(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程で構成される膜内外ｐＨ勾配ベシクルを製造する方法：
ａ）２００ｍＯｓｍ／ｌ以下の浸透圧を有する水性媒体において、両親媒性脂質および両親媒性ブロック共重合体からなる群から選ばれた少なくとも１つのマトリックス物質から作られたベシクルを調製する工程、
ｂ）前記ベシクルを、前記工程ａ）の水性媒体の浸透圧より少なくとも２００ｍＯｓｍ／ｌ高い浸透圧を有するアルカリ性または酸性のバッファーと混合し、前記ベシクルに浸透圧ショックを適用して、バッファーが充てんされたベシクルを得る工程、
ｃ）中和性溶液を加えることにより、バッファーが充てんされたベシクルを含んでいる、前記水性媒体およびアルカリ性または酸性バッファーの混合物を希釈し、アルカリ性または酸性バッファーと異なるｐＨを有する懸濁液バッファーに懸濁された、膜内外ｐＨ勾配ベシクルを得る工程、とを備える方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記工程ａ）で調製されたベシクルが殺菌され、前記工程ｂ）を実行する前に殺菌されたベシクルが得られる、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記ベシクルは、前記工程ｂ）を実行する前に第１の期間蓄えられる、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、前記工程ｂ）は、マトリックス物質の相転移温度未満の温度で実行される、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、前記工程ｂ）は３５℃以下で実行される、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法であって、アルカリ性または酸性バッファーの浸透圧は少なくとも２５０ｍＯｓｍ／ｌである、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法であって、水性媒体、および前記工程ｂ）の終わりにバッファーで充填されたベシクルが懸濁されるアルカリ性または酸性バッファーの混合物は、少なくとも２００ｍＯｓｍ／ｌの浸透圧を有する、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、前記中和性溶液は２５０ｍＯｓｍ／ｌ〜５５０ｍＯｓｍ／ｌの間の浸透圧を有する、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法であって、前記中和性溶液は、グリセリン、キシリトール、トリス、グルコース、マグネシウム塩、水酸化ナトリウム、ナトリウム塩類およびカルシウム塩からなる群から選ばれた少なくとも１つの物質を含む、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法であって、膜内外ｐＨ勾配ベシクルを含んでいる懸濁液バッファーのｐＨ値は、５．５〜８．５の範囲にある、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法であって、前記水性媒体は、水、有機塩の水溶液、無機塩類の水溶液、有機物質の水溶液およびその組み合わせからなる群から選ばれる、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法であって、前記マトリックス物質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホス
ホエタノール−アミン−Ｎ−［メトキシ（ＰＥＧ）−２０００］、コレステロール、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンおよびその組み合わせからなる群から選ばれた少なくとも１種である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は請求項１の前提部分による膜内外ｐＨ勾配ベシクル（小胞）を製造する方法に関し、請求項１３の前提部分による膜内外ｐＨ勾配ベシクルに関し、および、請求項１４の前提部分によるそのような膜内外ｐＨ勾配ベシクルの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベシクル（例えばリポソーム）の遠隔ローディング・キャパシティー（例えば膜内外ｐＨ勾配リポソーム）を利用した、静脈内投与（非特許文献１：Forster et al. Sci Transl Med 2014; 6: 258ra141）または腹腔内投与（非特許文献２：Forster at al. Biomaterials 2012; 33:3578-3585）は、医薬品過用の治療や内因性の代謝産物（例えば高アンモニア血）による中毒症状の治療のための興味あるアプローチとして最近評されている。これらのリポソームは内部区画を有する。内部区画は酸性またはアルカリ性バッファーを含む。また、内部区画により、イオン化状態中の有毒化合物の隔離を可能にする。この隔離は、内部区画と外部環境との間のｐＨ勾配の存在によって行われる。
【０００３】
先行技術によると、膜内外ｐＨ勾配リポソームは、一般に以下の方法で、調製される。まず、酸性またはアルカリ性媒体中で水和され、次いで滴定され（非特許文献３：Nichols and Deamer Biochimica et Biophysica Acta 1976; 455:269-271）、ゲルろ過により媒体交換（非特許文献４：Mayer et al. Biochimica et Biophysica Acta 1985; 816:294-302）、または透析（非特許文献５：Forster at al. Biomaterials 2012; 33:3578-3585）される。そして、そのリポソームは薬剤を封入する(encapsulate)ために速やかに使用される。
【０００４】
先行技術によれば、これらのベシクルの滅菌は、封入された化合物を含んでいる最終処方物に対して行なわれる。しかしながら、生物的解毒剤のように、膜内外ｐＨ勾配が長期間維持されなければならない場合、および／またリポソームが高温下で殺菌される場合、このアプローチは適切ではない。確かに、経時的に、膜内外ｐＨ勾配は、リポソーム膜を横切る化学種の拡散および／または、脂質二分子膜（主としてリン脂質）の脂質成分の分解により減少する。さらに、滅菌処理法が熱により行われる場合（例えばオートクレーブ）、リポソーム構成成分（主としてリン脂質）の化学分解はアルカリまたは酸性下で加速しうる。
【０００５】
スティーヴンズおよびリーによって記載されるこの問題への解決策（非特許文献６：Stevens and Lee Anticancer Res. 2003;23:439-442）によると、殺菌したフリーズドライのリポソームを準備し、その後、それを酸性またはアルカリ性媒体に懸濁し、続いて膜内外ｐＨ勾配を生成するために中和する。このアプローチは凍結乾燥工程を含んでいる。この工程は、一般に無菌状態の下でのリポソームの調製を意味するが、この方法は、高価であり、制御するのが困難になりうる方法、特に大量に冷凍乾燥する場合にそれが顕著である。したがって、このアプローチは産業的観点から理想的ではない。さらに、生物的解毒（例えば腹膜透析）の適用の場合のように、大量の脂質が使用される場合、複製可能な方法で凍結乾燥されたリポソームを高速で再懸濁することは問題になりうる。
【０００６】
特許文献１（米国５，３９３，５３０）はリポソームベシクルをリモートローディングする方法を記載している。その結果、膜透過での充填は、低い浸透圧（浸透圧濃度）のリポソーム溶液を封入される物質と混合することにより達成される。その後、その混合物は、膜不安定化を達成し、かつベシクルの内相に物質を組み入れるためにリポソームベシクルを構築する脂質の膜脂質遷移温度（Ｔｃ）よりも高い温度で加熱される。
【０００７】
バートランドら（非特許文献７：ACS nano 2010; 4: 7552-7558）は、酸性のバッファーが第１工程でリポソームに封入される、膜内外ｐＨ勾配リポソームを形成する方法を記載している。第２工程では、リポソームの周囲の外部バッファーが交換され、形成されたリポソームの内相と外相の間で膜内外ｐＨ勾配が確立される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国５，３９３，５３０
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Forster et al. Sci Transl Med 2014; 6: 258ra141
【非特許文献２】Forster at al. Biomaterials 2012; 33:3578-3585
【非特許文献３】Nichols and Deamer Biochimica et Biophysica Acta 1976; 455:269-271
【非特許文献４】Mayer et al. Biochimica et Biophysica Acta 1985; 816:294-302
【非特許文献５】Forster at al. Biomaterials 2012; 33:3578-3585
【非特許文献６】Stevens and Lee Anticancer Res. 2003;23:439-442
【非特許文献７】ACS nano 2010; 4: 7552-7558
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、先行技術で記載されたことがない、単純な方式で安定した膜内外ｐＨ勾配ベシクルを作ることができる製造方法を提供することを目的とする。特に、前記製造方法は、工業的応用が可能であるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この目的は、請求項１の特徴を有する膜内外ｐＨ勾配ベシクルを調製する方法によって達成される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
前記方法は、下記に説明される工程で構成される。第１工程（または工程ａ）では、少なくとも１つのマトリックス物質から作られたベシクルは、２００ｍＯｓｍ／ｌ以下の浸透圧を有する水性媒体中に準備されている。一実施態様では、水性媒体の浸透圧は１５０ｍＯｓｍ／ｌ以下、特に１００ｍＯｓｍ／ｌ以下、特に７５ｍＯｓｍ／ｌ以下、特に５０ｍＯｓｍ／ｌ以下、特に２５ｍＯｓｍ／ｌ以下、特に１０ｍＯｓｍ／ｌ以下、特に５ｍＯｓｍ／ｌ以下、特に１ｍＯｓｍ／ｌ以下である。一実施態様では、浸透圧は１ｍＯｓｍ／ｌ〜２００ｍＯｓｍ／ｌの範囲にある。あるいは前述の浸透圧のうちのいずれかから構築された範囲（１０ｍＯｓｍ／ｌ〜１５０ｍＯｓｍ／ｌなど）にある。
【００１３】
第２工程（または工程ｂ）では、前記ベシクルは、工程ａ）の水性媒体の浸透圧より少なくとも２００ｍＯｓｍ／ｌ高い浸透圧を有するアルカリ性または酸性バッファーと混合され、前記ベシクルに浸透圧ショック(osmotic shock)を加え、バッファー充填ベシクルが得られる。一実施態様では、アルカリ性または酸性バッファーの浸透圧は、工程ａの水性媒体の浸透圧より少なくとも２２０ｍＯｓｍ／ｌ高い、特に少なくとも２５０ｍＯｓｍ／ｌ高い、特に少なくとも３００ｍＯｓｍ／ｌ高い、特に少なくとも３５０ｍＯｓｍ／ｌ高い、特に少なくとも４００ｍＯｓｍ／ｌ高い、特に少なくとも４５０ｍＯｓｍ／ｌ高い、特に少なくとも５００ｍＯｓｍ／ｌ高い、特に少なくとも５５０ｍＯｓｍ／ｌ高い浸透圧である。一実施態様では、アルカリ性または酸性バッファーの浸透圧は、工程ａ）の水性媒体の浸透圧より２００ｍＯｓｍ／ｌ〜５５０ｍＯｓｍ／ｌ高い範囲にあるか、あるいは前述の浸透圧のうちのいずれかから構築された範囲（２２０ｍＯｓｍ／ｌ〜５００ｍＯｓｍ／ｌなど）にある。
【００１４】
したがって、アルカリ性または酸性バッファーは、第１工程の中で使用した水性媒体に対して超浸透のバッファーである。それにより、浸透圧ショックは、ベシクルに即座で適用される。この浸透圧ショックによって、ベシクル内に、酸性またはアルカリ性バッファーが組み込まれる。したがって、浸透圧ショックによりベシクルは短期間不安定化し、ベシクルにバッファーを導入することが可能となる。バッファーが充てんされたベシクルが得られる。一実施態様では、超浸透圧バッファーは、さらに電解質を含んでもよく、この電解質は、浸透圧を調整するか、または生理機能をもたらすために使用される。
【００１５】
浸透圧ショックを達成する観点から、十分な量のアルカリ性または酸性バッファーが水性媒体中に懸濁されたベシクルに加えられる点が注意する必要がある。水性媒体の浸透圧、および酸性またはアルカリ性バッファーの浸透圧の違いに応じて適宜設定されるが、十分な量とは、第１工程の中で使用される水性媒体の体積の少なくとも０．１倍、特に少なくとも０．３倍、特に少なくとも０．５倍、特に少なくとも０．８倍、特に少なくとも１．５倍、特に少なくとも２倍、特に少なくとも２．５倍、特に少なくとも３倍および特に少なくとも５倍に相当する体積であってもよい。一実施態様では、アルカリ性または酸性バッファーは、水性媒体のボリュームと等しいボリュームで加えてもよい。一実施態様では、加えられるアルカリ性または酸性バッファーのボリュームは、水性のベシクルの懸濁液（aqueous vesical suspension）の０．１倍〜５倍の体積であるか、あるいは前述の値から構築できる他のいかなる範囲（０．３倍〜３倍など）であってもよい。
【００１６】
一実施態様では、超浸透バッファーのｐＨ値は、ｐＨ１〜ｐＨ６．９、特にｐＨ１．５〜ｐＨ６．５、特にｐＨ２．０〜ｐＨ６．０、特にｐＨ２．５〜ｐＨ５．５、特にｐＨ３．０〜ｐＨ５．０、特にｐＨ３．５〜ｐＨ４．５、特にｐＨ３．０〜ｐＨ３．５の範囲であってもよい。
【００１７】
一実施態様では、超浸透バッファーのｐＨ値はｐＨ７．１〜ｐＨ１４、特にｐＨ７．５〜ｐＨ１３．５、特にｐＨ８．０〜ｐＨ１３．０、特にｐＨ８．５〜ｐＨ１２．５、特にｐＨ９．０〜ｐＨ１２．０、特にｐＨ９．５〜ｐＨ１１．５、特にｐＨ１０．０〜ｐＨ１１．０、特にｐＨ１０．５〜ｐＨ１１．０の範囲にあってもよい。
【００１８】
一実施態様では、超浸透バッファーは、錯化剤あるいはキレート剤などの付加的な化学薬品を含むことができる。
【００１９】
第３工程では、バッファーが充てんされたベシクルを含んでいる、水性媒体およびアルカリ性または酸性バッファーの混合物は、中和性水溶液を加えることにより希釈される。アルカリ性または酸性バッファーと中和溶液との混合物により、懸濁液バッファー(suspension buffer)が形成される。したがって、希釈の後、懸濁液バッファー中に懸濁した、膜内外ｐＨ勾配ベシクルが得られる。その結果、懸濁液バッファーのｐＨは、バッファーが充てんされたベシクルに含まれるアルカリ性または酸性バッファーのｐＨとは異なる。一実施態様におけるｐＨの差は、少なくとも１ｐＨ単位、特に少なくとも１．５ｐＨ単位、特に少なくとも２ｐＨ単位、特に少なくとも２．５ｐＨ単位、特に少なくとも３ｐＨ単位、特に少なくとも３．５ｐＨ単位、特に少なくとも４ｐＨ単位、特に少なくとも４．５のｐＨ単位、特に少なくとも５ｐＨ単位、特に少なくとも５．５ｐＨ単位、特に少なくとも６ｐＨ単位、特に少なくとも６．５ｐＨ単位、特に少なくとも７ｐＨ単位である。
【００２０】
一実施態様では、中和性溶液のｐＨ値は、ｐＨ７．１〜ｐＨ１４、特にｐＨ７．５〜ｐＨ１３．５、特にｐＨ８．０〜ｐＨ１３．０、特にｐＨ８．５〜ｐＨ１２．５、特にｐＨ９．０〜ｐＨ１２．０、特にｐＨ９．５〜ｐＨ１１．５、特にｐＨ１０．０〜ｐＨ１１．０、特にｐＨ１０．５〜ｐＨ１１．０の範囲にあってもよい。
【００２１】
一実施態様では、中和性溶液のｐＨ値は、ｐＨ１〜ｐＨ６．９、特にｐＨ１．５〜ｐＨ６．５、特にｐＨ２．０〜ｐＨ６．０、特にｐＨ２．５〜ｐＨ５．５、特にｐＨ３．０〜ｐＨ５．０、特にｐＨ３．５〜ｐＨ４．５、特にｐＨ３．０〜ｐＨ３．５の範囲にあってもよい。
【００２２】
懸濁液バッファーと、アルカリ性または酸性のバッファーとのｐＨが異なるため、ベシクルの内相と周囲（外相）の懸濁液バッファーとの間で膜内外ｐＨ勾配が達成される。
【００２３】
一実施態様では、第１工程で調製されたベシクルが殺菌され、その結果、殺菌されたベシクルまたは殺菌されたベシクルを含む液体（liquid solution）が得られる。その後、これらの殺菌されたベシクルを使用して、上に説明された製造方法の第２工程が行なわれる。この第２工程では、一実施態様の中で、殺菌されたアルカリ性または酸性バッファーが使用される。そうすることにより、完全に無菌のバッファー充填ベシクルまたはバッファーが充てんされたベシクルを含む完全無菌液を調製することができる。滅菌は、例えば濾過滅菌またはオートクレーブにより実行される。
【００２４】
別の実施態様では、ベシクルは第１の期間に保管され、次いで、ベシクル（またはベシクル含有液）をアルカリ性または酸性のバッファーと混合する工程が行なわれる。第１調製工程の後にベシクルが殺菌される場合、その後、殺菌されたベシクル懸濁液では、分解が全くまたはほとんど生じないので、このような保管は、適宜適した方式で遂行することができる。第１の期間は、１日、２〜３日、１週間、または数週間、１か月どころか数か月であってもよい。水性媒体に含まれる、殺菌されたベシクルは、安定した存在であることに注目するべきである。殺菌されたベシクル懸濁液は、後の段階やベシクルを使用する段階のような特定の酸性またはアルカリ性バッファーをまだ含んでいないので、ベシクルのベシクル分解または漏出によるバッファー・ロスを心配しなくてもよい。これはさらに一実施態様において、ベシクルが電解質分子を少ない量で含む場合もあてはまる。なぜならその場合、ベシクル内の浸透圧が１ｍＯｓｍ／ｌ〜２００ｍＯｓｍ／ｌの間にあるためである。さらに、ベシクルが貯蔵中に水性媒体に維持されるので、ベシクルの凍結乾燥の場合に発生するような不利益が生じない。
【００２５】
アルカリ性または酸性バッファーの導入は、強い浸透圧ショックによって達成されるので、温度を上げてベシクル不安定化を行う必要はない。特に、ベシクルを調製するために使用されたマトリックス物質の遷移温度を超える温度にベシクルを加熱することは必要ではない。脂質がマトリックス物質として使用される場合、膜脂質相転移温度を上まわる温度でベシクルにバッファーを組み入れる工程を行なう必要はないことは、むしろ驚くべきことである。
【００２６】
したがって、一実施態様では、本発明の方法の第２工程は、マトリックス物質の相転移温度未満である温度で行なわれる。脂質がマトリックス物質として使用される場合、そのような相転移温度は膜脂質遷移温度になりえる。
【００２７】
一実施態様では、方法の第２工程は３５℃以下、特に３０℃以下、特に２５℃以下、特に２０℃以下、特に１５℃以下、特に１０℃以下の温度で行なわれる。例えば、第２工程を行なうための適した温度範囲は１５〜３５℃である。さらに、所望で、前述の温度を使用するさらなる温度範囲（例えば１０〜３０℃など）を構築することができる。別の実施態様では、生産方法全体が、前述の温度または温度範囲（滅菌処理法、特にすなわちオートクレーブ法を除外するいくつかの実施態様において）で実行される。
【００２８】
一実施態様では、中和性溶液は２５０ｍＯｓｍ／ｌ〜５５０ｍＯｓｍ／ｌ、特に２７０〜５２０ｍＯｓｍ／ｌの、特に２９０〜５００ｍＯｓｍ／ｌの、特に３００〜４８０ｍＯｓｍ／ｌの、特に３２０〜４５０ｍＯｓｍ／ｌの、特に３３０〜４２０ｍＯｓｍ／ｌの、特に３５０〜４００ｍＯｓｍ／ｌの間の浸透圧を有する。
【００２９】
一実施態様では、中和性溶液は、バッファーを含むベシクル（つまりバッファーを含むベシクル溶液）を含んでいる混合物の浸透圧より、２００ｍＯｓｍ／ｌ未満で高いまたは低い浸透圧、特に、１５０ｍＯｓｍ／ｌ未満で高いまたは低い浸透圧、特に、１００ｍＯｓｍ／ｌ未満で高いまたは低い浸透圧、特に、５０ｍＯｓｍ／ｌ未満で高いまたは低い浸透圧、特に、２０ｍＯｓｍ／ｌ未満で高いまたは低い浸透圧、特に、１０ｍＯｓｍ／ｌ未満で高いまたは低い浸透圧を有する。一実施態様では、中和性溶液と、バッファーを含むベシクルを含んでいる混合物との間の浸透圧の差は、１ｍＯｓｍ／ｌ〜２００ｍＯｓｍ／ｌ、特に１０ｍＯｓｍ／ｌ〜１５０ｍＯｓｍ／ｌの間、特に２０ｍＯｓｍ／ｌ〜１００ｍＯｓｍ／ｌの間、特に３０ｍＯｓｍ／ｌ〜８０ｍＯｓｍ／ｌの間、特に４０ｍＯｓｍ／ｌ〜６０ｍＯｓｍ／ｌの間にある。
【００３０】
一実施態様では、超浸透のバッファーの浸透圧は２５０ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に３００ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に３５０ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に４００ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に４５０ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に５００ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に５５０ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に６００ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に７００ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に８００ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に９００ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に１０００ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に１１００ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に１２００ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に１３００ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に１４００ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に１５００ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に１６００ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に１７００ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に１８００ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に１９００ｍＯｓｍ／ｌ以上、特に２０００ｍＯｓｍ／ｌ以上である。一実施態様では、浸透圧は２５０ｍＯｓｍ／ｌ〜２０００ｍＯｓｍ／ｌの範囲にある。あるいは前述の浸透圧から構築された範囲（３００ｍＯｓｍ／ｌ〜１４００ｍＯｓｍ／ｌなど）にある。
【００３１】
一実施態様では、水性媒体、およびアルカリ性または酸性のバッファー（バッファー充填ベシクルが懸濁されたバッファー）の混合物は、工程ｂ）の終わりにおいて、少なくとも２００ｍＯｓｍ／ｌの、特に少なくとも２２０ｍＯｓｍ／ｌの、特に少なくとも２５０ｍＯｓｍ／ｌの、特に少なくとも３００ｍＯｓｍ／ｌの、特に少なくとも３５０ｍＯｓｍ／ｌの、特に少なくとも４００ｍＯｓｍ／ｌの、特に少なくとも４５０ｍＯｓｍ／ｌの、特に少なくとも５００ｍＯｓｍ／ｌの、特に少なくとも５５０ｍＯｓｍ／ｌの浸透圧を有する。一実施態様では、浸透圧は２００ｍＯｓｍ／ｌ〜５５０ｍＯｓｍ／ｌの範囲にある。あるいは前述の浸透圧から構築された範囲（２２０ｍＯｓｍ／ｌ〜５００ｍＯｓｍ／ｌなど）にある。
【００３２】
一実施態様では、中和性溶液は、バッファー充填ベシクルを破裂させない組成を有し、これらのベシクルが不安定になるのを抑制する。中和性溶液は中和性化合物（弱塩基または弱い酸のようなアルカリ性または酸性物質）を含んいてもよいし、さらに、浸透圧を調節し、および／または生理的機能を提供できる化学薬品を含んでいてもよい。グリセリンおよびトリス（（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（ＴＲＩＳ：トリス）を中和性溶液に添加すると、特に興味深いことに、カルシウム塩をより高い濃度で混和できることが見出された。カルシウム塩は、弱酸（例えばクエン酸）の抗凝固効果を打ち消すために調製工程で加えることができる。これは特に、ベシクルが、生体内の適用の中で使用されることになっている点から重要である。水酸化ナトリウム、ナトリウム塩類（ＮａＣｌなど）、マグネシウム塩、乳酸塩、グリセリン、イコデキストリン、グルコース、ソルビトール、フルクトース、アミノ酸またはキシリトールも、中和性溶液の成分として使用することができる。
【００３３】
一実施態様では、膜内外ｐＨ勾配ベシクルを含んでいる懸濁液バッファーのｐＨ値は、５．５〜８．５の、特に６．０〜８．０の、特に６．５〜７．７の、特に６．８〜７．５の、特に７．０〜７．４の範囲にある。したがって、懸濁液バッファーは生理的なｐＨ値を有していてもよい。
【００３４】
一実施態様では、水性媒体は酸でも塩基でもなく、約７のｐＨ値（例えば６．０〜７．５の範囲）、特に６．１〜７．４の、特に６．２〜７．３の、特に６．３〜７．２の、特に６．４〜７．１の、特に６．５〜７．３の、特に６．６〜７．３の、特に６．７〜７．３の、特に６．８〜７．３の、特に６．９〜７．１の、特に６．９５〜７．０１の、特に７．０のｐＨ値を有している。したがって、水性媒体は、また、中性の水性媒体として呼ぶことができる。
【００３５】
一実施態様では、水性媒体は、水、有機塩の水溶液、無機塩の水溶液、有機物質の水溶液およびその組み合わせからなる群から選ばれる。
【００３６】
一実施態様では、水性媒体は約ｐＨ７の有機塩の水溶液、約ｐＨ７の無機塩の水溶液、約ｐＨ７の有機物質の水溶液、水、およびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００３７】
水は、例えば、蒸留水、脱イオン水、超純水または他の種類の純水であってもよい。有機塩、無機塩または他の有機化合物（有機物質）を使用する場合、これらの塩類または化合物は、水性媒体（一実施態様では低濃度）に存在し、水性媒体と超浸透のバッファーの間の浸透圧の差を維持して、ベシクル内部の区画の中へ、酸性またはアルカリ性の超浸透バッファーの拡散を引き起こすのに十分に大きな差によって、浸透圧ショックを引き起こす。
【００３８】
水性媒体は、水に類似する媒体（特にｐＨに関して）であるが、塩類または化合物（例えば、中性の範囲でｐＨ値をバッファーするための化合物）を低濃度で含んでいてもよい媒体である。一実施態様では、水性媒体の浸透圧は、０ｍＯｓｍ／ｌ〜４９ｍＯｓｍ／ｌ、特に５ｍＯｓｍ／ｌ〜４５ｍＯｓｍ／ｌの間、特に１０ｍＯｓｍ／ｌ〜４０ｍＯｓｍ／ｌの間、特に１５ｍＯｓｍ／ｌ〜３５ｍＯｓｍ／ｌの間、特に２０ｍＯｓｍ／ｌ〜３０ｍＯｓｍ／ｌの間、特に２５ｍＯｓｍ／ｌ〜２８ｍＯｓｍ／ｌの間の範囲にある。
【００３９】
一実施態様では、マトリックス物質は、両親媒性脂質および両親媒性ブロック共重合体からなる群から選ばれる。両親媒性脂質が使用される場合、リポソームはベシクルとして形成される。適したリポソームは、多層ベシクル（ＭＬＶ）、小さな一枚膜ベシクル（ＳＵＶ）および大きな一枚膜ベシクル（ＬＵＶ）である。
【００４０】
両親媒性ブロック共重合体が使用される場合、ポリマーソーム（polymersome）がベシクルとして形成される。適した両親媒性のブロック共重合体は線形のジブロックまたはトリブロック共重合体である。ブロック共重合体は、１つの疎水性ブロック、および１つまたは２つの他の親水性のブロックを有することができる。さらに、櫛形コポリマーも使用可能であり、そのような櫛形コポリマーのバックボーンブロックは親水性であり、くし枝部は疎水性であってもよい。さらに、樹状突起のデンドリマーブロック共重合体も使用可能であり、これらのコポリマーのデンドリマー部分は親水性であってもよい。すべての場合に、親水性のブロックはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ／ＰＥＯ）またはポリ（２−エチルオキサゾリン）から作ることができる。さらに、すべての場合に、疎水性ブロックはポリ（ジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）またはポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）から作ることができる。
【００４１】
一実施態様では、マトリックス物質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン−Ｎ−［メトキシ（ＰＥＧ）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、コレステロール、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）およびその組み合わせからなる群から選ばれた少なくとも１つの両親媒性脂質である。
【００４２】
一構成では、本発明は、前記方法によって得ることができる膜内外ｐＨ勾配ベシクルに関する。これらの膜内外ｐＨ勾配ベシクルは先行技術から公知であるベシクルと、安定性において異なる。これは上に概説された特定の製造工程に起因する構造の違いによる。したがって、上述した方法により作られたベシクルは、先行技術から知られていない。
【００４３】
一構成では、in vitroまたはin vivo（人間または動物（特に哺乳動物、げっ歯動物）における、解毒剤としてのこれらの膜内外ｐＨ勾配ベシクルの使用がクレームされる。膜内外ｐＨ勾配ベシクルは過剰服用された薬剤、毒（またはそれらの代謝産物）、または中毒を生じ得る高濃度の内因性の代謝産物などの望まれない物質を抽出し拘束するために使用することができる。膜内外ｐＨ勾配ベシクルによって吸収できる物質の例は、アンモニアとプロピオン酸である。in vivoまたはin vitroにおいて、溶液からアンモニアとプロピオン酸を取り除くことにより、アンモニアおよび／またはプロピオン酸からの、そのような溶液の解毒につながる。
【００４４】
ここに開示された実施態様はすべて、任意の所望の方法で組み合わせることができる。
記載された方法の実施態様は、記載していたベシクルおよび記載していた使用について適用されてもよく、またその逆であってもよい。
なお、本発明は、態様として以下の内容を含む。
〔態様１〕
次の工程で構成される膜内外ｐＨ勾配ベシクルを製造する方法：
ａ）２００ｍＯｓｍ／ｌ以下の浸透圧を有する水性媒体において、両親媒性脂質および両親媒性ブロック共重合体からなる群から選ばれた少なくとも１つのマトリックス物質から作られたベシクルを調製する工程、
ｂ）前記ベシクルを、前記工程ａ）の水性媒体の浸透圧より少なくとも２００ｍＯｓｍ／ｌ高い浸透圧を有するアルカリ性または酸性のバッファーと混合し、前記ベシクルに浸透圧ショックを適用して、バッファーが充てんされたベシクルを得る工程、
ｃ）中和性溶液を加えることにより、バッファーが充てんされたベシクルを含んでいる、前記水性媒体およびアルカリ性または酸性バッファーの混合物を希釈し、アルカリ性または酸性バッファーと異なるｐＨを有する懸濁液バッファーに懸濁された、膜内外ｐＨ勾配ベシクルを得る工程、とを備える方法。
〔態様２〕
態様１に記載の方法であって、前記工程ａ）で調製されたベシクルが殺菌され、前記工程ｂ）を実行する前に殺菌されたベシクルが得られる、方法。
〔態様３〕
態様１または２に記載の方法であって、前記ベシクルは、前記工程ｂ）を実行する前に第１の期間蓄えられる、方法。
〔態様４〕
態様１〜３のいずれか一態様に記載の方法であって、前記工程ｂ）は、マトリックス物質の相転移温度未満の温度で実行される、方法。
〔態様５〕
態様１〜４のいずれか一態様に記載の方法であって、前記工程ｂ）は３５℃以下で実行される、方法。
〔態様６〕
態様１〜５のいずれか一態様に記載の方法であって、アルカリ性または酸性バッファーの浸透圧は少なくとも２５０ｍＯｓｍ／ｌである、方法。
〔態様７〕
態様１〜６のいずれか一態様に記載の方法であって、水性媒体、および前記工程ｂ）の終わりにバッファーで充填されたベシクルが懸濁されるアルカリ性または酸性バッファーの混合物は、少なくとも２００ｍＯｓｍ／ｌの浸透圧を有する、方法。
〔態様８〕
態様１〜７のいずれか一態様に記載の方法であって、前記中和性溶液は２５０ｍＯｓｍ／ｌ〜５５０ｍＯｓｍ／ｌの間の浸透圧を有する、方法。
〔態様９〕
態様１〜８のいずれか一態様に記載の方法であって、前記中和性溶液は、グリセリン、キシリトール、トリス、グルコース、マグネシウム塩、水酸化ナトリウム、ナトリウム塩類およびカルシウム塩からなる群から選ばれた少なくとも１つの物質で構成される、方法。
〔態様１０〕
態様１〜９のいずれか一態様に記載の方法であって、膜内外ｐＨ勾配ベシクルを含んでいる懸濁液バッファーのｐＨ値は、５．５〜８．５の範囲にある、方法。
〔態様１１〕
態様１〜１０のいずれか一態様に記載の方法であって、前記水性媒体は、水、有機塩の水溶液、無機塩類の水溶液、有機物質の水溶液およびその組み合わせからなる群から選ばれる、方法。
〔態様１２〕
態様１〜１１のいずれか一態様に記載の方法であって、前記マトリックス物質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン−Ｎ−［メトキシ（ＰＥＧ）−２０００］、コレステロール、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンおよびその組み合わせからなる群から選ばれた少なくとも１種である、方法。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
本発明のさらなる構成および詳細が、図および以下の実施例を使用して説明される。
【図１】図１は、リポソーム水性懸濁液の一実施態様のＨＰＬＣ電荷エーロゾル検出器（ＣＡＤ）でのトレースを示す、ここで前記懸濁液は、蒸気滅菌法の前（上パネル）であって、蒸気滅菌法の後（下パネル）である。
【図２】図２は、蒸気滅菌法前後における、リポソームの一実施態様の相対的な脂質濃度を示す。
【００４６】
［実施例１］
（リポソームの処方）
ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ、類脂質）、コレステロール（Sigma-Aldrich）および、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン−Ｎ−［メトキシ（ＰＥＧ）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、類脂質）が、８５：１４：１（ｍｏｌ％）で含まれるリポソームが、フィルム水和方法によって調製された。１６８５ｍｇのＤＰＰＣ、１４６ｍｇのコレステロールおよび７５ｍｇのＤＳＰＥ−ＰＥＧが、１０ｍＬのジクロロメタン：メタノール（９５：５）（ｖ／ｖ）に共溶解された。有機溶媒は、次いでロータリーエバポレーションによって除去された。また、脂質フィルムは減圧下一晩維持された。乾いたフィルムが、加熱してゆっくり４５分間５６℃で混合しつつ２７ｍＬの超純水（脂質濃度＝１００ｍＭ）と水和され、そして、密封したボトルの中で、最後に１２１℃で２０分オートクレーブにより殺菌した。
【００４７】
（安定性）
加えられた熱による分解を評価するために、リポソームはオートクレーブ中で蒸気滅菌にさらされた。酸または塩基で満たされたリポソームが、それぞれ酸性またはアルカリ性の加水分解の対象であることは公知である。本発明で得られたリポソームは、蒸気滅菌法により全く劣化しなかった。
【００４８】
図１に示されるように、ＨＰＬＣ電荷エーロゾル検出器（ＣＡＤ）によるリポソーム水性懸濁液のトレースは、蒸気滅菌法（図１の上パネル）の前、および蒸気滅菌法（図１の下パネル）の後と、オーバーラップする。
【００４９】
これらの結果は、リポソームの相対的な脂質濃度の評価によって確認される。図２に示すように、相対的な脂質濃度は蒸気滅菌法の前の相対的な脂質濃度と比較して、蒸気滅菌法の後でも安定していた。もし加水分解物が観察されれば、脂質濃度は減少していただろう。
【００５０】
（浸透圧ショック）
得られたリポソームは、クエン酸（クエン酸一水化物）２９０ｍＭ、クエン酸カルシウム（クエン酸カルシウムの三塩基性のテトラハイドレード）５５ｍＭおよびＨＣｌ８０ｍＭを含んでいる、２７ｍＬのクエン酸塩バッファー４００ｍＭ（ｐＨ２、７００ｍＯｓｍ／ｌ）において、３０分間インキュベートされた。インキュベーションは、室温でオービタルシェーカーで行なわれた。
【００５１】
（グラディエントの生成）
膜内外ｐＨ勾配は、２８０ｍＭのトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Panreac Applichemおよび５０ｍＭの塩化カルシウム（無水塩化カルシウム、Merck Millipore）を含む、１０６ｍＬの中和溶液（ｐＨ＝１０．６、４１０ｍＯｓｍ／ｌ）で外部酸性媒体を中和することにより行われた。得られたリポソーム処方物（１６．９ｍＭ、ｐＨ７．４、３１２ｍＯｓｍ／ｌ）は、in vitroでのアンモニア吸収研究に使用された。
【００５２】
（in vitroのアンモニア吸収）
３７℃で維持されたサイドバイサイド拡散セルズ（PermGear）はＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（２０ｍＭ、３００ｍＯｓｍ／ｌ）中のアンモニア吸収をモニターするために使用された。リポソームは、ポリカーボネート膜（細孔径＝１００ｎｍ、Steriltech）によってデュアルチャンバシステムの１方の側に物理的に分離された。拡散セル内のリポソームおよびアンモニア濃度はそれぞれ４．２ｍＭおよび１．５ｍＭだった。分配された時間に、５０μＬのアリコートがリポソームなしの区画からサンプリングされ、そのアンモニア濃度が、酵素分析（アンモニアの酵素キット、Sigma Aldrich）によって評価された。アンモニアの吸収量は次の方程式（式１および式２）によって計量された
【００５３】
［式１］
吸収＝（ｍｍｏｌアンモニアの封入量）／（ｍｍｏｌ脂質）
＝（ｍｍｏｌアンモニア合計−ｍｍｏｌアンモニア遊離）（ｍｍｏｌ脂質）
［式２］
吸収（％）＝（吸収）／（最大吸収）ｘ１００
＝（吸収）／［（ｍｍｏｌアンモニア合計）（ｍｍｏｌ脂質］）］ｘ１００
【００５４】
５時間のインキュベーション後、式２でに計算されたアンモニア吸収量は８２±５％だった。
【００５５】
［実施例２］
（リポソームの処方）
ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧからなるリポソームが、実施例１に記載されたように調製され殺菌された。
【００５６】
（浸透圧ショック）
得られたリポソームは、クエン酸４９０ｍＭ、クエン酸カルシウム５５ｍＭ、塩化ナトリウム（FischerScientific）１２５ｍＭおよびＨＣｌ１３５ｍＭを含む、１３．５ｍＬのクエン酸塩バッファー６００ｍＭ（ｐＨ２、１０４０ｍＯｓｍ／ｌ）で３０分インキュベートされた。インキュベーションは、室温でオービタルシェーカーで行なわれた。
【００５７】
（グラディエントの生成）
膜内外ｐＨ勾配は、トリス１６０ｍＭ、塩化カルシウム３５ｍＭおよび塩化ナトリウム１００ｍＭからなる１１９．５ｍＬの中和溶液（ｐＨ１０．６、４４０ｍＯｓｍ／ｌ）でリポソームを希釈することにより行われた。最終的なリポソーム処方物（１６．９ｍＭ、ｐＨ７．５）は、in vitroのアンモニア吸収の研究に使用された。
【００５８】
（in vitroのアンモニア吸収）
in vitroでのアンモニア吸収は、実施例１に記載するように、サイドバイサイド拡散セルズを用いて調査された。５時間のインキュベーション後、リポソーム内の平均アンモニア吸収は９２±８％だった。
【００５９】
［実施例３］
（リポソームの処方）
ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧからなるリポソームが、実施例１に記載されたように調製され殺菌された。
【００６０】
（浸透圧ショック）
浸透圧ショックは実施例２に記載したリポソームのインキュベートにより行なわれた。
【００６１】
（グラディエントの生成）
膜内外ｐＨ勾配は、水酸化ナトリウム１５５ｍＭ、グリセリン２１０ｍＭ、塩化カルシウム２０ｍＭ、およびトリス２０ｍＭからなる、１１９．５ｍＬの中和溶液（ｐＨ＝１２．７、４８０ｍＯｓｍ／ｌ）でリポソームを希釈することにより生成された。得られたリポソームの処方物（１６．９ｍＭ）はｐＨ６、３４１ｍＯｓｍ／ｌだった。
【００６２】
（in vitroのアンモニア吸収）
in vitroでのアンモニア吸収は、実施例１に記載するように、サイドバイサイド拡散セルズを用いて調査された。５時間のインキュベーション後、平均アンモニア吸収は９６±３％だった。
【００６３】
［実施例４］
（リポソームの処方）
１−パルミトイル−２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ、類脂質）、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧを５４：４５：１（ｍｏｌ％）で含むリポソームが、フィルム水和方法によって調製された。１１０８ｍｇのＰＯＰＣ、４６９ｍｇのコレステロールおよび７５ｍｇのＤＳＰＥ−ＰＥＧが、１０ｍＬのジクロロメタン：メタノール（９５：５）（ｖ／ｖ）に共溶解された。有機溶媒は、次いでロータリーエバポレーションによって除去された。また、脂質フィルムは減圧下一晩維持された。乾いたフィルムが、加熱してゆっくり３０分間５６℃で混合しつつ２７ｍＬの超純水（脂質濃度＝１００ｍＭ）と水和され、そして、密封したボトル中で、最後に１２１℃で２０分オートクレーブにより殺菌した。
【００６４】
（浸透圧ショック）
浸透圧ショックは、リポソームに対し実施例２に記載したインキュベートによって行なわれた。
【００６５】
（グラディエントの生成）
膜内外ｐＨ勾配は、水酸化ナトリウム１５０ｍＭ、グリセリン２２０ｍＭ、塩化カルシウム１０ｍＭおよびトリス２０ｍＭで作られた、１１９．５ｍＬの中和溶液（ｐＨ＝１２．７、４８０ｍＯｓｍ／ｌ）でリポソームを希釈することにより行われた。得られたリポソームの処方物（１６．９ｍＭ）はｐＨ７．４、３５０ｍＯｓｍ／ｌだった。
【００６６】
（in vitroのアンモニア吸収）
in vitroでのアンモニア吸収は、実施例１に記載するように、サイドバイサイド拡散セルズを用いて調査された。５時間のインキュベーション後、アンモニア吸収は５３．５±８．７％だった。
【００６７】
［実施例５］
（リポソームの処方）
ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧからなるリポソームが、実施例１に記載されたように調製され殺菌された。
【００６８】
（浸透圧ショック）
リポソームは、１３．５ｍｌの酢酸カルシウムバッファー（ｐＨ１０、１０５０ｍＯｓｍ／ｌ）を用いて、室温でオービタルシェーカの下で３０分でインキュベートされた。前記バッファーは酢酸カルシウム（３５０ｍＭ）、水酸化ナトリウム（０．７５ｍＭ）を含んでいた。
【００６９】
（グラディエントの生成）
リポソームは、グリセリン２３０ｍＭ、塩化ナトリウム５０ｍＭ、トリス２０ｍＭおよび酢酸２０ｍＭを含む３３ｍｌの溶液（ｐＨ＝６．７、３８０ｍＯｓｍ／ｌ）で希釈された。得られたリポソーム処方物（３０ｍＭ、ｐＨ７、３３５ｍＯｓｍ／ｌ）がプロピオン酸のin vitroでの吸収を調査するために使用された。
【００７０】
（プロピオン酸のin vitroの吸収）
３７℃で維持されたサイドバイサイド拡散セルズが用いられ、１％の［１−１４Ｃ］プロピオン酸（５０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、BIOTREND Chemikalien製）でラベルされたプロピオン酸溶液のin vitroでの吸収がモニターされた。リポソームは、ポリカーボネート膜（細孔径＝１００ｎｍ）によってデュアル・チャンバシステムの一方の側に物理的に分離された。ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（２０ｍＭ、３００ｍＯｓｍ／ｌ）で希釈した後、拡散セルズ内のリポソーム濃度およびプロピオン酸濃度は、それぞれ４．２および１．５ｍＭだった。割り付けられた時間間隔（６−３０分、１−２−３−４−５ｈ）で、５０μＬのアリコートがリポソームなしの区画からサンプリングされ、３ｍｌのUltima Gold cocktail（Perking Elmer）と混合された。そして、各サンプル中の放射能活性（β崩壊）がシンチレーション計数（ＬＳ６５００シンチレーション計数器、ベックマン）によって評価された。代謝産物濃度は減衰を検量線と比較することにより確定された。その線形性は３１μΜから２ｍＭの範囲内に確認された。プロピオン酸（ＰＡ）吸収の量は以下の式（式３および式４）によって計量された。
【００７１】
［式３］
吸収＝（ｍｍｏｌＰＡの封入量）／（ｍｍｏｌ脂質）
＝（ｍｍｏｌＰＡ合計−ｍｍｏｌＰＡ遊離）（ｍｍｏｌ脂質）
［式４］
吸収（％）＝（吸収）／（最大吸収）ｘ１００
＝（吸収）／［（ｍｍｏｌＰＡ合計）（ｍｍｏｌ脂質］）］ｘ１００
【００７２】
５時間のインキュベーション後、式４で計算されたプロピオン酸の吸収は２５±３％であった。
【００７３】
［実施例６］
（リポソームの処方）
ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧからなるリポソームが調製され、上述（実施例１）したように殺菌された。
【００７４】
（浸透圧ショック）
得られたリポソームは、クエン酸４９０ｍＭ、クエン酸カルシウム１５ｍＭ、クエン酸ナトリウム（Sigma Aldrich）７４ｍＭ、クエン酸マグネシウム（Applichem Panreac）６ｍＭ、塩化ナトリウム３５ｍＭおよびＨＣｌ１７８ｍＭを含む１３．５ｍＬのクエン酸塩バッファー６００ｍＭ（ｐＨ２、１０５０ｍＯｓｍ／ｌ）とともに３０分インキュベートされた。インキュベーションは、室温でオービタルシェーカーで行なわれた。
【００７５】
（グラディエントの生成）
膜内外ｐＨ勾配は、水酸化ナトリウム４３ｍＭ、キシリトール（ＡＢＣＲ Ｇｍｂｈ）２６０ｍＭ、塩化カルシウム１ｍＭ、トリス２０ｍＭ、塩化ナトリウム１５ｍＭからなる、２７９．５ｍｌの中和溶液（ｐＨ＝１２．６、３６０ｍＯｓｍ／ｌ）でリポソームを希釈することにより行われた。得られたリポソーム処方物（８．４ｍＭ、ｐＨ６．４、３５０ｍＯｓｍ／ｌ）は生体内のアンモニア吸収を調査するために使用された。
【００７６】
（生体内のアンモニア吸収）
６体の成体オスのスピローグ・ドーリー・ラット（重さ約３００ｇ、Charles River Laboratories）を、５日かけて環境に順応させた。ラットは、食物と水をいつでも摂取でき、また、１２ｈの明／暗サイクルに置かれた。実験の日に、新たに準備した透析溶液（１６．７ｍＭ）を、あらかじめ３７℃に暖め、イソフルラン麻酔（０．８ｍＬ／分酸素フロー中２．５％）の下におかれたラットの腹膜腔にゆっくり注入した（６０ｍＬ／ｋｇ）。点滴注入は２０ゲージ皮下注射針で行なわれた。割り付けられた時間において、ラットは簡単に麻酔をかけられ（前記と同様の条件の下で、イソフルラン吸入を使用）、約４００μＬ透析物を、２２ゲージ穿孔シリコーン・カテーテル（Venflon；Becton Dickinson）を備える無菌の腹腔穿刺により取り出された。アリコートは、直ちに液体窒素中で凍らせ、酵素分析（酵素のアンモニア分析、Sigma Aldrich）によって付加的なアンモニア含量を決定するため−８０℃で維持された。分析を実行する前に、各サンプル（１００μＬ）が３％のトリトン−Ｘ−１００（５０μＬ）で希釈され、超音波浴において５分間超音波で処理された。動物実験は、郡の獣医学当局（Kantonales Veterinaramt チューリッヒ）によって承認された手順とプロトコルに従って行なわれた。実験終了時に、動物を二酸化炭素窒息によって安楽死させ、続けて開胸術を行った。処理の４時間後に透析物サンプルで見つかった平均アンモニア濃度は、１．２５±０．２ｍＭだった。
【図１】
0006715265.tif 000002
【図２】
0006715265.tif 000003