(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３つのドメインを含む融合タンパク質であって、
（ａ）第１のドメインは、天然ヒトフェリチンの重鎖のアミノ酸配列、または天然ヒトフェリチンの重鎖のアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含み、
（ｂ）第２のドメインは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断部位のアミノ酸配列を含み、そして
（ｃ）第３のＮ末端ドメインは、プロリン、セリンおよびアラニン（ＰＡＳ）からなる少なくとも２０アミノ酸残基の非構造化ポリペプチドからなり、
前記ＰＡＳは、８０アミノ酸残基より短い長さを有する、
融合タンパク質。
【請求項２】
前記第１のドメインは、配列番号１の天然ヒトフェリチンの重鎖のアミノ酸配列、または配列番号２のヒトフェリチンの重鎖変異体のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記第２のドメインは、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７およびＭＭＰ−９からなる群から選択されるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断部位のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断部位の前記アミノ酸配列は、配列番号３〜８からなる群から選択される、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ＰＡＳポリペプチドの前記プロリン残基が、その全アミノ酸残基の１０〜４０％に達する、請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ＰＡＳポリペプチドの前記アミノ酸配列は、配列番号９および配列番号１０から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
それぞれ第１のドメインを第２のドメインに、および／または第２のドメインを第３のドメインに連結する、第１および／または第２のリンカーアミノ酸配列（複数可）を含み、前記第１および前記第２のアミノ酸配列は、互いに同じまたは異なる、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
活性成分および／または造影剤に連結している、請求項１から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質の複数のモノマーを含むナノ粒子。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸または請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤と組み合わされた、請求項１から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項９に記載のナノ粒子、請求項１０に記載の単離核酸、請求項１１に記載のベクター、または請求項１２に記載の宿主細胞を含む薬学的組成物。
【請求項１４】
薬剤としての使用のための、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
腫瘍の治療処置および／または診断における使用のための、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質、前記融合タンパク質の複数のモノマーで構成されるナノ粒子、前記融合タンパク質をコードする核酸、ならびにその診断および治療用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾患領域における治療薬剤の選択的放出は、現在の治療を改善するための最も重要な課題の１つとなっている。これに関して、治療薬剤の担体としてのナノ粒子（ナノベクター）の使用は、投与部位と最終標的との間に存在し得る生物学的障壁を回避すると共に、より具体的には、正常組織ではなく疾患領域において選択的に薬物を蓄積させることを可能にし得る。基本的な必要条件として、ナノベクターは、大量の薬物と効果的に結合することができなければならない。
【０００３】
標的化薬物放出のための既知の担体のうち、（Ｆｔ）フェリチンに基づくナノ粒子は、その生体適合性の特に優れた特性、生物学的障壁を乗り越える能力、機能化の多様性、およびある特定種の薬物に結合する能力のために、ますます関心を呼んでいる（Ｖａｎｎｕｃｃｉ，Ｌ．，Ｆａｌｖｏ，Ｅ．，Ｃｅｃｉ，Ｐ．Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｎｏｓｉｓ．２０１４，Ａ．Ｐｒｏｋｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ７）。Ｆｔは、本質的に球状のシェルを有する分子構造となる２４個のサブユニットからなる、極めて対称性の多量体タンパク質構造であり、シェルは、鉄を貯蔵するために生理学的に使用される空洞を包囲する。外径および内径は、それぞれ１２ｎｍおよび８ｎｍである。そのようなシェル状分子構造は、以降、「ナノ粒子」または「ＨＦｔナノ粒子」と呼ばれる。
【０００４】
ヒトフェリチン（ＨＦｔ）の重鎖に基づくナノ粒子は、特にｉｎ  ｖｉｖｏヒト用途に関連して、他の薬物放出系と比較していくつかの利点を示す。実際に、ＨＦｔ分子は、生物学的障壁を乗り越えるように設計され（小径２０ｎｍ）、生理学的条件下で細胞内および血液中の両方に存在するが、濃度は低い（約２０μｇ／Ｌ）。
【０００５】
天然の要素であることから、それらは強い非自己（外来）抗体および／またはＴ細胞免疫反応を誘起する可能性が低い。
【０００６】
さらに、ＨＦｔは、それだけで腫瘍細胞に効果的および選択的に結合することができる数少ないナノ粒子の１つである。実際、標的化がん治療のための最も魅力的な分子の１つであるトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）を使用することにより、ＨＦｔが内部移行されることが示されている。ＴｆＲ１は、確かに、多くの種類のがんの表面で上方調節され（正常細胞内よりも最大１００倍高い）、効率的に内部移行される。４７４を超える臨床組織試料において、ヒトフェリチンの軽鎖（ＬＦｔ）ではなくＨＦｔが、ＴｆＲ１により内部移行され、非腫瘍組織と比較して、多くの種類の腫瘍（すなわち、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、結腸がん、頸がん、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、肉腫、および胸腺がん）を９８％の感度および９５％の特異性をもって特異的に認識することが証明された（Ｆａｎ  Ｋ，Ｃａｏ  Ｃ，Ｐａｎ  Ｙ，Ｌｕ  Ｄ，Ｙａｎｇ  Ｄ，Ｆｅｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｍａｇｎｅｔｏｆｅｒｒｉｔｉｎ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２；７：４５９−６４）。
【０００７】
しかしながら、天然ＨＦｔは、いくつかの欠点を示す。第１に、ある特定種の薬物、例えばドキソルビシン（広い抗腫瘍スペクトルを有する抗新生物薬物の１つ）等に結合することができる収率が低く、これは可能な使用および臨床開発を制限し得る。第２に、天然ＨＦｔは、全身経路で注射された場合、約２〜３時間の非常に短い血漿半減期を有する。最後に、その自然のフェロオキシダーゼ活性は、ヒト骨芽細胞の成長および成熟を阻害し、石灰化の低下、骨減少および骨粗しょう症をもたらす可能性がある（Ｚａｒｊｏｕ  Ａ，Ｊｅｎｅｙ  Ｖ，Ａｒｏｓｉｏ  Ｐ，Ｐｏｌｉ  Ｍ，Ｚａｖａｃｚｋｉ  Ｅ，Ｂａｌｌａ  Ｇ，Ｂａｌｌａ  Ｊ．Ｆｅｒｒｉｔｉｎ  ｆｅｒｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ：  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０，２５：１６４−７２）。このため、阻害を生じない、部位特異的突然変異により得られるフェロオキシダーゼ活性を有さないＨＦｔ変異体（以降ｖＨＦｔと呼ばれる）を使用することが望ましい。
【０００８】
天然ＨＦｔに関する上で列挙された欠点の全てを同時に解決するために、本発明者は、タンパク質の外側表面上で直接作用することにより、ヒトフェリチン（ＨＦｔ）の重鎖を遺伝子的に改変することを決定した。その際、タンパク質空洞内に薬物ドキソルビシンをカプセル化する能力が劇的に、また驚くほど改善され、腫瘍細胞を認識するタンパク質の能力に影響を与えることなく血漿半減期が延長した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的および他の目的は、添付の請求項１に記載の融合タンパク質により達成される。他の独立請求項および従属請求項は、本発明のさらなる態様および具体的実施形態に関連するが、これらは本明細書の不可欠な部分を形成する。
【００１０】
本発明のさらなる特徴および利点は、添付の図面を参照しながら、限定としてではなく例示のみを目的として提供される以下の詳細な説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＨＦｔナノ粒子の製造の概略図であり、２４個のモノマーのそれぞれのＮ末端は、切断可能なペプチド配列に、および本質的にプロリン、アラニンおよびセリン（ＰＡＳ）からなる配列に遺伝子的に結合している。明確性のために、２４個のうち５つのみのＮ末端の存在が示されている。
【図２】治療および／または診断分子を担持するＨＦｔナノ粒子の製造の概略図である。これらは、内部空洞内に保持されてもよく、またはタンパク質の外側表面に結合してもよい。
【図３】腫瘍細胞上のＨＦｔナノ粒子の作用様式を説明する概要図である。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続くクーマシーブルーＲ−２５０での染色による、確立されたコンストラクトＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５  （ＰＡＳ長：７５残基）の１つのタンパク質発現プロファイルを示す図である。ＩＰＴＧ誘発性プラスミドｐｅｔ−１１ａを使用することにより大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３において組換えタンパク質を作製し、実施例に関連した項で説明されるように精製した。レーン１：非ＩＰＴＧ誘発細胞の可溶性および不溶性分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン２：０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘発された細胞の可溶性および不溶性分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳバンドは、黒矢印で示され、２８．５ｋＤａの計算質量とは対照的に、約４０ｋＤａで移動する。この現象は、ＰＡＳ化タンパク質に関して報告された他のものと一致しており、ＰＡＳ配列の低減されたＳＤＳ結合に起因する。さらに、ＰＡＳ配列は、クーマシーブルーにより僅かに染色され、これはゲル中のタンパク質バンドの過小評価につながる。
【図５】天然ＨＦｔ（点線）および融合タンパク質コンストラクトＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５（実線）、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０（一点鎖線）  またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）５ｋＤａで機能化されたＨＦｔ（ＨＦｔ−ＰＥＧ５Ｋ、破線）のサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを示す図である。
【図６】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのプロテアーゼＭＭＰ−２／９（コラゲナーゼＩＶ）によるＰＡＳ除去の前（実線）および後（点線）の、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５の典型的なサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを示す。
【図７】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのプロテアーゼＭＭＰ−２／９（コラゲナーゼＩＶ）によるＰＡＳ除去の前および後の、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５の移動プロファイルを示す図である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、クーマシーブルーＲ−２５０で染色された。レーン１：タンパク質マーカー；レーン２：ＨＦｔ（１ｍｇ／ｍｌ）；レーン３：０．２ｍｇ／ｍｌ  ＭＭＰ−２／９プロテアーゼ（コラゲナーゼＩＶ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ分解後のＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５（２ｍｇ／ｍｌ）；レーン４：０．２ｍｇ／ｍｌ  ＭＭＰ−２／９プロテアーゼ（コラゲナーゼＩＶ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ分解後のＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５（２ｍｇ／ｍｌ）。
【図８】天然ＨＦｔタンパク質および文献からの他のデータと比較した、確立されたコンストラクトの２つ（ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０およびＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５）によりドキソルビシンをカプセル化する能力を示す表である。相対的収率は、％タンパク質回収、およびカプセル化されたドキソルビシン分子の数に関して示されている。本特許の主題のコンストラクトは、驚くべきことに、また予想外にも、天然ＨＦｔと比較して少なくとも６倍改善された、薬物ドキソルビシンをカプセル化する能力を獲得したことが確認され得る。
【図９】経時的な％薬物放出に関する、４℃および３７℃でのフェリチン−ドキソルビシン複合体（ＨＦｔ−ＤＯＸＯ、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０−ＤＯＸＯおよびＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５−ＤＯＸＯ）の安定性を示す図である。本発明に記載のＨＦｔに対して行われた改質により、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０コンストラクト（ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５でもまた同じ結果が得られた）は、その薬物結合形態において、対応する天然ＨＦｔコンストラクトと比較してはるかに安定である（４℃または３７℃で保存された場合、経時的に放出される薬物の％がより低い）。アスタリスク（＊）は、材料が曇って析出する傾向を有していたため、天然ＨＦｔ試料において放出された薬物の量がこの期間を超えて決定することができなかったことを示す。
【図１０】２８０ｎｍ（実線）および４８５ｎｍ（点線）に読取り値を有する、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０−ＤＯＸＯの典型的なサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを示す。
【図１１】肉腫ＨＴ−１０８０細胞に対するＤＯＸＯＲＵＢＩＣＩＮ、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５およびＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５−ＤＯＸＯの抗増殖活性を示す図である。
【図１２】ドキソルビシン含有化合物に対する薬物動態試験からの結果を示す図である。ドキソルビシン血漿濃度は、裸の薬物ドキソルビシンおよびＩＮＮＯ−２０６（新しくより活性なドキソルビシン製剤）の、またはフェリチンベースの化合物、天然ＨＦｔ、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０およびＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５内にカプセル化されたドキソルビシンの、健康なマウスにおける静脈注射後に異なる時点（１０、６０、１８０、３６０および１４４０分）で計算された。
【図１３】ヒト膵臓腫瘍（異種移植）を有するマウスにおける治療効果を評価するための典型的な実験を示す図である。腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に達したら、マウス群（ｎ＝６）を５ｍｇ／ｋｇドキソルビシンの単回投薬で４回（４日毎）処置した。試験した化合物は、ＩＮＮＯ−２０６、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０−ＤＯＸＯおよびＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５−ＤＯＸＯであった。図中、腫瘍（および代表的画像）の重量が、処置の開始から約３週間後に報告されている。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の主題である融合タンパク質は、少なくとも３つのドメインを含む。
【００１３】
第１のドメインは、ヒトフェリチンの重鎖のアミノ酸配列を含む。そのようなアミノ酸配列は、天然配列、または少なくとも９０％の配列同一性を有する天然配列の変異体である。ヒトフェリチンの重鎖は、１８３アミノ酸（配列番号１）の長さを有するため、少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体は、天然配列と比較して最大１９のアミノ酸置換を含有する。この定義は、中でも、フェロオキシダーゼ活性を有さない上述のｖＨＦｔ変異体のアミノ酸配列の配列番号２を含み、これは代替の変異体を表す。ｖＨＦｔのアミノ酸配列は、グルタメート６２に代わるリシン、およびヒスチジン６５に代わるグリシンの２つのアミノ酸置換を特徴とする。
【００１４】
本発明の融合タンパク質の第２のドメインは、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断部位、具体的にはＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７またはＭＭＰ−９のアミノ酸配列を含む。限定されない例として、以下にいくつかのペプチドを列挙するが、これらはコラーゲン鎖の切断配列を模擬的に示し、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９により特に効果的に切断される。
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（配列番号３）
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（配列番号４）
Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号５）
Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号６）
Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号７）
【００１５】
意図される酵素に対する切断部位を含有するアミノ酸配列はまた、例えば以下に示されるような配列で、切断部位が数回反復されるように構築されてもよい。
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（配列番号８）
【００１６】
上で言及されたアミノ酸配列は全て、本発明による融合タンパク質およびナノ粒子の製造の、代表的であるが限定されない例である。
【００１７】
Ｎ末端に連結した本発明の融合タンパク質の第３のドメインは、プロリン、セリンおよびアラニン（簡潔性のために「ＰＡＳ」と呼ばれる）に富むポリペプチドのアミノ酸配列からなり、好ましくは薬物ドキソルビシンの薬物カプセル化プロセスの間のタンパク質の安定化を増加させること、およびタンパク質−薬物複合体の安定性を増加させることを目的とする。ＰＡＳの存在はまた、タンパク質表面をマスキングすることができ、したがって血漿半減期を延長することができる。
【００１８】
ポリペプチドＰＡＳは、主に、Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＳｅｒに富むアミノ酸配列からなり、これらは非構造化ポリマーを形成し、またその長さは、好ましくは８０アミノ酸残基より短く、より好ましくは２０から８０アミノ酸残基の間に含まれ、さらにより好ましくは４０から７５アミノ酸残基の間に含まれる。好ましい実施形態において、上述のポリペプチドＰＡＳのプロリン残基は、ポリペプチドＰＡＳの全アミノ酸残基の１０〜４０％に達する。
【００１９】
本発明の範囲内で使用されるのに特に好適である、したがって好ましいＰＡＳポリペプチドの例は、４０または７５アミノ酸残基、例えば以下のアミノ酸残基等のＰＡＳポリペプチドである。
ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号９）
ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡ（配列番号１０）
【００２０】
安定化およびマスキングＰＡＳポリペプチドは、本発明の融合タンパク質に置換可能なマスキングを提供するために、以前に上述したように１つ以上のメタロプロテイナーゼ切断部位を含有する短鎖ペプチド配列を介してＨＦｔの表面に付加される。実際に、ＰＡＳポリペプチドは、細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）により標的組織において選択的に除去され得る。特に、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９は、腫瘍微小環境において過剰発現し、血管形成、浸潤、および腫瘍転移に関与する重要なメタロプロテイナーゼであることが示された。
【００２１】
本発明の範囲内のフェリチンの多量体表面上のＰＡＳポリペプチドの使用は、先行技術に勝るいくつかの利点を提供する。フェリチンのタンパク質空洞内に薬物または小分子をカプセル化するために、これまで最も明白な措置が取られた、すなわち、薬物またはタンパク質の内側空洞自体が直接改変された。このようにして、フェリチンの内側空洞内の薬物（または小分子）と結合部位との間の相互作用が有利となる。例えば、カプセル化収率を増加させるために、ドキソルビシンが銅（ＩＩ）と事前に複合化された（Ｚｈｅｎ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１３  Ｊｕｎ  ２５；７（６）：４８３０−７）。フェリチンの内側空洞を金結合ペプチドで遺伝子的に改変することにより、金ナノ粒子がカプセル化された（Ｚｈｅｎｇ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１０  Ｊａｎ  ２９；２１（４）：０４５３０５）。しかしながら、本発明者は、薬物の存在下でＨＦｔを解離させる（ｐＨ２．０）および再結合させる（ｐＨ７．５）ために一般的に使用されるｐＨの突然の変化の間、タンパク質を安定化させるために、不活性ＰＡＳポリマーを使用して外側タンパク質表面上で直接作用させることを決定した。ＰＡＳポリマーの存在はまた、その表面上の薬物の非特異的結合を制限し得る。
【００２２】
さらに、ＰＡＳの存在はまた、ＸＬ−ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｍｂｈ社が最近いくつかのタンパク質に関して提案したように、タンパク質の血漿半減期を延長する方法となり得る。実際に、「ＰＡＳ化」と呼ばれる技術は、ＰＥＧの生物学的代替品として自然非構造化アミノ酸鎖を使用してバイオ医薬品の血漿半減期を延長することができる（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  Ｍ，Ｂｉｎｄｅｒ  Ｕ，Ｂoｒｇｅｒ  Ｃ，Ｔｈｅｏｂａｌｄ  Ｉ，Ｗａｃｈｉｎｇｅｒ  Ｋ，Ｋｉｓｌｉｎｇ  Ｓ，Ｈａｌｌｅｒ  Ｄ，Ｓｋｅｒｒａ  Ａ．ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ：  ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２０１３，２６：４８９−５０１）。この技術を使用して、生物学的に活性なタンパク質が、小アミノ酸プロリン、セリンおよびアラニン（ＰＡＳ）の数百の残基を含むポリペプチド配列と遺伝子的に融合される。一般に、ＰＡＳ配列は、生物学的に活性なタンパク質に融合した１００〜３０００残基（好ましくは４００〜６００残基）からなる。特許ＷＯ２００８／１５５１３４において言及されている生物学的に活性なタンパク質は、結合タンパク質、抗体断片、サイトカイン、成長因子、酵素、ホルモンのカテゴリーに分類される。ヒトフェリチンの重鎖は言及されておらず、特にｖＨＦｔ形態では、列挙されたカテゴリーに属さない。以降でさらに詳細に説明される本発明者により行われた試験によれば、ヒト（天然または変異体）フェリチンの重鎖において、ＰＡＳ配列は、ＷＯ  ２００８／１５５１３４に記載されるものよりはるかに短く、例えば８０アミノ酸残基より短くなり得る。換言すれば、２４個のモノマーからなるナノ粒子を形成するＨＦｔの特定の能力を利用することにより、はるかに短いＰＡＳ配列が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＦｔの血漿半減期を延長させる上で効果的および効率的であることが明らかである。マスキングＰＡＳポリペプチドの長さの選択は、所望の特性を有するＨＦｔの開発において重要なステップである。実際に、一方では、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、ＨＦｔが所望の部位で蓄積することができるように十分長くなければならない。他方では、ＨＦｔは、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）に富む環境において、マスキングポリマーから解放されることが可能でなければならない。ＰＡＳ配列が短過ぎる場合、コンストラクトは、生物から過度に急速に除去され得る。ＰＡＳ配列が長過ぎる場合、コンストラクトは、それを標的組織および細胞から分離する生物学的障壁（すなわち、血管、密着結合、腫瘍間質等）を乗り越えるのを阻害し得、ならびに／または、ＭＭＰ切断部位（複数可）をマスキングし得る。
【００２３】
さらに、過剰発現し、完全に可溶性であり、また適切に折り畳まれ集合する最終タンパク質生成物の達成は、本発明の融合タンパク質の場合のように、タンパク質のＮ末端が改変されている場合、事前に明らかではない。確かに、タンパク質のＮ末端改変は、その発現、可溶性、ならびに／または適切な折り畳みおよび集合を悪化させる可能性があることは周知である。
【００２４】
これらの結果の全て、特に薬物ドキソルビシンのカプセル化収率の改善は、驚くべきことに、および予想外にも、本発明者により達成され、本発明者は、遺伝子融合技術および組換えタンパク質の生成技術の両方を使用することにより、天然形態または変異体形態（好ましくはｖＨＦｔ）でのヒトフェリチン（ＨＦｔ）の重鎖に基づくナノ粒子を構築した。特に、実施例に関連する項にいて詳細に説明されるように、単一の核酸配列（例えばＤＮＡ）において、図１に記載される３つの配列、すなわちｉ）ＨＦｔ（またはｖＨＦｔ）；ｉｉ）ＭＭＰ−２／９により切断可能な短ペプチド配列（ＭＭＰ）；ｉｉｉ）好ましくは２０から８０残基の間に含まれる長さを有するＰｒｏ、ＳｅｒおよびＡｌａ（ＰＡＳ）に富む非構造化ポリペプチド配列をコードする、遺伝子コンストラクトが作製された。配列ｉｉ）およびｉｉｉ）は、その可逆的なマスキングのために、ＨＦｔのＮ末端に結合している。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質ＨＦｔは、それぞれ第１のドメインを第２のドメインに、および／または第２のドメインを第３のドメインに連結する、第１および／または第２のリンカーアミノ酸配列（複数可）を含む。第１および／または第２のアミノ酸配列は、互いに同じまたは異なってもよい。
【００２６】
既に上述したように、本発明者により得られたＨＦｔ融合タンパク質は、治療的（化学化合物、モノクローナル抗体、ペプチド等）および／または診断分子を担持することができるＨＦｔナノ粒子を自発的に形成する（図２）。好ましい実施形態において、少なくとも５つの治療および／または診断分子がＨＦｔナノ粒子の内側空洞内にカプセル化されるか、またはＨＦｔナノ粒子の表面に共有結合する。結合した薬物の量およびタンパク質−薬物複合体自体の安定性は、ＰＡＳポリペプチドの存在のために、非改変タンパク質と比較して大幅に増加する。本明細書において使用される場合、「タンパク質−薬物複合体の安定性」という用語は、空洞内に薬物を維持し、複合体の保存期間の間経時的に放出しない、ＨＦｔ融合タンパク質の能力を指す。その最終的な使用の前のＨＦｔタンパク質からの薬物の放出は、析出、クラスタ化、および最終生成物の損失等の望ましくない効果をもたらし得る。
【００２７】
薬物または診断薬剤の標的化された結合および放出系として機能する、本発明のＨＦｔナノ粒子は、循環内、およびＭＭＰを発現しない、または不十分に発現する組織内で一時的に不活性であり、その後、それらがＭＭＰ（ＭＭＰ−２／９）に富む標的組織に到達すると活性化され、それらが保持しているものが放出され得る（図３）。治療分子は、例えば医薬品活性成分である。本明細書において使用される場合、「医薬品活性成分」またはより単純に「活性成分」という表現は、任意の薬学的に活性な分子（化学化合物、モノクローナル抗体、ペプチド等）、例えばがんの処置に使用され得る分子を指す。本発明における使用に好ましい活性成分は、例えば、限定されることなく、ドキソルビシン、パクリタキセル、ゲムシタビンおよび白金系活性成分である。上で列挙された活性成分の前駆体もまた使用され得る。
【００２８】
診断分子は、例えば造影剤である。本明細書において使用される場合、「造影剤」という用語は、器官、組織または体組織の可視化を可能にする分子に関する。例示的な造影剤は、常磁性薬剤、光学プローブ、および放射性核種を含む。「光学プローブ」という用語は、第１の波長での励起、および第２の波長での読取りにより検出され得る蛍光化合物を指す。例示的な光学プローブは、フルオレセインイソチオシアネートならびに５−（および６）−カルボキシテトラメチルローダミン、スクシンイミジルエステルを含む。
【００２９】
診断および治療用途において、標的化担体系として機能する本発明のＨＦｔナノ粒子は、任意の好適な投与経路により、例えば、経口投与により、非経口投与により、静脈内投与により、腹腔内投与により、筋肉内投与により、坐剤として、病巣内投与により、鼻腔内または皮下投与により、髄腔内投与により、リンパ管内投与により、微液滴の吸引により、または徐放デバイス、例えば浸透圧ポンプの移植により、対象または患者に投与され得る。本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、人間、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス等を含む哺乳動物等の動物に関連する。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「処置する」または「処置」という用語は、ある特定の疾患、病巣、状態または症状の処置における成功または改善の兆候、あるいは、ある特定の状況においては、症状または状態の発生の予防を指す。
【００３１】
治療用途において、本発明のＨＦｔナノ粒子は、治療有効用量の医薬品活性成分の投与のために使用される。「治療有効用量」は、投与される治療効果を生じる用量を意味するように意図される。厳密な用量は、処置の目的、対象、処置される疾患等を含むいくつかの因子に依存し、それ自体知られている方法を使用することにより、当業者に容易に決定され得る（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  （ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ  （１９９９）；Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ  （１９９９）；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい）。
【００３２】
本発明のＨＦｔナノ粒子は、例えば、活性成分をナノ粒子の空洞内に封鎖することにより、またはそれをナノ粒子表面に共有結合させることにより、薬学的成分の投与を必要とする任意の疾患の処置に使用され得る。ナノ粒子はまた、疾患の診断に、より具体的には、造影剤をナノ粒子の空洞内に封鎖することにより、またはそれをナノ粒子表面に共有結合させることにより、造影に使用され得る。
【００３３】
本発明のＨＦｔナノ粒子は、任意の疾患、好ましくは、癌腫、神経膠腫、中皮腫、黒色腫、肉腫、リンパ腫、白血病、腺癌、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、膠芽腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌、バーキットリンパ腫、頭頸部がん、結腸癌、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、肝胆道がん、膀胱がん、小腸がん、直腸がん、腎臓がん、胆嚢がん、陰茎がん、尿道がん、精巣がん、頸がん、膣がん、子宮がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、膵内分泌腫瘍、カルチノイド腫瘍、骨がん、皮膚がん、網膜芽細胞腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫等のがんを含む、過剰増殖性疾患の処置のために対象に投与され得る（その他のがんの種類に関しては、ＣＡＮＣＥＲ：  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  （ＤｅＶｉｔａ，Ｖ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照されたい）。
【００３４】
以下の実施例は、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲を制限するものとしてではなく、例示を目的として提供される。
【実施例】
【００３５】
例１
ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０およびＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５融合タンパク質の発現ベクトルの構築
ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ（またはｖＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ）コンストラクトを設計するための第１のステップとして、Ｘ線結晶学により実験的に決定された、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）においてコード３ＡＪＯで利用可能なＨＦｔの三次元構造に基づいて、いくつかの分子モデルを構築した。この構造を計算的に改変するために、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ分子モデルソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．）を使用した。
【００３６】
ｉ）好適な流体力学的容積を有する、Ｖａｎｎｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）において説明されたＨＦｔ変異体のモデルを構築するために、ＨＦｔの表面上に表示された−ＳＨ基に結合した１１０個のＰＥＧ単位を含有するポリマーを使用した。ＰＥＧポリマーは、持続的循環ＰＥＧ化ＨＦｔ（ＰＥＧ  ５ｋＤａ）に対して実験的に測定された流体力学的容積を反映するように、タンパク質表面上に密に充填された構造にモデル化された（Ｖａｎｎｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２を参照されたい）。
【００３７】
ｉｉ）新たなＨＦｔのモデルを構築するために、選択されたＭＭＰ切断配列（配列番号５）を、各ＨＦｔサブユニット（配列番号１）の露出したＮ末端に結合させ、いくつかの異なる長さのＰＡＳポリマーを構築した。これらのＰＡＳポリマーを、３つのグリシン残基を介してＭＭＰ切断配列に結合させ、それらの容積をＰＥＧ化ＨＦｔのものと比較した。まず、ペプチド結合およびプロリン残基の存在によって、ＰＡＳポリマーが、極めて柔軟なＰＥＧと比較して大幅に減少した自由度を有することを考慮して、２つの異なるシナリオ、すなわち拡張した構造（ＰＡＳ４０）およびより充填された構造（ＰＡＳ７５）を反映するために２つのＰＡＳ長を選択した。
【００３８】
ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０遺伝子は、ＨＦｔ（配列番号１）、ＭＭＰ（配列番号５）およびＰＡＳ（配列番号９）の３つの異なる配列を単一の配列として組み合わせることにより達成された。３つのグリシン残基からなるリンカーが、ＨＦｔとＭＭＰとの間、およびＭＭＰとＰＡＳとの間に挿入された。
【００３９】
ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５遺伝子は、ＨＦｔ（配列番号１）、ＭＭＰ（配列番号５）およびＰＡＳ（配列番号１０）の３つの異なる配列を単一の配列として組み合わせることにより達成された。３つのグリシン残基からなるリンカーが、ＨＦｔとＭＭＰとの間、およびＭＭＰとＰＡＳとの間に挿入された。
【００４０】
ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０遺伝子またはＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５遺伝子を含有するｐＥＴ−１１ａ発現ベクターは、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｇｅｒｍａｎｉａ）を使用することにより合成された。遺伝子合成は、大腸菌における高レベルの発現のためのコドン最適化を考慮して行われた。
【００４１】
例２
ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０およびＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５融合タンパク質の細菌発現および精製
例１からのＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０またはＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５を含有するｐＥＴ−１１ａ発現ベクターを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に挿入し、ジデオキシ配列決定法により配列決定して、正しい遺伝子の存在を確認した。組換えプラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、アンピシリンを含有する１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）液体培地（２３．６ｇ／Ｌの酵母抽出物、１１．８ｇ／Ｌのトリプトン、９．４ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、２．２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４）中３７℃で、０．６のＯＤ６００まで培養した。遺伝子発現は、０．５ｍＭのイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより誘発し、培養物をさらに３時間インキュベートした。細胞を遠心分離（１５０００ｒｐｍで２０分間）により収集し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＥＤＴＡ、および３００ｍＭのＮａＣｌ中に懸濁させ、超音波処理により破壊した。溶解物を１５０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、可溶性分画を含有する上澄みを、０．１ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅで３７℃で３０分間処理し、５ｍＭのＭｇＣｌ２で濃縮し、７５℃に１０分間加熱し、氷上で冷却し、次いで遠心分離して変性タンパク質を除去した。６５％の濃度の飽和（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウムを使用することにより、回収された上澄みを沈殿させた。ペレットを再懸濁させ、３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２５ＭのＮａＣｌに対して一晩透析し、次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で事前に平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｈｉｌｏａｄ  ２６／６００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に投入した。分画をプールし、濃縮し、滅菌濾過し、４℃で保存した。ＳＤＳの存在下で行った１５％ＰＡＧＥゲルのクーマシーブルー染色を使用することにより、全ての調製物の純度を評価した。ＰｒｏｔＰａｒａｍソフトウェア（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）により得られたモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍで分光光度法によりタンパク質濃度を決定した。
【００４２】
ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５コンストラクトの細菌発現プロファイルを図４に示す。
【００４３】
例３
ＨＦｔタンパク質のＰＥＧ化型の調製
天然ＨＦｔをＰＥＧ  ５ｋＤａでＰＥＧ化し、サイズ排除クロマトグラフィー実験（ＳＥＣ）において標準として使用した。溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を、ｐＨ７．０のＰＢＳ中、室温で約２時間撹拌しながら、１．０ｍＭのメトキシポリエチレングリコールマレイミド５ＫＤａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でインキュベートした。その後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ）からの３０ｋＤａ回転濾過デバイスを使用して、試料の濾過およびＨ２Ｏｄｄとの交換を５回行い、過剰の試薬を除去した。ＰＥＧ化試料（ＨＦｔ−ＰＥＧ５Ｋ）を滅菌濾過し、４℃で保存した。
【００４４】
例４
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による、ＨＦｔ、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５およびＨＦｔ−ＰＥＧ５Ｋの流体力学的容積の評価
ｐＨ７．５のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化されたゲル濾過Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６カラムを使用することにより、ＳＥＣ実験を行った。試料は全て、濾過されたＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬで調製した。
【００４５】
ＳＥＣ溶出プロファイルは全て、Ｏｒｉｇｉｎ  ８．０（Ｏｒｉｇｉｎｌａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）で分析した。ＨＦｔおよびその融合タンパク質または機能化型の溶出プロファイルを、図５に示す。これらの結果は、ＰＡＳ化型の両方が、天然タンパク質と比較してより高く、またＰＥＧ化型（ＰＥＧ  ５ｋＤａ）のＨＦｔと同等の流体力学的容積を有し、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５が若干より高く、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０が若干より低いことを示している。さらに、ＰＡＳ化型の両方が、ＰＥＧ化型と比較して、より均質で単分散性のプロファイルを有する。これらの流体力学的容積は、本発明者の目的に適切な値であると考えられ、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５およびＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０融合タンパク質の両方が、さらに特性決定され、薬物をカプセル化するため、およびがん処置のためのナノ担体として使用された。
【００４６】
例５
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのプロテアーゼＭＭＰ２／９の存在下におけるＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５融合タンパク質からの保護ＰＡＳの除去
ＭＭＰ感受性コンジュゲートの酵素的切断を分析するために、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５の切断をＭＭＰ−２／９の存在下で試験した。ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５の溶液をコラゲナーゼＩＶ（ＭＭＰ２および９を含有）と混合し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、ｐＨ７．５のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化されたゲル濾過Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６カラムを使用して（図６）、およびＳＤＳゲルクロマトグラフィーにより（図７）、試料をＳＥＣ実験において試験した。
【００４７】
例６
化学療法剤を担持するＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０およびＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５の調製
化学療法剤として、本発明者は、薬物ドキソルビシン（ＤＯＸＯ）を使用した例を報告した。ＤＯＸＯは、ｐＨに応じたタンパク質非共役−共役プロセスを利用することにより、２つの融合タンパク質のタンパク質空洞内にカプセル化した。反応は、１．５ｍＭのＤＯＸＯの好ましい濃度および５μＭのタンパク質の好ましい濃度を使用することにより行った。カプセル化反応は、１．８から２．５の間に含まれるｐＨ、より好ましくは２．０のｐＨの酸性条件下で、ＤＯＸＯおよびタンパク質を暗所で穏やかに混合することにより行った。反応温度は、通常、５から３０分、好ましくは１０分の期間で、＋１０℃から＋４０℃の間に含まれ、好ましくは＋２５℃である。その後、濃ＮａＯＨを使用して溶液を６．５から９．０の間に含まれるｐＨに、より好ましくはｐＨ７．５に速やかに調節し、さらに３０分間撹拌し続けた。次いで、溶液を４℃で１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄みを、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１０から１６時間に含まれる期間、暗所で４℃で透析した。最終ステップとして、３０ｋＤａ回転デバイスＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ）により、溶液を所望の濃度に調節した。ＤＯＸＯを含有するＨＦｔナノ粒子（ＮＰ）（ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０−ＤＯＸＯおよびＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５−ＤＯＸＯ）を滅菌濾過し、暗所で４℃で保存した。
【００４８】
例７
薬物ドキソルビシンのカプセル化収率の試験
確立されたコンストラクトの２つ（ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０およびＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５）によるドキソルビシンのカプセル化能力を試験し、天然ＨＦｔタンパク質の能力および文献からの他のデータと比較した。ドキソルビシンの量は、試料を２５℃で３０分間酸性イソプロパノール（２Ｎ  ＨＣｌ）でインキュベートした後に決定した。評価は、ＵＶ−可視分光光度計を使用することにより、４８５ｎｍの読取り値、および９２５０Ｍ−１ｃｍ−１のＤＯＸＯの吸光係数を用いて行った。
次いで、相対的収率を、％タンパク質回収、およびカプセル化されたドキソルビシン分子の数に関して報告した（図８）。本特許の主題のコンストラクトは、驚くべきことに、また予想外にも、天然ＨＦｔと比較して少なくとも６倍良好な、薬物ドキソルビシンをカプセル化する能力を獲得したことが確認され得る。
【００４９】
例８
フェリチン−ドキソルビシン複合体の安定性の試験
フェリチン−ドキソルビシン複合体の安定性を、経時的な％薬物放出に関して、４℃および３７℃で試験した。放出されたドキソルビシンの％は、ｐＨ７．５のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化されたゲル濾過Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６カラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により評価した。試料は全て、２８０および４８５ｎｍでの吸収に従い、濾過されたＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬに調製した。ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０−ＤＯＸＯの典型的な溶出プロファイルを、図１０に示す。
図９に示されるように、本特許に記載のＨＦｔに対して行われた改変によって、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０コンストラクト（ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５でも同じ結果が得られた）は、対応する天然ＨＦｔコンストラクトと比較して、その薬物結合形態においてはるかにより安定である。
【００５０】
例９
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５−ＤＯＸＯの抗増殖効果
増殖を試験するために、ヒト肉腫細胞（ＨＴ−１０８０）を、３７℃の２００μｌの完全培地中、約５×１０３／ウェルで９６ウェルプレート上に播種した。翌日、ウェルにＰＢＳ、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５、ドキソルビシンまたはＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５−ＤＯＸＯを３回、異なる濃度のドキソルビシンで加え、細胞を７２時間培養した。培養中の最後の４時間の間、［３Ｈ］−チミジンを添加し（１μＣｉ／ウェル；１ｍＣｉ＝３７ＭＢｑ）、洗浄した細胞を溶解させ、ＴＣＡ沈殿可能な放射能をカウントすることにより、取り込みを評価した。
【００５１】
培養されたがん細胞に対するＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５−ＤＯＸＯの抗増殖効果を、図１１に示す。結果は、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５−ＤＯＸＯが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長させた肉腫細胞を濃度依存的に効果的に阻害することを示しており、ＩＣ５０値は、封入されていないドキソルビシンと比較して、同一であるか、またはさらにはより低い。これらの結果は、潜在的治療用途の観点から、主として重要である。
【００５２】
例１０
ドキソルビシン含有化合物に対する薬物動態実験
血漿安定性および薬物動態を評価するために、健康なマウスにドキソルビシン含有化合物を静脈内注射した。次いで、血液試料を異なる時点（１０、６０、１８０、３６０および１４４０分）で採取し、酸性イソプロパノール（０．７５Ｎ  ＨＣｌ）で１：１０に希釈し、−２０℃で凍結した。翌日、抽出したドキソルビシンを、マルチモードスキャンプレートリーダを使用して、４８５ｎｍの励起および５９０ｎｍの発光で蛍光を測定することにより定量した。ドキソルビシン、ＩＮＮＯ−２０６（新しくより活性なドキソルビシン製剤）、ＨＦｔ−ＤＯＸＯ、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０−ＤＯＸＯおよびＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５−ＤＯＸＯの試料を評価した。結果を図１２に示す。
【００５３】
例１１
動物モデルにおけるドキソルビシン含有化合物の治療効果の評価
ドキソルビシン含有化合物の治療効果を評価するための典型的な実験を、ヒト膵臓腫瘍（異種移植）を有するマウスにおいて行った。腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に達したら、マウス群（ｎ＝６）を５ｍｇ／ｋｇドキソルビシンの単回投薬で４回（４日毎）処置した。試験した化合物は、ＩＮＮＯ−２０６、ＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ４０−ＤＯＸＯおよびＨＦｔ−ＭＭＰ−ＰＡＳ７５−ＤＯＸＯであった。処置の開始から約３週間後の腫瘍重量の典型的な実験の結果（および代表的画像）を、図１３に報告する。図に示されるように、本発明者により確立されたドキソルビシン含有コンストラクトは、試験した用量において、薬物ドキソルビシンの新たな製剤（ＩＮＮＯ−２０６）と比較してより高い治療活性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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