(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性基を含む基及び抗体アフィニティーリガンドを合成高分子支持体上に有し、前記酸性基として、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-Ｍ+（Ｍ+は対イオンを示す）及び−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-から選ばれる１種又は２種以上を有し、且つ前記合成高分子支持体が、（メタ）アクリレート系モノマー及び（メタ）アクリルアミド系モノマーから選ばれる１種以上のモノマーに由来するものであるミックスモード用担体と、抗体とを接触させる工程Ａと、
前記抗体アフィニティーリガンドと前記抗体とを解離させる解離液と、前記工程Ａで抗体を捕捉したミックスモード用担体とを接触させて抗体を解離させる工程Ｂと、を含み、
前記工程Ｂが、抗体アフィニティーリガンドから抗体が解離する条件下で、イオン強度が段階的に高くなる塩濃度を２種類以上使用するステップワイズ方式、又は勾配的に塩濃度を高くするグラジェント方式の少なくともいずれかで解離する工程であることを特徴とする、
抗体の精製方法。
【請求項２】
前記酸性基を含む基のｐＫａが、−３．０〜１．０である、請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
前記酸性基を含む基が、式（１）で表される１価の基である、請求項１に記載の精製方法。
【化１】
0006630036.tif 000008
〔式（１）中、Ｒ1は、式（２）で表される２価の基を示し、Ｘは酸性基を示す。〕
【化２】
0006630036.tif 000009
〔式（２）中、Ｒ2は、炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を示し、Ｙ1は、＞Ｓ、＞Ｓ＝Ｏ、＞Ｓ（＝Ｏ）2、＞ＮＨ、又は＞Ｏを示し、＊は、式（１）中のＸとの結合位置を示す。〕
【請求項４】
Ｙ1が、＞Ｓ、＞Ｓ＝Ｏ、又は＞Ｓ（＝Ｏ）2である、請求項３に記載の精製方法。
【請求項５】
前記酸性基を含む基の含有量が、ミックスモード用担体の表面積１ｍ2あたり０．０５μｍｏｌ以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項６】
前記抗体アフィニティーリガンドが、イムノグロブリン結合タンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項７】
前記抗体アフィニティーリガンドが、環状エーテル基が開環してなる基を介して前記合成高分子支持体表面上に結合している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項８】
前記合成高分子支持体が、（Ｍ−１）エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位を全構造単位に対し２０質量部を超えて、９９．５質量部以下、および（Ｍ−２）ポリビニル単量体に由来する構造単位を全構造単位に対し０．５〜８０質量部を含む共重合体を含有する固相の支持体であり、前記エポキシ基含有モノビニル単量体が、エポキシ基含有（メタ）アクリレート系モノビニル単量体であり、前記ポリビニル単量体が、（メタ）アクリレート系ポリビニル単量体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項９】
前記合成高分子支持体が、多孔質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項１０】
前記合成高分子支持体が、粒子状、モノリス状、板状、繊維状又は膜状である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項１１】
合成高分子支持体上に酸性基を含む基及び抗体アフィニティーリガンドを有し、
前記酸性基として、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-Ｍ+（Ｍ+は対イオンを示す）及び−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-から選ばれる１種又は２種以上を有し、
前記合成高分子支持体が、（メタ）アクリレート系モノマー及び（メタ）アクリルアミド系モノマーから選ばれる１種以上のモノマーに由来するものであることを特徴とする、
ミックスモード用担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物の精製方法、及び、ミックスモード用担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬品の主成分であるモノクローナル抗体は、主に哺乳類培養細胞等を用いて組換え蛋白質として培養液中で発現させ、数段のクロマトグラフィーや膜工程により高純度に精製された後に製剤化されている。この培養、精製、製剤化の工程で形成又は残留する凝集体（２量体以上の多量体）が副作用の主要原因となるため、その低減が抗体医薬品生産の重要課題となっている。そのため、培養、精製、製剤化の各工程において、複雑な管理をすることや添加剤を使用することによって凝集体の生成抑制やその除去をする試みがなされてきた。特に精製工程では、凝集体の生成を抑制する他にその除去が重要である。よって、精製工程では、簡便で効率的な凝集体除去技術の開発が求められてきている。
【０００３】
抗体医薬品の精製工程は、特定の単位操作の組み合わせによる精製手法のプラットフォーム化が進み、その精製工程では、アフィニティーリガンドとしてプロテインＡが固定されたプロテインＡ担体が広く利用されている。中性条件下で抗体をプロテインＡ担体に吸着させ、酸性条件下で抗体を溶出させる手法が一般的に用いられているが、この溶出過程で酸性条件下に曝された抗体が変性しやすく凝集体が形成されやすい。一般的には、プロテインＡ担体による精製の後に、イオン交換クロマトグラフィーや疎水性相互作用クロマトグラフィー等の組み合わせにより、凝集体等の不純物が除去されている。しかしながら、プロテインＡ担体による精製後に凝集体含量が多い場合は、後段の不純物除去工程において、目的の抗体の単量体の収率低下に繋がることから、プロテインＡ担体による精製での凝集体形成を抑えようとする試みの他、更に、当該精製工程においても凝集体を除去する試みがなされている（特許文献１〜５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００８／０８５９８８号公報
【特許文献２】特表２０１０−５０７５８３号公報
【特許文献３】国際公開第２０１０／０１９４９３号公報
【特許文献４】国際公開第２０１０／１４１０３９号公報
【特許文献５】国際公開第２０１４／０３４４５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、ＨＣＰの除去性に優れ、抗体の単量体と凝集体との分離能に優れる標的物の精製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、下記の手段により解決された。
＜１＞酸性基を含む基及びアフィニティーリガンドを合成高分子支持体上に有するミックスモード用担体と、前記アフィニティーリガンドが捕捉しうる標的物とを接触させる工程Ａと、前記アフィニティーリガンドと前記標的物とを解離させる解離液と、前記工程Ａで標的物を捕捉したミックスモード用担体とを接触させて標的物を解離させる工程Ｂと、を含み、前記工程Ｂが、アフィニティーリガンドから標的物が解離する条件下で、イオン強度が段階的に高くなる塩濃度を２種類以上使用するステップワイズ方式、又は勾配的に塩濃度を高くするグラジェント方式の少なくともいずれかで解離する工程であることを特徴とする、標的物の精製方法。
＜２＞前記ミックスモード用担体が、前記酸性基として、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-Ｍ+、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-Ｍ+、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）2、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）2、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-）2、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-Ｍ+）、及び−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-）（上記Ｍ+は、それぞれ対イオンを示す）から選ばれる１種又は２種以上を有する、＜１＞の精製方法。
＜３＞前記酸性基を含む基のｐＫａが、−３．０〜５．０である、＜１＞又は＜２＞の精製方法。
＜４＞前記酸性基を含む基の含有量が、ミックスモード用担体の表面積１ｍ2あたり０．０５μｍｏｌ以上である、＜１＞〜＜３＞いずれかの精製方法。
＜５＞前記アフィニティーリガンドが、タンパク質、核酸、又はキレート化合物である、＜１＞〜＜４＞いずれかの精製方法。
＜６＞前記アフィニティーリガンドが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、又はそれら類縁物質である、＜１＞〜＜５＞いずれかの精製方法。
＜７＞前記アフィニティーリガンドが、環状エーテル基が開環してなる基を介して前記合成高分子支持体表面上に結合している、＜１＞〜＜６＞いずれかの精製方法。
＜８＞前記合成高分子支持体が、（Ｍ−１）エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位を全構造単位に対し２０質量部を超えて、９９．５質量部以下、および（Ｍ−２）ポリビニル単量体に由来する構造単位を全構造単位に対し０．５〜８０質量部を含む共重合体を含有する固相の支持体である、＜１＞〜＜７＞いずれかの精製方法。
＜９＞前記合成高分子支持体が、多孔質である、＜１＞〜＜８＞いずれかの精製方法。
＜１０＞前記合成高分子支持体が、粒子状、モノリス状、板状、繊維状又は膜状である、＜１＞〜＜９＞の精製方法。
＜１１＞合成高分子支持体上に酸性基を含む基及びアフィニティーリガンドを有することを特徴とする、ミックスモード用担体。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、ＨＣＰの除去性に優れ、抗体の単量体と凝集体との分離能に優れる標的物の精製方法を提供することができた。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の標的物の精製方法は、酸性基を含む基及びアフィニティーリガンドを合成高分子支持体上に有するミックスモード用担体と、前記アフィニティーリガンドが捕捉しうる標的物とを接触させる工程Ａと、前記アフィニティーリガンドと前記標的物とを解離させる解離液と、前記工程Ａで標的物を捕捉したミックスモード用担体とを接触させて標的物を解離させる工程Ｂと、を含み、前記工程Ｂが、アフィニティーリガンドから標的物が解離する条件下で、イオン強度が段階的に高くなる塩濃度を２種類以上使用するステップワイズ方式、又は勾配的に塩濃度を高くするグラジェント方式の少なくともいずれかで解離する工程であることを特徴とする。以下、まずは本発明のミックスモード用担体について説明し、その後に本発明の標的物の精製方法（以下、本発明の精製方法ともいう。）について説明する。なお、本明細書において、数値範囲を表すａ〜ｂ等の記載は、ａ以上、ｂ以下と同義であり、ａ及びｂを数値範囲内に含む。
【０００９】
〔ミックスモード用担体〕
本発明のミックスモード用担体は、合成高分子支持体上に酸性基を含む基及びアフィニティーリガンドを有する。本発明の精製方法においては、酸性基を含む基は陽イオン交換基として機能する。本発明のミックスモード用担体は、アフィニティーリガンドと酸性基を含む基とが共に水不溶性の合成高分子支持体上に共有結合を介して固定されているミックスモード用のアフィニティー分離マトリックスであり、異なる分離機能を複合させて、各分離機能の協奏作用から優れた分離性（例えば、単量体の選択性、凝集体の除去性）を発揮することができる。特に本発明のミックスモード用担体は、凝集体との疎水性相互作用が多糖類系の支持体よりも強い合成高分子支持体を使用したことに特徴があり、かかる構成を採用することで、アフィニティー精製による作用、イオン交換基による作用だけでなく疎水性相互作用も発揮されることで多糖類系支持体よりも高い分離性能を発揮することができる。
【００１０】
＜合成高分子支持体＞
本発明に用いることのできる合成高分子支持体は、水に不溶な基材であって、アフィニティーリガンドと酸性基を含む基とを固定できれば特に制限されないが、例えば、ポリビニルアルコール類、ポリ（メタ）アクリレート類、ポリ（メタ）アクリルアミド類、ポリスチレン類、エチレン−無水マレイン酸共重合物等で構成されるものが挙げられる。これらの中でも、合成高分子支持体の耐圧性の観点から、ポリビニルアルコール類、ポリ（メタ）アクリレート類及びポリ（メタ）アクリルアミド類から選ばれる合成高分子で構成される支持体がより好ましく、ポリ（メタ）アクリレート類を主要成分とする支持体がさらに好ましい。
【００１１】
本発明における合成高分子支持体は、単官能モノマーと多官能モノマーとの共重合体であることが好ましく、より具体的には合成高分子支持体は、（Ｍ−１）エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位を全構造単位に対し２０質量部を超えて、９９．５質量部以下、および（Ｍ−２）ポリビニル単量体に由来する構造単位を全構造単位に対し０．５〜８０質量部を含む共重合体を含有する固相の支持体であることがより好ましい。また、合成高分子支持体は、上記共重合体以外に、天然高分子や合成高分子などを含んでいてもよい。上記の単量体（Ｍ−１）、（Ｍ−２）の含有量が上記範囲となる共重合体を使用することで、耐圧性だけでなく、抗体の凝集体との疎水性相互作用が得られ、抗体の単量体と凝集体との分離性能に優れたミックスモード用担体が得られる。
【００１２】
（（Ｍ−１）エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位）
エポキシ基含有モノビニル単量体は、１分子中に、１個の重合性ビニル基（エチレン性不飽和結合を有する基）と、１個以上のエポキシ基とを有する単量体である。エポキシ基含有モノビニル単量体は、固相担体に適切な量のエポキシ基を導入し、適切なリガンド結合量を得るための成分である。
【００１３】
エポキシ基含有モノビニル単量体としては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、３，４−エポキシシクロヘキシルメチル（メタ）アクリレート、α−（メタ）アクリル−ω−グリシジルポリエチレングリコール等のヒドロキシ基非含有（メタ）アクリル酸エステル類；グリセリンモノ（メタ）アクリレートグリシジルエーテル等のヒドロキシ基含有（メタ）アクリル酸エステル類；ビニルベンジルグリシジルエーテル等の芳香族モノビニル化合物の他、アリルグリシジルエーテル、３，４−エポキシ−１−ブテン、３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブテン等が挙げられる。これらのうち１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらの中でも、エポキシ基含有モノビニル単量体としては、エポキシ基含有（メタ）アクリル酸エステル類、エポキシ基含有芳香族モノビニル化合物が好ましく、エポキシ基含有（メタ）アクリル酸エステル類がより好ましく、グリシジル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテルがさらに好ましく、グリシジル（メタ）アクリレートが特に好ましい。なお、固相担体を順相懸濁重合により粒子状にする場合には、エポキシ基含有モノビニル単量体としては、開環エポキシ基量のコントロールが容易となることから水不溶性のものが好ましい。ここで水不溶性とは水１００ｍＬに対して室温（２５℃）で１０ｇ以上は溶解しないことをいう。
エポキシ基含有モノビニル単量体は市販品を用いてもよく、公知の方法に従い合成して使用してもよい。
【００１４】
エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位の含有量は、全構造単位に対し２０質量部を超えて、９９．５質量部以下が好ましい。上記の範囲内であれば、親水性に優れ、機械的強度に優れた合成高分子支持体が得られる。エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位の含有量は、全構造単位に対し、より好ましくは２５質量部以上、さらに好ましくは３０質量部以上、さらに好ましくは４０質量部以上、特に好ましくは５０質量部以上であり、また、全構造単位に対し、好ましくは９５質量部以下、より好ましくは９０質量部以下、特に好ましくは８０質量部以下である。
【００１５】
（（Ｍ−２）ポリビニル単量体に由来する構造単位）
ポリビニル単量体は、１分子中に、２個以上の重合性ビニル基（エチレン性不飽和結合を有する基）を有するビニル単量体である。以下、当該ポリビニル単量体を、ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体と、ヒドロキシ基含有ポリビニル単量体とに分けて説明する。なお、ポリビニル単量体は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００１６】
ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体としては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル類；ジビニルベンゼンなどの芳香族ポリビニル化合物；ブタジエン、イソシアヌル酸ジアリル、イソシアヌル酸トリアリルなどのアリル化合物などが挙げられ、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。これらの中でも、ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体としては、（メタ）アクリル酸エステル類、芳香族ポリビニル化合物が好ましく、（メタ）アクリル酸エステル類がより好ましい。
また、上記ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体に含まれる重合性ビニル基の個数としては、１分子中に、２〜５個が好ましく、２又は３個がより好ましい。
【００１７】
ヒドロキシ基含有ポリビニル単量体としては、多価アルコールの（メタ）アクリル酸エステル類、各種糖類の２置換以上の（メタ）アクリル酸エステル類、多価アルコールの（メタ）アクリルアミド類が好ましい。
多価アルコールの（メタ）アクリル酸エステル類としては、グリセリンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、ブタントリオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、イノシトールジ（メタ）アクリレート、イノシトールトリ（メタ）アクリレート、イノシトールテトラ（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
各種糖類の２置換以上の（メタ）アクリル酸エステル類としては、例えば、グルコースジ（メタ）アクリレート、グルコーストリ（メタ）アクリレート、グルコーステトラ（メタ）アクリレート、マンニトールジ（メタ）アクリレート、マンニトールトリ（メタ）アクリレート、マンニトールテトラ（メタ）アクリレート、マンニトールペンタ（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
さらに、ヒドロキシ基含有ポリビニル単量体としては、上記例示したものの他に、ジアミノプロパノール、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グルコサミンなどのアミノアルコールと（メタ）アクリル酸との脱水縮合反応物なども挙げることができる。
また、上記ヒドロキシ基含有ポリビニル単量体に含まれる重合性ビニル基の個数としては、１分子中に、２〜５個が好ましく、２又は３個がより好ましく、３個が特に好ましい。
【００１８】
これらの中でも、ポリビニル単量体としては、比較的少量の使用で良好な多孔性と機械的強度が得られ、エポキシ基含有モノビニル単量体の使用量を制限することが少ないなどの観点から、ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体が好ましく、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレートがより好ましく、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレートが特に好ましい。
【００１９】
ポリビニル単量体に由来する構造単位の含有量は、全構造単位に対し０．５〜８０質量部が好ましい。ポリビニル単量体に由来する構造単位の含有量を０．５質量部以上とすることにより、担体の機械的強度が高くなる。また、８０質量部以下とすることにより、親水性が高くなり、ＨＣＰの低減効果が向上し、また、アフィニティーリガンドの活性が改善される。
ポリビニル単量体に由来する構造単位の含有量は、全構造単位に対し、好ましくは１０質量部以上、より好ましくは１５質量部以上、さらに好ましくは２０質量部以上、特に好ましくは２５質量部以上であり、また、全構造単位に対し、好ましくは７０質量部以下、より好ましくは６５質量部以下、さらに好ましくは６０質量部以下、さらに好ましくは５０質量部以下、特に好ましくは４０質量部以下である。
【００２０】
（（Ｍ−３）エポキシ基を含有しないモノビニル単量体に由来する構造単位）
本発明で用いる合成高分子支持体に含まれる共重合体としては、上記構造単位（Ｍ−１）及び構造単位（Ｍ−２）に加えて、（Ｍ−３）エポキシ基を含有しないモノビニル単量体に由来する構造単位を更に含むものが好ましい。
【００２１】
エポキシ基を含有しないモノビニル単量体は、１分子中に、１個の重合性ビニル基（エチレン性不飽和結合を有する基）を有し、エポキシ基を含有しないビニル単量体である。以下、エポキシ基を含有しないモノビニル単量体単量体を、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基非含有モノビニル単量体と、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニル単量体とに分けて説明する。
【００２２】
エポキシ基を含有しないヒドロキシ基非含有モノビニル単量体としては、精製時の不純物の非特異吸着を防ぐ点から、非イオン性単量体が好ましい。このような非イオン性単量体としては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル類；（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリロイルモルホリン、ダイアセトン（メタ）アクリルアミドなどの（メタ）アクリルアミド類が挙げられ、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。なお、非イオン性単量体として、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレートのような疎水性（メタ）アクリレート類；スチレン、α−メチルスチレンのような芳香族ビニル化合物を用いてもよいが、精製時の不純物の非特異吸着を抑える観点から、このような単量体ではなく、上記で例示した単量体のうち、炭素数５以下のアルキル基又はアルコキシアルキル基を有するような（メタ）アクリル酸アルキルエステル類や、上記の（メタ）アクリルアミド類が好ましい。
【００２３】
エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニル単量体としては、例えば、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ（メタ）アクリレート、ブタントリオールモノ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、イノシトールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル類；ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミドなどの（メタ）アクリルアミド類などが挙げられ、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
また、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニル単量体に含まれるヒドロキシ基の個数としては、１分子中に、１〜５個が好ましく、１〜３個がより好ましい。
【００２４】
これらの中でも、エポキシ基を含有しないモノビニル単量体としては、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニル単量体が好ましく、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミドがより好ましく、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミドがさらに好ましく、グリセロールモノ（メタ）アクリレートが特に好ましい。
【００２５】
エポキシ基を含有しないモノビニル単量体に由来する構造単位の含有量としては、全構造単位に対し４０質量部以下が好ましい。当該含有量を４０質量部以下とすることにより、ヒドロキシ基含有モノビニル単量体の場合には多孔質粒子の親水性が向上し、凝集が抑制され、アフィニティーリガンドの活性が高くなり標的物質の動的結合量が改善される。また、機械的強度も改善される。上記構造単位の含有量としては、全構造単位に対し、より好ましくは３５質量部以下、さらに好ましくは３０質量部以下、特に好ましくは２０質量部以下である。また、エポキシ基を含有しないモノビニル単量体に由来する構造単位の含有量は０質量部でもよいが、当該構造単位を含有する場合は、全構造単位に対し５質量部以上が好ましい。
【００２６】
上記構造単位（Ｍ−１）〜（Ｍ−３）の含有量の好ましい組み合わせは、構造単位（Ｍ−１）：全構造単位に対し４０〜８０質量部、構造単位（Ｍ−２）：全構造単位に対し２０〜６０質量部、構造単位（Ｍ−３）：全構造単位に対し０〜２０質量部である。
【００２７】
本発明に用いる合成高分子支持体は、単位時間当たりの処理容量の観点から、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。
合成高分子支持体の形態としては、粒子状（ビーズ状）、モノリス状、板状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。また、合成高分子支持体は、水不溶性担体であることを考慮すると、多孔性ビーズ、モノリス、又は膜が好ましく、特に水不溶性担体上に配置された抗体アフィニティーリガンドと陽イオン交換基が協奏的に機能するために、その物理的距離が近接し、一定の滞留時間が得られることが当該分離マトリックスの機能を効果的に発揮できることから、多孔性ビーズ（多孔質ビーズ）が好ましい。
【００２８】
＜酸性基を含む基＞
本発明における、酸性基を含む基は、アフィニティーリガンドから抗体等の標的物を解離させる条件下で陽イオン交換基として機能し、標的物を捕捉できると共に、ナトリウムイオン、カリウムイオン等のカウンターイオンにより、該標的物の単量体、凝集体の順序でイオン強度依存的に溶出（脱離）できればよい。また、本発明のミックスモード用担体は、酸性基を含む基が、合成高分子支持体表面上に結合しているものである。これによって、優れた防汚性が得られる。
【００２９】
酸性基としては、具体的には、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-Ｍ+、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-Ｍ+、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）2、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）2、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-）2、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-Ｍ+）、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-）等の１価の酸性基；−Ｏ−（Ｏ＝Ｐ−ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−（Ｏ＝Ｐ−Ｏ-Ｍ+）−Ｏ−、−Ｏ−（Ｏ＝Ｐ−Ｏ-）−Ｏ−等の２価の酸性基が挙げられる。ミックスモード用担体は、これらのうち１種又は２種以上を合成高分子支持体上に有していてよい。
なお、上記１価の酸性基は、結合手が１つの酸性基を意味し、２価の酸性基は、結合手が２つの酸性基を意味する。上記Ｍ+は、それぞれ対イオンを示す。対イオンとしては、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン等のアルカリ金属イオン；マグネシウムイオン、カルシウムイオン等のアルカリ土類金属イオン；アンモニウムイオン；有機アンモニウムイオン等が挙げられる。
これら酸性基の中でも、上記１価の酸性基が好ましい。なお、防汚性の観点からは、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-Ｍ+、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-Ｍ+、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-がより好ましい。
酸性基としては、アフィニティーリガンドからの標的物の溶出ｐＨ域において、局所的な酸性環境の形成を避けることが好ましく、弱酸性基であることが好ましい。たとえば、プロテインＡを抗体アフィニティーリガンドとする場合は、陽イオン交換基としてカルボキシ基の利用が好ましい。
【００３０】
酸性基を含む基は、合成高分子支持体上に直接固定されていてもよいし、スペ一サー、リンカー等を介して固定されていてもよい。また、アフィニティーリガンドから標的物が解離する酸性ｐＨ条件下で陽イオン交換体として機能できれば、陽イオン交換基、スペーサーやリンカーが他の機能を有する官能基を含んでいてもよく、それらの分子形状も特に制限されない。
【００３１】
酸性基を含む基としては、アフィニティーリガンドから標的物を解離する際に少ない解離液の使用量で解離させ、効率よく標的物を分離精製、定量又は検出する観点から、ｐＫａが−３．０〜５．０の範囲内の基が好ましい。特に、ｐＫａが−３．０〜１．０の範囲内であると、標的物を解離させる際に使用する解離液として一般的に用いられているような解離液を用いた場合でも解離液の量を少なく抑えることができ、標的物を高濃度で回収することができる。
【００３２】
酸性基を含む基としては、酸性基を含む有機基が挙げられ、好適な例としては、以下の式（１）で表される１価の基が挙げられる。
【００３３】
【化１】
0006630036.tif 000002
【００３４】
〔式（１）中、Ｒ1は、炭素数１〜１２の２価の有機基を示し、Ｘは酸性基を示す。〕
【００３５】
上記式（１）中のＸで示される酸性基は、上記１価の酸性基と同様である。
Ｒ1で示される２価の有機基の炭素数は、好ましくは１〜８であり、より好ましくは１〜６であり、更に好ましくは１〜４である。
Ｒ1で示される２価の有機基としては、以下の式（２）で表される２価の基が好ましい。
【００３６】
【化２】
0006630036.tif 000003
【００３７】
〔式（２）中、Ｒ2は、炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を示し、Ｙ1は、＞Ｓ、＞Ｓ＝Ｏ、＞Ｓ（＝Ｏ）2、＞ＮＨ、又は＞Ｏを示し、＊は、式（１）中のＸとの結合位置を示す。〕
【００３８】
Ｙ1としては、＞Ｓ、＞ＮＨが好ましく、＞Ｓがより好ましい。
【００３９】
Ｒ2で示される２価の炭化水素基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。２価の炭化水素基の炭素数は、好ましくは１〜８であり、より好ましくは１〜６であり、更に好ましくは１〜４である。また、２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。アルカンジイル基の具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。
【００４０】
酸性基を含む基の含有量としては、防汚性の観点から、ミックスモード用担体の表面積１ｍ2あたり、０．０５μｍｏｌ以上が好ましく、０．５〜３０μｍｏｌがより好ましく、１．０〜１０μｍｏｌがさらに好ましく、２．０〜５．０μｍｏｌが特に好ましい。酸性基を含む基の含有量は、後述する実施例と同様の方法で測定すればよい。
【００４１】
＜アフィニティーリガンド＞
本発明におけるアフィニティーリガンドとは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から標的（目的）の分子を選択的に捕集（結合）する物質を示す。本発明のミックスモード用担体は、酸性基を含む基を介さずに合成高分子支持体表面上にアフィニティーリガンドが結合したものであることが好ましい。これによって、アフィニティーリガンドの多点結合が抑えられ、アフィニティーリガンドの三次元構造が維持されるため、アフィニティーリガンドの活性が保たれ、標的物へのアフィニティー低下を防ぐことができる。
【００４２】
本発明において、アフィニティーリガンドは、標的物と特異的に結合するものであればよいが、例えば、タンパク質、核酸、ペプチド、酵素、キレート化合物、レセプター、アプタマー、抗体、抗原、ビタミン、金属イオン等が挙げられる。斯様なアフィニティーリガンドの中でも、タンパク質、核酸、キレート化合物が好ましい。中でも、精製の標的物を抗体とする抗体アフィニティーリガンドである場合は、イムノグロブリン結合タンパク質がより好ましい。
【００４３】
本発明に用いることができる抗体アフィニティーリガンドは、標的物として抗体又は抗体の定常領域であるＦｃ含有分子に特異的に結合しうる特徴を有していれば特に限定されないが、ペプチド性リガンド、蛋白質性リガンド、又は化学合成性リガンド（合成化合物）が好ましい。標的物に対する特異性の視点からペプチド性又は蛋白質性リガンドが更に好ましく、その内、抗体アフィニティーリガンドがプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐ、プロテインＦｃγＲ、抗体結合性合成ペプチドリガンド及びそれら類縁物質であることが更に好ましい。抗体アフィニティーリガンドとしては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ及びそれら類縁物質がより好ましく、プロテインＡ及びその類縁物質が最も好ましい。抗体アフィニティーリガンドは、標的分子結合ドメイン（単量体ペプチド又は蛋白質、単ドメイン）を有していれば特に制限されないが、２個以上のドメインが連結された多量体ペプチド又は蛋白質（複ドメイン）が好ましい。上記ドメインの数は２〜１０個がより好ましく、２〜８個が更に好ましく、２〜６個が更に好ましい。特に３〜６個のドメインが連結された多量体蛋白質であることが好ましい。これらの多量体蛋白質は、単一の標的分子結合ドメインの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、標的物が同一であれば、複数種類の標的分子結合ドメインの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
【００４４】
抗体アフィニティーリガンドの標的分子結合ドメインを連結する方法としては、多量体蛋白質の３次元立体構造を不安定化しない方法が好ましく、たとえば、ドメイン配列の末端アミノ酸を介する連結方法、ドメイン配列のアミノ酸残基を介さず連結する方法、又は、１又は複数のドメイン配列以外のアミノ酸残基で連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。
【００４５】
抗体アフィニティーリガンドとしては、多量体蛋白質を１つの構成成分として、機能の異なる他の蛋白質と融合させた融合蛋白質を好ましく用いることができる。融合蛋白質としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ一トランスフェラーゼ）が融合した蛋白質やＤＮＡアプタマー等の核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている蛋白質等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
アフィニティーリガンド結合量としては、動的結合容量の観点から、担体の乾燥重量１ｇあたり、好ましくは１０〜２００ｍｇ、より好ましくは２５〜１００ｍｇ、更に好ましくは３０〜１００ｍｇ、特に好ましくは５０〜１００ｍｇである。
【００４７】
アフィニティーリガンドを合成高分子支持体に固定する方法としては、一般的な方法を用いることができる。例えば、アフィニティーリガンドのアミノ基が担体上に導入されたホルミル基を介して合成高分子支持体に結合してもよく、アフィニティーリガンドのアミノ基が合成高分子支持体上の活性化されたカルボキシ基を介して担体に結合してもよく、アフィニティーリガンドのアミノ基が合成高分子支持体上のエポキシ基を介して担体に結合してもよい。
【００４８】
アフィニティーリガンドを固定するために合成高分子支持体に導入される官能基としては、アフィニティーリガンドと共有結合を形成することができる官能基であれば、特に限定されないが、例えばエポキシ基（エピクロルヒドリン）、臭化シアン、Ｎ，Ｎ一ジスクシンイミジル炭酸塩（ＤＳＣ）などで活性化されるヒドロキシ基、アルデヒド基又は活性化力ルボン酸基（例えば、Ｎ一ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）活性化エステル）などの反応性官能基（ｒ活性化基）等を挙げることができる（ＨｅｒｍａｎｓｏｎＧ．Ｔ．他著、「ＩｍｍｏｂｉＩｉｚｅｄＡｆｆｉｎｉｔｙＬｉｇａｎｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ」、１９９２年；米国特許第５，８７４，１６５号；米国特許第３，９３２，５５７号；米国特許第４，７７２，６５３号；米国特許第４，２１０，７２３号；米国特許第５，２５０，６１２３号；欧州特許公開第１３５２９５７号；国際公開第２００４／０７４４７１号）。これらの中にはアフィニティーリガンドが合成高分子支持体に直接共有結合するものと、直鎖、分岐鎖、又は環状のリンカー又はスペーサーが用いられるものが含まれる。なお、アフィニティーリガンドが導入された合成高分子支持体を活性化する場合はアフィニティーリガンドと直接反応しない活性化手法が好ましい。
【００４９】
アフィニティーリガンドのうち、蛋白質性リガンドを担体に固定する方法は、蛋白質の官能基の一部と担体の官能基の一部を反応させる方法を用いることができる。その反応に利用できる蛋白質側の主な官能基（活性基）としては、Ｎ末端アミノ酸またはリジン（Ｌｙｓ）側鎖のアミノ基；システイン（Ｃｙｓ）側鎖のチオール基；Ｃ末端アミノ酸、グルタミン酸（ＧＩｕ）側鎖またはアスパラギン酸（Ａｓｐ）側鎖のカルボキシ基等があげられるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
また、リガンドの配向性を制御して蛋白質性抗体アフィニティーリガンドを合成高分子支持体に固定する方法として、Ｃ末端にシステインを有するプロテインＡを利用する方法が提案されており（米国特許第６，３９９，７５０号、ＬｊｕｎｇｑｕｉｓｔＣ．他著，ｒＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」，１９８９年，１８６巻，５５７−５６１頁）、これを利用してもよい。
【００５１】
リンカーを利用する固定技術としては、合成高分子支持体とアフィニティーリガンドとの距離を確保し、立体障害を排除して高性能化を図る方法の他、リンカー又はスペーサーの中に官能基（例えば、帯電アミン）を付与、形成させる方法等が挙げられる。抗体アフィニティーリガンドの固定時にリンカー又はスペーサー部分に抗体アフィニティーリガンドを効果的に集積し、固定収率の向上による分離性能の向上が検討されてきている。たとえば、リンカーアームの１部としてＮＨＳ活性化されたカルボン酸で誘導体化された担体への蛋白質性リガンドの固定技術が挙げられ（米国特許第５，２６０，３７３号、特開２０１０−１３３７３３号公報、特開２０１０−１３３７３４号公報）、これを利用してもよい。
【００５２】
また、リンカーやスペーサーとは別に担体に会合性基を利用し、アフィニティーリガンドを支持体上に集積した後に、会合性基とアフィニティーリガンドの間に共有結合を形成させずに支持体上に抗体アフィニティーリガンドを個別に固定する方法も提案されており（特開２０１１−２５６１７６号公報）、これを利用してもよい。
【００５３】
＜ヒドロキシ基を含む基＞
また、本発明のミックスモード用担体は、ヒドロキシ基を含む基が、合成高分子支持体表面上に結合していてもよい。酸性基の他に更にヒドロキシ基を含む基が支持体表面上に結合していると、さらに優れた防汚性を発揮できる。
【００５４】
ヒドロキシ基を含む基としては、ヒドロキシ基を含む有機基が挙げられ、好適な例としては、以下の式（３）で表される１価の基が挙げられ、より好ましくは以下の式（４）で表される１価の基である。
【００５５】
【化３】
0006630036.tif 000004
【００５６】
〔式（３）中、Ｒ3は、炭素数１〜１２の２価又は３価の有機基を示し、ｎは、１又は２を示す。〕
【００５７】
【化４】
0006630036.tif 000005
【００５８】
〔式（４）中、Ｒ4は、炭素数１〜１２の２価又は３価の炭化水素基を示し、Ｙ2は、＞Ｓ、＞Ｓ＝Ｏ、＞Ｓ（＝Ｏ）2、＞ＮＨ、又は＞Ｏを示し、ｎは、１又は２を示す。〕
【００５９】
式（３）中、Ｒ3で示される２価又は３価の有機基の炭素数は、好ましくは１〜８であり、より好ましくは１〜６であり、更に好ましくは１〜４である。
【００６０】
式（４）中、Ｙ2としては、＞Ｓが好ましい。
【００６１】
Ｒ4で示される２価又は３価の炭化水素基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。２価又は３価の炭化水素基の炭素数は、好ましくは１〜８であり、より好ましくは１〜６であり、更に好ましくは１〜４である。
また、２価又は３価の炭化水素基は、好ましくは２価又は３価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基、アルカントリイル基である。
上記アルカンジイル基の具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。
上記アルカントリイル基の具体例としては、メタン−１，１，１−トリイル基、エタン−１，１，２−トリイル基、プロパン−１，２，３−トリイル基、プロパン−１，２，２−トリイル基等が挙げられる。
【００６２】
酸性基を含む基の含有量（α）とヒドロキシ基を含む基の含有量（β）とのモル比〔（α）：（β）〕は特に限定されないが、好ましくは１００：０〜５：９５、より好ましくは９９：１〜２５：７５、更に好ましくは９０：１０〜５０：５０、更に好ましくは８５：１５〜５５：４５、特に好ましくは８５：１５〜６０：４０とした場合には、優れた防汚性を得ることができる。
【００６３】
本発明の担体において、アフィニティーリガンド、酸性基を含む基、ヒドロキシ基を含む基は、担体の安定性の観点から、環状エーテル基が開環してなる基、ホルミル基が還元してなる基、トシル基が求核置換されてなる基等のような、反応性基が開環、還元又は求核置換等してなる基を介して、合成高分子支持体表面上に共有結合しているものが好ましく、環状エーテル基が開環してなる基を介して合成高分子支持体表面上に結合しているものがより好ましい。環状エーテル基が開環してなる基としては、開環エポキシ基が好ましい。
【００６４】
ここで、「環状エーテル基」としては、環を構成する原子数が３〜７個の環状エーテル基が好ましい。環状エーテル基は、置換基としてアルキル基を有していてもよい。環状エーテル基の具体例としては、以下の式（５）〜（１０）で表される環状エーテル基が挙げられ、式（５）で表される環状エーテル基がより好ましい。
【００６５】
【化５】
0006630036.tif 000006
【００６６】
〔式中、Ｒ5〜Ｒ8は、それぞれ独立して、水素原子又はアルキル基を示し、＊は結合位置を示す。〕
【００６７】
Ｒ5〜Ｒ8で示されるアルキル基の炭素数は、好ましくは１〜４であり、より好ましくは１又は２である。アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
また、Ｒ5〜Ｒ8としては、水素原子が好ましい。
【００６８】
（担体の製造方法）
本発明のミックスモード用担体は、例えば、以下の工程１及び２を含む方法により製造できる。斯かる方法によれば、簡便且つ容易に、本発明のミックスモード用担体を得ることができる。
（工程１）アフィニティーリガンドと結合可能な反応性基（以下、単に反応性基ともいう）を表面に有する合成高分子支持体（以下、単に原料支持体ともいう）の前記反応性基の一部に、アフィニティーリガンドを結合する工程
（工程２）残りの反応性基に、当該反応性基と反応可能な官能基及び酸性基を有する化合物を反応させる工程
【００６９】
＜工程１＞
工程１は、原料支持体の反応性基の一部に、アフィニティーリガンドを結合する工程である。反応性基に対してアフィニティーリガンドを結合させる手法は特に限定されるものではなく、例えば、アフィニティーリガンドに存在するアミノ基やカルボキシ基、チオール基等を利用した、従来のカップリング法で行えばよい。カップリング法としては、（ｉ）臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン、過ヨウ素酸ナトリウム等を用いて原料支持体を活性化し、アフィニティーリガンドとカップリング反応を行い固定する方法、（ｉｉ）原料支持体とアフィニティーリガンドが存在する系に、カルボジイミドのような縮合試薬やグルタルアルデヒドのような分子中に複数の反応性基を持つ試薬を加えて、縮合・架橋することにより固定する方法、（ｉｉｉ）原料支持体に反応性基をあらかじめ導入しておき、原料支持体の活性化を経ずに、カップリング反応を行い固定する方法等が挙げられる。
【００７０】
なお、原料支持体として多孔質粒子を用いる場合には、公知のシード重合、懸濁重合等で多孔質粒子を合成すればよい。重合に際しては、モノマーに加えて、重合開始剤、多孔化剤、水系媒体、分散安定剤、界面活性剤、重合調整剤、重合禁止剤、シード粒子等を必要に応じて使用する。モノマーとしては、反応性基を有するモノマーに加え、必要に応じて当該モノマー以外のモノマーを用いてよい。これらモノマーとしては、いずれも、エチレン性不飽和モノマーが挙げられる。具体的には、スチレン系モノマー、ビニルケトン系モノマー、（メタ）アクリロニトリル系モノマー、（メタ）アクリレート系モノマー及び（メタ）アクリルアミド系モノマーから選ばれる１種又は２種以上のモノマーを例示できる。
【００７１】
また、原料支持体が有する反応性基としては、水系中でも安定してカップリング反応を実施できる観点から、環状エーテル基が好ましく、環を構成する原子数が３〜７個の環状エーテル基がより好ましい。環状エーテル基は、置換基としてアルキル基を有していてもよい。環状エーテル基の具体例としては、上記式（５）〜（１０）で表される環状エーテル基が挙げられる。
【００７２】
また、原料支持体に結合させるアフィニティーリガンドは上記と同様である。
アフィニティーリガンドの合計使用量は、原料支持体１ｇに対し、通常５０〜３００ｍｇ程度であるが、好ましくは１２０〜１８０ｍｇである。
【００７３】
また、工程１は、塩を添加したバッファー存在下で行うのが好ましい。塩の種類としては、クエン酸三ナトリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられ、バッファーとしては、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー、ホウ酸バッファー等が挙げられる。バッファーの合計使用量は、原料支持体に対し、通常２０〜８０質量倍程度であるが、好ましくは３５〜４５質量倍である。
また、工程１の反応時間は特に限定されないが、通常０．５〜７２時間程度であり、反応温度は通常１〜６０℃程度である。
【００７４】
＜工程２＞
工程２は、残りの反応性基に、当該反応性基と反応可能な官能基及び酸性基を有する化合物（以下、酸性基含有化合物ともいう）を反応させる工程である。
【００７５】
酸性基含有化合物としては、メルカプト酢酸（ｐＫａ＝３．５〜４．０）、３−メルカプトプロピオン酸（ｐＫａ＝３．５〜４．０）、４−メルカプトブタン酸（ｐＫａ＝３．５〜４．０）等のメルカプトカルボン酸；グリシン（ｐＫａ＝２．０〜２．５）、β−アラニン（ｐＫａ＝２．０〜２．５）等のアミノ酸；２−メルカプトエタンスルホン酸（ｐＫａ＝−２．５〜−２．０）、３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸（ｐＫａ＝−２．５〜−２．０）等のメルカプトスルホン酸；アミノメタンスルホン酸（ｐＫａ＝−２．０〜−１．０）、２−アミノエタンスルホン酸（ｐＫａ＝−２．０〜−１．０）、３−アミノ−１−プロパンスルホン酸（ｐＫａ＝−２．３〜−１．３）等のアミノ基含有スルホン酸；これらの塩等が挙げられる。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；有機アンモニウム塩等が挙げられる。
酸性基含有化合物の合計使用量は、残留反応性基１モルに対し、通常０．１〜４０モル当量であるが、アフィニティーリガンドの多点結合を防ぐ観点から、２〜４０モル当量の過剰量にて残留反応性基をブロッキングすることが好ましい。
【００７６】
なお、ヒドロキシ基を含む基を導入する場合は、メルカプトエタノール、チオグリセロール等のメルカプト基を含むアルコール等を酸性基含有化合物と組み合わせて添加すればよい。
【００７７】
また、工程２の反応時間は特に限定されないが、通常０．５〜７２時間程度であり、好ましくは１〜４８時間である。また、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常２〜１００℃程度である。
なお、上記工程１と工程２は、効率やコストの面から工程１から工程２の順に行うのが好ましい。
【００７８】
そして、上記のようにして得られる本発明のミックスモード用担体は、標的物の動的結合容量が高く、且つ非特異吸着が起こり易い合成高分子支持体を用いた場合でも、防汚性に優れる。したがって、本発明のミックスモード用担体は、合成高分子支持体の組成等に依存することなく、宿主細胞に含まれるＨＣＰ（Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）やＤＮＡ等の生体由来不純物等に対して優れた防汚性を示し、極めて高い分離選択性を有しながら、多糖類系の支持体よりも抗体の凝集体との疎水性相互作用を有しているため、より分離性能に優れた担体が得られる。
【００７９】
〔標的物の精製方法〕
本発明の標的物の精製方法は、酸性基を含む基及びアフィニティーリガンドを合成高分子支持体上に有するミックスモード用担体と、前記アフィニティーリガンドが捕捉しうる標的物とを接触させる工程Ａと、前記アフィニティーリガンドと前記標的物とを解離させる解離液と、前記工程Ａで標的物を捕捉したミックスモード用担体とを接触させて標的物を解離させる工程Ｂと、を含み、前記工程Ｂが、アフィニティーリガンドから標的物が解離する条件下で、イオン強度が段階的に高くなる塩濃度を２種類以上使用するステップワイズ方式、又は勾配的に塩濃度を高くするグラジェント方式の少なくともいずれかで解離する工程を含むことを特徴とする。なお、工程Ｂにおいて、ステップワイズ方式とグラジェント方式の両方を組合せてもよい。
工程Ａに関しては、上記のミックスモード用担体を使用すればよく、特に制限はない。標的物も特に限定されないが、アフィニティーリガンドとしてプロテインＡなどの抗体アフィニティーリガンドを用いた場合には、標的物として抗体が例示される。
【００８０】
本発明のミックスモード用担体を用いる場合、酸性基を有する基とアフィニティーリガンドとの両リガンドにより、抗体の単量体と凝集体との分離機能が協奏的に機能することで優れた分離特性を示すほか、アフィニティー精製工程とイオン交換基による精製工程との２工程のクロマトグラフィー操作を１工程に短縮可能で、使用する緩衝液の種類および使用量、更に、作業時間の短縮が期待できる。
【００８１】
また、本発明のミックスモード用担体を用いた精製方法は、アフィニティーリガンドから標的物が解離する狭いｐＨ域（好ましくはｐＨ３〜４、より好ましくはｐＨ３．１〜３．９、さらに好ましくはｐＨ３．２〜３．８）の条件下で、イオン強度（好ましくは１０〜５００ｍＭ、より好ましくは１５〜４００ｍＭ、さらに好ましくは２０〜３５０ｍＭ）が段階的に高くなる塩濃度を２種以上使用する「ステップワイズ方式」、又は前記範囲で勾配的に塩濃度を高くする「グラジェント方式」）の設定により単量体含量の高い溶出画分を得ることが可能である。
【００８２】
特にモノクローナル抗体の精製においては、前記解離ｐＨは標的物の等電点から大きく離れているため、抗体毎に解離イオン強度の幅に大きな差異がなく、狭い範囲で各種標的物の使用条件の設定が可能であることが期待できる。更に、アフィニティーリガンドとしては、抗体アフィニティーリガンドが好ましく、解離ｐＨ域を更に狭く設定可能であるほか、アルカリＣＩＰ洗浄の使用により、効果的な洗浄も可能であるため、安定的なプロセス構築の観点からは改変プロテインＡの利用がより好ましい。
【００８３】
本発明のミックスモード用担体の使用方法に関し、中性付近で抗体等の標的物を吸着させる場合、陽イオン交換基のカウンターイオンを一定濃度以上添加して使用することが好ましい。当該条件では陽イオン交換体機能は作用せず、また、作用しても更に高いイオン強度の洗浄でその陽イオン交換基に由来する非特異的な吸着物は洗浄除去できる。
一方、イオン強度は抗体アフィニティーリガンドの吸着を阻害せず、高い特異性をもって標的物を吸着できるほか、高イオン強度の洗浄液の使用により、基材、リンカー、スペーサー、リガンドおよび標的物に非特異的に吸着する分子を効果的に洗浄除去しうる。
【００８４】
通常、組換えモノクローナル抗体を発現させた培養上清は、ヒトなどの体液に近いイオン強度を有することから直接本発明の分離マトリックスに供しても高い特異性を維持できる他、より高いイオン強度の洗浄液により夾雑物を更に低減できる。
【００８５】
本発明により調製されたミックスモードアフィニティー分離マトリックスは、抗体アフィニティーリガンドと陽イオン交換基の比率によってその機能が調節可能である。抗体アフィニティーリガンドの結合容量が陽イオン交換基の結合容量よりも大きい場合は、酸性溶出時に低イオン強度でも抗体が担体から解離される傾向があり、抗体アフィニティーリガンドの結合容量が陽イオン交換基の結合容量と同程度又は低い場合には、低イオン強度では抗体アフィニティーリガンドから解離された抗体が陽イオン交換基に強く保持され、抗体が解離されにくい傾向にあり、より高い回収率を得るには解離イオン強度を高めに設定する必要がある。何れの場合も、イオン強度の調節により回収率および、そのモノマー比率の制御が可能である。
【００８６】
抗体アフィニティーリガンドに基づく抗体結合容量と陽イオン交換基に基づく抗体結合容量の比率に特に制限を設けないが、本発明のミックスモード用担体における標的物（特に抗体、より好ましくはヒトＩｇＧ又はヒト化モノクローナル抗体などのＩｇＧである。）の解離ｐＨ条件下における陽イオン交換基による標的物（特に抗体、より好ましくはヒトＩｇＧ又はヒト化モノクローナル抗体などのＩｇＧ）の動的結合容量が、抗体吸着条件下（中性条件下）における抗体アフィニティーリガンドによる標的物（特に抗体、より好ましくはヒトＩｇＧ又はヒト化モノクローナル抗体などのＩｇＧ）の動的結合容量に対し、２倍以下であることが好ましく、等倍以下であることがより好ましく、１／５倍以下が特に好ましい。下限値は、例えば１／１００倍以上であってもよく、１／５０倍以上であってもよい。陽イオン交換基による抗体結合量が小さい場合には、解離イオン強度を低く設定することが可能であり、後段の抗体精製プロセスにて脱塩等の処理が必要でなくなる傾向があるほか、解離イオン強度の設定の幅が狭くプロセス開発が容易である。
【００８７】
本発明のミックスモードアフィニティー分離マトリックスにより精製される標的物は、例えば、免疫グロブリンＧおよびその類縁体（誘導体を含む）などであり、一般的に抗体と称される分子の他、免疫グロブリン分子の定常領域であるＦｃ領域と他の機能性蛋白質又はペプチドを融合してなるＦｃ融合蛋白質（Ｆｃ含有分子）が含まれる。これらは、抗体医薬品の原料として利用される。
【００８８】
以下に、本発明のミックスモード用担体を用いた精製方法の詳細な説明を、標的物が免疫グロブリンＧの場合について例示するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８９】
本発明の標的物の精製方法は、合成高分子支持体上に酸性基を含む基及びアフィニティーリガンドを有するミックスモード用担体と、前記アフィニティーリガンドが捕捉しうる標的物とを接触させる工程Ａを含む。免疫グロブリンＧを含む蛋白質溶液のｐＨが中性付近となるように調整した後、該溶液を本発明のミックスモード用担体を充填したカラムに通過させ、アフィニティーリガンドを介して免疫グロブリンＧを特異的にミックスモード用担体に吸着させる。たとえば、プロテインＡをアフィニティーリガンドとする場合、その負荷ｐＨは６以上が好ましく、６．３以上９以下がより好ましく、６．５以上８．５以下がさらに好ましい。哺乳類培養細胞により生産される免疫グロブリンＧの精製において、特にイオン強度の調製を必要としないほか、あらかじめイオン強度を上げて更に非特異吸着を抑制することもできる。
【００９０】
本発明においては、さらに洗浄工程を有することが好ましい。洗浄工程では、アフィニティーリガンドが機能する条件範囲の緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。すなわち、ｐＨの好ましい範囲は前記負荷時と同じ範囲（中性付近のｐＨ）であってもよく、例えば、６以上が好ましい。この時点では標的物である免疫グロブリンＧは本発明のミックスモード用担体に吸着されている。この時、中性付近のｐＨでイオン強度や組成物の最適化により、不純物を効果的に除去できる場合がある。負荷、洗浄時において、陽イオン交換基が機能しない条件が好ましく、すなわち、中性付近のｐＨにすると共に一定以上のイオン強度の洗浄液を利用することが好ましい。この過程で該分離マトリックスおよび／又は、免疫グロブリンＧを介して非特異的にカラムに残留する不純物を洗浄することができる。イオン強度は、例えば、０．２Ｍ以上が好ましく、０．５Ｍ以上がより好ましい。
【００９１】
本発明の精製方法は、前記アフィニティーリガンドと前記標的物とを解離させる解離液と、前記工程Ａで標的物を捕捉したミックスモード用担体とを接触させる工程Ｂを含む。工程Ｂは、アフィニティーリガンドから解離する条件下、イオン強度が段階的に高くなる塩濃度を２種類以上使用するステップワイズ方式、又は、勾配的に高くなる塩濃度を使用するグラジェント方式の少なくともいずれかで解離する工程である。
【００９２】
工程Ｂでは、中性付近でイオン強度が低い緩衝液にカラムを置換し、解離時の陽イオン交換基によるイオン強度依存的解離機能の発現に備える。
解離の際には酸性ｐＨ、イオン強度の組み合わせにより、抗体アフィニティーリガンドからの解離時に陽イオン交換分離モードを機能させ、両リガンドの協奏的な作用で、単量体含量の高い画分を低イオン強度溶出画分に回収することができる。解離液のｐＨは抗体アフィニティーリガンドからの免疫グロブリンＧの解離ｐＨが適用できる。当該ｐＨは、ミックスモード用担体の作製に用いたアフィニティーリガンドと免疫グロブリンＧの種類により決定される分離条件を中心に決定されることから、特段の条件設定を必要としない。
【００９３】
抗体アフィニティーリガンドにプロテインＡを用いた場合は、ｐＨは２〜６の間に設定されることが好ましい。ただし、標的物の酸変性を避ける目的から、ｐＨ３．０以上がより好ましく、ｐＨ３．３以上がより好ましく、ｐＨ３．５以上が特に好ましい。ｐＨは、好ましくは５．５以下、より好ましくは５．０以下である。アルカリ耐性型のプロテインＡリガンドを使用する場合は、一般的にその解離ｐＨは３．５〜４．０の間を中心に設定されるが、これに限定されるものではない。
【００９４】
また、解離イオン強度は、抗体アフィニティーリガンドと陽イオン交換基の導入比率に依存するほか、単位体積当たりの免疫グロブリンＧの負荷量にも依存するが、グラジエント実験やステップワイズ解離実験により最適化ポイントを容易に設定しうる。
【００９５】
本発明により調製されるミックスモード用担体からの抗体解離は、塩濃度グラジエント方式でもステップワイズ方式でも適用可能であり、また、これらを組み合わせたものでもよいが、溶出液量の低減を目的にした場合はイオン強度によるステップワイズ方式が好ましい。更に、操作の単純化のためには、ワンステップで抗体の回収と高モノマー含量化を達成できる条件設定が好ましい。
【００９６】
なお、洗浄工程のイオン強度と酸性ｐＨの組み合わせでも凝集体がカラムに残留し溶出画分に混入しない場合は、イオン強度調節工程を省略することができる。
【００９７】
本発明により調製されたミックスモード用担体を用いて精製された免疫グロブリンＧは、単一の分離モードに基づく抗体アフィニティー分離マトリックスよりも高いモノマー選択性を示し、その溶出液中のモノマー含量が高い。
【００９８】
本発明のミックスモード抗体アフィニティー分離マトリックスを用いることにより、特異性の高いアフィニティー精製と、主に陽イオン交換クロマトグラフィーにより達成しうるモノマー含量の向上を、高回収率を維持したまま単一のクロマト操作で効率的に達成可能であることから、後段プロセスヘの負荷の低減が可能となり、プロセス全体の収率向上と単量体含量の向上に貢献できる。すなわち、本発明により、抗体医薬品の製造プロセスの生産性向上と高純度化に寄与できる。
【実施例】
【００９９】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例における各分析条件を以下に示す。なお、実施例１は参考例である。
【０１００】
＜エポキシ基含有量＞
重合で使用したエポキシ基含有モノマー量より計算されるエポキシ基のモル数が１．００ｍｍｏｌとなるように、多孔質粒子分散液（Ｓ−３）をポリエチレンボトルに正確に測り取り、これに塩化カルシウム３７．５質量％水溶液２５ｍＬ及び０．２規定の塩酸１０ｍＬを加えて、７５℃で１時間撹拌することによりエポキシ基を開環し、冷却後、０．２規定の水酸化ナトリウム水溶液１０ｍＬで中和し、さらにｐＨメーターでｐＨをモニターしながら０．１規定の塩酸で逆滴定することにより、アフィニティーリガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量を定量した。
【０１０１】
＜酸性基の結合量＞
担体１〜５を固形分換算で０．５ｇ正確に測り取り、電気伝導度測定計（Ｍｅｔｒｏｈｍ製  ７９４  Ｂａｓｉｃ  Ｔｉｔｒｉｎｏ）を用いて、酸性基の結合量を算出した。
【０１０２】
（実施例１）
（１）３６０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製  ＰＶＡ−２１７）０．７２ｇを添加し、加熱撹拌しポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製  エマール１０Ｇ）０．１８ｇ、炭酸ナトリウム０．３６ｇ及び亜硝酸ナトリウム０．１８ｇを添加し、撹拌して、水溶液（Ｓ−１）を調製した。
一方、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）６．８８ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）１．３７ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）４．１２ｇ及びポリエチレングリコール＃４００ジメタクリレート（新中村化学社製、９Ｇ）１．３７ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）２０．６３ｇ及びアセトフェノン（井上香料製造所社製）５．３０ｇの混液に溶解させ、単量体溶液（Ｓ−２）を調製した。
次いで、前記水溶液（Ｓ−１）を、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に前記単量体溶液（Ｓ−２）を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５３ｇを添加し、８６℃に温度を維持した。
【０１０３】
（２）その後、８６℃に温度を維持したまま３時間撹拌を行い、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させ、多孔質粒子分散液（Ｓ−３）を得た。この多孔質粒子のエポキシ基含有量は、粒子の乾燥重量１ｇあたり１．５７ｍｍｏｌであった。
【０１０４】
（３）次に、改変プロテインＡ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製  ｒＳＰＡ）０．１５ｇを、１．０Ｍクエン酸三ナトリウム／０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）４０ｍＬに分散させプロテインＡ分散液を得、このプロテインＡ分散液に、前記多孔質粒子分散液（Ｓ−３）を粒子乾燥重量換算で１ｇ添加した。この分散液を２５℃で５時間振とう撹拌し、プロテインＡを粒子に固定した。この粒子を、プロテインＡ固定粒子（Ｓ−４）とする。
【０１０５】
（４）前記プロテインＡ固定粒子（Ｓ−４）を、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）で洗浄した後、１．０Ｍメルカプト酢酸（和光純薬工業社製）／０．１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を完全に開環（ブロッキング）させた。
その後、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、ミックスモード用担体（担体１）を得た。メルカプト酢酸の結合量は、担体の表面積１ｍ2あたり、２．４８μｍｏｌであった。
【０１０６】
（実施例２）
実施例１のエポキシ開環工程に用いる溶液を、１．０Ｍメルカプト酢酸（和光純薬工業社製）／０．１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）から、１．０Ｍ  ３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）／０．１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、ミックスモード用担体（担体２）を得た。３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウムの結合量は、担体の表面積１ｍ2あたり、３．１２μｍｏｌであった。
【０１０７】
（比較例１）
実施例１のエポキシ開環工程に用いる溶液を、１．０Ｍメルカプト酢酸（和光純薬工業社製）／０．１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）から、１．０Ｍ  チオグリセロール（旭化学工業社製）／０．１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、担体３を得た。酸性基の結合量は、担体の表面積１ｍ2あたり、＜０．０５μｍｏｌであった。
【０１０８】
（比較例２）
プロテインＡ固定担体として０．５Ｍの食塩水に置換したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）使用し、これにカルボキシ基を導入した。
すなわち、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅを湿潤体積として４ｍＬを反応容器にとり、水にてスラリー体積を５ｍＬとし、これに０．２５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）溶液を１ｍＬ加えた。次に０．１Ｍクエン酸／０．１Ｍグルタミン酸（ｐＨ３．５）溶液を１ｍＬ加え撹拌した。次いで０．８Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液０．５ｍＬ加え、室温で１時間転倒撹拌してアルデヒド基を導入した。この担体スラリーを、冷水で１００倍に希釈した１Ｍグルタミン酸／ＰＢＳ（ｐＨ７）で５回洗浄し、回収後にスラリーの液量を５ｍＬとした。これに１Ｍグルタミン酸／ＰＢＳ（ｐＨ７）を５ｍＬ添加し、室温で２時間転倒撹拌した後に、１Ｍのジメチルアミンボラン水溶液を０．５ｍＬ追加投入し一晩室温で転倒撹拌した。遠心して担体を沈降させた後に液面が６ｍＬになるように上清を除去した中に、２０ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを直接加え、室温で更に２時間転倒撹拌した。水と、０．１Ｍクエン酸と、０．１Ｍ水酸化ナトリウムと、０．５ＭのＮａＣＩを添加したＰＢＳとで十分に洗浄した。このようにして、グルタミン酸のアミノ基を介し還元的アミノ化法でアルデヒド基にカルボキシル基を導入して、ミックスモード用担体（担体４）を得た。カルボキシ基の結合量は、担体の表面積１ｍ2あたり、２．９８μｍｏｌであった。
【０１０９】
（比較例３）
４％アガロースビーズとして水に置換したＬｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｇｌｙｏｘａｌ  ４  Ｒａｐｉｄ  Ｒｕｎ（ＡＢＴ社）を、湿潤体積で４ｍＬ分を反応容器にとり、水にてスラリー体積を５ｍＬとした。その後、０．２５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）溶液を１ｍＬ加えた。更に０．８Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム２ｍＬ加え、室温で０．５時間転倒撹拌し、アルデヒド基が導入された担体を得た。この担体のスラリーを水およびリン酸緩衝液としてダルベッコＰＢＳ（一）（日水）（以下、ＰＢＳ）で十分に洗浄し、回収後にスラリーの量を５ｍＬとした。次に０．１Ｍリン酸ナトリウム、１Ｍクエン酸ナトリウム、０．３Ｍ塩化ナトリウムの混合溶液（ｐＨ６．８）を５ｍＬ加え、混合した後に液量を調整し５．５ｍＬとした。これに５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加え担体のスラリーのｐＨを１１．５〜１２に調整した後、直ちに１００ｍｇのプロテインＡを加えて２〜８℃の条件下で２．５時間撹拌した。１Ｍクエン酸溶液を用いて担体スラリーのｐＨを７〜５に調整した後に１Ｍのジメチルアミンボラン０．５ｍＬを加え室温で一晩転倒撹拌した。水、０．１Ｍクエン酸、０．１Ｍ水酸化ナトリウム、およびＰＢＳで十分に洗浄し、アガロースにプロテインＡが共有結合で固定（結合）された担体（担体５）を得た。酸性基の結合量は、担体の表面積１ｍ2あたり、＜０．０５μｍｏｌであった。
【０１１０】
（試験例１  抗体アフィニティーリガンドに基づく動的結合容量（ＤＢＣ）測定試験）
実施例１〜２、比較例１〜３で作製した担体１〜５について、抗体分離用の担体としての抗体の動的結合容量を測定した。具体的には、担体に結合しないＩｇＧ３等の画分以外の負荷ＩｇＧの１０％が漏出するまでにカラムに結合した抗体量をカラム中の担体体積で割った値から、担体１ｍＬ当たりのＩｇＧ吸着量を１０％動的結合容量（Ｄｙｎａｍｉｃｂｉｎｄｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙｌ；ＤＢＣ）として算出した。クロマトグラフィー条件は以下に示すが、負荷時の流速は、０．４ｍＬ／分とし、接触時間６分の動的結合容量を求めた。なお、負荷時以外の流速設定は、０．６ｍＬ／分（接触時間＝４分）とした。
抗体アフィニティーリガンドに基づく１０％ＤＢＣ測定に用いたクロマトグラフィー条件は以下の通りである。
カラム＝ＩＤ０．６６ｃｍｘＨｅｉｇｈｔ７ｃｍ（Ｏｍｎｉｆｉｔ社製）
流速＝０．４ｍＬ／分（接触時間＝６分）又は０．６ｍＬ／分（接触時間＝４分）
ポリクローナル抗体（ＩｇＧ）＝ガンマグロブリン・ニチヤク（ヒト免疫グロブリンＧ）（日本製薬）
負荷液＝２．５ｍｇ−ＩｇＧ／ｍＬ（ＰＢＳ＝ダルベッコ・日水）平衡化液＝ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
解離液＝５０ｍＭ酢酸、０．１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ３．７５）再生液＝０．１Ｍ酢酸、１Ｍ塩化ナトリウム
ＣＩＰ液＝０．１Ｍ水酸化ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム中和・再平衡化液＝ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
【０１１１】
（試験例２  陽イオン交換基に基づく動的結合容量（ＤＢＣ）測定試験）
実施例１〜２、比較例１〜３で作製した担体１〜５について陽イオン交換基に基づく抗体結合容量を測定した。具体的には、抗体の負荷条件として、抗体アフィニティーリガンドであるプロテインＡの抗体捕捉能力が殆どなく、陽イオン交換基として導入した酸性基含有基が機能しうる条件としてｐＨ３．５の１０ｍＭ酢酸緩衝液を用いた。陽イオン交換基はプロテインＡリガンドと異なりＩｇＧ３等に選択性を示さないことから、負荷開始から全負荷ＩｇＧの１０％が漏出するまでにカラムに結合した抗体量をカラム中の担体体積で割った値から、担体１ｍＬ当たりのＩｇＧ吸着量を１０％ＤＢＣとして算出した。クロマトグラフィー条件は以下に示すが、負荷時の流速は、０．４ｍＬ／分とし、接触時間６分の動的結合容量を求めた。なお、負荷時以外の流速設定は、０．６ｍＬ／分（接触時間＝４分）とした。
陽イオン交換基に基づく１０％ＤＢＣ測定に用いたクロマトグラフィー条件は以下の通りである。
カラム＝ＩＤ０．６６ｃｍｘＨｅｉｇｈｔ７ｃｍ（Ｏｍｎｉｆｉｔ社製）
流速＝０．４ｍＬ／分（接触時間＝６分）又は０．６ｍＬ／分（接触時間＝４分）
ポリクローナル抗体（ＩｇＧ）＝ガンマグロブリン・ニチヤク（日本製薬）負荷液＝２．５ｍｇ−ＩｇＧ／ｍＬ（１０ｍＭ酢酸＝ｐＨ３．５）平衡化液＝１０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）
解離液＝１０ｍＭ酢酸、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ３．５）ＣＩＰ液＝０．１Ｍ水酸化ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム中和・再平衡化液＝１０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）
【０１１２】
（試験例３  酸性条件下でのステップワイズ方式による解離と凝集体の分離）
試験例１に用いたＯｍｎｉｆｉｔ社製のカラム（ＩＤ０．６６ｃｍｘＨｅｉｇｈｔ７ｃｍ）に充填した実施例１〜２、比較例１〜３で作製した担体１〜５に、中性条件下でヒトポリクローナル抗体を担体１ｍＬ当たり７ｍｇ負荷し、酸性条件下で各種イオン強度（ＮａＣｌ  ０ｍＭ、５０ｍＭ、３００ｍＭ）の解離液で抗体を溶出させた。各溶出液をゲルろ過クロマトグラフィーで分析し、各溶出フラクション（画分）の蛋白質ピークエリア値から抗体含量と抗体収率（ＹｉｅＩｄ）を求めた。また、蛋白質ピーク分析から単量体（モノマー）と凝集体（多量体）等の比率を求めて単量体含量（Ｍｏｎｏｍｅｒｃｏｎｔｅｎｔ）及び担体５の単量体収率（ＭｏｎｏｍｅｒＹｉｅＩｄ）を算出した。
担体１〜５の単量体収率は、抗体収率と単量体含量から、担体５からの溶出画分のエリア値の総和を１００％として、以下の式によりを求めた。
［ＮａＣｌ  ０ｍＭ、５０ｍＭまたは３００ｍＭにおける担体１〜４の単量体収率］
（担体１〜５の各ＮａＣｌ濃度における単量体収率（％））＝｛（担体１〜５の抗体収率（％））×（担体１〜５の単量体含量（％））×１００｝／｛９９．４×９４．５＋０．６×８６．３｝
なお、アフィニティー分離マトリックスからの溶出フラクション中における凝集体形成阻止を行う目的で、各解離液に終濃度が０．０５Ｍ以上となるようにアルギニンを添加し、また、ｐＨ５のリン酸ナトリウム溶液を用いて各解離液のｐＨを５〜６として、ゲルろ過クロマトグラフィーに供した。
各クロマトグラフィー条件は、以下の通りである。
カラム＝ＩＤ０．６６ｃｍｘＨｅｉｇｈｔ７ｃｍ（Ｏｍｎｉｆｉｔ社製）
流速＝０．６ｍＬ／分（接触時間＝４分）
ポリクローナル抗体（ＩｇＧ）＝ガンマグロブリン・ニチヤク（日本製薬）負荷液＝２．５ｍｇ−ＩｇＧ／ｍＬ（ＰＢＳ＝ダルベッコ・日水）平衡化液＝ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（３ＣＶ、ＣＶ＝カラム体積）負荷＝６．８ｍＬ
負荷後洗浄＝ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（５ＣＶ）
解離前洗浄液＝１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣＩ（ｐＨ７）（５ＣＶ）解離液１＝１０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）（８ＣＶ）
解離液２＝５０ｍＭ塩化ナトリウム含有、１０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）（８ＣＶ）
解離液３＝３００ｍＭ塩化ナトリウム含有、１０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）（４ＣＶ）
ＣＩＰ液＝０．１Ｍ水酸化ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム（４ＣＶ）中和・再平衡化液＝ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
ゲルろ過クロマトグラフィー条件
カラム＝Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００ＧＬ（ＩＤｌｃｍｘＨｅｉｇｈｔ３０ｃｍ）（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社製）
流速＝０．５ｍＬ／分
検出波長＝２１４ｎｍ
負荷液＝１００μＬ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（吸光度値が１を超えない範囲に希釈）
溶離液＝ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
担体１〜５の酸性条件下でのステップワイズ塩溶出と凝集体の分離特性の評価結果を表１に示した。
【０１１３】
（試験例４  ＨＣＰ測定試験）
実施例１〜２、比較例１〜３で作製した担体１〜５を７０μＬ（湿潤状態）それぞれ秤取り、各抗体に１．０ｍｇ／ｍＬモノクローナル抗体溶液（モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂのバイオシミラーを含有するＣＨＯ細胞培養上清）２．４５ｍＬを加えて、室温で１．５時間撹拌振とうして、抗体を担体に捕捉した。
次いで、前記抗体を捕捉させた担体の全量をスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ製）に移し、遠心分離（１０００ｒｐｍ）によって抗体溶液を除いた。
次に、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファー（ｐＨ７．５）をスピンカラムに加え、合計８４０μＬを遠心分離によって通液し、担体を洗浄した。
次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１．０Ｍ  ＮａＣｌバッファー（ｐＨ７．５）をスピンカラムに加え、合計８４０μＬを遠心分離によって通液し、担体を洗浄した。
次に、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファー（ｐＨ７．５）をスピンカラムに加え、合計８４０μＬを遠心分離によって通液し、担体を洗浄した。
その後、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．２）をスピンカラムに加え、合計７００μＬを遠心分離によって通液し、担体に捕捉されていたモノクローナル抗体を解離した。解離液中の抗体濃度を、ＢｉｏＲＡＤ製Ｓｍａｒｔｓｐｅｃ  Ｐｌｕｓを使用して吸光度から算出した。
そして、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製  ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ，３Ｇを用い、Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）濃度を測定し、抗体濃度でスタンダード化した。結果を表１に示す。
×：１０００ｐｐｍ／ＩｇＧを超える
○：５００〜１０００ｐｐｍ／ＩｇＧ
◎：５００ｐｐｍ／ＩｇＧ未満
【０１１４】
【表１】
0006630036.tif 000007
【０１１５】
ＮａＣｌ濃度が５０ｍＭの場合における実施例１の単量体含量と比較例２の単量体含量とを対比すると、実施例１が９９．２％であるのに対して、比較例２が９６．３％であり、本発明のミックスモード用担体のほうが、より単量体と凝集体との分離性能に優れるという結果が得られた。また、実施例２のように、酸性基の種類によっては、凝集体の除去能を維持しながら、比較例２よりもＨＣＰを低減することができた。これらの担体はいずれもプロテインＡと酸性基とのミックスモードにより単量体と凝集体とを分離するが、実施例における担体は合成高分子を支持体とし、比較例のものは多糖類を支持体とする点に違いがある。合成高分子は多糖類と比較して抗体の凝集体との相互作用が強いため、単量体と凝集体との分離に有利に作用したと予測される。一方で、合成高分子の支持体を使用すると通常であればＨＣＰが増加するが、酸性基を導入したことで、ＨＣＰを低減することができた。