癌が再出現したならば、二量体化分子をそのとき投与できる。ある態様において、対象は、例えば、毎週または毎月の間隔でまたは必要であるとの決定により、さらなるまたは続く、例えば、第二、第三または第四、ＲＣＡＲＴ細胞注入を受ける。ある態様において、続く投与は、二量体化分子の投与を伴うか、それに先立つ。ある態様において、ＲＣＡＲＸまたは二量体化分子の続く投与は、例えば、腫瘍負荷がなくなるまで、さらなる利益が認知されなくなるまでまたは予め選択した基準に合うまで続ける。ある態様において、ここに開示する方法は、細胞療法の投与を含み、ここで、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように遺伝子修飾されている。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、それを必要とするレシピエントに注入する。注入した細胞はレシピエント内の腫瘍細胞を殺すことが可能であるが、二量体化分子の存在下のみである。さらに、二量体化分子の存在下、ＲＣＡＲＴ細胞は、標的抗原との結合によりインビボで増殖および複製し、これにより持続した腫瘍制御がもたらされる。腫瘍細胞死滅の間のサイトカイン放出を血清で測定できる。この増幅およびサイトカイン産生を、通常の採血と続くＣＡＲ発現および血清サイトカインレベルの分析により患者で測定できる。この方法はまた機能的ＲＣＡＲＴ細胞集団を維持するために、二量体化分子の投与戦略を修飾する方法を当業者に知らせる。二量体化分子の投与を、腫瘍負荷が減少している限り続けることが企図される。
【１４２６】
二量体化分子の投与量は、使用する二量体化分子のタイプおよび個々の二量体化分子のＰＫ特性による。
【１４２７】
ここでまた提供されるのは、約０.００５〜１.５mg、約０.００５〜１.５mg、約０.０１〜１mg、約０.０１〜０.７mg、約０.０１〜０.５mgまたは約０.１〜０.５mg濃度のＦＫＢＰ−ＦＲＢヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を含む組成物である。さらなる面において、本発明は、０.００５〜１.５mg、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１mg、０.０１〜０.７mg、０.０１〜０.５mgまたは０.１〜０.５mgの濃度でＦＫＢＰ−ＦＲＢヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を含む組成物を提供する。より具体的に、一つの面において、本発明は、約０.００５mg、０.００６mg、０.００７mg、０.００８mg、０.００９mg、０.０１mg、０.０２mg、０.０３mg、０.０４mg、０.０５mg、０.０６mg、０.０７mg、０.０８mg、０.０９mg、０.１mg、０.２mg、０.３mg、０.４mg、０.５mg、０.６mg、０.７mg、０.８mg、０.９mgまたは１.０mgの用量でＦＫＢＰ−ＦＲＢヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を含む組成物を提供する。一つの面において、ＦＫＢＰ−ＦＲＢヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１は、０.５mg以下の用量である。さらに別の面において、ＦＫＢＰ−ＦＲＢヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１約０.５mgの用量である。さらなる面において、本発明は、０.００５mg、０.００６mg、０.００７mg、０.００８mg、０.００９mg、０.０１mg、０.０２mg、０.０３mg、０.０４mg、０.０５mg、０.０６mg、０.０７mg、０.０８mg、０.０９mg、０.１mg、０.２mg、０.３mg、０.４mg、０.５mg、０.６mg、０.７mg、０.８mg、０.９mgまたは１.０mgの用量でＦＫＢＰ−ＦＲＢヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を含む組成物を提供する。一つの面において、ＦＫＢＰ−ＦＲＢヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１は、０.５mg以下の用量である。さらに別の面において、ＦＫＢＰ−ＦＲＢヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１は０.５mgの用量である。さらなる面において、本発明は、ＲＡＤ００１について明記した特定の量または用量と生物学的に同等である量で、ＲＡＤ００１ではないラパマイシンまたはラパマイシン類似体を含む組成物に関する。さらなる面において、本発明は、ＮＦＡＴ活性化、腫瘍細胞死滅またはサイトカイン産生で測定して、標的結合後ＲＣＡＲＴ活性化を促進するのに十分な量で、ＦＫＢＰ−ＦＲＢヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を含む組成物に関する。ある態様において、ＦＫＢＰ−ＦＲＢヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１の用量は免疫抑制性ではない。ある態様において、ここに提供する用量は、ｍＴＯＲ活性の一部のまたは最小限の阻害しか生じないように設計する��
【１４２８】
また本発明の範囲内であるのは、ここに記載する１日投与量のいずれかの２５％、５０％、１００％、１５０％または２００％を含む、ヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１の単位投与形態である。
【１４２９】
Ａ  ＦＫＢＰ−ＦＲＢヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、治療効果を生じる用量で投与できる。
【１４３０】
ある態様において、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、約０.００５〜１.５mg連日、約０.０１〜１mg連日、約０.０１〜０.７mg連日、約０.０１〜０.５mg連日または約０.１〜０.５mg連日の用量で投与する。
【１４３１】
ある態様において、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、の用量で投与する０.００５〜１.５mg連日、０.００５〜１.５mg連日、０.０１〜１mg連日、０.０１〜０.７mg連日、０.０１〜０.５mg連日または０.１〜０.５mg連日。
【１４３２】
ある態様において、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、約０.００５mg連日、０.００６mg連日、０.００７mg連日、０.００８mg連日、０.００９mg連日、０.０１mg連日、０.０２mg連日、０.０３mg連日、０.０４mg連日、０.０５mg連日、０.０６mg連日、０.０７mg連日、０.０８mg連日、０.０９mg連日、０.１mg連日、０.２mg連日、０.３mg連日、０.４mg連日、０.５mg連日、０.６mg連日、０.７mg連日、０.８mg連日、０.９mg連日または１.０mg連日の用量で投与する。
【１４３３】
ある態様において、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、０.５mg連日または０.５mg未満連日の用量で投与する。
【１４３４】
ある態様において、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、約０.１〜２０mg毎週、約０.５〜１５mg毎週、約１〜１０mg毎週または約３〜７mg毎週の用量で投与する。
【１４３５】
ある態様において、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、０.１〜２０mg毎週、０.５〜１５mg毎週、１〜１０mg毎週または３〜７mg毎週の用量で投与する。
【１４３６】
ある態様において、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、約２４時間で０.７mgを超えない；２４時間で０.５mgを超えないの用量で投与する。ある態様において、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、０.５mg以下連日の用量で投与できる。ある態様において、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、０.５mg連日の用量で投与できる。
【１４３７】
ある態様において、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、約０.１mg毎週、０.２mg毎週、０.３mg毎週、０.４mg毎週、０.５mg毎週、０.６mg毎週、０.７mg毎週、０.８mg毎週、０.９mg毎週、１mg毎週、２mg毎週、３mg毎週、４mg毎週、５mg毎週、６mg毎週、７mg毎週,８mg毎週,９mg毎週、１０mg毎週、１１mg毎週、１２mg毎週、１３mg毎週、１４mg毎週、１５mg毎週、１６mg毎週、１７mg毎週、１８mg毎週、１９mg毎週または２０mg毎週の用量で投与する。
【１４３８】
ある態様において、本発明は、ＲＣＡＲの活性化の観点で、ＲＡＤ００１について特定した量または用量と生物学的に同等である量で、ＲＡＤ００１以外のＦＫＢＰ−ＦＲＢヘテロ二量体化分子を利用できる。
【１４３９】
ある態様において、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、約３０pM〜４nM；５０pM〜２nM；１００pM〜１.５nM；２００pM〜１nM；３００pM〜５００pM；５０pM〜２nM；１００pM〜１.５nM；２００pM〜１nM；または３００pM〜５００pMの投与量で投与する。
【１４４０】
ある態様において、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、約３０pM、４０pM、５０pM、６０pM、７０pM、８０pM、９０pM、１００pM、１５０pM、２００pM、２５０pM、３００pM、３５０pM、４００pM、４５０pM、５００pM、５５０pM、６００pM、６５０pM、７００pM、７５０pM、８００pM、８５０pM、９００pM、９５０pM、１nM、１.５nM、２nM、２.５nM、３nM、３.５nMまたは４nMの投与量で投与する。
【１４４１】
ある態様において、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、目標トラフレベルを提供する投与量で対象に投与する。ここで使用する用語“トラフレベル”は、次の投与直前の血漿中の薬物濃度または２回の投与の間の最少薬物濃度をいう。ある態様において、トラフレベルは、臓器移植片および癌患者において使用される投薬レジメンに付随するトラフレベルより有意に低い。ある態様において、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、免疫抑制または抗癌効果を生じるトラフレベルの１／２、１／４、１／１０または１／２０未満のトラフレベルを生じるように投与する。ある態様において、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、免疫抑制または抗癌適応症への使用についてＦＤＡにより承認された添付文書に提供されるトラフレベルの１／２、１／４、１／１０または１／２０未満のトラフレベルを生じるように投与する。
【１４４２】
ある態様において、ヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、選択した範囲内のトラフレベルを提供するのに十分な量で投与する。ある態様において、範囲は０.１〜４.９ng／ml；２.４〜４.９ng／ml；約０.１〜２.４ng／ml；約０.１〜１.５ng／mlから選択する。
【１４４３】
ある態様において、ヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、約０.１ng／ml；０.２ng／ml；０.３ng／ml；０.４ng／ml；０.５ng／ml；０.６ng／ml；０.７ng／ml；０.８ng／ml；０.９ng／ml；１.０ng／ml；１.１ng／ml；１.２ng／ml；１.３ng／ml；１.４ng／ml；および１.５ng／mlのトラフレベルを提供するのに十分な量で投与する。
【１４４４】
ある態様において、ヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１を、５ng／ml。２.５ng／ml；２ng／ml；１.９ng／ml；１.８ng／ml；１.７ng／ml；１.６ng／ml；１.５ng／ml；１.４ng／ml；１.３ng／ml、１.２ng／ml；１.１ng／ml；１.０ng／ml；０.９ng／ml；０.８ng／ml；０.７ng／ml；０.６ng／ml；０.５ng／ml；０.４ng／ml；０.３ng／ml；０.２ng／ml；または０.１ng／ml未満のトラフレベルを提供するのに十分な量で投与する。
【１４４５】
ここに記載するあらゆる１日投与量を含む、ヘテロ二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＡＰ２１９６７またはＲＡＤ００１の単位投与形態も本発明の範囲内である。
【１４４６】
ある態様において、ＲＣＡＲ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を、体から除去後、しかし、対象への導入前に、二量体化分子で処理する。
【１４４７】
ある態様において、ＲＣＡＲ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を、ＲＣＡＲのエクスビボ産生後かつ対象への導入前に二量体化分子で処理する。
【１４４８】
ある態様において、ＲＣＡＲは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチ、例えば、ここに記載するＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、ここに記載するＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースのスイッチを含む。
【１４４９】
ある態様において、ＲＣＡＲは、ＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチ、例えば、ここに記載するＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、ここに記載するＧＡＩ−ＧＩＤ１ベースのスイッチを含む。
【１４５０】
ある態様において、ＲＣＡＲは、ハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチ、例えば、ここに記載するハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチ、例えば、二量体化スイッチモジュールにおける、例えば、ここに記載するハロタグ／ＳＮＡＰタグベースのスイッチを含む。
【１４５１】
ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を、次のものから選択される濃度で二量体化分子と接触させる：
２,０００〜０.０１nM；２,０００〜１００nM；１０００〜０.０１nM；５００〜０.０１nM；１００〜０.０１nM；１００〜０.０５nM；１００〜０.５nM；１００〜１nM１００〜１０nM；２５〜０.０１nM；２０〜０.０１nM；１０〜０.０１nM；１０〜０.１nM；または１０〜１.０nM。
【１４５２】
ある態様において、ＲＣＡＲは、ＦＫＢＰ−ＦＲＡＰベースのスイッチ、例えば、ここに記載するＦＫＢＰ−ＦＲＡＰベースのスイッチを、例えば、二量体化スイッチモジュールに、例えば、ここに記載するＦＫＢＰ−ＦＲＡＰベースのスイッチを含む。
【１４５３】
ある態様において、ＲＣＡＲＸ、例えば、ＲＣＡＲＴはＦＫＢＰ−ＦＲＡＰ二量体化スイッチであり、二量体化分子はラパマイシンまたはラパマイシン類似体、例えば、ここに開示するラパマイシン類似体、例えば、ＲＡＤ００１またはＡＰ２１９６７であり、ＲＣＡＲＸ細胞を、次のものから選択される濃度で二量体化分子と接触させる：
２,０００〜０.０１nM；２,０００〜１００nM；１０００〜０.０１nM；５００〜０.０１nM；１００〜０.０１nM；１００〜０.０５nM；１００〜０.５nM；１００〜１nM１００〜１０nM；２５〜０.０１nM；２０〜０.０１nM；１０〜０.０１nM；１０〜０.１nM；または１０〜１.０nM。
【１４５４】
さらなる態様において、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸およびFK506のような免疫抑制性剤、抗体またはCAMPATH、抗ＣＤ３抗体または他の抗体療法、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド類、ＦＲ９０１２２８、サイトカインおよび照射のような他の免疫除去剤と組み合わせて、処置レジメンで使用し得る。カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン(シクロスポリンおよびＦＫ５０６)を阻害するか、または増殖因子誘発シグナル伝達(ラパマイシン)に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する薬物(Liu et al.,Cell 66:807-815,1991;Henderson et al.,Immun. 73:316-321,1991;Bierer et al.,Curr. Opin. Immun. 5:763-773,1993)も使用できる。
【１４５５】
さらなる態様において、細胞組成物を、骨髄移植、フルダラビンのような化学療法剤、外部ビーム放射線療法(ＸＲＴ)、シクロホスファミドまたはＯＫＴ３またはCAMPATHのような抗体を死羽陽するＴ細胞除去療法と組み合わせて(例えば、前、同時または後)
患者に投与する。ある態様において、細胞組成物を、例えば、リツキサンのようなＣＤ２０と反応する薬剤のようなＢ細胞除去療法後に投与する。例えば、ある態様において、対象は、高用量化学療法剤での標準処置と続く末梢血幹細胞移植を受ける。ある態様において、移植後、対象は、ここに記載する増殖免疫細胞を注入される。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を移植後に投与するとき、ＲＣＡＲＸ細胞、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞の製造に使用する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、移植後に対象から得る。ある態様において、ＲＣＡＲＸ、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞の製造に使用する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、ドナー起源であり、例えば、対象にインプラントされたドナー細胞由来である。
【１４５６】
さらなる態様において、増殖した細胞を手術の前または後に投与する。ある態様において、ＲＣＡＲＸ、例えば、ＲＣＡＲＴ細胞を、腫瘍を減量させる手術後に対象に投与する。
【１４５７】
特定の代表的態様において、対象を白血球除去に付してよく、ここで、白血球を回収し、エクスビボで富化しまたは枯渇させて、興味のある細胞、例えば、Ｔ細胞を選択および／または単離する。これらのＴ細胞単離物を当分野で知られる方法により増殖し、ここに開示するＲＣＡＲ構築物の１個以上が導入され、それによりＲＣＡＲＴ細胞が産生されるように処理し得る。これを必要とする対象は、その後、高用量化学療法剤での標準処置と、続く末梢血幹細胞移植に付し得る。ある態様において、移植の後にまたは同時に、対象は、ここに開示する増殖されたＲＣＡＲＴ細胞の注入を受ける。さらなる態様において、増殖した細胞を手術の前または後に投与する。
【１４５８】
低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤での補助的処置
ここで使用する用語“ｍＴＯＲ阻害剤”は、細胞におけるｍＴＯＲキナーゼを阻害する化合物またはリガンドまたはその薬学的に許容される塩をいう。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はアロステリック阻害剤である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は触媒的阻害剤である。
【１４５９】
低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を、調節可能キメラ抗原受容体(ＲＣＡＲ)を発現するように操作したここに記載するＲＣＡＲ細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の投与と組み合わせ得る。
【１４６０】
低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、対象における免疫エフェクター細胞の性能を最適化できる。ｍＴＯＲ阻害剤の投与のタイミングおよび投与量によって、回収Ｔ細胞、非回収Ｔ細胞または両者の性能を最適化できる。
【１４６１】
理論に縛られることを望まないが、低い、免疫増強用量(例えば、免疫系を完全に抑制するには不十分であるが、免疫機能の改善には十分である用量)での処置は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の減少またはＰＤ−１陰性細胞の増加を伴うと考えられる。ＰＤ−１陰性Ｔ細胞ではなく、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞を、ＰＤ−１リガンド、例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する細胞との結合により消耗させ得る。これに加えてまたはこれとは別に、また理論に縛られることを望まないが、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤はナイーブＴ細胞数を、例えば、少なくとも一過性に、例えば、非処置対象と比較して増加できると考えられる。これとは別にまたはこれに加えて、また理論に縛られることを望まないが、十分な時間後または十分な投薬量のｍＴＯＲ阻害剤は、次の一つ以上を生じると考えられる：
次のマーカーの１個以上の、例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上の発現の増加：ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上のＫＬＲＧ１の発現減少；および
記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次の特徴の任意の１個または組み換えを有する細胞の数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、上記変化のいずれかは、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
【１４６２】
記憶Ｔ細胞前駆体は、分化プログラムの初期にある記憶Ｔ細胞である。例えば、記憶Ｔ細胞は、次のＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少および／またはＢＣＬ２増加の特徴の１個以上を有する。
【１４６３】
ある態様において低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤の投与を、ＲＣＡＲを発現するように操作したここに記載するＲＣＡＲ細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の投与前(例えば、ＲＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の回収前または後であるが、ＲＣＡＲ細胞の投与前)に投与する。理論に縛られることを望まないが、ある態様において、次の１個以上が生じると考えられる。
ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞数の減少；
ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞数の増加；
ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の比の増加；
ナイーブＴ細胞数の増加；
次のマーカーの１個以上の、例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上の発現の増加：ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上のＫＬＲＧ１の発現減少；または
記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次の特徴の任意の１個または組み換えを有する細胞の数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、上記変化のいずれかは、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
【１４６４】
低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、ＲＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の性能を増強できる。ある態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を、ＲＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の回収前に投与する。
【１４６５】
一つの態様において、ＲＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投薬の開始または完了後少なくとも５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日または６０日に回収する。
【１４６６】
ある態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を、ＲＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の回収を開始するかなり前に、性能が増強されるように開始するかまたは完了する。理論に縛られることを望まないが、ある態様において、次の１個以上が、回収細胞または操作した細胞(または非回収細胞または両者)で生じると考えられる。
ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞数の減少；
ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞数の増加；
ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の比の増加；
ナイーブＴ細胞数の増加；
次のマーカーの１個以上の、例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上の発現の増加：ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上のＫＬＲＧ１の発現減少；または
記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次の特徴の任意の１個または組み換えを有する細胞の数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、上記変化のいずれかは、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
【１４６７】
ある態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤を、ＲＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の回収後に開始する。理論に縛られることを望まないが、ある態様において、次の１個以上が生じると考えられる。
ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞数の減少；
ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞数の増加；
ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の比の増加；
ナイーブＴ細胞数の増加；
次のマーカーの１個以上の、例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上の発現の増加：ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上のＫＬＲＧ１の発現減少；または
記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次の特徴の任意の１個または組み換えを有する細胞の数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、上記変化のいずれかは、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
【１４６８】
ある態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤を、ＲＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の投与後に開始する。理論に縛られることを望まないが、ある態様において、次の１個以上が生じると考えられる。
ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞数の減少；
ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞数の増加；
ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の比の増加；
ナイーブＴ細胞数の増加；
次のマーカーの１個以上の、例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上の発現の増加：ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上のＫＬＲＧ１の発現減少；または
記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次の特徴の任意の１個または組み換えを有する細胞の数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、上記変化のいずれかは、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
【１４６９】
他の態様において、ＲＣＡＲを発現するように操作されたまたは操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、性能を最適化する量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処理する。理論に縛られることを望まないが、ある態様において、次の１個以上が生じると考えられる。
ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞数の減少；
ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞数の増加；
ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の比の増加；
ナイーブＴ細胞数の増加；
次のマーカーの１個以上の、例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上の発現の増加：ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上のＫＬＲＧ１の発現減少；または
記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次の特徴の任意の１個または組み換えを有する細胞の数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、上記変化は、例えば、未処置細胞と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
【１４７０】
用語“生物学的に同等”は、対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)の対照用量または対照量により生じる効果と同等の効果を生じるのに必要な対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)以外の薬剤の量である。ある態様において、効果は、例えば、インビボまたはインビトロアッセイにおいて評価される、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Boulayアッセイにより測定される、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ阻害により測定される、ｍＴＯＲ阻害のレベルまたはウェスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定値である。ある態様において、効果は、細胞選別により測定した、ＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞比の変更である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同レベルのＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害を達成する量または用量である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同レベルのＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞比またはナイーブＴ細胞のレベルの変更を達成する量または用量である。
【１４７１】
用語“免疫老化”は、とりわけ、例えば、癌、ワクチン接種、感染性病原体に対する免疫応答の障害にいたる、免疫機能の低下をいう。感染に対する宿主能および、特にワクチン接種による長期免疫記憶発生の両方が関与する。この免疫欠損は遍在性であり、経時的時間ではなく、寿命に対する関数として、短命種および長命種の両者で見られる。これは、高齢者における罹病率および死亡率の頻度増加の主要な寄与因子と考えられる。免疫老化は無作為な劣化的現象ではなく、むしろ、進化的パターンを逆になぞるように見え、免疫老化に影響するパラメータの大部分は、遺伝子制御下にあるように見える。免疫老化はまたウイルスおよび細菌のような多様な抗原に対する不可避の連続的攻撃の結果として予想できることもある。免疫老化は、例えば、高齢集団において、多くの病理学的に顕著な健康問題にいたる多因子的状態である。造血幹細胞枯渇、貪食細胞およびＮＫ細胞の総数減少および液性免疫の低下のような年齢依存的生物学的変化が、免疫老化の発生に貢献する。一つの面において、免疫老化は、免疫細胞におけるテロメア長の測定により個体において測定できる(例えば、ＵＳ５７４１６７７号参照)。免疫老化はまた６５歳以上の対象における、ナイーブＣＤ４および／またはＣＤ８  Ｔ細胞、Ｔ細胞レパートリーまたはワクチン接種に対する応答の正常より低い数を個体で考証することによっても決定できる。
【１４７２】
用語“免疫応答障害”は、対象が、とりわけ、例えば、癌、ワクチン接種、病原体感染に対する、適切な免疫応答を有しない状態をいう。ある態様において、免疫応答障害を有する対象は、予防的ワクチン接種後に保護的抗体力価レベルが得られないまたは対象に治療ワクチン接種後、疾患負荷が減少しないと予測される。対象はまた対象が免疫機能低下を有することが知られる集団のメンバーであるまたは高齢、化学療法剤を受けている対象、無脾症対象、免疫無防備状態対象またはＨＩＶ／ＡＩＤＳを有する対象のような、免疫機能の低下の病歴を有するならば、免疫応答障害を有し得る。ここに記載する方法は、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の、例えば、ＲＡＤ００１のような、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤投与による免疫応答障害の処置を可能にする。
【１４７３】
用語“低い、免疫増強用量”は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンまたは触媒的ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて使用するとき、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の阻害により測定して、ｍＴＯＲ活性を、完全にではないが、一部阻害する、ｍＴＯＲ阻害剤の用量である。例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼの阻害によりｍＴＯＲ活性を評価する方法を、ここに記載する。本用量は、完全な免疫抑制を生じるには不十分であるが、免疫応答の増強には十分である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い、免疫増強用量は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞数の減少および／またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞数の増加またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比の増加またはナイーブＴ細胞数増加を生じる。
【１４７４】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが、９０％を超えない、少なくとも１０％であるが、９０％を超えない、少なくとも１５％であるが、９０％を超えない９０％、少なくとも２０％であるが、９０％を超えない、少なくとも３０％であるが、９０％を超えない、少なくとも４０％であるが、９０％を超えない、少なくとも５０％であるが、９０％を超えない、少なくとも６０％であるが、９０％を超えないまたは少なくとも７０％であるが、９０％を超えない、ｍＴＯＲ阻害と関係するまたはそれを提供する。
【１４７５】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが、８０％を超えない、少なくとも１０％であるが、８０％を超えない、少なくとも１５％であるが、８０％を超えない、少なくとも２０％であるが、８０％を超えない、少なくとも３０％であるが、８０％を超えない、少なくとも４０％であるが、８０％を超えない、少なくとも５０％であるが、８０％を超えないまたは少なくとも６０％であるが、８０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたはそれを提供する。
【１４７６】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが、７０％を超えない、少なくとも１０％であるが、７０％を超えない、少なくとも１５％であるが、７０％を超えない、少なくとも２０％であるが、７０％を超えない、少なくとも３０％であるが、７０％を超えない、少なくとも４０％であるが、７０％を超えないまたは少なくとも５０％であるが、７０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたはそれを提供する。
【１４７７】
ある態様において、少なくとも５％であるが、６０％を超えない、少なくとも１０％であるが、６０％を超えない、少なくとも１５％であるが、６０％を超えない、少なくとも２０％であるが、６０％を超えない、少なくとも３０％であるが、６０％を超えないまたは少なくとも４０％であるが、６０％を超えないｍＴＯＲ阻害剤の用量は、ｍＴＯＲ阻害と関係するまたはそれを提供する。
【１４７８】
ある態様において、少なくとも５％であるが、５０％を超えない、少なくとも１０％であるが、５０％を超えない、少なくとも１５％であるが、５０％を超えない、少なくとも２０％であるが、５０％を超えない、少なくとも３０％であるが、５０％を超えないまたは少なくとも４０％であるが、５０％を超えないｍＴＯＲ阻害剤の用量は、ｍＴＯＲ阻害と関係するまたはそれを提供する。
【１４７９】
ある態様において、少なくとも５％であるが、４０％を超えない、少なくとも１０％であるが、４０％を超えない、少なくとも１５％であるが、４０％を超えない、少なくとも２０％であるが、４０％を超えない、少なくとも３０％であるが、４０％を超えないまたは少なくとも３５％であるが、４０％を超えないｍＴＯＲ阻害剤の用量は、ｍＴＯＲ阻害と関係するまたはそれを提供する。
【１４８０】
ある態様において、少なくとも５％であるが、３０％を超えない、少なくとも１０％であるが、３０％を超えない、少なくとも１５％であるが、３０％を超えない、少なくとも２０％であるが、３０％を超えないまたは少なくとも２５％であるが、３０％を超えないｍＴＯＲ阻害剤の用量は、ｍＴＯＲ阻害と関係するまたはそれを提供する。
【１４８１】
ある態様において、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、２０％を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、３０％を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％の％であるが、３５％を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、４０％を超えないまたは少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、４５％を超えないｍＴＯＲ阻害剤の用量は、ｍＴＯＲ阻害と関係するまたはそれを提供する。
【１４８２】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、９０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたはそれを提供する。
【１４８３】
ここに記載するとおり、ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０  Ｓ６阻害の程度として表すことができ、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０  Ｓ６活性のレベルの低下により、例えば、Ｐ７０  Ｓ６基質のリン酸化の減少により決定できる。ｍＴＯＲ阻害のレベルは、ここに記載する方法で、例えばBoulayアッセイにより評価できる。
【１４８４】
ｍＴＯＲ阻害剤
アロステリックｍＴＯＲ阻害剤は、中性三環式化合物ラパマイシン(シロリムス)、例えば、ラパマイシン誘導体、ラパマイシン類似体(ラパログとも呼ぶ)およびｍＴＯＲ活性を阻害する他のマクロライド化合物を含む、ラパマイシンに構造的および機能的類似性を有する化合物であるラパマイシン関連化合物を含む。
【１４８５】
ラパマイシンは、式Ａに示す構造を有する、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスにより産生される既知マクロライド抗生物質である。
【化２０】
0006793902.tif 000060
【１４８６】
例えば、McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433；米国特許３,９２９,９９２号参照。ラパマイシンについて多様な番号付けスキームが提唱されている。混乱を避けるために、特定のラパマイシン類似体をここで名づけるとき、式Ａの番号付けスキームを使用したラパマイシンを参照して名づける。
【１４８７】
本発明において有用なラパマイシン類似体は、例えば、ラパマイシンのシクロヘキシル環におけるヒドロキシル基がＯＲ１(ここで、Ｒ１はヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたはアミノアルキルである)で置換されているＯ置換類似体であり、例えばその内容を引用して本明細書に包含させるＵＳ５,６６５,７７２号およびＷＯ９４／０９０１０号に記載された、エベロリムスとしても知られるＲＡＤ００１である。他の適当なラパマイシン類似体は、２６位または２８位が置換されているものを含む。ラパマイシン類似体は、上記類似体のエピマーであってよく、特に、例えば、その内容を引用して本明細書に包含させるＵＳ６,０１５,８１５号、ＷＯ９５／１４０２３号およびＷＯ９９／１５５３０号に記載のとおり、４０位、２８位または２６位が置換され、所望によりさらに水素化されていてよい類似体のエピマー、例えばゾタロリムスとして知られるABT578またはその内容を引用して本明細書に包含させるＵＳ７,０９１,２１３号、ＷＯ９８／０２４４１号およびＷＯ０１／１４３８７号に記載のラパマイシン類似体、例えばリダフォロリムスとしても知られるAP23573を含む。
【１４８８】
ＵＳ５,６６５,７７２号の本発明における使用に適当なラパマイシン類似体の例は、４０−Ｏ−ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(４’−ヒドロキシメチル)ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[４’−(１,２−ジヒドロキシエチル)]ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−アリル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[３’−(２,２−ジメチル−１,３−ジオキソラン−４(Ｓ)−イル)−プロプ−２’−エン−１’−イル]−ラパマイシン、(２’Ｅ,４’Ｓ)−４０−Ｏ−(４’,５’−ジヒドロキシペント−２’−エン−１’−イル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エトキシカルボニルメチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(３−ヒドロキシ)プロピル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(６−ヒドロキシ)ヘキシル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(２−ヒドロキシ)エトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(３Ｓ)−２,２−ジメチルジオキソラン−３−イル]メチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(２Ｓ)−２,３−ジヒドロキシプロプ−１−イル]−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチノイルオキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−モルホリノ)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−Ｎ−イミダゾリルアセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−メチル−Ｎ’−ピペラジニル)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、３９−Ｏ−デスメチル−３９,４０−Ｏ,Ｏ−エチレン−ラパマイシン、(２６Ｒ)−２６−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチンアミドエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−(Ｎ−メチル−イミダゾ−２’−イルカルベトキサミド)エチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−エトキシカルボニルアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−トリルスルホンアミドエチル)−ラパマイシンおよび４０−Ｏ−[２−(４’,５’−ジカルボエトキシ−１’,２’,３’−トリアゾール−１’−イル)−エチル]−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【１４８９】
本発明において有用な他のラパマイシン類似体は、ラパマイシンのシクロヘキシル環におけるヒドロキシル基および／または２８位のヒドロキシ基がヒドロキシエステル基で置換されている類似体を含み、例えば、ＵＳＲＥ４４,７６８号に見られるラパマイシン類似体、例えばテムシロリムスが知られる。
【１４９０】
本発明において有用な他のラパマイシン類似体は、１６位のメトキシ基が他の置換基、好ましくは(所望によりヒドロキシ置換)アルキニルオキシ、ベンジル、オルトメトキシベンジルまたはクロロベンジルで置換されているおよび／または３９位のメトキシ基が、３９番炭素と共に欠失しており、ラパマイシンのシクロヘキシル環が３９位メトキシ基を欠くシクロペンチル環となるものを含み、例えば、引用によりその内容を本明細書に包含させるＷＯ９５／１６６９１号およびＷＯ９６／４１８０７号に記載されている。ラパマイシンの４０位のヒドロキシがアルキル化されるおよび／または３２−カルボニルが還元されるように、類似体をさらに修飾できる。
【１４９１】
ＷＯ９５／１６６９１号からのラパマイシン類似体は、１６−デメトキシ−１６−(ペント−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(ブト−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(プロパルギル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−オルト−メトキシベンジル−ラパマイシン、１６−デメトキシ−４０−Ｏ−(２−メトキシエチル)−１６−ペント−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ホルミル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ヒドロキシメチル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−カルボキシ−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(モルホリン−４−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−[Ｎ−メチル、Ｎ−(２−ピリジン−２−イル−エチル)]カルバモイル−４２−ノル−ラパマイシンおよび３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(ｐ−トルエンスルホニルヒドラゾノメチル)−４２−ノル−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【１４９２】
ＷＯ９６／４１８０７号からのラパマイシン類似体は、３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ−エチル)−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−メトキシ)エチル−ラパマイシンおよび３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【１４９３】
他の適当なラパマイシン類似体は、引用によりその内容を本明細書に包含させる、ＵＳ２００５／０１０１６２４号に記載されたウミロリムスである。
【１４９４】
哺乳動物細胞において、ラパマイシン(ｍＴＯＲ)キナーゼの標的は、ｍＴＯＲＣ１複合体またはｍＴＯＲＣ２複合体として記載される多タンパク質複合体として存在し、これは、栄養素およびエネルギーの利用性を感知し、増殖因子からの入力を統合し、シグナル伝達を強調する。ｍＴＯＲＣ１複合体は、ラパマイシンのようなアロステリックｍＴＯＲ阻害剤に感受性であり、ｍＴＯＲ、ＧβＬおよびｍＴＯＲの制御関連タンパク質(rapator)からなり、ペプチジルプロリルイソメラーゼＦＫＢＰ１２タンパク質(ＦＫ５０６結合タンパク質１Ａ、１２kDa)と結合する。対照的に、ｍＴＯＲＣ２複合体はｍＴＯＲ、ＧβＬおよびｍＴＯＲのラパマイシン非感受性コンパニオンタンパク質(rictor)からなり、インビトロでＦＫＢＰ１２タンパク質と結合しない。
【１４９５】
ｍＴＯＲＣ１複合体は、タンパク質翻訳制御に関与することが示されており、増殖および拡張制御のための増殖因子および栄養素感受性装置として機能する。ｍＴＯＲＣ１は、、リボソームタンパク質Ｐ７０  Ｓ６をその後リン酸化するＰ７０  Ｓ６キナーゼおよびｅＩＦ４Ｅ制御キャップ依存的翻訳の制御に重要な役割を有する真核翻訳開始因子４Ｅ結合タンパク質１(４ＥＢＰ１)である２個の重要な下流基質を介してタンパク質翻訳を制御する。ｍＴＯＲＣ１複合体は、細胞のエネルギーおよび栄養素恒常性に応答して細胞増殖を制御し、ｍＴＯＲＣ１の下方制御は、広範なヒト癌に共通する。ｍＴＯＲＣ２の機能は、Ａｋｔリン酸化およびアクチン細胞骨格動力学調節により細胞生存の制御に関与する。
【１４９６】
ｍＴＯＲＣ１複合体は、大部分、ＦＫＢＰ１２との細胞内複合体形成およびｍＴＯＲのＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合(ＦＲＢ)ドメインへの結合を含む、ラパマイシンの作用機序により、ラパマイシンおよび誘導体のようなアロステリックｍＴＯＲ阻害剤に感受性である。これは、ｍＴＯＲＣ１における立体構造変化を生じ、これは足場タンパク質raptorとの相互作用を改変および弱化し、続いてＰ７０  Ｓ６Ｋ１のような基質がｍＴＯＲに接近し、リン酸化されるのを妨害する。ＲＡＤ００１のようなラパマイシンおよびラパログは、良性および悪性増殖障害の両者と関係するｍＴＯＲの高活性化の阻害により、臨床的関連性を獲得している。
【１４９７】
エベロリムス(Afinitor(登録商標))としても知られるＲＡＤ００１は化学名(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ,２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｅ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１２−{(１Ｒ)−２−[(１Ｓ,３Ｒ,４Ｒ)−４−(２−ヒドロキシエトキシ)−３−メトキシシクロヘキシル]−１−メチルエチル}−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３,２９,３５−ヘキサメチル−１１,３６−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−２,３,１０,１４,２０−ペタオンを有し、次の化学構造を有する。
【化２１】
0006793902.tif 000061
【１４９８】
エベロリムスは、進行性腎臓癌の処置についてＦＤＡで承認された薬物であり、腫瘍学において数種の他のフェーズIII臨床治験で試験されている。前臨床試験は、エベロリムスが、おそらくラパマイシン感受性ｍＴＯＲＣ１機能の抑制により、インビトロおよびインビボで広範な腫瘍細胞株の増殖を阻害できることを示している。エベロリムスは、ラパマイシン誘導体として、ｍＴＯＲＣ１機能の一部、すなわちＰ７０  Ｓ６キナーゼ(Ｐ７０  Ｓ６Ｋ)および下流Ｐ７０  Ｓ６Ｋ基質Ｐ７０  Ｓ６の阻害に極めて強力である、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤である。エベロリムス(および他のラパマイシン類似体)のようなアロステリックｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲＣ２経路またはその結果としてのＡｋｔシグナル伝達活性化の阻害にはほとんどまたは全く効果を有しない。アロステリックｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、シロリムス(ラパマイシン、AY-22989)、４０−[３−ヒドロキシ−２−(ヒドロキシメチル)−２−メチルプロパノエート]−ラパマイシン(テムシロリムスまたはCCI-779とも呼ばれる)およびリダフォロリムス(AP-23573／MK-8669)を含む。アロステリックｍＴＯＲの他の例は、ゾタロリムス(ABT578)およびウミロリムスを含む。
【１４９９】
これとは別にまたはこれに加えて、触媒的、ＡＴＰ競合的ｍＴＯＲ阻害剤が、ｍＴＯＲキナーゼドメインを直接標的とし、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両者を標的とすることが知られている。これらはまた、４ＥＢＰ１−Ｔ３７／４６リン酸化およびキャップ依存性翻訳のようなラパマイシン耐性ｍＴＯＲＣ１アウトプットを調節するため、ラパマイシンのようなアロステリックｍＴＯＲ阻害剤よりも完全なｍＴＯＲＣ１阻害剤でもある。
【１５００】
ＢＥＺ２３５は触媒的ｍＴＯＲ阻害剤であり、化学名２−メチル−２−[４−(３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２,３−ジヒドロ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル)−フェニル]−プロピオニトリルを有し、次の化学構造を有する。
【化２２】
0006793902.tif 000062
【１５０１】
ＢＥＺ２３５は、その一トシル酸塩形態でも使用し得る。ＢＥＺ２３５の合成はＷＯ２００６／１２２８０６号に記載されている。
【１５０２】
触媒的ｍＴＯＲ阻害剤として、ＢＥＺ２３５は、ラパマイシン感受性(Ｐ７０  Ｓ６Ｋリン酸化と続くＰ７０  Ｓ６のリン酸化)およびラパマイシン非感受性(４ＥＢＰ１のリン酸化)機能の両者を含む、ｍＴＯＲＣ１複合体の完全な機能を阻止できる。ＢＥＺ２３５は使用する薬物濃度により異なる効果を有し、それにより、ｍＴＯＲ阻害は低濃度(１００nmol／Ｌ未満)で、デュアルＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害は比較的高濃度(約５００nmol／Ｌ)で優勢である、Serra et al.,2008。
【１５０３】
文献に記載されている他の触媒的ｍＴＯＲ阻害剤はＣＣＧ１６８(別名ＡＺＤ−８０５５、Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298)であり、これは、化学名{５−[２,４−ｂｉｓ−((Ｓ)−３−メチル−モルホリン−４−イル)−ピリド[２,３ｄ]ピリミジン−７−イル]−２−メトキシ−フェニル}−メタノールを有し、次の化学構造を有する。
【化２３】
0006793902.tif 000063
【１５０４】
文献に記載されている他の触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は３−[２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル]−Ｎ−メチルベンズアミド(ＷＯ０９１０４０１９)であり、次の化学構造を有する。
【化２４】
0006793902.tif 000064
【１５０５】
文献に記載されている他の触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は３−(２−アミノベンゾ[ｄ]オキサゾール−５−イル)−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−アミン(ＷＯ１００５１０４３およびＷＯ２０１３０２３１８４)であり、次の化学構造を有する。
【化２５】
0006793902.tif 000065
【１５０６】
文献に記載されている他の触媒的ｍＴＯＲ阻害剤はＮ−(３−(Ｎ−(３−((３,５−ジメトキシフェニル)アミノ)キノキサリン−２−イル)スルファモイル)フェニル)−３−メトキシ−４−メチルベンズアミド(ＷＯ０７０４４７２９およびＷＯ１２００６５５２)であり、次の化学構造を有する。
【化２６】
0006793902.tif 000066
【１５０７】
文献に記載されている他の触媒的ｍＴＯＲ阻害剤はＰＫＩ−５８７(Venkatesan,A.M.,J. Med. Chem.,2010,53,2636-2645)であり、これは、化学名１−[４−[４−(ジメチルアミノ)ピペリジン−１−カルボニル]フェニル]−３−[４−(４,６−ジモルホリノ−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素であり、次の化学構造を有する。
【化２７】
0006793902.tif 000067
【１５０８】
文献に記載されている他の触媒的ｍＴＯＲ阻害剤はＧＳＫ−２１２６４５８(ACS Med. Chem. Lett.,2010,1,39-43)であり、これは、化学名２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−メトキシ−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドであり、次の化学構造を有する。
【化２８】
0006793902.tif 000068
【１５０９】
文献に記載されている他の触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＷＯ１０１１４４８４)であり、次の化学構造を有する。
【化２９】
0006793902.tif 000069
【１５１０】
文献に記載されている他の触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は(Ｅ)−Ｎ−(８−(６−アミノ−５−(トリフルオロメチル)ピリジン−３−イル)−１−(６−(２−シアノプロパン−２−イル)ピリジン−３−イル)−３−メチル−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−イリデン)シアナミド(ＷＯ１２００７９２６)であり、次の化学構造を有する。
【化３０】
0006793902.tif 000070
【１５１１】
触媒的ｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、８−(６−メトキシ−ピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−ピペラジン−１−イル−３−トリフルオロメチル−フェニル)−１,３−ジヒドロ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２−オン(ＷＯ２００６／１２２８０６号)およびKu-0063794(Garcia-Martinez JM, et al., Biochem J., 2009, 421(1), 29-42)を含む。Ku-0063794は、ラパマイシンの哺乳動物標的(ｍＴＯＲ)の特異的阻害剤である。WYE-354は、触媒的ｍＴＯＲ阻害剤の他の例である(Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240)。
【１５１２】
本発明に有用なｍＴＯＲ阻害剤はまた前記のいずれかのプロドラッグ、誘導体、薬学的に許容される塩または類似体を含む。
【１５１３】
ＲＡＤ００１のようなｍＴＯＲ阻害剤は、ここに記載する特定の投与量に基づき、当分野で十分確立された方法を利用して送達用に製剤し得る。特に、ＵＳ特許６,００４,９７３号(引用により本明細書に包含させる)は、ここに記載のｍＴＯＲ阻害剤に有用な製剤の例を提供する。
【１５１４】
下流阻害剤
ここに記載する多くの方法が、例えば、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルを増加させるために、ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルを低下させるために、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞比を増加させるためにまたはナイーブＴ細胞のレベルを増加させるために、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の使用に頼る。これらの方法のいずれも、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の代わりに、経路における下流要素、例えば、Ｐ７０  Ｓ６ＫまたはｍＴＯＲＣ１の阻害剤の投与を用いても実施できる。Ｐ７０  Ｓ６Ｋの阻害剤の例は、ＰＦ−４７０８６７１またはＬＹ２５８４７０２トシレートを含む。ｍＴＯＲＣ１の阻害剤の例は、ｍＴＯＲＣ１活性を特異的に阻害するが、ｍＴＯＲＣ２活性を阻害しない、ｍＴＯＲのアロステリック阻害剤、例えば、ｍＴＯＲ阻害剤である。ある態様において、下流阻害剤を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルを増加させるために、ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルを低下させるために、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞比を増加させるためにまたはナイーブＴ細胞のレベルを増加させるために有効な用量で投与する。
【１５１５】
ｍＴＯＲ阻害の評価
ｍＴＯＲはキナーゼＰ７０  Ｓ６(Ｐ７０  Ｓ６ＫまたはＳ６Ｋとしても既知)をリン酸化し、それによりＰ７０  Ｓ６Ｋを活性化し、その基質をリン酸化させる。ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０  Ｓ６Ｋ阻害の程度により表すことができ、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度は、例えば、Ｐ７０  Ｓ６Ｋ基質のリン酸化の減少による、Ｐ７０  Ｓ６Ｋ活性レベルの減少により決定できる。阻害剤の非存在下、例えば、阻害剤投与前と、阻害剤存在下または阻害剤投与後のＰ７０  Ｓ６Ｋ活性(Ｐ７０  Ｓ６Ｋが基質をリン酸化する能力)を評価することにより、ｍＴＯＲ阻害のレベルを決定できる。Ｐ７０  Ｓ６Ｋ阻害レベルは、ｍＴＯＲ阻害のレベルを示す。それゆえに、Ｐ７０  Ｓ６Ｋが４０％阻害されたら、Ｐ７０  Ｓ６Ｋ活性で測定して、ｍＴＯＲ活性は４０％阻害される。ここでいう阻害の程度またはレベルは、投与間隔の間の阻害の平均レベルである。例えば、阻害剤を週に１回与えるとき、阻害のレベルは、そのその間隔の間の、すなわち１週間の阻害の平均レベルを示す。
【１５１６】
引用により本明細書に包含させるBoulay et al., Cancer Res, 2004, 64:252-61は、ｍＴＯＲ阻害のレベルの評価に使用できるアッセイを教示する(ここではBoulayアッセイと称す)。ある態様において、アッセイは、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の投与前後の生物学的サンプルからのＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性の測定に頼る。サンプルを、ｍＴＯＲ阻害剤での処置後、予め選択した時間、例えば、処置の２４時間、４８時間および７２時間後に採り得る。例えば、皮膚または末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)からの生物学的サンプルを使用できる。総タンパク質抽出物をサンプルから調製する。Ｐ７０  Ｓ６キナーゼを特異的に認識する抗体を使用した免疫沈降により、タンパク質抽出物からＰ７０  Ｓ６キナーゼを単離する。単離したＰ７０  Ｓ６キナーゼの活性を、インビトロキナーゼアッセイで測定する。単離したキナーゼを４０Ｓリボソームサブユニット基質(Ｐ７０  Ｓ６Ｋの内在性基質である)およびガンマ−３２Ｐと、該基質のリン酸化を可能とする条件下でインキュベートできる。次いで、反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分割し、３２ＰシグナルをPhosphorImagerを使用して解析する。４０Ｓリボソームサブユニットのサイズに対応する３２Ｐシグナルが、リン酸化された基質およびＰ７０  Ｓ６Ｋの活性を示す。キナーゼ活性の増加または減少を、リン酸化基質の３２Ｐシグナルの面積および強度を定量し(例えば、ImageQuant, Molecular Dynamicsを使用)、任意単位値を定量化シグナルに割り当て、投与後の値と投与前の値または対照値を比較することにより、計算できる。例えば、キナーゼ活性阻害パーセントを次の式で計算できる：１−(投与後に得た値／投与前に得た値)×１００。上記のとおり、阻害の程度またはレベルは、ここでは、投与の合間の阻害の平均レベルをいう。
【１５１７】
キナーゼ活性、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性を評価する方法もまた、引用により本明細書に包含させるＵＳ７,７２７,９５０号に提供されている。
【１５１８】
ｍＴＯＲ阻害のレベルはまた、ＰＤ１陰性細胞対ＰＤ１陽性Ｔ細胞の比の変化によっても評価できる。末梢血からのＴ細胞を、当分野で知られる方法によりＰＤ１陰性または陽性と同定できる。
【１５１９】
低用量ｍＴＯＲ阻害剤
ここに記載する方法は、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１のようなラパログを含むアロステリックｍＴＯＲ阻害剤の複数用量を使用する。対照的に、ｍＴＯＲ経路を完全にまたはほぼ完全に阻害するレベルの阻害剤は免疫抑制性であり、例えば、臓器移植片拒絶の予防に使用される。さらに、ｍＴＯＲを完全に阻害する高用量のラパログも腫瘍細胞増殖を阻止し、多様な癌の処置に使用されている(例えば、Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors. Salvadori M. World J Transplant. 2012 Oct 24;2(5):74-83; Current and Future Treatment Strategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma: Role of mTOR Inhibition. Finn RS. Liver Cancer. 2012 Nov;1(3-4):247-256; Emerging Signaling Pathways in Hepatocellular Carcinoma. Moeini A, Cornella H, Villanueva A. Liver Cancer. 2012 Sep;1(2):83-93; Targeted cancer therapy - Are the days of systemic chemotherapy numbered? Joo WD, Visintin I, Mor G. Maturitas. 2013 Sep 20.; Role of natural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIs and mTOR inhibitor. Santoni M, Berardi R, Amantini C, Burattini L, Santini D, Santoni G, Cascinu S. Int J Cancer. 2013 Oct 2参照)。
【１５２０】
本発明は、少なくとも一部、現在臨床の現場で使用されるよりはるかに低用量のｍＴＯＲ阻害剤が、対象における免疫応答の増加に優れた効果を有し、ＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比を増加させるという驚くべき発見に基づく。ｍＴＯＲ活性を一部しか阻害しない低用量のｍＴＯＲ阻害剤が、ヒト対象における免疫応答を効率的に改善し、ＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比を増加できることは、驚きであった。
【１５２１】
したがって、一つの面において、本発明は、約０.００５〜１.５mg、約０.００５〜１.５mg、約０.０１〜１mg、約０.０１〜０.７mg、約０.０１〜０.５mgまたは約０.１〜０.５mgの濃度でｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を含む、例えば、単位用量形態として提供される、組成物を提供する。さらなる面において、本発明は、０.００５〜１.５mg、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１mg、０.０１〜０.７mg、０.０１〜０.５mgまたは０.１〜０.５mgの濃度でｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を含む、組成物を提供する。より具体的に、一つの面において、本発明は、約０.００５mg、０.００６mg、０.００７mg、０.００８mg、０.００９mg、０.０１mg、０.０２mg、０.０３mg、０.０４mg、０.０５mg、０.０６mg、０.０７mg、０.０８mg、０.０９mg、０.１mg、０.２mg、０.３mg、０.４mg、０.５mg、０.６mg、０.７mg、０.８mg、０.９mgまたは１.０mgの用量でｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を含む、組成物を提供する。一つの面において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１、は、０.５mg以下の用量である。さらに別の面において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１は、約０.５mgの用量である。さらなる面において、本発明は、０.００５mg、０.００６mg、０.００７mg、０.００８mg、０.００９mg、０.０１mg、０.０２mg、０.０３mg、０.０４mg、０.０５mg、０.０６mg、０.０７mg、０.０８mg、０.０９mg、０.１mg、０.２mg、０.３mg、０.４mg、０.５mg、０.６mg、０.７mg、０.８mg、０.９mgまたは１.０mgの用量でｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を含む、組成物を提供する。一つの面において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１、は、０.５mg以下の用量である。さらに別の面において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１は、０.５mgの用量である。
【１５２２】
さらなる面において、本発明は、ＲＡＤ００１について明記した特定の量または用量と生物学的に同等である量でＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤を含む組成物に関する。
【１５２３】
さらなる面において、本発明は、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼを８０％未満阻害するのに十分な量のｍＴＯＲ阻害剤を含む、組成物に関する。さらなる面において、ここに記載する組成物は、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼを３８％未満阻害するのに十分な量のｍＴＯＲ阻害剤を含む。
【１５２４】
ある態様において、本発明は、選択した投与レジメン、例えば、１日１回または週に１回で投与したとき、完全なまたは顕著な免疫抑制には結びつかないが、免疫応答の増強に結びつくｍＴＯＲ阻害のレベルと関係する、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパログ、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤の組成物または投薬形態に関する。
【１５２５】
さらなる面において、本発明は、対象にｍＴＯＲ阻害剤を投与する過程を含む、免疫応答を増強する、例えば、免疫老化を処置する方法を提供する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、約０.００５〜１.５mg連日、約０.０１〜１mg連日、約０.０１〜０.７mg連日、約０.０１〜０.５mg連日または約０.１〜０.５mg連日の用量で投与できる。さらなる面において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、約０.１〜２０mg毎週、約０.５〜１５mg毎週、約１〜１０mg毎週または約３〜７mg毎週の用量で投与できる。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.００５〜１.５mg連日、０.０１〜１mg連日、０.０１〜０.７mg連日、０.０１〜０.５mg連日または０.１〜０.５mg連日の用量で投与できる。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、約０.１〜２０mg毎週、０.５〜１５mg毎週、１〜１０mg毎週、３〜７mg毎週または５mg毎週の用量で投与できる。
【１５２６】
さらなる面において、本発明は、ＲＡＤ００１についてここに記載する特定の量または用量と生物学的同等である量でＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤を投与することを含む、免疫応答を増強する、例えば、免疫老化を処置する方法に関する。
【１５２７】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、約０.００５mg連日、０.００６mg連日、０.００７mg連日、０.００８mg連日、０.００９mg連日、０.０１mg連日、０.０２mg連日、０.０３mg連日、０.０４mg連日、０.０５mg連日、０.０６mg連日、０.０７mg連日、０.０８mg連日、０.０９mg連日、０.１mg連日、０.２mg連日、０.３mg連日、０.４mg連日、０.５mg連日、０.６mg連日、０.７mg連日、０.８mg連日、０.９mg連日または１.０mg連日の用量で投与できる。ある態様において、ＲＡＤ００１を、２４時間で約０.７mgを超えない用量で投与できる。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、を、２４時間で約０.５mgを超えない用量で投与できる。ある態様において、ＲＡＤ００１を連日０.５mgまたはそれ未満の用量で投与できる。ある態様において、ＲＡＤ００１を０.５mg連日の用量で投与できる。
【１５２８】
さらなる面において、本発明は、ＲＡＤ００１について明記した特定の量または用量と生物学的に同等である量でＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤を利用できる。
【１５２９】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.１mg毎週、０.２mg毎週、０.３mg毎週、０.４mg毎週、０.５mg毎週、０.６mg毎週、０.７mg毎週、０.８mg毎週、０.９mg毎週、１mg毎週、２mg毎週、３mg毎週、４mg毎週、５mg毎週、６mg毎週、７mg毎週、８mg毎週、９mg毎週、１０mg毎週、１１mg毎週、１２mg毎週、１３mg毎週、１４mg毎週、１５mg毎週、１６mg毎週、１７mg毎週、１８mg毎週、１９mg毎週または２０mg毎週の用量で投与できる。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、毎週５mgまたはそれ未満の用量で投与する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、毎週５mgの用量で投与する。
【１５３０】
ある態様において、本発明は、ＲＡＤ００１について明記した特定の量または用量と生物学的に同等である量でＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤を利用できる
【１５３１】
ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパログ、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は、徐放製剤で投与できる。ここに記載する組成物または単位投与形態のいずれも徐放製剤で提供できる。ある態様において、徐放製剤は、即時放出製剤より低いバイオアベイラビリティを有する。例えば、いくつかの態様において、即時放出製剤に類する治療効果を達成するために、徐放製剤は、即時放出製剤に提供される約２〜約５倍、約２.５〜約３.５倍または約３倍量の阻害剤を有する。
【１５３２】
ある態様において、単位投薬形態あたり０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgを有する、概して週１回投与に使用される、例えば、ＲＡＤ００１の、即時放出形態が提供される。週１回投与のために、これらの即時放出製剤は、それぞれ、０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する徐放形態に対応する。ある態様において、両方の形態を週１回投与する。
【１５３３】
ある態様において、単位投薬形態あたり０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgを有する、概して１日１回投与に使用される、例えば、ＲＡＤ００１の、即時放出形態が提供される。１日１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する、徐放形態に対応する。週１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する徐放形態に対応する。
【１５３４】
ある態様において、単位投薬形態あたり０.０１〜１.０mgを有する、概して１日１回投与に使用される、例えば、ＲＡＤ００１の、即時放出形態が提供される。１日１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.０３〜３mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する、徐放形態に対応する。週１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.２〜２０mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する、徐放形態に対応する。
【１５３５】
ある態様において、単位投薬形態あたり０.５〜５.０mgを有する、概して週１回投与に使用される、例えば、ＲＡＤ００１の、即時放出形態が提供される。週１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、１.５〜１５mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する、徐放形態に対応する。
【１５３６】
上記のとおり、ｍＴＯＲ経路の一つの標的はＰ７０  Ｓ６キナーゼである。それゆえに、ここに記載する方法および組成物に有用なｍＴＯＲ阻害剤の用量は、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Boulayアッセイにより測定して、ｍＴＯＲ阻害剤非存在下におけるＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性と比較して、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の８０％を超えない阻害を達成するのに十分である。さらなる面において、本発明は、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Boulayアッセイにより測定して、ｍＴＯＲ阻害剤の非存在下におけるＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性と比較して、３８％を超えないＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性の阻害を達成するのに十分なｍＴＯＲ阻害剤の量を提供する。一つの面において、本発明の方法および組成物において有用なｍＴＯＲ阻害剤の用量は、例えば、ヒト対象に投与したとき、ここに記載するアッセイ、例えば、Boulayアッセイにより測定して、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５４％、５３％、５２％、５１％、５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％または１０％またはそれ未満のＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性阻害を達成するのに十分である。
【１５３７】
一つの面において、本発明の方法および組成物において有用なｍＴＯＲ阻害剤の用量は、例えば、ヒト対象に投与したとき、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Boulayアッセイにより測定して、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の９０±５％(すなわち、８５〜９５％)、８９±５％、８８±５％、８７±５％、８６±５％、８５±５％、８４±５％、８３±５％、８２±５％、８１±５％、８０±５％、７９±５％、７８±５％、７７±５％、７６±５％、７５±５％、７４±５％、７３±５％、７２±５％、７１±５％、７０±５％、６９±５％、６８±５％、６７±５％、６６±５％、６５±５％、６４±５％、６３±５％、６２±５％、６１±５％、６０±５％、５９±５％、５８±５％、５７±５％、５６±５％、５５±５％、５４±５％、５４±５％、５３±５％、５２±５％、５１±５％、５０±５％、４９±５％、４８±５％、４７±５％、４６±５％、４５±５％、４４±５％、４３±５％、４２±５％、４１±５％、４０±５％、３９±５％、３８±５％、３７±５％、３６±５％、３５±５％、３４±５％、３３±５％、３２±５％、３１±５％、３０±５％、２９±５％、２８±５％、２７±５％、２６±５％、２５±５％、２４±５％、２３±５％、２２±５％、２１±５％、２０±５％、１９±５％、１８±５％、１７±５％、１６±５％、１５±５％、１４±５％、１３±５％、１２±５％、１１±５％または１０±５％阻害を達成するのに十分である。
【１５３８】
対象におけるＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性は、例えば、米国特許７,７２７,９５０号に記載する方法による、ホスホＰ７０  Ｓ６Ｋレベルおよび／またはホスホＰ７０  Ｓ６レベルの免疫ブロット解析またはインビトロキナーゼ活性アッセイのような、当分野で知られる方法を使用して測定し得る。
【１５３９】
さらなる面において、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１のようなｍＴＯＲ阻害剤を含む、組成物に関する。このような組成物におけるｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の用量は、約３０pM〜４nMの範囲であり得る。一つの面において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の用量は、約５０pM〜２nM、約１００pM〜１.５nM、約２００pM〜１nMまたは約３００pM〜５００pMの範囲である。一つの面において、ＲＡＤ００１の用量は、５０pM〜２nM、１００pM〜１.５nM、２００pM〜１nMまたは３００pM〜５００pMの範囲である。さらなる面において、ＲＡＤ００１の用量は約３０pM、４０pM、５０pM、６０pM、７０pM、８０pM、９０pM、１００pM、１５０pM、２００pM、２５０pM、３００pM、３５０pM、４００pM、４５０pM、５００pM、５５０pM、６００pM、６５０pM、７００pM、７５０pM、８００pM、８５０pM、９００pM、９５０pM、１nM、１.５nM、２nM、２.５nM、３nM、３.５nMまたは４nMである。
【１５４０】
さらなる面において、本発明は、ＲＡＤ００１について明記した特定の量または用量と生物学的に同等である量でＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤を利用できる
【１５４１】
本発明は、さらにｍＴＯＲ阻害剤の対象への投与を含む方法に関する。このような方法は、約３０pM〜４nMの範囲のｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１の用量を使用し得る。さらなる面において、ＲＡＤ００１の用量は約５０pM〜２nM、約１００pM〜１.５nM、約２００pM〜１nMまたは約３００pM〜５００pMの範囲であり得る。一つの面において、ＲＡＤ００１の用量は５０pM〜２nM、１００pM〜１.５nM、２００pM〜１nMまたは３００pM〜５００pMの範囲である。さらなる面において、ＲＡＤ００１の用量は約３０pM、４０pM、５０pM、６０pM、７０pM、８０pM、９０pM、１００pM、１５０pM、２００pM、２５０pM、３００pM、３５０pM、４００pM、４５０pM、５００pM、５５０pM、６００pM、６５０pM、７００pM、７５０pM、８００pM、８５０pM、９００pM、９５０pM、１nM、１.５nM、２nM、２.５nM、３nM、３.５nMまたは４nMである。
【１５４２】
さらなる面において、本発明の方法は、ＲＡＤ００１について明記した特定の量または用量と生物学的に同等である量でＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤を利用できる
【１５４３】
ｍＴＯＲ阻害剤の用量と関連してここで使用する用語“約”は、ｍＴＯＲ阻害剤の用量の最大±１０％ばらつきをいうが、記載した用量の周辺のばらつきを含まなくてよい。
【１５４４】
ある態様において、本発明は、対象に、目標トラフレベル内の投与量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を投与することを含む、方法を提供する。ある態様において、トラフレベルは、臓器移植および癌患者で使用される投与レジメンに関係するトラフレベルより顕著に低い。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを、免疫抑制または抗癌効果を生じるトラフレベルの１／２、１／４、１／１０または１／２０未満であるトラフレベルを生じるように投与する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを、免疫抑制または抗癌適応症における使用についてＦＤＡが承認した添付文書に従い提供されるトラフレベルの１／２、１／４、１／１０または１／２０未満であるトラフレベルを生じるように投与する。
【１５４５】
ある態様において、ここに開示する方法は、対象に、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.１〜１０ng／ml、０.１〜０.５ng／ml、０.１〜３ng／ml、０.１〜２ng／mlまたは０.１〜１ng／mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
【１５４６】
ある態様において、ここに開示する方法は、対象にｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.２〜１０ng／ml、０.２〜５ng／ml、０.２〜３ng／ml、０.２〜２ng／mlまたは０.２〜１ng／mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
【１５４７】
ある態様において、ここに開示する方法は、対象にｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.３〜１０ng／ml、０.３〜５ng／ml、０.３〜３ng／ml、０.３〜２ng／mlまたは０.３〜１ng／mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
【１５４８】
ある態様において、ここに開示する方法は、対象にｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.４〜１０ng／ml、０.４〜５ng／ml、０.４〜３ng／ml、０.４〜２ng／mlまたは０.４〜１ng／mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
【１５４９】
ある態様において、ここに開示する方法は、対象にｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.５〜１０ng／ml、０.５〜５ng／ml、０.５〜３ng／ml、０.５〜２ng／mlまたは０.５〜１ng／mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
【１５５０】
ある態様において、ここに開示する方法は、対象にｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、１〜１０ng／ml、１〜５ng／ml、１〜３ng／mlまたは１〜２ng／mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
【１５５１】
ここで使用する用語“トラフレベル”は、次の投与直前の血漿中の薬物濃度または２回の投与の間の最少薬物濃度をいう。
【１５５２】
ある態様において、目標トラフレベルのＲＡＤ００１は約０.１〜４.９ng／mlの範囲である。ある態様において、目標トラフレベルは３ng／ml以下、例えば、０.３ng／ml以下〜３ng／ml。ある態様において、目標トラフレベルは３ng／ml以下、例えば、０.３ng／ml以下〜１ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは約２.４〜４.９ng／mlの範囲である。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは約０.１〜２.４ng／mlの範囲である。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは約０.１〜１.５ng／mlの範囲である。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは０.１〜４.９ng／mlの範囲である。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは２.４〜４.９ng／mlの範囲である。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは０.１〜２.４ng／mlの範囲である。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは０.１〜１.５ng／mlの範囲である。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは０.１ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは０.２ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは０.３ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは０.４ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは０.５ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは０.６ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは０.７ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは０.８ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは０.９ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは１.０ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは１.１ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは１.２ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは１.３ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは１.４ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは１.５ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは５ng／ml未満である。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは２.５ng／ml未満である。ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは２ng／ml、１.９ng／ml、１.８ng／ml、１.７ng／ml、１.６ng／ml、１.５ng／ml、１.４ng／ml、１.３ng／ml、１.２ng／ml、１.１ng／ml、１.０ng／ml、０.９ng／ml、０.８ng／ml、０.７ng／ml、０.６ng／ml、０.５ng／ml、０.４ng／ml、０.３ng／ml、０.２ng／mlまたは０.１ng／ml未満である。
【１５５３】
さらなる面において、本発明は、ＲＡＤ００１の特定した目標トラフレベルと生物学的同等である目標トラフレベルと関係する量で、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤を使用できる。ある態様において、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の目標トラフレベルは、ここに記載するＲＡＤ００１のトラフレベルと同じレベルのｍＴＯＲ阻害(例えば、ここに記載する方法で測定して、例えば、Ｐ７０  Ｓ６の阻害)を示すレベルである。
【１５５４】
医薬組成物：ｍＴＯＲ阻害剤
一つの面において、本発明は、ここに記載するＣＡＲ細胞と組み合わせて使用するために製剤された、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤を含む医薬組成物に関する。
【１５５５】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ここに記載する、さらなる薬剤と組み合わせて投与するために製剤される。
【１５５６】
一般に、本発明の化合物は、単独でまたは１種以上の治療剤と組み合わせて、当分野で知られる通常のかつ許容される方法のいずれかにより、上記の治療有効量で投与される。
【１５５７】
医薬製剤は、慣用の溶解および混合法を使用して製造できる。例えば、原体物質(例えば、ｍＴＯＲ阻害剤または該化合物の安定化形態(例えば、シクロデキストリン誘導体または他の既知複合化薬物との複合体))を、ここに記載する添加物の１種以上の存在下、適当な溶媒に溶解させる。ｍＴＯＲ阻害剤は、概して薬物の投与量を容易に制御可能とし、患者に洗練され、取り扱いが容易な製品を与えるような、医薬投与形態に製剤される。
【１５５８】
本発明の化合物は、医薬組成物として、任意の慣用の経路で、特に経腸的に、例えば、錠剤またはカプセル剤の形で、例えば、経口でまたは、例えば、注射溶液剤または懸濁液剤の形で、非経腸的に、例えば、ローション剤、ゲル剤、軟膏剤またはクリーム剤の形で、局所的にまたは経鼻または坐薬形態で投与できる。ここに記載するようにｍＴＯＲ阻害剤を他の薬剤と組み合わせて(同時にまたは別々に)投与するとき、一つの面において、両方の成分を同じ経路で(例えば、非経腸的に)投与する。あるいは、他の薬剤を、ｍＴＯＲ阻害剤と異なる経路で投与し得る。例えば、ｍＴＯＲ阻害剤を経口で投与してよく、他の薬剤を非経腸的に投与してよい。遊離形態または薬学的に許容される塩形態のｍＴＯＲ阻害剤を、少なくとも１個の薬学的に許容される担体または希釈剤とともに含む医薬組成物は、混合法、造粒法またはコーティング法による通常の方法で製造できる。例えば、経口組成物は、活性成分とともにａ)希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン；ｂ)滑沢剤、例えば、シリカ、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウムまたはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコール；錠剤についてはまたｃ)結合剤、例えば、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよびまたはポリビニルピロリドン；所望によりｄ)崩壊剤、例えば、デンプン、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩または起沸性混合物；および／またはｅ)吸収剤、着色剤、香味剤および甘味剤を含む錠剤またはゼラチンカプセル剤であり得る。経口製剤はまた活性成分を２０〜６０％Eudragit EPO、ヒドロキシプロピルセルロースＥＦ、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはKollidon VA64および５％までのpluronic F68、Cremophor ELまたはGelucire 44/14とともに含み得る。注射可能組成物は、水性等張溶液剤または懸濁液剤であり、坐薬は脂肪エマルジョンまたは懸濁液から製造できる。組成物は滅菌してよくおよび／または防腐剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶解促進剤、浸透圧調整用塩類および／または緩衝液のようなアジュバントを含んでよい。さらに、他の治療的に価値ある物質も含み得る。経皮適用に適当な製剤は、本発明の化合物の有効量を担体とともに含む。担体は、宿主の皮膚の通過を助けるために吸収性の薬理学的に許容される溶媒を含み得る。例えば、経皮デバイスは、裏打ち部材、化合物を所望により担体と共に含む貯蔵部、所望により化合物を宿主皮膚に制御されかつ予定された速度で長期間にわたり送達するための速度制御バリアおよび該デバイスを皮膚に固定するための手段を含む、バンデージの形であり得る。マトリクス経皮製剤も使用し得る。さらなる面において、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤を、マイクロニードルパッチにより投与し得る。マイクロニードルベースの薬物送達は当分野で周知であり(例えば、米国特許８,１６２,９０１号参照)、当業者は、これらの技術および方法を、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤の投与に応用できる。例えば、皮膚および眼への局所適用のための適当な製剤は、好ましくは当分野で周知��水溶液、軟膏、クリームまたはゲルである。このような製剤は可溶化剤、安定化剤、張性増加剤、緩衝液および防腐剤を含み得る。
【１５５９】
ここで使用する用語“医薬組み合わせ剤”は、１個を超える活性成分の混合または組み合わせに由来する産物を意味し、活性成分の固定されたおよび固定されていない組み合わせの両者を含む。用語“固定された組み合わせ”は、複数活性成分、例えばｍＴＯＲ阻害剤と他の薬剤が、両者とも患者に、同時に一個の物または投与量として投与されることを意味する。用語“固定されていない組み合わせ”は、複数活性成分、例えばｍＴＯＲ阻害剤と他の薬剤を、別々の物として、同時に、一緒にまたは別々に具体的時間制限なく患者に投与し、ここで、このような投与が、患者の体内で２化合物の治療的有効レベルを提供することを意味する。後者はまたカクテル療法、例えば３種以上の活性成分の投与にも適用される。
【１５６０】
徐放
ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は、製品安定性要求を満たすおよび／または平均血漿ピーク濃度減少、薬物吸収の程度および血漿ピーク濃度の患者間および患者内ばらつき減少、Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ比減少および／または食効減少のような即時放出(ＩＲ)錠剤より都合よい薬物動態特性を有する、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む経口固体投与形態の形の医薬製剤として提供できる。提供された医薬製剤は、より厳密な用量調節を可能にするおよび／または有害事象の頻度を減少させ、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１での患者のより安全な処置を提供することができる。
【１５６１】
ある態様において、本発明は、多粒子系であり、機能的層およびコーティングを有し得る、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤を提供する。
【１５６２】
ここで使用する用語“持続放出、多粒子製剤”は、長時間にわたり、例えば少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間にわたり、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の放出を可能とする製剤である。持続放出製剤は、活性成分を摂取後長時間にわたり利用可能とするような方法で製剤された、例えば、ここに記載する、特別の添加物からなるマトリクスおよびコーティングを含み得る。
【１５６３】
用語“持続放出”は用語“徐放”(ＳＲ)または“持効性放出”と交換可能に使用する。用語“持続放出”は、錠剤およびカプセル剤についての欧州薬局方(第７版)モノグラフおよびＵＳＰの医薬投与形態についての一般的な章＜１１５１＞の定義に従う、活性薬物物質を、経口投与直後ではなく、長時間にわたり放出する医薬製剤をいう。ここで使用する用語“即時放出”(ＩＲ)は、Guidance for Industry: “Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms” (FDA CDER, 1997)の定義に従い、６０分以内に活性薬物物質の８５％を放出する医薬製剤である。ある態様において、用語“即時放出”は、例えば、ここに記載する溶解アッセイで測定して、エベロリムスの錠剤からの３０分以内の放出を意味する。
【１５６４】
ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤は、ここに記載する溶解アッセイのような当分野で知られるアッセイを使用してインビトロ放出プロファイルにより特徴づけできる。３７℃でドデシル硫酸ナトリウム０.２％を含む９００mLリン酸緩衝液ｐＨ６.８で魅した溶解容器で、それぞれＵＳＰ試験モノグラフ７１１および欧州薬局方試験モノグラフ２.９.３.に従い、ＵＳＰに従い、パドル法で、７５rpmで溶解を行う。
【１５６５】
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤は、インビトロ放出アッセイで、次の放出明細に従いｍＴＯＲ阻害剤を放出する。
０.５時間：＜４５％または＜４０、例えば、＜３０％
１時間：２０〜８０％、例えば、３０〜６０％
２時間：＞５０％または＞７０％、例えば、＞７５％
３時間：＞６０％または＞６５％、例えば、＞８５％、例えば、＞９０％。
【１５６６】
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤は、インビトロ溶解アッセイで、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分または１２０分より速くｍＴＯＲ阻害剤の５０％を放出しない。
【１５６７】
一つの態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な徐放性製剤は、コーティングと組み合わせて、速く溶解または崩壊する担体マトリクス内にｍＴＯＲ阻害剤を含み、ここで、コーティングの少なくとも１個は徐放性コーティングである。他の態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な徐放性製剤は、所望によりさらなるコーティングと組み合わせ得る、持続放出特性を備えた非崩壊担体マトリクス中にｍＴＯＲ阻害剤を含む。
【１５６８】
ある態様において、担体マトリクスはマトリクス形成剤、概してマトリクス形成ポリマーを含み、充填剤、例えば、ラクトース、マンニトール、マルトデキストリン、アルファ化デンプン、リン酸カルシウムまたは微結晶性セルロースおよび崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、クロスカルメロース、デンプングリコール酸ナトリウムまたはクロスポビドン、抗酸化剤、例えば、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルオール、アスコルビルパルミテート、トコフェロール、ビタミンＥポリエチレングリコールスクシネートおよび滑沢剤および流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、モノステアリン酸グリセリル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたはフマル酸ステアリルナトリウムのような処理改良剤のようなさらなる添加物を含み得る。用語“マトリクス形成剤”は、概して、例えば、機械的または結合安定性のような物理的安定性を提供する、薬学的不活性物質に関する。
【１５６９】
速く溶解または崩壊する担体マトリクスに使用するための適当なマトリクス形成ポリマーは当分野で知られ、例えばセルロースまたはデンプン、例えば微結晶性セルロース(“ＭＣＣ”)、例えばAvicel PH 101(FMC BioPolymer)、アカシア、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、アルファ化デンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(“ＨＰＭＣ”)、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコールまたはポリビニルピロリドン(“ＰＶＰ”)、GP 812のようなカラゲナンまたはそれらの組み合わせを含む。
【１５７０】
持続放出特性を備えた非崩壊担体マトリクスのための適当なマトリクス形成添加物は当分野で知られ、例えばアカシア、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、カルボキシメチルセルロースナトリウム(または“ＣＭＣナトリウム”)、メチルセルロース、エチルセルロースおよびセルロースアセテートまたはポリアクリレート、例えば、アミノメタクリレートコポリマー(Eudragit RS/RL)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(“ＨＰＭＣ”)、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアセテート、ポリエチレングリコールまたはポリビニルピロリドン(“ＰＶＰ”)、例えば、GP 812のようなカラゲナン、モノステアリン酸グリセリル、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、ビタミンＥポリエチレングリコールスクシネートまたはそれらの組み合わせを含む。
【１５７１】
一つの態様において、徐放性コーティングは、水不溶性、非崩壊ポリマーから形成される層であり、この層により薬物の浸透による遊離を制御する。
【１５７２】
徐放性コーティングはまた１個以上の多孔形成剤、可塑剤ならびに滑沢剤および固化防止剤のような処理改良剤を含み得る。拡散制御放出を可能にする適当な徐放性コーティング形成ポリマーは当分野で知られ、例えばエチルセルロースおよびセルロースアセテートまたはポリアクリレート、例えば、アミノメタクリレートコポリマー(Eudragit RS/RL)、ポリビニルアセテートまたはそれらの組み合わせを含む。特定の態様において、徐放性コーティング形成ポリマーはエチルセルロースまたはセルロースアセテートまたはポリアクリレート、例えば、アミノメタクリレートコポリマータイプＡ(Eudragit RS)またはアミノメタクリレートコポリマータイプＢ(Eudragit RL)またはそれらの組み合わせである。さらに、徐放性コーティングはトリアセチン、トリエチルシトレート、ジブチルセバケート、ジエチルセバケート、ポリエチレングリコール３０００、４０００または６０００、アセチルトリエチルシトレート、アセチルトリブチルシトレートまたはジエチルフタレートのような可塑剤および／またはSyloid 244 FP、タルク、モノステアリン酸グリセリルまたは二酸化チタンのような固化防止剤を含み得る。ある態様において、可塑剤の量は、徐放性ポリマーの量に対して５〜４０％、好ましくは１０〜２５％である。
【１５７３】
ある態様において、徐放性コーティングは、水不溶性コーティング形成ポリマーおよび孔形成剤を含む孔形成系である。用語“孔形成剤”は、孔の導入またはコーティングの透過性増加可能とし、活性成分の拡散制御放出を可能とする、易溶解性添加物である。適当な孔形成剤は当分野で知られ、例えばヒドロキシプロピルセルロース(ＨＰＣ(例えば、KlucelTM EF、EXF,LF)またはヒドロキシプロピルメチルセルロース(ＨＰＭＣ、例えば、MethocelTM E3/E5、Pharmacoat 603TM)、ポリエチレングリコール(例えば、Macrogol 1500、3500、4000、6000)、ポロクサマー１８８(Pluronic F68TM)またはポビドン(ＰＶＰ、例えば、Kollidon K25/K30)、糖類、例えば、デキストロース、マンノース、フルクトースのような単糖、スクロースまたはグルコジフルクトースのような二糖またはそれらの組み合わせを含む。好ましくは孔形成剤はヒドロキシプロピルセルロース(ＨＰＣ  (KlucelTM EF、EXF,LF)またはヒドロキシプロピルメチルセルロース(ＨＰＭＣ、MethocelTM E3/E5、Pharmacoat 603TM)、ポリエチレングリコール(Macrogol 1500、3500、4000、6000)、ポロクサマー１８８(Pluronic F68TM)またはポビドン(ＰＶＰ、Kollidon K25/K30)またはそれらの組み合わせである。ある態様において、コーティングに含まれる孔形成剤の適当な量は、コーティング形成ポリマーの量に対して、例えば１００：２０〜１００：５０または１００：２０〜１００：１００のコーティングポリマー対孔形成剤の比、好ましくは比１００：３５〜１００：４５、特に比１００：３５〜１００：５０に等しい。ある態様において、包含されるコーティング形成ポリマーの適当な量は、医薬製剤の総重量の例えば、４重量％〜１５重量％、５重量％〜１５重量％、好ましくは５重量％〜１２重量％、より好ましくは６重量％〜１２重量％のポリマー重量増加のパーセンテージに等しい。
【１５７４】
他の態様において、非崩壊徐放性担体マトリクスは、ポリマーの水和により活性成分の拡散制御放出を可能にする、マトリクス形成ポリマーを含む。持続した担体マトリクスは、さらに結合剤およびまたは充填剤のような添加物ならびに滑沢剤および流動促進剤などのような処理改良剤を含み得る。
【１５７５】
以下の代表的マトリクス形成ポリマーを拡散制御放出用に使用し得る：アルギン酸ナトリウム、ポリアクリル酸(または“カルボマー”)、カルボキシメチルセルロースナトリウム、(または“ＣＭＣナトリウム”)、メチルセルロース、エチルセルロースおよびセルロースアセテートまたはポリアクリレート、例えば、アミノメタクリレートコポリマー(Eudragit RS/RL)、異なる粘性グレード(すなわち、平均ポリマー鎖長)のヒドロキシプロピルメチルセルロース(“ＨＰＭＣ”)およびそれらの組み合わせ、例えば、MethocelTM CRグレード、ヒドロキシプロピルセルロース、例えばKlucelTM HF/MF、ポリオキシエチレン、例えば、PolyoxTMまたはポリビニルピロリドン(“ＰＶＰ”)、例えば、PVP K60、K90、ViscarinTM GP-209/GP-379のようなカラゲナンまたはそれらの組み合わせ。マトリクス形成ポリマーの組み合わせは、必要に応じた、活性成分の溶解速度の調節を可能とする。
【１５７６】
ある態様において、非崩壊徐放性マトリクスは、制御された浸食により活性成分の放出を可能とする添加物で形成される。浸食制御マトリクスは、親油性マトリクス形成剤およびまたさらに充填剤、崩壊剤および滑沢剤および流動促進剤のような処理改良剤のような添加物を含み得る。このマトリクスタイプに関連する代表的親油性マトリクス形成添加物は、モノステアリン酸グリセリル、例えば、Cutina GMS、ベヘン酸グリセリル、例えば、Compritol 888 ATO、ステアリルアルコール、ステアリン酸、固い脂肪(hart fat)、例えば,GelucireTMまたはビタミンＥポリエチレングリコールスクシネート、例えば、Speziol TPGSまたはそれらの組み合わせのような親油性添加物を含む。
【１５７７】
代表的適当な結合剤、充填剤またはさらなる添加物は、マンニトール、アルファ化デンプン、微結晶性セルロース、ラクトース、リン酸カルシウム、タルク、二酸化チタン、トリエチルシトレート、Aerosil、例えば、ＢＨＴのような抗酸化剤、乾燥剤および例えば、クロスポビドンまたはデンプングリコール酸ナトリウム、デンプンまたはクロスカルメロースのような崩壊剤を含むが、これらに限定されない。
【１５７８】
ある態様において、安定な徐放性製剤は、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を、速く溶解／崩壊するマトリクスに、例えば、ここに記載する固体分散の形で、機能的層またはコーティングとともに含み、機能的層またはコーティングの少なくとも１個は、活性成分の徐放性を可能とする放出制御行動を有する。他の態様において、安定な徐放性製剤は、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を徐放性マトリクス内に含み、これは、所望により、さらに保護的または徐放性層またはコーティングのような機能的層またはコーティングを含み得る。ある態様において、コーティング、例えば、徐放性コーティングは、１０〜１００μm、例えば、１０〜５０μmの範囲の厚さを有する(共焦点ＲＡＭＡＮスペクトロスコピーで評価)。
【１５７９】
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の製剤は、多粒子送達系の形である。ある態様において、多粒子薬物送達系は、複数の、小さく分かれた用量単位からなる経口投与形態である。このような系において、カプセル剤、錠剤、サシェ剤またはスティックパック剤のような薬物物質の投与形態は、概して直径０.０５〜２.００mmの数十から数百または最大数千の球形粒子からなる、複数のサブユニットを含み得る。１.５〜３mmサイズの製剤、例えば、ミニ錠剤は他の代替である。投与形態は、胃で急速に崩壊して、多粒子を遊離するように設計し得る。特定の理論に縛られることを望まないが、多粒が胃腸管腔で拡散し、胃から徐々に空にされて、薬物物質を制御された方式で遊離すると考えられる。
【１５８０】
一つの態様において、例えば、多粒子送達系の形の、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の製剤は、例えば、粒子のコアに溶解または分散された(例えば、ビーズ、ペレット、顆粒またはミニ錠剤)または粒子の不活性コアを囲む層に、ｍＴＯＲ阻害剤を活性成分として含む。活性成分は、好ましくは親水性または親油性マトリクス形成添加物を含む徐放性マトリクスに例えば包埋できまたは速く崩壊および／または溶解するマトリクスに機能的層およびトップコーティングと組み合わせて包埋され、ここで、機能的層またはトップコーティングの少なくとも１個は、活性成分の拡散制御持続放出を可能とするコーティング形成ポリマーを含む。所望により、活性成分の安定性を改善するための保護層は、医薬品の安定性を確実にするために活性物質含有マトリクスを機能的層またはトップコーティングから分離する。
【１５８１】
他の態様において、例えば、多粒子送達系の形の、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の製剤は、活性成分としてのｍＴＯＲ阻害剤および不溶性ポリマーおよび孔形成剤としての可溶性成分および所望によりさらに機能的層を含む外側のコーティング層を含む。本発明の目的で、用語“外側の層”は、粒子の外側に位置する層であり、さらなる層でコーティングされてよくまたはトップコーティングであってよい。用語“外側の層”、“コーティング層”または“トップコート”は、該用語を使用する文脈によって、交換可能に使用し得る。
【１５８２】
一つの態様において、粒子は、活性成分の持続放出を可能とする１個〜数個のトップコートを含む。トップコートは、概して多粒子の各々を別々に含む、放出制御行動を備えた最終層である。
【１５８３】
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の製剤は、所望により不溶性ポリマー層への孔形成によりまたはあるいは単に不溶性ポリマーの水和により透過性であるコーティング層を介した薬物の拡散により遊離素制御するまたは孔形成剤および不溶性ポリマーの水和の組み合わせにより遊離を制御する、外側の層またはトップコーティングを含む。ポリマーは、ｐＨと無関係に不溶性であり、所望により水可溶性孔形成剤を含む。放出速度は、孔形成剤が溶解した後の孔の形成程度に影響される。不溶性コーティングポリマーは、エチルセルロースおよびセルロースアセテートのようなセルロースエーテルまたはポリアクリレート、例えば、アミノメタクリレートコポリマー(Eudragit RS/RL)であり得る。適当な孔形成剤は、水可溶性セルロースエーテル、例えばヒドロキシプロピルセルロース(ＨＰＣ(KlucelTM EF,EXF,LF)またはヒドロキシプロピルメチルセルロース(ＨＰＭＣ、MethocelTM E3/E5、Pharmacoat 603TM)、ポリエチレングリコール(Macrogol 1500、3500、4000、6000)、ポロクサマー１８８(Pluronic F68TM)またはポビドン(ＰＶＰ、Kollidon K12、K25、K30)を含む。例えば、水可溶性孔形成剤を、２：１〜１：１０、例えば１：１〜１：５、１：３または１：５の比で不溶性ポリマーと混合してよい。ある態様において、孔形成剤対不溶性ポリマー比は、ＨＰＣ、例えば、KlucelTM EF、EXF、LFまたはHMPC 3cP、例えば、MethocelTM E3のもの、１：１〜１：４、例えば、約１：１、１：１.２、１：１.５または１：２の比である。代表的不溶性ポリマーは、孔形成剤と組み合わせたエチルセルロース(ＥＣ、Aqualon EC N10TM)を含むが、これに限定されない。ある態様において、孔形成剤を用いずに、不溶性ポリマーアミノメタクリレートコポリマータイプＡ(Eudragit RS)とアミノメタクリレートコポリマータイプＢ(Eudragit RL)の組み合わせは、１：２〜９：１、好ましくは１：１〜４：１の比であり得る。
【１５８４】
徐放トップコートは、活性物質の大部分の小腸への遊離を達成し、胃液から活性物質を保護し、活性物質の口腔、食道および胃への暴露を最小にし得る。
【１５８５】
一つの態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の製剤は、薬物物質含有マトリクス、例えば、速く崩壊および／または溶解するマトリクス層を含むかまたは、例えば、１個以上の成分を含むことができ、活性成分が分散または溶解しているビーズ、ペレットまたは顆粒のような開始コア上の、徐放性マトリクス層に含む。例えば、非晶質または結晶ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を、マトリクス内に重量で１：１００〜１００：１、例えば、重量で１：５０〜５：１；または１：５０〜１：１または１：５〜２：３または重量で１：１０〜１：５(マトリクス形成剤に対して)で分散または溶解できる。
【１５８６】
ある態様において、薬物物質含有マトリクスは、出発コアの表面上に重層される。層は、均一な、規則的サイズおよび形の粒子上に流動床法で、マトリクス成分および薬物物質の分散または溶液を噴霧することにより構築し得る。あるいは、マトリクス成分の粉末混合物を、回転ディスクプロセッサを使用して重層できる。出発コアは、平均粒子径０.１〜２.５mmを有する。単結晶、例えば、スクロースまたは流動床造粒、回転造粒、押し出し、球形化または圧密過程により製造される顆粒状凝集体である。ある態様において、ミニ錠剤を出発コアとして使用できる。特に態様、出発コアは球形であり、スクロースおよびデンプン(Sugar Spheres、SugletsTM、ノンパレイユ)、マンニトール(例えばMCellsTM)、ラクトース(例えば、噴霧乾燥ラクトース)または微結晶性セルロース(例えば、CelletsTM)のような不活性物質からなる。
【１５８７】
他の態様において、薬物物質含有マトリクスは、粒子のコアに取り込まれる。マトリクス形成添加物、充填剤および処理を改良するための他の成分を薬物物質と混合する。得られた粉末混合物を、湿式押し出しまたは融解押し出しとその後の混合物の球形化を使用して粒子として、またはミニ錠剤への圧密化により製剤する。形成したマトリクスは、速く崩壊／溶解するマトリクスまたは親水性または親油性マトリクス形成添加物で構築された持続放出特性を備えた非崩壊マトリクスである。
【１５８８】
ある態様において、薬物物質またはその固体分散を含む親水性、非崩壊マトリクスからなる多粒子を、活性成分、増量剤、例えば、ラクトースを、親水性、異なる粘性のヒドロゲル形成ポリマー、流動促進剤および滑沢剤と混合することにより製造する。ある態様において、親水性、ヒドロゲル形成ポリマーは、例えば、２重量％水溶液で２０mPas未満の低粘性グレードのヒドロキシプロピルメチルセルロース、例えば、Methocel E5と２重量％水溶液で１００mPasを超える高粘性のヒドロキシプロピルメチルセルロースグレード、例えば、Methocel K100の組み合わせであり得る。粉末混合物を次いで打錠機で圧縮して、ミニ錠剤を得る。あるいは、粉末混合物を有機溶媒、例えば、エタノールで湿らせ、押し出し、多粒子を得るために球形化する。
【１５８９】
他の態様において、薬物物質またはその固体分散を含む親油性、非崩壊マトリクスからなる多粒子を、活性成分、親油性、融解可能、マトリクス形成添加物および充填剤の混合により製造できる。混合物を、押し出し機での融解および混合により製造する。得られた伸張した鎖を粒子に切断し、所望により球形化する。使用する親油性添加物は、例えばビタミンＥポリエチレングリコールスクシネート(Vit E TPGS、例えば、BASFからのKolliphor TPGS Pharma)単独またはモノステアリン酸グリセロール(ＧＭＳ、例えば、ＢＡＳＦからのKolliwax GMS)と９：１〜１：９比の混合物である。
【１５９０】
ある態様において、徐放性ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の製剤は、患者に使用可能な速放性錠剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１速放性錠剤(Final Market Imageまたは“ＦＭＩ”錠剤)と比較して、２４名の健常対象における一回投与後、ピーク濃度(Ｃｍａｘ)対投与２４時間後濃度(Ｃ２４ｈ)比を減少させる。ある態様において、Ｃｍａｘ／Ｃ２４ｈ比は、例えば、薬物動態モデルシミュレーションで測定して減少する。Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ比減少の利点は、ＦＭＩ製剤に対するｍＴＯＲ阻害剤のバイオアベイラビリティに基づく適切な用量で、ｍＴＯＲ阻害剤の濃度を、薬物の治療範囲の低い側(十分な有効性)に維持し、同時に薬物の治療範囲の高い側(毒性の濃度領域)から離すことである。それゆえに、ある態様において、徐放性ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の製剤は、その有効性に影響することなく、ｍＴＯＲ阻害剤の安全性プロファイルを改善できる。ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の徐放性製剤を投与されている患者におけるＣｍａｘ／Ｃ２４ｈ(ゆえにＣｍａｘ／Ｃｍｉｎ)比は＜５または＜４、例えば３.５±１または３±０.５である。
【１５９１】
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１は、機能的層またはトップコートから離れた層に含まれ、製剤からの持続放出特性を制御する。このような層は、ｍＴＯＲ阻害剤を分散または溶解するのに適するあらゆる物質から製造され得る。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を含む層は親水性担体マトリクスからなる。担体マトリクスは活性成分を包埋し、分解から保護し得る。適当なマトリクス形成剤は、親水性ポリマー、例えばＨＰＭＣタイプ２９１０またはタイプ２２８０、ＨＰＣ、ＨＥＣ、ＭＥＣ、ＭＨＥＣ、ポビドンを含むが、これらに限定されず、これは、水に溶解できるかまたは急速に分散できる。一つの態様において、マトリクス層は、その各々を全内容を引用により本明細書に包含させる、例えばＷＯ９７／０３６５４号またはＷＯ０３／０２８７０５号に記載の、固体分散の形である。
【１５９２】
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１のための速く溶解／崩壊する担体マトリクスは、固体分散の形である。ある態様において、固体分散は担体、例えば、水可溶性ポリマーを含み、例えば次のポリマーの１個または混合物を使用し得る。
− ヒドロキシプロピルメチルセルロース(ＨＰＭＣ)、例えば、Dow ChemicalsのMethocelTM Eまたは信越のPharmacoatTMとして入手可能なヒプロメロースタイプ２９１０。良好な結果が、低い見かけの粘性、例えば、２０℃で２重量％水溶液で測定して１００cps以下、例えば５０cps以下、好ましくは２０cps以下のＨＰＭＣ、例えばＨＰＭＣ  ３cpsを使用して、得られ得る；
− ポリビニルピロリドン(ポビドン、ＰＶＰ)、例えば、ＰＶＰ  Ｋ２５、Ｋ３０またはＰＶＰ  Ｋ１２。ＰＶＰは、例えば、ＢＡＳＦ社からKollidon(登録商標)としてまたはＩＳＰ社からPlasdone(登録商標)として商業的に入手可能である。平均分子量約８,０００〜約５０,０００ダルトンを有するＰＶＰ、例えば、ＰＶＰ  Ｋ３０が好ましい；
− ヒドロキシプロピルセルロース(ＨＰＣ)、例えば、Ｋｌｕｃｅｌ  ＥＦ／ＬＦ／ＪＦまたはその誘導体。ＨＰＣ誘導体の例は、水性媒体、例えば、水中で低動的粘性、例えば、５％水溶液中、２５℃で測定して約４００cps以下を有するものを含む。好ましいＨＰＣ誘導体は、約２００,０００ダルトン以下、例えば、８０,０００〜１４０,０００ダルトンの平均分子量を有する。商業的に入手可能なＨＰＣは、Hercules Aqualon社からのＫｌｕｃｅｌ(登録商標)ＬＦ、Ｋｌｕｃｅｌ(登録商標)ＥＦおよびＫｌｕｃｅｌ(登録商標)ＪＦ；および日本曹達株式会社から入手可能なＮｉｓｓｏ(登録商標)ＨＰＣ−Ｌを含む；
− ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)。例は、１０００〜９０００ダルトン、例えば約１８００〜７０００の平均分子量を有するＰＥＧ、例えばＰＥＧ  ２０００、ＰＥＧ  ４０００またはＰＥＧ  ６０００を含む(Handbook of Pharmaceutical Excipients, p. 355-361)；
− 例えば、Gattefosse社から、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ(登録商標)、例えば、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ(登録商標)４４／１４、５３／１０、５０／１３、４２／１２または３５／１０として入手可能な飽和ポリグリコール化グリセリド；または
− シクロデキストリン、例えばｂ−シクロデキストリンまたはａ−シクロデキストリン。適当なｂ−シクロデキストリンの例は、メチル−ｂ−シクロデキストリン；ジメチル−ｂ−シクロデキストリン；ヒドロキシプロピル−ｂ−シクロデキストリン；グリコシル−ｂ−シクロデキストリン；マルトシル−ｂ−シクロデキストリン；スルホ−ｂ−シクロデキストリン；ｂ−シクロデキストリンのスルホ−アルキルエーテル、例えばスルホ−Ｃ１４−アルキルエーテルを含むが、これらに限定されない。ａ−シクロデキストリンの例は、グルコシル−ａ−シクロデキストリンおよびマルトシル−ａ−シクロデキストリンを含むが、これらに限定されない。
【１５９３】
一つの態様において、ｍＴＯＲ阻害剤−含有層は、抗酸化剤を、薬物物質の量に対して１：１０００〜１：１比で含む。抗酸化剤はまた他の機能的層に、例えば、０.１〜１０％、好ましくは０.１〜１％の濃度で使用し得る。適当な抗酸化剤は、ブチルヒドロキシルトルオール、ブチルヒドロキシアニソール、アスコルビルパルミテート、トコフェロール、ビタミンＥポリエチレングリコールスクシネートを含むが、これらに限定されない。特定の態様において、抗酸化剤はブチルヒドロキシルトルオールである。
【１５９４】
一つの態様において、保護層は、活性物質を含む層を、例えば、トップコーティングのような他の機能的層から離し、医薬品の安定性を増強する。薬物物質は、トップコーティングとの直接接触の排除により安定化される。保護層はまた層を通して移動できるトップコーティングにおける何らかの成分、例えば、ポリマー副産物または可塑剤が、活性剤と直接接触することを阻止する拡散バリアとしても作用する。マトリクス形成剤(例えば、上記マトリクス形成剤)としても使用するポリマー以外に、適用したポリマーの量に対して、例えば、１０〜１００％、例えば、２０〜５０％の、高含量の、タルクおよび／または二酸化チタンのような無機色素または固化防止剤はバリア機能に寄与する。保護層厚さは、最適化された薬物製品安定性を得るために調節できる。
【１５９５】
他の態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１は、徐放性担体マトリクスに直接包埋される。
【１５９６】
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む製剤は、製剤に閉じ込められた水湿気と結合でき、内部乾燥剤として作用する、強度に吸湿性の添加物を含む。例えば、クロスポビドン、クロスカルメロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウムまたはデンプンのような吸着剤を使用できる。例えば、ある態様において、クロスポビドンを錠剤崩壊剤として、例えば、２％〜２５％クロスポビドンで使用する。吸着剤、例えば、クロスポビドンは、湿式および融解押し出しで使用する粉末混合物の一部、ミニ錠剤に圧縮する粉末混合物の一部、多粒子を打錠する粉末混合物の一部および／またはサシェ剤またはカプセル剤充填工程で多粒子に直接添加されることが可能である。
【１５９７】
一つの面において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１は、計５％未満、例えば、計３％未満または計２.５％未満の低水湿気含量の粒子(例えば、０.１〜０.５mm)、ビーズ、ペレット(例えば、０.２〜２mm)またはミニ錠剤(例えば、１.５〜３mm)で存在する。
【１５９８】
ある態様において、医薬組成物、例えば、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の多粒子送達系を、例えば、カプセル剤(例えば、ＨＰＭＣまたはHart Gelatineカプセル)のような医薬品としてまたは小袋またはスティックパックに包装してまたは崩壊により粒子を放出する錠剤として製剤できる。
【１５９９】
ある態様において、小袋、スティックパック、ブリスターまたはボトルのような一次放送は、貯蔵寿命保存中および／または使用時間中医薬品の水湿気含量を減らすかまたは安定化する水収着成分、例えば、シリカゲルを含み得る。
【１６００】
提供される製剤は、複数ペレット、顆粒またはミニ錠剤を含みおよび／または遊離し得る。
【１６０１】
ある態様において、提供される製剤、例えば、多粒子製剤は、マトリクス形成添加物と薬物物質の混合物を、熱または湿潤液体の助けを借りて、押し出し、球状化しまたは薬物含有混合物のミニ錠剤を圧密化しまたは薬物含有マトリクス層を流動床または回転造粒工程でコア上に重層することにより製造できる。
【１６０２】
ある態様において、活性物質含有層は、親水性成分および活性物質が分散または溶解した、有機溶媒のスプレー分散をコア物質に噴霧し、同時に、溶媒を加熱、乾燥空気の助けを借りて除去することにより製造できる。この方法で、コアを囲むマトリクス層が形成され、例えば、形成された層は、例えば、ＨＰＭＣ、ＨＰＣ、ＨＥＣのようなポリマー中の活性剤の固体分散である。
【１６０３】
一つの面において、提供される医薬製剤は、次のとおり、製造し得る。親水性ポリマーがコロイド状に分散している有機フィード混合物およびここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を分散または溶解し、これが修飾放出コートでコートされ得るような方法で、溶媒の除去により固体分散の均一な、平滑層として沈殿する。ある態様において、得られた薬物含有多粒子を、さらなる機能的層およびトップコーティングでコーティングし得る。有機溶媒およびそれらの混合物に溶解、分散および懸濁されたコーティングポリマー、滑沢剤、粘着防止剤、孔形成剤および可塑剤を含む噴霧分散を、薬物含有多粒子に噴霧する。処理中、多粒子は、制御された運動または流動化を連続して維持し、一方乾燥、加熱処理ガスを、多粒子表面上の溶媒の蒸発のために製品に適用し、ここで、フィルム層が規定温度で形成される。フィルム層厚さは、噴霧するコーティング分散の量により制御できる。最終乾燥を、重層および被覆多粒子における残存溶媒含量を最小化するために適用する。
【１６０４】
他の面において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１は、徐放性製剤の一部の高薬物充填部分として製剤し得る。ある態様において、製剤はさらに界面活性剤を含む。用語“界面活性剤”は、“湿潤剤”または“洗剤”と交換可能に使用でき、例えば、非イオン性、イオン性、アニオン性または両性界面活性剤をいう。適当な界面活性剤／湿潤剤の例は、例えば、Pluronicまたはポロクサマー(例えばポロクサマー１８８(Pluronic F68)の商品名の下に知られるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーおよびブロックコポリマー、ポリオキシエチレン、Tweenの商品名の下に知られるタイプのモノおよびトリラウリル、パルミチル、ステアリルおよびオレイルエステルを含むソルビタン脂肪酸エステル、Myrjの商品名の下に知られるタイプのポリオキシエチレンステアリン酸エステルを含むポリオキシエチレン脂肪酸エステル、Brijの商品名の下に知られるポリオキシエチレンアルキルエーテル、ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)のようなナトリウムアルキルスルフェートおよびスルホネートおよびナトリウムアルキルアリールスルホネート、水可溶性トコフェリルポリエチレングリコールコハク酸エステル(ＴＰＧＳ)、ポリグリセロール脂肪酸エステル、アルキレンポリオールエーテルまたはエステル、ポリエチレングリコールグリセリル脂肪酸エステル、ステロールおよびその誘導体、エステル交換、ポリオキシエチル化カプリル−カプリン酸グリセリド、糖脂肪酸エステル、ＰＥＧステロールエーテル、リン脂質、脂肪酸の塩、脂肪酸スルフェートおよびスルホネート、脂肪酸の塩、脂肪酸スルフェートおよびスルホネート、中鎖または長鎖アルキル、例えば、Ｃ６−Ｃ１８、アンモニウム塩、胆汁酸またはその塩；例えばコール酸、グリコール酸または塩、例えば、コール酸ナトリウムおよび飽和Ｃ１０−Ｃ２２脂肪酸のポリオキシエチレンモノエステルを含むが、これらに限定されない。特定の態様において、界面活性剤はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーまたはブロックコポリマーまたは水可溶性トコフェリルポリエチレングリコールコハク酸エステル、例えば、水可溶性トコフェリルポリエチレングリコールコハク酸エステル、例えば、ビタミンＥポリエチレングリコール１０００スクシネート(ＴＰＧＳ)である。他の態様において、本医薬製剤中の界面活性剤はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、例えば、ポロクサマー１８８だる。さらに他の態様において、医薬製剤は界面活性剤アルキル硫酸ナトリウム、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムを含む。
【１６０５】
界面活性剤または湿潤剤は、製剤中に、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１に対して、重量で１０：１〜１：２００、例えば、重量で１：１〜１：１００、重量で１：２〜１：８、重量で１：４〜１：６の比で存在し得る。
【１６０６】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１は、高薬物負荷含有第一層であり、界面活性剤は第二層であり、ここで、該第二層は第一層の下にあり、所望によりさらなる徐放性コーティングを伴う。このような態様のいくつかにおいて、界面活性剤はポロクサマー１８８およびＴＰＧＳではない。ある態様において、第二層の界面活性剤または湿潤剤は、活性成分含有層を、製剤を覆うコーティングと離す、保護層を形成できる。製剤を覆うコーティンは徐放性コーティングであり得る。
【１６０７】
患者に投与する上記処置剤の投与量は、処置する状態の厳密な性質および処置するレシピエントにより変わる。ヒト投与のための投与量のスケーリングは、当分野で認められた習慣に従い実施できる。ある態様において、CAMPATHについての用量は、例えば、一般に成人患者で１mg〜約１００mgの範囲であり、通常１〜３０日の期間連日投与する。好ましい１日用量は１日あたり１〜１０mgであるが、いくつかの例においては１日あたり最大４０mgの高用量を使用し得る(米国特許６,１２０,７６６号に記載)。
【実施例】
【１６０８】
本発明を、次の実験的実施例を参照してさらに詳細に記載する。これらの実施例は、説明のみを目的とするものであり、特に断らない限り限定的と解釈してはならない。それゆえに、本発明は、次の実施例に限定されると決して解釈してはならず、むしろ、ここに記載する教示の結果として明らかとなるありとあらゆる多様性を包含すると解釈すべきである。
【１６０９】
さらに記載しなくても、当業者は、先の記載および下の説明的実施例を使用して、本発明の化合物を製造および利用し、請求する方法を実施できると考える。次の作業実施例は、本発明の種々の面を具体的に示し、残りの開示をいかなる方法でも限定すると解釈してはならない。
【１６１０】
実施例１：ラパログスイッチを使用する調節可能ＣＡＲ
この実施例は、抗原結合メンバー(“結合事象”)と細胞内シグナル伝達メンバー(“シグナル伝達事象”)の分離に基づく、調節可能キメラ抗原受容体(ＲＣＡＲ)の態様の根底にある重要な一般的概念を説明する。二量体化分子、例えば、小分子の存在下、抗原結合メンバーおよび細胞内シグナル伝達メンバーのスイッチドメインは、結合し、今結合したＲＣＡＲ分子におけるシグナル伝達の引き金を引く。例として、ｓｃＦｖのような細胞外抗原結合ドメインを、膜貫通ドメインおよび二量体化スイッチ(例えば、ヘテロ二量体化スイッチ)の第一スイッチドメイン(例えば、ＦＫＢＰまたはＦＲＢからのスイッチドメイン)と融合させる。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヘテロ二量体化スイッチの第二スイッチドメイン(例えば、ＦＲＢまたはＦＫＢＰ)および１個以上の４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータのような細胞内シグナル伝達ドメインを含む。二量体化およびシグナル伝達カスケードの開始は、細胞外結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインと連結する小分子ヘテロ二量化剤(スイッチドメインが同じではないため“ヘテロ二量体化分子”)の付加により達成された。本実施例において、二量体化を含む小分子は、ラパマイシンまたはその類似体(“ラパログ”と呼ばれる)であり得る。ラパマイシンまたはラパログは、ＦＫＢＰおよびｍＴＯＲのＦＲＢドメインと高親和性で結合し、それにより複合体形成を誘発するヘテロ二量化剤として作用することにより、機能する(Choi, J., et al(1996) Structure of the FKBP12-rapamycin complex interacting with the binding domain of human FRAP Science 273: 239-42)。
【１６１１】
次の実施例は、二量体化スイッチが細胞の内側または外側であり得ることを説明する。
【１６１２】
説明のみを目的として、“１３９”と呼ばれるＥＧＦＲｖIII  ｓｃＦｖフラグメントを、ＲＣＡＲを産生するための細胞外抗原結合ドメインとして使用した。このｓｃＦｖは、ＥＧＦＲｖIIIに対するヒト抗体由来である(Morgan et al., 2012 Hum Gene Ther 23(10): 1043-53)。ＲＣＡＲを産生するために、構築物の対を産生し、標的免疫エフェクター細胞で共発現させた。ヘテロ二量体化スイッチの多様なスイッチドメインを、ＲＣＡＲ構築物の異なるドメインと連結できる。
【１６１３】
“スイッチ１”は構築物の対を含む。第一構築物は、抗原結合ドメイン(１３９  ｓｃＦｖ)が、ヒンジ領域、膜貫通領域、リンカーおよび第一細胞内スイッチドメイン−ＦＲＢ(配列番号３)が続くリーダー配列の１３９  ｓｃＦｖに融合することにより構築するように設計した。第二構築物は、第二スイッチドメイン−ＦＫＢＰを第二リンカーおよびシグナル伝達ドメイン４−１ＢＢと続くＣＤ３ゼータ(配列番号４)に融合することにより設計した。
【１６１４】
“スイッチ２”は構築物の対を含む。第一構築物は、抗原結合ドメインが、リーダー配列が、１３９  ｓｃＦｖと続くヒンジ領域、膜貫通領域、リンカーおよび第一細胞内スイッチドメイン−ＦＫＢＰに融合することにより構築するように設計した(配列番号５)。対応する細胞内シグナル伝達構築物は、第二スイッチドメイン−ＦＲＢが第二リンカーおよび細胞内シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢと続くＣＤ３ゼータに融合することにより設計した(配列番号６)。
【１６１５】
１３９  ｓｃＦｖに対するＥＧＦＲｖIII  ＣＡＲ配列を、４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータに対するシグナル伝達ドメインでクローン化した。非調節可能ＣＡＲ構築物(１３９ｓｃＦｖ−ＢＢＺ、配列番号７)を、レンチウイルス産生のためにｐＥＬＮＳベクターから発現させ、続く実験で対照として使用する。
【１６１６】
ＥＧＦＲｖIII  クローン１３９−ＣＤ８アルファＴＭ−ＦＲＢ(配列番号３)
【化３１】
0006793902.tif 000071
【１６１７】
ＦＫＢＰ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ(配列番号４)
【化３２】
0006793902.tif 000072
【１６１８】
ＥＧＦＲｖIII  クローン１３９−ＣＤ８アルファＴＭ−ＦＫＢＰ(配列番号５)
【化３３】
0006793902.tif 000073
【１６１９】
ＦＲＢ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ(配列番号６)
【化３４】
0006793902.tif 000074
【１６２０】
１３９ｓｃＦｖ−ＢＢｚ(対照)(配列番号７)
【化３５】
0006793902.tif 000075
【１６２１】
構造１：ＡＰ２１９６７
【化３６】
0006793902.tif 000076
【１６２２】
材料および方法
ＥＧＦＲｖIII  ＣＡＲ構築物の表面発現およびＦＡＣＳによる染色
Jurkat  Ｅ６細胞を、Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V(Lonza, Colgne AG, Germany)およびプログラムＸ−００１を使用して、種々のＥＧＦＲｖIII  ＣＡＲ構築物または１３９  ＣＡＲ対照ベクターと電気穿孔した。遺伝子導入１日後、０.５×１０６細胞を、０.２ml  ＦＡＣＳ緩衝液(５％ＦＢＳ含有ＤＰＢＳ緩衝液)中、Ｖ字型９６ウェルプレート(Greiner Bio-One, Germany)の各ウェルに入れ、１０分、室温でインキュベートした。細胞を遠沈し、１００nMのＥＧＦＲｖIII−Ｆｃを含む０.２mlのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、４℃で６０分インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１μlのＰＥ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)を含む０.２mlのＦＡＣＳ緩衝液中、３０分、４℃で暗所でインキュベートした。０.２mlのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄後、細胞を、ＬＳＲII(BD Biosciences,San Jose,CA)装置で、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア(BD Biosciences,San Jose,CA)を使用して分析した。免疫蛍光染色を、生存細胞の相対的対数蛍光として分析し、ＰＥ陽性細胞のパーセンテージを測定した。
【１６２３】
ＣＡＲ機能の初期特徴づけのためのJurkatレポーター細胞株の産生
一次Ｔ細胞形質導入および活性化の代わりとして、Jurkat−ＮＦＡＴレポーター細胞株を使用して、ＣＡＲ構築物の機能的活性を評価できる。Jurkat  Ｔ細胞株(Ｅ６−１)を、ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーター構築物で遺伝子導入し、安定な、ＮＦＡＴ−ＬＵＣレポーター(ＪＮＬ)を有するクローン細胞株Jurket細胞を、ＰＭＡおよびイオノマイシン刺激後のＮＦＡＴレポーターの強い誘導に基づくさらなる特徴づけのために選択した。
【１６２４】
Jurkatレポーター細胞株の遺伝子導入およびスイッチ１またはスイッチ２によるＮＦＡＴの活性化
ＮＦＡＴ−ＬＵＣレポーターを有するJurkat細胞(ＪＮＬ)を、０.５μg／mlのピューロマイシンを含むJurkat細胞増殖培地中、０.５×１０６／mlの密度まで増殖した。各遺伝子導入について、２.５×１０６細胞を１００ｇで１０分遠沈した。２μgのＤＮＡ／構築物を遺伝子導入あたり使用した。Amaxa Nucleofector solution VおよびサプリメントＩを混合し、１００μlをＤＮＡ構築物とともにチューブに入れた。混合物を細胞に添加し、エレクトロポレーションキュベットに移した。エレクトロポレーションを、Amaxa Nucleofector II Deviceを使用して設定Ｘ−００１下に実施した。０.５mlの増殖培地を電気穿孔直後に添加し、混合物を、２ml  増殖培地中、６ウェルプレートの１ウェルに移した。１時間後、Ａ／Ｚ化合物を５００nMの最終濃度で適用した。細胞を、５％ＣＯ２の３７℃インキュベーターで、一夜１８時間インキュベートした。組織培養プレートを５μg／mlのＥＧＦＲｖIII−ＦｃまたはＩｇＧ１−Ｆｃで２時間被覆し、ブロッキング緩衝液(５％血清含有ＤＰＢＳ)で１時間ブロックした。Ａ／Ｚ化合物含有または不含遺伝子導入細胞を再懸濁し、標的プレートに１００μl／ウェルで添加し、１８時間インキュベートした。Luciferase One Glo試薬１００μlをウェルあたり添加した。サンプルを５分、３７℃でインキュベートし、発光をルミノメーターを使用して測定する。
【１６２５】
ＮＦＡＴ活性化に対するラパログの用量応答
ＲＣＡＲ構築物が、抗原結合ドメインの標的抗原結合後にラパログ依存性シグナル活性化を示す能力を、ＮＦＡＴ−ＬＵＣレポーター(ＪＮＬ)レポーターを伴うJurket細胞で測定した。具体的に、ＪＮＬを、０.５μg／mlのピューロマイシン含有Jurket細胞増殖培地中、０.５×１０６／mlの密度に増殖した。各遺伝子導入について、２.５×１０６細胞を１００ｇで１０分遠沈した。２μgのＤＮＡ／構築物を遺伝子導入あたり使用した。Amaxa Nucleofector solution VおよびサプリメントＩを混合し、１００μlをＤＮＡ構築物とともにチューブに入れた。混合物を細胞に添加し、エレクトロポレーションキュベットに移した。エレクトロポレーションを、Amaxa Nucleofector II Deviceを使用して設定Ｘ−００１下に実施した。０.５mlの増殖培地を電気穿孔直後に添加し、混合物を、２ml  増殖培地中、６ウェルプレートの１ウェルに移した。１時間後、多様な濃度のラパログ化合物を細胞に添加した。細胞を、５％ＣＯ２の３７℃インキュベーターで、一夜１８時間インキュベートした。組織培養プレートを５μg／mlのＥＧＦＲｖIII−ＦｃまたはＩｇＧ１−Ｆｃで２時間被覆し、ブロッキング緩衝液(５％血清含有ＤＰＢＳ)で１時間ブロックした。遺伝子導入細胞を、標的プレートに１００μl／ウェルで添加し、さらに１８時間インキュベートした。Luciferase One Glo試薬１００μlをウェルあたり添加した。サンプルを５分、３７℃でインキュベートし、発光をルミノメーターを使用して測定する。
【１６２６】
結果
ラパログ制御ＣＡＲ−ＥＧＦＲｖIIIの標的介在活性を試験するためのJurkatレポーターアッセイ
集合的に、これらの実験は、ＲＣＡＲの種々の成分を別々に操作し、二量体化分子の存在下で合わせて、ＲＣＡＲにおけるシグナル伝達を伝達できることを示す。ｓｃＦｖの表面発現をフローサイトメトリーで評価し、全構築物の約〜５０％であることが示された(データは示していない)。ＪＮＬ−ＲＣＡＲ−ＥＧＦＲｖIII細胞を次いでラパログ(ヘテロ二量体化分子)を用いてまたは用いずに刺激して、ＲＣＡＲ構築物が細胞の表面に発現されたことを示した。ＪＮＬ親細胞および対照ＣＡＲを発現するＪＮＬ細胞をさらなる対照として包含させた。図１２Ａは、ヘテロ二量体化分子存在下の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖを発現するＲＣＡＲおよび細胞内シグナル伝達ドメインを発現するＲＣＡＲの間のシグナル伝達事象を調査するために設計した試験の結果を示す。データは、対照ＲＣＡＲに等しいラパログでの刺激後の顕著な標的制御活性化を示す。さらに、ラパログ非存在下で顕著な標的上活性化は観察されず、スイッチドメインの小分子制御ヘテロ二量体化(ＦＫＢＰおよびＦＲＢ)が介在するスイッチを示す。最後に、対照標的(ＩｇＧ１−Ｆｃのみ)(白棒)に対する活性化は観察されなかった。これらのデータは、ラパログのみの存在下のＥＧＦＲｖIII標的に対するＲＣＡＲ構築物の特異性および対照標的に対するまたはラパログ非存在下の交差反応性の欠如を示す。これらのデータは、ＲＣＡＲ構築物がヘテロ二量体化スイッチで制御できることを示した最初である。
【１６２７】
用量応答を決定するために、ラパログ(“Ａ／Ｃヘテロ二量化剤”ＡＰ２１９６７)を、多様な濃度で、ＥＧＦＲｖIII  クローン１３９−ＣＤ８アルファＴＭ−ＦＫＢＰ(配列番号５、構築物６６)およびＦＲＢ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ(配列番号６、構築物６７)と共遺伝子導入した遺伝子導入細胞に適用し、ＮＦＡＴ活性化を測定した。ＥＧＦＲｖIII  １３９ｓｃＦｖ−ＢＢｚ(配列番号７)を対照として使用した。
【１６２８】
図１２Ｂに示すように、ＮＦＡＴの活性化倍率は、５００nMから２０nMほどの低用量まで相対的に一定のままであった。驚くべきことに、０.８nM濃度のラパログでさえ、標的が介在するＮＦＡＴの２〜３倍の誘導があった。活性化倍率の低下は、二量体化４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータの程度の減少によるものである可能性があり、発現は、多様な濃度のラパログ処置をとおして比較的同等であった。この結果は、ラパログがＲＣＡＲに使用したヘテロ二量体化スイッチの状況で、ＦＫＲＰおよびＦＢＰの二量体化を強力に媒介することを示した。スイッチが、ＦＫＢＰが細胞内シグナル伝達ドメインでＦＲＢが１３９  ｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるように逆にしたとき、類似の結果が見られることが期待される。図１２Ａのように、対照標的ＩｇＧ１−Ｆｃに対する活性化は見られなかった(各対の２番目の棒)。
【１６２９】
実施例２：クーママイシンスイッチを使用する調節可能ＣＡＲ
次の実施例は、ＲＣＡＲ構築物を達成するためのクーママイシン制御二量体化(Farrar, M. A. et al, 1996, nature. 383,: 178-181)の使用を説明する。この実施例において、スイッチは、リーダー配列を、１３９  ｓｃＦｖと続くヒンジ領域、膜貫通領域、リンカーおよび第一細胞内スイッチドメイン−ＧｙｒＢに融合させることにより設計する(配列番号８)。第二構築物は、第二スイッチドメインＧｙｒＢを、第二リンカーおよび細胞内シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢと続くＣＤ３ゼータに融合することにより設計した(配列番号９)。スイッチドメインが同じであるため、この二量体化スイッチは“ホモ二量体化スイッチ”という。Ｔ細胞のシグナル活性化は、小分子クーママイシン(構造２)の添加により制御される。
【１６３０】
構造２；クーママイシン
【化３７】
0006793902.tif 000077
【１６３１】
ＥＧＦＲｖIII  クローン１３９−ＣＤ８アルファＴＭ−ｇｙｒＢ(配列番号８)
【化３８】
0006793902.tif 000078
【１６３２】
ＧｙｒＢ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ(配列番号９)
【化３９】
0006793902.tif 000079
【１６３３】
材料および方法
クーママイシンスイッチを使用する調節可能ＣＡＲのためのＤＮＡの合成
クーママイシンはいくつかの業者から商業的に入手可能である。１３９  ｓｃＦｖの配列を、４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータに対するシグナル伝達ドメインとともにクローン化した。非調節可能ＣＡＲ構築物である１３９ｓｃＦｖ−ＢＢＺ(配列番号７)を対照として使用できる。クーママイシンＲＣＡＲについて、１３９  ｓｃＦｖを、膜貫通ドメインと続くＧｙｒＢスイッチドメインをＣ末端(配列番号８)およびＧｙｒＢをリンカーおよびシグナル伝達ドメイン４−１ＢＢと続くＣＤ３ゼータに融合することにより製造した活性化構築物(配列番号９)とクローン化した。Jurkatアッセイを、最終工程が遺伝子導入細胞を１８時間、種々の濃度のクーママイシンとインキュベートすることを含む以外、本質的に実施例１に記載するとおり実施した。Luciferase One Glo試薬１００μlをウェルあたり添加した。サンプルを５分、３７℃でインキュベートし、発光をルミノメーターを使用して測定した。
【１６３４】
図２０Ａおよび２０Ｂは、２個の異なる比の抗原結合メンバー：細胞内シグナル伝達メンバー(５：１および１：５)でのシグナルへのクーママイシンの添加の効果を示す。クーママイシンの添加は、両方の比で、１mMおよび１０mMの両方でシグナルの有意な増加をもたらした。
【１６３５】
実施例３：ジベレリンスイッチを使用する調節可能ＣＡＲ
次の実施例は、ＲＣＡＲ構築物を活性化するためのジベレリン介在ヘテロ二量体化の使用を説明する(Takafumi M et al,2012. Nat Chem Biol.;8(5):465-470)。ＲＣＡＲを産生するために、構築物の対を産生し、標的細胞で共発現させた。スイッチドメインの多様なヘテロ二量体化ドメインを、ＲＣＡＲ構築物の異なるドメインに連結できる。
【１６３６】
“スイッチ１”は構築物の対を含む。第一構築物は、リーダー配列を、１３９  ｓｃＦｖと続くヒンジ領域、膜貫通領域、リンカーおよび第一細胞内スイッチドメイン−ＧＡＩに融合することにより設計した(配列番号１０)。対応する第二構築物は、第二スイッチドメイン−ＧＩＤ１を、第二リンカーおよびシグナル伝達ドメイン４−１ＢＢと続くＣＤ３ゼータに融合することにより設計した(配列番号１１)。
【１６３７】
“スイッチ２”は構築物の対を含む。第一構築物は、リーダー配列を、ｓｃＦｖと続くヒンジ領域、膜貫通領域、リンカーおよび第一細胞内スイッチドメイン−ＧＩＤ１に融合することにより設計した(配列番号１２)。対応する第二構築物は、第二スイッチドメイン−ＧＡＩを、第二リンカーおよび細胞内シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢと続くＣＤ３ゼータに融合することにより設計した(配列番号１３)。
【１６３８】
ヘテロ二量体化スイッチの誘導は、ジベレリン酸アセトキシメチルエステル(構造３、Toronto Research Chemicals,Inc.から商業的に入手可能)の添加により達成する。
構造３：ジベレリン酸アセトキシメチルエステル
【化４０】
0006793902.tif 000080
【１６３９】
ＥＧＦＲｖIII  クローン１３９−ＣＤ８アルファＴＭ−ＧＡＩ(配列番号１０)
【化４１】
0006793902.tif 000081
【１６４０】
ＧＩＤ１−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ(配列番号１１)
【化４２】
0006793902.tif 000082
【１６４１】
ＥＧＦＲｖIII  クローン１３９−ＣＤ８アルファＴＭ−ＧＩＤ１(配列番号１２)
【化４３】
0006793902.tif 000083
【１６４２】
ＧＡＩ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ(配列番号１３)
【化４４】
0006793902.tif 000084
【１６４３】
材料および方法
クーママイシンスイッチを使用する調節可能ＣＡＲのためのＤＮＡの合成
ジベレリン酸アセトキシメチルエステルはToronto Research Chemicals,Inc.から商業的に入手可能である。１３９  ｓｃＦｖの配列を、４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータに対するシグナル伝達ドメインとクローン化した。非調節可能ＣＡＲ構築物、１３９ｓｃＦｖ−ＢＢＺ、配列番号７を対照として使用できる。ジベレリンＲＣＡＲについて、
【１６４４】
“スイッチ１”は構築物の対を含む。第一構築物において、１３９  ｓｃＦｖを、ＧＡＩ−スイッチドメインをＣ末端でクローン化し(配列番号１０)、対応する第二構築物を、ＧＩＤ１−スイッチドメインをリンカーおよび細胞内シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢと続くＣＤ３ゼータに融合することにより設計した(配列番号１１)。
【１６４５】
“スイッチ２”は構築物の対を含む。第一構築物において、１３９  ｓｃＦｖをＧＩＤ１−スイッチドメインとＣ末端でクローン化し(配列番号１２)、対応する第二構築物を、ＧＡＩ−スイッチドメインをリンカーおよび細胞内シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢと続くＣＤ３ゼータに融合することにより設計した(配列番号１３)。
【１６４６】
Jurkatアッセイを、最終工程が遺伝子導入細胞を１８時間、種々の濃度のジベレリン酸アセトキシメチルエステルまたはジベレリン酸とインキュベートすることを含む以外、実施例１に記載するとおり実施した。Luciferase One Glo試薬１００μlをウェルあたり添加した。サンプルを５分、３７℃でインキュベートし、発光をルミノメーターを使用して測定した。
【１６４７】
図２１Ａは、ＮＦＡＴ発現に対するＤＭＳＡ、ジベレリン酸アセトキシメチルエステルおよびジベレリン酸の効果を示す。
図２１Ｂは、ジベレリン酸アセトキシメチルエステルの増加している用量に対するＮＦＡＴ発現の応答を示す。
【１６４８】
実施例４：内部共有結合スイッチ
ヘテロ二量体化の代替としての特異的共有結合性架橋剤の使用が最近記載されいているが(Erhart et al.,2013 Chem Biol 20(4):549-557)、ＲＣＡＲの状況においてではない。ある態様において、ＨａＸＳと呼ぶこれらの薬剤は、オフ速度に関する可能性のある動力学的限界およびＴ細胞介在死滅のための必要なシグナルカスケードの活性化のための必要条件としての細胞における非共有結合分子の蓄積の必要性を克服し得る。ＨａＸＳは、ハロタグ(例えば、配列番号１４参照)とＳＮＡＰタグ(例えば、配列番号１５参照)を細胞浸透性コアと共に連結するための官能基を含む。調節可能ＲＣＡＲの状況におけるＨａＸＳ分子の評価を、モデル系としてＥＧＦＲｖIII  ＲＣＡＲ(１３９  ｓｃＦｖ)を使用して実施した。例えば、図１３参照。
【１６４９】
材料および方法
ＨａＸＳの合成および調節可能ＣＡＲのためのＤＮＡ
代表的ＨａＸＳ(構造５)は、Erhart et. Al supraに記載のように化学的に合成される。１３９  ｓｃＦｖの配列を、細胞内４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータに対するシグナル伝達ドメインと共にクローン化する。非調節可能ＣＡＲ構築物である１３９ｓｃＦｖ−ＢＢＺ(配列番号７)を対照として使用する。ＨａＸｓ  ＲＣＡＲについて、スイッチドメインの多様なヘテロ二量体化ドメインを、ＲＣＡＲ構築物の異なるドメインに連結できる。
【１６５０】
“スイッチ１”は構築物の対を含む。第一構築物において、１３９  ｓｃＦＶを、ＳＮＡＰタグとＣ末端にクローン化し(配列番号１６)、対応する第二構築物を、ハロタグのリンカーおよび細胞内シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢと続くＣＤ３ゼータへの融合により設計した(配列番号１７)。“スイッチ２”は構築物の対を含む。第一構築物において、１３９  ｓｃＦＶを、ＳＮＡＰタグとＣ末端でクローン化し(配列番号１８)、対応する第二構築物を、ハロタグを、リンカーおよび細胞内シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢと続くＣＤ３ゼータに融合することにより設計する(配列番号１９)。Jurkatアッセイを、最終工程が遺伝子導入細胞を１８時間、種々の濃度のＨａＸＳとインキュベートすることを含む以外、実施例１に記載するとおり実施する。Luciferase One Glo試薬１００μlをウェルあたり添加する。サンプルを５分、３７℃でインキュベートし、発光をルミノメーターを使用して測定する。
【１６５１】
ハロタグ(配列番号１４)
【化４５】
0006793902.tif 000085
【１６５２】
ＳＮＡＰタグ(配列番号１５)
【化４６】
0006793902.tif 000086
【１６５３】
１３９ｓｃＦＶ−ＣＤ８アルファＴＭ−ＳＮＡＰ(配列番号１６)
【化４７】
0006793902.tif 000087
【１６５４】
ハロ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ(配列番号１７)
【化４８】
0006793902.tif 000088
【１６５５】
１３９ｓｃＦＶ−ＣＤ８アルファＴＭ−ハロ(配列番号１８)
【化４９】
0006793902.tif 000089
【１６５６】
ＳＮＡＰ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ(配列番号１９)
【化５０】
0006793902.tif 000090
【１６５７】
構造５；ＨａＸＳ
【化５１】
0006793902.tif 000091
【１６５８】
実施例５：ペプチドベースの二量体化スイッチ−Ｍｙｃタグ
ある態様において、Ｔ細胞介在細胞死は、細胞内空間での外部結合事象のシグナル伝達活性化カスケードへの連結を必要とする、例えば、図６参照。外部的にディスプレイされたスイッチドメイン(例えば、ｃ−ｍｙｃペプチドタグ)および標的細胞結合受容体／ｓｃＦｖを伴う可溶性リガンド(例えば、抗ｍｙｃ抗体)を経るこれらの細胞内シグナル伝達ドメインの共局在性およびクラスター形成は、所望のシグナル伝達応答の誘発を可能とする。細胞外スイッチドメインは、適切な二量体化分子と相互作用する、ｃ−ｍｙｃペプチドタグ、ｆｌａｇペプチドタグ、ＨＡペプチドタグまたはＶ５ペプチドタグのようなあらゆるタグ分子であり得る。これらの場合、二量体化分子は架橋剤として働き、スイッチドメインにより含まれるペプチドタグ分子に対する抗体を含み得る。細胞外ドメインはまたＥＧＦＲｖIII抗原に対するｓｃＦｖ(例えば、１３９)のような癌抗原に対するｓｃＦｖｓでもあり得る。この場合、架橋剤は、ＥＧＦＲｖIII−Ｆｃ分子のような抗原自体であり得る。抗タグ抗体のように単一架橋剤として作用するスイッチドメインがクラスターを形成し、シグナルを活性化するのに不十分であるとき、さらに架橋剤を使用できる。これは、抗タグ抗体に対する抗体またはさらにＥＧＦＲｖIII−Ｆｃを架橋するためのＦｃに対する抗体であり得る。具体的に、この例において、スイッチは外部ホモ二量体化スイッチであり、第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインは、細胞内膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに連結するｍｙｃタグペプチドである。抗原結合ドメイン、例えば、１３９  ｓｃＦｖはスイッチドメインを有さず、標的癌細胞と結合するためでだけに働く。この例において、シグナル伝達は、架橋ウサギポリクローナルｍｙｃ抗体(すなわち、ホモ二量体化分子)の添加により開始し、これは、外部第一および第二ｍｙｃペプチドスイッチドメインの各々に結合して、クラスター化させる。外部ホモ二量体化スイッチのこのクラスター形成は、細胞内シグナル伝達ドメインをクラスター化させ、シグナル伝達を活性化させる  −  図１４Ａ参照。細胞内シグナル伝達事象のさらなる増強が、さらなる架橋抗体の添加による外部共クラスター形成の増加により達成される。この例において、さらなるクラスター形成は、図１４Ｂに示すように、ウサギポリクローナルｍｙｃ抗体に対する抗ウサギ抗体の添加により達成される。
【１６５９】
方法および材料
細胞表面上にディスプレイされたｆｌａｇまたはｃ−ｍｙｃペプチドタグを有するＲＣＡＲは、対応する配列のリンカーおよび細胞内シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢと続くＣＤ３ゼータへの融合により設計された(それぞれ配列番号２０および２１)。非調節可能ＣＡＲ構築物である１３９ｓｃＦｖ−ＢＢＺ(配列番号７)を対照として使用する。ＮＦＡＴ−ＬＵＣレポーターを有するJurket細胞(ＪＮＬ)を、０.５μg／mlのピューロマイシン含有Jurket細胞増殖培地中、０.５×１０６／mlの密度に増殖した。各遺伝子導入について、２.５×１０６細胞を、１００ｇで１０分遠沈した。２μgのＤＮＡ／構築物を遺伝子導入あたり使用した。Amaxa Nucleofector solution VおよびサプリメントＩを混合し、１００μlをＤＮＡ構築物とともにチューブに入れた。混合物を細胞に添加し、エレクトロポレーションキュベットに移した。エレクトロポレーションを、Amaxa Nucleofector II Deviceを使用して設定Ｘ−００１下に実施した。０.５mlの増殖培地を電気穿孔直後に添加し、混合物を、２ml  増殖培地中、６ウェルプレートの１ウェルに移した。細胞を、５％ＣＯ２の３７℃インキュベーターで、一夜インキュベートした。ｍｙｃタグに対するウサギポリクローナル抗体を、細胞外ドメインとしてｍｙｃタグを有するＲＣＡＲ構築物で遺伝子導入した細胞に添加した。ポリクローナル抗体の濃度は１００nMであった。１.５時間後、１００nMの抗ウサギ抗体を、クラスター形成を増強するために添加した。細胞混合物を、３７℃で１８時間インキュベートした。Luciferase One Glo試薬１００μlをウェルあたり添加した。サンプルを５分、３７℃でインキュベートし、発光をルミノメーターを使用して測定した。
【１６６０】
同様に、細胞外ドメインとしてＦｌａｇペプチドタグを有する構築物を、レポーター細胞の遺伝子導入に使用した。Ｆｌａｇペプチドタグに対するウサギポリクローナル抗体を１００nMで使用し、さらなるクラスター形成を促進するために、ウサギポリクローナル抗体に対する抗体を１００nMで使用した。さらに、細胞外ドメインとしてｓｃＦｖ  １３９を有する構築物を、レポーター細胞の遺伝子導入に使用し、ＥＧＦＲｖIII−Ｆｃを１００nMで使用し、１.５時間後抗Ｆｃ抗体を使用した。
【１６６１】
ｆｌａｇタグＣＡＲ(配列番号２０)
【化５２】
0006793902.tif 000092
【１６６２】
ｍｙｃタグＣＡＲ(配列番号２１)
【化５３】
0006793902.tif 000093
【１６６３】
図１４Ａに示すとおり、細胞外ドメインとしてｃ−ｍｙｃペプチドタグを有するＲＣＡＲは、他の抗体と比較して、ウサギポリクローナル抗ｍｙｃ抗体とインキュベートしたとき高いＮＦＡＴ活性を示した。これは、活性化がクラスターを形成する、細胞表面上のｃ−ｍｙｃペプチドタグの架橋に特異的に起因したことを示す。図１４Ａに示すように、抗ウサギ抗体の添加により活性化はさらに増強された。
【１６６４】
Ｆｌａｇタグのみを有するＲＣＡＲは、両架橋剤、すなわち、ウサギポリクローナル抗Ｆｌａｇ抗体および抗ウサギ抗体の両者を添加したとき活性化された。同様に、細胞外ドメインとして１３９  ｓｃＦｖを有するＲＣＡＲは、ＥＧＲＦｖIII−Ｆｃおよび抗Ｆｃ抗体を添加したとき活性化を示した。図１４参照。
【１６６５】
実施例６：活性化シグナル伝達ドメインのペプチドベースの多量体化
ある態様において、Ｔ細胞介在細胞死は、細胞内空間における外部結合事象のシグナル伝達活性化カスケードへの連結を必要とする。外部的にディスプレイされた分子、スイッチドメインおよび標的細胞結合受容体／ｓｃＦｖと組み合わせて多量体化可溶性リガンドを含む二量体化分子を経るこれらの細胞内シグナル伝達ドメインの共局在性およびクラスター形成を所望の応答の誘発に使用できる。例えば、図１５参照。調節可能ＣＡＲの状況でのこの原則の例を、ｃ−ｍｙｃペプチドタグの多様な多量体(二量体化分子として)にディスプレイされたさらなるｓｃＦｖ(スイッチドメインとして)を有するモデル系としてＥＧＦＲｖIII  ＲＣＡＲ(１３９ｓＦｖ)を使用して実施できる。
【１６６６】
材料および方法
調節可能ＲＣＡＲのためのｃ−ｍｙｃペプチド多量体およびＤＮＡの合成
ｃ−ｍｙｃペプチドの単量体、二量体、三量体および四量体(配列番号２２〜２５)を、標準固相ペプチド合成により合成し、多量体二量体化スイッチとして使用する。ｃ−ｍｙｃペプチド単量体の各々をＧＳリンカーにより連結する。１３９  ｓｃＦｖの配列を、細胞内４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータに対するシグナル伝達ドメインとクローン化する。非調節可能ＣＡＲ構築物である１３９ｓｃＦｖ−ＢＢＺ(配列番号７)を対照として使用する。ｃ−ｍｙｃ調節可能ＣＡＲについて、１３９  ｓｃＦｖをＣＤ８アルファ膜貫通ドメインとクローン化し(配列番号２６)、対応する細胞内シグナル伝達構築物を９Ｅ１０抗ｍｙｃ  ｓｃＦｖをリンカーおよび細胞内シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢと続くＣＤ３ゼータに融合することにより設計した(９ｅ１０  ｓｃＦｖ−ＢＢＺ、配列番号２７)。
【１６６７】
ｃ−ｍｙｃ単量体ペプチド(配列番号２２)
【化５４】
0006793902.tif 000094
【１６６８】
ｃ−ｍｙｃ二量体ペプチド(配列番号２３)
【化５５】
0006793902.tif 000095
【１６６９】
ｃ−ｍｙｃ三量体ペプチド(配列番号２４)
【化５６】
0006793902.tif 000096
【１６７０】
ｃ−ｍｙｃ四量体ペプチド(配列番号２５)
【化５７】
0006793902.tif 000097
【１６７１】
１３９ｓｃＦＶ−ＣＤ８アルファＴＭ(配列番号２６)
【化５８】
0006793902.tif 000098
【１６７２】
９Ｅ１０ｓｃＦｖ−ＢＢｚ(配列番号２７)
【化５９】
0006793902.tif 000099
【１６７３】
ＮＦＡＴ活性化アッセイ
ＮＦＡＴ−ＬＵＣレポーターを有するJurkat細胞(ＪＮＬ)を、０.５μg／mlのピューロマイシンを含むJurkat細胞増殖培地で０.５×１０６／mlの密度まで増殖させた。各遺伝子導入について、２.５×１０６細胞を１００ｇで１０分遠沈した。２μgのＤＮＡ／構築物を遺伝子導入あたり使用した。Amaxa Nucleofector solution VおよびサプリメントＩを混合し、１００μlをＤＮＡ構築物とともにチューブに入れた。混合物を細胞に添加し、エレクトロポレーションキュベットに移した。エレクトロポレーションを、Amaxa Nucleofector II Deviceを使用して設定Ｘ−００１下に実施した。０.５mlの増殖培地をエレクトロポレーションの直後に添加し、混合物を、２ml  増殖培地中、６ウェルプレートの１ウェルに移し、２時間インキュベートした。溶液中のｍｙｃタグについて、細胞を９６ウェルに分配し、単量体、二量体、三量体または四量体ｍｙｃタグまたはＩｇＧ１  Ｆｃを１００nMで適用した。細胞を１８時間インキュベートした。あるいは、組織培養プレートを１００nMの種々のｍｙｃタグまたはＩｇＧ１  Ｆｃで２時間被覆し、ブロッキング緩衝液(５％血清含有ＤＰＢＳ)で１時間ブロックした。遺伝子導入細胞を、標的プレートに１００μl／ウェルで添加し、１８時間インキュベートした。Luciferase One Glo試薬１００μlをウェルあたり添加した。サンプルを５分、３７℃でインキュベートし、発光をEnvisionプレートリーダーを使用して測定する。
【１６７４】
結果
図５７に示すように、ＮＦＡＴ活性化は、ｍｙｃタグの多量体の数に依存する。遺伝子導入細胞に高次多量体、例えば、三量体または四量体ｍｙｃタグを使用したとき、高いＮＦＡＴ活性化が観察された。溶液中１００nMのポリｍｙｃタグは、１００nM  ｍｙｃタグを有する被覆プレートからの活性化と比較して、ＮＦＡＴ活性化の増加を生じた。これらの結果は、ｍｙｃタグの多量体を細胞外スイッチＲＣＡＲ上のスイッチとして使用できることを示す。
【１６７５】
実施例７：再指示阻害ＲＣＡＲ
免疫系の一般的原則は、Ｔ細胞がその微小環境を感知し、感知したシグナルによって、活性化または阻害されるかのいずれかである。この細かく調整されたバランスは、ＣＤ２８およびＩＣＯＳのような数個の活性化受容体および数個の不活性化受容体、例えばＣＴＬＡ４、ＰＤ−１およびＢＴＬＡにより伝達される(Riley et al.,2005,Blood 105:13-21)。ＰＤ−１のためのリガンドはＰＤＬ１およびＰＤＬ２である。ＰＤ−１リガンドはしばしば腫瘍微小環境内で発現され、ＰＤＬ１またはＰＤＬ２によるＴ細胞上のＰＤ−１(プログラム細胞死１)は、Ｔ細胞不活性化に至り得る。腫瘍微小環境におけるこのＴ細胞不活性化に打ち勝つための処置選択肢の限定は、それゆえに有益であり得る。ここに開示する方法は、養子Ｔ細胞療法を使用して阻害シグナルを再指示し、それにより、例えばＰＤ１受容体の活性化により誘発される、陰性制御シグナルを、結合したときにＴ細胞活性を増強する陽性シグナルにする。ここに概説する一般的概念は、先に述べた調節可能スイッチＲＣＡＲに基づく。しかしながら、この態様において、ＲＣＡＲは、ＰＤ１のような阻害受容体の細胞外ドメインを含む癌ターゲティング部分を含む。さらに、ＲＣＡＲは、特定の癌細胞に対してホーミング誘導剤として使用される膜に係留された標準ＣＡＲまたはｓｃＦｖをディスプレイしてもしなくてもよい。例えば、図９に示すＲＣＡＲ参照。この実施例において、スイッチは、リーダー配列の、ＰＤ１の細胞外ドメインと続くヒンジ領域、膜貫通領域、リンカーおよび第一細胞内スイッチドメイン−ＦＫＢＰへの友語うにより設計された(配列番号２８)。第二構築物は、第二スイッチドメインＦＲＢの、第二リンカーおよび内部シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢと続くＣＤ３ゼータへの融合により設計された(配列番号６)。Ｔ細胞の活性化は、二量体化分子、例えば、ラパログのみの存在下、ＰＤ１リガンドＰＤＬ１またはＰＤＬ２の結合により制御される。標準ＣＡＲまたはターゲティングｓｃＦｖの共発現も、キメラＴ細胞の特異性を増強するためにＲＣＡＲに包含させてよい。
【１６７６】
材料および方法
阻害ＲＣＡＲ再指示のためのＤＮＡの合成
ヒトＰＤ１受容体の細胞外ドメインの配列を、ＦＲＢ−ドメインとＣ末端でクローン化し(配列番号２８)、対応する活性化構築物をＦＫＢＰ−ドメインをリンカーおよび活性化ドメイン４−１ＢＢと続くＣＤ３ゼータへの融合により設計する(配列番号６)。他の態様において、ヒトＰＤ１受容体の細胞外ドメインをＦＲＢＰドメインとＣ末端でクローン化し(配列番号２９)、対応する活性化構築物をＦＲＢ−ドメインをリンカーおよび活性化ドメイン４−１ＢＢと続くＣＤ３ゼータに融合することにより設計した(配列番号４)。Jurkatアッセイを実施例１に記載のとおり実施する。再指示阻害ＣＡＲの刺激は、細胞外リガンドＰＤ１ＬまたはＰＤ２Ｌの添加またはＰＤ１ＬまたはＰＤ２Ｌを発現する細胞の共インキュベーションにより達成できる。Luciferase One Glo試薬１００μlをウェルあたり添加する。サンプルを５分、３７℃でインキュベートし、発光をルミノメーターを使用して測定する。
【１６７７】
ヒトＰＤ１スイッチＣＡＲＴ  ＦＲＢ(配列番号２９)
【化６０】
0006793902.tif 000100
【１６７８】
ヒトＰＤ１スイッチＣＡＲＴ  ＦＫＢＰ(配列番号２８)
【化６１】
0006793902.tif 000101
【１６７９】
再指示阻害ＲＣＡＲの活性化アッセイ
ＮＦＡＴ−ＬＵＣレポーターを有するJurkat細胞(ＪＮＬ)を、０.５μg／mlのピューロマイシンを含むJurkat細胞増殖培地で０.５×１０６／mlの密度まで増殖させた。各遺伝子導入について、３×１０６細胞を１００ｇで１０分遠沈した。Ｆｏｕｒμg  ＤＮＡ／構築物を遺伝子導入あたり使用した。Amaxa Nucleofector solution VおよびサプリメントＩを混合し、１００μlをＤＮＡ構築物とともにチューブに入れた。混合物を細胞に添加し、エレクトロポレーションキュベットに移した。エレクトロポレーションを、Amaxa Nucleofector II Deviceを使用して設定Ｘ−００１下に実施した。０.５mlの増殖培地を電気穿孔直後に添加し、混合物を、２ml  増殖培地中、６ウェルプレートの１ウェルに移した。２時間後、多様な濃度のラパログ化合物を細胞に添加した。細胞を、標的でコートした組織培養プレートウェルに適用した。組織培養プレートを５μg／mlのＰＤＬ１−ＦｃまたはＩｇＧ１−Ｆｃまたは任意の標的で２時間、３７℃で被覆し、ブロッキング緩衝液(５％血清含有ＤＰＢＳ)で３０分ブロックした。遺伝子導入細胞を、標的プレートに１００μl／ウェルで添加し、さらに１６時間インキュベートした。Luciferase One Glo試薬１００μlをウェルあたり添加した。サンプルを５分、３７℃でインキュベートし、発光をEnvisionプレートリーダーを使用して測定する。
【１６８０】
ＰＤ１  ＣＡＲ構築物はＰＤ１−ＥＣＤ−ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータを含む。この構築物は、構築物を遺伝子導入された細胞、例えば、ＰＤ１  ＣＡＲを遺伝子導入されたＣＡＲＴ細胞の残留性を改善し得る。
【１６８１】
ＰＤ１  ＲＣＡＲ(スイッチ切り替え可能なＰＤ１  ＣＡＲ)構築物はＦＲＢ−ＦＫＢＰヘテロ二量体化スイッチおよびラパログヘテロ二量体化分子ＡＰ２１９６７を使用する。具体的に、ＰＤ１  ＲＣＡＲは、ＰＤ１−ＥＣＤ−ＴＭ−ＦＲＢ構築物；およびＦＫＢＰ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ構築物を含み、これらはJurkat細胞に共遺伝子導入された。これらの構築物は、構築物を遺伝子導入された細胞、例えば、ＰＤ１  ＲＣＡＲを遺伝子導入されたＲＣＡＲＴ細胞の残留性を改善し得る。
【１６８２】
図１７Ａに示すように、ＰＤ１  ＣＡＲは、ＩｇＧ１−Ｆｃによる対照処理と比較して、有意なＰＤ１誘発ＮＦＡＴの活性化誘導性プロモーター駆動ルシフェラーゼ活性を示した。これは、ＰＤＬ−１とのＰＤ１相互作用が、Jurket細胞表面上のＰＤ１をクラスター形成させ、ＮＦＡＴ経路の強い活性化を誘発するのに十分であることを示す。このＰＤ１  ＣＡＲをＰＤ１  ＲＣＡＲ実験のために対照として使用した。図１７Ｂにおいて、Jurketレポーター細胞を、ＰＤ１−ＥＣＤ−ＴＭ−ＦＲＢおよびＦＫＢＰ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータを含むＰＤ１  ＲＣＡＲにより共遺伝子導入し、５００nM  ＡＰ２１９６７ヘテロ二量体化分子とインキュベートしたとき、ＰＤＬ−１標的によるシグナル伝達の顕著な誘発があり、これは、ＡＰ２１９６７ヘテロ二量体化分子が、ある構築物からのＰＤ１と他の構築物の４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータの二量体化を誘発し、これが、ＮＦＡＴシグナル伝達の活性化を生じることを示す。ＲＣＡＲにおけるＡＰ２１９６７ヘテロ二量体化分子の効果をさらに試験するために、種々の濃度のＡＰ２１９６７ヘテロ二量体化分子を細胞に添加した。図１８に示すように、ＡＰ２１９６７処置と用量応答があった。左側の各棒はＰＤ１  ＲＣＡＲであり、各棒は異なる濃度のＡＰ２１９６７でのＰＤ１  ＣＡＲ対照である。ＡＰ２１９６７は、ＮＦＡＴシグナル伝達の活性化を生じるヘテロ二量体化スイッチの二量体化の誘発に、nM以下の濃度でさえ強力であった。
【１６８３】
実施例８：ＰＤ１を含む共クラスター受容体によるスイッチ切り替え可能なＣＡＲＴ活性化
癌細胞は、癌抗原を異常に発現するだけではなく、エフェクターＴ細胞による免疫攻撃からのエスケープをもたらすＰＤ１リガンドも発現できる。ＰＤ１は、リガンドとの結合により、ＴＣＲとミクロクラスターを形成し、Ｔ細胞活性化を直接阻害する。共刺激剤または共阻害剤によるクラスターの形成が、デジタル事象に類似する免疫応答の増強または阻害に生来使用され、すなわち、“オン”または“オフ”である。換言すると、免疫応答は、複数因子が整列したときオンとなる。これは、“実”シグナルと、有害であり得る“ノイズ”を区別する。図１０参照。
【１６８４】
共刺激剤／共阻害剤クラスターの現象を、ＣＡＲＴ療法のために使用して、ターゲティング／死滅特異性を確実にできる。これを、ＲＣＡＲ細胞活性のための二量体化スイッチとして小分子(ラパログ)と組み合わせ得る。ある態様において、これは、治療窓を広げ、毒性副作用を減らす。
【１６８５】
Ｔ細胞による癌細胞の認識および結合は、死滅特異性を確立するための重要な初期段階を表す。低親和性ｓｃＦｖにより認識される癌細胞特異的抗原およびＰＤ１によるＰＤＬ１／２による癌細胞の共ターゲティングは、低親和性相互作用を介して達成できる：ＰＤ１と癌細胞からのＰＤＬ１またはＰＤＬ２およびｓｃＦｖと癌細胞上の癌抗原の低親和性相互作用。この二重結合事象はアビディティー効果を介して増幅され、ｓｃＦｖおよびＰＤ１のミクロ−クラスター形成によりさらに増幅される。これらの認識および結合事象は、ＲＣＡＲＴ制御癌細胞死滅の第一段階である標的細胞とＲＣＡＲＴ細胞の免疫シナプス形成を可能にする。ラパログ添加は、４−１ＢＢ／ＣＤ３ゼータを二量体化／クラスター化し、これはさらに癌細胞死滅のためにＲＣＡＲＴ細胞を活性化する。
【１６８６】
実験法
マウスまたはヒトＰＤ１  ＥＣＤを膜貫通ドメインと続くＦＫＢＰスイッチドメインと融合する。メソテリンのような腫瘍抗原の一つに対する低親和性ｓｃＦｖを、膜貫通ドメインと続くＦＫＢＰスイッチドメインと融合する。ＦＲＢスイッチドメインを、細胞内シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータと融合する。例えば、図１０に示すＲＣＡＲ参照。ＮＦＡＴ駆動ルシフェラーゼレポーターを有するJurket  Ｔ細胞を、３構築物、ＰＤ１−ＴＭ−ＦＫＢＰ、ｓｃＦｖ−ＴＭ−ＦＫＰＢおよびＦＲＢ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータと共遺伝子導入する。遺伝子導入、Amaxa nucleofactorを用いて、２μg  ＤＮＡ／構築物で遺伝子導入あたり３×１０６  Jurket細胞で行う。細胞を、共遺伝子導入後、１日インキュベーションのために、３７℃で８％ＣＯ２でインキュベートする。Jurket細胞を、５μg／mlのヒトメソテリンおよび５μg／mlのマウスＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２で被覆したウェルに適用する。３７℃で１日のインキュベーション後、ルシフェラーゼ活性を、PromegaからのOne-Glo試薬により測定する
【１６８７】
さらに、共遺伝子導入細胞を、メソテリンおよびＰＤＬ１またはＰＤＬ２の両者を発現する癌細胞ならびに正常細胞と、エフェクターＣＡＲＴ細胞：標的細胞の１：０.３比で混合する。１日のインキュベーション後、ルシフェラーゼ活性を測定する。
ＰＤＬ１またはＰＤＬ２の過発現を示す標的癌細胞を試験する。
【１６８８】
実施例９：小分子制御ＣＡＲ活性化−細胞外スイッチ
Ｔ細胞介在細胞死は、細胞内空間における外部結合事象とシグナル伝達活性化カスケードの連結を必要とする。ある態様において、ＲＣＡＲは細胞外二量体化スイッチ、例えば、小分子ヘテロ二量体化分子により活性化された細胞外ヘテロ二量体化スイッチを含む。例えば、図５に記載するＲＣＡＲ参照。次の実施例は、このような“細胞外小分子”スイッチの設計を説明する。
【１６８９】
この実施例において、スイッチを、リーダー配列を、１３９  ｓｃＦｖと続くリンカーおよび第一スイッチドメイン−ＦＫＢＰ、ヒンジ領域および膜貫通領域に融合させることにより設計する(配列番号３１)。第二構築物を、リーダー配列をＦＲＢスイッチドメイン、膜貫通領域および細胞内シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢと続くＣＤ３ゼータに融合することにより設計する(配列番号３２)。
【１６９０】
あるいは次の設計を有する構築物の対(１３９−ＦＲＢ−ＴＭ(配列番号３０)、ＦＫＢＰ−ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ(配列番号３３)も使用し得る。
構築物の対のＴ細胞の共遺伝子導入は、小分子ラパログ(構造１)の添加により制御される調節可能な細胞外活性化スイッチを生じる。
【１６９１】
ＥＧＦＲｖIII  クローン１３９−ＦＲＢ−ＣＤ８アルファＴＭ(配列番号３０)
【化６２】
0006793902.tif 000102
【１６９２】
ＥＧＦＲｖIII  クローン１３９−ＦＫＢＰ−ＣＤ８アルファＴＭ(配列番号３１)
【化６３】
0006793902.tif 000103
【１６９３】
ＦＲＢ−ヒンジ−ＣＤ８アルファＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ(配列番号３２)
【化６４】
0006793902.tif 000104
【１６９４】
ＦＫＢＰ−ヒンジ−ＣＤ８アルファＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ(配列番号３３)
【化６５】
0006793902.tif 000105
【１６９５】
細胞外スイッチ遺伝子導入および活性化を、本質的に実施例１において細胞内スイッチについて記載したとおりに行った。
【１６９６】
図１９は、ヘテロ二量体化分子の存在下、抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖを発現するＲＣＡＲと細胞内シグナル伝達ドメインを発現するＲＣＡＲの間のシグナル伝達事象を調べるために設計した試験の結果であり、ここで、該ヘテロ二量体化スイッチドメインは外部である。データは、２５０nMのラパログでの刺激による顕著な標的制御活性化を示す。さらに、ラパログ非存在下で顕著な標的上活性化は観察されず、小分子制御ヘテロスイッチドメイン(ＦＫＢＰおよびＦＲＢ)の二量体化が介在する外部スイッチを示す。最後に、対照標的(ＩｇＧ１−Ｆｃのみ)に対する活性化は観察されなかった。これらのデータは、ラパログのみの存在下のＥＧＦＲｖIII標的に対する外部的スイッチ型ＲＣＡＲ構築物の特異性および対照標的またはラパログ非存在下の交差反応性の欠如を示す。
【１６９７】
細胞外スイッチを含むさらなるＲＣＡＲ構築物およびその機能的分析を実施例２２に記載する。
【１６９８】
実施例１０：ｓｈＲＮＡを使用するマウスおよびヒトプログラム細胞死１(ＰＤＣＤ１)遺伝子のターゲティング
実施例１〜９に記載するＲＣＡＲ構築物に加えて、ＲＣＡＲをコードする核酸へのｓｈＲＮＡの操作によりさらなる制御が提供できる。Ｕ６およびＨ１のような一般的に使用されるプロモーターを、ＲＣＡＲレンチウイルス構築物の下流に配置し得る。ＰＤＣＤ１、ＴＩＭ３またはＴ細胞活性の他の陰性レギュレーターは、適当なｓｈＲＮＡ構築物の発現により減弱させ得る。ＲＣＡＲおよびｓｈＲＮＡの共発現のために調節可能ＣＡＲとｓｈＲＮＡをコードする構築物の種々の配置を示す遺伝子マップを図１６に提供する。
【１６９９】
２個のスイッチドメイン含有メンバー(ＲＣＡＲａおよびＲＣＡＲｂ)、例えば、抗原結合メンバーおよび細胞内シグナル伝達メンバーは、ＥＦ１アルファプロモーターおよびＥＭＣＶのような適当なＩＲＥＳ成分の組み合わせにより制御される。図１６に示すように、ＥＦ１アルファプロモーターは第一ＲＣＡＲメンバー、例えば、ＲＣＡＲａの上流に位置し、これにＩＲＥＳ成分および最後に第二ＲＣＡＲメンバー、例えば、ＲＣＡＲｂが続く。ある態様において、ｓｈＲＮＡはＵ６プロモーターにより制御される。ある態様において、ｓｈＲＮＡおよびＲＣＡＲコード化成分は単一ベクター上に存在する。図１６Ａ〜１６Ｄは、例えば、Ｕ６制御ｓｈＲＮＡがＥＦ１アルファ制御ＲＣＡＲコード化成分の上流または下流である、単一ベクター上の多様な配置を示す。図１６Ａおよび１６Ｂに示す代表的構築物において、転写は、同じ方向でＵ６およびＥＦ１アルファプロモーターを介して生じる。図１６Ｃおよび１６Ｄに記載する代表的構築物において、転写は、異なる方向でＵ６およびＥＦ１アルファプロモーターを介して生じる。他の態様において、ｓｈＲＮＡ(および対応するＵ６プロモーター)は第一ベクター上であり、ＲＣＡＲ(および対応するＥＦ１アルファプロモーター)は第二ベクター上である(図１６Ｅ)。癌細胞を特異的にターゲティングするＴ細胞におけるＰＤ１のような阻害受容体の構成的減弱は、腫瘍微小環境におけるＰＤ１経路介在免疫抑制に打ち勝つはずである。
【１７００】
配列選択のためのコンピューター解析
ｓｈＲＮＡ設計を、マウスおよびヒト遺伝子プログラム細胞死１(ＰＤＣＤ１)遺伝子をターゲティングするｓｈＲＮＡの同定のために実施した。使用した設計は、それぞれ、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑコレクションからのＮＭ＿００８７９８.２(マウス)およびＮＭ＿００５０１８.２転写物であった。全ての可能な１９量体の効力および特異性を各配列から予測した。効力予測のために、ＢｉｏＰｒｅｄスコア＞０.８およびＤｈａｒｍａｃｏｎスコア＞４を含む１９量体配列を選択した。特異性について、４ヌクレオチドより長い反復を欠くおよび複数(＞１０)の既知ヒトｍｉＲＮＡとマッチするシード領域を含まない１９量体配列を選択した。さらに、１９量体配列は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用してそれぞれヒトおよびマウストランスクリプトーム(ヒト、マウスＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓｅｑセット内のＮＭ＿およびＸＭ＿レコードのセットとして定義)に対して検索したとき、アンチセンス鎖またはセンス鎖(ガイド鎖の５’末端から続く１または２連続位置を含む)がＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓｅｑにおける何らかの他のｍＲＮＡ転写物と共通する＞１５連続ヌクレオチドを有するとき、廃棄した。さらに、自然免疫ならびに細胞毒性応答を誘発する可能性が報告されているモチーフを含む配列を廃棄した。
【１７０１】
最終工程において、許容される１９量体配列を予測される効力スコアによりソートし、上位１２配列を、ｓｈＲＮＡ合成のためにその対応する２１量体配列で選択した。
【１７０２】
下記表１８に、ＤＮＡ配列を表す配列番号３４〜８１と共にＰＤＣＤ１(ＰＤ１)ＲＮＡｉ剤(マウスＰＤＣＤ１遺伝子配列ＮＭ＿００８７９８.２におけるその位置由来)の名称を提供する。センス(Ｓ)配列およびアンチセンス(ＡＳ)配列の両者を１９量体として提供し、２１量体配列が本表にある。位置(ＰｏＳ、例えば、１７６)がマウスＰＤＣＤ１遺伝子配列ＮＭ＿００８７９８.２の位置番号に由来することも注意する。配列番号は、１２のグループで示し、これは、“センス１９”配列番号３４〜４５；“センス２１”配列番号４６〜５７；“アセンス２１”配列番号５８〜６９；“アセンス１９”配列番号７０〜８１に対応する。
【１７０３】
【表４０】
0006793902.tif 000106
【表４１】
0006793902.tif 000107
【１７０４】
下記表１９は、ＤＮＡ配列を表す配列番号８２〜１２９と共にＰＤＣＤ１(ＰＤ１)ＲＮＡｉ剤(ヒトＰＤＣＤ１遺伝子配列におけるその位置由来)の名称を提供する。センス(Ｓ)配列およびアンチセンス(ＡＳ)配列両者を１９量体および２１量体配列として提示する。配列番号は、１２のグループで示し、これは、“センス１９”配列番号８２〜９３；“センス２１”配列番号９４〜１０５；“アセンス２１”配列番号１０６〜１１７；“アセンス１９”配列番号１１８〜１２９に対応する。
【１７０５】
【表４２】
0006793902.tif 000108
【表４３】
0006793902.tif 000109
【１７０６】
ｓｈＲＮＡ介在ＰＤ１ノックダウンの検証
ヒトおよびマウスＰＤ１をターゲティングするｓｈＲＮＡ配列を、インビトロノックダウンアッセイにより検証した。表２０に挙げたヒト２１量体ｓｈＲＮＡ配列(配列番号１０６〜１１７)および表１９に挙げたマウス２１量体ｓｈＲＮＡ配列(配列番号４６〜５７)を次の設計スキームに従い合成した。
【化６６】
0006793902.tif 000110
(配列番号３２５)
【１７０７】
一個の５’Ｇを、上記標的センス配列と該標的センス配列はｘにより指定し(表１９または２０に提供)、その後配列ＴＴＣＡＡＧＡＧＡのヘアピンループ(配列番号３２６)、対応する標的抗センス配列(ｙにより指定)および３’ポリＴターミネーター配列(上記下線)に添加した。クローニングを促進するために、各構築物をまた５’ＢａｍＨＩ部位および３’ＥｃｏＲＩ部位と隣接させた。最後に、合成した構築物を、組み換えＤＮＡ技術を使用してｐＬＶＸ−ｓｈＲＮＡ２(Clontech)にサブクローン化した。
【１７０８】
ヒトＰＤ１ノックダウンアッセイを下記のとおり実施した。２００万Jurkat JNL細胞を、Lonza's SE Cell Line 4D KitおよびパルスコードＣＬ−１１６を製造業者の推奨に従い使用して、１〜２μg  ｓｈＲＮＡプラスミドＤＮＡ(原液濃度に依存)でヌクレオフェクトした。細胞を直ぐに無抗生物質増殖培地に再懸濁し、１×１０６／mLの密度まで播種した。ヌクレオフェクトしたJurkat JNL細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、２４時間、４８時間または７２時間インキュベートした。各時点の最後に、製造業者の推奨に従い、QIAGEN's FastLane Cell Multiplex kitを使用して細胞溶解を実施した。マルチプレックスｑＰＣＲを、hPDCD1 TaqmanプローブであるHs01550088_m1およびhGAPDH Taqmanプローブである4326317Eを使用して希釈細胞ライセートで実施した。残存転写物パーセントを、ＰＢＳヌクレオフェクション対照に対するデルタデルタＣｔ法を使用して決定した。エラーバーは、技術的および生物学的反復の標準偏差である。
【１７０９】
図４０に示すとおり、全ての試験したヒトＰＤ１  ｓｈＲＮＡ構築物は、例えば、ヌクレオフェクション２４時間後、１００％より少ないＰＤ１転写物が残存していることにより示されるように、ＰＤ１発現をノックダウンした。ｓｈＲＮＡターゲティング位置１８６７、１８６８、１８６９、１８７０および２０７９は、正常発現レベルの７５％未満までＰＤ１発現を減少し、ｓｈＲＮターゲティング位置２０７９が、２４時間、４８時間および７２時間の試験した全３時点で最も頑強なノックダウンを有することが示された。
【１７１０】
マウスＰＤ１ノックダウンアッセイを下記のとおり実施した。２０万ＥＬ４細胞を、製造業者の指示に従い、Lonza's SF Cell Line 4D KitおよびパルスコードＣＭ−１２０−ＡＡを使用して、０.５〜１μg  ｓｈＲＮＡプラスミドＤＮＡ(原液濃度に依存)でヌクレオフェクトした。細胞を直ぐに無抗生物質増殖培地に再懸濁し、２.５×１０６／mLの密度まで播種した。ヌクレオフェクトしたＥＬ４細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、２４時間または４８時間インキュベートした。各時点の最後に、細胞溶解を、製造業者の指示に従いQIAGEN's FastLane Cell Multiplex kitを使用して実施した。マルチプレックスｑＰＣＲを、mPDCD1 TaqmanプローブであるMm01285676_m1およびｍβ−アクチンTaqmanプローブである4352341Eを使用して、希釈した細胞ライセートで実施した。残存転写物パーセントを、ＰＢＳヌクレオフェクション対照に対するデルタデルタＣｔ法を使用して決定した。エラーバーは、技術的および生物学的反復の標準偏差である。
【１７１１】
図４１に示すように、試験した種々のｓｈＲＮＡ構築物は、多様なレベルのＰＤ１ノックダウンを示した。ｓｈＲＮＡ構築物ターゲティング位置５８４(mmPD1_584)および１０９７(mmPD1_1097)は、全構築物の最も頑強なＰＤ１ノックダウンを示した。
【１７１２】
実施例１１：Ｔ細胞における調節可能ＣＡＲ構築物の分析
調節性ＣＡＲテクノロジーの実現可能性を評価するために、調節可能ＣＡＲを、ＥＦ１アルファプロモーターの制御下の種々の配置でＣＤ３ゼータ鎖および４−１ＢＢ共刺激分子と共にレンチウイルスＣＡＲ発現ベクターにクローン化した。抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載するｓｃＦｖをコードする配列を、下記のリーダー配列とヒンジ配列の間に挿入できる。
【１７１３】
ＲＣＡＲ成分−核酸配列
リーダー(核酸配列)；(配列番号１３０)
【化６７】
0006793902.tif 000111
・ ヒンジ(核酸配列)；(配列番号１３１)
【化６８】
0006793902.tif 000112
・膜貫通(核酸配列)；(配列番号１３２)
【化６９】
0006793902.tif 000113
・４−１ＢＢ細胞内ドメイン(核酸配列)；(配列番号１３３)
【化７０】
0006793902.tif 000114
・ＣＤ３ゼータ(核酸配列)；(配列番号１３４)
【化７１】
0006793902.tif 000115
【１７１４】
ＲＣＡＲ成分−アミノ酸配列
・ リーダー(アミノ酸配列)(配列番号１３５)
【化７２】
0006793902.tif 000116
・ ヒンジ(アミノ酸配列)(配列番号１３６)
【化７３】
0006793902.tif 000117
・膜貫通(アミノ酸配列)(配列番号１３７)
【化７４】
0006793902.tif 000118
・４−１ＢＢ細胞内ドメイン(アミノ酸配列)(配列番号１３８)
【化７５】
0006793902.tif 000119
・ＣＤ３ゼータドメイン(アミノ酸配列)(配列番号１３９)
【化７６】
0006793902.tif 000120
ＥＦ１アルファプロモーター(配列番号１４０)
【化７７】
0006793902.tif 000121
【１７１５】
最適構築物を、ＥＧＦＲｖIII＋およびＥＧＦＲ野生型標的に対する応答におけるエフェクターＴ細胞応答調節可能ＲＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の量および質に基づき選択する。エフェクターＴ細胞応答は、細胞拡張、増殖、倍加、サイトカイン産生および標的細胞死滅または細胞溶解性活性(脱顆粒)を含む。
【１７１６】
調節可能ＣＡＲ  Ｔ細胞の産生
ＲＣＡＲレンチウイルストランスファーベクターを使用して、ＶＳＶｇ偽型レンチウイルス粒子に包装されたゲノム物質に導入する。レンチウイルストランスファーベクターＤＮＡを、リポフェクタミン試薬と組み合わせたＶＳＶｇ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｒｅｖの３個のパッケージング成分と混合し、これらをＬｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞に一緒に遺伝子導入する。２４時間および４８時間後、培地を回収し、濾過し、超遠心分離法により濃縮する。得られたウイルス調製物を−８０℃で保存する。形質導入ユニットの数を、ＳｕｐＴ１細胞におけるタイトレーションにより決定する。
【１７１７】
例えば、再指示ＥＧＦＲｖIII特異的ＲＣＡＲＴ細胞を、ＣＤ３ｘ２８ビーズと２４時間結合させ、形質導入したＴ細胞の所望のパーセンテージを得るために適切な数の形質導入ユニットを添加することにより新鮮Ｔ細胞を活性化することにより産生する。これらの修飾Ｔ細胞を、休止し、サイズが減少し始めるまで増殖させ(約３００fl)、その時点で、その後の解析のために凍結保存する。細胞数およびサイズをCoulter multisizer IIIを使用して測定する。凍結保存前に、形質導入された(細胞表面にＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲを発現する)細胞のパーセンテージおよびその発現の相対的蛍光強度を、ＬＳＲIIでのフローサイトメトリー分析により決定する。ヒストグラムプロットから、ＣＡＲの相対的発現レベルを、形質導入されたパーセンテージとそれらの相対的蛍光強度の比較により試験できる。
【１７１８】
ＥＧＦＲｖIII再指示、調節可能ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解性活性、増殖能力およびサイトカイン分泌の評価
ＥＧＦＲｖIII特異的ＲＣＡＲ  Ｔ細胞の殺し、増殖し、サイトカインを分泌する機能的能力を評価するために、細胞を解凍し、一夜回復させる。ＲＣＡＲ構築物に加えて、標準第二世代ＥＧＦＲｖIII−クローン１３９−ＢＢｚ  ＣＡＲを比較目的で使用し、ＳＳ１−ＢＢｚ(メソテリン特異的)を、バックグラウンドＣＡＲ／Ｔ細胞効果のために非ターゲティング発現ＣＡＲとして使用する。このフローベースの細胞毒性アッセイについて、標的細胞をＣＳＦＥで染色して、その存在を定量する。標的細胞をまたＥＧＦＲｖIII発現について染色して、類似の標的抗原レベルを確認する。ＥＧＦＲｖIII  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解性活性を、エフェクター：標的細胞比１０：１、３：１、１：１、０.３：１および０：１のタイトレーションで測定し、ここで、エフェクターは、抗ＥＧＦＲｖIIIキメラ受容体を発現するＴ細胞と規定された。アッセイを、適切な数のＴ細胞と一定数の標的細胞の混合により開始した。二量体化分子の用量タイトレーションも培養に追加し、ラパログまたは抗Ｍｙｃ抗体について０〜１０００nM濃度であった。４時間または１６時間後、各混合物の全体積を除去し、各ウェルを洗浄した。Ｔ細胞をＣＤ３について染色し、全細胞を生存／死マーカー７ＡＡＤで染色した。最終洗浄後、ペレット化細胞を、予定した数のカウントビーズと共に特定体積で再懸濁した。細胞染色データをＬＳＲIIフローサイトメトリーにより集め、結果を定量するためにビーズを使用するFlowJoソフトウェアで分析する。
【１７１９】
ＲＣＡＲ−ＥＧＦＲｖIII  Ｔ細胞の細胞増殖およびサイトカイン産生を測定するために、細胞を解凍し、一夜回復させる。ＲＣＡＲ構築物に加えて、標準第二世代ＥＧＦＲｖIII−クローン１３９−ＢＢｚ  ＣＡＲを比較目的で使用し、ＳＳ１−ＢＢｚ(メソテリン特異的)を、バックグラウンドＣＡＲ／Ｔ細胞効果のための非ターゲティング発現ＣＡＲとして使用する。Ｔ細胞はＵ８７、神経膠芽腫、ＥＧＦＲｖIIIを発現するまたは発現しない星状細胞腫細胞株を指向する。さらに、ＣＤ３ｘ２８ビーズを使用して、Ｔ細胞が第二ラウンドの内因性免疫学的シグナルに応答する能力を評価する。二量体化分子の用量タイトレーションも培養に追加し、ラパログまたは抗Ｍｙｃ抗体について０〜１０００nM濃度である。増殖を評価するために、Ｔ細胞をＣＳＦＥで染色する。増殖は、ＣＳＦＥ染色の希釈であり、現在２個の娘細胞にある親標識の分離を反映する。アッセイは、エフェクター：標的比１：１および１：０でのみ試験し、ここで、エフェクターを、共通するパーセンテージで抗ＥＧＦＲｖIIIキメラ受容体を発現するように標準化した総Ｔ細胞(ＣＤ４および８)と規定した。アッセイを２回行い、細胞混合２４時間後、上清をサイトカイン産生のために除去する。５日後、Ｔ細胞を、Live/Dead Violet(Invitrogen)で生存／死について染色し、次いで、ＣＡＲ発現について染色し、ＣＤ４またはＣＤ８細胞のいずれかに表現型決定する。最終洗浄後、ペレット化細胞を、予定した数のＢＤカウントビーズと共に特定体積で再懸濁する。細胞染色データをＬＳＲIIフローサイトメトリーにより集め、結果を定量するためにビーズを使用するFlowJoソフトウェアで分析する。総細胞数を、まだ計数していないビーズのフラクションで乗じた特定の数のビーズに対して計数された細胞の数として決定する。
【１７２０】
インビボでの調節可能ＣＡＲＴの評価
次の実験を、調節可能ＣＡＲＴの機能がインビボで調節され得るかに取り組むために設計した。実験を、腫瘍モデルの状況におけるインビボ送達および二量体化分子の機能を試験するために設計する。測定するパラメータは、ＣＡＲＴ増殖、末梢血サンプルのＦＡＣＳにより測定した末梢におけるＣＡＲＴ細胞の活性化状態および腫瘍細胞死滅を含むが、これらに限定されない。３個の異なるインビボ実験が、ＲＣＡＲおよび二量体化分子の有用性に取り組むために企図される。これらの実験は、１)二量体化分子を伴うＲＣＡＲの基本的機能、２)再指示スイッチ切り替え可能な阻害ＲＣＡＲを伴うＰＤ−１依存性腫瘍モデルおよび３)ＲＣＡＲおよびＰＤ−１に対するｓｈＲＮＡの共発現を伴うＰＤ−１依存性腫瘍モデルの評価を含む。
【１７２１】
免疫不全ＮＯＤ／ｓｃｉｄ／γｃｎｕｌｌ(ＮＳＧ)マウスは、ヒト腫瘍細胞株または一次腫瘍およびヒトＴ細胞を移植するのに適当な異種移植モデルである。生着後、ヒトＴ細胞は、注入したヒトＴ細胞の用量に依存して、ＮＳＧマウスに約２ヶ月または致命的異種ＧＶＨＤ(ｘＧＶＨＤ)を発症するまで維持できる。二量体化分子の投与を、分子の薬物動態特性ならびに予め決定された最適化された投与量および処置レジメンに基づき、任意の好都合な方法で実施できる。
【１７２２】
実施例１２：二量体化分子を有する基本的ＲＣＡＲのインビボ分析
二量体化分子によりインビボでＲＣＡＲＴ機能がオンになることを評価するために、スイッチ１またはスイッチ２のいずれかとヒトＣＤ１９特異的ｓｃＦｖを発現するヒトＴ細胞(ＦＭＣ６３)を、ヒトＣＤ１９を発現するＮＡＬＭ６−ルシフェラーゼ(ＮＡＬＭ６−Ｌｕｃ)腫瘍細胞株を使用する、ＡＬＬ腫瘍モデルで試験する。ＦＭＣ６３  ｓｃＦｖは、前臨床モデルにおいて完全腫瘍退縮を仲介する第二世代ＣＡＲ構築物(ＣＤ１９−４１ＢＢ−ゼータ)の一部として広く確認されている(Milone et al., Molecular Therapy 17(8):  1453-1464 (2009))。簡単にいうと、レンチウイルス構築物を、ＦＭＣ６３  ｓｃＦｖを使用してスイッチ１またはスイッチ２と産生し、これらの構築物を、一次ヒトＴ細胞に形質導入する。Ｔ細胞をエクスビボで１０〜１２日増殖させ、先に記載した方法で凍結保存する。ＮＳＧマウスに静脈内接種によりＮＡＬＭ６−Ｌｕｃ腫瘍細胞株を移植し、５〜８日腫瘍負荷を確立させる。腫瘍負荷を、ルシフェラーゼ活性についての標準造影により測定できる。マウスを、次の群を含む処置群に無作為化する。１)偽／ＰＢＳ、２)非形質導入Ｔ細胞、３)ＣＡＲＴ１９(第二世代完全ＣＡＲ)、４)ＣＤ１９−スイッチ１、５)ＣＤ１９−スイッチ１＋ラパログまたはＲＡＤ００１および６)ラパログまたはＲＡＤ００１単独。処置群は、ＰＢＳ(群１および６)または５×１０６  ＣＡＲＴ細胞／マウスを、腫瘍移植５〜８日後に投与される。Ｔ細胞注入予定時間後、例えば１〜３日後、マウスにラパログまたはＲＡＤ００１を投与する。投与量および用量は、それ自体では腫瘍細胞増殖を阻害しない二量体化分子の用量に基づく。試験期間をとおして、マウスを腫瘍負荷について隔日にまたは、腫瘍増殖の影響を正確に評価するために必要に応じて頻繁に造影する。種々の間隔で、血液サンプルを、免疫表現型検査分析および末梢Ｔ細胞計数のために採集する。
【１７２３】
ラパログまたはＲＡＤ００１の用量依存的効果を、異なる用量のラパログまたはＲＡＤ００１および／または別の投薬レジメンを受ける処置群を用いるさらなる実験でさらに評価できる。経時的な腫瘍退縮ならびに腫瘍退縮の程度を、いずれも造影分析に基づき定量できる。
【１７２４】
実施例１３：ｓｈＲＮＡでチェックポイント阻害剤をターゲティングしながらの基本的ＲＣＡＲのインビボ分析
再指示スイッチ切り替え可能な阻害ＲＣＡＲを評価するために、ＲＣＡＲを発現するヒトＴ細胞を、ＰＤ−Ｌ１を発現するメソテリン異種移植腫瘍モデルで評価する。スイッチ１とヒトメソテリン特異的ｓｃＦｖ(ＳＳ１)を、ＰＤ−１に対するｓｈＲＮＡと共発現するＴ細胞を産生する。ＳＳ１  ｓｃＦｖ前臨床モデルにおいて完全腫瘍退縮を仲介する第二世代ＣＡＲ構築物の一部として広く確認されている(Carpenito et al,PNAS,106:3360-3365,2009)。簡単にいうと、メソテリンおよびＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍細胞をＮＳＧマウスの側腹部に注射する。これらの腫瘍細胞は、Ｍ１０８のような一次腫瘍またはＯｖＣＡＲ８のような腫瘍細胞株由来である。ＯｖＣＡＲ８について、細胞株を、ＰＤ−Ｌ１を、内因性レベルの該タンパク質を発現しないならば、発現するように操作してよい。腫瘍が確立され、腫瘍負荷が約２００〜３００mm３になったら、マウスを次の処置群に無作為化する。１)偽／ＰＢＳ、２)非形質導入Ｔ細胞、３)ＳＳ１−ＢＢｚ(第二世代完全ＣＡＲ)、４)メソ−スイッチ１＋ラパログ、５)メソ−スイッチ１とＰＤ−１  ｓｈＲＮＡおよびラパログおよび６)ラパログ単独。処置群は、ＰＢＳ(群１および６)または５×１０５  ＣＡＲＴ細胞／マウスを投与される。Ｔ細胞注入後予定時間後、例えば１〜３日後、マウスにラパログを投与する。試験期間をとおして、腫瘍体積をカリパスで測定する。種々の間隔で、血液サンプルを、免疫表現型検査分析および末梢Ｔ細胞計数のために採集する。ＲＣＡＲＴ細胞上のＰＤ−１発現レベルを測定して、ｓｈＲＮＡによる標的ノックダウンレベルを評価する。
【１７２５】
ラパログの用量依存的効果を、異なる用量のラパログおよび／または別の投薬レジメンを受ける処置群を用いるさらなる実験でさらに評価できる。経時的な腫瘍退縮ならびに腫瘍退縮の程度をいずれも腫瘍体積に基づき定量できる。
【１７２６】
実施例１４：単ベクター構築物の発現
ＲＣＡＲの２成分をコードするレンチウイルスベクターを構築した。
構築物１４３７７５は、ＣＤ１９  ｓｃＦＶベースの抗原結合メンバーであるＩＲＥＳをコードする配列に操作性に連結したＥＦ１アルファプロモーターおよび４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバーを含む単一核酸ベクターである。これは、２個の産物が別々に転写される単一転写物を発現する。
【１７２７】
構築物１４３７７６は、ＣＤ１９  ｓｃＦＶベースの抗原結合メンバーをコードする配列に操作性に連結したＥＦ１アルファプロモーターおよび４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列に操作性に連結したＣＭＶ最小プロモーターを含む単一核酸ベクターである。
【１７２８】
構築物１４３７７７は、ＣＤ１９  ｓｃＦＶベースの抗原結合メンバーをコードする配列に操作性に連結したＥＦ１アルファプロモーターおよび４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列に操作性に連結したＣＭＶ最小プロモーターを含む単一核酸ベクターである。
【１７２９】
構築物およびウイルス粒子を、本質的に実施例１１に記載のように製造し、試験した。ウイルス粒子をＪＮＬ細胞に導入し、標的がＣＤ１９(ＥＧＦＲviiiではない)である以外、実施例１に本質的に記載したように、活性を評価した。
【１７３０】
図２３は、ＲＣＡＲＴ構築物が単ベクター構築物から発現して、ＲＣＡＲＴを活性化する能力を示す。二量体化分子はＲＡＤ００１であった。グラフは、ＮＦＡＴの制御下のレポータープロモーターの発現により測定して、単一ベクターによりコードされたＲＣＡＲの成分が発現され、二量体化分子に応答して細胞を活性化することを示す。
【１７３１】
実施例１５：二量体化分子用量応答
構築物１４３７７５を細胞に導入し、二量体化分子の濃度の活性化に対する影響を、本質的に実施例１４に記載のように評価した。
【１７３２】
図２４Ａは、活性化に対するnM用量のＲＡＤ００１の効果を示す。図２４Ｂは、活性化に対するnM用量のラパマイシンの効果を示す。
【１７３３】
図２５Ａは、活性化に対するnM以下の用量のＲＡＤ００１の効果を示す。図２５Ｂは、活性化に対するnM以下の用量のラパマイシンの効果を示す。データは、ＲＡＤ００１およびラパマイシンの両者が、広い濃度範囲で有効であることを示す。
【１７３４】
実施例１６：抗原結合ドメインまたは他の細胞外結合ドメインを有する最適化されたメンバー
構築
抗ヒトＥＧＦＲｖIII  １３９  ｓｃＦｖのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインと続く４−１ＢＢのためのエンドドメインおよび第一細胞内スイッチドメインＦＫＢＰと共にクローン化する。第二スイッチドメインＦＲＢおよびＣＤ３ゼータを有する細胞内シグナル伝達メンバーに対応するＤＮＡも合成する。さらに、ＦＲＢドメインおよびＦＫＢＰドメインが互いに逆であるＤＮＡを合成する。４−１ＢＢを表２に示す共刺激エンドドメインに置き換えたさらなるスイッチをまたクローン化する。
【１７３５】
ＣＡＲ機能の初期特徴づけのためのJurkatレポーター細胞株の産生
一次Ｔ細胞形質導入および活性化の代替として、Jurkat−ＮＦＡＴレポーター細胞株を使用して、ＣＡＲ構築物の機能的活性を評価できる。Jurkat  Ｔ細胞株(Ｅ６−１)を、ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーター構築物で遺伝子導入し、安定な、クローン細胞株(ＪＮＬ)を、ＰＭＡおよびイオノマイシン刺激後のＮＦＡＴレポーターの強い誘導に基づき、さらなる特徴付けのために選択する。
【１７３６】
ＮＦＡＴ−ＬＵＣレポーターでのJurkat細胞の遺伝子導入および精製タンパク質を使用する機能的アッセイ
ＮＦＡＴ−ＬＵＣレポーターを有するJurkat細胞(ＪＮＬ)を、０.５μg／mlのピューロマイシンを含むJurkat細胞増殖培地で５×１０５細胞／mLの密度まで増殖させる。各遺伝子導入について、２.５×１０６細胞を、１００ｇで１０分遠心する。２μgのＤＮＡ／構築物を遺伝子導入あたり使用する。Amaxa Nucleofector solution VおよびサプリメントＩを混合し、１００μlを各ＤＮＡ構築物と共にチューブに添加する。混合物を細胞に添加し、エレクトロポレーションキュベットに移す。エレクトロポレーションを、Ｘ−００１設定下、Amaxa Nucleofector II Deviceを使用して行う。５００μL  増殖培地を電気穿孔直後に添加し、混合物を、その後、６ウェルプレートの１ウェル中のさらなる２ml  増殖培地に移す。細胞を、５％ＣＯ２の３７℃インキュベーターで、２４時間インキュベートする。組織培養プレートを５μg／mlのＥＧＦＲｖIII−Ｆｃまたは５μg／mlのＩｇＧ１−Ｆｃで２時間被覆し、ＤＰＢＳ中の５％血清で１時間ブロックする。遺伝子導入細胞を、１００μl／ウェルで標的プレートに添加し、さらに１８時間、種々の濃度の適当なラパログ存在下でインキュベートする。Luciferase One Glo試薬１００μlをウェルあたり添加する。サンプルを５分、３７℃でインキュベートし、発光をルミノメーターを使用して測定する。
構築物が残留性を改善する程度をここに記載する方法により評価できる。
【１７３７】
実施例１７：高齢者における免疫老化に対するｍＴＯＲ阻害の効果
加齢と最も明確に結びついている経路の一つは、ｍＴＯＲ経路である。ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンがマウスで寿命を延長し、高齢マウスで多様な加齢関連状態を改善することが示されている(Harrison, DE et al. (2009) Nature 460:392-395; Wilkinson JE et al. (2012) Aging Cell 11:675-682;およびFlynn, JM et al. (2013) Aging Cell 12:851-862)。それゆえに、これらの知見は、ｍＴＯＲ阻害剤がヒトにおける加齢および加齢関連状態に有益な効果を有し得ることを示す。
【１７３８】
短い臨床試験時間枠で試験できる年齢関連表現型は免疫老化である。免疫老化は、感染に対する感受性の増加およびインフルエンザワクチン接種を含むワクチン接種に対する応答の減少に至る、高齢者で生じる免疫機能の減少である。年齢による免疫機能の減少は、造血幹細胞(ＨＳＣ)がナイーブリンパ球を産生する能力の減少および抗原刺激に対する応答が不完全な疲弊したＰＤ−１陽性リンパ球数の増加を含む、免疫欠損の蓄積による(Boraschi, D et al. (2013) Sci. Transl. Med.5:185ps8; Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798;およびShimatani, K et al., (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:15807-15812)。高齢マウスでの試験は、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンでの６週間の処置がＨＳＣ機能を若返らせ、ナイーブリンパ球産生増加、インフルエンザワクチン接種に対する応答改善および寿命延長に至ることを示した(Chen, C et al. (2009) Sci. Signal. 2:ra75)。
【１７３９】
ヒト加齢関連表現型に対するｍＴＯＲ阻害の効果をおよびｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１が免疫老化を軽減するかを評価するために、ＲＡＤ００１またはプラセボを投与された高齢志願者におけるインフルエンザワクチンに対する応答を評価した。ここに示す知見は、ＲＡＤ００１が、十分耐容性である用量で高齢志願者のインフルエンザワクチンに対する応答を増強したことを示唆する。ＲＡＤ００１はまた年齢とともに蓄積されるプログラム死(ＰＤ)−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔリンパ球のパーセンテージも減少させた。これらの結果は、ｍＴＯＲ阻害が高齢志願者における免疫老化に有益な効果を有することを示す。
ここに記載するとおり、ラパマイシン類似体であるｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１での６週間処置は、高齢ヒト志願者におけるインフルエンザワクチン接種に対する応答を改善した。
【１７４０】
方法
治験集団
不安定な基礎疾患のない６５歳以上の高齢志願者が、ニュージーランドおよびオーストラリアの９箇所で参加した。スクリーニング時の除外基準はヘモグロビン＜９.０ｇ／dL、白血球数＜３,５００／mm３、好中球数＜２,０００／mm３または血小板数＜１２５,０００／mm３、未管理の糖尿病、不安定虚血性心疾患、臨床的に顕著な基礎肺疾患、免疫不全の病歴または免疫抑制性治療歴、凝固障害の病歴または長期抗凝固を必要とする 医学的状態、概算糸球体濾過速度＜３０ml／分、重度の未管理高コレステロール血症(＞３５０mg／dL、９.１mmol／Ｌ)または高トリグリセリド血症(＞５００mg／dL、５.６mmol／Ｌ)の存在を含んだ。
【１７４１】
処置アーム間のベースライン個体群統計学は類似した(表８)。２１８名の参加対象中、２１１名が治験を終了した。７名は治験を中止した。５名は有害事象(ＡＥ)が原因であり、１名は同意の上中止し、１名はプロトコール違反の結果、治験を去った。
【表４４】
0006793902.tif 000122
＊肥満度指数は、身長(ｍ)の二乗で除した体重(kg)である
【１７４２】
治験設計および遂行
２０１１年１２月から２０１２年４月まで、２１８名の高齢志願者が、無作為化、観察者盲検化、プラセボ対照試験に参加した。対象を、各処置アームにおけるＲＡＤ００１対プラセボ比５：２で、検証された自動化無作為化系を使用して処置アームに無作為化した。処置アームは
ＲＡＤ００１  ０.５mg連日またはプラセボ
ＲＡＤ００１  ５mg毎週またはプラセボ
ＲＡＤ００１  ２０mg毎週またはプラセボ
であった。
【１７４３】
ＲＡＤ００１  ０.５mg連日および２０mg毎週コホートにおけるプラセボがこれらのコホートにおけるＲＡＤ００１錠剤とわずかに異なったため、本治験は観察者盲検であった。対象を評価する治験職員は治験薬物を見ておらず、それゆえに完全に盲検式であった。全コホートの処置期間は６週間であり、その間、対象は２週間毎に診療所での安全性評価を受けた。対象が４週間投与された後、ＲＡＤ００１定常レベルを投与前および投与１時間後に測定した。６週間コースの治験薬完了後、対象はＲＡＤ００１が誘発した可能性のある免疫抑制から回復するために２週間休薬させ、その後株Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ｈ３Ｎ２  Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８を含む２０１２年季節性インフルエンザワクチンを接種した(Agrippal(登録商標), Novartis Vaccines and Diagnostics, Siena, Italy)。インフルエンザワクチン接種４週間後、対象から血清を採取し、インフルエンザ力価を測定した。３種のインフルエンザワクチン株ならびに２種の異種株(Ａ／Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｙ／８／７６およびＡ／Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／１１)に対する抗体力価を、標準血球凝集阻害アッセイにより測定した(Kendal, AP et al. (1982) Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention B17-B35)。
【１７４４】
Ａ／Ｈ１Ｎ１／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９特異的ＩｇＧおよびＩｇＭレベルを、先に記載のとおりインフルエンザワクチン接種前および４週間後に測定した(Spensieri, F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:14330-14335)。結果を蛍光強度として表した。
【１７４５】
全ての対象にインフォームド・コンセント書類を渡した。治験は、Good Clinical Practiceの原則に従い、適切な倫理委員会および規制統御句に承認された。
【１７４６】
安全性
有害事象評価ならびに血液学的および生化学的安全性評価のための採血は、来院日に実施した。有害事象情報は、対象が治験薬を受けている６週間の間、家で記載した日記からも集めた。全有害事象データを、インフォームド・コンセント時から最後の来院日から３０日後まで集めた。事象は治験医により軽度、中程度または重度と分類された。
【１７４７】
統計解析
幾何平均力価比の一次解析を、無情報事前分布を用いる正規ベイズ回帰モデルを使用して行った。このモデルを、対数尺度で各抗体力価に適合させた。各モデルの主要評価項目は８４日目測定値であった。６３日目測定値をアウトカムベクターに包含させた。モデルを、先のステートメントと混ぜたＳＡＳ  ９.２  ｐｒｏｃを使用してフィットさせた。マトリクス共分散構造は、非構造化(選択肢タイプ＝ＵＮ)として考慮した。平らである事前分布を使用した。抗体陽転率の二次解析のために、ロジスティック回帰を使用した。
【１７４８】
治療企図集団は、少なくとも１回の完全用量の治験薬を投与され、有効性データに影響する重大なプロトコール逸脱がない全対象と定義された。治験に参加した２１８名の対象中１９９名治験が治療企図集団であった。
【１７４９】
免疫表現型検査
末梢血単核細胞を、ベースライン、６週間の治験薬処置後および対象が６週間治験薬物から離れており、インフルエンザワクチン接種した４週間後である治験の最後の３時点に採血した全血から単離した。７６個のＰＢＭＣサブセットを、先に記載されたように、Human Immune Monitoring Center at Stanford University, CA, USAで８色免疫表現型検査パネルを使用したフローサイトメトリーにより解析した(Maecker, HT et al. (2012) Nat Rev Immunol. 12:191-200)。７６個のＰＢＭＣサブセットを、８色凍結乾燥免疫表現型検査パネルを使用するフローサイトメトリーにより解析した(BD Lyoplate、BD Biosciences, San Diego, CA)。生存能＞８０％および２×１０６細胞を超える収量のＰＢＭＣサンプルを解析に入れた。
【１７５０】
ベースラインから治験薬処置６週目までおよびベースラインから治験の最後(１２週目)までの免疫表現型の相対的変化を、各ＲＡＤ００１投薬コホートで計算した。スチューデントＴ検定を行い、ベースラインから２回の採血時点までの免疫表現型の相対的変化が、それぞれ、プラセボ効果について調整した後、各投与群内で０とは有意に異なるかを試験した。処置効果解析における欠損値補完は行わなかった。それゆえに、患者がベースラインで表現型データ欠損があるとき、この患者は、この表現型の解析を行わなかった。患者の６週目または１２週目の表現型データが欠損しているとき、この患者は、影響する時点でのこの表現型の解析に貢献しなかった。
【１７５１】
３投薬群下の７６表現型の６０８試験を行い、プラセボ効果に対する処置効果を比較した。層別化偽発見率(ＦＤＲ)管理方法論を、今なお相当に優れた検出力を提供する複数の試験と関係する偽陽性の発生を制御するために実施した。細胞型群を層別因子として取り、各層内のＦＤＲ(ｑ値)計算をそれぞれ行った。全帰無仮説は、対応するｑ値≦０.１の０.０５有意水準で棄却された。０.０５有意水準および対応するｑ＜０.１で棄却される複数試験調節戦略は、結果の１０％未満が偽であることを確実にした。
【１７５２】
第二の解析において、免疫表現型は、全３個のＲＡＤ００１投薬群を合わせたプールした処置群とプラセボ群で変化する。どの免疫表現型変化が処置群とプラセボ群を区別するかを決定するために、各測定した表現型の患者内細胞数比を、ベースラインと治験薬処置６週目およびベースラインと治験終了時(１２週目)で計算した。比を対数変換し、プールした処置およびプラセボ群の間の差異を検出するために、各時点の共分散の解析により分析した。７６個の表現型の１５２試験を実施して、プラセボ効果に対するプールした処置効果を比較した。層別化偽発見率(ＦＤＲ)管理方法論を、今なお相当に優れた検出力を提供する複数の試験と関係する偽陽性の発生を制御するために実施した(Benjamini, Y. et al. (1995) J. Roy. Statist. 57:289-300;およびSun, L. et al. (2006) Genet. Epidemiol. 30:519-530)。細胞型群を層別因子として取り、ＦＤＲ(ｑ値)計算を、それぞれ各層内で実施した。０.０５有意水準およびｑ値２０％未満での全帰無仮説は棄却された。これは、０.０５未満のＰ値および各観察された有意な結果が複数試験によるものである２０％未満の確率のみを棄却すると解釈できる。
【１７５３】
結果
一般に、ＲＡＤ００１は、特に０.５mg連日および５mg毎週投与レジメンで良好な耐容性であった。治験中に死亡例はなかった。３名の対象は、ＲＡＤ００１と無関係であると評価された４つの重篤な有害事象(ＳＡＥ)を経験した。４つのＳＡＥは、先に６週間５mg毎週ＲＡＤ００１の６週のコースを完了していた正常血小板数の対象の左眼の網膜出血とその後の失明；プラセボ処置対象における重度の背部痛およびプラセボ処置対象における重度の胃腸炎であった。あらゆる処置群における発生率＞２％の処置関連有害事象(ＡＥ)のリストを表２１に提供する。最も一般的なＲＡＤ００１関連ＡＥは、大部分の症例で、軽度であった口腔内潰瘍であった。全体的に、ＲＡＤ００１を投与された対象と、プラセボ処置対照の重度のＡＥ発生率は類似した。１個の重度のＡＥのみがＲＡＤ００１と関連すると評価され、２０mg毎週ＲＡＤ００１処置対象の口腔内潰瘍であった。
【表４５】
0006793902.tif 000123
【１７５４】
ＲＡＤ００１が高齢志願者における免疫機能を改善する能力を、２０１２年の季節性インフルエンザワクチンに対する血清学的応答を測定することにより評価した。３種のインフルエンザワクチン株の各々に対するベースラインおよびインフルエンザワクチン接種４週間後の血球凝集阻害(ＨＩ)幾何平均力価(ＧＭＴ)を表１０に示す。一次解析変数は、ＨＩ  ＧＭＴ比(ワクチン接種４週間後／ベースライン)であった。治験を、少なくとも３種のインフルエンザワクチン株中２種において、１)プラセボに対して相対的に≧１.２倍ＧＭＴ；および２)８０％以上が、１を超えるプラセボ補正ＧＭＴ比である事後確率の存在を証明できるように強化した。このエンドポイントは、ＭＦ−５９ワクチンアジュバントにより誘発されるインフルエンザＧＭＴ比の１.２倍増加がインフルエンザ疾病の減少と関連するために、選択した(Iob, A et al. (2005) Epidemiol Infect 133:687-693)。
【表４６】
0006793902.tif 000124
４週目はインフルエンザワクチン接種４週間後を示す
Ｎはコホートあたりの対象数である
ＧＭＴは幾何平均力価である
ＧＭＴ比は、ワクチン接種４週目のＧＭＴ／ベースラインのＧＭＴである
ＣＶ％は、変動係数を示す
【１７５５】
治療企図(ＩＴＴ)集団において、高用量(２０mg毎週)コホートではなく、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１(０.５mg連日または５mg毎週)コホートが、治験の主要評価項目に合った(図２７Ａ)。これは、低用量でＲＡＤ００１の異なる免疫調節機構が存在し、高用量で、ｍＴＯＲ阻害の既知免疫抑制性効果が発揮されるようになる可能性を示す。さらに、本結果は、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１処置後の高齢者における免疫機能の改善傾向を示唆する。
【１７５６】
サブグループ解析において、低ベースラインインフルエンザ力価(≦１：４０)のサブセットの対象は、ＩＴＴ集団より高い力価のＲＡＤ００１関連増加を経験した(図２７Ｂ)。これらのデータは、ＲＡＤ００１が、ベースラインで予防的(＞１：４０)力価を有さず、それゆえにインフルエンザ疾病の最高のリスクにある対象のインフルエンザワクチン応答の増強に特に有効であることを示す。
【１７５７】
ＲＡＤ００１濃度対各インフルエンザワクチン株に対する力価増加の散布図は、逆暴露／応答相関を示す(図２８)。Ｓ６キナーゼ(Ｓ６Ｋ)のｍＴＯＲ介在リン酸化に基づくモデリングおよびシミュレーションは、２０mg毎週投与レジメンがｍＴＯＲ介在Ｓ６Ｋ活性をほぼ完全に阻止し、５mg毎週投与レジメンはＳ６Ｋ活性を５０％を超えて阻止し、０.５mg連日投与レジメンは、Ｓ６Ｋリン酸化を投与の合間に約３８％まで阻止することを予測する(Tanaka, C et al. (2008) J. Clin. Oncol 26:1596-1602)。それゆえに、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１での、部分的ｍＴＯＲ阻害、例えば、ｍＴＯＲ介在Ｓ６Ｋリン酸化阻害は、高齢者の免疫応答の増強における高用量ＲＡＤ００１でのほぼ完全なｍＴＯＲ阻害よりも有効ではないにしても、有効であり得る。
【１７５８】
インフルエンザワクチン接種４週間後の抗体陽転率も評価した。抗体陽転は、ワクチン接種前力価陰性(すなわち、ＨＩ力価＜１：１０)から、ワクチン接種後ＨＩ力価≧１：４０への変化または非陰性(≧１：１０)ワクチン接種前ＨＩ力価からの少なくとも４倍増加として定義された。治療企図集団、Ｈ３Ｎ２およびＢ株への抗体陽転率は、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で増加したが、該増加は統計的有意性には合わなかった(表１１)。ベースラインインフルエンザ力価≦１：４０の対象の亜集団において、ＲＡＤ００１処置はまたＨ３Ｎ２およびＢ株に対する抗体陽転率を増加させ、これらの結果は、０.５mg連日投薬コホートでＢ株に対して統計額的有意性に達した。これらのデータは、さらにＲＡＤ００１が、高齢者におけるインフルエンザワクチン接種に対する血清学的応答を増強させたことを示す。
【表４７】
0006793902.tif 000125
＊  ＲＡＤ００１とプラセボの間の抗体陽転のオッズ比は、有意に１より異なる(固定効果として処理したロジスティック回帰により得た両側ｐ値＜０.０５)
【１７５９】
現在の季節性インフルエンザワクチンは、しばしば、以前に広まったウイルスのバリアントとして存在するインフルエンザ株の継続する出現に対して適切な保護を提供しない。しかしながら、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンの存在下でインフルエンザに対してワクチン接種したマウスは、プラセボと比較して、インフルエンザに対する広い血清学的応答を発達させた。広い血清学的応答は、ワクチンに含まれないインフルエンザの異種株での感染に対する保護を提供する、複数のサブタイプのインフルエンザにより発現される保存的エピトープに対する抗体を含んだ(Keating, R et al. (2013) Nat Immunology 14:2166-2178)。ＲＡＤ００１が高齢志願者におけるインフルエンザに対する血清学的応答を広幅化するかについて、インフルエンザワクチン(Ａ／Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ／８／７６およびＡ／Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／１１)に含まれないインフルエンザの２種の異種株に対するＨＩ力価を測定した。異種株に対するＨＩ  ＧＭＴ比の増加は、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で高かった(図２９)。さらに、異種株に対する抗体陽転率は、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で高かった。５mgおよび２０mg毎週ＲＡＤ００１投薬コホートにおける抗体陽転率の増加は、Ｈ３Ｎ２異種株に対して統計的有意であった(表２４)。プールしたＲＡＤ００１コホートについてのＨ３Ｎ２抗体陽転率は３９％であり、それに対しプラセボコホートは２０％であった(ｐ＝０.００７)。ここに示した結果は、ｍＴＯＲ阻害がインフルエンザワクチン接種に対する高齢志願者の血清学的応答を広幅化し、季節性インフルエンザワクチンに含まれないインフルエンザの異種株に対する抗体力価を高めることを示唆する。
【１７６０】
ラパマイシンで処置したマウスにおけるインフルエンザの異種株に対する血清学的応答の広幅化は、Ｂ細胞におけるクラススイッチングの阻止および抗インフルエンザＩｇＭレベルの増加と関係している(Keating, R. et al. (2013) Nat Immunol 14:2166-2178)。しかしながら、クラススイッチングの阻止は、ワクチン接種後抗インフルエンザＩｇＭおよびＩｇＧレベルがＲＡＤ００１コホートとプラセボ処置コホート間で差がなかったため、ＲＡＤ００１で処置したヒトにおける広幅化された血清学的応答とは関係しない可能性がある(図３０)。
【表４８】
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＊  ＲＡＤ００１とプラセボの間の抗体陽転のオッズ比は、有意に１より異なる(固定効果として処理したロジスティック回帰により得た両側ｐ値＜０.０５)
【１７６１】
ＲＡＤ００１が高齢志願者における免疫機能を増強する機構に取り組むため、免疫表現型検査を、ベースライン、治験薬処置６週間後およびインフルエンザワクチン接種４週間後(治験薬中止６週間後)に対象から得たＰＢＭＣサンプルで実施した。大部分のＰＢＭＣサブセットのパーセンテージはＲＡＤ００１コホートとプラセボの間で差がなかったが、ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８細胞のパーセンテージは、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で低かった(図３７)。ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８細胞は年齢とともに蓄積し、ＰＤ−１がＴ細胞受容体誘発Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生および細胞溶解性機能を阻止するため、抗原刺激に対する不完全な応答を有する(Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798)。プラセボコホートにおいてＰＤ−１陽性Ｔ細胞のパーセンテージの経時的増加があった。１２週目(ワクチン接種４週間後)で、インフルエンザウイルスがＰＤ−１陽性Ｔ細胞を増加させることが示されているため、この増加はインフルエンザワクチン接種によるものであり得る(Erikson, JJ et al. (2012) JCI 122:2967-2982)。しかしながら、全ＲＡＤ００１コホートでＣＤ４  ＰＤ−１陽性Ｔ細胞のパーセンテージは６週目および１２週目でベースラインから下がった(図３１Ａ)。ＣＤ８  ＰＤ−１陽性細胞のパーセンテージも、２つの低用量ＲＡＤ００１コホートで６週目および１２週目の両者でベースラインから下がった(図３１Ｂ)。ＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞のパーセンテージを評価し、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１コホートで増加した(図３１Ｃ)。
【１７６２】
ＲＡＤ００１コホートからの結果をプールし、ベースラインＰＤ−１発現の差異について調整したより厳密な統計解析下、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、プールしたＲＡＤコホート(ｎ＝８４)で、６週目にＰＤ−１陽性ＣＤ４  Ｔ細胞の３０.２％の統計的に有意な減少があり、ｐ＝０.０３(ｑ＝０.１３)であった(図３２Ａ)。プラセボコホートと比較した、プールしたＲＡＤにおける１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ４  Ｔ細胞の減少は３２.７％であり、ｐ＝０.０５(ｑ＝０.１９)である。図３２Ｂは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、プールしたＲＡＤ００１コホート(ｎ＝８４)における６週目のＰＤ−１陽性ＣＤ８  Ｔ細胞の統計的に有意な３７.４％の減少を示し、ｐ＝０.００８(ｑ＝０.０７)である。プラセボコホートと比較した、プールしたＲＡＤ００１の１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ８  Ｔ細胞減少は４１.４％であり、ｐ＝０.０６６(ｑ＝０.２１)である。それゆえに、図３１および３２の結果は、合わせて、ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞のパーセンテージのＲＡＤ００１関連減少が、免疫機能の増強に貢献している可能性を示唆する。
【１７６３】
結論
結論として、ここに提供したデータは、ｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１が、インフルエンザワクチン接種に対する応答で評価して、ヒト高齢者の免疫学的機能における年齢関連減少を軽減し、この改善が許容されるリスク対効果バランスで得られることを示す。高齢マウスでの試験において、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンでの６週間処置はインフルエンザワクチン接種に対する応答を増加しただけでなく、寿命も延長し、免疫老化の改善は、加齢関連表現型に対するより広範な効果のマーカーであり得ることを示唆する。
【１７６４】
ＲＡＤ００１投薬をワクチン接種２週間前に中断したため、ＲＡＤ００１の免疫増強効果は、薬物処置中止後も残留する適切な細胞集団における変化により介在され得る。ここに示した結果は、ＲＡＤ００１が、プラセボと比較して疲弊したＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞のパーセンテージを減少させたことを示す。ＰＤ−１発現はＴＣＲシグナル伝達により誘発され、慢性ウイルス感染を含む永続性抗原刺激の設定で高いままである。理論に縛られることを望まないが、ＲＡＤ００１が高齢志願者における慢性免疫活性化を減少し、それによりＰＤ−１発現を減少させた可能性がある。ＲＡＤ００１はまたイムノフィリンシクロスポリンＡについて報告されているように、ＰＤ−１発現を直接的にも阻害し得る(Oestreich, KJ et al. (2008) J Immunol. 181:4832-4839)。ＰＤ−１陽性Ｔ細胞のパーセンテージのＲＡＤ００１誘発減少は、Ｔ細胞応答の品質を改善させる可能性がある。これは、ｍＴＯＲ阻害が、マウスおよび霊長類におけるワクチン接種に対する記憶ＣＤ８  Ｔ細胞応答の品質を改善したことを示す試験と先の一致する(Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112)。高齢マウスにおいて、ｍＴＯＲ阻害はまた造血幹細胞の数を増加させ、ナイーブリンパ球の産生増加に至ることも示されている(Chen, C et al. (2009) Sci Signal 2:ra75)。本実施例においてＲＡＤ００１対プラセボコホートでナイーブリンパ球のパーセンテージに有意な差は検出されなかったが、この可能性がある機構をさらに調査し得る。
【１７６５】
ＲＡＤ００１がインフルエンザの異種株に対する血清学的応答を広幅化する機構をさらに調査し得る。ラパマイシンも、インフルエンザワクチン接種後Ｂ細胞におけるクラススイッチングを阻止することが示されている。その結果、抗インフルエンザ抗体の独特のレパートリーが産生され、それがインフルエンザワクチンに含まれないインフルエンザウイルスサブタイプでの致死的感染に対する株間保護を促進した(Keating, R et al. (2013) Nat Immunol. 14:2166-2178)。ここに記載した結果は、ＲＡＤ００１がインフルエンザワクチン接種２週間前にＲＡＤ００１を中止した高齢対象におけるＢ細胞クラススイッチングを改変したことを示さなかった。基礎機構をさらに解明する必要があるが、ここに記載する異種インフルエンザ株に対する血清学的応答の増加は、インフルエンザの季節性ワクチンと地域社会で広まっている株があまり適合していない年のインフルエンザ疾病に対する保護の増強に寄与し得る。
【１７６６】
インフルエンザ抗体力価に対するＲＡＤ００１の効果は、高齢者のインフルエンザワクチン接種に対する応答の増加について承認されているＭＦ５９ワクチンアジュバントの効果と同等であった(Podda, A (2001) Vaccine 19:2673-2680)。それゆえに、インフルエンザワクチン接種に対する抗体応答のＲＡＤ００１駆動増強は、高齢者におけるＭＦ５９アジュバント添加インフルエンザワクチンで証明される臨床的利益に翻訳され得る(Iob, A et al. (2005) Epidemiol Infect. 133:687-693)。しかしながら、ＲＡＤ００１はまた臓器移植患者の免疫応答の抑制にも使用される。これらの外見上逆説的な結果は、ｍＴＯＲ阻害剤の免疫調節効果が用量および／または抗原依存性であり得る可能性を惹起する(Ferrer, IR et al. (2010) J Immunol. 185:2004-2008)。逆ＲＡＤ００１暴露／ワクチン接種応答相関の傾向がここで見られた。完全なｍＴＯＲ阻害は通常のシクロフィリン−ラパマイシン機構を介して免疫機能を抑制するが、部分的ｍＴＯＲ阻害は、少なくとも高齢者において、異なる加齢関連表現型阻害により免疫機能を増強する可能性がある。興味深いことに、ｍＴＯＲ活性は、高齢動物モデルにおける造血幹細胞を含む多様な組織で増加する(Chen C. et al. (2009) Sci Signal 2:ra75 and Barns, M. et al. (2014) Int J Biochem Cell Biol. 53:174-185)。それゆえに、ｍＴＯＲ活性の、若い組織で見られるレベルへの下落が、ｍＴＯＲ活性のより完全な抑制とは逆に、老化減少適応症に臨床的利益があり得る。
【１７６７】
加齢関連適応症の処置におけるＲＡＤ００１のようなｍＴＯＲ阻害剤の安全性プロファイルは懸念されている。腫瘍学または臓器移植適応症で使用される用量でのＲＡＤ００１の毒性は、多くの加齢関連適応症では許容されないであろう口内炎、下痢、悪心、血球減少、高脂血症および高血糖を含む。しかしながら、これらのＡＥは、血中のＲＡＤ００１のトラフレベルに関係する。それゆえに、本治験で使用したＲＡＤ００１投与レジメンは、トラフレベルを最少化するように選択した。０.５mg連日、５mg毎週および２０mg毎週投薬コホートの平均ＲＡＤ００１トラフレベルは、それぞれ０.９ng／ml、０.３ng／ml(定量下限)未満および０.７ng／mlであった。これらのトラフレベルは、臓器移植および癌患者で使用される投与レジメンと関係するトラフレベルより顕著に低い。さらに、６週間の限られた処置コースが有害事象のリスクを減らした。これらの結果は、この治験で使用された投与レジメンが、高齢者のある状態については許容されるリスク対効果を有し得ることを示唆する。それにもかかわらず、ここに記載した試験の対象の相当数が、０.５mg連日ほど低い投薬でも口腔内潰瘍を発症した。それゆえに、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１の安全性プロファイルはさらなる治験を必要とする。現在利用可能なラパログよりも問題のない安全性プロファイルを有するｍＴＯＲ阻害剤は、将来加齢関連状態における良好な治療選択肢を提供し得る。
【１７６８】
実施例１８：高齢者対象におけるワクチンに対する免疫応答の増強
免疫機能は高齢者で低下し、感染発生率増加およびワクチン接種に対する応答減少に至る。ｍＴＯＲ阻害がヒトにおいて抗加齢効果を有するかの決定の第一段階として、無作為化プラセボ対照治験を実施し、ｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１が、高齢志願者におけるワクチン接種に対する応答により評価された免疫機能の加齢関連低下を反転させるかを決定した。全例で、適切な患者同意を得て、治験は国の保健機関により承認された。
【１７６９】
ＲＡＤ００１の次の３投与レジメンを治験で使用した：
２０mg毎週(トラフレベル：０.７ng／ml)
５mg毎週(トラフレベルは検出限界以下であった)
０.５mg連日(トラフレベル：０.９ng／ml)
【１７７０】
移植および腫瘍適応症で承認されているＲＡＤ００１の用量より低いトラフレベルのために、これらの投与レジメンを選択した。トラフレベルは、体内の薬物の最低レベルである。１０mg連日腫瘍学投与レジメンに付随するＲＡＤ００１のトラフレベルは約２０ng／mlである。０.７５〜１.５mg  ｂｉｄ移植投与レジメンに付随するトラフレベルは約３ng／mlである。対照的に、我々の免疫化治験で使用した投与レジメンに付随するトラフレベルは３〜２０倍低かった。
【１７７１】
ＲＡＤ００１関連ＡＥがトラフレベルと関係するため、３投与レジメンは正常志願者に対する適切な安全性を有することが予測された。さらに、３用量は、一定範囲のｍＴＯＲ阻害を与えることが予想された。Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ(Ｐ７０  Ｓ６Ｋ)は、ｍＴＯＲによりリン酸化される下流標的である。Ｐ７０  Ｓ６Ｋリン酸化のレベルは、ｍＴＯＲ活性の指標として働く。ＲＡＤ００１の前臨床試験および臨床試験で得たＰ７０  Ｓ６Ｋリン酸化データのモデリングおよびシミュレーションに基づき、２０mg毎週が丸一週間ｍＴＯＲ活性をほぼ完全に阻害すると予測され、一方５mg毎週および０.５mg連日はｍＴＯＲ活性を一部阻害すると予測された。
【１７７２】
６５歳以上の高齢志願者を、３つのＲＡＤ００１処置群(５０対象／アーム)またはプラセボ(２０対象／アーム)の一つに無作為化した。対象を治験薬物で６週間処置し、２週間休薬し、インフルエンザワクチン接種(Aggrippal, Novartis)および肺炎球菌ワクチン接種(Pneumovax 23, Merck)をした。インフルエンザワクチン接種に対する応答を、ワクチン接種４週間後、インフルエンザワクチンの３インフルエンザ株(Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＢインフルエンザサブタイプ)に対する血球凝集阻害アッセイによる幾何平均力価(ＧＭＴｓ)の測定により評価した。治験の主要評価項目は(１)安全性および耐容性および(２)ワクチン接種４週間後、プラセボと比較した、インフルエンザワクチン株の２／３のインフルエンザ力価の１.２倍増加であった。このエンドポイントは、インフルエンザ力価の１.２倍増加が、ワクチン接種後のインフルエンザ疾病の減少と関連し、それゆえに臨床的に適切であるために、選択した。５mg毎週および０.５mg  １日用量は十分耐容性であり、２０mg毎週用量と異なり、ＧＭＴ主要評価項目を満たした(図２７Ａ)。高齢志願者においてプラセボと比較して、ＲＡＤ００１がインフルエンザワクチン接種に対する応答を改善しただけでなく、肺炎球菌ワクチン接種に対する応答も改善した。肺炎球菌ワクチンは、２３種の肺炎球菌血清型からの抗原を含む。血清型の７種に対する抗体力価を我々の対象で測定した。６／７血清型に対する抗体力価が、プラセボと比較して全３つのＲＡＤコホートで増加した。
【１７７３】
合わせたインフルエンザおよび肺炎球菌力価データは、部分的(８０〜１００％未満)ｍＴＯＲ阻害が、完全なｍＴＯＲ阻害よりも免疫機能における加齢関連低下の反転により有効であることを示す。
【１７７４】
実施例１９：低用量ｍＴＯＲ阻害はエネルギーおよび運動を増やす
前臨床モデルにおいて、ラパログであるラパマイシンでのｍＴＯＲ阻害は、老齢マウスにおける自発的身体活動性を増加させる(Wilkinson et al. Rapamycin slows aging in mice. (2012) Aging Cell; 11:675-82)。興味深いことに、実施例１８に記載した０.５mg連日投薬コホートの対象も、投与１年後のアンケートで、プラセボと比較してエネルギーおよび運動能の増加を報告した(図３３)。これらのデータは、ラパログでの部分的ｍＴＯＲ阻害が、単なる免疫機能を超えて加齢関連罹病率に対する効果を有し得ることを示唆する。
【１７７５】
実施例２０：ＲＡＤ００１でのＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害
モデリングおよびシミュレーションを実施し、ｍＴＯＲ活性を部分的に阻害すると予測されるＲＡＤ００１の連日および毎週用量範囲を予測した。上記のとおり、Ｐ７０  Ｓ６ＫはｍＴＯＲによりリン酸化され、Ｐ７０  Ｓ６Ｋのノックアウトが寿命を増加するため加齢とより密接に結びついたｍＴＯＲの下流標的である。それゆえにモデリングを、Ｐ７０  Ｓ６Ｋ活性を一部阻害するＲＡＤ００１の用量で行った。≧０.１mgおよび＜２０mgの範囲の毎週投薬がＰ７０  Ｓ６Ｋ活性の部分的阻害を達成すると予測される(図３４)。
【１７７６】
連日投薬について、３０pM〜４nMの濃度のＲＡＤ００１が細胞株におけるＰ７０  Ｓ６Ｋ活性を部分的に阻害する(表２５)。これらの血清濃度は、≧０.００５mg〜＜１.５mg連日のＲＡＤ００１の用量で達成されると予測される。
【表４９】
0006793902.tif 000127
【１７７７】
結論
Ｐ７０  Ｓ６Ｋを部分的にしか阻害しない用量のｍＴＯＲ阻害剤を用いる、加齢関連罹患を処置するまたは一般に免疫応答を増強する方法。加齢適応症における低用量のＲＡＤ００１での部分的ｍＴＯＲ阻害の有効性は予想外の発見である。≧０.１mg〜＜２０mg毎週および≧０.００５mg〜＜１.５mg連日のＲＡＤ００１用量範囲が部分的ｍＴＯＲ阻害を達成し、それゆえに加齢関連罹患または免疫応答の増強に有効性を有することが期待される。
【１７７８】
実施例２１：変異体ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化スイッチの産生および特徴づけ
この実施例において、スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢまたはＦＫＢＰと二量体化分子の結合に関与する残基の変異を実施して、ＦＫＢＰ、ＦＲＢと二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の複合体形成を増強する変異を同定した。候補変異体ＦＫＢＰおよびＦＲＢスイッチドメインのライブラリーを、ここに記載するとおり産生し、スクリーニングした。変異体ＦＫＢＰまたはＦＲＢは、免疫抑制の仲介に使用する濃度より低い循環濃度の二量体化分子、例えば、ＲＡＤ００１の使用を可能にする。
【１７７９】
ＦＫＢＰ、ＦＲＢとラパマイシンの界面は明確に規定され、ＦＲＢ／ラパマイシンおよびＦＲＢ／ＦＫＢＰ界面の検査を可能とする。三元ＦＫＢＰ／ＦＲＢ／ラパマイシン複合体の２.２Åｘ線構造において、ＦＲＢ残基Ｌｅｕ２０３１、Ｇｌｕ２０３２、Ｓｅｒ２０３５、Ａｒｇ２０３６、Ｐｈｅ２０３９、Ｇｌｙ２０４０、Ｔｈｒ２０９８、Ｔｒｐ２１０１、Ｔｙｒ２０１５およびＰｈｅ２１０８は、ラパマイシンと３８の直接接触があり、ＦＲＢ残基Ａｒｇ２０４２およびＡｓｐ２１０２は、該化合物と水介在接触がある(Liang et al.,1999,J. Acta Cryst. D55:736-744)。図３５は、Molecular Operating Environment(ＭＯＥ)を使用して産生したＲＣＳＢコード２ＦＡＰである三元複合体のｘ線構造において決定したＦＫＢＰおよびＦＲＢとのラパマイシン相互作用を示す(Clark et al., 2007, J. Chem. Inf. Model. 47(5):1933-1944)。ＦＲＢ分子は、構造における鎖Ｂである。
【１７８０】
変異のためにＦＲＢ残基は、Ｌ２０３１、Ｅ２０３２、Ｓ２０３５、Ｒ２０３６、Ｆ２０３９、Ｇ２０４０、Ｔ２０９８、Ｗ２１０１、Ｄ２１０２、Ｙ２１０５およびＦ２１０８を含んだ。各点変異体ライブラリーを、ＮＮＫライブラリー(ここで、Ｎはアデニン(Ａ)、シトシン(Ｃ)、グアニン(Ｇ)またはチミン(Ｔ)であってよく、Ｋはグアニン(Ｇ)またはチミン(Ｔ)であってよい)を使用し、所望の位置でコドンを無作為化することにより産生した。表１３はＮＮＫライブラリーのコドン分布および対応するアミノ酸を示す。図３６は、ＮＮＫライブラリーにおけるコドンから産生されたアミノ酸の分布を示し、低い３.１％〜から高い９.４％の範囲である。各点変異体ライブラリーを、Ｎ末端ヒスチジンタグとｐＮＡＴ４３ベクターにクローン化した。配列番号３０１〜３１１は、各点変異体ライブラリーのアミノ酸組成を示し、ここで、ＸはＮＮＫライブラリーの位置を示す。各ライブラリーのＤＮＡを、Acellaケミカルコンピテント大腸菌に形質転換し、５０μg／mL硫酸カナマイシン含有１００mm  ＬＢ寒天プレートに播種し、一夜、３７℃でインキュベートした。各ライブラリープレートからの９４コロニーをCostar  ２mLピラミッド形底９６ウェルプレートに７５μg／mL硫酸カナマイシンを含む１mLのＺＹＰ−５０５２自己誘導培地と共に移した。プレートを、４０時間、８００rpmで、３０℃でミクロプレートインキュベーター中インキュベートした。
【１７８１】
候補ＦＲＢクローンを次のとおり単離した。まず、細胞を溶解した。細胞を、２,０００×ｇで、４℃で３０分遠心することによりペレット化した。上清を廃棄し、細胞ペレットを−８０℃で保存した。細胞ペレット含有９６ウェルプレートを、−８０℃での貯蔵から出し、室温で１時間解凍した。０.５mLの５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.５、１５０mM  ＮａＣｌ、５mM  ＥＤＴＡ、０.２５％(ｖ／ｖ)  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２.５mg／mL  リゾチームを各ウェルに添加した。ペレットを、１８０μLを６０回ピペッティングすることにより再懸濁した。サンプルを室温で０.１〜１時間インキュベートした。０.５mLの５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.５、１５０mM  ＮａＣｌ、２０mM  ＣａＣｌ２、２０mMmgＣｌ２、０.５mg／mL  ＤＮａｓｅ  Ｉを各ウェルに添加した。サンプルを、１８０μLを１０回ピペッティングすることにより混合した。プレートを、３０分、室温でインキュベートした。溶解した細胞を、２,０００×ｇで、４℃で３０分の遠心によりペレット化した。上清を、逆さにし、軽打することにより各プレートから廃棄した。プレートを、一夜、−８０℃で保存した。
【１７８２】
次に、保存ライセートを、次のとおり変異体ＦＲＢを単離するために親和性精製した。翌朝、プレートを、−８０℃の保存から出し、室温で１時間解凍した。０.７mLの５０mM  ＨＥＰＥＳ、５００mM  ＮａＣｌ、５mM  ＴＣＥＰ、５％(ｖ／ｖ)  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７.５を各ウェルに添加した。ペレットを、１８０μLを５０回ピペッティングすることにより再懸濁し、続いて室温で１時間インキュベーションした。プレートを、３０分、２,０００×ｇで、４℃で遠心し、各ウェルの上清を廃棄した。０.５mLの５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.５、１mM  ＴＣＥＰ、６０％エタノールを各ウェルに添加した。ペレットを、１８０μLを５０回ピペッティングすることにより再懸濁し、続いて室温で１時間インキュベーションした。プレートを、３０分、２,０００×ｇで、４℃で遠心し、各ウェルの上清を廃棄した。０.５mLの５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.５、５００mM  ＮａＣｌ、１mM  ＴＣＥＰ、８Ｍ  尿素を各ウェルに添加した。ペレットを、１８０μLを５０回ピペッティングすることにより再懸濁し、一夜、室温でインキュベートした。翌朝、サンプルを２０μm  焼結９６ウェルプレートに移した。サンプルをプレートを通して、新しい２mL  Ｃｏｓｔａｒ  ９６ウェルプレートに、５分、１,５００×ｇで、４℃で遠心することにより濾過して入れた。５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.５、５００mM  ＮａＣｌ、１mM  ＴＣＥＰ、８Ｍ  尿素中のNi Sepharose 6 Fast Flow樹脂の２５％スラリーを調製した。１００μLのスラリー、２５μLの樹脂を各ウェルに添加した。樹脂を、サンプルと、１時間、室温でインキュベートした。樹脂を２０μm  焼結９６ウェルプレートに移し、カラムフロースルーを減圧により除去した。５００μLの５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.５、１５０mM  ＮａＣｌ、１mM  ＴＣＥＰ、４Ｍ  尿素を各ウェルに添加し、５分インキュベートし、減圧により除去した。５００μLの５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.５、１５０mM  ＮａＣｌ、１mM  ＴＣＥＰ、２Ｍ  尿素を各ウェルに添加し、５分インキュベートし、減圧により除去した。５００μLの５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.５、１５０mM  ＮａＣｌ、１mM  ＴＣＥＰ、１Ｍ  尿素を各ウェルに添加し、５分インキュベートし、減圧により除去した。５００μLの５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.５、１５０mM  ＮａＣｌ、１mM  ＴＣＥＰ、２５mM  イミダゾールを各ウェルに添加し、５分インキュベートし、減圧により除去した。２００μLの５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.５、１５０mM  ＮａＣｌ、１mM  ＴＣＥＰ、５００mM  イミダゾールを各々に添加し、５分インキュベートした。結合タンパク質を、新しい３００μL  ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  ９６ウェルプレートへの、２分、５００×ｇで、４℃の遠心により評価した。各ウェルのタンパク質濃度(mg／mL)を、BradfordアッセイでＢＳＡを標準として用いて測定した。タンパク質濃度を、野生型ＦＲＢの分子量を使用してμMに変換した。点変異体ライブラリーは、４７％であったＦＲＢ  Ｄ２１０２以外、少なくとも５０％のウェルで発現した。図３７Ａは各ライブラリーの発現レベルを示し、図３７Ｂは発現ウェルの平均濃度を示す。
【１７８３】
各ライブラリーについてタンパク質を発現する各ウェルの阻害を、ブランク測定値としてプロテインＡを含まない、周知のものを使用することにより計算した。各ライブラリープレートについて、ブランクウェルに対する平均を計算した。ブランクウェルについての平均より大きな値の発現ウェルを０％阻害と定義した。ブランクウェルについての平均以下の値のウェルの阻害パーセントを計算し、−１を乗じたブランクウェルの平均をウェル値から減算し、ブランクウェルの平均で除し、１００を乗ずることにより計算した。ウェル値が０であるとき、１００％阻害であり、ウェル値がブランクウェルの平均と等しいとき、０％阻害であった。７５％以上の阻害のウェルを再配置のために選択した。表２６は、各ライブラリーについて選択したウェルの数および野生型ＦＲＢであると予測されるウェルの数を示す。１０３４ウェル中３２０、３１.３％を選択した。選択したウェルを、記載のように増殖させ、精製し、分析した。選択したウェルの各々のＤＮＡを配列決定して、個々の変異を同定した。変異体の各々のタンパク質濃度をBradfordアッセイにより評価した。各変異体の活性を、野生型ＦＲＢがエベロリムス、例えば、ＲＡＤ００１と結合する能力と、複数アッセイ形式で比較した。
【１７８４】
【表５０】
0006793902.tif 000128
【１７８５】
競合アッセイについて、興味のあるＦＲＢ変異を、野生型ＦＲＢと比較してランク付けする。興味のある非標識ＦＲＢタンパク質(配列番号３１３〜３１７)および非標識野生型ＦＲＢ(配列番号３１２)を、発現によって０.９〜４μMの出発最終濃度から１：３連続希釈し、９６ウェル１／２表面平底プレート(PerkinElmer)中、６０nM(最終)エベロリムスの存在下、３０nM(最終)野生型Ｆｌａｇ−ＦＲＢ(配列番号３１８)および３０nM(最終)ビオチニル化野生型ＦＫＢＰ(配列番号２４)の溶液に添加した。全希釈を、１ｘAlphaLISA Immunoassay緩衝液(PerkinElmer)で行った。プレートを１時間、室温で穏やかに撹拌しながらインキュベートした。抗Ｆｌａｇアクセプタービーズ(PerkinElmer)を１０μg／ml最終濃度で添加し、１時間、室温で穏やかに撹拌しながらインキュベートした。ストレプトアビジンドナービーズ(PerkinElmer)を４０μg／mlの最終濃度で添加し、プレートを遮光し、３０分、室温で穏やかに撹拌しながらインキュベートした。プレートを、
Alpha Moduleを備えたPerkinElmer EnVision Multiplate readerで、６８０nmの励起および５７０nm吸収フィルターを使用して読んだ。競合アッセイからの各ＦＲＢ配列のＥＣ５０を、同じプレートで分析したＷＴ  ＦＲＢと比較して表２７に示す。単一点変異Ｅ２０３２Ｌ(配列番号３１４)およびＥ２０３２Ｉ(配列番号３１３)は野生型より２倍良好であり(図３８Ａおよび３８Ｂ)；Ｔ２０９８Ｌ(配列番号３１５)は３倍改善された(図３８Ｃ)。両部位に変異が取り込まれたＦＲＢタンパク質(配列番号３１６および３１７)は、５倍の相対的改善を示した(図３８Ｄおよび３８Ｅ)。
【表５１】
0006793902.tif 000129
【１７８６】
ＦＲＢ変異も別のアッセイ形式でランク付けした。簡単にいうと、単および二重変異を含むＦＲＢタンパク質(配列番号３１９〜３２３)を、先に記載のように大腸菌におけるＦＬＡＧタグ付き構築物のように産生した。３０nM(最終)のビオチニル化ＦＫＢＰ(配列番号３２４)および各ＦＬＡＧ  ＦＲＢタンパク質を、９６ウェル１／２表面平底プレート(PerkinElmer)中、６００nMの出発最終濃度から１：３連続希釈したエベロリムスの存在下合わせ、１時間、室温でインキュベートした。全希釈物を１ｘAlphaLISA Immunoassay緩衝液(PerkinElmer)で製造した。抗Ｆｌａｇアクセプタービーズ(PerkinElmer)を１０μg／ml最終濃度で添加し、１時間、室温でインキュベートした。ストレプトアビジンドナービーズ(PerkinElmer)を４０μg／mlの最終濃度で添加し、プレートを遮光し、３０分、室温でインキュベートした。プレートをlpha Moduleを備えたPerkinElmer EnVision Multiplate readerで、６８０nmの励起および５７０nm吸収フィルターを使用して読んだ。このアッセイからの各ＦＲＢ配列のＥＣ５０を表２８に示す。単点変異Ｅ２０３２Ｉ(配列番号３１９)およびＥ２０３２Ｌ(配列番号３２０)は、野生型より約１.５〜２倍良好であり(図３９Ａおよび３９Ｂ)；Ｔ２０９８Ｌ(配列番号３２１)は３倍改善した(図３９Ｃ)。二重変異を取り込んだＦｌａｇタグ付ＦＲＢタンパク質(配列番号３２２および３２３)は、本アッセイで制限された動的範囲を示し、それゆえに評価できなかった。
【１７８７】
【表５２】
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【１７８８】
【表５３】
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【１７８９】
実施例２２：細胞外スイッチでのＲＣＡＲの活性化
この実施例において、細胞外スイッチでのＲＣＡＲの活性化を、二量体化分子ＲＡＤ００１の存在下評価した。４種のＲＣＡＲを試験した。２個の半スイッチ構築物、例えば、両配向の二量体化スイッチ(図４２Ａ)および例えば、両配向の二量体化スイッチを有する、２個の完全スイッチ構築物(図４２Ｂ)であって、ここで、二量体化スイッチは、図４２Ａおよび４２Ｂに示すように細胞外ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化である。半スイッチ構築物において、抗原結合メンバーはｓｃＦＶドメイン、細胞外スイッチドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢを含み、細胞内シグナル伝達メンバーは、細胞外スイッチドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内一次シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータ(図４２Ａ)を含む。完全スイッチ構築物において、抗原結合メンバーはｓｃＦｖドメイン、細胞外スイッチドメインおよび膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達メンバーは細胞外スイッチドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、４−１ＢＢおよび細胞内一次シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータを含む(図４２Ｂ)。
【１７９０】
材料および方法
ＲＣＡＲ構築物をJurkatレポーター細胞株で発現させた。ＮＦＡＴ−ＬＵＣレポーターを有するJurkat細胞(ＪＮＬ)を、０.５μg／mlのピューロマイシンを含むJurkat細胞増殖培地で０.５×１０６／mlの密度まで増殖させた。各遺伝子導入について、２.５×１０６細胞を１００ｇで１０分遠沈した。ＲＣＡＲ構築物あたり２μgのＤＮＡを遺伝子導入あたり使用した。Amaxa Nucleofector solution VおよびサプリメントＩを混合し、１００μlをＤＮＡ構築物とともにチューブに入れた。混合物を細胞に添加し、エレクトロポレーションキュベットに移した。エレクトロポレーションを、Amaxa Nucleofector II Deviceを使用して設定Ｘ−００１下に実施した。０.５mlの増殖培地を電気穿孔直後に添加し、混合物を、２ml  増殖培地中、６ウェルプレートの１ウェルに移した。
【１７９１】
１時間後、ＲＡＤ００１化合物を多様な濃度で適用した：０nM、０.０１nM、０.０３nM、０.１nM、０.３nM、１nM、５nMおよび５０nM。組織培養プレートを５μg／mlの抗抗ＣＤ１９抗体またはアイソタイプ対照で２時間被覆し、ブロッキング緩衝液(５％血清含有ＤＰＢＳ)で１時間ブロックした。ＲＡＤ００１含有または不含遺伝子導入細胞を再懸濁し、標的プレートに１００μl／ウェルで添加し、１８時間インキュベートした。Luciferase One Glo試薬１００μlをウェルあたり添加した。サンプルを５分、３７℃でインキュベートし、発光をEnvisionプレートリーダーを使用して測定した。
【１７９２】
結果
図４３Ａおよび４３Ｂに示すように、ＲＡＤ００１の濃度の増加は、検出された発光により示されるように、両方の細胞外半スイッチのＮＦＡＴ活性の増加と相関した。用量依存的応答が両方のＲＣＡＲ半スイッチ構築物で得られた。半スイッチ２について、ＮＦＡＴ活性は１nM  ＲＡＤ００１用量でピークであり、ＮＦＡＴ活性は高ＲＡＤ００１投与量で減少した(５nMおよび５０nM)。観察される活性化の減少は、高投与量のＲＡＤ００１による一般的免疫抑制によるものであり得る。半スイッチ１について、高投与量のＲＡＤ００１、例えば、５nMおよび５０nMで活性阻害は観察されなかった。
【１７９３】
図４３Ｃおよび４３Ｄに示すように、ＲＡＤ００１の濃度の増加は、検出された発光により示されるように、両方の細胞外完全スイッチのＮＦＡＴ活性の増加とも相関した。ＲＣＡＲ完全スイッチの活性化パターンはＲＣＡＲ半スイッチ２のものと類似し(図４２Ｂ)、ここで、ＮＦＡＴ活性は１nM  ＲＡＤ００１用量でピークであり、高ＲＡＤ００１投与量、例えば、５nMおよび５０nMで減少した。
【１７９４】
これらのデータは、ＲＡＤ００１が、ＲＣＡＲ半スイッチおよび完全スイッチ構築物に存在する細胞外ＦＫＢＰ／ＦＲＢスイッチドメインの二量体化および標的依存的ＮＦＡＴ活性化を誘発することを示す。
【１７９５】
実施例２３：ＲＣＡＲ半スイッチの活性化
この実施例において、ＲＣＡＲ半スイッチの活性化を、二量体化分子ＲＡＤ００１の存在下評価した。２個のＲＣＡＲ構築物を試験し、ここで、二量体化スイッチは細胞内ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化スイッチであり、スイッチドメインは、抗原結合メンバーおよび細胞内メンバーに対して両方の配向に位置する。例えば、抗原結合メンバーはｓｃＦＶドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内スイッチドメインおよび細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含み、細胞内シグナル伝達メンバーは細胞外スイッチドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータを含む(図４４Ａ)。
【１７９６】
材料および方法
ＮＦＡＴ−ＬＵＣレポーターを有するJurkat細胞(ＪＮＬ)を、０.５μg／mlのピューロマイシンを含むJurkat細胞増殖培地で０.５×１０６／mlの密度まで増殖させた。各遺伝子導入について、２.５×１０６細胞を１００ｇで１０分遠沈した。２μgのＤＮＡ／構築物を遺伝子導入あたり使用した。Amaxa Nucleofector solution VおよびサプリメントＩを混合し、１００μlをＤＮＡ構築物とともにチューブに入れた。混合物を細胞に添加し、エレクトロポレーションキュベットに移した。エレクトロポレーションを、Amaxa Nucleofector II Deviceを使用して設定Ｘ−００１下に実施した。０.５mlの増殖培地を電気穿孔直後に添加し、混合物を、２ml  増殖培地中、６ウェルプレートの１ウェルに移した。
【１７９７】
１時間後、ＲＡＤ００１化合物を５０nMで送達し、その時点で異なる共刺激シグナル伝達ドメイン(図４４)または０nM、０.０１nM、０.０３nM、０.１nM、０.３nM、１nM、３nMおよび１０nM(図４５)の多様な濃度でＲＣＡＲを試験した。組織培養プレートを５μg／mlの抗抗ＣＤ１９抗体またはアイソタイプ対照で２時間被覆し、ブロッキング緩衝液(５％血清含有ＤＰＢＳ)で１時間ブロックした。ＲＡＤ００１を含むまたは含まない遺伝子導入細胞を再懸濁し、標的プレートに１００μl／ウェルで添加し、１８時間インキュベートした。Luciferase One Glo試薬１００μlをウェルあたり添加した。サンプルを５分、３７℃でインキュベートし、発光をEnvisionプレートリーダーを使用して測定する。
【１７９８】
結果
５個の異なるＲＣＡＲ半スイッチ構築物を、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０および４−１ＢＢの種々の共刺激シグナル伝達ドメインを用いて産生し、ＲＡＤ００１とインキュベーション後のＮＦＡＴ活性化を評価した。図４４Ｂに示すように、共刺激ドメインとしてＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０および４１ＢＢを、一次シグナル伝達ドメインとしてのＣＤ３ゼータと共に含むＲＣＡＲは、全て、ＲＡＤ００１添加後に、標的依存的ＮＦＡＴ活性を活性化できた。ＣＤ２８−ＣＤ３ゼータおよびＯＸ４０−ＣＤ３ゼータ二量体を有するＲＣＡＲは、他の共刺激シグナル伝達ドメイン−ＣＤ３ゼータ二量体(例えば、４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ、ＩＣＯＳ−ＣＤ３ゼータおよびＯＸ４０−ＣＤ３ゼータ)と比較して、最も頑強な活性化を有することが示された。
【１７９９】
ＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインのいずれかを含む２個のＲＣＡＲ半スイッチも、ＲＡＤ００１の用量増加に応答するＮＦＡＴ活性について評価した。図４５Ａおよび４５Ｂに示すように、両方の半スイッチは、一般に用量依存的ＮＦＡＴ活性を示し、ここで、ＲＡＤ００１濃度増加は発光またはＮＦＡＴ活性増加と相関した。両方の半スイッチについて、ＮＦＡＴ活性は１nM  ＲＡＤ００１濃度でピークであり、ＮＦＡＴ活性は高ＲＡＤ００１濃度(例えば、３nMおよび１０nM)で減少した。
【１８００】
これらの結果は、ＲＡＤ００１が、種々の異なる共刺激シグナル伝達ドメインを有するＲＣＡＲ半スイッチの二量体化および標的依存的ＮＦＡＴ活性化を誘発することを示す。
【１８０１】
実施例２４：半スイッチ構築物の分析
半スイッチテクノロジーの実現可能性を評価するために、レンチウイルスを全半スイッチ構築物について産生し、Ｔ細胞を形質導入した。試験した構築物は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを使用して１ベクターから共発現される、２遺伝子からなる。遺伝子は２個のタンパク質をコードし、これは、ａ)ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインおよびＦＫＢＰヘテロ二量体化ドメインに融合した抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖおよびｂ)ＣＤ３ｚ細胞質ドメインに融合したＦＲＢヘテロ二量体化であった。試験した共刺激シグナル伝達ドメインは４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０であった。半スイッチを、４１ＢＢ完全スイッチＣＡＲおよび非調節可能４１ＢＢ  ＣＡＲと比較した。全てのＣＡＲ形質導入Ｔ細胞(ＣＡＲＴ)を、エフェクターＴ細胞応答、すなわち標的細胞死滅および標的細胞誘発増殖およびサイトカイン産生について試験した。
【１８０２】
材料および方法
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞(ＣＡＲＴ)の産生
ＣＡＲレンチウイルストランスファーベクターを使用して、ＶＳＶｇ偽型レンチウイルス粒子に包装されたゲノム物質に導入する。レンチウイルストランスファーベクターＤＮＡを、リポフェクタミン試薬と組み合わせたＶＳＶｇ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｒｅｖの３個のパッケージング成分と混合し、これらをレンチ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞に遺伝子導入する。２４時間後およびさらに２４時間後培地を交換し、培地を回収し、濾過し、−８０℃で保存する。ＣＡＲＴを、健常ドナー血液の陰性磁性選択により得られた新鮮または凍結ナイーブＴ細胞の形質導入により産生する。Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズと２４時間インキュベーションすることにより活性化し、その後１mLのウイルス上清または濃縮ウイルス(ｍｏｉ＝１０)を培養に添加する。これらの修飾Ｔ細胞を約１０日増殖させる。形質導入(細胞表面上にＣＡＲを発現)細胞のパーセンテージおよびＣＡＲ発現レベル(相対的光強度、Geo Mean)を、７〜９日にフローサイトメトリー分析で決定する。遅い増殖速度と、約３００flに近づくＴ細胞サイズの組み合わせにより、Ｔ細胞の状態が、その後の解析のために凍結保存すべきであると決定する。
【１８０３】
ＣＡＲＴの細胞溶解性活性、増殖およびサイトカイン分泌分析
ＣＡＲＴの機能性を評価するために、Ｔ細胞を解凍し、計数し、Cellometerにより生存能を評価する。各培養におけるＣＡＲ陽性細胞数を、非形質導入Ｔ細胞に対して標準化する。調節可能ＣＡＲＴの導入を、５０nMから開始するＲＡＤ００１のタイトレーションにより試験した。全ての共培養実験で使用した標的細胞株は、ＣＤ１９を発現し、ルシフェラーゼを発現するように形質導入したＮａｌｍ−６、ヒト前Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)細胞株である。ルシフェラーゼを発現するヒト神経膠芽腫株Ｕ８７ＭＧは陰性対照として役立つ。
【１８０４】
ＣＡＲＴの細胞溶解性活性を、エフェクター：標的比４：１で測定し、ここで、エフェクターは全Ｔ細胞と定義され、それぞれ陽性または陰性癌株を標的とする。共培養２０時間後、培養を溶解し、ルシフェラーゼの基質(BrightGlo)を添加して、生存標的細胞を定量する。プレートをルミノメーター(EnVisionで読み、特異的溶解(％)をｌｕｍ(サンプル)／ｌｕｍ(ｍａｘ)＊１００として計算する。
【１８０５】
ＣＡＲＴによるサイトカイン産生を測定するために、Ｔ細胞を標的細胞と１：１比で培養する。さらに、ＰＭＡ／イオノマイシンを使用して、ＣＡＲＴ集団の最大分泌の評価に使用し、およびＣＡＲ  Ｔ細胞単独は基底活性の読み取りを提供する。アッセイを２４時間実施し、その時点で培地をヒトサイトカイン検出用ＣＢＡキットを使用するサイトカイン分析のために除去し、ＩＦＮγ、ＩＬ２およびＴＮＦαの量を測定した。
【１８０６】
ＣＡＲＴの増殖を測定するために、Ｔ細胞を標的細胞と１：１比で培養する。アッセイを４日行い、その時点で細胞をＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＡＲ発現について染色する。Ｔ細胞数を、対象としてカウントビーズを使用するフローサイトメトリーにより評価する。
【１８０７】
結果
この実験に使用した体部分のＣＡＲが極めて類似した表面発現を示し、標準ｈｕＣＡＲＴ１９、４１ＢＢ完全スイッチならびにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＩＣＯＳ半スイッチは十分に発現し、ＣＡＲ＋集団パーセントおよび細胞あたりのＣＡＲ分子数(GeoMean)に関して同等である。４１ＢＢ半スイッチのみが、細胞あたり基準では発現が低かったが、ＣＡＲ陽性細胞の集団は、他のＣＡＲＴと類似する(図４６)。
【１８０８】
これらのＣＡＲが、種々の濃度のＲＡＤ００１の存在下、ＣＤ１９陽性標的細胞(Ｎａｌｍ６−Ｌｕｃ)を殺す能力を、２０時間アッセイで試験した。ほぼ１００％死滅が、非誘導性ｈｕＣＡＲＴ１９で見られ、非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)はバックグラウンド死滅を示した(図４７)。４１ＢＢ完全スイッチＣＡＲＴは、ＲＡＤ濃度が増加するに連れて死滅の誘導を示し、０.４nM  ＲＡＤ００１で最高であり、高濃度で死滅は減少する。ＣＤ２８、ＣＤ２７およびＯＸ４０半スイッチＣＡＲＴは死滅の増加を示し、最高濃度のＲＡＤ００１で最大である。これらの半スイッチで見られる最大死滅は、完全スイッチで水落得るより高かった。４１ＢＢおよびＩＣＯＳ半スイッチＣＡＲＴは、それぞれ、中程度および低レベルの非誘導性死滅を示した。
【１８０９】
ＣＡＲＴ細胞の増殖能を４日共培養アッセイで試験した。ＣＡＲ陽性ＣＤ３陽性Ｔ細胞数を、Ｎａｌｍ６と種々に形質導入したＴ細胞の培養後評価した(図４８)。ｈｕＣＡＲＴ１９細胞は、０.０１６nM未満のＲＡＤ００１と培養したとき、劇的に増加し、高濃度の該化合物では少ない程度に増加した。半スイッチ４１ＢＢ、ＯＸ４０およびＣＤ２７は同等に、低いレベルで増殖し、０.０１６nM  ＲＡＤ００１で最大を示した。ＩＣＯＳおよびＣＤ２８半スイッチおよび４１ＢＢ完全スイッチは検出可能な増殖を示さなかった。
【１８１０】
調節可能ＣＡＲＴがサイトカインを産生する能力を類似のアッセイで試験し、ここで、ＣＡＲＴ細胞を、Ｎａｌｍ６細胞と１：１で２０時間共培養した。上清を回収し、ＩＦＮγ濃度を測定した。また、我々は、高ＲＡＤ００１レベルでｈｕＣＡＲＴ１９による最強の機能および阻害を見た(図４９)。スイッチＣＡＲＴの中で、唯一ＣＤ２８半スイッチが、分泌型ＩＦＮの明確な増加を示した。最高誘導は、ＲＡＤ００１の最高レベルで見られた。
【１８１１】
実施例２５：ハロ／ｓｎａｐタグによる共有結合性二量体化スイッチ
この実施例において、共有結合性二量体化スイッチによるＲＣＡＲの活性化を、二量体化分子ＮＶＰ−ＨＡＬ４２１の添加後評価した。共有結合性二量体化スイッチを有するＲＣＡＲ構築物の例は図１３に示す。
【１８１２】
材料および方法
ＮＦＡＴ−ＬＵＣレポーターを有するJurkat細胞(ＪＮＬ)を、０.５μg／mlのピューロマイシンを含むJurkat細胞増殖培地で０.５×１０６／mlの密度まで増殖させた。各遺伝子導入について、２.５×１０６細胞を１００ｇで１０分遠沈した。２μgのＤＮＡ／構築物を遺伝子導入あたり使用した。Amaxa Nucleofector solution VおよびサプリメントＩを混合し、１００μlをＤＮＡ構築物とともにチューブに入れた。混合物を細胞に添加し、エレクトロポレーションキュベットに移した。エレクトロポレーションを、Amaxa Nucleofector II Deviceを使用して設定Ｘ−００１下に実施した。０.５mlの増殖培地をエレクトロポレーションの直後に添加し、混合物を、２ml  増殖培地中、６ウェルプレートの１ウェルに移した。
【１８１３】
１時間後、ＮＶＰ−ＨＡＬ４２１を多様な濃度、例えば、０nM、５０nM、５００nMおよび５μM；または０nM、０.０６nM、０.２nM、０.６nM、２nM、６nM、２０nMおよび６０nMで適用した。組織培養プレートを５μg／mlのＥＧＦＲＶIII−ＦｃまたはＩｇＧ１  Ｆｃ対照で２時間被覆し、ブロッキング緩衝液(５％血清含有ＤＰＢＳ)で１時間ブロックした。遺伝子導入細胞を再懸濁し、標的プレートに１００μl／ウェルで添加し、１８時間インキュベートした。Luciferase One Glo試薬１００μlをウェルあたり添加した。サンプルを５分、３７℃でインキュベートし、発光をEnvisionプレートリーダーを使用して測定する。
【１８１４】
結果
スイッチドメインとしてハロタグおよびｓｎａｐタグを有するＲＣＡＲの概念を図１３に記載する。ＪＮＬ細胞を、ハロタグおよびｓｎａｐタグスイッチドメインを含むＲＣＡＲ構築物と共遺伝子導入した。５０nMでのＮＶＰ−ＨＡＬ４２１添加は、図５０に示すように、ハロタグとｓｎａｐタグスイッチドメインの共有結合結合を生じ、これは、次に、ＮＦＡＴ活性化をもたらす。ＮＦＡＴ活性のレベルは５０nMのＮＶＰ−ＨＡＬ４２１でピークであり、ＮＦＡＴ活性化は、５０nMでの活性と比較して、高濃度のＮＶＰ−ＨＡＬ４２１(５００nMおよび５μM)で減少しが。この標的特異的活性化の減少は、化合物の毒性によるものであろう。
【１８１５】
二回目のアッセイを実施して、０nM〜６０nMの種々の投与量のＮＶＰ−ＨＡＬ４２１についてＮＦＡＴ活性を評価した。図５１に示すように、ＮＦＡＴ活性は、二量体化分子ＮＶＰ−ＨＡＬ４２１の投与量が増加するに連れて増加し、最高レベルのＮＦＡＴ活性は、試験した最高投与量、６０nMで観察された。
【１８１６】
均等物
ここに引用した各および全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、その全体を引用により本明細書に包含させる。本発明を特定の面を引用して開示しているが、本発明の他の面およびバリエーションが、他の当業者により、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく考案され得る。添付する特許請求の範囲は、全てのこのような面および同等のバリエーションを含むと解釈されることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【配列表】
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