(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リソソーム酵素を、基質からの放射性同位体を切断することが可能となる条件下で、リソソーム酵素により、開裂可能な放射性同位体で標識化したリソソーム酵素の基質を含む細胞と目的のリソソーム酵素を含むサンプルを接触させ；ここに、前記細胞は、シンチレーション事象が、前記細胞に関連する放射能放出レベルの指標となるように、シンチラントベースに取り付けられ；
接触工程の前に、ベースラインのシンチレーション事象と比較して、シンチレーション事象を検出することにより、前記細胞に関連する放射能放出レベルの変化を測定し；及び、
対照と比較して、前記細胞に関連した放射能放出レベルの変化に基づいて、リソソーム酵素の効力を決定する；
工程を含有する、リソソーム酵素の効力を測定する方法であって、前記方法が、前記細胞の溶解を伴わない、方法。
【請求項２】
前記細胞が（ｉ）目的の内因性リソソーム酵素を欠損する、そして／または（ｉｉ）目的の前記リソソーム酵素の欠損に関連したリソソーム蓄積症を病む患者に由来する線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
放射性同位体で標識化したリソソーム酵素の前記基質が、放射性同位体の存在下で前記細胞により合成される、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）前記基質がグリコサミングリカン（ＧＡＧ）であるか、または、（ｉｉ）前記基質がＧＡＧであり、かつ前記放射性同位体が３５Ｓである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記基質が３５Ｓ−硫酸ナトリウムで細胞を処理することにより標識化される、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）望ましいコンフルエンスまで細胞を増殖させ；
放射性同位体が、前記リソソーム酵素の新たに合成された基質に組み込まれるように、放射性同位体で細胞を処理し；及び、
前記細胞がシンチラントベースに取り付けられるように、シンチラントベースを有するウェルに前記細胞を播種する工程；
（ｂ）前記測定工程の前に前記細胞を洗浄する工程；ならびに／または
（ｃ）前記サンプル中の目的の前記リソソーム酵素の総量を決定する工程
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、目的の前記リソソーム酵素の比活性を決定することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記リソソーム酵素を前記基質からの放射性同位体を切断することを可能にする条件は、細胞、及び、大気中５％ＣＯ２を有し、３７℃で、前記リソソーム酵素を含む前記サンプルを培養することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記シンチレーション事象をβカウンターにより検出する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対照が、目的のリソソーム酵素の所定の効力を示す標準品、及び／または、用量応答曲線である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記リソソーム酵素の効力を決定する工程は、（ｉ）相対的な効力を計算することを含み、そして／または（ｉｉ）定量的である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）前記細胞のトリプシン処理を必要としない、そして／または（ｉｉ）前記細胞の溶解を伴わない、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記接触工程が、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）の存在下で実施され、及び、細胞取り込みが、Ｍ６Ｐに依存しているかどうかを決定するために、Ｍ６Ｐなしで測定する対照のためのクリアランスまたは効力を比較する工程をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
複数のサンプルを同時に測定するハイスループット形式で行われる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
マルチウェルプレートが使用され、そして、各々個々のウェルのベースは、シンチラントベースである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記マルチウェルプレートが、６、１２、２４、４８、９６、３８４、または、１５３６のウェルプレートである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リソソーム酵素がスルファターゼである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記スルファターゼが、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−イズロニダーゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、アセチル−ＣｏＡ  Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、及びその組み合わせから成るグループから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルが、
（ｉ）組換え産生される目的の前記リソソーム酵素を含む細胞培養物サンプルであるか、（ｉｉ）精製された、若しくは、部分的に精製された目的のリソソーム酵素を
含む精製プロセスから得られる溶出液、または、貯蔵された溶出液であるか、
（ｉｉｉ）目的の前記リソソーム酵素を含む製剤であるか、または
（ｉｖ）患者から得られた組織サンプルである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記組織サンプルが、血液サンプル、ＣＳＦサンプル、尿サンプル、及び／または、固形臓器の生検サンプルである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法による前記リソソーム酵素の効力を決定する工程を含む、目的のリソソーム酵素の製造プロセス。
【請求項２２】
前記リソソーム酵素の効力を決定する工程が、ロットを放出する前に実施され、そして／または、前記プロセスが、決定された前記リソソーム酵素の効力に基づいて、製造条件を調整する工程をさらに含む、請求項２１に記載のプロセス。
【請求項２３】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法による前記リソソーム酵素の効力を決定する工程を含む、目的のリソソーム酵素を精製するプロセス。
【請求項２４】
前記リソソーム酵素の効力を決定する工程は、精製されたロットを放出する前に実施され、そして／または、前記プロセスが、決定された前記リソソーム酵素の効力に基づいて、精製条件を調整する工程をさらに含む、請求項２３に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年２月１８日出願された、米国仮特許出願シリアル番号第６１／９４１３６５の３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）の下での利益を主張し、それは、その特許全体を参照することにより本明細書に導入したものとする。
【背景技術】
【０００２】
リソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）は、通常、脂質、または、ムコ多糖類として知られている糖タンパク質などのその基質の代謝に必要なリソソーム酵素の欠損に起因するリソソーム機能不全に関連するまれな代謝性疾患である。中でも、ムコ多糖症（ＭＰＳ）は、グリコサミングリカン（ＧＡＧ）の分解を担当するリソソーム酵素のいずれかの遺伝的欠損に起因するＬＳＤファミリーである。ＧＡＧは、細胞外マトリックスの主要成分であり、また細胞シグナル伝達プロセスに広範囲に関与している直鎖及び可変性の、硫酸化多糖類の鎖である。リソソームにおけるＧＡＧの病理学的蓄積は、最終的に細胞機能の障害及び広範囲の症状をもたらす。
【０００３】
酵素補充療法（ＥＲＴ）は、ＬＳＤの治療のための重要な手段である。一般的には、ＥＲＴは、リソソーム酵素が欠損している対象に対して、天然または組換え由来のリソソーム酵素の全身投与を含む。成功するＥＲＴは、基質の効率的で、明確な病理学的蓄積、及び、損なわれた細胞機能の復元を実施できる強力なリソソーム酵素を必要とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、リソソーム蓄積疾患の治療のための酵素補充療法、及び治療の他のタイプ（例えば、生物製剤（例えば、タンパク質、酵素、抗体）、小分子、核酸）のために、とりわけ、リソソーム酵素の効力を評価するために、正確で、信頼性の高い、簡単かつ非常に効率的な、基質クリアランスアッセイプラットフォームを提供する。一部において、本発明は、リソソーム酵素、シンチレーション技術の生理学的基質細胞アッセイの異例な組み合わせに基づく。例えば、本発明は、細胞、特に、関連する内因性リソソーム酵素が不足している細胞が、例えば、所望の細胞密度（例えば、約８０〜９８％のコンフルエンス）で、細胞を増殖させるために、基質内（例えば、３５Ｓ）に組み込むべき放射性同位体の存在下で、放射性標識化生理学的基質（例えば、ＧＡＧ）を合成できることを実証する。このような細胞は、シンチラントベースに成功裡に取り付けることができる。細胞内部の放射性標識化基質は、シンチレーション事象を引き起こす電子を放出するシンチラントベースに十分に近い。それ故、目的のリソソーム酵素を細胞に添加することができる。酵素が強力である場合（即ち、適切に内在化し、リソソームに送達され、酵素的に活性である）、細胞は、分解の結果、蓄積された基質を代謝し、洗い流すことができる細胞からの放射性標識物を放出することができる。従って、細胞に関連する低減されたシグナル（即ち、シンチレーション事象）が、リソソーム酵素の効力を示している。実施例の項を含む本明細書に記載される通り、この方法は、目的のリソソーム酵素の効力（例えば、相対的効力）の測定及び定量において、驚くべきことに、正確で、再現性のあるものである。例えば、バイオアッセイの直線性は、所定の範囲にわたって生物学的効力に直接的に比例する正確な検査結果を得るために、アッセイの能力を測定するための重要なパラメータである。実施例に示す通り、このプラットホームアッセイは、高精度で予想外に広い線形範囲（例えば、少なくとも４０〜２５０％）を実証した。
【０００５】
本発明の以前では、欠損酵素への曝露の影響として蓄積されたＧＡＧのクリアランスは、通常、細胞のトリプシン処理、いくつかの遠心分離、洗浄工程、回収した細胞の溶解及びシンチレーション媒体の個々のチューブにおける溶解物の再懸濁を必要とした。その結果、１サンプルは、通常、１６時間の実践時間を必要とする。対照的に、本発明は、巧みに、プロセスを簡略化するために、シンチレーション技術を使用する。例えば、本発明は、トリプシン処理、溶解、遠心分離、または、再懸濁の工程を必要としない。グロー培地中の遊離放射性標識の減衰が、シグナルを生成するためのシンチラントベースにあまりにも離れているので、本発明に係るクリアランスアッセイはまた、一般的には、大規模な洗浄工程を必要としない。さらに、本アッセイプラットフォームは、マルチウェルのシンチレーションプレート、例えば、９６ウェルのシンチレーションプレートを使用することができ、それは、通常、βカウンターでのプレート読み取り時間当たり１６分を必要とする。それ故、このアッセイプラットフォームは、作業工程及び実践時間の有意な低下と共にスループットの有意な上昇をもたらす。従って、本発明は、製造及びプロセス開発中にサンプルの特性評価のための簡単で、信頼性の高い、品質管理ツールを提供する。それはまた、製品の承認、標識化、及び／または、パッケージングのためのリソソーム酵素、または、他の治療の効力を標準化するために使用することができる分析ツールを提供する。本明細書に記載のアッセイプラットフォームはまた、診断及び治療モニタリングの目的のために、直接、患者から得られた生物学的サンプル中の酵素の効力を評価するために使用してもよい。
【０００６】
１つの態様において、本発明は、リソソーム酵素を、切断、分解、または、基質から放射性同位元素を除去することを可能にする条件下で、リソソーム酵素により切断可能な（または分解可能な）放射性同位体で標識化したリソソーム酵素の基質を含有する細胞と目的のリソソーム酵素を含むサンプルを接触させる工程を含む基質クリアランスアッセイを提供し、ここに、シンチレーション事象が細胞に関連する放射能放出レベルを示しているように、細胞がシンチラントベースに取り付けられ、そして、シンチレーション事象を検出することにより、細胞に関連する放射能放出量を測定し、ここに、接触工程の前にベースライン放射能発光レベルと比較して、放射能放出レベルの減少は、目的のリソソーム酵素による対象基質のクリアランスを示す。
【０００７】
別の態様において、本発明は、リソソーム酵素を、切断、分解、または、基質から放射性同位元素を除去することを可能にする条件下で、リソソーム酵素により切断可能な（または分解可能な）放射性同位体で標識化したリソソーム酵素の基質を含有する細胞と目的のリソソーム酵素を含むサンプルを接触させる工程を含む、リソソーム酵素の効力を測定する方法を提供し、ここに、シンチレーション事象が細胞に関連する放射能放出レベルを示すように、細胞はシンチレーションベースに取り付けられ、接触工程の前に、ベースラインのシンチレーション事象と比較したシンチレーション事象を検出することにより、細胞に関連する放射能放出レベルの変化を測定し、そして、対照物と比較して、細胞に関連した放射能放出レベルの変化に基づいて、リソソーム酵素の効力を決定する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、細胞は、目的の内因性リソソーム酵素を欠いている。いくつかの実施形態において、細胞は、目的のリソソーム酵素の欠損に関連したリソソーム蓄積症に罹患した患者に由来する線維芽細胞である。いくつかの実施形態おいて、放射性同位元素で標識化したリソソーム酵素の基質は、放射性同位元素の存在下で細胞により合成される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、リソソーム酵素の能力を測定する方法は、放射性同位元素が、リソソーム酵素の新たに合成された基質に組み込まれて、そして細胞がシンチラントベースに取り付けるようにシンチラントベースでウェルに細胞を播種するように、望ましいコンフルエンスに細胞を増殖し、放射性同位体で細胞を処理することを含む。いくつかの実施形態において、基質はグリコサミングリカン（ＧＡＧ）である。いくつかの実施形態において、放射性同位体は、３５Ｓである。いくつかの実施形態において、基質は、３５Ｓ−硫酸ナトリウムで細胞を処理することにより標識化される。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素が基質から放射性同位体を切断することを可能にする条件は、大気中５％ＣＯ２、３７℃において、細胞、及び、リソソーム酵素を含むサンプルを培養することを含む。いくつかの実施形態において、さらに、リソソーム酵素の効力の測定方法は、測定工程の前に細胞を洗浄する工程を含む。いくつかの実施形態において、シンチレーション事象は、βカウンターにより検出される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、対照は、目的の及び／または用量応答曲線の、リソソーム酵素の所定の効力を示す標準品である。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素の効力を決定する工程は、制限されたモデルを用いて、相対的な効力を計算することを含む。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素の効力を決定する工程は、定量的である。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素の能力を測定する方法は、さらに、サンプル中の目的のリソソーム酵素の総量を決定する工程を含む。いくつかの実施形態において、この方法は、さらに、目的のリソソーム酵素の比活性を決定することを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、リソソーム酵素の能力を測定する方法は、細胞のトリプシン処理を伴わない。いくつかの実施形態において、この方法は、細胞の溶解を伴わない。
【００１２】
いくつかの実施形態において、リソソーム酵素の能力を測定する方法は、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）の存在下で行われる接触工程を含み、そして、この方法は、さらに、細胞取り込みが、Ｍ６Ｐに依存しているかどうかを決定するために、Ｍ６Ｐなしで、測定された対照物に対するクリアランスまたは効力を比較する工程を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、リソソーム酵素の能力を測定する方法は、複数のサンプルを同時に測定するハイスループット形式で行われる。いくつかの実施形態において、方法は、マルチウェルのプレートの使用を含み、各個々のウェルのベースは、シンチラントベースである。いくつかの実施形態において、マルチウェルプレートは、６、１２、２４、４８、または９６ウェルのプレートである。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素は、スルファターゼである。いくつかの実施形態において、スルファターゼは、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−イズロニダーゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、アセチル−ＣｏＡ  Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、及び、その組み合わせからなるグループから選択される。いくつかの実施形態において、スルファターゼは、イズロン酸−２−スルファターゼである。いくつかの実施形態において、スルファターゼは、ヘパリンＮ−スルファターゼである。
【００１４】
いくつかの実施形態において、リソソーム酵素の能力を測定する方法は、組換えにより産生され、目的のリソソーム酵素を含む細胞培養サンプルであるサンプルを含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、溶出液または目的の、精製された、または、部分的に精製されたリソソーム酵素を含む精製プロセスから得られた、単数若しくは複数の貯蔵した溶出液である。いくつかの実施形態において、サンプルは、目的のリソソーム酵素を含む製剤である。いくつかの実施形態において、サンプルは、患者から得られた組織サンプルである。いくつかの実施形態において、組織サンプルは、血液サンプル、ＣＳＦサンプル、尿サンプル、及び／または、固形臓器からの生検サンプルである。
【００１５】
一態様において、本発明は、本明細書に記載の方法に従って、リソソーム酵素の効力を決定する工程を含む、目的のリソソーム酵素を製造するためのプロセスを提供する。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素の効力を決定する工程は、ロットを放出する前に行われる。いくつかの実施形態において、プロセスは、さらに、決定されたリソソーム酵素の能力に基づいて、製造条件を調整する工程を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、目的のリソソーム酵素を精製するプロセスは、リソソーム酵素の効力を測定する方法に基づき、リソソーム酵素の効力を決定する工程を含む。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素の効力を決定する方法は、精製されたロットを放出する前に実施される。いくつかの実施形態において、プロセスは、さらに、決定されたリソソーム酵素の効力に基づいて、精製条件を調整する工程を含む。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」及び「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、等価として使用される。本出願において使用される、約、及び、およその意味を有する、または有しない、任意の数字は、関連分野の当業者により認識される、任意の通常の変動をカバーするように意図されている。
【００１８】
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下の詳細な記述において明らかである。なお、本発明の実施形態を示している詳細な説明は、例示のためのみであり、限定的に与えられるものでないことは当然である。本発明の範囲内での様々な変更及び改変は、詳細な記述から、当業者に明らかになるであろう。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
リソソーム酵素を、基質からの放射性同位体を切断することが可能となる条件下で、リソソーム酵素により、開裂可能な放射性同位体で標識化したリソソーム酵素の基質を含む細胞と目的のリソソーム酵素を含むサンプルを接触させ；ここに、前記細胞は、シンチレーション事象が、前記細胞に関連する放射能放出レベルの指標となるように、シンチレーションベースに取り付けられ；
接触工程の前に、ベースラインのシンチレーション事象と比較して、シンチレーション事象を検出することにより、前記細胞に関連する放射能放出レベルの変化を測定し；及び、
対照と比較して、前記細胞に関連した放射能放出レベルの変化に基づいて、リソソーム酵素の効力を決定する；
工程を含有する、リソソーム酵素の効力を測定する方法。
（項目２）
前記細胞が目的の内因性リソソーム酵素を欠損する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞が、目的の前記リソソーム酵素の欠損に関連したリソソーム蓄積症を病む患者に由来する線維芽細胞である、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目４）
放射性同位体で標識化したリソソーム酵素の前記基質が、放射性同位体の存在下で前記細胞により合成される、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
望ましいコンフルエンスまで細胞を増殖させ；
放射性同位体が、前記リソソーム酵素の新たに合成された基質に組み込まれるように、放射性同位体で細胞を処理し；及び、
前記細胞がシンチラントベースに取り付けられるように、シンチラントベースを有するウェルに前記細胞を播種する工程をさらに含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記基質がグリコサミングリカン（ＧＡＧ）である、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記放射性同位体が３５Ｓである、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記基質が、３５Ｓ−硫酸ナトリウムで細胞を処理することにより標識化される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記リソソーム酵素を前記基質からの放射性同位体を切断することを可能にする条件は、細胞、及び、大気中５％ＣＯ２を有し、３７℃で、前記リソソーム酵素を含む前記サンプルを培養することを含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記測定工程の前に細胞を洗浄する工程をさらに含む、先行項目のいずれか１項に記載の前記方法。
（項目１１）
前記シンチレーション事象をβカウンターにより検出する、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記対照が、目的のリソソーム酵素の所定の効力を示す標準品、及び／または、用量応答曲線である、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記リソソーム酵素の効力を決定する工程は、制限されたモデルを用いて相対的な効力を計算することを含む、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記リソソーム酵素の効力を決定する工程が定量的である、項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記サンプル中の目的の前記リソソーム酵素の総量を決定する工程をさらに含む、項目１〜１４のいずれか１項に記載の前記方法。
（項目１６）
目的の前記リソソーム酵素の比活性を決定することをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記細胞のトリプシン処理を必要としない、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞の溶解を伴わない、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記接触工程が、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）の存在下で実施され、及び、細胞取り込みが、Ｍ６Ｐに依存しているかどうかを決定するために、Ｍ６Ｐなしで測定する対照のためのクリアランスまたは効力を比較する工程をさらに含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
複数のサンプルを同時に測定するハイスループット形式で行われる、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
マルチウェルプレートが使用され、そして、各々個々のウェルのベースは、シンチラントベースである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記マルチウェルプレートが、６、１２、２４、４８、９６、３８４、または、１５３６のウェルプレートである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記リソソーム酵素がスルファターゼである、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記スルファターゼが、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−イズロニダーゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、アセチル−ＣｏＡ  Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、及びその組み合わせから成るグループから選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記スルファターゼが、イズロン酸−２−スルファターゼである、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２６）
前記スルファターゼが、ヘパリンＮ−スルファターゼである、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２７）
前記サンプルが、組換え産生される目的の前記リソソーム酵素を含む細胞培養物サンプルである、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記サンプルが、精製された、若しくは、部分的に精製された目的のリソソーム酵素を含む精製プロセスから得られる溶出液、または、貯蔵された溶出液である、項目１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記サンプルは、目的の前記リソソーム酵素を含む製剤である、項目１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記サンプルは、患者から得られた組織サンプルである、項目１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記組織サンプルが、血液サンプル、ＣＳＦサンプル、尿サンプル、及び／または、固形臓器の生検サンプルである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
先行項目のいずれか１項に記載の方法による前記リソソーム酵素の効力を決定する工程を含む、目的のリソソーム酵素の製造プロセス。
（項目３３）
前記リソソーム酵素の効力を決定する工程が、ロットを放出する前に実施される、項目３２に記載のプロセス。
（項目３４）
決定された前記リソソーム酵素の効力に基づいて、製造条件を調整する工程をさらに含む、項目３２または３３に記載のプロセス。
（項目３５）
項目１〜２９のいずれか１項に記載の方法による前記リソソーム酵素の効力を決定する工程を含む、目的のリソソーム酵素を精製するプロセス。
（項目３６）
前記リソソーム酵素の効力を決定する工程は、精製されたロットを放出する前に実施される、項目３５に記載のプロセス。
（項目３７）
決定された前記リソソーム酵素の効力に基づいて、精製条件を調整する工程をさらに含む、項目３５または３６に記載のプロセス。
【００１９】
図面は、限定するものではなく、例示目的のためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】（糖鎖生物学のエッセンシャルからの応用した）各工程に必要な酵素と一緒にヘパランスルフェートの段階的な分解を示している。
【図２】Ｂ行〜Ｇ行間で分布する、１つの対照物、標準物、及び、３つのサンプルによる基質クリアランスアッセイ用の９６ウェルプレートのセットアップの概要を図示し、それは、１〜１２列の間で分布する３つのサンプルの連続希釈で処理される。
【図３】４パラメータロジスティック曲線適合を用いて推定した効力で、ＧＡＧ基質クリアランスアッセイのデータ分析のための例示的なグラフを図示する。
【図４Ａ】ヘパランＮスルファターゼ（図４Ａ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（図４Ｂ）及びＮ−アセチルグルコサミニダーゼ（図４Ｃ）の酵素を用いた、ＧＡＧ基質クリアランスアッセイのデータ分析のための例示的なグラフである。
【図４Ｂ】ヘパランＮスルファターゼ（図４Ａ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（図４Ｂ）及びＮ−アセチルグルコサミニダーゼ（図４Ｃ）の酵素を用いた、ＧＡＧ基質クリアランスアッセイのデータ分析のための例示的なグラフである。
【図４Ｃ】ヘパランＮスルファターゼ（図４Ａ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（図４Ｂ）及びＮ−アセチルグルコサミニダーゼ（図４Ｃ）の酵素を用いた、ＧＡＧ基質クリアランスアッセイのデータ分析のための例示的なグラフである。
【図５】広い直線範囲での相対的な効力の精度を実証する例示的なグラフを示す。
【図６Ａ】広い直線範囲にわたって、酵素ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（図６Ａ）及びイズロン酸−２−スルファターゼ（図６Ｂ）のＧＡＧクリアランスの相対的な効力の精度を実証する例示的なグラフを示す。
【図６Ｂ】広い直線範囲にわたって、酵素ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（図６Ａ）及びイズロン酸−２−スルファターゼ（図６Ｂ）のＧＡＧクリアランスの相対的な効力の精度を実証する例示的なグラフを示す。
【図７】ＧＡＧクリアランスアッセイでその活性を低下させるスルファターゼからリン酸を除去しながら、内部移行を媒介するマンノース−６−リン酸を実証する例示的なグラフを示している。
【図８】５ｍＭのマンノース−６−リン酸の存在下で、イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）依存性のＧＡＧクリアランスの完全な阻害を実証する例示的なグラフを図示している。マンノース−６−リン酸は、マンノース−６−リン酸受容体に結合し、治療用酵素との結合、及び、その後のリソソームの内在化、及び、輸送を遮断する。
【図９】イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）依存性のＧＡＧクリアランスのマンノース−６−リン酸の用量依存性阻害を実証する、例示的なグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、とりわけ、リソソーム蓄積症の治療のための、リソソーム酵素、または、他の治療薬の効力を測定するために、特に、有用であるリソソーム酵素のための改良された基質クリアランスアッセイを提供する。特に、本発明は、生理学的に関連する基質細胞アッセイ、及び、効率的なシンチレーションベースの検出方法を組み合わせる。本明細書で使用する場合、用語「効力」は、細胞への取り込み、細胞内リソソーム輸送、及び／または、酵素活性を組み込む。いくつかの場合において、対照物、または、標準品と比較して、定量化された効力は、また、「相対効力」と呼ばれる。
【００２２】
本発明の様々な態様は、以下のセクションに詳細に記載されている。セクションの使用は、本発明を限定するものではない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願において、「または（ｏｒ）」の使用は、特に指示の無い限り、「及び／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。
【００２３】
リソソーム酵素及び基質
いくつかの実施形態において、本発明によれば、本発明の方法は、任意のリソソーム酵素を測定するために使用されてもよく、特に、それらは、リソソーム蓄積症に関与している。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素は，また、代替用の酵素、または、治療用酵素と呼ばれている。本明細書で使用される場合、代替、または、治療用酵素は、リソソーム蓄積症において、欠損または欠落したリソソーム酵素の少なくとも部分的な活性を代替するために作用できる、任意の酵素またはタンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態において、代替または治療用酵素は、リソソームが蓄積された物質を減少させるか、または、１つ若しくはそれ以上のリソソーム蓄積症を救助するか、または、改善することができることを可能にする。
【００２４】
リソソーム蓄積症の遺伝的病因、臨床症状、及び、分子生物学に関する詳細な総説は、Ｓｃｒｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ，：Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ７．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄ．，Ｖｏｌ．ＩＩ，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，  （１９９５）において、詳述されている。これら及びそれぞれの基質の一部を、以下の表に例示する。
【表１−１】
0006684715.tif 000002
【表１−２】
0006684715.tif 000003
【００２５】
一般的に言って、リソソーム酵素のための生理学的に関連する基質は、脂質及びムコ多糖類、または、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）として知られている、糖タンパク質である。本明細書で使用される用語「生理学的に関連する基質」は、酵素が欠損している患者に蓄積するリソソーム酵素の基質を指す。本出願において、特に指示のない限り、用語「基質」及び「生理学的に関連する基質」は、互換的に使用される。
【００２６】
一般的に、ＧＡＧは，繰り返し二糖ユニットからなる長鎖で非分岐の多糖類ユニットである。表１に示す通り、ムコポリサッカリドシスに含まれるＧＡＧの１例は、ヘパラン硫酸である。正常なヘパラン硫酸クリアランスは、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−イズロニダーゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、アセチル−ＣｏＡ  Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼを含むが、それに限定されない多くのリソソーム酵素による、末端の非還元端におけるオリゴサッカリド鎖の工程的分解を必要とする。ヘパラン硫酸の工程的な分解は、各工程で必要とされる酵素と一緒に、図１に示されている（糖鎖生物学のエッセンシャルから応用して）。従って、いくつかの実施形態において、本発明は、スルファターゼを測定するために使用されるが、本明細書に記載された様々な特定のスルファターゼに限定されない。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本発明は、天然の供給源（例えば、細胞、動物、植物または患者）から直接得られる内因性酵素を含む、天然に発生するリソソーム酵素を測定するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本発明は、組換えにより、または、化学的に任意の利用可能な手段により生成されるリソソーム酵素を測定するために使用されるが、しかし、補充酵素をコードする核酸を発現するように操作された宿主細胞系を利用して組換えにより産生したリソソーム酵素、または、活性化内因性遺伝子により産生されるリソソーム酵素、または、部分的若しくは完全に化学合成により調製されたリソソーム酵素などのリソソーム酵素に限定されるものではない。いくつかの実施形態において、本発明は、リソソーム標的化部分（例えば、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７、及び、その変異体、相同体またはそのフラグメント）に、及び／または、グルコシル化パターン（例えば、増加し、または、減少した、Ｍ６Ｐまたはビス−Ｍ６Ｐレベル）で融合し、または、接合したリソソーム酵素を測定することができる。
【００２８】
生理学的基質の標識化：
一般的には、本発明に適した生理学的に関連する基質は、検出を容易にするために、検出可能なシグナルで標識化される。いくつかの実施形態において、本発明に特に適した生理学的に関連する基質は、目的のリソソーム酵素により、検出可能なシグナルで切断可能に標識化される。生理学的基質を合成し、標識化するための様々な方法は、使用されてもよい。特定の実施形態において、生理学的に適切な基質は、細胞または生物体により合成され、合成の間に検出可能なシグナルを組み込む。非限定的な例として、細胞ベースのシステムを以下に示す。
【００２９】
細胞：
様々な細胞型は、本発明に適した生理学的基質を合成するために使用されてもよい。適切な細胞は、接着性または非接着性細胞型の両方であってもよい。これは、標準的な組換え技術に使用されてきた細胞を含む、初代細胞及び不死化細胞株を含む。
【００３０】
特に有用な細胞型は、目的のリソソーム酵素のための基質を、例えば、合成することができるが、基質を分解、または、完全に分解することができない細胞型を蓄積する細胞型である。従って、いくつかの実施形態において、本発明に適した細胞は、目的のリソソーム酵素（例えば、スルファターゼ）が欠損している細胞である。例えば、本発明に適した細胞は、目的のリソソーム酵素が不足しているか、または酵素活性若しくは発現が低下している。いくつかの実施形態において、適切な細胞は、目的のリソソーム酵素の欠損に起因するリソソーム蓄積症に苦しむ、ヒト患者または他の生物に由来する（例えば、霊長類、ラット、マウス、イヌ、ブタ、ヒツジなどの非ヒト動物）。適切な細胞は、脳、肝臓、肺、心臓、腎臓、皮膚、筋肉を含む組織供給源に由来するが、それに限定されない。適当な細胞はまた、上皮細胞、内皮細胞、間葉系、及び、神経外胚葉細胞であってもよい。特定の実施形態においては、適切な細胞は、ヒト患者または他の生物に由来する線維芽細胞である。特定の他の実施形態においては、適切な細胞は、ヒト患者または他の生物由来のニューロンである。
【００３１】
いくつかの実施形態において、適切な細胞は、また、標準遺伝子ノックアウト技術により、または、アンチセンス若しくは妨害ＲＮＡ技術により、目的の内因性リソソーム酵素を枯渇することにより産生することができる。このような適切な細胞は、原核生物（例えば、細菌）または、植物、酵母、若しくは哺乳動物細胞を含む真核細胞であってもよい。本発明に従って使用することができる哺乳動物細胞の非限定的な例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ：第８５１１０５０３号）；ヒト網膜芽（ＰＥＲ．Ｃ６、Ｃｒｕｃｅｌｌ社、ライデン、オランダ）；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ：１６５１）；ヒト胚腎臓株（懸濁培養での増殖用に、サブクローニングした２９３または２９３細胞；Ｇｒａｈａｍ  ｅt  ａl、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．,  ３６：５９，１９７７）；ヒト線維肉腫細胞株（例えば、ＨＴ１０８０）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ：Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７：４２１６，  １９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４：Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１，１９８０）；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨＥＰＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ３８３：４４−６８，１９８２）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及び、ヒト肝癌株（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。
【００３２】
基質を合成した標識化細胞：
一般的に、基質を合成した細胞は、検出可能なシグナルを提供するために、基質に組み込むことができる物質または試薬の存在下で、本明細書に記載の適切な細胞を増殖させることを含む。いくつかの実施形態において細胞は、凍結状態から解凍し、所定の望ましい細胞密度になるように標準的な細胞培養条件下で増殖させる。適切な細胞密度は、コンフルエンスにより決定することができる。例えば、適切な細胞密度は、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％コンフルエンスとすることができる。いくつかの実施形態において、適切な細胞密度は、約２５％〜１００％、３０％〜９５％、３５％〜９０％、４０％〜８５％、４５％〜８０％、５０％〜７５％、５０％〜９９％、５０％〜９８％、５０％〜９７％、５０％〜９６％、６０％〜９９％、６０％〜９８％、６０％〜９７％、６０％〜９６％、７０％〜９９％、７０％〜９８％、７０％〜９７％、７０％〜９６％、８０％〜９９％、８０％〜９８％、８０％〜９７％、８０％〜９６％、４０％〜５０％、４５％〜５５％、５０％〜６０％、５５％〜６５％、６０％〜７０％、６５％〜７５％、７０％〜８０％、７５％〜８５％、８０％〜９０％、８５％〜９５％、または、９０％〜１００％のコンフルエンスの範囲内であってもよい。いくつかの実施形態において、適切な細胞密度は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％までのコンフルエンスとすることができる。いくつかの実施形態において、適切な細胞密度は、ウェル当たり（例えば、６、１２、２４、４８または９６のウェルプレート）の細胞数により決定することができる。例えば、適切な細胞密度は、少なくとも約５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１２５００、１５０００、１７５００、２００００、２２５００、２５０００、２７５００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、５００００、５５０００、６００００、６５０００、７００００、７５０００、８００００、８５０００、９００００、９５０００、１０００００のウェル当たり細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、適切な細胞密度は、約５００〜１０００００ウェル当たりの細胞；１０００〜９００００ウェル当たりの細胞；２０００〜８００００ウェル当たりの細胞；３０００〜７００００ウェル当たりの細胞；４０００〜６００００ウェル当たりの細胞；５０００〜５００００ウェル当たりの細胞；６０００〜４００００ウェル当たりの細胞；７０００〜３００００ウェル当たりの細胞；８０００〜２７５００ウェル当たりの細胞；９０００〜２５０００ウェル当たりの細胞；１００００〜２５０００ウェル当たりの細胞；１２５００〜２５０００ウェル当たりの細胞；１５０００〜２５０００ウェル当たりの細胞；１５０００〜２２５００ウェル当たりの細胞；または、１５０００〜２００００ウェル当たりの細胞の範囲内であってもよい。いくつかの実施形態において、適切な細胞密度は、約５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１２５００、１５０００、１７５００、２００００、２２５００、２５０００、２７５００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、５００００、５５０００、６００００、６５０００、７００００、７５０００、８００００、８５０００、９００００、９５０００、１０００００ウェル当たりの細胞までとなってもよい。
【００３３】
細胞は、その後、新たに合成された基質を組み込み、検出可能なシグナルを発生できる物質または試薬で処理される。いくつかの実施形態において、そのような適切な物質または試薬は、新たに合成された基質に組み込むことができる放射性同位体を提供する。いくつかの実施形態において、適切な放射性同位体は、水性媒体中で２０００μｍまでの平均範囲で電子を放出するこれらの同位体を含む。非限定的な例として、適切な放射性同位体には、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３５Ｓ、４５Ｃａ、３３Ｐ、３２Ｐ、５５Ｆｅ、１０９Ｃｄ、及び、５１Ｃｒが挙げられる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、３５Ｓを含む物質または試薬は、ＧＡＧなどの細胞により合成された放射性標識化生理学的基質を生成するために使用される。非限定の例として、３５Ｓ−硫酸ナトリウムが、放射性標識化ＧＡＧ（例えば、放射性標識化ヘパラン硫酸）を生成するために、望ましい細胞密度（例えば、約９５％のコンフルエンス）で増殖培地に添加してもよい。
【００３５】
シンチラントベースへの結合
放射性標識化された基質を含む細胞は、細胞がシンチラントベースに取り付けることができるように、シンチラントベースを含有する容器に播種することができる。細胞を増殖し、シンチレーションベースを有して使用することができる任意の容器は、本発明に適している。これは、フラスコ、ペトリ皿、コニカルバイアル、使い捨てのバッグ及びマルチウェルのプレートを含む。容器の少なくとも１つの面は、シンチラントベースとして機能し（また、シンチレーションベースプレートまたはシンチラント層とも呼ばれる）、これは、電離放射線により励起されるとき、発光を示すシンチレータ材料を含む。一般的には、シンチレーションベースプレートまたはディスクは、すべてのプラスチック製の組織培養容器と同様に、細胞の付着、及び／または、増殖のために適応させるために、表面改質を必要とする。治療は、好ましくは、高電圧プラズマ放電、負に帯電したプラスチック表面を作成するための十分に確立された方法の使用を含む（Ａｒｎｓｔｅｉｎ，  Ｃ．  Ｆ．  ａｎｄ  Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｐ．Ａ，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，２，１，４６−５４，（１９７５））。多くの細胞型では、この表面は、増殖及びアッセイの目的の両方に適している。しかし、細胞付着または増殖は、さらに、デバイスの培養表面に追加のコーティング範囲を適用することにより改良することができる。これは、（ｉ）ポリリシンまたは他のバイオポリマーなど、正または負に荷電した化学コーティング（ＭｃＫｅｅｈａｎ，  Ｗ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｈａｍ，  Ｒ．  Ｇ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｉ．，  ７１，  ７２７−７３４，  （１９７６））；（ｉｉ）コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックスの成分（Ｋｌｅｉｎｍａｎ，  Ｈ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６６，１−１３，  （１９８７））；及び（ｉｉｉ）プラスチック表面上で培養された細胞により産生された自然に分泌される細胞外マトリックス（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  Ｒ．Ｉ．）を含むことが可能である。さらに、シンチレーションベースプレートは、通常、懸濁液中で増殖する細胞膜または細胞型の付着を可能にするために、レクチンなどの薬剤、または接着分子でコーティングすることができる。このような薬剤でプラスチック容器をコーティングする方法は、以前に記載されている（例えば：Ｂｏｌｄｔ，Ｄ．  Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｙｏｎｓ，Ｒ．  Ｄ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，８０８，（１９７９）を参照）。
【００３６】
適当なシンチラントベースは、好ましくは、光学的に透明であり、培養中の細胞は、逆相位相差顕微鏡を用いて観察することを可能にし、そして、材料を、最大効率で所定の波長の光を透過することを可能にする。さらに、ベースは、プレートの滅菌に必要な厳しい放射線条件下と同様に、放射性同位体から入射β放射線への曝露後にも、その光学的性質を保持している。
【００３７】
適当なシンチラントベースは、シンチラント、例えば、ランタニド金属化合物を基礎とするシンチラントガラスを含む任意の透明な材料より構成することができる。特定の形式では、ベースプレートは、任意のプラスチック材料から構成され、ここで、通常、ポリマーを含むモノマー単位は、表面に近接している放射性核種からの入射放射エネルギーを吸収するために、フェニルまたはナフチル部分を含む。典型的なプラスチックベースプレートは、シンチラント物質が組み込まれたポリスチレン若しくはポリビニルトルエンから構成されている。適切なシンチラント物質は、ｐ−ターフェニル、ｐ−クアテルフェニル及びその誘導体、ならびに、２−（４−ｔ−ブチルフェニル）−５−（４−ビフェニリル）−１，３，４−オキサジアゾール及び２，５−ジフェニルオキサゾールなどのオキサゾール及び１，３，４−オキサジアゾールを含むことができる。また、高分子組成物において、１，４−ビス（５−フェニル−２−オキサゾリル）ベンゼン、９，１０−ジフェニルアントラセン、１，４−ビス（２−メチルスチリル）−ベンゼンなどの.波長シフターであってもよい。波長シフターの機能は、シンチラント物質により放射される光を吸収すること、シンチレーションカウンターで使用される感光性検出器により良く一致するより長波長の光を再放出することである。
【００３８】
本発明に適したシンチラントベースを有する追加のデバイス、ならびに、同物を作り及び使用する方法は、例えば、ＵＳ５６６５５６２、及び、ＵＳ５９８９８５４に記載され、各々は参照することにより、本明細書に導入したものとする。
【００３９】
本発明に従い、シンチラントベースに取り付け、または接着した細胞により、合成した放射性標識化生理学的基質により放出された放射能の排出は、シンチレーション事象を観測するための検出手段により検出できる発光を引き起こすためのシンチラントベースに十分近く接近している。いくつかの実施形態において、細胞により合成された放射性標識化生理学的基質の崩壊は、水性媒体中で、電子（例えば、平均範囲２０００μmまで、（例えば、１８００μｍ、１６００μｍ、１４００μｍ、１２００μｍ、１０００μｍ、８００μｍ、６００μｍ、４００μｍ、または、２００μｍｍまで））を放出し、それは、βカウンターなどの標準的な検出手段による検出シンチレーション事象を引き起こすのに十分である。増殖培地中の非結合または遊離の放射性標識は、ウェルのシンチラントベースの表面から、一般的に、十分に離れすぎ、放射エネルギーは水性環境に放散され、放射性壊変は、検出器により検出されないままになる。従って、シンチラントベースで生成されたシンチレーション事象は、ベースに取り付け、または、接着した細胞に関連する放射能放出レベルを示すものであり、それは、細胞内の放射性標識化生理学的基質の量の指標である。放射性標識化基質を含有する細胞に関連するベースラインの放射能放出レベルは、リソソーム酵素の添加前に測定することができる。
【００４０】
シンチレーション事象の測定のための装置及び方法は、非侵襲的な技術、即ち、細胞の整合性または有効性を損なわない技術を使用して、実時間測定を含むことができる。このようなマイクロβ２カウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）のような種々のβカウンターは、本発明を実施するために使用されてもよい。
【００４１】
基質クリアランスアッセイ：
細胞の層が、シンチラントベースに接着し、または、取り付けられるとき、目的のリソソーム酵素を含むサンプルは、基質クリアランスアッセイを実施するために添加され得る。いくつかの実施形態において、適切なサンプルは、精製されたリソソーム酵素を含むことができる。例えば、適切なサンプルは、目的のリソソーム酵素を含む製剤のサンプルであってもよい。適切なサンプルは、また、部分的に精製された、または、未精製リソソーム酵素を含んでいてもよい。例えば、培養細胞から分泌された目的のリソソーム酵素を含む組換え製造プロセスから得られた細胞培養培地サンプルは、本発明に係るクリアランスアッセイにおいて、直接、使用することができる。あるいは、目的のリソソーム酵素を産生する組換え細胞の溶解物を用いてもよい。いくつかの実施形態において、精製プロセスから得られたサンプルは、クロマトグラフィー、及び／または、濾過工程から、例えば、溶出液または蓄積した溶出液などを使用することができる。いくつかの実施形態において、適切なサンプルは、血液サンプル、脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル、尿サンプル、及び固形臓器からの組織抽出物（例えば、脳、肝臓、肺、心臓、腎臓、皮膚、または、筋肉）を含むが、それに限定されない、患者から直接採取した生体サンプであってもよい。いくつかの実施形態において、酵素の滴定量を有する複数のサンプルは、酵素の相対的効力の算出を容易にするため、用量応答曲線を生成するために同時にアッセイしてもよい。
【００４２】
一般的には、リソソーム酵素を含むサンプル及び細胞は、リソソーム酵素が、基質からの放射性同位体を除去するために蓄積された基質を分解するように作用することができるように、リソソーム酵素は、内在化し、適切にリソソームに送達することを可能にする条件下で培養される。一般的には、標準的な細胞培養条件をこの目的のために使用してもよい。例えば、細胞は、予め決定された期間、加湿９５％空気中／５％ＣＯ２雰囲気下で、インキュベーター中、３７℃で、培養することができる（例：約５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、６０分、２時間、６時間、８時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間以上）。
【００４３】
放射性標識化基質（例えば、３５Ｓで標識化したＧＡＧ）の劣化は、基質からの放射性同位元素（例えば、３５Ｓ）の切断をもたらすことが想定される。その結果、切断された放射性同位体は、細胞から増殖培地中に放出される。増殖培地中の遊離された放射性標識体の減衰は、シグナルを生成する（例えば、シンチレーション事象）シンチラントベースから離れ過ぎ、そして、細胞内に残留し、未分解の放射性標識化基質の崩壊のみが、シグナルを放出することを続けるということがさらに想定される。従って、細胞に関連する放射能排出レベルの低減は、リソソーム酵素の効力を示す。細胞内の残存する基質に関連する低下した放射性シグナルが、内在化する活性酵素の大きい量の指標となる（即ち、大きい効力）。
【００４４】
増殖培地中の遊離の放射性標識体が、シグナル（例えば、シンチレーション事象）を生成するためにシンチラントベースから離れてすぎているので、本発明は、残存する放射能放出シグナルを測定する前に、広範囲の洗浄工程を必要としない。いくつかの実施形態において、しかし、洗浄工程は、残っている放射能発光シグナルを測定する工程の前に実施される。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本発明のクリアランス研究は、細胞取り込み、細胞内へのリソソーム輸送、及び／または、酵素活性を特徴付けるために使用することができる。例えば、細胞取り込みプロセス（即ち、内在化）を特徴付けるために、本発明に基づくクリアランスアッセイは、取り込みの候補阻害剤の存在下で実施できる。いくつかの実施形態において、細胞取り込み（すなわち、内在化）が、マンノース−６−リン酸受容体を介して発生するかどうかを決定するために、本明細書に記載のクリアランスアッセイは、サンプルと共に増殖培地に添加されるＭ６Ｐ残基の有り、なしで実施されてもよい。Ｍ６Ｐ残基の存在が、細胞に関連する放射能放出レベルの低下を低減した場合、細胞取り込みプロセスが、マンノース−６−リン酸受容体に依存していることを示している。同様に、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＲＡＰ、または、ｐ９７は、細胞取り込み（即ち、内在化）が、それぞれ、これらのペプチドの標的化部分のいずれかを介して発生したかどうかを判断するために、候補阻害剤として使用することができる。いくつかの実施形態において、本発明に係るクリアランスアッセイは、インスリン受容体またはＬＤＬ受容体を含むがそれに限定されない、他の受容体を介して起こる細胞取り込みを特徴付けるために使用される。
【００４６】
ハイスループット形式：
いくつかの実施形態において、本発明に係る基質クリアランスアッセイは、ハイスループットプラットフォームで実施することができる。ハイスループットプラットフォームは、同時に複数のサンプルでアッセイを実施するために特に有用である。特定の実施形態において、ハイスループットプラットアッセイは、（ａ）細胞がシンチラントベースに付着し、または、接着するように、本明細書に記載の通り、ＧＡＧがシンチラントベースでマルチウェル内に蓄積した細胞を提供する細胞を提供し；（ｂ）細胞を含有するマルチウェルに、同時に、または、連続して、目的のリソソーム酵素を含有する複数のサンプルを提供し；（ｃ）本明細書に記載の通り、基質クリアランスアッセイを行い；及び、（ｄ）リソソーム酵素の相対的効力を決定するために、同時または連続的に、マルチウェルの各々からの放射能放出シグナルを収集する；工程を含むことができる。いくつかの実施形態において、マルチウェルプレートは、例えば、６−、１２−、２４−、４８−、９６−、３８４−、または、１５３６のウェルプレートは、ハイスループットアッセイのために使用できる。いくつかの実施形態において、９６ウェルのＣｙｔｏｓｔａｒ  Ｔ（商標）シンチレーションプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）は、使用できる。
【００４７】
データ分析及び定量化：
いくつかの実施形態において、シンチレーションデータは、酵素を各ウェルに添加する前、または、その後の両方で、新たに形成された基質（例えば、ＧＡＧ類）内に、放射性同位体を組み込んだ細胞を含むシンチレーションプレートから収集される。酵素が細胞により内在化されるように、それが、細胞から放出された放射性標識化されたＧＡＧを切断する。一般的に言って、酵素処理後のシンチレーション検出器により検出された低減した放射性同位元素のシグナルは、ベースラインシグナルと比較して、内在化及びリソソーム酵素へ送達する強力な酵素の指標である。低下したシグナルは、内在化及び機能性酵素（例えば、より高い効力）の多くの量の指標である。
【００４８】
いくつかの実施形態において、リソソーム酵素の効力は、対照物と比較して定量化することができる。本明細書で使用される場合、対照物に対する定量化効力は、また、相対的効力と呼ばれる。いくつかの実施形態において、適切な対照物は、目的リソソーム酵素の所定の効力を示す標準品である。相対的効力は、サンプルの効力と参照ロットの効力の比を取ることにより決定することができる。これは、参照ロット及びサンプルの効力を独立して決定し、その後、比を取ることにより、または、等価物またはｆ検定を使用して平行線分析を行うことにより、実施できる。ほんの数例を挙げれば、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ、Ｅｘｃｅｌ−ｆｉｔ、Ｓｔｅｇｍａｎｎ  ＰＬＡ、ＳｔａｔＬＩＡなどの利用可能な標準曲線適合ソフトウェアは、データ分析のために使用することができる。いくつかの実施形態において、適切な対照物は、同じアッセイを使用して、目的のリソソーム酵素の既知量を含有する対照物から得られた放射能放出レベルである。いくつかの実施形態において、適切な対照物は、酵素の滴定量で、同一アッセイを実行することにより得られた用量反応曲線である。いくつかの実施形態において、 上記対照物の１つ若しくはそれ以上の組み合わせが使用される。
【００４９】
いくつかの実施形態において、マルチウェルプレートは、シンチレーションデータ（即ち、放射性同位元素のシグナル）が、１つ若しくはそれ以上の試験サンプル、１つ若しくはそれ以上の対照物、または、標準物、及び／または、酵素濃度を連続希釈した複数の滴定サンプルから収集できるように使用される。データ解析のための様々なソフトウェアは、当技術分野で利用可能で、データを分析し、定量し、そして、相対効力を計算するために使用できる。いくつかの実施形態において、複数のパラメータロジスティック曲線適合は、データを分析するために使用することがきる。いくつかの実施形態において、データ分析のために使用される曲線の適切なパラメータは、曲線の頂部、曲線の底部、曲線の傾き、曲線の変曲点、曲線から決定されるＥＣ５０、または、これらのパラメータの組み合わせを含むが、それに限定されない。２、３、４、５、若しくは、それ以上のいずれかのパラメータが使用できる。例えば、４パラメータロジスティック曲線は、各々標準物、対照物及び試験サンプルに適合することができる。比較される曲線の各ペアからスロープパラメータ間の差に基づいて並列処理用等価試験が行われる。並列処理のためのテストがパスされる場合、制限されたモデル（共有傾き、及び、上下の漸近線のパラメータ）は、相対効力を算出することができるように、両方の曲線に適合する。
【００５０】
バイオアッセイの直線性は、所定の範囲にわたって生物学的効力に直接比例する試験結果を得るためのエッセイの能力である。直線性を決定するために、様々な効力のを有する「既知」サンプルは、指定された濃度に標準品を事前希釈することより、生成することができる。このように、希釈の直線性は、効力の代用として使用される。Ｘ軸上に予想される相対効力値で、希釈直線性サンプルからのデータをプロットし、Ｙ軸上の相対的効力を観察し、そして、線形回帰にデータを適合することが、直線性の推定値を提供する。実施例に示すように、本発明に基づくプラットホームアッセイは、予想外の広い範囲の直線範囲の有する。 いくつかの実施形態において、本発明に基づくアッセイは、約１０〜４００％、２０〜３５０％、３０〜３００％、４０〜２５０％、または、５０〜２００％の相対効力の範囲にわたって直線性を有する。他の実施形態において、本発明に基づくアッセイは、約４０〜２４０％の相対効力範囲にわたって直線性である。
【００５１】
いくつかの実施形態において、各サンプル中のリソソーム酵素の合計量は、計算された能力を正規化するために決定される。
【００５２】
応用
とりわけ、本発明は、サンプルの特徴付け、及び／または、プロセス開発のために簡単で、信頼性の高い、品質管理ツールを提供する。例えば、本発明は、製造、及び／または、精製プロセス中に、リソソーム酵素または他の生物製剤の効力を評価する際に特に有用であり得る。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素の製造プロセスは、本明細書に記載の基質クリアランスアッセイを用いて、リソソーム酵素の効力を決定することによる品質管理工程を含んでもよい。例えば、リソソーム酵素の効力の決定を基礎とするそのような品質管理手順は、製造プロセスからロットを放出する前に行ってもよい。本発明はまた、プロセス開発の過程を介して酵素効力の変化を比較し、または、評価するために使用できる。異なる培養プロセスからの２つ以上のサンプルは、複数の時点で、複数の時間、本明細書に記載の基質クリアランスアッセイを用いて試験することができる。この場合、一製造プロセスからのサンプルは、異なったプロセスから別のサンプルのための対照品として使用してもよい。 いくつかの実施形態において、本発明により決定された酵素効力に基づき、１つ以上の製造条件を調整してもよい。
【００５３】
同様に、リソソーム酵素を精製するためのプロセスは、本明細書に記載の基質クリアランスアッセイを用いてリソソーム酵素の効力を決定する工程を含んでもよい。例えば、そのような工程は、精製されたロットを放出する前に行ってもよい。本発明は、また、精製プロセスの開発の過程を介して酵素効力の変化を比較し、または、評価するために使用してもよい。異なった精製プロセスからの２つ以上のサンプルは、複数の時点で、複数の時間、本明細書に記載の基質クリアランスアッセイを用いて試験することができる。この場合、一精製プロセスからのサンプルは、異なったプロセスから別のサンプルのための対照品として使用してもよい。いくつかの実施形態において、本発明により決定された酵素効力に基づき、１つ以上の精製条件を調整してもよい。
【００５４】
また、本発明は、製品の承認、標識化、及び／または、包装のための、リソソーム酵素、または、他の治療薬の効力を特徴化し、及び／または、標準化するために使用することができる。
【００５５】
さらに、本発明は、また、診断及び治療のモニタリングのために患者から、直接、得られた生物学的サンプル中の酵素の効力を評価するために使用してもよい。
【実施例】
【００５６】
実施例１：ＧＡＧ基質のクリアランスアッセイ
この実施例は、本発明に基づく相対的効力を決定するため、合成生理学的基質（例えば、ＧＡＧ）を合成した細胞の標識化、酵素クリアランスアッセイ、及びデータ分析用の例示的なプロセスを示す。
【００５７】
ＧＡＧを合成した標識化細胞
アッセイの第一週において、患者の線維芽細胞（ＧＡＧが蓄積する細胞型）を解凍し、細胞を所定の細胞密度に拡大するまで増殖させる。その後、１４日目に開始し、９５％コンフルエンスを有する患者の細胞は、新たに形成されたＧＡＧへ放射性同位元素を組み込むようにするため、１ｍＣｉの３５Ｓ−硫酸ナトリウムで４８時間処理する。次いで、細胞は、２５０００細胞／ウェルの割合で、９６ウェルのＣｙｔｏｓｔａｒＴ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）シンチレーションプレート内に播種した。シンチレーションプレートに取り付けられた後、細胞は、同時に、酵素の滴定量を投与した。次いで、それらは、３７℃で５％ＣＯ２で培養した。酵素が内在化された後、それは、細胞から放出された、洗浄された放射性標識化ＧＡＧを切断した。低下した３５Ｓシグナルは、多量の内在化した、機能的酵素の指標である。
【００５８】
データ分析：
この基質クリアランスアッセイは、取り込み、適切な細胞内のリソソーム輸送、及び、酵素活性を組み込む相対的な効力を測定する。１つの９６ウェルプレート上に、対照物、複数の標準物、及び、複数のサンプルは、酵素濃度の連続希釈を実行することができる（図２）。４パラメータロジスティック曲線は各々、標準、対照及びテストサンプルに適合する。比較される各ペアの曲線からのスロープパラメータの差異に基づく並列処理用等価試験が実施され、並列処理のためのテストがパスされた場合、制限されたモデル（共有傾きと上下の漸近線パラメータ）が、相対効力を算出することを可能にする両曲線に適合している（図３及び図４）。
【００５９】
直線性
バイオアッセイの直線性は、所定の範囲にわたって生物学的効力に直接比例する試験結果を得るためのアッセイ能力である。直線性を決定するために、様々な効力を有する「既知」サンプルは、特定濃度に標準物を事前希釈することにより、生成することができる。このようにして、希釈の直線性は、効力の代用として使用される。Ｘ軸上に予想される相対効力値を有する希釈直線性サンプルからデータをプロットし、そしてＹ軸上に観察された相対効力をプロットし、及び、データを線形回帰に適合することは、推定された直線性を提供する。図５、図６及び表２に見られるように、このアッセイは、予想外に広い線形範囲にわたって精度を示す。４１％のＲＰから２４３％のＲＰのサンプルは、互いに比各々較できる。
【００６０】
アッセイ能力の精度を決定するために、複数の分析者が起こすグループ内、グループ外変動にも関わらず、正確な結果を得るためのアッセイ能力により、希釈直線性試験を実施した。実行する間、考慮すべき要因は、アッセイが実施される日、分析者、細胞収穫濃度、及び３５Ｓロットを含む。の希釈直線性レベルでの％ＧＣＶを計算し、１０．３％の中間精度は、この特定のアッセイのために確立した。グループ間分散は、そのようなアッセイが行われる日、分析者、細胞収穫濃度、及び３５Ｓロットなどの要因に依存し、一方、グループ内で実行する分散は、プレート上でのサンプル位置の影響、ピペッティング操作の一貫性などの要因に依存し、＞７５％から９５％までの分散は、すべての希釈直線性レベルのために、グループ内の実行要因に起因する。４１％ＲＰから、２４３％ＲＰまで計算された％ＧＣＶは、この方法が４１〜２４３％ＲＰの方法範囲を支持し、線形範囲で正確であることを確認した。
【表２】
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【００６１】
再現性及び特異性
表３のデータは、低い標準偏差で見られるように、非常に小さい変動を有する再現性を実証する。確立されたアッセイの調整は、長期間にわたって複数の実験における予想された効力値を回復する。さらに、確立された調整が、Ｈ２Ｏ２、低ｐＨ（例えば、４．０）、または、光曝露などのストレス条件に曝露されたとき、ＲＰ％は減少する。このアッセイが、再現性と長期間の酵素の安定性を示すことが可能であることを実証している。
【表３】
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【００６２】
マンノース−６−リン酸依存性細胞取り込み
内在化（または、細胞取り込み）が、具体的に、マンノース−６−リン酸受容体を介して発生するかどうかを決定するための特定の例において、５ｍＭのマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）を増殖培地に添加し、上記の通りＧＡＧクリアランスアッセイを実施した。マンノース−６−リン酸は、マンノース−６−リン酸受容体に結合し、酵素の結合、及び、その後、リソソームの内在化、及び輸送を遮断する。図７及び８で示すように、５ｍＭのマンノース−６−リン酸の存在下で、スルファターゼ依存性ＧＡＧクリアランスの完全阻害が観察された。
【００６３】
受容体特異性を実証するための追加的な例では、可溶性Ｍ６Ｐの投与量の範囲は、Ｉ２Ｓの取り込みと競合するために使用された。特異性試験は、５０、５、０．５、０．０５及び０ｍＭのＭ６Ｐを使用して用量依存性取り込み阻害を実証した（図９）。可溶性Ｍ６Ｐの高濃度は、Ｍ６Ｐ受容体が占めるので、組み合わせの機能性Ｉ２Ｓ酵素の少ない取り込みは、高アッセイシグナルにより明らかなように、細胞から低い３５Ｓ標識化ＧＡＧのクリアランスをもたらした。高いＭ６Ｐの濃度で、ＧＡＧクリアランスの観察された阻害は、Ｉ２Ｓの取り込みが、主表面発現Ｍ６Ｐ受容体により媒介されることを確認した。
【００６４】
処方効果
処方緩衝液は、３５Ｓ標識化されたＧＡＧクリアランスに影響を与えるかどうかを決定するために、組換えＩ２Ｓは、３つの異なる製剤緩衝液に懸濁し、上記のように，ＧＡＧクリアランスアッセイを実施した。以下の表４に示すように、試験した製剤のいずれも、ＧＡＧのクリアランスの測定可能な効果を示さなかった。
【表４】
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【００６５】
堅牢性
本発明のアッセイの堅牢性を評価するために、実験（ＤＯＥ）研究のデザインは、方法の要因変動の影響を調べるために設計された。この研究は、３つの異なる因子の変動：細胞数／ウェル、３５Ｓ放射性標識化物の培養時間、及び投与処置品の培養時間を含む。研究では、最大シグナル／最小ＧＡＧクリアランスを評価した。各ランに、４つのプレートを導入し、それは、この方法の直線性範囲をカバーする、アッセイ陽性対照物の３つ効力レベル（４１％のＲＰ、１００％ＲＰ及び２４３％のＲＰ）のためのアッセイ対照物及びサンプルをテストした。幾何平均、９５％ＣＩ、％ＧＣＶ、及び％相対精度を決定した。堅牢性の評価内で、観察された％ＧＣＶ値は、１０．３％の観察された高精度のＧＣＶと一致している。また、平均の％相対精度は、希釈直線性データから測定された、％相対精度と一致し、９７．８〜１０７％の範囲内であった。これらのデータは、試験した条件のすべてが、観測された相対的効力には影響を示さなかったことを示し、従って、アッセイは、堅牢かつ正確であった。
【００６６】
従って、本発明に係る基質クリアランスアッセイは、効果的に細胞取り込みプロセスを特徴付けるために使用することができる。従って、本発明に基づく基質クリアランスアッセイは、効果的に細胞取り込みプロセスを特徴付けるために使用することができる。
【００６７】
本明細書に記載の特定の化合物、組成物及び方法は、特定の実施形態に従って具体的に説明してきたが、以下の実施例は、本発明の構成要素を説明するためにのみ役立ち、それを限定するものではない。
【００６８】
明細書、及び、特許請求範囲において使用される、冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、明確に反対に指示されない限り、複数の参照を含むと理解するべきである。グループの１つ若しくはそれ以上のメンバー間で「または（ｏｒ）」を含む特許請求の範囲及び明細書は、グループメンバーの１つ、１つより多くの、または、全てのグループメンバーが存在し、採用され、または、特定の製品または方法と他の方法で関連がない限り、文脈から反するか、またはそうでなければ明確に示されているならば、満足であると考えられる。本発明は、グループの正確に１つのメンバーが存在し、採用され、または、そうでなければ、特定の製品や方法に関連する実施形態を含む。本発明はまた、１つ若しくはそれ以上の、または、全グループメンバーが、存在し、採用され、または、そうでなければ、特定の製品や方法に関連する実施形態を含む。さらに、本発明が、１つ以上の記載された請求項からの、１つ以上の制限、要素、節、記述用語などが、同一基本請求項に従属する別の請求項に導入され（または、関連する他の請求項など）、特に指示の無い限り、または、矛盾や不一致性が発生することが当業者に明確で無ければ、すべての変動、組み合わせ、及び、順列を包含することが理解されるべきである。要素がリストとして表現される場合（例えば、マーカッシュグループまたは類似の形式で）、要素の各サブグループも開示され、そして、任意の要素（複数可）をグループから削除することができることは理解すべきである。一般的に、単数若しくは複数の発明または発明の態様は、特定要素、特徴などを含むものとして参照され、本発明の特定の実施形態または本発明の態様は、その様な要素、特徴等を本質的に含むことを理解すべきであろう。簡単にするために、これらの実施形態は、すべての場合において、本明細書に具体的に非常に多くの言葉では記載されていない。また、本発明の任意の実施形態または態様が、特定の除外が明細書に記載されているかどうかにかかわらず、明示的に特許請求の範囲から除外され得ることが理解されるべきである。出版物、ウェブサイト、及び本発明の背景を説明し、その実施に関するさらなる詳細を提供するために、本明細書で参照される他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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