(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列が、センス鎖
５’−ＣｍＣｍＵｍＵｍＧＡＧＧＣｍＡＵｍＡＣｍＵｍＵｍＣｍＡＡＡ−ｄＴｄＴ−３’、
アンチセンス鎖
５’−ＵｆＵｍＵｆＧＡＡＧＵｆＡＵＧＣＣＵｆＣＡＡＧＧ−ｄＴｄＴ−３’
で示されるｓｉＲＮＡであって、
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａ及びＴはヌクレオチドの塩基組成を示し、小文字ｄは該文字ｄの右側にある１つのヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドであることを示し、小文字ｍは該文字ｍの左側にある１つのヌクレオチドのリボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシ基で置換されたことを示し、小文字ｆは該文字ｆの左側にある１つのヌクレオチドのリボース基の２’−ヒドロキシ基がフッ素で置換されたことを示すｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
前記ｓｉＲＮＡの前記センス鎖及び／又は前記アンチセンス鎖の３’末端におけるオーバーハングｄＴｄＴの間のリン酸ジエステル結合はチオリン酸ジエステル結合で置換される、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項４】
前記薬学的に許容される担体はアミン含有化合物、コレステロール及びポリエチレングリコール化脂質からなる脂質混合物であり、ただし、前記アミン含有化合物が式Ｉで示す化合物又はその薬学的に許容される塩である、請求項３に記載の医薬組成物。
【化１２】
0006715325.tif 000024
［ただし、
Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ−Ａ又はＣ−Ａであり、Ａは水素又はＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖であり、
Ｙ及びＺはそれぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ−ＯＨ又はＳＯ２であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して水素、環状又は非環状の置換又は非置換の分岐鎖又は直鎖の脂肪族基、環状又は非環状の置換又は非置換の分岐鎖又は直鎖の複素脂肪族基、置換又は非置換の分岐鎖又は直鎖のアシル基、置換又は非置換の分岐鎖又は直鎖のアリール基、置換又は非置換の分岐鎖又は直鎖のヘテロアリール基であり、
ｘは１〜１０の整数であり、
ｎは１〜３の整数であり、ｍは０〜２０の整数であり、ｐは０又は１であり、ｍ＝ｐ＝０であると、Ｒ２が水素となり、
ただし、ｎ又はｍのうちの少なくとも一つが２である場合、Ｒ３と式Ｉにおける窒素とが式ＩＩ又は式ＩＩＩで示す構造を形成する。
【化１３】
0006715325.tif 000025
ただし、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１〜６の整数であり、「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、かつ各＊は式Ｉにおける窒素原子を表す。］
【請求項５】
前記アミン含有化合物は以下に示すアミン含有化合物７２又はアミン含有化合物８７であり、
【化１４】
0006715325.tif 000026
【化１５】
0006715325.tif 000027
前記ポリエチレングリコール化脂質は１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］である、
請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記薬学的に許容される担体におけるアミン含有化合物、コレステロール、及びポリエチレングリコール化脂質の三者のモルパーセントは、アミン含有化合物１９．７％〜８０％、コレステロール１９．７％〜８０％、ポリエチレングリコール化脂質０．３％〜５０％であり、
好ましくは、前記薬学的に許容される担体におけるアミン含有化合物、コレステロール、及びポリエチレングリコール化脂質の三者のモルパーセントは、アミン含有化合物５０％〜７０％、コレステロール２０％〜４０％、ポリエチレングリコール化脂質３％〜２０％である、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記薬学的に許容される担体におけるアミン含有化合物８７、コレステロール、及び１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ
（ポリエチレングリコール）−２０００］の三者のモルパーセントは、アミン含有化合物８７  １９．７％〜８０％、コレステロール１９．７％〜８０％、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］  ０．３％〜５０％であり、
好ましくは、前記薬学的に許容される担体におけるアミン含有化合物８７、コレステロール、及び１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］の三者のモルパーセントは、アミン含有化合物８７  ５０％〜７０％、コレステロール２０％〜４０％、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］  ３％〜２０％である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ｓｉＲＮＡと前記薬学的に許容される担体との重量比は１：（１〜５０）である、請求項３から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１又は２に記載のｓｉＲＮＡと薬学的に許容される結合分子とが結合して得られるｓｉＲＮＡ結合体であって、前記結合分子が薬学的に許容される標的分子と任意のリンカーとを含む、ｓｉＲＮＡ結合体。
【請求項１０】
前記薬学的に許容される標的分子はアシアロ糖タンパクレセプターのリガンドであり、
好ましくは、前記薬学的に許容される標的分子はガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミンである、請求項９に記載のｓｉＲＮＡ結合体。
【請求項１１】
前記ガラクトース又は前記Ｎ−アセチルガラクトサミンはリンカーを介して前記ｓｉＲＮＡと共有結合し、
好ましくは、前記ガラクトース又は前記Ｎ−アセチルガラクトサミンはリンカーを介して前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖３’末端に共有結合する、請求項１０に記載のｓｉＲＮＡ結合体。
【請求項１２】
前記リンカーの構造は、−（ＬＡ）ｎＬＣ−ＬＢ−であり、ただし、
ｎは１〜３の整数であり、
ＬＡはアミド結合を含む鎖状部分であって、Ｎ−アセチルガラクトサミン分子及びＬＣ部分とエーテル結合を介して結合しており、その構造が、以下の構造であり、
【化１６】
0006715325.tif 000028
ＬＢはアミド結合を含む鎖状部分であって、ＬＣ部分とアミド結合を介して結合し、ｓｉＲＮＡ部分とホスフェート結合を介して結合しており、その構造が、以下の構造であり、
【化１７】
0006715325.tif 000029
ＬＣはヒドロキシメチルアミノメタン、ジヒドロキシメチルアミノメタン又はトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく２〜４価の結合基であり、ＬＣの一端は酸素原子を介して１〜３個のＬＡ部分とエーテル結合により結合しており、ＬＣの他端は窒素原子を介してＬＢ部分とアミド結合により結合する、請求項１０に記載のｓｉＲＮＡ結合体。
【請求項１３】
前記ｓｉＲＮＡ結合体の構造が、以下の構造であり、
【化１８】
0006715325.tif 000030
前記結合分子が前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖３’末端に共有結合し、
前記ｓｉＲＮＡと前記Ｎ−アセチルガラクトサミンとのモル比が１：３である、請求項１０に記載のｓｉＲＮＡ結合体。
【請求項１４】
請求項１又は２に記載のｓｉＲＮＡ、及び／又は請求項３から８のいずれか一項に記載の医薬組成物、及び／又は請求項９から１３のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ結合体を含むキット。
【請求項１５】
請求項１又は２に記載のｓｉＲＮＡ及び／又は請求項３から８のいずれか一項に記載の医薬組成物及び／又は請求項９から１３のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ結合体のＢ型肝炎の治療及び／又は予防のための薬物の製造への応用。
【請求項１６】
請求項１又は２に記載のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物、請求項３から８のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は請求項９から１３のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ結合体を含む医薬組成物であって、慢性ＨＢＶ感染の肝炎細胞中におけるＨＢＶ遺伝子発現の抑制を行う為の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含む医薬組成物及び結合体、並びにそれらの応用に関する。具体的には、本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）の遺伝子発現を抑制するためのｓｉＲＮＡ、該ｓｉＲＮＡを活性成分として含む医薬組成物及び結合体、並びに該ｓｉＲＮＡ、医薬組成物及び結合体の、Ｂ型肝炎の予防及び／又は治療のための薬物の製造への応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型ウィルス性肝炎（Ｂ型肝炎又はＢ肝とも呼ばれる）は、全世界、特に中国を深刻に脅かしている感染症であるが、現在、世界的に認められているインターフェロンとヌクレオシド類似体という二種類のＢ型肝炎治療薬には、まだ様々な欠点がある。そのため、遺伝子レベルでＨＢＶの生成と複製を抑制し、それにより根本的にウィルスの代謝や肝細胞に対する感染を低減させることができれば、間違いなく最も理想的なＢ型肝炎の治療手段となる。この観点から、理論的には、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）というメカニズムに基づいて、如何なる所望の標的遺伝子（例えば、がんなどの疾患を誘発する遺伝子）であっても、その発現を配列特異的に抑制又は遮断することができ、疾患治療の目的を達成できる。
【０００３】
残念なことに、これまで実際に臨床応用に入ったｓｉＲＮＡ薬物は多くない。その主な原因の一つは、ｓｉＲＮＡ自体の安定性が劣り、体内でヌクレアーゼにより分解されやすい（特に、ｓｉＲＮＡは体内システムに投与された後、先ず体内の血管系に入り込み、血液中は内因性ヌクレアーゼに富んでいる）ことである。この障害を克服するための手段の一つとしては、ｓｉＲＮＡの血液中における安定性を向上させるように、ｓｉＲＮＡに対して化学的修飾を行うことである。しかしながら、本分野では、ｓｉＲＮＡの血液中における分解過程やメカニズムについてまだ十分に理解されていないので、修飾部位の選択はいまだに経験主義的で、実験を繰り返すことで検証しなければならない過程である。よって、十分な安定性を得るために、ｓｉＲＮＡに大量の（ひいては盲目的な、余計な）化学的修飾を施さざるを得ない。その結果、修飾によりある程度ｓｉＲＮＡの安定性を向上させることができるかもしれないが、過剰な修飾或いは不適切な修飾が導入されるため、必然的にコストの増加や、修飾後のｓｉＲＮＡにおける潜在的な細胞毒性の発生、修飾後のｓｉＲＮＡの生物活性及び特異性への影響などの欠陥を招く。
【０００４】
したがって、血液中において安定的で、良好な生物活性を有し、且つ細胞毒性が低いＨＢＶの遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡの開発が切望されている。
【０００５】
すでに特許権が付与された出願人による先行出願ＣＮ１０２１４０４６１Ｂにおいて、ＨＢＶ遺伝子を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ  ＣＡ１（センス鎖が５’−ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡ−ｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）であり、アンチセンス鎖が５’−ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧ−ｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）である）に対する様々な化学的修飾の方策を研究した。その結果、異なる修飾策は、ｓｉＲＮＡの安定性、生物活性及び細胞毒性などの指標に全く異なる影響を及ぼすことが判明し、例えば、未修飾の裸ｓｉＲＮＡ  ＣＡ１に比べて、２０箇所も化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ  ＣＡ２は、劣った細胞レベルの活性、高い細胞毒性を示しただけでなく、血液中においても安定状態に到達できなかった。この研究では、五つの有効な修飾方式が実証され、未修飾のｓｉＲＮＡ  ＣＡ１と比べると、そのうちの一つの修飾方式で得られるｓｉＲＮＡ  Ａ４は、血液の安定性を向上させることができるとともに、ｓｉＲＮＡ  ＣＡ１にほぼ相当する抑制活性を維持していた。とは言え、合成コストや合成効率、合成過程のプロセスの利便性、ｓｉＲＮＡ安定性、ｓｉＲＮＡ活性などの各方面から考えると、より優れたｓｉＲＮＡを得るために、やはりｓｉＲＮＡ  ＣＡ１の修飾部位に対する更なる簡略化と最適化が必要である。しかし、本分野の先行研究から明らかなように、ｓｉＲＮＡに対する異なる化学的修飾が「些細な動きが全局に影響する」可能性があり、即ち、１つの部位で異なる修飾策を取るだけでｓｉＲＮＡの安定性を根本的に変えてしまうかもしれないことを考えると、上述した簡略化と最適化は簡単ではない。
【０００６】
一方、化学的修飾のほか、適切な担体と医薬組成物を、又は適切な結合分子と結合体を形成することにより、ｓｉＲＮＡの血液安定性をさらに改善し、その標的指向性を向上させ、ｓｉＲＮＡの体内送達の問題を解決するなどしてもよい。Ｂ型肝炎の予防・治療を目的とするｓｉＲＮＡに対しては、肝臓指向性を付与又は向上できる担体や結合分子が非常に有利であり、これによって、ｓｉＲＮＡによるＨＢＶ遺伝子発現の抑制効率を極めて大きく向上させ、潜在的な副作用を低減させる。さらに、肝臓指向性の担体や結合分子を導入した後、ｓｉＲＮＡは標的部位で役割を果たす必要があり、即ち、担体や結合分子による被覆／結合はｓｉＲＮＡ自体の活性に影響してはならない（例えば、ｓｉＲＮＡを細胞内に導入するＲＮＡｉマシン、即ちＲＩＳＣ複合体に影響してはならない）。本分野では、このようなｓｉＲＮＡの臨床応用の将来性を高める薬学的に許容される担体又は結合分子、及びこのような担体又は結合分子を利用して製造されたｓｉＲＮＡ医薬組成物又はｓｉＲＮＡ結合体が同様に切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＣＮ１０２１４０４６１Ｂ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者は、ＨＢＶ遺伝子発現を抑制するためのｓｉＲＮＡ及びその修飾方式について鋭意検討したところ、所定の修飾方式を採用したｓｉＲＮＡは、優れた血液安定性を示し、且つヌクレオチドの修飾量の低減により合成と生産のコストを低下させ、合成終了後の脱保護試薬の選択肢を増やし、反応時間を短縮させ、合成効率を向上させたとともに、細胞毒性を低く維持したことを見出した。さらに重要なことは、本発明の新たな修飾策により得られるヌクレオチドの修飾量が低減したｓｉＲＮＡは、出願人にすでに特許権が付与された先行出願ＣＮ１０２１４０４６１Ｂに開示されているｓｉＲＮＡ  Ａ４よりも、体外での血液（血漿）安定性が優れ、且つ動物体内での生物活性も優れ、その臨床応用の将来性をさらに高めた。
【０００９】
さらに、本発明者は、ｓｉＲＮＡ投与のための薬学的に許容される様々な担体を検討し、担体分子のタイプ、配合割合（担体の内部成分の間の配合割合、及び担体と本発明のｓｉＲＮＡとの配合割合を含む）、物理・化学的性質、薬物担持効率、投与方式、投与用量、薬物処理時間などについて鋭意検討した。同時に、本発明者は、各タイプのｓｉＲＮＡ結合体についても研究し、薬学的に許容される結合分子の選択（標的分子の選択、標的分子と本発明のｓｉＲＮＡとのリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）の選択を含む）、合成経路の開発及び構築、体内生物活性の研究などが含まれる。前述のとおり系統的且つ全面的に研究した結果、本発明者は、本発明におけるｓｉＲＮＡは薬学的に許容される様々な担体と組み合わせ、又は薬学的に許容される様々な結合分子と結合して、優れた体内効果を実現できることを見出した。特に、アミン含有化合物、補脂質、ポリエチレングリコール化脂質の三つの成分から形成される脂質混合物を薬学的に許容される担体として、本発明におけるｓｉＲＮＡと医薬組成物を形成することにより、さらに本発明のｓｉＲＮＡを肝臓に特異的に送達することができ、投与用量を大幅に低減させるとともにより優れたＨＢＶ  ｍＲＮＡ抑制作用を発揮することができる。このように、本発明者は本発明を完成した。
【００１０】
したがって、第一の側面において、本発明は、ＨＢＶ遺伝子の４つのオープンリーディングフレームの１つであるＸ遺伝子領域に特異的に指向することができ、そのターゲットｍＲＮＡ配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で示すｓｉＲＮＡであって、前記ｓｉＲＮＡの配列が、
センス鎖  ５’−ＣｍＣｍＵｍＵｍＧＡＧＧＣｍＡＵｍＡＣｍＵｍＵｍＣｍＡＡＡ−ｄＴｄＴ−３’、
アンチセンス鎖  ５’−ＵｆＵｍＵｆＧＡＡＧＵｆＡＵＧＣＣＵｆＣＡＡＧＧ−ｄＴｄＴ−３’
で示され、
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａ及びＴはヌクレオチドの塩基組成を示し、小文字ｄは該文字ｄの右側にある１つのヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドであることを示し、小文字ｍは該文字ｍの左側にある１つのヌクレオチドのリボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシ基で置換されたことを示し、小文字ｆは該文字ｆの左側にある１つのヌクレオチドのリボース基の２’−ヒドロキシ基がフッ素で置換されたことを示す、ことを特徴とするｓｉＲＮＡを提供する。例えば、センス鎖の５’端の１番目の大文字Ｃとその右側のｍからなる「Ｃｍ」は、含まれる塩基がシトシンで、リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシ基で置換されたヌクレオチドを表し、また、アンチセンス鎖の５’端の１番目の大文字Ｕとその右側のｆからなる「Ｕｆ」は、含まれる塩基がウラシルで、リボース基の２’−ヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを表す。
【００１１】
第二の側面において、本発明は、活性成分として第一の側面に記載のｓｉＲＮＡと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【００１２】
第三の側面において、本発明は、第一の側面に記載のｓｉＲＮＡと、薬学的に許容される結合分子とを結合させてなるｓｉＲＮＡ結合体を提供する。
【００１３】
第四の側面において、本発明は、第一の側面に記載のｓｉＲＮＡ、及び／又は第二の側面に記載の医薬組成物、及び／又は第三の側面に記載のｓｉＲＮＡ結合体を含有するキットを提供する。
【００１４】
第五の側面において、本発明は、第一の側面に記載のｓｉＲＮＡ、及び／又は第二の側面に記載の医薬組成物、及び／又は第三の側面に記載のｓｉＲＮＡ結合体の、Ｂ型肝炎の予防及び／又は治療のための薬物の製造への応用を提供する。
【００１５】
第六の側面において、本発明は、第一の側面に記載のｓｉＲＮＡ、及び／又は第二の側面に記載の医薬組成物、及び／又は第三の側面に記載のｓｉＲＮＡ結合体を必要な患者に投与することを含む、Ｂ型肝炎の治療方法を提供する。
【００１６】
第七の側面において、本発明は、第一の側面に記載のｓｉＲＮＡ、及び／又は第二の側面に記載の医薬組成物、及び／又は第三の側面に記載のｓｉＲＮＡ結合体を前記慢性ＨＢＶ感染の肝炎細胞に導入することを含む、慢性ＨＢＶ感染の肝炎細胞中におけるＨＢＶ遺伝子発現の抑制方法を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
ＣＮ１０２１４０４６１ＢにおけるｓｉＲＮＡ  Ａ４と比べると、本発明に係るｓｉＲＮＡは、ヌクレオチドの修飾数をさらに減少させながら、類似する効果、ひいてはより優れた効果を達成できる（細胞実験におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現抑制活性が類似しており、動物実験におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現抑制活性、Ｂ型肝炎表面抗原ＨＢｓＡｇ抑制作用がより強い）。より重要なことは、ヌクレオチドの修飾数が減少された後、血液安定性が予想以上に向上したことである（体外実験では、全長ｓｉＲＮＡフラグメントが血漿において長期間にわたって安定性をより高く維持することができる）。同時に、ヌクレオチド修飾量が減少されたため、本発明に係るｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ  Ａ４よりも合成コストが低く、技術方案の選択範囲が広く、生産効率が高く、このように、より臨床応用の将来性のあるｓｉＲＮＡを提供している。
【００１８】
さらに、本発明に係るｓｉＲＮＡから形成される医薬組成物及びｓｉＲＮＡ結合体は、Ｂ型肝炎モデルマウスの体内で優れたＨＢＶ  ｍＲＮＡ抑制効率を示すとともに、表面抗原発現を有効に低下させることができ、慢性Ｂ型肝炎に対して良好な治療作用を示した。特に、上述したように、アミン含有化合物、補脂質、ポリエチレングリコール化脂質という三つの成分から形成される脂質混合物を薬学的に許容される担体として本発明におけるｓｉＲＮＡと医薬組成物を形成することにより、本発明のｓｉＲＮＡを肝臓に特異的に送達することができ、投与用量を大幅に低減させるとともに、より優れたＨＢＶ  ｍＲＮＡ抑制作用を発揮することができる（Ｂ型肝炎モデルマウスにおいて、投与用量が他の通常の担体から形成される医薬組成物の僅か１／５でありながら、該医薬組成物のＨＢＶ  ｍＲＮＡ抑制効率は他の通常の担体から形成される医薬組成物の２倍近くにもなり、さらには１０倍余りに達することもできる）。
【００１９】
本発明のほかの特徴及び利点については、後述する発明を実施するための形態で詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１ａは（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２二本鎖の超高速液体クロマトグラフィー（Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＵＰＬＣ）チャートの結果（巻き戻した後）を、図１ｂは（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２センス鎖のＭＳ質量分析結果を、図１ｃは（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２アンチセンス鎖のＭＳ質量分析結果をそれぞれ示す。
【図２】図２は表１に記載されているテストｓｉＲＮＡとコントロールｓｉＲＮＡのＨｅｐＧ２．２．１５細胞におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制活性の測定結果を示す。
【図３】図３は表１に記載されているテストｓｉＲＮＡとコントロールｓｉＲＮＡのインビトロヒト血漿における安定性の測定結果を示す。
【図４】図４は表１に記載されているテストｓｉＲＮＡを内包したＲＢＰ１３１／ｓｉＲＮＡリポソーム製剤のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（ＡｌｂｌＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／ＪトランスジェニックマウスにおけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制活性の測定結果を示す。
【図５】図５は測定される各群の供試品の異なる時点でのＭ−ＴｇＨＢＶトランスジェニックマウスの血清中のＨＢｓＡｇ発現に対する抑制活性の測定結果を示す。
【図６】図６は測定される各群の供試品の７、２８日目のｐＨＢＶマウス（高圧注射に基づくＨＢＶトランスフェクションマウス）の肝臓におけるＨＢｓＡｇ発現に対する抑制活性の測定結果を示す。
【図７】図７は測定される各群の供試品のｐＨＢＶマウス（高圧注射に基づくＨＢＶトランスフェクションマウス）の肝臓におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制活性の測定結果を示す。
【図８】図８は測定される各群の供試品のｐＨＢＶマウス（高圧注射に基づくＨＢＶトランスフェクションマウス）の血清中のＨＢｓＡｇ発現に対する抑制活性の測定結果を示す。
【図９】図９は測定される各群の供試品の異なる時点でのｐＨＢＶマウス（高圧注射に基づくＨＢＶトランスフェクションマウス）の血清中のＨＢｓＡｇ発現に対する抑制活性の測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の具体的な実施形態について詳しく説明する。ここに記載されている発明を実施するための形態は本発明を説明及び解釈するためのものに過ぎず、本発明を限定するものではないことを理解すべきである。
【００２２】
以下、本発明における第一の側面に記載されているｓｉＲＮＡをＸ２Ｍ２と呼んでもよい。
【００２３】
一、本発明に係るｓｉＲＮＡ
本発明に係るｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド基を基本構造単位として含み、前記ヌクレオチド基はリン酸基と、リボース基と、塩基とを含む。本発明に係るｓｉＲＮＡは修飾されたヌクレオチド基を含有し、前記修飾されたヌクレオチド基により前記ｓｉＲＮＡのＨＢＶ遺伝子発現を抑制する機能が著しく低下する又は失われることはない。現在、本分野において、骨格修飾（例えば、リン酸基修飾）、リボース基修飾、及び塩基修飾など（Ｗａｔｔｓ，  Ｊ．Ｋ．，  Ｇ．Ｆ．  Ｄｅｌｅａｖｅｙ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．  Ｄａｍｈａ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ：  ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ，  ２００８．  １３（１９−２０）：  ｐ．  ８４２−５５）を含め、ｓｉＲＮＡの修飾に利用可能な様々な修飾方法が存在する。本発明におけるｓｉＲＮＡのいくつかの実施形態において、前記修飾されたヌクレオチド基は、リボース基及び任意のリン酸基が修飾されたヌクレオチド基であるが、これに限定されない。
【００２４】
本発明におけるｓｉＲＮＡのいくつかの好ましい実施形態において、リン酸基修飾とは、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）修飾、すなわち、一つの硫黄原子でリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子を置換することにより、チオリン酸ジエステル結合でリン酸ジエステル結合を置換することを指す。この修飾によりｓｉＲＮＡの構造が安定し、塩基対合の高い特異性と高い親和力が維持される。
【００２５】
【化１】
0006715325.tif 000002
【００２６】
本発明におけるｓｉＲＮＡのいくつかの好ましい実施形態において、リボース基修飾とは、リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシ基又はフッ素で置換されることを指す。リボース基の２’−ヒドロキシ基の位置に、例えばメトキシ基又はフッ素を導入することによって、血液中のリボヌクレアーゼが核酸を切断しにくくなるため、核酸の安定性が増加し、核酸にヌクレアーゼによる加水分解に対するより強い抵抗性能を付与する。
【００２７】
【化２】
0006715325.tif 000003
【００２８】
本発明に係るｓｉＲＮＡでは、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端のいずれにもオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）ｄＴｄＴが接続されている。本発明の好ましい実施形態によれば、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’オーバーハングｄＴｄＴの間のリン酸ジエステル結合に対してホスホロチオエート修飾を行った。以下において、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’オーバーハングｄＴｄＴの間のリン酸ジエステル結合のいずれもホスホロチオエート修飾されたｓｉＲＮＡをＸ２Ｍ２（Ｓ＋＋）と呼び、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’オーバーハングｄＴｄＴの間のリン酸ジエステル結合のいずれもホスホロチオエート修飾されていないｓｉＲＮＡをＸ２Ｍ２（Ｓ−−）と呼び、センス鎖の３’オーバーハングｄＴｄＴの間のリン酸ジエステル結合のみがホスホロチオエート修飾されたｓｉＲＮＡをＸ２Ｍ２（Ｓ＋−）と呼び、アンチセンス鎖の３’オーバーハングｄＴｄＴの間のリン酸ジエステル結合のみがホスホロチオエート修飾されたｓｉＲＮＡをＸ２Ｍ２（Ｓ−＋）と呼んでもよい。そして、前後の文において特に断らない限り、ｓｉＲＮＡ  Ｘ２Ｍ２に言及する場合は、ここで列挙するＸ２Ｍ２（Ｓ＋＋）、Ｘ２Ｍ２（Ｓ−−）、Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋−）及びＸ２Ｍ２（Ｓ−＋）を含むことを意味する。
【００２９】
本分野の通常のｓｉＲＮＡ製造方法（例えば、固相合成と液相合成）により本発明におけるｓｉＲＮＡ、例えばＸ２Ｍ２（Ｓ＋＋）、Ｘ２Ｍ２（Ｓ−−）、Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋−）及びＸ２Ｍ２（Ｓ−＋）を得ることができることは、当業者にとって自明である。そのうち、固相合成については商業化カスタマイズサービスが既存しており、蘇州瑞博生物技術有限会社もこのような固相合成能力を備えている。対応する修飾が行われたヌクレオチドモノマーを使用することにより、修飾されたヌクレオチド基を本発明におけるｓｉＲＮＡに導入することができ、対応する修飾が行われたヌクレオチドモノマーの製造方法及び修飾されたヌクレオチド基のｓｉＲＮＡへの導入方法も、当業者にとって周知のものである。
【００３０】
二、本発明に係る医薬組成物
本発明に係る医薬組成物には、本発明のｓｉＲＮＡと薬学的に許容される担体が含まれる。前記薬学的に許容される担体とは、ｓｉＲＮＡ投与分野で常用される担体であってもよく、例えば、磁性ナノ粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、例えばＦｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３）、カーボンナノチューブ（ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ）、メソポーラスシリコン（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ  ｓｉｌｉｃｏｎ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）、ポリアミドアミンデンドリマ（ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ  （ＰＡＭＡＭ）  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、ポリＬ−リシン（ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）、ＰＬＬ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、ポリ−Ｄ−又はＬ−乳酸／グリコール酸コポリマー（ｐｏｌｙ（Ｄ＆Ｌ−ｌａｃｔｉｃ／ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、ＰＬＧＡ）、ポリ（２−アミノエチルエチレンホスフェート）（ｐｏｌｙ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＰＰＥＥＡ）及びポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ（２−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＰＤＭＡＥＭＡ）、並びにそれらの誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に係る医薬組成物においては、ｓｉＲＮＡと薬学的に許容される担体の含有量に対して特に要求はないが、一般的には、ｓｉＲＮＡと薬学的に許容される担体の重量比が１：（１〜５０）である。
【００３１】
本発明に係る医薬組成物には、さらに薬学的に許容される他の添加剤が含まれてもよく、この添加剤が本分野で常用される各種の製剤又は化合物の一種又は複数種であってもよい。例えば、上記の薬学的に許容される他の添加剤は、ｐＨ緩衝液、保護剤及び浸透圧調節剤のうちの少なくとも一種を含んでもよい。前記ｐＨ緩衝液は、ｐＨ７．５〜８．５のトリス塩酸塩緩衝液、及び／又はｐＨ５．５〜８．５のリン酸塩緩衝液であってもよく、ｐＨ５．５〜８．５のリン酸塩緩衝液であることが好ましい。前記保護剤は、イノシトール、ソルビトール、ショ糖、トレハロース、マンノース、麦芽糖、乳糖及びグルコースのうちの少なくとも一種であってもよい。前記医薬組成物の総重量を基準として、前記保護剤の含有量が０．０１〜３０重量％であってもよい。前記浸透圧調節剤は、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムであってもよい。前記浸透圧調節剤の含有量により前記医薬組成物の浸透圧を２００〜７００ミリオスモル／キログラムとする。所望の浸透圧に応じて、当業者であれば前記浸透圧調節剤の含有量を容易に決めることができる。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記医薬組成物は、液体製剤、例えば注射液であってもよく、投与の時に液体添加剤と混合して液体製剤とする注射用凍結乾燥粉末であってもよい。前記液体製剤は、皮下、筋肉又は静脈注射投与に用いられてもよく、噴霧により肺に、或いは肺を通して他の臓器・組織（例えば肝臓）に投与されてもよいが、これらに限定されない。前記医薬組成物を静脈注射投与に用いることが好ましい。
【００３３】
本発明に係る医薬組成物の好ましい実施形態において、前記医薬組成物はリポソーム製剤としてもよい。より好ましい実施形態において、前記リポソーム製剤で使用される薬学的に許容される担体は、アミン含有トランスフェクション化合物（以下、アミン含有化合物とも呼ばれる）、補脂質及び／又はポリエチレングリコール化脂質を含む。そのうち、前記アミン含有化合物、補脂質及びポリエチレングリコール化脂質は、それぞれＣＮ２０１１８００６０６６４．１（その全体を引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示されるアミン含有トランスフェクション化合物、或いはその薬学的に許容される塩又は誘導体、補脂質及びポリエチレングリコール化脂質から選ばれる一種又は複数種であってもよい。
【００３４】
具体的には、前記アミン含有化合物は、ＣＮ２０１１８００６０６６４．１に開示される式Ｉで示す化合物又はその薬学的に許容される塩であってもよい。
【００３５】
【化３】
0006715325.tif 000004
ただし、
Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ−Ａ又はＣ−Ａであり、そのうちのＡは水素又はＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖であり、
Ｙ及びＺはそれぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ−ＯＨ又はＳＯ２であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して水素、環状又は非環状の置換又は非置換の分岐鎖又は直鎖の脂肪族基、環状又は非環状の置換又は非置換の分岐鎖又は直鎖の複素脂肪族基、置換又は非置換の分岐鎖又は直鎖のアシル基、置換又は非置換の分岐鎖又は直鎖のアリール基、置換又は非置換の分岐鎖又は直鎖のヘテロアリール基であり、
ｘは１〜１０の整数であり、
ｎは１〜３の整数であり、ｍは０〜２０の整数であり、ｐは０又は１であり、そのうち、ｍ＝ｐ＝０であると、Ｒ２が水素となり、
ただし、ｎ又はｍのうちの少なくとも一つが２である場合、Ｒ３と式Ｉにおける窒素とが式ＩＩ又は式ＩＩＩで示す構造を形成する。
【００３６】
【化４】
0006715325.tif 000005
ただし、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１〜６の整数であり、「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、かつ各＊は式Ｉにおける窒素原子を表す。
【００３７】
前記アミン含有化合物はＣＮ２０１１８００６０６６４．１に開示されている、以下に示すアミン含有化合物７２又はアミン含有化合物８７であることが好ましい。
【００３８】
【化５】
0006715325.tif 000006
【化６】
0006715325.tif 000007
【００３９】
前記補脂質はコレステロール又はその類似体、誘導体などであることが好ましい。
【００４０】
前記ポリエチレングリコール化脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］、すなわち１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−［ｍｅｔｈｏｘｙ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−２０００］であることが好ましい。
【００４１】
本発明に係る医薬組成物のより好ましい実施形態において、使用される薬学的に許容される担体は、前述したアミン含有化合物、補脂質、ポリエチレングリコール化脂質の三つの成分を同時に含み、これらの成分は脂質混合物を形成している。この好ましい実施形態において、前記薬学的に許容される担体におけるアミン含有化合物、補脂質、ポリエチレングリコール化脂質のモルパーセントは、アミン含有化合物１９．７％〜８０％、補脂質１９．７％〜８０％、ポリエチレングリコール化脂質０．３％〜５０％であってもよい。より好ましくは、前記薬学的に許容される担体におけるアミン含有化合物、補脂質、ポリエチレングリコール化脂質のモルパーセントは、アミン含有化合物５０％〜７０％、補脂質２０％〜４０％、ポリエチレングリコール化脂質３％〜２０％である。
【００４２】
上述したアミン含有化合物、補脂質、ポリエチレングリコール化脂質及びｓｉＲＮＡを利用して機能性リポソーム製剤形の医薬組成物を製造する方法もＣＮ２０１１８００６０６６４．１を参照することができる。この製造方法について、医薬組成物における薬学的に許容される担体中のアミン含有化合物、補脂質、ポリエチレングリコール化脂質のモルパーセントを、アミン含有化合物１９．７％〜８０％、補脂質１９．７％〜８０％、ポリエチレングリコール化脂質０．３％〜５０％とすることができる。より好ましくは、医薬組成物における薬学的に許容される担体中のアミン含有化合物、補脂質、ポリエチレングリコール化脂質のモルパーセントを、アミン含有化合物５０％〜７０％、補脂質２０％〜４０％、ポリエチレングリコール化脂質３％〜２０％とすることができる。
【００４３】
本発明のｓｉＲＮＡと前記脂質混合物から形成されるリポソーム顆粒は、約３０ｎｍ〜約２００ｎｍの平均直径を有し、一般的には、約４０ｎｍ〜約１３５ｎｍであり、より一般的には、このリポソーム顆粒の平均直径は約５０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約９０ｎｍ、又は約７０ｎｍ〜約９０ｎｍであり、例えば、このリポソーム顆粒の平均直径は、約３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、又は１６０ｎｍである。
【００４４】
リポソーム製剤である医薬組成物において、本発明のｓｉＲＮＡと総脂質（例えば、アミン含有化合物、補脂質及び／又はポリエチレングリコール化脂質）との重量比（重量／重量比）は、約１：１〜約１：５０、約１：１〜約１：３０、約１：３〜約１：２０、約１：４〜約１：１８、約１：５〜約１：１７、約１：５〜約１：１５、約１：５〜約１：１２、約１：６〜約１：１２、又は約１：６〜約１：１０の範囲にあり、例えば、本発明のｓｉＲＮＡと総脂質の重量比は、約１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、又は１：１８である。
【００４５】
三、本発明に係るｓｉＲＮＡ結合体
本発明に係るｓｉＲＮＡ結合体は、本発明のｓｉＲＮＡと薬学的に許容される結合分子が結合して得られるものであり、前記結合分子は薬学的に許容される標的分子と任意のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含む。本発明の実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは前記結合分子に非共有結合してもよいが、前記結合分子に共有結合することが好ましい。結合によるｓｉＲＮＡ活性への影響を低下させるために、ｓｉＲＮＡと結合分子との結合部位は、ｓｉＲＮＡセンス鎖の３’末端又は５’末端に位置してもよく、アンチセンス鎖の５’末端に位置してもよい。いくつかの実施形態において、３’末端又は５’末端以外、ｓｉＲＮＡと結合分子との結合部位はさらにｓｉＲＮＡの内部配列に位置してもよい。
【００４６】
ｓｉＲＮＡと結合分子は酸に不安定な、又は還元可能な化学結合により結合することができ、細胞エンドソームの酸性環境では、これらの化学結合が分解して、ｓｉＲＮＡを自由状態にすることができる。分解不能の結合方式については、結合分子がｓｉＲＮＡのセンス鎖に結合して、結合によるｓｉＲＮＡ活性への影響をできる限り低減することができる。
【００４７】
前記薬学的に許容される標的分子は、ｓｉＲＮＡ投与分野で常用される標的分子であってもよく、例えば、脂肪親和分子、例えばコレステロール、胆汁酸、ビタミン（例えばビタミンＥ）、鎖長の異なる脂質分子；ポリマー、例えばポリエチレングリコール；ポリペプチド、例えば膜透過性ペプチド；アプタマー；抗体；量子ドット；糖類、例えば乳糖、ポリ乳糖、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）；葉酸（ｆｏｌａｔｅ）；又は肝実質細胞で発現するレセプターリガンド、例えばアシアロ糖タンパク、アシアロ糖残基、リボたんぱく質（例えば、高密度リボたんぱく質、低密度リボたんぱく質など）、グルカゴン、神経伝達物質（例えば、アドレナリン）、増殖因子、トランスフェリンなどの、標的分子又はその誘導体の一種又は複数種が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本発明に係るｓｉＲＮＡ結合体のいくつかの好ましい実施形態において、前記薬学的に許容される標的分子は、アシアロ糖タンパク、例えばアシアロオロソムコイド（ａｓｉａｌｏｏｒｏｓｏｍｕｃｏｉｄ、ＡＳＯＲ）；アシアロ糖タンパクレセプター（ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＡＳＧＰＲ）のリガンド、例えば乳糖、ポリ乳糖、マンノース、ガラクトース及びＮ−アセチルガラクトサミンから選ばれる一種又は複数種の分子であってもよい。
【００４９】
本発明に係るｓｉＲＮＡ結合体のいくつかのより好ましい実施形態において、前記薬学的に許容される標的分子は、ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミンであってもよく、そのうち、ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン分子は、一価、二価、三価、四価であってもよい。ここでいう一価、二価、三価、四価とは、それぞれｓｉＲＮＡ分子と標的分子であるガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン分子を含む結合分子とでｓｉＲＮＡ結合体が形成された後、該ｓｉＲＮＡ結合体におけるｓｉＲＮＡ分子とガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン分子とのモル比が１：１、１：２、１：３及び１：４であることを指すと理解すべきである。より好ましくは、前記薬学的に許容される標的分子はＮ−アセチルガラクトサミンである。本発明におけるｓｉＲＮＡとＮ−アセチルガラクトサミンを含む結合分子とが結合する場合、Ｎ−アセチルガラクトサミン分子が三価又は四価であることがさらにより好ましい。本発明におけるｓｉＲＮＡとＮ−アセチルガラクトサミンを含む結合分子とが結合する場合、Ｎ−アセチルガラクトサミン分子が三価であることがさらにより好ましい。
【００５０】
本発明におけるｓｉＲＮＡと結合分子とが結合する場合、結合分子は適切なリンカーを介してｓｉＲＮＡ分子と結合することができ、当業者は標的分子の具体的なタイプに応じて適切なリンカーを選択することができる。いくつかの実施形態において、前記標的分子がＮ−アセチルガラクトサミンである場合、適切なリンカーは、−（ＬＡ）ｎＬＣ−ＬＢ−であってもよく、ここで、
ｎは１〜３の整数であり、
ＬＡはアミド結合を含む鎖状部分であって、Ｎ−アセチルガラクトサミン分子及びＬＣ部分とエーテル結合を介して結合しており、その構造が以下で示される。
【化７】
0006715325.tif 000008
【００５１】
ＬＢはアミド結合を含む鎖状部分であって、ＬＣ部分とアミド結合を介して結合し、ｓｉＲＮＡ部分とホスフェート結合を介して結合しており、その構造が以下で示される。
【化８】
0006715325.tif 000009
【００５２】
ＬＣはヒドロキシメチルアミノメタン、ジヒドロキシメチルアミノメタン又はトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく２〜４価の結合基であり、ＬＣの一端は酸素原子を介して１〜３個のＬＡ部分とエーテル結合により結合して、ＬＡ部分を介して１〜３個のＮ−アセチルガラクトサミン分子と結合することができる。ＬＣの他端は窒素原子を介してＬＢ部分とアミド結合により結合する。
【００５３】
好ましい実施形態において、ｎ＝３、ＬＣがトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく４価の結合基である場合、リンカーである−（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン−ＬＢ−によりＮ−アセチルガラクトサミン分子とｓｉＲＮＡ分子とを結合して形成されるｓｉＲＮＡ結合体の構造は、以下で示される。
【化９】
0006715325.tif 000010
【００５４】
同様に、ｓｉＲＮＡと結合分子との結合部位は、ｓｉＲＮＡセンス鎖の３’末端又は５’末端であってもよく、アンチセンス鎖の５’末端であってもよく、さらにはｓｉＲＮＡの内部配列にあってもよい。
【００５５】
したがって、最も好ましくは、本発明におけるｓｉＲＮＡのセンス鎖３’末端は、リンカーである−（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン−ＬＢ−を介して三つのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）分子に共有結合し、ｓｉＲＮＡ分子とＧａｌＮＡｃ分子とのモル比が１：３であるｓｉＲＮＡ結合体が得られ、以下に、それを（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２と呼んでもよく、その構造は以下で示される。
【化１０】
0006715325.tif 000011
【００５６】
本発明のｓｉＲＮＡ結合体は、薬学的に許容される他の添加剤と併用してもよく、この添加剤は、本分野で常用される各種の製剤又は化合物の一種又は複数種であってもよく、詳しくは前述した本発明に係る医薬組成物に関する説明を参照することができる。
【００５７】
四、本発明に係るキット
本発明に係るキットのいくつかの実施形態において、一つの容器をｓｉＲＮＡの提供のために用い、少なくとももう一つの容器を薬学的に許容される担体及び／又は添加剤の提供のために用いることができる。ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容される担体及び／又は添加剤のほか、前記キットには他の成分、例えば安定剤又は防腐剤などをさらに含んでもよい。上述した他の成分は前記キットに含まれてもよいが、ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容される担体及び／又は添加剤の提供のための容器とは別の容器に存在する。これらの実施形態において、前記キットは、ｓｉＲＮＡと薬学的に許容される担体及び／又は添加剤、或いは他の成分とを混合するための説明書を含んでもよい。
【００５８】
本発明に係るキットの別のいくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ結合体を一つの容器に保存することができ、薬学的に許容される添加剤を提供するための少なくとももう一つの容器を選択的に含んでもよい。ｓｉＲＮＡ結合体及び任意の薬学的に許容される添加剤のほか、前記キットは他の成分、例えば安定剤又は防腐剤などをさらに含んでもよい。上述した他の成分は前記キットに含まれてもよいが、ｓｉＲＮＡ結合体及び任意の薬学的に許容される添加剤の提供のための容器とは別の容器に存在する。これらの実施形態において、前記キットは、ｓｉＲＮＡ結合体と薬学的に許容される添加剤（添加剤があれば）、又は他の成分とを混合するための説明書を含んでもよい。
【００５９】
本発明のキットにおいて、前記ｓｉＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体及び／又は添加剤、並びに前記ｓｉＲＮＡ結合体、及び任意の薬学的に許容される添加剤は、例えば液体、乾燥又は凍結乾燥のいずれの形態で提供してもよい。好ましくは、前記ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容される担体及び／又は添加剤、並びに前記ｓｉＲＮＡ結合体及び任意の薬学的に許容される添加剤は、基本的に清浄及び／又は無菌である。本発明のキットに選択的に無菌水を提供してもよい。
【００６０】
五、本発明に係るｓｉＲＮＡ、医薬組成物及びｓｉＲＮＡ結合体の応用
本発明のｓｉＲＮＡ、及び／又は医薬組成物、及び／又はｓｉＲＮＡ結合体を必要な患者に投与することにより、ＲＮＡ干渉のメカニズムによりＢ型肝炎を治療する目的を達成できる。したがって、本発明のｓｉＲＮＡ、及び／又は医薬組成物、及び／又はｓｉＲＮＡ結合体は、Ｂ型肝炎の予防及び／又は治療、或いはＢ型肝炎の予防及び／又は治療のための薬物の製造に用いられることができる。
【００６１】
本文で使用される「投与／付与」という用語は、少なくとも一部のｓｉＲＮＡ又は医薬組成物又はｓｉＲＮＡ結合体を所望の部位に位置させることで予期の効果を発生させる方法又は経路により、ｓｉＲＮＡ又は医薬組成物又はｓｉＲＮＡ結合体を被験者体内に置くことを指す。本発明の方法に適する投与経路は、局所投与と全身投与を含む。一般的には、局所投与は、被験者の全身よりも、ｓｉＲＮＡ又は医薬組成物又はｓｉＲＮＡ結合体を所定の部位に相対的に多く送達することに対して、全身投与は、前記ｓｉＲＮＡ又は医薬組成物又はｓｉＲＮＡ結合体を被験者のほぼ全身に送達する。本発明の目的はＢ型肝炎の予防及び／又は治療手段を提供することであることを考えると、薬物を肝臓に送達できる投与方式が好ましい。
【００６２】
本分野で既知の適切のいずれの方法により被験者に投与することもでき、前記経路は、経口又は胃腸以外の経路、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経気道投与（エアロゾル）、経肺投与、経鼻投与、直腸投与及び局所投与（口腔粘膜投与と舌下投与を含む）を含むが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明におけるｓｉＲＮＡ又は医薬組成物又はｓｉＲＮＡ結合体の用量は、本分野で常用される用量であってもよく、前記用量は各種のパラメーター、特に被験者の年齢、体重及び性別に応じて決定することができる。細胞培養又は実験動物に対して標準的な薬学的手順により毒性及び治療効果を測定することができ、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的である用量）及びＥＤ５０（量的反応では、５０％の最大反応強度を引き起こす用量を指し、質的反応では、５０％の実験対象が陽性反応を示す用量を指す）を測定する。毒性と治療効果との間の用量比は治療係数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０で示すことができる。高い治療係数を示すｓｉＲＮＡ又は医薬組成物又はｓｉＲＮＡ結合体が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータに基づいてヒト用の用量の範囲を得ることができる。
【００６４】
本発明に係る医薬組成物又はｓｉＲＮＡ結合体を投与する場合、例えば、雄又は雌の、６〜１２週齢、体重１８〜２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊ又はＣ３Ｈ／ＨｅＮＣｒｌＶｒマウスに対して、前記医薬組成物又はｓｉＲＮＡ結合体中のｓｉＲＮＡの量で、（ｉ）ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容される担体から形成される医薬組成物の場合、そのｓｉＲＮＡの用量は０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは０．０５〜５ｍｇ／ｋｇ体重であり、最も好ましくは０．１〜３ｍｇ／ｋｇ体重であり、（ｉｉ）ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容される結合分子から形成されるｓｉＲＮＡ結合体の場合、そのｓｉＲＮＡの用量は０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、好ましくは０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、最も好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。本発明に係るｓｉＲＮＡを投与する場合は、前記用量を参照することができる。
【００６５】
本発明のｓｉＲＮＡ、及び／又は医薬組成物、及び／又はｓｉＲＮＡ結合体を慢性ＨＢＶ感染の肝炎細胞に導入することにより、ＲＮＡ干渉のメカニズムにより慢性ＨＢＶ感染の肝炎細胞におけるＨＢＶ遺伝子の発現を抑制する目的を達成できる。好ましい実施形態において、前記細胞はＨｅｐＧ２．２．１５細胞である。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例により本発明を詳しく説明する。特に断りのない限り、以下の実施例で使用される試薬、培地はいずれも市販品であり、使用される核酸電気泳動、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲなどの操作はいずれも通常の方案に従って行われる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９））に記載されたとおりに行うことができる。
【００６７】
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞はＡＴＣＣから購入され、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及び３８０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｇｉｂｃｏ）にて、３７℃でＣＯ２を５％、空気を９５％含むインキュベーター中でインキュベートした。
【００６８】
調製実施例１で合成されたＨＢＶのＸ遺伝子領域に特異化するｓｉＲＮＡ又は陰性対照である非特異的ｓｉＲＮＡ（いずれも蘇州瑞博生物技術有限会社により合成されたものである）により細胞をトランスフェクションする場合、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をトランスフェクション試薬として用い、具体的な操作はメーカーにより提供された説明書を参照する。
【００６９】
全てのデータは「平均値±標準偏差」により示した。まず、Ｌｅｖｅｎｅ’ｓ検定により等分散性の検定を行った。分散が等しいデータについて一元配置分散分析を行い、有意差があれば、さらにＤｕｎｎｅｔｔ検定を行う。また、分散が等しくないデータについてはランク変換を行ってからＤｕｎｎｅｔｔ検定を行う。統計ソフトウェアはＳＰＳＳ  １３．０版である。Ｐ＜０．０５とはグループの間で有意差があることを意味する。
【００７０】
調製実施例１  ｓｉＲＮＡの選別及び合成
複数の修飾方式及び修飾部位を組み合わせて評価及び分析を行うことにより、以下の表１におけるｓｉＲＮＡ配列を選出した。そのうち、ＮＣ−ｐｏｓ、ＮＣ−ｂａｓ及びＮＣは、ＨＢＶ遺伝子に対する抑制作用のない陰性対照であり、以下にそれらをコントロールｓｉＲＮＡと呼ぶこともある。残りのｓｉＲＮＡはＨＢＶのＸ遺伝子領域に特異的に指向するｓｉＲＮＡであり、以下にそれらをテストｓｉＲＮＡと呼ぶこともある。
【００７１】
蘇州瑞博生物技術有限会社は通常の固相合成方法により表１に記載されているｓｉＲＮＡを得た。アニーリング塩溶液を用いて等モルのセンス鎖とアンチセンス鎖との混合物を溶解し、その後、通常のアニーリングによりｓｉＲＮＡ二本鎖を形成した。
【００７２】
【表１】
0006715325.tif 000012
【００７３】
注：大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａ及びＴはヌクレオチドの塩基組成を示し、小文字ｄは該文字ｄの右側にある１つのヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドであることを示し、小文字ｍは該文字ｍの左側にある１つのヌクレオチドのリボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシ基で置換されたことを示し、小文字ｆは該文字ｆの左側にある１つのヌクレオチドのリボース基の２’−ヒドロキシ基がフッ素で置換されたことを示す。小文字ｓは３’末端におけるオーバーハングｄＴｄＴの間のリン酸ジエステル結合がチオリン酸ジエステル結合で置換されたことを示す。
【００７４】
調製実施例２  ＲＢＰ１３１／ｓｉＲＮＡリポソーム製剤の合成
三つの乾燥粉末脂質化合物（すなわち、アミン含有化合物、補脂質、ポリエチレングリコール化脂質）をモル比５９：２９：１２でエタノールに懸濁させて混合し、三つの脂質化合物の総質量濃度は約８．８５ｍｇ／ｍｌであった。表１に記載されている合成されたｓｉＲＮＡを２００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）溶液に溶解させ、ｓｉＲＮＡの濃度を０．２ｍｇ／ｍｌとした。体積比１：３で、得られた脂質のエタノール溶液とｓｉＲＮＡの酢酸ナトリウム水溶液を迅速に混合した。表２に混合されたリポソーム製剤の具体的な組成を示した。
【００７５】
【表２】
0006715325.tif 000013
【００７６】
混合されたリポソーム製剤（すなわち、アミン含有化合物、コレステロール、ポリエチレングリコール化脂質とｓｉＲＮＡとの組成物）を約５０℃で１０分間インキュベートした。インキュベートの後、ＫｒｏｓＦｌｏ(R)タンジェンシャルフローシステムを使用し、中空糸カラム１００ＫＤａにより限外ろ過を行い、限外ろ過の交換溶液はｐＨ  ７．４のＰＢＳであった。限外ろ過と同時に、製剤を所望のｓｉＲＮＡ濃度まで濃縮又は希釈してもよい。限外ろ過後の製剤を０．２２μｍフィルターでろ過して除菌した。アミン含有化合物８７、コレステロール、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］からなる脂質混合物をＲＢＰ１３１と称した。得られたＲＢＰ１３１／ｓｉＲＮＡリポソーム製剤は使用前まで４℃で保存し、関連する物理・化学的性質を測定し、測定結果を表３に示した。
【００７７】
【表３】
0006715325.tif 000014
【００７８】
また、アミン含有化合物をＣＮ２０１１８００６０６６４．１における化合物７２に変更した以外、上述と同様の方法でリポソーム製剤ＲＢＰ１３０／ｓｉＲＮＡを製造した。このリポソーム製剤ＲＢＰ１３０／ｓｉＲＮＡの物理・化学パラメーターは表３に示すパラメーターと類似している。
【００７９】
調製実施例３  （ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２結合体の合成
（１）（ＧａｌＮＡｃ）３結合分子の合成
ＷＯ２０１４０２５８０５Ａ１に開示された調製方法により化合物３０、すなわち、上述したリンカー−（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン−ＬＢ−及び標的分子であるＮ−アセチルガラクトサミン分子（そのうち、ＬＡごとに一つのＮ−アセチルガラクトサミン分子が結合することができるため、一つのリンカーに三つのＮ−アセチルガラクトサミン分子が結合することができる）を含む結合分子を合成し、本文中ではそれを（ＧａｌＮＡｃ）３結合分子と呼んでもよく、前記化合物３０の構造は、以下で示される。
【化１１】
0006715325.tif 000015
【００８０】
（２）（ＧａｌＮＡｃ）３結合分子を固相担体に結合する
（ＧａｌＮＡｃ）３結合分子（５０ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（９．１ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）を秤量して反応フラスコに入れてから、ＤＭＦ  ２ｍｌ、ＤＩＥＡ（１０．８μｌ、０．０６ｍｍｏｌ）を加え、室温で２〜３ｍｉｎ軽く揺らして全て溶解させ、マクロ多孔質アミノメチル樹脂（５０ｍｇ、南開合成会社、商品番号ＨＣ４０２５−１／ＨＣ４０２５−２）を加えた。反応フラスコを振動台に置き、３０℃で２５０ｒｐｍ／ｍｉｎの速度で一晩振動した。反応が完了した後、ろ過し、得られた固体を２ｍｌのメタノール／ジクロロメタン（体積比＝１：９）で一回、さらに２ｍｌのエチルエーテルで一回洗浄してから、抽出して乾燥させた。固体粗生成物を約６６ｍｇ得た。
【００８１】
得られた固体粗生成物を１．５ｍｌ酢酸無水物／ピリジン（体積比＝１：３）に加え、振動台に置いて室温で３０ｍｉｎ振動した。ろ過し、得られた固体を２ｍｌのメタノール／ジクロロメタン（体積比＝１：９）で一回、さらに２ｍｌのエチルエーテルで一回洗浄してから、抽出して乾燥させた。固体最終生成物、すなわち（ＧａｌＮＡｃ）３結合分子に結合する固相担体を約５６ｍｇ得た。
【００８２】
（３）（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２結合体の合成
ホスホロアミダイトによる核酸の固相合成法により、上記工程で調製された（ＧａｌＮＡｃ）３結合分子に結合する固相担体を用いて、（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２のセンス鎖Ｓを合成した。また、ｄＴ固相担体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、商品番号：１７−５２５３−８３）を用いて、（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２のアンチセンス鎖ＡＳを合成した。
【００８３】
配列を以下の表４に示した。
【００８４】
【表４】
0006715325.tif 000016
【００８５】
（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２の合成スケールは１μｍｏｌであり、具体的な合成工程は以下のとおりである。
【００８６】
合成：核酸固相合成機（米国ＡＢＩ社、型番：ＡＢＩ３９４合成機）を使用し、核酸の３’から５’までの配列の延伸を自動的に循環して完成し、各循環には脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の四つの反応が含まれる。（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２の合成に使用される全ての通常のヌクレオシドモノマー、メトキシモノマー、フッ素化モノマーは濃度０．１Ｍのアセトニトリル溶液として調製され、且つ固相合成中の標準的な脱保護、カップリング、キャッピング、酸化試薬を使用した。モノマーのカップリング時間は１２ｍｉｎであった。（ＧａｌＮＡｃ）３結合分子とｓｉＲＮＡはリン酸ジエステル結合により結合し、最終的に得られた（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２結合体におけるｓｉＲＮＡ分子とＮ−アセチルガラクトサミン分子とのモル比は１：３であった。（ＧａｌＮＡｃ）３結合分子に結合する固相担体から循環を開始し、（ＧａｌＮａｃ）３結合分子を共有結合によりｓｉＲＮＡセンス鎖の３’末端に結合することができる。
【００８７】
ダイシング及び脱保護：（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２のセンス鎖Ｓ、アンチセンス鎖ＡＳをそれぞれ濃アンモニア水に加え、５５℃で１６ｈ反応させることにより、核酸鎖を固相担体からダイシングし、塩基上の保護基とリン酸上の保護基を除去した。アンモニア水の上澄みを抽出した後、乾燥するまで真空濃縮し、ＤＭＳＯで溶解させた後、リボース上の２’ＴＢＤＭＳ保護を除去するためにトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加えた。
【００８８】
精製及び脱塩：分取用イオンクロマトグラフ用精製カラム（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ）を利用し、ＮａＢｒの勾配溶離により、核酸の精製を完成した。純粋度が合格した製品を収集して合わせて、逆相クロマトグラフ精製カラムを用いて脱塩を行った。
【００８９】
測定：純粋度はイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）により測定した。分子量は液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により解析した。
【００９０】
アニーリング：Ｓ鎖とＡＳ鎖とを等モル比で混合し、９５℃まで加熱し、室温で冷却させた後、それらに水素結合を介して二本鎖構造を形成させた。
【００９１】
同定：液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量測定を行い、結果を図１ａ〜図１ｃに示し、実測値と理論値が一致していることを見出し、合成された（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２は設計目的である（ＧａｌＮＡｃ）３結合分子が結合した二本鎖核酸配列であることを確認した。
【００９２】
テスト実施例１  本テスト実施例は、本発明のｓｉＲＮＡ  Ｘ２Ｍ２の細胞レベル毒性及び動物レベル毒性を測定するためのものである。
【００９３】
本分野で常用される方法を利用し、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞及びラット初代肝細胞に対してＭＴＴ方法により本発明のｓｉＲＮＡ  Ｘ２Ｍ２の細胞毒性を測定したところ、５００ｎＭ濃度（薬効濃度の１００倍）でいかなる細胞毒性反応も認められなかった。また、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでは、ＲＢ１３１／Ｘ２Ｍ２を１０ｍｇ／ｋｇ（有効用量の３３倍）一回静脈投与し、１４日間連続して観察したところ、動物死亡が認められず、薬物不良反応に関する臨床病状も観察されなかった。また、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでは、（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２結合体を１０ｍｇ／ｋｇ一回皮下投与し、１４日間連続して観察したところ、動物死亡が認められず、薬物不良反応に関する臨床病状も観察されなかったことから、本発明のｓｉＲＮＡ  Ｘ２Ｍ２及びその医薬組成物又は結合体は低い細胞毒性と高い安全性を有し、臨床応用の可能性があることを示した。
【００９４】
実験実施例１  本実験実施例は、調製実施例１で得られたｓｉＲＮＡのＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対するインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）抑制効率を測定するためのものである。
【００９５】
調製実施例１で得られたｓｉＲＮＡを用いてインビトロでＨｅｐＧ２．２．１５細胞をトランスフェクションし、群ごとに３つ並行して、実験を少なくとも３回繰り返した。ｓｉＲＮＡ最終濃度はそれぞれ５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭであった。トランスフェクションから４８時間後、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｑＰＣＲ）により、以上で得られた細胞中のＨＢＶ  ｍＲＮＡの発現レベルを測定し、具体的には、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、商品番号Ｃａｔ．７４１０６）キットを使用し、その説明書に従って全ＲＮＡの抽出を行い、抽出された全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次に、蛍光定量ＰＣＲ法によりｓｉＲＮＡのＨｅｐＧ２．２．１５細胞のＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を測定した。
【００９６】
この蛍光定量ＰＣＲ法において、ＧＡＰＤＨ遺伝子を参照遺伝子とし、ＨＢＶに特異化するプライマーとＧＡＰＤＨに特異化するプライマーを用いてＨＢＶとＧＡＰＤＨについてそれそれ測定し、プライマー配列を以下の表５に示す。
【００９７】
【表５】
0006715325.tif 000017
【００９８】
該蛍光定量ＰＣＲ法において、ｓｉＲＮＡ抑制活性はＨＢＶ遺伝子発現残留量で表し、以下の式により計算した。
【００９９】
ＨＢＶ遺伝子発現残留量＝（テスト群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／テスト群ＧＡＰＤＨのコピー数）／（ｍｏｃｋ群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／ｍｏｃｋ群ＧＡＰＤＨのコピー数）×１００％。
【０１００】
そのうち、各テスト群はそれぞれ表１に記載されているｓｉＲＮＡで処理されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞であり、前記ｓｉＲＮＡはＨＢＶのＸ遺伝子領域に特異的に指向するｓｉＲＮＡ及び三つの対照ＮＣ  ｓｉＲＮＡを含む。また、ｍｏｃｋ群はいかなるｓｉＲＮＡ処理も行われていないＨｅｐＧ２．２．１５細胞である。
【０１０１】
図２には、表１に記載されているテストｓｉＲＮＡとコントロールｓｉＲＮＡのＨｅｐＧ２．２．１５細胞中におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現抑制活性の測定結果を示した。図２の結果から、ｓｉＲＮＡ  ３ｄとｓｉＲＮＡ  ＣＡ２以外、各テストｓｉＲＮＡのＨＢＶ  ｍＲＮＡ抑制活性が裸配列ｓｉＲＮＡ  ＣＡ１と類似していることが分かった。そのうち、表１から、ｓｉＲＮＡ  ３ｄがｓｉＲＮＡ  Ａ４アンチセンス鎖５’末端の第３位のヌクレオチド修飾を減少するｓｉＲＮＡであり、またｓｉＲＮＡ  ＣＡ２が裸配列ｓｉＲＮＡ  ＣＡ１をヌクレオチド間隔修飾するｓｉＲＮＡであることが分かった。
【０１０２】
この結果から、ｓｉＲＮＡに対して行う異なる化学的修飾は、確実にｓｉＲＮＡの活性に影響し、かつ、本発明のｓｉＲＮＡ  Ｘ２Ｍ２は細胞レベルで優れた活性を示したことが分かった。
【０１０３】
実験実施例２  本実験実施例は、調製実施例１で得られたｓｉＲＮＡのインビトロヒト血漿中の安定性を測定するためのものである。
【０１０４】
調製実施例１で得られたｓｉＲＮＡ（２０μＭ、１０μｌ）と５０％ヒト血漿（Ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ、ＨＰ）を３７℃でインビトロで一定期間インキュベートした後にサンプリングし、具体的には、０、２、４、６、８、２４、４８時間でサンプルを１０μｌ抽出し、直ちに液体窒素で急速冷凍し、その後−８０℃で冷凍保存した。２０重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを調製し、５倍希釈した上記サンプル（希釈液１×ＰＢＳ、ｐＨ  ７．４）１０μｌとローディングバッファー（２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、３６重量％グリセロール、０．０６重量％プロムフェノールブルー）４μｌを混合してからローディングし、定電流８０ｍＡの条件で６０分間程度電気泳動した。電気泳動が終了した後、１×Ｓｙｂｒ  Ｇｏｌｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１４９４）で１５分間染色してから相形成し、結果を図３に示した。
【０１０５】
図３は、表１に記載されているテストｓｉＲＮＡとコントロールｓｉＲＮＡのインビトロヒト血漿における安定性の測定結果を示し、そのうち、両端のＭａｒｋｅｒはヒト血漿処理が行われていない等量のｓｉＲＮＡを示し、処理されたｓｉＲＮＡのサイズの変化を表した。グレー値を定量的に読み取ることにより、これらのテストｓｉＲＮＡ及びコントロールｓｉＲＮＡのヒト血漿インキュベート後に残存した最長フラグメントとヒト血漿処理されていないｓｉＲＮＡ（すなわち図３に示すＭａｒｋｅｒ）の最長フラグメントとの比率（ｒａｔｉｏ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｏｎｇｅｓｔ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、ＲＬ）を算出し、結果を表６に示した。
【０１０６】
【表６】
0006715325.tif 000018
【０１０７】
結果から明らかになったように、未修飾の裸ｓｉＲＮＡ  ＣＡ１はヒト血漿に加えると迅速に分解し、血漿安定性が極めて低く、また、修飾されたｓｉＲＮＡはいずれもある程度血漿安定性を改善でき、そのうち、２０箇所の化学的修飾を施したｓｉＲＮＡ  ＣＡ２は血漿安定性が向上したが、満足できるものでもない。一方、３’末端におけるオーバーハングｄＴｄＴの間のリン酸ジエステル結合がチオリン酸ジエステル結合で置換されたか否かにかかわらず、本発明のｓｉＲＮＡ  Ｘ２Ｍ２はｓｉＲＮＡ  Ａ４よりも優れた血漿安定性を示し、ヒト血漿と４８ｈインキュベートした後でもＲＬを９０％以上に維持できた。本発明のｓｉＲＮＡ  Ｘ２Ｍ２はｓｉＲＮＡ  Ａ４を基礎としてさらに一つのヌクレオチドの修飾が減少されたものであることを考えると、この結果は期待を遥かに超えている。さらに驚いたことに、図３から、ｓｉＲＮＡ  Ａ４はヒト血漿と４８ｈインキュベートした後でも８１．２％のＲＬを維持しているが、そのバンドが明らかに次第に下方に移行し（他のＨＢＶのＸ遺伝子領域に特異的に指向するテストｓｉＲＮＡにも類似の状況が存在する）、すなわち、やはりある程度の分解が発生したが（その理由はその末端の塩基がＲＮａｓｅでダイシングされたことである可能性がある）、本発明のｓｉＲＮＡ  Ｘ２Ｍ２は終始全長状態を維持できたことが分かった。
【０１０８】
実験実施例３  本実験実施例は、調製実施例２で得られたＲＢＰ１３１／ｓｉＲＮＡリポソーム製剤のＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊ（北京維通利華実験動物技術有限会社から購入）におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を測定するためのものである。
【０１０９】
そのうち、使用されるテストｓｉＲＮＡは表１に記載されているｓｉＲＮＡ  Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋＋）、Ａ４、３ｄ、Ｘ２Ｍ２（Ｓ−−）を含み、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｉｒｅｆｌｙ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）に特異的に指向する無関連ｓｉＲＮＡであるｓｉＦＬ８６７を陰性対照として使用し、その配列は以下のとおりである。
【０１１０】
センス鎖：５’−ＣＣＣＵＡＵＵＣＵＣＣＵＵＣＵＵＣＧＣｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；
アンチセンス鎖：５’−ＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＵＡＧＧＧｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）。
【０１１１】
２４匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊマウスを血清ＨＢｓＡｇ含有量に応じてランダムに６群（各群４匹、いずれも雌）に分け、それぞれＰＢＳ対照群、ＲＢＰ１３１／ｓｉＦＬ８６７群、ＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋＋）群、ＲＢＰ１３１／Ａ４群、ＲＢＰ１３１／３ｄ群及びＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ−−）群とした。全ての動物に対してその体重に応じて投与量を算出し、一回尾静脈投与し、投与用量が１ｍｇ／ｋｇであり、体積が１０ｍｌ／ｋｇであった。投与後３日目に動物を殺し、動物の肉眼解剖を行い、体内臓器に病変があるか否かを観察し、目視で病変が認められた組織を１０％ホルマリンで保存し、さらに病理的に観察し、肝臓を収集し、ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存した。組織破砕用ホモジナイザーを用いて肝組織をホモジネートし、さらにＴｒｉｚｏｌを利用して全ＲＮＡ抽出の標準的な操作工程に従って全ＲＮＡを抽出して得た。
【０１１２】
リアルタイム蛍光定量ＰＣＲにより肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡの発現レベルを測定し、具体的には、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてその説明書に従って抽出された全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、そして蛍光定量ＰＣＲキット（北京康為世紀生物科技有限会社）を用いてｓｉＲＮＡの肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を測定した。この蛍光定量ＰＣＲ法において、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子を参照遺伝子とし、ＨＢＶに特異化するプライマー及びβ−アクチンに特異化するプライマーを用いてＨＢＶ及びβ−アクチンをそれぞれ測定した。
【０１１３】
測定プライマーの配列を表７に示す。
【０１１４】
【表７】
0006715325.tif 000019
【０１１５】
この蛍光定量ＰＣＲ法において、ｓｉＲＮＡ抑制活性をＨＢＶ遺伝子発現残留量で表し、以下の式により計算した。
【０１１６】
ＨＢＶ遺伝子発現残留量＝（テスト群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／テスト群β−ａｃｔｉｎのコピー数）／（対照群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／対照群β−ａｃｔｉｎのコピー数）×１００％。
【０１１７】
そのうち、対照群は本実験でＰＢＳを投与した対照群マウスであり、各テスト群はそれぞれ異なる医薬組成物を投与した投与群マウスであった。結果を図４に示した。
【０１１８】
結果から分かるように、ＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋＋）とＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ−−）のＢ型肝炎マウスの肝組織ＨＢＶ遺伝子のＸ遺伝子領域のｍＲＮＡに対する抑制活性が相当し、且つ十分に満足できるものであり、抑制率が９０％程度であったことに対して、陰性対照であるＲＢＰ１３１／ｓｉＦＬ８６７とテスト群におけるＲＢＰ１３１／３ｄはＢ型肝炎マウスの肝組織ＨＢＶのＸ遺伝子領域のｍＲＮＡに対して抑制作用を示さず、ＲＢＰ１３１／Ａ４のＢ型肝炎マウスの肝組織ＨＢＶのＸ遺伝子領域のｍＲＮＡに対する抑制率が約７０％であった。この結果から、動物レベルでは、ｓｉＲＮＡ自体の配列が同じである場合、非合理的な修飾策によりｓｉＲＮＡの活性が完全に失われることもあり（例えばＲＢＰ１３１／３ｄが示した活性）、それに対して、本発明におけるｓｉＲＮＡ  Ｘ２Ｍ２は疾患モデルマウス体内において生物活性が十分に優れており、かつすでに特許権が付与された出願人による先行出願ＣＮ１０２１４０４６１ＢにおけるｓｉＲＮＡ  Ａ４よりも高いことが証明された。
【０１１９】
また、同様の方法で、調製実施例２で得られたＲＢＰ１３０／Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋＋）及びＲＢＰ１３０／Ｘ２Ｍ２（Ｓ−−）リポソーム製剤を測定したところ、これらのリポソーム製剤はＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋＋）及びＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ−−）と類似した効果を示した。
【０１２０】
実験実施例４  本実験実施例は用量の異なるＸ２Ｍ２を内包したＲＢＰ１３１の異なる時点でのＨＢＶトランスジェニックマウスにおける血清ＨＢｓＡｇ発現量に対する抑制効率を測定するためのものである。
【０１２１】
調製実施例２の方法に従い、ＲＢＰ１３１／ｓｉＲＮＡリポソーム製剤を調製した。８０匹のＨＢＶトランスジェニックマウス（Ｍ−ＴｇＨＢＶと名付け、上海市公共衛生中心動物部から購入、トランスジェニックマウスの調製方法はＲｅｎ  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  ２００６，  ７８：  ５５１−５６０に記載されている）を血清ＨＢｓＡｇ含有量に応じてランダムに８群（各群１０匹、そのうち雄４匹、雌６匹）に分け、それぞれ１×ＰＢＳ対照群、ＲＢＰ１３１／ＮＣ対照群（１ｍｇ／ｋｇ）、ＩＦＮインターフェロン対照群（２５ｎｇ／ｇ）、用量の異なる三つのＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋＋）サンプル群（用量はそれぞれ０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇである）、用量が同一のＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ−−）サンプル群（１ｍｇ／ｋｇ）及びＲＢＰ１３１／Ａ４サンプル群（１ｍｇ／ｋｇ）とした。全ての動物に対してその体重に応じて投与量を算出し、投与体積は１０ｍｌ／ｋｇとした。ＰＢＳ群と各ＲＢＰ１３１／ｓｉＲＮＡ群に一回尾静脈投与し、インターフェロン群に週２回皮下投与し、つまり０、４、７、１１、１４日目に投与し、計５回投与した。投与前及び投与後の７、１４、２１、２８日目にマウス眼窩静脈叢から採血し、各時点で血清ＨＢｓＡｇレベルを測定した。
【０１２２】
眼窩採血は毎回約０．５ｍｌとし、遠心後の血清は２００μｌ以上とした。ＨＢｓＡｇ  ＣＬＩＡキット（安図生物製、ＣＬ０３１０）を利用して血清中のＨＢｓＡｇの発現レベルを測定した。ＨＢｓＡｇ発現残留量を以下の式により算出した。
【０１２３】
ＨＢｓＡｇ発現残留量＝（テスト群ＨＢｓＡｇ含有量／ＰＢＳ対照群ＨＢｓＡｇ含有量）×１００％。
【０１２４】
そのうち、ＨＢｓＡｇ含有量は１グラムあたりの肝組織タンパク質に含まれるＨＢｓＡｇ（ナノグラム）で表した。
【０１２５】
結果を図５に示した。その結果から分かるように、投与後の異なる時点で、ＩＦＮインターフェロン対照群及びＲＢＰ１３１／ＮＣ対照群ではマウス血清のＨＢｓＡｇ発現に対して抑制作用を示さなかった。ＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２及びＲＢＰ１３１／Ａ４では血清中のＨＢｓＡｇの発現を用量依存的に抑制した。そのうち、ＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋＋）の場合、低用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）で７日目の抑制率が６８％となり、中用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）の抑制効果は１４日間以上維持でき、高用量（１ｍｇ／ｋｇ）の抑制効果は２８日間以上維持できた。同じ用量（１ｍｇ／ｋｇ）では、ＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋＋）及びＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ−−）の血清中のＨＢｓＡｇの発現抑制効果は終始ＲＢＰ１３１／Ａ４より高かった。このことから、動物体内では、本発明のｓｉＲＮＡ  Ｘ２Ｍ２の生物活性はｓｉＲＮＡ  Ａ４より優れており、その臨床応用将来性がさらに向上したことが分かった。
【０１２６】
一方、この実験から、本発明のＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２は従来の抗Ｂ型肝炎薬物インターフェロンと比べて、ＨＢｓＡｇに対して明らかな抑制作用を有することが明らかになり、ｓｉＲＮＡのウィルス性Ｂ型肝炎に対する機能的治癒の可能性が証明された。
【０１２７】
また、同様の方法で、調製実施例２で得られたＲＢＰ１３０／Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋＋）及びＲＢＰ１３０／Ｘ２Ｍ２（Ｓ−−）リポソーム製剤を測定したところ、これらのリポソーム製剤はＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋＋）及びＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ−−）と類似した効果を示した。
【０１２８】
実験実施例５  本実験実施例は用量の異なるＸ２Ｍ２を内包したＲＢＰ１３１の異なる時点での高圧注射に基づくＨＢＶトランスフェクションマウスにおける肝臓ＨＢｓＡｇ発現量に対する抑制効率を測定するためのものである。
【０１２９】
調製実施例２の方法に従い、ＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２複合体を調製した。７２匹のＨＢＶプラスミドを高圧注射したＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス（ｐＨＢＶと名付け、上海市公共衛生中心動物部から購入、高圧注射マウスの調製方法はＰｅｎｇ  ＸＨ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  ２０１５，  ２１（１２）：  ３５２７−３５３６に記載されている）を血清ＨＢｓＡｇ含有量に応じてランダムに６群（各群１２匹、雌雄はそれぞれ半分ずつ）に分け、それぞれ１×ＰＢＳ対照群、ＥＴＶエンテカビル対照群（０．１ｍｇ／ｋｇ）、用量の異なる三つのＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋＋）サンプル群（用量はそれぞれ０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ）及び用量が同一のＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ−−）サンプル群（１ｍｇ／ｋｇ）とした。全ての動物に対してその体重に応じて投与量を算出し、投与体積は１０ｍｌ／ｋｇとした。ＰＢＳ群と各ＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２群に一回尾静脈投与し、エンテカビル群に対して毎日胃内投与し、７日間連続して、つまり０日目から６日目まで、毎日一回投与した。７、２８日目にそれぞれ半分の動物を殺し、肝組織ＨＢｓＡｇ発現レベルを測定し、ＨＢｓＡｇ測定方法は前記と同様とした。
【０１３０】
結果を図６に示した。その結果から分かるように、０．３ｍｇ／ｋｇ用量のＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋＋）は肝臓におけるＨＢｓＡｇ発現レベルを抑制することを示し、１ｍｇ／ｋｇと３ｍｇ／ｋｇ用量のＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋＋）は肝臓におけるＨＢｓＡｇ発現レベルを著しく抑制でき、投与後の７日目にはＰＢＳ群と比べ、肝臓におけるＨＢｓＡｇの抑制率が９０％以上と高くなり、一方、現在主流のヌクレオシド類の抗Ｂ型肝炎薬物であるエンテカビルは肝臓におけるＨＢｓＡｇの発現抑制に対して治療効果はなかった。また、ＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ−−）は異なる時点での高圧注射Ｂ型肝炎マウスｐＨＢＶにおける肝臓ＨＢｓＡｇ発現量に対する抑制効率がＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋＋）と類似しており、ＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２のウィルス性Ｂ型肝炎に対する機能的治癒上の潜在的な利点が示唆された。
【０１３１】
また、同様の方法で、調製実施例２で得られたＲＢＰ１３０／Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋＋）及びＲＢＰ１３０／Ｘ２Ｍ２（Ｓ−−）リポソーム製剤を測定したところ、これらのリポソーム製剤はＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋＋）及びＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２（Ｓ−−）と類似した効果を示した。
【０１３２】
実験実施例６  本実験実施例は、Ｉｎｖｉｖｏ  ｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２．０（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入）、ｉｎｖｉｖｏ  ｊｅｔＰＥＩ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（ＰＴ）から購入）、Ｅｎｔｒａｎｓｔｅｒ（Ｅｎｇｒｅｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから購入）及び本発明におけるＲＢＰ１３１を含め、ｓｉＲＮＡ  Ｘ２Ｍ２を内包した、異なるメーカーによる商品化されたｓｉＲＮＡ体内投与担体の、ＨＢＶトランスジェニックモデルマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊ（北京維通利華実験動物技術有限会社から購入）におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を測定するためのものである。
【０１３３】
メーカーが提供する標準的な操作フローに従い、本発明のｓｉＲＮＡ  Ｘ２Ｍ２（Ｓ＋＋）を前記商品化された担体に内包させ、対応する担体／ｓｉＲＮＡ組成物を調製し、それぞれＩＶＦ２．０／Ｘ２Ｍ２、ｉｎｖｉｖｏ  ｊｅｔＰＥＩ／Ｘ２Ｍ２、Ｅｎｔｒａｎｓｔｅｒ／Ｘ２Ｍ２とマークした。同時に、調製実施例２の方法に従い、ＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２組成物を調製した。
【０１３４】
３０匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊマウスを血清ＨＢｓＡｇ含有量に応じてランダムに５群（各群６匹、雌雄はそれぞれ半分ずつ）に分け、それぞれＰＢＳ対照群、ＩＶＦ２．０／Ｘ２Ｍ２、ｉｎｖｉｖｏ  ｊｅｔＰＥＩ／Ｘ２Ｍ２、Ｅｎｔｒａｎｓｔｅｒ／Ｘ２Ｍ２、ＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２サンプル群とした。全ての動物に対してその体重に応じて投与量を算出し、一回尾静脈投与し、ＩＶＦ２．０／  Ｘ２Ｍ２、ｉｎｖｉｖｏ  ｊｅｔＰＥＩ／Ｘ２Ｍ２、Ｅｎｔｒａｎｓｔｅｒ／Ｘ２Ｍ２の三つの群の投与用量は２．５ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡ）とし、ＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２群の投与用量は０．５ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡ）とし、全ての５群の投与体積は１０ｍｌ／ｋｇとした。投与後３日目に動物を殺し、動物の肉眼解剖を行い、体内臓器に病変があるか否かを観察し、目視で病変が認められた組織を１０％ホルマリンで保存し、さらに病理的に観察し、肝臓を収集し、ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存した。組織破砕用ホモジナイザーを用いて肝組織をホモジネートし、さらにＴｒｉｚｏｌを利用して全ＲＮＡ抽出の標準的な操作工程に従って全ＲＮＡを抽出して得た。
【０１３５】
リアルタイム蛍光定量ＰＣＲにより肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。測定方法は実験実施例３と同様であり、測定プライマーは表５と同様とした。
【０１３６】
この蛍光定量ＰＣＲ法において、ｓｉＲＮＡ抑制活性を以下の式により算出した。
【０１３７】
ｓｉＲＮＡ抑制活性＝［１−（テスト群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／テスト群ＧＡＰＤＨのコピー数）／（対照群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／対照群ＧＡＰＤＨのコピー数）］×１００％。
【０１３８】
そのうち、対照群は本実験におけるＰＢＳを投与した対照群マウスであり、各処理群はそれぞれ異なる医薬組成物を投与した投与群マウスであった。
【０１３９】
表８に測定された各群の供試品のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（ＡｌｂｌＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／ＪトランスジェニックマウスにおけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制活性の測定結果を示した。
【０１４０】
【表８】
0006715325.tif 000020
【０１４１】
結果から分かるように、他の商品化された担体から形成された医薬組成物のうちの効果が最も優れたＩＶＦ２．０／Ｘ２Ｍ２群と比べても、ＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２群のＢ型肝炎モデルマウスにおけるＨＢＶ  ｍＲＮＡに対する抑制率は３４％向上している。また、ＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２群の抑制活性はｉｎｖｉｖｏ  ｊｅｔＰＥＩ／Ｘ２Ｍ２群の２倍に近く、Ｅｎｔｒａｎｓｔｅｒ／Ｘ２Ｍ２群の１０倍に近かった。さらに、ＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２群の投与用量が他の三群の１／５でしかないことを考えると、他の商品化された担体から形成される医薬組成物と比較して、ＲＢＰ１３１／Ｘ２Ｍ２は極めて高い生物活性を示している。
【０１４２】
実験実施例７  本実験実施例は、異なる文献に由来するｓｉＲＮＡ体内投与担体及び本発明におけるＲＢＰ１３１によって、アポリポタンパクＢ（ＡｐｏＢ）遺伝子に特異化するｓｉＲＮＡ（ｓｉＡｐｏＢ：センス鎖（５’→３’）ＧＵＣＡＵＣＡＣＡＣＵＧＡＡＵＡＣＣＡＡＵｄＴｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）；アンチセンス鎖（５’→３’）ＡＵＵＧＧＵＡＵＵＣＡＧＵＧＵＧＡＵＧＡＣＡＣｄＴｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７））を内包して形成したリポソーム製剤の、正常Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ（又は血中脂質）発現量に対する抑制効率を測定するためのものである。ＡｐｏＢの主な機能は肝臓における脂質を血管系に運搬することであり、ＡｐｏＢの発現が抑制されると、相応的に、肝臓における脂質が蓄積していき、血液中の脂質レベルが低下する。
【０１４３】
文献（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１２  Ｊｕｎ；３３（１８）：４６５３−６４とＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１３  Ａｐｒ；３４（１２）：３１２０−３１）の記載に従って、担体とｓｉＲＮＡとを混合して対応するリポソーム製剤を調製した。具体的には、（１）二元及び三元複合体の調製：所望の複合体の電荷比（二元複合体、三元複合体の電荷比（Ｎ／Ｐ、Ｎ／Ｐ／Ｃ）では、ＮがＰＣＬ−ｇ−ＰＤＭＡＥＭＡ分子におけるアミノ基のモル量を表し、ＰがｓｉＲＮＡ分子におけるリン酸基のモル量を表し、ＣがＰＧＡ−ｇ−ＰＥＧ分子におけるカルボキシル基のモル量を表す）に応じて、ｓｉＲＮＡ（所望のｓｉＲＮＡ量を含む）とＰＣＬ−ｇ−ＰＤＭＡＥＭＡナノ粒子（所望のアミノ基量を含む）とを混合し、室温で１５分間インキュベートすることで、二元複合体を得た。二元複合体にさらに所定量のＰＧＡ−ｇ−ＰＥＧ（所望のカルボキシル基量を含む）を加え、続いて室温で１５分間インキュベートすることで、三元複合体を得た。（２）ＰＥＡ、ＰＥＡＧ複合体の調製：ポリマーＰＥＡ、ＰＥＡＧ及びｓｉＲＮＡのＮ／Ｐ比をポリマーのアミノ基／グアニジノ基（Ｎ）のモル数及びｓｉＲＮＡのリン酸基（Ｐ）のモル数から算出した。複合体を調製する時、所定量のポリマー（所望のアミノ基／グアニジノ基量を含む）と所定量のｓｉＲＮＡ溶液（所望のｓｉＲＮＡ量を含む）とをピペットで混合し、室温で２０分間インキュベートすることで、最終のＰＥＡ／ｓｉＲＮＡとＰＥＡＧ／ｓｉＲＮＡとの混合物を形成した。ＲＢＰ１３１については、調製実施例２の方法に従い、ＲＢＰ１３１／ｓｉＡｐｏＢ複合体を調製した。投与する前に、対応する実験の要求を満たすように、必要に応じて１×ＰＢＳによりこれらの複合体を体積調整してもよい。
【０１４４】
３６匹の正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをランダムに６群（各群６匹、雌雄はそれぞれ半分ずつ）に分け、それぞれＰＢＳ対照群、Ｂｉｎａｒｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ５：１（二元複合体）群、Ｔｅｒｎａｒｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ５：１：２（三元複合体）群、ＰＥＡ／ｓｉＡｐｏＢ  １０：１群、ＰＥＡＧ／ｓｉＡｐｏＢ  １０：１群、ＲＢＰ１３１／ｓｉＡｐｏＢ群とした。全ての動物に対してその体重に応じて投与量を算出し、一回尾静脈投与し、Ｂｉｎａｒｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘｃ  ５：１（二元複合体）群、Ｔｅｒｎａｒｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ５：１：２（三元複合体）群、ＰＥＡ／ｓｉＡｐｏＢ  １０：１群、ＰＥＡＧ／ｓｉＡｐｏＢ  １０：１群の投与用量は２．５ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡ）とし、ＲＢＰ１３１／ｓｉＡｐｏＢ群の用量は０．５ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡ）とし、全ての６群の投与体積は１０ｍｌ／ｋｇとした。投与後３日目に動物を殺し、マウス眼窩静脈叢から採血し、遠心して血清を得た。動物の肉眼解剖を行い、体内臓器に病変があるか否かを観察し、目視で病変が認められた組織を１０％ホルマリンで保存し、さらに病理的に観察し、肝臓を収集し、ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存した。組織破砕用ホモジナイザーを用いて肝組織をホモジネートし、さらにＴｒｉｚｏｌを利用して全ＲＮＡ抽出の標準的な操作工程に従って全ＲＮＡを抽出して得た。
【０１４５】
リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｑＰＣＲ）により肝組織におけるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡの発現レベルを測定し、具体的には、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてその説明書に従って抽出された全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次に蛍光定量ＰＣＲキット（北京康為世紀生物科技有限会社）によりｓｉＲＮＡの肝組織におけるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を測定した。
【０１４６】
【表９】
0006715325.tif 000021
【０１４７】
この蛍光定量ＰＣＲ法において、ｓｉＲＮＡ抑制活性を以下の式により算出した。
【０１４８】
ｓｉＲＮＡ抑制活性＝［１−（テスト群ＡｐｏＢ遺伝子のコピー数／テスト群β−ａｃｔｉｎのコピー数）／（対照群ＡｐｏＢ遺伝子のコピー数／対照群β−ａｃｔｉｎのコピー数）］×１００％。
【０１４９】
そのうち、対照群は本実験におけるＰＢＳを投与した対照群マウスであり、各テスト群はそれぞれ異なる医薬組成物を投与した投与群マウスであった。
【０１５０】
血清中の血中脂質レベルはＰＭ４０００／３血清生化学分析装置（ＳＡＢＡ、イタリア）を用いて直接測定した。
【０１５１】
表１０に、測定された各群の供試品のＣ５７ＢＬ／６Ｊ正常マウスにおけるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制活性及び血中脂質発現レベルの測定結果を示した。
【０１５２】
【表１０】
0006715325.tif 000022
【０１５３】
結果から分かるように、ＲＢＰ１３１／ｓｉＡｐｏＢ群は他の医薬組成物よりもＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ及び血中脂質に対する抑制効果が著しく優れており、そのうち、ＲＢＰ１３１／ｓｉＡｐｏＢの血中脂質に対する抑制率はＢｉｎａｒｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘｃ  ５：１（二元複合体）群とＰＥＡＧ／ｓｉＡｐｏＢ  １０：１群の２．８倍であり、Ｔｅｒｎａｒｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ５：１：２（三元複合体）群の１１．６倍であった。また、ＲＢＰ１３１／ｓｉＡｐｏＢ群の投与用量は依然として他の四群の１／５でしかないので、他の担体から形成された医薬組成物と比較して、ＲＢＰ１３１／ｓｉＡｐｏＢは極めて高い生物活性を示している。
【０１５４】
実験実施例８
本実験実施例は、用量の異なる（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２結合体の高圧注射に基づくＨＢＶトランスフェクションマウスにおける肝臓におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ及び血清中のＨＢｓＡｇ発現量に対する抑制効率を測定するためのものである。
【０１５５】
調製実施例３の方法に従い、（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２結合体及び（ＧａｌＮＡｃ）３−ＮＣ結合体（ｓｉＲＮＡの配列を表１に記載されているＮＣに変更すること以外、（ＧａｌＮＡｃ）３−ＮＣ結合体の調製方法は（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２結合体と同様である）を調製した。６０匹のＨＢＶプラスミドを高圧注射したＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス（ｐＨＢＶと名付け、上海市公共衛生中心動物部から購入、高圧注射マウスの調製方法はＰｅｎｇ  ＸＨ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  ２０１５，  ２１（１２）：  ３５２７−３５３６に記載されている）を血清ＨＢｓＡｇ含有量に応じてランダムに６群（各群１０匹、雌雄はそれぞれ半分ずつ）に分け、それぞれ１×ＰＢＳ対照群、ＥＴＶエンテカビル対照群（０．１ｍｇ／ｋｇ）、（ＧａｌＮＡｃ）３−ＮＣ対照群（３ｍｇ／ｋｇ）及び用量の異なる三つの（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２サンプル群（用量はそれぞれ０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ）とした。全ての動物に対してその体重に応じて投与量を算出し、投与体積は１０ｍｌ／ｋｇとした。ＰＢＳ群、（ＧａｌＮＡｃ）３−ＮＣ群及び各（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２群に対して一回皮下投与し、エンテカビル群に対して毎日胃内投与し、１４日間連続して、つまり０日目から１３日目まで、毎日一回投与した。１４日目に全ての動物を殺し、肝臓におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ及び血清中のＨＢｓＡｇ発現レベルを測定し、測定方法はそれぞれ実験実施例３及び実験実施例４と同様とした。
【０１５６】
結果を図７及び図８に示した。結果から分かるように、一回皮下投与した後、ＥＴＶエンテカビル対照群及び（ＧａｌＮＡｃ）３−ＮＣ対照群はマウス肝臓におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡと血清中のＨＢｓＡｇ発現のいずれに対しても抑制作用を示さなかった。（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２はＨＢＶマウスの肝臓におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ及び血清中のＨＢｓＡｇの含有量を用量依存的に低下し、抑制率を以下の表１１に示した。
【０１５７】
【表１１】
0006715325.tif 000023
【０１５８】
以上から、動物体内では、本発明の（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２結合体は良好な生物活性を発揮でき、臨床応用将来性を有することが分かった。また、本発明の（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２は臨床前線の抗Ｂ型肝炎薬物であるエンテカビルと比べて、ＨＢｓＡｇに対して明らかな抑制作用を有し、さらに（ＧａｌＮＡｃ）３−ｓｉＲＮＡ結合体のウィルス性Ｂ型肝炎に対する機能的治癒の可能性を示した。
【０１５９】
実験実施例９  本実験実施例は、用量の異なる（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２結合体の異なる時点での高圧注射に基づくＨＢＶトランスフェクションマウスにおける血清ＨＢｓＡｇ発現量に対する抑制効率を測定するためのものである。
【０１６０】
調製実施例３の方法により、（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２結合体を調製した。４０匹のＨＢＶプラスミドを高圧注射したＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス（ｐＨＢＶと名付け、上海市公共衛生中心動物部から購入、高圧注射マウスの調製方法はＰｅｎｇ  ＸＨ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  ２０１５，  ２１（１２）：  ３５２７−３５３６に記載されている）を血清ＨＢｓＡｇ含有量に応じてランダムに４群（各群１０匹、雌雄はそれぞれ半分ずつ）に分け、それぞれ１×ＰＢＳ対照群及び用量の異なる三つの（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２サンプル群（用量はそれぞれ０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ）とした。全ての動物に対してその体重に応じて投与量を算出し、投与体積は１０ｍｌ／ｋｇとした。ＰＢＳ群と各（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２群に対して一回皮下投与し、動物血清中のＨＢｓＡｇ含有量を毎週測定した。投与後の５６日目に全ての動物を殺し、以上の方法と同様に血清中のＨＢｓＡｇ発現レベルを測定した。
【０１６１】
結果を図９に示した。結果から分かるように、（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２は投与後の異なる時点でＨＢＶマウス血清中のＨＢｓＡｇ含有量を用量依存的に低下し、０．３ｍｇ／ｋｇで（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２を一回投与した後に、血清ＨＢｓＡｇに対する抑制作用を４２日間まで維持でき、１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇで（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２を一回投与した後に、血清ＨＢｓＡｇに対する抑制作用を４９日間まで維持できた。１ｍｇ／ｋｇで（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２を一回投与した後の２週間、ＨＢｓＡｇに対する抑制作用が９０％より高かった。このことから、（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｘ２Ｍ２の一回投与によりＢ型肝炎マウスの血清ＨＢｓＡｇを有効に長期間にわたって抑制でき、慢性Ｂ型肝炎患者の機能的治癒及びコンプライアンス改善に潜在的な可能性を提供することが示唆された。
【０１６２】
以上に、本発明の好ましい実施形態を詳しく説明したが、本発明は以上の実施形態の具体的な細部に限定されることはなく、本発明の技術的思想の範囲内で、本発明の技術方案に様々な簡単な変形を加えてもよく、これらの簡単な変形はいずれも本発明の保護範囲に属する。
【０１６３】
また、上述した具体的な実施形態において説明された各々の具体的な技術的特徴は、矛盾しない限り、任意の適切な方法により組み合わせることができ、不必要な重複を回避するために、本発明では各種の可能な組合せ方式について別に説明することを省略する。
【０１６４】
また、本発明における異なる各実施形態を任意に組み合わせることもでき、本発明の思想を逸脱しない限り、同様に本発明に開示される内容と見なすべきである。
【図１ａ】
0006715325.tif 000031
【図１ｂ】
0006715325.tif 000032
【図１ｃ】
0006715325.tif 000033
【図２】
0006715325.tif 000034
【図３】
0006715325.tif 000035
【図４】
0006715325.tif 000036
【図５】
0006715325.tif 000037
【図６】
0006715325.tif 000038
【図７】
0006715325.tif 000039
【図８】
0006715325.tif 000040
【図９】
0006715325.tif 000041
【配列表】
0006715325000001.app