(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃａｓ９酵素をコードし且つ細胞のゲノムに組み込まれた核酸を含むように遺伝的に改変された細胞内で、標的ＤＮＡを改変する方法であって、前記方法は、
（ａ）ガイドＲＮＡを、前記Ｃａｓ９酵素を含む前記細胞に導入すること；ここで前記ガイドＲＮＡは前記標的ＤＮＡに相補的であり、前記Ｃａｓ９酵素は前記ガイドＲＮＡと共に前記標的ＤＮＡに対する共局在複合体を形成する、
（ｂ）ドナー核酸配列を前記細胞に導入すること；ここで、前記ガイドＲＮＡおよび前記Ｃａｓ９酵素が前記標的ＤＮＡに共局在し、前記Ｃａｓ９酵素が前記標的ＤＮＡを切断し、前記ドナー核酸配列が前記標的ＤＮＡに挿入されて前記細胞内で改変ＤＮＡを産生する（ただし、該改変が人体内で行われる場合を除く）、および
ステップ（ａ）及びステップ（ｂ）を人為的に繰り返して、前記細胞内に複数の外来性核酸挿入を生じさせること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ガイドＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ＤＮＡがゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ドナー核酸配列が相同組換えにより挿入される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ドナー核酸配列が非相同末端結合により挿入される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｃａｓ９酵素または前記ガイドＲＮＡが、前記細胞によって発現される外来性核酸として前記細胞に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
複数のドナー核酸および複数のガイドＲＮＡを導入して、前記細胞内で前記標的ＤＮＡに複数の改変を生じさせることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞内で改変ＤＮＡを作製した後に、前記Ｃａｓ９酵素をコードする前記核酸が、前記細胞のゲノムから除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ガイドＲＮＡが、前記細胞の周囲の培地から前記細胞内へと導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ガイドＲＮＡが５’キャップ構造を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ガイドＲＮＡがホスフェート基を欠く、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ガイドＲＮＡが前記細胞の周囲の培地から前記細胞に連続的に供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞は、前記Ｃａｓ９酵素をコードする核酸を含み且つ酵素により除去可能なベクターまたはカセットを前記細胞のゲノムＤＮＡに挿入することにより、遺伝的に改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベクターがＰｉｇｇｙｂａｃベクターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｃａｓ９酵素をコードする前記核酸が、酵素を用いて除去される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｃａｓ９酵素をコードする前記核酸を含み且つ前記酵素により除去可能なベクターまたはカセットは、酵素を用いて除去される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｃａｓ９酵素をコードする前記核酸を含み且つ前記酵素により除去可能なベクターまたはカセットは、酵素を用いて挿入される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｃａｓ９酵素をコードする前記核酸を含み且つ前記酵素により除去可能なベクターまたはカセットは、トランスポゼースを用いて除去される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｃａｓ９酵素をコードする前記核酸は誘導可能である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｃａｓ９酵素をコードする前記核酸は、ドキシサイクリン誘導性プロモータの影響下にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｃａｓ９酵素をコードする前記核酸は、ドキシサイクリンを用いて誘導可能である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞は幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のデータ
本願は２０１３年７月２６日に出願された米国仮特許出願番号第６１／８５８８６６号の優先権を主張するものであり、全ての目的のためにここにその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
政府権益の説明
本発明は米国国立ヒトゲノム研究所ゲノム科学中核研究拠点の助成金番号Ｐ５０  ＨＧ００３１７０の国庫補助により行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
配列特異的ヌクレアーゼを介したゲノム編集が知られている。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献１、２、および３を参照されたい。ゲノム中のヌクレアーゼ介在性二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断は２つの主要な機構、すなわち、非特異的な挿入や欠失（インデル）が導入されることが多い非相同末端結合（Ｎｏｎ−Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｅｎｄ  Ｊｏｉｎｉｎｇ：ＮＨＥＪ）または修復鋳型として相同鎖を取り入れる相同性修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ：ＨＤＲ）によって修復され得る。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献４を参照されたい。配列特異的ヌクレアーゼが所望の変異を含む相同ドナーＤＮＡコンストラクトと共に送達されると、ドナーコンストラクト単独の場合と比べて、遺伝子ターゲティング効率が１０００倍上昇する。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献５を参照されたい。ＤＮＡドナーとして一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド（「ｓｓＯＤＮ」）を使用することが報告されている。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献２１および２２を参照されたい。
【０００４】
遺伝子編集ツールにおける大きな進歩にもかかわらず、カスタム設計されたヌクレアーゼをヒト人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞：「ｈｉＰＳＣ」）エンジニアリングにおいて使用することに関しては多くの課題と疑問が残っている。第一に、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、そのデザインが単純であるにもかかわらず、反復可変性二残基（ＲＶＤ）ドメインのタンデムコピーによって特定のＤＮＡ配列を標的とする。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献６を参照されたい。ＲＶＤのモジュール性がＴＡＬＥＮのデザインを単純にする一方で、ＲＶＤの反復配列はそのＤＮＡコンストラクトの合成方法を複雑にしており（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献２、９、および１５〜１９を参照されたい）、また、それをレンチウイルス遺伝子送達ビヒクルと共に使用することを妨げている。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献１３を参照されたい。
【０００５】
現在の実務では、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）と相同性修復（ＨＤＲ）は別々のアッセイを用いて評価されることが多い。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を評価するためにはミスマッチ感受性エンドヌクレアーゼアッセイ（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献１４を参照されたい）が多くの場合に使用されているが、この方法の定量的精度はばらつき得るもので、感度は約３％を超える非相同末端結合（ＮＨＥＪ）頻度に限定される。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献１５を参照されたい。相同性修復（ＨＤＲ）は、完全に異なっておりかつ多くの場合に面倒な手法であるクローニングおよびシークエンシングによって評価されることが多い。Ｕ２ＯＳおよびＫ５６２のような幾つかの細胞種について５０％程度の高い編集頻度がしばしば報告されているが（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献１２および１４を参照されたい）、ヒトｉＰＳ細胞では頻度が概してそれより低いので、感度が依然として問題である。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献１０を参照されたい。最近、ヒトｉＰＳ細胞およびヒトＥＳ細胞において、ＴＡＬＥＮを使用して高い編集頻度が報告されており（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献９を参照されたい）、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９−ｇＲＮＡシステムを使用してさらに高い頻度が報告されている（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献１６〜１９を参照されたい）。しかしながら、異なる部位における編集率は大幅にばらつくようであり（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献１７を参照されたい）、幾つかの部位では編集を全く検出できないこともある（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献２０を参照されたい）。
【０００６】
細菌および古細菌のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質と複合体になっている短鎖ガイドＲＮＡに依存して侵入性外来核酸内に存在する相補配列を分解する。Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ，  Ｅ．ら著、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｆａｃｔｏｒ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ．  Ｎａｔｕｒｅ誌、第４７１巻、６０２〜６０７頁（２０１１年）；  Ｇａｓｉｕｎａｓ，  Ｇ．，  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，  Ｒ．，  Ｈｏｒｖａｔｈ，  Ｐ．およびＳｉｋｓｎｙｓ，  Ｖ．著、Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｆｏｒ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ誌、第１０９巻、Ｅ２５７９〜２５８６頁（２０１２年）；  Ｊｉｎｅｋ，  Ｍ．ら著、Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３３７巻、８１６〜８２１頁（２０１２年）；  Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ，  Ｒ．ら著、Ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ誌、第３９巻、９２７５〜９２８２頁、（２０１１年）；およびＢｈａｙａ，  Ｄ．，  Ｄａｖｉｓｏｎ，  Ｍ．およびＢａｒｒａｎｇｏｕ，  Ｒ．著、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ａｒｃｈａｅａ：  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．  Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ誌、第４５巻、２７３〜２９７頁（２０１１年）を参照されたい。最近の化膿レンサ球菌（Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのインビトロ再構成により、通常はトランスにコードされているｔｒａｃｒＲＮＡ（「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」）に融合したｃｒＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」）は、Ｃａｓ９タンパク質に前記ｃｒＲＮＡに一致する標的ＤＮＡ配列を配列特異的に切断させるのに充分であることが示された。標的部位に相同であるｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）の発現によってＣａｓ９の動員およびその標的ＤＮＡの分解が起こる。Ｈ．  Ｄｅｖｅａｕら著、Ｐｈａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＣＲＩＳＰＲ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ誌、第１９０巻、１３９０頁（２００８年２月）を参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示のいくつかの態様は、細胞（体細胞または幹細胞など）を遺伝的に改変するために改変型転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用することに関する。ＴＡＬＥＮは反復配列を含むことが知られている。本開示のいくつかの態様は、反復配列を１００ｂｐ以上欠くＴＡＬＥＮを細胞に導入することを含む、細胞内で標的ＤＮＡを改変する方法に関し、ここで前記ＴＡＬＥＮは標的ＤＮＡを切断し、前記細胞で非相同末端結合が起こり、前記細胞内に改変ＤＮＡを産生する。ある態様によると、所望の長さの反復配列がＴＡＬＥＮから取り除かれている。ある態様によると、ＴＡＬＥＮはある所望の長さの反復配列を欠いている。ある態様によると、所望の長さの反復配列が取り除かれたＴＡＬＥＮが提供される。ある態様によると、所望の長さの反復配列を取り除くためにＴＡＬＥＮを改変する。ある態様によると、ＴＡＬＥＮは所望の長さの反復配列を除くように設計される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示のいくつかの態様は、細胞内で反復配列を１００ｂｐ以上欠くＴＡＬＥＮとドナー核酸配列とを組み合わせることを含む、細胞内で標的ＤＮＡを改変する方法を含み、ここで前記ＴＡＬＥＮは標的ＤＮＡを切断し、前記ドナー核酸配列は前記細胞内で当該ＤＮＡに挿入される。本開示のいくつかの態様は反復配列を１００ｂｐ以上欠くＴＡＬＥＮをコードする核酸配列を含むウイルスに関する。本開示のいくつかの態様は反復配列を１００ｂｐ以上欠くＴＡＬＥＮをコードする核酸配列を含む細胞に関する。本明細書に記載されるある態様によると、前記ＴＡＬＥＮは反復配列を１００ｂｐ以上、９０ｂｐ以上、８０ｂｐ以上、７０ｂｐ以上、６０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、４０ｂｐ以上、３０ｂｐ以上、２０ｂｐ以上、１９ｂｐ以上、１８ｂｐ以上、１７ｂｐ以上、１６ｂｐ以上、１５ｂｐ以上、１４ｂｐ以上、１３ｂｐ以上、１２ｂｐ以上、１１ｂｐ以上、または１０ｂｐ以上欠いている。
【０００９】
本開示のいくつかの態様は、エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、エクソヌクレアーゼ、反復可変性二残基ドメインをコードする複数の核酸ダイマーブロック、およびエンドヌクレアーゼ切断部位を含むＴＡＬＥ−Ｎ／ＴＦバックボーンベクターを組み合わせること、前記エンドヌクレアーゼを活性化して前記エンドヌクレアーゼ切断部位において前記ＴＡＬＥ−Ｎ／ＴＦバックボーンベクターを切断することにより第１末端および第２末端を作製すること、前記エクソヌクレアーゼを活性化して前記ＴＡＬＥ−Ｎ／ＴＦバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックに３’オーバーハングおよび５’オーバーハングを生じさせて前記ＴＡＬＥ−Ｎ／ＴＦバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックを所望の順序でアニールすること、前記ＤＮＡポリメラーゼおよび前記ＤＮＡリガーゼを活性化して前記ＴＡＬＥ−Ｎ／ＴＦバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックを連結すること、を含む、ＴＡＬＥの作製に関する。当業者は本開示に基づいて適切なエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、エクソヌクレアーゼ、反復可変性二残基ドメインをコードする核酸ダイマーブロック、およびＴＡＬＥ−Ｎ／ＴＦバックボーンベクターを容易に特定することができるであろう。
【００１０】
本開示のいくつかの態様は、標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断する酵素、を発現する、幹細胞内で標的ＤＮＡを改変する方法に関し、該方法は、（ａ）標的ＤＮＡに相補的であり前記酵素を標的ＤＮＡまで誘導（ｇｕｉｄｅ）するＲＮＡ、をコードする第１外来性核酸を、幹細胞に導入すること−ここで、前記ＲＮＡおよび前記酵素は前記標的ＤＮＡに対する共局在複合体のメンバーである；ドナー核酸配列をコードする第２外来性核酸を前記幹細胞に導入すること−ここで、前記ＲＮＡおよび前記ドナー核酸配列が発現し、前記ＲＮＡおよび前記酵素が前記標的ＤＮＡに共局在し、前記酵素が前記標的ＤＮＡを切断し、前記ドナー核酸が前記標的ＤＮＡに挿入されて、前記幹細胞内で改変ＤＮＡを産生する、を含む。
【００１１】
本開示のいくつかの態様は、標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断する酵素、をコードする第１外来性核酸、を含む幹細胞に関する。
【００１２】
本開示のいくつかの態様は、標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断する酵素、をコードする第１外来性核酸を含み、且つ、前記酵素の発現を促進するための誘導性プロモーターを含む、細胞に関する。このようにして発現を制御することができ、例えば、発現を開始することができ、発現を停止させることができる。
【００１３】
本開示のいくつかの態様は、標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断する酵素、をコードする第１外来性核酸、を含む細胞であって、ここで、前記第１外来性核酸は、トランスポゼース（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）などの除去酵素を使用して、前記細胞のゲノムＤＮＡから除去可能である、前記細胞に関する。
【００１４】
本開示のいくつかの態様は、標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断する酵素、を発現する細胞内で、前記標的ＤＮＡを改変する方法に関し、該方法は、（ａ）ドナー核酸配列をコードする第１外来性核酸を前記細胞に導入すること、前記標的ＤＮＡに相補的であり前記酵素を前記標的ＤＮＡまで誘導（ｇｕｉｄｅ）するＲＮＡを前記細胞の周囲の媒体から前記細胞に導入すること、を含み、ここで、前記ＲＮＡおよび前記酵素は前記標的ＤＮＡに対する共局在複合体のメンバーであり、前記ドナー核酸配列が発現し、前記ＲＮＡおよび前記酵素が前記標的ＤＮＡに共局在し、前記酵素が前記標的ＤＮＡを切断し、前記ドナー核酸が前記標的ＤＮＡに挿入されて、前記細胞内で改変ＤＮＡを産生する。
【００１５】
本開示のいくつかの態様は幹細胞を遺伝的に改変するためのＲＮＡ誘導型（ＲＮＡ  ｇｕｉｄｅｄ）ＤＮＡ結合タンパク質の使用に関する。１つの態様において、前記幹細胞は前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を含むように遺伝的に改変されており、前記幹細胞は前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質を発現する。ある態様によると、特定の変異を導入するためのドナー核酸は、前記改変型ＴＡＬＥＮあるいは前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質を使用するゲノム編集について最適化される。
【００１６】
本開示のいくつかの態様は、幹細胞によって発現されるヌクレアーゼ活性を有する酵素（例えばヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ結合タンパク質）をＤＮＡ（デオキシリボ核酸）上の標的部位に誘導（ｇｕｉｄｅ）する１種類以上のガイドＲＮＡ（リボ核酸）を使用する、前記幹細胞におけるＤＮＡの改変（例えばＤＮＡの多重改変）に関し、ここで、前記酵素が前記ＤＮＡを切断し、外来性ドナー核酸が例えば相同組換えにより前記ＤＮＡに挿入される。本開示のいくつかの態様は、幹細胞においてＤＮＡ改変の工程を循環（ｃｙｃｌｅ）させて、または繰り返して、細胞内にＤＮＡの多重改変を有する幹細胞を作製することを含む。改変は外来性ドナー核酸の挿入を含んでいてもよい。
【００１７】
複数のＲＮＡおよび複数の外来性ドナー核酸をコードする核酸を、前記酵素を発現する幹細胞に、一回の工程によって導入（例えば共形質転換によって導入）することで、複数の外来性核酸の挿入を達成することができる。ここでは、前記複数のＲＮＡが発現し、前記複数に含まれる各ＲＮＡが前記酵素を前記ＤＮＡの特定の部位に誘導（ｇｕｉｄｅ）し、前記酵素が前記ＤＮＡを切断し、そして前記複数の外来性核酸のうちの１つが前記切断部位において前記ＤＮＡに挿入される。この態様によると、前記細胞内における前記ＤＮＡの多数の変化または改変が一回のサイクルで作製される。
【００１８】
１種類以上のＲＮＡまたは複数のＲＮＡおよび１種類以上の外来性核酸または複数の外来性核酸をコードする１種類以上の核酸を、前記酵素を発現する前記幹細胞に導入する工程またはサイクルを繰り返すことによって、複数の外来性核酸の挿入を細胞内において達成することができる。ここでは、前記ＲＮＡが発現して前記酵素を前記ＤＮＡの特定の部位に誘導（ｇｕｉｄｅ）し、前記酵素が前記ＤＮＡを切断し、前記外来性核酸が前記切断部位において前記ＤＮＡに挿入される。その結果、幹細胞のＤＮＡ中に複数の改変または外来性ＤＮＡの複数の挿入を有する細胞が生じる。１つの態様によると、前記酵素を発現する前記幹細胞は、前記酵素を発現するように遺伝的に改変されており、例えば前記酵素をコードし前記幹細胞によって発現され得る核酸を前記細胞に導入することにより遺伝的に改変されている。これにより、本開示のいくつかの態様は、前記酵素を発現する幹細胞にＲＮＡを導入し、前記幹細胞に外来性ドナー核酸を導入し、前記ＲＮＡを発現し、前記ＲＮＡと前記酵素と前記ＤＮＡとの共局在複合体を形成し、前記酵素により前記ＤＮＡを酵素切断し、前記ＤＮＡに前記ドナー核酸を挿入する工程を循環させることを含む。上記工程を循環させるまたは繰り返すことにより、複数の座位における幹細胞の多重遺伝的改変が生じる。すなわち、複数の遺伝的改変を有する幹細胞が生じる。
【００１９】
ある態様によると、本開示の範疇のＤＮＡ結合タンパク質または酵素は、前記ガイドＲＮＡと複合体を形成するタンパク質であって、前記ガイドＲＮＡが前記複合体を二本鎖ＤＮＡ配列まで誘導（ｇｕｉｄｅ）し、前記複合体が前記ＤＮＡ配列に結合するタンパク質を含む。１つの態様によると、前記酵素はＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質、例えば、前記ＤＮＡに結合しＲＮＡによって誘導（ｇｕｉｄｅ）されるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質、であってもよい。１つの態様によると、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質はＣａｓ９タンパク質である。
【００２０】
本開示のこの態様を、前記ＲＮＡおよびＤＮＡ結合タンパク質の、二本鎖ＤＮＡへのまたは二本鎖ＤＮＡとの、共局在と呼ぶことができる。このように、ＤＮＡ結合タンパク質−ガイドＲＮＡ複合体を使用して、二本鎖ＤＮＡの複数の部位を切断して、外来性ドナーＤＮＡの複数の挿入などの複数の遺伝的改変を有する幹細胞を作製してもよい。
【００２１】
ある態様によると、標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断する酵素、を発現する幹細胞内で、前記標的ＤＮＡに複数の改変を行う方法が提供され、該方法は、（ａ）前記標的ＤＮＡに相補的であり前記酵素を前記標的ＤＮＡに誘導（ｇｕｉｄｅ）する１種類以上のＲＮＡをコードする第１外来性核酸を前記幹細胞に導入すること−ここで、前記１種類以上のＲＮＡおよび前記酵素は前記標的ＤＮＡに対する共局在複合体のメンバーである；１種類以上のドナー核酸配列をコードする第２外来性核酸を前記幹細胞に導入すること−ここで、前記１種類以上のＲＮＡおよび前記１種類以上のドナー核酸配列が発現し、前記１種類以上のＲＮＡおよび前記酵素が前記標的ＤＮＡに共局在し、前記酵素が前記標的ＤＮＡを切断し、前記ドナー核酸が前記標的ＤＮＡに挿入されて前記幹細胞内で改変ＤＮＡを産生する；および、工程（ａ）を複数回繰り返して前記幹細胞内で前記ＤＮＡに複数の改変を生じさせること、を含む。
【００２２】
１つの態様によると、前記ＲＮＡは約１０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチドの間である。１つの態様によると、前記ＲＮＡは約２０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの間である。
【００２３】
１つの態様によると、前記１種類以上のＲＮＡはガイドＲＮＡである。１つの態様によると、前記１種類以上のＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である。
【００２４】
１つの態様によると、前記ＤＮＡはゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである。
【００２５】
１つの態様によると、酵素を使用して容易に除去することができるベクターを使用して、ＤＮＡ結合性酵素をコードする核酸を可逆的に含むように細胞を遺伝的に改変することができる。有用なベクターおよび方法が当業者に知られており、それらにはレンチウイルス、アデノ関連ウイルス、ヌクレアーゼおよびインテグレース介在性標的挿入法、ならびにトランスポゾン介在性挿入法が含まれる。１つの態様によると、ＤＮＡ結合性酵素をコードする核酸、例えばカセットまたはベクターを使用して付加されたＤＮＡ結合性酵素をコードする核酸、は、その全体を除去することが出来る−例えば、ゲノムＤＮＡ中に、例えば前記核酸、カセット、またはベクターの一部を残すことなく、前記カセットおよびベクターと共にその全体を除去することができる。そのような除去は、前記ゲノムが前記核酸、カセット、またはベクターの付加前と同じであるので、当技術分野において「無痕性」（ｓｃａｒｌｅｓｓ）除去と呼ばれる。挿入および無痕性除去の１つの例示的実施形態はＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から市販されているＰｉｇｇｙＢａｃベクターである。
【００２６】
本発明の特定の実施形態のさらなる特徴および利点が下記の実施形態およびそれらの図面の説明において、ならびに特許請求の範囲から、さらに十分に明らかになる。
【００２７】
本実施形態の前述および他の特徴および利点は、添付図面と併せた下記の例示的実施形態の詳細な説明からさらに十分に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】図１は、ヒト体細胞および幹細胞におけるｒｅ−ＴＡＬＥＮの機能試験を示す図である。（ａ）ゲノムターゲティング効率を検査するための実験計画の模式的図示。終止コドンおよびＡＡＶＳ１座位に由来する６８ｂｐのゲノム断片の挿入により、ゲノムに組み込まれたＧＦＰコード配列が破壊されている（下）。ｔＧＦＰドナーとのヌクレアーゼ介在性相同組換えによるＧＦＰ配列の回復（上）により、ＦＡＣＳにより定量化可能なＧＦＰ陽性細胞が生じる。ｒｅ−ＴＡＬＥＮおよびＴＡＬＥＮは、ＡＡＶＳ１断片内の同一の配列を標的とする。
【図１Ｂ】（ｂ）ＦＡＣＳにより測定された、ｔＧＦＰドナーのみ、ｔＧＦＰドナーと組み合わせたＴＡＬＥＮ、およびｔＧＦＰドナーと組み合わせたｒｅ−ＴＡＬＥＮ、によって標的座位において誘導されたＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを示す棒グラフ（Ｎ＝３、エラーバー＝ＳＤ（標準偏差））。代表的なＦＡＣＳプロットが下に示されている。
【図１Ｃ】（ｃ）未改変ＡＡＶＳ１座位へのターゲティング戦略を示す模式的概観。スプライシングアクセプター（ＳＡ）−２Ａ（自己切断性ペプチド）、ピューロマイシン耐性遺伝子（ＰＵＲＯ）、およびＧＦＰを含むドナープラスミドが記載された（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献１０を参照のこと）。成功した編集事象を検出するために使用されたＰＣＲプライマーの位置が、青色の矢印として示されている。
【図１Ｄ】（ｄ）ＰＧＰ１  ヒトｉＰＳ細胞のターゲッティングに成功したクローンが２週間ピューロマイシン（０．５ｕｇ／ｍＬ）で選択された。３つの代表的なＧＦＰ陽性クローンの顕微鏡画像が示されている。多能性マーカーのＴＲＡ−１−６０についても細胞を染色した。スケールバー：２００μｍ。
【図１Ｅ】（ｅ）これらのモノクローナルＧＦＰ陽性ヒトｉＰＳ細胞クローンに対して行ったＰＣＲアッセイにより、ＡＡＶＳ１部位におけるドナーカセットの挿入の成功が示されたが（レーン１、２、３）、一方で無処理のヒトｉＰＳ細胞は挿入の成功の証拠は何も示していない（レーンＣ）。
【図１Ｆ】ヒト体細胞および幹細胞におけるｒｅ−ＴＡＬＥＮの機能試験を示す図である。
【図２Ａ】図２は、ｉＰＳ細胞内のＣＣＲ５に対する、ｒｅＴＡＬＥＮおよびＣａｓ９−ｇＲＮＡのゲノムターゲティング効率の比較を示す図である。（ａ）ゲノムエンジニアリング実験計画の模式的図示。ｒｅ−ＴＡＬＥＮペアまたはＣａｓ９−ｇＲＮＡのターゲティング部位において、ゲノムＤＮＡに対して２ｂｐのミスマッチを有する９０ｍｅｒの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが、ｒｅＴＡＬＥＮコンストラクトまたはＣａｓ９−ｇＲＮＡコンストラクトと共にＰＧＰ１  ヒトｉＰＳ細胞に送達された。それらのヌクレアーゼの切断部位は、図中に赤色の矢印で示されている。
【図２Ｂ】（ｂ）ｒｅ−ＴＡＬＥＮペア（ＣＣＲ５第３番）と一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド、またはＣａｓ９−ｇＲＮＡと一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドの、相同性修復（ＨＤＲ）効率および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率のディープシークエンシング分析。ゲノム編集評価システム（ＧＥＡＳ）により、ハイスループット配列データからヒトｉＰＳ細胞のゲノム中の変化を分析した。上）：一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドの中央に生じた２ｂｐの点変異（青色）を含むリードの割合から相同性修復（ＨＤＲ）を定量し、ゲノム中の特定位置それぞれにおける欠失（灰色）／挿入（赤色）の割合から非相同末端結合（ＮＨＥＪ）活性を定量した。ｒｅＴＡＬＥＮと一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドのグラフについて、ｒｅ−ＴＡＬＥＮペアの結合部位の外境界を示すために緑色の破線がプロットされており、該外境界は２つのｒｅ−ＴＡＬＥＮ結合部位の中央に対して−２６ｂｐおよび＋２６ｂｐの位置にある。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡと一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドのグラフについて、緑色の破線が、ｇＲＮＡターゲティング部位の外境界を示しており、該外境界はＰＡＭ配列に対して−２０ｂｐおよび−１ｂｐの位置にある。下）：上で示した処理を行い、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）集団全体から分析されたヒトｉＰＳ細胞における欠失／挿入サイズ分布。
【図２Ｃ】（ｃ）ＰＧＰ１  ヒトｉＰＳ細胞におけるＣＣＲ５を標的とするｒｅ−ＴＡＬＥＮおよびＣａｓ９−ｇＲＮＡのゲノム編集効率。上）：ＣＣＲ５中の標的とされたゲノム編集部位の模式的図示。下の青色の矢印によって、１５か所のターゲティング部位が図示されている。各部位について、一対のｒｅ−ＴＡＬＥＮと、ゲノムＤＮＡに対する２ｂｐのミスマッチを有するそれらの対応する一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーとを、細胞に共形質移入した。形質移入から６日後にゲノム編集効率をアッセイした。同様に、１５種類のＣａｓ９−ｇＲＮＡを、それらの対応する一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドと共に、個別にＰＧＰ１−ヒトｉＰＳ細胞に形質移入し、同じ１５か所の部位をターゲティングし、形質移入から６日後に効率を分析した。下）：ＰＧＰ１  ヒトｉＰＳ細胞における、ＣＣＲ５を標的とするｒｅ−ＴＡＬＥＮおよびＣａｓ９−ｇＲＮＡのゲノム編集効率。パネル１および２は、ｒｅＴＡＬＥＮが介在した非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率および相同性修復（ＨＤＲ）効率を示している。パネル３および４は、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡが介在した非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率および相同性修復（ＨＤＲ）効率を示している。ターゲティング領域に欠失または挿入を担持するゲノムアレルの頻度により、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）率を計算し、２ｂｐのミスマッチを有するゲノムアレルの頻度により、相同性修復（ＨＤＲ）率を計算した。パネル５、ＥＮＣＯＤＥデータベースからのヒトｉＰＳ細胞細胞株のＤＮａｓｅＩ  高感受性部位（ＨＳ）プロファイル（デュークＤＮａｓｅ  ＨＳ、ｉＰＳ  ＮＩＨｉ７  ＤＳ）。異なるパネルのスケールは異なっていることに留意されたい。  （ｆ）３つの標的とされたヒトｉＰＳ細胞コロニーに由来するＰＣＲアンプリコンのサンガーシークエンシングにより、ゲノム挿入境界に予想されたＤＮＡ塩基が存在することが確認された。Ｍ：ＤＮＡラダー。Ｃ：未処理ヒトｉＰＳ細胞ゲノムＤＮＡによる対照。
【図３Ａ】図３は、ＰＧＰ１  ヒトｉＰＳ細胞における、ｒｅ−ＴＡＬＥＮまたはＣａｓ９−ｇＲＮＡによる一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド介在性相同性修復（ＨＤＲ）を支配する機能パラメーターの試験を示す図である。（ａ）ｒｅ−ＴＡＬＥＮペア（第３番）および様々な長さの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド（５０ｎｔ、７０ｎｔ、９０ｎｔ、１１０ｎｔ、１３０ｎｔ、１５０ｎｔ、１７０ｎｔ）を、ＰＧＰ１  ヒトｉＰＳ細胞に共形質移入した。全ての一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドは、それらの配列の中央にゲノムＤＮＡに対する同一の２ｂｐのミスマッチを有していた。９０ｍｅｒの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドによって、標的とされたゲノムにおいて最適の相同性修復（ＨＤＲ）が達成された。相同性修復（ＨＤＲ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により招かれた欠失および挿入の効率の評価は、本明細書に記載される通りである。
【図３Ｂ】（ｂ）それぞれ中央に２ｂｐのミスマッチ（Ａ）およびＡからずれた異なる位置（それらのずれは−３０ｂｐから３０ｂｐまでばらつく）にある追加の２ｂｐのミスマッチ（Ｂ）を含む、ｒｅ−ＴＡＬＥＮペア第３番に対応する９０ｍｅｒの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを使用して、該一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドに沿った相同性からのずれの効果を検査した。ＰＧＰ１  ヒトｉＰＳ細胞において、各一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドのゲノム編集効率を評価した。下の棒グラフは、標的とされたゲノムにおける、Ａのみ、Ｂのみ、およびＡおよびＢの取り込み頻度を示している。中央からの相同性のずれの距離が広がるにつれて、相同性修復（ＨＤＲ）率が減少する。
【図３Ｃ】（ｃ）ｒｅ−ＴＡＬＥＮペア第３番の標的部位からの距離が様々である（−６２０ｂｐから４８０ｂｐ）部位を標的とする一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを試験して、変異を導入するために一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを中に配置することができる最大の距離を評価した。全ての一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドは、それらの配列の中央に２ｂｐのミスマッチを有していた。一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドのミスマッチがｒｅ−ＴＡＬＥＮペアの結合部位の中央から４０ｂｐ離れて位置するときに、最小の相同性修復（ＨＤＲ）効率（０．０６％以下）が観察された。
【図３Ｄ】（ｄ）Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ（ＡＡＶＳ１）と、方向が異なり（Ｏｃ：ｇＲＮＡに相補的；Ｏｎ：ｇＲＮＡと非相補的）、長さが様々（３０ｎｔ、５０ｎｔ、７０ｎｔ、９０ｎｔ、１１０ｎｔ）である一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドとを、ＰＧＰ１  ヒトｉＰＳ細胞に共形質移入した。全ての一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドは、それらの配列の中央に、ゲノムＤＮＡに対する同一の２ｂｐのミスマッチを有していた。７０ｍｅｒのＯｃによって、標的とされたゲノムにおける最適の相同性修復（ＨＤＲ）が達成された。
【図４Ａ】図４は、ｒｅ−ＴＡＬＥＮおよび一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを使用して、選択無しにモノクローナルゲノム編集されたヒトｉＰＳ細胞を獲得することを示す図である。（ａ）実験のタイムライン。
【図４Ｂ】（ｂ）図２ｂに記載されるＮＧＳ（次世代シークエンシング）プラットフォームにより評価される、ｒｅ−ＴＡＬＥＮペアおよび一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド（第３番）のゲノムエンジニアリング効率。
【図４Ｃ】（ｃ）ゲノム編集後のモノクローナルヒトｉＰＳ細胞コロニーのサンガーシークエンシングの結果。ＰＧＰ１−ｉＰＳ−３−１１コロニー、ＰＧＰ１−ｉＰＳ−３−１３コロニーのゲノムに、２ｂｐの不均一な遺伝型（ＣＴ／ＣＴ→ＴＡ／ＣＴ）が成功裏に導入された。
【図４Ｄ】（ｄ）標的とされたＰＧＰ１−ｉＰＳ−３−１１の免疫蛍光染色。多能性マーカーのＴｒａ−１−６０およびＳＳＥＡ４について細胞を染色した。
【図４Ｅ】（ｅ）モノクローナルＰＧＰ１−ｉＰＳ−３−１１細胞から生じたテラトーマ切片のヘマトキシリン・エオシン染色。
【図５Ａ】図５は、ｒｅＴＡＬＥのデザインを示す図である。（ａ）ｒｅ−ＴＡＬＥ−１６．５（ｒｅ−ＴＡＬＥ−Ｍ１→ｒｅ−ＴＡＬＥ−Ｍ１７）内のモノマーと元のＴＡＬＥ  ＲＶＤモノマーとの配列アラインメント。元の配列からのヌクレオチドの変化が灰色でハイライトされている。
【図５Ｂ】（ｂ）ＰＣＲによるｒｅ−ＴＡＬＥの反復度の検査。上のパネルはｒｅ−ＴＡＬＥ／ＴＡＬＥの構造およびＰＣＲ反応におけるプライマーの位置を示している。下のパネルは下に示されている条件によるＰＣＲバンドを示している。元のＴＡＬＥ鋳型（右のレーン）では、ＰＣＲラダーが現れている。
【図６Ａ】図６は、ＴＡＬＥ単回インキュベーションアセンブリー（ＴＡＳＡ）アセンブリーの設計および実施を示す図である。（ａ）ＴＡＳＡアセンブリー用ｒｅ−ＴＡＬＥダイマーブロックのライブラリーの模式的図示。２つのＲＶＤをコードするｒｅ−ＴＡＬＥダイマーブロック１０種類からなるライブラリーが存在する。それぞれのブロックにおける全１６ダイマーは、ＲＶＤコード配列以外では同じＤＮＡ配列を共有している。異なるブロックにおけるダイマーは異なる配列を有するが、隣接するブロックとは３２ｂｐの重複を有するように設計されている。ダイマーの一つ（ブロック６＿ＡＣ）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を右に示す。
【図６Ｂ】（ｂ）ＴＡＳＡアセンブリーの模式的図示。左のパネルはＴＡＳＡアセンブリー方法を示しており、１ポットインキュベーション反応が、酵素混合物／ｒｅ−ＴＡＬＥブロック／ｒｅ−ＴＡＬＥ−Ｎ／ＴＦバックボーンベクターを用いて行われる。反応産物は細菌の形質転換に直接使用することができる。右のパネルはＴＡＳＡの機序を示している。デスティネーションベクターをエンドヌクレアーゼにより３７℃で直線化してｃｃｄＢカウンターセレクションカセットを切り出し、各ブロックの末端および直線化したベクターの末端をプロセシングするエクソヌクレアーゼによって各断片の末端に一本鎖ＤＮＡオーバーハングを露出させ、ブロック群およびベクター骨格を指定された順序でアニールさせる。温度が５０℃まで上昇すると、ポリメラーゼとリガーゼが協同作用してギャップを埋め、これにより形質転換の準備が整った最終的なコンストラクトが作製される。
【図６Ｃ】（ｃ）異なるモノマー長を有するｒｅ−ＴＡＬＥのＴＡＳＡアセンブリー効率。アセンブリーに使用されたブロックが左に示されており、アセンブリー効率が右に示されている。
【図７Ａ】レンチ−ｒｅＴＡＬＥの機能性および配列完全性を示す図である。
【図７Ｂ】レンチ−ｒｅＴＡＬＥの機能性および配列完全性を示す図である。
【図７Ｃ】レンチ−ｒｅＴＡＬＥの機能性および配列完全性を示す図である。
【図７Ｄ】レンチ−ｒｅＴＡＬＥの機能性および配列完全性を示す図である。
【図８Ａ】図８は、ゲノム編集評価システム（ＧＥＡＳ）の感度および再現性を示す図である。（Ａ）相同性修復（ＨＤＲ）検出限界の情報ベース分析。所与のｒｅ−ＴＡＬＥＮ（第１０番）／一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドのデータセットにおいて、予想される編集（相同性修復（ＨＤＲ））を含むリードが特定され、これらの相同性修復（ＨＤＲ）リードを体系的に除去して「希釈された」編集シグナルを有する様々な人工的なデータセットを作成した。相同性修復（ＨＤＲ）リードを１００％、９９．８％、９９．９％、９８．９％、９７．８％、８９．２％、７８．４％、６４．９％、２１．６％、１０．８％、２．２％、１．１％、０．２％、０．１％、０．０２％、および０％除去したデータセットを作成して、０〜０．６７％の範囲の相同組換え（ＨＲ）効率を有する人工的データセットを作成した。それぞれ個々のデータセットについて、バックグラウンドシグナル（紫）およびターゲティング部位において得られたシグナル（緑）の相互情報量（ＭＩ）を評価した。相同性修復（ＨＤＲ）効率が０．００１４％を超えると、ターゲティング部位における相互情報量（ＭＩ）はバックグラウンドよりも顕著に高い。相同性修復（ＨＤＲ）検出の限界は、０．００１４％と０．００７１％との間と推定された。相互情報量（ＭＩ）の計算は、本明細書に記載されている。
【図８Ｂ】（Ｂ）ゲノム編集評価システムの再現性の検査。上に示されているｒｅ−ＴＡＬＥＮペアおよび細胞種を用いた２回の複製実験の相同性修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の評価の結果が、対をなすプロット（上と下）によって示されている。各実験について、ヌクレオフェクション、標的ゲノム増幅、ディープシークエンシングおよびデータ分析を独立して行った。複製実験のゲノム編集評価の分散は、√２（｜相同性修復（ＨＤＲ）１−ＨＤＲ２｜）／（ＨＤＲ＋ＨＤＲ２）／２）＝ΔＨＤＲ／ＨＤＲ、および√２（｜非相同末端結合（ＮＨＥＪ）１−ＮＨＥＪ２｜）／（（ＮＨＥＪ１＋ＮＨＥＪ２）／２）＝ΔＮＨＥＪ／ＮＨＥＪとして計算した。分散の結果を、プロットの下に示した。系の平均分散は（１９％＋１１％＋４％＋９％＋１０％＋３５％）／６＝１５％であった。該分散に寄与し得る因子には、ヌクレオフェクションにおける細胞の状態、ヌクレオフェクション効率、およびシークエンシングのカバー率および品質が含まれる。
【図９Ａ】図９は、ＣＣＲ５上でのｒｅＴＡＬＥＮおよびＣａｓ９−ｇＲＮＡによる非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率および相同性修復（ＨＤＲ）効率の統計分析を示す図である。（ａ）ｉＰＳ細胞中の同一の部位におけるｒｅＴＡＬＥＮが介在した相同組換え（ＨＲ）効率と非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率との相関（ｒ＝０．９１、Ｐ＜１×１０−５）。
【図９Ｂ】（ｂ）ｉＰＳ細胞中の同一の部位におけるＣａｓ９−ｇＲＮＡが介在した相同組換え（ＨＲ）効率と非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率との相関（ｒ＝０．７４、Ｐ＝０．００２）。
【図９Ｃ】（ｃ）Ｃａｓ９−ｇＲＮＡが介在した非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率とｉＰＳ細胞中のｇＲＮＡターゲティング部位のＴｍ温度との相関（ｒ＝０．５２、Ｐ＝０．０４）。
【図１０】ゲノム編集効率とエピジェネティック状態との相関分析を示す図である。ピアソン相関を用いてＤＮａｓｅＩ感受性とゲノムエンジニアリング効率（相同組換え（ＨＲ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ））との間の、存在しうる関係を分析した。観察された相関をランダム化セット（Ｎ＝１０００００）と比較した。シミュレートされた分布の９５％目よりも高い、または５％目よりも低い観察された相関を、存在しうる関係とみなした。ＤＮａｓｅ１感受性と非相同末端結合（ＮＨＥＪ）／相同組換え（ＨＲ）効率との間に顕著な相関は観察されなかった。
【図１１Ａ】図１１は、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド介在性ゲノム編集における相同性対合の影響を示す図である。  （ａ）図３ｂに記載される実験において、中央の２ｂミスマッチ（Ａ）が組み込まれる率によって測定される全体的相同性修復（ＨＤＲ）は、二次的なミスマッチＢのＡからの距離を増加させると（Ａに対するＢの相対的な位置は−３０ｂｐから３０ｂｐまで変化する）低下した。ＢがＡからたった１０ｂｐだけ離れている（−ｌ０ｂｐおよび＋１０ｂ）場合におけるより高率の組込みは、二本鎖ＤＮＡ切断に対して近位にあるゲノムＤＮＡに対しては一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが対合することの必要性がより低いことを反映したものでありうる。
【図１１Ｂ】（ｂ）一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドに沿った遺伝子変換長の分布。Ａから各距離にあるＢそれぞれにおいて、相同性修復（ＨＤＲ）事象のある割合はＡのみを組み込むものであり、別のある割合はＡとＢの両方を組み込むものである。これらの２つの事象は遺伝子変換トラクトの観点から説明可能であり得（Ｅｌｌｉｏｔｔら著、１９９８年）、これによればＡ＋Ｂ事象はＢを越えて延びる長い変換トラクトを表し、Ａのみの事象はＢに到達しないより短い変換トラクトを表す。この解釈の下で、前記オリゴに沿った両方の方向における遺伝子変換長の分布を評価することができる（一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドの中央を０と定義し、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端に向かう変換トラックを−方向と定義し、３’末端に向かう変換トラックを＋方向と定義する）。遺伝子変換トラクトの長さが増加するにつれて、当該遺伝子変換の発生率は徐々に減少する。これは、二本鎖ＤＮＡドナーについて見られる遺伝子変換トラクト分布と非常に類似する結果であるが、二本鎖ＤＮＡドナーの場合の数百塩基という距離スケールと比べると、一本鎖ＤＮＡオリゴの場合は数十ｂｐという非常に圧縮された距離スケールにおいてのことである。
【図１１Ｃ】（ｃ）一連の変異を含む単一の一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを使用し、連続的な組込みを測定する遺伝子変換トラクトのアッセイ。中央の２ｂｐミスマッチのどちらの側にも１０ｎｔの間隔で並んだ３対の２ｂｐミスマッチ（オレンジ）を有する一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナー（上）を使用した。この領域をシークエンシングする３００，０００を超えるリードのうち、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドによって規定される１以上のミスマッチを保持するゲノムシークエンシングリードは少数であった（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献６２を参照されたい）。これらのリードの全てをプロットし（下）、リードの配列をカラーコード化した。オレンジ：規定のミスマッチ；緑：野生型配列。この一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドによるゲノム編集により、中央の変異だけが組み込まれたものが場合数の８５％（５３／６２）であり、他の場合は複数のＢミスマッチが組み込まれた、パターンが生じた。Ｂが組込まれた事象の数は、１０ｂｐを超えるトラクト長の分布を推定するには少な過ぎるものであったが、−１０〜１０ｂｐの短いトラクト領域が優勢であることは明らかである。
【図１２】Ｃａｓ９−ｇＲＮＡヌクレアーゼおよびニッケースによるゲノム編集効率を示す図である。ＰＧＰ１  ｉＰＳ細胞に、ヌクレアーゼ（Ｃ２）（Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ）またはニッケース（Ｃｃ）（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ−ｇＲＮＡ）および方向が異なる一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯｃおよびＯｎ）の組合せを共形質移入した。全ての一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドは、その配列の中央に、ゲノムＤＮＡに対する同一の２ｂｐのミスマッチを有している。相同性修復（ＨＤＲ）の評価は、本明細書に記載される。
【図１３】ｒｅ−ＴＡＬＥ配列の設計および最適化を示す図である。幾つかのデザインサイクルでリピートを除去して、ｒｅ−ＴＡＬＥ配列を進化させた。各サイクルにおいて、各リピート由来の同義配列を評価する。進化中のＤＮＡに対するハミング距離が最大の配列を選択する。最終的な配列はｃａｉ＝０．５９、ΔＧ＝−９．８ｋｃａｌ／ｍｏｌを有する。合成タンパク質デザインのためのこの全般的なフレームワークを実施するために、Ｒパッケージが提供された。
【図１４】ＰＧＰ１細胞内におけるＣａｓ９のゲノム挿入のＰＣＲによる確認を示すゲル像である。ライン３、６、９、１２は通常の（ｐｌａｉｎ）ＰＧＰ１細胞株のＰＣＲ産物である。
【図１５】誘導下でのＣａｓ９  ｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルのグラフである。
【図１６】様々なＲＮＡデザインによるゲノムターゲティング効率を示すグラフである。
【図１７】ガイドＲＮＡ−ドナーＤＮＡ融合体によって達成された４４％の相同組換えのゲノムターゲティング効率を示すグラフである。
【図１８】本明細書に記載されるシステムによって作製された同質遺伝子系統ＰＧＰ１細胞株の遺伝子型を示すダイアグラムである。ＰＧＰ１−ｉＰＳ−ＢＴＨＨは、ＢＴＨＨ患者として単一ヌクレオチド欠失表現型を有する。ＰＧＰ１−ＮＨＥＪは、違った方法でフレームシフト変異を生じさせた４ｂｐの欠失を有する。
【図１９】同質遺伝子系統ＰＧＰ１  ｉＰＳに由来する心筋細胞が、患者特異的細胞において示されるのと同様のＡＴＰ産生欠陥およびＦ１Ｆ０  ＡＴＰａｓｅ特異的活性欠陥を再現したことを示すグラフである。
【図２０Ａ】ｒｅ−ＴＡＬＥＮおよびｒｅ−ＴＡＬＥ−ＴＦ（転写因子）バックボーンの配列を示す。
【図２０Ｂ】ｒｅ−ＴＡＬＥＮおよびｒｅ−ＴＡＬＥ−ＴＦバックボーンの配列を示す。
【図２０Ｃ】ｒｅ−ＴＡＬＥＮおよびｒｅ−ＴＡＬＥ−ＴＦバックボーンの配列を示す。
【図２０Ｄ】ｒｅ−ＴＡＬＥＮおよびｒｅ−ＴＡＬＥ−ＴＦバックボーンの配列を示す。
【図２０Ｅ】ｒｅ−ＴＡＬＥＮおよびｒｅ−ＴＡＬＥ−ＴＦバックボーンの配列を示す。
【図２０Ｆ】ｒｅ−ＴＡＬＥＮおよびｒｅ−ＴＡＬＥ−ＴＦバックボーンの配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明のいくつかの態様は、ある特定の反復配列を欠くＴＡＬＥＮの、核酸エンジニアリングのための使用に関し、該核酸エンジニアリングは、例えば二本鎖核酸を切断することによる。二本鎖核酸を切断するための前記ＴＡＬＥＮの使用により、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え（ＨＲ）が生じ得る。本開示のいくつかの態様は、ドナー核酸の存在下における、反復配列を欠くＴＡＬＥＮの核酸エンジニアリング、例えば二本鎖核酸を切断することによる核酸エンジニアリング、のための使用も想定しており、また、該ドナー核酸の該二本鎖核酸への挿入、例えば非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え（ＨＲ）による挿入も想定している。
【００３０】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は当技術分野において知られており、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することにより作製された人工制限酵素を含む。制限酵素はＤＮＡ鎖を特定の配列のところで切断する酵素である。所望のＤＮＡ配列に結合するように転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を改変することができる。ここでその全体が参照により取り込まれるＢｏｃｈ，  Ｊｅｎｓ著（２０１１年２月）「ＴＡＬＥｓ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ誌、第２９巻（第２号）：１３５〜６頁を参照されたい。そのような改変ＴＡＬＥを（ＤＮＡ鎖を切断する）ＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることにより、あらゆる所望のＤＮＡ配列に特異的な制限酵素であるＴＡＬＥＮが作製される。ある態様によると、ｉｎ  ｓｉｔｕでの標的核酸編集、例えばｉｎ  ｓｉｔｕでのゲノム編集、のために細胞に前記ＴＡＬＥＮを導入する。
【００３１】
１つの態様によると、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの末端に由来する非特異的ＤＮＡ切断ドメインを使用して酵母細胞、植物細胞、および動物細胞において活性が有るハイブリッドヌクレアーゼを構築することができる。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、それぞれ固有のＤＮＡ結合ドメインを有する２つのコンストラクトを必要とするが、該ＤＮＡ結合ドメインそれぞれは、適切な方向性および間隔を有する標的ゲノム中の部位それぞれに対するものである。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基数および２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基数の両方が活性に影響する。
【００３２】
ＴＡＬＥ結合ドメインのアミノ酸配列とＤＮＡ認識との間の関係により、タンパク質が設計可能である。ＤＮＡワークスなどのソフトウェアプログラムを使用してＴＡＬＥコンストラクトを設計することができる。ＴＡＬＥコンストラクトを設計する他の方法は当業者に知られている。その全体がここに参照により取り込まれる参考文献Ｃｅｒｍａｋ，  Ｔ．；  Ｄｏｙｌｅ，  Ｅ．Ｌ．；  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，  Ｍ．；  Ｗａｎｇ，  Ｌ．；  Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．；  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｃ；  Ｂａｉｌｅｒ，  Ｊ．Ａ．；  Ｓｏｍｉａ，  Ｎ．Ｖ．ら著、（２０１１年）「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｃｕｓｔｏｍ  ＴＡＬＥＮ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」、  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ誌．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ２１８；  Ｚｈａｎｇ，  Ｆｅｎｇら著、（２０１１年２月）「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」、  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ誌、第２９巻（第２号）：１４９〜５３頁；  Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ，  Ｒ．；  Ｅｌｓａｅｓｓｅｒ，  Ｊ．；  Ｈａｕｓｎｅｒ，  Ｊ．；  Ｌａｈａｙｅ，  Ｔ．著、（２０１１年）「Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｃｕｓｔｏｍ  ＴＡＬＥ−ｔｙｐｅ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ」、  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ誌．ｄｏｉ：１０’１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ１５１；  Ｌｉ，  Ｔ．；  Ｈｕａｎｇ，  Ｓ．；  Ｚｈａｏ，  Ｘ．；  Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｄ．Ａ．；  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，  Ｓ．；  Ｓｐａｌｄｉｎｇ，  Ｍ．Ｈ．；  Ｗｅｅｋｓ，  Ｄ．Ｐ．；  Ｙａｎｇ，  Ｂ．著、（２０１１年）「Ｍｏｄｕｌａｒｌｙ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ」、  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ誌．ｄｏｉ’’１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ１８８；  
【００３３】
【化１】
0006739335.tif 000002
【００３４】
Ｗｅｂｅｒ，  Ｅ．；  Ｇｒｕｅｔｚｎｅｒ，  Ｒ．；  Ｗｅｒｎｅｒ，  Ｓ．；  Ｅｎｇｌｅｒ，  Ｃ；  Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，  Ｓ．著、（２０１１年）「Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ＴＡＬ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｂｙ  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｂｅｎｄａｈｍａｎｅ，  Ｍｏｈａｍｍｅｄ内、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ誌、第６巻（第５号）：ｅ１９７２２を参照されたい。
【００３５】
例示的態様によると、前記ＴＡＬＥＮ遺伝子が作製されると、ある特定の実施形態によれば、ＴＡＬＥＮ遺伝子はプラスミドに挿入されてもよい；そして該プラスミドを用いて標的細胞に形質移入を行い、該標的細胞において遺伝子産物が発現して細胞核に入り、ゲノムに到達する。例示的態様によると、本明細書に記載されるＴＡＬＥＮは、二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導し、該二本鎖切断に対して細胞が修復機構により反応することにより、ゲノムなどの標的核酸を編集するのに使用することができる。例示的修復機構には、アニーリングのための配列の重複が非常にわずかまたは存在しない、二本鎖切断の両側のＤＮＡを再連結する非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が含まれる。この修復機構は挿入または欠失（インデル）によりゲノム中にエラーを誘導するか、または染色体再構成を誘導し、そのようなエラーにより当該箇所にコードされる遺伝子産物が機能的なものでなくなり得る。その全体がここに参照により取り込まれるＭｉｌｌｅｒ，  Ｊｅｆｆｒｅｙら著、（２０１１年２月）．「Ａ  ＴＡＬＥ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ」  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ誌、第２９巻（第２号）：１４３〜８頁を参照されたい。この活性は使用する種、細胞種、標的遺伝子、およびヌクレアーゼによってまちまちであり得るので、ＰＣＲにより増幅された２つのアレルの間のあらゆる差を検出するヘテロ二本鎖切断アッセイを用いることによって前記活性をモニターすることができる。単純なアガロースゲルまたはスラブゲルシステムで切断産物を可視化することができる。
【００３６】
あるいは、外来性二本鎖ＤＮＡ断片の存在下で、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によりゲノムにＤＮＡを導入することができる。相同組換え修復も、形質移入された二本鎖配列が修復酵素の鋳型として使用されると二本鎖切断（ＤＳＢ）のところで外来性ＤＮＡを導入することができる。ある態様によると、本明細書に記載されるＴＡＬＥＮを使用して安定的に改変されたヒト胚性幹細胞クローンおよび人工多能性幹細胞（ＩＰＳ細胞）クローンを作製することができる。ある態様によると、本明細書に記載されるＴＡＬＥＮを使用してエレガンス線虫（Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ）などのノックアウト種、ノックアウトラット、ノックアウトマウスまたはノックアウトゼブラフィッシュを作製することができる。
【００３７】
本開示の１つの態様によると、実施形態は、幹細胞内でＤＮＡに共局在し、ＤＮＡを消化もしくは切断して外来性ＤＮＡを挿入するための、外来性ＤＮＡ、ＤＮＡ結合タンパク質などのヌクレアーゼ酵素、およびガイドＲＮＡ、の使用に関する。様々な目的のためにＤＮＡに結合するそのようなＤＮＡ結合タンパク質は、当業者に容易に知られるであろう。そのようなＤＮＡ結合タンパク質は天然のものであってもよい。本開示の範囲内に含まれるＤＮＡ結合タンパク質には、本明細書においてガイドＲＮＡと呼ばれるＲＮＡによって誘導（ｇｕｉｄｅ）され得るものが含まれる。この態様によると、該ガイドＲＮＡと該ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質とは、ＤＮＡのところで共局在複合体を形成する。ヌクレアーゼ活性を有するそのようなＤＮＡ結合タンパク質が当業者に知られており、それらにはヌクレアーゼ活性を有する天然のＤＮＡ結合タンパク質、例えばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在する、Ｃａｓ９タンパク質などが含まれる。そのようなＣａｓ９タンパク質およびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは当技術分野において文献によく記載されている。その全体がここに参照により取り込まれる、全ての補足情報を含むＭａｋａｒｏｖａら著、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ誌、第９巻、２０１１年６月、４６７〜４７７頁を参照されたい。
【００３８】
ヌクレアーゼ活性を有する例示的ＤＮＡ結合タンパク質は、二本鎖ＤＮＡにニックを入れるように、または二本鎖ＤＮＡを切断するように機能する。そのようなヌクレアーゼ活性は、ヌクレアーゼ活性を示す１つ以上のポリペプチド配列を有するＤＮＡ結合タンパク質から生じ得る。そのような例示的ＤＮＡ結合タンパク質は、二本鎖ＤＮＡの特定の鎖の切断またはニック形成をそれぞれ担っている、２つの別々のヌクレアーゼドメインを有し得る。当業者に知られているヌクレアーゼ活性を有する例示的ポリペプチド配列には、ＭｃｒＡ−ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメインおよびＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインが含まれる。したがって、例示的ＤＮＡ結合タンパク質は、ＭｃｒＡ−ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメインおよびＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのうちの１つ以上を本質的に含むＤＮＡ結合タンパク質である。
【００３９】
例示的ＤＮＡ結合タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質である。例示的ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。
【００４０】
化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）において、Ｃａｓ９はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３ｂｐ上流に平滑末端の二本鎖切断を形成するが、該形成は、タンパク質中の２つの触媒ドメインである、ＤＮＡの相補鎖を切断するＨＮＨドメインおよび非相補鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインが介在する過程によってなされる。その全体がここに参照により取り込まれるＪｉｎｋｅら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３３７巻、８１６〜８２１頁（２０１２年）を参照されたい。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｍａｋａｒｏｖａら著、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ誌、第９巻、２０１１年６月、４６７〜４７７頁の補足情報の中に特定されている以下のものを含む、多数のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに存在することが知られている：メタノコッカス・マリパルディスＣ７；コリネバクテリウム・ジフテリアエ；コリネバクテリウム・エフィシエンスＹＳ−３１４；コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２  Ｋｉｔａｓａｔｏ；コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２  Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ；コリネバクテリウム・グルタミカムＲ；コリネバクテリウム・クロッペンステッティイＤＳＭ４４３８５；マイコバクテリウム・アブセサスＡＴＣＣ１９９７７；ノカルディア・ファルシニカＩＦＭ１０１５２；ロドコッカス・エリスロポリスＰＲ４；ロドコッカス・ジョスティイＲＨＡ１；ロドコッカス・オパカスＢ４  ｕｉｄ３６５７３；アシドサーマス・セルロリティカス１１Ｂ；アルスロバクター・クロロフェノリカスＡ６；クリベラ・フラビダＤＳＭ１７８３６  ｕｉｄ４３４６５；サーモノスポラ・カーバタＤＳＭ４３１８３；ビフィドバクテリウム・デンティウムＢｄ１；ビフィドバクテリウム・ロングムＤＪＯ１０Ａ；スラッキア・ヘリオトリニレデューセンスＤＳＭ２０４７６；パーセフォネラ・マリナＥＸ  Ｈ１；バクテロイデス・フラギリスＮＣＴＣ９４３４；カプノサイトファガ・オクラセアＤＳＭ７２７１；フラボバクテリウム・サイクロフィルムＪＩＰ０２  ８６；アッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ  ＢＡＡ８３５；ロゼイフレクサス・キャステンホルツィイＤＳＭ１３９４１；ロゼイフレクサスＲＳＩ；シネコシスティスＰＣＣ６８０３；エルシミクロビウム・ミヌトゥムＰｅｉ１９１；非培養性シロアリ１群細菌系統型Ｒｓ  Ｄ１７；フィブロバクター・サクシノゲネスＳ８５；バチルス・セレウスＡＴＣＣ１０９８７；リステリア・イノキュア;ラクトバチルス・カゼイ；ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ；ラクトバチルス・サリバリウスＵＣＣ１１８；ストレプトコッカス・アガラクティアエＡ９０９；ストレプトコッカス・アガラクティアエＮＥＭ３１６；ストレプトコッカス・アガラクティアエ２６０３；ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ・エクイシミリスＧＧＳ１２４；ストレプトコッカス・エクイ・ズーエピデミカスＭＧＣＳ１０５６５；ストレプトコッカス・ガロリティカスＵＣＮ３４  ｕｉｄ４６０６１；ストレプトコッカス・ゴルドニイＣｈａｌｌｉｓ  ｓｕｂｓｔ  ＣＨ１；ストレプトコッカス・ミュータンスＮＮ２０２５  ｕｉｄ４６３５３；ストレプトコッカス・ミュータンス；ストレプトコッカス・ピ���ゲネスＭ１  ＧＡＳ；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ５００５；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ２０９６；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ９４２９；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ１０２７０；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ６１８０；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ３１５；ストレプトコッカス・ピオゲネスＳＳＩ−１；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ１０７５０；ストレプトコッカス・ピオゲネスＮＺ１３１；ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）ＣＮＲＺ１０６６；ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）ＬＭＤ−９；ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＧ１８３１１；クロストリジウム・ボツリヌムＡ３  Ｌｏｃｈ  Ｍａｒｅｅ；クロストリジウム・ボツリヌムＢ  Ｅｋｌｕｎｄ  １７Ｂ；クロストリジウム・ボツリヌムＢａ４  ６５７；クロストリジウム・ボツリヌムＦ  Ｌａｎｇｅｌａｎｄ；クロストリジウム・セルロリティカムＨ１０；フィネゴルディア・マグナＡＴＣＣ２９３２８；ユウバクテリウム・レクターレＡＴＣＣ３３６５６；マイコプラズマ・ガリセプティカム；マイコプラズマ・モービレ１６３Ｋ；マイコプラズマ・ペネトランス；マイコプラズマ・シノビアエ５３；ストレプトバチルス・モニリフォルミスＤＳＭ１２１１２；ブラディリゾビウムＢＴＡｉｌ；ニトロバクター・ハンブルゲンシスＸ１４；ロドシュードモナス・パルストリスＢｉｓＢ１８；ロドシュードモナス・パルストリスＢｉｓＢ５；バルビバクラム・ラバメンティボランスＤＳ−１；ディノロセオバクター・シバエＤＦＬ１２；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクスＰａｌ  ５  ＦＡＰＥＲＪ；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクスＰａｌ  ５  ＪＧＩ；アゾスピリルムＢ５１０  ｕｉｄ４６０８５；ロドスピリラム・ルブラムＡＴＣＣ１１１７０；ジアフォロバクターＴＰＳＹ  ｕｉｄ２９９７５；フェルミネフォロバクター・エイセニアエＥＦ０１−２；ナイセリア・メニンギティデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）０５３４４２；ナイセリア・メニンギティデスα１４；ナイセリア・メニンギティデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｚ２４９１；デスルホビブリオ・サレキシゲンスＤＳＭ２６３８；カンピロバクター・ジェジュニ・ドイレイ２６９  ９７；カンピロバクター・ジェジュニ８１１１６；カンピロバクター・ジェジュニ；カンピロバクター・ラリＲＭ２１００；ヘリコバクター・ヘパティカス；ウォリネラ・サクシノゲネス；トルモナス・アウエンシスＤＳＭ９１８７；シュードアルテロモナス・アトランティカＴ６ｃ；シュワネラ・ペアレアナＡＴＣＣ７００３４５；レジオネラ・ニューモフィラＰａｒｉｓ；アクチノバチルス・サクシノゲネス１３０Ｚ；パスツレラ・ムルトシダ；フランシセラ・ツラレンシス・ノビシダＵ１１２；フランシセラ・ツラレンシス・ホラルクティカ；フランシセラ・ツラレンシスＦＳＣ１９８；フランシセラ・ツラレンシス・ツラレンシス；フランシセラ・ツラレンシスＷＹ９６−３４１８；およびトレポネーマ・デ��ティコーラＡＴＣＣ３５４０５。したがって、本開示のいくつかの態様は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在するＣａｓ９タンパク質に関する。
【００４１】
Ｃａｓ９タンパク質は、文献中で、当業者によってＣｓｎ１と呼ばれる場合がある。化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質が下に示されている。その全体がここに参照により取り込まれるＤｅｌｔｃｈｅｖａら著、Ｎａｔｕｒｅ誌、第４７１巻、６０２〜６０７頁（２０１１年）を参照されたい。
【００４２】
【数１】
0006739335.tif 000003
【００４３】
【数２】
0006739335.tif 000004
【００４４】
１つの態様によると、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質には、ＤＮＡに結合し、ＲＮＡによって誘導（ｇｕｉｄｅ）され、且つＤＮＡを切断する当該タンパク質の能力を保持している、Ｃａｓ９のホモログおよびオーソログが含まれる。１つの態様によると、Ｃａｓ９タンパク質は化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）由来の天然Ｃａｓ９について示した配列、および該配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の相同性を有し、且つＤＮＡ結合タンパク質（例えばＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質）であるタンパク質配列を含む。
【００４５】
１つの態様によると、所望により幹細胞内で部位特異的にＲＮＡ誘導性ゲノム切断、および外来性ドナー核酸の挿入による幹細胞ゲノムの改変、を可能にする改変されたＣａｓ９−ｇＲＮＡシステムが提供される。ガイドＲＮＡはＤＮＡ上の標的部位または標的座位に相補的である。ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡキメラであってもよい。前記細胞の周囲の媒体からガイドＲＮＡを導入することができる。このようにして、種々のガイドＲＮＡが周囲の媒体に供給され、細胞によって該ガイドＲＮＡが取り込まれ、追加のガイドＲＮＡが媒体に補給される限りにおいて、細胞を連続的に改変する方法が提供される。前記補給は連続的であってもよい。前記Ｃａｓ９は標的ゲノムＤＮＡまたはその近傍に結合する。１つ以上のガイドＲＮＡが標的ゲノムＤＮＡまたはその近傍に結合する。前記Ｃａｓ９は該標的ゲノムＤＮＡを切断し、当該切断部位において外来性ドナーＤＮＡが前記ＤＮＡに挿入される。
【００４６】
したがって、ある方法は、ガイドＲＮＡをコードする核酸の挿入（または周囲の媒体からのＲＮＡの提供）および外来性ドナー核酸の挿入、前記ＲＮＡの発現（または前記ＲＮＡの取込み）、ＤＮＡを切断する様式での前記ＲＮＡ、Ｃａｓ９および該ＤＮＡの共局在化、および前記外来性ドナー核酸の挿入、を循環させることにより、Ｃａｓ９を発現する幹細胞内のＤＮＡへ外来性ドナー核酸を多重挿入するため、Ｃａｓ９タンパク質および外来性ドナー核酸と共にガイドＲＮＡを使用すること、に関する。任意の所望数のＤＮＡ改変を生じさせるために、任意の所望回数、前記方法の工程を循環させることができる。したがって、本開示のいくつかの方法は、本明細書に記載されるＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを使用して標的遺伝子を編集し、幹細胞の多重化ジェネティックエンジニアリングおよびエピジェネティックエンジニアリングを提供することに関する。
【００４７】
本開示のさらなる態様は、幹細胞（例えばヒト幹細胞）のＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ）への外来性ドナー核酸の多重挿入のための、ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合システム（本明細書に記載される改変型ＴＡＬＥＮＳまたはＣａｓ９など）一般の使用に関する。当業者は本開示に基づいて例示的ＤＮＡ結合システムを容易に特定するであろう。
【００４８】
本開示に従う細胞には、別途明示されない限り、本明細書に記載されるように外来性核酸を導入することができ、発現させることができる任意の細胞が含まれる。本明細書に記載される本開示の基本概念は細胞種によって制限されないことが理解されるべきである。本開示に係る細胞には体細胞、幹細胞、真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、古細菌細胞、真正細菌細胞などが含まれる。細胞には酵母細胞、植物細胞、および動物細胞などの真核細胞が含まれる。具体的な細胞にはヒト細胞などの哺乳類細胞が含まれる。さらに、細胞には、ＤＮＡを改変することが有益であるまたは望ましい任意の細胞が含まれる。
【００４９】
標的核酸には、本明細書に記載されるヌクレアーゼ活性を有するＴＡＬＥＮまたはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質がニックを入れるまたは切断する上で有用であり得る、任意の核酸配列が含まれる。標的核酸には、本明細書に記載される共局在複合体がニックを入れるまたは切断する上で有用であり得る任意の核酸配列が含まれる。標的核酸は遺伝子を含む。本開示の目的のためには、二本鎖ＤＮＡなどのＤＮＡは標的核酸を含むことができ、共局在複合体またはＴＡＬＥＮが該標的核酸に対して所望の作用を有し得るように、該標的核酸のところで、もしくは該標的核酸に隣接して、もしくは該標的核酸の近傍で、共局在複合体が前記ＤＮＡに結合するもしくは前記ＤＮＡと別の様式で共局在する、またはＴＡＬＥＮが前記ＤＮＡに結合する。そのような標的核酸は内在性（あるいは天然）核酸および外来性（あるいは外来）核酸を含み得る。当業者は、本開示に基づいて、標的核酸を含むＤＮＡに共局在するガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質、または標的核酸を含むＤＮＡに結合するＴＡＬＥＮ、を容易に特定または設計することができるであろう。当業者は、標的核酸を含むＤＮＡに同様に共局在する転写調節因子タンパク質またはドメイン（例えば転写活性化因子または転写抑制因子）を特定することも、さらに可能であろう。ＤＮＡにはゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたは外来性ＤＮＡが含まれる。１つの態様によると、本開示の実施に有用な材料および方法には、例示的株および培地、プラスミド構築、プラスミドの形質転換、過渡的（ｔｒａｎｓｃｉｅｎｔ）ｇＲＮＡカセットおよびドナー核酸のエレクトロポレーション、Ｃａｓ９発現細胞へのドナーＤＮＡおよびｇＲＮＡプラスミドの形質転換、Ｃａｓ９のガラクトース誘導、酵母ゲノム内でのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ標的の特定などをはじめとする、全ての目的のためにその全体がここに参照により取り込まれるＤｉ  Ｃａｒｌｏら著、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ誌、２０１３年、第４１巻、第７号、４３３６〜４３４３頁に記載されているものが含まれる。本発明を実施する上で当業者に有用な情報、材料、および方法を含む追加の参考文献が、各々全ての目的のためにその全体がここに参照により取り込まれるＭａｌｉ，  Ｐ．，  Ｙａｎｇ，  Ｌ．，  Ｅｓｖｅｌｔ，  Ｋ．Ｍ．，  Ａａｃｈ，  Ｊ．，  Ｇｕｅｌｌ，  Ｍ．，  ＤｉＣａｒｌｏ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｎｏｒｖｉｌｌｅ，  Ｊ．Ｅ．およびＣｈｕｒｃｈ，  Ｇ．Ｍ．（２０１３年）、ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９．  Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、１０．１１２６ｆｓｃｉｅｎｃｅ．１２３２０３３；Ｓｔｏｒｉｃｉ，  Ｆ．，  Ｄｕｒｈａｍ，  Ｃ．Ｌ．，  Ｇｏｒｄｅｎｉｎ，  Ｄ．Ａ．およびＲｅｓｎｉｃｋ，  Ｍ．Ａ．（２００３年）、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ａｒｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｆｏｒ  ｒｅｐａｉｒ  ｂｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．  ＰＮＡＳ誌、第１００巻、１４９９４〜１４９９９頁、およびＪｉｎｅｋ，  Ｍ．，  Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，  Ｋ．，  Ｆｏｎｆａｒａ，  ｌ．，  Ｈａｕｅｒ，  Ｍ．，  Ｄｏｕｄｎａ，  Ｊ．Ａ．およびＣｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，  Ｅ．（２０１２年）、Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３３７巻、８１６〜８２１頁に提供されている。
【００５０】
外来性核酸（すなわち、細胞の天然の核酸組成物の部分ではない核酸）の細胞への導入は、そのような導入のための当業者に知られている任意の方法を用いて行ってよい。そのような方法には形質移入、形質導入、ウイルス形質導入、微量注入、リポフェクション、ヌクレオフェクション、ナノ粒子ボンバードメント、形質転換、接合などが含まれる。当業者は容易に特定可能な文献資料を用いて容易にそのような方法を理解および適応化（ａｄａｐｔ）するであろう。
【００５１】
ドナー核酸には、本明細書に記載される核酸配列に挿入される任意の核酸が含まれる。
【００５２】
後述の実施例は本開示を代表しているものとして示される。これら実施形態およびその他の等価な実施形態は、本開示、図面、および添付の特許請求の範囲に照らせば明らかであるので、これらの実施例は本開示の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【００５３】
実施例１
ガイドＲＮＡのアセンブリー
選択した標的配列のうちの１９ｂｐ（すなわち、５’−Ｎ１９−ＮＧＧ−３’のうちの５’−Ｎ１９）を、２つの相補的な１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＣＧＮ１９ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ）に組み込んだ。１００ｍｅｒオリゴヌクレオチドそれぞれを１００ｍＭの濃度で水に懸濁し、等量で混合し、サーモサイクルマシーンでアニールした（９５℃、５分、４℃までの勾配、０．１℃／秒）。デスティネーションベクターを調製するため、ＡｆＩＩＩを使用してｇＲＮＡクローニングベクター（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号４１８２４）を直線化し、該ベクターを精製した。１０ｎｇのアニールした１００ｂｐ断片、１００ｎｇのデスティネーションバックボーン、１×Ｇｉｂｓｏｎアセンブリー反応ミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）により、５０℃で３０分間（１０ｕｌの）ｇＲＮＡアセンブリー反応を行った。その反応産物を、直接的に細菌の形質転換用に処理して、個々のアセンブリーをコロニー化することができる。
【００５４】
実施例２
再編集（ｒｅｃｏｄｅｄ）ＴＡＬＥの設計およびアセンブリー
アセンブリーを容易にし、発現を改善するために、様々なレベルでｒｅ−ＴＡＬＥを最適化した。まず、ｒｅ−ＴＡＬＥ  ＤＮＡ配列を、ヒトコドン使用頻度および５’末端における低ｍＲＮＡフォールディングエネルギー（ＧｅｎｅＧＡ、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）について共最適化した。得られた配列を幾つかのサイクルにより進化させて、１１ｂｐより長い（順方向または逆方向）リピートを除去した（図１２を参照のこと）。各サイクルにおいて、各リピートについての同義配列を評価する。進化中のＤＮＡに対して最大ハミング距離を有する配列を選択する。１６．５モノマーを有するｒｅ−ＴＡＬＥのうちの１つの配列は次の通り。
【００５５】
【数３】
0006739335.tif 000005
【００５６】
【数４】
0006739335.tif 000006
【００５７】
ある態様によると、上の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性、を有するＴＡＬＥを使用することができる。当業者は、上の配列のうちのどの箇所が当該ＴＡＬＥのＤＮＡ結合活性を維持しつつも変化しうるかを、容易に理解するであろう。
【００５８】
１ラウンド目のＰＣＲがＲＶＤコード配列を導入し、２ラウンド目のＰＣＲが隣接するブロックと３６ｂｐの重複を有するダイマーブロック全体を作製する、標準的なＫａｐａ  ＨＩＦＩ（ＫＰＡＰ）ＰＣＲ条件の下での２ラウンドのＰＣＲにより、２つのＲＶＤをコードするｒｅ−ＴＡＬＥダイマーブロック（図６Ａを参照のこと）を作製した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ９６  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用してＰＣＲ産物を精製し、Ｎａｎｏドロップにより濃度を測定した。プライマーおよび鋳型の配列が下の表１および表２に記載されている。
【００５９】
【表１−１】
0006739335.tif 000007
【００６０】
【表１−２】
0006739335.tif 000008
【００６１】
【表１−３】
0006739335.tif 000009
【００６２】
【表２−１】
0006739335.tif 000010
【００６３】
【表２−２】
0006739335.tif 000011
【００６４】
ＴＡＬＥ−ＴＦおよびＴＡＬＥＮクローニングバックボーンを改変することにより、ｒｅ−ＴＡＬＥＮおよびｒｅ−ＴＡＬＥ−ＴＦデスティネーションベクターを構築した（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献２４を参照されたい）。それらのベクター上の０．５ＲＶＤ領域を再編集し、指定されたｒｅ−ＴＡＬＥクローニング部位にＳａｐＩ切断部位を組み込んだ。ｒｅ−ＴＡＬＥＮおよびｒｅ−ＴＡＬＥ−ＴＦバックボーンの配列が図２０に提供されている。製造業者が推奨する条件で、ＳａｐＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いてプラスミドを前処理することができ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてそれらのプラスミドを精製することができる。
【００６５】
２００ｎｇの各ブロック、５００ｎｇのデスティネーションバックボーン、１×ＴＡＳＡ酵素混合物（２ＵのＳａｐＩ、１００Ｕのアンプリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）、１０ｍＵのＴ５エクソヌクレアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）、２．５ＵのＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社））および以前に記載された１×等温アセンブリー反応バッファー（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献２５を参照されたい）（５％のＰＥＧ−８０００、１００ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭずつの４種類のｄＮＴＰ、および１ｍＭのＮＡＤ）を用いて、（１０ｕｌの）１ポットＴＡＳＡアセンブリー反応を行った。インキュベーションを、３７℃で５分間、および５０℃で３０分間行った。ＴＡＳＡアセンブリー反応産物を直接的に細菌の形質転換用に処理して、個々のアセンブリーをコロニー化することができる。全長コンストラクトを得る効率は、このアプローチでは約２０％である。あるいは、３ステップアセンブリーにより、９０％を超える効率を達成することができる。まず、２００ｎｇの各ブロック、１×ｒｅ−ＴＡＬＥ酵素混合物（１００Ｕのアンプリガーゼ、１２．５ｍＵのＴ５エクソヌクレアーゼ、２．５ＵのＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ）および１×等温アセンブリーバッファーを５０℃で３０分間用いて、１０ｕｌのｒｅ−ＴＡＬＥアセンブリー反応を行い、続いて標準化されたＫａｐａ  ＨＩＦＩ  ＰＣＲ反応、アガロースゲル電気泳動、およびＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出（Ｑｉａｇｅｎ社）を行って、全長のｒｅ−ＴＡＬＥを濃縮する。次に、２００ｎｇのｒｅ−ＴＡＬＥアンプリコンを、５００ｎｇのＳａｐ１前処理されたデスティネーションバックボーン、１×ｒｅ−ＴＡＬＥアセンブリー混合物および１×等温アセンブリー反応バッファーと混合し、５０℃で３０分間インキュベートすることができる。ｒｅ−ＴＡＬＥ最終アセンブリー反応産物を直接的に細菌の形質転換用に処理して、個々のアセンブリーをコロニー化することができる。当業者は、本明細書に記載される方法を実施するために、公知のものの中からエンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、ポリメラーゼおよびリガーゼを容易に選択することができるであろう。例えば、ＦｏｋＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＳａｐＩなどのＩＩ型エンドヌクレアーゼを使用することができるであろう。ラムダエクソヌクレアーゼ、Ｔ５エクソヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼＩＩＩなどの滴定可能（ｔｉｔｒａｌａｂｌｅ）なエクソヌクレアーゼを使用することができる。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＶｅｎｔＲ  ＤＮＡポリメラーゼなどの非ホットスタートポリメラーゼを使用することができる。アンプリガーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼなどの熱安定性リガーゼをこの反応に使用することができる。加えて、使用する特定の種に応じて、そのようなエンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、ポリメラーゼおよびリガーゼを活性化するためにさまざまな反応条件を用いることができる。
【００６６】
実施例３
細胞株および細胞培養物
マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）コートプレート上、ｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）でＰＧＰ１  ｉＰＳ細胞を維持した。ＴｒｙｐＬＥエクスプレス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、培養物を５〜７日毎に継代した。１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）高グルコースの中で、２９３Ｔ細胞および２９３ＦＴ細胞を培養し、維持した。１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１５％）およびペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の中でＫ５６２細胞を培養し、維持した。加湿インキュベーターの中で、全ての細胞を３７℃および５％のＣＯ２で維持した。
【００６７】
その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献２６に記載されるように、相同性修復（ＨＤＲ）効率の検出用の安定した２９３Ｔ細胞株を構築した。具体的には、それらのレポーター細胞株は、終止コドンおよびＡＡＶＳ１座位に由来する６８ｂｐのゲノム断片の挿入により破壊されているゲノム上に組み込まれたＧＦＰコード配列を保持する。
【００６８】
実施例４
ｒｅ−ＴＡＬＥＮ活性の検査
２４ウェルプレートのウェル当たり２×１０５細胞の密度で２９３Ｔレポーター細胞を播種し、製造業者のプロトコルに従ってリポフェクタミン２０００を使用して、１μｇの各ｒｅ−ＴＡＬＥＮプラスミドおよび２μｇのＤＮＡドナープラスミドをそれらの細胞に形質移入した。形質移入から約１８時間後に、ＴｒｙｐＬＥエクスプレス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して細胞を回収し、ＬＳＲフォルテッサ細胞分析機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用するフローサイトメトリー分析用の２００μｌの媒体に再懸濁した。ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ社）を使用してフローサイトメトリーデータを分析した。各形質移入試料について少なくとも２５，０００イベントを分析した。２９３Ｔにおける内在性ＡＡＶＳ１座位ターゲティング実験について、形質移入法は上に記載されたものと同じであり、形質移入から１週間後に３μｇ／ｍｌの薬品濃度でピューロマイシン選択を実施した。
【００６９】
実施例５
機能的レンチウイルス生成評価
標準的なＰＣＲおよびクローニング技術により、レンチウイルスベクターを作製した。レンチウイルスパッケージングミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、リポフェクタミン２０００によってレンチウイルスプラスミドを２９３ＦＴ培養細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に形質移入して、レンチウイルスを作製した。形質移入から４８時間後および７２時間後に上清を回収し、滅菌濾過し、１００ｕｌの濾過上清をポリブレンと共に５×１０５個の新しい２９３Ｔ細胞に添加した。次の式：ウイルス感染価＝（ＧＦＰ陽性２９３Ｔ細胞のパーセンテージ×形質導入時の初期細胞数）／（形質導入実験に使用された元のウイルス回収上清の体積）  に基づいてレンチウイルス感染価を計算した。レンチウイルスの機能性を検査するため、形質導入から３日後に、３０ｎｇのｍＣｈｅｒｒｙレポーターを有するプラスミドおよび５００ｎｇのｐＵＣ１９プラスミドを、レンチウイルスで形質導入した２９３Ｔ細胞に、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して形質移入した。形質移入から１８時間後に、アクシオ・オブザーバーＺ．１（Ｚｅｉｓｓ社）を使用して細胞像を分析し、ＴｒｙｐＬＥエクスプレス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して細胞を回収し、ＬＳＲフォルテッサ細胞分析機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用するフローサイトメトリー分析用の２００μｌの媒体に再懸濁した。ＢＤ  ＦＡＣＳディーバ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用してフローサイトメトリーデータを分析した。
【００７０】
実施例６
ｒｅ−ＴＡＬＥＮおよびＣａｓ９−ｇＲＮＡのゲノム編集効率の検査
ヌクレオフェクションの２時間前に、ＰＧＰ１  ｉＰＳ細胞をＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤Ｙ−２７６３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）の中で培養した。Ｐ３プライマリー・セル４ＤヌクレオフェクターＸキット（Ｌｏｎｚａ社）を使用して形質移入を行った。具体的には、ＴｒｙｐＬＥエクスプレス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して細胞を回収し、１６．４μｌのＰ３ヌクレオフェクター溶液、３．６μｌのサプリメント、１μｇの各ｒｅ−ＴＡＬＥＮプラスミドもしくは１ｕｇのＣａｓ９および１ｕｇのｇＲＮＡコンストラクト、２μｌの１００μΜの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを含む２０μｌのヌクレオフェクション混合物中に、２×１０６個の細胞を再懸濁した。その後、該混合物を２０μｌヌクレオキュベットストリップに移し、ＣＢ１５０プログラムを用いてヌクレオフェクションを行った。最初の２４時間、マトリゲルコートプレート上の、ＲＯＣＫ阻害剤を添加したｍＴｅＳＲ１培地中に、細胞を播種した。二本鎖ＤＮＡドナーを使用する内在性ＡＡＶＳ１座位ターゲティング実験については、２μｇの二本鎖ＤＮＡドナーを使用し、且つ、形質移入から１週間後にｍＴｅＳＲ１培地に０．５ｕｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを添加したことを除いて、同じ方法に従った。
【００７１】
この実施例において使用したｒｅＴＡＬＥＮ、ｇＲＮＡおよび一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドの情報が、下の表３および表４に記載されている。
【００７２】
【表３−１】
0006739335.tif 000012
【００７３】
【表３−２】
0006739335.tif 000013
【００７４】
【表４−１】
0006739335.tif 000014
【００７５】
【表４−２】
0006739335.tif 000015
【００７６】
【表４−３】
0006739335.tif 000016
【００７７】
【表４−４】
0006739335.tif 000017
【００７８】
【表４−５】
0006739335.tif 000018
【００７９】
【表４−６】
0006739335.tif 000019
【００８０】
【表４−７】
0006739335.tif 000020
【００８１】
【表４−８】
0006739335.tif 000021
【００８２】
【表４−９】
0006739335.tif 000022
【００８３】
実施例７
ターゲティング領域のアンプリコンライブラリーの調製
ヌクレオフェクションから６日後に細胞を回収し、０．１μｌのｐｒｅｐＧＥＭ組織プロテアーゼ酵素（ＺｙＧＥＭ社）および１μｌのｐｒｅｐＧＥＭゴールドバッファー（ＺｙＧＥＭ社）を、８．９μｌの培地中の２〜５×１０５個の細胞に添加し、次に５μｌの２×ＫＡＰＡ  ＨＩＦＩホットスタート・レディミックス（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）および１００ｎΜの対応する増幅プライマーペアを含む９μｌのＰＣＲミックスに、１ｕｌの前記反応産物を添加した。反応産物を９５℃で５分間インキュベートし、続いて９８℃で２０秒、６５℃で２０秒、そして７２℃で２０秒のサイクルを１５サイクル行った。使用するイルミナシークエンスアダプターを付加するため、次に１２．５μｌの２×ＫＡＰＡ  ＨＩＦＩホットスタート・レディミックス（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）および２００ｎＭのイルミナシークエンスアダプターを有するプライマーを含む２０μｌのＰＣＲミックスに、５μｌの反応産物を添加した。反応産物を９５℃で５分間インキュベートし、続いて９８℃で２０秒、６５℃で２０秒、そして７２℃で２０秒のサイクルを２５サイクル行った。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットにより精製し、概ね同じ濃度で混合し、ＭｉＳｅｑパーソナルシーケンサーでシークエンシングした。ＰＣＲプライマーは、下の表５に記載されている。
【００８４】
【表５−１】
0006739335.tif 000023
【００８５】
【表５−２】
0006739335.tif 000024
【００８６】
【表５−３】
0006739335.tif 000025
【００８７】
【表５−４】
0006739335.tif 000026
【００８８】
【表５−５】
0006739335.tif 000027
【００８９】
実施例８
ゲノム編集評価システム（ＧＥＡＳ）
稀なゲノム変化を検出するために次世代シークエンシングが活用されている。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献２７〜３０を参照されたい。ヒトｉＰＳ細胞における相同性修復（ＨＤＲ）効率および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率を迅速に評価するためのこのアプローチの幅広い使用を可能にするため、ゲノムエンジニアリングデータを分析するための「パイプライン」と称されるソフトウェアを作成した。このパイプラインは単一のＵｎｉｘモジュールに統合されており、該モジュールはＲ、ＢＬＡＴ、およびＦＡＳＴＸツールキットなどの様々なツールを使用する。
【００９０】
バーコード・スプリッティング：一群の試料を一つにまとめ、ＭｉＳｅｑ  １５０ｂｐペアードエンド（ＰＥ１５０）（イルミナ・次世代シークエンシング）を使用してシークエンシングし、後にＦＡＳＴＸツールキットを使用してＤＮＡバーコードに基づく分離を行った。
【００９１】
品質フィルタリング：低い配列品質（ｐｈｒｅｄスコア＜２０）を有するヌクレオチドを除去した。除去の後に８０ヌクレオチドよりも短いリードを除いた。
【００９２】
マッピング：ＢＬＡＴを使用して対になったリードを独立して基準ゲノムにマップし、出力として．ｐｓｌファイルを作成した。
【００９３】
インデルコーリング：アラインメント中に２ブロックのマッチを含む全長リードとして、インデルを定義した。両ペアードエンドリードにおいて、このパターンに従うリードだけを考慮した。品質管理として、それらのインデルリードは基準ゲノムと最小で７０ｎｔのマッチを有することが必要とされ、両方のブロックが少なくとも２０ｎｔ長であることが必要とされた。基準ゲノムに対する各ブロックの位置によってインデルのサイズおよび位置を計算した。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）はインデルを含むリードのパーセンテージとして評価されている（下の式１を参照のこと）。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）事象の大部分が、ターゲティング部位の近傍で検出されている。
【００９４】
相同性修復（ＨＤＲ）効率：二本鎖切断（ＤＳＢ）上を中央とする１２ｂｐのウインドウ内でのパターンマッチング（ｇｒｅｐ）を使用して、基準配列を含むリード、基準配列の改変（２ｂｐの意図されたミスマッチ）を含むリード、および２ｂｐの意図されたミスマッチ内に１ｂｐだけ変異を含むリード、に対応する特異的なシグネチャを数えた（下の式１を参照のこと）。
【００９５】
式１．非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同性修復（ＨＤＲ）の評価
Ａ＝基準と同一のリード：ＸＸＸＸＸＡＢＸＸＸＸＸ
Ｂ＝一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドによってプログラムされた２ｂｐのミスマッチを含むリード：ＸＸＸＸＸａｂＸＸＸＸＸ
Ｃ＝標的部位内に変異を１ｂｐだけを含むリード：例えばＸＸＸＸＸａＢＸＸＸＸＸまたはＸＸＸＸＸＡｂＸＸＸＸＸ
Ｄ＝上に記載されたインデルを含むリード
【００９６】
【数５】
0006739335.tif 000028
【００９７】
【数６】
0006739335.tif 000029
【００９８】
実施例９
コロニー化したヒトｉＰＳ細胞の遺伝子型スクリーニング
ＦＡＣＳ選別前に、ＳＭＣ４（５ｕＭのチアゾビビン、１ｕＭのＣＨＩＲ９９０２１、０．４ｕＭのＰＤ０３２５９０１、２ｕＭのＳＢ４３１５４２）（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献２３を参照されたい）を添加したｍＴｅｓｒ−１培地で、無フィーダー培養上のヒトｉＰＳ細胞を少なくとも２時間にわたって前処理した。アキュターゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用して培養物を解離させ、ＳＭＣ４および生死判定色素ＴｏＰｒｏ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加したｍＴｅｓｒ−１培地に１〜２×１０７個／ｍＬの濃度で再懸濁した。１００ｕｍのノズルを有するＢＤ  ＦＡＣＳアリアＩＩ  ＳＯＲＰ  ＵＶ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、滅菌条件下で、生存しているヒトｉＰＳ細胞を、照射済み（ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ）ＣＦ−１マウス胚性線維芽細胞でコーティングされた９６ウェルプレート（Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｔｅｍ社）へとシングルセルソートした。各ウェルは、ＳＭＣ４と５μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ社）とが添加された１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を含むヒトＥＳ細胞培地（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献３１を参照されたい）を含んでいた。選別後に、プレートを７０×ｇで３分間遠心分離した。選別から４日後にコロニー形成が見られ、培地をＳＭＣ４が添加されたヒトＥＳ細胞培地と交換した。選別から８日後に、ＳＭＣ４をヒトＥＳ細胞培地から除去することができる。
【００９９】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）から８日後に数千個の細胞を回収し、０．１ｕｌのｐｒｅｐＧＥＭ組織プロテアーゼ酵素（ＺｙＧＥＭ社）および１ｕｌのｐｒｅｐＧＥＭゴールドバッファー（ＺｙＧＥＭ社）を８．９μｌの培地中の細胞に添加した。次に、その反応産物を、３５．５ｍｌのプラチナ１．１×スーパーミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、２５０ｎＭの各ｄＮＴＰおよび４００ｎＭのプライマーを含む、４０μｌのＰＣＲミックスに添加した。反応産物を９５℃で３分間インキュベートし、続いて９５℃で２０秒、６５℃で３０秒、そして７２℃で２０秒のサイクルを３０サイクル行った。表５の中のＰＣＲプライマーのうちのいずれか１つを使用して産物をサンガーシークエンシングし、ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ社）を使用して配列を分析した。
【０１００】
実施例１０
ヒトｉＰＳ細胞の免疫染色およびテラトーマアッセイ
次の抗体を使用して、細胞をＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中で３７℃で６０分インキュベートした：抗ＳＳＥＡ−４  ＰＥ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）（１：５００に希釈）；Ｔｒａ−１−６０（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）（１：１００に希釈）。インキュベーション後に、細胞をＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２で３回洗浄し、アクシオ・オブザーバーＺ．１（ＺＩＥＳＳ社）で画像を得た。
【０１０１】
テラトーマ形成分析を行うため、ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してヒトｉＰＳ細胞を回収し、それらの細胞を２００μｌのマトリゲルに再懸濁し、Ｒａｇ２γノックアウトマウスの後肢に筋肉内注射した。その注射後４〜８週間の間にテラトーマを単離し、ホルマリン中に固定した。その後に該テラトーマをヘマトキシリン・エオシン染色により分析した。
【０１０２】
実施例１１
ｒｅＴＡＬＥＮＳを使用するヒト体細胞およびヒト幹細胞におけるゲノム座位へのターゲティング
ある態様によると、反復配列を除去するために、当業者に知られているＴＡＬＥを改変または再編集する。ウイルス性送達ビヒクルおよび本明細書に記載される様々な細胞株および生物におけるゲノム編集方法における改変および使用に適切なそのようなＴＡＬＥは、その全体がここに参照により本明細書に取り込まれる参考文献２、７〜１２に開示されている。反復性ＴＡＬＥ  ＲＶＤアレイ配列をアセンブリーするために、幾つかの戦略が開発されている（その全体がここに参照により本明細書に取り込まれる参考文献１４および３２〜３４を参照のこと）。しかしながら、アセンブリーしても、ＴＡＬＥ配列リピートは不安定なままであり、このため、このツールの広範な有用性、特にウイルス遺伝子送達ビヒクルへの有用性、が制限される（その全体がここに参照により本明細書に取り込まれる参考文献１３および３５を参照のこと）。したがって、本開示の１つの態様は、リピートを欠く、例えばリピートを完全に欠く、ＴＡＬＥに関する。そのような再編集ＴＡＬＥは、伸長したＴＡＬＥ  ＲＶＤアレイのより速くてより簡易な合成を可能にするので利点が有る。
【０１０３】
リピートを除去するため、ＴＡＬＥ  ＲＶＤアレイのヌクレオチド配列を計算的に進化させて、アミノ酸組成を維持しつつ配列リピートの数を最少にした。１６個のタンデムＲＶＤ  ＤＮＡ認識モノマーおよび最後の半分のＲＶＤリピートをコードする再編集ＴＡＬＥ（Ｒｅ−ＴＡＬＥ）は、１２ｂｐのリピートを全く欠いている（図５ａを参照のこと）。特筆すべきことに、このレベルの再編集は、全長ｒｅ−ＴＡＬＥコンストラクトに由来するあらゆる特定のモノマーまたは小区分のＰＣＲ増幅を可能にするのに充分である（図５ｂを参照のこと）。高度に反復した配列に伴う追加の費用または方法を招くことなく、標準的なＤＮＡ合成技術を用いて改善されたデザインのｒｅ−ＴＡＬＥを合成することができる（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献３６を参照されたい）。さらに、その再編集配列デザインにより、本明細書内の方法に記載され図６を参照して記載される改変等温アセンブリー反応を用いて、ｒｅ−ＴＡＬＥコンストラクトの効率的なアセンブリーが可能になる。
【０１０４】
ゲノム編集ＮＧＳ（次世代シークエンシング）データを次のように統計分析した。相同性修復（ＨＤＲ）特異度分析について、正確二項検定を用いて、２ｂｐミスマッチを含む様々な数の配列リードを観察する確率を計算した。ターゲティング部位前後の１０ｂｐウインドウのシークエンシング結果に基づいて、２つのウインドウ（Ｐ１およびＰ２）の最大塩基変化率を評価した。２標的塩基ペアのそれぞれの変化が独立しているという帰無仮説を用いて、これらの２つの確率の積（Ｐ１×Ｐ２）としてのそのターゲティング部位において２ｂｐミスマッチを偶然に観察する期待確率を計算した。Ｎ個の全リードとｎ個の相同性修復（ＨＤＲ）リードを含むデータセットを基に、我々は観察された相同性修復（ＨＤＲ）効率のｐ値を計算した。相同性修復（ＨＤＲ）感度分析について、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドＤＮＡドナーはターゲティングゲノムに対する２ｂｐのミスマッチを含んでおり、該一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが該ターゲティングゲノムに組み込まれた場合に、それによって前記２標的塩基のペアにおいて塩基の変化が共存在する蓋然性が高いものとなった。他の想定外の観察された配列の変化が同時に変化する蓋然性は低い。したがって、想定外の変化の相互依存性はよりずっと低いものであった。これらの仮定に基づき、相互情報量（ＭＩ）を使用して、他の全てのペア位置における同時に２塩基ペアが変化することの相互依存性を測定し、ターゲットとなっている２ｂｐの部位のＭＩがこれ以外の位置のペア全てのＭＩよりも多い場合における最小の相同性修復（ＨＤＲ）として、相同性修復（ＨＤＲ）検出限界を評価した。所与の実験について、元のｆａｓｔｑファイルからの、所定の２ｂｐミスマッチを有する相同性修復（ＨＤＲ）リードを特定し、元のデータセットから様々な数の相同性修復（ＨＤＲ）リードを体系的に除去することにより、希釈された相同性修復（ＨＤＲ）効率を有する一組のｆａｓｔｑファイルをシミュレートした。ターゲティング部位上を中央とした２０ｂｐウインドウ内の位置の全てのペアの間で、相互情報量（ＭＩ）を計算した。これらの計算において、あらゆる２つの位置の間における塩基組成の相互情報量を計算する。上に記載される相同性修復（ＨＤＲ）特異度測定と異なり、この測定は、位置ペアが特定の標的塩基のペアに変化する傾向を評価せず、それらの位置ペアが同時に変化する傾向だけを評価する（図８Ａを参照のこと）。表６は、ＣＣＲ５を標的とするｒｅ−ＴＡＬＥＮ／一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドの相同性修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の効率、ならびにＣａｓ９−ｇＲＮＡのＮＨＥＬ効率を示している。我々は、我々の分析をＲでコード化し、パッケージｉｎｆｏｔｈｅｏを使用してＭＩを計算した。
【０１０５】
【表６】
0006739335.tif 000030
【０１０６】
ゲノム編集効率とエピジェネティック状態との間の相関は次のように対処された。エピジェネティックパラメーター（ＤＮａｓｅＩ  ＨＳ（高感受性部位）またはヌクレオソーム占有）とゲノムエンジニアリング効率（相同性修復（ＨＤＲ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ））との間のあり得る関係を試験するために、ピアソン相関係数を計算した。ＤＮＡａｓｅＩ超感受性のデータセットをＵＣＳＣゲノムブラウザーからダウンロードした。hiPSCs DNase I HS: /gbdb/hg19/bbi/wgEncodeOpenChromDnaseIpsnihi7Sig.bigWig
【０１０７】
Ｐ値を計算するため、エピジェネティックパラメーターの位置をランダム化することにより構築されたシミュレートされた分布に対して、観察された相関を比較した（Ｎ＝１０００００）。９５％目よりも高い、または５％目よりも低い、観察された相関を潜在的な関係と考えた。
【０１０８】
対応する非再編集ＴＡＬＥＮと比較しての、ｒｅＴＡＬＥＮのヒト細胞における機能を決定した。フレームシフト性挿入を有するＧＦＰレポーターカセットを含むＨＥＫ２９３細胞株を、その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献３７に記載されるように使用した。図１ａも参照されたい。その挿入配列を標的とするＴＡＬＥＮまたはｒｅＴＡＬＥＮを、プロモーターを有しないＧＦＰドナーコンストラクトと一緒に送達することにより、ＧＦＰカセットの二本鎖切断（ＤＳＢ）誘導性相同性修復（ＨＤＲ）修復が起こり、その結果、ＧＦＰ修復効率を用いてヌクレアーゼ切断効率を評価することができる。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献３８を参照されたい。ｒｅＴＡＬＥＮは、形質移入細胞の１．４％においてＧＦＰ修復を誘導し、ＴＡＬＥＮによって達成されたものと類似していた（１．２％）（図１ｂを参照のこと）。ＰＧＰ１  ヒトｉＰＳ細胞中のＡＡＶＳ１座位におけるｒｅＴＡＬＥＮの活性を検査したが（図１ｃを参照のこと）、該活性によって特定の挿入を含む細胞クローンの回復に成功し（図１ｄ、ｅを参照のこと）、ｒｅＴＡＬＥＮがヒト体細胞とヒト多能性細胞の両方において活性を有することが確認された。
【０１０９】
リピートの除去によって、ｒｅ−ＴＡＬＥカーゴによる機能的レンチウイルスの生成が可能になった。具体的には、ｒｅ−ＴＡＬＥ−２Ａ−ＧＦＰをコードするレンチウイルス粒子のパッケージングを行い、レンチ−ｒｅＴＡＬＥ−２Ａ−ＧＦＰ感染２９３Ｔ細胞のプールにｍＣｈｅｒｒｙレポーターを形質移入することによって、ウイルス粒子によりコードされるｒｅ−ＴＡＬＥ−ＴＦの活性について前記レンチウイルス粒子を検査した。レンチ−ｒｅ−ＴＡＬＥ−ＴＦによって形質導入された２９３Ｔ細胞は、レポーターのみの陰性と比べて、３６倍のレポーター発現活性化を示した（図７ａ、ｂ、ｃを参照のこと）。レンチウイルス感染細胞におけるｒｅ−ＴＡＬＥ−ＴＦの配列完全性を検査し、検査したクローンの全１０クローンで全長ｒｅＴＡＬＥが検出された（図７ｄを参照のこと）。
【０１１０】
実施例１２
ゲノム編集評価システム（ＧＥＡＳ）によるヒトｉＰＳ細胞におけるＲｅＴＡＬＥ効率とＣａｓ９−ｇＲＮＡ効率の比較
ヒトｉＰＳ細胞におけるｒｅ−ＴＡＬＥＮの編集効率とＣａｓ９−ｇＲＮＡの編集効率を比較するため、次世代シークエンシングプラットフォーム（ゲノム編集評価システム）を開発して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）遺伝子編集事象と相同性修復（ＨＤＲ）遺伝子編集事象の両方を特定および定量した。どちらもＣＣＲ５の上流領域を標的としたｒｅ−ＴＡＬＥＮペアおよびＣａｓ９−ｇＲＮＡ（表３中のｒｅ−ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡペア番号３）を、２ｂｐミスマッチを除いて標的部位と同一である９０ｎｔの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナー（図２ａを参照のこと）と共に設計および構築した。このヌクレアーゼコンストラクトおよびドナー一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドをヒトｉＰＳ細胞に形質移入した。遺伝子編集効率を定量するため、形質移入から３日後に、標的ゲノム領域に対するペアードエンド・ディープシークエンシングを行った。正確な２ｂｐミスマッチを含むリードのパーセンテージによって相同性修復（ＨＤＲ）効率を測定した。インデルを有するリードのパーセンテージによって非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率を測定した。
【０１１１】
一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドのみをヒトｉＰＳ細胞に送達したところ、最小の相同性修復（ＨＤＲ）率および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）率となったが、ｒｅ−ＴＡＬＥＮおよび一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを送達したところ、１．７％の相同性修復（ＨＤＲ）効率および１．２％の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率が得られた（図２ｂを参照のこと）。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡを一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドと共に導入することにより、１．２％の相同性修復（ＨＤＲ）効率および３．４％の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率が得られた。特筆すべきことに、ゲノム欠失と挿入の率は、２つのｒｅＴＡＬＥＮ結合部位間のスペーサー領域の中央でピークに達したが、一方、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡターゲティング部位のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の３〜４ｂｐ上流でピークに達した（図２ｂを参照のこと）。二本鎖切断がこれらの領域で起こるので、この結果は予期される通りであった。ｒｅ−ＴＡＬＥＮによって生じた６ｂｐというゲノム欠失サイズと３ｂｐという挿入サイズの中央値が観察され、また、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡによって７ｂｐという欠失サイズおよび１ｂｐという挿入の中央値が観察され（図２ｂを参照のこと）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって通常生じるＤＮＡ損傷パターンと一貫性があった（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献４を参照されたい）。次世代シークエンシングプラットフォームの幾つかの分析により、ゲノム編集評価システム（ＧＥＡＳ）は０．００７％という低い相同性修復（ＨＤＲ）検出率を検出することができ、それは非常に再現性に富み（複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）間の変動係数＝±１５％×測定された効率）、且つ、最も一般的に用いられるミスマッチ感受性エンドヌクレアーゼアッセイよりも４００倍敏感である（図８を参照のこと）ことが明らかになった。
【０１１２】
ＣＣＲ５ゲノム座位における１５か所の部位を標的とするｒｅ−ＴＡＬＥＮペアおよびＣａｓ９−ｇＲＮＡを構築して、編集効率を測定した（図２ｃを参照のこと、表３を参照のこと）。これらの部位は、広範囲のＤＮａｓｅＩ感受性を表すために選択された（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献３９を参照されたい）。ヌクレアーゼコンストラクトを、対応する一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナー（表３を参照のこと）と共に、ＰＧＰ１  ヒトｉＰＳ細胞へ形質移入した。形質移入から６日後に、これらの部位におけるゲノム編集効率のプロファイルを作成した（表６）。１５種類のｒｅ−ＴＡＬＥＮペア＋一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーのうちの１３種類について、統計的検出閾値よりも上のレベルで非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同性修復（ＨＤＲ）が検出され、平均非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率は０．４％であり、平均相同性修復（ＨＤＲ）効率は０．６％であった（図２ｃを参照のこと）。加えて、同じターゲティング座位において相同組換え（ＨＲ）効率と非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率との間に統計的に有意な正の相関（ｒ２＝０．８１）が見いだされ（Ｐ＜１×１０−４）（図９ａを参照のこと）、相同性修復（ＨＤＲ）と非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の両方に共通する上流工程である二本鎖切断（ＤＳＢ）生成が、ｒｅＴＡＬＥＮ介在性ゲノム編集の律速工程であることが示唆された。
【０１１３】
対照的に、１５種類全てのＣａｓ９−ｇＲＮＡペアが有意なレベルの非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え（ＨＲ）を示し、平均非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率が３％であり、平均相同性修復（ＨＤＲ）効率が１．０％であった（図２ｃを参照のこと）。加えて、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡによって誘導された非相同末端結合（ＮＨＥＪ）と相同性修復（ＨＤＲ）の効率の間でも正の相関が検出され（図９ｂを参照のこと）（ｒ２＝０．５２、ｐ＝０．００３）、ｒｅＴＡＬＥＮについての観察結果と一貫性があった。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡによって達成された非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率は、ｒｅＴＡＬＥＮによって達成されたものよりも有意に高かった（ｔ検定、ペアードエンド、Ｐ＝０．０２）。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率とｇＲＮＡターゲティング配列の融点との間に、ほどほどではあるが統計的に有意な相関が観察され（図９ｃを参照のこと）（ｒ２＝０．２８、ｐ＝０．０４）、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ介在性二本鎖切断（ＤＳＢ）生成効率における２８％ものばらつきをｇＲＮＡとそのゲノム標的との間の塩基対合の強度によって説明することができることが示唆された。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡは、対応するｒｅＴＡＬＥＮよりも平均して７倍高い非相同末端結合（ＮＨＥＪ）レベルを生じさせたにもかかわらず、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡは対応するｒｅＴＡＬＥＮの相同性修復（ＨＤＲ）レベル（平均値＝０．６％）と類似した相同性修復（ＨＤＲ）レベル（平均値＝１．０％）を達成しただけであった。科学理論に捉われることを望むものではないが、二本鎖切断（ＤＳＢ）における一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド濃度が相同性修復（ＨＤＲ）の律速因子であること、または、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡによって作られるゲノム切断構造が有効な相同性修復（ＨＤＲ）にとって好ましくないことが、これらの結果より示唆され得る。ＤＮａｓｅＩ  ＨＳ（高感受性部位）とゲノムターゲティング効率との間の相関は、どちらの方法についても観察されなかった（図１０を参照のこと）。
【０１１４】
実施例１３
相同性修復（ＨＤＲ）用一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーの設計の最適化
ヒトｉＰＳ細胞における高性能一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを次のように設計した。どれもＣＣＲ５  ｒｅ−ＴＡＬＥＮペア第３番の標的部位のスペーサー領域の中央に同一の２ｂｐのミスマッチを有する、異なる長さ（５０〜１７０ｎｔ）の一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーのセットを設計した。一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド長と共に変化する相同性修復（ＨＤＲ）効率が観察され、９０ｎｔの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドで約１．８％の最適相同性修復（ＨＤＲ）効率が観察され、一方でより長い一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドによって相同性修復（ＨＤＲ）効率が低下した（図３ａを参照のこと）。二本鎖ＤＮＡドナーがヌクレアーゼと共に使用されるときに、相同領域が長いほど相同性修復（ＨＤＲ）率が改善されるので（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献４０を参照されたい）、この結果についてのあり得る理由は、二本鎖ＤＮＡドナーと比べて、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドは代替的なゲノム修復過程において使用されること、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが長くなるほどゲノム修復装置による利用可能性が低下すること、またはより長い一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドはより長い相同性によって得られるあらゆる改善を相殺してしまう負の効果を招くこと、であり得る（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献４１を参照されたい）。しかし、最初の２つの理由のうちのどちらかが当てはまる場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復には一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーが関与しないので、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）率は影響されないか、または一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが長くなるほど増加はずである。しかしながら、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）率は相同性修復（ＨＤＲ）と共に低下することが観察されるため（図３ａを参照のこと）、より長い一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが相殺効果を示すことが示唆された。より長い一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドほど細胞にとって有毒である（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献４２を参照されたい）か、またはより長い一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドの形質移入がＤＮＡプロセシング装置を飽和状態にして、モルＤＮＡ取込量を減少させ、細胞がｒｅ−ＴＡＬＥＮプラスミドを取り込むまたは発現する能力を低下させる、というのがあり得る仮説である。
【０１１５】
一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーが有するミスマッチの組込み率が、ミスマッチから二本鎖切断（「ＤＳＢ」）までの距離によってどのように変化するかを調査した。どれもｒｅ−ＴＡＬＥＮペア第３番のスペーサー領域の中央に同一の２ｂｐのミスマッチ（Ａ）を有する、一連の９０ｎｔの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを設計した。各一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドは、中央から様々な距離に２つ目の２ｂｐミスマッチ（Ｂ）を含むものであった（図３ｂを参照のこと）。中央の２ｂｐミスマッチだけを有する一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを対照として使用した。これらの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドのそれぞれをｒｅ−ＴＡＬＥＮペア第３番と共に個々に導入し、ゲノム編集評価システム（ＧＥＡＳ）によって結果を分析した。我々は、Ａミスマッチが組み込まれた率（Ａのみ、またはＡ＋Ｂ）によって測定される全体の相同性修復（ＨＤＲ）は、Ｂミスマッチが中央から離れるほど、減少することを発見した（図３ｂを参照のこと、図１１ａを参照のこと）。ＢがＡからわずかに１０ｂｐ離れているときに観察されたより高い全体の相同性修復（ＨＤＲ）率は、二本鎖ＤＮＡ切断の近傍のゲノムＤＮＡに対して一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドがアニーリングする必要性がより低いことを反映しているものであり得る。
【０１１６】
ＡからＢの距離それぞれについて、ある割合の相同性修復（ＨＤＲ）事象はＡミスマッチを組み込んだだけであり、別の割合の相同性修復（ＨＤＲ）事象はＡミスマッチとＢミスマッチの両方を組み込むものであった（図３ｂを参照のこと（Ａのみ、およびＡ＋Ｂ））。これらの２つの結果は、一本鎖ＤＮＡオリゴの長さに沿った遺伝子変換トラクトに起因するものであり得（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献４３を参照されたい）、それによってＡミスマッチ＋Ｂミスマッチの組込みがＢミスマッチを越えて延びる長い変換トラクトから生じ、Ａミスマッチのみの組込みがＢに到達しないより短いトラクトから生じた。この解釈の下で、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドに沿った両方向の遺伝子変換長の分布を評価した（図１１ｂを参照のこと）。その評価された分布は、遺伝子変換トラクトの長さが増加するにつれてそれらの頻度が徐々に低下することを示しており、それは二本鎖ＤＮＡドナーについて見られる遺伝子変換トラクト分布と非常に類似する結果であるが、二本鎖ＤＮＡドナーの場合の数百塩基と比べると、一本鎖ＤＮＡドナーの場合数十塩基という非常に圧縮された距離スケールでのことである。この結果と整合して、中央の２ｂｐミスマッチ「Ａ」のどちらの側にも１０ｎｔの間隔で３対の２ｂｐミスマッチを含む一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーを使用する実験により、Ａ単独は場合数のうち８６％で組み込まれ、複数のＢミスマッチは他の場合に組み込まれるパターンが生じた（図１１ｃを参照のこと）。Ｂ単独の組込み事象の数は１０ｂｐ未満のトラクト長の分布を評価するには少なすぎたが、ヌクレアーゼ部位の１０ｂｐ以内の短いトラクト領域が優勢であることは明らかである（図１１ｂを参照のこと）。最後に、単一のＢミスマッチによる全ての実験において、少ない割合のＢ単独組込み事象が見られ（０．０４％〜０．１２％）、これはＡからのＢの距離がどの距離であっても大体において一定である。
【０１１７】
さらに、組込みを観察したままｒｅ−ＴＡＬＥＮ誘導性二本鎖ＤＮＡ切断からどれ位離れて一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーを配置することができるかについての分析を実施した。ｒｅ−ＴＡＬＥＮ誘導性二本鎖ＤＮＡ切断部位からより大きな距離（−６００ｂｐ〜＋４００ｂｐ）離れた範囲を標的とし、中央の２ｂｐミスマッチを有する９０ｎｔの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドのセットを検査した。一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが４０ｂｐ以上離れたところにマッチする場合、我々は、切断領域上にと中央に位置した対照一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドと比較して、３０分の１未満と低い相同性修復（ＨＤＲ）効率を観察した（図３ｃを参照のこと）。観察された低いレベルの組込みは、二本鎖ＤＮＡ切断と無関係の過程に起因し得、このことは、一本鎖ＤＮＡドナー単独によってゲノムが改変される実験に見ることができる（その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献４２を参照されたい）。一方、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが約４０ｂｐ離れているときに存在する相同性修復（ＨＤＲ）の低いレベルは、二本鎖ＤＮＡ切断のミスマッチ含有側のホモロジー低下と二本鎖ＤＮＡ切断の反対側の不充分な一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドオリゴ長の組合せに起因し得る。
【０１１８】
Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ介在性ターゲティング用の一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド  ＤＮＡドナーデザインを検査した。ＡＡＶＳ１座位を標的とするＣａｓ９−ｇＲＮＡ（Ｃ２）を構築し、方向性（Ｏｃ：ｇＲＮＡに対して相補的、およびＯｎ：ｇＲＮＡに対して非相補的）および長さ（３０、５０、７０、９０、１１０ｎｔ）が様々であり得る一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーを設計した。ＯｃはＯｎよりも優れた効率を達成し、７０ｍｅｒのＯｃは１．５％という最適相同性修復（ＨＤＲ）率を達成した（図３ｄを参照のこと）。一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを伴うＣａｓ９由来ニッケース（Ｃｃ：Ｃａｓ９＿Ｄ１０Ａ）が介在した相同性修復（ＨＤＲ）効率はＣ２よりも有意に低い（ｔ検定、ペアードエンド、Ｐ＝０．０２）という事実にもかかわらず、Ｃｃを使用しても同じ一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド鎖バイアスが検出された（図１２を参照のこと）。
【０１１９】
実施例１４
修正された細胞のヒトｉＰＳ細胞クローン単離
ｒｅ−ＴＡＬＥＮペア第３番がヒトｉＰＳ細胞内で正確なゲノム編集を約１％の効率で達成することがゲノム編集評価システム（ＧＥＡＳ）により明らかになったが、この効率は、正確に編集された細胞をクローンのスクリーニングにより通常単離することが可能なレベルである。単一細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞は低い生存度を有する。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献２３に記載の最適化プロトコルを単一細胞ＦＡＣＳ選別法と共に用いて、２５％を超える生存率でヒトｉＰＳ細胞クローンを回収することができる単一ヒトｉＰＳ細胞の選別および維持のための頑健なプラットフォームを構築した。この方法を急速高効率遺伝子型判定システムと組み合わせて、１時間の単一試験管反応において染色体ＤＮＡ抽出および標的ゲノム増幅を行い、編集されたヒトｉＰＳ細胞の大規模遺伝子型判定を可能にした。まとめると、これらの方法は、ゲノム編集されたヒトｉＰＳ細胞を選択無しに強力に得るためのパイプラインを含む。
【０１２０】
この系を実証するため（図４ａを参照のこと）、第３部位における、ＣＣＲ５を標的とするｒｅ−ＴＡＬＥＮのペアおよび一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドをＰＧＰ１  ヒトｉＰＳ細胞に形質移入した（表３を参照のこと）。形質移入された細胞の一部を用いてゲノム編集評価システム（ＧＥＡＳ）を行い、１．７％という相同性修復（ＨＤＲ）頻度を見出した（図４ｂを参照のこと）。選別された単一細胞クローンの２５％の回収度と共にこの情報によって、９８％のポワソン確率（μ＝０．０１７×０．２５×φθ×５×２と仮定）で、５枚の９６ウェルプレートから少なくとも１つの正確に編集されたクローンが得られるという評価が可能になる。形質移入から６日後にヒトｉＰＳ細胞をｆａｃｓ選別し、選別から８日後に１００個のヒトｉＰＳ細胞クローンをスクリーニングした。これらの選択されていないヒトｉＰＳ細胞コロニーのうちの１００個につき２個が、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーによって導入される２ｂｐの変異を有するヘテロ接合性の遺伝子型を含むことが、サンガーシークエンシングにより明らかになった（図４ｃを参照のこと）。１％というターゲティング効率（１％＝２／２×１００、スクリーニングされた１００個の細胞のうちの２個の単アレル性修正クローン）は、次世代シークエンシング解析（１．７％）と一致した（図４ｂを参照のこと）。結果生じたヒトｉＰＳ細胞の多能性が、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０についての免疫染色によって確認された（図４ｄを参照のこと）。ターゲティングに成功したヒトｉＰＳ細胞クローンは、３種類全ての胚葉の特徴を有する成熟テラトーマを形成することができた（図４ｅを参照のこと）。
【０１２１】
実施例１５
連続的細胞ゲノム編集の方法
ある態様によると、細胞（ヒト細胞など、例えばヒト幹細胞）におけるゲノム編集のための方法であって、標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断する酵素をコードする核酸を含むように、細胞を遺伝的に改変する方法が提供される。そのような酵素には、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質、例えばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質、が含まれる。例示的酵素の一つはＣａｓ９である。この態様によると、前記細胞は前記酵素を発現し、前記細胞の周囲の媒体から前記細胞へガイドＲＮＡが提供される。ガイドＲＮＡと前記酵素は共局在複合体を前記標的ＤＮＡのところで形成し、そこで前記酵素は該ＤＮＡを切断する。所望により、該切断部位において前記ＤＮＡに挿入されるためのドナー核酸が存在してもよく、前記挿入は、例えば非相同末端結合または相同組換えによる。１つの態様によると、前記標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断する酵素（例えばＣａｓ９）をコードする核酸は、プロモーターの影響下にあり、例えば前記核酸が活性化および発現抑制（ｓｉｌｅｎｃｅ）され得る。そのようなプロモーターは当業者によく知られている。１つの例示的プロモーターはｄｏｘ（ドキシサイクリン）誘導性プロモーターである。１つの態様によると、前記細胞は、前記標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断する酵素をコードする核酸が、細胞のゲノムに可逆的に挿入されていることにより、遺伝的に改変されている。挿入されると、トランスポゼースなどの試薬を使用してその核酸を除去することができる。このように該核酸は使用後に容易に除去することができる。
【０１２２】
１つの態様によると、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用するヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）における連続ゲノム編集システムが提供される。例示的態様によると、前記方法は、ゲノムに可逆的に挿入されたＣａｓ９を有するヒトｉＰＳ細胞株（Ｃａｓ９−ｈｉＰＳＣ）、および前記Ｃａｓ９と共に使用されるために前記細胞の周囲の媒体から前記細胞中への移行を可能にするよう天然型から改変されたｇＲＮＡ、の使用を含む。そのようなｇＲＮＡは、ホスフェート基を取り除くようにホスファターゼで処理されている。組織培養培地中にホスファターゼ処理されたｇＲＮＡを添加することにより、Ｃａｓ９を用いて前記細胞におけるゲノム編集を行う。このアプローチにより、一日の処理によって最大５０％の効率でヒトｉＰＳ細胞における無痕性ゲノム編集が可能となり、これはこれまでに報告されている最良の効率の２〜１０倍効率的である。さらに、前記方法は使いやすく、細胞毒性が著しく少なくなっている。本開示の実施形態は生物学的研究用途および治療用途のためのヒトｉＰＳ細胞の単一編集、生物学的研究用途および治療用途のためのヒトｉＰＳ細胞の多重編集、指向性ヒトｉＰＳ細胞進化、ならびにヒトｉＰＳ細胞およびその派生細胞の表現型スクリーニングを含む。
【０１２３】
ある態様によると、幹細胞に加え、本明細書に記載される他の細胞株および生物も使用することができる。例えば、本明細書に記載される方法をマウス細胞またはラット細胞などの動物細胞に用いることができ、それにより、Ｃａｓ９が安定に組み込まれたマウス細胞およびラット細胞を作製することができ、また、ホスファターゼ処理されたｇＲＮＡを前記細胞の周囲の媒体から局所的に導入することにより、組織特異的ゲノム編集を行うことができる。また、多数の細胞株および生物に他のＣａｓ９誘導体を挿入することができ、配列特異的ニック形成、遺伝子活性化、抑制、およびエピジェネティック改変などの標的化ゲノム改変を行うことができる。
【０１２４】
本開示のいくつかの態様は、ゲノムに挿入されたＣａｓ９を用いて安定なヒトｉＰＳ細胞を作製することに関する。本開示のいくつかの態様は、ＲＮＡが、細胞の免疫応答を回避しつつ、細胞壁を通じて細胞に侵入およびＣａｓ９と共局在することを可能にするようＲＮＡを改変することに関する。そのような改変型ガイドＲＮＡは、最小の毒性で、最適形質移入効率を達成することができる。本開示のいくつかの態様は、ホスファターゼ処理されたｇＲＮＡを使用する、Ｃａｓ９−ヒトｉＰＳ細胞における最適化ゲノム編集に関する。本開示のいくつかの態様は、無痕性ゲノム編集を達成するためのヒトｉＰＳ細胞からのＣａｓ９の除去を含み、その場合にＣａｓ９をコードする核酸は前記細胞ゲノム内に可逆的に配置されている。本開示のいくつかの態様は、ゲノムに挿入されたＣａｓ９を有するヒトｉＰＳ細胞を使用して所望の遺伝的変異を形成する、生体医学エンジニアリングを含む。そのような改変されたヒトｉＰＳ細胞は多能性を維持し、患者細胞株の表現型を完全に再現する様々な細胞種（心筋細胞など）へ成功裏に分化することができる。
【０１２５】
本開示のいくつかの態様は、多重ゲノム編集用のホスファターゼ処理されたｇＲＮＡのライブラリーを含む。本開示のいくつかの態様は、それぞれ１個から数個の指定された変異をゲノム中に有し、薬品スクリーニング用のリソースとして機能し得る、ＰＧＰ細胞株のライブラリーを作製することを含む。本開示のいくつかの態様は、レトロトランスエレメントの位置および活性を追跡するため、全てのレトロトランスエレメントが種々の配列でバーコード化された、ＰＧＰ１細胞株を作製することを含む。
【０１２６】
実施例１６
ゲノムに挿入されたＣａｓ９を有する安定なヒトｉＰＳ細胞の作製
Ｃａｓ９がｄｏｘ誘導性プロモーターの下にコードされ、Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゼースの助けによってゲノムに挿入除去可能なＰｉｇｇｙｂａｃベクター内にコンストラクトを配置した。ＰＣＲ反応によって、該ベクターの安定な挿入を確認した（図１４を参照のこと）。ＲＴ−ＱＰＣＲにより誘導性Ｃａｓ９発現を判定した。Ｃａｓ９のｍＲＮＡレベルは、培地中に１ｕｇ／ｍＬのＤＯＸを添加してから８時間後に１０００倍に増加し、Ｃａｓ９のｍＲＮＡのレベルはＤＯＸの除去から約２０時間後に正常レベルまで低下した（図１５を参照のこと）。
【０１２７】
１つの態様によると、前記Ｃａｓ９−ヒトｉＰＳ細胞システムベースのゲノム編集は、ヒトｉＰＳ細胞における形質移入効率が通常は１％未満である大きなコンストラクトであるＣａｓ９プラスミド／ＲＮＡの形質移入手順、を迂回する。本Ｃａｓ９−ヒトｉＰＳ細胞システムは、ヒト幹細胞において高効率のゲノムエンジニアリングを実施するためのプラットフォームとして役立ち得る。加えて、Ｐｉｇｇｙｂａｃシステムを使用してヒトｉＰＳ細胞に導入された前記Ｃａｓ９カセットは、トランスポゼースの導入によって容易にゲノムから除去することができる。
【０１２８】
実施例１７
ホスファターゼ処理されたガイドＲＮＡ
Ｃａｓ９−ヒトｉＰＳ細胞での連続ゲノム編集を可能にするため、ｇＲＮＡをコードする一連の改変ＲＮＡを作製し、リポソームと複合してＣａｓ９−ｉＰＳ培養培地に添加した。どのようなキャッピングも有しないホスファターゼ処理された未改変ＲＮＡは、１３％という最適相同性修復（ＨＤＲ）効率を達成したが、これは、これまでに報告された５’キャップ付加改変ＲＮＡよりも３０倍高いものである（図１６を参照のこと）。
【０１２９】
１つの態様によると、ガイドＲＮＡは物理的にドナーＤＮＡに結合している。これにより、Ｃａｓ９介在性ゲノム切断と一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド介在性相同性修復（ＨＤＲ）を連結し、そうして配列特異的ゲノム編集を促進する方法が提供される。最適な濃度のＤＮＡ  一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーと結合したｇＲＮＡは、４４％の相同性修復（ＨＤＲ）および２％の非特異的非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を達成した（図１７を参照のこと）。この方法がヌクレオフェクションまたはエレクトロポレーションで観察されるような目に見える毒性を招かないことは、特筆すべきことである。
【０１３０】
１つの態様によると、本開示はｇＲＮＡをコードし、ゲノム中に挿入されたＣａｓ９と協同して高い形質移入効率、ゲノム編集効率を達成する、インビトロ改変ＲＮＡ構造体を提供する。加えて本開示は、ゲノム切断事象を相同性指向性組換え反応と結びつけるｇＲＮＡ−ＤＮＡキメラコンストラクトを提供する。
【０１３１】
実施例１８
無痕性ゲノム編集を達成するための、可逆的に改変されたＣａｓ９のヒトｉＰＳ細胞からの除去
ある態様によると、可逆的ベクターを使用してヒトｉＰＳ細胞のゲノムにＣａｓ９カセットが挿入される。したがって、ＰｉｇｇｙＢａｃベクターを使用してヒトｉＰＳ細胞のゲノムにＣａｓ９カセットを可逆的に挿入した。ゲノム編集されたヒトｉＰＳ細胞にトランスポゼースをコードするプラスミドを形質移入することにより前記細胞からＣａｓ９カセットを除去した。したがって、本開示のいくつかの態様は、当業者に知られた可逆的ベクターの使用を含んでいる。可逆的ベクターは、例えばゲノムに挿入可能であり、後に対応するベクター除去酵素によって除去可能であるベクターである。そのようなベクターおよび対応するベクター除去酵素は当業者に知られている。コロニー化ｉＰＳ細胞に対してスクリーニングを行い、ＰＣＲ反応によって確認されるように、Ｃａｓ９カセットを欠くコロニーを回収した。したがって、本開示は、細胞に存在する恒久的なＣａｓ９カセットを有することにより、ゲノムの残りの部分に影響を与えることが無いゲノム編集方法を提供する。
【０１３２】
実施例１９
ｉＰＧＰ１細胞におけるゲノム編集
心筋症の発病の研究は適切なモデル系の欠如によって歴史的に妨げられてきた。患者由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の心筋細胞分化がこの障壁を乗り越える１つの有望な道筋を提示しており、心筋症のｉＰＳ細胞モデリングの報告が現れ始めたところである。しかしながら、この見込みの実現には、患者由来ｉＰＳ細胞株の遺伝的異質性を克服するためのアプローチが必要とされる。
【０１３３】
Ｃａｓ９−ｉＰＧＰ１細胞株およびＤＮＡに結合したホスファターゼ処理されたガイドＲＮＡを使用して、バース症候群患者における単一ヌクレオチド欠失を担持すると特定されたＴＡＺエクソン６の配列を除いて同質遺伝子系統である３つのｉＰＳ細胞株を作製した。一回のＲＮＡ形質移入により、約３０％の相同性修復（ＨＤＲ）効率が達成された。所望の変異を有する改変Ｃａｓ９−ｉＰＧＰ１細胞をコロニー化し（図１８を参照のこと）、前記細胞株を心筋細胞に分化させた。前記改変Ｃａｓ９−ｉＰＧＰ１に由来する心筋細胞は、患者由来ｉＰＳ細胞および新生児期ラットＴＡＺノックダウンモデルにおいて観察されるカルジオリピン、ミトコンドリアおよびＡＴＰの欠陥を充分に再現した（図１９を参照のこと）。したがって、多能性細胞において疾患の原因となる変異を修正し、引き続いて該細胞を所望の細胞種に分化させる方法が提供される。
【０１３４】
実施例２０
材料および方法
１．  ＰｉｇｇｙＢａｃ  Ｃａｓ９  ｄｏｘ誘導性安定ヒトｉＰＳ／ＥＳ株の構築
１．  細胞が７０％の集密に達した後に、培養物を１０ｕＭの終濃度のＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２で一晩前処理する。
２．  翌日、１．５ｍｌの滅菌エッペンドルフチューブ中で８２μｌのヒト幹細胞ヌクレオフェクター溶液と１８ｕｌの添加物１を混合してヌクレオフェクション溶液を調製する。よく混合する。溶液を３７℃で５分間保温する。
３．  ｍＴｅＳＲ１を吸引し、６ウェルプレートのウェル当たり２ｍＬのＤＰＢＳで前記細胞を穏やかに洗浄する。
４．  ＤＰＢＳを吸引し、２ｍＬ／ウェルのヴェルセン（Ｖｅｒｓｅｎｅ）を添加し、細胞が丸みを帯びて接着が緩くなるが、離れてはいない状態になるまでその培養物を３７℃のインキュベーターに戻す。これには３〜７分が必要とされる。
５．  ヴェルセン（Ｖｅｒｓｅｎｅ）を穏やかに吸引し、ｍＴｅＳＲ１を添加する。１ｍｌのｍＴｅＳＲ１を添加し、１，０００ｕＬのマイクロピペットにより前記細胞の上でｍＴｅＳＲ１を穏やかに流動させることでそれらの細胞を剥がす。
６．  剥がされた細胞を回収し、該細胞を単一細胞懸濁液へと穏やかにすりつぶし（ｔｒｉｔｕｒａｔｅ）て、そして血球計算板により定量し、そして細胞密度をｍｌ当たり１００万細胞に調節する。
７．  １ｍｌの細胞懸濁液を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、卓上遠心機で１１００ＲＰＭで５分間遠心分離する。
８．  工程２の１００μｌのヒト幹細胞ヌクレオフェクター溶液中に細胞を再懸濁する。
９．  １ｍｌのピペットチップを使用して細胞をヌクレオフェクターキュベットに移す。前記キュベット中の細胞懸濁液に、１μｇのプラスミドトランスポゾナーゼおよび５ｕｇのＰＢ  Ｃａｓ９プラスミドを添加する。穏やかに回旋して細胞とＤＮＡを混合する。
１０．  前記キュベットをヌクレオフェクターに入れる。プログラムＢ−０１６が選択された。ボタンＸを押して細胞をヌクレオフェクトする。
１１．  ヌクレオフェクション後に、ＲＯＣＫ阻害剤を有する５００ｕｌのｍＴｅＳＲ１培地を前記キュベット中に添加する。
１２．  提供されたパスツールプラスチックピペットを使用して、前記キュベットからヌクレオフェクトされた細胞を吸引する。そしてＲＯＣＫ阻害剤を含むｍＴｅＳＲ１培地の６ウェルプレートのマトリゲルコートウェルに細胞を滴下して移す。それらの細胞を３７℃で一晩培養する。
１３．  翌日および形質移入から７２時間後に、培地をｍＴｅｓｒ１に変える。１ｕｇ／ｍｌの終濃度でピューロマイシンを添加する。そして株は７日以内に樹立される。
【０１３５】
２．  ＲＮＡの調製
１．  ｇＲＮＡコード配列の上流にＴ７プロモーターを有するＤＮＡ鋳型を調製する。
２．  メガクリア・ピューリフィケーションを使用して前記ＤＮＡを精製し、濃度を標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）する。
３．  様々なｇＲＮＡ作製のためのオーダーメイド（ｃｕｓｔｏｍ）のＮＴＰ混合物を調製する。
【０１３６】
【表７−１】
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【０１３７】
【表７−２】
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【０１３８】
【表７−３】
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【０１３９】
【表７−４】
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【０１４０】
４．  インビトロ転写ミックスを室温で調製する。
【０１４１】
【表８】
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【０１４２】
５．  ３７℃（サーモサイクラー）で４時間（３〜６時間でｏｋ）インキュベートする。
６．  各試料に２μｌのＴｕｒｂｏ  ＤＮＡｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ社のＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔキット）を添加する。穏やかに混合し、３７℃で１５分間インキュベートする。
７．  Ａｍｂｉｏｎ社のメガクリアを製造業者の指示に従って使用して、ＤＮＡｓｅ処理反応産物を精製する。
８．  メガクリアを使用してＲＮＡを精製する（精製したＲＮＡは、−８０℃で数ヶ月保存することができる）。
９．  宿主細胞のＴｏｌｌ２免疫反応を回避するために、ホスフェート基を除去する。
【０１４３】
【表９】
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【０１４４】
３．  ＲＮＡ形質移入
１．  抗生物質を使用せずに４８ウェル当たり１０〜２０Ｋの細胞を播種する。形質移入用に、細胞は３０〜５０％コンフルエントであるべきである。
２．  形質移入の少なくとも２時間前に、前記細胞培地をＢ１８Ｒ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ＤＯＸ（１ｕｇ／ｍｌ）、ピューロマイシン（２ｕｇ／ｍｌ）を含むものに変更する。
３．  ｇＲＮＡ（０．５ｕｇ〜２ｕｇ）、ドナーＤＮＡ（０．５ｕｇ〜２ｕｇ）およびＲＮＡｉＭａｘを含む形質移入試薬を調製し、その混合物を室温で１５分間インキュベートし、そして前記細胞に移入する。
【０１４５】
４．  単一ヒトｉＰＳ細胞播種および単一クローンピックアップ
１．  ｄｏｘ誘導から４日後およびｄｏｘ除去から１日後に培地を吸引し、ＤＰＢＳで穏やかに洗浄する。２ｍＬ／ウェルのヴェルセン（Ｖｅｒｓｅｎｅ）を添加し、細胞が丸みを帯びて接着が緩くなるが、離れてはいない状態になるまでその培養物を３７℃のインキュベーターに戻す。これには３〜７分が必要である。
２．  ヴェルセン（Ｖｅｒｓｅｎｅ）を穏やかに吸引し、ｍＴｅＳＲ１を添加する。１ｍｌのｍＴｅＳＲ１を添加し、前記細胞の上で１，０００ｕＬのマイクロピペットによりｍＴｅＳＲ１を穏やかに流動させることでそれらの細胞を剥がす。
３．  剥がされた細胞を回収し、それらの細胞を単一細胞懸濁液へと穏やかにすりつぶし、血球計算板により定量し、そして細胞密度をｍｌ当たり１００Ｋの細胞となるよう調節する。
４．  ｍＴｅＳＲ１およびＲＯＣＫ阻害剤を含むマトリゲルコート１０ｃｍディッシュに、前記細胞を、１０ｃｍディッシュ当たり５０Ｋ、１００Ｋ、および４００Ｋの細胞密度で播種する。
【０１４６】
５．  単一細胞形成クローンのスクリーニング
１．  １０ｃｍディッシュで１２日間培養してクローンが肉眼で特定するのに十分に大きくなった後に、大腸マーカーでクローンを標識する。クローンが大きくなりすぎて相互に接着しないようにすること。
２．  培養フードに前記１０ｃｍディッシュを配置し、フィルターチップ付きのＰ２０ピペットを（１０ｕｌに設定して）使用して２４ウェルプレートの１つのウェルについて１０ｕｌの培地を吸引する。クローンを引っ掻いて細かくすることによりクローンをピックアップし、２４ウェルプレートの１つのウェルに移す。クローン毎にフィルターチップを変える。
３．  ４〜５日後に、２４ウェルプレートの１つのウェルの中のクローンが分割するのに十分なほど大きくなる。
４．  培地を吸引し、２ｍＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄する。
５．  ＤＰＢＳを吸引し、２５０ｕｌ／ウェルのディスパーゼ（０．１Ｕ／ｍＬ）と置き換え、前記細胞をディスパーゼ中において３７℃で７分間インキュベートする。
６．  ディスパーゼを２ｍｌのＤＰＢＳで置き換える。
７．  ２５０ｕｌのｍＴｅＳＲ１を添加する。セルスクレーパーを使用して前記細胞を剥がし、前記細胞を回収する。
８．  マトリゲルコート２４ウェルプレートのウェルに、１２５ｕｌの細胞懸濁液を移す。
９．  ゲノムＤＮＡ抽出用に、１２５ｕｌの細胞懸濁液を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移す。
【０１４７】
６．  クローンのスクリーニング
１．  工程７．７のチューブを遠心分離する。
２．  培地を吸引し、ウェル当たり２５０ｕｌの溶解バッファー（１０ｍＭのトリスｐＨ７．５（または８．０）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭ）を添加する。
３．ＮａＣｌ＋１０％のＳＤＳ＋４０ｕｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（前記バッファーを使用する前に新しく添加）。
４．  一晩５５でインキュベートする。
５．  ２５０ｕｌのイソプロパノールを添加してＤＮＡを沈殿させる。
６．  高速で３０分間遠心分離する。７０％のエタノールで洗浄する。
７．  エタノールを穏やかに除去する。５分間風乾する。
８．  １００〜２００ｕｌのｄＨ２ＯでｇＤＮＡを再懸濁する。
９．  特定のプライマーを用いる標的ゲノム領域のＰＣＲ増幅。
１０．  各プライマーを用いるＰＣＲ産物のサンガーシークエンシング。
１１．  サンガー配列データの分析および標的クローンの増殖。
【０１４８】
７．  Ｐｉｇｇｙｂａｃベクターの除去
１．  工程２．１〜２．９を反復する。
２．  １ｍｌのピペットチップを使用して細胞をヌクレオフェクターキュベットに移す。前記キュベット中の細胞懸濁液に２μｇのトランスポゾナーゼのプラスミドを添加する。穏やかに回旋して細胞とＤＮＡを混合する。
３．  工程２．１０〜２．１１を反復する。
４．  提供されたパスツールプラスチックピペットを使用して前記キュベットからヌクレオフェクトされた細胞を吸引する。そしてｍＴｅＳＲ１培地およびＲＯＣＫ阻害剤を含む１０ｃｍディッシュのマトリゲルコートウェルに細胞を滴下して移す。該細胞を３７℃で一晩培養する。
５．  翌日、培地をｍＴｅｓｒ１に変え、後続の４日間培地を毎日交換する。
６．  クローンが充分に大きくなった後で２０〜５０クローンをピックアップし、２４ウェルに播種する。
７．  ＰＢ  Ｃａｓ９  ＰｉｇｇｙＢａｃベクタープライマーおよび増殖陰性クローンを用いて、それらのクローンの遺伝子型を判定する。
【０１４９】
参考文献
参考文献は、本明細書を通じて以下の番号によって指定され、あたかも本明細書において完全に説明されたかのように本明細書に取り込まれる。後続の参考文献の各々は、その全体がここに参照により取り込まれる。
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本発明の実施形態は以下を含む。
＜１＞
反復配列を１００ｂｐ以上欠くＴＡＬＥＮを細胞に導入することを含み、前記ＴＡＬＥＮが標的ＤＮＡを切断し、前記細胞が非相同末端結合を起こして前記細胞内で改変ＤＮＡを産生する、細胞内で標的ＤＮＡを改変する方法。
＜２＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を９０ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜３＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を８０ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜４＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を７０ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜５＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を６０ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜６＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を５０ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜７＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を４０ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜８＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を３０ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜９＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を２０ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜１０＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１９ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜１１＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１８ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜１２＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１７ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜１３＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１６ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜１４＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１５ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜１５＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１４ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜１６＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１３ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜１７＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１２ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜１８＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１１ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜１９＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１０ｂｐ以上欠く、＜１＞に記載の方法。
＜２０＞
前記細胞が真核細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜２１＞
前記細胞が酵母細胞、植物細胞または動物細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜２２＞
前記細胞が体細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜２３＞
前記細胞が幹細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜２４＞
前記細胞がヒト幹細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜２５＞
前記ＴＡＬＥＮをコードする第１外来性核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記ＴＡＬＥＮが発現し、前記ＴＡＬＥＮが前記標的ＤＮＡを切断して前記細胞内で改変ＤＮＡを産生する、＜１＞に記載の方法。
＜２６＞
前記ＴＡＬＥＮをコードする第１外来性核酸を含むウイルスを前記細胞に導入することを含み、
前記ＴＡＬＥＮが発現し、前記ＴＡＬＥＮが前記標的ＤＮＡを切断して前記細胞内で改変ＤＮＡを産生する、＜１＞に記載の方法。
＜２７＞
ＣＴＡＡＣＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＴＣＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＣＧＧＧＧＧＣＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＴＴＧＡＧＡＣＣＧＴＴＣＡＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＡＧＣＣＣＡＴＧＧＡＴＴＧＡＣＴＣＣＧＧＡＧＣＡＡＧＴＣＧＴＣＧＣＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＴＡＣＴＴＴＧＴＣＡＧＧＣＧＣＡＴＧＧＴＣＴＣＡＣＣＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＴＴＧＴＣＧＣＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＡＡＴＡＴＡＧＧＣＧＧＴＡＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＴＧＣＡＡＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＴＧＴＣＡＧＧＣＴＣＡＣＧＧＴＣＴＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＴＴＧＴＣＧＣＧＡＴＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＧＧＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧＴＴＧＴＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣＡＣＡＴＧＧＧＴＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＴＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＡＴＡＡＣＧＧＧＧＧＴＡＡＡＣＡＧＧＣＴＴＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＡＣＡＧＣＧＧＴＴＡＴＴＧＣＣＧＧＴＣＣＴＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＡＣＴＴＡＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＴＧＣＡＡＴＴＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣＡＡＧＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＴＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＴＴＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＴＡＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＡＧＣＧＡＣＴＴＣＴＣＣＣＡＧＴＴＴＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＧＧＧＣＴＡＡＣＣＣＣＣＧＡＧＣＡＡＧＴＡＧＴＴＧＣＣＡＴＡＧＣＡＡＧＣＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＣＡＧＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＣＧＧＴＡＣＴＣＴＧＴＣＡＧＧＣＡＣＡＣＧＧＴＣＴＡＡＣＴＣＣＧＧＡＡＣＡＧＧＴＣＧＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＧＣＣＴＧＴＧＴＴＡＴＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡＴＧＧＣＣＴＣＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＣＧＴＴＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴＣＧＧＣＧＧＡＡＡＧＣＡＡＧＣＴＣＴＣＧＡＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＡＧＴＣＣＴＡＴＧＴＣＡＡＧＣＴＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＣＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＴＧＧＣＡＡＴＣＧＣＡＴＣＴＣＡＣＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＧＴＣＣＡＡＡＧＡＴＴＧＴＴＡＣＣＣＧＴＡＣＴＡＴＧＣＣＡＡＧＣＧＣＡＴＧＧＴＴＴＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＴＴＧＴＧＧＣＴＡＴＴＧＣＡＴＣＴＡＡＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＧＣＣＴＴＧＧＡＧＡＣＡＧＴＧＣＡＡＣＧＡＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＡＧＧＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＴＣＧＴＡＧＣＴＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＴＡＧＧＴＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＡＡＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＡＣＡＣＧＧＧＴＴＧＡＣＡＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＴＧＣＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＡＣＣＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＧＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＧＧＣＴＣＡＴＧＧＧＣＴＣＡＣＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＴＣＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＡＧＣＧＣＴＴＧＡＡＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＡＣＧＧＡＣＴＣＡＣＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＧＴＧＧＴＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＡＣＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＴＧＴＣＡＡＧＣＧＣＡＣＧＧＣＣＴＣＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＡＡＣＡＡＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＡのＴＡＬＥ配列または該ＴＡＬＥ配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する前記ＴＡＬＥＮをコードする第１外来性核酸を、前記細胞に導入することを含み、
前記ＴＡＬＥＮが発現し、前記ＴＡＬＥＮが前記標的ＤＮＡを切断して前記細胞内で改変ＤＮＡを産生する、＜１＞に記載の方法。
＜２８＞
ＣＴＡＡＣＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＴＣＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＣＧＧＧＧＧＣＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＴＴＧＡＧＡＣＣＧＴＴＣＡＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＡＧＣＣＣＡＴＧＧＡＴＴＧＡＣＴＣＣＧＧＡＧＣＡＡＧＴＣＧＴＣＧＣＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＴＡＣＴＴＴＧＴＣＡＧＧＣＧＣＡＴＧＧＴＣＴＣＡＣＣＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＴＴＧＴＣＧＣＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＡＡＴＡＴＡＧＧＣＧＧＴＡＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＴＧＣＡＡＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＴＧＴＣＡＧＧＣＴＣＡＣＧＧＴＣＴＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＴＴＧＴＣＧＣＧＡＴＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＧＧＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧＴＴＧＴＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣＡＣＡＴＧＧＧＴＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＴＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＡＴＡＡＣＧＧＧＧＧＴＡＡＡＣＡＧＧＣＴＴＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＡＣＡＧＣＧＧＴＴＡＴＴＧＣＣＧＧＴＣＣＴＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＡＣＴＴＡＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＴＧＣＡＡＴＴＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣＡＡＧＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＴＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＴＴＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＴＡＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＡＧＣＧＡＣＴＴＣＴＣＣＣＡＧＴＴＴＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＧＧＧＣＴＡＡＣＣＣＣＣＧＡＧＣＡＡＧＴＡＧＴＴＧＣＣＡＴＡＧＣＡＡＧＣＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＣＡＧＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＣＧＧＴＡＣＴＣＴＧＴＣＡＧＧＣＡＣＡＣＧＧＴＣＴＡＡＣＴＣＣＧＧＡＡＣＡＧＧＴＣＧＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＧＣＣＴＧＴＧＴＴＡＴＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡＴＧＧＣＣＴＣＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＣＧＴＴＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴＣＧＧＣＧＧＡＡＡＧＣＡＡＧＣＴＣＴＣＧＡＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＡＧＴＣＣＴＡＴＧＴＣＡＡＧＣＴＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＣＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＴＧＧＣＡＡＴＣＧＣＡＴＣＴＣＡＣＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＧＴＣＣＡＡＡＧＡＴＴＧＴＴＡＣＣＣＧＴＡＣＴＡＴＧＣＣＡＡＧＣＧＣＡＴＧＧＴＴＴＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＴＴＧＴＧＧＣＴＡＴＴＧＣＡＴＣＴＡＡＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＧＣＣＴＴＧＧＡＧＡＣＡＧＴＧＣＡＡＣＧＡＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＡＧＧＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＴＣＧＴＡＧＣＴＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＴＡＧＧＴＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＡＡＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＡＣＡＣＧＧＧＴＴＧＡＣＡＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＴＧＣＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＡＣＣＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＧＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＧＧＣＴＣＡＴＧＧＧＣＴＣＡＣＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＴＣＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＡＧＣＧＣＴＴＧＡＡＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＡＣＧＧＡＣＴＣＡＣＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＧＴＧＧＴＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＡＣＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＴＧＴＣＡＡＧＣＧＣＡＣＧＧＣＣＴＣＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＡＡＣＡＡＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＡのＴＡＬＥ配列または該ＴＡＬＥ配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する前記ＴＡＬＥＮをコードする第１外来性核酸を含むウイルスを、前記細胞に導入することを含み、
前記ＴＡＬＥＮが発現し、前記ＴＡＬＥＮが前記標的ＤＮＡを切断して前記細胞内で改変ＤＮＡを産生する、＜１＞に記載の方法。
＜２９＞
細胞内で反復配列を１００ｂｐ以上欠くＴＡＬＥＮとドナー核酸配列とを組み合わせることを含み、前記ＴＡＬＥＮが標的ＤＮＡを切断し、前記ドナー核酸配列が前記細胞内で前記ＤＮＡに挿入される、細胞内で標的ＤＮＡを改変する方法。
＜３０＞
前記細胞が非相同末端結合を起こして前記細胞内で改変ＤＮＡを産生する、＜２９＞に記載の方法。
＜３１＞
前記細胞が相同組換えを起こして前記細胞内で改変ＤＮＡを産生する、＜２９＞に記載の方法。
＜３２＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を９０ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜３３＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を８０ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜３４＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を７０ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜３５＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を６０ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜３６＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を５０ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜３７＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を４０ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜３８＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を３０ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜３９＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を２０ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜４０＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１９ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜４１＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１８ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜４２＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１７ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜４３＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１６ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜４４＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１５ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜４５＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１４ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜４６＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１３ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜４７＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１２ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜４８＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１１ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜４９＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１０ｂｐ以上欠く、＜２９＞に記載の方法。
＜５０＞
前記細胞が真核細胞である、＜２９＞に記載の方法。
＜５１＞
前記細胞が酵母細胞、植物細胞または動物細胞である、＜２９＞に記載の方法。
＜５２＞
前記細胞が体細胞である、＜２９＞に記載の方法。
＜５３＞
前記細胞が幹細胞である、＜２９＞に記載の方法。
＜５４＞
前記細胞がヒト幹細胞である、＜２９＞に記載の方法。
＜５５＞
前記ＴＡＬＥＮをコードする第１外来性核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記ＴＡＬＥＮが発現し、前記ＴＡＬＥＮが前記標的ＤＮＡを切断して前記細胞内で改変ＤＮＡを産生する、＜２９＞に記載の方法。
＜５６＞
前記ＴＡＬＥＮをコードする第１外来性核酸を含むウイルスを前記細胞に導入することを含み、
前記ＴＡＬＥＮが発現し、前記ＴＡＬＥＮが前記標的ＤＮＡを切断して前記細胞内で改変ＤＮＡを産生する、＜２９＞に記載の方法。
＜５７＞
ＣＴＡＡＣＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＴＣＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＣＧＧＧＧＧＣＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＴＴＧＡＧＡＣＣＧＴＴＣＡＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＡＧＣＣＣＡＴＧＧＡＴＴＧＡＣＴＣＣＧＧＡＧＣＡＡＧＴＣＧＴＣＧＣＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＴＡＣＴＴＴＧＴＣＡＧＧＣＧＣＡＴＧＧＴＣＴＣＡＣＣＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＴＴＧＴＣＧＣＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＡＡＴＡＴＡＧＧＣＧＧＴＡＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＴＧＣＡＡＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＴＧＴＣＡＧＧＣＴＣＡＣＧＧＴＣＴＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＴＴＧＴＣＧＣＧＡＴＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＧＧＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧＴＴＧＴＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣＡＣＡＴＧＧＧＴＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＴＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＡＴＡＡＣＧＧＧＧＧＴＡＡＡＣＡＧＧＣＴＴＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＡＣＡＧＣＧＧＴＴＡＴＴＧＣＣＧＧＴＣＣＴＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＡＣＴＴＡＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＴＧＣＡＡＴＴＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣＡＡＧＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＴＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＴＴＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＴＡＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＡＧＣＧＡＣＴＴＣＴＣＣＣＡＧＴＴＴＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＧＧＧＣＴＡＡＣＣＣＣＣＧＡＧＣＡＡＧＴＡＧＴＴＧＣＣＡＴＡＧＣＡＡＧＣＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＣＡＧＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＣＧＧＴＡＣＴＣＴＧＴＣＡＧＧＣＡＣＡＣＧＧＴＣＴＡＡＣＴＣＣＧＧＡＡＣＡＧＧＴＣＧＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＧＣＣＴＧＴＧＴＴＡＴＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡＴＧＧＣＣＴＣＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＣＧＴＴＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴＣＧＧＣＧＧＡＡＡＧＣＡＡＧＣＴＣＴＣＧＡＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＡＧＴＣＣＴＡＴＧＴＣＡＡＧＣＴＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＣＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＴＧＧＣＡＡＴＣＧＣＡＴＣＴＣＡＣＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＧＴＣＣＡＡＡＧＡＴＴＧＴＴＡＣＣＣＧＴＡＣＴＡＴＧＣＣＡＡＧＣＧＣＡＴＧＧＴＴＴＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＴＴＧＴＧＧＣＴＡＴＴＧＣＡＴＣＴＡＡＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＧＣＣＴＴＧＧＡＧＡＣＡＧＴＧＣＡＡＣＧＡＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＡＧＧＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＴＣＧＴＡＧＣＴＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＴＡＧＧＴＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＡＡＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＡＣＡＣＧＧＧＴＴＧＡＣＡＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＴＧＣＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＡＣＣＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＧＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＧＧＣＴＣＡＴＧＧＧＣＴＣＡＣＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＴＣＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＡＧＣＧＣＴＴＧＡＡＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＡＣＧＧＡＣＴＣＡＣＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＧＴＧＧＴＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＡＣＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＴＧＴＣＡＡＧＣＧＣＡＣＧＧＣＣＴＣＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＡＡＣＡＡＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＡのＴＡＬＥ配列または該ＴＡＬＥ配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する前記ＴＡＬＥＮをコードする第１外来性核酸を、前記細胞に導入することを含み、
前記ＴＡＬＥＮが発現し、前記ＴＡＬＥＮが前記標的ＤＮＡを切断して前記細胞内で改変ＤＮＡを産生する、＜２９＞に記載の方法。
＜５８＞
ＣＴＡＡＣＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＴＣＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＣＧＧＧＧＧＣＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＴＴＧＡＧＡＣＣＧＴＴＣＡＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＡＧＣＣＣＡＴＧＧＡＴＴＧＡＣＴＣＣＧＧＡＧＣＡＡＧＴＣＧＴＣＧＣＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＴＡＣＴＴＴＧＴＣＡＧＧＣＧＣＡＴＧＧＴＣＴＣＡＣＣＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＴＴＧＴＣＧＣＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＡＡＴＡＴＡＧＧＣＧＧＴＡＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＴＧＣＡＡＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＴＧＴＣＡＧＧＣＴＣＡＣＧＧＴＣＴＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＴＴＧＴＣＧＣＧＡＴＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＧＧＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧＴＴＧＴＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣＡＣＡＴＧＧＧＴＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＴＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＡＴＡＡＣＧＧＧＧＧＴＡＡＡＣＡＧＧＣＴＴＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＡＣＡＧＣＧＧＴＴＡＴＴＧＣＣＧＧＴＣＣＴＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＡＣＴＴＡＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＴＧＣＡＡＴＴＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣＡＡＧＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＴＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＴＴＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＴＡＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＡＧＣＧＡＣＴＴＣＴＣＣＣＡＧＴＴＴＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＧＧＧＣＴＡＡＣＣＣＣＣＧＡＧＣＡＡＧＴＡＧＴＴＧＣＣＡＴＡＧＣＡＡＧＣＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＣＡＧＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＣＧＧＴＡＣＴＣＴＧＴＣＡＧＧＣＡＣＡＣＧＧＴＣＴＡＡＣＴＣＣＧＧＡＡＣＡＧＧＴＣＧＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＧＣＣＴＧＴＧＴＴＡＴＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡＴＧＧＣＣＴＣＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＣＧＴＴＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴＣＧＧＣＧＧＡＡＡＧＣＡＡＧＣＴＣＴＣＧＡＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＡＧＴＣＣＴＡＴＧＴＣＡＡＧＣＴＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＣＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＴＧＧＣＡＡＴＣＧＣＡＴＣＴＣＡＣＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＧＴＣＣＡＡＡＧＡＴＴＧＴＴＡＣＣＣＧＴＡＣＴＡＴＧＣＣＡＡＧＣＧＣＡＴＧＧＴＴＴＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＴＴＧＴＧＧＣＴＡＴＴＧＣＡＴＣＴＡＡＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＧＣＣＴＴＧＧＡＧＡＣＡＧＴＧＣＡＡＣＧＡＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＡＧＧＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＴＣＧＴＡＧＣＴＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＴＡＧＧＴＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＡＡＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＡＣＡＣＧＧＧＴＴＧＡＣＡＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＴＧＣＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＡＣＣＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＧＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＧＧＣＴＣＡＴＧＧＧＣＴＣＡＣＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＴＣＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＡＧＣＧＣＴＴＧＡＡＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＡＣＧＧＡＣＴＣＡＣＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＧＴＧＧＴＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＡＣＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＴＧＴＣＡＡＧＣＧＣＡＣＧＧＣＣＴＣＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＡＡＣＡＡＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＡのＴＡＬＥ配列または該ＴＡＬＥ配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する前記ＴＡＬＥＮをコードする第１外来性核酸を含むウイルスを、前記細胞に導入することを含み、
前記ＴＡＬＥＮが発現し、前記ＴＡＬＥＮが前記標的ＤＮＡを切断して前記細胞内で改変ＤＮＡを産生する、＜２９＞に記載の方法。
＜５９＞
反復配列を１００ｂｐ以上欠くＴＡＬＥＮをコードする核酸配列を含むウイルス。
＜６０＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を９０ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜６１＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を８０ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜６２＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を７０ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜６３＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を６０ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜６４＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を５０ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜６５＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を４０ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜６６＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を３０ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜６７＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を２０ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜６８＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１９ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜６９＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１８ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜７０＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１７ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜７１＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１６ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜７２＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１５ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜７３＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１４ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜７４＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１３ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜７５＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１２ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜７６＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１１ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜７７＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１０ｂｐ以上欠く、＜５９＞に記載のウイルス。
＜７８＞
レンチウイルスである＜５９＞に記載のウイルス。
＜７９＞
反復配列を１００ｂｐ以上欠くＴＡＬＥＮをコードする核酸配列を含む細胞。
＜８０＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を９０ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜８１＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を８０ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜８２＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を７０ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜８３＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を６０ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜８４＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を５０ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜８５＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を４０ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜８６＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を３０ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜８７＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を２０ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜８８＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１９ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜８９＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１８ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜９０＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１７ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜９１＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１６ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜９２＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１５ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜９３＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１４ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜９４＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１３ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜９５＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１２ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜９６＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１１ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜９７＞
前記ＴＡＬＥＮが反復配列を１０ｂｐ以上欠く、＜７０＞に記載の細胞。
＜９８＞
真核細胞である＜７０＞に記載の細胞。
＜９９＞
酵母細胞、植物細胞または動物細胞である＜７０＞に記載の細胞。
＜１００＞
体細胞である＜７０＞に記載の細胞。
＜１０１＞
幹細胞である＜７０＞に記載の細胞。
＜１０２＞
ヒト幹細胞である＜７０＞に記載の細胞。
＜１０３＞
エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、エクソヌクレアーゼ、反復可変性二残基ドメインをコードする複数の核酸ダイマーブロック、およびエンドヌクレアーゼ切断部位を含むＴＡＬＥ−Ｎ／ＴＦバックボーンベクターを組み合わせ、
前記エンドヌクレアーゼを活性化して前記エンドヌクレアーゼ切断部位において前記ＴＡＬＥ−Ｎ／ＴＦバックボーンベクターを切断することにより第１末端および第２末端を作製し、
前記エクソヌクレアーゼを活性化して前記ＴＡＬＥ−Ｎ／ＴＦバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックに３’オーバーハングおよび５’オーバーハングを作製して前記ＴＡＬＥ−Ｎ／ＴＦバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックを所望の順序でアニールし、
前記ＤＮＡポリメラーゼおよび前記ＤＮＡリガーゼを活性化して前記ＴＡＬＥ−Ｎ／ＴＦバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックを連結することを含む、ＴＡＬＥを作製する方法。
＜１０４＞
標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断する酵素、を発現する幹細胞内で、前記標的ＤＮＡを改変する方法であって、前記方法は、
（ａ）前記標的ＤＮＡに相補的であり前記酵素を前記標的ＤＮＡまで誘導（ｇｕｉｄｅ）するＲＮＡをコードする第１外来性核酸を、前記幹細胞に導入すること；ここで前記ＲＮＡおよび前記酵素は前記標的ＤＮＡに対する共局在複合体のメンバーである、
ドナー核酸配列をコードする第２外来性核酸を前記幹細胞に導入すること、
を含み、
前記ＲＮＡおよび前記ドナー核酸配列が発現し、前記ＲＮＡおよび前記酵素が前記標的ＤＮＡに共局在し、前記酵素が前記標的ＤＮＡを切断し、前記ドナー核酸が前記標的ＤＮＡに挿入されて前記幹細胞内で改変ＤＮＡを産生する、前記方法。
＜１０５＞
前記酵素がＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質である、＜１０４＞に記載の方法。
＜１０６＞
前記酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質である、＜１０４＞に記載の方法。
＜１０７＞
前記酵素がＣａｓ９である、＜１０４＞に記載の方法。
＜１０８＞
前記ＲＮＡが約１０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチドの間である、＜１０４＞に記載の方法。
＜１０９＞
前記ＲＮＡが約２０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの間である、＜１０４＞に記載の方法。
＜１１０＞
前記ＲＮＡがガイドＲＮＡである、＜１０４＞に記載の方法。
＜１１１＞
前記ＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である、＜１０４＞に記載の方法。
＜１１２＞
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、＜１０４＞に記載の方法。
＜１１３＞
前記ドナー核酸配列が組換えにより挿入される、＜１０４＞に記載の方法。
＜１１４＞
前記ドナー核酸配列が相同組換えにより挿入される、＜１０４＞に記載の方法。
＜１１５＞
前記ドナー核酸配列が非相同末端結合により挿入される、＜１０４＞に記載の方法。
＜１１６＞
前記ＲＮＡおよび前記ドナー核酸配列が１つ以上のプラスミド上に存在する、＜１０４＞に記載の方法。
＜１１７＞
工程（ａ）を複数回繰り返して前記細胞内で前記ＤＮＡに複数の改変を生じさせることをさらに含む、＜１０４＞に記載の方法。
＜１１８＞
幹細胞内で改変ＤＮＡを作製した後に、前記標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断する前記酵素をコードする核酸が、前記幹細胞のゲノムから除去される、＜１０４＞に記載の方法。
＜１１９＞
前記ＲＮＡおよび前記ドナー核酸配列が結合した核酸配列として発現する、＜１０４＞に記載の方法。
＜１２０＞
標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断する酵素をコードする第１外来性核酸を含む、幹細胞。
＜１２１＞
前記標的ＤＮＡに相補的であり前記酵素を前記標的ＤＮＡまで誘導（ｇｕｉｄｅ）するＲＮＡをコードする第２外来性核酸をさらに含み、前記ＲＮＡおよび前記酵素が前記標的ＤＮＡに対する共局在複合体のメンバーである、＜１２０＞に記載の幹細胞。
＜１２２＞
ドナー核酸配列をコードする第３外来性核酸をさらに含む、＜１２１＞に記載の幹細胞。
＜１２３＞
前記酵素の発現を促進するための誘導性プロモーターをさらに含む＜１２０＞に記載の幹細胞。
＜１２４＞
前記第１外来性核酸が前記細胞のゲノムＤＮＡからトランスポゼースを使用して除去可能である、＜１２０＞に記載の幹細胞。
＜１２５＞
前記酵素がＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質である、＜１２０＞に記載の幹細胞。
＜１２６＞
前記酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質である、＜１２０＞に記載の幹細胞。
＜１２７＞
前記酵素がＣａｓ９である、＜１２０＞に記載の幹細胞。
＜１２８＞
前記ＲＮＡが約１０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチドの間である、＜１２０＞に記載の幹細胞。
＜１２９＞
前記ＲＮＡが約２０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの間である、＜１２０＞に記載の幹細胞。
＜１３０＞
前記ＲＮＡがガイドＲＮＡである、＜１２０＞に記載の幹細胞。
＜１３１＞
前記ＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である、＜１２０＞に記載の幹細胞。
＜１３２＞
前記標的ＤＮＡがゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、＜１２０＞に記載の幹細胞。
＜１３３＞
標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断する酵素をコードし、且つ前記酵素の発現を促進するための誘導性プロモーターを含む第１外来性核酸、を含む細胞。
＜１３４＞
前記標的ＤＮＡに相補的であり前記酵素を前記標的ＤＮＡまで誘導（ｇｕｉｄｅ）するＲＮＡをコードする第２外来性核酸をさらに含み、前記ＲＮＡおよび前記酵素が前記標的ＤＮＡに対する共局在複合体のメンバーである、＜１３３＞に記載の細胞。
＜１３５＞
ドナー核酸配列をコードする第３外来性核酸をさらに含む、＜１３４＞に記載の幹細胞。
＜１３６＞
標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断する酵素をコードする第１外来性核酸を含む細胞であって、前記第１外来性核酸が前記細胞のゲノムＤＮＡからトランスポゼースを使用して除去可能である、前記細胞。
＜１３７＞
前記標的ＤＮＡに相補的であり前記酵素を前記標的ＤＮＡまで誘導（ｇｕｉｄｅ）するＲＮＡをコードする第２外来性核酸をさらに含み、前記ＲＮＡおよび前記酵素が前記標的ＤＮＡに対する共局在複合体のメンバーである、＜１３６＞に記載の細胞。
＜１３８＞
ドナー核酸配列をコードする第３外来性核酸をさらに含む、＜１３７＞に記載の幹細胞。
＜１３９＞
標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断する酵素をコードする第１外来性核酸を含む細胞であって、前記第１外来性核酸が前記細胞のゲノムＤＮＡに可逆的に挿入されている、前記細胞。
＜１４０＞
前記標的ＤＮＡに相補的であり前記酵素を前記標的ＤＮＡまで誘導（ｇｕｉｄｅ）するＲＮＡをコードする第２外来性核酸をさらに含み、前記ＲＮＡおよび前記酵素が前記標的ＤＮＡに対する共局在複合体のメンバーである、＜１３９＞に記載の細胞。
＜１４１＞
ドナー核酸配列をコードする第３外来性核酸をさらに含む、＜１４０＞に記載の幹細胞。
＜１４２＞
標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断する酵素、を発現する細胞内で、前記標的ＤＮＡを改変する方法であって、前記方法は、
（ａ）ドナー核酸配列をコードする第１外来性核酸を前記細胞に導入すること、
前記標的ＤＮＡに相補的であり前記酵素を前記標的ＤＮＡまで誘導（ｇｕｉｄｅ）するＲＮＡを前記細胞の周囲の培地から前記細胞に導入すること；ここで、前記ＲＮＡおよび前記酵素が前記標的ＤＮＡに対する共局在複合体のメンバーである、
を含み、
前記ドナー核酸配列が発現し、
前記ＲＮＡおよび前記酵素が前記標的ＤＮＡに共局在し、前記酵素が前記標的ＤＮＡを切断し、前記ドナー核酸が前記標的ＤＮＡに挿入されて前記細胞内で改変ＤＮＡを産生する、前記方法。
＜１４３＞
前記ＲＮＡが５’キャップ構造を含む、＜１４２＞に記載の方法。
＜１４４＞
前記ＲＮＡがホスフェート基を欠く、＜１４２＞に記載の方法。
＜１４５＞
前記酵素がＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質である、＜１４２＞に記載の方法。
＜１４６＞
前記酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質である、＜１４２＞に記載の方法。
＜１４７＞
前記酵素がＣａｓ９である、＜１４２＞に記載の方法。
＜１４８＞
前記ＲＮＡが約１０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチドの間である、＜１４２＞に記載の方法。
＜１４９＞
前記ＲＮＡが約２０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの間である、＜１４２＞に記載の方法。
＜１５０＞
前記ＲＮＡがガイドＲＮＡである、＜１４２＞に記載の方法。
＜１５１＞
前記ＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である、＜１４２＞に記載の方法。
＜１５２＞
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、＜１４２＞に記載の方法。
＜１５３＞
前記ドナー核酸配列が組換えにより挿入される、＜１４２＞に記載の方法。
＜１５４＞
前記ドナー核酸配列が相同組換えにより挿入される、＜１４２＞に記載の方法。
＜１５５＞
前記ドナー核酸配列が非相同末端結合により挿入される、＜１４２＞に記載の方法。
＜１５６＞
工程（ａ）を複数回繰り返して前記細胞内で前記ＤＮＡに複数の改変を生じさせることをさらに含む、＜１４２＞に記載の方法。
＜１５７＞
細胞内で改変ＤＮＡを作製した後、前記標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断する前記酵素をコードする核酸が、前記細胞のゲノムから除去される、＜１４２＞に記載の方法。
＜１５８＞
前記ＲＮＡおよび前記ドナー核酸配列が結合した核酸配列として発現する、＜１４２＞に記載の方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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