(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のいずれかのアミノ酸配列を有するグライコシンターゼ。
（１）配列表の配列番号１または３に記載されるアミノ酸配列；または
（２）配列表の配列番号１または３に記載されるアミノ酸配列において１から２０個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有するアミノ酸配列を有し、抗体糖鎖のリモデリングに使用できるグライコシンターゼ活性を有するアミノ酸配列：
【請求項２】
請求項１に記載のグライコシンターゼのアミノ酸配列をコードすることを特徴とするグライコシンターゼ遺伝子。
【請求項３】
下記のいずれかの塩基配列を有する請求項２に記載のグライコシンターゼ遺伝子。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列中の塩基番号１から２５３２で特定される塩基配列；
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列中の塩基番号１から２５３２で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換および／または付加を有する塩基配列を有し、グライコシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：
（３）配列表の配列番号４に記載の塩基配列中の塩基番号１から２５３２で特定される塩基配列；
（４）配列表の配列番号４に記載の塩基配列中の塩基番号１から２５３２で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換および／または付加を有する塩基配列を有し、グライコシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：
【請求項４】
請求項２または請求項３に記載のグライコシンターゼ遺伝子を含むことを特徴とする組換えベクター。
【請求項５】
発現ベクターである、請求項４に記載の組換えベクター。
【請求項６】
請求項４または請求項５に記載の組換えベクターにより形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養し、該培養物からグライコシンターゼを採取することを特徴とするグライコシンターゼの製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載のグライコシンターゼを用い、一方または両方のＨ鎖に糖鎖成分としてフコースがα１，６−結合したＮ−アセチルグルコサミンのみが、「抗体のＦｃ領域に存在する糖鎖付加部位」に結合した抗体をアクセプター基質とし、高マンノース型糖鎖をドナー基質として、ドナー基質由来の高マンノース型糖鎖をアクセプター基質に糖鎖転移する反応工程を含む、１本または２本のコアフコースが付加した高マンノース型糖鎖をもつことを特徴とする抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖鎖転移活性を有する酵素であるグライコシンターゼおよび該酵素をコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
詳細には、糖タンパク質、特に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体に結合しているＮ結合型糖鎖をエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）等のエンドグリコシダーゼで切断し、該タンパク質の糖鎖付加部位であるアスパラギン残基にＮ−アセチルグルコサミンのみが結合した状態のタンパク質、あるいはそのＮ−アセチルグルコサミンにコアフコースとよばれるα１，６−結合したフコースが付加した状態のタンパク質をアクセプター基質とし、オキサゾリン糖鎖を含む各種糖鎖をドナー基質とした場合、このアクセプター基質にドナー基質由来の糖鎖を転移する活性を有する酵素（グライコシンターゼ）および該酵素をコードするＤＮＡに関する。
一般に、糖タンパク質の糖鎖は不均一な構造をしているが、これを均一な構造にすることで、該糖タンパク質の機能や安定性の向上、品質の維持などがはかれる可能性がある。また、特定の、あるいは新規の糖鎖構造を有する糖タンパク質を作成することで、該糖タンパク質の機能を向上させたり、新規機能を付加したりすることができる。グライコシンターゼは均一な糖鎖構造をもつ糖タンパク質の製造に有用である。グライコシンターゼは所望する糖鎖構造をもつ糖タンパク質の製造に有用である。すなわち、グライコシンターゼは自在な糖鎖構造をもつ糖タンパク質の製造に有用である。  
【背景技術】
【０００３】
多くのタンパク質には翻訳後修飾として糖鎖付加がなされている。糖鎖付加の様式には２種類あって、タンパク質中のＡｓｎ−Ｘａａ（Ｐｒｏ以外のアミノ酸）−Ｓｅｒ／Ｔｈｒという配列中のＡｓｎに糖鎖が付加される場合はＮ結合型糖鎖、タンパク質中のＳｅｒ、Ｔｈｒの水酸基を介して糖鎖が付加される場合はＯ結合型糖鎖とよぶ。
【０００４】
糖鎖はタンパク質が適正なｆｏｌｄｉｎｇをとる際に必要であったり、当該タンパク質の分泌促進、機能発現、血中での安定化、分子間相互作用などにも関与していたりする。ところで、糖鎖は遺伝子の直接産物ではない。すなわち、タンパク質の特定の糖鎖付加部位にどういった構造の糖鎖が付加されるのかは、遺伝子によって決まっているわけではなく、各糖転移酵素の発現量や糖ヌクレオチド基質の存在量の違いなどの影響をうけて、その都度変化する。従って、同じタンパク質の同じ糖鎖付加部位に、いつも同じ構造の糖鎖が付加されるわけではなく、むしろ多種多様な構造の糖鎖が付加されるほうが一般的である。つまり、ある糖タンパク質の集団をみると、タンパク質のアミノ酸配列の観点からは均一な集団でも、糖鎖構造の観点からは、通常、不均一な集団である場合が多い。
【０００５】
抗体医薬などの糖タンパク質製剤の場合、このような糖鎖の不均一性によって、品質のばらつきが生じる可能性がある。特に、糖鎖が糖タンパク質製剤としての機能や安定性に直接関わる場合、そういった機能性糖鎖の含量が異なれば、力価や安定性にも影響することが考えられる。このような糖鎖の不均一性は、医薬品として十分な品質管理をする上で問題である。
【０００６】
ところで、糖タンパク質の機能発現や血中内での安定化に関わる機能性糖鎖は、ある特定の糖鎖構造をもつ。例えば、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に結合しているＮ結合型糖鎖の場合、コアフコースがない糖鎖をもつ抗体では、コアフコースがある糖鎖をもつ抗体にくらべて、高い抗体依存性細胞傷害活性を示すことが知られている（非特許文献１参照）。すなわち、ＩｇＧ１抗体の場合、このようなコアフコース欠失糖鎖含有抗体の割合が多ければ、その分、高い抗体依存性細胞傷害が期待できると考えられる。
【０００７】
しかし実際には、例えば抗体医薬品であるトラスツズマブに結合している糖鎖の構造組成を調べると、このようなコアフコース欠失糖鎖の割合は数パーセントである（非特許文献２参照）。より力価の高い抗体医薬品を得ようとするならば、コアフコース欠失糖鎖のような、ある特定の構造をもつ機能性糖鎖のみが付加された抗体を製造することが望ましい。
このように、天然型では微量な、あるいは、存在しないかもしれない糖鎖構造をもつ抗体などの糖タンパク質製剤が極めて有効である可能性があるが、その作成が困難であるため、開発は容易でない。
【０００８】
抗体の品質管理や機能向上の観点から、抗体に均一構造の糖鎖を結合させる糖鎖リモデリングが試みられている（非特許文献３、特許文献１参照）。この方法によれば、抗体のＦｃ領域に結合しているＮ結合型糖鎖を、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの一種であり、抗体の糖鎖を特異的に切断する活性を有するＥｎｄｏＳという酵素（非特許文献４参照）を用いて除去する。この際、抗体の糖鎖付加部位であるアスパラギンにはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が一残基、あるいはこれにコアフコースが結合した糖鎖が残る。この抗体をアクセプター基質とし、糖鎖の還元末端をオキサゾリン体にしたオキサゾリン糖鎖をドナー基質として、ＥｎｄｏＳの糖鎖切断活性を抑制し、かつ糖鎖転移活性を強化させ、グライコシンターゼ化した変異体（ＥｎｄｏＳ  Ｄ２３３Ａ変異体、またはＤ２３３Ｑ変異体）を作用させて、抗体へ均一構造の糖鎖を付加させることに成功している（図１）。
【０００９】
一般に、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼなどのグリコシダーゼは、糖鎖切断活性を示すとともに、基質濃度が高いときなどに糖鎖転移活性（トランスグリコシレーション活性）を示すことが知られている。これを利用して、酵素の活性中心付近に変異を導入することにより、糖鎖切断活性を抑制し、かつ糖鎖転移活性を強化させて、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをグライコシンターゼにする試みがなされてきている。例えば、Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼであるＥｎｄｏ−Ｍは、Ｎ１７５Ｑの変異によりグライコシンターゼに変換される（非特許文献５参照）。
【００１０】
このようなグライコシンターゼの基質特異性は、もとのエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの基質特異性と密接な関係にあると考えられている。すなわち、該エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの基質になる糖タンパク質糖鎖であれば、対応するグライコシンターゼにおいても基質になる（糖鎖転移できる）可能性が高いが、該エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによって切断できない糖タンパク質糖鎖であれば、対応するグライコシンターゼにおいても基質にできないと思われる。
【００１１】
抗体分子の立体構造の関係で、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの中には、抗体のＦｃ領域に結合しているＮ結合型糖鎖（抗体糖鎖）を基質として切断できないものがある。また、抗体糖鎖には、高マンノース型糖鎖、二本鎖複合型糖鎖、ハイブリッド型糖鎖があり、さらにシアル酸の有無、コアフコースの有無、分岐Ｎ−アセチルグルコサミンの有無、結合様式の違い、など様々な種類の糖鎖が存在し得る。この糖鎖構造の違いも、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが基質として切断できるかに影響してくる。例えば、Ｅｎｄｏ−Ｍはコアフコースが結合した抗体糖鎖は切断できないし、ＥｎｄｏＳは高マンノース型の抗体糖鎖は切断できない。
【００１２】
現在、抗体糖鎖のリモデリングに使用できるグライコシンターゼは限られており、利用できるものでも基質特異性において制限がある。また、反応時に酵素を大量に必要とする場合があるが、酵素調製操作が煩雑なこともあるため、より少量で反応する比活性の高い酵素が望まれる。そのため、基質特異性が広く、比活性の高いグライコシンターゼの開発が必要である。さらに、酵素や基質の安定性を確保したり、酵素反応を制御する上で、様々なｐＨ条件で酵素反応を行うことが考えられるが、広いｐＨ領域でも高い活性を発揮するグライコシンターゼが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１２００６６号
【特許文献２】国際公開第２０１３／０３７８２４号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｔｏｙｏｈｉｄｅ  Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８，  ３４６６−３４７３  （２００３）
【非特許文献２】Ｃａｒａｌａ  Ｗ．  Ｎ．  Ｄａｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  ２０，  ２０２１−２０３３  （２００９）
【非特許文献３】Ｗｅｉ  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３４，  １２３０８−１２３１８  （２０１２）
【非特許文献４】Ｍａｔｔｉａｓ  Ｃｏｌｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２０，  ３０４６−３０５５  （２００１）
【非特許文献５】Ｍｉｄｏｒｉ  Ｕｍｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８５，  ５１１−５２１  （２０１０）
【非特許文献６】Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｓｊｏｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ４５５，  １０７−１１８  （２０１３）
【非特許文献７】Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｓｊｏｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２５，  １０５３−１０６３  （２０１５）
【非特許文献８】Ｂｅａｔｒｉｚ  Ｔｒａｓｔｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １１１，  ６７１４−６７１９  （２０１４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の課題は、抗体糖鎖のリモデリングに使用できるグライコシンターゼで、従来の酵素より基質特異性が広く、比活性の高い酵素であり、かつより広いｐＨ領域でも活性を示すグライコシンターゼを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼであるＥｎｄｏＳ２（特許文献２、非特許文献６参照）について、その活性部位にあるＤｘｘＤｘＤｘＥモチーフ（ｘは任意のアミノ酸、ＥｎｄｏＳ２ではＤ１７９〜Ｅ１８６に相当）への変異導入の影響を調べた。その結果、Ｄ１８２またはＤ１８４への変異導入により、糖鎖転移活性が強化されることを見出した。糖鎖切断活性を抑制するため、さらなる変異導入を検討したところ、Ｄ１８２ＱおよびＤ１８２Ａ／Ｄ１８４Ａの変異体では糖鎖切断活性が十分抑制されていることを確認した。これらの変異体の糖鎖転移活性を調べてみたところ、驚くべきことに、Ｄ１８２Ｑ変異体においては、従来のグライコシンターゼであるＥｎｄｏＳのＤ２３３Ｑ変異体よりも、比活性が高く、かつ広いｐＨ領域で高い活性を示すグライコシンターゼであることを見出した。ＥｎｄｏＳ２はＥｎｄｏＳと異なり、高マンノース型の糖鎖を含むほぼ大部分の二本鎖抗体糖鎖を切断できるほか、α１−酸性糖タンパク質の二本鎖糖鎖も切断できることから（非特許文献６、非特許文献７参照）、その糖鎖転移反応においても広い基質特異性を発揮することが予測され、ここに本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明によれば、以下の基質特異性を有することを特徴とするグライコシンターゼが提供される。
以下の基質特異性を有することを特徴とするグライコシンターゼ。
基質特異性：糖鎖成分としてＮ−アセチルグルコサミンのみが「抗体のＦｃ領域に存在する糖鎖付加部位」に結合した抗体、または「そのＮ−アセチルグルコサミンにα１，６−結合したフコースが付加した状態の抗体」をアクセプター基質とし、各種糖鎖をドナー基質とした反応系において、ｐＨ４以上１０以下の条件下で、ドナー基質由来の糖鎖をアクセプター基質に効率よく糖鎖転移する。
【００１８】
好ましくは、本発明により、下記のいずれかのアミノ酸配列を有するグライコシンターゼが提供される。
（１） 配列表の配列番号１または３に記載されるアミノ酸配列；または
（２） 配列表の配列番号１または３に記載されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有するアミノ酸配列を有し、抗体糖鎖のリモデリングに使用できるグライコシンターゼ活性を有するアミノ酸配列：
【００１９】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のグライコシンターゼのアミノ酸配列をコードするグライコシンターゼ遺伝子が提供される。好ましくは、本発明により、下記のいずれかの塩基配列を有するグライコシンターゼが提供される。
（１）  配列表の配列番号２に記載の塩基配列中の塩基番号１から２５３２で特定される塩基配列；
（２）  配列表の配列番号２に記載の塩基配列中の塩基番号１から２５３２で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換および／または付加を有する塩基配列を有し、グライコシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：
（３）  配列表の配列番号４に記載の塩基配列中の塩基番号１から２５３２で特定される塩基配列；
（４）  配列表の配列番号４に記載の塩基配列中の塩基番号１から２５３２で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換および／または付加を有する塩基配列を有し、グライコシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：
【００２０】
また、本発明の別の側面によれば、上記した本発明のグライコシンターゼ遺伝子を含む組換えベクター（好ましくは、発現ベクター）；上記した組換えベクターにより形質転換された形質転換体；ならびに上記した形質転換体を培養し、該培養物から本発明のグライコシンターゼを採取することを特徴とするグライコシンターゼの製造方法が提供される。
【００２１】
また、本発明の別の側面によれば、上記した本発明のグライコシンターゼを用い、一方または両方のＨ鎖に糖鎖成分としてフコースがα１，６−結合したＮ−アセチルグルコサミンのみが、「抗体のＦｃ領域に存在する糖鎖付加部位」に結合した抗体をアクセプター基質とし、高マンノース型糖鎖をドナー基質として、ドナー基質由来の高マンノース型糖鎖をアクセプター基質に糖鎖転移する反応工程を含む、１本または２本のコアフコースが付加した高マンノース型糖鎖をもつことを特徴とする抗体の製造方法；ならびに、１本または２本のコアフコースが付加した高マンノース型糖鎖をもつことを特徴とする抗体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】抗体糖鎖のリモデリング法の概念図である。
【図２】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来ＥｎｄｏＳおよびＥｎｄｏＳ２のアミノ酸配列の比較の結果を示す図である。＊は同じアミノ酸であることを示す。
【図３】各種オキサゾリン糖鎖の構造模式図である。
【図４】各種ＥｎｄｏＳ２変異体による糖鎖転移反応の結果を示す図である。矢印は糖鎖転移反応産物を示す。
【図５】基質濃度を高めた場合のＥｎｄｏＳ２変異体による糖鎖転移反応の結果を示す図である。矢印は糖鎖転移反応産物を示す。
【図６】各種ＥｎｄｏＳ２変異体による糖鎖切断反応の結果を示す図である。
【図７】ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑ変異体、Ｄ１８２Ａ／Ｄ１８４Ａ変異体、およびＥｎｄｏＳ  Ｄ２３３Ｑ変異体による糖鎖転移反応の結果を示す図である。矢印は糖鎖転移反応産物を示す。
【図８】糖鎖転移活性に対するｐＨの影響の結果を示す図である。矢印は糖鎖転移反応産物を示す。
【図９】抗体アクセプター基質に対し、Ａ２−オキサゾリンあるいは高マンノース型糖鎖のオキサゾリンをドナー基質として、ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑ変異体あるいはＥｎｄｏＳ  Ｄ２３３Ｑ変異体を作用させたときの糖鎖転移反応の結果を示す図である。矢印は糖鎖転移反応産物を示す。
【図１０】ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｘ変異体による糖鎖転移反応の結果を示す図である。矢印は糖鎖転移反応産物を示す。
【図１１】ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｘ変異体による糖鎖切断反応の結果を示す図である。
【図１２】ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２、およびＥｎｄｏＳ２欠失変異体のドメイン構造を示す図である。数字はアミノ酸番号を示す。
【図１３】ＥｎｄｏＳ２欠失変異体による糖鎖切断反応の結果を示す図である。矢印は糖鎖が切断された基質糖タンパク質を示す。
【図１４】ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑ欠失変異体による糖鎖転移反応の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的形態に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
【００２４】
＜１＞本発明の酵素およびタンパク質
本発明のグライコシンターゼは、以下の基質特異性を有することを特徴とする。
以下の基質特異性を有することを特徴とするグライコシンターゼ。
基質特異性：糖鎖成分としてＮ−アセチルグルコサミンのみが「抗体のＦｃ領域に存在する糖鎖付加部位」に結合した抗体、または「そのＮ−アセチルグルコサミンにα１，６−結合したフコースが付加した状態の抗体」をアクセプター基質とし、各種糖鎖をドナー基質とした反応系において、ｐＨ４以上１０以下の条件下で、ドナー基質由来の糖鎖をアクセプター基質に効率よく糖鎖転移する。
【００２５】
ここで、「各種糖鎖」とは、糖鎖の末端にＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び脱離化合物がその順に結合した糖鎖のことをいう。各種糖鎖の糖鎖構造や形態は特に限定されない。脱離化合物は特に限定されないが、オキサゾリンであることが好ましい。
上記各種糖鎖の例として、糖鎖の末端に、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び脱離化合物がその順に結合した糖鎖（以下、「オキサゾリン糖鎖」と略記する場合がある）が挙げられる。該オキサゾリン糖鎖の糖鎖構造や形態は特に限定されない。
【００２６】
上記した基質特異性は、本明細書に記載した実施例で取得されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＮＺ１３１  （ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ｍ４９）株由来ＥｎｄｏＳ２の変異体について実証された性質である。本発明のグライコシンターゼの由来は同株由来のものに限定されるものではなく、近縁の株に存在し、ＥｎｄｏＳ２と高度の相同性を示すエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを改変して製造した上記基質特異性を有するグライコシンターゼも、すべて本発明の範囲に属するものである。
【００２７】
このような酵素としては、微生物由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを遺伝子組換え技術により改変した酵素や、その酵素に各種のタグを付加するなどした酵素、または自然突然変異によってグライコシンターゼ活性を獲得した酵素などを挙げることができるが、これらはいずれも本発明の範囲に包含されるものである。
【００２８】
本発明のグライコシンターゼの一例としては、下記のいずれかのアミノ酸配列を有するグライコシンターゼが挙げられる。
（１） 配列表の配列番号１または３に記載のアミノ酸配列；または
（２） 配列表の配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有するアミノ酸配列を有し、抗体糖鎖のリモデリングに使用できるグライコシンターゼ活性を有するアミノ酸配列：
【００２９】
さらに、本発明のグライコシンターゼの活性ドメイン、あるいはそのアミノ酸配列の一部を改変または修飾して得られるグライコシンターゼ活性を有するタンパク質はすべて本発明の範囲の包含されることを理解すべきである。このような活性ドメインの好ましい例としては、配列表の配列番号１および３に記載したアミノ酸配列の１〜４４０により特定されるグライコシンターゼの活性ドメインを挙げることができる。
【００３０】
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００３１】
本発明の酵素またはタンパク質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質でもよい。
【００３２】
組換えタンパク質を作製する場合には、まず当該タンパク質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号１から４に記載したアミノ酸配列および塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、それらを用いて適当なＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行い、場合によってはさらに取得ＤＮＡに対して変異導入を行うことにより、本発明の酵素をコードするＤＮＡを取得できる。あるいは人工遺伝子合成により、本発明の酵素をコードするＤＮＡを全合成してもよい。
【００３３】
例えば、配列番号１および配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するグライコシンターゼをコードするＤＮＡを単離する方法は以下の実施例に詳細に説明されている。もっとも、本発明のグライコシンターゼをコードするＤＮＡの単離方法はこれらの方法に限定されることはなく、当業者は下記の実施例に記載された方法を参照しつつ、この方法を適宜修飾ないし変更することにより、容易に目的のＤＮＡを単離することができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の酵素を産生することができる。発現系での発現については本明細書中後記する。
【００３４】
本発明のグライコシンターゼは、発現後に不溶性タンパク質となる可能性がある。上記のグライコシンターゼ活性を有効に利用するために、本酵素の活性を維持し、かつ発現時に可溶性形態のタンパク質を製造することができる。このようなタンパク質としては、本発明のグライコシンターゼとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質が挙げられる。もっとも、可溶化の方法は上記方法に限定されることはなく、当業者はグライコシンターゼと融合させるタンパク質やタグとなるペプチド配列を適宜選択することができるし、あるいは化学的な手法によって可溶化してもよい。
【００３５】
＜２＞ 本発明の遺伝子
本発明によれば、本発明のグライコシンターゼのアミノ酸配列をコードするグライコシンターゼ遺伝子が提供される。
本発明のグライコシンターゼのアミノ酸配列をコードするグライコシンターゼ遺伝子の具体例としては、下記のいずれかの塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
（１）  配列表の配列番号２に記載の塩基配列中の塩基番号１から２５３２で特定される塩基配列；
（２）  配列表の配列番号２に記載の塩基配列中の塩基番号１から２５３２で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換および／または付加を有する塩基配列を有し、グライコシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：
（３）  配列表の配列番号４に記載の塩基配列中の塩基番号１から２５３２で特定される塩基配列；
（４）  配列表の配列番号４に記載の塩基配列中の塩基番号１から２５３２で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換および／または付加を有する塩基配列を有し、グライコシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：
【００３６】
本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換および／または付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００３７】
本発明の遺伝子の取得方法は上述した通りである。また、所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異導入法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤または放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築できる。このような公知の技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，  １９８９、ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９８７−１９９７）に記載されている。
【００３８】
＜３＞本発明の組換えベクター
本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミドやファージベクター）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
【００３９】
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、タンパク質をコードするＤＮＡ、およびプロモーター等の転写に必要な要素が機能的に連結されている。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ、もしくはｔａｃプロモーターや、哺乳動物細胞で作動可能なＳＶ４０プロモーターなどが挙げられる。また、これらの発現ベクターはアンピシリン耐性遺伝子などの適当な選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。発現ベクターの例としては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  ｖｅｒ．Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが挙げられるが、本発明に用いる発現ベクターはこれらに限定されるものではない。
本発明の遺伝子（ＤＮＡ）やプロモーター、選択マーカー遺伝子などをそれぞれ連結し、適当なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００４０】
＜４＞ 本発明の形質転換体
本発明の遺伝子（ＤＮＡ）または組換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明の遺伝子（ＤＮＡ）または組換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
【００４１】
細菌細胞の例としてはバチルスなどのグラム陽性菌、または大腸菌などのグラム陰性菌が挙げられる。これらの細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞やＣＨＯ細胞などが挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
そのほか、酵母細胞、糸状菌細胞、昆虫細胞なども宿主細胞として利用でき、それぞれの宿主に応じた公知の形質転換法を用いてＤＮＡ構築物を導入し、形質転換体を得ることができる。
【００４２】
＜５＞本発明の酵素の製造方法
本発明のグライコシンターゼの製造方法は、上記形質転換体を培養し、該培養物からグライコシンターゼを採取することを特徴とする。
上記の形質転換体は、導入されたＤＮＡ構築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の酵素を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明の酵素が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、スルホプロピル（ＳＰ）セファロース等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００４３】
本発明のタンパク質を製造する方法は、細胞を用いる方法に限定されるものではなく、無細胞タンパク質合成系によって製造することもできる。無細胞タンパク質合成系としては、例えば、コムギ胚芽、大腸菌、ウサギ網状赤血球、昆虫細胞などから調製したものが挙げられる。目的タンパク質をコードするＤＮＡを逆転写が可能なベクターに組み込み、これより逆転写反応によって合成したｍＲＮＡを適当な無細胞タンパク質合成系に加えて目的タンパク質を合成する。そして、その反応液より目的タンパク質を上記と同様にして精製する。
【００４４】
＜６＞本発明の酵素を用いた糖鎖改変抗体の製造方法とその反応産物
本発明の抗体の製造方法は、上記グライコシンターゼを用い、一方または両方のＨ鎖に糖鎖成分としてフコースがα１，６−結合したＮ−アセチルグルコサミンのみが、「抗体のＦｃ領域に存在する糖鎖付加部位」に結合した抗体をアクセプター基質とし、高マンノース型糖鎖をドナー基質として、ドナー基質由来の高マンノース型糖鎖をアクセプター基質に糖鎖転移する反応工程を含む、１本または２本のコアフコースが付加した高マンノース型糖鎖をもつことを特徴とする抗体を製造する方法である。
【００４５】
また、本発明の抗体は、１本または２本のコアフコースが付加した高マンノース型糖鎖をもつことを特徴とする。
【００４６】
糖鎖成分としてＮ−アセチルグルコサミンのみが、「抗体のＦｃ領域に存在する糖鎖付加部位」に結合した抗体、または「そのＮ−アセチルグルコサミンにα１，６−結合したフコースが付加した状態の抗体」をアクセプター基質とし、各種糖鎖をドナー基質とした反応系において、本発明のグライコシンターゼを作用させた場合に、アクセプター基質の原料である抗体とは異なる糖鎖組成を有する抗体を製造することができる。さらに、本発明のグライコシンターゼを用いて、非天然型の糖鎖を有する抗体や、通常の抗体には存在しない糖鎖をもった抗体を製造することができる。
【００４７】
例えば、天然型の高マンノース型糖鎖には、コアフコースは結合していない。しかし、コアフコースが結合した糖鎖をもつ抗体にエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを作用させて糖鎖を切断した抗体をアクセプター基質とし、マンノースを５個（Ｍ５）あるいは６個（Ｍ６）含む高マンノース型糖鎖のオキサゾリン体をドナー基質として、本発明のグライコシンターゼを作用させた場合に、コアフコースが結合した非天然型の高マンノース型糖鎖（Ｍ５またはＭ６）をもつ抗体を製造することができる。すなわち、コアフコース有無のアクセプター基質と、各種糖鎖のオキサゾリン体ドナー基質の組合せによって、通常の抗体には存在しない糖鎖をもった抗体を製造することが可能である。この場合、ドナー基質は抗体以外の糖タンパク質から調製した抗体糖鎖に含まれない構造をした糖鎖や、化学合成した糖鎖（非天然型糖鎖を含む）をオキサゾリン体にしたものを用いてもよい。
【実施例】
【００４８】
以下に記載する実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【００４９】
＜実施例１＞
ＥｎｄｏＳ２変異体の作製
本実施例ではＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＥｎｄｏＳ２変異体が有する糖鎖転移活性を調べた。ＥｎｄｏＳ２は、ＣＡＺｙ  （Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ｅｎＺＹｍｅｓ）データーベースにおいてＧＨ１８ファミリーに属する８４３アミノ酸よりなる一種のエンドβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで（図２）、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合しているＮ結合型糖鎖やα１−Ａｃｉｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎに結合しているＮ結合型糖鎖を切断することが報告されている（非特許文献６参照）。
【００５０】
まず、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＮＺ１３１  （ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ｍ４９）株由来ゲノミックＤＮＡ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を鋳型として、プライマーＮＧ１３７０＋、ＮＧ１３７１−（配列表配列番号５、６）とＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ  （ＫＡＰＡ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ここで増幅したＥｎｄｏＳ２遺伝子の全長ＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。これよりＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで切り出したＤＮＡ断片をｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入したものを、野生型ＥｎｄｏＳ２（ＷＴ）の発現ベクターとした。なお、この発現ベクターを用いると、ＥｎｄｏＳ２はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末端側に融合した形で発現される。このＧＳＴはＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア）で処理することにより切断できる。
【００５１】
つぎに、糖鎖切断活性を抑制するとともに、糖転移活性を強化したＥｎｄｏＳ２変異体の作製を試みた。ＧＨ１８ファミリー酵素では、酵素の活性部位近傍のアミノ酸配列においてＤｘｘＤｘＤｘＥ（ｘは任意のアミノ酸）というモチーフが保存されている。このＤやＥといった酸性アミノ酸が活性発現に重要な役割を果たし、この部位への変異導入で、糖鎖切断活性が低下するとともに、糖鎖転移活性が顕著になる場合があることが報告されている（非特許文献３、５参照）。そこでＥｎｄｏＳ２の当該モチーフ（Ｄ１７９〜Ｅ１８６）にあるＤ１７９をＡｌａに置換したＤ１７９Ａ変異体、Ｄ１８２をＡｌａに置換したＤ１８２Ａ変異体、Ｄ１８２をＧｌｎに置換したＤ１８２Ｑ変異体、Ｄ１８４をＡｌａに置換したＤ１８４Ａ変異体、Ｄ１８４をＧｌｎに置換したＤ１８４Ｑ変異体、Ｄ１８４をＡｓｎに置換したＤ１８４Ｎ変異体、Ｅ１８６をＡｌａに置換したＥ１８６Ａ変異体、およびＤ１８２とＤ１８４をＡｌａに置換したＤ１８２Ａ／Ｄ１８４Ａ変異体を作製した。
【００５２】
Ｄ１７９をＡｌａに置換するためにはプライマーＮＧ１３９０＋、ＮＧ１３９１−（配列表配列番号７、８）の各プライマーの組み合わせと、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ  （ＫＡＰＡ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて、上記ＥｎｄｏＳ２遺伝子を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  IIプラスミドを鋳型としてＰＣＲによる変異導入を行った。Ｄ１８２をＡｌａに置換するためにはプライマーＮＧ１３９２＋、ＮＧ１３９３−（配列表配列番号９、１０）の各プライマーの組み合わせを用いて、上記と同様にしてＰＣＲによる変異導入を行った。Ｄ１８２をＧｌｎに置換するためにはプライマーＮＧ１４５１＋、ＮＧ１４５２−（配列表配列番号１１、１２）の各プライマーの組み合わせを用いて、上記と同様にしてＰＣＲによる変異導入を行った。また、Ｄ１８４をＡｌａに置換するためにはプライマーＮＧ１３７４＋、ＮＧ１３７５−（配列表配列番号１３、１４）の各プライマーの組み合わせを用い、上記と同様にしてＰＣＲによる変異導入を行った。Ｄ１８４をＧｌｎに置換するためにはプライマーＮＧ１３８１＋、ＮＧ１３８２−（配列表配列番号１５、１６）の各プライマーの組み合わせを用い、上記と同様にしてＰＣＲによる変異導入を行った。Ｄ１８４をＡｓｎに置換するためにはプライマーＮＧ１３８３＋、ＮＧ１３８４−（配列表配列番号１７、１８）の各プライマーの組み合わせを用い、上記と同様にしてＰＣＲによる変異導入を行った。また、Ｅ１８６をＡｌａに置換するためにはプライマーＮＧ１３８５＋、ＮＧ１３８６−（配列表配列番号１９、２０）の各プライマーの組み合わせを用い、上記と同様にしてＰＣＲによる変異導入を行った。さらに、Ｄ１８２とＤ１８４をＡｌａに置換するためにはプライマーＮＧ１４１９＋、ＮＧ１４２０−（配列表配列番号２１、２２）の各プライマーの組み合わせを用い、上記と同様にしてＰＣＲによる変異導入を行った。Ｄ１８２をＡｌａに、Ｄ１８４をＧｌｎに置換するためにはプライマーＮＧ１４５５＋、ＮＧ１４５６−（配列表配列番号２３、２４）の各プライマーの組み合わせを用い、上記と同様にしてＰＣＲによる変異導入を行った。Ｄ１８２をＧｌｎに、Ｄ１８４をＡｌａに置換するためにはプライマーＮＧ１４５３＋、ＮＧ１４５４−（配列表配列番号２５、２６）の各プライマーの組み合わせを用い、上記と同様にしてＰＣＲによる変異導入を行った。Ｄ１８２とＤ１８４をＧｌｎに置換するためにはプライマーＮＧ１４５７＋、ＮＧ１４５８−（配列表配列番号２７、２８）の各プライマーの組み合わせを用い、上記と同様にしてＰＣＲによる変異導入を行った。また、Ｄ１８４とＥ１８６をＡｌａに置換するためにはプライマーＮＧ１３８７＋、ＮＧ１３８８−（配列表配列番号２９、３０）の各プライマーの組み合わせを用い、上記と同様にしてＰＣＲによる変異導入を行った。
いずれの場合も変異導入の確認はＤＮＡシーケンスにより行った。変異導入がなされたＥｎｄｏＳ２遺伝子は、それぞれｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入し、各変異体の発現ベクターとした。
【００５３】
このようにして構築した各発現ベクターを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。得られた形質転換体は、５０μｇ／ｍＬになるようアンピシリンを添加した液体ＬＢ培地２ｍＬで一晩３７℃で振盪培養した。
つぎに、この種培養より１ｍＬとり、アンピシリン入り液体ＬＢ培地１００ｍＬに新たに植菌して、３７℃で３時間振盪培養した。ここで０．１ｍＭになるようＩｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３時間、３７℃で振盪培養した後、菌体を遠心分離により回収した。この菌体に対し、５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えて撹拌し、さらに超音波処理を行って菌体を破砕した。この菌体破砕液に５０μＬのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加え、室温で３０分間振盪した。その後、再び超音波処理を行い、さらに遠心分離によって、可溶性画分と不溶性画分に分画した。
【００５４】
ここで得られた可溶性画分に対し、適量（〜１００μＬ）のＧｌｕｔｈａｔｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア）を加えて４℃で一晩混和し、ＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ２変異体融合タンパク質を吸着させた。このＧｌｕｔｈａｔｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを遠心分離により回収後、ＰＢＳで数回洗浄した。そして、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅによる切断反応用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １  ｍＭ  ＤＴＴ，  ｐＨ７．０）とＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅを加え、４℃で１６時間、ＧＳＴの切断反応を行った。
つぎに、遠心分離によりＧｌｕｔｈａｔｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを除去し、得られた反応液をＶＩＶＡＳＰＩＮ  ５００（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）によって遠心濃縮するとともに、ＰＢＳを加えてバッファー交換を行った。このようにして各ＥｎｄｏＳ２変異体の酵素溶液を得た。
【００５５】
なお、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のもう一つのエンドグリコシダーゼであるＥｎｄｏＳは、ＥｎｄｏＳ２とアミノ酸配列比較で３７％の相同性を示すが（図２）、この野生型およびＤ２３３Ｑ変異体の酵素溶液は、文献を参考にして調製した（非特許文献３参照）。
【００５６】
＜実施例２＞
糖鎖転移反応
上記により得た酵素溶液を用いて、ヒトＩｇＧ抗体に対する糖鎖転移反応を実施した。この転移反応においては、糖鎖の供与体となるドナー基質と、糖鎖が転移されるアクセプター基質が必要である。アクセプター基質としては、抗体医薬品トラスツズマブのＦｃ領域に結合したＮ結合型糖鎖の主要部分を、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＤ、ＥｎｄｏＬＬといったエンドグリコシダーゼを組み合わせて除去し、糖鎖成分としてはＮ−アセチルグルコサミンのみが結合した状態にした抗体（原料としてカイコに生産させたトラスツズマブ＜ここではＨｅｒＢと表す＞を使用した場合）、またはそのＮ−アセチルグルコサミンにコアフコースとよばれるα１，６−結合したフコースが付加した抗体（原料としてＣＨＯ細胞に生産させたトラスツズマブ＜ここではＨｅｒＣと表す＞を使用した場合）を用いた。糖鎖の供与体となるドナー基質には、各種糖鎖、より具体的には図３に示す各種糖鎖のオキサゾリン体を用いた。なお、アクセプター基質の調製法の詳細については、現在出願中である（特願２０１４−０９１１５７、特願２０１４−２２２１９１、特願２０１５−０８２３８８）。
【００５７】
酵素反応液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０μＬ中にアクセプター基質を１μｇ、ドナー基質を１μｇ、ＥｎｄｏＳ２変異体を１μｇ、それぞれ含むように調製した。これを３０℃にて反応させ、経時的にサンプリングした。酵素反応は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用のサンプルバッファーを添加することにより停止させた。このサンプル溶液を煮沸処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ（和光純薬）により染色し、抗体のＨ鎖に着目して転移産物の有無を確認した。
【００５８】
図４は、ＣＨＯ細胞に生産させたトラスツズマブ（ＨｅｒＣ）の糖鎖を各種エンドグリコシダーゼにより切断した抗体をアクセプター基質（ＨｅｒＣアクセプター：コアフコースあり）とし、Ａ２−オキサゾリン（Ａ２−Ｏｘａ）あるいはＧ２−オキサゾリン（Ｇ２−Ｏｘａ）をドナー基質として、ＥｎｄｏＳ２変異体による糖鎖転移反応を実施した結果である。図４中の横軸の数字は、酵素反応を開始してからの時間を示す（単位：時）。また矢印は糖鎖転移反応産物を示す。
Ｄ１８２Ａ変異体、Ｄ１８４Ａ変異体、Ｄ１８４Ｎ変異体、Ｄ１８４Ｑ変異体では、未反応のアクセプター基質のバンドとともに、転移産物と考えられるバンドが検出された。変異体によっては、長時間反応によりこの転移産物と考えられるバンドが消失したが、これは変異体の糖鎖切断活性が十分に抑制されていないために、転移産物の糖鎖を切断したためと考えられた。
一方、Ｄ１７９Ａ変異体やＥ１８６Ａ変異体では、このような転移産物と考えられるバンドは検出されなかった。以上の結果より、ＥｎｄｏＳ２の場合、糖鎖転移活性を強化するにはＤｘｘＤｘＤｘＥモチーフのうち、Ｄ１８２またはＤ１８４への変異導入が効果的であり、置換するアミノ酸によって、糖鎖切断活性の抑制効果にも差があると考えられた。
【００５９】
ところで、図４の反応条件は、各変異体に糖鎖転移活性があるかどうかをスクリーニングするために用いた条件で、基質濃度が低かった。そこで、基質濃度を高め、より至適化された反応条件で、ＥｎｄｏＳ２変異体の糖鎖転移活性を調べることにした。非特許文献３に記載されている反応条件を参考にして、酵素反応液は、２μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中に、アクセプター基質を１０μｇ、ドナー基質をその１５０倍モル比、ＥｎｄｏＳ２変異体を０．２μｇ（２．１  ｐｍｏｌ）、それぞれ含むように調製した。これを３０℃にて反応させ、経時的にサンプリングした。酵素反応は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーを添加することにより停止させた。このサンプル溶液を煮沸処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ（和光純薬）により染色し、抗体のＨ鎖に着目して転移産物の有無を確認した。
【００６０】
図５は、アクセプター基質としてＨｅｒＣアクセプターを、ドナー基質としてＡ２−オキサゾリンを用い、ＥｎｄｏＳ２変異体による糖鎖転移反応を実施した結果である。図５中の横軸の数字は、酵素反応を開始してからの時間を示す（単位：時）。また矢印は糖鎖転移反応産物を示す。
図４の場合と異なり、Ｄ１８２Ａ変異体、Ｄ１８４Ａ変異体、Ｄ１８４Ｎ変異体、Ｄ１８４Ｑ変異体、いずれの変異体の場合でも、３０分の反応時間でアクセプター基質の８〜９割以上に糖鎖転移がなされた。しかし、反応時間が進むにつれ、転移産物量が減少した。すなわち、これらの変異体は糖鎖転移活性を示すものの、糖鎖切断活性が十分に抑制されていないため、反応時間が長いと転移産物の糖鎖を切断することが考えられた。
【００６１】
そこで、糖鎖切断活性が十分に抑制されたＥｎｄｏＳ２変異体のスクリーニングを試みた。反応条件は、２０μＬのＰＢＳ中に、１μｇのヒト血清由来ＩｇＧと、０．３μｇのＥｎｄｏＳ２変異体を加え、３７℃で１６時間反応させた。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーを添加することによって酵素反応を停止させた。このサンプル溶液を煮沸処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ（和光純薬）により染色した。
その結果、調べた変異体の中では、Ｄ１８２Ｑ変異体、Ｄ１８２Ａ／Ｄ１８４Ａ変異体、Ｄ１８２Ａ／Ｄ１８４Ｑ変異体、Ｄ１８２Ｑ／Ｄ１８４Ａ変異体、Ｄ１８２Ｑ／Ｄ１８４Ｑ変異体、Ｅ１８６Ａ変異体、Ｄ１８４Ａ／Ｅ１８６Ａ変異体の糖鎖切断活性が抑制されていた（図６）。これらの変異体の糖鎖転移活性を調べたところ、Ｄ１８２Ｑ変異体が一番高い糖鎖転移活性を示し、つぎにＤ１８２Ａ／Ｄ１８４Ａ変異体が高い糖鎖転移活性を示した。Ｄ１８２Ａ／Ｄ１８４Ｑ変異体、Ｄ１８２Ｑ／Ｄ１８４Ａ変異体、Ｄ１８２Ｑ／Ｄ１８４Ｑ変異体にも糖鎖転移活性は認められたが、Ｅ１８６Ａ変異体、Ｄ１８４Ａ／Ｅ１８６Ａ変異体には糖鎖転移活性はなかった。そこで、Ｄ１８２Ｑ変異体（配列表配列番号１、２）、Ｄ１８２Ａ／Ｄ１８４Ａ変異体（配列表配列番号３、４）の糖鎖転移活性についてさらに詳しく調べることにした。
【００６２】
酵素反応液は、２μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中に、アクセプター基質を１０μｇ、ドナー基質をその１５０倍モル比、ＥｎｄｏＳ２変異体を０．２μｇ、それぞれ含むように調製した。またＥｎｄｏＳのＤ２３３Ｑ変異体についても同様の酵素反応液を調製した。これらを３０℃にて反応させ、経時的にサンプリングした。酵素反応は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーを添加することにより停止させた。このサンプル溶液を煮沸処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ（和光純薬）により染色し、抗体のＨ鎖に着目して転移産物の有無を確認した。
【００６３】
図７には、各種糖鎖のオキサゾリン体をドナー基質、ＨｅｒＣアクセプターまたはＨｅｒＢアクセプターをアクセプター基質としたときの、Ｄ１８２Ｑ変異体およびＤ１８２Ａ／Ｄ１８４Ａ変異体の糖鎖転移活性測定の結果を示す。
図７中の横軸の数字は、酵素反応を開始してからの時間を示す（単位：時）。また、図７中の丸数字１はＥｎｄｏＳ２のＤ１８２Ｑ変異体による糖鎖転移反応の結果、丸数字２はＥｎｄｏＳ２のＤ１８２Ａ／Ｄ１８４Ａ変異体による糖鎖転移反応の結果、丸数字３はＥｎｄｏＳのＤ２３３Ｑ変異体による糖鎖転移反応の結果を示す。図７中のバンドは抗体Ｈ鎖であり、矢印で示す高分子側にシフトしたバンドは糖鎖転移がなされた抗体Ｈ鎖である。
【００６４】
アクセプター基質としてＨｅｒＣアクセプターを用いた場合、ドナー基質の種類によらず、糖鎖転移活性はＥｎｄｏＳ２のＤ１８２Ｑ変異体＞ＥｎｄｏＳのＤ２３３Ｑ変異体＞ＥｎｄｏＳ２のＤ１８２Ａ／Ｄ１８４Ａ変異体の順に高かった（図７）。また、カイコに生産させたトラスツズマブ（ＨｅｒＢ）の糖鎖を各種エンドグリコシダーゼにより切断した抗体をアクセプター基質（ＨｅｒＢアクセプター：コアフコースなし）とした場合でも、同様の傾向が観察されたが、基質によってはＥｎｄｏＳ２のＤ１８２Ａ／Ｄ１８４Ａ変異体のほうがＥｎｄｏＳのＤ２３３Ｑ変異体よりも転移効率が高い場合があった。なおＨｅｒＢアクセプターの場合、糖鎖転移産物のほかに未反応のアクセプター基質由来のバンドが常に観察されるが、これはアクセプター基質の中に、もともと糖鎖が全く結合していない抗体が含まれているためである。
【００６５】
つぎに、反応に用いる緩衝液を変えて、様々なｐＨにおけるこれらの変異体の糖鎖転移活性を調べてみた。ｐＨ３．５から６．０までは５０ｍＭ  クエン酸緩衝液、ｐＨ７．４から８．８までは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ１０．０とｐＨ１１．０は５０ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ緩衝液を用い、上記と同様にして酵素反応を行った。
結果を図８に示す。図８中の横軸の数字は、酵素反応を開始してからの時間を示す（単位：時）。また、図８中の丸数字は、図７と同じ酵素による糖鎖転移反応の結果を示す。図８中のバンドは抗体Ｈ鎖であり、矢印で示す高分子側にシフトしたバンドは糖鎖転移がなされた抗体Ｈ鎖である。
【００６６】
その結果、アクセプター基質としてＨｅｒＣアクセプターを用いた場合、いずれの変異体もｐＨ４から１０の間では糖鎖転移活性が認められたが、ｐＨ６から８の間で高い活性が得られた（図８）。このうち、ＥｎｄｏＳ２のＤ１８２Ｑ変異体は、他の変異体と異なり、３０分間の反応時間でも、ｐＨ４から１０の間で明瞭な転移産物が確認されており、最も糖鎖転移活性が高かった。なお、アクセプター基質としてＨｅｒＢアクセプターを用いた場合では、いずれの変異体でもｐＨ６から８．８の間では糖鎖転移活性が確認されたが、この場合もＥｎｄｏＳ２のＤ１８２Ｑ変異体の糖鎖転移活性が最も高かった。
【００６７】
＜実施例３＞
高マンノース型糖鎖の糖鎖転移反応
抗体糖鎖の切断に関して、ＥｎｄｏＳとＥｎｄｏＳ２の酵素学的諸性質の違いとして、ＥｎｄｏＳは高マンノース型糖鎖を切断しないが、ＥｎｄｏＳ２はこれを切断することが報告されている（非特許文献７参照）。上記のＥｎｄｏＳ変異体およびＥｎｄｏＳ２変異体による糖鎖転移反応では、複合型糖鎖（Ａ２−Ｏｘａ，Ｇ２−Ｏｘａ，Ｇ０−Ｏｘａ）およびパウチマンノース型糖鎖（Ｍ３−Ｏｘａ）の転移について調べ、両者ともにこれら糖鎖の転移活性があることを示したが、高マンノース型糖鎖の転移活性については不明であった。そこで、ＥｎｄｏＳ  Ｄ２３３Ｑ変異体およびＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑ変異体について、糖鎖切断活性と同様に高マンノース型糖鎖の転移活性に違いがあるのか調べることにした。
【００６８】
高マンノース型糖鎖は、牛膵臓由来のリボヌクレアーゼＢをエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの一種であるＥｎｄｏＨ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理することにより調製し、これを化学的手法にてオキサゾリン体にしたものを糖鎖転移反応のドナー基質（ｈｉｇｈ  Ｍ−Ｏｘａ）として用いた。なお、高マンノース型糖鎖の組成を質量分析により調べたところ、マンノース５個からなるＭ５糖鎖が最も多く含まれており、次いでマンノース６個からなるＭ６糖鎖が多くふくまれ、その他のマンノース７〜９個からなるＭ７、Ｍ８、Ｍ９糖鎖は微量であった。
【００６９】
高マンノース型糖鎖を用いた糖鎖転移反応の酵素反応液は、２．５μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中に、アクセプター基質（ＨｅｒＣまたはＨｅｒＢより調製したもの）を１０μｇ、ドナー基質を６ｍＭ、ＥｎｄｏＳ  Ｄ２３３Ｑ変異体あるいはＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑ変異体を０．２μｇ、それぞれ含むように調製した。これを３０℃にて反応させ、経時的にサンプリングした。酵素反応は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーを添加することにより停止させた。このサンプル溶液を煮沸処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ（和光純薬）により染色し、抗体のＨ鎖に着目して転移産物の有無を確認した。なお対照として、ドナー基質としてＡ２−オキサゾリン（Ａ２−Ｏｘａ）を用いた場合についても、上記と同様にして反応させ、解析した。
【００７０】
図９は、上記反応産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した結果である。図９中の横軸の数字は、酵素反応を開始してからの時間を示す（単位：時）。また矢印は糖鎖転移反応産物を示す。ＥｎｄｏＳ  Ｄ２３３Ｑ変異体の場合、ドナー基質としてＡ２−オキサゾリンを用いたときには、ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑ変異体にくらべて転移効率は低いが、ＨｅｒＣアクセプター、ＨｅｒＢアクセプターともに５時間以内でほとんどのアクセプターに糖鎖が転移された。なお、転移反応後もＨｅｒＢアクセプターの位置に見られるバンドは、もともと糖鎖が全く結合していない抗体に由来するものである。一方、ドナー基質として高マンノース型糖鎖のオキサゾリンを用いたときには、ＨｅｒＣアクセプター、ＨｅｒＢアクセプターともに明確な糖鎖転移は観察されなかった。反応１時間後の反応産物について質量分析を行ったが、転移産物は検出されなかった。このことから、ＥｎｄｏＳ変異体には高マンノース型糖鎖の転移能がないと考えられた。
【００７１】
ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑ変異体の場合、ドナー基質としてＡ２−オキサゾリンを用いたときには、ＨｅｒＣアクセプター、ＨｅｒＢアクセプターともに１時間以内でほとんどのアクセプターに糖鎖が転移された。また、ドナー基質として高マンノース型糖鎖のオキサゾリンを用いたときには、ＨｅｒＣアクセプターについては、１時間以内に約半数のアクセプターに糖鎖が転移され、その後、反応時間をのばしても、転移産物量に変化はなかった。ＨｅｒＢアクセプターについては、反応１時間で５〜６％の糖鎖転移効率であったが、その後、反応時間をのばしても、転移産物量に大きな変化はなかった。
【００７２】
ＨｅｒＢアクセプターについては、コアフコースがないので主たる転移産物として質量分析によりＭ５糖鎖が検出された。一方、ＨｅｒＣアクセプターの場合、その９割以上にはコアフコースが含まれているので、上記転移産物にはほとんどがコアフコース結合糖鎖として含まれている。実際、質量分析により抗体上にフコース付きＭ５糖鎖とフコース付きＭ６糖鎖が検出された。通常、高マンノース型糖鎖にはコアフコースは結合していないことから、本転移反応においては、驚くべきことに、非天然型のコアフコースを有する高マンノース型糖鎖が生じたことを示している。
【００７３】
以上の結果から、高マンノース型糖鎖のオキサゾリンでは、Ａ２−オキサゾリンの場合とくらべると糖鎖転移効率が低くなるが、ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑ変異体は高マンノース型糖鎖の転移能をもつといえる。さらに、この転移反応においては非天然型の糖鎖が生じていた。この点において、本発明は従来のグライコシンターゼであるＥｎｄｏＳ  Ｄ２３３Ｑより、基質特異性が広い酵素であり、かつ通常の抗体が持たない糖鎖をも抗体に付加することができる応用性の広い酵素であるといえる。
【００７４】
＜実施例４＞
ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｘ変異体の解析
ＥｎｄｏＳ２のＤ１８２を置換した変異体は、上述したようにＤ１８２ＡおよびＤ１８２Ｑの変異体を作製した。一方、この残基をさらにほかのアミノ酸に置換することによって、より糖鎖転移活性の高い、あるいは残存水解活性が抑制された変異体が得られる可能性も考えられる。そこで、Ｄ１８２をＡｌａやＧｌｎ以外のアミノ酸に置換した変異体を作製し、その糖鎖転移活性と糖鎖切断活性について調べることにした。
【００７５】
変異体の作製、および変異酵素の調製は、前述した方法と同様にして行った。なお、Ｄ１８２をＰｈｅに置換するためにはプライマーＮＧ１５２０＋、ＮＧ１５２１−（配列表配列番号３１、３２）の各プライマーの組み合わせを用いた。Ｄ１８２をＬｅｕに置換するためにはプライマーＮＧ１５２２＋、ＮＧ１５２３−（配列表配列番号３３、３４）の各プライマーの組み合わせを用いた。Ｄ１８２をＩｌｅに置換するためにはプライマーＮＧ１５２４＋、ＮＧ１５２５−（配列表配列番号３５、３６）の各プライマーの組み合わせを用いた。Ｄ１８２をＭｅｔに置換するためにはプライマーＮＧ１５２６＋、ＮＧ１５２７−（配列表配列番号３７、３８）の各プライマーの組み合わせを用いた。Ｄ１８２をＳｅｒに置換するためにはプライマーＮＧ１５３０＋、ＮＧ１５３１−（配列表配列番号３９、４０）の各プライマーの組み合わせを用いた。Ｄ１８２をＰｒｏに置換するためにはプライマーＮＧ１５３２＋、ＮＧ１５３３−（配列表配列番号４１、４２）の各プライマーの組み合わせを用いた。
【００７６】
Ｄ１８２をＴｈｒに置換するためにはプライマーＮＧ１５３４＋、ＮＧ１５３５−（配列表配列番号４３、４４）の各プライマーの組み合わせを用いた。Ｄ１８２をＴｙｒに置換するためにはプライマーＮＧ１５３６＋、ＮＧ１５３７−（配列表配列番号４５、４６）の各プライマーの組み合わせを用いた。Ｄ１８２をＨｉｓに置換するためにはプライマーＮＧ１５３８＋、ＮＧ１５３９−（配列表配列番号４７、４８）の各プライマーの組み合わせを用いた。Ｄ１８２をＡｓｎに置換するためにはプライマーＮＧ１５４０＋、ＮＧ１５４１−（配列表配列番号４９、５０）の各プライマーの組み合わせを用いた。Ｄ１８２をＬｙｓに置換するためにはプライマーＮＧ１５４２＋、ＮＧ１５４３−（配列表配列番号５１、５２）の各プライマーの組み合わせを用いた。Ｄ１８２をＧｌｕに置換するためにはプライマーＮＧ１５４４＋、ＮＧ１５４５−（配列表配列番号５３、５４）の各プライマーの組み合わせを用いた。
【００７７】
Ｄ１８２をＣｙｓに置換するためにはプライマーＮＧ１５４６＋、ＮＧ１５４７−（配列表配列番号５５、５６）の各プライマーの組み合わせを用いた。Ｄ１８２をＴｒｐに置換するためにはプライマーＮＧ１５４８＋、ＮＧ１５４９−（配列表配列番号５７、５８）の各プライマーの組み合わせを用いた。Ｄ１８２をＡｒｇに置換するためにはプライマーＮＧ１５５０＋、ＮＧ１５５１−（配列表配列番号５９、６０）の各プライマーの組み合わせを用いた。Ｄ１８２をＧｌｙに置換するためにはプライマーＮＧ１５５２＋、ＮＧ１５５３−（配列表配列番号６１、６２）の各プライマーの組み合わせを用いた。Ｄ１８２をＶａｌに置換するためにはプライマーＮＧ１５５４＋、ＮＧ１５５５−（配列表配列番号６３、６４）の各プライマーの組み合わせを用いた。
【００７８】
糖鎖転移反応の酵素反応液は、２．５μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中に、ＨｅｒＣアクセプターを１０μｇ、Ａ２−オキサゾリンを６ｍＭ、ＥｎｄｏＳ２変異体を０．２μｇ、それぞれ含むように調製した。これらを３０℃にて反応させ、経時的にサンプリングした。酵素反応は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーを添加することにより停止させた。このサンプル溶液を煮沸処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ（和光純薬）により染色し、抗体のＨ鎖に着目して転移産物の有無を確認した。
【００７９】
図１０には、各ＥｎｄｏＳ２変異体の糖鎖転移活性測定の結果を示す。図１０中の横軸の数字は、酵素反応を開始してからの時間を示す（単位：時）。図１０中のバンドは抗体Ｈ鎖であり、矢印で示す高分子側にシフトしたバンドは糖鎖転移がなされた抗体Ｈ鎖である。この結果から、各変異体は３つのグループに大別される。すなわち、丸数字１は、糖鎖転移活性が高く、かつ糖鎖切断活性が抑制されている変異体のグループ（Ｄ１８２Ｃ、Ｄ１８２Ｈ、Ｄ１８２Ｌ、Ｄ１８２Ｍ、Ｄ１８２Ｎ、Ｄ１８２Ｑ、Ｄ１８２Ｓ、Ｄ１８２Ｔ、Ｄ１８２Ｖ）、丸数字２は、糖鎖切断活性が残存している変異体のグループ（長時間反応で糖鎖転移産物の糖鎖が切断される。Ｄ１８２Ａ、Ｄ１８２Ｅ、Ｄ１８２Ｇ、Ｄ１８２Ｉおよび野生型ＥｎｄｏＳ２）、丸数字３は糖鎖転移活性の低い変異体のグループ（Ｄ１８２Ｆ、Ｄ１８２Ｋ、Ｄ１８２Ｐ、Ｄ１８２Ｒ、Ｄ１８２Ｗ、Ｄ１８２Ｙ）である。このうち、糖鎖転移活性の低い丸数字３のグループは、Ｄ１８２をＬｙｓやＡｒｇといった塩基性アミノ酸、またはＰｈｅ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒといった芳香環をもつアミノ酸やＰｒｏに置換した変異体で構成されていた。
【００８０】
つぎに、各変異体の糖鎖切断活性を調べた。反応条件は、１０μＬの緩衝液中（５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、またはＰＢＳ）に、１μｇのヒト血清由来ＩｇＧと、０．２μｇのＥｎｄｏＳ２変異体を加え、３０℃で１５時間反応させた。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーを添加することによって酵素反応を停止させた。このサンプル溶液を煮沸処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ（和光純薬）により染色した。
【００８１】
図１１にその結果を示す。図１１中のバンドは抗体Ｈ鎖であり、ｈＩｇＧの表示のあるレーンのバンドの位置は糖鎖が結合した状態のもの、ＰＮＧａｓｅＦの表示のあるレーンのバンドの位置は糖鎖が切断された状態のものである。丸数字１〜３は図１０のグループ分けに準ずる。この場合、丸数字３のグループの変異体には糖鎖切断活性がなかった。また丸数字１、２のグループの変異体の多くは、１５時間反応では糖鎖切断活性を示したが、反応条件によっては糖鎖切断活性が抑制されているものもあった（Ｄ１８２Ｈ、Ｄ１８２Ｌ、Ｄ１８２Ｍ、Ｄ１８２Ｑ、Ｄ１８２Ａ）。すなわち、糖鎖転移活性が高い変異体を用い、糖鎖切断活性が抑制される反応条件で糖鎖転移反応を行えば、従来よりも効率の良い糖鎖転移反応が行えるといえる。
【００８２】
＜実施例５＞
ＥｎｄｏＳ２欠失変異体の解析
ＥｎｄｏＳの結晶構造が報告されており（非特許文献８参照）、それによるとＥｎｄｏＳ（全長９９５アミノ酸）のアミノ酸番号１〜３６はシグナルペプチド（ＳＰ）、アミノ酸番号３７〜９７はｐｕｔａｔｉｖｅ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌ領域（ＣＣ）、アミノ酸番号９８〜４４５は触媒ドメイン（Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｄ）、アミノ酸番号４４６〜６３１はロイシンリッチリピートドメイン（ＬＲＲ）、アミノ酸番号６３２〜７６４はｈｙｂｒｉｄ  Ｉｇドメイン（Ｈｙｂｒｉｄ  Ｉｇ  Ｄ）、アミノ酸番号７６５〜９２３はｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ（ＣＢＭ）、アミノ酸番号９２４〜９９５はｔｈｒｅｅ−ｈｅｌｉｘ  ｂｕｎｄｌｅドメイン（３Ｈ）となっている（図１２）。
【００８３】
アミノ酸配列の相同性からＥｎｄｏＳ２（全長８４３アミノ酸）のドメイン構造を類推すると、アミノ酸番号１〜３６はシグナルペプチド、ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌ領域に相当する部分は欠失しており、アミノ酸番号３７〜３８４が触媒ドメイン、アミノ酸番号３８５〜５４７はＬＲＲ、アミノ酸番号５４８〜６７７はｈｙｂｒｉｄ  Ｉｇドメイン、アミノ酸番号６７８〜８４３はＣＢＭで、ｔｈｒｅｅ−ｈｅｌｉｘ  ｂｕｎｄｌｅドメインに相当する部分は欠失している（図１２）。このようなドメイン構造を欠失させた場合、酵素活性にどのような影響があらわれるのかを調べてみた。
【００８４】
ＥｎｄｏＳ２欠失変異体としては、ＣＢＭを欠失させたＥｎｄｏＳ２  Δ（６７９−８４３）、Ｈｙｂｒｉｄ  ＩｇドメインとＣＢＭを欠失させたＥｎｄｏＳ２  Δ（５４８−８４３）、およびＬＲＲ、Ｈｙｂｒｉｄ  Ｉｇドメイン、ＣＢＭを欠失させたＥｎｄｏＳ２  Δ（３８６−８４３）を構築した（図１３）。ＥｎｄｏＳ２  Δ（６７９−８４３）をコードするＤＮＡは、ＥｎｄｏＳ２全長をコードするＤＮＡを鋳型として、プライマーＮＧ１３７０＋、ＮＧ１５６０−（配列表配列番号５、６５）とＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ  （ＫＡＰＡ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いてＰＣＲ増幅を行って合成し、ここで増幅したＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。これよりＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで切り出したＤＮＡ断片をｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入したものを、ＥｎｄｏＳ２  Δ（６７９−８４３）の発現ベクターとした。
【００８５】
ＥｎｄｏＳ２  Δ（５４８−８４３）をコードするＤＮＡは、ＥｎｄｏＳ２全長をコードするＤＮＡを鋳型として、プライマーＮＧ１３７０＋、ＮＧ１５５９−（配列表配列番号５、６６）とＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ  （ＫＡＰＡ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いてＰＣＲ増幅を行って合成し、ここで増幅したＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。これよりＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで切り出したＤＮＡ断片をｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入したものを、ＥｎｄｏＳ２  Δ（５４８−８４３）の発現ベクターとした。
【００８６】
ＥｎｄｏＳ２  Δ（３８６−８４３）をコードするＤＮＡは、ＥｎｄｏＳ２全長をコードするＤＮＡを鋳型として、プライマーＮＧ１３７０＋、ＮＧ１５５８−（配列表配列番号５、６７）とＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ  （ＫＡＰＡ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いてＰＣＲ増幅を行って合成し、ここで増幅したＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。これよりＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで切り出したＤＮＡ断片をｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入したものを、ＥｎｄｏＳ２  Δ（３８６−８４３）の発現ベクターとした。
【００８７】
また、各ＥｎｄｏＳ２欠失変異体に対応するグライコシンターゼも構築した。この場合は、ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２ＱをコードするＤＮＡを鋳型として、上記と同様にしてＰＣＲ増幅を行い、ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑ  Δ（６７９−８４３）、ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑ  Δ（５４８−８４３）、ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑ  Δ（３８６−８４３）の各発現ベクターを作製した。
このようにして作製した各発現ベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、前述した方法と同様にして各欠失変異体の発現と精製を行って、酵素溶液を調製した。
【００８８】
上記により得た各ＥｎｄｏＳ２欠失変異体の酵素溶液を用いて、ヒト血清由来ＩｇＧ（ｈＩｇＧ）、ヒト血漿由来α１−ａｃｉｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（α１−ＡＧＰ）、およびウシ膵臓由来ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｂ（ＲＮａｓｅ  Ｂ）の各糖タンパク質糖鎖の切断実験を行った。酵素反応液は、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１０μＬ中に基質糖タンパク質を１μｇ、ＥｎｄｏＳ２欠失変異体を０．２μｇ、それぞれ加え、３０℃で２０時間反応させた。また、対照として、Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｆ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、タカラバイオ）による反応も行った。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーを添加することによって酵素反応を停止させた。このサンプル溶液を煮沸処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ（和光純薬）により染色した。
【００８９】
図１３にその結果を示す。ＥｎｄｏＳ２欠失変異体のうち、ＥｎｄｏＳ２  Δ（６７９−８４３）とＥｎｄｏＳ２  Δ（５４８−８４３）は、野生型ＥｎｄｏＳ２と同様に、ｈＩｇＧとα１−ＡＧＰの糖鎖を切断する活性を有していた。矢印で示すバンドは、糖鎖が切断された基質タンパク質である。α１−ＡＧＰの場合、ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる消化のときとくらべると、ＥｎｄｏＳ２、ＥｎｄｏＳ２  Δ（６７９−８４３）、およびＥｎｄｏＳ２  Δ（５４８−８４３）による消化では、一部の糖鎖しか切断されなかった。また、ＥｎｄｏＳ２と異なり、ＥｎｄｏＳはα１−ＡＧＰの糖鎖を切断しなかった。ＥｎｄｏＳ２  Δ（３８６−８４３）はｈＩｇＧ、α１−ＡＧＰの糖鎖を切断しなかったことから、ＥｎｄｏＳ２には糖鎖切断活性を発揮する上でＬＲＲの全領域、あるいは一部の領域が必要であるといえる。なお、これらの欠失変異体は、もともとＥｎｄｏＳ２の基質ではないＲＮａｓｅ  Ｂの糖鎖は切断しなかった。
【００９０】
つぎに、ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑの欠失変異体の糖鎖転移活性について調べた。糖鎖転移反応の酵素反応液は、２．５μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中に、ＨｅｒＣアクセプターを１０μｇ、Ａ２−オキサゾリンを６ｍＭ、ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑの欠失変異体を０．２μｇ、それぞれ含むように調製した。これらを３０℃にて反応させ、経時的にサンプリングした。酵素反応は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーを添加することにより停止させた。このサンプル溶液を煮沸処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ（和光純薬）により染色し、抗体のＨ鎖に着目して転移産物の有無を確認した。
【００９１】
図１４には、ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑの各欠失変異体の糖鎖転移活性測定の結果を示す。図１４中の横軸の数字は、酵素反応を開始してからの時間を示す（単位：時）。図１４中のバンドは抗体Ｈ鎖であり、ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑのカラムで見られる、反応時間の経過とともに高分子側にシフトしたバンドは糖鎖転移がなされた抗体Ｈ鎖である。ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑ  Δ（６７９−８４３）、ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑ  Δ（５４８−８４３）、ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑ  Δ（３８６−８４３）の各カラムにおいても、反応時間の経過とともに高分子側にシフトしたバンドが少量、検出された。しかし、酵素なし（Ｎｏ  ｅｎｚｙｍｅ）のカラムにおいても、３および５時間経過時に高分子側にシフトしたバンドが少量、検出されていた。これはＡ２−オキサゾリンが非特異的に抗体Ｈ鎖に結合したものと考えられる。現時点では、ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑ  Δ（６７９−８４３）、ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑ  Δ（５４８−８４３）、ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２Ｑ  Δ（３８６−８４３）の各カラムにおいて検出される高分子側にシフトしたバンドが、転移産物なのか、非特異的な反応産物なのかは不明であるが、ＥｎｄｏＳ２  Ｄ１８２ＱをＣ末端側からドメインごとに欠失させていくと、その糖鎖転移活性は著しく低下するといえる。このことは、欠失変異体型のグライコシンターゼを構築する上で注意しなければならないことである。
【００９２】
以上のように、本発明のグライコシンターゼは、従来のグライコシンターゼであるＥｎｄｏＳ  Ｄ２３３Ｑ変異体にくらべて、より広いｐＨ領域で、より高い糖鎖転移活性を示す酵素であることが示された。また基質特異性に関しても、ＥｎｄｏＳ  Ｄ２３３Ｑ変異体にはない高マンノース型糖鎖の転移活性を有していた。実施例でオキサゾリン糖鎖をドナー基質としたときに効率よく糖鎖転移反応が確認されたので、オキサゾリン糖鎖以外の各種糖鎖をドナー基質として使用したときも同様の効果が得られる。このようなグライコシンターゼを糖タンパク質糖鎖の糖鎖リモデリングに用いれば、活性が高いため、オキサゾリン糖鎖を含む各種糖鎖をドナー基質とした糖鎖転移反応が効率よく進む。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明のグライコシンターゼは、不均一な構造をもつ糖鎖が結合した抗体などの糖タンパク質から、均一な構造をもつ糖鎖が結合した糖タンパク質を製造するのに有用であり、これによって該糖タンパク質の機能や安定性の向上、品質の維持などがはかれる可能性がある。また、特定の糖鎖構造をもつことで高機能性を発揮するような糖タンパク質を製造するのに有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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