(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌内で機能的である第１の複製起点；
真核細胞内のカーゴ配列を発現するための発現カセット；および
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌内のハイブリッドタンパク質を発現するための発現カセット
を含む核酸ベクターであって、該ハイブリッドタンパク質が、１または複数の分泌シグナル配列、１または複数のＤＮＡ結合ドメイン、および１または複数の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）ドメインを含み、該１または複数のＣＰＰドメインが、該ハイブリッドタンパク質のカルボキシ末端に位置し、該１または複数のＤＮＡ結合ドメインが、該核酸ベクターに結合する機能を有するＤＮＡ結合ドメインを含む、核酸ベクター。
【請求項２】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ内で機能的である第２の複製起点をさらに含む、請求項１に記載の核酸ベクター。
【請求項３】
前記第１の複製起点および前記第２の複製起点が、単一の二機能性起点内に含まれる、請求項２に記載の核酸ベクター。
【請求項４】
前記１または複数のＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ホメオボックスＤＮＡ結合ドメイン、ＭｅｒＲ  ＤＮＡ結合ドメイン、またはこれらの組合せを含む、請求項１に記載の核酸ベクター。
【請求項５】
前記ＣＰＰドメインが、ＴＡＴドメイン、単純ヘルペスウイルスのＶ２２タンパク質、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（Ａｎｔｐ）タンパク質のタンパク質形質導入ドメイン、またはこれらの組合せを含む、請求項１に記載の核酸ベクター。
【請求項６】
前記分泌シグナル配列が、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列、アルファアミラーゼシグナル配列または短縮型アルファアミラーゼシグナル配列である、請求項１に記載の核酸ベクター。
【請求項７】
前記ハイブリッドタンパク質の前記１または複数のＤＮＡ結合ドメインに結合する１または複数のＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸ベクター。
【請求項８】
前記カーゴ配列が、がん遺伝子、腫瘍抑制因子、成長因子、成長因子受容体、およびマーカータンパク質から選択されるタンパク質をコードする、請求項１に記載の核酸ベクター。
【請求項９】
ハイブリッドタンパク質−核酸ベクター複合体を含む、真核標的細胞を形質転換するための組成物であって、該複合体が、請求項１に記載の核酸ベクターを発現する第１の細胞内で形成され；該組成物が、該真核標的細胞と接触させられ、それによって、該真核標的細胞をカーゴ配列で形質転換することを特徴とする、組成物。
【請求項１０】
前記第１の細胞が原核細胞である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ハイブリッドタンパク質−核酸ベクター複合体を含む、原核標的細胞を形質転換するための組成物であって、該複合体が、請求項１に記載の核酸ベクターと請求項１に記載のハイブリッドタンパク質との結合から形成され；該組成物が、該原核標的細胞と接触させられることを特徴とする、組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の核酸ベクターを含有する細菌細胞。
【請求項１３】
請求項１に記載の核酸ベクターを含有する真核細胞。
【請求項１４】
細胞を、請求項１に記載の核酸ベクターで形質転換するためのキットであって、該核酸ベクターと、該核酸ベクターをどのようにして使用するのかについての指示とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１４年２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／９４０，２７４号；２０１４年２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／９４０，２５８号；および２０１４年６月１８日に出願された米国仮特許出願大６２／０１３，８５２号の優先権を主張する。これらの明細書は、法に従う限り本明細書により参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
１．分野
開示される対象物は一般に、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方における増殖に適し、真核生物発現カセットを含む、新規のシャトルベクターに関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術
当技術分野では、核酸配列を細菌内で増殖させ、このような配列を真核細胞へと導入するための、様々なベクターおよび方法が公知である。以下の刊行物：
Ｓａｌｏｍｏｎｅ，  Ｆ．ら、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｅｓｃａｐｅ」（２０１０年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ、１６３巻（２９３〜３０３頁）
Ｓｔｅｎｔｚ，  Ｒ．ら、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｖｉａｂｌｅ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｌｓ」（２０１０年）、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７６巻、３０２６〜３０３１頁。
Ｃｈｒｉｓｔｙ，  Ｂ．、およびＮａｔｈａｎｓ，  Ｄ．、「ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｚｉｆ２６８」（１９８９年）、８６巻、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、８７３７〜８７４１頁。
Ｋｈｏｋｈｌｏｖａ，  Ｅ．Ｖ．ら、「Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｌｏｎｇｕｍ  Ｍｏｄｉｆｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＨＵ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｔｏ  ＨＥＫ２９３  Ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ」（２０１１年）、１５１巻、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７１７〜７２１頁
は、注目に値する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓａｌｏｍｏｎｅ，  Ｆ．ら、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｅｓｃａｐｅ」（２０１０年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ、１６３巻（２９３〜３０３頁）
【非特許文献２】Ｓｔｅｎｔｚ，  Ｒ．ら、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｖｉａｂｌｅ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｌｓ」（２０１０年）、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７６巻、３０２６〜３０３１頁
【非特許文献３】Ｃｈｒｉｓｔｙ，  Ｂ．、およびＮａｔｈａｎｓ，  Ｄ．、「ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｚｉｆ２６８」（１９８９年）、８６巻、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、８７３７〜８７４１頁
【非特許文献４】Ｋｈｏｋｈｌｏｖａ，  Ｅ．Ｖ．ら、「Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｌｏｎｇｕｍ  Ｍｏｄｉｆｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＨＵ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｔｏ  ＨＥＫ２９３  Ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ」（２０１１年）、１５１巻、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７１７〜７２１頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ある実施形態では、グラム陽性菌内およびグラム陰性菌内の複製のための複製起点と；グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方における、選択のための少なくとも１つの選択マーカーと；少なくとも１つの発現カセットとを含む核酸ベクターが開示される。
【０００６】
代替的な実施形態では、核酸ベクターは、グラム陰性菌内で機能的な第１の複製起点と、グラム陽性菌内で機能的な第２の複製起点とを含みうる。
【０００７】
代替的な実施形態では、第１の複製起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ内で機能的であり、第２の複製起点は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属内のうちの少なくとも１つにおいて機能的である。
【０００８】
代替的な実施形態では、第１の複製起点および第２の複製起点は、単一の二機能性起点内に含まれる。
【０００９】
代替的な実施形態では、核酸ベクターは、グラム陽性菌内の第１のカーゴ配列を発現させるのに適する原核生物発現カセットもさらに含みうる。
【００１０】
代替的な実施形態では、第１のカーゴ配列は、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）ドメイン、および少なくとも１つの分泌シグナル配列を含むハイブリッドタンパク質である。
【００１１】
代替的な実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ホメオボックスＤＮＡ結合ドメイン、およびＭｅｒＲ  ＤＮＡ結合ドメイン、またはこれらの組合せのうちの１つである。
【００１２】
代替的な実施形態では、ＣＰＰは、ＴＡＴドメイン、単純ヘルペスウイルスのＶ２２タンパク質、もしくはＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（Ａｎｔｐ）タンパク質のタンパク質形質導入ドメイン、またはこれらの組合せを含む。
【００１３】
代替的な実施形態では、分泌シグナル配列は、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列、アルファアミラーゼシグナル配列または短縮型アルファアミラーゼシグナル配列である。
【００１４】
代替的な実施形態では、核酸ベクターは、ハイブリッドタンパク質の少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインに結合する少なくとも１つのＤＮＡモチーフもさらに含みうる。
【００１５】
代替的な実施形態では、核酸ベクターは、真核細胞内の第２のカーゴ配列を発現させるための真核生物発現カセットもさらに含みうる。
【００１６】
代替的な実施形態では、第２のカーゴ配列は、がん遺伝子、腫瘍抑制因子、成長因子、成長因子受容体、およびマーカータンパク質からなる群から選択される。
【００１７】
代替的な実施形態では、第２のカーゴ配列は、蛍光タンパク質である。
【００１８】
代替的な実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡモチーフは、配列番号４１または４３に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００１９】
代替的な実施形態では、少なくとも１つの選択マーカーは、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に対して有効な抗生物質に対して耐性である。
【００２０】
ある実施形態では、真核標的細胞を、候補ＤＮＡ配列で形質転換するための方法であって、第１の細胞内で、ハイブリッドタンパク質を、本明細書で開示される核酸ベクターの第１の発現カセットから発現させて、ハイブリッドタンパク質と核酸ベクターとの複合体を形成するステップと；標的細胞を、形成されたハイブリッドタンパク質と核酸ベクターとの複合体と接触させるステップとを含み、候補ＤＮＡ配列が、第２のカーゴ配列である方法が開示される。
【００２１】
ある実施形態では、真核標的細胞を、候補ＤＮＡ配列で形質転換するための方法であって、真核標的細胞を、原核細胞内の、本明細書で開示される核酸ベクターの第１の発現カセットからのハイブリッドタンパク質の発現により形成された、ハイブリッドタンパク質と核酸ベクターとの複合体と接触させるステップを含み、候補ＤＮＡ配列が、第２のカーゴ配列である方法が開示される。
【００２２】
ある実施形態では、原核標的細胞を、候補ＤＮＡ配列で形質転換するための方法であって、本明細書で開示される核酸ベクターを提供するステップであって、候補ＤＮＡ配列が、第１のカーゴ配列であるステップと；核酸ベクターを、核酸ベクター、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）ドメイン、および少なくとも１つの分泌シグナル配列に結合するのに適する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質に結合させて、ハイブリッドタンパク質と核酸ベクターとの複合体を形成するステップと；原核標的細胞を、ハイブリッドタンパク質と核酸ベクターとにより形成される複合体と接触させるステップとを含む方法が開示される。
【００２３】
ある実施形態では、原核標的細胞を、候補ＤＮＡ配列で形質転換するための方法であって、核酸ベクター、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）ドメイン、および少なくとも１つの分泌シグナル配列に結合するのに適する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質と、本明細書で開示される核酸ベクターとを接触させることにより形成される、ハイブリッドタンパク質と核酸ベクターとの複合体と、原核標的細胞とを接触させるステップを含み、候補ＤＮＡ配列が、第１のカーゴ配列である方法が開示される。
【００２４】
ある実施形態では、本明細書で開示される核酸ベクターを含有する細菌細胞が開示される。
【００２５】
ある実施形態では、本明細書で開示される核酸ベクターを含有する真核細胞が開示される。
【００２６】
ある実施形態では、細胞を、本明細書で開示されるベクターで形質転換するためのキットであって、核酸ベクター、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）ドメイン、および少なくとも１つの分泌シグナル配列に結合するのに適する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを含むある量のハイブリッドタンパク質と、キットをどのようにして使用するのかについての指示とを含むキットが開示される。
【００２７】
代替的な実施形態では、キットは、ある量の核酸ベクターもさらに含みうる。
【００２８】
代替的な実施形態では、標的原核細胞は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属である。
【００２９】
ある実施形態では、発現ベクターともまた称される核酸ベクターであって、グラム陰性菌内で機能的な第１の複製起点、およびグラム陽性菌内で機能的な第２の複製起点と；グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方における、選択に適する選択マーカーと、
【００３０】
グラム陽性菌内の、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）ドメイン、および少なくとも１つの分泌シグナル配列を含むハイブリッドタンパク質の発現のための原核生物発現カセットと；ハイブリッドタンパク質の少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインにより認識される少なくとも１つのＤＮＡモチーフと；真核細胞内の第２のカーゴ配列を発現させるための真核生物発現カセットとを含む核酸ベクターが開示される。
【００３１】
代替的な実施形態では、グラム陰性菌は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００３２】
代替的な実施形態では、グラム陽性菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のうちの少なくとも１つである。
【００３３】
代替的な実施形態では、選択マーカーは、スペクチノマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシンおよびテトラサイクリンのうちの少なくとも１つに対する耐性を付与する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
グラム陽性菌内およびグラム陰性菌内の複製のための複製起点と；
グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方における、選択のための少なくとも１つの選択マーカーと；
少なくとも１つの発現カセットと
を含む核酸ベクター。
（項目２）
グラム陰性菌内で機能的な第１の複製起点と、グラム陽性菌内で機能的な第２の複製起点とを含む、項目１に記載の核酸ベクター。
（項目３）
前記第１の複製起点が、Ｅ．ｃｏｌｉ内で機能的であり、前記第２の複製起点が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属内のうちの少なくとも１つにおいて機能的である、項目２に記載の核酸ベクター。
（項目４）
前記第１の複製起点および前記第２の複製起点が、単一の二機能性起点内に含まれる、項目２に記載の核酸ベクター。
（項目５）
前記グラム陽性菌内の第１のカーゴ配列を発現させるのに適する原核生物発現カセットをさらに含む、項目１に記載の核酸ベクター。
（項目６）
前記第１のカーゴ配列が、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）ドメイン、および少なくとも１つの分泌シグナル配列を含むハイブリッドタンパク質である、項目５に記載の核酸ベクター。
（項目７）
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ホメオボックスＤＮＡ結合ドメイン、およびＭｅｒＲ  ＤＮＡ結合ドメイン、またはこれらの組合せのうちの１つである、項目６に記載の核酸ベクター。
（項目８）
前記ＣＰＰが、ＴＡＴドメイン、単純ヘルペスウイルスのＶ２２タンパク質、もしくはＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（Ａｎｔｐ）タンパク質のタンパク質形質導入ドメイン、またはこれらの組合せを含む、項目６に記載の核酸ベクター。
（項目９）
前記分泌シグナル配列が、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列、アルファアミラーゼシグナル配列または短縮型アルファアミラーゼシグナル配列である、項目６に記載の核酸ベクター。
（項目１０）
前記ハイブリッドタンパク質の前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインに結合する少なくとも１つのＤＮＡモチーフをさらに含む、項目６に記載の核酸ベクター。
（項目１１）
真核細胞内の第２のカーゴ配列を発現させるための真核生物発現カセットをさらに含む、項目５に記載の核酸ベクター。
（項目１２）
前記第２のカーゴ配列が、がん遺伝子、腫瘍抑制因子、成長因子、成長因子受容体、およびマーカータンパク質からなる群から選択される、項目１１に記載の核酸ベクター。
（項目１３）
前記第２のカーゴ配列が、蛍光タンパク質である、項目１２に記載の核酸ベクター。
（項目１４）
前記少なくとも１つのＤＮＡモチーフが、配列番号４１または４３に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する、項目７に記載の核酸ベクター。
（項目１５）
前記少なくとも１つの選択マーカーが、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に対して有効な抗生物質に対して耐性である、項目２に記載の核酸ベクター。
（項目１６）
真核標的細胞を、候補ＤＮＡ配列で形質転換するための方法であって、
１）第１の細胞内で、ハイブリッドタンパク質を、項目１１に記載の核酸ベクターの第１の発現カセットから発現させて、該ハイブリッドタンパク質と該核酸ベクターとの複合体を形成するステップと；
２）該標的細胞を、該形成されたハイブリッドタンパク質と核酸ベクターとの複合体と接触させるステップと
を含み、
該候補ＤＮＡ配列が、第２のカーゴ配列である方法。
（項目１７）
真核標的細胞を、候補ＤＮＡ配列で形質転換するための方法であって、
該真核標的細胞を、原核細胞内の、項目６に記載の核酸ベクターの第１の発現カセットからの、ハイブリッドタンパク質の発現により形成された、ハイブリッドタンパク質と核酸ベクターとの複合体と接触させるステップ
を含み、
該候補ＤＮＡ配列が、第２のカーゴ配列である方法。
（項目１８）
原核標的細胞を、候補ＤＮＡ配列で形質転換するための方法であって、
１）項目３に記載の核酸ベクターを提供するステップであって、該候補ＤＮＡ配列が、前記第１のカーゴ配列であるステップと；
２）該核酸ベクターを、該核酸ベクター、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）ドメイン、および少なくとも１つの分泌シグナル配列に結合するのに適する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質に結合させて、該ハイブリッドタンパク質と該核酸ベクターとの複合体を形成するステップと；
３）該原核標的細胞を、該ハイブリッドタンパク質と該核酸ベクターとにより形成される該複合体と接触させるステップと
を含む方法。
（項目１９）
原核標的細胞を、候補ＤＮＡ配列で形質転換するための方法であって、
前記核酸ベクター、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）ドメイン、および少なくとも１つの分泌シグナル配列に結合するのに適する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質と、項目３に記載の核酸ベクターとを接触させることにより形成される、ハイブリッドタンパク質と核酸ベクターとの複合体と、該原核標的細胞とを接触させるステップ
を含み、
前記候補ＤＮＡ配列が、前記第１のカーゴ配列である方法。
（項目２０）
項目２または３に記載の核酸ベクターを含有する細菌細胞。
（項目２１）
項目１１に記載の核酸ベクターを含有する真核細胞。
（項目２２）
細胞を、項目１に記載の核酸ベクターで形質転換するためのキットであって、該核酸ベクター、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）ドメイン、および少なくとも１つの分泌シグナル配列に結合するのに適する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを含むある量のハイブリッドタンパク質と、該キットをどのようにして使用するのかについての指示とを含むキット。
（項目２３）
ある量の前記核酸ベクターをさらに含む、項目２２に記載のキット。
（項目２４）
前記標的原核細胞が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属である、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２５）
グラム陰性菌内で機能的な第１の複製起点、およびグラム陽性菌内で機能的な第２の複製起点と；
グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方における、選択に適する選択マーカーと；
該グラム陽性菌内の、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）ドメイン、および少なくとも１つの分泌シグナル配列を含むハイブリッドタンパク質の発現のための原核生物発現カセットと；
該ハイブリッドタンパク質の該少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインにより認識される少なくとも１つのＤＮＡモチーフと；
真核細胞内の第２のカーゴ配列を発現させるための真核生物発現カセットと
を含む核酸ベクター。
（項目２６）
前記グラム陰性菌が、Ｅ．ｃｏｌｉである、項目２５に記載の核酸ベクター。
（項目２７）
前記グラム陽性菌が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のうちの少なくとも１つである、項目２５に記載の核酸ベクター。
（項目２８）
前記選択マーカーが、スペクチノマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシンおよびテトラサイクリンのうちの少なくとも１つに対する耐性を付与する、項目２７に記載の核酸ベクター。
【００３４】
本明細書の対象物の特徴および利点は、付属の図において例示される通り、選択される実施形態についての以下の詳細な記載に照らして、いっそう明らかとなる。明確に理解される通り、開示され、特許請求される対象物は、全て、特許請求の範囲から逸脱することなしに、多様な点で変更が可能である。したがって、図面および記載は、本質において、例示的なものであり、限定的なものではないとみなされるものとし、対象物の完全な範囲は、特許請求の範囲において示される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、本対象物の第１の実施形態に従い、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴとして同定されるベクターの構造を示す図である。
【００３６】
【図２】図２は、本対象物の第２の実施形態に従い、ｐＦＲＧ１．５−ＳＨＴとして同定されるベクターの構造を示す図である。
【００３７】
【図３】図３は、ＳＨＴハイブリッドタンパク質およびＳＺＴハイブリッドタンパク質の、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴとの結合を裏付けるゲルシフトアッセイを示す図である。ＳＨＴおよびＳＺＴは、ｐＢＲＡ２．０と相互作用し、ペプチド濃度の増加に応じて、ゲルシフトをもたらす。
【００３８】
【図４】図４は、Ｅ．ｃｏｌｉを、本対象物のある実施形態に従うｐＢＲＡ２．０−ＳＨＴベクターで形質転換して、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｐＵＣ）複製起点の有効性を確認した結果を示す図である。
【００３９】
【図５】図５は、ＨＥＫ−２９３細胞およびＨｅＬａ細胞に、本対象物のある実施形態に従うｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴベクターをトランスフェクトした結果を示す図である。
【００４０】
【図６】図６は、ベクターを宿すＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ細胞からの、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴの分泌を示す図である。
【００４１】
【図７】図７は、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴを感染させたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ細胞の細胞上清に由来する、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴの消化産物を示す図である。
【００４２】
【図８】図８は、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴの分泌およびその特徴付けを示す、細胞上清濃縮物の可視化および消化を示す図である。
【００４３】
【図９】図９は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属内のＳＺＴタンパク質の発現を裏付ける、ＳＺＴハイブリッドタンパク質についての免疫ブロット解析を示す図である。
【００４４】
【図１０】図１０は、哺乳動物細胞の、ｐＢＲＡ２．０−ＳＨＴまたはｐＢＲＡ２．０−ＳＺＴを含むタンパク質複合体によるトランスフェクション、および哺乳動物細胞系内の、カーゴであるＧＦＰ配列の発現を示す図である。治療用分子であるｐＢＲＡ２．０−ＳＨＴ複合体およびｐＢＲＡ２．０−ＳＺＴ複合体は、哺乳動物細胞系にトランスフェクトし、哺乳動物細胞系内でＧＦＰを発現させることが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
実施形態の詳細な説明
本明細書では、以下の配列表が提示され、本開示の一部を形成する。
【００４６】
配列番号１は、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴの配列であって、真核生物発現カセットが、ＧＦＰタンパク質をコードし、原核生物発現カセットが、ＳＨＴタンパク質をコードする配列である。供給源：人工。
【００４７】
配列番号２は、ｐＦＲＧ１．５−ＳＨＴの配列であって、真核生物発現カセットが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含む配列である。供給源：人工。
【００４８】
配列番号３は、実施形態に従うＬａｃ  Ｉ  ＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列である。供給源：Ｅ．ｃｏｌｉ。
【００４９】
配列番号４は、実施形態に従うＨＵ  ＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列である。供給源：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
【００５０】
配列番号５は、実施形態に従うＭｅｒ  Ｒ  ＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列である。供給源：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
【００５１】
配列番号６は、実施形態に従うジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列である。供給源：人工。
【００５２】
配列番号７は、ＳＭＴハイブリッドタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。供給源：人工。
【００５３】
配列番号８は、ＳＨＴハイブリッドタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。供給源：人工。
【００５４】
配列番号９は、ＳＬＴハイブリッドタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。供給源：人工。
【００５５】
配列番号１０は、ＳＺＴハイブリッドタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。供給源：人工。
【００５６】
配列番号１１は、Ｔｒａｎｓ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（Ｔａｔ）形質導入ドメイン［ＨＩＶ］のアミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号１２は、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（Ａｎｔｐ）形質導入ドメインのアミノ酸配列である。供給源：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ。
【００５８】
配列番号１３は、ＨＩＶ  Ｒｅｖ形質導入ドメインのアミノ酸配列である。供給源：ヒトＨＩＶウイルス。
【００５９】
配列番号１４は、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２形質導入ドメインのアミノ酸配列である。供給源：ヒトＨＳＶウイルス。
【００６０】
配列番号１５は、Ｐ−ベータＭＰＧ（ｇｐ４１−ＳＶ４０）形質導入ドメインのアミノ酸配列である。供給源：ＳＶ４０。
【００６１】
配列番号１６は、トランスポータン（ガラニン−マストパラン）形質導入ドメインのアミノ酸配列である。供給源：真核細胞、種は未知。
【００６２】
配列番号１７は、Ｐｅｐ−１（Ｔｒｐリッチモチーフ−ＳＶ４０）形質導入ドメインのアミノ酸配列である。供給源：ＳＶ４０。
【００６３】
配列番号１８は、開裂部位を含むアルファアミラーゼシグナル配列をコードするＤＮＡ配列である。供給源：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
【００６４】
配列番号１９は、推定開裂部位を含むアルファアミラーゼシグナル配列をコードする４６アミノ酸の配列である。供給源：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
【００６５】
配列番号２０は、開裂型アルファアミラーゼシグナル配列をコードするＤＮＡ配列である。供給源：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
【００６６】
配列番号２１は、開裂型アルファアミラーゼシグナル配列の４４アミノ酸の配列である。供給源：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
【００６７】
配列番号２２は、アルファアラビノシダーゼシグナル配列をコードするＤＮＡ配列である。供給源：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属：。
【００６８】
配列番号２３は、アルファアラビノシダーゼシグナル配列のアミノ酸配列である。供給源：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属：。
【００６９】
配列番号２４は、ハイブリッドタンパク質の実施形態で指定されるＳＨＴのアミノ酸配列である。供給源：人工。
【００７０】
配列番号２５は、ハイブリッドタンパク質の実施形態で指定されるＳＬＴのアミノ酸配列である。供給源：人工。
【００７１】
配列番号２６は、ハイブリッドタンパク質の実施形態で指定されるＳＭＴのアミノ酸配列である。供給源：人工。
【００７２】
配列番号２７は、ハイブリッドタンパク質の実施形態で指定されるＳＺＴのアミノ酸配列である。供給源：人工。
【００７３】
配列番号２８は、ｐＤＯＪＨＲ  ＯＲＩを含むＤＮＡ配列である。供給源：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
【００７４】
配列番号２９は、ｐＵＣ／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＯＲＩを含むＤＮＡ配列である。供給源：Ｅ．ｃｏｌｉ。
【００７５】
配列番号３０は、ｐＢ４４  ＯＲＩを含むＤＮＡ配列である。供給源：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
【００７６】
配列番号３１は、ＴＡＴドメインをコードするＤＮＡ配列である。供給源：ヒトＨＩＶウイルス。
【００７７】
配列番号３２は、Ｐ−ベータＭＰＧ（ｇｐ４１−ＳＶ４０）形質導入ドメインをコードするＤＮＡ配列である。供給源：ＳＶ４０ウイルス。
【００７８】
配列番号３３は、トランスポータン（ガラニン−マストパラン）形質導入ドメインをコードするＤＮＡ配列である。供給源：真核細胞−種は未知。
【００７９】
配列番号３４は、Ｐｅｐ−１（Ｔｒｐリッチモチーフ−ＳＶ４０）形質導入ドメインをコードするＤＮＡ配列である。供給源：ＳＶ４０。
【００８０】
配列番号３５は、ＧＦＰフォワードプライマーである。供給源：Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ。
【００８１】
配列番号３６は、ＧＦＰリバースプライマーである。供給源：Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ。
【００８２】
配列番号３７は、スペクチノマイシン耐性フォワードプライマーである。供給源：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ。
【００８３】
配列番号３８は、スペクチノマイシンリバースプライマーである。供給源：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ。
【００８４】
配列番号３９は、ＣＭＶフォワードプライマーである。供給源：サイトメガロウイルス。
【００８５】
配列番号４０は、ＣＭＶリバースプライマーである。供給源：サイトメガロウイルス。
【００８６】
配列番号４１は、ＭｅｒＲ  ＤＮＡ認識部位である。供給源：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
【００８７】
配列番号４２は、ＬａｃＩ抑制因子ＤＮＡ結合部位である。供給源：Ｅ．Ｃｏｌｉ。
【００８８】
配列番号４３は、合成ジンクフィンガーＤＮＡ認識部位である。供給源：人工。
【００８９】
配列番号４４は、ＨＵ  ＤＮＡ結合ドメインである。供給源：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
【００９０】
配列番号４５は、Ｍｅｒ  Ｒ  ＤＮＡ結合ドメインである。供給源：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
【００９１】
配列番号４６は、ＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメインである。供給源：人工。
【００９２】
配列番号４７は、Ｌａｃ  Ｉ  ＤＮＡ結合ドメインである。供給源：Ｅ．ｃｏｌｉ。Ｅ．ｃｏｌｉ。
【００９３】
配列番号４８は、Ｈｕプロモーターおよびターミネーターを含む、ｐＦＲＧに由来する原核生物発現カセット（図２）である。供給源：人工／Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
【００９４】
配列番号４９は、発現させるＧＦＰコード配列を挟む、ＣＭＶプロモーター、コザック配列、ならびにＴＫポリＡ部位およびターミネーターを含む、ｐＦＲＧに由来する真核生物発現カセット（図２）である。供給源：人工。
【００９５】
用語の定義：本開示では、「〜を含むこと」という語を、語に後続する項目を含むが、具体的に言及されない項目を除外しないことを意味するように、非限定的な意味で使用する。要素に対する、不定冠詞「ある（ａ）」による言及は、文脈により、存在するのが、要素のうちの１つであり、要素のうちの１つに限られることが明らかに要求されない限りにおいて、１つを超える要素が存在する可能性を除外しない。
【００９６】
本開示では、終点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される全ての数であって、全ての整数（ｗｈｏｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ）、全ての整数値（ｉｎｔｅｇｅｒ）、および全ての中間の分数（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、および５などを含む）を含む全ての数を含む。
【００９７】
本開示では、単数形の「ある（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により、そうでないことが明らかに指示されない限りにおいて、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」を含有する組成物に対する言及は、２つまたはこれを超える化合物の混合物を含む。
【００９８】
本開示では、文脈により、そうでないことが明らかに指示されない限りにおいて、「または」という用語を一般に、「および／または」を含むその意味で用いる。
【００９９】
本開示では、そうでないことが指し示されない限りにおいて本明細書および特許請求の範囲で使用される量、成分、特性の測定値などを表す全ての数は、全ての場合に、「約」という用語により修飾されると理解されるものとする。したがって、逆のことが指し示されない限り、または文脈に照らして必要でない限りにおいて、本開示で示される数値パラメータは、本開示の教示を活用する当業者により得られることが求められる所望の特性に応じ、かつ、測定および定量の不正確さに照らして変化しうる概数である。同等物の原則の適用を、特許請求の範囲に限定せずに述べると、各数値パラメータは、少なくとも、報告される有効数字の桁数に照らして、かつ、通常の丸めの技法を適用することにより解釈すべきである。広範にわたる本開示を提示する数値範囲およびパラメータは、概数ではあるが、本開示の妥当性、および開示され、特許請求される対象物の、先行技術からの弁別と符合する限度において、具体例で示されるそれらの数値が広く理解されるに過ぎない。
【０１００】
本明細書で開示されるベクターは、グラム陰性菌内およびグラム陽性菌内のいずれにおいても複製が可能である。実施形態では、グラム陰性菌は、Ｅ．ｃｏｌｉである。実施形態では、グラム陽性菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属である。実施形態では、グラム陽性菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属である。実施形態では、グラム陽性菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属である。実施形態では、グラム陽性菌は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属である。実施形態では、グラム陽性菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属である。可能な標的細菌株の完全な範囲は、当業者によりたやすく理解されるし、株のリストは、法規により許容される場合、その文脈が本明細書に組み込まれる、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂａｃｔｅｒｉｏ．ｎｅｔ／−ａｌｉｎｔｒｏ．ｈｔｍｌのＬＰＳＮ  ｂａｃｔｅｒｉｏ．ｎｅｔにおいて利用可能である。特定の実施形態では、細菌は、プロバイオティックス細菌またはＧＲＡＳ細菌である。
【０１０１】
標的のグラム陽性菌が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属である実施形態では、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の例示的で可能な株または種は、限定なしに述べると、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｔｉｎｏｃｏｌｏｎｉｉｆｏｒｍｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｇｕｌａｔｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｓｔｅｒｏｉｄｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉａｖａｔｉｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｈｅｍｉｃｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｍｂｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｌｌｉｔｒｉｃｈｏｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｏｅｒｉｎｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｅｃｔｏｃｕｎｉｃｕｌｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｃｏｌｅｎｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｏｂｏｓｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｉｎａｔｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｓｈｉｗａｎｏｈｅｎｓｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｓｕｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｒｙｃｉｃｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｉｍｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｎｇｏｌｉｅｎｓｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｇｌｏｂｏｓｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｕｌｌｏｒｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｅｃｕｌａｒｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｇｕｉｎｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｃａｒｄｏｖｉｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｅｌｌｅｎｂｏｓｃｈｅｎｓｅ、Ｂ���ｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｂｔｉｌｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｐｏｒｃｉｎｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｓｕｒｕｍｉｅｎｓｅ；  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ
を含む。
【０１０２】
標的の細菌が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属である場合、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の例示的で可能な株または種は、限定なしに述べると、
Ｓ．ａｒｌｅｔｔａｅ；Ｓ．ａｇｎｅｔｉｓ；Ｓ．ａｕｒｅｕｓ；Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ；Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ；Ｓ．ｃａｐｒａｅ；Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ；Ｓ．ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ；Ｓ．ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ；Ｓ．ｃｏｈｎｉｉ；Ｓ．ｃｏｎｄｉｍｅｎｔｉ；Ｓ．ｄｅｌｐｈｉｎｉ；Ｓ．ｄｅｖｒｉｅｓｅｉ；Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ；Ｓ．ｅｑｕｏｒｕｍ；Ｓ．ｆｅｌｉｓ；Ｓ．ｆｌｅｕｒｅｔｔｉｉ；Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ；Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ；Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ；Ｓ．ｈｙｉｃｕｓ；Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ；Ｓ．ｋｌｏｏｓｉｉ；Ｓ．ｌｅｅｉ；Ｓ．ｌｅｎｔｕｓ；Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ；Ｓ．ｌｕｔｒａｅ；Ｓ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ；Ｓ．ｍｉｃｒｏｔｉ；Ｓ．ｍｕｓｃａｅ；Ｓ．ｎｅｐａｌｅｎｓｉｓ；Ｓ．ｐａｓｔｅｕｒｉ；Ｓ．ｐｅｔｔｅｎｋｏｆｅｒｉ；Ｓ．ｐｉｓｃｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ；Ｓ．ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ；Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ；Ｓ．ｐｕｌｖｅｒｅｒｉ；Ｓ．ｒｏｓｔｒｉ；Ｓ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ；Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ；Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ；Ｓ．ｓｃｉｕｒｉ；Ｓ．ｓｉｍｉａｅ；Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ；Ｓ．ｓｔｅｐａｎｏｖｉｃｉｉ；Ｓ．ｓｕｃｃｉｎｕｓ；Ｓ．ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ；Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ；およびＳ．ｘｙｌｏｓｕｓ
を含む。
【０１０３】
本開示では、「ベクター」という用語は、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、人工染色体、または他の核酸ベクターのうちの少なくとも１つを指す。実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの治療用薬剤をコードするか、またはこれを作り出すのに適するか、または、少なくとも１つの治療用配列を含む。微生物学的適用に適するベクターは、当技術分野で周知であり、日常的にデザインされ、特定の目的で開発されている。細菌株を形質転換するのに使用されているベクターの、一部の非限定的な公表例は、以下のプラスミド：ｐＭＷ２１１、ｐＢＡＤ−ＤＥＳＴ４９、ｐＤＯＮＲＰ４−Ｐ１Ｒ、ｐＥＮＴＲ−ＰＢＡＤ、ｐＥＮＴＲ−ＤＵＡＬ、ｐＥＮＴＲ−ｔｅｒｍ、ｐＢＲ３２２、ｐＤＥＳＴＲ４−Ｒ３、ｐＢＧＳ１８−Ｎ９ｕｃ８、ｐＢＳ２４Ｕｂ、ｐＵｂＮｕｃ、ｐＩＸＹ１５４、ｐＢＲ３２２ＤＥＳＴ、ｐＢＲ３２２ＤＥＳＴ−ＰＢＡＤ−ＤＵＡＬ−ｔｅｒｍ、ｐＪＩＭ２０９３、ｐＴＧ２２４７、ｐＭＥＣ１０、ｐＭＥＣ４６、ｐＭＥＣ１２７、ｐＴＸ、ｐＳＫ３６０、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＯＥ９３、ｐＢＲ３２７、ｐＤＷ２０５、ｐＫＣＬ１１、ｐＫＫ２２４７、ｐＭＲ６０、ｐＯＵ８２、ｐＲ２１７２、ｐＳＫ３３０、ｐＳＫ３４２、ｐＳＫ３５５、ｐＵＨＥ２１−２、ｐＥＨＬＹＡ２−ＳＤを含む。例えば、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｒｉｔｚｋｅｒら  Ｉｎｔｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２９７巻、１５１〜１６２頁（２００７年）；Ｇｒａｎｇｅｔｔｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．、７２巻、２７３１〜２７３７頁（２００４年）、ＫｎｕｄｓｅｎおよびＫａｒｌｓｔｒｏｍ、Ａｐｐ．  ａｎｄ  Ｅｎｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ８５〜９２頁、５７巻、１号（１９９１年）、Ｒａｏら、ＰＮＡＳ  １１１９３〜１１９９８頁、１０２巻、３４号（２００５年）を参照されたい。当業者は、本開示の教示に照らして、本明細書で特許請求される対象物の代替的な実施形態が可能であることを理解し、このような代替的な実施形態を構築するために、公知のベクターから採取された配列をどのように組み合わせるのかを理解する。例として、上記のリストによる既存のベクターは、さらなる複製起点、または適切なプロモーターおよび終結配列、もしくはさらなるＤＮＡ結合配列、もしくは本明細書で記載されるハイブリッドタンパク質（ＮＨＰ）のコード配列を含む、さらなる発現カセット（発現カセットの非限定的な例を、配列番号４８および４９として提示する）を挿入することにより修飾することができる。当業者は、当技術分野で公知の多様な代替物を理解し、採用し、当技術分野で周知の技法を使用してそのようにする。特定の実施形態では、実施形態における使用に適する複製起点は、ｐＤＯＪＨＲ複製起点内ならびにｐＢ４４複製起点内およびｐＵＣ（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点内にも含まれる複製起点を含む。本明細書では、これらを、それぞれ、配列番号２８、３０、２９として提示する。一部の実施形態では、ベクターの隣接する機能的構成要素を、配列を連結することにより接合する。
【０１０４】
実施形態では、ベクターは、標的真核細胞内の形質転換および遺伝子発現の両方を確認するマーカー配列を含有する、真核生物発現カセット（ＧＦＰコード配列を含む非限定的な例を、配列番号４９として提示する）を含む。代替的な実施形態では、一連の代替的なマーカータンパク質およびマーカー配列が可能であり、例えば、選択される実施形態では、かつ、限定なしに述べると、マーカー配列は、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、ルシフェラーゼ、ＧＡＬ（ベータ−ガラクトシダーゼ）、またはＧＵＳ（ベータ−グルクロニダーゼ）をコードすることが理解される。当業者は、当技術分野でたやすく利用可能な、標準的技法および標準的材料を使用して、全てのこのようなマーカー配列およびレポーター遺伝子をたやすく理解し、使用する。
【０１０５】
実施形態に従うベクターは、１または複数の原核生物発現カセットを含む。グラム陽性菌内の配列の発現に適し、実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属内の発現に適する、原核生物発現カセットの非限定的な例を、配列番号４８として提示する。実施形態では、このようなカセットは、ハイブリッドタンパク質を含み、本明細書では、このようなハイブリッドタンパク質の実施形態が開示される。
【０１０６】
実施形態では、ベクターは、少なくとも１つ、２つ、３つ、もしくはこれを超えるか、または１つ、２つ、３つだけの真核生物発現カセットを含む場合もあり、グラム陽性菌内の発現のための、少なくとも１つ、２つ、３つ、もしくはこれを超えるか、または１つ、２つ、３つだけの原核生物発現カセットを含む場合もあり、上記の組合せを含む場合もあることが理解される。
【０１０７】
本開示では、細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）という用語は、真核細胞の細胞膜を透過することが可能なタンパク質を意味する。ＣＰＰという用語は、転写のトランス活性化因子（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）ともまた称されるＴａｔを含む。より確定的にであるが、限定なしに述べると、Ｔａｔまたは他の任意のＣＰＰに対する言及は、天然配列を意味するが、また、全範囲にわたるその配列バリアントであって、問題となるタンパク質またはタンパク質ドメインの所望の機能を果たすのに適する配列バリアントも意味することが理解される。例として、Ｔａｔタンパク質の広範にわたる機能的バリアントは、Ｆ．  Ｓａｌｏｍｏｎｅら、（２０１０年）、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｅｓｃａｐｅ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１６３巻、２９３〜３０３頁において記載されている。
【０１０８】
実施形態に従うＣＰＰの他の非限定的な例は、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質、およびＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（Ａｎｔｐ）タンパク質のタンパク質形質導入ドメインならびに、表１で提示されるタンパク質形質導入ドメイン、すなわち、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ａｎｔｐ、ＶＰ２２、Ｐｅｐ１、およびトランスポータンを含む。実施形態では、ＣＰＰドメインは、Ｓａｌｏｍｏｎｅ  Ｆ．ら、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｅｓｃａｐｅ」、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ．  ２０１２年１０月２日（印字版に先行するｅｐｕｂ版）において記載されているドメインである。表１は、例示的なＣＰＰドメインの非限定的選択を示す。
【表１】
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【０１０９】
本開示では、「ＤＮＡ結合ドメイン」という用語は、適切なＤＮＡ配列に、可逆的ではあるが、緊密に、または高アフィニティーで、特異的に結合することが可能なタンパク質配列を意味する。実施形態では、ＤＮＡ結合配列は、ジンクフィンガー結合ドメインであることが可能であり、一方、広範にわたる適切なドメインおよびそれらの相補性のＤＮＡ結合配列は、当業者によりたやすく同定されるが、１９９９年１２月２８日に交付された、米国特許第６００７９８８号には、多数の例示的な例が開示されている。本明細書の特定の実施形態では、ＤＮＡ結合モチーフまたはＤＮＡ結合ドメインは、Ｍｅｒ  Ｒ、ジンクフィンガー、またはヒストン様ＤＮＡ結合タンパク質であるかまたはこれらに由来し、ＨＵタンパク質であるかまたはこれに由来し、ホメオボックスＤＮＡ結合タンパク質であるかまたはこれに由来する。ＨＵタンパク質は一般に、ホメオボックス様タンパク質と考えられることが理解される。
【０１１０】
多くの種類のＤＮＡ結合ドメインは、利用可能なデータベース、スクリーニング法、および周知の技法を使用して、当業者によりたやすく同定されるが、代替的な実施形態における使用に適するＤＮＡ結合ドメインの非限定的な例は、広範にわたるＤＮＡ結合タンパク質に由来しうる。実施形態では、適切なＤＮＡ結合ドメインは、へリックス−ターン−へリックス、ジンクフィンガー、ロイシンジッパー、ウィングドへリックス、ウィングドへリックス−ターン−へリックス、へリックス−ループ−へリックス、ＨＭＧボックス、Ｗｏｒ  ３、およびＲＮＡ誘導型結合ドメインを含むがこれらに限定されない、任意の一般的な種類でありうる。ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが、実施形態で活用されうる、そのＤＮＡ結合タンパク質の例示的な例は、広範にわたる代替的供給源および代替的オペロンから引き出されうる、ヒストン、ヒストン様タンパク質、転写プロモーター、転写リプレッサー、転写レギュレーターを含む。
【０１１１】
本明細書では、本開示における「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、および「タンパク質」という用語を、アミノ酸残基のポリマーを指すように、互換的に使用する。用語は、１または複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的類似体であるか、または明白な天然の類似体を伴わない、完全に人工のアミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用されるほか、天然に存在するアミノ酸ポリマーにも適用される。
【０１１２】
実施形態では、ベクター内に含まれる真核生物発現カセットは、適切なコザック配列、およびコザック配列上の可能なバリエーションを含み、その位置決めは、当業者によりたやすく理解される。非限定的な一例を、配列番号４９として提示する。
【０１１３】
ペプチドまたはペプチド断片は、親ペプチドもしくは親ポリペプチドのアミノ酸配列と相同であるか、またはこれらに由来する保存的断片であるアミノ酸配列を有する場合、親ペプチドまたは親ポリペプチド「に由来する」。代替的な実施形態では、このような配列は、天然のアミノ酸を含むか、または、人工的に作製されたアミノ酸を含むことが理解される。当業者は、上記の全てをたやすく同定する。
【０１１４】
実施形態では、ベクターは、開示される例と異なる配列を有する。当業者は、ベクターの、本明細書で開示される目的への適性に影響を及ぼさないか、またはこれを妨げない、一連の配列バリエーションが可能であることを理解する。例を目的とし、限定を目的とせずに述べると、当業者は、ある特定のＤＮＡ配列は、ベクターの機能に物質的な影響を及ぼさずに変化させうるが、他のＤＮＡ配列はそうではないことを認識する。ここでもまた、例を目的とし、限定を目的とせずに述べると、当業者は、選択された配列の機能を増強することが公知の配列修飾を認識し、採用し、このような機能を減殺することが公知の配列修飾を排除する。タンパク質コード配列に対する特定の言及により、当業者は、可変性領域および保存的領域を認識し、関与性のタンパク質またはポリペプチドの構造および／または機能を変化させる可能性がある変異、ならびにそうする可能性がない変異を認識する。特定のバリアントの実施形態では一般に、ベクターの核酸配列は、開示される例のうちの１つと１００％同一であるか、あるいは、開示される例のうちの１つと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、９５％、８４％、８３％、８２％、８１％、もしくは８０％もしくは約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、９５％、８４％、８３％、８２％、８１％、もしくは８０％同一であるか、または約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、９５％、８４％、８３％、８２％、８１％、もしくは８０％未満同一であり、実施形態では、このような配列同一性は、ベクターの長さの全部または一部だけにわたり広がることが理解される。実施形態では、ベクターは、代替的な複製起点、プロモーター、ポリアデニル化部位などを含むことが理解される。実施形態では、ベクターは、発現カセット内に挿入された配列を含み、実施形態では、ベクターは、発現カセット内の挿入を有さない。
【０１１５】
実施形態では、ハイブリッドタンパク質配列または実施形態に従う発現カセット内に含まれた配列によりコードされるポリペプチド配列は、開示される例のうちの１つと１００％同一であるか、あるいは、配列番号２４、２５、２６、２７として開示される例のうちの１つと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、９５％、８４％、８３％、８２％、８１％、もしくは８０％もしくは約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、９５％、８４％、８３％、８２％、８１％、もしくは８０％同一であるか、または約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、９５％、８４％、８３％、８２％、８１％、もしくは８０％未満同一であり、このような配列同一性は、タンパク質またはポリペプチドの長さの全部または一部だけにわたり広がる。
【０１１６】
実施形態では、相同性および配列同一性は、目的の１または複数の配列の全部または一部だけにわたり広がる。実施形態では、相同性および配列同一性は、特定の機能的ドメインまたは配列ドメインに限定される。実施形態では、相同性および配列同一性は、連続的であり、実施形態では、配列同一性または相同性のより低い領域により隔てられている。
【０１１７】
ベクターの構築：実施形態では、本明細書で提示されるベクターおよび配列は、公知の技法および市販のＤＮＡ合成サービスを使用してデノボで合成する。当業者には、本発明のベクター構築のための標準的な技法が周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９年）などの参考文献において見出すことができる。ＤＮＡ断片をライゲーションするために、様々な戦略が利用可能であり、それらの選択は、ＤＮＡ断片の末端の性質に依存し、それらの選択は、当業者によりたやすくなされうる。実施形態では、ベクターの配列は、適切なＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、およびタンパク質配列の操作ソフトウェアを使用して決定し、所望の配列は、適切な合成法を使用して合成するが、多種多様な合成法が、当業者によりたやすく利用可能であり、即座に理解および実装される。
【０１１８】
本明細書で記載される通り、本開示の態様は、単離核酸および単離核酸の使用法に関する。プラスミド調製物：当技術分野では、プラスミド調製物および複製手段が周知である。例えば、それらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第４，２７３，８７５号および同第４，５６７，１４６号を参照されたい。本発明の一部の実施形態は、標的微生物の遺伝子素材の一部を得て、標的微生物の遺伝子素材の一部を、内部対照プラスミドとしての使用のためのプラスミドへと挿入することを含む。
【０１１９】
増幅のための鋳型として使用される核酸は、標準的な方法に従い、細胞から単離される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）。核酸は、ゲノムＤＮＡの場合もあり、分画したＲＮＡまたは全細胞ＲＮＡの場合もある。ＲＮＡを使用する場合、ＲＮＡを相補性ｃＤＮＡへと変換することが所望でありうる。特異的配列に対応する核酸と選択的にハイブリダイズするプライマーの対を、単離核酸と、選択的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で接触させる。ハイブリダイズさせたら、核酸プライマーの複合体を、鋳型依存性核酸合成を容易とする、１または複数の酵素と接触させる。「サイクル」ともまた称される、複数ラウンドにわたる増幅を、十分な量の増幅産物が産生されるまで実行する。
【０１２０】
次に、増幅産物を検出する。ある特定の適用では、検出は、視覚的手段により実施することができる。代替的に、検出は、化学発光、組み込まれた放射性標識についての放射性シンチグラフィー（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｓｃｉｎｔｉｌｏｇｒａｐｈｙ）、もしくは蛍光標識を介するか、なおまたは電気インパルスシグナルもしくは熱インパルスシグナルを使用する系（Ａｆｆｙｍａｘ技術；Ｂｅｌｌｕｓ、１９９４年）を介する、産物の間接的な同定を伴う場合もある。
【０１２１】
プライマー：本明細書で定義されるプライマーという用語は、鋳型依存性の工程における新生核酸の合成をプライミングすることが可能な任意の核酸を包含することを意味する。プライマーは、１０〜２０塩基対の長さのオリゴヌクレオチドであることが典型的であるが、より長い配列も用いることができる。プライマーは、二本鎖形態で提供することもでき、一本鎖形態で提供することもできるが、一本鎖形態が好ましい。実施形態に従うベクターおよびヌクレオチド配列の部分を増幅するのに使用される特異的プライマーを、配列番号３５〜４０として提示する。当業者は、特定の要件に適する代替的なプライマーをたやすく選択する。
【０１２２】
鋳型依存性増幅法：多数の鋳型依存性の工程は、所与の鋳型試料中に存在する配列を増幅するのに利用可能である。公知の最良の増幅法のうちの１つは、それらの各々が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号、ならびにＩｎｎｉｓら、１９９０年において詳細に記載されている、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲと称される）である。
【０１２３】
増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために、逆転写酵素によるＰＣＲ増幅手順を実施することができる。ＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写させる方法は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年において記載されている。逆転写のための代替的な方法は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを活用する。これらの方法は、１９９０年１２月２１日に出願されたＷＯ９０／０７６４１において記載されている。当技術分野では、ポリメラーゼ連鎖反応の方法が周知である。当技術分野では、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、欧州出願第３２０３０８号において開示されている、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）など、ＰＣＲ以外の他の増幅法も公知である。
【０１２４】
別の実施形態ではまた、Ｑｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅも、本発明におけるさらに別の増幅法として使用することができる。この方法では、ＲＮＡポリメラーゼの存在下で、標的領域と相補的な領域を有する、ＲＮＡの複製配列を、試料へと添加する。ポリメラーゼは、複製配列をコピーし、次いで、これが検出される。
【０１２５】
核酸の合成：当業者は、所望の核酸配列を合成するための方法および装置の範囲をたやすく認識する。例を目的とし、限定を目的とせずに述べると、一連の実施形態では、プラスミドは、コンピュータにより、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）によって合成した。
【０１２６】
実施形態を行うための方法の範囲は、微生物の遺伝子素材のうちの少なくとも一部を増幅するための、任意の適切な方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわち、ＰＣＲ、および核酸配列ベースの増幅、すなわち、ＮＡＳＢＡ）を含み、１つの例として述べると、本発明では、ＰＣＲ技法に言及する実施形態について記載する。
【０１２７】
当技術分野では、遺伝子素材、例えば、ＤＮＡの増幅が周知である。例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，２０２号、および同第４，９９４，３７０号を参照されたい。所望の遺伝子素材または標的核酸配列のヌクレオチド配列を知ることにより、特異的プライマー配列をデザインすることができる。本発明の一実施形態では、プライマーは、約５〜５０オリゴヌクレオチド長、または約１０〜４０オリゴヌクレオチド長、なおまたは約１０〜３０オリゴヌクレオチド長であるがこれらに限定されない。適切なプライマー配列は、当業者がたやすく合成することができ、ＢＲＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（商標））など、第三者プロバイダーからもたやすく入手可能である。また、ＰＣＲなど、核酸配列の増幅に必要な、ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドなど、他の試薬も市販されている。
【０１２８】
分離法：増幅に続き、特異的増幅が生じたのかどうかを決定する目的で、増幅産物を鋳型および過剰なプライマーから分離することが所望されうる。一実施形態では、増幅産物を、標準的な方法を使用する、アガロースゲル電気泳動、アガロース−アクリルアミドゲル電気泳動、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年を参照されたい。
【０１２９】
代替的に、分離を実行するのに、クロマトグラフィー法を用いることもできる。本発明で使用されうる、多くの種類のクロマトグラフィー：吸着、分配、イオン交換、および分子ふるい、ならびにそれらを使用するための多くの特化法であって、カラムクロマトグラフィー、濾紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、およびガスクロマトグラフィーを含む特化法が存在する（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ、１９８２年）。
【０１３０】
同定法：増幅産物は、所望の配列の増幅を確認するために視覚化しなければならない。１つの典型的な視覚化法は、臭化エチジウムによるゲルの染色およびＵＶ光下における視覚化を伴う。代替的に、増幅産物を、放射性標識または蛍光標識された（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ−ｌａｂｅｌｅｄ）ヌクレオチドで統合的に標識する場合は、分離後に、増幅産物を、ｘ線フィルムへと曝露することもでき、適切な刺激スペクトル下で視覚化することもできる。
【０１３１】
一実施形態では、視覚化を間接的に達成する。増幅産物の分離後、標識された核酸プローブを、増幅されたマーカー配列と接触させる。プローブは、発色団へとコンジュゲートさせることが好ましいが、放射性標識することができる。別の実施形態では、プローブを、抗体またはビオチンなどの結合パートナーであって、結合対の他のメンバーが検出用部分を保有する結合パートナーへとコンジュゲートさせる。
【０１３２】
一実施形態では、検出は、サザンブロット法および標識されたプローブとのハイブリダイゼーションによる。当業者には、サザンブロット法に関与する技法が周知であり、分子プロトコールについての多くの標準的な書籍において見出すことができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年を参照されたい。略述すると、増幅産物を、ゲル電気泳動により分離する。次いで、ゲルを、核酸の転写および非共有結合を可能とするニトロセルロースなどの膜と接触させる。その後、膜を、標的増幅産物とハイブリダイズすることが可能な発色団コンジュゲートプローブと共にインキュベートする。検出は、膜の、ｘ線フィルムまたはイオン放出型検出デバイスへの曝露による。
【０１３３】
一般に、本発明で有用なベクターの構築における、ＤＮＡ配列のクローニングのために使用される原核細胞は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｋ１２など、任意のグラム陰性菌、ならびにＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属を含む。使用されうる他の微生物株は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株
ＰＡＯ１、およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｂ株、ならびにＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属を含む。これらの例は、限定的なものではなく、例示的なものである。特定の実施形態では、ベクターの構築におけるステップは、適切なＥ．ｃｏｌｉ株内または適切なＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の株におけるクローニングおよび増殖を含みうる。
【０１３４】
一般に、宿主細胞と適合性の種に由来する、プロモーターおよび制御配列を含有するプラスミドベクターを、これらの宿主と共に使用する。ベクターは通常、複製部位および、形質転換細胞内の表現型選択をもたらすことが可能な、１または複数のマーカー配列も保有する。本発明では、例えば、多くのグラム陰性菌株内で有用なＰＢＢＲ１レプリコン領域、または広範にわたるグラム陰性菌宿主内で有用な他の任意のレプリコン領域を使用することができる。
【０１３５】
本明細書では、「組換えポリペプチド」、「組換えタンパク質」、もしくは「融合タンパク質」、もしくは「ハイブリッドタンパク質」という用語、または類似の用語を、人工的にデザインされ、それらの初期の天然の環境では連続的ポリペプチド配列として見出されない、少なくとも２つのポリペプチド配列を含むポリペプチドを指すか、または組換えポリヌクレオチドから発現させたポリペプチドを指すように使用する。特定の実施形態では、融合タンパク質は、通常は会合しないタンパク質ドメインを接合する、配列の接合を含有する。実施形態では、幅広い概念において、融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン、分泌シグナル配列、および真核細胞内で機能的なｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎからなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む。さらなる実施形態では、融合タンパク質は、ＣＰＰドメインを含み、実施形態では、ＣＰＰドメインは、ＴＡＴドメインを含む。本明細書ではまた、シグナル配列、形質導入ドメイン、およびＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質を、文脈に応じて、単純に「ハイブリッドタンパク質」または「ＮＨＰ」とも称する。実施形態に従うハイブリッドタンパク質に含まれる異なるドメインは、それらの機能と符合する、任意の配置および任意の組合せおよび任意のコピー数で存在しうることが理解される。したがって、実施形態では、シグナル配列は、内部シグナル配列の場合もあり、末端シグナル配列の場合もあり、ドメインの各々のうちの１または複数には、複数のコピーが存在しうる。実施形態では、ベクターは、実施形態に従うハイブリッドタンパク質に含まれる、１または複数のＤＮＡ結合ドメインによる結合に適する、１つ、２つ、３つ、４つ、またはこれを超えるＤＮＡ配列を含みうる。
【０１３６】
実施形態では、ベクターは、グラム陽性菌においてＮＨＰを発現させるための原核生物発現カセットと、真核細胞において候補遺伝子または配列を発現させるための真核生物発現カセットとを含む。代替的な実施形態では、原核生物発現カセットは、本明細書で開示されるハイブリッドタンパク質のうちの１つの代わりに、標的のグラム陽性菌内で発現させることが所望される他のタンパク質を含有することが理解される。したがって、実施形態では、ベクターを使用して、目的の配列または遺伝子を、原核細胞内で発現させることもできる。
【０１３７】
本開示では、ＳＨＴ、ＳＺＴ、ＳＬＴ、ＳＭＴという用語は、本明細書で好ましいＮＨＰの形態を指し示す頭字語である。上記の頭字語において、記述子であるＺは、少なくとも１つのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの存在を指し示し、これをコードするＤＮＡ配列の例を、配列番号６として提示し、アミノ酸配列を、配列番号４６として提示し、Ｈは、少なくとも１つのＨＵ  ＤＮＡ結合ドメインの存在を意味し、これをコードするＤＮＡ配列の例を、配列番号４４として提示し、アミノ酸配列を、配列番号４４として提示し、Ｔは、ＣＰＰまたはタンパク質形質導入ドメインを意味し、その例を、配列番号１１〜１７として提示する。Ｓは、適切なシグナル配列を意味し、その例を、配列番号１８〜２３として提示する。Ｍは、少なくとも１つのＭｅｒ  Ｒ  ＤＮＡ結合ドメインの存在を意味し、これをコードするＤＮＡ配列の例を、配列番号５として提示し、そのタンパク質配列を、配列番号４５として提示する。Ｌは、Ｌａｃ−Ｉ  ＤＮＡ結合ドメインを表し、本明細書では、これを配列番号４７として提示するが、本発明者らは、Ｌａｃ−Ｉ  ＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質が、本明細書の目的に有効ではなく、本明細書で特許請求される対象物の実施形態ではないことを見出したことが理解される。
【０１３８】
実施形態では、提示されるシグナル配列は、配列番号２２、２３のアルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列であるが、代替的な実施形態では、配列番号１８、１９のアルファアミラーゼシグナル配列であるか、またはその短縮型である配列番号２０、２１が、非限定的な代替物である。実施形態では、形質導入ドメインであるＴとは、配列番号１１のＴａｔであるが、本明細書では、多数の非限定的で可能な代替物が提示される。例示的なＳＨＴハイブリッドタンパク質、ＳＭＴハイブリッドタンパク質、ＳＺＴハイブリッドタンパク質の配列を、配列番号２４、２６、および２７として提示する。
【０１３９】
ハイブリッドタンパク質内には、バリアントシグナルドメイン、ＣＰＰドメイン、およびＤＮＡ結合ドメインが含まれうることが理解される。したがって、例を目的とし、限定を目的とせずに述べると、Ｓまたはシグナル配列ドメインは、任意の適切なシグナル配列であることが可能であり、非限定的な例は、アルファアラビノシダーゼシグナル配列、アルファアミラーゼシグナル配列、およびこれらの短縮型、ならびに他のシグナル配列である。上記の配列、またはこれらの対応するＤＮＡ配列を、配列番号１８〜２３として提示する。
【０１４０】
可能なＣＰＰドメイン（実施形態に従うハイブリッドタンパク質についての略記法では、「Ｔ」として同定される）は、Ｔａｔ、Ａｎｔｐ、Ｒｅｖ、ＶＰ２２、ＰｂｅｔａＭＰＧ（ｇｐ４１−ＳＶ４０）、トランスポータン（ガラニン（ｇａｌａｎａｎ）−マストパラン）およびＰｅｐ１（ＴＲＰリッチモチーフ−ＳＶ４０）、またはこれらの生物学的に有効な部分を含む。上記のアミノ酸配列を、配列番号１１〜１７として提示する。
【０１４１】
実施形態では、上記のハイブリッドタンパク質の構築は、ベクターの原核生物遺伝子発現カセット内に含まれ、上記の原核生物発現カセットは、所望の細菌株内で機能的であるようにデザインされることが理解される。特定の実施形態では、このような株は、グラム陽性菌であり、実施形態では、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属である。実施形態では、このような株は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属である。実施形態では、標的細胞への形質転換に所望されるＤＮＡは、候補配列の、標的細胞内の発現のための、哺乳動物遺伝子発現カセットを含むことも理解される。実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
【０１４２】
本明細書では、「発現カセット」という用語を、選択された配列を、ＲＮＡとして発現可能となるように挿入しうる、１または複数の位置を含む、ＤＮＡ配列関係（ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ）について記載するのに使用する。一般に、発現カセットは、プロモーター、転写開始部位、転写終結部位を含む。次いで、カセットを、適切な宿主細胞へと導入すると、転写開始部位と転写終結部位との間の適切な位置に挿入された配列が発現する。実施形態では、フランキング配列の選択は、選択された細胞内で機能するように行う。こうして、当業者は、原核細胞内で発現させることが所望される配列が適切な配列関係（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ）に置かれ、真核細胞内で発現させることが所望される配列も同様に適切な配列関係に置かれるように、適切な発現カセット内で発現させるのに適する配列を挿入する。当業者は、特定の目的に適うか、または特定の細菌株内で機能するように、カセットの配列、構造および他の側面をたやすく調整する。一連の実施形態では、実施形態に従うハイブリッドタンパク質のコード配列を、ＨＵプロモーターおよびＨＵ転写開始部位およびＨＵ転写終結部位により境界づける。別の実施形態では（ｐＦＲＧ１．５、図１、配列番号２）、プロモーターは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属内で見出されるリボソームＲＮＡプロモーターであり、ターミネーターは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属内で見出されるリボソームＲＮＡターミネーターである。実施形態では、真核生物発現カセットは、適切なコザック配列を含む。
【０１４３】
本開示では、「分泌シグナル」、「分泌配列」、「分泌シグナル配列」、「シグナル配列」などの用語は、細胞膜を横切ってタンパク質の分泌を引き起こすのに有効なタンパク質モチーフを指す。実施形態では、分泌配列は、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列であるかもしくはこれに由来するか、またはアルファ−アミラーゼシグナル配列であるか、または短縮型アルファアミラーゼシグナル配列である。上記のタンパク質配列を、それぞれ、配列番号２３、１９、および２１として提示し、コードＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号２２、１８、および２０として提示する。当業者は、代替的な実施形態で使用可能な、適切なシグナル配列をたやすく同定および実装する。可能なシグナル配列の１つのリストは、＜ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ＞におけるシグナル配列データベース内、および＜ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ＞におけるＳＰｄｂ−Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅなど、他のリソース内で見出される。
【０１４４】
利用可能なデータベース、スクリーニングの方法、および周知の技法を使用して、当業者は、数千もの適切なシグナル配列を同定するが、代替的な実施形態における使用に適するシグナル配列の供給源の非限定的な例は、任意選択で、一連の分泌型酵素および他のタンパク質に由来することが可能であり、例は、アミラーゼ、スクラーゼなどのカルボヒドラーゼ、ガラクトシダーゼ、単糖転移酵素（ｍｏｎｏｓｈａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒａｓｅ）、リパーゼ、ホスホリパーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、ペプチダーゼ、トランスフェラーゼ、メチラーゼ、エチラーゼ、セルラーゼ、リグニナーゼ、分泌型シグナル伝達タンパク質、毒素、および他の分泌型タンパク質の全ての様態を含む。
【０１４５】
所望のコード配列および制御配列を含有する適切なベクターの構築は、標準的なライゲーション法を用いて達成することができる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片は、要求されるプラスミドを形成するのに所望の形態で開裂し、調整し、再ライゲーションする。実施形態では、ベクターを、本明細書の別の箇所で説明される、適切な核酸合成手順を使用して、デノボで合成する。当業者は、従来の方法およびリソースを使用して、一連の代替的なプロモーター、ポリアデニル化シグナル、ＤＮＡ結合ドメイン、細胞透過性ペプチドドメイン、シグナル配列などをたやすく同定する。
【０１４６】
構築されたプラスミド内の適正な配列を確認する解析のために、ライゲーション混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２などの細菌株を形質転換するのに使用することができ、適切な選択マーカーを使用して、成功した形質転換体を、抗生物質耐性により選択することができるが、実施形態では、選択マーカーは、それらの全てが、当業者により即座に認識され、使用される、テトラサイクリン、アンピシリン、スペクチノマイシン、ペニシリン、カナマイシン、ゲンタマイシン、ゼオマイシン、メチシリン、ハイグロマイシンＢ、および他の抗生物質などの抗生物質である。形質転換体に由来するプラスミドを制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）により調製し、解析し、かつ／または配列決定する。代替的な実施形態では、細菌を、それらの非限定的な例が、それらの性質および使用が、当業者により十分に理解されている、ＬＥＵ２選択マーカーおよびＵＲＡ３選択マーカーを含む、適切な栄養要求性選択マーカーを使用して選択することができる。特定の実施形態では、選択マーカーは、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に対して有効な抗生物質に対する耐性（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）を付与し、これは、実施形態では、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、またはクロラムフェニコール、またはエリスロマイシンである。代替的な実施形態では、ベクターは、グラム陽性菌およびグラム陰性菌において異なる抗生物質を使用する、選択を可能とする複数の選択マーカーを含む。
【０１４７】
宿主細胞は、本発明の核酸ベクターで形質転換し、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または遺伝子を増幅するのに適切な形で改変された、従来の栄養培地中で培養することができる。当業者には、温度、ｐＨなどのような培養条件が明らかである。
【０１４８】
「形質転換」とは、任意のコード配列を、実際に発現させるのであれ、発現させないのであれ、宿主細胞によるベクターまたは所望のＤＮＡ配列の取込みを指す。当業者には、多数の方法、例えば、Ｃａ塩および電気穿孔が公知である。形質転換の成功は一般に、ベクターの作動または導入されたＤＮＡの安定的な増殖についての任意の徴候が宿主細胞内で生じる場合に認識される。
【０１４９】
本明細書で開示されるベクターおよびハイブリッドタンパク質は、標準的な形質転換手順または一般に使用される形質転換手順が信頼できない場合に、特に価値があることが理解される。
【０１５０】
本明細書で互換的に使用される、「核酸分子（複数可）」、「オリゴヌクレオチド（複数可）」、および「ポリヌクレオチド（複数可）」、および「核酸」などの用語は、文脈内で符合するかまたは必要な形で、ＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列（一本鎖もしくは二本鎖、コード、相補性、またはアンチセンス）、または単鎖形態または二重鎖形態にある、１つを超えるヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列（ただし、上記の種の各々は個々に特定しうる）を含む。本明細書では、「ヌクレオチド」という用語を、一本鎖形態または二重鎖形態にある任意の長さのＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む分子について記載する形容詞として使用する。より正確には、「ヌクレオチド配列」という表現は、核酸材料自体を包含し、したがって、具体的なＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を生化学的に特徴付ける配列情報（すなわち、４つの塩基文字の中から選択される文字の連なり）に限定されない。本明細書では、「ヌクレオチド」という用語はまた、個々のヌクレオチドまたは多種多様なヌクレオチドを指す名詞としても使用され、分子または大型の核酸分子内の個々の単位であって、プリンもしくはピリミジン、リボースもしくはデオキシリボースの糖部分、およびリン酸基、またはオリゴヌクレオチド内もしくはポリヌクレオチド内のヌクレオチドの場合のホスホジエステル結合を含む単位を意味する。
【０１５１】
本明細書では、「上流」という用語を、特異的な参照点から、ポリヌクレオチドの５’末端へと向かう位置を指すように使用する。
【０１５２】
本明細書では、「塩基対合した」および「ワトソン−クリック式で塩基対合した」という用語を、それらの配列同一性に基づいて、２つの水素結合によりアデニン残基へと連結されたチミン残基またはウラシル残基、ならびに３つの水素結合により連結されたシトシン残基およびグアニン残基を有する二重螺旋ＤＮＡ内で見出される様式と類似の様式で互いと水素結合しうるヌクレオチドを指すように、互換的に使用する（その開示が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｓｔｒｙｅｒ、１９９５年を参照されたい）。
【０１５３】
本明細書では、「相補性」または「その相補体」という用語を、相補性領域の全体を通して、別の指定されたポリヌクレオチドとのワトソン−クリック式の塩基対合を形成することが可能なポリヌクレオチドの配列を指すように使用する。本発明の目的では、第１のポリヌクレオチド内の各塩基を、その相補性塩基と対合させる場合に、第１のポリヌクレオチドを、第２のポリヌクレオチドと相補的であるとみなす。相補性塩基は一般に、ＡおよびＴ（またはＡおよびＵ）、またはＣおよびＧである。本明細書では、「相補体」を、「相補的なポリヌクレオチド」、「相補的な核酸」、および「相補的なヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、２つのポリヌクレオチドが実際に結合する条件の任意の特定のセットには基づかずに、それらの配列だけに基づくポリヌクレオチドの対に適用される。そうでないことが言明されない限りにおいて、全ての相補的なポリヌクレオチドは、考慮されるポリヌクレオチドの全長において、完全に相補的である。
【０１５４】
ＤＮＡの消化とは、ＤＮＡ内のある特定の配列だけにおいて作用する、制限酵素の触媒作用によるＤＮＡの開裂を指す。本明細書で使用される多様な制限酵素は、市販されており、それらの反応条件、補因子、および他の要件は、当業者に公知の通りに使用した。解析の目的では、１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ断片を、約２０μｌの緩衝液中の約２単位の酵素と共に使用することが典型的である。プラスミド構築のためにＤＮＡ断片を単離する目的では、５〜５０μｇのＤＮＡを、より大きな体積中の２０〜２５０単位の酵素により消化することが典型的である。特定の制限酵素に適切な緩衝液量および基質量は、製造元により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間を通常使用するが、供給元の指示に従い、変化しうる。消化の後、反応物を、ポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動させて、所望の断片を単離する。
【０１５５】
所与のＤＮＡの断片の、制限消化物からの回収または単離とは、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲルでの消化物の、電気泳動による分離、分子量が公知のマーカーＤＮＡ断片の移動度と対比したその移動度の比較による、目的の断片の同定、所望の断片を含有するゲル区分の切除、およびゲルのＤＮＡからの分離を意味する。この手順は、一般に公知である（Ｌａｗｎ，  Ｒ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、９巻：６１０３〜６１１４頁［１９８１年］、およびＧｏｅｄｄｅｌ，  Ｄ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ８巻：４０５７頁［１９８０年］）。
【０１５６】
脱リン酸化とは、細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）による処理による、末端の５’リン酸の除去を指す。この手順により、ＤＮＡ断片の２つの制限開裂末端が、「環状化すること」または制限部位における別のＤＮＡ断片の挿入を妨げる閉鎖ループを形成することを防止する。脱リン酸化のための手順および試薬は、従来の手順および試薬である（Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、１３３  １３４頁  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、［１９８２年］）。ＢＡＰを使用する反応は、酵素調製物中に存在しうる任意のエキソヌクレアーゼの活性を抑制するために、５０ｍＭのトリス中、６８℃で実行する。反応は、１時間にわたり施す。反応後、ＤＮＡ断片をゲル精製する。
【０１５７】
ライゲーションとは、２つの二本鎖核酸断片の間のホスホジエステル結合を形成する工程を指す（Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．ら、同上、１４６頁）。そうでないことが示されない限りにおいて、ライゲーションは、ライゲーションされるほぼ等モル量のＤＮＡ断片０．５μｇ当たり１０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を含む、公知の緩衝液および条件を使用して達成することができる。
【０１５８】
充填または平滑化とは、制限酵素開裂型核酸の粘着末端内の一本鎖末端を、二本鎖へと変換する手順を指す。これにより、粘着末端を消失させ、平滑末端を形成する。この工程は、１つだけまたは少数の他の制限酵素により作製された末端と粘着しうる制限切断末端を、任意の平滑切断型制限エンドヌクレアーゼと適合性の末端または他の充填粘着末端（ｆｉｌｌｅｄ  ｃｏｈｅｓｉｖｅ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ）へとへと変換するための多目的のツールである。一実施形態では、平滑化は、約２〜２０μｇの標的ＤＮＡを、約３７℃、８単位のＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片、および各々２５０μＭずつである４つのデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのジチオトレイトール、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）緩衝液中でインキュベートすることにより達成する。インキュベーションは一般に、３０分間にわたる、フェノールおよびクロロホルムによる抽出ならびにエタノールによる沈殿の後で終結させる。
【０１５９】
本明細書で互換的に使用される「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、ポリマーの長さを問わない、アミノ酸のポリマーを指し、したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語はまた、本発明のポリペプチドの化学修飾または発現後修飾を指定しないか、または除外しないが、これらのポリペプチドの化学修飾または発現後修飾は、具体的実施形態としては含まれる場合もあり、除外される場合もある。したがって、例えば、ポリペプチドに対する修飾であって、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合を含む修飾は、ポリペプチドという用語により明確に包含される。さらに、これらの修飾を有するポリペプチドは、本発明に含まれるかまたは本発明から除外される個々の種として指定することもできる。上記の例で列挙した修飾など、天然の化学修飾または他の化学修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチド内の任意の場所に生じ得る。同じ種類の修飾は、所与のポリペプチド内の複数の部位において、同じ程度で、または様々な程度で存在しうることが察知される。所与のポリペプチドはまた、多くの種類の修飾も含有しうる。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として、分枝状の場合があり、分枝化を有するかまたは有さずに、環状でありうる。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋形成、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合的架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化など、トランスファーＲＮＡに媒介される、アミノ酸の、タンパク質への付加、およびユビキチン化を含む（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９９３年）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、（１９９０年）；Ｒａｔｔａｎら、（１９９２年）を参照されたい）。定義にはまた、アミノ酸の１または複数の類似体（例えば、天然に存在しないアミノ酸、天然では、非類縁の生体系だけで生じるアミノ酸、哺乳動物系に由来する修飾アミノ酸などを含む）、連結が置換されたポリペプチドおよび、当技術分野で公知の他の修飾であって、天然に存在する修飾および天然に存在しない修飾の両方を含有するポリペプチドも含まれる。
【０１６０】
本明細書で使用される、「作動可能に連結された」という用語は、機能的関係にあるポリヌクレオチド要素の連結を指す。プロモーターなど、調節的配列に「作動可能に連結された」配列とは、前記調節的要素が、核酸との関連で、ＲＮＡポリメラーゼの惹起および目的の核酸の発現を制御するのに適正な位置および配向性にあることを意味する。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。
【０１６１】
本開示では、「シャトルベクター」という用語は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方における複製が可能であり、真核細胞へと導入されると目的の配列または遺伝子を発現させるのに適する真核生物発現カセット、および真核細胞内で目的の遺伝子を発現させることが可能な原核生物発現カセットを含むＤＮＡベクターを意味する。実施形態では、宿主細菌の第１の株と第２の株とは、異なる属に由来し、実施形態では、それらは、異なる種に由来し、実施形態では、それらは、異なる亜種に由来する。実施形態では、グラム陰性菌は、Ｅ．ｃｏｌｉであり、実施形態では、グラム陽性菌は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属である。代替的な実施形態では、宿主細菌の第１の株と第２の株との多種多様な組合せが可能であり、上記の、Ｅ．ｃｏｌｉの、他の株との、例示的な組合せは、決して限定的なものではないことが理解される。実施形態では、シャトルベクターは、プラスミドである。したがって、本明細書で開示される核酸ベクターは、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方における複製が可能で、適切な種類のシャトルベクターである。
【０１６２】
「プロモーター」とは、細胞の合成機構により認識されるＤＮＡ配列、または導入される合成機構であって、遺伝子の特異的転写を開始するのに要求される合成機構を指す。「転写制御下の」という語句は、プロモーターが、核酸との関連で、ＲＮＡポリメラーゼの惹起および遺伝子の発現を制御するのに適正な位置および配向性にあることを意味する。ターゲティングされた細胞内の核酸の発現を方向付けることが可能である限りにおいて、目的の核酸配列の発現を制御するのに用いられる特定のプロモーターが重要であるとは考えられない。
【０１６３】
実施形態では、標的真核細胞は、哺乳動物細胞である。実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞であり、実施形態では、がん細胞である。実施形態では、がん細胞は、肺がん細胞、結腸（結腸直腸）がん細胞、腎臓がん細胞、または卵巣がん細胞である。特定の実施形態では、細胞は、ＨＥＫ−２９（ヒト胎児性腎臓）；ＨＴ２９、ＣａＣｏ２（いずれもヒト腺癌）；ＨｅＬａ、ＬＬ２（肺癌）である。実施形態では、細胞は、培養細胞である。
【０１６４】
ｃＤＮＡインサートを用いる場合、典型的には、遺伝子転写物の適正なポリアデニル化を実行するように、ポリアデニル化シグナルを含むことが典型的である。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功に肝要とは考えられず、任意のこのような配列を用いることができる。発現構築物の要素としてはまた、ターミネーターも想定される。これらの要素は、メッセージレベルを増強し、構築物から他の配列へのリードスルーを最小化するように働きうる。
【０１６５】
キット：一部の実施形態では、本明細書で開示されるベクターを含むキットが開示される。実施形態では、キットは、ある量のベクターＤＮＡを含む。例示的な核酸ベクターおよびそれらの配列についての実施形態を、図１および２ならびに配列番号１および２として提示する。実施形態では、キットは、ある量のＮＨＰを含む。実施形態では、キットは、指示を含む。
【０１６６】
キットの容器手段は一般に、ベクター、細胞、および／またはプライマーを入れ、好ましくは、適切にアリコートする、少なくとも１つのバイアル、テューブ、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段を含む。さらなる構成要素を提供する場合、キットはまた一般に、この構成要素を入れ得るさらなる容器も含有する。本発明のキットはまた、市販のために、プローブ、プライマーおよび他の任意の試薬容器を厳密に閉じ込めてを含有するための手段を含むことが典型的である。実施形態では、キットは、所望のバイアルを保持する、射出成型またはブロー成型されたプラスチック製容器を含み、実施形態では、キットは、キット内に含まれる材料の使用に関する指示を含む。
【０１６７】
本開示では、「目的の遺伝子」、「目的の配列」、「候補遺伝子」、または「カーゴ遺伝子」などの用語は、標的細胞へと形質転換することが所望されるか、または標的細胞内で発現させることが所望される配列または遺伝子を指す。本明細書の実施形態では、このような配列および遺伝子を、特定の標的細胞内のこのような配列の発現が可能なベクターへと組み込む。
【０１６８】
本開示では、「標的細胞」という用語は、候補遺伝子もしくは配列またはカーゴ遺伝子もしくは配列を導入することが所望される細胞を意味する。実施形態では、標的細胞は、真核細胞であり、実施形態では、哺乳動物細胞である。実施形態では、標的細胞は、原核細胞である。
【０１６９】
実施形態では、ベクターは、特異的ｍＲＮＡ配列または特異的ｓｉＲＮＡ配列をコードする特異的遺伝子または配列の、標的プロバイオティックス細胞内の、効率的な転写および翻訳に必要な配列を含有し、このため、転写開始部位および転写終結部位、およびエンハンサーなどを含み得る。同様に、発現させる任意のＲＮＡは、適切な翻訳開始部位、およびリボソーム結合部位などを含むことが可能である。当業者は、それらの全てをたやすく同定する。
【０１７０】
より一般に、本明細書では、「発現カセット」という用語を、選択された配列を、適切な細胞型内に存在する場合に発現可能となるように挿入しうる、１または複数の位置を含むＤＮＡ配列関係について記載するのに使用する。一般に、発現カセットは、プロモーター、転写開始部位、転写終結部位、および他の必要な配列または所望の配列を含む。実施形態では、発現カセットは、適合性の末端を有するＤＮＡ配列のその位置への簡便な挿入を可能とするのに適し、適切な細胞型により、翻訳可能なＲＮＡとして発現させることが可能な複数のクローニング部位を含む。実施形態では、複数のクローニング部位を有するのではなく、各発現カセットは、プロモーター、目的の遺伝子、およびターミネーターの５’末端および３’末端を挟む制限切断部位を有する。タンパク質を発現させるためには、ＤＮＡ配列の挿入を、適正なリーディングフレーム内で行わなければならないことが理解される。次いで、カセットを、適切な宿主細胞へと導入すると、転写開始部位と転写終結部位との間の適切な位置に挿入された配列が発現するが、実施形態では、このような宿主細胞は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細胞である。選択されたヌクレオチド配列を、発現カセットへと挿入するという場合、または発現カセットが、選択されたヌクレオチド配列を含むまたは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ  ｏｒ  ｉｎｃｌｕｄｅ）という場合、このような選択されたヌクレオチド配列は、転写および／または翻訳に適する形態で、このような発現カセットへと挿入されて、これによりコードされる任意のタンパク質またはオリゴペプチドの生物学的活性形態を作り出すか、あるいは適切なＲＮＡ種の形態で発現可能となることが理解される。当業者は、特定の目的に適うか、または特定の細菌株内で機能するように、カセットの配列、構造および他の側面をたやすく調整する。
【０１７１】
明確さのために述べると、本開示は、第１の発現カセットおよび第２の発現カセットの両方を指すが、これらの非限定的な例を、配列番号４８、４９として提示する。実施形態では、第１の発現カセットは、原核生物発現カセットであり、非限定的例は、配列番号４８として提示され、実施形態に従う所望の融合タンパク質を発現させるように働き、第２の発現カセットは、真核生物発現カセットであり、実施形態では、標的細胞内の候補ＤＮＡを発現させるように働く。したがって、実施形態では、融合タンパク質が、原核生物遺伝子発現カセットによりコードされ、カーゴ遺伝子または目的の配列が、真核生物または哺乳動物遺伝子発現カセット内に含まれる。
【０１７２】
実施形態では、所望のコード配列および制御配列を含有する適切なベクターの構築は、標準的なライゲーション技法を使用して達成する。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片は、要求されるプラスミドを形成するのに所望の形態で開裂し、調整し、再ライゲーションする。代替的な実施形態では、ベクター、インサート、プラスミド、および他の任意の目的の核酸配列は、標準的な核酸合成技法を使用して、デノボで合成する。一連の実施形態では、プラスミドは、コンピュータにより、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、Ｉｍ  Ｇｅｗｅｒｂｅｐａｒｋ  Ｂ３５、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、９３０５９  Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成した。他の市販の核酸合成プロバイダーの例は、そのウェブサイトが、ｗｗｗ．ｄｎａ２０．ｃｏｍに見出される、ＤＮＡ２．０、１１４０  Ｏ’Ｂｒｉａｎ  Ｄｒｉｖｅ  Ｓｕｉｔｅ  Ａ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ、９４０２５；およびウェブサイトをｗｗｗ．ｇｅｎｅｗｉｚ．ｃｏｍとする、Ｇｅｎｅｗｉｚ、１１５  Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ  ０７０８０である。
【０１７３】
限定なしに述べると、核酸およびアミノ酸の所望の配列の直接的合成は、一連の公知の技法を使用して、当業者によりたやすく達成される。関与性の合成法について記載する例示的な参考文献は、それらの文脈が、それらの全体において、法規により許容される完全な程度で本明細書に組み込まれる、以下の刊行物：Ｋｈｏｒａｎａ  ＨＧ、Ａｇａｒｗａｌ  ＫＬ、Ｂｕｅｃｈｉ  Ｈら（１９７２年１２月）、「Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．  １０３．  Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ａｎ  ａｌａｎｉｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  ｙｅａｓｔ」、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７２巻（２号）：２０９〜２１７頁；Ｉｔａｋｕｒａ  Ｋ、Ｈｉｒｏｓｅ  Ｔ、Ｃｒｅａ  Ｒら（１９７７年１２月）、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｆ  ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８巻（４３２１号）：１０５６〜１０６３頁；Ｅｄｇｅ  ＭＤ、Ｇｒｅｅｎ  ＡＲ、Ｈｅａｔｈｃｌｉｆｆｅ  ＧＲら（１９８１年８月）、「Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅ」、Ｎａｔｕｒｅ  ２９２巻（５８２５号）：７５６〜６２頁；「Ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ  ｔｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ第６回年次ＰＥＧＳ総会２０１０年；Ｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，  Ｋａｔｈｙ（２０１０年５月１日）、「Ｎｅｗ  Ｔｏｏｌｓ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｎｅｗｓ、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、３０巻（９号）（Ｍａｒｙ  Ａｎｎ  Ｌｉｅｂｅｒｔ）、１、４０〜４１頁；Ｗｅｌｃｈ  Ｍ、Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ  Ｍ、Ｎｅｓｓ  ＪＥ、Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ  Ａ、Ｇｕｒｎｅｙ  Ａ、Ｍｉｎｓｈｕｌｌ  Ｊ、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  Ｃ（２００９年）、Ｋｕｄｌａ、Ｇｒｚｅｇｏｒｚ編、「Ｄｅｓｉｇｎ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、４巻（９号）：ｅ７００２頁；「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、ＤＮＡ２．０．  ２０１０年５月１１日検索；Ｆｕｈｒｍａｎｎ  Ｍ、Ｏｅｒｔｅｌ  Ｗ、Ｈｅｇｅｍａｎｎ  Ｐ（１９９９年８月）、「Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＧＦＰ）  ｉｓ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｉｎ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ」、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １９巻（３号）：３５３〜６１頁；Ｍａｎｄｅｃｋｉ  Ｗ、Ｂｏｌｌｉｎｇ  ＴＪ（１９８８年８月）、「ＦｏｋＩ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇｅｎｅ  ６８巻（１号）：１０１〜７頁；Ｓｔｅｍｍｅｒ  ＷＰ、Ｃｒａｍｅｒｉ  Ａ、Ｈａ  ＫＤ、��ｒｅｎｎａｎ  ＴＭ、Ｈｅｙｎｅｋｅｒ  ＨＬ（１９９５年１０月）、「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｅｎｔｉｒｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｒｏｍ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ｇｅｎｅ  １６４巻（１号）：４９〜５３頁；Ｇａｏ  Ｘ、Ｙｏ  Ｐ、Ｋｅｉｔｈ  Ａ、Ｒａｇａｎ  ＴＪ、Ｈａｒｒｉｓ  ＴＫ（２００３年１１月）、「Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ  （ＴＢＩＯ）  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｉｍｅｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｌｏｎｇｅｒ  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１巻（２２号）：ｅ１４３頁；Ｙｏｕｎｇ  Ｌ，  Ｄｏｎｇ  Ｑ（２００４年）、「Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｔｏｔａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２巻（７号）：ｅ５９頁；Ｈｉｌｌｓｏｎ  ＮＨ、Ｒｏｓｅｎｇａｒｔｅｎ  ＲＤ、Ｋｅａｓｌｉｎｇ  ＪＤ（２０１２年）、「ｊ５  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ」、ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻（１号）：１４〜２１頁；Ｈｏｏｖｅｒ  ＤＭ、Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ  Ｊ（２００２年５月）、「ＤＮＡＷｏｒｋｓ：  ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０巻（１０号）：ｅ４３頁；Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ  Ａ、Ｎｅｓｓ  ＪＥ、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  Ｃ、Ｍｉｎｓｈｕｌｌ  Ｊ、Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ  Ｓ（２００６年）、「Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ：  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ」、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ７巻：２８５頁；Ｔｉａｎ  Ｊ、Ｇｏｎｇ  Ｈ、Ｓｈｅｎｇ  Ｎら（２００４年１２月）、「Ａｃｃｕｒａｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  ４３２巻（７０２０号）：１０５０〜４頁において記載されている。
【０１７４】
同様に、当業者は、ハイブリッド配列、プラスミド配列および他のベクター配列、コード配列および他の配列を含む、所望のヌクレオチド配列およびタンパク質配列の予測およびデザインのための、一連の適切なソフトウェア・アプリケーションおよびオンラインリソースを即座に認識し、使用する。
【０１７５】
例を目的とし、限定を目的とせずに述べると、本明細書の別の箇所で言及される、様々なオンラインＤＮＡデータベースは、様々なシグナルペプチド、ＤＮＡ結合ドメインおよびそれらの認識配列、選択マーカー、耐性遺伝子、栄養要求性変異体、プロモーター、および複製起点の配列を含有する。したがって、例えば、
【０１７６】
可能なシグナル配列の１つのリストは、＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｍ＝ｌｉｓｔｓｐｄｂａｔ＞のシグナル配列データベースで見出され、さらなる情報は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／のメインウェブサイトに見出される。
【０１７７】
本明細書では、可能な形質導入配列について記載するが、これらの配列および他の類似の配列は、オンラインリソースを使用して、たやすく同定される。
【０１７８】
一連の配列解析および操作ソフトウェアは、当業者によりたやすく利用可能であり、使用される。例を目的とし、限定を目的とせずに述べると、ヌクレオチド配列および／またはタンパク質配列の操作および解析に適するソフトウェアは、ＳＮＡＰＧＥＮＥ、ｐＤＲＡＷ３２、ＤＮＡＳＴＡＲ、ＢＬＡＳＴ、ＣＳ−ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＭＢ−ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア、ＤＮＡＤｙｎａｍｏ、Ｐｌａｓｍａ  ＤＮＡ、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒを含み；適切なモチーフの予測および解析ソフトウェアは、ＦＭＭ、ＰＭＳ、ｅＭＯＴＩＦ、ＰＨＩ−Ｂｌａｓｔ、Ｐｈｙｌｏｓｃａｎを含むがこれらに限定されず、タンパク質モチーフの例示的なライブラリーは、ｌ−Ｓｉｔｅｓである。上記の全てに対するリンクは、ウィキペディアのウェブページであるｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｌｉｓｔ＿ｏｆ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ（２０１５年１月１９日にアクセスした）で見出される。
【０１７９】
より一般に、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、およびタンパク質配列を含む広範なデータベースは、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＲｅｆＳｅｑデータベース、ＴＰＡデータベース、ＰＤＢデータベース、およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＮＣＢＩデータベースを含むがこれらに限定されない。これらのならびに他の適切なツールおよび適切なリソースは、当業者によりたやすく同定され、使用される。
実施形態についての記載
【０１８０】
以下では、それらの全てが、本開示の一部を形成し、本開示に組み込まれる、図１〜１０および配列番号１〜４９に全般的に言及しながら、本発明の実施形態について記載する。
第１の実施形態
【０１８１】
実施形態の第１の一般的な態様では、グラム陽性菌内の複製のための第１の複製起点およびグラム陰性菌内の複製のための第２の複製起点、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方における選択のための少なくとも１つの選択マーカー；グラム陽性菌内で機能的な第１の遺伝子発現カセットおよび哺乳動物細胞内で機能的な第２の遺伝子発現カセットであって、実施形態では、哺乳動物細胞がヒト細胞である第２の遺伝子発現カセットを含む核酸ベクターが開示される。
【０１８２】
実施形態では、ベクターは、グラム陽性菌内およびグラム陰性菌内の両方において有効な、単一の選択マーカーを含む。
【０１８３】
第１の実施形態に従う、ベクターについての第１の例示的な実施形態を、図１に示し、対応するベクター配列を、配列番号１として提示する。適切な発現カセットのデザインは、当業者によりたやすく理解される。実施形態ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴでは、グラム陽性菌内の発現のための第１の発現カセットは、図１で見られる通り、ＮＨＰコード配列を挟む、ＨＵプロモーターと、ＨＵターミネーターとを含む。実施形態ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴでは、真核細胞（実施形態では、哺乳動物細胞であり、実施形態では、ヒト細胞である）内の発現のための第２の発現カセットは、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、コザック配列、およびチミジンキナーゼのポリアデニル化／終結配列を含み、上記の配列は、カーゴ配列の挿入のための挿入配列を挟む。これは、配列番号１に見られ、ここでは、ＧＦＰタンパク質を、第２の発現カセットへと挿入する。
【０１８４】
第１の実施形態の特定のバリアントでは、第１の複製起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ内で機能的であり、第２の複製起点は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属内のうちの少なくとも１つにおいて機能的である。さらなるバリアントでは、単一の二機能性複製起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ内、ならびにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属内のうちの少なくとも１つにおいて機能的である。
【０１８５】
実施形態ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴでは、該ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ内の複製のためのｐＵＣ複製起点およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属内の複製のためのｐＢ４４複製起点を含む。
【０１８６】
グラム陰性菌、すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉにおける使用に適する複製起点は、配列番号２９として提示されるｐＵＣ複製起点と、当業者によりたやすく同定され、採用される、広範にわたる他のグラム陰性起点とを含むことが理解される。
【０１８７】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属および他のグラム陽性菌株に適する複製起点は、それらの中に該起点が含まれる、配列番号３０として提示されるＰＢ４４  ＯＲＩと、配列番号２８として提示されるｐＤＯＪＨＲ  ＯＲＩとを含む。
【０１８８】
ＤＮＡ−ＢＳは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質（配列番号４６）のヌクレオチド結合部位（配列番号４３）を表す。
【０１８９】
したがって、代替的な実施形態では、第１のグラム陰性複製起点は、少なくとも２０、４０、６０、８０、またはこれを超える連続したヌクレオチドにわたり、配列番号２９として提示されるｐＵＣ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＯＲＩに対して、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことが理解される。
【０１９０】
代替的な実施形態では、第２の複製起点またはグラム陽性複製起点は、２０、４０、６０、８０、またはこれを超える連続したヌクレオチドにわたり、それらの配列が、それぞれ、配列番号３０および２８として提示される、ｐＢ４４複製起点またはｐＤＯＪＨＲ複製起点に対して、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことも同様に理解される。
【０１９１】
実施形態では、選択マーカーは、グラム陽性菌内およびグラム陰性菌内の両方において有効である。実施形態では、選択マーカーは、スペクチノマイシンに対して耐性である。実施形態では、ベクター内に含まれる選択マーカーは、テトラサイクリンに対して耐性である。実施形態では、ベクター内に含まれる選択マーカーは、クロラムフェニコールに対して耐性である。
【０１９２】
代替的な実施形態では、ベクターは、グラム陽性菌およびグラム陰性菌のための別個の選択マーカーを含む。したがって、実施形態では、ベクターは、選択マーカーまたはアンピシリン、ペニシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、キノロン、フルオロキノロン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシンに対する耐性から選択される選択マーカーの組合せを含む。当業者は、それらに関与する、さらなる選択マーカーおよびそれらの遺伝子配列をたやすく同定する。バリアントの実施形態で採用されうる、可能な選択マーカーのリストは、法規により許容されるいかなる程度においても、それらの文脈の全てが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｒｙｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  １９８９年、Ｍａｎｉａｔｉｓにおいて見出される。
【０１９３】
例示される実施形態では、第１の複製起点またはグラム陰性複製起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ内で機能的である。例示される実施形態では、第２の複製起点またはグラム陽性複製起点は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属内およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内のうちの少なくとも１つにおいて機能的である。代替的な実施形態では、該起点は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、ならびにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属からなる群から選択される細菌内で機能的である。
【０１９４】
第１の実施形態では、第１の遺伝子発現カセットは、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）ドメイン、および少なくとも１つの分泌シグナル配列を含むハイブリッドタンパク質をコードする。ＮＨＰの代替的な実施形態も可能であり、例は下記に開示する。
【０１９５】
実施形態では、実施形態に従う核酸ベクターは、前記ハイブリッドタンパク質の少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインに結合する少なくとも１つのＤＮＡモチーフをさらに含む。実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、配列特異的であり、ＮＨＰがＨＵドメインを含む実施形態など、他の実施形態では、結合は配列特異的ではなく、このような実施形態では、ベクターは、相補的な結合モチーフを含む必要がないことが理解される。
第２の実施形態
【０１９６】
本明細書の対象物に従うプラスミドについての第２の例示的な実施形態を、図２に提示し、ベクターについての実施形態のための配列を、配列番号２として提示する。この第２の実施形態を、ｐＦＲ１，５  ＳＨＴと称し、挿入されるハイブリッドタンパク質の同一性を反映する。
【０１９７】
ベクターは、グラム陽性複製起点、すなわち、その配列が配列番号２８内に含まれる、ＰＤＯＪＨＲ複製起点（２）と、グラム陰性複製起点、すなわち、配列番号２９として提示される、ｐＵＣ  ＯＲＩ（１）とを含む。ベクターは、原核生物および真核生物発現カセットを含む。原核生物発現カセットは、本明細書の別の箇所で定義される通り、ハイブリッドタンパク質ＳＨＴのコード配列（９）を挟む、リボソームＲＮＡプロモーター（８）およびターミネーター（１０）を含む。哺乳動物遺伝子発現カセットは、ＣＭＶプロモーター（４）ならびにＴＫポリＡ部位およびターミネーター（６）を含む。この場合、挿入される遺伝子は、ＧＦＰレポーター配列（５）である。
【０１９８】
例では、プラスミドは、ＳＨＴハイブリッドタンパク質に含まれる配列への結合に適するＤＮＡ配列（１１）を含む。このプラスミド内の選択用マーカーは、スペクチノマイシン耐性遺伝子（３）であるが、本明細書で開示される耐性遺伝子を含む、代替的な選択マーカーも、当業者によりたやすく同定され、採用される。ハイブリッドタンパク質の代替的な形態、代替的なカーゴ配列、および代替的なタンパク質結合モチーフも、例示される実施形態のバリアントにたやすく組み込みうることが理解される。同様に、当業者により、広範にわたる周知のグラム陰性複製起点はそれらの中から選択されることが理解される。
【０１９９】
第１の実施形態のさらなる態様では、ハイブリッドタンパク質または融合タンパク質が開示される。ハイブリッドタンパク質は、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）ドメイン、および少なくとも１つの分泌シグナル配列を含む。
【０２００】
実施形態では、下記で記載されるか、または本明細書において他で開示されるハイブリッドタンパク質が開示される。実施形態では、ハイブリッドタンパク質は、少なくとも１つのシグナル配列と；少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと；少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）ドメインとを含む。実施形態では、タンパク質は、シグナル配列ドメイン、ＣＰＰドメイン、およびＤＮＡ結合ドメインのうちの１つのコピーだけを含むが、代替的な実施形態では、このようなドメインのうちの任意の１つ、２つ、もしくは３つが、１つを超えるコピーで存在しうるか、または、１つ、２つ、３つ、もしくはこれを超える異なるドメインを含みうることが理解される。したがって、実施形態では、例を目的とし、限定を目的とせずに述べると、タンパク質は、同じＤＮＡ結合ドメインの複数のコピーを含む場合もあり、２つ、３つ、またはこれを超える異なるＤＮＡ結合ドメインのコピーを含有する場合もある。同様に、実施形態では、タンパク質は、それらのコピーが、同じ場合もあり、異なる場合もある、ＣＰＰドメインの複数のコピーを含みうる。同様に、実施形態では、タンパク質は、複数のシグナル配列を含みうる。
【０２０１】
実施形態では、少なくとも１つのＣＰＰドメインは、ＴＡＴドメイン、ＶＰ２２ドメイン、Ａｎｔｐドメイン、またはＲｅｖドメインであるかまたはこれらを含む。代替的な実施形態では、ＣＰＰドメインは、Ｐ−ベータＭＰＧ（ｇｐ４１−ＳＶ４０）ドメイン、トランスポータン（ガラニン  マストパラン）ドメイン、またはＰｅｐ−１（Ｔｒｐリッチモチーフ−ＳＶ４０）ドメインであるかまたはこれらを含む。本明細書では、このようなドメインの配列を、配列番号１１〜１７として提示する。
【０２０２】
実施形態では、少なくとも１つの分泌シグナル配列は、アルファアミラーゼシグナル配列およびアルファアラビノシダーゼシグナル配列、またはこのようなシグナル配列の短縮型からなる群から選択される。これらの例示的なシグナル配列およびそれらの対応するＤＮＡ配列の配列を、配列番号１８〜２３として提示する。
【０２０３】
実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１つの配列特異的ＤＮＡ結合ドメインであるかまたはこれらを含む。実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ホメオボックスＤＮＡ結合ドメイン、ＭｅｒＲ  ＤＮＡ結合ドメイン、およびＨＵ  ＤＮＡ結合ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのドメインを含む。選択されたＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を、配列番号３〜６として提示する。
【０２０４】
上記のドメインを含むバリアントハイブリッドタンパク質の配列を、配列番号２４〜２７として提示し、対応するＤＮＡ配列を、配列番号７〜１０として提示する。実施形態では、ハイブリッドタンパク質は、アルファアラビノシダーゼシグナル配列（配列番号２３）、ＴＡＴドメイン（配列番号１１）、およびＨＵ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４）を含む。
【０２０５】
さらなる一連の実施形態では、標的細胞を、所望のＤＮＡで形質転換するための方法であって、標的細胞を、所望のＤＮＡと実施形態に従うハイブリッドタンパク質とを含むタンパク質−ＤＮＡ複合体と接触させるステップを含む方法が開示される。実施形態では、方法は、前記ＤＮＡを、前記ハイブリッドタンパク質と接触させて、前記タンパク質−ＤＮＡ複合体を形成するステップをさらに含む。実施形態では、標的細胞は、真核細胞であり、実施形態では、原核細胞であり、実施形態では、グラム陽性原核細胞である。
【０２０６】
方法についての実施形態では、ＤＮＡは、プラスミドであり、実施形態では、プラスミドは、ハイブリッドタンパク質を、グラム陽性菌内で発現させるための発現カセットを含む。実施形態では、プラスミドは、真核生物発現カセットを含み、実施形態では、真核生物発現カセットは、標的真核細胞内の発現のために、それへと挿入されたＤＮＡ配列を含む。実施形態では、プラスミドは、本明細書で開示される他の実施形態に従う核酸ベクターである。
【０２０７】
方法についての他の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列特異的ＤＮＡ結合ドメインであり、プラスミドは、前記少なくとも１つの配列特異的ＤＮＡ結合ドメインへの結合のための少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。方法についての実施形態では、少なくとも１つのＣＰＰ配列は、１０個の連続したアミノ酸にわたり、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７に対して、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。方法についての実施形態では、前記少なくとも１つのシグナル配列は、少なくとも１０、１５、２０、またはこれを超える連続したアミノ酸にわたり、配列番号１９、２１、または２３に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０２０８】
方法についての実施形態では、前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１０、１５、２０、またはこれを超える連続したアミノ酸にわたり、配列番号３、４、５、または６によりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０２０９】
方法についての実施形態では、形質転換される細胞は、グラム陽性菌であり、実施形態では、真核細胞であり、真核細胞は、実施形態では、哺乳動物細胞であり、実施形態では、ヒト細胞である。
【０２１０】
関連の実施形態では、実施形態に従うハイブリッドタンパク質を使用して外因性ＤＮＡで形質転換された細胞であって、グラム陽性菌であるか、または哺乳動物細胞である細胞が開示される。実施形態ではまた、本明細書の実施形態に従うハイブリッドタンパク質の使用であって、グラム陽性菌または哺乳動物細胞を形質転換する使用も開示される。実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。実施形態を使用して形質転換される細胞の例は、本明細書の別の箇所で開示される。
【０２１１】
実施形態では、ハイブリッドタンパク質を使用して形質転換される細胞は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、または本明細書で開示される、他の任意の細菌型である。実施形態では、形質転換される細胞は、哺乳動物細胞であり、実施形態では、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属である。
【０２１２】
実施形態では、実施形態に従うハイブリッドタンパク質を合成することが可能な細菌細胞が開示される。実施形態では、細胞は、ハイブリッドタンパク質を適切な発現状況においてコードするプラスミドを含み、実施形態では、細胞は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属である。
【０２１３】
実施形態では、ハイブリッドタンパク質は、細菌細胞により合成され、代替的な実施形態では、ハイブリッドタンパク質は、当技術分野で周知であり、本明細書でもさらに指し示される方法を使用して、コンピュータにより合成する。
【０２１４】
キットの実施形態
さらなる一連の実施形態では、標的細胞を、所望のＤＮＡで形質転換するためのキットであって、ある量の、実施形態に従うハイブリッドタンパク質と；前記ハイブリッドタンパク質の、所望のＤＮＡとの複合体を形成し、前記複合体を前記標的細胞と接触させるための指示とを含むキットが開示される。
【０２１５】
実施形態では、キットは、前記接触させることに適する媒体もしくはバッファおよび溶液を含むか、または前記媒体もしくはバッファのためのレシピもしくは構成要素を含有する。
【０２１６】
実施形態では、ハイブリッドタンパク質は、実施形態に従うベクターによりコードされ、ベクター内で適切な発現カセットを使用して、適切な宿主グラム陽性菌により合成される。代替的な実施形態では、ＮＨＰは、公知の技法に従うペプチドの固相合成を使用して、人工的に合成される。代替的な実施形態では、ＮＨＰは、別個の細菌により合成される。実施形態では、精製または富化ＮＨＰを、標的原核細胞または標的真核細胞へと形質転換されることが所望されるベクターを含む溶液へと直接添加し、ＤＮＡ／タンパク質複合体を含有する混合物を、標的細胞と接触させる。実施形態では、このようなタンパク質とＤＮＡとの接触は、複合体の形成が生じるのに適する条件下で行う。当業者は、既存のリソースおよび当技術分野で共通の一般的な知見を使用して、ハイブリッドタンパク質とＤＮＡとの特定の組合せの結合のための条件をたやすく決定し、最適化するが、非限定的な例で使用される特異的条件を、本明細書の実施例節に提示する。
【０２１７】
ＮＨＰについての実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＨＵ  ＤＮＡ結合ドメイン、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ホメオボックスＤＮＡ結合ドメイン、ホメオボックスＤＮＡ結合ドメインおよびＭｅｒＲ  ＤＮＡ結合ドメイン、またはこれらの組合せのうちの１つである。適切な結合ドメインをコードする例示的なＤＮＡ配列を、配列番号３、４、５、６として提示する。本明細書で提示される実施形態の、一連の代替的な実施形態では、適切なＤＮＡ結合ドメインは、へリックス−ターン−へリックス、ジンクフィンガー、ロイシンジッパー、ウィングドへリックス、ウィングドへリックスターンへリックス、へリックスループへリックス、ＨＭＧボックス、Ｗｏｒ  ３、およびＲＮＡ誘導型結合ドメインを含むがこれらに限定されない、任意の一般的な種類のものでありうる。それらのＤＮＡ結合ドメインが、実施形態で利用されうる、ＤＮＡ結合タンパク質の例示的な例は、広範にわたる代替的供給源および代替的オペロンから引き出されうる、ヒストン、ヒストン様タンパク質、転写プロモーター、転写リプレッサー、転写レギュレーターを含む。
【０２１８】
実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、細菌性ＨＵ  ＤＮＡ結合タンパク質に由来するＨＵ  ＤＮＡ結合ドメインである。ＨＵ結合ドメインの配列を、配列番号４４として提示し、そのコードＤＮＡを、配列番号４として提示する。
【０２１９】
実施形態では、ＣＰＰは、ＴＡＴドメイン（配列番号１１）、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質（配列番号１４）、またはＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（Ａｎｔｐ）タンパク質のタンパク質形質導入ドメイン（配列番号１２）、またはこれらの組合せを含む。当業者は、実施形態の代替的なバリアントでは、さらなるタンパク質形質導入ドメインを使用しうることを認識する。一連の代替的な実施形態の１つでは、ＣＰＰドメインは、Ｒｅｖドメインを含む。上記の詳細および代替的で可能な形質導入ドメインについては、Ｓｕｇｉｔａら、「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ」  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００８年３月、１５３巻（６号）：１１４３〜１１５２頁において記載されている。図１１は、上記の４つのタンパク質形質導入ドメインのタンパク質配列を示す表であり、Ｓｕｇｉｔａらから再掲するものである。
【０２２０】
実施形態では、分泌シグナル配列は、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼ（配列番号２３）、または全長（配列番号１９）もしくは短縮型（配列番号２１）のアルファ−アミラーゼシグナル配列である。上記のものをコードするＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号２２、１８、および２０として提示する。
【０２２１】
したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列（配列番号２３）、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４６）、およびＴＡＴドメイン（配列番号１１）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列（配列番号２３）、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４６）、およびＶＰ２２ドメイン（配列番号１４）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列（配列番号２３）、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４６）、およびＡｎｔｐタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン（配列番号１２）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列（配列番号２３）、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４６）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列（配列番号２３）、ＨＵ  ＤＮＡ結合ドメイン、（配列番号４４）、およびＴＡＴドメイン（配列番号１１）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列（配列番号２３）、ＨＵ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４４）、およびＶ２２ドメイン（配列番号１４）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列（配列番号２３）、ＨＵ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４４）、およびＡｎｔｐタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン（配列番号１２）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列（配列番号２３）、ＨＵ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４４）を含む。
【０２２２】
Ａ）アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼに基づくバリアント
したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列（配列番号２３）、Ｍｅｒ  Ｒ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４１）、およびＴＡＴドメイン（配列番号１１）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列、Ｍｅｒ  Ｒ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４１）、およびＶＰ２２ドメイン（配列番号１４）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列、Ｍｅｒ  Ｒ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４１）、およびＡｎｔｐタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン（配列番号１２）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列、Ｍｅｒ  Ｒ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４１）を含む。
【０２２３】
したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列（配列番号２３）、ＨＵ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４４）、およびＴＡＴドメイン（配列番号１１）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列、ＨＵ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４４）、およびＶＰ２２ドメイン（配列番号１４）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列、ＨＵ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４４）、およびＡｎｔｐタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン（配列番号１２）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アラビノシダーゼシグナル配列、ＨＵ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４４）を含む。
【０２２４】
ｂ）アルファアミラーゼシグナル配列に基づくバリアント
したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−アミラーゼシグナル配列（配列番号１９、２１）、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４６）、およびＴＡＴドメイン（配列番号１１）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アミラーゼシグナル配列（配列番号１９、２１）、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４６）、およびＶＰ２２ドメイン（配列番号１４）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アミラーゼシグナル配列（配列番号１９、２１）、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４６）、およびＡｎｔｐタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン（配列番号１２）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アミラーゼシグナル配列（配列番号１９、２１）、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４６）を含む。
【０２２５】
したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アミラーゼシグナル配列（配列番号１９、２１）、ホメオボックスＤＮＡ結合ドメイン、およびＴＡＴドメイン（配列番号１１）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アミラーゼシグナル配列（配列番号１９、２１）、ホメオボックスＤＮＡ結合ドメイン、およびＶＰ２２ドメイン（配列番号１４）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アミラーゼシグナル配列（配列番号１９、２１）、ホメオボックスＤＮＡ結合ドメイン、およびＡｎｔｐタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン（配列番号１２）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アミラーゼシグナル配列（配列番号１９、２１）、ホメオボックスＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０２２６】
したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アミラーゼシグナル配列（配列番号１９、２１）、Ｍｅｒ  Ｒ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４５）、およびＴＡＴドメイン（配列番号１１）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アミラーゼシグナル配列（配列番号１９、２１）、Ｍｅｒ  Ｒ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４５）、およびＶＰ２２ドメイン（配列番号１４）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アミラーゼシグナル配列、Ｍｅｒ  Ｒ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４５）、およびＡｎｔｐタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン（配列番号１２）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アミラーゼシグナル配列、Ｍｅｒ  Ｒ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４５）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アミラーゼシグナル配列（配列番号１９、２１）、ＨＵ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４４）、およびＴＡＴドメイン（配列番号１１）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アミラーゼシグナル配列、ＨＵ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４４）、およびＶＰ２２ドメイン（配列番号１４）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アミラーゼシグナル配列（配列番号１９、２１）、ＨＵ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４４）、およびＡｎｔｐタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン（配列番号１２）を含む。したがって、実施形態では、ＮＨＰは、アルファ−Ｌ−アミラーゼシグナル配列（配列番号１９、２１）、ＨＵ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４４）、およびＣＰＰドメインを含み、これらの非限定的な例を、配列番号１１〜１７として提示する。
【０２２７】
実施形態では、ＮＨＰの各構成要素ドメインは、実質的に全長である。実施形態では、ＮＨＰの構成要素ドメインの各々は、機能的であるが、部分ドメインである。
【０２２８】
したがって、実施形態では、上記のＮＨＰ、ならびにこのようなＮＨＰをコードする核酸配列、およびＮＨＰをコードする核酸配列を含むベクターが開示される。さらに実施形態では、コード配列は、作動的に連結され、宿主細菌により、真核生物発現カセットの一部として転写可能である。
【０２２９】
第１の実施形態の一連の実施形態では、核酸ベクターは、該ベクターの真核生物発現カセットへと挿入されるカーゴまたは候補のまたは外因性の遺伝子もしくは配列を含む。カーゴ遺伝子は、任意の遺伝子または核酸配列でありうる。特定の例では、該遺伝子は、ＧＦＰなどのマーカー遺伝子であるか、または、腫瘍抑制因子である。真核生物発現カセットへと挿入されうる、一連の可能な配列は、いかなる形でも限定されないことが理解される。当業者は、本開示に従うベクター内の発現に適する配列の適合および挿入をたやすく理解する。
【０２３０】
実施形態では、カーゴ配列または候補配列は、蛍光タンパク質またはマーカータンパク質である。
【０２３１】
実施形態では、ベクターは、実施形態に従うタンパク質またはハイブリッドタンパク質の適切なＤＮＡ結合ドメインの結合のための少なくとも１つのＤＮＡモチーフを含み、少なくとも約１０、１５、２０、またはこれを超える連続したヌクレオチドにわたり、配列番号４１または４３に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【０２３２】
実施形態では、選択マーカーは、グラム陽性菌内およびグラム陰性菌内の両方において有効である。実施形態では、選択マーカーは、スペクチノマイシンに対して耐性である。実施形態では、ベクター内に含まれる選択マーカーは、テトラサイクリンに対して耐性であり、実施形態では、ベクター内に含まれる選択マーカーは、クロラムフェニコールに対して耐性である。実施形態では、選択マーカーは、グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方に対して有効な任意の抗生物質である。
第３の実施形態
【０２３３】
実施形態の第３の系列では、細胞をＤＮＡで形質転換し、外因性または候補ＤＮＡ配列またはカーゴＤＮＡ配列を標的真核細胞内で発現させるための方法および組成物が開示される。実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞である。実施形態では、標的細胞は、がん細胞である。実施形態では、がん細胞は、肺癌細胞または結腸癌細胞であり、実施形態では、ＨＥＫ−２９（ヒト胎児性腎臓）；ＨＴ２９、ＣＡＣＯ（いずれも、ヒト腺癌）；ＨｅＬａ、ＬＬ２（肺癌）であり、これにより、実施形態の一バリアントでは、真核標的細胞を、候補ＤＮＡ配列で形質転換するための方法であって、ａ）第１の細胞内で、ハイブリッドタンパク質を、本発明に従う核酸ベクターの第１の発現カセットから発現させて、前記ハイブリッドタンパク質と前記核酸ベクターとの間の複合体を形成するステップと；ｂ）標的細胞を、形成されたハイブリッドタンパク質と核酸ベクターとの複合体と接触させるステップとを含み、前記候補ＤＮＡ配列が、第２の発現カセット内に含まれる方法が開示される。
【０２３４】
実施形態のさらなる態様では、真核標的細胞を、候補ＤＮＡ配列で形質転換するための方法であって、真核標的細胞を、本発明に従うベクターを、シグナル配列と、ＣＰＰ配列と、該ベクターに結合するのに適するＤＮＡ結合配列とを含むハイブリッドタンパク質と結合させることにより形成される核酸ベクター複合体と接触させるステップを含む方法が開示される。
【０２３５】
実施形態のさらなる態様では、原核標的細胞を、候補ＤＮＡ配列で形質転換するための方法であって、原核標的細胞を、本発明に従うベクターを、シグナル配列と、ＣＰＰ配列と、該ベクターに結合するのに適するＤＮＡ結合配列とを含むハイブリッドタンパク質と結合させることにより形成される核酸ベクター複合体と接触させるステップを含む方法が開示される。特定の実施形態では、ハイブリッドタンパク質−ＤＮＡ複合体は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属を形質転換するのに適する。
実施形態の第４の系列
【０２３６】
代替的な実施形態では、他の実施形態のうちのいずれかに従う核酸ベクターを含有する細胞が開示される。実施形態では、細胞は、原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、がん細胞、プロバイオティックス細菌、グラム陰性菌、またはグラム陽性菌である。実施形態では、細胞は、細菌細胞であるか、または、グラム陽性細胞もしくはグラム陰性細胞である。実施形態では、細胞は、ヒト腎臓細胞、ヒト腺癌細胞、またはヒト肺癌細胞である。実施形態では、細胞は、ＨＥＫ−２９細胞（ヒト胎児性腎臓細胞）；ＨＴ２９細胞、ＣａＣｏ２細胞（いずれもヒト腺癌細胞）；またはＨｅＬａ細胞もしくはＬＬ２細胞（肺癌細胞）である。実施形態では、細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細胞、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属細胞、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細胞、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細胞、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細胞である。
実施形態の第５の系列
【０２３７】
実施形態では、実施形態に従うベクター、または実施形態に従うＮＨＰ、あるいは実施形態に従うベクターと実施形態に従うＮＨＰとの組合せを含むキットが開示される。
【０２３８】
実施形態では、細胞を、請求項１に記載のベクターで形質転換するためのキットであって、ある量のベクターとある量のベクターと、ＤＮＡ結合ドメイン、シグナル配列ドメイン、およびＣＰＰドメインを含むある量のハイブリッドタンパク質を含むキットが開示される。実施形態では、キットは、ある量の核酸ベクターをさらに含む。
【０２３９】
実施形態に従う融合タンパク質を使用して、標的原核細胞または標的真核細胞を、所望のＤＮＡで形質転換する。実施形態では、所望のＤＮＡは、プラスミドまたは他のベクターである。実施形態では、所望のＤＮＡは、標的原核細胞内で発現させるのに適する発現カセットを含む。
【０２４０】
実施形態では、前記少なくとも１つの認識ヌクレオチド配列は、ＭｅｒＲ  ＤＮＡモチーフである配列番号４１、またはジンクフィンガーＤＮＡモチーフである配列番号４３に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７＄、９８％、９９％、またはこれを超える配列同一性を有する。
【０２４１】
実施形態では、融合タンパク質は、順次：シグナル配列−ＨＵ  ＤＮＡ結合ドメイン−ＴＡＴドメイン；またはシグナル配列−Ｍｅｒ  Ｒ  ＤＮＡ結合ドメイン−ＴＡＴドメイン；またはシグナル配列−ＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメイン−ＴＡＴドメイン；またはシグナル配列−ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン−ＴＡＴドメインを含む。実施形態に従うハイブリッドタンパク質の非限定的な例をコードするヌクレオチド配列を、配列番号７〜１０として提示し、アミノ酸配列を、配列番号２４〜２７として提示する。
【０２４２】
実施形態では、前記少なくとも１つの認識ヌクレオチド配列は、少なくとも１０、１５、または２０個の連続したヌクレオチド配列にわたり、配列番号４１または４３に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％の配列同一性を有する。
【実施例】
【０２４３】
（実施例１）
ＮＨＰの調製
ＮＨＰ調製物：
ＮＨＰライブラリーをデザインし、作製した。このライブラリーを使用して、ＮＨＰのＤＮＡ結合能、トランスフェクション能、および形質転換能に関する仮説を検証した。ライブラリーは、Ｈ（ＨＵ：配列番号４４）、Ｍ（Ｍｅｒ  Ｒ：配列番号４５）、Ｌ（Ｌａｃ  Ｉ：配列番号４７）、Ｚ（Ｚｎフィンガー：配列番号４６）、ならびにＣＰＰドメインとＤＮＡ結合ドメインとの組合せである、ＨＴ（配列番号４４および１１を順番に組み合わせるＨｕ−ＴＡＴ）、ＴＨ（配列番号１１および４４を順番に組み合わせるＴａｔ  ＨＵ）、ＬＴ（配列番号４７および１１を順番に組み合わせるＬａｃ  Ｔａｔ）、ＴＬ（配列番号１１および４７を順番に組み合わせるＴａｔ−Ｌａｃ  Ｉ）、ＴＭ（配列番号１１および４５を順番に組み合わせるＴａｔ−Ｍｅｒ  Ｒ）、ＭＴ（配列番号４５および１１を順番に組み合わせるＭｅｒ  Ｒ−Ｔａｔ）、ＴＺ（配列番号１１および４６を順番に組み合わせるＴａｔ−Ｚｎフィンガー）、ＺＴ（配列番号４６および１を順番に組み合わせるＺｎフィンガー  Ｔａｔ）、ＳＨＴ（アラビノシダーゼシグナル（ａｒａｂｉｎｏｓｉｄａｓｅ  ｓｉｇｎａ）  Ｈｕ  Ｔａｔ：配列番号２４）、ＴＨＳ（Ｔａｔ−Ｈｕ−アラビノシダーゼシグナル）およびＳＺＴ（アラビノシダーゼシグナル配列  Ｚｎフィンガー  Ｔａｔ：配列番号２７）からなった。全てのタンパク質は、ＬｉｆｅＴｅｉｎ（商標）ＬＣＣによる固相ペプチド合成によって化学合成した。
【０２４４】
ＮＨＰライブラリーを使用して、プラスミドＤＮＡの結合能を特徴付けた。Ｌａｃ−Ｉ  ＤＮＡ結合タンパク質ドメインを含むＮＨＰを除く全てのＮＨＰが、プラスミドＤＮＡに結合することが裏付けられた。
【０２４５】
異なるハイブリッドタンパク質は、結合アフィニティーにおいて有意差を示す。図３は、ＳＨＴおよびＳＺＴ（それぞれ、配列番号２４および２７）が、プラスミドＤＮＡ（ｐＢＲＡ２．０；図１および配列番号１）に結合する能力を描示する。図３は、ＳＨＴ（配列番号２４）およびＳＺＴ（配列番号２７）の濃度が増加するにつれ、ゲル電気泳動アッセイにおけるプラスミドの移動が遅延することを示す。
【０２４６】
ＮＨＰライブラリーを使用して、プラスミドＤＮＡの、ＨＥＫ−２９３、Ｈｅｌａ、ＣａＣｏ−２、ＬＬ２、およびＨＴ−２９を含む多様な哺乳動物細胞系へのトランスフェクションを特徴付けた。サイトメガロウイルスプロモーターの制御下で、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子をコードする多様なプラスミドを、ライブラリーに由来するＮＨＰに結合させた。次いで、ＮＨＰに結合したプラスミドを、多様な細胞系と共にインキュベートし、蛍光顕微鏡法の下で調査して、ＧＦＰの発現を検出した。予測される通り、ＤＮＡ結合ドメインは、単独では、プラスミドのトランスフェクションを結果としてもたらさなかったが；ＨＴ、ＬＴ、ＭＴ、ＺＴ、ＳＨＴ（配列番号２４）、およびＳＺＴ（配列番号２７）は、プラスミドのトランスフェクションを結果としてもたらし、ＺＴ、ＳＨＴ、およびＳＺＴのトランスフェクション効率は最良であった。ＴＬ、ＴＺ、ＴＳ、ＴＭ、およびＴＨＳなど、逆配向のＮＨＰが結果としてもたらすプラスミドのトランスフェクションは、極めて限定的である。これにより、ＴＡＴドメインおよびＤＮＡ結合ドメインは、具体的には、ＴＡＴドメインをカルボキシ末端とする配向性で、プラスミドのトランスフェクションに必要であることが示唆される。加えて、これらの知見はまた、分泌シグナルドメインであるＳが、トランスフェクション効率を改善することも示唆する。図１０は、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴプラスミド（配列番号１）の、ＨＥＫ−２９３細胞系内およびＨｅｌａ細胞系内の、ＳＨＴおよびＳＺＴに媒介されるトランスフェクションを描示する。試験した他の全ての細胞系も、一致した結果を明らかに示した。
【０２４７】
ＮＨＰライブラリーの一部を使用して、細菌を、プラスミドＤＮＡで形質転換する能力について調査した。ＮＨＰライブラリーは、ＨＴ、ＺＴ、ＴＨ、ＴＺ、ＳＨＴおよびＳＺＴを含んだ。ＮＨＰ媒介型形質転換アッセイを、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて調べた。ＳＨＴ（配列番号２４）およびＳＺＴ（配列番号２７）だけが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍを形質転換することが可能であるのに対し、ＨＴ、ＺＴ、ＴＨ、およびＴＺは、これが不可能であることが裏付けられたことから、この形質転換能には分泌シグナルが必要であることが示唆された。次いで、この実験を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉについて繰り返したところ、ＳＨＴおよびＳＺＴは、種間形質転換能を有することが確認された。グラム陽性菌からの、電気形質転換による従来の形質転換法と比較して、ＳＨＴの使用は、優れていることが実証され、その結果として、より高率の形質転換体をもたらした。ＳＨＴおよびＳＺＴで多様な細菌種を形質転換するので、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方である、他の細菌種も、この方法を介して有効に形質転換することが可能であることが考えられる。これは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍと同様に、形質転換が困難な種であって、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｉｕｓ属、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属を含む種を含む。
【０２４８】
したがって、両方の細菌のほか、哺乳動物標的細胞へのＮＨＰ媒介型遺伝子の送達は、細胞媒介型内部化工程を介して機能しうる。工程は、ＴＡＴドメインを要求し、分泌シグナルドメインにより増強されることが考えられる。細菌細胞の形質転換では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓアッセイおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉアッセイにおいて観察される形質転換効率の、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍと比較した低減に基づき、種特異的分泌シグナル（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）が、形質転換効率において重要な役割を果たすことが考えられる。
（実施例２）
プラスミド調製物
【０２４９】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍを、哺乳動物細胞へのＮＨＰ媒介型遺伝子送達のためのベクターとして使用するために、ＤＮＡプラスミドをデザインし、作製した（図１および２）。ベクターは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属が、そのデザインされた機能を実行することを可能とする情報をコードする、６つの構成要素を含む。コードされる遺伝子構成要素は、（ａ）哺乳動物発現カセット；（ｂ）新規のハイブリッドタンパク質をコードする原核生物発現カセット；（ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ内の複製起点；（ｄ）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ内の複製起点；（ｅ）選択用マーカー；（ｆ）新規のハイブリッドタンパク質に特異的なＤＮＡ結合部位を含む。２つのベクターの構造についてのより詳細な説明は、上記の実施形態についての記載に提示されている。
【０２５０】
略述すると、プラスミドｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ（図１および配列番号１）内で、グラム陽性菌内の発現のための第１の発現カセットは、図１で見られる通り、ＮＨＰコード配列を挟む、ＨＵプロモーターと、ＨＵターミネーターとを含む。ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ内で、ヒト細胞内の発現のための第２の発現カセットは、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、コザック配列、およびチミジンキナーゼのポリアデニル化／終結配列を含み、上記の配列は、カーゴ配列の挿入のための挿入配列を挟む。これは、配列番号１に見られ、ここでは、ＧＦＰタンパク質を、第２の発現カセットへと挿入する。実施形態ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴでは、該ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ内の複製のためのｐＵＣ複製起点およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属内の複製のためのｐＢ４４複製起点を含む。ＤＮＡ−ＢＳは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質（配列番号４６）のヌクレオチド結合部位（配列番号４３）を表す。
【０２５１】
プラスミドであるｐＦＲＧ１．５  ＳＨＴを、図２および配列番号２に示すが、数字は、図２における特徴の番号付けを指す。ベクターは、グラム陽性複製起点、すなわち、その配列が配列番号２８内に含まれる、ＰＤＯＪＨＲ複製起点（２）と、グラム陰性複製起点、すなわち、配列番号２９として提示される、ｐＵＣ  ＯＲＩ（１）とを含む。原核生物発現カセットは、本明細書の別の箇所で定義される通り、ハイブリッドタンパク質ＳＨＴのコード配列（９）を挟む、リボソームＲＮＡプロモーター（８）およびターミネーター（１０）を含む。哺乳動物遺伝子発現カセットは、ＣＭＶプロモーター（４）ならびにＴＫポリＡ部位およびターミネーター（６）を含む。この場合、挿入される遺伝子は、ＧＦＰレポーター配列（５）である。プラスミドは、ＳＨＴハイブリッドタンパク質に含まれる配列による結合に適するＤＮＡ配列（１１）を含む。ｐＦＲＧ１．５プラスミド内の選択用マーカーは、スペクチノマイシン耐性遺伝子（３）である。
【０２５２】
ベクターを、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属へと挿入したら、構成要素（ｂ）、（ｄ）および（ｆ）を、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細胞機構との相互作用に起因して活性化するようにデザインする。結果として、新規のハイブリッドタンパク質が発現し、ベクター上の特異的結合部位に結合し、その結果、ベクター−新規のハイブリッドタンパク質複合体の全体が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属から分泌され、哺乳動物細胞へと送達される。哺乳動物細胞内に入ると、哺乳動物発現カセットの構成要素は、細胞機構との相互作用に起因して活性化し、所望の機能を果たすように、治療用遺伝子を発現させる。構成要素（ｃ）および（ｅ）は、治療的に関与性でないが、技術の構築および検証の間に要求される。
【０２５３】
ＧｅｎｅＡｒｔ  Ｉｎｃを介してベクターを合成した後で、実験により、各構成要素の機能について調べた。
哺乳動物遺伝子発現カセット
【０２５４】
ベクターが、哺乳動物遺伝子発現カセットを発現させる能力を、ＬＬ２細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ｈｅｋ−２９３細胞、ＨＴ−２９細胞、およびＣａＣｏ−２細胞を含む、多様な哺乳動物細胞培養系中で調査した。緑色蛍光タンパク質遺伝子を含有する哺乳動物発現カセットを使用して、遺伝子構成要素の適正な機能を検出する蛍光顕微鏡法の使用を可能とした。図５は、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ（配列番号１）の、ＨｅＬａ細胞系内およびＨＥＫ−２９３細胞系内のトランスフェクション、ならびに得られた哺乳動物発現カセットの機能を描示する。
原核生物遺伝子発現カセット
【０２５５】
ベクターが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ内で、原核生物の哺乳動物遺伝子発現カセット（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）を発現させる能力について調査した。これを行うために、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍの細胞溶解物に対して、免疫ブロット解析を実施した。図９は、免疫ブロットを描示し、バンドは、予測される１４ｋＤａのＮＨＰサイズで、レーン９において検出された。
Ｅ．ｃｏｌｉ内の複製起点および選択用マーカー
【０２５６】
この構成要素について試験するため、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ（配列番号１）で形質転換した。それらを増殖させた後、プラスミドを精製した後で、ゲル電気泳動にかけて、陽性の形質転換体および複製起点の機能を確認した。図４は、Ｅ．ｃｏｌｉから精製されたｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ（配列番号１、図１）についてのゲル電気泳動を描示し、陽性の形質転換体を確認する。形質転換の後、培養物を、スペクチノマイシンを含有する培養培地中で増殖させた。この培養培地中の増殖は、プラスミドが複製されつつあり、選択用マーカーが機能することを示唆する。
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ内の複製起点および選択用マーカー
【０２５７】
この構成要素について調べるため、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細胞を、Ｅ．ｃｏｌｉから精製されたｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ（配列番号１、図１）で形質転換した。形質転換の後、培養物を、スペクチノマイシンを含有する培養培地中で増殖させた。この培養培地中の増殖は、プラスミドが複製されつつあり、選択用マーカーが機能することを示唆する。
ＮＨＰに特異的なＤＮＡ結合部位
【０２５８】
この機能について調べるため、精製ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ（配列番号１、図１）を使用し、ＳＨＴタンパク質およびＳＺＴタンパク質（配列番号２４および２７）と結合させた。図３は、この結合アッセイを描示するが、ＮＨＰ濃度の増加と共に、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴの移動が遅延した。加えて、ＳＨＴおよびＳＺＴに媒介されるｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴの、多様な細胞系への送達を実施した。陽性結果は、ＧＦＰをコードする哺乳動物遺伝子発現カセットの発現である。図５は、ＮＨＰ媒介型ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ（配列番号１、図１）のトランスフェクション後における、ＧＦＰ陽性細胞を描示する。
集合的なベクター機能：
【０２５９】
ベクターの構成要素を検証した後で、これとは独立に、それらの遺伝子送達系としての集合的機能について調査した。これを行うために、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ培養物の上清において、ＮＨＰに結合したｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ（配列番号１、図１）についてスクリーニングした。
【０２６０】
第１のステップは、ＰＣＲを介して、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ（配列番号１、図１）のプラスミドＤＮＡを検出することであった（図６）。厳密な遠心分離の後、野生型Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、ｐＴＭ１３陽性の形質転換体、およびｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ陽性の形質転換体の上清を回収した。ｐＴＭ１３は、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴと同じベクターであるが、ＮＨＰをコードする原核生物遺伝子発現カセットを伴わず、結果として、本発明者らは、ｐＴＭ１３形質転換体におけるプラスミド分泌を予期しなかった。ＰＣＲの後、陽性対照により、ＰＣＲ反応の妥当性が確認される一方、野生型、およびｐＴＭ１３陽性の形質転換体を含む陰性対照は、鋳型の増幅をもたらさなかった。ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ陽性の形質転換体だけが、単離上清からの鋳型の増幅をもたらした。
【０２６１】
第２に、改変型Ｑｉａｇｅｎ（商標）ｐｒｅｐキットのほか、従来のフェノール−クロロホルム精製プロトコールを含む、プラスミド精製プロトコールを、回収された上清に対して使用して、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ（配列番号１、図１）を、上清から単離した（図７および８）。図は、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ（配列番号１、図１）のサイズに対応する単離ベクターを描示し、制限消化解析では、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴであることが確認された。
【０２６２】
ＮＨＰの発現およびベクターのコピー数の増加により、哺乳動物細胞内のＮＨＰ媒介型遺伝子送達を検出するのに十分なＮＨＰ結合ベクターがもたらされることが考えられる。これを行うために、ベクターはｐＦＲＧ１．５（配列番号２、図２）など、構成要素（ｂ）および構成要素（ｄ）の増強形を有する。また、他の遺伝子発現カセット、複製起点、および選択用マーカーも、ゲノム解析を介して同定されうるので、別の種に対して種特異的となるように構成要素を変化させることも、比較的単純であることも考えられる。本デザインに基づけば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＢａｃｉｌｉｕｓ属など、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属と類似の種においても働くよう、ベクターを具体的にデザインし、調べうることが考えられる。
（実施例３）
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細胞の培養技法、継代培養、播種、および保存
【０２６３】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ細胞を、７〜７．５ｍＬのＲＣＢ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属用強化培養培地）を含有する、ねじ式止栓型嫌気性チューブ内で継代培養した。インキュベーションの１８〜２４時間後に、細胞を、ＲＣＢＡ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属用強化寒天培地）上に播種し、嫌気性条件下、３７℃で２４〜４８時間にわたりインキュベートした。単一のコロニーを採取し、７〜７．５ｍＬのＲＣＢを含有する、ねじ式止栓型嫌気性チューブ内で再度継代培養した。この２代にわたる連続継代培養物（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）または継代物（ｐａｓｓａｇｅ）（１０％  Ｖ／Ｖ）を、全ての実験のための出発培養物として使用した。細胞が、１．４〜１．８のＯＤ６００ｎｍに到達した後で、細胞ペレットを回収し、将来の使用のために、−８０℃で凍結させた。また、２ｍＬの活性培養物のグリセロール原液を、低温保存用バイアル内の５０％滅菌グリセロール０．５〜１ｍＬへも添加し、−８０℃で保存した。活性の細菌細胞培養物を得るために、細胞を、滅菌ＲＣＢテューブ内で、２日ごとに、定期的に継代した。
（実施例４）
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍにおける電気形質転換
電気穿孔のための細胞の調製
【０２６４】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍの一晩にわたる培養物（１０％  Ｖ／Ｖ）を、１０ｍＬのねじ式止栓型嫌気性チューブ中の新鮮なＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属用強化培養培地（ＲＣＢ）に接種し、嫌気性条件下、３７℃でインキュベートした。この培養物を、滅菌ＲＣＢテューブ内で、再度、嫌気性条件下、３７℃で、０．６〜０．７のＯＤ６００ｎｍに到達するまで連続継代した。細胞が、指数増殖期中期に到達したら、まず、細胞を氷上で冷却し、１５ｍＬのファルコンテューブ内、４℃、４，５００ｒｐｍで１５分間にわたり遠心分離した。遠心分離の後、細胞ペレットを再懸濁させ、エッペンドルフ管中０．５Ｍの氷冷スクロースで２回にわたり洗浄した。この後、細胞を、１ｍＭのクエン酸アンモニウム＋０．５Ｍのスクロース（ｐＨ６）からなる、３００μＬの氷冷電気穿孔用クエン酸緩衝液である、元の培養容量（１０ｍＬ）の２５０分の１中に、４℃で２．５時間にわたり再懸濁させた。
電気穿孔プロトコール
【０２６５】
プラスミドＤＮＡ（４００、６００、８００、１０００ｎｇ：８００ｎｇが最良である）を、電極間距離を０．２ｃｍとする、あらかじめ冷却されたＢｉｏ−Ｒａｄ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（商標）ディスポーザブルキュベット内で、８０μＬの細胞懸濁液と混合した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（商標）を使用して、２５μＦのキャパシタンスおよび２００Ωの抵抗とともに、２０００Ｖの高電圧電気パルスを送達した。電気穿孔に続き、形質転換体混合物を、０．５Ｍのスクロースを含有する９００〜９２０μＬの滅菌ＲＣＢを含有するエッペンドルフ管内に移し、細胞を、嫌気性グローブバッグ内、３７℃で３〜４時間にわたりインキュベートした。この手順は、細胞の回収および抗生物質耐性マーカーの発現のために要求される。細胞の回収後、細胞を、２５、５０、および１００μｇ／ｍＬのアンピシリン抗生物質およびスペクチノマイシン抗生物質のそれぞれを含有する滅菌ＲＣＢで継代培養し、３７℃で２〜４日間にわたりインキュベートした。
形質転換体の選択
【０２６６】
選択では、ＲＣＢＳおよびＲＣＢＡＳ（ベクターＰＴＭ１３のための、スペクチノマイシンを含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属用強化培地）を、形質転換体の選択のために使用した。陽性の形質転換体の選択のために使用される濃度は、テューブ内および寒天プレート中５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、および１５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンであった。液体の選択用培地を調製するために、上述の濃度のスペクチノマイシンを、嫌気性グローブバッグ内の滅菌ＲＣＢＳテューブへと、無菌的に添加した。電気穿孔後における形質転換体の選択のために、スプレッドプレート法を使用して、５０〜１００μＬの形質転換体混合物を、適切な濃度のスペクチノマイシンをあらかじめむらなく拡散させておいた（ｐｒｅ−ｓｐｒｅａｄ）滅菌ＲＣＡＳ寒天プレートへと播種し、グローブバッグ内、３７℃で４８〜７２時間にわたりインキュベートした。野生型Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ細胞（液体培養培地では１０％  Ｖ／Ｖであり、寒天プレートでは５０〜１００μＬの培養物）を含有する滅菌テューブおよび滅菌寒天プレートの両方について、同じ濃度のスペクチノマイシンを含有する対照プレートを使用した。４８〜７２時間後、なおまたは、場合によって、これを超える時間の後、グローブバッグ内で滅菌ループを使用して、陽性の形質転換体コロニーを採取し、１２５μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含む選択用ＲＣＢＳを含有するテューブ内で継代培養した。１週間後であってもなお、同じ濃度のスペクチノマイシンを含む対照ＲＣＢＡＳプレート上では、成長が観察されなかった。
陽性の形質転換体のスクリーニング：
プラスミドの単離
【０２６７】
１５ｍＬのファルコンテューブ内の選択用寒天プレートに由来する単一のコロニーからの一晩にわたる増殖の後に、４℃、５，０００ｒｐｍで１５分間、細胞（６〜７ｍＬの培養物）を採取する。ペレットを、１ｍＬのＰＢＳで１回洗浄して、培地中の過剰な最終産物を取り出す。ペレットを、５７０μＬの溶液Ａ｛６．７％のスクロース、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）｝で再懸濁させ、３７℃で５分間あらかじめ温める。細胞の溶解は、１４５μＬの溶液Ｂ｛２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍｇ／ｍＬのリゾチーム｝の添加により実施し、３７℃で４０〜４５分間インキュベートした。さらに、７２μＬの溶液Ｃ｛０．２５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）｝および４２μＬの溶液Ｄ｛２０％のＳＤＳ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）｝を添加し、静かに混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、テューブを、数秒間反転させることにより短時間混合し、ゲノムＤＮＡを、３ＭのＮａＯＨ４２μＬを添加し、１０分間静かに混合することにより変性させた。７５μＬの２Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を３分間添加することにより溶液を中和し、５ＭのＮａＣｌ  １０７μＬを使用して、１分間静かに混合することにより、ＤＮＡを沈殿させた。４℃、１４，０００ｒｐｍで１０〜１５分間の遠心分離により、沈殿させたゲノムＤＮＡを取り出した。上清を、７００μＬのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合物（２５：２４：１）を含有する、新しいエッペンドルフ管へと添加し、激しく混合した。これに続き、混合物を、室温、１４，０００ｒｐｍで１５〜２０分間、遠心分離した。遠心分離の後、上部の水性相を、注意深い吸引または静かなピペッティングにより、新しいテューブへと移し、６００μＬのイソプロパノールで処理し、ＤＮＡを、氷上で３０分間、沈殿させた。次いで、テューブを、４℃、１４，０００ｒｐｍで１５〜２０分間、遠心分離した。遠心分離の後、上清を廃棄し、ペレットを、氷冷（−２０℃）７０％のエタノールで洗浄した。
【０２６８】
１４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離の後、上清を廃棄し、ペレットを、５〜１０分間、空気乾燥させた。プラスミドＤＮＡペレットを、３５μＬのヌクレアーゼ非含有水中またはトリス−ＨＣｌ緩衝液中に再懸濁させた。１．５μＬのＲＮアーゼを、添加し、３７℃で１５〜３０分間にわたりインキュベートした。
制限消化およびアガロースゲル電気泳動
【０２６９】
１７μＬのプラスミドＤＮＡ（５５０〜６００ｎｇ）を、２μＬのＥｃｏＲ１、４μＬの反応緩衝液、および１７μＬの水を含有する混合物へと添加した。消化混合物を、３７℃で２〜２．５時間インキュベートした。次いで、反応物を、６５℃で１０〜１５分間、熱不活化した。形質転換体（切断型、非切断型）プラスミドＤＮＡ、対照：抗生物質の非存在下で増殖させた野生型（切断型、非切断型）、対照：抗生物質の存在下で増殖させた野生型（切断型、非切断型）、切断／非切断型のベクターＤＮＡ（ＰＴＭ１３）、およびＤＮＡラダーを含む試料を、１．５％のアガロースゲルにロードし、電気泳動させて、適切なバンドパターンを観察した。
他のプラスミド単離プロトコール
【０２７０】
必要とされる緩衝液：ＴＥＳ（２５ｍＭのトリス−Ｃｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのスクロース）；ＫＯＡｃ：３ＭのＫ＋、５Ｍのアセテート（３Ｍの酢酸カリウム、２Ｍの酢酸（氷酢酸の場合は１７Ｍ））；ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩液ｐＨ７．０。
【０２７１】
対数増殖期中期のＯＤ（約８〜１０時間）で、３７℃で嫌気的に増殖させた、１ｍＬの新鮮な培養物を、プラスミド単離のために使用した。遠心分離機内、４℃、４，０００ＲＰＭで２０分間、遠心分離する。上清を廃棄し、５ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で洗浄する。再度遠心分離し、上清を廃棄する。６ｍｇ／ｍＬのリゾチームおよび４０μｇ／ｍＬのムタノリシンを含有する、３００〜４００μＬのＴＥＳを添加し、ペレットを、２ｍＬのエッペンドルフ管内に再懸濁させる。３７℃で６０分間インキュベートする。Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎの方法により、２００μＬの２５％のスクロースを、３０ｍｇ／ｍＬのリゾチームと共に、再懸濁緩衝液として使用し、３７℃で１５〜２０分間インキュベートした。一方、０．２ＮのＮａＯＨおよび２％のＳＤＳを、新たに作り、溶解を実施した。６００μＬのＳＤＳ／ＮａＯＨミックスを、各テューブへと添加する。氷上で５分間インキュベートする。Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎの方法により、４００μＬの溶解緩衝液（３％のＳＤＳおよび０．２ＮのＮａＯＨ）でもまた試行し、反転により混合し、室温で５〜７分間インキュベートした。５００μＬのＫＯＡｃ（３ＭのＫ＋、５Ｍのアセテート）を添加する。氷上で２分間インキュベートする。激しく振とうし、４℃、１７，２００ｇ／１２，０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離する。Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎの方法により、３Ｍの氷冷酢酸ナトリウム３００μＬ（ｐＨ４．８）を使用し、テューブを反転させることにより混合し、４℃、１３，５００ｒｐｍで１５分間、遠心分離した。上清（約１ｍＬ）を、新鮮な２ｍＬテューブへと取り出し、ペレットおよび残りの上清を廃棄する。２分の１容量（５００μＬ）のイソプロパノールを添加する。１７，２００ｇ／１２，０００ｒｐｍ（室温）で１０分間、遠心分離する。上清を廃棄する。Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎの方法により、上清を、新しいエッペンドルフ管内に回収し、室温、６５０μＬのイソプロパノールと混合し、４℃、１３，５００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。ペレットを、７０％のエタノール１ｍＬで洗浄する。ベンチ上で、２〜５分間、空気乾燥させる。５００μＬのＴＥ緩衝液中に再懸濁させる。５ＭのＬｉＣｌ  ５００μＬを添加する。氷上で５分間インキュベートする。１７，２００ｇ／１２，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離する。上清を、エッペンドルフ管へと注ぎ込む。１ｍＬのイソプロパノールを添加する。ベンチ上で１０分間インキュベートする。１７，２００ｇ／１２，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離する。上清を廃棄する。ペレットを、１００μＬの７０％のエタノールで洗浄する。３７５μＬのＴＥ緩衝液中に再懸濁させる。５μＬの１ｍｇ／ｍＬのＲＮアーゼＡを添加する。３７℃で３０分間インキュベートする。同じプロトコールを、７０％のエタノールによる洗浄の後で、ＬｉＣｌステップを伴わずに実施し、空気乾燥させたペレットを、ＴＥ中に再懸濁させ、ＲＮアーゼＡ処理にかけた。Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎの方法により、ＤＮＡペレットを、イソプロパノールステップの後で、５００μＬの滅菌ヌクレアーゼ非含有水中に再懸濁させ、次いで、フェノール−クロロホルム精製にかけた。７００μＬのフェノール：クロロホ��ム：イソアミルアルコールを添加する。完全に混合されるまでボルテックスする。マイクロ遠心機の最高速度で２分間、遠心分離する。水性相（上部相）を、新しいエッペンドルフ管へとピペッティングする。次いで、同じ容量のクロロホルム：イソアミルアルコールを用いて、手順を２回繰り返して、任意のフェノールを除去する。７５０μＬの非希釈エタノールおよび１２５μＬの３Ｍの酢酸ナトリウムを添加する。３０分間−８０℃に置くか、または一晩−２０℃に置く。Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎの方法により、上部相を、１ｍＬのエタノール（−２０℃）と混合し、４℃、１３，５００ｒｐｍで１５分間、遠心分離した。４℃、１３，６００ｇ／１２，０００ｒｐｍで１５分間超、遠心分離する。上清を廃棄する。ペレットを、７０％のエタノール約１００μＬで洗浄する。元の細胞４０ｍＬ当たり、２００μＬのトリス緩衝液中に再懸濁させる。Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎの方法により、ＤＮＡペレットを、７０％のエタノールで洗浄し、空気乾燥させ、ＲＮアーゼＡを含有する５０μＬのＴＥ中に再懸濁させた。
（実施例５）
ＰＢＲＡ２．０  ＳＨＴ
【０２７２】
ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴの構造を、図１に示し、配列番号１として示す。ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴおよびそのヌクレオチド配列を、配列番号１として提示する。ベクターは、プラスミドであり、図１に指し示される通りであり、スペクチノマイシン耐性遺伝子であるＳｍＲ、Ｅ．ｃｏｌｉのｐＵＣ複製起点、およびｐＢ４４に由来するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍの複製起点を含む。真核生物発現カセットは、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ならびにＨＳＶウイルスに由来するチミジンキナーゼターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む。候補配列またはカーゴ配列（「ＧＯＩ」と称する）は、ＣＭＶプロモーターの作動を介する発現のために、適正なリーディングフレーム内に挿入することができる。
【０２７３】
ベクターはまた、カーゴである融合タンパク質またはＮＨＰの発現のための発現カセットも含む。図で見られる通り、原核生物発現カセットは、ＨｕプロモーターであるＨｕＰと、ＨｕターミネーターであるＨｕＴとにより枠決めされている（ｆｒａｍｅｄ）。所望のＮＨＰオープンリーディングフレームを、上記２つの間の適切なリーディングフレーム内に、Ｈｕプロモーターの制御下で挿入する。
【０２７４】
ＨｕＴ配列には、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが結合するＤＮＡモチーフである、ＤＮＡ−ＢＳ配列が続く。異なるバリアントでは、選択されるタンパク質は、配列ＳＨＴ、ＳＺＴ、ＳＭＴ、ＳＬＴ（配列番号２４、２５、２６、２７）を有しうることが理解される。例では、本明細書で提示されるＮＨＰは、ＳＨＴ構造を有するが、そのコードヌクレオチド配列を、配列番号２４として示し、その対応するＤＮＡ配列を、配列番号８として示す。
【０２７５】
この実施形態では、シグナル配列は、配列番号２２、２３のアルファアラビノシダーゼであり、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｈｕドメインであり、そのＤＮＡ配列を配列番号４として提示し、ＣＰＰドメインは、配列番号１１のＴＡＴドメインである。ｐＢＲＡ  ２．０プラスミド配列は、個々のＤＮＡ配列からアセンブルし、ＬｉｆｅＴｅｉｎ（商標）ＬＣＣを介して、商業的に合成した。
（実施例６）
ｐＦＲＧ１．５
【０２７６】
ｐＦＲＧ１．５  ＳＨＴの構造を、図２に示し、そのヌクレオチド配列を、配列番号２として示す。
ベクターは、グラム陽性複製起点、すなわち、その配列が、配列番号２８の一部として提示される、ｐＤＯＪＨＲ複製起点と、グラム陰性複製起点、すなわち、配列番号２９として提示されるｐＵＣ  ＯＲＩ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＯＲＩ）とを含む。ベクターは、原核生物発現カセットおよび真核生物発現カセットを含む。原核生物発現カセットは、本明細書の別の箇所で定義した、ハイブリッドタンパク質ＳＺＴのコード配列を挟む、リボソームＲＮＡプロモーターおよびターミネーターを含む。哺乳動物遺伝子発現カセットは、ＣＭＶプロモーターならびにＴＫポリＡ部位およびターミネーターを含む。この場合、挿入される遺伝子は、ＧＦＰ配列である。
【０２７７】
例では、プラスミドは、ジンクフィンガーコンセンサス配列への結合に適するＤＮＡ配列を含む。このプラスミド内の選択用マーカーは、スペクチノマイシン耐性遺伝子である。ｐＦＲＧは、商業的に入手し、標準的な方法を使用して合成した。
（実施例７）
ベクターの検証
【０２７８】
例では、ＧＦＰマーカーを含有するｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴプラスミドを、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細胞へと形質転換した。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細胞を、プラスミドを宿し、コードされるＮＨＰタンパク質を発現させる細胞として確認した。ｐＢＲＡ２．０プラスミドの、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細胞からの分泌は、直接確認した。
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＯＲＩの機能を検証する、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴによるＥ．ｃｏｌｉ形質転換アッセイ
【０２７９】
ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴを、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α化学的コンピテント細胞から、精製して、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ上のＥ．ｃｏｌｉ  ＯＲＩを検証した。１００μｇ／μＬのスペクチノマイシンを含有する寒天プレート上で、陽性の形質転換体を選択した。細胞を、製造元のプロトコールに従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用するプラスミド精製にかけ、ＥｃｏＲ１を使用する制限酵素消化にかけ、０．８％のアガロースゲルにおいて視覚化した。
【０２８０】
図４は、得られたＤＮＡ消化物の試料を、アガロースゲルで泳動させた結果を示す。レーンは、以下：１．１ｋｂのラダー、２．化学合成されたベクター、３．ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ陽性の形質転換体Ａ、４．ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ陽性の形質転換体Ｂ、の通りである。
ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴトランスフェクションアッセイ、真核生物ＯＲＦの検証
【０２８１】
ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ（配列番号１、図１）を、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ上の真核生物オープンリーディングフレームを検証するためのトランスフェクションにかけた。ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴを、製造元のプロトコールに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を使用して、ヒト細胞系へとトランスフェクトした。細胞は、直接蛍光顕微鏡法を使用して、ＧＦＰの発現について視覚化した。結果を、図５：パネル１：ＨＥＫ−２９３細胞：Ａ．対照；Ｂ．ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ；Ｃ．ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）；パネル２：ＨｅＬａ細胞：Ａ．対照；Ｂ．ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ；Ｃ．ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、に示す。
【０２８２】
図５の実験パネル１Ｃおよび２Ｃの、対照との比較により、これらの細胞内の真核生物発現カセットからのＧＦＰの発現が実証される。
ベクターの分泌の検証。ｐＴＭ１３上清およびｐＲＢＡ２．０上清のＰＣＲによるスクリーニング、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴの分泌の検証
【０２８３】
培養物を、ＯＤ１．８まで増殖させ、ここで、野生型培養物、ｐＴＭ１３（ＳＨＴ配列を含有しないプラスミド）培養物、およびｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ培養物の１ｍＬの上清を、製造元のプロトコールに従い、Ｑｉａｇｅｎ（商標）ＱＩＡｐｒｅｐ（商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用する、プラスミド精製にかけた。得られた溶出物を、ｐＴＭ１３／ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ特異的プライマーを使用するＰＣＲにかけて、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ形質転換体からのプラスミド分泌を検証した。プラスミドの存在を同定するのに使用可能な一連のプライマー対を、配列番号２５および３６（ＧＦＰ配列を増幅するプライマー対）；配列番号３７および３８（スペクチノマイシン耐性遺伝子配列を増幅するプライマー対）；ならびに配列番号３９および４０（ＣＭＶ配列を増幅するプライマー対）として提示する。結果のさらなる確認として、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ  Ｂ．Ｃ．により、アンプリコンを配列決定して、配列同一性を確認した。結果を図６に示す。１：１ｋｂのラダー；２：１００ｂｐのラダー；３：ＰＣＲ陰性対照−ＧＦＰプライマー、鋳型なし；４：ＰＣＲ陰性対照−ＳｐｅｃＲプライマー、鋳型なし；５：ＰＣＲ陰性対照−ＣＭＶプライマー、鋳型なし；６：ＰＣＲ陽性対照−ＧＦＰ、ｐＢＲＡ−ＳＨＴプラスミド．ＤＮＡ；７：ＰＣＲ陽性対照−ＳｐｅｃＲ、ｐＢＲＡ−ＳＨＴプラスミド．ＤＮＡ；８：ＰＣＲ陽性対照−ＣＭＶ、ｐＢＲＡ−ＳＨＴプラスミドＤＮＡ；９：ＰＣＲ陽性対照−ＧＦＰ、ｐＴＭ１３ＣプラスミドＤＮＡ；１０：ＰＣＲ陽性対照−ＳｐｅｃＲ、ｐＴＭ１３ＣプラスミドＤＮＡ；１１：ＰＣＲ陽性対照−ＣＭＶ、ｐＴＭ１３ＣプラスミドＤＮＡ；１２：対照Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ  Ｐ．ＤＮＡ−ＧＦＰ；１３：対照Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ  Ｐ．ＤＮＡ−ＳｐｅｃＲ；１４：対照Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ  Ｐ．ＤＮＡ−ＣＭＶ；１５：ＰＴＭ１３形質転換体上清−Ｐ．ＤＮＡ−ＧＦＰ；１６：ＰＴＭ１３形質転換体上清−Ｐ．ＤＮＡ−ＳｐｅｃＲ；１７：ＰＴＭ１３形質転換体上清−Ｐ．ＤＮＡ−ＣＭＶ；１８：ｐＢＲＡ−ＳＨＴ形質転換体上清−Ｐ．ＤＮＡ−ＧＦＰ；１９：ｐＢＲＡ−ＳＨＴ形質転換体上清−Ｐ．ＤＮＡ−ＳｐｅｃＲ；２０：ｐＢＲＡ−ＳＨＴ形質転換体上清−Ｐ．ＤＮＡ−ＣＭＶ。
【０２８４】
したがって、この実験の結果は、ｐＢＲＡベクターが、細菌により分泌されるのに対し、ｐＴＭ１３プラスミドは、細菌により分泌されないことを裏付ける。
ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ上清の視覚化および消化、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴの分泌の検証、ならびに特徴付け
【０２８５】
ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ培養物を、ＯＤ１．８まで増殖させ、ここで、培養物の１ｍＬの上清を、製造元のプロトコールに従い、Ｑｉａｇｅｎ（商標）ＱＩＡｐｒｅｐ（商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用する、プラスミド精製にかけた。溶出物を、制限酵素消化にかけ、０．８％のＰＡＧＥ上で視覚化して、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴの、陽性の形質転換体からの分泌を検証した。結果を図７に示す。パネルＡ：１．１ｋｂのラダー；２．ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ；３．ｐＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＫｉｔからのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ；パネルＢ：１．１ｋｂのラダー；２．ＥｃｏＲ１で消化されたｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ；３．ＥｃｏＲ１で消化された、ｐＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＫｉｔからのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ。
【０２８６】
この実験の結果により、細菌細胞からの、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴの分泌がより完全に確認される。
濃縮された上清の視覚化および消化、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴの分泌の検証、ならびに特徴付け
【０２８７】
野生型培養物、ｐＴＭ１３培養物、ｐＢＲＡ２．０−ＳＨＴ（原核生物発現カセット内にＳＨＴ  配列番号２４を含むｐＢＲＡ）培養物、およびｐＢＲＡ２．０−ＳＺＴ（配列番号２７のＳＺＴタンパク質を代わりに含む）培養物を、１．８のＯＤまで増殖させた。３０００ＭＷＣＯ濃縮器を使用して、７ｍＬの上清を、前記の条件の各々の下で濃縮し、試料を、フェノール−クロロホルムによるプラスミドＤＮＡ抽出にかけた。結果を、ＥｃｏＲ１を使用する制限酵素消化にかけ、０．８％のＰＡＧＥ上で視覚化して、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ形質転換体内のＤＮＡ分泌を検証した（ｖａｌｉｄ）。結果を図８に示す。パネルＡ：フェノール−クロロホルム試料：１．１ｋｂのラダー；２．１００ｂｐのラダー；３．ブランク；４．野生型、５．ｐＴＭ１３形質転換体、６．ブランク；７．ｐＢＲＡ２．０−ＳＨＴ；８．ｐＢＲＡ２．０−ＳＺＴ。パネルＢ：ＥｃｏＲ１で消化されたフェノール−クロロホルム試料。１．１ｋｂのラダー；２．野生型；３．ブランク；４．ｐＴＭ１３形質転換体；５．ブランク；６．ｐＢＲＡ２．０−ＳＨＴ形質転換体；７．ブランク；８．ｐＢＲＡ２．０−ＳＺＴ形質転換体。
（実施例８）
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属特異的ＯＲＦを検証するための、ＳＺＴ、ＳＨＴについてのウェスタンブロット解析
【０２８８】
野生型培養物、ならびにｐＴＭ１３、ｐＢＲＡ２．０−ＳＨＴ、およびｐＢＲＡ２．０−ＳＺＴで形質転換された培養物を、１．８のＯＤまで増殖させた。試料を、０．８％のＰＡＣＭゲルにロードし、電気泳動にかけ、本発明者らのハイブリッドタンパク質ＳＨＴおよびＳＺＴ  配列番号２７の発現を検出してＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属特異的プロモーターおよびターミネーターの機能性を検証する、抗ＴＡＴ抗体を使用する免疫ブロット解析のために、膜へと転写した。試料は、滅菌ＰＢＳ中で３回（ｔｈｒｅｅ  ｔｉｍｅｘ）洗浄された、新たに増殖させた細胞から調製した（ｐｒｅｐｐｅｄ）。細胞をペレット化し、氷冷浴中で３０秒間の間隔を伴う、２０秒間ずつ３回のパルスによる、脱イオン水中での超音波処理にかけた。ブラッドフォード法を使用して、試料を定量し、各試料のアリコートを、４倍濃度のＳＤＳローディング色素と混合し、摂氏９５度で１０分間煮沸し、氷上でクエンチした。これらの結果は、ｐＢＲＡ２．０上のＨＵデザインによるプロモーターおよびターミネーターの機能性は、タンパク質の発現に十分であることを示唆する。結果を図９に示す。１．Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；２．野生型、３．野生型；４．ｐＴＭ１３；５．ｐＴＭ１３；６．ｐＢＲＡ２．０−ＳＨＴ；７．ｐＢＲＡ２．０−ＳＨＴ；８．ｐＢＲＡ２．０−ＳＺＴ；９．ｐＢＲＡ２．０−ＳＺＴ。
【０２８９】
ＳＨＴおよびＳＺＴは、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴと相互作用し、ペプチド濃度の増加に応じて、ゲルシフトをもたらす。
【０２９０】
結合緩衝液中、室温で１５分間、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴを、ＳＨＴまたはＳＺＴ  配列番号２７と共にインキュベートし、ＰＡＧＥにかけた。結果を図３に示す。１．１ｋｂのラダー；２．１００ｂｐのラダー；３．５００ｎｇのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ；４．５００ｎｇのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋２ｎｇのＳＨＴ；５．５００ｎｇのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋５ｎｇのＳＨＴ；６．５００ｎｇのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋１０ｎｇのＳＨＴ；７．５００ｎｇのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋２０ｎｇのＳＨＴ；８．５００ｎｇのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋３０ｎｇのＳＨＴ、９．５００ｎｇのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋４０ｎｇのＳＨＴ；１０．５００ｎｇのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋５０ｎｇのＳＨＴ；１１．ブランク；１２．５００ｎｇのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ；１３．５００ｎｇのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋２ｎｇのＳＺＴ；１４．５００ｎｇのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋５ｎｇのＳＺＴ；１５．５００ｎｇのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋１０ｎｇのＳＺＴ；１６．５００ｎｇのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋２０ｎｇのＳＺＴ；１７．５００ｎｇのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋３０ｎｇのＳＺＴ、１８．５００ｎｇのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋４０ｎｇのＳＺＴ；１９．５００ｎｇのｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋５０ｎｇのＳＺＴ；２０．ブランク。
（実施例１０）
ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ  ＤＮＡとＳＨＴタンパク質との複合体およびＰＢＲＡ２．０  ＳＨＴ  ＤＮＡとＳＺＴタンパク質との複合体は、哺乳動物細胞系においてトランスフェクトし、ＧＦＰを発現させることが可能である。
【０２９１】
ＳＨＴおよびＳＺＴ  配列番号２７を、ＤＮＡ結合アッセイに続き、トランスフェクションアッセイにかけて、各ペプチドの細胞透過機能ドメインを検証した。製造元のプロトコールに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴを、陽性対照として、ヒト細胞系へとトランスフェクトした。細胞は、直接蛍光顕微鏡法を使用して、ＧＦＰの発現について視覚化した。結果を図１０に示す。パネル１：ＨＥＫ−２９３細胞：Ａ．対照；Ｂ．ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ；Ｃ．ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；Ｄ．ｐＢＲＡ２．０−ＳＨＴ複合体  パネル２：ＨｅＬａ細胞：Ａ．対照；Ｂ．ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ；Ｃ．ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴ＋Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；Ｄ．ｐＢＲＡ２．０−ＳＺＴ複合体。
（実施例１１）
ハイブリッドタンパク質を使用する細胞の形質転換
【０２９２】
アラビノシダーゼシグナル、ＨＵ  ＤＮＡ結合ドメイン、およびＴａｔ形質導入配列を含むハイブリッドタンパク質を、結合緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリスｐＨ７．２）中で、ｐＢＲＡ２．０  ＳＨＴプラスミドＤＮＡに結合させた。そうでないことが下記に示されない限りにおいて、手順は、上記の実施例１について示した手順と同じであった。ハイブリッドタンパク質−ｐＢＲＡ２．０結合アッセイのプロトコールは、以下の通りであった。
１．１ｎｇのＳＨＴおよび１５０ｎｇのｐＢＲＡ２．０  １を、５０μＬのＮＨＰ結合緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリスｐＨ７．２）を含有する、１．５ｍＬのエッペンドルフ管へとアリコートする。
２．得られたラダリング効果により、濃度依存的な新規のハイブリッドタンパク質−ｐＢＲＡ２．０結合を決定するように、ＳＨＴの濃度を、独立に１０、２０、３０、５０、１００、５００、および１０００ｎｇ増加させながら、ステップ１を繰り返す。
３．室温で３０分間放置し、０．８％のアガロースゲル電気泳動により視覚化する。
【０２９３】
ハイブリッドタンパク質−ｐＢＲＡ２．０による形質転換アッセイのためのプロトコール：
１．５μｇのＳＨＴおよび４００ｎｇのｐＢＲＡ２．０  １を、５０μＬのＮＨＰ結合緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリスｐＨ７．２）を含有する、１．５ｍＬのエッペンドルフ管へとアリコートし、室温で３０分間放置する。
２．１ｍＬ当たりの細胞を５×１０８個とする１５０μＬを、反応混合物へと再懸濁させる（ステップ１）。
３．嫌気性条件下で、３０分間、タンパク質−ＤＮＡ複合体を含有するテューブを静かに振とうする。
４．細胞を回収するために、嫌気性条件下で、８００μＬのＲＣＢを添加し、３７℃で４時間インキュベートする。
５．８０μＬの反応混合物を、ＲＣＡ−スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍＬ）耐性プレートに播種し、嫌気性条件下、３７℃で３日間インキュベートする。
６．陽性の形質転換体についてスクリーニングする。
【０２９４】
配列表
本明細書には、以下の配列表が組み込まれ、本開示の不可欠の一部を形成する。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表２−１４】
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【表２−１５】
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【表２−１６】
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【０２９５】
本明細書で提示される実施形態および実施例は、特許請求される対象物の一般的な性格を例示するものであり、これらを限定するものではない。当業者は、これらの実施形態を、特許請求される対象物の精神および範囲から逸脱せずに、多様な適用のために、多様な方式で、いかにたやすく変更し、かつ／または適合させうるのかを理解する。本明細書で用いられる語句、語、および用語は、例示的なものであり、限定的なものではない。法規により許容される場合、本明細書で引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。本明細書で開示される異なる実施形態の任意の態様は、可能な代替的実施形態、および代替的な特徴の組合せであって、それらの全ての変化させた特徴の組合せが、特許請求される対象物の一部を形成することが理解される組合せの範囲内で組み合わせうることが察知される。代替的に、特定の実施形態は、開示される要素のうちの任意の１または複数を含む場合もあり、これらからなる場合もあり、これらを除外する場合もある。
専属の権利または権限が主張される、本発明の実施形態を、以下の通りに定義する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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