(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター及びリボソーム結合部位を含む、アラビノース誘導性発現系のための発現エレメントであって、前記リボソーム結合部位が配列番号:01の配列を有し、前記プロモーターの-16領域が配列番号:07の配列を有し、前記発現エレメントが配列番号:08の配列を有するバクテリオファージT7エプシロンエンハンサーエレメントをさらに含んでもよい、前記発現エレメント。
【請求項２】
前記プロモーターの-10領域が配列番号:06の配列を有する、請求項１に記載の発現エレメント。
【請求項３】
前記リボソーム結合部位が、配列番号:02、配列番号:03、配列番号:04又は配列番号:05の配列を有する、請求項１に記載の発現エレメント。
【請求項４】
配列番号:19又は配列番号:21の配列を有する、請求項１に記載の発現エレメント。
【請求項５】
請求項１に記載の発現エレメント、開始コドン、発現されるべき遺伝子及び終止コドンを含む、発現カセット。
【請求項６】
前記発現エレメントのプロモーターの-10領域が配列番号:06の配列を有する、請求項５に記載の発現カセット。
【請求項７】
前記発現エレメントのリボソーム結合部位が、配列番号:02、配列番号:03、配列番号:04又は配列番号:05の配列を有する、請求項５に記載の発現カセット。
【請求項８】
下流配列が、開始コドンと発現されるべき遺伝子との間に配置され、前記下流配列が配列番号:09、配列番号:10、配列番号:11又は配列番号:12の配列を有する、請求項５に記載の発現カセット。
【請求項９】
前記発現エレメントが、配列番号:19又は配列番号:21の配列を有する、請求項５に記載の発現カセット。
【請求項１０】
さらに調節遺伝子を含む、請求項５に記載の発現カセット。
【請求項１１】
前記調節遺伝子がアラビノース誘導性発現系のaraCである、請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項１２】
発現されるべき遺伝子が、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、酵素をコードする遺伝子、抗原をコードする遺伝子、生理学的活性を有するペプチド若しくはタンパク質をコードする遺伝子、又はそれらの組み合わせである、請求項５に記載の発現カセット。
【請求項１３】
請求項５に記載の発現カセット及びマルチクローニング部位を含む、ベクター。
【請求項１４】
前記発現カセットの発現エレメントのプロモーターの-10領域が配列番号:06の配列を有する、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
前記発現カセットの発現エレメントのリボソーム結合部位が、配列番号:02、配列番号:03、配列番号:04又は配列番号:05の配列を有する、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１６】
下流配列が、開始コドンと発現カセットの発現されるべき遺伝子との間に配置され、前記下流配列が配列番号:09、配列番号:10、配列番号:11又は配列番号:12の配列を有する、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１７】
前記発現カセットの発現エレメントが、配列番号:19又は配列番号:21の配列を有する、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１８】
さらに複製開始部位、選別性マーカー、シグナルペプチド、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１９】
前記選別性マーカーが薬剤耐性選別性マーカー、非薬剤耐性選別性マーカー、又はそれらの組み合わせである、請求項１８に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発現エレメント、特にアラビノース誘導性発現系の発現エレメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
発現系は、宿主細胞及び遺伝学系エレメント、例えば転写及び翻訳シグナル、調節因子、遺伝子及びプラスミドから構成される。多様な真核細胞及び原核細胞発現系が樹立され、市販されてもいる。
発現系の中では、大腸菌（Escherichia coli）発現系の研究成果及び開発知見がもっとも多い。大腸菌発現系に関連する遺伝子操作及び発酵のための技術は非常に良好な発展を遂げた。大腸菌による組換えタンパク質生産の利点には、遺伝子を容易に操作できること、大腸菌のインキュベーションが容易なこと、大腸菌は急速に増殖し安価な培地で高密度にインキュベートできること、発現ベクター及び改良宿主（例えばプロテアーゼ欠損株）に多くの選択肢があること、タンパク質発現レベルが高いこと、及び生産時間が短いことが含まれる。
多様な大腸菌発現系（例えばtrc発現系、T7発現系及びpBAD発現系）が利用可能である。これら発現系でとりわけpBAD発現系はアラビノース誘導性発現系であり、前記系は、アラビノース誘導性発現エレメント、遺伝子発現を調節する発現ベクター及び大腸菌宿主細胞から成る。この発現系の利点は、（1）遺伝子発現を厳密に調節して遺伝子発現リークによって引き起こされる毒性を回避できること、（2）誘導物質としてアラビノースを使用するのでコストが低いこと、及び種々のアラビノース濃度によりタンパク質発現を制御できることである。
アラビノース誘導性発現系の上述の利点に照らせば、研究及び商業の両目的のためにより良好な発現エレメントの開発が希求される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の目的の1つは発現エレメント及び前記発現エレメントを含む発現カセットを提供することである。上記発現エレメントは発現されるべき遺伝子の発現レベルを強化し、したがって、本発現エレメントは工業的利用のためにより重要である。
本発明の別の目的はベクターを提供することであり、このベクターは上記発現カセットを含み、アラビノース誘導性発現系で用いられる。したがって、アラビノース誘導性発現系の利用に新規な選択肢が本発明分野で提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前述の目的を達成するために、本発明はアラビノース誘導性発現系の発現エレメントを提供し、前記エレメントは、プロモーター及び以下の要素（配列番号:01の配列を有するリボソーム結合部位又は配列番号:08の配列を有するバクテリオファージT7エプシロンエンハンサーエレメント）の少なくとも1つを含む。
本発明はまた発現カセットを提供し、前記カセットは、上述の発現エレメント、開始コドン、発現されるべき遺伝子、及び終止コドンを含む。
本発明はさらにベクターを提供し、前記ベクターは上述の発現カセット及びマルチクローニング部位を含む。
【０００５】
好ましくは、プロモーターの-10領域は配列番号:06の配列を有する。
好ましくは、プロモーターの-16領域は配列番号:07の配列を有する。
好ましくは、リボソーム結合部位は配列番号:02、配列番号:03、配列番号:04、配列番号:05又はそれらの組み合わせの配列を有する。
好ましくは、発現エレメントは配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21又はそれらの組み合わせの配列を有する。
好ましくは、下流配列は開始コドンと発現されるべき遺伝子との間に配置され、下流配列は配列番号:09、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12又はそれらの組み合わせの配列を有する。
【０００６】
好ましくは、発現カセットはさらに調節遺伝子を含む。好ましくは、調節遺伝子はアラビノース誘導性発現の調節遺伝子araCである。
好ましくは、発現されるべき遺伝子は、緑色蛍光タンパク質に翻訳される遺伝子、酵素の遺伝子、抗原の遺伝子、生理学的活性を有するペプチド及びタンパク質の遺伝子、又はそれらの組み合わせである。
好ましくは、ベクターはさらに複製開始部位、選別性マーカー、シグナルペプチド、又はそれらの組み合わせを含む。
好ましくは、ベクターに含まれる選別性マーカーは薬剤耐性選別性マーカー、非薬剤耐性選別性マーカー、又はそれらの組み合わせである。
要約すれば、本発明は、ベクターを構築するアラビノース誘導性発現系の発現エレメント及び発現カセットを提供する。前記ベクターを関心のある遺伝子の大腸菌による発現のために用いることができ、前記ベクターは発現されるべき遺伝子の発現レベルを強化する効果を有する。したがって、本発明は、遺伝子操作分野におけるまた別の新規な選択肢として新規な発現ベクターを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１−１】本発明の実施例の各発現エレメントの配列比較を示す。
【図１−２】本発明の実施例の各発現エレメントの配列比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
遺伝子操作におけるアラビノース誘導性発現系の利点に照らして、本発明は、アラビノース誘導性発現系のために用いられ、発現されるべき遺伝子の発現レベルの強化に役立つ発現エレメントを提供することを目的とする。本発明の発現エレメントを用いることによって、通常のアラビノース誘導性発現系はより大きな工業的利益を有しうる。
本発明のある特徴は発現エレメントを提供することである。前記発現エレメントは、プロモーター及び以下の要素（リボソーム結合部位又はバクテリオファージT7エプシロンエンハンサーエレメント）の少なくとも1つを含む。
本明細書で用いられる“発現エレメント”という用語は、遺伝子発現に密接に関係する、開始コドンの上流のヌクレオチオド配列を指す。適切な実施態様では、発現エレメントは、プロモーター（-10領域、-16領域、及び/又は-35領域を含む）、リボソーム結合部位、遺伝子発現の調節配列、又はそれらの組み合わせを含む。
また別の実施態様では、プロモーターのタイプを制限することは要求されない。当業者は彼らの必要に応じて適切なプロモーターを選択することができる。好ましい実施態様では、“プロモーター”はaraB遺伝子のプロモーターであり、前記プロモーターは、アラビノース誘導性発現系に適切な発現エレメントを許容する。好ましい実施態様では、プロモーターの-10領域は配列番号:06の配列を有する。別の好ましい実施態様では、発現エレメントに含まれるプロモーターの-16領域は配列番号:07の配列を有する。
【０００９】
本明細書で用いられる“リボソーム結合部位”という用語は、翻訳プロセスの間にリボソームが認識し結合することができる配列を指す。好ましい実施態様では、リボソーム結合部位は配列番号:01の配列を有する。適切な実施態様では、リボソーム結合部位は、配列番号:02、配列番号:03、配列番号:04、配列番号:05又はそれらの組み合わせの配列を有する。本明細書で用いられる“バクテリオファージT7エプシロンエンハンサーエレメント”という用語は、バクテリオファージT7遺伝子10の開始コドンの上流のヌクレオチド配列を指す。適切な実施態様では、バクテリオファージT7エプシロンエンハンサーエレメントは配列番号:08の配列を有する。
本発明の別の特徴は、上述の発現エレメント、開始コドン、発現されるべき遺伝子及び終止コドンを含む発現カセットを提供することである。好ましい実施態様では、下流配列は開始コドンと発現されるべき遺伝子との間に配置され、前記下流配列は、配列番号:09、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12又はそれらの組み合わせの配列を有する。好ましい実施態様では、発現カセットはさらに調節遺伝子を含む。
本明細書で用いられる“調節遺伝子”という用語は、遺伝子発現を制御する調節タンパク質を翻訳することができるDNA配列を指す。適切な実施態様では、調節遺伝子はaraCである。
【００１０】
本明細書に記載される“発現されるべき遺伝子”という用語は使用者の要求により変動しうる。例えば、発現されるべき遺伝子は、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、酵素をコードする遺伝子、抗原をコードする遺伝子、生理学的活性を有するペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子であるが、ただしこれらに限定されない。本明細書に記載される“開始コドン”という用語は翻訳が開始されるmRNAのコドンを指す。適切な実施態様では、開始コドンはATGである。本明細書に記載される“終止コドン”という用語は、翻訳を停止させるコドンを指す。適切な実施態様では、終止コドンはTAA、TAG又はTGAである。
本発明の別の特徴は、上述の発現カセット及びマルチクローニング部位を含むベクターを提供することである。好ましい実施態様では、ベクターはさらに、複製開始部位、選別性マーカー、シグナルペプチド、又はそれらの組み合わせを含む。
適切な実施態様では、マルチクローニング部位は、制限酵素が認識できる少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む。制限酵素には、例えばBamHI、BglII、EcoRI、HindIII、NdeI、PstI、SalI、SpeI、XbaI、XhoI、XmaI、又はそれらの組み合わせが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本明細書で用いられる“選別性マーカー”という用語は、上述のベクターが首尾よく宿主を形質転換したか否かを確認するために用いられる。選別性マーカーは、薬剤耐性選別性マーカー、非薬剤耐性選別性マーカー、又はそれらの組み合わせであるが、ただしこれらに限定されない。
【００１１】
本明細書で用いられる“薬剤耐性選別性マーカー”という用語は、ベクターによる宿主の形質転換が、形質転換体の抗生物質耐性によって確認されることを意味する。例えば、薬剤耐性選別性マーカーはテトラサイクリン耐性遺伝子である。この適切な実施態様では、ベクターにより首尾よく形質転換された宿主（例えば大腸菌）は、テトラサイクリンに対して耐性を有し、テトラサイクリンを含む環境中で生存するであろう。
本明細書で用いられる“非薬剤耐性選別性マーカー”という用語は、ベクターによる宿主の形質転換が形質転換体の抗生物質耐性によって確認されないことを意味する。非薬剤耐性選別性マーカーは、例えばβ-ガラクトシダーゼの核酸配列であるが、ただしこれらに限定されない。β-ガラクトシダーゼの核酸配列が選別性マーカーとして用いられる実施態様では、首尾よく形質転換された宿主細胞は、X-gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド)をガラクトース及び5-ブロモ-4-クロロ-3-ヒドロキシインドールに切断することができる。続いて、後者は偶発的に5,5’-ジブロモ-4,4’-ジクロロ-インジゴにダイマー化する（前記は不溶性で識別可能な青色の物質である）。
【００１２】
好ましい実施態様では、非薬剤耐性選別性マーカーは、栄養要求性変異の補完性遺伝子（例えばチミジレートシンターゼ遺伝子、アミノ酸合成関連遺伝子、炭水化物合成関連遺伝子、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド合成関連遺伝子）及び脂肪酸合成遺伝子fabIである。
【実施例】
【００１３】
［実施例１］
本発明のアラビノース誘導性発現ベクターの構築及び形質転換
本実施例では、原型アラビノース誘導性発現系の発現エレメントを入手し、前記プロモーターの-10領域、前記プロモーターの-16領域、及びリボソーム結合部位（シャイン-ダルガーノ配列；SD）を改変するか、又は追加のバクテリオファージT7エプシロンエンハンサー配列（T7）及び/又は下流配列を付加した。続いて、上述の発現エレメントをpRPSJ-GFPT、pARABM7-GFPT又はpARABM11-GFPに挿入して本発明の発現ベクターを形成した。最後に、強化緑色タンパク質遺伝子をレポーター遺伝子として用い、この遺伝子を大腸菌発現系で発現させた。本実施例で得られた発現エレメントを下記の表1に示す。
【００１４】
表1：本実施例で得られる発現エレメント
0006640226.tif 000002
-10：プロモーターの-10領域
-16：プロモーターの-16領域
SD：リボソーム結合部位
T7：バクテリオファージT7エプシロンエンハンサー配列
No.*：配列番号*
-**-：ヌクレオチド配列
【００１５】
本発明の多様なアラビノース誘導性発現ベクターの構築を以下に示す。
【００１６】
1．原型アラビノース誘導性発現ベクターの構築
大腸菌株ECOS 9-5の染色体を鋳型として用い、さらにAraCF及びAraWRのプライマーの組み合わせ（GATATACATATGTTCACTCCATCCAAAAAAACGGGT：配列番号:46）を用いて、原型アラビノース誘導性発現エレメントの増幅を実施した。50μLのPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）混合物は以下を含む：1X GDP-HiFi PCR緩衝液B、200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP、1μMの増幅プライマー、100ngのECOC 9-5染色体、並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼ。PCR反応条件は以下の通りであった：96℃で5分を1工程；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で1分を35サイクル；68℃で5分を1工程。PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムで回収し、pJET1.2プラスミドにT4 DNAリガーゼで連結し、DNAシーケンシングによって配列が正しいことを確認した後、このプラスミドをpJET-ARABWと命名した。その後、pJET-ARABWをEcoRI及びNdeIで切断し、araC及びaraB-W発現エレメントを含むDNAフラグメントを、Gel-MTMゲル抽出システムキット（GMbiolab, Taiwan）を用いて回収した。このaraC及びaraB-W発現エレメント含有DNAフラグメントを、同じ制限酵素で切断したpRPSJ-GFPTにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記接着生成物で大腸菌ECOS 9-5を形質転換した。形質転換体をコロニーポリメラーゼ連鎖反応でスクリーニングし、DNAシーケンシングのために形質転換体のプラスミドを抽出した。正しい配列を有するプラスミドをpARABW-GFPTと命名した。
【００１７】
2．改変リボソーム結合部位を有する発現ベクターの構築
大腸菌株ECOS 9-5の染色体を鋳型として用い、さらにAraCFをそれぞれAraM1R、AraM2R、AraM3R、AraM4R及びAraM5Rとともに用いて、リボソーム結合部位の配列を改変した。50μLのPCR混合物は以下を含む：1X GDP-HiFi PCR緩衝液B、200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP、1μMの増幅プライマー、100ngのECOC 9-5染色体、並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼ。PCR反応条件は以下の通りであった：96℃で5分を1工程；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で1分を35サイクル；68℃で5分を1工程。PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムで回収し、pJET1.2プラスミドにT4 DNAリガーゼで連結し、DNAシーケンシングによって配列が正しいことを確認した後、全5プラスミドをそれぞれpJET-ARABM1、pJET-ARABM2、pJET-ARABM3、pJET-ARABM4及びpJET-ARABM5と命名した。その後、前記5つのプラスミドをそれぞれEcoRI及びNdeIで切断し、araC及びaraB-M1、araC及びaraB-M2、araC及びaraB-M3、araC及びaraB-M4及びaraC及びaraB-M5発現エレメントを含むDNAフラグメントを、Gel-MTMゲル抽出システムキット（GMbiolab, Taiwan）を用いて回収した。これら5つの発現エレメントを、同じ制限酵素で切断したpRPSJ-GFPTにT4 DNAリガーゼを用いて個々に連結した。前記接着生成物で大腸菌ECOS 9-5を形質転換した。形質転換体をコロニーポリメラーゼ連鎖反応でスクリーニングし、DNAシーケンシングのために形質転換体のプラスミドを抽出した。正しい配列を有するプラスミドをそれぞれpARABM1-GFPT、pARABM2-GFPT、pARABM3-GFPT、pARABM4-GFPT及びpARABM5-GFPTと命名した。
【００１８】
3．改変プロモーター-10領域及びリボソーム結合部位を有する発現ベクターの構築
プラスミドpARABM4-GFPTを鋳型として用い、さらにAraCF/AraM6-2及びAraM6-1/GFPSALIRのプライマー組み合わせをそれぞれ用いて、DNAフラグメントを増幅した。50μLのPCR混合物は以下を含む：1X GDP-HiFi PCR緩衝液B、200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP、1μMの増幅プライマー、100ngのpARABM4-GFPT、並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼ。PCR反応条件は以下の通りであった：96℃で2分を1工程；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で1分を35サイクル；68℃で5分を1工程。PCR反応の後で、予想サイズを有するDNAフラグメントが存在するか否かをアガロースゲル電気泳動によってチェックした。PCR生成物をGel-MTMゲル抽出システムキットで回収した。その後、2つの回収PCR生成物を鋳型として用い、さらにAraCF/GFPSALIRのプライマー組み合わせを用いてDNAフラグメントを増幅した。PCR反応条件は以下の通りであった：98℃で2分を1工程；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で1分を35サイクル；68℃で5分を1工程。この工程の後で、araC及びaraB-M6発現エレメントを含むDNAフラグメントを得た。PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムで回収し、pJET1.2プラスミドにT4 DNAリガーゼで連結し、DNAシーケンシングによって配列が正しいことを確認した後、pJET-ARABM6と命名した。その後、前記プラスミドpJET-ARABM6をEcoRI及びNdeIで切断し、araC及びaraB-M6発現エレメントを含むDNAフラグメントを、Gel-MTMゲル抽出システムキットを用いて回収した。araC及びaraB-M6発現エレメントを含むDNAフラグメントを、同じ制限酵素で切断したpRPSJ-GFPTにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記接着生成物で大腸菌ECOS 9-5を形質転換した。形質転換体をコロニーポリメラーゼ連鎖反応でスクリーニングし、DNAシーケンシングのためにプラスミドを抽出した。正しい配列を有するプラスミドをpARABM6-GFPTと命名した。
【００１９】
4．改変プロモーター-16領域及びリボソーム結合部位を有する発現ベクターの構築
プラスミドpARABM4-GFPTを鋳型として用い、さらにAraCF/AraM7-2及びAraM7-1/GFPSALIRのプライマー組み合わせをそれぞれ用いて、DNAフラグメントを増幅した。50μLのPCR混合物は以下を含む：1X GDP-HiFi PCR緩衝液B、200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP、1μMの増幅プライマー、100ngのpARABM4-GFPT、並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼ。PCR反応条件は以下の通りであった：96℃で2分を1工程；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で1分を35サイクル；68℃で5分を1工程。PCR反応の後で、予想サイズを有するDNAフラグメントが存在するか否かをアガロースゲル電気泳動によってチェックした。PCR生成物をGel-MTMゲル抽出システムキットで回収した。その後、2つの回収PCR生成物を鋳型として用い、さらにAraCF/GFPSALIRのプライマー組み合わせを用いてDNAフラグメントを増幅した。PCR反応条件は以下の通りであった：96℃で2分を1工程；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で1分を35サイクル；68℃で5分を1工程。この工程の後で、araC及びaraB-M7発現エレメントを得た。PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムで回収し、pJET1.2プラスミドにT4 DNAリガーゼで連結し、DNAシーケンシングによって配列が正しいことを確認した後、pJET-ARABM7と命名した。その後、前記プラスミドpJET-ARABM7をEcoRI及びNdeIで切断し、araC及びaraB-M7発現エレメントを含むDNAフラグメントを、Gel-MTMゲル抽出システムキットを用いて回収した。araC及びaraB-M7発現エレメントを含むDNAフラグメントを、同じ制限酵素で切断したpRPSJ-GFPTにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記接着生成物で大腸菌ECOS 9-5を形質転換した。形質転換体をコロニーポリメラーゼ連鎖反応でスクリーニングし、DNAシーケンシングのために形質転換体のプラスミドを抽出した。正しい配列を有するプラスミドをpARABM7-GFPTと命名した。
【００２０】
5．改変リボソーム結合部位及びバクテリオファージT7エプシロンエンハンサー配列を有する発現ベクターの構築
大腸菌株ECOS 9-5の染色体を鋳型として用い、さらにプライマーAraM10Rと組み合わせたプライマーAraCFを用いて、発現エレメントを改変した。50μLのPCR混合物は以下を含む：1X GDP-HiFi PCR緩衝液B、200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP、1μMの増幅プライマー、100ngのECOC 9-5染色体、並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼ。PCR反応条件は以下の通りであった：96℃で5分を1工程；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で1分を35サイクル；68℃で5分を1工程。PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムで回収し、pJET1.2プラスミドにT4 DNAリガーゼで連結し、DNAシーケンシングによって配列が正しいことを確認した後、前記プラスミドをpJET-ARABM10と命名した。その後、前記pJET-ARABM10をEcoRI及びNdeIで切断し、araC及びaraB-M10発現エレメントを含むDNAフラグメントを、Gel-MTMゲル抽出システムキットを用いて回収した。araC及びaraB-M10発現エレメントを含むDNAフラグメントを、同じ制限酵素で切断したpRPSJ-GFPTにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記接着生成物で大腸菌ECOS 9-5を形質転換した。形質転換体をコロニーポリメラーゼ連鎖反応でスクリーニングし、DNAシーケンシングのために形質転換体のプラスミドを抽出した。正しい配列を有するプラスミドをpARABM10-GFPTと命名した。
【００２１】
6．改変プロモーター-16領域、リボソーム結合部位及びバクテリオファージT7エプシロンエンハンサー配列を有する発現ベクターの構築
pARABM7-GFPTを鋳型として用い、さらにAraCF/AraM10Rのプライマー組み合わせを用いて、DNAフラグメントを増幅した。50μLのPCR混合物は以下を含む：1X GDP-HiFi PCR緩衝液B、200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP、1μMの増幅プライマー、100ngのpARABM7-GFPT、並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼ。PCR反応条件は以下の通りであった：96℃で2分を1工程；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で1分を35サイクル；68℃で5分を1工程。PCR反応の後で、予想サイズを有するDNAフラグメントが存在するか否かをアガロースゲル電気泳動によってチェックした。PCR生成物をGel-MTMゲル抽出システムキットで回収し、pJET1.2プラスミドにT4 DNAリガーゼで連結し、DNAシーケンシングによって配列が正しいことを確認した後、このプラスミドをpJET-ARABM11と命名した。その後、pJET-ARABM11をEcoRI及びNdeIで切断し、araC及びaraB-M11発現エレメントを含むDNAフラグメントを、Gel-MTMゲル抽出システムキットを用いて回収した。araC及びaraB-M11発現エレメントを含むDNAフラグメントを、同じ制限酵素で切断したpRPSJ-GFPTにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記接着生成物で大腸菌ECOS 9-5を形質転換した。形質転換体をコロニーポリメラーゼ連鎖反応でスクリーニングし、DNAシーケンシングのために形質転換体のプラスミドを抽出した。正しい配列を有するプラスミドをpARABM11-GFPTと命名した。
【００２２】
7．追加の下流配列を有する発現ベクターの構築
種々の下流配列のためにプライマーを設計し、ポリメラーゼ連鎖反応によってDNA増幅を実施した。プラスミドpARABM7-GFPTを鋳型として用い、さらに種々のプライマー組み合わせを用いてDNAフラグメントを増幅した。50μLのPCR混合物は以下を含む：1X GDP-HiFi PCR緩衝液B、200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP、1μMの増幅プライマー、100ngのpARABM7-GFPT、並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼ。PCR反応条件は以下の通りであった：96℃で2分を1工程；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で30秒を35サイクル；68℃で5分を1工程。PCR反応の後で、予想サイズを有するDNAフラグメントが存在するか否かをアガロースゲル電気泳動によってチェックした。4つのPCR生成物をGel-MTMゲル抽出システムキットで回収し、続いてNdeI及びSalIで切断した。制限酵素で切断したPCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムで回収し、下流配列を含む4つのDNAフラグメント及び緑色蛍光タンパク質遺伝子を、同じ制限酵素で切断したpARABM7-GFPT及びpARABM11-GFPTプラスミドにT4 DNAリガーゼを用いてそれぞれ連結した。前記接着生成物で大腸菌ECOS 9-5を形質転換した。形質転換体をコロニーポリメラーゼ連鎖反応でスクリーニングし、DNAシーケンシングのために形質転換体のプラスミドを抽出した。pARABM7-GFPTに由来する正しい配列を有する得られたプラスミドを、それぞれpARABM7-DS1GFPT、pARABM7-DS2GFPT、pARABM7-DS4GFPT、及びpARABM7-DS5GFPTと命名した。pARABM11-GFPTに由来する正しい配列を有する得られたプラスミドを、それぞれpARABM11-DS1GFPT、pARABM11-DS2GFPT、pARABM11-DS4GFPT、及びpARABM11-DS5GFPTと命名した。
上述の実験手順で用いられたプライマー対は下記の表に列挙される。
【００２３】
表2：本発明で用いられたプライマーの配列
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【００２４】
［実施例２］
本発明のアラビノース誘導性発現ベクターの分析
本実施例では、実施例1で得られたアラビノース誘導性発現ベクターで大腸菌（ECOS 9-5）を形質転換し、タンパク質（GFP）発現を誘導した。続いて蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定して、実施例1の発現エレメントと原型発現エレメントとの間の発現レベルの違いを推定した。
1．アラビノース誘導性発現ベクターによる形質転換体の誘導及び蛍光強度の決定
大腸菌ECOS 9-5形質転換体をテトラサイクリン（25μg/mL）含有培地に接種し、37℃で180rpmの条件下でインキュベートした。一晩のインキュベーション後、前記培養を1：20の比率でテトラサイクリン（25μg/mL）含有LB培地に接種し、37℃で180rpmの条件下でインキュベートした。細菌を分光光度計によりOD600が約0.4まで培養し、タンパク質発現誘導のために0.2%のアラビノースを添加した。誘導4時間後に、細菌細胞を遠心分離（20630ｘg、5分、4℃）によって収集し、続いて1mLのPBS緩衝液で洗浄した。細菌細胞を遠心分離（20630ｘg、5分、4℃）によって収集し、続いて1mLのPBS緩衝液に懸濁した。TECAN INFINITE M200マイクロプレートリーダーを用いて、100μLの細菌培養の吸収を600nmの波長で測定した。サンプルの蛍光強度もまた482nmの励起波長及び512nmの発光波長で測定した。蛍光強度は、単位細胞当たりの蛍光値（蛍光/OD600）として提示される。実験結果は表3及び表4に示される。
【００２５】
表3：原型発現エレメント及び本発明の発現エレメントの発現効率
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【００２６】
表4：種々の発現エレメントの発現効率における種々の下流配列の影響
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【００２７】
改変リボソーム結合部位を有する発現エレメントaraB-M1、araB-M2、araB-M3、araB-M4及びaraB-M5を比較した。実験データによれば、上述の5発現エレメントはいずれも、原型発現エレメントと比較して発現されるべき遺伝子の発現レベルを有意に改善する。これらの発現エレメントの中で、araB-M4を用いて発現される遺伝子の発現レベルは、原型発現エレメントのレベルより2.14倍高かった。
次に、改変-10又は-16領域プロモーターを有するaraB-M6及びaraB-M7発現エレメントをそれぞれ原型発現エレメントと比較した。実験データによれば、araB-M6を用いて発現される遺伝子の発現レベルは原型発現エレメントのレベルよりも3.42倍高く、araB-M7を用いて発現される遺伝子の発現レベルは原型発現エレメントのレベルより2.87倍高い。araB-M6及びaraB-M７発現エレメントのデータは、araB-M4発現エレメントのデータよりもそれぞれ1.6倍及び1.34倍高いことは注目に値する。これは、リボソーム結合部位改変と組み合わせたプロモーター-10又は-16領域改変は累積効果を有することを意味する。
【００２８】
バクテリオファージT7エプシロンエンハンサー配列を有するaraB-M10及びaraB-M4発現エレメントを原型発現エレメントと比較した。araB-M10を用いた発現レベルはaraB-M4を用いた発現レベルより1.07倍高く、原型発現エレメントを用いた発現レベルより2.3倍高いことが注目される。加えて、バクテリオファージT7エプシロンエンハンサー配列を有するaraB-M11及びaraB-M7発現エレメントを原型発現エレメントと比較した。araB-M11を用いた発現レベルはaraB-M7を用いた発現レベルより1.08倍高く、原型発現エレメントを用いた発現レベルより3.11倍高いことが注目される。これらのデータは、バクテリオファージT7エプシロンエンハンサー配列の付加は発現レベルにプラスの効果を有することを示す。
表3に示すように、種々の下流配列（これはそれぞれaraB-M7及びaraB-M11の開始コドンの下流に付加された）によって構築された8つの発現エレメントを原型発現エレメントと比較した。araB-M7-DS4の発現効率はaraB-M7のそれより1.04倍高く、原型発現エレメントのそれより4.07倍高いことが注目される。加えて、他の発現エレメントの発現効率も原型発現エレメントのそれと比較して改善される。
【００２９】
本開示の要旨
本発明は、発現エレメント及び発現カセットを提供し、それらから新規なベクターを確立させる。本発明の発現エレメントは標的遺伝子の発現レベルを強化する効果を有し、したがって工業的に大いに重要である。したがって、本ベクターは遺伝子操作のための新規なツールとして利用される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【配列表】
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