(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テネイシンＣのＦＢＧドメインに結合する抗体または結合性断片であって、ＣＤＲＨ１が配列番号９であり、ＣＤＲＨ２が配列番号１０であり、ＣＤＲＨ３が、独立して、配列番号１１、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６から選択される、ＶＨ領域と、ＣＤＲＬ１が配列番号５であり、ＣＤＲＬ２が配列番号１３であり、ＣＤＲＬ３が配列番号１４である、ＶＬ領域と、を含む抗体または結合性断片。
【請求項２】
前記ＣＤＲＨ３が配列番号１１である、請求項１に記載の抗体または結合性断片。
【請求項３】
前記ＶＨ領域が配列番号１２に示される配列を有する、請求項２に記載の抗体または結合性断片。
【請求項４】
前記ＣＤＨ３が配列番号３６である、請求項１に記載の抗体または結合性断片。
【請求項５】
前記ＶＨ領域が配列番号３７に示される配列を有する、請求項４に記載の抗体または結合性断片。
【請求項６】
前記ＣＤＨ３が配列番号３０である、請求項１に記載の抗体または結合性断片。
【請求項７】
前記ＶＨ領域が配列番号３１に示される配列を有する、請求項６に記載の抗体または結合性断片。
【請求項８】
前記ＣＤＨ３が配列番号３４である、請求項１に記載の抗体または結合性断片。
【請求項９】
前記ＶＨ領域が配列番号３５に示される配列を有する、請求項８に記載の抗体または結合性断片。
【請求項１０】
前記ＶＬ領域が配列番号１５または１２５に示される配列を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体または結合性断片。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体または結合性断片、並びに薬剤的に許容できる担体、賦形剤および／または希釈剤を含む、組成物。
【請求項１２】
抗炎症剤、スタチン、生物学的作用物質、免疫抑制剤、サリチル酸塩並びに殺菌剤から成る群から選択される薬剤をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
治療における使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体または結合性断片。
【請求項１４】
慢性炎症性状態の治療における使用のための、請求項１３に記載の抗体または抗体結合性断片。
【請求項１５】
前記慢性炎症反応が、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫状態、炎症性腸疾患、非治癒性創傷、多発性硬化症、がん、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、糖尿病、紅斑性狼瘡（lupus erythrematosus）、喘息、線維性疾患、肺線維症、ＵＶダメージ、乾癬、強直性脊椎炎又は心血管疾患と関連している、請求項１４に記載の抗体または抗体結合性断片。
【請求項１６】
前記慢性炎症反応が、関節リウマチ（ＲＡ）と関連している、請求項１５に記載の抗体または抗体結合性断片。
【請求項１７】
治療における使用のための、請求項１１又は１２に記載の組成物。
【請求項１８】
慢性炎症性状態の治療における使用のための、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記慢性炎症反応が、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫状態、炎症性腸疾患、非治癒性創傷、多発性硬化症、がん、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、糖尿病、紅斑性狼瘡（lupus erythrematosus）、喘息、線維性疾患、ＵＶダメージ、乾癬、強直性脊椎炎又は心血管疾患と関連している、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記慢性炎症反応が、関節リウマチ（ＲＡ）と関連している、請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テネイシンＣのフィブリノーゲン様球（ＦＢＧ）ドメインと結合するための抗体、並びに慢性炎症を伴う障害の診断、予後判定および／または治療におけるそれらの用途、並びにそのような抗体を特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、病原体、組織損傷、または刺激物質等の有害刺激に対する組織の複雑な生物学的反応である。保護を目的として、組織は有害刺激を除去し、さらに組織の治癒プロセスを開始する。炎症に関連する異常は、様々なヒト疾患の原因となる大きな非関連障害群（炎症性障害）を含む。炎症現象を伴う疾患の例としては、（限定はされないが）喘息、自己免疫疾患、糸球体腎炎、アレルギー（過敏症）、がん、炎症性腸疾患、再灌流障害、関節リウマチおよび移植拒絶反応が挙げられる。
【０００３】
具体的には、慢性炎症は上記疾患の多くに関連する消耗性の重篤な状態であり、感染もしくは傷害の部位における持続的な炎症、または原因不明の、もしくは自己免疫疾患等における免疫応答変化に関連する持続的な炎症を特徴とする。
【０００４】
関節リウマチ（ＲＡ）は、限定はされないが、慢性炎症性状態の典型例である。ＲＡは、炎症誘発性サイトカインおよびマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の持続的な合成によって仲介される、滑膜炎並びに関節軟骨および骨の破壊を特徴としている。ＴＮＦαおよびＩＬ−６等の炎症性サイトカインの合成を抑制する生物学的化合物が、短期のＲＡ治療において成功を収めている。しかし、治療の反復を必要とするために高額な治療方法となってしまい、長期寛解も得られない。さらに、サイトカイン機能の全身抑制には感染リスクの増大等の固有の問題が伴う。このように、治療の進歩にもかかわらず、長期に亘って効果的な、慢性炎症疾患の経済的な治療様式のニーズは未だ満たされていない（Smolen(2006)およびWilliams(2007)）。
【０００５】
疾患の慢性を支える機構は不明瞭なままであり、炎症性で且つ破壊性の介在物質の長期発現を駆動する因子も現在知られていない。
【０００６】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）はＲＡにおける炎症性メディエーターの産生駆動において重要な役割を果たしており、ＴＬＲ機能の遮断は臨床的に非常に有効であり得る（Brentano(2005)およびO’Neill(2002)において概説される）。この受容体ファミリーは免疫系の不可欠の部分を形成する。ＴＬＲは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）および損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の両方を認識することにより、感染および傷害に対する宿主防御を仲介する（Matzinger (2002)）。ＤＡＭＰは組織傷害時に生成される内在性の炎症誘発性分子であり、損傷または壊死した細胞から放出される細胞内分子、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子の断片または傷害時に発現増加されるＥＣＭ分子が含まれる（Bianchi(2007)およびGordon(2002)において概説される）。
【０００７】
活性化後、ＴＬＲは自然免疫反応および適応免疫応答の両方を促進し、例えば、炎症誘発性サイトカインおよびＭＭＰの発現を刺激する（Medzhitov(2002)）。ＴＬＲはＲＡ患者由来の滑膜組織において高レベルで発現されており（Radstake(2004)、Roelofs(2005)、Sacre(2007)、および（Sacre、2008に原稿投稿）  、ＴＬＲ４に標的欠失または機能喪失型変異を有するマウスは実験的関節炎から保護される（Choe(2003)およびLee(2005)  。さらに、ＴＬＲ４の阻害剤はマウスにおける破壊性関節炎を低減することができ（Abdollahi-Roodsaz(2007)）、推定上のＴＬＲ４阻害剤は、予備的な第１相試験において、中等度〜重度のＲＡを患う、２３人中１５人の患者の症状を改善した（Vanags(2006)  。しかし、どのＴＬＲリガンドが病因に関与しているかは不明である。
【０００８】
組織傷害および創傷の修復に関連するテネイシンＣ（ＴＮＣ）はＥＣＭ糖タンパク質である。テネイシンＣは、胚形成の間の組織リモデリングの活動期中に特異的に発現され、原腸形成および体節形成の間に最初に観察される。発現は、発生のより後半の段階では、乳腺および肺の分岐形態形成の部位、発達中の骨格、心血管系および上皮間葉転換部位の結合組織に限定される。これらのプロセスが終了した後、および胚形成が完了する前に、発現は下方制御される（Jones(2000)）。
【０００９】
テネイシンＣは通常、健常成人組織では発現されない。しかし、成人において、急性炎症の間に特異的且つ一過性に発現上昇され、慢性炎症においては持続的に発現される（Chiquet-Ehrismann(2003)において概説される）。テネイシンＣは正常なヒト関節においてほとんど発現されないが、ＲＡ滑膜、炎症および線維症の領域、特に滑膜表層下、浸潤性パンヌスおよび血管周辺においてはレベルが大きく増加しているということが、免疫組織化学的な研究によって示されている（Cutolo(1992)、MacCachren(1992)およびSalter(1993)）。ＲＡ患者由来の滑液（Chevalier(1994)およびHasegawa(2007)）およびＲＡ軟骨（Salter(1993)およびChevalier(1994)）においても、テネイシンＣのレベルは著しく増加している。
【００１０】
テネイシンＣは１５０万Ｄａの巨大な六量体タンパク質である。各々の鎖は、集合ドメイン（ＴＡ）、ＥＧＦ様リピート（ＥＧＦ−Ｌ）、フィブロネクチンＩＩＩ型様リピート（ＴＮＩＩＩ）およびフィブリノーゲン様球（ＦＢＧ）を含む、様々なドメインを含んでいる（Orend(2005)において概説される）。テネイシンＣおよびそのドメインの配列を図１に示す。
【００１１】
本発明者らは以前に、テネイシンＣが炎症誘発性刺激であること、並びに、テネイシンＣが、関節炎において観察される破壊性関節炎に必要とされ、慢性炎症性状態を特徴付ける炎症反応の延長に関与すること、を示した。具体的には、テネイシンＣがＴＬＲ４の内在性活性化因子であることが示され、この分子が破壊性関節炎に必要とされることが明示された（国際公開第２０１０／１０３２８９）。
【００１２】
国際公開第２０１０／１０３２８９では、関節における免疫応答の仲介においてテネイシンＣが果たす役割が、インビボでマウスにテネイシンＣのＦＢＧドメインを関節内注射して関節炎を誘導することにより示された。さらに、ザイモサンによって誘導された急性関節炎は、テネイシンＣ欠損マウスではそれほど長期に亘るものではなかった。野生型マウスおよびテネイシンＣヌルマウスの両方がザイモサンによる急性炎症誘導に同等に応答し、これにより、テネイシンＣは炎症惹起に関与していないと思われる、ということが示された。しかし、テネイシンＣヌルマウスが示した滑膜炎の持続性の低さは、関節炎の維持における役割を示している。ｍＢＳＡでの免疫化により誘導された関節炎の間、テネイシンＣの標的欠失がマウスを持続型びらん性関節炎から保護したという観察により、関節炎の遷延におけるテネイシンＣの重要性が理解された。
【００１３】
テネイシンＣは関節内の細胞を活性化することが可能であることが示され、テネイシンＣの第一活性ドメインは、この分子のＣ末端にある２２７アミノ酸（２６．９ｋＤａ）の球状ドメインであるフィブリノーゲン様球（ＦＢＧ）に位置付けられた（Siri(1991)）。
【００１４】
ＲＡ患者由来の滑膜培養物にＦＢＧを添加することにより、炎症誘発性サイトカインの自然放出が増強された。また、この添加により、ＴＬＲ４およびＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路の活性化を介して、初代ヒトマクロファージにおけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−８の合成、並びにＲＡ滑膜線維芽細胞におけるＩＬ−６の合成が刺激された。
【００１５】
ＬＰＳの場合と同じように、ＦＢＧによるサイトカイン合成の誘導にはＴＬＲ４発現が必要であることが示されている。しかし、ＬＰＳとは異なり、ＴＬＲ４活性化にはＣＤ１４もＭＤ−２も必要とされないと思われる。ＣＤ１４は他のリガンドによるＴＬＲ４の活性化に不要である。ＴＬＲ４がＭｙＤ８８依存的にリピドＡに反応することは必要ではなく（Jiang(2005)）、フィブロネクチンＥＤＡ（エクストラドメインＡ）はＣＤ１４不在化であってもマスト細胞を活性化することができ（Gondokaryono(2007)）、ヒト単球ＴＨＰ−１細胞のヒアルロン酸活性化はＴＬＲ４、ＣＤ４４およびＭＤ−２の複合体を必要とするが、ＣＤ１４を必要とはしない（Taylor(2007)）。
【００１６】
各ＴＬＲ４リガンドによる異なる受容体複合体の形成は、様々な細胞内アダプター／シグナル伝達分子の動員を促進し得る。これが、ＦＢＧおよびＬＰＳで観察された示差的な細胞応答の原因となり得る。同様に、ＴＬＲ４・ＣＤ４４複合体のヒアルロン酸活性化は、ＬＰＳと異なる、マウス肺胞マクロファージ細胞系におけるあるパターンの遺伝子発現を誘導する（Taylor(2007)）。
【００１７】
テネイシンＣの厳密に制御された発現パターンは、テネイシンＣを慢性炎症治療の魅力的な標的としている。テネイシンＣは健常成人にはほぼ存在していないが、組織傷害時に特異的に発現が誘導される。急性炎症の間、テネイシンＣは一時的に発現される。誘導はしばしば炎症に先立って起こり、炎症が回復するまでにｍＲＮＡもタンパク質も共に組織からなくなる（Chiquet-Ehrismann(2003)において概説される）。
【００１８】
テネイシンＣの持続的発現は慢性炎症と関連していることが現在では示されている。ＲＡの他に、テネイシンＣレベルの上昇は、多発性硬化症（Gutowski(1999)）およびシェーグレン疾患（Amin(2001)）を含む他の自己免疫疾患、並びに非治癒性創傷、並びに糖尿病性潰瘍および静脈性潰瘍（Loots(1998)）において観察される。テネイシンＣの新規合成は口腔粘膜の疾患における炎症の強度とよく相関しており、テネイシンＣの血漿レベルは薬物治療または外科手術の前後における炎症性腸疾患の活性に対する信頼性のある指標である（Chiquet-Ehrismann(2003)において概説される）。
【００１９】
国際公開第２０１０／１０３２８９号は、テネイシンＣの生物活性を調節する、慢性炎症反応を調節するための薬剤の用途、および慢性炎症と関連した状態の治療におけるそれらの用途について記述している。しかしながら、そのような状態に対する新規の改善された治療が、今なお求められている。
【００２０】
Clark et al. (1997)（５２）には、テネイシンについての研究が記載されており、ＦＢＧドメインに特異的な抗体が記載されている。その抗体はマウス由来であるため、治療剤としては適切ではない。さらに、その抗体は、細胞遊走の尺度と考えられている「リンパ球ローリング（lymphocyte rolling）」を妨害し、細胞活性化および炎症性サイトカイン産生を妨害しないという特性を有するとのみ記載されている。Ｃｌａｒｋによって記述された細胞ローリング活性に関与する細胞性対抗受容体は特定されなかった。細胞ローリングまたは遊走のプロセスへの関与は、ＴＬＲ４の重要な特性とは考えられておらず、またＴＬＲ４は、Ｃｌａｒｋによって、ローリング挙動に関与する有望な対抗受容体候補のリストにも含まれていない。さらに、ＦＢＧと結合する抗体の全てが、炎症性サイトカインの産生を阻害できるわけではない。本明細書に記載の抗体配列の新規の一連の特性向上は、Ｃｌａｒｋによって教示も示唆もされず、また試験もされなかった。従って、Clarkに記載される抗体が本明細書に記載の抗体と同じＦＢＧ領域に結合するということを示すものは存在せず、ＴＬＲ４はリンパ球ローリング活性に関与しているとは一般的には考えられていない（例えば、それらの有力候補リストからのその脱落により、Clarkによって）ことから、ＴＬＲ４活性に関連しているとは思われず、Clark et alによって研究された機能は本明細書に記載の新規抗体の重要な抗炎症特性には無関係である。
【００２１】
従って、テネイシンＣのＦＢＧドメインに特異的な新規の改善された抗体、特に、治療薬として有用となるために必要とされる特性を有する抗体を作製する必要性が依然として残っている。
【発明の概要】
【００２２】
本発明者らは、治療における使用に適した特性を有する抗体およびその断片、具体的には、テネイシンＣのフィブリノーゲン様球（ＦＢＧ）ドメインに対し非常に高い親和性を有し、ＦＢＧの生物活性を中和するヒト抗体、を設計した。これらの高親和性抗体は、テネイシンＣ関連障害、特に、リウマチ様関節炎（ＲＡ）を含む慢性炎症と関連したテネイシンＣ関連障害の診断または治療において抗ＦＢＧ抗体分子を使用する治療法等の、種々の治療法において有用である。前記抗体はまた、関連する診断法および予後判定法においても有用である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の第一態様において、テネイシンＣのＦＢＧドメインに結合することが可能であり、配列番号９〜１５、５、１２５、３６、３７、３０〜３５、３８〜４７、１１５〜１１８および１４０から選択される一つもしくは複数の配列；並びに／または配列番号１〜８、１２４、４８〜９１、１２８〜１３８、１１２〜１１４および１３９から選択される一つもしくは複数の配列；並びに／または配列番号５、１３、１６〜２１、１２６、１１９〜１２１および１４１から選択される一つもしくは複数の配列；並びに／または配列番号２２〜２９、１２７、１２２〜１２３および１４２から選択される一つもしくは複数の配列を含む、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される。
【００２４】
配列ＩＤ番号（配列番号）は、特定の抗体、並びに実施例９および１１に列挙される抗体関連配列を示すもの指す。明記されていない場合、「抗体」への言及は、その抗原結合性断片、誘導体またはバリアントを包含する。
【００２５】
一実施形態において、本開示による抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、ヒトの、またはヒト化された、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。
【００２６】
一実施形態において、本開示による抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、完全ヒトを含んで、ヒトまたはヒト化である。
【００２７】
一実施形態において、本開示による抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、ＴＬＲ４の活性化を中和、低減または遮断する。
【００２８】
一実施形態において、本開示による抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、本明細書に記載のアッセイにおいてＩＬ−８等のサイトカインの放出を阻害する、ヒトの、またはヒト化された、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む（例えば、完全ヒト抗体または結合断片）。
【００２９】
一実施形態において、本開示による抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、テネイシンＣのＦＢＧドメインに特異的である。すなわち、本開示による抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、テネイシンＣファミリーの他のメンバーと交差反応しない。
【００３０】
一実施形態において、本開示による抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、少なくともマウスおよび／またはラットのテネイシンＣのＦＢＧドメインと交差反応性であり、特に、原始的なテネイシンＣのＦＢＧドメインと交差反応性である。これは、ヒトへの投与前にインビボで行われる安全性および有効性の研究を可能にすることから、有力な治療薬には特に重要である。
【００３１】
一実施形態において、例えば本明細書における抗体において開示される、６つのＣＤＲ、すなわち３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲを含み、さらにヒトフレームワークを含む、本開示による抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される。
【００３２】
一実施形態において、少なくとも１００ｎＭ以上、例えば５０ｎＭ以上、例えば１ｎＭ以上の、ヒトテネイシンＣのＦＢＧドメインに対する親和性を有する、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される。親和性が高いほど数値は低くなる。
【００３３】
一実施形態において、本開示は、実施例９または１１で提供される配列表に明示的に開示された「抗体」に及ぶ。
【００３４】
一実施形態において、本明細書で開示される抗体を交差遮断（cross-block）する、または、本明細書で開示される抗体と同じエピトープと競合的に（competively）結合する、抗体、例えばヒトまたはヒト化抗体、が提供される。
【００３５】
一実施形態において、本開示の抗体は、完全長抗体型、例えばエフェクター機能無しの型、例えばＩｇＧ４型、で提供される。
【００３６】
一実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、治療における使用、特に自己免疫疾患または炎症、特に本明細書に記載される状態、における使用のためのものである。
【００３７】
本発明の第一の態様の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、従って、抗原結合性断片であり得る。抗原結合性「断片」は、Ｆｖ断片（例えば、一本鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片およびＦ（ａｂ）２断片）、単一可変ドメイン（例えば、ＶＨドメインおよびＶＬドメイン）およびドメイン抗体（単一型および二重型を含むｄＡｂ［すなわち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］）からなる群から選択され得る。
【００３８】
抗体「誘導体」および「バリアント」という用語は、抗体の断片（例えば、Ｆａｂ断片またはＦｖ断片）等の、当業者に公知のイムノアッセイ型式で抗原に結合可能なあらゆる改変抗体分子（相同体を含む）、または、別のペプチドもしくはポリペプチドへの、大型の担体タンパク質への、もしくは固相への抗体の結合を促進するための、一つもしくは複数のアミノ酸もしくは他の分子（例えば、アミノ酸のチロシン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システインおよびこれらの誘導体、特に、ＮＨ２−アセチル基またはＣＯＯＨ末端アミド基）の付加によって改変された改変抗体分子を指す。
【００３９】
バリアントは、抗体のアミノ酸配列の変化を含み得る。例えば、バリアントのアミノ酸配列は、アミノ酸配列レベルにおいて、特定の抗体と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。
【００４０】
バリアントはまた、最も一般的な天然ヒト生殖系列抗体フレームワークおよびＣＤＲ多様性を利用するために、配列変化も含み得る。これは、天然ヒト抗体に一般に見られるアミノ酸で重要な残基を目的に合わせて操作することによって、実行され得る。このアプローチは、生殖系列抗体フレームワーク配列が個体間で高度に耐容性がよいことから、ヒトにおける抗体に対する反応の可能性を最小限にする。この技術は「生殖系列化（germlining）」として知られており、得られた配列は「生殖系列化（germlined）配列」と呼ばれる。配列は完全にまたは部分的に生殖系列化され得る。本発明の抗体の生殖系列化配列の例は、実施例１１に記載される。
【００４１】
本発明の抗体は、ＴＬＲ４と結合するＦＢＧドメインに結合し、直接的に、例えば、ＴＬＲ４との結合部位を物理的に塞ぐことにより、ＴＬＲ４活性化を遮断し得る。理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、ＴＬＲ４がテネイシンＣのＦＢＧドメインと直接結合することを示す証拠を有している。このことは、テネイシンＣがＴＬＲ４の活性を増強可能であると知られていたにもかかわらず、以前に証明されていなかった。
【００４２】
あるいは、ＴＬＲ４と結合しない抗体がＦＢＧドメインの一部に結合し得、これはＴＬＲ４活性化をなお妨げ得る（アロステリック効果）；その活性を遮断している別の受容体と相互作用する抗体がＦＢＧドメインに結合し得、これはＴＬＲ４活性に影響を与えても与えなくてもよい；および／または、他のいかなる受容体にも結合しないがこの受容体の活性化をなお妨げる（アロステリック効果）抗体がＦＢＧドメインに結合し得る。
【００４３】
一実施形態において、本開示は、ＦＢＧドメインと結合するが、ＴＬＲ４の活性化および／またはサイトカイン、特にＩＬ−８等の本明細書に記載のサイトカイン、の放出を阻害しない、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントに関する。
【００４４】
全長抗体（whole antibody）ではなく、抗体断片を使用することの利点は、幾重にもある。より小さな断片サイズは、固形組織のより良好な浸透等の薬理学的特性の向上をもたらし得る。さらに、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片等の抗原結合性フラグメントは大腸菌（E. coli）内で発現され、大腸菌から分泌され得ることから、大量の前記断片の容易な生産が可能である。
【００４５】
例えばポリエチレングリコールまたは他の適切な重合体の共有結合によって修飾された、抗体およびその抗原結合性フラグメントの修飾型も、本発明の範囲内に含まれる。抗体およびその抗原結合性断片の複合体、例えば抗体−薬剤複合体、も含まれる。
【００４６】
抗体および抗体断片を作製する方法は当該技術分野において周知である。例えば、抗体は、抗体分子のインビボにおける産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング（Orlandi. et al, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837; Winter et al., 1991, Nature 349:293-299）、または培養下の細胞株によるモノクローナル抗体分子の産生を採用するいくつかの方法のうちのいずれか１つによって作製され得る。これらの方法には、限定はされないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびエプスタイン‐バーウイルス（ＥＢＶ）−ハイブリドーマ技術が含まれる（Kohler et al., 1975. Nature 256:4950497; Kozbor et al., 1985. J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole et al., 1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120）。
【００４７】
選択された抗原に対する適切なモノクローナル抗体は、公知の技術、例えば、「Monoclonal Antibodies: A manual of techniques」、H Zola (CRC Press, 1988)および「Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications」、J G R Hurrell (CRC Press, 1982)で開示された技術によって、作製され得る。
【００４８】
抗体断片は当該技術分野において周知の方法を用いて得ることができる（例えば、Harlow & Lane, 1988, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照）。例えば、本発明による抗体断片は、抗体のタンパク分解性加水分解、または前記断片をコードするＤＮＡの大腸菌もしくは哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物もしくは他のタンパク質発現系）における発現によって作製することができる。あるいは、抗体断片は、常法による全長抗体のペプシン分解またはパパイン分解によって得ることができる。
【００４９】
ヒトにおける治療または診断では、ヒト化抗体の使用が好ましいことは、当業者には理解されよう。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト抗体由来の好ましくは最小部分を有する、遺伝子改変されたキメラ抗体または抗体断片である。ヒト化抗体には、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補性決定領域が、所望の機能性を有するマウス、ウサギのラット（rat of rabbit）等の非ヒト種（ドナー抗体）の相補性決定領域に由来する残基によって置換された抗体が含まれる。ある場合では、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入された相補性決定領域またはフレームワークの配列内にも存在しない残基を含んでいてもよい。概して、ヒト化抗体は、相補性決定領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のそれらに対応しており、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てが関連ヒトコンセンサス配列のそれらに対応している、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体は、典型的にはヒト抗体由来の、Ｆｃ領域等の抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る（例えば、Jones et al., 1986. Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596を参照）。
【００５０】
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術分野において周知である。概して、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入される一つまたは複数のアミノ酸残基を有する。しばしば移入残基（imported residue）と称されるこれらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には、移入された可変ドメインから取られる。ヒト化は基本的には、記述（例えば、Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al., 1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536l；米国特許第４，８１６，５６７号を参照）の通りに、ヒト相補性決定領域を対応するげっ歯類相補性決定領域と置換することにより、実行することができる。従って、このようなヒト化抗体は、実質的にインタクトではないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応配列によって置換されているキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は典型的には、いくつかの相補性決定領域残基および場合によってはいくつかのフレームワーク残基がげっ歯類抗体内の類似部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体であり得る。
【００５１】
本明細書で明示的に開示される抗体のＣＤＲはヒト由来である。ヒト由来は通常非ヒト由来の抗体よりも免疫原性が低いことため、これは利点である。
【００５２】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む当該技術分野において公知の種々の技術を用いることで特定することもできる（例えば、Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Cole et al., 1985, In: Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77; Boerner et al., 1991. J. Immunol. 147:86-95を参照）。
【００５３】
一実施形態において、本明細書で開示される抗体由来のＣＤＲ（例えば、６つのＣＤＲ）または可変領域を含む、抗体または抗原結合性断片が提供される。抗体または抗原結合性断片はキメラ体であってもよい。キメラ抗体は、非ヒト種（例えばマウス、ラット、サル等）由来の断片、例えば、フレームワークおよび／または定常領域を含む。これは、例えばインビボでの安全性および／または有効性研究で使用するための、平行試薬（parallel reagent）の調製に使用され得る。
【００５４】
適切な抗体が得られた後、前記抗体は、例えばＥＬＩＳＡによって、活性について試験され得る。
【００５５】
本発明の第一の態様の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、以下を含む：配列番号９〜１１、５、１３〜１４、３６、３０、３２、３４、３８、４０、４２、４４、４６、１１６および１１８から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ配列；および／または配列番号１〜３、５〜７、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、１３５、８８、９０および１１４から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ配列；および／または配列番号１６〜１８、５、１３、２０および１２１から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ配列；並びに／または配列番号２２〜２４および２６〜２８から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ配列。
【００５６】
「ＣＤＲ」とは、インタクトな免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖または可変軽（ＶＬ）鎖に存在する相補性決定領域を指す。３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、完全免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の両方の可変ドメイン上に存在する。ＣＤＲは、重鎖および軽鎖の両方においてＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と番号を付けられる。例えば、ＶＨ鎖はＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＶＬ鎖もまたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
【００５７】
本明細書に記載の各ＣＤＲ領域へのアミノ酸の割当は、Kabat EA et al. 1991, In "Sequences of Proteins of Immunological Interest" Fifth Edition, NIH Publication No. 91-3242, pp xv-xviiによる定義に従う。
【００５８】
従って、６つのＣＤＲ配列が抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントに含まれることが最も好ましい。しかし、より少ないＣＤＲ配列（例えば、わずか１つ）が、例えば一本鎖抗体断片に、含まれてもよい。
【００５９】
さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、以下を含む：配列番号１１、１４、３６、３０、３２、３４、３８、４０、４２、４４および４６から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ３配列；および／または配列番号３、７、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、１３５、８８および９０から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ３配列；および／または配列番号１８および２０から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ３配列；並びに／または配列番号２４および２８から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ３配列。
【００６０】
上記のように、「ＣＤＲ３」は、完全長可変重（ＶＨ）または完全長可変軽（ＶＬ）抗体鎖のいずれかに存在する３番目のＣＤＲを指す。
【００６１】
一実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号１１、３６、３０および３４から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ３配列；および／または配列番号３、５４、６６および７０から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ３配列；並びに／または配列番号７、７６、８８および９０から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ３配列。
【００６２】
特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号３、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および７０から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；配列番号３、５４、６６および７０から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；または配列番号３および５４から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列。
【００６３】
別の特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号７、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、１３５、８８および９０から選択されるＶＬ  ＣＤＲ３配列；配列番号７、７６、８８および９０から選択されるＶＬ  ＣＤＲ３配列；または配列番号７のＶＬ  ＣＤＲ３配列。
【００６４】
さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは配列番号４または１１２の配列を含むＶＨ配列を含み、前記ＶＨ配列は、配列番号４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および７０から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；配列番号５４、６６および７０から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；または配列番号５４のＶＨ  ＣＤＲ３配列で置換されたＣＤＲ３配列を含む。
【００６５】
「置換された」とは、ＶＨ配列のＣＤＲ３配列が除去され、別のＣＤＲ３配列（指定された）がその場所に含まれることを意味する。
【００６６】
この特定の文脈において、「置換された」とは、ＶＨ配列  配列番号４または１１２のＣＤＲ３配列が配列から除去され、別のＣＤＲ３配列（指定された）がその場所に含まれることを意味する。言い換えれば、配列番号３（配列番号４および１１２のＣＤＲ３配列である）が、別のＣＤＲ３配列（指定された）と置換される。
【００６７】
所望により、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、配列番号８、１２４、１１３または１３９の配列を含むＶＬ配列を含み、前記ＶＬ配列は、配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、１３５、８８および９０から選択されるＶＬ  ＣＤＲ３配列；または配列番号７６、８８および９０から選択されるＶＬ  ＣＤＲ３配列と置換されたＣＤＲ３配列を含む。
【００６８】
この特定の文脈において、「置換された」とは、ＶＬ配列  配列番号８、１２４、１１３または１３９のＣＤＲ３配列が配列から除去され、別のＣＤＲ３配列（指定された）がその場所に含まれることを意味する。言い換えれば、配列番号７（配列番号８、１２４、１１３および１３９のＣＤＲ３配列である）が、別のＣＤＲ３配列（指定された）と置換される。
【００６９】
さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号１１、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；配列番号１１、３０、３４および３６から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；または配列番号１１、３０および３６から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列。
【００７０】
一実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、配列番号１５、１２５、１１７または１４０の配列を含むＶＬ配列を含む。
【００７１】
別の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、配列番号１２または配列番号１１５の配列を含むＶＨ配列を含み、前記ＶＨ配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；配列番号３０、３４および３６から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；または配列番号３０および３６から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列で置換されたＣＤＲ３配列を含む。
【００７２】
この特定の文脈において、「置換された」とは、ＶＨ配列  配列番号１２または１１５のＣＤＲ３配列が配列から除去され、別のＣＤＲ３配列（指定された）がその場所に含まれることを意味する。言い換えれば、配列番号１１（配列番号１２および１１５のＣＤＲ３配列である）が、別のＣＤＲ３配列（指定された）と置換される。
【００７３】
特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、配列番１４のＶＬ  ＣＤＲ３配列並びに配列番号：１１および３０〜４６から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列を含む；または、配列番７のＶＬ  ＣＤＲ３配列並びに配列番号３および４８〜７０から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列を含む；または、配列番号３のＶＨ  ＣＤＲ３配列並びに配列番号７および７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、１３５、８８および９０から選択されるＶＬ  ＣＤＲ３配列を含む；または、配列番号１８のＶＨ  ＣＤＲ３配列並びに配列番２０のＶＬ  ＣＤＲ３配列を含む；または、配列番号２４のＶＨ  ＣＤＲ３配列および配列番２８のＶＬ  ＣＤＲ３配列を含む。
【００７４】
抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含むことが好ましい：
【００７５】
配列番号１〜３、および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、４８および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、５０および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、５２および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、５４および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、５６および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、５８および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、６０および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、６２および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、６４および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、６６および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、６８および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、７０および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または
【００７６】
配列番号１〜３、５、６および７２から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５〜６および７４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および７６から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および７８から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および８０から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および８２から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および８４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および８６から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および１３５から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および８８から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および９０から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、７および１１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ；または
【００７７】
配列番号９〜１１および５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１０、３０、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１０、３２、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１０、３４、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１０、３６、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１０、３８、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１０、４０、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１０、４２、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１０、４４、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１０、４６、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または番号９、１１、１１６、５、１４および１１８から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または
【００７８】
配列番号１６〜１８および５、１３および２０から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１６〜１８および５、１２１および２０から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号２２〜２４および２６〜２８から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列。
【００７９】
これらの配列群のそれぞれは、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３領域の配列に対応する。
【００８０】
抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、上記で列挙された群の１つから選択されるＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つのを含み得る。抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、上記で列挙された群の１つから選択される少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲ配列を含むことが好ましい。抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、上記で列挙された群の１つから選択される少なくとも３つまたは少なくとも６つのＣＤＲ配列を含むことがより好ましい。抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、上記で列挙された群の１つから選択される少なくとも６つのＣＤＲ配列を含むことが最も好ましい。
【００８１】
所望により、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号：１〜３から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号１、２および４８から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号１、２および５０から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号１、２および５２から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号１、２および５４から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号１、２および５６から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号１、２および５８から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号１、２および６０から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号１、２および６２から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号１、２および６４から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号１、２および６６から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号１、２および６８から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号１、２および７０から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または
【００８２】
配列番号：９〜１１から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１０および３０から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１０および３２から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１０および３４から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１０および３６から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１０および３８から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１０および４０から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１０および４２から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１０および４４から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１０および４６から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または
【００８３】
配列番号９、１１６および１１から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１１６および３０から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１１６および３２から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１１６および３４から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１１６および３６から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１１６および３８から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１１６および４０から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１１６および４２から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１１６および４４から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号９、１１６および４６から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または
【００８４】
配列番号：１６〜１８から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列；または配列番号：２２〜２４から選択される少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲ配列。
【００８５】
これらの配列群のそれぞれは、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の配列に対応する。
【００８６】
抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、上記で列挙された群の１つから選択されるＶＨ  ＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つのを含み得る。抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、上記で列挙された群の１つから選択される少なくとも１、２または３つのＶＨ  ＣＤＲ配列を含むことが好ましい。抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、上記で列挙された群の１つから選択される少なくとも３つのＶＨ  ＣＤＲ配列を含むことが最も好ましい。
【００８７】
所望により、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号：５〜７から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、６および７２から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５〜６および７４から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、６および７６から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、６および７８から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、６および８０から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、６および８２から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、６および８４から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、６および８６から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、６および１３５から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、６および８８から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、６および９０から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または
【００８８】
配列番号５、１１４および７から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、１１４および７２から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、１１４および７４から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、１１４および７６から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、１１４および７８から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、１１４および８０から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、１１４および８２から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、１１４および８４から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、１１４および８６から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、１１４および８８から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、１１４および９０から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または
【００８９】
配列番号５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、１１８および１４から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または
【００９０】
配列番号５、１３および２０から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号５、１２１および２０から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列；または配列番号：２６〜２８から選択される少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲ配列。
【００９１】
これらの配列群のそれぞれは、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の配列に対応する。
【００９２】
抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、上記で列挙された群の１つから選択されるＶＬ  ＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つのを含み得る。抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、上記で列挙された群の１つから選択される少なくとも１、２または３つのＶＬ  ＣＤＲ配列を含むことが好ましい。抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、上記で列挙された群の１つから選択される少なくとも３つのＶＬ  ＣＤＲ配列を含むことが最も好ましい。
【００９３】
特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号３および５４から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；または配列番号１１、３０および３６から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列。
【００９４】
別の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、以下を含むＶＨ配列および／またはＶＬ配列を含む：配列番号１２、１５、１２５、３７、３１、３３、３５、３９、４１、４３、４５、４７、１１５、１１７および１４０から選択される一つもしくは複数の配列；および／または配列番号４、８、１２４、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、１２８、７５、１２９、７７、１３０、７９、１３１、８１、１３２、８３、１３３、８５、１３４、８７、１３６、８９、１３７、９１、１３８、１１２、１１３および１３９から選択される一つもしくは複数の配列；および／または配列番号１９、２１、１２６、１１９、１２０および１４１から選択される一つもしくは複数の配列；並びに／または配列番号２５、２９、１２７、１２２、１２３および１４２から選択される一つもしくは複数の配列。
【００９５】
所望により、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントのＶＨ配列は、配列番号１２、３７、３１、３３、３５、３９、４１、４３、４５、４７および１１５から選択される；並びに／または、配列番号４、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１および１１２から選択される；並びに／または、配列番号１９および１１９から選択される；並びに／または、配列番号２５および１２２から選択される。
【００９６】
所望により、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントのＶＬ配列は、配列番号１５、１２５、１１７および１４０から選択される；並びに／または、配列番号８、１２４、７３、１２８、７５、１２９、７７、１３０、７９、１３１、８１、１３２、８３、１３３、８５、１３４、８７、１３６、８９、１３７、９１、１３８、１１３および１３９から選択される；並びに／または、配列番号２１、１２６、１２０および１４１から選択される；並びに／または、配列番号２９、１２７、１２３および１４２から選択される。
【００９７】
特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、以下の配列対から選択される、ＶＨおよびＶＬ配列対の配列を含むＶＨ配列およびＶＬ配列の両方を含む：配列番号１２、および１５または１２５；配列番号１１５、および１５または１２５；配列番号１２、および１１７または１４０；配列番号３７、および１５または１２５；配列番号３７、および１１７または１４０；配列番号３１、および１５または１２５；配列番号３３、および１５または１２５；配列番号３５、および１５または１２５；配列番号３９、および１５または１２５；配列番号４１、および１５または１２５；配列番号４３、および１５または１２５；配列番号４５、および１５または１２５；配列番号４７、および１５または１２５；配列番号３１、および１１７または１４０；配列番号３３、および１１７または１４０；配列番号３５、および１１７または１４０；配列番号３９、および１１７または１４０；配列番号４１、および１１７または１４０；配列番号４３、および１１７または１４０；配列番号４５、および１１７または１４０；配列番号４７、および１１７または１４０；並びに、配列番号１１５、および１１７または１４０；あるいは、
【００９８】
以下の配列対から選択される：配列番号４、および８または１２４；配列番号４９、および８または１２４；配列番号５１、および８または１２４；配列番号５３、および８または１２４；配列番号５５、および８または１２４；配列番号５７、および８または１２４；配列番号５９、および８または１２４；配列番号６１、および８または１２４；配列番号６３、および８または１２４；配列番号６５、および８または１２４；配列番号６７、および８または１２４；配列番号６９、および８または１２４；配列番号７１、および８または１２４；配列番号１１２、および８または１２４；配列番号４、および１１３または１３９；配列番号４９、および１１３または１３９；配列番号５１、および１１３または１３９；配列番号５３、および１１３または１３９；配列番号５５、および１１３または１３９；配列番号５７、および１１３または１３９；配列番号５９、および１１３または１３９；配列番号６１、および１１３または１３９；配列番号６３、および１１３または１３９；配列番号６５、および１１３または１３９；配列番号６７、および１１３または１３９；配列番号６９、および１１３または１３９；配列番号７１、および１１３または１３９；配列番号４、および７３または１２８；配列番号４、および７５または１２９；配列番号４、および７７または１３０；配列番号４、および７９または１３１；配列番号４、および８１または１３２；配列番号４、および８３または１３３；配列番号４、および８５または１３４；配列番号４、および８７または１３６；配列番号４、および８９または１３７；配列番号４、および９１または１３８；配列番号１１２、および７３または１２８；配列番号１１２、および７５または１２９；配列番号１１２、および７７または１３０；配列番号１１２、および７９または１３１；配列番号１１２、および８１または１３２；配列番号１１２、および８３または１３３；配列番号１１２、および８５または１３４；配列番号１１２、および８７または１３６；配列番号１１２、および８９または１３７；配列番号１１２、および９１または１３８；並びに、配列番号１１２、および１１３または１３９；あるいは、
【００９９】
以下の配列対から選択される：配列番号１９、および２１または１２６；配列番号１９、および１２０または１４１；配列番号１１９、および２１または１２６；並びに、配列番号１１９、および１２０または１４１；あるいは、
【０１００】
以下の配列対から選択される：配列番号２５、および２９または１２７；配列番号２５、および１２３または１４２；配列番号１２２、および２９または１２７；並びに、配列番号１２２、および１２３または１４２。
【０１０１】
言い換えれば、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントのＶＨ配列およびＶＬ配列は、特定の配列対のＶＨ配列およびＶＬ配列を含み、すなわち、各対は特定のＶＨ配列および２つの特定のＶＬ配列のうちの１つから構成される。
【０１０２】
好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、配列番号４、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１および１１２から選択される配列を含むＶＨ配列を含む。
【０１０３】
別の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、配列番号８、１２４、７３、１２８、７５、１２９、７７、１３０、７９、１３１、８１、１３２、８３、１３３、８５、１３４、８７、１３６、８９、１３７、９１、１３８、１１３および１３９から選択される配列を含むＶＬ配列を含む。
【０１０４】
一実施形態において、例えば、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号３または４８または５０または５２または５４または５６または５８または６０または６２または６４または６６または６８または７０のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７または７２または７４または７６または７８または８０または８２または８４または８６または８８または９０または１３５のＣＤＲＬ３。この命名法を用いると、例えば「ＣＤＲＨ１」はＶＨ鎖ＣＤＲ１を意味する。
【０１０５】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号３のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７のＣＤＲＬ３。
【０１０６】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号４８のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７のＣＤＲＬ３。
【０１０７】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号５０のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７のＣＤＲＬ３。
【０１０８】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号５２のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７のＣＤＲＬ３。
【０１０９】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号５４のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７のＣＤＲＬ３。
【０１１０】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号５６のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７のＣＤＲＬ３。
【０１１１】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号５８のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７のＣＤＲＬ３。
【０１１２】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号６０のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７のＣＤＲＬ３。
【０１１３】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号６２のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７のＣＤＲＬ３。
【０１１４】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号６４のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７のＣＤＲＬ３。
【０１１５】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号６６のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７のＣＤＲＬ３。
【０１１６】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号６８のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７のＣＤＲＬ３。
【０１１７】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号７０のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７のＣＤＲＬ３。
【０１１８】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号３のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７２のＣＤＲＬ３。
【０１１９】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号３のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７４のＣＤＲＬ３。
【０１２０】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号３のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７６のＣＤＲＬ３。
【０１２１】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号３のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号７８のＣＤＲＬ３。
【０１２２】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号３のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号８０のＣＤＲＬ３。
【０１２３】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号３のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号８２のＣＤＲＬ３。
【０１２４】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号３のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号８４のＣＤＲＬ３。
【０１２５】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号３のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号８６のＣＤＲＬ３。
【０１２６】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号３のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号８８のＣＤＲＬ３。
【０１２７】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号３のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号９０のＣＤＲＬ３。
【０１２８】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号３のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号６のＣＤＲＬ２、および配列番号１３５のＣＤＲＬ３。
【０１２９】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号９のＣＤＲＨ１、配列番号１０のＣＤＲＨ２、配列番号１１または３０または３２または３４または３８または４０または４２または４４または４６のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号１３のＣＤＲＬ２、および配列番号１４のＣＤＲＬ３。
【０１３０】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号９のＣＤＲＨ１、配列番号１０のＣＤＲＨ２、配列番号１１のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号１３のＣＤＲＬ２、および配列番号１４のＣＤＲＬ３。
【０１３１】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号９のＣＤＲＨ１、配列番号１０のＣＤＲＨ２、配列番号３０のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号１３のＣＤＲＬ２、および配列番号１４のＣＤＲＬ３。
【０１３２】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号９のＣＤＲＨ１、配列番号１０のＣＤＲＨ２、配列番号１１のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号１３のＣＤＲＬ２、および配列番号１４のＣＤＲＬ３。
【０１３３】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号９のＣＤＲＨ１、配列番号１０のＣＤＲＨ２、配列番号３２のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号１３のＣＤＲＬ２、および配列番号１４のＣＤＲＬ３。
【０１３４】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号９のＣＤＲＨ１、配列番号１０のＣＤＲＨ２、配列番号３４のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号１３のＣＤＲＬ２、および配列番号１４のＣＤＲＬ３。
【０１３５】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号９のＣＤＲＨ１、配列番号１０のＣＤＲＨ２、配列番号３８のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号１３のＣＤＲＬ２、および配列番号１４のＣＤＲＬ３。
【０１３６】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号９のＣＤＲＨ１、配列番号１０のＣＤＲＨ２、配列番号４０のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号１３のＣＤＲＬ２、および配列番号１４のＣＤＲＬ３。
【０１３７】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号９のＣＤＲＨ１、配列番号１０のＣＤＲＨ２、配列番号４２のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号１３のＣＤＲＬ２、および配列番号１４のＣＤＲＬ３。
【０１３８】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号９のＣＤＲＨ１、配列番号１０のＣＤＲＨ２、配列番号４４のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号１３のＣＤＲＬ２、および配列番号１４のＣＤＲＬ３。
【０１３９】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号９のＣＤＲＨ１、配列番号１０のＣＤＲＨ２、配列番号４６のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号１３のＣＤＲＬ２、および配列番号１４のＣＤＲＬ３。
【０１４０】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号１６のＣＤＲＨ１、配列番号１７のＣＤＲＨ２、配列番号１８のＣＤＲＨ３、配列番号５のＣＤＲＬ１、配列番号１３のＣＤＲＬ２、および配列番号２０のＣＤＲＬ３。
【０１４１】
一実施形態において、以下を含むヒト可変領域を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントが提供される：配列番号２２のＣＤＲＨ１、配列番号２３のＣＤＲＨ２、配列番号２４のＣＤＲＨ３、配列番号２６のＣＤＲＬ１、配列番号２７のＣＤＲＬ２、および配列番号２８のＣＤＲＬ３。
【０１４２】
さらなる好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、配列番号４または１１２の配列を含むＶＨ配列を含む。
【０１４３】
別の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、配列番号５５の配列を含むＶＨ配列を含む。
【０１４４】
さらなる好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、配列番号１２、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７および１１５から選択される配列を含むＶＨ配列を含む。
【０１４５】
別の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、配列番号１２または１１５の配列を含むＶＨ配列を含む。
【０１４６】
別の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、配列番号３１の配列を含むＶＨ配列を含む。
【０１４７】
別の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、配列番号３７の配列を含むＶＨ配列を含む。
【０１４８】
所望により、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、配列番号８、１２４、１１３または１３９の配列を含むＶＬ配列をさらに含む。
【０１４９】
所望により、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは配列番号４または１１２の配列を含むＶＨ配列をさらに含む。
【０１５０】
所望により、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、配列番号１５、１２５、１１７または１４０の配列を含むＶＬ配列をさらに含む。
【０１５１】
好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号３７の配列を含むＶＨ配列；および配列番号１５の配列を含むＶＬ配列。
【０１５２】
好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号３７の配列を含むＶＨ配列；および配列番号１２５の配列を含むＶＬ配列。
【０１５３】
好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号３１の配列を含むＶＨ配列；および配列番号１５の配列を含むＶＬ配列。
【０１５４】
好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号３１の配列を含むＶＨ配列；および配列番号１２５の配列を含むＶＬ配列。
【０１５５】
好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号５５の配列を含むＶＨ配列：および配列番号８の配列を含むＶＬ配列。
【０１５６】
好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号５５の配列を含むＶＨ配列：および配列番号１２４の配列を含むＶＬ配列。
【０１５７】
好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号４の配列を含むＶＨ配列：および配列番号８の配列を含むＶＬ配列。
【０１５８】
好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号４の配列を含むＶＨ配列：および配列番号１２４の配列を含むＶＬ配列。
【０１５９】
好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号１２の配列を含むＶＨ配列；および配列番号１５の配列を含むＶＬ配列。
【０１６０】
好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号１２の配列を含むＶＨ配列；および配列番号１２５の配列を含むＶＬ配列。
【０１６１】
好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号１９の配列を含むＶＨ配列：および配列番号２１の配列を含むＶＬ配列。
【０１６２】
好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号１９の配列を含むＶＨ配列：および配列番号１２６の配列を含むＶＬ配列。
【０１６３】
好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号２５の配列を含むＶＨ配列；および配列番号２９の配列を含むＶＬ配列。
【０１６４】
好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号２５の配列を含むＶＨ配列；および配列番号１２７の配列を含むＶＬ配列。
【０１６５】
別の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号９の配列に対応するＶＨ  ＣＤＲ１配列；配列番号１０または配列番号１１６の配列に対応するＶＨ  ＣＤＲ２配列；配列番号５の配列に対応するＶＬ  ＣＤＲ１配列；配列番号１３または配列番号１１８の配列に対応するＶＬ  ＣＤＲ２配列；配列番号１４の配列に対応するＶＬ  ＣＤＲ３配列；および配列番号：１１、３６、３０、３２、３４、３８、４０、４２、４４または４６から選択される配列に対応するＶＨ  ＣＤＲ３配列。ＶＨ  ＣＤＲ３配列は配列番号１１または配列番号３６の配列に対応することが好ましい。ＶＨ  ＣＤＲ３配列は配列番号３６の配列に対応することがさらにより好ましい。
【０１６６】
別の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは以下を含む：配列番号１の配列に対応するＶＨ  ＣＤＲ１配列；配列番号２の配列に対応するＶＨ  ＣＤＲ２配列；配列番号５の配列に対応するＶＬ  ＣＤＲ１配列；配列番号６または配列番号１１４の配列に対応するＶＬ  ＣＤＲ２配列；配列番号７の配列に対応するＶＬ  ＣＤＲ３配列；および配列番号：３、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８または７０から選択される配列に対応するＶＨ  ＣＤＲ３配列。ＶＨ  ＣＤＲ３配列は配列番号３または配列番号５４の配列に対応することが好ましい。ＶＨ  ＣＤＲ３配列は配列番号５４の配列に対応することがさらにより好ましい。
【０１６７】
末端残基が本明細書で開示される軽鎖可変領域配列におけるアルギニン（Ｒ）である場合、それが定常領域の最初のアミノ酸であることは、当業者には明らかである。従って、一実施形態において、末端残基（それが定常領域由来のアルギニン（Ｒ）である場合）が存在しない軽鎖可変領域配列が提供される。
【０１６８】
本発明の第一の態様の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、テネイシンＣの転写、翻訳および／または結合特性を変化させることにより、テネイシンＣの生物活性を調節し得る。
【０１６９】
このような抗体は、例えば以下の、当該技術分野において周知の方法を用いることで特定され得る：
【０１７０】
（ａ）  例えばサザンブロッティングもしくは関連のハイブリダイゼーション法による、テネイシンＣの発現レベルに対する試験抗体の影響の測定；
（ｂ）  例えば抗テネイシンＣ抗体を用いたイムノアッセイによる、テネイシンＣタンパク質のレベルに対する試験抗体の影響の測定；並びに
（ｃ）  例えば実施例の方法による、機能的マーカー、すなわちテネイシンＣ活性の結果に対する試験抗体の影響の測定。
【０１７１】
本発明の第一の態様の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、テネイシンＣの生物活性を下方制御し得る。
【０１７２】
本発明の第一の態様の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、テネイシンＣの生物活性を上方制御し得る。免疫性および炎症性の分子および細胞の上方制御活性の望ましさは、免疫不全および炎症性の患者に対する治療の作製、並びにワクチンの開発と関連している（Harandi(2009)を参照）。
【０１７３】
本発明の第一の態様の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、テネイシンＣの転写の阻害剤であり得る。
【０１７４】
本発明の第一の態様の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、テネイシンＣの翻訳の阻害剤であり得る。
【０１７５】
本発明の第一の態様の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、テネイシンＣの結合特性の阻害剤であり得る。例えば、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、テネイシンＣの高次構造を、テネイシンＣがその受容体（複数可）に結合できないように変化させ得る。
【０１７６】
本発明の第一の態様の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、テネイシンＣの競合的結合阻害剤であり得る。当業者には理解されることであるが、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、直接的に（テネイシンＣ受容体拮抗薬として機能することにより）、または間接的に（中間分子または補助分子と結合することにより）、テネイシンＣ受容体の機能を遮断することによっても、テネイシンＣの生物活性を阻害し得る。
【０１７７】
本発明の第一の態様の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、ＴＬＲ−４受容体の拮抗薬であり得る。ＴＬＲ４の拮抗薬には、間接的な拮抗作用が含まれる。その抗原結合性断片、誘導体またはバリアントは、ＴＬＲ４のテネイシンＣ活性化、またはあらゆる他の受容体のテネイシンＣ活性化も、妨げ得る。
【０１７８】
当業者には理解されることであるが、本発明の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントによるテネイシンCの生物活性の阻害は、全体的または部分的であり得る。例えば、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、テネイシンＣの生物活性を、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントに暴露されていない炎症性細胞上でのテネイシンＣの生物活性と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％、最も好ましくは１００％阻害し得る。
【０１７９】
本発明の第一の態様の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体から選択され得る。
【０１８０】
抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、テネイシンＣの活性部位に実質的に可逆的にまたは実質的に不可逆的に結合し得る。さらなる例では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、リガンドまたは受容体へのテネイシンＣの結合を妨げるように、活性部位ではないテネイシンＣの一部に結合し得る。さらに別の例では、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、アロステリック効果によってタンパク質の活性を低減するように、テネイシンＣの一部に結合し得る。このアロステリック効果は、テネイシンＣの活性の自然調節、例えば、「上流活性化配列」によるテネイシンＣの活性化、に関与しているアロステリック効果であり得る。
【０１８１】
試験抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントとテネイシンＣとの間の相互作用を検出するための方法は当該技術分野において周知である。
【０１８２】
例えば、イオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ法または他の物理的方法および分析法を用いた限外濾過が使用され得る。さらに、蛍光共鳴エネルギー転移（Fluorescence Energy Resonance Transfer）（ＦＲＥＴ）法が使用され得、この方法では、２つの蛍光標識された独立体の結合性が、互いにすぐそばにある場合の蛍光標識同士の相互作用を測定することにより測定され得る。
【０１８３】
高分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質およびリン脂質）に対するポリペプチドの結合性を検出する別の方法としては、例えばPlant et al., 1995, Analyt Biochem 226(2), 342-348に記載される、表面プラズモン共鳴アッセイが挙げられる。方法では、標識された（例えば放射性標識または蛍光標識を有する）ポリペプチドが利用される。
【０１８４】
ポリペプチドに結合することが可能な抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントを特定するさらなる方法は、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントに暴露され、前記ポリペプチドへの前記化合物のあらゆる結合が検出および／または測定される方法である。ポリペプチドに対する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントの結合の結合定数が決定され得る。ポリペプチドへの抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントの結合を検出および／または測定（定量化）するのに適した方法は当業者に周知であり、例えば、ハイスループット操作（例えばチップを用いた方法）が可能な方法を用いて実行され得る。ＶＬＳＩＰＳ（商標）と呼ばれる新技術により、数十万以上の異なる分子プローブを含有する極小チップの生産が可能となった。これらの生物学的チップまたはアレイは、アレイ内に配列されたプローブを有し、各プローブには特定の位置が指定されている。各位置が例えば１０ミクロンの規模を有する生物学的チップが生産されている。前記チップを用いることで、標的分子がチップ上のプローブのいずれかと相互作用するかどうかを判定することができる。選択された試験条件下でアレイを標的分子に暴露した後、走査装置がアレイ内の各位置を調べ、標的分子がその位置のプローブと相互作用しているかどうかを判定し得る。
【０１８５】
テネイシンＣに対して結合親和性を有する抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントを特定する別の方法は酵母ツーハイブリッド法であり、この方法では、本発明のポリペプチドを用いることで、テネイシンＣと結合するタンパク質を「捕捉」することができる。酵母ツーハイブリッド法はFields & Song, Nature 340:245-246 (1989)に記載されている。
【０１８６】
抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、抗体を模倣した高親和性分子（いわゆる、「アフィボディ（affibody）」）であり得る（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号およびwww.affibody.seを参照）。これらのリガンドは、プロテインＡ（黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来する表面タンパク質）のＩｇＧ結合ドメインのうちの１つの足場に基づいた３ヘリックスバンドルから構成される、小さく単純なタンパク質である。この足場は親和性リガンドとして優れた性質を有しており、あらゆる所与の標的タンパク質に高い親和性で結合するように設計することができる。
【０１８７】
本発明の第一の態様の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）もしくは他の受容体、Ｔｏｌｌ様受容体４の補助受容体、またはそれらの他の受容体の補助受容体のテネイシンＣ活性化を妨げ得る。
【０１８８】
ＴＬＲ４等の一次受容体に対する補助受容体は、リガンドの認識および結合を促進し、受容体結合から生じる生物学的プロセスを開始／維持するために、一次受容体へのシグナル伝達分子の結合を補助する。
【０１８９】
本発明の第一の態様の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、好ましくは、テネイシンＣのＦＢＧドメインに対する特異性を有し得る。
【０１９０】
本発明の第二の態様において、本発明の第一の態様において定義された抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、並びに薬剤的に許容できる担体、賦形剤および／または希釈剤を含む組成物が提供される。
【０１９１】
当業者には理解されることであるが、このような有効量の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントまたはその製剤は、単回ボーラス投与（すなわち、急性投与）として、または、より好ましくは、長期の一連の投与（すなわち、慢性投与）として、送達され得る。
【０１９２】
本発明の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、使用されている化合物の有効性／毒性およびそれが使用されている適応症に応じて、種々の濃度で製剤化することができる。製剤は、本発明の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントを、０．１μＭ〜１ｍＭ、より好ましくは１μＭ〜１００μＭ、５μＭ〜５０μＭ、１０μＭ〜５０μＭ、２０μＭ〜４０μＭ、最も好ましくは約３０μＭの濃度で含むことが好ましい。あるいは、６０μＭ〜７０μＭ、好ましくは約６７μＭ。インビトロ適用においては、製剤はより低濃度（例えば０．００２５μＭ〜１μＭ）の本発明の化合物を含み得る。
【０１９３】
当業者には理解されることであるが、本発明の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、概して、予定された投与経路および標準的薬務に関して選択された適切な医薬品賦形剤  希釈剤または担体と混合して投与されることになる（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995, Ed. Alfonso Gennaro, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USAを参照）。
【０１９４】
例えば、本発明の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、即効型、緩効型または徐放型の適用のために、香味剤または着色剤を含有していてもよい錠剤、カプセル剤、膣坐剤（ovules）、エリキシル剤、水剤または懸濁剤の形態で、経口投与、頬側投与または舌下投与することができる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは海綿体注射（intracavernosal injection）により投与されてもよい。
【０１９５】
このような錠剤は、微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびグリシン等の賦形剤、デンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、グリコール酸デンプンナトリウム（sodium starch glycollate）、クロスカルメロースナトリウムおよびある種の複合ケイ酸塩等の崩壊剤、並びに、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシ−プロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチンおよびアカシア等の造粒結合剤を含んでいてもよい。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよび滑石等の滑沢剤が含まれていてもよい。
【０１９６】
同じような種類の固体組成物をゼラチンカプセル内の充填剤として使用してもよい。これに関して好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁剤および／またはエリキシル剤において、本発明の化合物は、種々の甘味剤もしくは芳香剤、着色剤または色素と、乳化剤および／または懸濁化剤と、並びに、水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリン等の希釈剤並びにこれらの組合せと、組み合わされてもよい。
【０１９７】
本発明の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、非経口的に、例えば、静脈内、関節内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内または皮下に投与することもでき、あるいは、本発明の薬剤は点滴法によって投与されてもよい。本発明の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに充分な塩またはグルコースを含有していてもよい無菌水溶液の形態で、最も良好に使用される。前記水溶液は、必要であれば、適切に緩衝化（好ましくはｐＨ３〜９に）されるべきである。無菌条件下での適切な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に達成される。
【０１９８】
非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および製剤を予定受容者の血液と等張にする溶質を含有していてもよい水性および非水性の無菌注射液；並びに懸濁化剤および粘稠化剤を含んでいてもよい水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられる。製剤は単位投与または多回投与用の容器（例えば、密封されたアンプルおよびバイアル）内で提供されてもよく、使用の直前に無菌液体担体（例えば、注射用蒸留水）の添加のみを必要とする凍結乾燥された状態で貯蔵されてもよい。即席の注射液および懸濁液は、前述のような無菌の散剤、粒剤および錠剤から調製されてもよい。
【０１９９】
例となるアプローチ：
１）水性製剤中の凝集を阻害するために加えられる、緩衝液および界面活性剤（通常はＴｗｅｅｎ）等の賦形剤。
２）凝固様塊（cake）に容積、安定性および美容的魅力（cosmetic appeal）を与えるための適切な賦形剤による凍結乾燥。
３）トレハロース等の化合物を用いたガラス状の星（glassy star）の形成。
【０２００】
ヒト患者に対する経口投与および非経口投与、または他の投与経路において、本発明の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントの一日投与量レベルは、通常、成人１人当たり１〜１０００ｍｇ（すなわち、約０．０１５〜１５ｍｇ／ｋｇ）となり、単一用量または分割用量で投与されることになる。
【０２０１】
一例として、投与量レベルは約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであり得、投与計画は週に２または３回であり得、投与は静脈内投与であり得る。
【０２０２】
本発明の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、鼻腔内に、または吸入によって投与することもでき、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロ−メタン、ジクロロテトラフルオロ−エタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４Ａ３  もしくは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７ＥＡ３）、二酸化炭素または他の適切な気体を用いて、加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーから、ドライパウダー吸入器またはエアロゾルスプレー形（aerosol spray presentation）の形式で送達されることが好都合である。加圧エアロゾルの場合、計量された量を送達する弁を備えることにより、投与単位が決定されてもよい。加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーは、例えば、エタノールおよび噴霧剤の混合物を溶媒として用いる活性抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントの溶液または懸濁液を含有していてもよく、さらに、滑沢剤（例えば、ソルビタントリオレエート）を含有していてもよい。吸入器または吹入れ器で用いるカプセル剤およびカートリッジ剤（例えば、ゼラチン製）は、本発明の化合物およびラクトースまたはデンプン等の適切な粉末基剤の混合粉末を含有するように処方されてもよい。
【０２０３】
エアロゾルまたは乾燥粉末製剤は、各々の計量された用量または「ひと吹き」が患者への送達のために少なくとも１ｍｇの本発明の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントを含有するように、準備されることが好ましい。エアロゾルによる全一日量が、患者によって異なり、単一用量で投与されてもよく、あるいは、より一般的に１日を通じた分割用量で投与されてもよいことは理解されよう。
【０２０４】
あるいは、本発明の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは座薬または膣坐薬の形態で投与することができ、あるいは、ローション剤、水剤、クリーム剤、軟膏剤または散布粉剤の形態で局所適用されてもよい。本発明の化合物は、例えば、皮膚用パッチ剤の使用により、経皮投与されてもよい。また、それらは、経眼経路で投与されてもよい。
【０２０５】
眼用に、本発明の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、等張のｐＨ調整した無菌食塩水中の微粉化懸濁剤として、または、好ましくは、所望により塩化ベンザルコニウム（benzylalkonium chloride）等の保存剤と組み合わされた等張のｐＨ調整した無菌食塩水中の水剤として、製剤化することができる。あるいは、本発明の薬剤はワセリン等の軟膏剤中で製剤化されてもよい。
【０２０６】
皮膚への局所適用のために、本発明の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、例えば、以下のうちの一つまたは複数との混合物中に懸濁または溶解された本活性化合物を含有する適切な軟膏剤として製剤化することができる：ミネラルオイル、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ろうおよび水。あるいは、本発明の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、例えば、以下のうちの一つまたは複数の混合物中に懸濁または溶解された適切なローション剤またはクリーム剤として製剤化することができる：ミネラルオイル、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水。
【０２０７】
口内の局所投与に適した製剤としては、風味付けした基剤（通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガント）中に活性成分を含む菓子錠剤；不活性な基材（例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア）中に活性成分を含むパステル剤；並びに適切な液体担体中に活性成分を含む含嗽剤が挙げられる。
【０２０８】
ミクロスフェア等の徐放性薬物送達システムを用いることが好ましい場合がある。これらは特に注射の頻度を減少させるように設計されている。このようなシステムの一例は、注射後に長期に亘ってゆっくりとｒｈＧＨを放出する生分解性ミクロスフェア中に組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）を封入している、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  Ｄｅｐｏｔである。
【０２０９】
あるいは、本発明の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは、必要な部位に薬剤を直接放出する外科的に埋め込まれた装置によって投与することができる。
【０２１０】
抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントの投与に、電気穿孔療法（ＥＰＴ）システムも使用することができる。パルス電場を細胞に送達する装置により、薬剤に対する細胞膜の透過性が増加され、その結果、細胞内薬物送達の有意な増強がもたらされる。
【０２１１】
抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントは電気的取り込み（electroincorporation）（ＥＩ）によって送達することもできる。ＥＩは、皮膚表面上の直径３０ミクロン以下の小粒子がエレクトロポレーションで使用される電気パルスと同一のまたは類似した電気パルスを受けた場合に起こる。ＥＩにおいて、これらの粒子は角質層を通過して皮膚のより深い層に駆り立てられる。前記粒子は、薬剤もしくは遺伝子を搭載する、または薬剤もしくは遺伝子で被覆することができ、あるいは、単純に、薬剤が進入することが可能な細孔を皮膚につくり出す「弾」として作用し得る。
【０２１２】
抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントの別の送達法は、温度感受性のＲｅＧｅｌ注射液である。ＲｅＧｅｌは、体温以下では注射可能な液体であるが、体温の温度では直ちに、公知の安全な生分解性高分子へとゆっくりと腐食および溶解するゲルレザバー（gel reservoir）を形成する。活性薬剤は、生体高分子が溶解するのに伴い長い時間をかけて送達される。
【０２１３】
抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントの医薬品は、経口的に送達することもできる。１つのそのような系は、身体におけるビタミンＢ１２を経口摂取するための自然プロセスを利用することで、タンパク質およびポリペプチドを共送達する。ビタミンＢ１２取り込み系に乗ることで、タンパク質またはポリペプチドは腸壁を通過することができる。ビタミンＢ１２類似体と薬剤との複合体が形成され、この複合体は、複合体のビタミンＢ１２部分において内因子（ＩＦ）に対する有意な親和性を、そして複合体の薬剤部分において有意な生理活性を同時に保持する。
【０２１４】
本発明の第二の態様の組成物は、少なくとも１つの他の作用剤をさらに含み得る。
【０２１５】
そのようなさらなる作用剤は抗炎症剤であり得、例えば、限定はされないが、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、スタチン（例えば、シンバスタチン等のＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤）、生物学的作用物質（生物学的製剤）、ステロイド、免疫抑制剤、サリチル酸および／または殺菌剤が挙げられる。非ステロイド系抗炎症剤としては、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート）および抗炎症性金薬剤（anti-inflammatory gold agent）（例えば、金チオリンゴ酸ナトリウム、金チオリンゴ酸塩または金塩（例えば、オーラノフィン））が挙げられる。生物学的製剤としては、抗ＴＮＦ剤（例えば、アダリムマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、抗ＩＬ−１試薬、抗ＩＬ−６試薬、抗Ｂ細胞試薬（レトキシマブ（retoximab））、抗Ｔ細胞試薬（抗ＣＤ４抗体）、抗ＩＬ−１５試薬、抗ＣＬＴＡ４試薬、抗ＲＡＧＥ試薬）、抗体、可溶性受容体、受容体結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、変化もしくは減弱された機能を有する変異タンパク質、ＲＮＡｉ、ポリヌクレオチドアプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはω３脂肪酸が挙げられる。ステロイド類（副腎皮質ステロイドとしても知られている）としては、コルチゾン、プレドニゾロンまたはデキサメタゾンが挙げられる。免疫抑制剤としては、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸が挙げられる。サリチル酸系としては、アスピリン、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸コリンおよびサリチル酸マグネシウムが挙げられる。殺菌剤としては、キニーネおよびクロロキンが挙げられる。例えば、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントはＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、または免疫抑制剤のうちの一つまたは複数と組合せで投与されてもよい。
【０２１６】
本発明の第三の態様において、医薬として使用するための、本発明の第一および第二の態様で定義された抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物が提供される。
【０２１７】
本発明の第四の態様において、慢性炎症性状態の治療および/または診断で使用するための、本発明の第一または第二の態様で定義された抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物が提供される。
【０２１８】
本発明の第五の態様において、慢性炎症性状態の治療および／または診断のための医薬の製造における、本発明の第一または第二の態様において定義された抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物の使用が提供される。
【０２１９】
本発明の第六の態様において、有効量の本発明の第一または第二の態様で定義された抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物を対象に投与することを含む、慢性炎症性状態を治療する方法が提供される。
【０２２０】
本発明第三、第四、第五または第六の態様において定義された抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、組成物、使用または方法は、不適切な炎症を伴うあらゆる状態と関連した慢性炎症性状態の治療に関し得る。このような状態としては、限定はされないが、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫状態、炎症性腸疾患、非治癒性創傷、多発性硬化症、がん、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、糖尿病、紅斑性狼瘡（lupus erythrematosus）（例えば、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythrematosus））、喘息、線維性疾患（例えば、肝硬変）、肺線維症、ＵＶダメージおよび乾癬が挙げられる。
【０２２１】
第一または第二の態様で定義された抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物は、例えば、以下のうちの一つまたは複数のために使用され得る：対象における慢性炎症性状態の状態（chronic inflammatory condition status）の診断；対象が慢性炎症性状態を発症させる可能性の評価；慢性炎症性状態を有する対象の予後の判定；慢性炎症性状態の疾患増悪のモニター；および／または慢性炎症性状態の治療に対する有効性もしくは対象の応答のモニター。
【０２２２】
本発明の第七の態様において、慢性炎症性状態の診断および／または慢性炎症性状態を有する患者の予後判定で使用するための、第一または第二の態様で定義された抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物が提供される。
【０２２３】
本発明の第八の態様において、第一または第二の態様で定義された抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物を用いて、テネイシンＣのＦＢＧドメインの有無または量を検出することを含む、慢性炎症性状態の診断および／または慢性炎症性状態を有する患者の予後判定の方法が提供される。
【０２２４】
判定される予後は、例えば、慢性炎症性状態の悪化であり得る。あるいは、予後は、慢性炎症性状態における低減（すなわち、改善）であり得、または、予後は、慢性炎症性状態が現状維持を続ける（すなわち、悪化または改善することなく一定のままである）ことであり得る。
【０２２５】
一実施形態では、第八の態様の方法はインビトロ法である。別の実施形態では、第八の態様の方法はインビボ法である。
【０２２６】
検出されるテネイシンＣのＦＢＧドメインの量の増加は、慢性炎症性状態の判定および／または慢性炎症性状態を有する患者の予後を示すものであり得る。あるいは、検出されるテネイシンＣのＦＢＧドメインの量の減少が、慢性炎症性状態の判定および／または慢性炎症性状態を有する患者の予後を示すものであり得る。
【０２２７】
好ましくは、抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または第七の態様の組成物、または第八の態様の方法は、対象または患者由来の試料中のテネイシンＣのＦＢＧドメインのレベルまたは量の解析からの、対象における慢性炎症性状態の診断、または患者の予後の判定を可能にする。
【０２２８】
全ての態様の好ましい実施形態において、慢性炎症性状態はリウマチ様関節炎（ＲＡ）および／またはびらん性リウマチ様関節炎である。
【０２２９】
対象由来の試料中に存在するテネイシンＣのＦＢＧドメインのレベルまたは量は、以下のうちの一つまたは複数の使用を含み得る、あらゆる適切なアッセイにおいて、本発明の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントを使用することにより決定され得る：イムノアッセイ；分光法；ウェスタンブロット；ＥＬＩＳＡ；免疫沈降；スロットもしくはドットブロットアッセイ；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；抗体マイクロアレイ；免疫組織学的染色；ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；フルオロイムノアッセイ；および／またはアビジン−ビオチン系もしくはストレプトアビジン（streptoavidin）−ビオチン系を用いるイムノアッセイ。これらの方法は当該技術分野において周知である。
【０２３０】
「試料」には、対象由来の血液（例えば、血清または血漿）、滑液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿および／または関節組織の試料が包含される。
【０２３１】
検出されるテネイシンＣのＦＢＧドメインの量またはレベルは、量またはレベルが基準値と比較して増加したか、減少したか、または一定を維持したかを決定するために、基準値と比較されることが好ましい。
【０２３２】
テネイシンＣのＦＢＧドメインの検出レベルまたは検出量が比較される基準値は、いかなる検出可能な慢性炎症性状態／障害も慢性炎症性状態／障害のいかなる臨床症状も有しておらず（本明細書では「正常試料」と称される）、故に、いわゆる「正常値」（「正常レベル」または「正常量」とも称される）のテネイシンＣのＦＢＧドメインを有する、一または複数の対象に由来する試料中で検出された、テネイシンＣのＦＢＧドメインの量またはレベルであることが好ましい。それらの正常レベルの実測値は、それらを検出するために使用された特定のアッセイに依存する。しかし、試料中に存在するテネイシンＣのＦＢＧドメインの正常レベル／正常量（すなわち、正常値）の一例は、健常人および炎症性疾患を有する患者の血清中のテネイシンＣ発現が記述されたＰａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）の表２にテネイシンＣレベルについて以前に記述されたように、１５〜２５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０〜２１ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２０．７ｎｇ／ｍｌであろう。
【０２３３】
正常試料中のレベル（すなわち、テネイシンＣのＦＢＧドメインの正常な値／レベル／量）と比較した場合の、試料において測定されたテネイシンＣのＦＢＧドメインのレベルにおける約５０％以上の増加が、慢性炎症性状態の診断となる、または、慢性炎症性状態を有する患者の予後を判定することが好ましい。しかし、他の実施形態では、正常試料におけるレベルと比較した場合の、試料において測定されたテネイシンＣのＦＢＧドメインのレベルにおける、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％またはそれ以上の増加が、慢性炎症性状態の診断となる、または、慢性炎症性状態を有する患者の予後を判定する。
【０２３４】
例えば、対象由来の試料において測定されたテネイシンＣのＦＢＧドメインのレベルが、健常対象由来の試料において測定されたテネイシンＣのＦＢＧドメインの正常レベルから、５０％以上の増加である場合（すなわち、ほんの１つの具体例において、３１ｎｇ／ｍｌ以上と測定された場合）、前記対象は慢性炎症性状態（例えばＲＡ）を有していると診断される、および／または、前記対象の予後が判定される。判定される予後は、慢性炎症性状態の悪化であり得る。あるいは、予後は、慢性炎症性状態における低減（すなわち、改善）であり得、または、予後は、慢性炎症性状態が現状維持を続ける（すなわち、悪化または改善することなく一定のままである）ことであり得る。
【０２３５】
抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または第七および第八の態様の方法の特定の実施形態では、正常レベルと比較した場合の、検出されたテネイシンＣのＦＢＧドメインの量における少なくとも５０％の増加は、慢性炎症性状態の判定および／または慢性炎症性状態を有する患者の予後を示すものである。
【０２３６】
本発明の第九の態様において、検出されたテネイシンＣのＦＢＧドメインの量によって個体に対する適切な治療が示される、個体に対する適切な治療の決定に使用するための、第一または第二の態様で定義された抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物が提供される。
【０２３７】
本発明の第十の態様において、第一または第二の態様で定義された抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物を用いてテネイシンＣのＦＢＧドメインの有無または量を検出することを含み、検出されたテネイシンＣのＦＢＧドメインの量によって個体に対する適切な治療が示される、個体に対する適切な治療を決定する方法が提供される。
【０２３８】
一実施形態では、第十の態様の方法はインビトロ法である。別の実施形態では、第十の態様の方法はインビボ法である。
【０２３９】
適切な治療は有効量の作用剤または組成物の投与を含み得、作用剤または組成物は以下のうちの一つまたは複数であり得る：第一または第二の態様で定義された抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物；ＤＭＡＲＤＳ（例えば、メトトレキサート）；抗ＴＮＦ剤；抗ＩＬ１７治療；Ｔ細胞同時刺激修飾薬（例えば、Ｏｒｅｎｃｉａ（商標）-アバタセプト）：インターロイキン−６（ＩＬ−６）阻害剤（例えば、Ａｃｔｅｍｒａ（商標）-トシリズマブ）；抗ＣＤ２０抗体（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）-リツキシマブ（rituxumab）；Ｂ細胞活性化因子（例えば、抗ＢＡＦＦ）；ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）の阻害剤（例えば、Ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ（商標））；脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）の阻害剤（例えば、Ｆｏｓｔａｍａｔｉｎｉｂ（商標））；抗ＴＮＣ抗体もしくはシトルリン化テネイシンＣドメインに対する抗体；並びに／または、シトルリン化および／もしくは非シトルリン化テネイシンＣの生物活性を調節する作用剤。
【０２４０】
特定の実施形態では、適切な治療はテネイシンＣのＦＢＧドメインを標的とする。
【０２４１】
別の特定の実施形態では、適切な治療は、有効量の、第一または第二の態様で定義された抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物の投与である。
【０２４２】
所望により、第九および第十の態様において定義された個体は、慢性炎症性状態を有する。前記個体は、前記方法が実施される前にそのように診断されていてもされていなくてもよい。
【０２４３】
ある実施形態では、検出されたテネイシンＣのＦＢＧドメインの量における増加が、適切な治療を示す。別の実施形態では、検出されたテネイシンＣのＦＢＧドメインの量における減少が、適切な治療を示す。
【０２４４】
一実施形態では、正常試料中のレベル（すなわち、テネイシンＣのＦＢＧドメインの正常なレベルまたは量）と比較した場合の、試料において測定されたテネイシンＣのＦＢＧドメインのレベルにおける約５０％以上の増加または増加が、個体の適切な治療を決定する。しかし、他の実施形態では、正常試料におけるレベルと比較した場合の、試料において測定されたテネイシンＣのＦＢＧドメインのレベルにおける、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％またはそれ以上の増加または減少が、個体の適切な治療を決定する。
【０２４５】
例えば、対象由来の試料において測定されたテネイシンＣのＦＢＧドメインのレベルが、健常対象由来の試料において測定されたテネイシンＣのＦＢＧドメインの正常レベルから、５０％以上の増加である場合（すなわち、ほんの１つの具体例において、３１ｎｇ／ｍｌ以上と測定された場合）、適切な治療は決定される。例えば、その後、有効量の作用剤または組成物の投与によって対象を治療することが決定され得、作用剤または組成物は以下のうちの一つまたは複数であり得る：第一または第二の態様で定義された抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物；ＤＭＡＲＤＳ（例えば、メトトレキサート）；抗ＴＮＦ剤；抗ＩＬ１７治療；Ｔ細胞同時刺激修飾薬（例えば、Ｏｒｅｎｃｉａ（商標）-アバタセプト）：インターロイキン−６（ＩＬ−６）阻害剤（例えば、Ａｃｔｅｍｒａ（商標）-トシリズマブ）；抗ＣＤ２０抗体（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）-リツキシマブ（rituxumab）；Ｂ細胞活性化因子（例えば、抗ＢＡＦＦ）；ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）の阻害剤（例えば、Ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ（商標））；脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）の阻害剤（例えば、Ｆｏｓｔａｍａｔｉｎｉｂ（商標））；抗ＴＮＣ抗体もしくはシトルリン化テネイシンＣドメインに対する抗体、並びに／または、シトルリン化および／もしくは非シトルリン化テネイシンＣの生物活性を調節する作用剤。
【０２４６】
一実施形態では、検出されたテネイシンＣのＦＢＧドメインの増加は、適切な治療の増量が必要であることを示す。別の実施形態では、検出されたテネイシンＣのＦＢＧドメインの減少は、適切な治療の増量が必要であることを示す。
【０２４７】
正常試料中のレベル（すなわち、テネイシンＣのＦＢＧドメインの正常なレベルまたは量）と比較した場合の、試料において測定されたテネイシンＣのＦＢＧドメインのレベルにおける５０％以上の増加または減少が、適切な治療の増量または減量が必要であることを示すことが好ましい。しかし、他の実施形態では、正常試料におけるレベルと比較した場合の、試料において測定されたテネイシンＣのＦＢＧドメインのレベルにおける、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％またはそれ以上の増加または減少が、適切な治療の増量または減量が必要であることを示す。適切な治療の増量または減量は、用量、投与頻度または処置時間の増加または減少であり得る。
【０２４８】
第九および第十の態様の抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物、または方法の一実施形態では、テネイシンＣのＦＢＧドメインの正常レベルと比較した場合の、検出されたテネイシンＣのＦＢＧドメインの量における少なくとも５０％の増加が、適切な治療を決定する、および／または、適切な治療の増量が必要であることを示す。
【０２４９】
第八および／または第十の態様の診断法または適切な治療を決定する方法は、以下のうちの一つまたは複数の実行を含むことが好都合である：イムノアッセイ；分光法；ウェスタンブロット；ＥＬＩＳＡ；免疫沈降；スロットもしくはドットブロットアッセイ；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；抗体マイクロアレイ；免疫組織学的染色；ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；フルオロイムノアッセイ；および／またはアビジン−ビオチン系もしくはストレプトアビジン（streptoavidin）−ビオチン系を用いるイムノアッセイ。
【０２５０】
本発明の第七、第八、第九または第十の態様において定義された抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、組成物または方法は、不適切な炎症を伴うあらゆる状態と関連した慢性炎症性状態の治療に関し得る。このような状態としては、限定はされないが、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫状態、炎症性腸疾患、非治癒性創傷、多発性硬化症、がん、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、糖尿病、紅斑性狼瘡（lupus erythrematosus）（例えば、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythrematosus））、喘息、線維性疾患（例えば、肝硬変）、肺線維症、ＵＶダメージおよび乾癬が挙げられる。
【０２５１】
本発明の第十一の態様において、以下を含むパーツキットが提供される：
（ｉ）  本発明の第一または第二の態様で定義された抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物
（ｉｉ）  投与手段
（ｉｉｉ）  それらの使用のための説明書
【０２５２】
本発明の第七の態様のキットは、所望により以下をさらに含み得る：
（ｉｖ）  少なくとも１つの他の作用剤。
【０２５３】
本発明のさらなる態様により、以下を含む、対象の慢性炎症性状態の状態を決定で使用するためのパーツキットが提供される：
【０２５４】
（ｉ）  本発明の第一または第二の態様で定義された抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物；および
（ｉｉ）  使用のための説明書
【０２５５】
「慢性炎症性状態の状態（chronic inflammatory condition status）」には、慢性炎症性状態の診断、慢性炎症性状態の予後判定および／または慢性炎症性状態を有するもしくは有さない対象に対する適切な治療の決定が含まれる。
【０２５６】
本発明のさらなる態様は、先の態様で記載された抗体等の、ＦＢＧに対する特異性を有する一つまたは複数の治療抗体（抗体医薬）を特定する方法に関する（実施例に記載の詳細な抗体スクリーニング法を参照）。
【０２５７】
最終的な治療用分子の詳細な規格が抗体単離計画を開始するに先立ち重要となる。本明細書において単離された抗体について、設定規格は下記の表に提供される：
【０２５８】
【表１】
0006744857.tif 000002
【０２５９】
重要要件は、テネイシンＣ  ＦＢＧに対し高い親和性を有し、テネイシンＣ  ＦＢＧに応答した細胞活性化および炎症性サイトカインの産生を遮断することができ、他の種に対し十分な交差反応性を有することで、それらの種における関連性のある安全性研究および有効性研究の実施を可能にする、抗体の特定であった（それ故、平行試薬（parallel reagent）への要件は無い）。
【０２６０】
また、テネイシンファミリーの他のメンバーに対しより低い親和性を有するリード抗体を有することが有利と見なされていたため、テネイシンＲが、他の近縁タンパク質よりもテネイシンＣに（アミノ酸レベルで）より高度な相同性を有するこのタンパク質に基づく特異性試験のために選ばれた。細胞効力は、一連の関連性のある細胞に基づくアッセイにおいてテネイシンＣ  ＦＢＧにより誘導されたサイトカイン放出を阻害することができる最大半数濃度（half maximal concentration）と定義された。最終的に、候補は、製品の製造性に重大な問題が無かったといういくつかの早期指摘を提供するために、関連する抗体形式において安定であることを必要とした。
【０２６１】
採用されたスクリーニング法は、正確な規格を有する抗体の産生に基づいていた。従って、初期のＥＬＩＳＡスクリーニングには、ヒト、ラット、マウスおよびイヌＴＮＣ−ＦＢＧとの結合試験が組み込まれた。陽性クローンもヒトテネイシンＲ  ＦＢＧに対し試験された。正確な結合特性を有するものが、効力選別における試験のために適切な抗体フォーマットにサブクローニングされた（ＴＨＰ−１  Ｂｌｕｅ（商標）アッセイにおけるＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧ誘導性アルカリホスファターゼレポーターの阻害がスクリーニングに利用され、次いで、ＴＨＰ−１細胞からのＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧ誘導性サイトカイン発現の阻害を測定することにより活性が確認された）。第一の里程標を通過したリードクローンは、ファージディスプレイ法が第二の里程標を通過した抗体の提供という目的に合わせられた、リード最適化（lead optimization）に取り入れられた。リード最適化に取り入れられた本明細書に記載の「親」抗体（２Ａ５、Ｂ１２、Ｆ３およびＤ８）のうち、２つ（２Ａ５およびＢ１２）が、事前に定められた規定を通過した最適化されたクローンを提供した。
【０２６２】
従って、本発明のさらなる態様において、表Ａに列挙される特性のうちの一つまたは複数を有する抗体を選別することを含む、テネイシンＣのＦＢＧドメインに特異的な一つまたは複数の治療抗体（抗体医薬）を特定する方法が提供される。抗体は「第一の里程標」の下に列挙される特性の全てを示すことが好ましく、抗体は表Ａ中の特性の全てを示すことがさらにより好ましい。
【０２６３】
一実施形態において、テネイシンＣのＦＢＧドメインに特異的な一つまたは複数の治療抗体（抗体医薬）を特定する方法は、以下の特性のうちの一つまたは複数を有する抗体を選別することを含む：
（ａ）  抗体はＦａｂまたは全抗体（好ましくはヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４）である；
（ｂ）  抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定される、１〜１０ｎＭのヒトテネイシンＣ  ＦＢＧに対する結合親和性を有する、および／または、抗体は、好ましくはＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧを使用する細胞ベースアッセイにおいて、１００ｎＭ未満のＩＣ５０で、テネイシンＣ、好ましくは誘発サイトカイン放出の濃度関連阻害（concentration-related inhibition）を示す；並びに
（ｃ）  抗体は、好ましくはＥＬＩＳＡによって測定されて、ヒトＦＢＧ並びにマウス、ラットおよびイヌＦＢＧのうちの一つまたは複数に結合し、抗体はヒト、マウス、ラットおよびイヌＦＢＧの全てに結合することが好ましい。
【０２６４】
抗体は以下のさらなる特性のうちの一つまたは複数も示すことが好ましい：
（ｄ）  抗体は、ヒトテネイシンＣ陽性対照と比較して、ヒトテネイシン−Ｒに結合しない、またはヒトテネイシン−Ｒに対し低減された結合性を示す；および
（ｅ）  抗体はＰＢＳ中で少なくとも１ｍｇ／ｍＬまで可溶性である。
【０２６５】
ＳＰＲによって決定される親和性強度（affinity potency）が３２０ｐＭ以下であること、および／または、好ましくはＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧを使用する細胞に基づくアッセイにおいて誘導サイトカイン放出についてＩＣ５０が１ｎＭ以下であることが好ましい。
【０２６６】
抗体は、少なくとも１つのげっ歯類（例えばラット）および１つの非げっ歯類（例えばイヌ）テネイシンＣアイソフォームに対し、３ｎＭ以下の親和性を有することが好ましい。
【０２６７】
ヒトテネイシン−Ｒへの最大半量結合濃度は、好ましくはＥＬＩＳＡ結合実験またはＳＰＲによって測定されて、ヒトテネイシンＣへの等価な結合シグナルよりも、少なくとも５０倍、好ましくは１００倍高いことが好ましい。ヒトテネイシン−Ｒへの最大半量結合濃度は、ＳＰＲによって測定された場合、ヒトテネイシンＣへの等価な結合シグナルよりも、少なくとも５０倍高いことが好ましい。ヒトテネイシン−Ｒへの最大半量結合濃度は、ＥＬＩＳＡによって測定された場合、ヒトテネイシンＣへの等価な結合シグナルよりも、少なくとも１００倍高いことが好ましい。
【０２６８】
抗体は、１４日間に亘って沈殿／凝集無く、少なくとも２０ｍｇ／ｍＬまで、ＰＢＳ中で可溶性であることが好ましい。
【０２６９】
本発明のさらなる態様において、以下の段階を含む、テネイシンＣのＦＢＧドメインに特異的な一つまたは複数の治療抗体（抗体医薬）を特定する方法が提供される：
（ｉ）  好ましくはＥＬＩＳＡによる、ヒトテネイシンＣ  ＦＢＧ並びにラット、マウスおよびイヌテネイシンＣ  ＦＢＧのうちの一つまたは複数と結合する抗体または断片を求めた、抗体または抗体断片ライブラリー、例えばファージライブラリーのスクリーニング；
（ｉｉ）  好ましくはＥＬＩＳＡによる、ヒトテネイシンＣ  ＦＢＧと比較した場合の、ヒトテネイシン−Ｒ  ＦＢＧに対する結合性減少ついての、（ｉ）で特定された陽性抗体または陽性断片の試験；
（ｉｉｉ）  効力選別に適したフォーマット（例えば、Ｆａｂ、Ｆｃ−ｓｃＦｖ、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４）への、（ｉ）および（ｉｉ）から所望の特性を有すると特定された抗体または断片のサブクローニング；並びに
（ｉｖ）  Ｆｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧ活性の阻害を示す、（ｉｉｉ）からの抗体または断片の特定。
【０２７０】
所望により、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が段階（ｉ）および／または（ｉｉ）に使用される。
【０２７１】
段階（ｉｖ）は、Ｆｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧ誘導性アルカリホスファターゼレポーター（例えば、ＴＨＰ−１  Ｂｌｕｅ（商標）アッセイにおいて）を利用し；および／または、Ｆｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧ誘導性サイトカイン発現（例えば、ＴＨＰ−１細胞からの）の阻害を測定することが好ましい。
【０２７２】
段階（ｉ）において、抗体または断片は、ヒト、ラット、マウスおよびイヌ  テネイシンＣ  ＦＢＧの全てに結合することが好ましい。
【０２７３】
前記方法段階は順に実行されてもよいが、いかなる順番で実行されてもよい。
【０２７４】
一実施形態において、段階（ｉ）〜（ｉｖ）の方法を実行することにより特定された抗体医薬または抗体は、先の態様の特性（ａ）〜（ｅ）のうちの一つまたは複数を示す。
【０２７５】
定義
【０２７６】
「炎症」には、組織傷害、感染または局所的な免疫応答によって惹起される、体液、血漿タンパク質、および白血球局所的な蓄積の意味が含まれる。
【０２７７】
「急性炎症」には、傷害、感染または局所的な免疫応答の直後の、炎症の初期段階（開始）および短期的な一過性炎症反応の意味が含まれる。典型的には、急性炎症は急速に回復し、およそ数分から長くても数日しか継続しない。
【０２７８】
「慢性炎症」には、持続的な、および／または回復しない炎症の意味が含まれる。慢性炎症は健常組織の不適切な破壊としばしば関連している。これは、進行性であり、数週間以上に亘って継続し得る。慢性炎症は典型的には、自己免疫性状態を含むがこれに限定はされない、持続性の感染または疾患と関連している。
【０２７９】
「慢性関節炎」には、患部関節の歪み並びにヒト疾患で観察されるような軟骨および骨の破壊の証拠となるＸ線像をもたらす、数週間〜数ヶ月に亘る進行性で絶え間のない持続的な炎症の意味が含まれる（Kelly, Harris, Ruddy and Sledge, Textbook of Rheumatology 4th Edition）。
【０２８０】
実験的マウスモデルでは、慢性関節炎は、沈静せずに、比較的短期間に亘ってであっても不適切な組織破壊を引き起こす炎症を特徴とする。慢性関節炎は、組織学的には、滑膜および関節隙における炎症性細胞の遷延的存在、軟骨細胞死、並びに軟骨および骨のびらんを特徴とする（および、それらによって同定することができる）。
【０２８１】
「断片」とは、少なくとも４アミノ酸、例えば、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０アミノ酸を意味する。
【０２８２】
２つのポリペプチド間の配列同一性パーセントは、適切なコンピュータプログラム、例えばウィスコンシン大学Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを用いて決定され得、同一性パーセントが、配列が最適にアラインメントされたポリヌクレオチドについて算出されることは理解されよう。
【０２８３】
あるいは、アラインメントはＣｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを用いて実行され得る（Thompson et al., 1994, Nuc. Acid Res. 22:4673-4680に記載）。
【０２８４】
使用されるパラメーターは以下の通りであり得る：
【０２８５】
ファースト・ペアワイズ・アラインメントのパラメーター：Ｋ−タプル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティ；３、上部対角線（top diagonal）の数；５。スコアリング法：ｘパーセント。
【０２８６】
マルチプルアライメントのパラメーター：ギャップ開始ペナルティ；１０、ギャップ伸長ペナルティ；０．０５。
【０２８７】
スコア行列：ＢＬＯＳＵＭ。
【０２８８】
あるいは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを用いて局所的配列アラインメントを決定してもよい。
【０２８９】
「抗体」には、実質的にインタクトな抗体分子、並びにキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体（自然発生的なヒト抗体に対して少なくとも１つのアミノ酸が変異している）、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または抗体軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、並びにその抗原結合性断片および誘導体が含まれる。
【０２９０】
「抗原結合性断片」とは、テネイシンＣのＦＢＧドメインに結合することが可能な、抗体の機能性断片を意味する。
【０２９１】
用語「対象」または「個体」とは、ヒトを含む全ての動物を意味する。対象の例としては、ヒト、雌ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、およびブタが挙げられる。用語「患者」とは、治療を必要とする障害を有する対象または個体を意味する。
【０２９２】
本明細書で使用される場合、「医薬製剤」とは、本発明による治療効果のある製剤を意味する。
【０２９３】
「治療有効量」、または「有効量」、または「治療効果のある」とは、本明細書で使用される場合、所与の状態および投与計画に対して治療効果を与える量を指す。これは、必要とされる添加剤および希釈剤、すなわち担体または投与ビヒクルと共同して所望の治療効果を生むように算出される、活性物質の所定量である。さらに、活性、機能および宿主応答の臨床的に有意な不足を低減する、最も好ましくは防止するのに充分な量を意味することが意図される。あるいは、治療有効量は、宿主における臨床的に有意な状態の改善を引き起こすのに充分な量である。当業者には理解されることであるが、化合物の量はその比活性に応じて変動し得る。適切な投与量は、必要とされる希釈剤と共同して所望の治療効果を生むように算出される、所定量の活性組成物を含有し得る。本発明の組成物を製造するための方法および用途では、治療有効量の有効成分が提供される。治療有効量は、医学または獣医学の当業者によって、当該技術分野において周知であるような年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患等の患者の特徴に基づいて決定することができる。
【０２９４】
本発明の態様を具体化している実施例は、以下の図面を参照して記載される。
【図面の簡単な説明】
【０２９５】
【図１】ヒトテネイシンＣおよびそのドメインのアミノ酸配列
【図２−１】ヒトテネイシンＣのヌクレオチド配列
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【図３】ポリクローナルファージＥＬＩＳＡ。ポリクローナル由来２回目出力ファージを、抗原または融合パートナー（ＦｃまたはＣｄ４）で被覆したウェルと共にインキュベートし、結合したファージを抗Ｍ１３ｍＡｂおよびユウロピウム標識抗マウス抗体で検出した。選別の１ラウンド目と２ラウンド目の間の抗原特異的な結合体の富化、および、２ラウンド目の生産物集団における、抗Ｆｃまたは抗ｒＣｄ４ファージと比較した場合の、ｈｕＦＢＧ結合体のより大きな集団が存在する。
【図４−１】蛍光アッセイによって決定される、分泌型アルカリホスファターゼ放出のＴＨＰ１−Ｂｌｕｅアッセイにおける精製された抗ＦＢＧのスクリーニング。抗体を、達成可能な最も高い濃度で試験した。精製されたｓｃＦｖ−Ｆｃクローンの確認アッセイにおいて、２Ａ３、２Ａ５、２Ｂ１１および２Ｄ１２が、１０ｎＭ  Ｆｃ−Ｈｉｓ−ｈｕＦＢＧ（ａ）によって誘発されるシグナル伝達の有効な遮断剤であることが確認された。精製抗ＦＢＧ  Ｆａｂのアッセイは、抗体Ａ１２、Ｂ１２、Ｃ２、Ｄ７、Ｄ８、Ｆ３およびＧ１を含む、さらなる解析のためのいくつかの追加のヒット（hit）をハイライトした。この実験では、細胞を３ｎＭ  Ｆｃ−Ｈｉｓ−ｈｕＦＢＧ（ｂ）で刺激した。
【図４−２】同上。
【図５】固定化されたＴＮＣ  ＦＢＧ−ｒＣＤ４タンパク質（ヒト、マウス、ラットおよびイヌ）およびヒトＴＮＲ  ＦＢＧ−ｒＣＤ４に結合する精製Ｆａｂについての、交差反応性ＥＬＩＳＡの結果。抗κｍＡｂまたは抗λｍＡｂ、次いでユウロピウム結合型抗マウスｍＡｂを用いて、結合を検出した。
【図６ａ−１】ＣＭ５センサーチップ上に捕捉された抗ＦＢＧ  Ｆａｂ  Ｂ１２（ａ）、２Ａ５（ｂ）、Ｆ３（ｃ）、およびＤ８（ｄ）へのＦＢＧタンパク質の結合の動態を決定するためのＢｉＡｃｏｒｅセンサーグラム追跡。追跡は、ヒト、ラットおよびマウステネイシンＣ  ｒＣｄ４−ＦＢＧ並びにヒトテネイシン−Ｒ  ｒＣＤ４−ＦＢＧの結合を示している。
【図６ａ−２】同上。
【図６ｂ−１】同上。
【図６ｂ−２】同上。
【図６ｃ−１】同上。
【図６ｃ−２】同上。
【図６ｄ−１】同上。
【図６ｄ−２】同上。
【図７】抗ＦＢＧ  Ｆａｂ  Ｂ１２、２Ａ５、Ｄ８およびＦ３による分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）放出の濃度関連阻害。精製抗体を、ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ細胞と一緒に、３ｎＭヒトＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧの存在下で、３７℃で１８時間インキュベートした。Ｆｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧ誘導ＳＥＡＰの阻害のＩＣ５０値はＢ１２（１．７ｎＭ）、２Ａ５（２０．６ｎＭ）、Ｄ８（７．２ｎＭ）、Ｆ３（８．４ｎＭ）であった。
【図８】抗ＦＢＧ  Ｆａｂ  Ｂ１２、２Ａ５、Ｄ８およびＦ３によるＩＬ−８産生の濃度関連阻害。精製抗体を、ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ細胞と一緒に、３ｎＭヒトＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧの存在下で、３７℃で１８時間インキュベートした。Ｆｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧ誘導ＩＬ−８放出の阻害のＩＣ５０値はＢ１２（６．９ｎＭ）、２Ａ５（２８．５ｎＭ）、Ｄ８（１４．９ｎＭ）、Ｆ３（１３．８ｎＭ）であった。
【図９−１】抗ＦＢＧリード抗体のためのＣＤＲ３ランダム化戦略。ＶＨ  ＣＤＲ３ランダム化を、各々６つの残基から成る３つの重複ブロック（標識ＶＨ３．１、ＶＨ３．２、およびＶＨ３．３）において行い、ＶＬ  ＣＤＲ３を２つのブロック（標識ＶＬ３．１およびＶＬ３．２）においてランダム化した。矢印は、ライブラリーにおいて支配的な親クローンを排除するために鋳型ＤＮＡに導入された終止コドンの位置を示す。（Ｂ）ＣＤＲ３ライブラリー作製に使用されたオリゴヌクレオチド。
【図９−２】同上。
【図１０】ＣＤＲランダム化抗体ライブラリーの選別戦略。（ａ）ＣＤＲランダム化ライブラリーを用いたヒトｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧに対する選別。（ｂ）Ｂ１２  ＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ３ランダム化ライブラリーを用いたヒトおよびマウスＦＢＧに対するハイブリッド選択。
【図１１】ビオチン標識マウスまたはヒトｒＣｄ４−ＦＢＧに対する結合性向上を求めて親和性成熟クローンを選別するのに使用された抗ＦＬＡＧ捕捉ＥＬＩＳＡフォーマットの模式図。
【図１２】親和性成熟ｈＩｇＧ４  抗体１６５＿１３＿Ｂ１、１６５＿１３＿Ｃ３、および１６０＿０１＿Ａ４によるＦＢＧ−誘導サイトカイン放出の阻害。初代ヒトＰＢＭＣを２００ｎＭヒトＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧおよび試験抗体（１００ｎＭまたは１μＭ）の存在下でインキュベート（３７℃、２４時間）し、上清をＩＬ−８（ａ）およびＴＮＦａ（ｂ）についてアッセイした。全ての試験抗体が誘導サイトカイン放出を遮断した。データは３つの別々のドナーから得られた結果の平均値±ｓ．ｅ．平均を示している。
【図１３】膝置換手術後のリウマチ様関節炎患者由来の膝滑膜の固定凍結切片における内在性テネイシンＣ  ＦＢＧの免疫染色。陽性対照抗テネイシン抗体（ａ）、およびマウスＩｇＧ２ａとしてフォーマットされたＢ１２抗ＦＢＧ（ｃ）により、滑膜の特異的染色が見られた。非免疫アイソタイプ対照抗体（ｂ、ｄ）により、より低レベルの非特異的染色が観察された。
【図１４】抗体Ｃ３（１６５＿１３＿Ｃ３）およびＢ１２は、ウエスタンブロット解析に使用された場合、ＴＮＣ−ＦＢＧに対し良好な特異性を示す。組換えＴＮＣ−ＦＢＧ（ネイシェント社（Nascient））、ＴＮＲ−ＦＢＧまたはフィブリノーゲン（ケネディリウマチ学研究所（Kennedy Institute of Rheumatology）（ＫＩＲ））を、以下の抗体で検出した：Ａ）１６５＿１３＿Ｃ３  ＩｇＧ４  ＭＡｂ、１：２０，０００（０．２５ｕｇ／ｍｌ）、４℃で一晩、Ｂ）Ｂ１２  ＩｇＧ４  ＭＡｂ、１：２０，０００（０．２５ｕｇ／ｍｌ）、４℃で一晩、Ｃ）抗テネイシン−Ｒ抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー社（Santa Cruz Biotechnology））、ｓｃ−９８７５）、１：２，０００（０．１ｕｇ／ｍｌ）、４℃で一晩、Ｄ）抗ＴＮＣ−ＦＢＧポリクローナル抗体（ミッドウッド・グループ社（Midwood group））、１：５００、４℃で一晩。
【図１５】モノクローナル抗体Ｂ１２および対応するアイソタイプ対照を用いた神経膠腫細胞可溶化物のウエスタンブロット解析。神経膠腫細胞可溶化物（ＫＩＲ社）およびテネイシンＣ（ネイシェント社）を以下を用いて検出した：Ａ．  Ｂ１２  ＩｇＧ４  Ｍａｂ、１：２０，０００、４℃で一晩；Ｂ．  ＩｇＧ４アイソタイプ対照（エウレカ・セラピウティクス社（Eureka therapeutics））、１：４，０００、４℃で一晩。
【図１６】図１６Ａ  Ｆｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧはインビトロにおいて用量依存的にＴＬＲ４に結合する。ＰＢＳ中の組換えヒトＴＬＲ４（Ｒ＆Ｄシステムズ社）（またはＰＢＳ単独）を、９６ウェルプレートに結合させ、ブロッキング後、指示濃度のヒトＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧを添加し、１ｕｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ１  ＭＡｂ（ＡｂＤセロテック社（AbD Serotec）、クローン２Ｃ１１）、１ｕｇ／ｍｌの抗マウスＨＲＰ結合型二次抗体（ＡｂＤセロテック社、ＳＴＡＲ１３Ｂ）、およびＴＭＢ基質のインキュベーションにより検出を行った。ｎ＝４の平均値およびＳＥＭが示される。  図１６Ｂ  モノクローナルＡｂ  Ｃ３（１６５＿１３＿Ｃ３）はインビトロにおいてＦＢＧおよびＴＬＲ４との結合を乱す。ＰＢＳ中の組換えヒトＴＬＲ４（またはＰＢＳ単独）を９６ウェルプレートに結合させ、ブロッキング後、Ｃ３  Ｍａｂまたはアイソタイプ対照抗体と一緒にプレインキュベートされた組換えヒトＦｃ−Ｈｉｓ−ＴＮＣ−ＦＢＧ（１００ｎＭ）を添加した。前記タンパク質のＦｃ部分に対する抗体、抗マウスＨＲＰ結合型二次抗体およびＴＭＢ基質の一連のインキュベーションによって、検出を行った。Ｃ３プレインキュベート試料における阻害率を、アイソタイプ対照試料（ＩＣ５０＝４４．５ｎＭ）と比較して算出した。ｎ＝４。
【図１７−１】モノクローナル抗体Ｃ３（１６５＿１３＿Ｃ３）はヒトまたはマウスＴＮＣ−ＦＢＧで刺激された初代ヒトマクロファージによる炎症誘発性サイトカインの産生を減少させるが、ＬＰＳ刺激によるものは減少させない。（Ａ）組換えヒトテネイシンＣ  ＦＢＧ（１ｕＭ）またはＬＰＳ（Ｅｎｚｏ社）（１ｎｇ／ｍｌ）をＭＡｂ  Ｃ３（１、０．２および０．０４ｕＭ）またはアイソタイプ対照ＭＡｂ（１ｕＭ）と一緒に室温で３０分間プレインキュベートし、その後、その後ヒトＭ２マクロファージ培養物に３連で添加した。２４時間後、上清を取り、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＴＮＦサイトカインＥＬＩＳＡ（ＢＤバイオサイエンス社）にかけた。ｎ＝３；（Ｂ）組換えマウステネイシンＣ  ＦＢＧ（１ｕＭ）をＭＡｂ  Ｃ３（１、０．２および０．０４ｕＭ）またはアイソタイプ対照ＭＡｂ（１ｕＭ）と一緒に室温で３０分間プレインキュベートし、その後、その後ヒトＭ２マクロファージ培養物に３連で添加した。２４時間後、上清を取り、サイトカインＥＬＩＳＡにかけた。ｎ＝３以上、平均値およびＳＥＭが示される；（Ｃ）Ｆｃ部分が不活性になるよう変異されたタンパク質（Ｆｃ−Ｍｕｔ−Ｈｉｓ−ＦＢＧ）を使用した。他の有望な抗ＴＮＣ−ＦＢＧ抗体、Ｂ１２およびＡ４もこの系で試験した。Ｆｃ−Ｍｕｔ−Ｈｉｓ−ＦＢＧ（１ｕＭ）およびＣ３、１６０＿０１＿Ａ４またはＢ１２（１ｕＭ）を室温で３０分間プレインキュベートし、その後、ヒトＭ２マクロファージ培養物に添加した。２４時間後、上清を取り、サイトカインＥＬＩＳＡにかけた。ｎ＝３、平均値およびＳＥＭが示される。
【図１７−２】同上。
【図１７−３】同上。
【図１８】図１８Ａ  モノクローナル抗体Ｂ１２は、ヒトＴＮＣ−ＦＢＧで刺激された初代ヒトマクロファージによる炎症誘発性サイトカインの産生を減少させる。組換えヒトテネイシンＣ  ＦＢＧ（１ｕＭ）をＭＡｂ  Ｂ１２（１、０．１、０．０１または０．００１ｕＭ）またはアイソタイプ対照ＭＡｂ（１ｕＭ）と一緒にプレインキュベートし、その後、その後ヒトＭ２マクロファージ培養物に３連で添加した。２４時間後、上清を取り、サイトカインＥＬＩＳＡにかけた。  図１８Ｂ  研究室規模およびそれより大きな規模で作製されたモノクローナル抗体Ｃ３（１６５＿１３＿Ｃ３）は、初代ヒトマクロファージによるＦＢＧ誘導性サイトカイン合成の遮断において同一レベルの有効性を示す。より大きな規模で作製された抗体の作用強度を、研究室規模で作製されたものと比較した。組換えヒトテネイシンＣ  ＦＢＧ（１ｕＭ）をＭＡｂ  Ｃ３（１、０．２および０．０４ｕＭ）またはアイソタイプ対照ＭＡｂ（１ｕＭ）と一緒に室温で３０分間プレインキュベートし、その後、その後ヒトＭ２マクロファージ培養物に３連で添加した。２４時間後、上清を取り、サイトカインＥＬＩＳＡにかけた。ｎ＝１、Ｉｃｏ＝研究室規模、Ｌｏｎ＝より大きな規模。
【図１９】モノクローナル抗体Ｃ３（１６５＿１３＿Ｃ３）はヒトＴＮＣ−ＦＢＧで刺激されたＲＡ滑膜線維芽細胞による炎症誘発性サイトカインの産生を減少させる。組換えヒトテネイシンＣ  ＦＢＧ（１ｕＭ）をＭＡｂ  Ｃ３またはアイソタイプ対照ＭＡｂと一緒に室温で３０分間プレインキュベートし、その後、その後ＲＡ患者由来のヒト滑膜線維芽細胞培養物に３連で添加した。２４時間後、上清を取り、サイトカインＥＬＩＳＡにかけた。ｎ＝1、平均値およびＳＥＭが示される。
【図２０】ラットＣＩＡモデルにおけるテネイシンＣのレベル。コラーゲン誘発関節炎のラットモデルから得られた滑液中のＴＮＣレベル。測定されたＴＮＣの量が、各肢の対応する臨床スコアに対しプロットされて示される。
【図２１】コラーゲン誘発関節炎のラットモデルにおけるＣ３（１６５＿１３＿Ｃ３）抗体の評価から得られた臨床スコア。ビヒクル対１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＣ３抗体。データは平均値±ＳＥＭで表される。統計的有意性：７日目と比較した場合＃＃＃＃ｐ＜０．０００１、ビヒクル処置群と比較した場合＊＊ｐ＜０．０１。
【図２２】コラーゲン誘発関節炎のラットモデルにおけるＣ３（１６５＿１３＿Ｃ３）抗体の評価から得られた後肢体積。ビヒクル対１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＣ３抗体。データは平均値ＳＥＭで表される。統計的有意性：０日目と比較した場合、＃＃ｐ＜０．０１および＃＃＃＃ｐ＜０．０００１、ビヒクル処置群と比較した場合＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。
【図２３】抗原クローニングに使用したプライマー。この表は、抗原クローニングで使用するための発現コンストラクトを作製するのに使用されたプライマーを列挙している。
【実施例】
【０２９６】
実施例１：  抗原およびアッセイ試薬としての精製テネイシンＣ  ＦＢＧの生成
テネイシンＣのＦＢＧドメイン（ＴＮＣ  ＦＢＧ）を含有する精製可溶性タンパク質を、抗体選別における抗原として、および後のスクリーニングおよび特徴づけアッセイにおける試薬として使用するために生成した。複数の哺乳類種のテネイシンＣと結合する抗体の単離のための選別戦略を可能にするために、ヒト［配列番号９２］、マウス［配列番号９３］、ラット［配列番号９４］またはイヌ［配列番号９５］のＴＮＣ  ＦＢＧドメインを取り込んだ一連のＤＮＡ発現コンストラクトを合成した。ヒトテネイシン−Ｒ  ＦＢＧ［配列番号９６］コンストラクトも、この相同体への望まれない結合性を示した抗体の特定のために、作製した。コンストラクトは、下記のように、Ｃ末端またはＮ末端のＦＢＧドメインに結合したラットＣＤ４またはヒトＩｇＧ１  Ｆｃタグを有する６Ｈｉｓタグ化タンパク質として生成した。
【０２９７】
タンパク質発現コンストラクト
抗原発現のための全ての合成ＤＮＡコンストラクトは、合成され、ジェンスクリプト社（Genscript）（ピスカタウェイ、米国）によって配列を確認された。発現ドメインをそれぞれラットＣｄ４（ドメイン３および４）タグ（Chapple et al, 2006）またはヒトＩｇＧ１  Ｆｃタグ（Falk et al, 2012）と融合させる、哺乳類発現ベクターｐＢＩＯＣＡＭ４またはＢＩＯＣＡＭ５に、ＦＢＧドメインをクローニングした。ベクターは、発現タンパク質の分泌のための、マウスＶＨ鎖由来の小胞体（ＥＲ）シグナル配列を含有する、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ＥＲプラスミド（インビトロジェン社）（Falk et al, 2012）から改変した。Ｎ末端ＦＢＧ（例えば、ＦＢＧ−Ｆｃ−ＨｉｓまたはＦＢＧ−ｒＣｄ４−Ｈｉｓ）をもたらした全てのコンストラクトについては、消化されたＰＣＲ産物をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ  ｃｕｔ  ｐＢＩＯＣＡＭ４ベクターまたはｐＢＩＯＣＡＭ５ベクターと連結させた。Ｃ末端ＦＢＧ（例えば、Ｆｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧまたはｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ）をもたらした全てのコンストラクトについては、消化されたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ｃｕｔ  ｐＢＩＯＣＡＭ４ベクターまたはｐＢＩＯＣＡＭ５ベクターと連結させた。ＦＢＧドメインの増幅に使用したプライマーを図２５に収載する。コンストラクトは全て配列を確認した。ＥＬＩＳＡスクリーニングを促進するため、Ｈｉｓタグをコードするインサート（プライマー２５７４および２５７５）を、ＦＢＧ−Ｘ（Ｎ末端ＦＢＧ）融合物を有する発現プラスミドの、ＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にクローニングした（Ｈｉｓ−ＦＬＡＧタグを置換）。完全長テネイシンＣをＢｓｔＸＩおよびＢａｍＨＩによる消化によってＧｅｎｓｃｒｉｐｔ  ｐＵＣ５７プラスミドから直接クローニングし、ＢｓｔＸＩ／ＢａｍＨＩ  ｃｕｔ発現ベクターｐＦＢＧ−Ｆｃ−Ｈｉｓ６にクローニングした。Ｈｉｓ−ＦＢＧコンストラクトを作製するため、プライマーを設計してｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ発現プラスミドからのＰＣＲを行い、Ｈｉｓ−ＦＢＧをコードするＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＢＩＯＣＡＭ５にクローニングした。
【０２９８】
タンパク質発現および細胞培養
トランスフェクションクオリティプラスミドＤＮＡ（Transfection quality plasmid DNA）を、Ｍａｃｈｅｒｙ  Ｎａｇｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉキット（７４０４１０．５０、フィッシャー・サイエンティフィック社、英国）を用いて作製した。抗原および抗体発現用のＨＥＫ２９３Ｆ浮遊細胞およびＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地、並びにＲＰＭＩ培地は、ライフテクノロジーズ社（ペイズリー、英国）製であった。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞のトランスフェクションは以前の記述（Chapple et al, 2006）の通りに行った。
【０２９９】
タンパク質精製およびＱＣ
タンパク質親和性精製では、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースまたは固定化組換えタンパク質Ａ樹脂を使用した。
【０３００】
Ｈｉｓタグ化タンパク質の精製のため、培養上清をＮｉ−ＮＴＡアガロース（１０１８２４０、キアゲン社、クローリー、米国）と１時間混合し、この樹脂を遠心分離（２００×ｇ、２分）のためにＰｒｏｔｅｕｓ１ステップｍｉｄｉスピンカラム（ジェネロン社（Generon）、英国）に移した。非結合タンパク質を、２０ｍＭイミダゾールを添加したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ８）で洗い流した。結合タンパク質を、ＰＢＳ中３００ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）の添加およびカラム遠心分離（２００×ｇ、２分）によって、分画溶出させた。溶出タンパク質を含有するプール画分をＧｅｂａｆｌｅｘ  Ｍｉｄｉ透析チューブ（ジェネロン社Ｄ０１０；分画分子量３．５ｋＤａ）内に入れ、ＰＢＳに対し透析した。
【０３０１】
Ｆｃタグ化タンパク質およびヒトＩｇＧ４として発現された抗体を、プロテインＡセファロース（ＰＣ−Ａ２５、ジェネロン社、メーデンヘッド、英国）を用いて精製した。培養上清を遠心分離（２５００×ｇ、１５分）によって清澄にし、プロテインＡセファロースと４℃で一晩混合し、その後、その樹脂をＰｒｏｔｅｕｓ１ステップｍｉｄｉスピンカラム（ジェネロン社、英国）に移した。カラムを遠心し（２００×ｇ、２分）、ＰＢＳで洗浄して、非結合タンパク質を除去した。Ｆｃタグ化タンパク質またはＩｇＧ４タンパク質を、プロテインＡから、０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．８）を用いて、トリス塩酸（ｐＨ８）に、遠心分離（２００×ｇ、２分）によって、分画溶出させた。溶出画分をプールし、Ｇｅｂａｆｌｅｘ  Ｍａｘｉ透析チューブ（ジェネロン社Ｄ０４５；分画分子量８ｋＤａ）内でＰＢＳに対して透析した。
【０３０２】
タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ゲル）および分光光度法（理論上の吸光係数を用いてＯＤ２８０）によって、純度および濃度について解析した。精製タンパク質を細胞ベースアッセイで使用する場合、内毒素含量をリムラスアメーバ細胞溶解物色素生産性内毒素アッセイ（limulus amoebocyte lysate chromogenic endotoxin assay）（ピアス社）によって最初に測定した。タンパク質は、内毒素レベルが１内毒素ユニット／ミリグラム（すなわち１ＥＵ／ｍｇ）を超過した場合、使用しなかった。
【０３０３】
実施例２：一次抗ＦＢＧ抗体の単離
【０３０４】
抗体ファージディスプレイ
テネイシンＣ  ＦＢＧドメインに対する抗体を、４３のヒトリンパ球ドナーから単離されたＤＮＡを用いて構築された、イオンタス社（Iontas Ltd）専売のヒト抗体ファージディスプレイライブラリーを用いて単離した。選別、ファージレスキューおよびｐＳＡＮＧ１０へのサブクローニング（Martin et al, 2006）は全て、当該技術分野において周知の技術を用いて以前の記述（Schofield et al, 2007）の通りに行った。
【０３０５】
融合パートナー（例えば、ＦＢＧ−Ｆｃ、ＦＢＧ−ｒＣｄ４）のＮ末端に、またはＣ末端（Ｆｃ−ＦＢＧ、ｒＣｄ４−ＦＢＧ）においてヒトＩｇＧ１  ＦｃまたはｒＣｄ４に融合された固定化ＴＮＣ  ＦＢＧに対して、２回のパニング選別を行った。カッパ（κ）またはラムダ（λ）可変軽鎖（ＶＬ）を含有するファージ抗体ライブラリーを別々にパニングして、後の、定常軽（ＣＬ）カッパ（κ）またはラムダ（λ）鎖を含有するＦａｂ発現ベクターへのサブクローニングを促進した。
【０３０６】
ポリクローナルファージ集団を、選別された集団から作製し、ＴＮＣ  ＦＢＧ抗原または適切な融合パートナー（ＦｃまたはｒＣｄ４）で被覆されたＥＬＩＳＡプレートを用いるＥＬＩＳＡ（ポリクローナルファージＥＬＩＳＡ）において試験した。ファージと共にインキュベートした後、プレートを洗浄し、結合したファージをペルオキシダーゼ結合型抗Ｍ１３抗体を用いて検出した。図３は、選別の１回目と２回目の間の抗原特異的な結合体の富化、および、２回目の生産物集団における、抗Ｆｃまたは抗ｒＣｄ４ファージと比較した場合の、ＦＢＧ結合体のより大きな集団を示しており、これは、選別が成功したことを示している。
【０３０７】
抗原に対するｓｃＦｖ結合の確認およびＥＬＩＳＡによる交差反応性アッセイ
２回目の選別生産物を個々のｓｃＦｖクローンとして発現させ、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて抗原認識を確認した。生産物集団を細菌性発現ベクターｐＳＡＮＧ１０（Martin et al, 2006）にサブクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させ、個々の形質転換体を以前の記述（Schofield et al, 2007）の通りに９６ウェルプレート内で誘導した。大腸菌上清を収集し、ユウロピウム標識抗ＦＬＡＧ検出抗体を用いる、ＤＥＬＦＩＡに基づくＥＬＩＳＡを用いて、ＴＮＣ  ＦＢＧに対するｓｃＦｖの結合についてアッセイした。最初のＥＬＩＳＡの結果を表１にまとめる。
【０３０８】
【表２】
0006744857.tif 000003
【０３０９】
λライブラリーを用いて最も上手くいった選別は、抗原ｒＣｄ４−ＦＢＧおよびＦｃ−ＦＢＧに対するパニングに基づいていた（選択物１４７および１４８）。κライブラリーについては、最も上手くいった選別は、抗原ＦＢＧ−ｒＣｄ４（１５０）、ｒＣｄ４−ＦＢＧ（１５２）およびＦｃ−ＦＢＧ（１５３）を用いて得られた。このＥＬＩＳＡ選別から得られた７９の陽性クローンを、さらなる解析のために選択した。
【０３１０】
交差反応性ＥＬＩＳＡは、６７／７９（８５％）の抗ヒトＦＢＧ  ｓｃＦｖがマウスＴＮＣ  ＦＢＧに対し交差反応性であったと示した。抗ＦＢＧ  ｓｃＦｖのＤＮＡ配列解析は優れた配列多様性を示した。例えば、ＶＬλライブラリーからの選択物１４７および１４８は９２％ユニークな可変重（ＶＨ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含有し、ＶＬκライブラリーからの選択物１５０、１５２および１５３はそれぞれ６７％、９１％および１００％ユニークな可変ＶＨＣＤＲ３配列を含有した。
【０３１１】
最も有効な選別から単離されたさらなる１４２５のクローンをＥＬＩＳＡでスクリーニングしたところ、これは、追加で４０１の、ＦＢＧ結合特異性を有するｓｃＦｖの特定をもたらした（表２）。これらのクローンが、最初のＥＬＩＳＡで特定された７９のｓｃＦｖと共に、さらなる評価のために選択された。
【０３１２】
【表３】
0006744857.tif 000004
【０３１３】
１４２５のクローンを、ヒトテネイシンＲ  ＦＢＧに対する結合、並びにまたヒト、マウス、ラットおよびイヌＴＮＣ  ＦＢＧに対する結合について各ｓｃＦｖが試験される、特異性ＥＬＩＳＡにおいてさらに試験した。クローンを、テネイシンＲ  ＦＢＧ結合のシグナルで割った、テネイシンＣに対する結合の入手ＥＬＩＳＡシグナルに従って、順位付けした。５０超の比を有する上位２５０のクローンをサブクローニングおよびさらなる解析用に得た。
【０３１４】
実施例３：機能分析における一次抗ＦＢＧ抗体のスクリーニング
抗ＦＢＧ  ｓｃＦｖを、全細胞アッセイ（whole cell assay）系におけるＦＢＧ誘導性シグナル伝達の阻害剤としてのそれらの活性の評価のために、二価ｓｃＦｖ−Ｆｃとして、または単量体Ｆａｂとして再構成した。
【０３１５】
選択物１４７、１４８、１５０、１５２および１５３のそれぞれについて、一次ＥＬＩＳＡシグナルによって順位付けされた、上位５０の抗ＦＢＧ  ｓｃＦｖを、個々の選択集団として哺乳類発現プラスミドｐＢＩＯＣＡＭ５にサブクローニングし（Falk et al, 2012）、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞における一過性導入によって発現させた（Chapple et al, 2006）。Ｆａｂ発現について、プールされたλまたはκｓｃＦｖ可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）インサートを、専売のイオンタス社（Iontas Ltd）プロトコルを用いて、二重プロモーターＦａｂ発現ベクターにクローニングした（ｐＦａｂ−ｄｕａｌ−κまたはｐＦａｂ−ｄｕａｌ−λ、軽鎖生殖系列に依存）。培養上清をＴＨＰ−１細胞アッセイにおける活性についてスクリーニングし、選別されたｓｃＦＶ−ＦｃおよびＦａｂヒット（hit）を再アッセイおよび阻害活性の確認のために親和性精製した。
【０３１６】
ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）レポーター細胞アッセイ
テネイシンＣは、ＦＢＧドメインと細胞ＴＬＲ４の相互作用によって、炎症性細胞および線維芽細胞におけるサイトカインの産生を誘導することが示されている（Midwood et al, 2009）。ＴＮＦａ、ＩＬ−８およびＩＬ−６等の炎症性サイトカインの産生に繋がる受容体シグナル伝達カスケードは、転写因子ＮＦ−κＢの活性化を含む。このプロセスは、測定が容易なタンパク質シグナルの発生によるＮＦ−κＢ活性化に応答するよう改変された「レポーター」細胞株において研究することができる。ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）レポーター細胞株（インビボジェン社（InvivoGen）；トゥールーズ、フランス）は、ヒトＴＨＰ−１単球細胞株に由来し、ＮＦ−κＢ誘導性の分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーターコンストラクトを安定に発現する。これらの細胞はまた、中〜高処理のアッセイ法を用いる培養上清中のＳＥＡＰの比色または蛍光定量化を用いた、ＴＮＣ  ＦＢＧ融合タンパク質のシグナル伝達活性の容易な測定を可能にする、細胞表面ＴＬＲ４を恒常的に発現する。
【０３１７】
低ＦＢＧ濃度での活性は、あらゆるスクリーニングアッセイの成功に不可欠であり；レポータータンパク質のロバストな増加を生み出すのに必要とされるＦＢＧの濃度が高過ぎる場合、あらゆるそのようなシグナルを十分に阻害するのに必要とされるｓｃＦｖ、Ｆｃ−ＳｃＦｖまたはＦａｂコンストラクトの発現レベルおよび濃度は選別において容認できないものとなるだろう。Ｆｃ−ＦＢＧは、この細胞アッセイにおいてロバストなＳＥＡＰシグナルを低ｎＭレベルで生み出す（ＣＤ４−ＦＢＧはこの濃度範囲では反応を生じなかった）。
【０３１８】
ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）細胞を、細胞を超低付着Ｔ７５フラスコ内で増殖させた以外は供給業者のプロトコル（http://www.invivogen.com/PDF/THP1_Blue_NF_kB_TDS.pdf）に従って、補足ＲＰＭＩ培地中で培養および継代した。アッセイにおいて、ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）細胞を、１７０μｌの総体積において、ＲＰＭＩ培地中、Ｆｃ−ＦＢＧ（３または１０ｎＭ）を含有する９６ウェル組織培養プレートに加えた（１００，０００細胞／ウェル）。発現されたｓｃＦｖ−ＦｃもしくはＦａｂを含有する培養上清、またはＰＢＳ中の親和性精製した抗体を、３０μｌの体積で加え、細胞を３７℃で１８時間インキュベートした。上清を回収し、Ａｔｔｏｐｈｏｓ  ＡＰ蛍光定量系（Ｓ１０００；プロメガ社）を用いてＳＥＡＰについて、または、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ発色系（ＤＹ２０８；Ｒ＆Ｄシステムズ社、英国）を用いてＩＬ−８含量について、供給業者の説明書に従ってアッセイした。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（グラフパッド社（GraphPad））を用いて、データをプロットし、曲線の当てはめを行った。
【０３１９】
ＨＥＫ２９３Ｆ培養上清としての抗ＦＢＧ抗体のスクリーニングは、ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）細胞におけるＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧ誘導性シグナル伝達の推定上の阻害剤にハイライトを当て、そのうちの９つが再アッセイの際に精製されたｓｃＦｖ−Ｆｃ（図４ａ）またはＦａｂ（図４ｂ）として確認された。Ｆｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧは効力（potecy）アッセイを機能させるのに重要である。単量体ＦＢＧはＴＨＰ−１Ｂｌｕｅ細胞およびヒト細胞においていかなるサイトカイン応答も誘導しなかった。
【０３２０】
実施例４：一次抗ＦＢＧ抗体の機能的特徴づけ
【０３２１】
ＥＬＩＳＡ交差反応性アッセイ
ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）機能分析で特定された９つのヒトＦＢＧシグナル伝達阻害剤パネルを、ラット、マウス、およびイヌＦＢＧに対する交差反応性についてＥＬＩＳＡで評価した。ヒトテネイシン−Ｒ  ＦＢＧ相同体への結合も測定した。アッセイウェルをヒト、ラット、マウス、およびイヌＴＮＣ  ＦＢＧ−ｒＣＤ４、またはヒトＴＮＲ  ＦＢＧ−ｒＣｄ４融合タンパク質で被覆し、抗κｍＡｂまたは抗λｍＡｂ、次いでユウロピウム結合型抗マウスｍＡｂを用いてＦａｂの結合を検出した。ＥＬＩＳＡの結果により、４つのＦａｂが、ヒトＴＮＲ  ＦＢＧに対するより低い見かけの結合性で、ヒトＴＮＣ  ＦＢＧの他の哺乳類相同体に対し良好な交差反応性を示したことが明らかとなった（図５）。これらは以下であった：
【０３２２】
Ｆａｂ  ２Ａ５（ＶＨ配列番号４；ＶＬ配列番号８）、
Ｆａｂ  Ｂ１２（ＶＨ配列番号１２；ＶＬ配列番号１５）、
Ｆａｂ  Ｄ８（ＶＨ配列番号１９；ＶＬ配列番号２１）、および
Ｆａｂ  Ｆ３（ＶＨ配列番号２５；ＶＬ配列番号２９）。
【０３２３】
ＴＮＣ−ＦＢＧに対し乏しい種間交差反応性を示したＦａｂについてはさらなる考慮を行わなかった。
【０３２４】
表面プラズモン共鳴による結合親和性の決定
ヒト、ラットおよびマウスＴＮＣ  ＦＢＧ、並びにヒトＴＮＲ  ＦＢＧに対する結合においての、選択されたＦａｂの親和性並びに会合および解離速度を、２５℃の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。実験は、Ｈｕｍａｎ  Ｆａｂ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（ＧＥ、２８−９５８３−２５）と共に提供されたプロトコルに従って、ＣＭ５センサーチップを備えたＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００装置を用いて行った。種々の濃度のｒＣｄ４−ＦＢＧを、固定化Ｆａｂを有するフローセルおよび参照フローセルに注入した。参照シグナルの減算の後、Ｔ１００  ＢＩＡ評価用ソフトウェアを用いてデータをグローバル１：１フィット（global 1:1 fit）に当てはめた（図６ａ〜ｄ）。
【０３２５】
算出した速度定数を表３に示す。ヒトＴＮＣ  ＦＢＧに対するＦａｂの親和性の順番は、Ｂ１２（１１０ｐＭ）＞Ｄ８（８．４９ｎＭ）＞２Ａ５（１１．４ｎＭ）＞Ｆ３（２７．４ｎＭ）であった。全てのＦａｂが、げっ歯類ＴＮＣ  ＦＢＧに対し低ナノモルの親和性を示し、ヒトＴＮＲ  ＦＢＧに対する親和性は、典型的に、ヒトＴＮＲ  ＦＢＧよりも６０倍超より低かった。
【０３２６】
阻害活性アッセイ
ｈｕＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧ活性の中和における精製Ｆａｂの作用強度を、ＴＬＲ４介在性分泌型アルカリホスファターゼおよびＩＬ−８サイトカイン産生の測定を用いるＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）アッセイにおいて決定した。アッセイは、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（グラフパッド社）を用いたＩＣ５０値の算出を可能にするために精製Ｆａｂを一連の濃度（０．３〜１００ｎＭ）でアッセイウェルに加えた以外は実施例２に記載の通りに、行った。
【０３２７】
【表４】
0006744857.tif 000005
【０３２８】
全ての抗体が、Ｆｃ−Ｈｉｓ−ＨｕＦＢＧ誘導性アルカリホスファターゼ（図７）およびＩＬ−８産生（図８）の濃度関連阻害を示した。抗ＦＢＧ  Ｆａｂによるアルカリホスファターゼ阻害の阻害の作用強度（ＩＣ５０）の順番は、Ｂ１２（１．７ｎＭ）＞Ｄ８（７．２ｎＭ）＞Ｆ３（８．４ｎＭ）＞２Ａ５（２０．６ｎＭ）であった。作用強度（ＩＣ５０）の順番は、ＩＬ−８放出の阻害と同様であった：Ｂ１２（６．９ｎＭ）＞Ｆ３（１３．８ｎＭ）＞Ｄ８（１４．９ｎＭ）＞２Ａ５（２８．５ｎＭ）。
【０３２９】
実施例５：ｈｕＴＮＣ  ＦＢＧドメインに対する最適化抗体の作製および単離
【０３３０】
標的化ＣＤＲ変異誘発による親和性成熟
抗ＦＢＧ抗体２Ａ５、Ｂ１２、およびＦ３を親和性成熟のために選択した。標的化ＣＤＲ変異誘発を、Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発を用いて６つのアミノ酸から成るブロックにおいてＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ３残基をランダム化することにより、実行した（Fellouse and Sidhu, 2007; Kunkel et al., 1987; Sidhu and Weiss, 2004）。所与のクローンにおいてＶＨ  ＣＤＲ３は長いため（１０〜１６残基）、ランダム化は３つの重複ブロックにおいて行い、ＶＬ  ＣＤＲ３（９残基）は２つの重複ブロックにおいてランダム化した（図９ａ）。ランダム化は、３２のコドン組合せから所与の位置において２０個のアミノ酸のうちのいずれか（および単一のアンバー終止コドンのみ）をコードし得るＮＮＳ（Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｃ／ＴおよびＳ＝Ｇ／Ｃ）縮重プライマーを用いて、実行した。変異誘発に使用したオリゴヌクレオチドを図９ｂに示す。このように、１５のライブラリー（３つの抗体について３ライブラリー／ＶＨおよび２ライブラリー／ＶＬ）を最初に作製したところ、Ｆ３  ＶＬ３．１およびＦ３  ＶＬ３．２以外の全てのライブラリーは、ＮＮＳプライマーを用いた６つの残基のランダム化から生じる理論上の多様性（３２６＝１．１×１０９）を網羅するのに十分に大きかった（表４）。ＣＤＲ３ライブラリーをレスキュー過程の間に組み合わせたところ、これは、親抗体クローンのそれぞれにおいて、組み合わされた変異ＶＨライブラリーおよび組み合わされた変異ＶＬライブラリーをもたらし、合計で６つのライブラリーが得られた。
【０３３１】
【表５】
0006744857.tif 000006
【０３３２】
高度にストリンジェントなファージディスプレイ選別
ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄ上のファージ−抗体選別を以前の記述（Dyson et al, 2011）の通りに行った。複数ラウンドの液相選別をビオチン化ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧに対して実行し、親和性が向上したクローンを富化させた。各ラウンドの最適抗原濃度は、一連の抗原濃度に対する選別および抗原無し対照との結果数の比較によって、実験的に決定した。各ラウンドで使用される抗原の量を減少させることにより、選別のストリンジェンシーを増加させた。選別ウィンド（selection window）（選別結果および抗原無し対照間のファージ力価の倍率差）が１０を下回った後は、さらなるラウンドの選別は行わなかった。従って、３ラウンド目で観察された選別ウィンドの大きさのために４ラウンド目の選別を受けたＢ１２以外の全てのライブラリーについて、３ラウンドの選別（図１０ａ）がビオチン化ヒトｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧに対し行われた。全てのライブラリーに、各選別ラウンドにおいてストレプトアビジンビーズおよびテネイシン−Ｒ（１〜３回目は１００ｎＭ、４回目は１ｎＭ）に対する除外をかけて、ストレプトアビジンまたはテネイシン−Ｒに対する望まれない交差反応性を回避した。さらに、ヒト抗原およびマウス抗原を選別のラウンド間で交替させたハイブリッド選別戦略（図１０ｂ）を、Ｂ１２ランダム化ライブラリーのみに対し実行した。Ｂ１２ライブラリーに対しこの追加選別を行った理由は、ヒトおよびマウスｒＣｄ４−ｈｉｓ−ＦＢＧに結合するＢ１２親抗体において観察された、親和性における大きな差異のためであった。この差異は２Ａ５（６．９倍）またはＦ３（２．６倍）親抗体においてはそれほど明白ではなかった。さらに、優れたオフレート（off-rate）を有する抗体クローンを選別するために、追加ラウンドの選別を行った。オフレート選別では、ファージをビオチン化抗原（この場合１ｎＭ）に結合させ、その後、大過剰な非ビオチン化抗原（５００ｎＭ）を反応に加え、２０時間または４０時間インキュベートした。非ビオチン化抗原は、競合物として働き、ビオチン化抗原から解離したファージ抗体を捕捉し、すなわち、より長いオフレートを有する抗体のみが選別の最後に回収されることになる（Hawkins et al., 1992; Zahnd et al., 2010）。各選別ラウンドの結果のファージ力価を、算出した選別ウィンドウと共に、表５ａ〜ｃに示す。選別された集団を細菌性発現ベクターｐＳＡＮＧ１０（Martin et al, 2006）にサブクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させ、それぞれマウスＦＢＧおよびヒトＦＢＧに対し向上した結合性を有するクローンを特定するために、ＥＬＩＳＡ解析用およびＨＴＲＦ解析用に個々の形質転換体を選んだ（選別ごとに４６）。
【０３３３】
【表６】
0006744857.tif 000007
【０３３４】
【表７】
0006744857.tif 000008
【０３３５】
【表８】
0006744857.tif 000009
【０３３６】
ＥＬＩＳＡ選別
抗ＦＬＡＧ捕捉ＥＬＩＳＡを行って、親抗体と比較して、マウスＦＢＧ結合において向上した親和性を有したクローンを選別した。
【０３３７】
ｓｃＦｖ  ｐＳＡＮＧ１０発現プラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）クローンを、以前の記述（Schofield et al, 2007）の通りに、自動誘導培地（auto-induction media）を含む９６ウェルプレート内で誘導した。大腸菌上清をＥＬＩＳＡアッセイ用に回収した。ＥＬＩＳＡには、ユウロピウム標識抗ＦＬＡＧ抗体（シグマアルドリッチ社、英国）を用いる、ＤＥＬＦＩＡ（解離増強ランタニド蛍光免疫測定（dissociation enhanced lanthanide fluorescent immunoassay））系を使用した。黒色免疫吸収プレート（black immunosorb plate）（ヌンク社）を、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（シグマ社、Ｆ３１６５、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）で一晩被覆し、ウェルにおいて、２％粉乳、ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｍ、３００μｌ／ウェル）の添加によりブロッキングを行った。プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ−Ｍ中の発現されたｓｃＦｖを含有する９６ウェル自動誘導培養上清の１：２希釈物（５０μｌ／ウェル）を添加した。プレートを１時間インキュベートし、上記と同様に洗浄し、ビオチン化マウスまたはヒトｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ（ＰＢＳ−Ｍ中５μｇ／ｍｌ、５０μｌ）を各ウェルに加えた。プレートをさらに１時間インキュベートし、洗浄し、Ｓｔｒｅｐｒａｖｉｄｉｎ−Ｅｕを添加し（パーキンエルマー社、１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ−Ｍ、５０μｌ）、３０分間インキュベートし、洗浄し、ＤＥＬＦＩＡ増強液を添加し（５０μｌ）、パーキンエルマー社製Ｆｕｓｉｏｎプレートリーダー（励起＝３２０ｎｍ、放出６２０ｎｍ）上でプレートを読んだ。アッセイの形式を図１１に示す。
【０３３８】
自動誘導培養におけるｓｃＦｖの発現レベルは抗ＦＬＡＧ被覆ウェルを飽和させるため、このアッセイではｓｃＦｖ発現レベルの差を正規化する。従って、このアッセイで得られるシグナルは洗浄後に結合したビオチン化ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧの量を反映しており、これが、マウスまたはヒトＦＢＧに対するそのクローンのオフレートの関数となる。２Ａ５サブライブラリーおよびＢ１２サブライブラリーからの選別結果のＥＬＩＳＡスクリーニングは、マウスＴＮＣ  ＦＢＧに対し有意に向上した結合性を有するクローンを明らかにした。
【０３３９】
ＨＴＲＦ選別
ＨＴＲＦに基づく競合アッセイを開発して、ヒトＴＮＣ  ＦＢＧに対し向上した結合性を有する抗体バリアントをスクリーニングした。
【０３４０】
全ての試料および試薬は、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、０．１％ＢＳＡ、０．４Ｍ  ＫＦ、ｐＨ７．０）中で記載濃度の４倍に調製した。次に、５μｌの各試薬を、２０μｌの最終反応体積を得るように低容量３８４ウェルアッセイプレート（グレイナー社（Greiner）、７８４０７５）に添加した。製造業者の指示の通りにｄ２標識キット（ＣｉｓＢｉｏ社、６２Ｄ２ＤＰＥＡ）を用いてＩｇＧ抗体を標識した。ストレプトアビジンユウロピウムクリプテート（ＣｉｓＢｉｏ社、６１０ＳＡＫＬＡ、ロット番号２５Ｃ）は、製造業者による推奨の通りに、１．８ｎｇ活性部分（ＳＡ）／２０μｌ反応の最終濃度で使用した。ＥＺ−ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ試薬（サーモサイエンティフィック社、２１３２７）を用いてビオチン化ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧを調製し、ビオチン化蛍光定量化キット（サーモサイエンティフィック社、４６６１０）を用いてビオチン化の程度を定量化した。適切な場合には、ｓｃＦｖを含有する上清（ＥＬＩＳＡアッセイについての上記の通りに調製）を、１／２０の最終希釈で（すなわち、アッセイ緩衝液中で１／５希釈した後、５μｌの希釈試料を２０μｌのＦＲＥＴアッセイに添加）、３８４ウェルアッセイプレートに添加した。スクリーニングに使用したｄ２標識された２Ａ５  ＩｇＧおよびＢ１２  ＩｇＧの濃度は、それぞれ１５ｎＭおよび１．２５ｎＭであった。特に記載がない限り、ビオチン化ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ（ビオチン：タンパク質比＝１．８：１）は、２．２ｎＭ（２Ａ５  ＩｇＧ抗体を用いるアッセイ）または１ｎＭ（Ｂ１２  ＩｇＧを用いる実験）で存在した。試料を室温でおよそ１時間インキュベートし、ＦＲＥＴシグナルをＢＭＧ  Ｐｈｅｒａｓｔａｒ装置を用いて測定した：励起＝３２０ｎｍ；放出＝６２０ｎｍおよび６６５ｎｍ；積分開始時間（integration start time）＝６０μｓ；積分時間（integration time）＝５００μｓ；１００フラッシュ／ウェル。培養上清を含有する競合アッセイについて、ビオチン化ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ抗原をストレプトアビジンユウロピウムクリプテートと一緒に４５分間プレインキュベートし、その後、アッセイプレートに試薬を添加した。全てのＦＲＥＴシグナルはΔＲとして表され、ここで、Ｒ＝（Ｅ６６５／Ｅ６２０×１０４）およびΔＲ＝（Ｒ試料−Ｒバックグラウンド蛍光）である。
【０３４１】
親和性選択された変異体ライブラリーからの非標識ｓｃＦｖクローンを含有する培養上清を、ＦＢＧとフルオロフォア標識親ＩｇＧ抗体との間の相互作用の阻害について試験した。２Ａ５バリアントのスクリーニングに使用された場合、このアプローチにより、親と比較して向上した阻害を有する高比率のクローンが得られた（９２％のＶＨ  ＣＤＲ３バリアントおよび７９％のＶＬ  ＣＤＲ３バリアント）。ＦＲＥＴシグナルを完全に阻害したクローンを区別するために、２Ａ５バリアントを後に、Ｂ１２  ＩｇＧと競合するそれらの能力についてスクリーニングした。ヒトＦＢＧに対するＢ１２の親和性が２Ａ５のそれよりもおよそ１００倍より強い（２５℃での表面プラズモン共鳴によって決定された、これらの相互作用の解離定数は、それぞれ０．１１ｎＭおよび１５ｎＭであった）ことを考えると、これはよりストリンジェントなスクリーニングであった。両アッセイにおいて有用な範囲内のＦＲＥＴシグナルを示すクローンの相対順位はおおよそ変化せず、このことは、それらが類似のエピトープに対し競合していたことを示している。従って、親和性成熟選別からの全ての２Ａ５およびＢ１２  ｓｃＦｖバリアントを、ヒトＴＮＣ  ＦＢＧに対するＢ１２  ＩｇＧ分子の結合を阻害するそれらの能力についてスクリーニングした。親和性成熟クローンと並列してｓｃＦｖとして表される親クローンを、基準として使用した（表６）。
【０３４２】
ＳｃＦｖを配列決定し、ユニークなＶＨまたはＶＬ  ＣＤＲ３配列を有するクローンパネルを、それぞれＥＬＩＳＡアッセイおよびＨＴＲＦアッセイにおけるマウスおよびヒトＴＮＣ  ＦＢＧに対するそれらの結合性に基づいて、ヒトＩｇＧ４フォーマットにおけるさらなる研究のために選択した。抗体２Ａ５の選択されたバリアントは、マウスＦＢＧに対する結合においては１０倍以上の向上を、および、ＨＴＲＦアッセイにおいては９０％以上（ＶＨ  ＣＤＲ３バリアント）または８３％以上（ＶＬ  ＣＤＲ３バリアント）の阻害を示した。
【０３４３】
【表９】
0006744857.tif 000010
【０３４４】
抗体Ｂ１２のバリアントは、マウスＦＢＧ結合における４倍以上の向上、およびＨＴＲＦシグナルの９１％以上の阻害を示した。ユニークなＣＤＲ３配列を有し、これらの判定基準に適合する、合計で３１のクローンが特定された（表７）。
【０３４５】
【表１０】
0006744857.tif 000011
【０３４６】
これらは、ヒトおよびマウスＴＮＣ  ＦＢＧに結合し、それ故、本発明の方法、用途、組成物および化合物において潜在的な有用性を有する、抗体クローンの重鎖配列または軽鎖配列である。例えば、これらのＣＤＲ３配列を有するＴＮＦ  ＦＢＧと結合する抗体は、ＴＮＣまたはＴＮＣ  ＦＢＧの特定、その機能阻害、その検出およびその精製において有用であり得る。
【０３４７】
ＩｇＧ４フォーマットへの変換および結合速度の測定
ヒンジ安定化変異（hinge-stabilising mutation）（Ｓ２４１Ｐ；Angal et al, 1993）を有するヒトＩｇＧ４としての抗体を作製するために、目的の３１のｓｃＦｖをヒトＩｇＧ４発現ベクターにサブクローニングした。ＩｇＧ４抗体をＨＥＫ−２９３Ｆ細胞において一過性発現させ、ヒトおよびマウスＴＮＣ  ＦＢＧ、並びにヒトＴＮＲ  ＦＢＧに対する結合におけるそれらのオフレートの順位付けのために、表面プラズモン共鳴分光法を用いて培養上清をスクリーニングした。簡潔に説明すると、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００装置を用い、ヒト抗体捕捉キットプロトコル（ＧＥ社、ＢＲ−１００８−３９）に従うプロトコルに従って行った。オフレートスクリーニングにおいて、１０，０００反応単位（ＲＵ）の抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ（ＧＥ社、ＢＲ−１００８−３９）を、アミン結合キットプロトコル（ＧＥ社、ＢＲ−１０００−５０）に従ってＥＤＣ／ＮＨＳ架橋結合化学作用を用いて、Ｓｅｒｉｅｓ５  ＣＭ５デキストランセンサーチップ（ＢＲ−１００５−３０）のフローセル（ＦＣ１およびＦＣ２）上に固定化した。発現されたＩｇＧ４を含有する培養上清を２×ＰＢＳ−Ｔで１：２希釈し、ＦＣ２に注入して（流速５μｌ／分、６０ｓ接触時間）、２５℃における抗体捕捉を可能にした。抗体捕捉レベルは、上清中の抗体の発現レベルに依存して、３０８〜１９７５ＲＵの範囲であった。固定濃度の抗原（１５ｎＭのヒトおよびマウスＴＮＣ  ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ並びに１００ｎＭのヒトＴＮＲ  ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ）を、ＦＣ１（参照フローセル）およびＦＣ２（抗体捕捉フローセル）を介した流路を用い、３０μｌ／分の流速で注入し、会合相および解離相をそれぞれ１分間および５分間に亘って測定した。結合表面の再生には、３０ｓ接触時間の３Ｍ  ＭｇＣｌ２を用いた。対照セル減算およびＢＩＡ評価用ソフトウェア（ＧＥ社、ＢＲ−１００５−９７）を用いる１：１相互作用を想定したセンソグラム（sensogram）実験データの当てはめによって、オフレートを決定した。オフレート選別の結果を表８にまとめる。
【０３４８】
【表１１】
0006744857.tif 000012
【０３４９】
クローンを、ヒトおよびマウスＴＮＣ  ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧについては低オフレートに従って、ヒトＴＮＲ  ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧについては高オフレートに従って、順位付けした。各ライブラリーからの最も順位の高い３つの抗体を、精製ＩｇＧ４としてのより詳細な動態解析に優先させた。これらのクローンを表９、１０および１１に示す。
【０３５０】
【表１２】
0006744857.tif 000013
【０３５１】
【表１３】
0006744857.tif 000014
【０３５２】
【表１４】
0006744857.tif 000015
【０３５３】
９つの優先されたＩｇＧ４抗体について詳細な動態パラメータを評価した。ヒト、ラットおよびイヌＴＮＣ  ｒＣＤ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ、並びにヒトＴＮＲ  ｒＣＤ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧとの相互作用について、結合特性を決定した。動態アッセイは、基本的には上記のオフレート決定と同じプロトコルに従って、以下の通りにいくつか改変した。動態パラメータ決定の精度を向上させるために、抗ヒトＦｃ  ＩｇＧをより低レベル（２２２９ＲＵ）で固定化し、捕捉される抗ＦＢＧ  ＩｇＧ４の量における対応する減少を得た。精製抗ＦＢＧ  ＩｇＧ４をＰＢＳ（ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で３．５ｎＭの濃度に希釈し、１０μｌ／分の流速、６０ｓの接触時間で、ＦＣ２に注入した。これにより、典型的には、平均８０ＲＵの捕捉抗体（範囲：５５ＲＵ〜９０ＲＵ）が得られた。抗原をＰＢＳ（ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中の２倍希釈により調製した（７ｎＭであったマウスｒＣＤ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧを除いて、最高濃度１００ｎＭ）。アッセイは３７℃（３０μｌ／分、１２０ｓ接触時間；マウスｒＣＤ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧＦＢＧ  １０μｌ／分、６０ｓ接触時間）で行い、フローセルおよび注入チャンバは共にこの温度に平衡させた。前述の通りに、対照セル減算およびＢＩＡ評価用ソフトウェア（ＧＥ社、ＢＲ−１００５−９７）を用いる１：１相互作用を想定したセンソグラム（sensogram）実験データの当てはめによって、動態パラメータを決定した。
【０３５４】
９つ全ての抗体が、親和性成熟されなかった親クローンと比較して、マウスＴＮＣ  ＦＢＧドメインに対する向上した結合性を示し、抗体１６５＿１３＿Ｂ１、１６５＿１３＿Ｃ３、および１６０＿０１＿Ａ４が、ヒトＴＮＣ  ＦＢＧに対する結合においてｎＭ以下のＫＤ値を示し、ヒトＴＮＲ  ＦＢＧ類似体に対し７０倍超より低い親和性を有した（表１２）。
【０３５５】
【表１５】
0006744857.tif 000016
【０３５６】
実施例６：初代ヒトＰＢＭＣにおけるＴＮＣ  ＦＢＧ誘導性サイトカイン産生の阻害
精製ＩｇＧ４抗体１６５＿１３＿Ｂ１、１６５＿１３＿Ｃ３、および１６０＿０１＿Ａ４の機能的なＦＢＧ中和活性を、初代ヒトＰＢＭＣにおけるＦＢＧ誘導サイトカイン放出のインビトロアッセイにおいて確認した。
【０３５７】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）集団を、密度勾配遠心法によって、３つの健常ヒト単一ドナー軟膜調製物から単離した。アッセイを９６ウェルプレート内で２００μｌの最終体積で行い、リムラスアメーバ細胞溶解物（ＬＡＬ）内毒素定量化キット（ピアス社）を用いた測定により、全ての試薬および試験抗体の内毒素含量が許容限度内であることを使用前に確認した。
【０３５８】
単離したばかりのＰＢＭＣ試料（２×１０５細胞／ウェル）を、試験抗体（１００ｎＭおよび１μＭ）、対照アイソタイプ抗体（シグマ社Ｉ４６３９；１００ｎＭおよび１μＭ）、デキサメタゾン（１μＭ）またはＰＢＳ対照の存在下で１時間培養し、その後、細菌性リポ多糖類（ＬＰＳ；大腸菌０２６：Ｂ６；１００ｎｇ／ｍＬ）またはヒトＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧ（２００ｎＭ）で最大下刺激（submaximal stimulation）した。ＬＰＳまたはＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧが等量のＰＢＳと置き換えられた対照ウェルは、試験抗体またはデキサメタゾンを含有した。インキュベーション（２４時間、３７℃）後、培養上清を集め、−８０℃で貯蔵した。試料は、サイトカイン含量についての上清のアッセイの前に室温に解凍した。２５μｌの一定分量の各上清を等量のＲＰＭＩ培地（ライフテクノロジーズ社）で希釈し、得られた試料をＬｕｍｉｎｅｘ解析によりＩＬ−８およびＴＮＦαについて二連でアッセイした。
【０３５９】
ＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬ  ＬＰＳと一緒に２４時間インキュベートすることにより、ＩＬ−８およびＴＮＦａの産生がもたらされ、これは、対照ＩｇＧ４抗体または抗ＦＢＧ抗体への暴露によっては阻害されなかった。対照的に、Ｆｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧによって誘導されたＩＬ−８およびＴＮＦａの放出は、全ての試験抗体によって完全に遮断され、対照ＩｇＧ４によっては遮断されず、これにより、３つの親和性成熟された抗体１６５＿１３＿Ｂ１、１６５＿１３＿Ｃ３、および１６０＿０１＿Ａ４の強力且つ特異的なＦＢＧ中和活性が確認された（図１２ａ、ｂ）。
【０３６０】
実施例７：シトルリン化ＦＢＧへの抗ＦＢＧ  ＩｇＧ４結合
シトルリン化ＦＢＧへの抗体Ｂ１２の結合親和性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で決定した。Ｂ１２を、ＱＭＣＦ発現技術（イコサジェン社（Icosagen）、エストニア）を用いて、ヒンジ安定化Ｓ２４１Ｐ変異体を有するヒトＩｇＧ４として発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ；ＧＥヘルスケア社）で精製した。
【０３６１】
ヒトＴＮＣ  ＦＢＧのシトルリン化
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ２（ＰＡＤ２；ＭＱ−１６．２０１−２．５、モディクエスト社（Modiquest）、オランダ）またはペプチジルアルギニンデイミナーゼ４（ＰＡＤ４；ＭＱ−１６．２０３〜２．５、モディクエスト社、オランダ）を供給業者の説明書に従って使用して、精製ヒトＨｉｓ−ＦＢＧをシトルリン化した。簡潔に説明すると、Ｈｉｓ−ＦＢＧを、供給された脱イミノ化緩衝液（０．１Ｍトリス塩酸ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭジチオスレイトール）中で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、２５０μｌを１２５ｍＵのＰＡＤ２またはＰＡＤ４酵素と混合し、その後、３７℃で２時間インキュベートした。酵素処理した試料のアミノ酸解析によって、シトルリン化を確認した。非シトルリン化対照タンパク質として使用のために、一定分量の脱イミノ化緩衝液中Ｈｉｓ−ＦＢＧを、ＰＡＤ酵素を添加せずに、３７℃で２時間インキュベートした。シトルリン化Ｈｉｓ−ＦＢＧタンパク質および無修飾Ｈｉｓ−ＦＢＧタンパク質を下記の通りのＳＰＲ実験に使用した。
【０３６２】
表面プラズモン共鳴
ＳＰＲ実験はＢＩＡｃｏｒｅ３０００装置で行った。抗ヒトＩｇＧ（ＧＥヘルスケア社）を、アミノ結合化学作用を用いてＣＭ５センサーチップの表面に共有結合させた。ＲＵ単位で表される結合した抗ヒトＩｇＧの量は、６５００〜７０００（６．５〜７．０ｎｇ／ｍｍ２）の間で変動した。Ｂ１２−ｈＩｇＧ４（１〜１３ｎＭ）を、２５℃のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で、固定化された抗ヒトＩｇＧに付着させた。固定化されたＢ１２−ｈＩｇＧ４へのＨｉｓ−ＦＢＧバリアントの結合も、２５℃のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で測定した。流速は、固定化実験においては５μｌ／分、動態解析においては２０μｌ／分であった。センサーチップ表面は３Ｍ  ＭｇＣｌ２を用いて再生させた。ＢＩＡ評価用プログラム４．１（ＧＥヘルスケア社）を用いてデータを解析した。
【０３６３】
シトルリン化Ｈｉｓ−ＦＢＧに対するＢ１２−ＩｇＧ４結合の解析によって、動態パラメータが、無修飾Ｈｉｓ−ＦＢＧに対する結合について得られた値と比較した場合に、基本的に不変であったことが明らかとなった（表１３）。これらの結果は、Ｂ１２系統の抗ＦＢＧ抗体が、治療的適用または診断的適用において、ＴＮＣ  ＦＢＧのシトルリン化形態および非シトルリン化形態の両方と結合すると期待されることを示している。
【０３６４】
【表１６】
0006744857.tif 000017
【０３６５】
実施例８：免疫組織化学を用いたヒトＲＡ組織におけるＴＮＣ  ＦＢＧの検出
抗ＦＢＧ抗体がヒト組織における内在性形態のヒトＴＮＣ  ＦＢＧタンパク質を有効に認識するかどうかを決定するために、免疫組織化学研究を行った。テネイシンＣは慢性炎症の部位で発現され、リウマチ様関節炎を有する個体由来の関節の炎症性滑膜内でのその位置は、市販の抗体を用いた免疫組織化学によって以前に示されている（Goh et al, 2010; Salter DM, 1993）。
【０３６６】
Ｂ１２抗体を、ＱＭＣＦ発現技術（イコサジェン社、エストニア）を用いてマウスＩｇＧ２ａフォーマットとして発現させ、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーで精製し、その後Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過を行った。完全長ヒトテネイシンＣのＥＧＦドメインを認識する、対照マウスＩｇＧ１抗テネイシンＣ抗体（クローン４Ｆ１０ＴＴ；タカラ・クロンテック社（Takara Clontech））を、陽性対照コンパレーター（comparator）として使用した。無関係な細菌性抗原に対するマウスＩｇＧ１（ダコ社（Ｄａｋｏ）Ｘ０９３１）またはＩｇＧ２ａ（ダコ社Ｘ０９４３）を対照一次抗体として使用して、これらのアイソタイプによる非特異的なバックグラウンド染色のレベルを決定した。ＲＡ診断が確認されたドナー由来のヒト膝関節滑膜の凍結切片（アステランド社（Asterand）、英国）を、室温と平衡させ、１：１ｖ／ｖアセトン／メタノール中で固定し（１０分）、洗浄緩衝液に移した。製造業者のプロトコルに従いＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｆｌｅｘ試薬（ダコ社Ｋ８０１０）を用いるダコ社製Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒを使用して、免疫染色を行った。簡潔に説明すると、固定した組織スライドを、自動染色器（automated stainer）上に配置し、ブロッキングし（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｂｌｏｃｋ、５分；ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋ、１０分、ダコ社Ｘ０９０９）、その後、一次抗体（Ｂ１２またはクローン４Ｆ１０ＴＴ；１、２、または４μｇ／ｍｌ）を３０分間適用した。いくつかの対照において、スライドは一次抗体に曝さなかった。洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス二次抗体を適用し（２０分）、スライドを再度洗浄し、その後、ＤＡＢ＋Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎを１０分間適用した。スライドを洗浄し、ヘマトキシリンで対比染色し、染色の顕微鏡的可視化のためにカバーガラスをかけた。
【０３６７】
アセトン／メタノールを用いて固定されたＲＡ滑膜の凍結切片において、抗ＴＮＣ  ＦＢＧ  Ｂ１２マウスＩｇＧ２ａは、陽性対照抗体クローン４Ｆ１０ＴＴを用いて得られたものと非常に類似した染色パターンを示した。滑膜、線維性被膜、脈管構造および間質内で、特異的な免疫染色が観察された。リンパ系凝集体内には染色はなかった（図１３ａ、ｃ）。非免疫対照処理組織においていくらかの非特異的免疫染色が存在した（図１３ｂ、ｄ）。これらの結果は、ＲＡ滑膜内のテネイシンＣ発現の以前の報告を確認および拡張するものであり、Ｂ１２が炎症部位における内在性テネイシンＣと結合するための有効な作用剤であることを示しており、さらに、ＦＢＧがＲＡにおいて利用可能な標的であることを示している。
【０３６８】
実施例９：抗体配列
【０３６９】
抗体２Ａ５
【０３７０】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
ＶＨ  ＣＤＲ３：  ＡＱＫＥＴＹＡＬＴＹ（配列番号３）
【０３７１】
ＶＨアミノ酸配列：
【０３７２】
【化１】
0006744857.tif 000018
【０３７３】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号７）
【０３７４】
ＶＬアミノ酸配列：
【０３７５】
【化２】
0006744857.tif 000019
【０３７６】
抗体Ｂ１２
【０３７７】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＤＹＡＭＨ（配列番号９）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０）
ＶＨ  ＣＤＲ３：  ＤＩＳＡＶＰＤＴＦＤＩ（配列番号１１）
【０３７８】
ＶＨアミノ酸配列：
【０３７９】
【化３】
0006744857.tif 000020
【０３８０】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号１３）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＱＴ（配列番号１４）
【０３８１】
ＶＬアミノ酸配列：
【０３８２】
【化４】
0006744857.tif 000021
【０３８３】
抗体Ｄ８
【０３８４】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＳＹＧＩＳ（配列番号１６）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧ（配列番号１７）
ＶＨ  ＣＤＲ３：  ＮＱＤＳＳＳＤＹ（配列番号１８）
【０３８５】
ＶＨアミノ酸配列：
【０３８６】
【化５】
0006744857.tif 000022
【０３８７】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号１３）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＬＱＴ（配列番号２０）
【０３８８】
ＶＬアミノ酸配列：
【０３８９】
【化６】
0006744857.tif 000023
【０３９０】
抗体Ｆ３
【０３９１】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＳＹＧＭＨ（配列番号２２）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２３）
ＶＨ  ＣＤＲ３：  ＥＧＹＤＱＬＦＳＡＥＳＮＡＦＤＩ（配列番号２４）
【０３９２】
ＶＨアミノ酸配列：
【０３９３】
【化７】
0006744857.tif 000024
【０３９４】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＹＦＶＱ（配列番号２６）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＥＤＮＱＲＰＳ（配列番号２７）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＳＹＤＳＳＮＷＶ（配列番号２８）
【０３９５】
ＶＬアミノ酸配列：
【０３９６】
【化８】
0006744857.tif 000025
【０３９７】
抗体１６５＿１３＿Ｂ１（Ｂ１２由来）
【０３９８】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＤＹＡＭＨ（配列番号９）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０）
【０３９９】
【化９】
0006744857.tif 000026
【０４００】
ＶＨアミノ酸配列：
【０４０１】
【化１０】
0006744857.tif 000027
【０４０２】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号１３）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＱＴ（配列番号１４）
【０４０３】
ＶＬアミノ酸配列：
【０４０４】
【化１１】
0006744857.tif 000028
【０４０５】
抗体１６５＿１３＿Ｂ６（Ｂ１２由来）
【０４０６】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＤＹＡＭＨ（配列番号９）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０）
【０４０７】
【化１２】
0006744857.tif 000029
【０４０８】
ＶＨアミノ酸配列：
【０４０９】
【化１３】
0006744857.tif 000030
【０４１０】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号１３）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＱＴ（配列番号１４）
【０４１１】
ＶＬアミノ酸配列：
【０４１２】
【化１４】
0006744857.tif 000031
【０４１３】
抗体１６５＿１３＿Ｄ１（Ｂ１２由来）
【０４１４】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＤＹＡＭＨ（配列番号９）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０）
【０４１５】
【化１５】
0006744857.tif 000032
【０４１６】
ＶＨアミノ酸配列：
【０４１７】
【化１６】
0006744857.tif 000033
【０４１８】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号１３）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＱＴ（配列番号１４）
【０４１９】
ＶＬアミノ酸配列：
【０４２０】
【化１７】
0006744857.tif 000034
【０４２１】
抗体１６５＿１３＿Ｃ３（Ｂ１２由来）
【０４２２】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＤＹＡＭＨ（配列番号９）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０）
【０４２３】
【化１８】
0006744857.tif 000035
【０４２４】
ＶＨアミノ酸配列：
【０４２５】
【化１９】
0006744857.tif 000036
【０４２６】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号１３）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＱＴ（配列番号１４）
【０４２７】
ＶＬアミノ酸配列：
【０４２８】
【化２０】
0006744857.tif 000037
【０４２９】
抗体１６５＿１３＿Ｄ４（Ｂ１２由来）
【０４３０】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＤＹＡＭＨ（配列番号９）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０）
【０４３１】
【化２１】
0006744857.tif 000038
【０４３２】
ＶＨアミノ酸配列：
【０４３３】
【化２２】
0006744857.tif 000039
【０４３４】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号１３）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＱＴ（配列番号１４）
【０４３５】
ＶＬアミノ酸配列：
【０４３６】
【化２３】
0006744857.tif 000040
【０４３７】
抗体１６５＿１３＿Ａ４（Ｂ１２由来）
【０４３８】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＤＹＡＭＨ（配列番号９）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０）
【０４３９】
【化２４】
0006744857.tif 000041
【０４４０】
ＶＨアミノ酸配列：
【０４４１】
【化２５】
0006744857.tif 000042
【０４４２】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号１３）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＱＴ（配列番号１４）
【０４４３】
ＶＬアミノ酸配列：
【０４４４】
【化２６】
0006744857.tif 000043
【０４４５】
抗体１６５＿１３＿Ｂ３（Ｂ１２由来）
【０４４６】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＤＹＡＭＨ（配列番号９）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０）
【０４４７】
【化２７】
0006744857.tif 000044
【０４４８】
ＶＨアミノ酸配列：
【０４４９】
【化２８】
0006744857.tif 000045
【０４５０】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号１３）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＱＴ（配列番号１４）
【０４５１】
ＶＬアミノ酸配列：
【０４５２】
【化２９】
0006744857.tif 000046
【０４５３】
抗体１６５＿１３＿Ｅ１（Ｂ１２由来）
【０４５４】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＤＹＡＭＨ（配列番号９）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０）
【０４５５】
【化３０】
0006744857.tif 000047
【０４５６】
ＶＨアミノ酸配列：
【０４５７】
【化３１】
0006744857.tif 000048
【０４５８】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号１３）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＱＴ（配列番号１４）
【０４５９】
ＶＬアミノ酸配列：
【０４６０】
【化３２】
0006744857.tif 000049
【０４６１】
抗体１８０＿１１＿Ｆ５（Ｂ１２由来）
【０４６２】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＤＹＡＭＨ（配列番号９）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０）
【０４６３】
【化３３】
0006744857.tif 000050
【０４６４】
ＶＨアミノ酸配列：
【０４６５】
【化３４】
0006744857.tif 000051
【０４６６】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号１３）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＱＴ（配列番号１４）
【０４６７】
ＶＬアミノ酸配列：
【０４６８】
【化３５】
0006744857.tif 000052
【０４６９】
抗体１６０＿０１＿Ｅ３（２Ａ５由来）
【０４７０】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
【０４７１】
【化３６】
0006744857.tif 000053
【０４７２】
ＶＨアミノ酸配列：
【０４７３】
【化３７】
0006744857.tif 000054
【０４７４】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号７）
【０４７５】
ＶＬアミノ酸配列：
【０４７６】
【化３８】
0006744857.tif 000055
【０４７７】
抗体１６０＿０１＿Ｄ６（２Ａ５由来）
【０４７８】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
【０４７９】
【化３９】
0006744857.tif 000056
【０４８０】
ＶＨアミノ酸配列：
【０４８１】
【化４０】
0006744857.tif 000057
【０４８２】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号７）
【０４８３】
ＶＬアミノ酸配列：
【０４８４】
【化４１】
0006744857.tif 000058
【０４８５】
抗体１６０＿０１＿Ｈ４（２Ａ５由来）
【０４８６】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
【０４８７】
【化４２】
0006744857.tif 000059
【０４８８】
ＶＨアミノ酸配列：
【０４８９】
【化４３】
0006744857.tif 000060
【０４９０】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号７）
【０４９１】
ＶＬアミノ酸配列：
【０４９２】
【化４４】
0006744857.tif 000061
【０４９３】
抗体１６０＿０１＿Ａ４（２Ａ５由来）
【０４９４】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
【０４９５】
【化４５】
0006744857.tif 000062
【０４９６】
ＶＨアミノ酸配列：
【０４９７】
【化４６】
0006744857.tif 000063
【０４９８】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号７）
【０４９９】
ＶＬアミノ酸配列：
【０５００】
【化４７】
0006744857.tif 000064
【０５０１】
抗体１６０＿０１＿Ｆ１（２Ａ５由来）
【０５０２】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
【０５０３】
【化４８】
0006744857.tif 000065
【０５０４】
ＶＨアミノ酸配列：
【０５０５】
【化４９】
0006744857.tif 000066
【０５０６】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号７）
【０５０７】
ＶＬアミノ酸配列：
【０５０８】
【化５０】
0006744857.tif 000067
【０５０９】
抗体１６０＿０１＿Ｇ２（２Ａ５由来）
【０５１０】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
【０５１１】
【化５１】
0006744857.tif 000068
【０５１２】
ＶＨアミノ酸配列：
【０５１３】
【化５２】
0006744857.tif 000069
【０５１４】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号７）
【０５１５】
ＶＬアミノ酸配列：
【０５１６】
【化５３】
0006744857.tif 000070
【０５１７】
抗体１６１＿０１＿Ｆ６（１６０＿０１＿Ｆ６としても知られる）（２Ａ５由来）
【０５１８】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
【０５１９】
【化５４】
0006744857.tif 000071
【０５２０】
ＶＨアミノ酸配列：
【０５２１】
【化５５】
0006744857.tif 000072
【０５２２】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号７）
【０５２３】
ＶＬアミノ酸配列：
【０５２４】
【化５６】
0006744857.tif 000073
【０５２５】
抗体１６１＿０１＿Ａ１２（２Ａ５由来）
【０５２６】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
【０５２７】
【化５７】
0006744857.tif 000074
【０５２８】
ＶＨアミノ酸配列：
【０５２９】
【化５８】
0006744857.tif 000075
【０５３０】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号７）
【０５３１】
ＶＬアミノ酸配列：
【０５３２】
【化５９】
0006744857.tif 000076
【０５３３】
抗体１６１＿０１＿Ｃ０９（２Ａ５由来）
【０５３４】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
【０５３５】
【化６０】
0006744857.tif 000077
【０５３６】
ＶＨアミノ酸配列：
【０５３７】
【化６１】
0006744857.tif 000078
【０５３８】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号７）
【０５３９】
ＶＬアミノ酸配列：
【０５４０】
【化６２】
0006744857.tif 000079
【０５４１】
抗体１６１＿０１＿Ｈ１０（２Ａ５由来）
【０５４２】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
【０５４３】
【化６３】
0006744857.tif 000080
【０５４４】
ＶＨアミノ酸配列：
【０５４５】
【化６４】
0006744857.tif 000081
【０５４６】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号７）
【０５４７】
ＶＬアミノ酸配列：
【０５４８】
【化６５】
0006744857.tif 000082
【０５４９】
抗体１６１＿０１＿Ｃ１１（２Ａ５由来）
【０５５０】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
【０５５１】
【化６６】
0006744857.tif 000083
【０５５２】
ＶＨアミノ酸配列：
【０５５３】
【化６７】
0006744857.tif 000084
【０５５４】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号７）
【０５５５】
ＶＬアミノ酸配列：
【０５５６】
【化６８】
0006744857.tif 000085
【０５５７】
抗体１６２＿０２＿Ｄ３（２Ａ５由来）
【０５５８】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
【０５５９】
【化６９】
0006744857.tif 000086
【０５６０】
ＶＨアミノ酸配列：
【０５６１】
【化７０】
0006744857.tif 000087
【０５６２】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号７）
【０５６３】
ＶＬアミノ酸配列：
【０５６４】
【化７１】
0006744857.tif 000088
【０５６５】
抗体１６２＿０２＿Ｃ６（２Ａ５由来）
【０５６６】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
ＶＨ  ＣＤＲ３：  ＡＱＫＥＴＹＡＬＴＹ（配列番号３）
【０５６７】
ＶＨアミノ酸配列：
【０５６８】
【化７２】
0006744857.tif 000089
【０５６９】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
【０５７０】
【化７３】
0006744857.tif 000090
【０５７１】
ＶＬアミノ酸配列：
【０５７２】
【化７４】
0006744857.tif 000091
【０５７３】
抗体１６２＿０２＿Ｈ５（２Ａ５由来）
【０５７４】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
ＶＨ  ＣＤＲ３：  ＡＱＫＥＴＹＡＬＴＹ（配列番号３）
【０５７５】
ＶＨアミノ酸配列：
【０５７６】
【化７５】
0006744857.tif 000092
【０５７７】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
【０５７８】
【化７６】
0006744857.tif 000093
【０５７９】
ＶＬアミノ酸配列：
【０５８０】
【化７７】
0006744857.tif 000094
【０５８１】
抗体１６２＿０２＿Ｆ３（２Ａ５由来）
【０５８２】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
ＶＨ  ＣＤＲ３：  ＡＱＫＥＴＹＡＬＴＹ（配列番号３）
【０５８３】
ＶＨアミノ酸配列：
【０５８４】
【化７８】
0006744857.tif 000095
【０５８５】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
【０５８６】
【化７９】
0006744857.tif 000096
【０５８７】
ＶＬアミノ酸配列：
【０５８８】
【化８０】
0006744857.tif 000097
【０５８９】
抗体１６２＿０２＿Ｃ１（２Ａ５由来）
【０５９０】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
ＶＨ  ＣＤＲ３：  ＡＱＫＥＴＹＡＬＴＹ（配列番号３）
【０５９１】
ＶＨアミノ酸配列：
【０５９２】
【化８１】
0006744857.tif 000098
【０５９３】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
【０５９４】
【化８２】
0006744857.tif 000099
【０５９５】
ＶＬアミノ酸配列：
【０５９６】
【化８３】
0006744857.tif 000100
【０５９７】
抗体１６２＿０２＿Ｃ２（２Ａ５由来）
【０５９８】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
ＶＨ  ＣＤＲ３：  ＡＱＫＥＴＹＡＬＴＹ（配列番号３）
【０５９９】
ＶＨアミノ酸配列：
【０６００】
【化８４】
0006744857.tif 000101
【０６０１】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
【０６０２】
【化８５】
0006744857.tif 000102
【０６０３】
ＶＬアミノ酸配列：
【０６０４】
【化８６】
0006744857.tif 000103
【０６０５】
抗体１６２＿０２＿Ｆ４（２Ａ５由来）
【０６０６】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
ＶＨ  ＣＤＲ３：  ＡＱＫＥＴＹＡＬＴＹ（配列番号３）
【０６０７】
ＶＨアミノ酸配列：
【０６０８】
【化８７】
0006744857.tif 000104
【０６０９】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
【０６１０】
【化８８】
0006744857.tif 000105
【０６１１】
ＶＬアミノ酸配列：
【０６１２】
【化８９】
0006744857.tif 000106
【０６１３】
抗体１６２＿０２＿Ｃ３（２Ａ５由来）
【０６１４】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
ＶＨ  ＣＤＲ３：  ＡＱＫＥＴＹＡＬＴＹ（配列番号３）
【０６１５】
ＶＨアミノ酸配列：
【０６１６】
【化９０】
0006744857.tif 000107
【０６１７】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
【０６１８】
【化９１】
0006744857.tif 000108
【０６１９】
ＶＬアミノ酸配列：
【０６２０】
【化９２】
0006744857.tif 000109
【０６２１】
抗体１６２＿０２＿Ｅ１１（２Ａ５由来）
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
ＶＨ  ＣＤＲ３：  ＡＱＫＥＴＹＡＬＴＹ（配列番号３）
【０６２２】
ＶＨアミノ酸配列：
【０６２３】
【化９３】
0006744857.tif 000110
【０６２４】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
【０６２５】
【化９４】
0006744857.tif 000111
【０６２６】
ＶＬアミノ酸配列：
【０６２７】
【化９５】
0006744857.tif 000112
【０６２８】
抗体１６３＿０２＿Ａ１２（２Ａ５由来）
【０６２９】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
ＶＨ  ＣＤＲ３：  ＡＱＫＥＴＹＡＬＴＹ（配列番号３）
【０６３０】
ＶＨアミノ酸配列：
【０６３１】
【化９６】
0006744857.tif 000113
【０６３２】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
【０６３３】
【化９７】
0006744857.tif 000114
【０６３４】
ＶＬアミノ酸配列：
【０６３５】
【化９８】
0006744857.tif 000115
【０６３６】
抗体１６３＿０２＿Ｄ１１（２Ａ５由来）
【０６３７】
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＥＬＳＭＨ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）
ＶＨ  ＣＤＲ３：  ＡＱＫＥＴＹＡＬＴＹ（配列番号３）
【０６３８】
ＶＨアミノ酸配列：
【０６３９】
【化９９】
0006744857.tif 000116
【０６４０】
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＹＩＱＧＦＬＮ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＴＬＱＤ（配列番号６）
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＬＨＨＹＫＳＰＷＴ（配列番号９０）
【０６４１】
ＶＬアミノ酸配列：
【０６４２】
【化１００】
0006744857.tif 000117
【０６４３】
ＩｇＧ４  １６５＿１３＿Ｃ３（Ａｎｇａｌ  １９９３に記載されるヒンジ改変を有する定常領域）
参考文献：  Angal S1, King DJ, Bodmer MW, Turner A, Lawson AD, Roberts G, Pedley B, Adair JR. Mol Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8。
【０６４４】
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＫＳＹＱＳＤＥＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【０６４５】
実施例１０：タンパク質配列
【０６４６】
ヒトテネイシンＣ  ＦＢＧドメインのアミノ酸配列［配列番号９２］
ＩＧＬＬＹＰＦＰＫＤＣＳＱＡＭＬＮＧＤＴＴＳＧＬＹＴＩＹＬＮＧＤＫＡＥＡＬＥＶＦＣＤＭＴＳＤＧＧＧＷＩＶＦＬＲＲＫＮＧＲＥＮＦＹＱＮＷＫＡＹＡＡＧＦＧＤＲＲＥＥＦＷＬＧＬＤＮＬＮＫＩＴＡＱＧＱＹＥＬＲＶＤＬＲＤＨＧＥＴＡＦＡＶＹＤＫＦＳＶＧＤＡＫＴＲＹＫＬＫＶＥＧＹＳＧＴＡＧＤＳＭＡＹＨＮＧＲＳＦＳＴＦＤＫＤＴＤＳＡＩＴＮＣＡＬＳＹＫＧＡＦＷＹＲＮＣＨＲＶＮＬＭＧＲＹＧＤＮＮＨＳＱＧＶＮＷＦＨＷＫＧＨＥＨＳＩＱＦＡＥＭＫＬＲＰＳＮＦＲＮＬＥＧＲＲＫＲＡ
【０６４７】
マウステネイシンＣ  ＦＢＧドメインのアミノ酸配列［配列番号９３］
ＩＧＬＬＹＰＦＰＲＤＣＳＱＡＭＬＮＧＤＴＴＳＧＬＹＴＩＹＩＮＧＤＫＴＱＡＬＥＶＹＣＤＭＴＳＤＧＧＧＷＩＶＦＬＲＲＫＮＧＲＥＤＦＹＲＮＷＫＡＹＡＡＧＦＧＤＲＲＥＥＦＷＬＧＬＤＮＬＳＫＩＴＡＱＧＱＹＥＬＲＶＤＬＱＤＨＧＥＳＡＹＡＶＹＤＲＦＳＶＧＤＡＫＳＲＹＫＬＫＶＥＧＹＳＧＴＡＧＤＳＭＮＹＨＮＧＲＳＦＳＴＹＤＫＤＴＤＳＡＩＴＮＣＡＬＳＹＫＧＡＦＷＹＫＮＣＨＲＶＮＬＭＧＲＹＧＤＮＮＨＳＱＧＶＮＷＦＨＷＫＧＨＥＹＳＩＱＦＡＥＭＫＬＲＰＳＮＦＲＮＬＥＧＲＲ
ＫＲＡ
【０６４８】
ラットテネイシンＣ  ＦＢＧドメインのアミノ酸配列［配列番号９４］
ＩＧＬＬＹＰＦＰＲＤＣＳＱＡＭＬＮＧＤＴＴＳＧＬＹＴＩＹＩＮＧＤＫＴＱＡＬＥＶＹＣＤＭＴＳＤＧＧＧＷＩＶＦＬＲＲＫＮＧＲＥＤＦＹＲＮＷＫＡＹＡＴＧＦＧＤＲＲＥＥＦＷＬＧＬＤＮＬＳＫＩＴＡＱＧＱＹＥＬＲＶＤＬＱＤＨＧＥＳＡＹＡＶＹＤＲＦＳＶＧＤＡＫＳＲＹＫＬＫＶＥＧＹＳＧＴＡＧＤＳＭＮＹＨＮＧＲＳＦＳＴＹＤＫＤＴＤＳＡＩＴＮＣＡＬＳＹＫＧＡＦＷＹＫＮＣＨＲＶＮＬＭＧＲＹＧＤＮＮＨＳＱＧＶＮＷＦＨＷＫＧＨＥＹＳＩＱＦＡＥＭＫＬＲＰＳＮＦＲＮＬＥＧＲＲＫＲＡ
【０６４９】
イヌテネイシンＣ  ＦＢＧドメインのアミノ酸配列［配列番号９５］
ＩＧＬＬＹＰＦＰＲＤＣＳＱＡＭＬＮＧＤＴＴＳＧＬＹＴＩＹＬＮＧＤＫＡＱＡＬＥＶＹＣＤＭＴＳＤＧＧＧＷＩＶＦＬＲＲＫＮＧＲＥＤＦＹＲＮＷＫＡＹＡＡＧＦＧＤＲＲＥＥＦＷＬＧＬＤＮＬＨＫＩＴＡＱＧＱＹＥＬＲＶＤＬＲＤＨＧＫＴＡＹＡＶＹＤＲＦＳＶＧＤＡＫＴＲＹＫＬＫＶＥＧＹＳＧＴＡＧＤＳＭＡＹＨＮＧＲＳＦＳＴＦＤＫＤＴＤＳＡＩＴＮＣＡＬＳＹＫＧＡＦＷＹＫＮＣＨＲＶＮＬＭＧＲＹＧＤＮＮＨＳＱＧＶＮＷＦＨＷＫＧＨＥＹＳＩＱＦＡＥＭＫＬＲＰＳＮＦＲＮＬＥＧＲＲＫＲＡ
【０６５０】
ヒトテネイシン−Ｒ  ＦＢＧドメインのアミノ酸配列［配列番号９６］
ＦＰＨＰＱＤＣＡＱＨＬＭＮＧＤＴＬＳＧＶＹＰＩＦＬＮＧＥＬＳＱＫＬＱＶＹＣＤＭＴＴＤＧＧＧＷＩＶＦＱＲＲＱＮＧＱＴＤＦＦＲＫＷＡＤＹＲＶＧＦＧＮＶＥＤＥＦＷＬＧＬＤＮＩＨＲＩＴＳＱＧＲＹＥＬＲＶＤＭＲＤＧＱＥＡＡＦＡＳＹＤＲＦＳＶＥＤＳＲＮＬＹＫＬＲＩＧＳＹＮＧＴＡＧＤＳＬＳＹＨＱＧＲＰＦＳＴＥＤＲＤＮＤＶＡＶＴＮＣＡＭＳＹＫＧＡＷＷＹＫＮＣＨＲＴＮＬＮＧＫＹＧＥＳＲＨＳＱＧＩＮＷＹＨＷＫＧＨＥＦＳＩＰＦＶＥＭＫＭＲＰＹＮＨＲＬＭＡＧＲＫＲＱＳＬＱＦ
【０６５１】
実施例１１：生殖系列の配列
ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎを用いて最も近い生殖系列一致を決定した：Ehrenmann F., Kaas Q. and Lefranc M.P. Nucleic Acids Res., 38, D301-307(2010)。アミノ酸の下線により非生殖系列化配列からの変化を示す。ＣＤＲは四角で囲まれた配列で示される。
【０６５２】
抗体２Ａ５
【０６５３】
フレームワーク生殖系列化：  ＶＨアミノ酸配列：
【０６５４】
【化１０１】
0006744857.tif 000118
【０６５５】
フレームワーク生殖系列化：  ＶＬアミノ酸配列：
【０６５６】
【化１０２】
0006744857.tif 000119
【０６５７】
生殖系列化配列の結果の通りに変化したＣＤＲ：
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＡＡＳＳＬＱＳ  （配列番号１１４）
【０６５８】
抗体Ｂ１２
【０６５９】
フレームワーク生殖系列化：  ＶＨアミノ酸配列：
【０６６０】
【化１０３】
0006744857.tif 000120
【０６６１】
生殖系列化配列の結果の通りに変化したＣＤＲ：
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＧＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＹ  （配列番号１１６）
【０６６２】
フレームワーク生殖系列化：  ＶＬアミノ酸配列：
【０６６３】
【化１０４】
0006744857.tif 000121
【０６６４】
生殖系列化配列の結果の通りに変化したＣＤＲ：
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＤＡＳＳＬＱＳ  （配列番号１１８）
【０６６５】
抗体Ｄ８
【０６６６】
フレームワーク生殖系列化：  ＶＨアミノ酸配列：
【０６６７】
【化１０５】
0006744857.tif 000122
【０６６８】
フレームワーク生殖系列化：  ＶＬアミノ酸配列：
【０６６９】
【化１０６】
0006744857.tif 000123
【０６７０】
生殖系列化配列の結果の通りに変化したＣＤＲ：
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＤＡＳＳＬＱＳ  （配列番号１２１）
【０６７１】
抗体Ｆ３
【０６７２】
フレームワーク生殖系列化：  ＶＨアミノ酸配列：
【０６７３】
【化１０７】
0006744857.tif 000124
【０６７４】
フレームワーク生殖系列化：  ＶＬアミノ酸配列：
【０６７５】
【化１０８】
0006744857.tif 000125
【０６７６】
実施例１２：ウェスタンブロッティングにおける抗体の使用
モノクローナル抗体ＩｇＧ４  Ｃ３（上述した１６５＿１３＿Ｃ３）およびＩｇＧ４  Ｂ１２がウェスタンブロッティングにうまく使用することができることを確認するため、精製タンパク質を用いて第一の特異性を試験した（図１４）。次に、神経膠腫細胞可溶化物を用いて、他のタンパク質の生物学的に関連した混合物における完全長ＴＮＣを検出するＢ１２の能力を決定した（図１５）。
【０６７７】
図１４中のデータに示されるように、組換えＣＤ４−ＴＮＣ−ＦＢＧ（ネイシェント社（Nascient））、ＣＤ４−ＴＮＲ−ＦＢＧまたはフィブリノーゲン（ＫＩＲ社）を、還元条件下で４つの１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、その後、ニトロセルロース膜にブロットし、以下の抗体で検出した：Ａ）Ｃ３  ＩｇＧ４  ＭＡｂ（ネイシェント社）、１：２０，０００（０．２５ｕｇ／ｍｌ）、４℃で一晩、Ｂ）Ｂ１２  ＩｇＧ４  ＭＡｂ（ネイシェント社）、１：２０，０００（０．２５ｕｇ／ｍｌ）、４℃で一晩、Ｃ）抗テネイシン−Ｒ抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー社（Santa Cruz Biotechnology）、ｓｃ−９８７５）、１：２，０００（０．１ｕｇ／ｍｌ）、４℃で一晩、Ｄ）抗ＴＮＣ−ＦＢＧポリクローナル抗体（ミッドウッド・グループ社（Midwood group））、１：５００、４℃で一晩。Ｃ３抗体およびＢ１２抗体に使用した二次抗体は、アブカム社（ａｂ６８５８）、１：２０，０００、室温１時間であった。ＴＮＲ抗体については、二次抗体はＨＲＰ結合型抗ヤギ（シグマ・アルドリッチ社、ＳＡＢ３７００２５９）、１：１０，０００、室温で１時間であった。ポリクローナルＴＮＣ抗体については、使用した二次抗体はＨＲＰ結合型抗ウサギ（ダコ社、Ｐ０２１７）、１：５，０００、室温で１時間であった。フィルムへの露光は示された全てのブロットにおいて５分間であった。
【０６７８】
この実験では、Ｃ３およびＢ１２の両方が、ＴＮＲ−ＦＢＧまたはフィブリノーゲンとの交差反応性がほとんど無い、ＴＮＣ−ＦＢＧに対する特異性を示し、このことは、ＴＮＣ−ＦＢＧに対する良好な特異性を示すことから、ウェスタンブロッティング適応へのそれらの適合性を示している。
【０６７９】
図１５中のデータによって示されるように、神経膠腫細胞可溶化物（ＫＩＲ）およびテネイシンＣ（ネイシェント社）を、還元条件下で５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、その後、膜にブロットし、以下で検出した：Ａ．  Ｂ１２  ＩｇＧ４  Ｍａｂ（ネイシェント社）、１：２０，０００、４℃で一晩；Ｂ．  ＩｇＧ４アイソタイプ対照（エウレカ・セラピウティクス社（Eureka therapeutics））、１：４，０００、４℃で一晩。使用した二次抗体はアブカム社（ａｂ６８５８）、１：１０，０００、室温で１時間であった。ブロットはＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社、アマシャム社）で発色させた。ブロットを１分間フィルムに露光した。
【０６８０】
これらの結果は、Ｂ１２が完全長ＴＮＣ、並びにＴＮＣの分解生成物および／またはスプライスバリアントを検出でき、細胞可溶化物中に存在する他のタンパク質に対し低い交差反応性を示すことを示している。
【０６８１】
実施例１３：インビトロにおけるＣ３抗体の活性
モノクローナル抗体Ｃ３（１６５＿１３＿Ｃ３）がＴＮＣ−ＦＢＧのその受容体ＴＬＲ４への結合を乱すことにより作用することを確認するために、まず、ＴＬＲ４およびＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧに対するインビトロ結合アッセイを開発し、その後、Ｃ３と共にＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧをプレインキュベーションする効果を決定した。
【０６８２】
ＰＢＳ中の組換えヒトＴＬＲ４（Ｒ＆Ｄシステムズ社）（１ｕｇ／ｍｌ（１４．６ｎＭ））（またはＰＢＳ単独）を、９６ウェルプレートに結合させた。ブロッキング（１０％ＢＳＡ）の後、指定濃度のヒトＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧを添加し、１ｕｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ１  ＭＡｂ（ＡｂＤセロテック社（AbD Serotec）、クローン２Ｃ１１）、１ｕｇ／ｍｌの抗マウスＨＲＰ結合型二次抗体（ＡｂＤセロテック社、ＳＴＡＲ１３Ｂ）、およびＴＭＢ基質のインキュベーションにより、検出を行った。結果が図１６Ａに示され、ｎ＝４の平均値およびＳＥＭが示される。この実験は、Ｆｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧがインビトロにおいてＴＬＲ４と用量依存的に結合することを示している。
【０６８３】
図１６Ｂに示すように、モノクローナルＡｂ  Ｃ３はインビトロにおいてＦＢＧおよびＴＬＲ４との結合を乱す。ＰＢＳ中の組換えヒトＴＬＲ４（またはＰＢＳ単独）を９６ウェルプレートに結合させ、ブロッキング後、Ｃ３  Ｍａｂまたはアイソタイプ対照抗体と一緒にプレインキュベートされた組換えヒトＦｃ−Ｈｉｓ−ＴＮＣ−ＦＢＧ（１００ｎＭ）を添加した。前記タンパク質のＦｃ部分に対する抗体、抗マウスＨＲＰ結合型二次抗体およびＴＭＢ基質の一連のインキュベーションによって、検出を行った。Ｃ３プレインキュベート試料における阻害率を、アイソタイプ対照試料（ＩＣ５０＝４４．５ｎＭ）と比較して算出した。ｎ＝４。
【０６８４】
実施例１４：抗体Ｂ１２、Ａ４およびＣ３の抗炎症効果
抗ＴＮＣ−ＦＢＧ抗体Ｂ１２、Ａ４（１６０＿０１＿Ａ４）およびＣ３（１６５＿１３＿Ｃ３）が生物系において抗炎症効果を有することが確認された。これを行うために、フィコール勾配および向流遠心分離によって、ヒト単球を末梢血（ロンドン血液銀行（London blood bank））から単離した。次に、単球を１００ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦ（ペプロテック社（Peprotec））で５日間分化させ、Ｍ２マクロファージを得た。
【０６８５】
図１７Ａ中の結果に示されるように、組換えヒトＦｃ−ＴＮＣ  ＦＢＧ（１ｕＭ）またはＬＰＳ（Ｅｎｚｏ社）（１ｎｇ／ｍｌ）を、ＭＡｂ  Ｃ３（１、０．２、および０．０４ｕＭ）またはアイソタイプ対照（エウレカ社）ＭＡｂ（１ｕＭ）と一緒に室温で３０分間プレインキュベートし、その後、ヒトＭ２マクロファージ培養物に３連で添加した。２４時間後、上清を取り、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＴＮＦサイトカインＥＬＩＳＡ（ＢＤバイオサイエンス社）にかけた（ｎ＝３）。これらの結果は、１ｕＭにおいて、Ｃ３が、ＴＮＣ−ＦＢＧで刺激されたヒトＭ２マクロファージによる炎症誘発性サイトカイン放出を大いに減少させることを示しており、この減少はＩＬ−８およびＴＮＦの両方において統計的に有意である。予想された通り、Ｃ３はＬＰＳ誘導性サイトカイン放出に対しては効果を有さない。
【０６８６】
図１７Ｂは、組換えマウスＦｃ−ＴＮＣＦＢＧ（１ｕＭ）をＭＡｂ  Ｃ３（１、０．２および０．０４ｕＭ）またはアイソタイプ対照ＭＡｂ（エウレカ社）（１ｕＭ）と一緒に室温で３０分間プレインキュベートし、その後ヒトＭ２マクロファージ培養物に３連で添加した実験から得られた結果を示している。２４時間後、上清を取り、サイトカインＥＬＩＳＡにかけた。ｎ＝３以上、平均値およびＳＥＭが示される。再度、１ｕＭのＣ３はマクロファージによるマウスＦｃ−ＴＮＣ−ＦＢＧ誘導性サイトカイン放出を大いに減少させ、このことは、前記抗体の良好な異種間反応性を示している。ＦＢＧ誘導性サイトカイン放出が、ＦＧＢのＦｃ部分ではなく、ＦＢＧによって誘導されたことを確認するために、Ｆｃ部分が不活性となるよう変異されたタンパク質（Ｆｃ−Ｍｕｔ−ＦＢＧ）を使用し、また、抗ＴＮＣ−ＦＢＧ抗体、Ｂ１２、Ｃ３（１６５＿１３＿Ｃ３）およびＡ４（１６０＿０１＿Ａ４）をこの分子に対する活性について試験した。Ｆｃ−Ｍｕｔ−ＦＢＧ（１ｕＭ）およびＣ３、Ａ４またはＢ１２（１ｕＭ）を室温で３０分間プレインキュベートし、その後、ヒトＭ２マクロファージ培養物に添加した。２４時間後、上清を取り、サイトカインＥＬＩＳＡにかけた。ｎ＝３、平均値およびＳＥＭが示される。結果を図１７Ｃに示す。この実験により、Ｆｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧ誘導性サイトカイン合成がＦｃ受容体を介したＦｃ部分シグナリングによるものではないことが確認される。さらに、関連抗体Ｂ１２およびＡ４、並びにＣ３のプレインキュベーションがヒトＭ２マクロファージによるＦＢＧ誘導性サイトカイン放出を大いに減少させることが示される。
【０６８７】
図１８Ａは、モノクローナル抗体Ｂ１２が、ヒトＴＮＣ−ＦＢＧで刺激された初代ヒトマクロファージによる炎症誘発性サイトカインの産生を減少させることを示している。その実験では、組換えヒトテネイシンＣ  ＦＢＧ（１ｕＭ）をＭＡｂ  Ｂ１２（１、０．１、０．０１または０．００１ｕＭ）またはアイソタイプ対照ＭＡｂ（１ｕＭ）と一緒に室温で３０分間プレインキュベートし、その後、その後ヒトＭ２マクロファージ培養物に３連で添加した。２４時間後、上清を取り、サイトカインＥＬＩＳＡにかけた（ｎ＝１）。ここで再度、Ｂ１２抗体プレインキュベーションがＦＢＧ誘導性サイトカイン放出を減少させることが分かり、このドナーにおいては、ＩＬ−８が最小の応答を与える。
【０６８８】
図１８Ｂは、研究室規模またはそれより大きい規模で作製されたモノクローナル抗体Ｃ３が、初代ヒトマクロファージによるＦＢＧ誘導性サイトカイン合成の遮断において同一レベルの有効性を示すことを示している。
【０６８９】
Ｃ３抗体を動物試験に取り入れるため、市販のＧＳ−ＣＨＯ発現を用いて、主要な受託製造組織において、ＩｇＧ４  Ｂ１２  １６５−１３−Ｃ３産物をクローニング、発現および精製した。重鎖および軽鎖可変領域のｃＤＮＡを、ＣＨＯ発現用に最適化し、ライフテクノロジーズ社による合成を行い（市販のシグナル配列を使用）、その後、発現ベクターにクローニングした。ＣＨＯ細胞をプールとしてトランスフェクトし、最高発現プールを大規模振盪フラスコ生産（２２Ｌ  −  １１×５Ｌ振盪フラスコ中２Ｌ）に進めた。専売の餌を４日目および８日目に投与し、その後、１２日目に培養物を回収した。物質を遠心分離し、その後、深層濾過および濾過滅菌を行った。タンジェンシャルフロー・フィルトレーション（３０ｋＤａ分画分子量）を用いて物質のおよそ５．５倍の濃縮を行い、得られた濃縮物を再度濾過滅菌し、その後、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ精製を行った。生成物を溶出させ、生成物を中和し、その後、２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中でおよそ１１ｍｇ／ｍＬに濃縮／透析濾過（diafilter）した。分子ふるい−ＨＰＬＣを伴う還元型および非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、高純度であり９８％超が単量体である物質を示した。内毒素は０．１Ｅｕ／ｍｇ未満であった。
【０６９０】
この実験では、大規模抗体バッチの作用強度を、現在のより小さな規模のバッチと比較した。組換えヒトテネイシンＣ  ＦＢＧ（１ｕＭ）をＭＡｂ  Ｃ３（１、０．２および０．０４ｕＭ）またはアイソタイプ対照ＭＡｂ（１ｕＭ）と一緒に室温で３０分間プレインキュベートし、その後、その後ヒトＭ２マクロファージ培養物に３連で添加した。２４時間後、上清を取り、サイトカインＥＬＩＳＡにかけた。ｎ＝１、Ｉｃｏ＝研究室規模  Ｌｏｎ＝より大規模な物質。この実験は、両方の抗体バッチがＦＢＧ誘導性サイトカイン合成の減少において等しい作用強度を示すことを示しており、すなわち、この結果は生産にかかわらず一貫している。
【０６９１】
実施例１５：モノクローナル抗体Ｃ３（１６５＿１３＿Ｃ３）はヒトＴＮＣ−ＦＢＧで刺激されたＲＡ滑膜線維芽細胞による炎症誘発性サイトカインの産生を減少させる。  滑膜線維芽細胞は、ＲＡにおいて重要な炎症誘発性サイトカイン放出源であり得ることが報告されいる（R Bucala et al. (1991) Constitutive Production of Mitogenic and Inflammatory Cytokines by Rheumatoid Synovial Fibroblasts. J. Exp. Med. 173:569-574）。そのため、Ｃ３抗体がまた、マクロファージにおけるＦＢＧ誘導性サイトカイン放出と同様の効果を示すかどうかについて、滑膜線維芽細胞を試験した。
【０６９２】
ヒトＲＡ線維芽細胞を、０．５ｍｇ／ｍｌリベラーゼ（ロシュ社）および０．２ｍｇ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼ（ロシュ社）を含有するＲＰＭＩ（ロンザ社（Lonza））中での組織の消化および３７℃で１〜１．５時間のインキュベーションによって、ドナーＲＡ滑膜組織から生じさせた。得られた組織をピペットで２００μｍナイロンメッシュに通し；メッシュを通過しなかった物質を１０％ＦＢＳ（ライフテクノロジーズ社）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ライフテクノロジーズ社）を含有するＲＰＭＩを含有するペトリ皿に移し、３７℃で５日間インキュベートした。５日後、滑膜線維芽細胞が組織から生じ、残りの組織をＲＡ滑膜線維芽細胞（ＲＡＳＦ）培養物から取り除き、これをその後、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（ロンザ社）中で維持した。この実験において、ＲＡＳＦは１×１０４細胞／ウェルで播種した。組換えヒトＴＮＣ−ＦＢＧ（１ｕＭ）をＭＡｂ  Ｃ３（１、０．２および０．０４ｕＭ）またはアイソタイプ対照ＭＡｂ（１ｕＭ）と一緒に室温で３０分間プレインキュベートし、その後、その後滑膜線維芽細胞培養物に３連で添加した。２４時間後、上清を取り、サイトカインＥＬＩＳＡにかけた。ｎ＝１、平均値およびＳＥＭが示される（図１９参照）。
【０６９３】
これらの結果は、Ｃ３が、ＲＡ滑膜線維芽細胞におけるＦＢＧ誘導性炎症誘発性サイトカイン放出（ＩＬ−８およびＩＬ−６の両方）を減少させるように作用することを示しており、このことは、この作用が、炎症性ＲＡ関節に見られる複数の細胞型における有望な機構であることを示している。
【０６９４】
実施例１６：ラットモデルにおけるテネイシンＣのレベル
マウスおよびラットＣＩＡ（コラーゲン誘発関節炎）モデルの両方におけるテネイシンＣの発現を確認したところ、疾患活動性が臨床スコアと相関することが示された。図２０は、２つの別々のＣＩＡ試験（ＫＷＳ）の終わりに、ラットの足から洗い出しされた滑液中のテネイシンＣのレベルを測定する実験の結果を示している。テネイシンＣレベルをＥＬＩＳＡ（ＩＢＬ、ｌａｒｇｅ（ＦＮ  ＩＩＩ−Ｂ）ｋｉｔ）により測定した。次に、測定したＴＮＣレベルを、ＫＷＳで表されるその足と関連する臨床スコアと相関付けた。この実験は、足の臨床スコアが高いほど、その足から得られた滑液中に見られるＴＮＣのレベルがより高くなることを示している。このことは、ラットＣＩＡモデルがＣ３抗体の試験に良好なモデルであることを示している。
【０６９５】
実施例１７：コラーゲン誘発関節炎のラットモデルにおけるＣ３抗体の評価
ＩｇＧ４  Ｃ３（１６５＿１３＿Ｃ３）を、標準的なラットコラーゲン誘発関節炎モデルにおいて、治療活性について試験した。成体雄Ｌｅｗｉｓラットを無作為に実験群に割り当て、１週間順応させた。０日目に、動物に、５００μｌの、フロイント不完全アジュバント中のＩＩ型ウシコラーゲンの１ｍｇ／ｍｌエマルジョン（ＣＩＩ／ＩＦＡ）を、腰部における皮内注射により投与した。７日目、動物に２回目のＣＩＩ／ＩＦＡ注射を与えた。注射はガス（イソフルラン）麻酔下で行った。下記の表１４に示される投与計画に従って処置を施した。
【０６９６】
【表１７】
0006744857.tif 000126
【０６９７】
７日目から実験の最後まで、動物を、処置を知らない実験者により、関節炎の臨床徴候について週に３回スコア化した。０日目、１４日目、２１日目および２８日目に、肢の体積を、処置を知らない実験者により、プレチスモメーター（plethysmometer）を用いて測定した。
【０６９８】
結果
非特異性臨床症状
０日目から実験の最後まで、動物を、姿勢異常（猫背）、毛皮状態異常（立毛）および活動レベル異常（活動の減少または増加）を含む非特異性臨床徴候について毎日チェックした。第６群の１匹の動物（ＩＤ番号６．９、抗体１０ｍｇ／ｋｇ処置）は２１日目のイソフルラン麻酔から回復しなかった。動物は姿勢異常、毛皮状態異常および活動レベル異常等のいかなる非特異性臨床徴候も示さなかった。第１群の１匹の動物（ＩＤ番号１．１０、ビヒクル処置）を、関節炎の臨床徴候の重症度の理由から、実験終了に先立ち、２２日目に処分した。
【０６９９】
臨床スコア
７日目から実験の最後まで、動物を、前肢および後肢の腫脹を含む関節炎の臨床徴候について週に３回スコア化した。実験者は処置を知らされていなかった。各肢を５段階評価でスコア化した：（０）腫脹無し（１）軽微な腫脹および／または紅斑、（２）軽度の腫脹、（３）中程度の腫脹、並びに（４）重度の腫脹および／または関節硬直。各肢のスコアを足すことにより各動物の臨床スコアを算出した。図２１に示されるデータを、グラフ化し（各実験群についての平均値±ＳＥＭ）、２元配置分散分析、続いて実験群間の多重比較のためのダネット事後検定（Dunnett’s post-test）によって解析した。ビヒクル処置動物番号１．１０の最後に記録されたスコアを２２日目の後に使用した。動物番号６．９から記録されたデータは解析から除外した。ビヒクル処置群における臨床スコアは、７日目に測定された臨床スコアと比較した場合に、１７日目から２８日目の実験の最後まで、有意に増加した（ｐ＜０．０００１）。対照ＩｇＧ４およびＩｇＧ４  Ｃ３  １ｍｇ／ｍＬ投与群は、ビヒクル処置群と比較した場合に、７日目から２８日目の実験の最後まで、いかなる有意差も誘発しなかった。３ｍｇ／ｋｇで投与されたＩｇＧ４  Ｃ３は、２４日目において、ビヒクル処置群と比較した場合に、臨床スコアの有意な減少を引き起こした（ｐ＜０．０１）。１０ｍｇ／ｋｇで投与されたＩｇＧ４  Ｃ３は、２２日目から２８日目の実験の最後まで、ビヒクル処置群と比較した場合に、臨床スコアの有意な減少を引き起こした（ｐ＜０．０１）。
【０７００】
肢の体積
０日目、１４日目、２１日目および２８日目に、後肢の体積を、プレチスモメーター（水置換デバイス）を用いて測定した。ガス（イソフルラン）麻酔を用いて測定を行った。実験者は処置を知らされていなかった。各実験日の各動物の右左後肢および左後肢の体積を平均した。図２２は、グラフ化されたデータを示している（各実験群についての平均値±ＳＥＭ）。データを、２元配置分散分析、続いて実験群間の多重比較のためのダネット事後検定によって解析した。ビヒクル処置動物番号１．１０の最後に記録された値を２８日目に使用した。動物番号６．９から記録されたデータは解析から除外した。ビヒクル処置群にいて測定された肢体積は、０日目に測定された肢体積と比較した場合に、１４日目から２８日目の実験の最後まで、有意に増加した（１４日目はｐ＜０．０１、２１日目および２８日目はｐ＜０．０００１）。対照ＩｇＧ４および１ｍｇ／ｋｇ  ＩｇＧ４  Ｃ３投与群は、ビヒクル処置群と比較した場合に、０日目から２８日目まで、後肢体積においていかなる差異も引き起こさなかった。３ｍｇ／ｋｇで投与されたＩｇＧ４  Ｃ３は、２８日目において、ビヒクル処置群と比較した場合に、後肢体積の有意な減少を引き起こした（ｐ＜０．０１）。１０ｍｇ／ｋｇで投与されたＩｇＧ４  Ｃ３は、２１日目（ｐ＜０．０５）および２８日目（ｐ＜０．０１）において、ビヒクル処置群と比較した場合に、後肢体積の有意な減少を引き起こした。
【０７０１】
結論
試験抗体のＩｇＧ４  Ｃ３（１６５＿１３＿Ｃ３）は、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、臨床徴候の重症度を有意に減少させた。
【０７０２】
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【０７０３】
本発明の実施形態を以下の番号付きパラグラフに記載する：
【０７０４】
１．  テネイシンＣのＦＢＧドメインに結合することが可能であり、配列番号１〜８、４８〜９１および１１２〜１１４から選択される一つもしくは複数の配列；並びに／または配列番号５、９〜１５、３０〜４７および１１５〜１１８から選択される一つもしくは複数の配列；並びに／または配列番号５、１３、１６〜２１および１１９〜１２１から選択される一つもしくは複数の配列；並びに／または配列番号２２〜２９および１２２〜１２３から選択される一つもしくは複数の配列を含む、抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７０５】
２．  配列番号１〜３、５〜７、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０および１１４から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ配列；並びに／または配列番号９〜１１、５、１３〜１４、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、１１６および１１８から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ配列；並びに／または配列番号１６〜１８、５、１３、２０および１２１から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ配列；並びに／または配列番号２２〜２４および２６〜２８から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ配列を含む、パラグラフ１に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７０６】
３．  配列番号３、７、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８および９０から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ３配列；並びに／または配列番号１１、１４、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ３配列；並びに／または配列番号１８および２０から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ３配列；並びに／または配列番号２４および２８から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ３配列を含む、パラグラフ１または２に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７０７】
４．  配列番号３、５４、６６および７０から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ３配列；並びに／または配列番号７、７６、８８および９０から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ３配列；並びに／または配列番号１１、３０、３４および３６から選択される一つもしくは複数のＣＤＲ３配列を含む、パラグラフ３に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７０８】
５．  配列番号３、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および７０から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；配列番号３、５４、６６および７０から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；または配列番号３および５４から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列を含む、パラグラフ１に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７０９】
６．  配列番号７、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８および９０から選択されるＶＬ  ＣＤＲ３配列；配列番号７、７６、８８および９０から選択されるＶＬ  ＣＤＲ３配列；または配列番７のＶＬ  ＣＤＲ３配列を含む、パラグラフ１または５に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７１０】
７．  配列番号４または１１２の配列を含むＶＨ配列を含み、前記ＶＨ配列が配列番号４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および７０から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；配列番号５４、６６および７０から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；または配列番号５４のＶＨ  ＣＤＲ３配列で置換されたＣＤＲ３配列を含む、パラグラフ１に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７１１】
８．  配列番号８または１１３の配列を含むＶＬ配列を含み、前記ＶＬ配列が配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８および９０から選択されるＶＬ  ＣＤＲ３配列；または配列番号７６、８８および９０から選択されるＶＬ  ＣＤＲ３配列で置換されたＣＤＲ３配列を含む、パラグラフ１または７に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７１２】
９．  配列番号１１、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；配列番号１１、３０、３４および３６から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；または配列番号１１、３０および３６から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列を含む、パラグラフ１に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７１３】
１０．  配列番号１５、または１１７の配列を含むＶＬ配列を含む、パラグラフ１に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７１４】
１１．  配列番号１２または１１５の配列を含むＶＨ配列を含み、前記ＶＨ配列が配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；配列番号３０、３４および３６から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；または配列番号３０および３６から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列で置換されたＣＤＲ３配列を含む、パラグラフ１または１０に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７１５】
１２．  配列番７のＶＬ  ＣＤＲ３配列および配列番号３および４８〜７０から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列を含む；または配列番号３のＶＨ  ＣＤＲ３配列および配列番号７および７２〜９０から選択されるＶＬ  ＣＤＲ３配列を含む；または配列番１４のＶＬ  ＣＤＲ３配列並びに配列番号：１１および３０〜４６から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；または配列番号１８のＶＨ  ＣＤＲ３配列および配列番２０のＶＬ  ＣＤＲ３配列；または配列番号２４のＶＨ  ＣＤＲ３配列および配列番２８のＶＬ  ＣＤＲ３配列を含む、パラグラフ１に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７１６】
１３．  配列番号１〜３、および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、４８および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、５０および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、５２および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、５４および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、５６および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、５８および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、６０および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、６２および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、６４および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、６６および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、６８および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１、２、７０および５〜７から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および７２から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５〜６および７４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および７６から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および７８から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および８０から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および８２から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および８４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および８６から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および８８から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、６および９０から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１〜３、５、７および１１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ；または配列番号９〜１１および５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１０、３０、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１０、３２、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１０、３４、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１０、３６、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１０、３８、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１０、４０、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１０、４２、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１０、４４、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または���列番号９、１０、４６、５、１３および１４から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号９、１１、１１６、５、１４および１１８から選択される少なくとも１つのＣＤＲ；または配列番号１６〜１８および５、１３および２０から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号１６〜１８および５、１２１および２０から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；または配列番号２２〜２４および２６〜２８から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列を含む、パラグラフ１に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７１７】
１４．  配列番号３および５４から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列；または配列番号１１、３０および３６から選択されるＶＨ  ＣＤＲ３配列を含む、パラグラフ３に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７１８】
１５．  配列番号４、８、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、１１２および１１３から選択される一つもしくは複数の配列；並びに／または配列番号１２、１５、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、１１５および１１７から選択される一つもしくは複数の配列；並びに／または配列番号１９、２１、１１９および１２０から選択される一つもしくは複数の配列；並びに／または配列番号２５、２９、１２２および１２３から選択される一つもしくは複数の配列を含むＶＨ配列および／またはＶＬ配列を含む、パラグラフ１に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７１９】
１６．  ＶＨ配列が配列番号４、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１および１１２から選択される；並びに／または、配列番号１２、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７および１１５から選択される；並びに／または配列番号１９および１１９から選択される；並びに／または配列番号２５および１２２から選択される、パラグラフ１５に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７２０】
１７．  ＶＬ配列が配列番号８、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１および１１３から選択される；並びに／または配列番号１５および１１７から選択される；並びに／または配列番号２１および１２０から選択される；並びに／または配列番号２９および１２３から選択される、パラグラフ１５または１６に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７２１】
１８．  配列対：配列番号４および８；配列番号４９および８；配列番号５１および８；配列番号５３および８；配列番号５５および８；配列番号５７および８；配列番号５９および８；配列番号６１および８；配列番号６３および８；配列番号６５および８；配列番号６７および８；配列番号６９および８；配列番号７１および８；配列番号１１２および８；配列番号４および１１３；配列番号４９および１１３；配列番号５１および１１３；配列番号５３および１１３；配列番号５５および１１３；配列番号５７および１１３；配列番号５９および１１３；配列番号６１および１１３；配列番号６３および１１３；配列番号６５および１１３；配列番号６７および１１３；配列番号６９および１１３；配列番号７１および１１３；配列番号４および７３；配列番号４および７５；配列番号４および７７；配列番号４および７９；配列番号４および８１；配列番号４および８３；配列番号４および８５；配列番号４および８７；配列番号４および８９；配列番号４および９１；配列番号１１２および７３；配列番号１１２および７５；配列番号１１２および７７；配列番号１１２および７９；配列番号１１２および８１；配列番号１１２および８３；配列番号１１２および８５；配列番号１１２および８７；配列番号１１２および８９；配列番号１１２および９１；配列番号１１２および１１３から選択される；または配列対：配列番号１２および１５；配列番号３１および１５；配列番号３３および１５；配列番号３５および１５；配列番号３７および１５；配列番号３９および１５；配列番号４１および１５；配列番号４３および１５；配列番号４５および１５；配列番号４７および１５；配列番号１１５および１５；配列番号１２および１１７；配列番号３１および１１７；配列番号３３および１１７；配列番号３５および１１７；配列番号３７および１１７；配列番号３９および１１７；配列番号４１および１１７；配列番号４３および１１７；配列番号４５および１１７；配列番号４７および１１７；並びに配列番号１１５および１１７から選択される；または配列対：配列番号１９および２１；配列番号１９および１２０；配列番号１１９および２１；並びに配列番号１１９および１２０から選択される；または配列対：配列番号２５および２９；配列番号２５および１２３；配列番号１２２および２９；並びに配列番号１２２および１２３から選択される、ＶＨおよびＶＬ配列対の配列を含むＶＨ配列およびＶＬ配列の両方を含む、パラグラフ１に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７２２】
１９．  配列番号４、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１および１１２から選択される配列を含むＶＨ配列を含む、パラグラフ１に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７２３】
２０．  配列番号８、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１および１１３から選択される配列を含むＶＬ配列を含む、パラグラフ１または１９に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７２４】
２１．  配列番号４または１１２の配列を含むＶＨ配列を含む、パラグラフ１または２０に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７２５】
２２．  配列番号５５の配列を含むＶＨ配列を含む、パラグラフ１に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７２６】
２３．  配列番号１２、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７および１１５から選択される配列を含むＶＨ配列を含む、パラグラフ１に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７２７】
２４．  配列番号１２または１１５の配列を含むＶＨ配列を含む、パラグラフ１に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７２８】
２５．  配列番号３１の配列を含むＶＨ配列を含む、パラグラフ１に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７２９】
２６．  配列番号３７の配列を含むＶＨ配列を含む、パラグラフ１に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７３０】
２７．  配列番号８または１１３の配列を含むＶＬ配列をさらに含む、パラグラフ１９または２１〜２２に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７３１】
２８．  配列番号１５、または１１７の配列を含むＶＬ配列をさらに含む、パラグラフ２３〜２６のいずれに記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７３２】
２９．  配列番号３７の配列を含むＶＨ配列；および配列番号１５の配列を含むＶＬ配列を含む、パラグラフ１に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７３３】
３０．  ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアントである、パラグラフ１〜２９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７３４】
３１．  Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ、単一可変ドメインおよびドメイン抗体からなる群から選択される、パラグラフ３０に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７３５】
３２．  ヒト化された、パラグラフ１〜３１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７３６】
３３．  テネイシンＣまたはそのドメインに対する特異性を有する、パラグラフ１〜３２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７３７】
３４．  テネイシンＣのＦＢＧドメインに対する特異性を有する、パラグラフ３３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７３８】
３５．  テネイシンＣのＦＢＧドメインの活性を中和する、パラグラフ３４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７３９】
３６．  前記テネイシンＣがシトルリン化テネイシンＣである、パラグラフ１〜３５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７４０】
３７．  シトルリン化テネイシンＣがＦＢＧドメインにおいてシトルリン化されている、パラグラフ３６に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７４１】
３８．  シトルリン化テネイシンＣがＦＢＧドメインのみにおいてシトルリン化されている、パラグラフ３７に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７４２】
39.  慢性炎症反応の調節のためのものである、パラグラフ１〜３８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７４３】
４０．  テネイシンＣの生物活性を調節する、パラグラフ３９に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７４４】
４１．  前記作用剤がテネイシンＣの転写、翻訳および／または結合特性を変化させることによりテネイシンＣの生物活性を調節する、パラグラフ４０に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７４５】
４２．  テネイシンＣの生物活性を下方制御する、パラグラフ１〜４１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７４６】
４３．  テネイシンＣの生物活性を上方制御する、パラグラフ１〜４２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７４７】
４４．  テネイシンＣの転写、翻訳および／または結合特性の阻害剤である、パラグラフ１〜４３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７４８】
４５．  テネイシンＣの競合的結合阻害剤である、パラグラフ１〜４４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント。
【０７４９】
４６．  パラグラフ１〜４５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、並びに薬剤的に許容できる担体、賦形剤および／または希釈剤を含む、組成物。
【０７５０】
４７．  少なくとも１つの他の薬剤をさらに含む、パラグラフ４６に記載の組成物。
【０７５１】
４８．  少なくとも１つの他の薬剤が抗炎症剤、スタチン、生物学的作用物質（生物学的製剤）、免疫抑制剤、サリチル酸塩および／または殺菌剤である、パラグラフ４７に記載の組成物。
【０７５２】
４９．  抗炎症剤が非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、副腎皮質ステロイド、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）または免疫抑制剤から成る群から選択される、パラグラフ４８に記載の組成物。
【０７５３】
５０．  医薬として使用するための、パラグラフ１〜４９に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物。
【０７５４】
５１．  慢性炎症性状態の治療における使用のための、パラグラフ１〜４９に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物。
【０７５５】
５２．  慢性炎症性状態の治療または診断のための医薬の製造における、パラグラフ１〜４９に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物の用途。
【０７５６】
５３．  有効量の、パラグラフ１〜４９に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物を対象に投与することを含む、慢性炎症性状態を治療する方法。
【０７５７】
５４．  慢性炎症性状態の診断および／または慢性炎症性状態を有する患者の予後判定で使用するための、パラグラフ１〜４９に記載の抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物。
【０７５８】
５５．  パラグラフ１〜４９に記載の抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物を用いて、テネイシンＣのＦＢＧドメインの有無または量を検出することを含む、慢性炎症性状態の診断および／または慢性炎症性状態を有する患者の予後判定の方法。
【０７５９】
５６．  検出されたテネイシンＣのＦＢＧドメインの量の増加が、慢性炎症性状態の判定および／または慢性炎症性状態を有する患者の予後を示す、パラグラフ５４または５５に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または方法。
【０７６０】
５７．  正常レベルと比較した場合の、検出されたテネイシンＣのＦＢＧドメインの量における少なくとも５０％の増加が慢性炎症性状態の判定および／または慢性炎症性状態を有する患者の予後を示す、パラグラフ５６に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または方法。
【０７６１】
５８．  検出されたテネイシンＣのＦＢＧドメインの量によって個体に対する適切な治療が示される、個体に対する適切な治療の決定に使用するための、パラグラフ１〜４９に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物。
【０７６２】
５９．  パラグラフ１〜４９に記載の抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物を用いてテネイシンＣのＦＢＧドメインの有無または量を検出することを含み、検出されたテネイシンＣのＦＢＧドメインの量によって個体に対する適切な治療が示される、個体に対する適切な治療を決定する方法。
【０７６３】
６０．  適切な治療が有効量の作用剤または組成物の投与を含み、前記作用剤または組成物が、パラグラフ１〜４９に記載の抗体、またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物；ＤＭＡＲＤＳ（例えば、メトトレキサート）；抗ＴＮＦ剤；抗ＩＬ１７治療；Ｔ細胞同時刺激修飾薬（例えば、Ｏｒｅｎｃｉａ（商標）-アバタセプト）：インターロイキン−６（ＩＬ−６）阻害剤（例えば、Ａｃｔｅｍｒａ（商標）-トシリズマブ）；抗ＣＤ２０抗体（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）-リツキシマブ（rituxumab）；Ｂ細胞活性化因子（例えば、抗ＢＡＦＦ）；ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）の阻害剤（例えば、Ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ（商標））；脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）の阻害剤（例えば、Ｆｏｓｔａｍａｔｉｎｉｂ（商標））；抗ＴＮＣ抗体もしくはシトルリン化テネイシンＣドメインに対する抗体、並びに／または、シトルリン化および／もしくは非シトルリン化テネイシンＣの生物活性を調節する作用剤のうちの一つまたは複数であり得る、パラグラフ５８または５９に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物、または方法。
【０７６４】
６１．  適切な治療がテネイシンＣのＦＢＧドメインを標的とする、パラグラフ５８〜６０に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物  方法。
【０７６５】
６２．  適切な治療が有効量の、パラグラフ１〜４９に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物の投与である、パラグラフ５８〜６１に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物、または方法。
【０７６６】
６３．  個体が慢性炎症性状態を有する、パラグラフ５８〜６２に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物、または方法。
【０７６７】
６４．  検出されたテネイシンＣのＦＢＧドメインの量の増加が適切な治療を示す、パラグラフ５８〜６３に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物、または方法。
【０７６８】
６５．  検出されたテネイシンＣのＦＢＧドメインの量の増加が適切な治療の増量が必要であることを示す、パラグラフ６４に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物、または方法。
【０７６９】
６６．  検出されたテネイシンＣのＦＢＧドメインの量の増加が、テネイシンＣのＦＢＧドメインの正常レベルと比較した場合の少なくとも５０％の増加である、パラグラフ６４または６５に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物、または方法。
【０７７０】
６７．  テネイシンＣのＦＢＧドメインの量が、イムノアッセイ；分光法；ウェスタンブロット；ＥＬＩＳＡ；免疫沈降；スロットもしくはドットブロットアッセイ；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；抗体マイクロアレイ；免疫組織学的染色；ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；フルオロイムノアッセイ；並びに／またはアビジン−ビオチン系および／もしくはストレプトアビジン（streptoavidin）−ビオチン系を用いるイムノアッセイのうちの一つまたは複数の使用によって決定される、パラグラフ５６〜６６に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物、または方法。
【０７７１】
６８．  慢性炎症反応が不適切な炎症を特徴とする状態と関連している、パラグラフ５１〜６７に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、組成物、用途または方法。
【０７７２】
６９．  慢性炎症反応が、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫状態、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、非治癒性創傷、多発性硬化症、がん、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、糖尿病、紅斑性狼瘡（lupus erythrematosus）（例えば、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythrematosus））、喘息、線維性疾患（例えば、肝硬変）、肺線維症、ＵＶダメージ、乾癬、強直性脊椎炎および心血管疾患と関連している、パラグラフ５１〜６７に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、組成物、用途または方法。
【０７７３】
７０．  （ｉ）  パラグラフ１〜４９に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物；
（ｉｉ）  投与手段；および
（ｉｉｉ）  それらの使用のための説明書、
を含むパーツキット。
【０７７４】
７１．  （ｉｖ）  少なくとも１つの他の作用剤
を所望により含む、パラグラフ７０に記載のパーツキット。
【０７７５】
７２．  （ｉ）  パラグラフ１〜４９に記載の抗体またはその抗原結合性断片、誘導体もしくはバリアント、または組成物；および
（ｉｉ）  使用のための説明書、
を含む、対象の慢性炎症性状態の状態を決定で使用するためのパーツキット。
【０７７６】
本明細書に記載の本発明の好ましい実施形態に対する種々の変更および改変が当業者に明らかであることは、理解されるべきである。このような変更および改変は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、且つ、その意図された利点を減じることなく、為すことができる。従って、このような変更および改変は以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
0006744857.tif 000127
【図２−１】
0006744857.tif 000128
【図２−２】
0006744857.tif 000129
【図２−３】
0006744857.tif 000130
【図３】
0006744857.tif 000131
【図４−１】
0006744857.tif 000132
【図４−２】
0006744857.tif 000133
【図５】
0006744857.tif 000134
【図６ａ−１】
0006744857.tif 000135
【図６ａ−２】
0006744857.tif 000136
【図６ｂ−１】
0006744857.tif 000137
【図６ｂ−２】
0006744857.tif 000138
【図６ｃ−１】
0006744857.tif 000139
【図６ｃ−２】
0006744857.tif 000140
【図６ｄ−１】
0006744857.tif 000141
【図６ｄ−２】
0006744857.tif 000142
【図７】
0006744857.tif 000143
【図８】
0006744857.tif 000144
【図９−１】
0006744857.tif 000145
【図９−２】
0006744857.tif 000146
【図１０】
0006744857.tif 000147
【図１１】
0006744857.tif 000148
【図１２】
0006744857.tif 000149
【図１３】
0006744857.tif 000150
【図１４】
0006744857.tif 000151
【図１５】
0006744857.tif 000152
【図１６】
0006744857.tif 000153
【図１７−１】
0006744857.tif 000154
【図１７−２】
0006744857.tif 000155
【図１７−３】
0006744857.tif 000156
【図１８】
0006744857.tif 000157
【図１９】
0006744857.tif 000158
【図２０】
0006744857.tif 000159
【図２１】
0006744857.tif 000160
【図２２】
0006744857.tif 000161
【図２３】
0006744857.tif 000162
【配列表】
0006744857000001.app