(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の生菌コロニー数を増加させる方法であって、トリゴネラ  フォエヌム−グラエクム（フェヌグリーク）種子繊維、リキウム  バルバルム種子繊維、リヌム  ウシタティッシマム（アマ）種子繊維、ココス  ヌシフェラ（ココナッツ）繊維、ジンギベル  オフィシナーレ（ショウガ）根茎繊維、エンブリカ  オフィシナリス（アムラ）果実繊維、プランタゴ  オバタ（オオバコ）繊維、およびウァッキニウム  オキシコッコス（クランベリー）種子繊維からなる群から選択された天然植物繊維の存在下で、バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６を増殖させるステップを含む、方法。
【請求項２】
大腸菌を抑制する方法であって、前記大腸菌を、トリゴネラ  フォエヌム−グラエクム（フェヌグリーク）種子繊維、リキウム  バルバルム種子繊維、リヌム  ウシタティッシマム（アマ）種子繊維、ココス  ヌシフェラ（ココナッツ）繊維、ジンギベル  オフィシナーレ（ショウガ）根茎繊維、エンブリカ  オフィシナリス（アムラ）果実繊維、プランタゴ  オバタ（オオバコ）繊維、およびウァッキニウム  オキシコッコス（クランベリー）種子繊維からなる群から選択された天然植物繊維と共に培養したバチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６と接触させるステップを含む、方法。
【請求項３】
バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６を、トリゴネラ  フォエヌム−グラエクム（フェヌグリーク）種子繊維、リキウム  バルバルム種子繊維、リヌム  ウシタティッシマム（アマ）種子繊維、ココス  ヌシフェラ（ココナッツ）繊維、ジンギベル  オフィシナーレ（ショウガ）根茎繊維、エンブリカ  オフィシナリス（アムラ）果実繊維、プランタゴ  オバタ（オオバコ）繊維、およびウァッキニウム  オキシコッコス（クランベリー）種子繊維からなる群から選択された天然植物繊維と共に培養することによって、短鎖脂肪酸を産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それぞれ２０１４年８月２９日および２０１４年１０月１４日に出願された米国仮特許出願第６２０４３５９９号および第６２０６３４５３号の優先権を取得するＰＣＴ出願である。
本発明は、概して、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）（乳酸菌）に関する。より具体的には、本発明は、（ｉ）バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ  ５８５６）に対する天然植物性繊維の増殖促進活性、（ｉｉ）バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６による植物性天然繊維を用いた短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の産生、および（ｉｉｉ）病原性グラム陰性菌を抑制するための天然植物性繊維とバチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の組合せに関する。
【背景技術】
【０００２】
多菌株プロバイオティクス（プロバイオティック細菌）およびプレバイオティクスを組み合わせることで免疫補助効果の増強が達成されることは、当業界において周知である。具体的には、プロバイオティクスと天然植物性繊維を組み合わせ、シンバイオティクスを処方することは、有望な治療的手法として報告されている（Stig Bengmark and Robert Martindale. “Prebiotics and Synbiotics in Clinical Medicine”. Nutr Clin Pract vol 20 244-261, April 2005）。このような手法の成功は、腸における酵素加水分解および酸加水分解のいずれに対しても抵抗性のある天然植物性繊維によって、生菌数が効果的に増加する特定のプロバイオティック微生物を慎重に選択することにかかっている。微生物による基質の利用しやすさ、繊維（飼料）の物理的および化学的性質、ならびにまた、消化過程の動態という観点から、微生物による繊維の消化および利用には限界があるという教示をふまえると、こうした研究は、シンバイオティック食事療法に曝した宿主動物の性能に対応するために、決定的に重要である（Gabriella A. Varga and Eric S. Kolver, “Microbial and Animal Limitations to Fiber Digestion and Utilization”, J. Nutr. May 1, 1997 vol. 127 no. 5 819S-823S）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の主目的は、バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の生菌数を増加させる、選択した天然繊維の性能（酵素加水分解および酸加水分解に対する抵抗性）を評価することである。
また、本発明の別の目的は、病原性グラム陰性菌を抑制する、シンバイオティック組成物（天然繊維およびバチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６）の能力を評価することである。
さらに、本発明の別の目的は、望ましい短鎖脂肪酸を産生する、シンバイオティック組成物（天然繊維およびバチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６）の能力であって、甚大な治療的応用のある特性を評価することである。
本発明は、前述の目的を満たし、さらに関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（ｉ）バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６に対する天然植物性繊維の増殖促進活性、（ｉｉ）病原性グラム陰性菌を抑制する天然植物性繊維とバチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の組合せ、および（ｉｉｉ）バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６による植物性天然繊維を用いた短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の産生を開示する。
本発明の他の特徴および利点は、例として本発明の原理を例証する添付の画像と併せて、以下のより詳細な説明によって明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１ａ】様々な天然植物繊維（％、ｗ／ｖ）単独の存在下における、バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の生菌コロニー数の増加をグラフ表示した図である。
【図１ｂ】様々な天然植物繊維（％、ｗ／ｖ）単独の存在下における、バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の生菌コロニー数の増加をグラフ表示した図である。
【図１ｃ】様々な天然植物繊維（％、ｗ／ｖ）単独の存在下における、バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の生菌コロニー数の増加をグラフ表示した図である。
【図２ａ】ＭＲＳ培地（ブドウ糖欠除）中、様々な天然植物繊維（％、ｗ／ｖ）の存在下における（０．５、１．０、２．０％、ｗ／ｖ）、バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の生菌コロニー数の増加をグラフ表示した図である。
【図２ｂ】ＭＲＳ培地（ブドウ糖欠除）中、様々な天然植物繊維（％、ｗ／ｖ）の存在下における（０．５、１．０、２．０％、ｗ／ｖ）、バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の生菌コロニー数の増加をグラフ表示した図である。
【図２ｃ】ＭＲＳ培地（ブドウ糖欠除）中、様々な天然植物繊維（％、ｗ／ｖ）の存在下における（０．５、１．０、２．０％、ｗ／ｖ）、バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の生菌コロニー数の増加をグラフ表示した図である。
【図３】培地として植物性天然繊維中で共培養した場合の、Ｂ．コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ  ２５９２２の増殖抑制についてグラフ表示した図である。生菌数の平均値をｌｏｇ10ｃｆｕ／ｍｌで示す。
【図４】短鎖脂肪酸のクロマトグラフ読取り値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
最も好ましい実施形態において、本発明は、バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の生菌コロニー数を増加させる方法であって、トリゴネラ  フォエヌム−グラエクム（フェヌグリーク（コロハ））種子繊維（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ  ｆｏｅｎｕｍ−ｇｒａｅｃｕｍ（ｆｅｎｕｇｒｅｅｋ）  ｓｅｅｄ  ｆｉｂｅｒｓ）、リキウム  バルバルム種子繊維（Ｌｙｃｉｕｍ  ｂａｒｂａｒｕｍ  ｓｅｅｄ  ｆｉｂｅｒｓ）、リヌム  ウシタティッシマム（アマ）種子繊維（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（Ｆｌａｘ）  ｓｅｅｄ  ｆｉｂｅｒｓ）、ココス  ヌシフェラ（ココナッツ）繊維（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ（Ｃｏｃｏｎｕｔ）  ｆｉｂｅｒｓ）、ジンギベル  オフィシナーレ（ショウガ）根茎繊維（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ（Ｇｉｎｇｅｒ）  ｒｈｉｚｏｍｅ  ｆｉｂｅｒｓ）、エンブリカ  オフィシナリス（アムラ）果実繊維（Ｅｍｂｌｉｃａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（Ａｍｌａ）  ｆｒｕｉｔ  ｆｉｂｅｒｓ）、プランタゴ  オバタ（オオバコ）繊維（Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｏｖａｔａ（Ｐｓｙｌｌｉｕｍ）  ｆｉｂｅｒｓ）、およびウァッキニウム  オキシコッコス（クランベリー）種子繊維（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｏｘｙｃｏｃｃｏｓ（Ｃｒａｎｂｅｒｒｙ）  ｓｅｅｄ  ｆｉｂｅｒｓ）からなる群から選択された天然植物繊維の存在下で、バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６を増殖させるステップを含む、方法に関する。
【０００７】
別の最も好ましい実施形態において、本発明は、病原性グラム陰性菌を抑制する方法であって、前記グラム陰性菌を、トリゴネラ  フォエヌム−グラエクム（フェヌグリーク）種子繊維、リキウム  バルバルム種子繊維、リヌム  ウシタティッシマム（アマ）種子繊維、ココス  ヌシフェラ（ココナッツ）繊維、ジンギベル  オフィシナーレ（ショウガ）根茎繊維、エンブリカ  オフィシナリス（アムラ）果実繊維、プランタゴ  オバタ（オオバコ）繊維、およびウァッキニウム  オキシコッコス（クランベリー）種子繊維からなる群から選択された天然植物繊維と共に培養したバチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６と接触させるステップを含む、方法に関する。
【０００８】
さらに別の最も好ましい実施形態において、本発明は、バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６を、トリゴネラ  フォエヌム−グラエクム（フェヌグリーク）種子繊維、リキウム  バルバルム種子繊維、リヌム  ウシタティッシマム（アマ）種子繊維、ココス  ヌシフェラ（ココナッツ）繊維、ジンギベル  オフィシナーレ（ショウガ）根茎繊維、エンブリカ  オフィシナリス（アムラ）果実繊維、プランタゴ  オバタ（オオバコ）繊維、およびウァッキニウム  オキシコッコス（クランベリー）種子繊維からなる群から選択された天然植物繊維と共に培養することによって、短鎖脂肪酸を産生する方法にも関する。代替の実施形態において、本発明は、食事性肥満およびインスリン抵抗性からの防護効果をもたらすために、トリゴネラ  フォエヌム−グラエクム（フェヌグリーク）種子繊維、リキウム  バルバルム種子繊維、リヌム  ウシタティッシマム（アマ）種子繊維、ココス  ヌシフェラ（ココナッツ）繊維、ジンギベル  オフィシナーレ（ショウガ）根茎繊維、エンブリカ  オフィシナリス（アムラ）果実繊維、プランタゴ  オバタ（オオバコ）繊維、およびウァッキニウム  オキシコッコス（クランベリー）種子繊維からなる群から選択された天然植物繊維と共にバチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６を含む組成物を投与することによって、哺乳動物の腸における食事性肥満およびインスリン抵抗性から防護する方法にも関する。
本明細書中以下に挙げられる具体的な例は、本発明の前述の最も好ましい実施形態を例証する。
【実施例】
【０００９】
（例１）
繊維を調製する方法
トリゴネラ  フォエヌム−グラエクム（フェヌグリーク）種子繊維
トリゴネラ  フォエヌム−グラエクム（フェヌグリークとしても知られている）種子を現地市場から収集し、粉砕して粗粉末（１０メッシュを通過）とした。さらに、１００ｇのトリゴネラ  フォエヌム−グラエクム種子粗粉末に４容のｎ−ヘキサンを加え、還流温度で抽出した。ｎ−ヘキサン画分を、Ｗｈａｔｍａｎフィルターｎｏ１で濾過し、再び同じ抽出を３回行った。抽出後、残留物を８０℃で５時間乾燥させ、これを粉砕して４０メッシュを通過する粉末を得た。代替方法では、フェヌグリーク種子の脂肪または油を、液体ＣＯ２を溶媒として用いる超臨界流体抽出法によって除去した。食物繊維（ガラクトマンナン）の含有量を増やすため、フローチャートに示される通り、セルラーゼを用いて酵素加水分解を行った。ガラクトマンナン含有量は、Ｍｅｇａｚｙｍｅキット（Ｋ−ＧＡＬＭ０３／１１）を製造業者の指示通りに用いて決定した（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ、Ｂｒａｙ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐａｒｋ、Ｂｒａｙ、ウィックロー州、アイルランド）。
【００１０】
リキウム  バルバルム種子繊維
ゴジ、ゴジベリー、またはクコは、リキウム  バルバルムの果実である。リキウム  バルバルムの果実を乾燥させ、種子を取り出し、粉砕して粗粉末とした。さらに、１００ｇのリキウム  バルバルム粗粉末に４容のｎ−ヘキサンを加え、還流温度で抽出した。ｎ−ヘキサン画分を、Ｗｈａｔｍａｎフィルターｎｏ１で濾過し、再び同じ抽出を３回行った。抽出後、残留物を８０℃で５時間乾燥させ、これを粉砕して６０メッシュを通過する粉末を得た。食物繊維の総量は、酵素重量法（ＡＯＡＣ９８５．２９）によって決定した。
【００１１】
リヌム  ウシタティッシマム（アマ種子）繊維
リヌム  ウシタティッシマム（亜麻、アマニ、またはアマとしても知られている）種子を収集し、粉砕して粗粉末（１０メッシュを通過）とした。さらに、１００ｇのリヌム  ウシタティッシマム粗粉末に４容のｎ−ヘキサンを加え、還流温度で抽出した。ｎ−ヘキサン画分を、Ｗｈａｔｍａｎフィルターｎｏ１で濾過し、再び同じ抽出を３回行った。抽出後、残留物を８０℃で５時間乾燥させ、これを粉砕して４０メッシュを通過する粉末を得た。食物繊維の総量は、酵素重量法（ＡＯＡＣ９８５．２９）によって決定した。
【００１２】
ココス  ヌシフェラ繊維
成熟したココナッツを現地市場から入手し、乾燥させた。さらに、胚乳（ココナッツ果肉）を切って、粗く均一サイズの材料とした。さらに、１００ｇのココス  ヌシフェラ粗材料に４容のｎ−ヘキサンを加え、還流温度で抽出した。ｎ−ヘキサン画分を、Ｗｈａｔｍａｎフィルターｎｏ１で濾過し、再び同じ抽出を３回行った。抽出後、残留物を８０℃で５時間乾燥させ、これを粉砕して６０メッシュを通過する粉末を得た。食物繊維の総量は、酵素重量法（ＡＯＡＣ９８５．２９）によって決定した。
【００１３】
ジンギベル  オフィシナーレ（ショウガ）根茎繊維
ジンギベル  オフィシナーレ根茎、ショウガ根、または単にショウガを乾燥させ、粉砕して粗粉末（１０メッシュを通過）とした。さらに、１００ｇのジンギベル  オフィシナーレ根茎粗粉末に４容のｎ−ヘキサンを加え、還流温度で抽出した。ｎ−ヘキサン画分を、Ｗｈａｔｍａｎフィルターｎｏ１で濾過し、再び同じ抽出を３回行った。代替方法では、フェヌグリーク種子の脂肪または油を、液体ＣＯ２を溶媒として用いる超臨界流体抽出法によって除去した。抽出後、残留物を８０℃で５時間乾燥させ、これを粉砕して４０メッシュを通過する粉末を得た。食物繊維の総量は、酵素重量法（ＡＯＡＣ９８５．２９）によって決定した。
【００１４】
エンブリカ  オフィシナリス（アムラ）果実繊維
エンブリカ  オフィシナリス（フィランツス  エンブリカ（Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ  ｅｍｂｌｉｃａ））は、エンブリック、エンブリックミロバラン、ミロバラン、インディアングーズベリー、マラッカツリー、またはサンスクリット名ａｍａｌｉｋａ由来のアムラとしても知られている。エンブリカ  オフィシナリスの果実を現地市場から入手し、乾燥させ、粉砕し、６０メッシュに通した。この粉末を図２に示す通り、繊維抽出のために用いた。食物繊維の総量は、酵素重量法（ＡＯＡＣ９８５．２９）によって決定した。
【００１５】
（例２）
酸加水分解
表１に記載された植物性天然繊維２ｇを１００ｍｌのＨＣｌ（０．１０Ｍ）に溶解し、３７℃、１００ｒｐｍで１８０分間インキュベートした。０、３０、６０、９０、１２０、および１８０分の時点で試料を採取した。試験では、天然繊維との比較基準としてフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ、Ｔａｔａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インド）も用い、また対照としてデンプン（ジャガイモ可溶性デンプン、ＨｉＭｅｄｉａ、ムンバイ、インド）も用いた。還元性炭水化物の増加は、ジニトロサリチル酸試薬によって測定した（Nilsson and Bjorck 1988. Journal of Nutrition 118, 1482-1486）。
【００１６】
【表１】
0006630723.tif 000002
【００１７】
表２は、植物性天然繊維に対する酸加水分解（０．１Ｍ  ＨＣｌ、３７℃、１００ｒｐｍ）の影響を示す。還元糖の総量は、ジニトロサリチル酸（ＤＮＳＡ）によって決定した。
【００１８】
【表２】
0006630723.tif 000003
【００１９】
（例３）
酵素加水分解
１００ｍｇのブタ膵臓由来パンクレアチン４×ＵＳＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  セントルイス  ミズーリ州、アメリカ）を１００ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に溶解した。さらに、植物性天然繊維（２ｇ）を前述のパンクレアチン溶液に溶解し、３７℃、１００ｒｐｍで１８０分間インキュベートした。０、３０、６０、９０、１２０、および１８０分の時点で試料を採取した。試験では、植物性天然繊維との比較基準としてＦＯＳも用い、また対照としてデンプンも用いた。還元性炭水化物の増加は、ジニトロサリチル酸試薬によって測定した（Oku et al. 1984. Journal of Nutrition 114, 1574-1581）。植物性天然繊維に対する酵素加水分解（２０ｍＭ  ＰＢＳ中０．１％パンクレアチンｐＨ７．０、３７℃、１００ｒｐｍ）の影響を表３に示す。還元糖の総量は、ジニトロサリチル酸（ＤＮＳＡ）によって決定した。
【００２０】
【表３】
0006630723.tif 000004
【００２１】
（例４）
バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６に対する植物性天然繊維の増殖促進活性
バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の分離した単一コロニーをＭＲＳブロス（ｐＨ７．０±２０、Ｈｉｍｅｄｉａ、ムンバイ、インド）に接種し、３７℃、１２０ｒｐｍで一晩インキュベートした。植物性天然繊維単独（０．５、１．０、２．０％、ｗ／ｖ）、およびＭＲＳ培地（ブドウ糖欠除）中の前記繊維（０．５、１．０、２．０％、ｗ／ｖ）を調製した。ＭＲＳブロスおよびＭＲＳ（ブドウ糖欠除）も個別に調製した。同様に、試験では、植物性天然繊維と比較するための基準対照としてフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）も用いた。すべての培地の最終ｐＨを７．０に調整した。一晩増殖したバチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６培養菌の５％をすべてのフラスコに接種し、３７℃、１００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。インキュベーション０時間および発酵後（２４時間）の時点におけるｐＨ値も記録した。試料を滅菌生理食塩水で系列希釈し、グルコース酵母エキス寒天培地（ＨｉＭｅｄｉａ、ムンバイ、インド）にプレーティングすることで、０時間および発酵後（２４時間）の時点における生菌数を一覧表にまとめた。平板培地を３７℃で４８〜７２時間インキュベートした。各分析は、２つの異なる状況で、３連で実施された。生菌数の平均値をｌｏｇ10ｃｆｕ／ｍｌで示す（図１ａ、１ｂ、および１ｃ）。
【００２２】
（例５）
大腸菌の増殖抑制
プロバイオティック細菌であるバチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６を用いた植物性天然繊維による、病原性グラム陰性菌である大腸菌の抑制効果を評価するため、インビトロ実験を設計した。簡潔に述べると、２．０ｇの植物性天然繊維を１００ｍｌの脱イオン水に加えた。オオバコ殻繊維およびアマ種子繊維はゲル化特性が高いため、０．５ｇを１００ｍＬの脱イオン水に加えた。ｐＨを７．０±０．２に調整し、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。滅菌後、酸素還元酵素であるＯｘｙｒａｓｅ（Ｏｘｙｒａｓｅ（登録商標）ｆｏｒ  Ｂｒｏｔｈ、Ｏｘｙｒａｓｅ，Ｉｎｃ、マンスフィールド、オハイオ州、アメリカ）を各フラスコに加えた。バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６は、グルコース酵母エキス寒天培地（Ｈｉｍｅｄｉａ、ムンバイ、インド）で増殖し、大腸菌ＡＴＣＣ  ２５９２２は、トリプチケースソイ寒天培地（Ｈｉｍｅｄｉａ、ムンバイ、インド）で増殖した。両培養菌の単離した単一コロニーを用い、細菌懸濁液の濁度をＭｃＦａｒｌａｎｄ標準溶液０．５（１．５×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌと同等）に調整した。１ｍｌの大腸菌ＡＴＣＣ  ２５９２２を、植物性天然繊維を含有するフラスコに加えた。同様に、他の群では、１ｍｌの大腸菌ＡＴＣＣ  ２５９２２および１ｍｌのＢ．コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６を、植物性天然繊維を含有するフラスコに加えた。フラスコを３７℃、１００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。試料を滅菌生理食塩水で系列希釈し、エオシンメチレンブルー寒天培地（ＥＭＢ寒天培地、ＨｉＭｅｄｉａ、ムンバイ、インド）にプレーティングすることで、０時間および発酵後（２４時間）の時点における大腸菌ＡＴＣＣ  ２５９２２の生菌数を一覧表にまとめた。平板培地を３７℃で４８時間インキュベートした。各分析は、２つの異なる状況で、３連で実施された。生菌数の平均値をｌｏｇ10ｃｆｕ／ｍｌで示す（図３）。
【００２３】
（例６）
バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６による植物性天然繊維を用いたＳＣＦＡの産生
ＭｃＢｕｒｎｅｙおよびＴｈｏｍｐｓｏｎによって記載された方法（McBurney MI and Thompson LU. (1987) Effect of human faecal inoculum on in vitro fermentation variables. Brit J Nutr 58: 233-243）に若干修正を加えた下記方法によって、バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６を用いたインビトロ発酵を行った。簡潔に述べると、２．０ｇのグルコースまたは植物性天然繊維を１００ｍＬの脱イオン水に加えた。オオバコ殻繊維およびアマ種子繊維はゲル化特性が高いため、０．５ｇを１００ｍｌの脱イオン水に加えた。ｐＨを７．０±０．２に調整し、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。滅菌後、嫌気的条件を導出するため、酸素還元酵素であるＯｘｙｒａｓｅ（Ｏｘｙｒａｓｅ（登録商標）ｆｏｒ  Ｂｒｏｔｈ、Ｏｘｙｒａｓｅ，Ｉｎｃ、マンスフィールド、オハイオ州、アメリカ）を各フラスコに加えた。一晩増殖したバチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６培養菌の５％をすべてのフラスコに接種し、３７℃、穏やかな振とうｒｐｍで２４時間インキュベートした。ボトルを密閉し、パラフィルムで封をし、酵素補充によって生じた嫌気的条件を維持した。インキュベーション０時間および発酵後（２４時間）の時点におけるｐＨ値も記録した。１ｍｌの硫酸銅（１０ｇ／Ｌ）を各試料に加え、微生物がさらに増殖することを抑制した（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ）。前述の発酵試料中の短鎖脂肪酸の分析は、下記パラメーターを採用して行った。
【００２４】
試薬
１．ジエチルエーテル（ＡＲグレード）
２．Ｈ2ＳＯ4
３．ＲＯ水
４．塩化ナトリウム（ＡＲグレード）
クロマトグラフィーの条件
オーブン：
【００２５】
【表４】
0006630723.tif 000005
１．ポストラン温度    ２２０℃
２．ポスト時間    ５．０分
３．保持時間    １８．００分
注入
【００２６】
【表５】
0006630723.tif 000006
【００２７】
カラム
１．ＤＢ−ＦＦＡＰ（テレフタル酸修飾ポリエチレングリコール）
２．寸法：３０．００ｍ×２５０．００ｍｍ×０．２５μｍ。
３．キャリアガス：窒素
４．流量：１．０ｍｌ／分
検出器
１．種類    ＦＩＤ
２．温度    ３５０℃
３．水素流量    ３０．０ｍｌ／分
４．空気流量    ３００．０ｍｌ／分
５．メークアップ流量    ５．０ｍｌ／分
【００２８】
標準溶液の調製
各脂肪酸標準品（酢酸、プロピオン酸、および酪酸）を正確に１００．０ｍｇ量り、１００ｍｌメスフラスコに入れ、５０．０ｍＬの水に溶かし、標線まで水を補給し、よく混合した（ストック溶液）。さらに、ストック溶液１０．０ｍＬを水で１００．０ｍＬに希釈し、よく混合して標準溶液とした。本明細書中以下に記載されている通り、５ｍｌの標準溶液の抽出を行った。
【００２９】
１．標準溶液／試料を５ｍＬ取る。
２．０．５分間ボルテックスしながら、標準溶液に５ｍｌの水を加えた。
３．０．５分間ボルテックスしながら、３Ｍ  Ｈ2ＳＯ4でｐＨを１〜１．５に調整した。
４．１時間前までに−２０℃に保ったジエチルエーテルを試料／実用標準溶液に加えた。
５．１分間ボルテックスしながら、１０ｍｌのジエチルエーテルを加えた。
６．１分間ボルテックスしながら、４ｇの塩化ナトリウムを加えた。
７．遠心分離して、水層とジエチル層に分離した。
８．１．０ｍＬのジエチルエーテル層をＧＣバイアルに移し、注入した。
【００３０】
手順：
抽出した標準溶液を１μＬずつ３回クロマトグラフに注入し、酢酸、プロピオン酸、および酪酸による主要ピークの応答を記録した。３回の注入で得られた酢酸、プロピオン酸、および酪酸によるピーク面積の相対標準偏差％は、２．０％を超えるべきではない。抽出した試料溶液を１．０μＬずつクロマトグラフに注入した。酢酸、プロピオン酸、および酪酸の含有量を以下の通り算出した。
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クロマトグラフ分析の結果を図４に示す。
【００３１】
本発明は、好ましい実施形態を参照して記載されているが、本発明がこれに限定されるものではないことは、当業者に明確に理解されている。むしろ、本発明の範囲は、添付した特許請求の範囲に関連してのみ解釈されたものである。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の生菌コロニー数を増加させる方法であって、トリゴネラ  フォエヌム−グラエクム（フェヌグリーク）種子繊維、リキウム  バルバルム種子繊維、リヌム  ウシタティッシマム（アマ）種子繊維、ココス  ヌシフェラ（ココナッツ）繊維、ジンギベル  オフィシナーレ（ショウガ）根茎繊維、エンブリカ  オフィシナリス（アムラ）果実繊維、プランタゴ  オバタ（オオバコ）繊維、およびウァッキニウム  オキシコッコス（クランベリー）種子繊維からなる群から選択された天然植物繊維の存在下で、バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６を増殖させるステップを含む、方法。
〔２〕病原性グラム陰性菌を抑制する方法であって、前記グラム陰性菌を、トリゴネラ  フォエヌム−グラエクム（フェヌグリーク）種子繊維、リキウム  バルバルム種子繊維、リヌム  ウシタティッシマム（アマ）種子繊維、ココス  ヌシフェラ（ココナッツ）繊維、ジンギベル  オフィシナーレ（ショウガ）根茎繊維、エンブリカ  オフィシナリス（アムラ）果実繊維、プランタゴ  オバタ（オオバコ）繊維、およびウァッキニウム  オキシコッコス（クランベリー）種子繊維からなる群から選択された天然植物繊維と共に培養したバチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６と接触させるステップを含む、方法。
〔３〕バチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６を、トリゴネラ  フォエヌム−グラエクム（フェヌグリーク）種子繊維、リキウム  バルバルム種子繊維、リヌム  ウシタティッシマム（アマ）種子繊維、ココス  ヌシフェラ（ココナッツ）繊維、ジンギベル  オフィシナーレ（ショウガ）根茎繊維、エンブリカ  オフィシナリス（アムラ）果実繊維、プランタゴ  オバタ（オオバコ）繊維、およびウァッキニウム  オキシコッコス（クランベリー）種子繊維からなる群から選択された天然植物繊維と共に培養することによって、短鎖脂肪酸を産生する方法。
〔４〕食事性肥満およびインスリン抵抗性からの防護効果をもたらすために、トリゴネラ  フォエヌム−グラエクム（フェヌグリーク）種子繊維、リキウム  バルバルム種子繊維、リヌム  ウシタティッシマム（アマ）種子繊維、ココス  ヌシフェラ（ココナッツ）繊維、ジンギベル  オフィシナーレ（ショウガ）根茎繊維、エンブリカ  オフィシナリス（アムラ）果実繊維、プランタゴ  オバタ（オオバコ）繊維、およびウァッキニウム  オキシコッコス（クランベリー）種子繊維からなる群から選択された天然植物繊維と共にバチルス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６を含む組成物を投与することによって、哺乳動物の腸における食事性肥満およびインスリン抵抗性から防護する方法。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４】
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