(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列（５’−Ｎ１ＧＵＡＧＡＮ２Ｎ３−３’）と、配列番号２で表される塩基配列（５’−Ｎ４Ｎ５ＵＵＵＧＣＮ６−３’）と、前記配列番号１で表される塩基配列の３’−末端と前記配列番号２で表される塩基配列の５’−末端とをループ（loop）状に連結してヘアピン(hairpin)構造を形成する塩基配列と、からなるＲＮＡオリゴヌクレオチドにおいて、
前記配列番号１で表される塩基配列と前記配列番号２で表される塩基配列とは互いに相補的に結合して二本鎖を形成し、前記二本鎖は螺旋曲げ（helical bend）構造を有し、
前記配列番号１に表される塩基配列は、その５’−末端にヒドロキシ基（ＯＨ）を有する、ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記配列番号１または配列番号２で表される塩基配列において、Ｎ１〜Ｎ６はＧまたはＣであることを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記配列番号１で表される塩基配列において、Ｎ１はＧ、Ｎ２はＣ、Ｎ３はＧであり（配列番号３に該当）、前記配列番号２で表される塩基配列において、Ｎ４はＣ、Ｎ５はＧ、Ｎ６はＣである（配列番号４に該当）ことを特徴とする、請求項２に記載のＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記ループが少なくとも４個の塩基からなることを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記ループがＵＵＣＧ塩基からなることを特徴とする、請求項４に記載のＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記ループが４〜８０個の塩基からなることを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記ループがワトソン・クリック型塩基対を形成してステム・ループ（stem loop）構
造を有し、前記ステム・ループ構造がＡＵ塩基対からなるＡＵモチーフ（motif）を含む
ことを特徴とする、請求項６に記載のＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記ＡＵモチーフが１０〜５０個のＡＵ塩基対からなることを特徴とする、請求項７に記載のＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドが配列番号７または８で表される塩基配列からなることを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、これを形成するホスホジエステル結合のうち少なくとも一つ以上が、ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合およびメチルホスホネート結合から構成された群より選択された一以上の結合に変形されたことを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか一項に記載のＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載のＲＮＡオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、がん治療用医薬組成物。
【請求項１２】
前記がんが、膵臓がん、肝臓がん、胃がん、肺がん、大腸がん、直腸がん、甲状腺がん、食道がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮頸がん、乳がん、血液がん、皮膚がん、上皮がん、脳腫瘍、中枢神経腫瘍および卵巣がんからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１０に記載の前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、がん治療用医薬組成物。
【請求項１４】
前記がんが、膵臓がん、肝臓がん、胃がん、肺がん、大腸がん、直腸がん、甲状腺がん、食道がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮頸がん、乳がん、血液がん、皮膚がん、上皮がん、脳腫瘍、中枢神経腫瘍および卵巣がんからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の配列および構造を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むがん治療用医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、細胞自体の調節機能により分裂および成長し、寿命が尽きたり損傷すると、自ら死滅して全体数のバランスを維持する。しかし、様々な原因によってこのような細胞自体の調節機能に問題が生じると、死滅するべき異常細胞が無限に増殖するようになり、周囲の正常組織または器官に侵入して塊を形成して既存の構造を破壊したり変形させたりするが、このような状態を癌という。がんに対する治療法には、手術療法、放射線療法、化学療法などがあるが、低い完治率、多くの副作用などの問題点がある。したがって、副作用を減らしながら治療率を上げられる新たな抗がん剤の開発が求められている。
【０００３】
膵臓がんは他のがんに比べて発生頻度は低いが、期間別がん患者の死亡率が最も高いものと知られている。膵臓がんは、早期診断が難しいがんであり周辺の臓器やリンパ節に転移され易い特徴があり、これによる死亡率が増加し続けている。膵臓がんの治療のためには、化学療法と放射線療法が用いられている。
【０００４】
膵臓がん治療のために最も多く用いられている抗がん剤であるゲムシタビン（gemcitabine）は、シュウ酸（oxalate）や５−ＦＵ（5-fluorouracil）などの他の薬物と併用されているが、膵臓がん患者の有意な生存率の増加には大した影響を与えていない。
【０００５】
一方、近年、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを様々な疾患の治療に使用しようとする研究が行われている。特許文献１は、５’−末端にリン酸基（phosphate group）が結合され、キャップ（ｃａｐ）がない状態のオリゴヌクレオチドがＩ型インターフェロン、インターロイキン１８、インターロイキン１βなどの発現を増加させることができることを開示している。
【０００６】
また、特許文献２は、４つのヌクレオチドで構成されたＲＮＡがインターフェロン−αの活性を誘導して免疫反応を促すことを開示している。
【０００７】
前記公開されたＲＮＡは、すべて５’−末端にトリホスフェートを含むという共通点がある。このように、ＲＮＡがその５’−末端にキャップが存在せず、トリホスフェートを含むと、細胞内のＲＩＧ−Ｉ（retinoic acid-inducible gene I）たんぱく質と結合してインターフェロンの発現を活性化させることが知られている。
【０００８】
インターフェロンは、核が存在するほとんどの細胞から由来する糖タンパク質である。Ｉ型インターフェロン遺伝子クラスター（cluster）のインターフェロン−αおよびインターフェロン−β遺伝子が、腫瘍細胞において欠失していることが報告されて以来、インターフェロンが腫瘍の成長に重要な因子として知られており、組換えインターフェロン−βは１９８０年代から抗がん剤として使用されてきた（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許公開第２０１２／０２８８４７６号公報
【特許文献２】米国特許公開第２０１２／０１２１５５１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Jun Yoshida etal., Cancer Sci., 2004, Vol.95, No.11, 858-865
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、がんの治療に使用可能な物質を研究している中、従来知られていることと異なり、５’−末端にトリホスフェートがなくても、特定の配列および構造を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドが、インターフェロン−βによって発現されるインターフェロン活性因子５６（interferon stimulated gene56；ＩＳＧ５６）の発現を増加させ、がん細胞の細胞死滅（アポトーシス）を誘導することを確認することにより本発明を完成した。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、特定の配列および構造を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むがん治療用医薬組成物を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを有効成分として含有するがん治療用医薬組成物であって、前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドが配列番号１で表される塩基配列（５’−Ｎ１ＧＵＡＧＡＮ２Ｎ３−３’）と配列番号２で表される塩基配列（５’−Ｎ４Ｎ５ＵＵＵＧＣＮ６−３’）とが、互いに相補的に結合して二本鎖を形成し、前記二本鎖が螺旋曲げ（helical bend）構造を有して、前記配列番号１で表される塩基配列の３’−末端と配列番号２で表される塩基配列の５’−末端とがループ（ｌｏｏｐ）状に連結してヘアピン（hairpin）構造を有し、前記配列番号１で表される塩基配列がその５’−末端にヒドロキシ基（ＯＨ）を有する、がん治療用医薬組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る特定配列と螺旋曲げ構造を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドを細胞株に処理すると、ＩＳＧ５６の発現を増加させがん細胞の細胞死滅を誘導するので、前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む組成物は、がんの治療に有効に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の一実施例により調製されたＲＮＡオリゴヌクレオチドの配列および構造を示す図である。
【図２】図２は、本発明の一実施例により調製されたＲＮＡオリゴヌクレオチドである５’−ＯＨ−ｉａｖまたは５’−ＰＰＰ−ｉａｖの構造を確認した図である。
【図３】図３は、本発明の一実施例により調製されたＲＮＡオリゴヌクレオチドである５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳによるＩＳＧ５６の発現増加を確認したグラフである。
【図４】図４は、本発明の一実施例により調製されたＲＮＡオリゴヌクレオチドである５’−ＯＨ−Ｌｏｎｇ＿ＢｅｎｄによるＩＳＧ５６の発現増加を確認したグラフである。
【図５】図５は、本発明の一実施例により調製されたＲＮＡオリゴヌクレオチドである５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳと５’−ＯＨ−Ｌｏｎｇ＿Ｂｅｎｄとによる膵臓がん細胞株（Ｐａｎｃ０２）の細胞死滅誘導効果をＦＡＣＳにより確認したグラフである。
【図６】図６は、本発明の一実施例により調製されたＲＮＡオリゴヌクレオチドである５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳと５’−ＯＨ−Ｌｏｎｇ＿Ｂｅｎｄとによる正常細胞株（ＨＥＫ２９３）の細胞死滅誘導効果をＦＡＣＳにより確認したグラフである。
【図７】図７は、本発明の一実施例により調製されたＲＮＡオリゴヌクレオチドである５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳによる肝臓がん細胞株（ＳＮＵ８８６）の細胞死滅誘導効果をＦＡＣＳを用いて確認したグラフである。
【図８】図８ａおよび図８ｂはそれぞれ、本発明の一実施例により調製されたＲＮＡオリゴヌクレオチドである５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳによる胃がん細胞株ＳＮＵ２１６およびＭＫＮ７４の細胞死滅誘導効果をＦＡＣＳにより確認したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを有効成分として含有するがん治療用医薬組成物であって、前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドが配列番号１で表される塩基配列（５’−Ｎ１ＧＵＡＧＡＮ２Ｎ３−３’）と配列番号２で表される塩基配列（５’−Ｎ４Ｎ５ＵＵＵＧＣＮ６−３’）とが、互いに相補的に結合して二本鎖を形成し、前記二本鎖が螺旋曲げ構造を有し、前記配列番号１で表される塩基配列の３’−末端と配列番号２で表される塩基配列の５’−末端とがループ状に連結されてヘアピン構造を有し、前記配列番号１で表される塩基配列がその５’−末端にヒドロキシ基（ＯＨ）を有する、がん治療用医薬組成物を提供する。
【００１７】
本発明に係るＲＮＡオリゴヌクレオチドは、８〜１００個、８〜５０個、８〜３０個、８〜２０個、１０〜１００個、１０〜５０個、１０〜３０個、２０〜５００個、２０〜３００個、１０〜２００個、１０〜１００個、２０〜１００個、２０〜９０個または２０〜５０個の塩基を有し得る。
【００１８】
前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドを構成する配列番号１または配列番号２で表される塩基配列において、Ｎ１〜Ｎ６は、Ａ、Ｇ、ＣおよびＵから構成された群より選択されたいずれか一つであってよく、具体的にはＧまたはＣであり得る。本発明に係る一実施例において、前記配列番号１で表される塩基配列において、Ｎ１はＧ、Ｎ２はＣ、そしてＮ３はＧであってよく（配列番号３に該当）、配列番号２で表される塩基配列において、Ｎ４はＣ、Ｎ５はＧ、そしてＮ６はＣであり得る（配列番号４に該当）。
【００１９】
また、本発明に係るＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列の４番目の塩基（Ａ）と、配列番号２で表される塩基配列の５番目の塩基（Ｕ）との間で螺旋曲げ構造を形成することを特徴とする。
【００２０】
本発明に係る一実施例において、螺旋曲げ構造は、配列番号１で表される塩基配列の３番目の塩基（Ｕ）および５番目の塩基（Ｇ）が、配列番号２で表される塩基配列のそれぞれ６番目の塩基（Ｇ）および４番目の塩基（Ｕ）と、それぞれゆらぎ塩基対（wobble base pair）であるとき、配列番号１で表される塩基配列の４番目の塩基（Ａ）と配列番号２で表される塩基配列の５番目の塩基（Ｕ）において形成される。
【００２１】
前記螺旋曲げ構造は、二本鎖のＲＮＡがなす平面を基準に、１０〜９０度、具体的には３０〜７０度、より具体的には４０〜５０度で曲がった形状を有する。
【００２２】
前記ヘアピンＲＮＡ構造において、ループは少なくとも４つの塩基からなってよく、例えば、４〜８０個、４〜７５個、４〜７０個、４〜６５個、４〜６０個、４〜５５個、４〜５０個、４〜４５個、４〜４０個、４〜３５個、４〜３０個、４〜２５個、４〜２０個、４〜１５個または４〜１０個の塩基からなり得る。本発明に係る一実施例において、前記ループは４個または７３個の塩基からなり得る。本発明に係る一実施例において、前記ループを構成する４個の塩基配列はＵＵＣＧである。
【００２３】
また、前記ループにおいて、これを構成する一部の塩基配列が互いに相補的である時、ワトソン・クリック型塩基対を形成してステム・ループ構造を有し得る。前記ステム・ループ構造は、ＡおよびＵの間にワトソン・クリック型塩基対が形成されたＡＵモチーフ（motif）を含むことができる。
【００２４】
前記ＡＵモチーフは、１０〜５０個、１５〜４０個、２０〜３５個、２５〜３０個のＡＵ塩基対からなり得る。本発明に係る一実施例において、前記ＡＵモチーフは２６個の連続したＡＵ塩基対からなり得る。
【００２５】
本発明に係る一実施例において、前記ヘアピンＲＮＡ構造を有するオリゴヌクレオチドは、配列番号７または配列番号８で表される塩基配列であり得る。
【００２６】
本発明に係るＲＮＡオリゴヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ（endonuclease）による分解を抑制し生体内安定性の向上のために、前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドを形成するホスホジエステル結合（phosphodiester bond）のうち少なくとも一以上がホスホロチオエート（phosphorothioate）結合、ボラノホスフェート（boranophosphate）結合およびメチルホスホネート（methylphosphonate）結合からなる群より選択された一以上の結合に変形され得る。本発明に係る具体的な一実施例において、前記変形は少なくとも一以上のホスホロチオエート結合である。
【００２７】
本発明者らはヘアピンＲＮＡ構造を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドを調製し（図１）、そのうち５’−ＯＨ−ｉａｖまたは５’−ＰＰＰ−ｉａｖが螺旋曲げ構造を有し（図２）、前記螺旋曲げ構造を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドがＩＳＧ５６の発現を増加させることを確認した（図３および図４）。
【００２８】
また、前記螺旋曲げ構造を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドが、正常細胞の細胞死滅を誘導しないで、かつ、膵臓がん、肝臓がんおよび胃がんの細胞株の細胞死滅を誘導することを確認した（図５〜図８）。
【００２９】
したがって、本発明による螺旋曲げ構造を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ＩＳＧ５６の発現を増加させ、がん細胞の細胞死滅を誘導するので、前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む組成物は、がんの治療に有用に使用され得る。
【００３０】
本発明のがん治療用医薬組成物は、膵臓がん、肝臓がん、胃がん、肺がん、大腸がん、直腸がん、甲状腺がん、食道がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮頸がん、乳がん、血液がん、皮膚がん、上皮がん、脳腫瘍、中枢神経腫瘍または卵巣がんなど、様々ながんの治療のために使用され得る。
【００３１】
本発明によるがん治療用医薬組成物は、組成物全体重量に対して、有効成分である本発明によるＲＮＡオリゴヌクレオチドを１０〜９５重量％で含むことができる。また、本発明の医薬組成物は、前記有効成分の外に、同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上さらに含有することができる。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、投与のために、前記記載の有効成分に加えて、薬学的に許容可能な添加剤、例えば、賦形剤、担体、希釈剤、およびその他の補助剤等を１種以上さらに含むことができる。
【００３３】
本発明に係る医薬組成物の投与量は、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分および他の成分の種類および含有量、剤形の種類および患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路、治療期間および同時に使用される薬物をはじめとする様々な因子に応じて調節することができる。しかし、望ましい効果のために、本発明に係る医薬組成物に含まれるＲＮＡオリゴヌクレオチドの有効量は、細胞内濃度が１〜１０００ｎＭ、具体的には、１００〜５００ｎＭになるようにする。この際、投与は一日に一回投与することができ、数回に分けて投与することもできる。
【００３４】
また、本発明の医薬組成物は、当業界に公知の様々な方法により個体に投与することができる。前記投与経路は、投与方法、体液の体積、粘度などを考慮して、通常の技術者が適宜選択することができる。
（実施例）
【００３５】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するためのものであるのみ、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
（実施例１：ＲＮＡオリゴヌクレオチド（oligonucleotide）の調製）
【００３６】
インターフェロン−βまたはＩＳＧ５６の発現を増加させることができるＲＮＡオリゴヌクレオチドを作製した。
【００３７】
まず、配列番号５で表される塩基配列で構成され、５’−末端にトリホスフェートを有するＲＮＡオリゴヌクレオチドは、当業界に公知の技術を用いて作製した。一方、配列番号５〜８で表される塩基配列で構成され、５’−末端にヒドロキシ基を有するか、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合で置換されたＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インテグレイテッド・ＤＮＡテクノロジー（Integrated DNA Technologies）またはダルマコーン（Dharmacon）に注文作製した。
【００３８】
これにより、図１に示すように、配列番号５で表される塩基配列で構成され、５’−末端にヒドロキシ基またはトリホスフェートを有する５’−ＯＨ−ｉａｖおよび５’−ＰＰＰ−ｉａｖ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドを調製した。また、配列番号６で表される塩基配列で構成され、５’−末端にヒドロキシ基を有する５’−ＯＨ−Ｃｏｎｔ−ＧＣ−８ｂｐ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドを調製した。また、配列番号７で表される塩基配列で構成され、５’−末端にヒドロキシ基を有し、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを形成するホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合で置換された５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドを調製した。さらに、配列番号８で表される塩基配列で構成され、その５’−末端にヒドロキシ基を有する５’−ＯＨ−Ｌｏｎｇ＿Ｂｅｎｄ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドを調製した。
（実施例２：ＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造確認）
【００３９】
前記実施例１で調製された５’−ＯＨ−ｉａｖおよび５’−ＰＰＰ−ｉａｖ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造を確認するために、以下のような実験を行った。
【００４０】
まず、前記実施例１で調製されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、０．０１ｍＭのＥＤＴＡ、１０（ｖ／ｖ）％Ｄ２Ｏを含む緩衝液に溶解してサンプルを調製し、当業界に公知の方法により様々な分光実験を行った。この際、２次元ＮＯＥ分光実験（ＮＯＥＳＹ）は４００ＭＨｚ、６００ＭＨｚ、および８００ＭＨｚの核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光器（Bruker、米国）をもって１００ｍｓおよび２００ｍｓのミキシングタイムで行った。また、２７８Ｋの温度において、１Ｈ−１５Ｈ  ＨＳＱＣ（heteronuclear single quantum coherence）分光実験、１２５ｍｓのミキシングタイムにおいてＤＱＦ−ＣＯＳＹ（double quantum filtered correlated）および等核ＴＯＣＳＹ（total correlation分光実験）、３０ｍｓのミキシングタイムにおいて１Ｈ−３１Ｐ  ＨＥＴＣＯＲ（heteronuclear correlation）および１Ｈ−３１Ｐ  Ｈｅｔｅｒｏ−ＴＯＣＳＹ分光実験、並びに８０ｍｓ、１５０ｍｓ、および２５０ｍｓのミキシングタイムでＮＯＥＳＹを行った。そのほかにも、１Ｈ−１３Ｃ  ＣＴ−ＨＳＱＣ、ＨＣＣＨ−ＣＯＳＹ、２Ｄ  ＨＣＣＨ−ｒｅｌａｙｅｄ  ＣＯＳＹ、２Ｄ  ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹおよび３Ｄ  ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ分光実験をした。
【００４１】
ＮＭＲ分光実験の結果、前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの塩基水素と、Ｈ１’、Ｈ２’、Ｈ３’、Ｈ４’、Ｈ５’／Ｈ５’’のＮＭＲピークを定めた。ＮＯＥＳＹ分光実験から約５６３個のＮＯＥ距離規定値（distance constraints）を求め、距離規定値は距離に応じて３〜４つのグループ（例えば、１．８〜３．４Å、１．８〜５．０Åおよび３．８〜７．０Å、または１．８〜３．４Å、２．５〜４．５Å、３．５〜６．０Åおよび４．０〜７．０Å）に分類した。非ワトソン・クリック結合については水素結合の制限はしなかった。ＤＱＦ−ＣＯＳＹから得た３ＪＨ１’、Ｈ２’値でδ二面角（dihedral angle）を求め、すべてのχ二面角は−１５８±１５度で固定した。他の二面角（例えば、α、β、γ、ε、ζ）は、ＲＮＡのＡ型螺旋構造に制限した。バルジ（bulge）部分は、いくつかのβおよびε二面角を除いて、他の二面角は制限しなかった。残余双極子カップリング（residual dipolar coupling）値を±１Ｈｚの精度で感度が増加したＨＳＱＣ実験により測定した。また、特異値分解（singular value decomposition）によりアライメントテンソル（alignmenttensor）を分析した結果、−８．０Ｈｚの異方性（anisotropy）値と０．３２のロムビシティ（rhombicity）値を得た。すべての構造の計算は、Ｘ−ＰＬＯＲ３．１およびＣＮＳにより行った。１００個の構造を距離規定値に基づいて生成して３０００Ｋで１０ｐｓ間のシミュレーション後、５０ｐｓの間３００Ｋで冷やす焼きなまし法（simulated annealing）を行った。距離力定数（distanceforce constant）は５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Åに維持し、二面角定数は２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Åから４００ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Åに変化させた。最も低いエネルギー状態の構造は３００Ｋにて２０ｐｓで精製し、最後の５ｐｓは制限されたエネルギー最小化（restrained energy minimization）した。これから得られた合計２２０個の構造は、２２個の残余双極子カップリング規定値を追加して精製し、この際、残余双極子カップリングの力の定数値は、３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌを維持した。最終的に３２個の構造を得て、これをＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Biosym Technologies、米国）およびＣＵＲＶＥＳ５．２ソフトウェアにより分析した。
【００４２】
その結果、図２に示すように、５’−ＰＰＰ−ｉａｖおよび５’−ＯＨ−ｉａｖ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、螺旋曲げ構造を形成していた。このような螺旋曲げ構造は、５’−ＰＰＰ−ｉａｖおよび５’−ＯＨ−ｉａｖを構成する配列のうち、５’−ＧＵＡＧＡ−３’および５’−ＵＵＵＧＣ−３’の配列で構成された二つの一本鎖が非ワトソン・クリック結合により二本鎖を形成して生成される構造として確認された。したがって、前記５’−ＧＵＡＧＡ−３’および５’−ＵＵＵＧＣ−３’の配列を含む本発明のＲＮＡオリゴヌクレオチドである５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳおよび５’−ＯＨ−Ｌｏｎｇ＿Ｂｅｎｄ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドも螺旋曲げ構造を形成することが分かる。
（実験例１：５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳによるＩＳＧ５６の発現増加確認）
【００４３】
本発明で調製された曲げ構造を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドのうち、ホスホロチオエート結合で連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチド（５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳ）がインターフェロン−β発現増加の活性があるか否かを確認するために、インターフェロン−βの発現によって誘導されるＩＳＧ５６の発現変化を確認した。
＜１．１．細胞株の準備＞
【００４４】
まず、１００ｍｍの組織培養プレートに３×１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、米国）を１０％のウシ胎児血清（fetal bovine serum；ＦＢＳ、Gibco、米国）が含まれたＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）培地７ｍｌに分注し、これを３７℃、５％ＣＯ２の条件で２４時間培養して細胞株を準備した。
＜１．２．ＲＮＡオリゴヌクレオチドの処理＞
【００４５】
前記実験例１．１で準備した細胞株に、前記５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドを処理した。
【００４６】
まず、前記培養された細胞にトリプシン−ＥＤＴＡ（Gibco、米国）を処理して細胞を分離し、これを計数して６ウェルプレートに１×１０３個になるように分注した。その後、これを３７℃、５％ＣＯ２の条件で４２時間培養し、培地を除去した後、ＦＢＳが含まれていない４００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、米国）およびＲＮＡオリゴヌクレオチドを処理した。
【００４７】
ＲＮＡオリゴヌクレオチドの処理は、１μＭの５’−ＯＨ−Ｃｏｎｔ−ＧＣ−８ｂｐおよび５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳの各々に、４μｌのリポフェクタミンＬＴＸ（Lipofectamine（登録商標）ＬＴＸ;Invitrogen、米国）および１．６μｌのプラス試薬（PLUS reagent; Invitrogen、米国）を混合し、これを２００μｌずつ細胞に処理した。その後、前記細胞をさらに３７℃、５％ＣＯ２の条件で４時間培養し、この際、陽性対照群としてＲＩＧ−Ｉリガンドとして知られているポリ（Ｉ：Ｃ）［ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）］を、陰性対照群としては培地のみ処理した。４時間後、培地を除去し、１０％のＦＢＳを含む２ｍｌのＤＭＥＭ培地を入れて、３７℃、５％ＣＯ２の条件でさらに２時間培養した。
＜１．３．ＩＳＧ５６の発現確認＞
【００４８】
上述のように、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを処理した細胞においてＩＳＧ５６の発現を確認するために、以下のような方法でＲＮＡを分離した。
【００４９】
まず、バッジを除去して５００μｌのＴＲＩ試薬（Ambion、米国）で細胞を回収した後、集められた細胞にクロロホルムを入れてＲＮＡ層を分離した。これにイソプロパノールを添加してペレット（pellet）を作った後、前記ペレットを７５％のエタノールで洗浄し、乾燥させた後、滅菌処理された蒸留水に溶かした。このように分離されたＲＮＡにＤＮａｓｅ（Promega、米国）を添加して３０分間常温で処理して汚染されたＤＮＡを除去し、停止液（stopsolution）でこれを不活性化した。その後、スーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（Invitrogen、米国）を用いて、５０℃で１時間反応させてＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
【００５０】
このようにして合成されたｃＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲ（real-time ＰＣＲ）を行った。具体的に、リアルタイムＰＣＲは、ｈ−ｔａｇＤＮＡポリメラーゼ（solgent、大韓民国）、ｄＮＴＰ、塩化テトラエチルアンモニウム（tetraethylammoniumchloride）、エヴァグリーン蛍光色素（EvaGreen dye、 Biotium、米国）、および標的遺伝子であるインターフェロン−βおよび対照遺伝子であるＧＡＰＤＨのためのプライマーを混合して行った。リアルタイムＰＣＲは、９５℃で１５分間固定した後、９５℃で２０秒、６０℃で４０秒、および７２℃で２０秒を１回として、合計４０回繰り返した。このとき、ＩＳＧ５６およびＧＡＰＤＨをターゲットとするプライマーを表１に示した。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
その結果の、ＩＳＧ５６の発現変化を図３にグラフで示す。
図３に示すように、５’−末端にヒドロキシ基を有して螺旋曲げ構造を有する５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ＩＳＧ５６の発現を有意水準まで増加させたことを確認した。
（実験例２．：５’−ＯＨ−Ｌｏｎｇ＿ＢｅｎｄによるＩＳＧ５６の発現確認）
【００５３】
本発明において調製された曲げ構造を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドのうち、長尺のヘアピンＲＮＡオリゴヌクレオチド（５’−ＯＨ−Ｌｏｎｇ＿Ｂｅｎｄ）がインターフェロン−β発現増加の活性があるか否かを確認するために、ＩＳＧ５６の発現変化を確認した。
【００５４】
すべての実験は、前記実験例１と同様に行われた。ただし、陰性対照群は培地のみ処理し、陽性対照群としては５’−ＰＰＰ−ｉａｖを処理した。実験群としては、５’−ＯＨ−Ｌｏｎｇ＿Ｂｅｎｄ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドを処理した。
【００５５】
その結果の、ＩＳＧ５６の発現変化を図４にグラフで示す。
図４に示すように、５’−末端にヒドロキシ基を有して螺旋曲げ構造があり、長尺のヘアピンを有する５’−ＯＨ−Ｌｏｎｇ＿Ｂｅｎｄ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドがＩＳＧ５６の発現を増加させたことを確認した。
（実験例３：５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳおよび５’−ＯＨ−Ｌｏｎｇ＿Ｂｅｎｄ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドの膵臓がん細胞の死滅誘導効果確認）
＜３．１．細胞株の準備およびＲＮＡオリゴヌクレオチド処理＞
【００５６】
まず、２４ウェルプレートの各ウェルに、０．５×１０５個のＰａｎｃ０２細胞（Prof. Dr. med. Christiane Bruns、UniversittsklinikumMagdeburg）および５０倍希釈した２Ｘビタミン（Gibco、米国）と２Ｘ  ＮＥＡＡ（Non-essential Amino Acid solution; Sigma、米国）が含まれたＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium；WELGENE、米国）培地３００μｌを分注した。
【００５７】
一方、１μｇ／ｍＬのＲＮＡオリゴヌクレオチド（５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳまたは５’−ＯＨ−Ｌｏｎｇ＿Ｂｅｎｄ）とポリ（Ｉ：Ｃ）（Invivogen、米国）とをそれぞれ４０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Gibco、米国）と混ぜた。そして、１μｌのリポフェクタミンＬＴＸ（Invitrogen、米国）および０．６μｌのプラス試薬（Invitrogen、米国）を混合して、これを４０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Gibco、米国）に入れて常温で５分間反応させた。その後、用意したＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリ（Ｉ：Ｃ）の混合物４０μｌとリポフェクタミン−プラス試薬の混合物４０μｌをそれぞれ混合し２０分間常温に放置して、ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリ（Ｉ：Ｃ）とリポフェクタミンとが互いに結合体をなすようにした。
【００５８】
その後、８０μｌのＲＮＡオリゴヌクレオチド−リポフェクタミン結合体を、Ｐａｎｃ０２細胞が入っているウェルに投与し、前記細胞をさらに３７℃、５％ＣＯ２の条件で２４時間培養した。このとき、陽性対照群としてはＲＩＧ−Ｉリガンドとして知られているポリ（Ｉ：Ｃ）を、陰性対照群としては培地と５’−ＯＨ−Ｃｏｎｔ−ＧＣ−８ｂｐのみを処理した。
＜３．２．ＦＡＣＳ（Fluorecence-activated Cell Sorting）を用いた細胞死滅確認＞
【００５９】
実施例３．１のように、ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリ（Ｉ：Ｃ）を処理した細胞株を、０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Gibco、米国）を用いて５ｍＬの丸底チューブに回収した後、１５００ｒｐｍの速度で４℃で５分間スピン−ダウン（spin-down）して上澄み液を除去した。その後、細胞をＦＩＴＣが結合されたアネキシン（Annexin）Ｖ（Biolegend、米国）と７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ；BD Bioscience、米国）を含む１００μｌの１ｘ結合バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）で暗室において１５分間染色した。その後、染色された細胞をＬＳＲFortessa flow cytometry（ＢＤ  Bioscience、米国）により測定し、FlowJo解析ソフトウェア（Treestar、米国）により測定結果を分析した。
【００６０】
その結果の、細胞死滅によって死滅した細胞の割合を図５に示した。
図５に示すように、５’−末端にヒドロキシ基を有して曲げ構造がある５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドと、５’−ＯＨ−Ｌｏｎｇ＿Ｂｅｎｄ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドとが、有意水準で膵臓がん細胞株の死滅を誘導した。
（実験例４：５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳおよび５’−ＯＨ−Ｌｏｎｇ＿Ｂｅｎｄ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドの正常細胞の死滅誘導効果の確認）
【００６１】
正常細胞株（ＨＥＫ２９３；ＡＴＣＣ、米国）を、前記実験例３．１のようにＤＭＥＭ培地（WELGENE、米国）に分注して、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを前記実験例３．１のように処理した。その後、実験例３．２のようにＦＡＣＳを用いて細胞死滅効果を確認した。
【００６２】
その結果の、細胞死滅によって死滅した細胞の割合を図６に示した。図６に示すように、ポリ（Ｉ：Ｃ）はＨＥＫ２９３細胞株の死滅を誘導したのに対し、５’−末端にヒドロキシ基を有して曲げ構造がある５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドおよび５’−ＯＨ−Ｌｏｎｇ＿Ｂｅｎｄ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、有意水準でＨＥＫ２９３細胞株の死滅を誘導しなかった。
【００６３】
実験例３と４をまとめた結果、５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドと５’−ＯＨ−Ｌｏｎｇ＿Ｂｅｎｄ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドとは、正常細胞（ＨＥＫ２９３）とがん細胞（膵臓がん細胞；Ｐａｎｃ０２）との間でがん細胞だけを選択的に死滅させた。
（実験例５：５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳオリゴヌクレオチドの肝臓がん細胞の死滅誘導効果確認）
【００６４】
肝臓がんの細胞株（ＳＮＵ８８６； Korean Cell Line Bank、韓国）を前記実験例３．１のようにＤＭＥＭ培地（WELGENE、米国）に分注し、５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳオリゴヌクレオチドを前記実験例３．１と同様に処理した。その後、実験例３．２のように、ＦＡＣＳを用いて細胞の死滅効果を確認した。
【００６５】
その結果の、細胞死滅によって死滅した細胞の割合を図７に示した。図７に示すように、５’−末端にヒドロキシ基を有して曲げ構造がある５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドが有意水準で肝臓がん細胞株の死滅を誘導した。
（実験例６．：５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳオリゴヌクレオチドの胃がん細胞の死滅誘導効果を確認）
【００６６】
胃がんの細胞株（ＳＮＵ２１６およびＭＫＮ７４；Korean Cell Line Bank、韓国）を前記実験例３．１のようにＤＭＥＭ培地（WELGENE、米国）に分注し、５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳオリゴヌクレオチドを前記実験例３．１と同様に処理した。その後、実験例３．２のようにＦＡＣＳを用いて細胞の死滅効果を確認した。
【００６７】
その結果の、細胞死滅によって死滅した細胞の割合を図８ａおよび図８ｂにそれぞれ示した。図８ａおよび図８ｂに示すように、５’−末端にヒドロキシ基を有して曲げ構造がある５’−ＯＨ−Ｂｅｎｄ−ＧＣ−８ｂｐ−ＰＳ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドが有意水準で胃がん細胞株の死滅を誘導した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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