(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
減量および脂質低下のための、形質転換体を含む組成物であって、該形質転換体は、コドン最適化されたヒトオキシントモジュリン遺伝子（ＯＸＭ）でラクトコッカス・ラクチス・チミジル酸シンターゼ遺伝子（ｔｈｙＡ）が置換された組換え型乳酸菌ラクチスであることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記コドン最適化されたヒトオキシントモジュリン遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１に示すとおりであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ラクトコッカス・ラクチスは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ３９００またはＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１３６３であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
（１）ラクトコッカス・ラクチス・チミジル酸シンターゼ遺伝子の上流配列、コドン最適化されたヒトオキシントモジュリン遺伝子、ラクトコッカス・ラクチス・チミジル酸シンターゼ遺伝子の下流配列を順番に連結し、組換え遺伝子断片を構築するステップ１と、
（２）前記ステップ１で得られた組換え遺伝子断片をラクトコッカス・ラクチスに電気的に形質転換し相同的に組換えさせ、ｔｈｙＡ−  ＯＸＭ＋菌株をスクリーニングするステップ２と、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物に含まれる形質転換体の構築方法。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物の、減量および脂質低下のための薬品または食品の調製における使用。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物の、肥満患者、糖尿病患者のための低血糖薬の調製における使用。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物の、脂肪肝患者のための脂質低下薬の調製における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医薬分野に属し、特に、減量脂質低下のための形質転換体およびその構築方法、並びにその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、今日の世界中において注目される健康上の問題である。欧米の先進国では、半数以上の人は体重が基準を超え、そのうち、２０〜３０％は肥満患者である。肥満は行動や生活の質に影響するだけではなく、心血管疾患、２型糖尿病、腎臓病など一連の病気を誘発するおそれもあり、人間の健康に大きな害を及ぼす。調査統計によると、体重指数（体格指数、ＢＭＩ）が１つ増えるごとに、高血圧のリスクは１０％増加してしまう。
【０００３】
肥満はさまざまな原因があり、遺伝性、内分泌疾患、食生活および生活習慣などの要因で肥満を誘発する可能性がある。しかし、ほとんどの肥満患者は、不良の食生活と生活習慣による単純性肥満である。現在、肥満の治療は、主に飲食行動療法、薬物治療および外科治療などがある。ダイエットと運動量を増やすなど飲食行動療法は、体重減少効果が良くなく、繰り返しやすいため、ほとんどの人は長期的に遵守することが困難である。外科手術治療は、外傷が大きく、リスクが高く、患者に受け入れにくい。そのため、ほとんどの肥満患者は、薬物治療を受ける傾向がある。
【０００４】
現在のダイエット薬は、化学薬品と漢方薬がある。その中で、化学薬品、例えば、フェンテルミン（Ｐｈｅｎｔｅｒｍｉｎｅ）、デクスフェンフルラミン（Ｄｅｘｆｅｎｆｌｕｒａｍｉｎｅ）およびシブトラミン（Ｓｉｂｎｔｒａｍｉｎｅ）などは、一般的に神経中枢に作用し食欲を抑制することによって、体重減少の目的を達成する。しかし、これらの薬物は、セロトニン症候群、精神状態の変化（不安や躁病など）を誘発する副作用をもたらし、さらには高血圧や狭心症につながることもある。膵リパーゼ阻害剤オルリスタット（オルリスタット、商品名ｘｅｎｉｃａｌ、ｓａｉｎｉ）も化学減量薬であり、リパーゼのトリグリセリドに対する加水分解をブロックし、脂肪吸収を阻害することができるが、脂肪下痢や脂溶性ビタミン不足をもたらす副作用がある。減量用漢方薬は、ほとんど植物抽出物や食物繊維ベースであり、主に腸を緩めて便秘を緩和し、食量限定して排出を促すことによって減量の目的を達成する。長期間の使用は、栄養不均衡、水および電解質の障害、および疲労などの症状を引き起こす恐れがある。
【０００５】
オキシントモジュリン（Ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ，ＯＸＭ）は、腸管上皮Ｌ−細胞によって分泌される短鎖ペプチド腸ホルモンである。これは、プログルカゴン（ｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ）遺伝子によってコードされ、転写産物は、種々の異なるスプライシングによって、ＯＸＭ、腸グルカゴン（ｌｉｃｅｎｔｉｎ）、膵臓グルカゴン様ペプチド１（ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １,  ＧＬＰ−１）およびＧＬＰ−２など様々な活性な腸ペプチドホルモンを形成することができる。ヒトＯＸＭは、３７個アミノ酸残基を含み、食物吸収と食欲を抑制し、脂肪を動かす作用がある。ＯＸＭ発現は、肥満発病に密接に関連している。肥満患者では、ＯＸＭ分泌は減少し、一方、食欲不振（例えば、熱帯性下痢、空腸切除手術後）患者ではＯＸＭ分泌が増加する。ＯＸＭは、下記の３つの方法によって食欲とエネルギー摂取を調整することができる。１）胃腸粘膜上皮細胞ＧＬＰ−１受容体に直接作用し、糖と脂肪吸収を阻害する。２）迷走神経に作用し、胃オーキシンの分泌を低下させ、食欲を抑制する（研究によれば、ＯＸＭの皮下注射は、げっ歯類動物血液中の胃オーキシンを２０％減少させ、人類では４４％減少させることができることを示した）。３）甲状腺経を通じて甲状腺ホルモンの分泌と合成を刺激し、エネルギー消費量を増やし、脂肪を動かす。
【０００６】
齧歯類動物に、ＯＸＭを脳室内注射または皮下注射することによって、食物の吸収と体重を減らし、脂肪を減らすことができる。イギリスで、２６人の肥満患者に二重盲検試験を行って、被験者に、食事の３０分前にＯＸＭを皮下注射し、４週間続けた。結果として、治療群の体重は２．３ｋｇ減少したが、対照群は０．５ｋｇのみ減少した。また、被験者の食性および味覚に影響を及ぼさなかった。イギリスのＴｈｉａｋｉｓ社はＯＸＭ様ペプチドＴＫＳ１２２５を化学合成して、臨床段階の研究段階に入っている。米国のＷｙｅｔｈ製薬会社はＴＫＳ１２２５の独占的使用権を購入して、近い将来にＴＫＳ１２２５を体重を減らす新薬に開発することが望まれる。しかしながら、ＴＫＳ１２２５などＯＸＭ類似ペプチドは、一般に、化学合成または生物工程によって生産され、生成物は、主に粉末注射剤であり、注射によって投与される。このような生産および投与方法は、高生産コスト、短い半減期および投薬不便という欠点が存在し、肥満患者に容易に受け入れられない。
【０００７】
中国特許（特許文献１、中国特許出願番号２００９１００４１３８６．Ｘ）では、ヒトガストリンモジュレーター遺伝子を発現するビフィドバクテリアを開示し、該ヒトガストリンモジュレーター遺伝子を発現するビフィドバクテリアは、減量および脂質低下に非常に良好な効果を有するが、この発現系は薬物にならない重大な欠点を有する。また、用いられたプラスミドベクターｐＢＢＡＤｓは、アンピシリン耐性遺伝子を保有し、アンピシリンアレルゲンを人体に導入する可能性がある。長期間使用すると、宿主の腸内細菌叢の障害を引き起こす可能性があり、宿主が薬剤耐性を引き起こすこともあり得る。それに対し、本発明に使用されるラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）株は、新規な薬物組成物であり、抗生物質遺伝子を含まず、外来性アレルゲンを導入せず、高い生物学的安全性を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】中国特許出願公開第１０１６０８１７２号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする一つの技術課題としては、より高いヒトオキシントモジュリンの発現量を有し、抗生物質を含まず、人体により安全な減量脂質低下のための形質転換体を提供することである。
【００１０】
本発明が解決しようとするその他の技術課題としては、上記形質転換体の構築方法を提供することである。
【００１１】
本発明が解決しようとするまた別の技術課題としては、上記形質転換体の応用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の技術課題を解決するために、本発明が採用した技術案は以下の通りである。
【００１３】
減量脂質低下のための形質転換体であって、該形質転換体は、コドン最適化されたヒトオキシントモジュリン遺伝子で相同的組換えによってラクトコッカス・ラクチス・チミジル酸シンターゼ遺伝子を置換し得た減量脂質低下のための形質転換体。
【００１４】
その中、前記のヒトＯＸＭ遺伝子は、その核酸配列が、それにコードされるアミノ酸配列を変えることなく、選択された宿主の優先コドンに従って核酸配列を最適化することができ、その結果、ヒトオキシントモジュリン遺伝子を該形質転換体におけるヒトオキシントモジュリンの発現量を上げることができる。その好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１に示すとおりである。
【００１５】
その中、前記ラクトコッカス・ラクチスは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ３９００またはＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１３６３である。
【００１６】
上記減量脂質低下のための形質転換体の構築方法は、下記のステップを含む。
ステップ１、ラクトコッカス・ラクチス・チミジル酸シンターゼ遺伝子の上流配列、コドン最適化されたヒトオキシントモジュリン遺伝子、ラクトコッカス・ラクチス・チミジル酸シンターゼ遺伝子の下流配列を順番に連結し、遺伝子断片全体を人工化学合成する。
ステップ２、新しく構築した組換え遺伝子断片を相同的組換えのためにラクトコッカス・ラクチスに電気的に形質転換し、ｔｈｙＡ−  ＯＸＭ＋菌株をスクリーニングする。
【００１７】
本発明は、ヒトＯＸＭ遺伝子とラクトコッカス・ラクチスｔｈｙＡ遺伝子を相同的に組換えて、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）のゲノム中のｔｈｙＡ遺伝子を置き換えて、ヒトオキシントモジュリン遺伝子がラクトコッカス・ラクチスにおいて構成的に発現され得る。
【００１８】
減量脂質低下のための形質転換体の、減量脂質低下のための薬品または食品の調製における応用も本発明の請求範囲内である。その中、前記薬品は、経口液体、生菌パウダー、錠剤またはカプセル経口剤であり、前記食品は、固体食品または飲料である。
【００１９】
前記減量脂質低下のための形質転換体の、肥満患者のための低血糖薬の調製における応用も本発明の請求範囲内である。その中、前記薬品は、経口液体、生菌パウダー、錠剤またはカプセル経口剤である。
【００２０】
前記減量脂質低下のための形質転換体の、脂肪肝患者のための脂質低下薬の調製における応用も本発明の請求範囲内である。その中、前記薬品は、経口液体、生菌パウダー、錠剤またはカプセル経口剤である。
【００２１】
本発明の顕著な特徴は、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）の腸内で長期的に成長でき、定着できる特性を利用し、遺伝子相同的組換えによって、オキシントモジュリンを発現する乳酸菌をスクリーニングし、オキシントモジュリンの、食欲およびエネルギー吸収の調節、減重脂質低下の生物学作用を果たす。この方法は、オキシントモジュリンペプチドの分離と浄化を行う必要はなく、生産プロセスは簡単で、低コストであり、経口投与ができ、便利に投与できる。化学合成や遺伝子工程でのオキシントモジュリン類似ペプチドの生産にある高生産コスト、投与不便という欠点を克服できる。
【発明の効果】
【００２２】
従来技術と比較すれば、本発明は以下の利点を有する。
【００２３】
１．本発明は、恒常的にヒトＯＸＭを発現するラクトコッカス・ラクチスを調製し、それは、チミジン栄養要求株である。チミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）は、ラクトコッカス・ラクチスの増殖のための必須栄養素であるため、ゲノム中にｔｈｙＡ遺伝子が存在しない場合、チミジンを提供することができない。よって、形質転換後の乳酸菌は、外部環境で生殖成長できず、環境汚染もなく、環境中の他の微生物にも影響を与えない。
【００２４】
２．本発明の菌株は、抗生物質、プラスミドおよび毒性タンパク質を産生する可能性のある遺伝子を含む人体および環境に有害な要素を含まず、ヒトに安全に投与することができる。特許文献１に開示されたＯＸＭが発現される遺伝子組み換えビフィズス菌は、アンピシリン耐性遺伝子を含有し、長期に使用する場合は薬剤耐性につながる可能性がある。また、該菌株は糞便と伴って排泄され、環境中の他の菌株と再結合し、「スーパーバクテリア」を発生する可能性が高くなる。そして、現在、たくさんの人は、アンピシリンにアレルギー性を持ち、適用できる人が限られる。
【００２５】
３．該菌は、特許文献１に開示されたＯＸＭが発現される遺伝子組み換えビフィズス菌より、肥満マウスに対する体重減少効果が優れている。同じ期間内に、同じ用量で、ビフィズス菌の場合、体重を２１．４％減少させたが、一方、ラクトコッカス・ラクチスの場合、体重を３１．１％減少させた。また、血液、肝臓ではコレステロールが明らかに低下し、正常レベルに近い。動物実験によると、マウスにＯＸＭ遺伝子組み換え乳酸乳球菌を１ヶ月投与した後に、体重は正常値に戻っただけでなく、空腹血糖の含有量も正常に近づいた。
【００２６】
４．該菌は、糖尿病マウスにも体重減少と脂質低下の効果があり、受益者は肥満患者、糖尿病、脂質代謝障害メタボリックシンドロームの患者に拡張される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＰＣＲ法による遺伝子型判定結果を示す図である。
【図２】ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）によって発現されたＯＸＭのイムノブロッティングの結果を示す図である。
【図３】肥満マウスにラクトコッカス・ラクチスを給餌した５時間後の血清中のＯＸＭ含量を示す図である。
【図４】ラクトコッカス・ラクチスで給餌した肥満マウスの体重変化曲線の図である。
【図５】肥満マウスにラクトコッカス・ラクチスで６週間給餌しつづけた後の食物摂取曲線の図である。
【図６】ビフィドバクテリウム効果との比較図である。
【図７】肥満マウスにラクトコッカス・ラクチスで６週間給餌しつづけた後の腹部のＣＴスキャンの図であり、Ａは正常マウスを示し、ＢはＮＺ９０００を与えた肥満マウスを示し、ＣはＮＺ９０００−ＯＸＭを与えた肥満マウスを示す（白い線内部の明るい色の領域は、脂肪分布領域である）。
【図８】肥満マウスにラクトコッカス・ラクチスで６週間給餌しつづけた後の全身脂肪量を示す図である。
【図９】肥満マウスにラクトコッカス・ラクチスで６週間給餌しつづけた後の空腹時血糖値を示す図である。
【図１０】肥満マウスにラクトコッカス・ラクチスで６週間給餌しつづけた後の血清中のコレステロールレベルを示す図である。
【図１１】糖尿病マウスにラクトコッカス・ラクチスで５週間給餌しつづけた後の重量変化曲線図である。
【図１２】糖尿病マウスにラクトコッカス・ラクチスで５週間給餌しつづけた後の血清中のコレステロールレベルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、以下の実施例からよりよく理解されるであろう。 なお、当業者であれば、記載された実施形態は本発明を説明することを意図しており、特許請求の範囲に記載された本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【００２９】
実施例１：ＯＸＭ遺伝子変換ラクトコッカス・ラクチスの調製
【００３０】
（１）相同的組換え断片の構築
公表された乳酸菌Ｌ．ｌａｃｔｉｓの全ゲノムにおけるｔｈｙＡ遺伝子配列に基づいて、開始コドンの上流１０００ｂｐと終止コドンの下流１０００ｂｐの配列をそれぞれ見つけた。
【００３１】
ヒトＯＸＭアミノ酸および核酸配列に基づいて、ラクトコッカス・ラクチスのコドン使用頻度を参考して、ＯＸＭ核酸配列を最適化して、配列番号１に示した配列を得た。
【００３２】
遺伝子断片ＯＸＭ−Ｍの人工化学合成：ラクトコッカス・ラクチスｔｈｙＡ遺伝子開始コドンの上流１０００ｂｐ＋ヒトＯＸＭ遺伝子配列＋乳酸菌ｔｈｙＡ終止コドンの下流１０００ｂｐという配列。
【００３３】
（２）ＯＸＭ遺伝子転換のラクトコッカス・ラクチスの調製およびスクリーニング
ヒトオキシントモジュリンの断片ＯＸＭ−Ｍを菌株Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００に電気的に形質転換して、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＯＸＭと名付けた。
【００３４】
２μＬ ＯＸＭ−Ｍをとって、４０μＬラクトコッカス・ラクチス耐性細菌懸濁液に添加して均一させて、氷上に５分置いてから、０．４ｃｍのエレクトロポレーションカップに移した。
【００３５】
エレクトロポレーションカップをエレクトロポレーション装置のエレクトロポレーションボックスにいれて、電源をいれて電気的に形質転換させた。電気ショック条件：電圧２０００Ｖ、コンデンサ２５μＦ、抵抗２００Ω、電気ショック時間約４ミリ秒。
【００３６】
エレクトロポレーションを行った後に、素早く細菌液を取り出して、１ｍＬ Ｍ１７の培地を入れて、氷上に５分置いてから、３０°Ｃで１ｈ培養した。その後に、デオキシチミジンを含む固体培地上に被覆して一晩培養させた。翌日に、モノクローナルを選んで、デオキシチミジンを有しない固体培地と有する固体培地にそれぞれ播種して、デオキシチミジンを有する固体培地に成長でき、かつ、デオキシチミジンを有しない固体培地に成長できない菌株は陽性菌である。
【００３７】
（３）ＯＸＭ遺伝子転換菌の遺伝子型鑑定
下記のような遺伝子型鑑定用の３組のＰＣＲプライマーを設計した。
プライマー１：１Ｆ（配列番号２）５’−ＧＧＴＴＴＴＡＴＴＧＴＴＴＣＡＴＴＡＧＴ−３’，ｔｈｙＡ上流配列に位置する。
【００３８】
１Ｒ（配列番号３）５’−ＧＡＧＡＴＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴ−３’，ＯＸＭ遺伝子配列の開始位置に位置する。
【００３９】
プライマー２：２Ｆ（配列番号４）５’−ＧＧＡＡＴＡＡＣＡＴＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡ−３’，ＯＸＭ遺伝子配列の終止位置に位置する。
【００４０】
２Ｒ（配列番号５）５’−ＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡ−３’，ｔｈｙＡ下流配列に位置する。
【００４１】
プライマー３：３Ｆ（配列番号６）５’−ＡＴＧＡＣＴＴＡＣＧＣＡＧＡＴＣＡＡＧＴ−３’，ｔｈｙＡ遺伝子配列の開始位置に位置する。
【００４２】
３Ｒ（配列番号７）５’−ＴＴＡＡＡＴＴＧＣＴＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴ−３’，ｔｈｙＡ遺伝子配列の終止位置に位置する。
【００４３】
一晩培養した細菌液を２μＬ取って、標準的なＰＣＲ反応を行った。
【００４４】
ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動実験を行って、結果は図１に示した。そのうち、菌株ＮＺ９０００は、遺伝子組み換えを行っていなかったため、プライマー３でｔｈｙＡ配列のみ増幅できた。また、組み換え菌株ＮＺ９０００-ＯＸＭは、ｔｈｙＡ遺伝子を欠損しているため、プライマー３でＰＣＲを行っても産物が得られなかった一方、プライマー１と２のいずれも、ＯＸＭ遺伝子配列を含む断片が増幅できた。  
【００４５】
（４）ＯＸＭ発現鑑定
５ｍＬ培地に播種して、３０°Ｃで一晩培養した。
【００４６】
翌日に、細菌液を遠心分離して、上清サンプルに３分の１の体積の１００％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加し均一させて、氷上に２０〜３０分置いて、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、タンパク質を沈殿させて、上清を捨てた。次に、元のサンプルの３倍の体積のアセトンを添加して、室温で１０分間置いてＴＣＡを溶解させた。続いて、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、タンパク質を沈殿させて、上清を捨てた。その後に、ローディングバッファー１×ＳＤＳを添加して、タンパク質を溶解させた。そして、細菌沈殿物をリゾチームに添加して、３７°Ｃで３０分間培養して後に、均一させてから５００μＬのＲＩＰＡ溶解バッファーを添加して氷上で超音波を掛けて、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を捨てた。最後に、ローディングバッファー１×ＳＤＳを添加して、タンパク質を溶解させた。
【００４７】
すべてのサンプルを９５°Ｃで５分間ボイルした後に、１８％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動実験を行って、電圧を安定させながら氷浴中でＰＶＤＦ膜に転写して、ＢＳＡにて室温で１時間クローズした。その後ＴＢＳＴで洗浄して（３×５分）、ウサギ抗ＯＸＭ抗体（１：５００）を加えて、４°Ｃで一晩インキュベーションした。ＴＢＳＴで３回洗浄して、毎回５分だった。再びＨＲＰ標識の抗ウサギ二次抗体（１：５０００）を添加して、室温で１時間培養して、ＴＢＳＴで３回洗浄して、毎回５分だった。その後に、ＥＣＬ化学発光法によって現像させた。
【００４８】
図２に示した結果からわかるように、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００ではＯＸＭ発現は検出されなかったが、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００−ＯＸＭの菌体および培養上清のいずれもＯＸＭ発現は検出された。これは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００−ＯＸＭが成功裏にＯＸＭ発現させて、そして細胞外に分泌したことを表明した。
【００４９】
実施例２：ＯＸＭ転化乳酸菌の減量脂質低下の薬力学実験
【００５０】
（１）ちょうど離乳したばかりのＢ６マウスを若干用意して、肥満マウスがうまくモデル化されるまでに高脂肪食を摂取させた。肥満標準：（実験群の体重−正常マウスの平均体重）／正常マウスの平均体重＞２０％。肥満マウスを２つのグループに分け、各グループ１０匹で、高脂肪食摂取を続けた。１グループに、対照群として、ラクトコッカス・ラクチスＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００を与えた。別のグループには、実験群として、ラクトコッカス・ラクチスＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００−ＯＸＭを与えた。同時に、正常対照群を設けて、すなわち、正常食餌Ｂ６マウスであって、ラクトコッカス・ラクチスを給餌しなかった。
【００５１】
（２）各マウスに、胃内投与により５×１０９ＣＦＵラクトコッカス・ラクチスを、２日に１回で、与えた。マウスの体重、食物摂取量およびその他のバイタルサインを追跡し観測した。最初の胃内投与から５時間後、マウス血清を採取し、ＯＸＭ含量を質量分析法によって測定した。結果は図３に示したように、ＮＺ９０００−ＯＸＭで胃内投与した後に、マウスの血清中のＯＸＭ含量は、約２．５倍までに、すなわち約４９７ｎｇ／ｍＬまで有意に増加した。この結果は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００−ＯＸＭもマウスの体内においてＯＸＭの分泌発現ができることをさらに実証する。対照実験によれば、同量のＯＸＭ組換えビフィズス菌（特許文献１）を投与した場合、マウスの血清中のＯＸＭ含量は約３８０ｎｇ／ｍＬであり、ＯＸＭ組換えラクトコッカス・ラクチスのそれより低かった。体重観測データは、図４に示した通り、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００-ＯＸＭを肥満マウスに４週間投与したら、その体重は大幅に減少した。５週目に、体重は正常マウスに近くなった。実験終了後９週間まで、体重は約２４ｇのままであった。一方、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００を投与したマウスは、体重はわずかに減少した。また、特許文献１で開示されたＯＸＭ組換えビフィズス菌と比較すれば、同じ期間内で、ラクトコッカス・ラクチスＬ．ｌａｃｔｉｓＯＸＭは肥満マウスの体重は３１．１％減少したが、ＯＸＭ組換えビフィズス菌はマウスの体重は２１．４％しか減量できなかった（図６）。したがって、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００−ＯＸＭは、より優れた減量効果を有する。
【００５２】
（３）ラクトコッカス・ラクチスを連続６週間投与後に、代謝ケージによってマウスの２４時間食物摂取量について試験した。結果（図５）は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００−ＯＸＭを与えたマウスの食物摂取量は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００対照群の約２分の１まで有意に減少したことを示した。ＮＺ３９００−ＯＸＭはマウスの食物摂取量を対照群のほうより４２．１％減少させたが、一方、特許文献１に開示されたＯＸＭ組換えビフィズス菌の場合、マウスの食物摂取量を対照群のほうより２８．２％しか減少できなかった（図６）。したがって、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００-ＯＸＭは、より良く食欲を抑制し、食物摂取量を減らし、体重を制御することができる。
【００５３】
（４）ラクトコッカス・ラクチスの６週間連続給餌後、小動物のＣＴスキャンによりマウスの腹部の脂肪分布を分析した。図７は、腹腔の断面スキャン図であり、白色線でプロットした明るい灰色領域は脂肪組織である。Ａ図は普通の食事の対照組のマウスを示して、Ｂ図はＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００を投与したマウスを示して、Ｃ図はＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００−ＯＸＭを投与したマウスを示した。ＮＺ９０００−ＯＸＭを投与したマウスの体脂肪含量が有意に減少したことが分かる。ＣＴ解析ソフトウェアによって、脂肪の総量に対する割合を計算して、そして、各マウスに含まれる脂肪重量に換算して、統計解析後のデータを図８に示した。その結果、ラクトコッカス・ラクチスＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００を投与したマウスはまだ腹部脂肪が多く、Ｌ．ｌａｃｔｉｓＯＸＭを投与したマウスの腹部脂肪は、正常なマウスレベルまで有意に減少した。それは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００−ＯＸＭが体脂肪を減少させる効果を有することを示した。
【００５４】
（５）高脂肪食によりマウスを肥満に誘発させた後、空腹時血糖は約７ｍｍｏｌ／Ｌに増加して（図９）、正常マウスより明らかに高かった。しかし、ラクトコッカス・ラクチスで６週間摂食させた後、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００群のマウスの空腹時血糖値は約６．５ｍｍｏｌ／Ｌであって、Ｌ．ｌａｃｔｉｓＯＸＭ群のマウスの空腹時血糖値は正常値、約５ｍｍｏｌ／Ｌに戻った。比較試験によれば、特許文献１に開示されたＯＸＭ組換えビフィズス菌は、マウスの空腹時血糖を調節できなかった。したがって、ラクトコッカス・ラクチスは、ＯＸＭ組換えビフィズス菌より優れ、空腹時血糖を低下させる効果を有する。
【００５５】
（６）高脂肪食によりマウスを肥満に誘発させた後、その血清コレステロール含有量は、２．４２ｍｏｌ／Ｌとなった。実験終了しマウスを処死した後、採血して血清のコレステロールレベルを測定した。図１０に示したとおり、正常マウスの血清コレステロール含有量は２．１６７ｍｏｌ／Ｌであって、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００を与えたマウスの血清コレステロール含有量は３．４７８ｍｏｌ／Ｌであって、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００-ＯＸＭを与えたマウスの血清コレステロール含有量は１．８３ｍｏｌ／Ｌであって、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００を与えたマウスと比べて有意に低かった。そして、同じ期間において、特許文献１に開示されたＯＸＭ組換えビフィズス菌は、コレステロールの含有量を２．４ｍｏｌ／Ｌ程度までしか減らすことはできなかった。したがって、本発明によって提供されるラクトコッカス・ラクチスＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００-ＯＸＭは、血清コレステロールを有意に減少させることができる。
【００５６】
実施例３：ＯＸＭ組み換え乳酸菌の、遺伝子欠損型糖尿病マウスに対する減量脂質低下の薬力学実験
【００５７】
１．８週齢のｄｂ／ｄｂマウス２０匹を用意して、肥満マウスを２つのグループに分け、各グループ１０匹となった。１グループが、対照群として、ラクトコッカス・ラクチスＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００を与えた。別のグループは、実験群として、ラクトコッカス・ラクチスＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００−ＯＸＭを与えた。同時に、正常対照群を設けて、すなわち、正常食餌Ｂ６マウスであって、ラクトコッカス・ラクチスを給餌しなかった。
【００５８】
２．各マウスに、胃内投与により５×１０９ＣＦＵ  ラクトコッカス・ラクチスを、毎日与えた。体重観測データは、図１１に示したとおり、ＯＸＭ給餌されたマウス群は、投与前の体重と同じ体重を維持することができたが、一方、ＮＺ９０００給餌されたマウス群は体重が増加し続け、５週間で約８％増えた。この実験により、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００−ＯＸＭは、糖尿病マウスの体重増加を効果的に抑制することができると見つけた。
【００５９】
３．同時に、採血して血清コレステロール値を測定した（図１２）。ＯＸＭ給餌されたマウス群の血清コレステロール値は有意に５．５８ｍｏｌ／Ｌに低下し、対照群より有意に低かった。この結果は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００−ＯＸＭは糖尿病マウスの血中脂質を有意に減少することができることを示唆している。
【００６０】
以上の結果から、ＯＸＭで形質転換された乳酸菌はマウスの腸管でＯＸＭを分泌発現することができ、発現されたＯＸＭは体内の対応する受容体に作用することによって、食欲とエネルギー吸収を抑えることが示された。したがって、ＯＸＭ組換えラクトコッカス・ラクチスは、有意な体重減少、脂質低下、血糖降下生物学的効果を有することを示した。
【００６１】
（付記）
（付記１）
減量脂質低下のための形質転換体であって、該形質転換体は、コドン最適化されたヒトオキシントモジュリン遺伝子でラクトコッカス・ラクチス・チミジル酸シンターゼ遺伝子を置換し得る組換え型乳酸菌ラクチスであることを特徴とする減量脂質低下のための形質転換体。
【００６２】
（付記２）
前記コドン最適化されたヒトオキシントモジュリン遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１に示すとおりであることを特徴とする付記１に記載の減量脂質低下のための形質転換体。
【００６３】
（付記３）
前記ラクトコッカス・ラクチスは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ９０００、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＺ３９００またはＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１３６３であることを特徴とする付記１に記載の減量脂質低下のための形質転換体。
【００６４】
（付記４）
（１）ラクトコッカス・ラクチス・チミジル酸シンターゼ遺伝子の上流配列、コドン最適化されたヒトオキシントモジュリン遺伝子、ラクトコッカス・ラクチス・チミジル酸シンターゼ遺伝子の下流配列を順番に連結し、組換え遺伝子断片を構築するステップ１と、
（２）前記ステップ１で得られた組換え遺伝子断片をラクトコッカス・ラクチスに電気的に形質転換し相同的に組換えさせ、ｔｈｙＡ−  ＯＸＭ＋菌株をスクリーニングするステップ２と、
を含むことを特徴とする付記１に記載の減量脂質低下のための形質転換体の構築方法。
【００６５】
（付記５）
付記１に記載の減量脂質低下のための形質転換体の、減量脂質低下のための薬品または食品の調製における応用。
【００６６】
（付記６）
付記１に記載の減量脂質低下のための形質転換体の、肥満患者、糖尿病患者のための低血糖薬の調製における応用。
【００６７】
（付記７）
付記１に記載の減量脂質低下のための形質転換体の、脂肪肝患者のための脂質低下薬の調製における応用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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