(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶型のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して２５℃、ｐＨ７．１から７．５の間で表面プラズモン共鳴で測定されるときに約０．１４μＭから約１０．０μＭまでの解離定数で、ＨＬＡ−Ａ＊０２と複合体形成したＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号１）に結合する特性を有するＴＣＲであって、前記ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインおよびＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲ可変ドメインが、ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号１）の少なくとも残基Ｙ３およびＥ７との接触を形成し、前記アルファ鎖可変ドメインが、配列番号４のアミノ酸残基１〜１１１の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号５のアミノ酸残基１〜１１１の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記アルファ鎖可変ドメインにおいて
（ｉ）そのアミノ酸残基１〜２６の配列が、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基１〜２６の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｉｉ）アミノ酸残基２７〜３２の配列が、ＤＲＧＳＱＳ、ＤＲＧＳＡＳまたはＤＲＧＳＳＳであり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３３〜４９の配列が、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基３３〜４９の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｉｖ）アミノ酸残基５０〜５４の配列が、ＩＹＳＮＧであり、
（ｖ）そのアミノ酸残基５５〜８９の配列が、配列番号４のアミノ酸残基５５〜８９の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、またはそれに対して相対的に１つ、２つまたは３つの挿入、欠失もしくは置換を有し、
（ｖｉ）アミノ酸９０〜９３の配列が、ＡＶＲＧであり、
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基９４〜１１１の配列が、配列番号４のアミノ酸残基９４〜１１１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、またはそれに対して相対的に１つ、２つまたは３つの挿入、欠失もしくは置換を有し、
前記ベータ鎖可変ドメインにおいて
（ｉ）そのアミノ酸残基１〜２６の配列が、（ａ）配列番号５の残基１〜２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｉｉ）アミノ酸残基２７〜３１の配列が、ＭＮＨＥＹまたはＭＮＨＤＹであり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３２〜４８の配列が、（ａ）配列番号５のアミノ酸残基３２〜４８の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｉｖ）アミノ酸残基４９〜５３の配列が、ＳＶＧＥＧ、ＳＶＳＥＧ、ＳＶＡＥＧまたはＳＶＦＥＧであり、
（ｖ）そのアミノ酸残基５４〜９０の配列が、（ａ）配列番号５のアミノ酸残基５４〜９０の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｖｉ）アミノ酸９１〜９５の配列が、ＣＡＳＳＦであり、
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基９６〜１１１の配列が、配列番号５のアミノ酸残基９６〜１１１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、またはそれに対して相対的に１つ、２つまたは３つの挿入、欠失もしくは置換を有する、ＴＣＲ。
【請求項２】
アルファ鎖ＴＲＡＣ定常ドメイン配列およびベータ鎖ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を有する、アルファ−ベータヘテロ二量体である、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項３】
前記アルファ鎖およびベータ鎖定常ドメイン配列が、ＴＲＡＣのエクソン２のＣｙｓ４とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のエクソン２のＣｙｓ２との間の天然のジスルフィド結合を欠失させるためのトランケーションまたは置換によって修飾される、請求項２に記載のＴＣＲ。
【請求項４】
前記アルファ鎖およびベータ鎖定常ドメイン配列が、ＴＲＡＣのＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のＳｅｒ５７についてのシステイン残基の置換によって修飾され、前記システインが、前記ＴＣＲの前記アルファ定常ドメインと前記ベータ定常ドメインとの間のジスルフィド結合を形成する、請求項２または請求項３に記載のＴＣＲ。
【請求項５】
ＶαおよびＶβがそれぞれＴＣＲα可変領域およびＴＣＲβ可変領域であり、ＣαおよびＣβがそれぞれＴＣＲα定常領域およびＴＣＲβ定常領域であり、Ｌがリンカー配列である、型Ｖα−Ｌ−Ｖβ、Ｖβ−Ｌ−Ｖα、Ｖα−Ｃα−Ｌ−Ｖβ、またはＶα−Ｌ−Ｖβ−Ｃβの単鎖形式である、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項６】
検出可能な標識、治療剤またはＰＫ改変基と結合された、請求項１から５のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項７】
前記アルファ鎖可変ドメインが、配列番号４に示されている番号付けを参照して
【表１】
0006751391.tif 000011
の変異を有し、かつ／または前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号５に示されている番号付けを参照して
【表２】
0006751391.tif 000012
の変異のうちの少なくとも１つを有する、請求項１から６のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項８】
前記アルファ鎖可変ドメインが、配列番号６もしくは１２のアミノ酸残基１〜１１１のアミノ酸配列または
そのアミノ酸残基１〜２６、３３〜４９、５５〜８９および９４〜１１１がそれぞれ配列番号６もしくは１２のアミノ酸残基１〜２６、３３〜４９、５５〜８９および９４〜１１１の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２７〜３２、５０〜５４および９０〜９３がそれぞれ配列番号６もしくは１２のアミノ酸残基２７〜３２、５０〜５４および９０〜９３の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項９】
前記アルファ鎖可変ドメインが、配列番号７もしくは１３のアミノ酸残基１〜１１１のアミノ酸配列または
そのアミノ酸残基１〜２６、３３〜４９、５５〜８９および９４〜１１１がそれぞれ配列番号７もしくは１３のアミノ酸残基１〜２６、３３〜４９、５５〜８９および９４〜１１１の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２７〜３２、５０〜５４および９０〜９３がそれぞれ配列番号７もしくは１３のアミノ酸残基２７〜３２、５０〜５４および９０〜９３の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項１０】
前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号８もしくは１４のアミノ酸配列または
そのアミノ酸残基１〜２６、３２〜４８、５４〜９０および９６〜１１１がそれぞれ配列番号８もしくは１４のアミノ酸残基１〜２６、３２〜４８、５４〜９０および９６〜１１１の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２７〜３１、４９〜５３および９１〜９５がそれぞれ配列番号８もしくは１４のアミノ酸残基２７〜３１、４９〜５３および９１〜９５の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項１１】
前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号９もしくは１５のアミノ酸配列または
そのアミノ酸残基１〜２６、３２〜４８、５４〜９０および９６〜１１１がそれぞれ配列番号９もしくは１５のアミノ酸残基１〜２６、３２〜４８、５４〜９０および９６〜１１１の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２７〜３１、４９〜５３および９１〜９５がそれぞれ配列番号９もしくは１５のアミノ酸残基２７〜３１、４９〜５３および９１〜９５の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項１２】
前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号１０もしくは１６のアミノ酸配列
またはそのアミノ酸残基１〜２６、３２〜４８、５４〜９０および９６〜１１１がそれぞれ配列番号１０もしくは１６のアミノ酸残基１〜２６、３２〜４８、５４〜９０および９６〜１１１の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２７〜３１、４９〜５３および９１〜９５がそれぞれ配列番号１０もしくは１６のアミノ酸残基２７〜３１、４９〜５３および９１〜９５の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項１３】
前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号１１もしくは１７のアミノ酸配列または
そのアミノ酸残基１〜２６、３２〜４８、５４〜９０および９６〜１１１がそれぞれ配列番号１１もしくは１７のアミノ酸残基１〜２６、３２〜４８、５４〜９０および９６〜１１１の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２７〜３１、４９〜５３および９１〜９５がそれぞれ配列番号１１もしくは１７のアミノ酸残基２７〜３１、４９〜５３および９１〜９５の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項に記載のＴＣＲをコードする核酸。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれか１項に記載のＴＣＲを提示している、単離されたまたは天然に存在しない細胞、特に、Ｔ細胞。
【請求項１６】
（ａ）単一のオープンリーディングフレーム内に、もしくは前記アルファ鎖および前記ベータ鎖をそれぞれコードする２つの異なるオープンリーディングフレーム内に、請求項１４に記載の核酸を含むＴＣＲ発現ベクター、または
（ｂ）請求項１から１３のいずれか１項に記載のＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および請求項１から１３のいずれか１項に記載のＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクターを宿している細胞。
【請求項１７】
１種または複数の薬学的に許容される担体または添加剤と一緒に、請求項１から１３のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１４の核酸、または請求項１５もしくは請求項１６に記載の細胞を含む医薬組成物。
【請求項１８】
薬における使用のための、請求項１から１３のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１４の核酸または請求項１５もしくは請求項１６の細胞。
【請求項１９】
がんを治療する方法における使用のための、請求項１８に記載の使用のためのＴＣＲ、核酸または細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＡＧＥ−Ａ１０タンパク質由来のＨＬＡ−Ａ＊０２制限ペプチドＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号１）を結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。本発明のＴＣＲは、このＭＡＧＥエピトープに対する優れた特異性プロファイルを示す。
【背景技術】
【０００２】
ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号１）ペプチドは、多くの腫瘍型において発現される既知のＭＡＧＥ−Ａ１０タンパク質のアミノ酸残基番号２５４〜２６２に該当する。ＭＡＧＥ−Ａ１０は、多数の配列関連ＭＡＧＥがん−精巣抗原タンパク質の最も免疫原性のメンバーのうちの１つである。それは、１／３から１／２の間の一範囲の一般的な固形腫瘍型（例えば、肺、肝臓および胃の転移巣）によって発現される。加えて、それは、より一般的でない数種類の腫瘍型（例えば、種々の扁平上皮癌）によって発現される。
【０００３】
正常な成人のＭＡＧＥ−Ａ１０組織発現は、胎盤および精子細胞／精巣の免疫特権部位に限定される。
【０００４】
ＭＡＧＥ−Ａ１０  Ｔ細胞抗原ペプチドＧＬＹＤＧＭＥＨＬは、ＨＬＡ−Ａ２陽性腫瘍細胞株によって提示されると質量分析を介して確認されている。
【０００５】
いくつかのＭＡＧＥ遺伝子ファミリータンパク質は、生殖細胞およびがんにおいてのみ発現される（ＭＡＧＥ−ＡからＭＡＧＥ−Ｃファミリー）。他は、正常組織において広範に発現される（ＭＡＧＥ−ＤからＭＡＧＥ−Ｈ）。これらすべてのＭＡＧＥタンパク質ファミリーは、ＭＡＧＥ−Ａ１０  ＧＬＹＤＧＭＥＨＬペプチドの配列と近似した相同領域を有する。したがって、ＭＡＧＥ−Ａ１０ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２抗原に特異性が高い、または少なくとも、相補的な正常組織および腫瘍内の分布を有する他のＭＡＧＥファミリー抗原に結合する、ＴＣＲ臨床候補を選択することは重要である。
【発明の概要】
【０００６】
第１の態様では、本発明は、可溶型のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して２５℃、ｐＨ７．１から７．５の間で表面プラズモン共鳴で測定されるときに約０．０５μＭから約１０．０μＭまでの解離定数で、ＨＬＡ−Ａ＊０２と複合体形成したＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号１）に結合する特性を有するＴＣＲであって、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインおよびＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含み、ＴＣＲ可変ドメインは、ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号１）の少なくとも残基Ｙ３およびＥ７との接触を形成する、ＴＣＲを提供する。
【０００７】
一部の実施形態では、ＴＣＲのアルファ鎖可変ドメインは、配列番号４のアミノ酸残基１〜１１１の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／またはベータ鎖可変ドメインは、配列番号５のアミノ酸残基１〜１１１の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０００８】
さらなる態様では、本発明は、ＨＬＡ−Ａ＊０２と複合体形成したＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号１）に結合する特性を有し、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインおよびＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
アルファ鎖可変ドメインは、配列番号４のアミノ酸残基１〜１１１の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または
ベータ鎖可変ドメインは、配列番号５のアミノ酸残基１〜１１１の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＴＣＲを提供する。
【０００９】
ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ  ＨＬＡ−Ａ２複合体は、本発明のＴＣＲが標的としうるがんマーカーを提供する。本発明は、がん細胞に細胞傷害剤または免疫エフェクター剤を送達する目的に有用な、かつ／または養子療法における使用に有用な、こうしたＴＣＲを提供する。
【００１０】
ＴＣＲは、国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）ＴＣＲ命名法、およびＴＣＲ配列のＩＭＧＴ公的データベースへのリンクを使用して記載されている。天然のアルファ−ベータヘテロ二量体ＴＣＲは、アルファ鎖およびベータ鎖を有する。概して、それぞれの鎖は、可変領域、連結領域および定常領域を含み、ベータ鎖は、通常、可変領域と連結領域との間に短い多様性領域も含むが、この多様性領域は、連結領域の部分とみなされることが多い。それぞれの可変領域は、フレームワーク配列内に埋め込まれた３つのＣＤＲ（相補性決定領域）を含み、１つは、ＣＤＲ３と命名された超可変領域である。それらのフレームワーク、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列によって、ならびに部分的に定義されたＣＤＲ３配列によって、区別されるいくつかの型のアルファ鎖可変（Ｖα）領域およびいくつかの型のベータ鎖可変（Ｖβ）領域がある。Ｖα型は、ＩＭＧＴ命名法において固有のＴＲＡＶ番号によって称される。したがって、「ＴＲＡＶ２１」は、ＴＣＲからＴＣＲまでで保存されているがＴＣＲからＴＣＲまでで異なるアミノ酸配列も含むアミノ酸配列によって部分的に定義される固有のフレームワークおよびＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列、ならびにＣＤＲ３配列を有するＴＣＲ  Ｖα領域を定義する。同様の方法で、「ＴＲＢＶ５−１」は、固有のフレームワークおよびＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を有するＴＣＲ  Ｖβ領域を定義するが、部分的にのみ定義されたＣＤＲ３配列を有する。
【００１１】
ＴＣＲの連結領域は、固有のＩＭＧＴ  ＴＲＡＪおよびＴＲＢＪ命名法によって、定常領域は、ＩＭＧＴ  ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ命名法によって、同様に定義される。
【００１２】
ベータ鎖多様性領域は、ＩＭＧＴ命名法において略語ＴＲＢＤによって称され、上記のように、連鎖状のＴＲＢＤ／ＴＲＢＪ領域は、連結領域と一緒とみなされることが多い。
【００１３】
αβＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、一般に、それぞれ２つの「ドメイン」、すなわち、可変ドメインおよび定常ドメインを有するとみなされる。可変ドメインは、可変領域および連結領域の連鎖からなる。本明細書および特許請求の範囲において、「ＴＣＲアルファ可変ドメイン」という用語は、したがって、ＴＲＡＶおよびＴＲＡＪ領域の連鎖を指し、ＴＣＲアルファ定常ドメインという用語は、細胞外ＴＲＡＣ領域、またはＣ末端トランケート型ＴＲＡＣ配列を指す。同様に、「ＴＣＲベータ可変ドメイン」という用語は、ＴＲＢＶおよびＴＲＢＤ／ＴＲＢＪ領域の連鎖を指し、ＴＣＲベータ定常ドメインという用語は、細胞外ＴＲＢＣ領域、またはＣ末端トランケート型ＴＲＢＣ配列を指す。
【００１４】
ＩＭＧＴ命名法によって定義される固有の配列は、ＴＣＲ分野における当業者に広く知られており、利用可能である。例えば、それらは、ＩＭＧＴ公的データベースにおいて見出されうる。“Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ”，（２００１）ＬｅＦｒａｎｃ  ａｎｄ  ＬｅＦｒａｎｃ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−１２−４４１３５２−８も、ＩＭＧＴ命名法によって定義される配列を開示しているが、その公開日および結果として生じる時間のずれのため、その中の情報は、時に、ＩＭＧＴデータベースの参照による確認を必要とする。
【００１５】
本発明による１つのＴＣＲは、配列番号２に示されているようなアルファ鎖細胞外ドメインおよび配列番号３に示されているようなベータ鎖細胞外ドメインを含む。「親ＴＣＲ」、「親ＭＡＧＥ−Ａ１０  ＴＣＲ」という用語は、本明細書において同義的に使用され、配列番号２および３それぞれの細胞外アルファ鎖およびベータ鎖を含むこのＴＣＲを指す。ペプチド−ＨＬＡ複合体に対して親ＴＣＲよりも高い親和性および／または遅い解離速度を有する、親ＴＣＲに対して相対的に変異または修飾されたＴＣＲを提供することは望ましい。
【００１６】
こうした変異または修飾されたＴＣＲの結合プロファイルが比較されうるものに対する参照ＴＣＲを提供する目的で、図２ａ（配列番号４）に示されている親ＭＡＧＥ−Ａ１０  ＴＣＲアルファ鎖の細胞外配列および図２ｂ（配列番号５）に示されている親ＭＡＧＥ−Ａ１０  ＴＣＲベータ鎖の細胞外配列を有する本発明による可溶性ＴＣＲを使用することは都合がいい。そのＴＣＲは、本明細書において、「参照ＴＣＲ」または「参照ＭＡＧＥ−Ａ１０  ＴＣＲ」と称される。配列番号４は、Ｔ１６２（すなわち、ＴＲＡＣのＴ４８）からＣ１６２に置換されていることを除いて配列番号２の親アルファ鎖細胞外配列であることに留意されたい。同様に、配列番号５は、Ｓ１６９（すなわち、ＴＲＢＣ２のＳ５７）からＣ１６９に置換され、Ｃ１８７からＡ１８７に置換され、Ｎ２０１からＤ２０１に置換されていることを除いて配列番号３の親ベータ鎖細胞外配列である。親アルファ鎖および親ベータ鎖細胞外配列に対して相対的なこれらのシステイン置換は、リフォールディングされた可溶性ＴＣＲ、すなわち、細胞外アルファ鎖およびベータ鎖をリフォールディングすることによって形成されたＴＣＲを安定化する鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。安定なジスルフィドで連結された可溶性ＴＣＲを参照ＴＣＲとして使用することにより、結合親和性および結合半減期のさらに好都合な評価が可能となる。本発明のＴＣＲは、上記の変異を含んでいてもよい。
【００１７】
本発明のＴＣＲは、天然に存在しないものであってもよく、かつ／または精製および／もしくは改変されていてもよい。本発明のＴＣＲは、親ＴＣＲに対して相対的なアルファ鎖可変ドメインおよび／またはベータ鎖可変ドメインに存在する２つ以上の変異を有していてもよい。「改変ＴＣＲ」および「変異体ＴＣＲ」は、本明細書において同義的に使用され、親ＴＣＲに対して相対的に、特に、そのアルファ鎖可変ドメインおよび／またはベータ鎖可変ドメイン内に、導入された１つまたは複数の変異を有するＴＣＲを一般に意味する。これらの変異は、ＨＬＡ−Ａ＊０２と複合体形成したＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号１）に対する結合親和性を改良しうる。ある特定の実施形態では、アルファ鎖可変ドメイン内に１、２、３、４、５、６、７つまたは８つの変異、例えば、４つまたは８つの変異があり、かつ／またはベータ鎖可変ドメイン内に１、２、３、４つまたは５つの変異、例えば、５つの変異がある。一部の実施形態では、本発明のＴＣＲのα鎖可変ドメインは、配列番号４のアミノ酸残基１〜１１１の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、本発明のＴＣＲのβ鎖可変ドメインは、配列番号５のアミノ酸残基１〜１１１の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００１８】
本発明のＴＣＲのアルファ鎖可変ドメインは、配列番号４に示されている番号付けを参照して
【表１】
0006751391.tif 000002
の変異を有していてもよく、かつ／または
ベータ鎖可変ドメインは、配列番号５に示されている番号付けを参照して
【表２】
0006751391.tif 000003
の変異のうちの少なくとも１つを有していてもよい。
【００１９】
本発明のＴＣＲのアルファ鎖可変ドメインは、配列番号６もしくは１２のアミノ酸残基１〜１１１のアミノ酸配列
またはそのアミノ酸残基１〜２６、３３〜４９、５５〜８９および９４〜１１１がそれぞれ配列番号６もしくは１２のアミノ酸残基１〜２６、３３〜４９、５５〜８９および９４〜１１１の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２７〜３２、５０〜５４および９０〜９３がそれぞれ配列番号６もしくは１２のアミノ酸残基２７〜３２、５０〜５４および９０〜９３の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでいてもよい。
【００２０】
代替的に、アルファ鎖可変ドメインは、配列番号７もしくは１３のアミノ酸残基１〜１１１のアミノ酸配列
またはそのアミノ酸残基１〜２６、３３〜４９、５５〜８９および９４〜１１１がそれぞれ配列番号７もしくは１３のアミノ酸残基１〜２６、３３〜４９、５５〜８９および９４〜１１１の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２７〜３２、５０〜５４および９０〜９３がそれぞれ配列番号７もしくは１３のアミノ酸残基２７〜３２、５０〜５４および９０〜９３の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでいてもよい。
【００２１】
アルファ鎖可変ドメインにおいて
（ｉ）そのアミノ酸残基１〜２６の配列は、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基１〜２６の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有していてもよく、
（ｉｉ）アミノ酸残基２７〜３２の配列は、ＤＲＧＳＱＳ、ＤＲＧＳＡＳまたはＤＲＧＳＳＳであってもよく、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３３〜４９の配列は、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基３３〜４９の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有していてもよく、
（ｉｖ）アミノ酸残基５０〜５４の配列は、ＩＹＳＮＧであってもよく、
（ｖ）そのアミノ酸残基５５〜８９の配列は、配列番号４のアミノ酸残基５５〜８９の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、またはそれに対して相対的に１つ、２つまたは３つの挿入、欠失もしくは置換を有していてもよく、
（ｖｉ）アミノ酸９０〜９３の配列は、ＡＶＲＧであってもよく、
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基９４〜１１１の配列は、配列番号４のアミノ酸残基９４〜１１１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、またはそれに対して相対的に１つ、２つまたは３つの挿入、欠失もしくは置換を有していてもよい。
【００２２】
本発明のＴＣＲのベータ鎖可変ドメインは、配列番号８もしくは１４のアミノ酸配列
またはそのアミノ酸残基１〜２６、３２〜４８、５４〜９０および９６〜１１１がそれぞれ配列番号８もしくは１４のアミノ酸残基１〜２６、３２〜４８、５４〜９０および９６〜１１１の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２７〜３１、４９〜５３および９１〜９５がそれぞれ配列番号８もしくは１４のアミノ酸残基２７〜３１、４９〜５３および９１〜９５の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでいてもよい。
【００２３】
代替的に、本発明のＴＣＲのベータ鎖可変ドメインは、配列番号９もしくは１５のアミノ酸配列
またはそのアミノ酸残基１〜２６、３２〜４８、５４〜９０および９６〜１１１がそれぞれ配列番号９もしくは１５のアミノ酸残基１〜２６、３２〜４８、５４〜９０および９６〜１１１の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２７〜３１、４９〜５３および９１〜９５がそれぞれ配列番号９もしくは１５のアミノ酸残基２７〜３１、４９〜５３および９１〜９５の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでいてもよい。
【００２４】
代替的に、本発明のＴＣＲのベータ鎖可変ドメインは、配列番号１０もしくは１６のアミノ酸配列
またはそのアミノ酸残基１〜２６、３２〜４８、５４〜９０および９６〜１１１がそれぞれ配列番号１０もしくは１６のアミノ酸残基１〜２６、３２〜４８、５４〜９０および９６〜１１１の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２７〜３１、４９〜５３および９１〜９５がそれぞれ配列番号１０もしくは１６のアミノ酸残基２７〜３１、４９〜５３および９１〜９５の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでいてもよい。
【００２５】
代替的に、本発明のＴＣＲのベータ鎖可変ドメインは、配列番号１１もしくは１７のアミノ酸配列
またはそのアミノ酸残基１〜２６、３２〜４８、５４〜９０および９６〜１１１がそれぞれ配列番号１１もしくは１７のアミノ酸残基１〜２６、３２〜４８、５４〜９０および９６〜１１１の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２７〜３１、４９〜５３および９１〜９５がそれぞれ配列番号１１もしくは１７のアミノ酸残基２７〜３１、４９〜５３および９１〜９５の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでいてもよい。
【００２６】
ベータ鎖可変ドメインにおいて
（ｉ）そのアミノ酸残基１〜２６の配列は、（ａ）配列番号５の残基１〜２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有していてもよく、
（ｉｉ）アミノ酸残基２７〜３１の配列は、ＭＮＨＥＹまたはＭＮＨＤＹであってもよく、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３２〜４８の配列は、（ａ）配列番号５のアミノ酸残基３２〜４８の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有していてもよく、
（ｉｖ）アミノ酸残基４９〜５３の配列は、ＳＶＧＥＧ、ＳＶＳＥＧ、ＳＶＡＥＧまたはＳＶＦＥＧであってもよく、
（ｖ）そのアミノ酸残基５４〜９０の配列は、（ａ）配列番号５のアミノ酸残基５４〜９０の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有していてもよく、
（ｖｉ）アミノ酸９１〜９５の配列は、ＣＡＳＳＦであってもよく、
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基９６〜１１１の配列は、配列番号５のアミノ酸残基９６〜１１１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよい、またはそれに対して相対的に１つ、２つまたは３つの挿入、欠失もしくは置換を有していてもよい。
【００２７】
本発明のＴＣＲは、以下のアルファ鎖およびベータ鎖可変ドメインの組合せのうちの１つを有していてもよい：
【表３Ａ】
0006751391.tif 000004
【表３Ｂ】
0006751391.tif 000005
【表３Ｃ】
0006751391.tif 000006
【００２８】
本明細書中に開示されている本発明のいずれのＴＣＲの表現型的にサイレントなバリアントも本発明の範囲内である。本明細書中で使用される場合、「表現型的にサイレントなバリアント」という用語は、上記のものに加えて１つまたは複数のさらなるアミノ酸変更を組み込むＴＣＲであって前記変更を含まない対応するＴＣＲと類似した表現型を有するＴＣＲを指すことが理解される。本出願の目的で、ＴＣＲ表現型には、抗原結合特異性（ＫＤおよび／または結合半減期）および抗原特異性が含まれる。表現型的にサイレントなバリアントは、同一条件下で（例えば、２５℃、同じＳＰＲチップ上で）測定されたときに、前記変更を含まない対応するＴＣＲの測定されたＫＤおよび／または結合半減期の１０％以内の、ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号１）  ＨＬＡ−Ａ＊０２複合体に対するＫＤおよび／または結合半減期を有していてもよい。好適な条件は、実施例３においてさらに定義されている。抗原特異性は、以下でさらに定義されている。当業者に知られているように、ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号１）  ＨＬＡ−Ａ＊０２複合体との相互作用のための親和性を変えることなく、上記に詳述されているものと比較して、その定常ドメインおよび／または可変ドメイン内に変更を組み込むＴＣＲを作製することが可能でありうる。特に、こうしたサイレントな変異は、抗原結合に直接に関与しないことが知られている配列の部分内（例えば、ＣＤＲの外側）に組み込まれうる。こうした些細なバリアントは、本発明の範囲内に含まれる。１つまたは複数の保存的置換がなされているＴＣＲも、本発明の部分を構成する。
【００２９】
変異は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいたもの、制限酵素に基づいたクローニング、またはライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）手順を含むが、これらに限定されない、任意の適切な方法を使用して行われうる。これらの方法は、多くの標準的な分子生物学教科書の中で詳述されている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および制限酵素に基づいたクローニングに関するさらなる詳細については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄ．）ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）手順についてのさらなる情報は、Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎ，（１９９５）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６（１）：３０−６において見出されうる。
【００３０】
本発明のＴＣＲは、ＭＡＧＥ−Ａ１０ペプチド、ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号１）  ＨＬＡ−Ａ２複合体を結合する特性を有する。本発明のＴＣＲは、他の、関連性のないエピトープに対して相対的に、そのＭＡＧＥエピトープに対する特異性が高いことが見出されており、したがって、そのエピトープを提示している細胞および組織に治療剤または検出可能な標識を送達するためのターゲティングベクターとして特に好適である。本発明のＴＣＲの文脈における特異性は、ペプチドＧＬＹＤＧＭＥＨＬについて陰性であるＨＬＡ−Ａ＊０２標的細胞を認識するきわめて低い能力を有するのに対して、該ペプチドについて陽性であるＨＬＡ−Ａ＊０２標的細胞を認識する本発明のＴＣＲの能力に関する。特異性を試験するために、ＴＣＲは、可溶型であってもよく、かつ／またはＴ細胞の表面上で発現されてもよい。認識は、ＴＣＲおよび標的細胞の存在下におけるＴ細胞活性化のレベルを測定することによって決定されうる。この場合には、ペプチド陰性標的細胞の最低限の認識は、同じ条件下で測定されたときに、ペプチド陽性標的細胞の存在下で産生されるレベルの１０％未満、好ましくは、５％未満、より好ましくは、１％未満のＴ細胞活性化のレベルとして定義される。本発明の可溶性ＴＣＲについて、特異性は、治療的に関連するＴＣＲ濃度で決定されうる。治療的に関連する濃度は、１０−９Ｍ以下のＴＣＲ濃度として、かつ／または対応するＥＣ５０値よりも最高１００倍、好ましくは、最高１０００倍高い濃度として定義されうる。ペプチド陽性細胞は、ペプチドをパルスすることによって得られてもよく、または、より好ましくは、それらは天然に存在する前記ペプチドであってもよい。好ましくは、ペプチド陽性細胞およびペプチド陰性細胞の両方がヒト細胞である。
【００３１】
本発明のある特定のＴＣＲは、養子療法における使用にきわめて好適であることが見出されている。こうしたＴＣＲは、２００μＭ未満、例えば、約０．０５μＭから約１００μＭまでの、複合体に対するＫＤを有していてもよく、かつ／または約０．５秒から約１２分までの範囲内の、複合体に対する結合半減期（Ｔ１／２）を有していてもよい。一部の実施形態では、本発明のＴＣＲは、約０．０５μＭから約１０μＭ、約０．１μＭから約５μＭまたは約０．１μＭから約２μＭまでの、複合体に対するＫＤを有しうる。理論に拘束されることを望むものではないが、養子細胞療法における治療的使用を伴うＴＣＲに対する親和性の最適枠があるようである。腫瘍抗原からエピトープを認識する天然に存在するＴＣＲは、一般に、親和性が低すぎ（２０マイクロＭから５０マイクロＭ）、（ナノモル範囲内またはそれより高い）きわめて高い親和性のＴＣＲは、交差反応性の問題を持つ（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０  ６１１６−６１３１；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９  ５８４５−５８５４；Ｓｃｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８４  ４９３６−４９４６）
【００３２】
本発明のＴＣＲは、αβヘテロ二量体であってもよくまたは単鎖形式であってもよい。単鎖形式には、Ｖα−Ｌ−Ｖβ、Ｖβ−Ｌ−Ｖα、Ｖα−Ｃα−Ｌ−ＶβまたはＶα−Ｌ−Ｖβ−Ｃβ型のαβＴＣＲポリペプチドが含まれ、ＶαおよびＶβはそれぞれＴＣＲα可変領域およびＴＣＲβ可変領域であり、ＣαおよびＣβはそれぞれＴＣＲα定常領域およびＴＣＲβ定常領域であり、Ｌはリンカー配列である。治療剤を抗原提示細胞に送達するためのターゲティング剤としての使用のために、ＴＣＲは、可溶型（すなわち、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを有していない）であってもよい。安定性のために、可溶性αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、ＷＯ０３／０２０７６３に、記載されているように、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有することが好ましい。本発明のαβヘテロ二量体内に存在する定常ドメインのうちの１つまたは両方は、例えば、多くとも１５個、または多くとも１０個もしくは多くとも８個の、またはそれより少ないアミノ酸だけ、Ｃ末端でトランケートされていてもよい。養子療法における使用のために、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの両方を有する完全長の鎖としてトランスフェクトされてもよい。養子療法における使用のためのＴＣＲは、自然界においてそれぞれのアルファ定常ドメインとベータ定常ドメインとの間に見出されるものと一致しているジスルフィド結合を含んでいてもよく、付加的にまたは代替的に、天然でないジスルフィド結合が存在していてもよい。
【００３３】
当業者には明らかであろうように、ＴＣＲの結合特性に実質的に影響を及ぼすことなく、所与の配列をそのＣ末端および／またはＮ末端で、１、２、３、４、５つまたはそれ以上の残基だけ、トランケートすることも可能でありうる。すべてのこうした些細なバリアントは、本発明によって包含される。
【００３４】
本発明のアルファ−ベータヘテロ二量体ＴＣＲは、通常、アルファ鎖ＴＲＡＣ定常ドメイン配列およびベータ鎖ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を含む。アルファ鎖およびベータ鎖定常ドメイン配列は、ＴＲＡＣのエクソン２のＣｙｓ４とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のエクソン２のＣｙｓ２との間の天然のジスルフィド結合を欠失させるためのトランケーションまたは置換によって修飾されていてもよい。アルファ鎖およびベータ鎖定常ドメイン配列は、ＴＲＡＣのＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のＳｅｒ５７についてのシステイン残基の置換によっても修飾されていてもよく、前記システインは、ＴＣＲのアルファ定常ドメインとベータ定常ドメインとの間でジスルフィド結合を形成する。
【００３５】
本発明のいくつかのＴＣＲは、参照ＭＡＧＥ−Ａ１０  ＴＣＲのものよりも実質的に高いＧＬＹＤＧＭＥＨＬ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に対する結合親和性、および／または結合半減期を有する。天然のＴＣＲの結合親和性を高めると、そのペプチド−ＭＨＣリガンドに対するＴＣＲの特異性が低下されることが多く、これは、Ｚｈａｏ  Ｙａｎｇｂｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔｓ，ＵＳ，ｖｏｌ．１７９，Ｎｏ  ９，１  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００７，５８４５−５８５４において実証されている。しかし、親ＴＣＲに由来する本発明のＴＣＲは、親ＴＣＲよりも実質的に高い結合親和性を有しているにもかかわらず、ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に対する特異的を維持している。
【００３６】
結合親和性（平衡定数ＫＤに反比例する）および結合半減期（Ｔ１／２と表される）は、本明細書中の実施例３の表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）法を使用して決定されうる。測定は、可溶型のＴＣＲを使用して２５℃、ｐＨ７．１から７．５の間で行われうる。ＴＣＲの親和性が２倍になると、結果としてＫＤは半分になることは理解されよう。Ｔ１／２は、解離速度（ｋｏｆｆ）によって除算されたｌｎ２として算出される。したがって、Ｔ１／２が２倍になると、結果としてｋｏｆｆは半分になる。ＴＣＲについてのＫＤおよびｋｏｆｆ値は、通常、可溶型、すなわち、トランケートされて疎水性膜貫通ドメイン残基が除去された形態のＴＣＲについて測定される。したがって、所与のＴＣＲは、そのＴＣＲの可溶型がその必要条件を満たす場合には、それが、ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に対する結合親和性、および／または結合半減期を有するという必要条件を満たすことが理解されるべきである。好ましくは、所与のＴＣＲの結合親和性または結合半減期は、同じアッセイプロトコールを使用して、数回、例えば、３回以上測定され、結果の平均がとられる。参照ＭＡＧＥ−Ａ１０  ＴＣＲは、その方法によって測定されるように、約２μＭのＫＤを有し、そのｋｏｆｆは約０．７３／秒である（すなわち、Ｔ１／２は約０．９５秒である）。
【００３７】
さらなる態様では、本発明は、本発明のＴＣＲをコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、ｃＤＮＡである。一部の実施形態では、本発明は、本発明のＴＣＲのα鎖可変ドメインをコードする配列を含む核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、本発明のＴＣＲのβ鎖可変ドメインをコードする配列を含む核酸を提供する。核酸は、天然に存在しないものであってもよく、かつ／または精製および／もしくは改変されていてもよい。
【００３８】
別の態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。好ましくは、ベクターは、ＴＣＲ発現ベクターである。
【００３９】
本発明は、本発明のベクター、好ましくは、ＴＣＲ発現ベクターを宿している細胞も提供する。ベクターは、単一のオープンリーディングフレーム、または２つの異なるオープンリーディングフレームにおいて、アルファ鎖およびベータ鎖をそれぞれコードする本発明の核酸を含んでいてもよい。別の態様は、本発明のＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および本発明のＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクターを宿している細胞を提供する。こうした細胞は、養子療法において特に有用である。本発明の細胞は、単離されていてもよく、かつ／または組換え体および／または天然に存在しないものであってもよく、かつ／または改変されていてもよい。
【００４０】
本発明のＴＣＲは、養子療法における有用性を有するので、本発明には、本発明のＴＣＲを提示している、天然に存在しないかつ／または精製および／もしくは改変された細胞、特に、Ｔ細胞が含まれる。本発明は、本発明のＴＣＲを提示しているＴ細胞の増殖した集団も提供する。本発明のＴＣＲをコードする核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡなど）でのＴ細胞のトランスフェクションに好適ないくつかの方法がある（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：６１１６−６１３１を参照されたい）。本発明のＴＣＲを発現しているＴ細胞は、養子療法に基づいたがんの治療における使用に好適となる。当業者には知られているであろうように、養子療法が行われうるいくつかの好適な方法がある（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ８（４）：２９９−３０８を参照されたい）。
【００４１】
本発明の可溶性ＴＣＲは、抗原提示細胞および抗原提示細胞を含む組織に対する検出可能な標識または治療剤を送達するのに有用である。したがって、（ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ−ＨＬＡ−Ａ２複合体を提示している細胞の存在を検出するためにＴＣＲが使用される、診断目的のための）検出可能な標識；治療剤；または（例えば、ペグ化による）ＰＫ改変基と（共有結合または他の方法で）結合されていてもよい。 
【００４２】
診断目的のための検出可能な標識としては、例えば、蛍光標識、放射標識、酵素、核酸プローブおよびコントラスト試薬が含まれる。
【００４３】
本発明のＴＣＲと結合されうる治療剤としては、免疫調節物質、放射性化合物、酵素（例えばパーフォリン）または化学療法剤（例えばシスプラチン）が含まれる。毒性作用が望ましい部位において果たされることを確実にするために、毒素は、化合物がゆっくりと放出されるように、ＴＣＲに連結されたリポソームの中にあってもよい。これは、体内での輸送中の損傷作用を防止することになり、関連する抗原提示細胞に対するＴＣＲの結合後に毒素が最も高い効果を有することを確実にする。
【００４４】
他の好適な治療剤としては、
・  小分子細胞傷害剤、すなわち、７００ダルトン未満の分子量を有し、哺乳動物細胞を死滅させる能力を有する化合物。こうした化合物としては、細胞傷害作用を有する能力のある毒性金属も含まれうる。さらに、これらの小分子細胞傷害剤としては、プロドラッグ、すなわち、生理学的な条件下で壊変してまたは変換されて細胞傷害剤を放出する化合物も含まれることが理解されるべきである。こうした作用剤の例には、シスプラチン、メイタンシン誘導体、ラシェルマイシン、カリケアマイシン、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーソディウムフォトフリンＩＩ（ｓｏｒｆｉｍｅｒ  ｓｏｄｉｕｍｐｈｏｔｏｆｒｉｎ  ＩＩ）、テモゾロミド、トポテカン、トリメトレートグルクロネート（ｔｒｉｍｅｔｒｅａｔｅ  ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）、オーリスタチンＥ  ビンクリスチンおよびドキソルビシンが含まれる；
・  ペプチド細胞毒素、すなわち、哺乳動物細胞を死滅させる能力を有するタンパク質またはその断片。例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼ；
・  放射性核種、すなわち、α粒子もしくはβ粒子、またはγ線のうちの１つまたは複数の同時発生的な放出を伴って壊変する元素の不安定同位体。例えば、ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イットリウム９０、ビスマス２１０および２１３、アクチニウム２２５ならびにアスタチン２１３；高親和性ＴＣＲ、またはその多量体に対するこれらの放射性核種の結合を促進するためにキレート化剤が使用されてもよい；
・  免疫刺激剤、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子。例えば、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γなどのサイトカイン、
・  スーパー抗原およびその変異体；
・  ＴＣＲ−ＨＬＡ融合体；
・  ケモカイン、例えば、ＩＬ−８、血小板第４因子、黒色腫増殖刺激タンパク質など；
・  抗Ｔ細胞または抗ＮＫ細胞決定因子抗体（例えば、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８または抗ＣＤ１６）を含む、抗体またはその断片；
・  抗体様結合特性を有する代替のタンパク質足場
・  補体活性化因子；
・  異種のタンパク質ドメイン、同種異系のタンパク質ドメイン、ウイルス／細菌のタンパク質ドメイン、ウイルス／細菌のペプチド
が含まれる。
【００４５】
好ましい一実施形態は、抗ＣＤ３抗体、または前記抗ＣＤ３抗体の機能的な断片もしくはバリアントと（通常、アルファ鎖またはベータ鎖のＮ末端またはＣ末端への融合によって）結合された本発明のＴＣＲによって提供される。本明細書に記載の組成物および方法における使用に好適である抗体断片およびバリアント／アナログとしては、ミニボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｄｓＦｖおよびｓｃＦｖ断片、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）（Ａｂｌｙｎｘ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって市販されている、これらのコンストラクトは、ラクダ科動物（例えば、ラクダまたはラマ）抗体に由来する合成単一免疫グロブリン可変重鎖ドメインを含む）ならびにドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）、親和性が成熟した単一の免疫グロブリン可変重鎖ドメインまたは免疫グロブリン可変軽鎖ドメインを含む）または抗体様結合特性を示す代替のタンパク質足場、ほんの少し例を挙げれば、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（Ｓｗｅｄｅｎ）、改変されたプロテインＡ足場を含む）またはＡｎｔｉｃａｌｉｎｓ（Ｐｉｅｒｉｓ（Ｇｅｒｍａｎ）、改変されたアンチカリンを含む）などが含まれる。
【００４６】
いくつかの目的のために、本発明のＴＣＲは、数種類のＴＣＲを含む複合体に凝集されて多価ＴＣＲ複合体を形成していてもよい。多価ＴＣＲ複合体の生成において使用されうる、多量体化ドメインを含むいくつかのヒトタンパク質がある。例えば、ｐ５３の四量体化ドメイン、これは、単量体ｓｃＦｖ断片と比較して、血清残留性の上昇および解離速度の顕著な低下を示す、ｓｃＦｖ抗体断片の四量体を生成するために利用されてきた（Ｗｉｌｌｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（１７）１４３８５−１４３９２）。ヘモグロビンも、この種類の適用に潜在的に使用されうる四量体化ドメインを有する。本発明の多価ＴＣＲ複合体は、多量体でない野生型または本発明のＴ細胞受容体ヘテロ二量体と比較して、ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ  ＨＬＡ−Ａ２複合体に対する増強された結合能力を有しうる。したがって、本発明のＴＣＲの多価複合体も本発明の範囲内に含まれる。本発明によるこうした多価ＴＣＲ複合体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで特定の抗原を提示している細胞をトラッキングまたはターゲティングするのに特に有用であり、こうした使用を有するさらなる多価ＴＣＲ複合体の生成のための中間体としても有用である。
【００４７】
当技術分野においてよく知られているように、ＴＣＲには、翻訳後修飾が行われうる。グリコシル化は、１つのこうした修飾であり、これは、ＴＣＲ鎖における定められたアミノ酸に対するオリゴ糖部分の共有結合的付加を含む。例えば、アスパラギン残基、またはセリン／スレオニン残基は、よく知られているオリゴ糖付加のための部位である。特定のタンパク質のグリコシル化状態は、タンパク質配列、タンパク質高次構造および特定の酵素の有用性を含む、いくつかの要因に依存する。さらに、グリコシル化状態（すなわち、オリゴ糖型、共有結合および付加の総数）は、タンパク質機能に影響しうる。したがって、組換えタンパク質を製造するとき、グリコシル化を制御するのが望ましいことが多い。制御されたグリコシル化は、抗体に基づいた療法を改良するために使用されてきた。（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  Ｒ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００９  Ｍａｒ；８（３）：２２６−３４．）。本発明の可溶性ＴＣＲに対して、グリコシル化は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、特定の細胞株を使用することによって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、化学修飾によって、制御されてもよい。グリコシル化は、薬物動態を改良すること、免疫原性を低下させること、および天然のヒトタンパク質をより近く模倣することができるので、こうした修飾は望ましい（Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ＡＭ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ  Ｓ．，Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２００５  Ａｕｇ；９４（８）：１６２６−３５）。
【００４８】
患者への投与のために、（通常、検出可能な標識または治療剤と結合された）本発明のＴＣＲ、核酸および／または細胞は、薬学的に許容される担体または添加剤と一緒に医薬組成物中で提供されてもよい。本発明による治療用またはイメージング用ＴＣＲは、通常、薬学的に許容される担体を通常は含むであろう無菌の医薬組成物の部分として供給されることになる。この医薬組成物は、（患者にそれを投与する望ましい方法に依存して）いかなる好適な形態であってもよい。それは、単位剤形で提供されてもよく、一般には密封された容器内で提供されることになり、キットの部分として提供されてもよい。こうしたキットには、通常は（必ずではないが）、使用のための説明書が含まれるはずである。それは、複数の前記単位剤形を含んでいてもよい。
【００４９】
医薬組成物は、任意の適切な経路、好ましくは、非経口（皮下、筋肉内、または好ましくは静脈内を含む）経路による投与用に構成されていてもよい。こうした組成物は、製薬の分野において知られている任意の方法によって、例えば、無菌条件下で活性成分を担体または添加剤と混合することによって調製されうる。
【００５０】
本発明の物質の用量は、治療される疾患または障害、治療される個体の年齢および状態などによって広い範囲の間で変化しえ、医師が、使用される適切な用量を最終的に決定することになる。
【００５１】
本発明のＴＣＲ、医薬組成物、ベクター、核酸および細胞は、実質的に純粋な形態で、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％純粋で、提供されてもよい。
【００５２】
本発明によってさらに提供されるのは、以下である：
・  医学における使用のための、好ましくは、がん、例えば、固形腫瘍（例えば、肺、肝臓および胃の転移巣）および／または扁平上皮癌などを治療する方法における使用のための、本発明のＴＣＲ、核酸または細胞。
・  がんを治療するための医薬品の製造における本発明のＴＣＲ、核酸または細胞の使用。
・  患者に本発明のＴＣＲ、核酸または細胞を投与することを含む、患者においてがんを治療する方法。
【００５３】
本発明のそれぞれの態様の好ましい特徴は、必要な変更を加えて他の態様のそれぞれについてのものと同様である。本明細書において言及されている従来技術文献は、法律によって許可される最大限の範囲まで組み込まれている。
【００５４】
本発明は、以下の非限定的な実施例においてさらに記載される。以下の通りである添付の図面が参照される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１ａ】親ＭＡＧＥ−１０特異的ＴＣＲのアルファ鎖の細胞外部分のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図１ｂ】親ＭＡＧＥ−Ａ１０特異的ＴＣＲベータ鎖アミノ酸配列のベータ鎖の細胞外部分のアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
【図２ａ】（本明細書において「参照ＴＣＲと称される）可溶性ＴＣＲのアルファ鎖のアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。配列は、配列番号１のＴ１６２（すなわち、ＴＲＡＣ定常領域のＴ４８）にシステイン（太字かつ下線付き）が置換されることを除いて図１のものと同じである。
【図２ｂ】（本明細書において「参照ＴＣＲと称される）可溶性ＴＣＲのベータ鎖のアミノ酸配列（配列番号５）を示す図である。配列は、Ｓ１６９（すなわち、ＴＲＢＣ２定常領域のＳ５７）にシステイン（太字かつ下線付き）が置換され、Ｃ１８７にＡ１８７が置換され、Ｎ２０１にＤ２０１が置換されることを除いて図２のものと同じである。
【図３】本発明のＴＣＲ内に存在しうるアルファ鎖のそれぞれのアミノ酸配列（配列番号６および７）を示す図である。ＣＤＲ領域を形成している部分配列、またはＣＤＲ領域の実質的な部分は、下線付きである。
【図４】本発明のＴＣＲ内に存在しうるベータ鎖のそれぞれのアミノ酸配列（配列番号８、９、１０および１１）を示す図である。ＣＤＲ領域を形成している部分配列、またはＣＤＲ領域の実質的な部分は下線付きである。
【図５】本発明のＴＣＲ内に存在しうるアルファ鎖のそれぞれのアミノ酸配列（配列番号１２および１３）を示す図である。図３に示されている配列に対して相対的に、導入されたシステインは、太字かつ下線付きで示されている。
【図６】本発明のＴＣＲ内に存在しうるベータ鎖のそれぞれのアミノ酸配列（配列番号１４および１５）を示す図である。図４に示されている配列に対して相対的に、導入されたシステインは、太字かつ下線付きで示されている。さらに図４に対して相対的に、これらのベータ鎖を有するあらゆるアルファ−ベータＴＣＲ内の不対のシステインを除くために、Ｃ１８７がＡ１８７に変異されている。
【図７】親ＭＡＧＥ  Ａ１０  ＴＣＲ遺伝子（ブタのテッショウウイルス−１の２Ａ配列を有するアルファ鎖−２Ａ−ベータ鎖コンストラクト）についてのＤＮＡ配列を示す図（配列番号１８）である。
【図８】図７のＤＮＡ配列から産生される、Ｔ細胞形質導入のための親ＭＡＧＥ  Ａ１０  ＴＣＲのアミノ酸配列を示す図（配列番号１９）である。ブタのテッショウウイルス−１の２Ａ配列は、太字かつ下線付きである。
【図９】本発明によるＴ細胞の活性化の結果を示しているグラフである。
【実施例】
【００５６】
［実施例１］
ｐＧＭＴ７に基づく発現プラスミド内への参照ＭＡＧＥ−Ａ１０  ＴＣＲアルファ鎖およびベータ鎖可変領域配列のクローニング
それぞれ配列番号２および３の親ＭＡＧＥ−Ａ１０  ＴＣＲ可変アルファドメインおよびＴＣＲ可変ベータドメインは、ＣαまたはＣβのいずれかを含むｐＧＭＴ７に基づく発現プラスミド内に、（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）に記載されている標準的な方法によってクローニングされた。プラスミドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用してシークエンスされた。それぞれ配列番号４および５の参照ＭＡＧＥ−Ａ１０  ＴＣＲ可変アルファドメインおよびＴＣＲ可変ベータドメインは、同様の方法でクローニングされた。
【００５７】
ＴＣＲアルファ鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列は、Ｎｄｅ１およびＸｈｏ１で切断された、ｐＥＸ９５６内にライゲーションされた。ＴＣＲベータ鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列は、同じくＮｄｅ１およびＸｈｏ１で切断された、ｐＥＸｂ２１内にライゲーションされた。
【００５８】
ライゲーションされたプラスミドは、コンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞内に形質転換され、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ／寒天プレート上に播種された。３７℃で一晩インキュベーション後、単一コロニーが採取され、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ中で３７℃で振盪しながら一晩培養された。クローニングされたプラスミドは、Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製され、プラスミドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用してシークエンスされた。
【００５９】
［実施例２］
可溶性参照ＭＡＧＥ−Ａ１０  ＴＣＲの発現、リフォールディングおよび精製
実施例１において調製されるような、参照ＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれ含む発現プラスミドが大腸菌株ＢＬ２１ｐＬｙｓＳ内に別々に形質転換され、単一のアンピシリン耐性コロニーがＴＹＰ（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）培地中で３７℃で約０．６〜０．８のＯＤ６００まで培養された後に、０．５ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質発現が誘発された。細胞は、導入３時間後に、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ−６Ｂ内で４０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって回収された。細胞ペレットは、ＭｇＣｌ２およびＤＮアーゼＩの存在下で２５ｍｌのＢｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ（ＮｏｖａＧｅｎ）で溶解された。封入体ペレットは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−２１遠心分離機内で１３０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって回収された。次いで、３回の界面活性剤での洗浄が行われて細胞デブリおよび膜成分が除去された。封入体ペレットは、毎回、Ｔｒｉｔｏｎバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ  ｐＨ８．０、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＥＤＴＡ）中でホモジナイズされた後に、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−２１内で１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によってペレット化された。次いで、以下のバッファー：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＮａＥＤＴＡ中での同様の洗浄によって界面活性剤および塩が除去された。最終的に、封入体は、３０ｍｇの一定分量に小分けされて−７０℃で凍結された。封入体タンパク質の収量は、６Ｍのグアニジン−ＨＣｌで可溶化することによって定量化され、ＯＤ測定は、日立Ｕ−２００１分光光度計上で行われた。次いで、吸光係数を使用してタンパク質濃度が算出された。
【００６０】
約１５ｍｇのＴＣＲα鎖および１５ｍｇのＴＣＲβ鎖の可溶化封入体が凍結ストックから解凍され、確実に完全に鎖変性するように、１０ｍｌのグアニジン溶液（６Ｍ  塩酸グアニジン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．１、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）中に希釈された。完全に還元および変性されたＴＣＲ鎖を含むグアニジン溶液は、次いで、０．５リットルの以下のリフォールディングバッファー：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１、４００ｍＭ  Ｌ−アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５Ｍ  尿素中に注入された。酸化還元対（システアミン塩酸塩およびシスタミン二塩酸塩）がそれぞれ６．６ｍＭおよび３．７ｍＭの最終濃度まで添加され、約５分後に、変性されたＴＣＲ鎖が添加された。溶液は、約３０分間放置された。リフォールディングされたＴＣＲは、Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ１メンブレン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ；製品番号１３２６７０）において１０ＬのＨ２Ｏに対して１８〜２０時間透析された。この時間の後に、透析バッファーは、新しい１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１（１０Ｌ）に２回交換され、透析は、５℃±３℃でさらに約８時間継続された。
【００６１】
可溶性ＴＣＲは、透析されたリフォールディング物をＰＯＲＯＳ  ５０ＨＱ陰イオン交換カラム上にロードすることによっておよび結合したタンパク質をＡｋｔａ精製装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して５０カラム容量を超える１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．１中の０〜５００ｍＭのＮａＣｌの勾配で溶出することによって分解産物および夾雑物から分離された。ピーク画分がプールされ、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）が添加された。プールされた画分は、次いで、４℃で保存され、クマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析された後にプールおよび濃縮された。最終的に、可溶性ＴＣＲは、ＰＢＳバッファー（Ｓｉｇｍａ）中で予め平衡化されたＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ＨＲゲル濾過カラムを使用して精製および特性評価された。約５０ｋＤａの相対分子量で溶出していたピークがプールされ、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴解析による特性評価の前に濃縮された。
【００６２】
［実施例３］
結合特性評価
ＢＩＡｃｏｒｅ解析
表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００（商標））は、可溶性ＴＣＲの、そのペプチド−ＭＨＣリガンドに対する結合を解析するために使用されうる。これは、ストレプトアビジンでコーティングされた結合表面（センサーチップ）に固定されうる可溶性ビオチン化ペプチド−ＨＬＡ（「ｐＨＬＡ」）複合体を作製することによって容易になる。センサーチップは、異なる４種のｐＨＬＡ複合体に対するＴ細胞受容体の結合を同時に測定することを可能にする４つの個別のフローセルを含む。ｐＨＬＡ複合体の手動注入により、固定されたクラスＩ分子の正確なレベルを容易に操作することが可能となる。
【００６３】
ビオチン化されたクラスＩのＨＬＡ−Ａ＊０２分子は、構成サブユニットタンパク質および合成ペプチドを含む、細菌で発現された封入体からｉｎ  ｖｉｔｒｏでリフォールディングされ、その後、精製されて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで酵素によりビオチン化された（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６６：９−１５）。ＨＬＡ−Ａ＊０２重鎖は、適切なコンストラクトにおいてタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを置き換えるＣ末端ビオチン化タグ付きで発現された。１リットルの細菌培養液あたり約７５ｍｇの封入体発現レベルが得られた。ＭＨＣ軽鎖またはβ２−ミクログロブリンも、適切なコンストラクトから大腸菌における封入体として、１リットルの細菌培養液あたり約５００ｍｇのレベルで発現された。
【００６４】
大腸菌細胞は溶解され、封入体は約８０％の純度まで精製された。封入体からのタンパク質は、６Ｍ  グアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で変性され、０．４Ｍ  Ｌ−アルギニン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１、３．７ｍＭ  シスタミン二塩酸塩、６．６ｍＭ  システアミン塩酸塩、ＨＬＡ−Ａ＊０１分子によるロードが必要とされる４ｍｇ／ＬのＭＡＧＥ−３  ＥＶＤＰＩＧＨＬＹペプチド中に３０ｍｇ／リットル  重鎖、３０ｍｇ／リットル  β２ｍの濃度で、変性タンパク質の単一パルスを＜５℃のリフォールディングバッファー中に添加することによってリフォールディングされた。リフォールディングは、４℃で少なくとも１時間で完了に到達することが可能にされた。
【００６５】
バッファーは、１０容量の１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．１中での透析によって交換された。バッファーの２回の交換は、溶液のイオン強度を十分に低下させるために必要とされた。次いで、タンパク質溶液は、１．５μｍのセルロースアセテートフィルターを通して濾過され、ＰＯＲＯＳ  ５０ＨＱ陰イオン交換カラム（８ｍｌのベッド容量）上にロードされた。タンパク質は、Ａｋｔａ精製装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．１中の直線的な０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配で溶出された。ＨＬＡ−Ａ＊０２−ペプチド複合体は、約２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出され、ピーク画分が収集されて、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）が添加され、それらの画分が氷上で冷却された。
【００６６】
ビオチンタグ付きｐＨＬＡ分子は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１、５ｍＭ  ＮａＣｌ中で平衡化されたＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの高速脱塩カラムを使用して、同バッファー中にバッファー交換された。溶出されるとすぐに、タンパク質含有分画は氷上で冷却され、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）が添加された。次いで、ビオチン化試薬：１ｍＭ  ビオチン、５ｍＭ  ＡＴＰ（ｐＨ８に緩衝された）、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および５μｇ／ｍｌ  ＢｉｒＡ酵素（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６６：９−１５に従って精製された）が添加された。次いで、この混合物は、室温で一晩インキュベート可能にされた。
【００６７】
ビオチン化されたｐＨＬＡ−Ａ＊０２分子は、ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して精製された。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ＨＲ  １０／３０カラムは、濾過されたＰＢＳで予め平衡化されて１ｍｌのビオチン化反応混合物がロードされ、そのカラムは、Ａｋｔａ精製装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＰＢＳを用いて０．５ｍｌ／分で展開された。ビオチン化されたｐＨＬＡ−Ａ＊０２分子は、約１５ｍｌで単一のピークとして溶出された。タンパク質を含む画分は、プールされて、氷上で冷却され、プロテアーゼ阻害剤カクテルが添加された。タンパク質濃度は、クマシー結合アッセイ（ＰｅｒＢｉｏ）を使用して決定され、ビオチン化されたｐＨＬＡ−Ａ＊０１分子の一定分量は、−２０℃で凍結保存された。
【００６８】
こうした固定された複合体は、Ｔ細胞受容体および補助受容体ＣＤ８ααの両方を結合することができ、その両方が可溶相に注入されうる。可溶性ＴＣＲのｐＨＬＡ結合特性は、ＴＣＲが可溶相または固定相のいずれかにおいて使用される場合、質的にも量的にも類似していることが認められる。これは、可溶種の部分活性についての重要な対照であり、ビオチン化ｐＨＬＡ複合体が生物学的に非ビオチン化複合体と同じくらい活性であることも示唆する。
【００６９】
ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーは、小さなフローセル内のセンサー表面付近のレスポンスユニット（ＲＵ）で表される屈折率における変化を測定し、受容体リガンド相互作用を検出するためおよびそれらの親和性および動態パラメーターを解析するために使用されうる原理である。ＢＩＡｃｏｒｅ実験は、２５℃の温度で、ランニングバッファーとしてＰＢＳバッファー（Ｓｉｇｍａ、ｐＨ７．１〜７．５）を使用し、タンパク質試料の希釈物を調製して行われた。ストレプトアビジンは、標準的なアミンカップリング法によってフローセルに固定された。ｐＨＬＡ複合体は、ビオチンタグを介して固定された。次いで、異なるフローセルの表面上を一定流速で通過する可溶性ＴＣＲによってアッセイが行われ、その際のＳＰＲレスポンスが測定された。
【００７０】
平衡結合定数
平衡結合定数を決定するために、上記のＢＩＡｃｏｒｅ解析法が使用された。ジスルフィドで連結された可溶性ヘテロ二量体形態の参照ＭＡＧＥ−Ａ１０  ＴＣＲの段階希釈物が調製され、１つめは約１０００ＲＵの特異的なＧＬＹＤＧＭＥＨＬ  ＨＬＡ−Ａ＊０２複合体でコーティングされ、２つめは約１０００ＲＵの非特異的な複合体でコーティングされた、２つの異なるフローセル上に毎分５μｌの一定流速で注入された。レスポンスは、対照細胞からの測定値を使用して各濃度について標準化された。標準化されたデータレスポンスは、ＴＣＲ試料の濃度に対してプロットされ、平衡結合定数ＫＤを算出するために非線形曲線適合モデルに適合された。（Ｐｒｉｃｅ＆Ｄｗｅｋ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｉｎ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）１９７９，Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。ジスルフィドで連結された可溶型の参照ＭＡＧＥ−１０  ＴＣＲ（実施例２）は、約２．００μＭのＫＤを示した。同じＢＩＡｃｏｒｅデータより、Ｔ１／２は約０．９５秒であった。
【００７１】
動態パラメーター
上記のＢＩＡｃｏｒｅ解析法は、平衡結合定数および解離速度を決定するためにも使用された。
【００７２】
高親和性ＴＣＲ（下記の実施例４を参照されたい）のために、ＫＤは、解離速度定数、ｋｏｆｆ、および結合速度定数、ｋｏｎを実験的に測定することによって決定された。平衡定数ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出された。
【００７３】
１つめは約１０００ＲＵの特異的なＧＬＹＤＧＭＥＨＬ  ＨＬＡ−Ａ＊０２複合体でコーティングされ、２つめは約１０００ＲＵの非特異的な複合体でコーティングされた２つの異なるセルにＴＣＲが注入された。流速は、５０μｌ／分に設定された。典型的には、約１μＭの濃度の２５０μｌのＴＣＲが注入された。次いで、レスポンスがベースラインに戻るまでまたは＞２時間が経過するまでバッファーが流された。動態パラメーターは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して算出された。解離相は、半減期の算出を可能にする単一指数関数的減衰方程式に適合された。
【００７４】
［実施例４］
本発明の高親和性ＴＣＲの調製
ＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれ含む発現プラスミドは、実施例１におけるように調製された：
【表４】
0006751391.tif 000007
【００７５】
プラスミドが大腸菌株ＢＬ２１ｐＬｙｓＳ内に別々に形質転換され、単一のアンピシリン耐性コロニーがＴＹＰ（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）培地中で３７℃で約０．６〜０．８のＯＤ６００まで培養された後に、０．５ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質発現が誘発された。細胞は、導入３時間後に、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ−６Ｂ内で４０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって回収された。細胞ペレットは、ＭｇＣｌ２およびＤＮアーゼＩの存在下で２５ｍｌのＢｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で溶解された。封入体ペレットは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−２１遠心分離機内で１３０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって回収された。次いで、３回の界面活性剤での洗浄が行われて細胞デブリおよび膜成分が除去された。封入体ペレットは、毎回、Ｔｒｉｔｏｎバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ  ｐＨ８．０、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＥＤＴＡ）中でホモジナイズされた後に、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−２１内で１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によってペレット化された。次いで、以下のバッファー：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＮａＥＤＴＡ中での同様の洗浄によって界面活性剤および塩が除去された。最終的に、封入体は、３０ｍｇの一定分量に小分けされて−７０℃で凍結された。封入体タンパク質の収量は、６Ｍのグアニジン−ＨＣｌで可溶化することによって定量化され、ＯＤ測定は、日立Ｕ−２００１分光光度計上で行われた。次いで、吸光係数を使用してタンパク質濃度が算出された。
【００７６】
確実に完全に鎖変性するように、本発明の各ＴＣＲのための約１０ｍｇのＴＣＲα鎖および１０ｍｇのＴＣＲβ鎖の可溶化封入体は、１０ｍｌのグアニジン溶液（６Ｍ  塩酸グアニジン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．１、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）中に希釈された。完全に還元および変性されたＴＣＲ鎖を含むグアニジン溶液は、次いで、０．５リットルの以下のリフォールディングバッファー：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１、４００ｍＭ  Ｌ−アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５Ｍ  尿素中に注入された。酸化還元対（システアミン塩酸塩およびシスタミン二塩酸塩）がそれぞれ６．６ｍＭおよび３．７ｍＭの最終濃度まで添加され、約５分後に、変性されたＴＣＲ鎖が添加された。溶液は、約３０分間放置された。リフォールディングされたＴＣＲは、Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ１メンブレン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ；製品番号１３２６７０）において１０ＬのＨ２Ｏに対して１８〜２０時間透析された。この時間の後に、透析バッファーは、新しい１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１（１０Ｌ）に２回交換され、透析は、５℃±３℃でさらに約８時間継続された。
【００７７】
可溶性ＴＣＲは、透析されたリフォールディング物をＰＯＲＯＳ  ５０ＨＱ陰イオン交換カラム上にロードすることによっておよび結合したタンパク質をＡｋｔａ精製装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１５カラム容量を超える１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．１中の０〜５００ｍＭのＮａＣｌの勾配で溶出することによって分解産物および夾雑物から分離された。プールされた画分は、次いで、４℃で保存され、クマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析された後にプールおよび濃縮された。最終的に、可溶性ＴＣＲは、ＰＢＳバッファー（Ｓｉｇｍａ）中で予め平衡化されたＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ＨＲゲル濾過カラムを使用して精製および特性評価された。約５０ｋＤａの相対分子量で溶出していたピークがプールされ、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴解析による特性評価の前に濃縮された。
【００７８】
ＭＡＧＥ−Ａ１０エピトープに対するこうして調製されたＴＣＲの親和性プロファイルは、実施例３の方法を使用して評価され、参照ＴＣＲと比較された。結果は、以下の表に記載されている：
【表５】
0006751391.tif 000008
【００７９】
［実施例５］
親ＭＡＧＥ−Ａ１０  ＴＣＲおよびバリアントＭＡＧＥ−Ａ１０  ＴＣＲでのＴ細胞のトランスフェクション
（ａ）Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｉｎを介した２９３Ｔ細胞の一過的トランスフェクションによるレンチウイルスベクター調製
望ましいＴＣＲをコードする遺伝子を含むレンチウイルスベクターをパッケージングするために、第３世代レンチウイルスパッケージングシステムが使用された。Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｉｎを介したトランスフェクション（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、２９３Ｔ細胞は、４種のプラスミド（実施例５ｃ（以下）に記載のＴＣＲアルファ鎖−Ｐ２Ａ−ＴＣＲベータ鎖単一ＯＲＦ遺伝子を含む１種のレンチウイルスベクター、および感染性であるが複製不可能なレンチウイルス粒子を構築するために必要な他の構成要素を含む３種のプラスミド）でトランスフェクトされた。
【００８０】
トランスフェクションのために、指数関数的な増殖期にある２９３Ｔ細胞の１つのＴ１５０フラスコが回収され、細胞は、プレート上に均一に分散され、わずかに５０％を超えるコンフルエントであった。Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｉｎの一定分量は、室温にされた。３ｍＬの無血清培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）が無菌の１５ｍｌのコニカルチューブ内に入れられた。１７４μｌのＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｎ試薬が無血清培地中に直接に添加された（これは、３．６：１の試薬対ＤＮＡの重量比を実現する）。これは、３〜４回チューブを逆さにすることによって完全に混合されて、室温で５〜２０分間インキュベートされた。
【００８１】
別の１．５ｍｌのマイクロチューブ内で、予め混合されたパッケージング混合物一定分量（１８μｇのｐＲＳＶ．ＲＥＶ（Ｒｅｖ発現プラスミド）、１８μｇのｐＭＤＬｇ／ｐ．ＲＲＥ（Ｇａｇ／Ｐｏｌ発現プラスミド）、７μｇのｐＶＳＶ−Ｇ（ＶＳＶ糖タンパク質発現プラスミド）を含む、通常約２２μｌ）に１５μｇのプラスミドＤＮＡが添加され、ＤＮＡ混合物を確実に均一にさせるために上および下にピペッティングされた。このＤＮＡ混合物に約１ｍＬのＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｎ／無血清培地が滴下で添加され、次いで、上および下に穏やかにピペッティングされた後に、残りのＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｎ／無血清培地に移し戻された。チューブは、３〜４回逆さにされて、室温で１５〜３０分間インキュベートされた。細胞のフラスコから古い培地が除去された。２９３Ｔ細胞の直立型フラスコの底にＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｎ／培地／ＤＮＡ（３ｍＬ）複合体が直接に添加された。ゆっくりと、フラスコは、細胞を覆うように平らに置かれ、確実に分散するようにきわめて穏やかに揺動された。１分後、２２ｍｌの新しい培地（Ｒ１０＋ＨＥＰＥＳ：ＲＰＭＩ１６４０、熱失活された１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）が添加され、フラスコは、インキュベーターに注意深く戻された。これは、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートされた。２４時間後、パッケージングされたレンチウイルスベクターを含む培地が回収された。
【００８２】
パッケージングされたレンチウイルスベクターを回収するために、細胞培養液上清は、０．４５ミクロンのナイロンシリンジフィルターを通して濾過され、培養液は、１０，０００ｇで１８時間（または１１２，０００ｇで２時間）遠心分離され、（ペレットを乱さないように注意しながら）上清の大部分が除去され、残りの数ｍＬ（チューブあたり３１ｍｌの開始容量から、通常、約２ｍｌ）の上清中にペレットが再懸濁された。これは、１ｍｌずつの一定分量でドライアイス上でスナップ凍結され、−８０℃で保存された。
【００８３】
（ｂ）目的の遺伝子を含むパッケージングされたレンチウイルスベクターでのＴ細胞の形質導入
パッケージングされたレンチウイルスベクターでの形質導入前に、健常な志願者の血液からヒトＴ細胞（ＣＤ８もしくはＣＤ４または必要条件によっては両方）が単離された。これらの細胞は、計数され、４８ウェルプレート内で、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲ１０中、１ｍｌあたり１×１０６細胞（０．５ｍＬ／ウェル）で、１細胞あたり３個のビーズの比率で、予め洗浄された抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体コーティング付きマイクロビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｄｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に一晩インキュベートされた。
【００８４】
一晩の刺激後、０．５ｍｌの無希釈のパッケージングされたレンチウイルスベクターが、望ましい細胞に添加された。これは、３７℃／５％ＣＯ２で３日間インキュベートされた。形質導入３日後、細胞は、計数され、０．５×１０６細胞／ｍｌまで希釈された。ＩＬ−２を含む新しい培地が必要に応じて添加された。ビーズは、形質導入５〜７日後に除去された。２日間隔で、細胞が計数され、ＩＬ−２を含む新しい培地が交換または添加された。細胞は、０．５×１０６細胞／ｍＬおよび１×１０６細胞／ｍＬの間で維持された。細胞は、３日目からフローサイトメトリーによって解析され、５日目から機能アッセイ（例えば、ＩＦＮγ放出についてのＥＬＩＳｐｏｔ、実施例６を参照されたい）に使用された。１０日目から、または細胞が分裂を遅延させ、大きさが減少したときに、細胞は、保存のために（９０％ＦＢＳ／１０％ＤＭＳＯ中に１×１０７細胞／ｍｌで）少なくとも４×１０６細胞／バイアルの一定分量で凍結される。
【００８５】
（ｃ）上記の方法（ａ）および（ｂ）による、Ｔ細胞トランスフェクション用の親ＴＣＲ遺伝子
図７は、（最も高いヒト細胞発現のためにコドンが最適化された）親ＭＡＧＥ  Ａ１０  ＴＣＲをコードするＤＮＡ配列（配列番号１８）である。それは、完全長アルファ鎖−ブタのテッショウウイルス−１の２Ａ−完全長ベータ鎖の単一オープンリーディングフレームコンストラクトである。２Ａ配列は、下線付きであり、２Ａ配列のタンパク質分解除去を補助するためのフューリン切断部位をコードするヌクレオチドが前にある（以下に図８（配列番号１９）に関してさらに述べられている。ｍＲＮＡのタンパク質翻訳中の２Ａ配列の３’末端におけるペプチド結合スキッピングにより、２種のタンパク質：１）アルファＴＣＲ鎖−２Ａ融合体、２）ベータＴＣＲ鎖が産生される。
【００８６】
図８は、図７に対応しているアミノ酸配列（配列番号１９）である。図８において：
・  Ｍ１〜Ｑ２２は、親アルファ鎖ＴＣＲの成熟において除去されるリーダー配列である；
・  Ｑ２３〜Ｓ２７４は、親アルファ鎖配列に相当する；
・  Ｑ２３〜Ｎ２４７は、親アルファ鎖細胞外ドメインに相当する；
・  Ｌ２４８〜Ｔ２６８は、成熟ＴＣＲのアルファ鎖膜貫通領域である；
・  Ｌ２６９〜Ｓ２７４は、成熟ＴＣＲのアルファ鎖細胞内領域である；
・  Ｒ２７７〜Ｒ２８０は、ゴルジ装置における、Ｐ２Ａ配列Ａ２８５〜Ｐ３０３のタンパク質分解除去を補助するためのフューリン切断部位である；
・  Ｇ２７５、Ｓ２７６、Ｓ２８１からＧ２８４は、フューリン切断およびＰ２Ａ配列の完全な機能を可能にするフレキシブルリンカーである；
・  Ｒ３０４〜Ｖ３２３は、親ベータ鎖ＴＣＲの成熟において除去されるリーダー配列である；
・  Ｎ３２４〜Ｇ６１２は、親ベータ鎖配列に相当する；
・  Ｎ３２４〜Ｅ５８３は、親ベータ鎖細胞外ドメインに相当する；
・  Ｉ５８４〜Ｖ６０５は、成熟ＴＣＲのベータ鎖膜貫通領域である；
・  Ｋ６０６〜Ｇ６１２は、成熟ＴＣＲのベータ鎖細胞内領域である。
【００８７】
（ｄ）親ＭＡＧＥ−Ａ１０  ＴＣＲおよび高親和性ＭＡＧＥ−Ａ１０  ＴＣＲでトランスフェクトされたＴ細胞
上記の（ａ）および（ｂ）に記載されている手順に従って、両方のＤＮＡコンストラクトに固有のＮｈｅＩおよびＳａｌＩ制限部位を使用して、親ＭＡＧＥ  Ａ１０アルファ−２Ａ−ベータＴＣＲ遺伝子（配列番号１８（図７））がｐＥＬＮＳｘｖレンチベクター内に挿入され、トランスフェクトＴ細胞が作製された。
【００８８】
同様に、Ｔ細胞は、配列番号２、６または７のうちの１つを有するアルファ鎖可変ドメインをコードし、ベータ鎖可変ドメイン配列番号３、８、９、１０または１１をコードする配列と結合された配列を含む遺伝子でのトランスフェクションによって作製されてもよい。
【００８９】
［実施例６］
ＭＡＧＥ  Ａ１０  ＴＣＲ改変Ｔ細胞の活性化
腫瘍細胞株に応答した、ＴＣＲ形質導入した細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化を実証するために、以下のアッセイを行った。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して測定されるような、ＩＦＮ−γ産生を、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性化についての読み出しとして使用した。
【００９０】
ＥＬＩＳＰＯＴ
試薬
アッセイ培地：  １０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２０１１−０９）、８８％ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号４２４０１）、１％グルタミン（Ｇｉｂｃｏカタログ番号２５０３０）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１５０７０−０６３）。
洗浄バッファー：０．０１Ｍ  ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０
ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１００１０）
関連したＡＥＣ基質セット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５１９５１）と共に、捕捉抗体および検出抗体ならびにヒトＩＦＮ−γ  ＰＶＤＦ  ＥＬＩＳＰＯＴ  ９６ウェルプレートを含むヒトＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；カタログ番号５５１８４９）
【００９１】
方法
標的細胞の調製
この方法において使用される標的細胞は、天然のエピトープ提示細胞：両方ＨＬＡ−Ａ２＋  ＭＡＧＥ  Ａ１０＋であるＡ３７５ヒト黒色腫細胞であった。ＨＬＡ−Ａ２＋  ＭＡＧＥ  Ａ１０−である、ＨＣＴ１１６ヒト結腸がんは、陰性対照として使用された。十分な標的細胞（５０，０００細胞／ウェル）は、Ｍｅｇａｆｕｇｅ（登録商標）１．０（Ｈｅｒａｅｕｓ）内で１２００ｒｐｍで１０分の遠心分離３回によって洗浄された。細胞は、次いで、アッセイ培地中に１０６細胞／ｍｌで再懸濁された。
【００９２】
エフェクター細胞調製
この方法において使用されるエフェクター細胞（Ｔ細胞）は、ＣＤ１４およびＣＤ２５マイクロビーズキット（それぞれＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号１３０−０５０−２０１および１３０−０９２−９８３）を使用して、健常な志願者の静脈血から新たに単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から負の選択によって得られた、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）であった。細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティング付きビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｄｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で刺激され、（実施例５に記載のコンストラクトに基づいた）目的の全αβＴＣＲをコードする遺伝子を運ぶレンチウイルスで形質導入され、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含むアッセイ培地中で形質導入１０日後および１３日後の間まで増殖した。これらの細胞は、次いで、アッセイ培地中に入れられた後に、Ｍｅｇａｆｕｇｅ（登録商標）１．０（Ｈｅｒａｅｕｓ）内で１２００ｒｐｍで１０分の遠心分離によって洗浄された。細胞は、次いで、４×最終的に必要とされる濃度でアッセイ培地中に再懸濁された。
【００９３】
プレートは、以下のように調製された：１００μＬの抗ＩＦＮ−γ捕捉抗体は、１プレートあたり１０ｍｌの無菌ＰＢＳ中に希釈された。次いで、各ウェル内に１００μＬの希釈された捕捉抗体が分注された。プレートは、次いで、４℃で一晩インキュベートされた。インキュベーション後、プレートは、洗浄（プログラム１、プレート型２、Ｕｌｔｒａｗａｓｈ  Ｐｌｕｓ  ９６ウェルプレート洗浄機；Ｄｙｎｅｘ）されて捕捉抗体が除去された。プレートは、次いで、各ウェルに２００μＬのアッセイ培地を添加することによってブロッキングされ、室温で２時間インキュベートされた。アッセイ培地は、次いで、プレートから洗浄され（プログラム１、プレート型２、Ｕｌｔｒａｗａｓｈ  Ｐｌｕｓ  ９６ウェルプレート洗浄機、Ｄｙｎｅｘ）、残りのすべての培地は、ＥＬＩＳＰＯＴプレートをペーパータオル上で軽く振り払うことおよび軽く叩くことによって除去された。
【００９４】
次いで、以下の順序でアッセイの成分がＥＬＩＳＰＯＴプレートに添加された：
５０μＬの標的細胞１０６細胞／ｍｌ（合計５０，０００個の標的細胞／ウェルにする）
５０μＬ  培地（アッセイ培地）
５０μＬ  エフェクター細胞（２０，０００個のＴＣＲ形質導入ＰＢＬ細胞／ウェル）
【００９５】
プレートは、次いで、一晩インキュベートされた（３７℃／５％ＣＯ２）。翌日、プレートは、洗浄バッファーで３回洗浄され（プログラム１、プレート型２、Ｕｌｔｒａｗａｓｈ  Ｐｌｕｓ  ９６ウェルプレート洗浄機、Ｄｙｎｅｘ）、ペーパータオル上で軽く叩かれて乾燥されて余分な洗浄バッファーが除去された。１００μｌの一次検出抗体は、次いで、各ウェルに添加された。一次検出抗体は、製造業者の説明書に明記された希釈を使用して、１０ｍＬの希釈バッファー（単一のプレートに必要とされる容量）中に希釈された。プレートは、次いで、室温で少なくとも２時間インキュベートされた後に洗浄バッファーで３回洗浄された（プログラム１、プレート型２、Ｕｌｔｒａｗａｓｈ  Ｐｌｕｓ  ９６ウェルプレート洗浄機、Ｄｙｎｅｘ）；余分な洗浄バッファーは、プレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって除去された。
【００９６】
二次検出は、各ウェルに１００μＬの希釈されたストレプトアビジン−ＨＲＰを添加してプレートを室温で１時間インキュベートすることによって行われた。ストレプトアビジン−ＨＲＰは、製造業者の説明書に明記された希釈を使用して、１０ｍＬの希釈バッファー（単一のプレートに必要とされる容量）中に希釈された。プレートは、次いで、洗浄バッファーで３回洗浄され（プログラム１、プレート型２、Ｕｌｔｒａｗａｓｈ  Ｐｌｕｓ  ９６ウェルプレート洗浄機、Ｄｙｎｅｘ）、ペーパータオル上で軽く叩かれて余分な洗浄バッファーが除去された。プレートは、次いで、ＰＢＳで各ウェルに２００μＬを添加することによって２回洗浄され、バッファーが軽く振り出され、ペーパータオル上で軽く叩かれて余分なバッファーが除去された。使用前１５分以内に、１滴（２０ｕＬ）のＡＥＣ色素原が各１ｍｌのＡＥＣ基質に添加されて混合された。各プレートについて１０ｍｌのこの溶液が調製された；１ウェルあたり１００μＬが添加された。プレートは、次いで、ホイルを使用して光から保護され、通常、５〜２０分以内に生じる、スポット発色が定期的にモニターされる。プレートは、発色反応を終了させるために水道水中で洗浄され、それらが３つの成分に分解される前に振盪乾燥された。プレートは、次いで、室温で少なくとも２時間乾燥可能にされた後に、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（登録商標）プレートリーダー（ＣＴＬ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を使用してスポットが計数された。
【００９７】
結果
多様なＡＦＰ陽性および対照の腫瘍細胞株に応答した、活性化されたＴＣＲ形質導入Ｔ細胞によるＩＦＮγ放出は、（上記のように）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって試験された。各ウェル内で観察されるＥＬＩＳＰＯＴスポットの数は、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）を使用してプロットされた。
【００９８】
ＴＣＲ番号１〜８のうちの１種を発現しているＣＤ４＋、ＣＤ８＋または混合されたＣＤ４＋／ＣＤ８＋のＴ細胞は、ＭＡＧＥ  Ａ１０＋  ＨＬＡ：Ａ２＋腫瘍細胞株Ａ３７５と共にまたはＭＡＧＥ  Ａ１０＋  ＨＬＡ：Ａ２＋  ＨＣＴ１１６腫瘍細胞株と共にインキュベートされた。Ｔ細胞を含んでいない試料および形質導入されていないＴ細胞の試料は、対照として使用された。
【００９９】
【表６】
0006751391.tif 000009
【０１００】
図９は、上記の表に記載のＴＣＲで形質導入されたＴ細胞が、ＭＡＧＥ  Ａ１０陽性腫瘍細胞に応答して活性化されることを示している。正常肝細胞（ＨＣＴ１１６）は、ＭＡＧＥ  Ａ１０陰性であり、ＭＡＧＥ  Ａ１０  ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞の活性化を誘導しない。したがって、本発明のＭＡＧＥ  Ａ１０  ＴＣＲは、ＭＡＧＥ  Ａ１０提示細胞を選択的に認識する。
【０１０１】
［実施例７］
すべての代替アミノ酸での置換による結合モチーフの同定
それぞれの位置のアミノ酸残基が１９種すべての代替の天然に存在するアミノ酸で順次置き換えられた天然のＭＡＧＥ−Ａ１０ペプチドのバリアントが得られ、それによって、全部で１７１種のペプチドが調製された。天然のペプチドおよびアミノ酸置換されたペプチドが、抗原提示細胞上にパルスされ、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して測定されるような、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）産生が、ＴＣＲ５で形質導入されたＴ細胞の活性化についての読み出しとして使用された。不可欠な位置は、天然のペプチドに対して相対的に５０％を超えるＴ細胞活性における低下によって定義された。
【０１０２】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、実施例６に記載のように行われた。
【０１０３】
ペプチドの各位置における許容される残基は、以下に示される。下線付きのアミノ酸は、ペプチド内の該当位置における天然の残基を表す。
【０１０４】
【表７】
0006751391.tif 000010
【０１０５】
したがって、抗原提示細胞の表面上でＨＬＡ−Ａ＊０２と複合体形成しているときに、ＭＡＧＥ  Ａ１０  ＴＣＲ５が、ＧＬＹＤＧＭＥＨＬペプチド（配列番号１）の少なくともＹ３および７Ｅと接触することは明らかである。
【図１ａ】
0006751391.tif 000013
【図１ｂ】
0006751391.tif 000014
【図２ａ】
0006751391.tif 000015
【図２ｂ】
0006751391.tif 000016
【図３】
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【図４】
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【図５】
0006751391.tif 000019
【図６】
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【図７】
0006751391.tif 000021
【図８】
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【図９】
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【配列表】
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