(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記：
ｄａｍ遺伝子中の機能損失型突然変異ならびにｓｉｆＡ、ｓｐｖＢおよびｍｇｔＣからなる群から選択される遺伝子中の少なくとも１つのさらなる機能損失型突然変異を含む、ネズミチフス菌、ゲルトネル菌、ブタコレラ菌、またはサルモネラ・ボビスモルビフィカンス（Ｓ．Ｂｏｖｉｓｍｏｒｂｉｆｉｃａｎｓ）；
ｄａｍ遺伝子中の機能損失型突然変異ならびにｓｐｖＢおよびｍｇｔＣからなる群から選択される遺伝子中に少なくとも１つの機能損失型突然変異を含むサルモネラ・ダブリン；または、
ｄａｍ遺伝子中の機能損失型突然変異ならびにｓｉｆＡおよびｍｇｔＣからなる群から選択される遺伝子中に少なくとも１つのさらなる機能損失型突然変異を含むサルモネラ・ニューポート；
から選択されるサルモネラ属微生物。
【請求項２】
前記機能損失型突然変異が、前記遺伝子中の１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失およ
び／または置換からなる群から選択される、請求項１のサルモネラ属微生物。
【請求項３】
ネズミチフス菌である、請求項１または２に記載のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物。
【請求項４】
前記微生物が、ネズミチフス菌、ゲルトネル菌、ブタコレラ菌、サルモネラ・ニューポート、またはサルモネラ・ボビスモルビフィカンス（Ｓ．Ｂｏｖｉｓｍｏｒｂｉｆｉｃａｎｓ）から選択され、前記少なくとも１つのさらなる機能損失型突然変異が、ｓｉｆＡ遺伝子中に存在する、請求項１又は２に記載のサルモネラ属微生物。
【請求項５】
サルモネラ属微生物に対する対象における免疫応答を誘導するための組成物であって、前記対象における免疫応答を誘発するために十分な量の請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物、およびアジュバント、希釈剤、担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のサルモネラ属微生物の精製培養物。
【請求項７】
凍結乾燥、凍結、または再構成される、請求項６に記載の精製培養物。
【請求項８】
ビルレントサルモネラ属微生物による対象の感染の可能性を予防または低減させるための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物、または請求項６もしくは７に記載の精製培養物を含む組成物であって、前記微生物または精製培養物が、前記対象における免疫応答を誘発するために十分な量で対象に投与される、組成物。
【請求項９】
経口、鼻腔または非経口経路を介して前記微生物または精製培養物が対象に投与される
、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記対象が、ヒト対象である、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記対象が、動物種である、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記対象が、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタおよび家禽からなる群から選択される、
請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ワクチンである、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸内細菌感染に対する保護のための生ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書における任意の従来技術への言及は、この従来技術がいずれの管轄においても共通一般知識の一部を形成すること、または当業者によりこの従来技術が当然に理解を予測され、関連するものとみなされ、および／もしくは従来技術の他の一部と組み合わせられ得ることの肯定でも示唆でもない。
【０００３】
非チフス性サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）は、米国において深刻な最大の食料経由疾患負荷であり、最大の感染、入院および死亡を引き起こし、毎年１０３万人の疾病が報告されている。この疾患に伴う経済的負担は膨大であり、医療コストだけで年間１１０億ドル超に達し、相当の追加コストを食料産業（リコール、訴訟、消費者の信用の低減）、ならびにＮＴＳ発生に応答して国家、地方および連邦公共健康機関が負担する。世界的には、非チフス性サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）は、毎年９３８０万人の症例および１５５，０００人の死者と推定され、サハラ以南のアフリカにおける菌血症の主因として現れており、その致死率は２５％まで達する。
【０００４】
サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に伴う健康および経済的負担は、悪化傾向である。それというのも、長期の抗生物質投与が世界中で広まっている多剤耐性株の出現をもたらしているためであり；例えば、ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＤＴ１０４は、過去２０年間にわたりいくつかの食料経由疾患発生を引き起こしており、獣医学における５つの最も一般的に使用される抗生物質の４つ（テトラサイクリン、β−ラクタム、アミノグリコシド、およびスルホンアミド）に耐性である。これらの多剤耐性株は、より多くの入院および菌血症を伴うことが多く、それらの天然での維持は、地下水を含む環境中で一般に見出される極めて低い抗生物質濃度において生じ得る。さらに、β−ラクタム、フルオロキノリン、およびアミノグリコシドに耐性であるカルバペネム耐性腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の新たなクラスが２００９年に患者から単離され、そのような耐性は、目下、グラム陰性病原体、例として、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）間の広域分布を示している。さらに、「超ビルレント」サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）が家畜に由来する天然微生物集団から近年単離されている（２０１２年）。これらの超ビルレント株は、ほとんどの臨床単離株よりも１００倍高いビルレントを示し、ワクチン接種動物をより多く殺傷し得、エクスビボでの低ビルレント状態への急速なスイッチングに起因して標準的な実験室試験条件下で検出可能でない。まとめると、これらの知見は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）疾患負荷が、現在利用可能な抗生物質により制御困難であるより高いビルレントの多剤耐性株の潜在的な出現により悪化傾向である見解を支持する。
【０００５】
サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）は糞口経路を介して獲得され、炭水化物、リポ多糖（ＬＰＳ）、および鞭毛組成に基づく２５００超の血清型（血清学的バリアント）に下位分類される６つの亜種を含み、亜種のエンテリカ（ｅｎｔｅｒｉｃａ）はヒト病原性単離株の９９％超を含有する。サルモネラ・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）感染は、４つの区別される疾患症候群のいずれか：腸炎／下痢、菌血症、腸チフスおよび慢性無症状保菌をもたらし得る。多くの血清型はヒトおよび動物の両方に感染し、疾患重症度は血清型、株ビルレンスおよび宿主感受性の関数である。
【０００６】
家畜におけるサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）制御の試みは、以下の理由で問題となり続ける：１）ほとんどの家畜感染は亜臨床的である；２）疾患発生は散発性であり、規定の血清型により高頻度で引き起こされるが、多くの血清型は、家畜生産系に固有である；３）環境生残性は、家畜感染のための継続的な保菌体を提供する；４）より高いビルレントであり、ワクチン接種動物を殺傷し得る株バリアントの近年の出現；５）ヒトサルモネラ症患者に由来する一部の株は、動物起源のものと区別される；６）管理および環境イベントは、病原体曝露を増加させ、および／または宿主免疫を低下させ得る。
【０００７】
ワクチン接種は、食料生産鎖の開始時における病原体曝露を低減させる任意の食料安全プランへの持続可能なアプローチを表す［１］。しかしながら、慣用のワクチンにより付与される免疫は、狭い範囲の密接に関連する株に制限され、農場での制御は、多くの病原性血清型に対する保護を誘発するワクチンの開発を要求する［１］。近年の進歩は、改変生サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）交差保護ワクチンの開発をもたらしており、その多くは、抗原産生を支持し、異種抗原の発現に好適でもある包括的な調節ネットワークにおける突然変異を含有する［２〜６］。交差保護ワクチン効力の分子的機序は、完全には明らかでない。関連パラメータは、以下を含み得る：病原性血清型間で共有される複数の抗原の発現；ワクチン誘導免疫抑制の縮小；交差保護エピトープを曝露させるための免疫優性抗原の標的化除去；組換え抗原のＩＩＩ型分泌；および／または免疫応答の刺激向上のためのワクチン弱毒化の遅延（［１、３、７、８］に概説）。
【０００８】
遺伝子中の機能損失型突然変異を保有する改変生弱毒化ネズミチフス菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）は、多様なサルモネラ菌に対する保護の提供に有用であり得る。適用可能な機能損失型突然変異の提供のために考慮することができる遺伝子座の数は、それぞれの遺伝子座における適用可能な突然変異の数と同様に大きい。機能の損失の提供のための遺伝子座の一部の例としては、細菌の接着、侵入、ならびに細胞内および細胞外生存に関与する遺伝子座（例として、代謝プロセスに関与するタンパク質をコードする多くの遺伝子）が挙げられる。ＤＮＡアデニンメチラーゼをコードする遺伝子（ｄａｍ）の一部の突然変異は、多様なサルモネラ菌に対する保護を誘発し得る。これらは、マウス［２、９］、家禽［１０、１１］、ヒツジ［１２］および仔牛［１３〜１５］において改変生ワクチンとして適用する場合、十分忍容されると考えられる。免疫の誘導は急速であり、ワクチンは、低コストおよび家畜集団の低ストレス免疫化のために飲料水を介する送達により投与することができる［１２、１６］。
【０００９】
任意のワクチンの商業的成功は、治療指数、安全性／毒性の比に依存的であり、安全性が、特に、増大したビルレンスに復帰する潜在性を有する改変生ワクチンについて懸念される。一般に、ワクチンは、家畜生産系における商業的使用のための候補としてみなすことができる４つの安全性カテゴリーを満たすべきである。関連安全性表現型は、以下のとおりである：低減したｉ）ワクチン排出；ｉｉ）チャレンジ株排出；ｉｉｉ）全身組織（肝臓／脾臓）中の生残性；およびｉｖ）環境中の生残性。
【００１０】
機能損失型突然変異を含有する弱毒化株の提供において、関連突然変異から生じる改善された安全性プロファイルが、ワクチンの効力をそれが提供する保護に関して減少させないことが重要であることが理解される。最終的に追求することは、免疫化個体における低レベル感染の生残性を減少させず、病原体が免疫化動物から排出され、環境に放出された場合に環境中の免疫原の生残性を増加させない突然変異である。
【００１１】
それぞれの遺伝子座および突然変異に関連する効能および病原性への復帰に関するデータが異なる実験室系から生じることを特に考慮すると、どの機能損失型突然変異が、他のものよりも弱毒化に有用であるかを予測することは困難である。
【００１２】
さらなる複雑性は、少なくとも１つの機能損失型突然変異が消失した場合、病原性表現型への復帰を予防するため、突然変異のための２つ以上の遺伝子座を選択することが望ましいことである。このようなアプローチは、広範な候補遺伝子座のリストからの少なくとも２つの遺伝子座を組み合わせることを要求し、依然として、特定の組合せが復帰の可能性を増加もしくは減少させる可能性が高いか否か、または得られる弱毒化ワクチンの効能を増加もしくは減少させる可能性が高いか否かに関する指針は限定される。
【００１３】
サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）感染に対する保護のための弱毒化生ワクチンが必要とされている。
【００１４】
改善された安全性表現型を有するサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）感染に対する保護のための弱毒化生ワクチンも必要とされている。
【００１５】
動物から排出された場合、環境中での最小の生残性を有し、免疫を誘発する動物中の許容可能なレベルの生残性を保持する、動物からの排出傾向が制限され、またはその傾向を有さない弱毒化生ワクチンが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、上記の問題、制限または必要性の１つ以上を改善またはそれに対処することを探求し、一実施形態において、
−  ＤＮＡアデニンメチラーゼをコードする遺伝子（本明細書ではｄａｍ）中の第１の機能損失型突然変異ならびに
−  ｓｉｆＡ、ｓｐｖＢおよびｍｇｔＣからなる群から選択される遺伝子中の第２の機能損失型突然変異
を含む腸内細菌を提供する。
【００１７】
さらなる実施形態において、
−  上記の腸内細菌；および
−  担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバント
を含むワクチンが提供される。
【００１８】
さらなる実施形態において、上記のワクチンを、細菌性腸疾患または病態を予防または治療すべき個体に提供するステップを含む、細菌性腸疾患または病態を予防または治療する方法が提供される。
【００１９】
さらなる実施形態において、細菌性腸疾患または病態の予防または治療のためのワクチンにおける使用に好適な免疫原のコレクションを生産する方法であって、
−  ｄａｍ中の機能損失型突然変異を有する腸内細菌を提供すること、
−  機能損失型突然変異を、ｓｉｆＡ、ｓｐｖＢおよびｍｇｔＣからなる群から選択される細菌の遺伝子中に導入すること
を含む方法が提供される。
【００２０】
さらなる実施形態において、細菌性腸疾患または病態の予防または治療のためのワクチンにおける使用に好適な免疫原のコレクションを生産する方法であって、
−  ｓｉｆＡ、ｓｐｖＢおよびｍｇｔＣからなる群から選択される機能損失型突然変異を有する腸内細菌を提供すること、
−  機能損失型突然変異を、細菌のｄａｍ遺伝子中に導入すること
を含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】粘膜および全身組織中のコロニー化および生残性についてのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補の評価。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２二重突然変異ワクチン候補（ｄａｍ  ａｒｏＡ［ＭＴ３１３８］、ｄａｍ  ｈｔｒＡ［ＭＴ３１４２］、ｄａｍ  ｍｇｔＣ［ＭＴ３１４６］、ｄａｍ  ｓｉｆＡ［ＭＴ３１５０］、ｄａｍ  ｓｐｉＣ［ＭＴ３１５４］、ｄａｍ  ｓｐｖＢ［ＭＴ３１５８］、ｄａｍ  ｓｓａＶ［ＭＴ３１６２］）または親ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２ワクチン株（ＭＴ３１３４）により経口免疫化した（１０９ＣＦＵ）。経口免疫化から２週間（Ａ）および４週間（Ｂ）後、パイエル板（ＰＰ）、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、肝臓（Ｌ）および脾臓（Ｓ）から回収された細菌を、ＬＢ培地上でコロニー形成単位（ＣＦＵ）について評価した。検出限界：ＰＰ、ＭＬＮ、脾臓＜１００ＣＦＵ；肝臓＜５０ＣＦＵ。
【図２】サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補の同種株効力評価。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２二重突然変異ワクチン候補（ｄａｍ  ａｒｏＡ  ［ＭＴ３１３８］、ｄａｍ  ｈｔｒＡ［ＭＴ３１４２］、ｄａｍ  ｍｇｔＣ［ＭＴ３１４６］、ｄａｍ  ｓｉｆＡ［ＭＴ３１５０］、ｄａｍ  ｓｐｉＣ［ＭＴ３１５４］、ｄａｍ  ｓｐｖＢ［ＭＴ３１５８］、ｄａｍ  ｓｓａＶ［ＭＴ３１６２］）または親ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２ワクチン株（ＭＴ３１３４）により経口免疫化した（１０９  ＣＦＵ）。免疫化から１１週間後、ワクチン接種マウスを２００ＬＤ５０の経口用量の同種株、野生型ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１（χ３７６１）によりチャレンジした。非ワクチン接種対照マウスは、感染後２１日目までに全て死亡した。ロジスティック回帰（Ｇｅｎｓｔａｔ  １５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ［３４］）を使用してビルレントチャレンジを生存したマウスの比率の差を分析した。ワクチン接種は、有意な保護を提供した（Ｐ＜０．０１）。同様の保護が、親ｄａｍワクチンと比較して第２の欠失ｍｇｔＣ、ｓｉｆＡおよびｓｐｖＢを取り込むｄａｍワクチンにより与えられた。ｄａｍワクチンの効力の有意な低減が、第２の欠失ａｒｏＡ、ｈｔｒＡ、ｓｐｉＣおよびｓｓａＶの導入後に観察された（＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図３】サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補の異種交差保護効力評価。ＢＡＬＢ／ｃマウス（コホート当たり１６から２５匹）を、ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２二重突然変異ワクチン候補（ｄａｍ  ｍｇｔＣ［ＭＴ３１４６］、ｄａｍ  ｓｉｆＡ［ＭＴ３１５０］、ｄａｍ  ｓｐｖＢ［ＭＴ３１５８］；１０９ＣＦＵ）により経口免疫化した。免疫化から１１週間後、ワクチン接種マウスを、１００ＬＤ５０の経口用量の家畜産業と臨床関連の異種サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）血清型（サルモネラ・ダブリン（Ｓ．Ｄｕｂｌｉｎ）８８９５［畜牛］、サルモネラ・ボビスモルビフィカンス（Ｓ．Ｂｏｖｉｓｍｏｒｂｉｆｉｃａｎｓ）２２５［ヒツジ］、ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）１３１［ヒツジ］）によりチャレンジした。非ワクチン接種対照マウスは、感染後２１日目までに全て死亡した。ロジスティック回帰（ＧｅｎＳｔａｔ  １５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，［３４］）を使用してビルレントチャレンジを生存したマウスの比率の差を分析した。第２の欠失ｍｇｔＣ、ｓｉｆＡおよびｓｐｖＢを取り込むｄａｍワクチンのそれぞれによるワクチン接種は、評価された同種および異種チャレンジ株に対する有意な保護を提供した（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図４】サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補間のワクチン安全性評価（２−ＡＰ耐性への復帰）。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０５ＣＦＵのネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２二重突然変異ワクチン候補（ｄａｍ  ｍｇｔＣ［ＭＴ３１４６］、ｄａｍ  ｓｉｆＡ［ＭＴ３１５０］、ｄａｍ  ｓｐｖＢ［ＭＴ３１５８］）またはｄａｍ  ＵＫ−１親ワクチン株［ＭＴ３１３４］を腹腔内感染させた。脾臓（Ａ）または肝臓（Ｂ）中の２−ＡＰ感受性（白色四角）または２−ＡＰ耐性（黒色四角）サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）生物の数を、感染後５日目において計数した。０ＣＦＵ値下方の記号は、脾臓および肝臓中の細菌負荷が検出限界未満（＜２５ＣＦＵ）であったマウスの数を表す。親サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍΔ２３２ワクチン株と比較した、ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍ二重突然変異ワクチン生残性（２−ＡＰｓ）および増大したビルレンスへの復帰（２−ＡＰｒ）についての統計的有意性を、分散分析を使用して決定した（＊Ｐ＜０．０５）。
【図５】サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補のワクチン糞便排出評価。ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２二重突然変異ワクチン候補、ｄａｍ  ｍｇｔＣ（ＭＴ３１８３）、ｄａｍ  ｓｉｆＡ（ＭＴ３１８４）、ｄａｍ  ｓｐｖＢ（ＭＴ３１８６）、およびｄａｍ  ＵＫ−１親株（ＭＴ３１８０）のカナマイシン耐性誘導体を使用してＢＡＬＢ／ｃマウスを経口経路によりワクチン接種した（１０９ＣＦＵ）。免疫化後２、４、７、１１、１４、および２１日目に糞便を個々のマウスから回収し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌのＬＢ培地上でＣＦＵ／ｇのためにプレーティングした。親サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍΔ２３２ワクチン株に対するサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重欠失ワクチン候補の糞便排出を、ＲＥＭＬ反復測定分析を使用して分析した。ワクチンおよびワクチン接種後の時間の両方が有意であった（＊Ｐ＜０．０５）。異なる二重欠失ｄａｍワクチン間で糞便排出の有意差は観察されなかった。挙げられた値は、ワクチン接種後のマウスの糞便中のＣＦＵ／ｇのモデル予測平均数である。検出限界は６０ＣＦＵである。
【図６】サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補により免疫化されたマウスにおけるチャレンジ株糞便排出。ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２二重突然変異ワクチン候補、ｄａｍ  ｍｇｔＣ（ＭＴ３１８３）、ｄａｍ  ｓｉｆＡ（ＭＴ３１８４）、ｄａｍ  ｓｐｖＢ（ＭＴ３１８６）、およびｄａｍ  ＵＫ−１親株（ＭＴ３１８０）のカナマイシン耐性誘導体を使用してＢＡＬＢ／ｃマウスを経口経路によりワクチン接種した（１０９ＣＦＵ）。ワクチン株糞便クリアランスは、免疫化から４週間後に達成された。免疫化から１１週間後、ワクチン接種マウスを１００ＬＤ５０の用量の野生型ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１のカナマイシン耐性誘導体（ＭＴ２３１５；１０７ＣＦＵ）によりチャレンジした。免疫化後２、４、７、１１、１４、および２１日目に糞便を個々のマウスから回収し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌのＬＢ培地上でＣＦＵ／ｇのためにプレーティングした。ワクチン接種マウスのチャレンジ後の野生型チャレンジ株の糞便排出を、ＲＥＭＬ反復測定分析を使用して分析した。ワクチンおよびワクチン接種後の時間の両方が有意であり（＊Ｐ＜０．０５）、時間およびワクチン間の有意な相互作用についての傾向が存在した（Ｐ＝０．０７５）。ペアワイズ比較は、ビルレントチャレンジ後の異なる時間における群間の有意差を明らかにし；ａ＝二重欠失ワクチンの排出は、親ｄａｍワクチンの排出よりも有意に小さく；ｂ＝ｄａｍ  ｓｉｆＡおよびｄａｍ  ｓｐｖＢワクチンの排出は、親ｄａｍワクチンの排出よりも小さく、ｄａｍ  ｓｉｆＡ排出は、ｄａｍ  ｍｇｔＣおよびｄａｍ  ｓｐｖＢワクチンの排出よりも有意に小さく；ｃ＝ｄａｍ  ｓｉｆＡおよびｄａｍ  ｓｐｖＢワクチンの排出は、ｄａｍ  ｍｇｔＣおよびｄａｍ  ｓｐｖＢワクチンの排出よりも有意に小さく、ｄａｍ  ｓｐｖＢワクチンの排出は、ｄａｍ  ｍｇｔＣワクチンの排出よりも有意に小さく；ｄ＝ｄａｍ  ｓｉｆＡ、ｄａｍ  ｓｐｖＢおよびｄａｍ  ｍｇｔＣワクチンの排出は、ｄａｍ  ｓｐｖＢワクチンの排出よりも有意に小さかった。挙げられた値は、チャレンジ後の糞便中の野生型チャレンジ株のモデル予測平均ＣＦＵである。検出限界は６０ＣＦＵである。
【図７】サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補の環境ワクチン生残性（脱イオン水）評価。ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２二重突然変異ワクチン候補、ｄａｍ  ｍｇｔＣ（ＭＴ３１８３）、ｄａｍ  ｓｉｆＡ（ＭＴ３１８４）、ｄａｍ  ｓｐｖＢ（ＭＴ３１８６）、およびｄａｍ  ＵＫ−１親株（ＭＴ３１８０）のカナマイシン耐性誘導体を使用して２０ｍｌの脱イオン水を接種した（１０４ＣＦＵ／ｍｌ）。緩いキャップを有する５０ｍｌのコニカルチューブ中で３つ組アッセイを室温において実施した。試料をボルテックスにかけ、示される時点におけるＣＦＵ／ｍｌのために２週間の期間プレーティングした。挙げられた値は平均ＣＦＵ／ｍｌであり、エラーバーは、±標本平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。経時的な水中に存在するＣＦＵ／ｍｌの数を、ＲＥＭＬ反復測定分析を使用して分析した。ワクチン群および時間間の有意な相互作用が観察された（Ｐ＜０．００１）。ペアワイズ比較は、異なる時間における群間の有意差を明らかにした（Ｐ＜０．０５）。ａ＝全てのワクチンは、親ＵＫ−１野生型株よりも低いＣＦＵ／ｍｌを有し；ｂ＝ｄａｍΔ２３２株についてのＣＦＵ／ｍｌは、ｄａｍ  ｍｇｔＣ、ｄａｍ  ｓｉｆＡおよびｄａｍ  ｓｐｖＢ株についてのＣＦＵ／ｍｌよりも有意に小さく；ｃ＝ｄａｍΔ２３２およびｄａｍ  ｓｐｖＢ株についてのＣＦＵ／ｍｌは、ｄａｍ  ｓｉｆＡおよびｄａｍ  ｍｇｔＣ株よりも有意に小さかった。
【図８】サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補の環境ワクチン生残性（ヒツジ糞便）評価。２０ｍｌの脱イオン水を５ｇの乾燥ヒツジ糞便（Ｂａｒｂａｒａ  Ｂｙｒｎｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｄａｖｉｓから寄贈；［３２，３３］）に添加することにより、２０パーセントの糞便乾燥物を生成した。２０％の糞便乾燥物に、ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２二重突然変異ワクチン候補、ｄａｍ  ｍｇｔＣ（ＭＴ３１８３）、ｄａｍ  ｓｉｆＡ（ＭＴ３１８４）、ｄａｍ  ｓｐｖＢ（ＭＴ３１８６）、またはｄａｍ  ＵＫ−１親株（ＭＴ３１８０）のカナマイシン耐性誘導体を接種した（１０４ＣＦＵ／ｍｌ）。緩いキャップを有する５０ｍｌのコニカルチューブ中で３つ組アッセイを室温において実施した。試料をボルテックスにかけ、示される時点におけるＣＦＵ／ｍｌのために２週間の期間プレーティングした。挙げられた値は平均ＣＦＵ／ｍｌであり、エラーバーは、±標本平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。経時的な糞便中に存在するＣＦＵ／ｍｌの数を、ＲＥＭＬ反復測定分析を使用して分析した。ワクチン群および時間間の有意な相互作用が観察された（Ｐ＜０．００１）。ペアワイズ比較は、異なる時間における群間の有意差を明らかにした（Ｐ＜０．０５）。全てのワクチン株についてのＣＦＵ／ｍｌは、１および６日目を除き全ての時点について親ＵＫ−１野生型よりも小さかった。ａ＝ｄａｍ  ｓｉｆＡは、ｄａｍ、ｄａｍ  ｍｇｔＣおよびａｍ  ｓｐｖＢよりも有意に小さく；ｂ＝ｄａｍ  ｓｉｆＡは、ｄａｍおよびｄａｍ  ｍｇｔＣよりも有意に小さく；ｃ＝ｄａｍ  ｓｉｆＡは、ｄａｍ  ｍｇｔＣよりも有意に小さく；ｄ＝ｄａｍ  ｓｐｖＢは、ｄａｍ  ｍｇｔＣよりも有意に小さく；ｅ＝ｄａｍ  ｓｐｖＢは、ｄａｍよりも有意に小さく；ｆ＝ｄａｍ  ｍｇｔＣは、ｄａｍよりも有意に小さかった。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
上記のとおり、腸内細菌疾患、例えば、胃腸炎ならびに下痢、発熱および脱水を特徴とする他の病態は、家畜生産における主要な問題のままである。サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）感染、およびサルモネラ症が主な懸念事項である。今日まで、家畜動物におけるこれらの病態を予防または治療するための試みの全ては、ワクチンの含有もしくは制限される効能または含有される安全性プロファイルのいずれかのため、成功の制限に見舞われてきた。特に、動物から排出され、環境中で生残するワクチンが懸念されてきた。
【００２３】
家畜動物において生残的であり得、それにより免疫を提供するように十分にロバストであり、糞便およびより一般に環境、例えば、フィードロットまたは家畜生産鎖の他の一部中の排出および生残性について制限された潜在性を有する弱毒化細菌を提供することは、困難であった。病原性表現型への復帰を予防するための二重突然変異を提供する必要性は、特に、不活性化のための極めて多数の候補遺伝子が公知である場合、複雑性のレベルを追加する。
【００２４】
本発明者らは、病原性表現型への復帰のより低い可能性、排出のより低い可能性、および環境中の生残性のより低い可能性を有する限り、例えば、改善された安全性プロファイルまたは表現型を有する弱毒化生ワクチン中の生免疫原として有用な腸内細菌を提供する関心を有した。広範な潜在的候補遺伝子座のリストから、本発明者らは、所望の安全性プロファイルを有する一方、広範囲の腸内細菌、特に広範囲のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に対して保護またはそれを治療するための効能を保持する弱毒化生物を提供するためのｄａｍ不活性化株中の機能損失型突然変異を導入するために使用することができる３つの遺伝子座を同定した。
【００２５】
Ａ．定義
「機能損失型突然変異」は、一般に、所与の生物学的プロセスにおける遺伝子の関連機能を完全にまたは部分的に不活性化させる遺伝子の突然変異を指す。目的の特定の機能損失型突然変異は、宿主中の腸内細菌の生活環を遮断する一方、細菌の免疫学的プロファイルを破壊しないものである。
【００２６】
「腸内細菌」は、一般に、腸または消化管の細菌を指す。特に、病原体、例えば、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）およびシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）が挙げられるグラム陰性腸内細菌の大きなファミリーの「腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）」に関心が持たれる。このファミリー中の他の疾患惹起細菌としては、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、およびシトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）が挙げられる。
【００２７】
「サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）」は、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の腸内細菌である。
【００２８】
「ｄａｍ」は、デオキシアデノシンメチラーゼ、ＤＮＡアデニンメチルトランスフェラーゼまたはデオキシアデノシルメチルトランスフェラーゼとしても公知のＤＮＡアデニンメチラーゼをコードする遺伝子を指す。ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｄａｍ遺伝子についてのアクセッション番号の一例は、ＮＣＢＩアクセッション番号：１２５５００７である。この遺伝子についての遺伝子座タグは、ＳＴＭ３４８４である。
【００２９】
「ｓｉｆＡ」は、分泌エフェクタータンパク質ＳｉｆＡをコードする遺伝子を指す。ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｓｉｆＡ遺伝子についてのアクセッション番号の一例は、ＮＣＢＩアクセッション番号１２５２７４２である。この遺伝子についての遺伝子座タグは、ＳＴＭ１２２４である。
【００３０】
「ｓｐｖＢ」は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）プラスミドビルレンスタンパク質Ｂ（ＳｐｖＢ）をコードする遺伝子を指す。ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｓｐｖＢ遺伝子についてのアクセッション番号の一例は、ＮＣＢＩアクセッション番号１２５６１９９である。この遺伝子についての遺伝子座タグは、ＰＳＬＴ０３９である。
【００３１】
「ｍｇｔＣ」は、Ｍｇ（２＋）輸送ＡＴＰアーゼタンパク質Ｃ、ＭｇｔＣをコードする遺伝子を指す。ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｍｇｔＣ遺伝子についてのアクセッション番号の一例は、ＮＣＢＩアクセッション番号１２５５２８８である。この遺伝子についての遺伝子座タグは、ＳＴＭ３７６４である。
【００３２】
例えば、「弱毒化細菌」における「弱毒化」は、一般に、細菌のビルレンスを低減させるが、より緩慢な速度においてまたは異なる条件下ではあるが細菌が複製し得るように依然としてそれを生存（または「生」）させたままとする細菌の改変を指す。弱毒化は感染物質を要し、それが無害または低ビルレントになるようにそれを変化させる。典型的には、弱毒化は、関連細菌の免疫原性を実質的に減少させない。
【００３３】
「ワクチン」は、一般に、免疫原、すなわち、免疫応答を誘発し得る物質を含有する組成物を指す。典型的には、ワクチンは、病原体への曝露時、特に曝露がチャレンジの形態である場合、免疫化、予防または感染、もしくは関連症状の顕在化に対する保護の提供に有用である。ワクチンは、病態の予防または治療に使用することができる。ワクチンは、病原体による感染の可能性を最小化するために使用することができる。
【００３４】
「細菌性腸疾患または病態」は、一般に、腸内細菌による個体の感染から生じる病態を指す。このような病態は、以下の症状：胃炎、脱水、下痢、発熱を含み得る。サルモネラ症は、細菌性腸疾患または病態の一例である。
【００３５】
本明細書において使用される「免疫化」は、一般に、対象の免疫系が免疫原に対して強化されるプロセスを指す。本発明の弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｗ）に対する対象の免疫化における有用性を有し、それにより他の、より高いビルレントのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）血清型による感染を予防する。
【００３６】
本明細書において使用される「遺伝子」は、コード配列およびその調節配列、例えば、プロモーターおよび終結シグナルを指す。
【００３７】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびこの用語の変形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」は、さらなる添加剤も、構成要素も、整数も、ステップも排除するものではない。
【００３８】
本発明者らは、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）遺伝子中の機能損失型突然変異の規定の組合せが、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のビルレントまたは病原性血清型による感染から免疫を付与するための生ワクチンとしての有用性を有するサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の生弱毒化株の生成における特定の利点を提供することを見出した。
【００３９】
具体的には、本発明者らは、ｄａｍ遺伝子中の機能損失型突然変異も有するサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の株中のｓｉｆＡ、ｓｐｖＢまたはｍｇｔＣ遺伝子中の突然変異の導入が、対象に安全に投与することができ、環境中で安全であり、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の異種病原性血清型に対する保護を付与する能力を維持する微生物の生成をもたらすことを見出した。
【００４０】
したがって、本発明は、生弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物であって、ｄａｍ遺伝子中の機能損失型突然変異ならびにｓｉｆＡ、ｓｐｖＢおよびｍｇｔＣからなる群から選択される遺伝子中の少なくとも１つのさらなる機能損失型突然変異を含む微生物を提供する。
【００４１】
特に好ましい実施形態において、本発明による微生物は、ｄａｍ中の機能損失型突然変異およびｓｉｆＡ中のさらなる機能損失型突然変異を有する。この実施形態において、微生物または腸内細菌は、ｓｐｖＢ中でもｍｇｔＣ中でも機能損失型突然変異を有し得ない。
【００４２】
本発明の弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物は、公知の技術により、例えば、標的遺伝子中の１つ以上のヌクレオチドの欠失突然変異誘発、挿入不活性化または置換により調製することができる。当業者は、天然遺伝子産物の発現が何らかの手法で破壊される場合、標的遺伝子が突然変異を必ずしも必要としないことを認識する。例えば、突然変異は、標的遺伝子の上流で、例えば、プロモーターまたは調節領域中で作製することができる。
【００４３】
一実施形態において、ｄａｍ、ｓｉｆＡ、ｍｇｔＣおよびｓｐｖＢ遺伝子中に遺伝子操作された機能損失型突然変異は、インフレーム欠失である。インフレーム欠失の使用は、下流遺伝子の転写が維持されるようなものである。
【００４４】
他の好適な技術としては、突然変異遺伝子および選択マーカーを含む自殺ベクターの使用が挙げられる。自殺ベクターは、コンジュゲーションにより野生型遺伝子配列を担持する（しかし、当業者が認識するとおり、代替遺伝子座における１つ以上の突然変異を含み得る）サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物中に導入される。野生型遺伝子は、相同性組換えを介して突然変異遺伝子により置き換えられ、突然変異された微生物が選択マーカーを使用して同定される。他の好適な技術は、例えば、国際公開第１９９６／１７９５１号パンフレットに記載されている。
【００４５】
当業者は、導入された突然変異が機能損失をもたらしたか否か、または遺伝子機能が損なわれるか否かを容易に決定することもできる。例えば、ｍｇｔＣ遺伝子は、低マグネシウム濃度を有する環境中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の生存に要求される。
【００４６】
ｄａｍ遺伝子およびｓｉｆＡ、ｓｐｖＢまたはｍｇｔＣ遺伝子中のいずれか１つに導入される機能損失型突然変異は、微生物の弱毒化をもたらすのに有効である。
【００４７】
好ましくは、微生物は、腸内細菌、特に、病原性腸内細菌、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ）のメンバーである。
【００４８】
最も好ましくは、微生物は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）である。当業者により、通常、ビルレントまたは病原性であるサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）血清型の任意のメンバーを上記技術を使用して処理して生弱毒化株を生成することができることが認識される。例えば、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物は、広範なサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）亜種エンテリカ（Ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型、例として、限定されるものではないが、血清型のネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ゲルトネル菌（Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ・ダブリン（Ｓ．Ｄｕｂｌｉｎ）、サルモネラ・ニューポート（Ｓ．Ｎｅｗｐｏｒｔ）、ブタコレラ菌（Ｓ．Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、またはサルモネラ・ボビスモルビフィカンス（Ｓ．Ｂｏｖｉｓｍｏｒｂｉｆｉｃａｎｓ）からのものであり得る。特に好ましい実施形態において、機能損失型突然変異は、ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）微生物中に導入される。
【００４９】
さらに、さらなる好ましい実施形態において、弱毒化生微生物は、ｄａｍおよびｓｉｆＡ遺伝子中の両方で機能損失型突然変異を有するネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）である。
【００５０】
本発明者らは、本発明の微生物が、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のビルレント血清型に対して対象を免疫化するため、およびビルレント血清型による感染の可能性を最小化するためのワクチンとしての使用に特に好適であることを見出した。特に、本発明者らは、遺伝子の他の組合せにおける機能損失型突然変異を有するサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）と比較して、ｄａｍ遺伝子中およびｓｉｆＡ、ｓｐｖＢまたはｍｇｔＣ遺伝子中のいずれかで突然変異を有するサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）が、免疫化すべき対象および環境中で改善されたワクチン安全性を示すことを見出した。
【００５１】
したがって、さらなる態様において、本発明は、腸内細菌、好ましくは、病原性細菌、例えば、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に対する対象における免疫応答を誘導するためのワクチン組成物を提供する。ワクチン組成物は、対象における免疫応答を誘発するために十分な量の生弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物および好適な担体または希釈剤を含み、前記生弱毒化生物は、ｄａｍ遺伝子中の機能損失型突然変異ならびにｓｉｆＡ、ｓｐｖＢおよびｍｇｔＣからなる群から選択される遺伝子中の少なくとも１つのさらなる機能損失型突然変異を含む。
【００５２】
特に好ましい実施形態において、ワクチン組成物は、ｄａｍおよびｓｉｆＡ遺伝子中の両方で機能損失型突然変異を含むある量の生弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を含む。
【００５３】
ワクチン組成物を配合するため、弱毒化微生物は、組成物中で任意の好適な賦形剤と一緒に存在し得る。例えば、組成物は、任意の好適なアジュバントを含み得る。さらに、組成物は、種々の投与手段に適合させることができる。好ましい投与経路としては、経口、粘膜（例えば、経鼻）または全身経路（例えば、非経口注射）が挙げられ、ワクチンは、生弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物である。１つの特定の実施形態において、ワクチン組成物は、それを送達すべき対象の飲料水または食料またはフィードロットでの包含のために提供することができる。
【００５４】
ワクチン組成物中に存在する弱毒化微生物の数は、意図されるワクチン組成物の投与経路およびそれが最終的に送達される対象に応じて当業者が容易に決定することができる。
【００５５】
ワクチン組成物中で用いられる特定の好適な担体または希釈剤は、本発明には重要でなく、当分野において慣用のものである。希釈剤の例としては、胃中で胃酸を緩衝するための緩衝液、例えば、スクロースを含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、重炭酸緩衝液（ｐＨ７．０）単独、またはアスコルビン酸、ラクトースおよび場合により、アスパルテームを含有する重炭酸緩衝液（ｐＨ７．０）が挙げられる。担体の例としては、タンパク質、例えば、脱脂粉乳中で見出されるもの；糖、例えば、スクロース；またはポリビニルピロリドンが挙げられる。
【００５６】
本発明者らは、本発明の弱毒化微生物またはそれを含むワクチン組成物の対象への投与が、野生型または病原性血清型による後続の感染に対するその対象における耐性を付与することを見出した。
【００５７】
したがって、さらに、さらなる態様において、本発明は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のビルレント株による感染を予防する方法であって、
−  それが必要とされる対象に：
−  ある量の生弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物であって、ｄａｍ遺伝子中の機能損失型突然変異ならびにｓｉｆＡ、ｓｐｖＢおよびｍｇｔＣからなる群から選択される遺伝子中の少なくとも１つのさらなる機能損失型突然変異を含む微生物または
−  生弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物および好適な担体または希釈剤を含むワクチン組成物であって、前記生弱毒化微生物は、ｄａｍ遺伝子中の機能損失型突然変異ならびにｓｉｆＡ、ｓｐｖＢおよびｍｇｔＣからなる群から選択される遺伝子中の少なくとも１つのさらなる機能損失型突然変異を含むワクチン組成物
を投与することを含み、
−  投与される微生物またはワクチンの量は、対象における免疫応答を誘発するために十分である
方法を提供する。
【００５８】
サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のビルレント株による感染の予防において、本発明はまた、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のビルレント血清型による感染に対して対象を免疫化する方法を提供することが認識される。
【００５９】
本発明の弱毒化微生物およびそれを含むワクチン組成物は、通常、サルモネラ症をもたらすサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のビルレントおよび病原性血清型による感染に対する対象の免疫に好適である。本発明の弱毒化微生物およびそれを含むワクチン組成物は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物による感染に感受性である任意の動物の免疫化に特に好適である。例えば、一部の実施形態において、免疫化することができる対象は、ヒトであり得る。あるいは、免疫化すべき対象は、動物種および家畜であり得る。本発明により免疫化すべき対象の例としては、ブタ、ヒツジ、仔牛、畜牛、シカ、ヤギ、ラクダ、ウマ、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ウズラなどが挙げられる。
【００６０】
弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物またはワクチンの量または数は、当業者が容易に決定することができる。一般に、約１０２ｃｆｕ〜約１０１０ｃｆｕ、好ましくは、約１０５〜約１０１０ｃｆｕの微生物が投与される。免疫化用量は、投与経路により変動する。当業者は、非経口投与される（例えば、静脈内、腹腔内または皮下注射による）ワクチンについての有効な用量は、例えば、飲料水または食料中で経口投与される同様のワクチンよりも少ない可能性が高いことを認識する。
【００６１】
本明細書において使用される「免疫化量」は、弱毒化微生物またはそれを含むワクチンを受ける対象における保護免疫応答を誘導し得る量を意味する。免疫応答は、体液性、粘膜、局所および／または細胞免疫応答であり得る。さらに、当業者が認識するとおり、要求される弱毒化微生物またはワクチンの量は、年齢、体重および免疫化される対象に関する他の因子にも依存する。
【００６２】
当業者は、十分な数の本明細書に記載の生弱毒化微生物を生産するため、微生物を好適な条件において培養することが必要であり得ることを認識する。例えば、意図される微生物の投与経路に応じて、微生物を好気性または嫌気性条件下で培養することが必要であり得る。当業者は、関連培養条件を容易に決定することができる。さらに、十分な数の微生物を培養物中で生産したら（例えば、微生物が対数期増殖に達したら）、培養物を精製して微生物の下流の使用における包含が意図されない培養培地の任意の要素を除去することが望ましいことがある。
【００６３】
したがって、一実施形態において、本発明は、上記の生弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物の精製培養物を提供する。
【００６４】
生弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物を含む培養物は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物に対する対象における免疫応答を誘導するためにそれを下流の用途において、例として、ワクチンとしての使用に、またはワクチン組成物の製造においてそれを使用することができるように精製することができる。
【００６５】
精製培養物は、培養物の意図される下流の用途に応じて凍結乾燥し、凍結し、または再構成することができることが認識される。
【００６６】
本発明のさらなる態様および上記段落に記載の態様のさらなる実施形態は、具体例を挙げ、添付の図面を参照して以下の詳細な説明から明らかになる。
【００６７】
本明細書に開示され、定義される本発明は、挙げられた、または本文もしくは図面から明らかな個々の特徴部の２つ以上の全ての代替的組合せに及ぶことが理解される。これらの異なる組合せの全てが、本発明の種々の代替的態様を構成する。本明細書に引用される全ての特許、特許出願、および刊行物は、それぞれの独立した特許出願、または刊行物が参照により組み込まれることが個別具体的に示されるのと同じ程度で参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００６８】
１．材料および方法
１．１．細菌株および増殖条件
サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）動物単離株は、異なる発生、個々の症例、または臨床検査室へのサーベイランス提出に由来した［３１］。ビルレントネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１を比較のために全ての試験において使用した［１７］。特に記載のない限り、細菌は、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地を含有する３７℃において通気させた静止期培養物に由来した［１８］。抗生物質は、以下の濃度において使用した：カナマイシン（Ｋｎ）、５０μｇ／ｍｌ、アンピシリン（Ａｐ）、５０μｇ／ｍｌ。
【００６９】
１．２．追加の弱毒化突然変異を含むネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｄａｍワクチン候補の構築
ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１Δｄａｍは、標準的な遺伝子プロトコル［２０］を使用して、定義されたｄａｍ配列のインフレーム３００ｂｐ欠失を導入することにより構築した（ｄａｍΔ２３２と称する［１９］）。得られたネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２株（ＭＴ３１３４）は、非機能的ＤＮＡアデニンメチラーゼを欠く株に毒性であるプリン類似体、２−アミノプリン（２−ＡＰ）に感受性であることが示され［２１、２２］、それを親サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍワクチン株として全ての試験に使用した。記載［２０］の自殺ベクターｐＣＶＤ４４２を利用して、第２のビルレンス弱毒化欠失突然変異を親ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２株中に導入し、以下の標的化遺伝子中の定義されたコード配列のインフレーム欠失の構築をもたらした：ｄａｍ  ａｒｏＡ（ＭＴ３１３８；１０５６ｂｐ欠失）；ｄａｍ  ｈｔｒＡ（ＭＴ３１４２；１３４１ｂｐ欠失）；ｄａｍ  ｍｇｔＣ（ＭＴ３１４６；６０６ｂｐ欠失）；ｄａｍ  ｓｉｆＡ（ＭＴ３１５０；８０７ｂｐ欠失）；ｄａｍ  ｓｐｉＣ（ＭＴ３１５４；３０６ｂｐ欠失）；ｄａｍ  ｓｐｖＢ（ＭＴ３１５８；１５６３ｂｐ欠失）；およびｄａｍ  ｓｓａＶ（ＭＴ３１６２；１９５９ｂｐ欠失）。得られた遺伝子構築物は、欠失配列をフランキングするプライマーを使用するＰＣＲにより確認した。
【００７０】
１．３．ビルレンスおよび保護アッセイ
経口および腹腔内致死用量５０（ＬＤ５０）：感染動物の５０％を殺傷するために要求される用量を、経口（胃腸挿管を介して）および腹腔内（ｉ．ｐ．）経路を介して、少なくとも１０匹のマウスを感染させることにより決定した［３０、１９］。サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）試験株および野生型ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）参照株１４０２８を、ＬＢ培地中で一晩増殖させた。０．２ｍｌの０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４  ｐＨ８．１または０．１ｍｌの０．１５ＭのＮａＣｌ（それぞれ経口および腹腔内投与用）中で再懸濁された細菌細胞を使用してマウスを感染させ、それを罹患率および死亡率について感染から３週間後まで毎日試験した。ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１についての経口および腹腔内ＬＤ５０は、それぞれ１０５および＜１０匹の生物である［３０］。６から８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを全てのビルレンス試験において使用した。保護アッセイ。マウスを、１０９ＣＦＵの用量におけるネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｄａｍワクチン株により経口免疫化した［３０、１９］。宿主組織内のワクチン株の生残性に起因する一過的な非特異的交差保護免疫応答を回避するため［２３〜２５］、免疫化マウスは、ワクチン株が免疫化動物の粘膜（パイエル板；腸間膜リンパ節）および全身組織（肝臓；脾臓）からクリアランスされてから４から５週間後までビルレントサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）によりチャレンジしなかった。免疫化から１１週間後、マウスを、１００から２００倍ＬＤ５０と等しい感染用量におけるビルレントサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型により経口チャレンジした。マウスは、罹患率および死亡率についてチャレンジから３週間後までチャレンジ後毎日試験した。
【００７１】
１．４．ワクチンおよびチャレンジ株糞便排出、ならびに脱イオン水およびヒツジ糞便内の生残性を評価するためのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ワクチン候補の抗生物質耐性誘導体の構築
ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２二重突然変異ワクチン候補のカナマイシン耐性（Ｋｎｒ）誘導体を構築してワクチン糞便排出を評価した。ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＭＴ２０５７は、野生型参照株１４０２８のＫｎｒ誘導体であり、それを本来Ｌａｃ−である他のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）から区別するために使用されるＫｎｒをコードするＬａｃ＋ＭｕｄＪ転写融合物を含有する［１９、２６］。ドナー株ＭＴ２０５７上で増殖させたファージＰ２２を使用してカナマイシン耐性のためにレシピエントサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍワクチン候補を形質導入し［１８］、Ｋｎｒネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２二重突然変異ワクチン候補、ｄａｍ  ｍｇｔＣ（ＭＴ３１８３）、ｄａｍ  ｓｉｆＡ（ＭＴ３１８４）、ｄａｍ  ｓｐｖＢ（ＭＴ３１８６）、およびｄａｍ  ＵＫ−１親株（ＭＴ３１８０）を生成した。ワクチン株排出。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、Ｋｎｒネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補を経口経路によりワクチン接種した（１０９ＣＦＵ）。免疫化後２、４、７、１１、１４、および２１日目に糞便を個々のマウスから回収し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌのＬＢ培地上のＣＦＵ／ｇのためにプレーティングした。チャレンジ株排出。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、Ｋｎｒネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補を経口経路によりワクチン接種した（１０９ＣＦＵ）。免疫化から４週間後までにワクチン株糞便クリアランスが生じた。免疫化から１１週間後、ワクチン接種マウスを１００ＬＤ５０の用量のネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１のＫｎｒ誘導体（ＭＴ２３１５；１０７ＣＦＵ）によりチャレンジした。免疫化後２、４、７、１１、１４、および２１日目に糞便を個々のマウスから回収し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌのＬＢ培地上のＣＦＵ／ｇのためにプレーティングした。脱イオン水およびヒツジ糞便内の生残性。２０ｍｌの脱イオン水を５ｇの乾燥ヒツジ糞便（Ｂａｒｂａｒａ  Ｂｙｒｎｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｄａｖｉｓから寄贈；［２７、２８］）に添加することにより、２０パーセントの糞便乾燥物を調製した。脱イオン水（２０ｍｌ）および２０％のヒツジ糞便に、ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２二重突然変異ワクチン候補、ｄａｍ  ｍｇｔＣ（ＭＴ３１８３）、ｄａｍ  ｓｉｆＡ（ＭＴ３１８４）、ｄａｍ  ｓｐｖＢ（ＭＴ３１８６）、またはｄａｍ  ＵＫ−１親株（ＭＴ３１８０）のＫｎｒ誘導体（２×１０５ＣＦＵ）を接種した。緩いキャップを有する５０ｍｌのコニカルチューブ中で３つ組アッセイを室温において実施した。試料をボルテックスにかけ、２週間の期間にわたりＣＦＵのためにプレーティングした。
【００７２】
１．５  統計分析
残差（または制限付き）最尤法（ＲＥＭＬ）分析（Ｇｅｎｓｔａｔ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＶＳＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＵＫ，［３４］）を使用して連続反復測定データを分析した。単変量、反復測定モデルを、変数ＣＦＵについての時間または処理の因子にフィットさせた。ワルドカイ二乗検定を使用して有意な個々の効果およびまたは因子間の有意な相互作用を決定した。任意の非有意項目をモデルから引き、分析を反復した。以下の分析データは、予測モデルに基づく平均として提示する。予測平均は、未処理試料平均ではなくフィットモデルから得られたものである。これは、重要である。それというのも、予測平均は、共通の変数集合に調整された手段を表し、したがって、平均間の妥当な比較を可能とするためである。０．０５未満のＰ値を、統計的に有意であるとみなした。解剖における組織中に存在するＣＦＵの数は、分散分析（ＡＮＯＶＡ，Ｇｅｎｓｔａｔ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＶＳＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＵＫ）を使用して分析した。ＲＥＭＬおよびＡＮＯＶＡを使用して計算された個々の平均間の差は、近似最小有意差（ＬＳＤ）を計算することにより決定した。計算ＬＳＤを超過した平均の差は、有意とみなした。
【００７３】
２項データ（排出［有／無］およびアウトカム［生存／死亡］）は、ロジスティック回帰モデル（Ｇｅｎｓｔａｔ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＶＳＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＵＫ，［３４］）を使用して分析した。ワクチンをモデルにフィットさせた。ワルド統計量を使用して全体の有意性を評価した（Ｐ＜０．０５）。固定効果（ワクチン）の有意性を、参照群に対するｔパラメータ推定により評価した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなした。
【００７４】
１．６．動物倫理に関する記述
全ての動物実験は、実験動物の飼育およびケアのためのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ指針に従って行い、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎｔａ  ＢａｒｂａｒａにおけるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる関連調査および承認後に協会の規程に従って実施した。
【００７５】
２．結果
２．１．第２のビルレンス弱毒化突然変異を含有するサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍワクチン候補の構築
改変生ワクチンの商業的成功は、治療指数、安全性／毒性の比に依存的であり、したがって、第２のビルレンス弱毒化突然変異をネズミチフス菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｄａｍワクチン中に導入してワクチン安全性を改善した。親株ＵＫ−１の抗生物質感受性のｄａｍ欠失誘導体を構築して他の微生物株への抗生物質耐性の潜在的な伝達を排除した（材料および方法）。得られたネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２（ＭＴ３１３４）を、全ての試験に親ワクチンバックグラウンドとして使用した。続いて、第２のビルレンス弱毒化突然変異をネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２中に導入してワクチン安全性を改善した（材料および方法）。これらの突然変異は、細胞内および／または全身生存に関与する遺伝子、例として、ａｒｏＡ（アミノ酸生合成）；ｈｔｒＡ（ストレス応答）；ｍｇｔＣ（マグネシウム輸送）；ｓｉｆＡ、ｓｐｉＣ、ｓｓａＶ（サルモネラ属病原性遺伝子島（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｉｓｌａｎｄ）−２（ＳＰＩ−２）；およびｓｐｖＢ（細胞毒素産生）に標的化させた。続いて、得られたサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補、ｄａｍ  ａｒｏＡ、ｄａｍ  ｈｔｒＡ、ｄａｍ  ｍｇｔＣ、ｄａｍ  ｓｉｆＡ、ｄａｍ  ｓｐｉＣ、ｄａｍ  ｓｐｖＢ、ｄａｍ  ｓｓａＶを、親サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍワクチン株と比較して改善された安全性／効力について評価した。
【００７６】
２．２．粘膜および全身組織中のコロニー化および生残性についてのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補の評価
第２のビルレンス弱毒化突然変異を改変生ワクチン中に導入することの主な懸念は、ワクチンクリアランスの加速の結果としての抗原曝露の低減に起因する効力の損失の潜在性である。したがって、ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２二重突然変異ワクチン候補、ｄａｍ  ａｒｏＡ、ｄａｍ  ｈｔｒＡ、ｄａｍ  ｍｇｔＣ、ｄａｍ  ｓｉｆＡ、ｄａｍ  ｓｐｉＣ、ｄａｍ  ｓｐｖＢ、ｄａｍ  ｓｓａＶを、親ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２ワクチン株において見出されたものと類似するコロニー化および生残性パラメータを維持したものについて試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウスにサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補を経口感染させ（１０９ＣＦＵ）、ワクチン株のコロニー化／生残性を粘膜（パイエル板；腸間膜リンパ節）および全身組織（肝臓および脾臓）中で感染から２および４週間後において評価した（図１）。サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補を２つの群に分類した、クラスＩ：親ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２単一突然変異ワクチン株に対して類似するコロニー化および生残性を示したもの（ｄａｍ  ｍｇｔＣ；ｄａｍ  ｓｉｆＡ；ｄａｍ  ｓｐｖＢ）；ならびにクラスＩＩ：親サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍワクチンにより示されるものに対するコロニー化および生残性を示したもの（ｄａｍ  ａｒｏＡ、ｄａｍ  ｈｔｒＡ、ｄａｍ  ｓｐｉＣ、ｄａｍ  ｓｓａＶ）。これらのデータは、クラスＩワクチン候補ワクチンが宿主組織中で軽度の生残性を持続した一方、クラスＩＩワクチンはワクチン接種動物中で急速なクリアランスを示したことを示す。
【００７７】
２．３．サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補の効力評価
サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補（クラスＩおよびクラスＩＩ）を試験して親サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍワクチンにより誘発されるものと類似する保護免疫応答を付与するために軽度の生残性が必要であるか否かを区別した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、７つのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補のそれぞれにより経口免疫化した（１０９ＣＦＵ）。宿主組織内のワクチン株の生残性に起因する一過的な非特異的交差保護免疫応答を回避するため［２３〜２５］、免疫化マウスは、ワクチン株が免疫化動物の粘膜（パイエル板；腸間膜リンパ節）および全身組織（肝臓；脾臓）からクリアランスされてから４から５週間後までビルレントサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）によりチャレンジしなかった。免疫化から１１週間後、マウスを、２００倍ＬＤ５０感染用量のビルレント親株ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１により経口チャレンジした。全て（３つのうち３つ）のクラスＩワクチン候補（ｄａｍ  ｍｇｔＣ、ｄａｍ  ｓｉｆＡ、ｄａｍ  ｓｐｖＢ）により免疫化されたマウスは、ビルレント同種チャレンジに対するロバストな保護を示し、これは親ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２株により示されたものと類似する（図２）。逆に、クリアランスの加速を示したクラスＩＩワクチン候補（ｄａｍ  ａｒｏＡ、ｄａｍ  ｈｔｒＡ、ｄａｍ  ｓｐｉＣ、ｄａｍ  ｓｓａＶ）は１つも（４つのうち０）、親ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２株と比較してビルレント同種チャレンジに対する有意な保護を付与しなかった（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【００７８】
クラスＩワクチン候補を、サルモネラ症のネズミ［２、９］、鳥類［１０、１１］、ヒツジ［１２］およびウシ［１３〜１５］モデルにおけるサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍワクチン株について示されている異種株に対する交差保護を誘発する能力について評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、クラスＩワクチン候補（ｄａｍ  ｍｇｔＣ、ｄａｍ  ｓｉｆＡ、またはｄａｍ  ｓｐｖＢ；１０９ＣＦＵ）により経口免疫化した。免疫化から１１週間後、マウスを、血清学的グループＣ２〜Ｃ３、Ｂ、およびＤをそれぞれ含むヒツジ（サルモネラ・ボビスモルビフィカンス（Ｓ．Ｂｏｖｉｓｍｏｒｂｉｆｉｃａｎｓ）１７４、ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）１３１）および畜牛（サルモネラ・ダブリン（Ｓ．Ｄｕｂｌｉｎ）８８９５）に由来する家畜産業関連病原性サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株によりチャレンジした。３つ全てのクラスＩワクチン候補は、試験された３つの異種ビルレント株に対するロバストな交差保護を付与し（図３；＊＊＊Ｐ＜０．００１）、ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）１４０２８  ｄａｍΔ２３２ワクチン株によりワクチン接種されたマウスにおいてそれら３つの異種チャレンジ株に対して既に示された交差保護のレベルと類似した［２］。これらのデータは、宿主組織中のクラスＩワクチン候補（ｄａｍ  ｍｇｔＣ、ｄａｍ  ｓｉｆＡ、およびｄａｍ  ｓｐｖＢ）の軽度の生残性が、強力な適応免疫応答の発生への移行に必要とされる時間にわたり安定な抗原資源を提供し得るという仮定と一致する［２、９、１９］。
【００７９】
２．４．２−ＡＰ耐性への復帰の評価を介するワクチン安全性評価
増大したビルレンスへの復帰は、全ての改変生ワクチンについての懸念事項である。サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ突然変異ワクチンは、メチル指向ミスマッチ修復遺伝子中の突然変異の獲得を介する腹腔内（経口でない）感染後のより高いビルレント状態への復帰を受ける能力を有する［２９］。このような復帰は、Ｄａｍ機能を欠く細菌に毒性であるプリン類似体２−アミノプリン（２−ＡＰ）を使用して評価することができる［２１］。すなわち、親ｄａｍ株（２−ＡＰＳ）を、全身組織中の２−ＡＰｒ（増大したビルレンスの潜在的指標として）への復帰について評価することができる［２９］。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補、ｄａｍ  ｍｇｔＣ、ｄａｍ  ｓｉｆＡ、ｄａｍ  ｓｐｖＢ．または親ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２株を腹腔内感染させた（１０３ＣＦＵ）。感染から５日後、細菌を肝臓および脾臓から回収し、２−ＡＰｓ（生残性）および２−ＡＰｒ表現型への復帰について評価した（図４）。３つ全てのワクチン候補（ｄａｍ  ｍｇｔＣ、ｄａｍ  ｓｉｆＡ、ｄａｍ  ｓｐｖＢ）が、脾臓／肝臓において親ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２株のものに対して有意に低減したコロニー化および生残性（２−ＡＰｓ）ならびに低減した２−ＡＰ耐性への復帰を示した（＊Ｐ＜０．０５）。
【００８０】
感染マウスの脾臓から単離されたサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補の２−Ａｐｒ誘導体および親ｄａｍＵＫ−１ワクチンを、経口および腹腔内致死用量（ＬＤ５０）ビルレンスアッセイを介して評価した。野生型ＵＫ−１についての経口および腹腔内ＬＤ５０は、それぞれ１０５および＜１０ＣＦＵである。全てのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補に由来する経口ＬＤ５０の全ての２−ＡＰｒ単離株（１１のうちの１１）または親サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍワクチン（５つのうちの５つ）は、経口投与により非ビルレントであった（表２）。対照的に、既に実証されるとおり［２９］、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補に由来する全て（１１のうちの１１）の２−ＡＰｒ単離株は、腹腔内感染を介して高度に弱毒化された一方、親ｄａｍワクチンに由来するもの（５つのうちの５つ）は、より高いビルレント状態への復帰を伴った。これらのデータは、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍワクチンと異なり、感染プロセスの間のビルレント復帰を生じさせることの破綻により証明されるとおり、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ  ｍｇｔＣ、ｄａｍ  ｓｉｆＡ、およびｄａｍ  ｓｐｖＢワクチン株が、有意に改善されたワクチン安全性を示したことを示す。
【００８１】
２．５．サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン株のワクチンおよびチャレンジ株排出評価
ワクチン接種動物における低減したワクチンおよびチャレンジ株排出は、ワクチン安全性に望ましい形質である。ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２二重突然変異ワクチン候補のカナマイシン耐性誘導体を構築し、使用して免疫化動物の糞便中のワクチン株およびチャレンジ株排出を評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補（ｄａｍ  ｍｇｔＣ［ＭＴ３１８３］；ｄａｍ  ｓｉｆＡ［ＭＴ３１８４］；ｄａｍ  ｓｐｖＢ［ＭＴ３１８６］）またはｄａｍ  ＵＫ−１親株（ＭＴ３１８０）のいずれかにより経口経路により免疫化した（１０９ＣＦＵ）。ワクチン株排出。感染後２、４、７、１１、１４、および２１日目に糞便ペレットを得、Ｋｎｒ細菌について評価した。全てのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重欠失ワクチン候補は、親ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２株のものと比較して有意に低減したワクチン株糞便排出を示した（図５；Ｐ＜０．０５）。チャレンジ株排出。免疫化から１１週間後、ワクチン接種マウスを、１００ＬＤ５０の用量のネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１のＫｎｒ誘導体（ＭＴ２３１５；１０７ＣＦＵ）によりチャレンジした。感染後２、４、７、１１、１４、および２１日目に糞便ペレットを得、Ｋｎｒ細菌について評価した。サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ  ｍｇｔＣ、ｄａｍ  ｓｉｆＡおよびｄａｍ  ｓｐｖＢ株は、３週間の期間にわたり親ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１  ｄａｍΔ２３２ワクチンのものに対してチャレンジ株排出の有意な低減を示し、ｄａｍ  ｓｉｆＡおよびｄａｍ  ｓｐｖＢ株は、４から２１日目に低減した排出を示した（図６；Ｐ＜０．０５）。これらのデータは、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチンによるワクチン接種が、親サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍワクチンのものに対して少ないワクチン糞便排出をもたらし、二重欠失ワクチン接種がｄａｍ親ワクチンよりもロバストな、ビルレントチャレンジ後の野生型サルモネラ菌排出の弱毒化を提供することを示す。
【００８２】
２．６．サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン株の環境生残性（脱イオン水およびヒツジ糞便）評価
サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補を、脱イオン水中およびヒツジ糞便中の環境生残性について評価した。脱イオン水。脱イオン水に、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補（ｄａｍ  ｍｇｔＣ［ＭＴ３１８３］；ｄａｍ  ｓｉｆＡ［ＭＴ３１８４］；ｄａｍ  ｓｐｖＢ［ＭＴ３１８６］）またはｄａｍ  ＵＫ−１親株（ＭＴ３１８０）のいずれかのＫｎｒ誘導体を接種した（１０４ＣＦＵ／ｍｌ）（図７）。水試料を２週間の期間にわたりＣＦＵ／ｇのためにプレーティングした。全て（３つのうちの３つ）のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補および親ｄａｍ株は、野生型ＵＫ−１株のものと比較して有意に低減した２週間のインキュベーションにわたる脱イオン水中の生存能を示した（図７；Ｐ＜０．０５）。さらに、水中の低レベルワクチン生残性は、容器水ワクチン投与に適合し得る。ヒツジ糞便。２０パーセントの乾燥物ヒツジ糞便に、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補（ｄａｍ  ｍｇｔＣ［ＭＴ３１８３］；ｄａｍ  ｓｉｆＡ［ＭＴ３１８４］；ｄａｍ  ｓｐｖＢ［ＭＴ３１８６］）またはｄａｍ  ＵＫ−１親株（ＭＴ３１８０）のいずれかのＫｎｒ誘導体を接種した（１０４ＣＦＵ／ｍｌ）。糞便試料を２週間の期間にわたりＣＦＵ／ｇのためにプレーティングした。全て（３つのうちの３つ）のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ二重突然変異ワクチン候補および親ｄａｍ株は、２週間のインキュベーション期間にわたる野生型ＵＫ−１株のものと比較して有意に低減した２週間のインキュベーションにわたるヒツジ糞便中の生存能を示した（図８；Ｐ＜０．０５）。さらに、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ  ｓｉｆＡは、他の３つのワクチン株試験のものに対して有意に低減したヒツジ糞便中の生存能力を示した（Ｐ＜０．０５）。これらのデータは、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ワクチン候補が、野生型ＵＫ−１株のものと比較して脱イオン水およびヒツジ糞便中の両方で低減した環境生残性を示すことを示す。
【００８３】
３．考察
良好な畜産実務にかかわらず、サルモネラ症は、糞口伝達を支持する集約的な生産系において重要な問題であり続ける。疾患は、主として、増加した病原体曝露および疾患感受性により引き起こされる。環境条件の変動は、環境病原体負荷および続いて宿主チャレンジの変化を引き起こす。妊娠および出産に伴う生理学的変化は、非ワクチン接種免疫状態の新生児と同様に疾患に対する感受性を増加させる。管理実務も、農場で（寄せ集め、囲い入れ、輸送前の食料および水制限）、輸送の間（食料および水制限、環境ストレス）および販売場（混じり合い、病原体曝露）家畜が受ける蓄積的なストレス因子により宿主免疫に悪影響を与え得る。
【００８４】
サルモネラ症に対する家畜ワクチン接種は、疾患を予防するための実行可能なアプローチである。それというのも、それは開始時における食料および給水の汚染を予防し、病原体曝露、伝達、動物疾患、ならびに家畜由来食品の直接汚染および汚染水による果実および植物性食品の間接汚染の縮小をもたらすためである。
【００８５】
最適には、家畜が販売、輸送、およびフィードロット中への入場後の高リスク期に伴うストレス因子および病原体曝露を受ける前に、家畜を、それが生産された農場でワクチン接種して免疫を誘発すべきである。家畜をフィードロットに供給する生産者に、販売前に動物をワクチン接種することを説得することが困難である。それというのも、疾患のコストが起源の特性に関して負担されず、フィードロット中への入場直後の高リスク期の間の家畜免疫化の現行実務をもたらすためである。
【００８６】
手頃で有効な生産物が商業部門に利用可能とされる場合、ワクチンは、動物生産業にわたり広く適用することができる。それというのも、ワクチン接種は簡単であり、生産者により理解されており、採用される可能性が高く、したがって、任意の包括的食料安全性プランの成功における重要な役割を担い得るためである。
【００８７】
この問題に対処するための潜在的な手段として、改変生サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍワクチンが免疫化家畜において有効であり、十分忍容されることが示されており［１０〜１５］、飲料水を介してそれを投与することができる［１２、１６］。しかしながら、生ワクチンの主な懸念事項は、安全性、排出、および環境生残性である。
【００８８】
本明細書では、第２のビルレンス弱毒化突然変異をサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ株中に導入して動物および環境中で安全であり、交差保護効力を付与する能力を維持するワクチン候補をスクリーニングした。ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｄａｍ  ｓｉｆＡは、改善されたワクチン安全性、低減したワクチンおよびチャレンジ株排出、低減した環境生残性を示し、感染家畜に由来する異種病原性サルモネラ菌血清型に対する交差保護を付与するために十分である宿主組織中の軽度の生残性を付与した［３１］。これらのデータは、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ  ｓｉｆＡが、商業用途に好ましい治療指数（安全性／効力）を示すことを示し、病原性血清型に対する交差保護免疫を誘発する能力とともにワクチン接種および環境の両方において改善された安全性を支持する。
【００８９】
本明細書では、ワクチンの安全性を、ワクチン接種動物において、および環境を模倣する条件において評価した。サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ  ｍｇｔＣ、ｄａｍ  ｓｉｆＡ、およびｄａｍ  ｓｐｖＢワクチン株は、感染家畜に由来する異種病原性血清型に対する交差保護免疫の維持に伴う宿主組織中の軽度の生残性を持続した。さらに、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ  ｓｉｆＡワクチンは、改善されたワクチン安全性（ワクチン排出；チャレンジ株排出；全身組織中の生残性；環境中の生残性）を示した一方、同種および異種病原性血清型によるビルレンスチャレンジに対するロバストな効力を維持した。したがって、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｄａｍ  ｓｉｆＡワクチン候補は、交差保護効力を低下させることなく、かなり増加した安全性を示し、有意な環境生残性を有さない家畜の経口投与の安全で有効であり、低コスト手段であることが証明され得る。
本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物であって、ｄａｍ遺伝子中の機能損失型突然変異ならびにｓｉｆＡ、ｓｐｖＢおよびｍｇｔＣからなる群から選択される遺伝子中の少なくとも１つのさらなる機能損失型突然変異を含む微生物。
［２］
前記機能損失型突然変異が、前記遺伝子中の１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換からなる群から選択される、請求項１に記載のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物。
［３］
ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ゲルトネル菌（Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ・ダブリン（Ｓ．Ｄｕｂｌｉｎ）、サルモネラ・ニューポート（Ｓ．Ｎｅｗｐｏｒｔ）、ブタコレラ菌（Ｓ．Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、およびサルモネラ・ボビスモルビフィカンス（Ｓ．Ｂｏｖｉｓｍｏｒｂｉｆｉｃａｎｓ）からなる群から選択されるサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）亜種エンテリカ（Ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型である、請求項１または２に記載のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物。
［４］
ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物。
［５］
前記少なくとも１つのさらなる機能損失型突然変異が、ｓｉｆＡ遺伝子中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物。
［６］
サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物に対する対象における免疫応答を誘導するための組成物であって、前記対象における免疫応答を誘発するために十分な量の請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物およびアジュバント、希釈剤、担体または賦形剤を含む組成物。
［７］
請求項１〜５のいずれか一項に記載のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物の精製培養物。
［８］
凍結乾燥、凍結、または再構成される、請求項７に記載の精製培養物。
［９］
ビルレントサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物による対象の感染の可能性を予防または低減させる方法であって、
−  それが必要とされる対象に、ある量の請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物、請求項６に記載の組成物または請求項７もしくは８に記載の精製培養物を投与すること；
を含み、
−  投与される微生物、組成物または精製培養物の前記量は、前記対象における免疫応答を誘発するために十分である
方法。
［１０］
経口、鼻腔または非経口経路を介して前記微生物、組成物および／または精製培養物を投与する、請求項９に記載の方法。
［１１］
前記対象が、ヒト対象である、請求項９または１０に記載の方法。
［１２］
前記対象が、動物種である、請求項９または１０に記載の方法。
［１３］
前記対象が、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタおよび家禽からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
［１４］
ビルレントサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物による対象の感染の可能性を予防し、または低減させるための医薬品の製造における、請求項１〜５のいずれか一項に記載のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物の使用。
［１５］
ビルレントサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物による対象の感染の可能性を予防し、または低減させるための医薬品の製造における、請求項７または８に記載の精製培養物の使用。
［１６］
前記医薬品が、ワクチンである、請求項１４または１５に記載の使用。
［１７］
ビルレントサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物による対象の感染の可能性の予防または低減において使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物。
【００９０】
【表１】
0006683684.tif 000002
【００９１】
【表２】
0006683684.tif 000003
【００９２】
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
［１］Ｍａｈａｎ  ＭＪ，Ｈｅｉｔｈｏｆｆ  ＤＭ，Ｈｏｕｓｅ  ＪＫ．Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｆａｓｔ−ｆｏｒｗａｒｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｏｄ  ｓａｆｅｔｙ．Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２；７：８０５−８．
［２］Ｈｅｉｔｈｏｆｆ  ＤＭ，Ｅｎｉｏｕｔｉｎａ  ＥＹ，Ｂａｒｅｙａｎ  Ｄ，Ｄａｙｎｅｓ  ＲＡ，Ｍａｈａｎ  ＭＪ．Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｄｉｍｉｎｉｓｈ  ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００８；７６：５１９１−９．
［３］Ｈｅｇａｚｙ  ＷＡＨ，Ｈｅｎｓｅｌ  Ｍ．Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ａｓ  ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｒｒｉｅｒ．Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２；７：１１１−２７．
［４］Ｋｏｎｇ  Ｑ，Ｙａｎｇ  Ｊ，Ｌｉｕ  Ｑ，Ａｌａｍｕｒｉ  Ｐ，Ｒｏｌａｎｄ  ＫＬ，Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＩＩＩ  Ｒ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ａｎｄ  Ｏ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｎ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２０１１；７９：４２２７−３９．
［５］Ｌｉ  Ｙ，Ｗａｎｇ  Ｓ，Ｓｃａｒｐｅｌｌｉｎｉ  Ｇ，Ｇｕｎｎ  Ｂ，Ｘｉｎ  Ｗ，Ｗａｎｄａ  ＳＹ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｄｅｌａｙｅｄ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＰｓｐＡ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００９；１０６：５９３−８．
［６］Ｎａｇｙ  Ｇ，Ｐａｌｋｏｖｉｃｓ  Ｔ，Ｏｔｔｏ  Ａ，Ｋｕｓｃｈ  Ｈ，Ｋｏｃｓｉｓ  Ｂ，Ｄｏｂｒｉｎｄｔ  Ｕ，ｅｔ  ａｌ．“Ｇｅｎｔｌｙ  ｒｏｕｇｈ”：ｔｈｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｍｕｔａｎｔ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２００８；１９８：１６９９−７０６．
［７］Ｃｕｒｔｉｓｓ  Ｒ，Ｘｉｎ  Ｗ，Ｙｕｈｕａ  Ｌ，Ｋｏｎｇ  Ｗ，Ｗａｎｄａ  ＳＹ，Ｇｕｎｎ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；３０：２５５−７０．
［８］Ｓｉｎｇｈ  Ｂ．Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  ｂｉｒｄｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｏｐｅｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｊ．２００９；２：１００−１２．
［９］Ｈｅｉｔｈｏｆｆ  ＤＭ，Ｅｎｉｏｕｔｉｎａ  ＥＹ，Ｄａｙｎｅｓ  ＲＡ，Ｓｉｎｓｈｅｉｍｅｒ  ＲＬ，Ｌｏｗ  ＤＡ，Ｍａｈａｎ  ＭＪ．Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ＤＮＡ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｃｏｎｆｅｒ  ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００１；６９：６７２５−３０．
［１０］Ｄｕｅｇｅｒ  ＥＬ，Ｈｏｕｓｅ  ＪＫ，Ｈｅｉｔｈｏｆｆ  ＤＭ，Ｍａｈａｎ  ＭＪ．Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ＤＮＡ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｅｌｉｃｉｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｒｏｖａｒｓ  ｉｎ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００１；６９：７９５０−４．
［１１］Ｄｕｅｇｅｒ  ＥＬ，Ｈｏｕｓｅ  ＪＫ，Ｈｅｉｔｈｏｆｆ  ＤＭ，Ｍａｈａｎ  ＭＪ．Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ＤＮＡ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗｌｙ  ｈａｔｃｈｅｄ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｒｏｖａｒｓ．Ｉｎｔｌ  Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３ａ；８０：１５３−９．
［１２］Ｍｏｈｌｅｒ  ＶＬ，Ｈｅｉｔｈｏｆｆ  ＤＭ，Ｍａｈａｎ  ＭＪ，Ｗａｌｋｅｒ  ＫＨ，Ｈｏｒｎｉｔｚｋｙ  ＭＡ，Ｇａｂｏｒ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ  ｂｙ  ａ  ＤＮＡ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｗｈｅｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｉｎ−ｗａｔｅｒ  ｔｏ  ｓｈｅｅｐ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１１；２９：３５７１−８２．
［１３］Ｄｕｅｇｅｒ  ＥＬ，Ｈｏｕｓｅ  ＪＫ，Ｈｅｉｔｈｏｆｆ  ＤＭ，Ｍａｈａｎ  ＭＪ．Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ＤＮＡ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｅｌｉｃｉｔ  ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  ｌａｔｅ  ｏｎｓｅｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｃａｌｖｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２００３；２１：３２４９−５８．
［１４］Ｍｏｈｌｅｒ  Ｖ，Ｈｅｉｔｈｏｆｆ  Ｄ，  Ｍａｈａｎ  Ｍ，Ｗａｌｋｅｒ  Ｋ，Ｈｏｒｎｉｔｚｋｙ  Ｍ，ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｃａｌｖｅｓ  ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ  ｂｙ  ａ  ＤＮＡ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２００６；２４：１３３９．
［１５］Ｍｏｈｌｅｒ  Ｖ，Ｈｅｉｔｈｏｆｆ  Ｄ，Ｍａｈａｎ  Ｍ，Ｗａｌｋｅｒ  Ｋ，Ｈｏｒｎｉｔｚｋｙ  Ｍ，Ｓｈｕｍ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ  ｂｙ  ａ  ＤＮＡ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｃａｌｖｅｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｎｅｗｐｏｒｔ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２００８；２６：１７５１−８．
［１６］Ｍｏｈｌｅｒ  Ｖ，Ｈｅｉｔｈｏｆｆ  Ｄ，Ｍａｈａｎ  Ｍ，Ｈｏｒｎｉｔｚｋｙ  Ｍ，Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｐ，  Ｈｏｕｓｅ  Ｊ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎ−ｗａｔｅｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｓｈｅｅｐ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１２；３０：１４８１−９１．
［１７］Ｈａｓｓａｎ  ＪＯ，Ｃｕｒｔｉｓｓ  Ｒ，３ｒｄ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｌｉｖｅ  ａｖｉｒｕｌｅｎｔ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９４；６２：５５１９−２７．
［１８］Ｄａｖｉｓ  ＲＷ，Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  Ｄ，Ｒｏｔｈ  ＪＲ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；１９８０．
［１９］Ｈｅｉｔｈｏｆｆ  ＤＭ，  Ｓｉｎｓｈｅｉｍｅｒ  ＲＬ，  Ｌｏｗ  ＤＡ，Ｍａｈａｎ  ＭＪ．Ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ［ｓｅｅ  ｃｏｍｍｅｎｔｓ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９；２８４：９６７−７０．
［２０］Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ  ＭＳ，Ｋａｐｅｒ  ＪＢ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅａｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９１；５９：４３１０−７．
［２１］Ｇｌｉｃｋｍａｎ  Ｂ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｓｅｎ  Ｐ，Ｒａｄｍａｎ  Ｍ．Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｄａｍ−ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ６−ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｖｏｉｄａｎｃｅ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９７８；１６３：３０７−１２．
［２２］Ｊｕｌｉｏ  Ｓ，Ｈｅｉｔｈｏｆｆ  Ｄ，Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏ  Ｄ，Ｋｌｏｓｅ  Ｋ，Ｓｉｎｓｈｅｉｍｅｒ  Ｒ，Ｌｏｗ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．ＤＮＡ  Ａｄｅｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｌａｙｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００１；６９：７６１０−５．
［２３］Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＪＡ，Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ−Ｒａｍｏｓ  Ｂ，Ｍａｓｔｒｏｅｎｉ  Ｐ，Ｄｅｍａｒｃｏ  ｄｅ  Ｈｏｒｍａｅｃｈｅ  Ｒ，Ｈｏｒｍａｅｃｈｅ  ＣＥ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｌｉｖｅ  Ａｒｏ−Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｙｐｈｏｉｄ  ｍｏｄｅｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９７；９０：６１８−２５．
［２４］Ｈｏｒｍａｅｃｈｅ  ＣＥ，Ｊｏｙｓｅｙ  ＨＳ，Ｄｅｓｉｌｖａ  Ｌ，Ｉｚｈａｒ  Ｍ，Ｓｔｏｃｋｅｒ  ＢＡ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ  ｂｙ  Ａｒｏ−Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｌｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐａｔｈｏｇ．１９９１；１０：１４９−５８．
［２５］Ｈｏｒｍａｅｃｈｅ  ＣＥ，Ｍａｓｔｒｏｅｎｉ  Ｐ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＪＡ，Ｄｅｍａｒｃｏ  ｄｅ  Ｈｏｒｍａｅｃｈｅ  Ｒ，Ｓｖｅｎｓｏｎ  Ｓ，Ｓｔｏｃｋｅｒ  ＢＡ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｒａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｔｈｒｅｅ  ｍｏｎｔｈｓ  ａｆｔｅｒ  ｉ．ｖ．ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｌｉｖｅ  Ａｒｏ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ（ｓｐｅｃｉｅｓ）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｏｎｌｙ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍａｉｎ  ＬＰＳ  Ｏ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ．１９９６；１４：２５１−９．
［２６］Ｃｏｎｎｅｒ  ＣＰ，Ｈｅｉｔｈｏｆｆ  ＤＭ，Ｊｕｌｉｏ  ＳＭ，Ｒ．Ｌ．Ｓ，Ｍａｈａｎ  ＭＪ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｔｒａｉｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９８．；９５：４６４１−５．
［２７］Ｇｒｉｇｇｓ  Ｔ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｆｏｒａｇｅ  ｄｒｙ  ｍａｔｔｅｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  ｏｖｅｎ  ＡＧ／Ｆｏｒａｇｅ  ＆  Ｐａｓｔｕｒｅ／２００５−０１．２００５．
［２８］Ｐｉｔｔ  Ｒ，Ｂｒｕｓｅｗｉｔｚ  Ｇ，Ｃｈａｓｅ  Ｌ，Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｍ．Ｆｏｒａｇｅ  ｍｏｉｓｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．ＮＲＡＥＳ  （５９）（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）．１９９３．
［２９］Ｈｅｉｔｈｏｆｆ  Ｄ，Ｂａｄｉｅ  Ｇ，Ｊｕｌｉｏ  Ｓ，Ｅｎｉｏｕｔｉｎａ  Ｅ，Ｄａｙｎｅｓ  Ｒ，Ｓｉｎｓｈｅｉｍｅｒ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｅｔｈｙｌ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｄａｍ  ｍｕｔａｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｏｒａｌ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａiｖｅ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００７；１８９：４７０８−１７．
［３０］Ｈｅｉｔｈｏｆｆ  ＤＭ，Ｓｈｉｍｐ  ＷＲ，Ｈｏｕｓｅ  ＪＫ，Ｘｉｅ  Ｙ，Ｗｅｉｍｅｒ  ＢＣ，Ｓｉｎｓｈｅｉｍｅｒ  ＲＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｒａｓｐｅｃｉｅｓ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｉｎ  ｎａｔｕｒｅ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．２０１２；８：ｅ１００２６４７．
［３１］Ｈｅｉｔｈｏｆｆ  ＤＭ，Ｓｈｉｍｐ  ＷＲ，Ｌａｕ  ＰＷ，Ｂａｄｉｅ  Ｇ，Ｅｎｉｏｕｔｉｎａ  ＥＹ，Ｄａｙｎｅｓ  ＲＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｏｓｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｏｒｉｇｉｎ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８；７４：１７５７−６６．
［３２］Ｇｒｉｇｇｓ  Ｔ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｆｏｒａｇｅ  ｄｒｙ  ｍａｔｔｅｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  ｏｖｅｎ  ＡＧ／Ｆｏｒａｇｅ  ＆  Ｐａｓｔｕｒｅ／２００５−０１．２００５．
［３３］Ｐｉｔｔ  Ｒ，Ｂｒｕｓｅｗｉｔｚ  Ｇ，Ｃｈａｓｅ  Ｌ，Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｍ．Ｆｏｒａｇｅ  ｍｏｉｓｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．ＮＲＡＥＳ（５９）（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）．１９９３．
［３４］Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖ．ＧｅｎＳｔａｔ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ  １５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＶＳＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｈｅｍｅｌ  Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ．２０１２
【図１】
0006683684.tif 000004
【図２】
0006683684.tif 000005
【図３】
0006683684.tif 000006
【図４】
0006683684.tif 000007
【図５】
0006683684.tif 000008
【図６】
0006683684.tif 000009
【図７】
0006683684.tif 000010
【図８】
0006683684.tif 000011