(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１の配列を含む、単離されたポリペプチドを含有する、医薬組成物。
【請求項３】
治療上有効な量でそれを必要とする被験者に投与して糖尿病を治療する医薬組成物を製造するための、配列番号１の配列を含む、単離されたポリペプチドの使用。
【請求項４】
前記糖尿病は、Ｉ型糖尿病である、請求項３に記載の単離されたポリペプチドの使用。
【請求項５】
前記糖尿病は、ＩＩ型糖尿病である、請求項３に記載の単離されたポリペプチドの使用。
【請求項６】
治療上有効な量でそれを必要とする被験者に投与して肥満および／または脂肪肝を治療する医薬組成物を製造するための、配列番号１の配列を含む、単離されたポリペプチドの使用。
【請求項７】
治療上有効な量でそれを必要とする被験者に投与して癌を治療する医薬組成物を製造するための、配列番号１の配列を含む、単離されたポリペプチドの使用。
【請求項８】
前記癌は、乳癌、脳腫瘍、結腸癌、黒色腫、白血病（例えば、ＡＭＬ）、リンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、および胃癌からなる群から選択される癌である、請求項７に記載の単離されたポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１３年３月１５日出願の米国特許仮出願第６１／８０１，４７４号に優先権を主張し、それは、全ての目的のために、その特許内容全体を参照により本明細書に導入されたものとする。
【０００２】
政府の権利
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与された、助成金番号：１Ｒ０１ＡＧ０３４４３０、及び助成金番号：１Ｒ０１ＧＭ０９０３１１による政府の支援で行われた。米国政府は本発明に関して、一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、新規なミトコンドリア由来のペプチド（ＭＯＴＳ３）に関する。この新規ペプチドは、糖尿病、肥満症、脂肪肝及び癌などの疾病を治療する方法に使用することができる。
【背景技術】
【０００４】
代謝プロセスの中心であるミトコンドリアは、エネルギー産生、プログラム化細胞死、及び反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成を包含し、そして、癌、糖尿病、神経変性疾病及び加齢を含む主要疾病の様々な段階に重く関与する。尚、病因におけるその役割は、依然として大部分が不明のままである。従来、ミトコンドリアは、エネルギー産生及び細胞死を調節する膨大な量の細胞シグナルの受け取り及び処理を行うオルガネラの「末端機能」として考えられていた。しかし、ミトコンドリアが細胞に戻って伝達することによる逆行性シグナル伝達は、あまり理解されていない生物学的プロセスである。
【０００５】
カルシウム、チトクロームＣ及びＲＯＳは、逆行ミトコンドリア分子と考えられていた。注目すべきことに、Ｄｕｒｉｅｕｘらは、ミトコンドリアに由来するシグナルは、細胞の非自律的方法で、線虫の寿命を調節することができるが、そのようなシグナルの性質は、虫では同定されていないということを提案した（Ｄｕｒｉｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １４４，  ７９  （Ｊａｎ  ７，  ２０１１））。このようなミトコンドリア由来のシグナルの同定は、２００１年に、現在ヒューマニン（ＨＮ）として知られている２４個のアミノ酸のペプチドが、アルツハイマー病患者の脳の生存部分から構築したｃＤＮＡライブラリーからクローニングされ、ミトコンドリア１６ＳｒＲＮＡの遺伝子座にマッピングされた（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，  ６３３６  （Ｍａｙ  ２２，  ２００１））ときに発見されたかもしれない。その時以来、ＨＮは、癌細胞上のＩＧＦＢＰ−３のアポトーシス作動を拮抗するＩＧＦＢＰ−３パートナーとして（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２３，  ４５６  （Ｍａｙ  ２２，  ２００３））、様々な癌細胞において、アポトーシスを防止するＢａｘアンタゴニストとしてのその役割に部分的に起因する細胞保護及び抗アポトーシス因子であることが示されている（Ｉｋｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，  １３０４２  （Ｏｃｔ  ２８，  ２００３））。最近の研究では、ＨＮは、広いスペクトルの生存因子であることを示しているが（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １０，  １０２  （Ｍａｒ，  ２００４））、しかし、その正確な作用機構は明確ではない。
【０００６】
ミトコンドリア由来ヒューマニンは、その発現が検証されていない大きな仮説的遺伝子内にドメインを表す幾つかの核コード化されたｃＤＮＡと９２〜９５％の同一性を共有する（Ｔａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ３２４，  ２２７  （Ｍａｙ  ２４，  ２００２））。ミトコンドリア由来のＨＮ転写物は、腎臓、精巣、脳及び胃腸管に存在する。注目すべきは、ヒューマニンが、下等生物を含む、種間（９０〜１００％間の同一性）で、高度に保存されていることである。ペプチドは、脳及び精巣において実証されており、及び、それが血漿、ＣＳＦ及び精液中において、１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在することを示している。ＨＮＧ（Ｓ１４Ｇ）、ＨＮＧ−Ｆ６Ａ（非ＩＧＦＢＰ−３結合：最近、ＡＥＣＯＭ／ＵＣＬＡが出願した共同出願特許の元で、ＩＩ型糖尿病治療として保護されている）及びコリベリン（ＨＮ及びＡＤＮＦ９の部分配列を含むハイブリッドペプチド）を含むより強力な作用を有するＨＮの新規な変異体及び類似体、が説明されている。ヒューマニン及びその類似体及び誘導体は、アルツハイマー病、糖尿病及び腎不全を含む一連の疾病の治療可能性を示している。
【０００７】
この報告は、１２Ｓ  ｒＲＮＡにおける新規なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の最初の説明である。１２Ｓ  ｒＲＮＡの中の、この新規なＯＲＦの名称は、１２個の、Ｓ  ｒＲＮＡの３（ＭＯＴＳ３）におけるミトコンドリアＯＲＦである。ＨＮと同様に（非特許文献２）、ＭＯＴＳ３転写物は、ポリアデニル化され、及び種を通じて十分に保存された遺伝子内遺伝子構造を示唆している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＭＯＴＳ３は、肝臓、心臓、精巣において同一分子量で検出されたが、マウス及びラットの脳では、若干高い分子量で見出された。その主な生物学的機能は、細胞培養とマウスの両方におけるミトコンドリア呼吸とグルコースの利用に強い影響力を持つ代謝調節である。ＭＯＴＳ３は、また、ミトコンドリア呼吸、グルコース利用、インスリン調節及び細胞増殖／生存に影響を与えるために、生体外及び生体内において様々な方法で試験されてきた。
【０００９】
更にその上、ＭＯＴＳ３は、一般的な代謝調節の役割を有するミトコンドリア由来の非毒性の天然のペプチドである。これは、強力な体重及び血糖調節、並びに、ｍＴＯＲ経路を経由して、糖尿病及び癌のための主要な薬物標的であるＡＭＰＫの活性化を提供するその種の最初のものである。これは、薬物の全く新しいカテゴリ、即ち、最近に説明された、ミトコンドリアＤＮＡ由来のシグナル伝達のペプチドからのものである。従って、ＭＯＴＳ３及びその医薬製剤は、疾病を治癒するのに十分ではない、癌、糖尿病、肥満症及び神経変性疾病のような重要な代謝的意味を有する様々な加齢性の疾病を治療するために用いることができる。
【００１０】
それ故、本発明は、新規なＭＯＴＳ３  ＯＲＦ、及び疾病を治療するためのその使用方法を開示する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ある実施形態において、本発明は、配列番号１に対して、７０％配列同一性を含む単離されたポリペプチドを含有する。ある実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号１に対して、８０％配列同一性を含む。ある実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号１に対して、９０％配列同一性を含む。ある実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号１の配列を含む。
【００１２】
ある実施形態において、本発明は、上述のポリペプチドに特異的に接合する単離された抗体を含む。ある実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
【００１３】
ある実施形態において、本発明は、配列番号１に対して、７０％の配列同一性を含む単離されたポリペプチドを含有する。ある実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１に対して、８０％又は９０％の配列同一性を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１の配列を含有する。
【００１４】
ある実施形態において、本発明は、糖尿病の治療方法を含み、方法は、配列番号１に対して７０％配列同一性を含む、単離されたポリペプチドを含有する医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする被験者に投与する工程を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１に対して、８０％または９０％の配列同一性を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１の配列を含む。ある実施形態において、糖尿病は、Ｉ型糖尿病である。ある実施形態において、糖尿病は、ＩＩ型糖尿病である。ある実施形態において、被験者はヒトである。
【００１５】
ある実施形態において、本発明は、肥満及び／または脂肪肝の治療方法であって、方法は、配列番号１に対して、７０％の配列同一性を含む単離されたポリペプチドを含有する医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする被験者に投与する工程を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１に対して、８０％または９０％の配列同一性を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１の配列を含む。ある実施形態において、被験者は、哺乳動物である。ある実施形態において、被験者は、ヒトである。
【００１６】
ある実施形態において、本発明は、癌を治療する方法を含み、方法は、配列番号１に対して７０％の配列同一性を含む、単離されたポリペプチドを含む医薬組成物の治療有効量をそれを必要とする被験者に投与する工程を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１に対して８０％または９０％の配列同一性を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１の配列を含む。ある実施形態において、被験者はヒトである。ある実施形態において、癌は、乳癌、脳腫瘍、結腸癌、黒色腫、白血病（例えば、ＡＭＬ）、リンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、及び胃癌からなるグループから選択される癌である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１をコード化するｃＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２に対して、少なくとも８０％、９０％、または１００％の同一性を有するｃＤＮＡを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１をコード化する核酸配列を含む発現ベクター発現を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２に対して、少なくとも８０％、９０％または１００％の同一性を含む発現ベクターを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本発明は、形質転換された、または本開示で明細書に説明された通りに発現ベクタで形質移入された宿主細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＭＯＴＳ３が、ミトコンドリア１２Ｓ  ｒＲＮＡ（Ａ）からのポリアデニル化された転写体であることを示す。ＭＯＴＳ３配列は、様々な生物体（Ｂ）によく保存されている。ウサギポリクローナル抗ＭＯＴＳ３抗体は、過剰発現したＭＯＴＳ３、並びに、細胞内で発現ベクターにクローン化されたＧＦＰタグを付きのＭＯＴＳ３（Ｃ）を認識している。ＭＯＴＳ３は、同様の分子量でラットの心臓、肝臓、及び精巣で見い出されるが、脳（Ｄ）では、わずかに高い分子量で見い出される。ＭＯＴＳ３は、ミトコンドリアＤＮＡ（Ｅ）を有していないＲｈｏ−０細胞では検出されない。ＣＯＩ／ＩＩ（シトクロムオキシダーゼＩ／ＩＩ）は、ミトコンドリアＤＮＡの欠如を確認するために使用した。
【図２】１０％及び１％ＦＢＳ培養条件下でのＭＯＴＳ３のミトコンドリア活性に及ぼすＭＯＴＳ３の影響（Ａ）。ミトコンドリアレダクターゼ酵素によるＭＴＴ還元、並びに、酸素消費速度（ＯＣＲ）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ：乳酸分泌によって作られた培地中のｐＨ変化による解糖を測定する）（Ｂ）を図示する。
【図３】ミトコンドリア呼吸に及ぼす外因性ＭＯＴＳ３処理の影響を図示する。各薬物は、チャートの上部に説明される特定の代謝パラメータ；即ち、オリゴマイシン−ＡＴＰ代謝回転、ＦＣＣＰ−最大呼吸容量、ロテノン非ＡＴＰ呼吸；を試験するために処理した。
【図４】ミトコンドリア活性に及ぼす、形質移入によるＭＯＴＳ３の過剰発現の影響を図示する。ＭＯＴＳ３の種々のバージョンをクローン化し、細胞内で発現させた。
【図５】外因性ＭＯＴＳ３の影響を図示する。
【図６】グルコース取込み及び解糖に及ぼす外因性ＭＯＴＳ３処理の影響を図示する。
【図７】ＭＯＴＳ３（Ｍ３）は、９６時間の処理後に、対照群（Ｃ）と比較して、ＡＭＰＫの活性化を有意に誘導することを示す。これは、図６における９６時間処理後の、培地中でのグルコースの可用性の急激な低下と相関する。
【図８】ＭＯＴＳ３がグルコース培地では細胞増殖及び生存を抑制するが、細胞を生存のためにミトコンドリア機能に大きく依存することを細胞に強いるガラクトース培地中では抑制しないことを示している。
【図９】ＭＯＴＳ３の細胞内発現の細胞増殖に及ぼす影響を図示する。ＭＯＴＳ３は、発現ベクター内にクローン化し、細胞に形質移入した。
【図１０】外因性ＭＯＴＳ３の細胞老化に及ぼす影響を図示する。老化は、老化関連β−ガラクトシダーゼのレベル（青）により測定した。
【図１１】ＭＯＴＳ３が、体重及び肝臓ミトコンドリア呼吸能を低下させることを示す。マウスにおけるＭＯＴＳ３の４日間の注射（腹腔内；０．５及び５．０ｍｇ／ｋｇ／日）は、有意に体重を減少させたが、食物摂取量を変化させなかった。肝臓ミトコンドリア呼吸能も、また、ＭＯＴＳ３の両投与量で低下した。
【図１２】４日間ＭＯＴＳ３で処理したマウスが、低下した血糖値レベル（Ａ）及び上昇したインスリンレベル（Ｂ）を示すことを図示する。
【図１３】ＭＯＴＳ−ｃがミトコンドリアゲノムにコード化される新規ペプチドであることを説明する：（ａ）ＭＯＴＳ−ｃが、５１ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）としてミトコンドリアゲノムの１２ＳｒＲＮＡ内にコード化される。ミトコンドリアの遺伝子コードの使用は、タンデム型の出発／停止コドンをもたらすが、一方、細胞質遺伝コードが実行可能なペプチドを生成する。（ｂ）ｃＤＮＡの末端の３′迅速増幅（３′ＲＡＣＥ）は、ＭＯＴＳ−ｃ及びヒューマニン転写物がポリアデニル化されていることを示す。（ｃ）ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）にコード化されたＭＯＴＳ−ｃ、及び進化の過程でのｍｔＤＮＡ（ＮＵＭＴ）から転移された核ＤＮＡにコード化されたペプチドとの比較を行なう。（ｄ）〜（ｅ）低用量のエチジウムブロミド（ＥｔＢｒ）への長期暴露により、ミトコンドリアＤＮＡを欠如しているＨｅＬａρ０細胞は、（ｄ）１２Ｓ  ｒＲＮＡ及びｑＲＴ−ＰＣＲによるＭＯＴＳ−ｃ転写物；及び（ｅ）ミトコンドリアにコード化したタンパク質チトクロームＣオキシダーゼＩ及びＩＩ（ＣＯＩ／ＩＩ）、並びに、ＭＯＴＳ−ｃの未検出レベルを示すが、しかし、通常は、イムノブロットにより検出される核コード化したＧＡＰＤＨを発現する。（ｆ）ＨＥＫ２９３細胞で免疫染色するＭＯＴＳ−ｃ（緑）、及びｈｓｐ６０（赤）。スケールバーは、２０μｍ。（ｇ）〜（ｈ）ＭＯＴＳ−ｃは、（ｇ）マウス及びラットでの種々の組織及び（ｈ）ヒト及び齧歯類における循環（血漿）において検出される。（ｉ）〜（ｊ）飢餓、代謝ストレスがマウスにおける（ｉ）組織及び（ｊ）血漿中の内因性ＭＯＴＳ−ｃの発現を変化させる。データは、平均±ＳＥＭを示す。スチューデントｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１４】ＭＯＴＳ−ｃが遺伝子発現を調節し、ＡＩＣＡＲ及びＡＭＰＫシグナル伝達を介して代謝を規制することを以下の観点より説明する：（ａ）ＭＯＴＳ−ｃ処理（１０μＭ；Ｎ＝６）の、４時間及び７２時間後のＨＥＫ２９３細胞の主成分分析（ＰＣＡ）。（ｂ）時間依存性の包括的遺伝子発現の変化（Ｎ＝６）を更に示す遺伝子セットエンリッチメントのパラメトリック解析（ＰＡＧＥ）。（ｃ）時点（Ｎ＝６）毎に、上方調節された遺伝子（赤色）及び下方調節された遺伝子（青）を示すＶｅｎｎ図。（ｄ）ＨＥＫ２９３細胞におけるＭＯＴＳ−ｃ処理７２時間後の代謝及び炎症に関連する種々の遺伝子セットに及ぼす影響（１０μＭ；Ｎ＝６）。（ｅ）新規のプリン生合成に及ぼすＭＯＴＳ−ｃの影響。ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）及びＮＡＤ＋は、新規のプリン生合成経路に供給する（Ｎ＝５）。ＭＯＴＳ−ｃの４時間及び７２時間後に改変された酵素は、マイクロアレイ分析により決定する（図１８ｂ）。ＧＡＲ：グリシンアミドリボヌクレオチド；ＦＧＡＭ：Ｎ−ホルミルグリシンアミジンリボヌクレオチド；ＡＩＲ：アミノイミダゾールリボヌクレオチド；ＮＣＡＩＲ：Ｎ５−カボキシアミノイミダゾールリボヌクレオチド；ＳＡＩＣＡＲ：Ｎ−スクシノカルボキシアミド−５−アミノイミダゾールリボヌクレオチド。色は、ＭＯＴＳ−ｃによる変化：赤色：上方調節；青色：下方調節；灰色：未測定を示す。（ｆ）ＭＯＴＳ−ｃの安定した過剰発現おこなうＨＥＫ２９３は、著しいＡＩＣＡＲレベルの上昇を示している（Ｎ＝５）。（ｇ）ＭＯＴＳ−ｃの安定的に過剰発現をおこなうＨＥＫ２９３細胞において新規プリン生合成経路の代謝中間体が示されている（Ｎ＝５）。（ｈ）ＡＩＣＡＲはＡＭＰＫの強力な活性化因子である。ＭＯＴＳ−ｃは、ＡＭＰＫを活性化し、及びその下流経路は、脂肪酸酸化（ＡＣＣ及びＣＰＴ−１）、及びグルコース取込み（ＧＬＵＴ−４）を制御する。（ｉ）ＭＯＴＳ−ｃは、時間及び用量依存的手法で、ＡＭＰＫ及びＡｋｔのリン酸化を促進する。データは、平均±ＳＥＭを示す。スチューデントｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１５】ＭＯＴＳ−ｃは、細胞のグルコース、ミトコンドリア及び脂肪酸代謝を調整させることを以下の観点より説明する：ＭＯＴＳ−ｃ処理（１０μＭ；Ｎ＝６）後の細胞培養媒体中の（ａ）グルコース、及び（ｂ）乳酸の測定。（ｃ）メタボロミクスにより検出されるＭＯＴＳ−ｃ−依存型の解糖中間体の変化。（ｄ）リアルタイム解糖フラックスは、細胞外酸性化率（ＥＣＡＲ）によって決定した（Ｎ＝６）。解糖、解糖能力、及び解糖保持は、細胞をグルコース、オリゴマイシン、及び２−デオキシグルコースでそれぞれ刺激することにより推定した。（ｅ）〜（ｆ）リアルタイムの酸素消費速度（ＯＣＲ）は、ＭＯＴＳ−ｃの処理後に測定した（Ｎ＝６）。（ｅ）ＡＴＰの代謝回転、最大呼吸容量は、細胞をオリゴマイシン及びＦＣＣＰで刺激することにより推定し、（ｆ）予備の呼吸容量、プロトン漏出、及びカップリング効率を算出した。（ｇ）メタボロミクスにより決定されるＭＯＴＳ−ｃ処理後のＴＣＡ中間体が示されている（Ｎ＝５）。（ｈ）細胞数は、グルコースまたはガラクトース培地下で、ＭＯＴＳ−ｃ処理後に計測した。ガラクトースは、哺乳動物の細胞をミトコンドリア代謝に依存させる（Ｎ＝６）。ＭＯＴＳ−ｃは、メタボロミクス（Ｎ＝５）で決定される細胞内（ｉ）、アシルカルニチンの往復運動（ｊ）、必須脂肪酸、及びβ−酸化の中間体ミリストイルＣｏＡ（ｋ）の変化を誘導する。データは、平均±ＳＥＭを示す。スチューデントｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１６】ＭＯＴＳ−ｃが、マウスにおける体重、代謝ホメオスタシス、及びマウスでのインスリン感受性を規制することを説明する。（ａ）４日間の急性ＭＯＴＳ−ｃ（５ｍｇ／ｋｇ／日；ＩＰ；ＢＩＤ）処理が、非近交系ＣＤ−１雄マウス（Ｎ＝６）における主要なアディポカインＩＬ−６及びＴＮＦαの循環レベルに及ぼす影響。（ｂ）〜（ｆ）８週齢の雄ＣＤ−１マウスに高脂肪食（カロリーで６０％）、またはマッチした対照食（Ｎ＝１０）を供与した。ＭＯＴＳ−ｃは、毎日、腹腔内に注射した（０．５ｍｇ／ｋｇ／日）。（ｂ）体重、（ｃ）血糖、（ｄ）インスリン、（ｅ）肝臓のＨ＆Ｅ染色、（ｆ）骨格筋ＡＭＰＫリン酸化及びＧＬＵＴ４レベル。（ｇ）７日間の急性ＭＯＴＳ−ｃ処理（５ｍｇ／ｋｇ／日；ＩＰ）の、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスで実施した腹腔内グルコース耐性試験（ＩＰＧＴＴ）に及ぼす影響（Ｎ＝７）。（ｈ）〜（ｊ）正常血糖−高血糖クランプを、高脂肪食（カロリーで６０％）を与え、そしてＭＯＴＳ−ｃ（５ｍｇ／ｋｇ／日：ＩＰ）で７日間処理した（Ｎ＝６〜８）Ｃ５７ＢＬ／６マウスで実施した。（ｈ）全身のインスリン感受性を反映したグルコース注入速度（ＧＩＲ）。（ｉ）主に、筋肉のインスリン感受性を反映するインスリン刺激糖の排出速度（ＩＳ−ＧＤＲ）、および（ｊ）肝グルコース産生（ＨＧＰ）。（ｋ）〜（ｌ）若月齢（４ヶ月）及び高月齢（３２ヶ月）マウスでのＭＯＴＳ−ｃレベル（Ｎ＝３〜４）は、（ｋ）骨格筋；及び（ｌ）循環物質（血清）で低下する。（ｍ）７日間の急性ＭＯＴＳ−ｃ処理（５ｍｇ／ｋｇ／日：ＩＰ）月）の、インスリン刺激（６０μＵ／ｍｌ）した２−デオキシグルコースの若月齢（３ヶ月）及び高月齢（１２ヶ月）雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝６）のヒラメ筋内への取り込みに及ぼす影響。（ｎ）ＭＯＴＳ−ｃ作用に対する提案されたモデル。データは、平均±ＳＥＭを示す。スチューデントｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１７】以下の項目を説明する：（ａ）ＭＯＴＳ−ｃのペプチド配列は、高度に保存される。（ｂ）ＭＯＴＳ−ｃの推定上の翻訳後修飾。（ｃ）ＭＯＴＳ−Ｃ抗体が生成され、免疫ブロット法によりＭＯＴＳ−ｃに対する特異性について試験された。ｐＥＶ、ｐＭＯＴＳ−ｃ、ｐＭＯＴＳ−ｃ−ＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＰで形質移入したＨＥＫ２９３細胞からＭＯＴＳ−ｃの検出を示す、免疫ウェスタンブロット法。（ｄ）ＨＥＫ２９３細胞を、抗ＭＯＴＳ−Ｃ抗体（緑）単独で、またはＭＯＴＳ−ｃペプチド（ブロッキング）の存在下で染色した。（ｅ）ＨＥＫ２９３細胞における免疫染色：ＭＯＴＳ−ｃ（緑）、ｈｓｐ６０（赤）。核はヘキスト３３２５８（青）で染色した。スケールバー：２０μｍ。（ｆ）血漿中のＭＯＴＳ−ｃを測定するために使用した室内のＭＯＴＳ−ｃＥＬＩＳＡの標準曲線。
【図１８】新規なプリン生合成経路（Ｎ＝５）に及ぼすＭＯＴＳ−ｃの影響をより説明する。（ａ）ＭＯＴＳ−ｃ処理（１０μＭ；処理後、２４及び７２時間）は、ＨＥＫ２９３細胞における新規なプリン生合成経路を調節する；（ｂ）ＭＯＴＳ−ｃ処理（１０μＭ）は、マイクロアレイ及びインジェヌイティ-パスウエイ-アナリシス（ＩＰＡ）により決定される通りの新規プリン生合成に関与する遺伝子発現の経路を変化させる（Ｎ＝６）。メタボロミクス解析とのオーバーレイのためには図１４ｅを参照されたい。同一時間点内でのグループ間のスチューデントｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１９】アデニルシステム構成成分及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）サイクルの構成成分に及ぼすＭＯＴＳ−ｃの影響を以下の観点より説明する：（ａ）ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、及び環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）のレベル；及び（ｂ）ＭＯＴＳ−ｃを安定的に過剰発現した、ＨＥＫ２９３細胞におけるＮＡＤ＋及びＮＡＤＨレベル；ＥＶ：空のベクターで安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３。スチューデントｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２０】メタボロミクス（Ｎ＝５）により決定される、ＭＯＴＳ−ｃを安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞における（ａ）プリン代謝及び（ｂ）共因子、及びビタミン代謝の成分にＭＯＴＳ−ｃが及ぼす影響を説明する。ＥＶ：安定的に空のベクターで形質移入したＨＥＫ２９３。
【図２１】ＭＯＴＳ−ｃの（ａ）ＭＯＴＳ−ｃを安定的過剰発現するＨＥＫ２９３細胞中のグルコース及び乳酸の細胞外（培地）レベル（Ｎ＝６）及び（ｂ）ＭＯＴＳ−ｃで処理されたＨＥＫ２９３細胞において、蛍光グルコース類似体２−ＮＢＤＧによりで決定される細胞内グルコース摂取率（１０μＭ、７２時間）（Ｎ＝３）に及ぼす影響を説明する。スチューデントｔ検定：＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２２】メタボロミクスによって決定される（Ｎ＝５）、ＭＯＴＳ−ｃを安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞における種々の糖基質の代謝に及ぼすＭＯＴＳ−ｃの影響を説明する。ＥＶ：安定的に空のベクターで形質移入したＨＥＫ２９３。
【図２３】メタボロミクスによって決定される（Ｎ＝５）、（ａ）解糖；及び（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞における外因性ＭＯＴＳ−ｃ（１０μＭ）処理後２４時間、または７２時間のペントースリン酸経路（ＰＰＰ）、及び（ｃ）安定的にＭＯＴＳ−ｃを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるＰＰＰの中間代謝物を説明する。ＥＶ：安定的に空のベクターで形質移入したＨＥＫ２９３。同一時間点内のグループ間のスチューデントｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２４】メタボロミクスにより決定される（Ｎ＝５）、ＨＥＫ２９３細胞におけるトリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの中間体レベルに及ぼす外因性ＭＯＴＳ−ｃ処理（１０μＭ：２４時間または７２時間）の影響を説明する。同一時間点内のグループ間のスチューデントｔ検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２５】ＨＥＫ２９３細胞（Ｎ＝１２）での酸素消費速度（ＯＣＲ）に及ぼす、種々のＭＯＴＳ−ｃ発現クローンの影響を説明する。ＭＯＴＳ−ｃ−ＨＡ：Ｎ末端でＨＡでタグを付与したＭＯＴＳ−ｃ；ＭＯＴＳ−ｃ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ：内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を介在してＧＦＰを独立して発現する発現ベクター内にクローン化したＭＯＴＳ−ｃ；ＭＯＴＳ−ｃ−ＨＡ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ：ＩＲＥＳ−ＧＦＰを有する発現ベクタ内にクローン化したＭＯＴＳ−ｃ−ＨＡ。スチューデントｔ検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２６】細胞酸化還元ホメオスタシスが、グルタチオン系の状態によって決定することを説明する：還元型（ＧＳＨ）、及び酸化型（ＧＳＳＧ）のグルタチオン、その比（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）、及び総グルタチオンレベル（ＧＳＨ＋ＧＳＳＧ）は、（ａ）ＭＯＴＳ−ｃを安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞；及び（ｂ）２４時間または７２時間（Ｎ＝５）外因性のＭＯＴＳ−ｃ（１０  μＭ）で処理されたＨＥＫ２９３細胞。ＥＶ：安定的に空のベクターで形質移入したＨＥＫ２９３において決定される。スチューデントｔ検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２７】ＭＯＴＳ−ｃの脂質代謝に及ぼす影響を以下の観点より説明する：（ａ）ＭＯＴＳ−ｃを安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞での脂質代謝を調節する。外因性のＭＯＴＳ−ｃ処理（１０μＭ；２４または７２時間）は、（ｂ）カルニチン−シャトルシステム部剤、（ｃ）必須脂肪酸、及び（ｄ）β−酸化中間ミリストイルＣｏＡのレベルを調節する。スチューデントｔ検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２８】（ａ）ＭＯＴＳ−ｃを安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞および（ｂ）２４時間または７２時間外因性のＭＯＴＳ−ｃ（１０μＭ）で処理されたＨＥＫ２９３細胞（Ｎ＝５）におけるメタボロミクスにより決定される長鎖脂肪酸のレベルを説明する。ＥＶ：安定的に空のベクターで形質移入したＨＥＫ２９３。スチューデントｔ検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２９】ＭＯＴＳ−ｃの４日間急性（５ｍｇ／ｋｇ／日；ＩＰ；ＢＩＤ）処理の（ａ）体重変化（％）、（ｂ）食物摂取量、（ｃ）血糖値、及び（ｄ）ＣＤ−１雄マウス中のアジポカインに及ぼす影響を説明する（Ｎ＝６）。（ｅ）〜（ｆ）ＭＯＴＳ−ｃ（０．５ｍｇ／ｋｇ／日）処理の（ｅ）毎日の食物摂取量、及び（ｆ）８週間、高脂肪食（カロリー：６０％）で飼育したマウスの総食物／カロリーの摂取量に及ぼす影響を説明する。スチューデントｔ検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図３０】７２時間、ＭＯＴＳ−ｃ（１０μＭ）で処理したＨＥＫ２９３細胞のマイクロアレイデータを説明する（Ｎ＝６）。図１４ｄ参照。
【図３１】外因性のＭＯＴＳ−ｃ処理（１０μＭ）の２４時間及び７２時間後の変化、または安定的に過剰発現するＭＯＴＳ−ｃ、または、空のベクタ（ＥＶ）（Ｎ＝５）の有意差（Ｐ≦０．０５）、及び境界有意差（０．０５＜Ｐ＜０．１）を有するＨＥＫ２９３細胞における生化学物質（代謝物）の全数を説明する。赤：増加；青：減少。Ｗｅｌｃｈの２標本ｔ検定。
【図３２】図１６ｈ〜ｊで正常血糖高インスリンクランプ試験からの代謝パラメータ及び循環因子を説明する。スチューデントｔ検定。
【図３３】６日目の空腹血糖を説明する。ＺＤＦ糖尿病ラットは、その血糖値が、＞３００ｎｇ／ｍｌになるまで追跡し、その時点で、ＭＯＴＳ−ｃまたはインスリンの２用量での処理を開始し、６日間午前８時にＩＶで与えた。グループ当たり、６ラットを使用した。空腹時の血糖は、６日後測定した。ＡＮＯＶＡ及びスチューデントｔ−検定は、分析及びｐ値のために使用した。
【図３４】６日目の血糖の絶対変化を説明する。図３３に記載したものと同じ実験において、血糖の絶対変化が示されている。生理食塩水で処理したＺＤＦラットは、その血糖値が１００ｎｇ／ｍｌの更なる上昇を示した。毎日インスリンを投与したラットは、ベースラインと同レベルで血糖を安定させるが、一方、ＭＯＴＳ−ｃ処理したラット（１ｍｇ／４００ｇラット）は、その血糖を実質的に低下させる。
【図３５】ＭＯＴＳ−ｃは、解糖フラックスの増加を刺激し、それはグルコースの取り込みと乳酸生産によって証明されたことを説明する：ＭＯＴＳ−ｃを安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞の培地中の細胞外グルコース（Ａ）、及び（Ｂ）乳酸（Ｎ＝６）。
【図３６】ＭＯＴＳ−ｃは、生体外での細胞のグルコースフラックスを強化し、急性処理は、正常食を与えたマウスの血糖値を低下させることを説明する。インスリンの感受性を試験するために、マウスに７日間のＭＯＴＳ−ｃの腹腔内注射（５ｍｇ／ｋｇ／日）の処理をおこない、その後、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、グルコース耐性試験（ＧＴＴ；１ｇ／ｋｇグルコース）にかけた（Ｎ＝７）。改善されたインスリン感受性を示すかなり強化されたグルコースクリアランスを見い出した。
【図３７】高脂肪食（ＨＦＤ：カロリーで６０％）の代謝に及ぼすＭＯＴＳ−ｃ（０．５ｍｇ／ｋｇ／日：ＩＰ）の影響（Ｎ＝１０）の試験を説明する：通常の食餌を与えたとき、ＭＯＴＳ−ｃ処理が体重に影響を及ぼさなかったが、それがＨＦＤ（Ａ）で飼育されたマウス（Ａ）の肥満を明確に予防している；（Ｂ〜Ｃ）：この体重の差は、カロリー摂取がグループ間で同一であるとき、食事の摂取量に起因しなかった；（Ｄ〜Ｅ）：更に、ＭＯＴＳ−ｃ処理が、ＨＦＤで誘導される高インスリン血症を予防し、改良されたグルコースホメオスタシスを示し；（Ｆ）ＭＯＴＳ−ｃは、また、肝臓のＨ＆Ｅ染色により決定されるＨＦＤ誘発性の脂肪肝を減少させた。
【図３８】ＭＯＴＳ−ｃ（５．０ｍｇ／ｋｇ／日：ＩＰ）が異なる遺伝的背景を有するマウス：Ｃ５７ＢＬ／６（Ｎ＝１２）における高脂肪食（ＨＦＤ：カロリーで６０％）へ及ぼす影響の試験結果を説明する。（Ａ）：ＣＤ−１マウスと同様に、ＭＯＴＳ−ｃ処理は、ＨＦＤを与えたＣ５７ＢＬ／６マウスの肥満を予防した。（Ｂ）減少した体重の増加は、部分的に、内臓脂肪レベルの低下に帰することができる。（Ｃ）この体重の差は少ない食物摂取に起因しない。また、ＭＯＴＳ−ｃ処理が、ＨＦＤ誘発性の高インスリン血症を予防し、改善したグルコースホメオスタシス（Ｄ〜Ｅ）を示した。ＮＤ：正常食事；ＨＦＤ：高脂肪食事。
【図３９】全身代謝に及ぼすＭＯＴＳ−ｃの影響を示す。正常食事で飼育された非近交系ＣＤ−１雄マウスは、ＭＯＴＳ−ｃ（５ｍｇ／ｋｇ／日；ＢＩＤ：４日間）で、またはビヒクル対照群（Ｎ＝６）で処理された。ＭＯＴＳ−ｃでの４日間の処理は、体重、食事及び血糖値を下げた。また、肥満及びインスリン抵抗性の発症に関与する、循環ＩＬ−６及びＴＮＦα（Ａ）の基礎レベルは、有意にＭＯＴＳ−ｃ処理により減少した。
【図４０】癌細胞は、その激しい成長を支持するために錯乱代謝を有することが知られていることを示している。ＭＯＴＳ−ｃは代謝ホメオスタシスの調節因子であり、悪性細胞の増殖能力に影響を与える。安定的にＭＯＴＳ−ｃを過剰発現する乳癌細胞（４Ｔ１）は、（Ａ）低下した増殖速度、及び（Ｂ）低下した呼吸を示す。また、（Ｃ）ＭＯＴＳ−ｃ処理は、皮下同種移植マウスモデルにおける乳癌（４Ｔ１）の増殖を遅らせた。（Ｄ）ＭＯＴＳ−ｃ処理は、安定した体重の維持によって反映されるように、毒性はなかった。
【図４１】乳癌と同様に、ＭＯＴＳ−ｃは、また、前立腺癌細胞の増殖を遅らせることを示している。（Ａ）：生体外でのＭＯＴＳ−ｃ処理が、前立腺癌細胞（２２ＲＶ１）の増殖を遅らせた。（Ｂ〜Ｃ）：また、皮下同種移植マウスモデルにおける、ＭＯＴＳ−ｃ処理が、前立腺癌（２２Ｒｖ１）の増殖を抑える；（Ｄ）ＭＯＴＳ−ｃ処理は、安定した体重の維持により反映されるように、毒性はなかった。
【図４２】ＭＯＴＳ−ｃ処理は、用量依存的に、生体外での４つの異なる前立腺癌細胞株の増殖を遅らせることが説明されている。ＭＴＴの還元は、細胞増殖を評価するために使用し、対照群に対する相対量（ＲＱ）が提示されている。細胞は、最適成長条件下で、４８〜７２時間処理した。
【００２１】
定義
便宜上、明細書、実施例及び添付の特許請求範囲で使用される特定の用語及び語句は、以下の通りに提供される。
【００２２】
本明細書で使用される、用語「糖尿病」は、損傷したインスリン産生及びグルコース耐性を特徴とする広いクラスの疾病を参照する。糖尿病は、Ｉ型及びＩＩ型（それぞれ、若年及び成人発症と呼ばれる）糖尿病、妊娠糖尿病、前糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、及びグルコース耐性障害が含まれる。一般的な症状としては、頻尿、過度の口渇、極端な飢餓、異常な体重減少、疲労感の増大、神経過敏、及びかすみ目が挙げられる。これらの個々の障害の診断は、以下でより詳細に記載する。
【００２３】
Ｉ型糖尿病は、また、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、Ｉ型糖尿病、及び若年性糖尿病としても知られている。用語は、本明細書において互換的に使用される。疾病の治療及び診断は、以下により詳細に記載される。
【００２４】
「膵β細胞」、「β島細胞」及び類似の用語は、ランゲルハンス島で見つかった膵内分泌細胞の個体群を参照する。β島細胞は、インスリン及びアミリンを生成し、血流内に分泌する。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「細胞の生存を改善する」は、対照群と比較して、与えられた条件で生き残る細胞数、例えば、治療の非存在下で同じ条件で生き残る細胞数の増加を参照する。条件は、生体外で、生体内で、または、その場であってもよい。改善された細胞生存率は、比較値として表現でき、例えば、細胞生存率が２倍に改善される場合、２倍の細胞が生存する。改善された細胞の生存は、アポトーシスの減少、細胞寿命の上昇、または細胞の機能や症状の改善をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、対照群のレベルと比較して、細胞の生存率は、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％改善されている。いくつかの実施形態では、細胞生存率は、対照群レベルの２、３、４、５、または１０倍である。或いは、改良された細胞の生存率は、アポトーシスのパーセント減少として表現できる。いくつかの実施形態では、例えば、対照群サンプルと比較して、アポトーシスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％減少する。
【００２６】
本明細書で使用する「障害を予防する」という用語は、絶対的な用語として意図されたものではない。その代わりに、例えば、Ｉ型糖尿病の予防は、発症の遅延、症状頻度の低下、または障害に関連する症状の重症度の低下を参照する。ゆえに予防は、当業者により理解される広範囲の予防措置を指す。いくつかの状況において、例えば、個人が従来のインスリン補充療法を必要としないように、症状の頻度及び重症度が非病理学的なレベルまでに低減される。いくつかの状況では、本発明の組成物を受ける個人の症状は、未治療の障害を有する個人が経験する症状と比べて、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５または１％の頻度、または重症度である。
【００２７】
同様に、用語「疾病の治療」は、絶対的な用語として意図するものではない。いくつかの態様では、本発明の組成物は、糖尿病の症状につながるインスリン産生細胞の損失を低減しようとする。いくつかの状況において、治療は、予後の改善や頻度または重症度の低下をもたらす。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「治療または予防を必要とする個人」は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠糖尿病、前糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、または損傷されたグルコース耐性、もの、及びと診断されたまたは、これらの障害のいずれかを発症するリスクがある個人を指す。治療を必要とする個人は、また、膵臓に影響を与える傷害、疾病、または外科的処置を受けているものが含まれるが、そうでない場合、個人はインスリンを作る能力が損なわれている。その様な個人は、哺乳類、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ、または霊長類のいずれかであり得る。
【００２９】
本明細書で使用する場合、用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウインドウにわたって、２つの最適に整列された配列を比較することにより決定されるが、ここに、参照配列と比較して、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分（例えば、本発明のポリペプチド）は、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよく、それは、２つの最適に整列された配列のための付加または欠失を含まない。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が合致した位置の数を得るために、両方の配列に存在する位置の数を決定し、比較ウインドウ中における合致した位置の数を全位置数で除し、そして１００を乗じて計算し、配列同一性のパーセンテージを得る。
【００３０】
本明細書で使用されるように、２つ若しくはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一的」または「同一性」のパーセントは、２つまたはそれ以上の配列、または同一配列であるサブ配列を参照する。２つの配列が、比較ウィンドウにおける最大の一致を得るために、比較し、整列させた場合、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドがあるパーセンテージを有している場合、配列は「実質的に同一」であり（即ち、６０％の同一性、任意で、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性をある領域にわたって、または、特に指定のない場合、配列全体にわたって有する）、それは以下の配列比較アルゴリズムの１つ、または手動アラインメント及び目視検査を用いて測定したときの領域、または示されていない配列全体を含めた領域を指定する。本発明は、ポリペプチド、または実質的に同一であるポリペプチドをコード化し、または本明細書に例示されるポリペプチド（例えば、ヒューマニン）と実質的に同一の配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。この定義は、また、ヌクレオチドの試験配列の相補体を参照する。
【００３１】
「前糖尿病の個人」は、空腹時血糖値が１１０ｍｇ／ｄｌを超えるが、１２６ｍｇ／ｄｌ以下であり、または２時間ＰＧの読み取り値が、１４０ｍｇ／ｄｌより大きいが、２００ｍｇ／ｄｌ以下である成人を指す。「糖尿病の個人」は、空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄｌより大きいか、または２時間ＰＧの読み取り値が、２００ｍｇ／ｄｌより大きい成人を指す。
【００３２】
発明を実施するための形態
序論
１０年前、最初のミトコンドリア由来ペプチド（ＭＤＰ）、ヒューマニン（ＨＮ）は、アルツハイマー病患者の脳の非影響の画分から構築したｃＤＮＡライブラリーからクローン化し、ミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子座にマッピングした。ＨＮは、細胞保護及び抗アポトーシス因子であることが示された（Ｂａｃｈａｒ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１０））。ヒューマニンは、ヒトの血管壁で発現され、酸化されたＬＤＬ誘発性の酸化ストレスに対する細胞保護効果を有している（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８８，３６０−３６６；  Ｇｕｏ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３））。ヒューマニンペプチドは、Ｂａｘの活性化を妨害することにより、アポトーシスを抑制する（Ｎａｔｕｒｅ  ４２３，４５６−４６１；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００１））。家族性アルツハイマー病遺伝子及びＡベータの広いスペクトルにより神経細胞死を無効にする救助因子（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，６３３６−６３４１；  Ｈｏａｎｇ，Ｐ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１０））。神経生存因子ヒューマニンは、シグナルトランスジューサ、及び転写３活性体の活性化及び遅延を介して、β細胞アポトーシスを阻害し、非肥満性糖尿病マウスにおける糖尿病を改善する（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ５９，  ３４３−３４９；  ａｎｄ  Ｉｋｏｎｅｎ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．（２００３））。アルツハイマー病患者の生存ペプチドヒューマニン及びインスリン様成長因子接合タンパク質３との間の相互作用は、細胞生存及びアポトーシスを調節する（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，  １３０４２−１３０４７））。ＨＮ生物学のさまざまな態様を記述する１３０件以上の公開文献がある。
【００３３】
従来の観察結果を構築して、追加のＭＤＰは、１２Ｓ  ｒＲＮＡの内にコード化し、それをＭＯＴＳ３（１２個のＳ  ｒＲＮＡ内のミトコンドリアオープンリーディングフレーム）と命名し、インシリコで発見され、そして本明細書で開示された（表１）。
表１.  ＭＯＴＳ３の配列及び位置（配列番号１及び配列番号２）
【表１】
0006640076.tif 000002
【００３４】
本明細書において報告するように、ＭＯＴＳ３はミトコンドリア機能／代謝及びグルコース利用を調節することにより、細胞の代謝状態を移動させる。これは、ミトコンドリアが、病因または疾病の保守／進行のいずれかで重要な役割を果たしている癌、糖尿病、脂肪肝、神経変性疾病、高血圧症、及び加齢などのさまざまな疾病に適用することに多くの可能性を有している。
【００３５】
更にその上、ミトコンドリア機能障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、並びに、高血圧を含む神経変性疾病の病因において中心的な役割を果たしている。
【００３６】
癌においては、ミトコンドリアは、その署名した激しい増殖を供給するため、生合成前駆体の製造のための中心的な細胞オルガネラであり、これはＭＯＴＳ３依存性のミトコンドリア機能の抑制により相殺し、細胞増殖を減少させることができる（Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，（２０１２）  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ：ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｈａｌｌｍａｒｋ  ｅｖｅｎ  ｗａｒｂｕｒｇ  ｄｉｄ  ｎｏｔ  ａｎｔｉｃｉｐａｔｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ２１，２９７−３０８）。  
【００３７】
肥満及び脂肪肝などの代謝性疾病は、また、同量の食物消費の元で、体重及び肝臓のミトコンドリア呼吸を調節するのに有効であるように、ＭＯＴＳ３で治療することができる（図１１）。糖尿病において、メトホルミン及びＡＩＣＡＲなどのアデノシン５′一リン酸（ＡＭＰ）活性プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を活性化する薬物は、グルコースホメオスタシスを調節するために十分に実証されており、現在臨床で使用される。（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）、ＡＭＰＫ：ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｃｅｌｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ９，４０７−４１６）。したがって、ＭＯＴＳ３は、また、ＡＭＰＫの強力な活性化剤（図６）、並びに、グルコースレベルの重要な調節因子（図１２Ａ）でもあり、従って、糖尿病を治療するために使用することができる。
【００３８】
糖尿病
ＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）は、特に先進国において、急速に増大し、一般的な代謝障害である。これは、インスリン抵抗性、インスリン欠乏及び高血糖によって特徴づけられる。ＩＩ型糖尿病につながる要因としては、高コレステロール、肥満及び高血圧が含まれる。
【００３９】
症状が散発的である可能性があり、確かにＩ型糖尿病に関連したものよりも穏やかであるため、ＩＩ型糖尿病は、長年に亘って診断することはできなかった。ただし、未治療のＩＩ型糖尿病患者における上昇した血糖値は、腎臓、目、及び心血管系の機能障害につながることがあり得る。
【００４０】
更に、ＩＩ型糖尿病は、インスリン抵抗性を補償するβ細胞の障害によって引き起こされることがある。高カロリーの食事及び不十分な筋肉仕事は、肥満症及びＩＩ型糖尿病の発症に関与する重要な環境要因であると思われる。環境要因は、２つの主要な目標を介して作用するように見える。組織の大部分において、インスリン及び他のホルモンにより調節されるように、一方はグルコース、脂肪酸及び他の代謝産物の処理であり、他方はβ細胞機能である。
【００４１】
肥満は、公衆衛生上の大きな問題となってきた。肥満により引き起こされるか、または悪化する健康状態は、高血圧、糖尿病、睡眠時無呼吸、肥満に関連する低換気、背中及び関節の問題、心血管疾病、非アルコール性脂肪肝疾病及び胃食道逆流性疾病が含まれる。
【００４２】
ボディマス指数（ＢＭＩ）（身長（メートル）の二乗で割ったキログラムの体重として計算）が過体重及び／又は肥満の最も一般的に受け入れられている測定値である。２５を超えるＢＭＩは、過体重であると考えられ、一方肥満は、３０またはそれ以上のＢＭＩとして定義され、３５またはそれ以上のＢＭＩは、深刻な共存疾病であり、４０またはそれ以上のＢＭＩは、病的肥満であると考えられる。
【００４３】
Ｉ型糖尿病は、リンパ球による膵島への浸潤に続く、膵臓β細胞の進行破壊により特徴付けられる自己免疫疾病である。これは、インスリン欠乏をもたらす。
【００４４】
アポトーシスは、Ｉ型糖尿病の発症の間、β細胞死の主要モードである（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６：７５０−５７）。ＩＬ−１、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γは、この自己免疫応答の間にＴ細胞及びマクロファージにより放出され、β細胞の破壊の重要な介在物質である。（Ｅｉｚｉｒｉｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｄｒｕｐ−Ｐｏｕｌｓｅｎ  （２００１）  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４４：２１１５−２１３３）。  
【００４５】
インスリン様成長因子接合蛋白質３（ＩＧＦＢＰ−３）は、そのＩＧＦ接合とは無関係の様式でアポトーシスを誘導する（Ｒａｊａｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７２：１２１８１−８８）。前炎症性Ｔｈ１サイトカインは、内因性ＩＧＦＢＰ−３の核内集約を増大させ、及び外因性ＩＧＦＢＰ−３のβ細胞への添加がアポトーシスを誘導する（Ｓｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｎｏｒｍ  ＩＧＦ  Ｒｅｓ．１４：２１６−２５）。ＩＧＦＢＰ−３は、グルコース代謝を調節する中枢神経系に作用することが示されているインスリン、レプチン、アディポネクチン、及びレジスチンを含む多くのペプチドの一つである（Ｍｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１７：１６７０−７８；  Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８：１３７６−８２）。アポトーシスによるβ細胞の損失は、また、膵島移植後にも発生する（Ｐａｒａｓｋｅｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５５：２０３−８）；Ｔｏｂｉａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｍｅｄ．４９：５６６−７１）。最近の研究では、単離されたヒト膵島は、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２よりも高いレベルでのアポトーシス促進タンパク質Ｂａｘを発現することを実証した（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７４：１４８９）。  
【００４６】
米国では百万人以上の人々がＩ型糖尿病を患っている。米国糖尿病協会によると、疾病は、毎年数千人の死亡を引き起こし、毎年２００億ドル以上の費用がかかる。Ｉ型糖尿病のために利用できる有効な治療薬または予防薬が必要とされる。
【００４７】
Ｉ型及びＩＩ型糖尿病を治療し、予防するための方法を開発する必要性がある。したがって、本発明のある実施形態では、ＭＯＴＳ３及びその医薬組成物は、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病を治療し、予防するために使用できる。
【００４８】
癌
癌は、現代社会に対する深刻な脅威である。世界的には、毎年、１０００万人以上の人々が、癌と診断され、この数は、２０２０年までに毎年１５００万の新たな症例に成長すると推定されている。癌は、毎年、６００万人の死亡を引き起こし、または世界中の死因の１２％を占める。
【００４９】
それらの固有の特性に基づく悪性の癌性増殖は、現代医学に対して深刻な課題を提起する。その特徴は、悪性組織の無秩序な成長をもたらす制御不能な細胞増殖、局部及び遠隔組織であっても侵入する能力、分化の欠如、検出可能な症状の欠如、最も重要な効果的な治療及び予防の欠如をもたらす、を含む。
【００５０】
癌は、いずれの年齢でも、いずれの器官のいずれの組織でも発生することができる。癌の病因は明確に定義されていないが、遺伝的感受性、染色体切断障害、ウイルス、環境要因、及び免疫学的障害などのメカニズムはすべて、悪性細胞増殖及び形質転換に結びついている。癌は、世界中の何百万人に影響を与える医学的症状の大分類を包含する。癌細胞は、ほぼすべての臓器、及び／または、身体の組織に発生する可能性がある。身体の一部に細胞が、制御不能に成長または分化し始めるときに癌が発生する。全ての癌の種類は、異常細胞の制御不能な成長で始まる。
【００５１】
脳腫瘍、結腸癌、黒色腫、白血病（例えば、ＡＭＬ）、リンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、及び胃癌を含む、がこれらに限定されない多くの種類の癌がある。
【００５２】
現在、幾つかの利用可能な主要治療法は、手術、放射線療法、及び化学療法である。手術は、多くの場合、大幅な処置であり、深刻な結果を有する可能性がある。例えば、卵巣癌に対する全ての治療は、不妊症をもたらすことになる。子宮頸癌や膀胱癌のためのいくつかの治療は、不妊症及び／または性的機能不全を引き起こす可能性がある。膵臓癌を治療する外科的処置は、膵臓の部分的または全体的除去をもたらすことになり、患者に重大なリスクを運ぶこととなる可能性がある。乳癌手術は、常に、乳房の一部または全体を除去することを含む。前立腺癌のための幾つかの外科的処置は、尿失禁及びインポテンスのリスクを伴う。肺癌患者のための手順は、癌の肺組織に近づき、それを除去するために、肋骨を切開かれなければならないので、術後、しばしば、かなりの苦痛を伴う。また、肺癌及び肺気腫または慢性気管支炎などの他の肺疾病の両方を病む患者は、一般的には、手術後の呼吸の息切れの増加を経験する。放射線療法は、癌細胞を死滅させる利点を有するが、それが、同時に、非癌性組織を損傷させることになる。化学療法は、患者への種々の抗がん剤の投与を含むが、しばしば有害な副作用を伴う。
【００５３】
したがって、癌を治療及び予防することができる方法に対する必要性が依然として存在する。これらの方法は、ヒト及び他の哺乳動物における癌の予防及び治療に有用な医薬組成物用の基礎を提供することができる。従って、本発明のある実施形態において、ＭＯＴＳ３及びその医薬組成物は、癌を治療し、及び予防するために使用することができる。非限定的な例として、具体的には、ＭＯＴＳ３及びその医薬組成物は、脳腫瘍、結腸癌、黒色腫、白血病（例えば、ＡＭＬ）、リンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、及び胃癌を治療し、予防するために使用することができる。
【００５４】
脂肪肝及び肥満症
脂肪肝疾病（ＦＬＤ）としても知られている脂肪肝は、トリグリセリド油脂の液胞が肝臓に蓄積する可逆的な症状である。肝細胞中の脂肪蓄積のプロセスは、脂肪症として知られている。
【００５５】
肥満は、多ぎる体脂肪を持つことを説明するための一般的な用語である。被験者が、彼／彼女が燃焼するよりも多くのカロリーを取り込み、脂肪の貯蔵に導くとき、肥満が発生する。肥満は、被験者が必要とするより多くのカロリーを摂取し、十分な運動をしないことが原因である。肥満を評価するための最も一般的な２つの方法は、ボディマス指数（ＢＭＩ）およびウエスト周囲径がある。ＢＭＩは身長と体重を使用して計算される。高ＢＭＩ、即ち、肥満は、ＩＩ型糖尿病、心臓病、及び脳卒中のリスクを増大させる。
【００５６】
したがって、脂肪肝疾病及び肥満を治療し、及び防止することができる方法に対する必要性が依然として存在する。したがって、本発明のある実施形態では、ＭＯＴＳ３及びその医薬組成物は、脂肪肝疾病及び肥満を治療し、及び予防するために用いることができる。
【００５７】
ポリペプチドの発現及び精製
天然に存在するペプチド、合成ペプチド、または本発明の組換えポリペプチドは、組成物及び機能分析に使用するために精製することができる。本発明の天然に存在するポリペプチドは、いずれの供給源からも精製することができる。組換えポリペプチドは、いずれかの適切な発現系（例えば、哺乳動物、昆虫、酵母、または細菌細胞培養物）からも精製することができる。
【００５８】
本発明（すなわち、ＭＯＴＳ３及びＭＯＴＳ３類似体）のペプチドは、修飾されたペプチド及び合成ペプチド類似体の両方を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１に対して、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％同一性を有するペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１を含むペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１である。本明細書に記載のペプチドは、処方及び貯蔵特性を改善するために、または非ペプチド構造を導入することにより不安定なペプチド接合を保護するために改変できる。本発明のペプチドは、当該分野で公知の方法を用いて調製することができる。例えば、ペプチドは、化学合成によって、例えば、固相技術、及び／または自動ペプチド合成機を用いて製造してもよい。ある例において、ペプチドは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を使用して、自動化された複数のペプチド合成機（Ａｂｉｍｅｄ  ＡＭＳ４２２）上での固相方式を用いて合成することができる。ペプチドは、その後、逆相ＨＰＬＣで精製し凍結乾燥することができる。
【００５９】
組換え方式へのアプローチのために、本発明は、本明細書に開示されるポリペプチドをコード化する単離された核酸、核酸を含む発現ベクター、及び発現ベクターを含む宿主細胞を含有する。より詳細には、本発明は、ＭＯＴＳ３ペプチドをコード化する単離された核酸、及びＭＯＴＳ３活性を有するＭＯＴＳ３ペプチド類似体を提供し、ペプチドは、配列番号１を含むが、それに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも、配列番号１に対しての、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％同一性を有するペプチドをコード化したｃＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１をコード化するｃＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも、配列番号２に対して、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％の同一性を有するｃＤＮＡを含有する。
【００６０】
組換えタンパク質を大量に形質転換された細菌により発現させるとき、発現が構成されるが、一般的にはプロモーター誘導の後、タンパク質は不溶性凝集体を形成するかもしれない。タンパク質封入体の精製に適したいくつかの手順がある。例えば、タンパク質集合体（以下、封入体と呼ばれる）の精製は、一般的には、約１００〜１５０μｇ／ｍｌのリゾチーム、及び０．１％のノニデットＰ４０、非イオン性界面活性剤の緩衝液中での培養による、細菌細胞の破壊による封入体の抽出、分離、及び／または、精製を含むがそれに限定されない。細胞懸濁液はポリトロン粉砕機を用いて粉砕することができる（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，  Ｎ．Ｙ．）。あるいは、細胞を氷上で超音波処理することができる。細菌を溶解する代替方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（両方共、前述されたもの）により記載され、それらは当業者には明白であろう。
【００６１】
細胞懸濁液は、一般的に、遠心分離し、封入体を含むペレットを、例えば、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、非イオン洗浄剤などを含む、封入体を溶解しないが、洗浄する緩衝液に再懸濁させる。できるだけ多くの細胞破片を除去するために、洗浄工程を繰り返す必要があるかもしれない。封入体の残存ペレットを適切な緩衝液中に再懸濁してもよい（例えば、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８で、１５０ｍＭのＮａＣｌ）。他の適切な緩衝液は、当業者には明白であろう。
【００６２】
洗浄工程の後、封入体は、強い水素受容体及び強力な水素供与体（または、これらの特性のうち１つを有する各溶媒の組み合わせ）である溶媒を添加することにより可溶化する。封入体を形成したタンパク質は、その後、適合性のある緩衝液で希釈または透析することにより再生してもよい。好適な溶媒としては、尿素（約４Ｍ〜約８Ｍ）、ホルムアミド（少なくとも、体積比で約８０％）、及びグアニジン塩酸塩（約４Ｍ〜約８Ｍ）が挙げられるがそれに限定されない。ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）及び７０％ギ酸などの凝集体形成タンパク質を可溶化できる幾つかの溶媒は、免疫原性及び／または活性の欠如を伴う、タンパク質の不可逆的変性の可能性に起因して、この手法での使用は不適切である。グアニジン塩酸塩及び類似の薬剤は変性剤であるが、この変性は不可逆的ではなく、再生は、（例えば、透析により）除去する際に、または変性剤を希釈する際に発生し、目的の免疫学的、及び／または、生物学的に活性なタンパク質の再形成を可能にする。可溶化の後、タンパク質は、標準的な分離技術により、他の細菌タンパク質から分離することができる。
【００６３】
あるいは、細菌ペリプラズムからタンパク質を精製することが可能である。タンパク質が細菌ペリプラズムに注入されるとき、細菌ペリプラズム画分は、当業者に公知の他の方法に加えて、低温浸透圧衝撃により単離することができる（参照：Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．上記記載）。ペリプラズムから組換えタンパク質を単離するため、細菌細胞は、遠心分離してペレットを形成する。ペレットは２０％スクロースを含有する緩衝液に再懸濁する。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離し、ペレットを氷冷した５ｍＭのＭｇＳＯ４中に再懸濁し、そして約１０分間氷浴中に保持する。細胞懸濁液を遠心分離し、上清液をデカントし、保存する。上清液中に存在する組換えタンパク質は、当業者に公知の標準的な分離技術により、宿主タンパク質から分離することができる。
【００６４】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムなどの物質による選択的沈殿、カラムクロマトグラフィー、免疫精製法、及びその他の方法を含む、標準的な技術により実質的に純粋に精製することができる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  （１９８２）；  米国特許第４，６７３，６４１；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９５  補足）；  及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  第２版，（１９８９））。
【００６５】
ポリペプチドが精製されているときに多くの手順を用いることができる。例えば、ポリペプチドは、イオン交換または免疫親和性カラムを用いて精製することができる。
【００６６】
しばしば、最初の段階として、そして、タンパク質混合物が複雑な場合、最初の塩画分は、目的の組換えタンパク質から多くの不要な宿主細胞タンパク質（または、細胞培地に由来するタンパク質）を分離することができる。好ましい塩は、硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、効果的に、タンパク質混合物中の水の量を減少させることにより、タンパク質を沈殿させる。その後、タンパク質を、その溶解度に基づいて沈殿させる。タンパク質の疎水性が大きければ大きいほど、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿することがあり得る。一般的な手順は、得られた硫酸アンモニウム濃度が、２０〜３０％の間になるように、タンパク質溶液に飽和の硫酸アンモニウム溶液を加えることである。これは、最も疎水性のタンパク質を沈殿させる。沈殿物は廃棄し（目的のタンパク質が疎水性でない限り）、硫酸アンモニウムは、目的のタンパク質を沈殿させるために既知の濃度になるように上清液に加える。その後、沈殿物を緩衝液中に可溶化し、過剰の塩は、必要に応じて、透析または透析濾過のいずれかを介して除去する。冷エタノール沈殿などのタンパク質の溶解度に依存する他の方法は、当業者に周知であり、複雑なタンパク質混合物を分画するために使用することができる。
【００６７】
計算された分子量に基づいて、より大きい、及びより小さいサイズのタンパク質は、異なる孔径の膜を通す限外濾過を用いて単離することができる（例えば、Ａｍｉｃｏｎ社製またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製の膜）。第一の段階として、タンパク質混合物は、目的のタンパク質の分子量よりも低い分子量をカットオフする孔サイズを有する膜を通して限外濾過する。限外ろ過の残余液は、その後、目的のタンパク質の分子量よりも大きい分子量カットオフする膜で限外濾過する。組換えタンパク質は、濾液の中にむかい膜を通過する。濾液を、その後、下記のようにクロマトグラフィーにかけることができる。
【００６８】
目的のタンパク質は、また、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性、及びリガンドに対する親和性に基づいて他のタンパク質から分離することができる。更に、タンパク質に対して生育した抗体を、カラムマトリックスに接合し、タンパク質を免疫精製することができる。全てのこれらの方法は、当該分野で公知である。
【００６９】
血球凝集素（ＨＡ）、ＦＬＡＧ，  Ｘｐｒｅｓｓ，  Ｍｙｃ、ヘキサヒスチジン、グルタチオンＳトランンスフェラーゼ（ＧＳＴ）などの多様な親和性タグで生育した抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィーは、ポリペプチドを精製するために使用できる。Ｈｉｓタグは、また、ある金属（例えば、Ｎｉ）に対するキレート化剤として作用し、その結果、金属は、また、Ｈｉｓを含むポリペプチドを精製するために使用することができる。精製した後、タグは、任意で、特定のタンパク質分解切断により除去される。
【００７０】
クロマトグラフィー技術が、任意のスケールで、多くの異なる製造業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）からの装置を使用して実施できることは、当業者には明らかであろう
【００７１】
医薬組成物
本発明のペプチドは、必要に応じて、適切な薬学的賦形剤と一緒に投与することができる。当業者は、組成物が投与方式及び単回投与量の形態に応じて変化することを理解するであろう。
【００７２】
組成物は、一般的には、従来の薬学的担体または賦形剤を含み、更に、他の薬剤、担体、助剤、希釈剤、組織透過促進剤、可溶化剤などを含んでもよい。好ましくは、組成物は、本発明の抱合体、またはその組み合せの、重量％で、約０．０１％〜約９０％、約０．１％〜約７５％、約０．１％〜５０％、または約０．１％〜１０％を含有し、適切な医薬担体及び／または賦形剤からなる残余物も一緒に有する。適切な賦形剤は、当技術分野で公知の方法により、特定の組成物、及び投与経路に合わせることができる。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，  １８ＴＨ  ＥＤ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）を参照のこと。
【００７３】
好適な賦形剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びカルボポールなどのポリアクリル酸、例えば、カルボポール９４１、カルボポール９８０、カルボポール９８１などが挙げられるが、それに限定されない。組成物は、更に、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油などの潤滑剤；湿潤剤；乳化剤；懸濁剤；ヒドロキシ安息香酸メチル、エチル、及びプロピル（即ち、パラベン）などの保存剤；無機及び有機酸及び塩基などのｐＨ調整剤；甘味剤；着色剤；及び香味剤を含むことができる。組成物は、また、生分解性ポリマービーズ、デキストラン、及びシクロデキストリン包接複合体を含むことができる。
【００７４】
経口投与の場合、組成物は、錠剤、トローチ剤、カプセル、乳化剤、懸濁剤、液剤、シロップ、スプレー剤、粉末、及び徐放性製剤の形態であり得る。経口投与に適した賦形剤には、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどの医薬品グレードを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ピル、錠剤、またはカプセルの形態をとり、そしてその結果、組成物は、以下のラクトース、スクロース、リン酸ジカルシウムなどの希釈剤；デンプン、またはその誘導体などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤；及び、デンプン、アカシアガム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロース、及びその誘導体などの結合剤のいずれかを、抱合体、または抱合体の組み合わせと一緒に含むことができる。抱合体は、また、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）担体に配置された坐剤に処方することができる。
【００７６】
液体組成物は、例えば、経口、局所、または静脈内投与用の溶液または懸濁液を形成するために、例えば、水性生理食塩水（例えば、０．９％（重量／容積）の塩化ナトリウム）、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどの担体中に、抱合体、及び任意の１つ、またはそれ以上の薬学的に許容可能な補助剤を、溶解または分散することにより調製することができる。本発明の抱合体は、また、保持浣腸剤に処方することができる。
【００７７】
局所投与の場合、本発明の組成物は、エマルジョン、ローション、ゲル、クリーム、ゼリー、溶液、懸濁液、軟膏、及び経皮パッチの形態であり得る。吸入による送達の場合、組成物は、噴霧器を介して、乾燥粉末としてまたは液体の形態で送達できる。非経口投与の場合、組成物は、滅菌注射溶液及び滅菌包装粉末の形態であり得る。好ましくは、注射可能溶液は、約４．５〜約７．５のｐＨで処方される。
【００７８】
本発明の組成物は、また、凍結乾燥形態で提供できる。そのような組成物は、投与前の再構成のために、緩衝剤、例えば、重炭酸塩を含めてもよく、または緩衝液は、例えば、水と一緒に再構成するために、凍結乾燥組成物に含めてもよい。凍結乾燥組成物は、更に、適切な血管収縮剤、例えばエピネフリンを含めてもよい。凍結乾燥組成物は、場合により、再構成組成物を即座に患者に投与することができるように、再構成のための緩衝液と組み合わせて任意に包装された注射器で提供することができる。
【００７９】
投与すべき用量は、投与すべき特定ペプチドの組成物、投与の方式、適用のタイプ（例えば、予防用、治療用など）、患者の年齢、及び患者の体調を含む多くの因子に依存して変化するが、それに限定されないことを、当業者は理解するであろう。好ましくは、所望の結果を得るために必要な最小用量及び濃度が使用されるべきである。投与量は、子供、高齢者、衰弱した患者、及び心臓及び／または肝臓疾病を病む患者のために適切に調整することができる。更なる指針は、投与量を評価するために実験動物モデルを使用して、当該分野で公知の試験から得られる。ＭＯＴＳ３またはＭＯＴＳ３類似体は、特定の用途に適するよう、ヒトを含む哺乳動物への投与のために、過度の実験なしに処方することができる。更に、組成物の適切な用量は、標準用量−応答手順を使用して、過度の実験なしに決定できる。
【００８０】
幾つかの実施形態では、本発明の組成物を含むペプチドは、ペプチドの特定の用量は被験者に投与されるか、または被験者へのペプチドの単回用量投与のために処方される。幾つかの実施形態では、被験者に投与される用量は、１日当たり約０．００１〜約１０００ｍｇである。幾つかの実施形態では、被験者に投与される用量は、１日あたり約０．１〜約５００ｍｇである。幾つかの実施形態では、被験者に投与される用量は、１日あたり約０．５〜約１００ｍｇである。幾つかの実施形態では、本発明の組成物は、単回投与量のために処方され、ここに、単回投与量は一日あたり約０．００１〜約１０００ｍｇである。幾つかの実施形態では、本発明の組成物は、単回投与量のために処方され、ここに、単回投与量は一日あたり約０．１〜約５００ｍｇである。幾つかの実施形態では、本発明の組成物は、単回投与量のために処方され、ここに、単回投与量は一日あたり約０．５〜約１００ｍｇである。
【００８１】
投与方法
必要に応じて、適切な薬学的賦形剤を有する本発明のペプチド投与は、投与の許容されるいずれかのモードを介して実施することができる。従って、投与は、例えば、静脈内、局所、皮下、経皮的、経真皮的、筋肉内、経口、関節間、非経口、動脈内、皮内、脳室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸内、膣内、または吸入により実施できる。投与は、例えば、注射を介在して、膵臓組織を直接標的とすることができる。
【００８２】
本発明の組成物は、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上の回数、繰り返して投与することができ、または組成物は、連続注入により投与することができる。投与の適切な部位としては、皮膚、粘膜、気管支、胃腸、肛門、膣、眼、耳が挙げられるがそれに限定されない。製剤は、固体、半固体、凍結乾燥粉末、または、例えば、錠剤、ピル、トローチ、カプセル、粉末、溶液、懸濁液、乳化剤、坐剤、保持浣腸、クリーム、軟膏、ローション、ゲル、エアロゾルなどの形態、好ましくは、正確な投与量の単独投与に適した単回投与量形態での液体製剤の形態を取ることができる。
【００８３】
用語「単回投与量形態」は、ヒト被験者のための単回用量として適した物理的に別個の単位を指し、各々の単位は、適切な薬学的賦形剤（例えば、アンプル）と一緒に、望ましい徴候、耐性、及び／または、治療効果を生じるように計算された活性物質の所定量を含む。更に、より濃縮された組成物を調製することができ、それから、その後、より希薄な単回用量組成物を製造できる。それ故、より濃縮された組成物は、実質的に、例えば、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、またはそれ以上の量の抱合体または抱合体の組み合せを含むであろう。
【００８４】
このような投与形態を調製するための方法は、当業者に公知である。（参照：例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ＴＨ  ＥＤ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０））。投与される組成物は、本発明のペプチドの量のβ膵島細胞の生存を改善するための薬学的に有効な量を含む。また、本発明のペプチドの薬学的に許容可能な塩（例えば、酸付加塩）は、合成有機化学の当業者に公知の標準的な手法を用いて、調製し、組成物中に含まれてもよく、例えば、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９２）に記載されている。  
【００８５】
別のアプローチにおいて、本発明のポリペプチドをコード化する核酸は、生体外及び生体内での細胞の形質移入のために使用される。これらの核酸は、下記で記載のように、標的細胞、及び生物への形質移入のために公知の多数のベクターのいずれかに挿入できる。核酸は、ベクター及び標的細胞の相互作用を通して、細胞に生体外または生体内で形質移入される。核酸は、プロモーターの制御の元で、本発明のポリペプチドを発現し、それにより低減したインスリン産生に関連した疾病の影響を緩和する。
【００８６】
このような遺伝子治療の手順は、多くの状況における、得られた、及び継承した遺伝子欠損、癌、及び他の疾病を改変するために使用されてきた。ヒトにおいて人工遺伝子を発現する能力は、他の療法による治療に適していない多くの疾病を含む多くの重要なヒト疾病の予防及び／または治癒を促進する。（遺伝子治療手順の総説は以下を参照：Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ，１１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ，１１：１６２−１６６  （１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，９２６−９３２  （１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ，１１：１６７−１７５  （１９９３）；  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ６（１０）：１１４９−１１５４（１９９８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，  ５１（１）：３１−４４  （１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  ＆  Ｂｏｈｍ  ｅｄｓ．，  １９９５）；  ａｎｄ  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１：１３−２６  （１９９４））。  
【００８７】
核酸の送達のために、ウイルスベクターを使用することができる。適切なベクターとしては、例えば、Ｌｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １（４）：３３９−５８（２００１）に記載されているような、単純ヘルペスウイルスベクター；例えば、Ｐｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．（Ｂａｓｅｌ），１０４：１８１−５（２０００）に記載されているような、αウイルスＤＮＡ、及び、粒子レプリコン；例えば、Ｍａｚｄａ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，２（３）：３７９−９２  （２００２）に記載されているような、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）をベースとするプラスミドベクター；例えば、Ｏｔｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．，３（４）：３４５−５２  （２００１）に記載されているような、ＥＢＶレプリコンベクターシステム；例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９９（１８）：１１８５４（２００２）に記載されているような、アカゲザルからのアデノウイルス関連ウイルス；例えば、Ｎｉｃｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，２（３）：２７３−９３（２００２）に記載されているような、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスベクターを含む。他の適切なアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系は、当該分野で周知の技術を用いて容易に構築することができる。（参照、例えば、米国特許第５，１７３，４１４；及び５，１３９，９４１；ＰＣＴ出願第ＷＯ９２／０１０７０、及び、ＷＯ９３／０３７６９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，８：３９８８−３９９６  （１９８８）；Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９  （１９９２）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２９（１９９２）；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，５：７９３−８０１（１９９４）；Ｓｈｅｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１：１６５−１６９（１９９４）；及び  Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１８６７−１８７５（１９９４））。更なる好適なベクターとしては、例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，９（９）：７２５−３６（２００２）に記載のような、Ｅ１Ｂ遺伝子減弱複製アデノウイルス、及び、例えば、Ｐａｓｃｕａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０（９）：４４６５−７２（１９９８）に記載のような、非複製性のアデノウイルスベクターを含む。例示的なベクターは、Ｏｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：２８０（１９８３）に開示された通りに構築できる。
【００８８】
幾つかの実施形態において、本発明は、配列番号１をコード化する核酸配列を含む発現ベクターを含有する。幾つかの実施形態において、本発明は、配列番号１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％同一性を有するペプチドをコード化する核酸配列を含む発現ベクターを含有する。幾つかの実施形態において、本発明は、配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％同一性を有するｃＤＮＡを含む発現ベクターを含有する。
【００８９】
Ｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：６８６６−６８６９（１９９３）及びＷａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６０９９−６１０３（１９９２）に記載の、アデノウイルスキメラベクターなどの分子抱合体ベクターは、また、本発明の方法による遺伝子送達のために使用できる。
【００９０】
例示的な一実施形態において、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのために便利で有益なプラットフォームを提供する。本発明のポリペプチドをコード化する選択的ヌクレオチド配列は、ベクター内に挿入し、当該分野で公知の技術を用いてレトロウイルス粒子中に包装される。組換えウイルスは、その後、単離され、そして被験者に送達することができる。適切なベクターは、例えば、Ｓｃｈｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，２（１）：４５−５５（２００２）に記載のように、レンチウイルスベクターを含む。追加の例示的なレトロウイルス系が以下に記載されている（例えば、米国特許第５，２１９，７４０；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７：９８０−９９０  （１９８９）；  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １：５−１４  （１９９０）；Ｓｃａｒｐａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８０：８４９−８５２  （１９９１）；  Ｂｕｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：８０３３−８０３７  （１９９３）；及びＢｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，３：１０２−１０９  （１９９３）。
【００９１】
他の公知のウイルスベースの送達システムは、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８６：３１７−３２１（１９８９）；Ｆｌｅｘｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５６９：８６−１０３（１９８９）；Ｆｌｅｘｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，８：１７−２１（１９９０）；米国特許第４，６０３，１１２、４，７６９，３３０、及び５，０１７，４８７；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７；ＧＢ２，２００，６５１；ＥＰ０，３４５，２４２；ＷＯ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６１６−６２７（１９８８）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｋｏｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ９１：２１５−２１９（１９９４）；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１１４９８−１１５０２（１９９３）；Ｇｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８８：２８３８−２８４８（１９９３）；Ｇｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．，７３：１２０２−１２０７（１９９３）；及び  Ｌｏｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，９（８）：６９２−９（２００２）に記載されている。
【００９２】
治療的及び予防的適用
ある態様において、本発明の組成物は、それを必要とする対象者における疾病または障害の治療または予防のために使用される。本明細書に記載されるＭＯＴＳ３またはＭＯＴＳ３類似体の組成物で治療のために適切な疾病または障害の例は、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病、妊娠糖尿病、前糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、グルコース耐性障害、癌（例えば、乳癌、脳腫瘍、結腸癌、黒色腫、白血病（例えば、ＡＭＬ）、リンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、及び胃癌）、肥満症、及び脂肪肝疾病を含むが、それに限定されない障害を治療すること及び予防することを含むが、それに限定されない。本発明の組成物は、例えば、糖尿病の遺伝的素因を有する個人のために、予防的に使用することができる。
【００９３】
当業者は、本発明のＭＯＴＳ３ペプチド及び類似体が、本明細書に記載の疾病のいずれかの治療または予防のために、他の治療薬と同時投与できることを理解するであろう。同時投与は、例えば、単一の医薬組成物または別々の組成物において、同時であってもよい。本発明の組成物は、また、例えば、独立した投与スケジュールで、他の単数若しくは複数の治療薬とは別に投与することができる。
【実施例】
【００９４】
実施例１
３′ＲＡＣＥ分析により、ＨＮと同様にＭＯＴＳ３が、ポリアデニル化されていることが分かった（図１Ａ）。下記のように最初のスクリーニングの後、ＭＯＴＳ３は、強力な生物学的活性を有すると判断し、そのペプチド配列は、様々な種において十分に保存されている（図１Ｂ）。我々は、ＧＦＰタグ付きＭＯＴＳ３と同様に、細胞培養において、発現ベクター内にＯＲＦをクローン化することにより、内因性で、及び過剰発現したＭＯＴＳ３検出することができる抗ＭＯＴＳ３ポリクローナルウサギ抗体を発生させた（図１Ｃ）。これらの検証抗体を用いて、我々はラットの心臓、肝臓、精巣で類似の分子量のＭＯＴＳ３を，脳内で若干高い分子量のＭＯＴＳ３を検出することができる（図１Ｄ）。発現レベルは、最高のミトコンドリア密度を有する器官の１つである心臓で、最も高いように見える。更に、エチジウムブロミドを用いてミトコンドリアＤＮＡをパージしたrho−Ｏ  ＨｅＬａ細胞は、ＭＯＴＳ３、並びに、チトクロームオキシダーゼＩ及びＩＩ（ＣＯＩおよびＣＯＩＩ）などの他の十分に説明したミトコンドリアをコード化したタンパク質を発現せず、そのミトコンドリア源を確認した（図１Ｅ）。
【００９５】
実施例２
合成ＭＯＴＳ３の外因性処理は、シーホース技術により測定した酸素消費速度（ＯＣＲ）、並びに、（１０％及び１％ＦＢＳ条件下での）ＭＴＴ還元により測定したミトコンドリア依存性の代謝シフトを引き起こす（図２）。合成ペプチドによるＭＯＴＳ３の外因性処理（図３）、並びに、クローニングによる内因性発現（図４）の両方がミトコンドリア活性を阻害した。注目すべきことに、外因性ＭＯＴＳ３の処理は、細胞のＡＴＰレベル及びミトコンドリア活性（ＭＴＴ）を低下させ、それは、同時に、増加したオートファジーにより発生した（図５）。
【００９６】
培地中の残留グルコース濃度により、及び蛍光標識されたグルコース類似体の取込み量により測定されるように、ＭＯＴＳ３の処理は、グルコース取込み量の増加を誘導する（図６Ａ及び図６Ｂ）。期待した通り、乳酸分泌が上昇したグルコース消費の維持により上昇した（図６Ａ）。注目すべきことに、培地中の大半のグルコースが消費されたＭＯＴＳ３処理の９６時間までに、ＡＭＰＫの活性化は、ＭＯＴＳ３処理した細胞において有意に高く（図７）、それは、図５に示すように、細胞のＡＴＰレベルの急激な減少及び増加したオートファジーと一致する（図７）。外因性ＭＯＴＳ３により誘発される障害のある細胞の代謝が、ガラクトース培地ではなく、グルコース培地の元で、低下した細胞増殖や生存に導き（図８）、ガラクトースは、細胞を生存のためにミトコンドリア代謝に依存させる。
【００９７】
クローン発現を形質移入することによる細胞内ＭＯＴＳ３の過剰発現は、また、細胞増殖を遅延させた（図９）。興味深いことに、８日間の外因性ＭＯＴＳ３処理は、老化関連β−ガラクトシダーゼ染色により測定する通り、細胞老化を誘導する（図１０）。
【００９８】
実施例３
マウスにおいては、４日間のＭＯＴＳ３注射（Ｉ.Ｐ.；０．５または５．０ｍｇ／ｋｇ／日）は、食物摂取の有意な変化なしで、有意な体重減少につながった（図１１）。更に、生体外での研究と一致して、試験した両用量において、ＭＯＴＳ３処理後の、肝臓のミトコンドリア呼吸容量が減少した（図１１）。注目すべきことに、ＭＯＴＳ３処理は、大幅に血糖レベルを減少させ（図１２Ａ）、また、インスリンレベルを高め（図１２Ｂ）、細胞培養で観察されたものと同様にグルコース取込みの増加を示唆した（図６）。
【００９９】
実施例４
ＭＯＴＳ−ｃ：肥満を防ぎ、代謝のホメオスタシスを調節するミトコンドリアゲノム内にコード化された新規ペプチド
【０１００】
要約
ミトコンドリアゲノムは、伝統的にミトコンドリアに特異的な遺伝子コードを使用して翻訳された１３タンパク質のみにコード化されることが知られている。これは、最近、ヒューマニン、ミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡの内にコード化されるペプチドの発見でチャレンジされている。ヒューマニンは、生理活性ペプチドを発生させる未発見のミトコンドリア遺伝子が存在する可能性を示唆している（Ｃ．Ｌｅｅ，Ｋ．Ｙｅｎ，Ｐ．Ｃｏｈｅｎ，Ｈｕｍａｎｉｎ：  ａ  ｈａｒｂｉｎｇｅｒ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ？  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：ＴＥＭ，（Ｆｅｂ  ７，２０１３））。ここで、ミトコンドリアの１２Ｓ  ｒＲＮＡ内にコード化される、ＭＯＴＳ−ｃ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｏｐｅｎ−ｒｅａｄｉｎｇ−ｆｒａｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｗｅｌｖｅ  ＳｒＲＮＡ  ｃ）と命名される、新規ペプチドが報告された。ここで、種々の組織及び循環系中に検出されたミトコンドリアの１２Ｓ  ｒＲＮＡ内にコード化される新規ペプチドを報告しており、これは、さまざまな組織および循環内で検出された。ＭＯＴＳ−ｃは、ヌクレオチド、グルコース、ミトコンドリア、及び脂肪酸代謝を調節することにより、代謝ホメオスタシスの重要な調節因子として作用する。注目すべきは、ＭＯＴＳ−ｃは、新規のプリン生合成経路を介して、内因性ＡＩＣＡＲレベルの、＞２０倍の増加を引き起こし、また、ＨＥＫ２９３細胞及びマウスにおける骨格筋において、ＡＭＰＫシグナル伝達を活性化した。マウスにおけるＭＯＴＳ−ｃ処理は、高脂肪食誘発性の体重増加及びインスリン抵抗性を防止する。また、筋肉における年齢依存性インスリン抵抗性と一致するＭＯＴＳ−ｃレベルは、血漿及び筋肉に年齢とともに低下することが見出され、ＭＯＴＳ−ｃ処理は、老マウスのインスリン感受性を十分に回復させる。ＭＯＴＳ−ｃの発見は、ヒューマニンと共に、ＭＯＴＳ−ｃの代謝を含めた重要な細胞プロセスの調整において、ミトコンドリアのために今まで未知の調節する役割を示唆する。我々の発見は、ＭＯＴＳ−ｃを含むミトコンドリア由来のペプチド（ＭＤＰ）が、新たなミトコンドリア生物学を解明できるばかりでなく、また、新規な診断バイオマーカーおよび高齢化と年齢関連の慢性疾病に関連する代謝機能障害を改善するために活用できる治療標的を提供することを示唆する。
【０１０１】
ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡの）の１２Ｓ  ｒＲＮＡの領域内に生理活性ペプチドをコード化する潜在的なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のためのインシリコ検索を行なった。ＭＯＴＳ−ｃは、１６個のアミノ酸ペプチド（図１３ａ）に翻訳する高度に保存された５１ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と同定した（図１７ａ）。このペプチドは、また、幾つかの推定の翻訳後修飾の対象となる（図１７ｂ）。ＭＯＴＳ−ｃの翻訳は、理論的には、ミトコンドリアまたは細胞質のいずれかであるが、ミトコンドリアの遺伝子コードは、タンデム開始／コドン停止をもたらす可能性がある（図１３ａ）。ＭＯＴＳ−ｃは、そのポリアデニル化転写物（図１３ｂ）が、現在、未知のメカニズムにより、ミトコンドリアから送り出されていることを示し、細胞質の翻訳を受けなければならない（Ｙ．Ｎｉｎｏｍｉｙａ，Ｓ．Ｉｃｈｉｎｏｓｅ，Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｏｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  ｚｙｇｏｔｅ．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２，  ｅ１２４１  （２００７）、及び、Ｒ．Ａｍｉｋｕｒａ，Ｍ．  Ｋａｓｈｉｋａｗａ，Ａ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ｔｙｐｅ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ  ｏｕｔｓｉｄｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｉｎ  ｇｅｒｍ  ｐｌａｓｍ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９８，９１３３（Ｊｕｌ  ３１，  ２００１））。
【０１０２】
ＭＯＴＳ−ｃは、また、核ミトコンドリアＤＮＡの転送（ＮＵＭＴ）として知られる現象に基づく核起源のものであり得ることが認識された（Ｍ．Ｒｉｃｃｈｅｔｔｉ，Ｆ．Ｔｅｋａｉａ，Ｂ．Ｄｕｊｏｎ，Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｂｙ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ．ＰＬｏＳ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，Ｅ２７３（Ｓｅｐ，２００４））。ＮＣＢＩヌクレオチド基本局部アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）を使用して、ＮＵＭＴまたはそのペプチド生成物のいずれも、ミトコンドリアＭＯＴＳ−ｃ配列と完全な同一性を有していなかったことが判明した（図１３ｃ）。更にそのミトコンドリアの起源を確認するために、選択的にミトコンドリアＤＮＡ（ρ０）が枯渇されたＨｅＬａ細胞におけるＭＯＴＳ−ｃ発現を測定した。ＨｅＬａ−ρ０細胞において、１２Ｓ  ｒＲＮＡ及びＭＯＴＳ−ｃの両転写物は、ｑＲＴ−ＰＣＲによる検出は不可能であり（図１３ｄ）、ＭＯＴＳ−ｃ特異的抗体を用いたイムノブロット（図１７ｃ）は、ミトコンドリアをコード化したチトクロームオキシダーゼＩ及びＩＩ（ＣＯＩ／ＩＩ）及びＭＯＴＳ−ｃの検出不可能レベルを示したが、しかし、核コード化ＧＡＰＤＨの発現が不変であることを示した（図１３ｅ）。その細胞内分布パターンを研究するために、ＨＥＫ２９３細胞は、ＭＯＴＳ−ｃのために免疫染色し、ミトコンドリアの共局在化を観察した（図１３ｆ；図１７ｄ、１７ｅ）。ＭＯＴＳ−ｃは、マウス及びラットの様々な組織（図１３ｇ）で、並びに、ヒト及び齧歯類の血行中の血漿で（図１３ｈ；図１７ｆ）、注目すべきは、空腹が、特定の代謝的に活性組織（図１３ｉ）で、及び血漿（図１３ｊ）中で、ＭＯＴＳ−ｃの内因性発現を変化させた。
【０１０３】
ＭＯＴＳ−ｃの生物学的役割を解明するために、ＭＯＴＳ−ｃ処理（１０μＭ）の４時間及び７２時間後に、ＨＥＫ２９３細胞に関するマイクロアレイ解析を実施した。主成分分析（ＰＣＡ）は、ＭＯＴＳ−ｃが７２時間までに、明確で包括的な遺伝子発現のプロファイルのシフトを促進することを示した（図１４ａ）。ＭＯＴＳ−ｃで改変された機能的経路の間の違いを、更に、強調するために、７２時間までに著しく明確になったＭＯＴＳ−ｃ処理の後、遺伝子発現が４時間までに著しく変化したことを示すために、遺伝子セットエンリッチメントのパラメトリック解析（ＰＡＧＥ）が採用された（図１４ｂ）。４時間及び７２時間の遺伝子署名の間に適度な重なりが存在し、ＭＯＴＳ−ｃ処理に応答した時間に依存する進行を示唆した（図１４ｃ）。ＭＯＴＳ−ｃが、細胞代謝及び炎症に関与する経路における遺伝子発現に大きな影響を及ぼしたことが判明した（図１４ｄ；図３０）。
【０１０４】
次に、大幅な代謝に及ぼすＭＯＴＳ−ｃの影響は、ＭＯＴＳ−ｃ、または、空の発現クローン（ＭＯＴＳ−ｃ−ＳＴ、及び、ＭＯＴＳ−ｃ−ＥＶ細胞）で安定的に形質移入した、または、２４時間及び７２時間で合成したＭＯＴＳ−ｃ（１０μＭ）で外因的に処理した、いずれか方式でＨＥＫ２９３細胞で、バイアスのないメタボロミックプロファイリングを用いて研究した。３５６個の命名した代謝物の内、１９４個がＭＯＴＳ−ｃ−ＳＴ細胞において有意に変化し、４９個及び１７７個は、それぞれ２４時間及び７２時間で有意に変化したことが見出された（図３１）。興味深いことに、外因性ＭＯＴＳ−ｃ処理の７２時間後、内因性ＡＩＣＡＲ（５−アミノイミダゾール−４−カルボキシアミドリボヌクレオチド）の濃度が（図１８ａ）、＞２０倍増加することを含む、新規なプリン生合成経路が、有意に変化したことが見出した（図１４ｅ、図２０ａ）。メタボロミクスの知見と一致して、マイクロアレイ解析も、ＭＯＴＳ−ｃは、早くて４時間後に後処理することにより、新規なプリン生合成を変化させたことを示した（図１８ｂ）。プリンは、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）から、及び、また、ＮＡＤ＋から誘導されるＡＤＰリボースにより生成されたリボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）から合成される（図１４ｅ）。加速した解糖／ＰＰＰ及びＮＡＤ＋レベルの増加（図１８ａ、１９ｂ）、ＭＯＴＳ−ｃ処理した細胞中のＡＤＰリボース及びＲ５Ｐのレベル低下が検出された。これらのデータは、更に、減少したグルタミン及び上昇したピロリン酸（ＰＰＩ）レベル（図１４ｇ）より判明し、ＭＯＴＣ−ｃが、ＨＥＫ２９３細胞におけるこれらの経路の増加したフラックスを刺激することを示している。ＡＩＣＡＲでのビルドアップは、結果的に、イノシン、アデニルスクシネート、ＡＭＰ、及び、また、アデニン、グアニン及びキサンチンを含むプリンの最終生成物などの下流中間体を、ブロックし、減少させる（図１４ｇ、１８及び２０ａ）。ＭＯＴＳ−ｃは、葉酸代謝を変化させることにより、ＡＩＣＡＲでの蓄積を促進することができる。その下流中間体のＦ−ＡＩＣＡＲに対して、ＡＩＣＡＲのホルミル化を触媒するために必要である５−メチルテトラヒドロ葉酸（５Ｍｅ−ＴＨＦ）の有意な減少が、観察された（図２０ｂ）。実際、従来の報告は、メトトレキサートにより葉酸代謝を阻害することは、細胞内のＡＩＣＡＲレベルを増加させることを示していた（Ｅ．Ｓ．Ｃｈａｎ，Ｂ．Ｎ．Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ−ｈｏｗ  ｄｏｅｓ  ｉｔ  ｒｅａｌｌｙ  ｗｏｒｋ？  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ６，１７５（Ｍａｒ，２０１０））。減損した葉酸代謝、特に５Ｍｅ−ＴＨＦは、また、抗糖尿病薬メトホルミンにより、ＡＭＰＫの活性化の基礎となるメカニズムとして関与する（Ｂ．Ｃｏｒｏｍｉｎａｓ−Ｆａｊａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈａｔ  ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｏｎｅ−ｃａｒｂｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ａ  ｍａｎｎｅｒ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｆｏｌａｔｅ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｄｒｕｇｓ．Ａｇｉｎｇ  ��，４８０（Ｊｕｌ，２０１２））。
【０１０５】
ＡＩＣＡＲは、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ−１）、β酸化のためのミトコンドリアへの脂肪酸の中央搬送機構のアロステリック阻害を軽減する、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）のリン酸化により誘発される不活性化を介して脂肪酸酸化を刺激することが示されるマスターエネルギーレギュレータＡＭＰＫの強力な活性化因子である（Ｇ．Ｈａｓｋｏ，Ｂ．Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４，８５（２０１３））。ＡＩＣＡＲを誘発するＡＭＰＫの活性化は、運動によって達成されるものに匹敵するＧＬＵＴ４転写の上昇により、部分的には、筋肉におけるグルコースの取込みを強化する（Ｇ．Ｒ．Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｂ．Ｅ．Ｋｅｍｐ，ＡＭＰＫ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ８９，１０２５（Ｊｕｌ，２００９））。ＭＯＴＳ−ｃの７２時間処理（１０μＭ）は、ＡＭＰＫα（Ｔｈｒ１７２）及びＡＣＣ（Ｓｅｒ７９）のリン酸化につながり、そして、また、ＣＰＴ−１及びＧＬＵＴ４タンパク質レベル（図１４ｈ）を、時間及び用量依存的手法で増加させる（図１４ｉ）。また、ＭＯＴＳ−ｃが、Ｓｅｒ−４７３でのＡｋｔのリン酸化を促進することが見出された（図１４ｉ）。注目すべきは、ＡＭＰＫの活性化は、低ＡＭＰレベル及び高ＡＤＰ及び高ＡＴＰレベルで観察した（図１９ａ、２０ａ）。増加したＡＴＰは、ＡＴＰ産生に迅速であるが、非効率的な方法で、解糖を強化することに起因するかもしれない（Ｐ．Ｓ．Ｗａｒｄ，Ｃ．Ｂ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ：  ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｈａｌｌｍａｒｋ  ｅｖｅｎ  ｗａｒｂｕｒｇ  ｄｉｄ  ｎｏｔ  ａｎｔｉｃｉｐａｔｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ２１，  ２９７（Ｍａｒ  ２０，２０１２））。これらの知見は、ＭＯＴＳ−ｃがサリチル酸、（Ｋ．Ｈａｓｈｉｇｕｃｈｉ，Ｑ．  Ｍ．Ｚｈａｎｇ−Ａｋｉｙａｍａ，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ５５４，３８３（２００９））、レプチン（Ｔ．Ｏｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ａｓ  ａｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｖｅ  ｔｏｏｌ  ｏｆ  ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  ３４４  ｍａｌｅ  ｒａｔｓ．  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３７，  ５２１  （Ｊｕｎ，２００９））、及びメトホルミン（Ｎ．Ｆｕｊｉｉ，Ｎ．Ｊｅｓｓｅｎ，Ｌ．  Ｊ．Ｇｏｏｄｙｅａｒ，  ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ２９１，Ｅ８６７（Ｎｏｖ，２００６））により達成されるものと同様に、ＡＭＰＫのＡＭＰに独立した活性化を促進することを示唆している。
【０１０６】
次に、グルコース及び脂肪酸代謝及び細胞呼吸に焦点を当て、細胞代謝に及ぼすＭＯＴＳ−ｃの効果を調べた。ＭＯＴＳ−ｃが、増加したグルコース取込み（図１５ａ；図２１ａ、２１ｂ）により反映される解糖及び乳酸産生（図１５ｂ；図２１ａ）を刺激することが見出された。更に、解糖フラックスの増加を支援する細胞内のグルコースレベルは、他の解糖中間体（図１５ｃ、図２２）と共に減少した。ＭＯＴＳ−ｃは、また、他の糖基質の活用を変化させた（図２２）。リアルタイムで解糖速度を直接試験するために、細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を測定した。ＭＯＴＳ−ｃ−ＳＴ細胞が基礎的解糖で高速度を有し、グルコースで刺激した場合、改善した解糖応答を示した（図１５ｄ）。また、オリゴマイシン処理により推定される総解糖能力は、これらの細胞において高かった（図１５ｄ）。細胞内乳酸濃度は、ＭＯＴＳ−ｃ−ＳＴ細胞による過剰産生物が培地中に放出されるとき（図１５ｂ；図２１ａ）、ＭＯＴＳ−ｃ−ＳＴとＭＯＴＳ−ｃ−ＥＶ細胞との間で同一であった（図１５ｃ）。ＭＯＴＳ−ｃ−ＳＴ細胞における観察結果と一致して、質量分析は、ＭＯＴＳ−ｃ処理の２４時間以内に、ＨＥＫ２９３細胞において増加した解糖のさらなる証拠を提供した（図２３ａ）。ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）、解糖の代替ブランチは、新規なプリン生合成のためにＲ５Ｐを提供する。Ｒ５Ｐ含むＰＰＰ中間体のレベル低下は、外因性ＭＯＴＳ−ｃ処理（１０μＭ）の７２時間後に、ＭＯＴＳ−ｃ−ＳＴ細胞、及び、また、ＭＯＴＳ−ｃ−ＥＶ細胞で観察された（図２３ｂ、ｃ）。
【０１０７】
次に、解糖の最終産物は、酸化的リン酸化を通して、更なるエネルギー抽出のために、ミトコンドリアに往復しているので、ミトコンドリア呼吸を測定した。解糖の増加に合わせて、ＭＯＴＳ−ｃ処理は、ＨＥＫ２９３細胞における基礎酸素消費速度（ＯＣＲ）、並びに、最大呼吸容量を低下させた（図１５ｅ）。これは、癌細胞、リンパ球、幹細胞、及び精子を含む、急速に分割する細胞が高いグルコース濃度に応答して、抑制された呼吸を提示する現象である、「クラブトリー効果」と一致している（Ｋ．Ｈ．Ｉｂｓｅｎ，  Ｔｈｅ  Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ｅｆｆｅｃｔ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１，８２９（Ａｕｇ，１９６１）；  Ｔ．Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｍａｒｑｕａｒｄｔ，Ｊ．Ｆｏｋｅｒ，Ａｅｒｏｂｉｃ  ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ２６１，  ７０２  （Ｊｕｎ  ２４，  １９７６）；  ａｎｄ  Ｖ．Ｇｏｇｖａｄｚｅ，Ｓ．  Ｏｒｒｅｎｉｕｓ，Ｂ．Ｚｈｉｖｏｔｏｖｓｋｙ，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ：  ｗｈａｔ  ｉｓ  ｓｏ  ｓｐｅｃｉａｌ  ａｂｏｕｔ  ｔｈｅｍ？  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １８，  １６５  （Ａｐｒ，  ２００８））。電子伝達系の活性低下が、プロトン漏出の減少により示された（Ｍ．Ｊａｓｔｒｏｃｈ，Ａ．Ｓ．Ｄｉｖａｋａｒｕｎｉ，Ｓ．Ｍｏｏｋｅｒｊｅｅ，Ｊ．Ｒ．Ｔｒｅｂｅｒｇ，Ｍ．Ｄ．Ｂｒａｎｄ，  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｏｔｏｎ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｌｅａｋｓ．Ｅｓｓａｙｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７，  ５３  （２０１０））（図１５ｆ）。低下した酸化能力は、外因性ＭＯＴＳ−ｃで処理したＭＯＴＳ−ｃ−ＳＴ細胞及びＨＥＫ２９３細胞におけるＴＣＡサイクルの中間体の消耗と関連していた（図１５ｇ；図２４）。ＨＥＫ２９３細胞におけるＭＯＴＳ−ｃ発現クローンの一過性の形質移入は、また、ＯＣＲを減少させた（図２５）。ミトコンドリアの代謝の減少にかかわらず、ＭＯＴＳ−ｃが、酸化型グルタチオンの減少比率（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）で決定されるとき、細胞の酸化還元ホメオスタシスを混乱させなかったが、しかし、総グルタチオンレベルは、ＭＯＴＳ−ｃ処理７２時間後のＭＯＴＳ−ｃ−ＳＴ細胞、及びＨＥＫ２９３細胞中で減少した（図２６）。ＭＯＴＳ−ｃが解糖フラックスを増加させることにより、またはそれ自体がミトコンドリア代謝を標的とすることにより、ミトコンドリアの呼吸を抑制するかどうかを試験するために、ＨＥＫ２９３細胞を、主炭素源としてのグルコースまたはガラクトースのいずれかを含む培地中で培養した。哺乳動物細胞中で、ガラクトースは、ミトコンドリアにより主に代謝され、エネルギー産生のための酸化的リン酸化に依存してシフトする（Ｌ．Ｄ．Ｍａｒｒｏｑｕｉｎ，  Ｊ．Ｈｙｎｅｓ，Ｊ．Ａ．Ｄｙｋｅｎｓ，Ｊ．Ｄ．Ｊａｍｉｅｓｏｎ，Ｙ．Ｗｉｌｌ，  Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ｅｆｆｅｃｔ：  ｒｅｐｌａｃｉｎｇ  ｍｅｄｉａ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｗｉｔｈ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＨｅｐＧ２  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｍｉ��ｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｏｘｉｃａｎｔｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ９７，５３９（Ｊｕｎ，２００７））。ＭＯＴＳ−ｃが、豊富なグルコースの条件の下で細胞増殖を減少させたが、ガラクトース培地で培養した細胞には影響しなかった。これらのデータは、ＭＯＴＳ−ｃ誘導の呼吸抑制が、増加したグルコース取込みに対して可能性が二次的であることを示唆している（図１５ｈ）。
【０１０８】
脂質代謝も、ＭＯＴＳ−ｃの影響を有意に受けた（図２７ａ）。ＭＯＴＳ−ｃ−ＳＴ細胞は、ＭＯＴＳ−ｃ−ＥＶ細胞と比較して、高レベルのカルニチンシャトル、並びに、カルニチン及びデオキシカルニチン濃度の増加を示した（図１５ｉ）。これらの知見は、また、観察されたが、しかし、外因性ＭＯＴＳ−ｃで処理した細胞では、程度が少なかった（図２７ｂ）。増加したカルニチンシャトルと一致して、ＭＯＴＳ−ｃ−ＳＴ細胞においても（図１５j）、並びに、ＭＯＴＳ−ｃで処理されたＨＥＫ２９３細胞においても（図２７ｃ）、必須脂肪酸の減少レベルを見出した。ミトコンドリアを投入した後、脂肪酸は、潜在的に、及びアセチルＣｏＡを削減抽出するためにβ酸化を受ける。ミリストイルＣｏＡ、初期β−酸化中間体は、ＭＯＴＳ−ｃ−ＳＴ細胞で（図１５ｋ）、並びに、ＭＯＴＳ−ｃ（１０μＭ）で外因的に処理されたＨＥＫ２９３細胞（図２７ｄ）で有意に増加した。更に、他の長鎖脂肪酸が有意に減少し、増加した脂肪酸の活用を示唆している（図２８）。注目すべきは、β−酸化自体は、好気性反応ではなく、増加した脂肪酸酸化が、ＡＩＣＡＲを用いた治療の間、減少した呼吸の元で観察される（Ｌ．Ｄ．Ｍａｒｒｏｑｕｉｎ，Ｊ．Ｈｙｎｅｓ，Ｊ．Ａ．Ｄｙｋｅｎｓ，Ｊ．Ｄ．  Ｊａｍｉｅｓｏｎ，Ｙ．Ｗｉｌｌ，  Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ｅｆｆｅｃｔ：  ｒｅｐｌａｃｉｎｇ  ｍｅｄｉａ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｗｉｔｈ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＨｅｐＧ２  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｏｘｉｃａｎｔｓ．  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ９７，  ５３９  （Ｊｕｎ，  ２００７））  ａｎｄ  ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ  （Ａ．  Ｍａｒｔｉｎ−Ｍｏｎｔａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｈｅａｌｔｈｓｐａｎ  ａｎｄ  ｌｉｆｅｓｐａｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ４，  ２１９２  （Ｊｕｌ  ３１，２０１３））。
【０１０９】
４日間（５ｍｇ／ｋｇ／日；ＢＩＤ）、非近交系ＣＤ−１雄マウスでのＭＯＴＳ−ｃの急性治療は、体重、食物摂取及び血中グルコースレベルの穏やかな減少を引き起こしたが（図２９ａ〜ｃ）、血漿ＩＬ−６及びＴＮＦαの基礎レベル（図１６ａ；図２９ｄ）を有意に低下させ（図１６ａ；図２９ｄ）、それは肥満及びインスリン抵抗に関係がある。（Ｍ．Ｆ．Ｇｒｅｇｏｒ，Ｇ．Ｓ．Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２９，４１５（２０１１））。培養細胞における我々の知見を考慮して、高脂肪食（ＨＦＤ：カロリー６０重量％）を飼育した非近交系ＣＤ−１マウスでの代謝に及ぼすＭＯＴＳ−ｃの影響を試験した（Ｌ．Ａ．Ｓｃｒｏｃｃｈｉ，Ｄ．Ｊ．Ｄｒｕｃｋｅｒ，Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ａ  ｈｉｇｈ  ｆａｔ  ｄｉｅｔ  ｏｎ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  −／−  ｍｉｃｅ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３９，  ３１２７  （Ｊｕｌ，  １９９８）  ａｎｄ  Ｗ．  Ｌ．Ｂｒｅｓｌｉｎ，Ｋ．Ｓｔｒｏｈａｃｋｅｒ，Ｋ．Ｃ．Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｌ．Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，Ｂ．Ｋ．ＭｃＦａｒｌｉｎ，Ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｈｉｇｈ−ｆａｔ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｉｎ  ＣＤ−１  ｍａｌｅ  ｍｉｃｅ．  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｉｍａｌｓ  ４４，  ２３１  （Ｊｕｌ，２０１０））。８週間のＭＯＴＳ−ｃ処理は、通常食で飼育したマウスの体重に影響を及ぼさなかったが、ＨＦＤ−誘発性肥満を著しく防止した（図１６ｂ）。カロリー消費がグループ間で同一であるので、この体重の差は食物摂取に起因していなかった（図２９ｅ〜ｆ）。高脂肪の給餌は、グルコースホメオスタシスを維持するために、末梢インスリン抵抗性を克服するための試みで、高インスリン血症を促進する（Ｍ．Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ  ｉｎ  ＣＤ１  ｍｉｃｅ  ｐｌａｃｅｄ  ｏｎ  ａ  ｈｉｇｈ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｈｉｇｈ  ｆａｔ  ｄｉｅｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３９７，  ５３７  （Ｊｕｌ  ２，  ２０１０））。重要なことに、ＭＯＴＳ−ｃ処理は、高インスリン血症を防止し（図１６ｃ、ｄ）、及び、ＨＦＤで飼育したマウスにおける肝脂質蓄積を改善した（図１６ｅ）。注目すべきは、私たちの生体外研究に沿って、ＭＯＴＳ−ｃは、これらのＨＦＤで飼育したマウスの筋肉におけるＡＭＰＫの活性化及びＧＬＵＴ４の発現を促進した（図１６ｆ）。
【０１１０】
次に、グルコースホメオスタシスに及ぼすＭＯＴＳ−ｃの影響を、一般的に、調査し、肥満傾向のＣ５７ＢＬ／６マウス株を、グルコース耐性試験（ＧＴＴ）を実施することにより試験した。ＭＯＴＳ−ｃ処理したマウスは、迅速なグルコースクリアランスを示し、強化されたインスリン感受性を示唆した（図１６ｇ）。次に、高インスリン正常血糖クランプ試験は、延長した治療期間で起こる体重の変化とは無関係に全身のインスリン感受性に及ぼす、ＭＯＴＳ−ｃでの７日間の治療の効果を定量するために実施した。ＭＯＴＳ−ｃは、インスリン刺激の間に正常血糖を維持するために必要な外因性グルコース注入速度（ＧＩＲ）の約３０％の増加によって反映されるように、全身のインスリン感受性を改善した（図１６ｈ）。インスリンは末梢組織へのグルコース処理を促進し、増加したグルコースの可用性の期間にホメオスタシスを維持するために、肝グルコース産生（ＨＧＰ）を抑制する（Ｃ．Ｒ．Ｋａｈｎ，Ｂａｎｔｉｎｇ  Ｌｅｃｔｕｒｅ．Ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｃｔｉｏｎ，  ｄｉａｂｅｔｏｇｅｎｅｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４３，１０６６（Ａｕｇ，  １９９４））。インスリン感受性に関するＭＯＴＳ−ｃの作用の組織特異性を決定するために、トリチウム化グルコースをクランプ間に注入した。ＭＯＴＳ−ｃの処理が、インスリン刺激グルコース処理速度（ＩＳ−ＧＤＲ）を著しく強化したことが観察されたが（図１６ｉ）、肝グルコース産生速度（ＨＧＰ）がグループ間で同等であったので、肝臓インスリン感受性に及ぼすＭＯＴＳ−ｃの効果が全く検出されなかった（図１６ｊ）。インスリン刺激グルコース処理の７０−８５％は、骨格筋にあることを考慮すると、インスリン感受性、グルコースホメオスタシスを強化するためのＭＯＴＳ−ｃの作用は、この組織に仲介され得る。実際、この概念は、ＭＯＴＳ−ｃ処理後の強いＡＭＰＫ活性化、及びＨＦＤを与えたマウスの骨格筋における増大したＧＬＵＴ４の発現によって支持されていた（図１６ｆ）。また、ＭＯＴＳ−ｃは、ヒトインスリンの生理学的用量で生体外で刺激されたヒラメ筋へのグルコースの取込みを強化した。筋肉内（図１６ｋ）、及び循環系中（図１６ｌ）の、ＭＯＴＳ−ｃレベルは、加齢の間、インスリン抵抗性の発症に付随して低下するため（Ｃ．Ｒ．Ｋａｈｎ，Ｂａｎｔｉｎｇ  Ｌｅｃｔｕｒｅ．Ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｃｔｉｏｎ，  ｄｉａｂｅｔｏｇｅｎｅｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４３，  １０６６  （Ａｕｇ，  １９９４））、ＭＯＴＳ−ｃは、中月齢（１２ヶ月）及び若月齢（３ヶ月）の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスのヒラメ筋内へのインスリン刺激グルコース（２−デオキシグルコース）の取得量を測定することにより、インスリン作用における年齢依存性の障害を逆転させ得るかどうかを決定した。インスリン抵抗性の徴候は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは生後１２ヶ月近辺で示し始める（Ｃ．Ｒ．Ｋａｈｎ，Ｂａｎｔｉｎｇ  Ｌｅｃｔｕｒｅ．Ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｃｔｉｏｎ，  ｄｉａｂｅｔｏｇｅｎｅｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４３，１０６６（Ａｕｇ，１９９４））。実際、老齢マウスからの筋肉が多くのインスリン抵抗性を有するが、７日間のＭＯＴＳ−ｃ処理が、若齢動物に匹敵する感度を修復する（図１６ｍ）。
【０１１１】
議論
技術の進歩は、ミトコンドリアＤＮＡの小さなＯＲＦの存在を示唆する、ミトコンドリアの遺伝学の従来の未知の性質を明らかにしてきた。（Ｔ．Ｒ．Ｍｅｒｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ．  Ｃｅｌｌ  １４６，  ６４５  （Ａｕｇ  １９，  ２０１１））。注目すべきは、核ゲノムにおける様々な生理活性を有する小ＯＲＦが、ショウジョウバエで報告されている（Ｅ．Ｇ．Ｍａｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｕｐｔａｋｅ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１，  １１１６  （Ｓｅｐ  ６，  ２０１３）；（Ｊ．Ｓａｖａｒｄ，Ｈ．Ｍａｒｑｕｅｓ−Ｓｏｕｚａ，Ｍ．Ａｒａｎｄａ，  Ｄ．Ｔａｕｔｚ，Ａ  ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ａ  ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｍＲＮＡ  ｔｈａｔ  ｃｏｄｅｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  Ｃｅｌｌ  １２６，  ５５９  （Ａｕｇ  １１，  ２００６））；（Ｔ．Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｓｗｉｔｃｈ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｈａｖｅｎｂａｂｙ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９，  ３３６  （Ｊｕｌ  １６，  ２０１０））；及び（Ｍ．Ｉ．Ｇａｌｉｎｄｏ，Ｊ．Ｉ．Ｐｕｅｙｏ，Ｓ．Ｆｏｕｉｘ，Ｓ．Ａ．Ｂｉｓｈｏｐ，  Ｊ．  Ｐ．  Ｃｏｕｓｏ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｓｈｏｒｔ  ＯＲＦｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｅｆｉｎｅ  ａ  ｎｅｗ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ．  ＰＬｏＳ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ５，  ｅ１０６  （Ｍａｙ，２００７））。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）内に、コード化された因子の潜在的な存在を議論する文献にその証拠がある。例えば、ポリアデニル化ミトコンドリアｒＲＮＡのクローンが、インターフェロン誘導のヒト骨髄芽球細胞から構築されたｃＤＮＡライブラリーの一部として、１９８０年代初期にクローニングされ（Ｊ．Ｖｉｌｌｅｇａｓ，Ｐ．  Ａｒａｙａ，Ｅ．Ｂｕｓｔｏｓ−Ｏｂｒｅｇｏｎ，Ｌ．Ｏ．Ｂｕｒｚｉｏ，  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  １６Ｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｒＲＮＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ８，  ９７７  （Ｎｏｖ，  ２００２））、それはミトコンドリアＤＮＡにコード化された強力なインターフェロン誘導因子であることを示唆している。また、ヒトでは、１６Ｓ  ｒＲＮＡは、ヒトの精子形成細胞の核に局在化していることを発見し（Ｊ．Ｄｕｒｉｅｕｘ，Ｓ．Ｗｏｌｆｆ，Ａ．Ｄｉｌｌｉｎ，Ｔｈｅ  ｃｅｌｌ−ｎｏｎ−ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｃｈａｉｎ−  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ．  Ｃｅｌｌ  １４４，  ７９  （Ｊａｎ  ��，  ２０１１））、一方、ショウジョウバエにおいては、ミトコンドリアｒＲＮＡは、それらが生殖細胞の確立において役割を果たす細胞質中に見出される（Ｒ．Ａｍｉｋｕｒａ，Ｍ．Ｋａｓｈｉｋａｗａ，Ａ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ｔｙｐｅ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ  ｏｕｔｓｉｄｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｉｎ  ｇｅｒｍ  ｐｌａｓｍ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｅｍｂｒｙｏｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９８，９１３３  （Ｊｕｌ  ３１，２００１））。
【０１１２】
特にその翻訳が哺乳動物の遺伝子コードを必要とすることを考慮すると、ＭＯＴＳ−ｃは、ミトコンドリア及び細胞、または骨格筋などの遠隔臓器間の効果的な双方向通信のための適応の産物であり得る。本明細書は、大幅な生理機能を調節する本来のミトコンドリアシグナルの新規クラスとして、ＭＯＴＳ−ｃ、及びヒューマニンを提案するための十分な証拠を提供する（Ｃ．Ｌｅｅ，Ｋ．Ｙｅｎ，Ｐ．Ｃｏｈｅｎ，  Ｈｕｍａｎｉｎ：  ａ  ｈａｒｂｉｎｇｅｒ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ？  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：  ＴＥＭ，（Ｆｅｂ  ７，  ２０１３））。最近の報告では、線虫Ｃ．エレガンスを使用して、神経細胞におけるミトコンドリアの破壊は、腸におけるミトコンドリアの折り畳まれていないタンパク質応答（ＵＰＲ）を引き起こし、寿命を延長することが示され、これはストレスの臓器間の通信を可能にする未確認の循環信号により媒介される効果である（Ｄ．Ｋ．Ｗｏｏ，Ｇ．Ｓ．Ｓｈａｄｅｌ，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｓｔｒｅｓｓ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｒｅｖｉｓｅ  ａｎ  ｏｌｄ  ａｇｉｎｇ  ｔｈｅｏｒｙ．  Ｃｅｌｌ  １４４，  １１  （Ｊａｎ．  ７，  ２０１１）  ａｎｄ  Ｃ．  Ｃｈｅａｄｌｅ，Ｍ．Ｐ．Ｖａｗｔｅｒ，Ｗ．Ｊ．Ｆｒｅｅｄ，Ｋ．Ｇ．Ｂｅｃｋｅｒ，  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ  ｕｓｉｎｇ  Ｚ  ｓｃｏｒｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：ＪＭＤ  ５，  ７３  （Ｍａｙ，  ２００３））。
【０１１３】
ＭＯＴＳ−ｃの作用の特定のメカニズムの詳細がまだ完全に同定されていないが、代謝への影響は、高齢化及び糖尿病、癌、アテローム性動脈硬化症、及び神経変性などの高齢化関連の疾病に大きな影響を与えるかもしれない。ＭＤＰの新興生物学、及びＭＯＴＳ−ｃの作用（図１６ｎ）におけるＡＩＣＡＲ及びＡＭＰＫの新規な関与は、生理学的及び病理学的状態におけるミトコンドリアの役割の理解を拡大する興味深い機会を提供するだけでなく、新規の診断及び治療標的を明確にする。
【０１１４】
方法
細胞培養
ＨＥＫ２９３及びＨｅＬａ細胞は、５％ＣＯ２、３７℃で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、日常的に培養し、ミトコンドリアＤＮＡを欠くρ０細胞を、下記に説明するように、低用量のエチジウムブロミド（ＥｔＢｒ：１００ｎｇ／ｍＬ）でＨｅＬａ細胞を培養することにより生成した（Ｋ．Ｈａｓｈｉｇｕｃｈｉ，Ｑ．Ｍ．Ｚｈａｎｇ−Ａｋｉｙａｍａ，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ５５４，  ３８３  （２００９））。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で、ＭＯＴＳ−ｃ−ＳＴ細胞は、Ｇ４１８（シグマ：５００μＭ）で選択及び維持することにより生成した。
マウス
【０１１５】
全ての動物作業は、南カリフォルニア大学及びカリフォルニア大学ロサンゼルス校の施設内動物管理使用委員会の指針に従って行った。ＭＯＴＳ−ｃ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製、ＵＳＡ）は、すべての生体内実験で腹腔内注射を介して毎日注射した。８週齢のＣＤ−１（ＩＣＲ）マウスは、Ｈａｒｌａｎ社から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入した。マウスは、リサーチダイエット社（カタログ番号：Ｄ１２４９２及びＤ１２４５０Ｊ）から購入した高脂肪食（カロリー６０％）及びそれと調和する対照食で８週間給餌した。ペレットは、週二回代替し、そして体重及び食物消費量を毎日記録した（Ｎ＝１０）。
【０１１６】
クローニング
制限酵素、ＥｃｏＲＩ（５′）及びＸｈｏＩ（３′）を用いた方向性クローニングは、ＭＯＴＳ−ｃ発現クローンを構築するために行った。制限酵素と隣接したＭＯＴＳ−ｃ及びＭＯＴＳ−ｃ−ＨＡのヌクレオチド配列は、合成し、及び５′−リン酸化し（ＩＤＴ、ＵＳＡ）、ハイブリッド化し、及び消化されたｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＵＳＡ）、またはｐｃＤＮＡ−ＩＲＥＳ  ＧＦＰ（ＡＥＣＯＭでＮｉｒ  Ｂａｒｚｉｌａｉからの親切な贈物）と連結する。全ての酵素は、特に指示のない限り、ＮＥＢ社（ＵＳＡ）から購入した。
【０１１７】
免疫細胞化学
カバースリップ上に播種したＨＥＫ２９３細胞は、室温で１５分間、４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定後、細胞を、室温で１０分間、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．２％トリトンＸ−１００で透過処理し、室温で１時間、０．２％トリトンＸ−１００及び１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳでブロックされた。その後、細胞をウサギ抗ＭＯＴＳ−ｃ抗体（１：５０）及びヤギ抗ｈｓｐ６０抗体（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社：ＵＳＡ）で０．２％トリトンＸ−１００及び１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で、４℃、終夜培養した。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞は、更に、アレクサフルオロ４８８接合ロバ抗ウサギＩｇＧ（１：２００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）及びアレクサフルオロ５６８接合ロバ抗ヤギＩｇＧ（１：２００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）で、０．２％トリトンＸ−１００及び１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で、室温で、１時間培養した。核はヘキスト３３２５８（２ｍｇ／ｍｌ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＰＢＳ中、室温で５分間染色した。免疫染色の特異性は、室温で１時間、６９μｇ／ｍｌのＭＯＴＳ−ｃペプチド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、ＵＳＡ）との培養の後、ＭＯＴＳ−ｃ抗体を用いて提示した。カバースリップをＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で取り付け、広範囲のレーザーを用いて、ＥＬＹＲＡ  ＰＳ．１（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製、ドイツ）で観察した。構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）像のために、Ｚスタックセクションは、ＥＬＹＲＡ  ＰＳ．１ソフトウェアを使用して再構築した格子及び画像の５回転で収集した。
【０１１８】
免疫測定法
全体のＭＯＴＳ−ｃペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と接合し、ウサギに注射した。ＩｇＧを精製した血清は、ウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡ用に使用された。循環ＭＯＴＳ−ｃレベルは、ＵＳＣで開発した、室内でサンドイッチしたＥＬＩＳＡにより、血清、血漿、及びＣＳＦから測定した。カスタムウサギ抗ＭＯＴＳ−ｃポリクローナル抗血清は、ＹｅｎＺｙｍ抗体、ＬＬＣで生産された（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ：ＣＡ）。プロテインＡ／Ｇカラムクロマトグラフィー（Ｐｉｅｒｃｅ社製、ロックフォード、ＩＬ）を用いて精製したサブクラスのＩｇＧは、捕捉抗体として使用した。抗ＭＯＴＳ−ｃのＩｇＧはビオチンで標識化し、検出抗体として用いた。内因性ＭＯＴＳ−ｃレベルを測定するために、合成ＭＯＴＳ−ｃ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）は、２５ｐｇ／ｍＬ〜６４００ｐｇ／ｍＬの範囲内標準として使用した。分析の前に、ＭＯＴＳ−ｃは、９０％のアセトニトリル及び１０％、１ＮのＨＣｌで抽出した。簡単に言えば、抽出試薬２００μＬを、１００μＬの血漿に加え、穏やかに混合し、３０分間室温で培養した。混合物を遠心分離し、上清液を除去し、乾燥させた。乾燥した抽出物は、０．５％のＴｗｅｅｎ２０と一緒にリン酸緩衝液２００μＬで再構成し、その後、分析のために使用した。９６個のウェルマイクロタイタープレートは、０．５μｇ／ウェルで捕捉抗体をコーティングし、シェーカー上で室温、４時間培養した。標準、対照または抽出サンプル及び前滴定検出抗体は、適切なウェルに添加し、スーパーブロックバッファー液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の洗浄緩衝液で２回洗浄した後、終夜、培養した。ウェルを３回洗浄した後、ストレプトアビジンＨＲＰを加え、更に、室温で３０分間、培養した。洗浄後、２００μＬ／ウェルのＯＰＤ溶液（過酸化水素基質における１ｍｇ／ｍＬ）を加え、１０〜２０分間培養した。反応を２ＮのＨ２ＳＯ４の添加により停止させ、そして吸光度を４９０ｎｍでプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ社製、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で測定した。アッセイ内及びアッセイ間の係数の変動（ＣＶ）は、１０％未満であった。血漿インスリンレベルは、マウスインスリンアッセイキット（ＭＳＤ社製；カタログ番号Ｋ１１２ＢＺＣ−１）及びＳｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ２４００Ａ（ＭＳＤ社製；ＵＳＡ）を用いて検出した。
【０１１９】
ウェスタンブロッティングのために、タンパク質サンプルは、ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ社、ＵＳＡ）を有する１％のトリトンＸ−１００で調製し、９５℃で、５分間加熱し、４〜２０％勾配のトリスグリシンゲル（ＴＧＸ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、ＵＳＡ）で実施し、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に移し、ターボセミドライトランスファーシステム（Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ；Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いて、９Ｖ、１５〜３０分間操作した。膜を３０分間、５％のＢＳＡでブロックし、４℃で終夜、一次抗体と培養した後、室温で１時間二次ＨＲＰ接合抗体と培養した。化学発光が、強化されたＥＣＬ（ＩＭＭＵＮ−Ｓｔａｒ  ＷｅｓｔｅｒｎＣ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）及びＣｈｅｍｉｄｏｃ  ＸＲＳシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、検出し、画像化した。
【０１２０】
マイクロアレイ
ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社製、Ｖａｌｅｎｃｏａ、ＣＡ）を用いて単離し、その後、ＢＤ−１０３〜０６０３  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＣｈｉｐにハイブリッド形成した。生データは、Ｚ−正規化を、前述の（Ｃ．Ｃｈｅａｄｌｅ，Ｍ．Ｐ．Ｖａｗｔｅｒ，Ｗ．Ｊ．Ｆｒｅｅｄ，  Ｋ．Ｇ．Ｂｅｃｋｅｒ，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ  ｕｓｉｎｇ  Ｚ  ｓｃｏｒｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：ＪＭＤ  ５，７３（Ｍａｙ，２００３））の通りに行なった。サンプルでの全ての検出可能プローブの正規化Ｚスコアで実施した主成分分析は、ＤＩＡＮＥ６．０ソフトウエアを用いて行った（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒｃ．ｎｉａ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｒａｎｃｈｅｓ／ｒｒｂ／ｄｎａ／ｄｉａｎｅ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｐｄｆ）。重要な遺伝子は、ｚ検定：＜０．０５、偽発見率：＜０．３０、並びに、両方向のＺ比：＞１．５及びＡＮＯＶＡ：ｐ値＜０．０５より選択した。遺伝子セットエンリッチメントのパラメトリック解析（ＰＡＧＥ）は、（Ｓ．  Ｙ．  Ｋｉｍ，Ｄ．Ｊ．Ｖｏｌｓｋｙ，ＰＡＧＥ：  ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｓｅｔ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ．  ＢＭＣ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ６，  １４４  （２００５））に、上記で記載した通りに分析した。遺伝子調節ネットワーク及び正準経路解析をＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（著作権）（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社；Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）（Ｎ＝６）を用いて実施した。
【０１２１】
メタボロミクス
ＨＥＫ２９３細胞は、２４及び７２時間、ＭＯＴＳ−ｃ（１０μＭ）または水（ビヒクル）で処理した。また、安定的に検証したＭＯＴＳ−ｃの発現ベクター、または空のベクター（対照群）で形質移入したＨＥＫ２９３細胞を用いた。細胞を、１０％ＦＢＳを補充したフェノールフリーの７ｍＬのＤＭＥＭ中、１０ｃｍの皿で培養した。収集のために、細胞を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、すぐに掻き取り、遠心分離し、上清液を吸引した後に、急速凍結した。冷凍ペレットは、メタボロミクス解析（Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ）のために使用した。非標的代謝プロファイリング測定は、３つの独立したプラットフォームの組み合わせ：塩基種に対して最適化された超高性能液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析（ＵＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ２）；酸性種に対して最適化されたＵＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ２；及びガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）を採用した。サンプルは、以下に記載の通りに、本質的に処理された：（Ｔ．Ｏｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ａｓ  ａｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｖｅ  ｔｏｏｌ  ｏｆ  ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  ３４４  ｍａｌｅ  ｒａｔｓ．  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３７，  ５２１  （Ｊｕｎ，  ２００９）  ａｎｄ  Ａ．  Ｍ．  Ｅｖａｎｓ，  Ｃ．  Ｄ．  ＤｅＨａｖｅｎ，  Ｔ．  Ｂａｒｒｅｔｔ，  Ｍ．  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  Ｅ．  Ｍｉｌｇｒａｍ，  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ，  ｎｏｎｔａｒｇｅｔｅｄ  ｕｌｔｒａｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｉｓｔｒｙ  ８１，  ６６５６  （Ａｕｇ  １５，  ２００９））。細胞は、Ｃｏｖａｒｉｓ社の適用した音響重視のＥシリーズである、組織ディスラプター／ホモジナイザーを用いて、最少量の水で溶解した。ホモジネートから、１００μＬ分のアリコートを、その後の質量分析のために引き取り、そして２５μＬ分を全タンパク質の測定のために用いた（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙ）。自動化液体ハンドラー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＬａｂＳｔａｒ社製、ソルトレイクシティ、ＵＴ）を使用して、抽出効率について報告する４規格を含むメタノールで、タンパク質をホモジネートから沈殿させた。生成した上清液は、３つのプラットフォーム上で分析するために、等しいアリコートに分けた。窒素及び真空乾燥下で乾燥させたアリコートを、その後、２つのＵＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ２分析のため、０．１％ギ酸水溶液（酸性条件）５０μＬで、または、ｐＨ８の６．５ｍＭの重炭酸アンモニウム水溶液５０μＬ（塩基性条件）で再構築し、または、ＧＣ／ＭＳ分析のため、等分量のビストリメチルシリルトリフルオロアセトアミド及び５���トリメチルアミンを有する、アセトニトリル：ジクロロメタン：シクロヘキサン（５：４：１）溶媒混合物を用い、６０℃、１時間で、５０μＬの最終容積に誘導した。更に、最少量の水で３タイプの対照群である：データセットを通した技術複写物として提供される蓄積した実験アリコートから誘導したサンプルアリコート；プロセスブランクとして提供される抽出した水サンプル；及び機器性能のモニタリングを可能とする全ての分析サンプルに加えられる標準液の組み合せを、実験サンプルと合わせて分析した。実験サンプル及び対照群は、プラットフォームの操作日を越えランダム化した。
【０１２２】
ＵＨＬＣ／ＭＳ／ＭＳ２分析のために、アリコートは、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製、Ｍｉｌｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて分離し、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源、及びリニアイオントラップ（ＬＩＴ）質量分析器から成るＬＴＱ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて分析した。ＭＳ機器は、９９〜１０００ｍ／ｚをスキャンし、そして毎秒約６スキャンでの動的排除を用いてＭＳとＭＳ２の間で交互にスキャンした。ＧＣ／ＭＳのための誘導体化されたサンプルは、キャリアガスとしてヘリウムを有する５％フェニルジメチルシリコーンカラム上で、６０℃〜３４０℃の温度勾配で分離し、その後、電子衝撃イオン化及び５０〜７５０原子質量単位のスキャン範囲を有する単位質量解像力で作動する、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｔｒａｃｅ  ＤＳＱ  ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で分析した。
【０１２３】
代謝物は、保持時間、分子量（ｍ／ｚ）、好ましい付加物及びインソース断片、並びに、関連するＭＳスペクトルを含む化学的標準エントリの参照ライブラリと、実験試料中のイオン特性の自動化比較を行うことにより同定し、そして、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ社で開発されたソフトウェアを使用して、品質管理のための目視検査により管理した。（Ｃ．Ｄ．Ｄｅｈａｖｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｅｖａｎｓ，Ｈ．Ｄａｉ，Ｋ．Ａ．Ｌａｗｔｏｎ，  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＣ／ＭＳ  ａｎｄ  ＬＣ／ＭＳ  ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  ｄａｔａ  ｉｎｔｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２，  ９  （２０１０））。
【０１２４】
統計分析及びデータ表示目的のために、任意の欠損値は検出限界未満であると仮定し、これらの値は、化合物の最小値（最小値補完）に帰属した。また、それぞれの値は、サンプルごとの総タンパク質値に正規化した。対数変換データの統計的分析は、自由に利用できるオープンソースソフトウェアパッケージである「Ｒ」（ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）を用いて実施した。スチューデントｔ検定は、実験群間のデータを比較するために実施した。
【０１２５】
グルコース及び乳酸分析
細胞培養培地からの細胞外グルコース及び乳酸は、製造業者の指示（Ｅｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｓ社製、ＵＳＡ）に従い、グルコース及びＤ−乳酸の分析キットを用いて測定した。細胞内のグルコースは、製造業者の指示に従って２−ＮＢＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＵＳＡ）を用いて顕微鏡検査により決定した。
【０１２６】
酸素消費量と細胞外酸性化速度
リアルタイムの酸素消費速度（ＯＣＲ）は、ＸＦ２４／９６細胞外フラックスアナライザー（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて測定した。ＡＴＰの代謝回転および最大呼吸容量は、オリゴマイシン及びＦＣＣＰで細胞を刺激することにより推定した。予備呼吸容量は、「最大呼吸速度／基礎呼吸速度」、「ＡＴＰ代謝回転ＯＣＲ−非ミトコンドリアＯＣＲ（ロテノン／アンチマイシンＡ）」によるプロトン漏洩、及び「１−ＡＴＰ代謝回転ＯＣＲ／基礎呼吸速度」によるカップリング効率により決定した。解糖速度は、細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を用いて決定した。細胞は、最大解糖容量を決定するためにオリゴマイシンで、及び解糖容量を決定するために２−ＤＧで、活性解糖速度を決定するために、グルコースで刺激した。
生体外でのヒラメ筋ストリップのグルコース取込み
【０１２７】
全筋肉の生体外グルコース取込みは、２−デオキシグルコース（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いて、生後１２週齢のマウスで評価し、及び、６０μｌ／ｍｌのヒトインスリン（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）で評価し、前述したものとわずかな変化を示した（Ｖ．Ｒｉｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｙｅｌｏｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８，  １６４５７（Ｓｅｐ  ２７，  ２０１１）  ａｎｄ  Ｃ．Ｅ．ＭｃＣｕｒｄｙ，Ｇ．Ｄ．Ｃａｒｔｅｅ，Ａｋｔ２  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃａｌｏｒｉｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４，１３４９（Ｍａｙ，２００５））。簡単に言うと、ヒラメ筋及びＥＤＬ筋は、慎重に麻酔をかけた動物から切除し、直ちに３５℃、６０μＵ／ｍｌのインスリンあり、またはなしで、完全Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液中、３０分間培養した。筋肉は次に３ｍＣｉ／ｍｌの３Ｈ−２−デオキシグルコース、及び０．０５３ｍＣｉ／ｍｌの１４Ｃ−マンニトールを含有する同じ緩衝液に移し、凍結スナップ前に２０分間培養した。筋肉は、溶解緩衝液中でホモジナイズし、放射能をカウントし、またはウェスタンブロッティングに付した。グルコース取込みは、マンニトールの非特異的な取込みを標準化し、ヒラメ筋のグラムあたりのグルコース取込みのｍｍｏｌを推定した。
【０１２８】
高インスリン−正常血糖クランプ試験
デュアルカテーテルは、外科的に、右頸静脈に入れ、そしてグルコースクランプ研究は、前述のように手術後、３日間で実施した（Ｖ．Ｒｉｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｙｅｌｏｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８，  １６４５７  （Ｓｅｐ  ２７，  ２０１１）；  Ａ．  Ｌ．  Ｈｅｖｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｓｃｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｐａｒｇ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９，  １４９１  （Ｄｅｃ，  ２００３）；  ａｎｄ  Ａ．  Ｌ．  Ｈｅｖｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ＰＰＡＲ  ｇａｍｍａ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｎｏｒｍａｌ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｕｌｌ  ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７，  １６５８  （Ｊｕｎ，  ２００７））。すべての動物は、６時間絶食させ、最終ＭＯＴＳ−ｃの用量は、クランプの前に４時間投与した。動物は意識状態で研究した。基礎グルコース代謝回転は、［３−３Ｈ］Ｄ−グルコース（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）の（５．０μＣｉ／時間、０．１２ｍｌ／時間）の９０分間の一定注入後に決定した。基礎期間の後、グルコース（５０％デキストロース、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、及びインスリン（８ｍＵ／ｋｇ／分）、（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）＋トレーサー（５．０μＣｉ／ｈ）注入を、同時に開始し、グルコースレベルは、可変グルコース注入速度（ＧＩＲ）を用いて、正常血糖でクランプした。定常状態において、トレーサー希釈法により測定された総グルコース処理速度（ＧＤＲ）は、内因性の、または肝グルコース産生の速度（ＨＧＰ）、及び、外因性の（冷却した）グルコース注入速度（ＧＩＲ）の和に等しい。（Ａ．Ｌ．Ｈｅｖｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｓｃｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｐａｒｇ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９，１４９１  （Ｄｅｃ，  ２００３）；Ａ．Ｌ．Ｈｅｖｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ＰＰＡＲ  ｇａｍｍａ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｎｏｒｍａｌ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｕｌｌ  ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７，１６５８  （Ｊｕｎ，  ２００７）；ａｎｄ  Ｒ．  Ｓｔｅｅｌｅ，  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｌｏａｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｆ  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｏｎ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｕｔｐｕｔ．  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８２，  ４２０  （Ｓｅｐ  ２５，１９５９））。総ＧＤＲのインスリン刺激成分（ＩＳ−ＧＤＲ）は、総ＧＤＲマイナス基礎グルコース代謝回転速度に等しい。
グルコース耐性試験（ＧＴＴ）
【０１２９】
血糖値は、グルコメーター（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ、Ａｂｂｏｔｔ社製）を用いて測定した。１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＭＯＴＳ−ｃ（０．５ｍｇ／ｋｇ／日：ＩＰ）で、または、滅菌純水（ビヒクル）で、７日間、毎日、処理した。その後、マウスは、Ｄ−グルコース（１ｇ／ｋｇ；ＩＰ）を注射し、血液を、グルコース注射後、０、１５、３０、６０、９０、及び１２０分で尾から採取した。
【０１３０】
上記で開始した実施例は、当業者に、組成物、システム、および開示の方法の実施形態の生成及び使用方式について、完全な開示及び説明を与えるために提供し、発明者がその開示として見なす範囲を限定する意図はない。当業者に明らかである開示を実施するための上記の様式の改変は、以下の特許請求の範囲内にあることを意図する。明細書で述べた全ての特許、公開情報は、本開示が属する当業者のレベルの指標である。本明細書で引用した全ての参考文献は、各文献が個々にその全体が参照により組み込まれたと同程度に参考として導入される。
【０１３１】
すべての見出しとセクションの指定は、明確かつ参照のみを目的として使用され、決して限定と考えるべきではない。例えば、当業者は、本明細書に記載の本発明の精神及び範囲に応じて適宜異なる見出しやセクションの種々の態様を組み合わせた有用性を認識するであろう。
【０１３２】
明細書に引用される全ての参考文献は、本明細書にその全体が、それぞれ個々の公開情報または特許または特許出願が、具体的かつ個別に全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれることが示された場合と同程度にすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
当業者には明らかなように、多くの改変及び本出願の変更は、その精神及び範囲から逸脱することなく実施できる。本明細書に記載の特定の実施形態及び実施例は、例示としてのみ提供され、そして本開示は、特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲とともに、添付の請求項によってのみ限定されるものである。
【図１】
0006640076.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0006640076.tif 000013
【図１２】
0006640076.tif 000014
【図１３ａ】
0006640076.tif 000015
【図１３ｂ】
0006640076.tif 000016
【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１３ｅ】
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【図１３ｆ】
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【図１３ｇ】
0006640076.tif 000021
【図１３ｈ】
0006640076.tif 000022
【図１３ｉ】
0006640076.tif 000023
【図１３ｊ】
0006640076.tif 000024
【図１４ａ】
0006640076.tif 000025
【図１４ｂ−ｄ】
0006640076.tif 000026
【図１４ｅ】
0006640076.tif 000027
【図１４ｆ−ｇ】
0006640076.tif 000028
【図１４ｈ】
0006640076.tif 000029
【図１４ｉ】
0006640076.tif 000030
【図１５ａ−ｂ】
0006640076.tif 000031
【図１５ｃ】
0006640076.tif 000032
【図１５ｄ】
0006640076.tif 000033
【図１５ｅ−ｆ】
0006640076.tif 000034
【図１５ｇ】
0006640076.tif 000035
【図１５ｈ】
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【図１５ｉ】
0006640076.tif 000037
【図１５ｊ−ｋ】
0006640076.tif 000038
【図１６ａ】
0006640076.tif 000039
【図１６ｂ】
0006640076.tif 000040
【図１６ｃ−ｄ】
0006640076.tif 000041
【図１６ｅ】
0006640076.tif 000042
【図１６ｆ】
0006640076.tif 000043
【図１６ｇ】
0006640076.tif 000044
【図１６ｈ−ｊ】
0006640076.tif 000045
【図１６ｋ】
0006640076.tif 000046
【図１６ｌ】
0006640076.tif 000047
【図１６ｍ】
0006640076.tif 000048
【図１６ｎ】
0006640076.tif 000049
【図１７】
0006640076.tif 000050
【図１８】
0006640076.tif 000051
【図１９】
0006640076.tif 000052
【図２０ａ】
0006640076.tif 000053
【図２０ｂ】
0006640076.tif 000054
【図２１】
0006640076.tif 000055
【図２２】
0006640076.tif 000056
【図２３】
0006640076.tif 000057
【図２４】
0006640076.tif 000058
【図２５】
0006640076.tif 000059
【図２６】
0006640076.tif 000060
【図２７ａ】
0006640076.tif 000061
【図２７ｂ−ｄ】
0006640076.tif 000062
【図２８】
0006640076.tif 000063
【図２９】
0006640076.tif 000064
【図３０】
0006640076.tif 000065
【図３１】
0006640076.tif 000066
【図３２】
0006640076.tif 000067
【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
0006640076.tif 000070
【図３６】
0006640076.tif 000071
【図３７】
0006640076.tif 000072
【図３８】
0006640076.tif 000073
【図３９】
0006640076.tif 000074
【図４０】
0006640076.tif 000075
【図４１】
0006640076.tif 000076
【図４２】
0006640076.tif 000077
【配列表】
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