(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO: 1が、
X14がSであり、
X23が任意のアミノ酸、好ましくはS、R、またはN、より好ましくはSであり得、
X50がSであり、
X1が存在していないか、または任意のアミノ酸、とりわけMであり得、
X82が任意のアミノ酸、好ましくはTまたはIであり得、
X122が任意のアミノ酸、好ましくはIまたはMであり得、
X149が任意のアミノ酸、好ましくはMまたはPであり得、
X154が任意のアミノ酸、好ましくはLまたはTであり得、
X160が任意のアミノ酸、好ましくはAまたはTであり得、
X167が任意のアミノ酸、好ましくはIまたはLであり得、
X179が任意のアミノ酸、好ましくはNまたはFであり得、
X180が任意のアミノ酸、好ましくはMまたはEであり得、
X186が任意のアミノ酸、好ましくはVまたはYであり得、
X206が任意のアミノ酸、好ましくはA、N、またはVであり得、
X212が任意のアミノ酸、好ましくはTまたはNであり得、
X224が任意のアミノ酸、好ましくはPまたはQであり得、
X230が任意のアミノ酸、好ましくはNまたはYであり得、
X232が任意のアミノ酸、好ましくはSまたはTであり得る；
ことを特徴とするポリペプチドであって、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列のいずれも含まない、前記ポリペプチド。
【請求項２】
X23がSである、
X82がIである、
X122がMである、
X149がPである、
X154がTである、
X160がTである、
X167がLである、
X179がFである、
X180がEである、
X186がYである、
X206がNもしくはVである、
X212がNである、
X224がQである、
X230がYである、および／または
X232がTである、
ことのうちの少なくとも1つを呈する、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
X23がSである、請求項1または2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
X82がTまたはIであり、
X122がIまたはMであり、
X149がMまたはPであり、
X154がLまたはTであり、
X160がAまたはTであり、
X167がIまたはLであり、
X179がNまたはFであり、
X180がMまたはEであり、
X186がVまたはYであり、
X206がA、N、またはVであり、
X212がTまたはNであり、
X224がPまたはQであり、
X230がNまたはYであり、
X232がSまたはTである、
請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
SEQ ID NO: 6、9〜28、および31〜49からなる群より選択される配列を含む、請求項1〜2のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
KRKおよびSEQ ID NO: 50〜120からなる群より選択される少なくとも1つの追加的なアミノ酸配列ストレッチを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
SMAP-29、SEQ ID NO: 76のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの追加的なアミノ酸配列ストレッチを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
SEQ ID NO: 121〜134からなる群より選択される配列を含むか、またはSEQ ID NO: 136、139〜143、および146〜149からなる群より選択される配列を含む、請求項1〜2のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
グラム陰性細菌、とりわけシュードモナス属（Pseudomonas）細菌および／またはカンピロバクター属（Campylobacter）細菌のペプチドグリカンを分解する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
SEQ ID NO: 140の配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90％の配列同一性を呈するアミノ酸配列を含むポリペプチドに関連する。前記ポリペプチドは、好ましくは、グラム陰性細菌、とりわけシュードモナス属（Pseudomonas）細菌および／またはカンピロバクター属（Campylobacter）細菌のペプチドグリカンを分解する。加えて、本発明は、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのような核酸を含むベクター、および対応する宿主細胞に関連する。最後に、本発明は、本発明によるそのようなポリペプチド、核酸、ベクター、および／または宿主細胞を含む組成物に関連する。
【背景技術】
【０００２】
巨大な溶解性ミオウイルス科（Myoviridae）バクテリオファージφKZ（280 334 bp）は、多くの一般的に使用される抗生物質に対して耐性の重要な日和見院内病原体でありしたがって病院環境において考慮すべき懸念の原因であるシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）に感染する。2007年に、Briers et al.（Molecular Microbiology (2007) 65(5), 1334-1344）（非特許文献1）は、前記バクテリオファージのゲノムを配列決定し、溶解性が高いペプチドグリカンヒドロラーゼであるエンドリシンKZ144を同定した。国際公開公報第2010/149792号（特許文献1）において、前記エンドリシンの配列を酵素エレメントとして含む融合タンパク質が、グラム陰性細菌の細胞壁を分解する用途について提案されている。
【０００３】
前記エンドリシンおよび融合タンパク質は、概して有効であるが、いくつかの技術的応用について、エンドリシンポリペプチドが、とりわけ安定性および加工処理の観点で最適に及ばない特徴を呈することが判明した。したがって、この点において好ましく改善された特徴を呈するさらなるエンドリシン酵素について、当技術分野において必要性がある。本発明の課題は、したがって、そのようなポリペプチドを提供することであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開公報第2010/149792号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Briers et al. Molecular Microbiology (2007) 65(5), 1334-1344
【発明の概要】
【０００６】
課題は、添付の特許請求の範囲に示されている内容によって解決される。
[本発明1001]
SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90％の配列同一性を呈するアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO: 1が、
X1が存在していないか、または任意のアミノ酸、とりわけMであり得、
X14が任意のアミノ酸、好ましくはS、R、またはN、より好ましくはSまたはRであり得、
X23が任意のアミノ酸、好ましくはS、R、またはN、より好ましくはSであり得、
X50が任意のアミノ酸、好ましくはS、R、またはN、より好ましくはSまたはNであり得、
X82が任意のアミノ酸、好ましくはTまたはIであり得、
X122が任意のアミノ酸、好ましくはIまたはMであり得、
X149が任意のアミノ酸、好ましくはMまたはPであり得、
X154が任意のアミノ酸、好ましくはLまたはTであり得、
X160が任意のアミノ酸、好ましくはAまたはTであり得、
X167が任意のアミノ酸、好ましくはIまたはLであり得、
X179が任意のアミノ酸、好ましくはNまたはFであり得、
X180が任意のアミノ酸、好ましくはMまたはEであり得、
X186が任意のアミノ酸、好ましくはVまたはYであり得、
X206が任意のアミノ酸、好ましくはA、N、またはVであり得、
X212が任意のアミノ酸、好ましくはTまたはNであり得、
X224が任意のアミノ酸、好ましくはPまたはQであり得、
X230が任意のアミノ酸、好ましくはNまたはYであり得、
X232が任意のアミノ酸、好ましくはSまたはTであり得る；
ことを特徴とするポリペプチドであって、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列のいずれも含まない、ポリペプチド。
[本発明1002]
SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90％の配列同一性を呈するアミノ酸配列において、
X14がCではない、
X23がCではない、
X50がCではない、
X82がIである、
X122がMである、
X149がPである、
X154がTである、
X160がTである、
X167がLである、
X179がFである、
X180がEである、
X186がYである、
X206がNもしくはVである、
X212がNである、
X224がQである、
X230がYである、および／または
X232がTである、
ことのうちの少なくとも1つを呈する、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1003]
X14がS、R、またはN、より好ましくはSまたはRであり、
X23がS、R、またはN、より好ましくはSであり、
X50がS、R、またはN、より好ましくはSまたはNであり、
X82がTまたはIであり、
X122がIまたはMであり、
X149がMまたはPであり、
X154がLまたはTであり、
X160がAまたはTであり、
X167がIまたはLであり、
X179がNまたはFであり、
X180がMまたはEであり、
X186がVまたはYであり、
X206がA、N、またはVであり、
X212がTまたはNであり、
X224がPまたはQであり、
X230がNまたはYであり、
X232がSまたはTである、
本発明1001または1002のポリペプチド。
[本発明1004]
SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90％の配列同一性を呈する配列が、X1、X14、X23、X50、X82、X122、X149、X154、X160、X167、X179、X180、X186、X206、X212、X224、X230、および／またはX232から選択される1つまたは複数の残基でのみ、本発明1002〜1003において定義されるようにSEQ ID NO: 1の配列から逸脱している、前記本発明1002〜1003のいずれかのポリペプチド。
[本発明1005]
SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90％の配列同一性を呈するアミノ酸配列において、115位にグルタミン酸残基を呈する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1006]
SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、少なくとも約99.5％、またはさらに100％の配列同一性を呈する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1007]
SEQ ID NO: 1の配列を含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1008]
X14がCではない、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1009]
X23がCではない、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1010]
X50がCではない、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1011]
X14およびX23がCではない、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1012]
X14およびX50がCではない、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1013]
X23およびX50がCではない、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1014]
X14もX23もX50もいずれもCではない、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1015]
X14がSである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1016]
X14がRである、前記本発明1001〜1014のいずれかのポリペプチド。
[本発明1017]
X23がSである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1018]
X50がSである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1019]
X50がNである、前記本発明1001〜1017のいずれかのポリペプチド。
[本発明1020]
X14およびX23がSである、前記本発明1001〜1015および1017〜1019のいずれかのポリペプチド。
[本発明1021]
X14およびX50がSである、前記本発明1001〜1015、1017、および1018のいずれかのポリペプチド。
[本発明1022]
X23およびX50がSである、前記本発明1001〜1018のいずれかのポリペプチド。
[本発明1023]
X14、X23、およびX50がSである、前記本発明1001〜1015、1017、および1018のいずれかのポリペプチド。
[本発明1024]
X14がRであり、かつX50がSである、本発明1016のポリペプチド。
[本発明1025]
X14がSであり、かつX50がNである、本発明1015のポリペプチド。
[本発明1026]
X14がRであり、かつX50がNである、本発明1016のポリペプチド。
[本発明1027]
X149がPである、本発明1016のポリペプチド。
[本発明1028]
X160がTである、本発明1027のポリペプチド。
[本発明1029]
X82がIである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1030]
X122がMである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1031]
X149がPである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1032]
X154がTである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1033]
X160がTである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1034]
X167がLである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1035]
X179がFである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1036]
X180がEである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1037]
X186がYである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1038]
X206がVである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1039]
X206がNである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1040]
X212がNである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1041]
X224がQである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1042]
X230がYである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1043]
X232がTである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1044]
X122がMであり、かつX160がTである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1045]
X82がIであり、X206がVであり、かつX232がTである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1046]
X160がAである、本発明1027のポリペプチド。
[本発明1047]
X122がMであり、かつX160がTである、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1048]
X122がMである、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1049]
X122がMであり、かつX160がTである、本発明1021のポリペプチド。
[本発明1050]
X14がSであり、かつX50がSである、本発明1047のポリペプチド。
[本発明1051]
X82がIであり、X206がNであり、かつX232がTである、本発明1049のポリペプチド。
[本発明1052]
X149がPである、本発明1051のポリペプチド。
[本発明1053]
M180がEである、本発明1051のポリペプチド。
[本発明1054]
X186がYである、本発明1051のポリペプチド。
[本発明1055]
X230がYである、本発明1051のポリペプチド。
[本発明1056]
X82がIであり、X122がMであり、X206がVであり、かつX232がTである、本発明1024のポリペプチド。
[本発明1057]
X160がTである、本発明1056のポリペプチド。
[本発明1058]
X149がPである、本発明1056または1057のポリペプチド。
[本発明1059]
X82がIであり、X122がMであり、X160がTであり、X206がVであり、かつX232がTである、本発明1024のポリペプチド。
[本発明1060]
X82がIであり、X122がMであり、X160がTであり、X206がVであり、かつX232がTである、本発明1025のポリペプチド。
[本発明1061]
X82がIであり、X122がMであり、X149がPであり、X206がVであり、かつX232がTである、本発明1026のポリペプチド。
[本発明1062]
X167がLである、本発明1061のポリペプチド。
[本発明1063]
X179がFである、本発明1061のポリペプチド。
[本発明1064]
X212がNである、本発明1061のポリペプチド。
[本発明1065]
X224がQである、本発明1061のポリペプチド。
[本発明1066]
X154がTである、本発明1061のポリペプチド。
[本発明1067]
X1がMではない、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1068]
SEQ ID NO: 1が、SEQ ID NO: 6〜49からなる群より選択される配列である、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1069]
SEQ ID NO: 6〜49からなる群より選択される配列を含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1070]
両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、天然に存在する抗微生物ペプチド、スシ（sushi）ペプチド、およびデフェンシンからなる群より選択される、少なくとも1つのアミノ酸配列ストレッチを追加的に含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1071]
両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、天然に存在する抗微生物ペプチド、スシペプチド、およびデフェンシンの群より選択される、少なくとも2つの別個のアミノ酸配列ストレッチを含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1072]
少なくとも1つのアミノ酸配列ストレッチが、ポリペプチドのN末端またはC末端に存在している、本発明1070〜1071のいずれかのポリペプチド。
[本発明1073]
KRKおよびSEQ ID NO: 50〜120からなる群より選択される少なくとも1つの追加的なアミノ酸配列ストレッチを含む、前記本発明1070〜1072のいずれかのポリペプチド。
[本発明1074]
SMAP-29、SEQ ID NO: 76のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの追加的なアミノ酸配列ストレッチを含む、前記本発明1070〜1073のいずれかのポリペプチド。
[本発明1075]
SMAP-29、SEQ ID NO: 76の配列が、ポリペプチドにおいて、配列SEQ ID NO: 1と少なくとも約90％の配列同一性を呈する配列のN末端に位置している、本発明1074のポリペプチド。
[本発明1076]
SEQ ID NO: 121〜134のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも91.5％の配列同一性を呈するアミノ酸を含み、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列のいずれも含まない、本発明1070〜1075のいずれかのポリペプチド。
[本発明1077]
SEQ ID NO: 121〜134のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約98.5％、少なくとも約98.75％、少なくとも約99％、または少なくとも約99.5％の配列同一性を呈するアミノ酸配列を含む、本発明1076のポリペプチド。
[本発明1078]
SEQ ID NO: 121〜134からなる群より選択される配列を含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1079]
タグ配列を追加的に含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1080]
タグが、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも90％の配列同一性を呈するアミノ酸配列のC末端に位置している、本発明1079のポリペプチド。
[本発明1081]
タグが、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも90％の配列同一性を呈するアミノ酸配列に、直接、または、1〜10アミノ酸残基、好ましくは1〜5アミノ酸残基、さらにより好ましくは1〜2アミノ酸の短いリンカーを介して連結されている、本発明1079〜1080のいずれかのポリペプチド。
[本発明1082]
His-タグ、好ましくはSEQ ID NO: 135のHisタグを含む、本発明1079〜1081のいずれかのポリペプチド。
[本発明1083]
SEQ ID NO: 136〜149のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも91.5％の配列同一性を呈するアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列のいずれも含まない、本発明1079〜1082のいずれかのポリペプチド。
[本発明1084]
SEQ ID NO: 136〜149のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約98.5％、少なくとも約98.75％、少なくとも約99％、または少なくとも約99.5％の配列同一性を呈するアミノ酸配列を含む、本発明1083のポリペプチド。
[本発明1085]
約320アミノ酸を超えない、好ましくは約310アミノ酸を超えない全体の長さを有する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1086]
SEQ ID NO: 136〜149からなる群より選択される配列を含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1087]
グラム陰性細菌、とりわけシュードモナス属（Pseudomonas）細菌および／またはカンピロバクター属（Campylobacter）細菌のペプチドグリカンを分解する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1088]
本発明1001〜1087のいずれかのポリペプチドをコードする、核酸。
[本発明1089]
本発明1088の核酸を含む、ベクター。
[本発明1090]
本発明1001〜1087のいずれかのポリペプチド、本発明1088の核酸、および／または本発明1089のベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1091]
本発明1001〜1087のいずれかのポリペプチド、本発明1088の核酸、本発明1089のベクター、および／または本発明1090の宿主細胞を含む、組成物。
[本発明1092]
薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体を含む薬学的組成物である、本発明1091の組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
以下に、添付の図面の簡単な説明を示す。図面は、本発明をより詳細に例証するように意図される。しかしながら、それらは、本発明の内容をいかなる程度までも限定するようには意図されない。
【図１ａ】以下を示す：  SEQ ID NO: 1。  SEQ ID NO: 2  N末端のメチオニンを有さないKZ144エンドリシン。  SEQ ID NO: 3  N末端のメチオニンを有さず、メチオニン残基の代わりにセレノメチオニン残基を有するKZ144エンドリシン。  SEQ ID NO: 4  E115A変異を有し、N末端のメチオニンを有さないKZ144エンドリシン。
【図１ｂ】以下を示す：  SEQ ID NO: 5  KZ144エンドリシン。
【図２ａ】以下を示す：  SEQ ID NO: 136  SMAP-29（実線の下線；SEQ ID NO: 76）、N末端のメチオニンを有さず、C14SおよびC50Sを有する改変されたKZ144（一点鎖線（semi-dotted/semi-solid line）の下線；SEQ ID NO: 28）、ならびにHis-タグ（点線の下線；SEQ ID NO: 135）の融合タンパク質。  SEQ ID NO: 137   SMAP-29（実線の下線；SEQ ID NO: 76）、N末端のメチオニンを有さず、T82I、A206V、およびS232Tを有する改変されたKZ144（一点鎖線の下線；SEQ ID NO: 29）、ならびにHis-タグ（点線の下線；SEQ ID NO: 135）の融合タンパク質。  SEQ ID NO: 138   SMAP-29（実線の下線；SEQ ID NO: 76）、N末端のメチオニンを有さず、T82I、A206V、S232T、I122M；およびA160Tを有する改変されたKZ144（一点鎖線の下線；SEQ ID NO: 30）、ならびにHis-タグ（点線の下線；SEQ ID NO: 135）の融合タンパク質。  SEQ ID NO: 139   SMAP-29（実線の下線；SEQ ID NO: 76）、N末端のメチオニンを有さず、C14S、C50S、I122M；およびA160Tを有する改変されたKZ144（一点鎖線の下線；SEQ ID NO: 31）、ならびにHis-タグ（点線の下線；SEQ ID NO: 135）の融合タンパク質。
【図２ｂ】以下を示す：  SEQ ID NO: 140   SMAP-29（実線の下線；SEQ ID NO: 76）、N末端のメチオニンを有さず、C14S、C23S、およびC50Sを有する改変されたKZ144（一点鎖線の下線；SEQ ID NO: 32）、ならびにHis-タグ（点線の下線；SEQ ID NO: 135）の融合タンパク質。  SEQ ID NO: 141   SMAP-29（実線の下線；SEQ ID NO: 76）、N末端のメチオニンを有さず、T82I、A206V、S232T、I122M；A160T、C14S、およびC50Sを有する改変されたKZ144（一点鎖線の下線；SEQ ID NO: 33）、ならびにHis-タグ（点線の下線；SEQ ID NO: 135）の融合タンパク質。  SEQ ID NO: 142   SMAP-29（実線の下線；SEQ ID NO: 76）、N末端のメチオニンを有さず、T82I、A206N、S232T、I122M；A160T、C14S、およびC50Sを有する改変されたKZ144（一点鎖線の下線；SEQ ID NO: 49）、ならびにHis-タグ（点線の下線；SEQ ID NO: 135）の融合タンパク質。  SEQ ID NO: 151   SMAP-29（実線の下線；SEQ ID NO: 76）、N末端のメチオニンを有さないKZ144（一点鎖線の下線；SEQ ID NO: 2）、およびHis-タグ（点線の下線；SEQ ID NO: 135）の融合タンパク質。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
第1の局面において、本発明は、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90％の配列同一性を呈するアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO: 1が、
X1が存在していないか、または任意のアミノ酸、とりわけMであり得、
X14が任意のアミノ酸、好ましくはS、R、またはN、より好ましくはSまたはRであり得、
X23が任意のアミノ酸、好ましくはS、R、またはN、より好ましくはSであり得、
X50が任意のアミノ酸、好ましくはS、R、またはN、より好ましくはSまたはNであり得、
X82が任意のアミノ酸、好ましくはTまたはIであり得、
X122が任意のアミノ酸、好ましくはIまたはMであり得、
X149が任意のアミノ酸、好ましくはMまたはPであり得、
X154が任意のアミノ酸、好ましくはLまたはTであり得、
X160が任意のアミノ酸、好ましくはAまたはTであり得、
X167が任意のアミノ酸、好ましくはIまたはLであり得、
X179が任意のアミノ酸、好ましくはNまたはFであり得、
X180が任意のアミノ酸、好ましくはMまたはEであり得、
X186が任意のアミノ酸、好ましくはVまたはYであり得、
X206が任意のアミノ酸、好ましくはA、N、またはVであり得、
X212が任意のアミノ酸、好ましくはTまたはNであり得、
X224が任意のアミノ酸、好ましくはPまたはQであり得、
X230が任意のアミノ酸、好ましくはNまたはYであり得、
X232が任意のアミノ酸、好ましくはSまたはTであり得る；
ことを特徴とするポリペプチドであって、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列のいずれも含まない、ポリペプチドに関連する。
【０００９】
本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語は、とりわけ、特定の配列においてペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリペプチドのアミノ酸残基は、例えば、糖質およびリン酸などの種々の基の共有結合性付加によって改変されていてもよい。ヘムまたは脂質などの他の物質が、ポリペプチドとより緩やかに会合していてもよく、本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語にまた含まれる複合ポリペプチドを生じる。本明細書において使用される用語は、タンパク質もまた包含するように意図される。したがって、「ポリペプチド」という用語はまた、例えば、2つ以上のアミノ酸ポリマー鎖の複合体も包含する。「ポリペプチド」という用語は、当技術分野において典型的に使用される改変、例えば、ビオチン化、アセチル化、ペグ化、アミノ基、SH基、またはカルボキシル基の化学的変化（例えば、保護基）などを任意で呈する、ポリペプチドの態様を包含する。下記の説明から明らかになるであろうように、本発明によるポリペプチドはまた、融合タンパク質、すなわち、天然ではこの組み合わせで生じない少なくとも2つのアミノ酸配列の連結であってもよい。本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語は、特定の長さのアミノ酸ポリマー鎖に限定されないが、典型的に、ポリペプチドは、約50アミノ酸より長い、約100アミノ酸より長い、またはさらに約150アミノ酸より長い長さを呈することになる。通常、しかし非必然的に、本発明の典型的なポリペプチドは、長さが約750アミノ酸を超えないことになる。
【００１０】
本明細書において使用される際、「％配列同一性」という用語は、以下のように理解されなければならない：比較するべき2つの配列を、配列の間に最大の相関が生じるように整列させる。これは、アラインメントの程度を増強するために、いずれかの1つの配列または両方の配列に「ギャップ」の挿入を含んでもよい。％同一性を次に、同じまたは類似した長さの配列に特に適している、比較する配列の各々の全長にわたって決定してもよいし（いわゆるグローバルアラインメント）、または、等しくない長さの配列により適している、より短い定義された長さにわたって決定してもよい（いわゆるローカルアラインメント）。上記の文脈において、クエリーアミノ酸配列に対して少なくとも、例えば95％の「配列同一性」を有するアミノ酸配列は、対象アミノ酸配列がクエリーアミノ酸配列の各100アミノ酸当たり5個までのアミノ酸変更を含み得ることを除いて、対象アミノ酸配列の配列がクエリー配列と同一であることを意味するように意図される。換言すると、クエリーアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一性の配列を有するアミノ酸配列を得るために、対象配列において5％（100個のうち5個）までのアミノ酸残基を、挿入してもよく、または別のアミノ酸と置換してもよく、または欠失させてもよい。2つ以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法は、当技術分野において周知である。2つの配列が同一であるパーセンテージは、例えば、数学アルゴリズムを用いることによって決定することができる。用いることができる数学アルゴリズムの、好ましいが非限定的な例は、Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、NCBIのホームページ（ワールドワイドウェブサイトncbi.nlm.nih.gov）を通してアクセス可能なBLASTファミリーのプログラム、例えば、BLASTまたはNBLASTプログラム（Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410またはAltschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402も参照されたい）、およびFASTA（Pearson (1 990), Methods Enzymol. 83, 63-98；Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448.）に組み込まれている。ある程度まで他の配列と同一である配列は、これらのプログラムによって同定することができる。さらに、Wisconsin Sequence Analysis Package、バージョン9.1（Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Res., 387-395）において利用可能なプログラム、例えば、プログラムBESTFITおよびGAPを使用して、2つのポリペプチド配列間の％同一性を決定してもよい。BESTFITは、（Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197.）の「局所相同性」アルゴリズムを使用し、2つの配列間の類似性の最良の単一領域を見出す。本明細書において、参照配列に対して特定の程度の配列同一性を共有するアミノ酸配列に言及がなされる場合、配列におけるこの違いは、好ましくは、保存的アミノ酸置換によるものである。好ましくは、そのような配列は、例えば、場合によってはたとえより遅い速度であっても、参照配列の活性を保持している。加えて、本明細書において、「少なくとも」ある特定のパーセンテージの配列同一性を共有する配列に言及がなされる場合、100％配列同一性は、好ましくは包含されない。
【００１１】
本明細書において使用される「保存的アミノ酸置換」は、群のメンバー間の置換が、分子の生物学的活性を保存することになるように、十分に類似した物理化学特性を有するアミノ酸の群内で起こり得る（例えば、Grantham, R. (1974), Science 185, 862-864を参照されたい）。特に、保存的アミノ酸置換は、好ましくは、アミノ酸が、同じ種類のアミノ酸（例えば、塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、正または負に荷電した側鎖を有するアミノ酸、側鎖に芳香族基を有するアミノ酸、水素結合中に入り得る側鎖、例えば、ヒドロキシル機能をもつ側鎖を有するアミノ酸など）に由来する置換である。保存的置換は、本発明の事例において、例えば、塩基性アミノ酸残基（Lys、Arg、His）を別の塩基アミノ酸残基（Lys、Arg、His）と置換すること、脂肪族アミノ酸残基（Gly、Ala、Val、Leu、Ile）を別の脂肪族アミノ酸残基と置換すること、芳香族アミノ酸残基（Phe、Tyr、Trp）を別の芳香族アミノ酸残基と置換すること、スレオニンをセリンによって、またはロイシンをイソロイシンによって置換することである。さらなる保存的アミノ酸交換が、当業者に公知であろう。
【００１２】
本明細書において使用される「欠失」という用語は、好ましくは、配列内（intrasequentially）またはN末端もしくはC末端のいずれかでの、それぞれの参照配列と比較した、誘導配列における1、2、3、4、5個の（またはさらに5個より多い）連続したアミノ酸残基の欠如を指す。
【００１３】
本明細書において使用される「挿入」という用語は、好ましくは、それぞれの参照配列と比較した、誘導配列における1、2、3、4、5個の（またはさらに5個より多い）連続したアミノ酸残基の付加的な配列内の存在を指す。
【００１４】
本明細書において使用される「付加」という用語は、好ましくは、それぞれの参照配列と比較した、誘導配列のN末端および／またはC末端での1、2、3、4、5個の（またはさらに5個より多い）連続したアミノ酸残基の付加的な存在を指す。
【００１５】
本明細書において使用される「置換」という用語は、参照配列における対応する位置に存在しているかまた存在していないアミノ酸残基とは異なる、誘導配列のある特定の位置のアミノ酸残基の存在を指す。上述のように、好ましくは、そのような置換は保存的置換である。
【００１６】
本明細書において使用される「細胞壁」という用語は、グラム陰性細菌の外側の細胞の囲いを形成し、したがってそれらの完全性を保証するすべての構成要素を指す。とりわけ、本明細書において使用される「細胞壁」という用語は、ペプチドグリカン、リポ多糖を含むグラム陰性細菌の外膜、細菌細胞膜を指すが、例えば、莢膜、外側タンパク質層、または粘液などのペプチドグリカン上に付着した追加的な層もまた指す。
【００１７】
本明細書において使用される「アミノ酸配列ストレッチ」という用語は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列中のアミノ酸配列の特定のストレッチを指す。前記配列は、カチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、疎水性ペプチド、スシ（sushi）ペプチド、および／または抗微生物ペプチドの配列を指す。用語は、His5-タグ、His6-タグ、His7-タグ、His8-タグ、His9-タグ、His10-タグ、His11-タグ、His12-タグ、His16-タグ、およびHis20-タグなどのHis-タグ、Strep-タグ、Avi-タグ、Myc-タグ、Gst-タグ、JS-タグ、システイン-タグ、FLAG-タグ、もしくは当技術分野において公知である他のタグ、チオレドキシン、またはマルトース結合タンパク質（MBP）のような従来のタグを指さない。好ましくは、本明細書において使用されるアミノ酸配列ストレッチは、約6〜約39アミノ酸残基の長さを有する。
【００１８】
本明細書において使用される際、「カチオン性ペプチド」という用語は、好ましくは、正に荷電したアミノ酸残基を有するペプチドを指す。好ましくは、カチオン性ペプチドは、9.0またはそれより大きいpKa値を有する。典型的には、カチオン性ペプチドのアミノ酸残基のうちの少なくとも4個が、正に荷電し得、例えば、リジンまたはアルギニンであり得る。「正に荷電した」とは、ほぼ生理学的条件で正味の正電荷を有するアミノ酸残基の側鎖を指す。本明細書において使用される「カチオン性ペプチド」という用語はまた、ポリカチオン性ペプチドも指すが、例えば、20％未満、好ましくは10％未満の正に荷電したアミノ酸残基を含むカチオン性ペプチドもまた含む。
【００１９】
本明細書において使用される「ポリカチオン性ペプチド」という用語は、好ましくは、大部分が正に荷電したアミノ酸残基、とりわけリジンおよび／またはアルギニン残基で構成されているペプチドを指す。アミノ酸残基の少なくとも約20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、または約100％が、正に荷電したアミノ酸残基、とりわけリジンおよび／またはアルギニン残基である場合に、ペプチドは、大部分が正に荷電したアミノ酸残基で構成されている。正に荷電したアミノ酸残基ではないアミノ酸残基は、中性の電荷のアミノ酸残基、および／または負に荷電したアミノ酸残基、および／または疎水性アミノ酸残基であり得る。好ましくは、正に荷電したアミノ酸残基ではないアミノ酸残基は、中性の電荷のアミノ酸残基、とりわけセリンおよび／またはグリシンである。
【００２０】
本明細書において使用される「抗微生物ペプチド」（AMP）という用語は、好ましくは、例えば、細菌、ウイルス、真菌、酵母、マイコプラズマ、および原生動物に対して殺微生物活性および／または静微生物（microbistatic）活性を有する、任意の天然に存在するペプチドを指す。したがって、本明細書において使用される「抗微生物ペプチド」という用語は、とりわけ、抗細菌、抗真菌、抗糸状菌、抗寄生生物、抗原生動物、抗ウイルス、抗感染性、抗伝染性、および／または殺菌、殺藻、殺アメーバ、殺微生物、殺細菌、殺真菌、殺寄生生物、殺原生動物、殺原虫特性を有する任意のペプチドを指す。抗細菌ペプチドが、好ましい。抗微生物ペプチドは、RNアーゼAスーパーファミリーのメンバー、デフェンシン、カテリシジン、グラニュライシン、ヒスタチン、ソリアシン、ダームシジン、またはヘプシジンであり得る。抗微生物ペプチドは、昆虫、魚、植物、クモ形類動物、脊椎動物、または哺乳動物に天然に存在し得る。好ましくは、抗微生物ペプチドは、昆虫、魚、植物、クモ形類動物、脊椎動物、または哺乳動物に天然に存在し得る。好ましくは、抗微生物ペプチドは、ラディッシュ、カイコガ、コモリグモ、カエル、好ましくはアフリカツメガエル（Xenopus laevis）、アカガエル属のカエル、より好ましくはウシガエル（Rana catesbeiana）、ヒキガエル、好ましくはアジアヒキガエル（Bufo gargarizans）、ハエ、好ましくはショウジョウバエ属（Drosophila）、より好ましくはキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）、ミツバチ、マルハナバチ（bumblebee）、好ましくはマルハナバチ（Bombus pascuorum）、ニクバエ、好ましくはセンチニクバエ（Sarcophaga peregrine）、サソリ、カブトガニ、ナマズ（catfish）、好ましくはナマズ（Parasilurus asotus）、雌牛、豚（pig）、ヒツジ、ブタ（porcine）、ウシ、サル、およびヒトに天然に存在し得る。本明細書において使用される際、「抗微生物ペプチド」（AMP）は、とりわけ、カチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、スシペプチド、デフェンシン、および疎水性ペプチドではないが、それにもかかわらず抗微生物活性を呈するペプチドであり得る。
【００２１】
本明細書において使用される「スシペプチド」という用語は、短いコンセンサスリピートを有する補体制御タンパク質（CCP）を指す。スシペプチドのスシモジュールは、多くの異なるタンパク質においてタンパク質-タンパク質相互作用ドメインとして機能する。スシドメインを含有するペプチドは、抗微生物活性を有することが示されている。好ましくは、スシペプチドは、天然に存在するペプチドである。
【００２２】
本明細書において使用される「両親媒性ペプチド」という用語は、親水性官能基および疎水性官能基の両方を有する合成ペプチドを指す。好ましくは、本明細書において使用される「両親媒性ペプチド」という用語は、親水性基および疎水性基の規定された配置を有するペプチドを指し、例えば、両親媒性ペプチドは、例えばαヘリックス状であってもよく、主に、ヘリックスの一方の側に沿って非極性側鎖を、残りの表面に沿って極性残基を有する。
【００２３】
本明細書において使用される「疎水性基」という用語は、好ましくは、実質的に水に不溶性であるが、油相において可溶性であり、油相における溶解性が水または水相におけるものよりも高いアミノ酸側鎖などの、化学基を指す。水において、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基は、互いに相互作用して非水性環境を生成する。疎水性側鎖を有するアミノ酸残基の例は、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、およびプロリン残基である。
【００２４】
本明細書において使用される「疎水性ペプチド」という用語は、好ましくは大部分が疎水性基を有するアミノ酸残基で構成されている、疎水性ペプチドを指す。そのようなペプチドは、好ましくは、大部分が疎水性アミノ酸残基で構成されており、すなわち、アミノ酸残基の少なくとも約20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、または少なくとも約100％が、疎水性アミノ酸残基である。疎水性ではないアミノ酸残基は、好ましくは中性であり、好ましくは親水性ではない。
【００２５】
本明細書において使用される際、「タグ」という用語は、当技術分野において典型的に、a）アミノ酸配列もしくはポリペプチド全体の発現を改善する、b）アミノ酸配列もしくはポリペプチド全体の精製を容易にする、c）アミノ酸配列もしくはポリペプチド全体の固定化を容易にする、および／またはd）アミノ酸配列もしくはポリペプチド全体の検出を容易にするために、別のアミノ酸配列に融合されるかまたはそれに含まれる、アミノ酸配列を指す。タグの例は、His5-タグ、His6-タグ、His7-タグ、His8-タグ、His9-タグ、His10-タグ、His11-タグ、His12-タグ、His16-タグ、およびHis20-タグなどのHisタグ、Strep-タグ、Avi-タグ、Myc-タグ、GST-タグ、JS-タグ、システイン-タグ、FLAG-タグ、HA-タグ、チオレドキシン、またはマルトース結合タンパク質（MBP）、CAT、GFP、YFPなどである。当業者は、様々な技術的応用に適する莫大な数のタグを知っているであろう。タグは、例えば、そのようなタグ付加されたポリペプチドを、例えば、様々なELISAアッセイ形式における抗体結合または他の技術的応用に適するようにさせ得る。
【００２６】
本明細書において使用される「含む」という用語は、「からなる」（すなわち、追加的な他のものの存在を排除する）の意味に限定されると解釈されることはない。むしろ、「含む」とは、任意で追加的なものが存在し得ることを暗示する。「含む」という用語は、その範囲内に入る特に構想される態様として、「からなる」（すなわち、追加的な他のものの存在を排除する）および「含むがそれからならない」（すなわち、追加的な他のものの存在を必要とする）を包含し、前者がより好ましい。
【００２７】
本発明によるポリペプチドは、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90％の配列同一性を呈するアミノ酸配列において、以下のうちの少なくとも1つ（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、またはさらに17すべて）を呈し得る：X14はCではない；X23はCではない；X50はCではない；X82はIである；X122はMである；X149はPである；X154はTである、X160はTである；X167はLである；X179はFである；X180はEである；X186はYである；X206はNもしくはVである、X212はNである；X224はQである；X230はYである、および／またはX232はTである。それぞれのアミノ酸残基の位置を示す数は、SEQ NO: 1に対応する配列における相対位置を示し、より長い可能性がある本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列全体には対応しないことが、理解される。
【００２８】
本発明のポリペプチドは、前記の少なくとも90％の配列同一性を呈する。本発明のポリペプチドは、したがって、例えば、より高いレベルの配列同一性を呈し得、例えば、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約98.5％、少なくとも約99％（例えば、3アミノ酸未満の逸脱）、少なくとも約99.3％（例えば、2アミノ酸未満の逸脱）、少なくとも約99.5％、少なくとも約99.6％、またはさらに100％の配列同一性を呈し得る。
【００２９】
SEQ ID NO: 1の配列（またはそのより具体的な配列、下記を参照されたい）と所定のレベルの配列同一性を共有する配列を含む発明のポリペプチドは、例えば、1つまたは複数のアミノ酸残基の付加、置換、挿入、または欠失、およびすべての可能なそれらの組み合わせによって、参照配列から逸脱することができる。明瞭さのためだけに、そのような組み合わせは配列において別個の位置に言及することが、指摘される。同じ相対的位置での1つまたは複数のアミノ酸の、「付加」が後に続く「欠失」、または「欠失」が後に続く「付加」は、「付加」および「欠失」（またはその逆）の組み合わせではないが、「置換」という用語の下に入る。好ましくは、配列におけるSEQ ID NO: 1の配列（またはそのより具体的な配列、下記を参照されたい）からの逸脱は、保存的性質のもの、例えば保存的置換であろう。さらにより好ましくは、配列における逸脱は、酵素活性について重要ではないと特定されている、SEQ ID NO: 1（またはそのより具体的な配列、下記を参照されたい）における位置、すなわち、X1、X14、X23、X50、X82、X122、X149；X160、X167、X179、X180、X186；X206；X212；X224；X230、および／またはX232に限定されている。
【００３０】
好ましくは、本発明によるポリペプチドは、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90％の配列同一性を呈するアミノ酸配列において、115位にグルタミン酸を呈する。刊行物Briers et al. (Molecular Microbiology (2007) 65(5), 1334-1344)において示されているように、E115Aの変異は、酵素の約70％の活性の喪失をもたらした。したがって、前記変異を含む発明のポリペプチドは、そのように機能喪失ポリペプチドではなく、依然として種々の技術的目的を果たし得るが、そのような変異が発明のポリペプチド内のSEQ ID NO: 1に対応する配列ストレッチ中に存在しない場合が、間違いなく好ましい。
【００３１】
本発明による特定の好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、SEQ ID NO: 1の配列を含む。
【００３２】
本発明の発明者らは、SEQ ID NO: 5（KZ144エンドリシン配列）のアミノ酸配列における3個のシステイン残基が酵素活性に必須ではないことを、見出した。したがって、本発明のポリペプチドのSEQ ID NO: 1（本発明のコンセンサス配列）に対応する（またはそれと少なくとも90％の配列同一性を共有する）配列中で、いくつかの態様において、X14はCではなく、X23はCではなく、またはX50はCではない。組み合わせが可能であり、例えば、X14およびX23はCではなく、X14およびX50はCではなく、またはX23およびX50はCではない。同様に、X14もX23もX50もCではないこともまた、可能である。原則として、前記アミノ酸残基は、欠失するか、または任意の他のアミノ酸によって置換されることができる。そのような他のアミノ酸の例は、S、R、およびNである。したがって、X14は、例えばS、N、またはR；より好ましくはSまたはR；最も好ましくはRであってもよく；X23は、例えばS、N、またはR、より好ましくはSであってもよく；およびX50は、例えばS、N、またはR、より好ましくはSまたはN；最も好ましくはNであってもよい。X14、X23、およびX50は、当然、異なるアミノ酸置換を呈してもよく、例えば、X23およびX50がSであるが、X14はRであってもよく；または、X50がNであるが、X14およびX23はSであってもよく；X23がSであり、X50がNであるが、X14はRであってもよい、などである。考えられる任意の他の組み合わせもまた、本発明によって企図される。保存的アミノ酸置換が、好ましい。特に好ましいのは、システイン残基に対するセリン残基の置換である。したがって、本発明の特に好ましい例において、X14はSであり、X23はSであり、またはX50はSである。当然、X14およびX23がSであること、またはX14およびX50がSであること、またはX23およびX50がSであることもまた、可能である。X14、X23、およびX50はまた、3個すべてがSであってもよい。これらのシステイン残基の1個もしくは複数、またはそのすべてさえ無いことは、例えば、望ましくないジスルフィド架橋の形成による、本発明によるポリペプチドの凝集のリスクが低減する利点を有し、したがって本発明の好ましい態様である。
【００３３】
上記で言及されるシステイン残基の非重要性のほかに、本発明の発明者らはまた、SEQ ID NO: 5の配列中の種々の他の残基もまた、必須ではなく、かつさらに、他の残基によって置き換えられ、それによって、例えば、本発明のポリペプチドの温度安定性を増大させ得ることを、解明した。そのような置換の例は、X82I、X122M、X149P；X154T、X160T、X167L、X179F、X180E、X186Y、X206V、X206N、X212N、X230Y、およびX232Tである。これらの置換は、単独でまたは任意の組み合わせで存在してもよい。典型的な組み合わせは、X122MおよびX160Tの組み合わせである。組み合わせの他の例は、それらに限定されることなく、X82I、X206V、プラスX232T；X82I、X122M、X160T、X206V、プラスX232T；X82I、X122M、X160T、X206N、プラスX232T；X82I、X122M、X206V、プラスX232T；X82I、X122M、X149P、X160T、X206V、プラスX232T；X82I、X122M、X160T、X180E、X206V、プラスX232T；X82I、X122M、X160T、X186Y、X206V、プラスX232T；X82I、X122M、X160T、X206V、X230Y、プラスX232T；X82I、X122M、X149P、X206V、プラスX232T；X82I、X122M、X149P、X160T、X206V、プラスX232T；X82I、X122M、X149P、X206V、プラスX232T；X82I、X122M、X149P、X167L、X206V、プラスX232T；X82I、X122M、X149P、X179F、X206V、プラスX232T；X82I、X122M、X149P、X206V、X212N、プラスX232T；X82I、X122M、X149P、X206V、X224Q、プラスX232T；X82I、X122M、X149P、X154T、X206V、プラスX232Tなどである。当然、この第2のタイプのアミノ酸改変は、考えられる任意のタイプの組み合わせにおいて、上述のシステイン置換と組み合わされてもよい。そのような組み合わせの例は、それらに限定されることなく、X14S、X50S、X122M、およびX160T；X14S、X50S、X82I、X122M、X160T、X206V、およびX232T；X14S、X50S、X82I、X122M、X160T、X206N、およびX232T；X14S、X50S、X82I、X122M、X206V、およびX232T；X14S、X50S、X82I、X122M、X149P、X160T、X206V、およびX232T；X14S、X50S、X82I、X122M、X160T、X180E、X206V、およびX232T；X14S、X50S、X82I、X122M、X160T、X186Y、X206V、およびX232T；X14S、X50S、X82I、X122M、X160T、X206V、X230Y、およびX232T；X14R、X50S、X82I、X122M、X160T、X206V、およびX232T；X14S、X50N、X82I、X122M、X160T、X206V、およびX232T；X14R、X50S、X82I、X122M、X149P、X206V、およびX232T；X14R、X50S、X82I、X122M、X149P、X160T、X206V、およびX232T；X14R、X50N、X82I、X122M、X149P、X206V、およびX232T；X14R、X50N、X82I、X122M、X149P、X167L、X206V、およびX232T；X14R、X50N、X82I、X122M、X149P、X179F、X206V、およびX232T；X14R、X50N、X82I、X122M、X149P、X206V、X212N、およびX232T；X14R、X50N、X82I、X122M、X149P、X206V、X224Q、およびX232T；X14R、X50N、X82I、X122M、X149P、X154T、X206V、およびX232Tなどである。
【００３４】
SEQ ID NO: 1（本発明のコンセンサス配列）において、最初のアミノ酸残基は、存在していないか、または任意のアミノ酸、とりわけMであるように示されている。本発明者らの結果、および以前の研究（国際公開公報第2010/149792号を参照されたい）の結果により、KZ144のN末端メチオニンは重要ではないことが示されている。したがって、本発明のいくつかの態様において、本発明のポリペプチドにおけるSEQ ID NO: 1に対応する配列中のX1の位置は、Mではない。本発明のポリペプチドが、例えば、SEQ ID NO: 1に対応する配列のN末端にさらなる配列エレメントを呈する場合、それは、例えば、宿主細胞における有効な発現の目的で有用であり得、SEQ ID NO: 1の1位のメチオニンが、対応する核酸配列において開始コドンを回避するために除去されているかまたは別のアミノ酸によって置き換えられている場合は、よりN末端に位置するさらなる配列エレメントを欠如しているポリペプチドの並行した発現を潜在的にもたらす。他方で、本発明のポリペプチドにさらなるN末端配列エレメントが存在しない場合、X1は当然、（例えば、発現目的で）好ましくはメチオニンである。しかしながら、酵素活性のためには、X1は全く必要ではない。
【００３５】
本発明者らによって特に試験されている、SEQ ID NO: 1の定義の下に入る配列は、例えば、SEQ ID NO: 6〜27（およびN末端メチオニンを有さない対応する配列、SEQ ID NO: 28〜49）である。
【００３６】
包括的配列SEQ ID NO: 1に関してこれまで示されているすべては、より具体的な配列にも同様の様式で当てはまることが、理解される。したがって、明瞭さのためだけに、上記で詳述されているようなSEQ ID NO: 1の包括的配列と少なくとも90％の配列同一性を呈する配列を含む、本発明によるポリペプチドは、好ましい態様において、本明細書に記載されているかまたはさらに特に開示されているSEQ ID NO: 1のより具体的な配列と類似した様式で少なくとも90％の配列同一性を確かに呈し得ることが、指摘される。したがって、本発明の好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、例えば、SEQ ID NO: 6〜49のいずれかから選択される配列と少なくとも90％の配列同一性を呈する配列を含み得、該ポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列のいずれも含まない。
【００３７】
本発明によるポリペプチドは、酵素のアミノ酸配列のほかに、例えば、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90％の配列同一性を呈する配列（または、これらの定義の下に入る他の配列）、さらに、例えば、国際公開公報第2010/149792号において同様の様式で既に開示されているような、アミノ酸配列ストレッチを含み得る。本発明によるポリペプチドは、例えば、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、または、スシペプチドおよびデフェンシンのような天然に存在する抗微生物ペプチドからなる群より選択される、少なくとも1つのアミノ酸配列ストレッチを追加的に含み得る。そのような追加的なアミノ酸配列ストレッチは、本発明のポリペプチドの抗細菌特性を改善し得る。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、または、スシペプチドおよびデフェンシンのような天然に存在する抗微生物ペプチドの群より選択される、少なくとも2つの別個のアミノ酸配列ストレッチを含み得る。
【００３８】
これらの1つまたは複数の追加的なアミノ酸配列ストレッチは、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90％の配列同一性を呈する配列のN末端またはC末端に存在していてもよい。それらは、例えば、本発明のポリペプチドのN末端またはC末端に位置していてもよい。そのような追加的なアミノ酸配列ストレッチの好ましい例は（それらに限定されることなく）、下記により詳細に述べられているような、配列KRKおよびSEQ ID NO: 50〜120である。本発明によるポリペプチドは、この群から選択される少なくとも1つの追加的なアミノ酸配列ストレッチを含み得る。さらなる手引きのために、とりわけ、可能な追加的なアミノ酸配列ストレッチの包括的性質および具体的性質については、例えば、国際公開公報第2010/023207号、国際公開公報第2010/149792号、国際公開公報第2010/149795号、および国際公開公報第2012/085259号もまた参照されたい。
【００３９】
カチオン性およびポリカチオン性のアミノ酸配列ストレッチの例を、以下の表に列挙する。
【００４０】
【表１】
0006745720.tif 000002
【００４１】
本発明を実施する際に使用され得る抗微生物アミノ酸配列の例を、以下の表に列挙する。
【００４２】
【表２】
0006745720.tif 000003
0006745720.tif 000004
【００４３】
少なくとも1つの追加的なアミノ酸配列ストレッチは、Ding JL, Li P, Ho B Cell Mol Life Sci. 2008 Apr;65(7-8):1202-19. The Sushi peptides: structural characterization and mode of action against Gram-negative bacteria.により記載されているスシペプチドであってもよい。特に好ましいのは、SEQ ID NO: 115記載のスシ1ペプチドである。他の好ましいスシペプチドは、スシペプチドS1およびS3、ならびにその多数体（multiple）である；FASEB J. 2000 Sep;14(12):1801-13。
【００４４】
好ましい疎水性ペプチドは、SEQ ID NO: 116記載のアミノ酸配列を有するワルマフ（Walmagh）1、およびアミノ酸配列Phe-Phe-Val-Ala-Pro（SEQ ID NO: 117）を有する疎水性ペプチドである。
【００４５】
好ましい両親媒性ペプチドは、SEQ ID NO: 118記載のT4リゾチームのα4ヘリックス、およびSEQ ID NO: 119記載のアミノ酸配列を有するWLBU2-バリアント、およびSEQ ID NO: 120記載のワルマフ2である。
【００４６】
上述のように、本発明によるポリペプチドは、KRKおよびSEQ ID NO: 50〜120からなる群より選択される少なくとも1つの追加的なアミノ酸配列ストレッチを含み得る。対応する例は、例えば、SEQ ID NO: 121〜127（およびN末端メチオニンを有さない対応する配列、SEQ ID NO: 128〜134）からなる群より選択される配列を含むポリペプチドである。
【００４７】
本発明によるポリペプチドは、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90％の配列同一性を呈するアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列のいずれも含まない。したがって、本発明のポリペプチドはまた、SEQ ID NO: 121〜134のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも91.5％の配列同一性を呈するアミノ酸配列も含み得、該ポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列のいずれも含まない。
【００４８】
そのような発明のポリペプチドは、したがって、例えば、SEQ ID NO: 121〜134のいずれかから選択されるアミノ酸配列と91.5％よりも高いレベルの配列同一性を呈する配列を含み得、例えば、SEQ ID NO: 121〜134のいずれかから選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約98.5％、少なくとも約98.75％、少なくとも約99％（例えば、3アミノ酸未満の逸脱）、少なくとも約99.5％（例えば、2アミノ酸未満の逸脱）、少なくとも約99.6％、またはさらに100％の配列同一性を呈し得る。
【００４９】
加えて、上記で詳述されているような1つまたは複数の追加的なアミノ酸配列ストレッチが本発明のポリペプチドに存在しているか否かにかかわらず、ポリペプチドは、1つまたは複数のタグ配列を追加的に含み得る。そのようなタグ配列は、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90％の配列同一性を呈する配列のN末端またはC末端に存在していてもよい。それらは、例えば、本発明のポリペプチドのN末端またはC末端に位置していてもよい。好ましい態様において、1つまたは複数のタグ配列は、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも90％の配列同一性を呈するアミノ酸配列のC末端に位置している。
【００５０】
1つまたは複数のタグ配列は、例えば、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも90％の配列同一性を呈するアミノ酸配列に、直接、または、1〜10アミノ酸残基、好ましくは1〜5アミノ酸残基、さらにより好ましくは1〜2アミノ酸の短いリンカーを介して連結されていてもよい。リンカー配列は、好ましくは、1個または複数のグリシン残基を含む、可撓性配列である。タグについての多数の例が、当技術分野において公知であり、そのうちのいくつかは、既に上述されている。本発明の文脈において、特に好ましいタグ配列は、His-タグ、好ましくはSEQ ID NO: 135記載のHisタグである。
【００５１】
本発明によるポリペプチドの長さは、原則として限定されていないが、好ましくは、長さは過度に長くはない。好ましくは、本発明によるポリペプチドは、約320アミノ酸を超えない、好ましくは約310アミノ酸を超えない全体の長さを有する。
【００５２】
本発明によるポリペプチドの具体例は、SEQ ID NO: 136〜142（およびN末端メチオニンを有さない対応する配列、SEQ ID NO: 143〜149）からなる群より選択することができる。
【００５３】
本発明によるポリペプチドは、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90％の配列同一性を呈するアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列のいずれも含まない。したがって、本発明のポリペプチドはまた、SEQ ID NO: 136〜149のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも91.5％の配列同一性を呈するアミノ酸配列も含み得、該ポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列のいずれも含まない。
【００５４】
そのような発明のポリペプチドは、したがって、例えば、SEQ ID NO: 136〜149のいずれかから選択されるアミノ酸配列と91.5％よりも高いレベルの配列同一性を呈する配列を含み得、例えば、SEQ ID NO: 136〜149のいずれかから選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約98.5％、少なくとも約99％、少なくとも約99.25％（例えば、3アミノ酸未満の逸脱）、少なくとも約99.5％（例えば、2アミノ酸未満の逸脱）、少なくとも約99.6％、またはさらに100％の配列同一性を呈し得る。SEQ ID NO: 136〜149からの逸脱は、とりわけ、構成要素であるSMAP29ペプチド、改変されたKZ144エンドリシン、およびHis-タグを連結する2つの配列において起こり得る。
【００５５】
本発明によるポリペプチドは、好ましくは、グラム陰性細菌、とりわけシュードモナス属細菌および／またはカンピロバクター属細菌のペプチドグリカンを分解する能力を特徴とする。とりわけ、本発明によるポリペプチドは、好ましくは、シュードモナス・エルギノーサ、とりわけシュードモナス・エルギノーサPAO1、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、および／またはカンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）のペプチドグリカンを分解することができる。
【００５６】
グラム陰性細菌に対するペプチドグリカン分解活性は、当技術分野において周知のアッセイによって、例えば、推定上の酵素がペプチドグリカン層に接触することを可能にするように、グラム陰性細菌の外膜を透過化処理または除去（例えば、クロロホルムで）する壁溶解（muralytic）アッセイによって、測定することができる。酵素が活性を有する場合は、ペプチドグリカン層の分解が濁度の低下をもたらすことになり、これを光度計で測定することができる（例えば、Briers et al., J. Biochem. Biophys Methods 70: 531-533, (2007)を参照されたい）。
【００５７】
さらなる局面において、本発明は、本発明によるポリペプチドをコードする核酸に関連する。当業者は、遺伝暗号の縮重を認識しており、そのような核酸を生成する手段を承知しているであろう。
【００５８】
さらなる局面において、本発明は、本発明による核酸を含む、発現ベクターまたはクローニングベクターなどの、ベクターに関連する。
【００５９】
さらなる局面において、本発明は、本発明によるポリペプチド、本発明による核酸、および／または本発明によるベクターを含む宿主細胞に関連する。
【００６０】
さらなる局面において、本発明は、本発明によるポリペプチド、本発明による核酸、本発明によるベクター、および／または本発明による宿主細胞を含む組成物に関連する。好ましくは、前記組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体を含む薬学的組成物である。
【００６１】
上記で詳述されているように、本発明によるポリペプチドは、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90％の配列同一性を呈するアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列のいずれも含まない。しかしながら、さらなる局面において、本発明の上述のポリペプチドとはわずかに異なり、本発明はまた、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90％の配列同一性を呈するアミノ酸を含むポリペプチドであって、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列のいずれも含まないポリペプチドにも、追加的に関連する。任意で、この追加的な局面の前記ポリペプチドはまた、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列も含まない。本発明のポリペプチド、ならびにそれぞれの核酸、ベクター、宿主細胞、および組成物について、上記で、実施例において、または添付の特許請求の範囲において開示されているすべての態様および組み合わせが、このさらなる局面のために同様に具体的に企図される。
【実施例】
【００６２】
以下において、本発明の種々の態様および局面を例証する具体例を提示する。しかしながら、本発明は、本明細書に記載されている具体的態様による範囲に限定されることはない。実際に、本明細書に記載されているものに加えた本発明の種々の改変が、前記の説明、添付の図面、および下記の実施例から、当業者に容易に明らかになるであろう。そのような改変のすべてが、添付の特許請求の範囲内に入る。
【００６３】
実施例1：KZ144エンドリシンを安定化させる変異の特定
エンドリシンKZ144（SEQ ID NO: 5）における有利な改変の部位の特定のために、本発明者らは、第1段階で、標的タンパク質の標的不安定化を用いた。この目的で、N末端が切断されたKZ144を生成させ（SEQ ID NO: 150）、それにランダム変異誘発（エラープローンPCR）を介して配列変異を導入し、その後融合させて、クロラムフェニコールアッセイ（CATアッセイ）で選択した。
【００６４】
有望な候補のタンパク質融解温度を、円偏光二色性（CD）によって決定した。タンパク質の楕円率の変化を、Jasco J-815 CD分光計を用いて温度の関数として220nmで記録し、JASCO解析ソフトウェアを用いて単純なシグモイドアンフォールディングモデルに適合させた。タンパク質融解温度（Tmelt）を、アンフォールディング移行の中間点として決定した。スペクトルを、5.0〜5.8μMのタンパク質濃度で、1℃／分の加熱速度および3秒のインキュベーション時間で、1 mm光路Hellma石英キュベット中の410μlの体積において記録した。測定は、7.4、7.0、6.2、および5.7のpHの、50mM NaPh緩衝液、300mM NaCl中で行った。
【００６５】
特定された最も有望な候補のいくつかを、以下の表に示す。
【００６６】
【表３】
0006745720.tif 000005
＊示されている位置は、KZ144配列であるSEQ ID NO: 5の配列における位置を指し、SEQ ID NO: 150における位置を指さないことに、注意されたい。
【００６７】
このように特定された安定化変異は、完全長配列などの他の配列に導入することができ、その後導入して、そこで同様に安定性を増大させた。
【００６８】
さらなる段階において、セリンを、いくつかの構築物においてシステイン残基C14、C23、および／またはC50の置換のために使用した（SEQ ID NO: 5について示されている位置；保存的置換）。前記位置で試験した他の置換基は、NおよびRであった。
【００６９】
実験のさらなるラウンドにおいて、変異の種々の組み合わせを、完全長エンドリシンKZ144（SEQ ID NO: 5）の状況において試験した。
【００７０】
【表４】
0006745720.tif 000006
＊SEQ ID NO: 5に対するΔTM
【００７１】
実施例2：いくつかの本発明によるポリペプチドの融解温度および選択された細菌株についてのMIC
SEQ ID NO: 151（変異なし）およびSEQ ID NO: 136〜142記載のポリペプチドの構築のために、シュードモナス・エルギノーサファージKZの溶解酵素（gp144）を使用した。ペプチド融合パートナーとして、SMAP-29を選択した。SMAP-29は、ヒツジリンパ球において見出され、29アミノ酸からなる（RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG；分子量：3.3 kDa、SEQ ID NO: 76）。これは、中央のヒンジによって接続されている2つのLPS結合部位でできている。
【００７２】
クローニング
それぞれのペプチドおよびエンドリシンをコードする核酸分子を、核酸分子の5'端のNdeI（5'-CAT ATG-3'）制限酵素部位および核酸分子の3'端のXhoI（5'-CTC GAG-3'）制限酵素部位とともに構築した。ペプチドおよびエンドリシンは、BamHI（5'-GGA TCC-3'）を介して接続されている。
【００７３】
少なくとも2つの核酸配列を、例えば、Sambrook et al. 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manualにより記載されているような標準的なクローニング技術を用いて連結することによって、融合タンパク質を構築した。そこで、ペプチドストレッチをコードする核酸分子を、それぞれの制限酵素NdeIおよびBamHIでの消化で切断した。続いて、ペプチドストレッチをコードする切断した核酸を、それぞれの制限酵素NdeIおよびBamHIでの消化で事前に同様に切断したpET21 b発現ベクター（Novagen, Darmstadt, Germany）中に、ライゲーションした。その後、エンドリシンを、それぞれの制限酵素BamHIおよびXhoIでの消化で事前に同様に切断したpET21b発現ベクター（Novagen, Darmstadt, Germany）中にライゲーションできるように、エンドリシンをコードする核酸分子を、BamHIおよびXhoIでの消化で切断した。
【００７４】
ペプチド-エンドリシン融合物の配列を、DNA配列決定によって確認し、タンパク質発現のために正確なクローンで大腸菌（E.coli）BL21(DE3)pLysS（Novagen, Darmstadt, Germany）を形質転換した。
【００７５】
精製
融合タンパク質の組み換え発現を、大腸菌BL21(DE3)pLysS細胞（Novagen, Darmstadt, Germany）において行った。細胞を、OD600nm＝0.5〜0.8の光学密度に達するまで増殖させた。その後、融合タンパク質の発現を0.5 mM IPTG（イソプロピルチオガラクトシド）で誘導し、発現を37℃で4時間行った。
【００７６】
細胞を、20分間、6000gでの遠心分離により収集し、氷上での超音波処理によって破壊した。大腸菌粗製抽出物の可溶性および不溶性の画分を、遠心分離（Sorvall, SS34, 30分, 15 000 rpm）によって分離した。すべてのタンパク質を、pET21bベクターによりコードされるC末端のHis6タグを用いて、Ni2+親和性クロマトグラフィー（Akta FPLC, GE Healthcare）によって精製した。あらゆるクロマトグラフィー段階の前に、試料を精密ろ過（0.2μm）した。
【００７７】
Ni2+親和性クロマトグラフィーは、すべて室温で、4つの次の段階において行う：
1．3〜5 ml／分の流速での、10カラム体積までの洗浄緩衝液（20mMイミダゾール、1 M NaCl、および20mM HEPES、pH7.4）を用いた、Histrap FF 5 mlカラム（GE Healthcare）の平衡化。
2．3〜5 ml／分の流速での、Histrap FF 5 mlカラムへの、望まれる標的タンパク質を含む全溶解物のローディング。
3．結合していないタンパク質を除去するための、10カラム体積までの洗浄緩衝液を用いたカラムの洗浄。
4．3〜5 ml／分の流速での、15カラム体積の溶出緩衝液（500mMイミダゾール、500mM NaCl、および20mM HEPES、pH7.4）の100％へ増加する直線勾配を用いた、結合した標的タンパク質のカラムからの溶出。
【００７８】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）は、すべて室温で、5つの次の段階において行う：
1．1〜2 ml／分の流速での、5カラム体積までの洗浄緩衝液（850mM硫酸アンモニウム、500mM NaCl、および20mM HEPES、pH7.4）を用いた、HiScreen Phenyl HP 5 mlカラム（GE Healthcare）の平衡化。
2．試料（Ni2+親和性段階由来のタンパク質プールの1 mlカラム体積当たり5mg）の調製は、Ni2+親和性段階由来の洗浄緩衝液のあらかじめ規定された量の添加によって、最初にタンパク質濃度を0.5mg/mlに設定することにより開始する。その後、およそ850mMの最終濃度まで、あらかじめ規定された量の硫酸アンモニウムストック溶液（3.8M）を段階的に添加することによる、硫酸アンモニウム濃度の調整が続く。
3．1〜2 ml／分の流速での、HiScreen Phenyl HP 5 mlカラムへの、調製した試料のローディング。
4．結合していないタンパク質を除去するための、5カラム体積の洗浄緩衝液を用いたカラムの洗浄。
5．1〜2 ml／分の流速での、40％溶出緩衝液（500mM NaCl、および20mM HEPES、pH7.4）の段階を用いた、標的タンパク質のカラムからの溶出。標的タンパク質は、この段階で幅広いピークで溶出される。
【００７９】
膜透析による緩衝液交換：
HIC段階の溶出プールを、4℃で保存緩衝液（500mM NaClおよび20mM HEPES; pH7.4）中で透析した（膜：MWCO:6000-8000Dを有する再生セルロース）。透析率は、160〜250である。
【００８０】
特徴決定
SEQ ID NO: 136〜142記載のポリペプチドの、上昇した温度での安定性を特徴づける融解温度を、上述のように円偏光二色性分光法（CD）によって決定した。
【００８１】
P.エルギノーサ、C.ジェジュニ、およびC.コリに対するSEQ ID NO: 136〜142によるポリペプチドの活性を、それぞれの株に対する最小阻止濃度（MIC）の決定によって特徴決定した。
【００８２】
最小阻止濃度（MIC）の決定
抗生物質についての「最小阻止濃度（MIC）」の決定と同様に、MICを、微量希釈試験として決定した。カンピロバクター種に対する試験は、完全に微好気性の条件および42℃で行う。
【００８３】
実験の設定は、以下である。
【００８４】
それぞれの一晩培養物を、1:10に希釈した。Ps.エルギノーサは、OD600＝0.6（およそ109細胞／ml）まで37℃でインキュベーションした。カンピロバクター種は、OD600＝0.08（およそ2.5x108細胞／ml）まで微好気性でインキュベーションした。細菌培養物を、ミュラーヒントンブロス（カチオン調整されていないミュラーヒントンブロス）において1ml当たり2x105〜8x105コロニー形成単位の濃度に希釈して、必要な量のチューブに分割した。
【００８５】
関心対象のポリペプチドを、様々な濃度（ミュラーヒントンブロスにおけるμg/ml最終濃度として決定される）で添加した。Ps.エルギノーサの場合は、EDTAを2 mMの最終濃度になるように添加した。カンピロバクター種の場合は、EDTAを使用しなかった。
【００８６】
混合物を、Ps.エルギノーサについては37℃で、カンピロバクター種については42℃で、一晩インキュベーションした。細菌増殖を、（陰性対照と比較して）濁度により、眼で見て判定した。MICは、細菌増殖が観察されなかったチューブにおける濃度として定義した。陽性対照（関心対象のポリペプチドおよび／またはEDTAを含まない）および陰性対照（細菌を含まないミュラーヒントンブロス）を、実験に含めた。
【００８７】
結果を、以下の表に要約する。
【００８８】
【表５】
0006745720.tif 000007
融解温度はCDによって測定、緩衝液：50mM NaPh, pH 7.45 300mM NaCl
【００８９】
示されている位置は、KZ144配列であるSEQ ID NO: 5の配列における位置を指し、表に示されているSEQ ID NO:の位置を指さないことに、再び注意されたい。
【００９０】
導入した変異は、このように、SEQ ID NO: 151のポリペプチドに対してSEQ ID NO: 136〜142のポリペプチドの融解温度を上昇させただけではなく、また、SEQ ID NO: 141の7重の変異でさえも、ポリペプチドの活性に影響を及ぼさなかった。
【００９１】
実施例3：SEQ ID NO: 139およびSEQ ID NO: 141記載のポリペプチドの温度安定性
上昇した融解温度が、それぞれの変異ポリペプチドの温度安定性に実際に影響を及ぼすことを例証するために、本発明者らは、例示的にSEQ ID NO: 139およびSEQ ID NO: 141の変異ポリペプチドを、天然の変異していない参照ポリペプチド（SEQ ID NO: 151）の融解温度を明らかに超える温度に曝露した。
【００９２】
この目的で、両方のポリペプチドを、51℃および52℃の温度での長期直接加熱に供した。その後、モデル系としてシュードモナス・エルギノーサ株に対して、適合した条件で活性試験を行った。
【００９３】
結果を、以下の表に要約する。
【００９４】
【表６】
0006745720.tif 000008
タンパク質緩衝液：50mM NaPh, pH 7.45 300mM NaCl
【００９５】
前述のように、示されている位置は、KZ144配列であるSEQ ID NO: 5に対応する配列部分内の位置を指し、表に示されているSEQ ID NO:の完全長配列内の位置を指さない。
【図１ａ】
0006745720.tif 000009
【図１ｂ】
0006745720.tif 000010
【図２ａ】
0006745720.tif 000011
【図２ｂ】
0006745720.tif 000012
【配列表】
0006745720000001.app