(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−ヒドロキシテストステロン、そのエステル(カーボネート、カルバメート、ホスフェート、ホスホネート、サルフェート又はスルホネート)、及びそれらの塩からなる群から選ばれるいずれかの化合物を有効成分として含む、炎症状態における血管新生又は腫瘍によって誘発される血管新生の阻止又は阻害用医薬製剤。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬製剤であって、単独又は組み合わせて、内皮細胞の分化増殖の阻害、平滑筋細胞の分化増殖の阻害、内皮細胞の移動の阻害、平滑筋細胞の分化増殖の阻害、血管内皮増殖因子の阻害、血管内皮増殖因子受容体の阻害、線維芽細胞増殖因子受容体13の阻害、血小板由来増殖因子受容体α及び／又はβの阻害、並びにマスト細胞／幹細胞増殖因子受容体の分化増殖又は合成を阻害する、炎症及び／又は腫瘍の治療に使用するための医薬製剤。
【請求項３】
前記炎症状態は、関節炎、炎症性腸疾患、湿疹及び神経皮膚炎からなる群から選ばれるいずれかである、請求項１又は２に記載の医薬製剤。
【請求項４】
前記血管新生は、乳癌又は前立腺癌によって誘発される、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項５】
前記腫瘍は、固形癌又は非固形癌である、請求項１又は２に記載の医薬製剤。
【請求項６】
前記固形癌は、腎癌、結腸直腸癌、肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、膵臓癌及びリンパ腫、並びにそれらの転移からなる群から選ばれるいずれかのものであり；前記非固形癌は、多発性骨髄腫又はその転移からなる群から選ばれるいずれかのものである、請求項５に記載の医薬製剤。
【請求項７】
請求項１に記載の医薬製剤を含有する、炎症状態における血管新生又は腫瘍によって誘発される血管新生に関連する疾病の治療用医薬製剤。
【請求項８】
VEGF、VEGFR又は可溶性VEGFR/VEGFRハイブリッド、及びチロシンキナーゼ阻害剤に対する抗体からなる群から選ばれる活性物質と、請求項１に記載の医薬製剤とを組み合わせた医薬製剤。
【請求項９】
VEGF、VEGFR又は可溶性VEGFR/VEGFRハイブリッド、及びチロシンキナーゼ阻害剤に対する抗体からなる群から選ばれる活性物質をさらに含む、請求項７記載の医薬製剤。
【請求項１０】
前記血管新生に関連する疾病は、血管新生物、血管増殖性新生物、内皮細胞腫瘍及び血管腫、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、眼炎、角膜炎、角膜血管新生、硝子体への血管の進入（injection）、水晶体の血管新生、創傷修復、正常な機能性組織の軟組織への形質転換、オーバーシュートしている瘢痕形成の減少、皮膚における血管腫、固形臓器における血管腫、血管奇形、高血圧、血管の狭窄、血管の再狭窄、動脈硬化症、肥満、及び子宮内膜症からなる群から選ばれるいずれかのものである、請求項７〜９のいずれかに記載の医薬製剤。
【請求項１１】
製剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の医薬製剤。
【請求項１２】
皮膚投与、粘膜投与、粘膜下投与、経皮投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、経鼻投与、眼内投与、又は坐薬投与若しくは腔内への点滴用の製剤として調製されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬分野、特に、Ｃ−１９ステロイド化合物の新規な使用、より特別には、特異的な構造的配置（とりわけ４−及び／又は１７−位における構造的配置）を有するアンドステロン−３−オン構造を含むC19ステロイド類の新生血管形成、血管新生の阻害及び他の使用に関する。
【０００２】
本発明は、特に、選択されたＣ−１９ステロイドに関し、前記Ｃ−１９ステロイドは、疾患（例えば、腫瘍又は炎症状態に関連する病理学的な血管新生及び／又は過剰な再生プロセス）の治療における血管内皮細胞及び／又は平滑筋の分化増殖及び／又は遊走を阻害する。
【０００３】
さらに、本発明は、分化増殖関連、癌関連、及び／又は炎症関連増殖因子又は増殖因子受容体の合成又は発現、とりわけ、治療下における炎症及び／又は癌及び随伴組織の関連状態の低減に関連する。前記増殖因子は、血管内皮増殖因子(VEGF)、血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)及び機能的に関連する増殖因子、とりわけ、線維芽細胞増殖因子受容体13 (FGFR 13)、血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)α及び／又はβ、並びにマスト細胞／幹細胞成長因子受容体（SCFR；c-Kit若しくはチロシンタンパク質キナーゼKit、又はCD117として知られている）である。
【背景技術】
【０００４】
血管新生は、組織の血管新生の生理学的プロセスであり、新生血管が必要とされる組織内への新生血管の増殖を含む。例えば、創傷形成後の状態と同様に、酸素欠乏の状態では、細胞は血管新生因子を放出し、こうして新生血管の増殖を誘導すると考えられている。例えば、血管内皮成長因子は、内皮細胞の増殖を誘導する最も重要な因子として認識されており、細胞は血管を形成し血管新生を行なう。
【０００５】
しかしながら、この生理学的プロセスは、幾つかの病的状況では制御からはずれ、過剰で不必要な、又は有害ですらある新生血管形成を誘導するが、これは、新血管形成として呼ばれることもある。一方で、この新血管形成の状態自体、疾患や病的状態、例えば、過剰な瘢痕形成又は血管新生緑内障等を惹起する可能性がある。他方では、新血管形成は、ある種の疾患の進行を促進させる。これは、例えば、乳癌、前立腺癌のようないくつかの固形腫瘍、ホジキン又は非ホジキンリンパ腫のようなリンパ腫、又は多発性骨髄腫のような非固形腫瘍によって引き起こされる。
【０００６】
血管新生又は新血管形成は、腫瘍の特徴であるから、新たな血管の形成を阻害して腫瘍を「飢餓状態にする」ことが、抗癌治療における１つのコンセプトである。内皮細胞の増殖及び遊走を防ぐことを目的として、幾つかの新しい化合物が開発されている。例えば、VEGFに対するモノクローナル抗体−ベバシズマブ （アバスチン)は、様々な腫瘍に罹患した患者において、転移を阻害し腫瘍を縮小させるための使用に成功している。
【０００７】
VEGF及びその受容体であるVEGFRをブロックする抗体に加えて、小分子がチロシンキナーゼ阻害剤（TKIs、スニチニブ（Sunitinib）のようなTKIs及び第二世代薬であるドビチニブ（Dovitinib＝TKi258）として幅広く使用されており、Mukherjiら、又はHeideggerらによって、前立腺癌との関係でレビューにまとめられている(Mukherji D, Temraz S, Wehbe D, Shamseddine A: Angiogenesis and anti-angiogenic therapy in prostate cancer. Critical Reviews in Oncology/Hematology 87 (2013) 122-131 ; Heidegger I, Massoner P, Eder IE, Pircher A, Pichler R, Aigner F, Bektic J, Horninger W, Klocker H: Novel therapeutic approaches for the treatment of castration-resistant prostate cancer. Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 138 (2013) 248-256).
【０００８】
しかしながら、ベバシズマブ又は小分子の阻害剤の摂取は、かなりの重篤な及び／又はそれ程には重篤ではない副作用を伴う。更に、臨床の現場では治療の過程において、薬剤耐性の発現が普通に観察される。従って、抗血管新生治療用の新規標的分子に対する要請と、副作用が少ない治療法とに対する要請がある。
【０００９】
近年、ステロイドホルモンが、血管新生に対する効果について議論を呼ぶほどに評価されている。例えば、フランク−リスブラント（Frank-Lissbrant）及びその同僚は、テストステロンを繰り返し皮下投与した去勢ラットの腹側前立腺外側葉における急速な血管新生形成について記載している(Franck-Lissbrant I, Haggstrom S, Damber JE, Bergh A: Testosterone stimulates angiogene-sis and vascular regrowth in the ventral prostate in castrated adult rats. Endocrinology 1998;139(2):451 -6)。
【００１０】
更に、リャオ（Liao）らは、培養ヒト臍帯内皮細胞（HUVECs）の血管内皮細胞への移動（migration）を促進するテストステロンの効果について記載している(Liao W, Huang W, Guo Y, Xin M, Fu X: Testosterone promotes vascular endothelial cell migration via upregulation of ROCK-2/moesin cascade. Mol Biol Rep (2013) 40:6729-6735)。
【００１１】
内皮機能の制御におけるテストステロンの役割、及び勃起性生理学との関連における内皮前駆細胞の発達や成熟においてある役割を果たすことは、トラッシュ（Traish）とガルーシアン（Galoosian）の総説中で更に示唆されている(Traish AM, Galoosian A: Androgens modulate endothelial function and endothelial progenitor cells in erectile physiology, Korean J Urol 2013; 54:721 -731 )。
【００１２】
アイザーマン（Eisermann）らは、アンドロゲン類縁体であるR1881が、前立腺癌細胞株においてVEGFの発現を誘導し、それによって、恐らくVEGF誘導血管新生が起こると報告している (Eisermann K, Broderick CJ, Bazarov A, Moazam MM, Fraizer GC: Androgen up-regulates vascular endothe-Iial growth factor expression in prostate cancer cells via an Sp1 binding site. Molecular Cancer 2013, 12:7)。
【００１３】
対照的に、カオ（Chao）らは、SR16388（ERα及びERβ受容体と結合する性質を有する合成ステロイド）の抗血管新生効果について記載している(Chao WR, Amin K, Shi Y, Hobbs P, Tanabe M, Tanga M, Jong L, Collins N, Peters R, Laderoute K, Dinh D, Yean D, Hou C, Sato B, Alt C, Sambucetti L: SR16388: a steroidal antiangiogenic agent with potent inhibitory effect on tumor growth in vivo. Angiogenesis. 201 1 Mar; 14(1 ): 1 -16)。
【００１４】
血管新生についての予期不能な効果は、他の周知のアンドロゲン類においても見られ、それらは全て市販が禁止されているか、又は副作用により市場から撤退した。トマスらは、ダナゾール（Danazol）、17a-エチニル-17β-ヒドロキシアンドロスト-4エノ[2，3-d]イソキサゾール(17a-thinyl-17β-hydroxyandrost-4-eno [2,3-d]isoxazol)が、分化増殖や血管形成のようなある種の内皮細胞の機能を阻害するが、組織への浸潤における重要な段階の阻害が欠落していると報告している(Thomas GW, Rael LT, Shimonkevitz R, Curtis CG, Bar-Or R, Bar-Or D: Effects of danazol on endothelial cell function and angiogenesis. Fertil Steril. 2007 Oct;88 (4 Suppl): 1065-70)。そのアンドロゲンの性質（男性化、テストステロン合成の阻害に関わらない遊離テストステロンの増加）とその好ましくないプロフィールによって、市場から撤退した。
【００１５】
ナンドロロン（Nandrolone）（17β-ヒドロキシエステル-4-エン-3-オン(17β-Hydroxyestr-4-en-3-on)）もまた周知のタンパク同化薬であり、HUVEC細胞に対してある種の抗増殖特性を発揮する（D'Ascenzo S, Millimaggi D, Di Massimo C, Saccani-Jotti G, Botre F, Carta G, Tozzi-Ciancarelli MG, Pavan A, Dolo V.: Detrimental effects of ana-bolic steroids on human endothelial cells. Toxicol Lett. 2007 Mar 8; 169 (2): 129-36.)。
【００１６】
しかしながら、これが、血管新生を阻害すると解釈されるか否かは不明である。なぜなら、筋萎縮性側索硬化症の動物モデルでは、TGF-βの産生を増加させることが観察されており、TGF-βは、最も強い血管新生因子の一つ、すなわち、VEGFの発現を刺激することが知られている (Galbiati M, Onesto E, Zito A, Crippa V, Rusmini P, Mariotti R, Bentivoglio M, Ben- dotti C, Poletti A). The anabolic/androgenic steroid nandrolone exacerbates gene expression modifications induced by mutant SOD1 in muscles of mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Pharmacol Res. 2012 Feb; 65(2):221 -30)。対照的に、ナンドロロンは運動しているラットのVEGFレベルを減少させた(Paschoal M, de Cassia Marqueti R, Perez S, Selistre-de-Araujo HS. Nandrolone inhibits VEGF mRNA in rat muscle. Int J Sports Med. 2009 Nov;30(1 1 ):775-8)。
【００１７】
スタンダゾロール（Stanazolol）（17α-メチル-5α-アンドロスタノ[3,2-c]ピラゾール-17β-オール(17α-Methyl-5α-androstano[3,2-c]pyrazol-17β-ol)）は、TGFβ1の発現を増加させ、TGFβ1は、最も強力な血管新生因子であるVEGFの産生量を増加させることが知られている (Cao Y,Townsend CM, Ko T: Transforming growth factor-beta (TGF-beta) induces vas-cular endothelial growth factor (VEGF) and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1 ) gene expression through Smad3 transcription factor. ACS, 2005 Volume 201 , Issue 3, Suppl.17- 18)。
【００１８】
さらに、トープらは、ヘパリンアジピン酸ヒドラジド（HAH-）結合コルチゾールが、癌及び他の血管新生疾患治療用の新規な血管新生阻害剤であることを示した(Thorpe PE, Derbyshire EJ, Andrade SP, Press N, Knowles PP, King S, Watson GJ, Yang YC, Rao-Bette M.: Heparin-steroid conjugates: new angiogenesis inhibitors with antitumor activity in mice. Cancer Res. 1993 Jul 1 ;53(13):3000-7.)。
【００１９】
ステロイドホルモンの様々な強力な標的分子、例えば、ステロイドホルモン受容体又は酵素を考慮すると、定義された細胞又は組織と定義されたステロイドとの相互作用の結果は、ジェンダーからジェンダーへ、組織から組織へ、及び有用で活性のあるステロイド受容体の特異的なパターンとは異なるという証明になる。ステロイドホルモンに対する特異的な生物学的反応は、(i)例えば、ステロイドホルモン受容体の発現パターンの違い、(ii)酵素の発現、(iii)受容体の反応を制御する受容体の補因子（活性化補助因子又は補助抑制因子）の発現の違い、及び(iv)細胞培養物中、臓器中又は組織中のステロイドの存在、によって影響を受ける。天然のステロイド又は合成の類縁体に対する生物学的反応の予測は困難と思われ、入手可能な文献に基づいて、当業者はテストステロン様化合物が血管新生を誘導すると予測することさえありうる。
【００２０】
本願発明の目的である、効果的な血管新生阻害剤を提供することについての必要性がある。当阻害剤は内皮細胞及び／又は平滑筋細胞の分化増殖及び／又は移動を阻害することができ、及び／又はVEGF及び／又はVEGFRの合成又は発現を減少させることができ、そのようにして過剰な再生過程、例えば様々な疾患で生じている過程、を含む疾患における血管新生を阻害する。
【００２１】
これらの目的及び他の目的は、以下の本願発明の説明によって明らかにされ、独立請求項の法定主題によって達成される。本願発明の幾つかの好ましい実施形態は、従属請求項の主題によって定義される。
【発明の概要】
【００２２】
以下の項目で要約した本願発明の様々な態様、有利な特徴及び好ましい実施形態は、それぞれ単独で又は組み合わせて本願の課題の解決に寄与している。
１．４−ヒドロキシテストステロン、そのエステル(カーボネート、カルバメート、ホスフェート、ホスホネート、サルフェート又はスルホネート)、及びその塩からなる群から選ばれるいずれかの化合物を有効成分として含む、炎症状態における血管新生又は腫瘍によって誘発される血管新生の阻止又は阻害用医薬製剤であって、下記式１で定義される化合物を有効成分として含む。
【００２３】
【化１】
0006788592.tif 000002
【００２４】
式中、ａ、ｂ及びｃは、それぞれ互いに独立して、単結合又は二重結合である：但し、ａ、ｂ及びｃのうちの少なくとも１つは二重結合であり、ａが単結合かつｂが二重結合のときＲ２は水素原子ではなく；
Ｒ１は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり；
Ｒ２は、ＯＲ５又は水素原子であり、ここで、Ｒ５は水素原子又はＣ１〜Ｃ１２の直鎖アルキル基又は分岐鎖アルキル基であり；
【００２５】
Ｒ３は、ｃが単結合のときには、水素原子又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基であるか、又はｃが二重結合であるときには、ＣＨＲ５であり、ここでＲ５は先に定義した通りであり；Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１２のアルキル基、置換されていないフェニル基もしくはＣ１〜Ｃ１２のアルキル基で置換されているフェニル基、又はＣＯＲ６のアシル基であり；Ｒ６は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１２の直鎖アルキル基もしくは分岐鎖アルキル基、フェニル基又はベンゾイル基であり、各置換基は置換されていなくてもよく、Ｃ１〜Ｃ１２の直鎖アルキル基又は分岐鎖アルキル基、又は、それらは生物学的代謝もしくは化学的な脱保護を起こすヒドロキシ基を導くいずれかの置換基で置換されていてもよく、
【００２６】
とりわけ、エステル、エーテル、アセタール、カーボネート、カルバメート、リン酸塩、ホスホン酸塩、ケタール、硫酸塩又はスルホン酸塩；及びそれらの塩である、血管新生阻害剤として医学的治療において使用するための化合物を導くことができるいずれかの置換基。
【００２７】
２．４−ヒドロキシテストステロン、そのエステル(カーボネート、カルバメート、ホスフェート、ホスホネート、サルフェート又はスルホネート)、及びその塩からなる群から選ばれるいずれかの化合物を有効成分として含む炎症又は癌の治療用医薬製剤であって、下記式１で定義される化合物を有効成分として含む。
【００２８】
【化２】
0006788592.tif 000003
【００２９】
ａ、ｂ及びｃは、それぞれ互いに独立して、単結合又は二重結合である：但し、ａ、ｂ及びｃの少なくとも１つは二重結合であり、ａが単結合でありｂが二重結合のときＲ２は水素原子ではなく；
【００３０】
Ｒ１は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり；
Ｒ２は、ＯＲ５又は水素原子であり、Ｒ５は水素原子又はＣ１〜Ｃ１２の直鎖アルキル基又は分岐鎖アルキル基であり；
【００３１】
Ｒ３は、ｃが単結合のときは水素原子又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、ｃが二重結合のときはＣＨＲ５であり、ここでＲ５は先に定義した通りであり；
【００３２】
Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１２のアルキル基、置換されていないフェニル基もしくはＣ１〜Ｃ１２のアルキル基で置換されているフェニル基、又はＣＯＲ６のアシル基であり、Ｒ６は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１２の直鎖アルキル基もしくは分岐鎖アルキル基、フェニル基もしくはベンゾイル基であり、各置換基は置換されていなくてもよく、Ｃ１〜Ｃ１２の直鎖アルキル基又は分岐鎖アルキル基で置換されていてもよく、又は生物学的代謝もしくは化学的な脱保護を起こすヒドロキシ基につながるいずれかの置換基であり、とりわけ、エステル、エーテル、アセタール、カーボネート、カルバメート、リン酸塩、ホスホン酸塩、ケタール、硫酸塩又はスルホン酸塩；及びそれらの塩である、血管新生阻害剤として治療に使用する化合物であり、
【００３３】
これらのうちのいずれか単独又は組み合わせて、内皮細胞の分化増殖の阻害、平滑筋細胞の分化増殖の阻害、内皮細胞のマイグレーションの阻害、平滑筋細胞の分化増殖の阻害、血管内皮増殖因子（VEGF）の合成阻害、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）の合成阻害、線維芽細胞増殖因子受容体13(FGFR13) の合成阻害、血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)α及び／又はβの合成阻害、並びにマスト細胞／幹細胞増殖因子受容体（SCFR；c‐Kit又はチロシン−タンパク質リン酸化酵素Kit又はCD117）の合成阻害によって、炎症及び／又は癌の治療の用途で使用するための化合物。
【００３４】
３．上記項目１又は２で使用するための化合物であって、前記化合物は、ａ及びｃは単結合であり、ｂは二重結合であり、Ｒ２はＯＲ５で定義される。ここで、ＯＲ５は請求項１に定義された通りであり、Ｒ５は水素原子又はＣ１〜Ｃ６の直鎖アルキル基又は分岐鎖アルキル基であることが好ましく、及びＲ４は水素原子又はＣＯＲ６であることが好ましく、ここで、Ｒ６は炭素数１〜６の直鎖アルキル基又は分岐鎖アルキル基である。
【００３５】
４．前記化合物が、4−ヒドロキシテストステロン（4−OHT）、その塩又はそのエステルであることを特徴とする、上記項目１〜３のいずれかに記載の用途で使用するための化合物。
５．再生過程を含む病理学的状態における新生血管形成阻害剤として使用する、前記いずれかの項目に記載の用途で使用するための化合物。
【００３６】
６．炎症状態における血管新生の予防又は阻止のための前記いずれかの項目に記載の用途で使用するための化合物。
７．前記炎症状態が、関節炎、炎症性腸疾患、湿疹及び神経皮膚炎からなる群から選ばれるいずれかであることを特徴とする、前記いずれかの項目に記載の用途で使用するための化合物。
【００３７】
８．腫瘍によって誘発される血管新生の阻止又は阻害に使用する、上記項目１〜５のいずれかに記載の用途で使用するための化合物。
９．前記血管新生が、胸部組織の腫瘍、好ましくは乳癌、又は前立腺組織、好ましくは前立腺癌によって誘発されることを特徴とする、上記項目８に記載の用途で使用するための化合物。
【００３８】
10．固形癌及びそれらの転移の予防又は治療における、上記項目１〜５のいずれかに記載の用途で使用するための化合物。
11．前記固形癌は、腎細胞癌等の腎癌、結腸直腸癌、肺癌、脳腫瘍、及び特に膠芽腫、卵巣癌、膵臓癌及びリンパ腫、並びにそれらの転移からなる群から選ばれる癌であることを特徴とする、項目１０に記載の用途で使用するための化合物。
【００３９】
12．非固形癌とそれらの転移の予防又は治療における、上記項目１〜５のいずれかに記載の用途で使用するための化合物。
13．前記非固形癌が、多発性骨髄腫及びその転移であることを特徴とする、上記項目９に記載の用途で使用するための化合物。
【００４０】
14．血管新生物又は血管増殖性新生物、特に血管腫からなる群から選ばれる内皮細胞種の予防又は治療における、項目１〜５のいずれかに記載の用途で使用するための化合物。
15．眼関連疾患の予防又は治療用の、上記項目１〜７のいずれかに記載の用途で使用するための化合物。
【００４１】
16．糖尿病性網膜症、黄斑変性症、眼炎、特に角膜炎、角膜血管新生、硝子体への血管の進入、及び水晶体の血管新生からなる群から選ばれる、眼関連疾患の予防又は治療における、項目１〜５のいずれかに記載の用途で使用するための化合物。
17．正常な機能性組織から軟組織への形質転換を含む創傷修復における血管新生を阻止又は阻害するための、上記項目１〜５のいずれかに記載の用途で使用するための化合物。
【００４２】
18．急性又は慢性障害後肝臓や心臓のような臓器、又は皮膚上における過剰な瘢痕形成を減少させることを特徴とする、上記項目１７に記載の用途で使用するための化合物。
19．血管奇形、特に皮膚又は肝臓、脳及び心臓といった固形臓器の血管腫を予防又は阻害するための、上記項目１〜５のいずれかに記載の用途で使用するための化合物。
【００４３】
20．循環器疾患、特に高血圧、血管狭窄又は血管の再狭窄、及び動脈硬化症を阻止又は阻害するための、上記項目１〜５のいずれかに記載の用途で使用するための化合物。
21．肥満治療のための、上記項目１〜５のいずれかに記載の用途で使用するための化合物。
【００４４】
22．子宮内膜症に対する治療のための、上記項目１〜５のいずれかに記載の用途で使用するための化合物。
23．前記いずれかの請求項において定義された式で表される化合物、及び前記いずれかの請求項における医学的治療で使用するための製剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む、医薬組成物。
【００４５】
24．前記医薬組成物は、皮膚投与、粘膜投与、粘膜下投与、経皮投与、筋肉内投与（i.m.）、皮下投与（s.c.）、静脈内投与（i.v.）、経口投与又は坐薬投与若しくは腔内への点滴用に調製されることを特徴とする、上記項目２３に記載の医薬組成物。
25．前記医薬組成物が、経口用途、皮下用途、皮膚用途、筋肉内、静脈内用途、眼内用途、経鼻用途、又は経皮用途で調製されることを特徴とする、上記項目23又は24に記載の医薬組成物。
【００４６】
26． VEGF、VEGFR又は可溶性VEGFR/VEGFRハイブリッド、及びチロシンキナーゼ阻害剤に対する抗体からなる群から選ばれる活性物質と、４−ヒドロキシテストステロン、そのエステル(カーボネート、カルバメート、ホスフェート、ホスホネート、サルフェート又はスルホネート)、及びそれらの塩からなる群から選ばれるいずれかの化合物との組み合わせを有効成分として含む炎症又は癌の治療用医薬製剤とを組み合わせた医薬製剤。
【００４７】
【化３】
0006788592.tif 000004
【００４８】
式中、ａ、ｂ及びｃは、それぞれ互いに独立して、単結合又は二重結合である：但し、ａ、ｂ及びｃの少なくとも１つは二重結合であり、ａが単結合かつｂが二重結合のときＲ２は水素原子ではなく；
Ｒ１は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり；
Ｒ２は、ＯＲ５又は水素原子であり、ここで、Ｒ５は水素又はＣ１〜Ｃ１２の直鎖アルキル基又は分岐鎖アルキル基であり；
【００４９】
Ｒ３は、ｃが単結合のときには、水素原子又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基であるか、又はｃが二重結合であるときには、ＣＨＲ５であり、ここでＲ５は先に定義した通りであり；
Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１２のアルキル基、置換されていないフェニル基もしくはＣ１〜Ｃ１２のアルキル基で置換されているフェニル基、又はＣＯＲ６のアシル基であり、
【００５０】
Ｒ６は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１２の直鎖アルキル基もしくは分岐鎖アルキル基、フェニル基又はベンゾイル基であり、各置換基は置換されていなくてもよく、Ｃ１〜Ｃ１２の直鎖アルキル基又は分岐鎖アルキル基で置換されていてもよく、又は生物学的代謝もしくは化学的な脱保護を起こすヒドロキシ基につながるいずれかの置換基であり、とりわけ、エステル、エーテル、アセタール、カーボネート、カルバメート、ホスフェート、ホスホネート、ケタール、サルフェート、又はスルフォネート；及びそれらの塩であり、好ましくは、上記いずれかの項目で定義された用途のための組み合わせである。
【００５１】
27．上記項目２６に記載の組み合わせを含む医薬組成物（VEGF、VEGFR又は可溶性VEGFR/VEGFRハイブリッド、及びチロシンキナーゼ阻害剤に対する抗体からなる群から選ばれる活性物質をさらに含む医薬組成物）。
28．上記項目１〜27のいずれかで定義された化合物又は医薬組成物の医学的治療における抗血管新生剤としての使用。
29．医学的治療における抗血管新生剤としての、上記項目26又は27に記載の組み合わせの使用。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１Ａ】図１Ａは、WST-1試験を用いてHUVEC細胞を4−OHTとTKI258に、単独又は組み合わせで曝露したときの増殖分化アッセイを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、WST-1試験を用いてHUVEC細胞を4−OHTとTKI258に、単独又は組み合わせで曝露したときの増殖分化アッセイを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、トランスウェル遊走アッセイの原理を示す。
【００５３】
［図２Ｂ］  図２Ｂは、HUVEC細胞を4−OHに曝露したときのトランスウェル遊走アッセイの解析を示す。
［図３］  図３は、HUVEC細胞を4−OHTに曝露したときの創傷治癒アッセイを示す。
［図４］  図４は、HUVEC細胞を4−OHTに曝露したときのマトリゲルを用いたチューブ遊走アッセイを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
（発明の詳細な説明）
好ましい実施形態や実施例により、本願発明をより詳細に説明するが、それらは例示的な目的で示すに留まるものであり、本願発明の範囲を制限するものとして理解されるべきではない。
【００５５】
本願発明は、上記で定義された一般式１の化合物を提供する。当該化合物は、驚くべきことに、効率よく血管新生を阻害し、とくに、（i）から（vi）のいずれか１つ又はそれらの組み合わせにおいて効果を示した。
【００５６】
（i）内皮細胞の分化増殖阻害
（ii）平滑筋細胞の分化増殖阻害
（iii）内皮細胞の遊走阻害
（iv）平滑筋細胞の遊走阻害
【００５７】
（v）VEGFタンパクの発現又は合成の減少
（vi）VEGFRタンパクの発現又は合成の減少
（vii）繊維芽細胞成長因子受容体13（FGFR13）、血小板由来成長因子（PDGFR）α細胞及び／又はβ細胞、並びにマスト細胞／幹細胞成長因子受容体（SCFR；c-Kit若しくはチロシンタンパク質キナーゼKit、又はCD117として知られている）を含む機能的に関連する成長因子のタンパク質の発現又は合成の低下。
【００５８】
こうして、本願発明は、組織における血管新生を含む過剰な再生過程を伴う疾患の治療に特に適している。更に、上記（i）から（vii）の抗癌治療／抗分化増殖治療、及び／又は抗炎症治療のいずれかは、このような異常な分化増殖（proliferation）によって影響を受けている患者において特異的かつ選択的に効果を示し、及び／又は異常な分化増殖が生じているような患者の特別な組織の標的及び臓器の標的において、特異的かつ選択的に効果を示す。式１の化合物、及び上記で特定されたようなそれらの好ましい実施形態は、驚くべきことに、上記記載の項目（i）から（vii）の抗血管形成活性及び阻害効果を示すことが見いだされた。
【００５９】
ここで、前記それらの好ましい実施形態(例えば、上記の式１の化合物であり、そして、好ましくはａ及びｃが単結合、ｂは二重結合であり、Ｒ２はＯＲ５であり、ＯＲ５は先に定義した通りである。好ましくは、Ｒ５は水素原子又はＣ１〜Ｃ６の直鎖又は分岐鎖アルキル基であり、Ｒ４は水素原子又は炭素数１〜６のＲ６を有するＣＯＲ６であることを特徴とする化合物である。より好ましくは、当該化合物である、４‐ヒドロキシテストステロン（4-OHT）又はその塩もしくはそのエステル)は、驚くべきことに、上記の項目（i）から（vii）として特定された抗血管形成活性及び抗血管形成抑制活性を発揮することが見いだされた。但し、式１の構造中、ａが単結合であり、ｂが二重結合であり、Ｒ２が水素原子でないときは、テストステロン関連効果やテストステロン様効果を示さないことが確認されている。
【００６０】
重要なことには、上記組織はヒトの体内に特異的な組織や臓器であってもよく、そこでは（新生）血管新生が生じたり、特別な癌（癌化又は非癌化胸部組織、前立腺組織、全ての小腸組織、肺組織、腎組織、脳、眼、卵巣組織、又は脈管異常の意味における脈管組織それ自体）が引き金となったりする。例えば、血管腫等の脈管の悪性新生物もしくは血管増殖性悪性新生物、又は血管形成異常、例えば、低流速血管奇形、毛細血管奇形、静脈奇形、リンパ管奇形、高流速血管奇形、動脈奇形、動静脈奇形、動静脈瘻又は複合的な血管異常（上記の様々な組合せ）によって（新生）血管新生が惹起され得る。
【００６１】
それゆえ、式１の化合物は、（新生）血管新生を引き起こす病的状態や病的状況、例えば、癌や任意の炎症状態のそれぞれの場合において非常に有用である。式１の化合物は、他の癌及び／又はその転移の予防もしくは治療に非常に有用である。ここで、抗血管新生もしくは血管新生／新生血管形成、又は前記（i）から（vii）の阻害若しくは低下が適切な場合には、例えば、腎細胞癌のような腎臓癌、結腸直腸癌、肺癌、脳腫瘍、
【００６２】
特に、神経膠芽腫、卵巣癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、リウマチ性関節炎のような炎症性疾患、瘢痕形成（特に、急性又は慢性障害後の肝臓又は心臓のその他の臓器中もしくは皮膚上における瘢痕形成）を減少させる創傷治療、血管異常、血管新生物又は血管増殖性新生物、血管腫等の内皮細胞癌（特に、肝臓、脳及び／又は心臓における血管腫）、（糖尿病性）網膜症、黄斑変性、目の炎症等の目に関連する疾患の予防もしくは治療に非常に有用である。また、循環器系疾患、特に、例えば、動脈硬化によって惹起される高血圧、血管狭窄又は血管の再狭窄、特に、損傷及び／又は血管形成術又はステント移植に起因するアテローム性動脈硬化症の予防と治療に非常に有用である。
【００６３】
更に、本願発明の血管新生阻害剤は抗肥満剤として使用することができる。なぜなら、脂肪組織中の血管が完全に成熟することはなく、血管新生阻害剤によって破壊されることが知られているためである(D. Bruemmer, Targeting Angiogenesis as Treatment for Obesity; Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 32 (2), 161-162, 2012)。
【００６４】
また、本願発明の血管新生阻害剤は、抗血管新生と子宮内膜症に対する肯定的な効果との間の関連により、子宮内膜症を治療する活性物質として使用することができる。
【００６５】
さらに、式１の化合物は、腎細胞癌等の腫瘍の治療に非常に有用である。これらは、しばしば初期の抗癌治療に対して抵抗性を示し、mTOR阻害剤又は第二世代TKIsを使用する二次選択治療が必要になる。このため、本願発明の化合物は、抵抗性となった後の古典的な抗癌治療の代替物を提供する。
【００６６】
さらにまた、本発明は、４−ヒドロキシテストステロン、そのエステル(カーボネート、カルバメート、ホスフェート、ホスホネート、サルフェート又はスルホネート)、及びそれらの塩からなる群から選ばれるいずれかの化合物又は前記の好ましい構造型（structural form）と、VEGF、VEGFR又は可溶性VEGFR/VEGFRハイブリッド、及びチロシンキナーゼ阻害物質（TKIs）に対する抗体からなる群から選ばれる１つの活性物質と、を含む組み合わせを提供する。当該「組み合わせ」は、通常の組成物又は通常の剤形の範囲内で定められた組み合わせ、又は別々であるが関連のある組み合わせを意味し、例えば、式１の化合物と特定の抗体又はTKIとをそれぞれ含む同時投与用又は逐次投与用組成物による組み合わせが挙げられる。前記抗体の好ましい例には、VEGFに対するモノクローナル抗体であるベバシズマブ（アバスチン）が含まれ、TKIsの好ましい例には、スニチニブ（sunitinib）、ドビチニブ（dovitinib、TKI 258)、イマチニブ（imatinib）、ソラフェニブ（sorafenib）、及びそれらのTKIsが含まれ、上述したようにMukherji et al. (2013)及びHeidegger et al. (2013)によって報告されている。
【００６７】
さらに、式１の化合物は、腫瘍、特に癌又はそれらの転移、例えば、乳癌もしくは前立腺癌又はそれらの転移によって引き起こされる血管新生の治療に非常に有用である。
【００６８】
驚くべきことに、ホルモン関連腫瘍細胞の増殖及び転移形成を阻害するための化合物に関連した先行技術、特に、乳癌又は前立腺癌関連の先行技術(WO2007/131736, WO2007/131737)とは異なって、上記で定義された一般式１の化合物が、ヒト内皮細胞及び／又はヒト平滑筋細胞の分化増殖及び／又は遊走を阻害することを、本願発明者は見出した。
【００６９】
さらに、驚くべきことに、上記で定義された一般式１の化合物が、炎症を起こした環境及び／又は癌性の環境におけるVEGF及びVEGFRの発現を低下させることを見出した。例えば、乳癌や前立腺癌に関連する場合（WO2007/131736, WO2007/131737）のように、ホルモン関連腫瘍細胞の増殖及び転移形成の阻害を含む抗癌治療とは独立かつ区別される抗癌治療の場合には、本願発明の知見は、対応する新たな臨床設定において抗血管新生治療に利用することを可能にする。
【００７０】
例えば、癌の標的細胞又は標的組織の直接の破壊とは異なり、本願発明による血管新生阻害は、抗血管新生を介するか、及び／又は上記で特定した（i）から（vii）の阻害又は減少効果を介して、更なる腫瘍の増殖及び腫瘍血管新生（tumor vascularization）の効率的な阻害を可能にする。このようにして、腫瘍が自分自身に栄養を与える手段、それにより転移が妨げられる手段が、腫瘍を飢えさせ、それによって間接的な抗腫瘍活性をもたらす。例えば、乳癌又は前立腺癌のような、ホルモン関連癌及びそれらの転移の治療においては、そのような癌によって引き起こされる血管新生の阻害に効果的である。
【００７１】
さらに、コラーゲン及び任意の他の支持タンパク質の安定化等の単なる一般的な同化作用、及びそれによって考慮される支持組織の安定化、及び心筋梗塞、脳梗塞、動脈硬化、尿失禁等のような関連する治療(WO2009/062683)とは異なって、再度、本発明の知見は、対応する新たな臨床設定（セッティング）での抗血管新生治療の使用を可能にする。
【００７２】
一般的に、治療適用に関しては、新たな臨床設定は、例えば、患者のグループ、時期（例えば、いつどこで治療を始めるかの決定）、用量及び他の治療との組み合わせに関する違いによって特徴づけられる。
【００７３】
いかなる理論にも縛られることなく、このことは、例えば、VEGF及び／又はVEGFR、及び／又はその他の分化増殖関連成長因子又はその受容体、癌関連成長因子又はその受容体、及び／又は炎症関連成長因子又はその受容体の、上述したような炎症組織及び／又は癌組織の細胞、例えば、上記器官及び／又は組織を形成しているすべての上皮細胞及び／又は癌細胞、又は間質細胞におけるダウンレギュレーションによるものであり、かくして、血管細胞に対する抗血管新生効果を間接的に有すると推測される。
【００７４】
又は、内皮細胞及び／又は平滑筋細胞それ自身におけるVEGF及び／又はVEGFR、及び／又はその他の分化増殖関連成長因子又はその受容体、癌関連成長因子又はその受容体、及び／又は炎症関連成長因子又はその受容体のダウンレギュレーションによるものと推測される。このようにして、本願発明は、内皮細胞及び／又は平滑筋細胞の望ましくない分化増殖及び／又は遊走を含む疾患、例えば、上述した疾患の治療のための化合物を提供する。
【００７５】
これら本願発明の驚くべき知見に基づいて、式１の化合物は、治療の臨床設定において、確かに有用である。当該臨床設定では、機能的に関連する成長因子が含まれ、特に、重要な繊維芽細胞増殖因子受容体13（FGFR13）、血小板由来増殖因子受容体（PDGFR）α及び／又はβ、並びにマスト細胞／幹細胞成長因子受容体（SCFR；c-Kit若しくはチロシンタンパク質キナーゼKit、又はCD117として知られている）が含まれる。
【００７６】
この阻害効果は、様々な場面で利用することができる。
１．癌によって引き起こされた血管新生の効率的な阻害
２．炎症組織中への血管新生の阻害
３．内皮細胞及び／又は平滑筋細胞自体の異常な増殖の阻害（内皮細胞腫瘍又は血管異常における病理学的変化であるから）
【００７７】
使用の際は、上記化合物を、内皮細胞及び／又は平滑筋細胞の分化増殖及び／又は遊走を阻害するのに適した量で患者に投与してもよい。さらに、前記使用は、患者のタイプ、標的部位もしくは標的臓器、又は上記の患者の体内の指定した最終標的部位もしくは臓器、又は上記のin vivo活性（activities）を輸送することができる医薬組成物若しくは処方等の適切な適用条件によって決定される。
【００７８】
さらに、上記化合物は、局所的及び／又は粘膜に対して、例えば、軟膏、クリーム、ローション、ジェル、スプレー、粉末、油剤及び経皮硬膏の形で、また、ペレット剤を含むデポ剤投薬の形状で投与することができる。それは、非経口的、例えば、筋肉内に投与することができ、又は静脈内若しくは皮下注射若しくは注入によって投与することもできる。または、鼻腔内投与、腔（例えば膀胱、腹部、小腸）への点滴、及び／又は経口的に、例えば、錠剤、カプセル、糖衣錠若しくはフィルムコート錠の形態、液剤若しくは懸濁剤の形態で投与することができる。又は、例えば、坐剤の形状で直腸へ投与することができる。又は、注射剤及び点眼剤として眼内へ投与することができる。
【００７９】
内皮細胞及び／又は平滑筋細胞の分化増殖及び／又は遊走を阻害するための適用量は、例えば、使用者の年齢、体重、健康状態及び投与形態によって、適切に選択することができる。例えば、成人に対する経口投与量は、１日１〜５回、約１mg／回から約150〜1,000mg／回までの範囲である。
【００８０】
したがって、前記化合物は、製剤学的に許容できる担体及び／又は賦形剤及び／又は希釈剤を更に含む医薬組成物に含まれ得る。
【００８１】
局所的使用のため、当該組成物は、例えば、アーモンド油、ピーナッツ油、オリーブ油、桃仁油、ひまし油等の植物油脂；植物抽出物；エーテル油（ethereal oil）；更に植物性の蝋及び合成油及び動物性油；ステアリン酸及びステアリン酸エステル、ラウリン酸及びラウリン酸エステル、ソルビタンエステル並びにセテアリルアルコール等の脂質及びワックス；レシチン、ラノリンアルコール、カロテン、香料、一価又は多価アルコール、尿素、ポロキサマー類、Tween類等の界面活性剤；保存料及び着色剤等を含めて処方することができる。水中油型又は油中水型のエマルジョンとしての処方が好ましい。
【００８２】
固形の経口剤は、活性化合物と共に、希釈剤（例えば、ラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンスターチ、ポテトスターチ等）；滑沢剤（例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、マグネシウム又はステアリン酸カルシウム）、及び／又はポリエチレングリコール、ポロキサマー類、トコフェリルポリエチレングリコールスクシネート（TPGS）等；
【００８３】
結合剤（例えば、デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドン）；脱凝集剤（例えば、デンプン、アルギン酸、アルギン酸エステル又はデンプングリコール酸ナトリウム）；発泡性混合物
【００８４】
着色料、甘味料、湿潤剤（例えば、レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩）、及び、一般的に、医薬組成物に使用される無毒性かつ薬理学的に不活性な物質を含むことができる。これら製剤は、公知の方法、例えば、混合、造粒、打錠、糖衣又はフィルムコーティング法によって製造することができる。経口用液体分散液は、例えば、シロップ、エマルジョン及び懸濁液であってもよい。
【００８５】
上記シロップは、担体として、例えば、サッカロース、又はグリセリン及び／又はマンニトール及び／又はソルビトールとともにサッカロースを含んでもよい。
【００８６】
前記懸濁液及びエマルジョンは、担体として、例えば、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はポリビニルアルコール、ポロキサマー類、又はTPGSを含んでもよい。
【００８７】
筋肉注射用の懸濁液又は溶液は、前記活性化合物と共に、製剤学的に許容される担体、例えば、滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、ポリエチレングリコール等のグリコール、及び必要に応じて、適切な量の塩酸リドカインを含んでもよい。
【００８８】
静脈内又は皮下への注射又は注入用の溶液は、担体として、例えば、滅菌水を含んでもよく、又は好ましくは、滅菌した水性等張生理食塩水であってもよい。
【００８９】
坐剤は、前記活性化合物と共に、製剤学的に許容できる担体、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、界面活性剤又はレシチンを含んでもよい。
【００９０】
適切な組成物中の前記活性化合物の含有量は、本願で使用される化合物の少なくとも0.0001重量％であってもよく、例えば、0.0001〜20重量％、好ましくは0.6〜10重量％、さらに好ましくは１〜５重量％である。
【００９１】
皮膚への浸透を促進する目的で物質を混合する場合、それらの含有量は、ヒアルロニダーゼを使用するときは、例えば、0.01〜１重量％、好ましくは0.05〜0.2重量％、ジメチルイソソルビド又はDMSOを使用するときは１〜25重量％、好ましくは５〜10重量％、ポロキサマーを使用するときは0.5〜30重量％であり得るし、TPGSを使用するときは0.5〜30重量％であり得る。
【００９２】
本願発明を以下に実施例によってさらに説明する。しかし、これらは例示に過ぎず、本願発明を何等制限するものではない。
【実施例】
【００９３】
ヒト臍帯静脈内皮細胞の調製及び処理
以下の章で記載された全ての実験は、少なくともトリプリケートで、主に２つの異なる細胞数にて、培養時間を変えて行った。さらに全ての実験は、異なる継代数の一つのHUVECに対して異なる調製物（preparations）とともに、さらに数回繰り返して行った。
【００９４】
簡潔に述べると、ヒト臍帯静脈内皮細胞（以下、HUVEC）は、当該技術分野の公知の方法により、ヒト臍帯から新たに単離し、in vitroにおける細胞の変化に端を発するいかなる実験で生じたデータ（アーティファクト）を防ぐため、継代回数４から10までの細胞を実験に使用した。
【００９５】
全ての実験において、培地に含まれる外因性の要因に由来するすべてのアーティファクトを除外するため、Ｃ−１９ステロイド化合物である4-OHTをEGM-2培地（Lonza社製）中の細胞に、指示された濃度で添加した。全ての実験を少なくとも３回行い、同じ応答パターンが示された。
【００９６】
培養したHUVEC細胞の遺伝子発現の同一性、分化及び長期安定性は、抗フォンヴィレブランド因子（von-Willebrand Factor；vWF）抗体を用いた免疫細胞化学染色により評価した。vWFの発現は、内皮細胞に非常に特異的である。継代1回目と10回目との間で、vWFの発現の安定性を数値で定量的に表した。このタイムタイムスケジュール間では、培養期間内及び使用した異なるバッチ間で、わずかな変化が生じたに過ぎなかった。
【００９７】
実施例１  内皮細胞の分化増殖の阻害
【００９８】
哺乳類の内皮細胞の細胞分化増殖を定量する一つの方法として、以下に記載する通りの分化増殖アッセイ（proliferation assay）を行った。
【００９９】
増殖速度の測定について、WST-1テストを行った。本質的に、96ウェルプレートに、1,000個／ウェルでHUVECを播種し、指示された濃度の4-OHT（ラボコードCR1447によって示される）で５日間処理した。分化増殖阻害は、細胞のミトコンドリア脱水素酵素によってテトラゾリウム塩であるWST-1のホルマザンへの酵素的開裂を、細胞生存率のための読出し情報として測定することによって定量した。ここで、適切な濃度の溶媒だけを含む未処理の対照群に対する百分率として、処理した細胞の生存率を表示した。検体数３（triplicate）で実施した３回の独立した実験の平均値を図１Ａに示す。
【０１００】
図１Ａに示すように、4-ヒドロキシテストステロンによる増殖阻害は、１μＭ、２μＭ及び５μＭの全濃度で、３つのHUVEC細胞培養物すべてにおいて、高い有意性（p<0.001）を示した（ｔ検定）。これは、0.2μＭ、0.4μＭ及び1.0μＭにおける既知のVEGF阻害剤であるTKI258（ドビニチブ(Dovitinib)）と同程度であった。細胞は、それぞれ内皮細胞成長培地（EGM）で３日間継代培養（サブカルチャー）させ、そして５日間増殖させた。更に図１Ｂに示すように、TKI258と組み合わせたCR1447の増殖阻害は、それぞれ単独の場合と比較して、３つの全てのHUVEC細胞培養物中でも高い有意性（p<0.001）を示した（ｔ検定）。
【０１０１】
実施例２  トランスウェル遊走アッセイを用いた内皮細胞の遊走阻害
血管新生の必要条件は、内皮細胞の組織内へ遊走する能力である。この過程は、創傷被覆及び癌の増殖過程で観察される。内皮細胞はVEGFなどの因子の濃度勾配に沿って、組織内へと遊走する。この挙動は、例えば、図２Ａから明らかなように、トランスウェルシステム（transwell system）を用いたin vitroの遊走モデルで調べることができる。特に、図２Ａは、細胞の遊走をモニターするためのトランスウェルアッセイ用の典型的な装置を示している。
【０１０２】
孔径３μmのPET膜（フィブロネクチンコーティングをしていない24ウェル）を備えるトランスウェルシステムを用いたHUVEC細胞の遊走実験のために、異なる細胞数のHUVEC細胞を上部コンパートメントに載せ、一方、誘引物質を下部コンパーメントに置いた。前記誘引物質側の膜上の細胞数を、対照系（バッファー対照）及び4-OHT存在下の誘引物質（VEGF）とで、目に見える細胞で比較した。
【０１０３】
図２Ｂは、３つの独立した実験の典型的な画像を示す。具体的には、Fl-ブロック膜を用いて、遊走したHUVEC細胞をヨウ化プロミジウム染色した画像である。細胞を上述したように播種し、下部チャンバー中のVEGFを誘引物質として使用して、48時間遊走を行なった。図は３つの独立した実験の例を示す。対照群と比較して見てもわかるように、4-OHTは細胞の膜内への遊走を有意に阻害し、4-OHT（記号「CR」）で処理されたサンプルにおける遊走細胞の数が著しく減少していることが示された。
【０１０４】
実施例３  創傷治癒アッセイを使用した内皮細胞の遊走阻害
細胞遊走を検討する別の方法は、創傷治癒（スクラッチ）アッセイである。このアッセイは、急性の創傷治癒過程で生じる事象に似ている。創傷部位からファクターを取り除くことで、内皮細胞はスクラッチ領域内に遊走する。これは、血管形成による創傷治癒とその後の瘢痕形成による傷の閉塞の過程に似ている。
【０１０５】
要約すると、HUVEC細胞を12ウェルプレートに播種し、コンフルエントになるまで増殖させた。引き続き、スクラッチをセットし、それによってスクラッチ領域内から細胞を除いた。細胞を10μMの4-OHTに曝露し、個々の実験計画に従って、2時間から48時間までのスケジュールで、顕微鏡で内皮細胞のスクラッチ領域内への遊走を観察した。
【０１０６】
３つの独立した実験から得られた典型的な画像を図３に示す。図３は、異なる濃度やタイムスケジュールによる10の独立した実験から得られた典型的な結果を示している。当該創傷治癒アッセイ（スクラッチアッセイ）で示したように、内皮細胞の遊走は、4-OHTにより効果的に阻害された。24時間後、未処理の対照群に比べて、HUVEC細胞の遊走の明らかな減少が4-OHT（CR 1447）の影響下で見られた。
【０１０７】
実施例４：チューブ遊走アッセイ
スクラッチ（掻き取った小片）の組織内への遊走後、HUVEC細胞は成長特性を変化させ、微小血管を形成する。この効果は、顕微鏡で評価することができる。
【０１０８】
HUVEC細胞をマトリゲル上に播種した（7mg/ml）。10μM/Lの4-OHTを含むゲルと細胞懸濁液とを播種物の上に加えた。基底膜の性質を模倣するこの表面上に接着する間に、分岐点（branching points）を形成させた。12時間後及び48時間後、管腔形成を顕微鏡で分析した。
【０１０９】
３つの独立した実験から得られた典型的な画像を図４に示した。その結果、ヒト内皮細胞（HUVEC）の管腔形成は、4-OHT（下の列のCRと特定されたサンプル）の適用により、有意に阻害された。ヒト内皮細胞をマトリゲルパッド上に供した場合、未処理の非対照群（赤い矢印）に比べて、管形成のマーカーとしての分岐点は、4-OHTによって阻害されていた。このように、4-OHTはゲル上の細胞の分岐形成を著しく阻害し、直線状の細胞と細胞‐細胞結合を妨害した。これは（新生）血管形成の著しい阻害を示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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