(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料内の染色体領域および／またはＤＮＡ領域の検出によるインサイチュハイブリダイゼーションによる相互に異なる少なくとも２つの染色体異常の検出方法であって、
前記インサイチュハイブリダイゼーションを間期インサイチュハイブリダイゼーションとして実施すること
それぞれ第１検出標識で標識された相互に異なる少なくとも４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いて前記インサイチュハイブリダイゼーションを実施し、特に、少なくとも１点の混合シグナルを生成するために前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１つを、前記各座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに関して前記第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識で標識し、それによりシグナルパターンを生じさせること、および
前記シグナルパターンを用いて存在する染色体異常を特定すること、および／または存在する染色体異常を染色体領域および／またはＤＮＡ領域に割り当てること、
前記ハイブリダイゼーションプローブが前記検出標識で直接標識されていること、
座位特異的ハイブリダイゼーションプローブは、１つの特定の染色体領域および／またはＤＮＡ領域に対して相補的なプローブであること、
検出される染色体領域またはＤＮＡ領域は少なくとも５００ｂｐの長さを有し、全ての検出される染色体領域またはＤＮＡ領域は同一の細胞内に位置すること、
混合シグナルは、同一の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブ上に位置する相互に異なる少なくとも２種の検出標識によって生成されるシグナルであること、
それぞれ２本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが切断点領域に隣接し、切断点領域に隣接するそれぞれ２本の前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが相互に異なる検出標識で標識され、それによりそれぞれ切断点領域に遠位および近位に隣接する前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが、染色体異常が存在しない場合にシグナルパターンとして融合シグナルを生成すること
を特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記染色体異常が相互無関係の染色体異常であり、且つ／または前記染色体異常が相互的染色体異常ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１種の追加検出標識を用いて追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの標識を行い、追加の検出標識で標識された前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブがシグナルパターンとして相互に異なる混合シグナルをそれぞれ生成し、且つ／または少なくとも１種の追加検出標識を用いて追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの標識を行い、少なくとも１種の追加検出標識で標識されている各座位特異的ハイブリダイゼーションプローブによって染色体領域および／またはＤＮＡ領域に特異的な
混合シグナルがシグナルパターンとして生成され、且つ／または
少なくとも２本の追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを前記第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識で標識し、且つ／または染色体領域および／またはＤＮＡ領域に特異的な混合シグナルが少なくとも２本の追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブによってシグナルパターンとして生成される
請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
一つの染色体部分毎にそれぞれ２本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが隣接する少なくとも６本の異なる座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用し、且つ
各隣接染色体部分、ならびに／または検出される各染色体領域および／もしくはＤＮＡ領域が、シグナルパターンとして融合および混合シグナルによって特定および／または割り当てられ得るように第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識で追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの標識を行う、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）検出標識Ａで標識された第１座位特異的ハイブリダイゼーションプローブおよび検出標識Ｂで標識された第２座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが染色体部分に隣接し、且つ、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合シグナルＡ-Ｂを生成し、
（ｂ）２〜１２本の追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブがさらに６か所の染色体部分に隣接し、同様に、一つの染色体部分に隣接する２本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの１つずつを検出標識Ａで標識し、且つ、一つの染色体部分に隣接する２本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの１つずつを検出標識Ｂで標識し、それにより染色体部分にそれぞれ隣接する前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブがインサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合シグナルＡ-Ｂを生成し、且つ、
（ｃ）前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１つのプローブを少なくとも１種の追加検出標識Ｘで標識し、それにより少なくとも１種の追加検出標識で標識された前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブがインサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合および混合シグナルＡ-Ｂ／Ｘを生成し、
染色体異常の場合での前記融合および混合シグナルＡ-Ｂ／Ｘは、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて混合シグナルＡ／Ｘおよび／または混合シグナルＢ／Ｘに変化し、且つ／または
染色体異常の場合での前記融合シグナルＡ-Ｂは、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて単独のシグナルＡおよび／またはシグナルＢに変化し、
それにより、前記インサイチュハイブリダイゼーションによって生成された前記シグナルパターンを用いて染色体異常を２本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが隣接する染色体領域および／またはＤＮＡ領域および／または染色体部分に割り当て、
第１ステップにおいて、前記第１検出標識によって生成された前記融合シグナルが検出および／または分析され、そして後続のステップにおいて単独のシグナルが生じる場合は前記混合シグナルの検出および／または分析と検出された染色体領域および／またはＤＮ
Ａ領域への前記混合シグナルの割り当てを行い、且つ／またはコンピューター支援分析により前記シグナルパターンの検出を行う、
請求項１または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが、検出予定の前記染色体領域および／またはＤＮＡ領域をそれぞれ包含する複数の核酸断片（「プローブ断片」）によってそれぞれ形成される、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）ハイブリダイゼーション特異的プローブの個々の核酸断片がたった１種の検出標識で標識され、且つ、
（ｉｉ）ハイブリダイゼーション特異的プローブの個々の核酸断片が相互に異なる複数の検出標識で標識され、
前記可能性（ｉ）と（ｉｉ）の組合せによっても混合シグナルが生じる、
請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記インサイチュハイブリダイゼーションが前記ハイブリダイゼーションプローブの直接標識によって行われ、且つ前記インサイチュハイブリダイゼーションが、蛍光色素の標識によって行われる、
請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
インサイチュハイブリダイゼーションにより、相互に異なる少なくとも２つの染色体異常を検出するための組成物であって、それぞれ第１検出標識で標識された相互に異なる少なくとも４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを含み、且つ、前記の各座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに関して、前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１本のプローブが前記第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識で標識されており、
前記ハイブリダイゼーションプローブが前記検出標識で直接標識され、
座位特異的ハイブリダイゼーションプローブは、１つの特定の染色体領域および／またはＤＮＡ領域に対して相補的なプローブであり、
検出される染色体領域またはＤＮＡ領域は少なくとも５００ｂｐの長さを有し、全ての検出される染色体領域またはＤＮＡ領域は同一の細胞内に位置し、
混合シグナルは、同一の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブ上に位置する相互に異なる少なくとも２種の検出標識によって生成されるシグナルであり、
それぞれ２本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが切断点領域に隣接し、切断点領域に隣接するそれぞれ２本の前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが相互に異なる検出標識で標識され、それによりそれぞれ切断点領域に遠位および近位に隣接する前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが、染色体異常が存在しない場合にシグナルパターンとして融合シグナルを生成する
前記組成物。
【請求項１０】
染色体異常と関連する疾患であって、悪性腫瘍、好ましくは癌腫、肉腫、および／または白血病から選択される疾患の診断および／または予後判定に使用される組成物であって、
それぞれ第１検出標識で標識された相互に異なる少なくとも４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを含み、且つ、前記の各座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに関して、前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１本のプローブが前記第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識で標識されており、
前記ハイブリダイゼーションプローブが前記検出標識で直接標識され、
座位特異的ハイブリダイゼーションプローブは、１つの特定の染色体領域および／またはＤＮＡ領域に対して相補的なプローブであり、
検出される染色体領域またはＤＮＡ領域は少なくとも５００ｂｐの長さを有し、全ての検出される染色体領域またはＤＮＡ領域は同一の細胞内に位置し、
混合シグナルは、同一の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブ上に位置する相互に異なる少なくとも２種の検出標識によって生成されるシグナルであり、
それぞれ２本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが切断点領域に隣接し、切断点領域に隣接するそれぞれ２本の前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが相互に異なる検出標識で標識され、それによりそれぞれ切断点領域に遠位および近位に隣接する前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが、染色体異常が存在しない場合にシグナルパターンとして融合シグナルを生成する
前記組成物。
【請求項１１】
インサイチュハイブリダイゼーションにより、特に請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法により染色体異常を検出するための請求項９に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
インサイチュハイブリダイゼーションにより相互に異なる少なくとも２つの染色体異常を検出するためのキットであって、それぞれ第１検出標識で標識された相互に異なる少なくとも４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを含み、前記の各ハイブリダイゼーションプローブに関して、前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１本のプローブが前記第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識で標識されており、
前記ハイブリダイゼーションプローブが前記検出標識で直接標識され、
座位特異的ハイブリダイゼーションプローブは、１つの特定の染色体領域および／またはＤＮＡ領域に対して相補的なプローブであり、
検出される染色体領域またはＤＮＡ領域は少なくとも５００ｂｐの長さを有し、全ての検出される染色体領域またはＤＮＡ領域は同一の細胞内に位置し、
混合シグナルは、同一の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブ上に位置する相互に異なる少なくとも２種の検出標識によって生成されるシグナルであり、
それぞれ２本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが切断点領域に隣接し、切断点領域に隣接するそれぞれ２本の前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが相互に異なる検出標識で標識され、それによりそれぞれ切断点領域に遠位および近位に隣接する前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが、染色体異常が存在しない場合にシグナルパターンとして融合シグナルを生成する
前記キット。
【請求項１３】
相互に異なる少なくとも４本の前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが共通の組成物内に存在する、請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は染色体不規則、すなわち染色体異常の検出方法の技術分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
特に、本発明はインサイチュハイブリダイゼーションを用いる染色体異常の検出方法に関する。さらに、本発明は染色体異常の検出に適切な組成物、ならびに本発明によるその組成物の使用に関する。検出標識で標識された座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの使用が本発明のその他の課題である。最後に、染色体異常の検出用キットが本発明の課題である。
【０００３】
多くの腫瘍病が転座、逆位、部分重複、欠失、挿入、重複、異数性、および増幅などの構造的および数的染色体変異に基づく。予測的予後判定マーカーまたは予測的鑑別診断マーカーとしてのこれらの変異の検出は原則としてインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を用いて行われる。
【０００４】
インサイチュハイブリダイゼーションは相補性核酸一本鎖塩基、特にＤＮＡ一本鎖塩基のハイブリダイゼーションまたは対合に基づいており、それにより試料内、特に組織調製物内または細胞調製物内の特定の核酸配列を検出することができる。この目的のため、直接的または間接的に標識された合成プローブを試料の核酸一本鎖とハイブリダイズし、その後で検出する。
【０００５】
検出目的で蛍光標識核酸断片または蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブを使用することができる（蛍光ＩＳＨ（ＦＩＳＨ））。さらに、抗原標識プローブ、特にハプテン標識プローブを使用することができ、それらのプローブは後に抗体を用いて発色反応により可視化され、それにより光学顕微鏡分析が可能である（（明視野ＩＳＨ（ＢｒＩＳＨ）、発色性ＩＳＨ（ＣＩＳＨ）、銀ＩＳＨ（ＳＩＳＨ））。
【０００６】
複数のゲノム領域を同時に、且つ、明らかに相互識別されるように検出することができることがＦＩＳＨの利点である。この目的のため、異なるゲノム領域に対処する、または異なるゲノム領域に特異的な核酸断片が、吸収スペクトルおよび／または発光スペクトルに関して相互に異なる蛍光色素でそれぞれ標識されるか、またはそのような蛍光色素と結合される。それぞれ異なる単一プローブから構成されるマルチカラープローブを中期染色体調製物または間期細胞核調製物に対して使用する場合、それらの色素を励起するためにその調製物に当てられる正確に限定された波長域の光を伝導し、同様にそれらの色素が発した光の正確に限定された波長域を評価器に伝導する特異的な顕微鏡フィルター（シングルバンドパスフィルターセットと呼ばれる）を使用することによりそれぞれの色を相互に分別して表示することができる。さらに、異なる蛍光色素の同時表示、したがって複数の核酸断片の同時表示を可能にするフィルターおよびフィルターセットも存在する。例えば２種類の異なる蛍光色素の場合ではデュアルバンドパスフィルターセットと言う。
【０００７】
しかしながら、特定のプローブによって検出されるゲノム領域毎に１種類の標識だけが使用可能であるので、同時表示には明らかな制限がある。さらに、それらの色素の吸収域と発光域は、それらの顕微鏡フィルターセットによって分別することができないほど互いに近接して存在することが多い。これらの理由のため、通常は２色（オレンジ色／赤色と緑色）または３色（青色細胞核対比染色（ＤＡＰＩ）と同時または一緒にオレンジ色／赤色と緑色）だけがＦＩＳＨにおいて同時に分析される。ＦＩＳＨについて述べることができる制限とほぼ同じの制限がＢｒＩＳＨにも当てはまる。本技術分野では、ビオチン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、およびジゴキシゲニンからなる群より主に選択される２種類のハプテンと２種類の抗体結合酵素、主にアルカリホスファターゼとペルオキシダーゼを使用することが先行技術である。
【０００８】
同時表示または同時分析についての前記制限は構造的および数的染色体異常の検出用プローブの構成（組成）または連携に対して重要な影響を持ち、間期の状態にある細胞を含む腫瘍の診断のためにはいわゆる座位特異的プローブだけを用いて同時表示または同時分析を実施することができ、数的染色体変異の検出のために時にはいわゆる反復配列プローブを使用することもある。
【０００９】
座位特異的プローブは、最大で約１０００ｋｂの合計サイズになる染色体の選択されたＤＮＡ部分、主に個々の遺伝子、または隣接遺伝子に対処し、遺伝子特異的プローブまたは単一コピープローブと呼ばれるプローブであると理解される。反復配列特異的プローブは、反復配列に対処し、したがって数千ｋｂのサイズを有する領域に対処するプローブである。これらのプローブには例えばセントロメアプローブまたはαサテライトプローブも含まれる。
【００１０】
転座および逆位の検出に関し、基本的に２種類の関連技術および基礎となるプローブ構成、すなわちプローブ組成が存在し、すなわち、一方の融合シグナル発生原理（デュアルカラー・デュアルヒュージョンアプローチと呼ばれる）（国際公開第０２／０９３１３０（Ａ２）号パンフレット）と他方の融合シグナル分離原理（デュアルカラー・ブレイク・アパートアプローチまたはデュアルカラー・スプリットアプローチと呼ばれる）が存在する。これらの２つの原理についての以下の記載とそれらより導出されるシグナルパターンにおいて、正常な細胞は原則的に二倍体であること、すなわち、各アレルが二つ一組で存在することが特筆されるべきである。原則的には２つのアレルのうちの１つだけが異常の影響を受けるので、原則的に異常なシグナルと共に異常による影響を受けていないアレルの正常なシグナルも見ることができる。より良好な理解のために説明すると、以下では正常なシグナルのシグナルパターンは常に明確にそうであると記載されているわけではない。
【００１１】
デュアルカラー・デュアルヒュージョンアプローチでは染色体の第１切断点領域の近位と遠位に同じ色（例えばオレンジ色）の核酸断片が隣接し、第２切断点領域、すなわち相互転座パートナーの領域の近位と遠位に第２色（例えば緑色）の核酸断片が隣接する。この場合、正常な状況、すなわち、両方の転座パートナーの領域に染色体切断が無い状況は、緑色のシグナルおよび空間的に分かれたオレンジ色のシグナルを特徴とする。
【００１２】
相互転座の場合、両方の転座パートナーの切断点において切断が生じ、一方の転座パートナーの近位領域が他方のパートナーの遠位領域と融合し、一方の転座パートナーの遠位領域が他方のパートナーの近位領域と融合する。異なるように色づけられたシグナルが重なり合うことが多いので、したがって融合シグナルとも呼ばれる２点の緑色／オレンジ色シグナルペアが生じる。それらの２つの転座パートナーの切断点が各標識核酸断片の領域内にある場合でしか融合シグナルが生じないことがこのプローブ技術の欠点である。転座がそれらの２つのパートナーの一方だけに関連する場合では融合シグナルが生じない。この場合、転座によって影響を受けたパートナーに特徴的なシグナルの色を有する追加シグナルの形成が起こる。このことは、緑色フルオロクロームで標識された核酸が範囲とする領域内に転座切断点がある場合には追加の緑色シグナルが生じることを意味する。使用した２色によって単一の転座または逆位の両切断点領域だけが検出可能であり、したがって特定の転座または逆位だけが検出可能であることがこのプローブ構成の欠点である。
【００１３】
デュアルカラー・ブレイク・アパートアプローチの場合では切断点領域の近位と遠位に異なるように標識または発色標識された核酸断片（例えば遠位のオレンジ色、近位の緑色）が隣接する。これに関し、正常な状況、すなわち、この転座パートナーの領域に染色体切断が無い状況は、融合シグナルを特徴とする。異常な状況、すなわちそれらのプローブ断片の間で染色体切断が生じている場合では、それらのシグナルが互いに空間的に分離する。したがって、異なるように色づけられたシグナルとシグナルとの間の距離が、正常な状況と異常な状況との間の差の特徴である。この方法では関与する転座パートナーについて述べることができない。特定の染色体再構成が起きたと結論できるだけである。使用した２色によって単一の切断点領域だけが検出可能であり、したがって特定の転座または逆位だけが検出可能であることがこのプローブ構成の欠点である。
【００１４】
欠失、異数性および増幅に関し、一般的には座位特異的プローブに関連する通常はたった１つの関連技術および基礎となるプローブ構成が使用される。しかしながら、座位特異的プローブは例えばセントロメアプローブまたはαサテライトプローブなどのいわゆる反復配列特異的プローブによって補足されてもよく、欠失、異数性、および増幅の発生により生じるシグナル獲得またはシグナル喪失の検出原理が通常はいわゆるデュアルカラー・プローブアプローチによって行われる。以下に記述されるこの原理およびその原理から導出されるシグナルパターンでも正常な細胞は原則的に二倍体であること、すなわち、各アレルが二つ一組で存在することが特筆されるべきである。
【００１５】
デュアルカラー・プローブアプローチでは２か所の異なる染色体領域が異なる様に標識された、または異なるように色で標識された核酸断片で標識される（例えばゲノム領域１または標的領域１がオレンジ色であり、ゲノム領域２または標的領域２が緑色である）。正常な状態であること、すなわち、これらの領域の獲得または損失が存在しないことは２点のオレンジ色のシグナルと２点の緑色のシグナルによって特徴づけられる。異常な状態では、すなわち、標的領域１および／または標的領域２内のゲノム領域の獲得または損失が起こっている場合、損失の場合は眼に見える緑色および／またはオレンジ色のシグナルが少なくなり、獲得の場合はシグナルが多くなる。大規模な遺伝子増幅またはゲノム領域の増幅の場合、多数の追加シグナルを目視することができ、それらのシグナルはクラスターとしても示され得る。
【００１６】
したがって、２点の標準的シグナルまたは２色の標準的色を用いる前述の標準的方法および標準的組成物を用いると、構造的変化の場合ではたった１例の（あり得る）異常しか検出することができず、数的染色体変異の場合では最大でも２例の（あり得る）異常を検出するだけである。
【００１７】
上記の２色アプリケーションに加え、ＦＩＳＨ分析では３色、まれに４色、非常にまれに５色のプローブも使用される。プローブの標識のために対比染色を行わずに少なくとも３種類の異なるリガンドまたはフルオロクロームを同時に使用する方法がマルチカラーＦＩＳＨ法（ｍＦＩＳＨ法）と定義される。この場合、明らかに比較的に強い標準的蛍光色であるオレンジ色／赤色と緑色に加えて他の利用可能な比較的に弱い色、例えば金色、詳しくはゴールデンイエローもしくは金色、赤色または青色が使用される。したがって、本技術分野では、主に反復配列に対するプローブの標識の場合、例えば青色および金色の色強度を増幅することが可能であるので、４色ＦＩＳＨプローブは、例えば、欠失または増幅の検出のためだけに使用されることが一般的である。そのような方法は、多くの中でも欧州登録特許第１０３５２１５（Ｂ１）号、国際公開ＷＯ２００７／０２８０３１（Ａ１）号、および欧州登録特許第０５４９７０９（Ｂ１）に記載されている。
【００１８】
さらに、先行技術では三重ＦＩＳＨアプローチが記載されており、そのアプローチは染色体領域内に互いに隣接してクラスター形成し得る（すなわち、互いに近傍に位置する異なる遺伝子が関与している）様々な転座事象の検出に対処する。この場合、シグナルパターンの対応する評価のためにそれぞれ２色だけが分析され、それらが単一の異常を検出し、３番目の色はどの場合も役割を持たない。３種類の異なる座位特異的プローブが使用され、それらのプローブはそれぞれ異なる標識で標識される。
【００１９】
２色より多くの色を使用する明視野ＩＳＨ（ＢｒＩＳＨ）に関し、発色性三重インサイチュハイブリダイゼーションの実施が先行技術に記載されており、そのインサイチュハイブリダイゼーションは３か所の反復性染色体領域の検出を目的としていることが一般的である。先行技術によると、２種類のハプテンを使用し、したがって２種類の色素を使用しただけでＢｒＩＳＨによって転座が検出される。特許出願国際公開ＷＯ２０１２／１５００２２（Ａ１）号では、逆位の検出のため、３種類の異なる色になる３種類の標識であるビオチン、ジゴキシゲニン、およびＤＮＰを使用するＢｒＩＳＨ法による３本の異なるプローブの使用について開示する方法が記載されている。
【００２０】
国際公開ＷＯ２００５／１１１２３５（Ａ２）号は検出目的のために３色の使用を含む方法について記載している。しかしながら、プローブの３番目の標識により標識される染色体領域は変異の影響を直接的に受けず、そのために染色体構造変化の場合では第１融合シグナルが除外され、そのために新規スプリットシグナルと新規融合シグナルが生じる。この方法はそれぞれ１種類の標識だけで標識されているプローブを使用する。さらに、それらのプローブによって規定されるたった１例のあり得る転座がこの方法で検出され得る。
【００２１】
国際公開ＷＯ０２／０９３１３０（Ａ３）号は、一例の転座に関与する両方の切断点において切断点の遠位と近位に隣接する２種類、または代わりに４種類の標識または色素を使用する染色体転座の検出方法を開示している。この方法により、それらのプローブが隣接する切断点領域内でその１つの転座より多くの転座を検出する可能性が提供されることはない。
【００２２】
まとめると、したがって、当技術分野から知られている方法ではインサイチュハイブリダイゼーションによって細胞または組織内に存在する複数の染色体異常を一緒に、または同時に効率的に検出することが不可能であると結論することができる。
【００２３】
インサイチュハイブリダイゼーションの範囲内での複数の所定のＤＮＡ領域または染色体領域の同時または一緒の割り当ては、今までに、ヒトにおいて約５０Ｍｂｐと２５０Ｍｂｐの間のサイズを持つ染色体全体、またはより大きな染色体領域、例えば染色体腕を検出するための、「全染色体ペイントプローブ」（ＷＣＰ）または「部分染色体ペイントプローブ」（ＰＣＰ）と呼ばれるものを使用する方法の場合においてのみ知られている。基本的技術、例えばｍＦＩＳＨ（多重ＦＩＳＨ）、ＳＫＹ−ＦＩＳＨ（スペクトル核型分析）、マルチカラーＦＩＳＨ、ＣＯＢＲＡ−ＦＩＳＨ（コンバインド・バイナリ・レシオ・ラベリングＦＩＳＨ）または２４カラーＦＩＳＨでも、約４種類から７種類の異なる蛍光色素を使用して総計で２４色の異なる「染色体ペイントプローブ」を標識および識別することが可能である。類似の方法では、いわゆる４２色ＦＩＳＨにおいて全ての染色体の染色体腕特異的プローブを異なるように標識することができる。しかしながら、前述の方法は中期にある細胞にしか適切ではない。前述の方法において使用されるプローブでは少なくとも基本的に染色体物質をスーパーインポーズせずに評価できるゲノム領域／染色体領域は中期のものだけであるのでそれらの方法は中期でしか可能ではない。間期の細胞は一般的に固形腫瘍の遺伝物質を分析するために必要とされるが、そのような方法では間期の細胞の分析は可能ではない。さらに、このときに使用されるプローブは大きな領域に対処しているため、それらは比較的に簡単に検出され得る。これらの分析の評価を手作業で、すなわち、蛍光顕微鏡でのシグナルの観察で行うことはできず、むしろ適切な評価ソフトウェアを使用してコンピューターベースの方法でのみ行うことができる。
【００２４】
構造的および数的染色体変異または染色体異常と関連した、特に腫瘍または癌疾患と関連したＢｒＩＳＨおよびＦＩＳＨのための当技術分野において知られている方法とプローブ組成物は幾つかの欠点を伴う。例えば、複数の異なる可能性がある構造的および／または数的染色体変異または染色体異常の、信頼性があり、簡単であり、且つ、迅速な検出および識別を可能にする座位特異的プローブ組成物と方法が存在しない。
【００２５】
特に、構造的染色体変異の場合、相互に依存しない、すなわちどんな染色体物質も交換しておらず、または相互的ではない複数の異なる染色体変異を同時または一緒に分析することは、特に基本的なブレイク・アパートアプローチにおいて全く不可能であるか、またはわずかに可能であっても非常に困難である。
【００２６】
したがって、本発明は、染色体変異または染色体異常の検出および分析に適切であり、且つ、先行技術の上記の欠点を少なくとも大幅に回避または少なくとも緩和する方法または組成物を提供することを目的とする。
【００２７】
特に、本発明は、相互に異なる複数の染色体異常、特に、互いに無関係の（すなわち、相互的ではない）染色体異常の、特に１回のアプローチでの信頼性のある同時検出を可能にする方法を提供することを目的とする。同様に、本発明は、特定の染色体領域またはＤＮＡ領域への染色体異常の割り当てもさらに可能にする方法を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【００２８】
上記の課題を達成するため、本発明は請求項１に記載の方法を提唱する。その他の有利な形態がこれに関する従属請求項の目的である。
【００２９】
さらに、これに関する独立請求項に従う染色体異常の検出のための組成物、すなわち、染色体異常と関連する疾患の予防処置または治療処置または診断または予後判定に使用される組成物が本発明の対象である。
【００３０】
これに関する独立請求項に一致する本発明に従う組成物の使用が本発明のさらに別の対象である。
【００３１】
さらに、本発明は、これに関する独立請求項に従う相互に異なる少なくとも２本、特に少なくとも３本、好ましくは少なくとも４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの使用に関する。
【００３２】
さらに、これに関する独立請求項に従う少なくとも２種の検出標識で標識された少なくとも１本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの使用が本発明の対象である。
【００３３】
最後に、染色体異常の検出用のキットまたは部分キットまたはセットが本発明の対象であり、さらに、有利な特徴がこれに関する従属請求項の対象である。
【００３４】
以下の本発明の一態様と関連するというだけで記載されている特別な形態、実施形態、またはそのようなものは本発明の別の態様に関しても同様に適用されることが言うまでもなく理解される。
【００３５】
さらに、以下で述べられる全ての相対量、詳しくはパーセンテージ量、特に相対重量について、各成分、活性物質、添加物または補助物質等の合計が常に１００％または１００重量％になるようにこれらは本発明の範囲内で当業者によって選択されることに注意されたい。しかしながら、このことは当業者には明らかである。
【００３６】
さらに、当業者は、本発明の範囲から逸脱することはないが、用途に応じて、またはケースバイケースで以下に記載される数、範囲、または量に関する情報から逸脱する可能性がある。
【００３７】
さらに、確かなことに、以下で述べられる全てのパラメーター情報等は基本的に、標準的な、または明示された測定方法を用いて、または代わりに当業者には自明である測定方法を用いて測定または調査され得る。
【００３８】
上記の課題を達成するため、本発明は、本発明の第１態様に従い、生体試料内、好ましくは１つ以上の細胞内および／または１つ以上の細胞核内の染色体領域および／またはＤＮＡ領域の検出によるインサイチュハイブリダイゼーションにより染色体異常、特に構造的および／または数的染色体異常、好ましくは構造的染色体異常を検出するための方法であって、
間期インサイチュハイブリダイゼーションとして前記インサイチュハイブリダイゼーションを実施し、
それぞれ第１検出標識で標識された相互に異なる少なくとも４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いて前記インサイチュハイブリダイゼーションを実施し、特に、少なくとも１点の混合シグナルを生成するために前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１つを、前記各座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに関して前記第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識で標識することでシグナルパターンを生成し、そして前記シグナルパターンを用いて存在する染色体異常を特定し、且つ／または染色体領域および／またはＤＮＡ領域に割り当てる
前記方法を提唱する。
【００３９】
換言すると、本発明は、間期インサイチュハイブリダイゼーションにより生成されるシグナルパターンで混合シグナルが目的通りに生成されることにより、生体試料内で相互に異なる複数の染色体異常、特に相互無関係の、すなわち、相互的ではない染色体異常を同時または一緒に検出すること、ならびに検出された染色体領域またはＤＮＡ領域にそれらの染色体異常を割り当てることを可能にする基本原理に基づく。
【００４０】
したがって、前記染色体異常が相互無関係の染色体異常であることが本発明の範囲内で特に規定され得る。換言すると、本発明によると、前記染色体異常は相互依存的ではないことが規定され得る。同様に、前記染色体異常が相互的染色体異常ではないことが規定され得る。
【００４１】
本発明の特別な実施形態によると、前記染色体異常は相互的または相互依存的染色体異常と関係ない、またはそれらと関連しないことがさらに好ましい。
【００４２】
本発明は、以下で非限定的に考察され、且つ、本発明の特許性を表すものとして評価されるべき多数の利点および特殊性に関する。
【００４３】
本発明の範囲内において、全く驚くべきことに、間期インサイチュハイブリダイゼーションの範囲内において、一方で複数のあり得る構造的または数的染色体異常の明確な検出を、他方でこれらの染色体異常間の明確な識別、すなわち、検出された染色体異常の特定の染色体領域またはＤＮＡ領域への明確な割り当てを一回のハイブリダイゼーションアプローチで可能にする染色体異常の検出方法を提供することが可能である。特に、それらの染色体異常は相互無関係の染色体異常であって、相互依存的ではなく、且つ、相互的ではない染色体異常であり得る。これは今まで当技術分野において、特に間期インサイチュハイブリダイゼーションの範囲内では不可能であった。
【００４４】
したがって、本発明の方法を用いることにより、一つの試料を相互に異なる複数の染色体異常について同時に、すなわち１回のアプローチで検査することができるので、例えば組織切片、特に腫瘍組織切片などの特に染色体異常について検査される生体試料を明らかにより迅速に、且つ、より効率的に分析することができる。さらに、検出されるあらゆる染色体異常を限定された、すなわち特定のＤＮＡ領域または染色体領域に割り当てることができる。
【００４５】
さらに、本発明の方法を用いると染色体異常の検出に必要な試料の量を著しく減らすことができる。検査目的の組織切除、特に癌疾患の診断、すなわち、癌疾患の特定または更なる分析との関連での組織切除は現在ではたいてい限られた量の試料の採取しかできない細針生検により行われており、一方でより大量の組織の採取を可能にする開放生検の実施は増々まれになってきているという背景を考えると、このことは特に有利である。
【００４６】
さらに、本発明の方法の高い効率性のため、酵素、蛍光色素等のような時には高価な材料の必要量を前記インサイチュハイブリダイゼーションの実施のために減らすことができ、したがって本方法は経済面および環境面の点でも有利である。
【００４７】
本発明のより良好な理解のため、本発明の方法の中心的な用語と名称を以下で定義する。
本発明によると、染色体異常という用語は同義語として染色体不規則とも呼ばれ、特に構造的および数的染色体異常を意味することが理解される。構造的染色体異常の場合、染色体の構造に変異が存在し、そのためにこれは染色体変異とも呼ばれる。特に、この染色体異常は逆位、転座、欠失、部分重複、挿入、重複、または増幅を含み得る。対照的に、数的染色体異常は染色体の数の変化に至る。ゲノム変異という用語が同義的に使用される。数的染色体異常、すなわちゲノム変異の場合、これらの染色体異常は特に異数性または倍数性を含み得る。本発明の方法は構造的染色体異常の検出に特に適切である。
【００４８】
本発明に従って使用されるインサイチュハイブリダイゼーションは核酸一本鎖、特にＤＮＡ一本鎖の相補的塩基のハイブリダイゼーション、すなわち対合に基づいており、それにより組織または細胞調製物などの試料内で特定の核酸配列を検出することができる。インサイチュハイブリダイゼーションの範囲内において、直接的または間接的に標識された合成ハイブリダイゼーションプローブ、特に座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが試料の核酸一本鎖とハイブリダイズし、その後で検出される。
【００４９】
基本的に、検査される異なるステージの細胞周期の細胞または細胞核に対してインサイチュハイブリダイゼーションを行う、または実施することができ、染色体が凝縮した状態で存在する中期、または染色体が脱凝縮した状態で存在する間期においてこのインサイチュハイブリダイゼーションを実施することが確立している。インサイチュハイブリダイゼーションの目標または目的によっては、特に、例えば、染色体異常についての固形腫瘍の細胞の検査の場合には、中期の凝縮した染色体に対してインサイチュハイブリダイゼーションを実施することが常に可能であるわけではない。したがって、本発明によると間期にある細胞または細胞核に対してインサイチュハイブリダイゼーションを実施することが規定される。
【００５０】
本発明の範囲内において、座位特異的ハイブリダイゼーションプローブは、検査される試料内のＤＮＡ物質、すなわち遺伝物質の特定の染色体領域もしくはＤＮＡ領域に対して特異的であるプローブ、またはその特定の染色体領域もしくはＤＮＡ領域に対して相補的なプローブであると理解される。通常、本発明に従って使用されるハイブリダイゼーションプローブは核酸または核酸断片をベースとしており、検出されるべき染色体領域またはＤＮＡ領域に特異的に結合またはハイブリダイズすることが可能である。検出されるべきその染色体領域またはＤＮＡ領域は様々な長さであり得る。特に、検出されるべき染色体領域またはＤＮＡ領域は単独、すなわち単一の遺伝子を全体的または部分的に含むことが規定され得る。同様に、検出されるべき染色体領域またはＤＮＡ領域は複数の遺伝子、好ましくは隣り合う遺伝子、好ましくは２つの遺伝子を全体的または部分的に含むことも規定され得る。
【００５１】
特にハイブリダイゼーションプローブの本発明による形態に関し、座位特異的ハイブリダイゼーションプローブは複数の、特に多数の核酸断片（同義語としてはプローブ断片ともいう）をベースとしており、それらの核酸断片をまとめて座位特異的ハイブリダイゼーションプローブと呼ぶことが特に規定され得る。さらに、あまり好ましくはないが、それらの座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが単一の核酸断片だけをベースとする、または単一の核酸断片だけから形成される場合があり得る。
【００５２】
本発明の範囲内において、検出標識は発見目的または検出目的のために核酸または核酸断片に結合している材料または物質を指す。適切な検出標識の選択は通常は当業者の能力の範囲内にあり、この点に関しては他のあらゆる説明を必要としない。検出標識で標識され、且つ、インサイチュハイブリダイゼーションにより発見または検出されるＤＮＡ部分または染色体部分と結合またはハイブリダイズした核酸断片は、当業者には自明であり、且つ、使用される検出標識に適応した方法によって直接的または間接的に検出可能であり、例えば、蛍光顕微鏡観察によって直接的に検出可能であり、または特に酵素反応の後、すなわち、酵素的に反応した色素基質による視覚化の後に明視野顕微鏡観察によって間接的に検出可能である。特に、インサイチュハイブリダイゼーションの範囲内の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブ上の検出標識によってシグナルパターンが生成され、あり得る染色体異常について試料を検査する基礎としてそのシグナルパターンが機能する。
【００５３】
さらに、本発明に従って使用される「検出標識」という用語は以下において検出標識分子の数を表すのではなく、検出標識の種類またはタイプを表し、すなわち、「少なくとも１種の検出標識」といった語句は検出標識のある特定の種類を意味するか、または検出標識の特定の選択を意味する。したがって、「複数の検出標識」という用語は、同様に、異なる種類の相互に異なる検出標識の選択に関し、使用される検出標識分子の数に関するわけではない。ハイブリダイゼーションプローブの標識の範囲内において、通常、これらのプローブが１つより多くの検出標識分子と結合していることは当業者にとって明らかである。
【００５４】
したがって、本発明に従って使用される座位特異的ハイブリダイゼーションプローブ、特にプローブ断片または核酸断片は、試料内の遺伝物質の選択されたＤＮＡ領域または染色体領域と特異的にハイブリダイズし、インサイチュハイブリダイゼーションの範囲内において結合検出標識に基づいてシグナルパターンを生成する。本発明の範囲内において、シグナルパターンとは、検出標識で標識された座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに基づいたインサイチュハイブリダイゼーションによって生成されたあらゆるシグナルであることが理解される。
【００５５】
この背景で、少なくとも２種の相互に異なる検出標識での座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの標識により、良好に検出可能であり、且つ、他のシグナルと容易に識別可能である混合シグナルをシグナルパターンとして生成することができ、生じていた染色体異常の検出ＤＮＡ領域または検出染色体領域への割り当てがそれらの混合シグナルにより可能になることが驚くべきことに本発明の範囲内で示された。したがって、本発明の意味での混合シグナルは、座位特異的ハイブリダイゼーションプローブ上に位置する相互に異なる少なくとも２種の検出標識によって生成されるシグナルであるが、同様に、より多くの検出標識によって生成されるシグナルでもある。座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの少なくとも２種、特にそれより多くの検出標識によって混合シグナルが生成されるので、これらの検出標識は染色体異常の場合であってもインサイチュハイブリダイゼーションのシグナルパターンとして可視化されており、且つ、染色体異常の場合であっても存在し続ける。混合シグナルを生成するための座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのあり得る実施形態または形態を以下において詳しくさらに説明する。
本発明の方法の好ましい実施形態を以下において詳しく説明する。
【００５６】
本発明の第１の実施形態によると、使用される複数の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの第１検出標識はそれぞれ同じであることが規定され得る。本発明の同様に好ましい第２の実施形態によると、使用される複数の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブはそれぞれ相互に異なる第１検出標識で標識されることが規定され得る。
【００５７】
換言すると、本発明によると、単なる例であって、限定するものではないが、使用される複数の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブは、例えば、第１検出標識と同じ蛍光色素または同じハプテンを有することが規定され得る。
【００５８】
同様に、これも例であって、限定するものではないが、使用される複数の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブはそれぞれ第１検出標識として相互に異なる蛍光色素、相互に異なるハプテン、またはそのようなものを有することができる。相互に異なる第１検出標識での標識が特に転座または逆位などの染色体切断に伴う染色体異常の検出の点で有利であることが示されている。
【００５９】
さらに本発明による染色体異常の検出に関し、複数のあり得る染色体異常の中から少なくとも１例の染色体異常、特に相互に異なる複数の染色体異常が試料中に検出および／または特定されることが本発明によると好ましい。
【００６０】
同様に、複数のあり得る染色体異常の中から少なくとも２例の染色体異常、特に相互に異なる複数の染色体異常が一緒に、特に同時に試料中に検出されることが規定され得る。
【００６１】
本発明のさらに好ましい実施形態によると、相互に異なる複数の染色体異常の同時検出のための多重方法として本発明の方法が実施されることが規定され得る。
【００６２】
したがって、先行技術において知られているインサイチュハイブリダイゼーションによる染色体異常の検出方法に対する本発明の方法の既に上で説明したような特別な利点は、試料、特に間期にある細胞または細胞核に基づく試料を複数のあり得る染色体異常について一回のハイブリダイゼーションアプローチで同時に、または一緒に検査し、これらの異常を特定のＤＮＡ領域または染色体領域に割り当て得ることである。
【００６３】
この背景で、染色体異常は少なくとも１点の混合シグナル、特に複数の混合シグナルによるシグナルパターンとして特定され、且つ、検出染色体領域および／または検出ＤＮＡ領域に割り当てられることが特に規定され得る。これに関し、増幅という形での染色体異常の本発明による検出を例として示す図７を特に参照する。図７によると、４か所の異なる染色体領域が検査されており、４本のうちの３本のハイブリダイゼーションプローブがそれぞれ特定の混合シグナルの生成のために少なくとも１種の追加検出標識で標識されている相互に異なるハイブリダイゼーションプローブが使用されている（図７（ａ）参照）。それらの４か所の染色体領域のうちの３か所のそれぞれ特定の混合シグナルによる標識に基づき、シグナルパターンとしての検出染色体領域の増幅により生成された「クラスター」をハイブリダイゼーションプローブに、すなわち検出染色体領域に割り当てることができる（図７（ｂ）参照）。
【００６４】
したがって、本発明によると、少なくとも１種の追加検出標識で標識された座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが相互に異なる混合シグナルをシグナルパターンとしてそれぞれ生成するように少なくとも１種の追加検出標識を用いる追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの標識が行われることが特に規定され得る。
【００６５】
同様に、特に染色体切断から生じたわけではない染色体異常、例えば、増幅または欠失が検出される場合、少なくとも１種の追加検出標識で標識されている各座位特異的ハイブリダイゼーションプローブによって染色体領域および／またはＤＮＡ領域に特異的な混合シグナルがシグナルパターンとして生成されるように少なくとも１種の追加検出標識で追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの標識が行われることが規定され得る。したがって、この背景では、座位特異的ハイブリダイゼーションプローブによって検出される各領域がシグナルパターン内の特定のシグナル、特に混合シグナルに割り当てられ得る場合が本発明の範囲内で好ましい。
【００６６】
さらに、本発明によると、特定の混合シグナルによるシグナルパターンとしての各検出染色体異常が検出染色体領域および／または検出ＤＮＡ領域に割り当てられるように少なくとも１種の追加検出標識で追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの標識が行われる場合が好ましい。
【００６７】
少なくとも１種の追加検出標識で標識された座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの数に関し、この数は変更可能であり、特に検出または検査される染色体異常の数に左右される。
【００６８】
本発明によると、少なくとも２本、特に少なくとも３本、好ましくは少なくとも４本、好ましくは少なくとも５本、特に好ましくは少なくとも６本、非常に特に好ましくは少なくとも７本の追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識で標識されている場合が好ましい。同様に、染色体領域および／またはＤＮＡ領域に特異的な混合シグナルが少なくとも２本、特に少なくとも３本、好ましくは少なくとも４本、好ましくは少なくとも５本、特に好ましくは少なくとも６本、非常に特に好ましくは少なくとも７本の追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブによってシグナルパターンとして生成されることが規定され得る。
【００６９】
上記の本発明のこの手法は、染色体切断から生じたわけではない染色体異常、例えば、増幅または欠失が検出されるべきである場合に特に適切である。少なくとも１種の追加検出標識、好ましくは複数の検出標識で標識されているハイブリダイゼーションプローブであって、それぞれ個々の混合シグナルを生成するプローブの数が増えることにより、一緒に検出または発見される染色体異常の数もそれに応じて増加する。
【００７０】
本発明の追加の特別な実施形態によると、染色体切断により生じる染色体異常、例えば、転座または逆位等を検出すること、およびそれらの染色体異常を特定の染色体領域またはＤＮＡ領域に割り当てることが可能である。
【００７１】
本発明のこの実施形態によると、それぞれ２本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが染色体部分、特に切断点領域に隣接し、染色体部分、特に切断点領域に隣接するそれぞれ２本の前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを相互に異なる検出標識で標識し、それによりそれぞれ染色体部分、特に切断点領域に隣接する前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが、特に染色体異常が存在しない場合にシグナルパターンとして融合シグナルを生成することが規定され得る。
【００７２】
この背景で、「隣接する」とは、好ましくは、染色体部分または切断点領域に最も近接するハイブリダイゼーションプローブの末端がその染色体部分または切断点領域から０〜１Ｍｂｐの距離、特に０〜５００ｋｂの距離、好ましくは０〜１００ｋｂの距離、好ましくは０〜１０，０００ｂｐの距離、および特に好ましくは０〜１，０００ｂｐの距離を有する塩基とハイブリダイズすることを意味する。
【００７３】
換言すると、本発明のこの実施形態によれば、検出されるＤＮＡ領域または染色体領域は特に選択された染色体部分、特に染色体上の潜在的な切断点領域から遠位および近位に位置することが規定される。このとき、遠位または代わりに近位に位置する染色体部分は第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識で標識されたハイブリダイゼーションプローブを用いて検出されることが特に規定され得る。
【００７４】
本発明の範囲内において、切断点領域とは染色体切断によって影響され得る染色体の領域のことであると理解されている。染色体切断の結果として構造的再構成に基づく染色体異常、特に転座または逆位が起こり得る。一連の疾患について染色体切断、特に転座または逆位に基づく疾患特異的染色体異常がそれぞれ知られている。したがって、本発明の方法を用いることにより、染色体異常の存在について試料、特に組織試料の遺伝物質内の複数の、特に既知の切断点領域を検査することができる。
【００７５】
本発明のこの実施形態において、ある切断点領域にそれぞれ隣接する２本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブによって融合シグナルが生成され、その第１および第２座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの相互に異なる２種の検出標識に基づいてその融合シグナルが、特に染色体異常が存在しない場合に生成される。
【００７６】
座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの異なる検出標識によって生成される前記混合シグナルとは対照的に、融合シグナルは、試料中の遺伝物質、すなわちＤＮＡにハイブリダイズして互いの近くに存在する相互に異なる座位特異的ハイブリダイゼーションプローブによって生成される。
【００７７】
換言すると、本発明の方法の範囲内において、隣接する切断点に染色体異常が存在せず、且つ、使用される座位特異的ハイブリダイゼーションプローブがすぐ近傍で試料中の遺伝物質、すなわちＤＮＡとハイブリダイズする場合に融合シグナルが生成される。対照的に切断点領域に染色体異常が存在する場合、使用される複数の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡ部分の構造的再構成のためにもはやすぐ近傍に結合することができない。融合シグナルの代わりに、好ましくは相互に異なる２点の個々のシグナル（同義語としては「スプリットシグナル」ともいう）がシグナルパターンとして検出される。
【００７８】
さらに、第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識で標識されたハイブリダイゼーションプローブは、各ハイブリダイゼーションプローブのその第１検出標識およびその少なくとも１種の追加検出標識に基づいて混合シグナルを生成する。したがって、これらのハイブリダイゼーションプローブは、染色体異常が存在しない場合に染色体部分、特に切断点領域に隣接する第２ハイブリダイゼーションプローブと共にシグナルパターンとして混合および融合シグナルを形成することができる。対照的に、染色体異常の場合では、正常細胞または正常細胞核の染色体部分、特に切断点領域に隣接するハイブリダイゼーションプローブであって、それらのうちの１つが少なくとも１種の追加検出標識で標識されている前記プローブに基づいて、単一のシグナル、ならびに混合シグナルを伴う単一のシグナルが生成される。
【００７９】
したがって、本発明の範囲内において、少なくとも１種の追加検出標識で標識された座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに基づく混合シグナルにより、染色体異常を限定された切断点領域または検出された染色体領域もしくはＤＮＡ領域に割り当てることが可能である。
【００８０】
したがって、本発明によると、特に染色体異常が存在しない場合に第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識で標識された前記ハイブリダイゼーションプローブが染色体部分、特に切断点領域に隣接する前記第２座位特異的ハイブリダイゼーションプローブと共にシグナルパターンとして混合および融合シグナルを生成する場合が好ましい。
【００８１】
さらに、第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識で標識された前記ハイブリダイゼーションプローブ、および染色体部分、特に切断点領域に隣接する前記第２座位特異的ハイブリダイゼーションプローブがそれぞれシグナルパターンとして単一のシグナルを生成し、特に少なくとも１種の追加検出標識で標識された前記ハイブリダイゼーションプローブが、特に染色体異常が存在する場合にシグナルパターンとして混合シグナルをさらに生成することが規定され得る。
【００８２】
したがって、前記シグナルパターンにおいて混合シグナルによって検出染色体領域および／または検出ＤＮＡ領域、および／または染色体部分、特に切断点領域に染色体異常を割り当てることが本発明の方法の範囲内において特に規定され得る。
【００８３】
したがって、本発明の方法のこの好ましい実施形態によると間期インサイチュハイブリダイゼーションによって単一の試料内の一連の潜在的な切断領域を同時に示す、または標識することが可能である。標識された切断点に染色体異常が生じていなかった場合にシグナルパターンとして融合シグナルが生成され、一方で単一のシグナルまたはスプリットシグナルの発生は染色体異常の存在を示す。追加的に生成された混合シグナルに基づいて異常な単一のシグナルまたはスプリットシグナルを特定のハイブリダイゼーションプローブに割り当てることができ、したがって特定の切断点領域に割り当てることができる（図１参照）。
【００８４】
特に、一つの染色体部分、特に切断点領域毎にそれぞれ２本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが隣接する少なくとも６本、好ましくは少なくとも８本、好ましくは少なくとも１０本、特に好ましくは少なくとも１２本、さらにより好ましくは少なくとも１４本の異なる座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用し、または一つの染色体部分、特に切断点領域毎にそれぞれ２本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが隣接する最多でも２４本の異なる座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用することが本発明の範囲において規定され得る。
【００８５】
さらに、本発明によると、各隣接染色体部分、特に切断点領域、ならびに／または検出される各染色体領域および／もしくはＤＮＡ領域が、シグナルパターンとして融合および混合シグナルによって特定および／または割り当てられ得るように第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識での追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの標識が行われる場合が好ましい。
【００８６】
この背景で、本発明によると、検査される第１切断点領域に２本のハイブリダイゼーションプローブが隣接し、それらのハイブリダイゼーションプローブがそれぞれ１種の検出標識しか有しないことでシグナルパターン内のこの切断点領域が融合シグナル、または２点の個々のシグナルもしくはスプリットシグナルだけで可視化されている場合が特に好ましい。対照的に、２本の隣接ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１つを少なくとも１種の追加検出標識によって標識することによってシグナルパターン内の特定の混合シグナル、または個々の混合シグナルが追加の検出される各切断点領域に割り当てられ、それにより全体として複数の染色体領域またはＤＮＡ領域、特に切断点領域をシグナルパターンとして相互に識別可能であるように示すことができる。
【００８７】
本発明の方法の特に好ましい実施形態によると、
（ａ）検出標識Ａで標識された第１座位特異的ハイブリダイゼーションプローブおよび検出標識Ｂで標識された第２座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが染色体部分、特に切断点領域に隣接し、且つ、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合シグナルＡ−Ｂを生成し、
（ｂ）２〜１２本の追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブがさらに６か所の染色体部分、特に切断点に隣接し、同様に、一つの染色体部分、特に切断点領域に隣接する２本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの１つずつを検出標識Ａで標識し、且つ、一つの染色体部分、特に切断点領域に隣接する２本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの１つずつを検出標識Ｂで標識し、それにより染色体部分、特に切断点領域にそれぞれ隣接する前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブがインサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合シグナルＡ−Ｂを生成し、且つ
（ｃ）それらの座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１つ、好ましくは複数のプローブを少なくとも１種の追加検出標識Ｘで標識し、それにより少なくとも１種の追加検出標識で標識されたそれらの座位特異的ハイブリダイゼーションプローブがインサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合および混合シグナルＡ−Ｂ／Ｘを生成し、
染色体異常の場合での前記融合および混合シグナルＡ−Ｂ／Ｘは、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて混合シグナルＡ／Ｘおよび／または混合シグナルＢ／Ｘに変化し、且つ／または
染色体異常の場合での前記融合シグナルＡ−Ｂは、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて単独のシグナルＡおよび／またはシグナルＢに変化し、それにより、そのインサイチュハイブリダイゼーションによって生成された前記シグナルパターンを用いて染色体異常を２本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが隣接する染色体領域および／またはＤＮＡ領域および／または染色体部分、特に切断点領域に割り当てる
ことが規定され得る。
【００８８】
さらに前記実施形態において規定された検出標識Ｘに関し、この実施形態は単一の検出標識、特に検出標識Ｘ１によって形成され得る。
【００８９】
さらに、検出標識Ｘは相互に異なる複数の検出標識、好ましくは検出標識Ｘ１、Ｘ２、．．．および／またはＸｎからなる群より選択される検出標識により形成され、指数「ｎ」は１から２０まで、特に１から１０、好ましくは１から５までの自然数を表すことが規定され得る。このとき、検出標識Ｘ１、Ｘ２、．．．および／またはＸｎを使用して相互に異なる混合シグナル、特に互いに対して比率が異なる特定の混合シグナルが生成されることがさらに規定され得る。
【００９０】
追加の実施形態によると、相互に異なる、好ましくは検出標識Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５および／またはＸ６からなる群より選択される複数の検出標識によって検出標識Ｘを形成することも可能である。この背景で、相互に異なる混合シグナル、特に互いに対して比率が異なる特定の混合シグナルを生成するために検出標識Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５および／またはＸ６を使用する場合が好ましい。
【００９１】
したがって、驚くべきことに、混合シグナルを生成するために座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを少なくとも１種の追加検出標識で標識し、混合シグナルを生成するために相互に異なる複数の検出標識で標識することにより、少数の個々の検出標識に基づいても多数の混合シグナルを生成することが本発明の範囲内で可能である。
【００９２】
特に、本発明によると、座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの標識の範囲内において、混合シグナルを生成するために複数の、特に２〜６種の相互に異なる検出標識をそれぞれ相互に異なる比率（量）で使用することが規定され得る。限定するものではないが例として、座位特異的ハイブリダイゼーションプローブは第１検出標識と共に３種の追加検出標識を有することができ、このときそれらの３種の追加検出標識に対して第１検出標識の割合が２０％になり、第２検出標識の割合が６０％になり、第３検出標識の割合が２０％になる。
【００９３】
本発明のさらに別の実施形態によると、
（ａ）検出標識Ａで標識された第１座位特異的ハイブリダイゼーションプローブおよび検出標識Ｂで標識された第２座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが第１染色体部分、特に第１切断点領域に隣接し、且つ、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合シグナルＡ−Ｂを生成し、
（ｂ）検出標識Ａで標識された第３座位特異的ハイブリダイゼーションプローブおよび検出標識Ｂで標識された第４座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが第２染色体部分、特に第２切断点領域に隣接し、且つ、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合シグナルＡ−Ｂを生成し、且つ
（ｃ）その第３座位特異的ハイブリダイゼーションプローブおよび／または第４座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが追加の検出標識Ｘ１で標識されており、且つ、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合および混合シグナルＡ−Ｂ／Ｘ１を生成し、
前記シグナルパターンにおいて、単独のシグナルＡおよび／またはシグナルＢによって第１染色体部分、特に第１切断点領域の染色体異常が特定され、および／または混合シグナルＡ／Ｘ１および／またはＢ／Ｘ１によって第２染色体部分、特に第２切断点領域の染色体異常が特定され、且つ／または第２染色体部分、特に第２切断点領域に割り当てられる
ことがさらに規定され得る。
【００９４】
インサイチュハイブリダイゼーションによって生成されるシグナルパターンにおける染色体異常の分析手法に関し、第１ステップにおいて第１検出標識によって生成された前記融合シグナルを検出および／または分析し、そして後続のステップにおいて単一のシグナルが生じる場合は混合シグナルの検出および／または分析と検出された染色体領域および／またはＤＮＡ領域へのその混合シグナルの割り当てを行う場合が特に効率的であることが示されている。
【００９５】
特に、これは、第１検出標識によって生成されたシグナル、すなわち融合シグナルまたは潜在的な個々のシグナルだけを可視化するフィルターをシグナルパターンの分析において使用することにより行うことができる。シグナルパターンにおいて個々のシグナルが生じているときにのみ、より詳細な分析を必要とする染色体異常が存在するので、混合シグナルは、特に、異なるフィルター、特に混合シグナルの表示に適切なフィルターを使用することにより表示され、これによりシグナルパターンにおける融合シグナルまたは個々のシグナルの位置に関連して染色体異常を特定の染色体領域またはＤＮＡ領域に割り当てることができる。
【００９６】
さらに、本発明の方法の特別な実施形態によると、コンピューター支援分析により前記シグナルパターンの検出を行うことが規定され得る。これは、混合シグナルを生成するためにハイブリダイゼーションプローブが少なくとも１種の追加検出標識より多くの検出標識、好ましくは少なくとも２種の追加検出標識、好ましくはより多くの追加の検出標識によって相互に異なる、または規定の比率で標識される場合に特に有利である。コンピューター支援分析により、裸眼では、すなわち蛍光顕微鏡下で観察したときに相互に区別できない混合シグナルの識別も基礎となる色成分または色の測定によって可能になる。
【００９７】
したがって、本発明によると、切断点領域毎にそれぞれ２本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが遠位と近位に隣接し、且つ、これらのプローブペアの個々の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが追加の検出標識で標識されている最大で２４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用して転座または逆位の検出が行われることが特に規定され得る。したがって、好ましいことに、最大で１２例の転座または逆位の表示のために最大で１２か所の異なる切断点領域を１回のアプローチで、最大で１２回の異なるブレイク・アパートアプローチにより検出することができる。特定の転座の検出は、プローブペアの分離またはプローブペアの融合シグナルの分離の特定により、各混合色または混合シグナルを用いて行われる。
【００９８】
それぞれ２本のプローブが各切断点領域の遠位と近位に隣接し、且つ、これらのプローブペアが同じラベルＡおよびラベルＢでそれぞれ標識されており、それぞれ一方のプローブが標識Ａで標識されており、他方のプローブが標識Ｂで標識されており、且つ、同時にこれらのプローブペアの個々のプローブが追加の検出標識Ｘで標識されている最大で２４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用して転座および逆位を検出することも可能である。特定の転座および／または逆位は、染色体異常の場合に特定の融合および混合シグナルＡ−Ｂ／Ｘが新規、且つ、分離した混合シグナルＡ／Ｘおよび／またはＢ／Ｘに変化することにより検出される。このとき、プローブペアに追加の標識Ｘを使用しないことも可能であり、それにより根底にある異常の場合に通常の分離したシグナルＡおよび／またはシグナルＢがこのプローブペアについてのみ生じる。
【００９９】
したがって、複数の異なる潜在的に検出可能な構造的染色体変異の第１分析において、シグナルＡとＢを可視化するが追加の標識Ｘを可視化しない特定のフィルターシステム、例えばシグナルＡおよびＢ用の二重フィルターを使用することでシグナルＡとＢのみにより、融合シグナルＡ−Ｂのブレイク・アパートが起きているかどうか、一般化すると、転座または逆位が存在するかどうかを迅速に判定することができるということも初めて可能になる。分離したシグナルＡおよび／またはシグナルＢの発生が明確である場合にのみ、標識Ｘの関与を伴う混合シグナルの評価が行われ、それにより根底にある転座の明確な割り当てが行われる。
【０１００】
上記の本発明の方法の全てのあり得る形態に同様に適用される本発明の方法のその他の特徴または可能な実施形態を以下でさらに説明する。
【０１０１】
それぞれ単一の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブによって検出されるべき個々の染色体領域またはＤＮＡ領域に関し、これらの領域は本発明の範囲において５Ｍｂｐ未満、特に２Ｍｂｐ未満、好ましくは１Ｍｂｐ未満、好ましくは７５０ｋｂｐ未満、特に好ましくは５００ｋｂｐ未満の長さを有することが好ましい。同様に、単一の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブによって検出される染色体領域および／またはＤＮＡ領域は少なくとも５００ｂｐ、特に少なくとも１ｋｂｐ、好ましくは少なくとも５ｋｂｐ、好ましくは少なくとも１０ｋｂｐの長さを有することが規定され得る。最後に、単一の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブによって検出される染色体領域および／またはＤＮＡ領域は５００ｂｐから５Ｍｂｐまでの範囲、特に１ｋｂｐから２Ｍｂｐまでの範囲、好ましくは５ｋｂｐから１Ｍｂｐまでの範囲、好ましくは１０ｋｂｐから７５０ｋｂｐまでの範囲、特に好ましくは１０ｋｂｐから５００ｋｂｐまでの範囲の長さであることも規定され得る。
【０１０２】
さらに、本発明に従って使用される座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの追加の形態に関し、これらのハイブリダイゼーションプローブは核酸断片の形態、特にポリヌクレオチド、修飾型ポリヌクレオチド、修飾型核酸断片、オリゴヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチドの形態で存在することが好ましい。特に修飾型核酸断片に関し、これらの核酸断片は特にロックド核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。
【０１０３】
本発明の第１実施形態によると、座位特異的ハイブリダイゼーションプローブは、検出予定の染色体領域および／またはＤＮＡ領域をそれぞれ包含する単一の核酸断片によってそれぞれ形成されることがさらに規定され得る。
【０１０４】
本発明の別の、且つ、さらに好ましい実施形態によると、座位特異的ハイブリダイゼーションプローブは、複数の核酸断片（「プローブ断片」）によってそれぞれ形成され、それらの核酸断片が検出予定の染色体領域および／またはＤＮＡ領域をそれぞれ包含することも規定され得る。このとき、座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの個々の核酸断片（「プローブ断片」）が５〜２，０００ｂｐまでの範囲、特に１０〜１，５００ｂｐまでの範囲、好ましくは５０〜１，０００ｂｐまでの範囲の長さである場合がさらに好ましい。
【０１０５】
さらに、混合シグナルの生成を対象とした第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識での座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの標識による混合シグナルの生成に関し、これを異なる方法で行うことができる。
【０１０６】
本発明の第１実施形態によると、このとき、混合シグナルを生成するために座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの核酸断片（「プローブ断片」）が第１検出標識で標識されると共に、前記第１検出標識とは異なる１種の追加検出標識で標識されることが規定され得る。したがって、このように標識されたハイブリダイゼーションプローブは相互に異なる２種の検出標識にだけ基づいている混合シグナルを生成する。
【０１０７】
さらに、本発明の追加の実施形態によると、特に、特定の混合シグナルの帯域幅を増加させる背景、すなわち、特定の混合シグナル、または相互に識別可能な混合シグナルの数を増やす背景に基づいて、混合シグナルを生成するために座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの核酸断片（「プローブ断片」）が第１検出標識で標識されると共に、第１検出標識とは異なる複数の検出標識、特に２〜２０種の検出標識、好ましくは２〜１０種の検出標識、好ましくは２〜６種の検出標識で標識されることが規定され得る。このとき、相互に異なる量でそれらの検出標識が使用されることが特に規定され得る。
【０１０８】
したがって、本発明によると、混合シグナルを生成するため、座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの標識の範囲内において、相互に異なる複数の検出標識をそれぞれ相互に異なる比率で使用することが規定され得る。限定するものではないが例として、座位特異的ハイブリダイゼーションプローブは第１検出標識と共に３種の追加検出標識を有することができ、それらの３種の追加検出標識に対して第１検出標識の割合が２０％になり、第２検出標識の割合が６０％になり、第３検出標識の割合が２０％になる。
【０１０９】
したがって、この実施形態によると、前記ハイブリダイゼーションプローブは第１検出標識と共に少なくとも２つ、好ましくはさらに多くの相互に異なる検出標識を有することが規定され得る。相互に異なる比率の異なる検出標識を使用することにより、特定の混合シグナル、特に相互に識別可能なシグナルの数を全体として増加させることができ、これにより次により多数の検出可能な染色体異常の検出が可能になる。
【０１１０】
座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの標識の範囲内において、本発明によれば、さらに原則的に、ハイブリダイゼーション特異的プローブの個々の核酸断片がたった１種類の検出標識で標識されることが規定され得る。このとき、この検出標識は第１検出標識および／または他のあらゆる検出標識であり得る（図２（Ｉ）参照）。
【０１１１】
換言すると、したがって、本発明によると、座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの核酸断片の第１部分が第１検出標識だけで標識され、座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの核酸断片のその他の部分が第１検出標識とは異なる追加の検出標識でそれぞれ標識されることがあり得る。したがって、混合シグナルの生成は、本発明の実施形態によると、混合シグナル用の相互に異なる検出標識がハイブリダイゼーション特異的プローブの相互に異なる核酸断片上に存在することで達成され得る（図２（Ｉ）参照）。
【０１１２】
さらに、ハイブリダイゼーション特異的プローブの個々の核酸断片は相互に異なる複数の検出標識で標識され、特にこれには第１検出標識および／または他のあらゆる検出標識が関与し得ることが規定され得る（図２（ＩＩ）参照）。
【０１１３】
したがって、本発明のこの実施形態によると、混合シグナルを形成し、且つ、相互に異なる検出標識はハイブリダイゼーション特異的プローブの同じ核酸断片上に存在する、またはハイブリダイゼーション特異的プローブの同じ核酸断片上に連結して存在する（「混合プローブ」と呼ばれる）ことが規定され得る（図２（ＩＩ）参照）。
【０１１４】
さらに、前記範囲内において、混合シグナルを生成するため前述の２つの実施形態を一緒に組み合わせること、すなわち、混合シグナルを形成する座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの核酸断片の一部を１種の検出標識だけで標識し、ハイブリダイゼーションプローブの核酸断片の１つ以上の追加の部分を少なくとも２種の異なる検出標識で標識することも規定され得る。
【０１１５】
さらに、少なくとも１種の追加検出標識で標識されている座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの個々のハイブリダイズした核酸断片と核酸断片の間に最大で３Ｍｂｐ、特に最大で２．５Ｍｂｐ、好ましくは最大で２Ｍｂｐ、好ましくは最大で１Ｍｂｐ、特に好ましくは最大で５００ｋｂ、さらにより好ましくは最大で２００ｋｂの距離が存在する場合に混合シグナルが生成されることもあり得る。換言すると、したがって、本発明によると、少なくとも１種の追加検出標識で標識されている座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのハイブリダイズした個々の核酸断片と核酸断片の間に、ハイブリダイズした状態で、最大で３Ｍｂｐ、特に最大で２．５Ｍｂｐ、好ましくは最大で２Ｍｂｐ、好ましくは最大で１Ｍｂｐ、特に好ましくは最大で５００ｋｂ、さらにより好ましくは最大で２００ｋｂの「ギャップ」が存在する場合に混合シグナルが生成されることもあり得る（図２（ＩＩＩ）参照）。
【０１１６】
したがって、特に、単独のプローブの「混合標識」を使用することによって混合シグナルが生成され得る。特に、染色体領域またはゲノム部分に特異的な混合シグナルの形成のため、所望により、Ｉ）プローブの全ての断片、または所望によりプローブの個々の断片のみを複数の標識で標識するか、またはＩＩ）同一の断片を異なる標識でそれぞれ標識するか、またはＩＩＩ）交互に断片を異なる標識で標識することにより、この場合も最終的に１点の混合シグナルだけが可視化されている、または検出可能である（図２（Ｉ）〜（ＩＩＩ）参照）。
【０１１７】
本発明の方法の意味での混合標識および混合シグナルは（Ｉ）〜（ＩＩＩ）において記載された断片の１つずつ、または全てが部分的にのみ重複している場合にも生じ得る。
【０１１８】
混合標識は、少なくとも１種の標識で標識されているあるプローブの個々の断片または断片群と少なくとも１種の追加標識で標識されているそのプローブの他の個々の断片または断片群が２Ｍｂｐの距離、所望により１Ｍｂｐの距離、所望により５００ｋｂの距離、および所望により２００ｋｂの距離を有する場合に本発明の方法の意味で生じることもできる。
【０１１９】
本発明の方法の意味での混合標識および混合シグナルは、したがって、同じ配列、またはほぼ同じ配列を有する２つ以上のプローブが使用される場合、すなわち、２つ以上のプローブが同じ特定の染色体領域または同じゲノム部分に対処するが、異なる標識で標識されている場合に生じることもでき、その場合にそれらのプローブは９５％、所望により９０％、所望により８０％、所望により７０％、所望により６０％、所望により５０％だけ一致していてもよく、基本的に類似するそれらの配列の配列変異によって、またはそれらのプローブの個々の領域のみを部分的に重複させることによって相違が生じる。
【０１２０】
適切な検出標識の選択は当業者の技術範囲内にあり、インサイチュハイブリダイゼーションを実施するために使用される方法に応じて行われる。通常、ハイブリダイゼーションプローブの直接標識または間接標識は適切な検出標識を選択することで行われ得る。
【０１２１】
特に、本発明の範囲内では、検出標識が色素；色素基質；化学発光色素、特にアクリジニウム；放射性同位体；スピン標識；酵素、特にアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、大豆ペルオキシダーゼおよび／またはβガラクトシダーゼ；ハプテン、特にジゴキシゲニン、ビオチン、２，４−ジニトロフェノール、５（６）−カルボキシフルオレセイン、ローダミン、ブロモデオキシウリジン、アセチルアミノフルオレン、トリニトロフェノール、トリニトロフェノール誘導体、エストラジオールおよび／または２，４−ジニトロフェノール；カンタムドット；ビーズ；アミノヘキシレン；ピレン類；および／または蛍光色素、特にフルオレセイン、フルオレセイン誘導体、５（６）−カルボキシフルオレセイン、クマリン、クマリン誘導体、ローダミン、ローダミン誘導体、テトラメチルローダミン、リサミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡ、ＴＲＩＴＣ、ＩＲ色素、Ａｌｅｘａ色素、Ｄｙｏｍｉｃｓ色素、フィコエリトリン、カスケードブルー、オレゴングリーン４８８、パシフィックブルーおよび／またはローダミングリーンからなる群より選択される場合に良好な結果が得られる。
【０１２２】
インサイチュハイブリダイゼーションの実施に関し、異なる方法でインサイチュハイブリダイゼーションを行うことができる。
【０１２３】
特に、本インサイチュハイブリダイゼーションの第１の好ましい実施形態によると、ハイブリダイゼーションプローブの直接標識によって、特に蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって本インサイチュハイブリダイゼーションが行われる。
【０１２４】
同様に、ハイブリダイゼーションプローブを蛍光色素、特に可視光領域、赤外線領域、および／または紫外線領域向けの蛍光色素、好ましくは緑色、オレンジ色／赤色、赤色、金色、および／または青色の発光領域向けの蛍光色素で標識することによって本インサイチュハイブリダイゼーションが行われることが規定され得る。
【０１２５】
本インサイチュハイブリダイゼーションのさらに好ましい実施形態によると、ハイブリダイゼーションプローブの間接標識によって、特に明視野／インサイチュハイブリダイゼーション（ＢｒＩＳＨ）によって本インサイチュハイブリダイゼーションが行われることが同様に規定され得る。
【０１２６】
さらに、本発明によると、ハプテン、特にビオチン、ジゴキシゲニン、および／またはＤＮＰでのハイブリダイゼーションプローブの標識と後続の抗体結合アルカリホスファターゼ、抗体結合ペルオキシダーゼ、および／または抗体結合βガラクトシダーゼによる検出によって本インサイチュハイブリダイゼーションが行われることが規定され得る。
【０１２７】
蛍光ベースのインサイチュハイブリダイゼーションの分析に関し、特定の単独の、または複数のフィルターセット、特に、融合および混合シグナルの対象とする表示を可能にするフィルターセットを使用してこの分析が行われることが好ましい。
【０１２８】
さらに、特に少なくとも１種の追加検出標識より多くの検出標識に基づく混合シグナルの生成において、特に相互に異なる、または規定の比率の少なくとも２種の追加検出標識、好ましくはより多くの追加の検出標識に基づく混合シグナルの生成において、コンピューター支援分析による評価を行うことが有利であり得る。さらに、特に、異なる単独の、または複数のフィルターセットのシグナルパターンを結合した表示を可能にするコンピューター支援分析によりスーパーインポーズされた画像を利用可能にすることも規定され得る。
【０１２９】
基本的に、本発明の方法を用いて多数の異なるタイプの染色体異常を検出することが可能である。特に、転座、逆位、部分重複、欠失、挿入、重複、異数性、および増幅、特に転座および／または逆位の検出のために本発明の方法を用いることができる。
【０１３０】
本発明の方法の範囲内において、このとき、染色体異常が疾患、特に悪性腫瘍、好ましくは癌腫、肉腫、および／または白血病と関連することが規定され得る。
【０１３１】
潜在的な染色体異常について検査される遺伝子は、好ましくは、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＮＲＧ１、ＮＴＲＫ１、ＣＡＲＳ、ＥＭＬ４、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＫＩＦ５Ｂ、ＴＧＦ、ＢＣＲ、ＡＢＬ、ＡＬＫ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＩＲＣ３、ＣＣＮＤ１、ＥＧＲ１、ＥＴＶ６、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＩＧＨ、ＫＭＴ２Ａ、ＭＹＣ、ＰＭＬ、ＲＡＲＡ、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ１Ｔ１、ＥＷＳＲ１、ＣＨＯＰ、ＦＵＳ、ＣＯＬ１Ａ１、ＤＤＩＴ３、ＪＡＺＦ１、ＮＲ４Ａ３、ＦＯＸＯ１、ＦＵＳ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＰＤＧＦＢ、ＳＳ１８、ＴＦＥ３、ＵＳＰ６、ＷＴ１、ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ１、ＡＬＫ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤ２７４、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＥＧＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＳＲ１、ＥＴＶ１、ＦＧＦ３、４、１９、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨＩＴ（ＲＣＣ）、ＫＲＡＳ、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＴ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＯＸ２、ＴＥＲＴ、ＴＯＰ２Ａ、ＴＰ５３、ＴＹＭＳ、および／またはＶＨＬからなる群より選択される。
【０１３２】
本発明の方法の範囲内において、逆位および／または転座の検出に本発明の方法が用いられる場合に特に良好な結果が達成される。
【０１３３】
本発明の好ましい実施形態の範囲内において、本発明の方法は特に肺腫瘍、特に、遺伝子ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＮＲＧ１、ＮＴＲＫ１、ＣＡＲＳ、ＥＭＬ４、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＫＩＦ５Ｂ、および／またはＴＧＦが影響を受けている肺腫瘍の場合に様々な転座および／または逆位の検出に用いられる。
【０１３４】
さらに、本発明の方法は特にリンパ腫および白血病、特に、遺伝子ＢＣＲ、ＡＢＬ、ＡＬＫ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＩＲＣ３、ＣＣＮＤ１、ＥＧＲ１、ＥＴＶ６、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＩＧＨ、ＫＭＴ２Ａ、ＭＹＣ、ＰＭＬ、ＲＡＲＡ、ＲＵＮＸ１、および／またはＲＵＮＸ１Ｔ１が影響を受けているリンパ腫および白血病の場合に様々な転座および／または逆位の検出に用いられることが規定され得る。
【０１３５】
本発明のさらに好ましい実施形態によると、本発明の方法は特に肉腫、特に、遺伝子ＥＷＳＲ１、ＣＨＯＰ、ＦＵＳ、ＣＯＬ１Ａ１、ＤＤＩＴ３、ＪＡＺＦ１、ＮＲ４Ａ３、ＦＯＸＯ１、ＦＵＳ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＰＤＧＦＢ、ＳＳ１８、ＴＦＥ３、ＵＳＰ６、および／またはＷＴ１が影響を受けている肉腫の場合に様々な転座および／または逆位の検出に用いられる。
【０１３６】
本発明によると、本発明の方法は特に遺伝子ＡＬＫおよびＲＯＳ１が影響を受けている場合に逆位および／または転座の検出に用いられることも規定され得る。
【０１３７】
さらに、本発明の範囲内において、本発明の方法が増幅および／または欠失の検出に用いられる場合に良好な結果が達成される。
【０１３８】
各プローブが各ゲノム領域に対応し、且つ、異なるプローブが異なる組合せおよび比率で異なる標識によって標識されている最大で２４本の異なる座位特異的プローブを増幅または欠失の検出のために使用することができる。シグナルパターンとして得られている混合シグナルに基づき、異なる座位特異的プローブを互いに明確に識別することができる。したがって、単一の方法を用いて問題となっているゲノム領域の最大で２４種類の異なる増幅事象および／または欠失事象を調査することができる。異なる混合シグナルまたは混合色を計数することにより特定の増幅または欠失の検出が行われる。
【０１３９】
好ましくは、本発明の方法は特に乳房腫瘍、結腸腫瘍、および肺腫瘍、特に、遺伝子ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ１、ＡＬＫ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤ２７４、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＥＧＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＳＲ１、ＥＴＶ１、ＦＧＦ３、４、１９、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨＩＴ（ＲＣＣ）、ＫＲＡＳ、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＴ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＯＸ２、ＴＥＲＴ、ＴＯＰ２Ａ、ＴＰ５３、ＴＹＭＳ、および／またはＶＨＬが影響を受けている乳房腫瘍、結腸腫瘍、および肺腫瘍の場合に様々な増幅および欠失の検出に用いられる。
【０１４０】
したがって、まとめると、本発明の範囲内において、驚くべきことに、混合標識を有する座位特異的プローブを使用することで異常の影響を受けた染色体領域の明確な特定を可能にする混合シグナルであって、良好、且つ、確かに検出可能および評価可能な混合シグナルが生成されることが分かった。したがって、本発明の方法により初めて、且つ、驚くべきことに、複数の異なる構造的および／または数的染色体変異の検出が可能になる。これは先行技術では不可能である。
【０１４１】
本発明の第２態様によると本発明の追加の対象は、インサイチュハイブリダイゼーション、特に生体試料内、好ましくは１つ以上の細胞内および／または１つ以上の細胞核内の染色体領域および／またはＤＮＡ領域の検出によるインサイチュハイブリダイゼーションにより、特に前述の請求項のいずれか１項に記載の方法により染色体異常、特に構造的および／または数的染色体異常、好ましくは構造的染色体異常を検出するための組成物であって、それぞれ第１検出標識で標識された相互に異なる少なくとも２本、特に少なくとも３本、好ましくは少なくとも４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを含み、且つ、各座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに関して、それらの座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１本のプローブが第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識で標識されている前記組成物である。
【０１４２】
同様に、本発明のこの態様によると、予防処置および／または治療処置および／または染色体異常と関連する疾患、特に悪性腫瘍、好ましくは癌腫、肉腫、および／または白血病、特に好ましくは肺腫瘍、リンパ腫、白血病、肉腫、乳癌、および／または結腸癌の予防処置および／または治療処置および／または診断および／または予後判定に使用される組成物が本発明の対象であり、その組成物はそれぞれ第１検出標識で標識された相互に異なる少なくとも２本、特に少なくとも３本、好ましくは少なくとも４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを含み、且つ、各座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに関して、それらの座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１本のプローブが第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識で標識されている。
【０１４３】
この背景で、本発明による組成物は上で記載されたような方法の実施を目的とされているか、またはそのような方法の実施のために使用されることが特に規定され得る。
【０１４４】
本発明のこの態様に関するこの他の詳細について、本発明のこの態様についても同様に適用される本発明の他の態様についての上記の説明を参照することができる。
【０１４５】
さらに、本発明の第３の態様に従うと本発明の対象は、インサイチュハイブリダイゼーション、特に生体試料内、好ましくは１つ以上の細胞内および／または１つ以上の細胞核内の染色体領域および／またはＤＮＡ領域の検出によるインサイチュハイブリダイゼーションにより、特に上記の方法により染色体異常、特に構造的および／または数的染色体異常、好ましくは構造的染色体異常を検出するための組成物、特に上で記載されたような組成物の使用である。
【０１４６】
本発明のこの態様に関するこの他の詳細について、本発明のこの態様についても同様に適用される本発明の他の態様についての上記の説明を参照することができる。
【０１４７】
さらに、本発明の第４の態様によると本発明の追加の対象は、それぞれ第１検出標識で標識された相互に異なる少なくとも２本、特に少なくとも３本、好ましくは少なくとも４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの使用であって、各座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに関して、それらの座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１本のプローブが第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識で標識されている前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの、インサイチュハイブリダイゼーション、特に生体試料内、好ましくは１つ以上の細胞内および／または１つ以上の細胞核内の染色体領域および／またはＤＮＡ領域の検出によるインサイチュハイブリダイゼーションにより、好ましくは上記の方法により染色体異常、特に構造的および／または数的染色体異常を検出するための前記使用である。
【０１４８】
同様に、本発明のこの態様によると本発明の対象は、それぞれ第１検出標識で標識された相互に異なる少なくとも２本、特に少なくとも３本、好ましくは少なくとも４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの使用であって、各座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに関して、それらの座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１本のプローブが第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識で標識されている前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの、染色体異常と関連する疾患、特に悪性腫瘍、好ましくは癌腫、肉腫、および／または白血病、特に好ましくは肺腫瘍、リンパ腫、白血病、肉腫、乳癌、および／または結腸癌の診断および／または予後判定における好ましくは本発明の前述の方法の範囲内での使用である。
【０１４９】
本発明のこの態様に関するこの他の詳細について、本発明のこの態様についても同様に適用される本発明の他の態様についての上記の説明を参照することができる。
【０１５０】
さらに、本発明の第５の態様によると本発明の別の対象は、少なくとも２種類の検出標識で標識された少なくとも１種類の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの、それぞれ第１検出標識で標識された相互に異なる少なくとも１つ、特に少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３本の追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブと一緒の使用であって、インサイチュハイブリダイゼーション、特に生体試料内、好ましくは１つ以上の細胞内および／または１つ以上の細胞核内の染色体領域および／またはＤＮＡ領域の検出によるインサイチュハイブリダイゼーションにより、好ましくは上記の方法により染色体異常、特に構造的および／または数的染色体異常、好ましくは構造的染色体異常を検出するための前記使用である。
【０１５１】
本発明のこの態様に関するこの他の詳細について、本発明のこの態様についても同様に適用される本発明の他の態様についての上記の説明を参照することができる。
【０１５２】
最後に、本発明の第６の態様によると本発明の対象は、インサイチュハイブリダイゼーション、特に生体試料内、好ましくは１つ以上の細胞内および／または１つ以上の細胞核内の染色体領域および／またはＤＮＡ領域の検出によるインサイチュハイブリダイゼーションにより染色体異常、特に構造的および／または数的染色体異常、好ましくは構造的染色体異常を検出するためのキットまたは部分キットまたはセットであって、それぞれ第１検出標識で標識された相互に異なる少なくとも２本、特に少なくとも３本、好ましくは少なくとも４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを含み、且つ、各ハイブリダイゼーションプローブに関して、それらの座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１本のプローブが第１検出標識とは異なる少なくとも１種の追加検出標識で標識されている前記キットまたは部分キットまたはセットであり、特に上記の方法の実施を目的としており、且つ／またはその方法の実施に使用される前記キットである。
【０１５３】
この背景で、相互に異なる少なくとも２本、特に少なくとも３本、好ましくは少なくとも４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが共通の組成物、特に上記の組成物内に存在することが特に規定され得る。同様に、相互に異なる少なくとも２本、特に少なくとも３本、好ましくは少なくとも４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが互いに分かれた別々の組成物内に存在することが規定され得る。
【０１５４】
本発明のこの態様に関するこの他の詳細について、本発明のこの態様についても同様に適用される本発明の他の態様についての上記の説明を参照することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
以下、図面および実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。
【０１５６】
【図１】２例の転座を検出するための本発明による方法の模式図。
【図２】混合標識および混合シグナルを表示するための複数の標識の使用に関しての本発明による方法の模式図。
【図３】ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ社の四重ＦＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１ブレイク・アパート・デュアルミックスＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用したときのシグナルパターンの模式図。
【図４】ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ社の四重ＦＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１ブレイク・アパート・シングルミックスＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用したときのシグナルパターンの模式図。
【図５】ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ社の六重ＦＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１  ＆  ＲＥＴブレイク・アパート・シングルミックスＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用したときのシグナルパターンの模式図。
【図６】ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ社の六重ＦＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１  ＆  ＲＥＴブレイク・アパート・シングルミックスＩＩ  ＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用したときのシグナルパターンの模式図。
【図７】４例の数的異常の検出のための本発明による方法の模式図。
【図８】７例の転座または増幅の検出のための本発明による方法の模式図。
【図９】ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ社の四重ＦＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１ブレイク・アパート・シングルミックスＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用する６ｑ２２のＲＯＳ１領域の転座を検出するためのＦＩＳＨ分析を示す図である。
【図１０】ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ社の四重ＣＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＤｏｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１ブレイク・アパート・シングルミックスＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用する２ｐ２３のＡＬＫ領域の転座を検出するためのＣＩＳＨ分析を示す図である。
【図１１】ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ社の五連ＦＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＥＲＢＢ２，  ＥＧＦＲ，  ＦＧＦＲ１，  ＭＥＴ  ＆  ＳＯＸ２  ＦｉｖｅＣｈｅｃｋ（商標）ＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用するＥＲＢＢ２領域の増幅を検出するためのＦＩＳＨ分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１５７】
図１は１本のプローブが２種の標識で同時に標識されている４本のプローブと３種の標識を使用する２例の転座を検出するための本発明による方法の模式図を示している。その図は正常細胞の場合のシグナルパターンならびに２ｐ２３にあるＡＬＫ遺伝子の転座または６ｑ２２にあるＲＯＳ１遺伝子の転座を有する細胞の場合のシグナルパターンを示している。
【０１５８】
それらの２か所の切断点領域（ＡＬＫおよびＲＯＳ１）には四重ＩＳＨプローブの標識Ａおよび標識Ｂがそれぞれ隣接し、それぞれの場合で融合シグナルＡ−Ｂを生じる。ＡＬＫ切断点領域の一方の側には標識Ｃがさらに隣接し、それにより混合標識Ａ／Ｃが生じる。
【０１５９】
正常細胞（ＡＬＫまたはＲＯＳ１の異常を持たない）の間期では、ＲＯＳ１遺伝子座は融合シグナルＡ−Ｂによって標識され、ＡＬＫ遺伝子座は融合シグナルＡ−Ｂによって標識され、そのシグナルにＡ／Ｃ混合シグナルが付随する。ＡＬＫ転座の影響を受けた細胞の間期では、転座の影響を受けたＡＬＫ遺伝子が分離した標識Ｂのシグナルならびに前者から分離した混合シグナルＡ／Ｃによって標識される。ＲＯＳ１転座の影響を受けた細胞の間期では、転座の影響を受けたＲＯＳ１遺伝子が分離した標識Ａのシグナルならびに分離した標識Ｂのシグナルによって標識される。
【０１６０】
図２は混合標識および混合シグナルを表示するための複数の標識の使用に関しての本発明による方法の模式図を示している。明確に説明するために２種の標識だけが例示されている。座位特異的プローブに特異的であり、したがって染色体領域またはゲノム部分に特異的である混合シグナルが、Ｉ）プローブの断片がそれぞれ異なる標識で標識されている場合に生じることができ、および／またはＩＩ）プローブの全ての断片が複数の標識されている場合、または所望によりプローブの個々の断片だけが複数の標識されている場合にも生じることができ、および／またはＩＩＩ）交互に断片が異なる標識で標識されている場合に生じることができ、この場合も最終的に１点の混合シグナルだけが可視化されている、または検出可能である。このとき、（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に従う全ての断片を、または個々の断片だけをもスーパーインポーズ、すなわち重ね合わせることができ（示さず）、（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に従う個々の断片または断片群が例えば表示されている「ギャップ」に最大で２Ｍｂｐの長さを有する場合には混合標識を生成することもできる。
【０１６１】
図３はＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ社の対応する四重ＦＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１ブレイク・アパート・デュアルミックスＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用したときのシグナルパターンの模式図を示している。そのプローブは、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の近位に位置する配列と６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の近位に位置する配列に対する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍでの吸光、および５２８ｎｍでの発光）、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の遠位に位置する配列と６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の遠位に位置する配列に対するオレンジ色標識ポリヌクレオチド（５４７ｎｍでの吸光、および５７２ｎｍでの発光）、ならびに領域２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の遠位と近位に位置する配列に対する青色標識ポリヌクレオチド（４２６ｎｍでの吸光、および４８０ｎｍでの発光）からなる。
【０１６２】
適切なフィルターセットを使用すると、再構成されていないＡＬＫ遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは緑色−オレンジ色蛍光融合シグナルとして現れ、それらの融合混合シグナルは緑色／青色蛍光混合シグナルとオレンジ色／青色蛍光混合シグナルから構成される。再構成されていないＲＯＳ１遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは緑色−オレンジ色蛍光融合シグナルとして現れる。
【０１６３】
正常細胞（ＡＬＫまたはＲＯＳ１の異常を持たない）の間期では、適切な緑色−オレンジ色デュアルバンドパスフィルターセットを使用すると４点の緑色−オレンジ色融合シグナルが生じ、適切なシングルバンドパスフィルターセットを使用すると２点の青色シグナルが生じ、適切なトリプルバンドパスフィルターセットを使用すると２点の緑色−オレンジ色融合シグナルおよび２点の緑色−オレンジ色／青色融合および混合シグナルが生じる（図３ａ参照）。
【０１６４】
ＡＬＫ転座の影響を受けた２ｐ２３座位は分離した緑色／青色混合シグナルおよび分離したオレンジ色／青色混合シグナルを特徴とする（図３ｂ参照）。
【０１６５】
ＲＯＳ１転座の影響を受けた６ｑ２２座位は分離した緑色シグナルおよび分離したオレンジ色シグナルを特徴とする（図３ｃ参照）。
【０１６６】
緑色シグナルおよびオレンジ色シグナルに適切なデュアルバンドパスフィルターセットを使用すると、緑色シグナルおよびそれから分離したオレンジ色シグナルは最初には基本的にＡＬＫまたはＲＯＳ１の転座が存在するという判定を下すだけである。青色蛍光シグナルが内包されることでＡＬＫ転座またはＲＯＳ１転座の間での診断的にあり得る適切な区別が生じ得る。分離した緑色シグナルが青色シグナルに重なる（緑色／青色混合シグナル）場合、または分離したオレンジ色シグナルが青色シグナルに重なる（オレンジ色／青色混合シグナル）場合、これはＡＬＫ転座を表す。分離した緑色シグナルおよび分離したオレンジ色シグナルが青色シグナルと重ならない場合、これはＲＯＳ１転座を表す。
【０１６７】
図４はＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ社の対応する四重ＦＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１ブレイク・アパート・シングルミックスＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用したときのシグナルパターンの模式図を示している。そのプローブは、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の近位に位置する配列と６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の近位に位置する配列に対する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍでの吸光、および５２８ｎｍでの発光）、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の遠位に位置する配列と６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の遠位に位置する配列に対するオレンジ色標識ポリヌクレオチド（５４７ｎｍでの吸光、および５７２ｎｍでの発光）、ならびに領域２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の遠位に位置する配列に対する青色標識ポリヌクレオチド（４２６ｎｍでの吸光、および４８０ｎｍでの発光）からなる。
【０１６８】
適切なフィルターセットを使用すると、再構成されていないＡＬＫ遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは緑色−オレンジ色蛍光融合シグナルとして現れ、それらの融合シグナルは緑色シグナルとオレンジ色／青色蛍光混合シグナルから構成される。再構成されていないＲＯＳ１遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは緑色−オレンジ色蛍光融合シグナルとして現れる。
【０１６９】
正常細胞（ＡＬＫまたはＲＯＳ１の異常を持たない）の間期では、適切な緑色−オレンジ色デュアルバンドパスフィルターセットを使用すると４点の緑色−オレンジ色融合シグナルが現れ、適切なシングルバンドパスフィルターセットを使用すると２点の青色シグナルが現れ、適切なトリプルバンドパスフィルターセットを使用すると２点の緑色−オレンジ色融合シグナルおよび２点の緑色−オレンジ色／青色融合および混合シグナルが現れる（図４ａ参照）。
【０１７０】
ＡＬＫ転座の影響を受けた２ｐ２３座位は分離した緑色シグナルおよび分離したオレンジ色／青色混合シグナルを特徴とする（図４ｂ参照）。
【０１７１】
ＲＯＳ１転座の影響を受けた６ｑ２２座位は分離した緑色シグナルおよび分離したオレンジ色シグナルを特徴とする（図４ｃ参照）。
【０１７２】
緑色シグナルおよびオレンジ色シグナルに適切なデュアルバンドパスフィルターセットを使用すると、緑色シグナルおよびそれから分離したオレンジ色シグナルは最初には基本的にＡＬＫまたはＲＯＳ１の転座が存在するという判定を下すだけである。青色蛍光シグナルが内包されることでＡＬＫ転座またはＲＯＳ１転座の間での診断的にあり得る適切な区別が生じ得る。分離したオレンジ色シグナルが青色シグナルに重なる（オレンジ色／青色混合シグナル）場合、これはＡＬＫ転座を表す。分離したオレンジ色シグナルが青色シグナルと重ならない場合、これはＲＯＳ１転座を表す。
【０１７３】
図５はＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ社の対応する六重ＦＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１  ＆  ＲＥＴブレイク・アパート・デュアルミックスＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用したときのシグナルパターンの模式図を示している。そのプローブは、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の近位に位置する配列、６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の近位に位置する配列、および１０ｑ１１にあるＲＥＴ切断点領域の近位に位置する配列に対する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍでの吸光、および５２８ｎｍでの発光）、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の遠位に位置する配列、６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の遠位に位置する配列、および１０ｑ１１にあるＲＥＴ切断点領域の遠位に位置する配列に対するオレンジ色標識ポリヌクレオチド（５４７ｎｍでの吸光、および５７２ｎｍでの発光）、ならびに領域２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の遠位に位置する配列、および１０ｑ１１にあるＲＥＴ切断点領域の近位に位置する配列に対する青色標識ポリヌクレオチド（４２６ｎｍでの吸光、および４８０ｎｍでの発光）からなる。
【０１７４】
適切なフィルターセットを使用すると、再構成されていないＡＬＫ遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは緑色−オレンジ色蛍光融合シグナルとして現れ、それらの融合シグナルは緑色シグナルとオレンジ色／青色蛍光混合シグナルから構成される。再構成されていないＲＥＴ遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは緑色−オレンジ色蛍光融合シグナルとして現れ、それらの融合シグナルは緑色／青色混合シグナルおよびオレンジ色シグナルから構成される。再構成されていないＲＯＳ１遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは緑色−オレンジ色蛍光融合シグナルとして現れる。
【０１７５】
正常細胞（ＡＬＫ、ＲＯＳ１またはＲＥＴの異常を持たない）の間期では、適切な緑色−オレンジ色デュアルバンドパスフィルターセットを使用すると６点の緑色−オレンジ色融合シグナルが現れ、適切なシングルバンドパスフィルターセットを使用すると４点の青色シグナルが現れ、適切なトリプルバンドパスフィルターセットを使用すると２点の緑色−オレンジ色融合シグナル、２点の緑色−オレンジ色／青色融合および混合シグナル、および２点の緑色／青色−オレンジ色融合および混合シグナルが現れる（図５ａ参照）。
【０１７６】
ＡＬＫ転座の影響を受けた２ｐ２３座位は分離した緑色シグナルおよび分離したオレンジ色／青色混合シグナルを特徴とする（図５ｂ参照）。
【０１７７】
ＲＯＳ１転座の影響を受けた６ｑ２２座位は分離した緑色シグナルおよび分離したオレンジ色シグナルを特徴とする（図５ｃ参照）。
【０１７８】
ＲＥＴ転座の影響を受けた１０ｑ１１座位は分離したオレンジ色シグナルおよび分離した緑色／青色混合シグナルを特徴とする（図５ｄ参照）。
【０１７９】
緑色シグナルおよびオレンジ色シグナルに適切なデュアルバンドパスフィルターセットを使用すると、緑色シグナルおよびそれから分離したオレンジ色シグナルは最初には基本的にＡＬＫ転座、ＲＯＳ１転座、またはＲＥＴ転座が存在するという判定を下すだけである。青色蛍光シグナルが内包されることでＡＬＫ転座、ＲＯＳ１転座、またはＲＥＴ転座の間での診断的にあり得る適切な区別が生じ得る。分離したオレンジ色シグナルが青色シグナルに重なる（オレンジ色／青色混合シグナル）場合、これはＡＬＫ転座を表す。分離した緑色シグナルが青色シグナルに重なる（緑色／青色混合シグナル）場合、これはＲＥＴ転座を表す。分離したオレンジ色シグナルも分離した緑色シグナルも青色シグナルと重ならない場合、これはＲＯＳ１転座を表す。
【０１８０】
図６はＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ社の対応する六重ＦＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１  ＆  ＲＥＴブレイク・アパート・デュアルミックスＩＩ  ＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用したときのシグナルパターンの模式図を示している。そのプローブは、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の近位に位置する配列、６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の近位に位置する配列、および１０ｑ１１にあるＲＥＴ切断点領域の近位に位置する配列に対する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍでの吸光、および５２８ｎｍでの発光）、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の遠位に位置する配列、６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の遠位に位置する配列、および１０ｑ１１にあるＲＥＴ切断点領域の遠位に位置する配列に対する赤色標識ポリヌクレオチド（５８０ｎｍでの吸光、および５９９ｎｍでの発光）、領域２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の遠位に位置する配列に対する青色標識ポリヌクレオチド（４２６ｎｍでの吸光、および４８０ｎｍでの発光）、ならびに領域１０ｑ１１にあるＲＥＴ切断点領域の近位に位置する配列に対するゴールデンイエロー標識ポリヌクレオチド（５３２ｎｍでの吸光、および５５３ｎｍでの発光）からなる。
【０１８１】
適切なフィルターセットを使用すると、再構成されていないＡＬＫ遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは緑色−赤色蛍光融合シグナルとして現れ、それらの融合シグナルは緑色シグナルおよび赤色／青色蛍光混合シグナルから構成される。再構成されていないＲＥＴ遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは緑色−赤色蛍光融合シグナルとして現れ、それらの融合シグナルは緑色／ゴールデンイエロー混合シグナルおよび赤色シグナルから構成される。再構成されていないＲＯＳ１遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは緑色−赤色蛍光融合シグナルとして現れる。
【０１８２】
正常細胞（ＡＬＫ、ＲＯＳ１またはＲＥＴの異常を持たない）の間期では、適切な緑色−赤色デュアルバンドパスフィルターセットを使用すると６点の緑色−赤色融合シグナルが現れ、適切なシングルバンドパスフィルターセットを使用すると２点の青色シグナルが現れ、適切なシングルバンドパスフィルターセットを使用すると２点のゴールデンイエローシグナルが現れる（図６ａ参照）。
【０１８３】
ＡＬＫ転座の影響を受けた２ｐ２３座位は分離した緑色シグナルおよび分離した赤色／青色混合シグナルを特徴とする（図６ｂ参照）。
【０１８４】
ＲＯＳ１転座の影響を受けた６ｑ２２座位は分離した緑色シグナルおよび分離した赤色シグナルを特徴とする（図６ｃ参照）。
【０１８５】
ＲＥＴ転座の影響を受けた１０ｑ１１座位は分離した赤色シグナルおよび分離した緑色／ゴールデンイエロー混合シグナルを特徴とする（図６ｄ参照）。
【０１８６】
緑色シグナルおよび赤色シグナルに適切なデュアルバンドパスフィルターセットを使用すると、緑色シグナルおよびそれから分離した赤色シグナルは最初には基本的にＡＬＫ転座、ＲＯＳ１転座、またはＲＥＴ転座が存在するという判定を下すだけである。青色蛍光シグナルまたはゴールデンイエロー蛍光シグナルが内包されることでＡＬＫ転座、ＲＯＳ１転座、またはＲＥＴ転座の間での診断的にあり得る適切な区別が生じ得る。分離した赤色シグナルが青色シグナルに重なる（赤色／青色混合シグナル）場合、これはＡＬＫ転座を表す。分離した緑色シグナルがゴールデンイエローシグナルに重なる（緑色／ゴールデンイエロー混合シグナル）場合、これはＲＥＴ転座を表す。分離した赤色シグナルも分離した緑色シグナルも青色シグナルまたはゴールデンイエローシグナルと重ならない場合、これはＲＯＳ１転座を表す。
【０１８７】
図７は、３本のプローブがそれぞれ異なる組合せの２種の標識を使用して同時に標識されている４本のプローブと４種の標識を使用する、４例の数的異常を検出するための本発明による方法の模式図を示している。その図は正常細胞の場合のシグナルパターンおよび７ｑ３１にあるＭＥＴ遺伝子の増幅を有する細胞の場合シグナルパターンを示している。ＥＲＢＢ２遺伝子の領域１７ｑ１１．２−ｑ１２が標識Ａによって被覆され、ＥＧＦＲ遺伝子の領域７ｐ１２が標識Ａとさらに標識Ｄで被覆されることにより混合標識Ａ／Ｄが生じ、ＦＧＦＲ１遺伝子の領域８ｐ１１．２３−ｐ１１．２２が標識Ａとさらに標識Ｃで被覆されることにより混合標識Ａ／Ｃが生じ、ＭＥＴ遺伝子の領域７ｑ３１が標識Ａとさらに標識Ｂで被覆されることにより混合標識Ａ／Ｂが生じる。
【０１８８】
正常細胞（ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１またはＭＥＴの数的異常を持たない）の間期では、全ての座位が標識Ａのシグナルによって標識される。標識Ａのシグナルの標識Ｂのシグナルとの共局在により混合標識Ａ／Ｂが生じ、その共局在がＭＥＴ遺伝子座を標識する。したがって、混合標識Ａ／ＣはＦＧＦＲ１遺伝子座を標識し、混合標識Ａ／ＤはＥＧＦＲ遺伝子座を標識する。ＥＲＢＢ２遺伝子座は別の標識との共局在が生じないことを特徴とする。ＭＥＴ遺伝子増幅を有する細胞の間期では、標識Ｂのシグナルと共局在する標識Ａのシグナルの増加が生じ、したがって混合標識Ａ／Ｂのシグナルの増加が生じる。
【０１８９】
図８は、プローブ毎に量比が異なる２種の標識でプローブが同時に標識されているそれぞれ１４本のプローブと５種の標識を使用する、７例の転座または増幅を検出するための本発明による方法の模式図を示している。それらのプローブは、図８の左上部と右上部に示されているように、それぞれ切断点領域（「切断点」）に隣接し、または増幅領域（「増幅」）に対処し、ならびに同じ染色体上の追加の領域（例えばセントロメア領域）に対処する。一本の染色体のそれらの２本のプローブは２種の異なる標識と１種の同じ標識で標識されている（例えば、プローブ１：２５％の緑色、７５％の青色、およびプローブ２：２５％黄色と７５％青色）。したがって、それぞれ切断点領域に隣接するそれらの２本のプローブは、転座の影響を受けていない細胞において３種の標識から融合シグナルと混合シグナルをそれぞれ生成する。したがって、それぞれ増幅領域および同じ染色体上の追加の領域に対処するそれらの２本のプローブは、（それらの２本のプローブ間の距離が、融合および混合シグナルが生じるほどわずかではない場合に）増幅の影響を受けていない細胞において分離した混合シグナルをそれぞれ生成する。プローブを標識するために使用する２種の標識の間の量比を変えることにより同じ標識を使用して識別可能であるように複数のプローブを標識することができ、それにより様々な混合シグナルが生じる（例えば、示されている例では切断点領域１〜４の４本のプローブは２５％〜７５％、５０％〜５０％、７５％〜２５％、および１００％〜０％である）。
【０１９０】
正常細胞（転座を持たない）の間期では、遺伝子の切断点領域が混合シグナルＡ−ＢおよびＣ−Ｂによって標識され、それらの混合シグナルが組み合わさってＡ／Ｂ／Ｃ融合シグナルを生成する。正常細胞（増幅を持たない）の間期では、遺伝子の増幅領域が混合シグナルＡ−Ｂによって標識され、同じ染色体上の追加の領域、例えばセントロメア領域が混合シグナルＣ−Ｂによって標識される。転座の影響を受けた細胞の間期では、転座の影響を受けたその遺伝子が分離した標識Ａ−Ｂのシグナルおよびそれから分離した混合シグナルＣ−Ｂによって標識される。増幅の影響を受けた細胞の間期では、増幅の影響を受けたその遺伝子が標識ペア、例えばＡ−Ｂの複製混合シグナルによって標識される。
【０１９１】
図９はＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ社の四重ＦＩＳＨ−プローブ「ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１ブレイク・アパート・シングルミックスＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用する６ｑ２２のＲＯＳ１領域の転座を検出するためのＦＩＳＨ分析を示している。そのプローブは、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の近位に位置する配列と６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の近位に位置する配列に対する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍでの吸光、および５２８ｎｍでの発光）、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の遠位に位置する配列と６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の遠位に位置する配列に対するオレンジ色標識ポリヌクレオチド（５４７ｎｍでの吸光、および５７２ｎｍでの発光）、ならびに領域６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の近位に位置する配列に対する青色標識ポリヌクレオチド（４２６ｎｍでの吸光、および４８０ｎｍでの発光）からなる。
【０１９２】
適切なフィルターセットを使用すると、再構成されていないＲＯＳ１遺伝子および／またはＡＬＫ遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは緑色−オレンジ色蛍光融合シグナルとして現れ、再構成されたＲＯＳ１遺伝子および／またはＡＬＫ遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは分離した緑色シグナルおよび分離したオレンジ色シグナルとして現れる（緑色およびオレンジ色の蛍光シグナルを示している図９Ａを参照のこと）。このとき、ＲＯＳ１特異的緑色シグナルは青色蛍光シグナルと共局在し（青色蛍光シグナルを示している図９Ｂを参照のこと）、それにより再構成されていないＲＯＳ１遺伝子がオレンジ色シグナルおよび緑色／青色蛍光混合シグナルから構成される。再構成されていないＡＬＫ遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは緑色−オレンジ色蛍光融合シグナルとして現れ、青色蛍光シグナルを含む混合シグナルを有しない。ＲＯＳ１転座の影響を受けた６ｑ２２座位は分離した緑色シグナルおよび分離したオレンジ色シグナル（図９ＡおよびＣの矢印）を特徴とする。このとき、分離した緑色シグナルが青色シグナルと重なる。この緑色／青色混合シグナルは転座の影響を受けた遺伝子としてＡＬＫではなくＲＯＳ１を示す（青色、緑色、およびオレンジ色の蛍光シグナルを示している図９Ｃを参照のこと）。適切なフィルターセットを使用して前記シグナルパターンを容易に可視化することが可能である。
【０１９３】
図１０はＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ社の四重ＣＩＳＨ−プローブ「ＺｙｔｏＤｏｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１ブレイク・アパート・シングルミックスＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用する２ｐ２３のＡＬＫ領域の転座を検出するためのＣＩＳＨ分析を示している。そのプローブは、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の近位に位置する配列と６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の近位に位置する配列に対するジゴキシゲニン標識ポリヌクレオチド、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の遠位に位置する配列と６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の遠位に位置する配列に対するＤＮＰ標識ポリヌクレオチド、ならびに領域６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の遠位に位置する配列に対するビオチン標識ポリヌクレオチドからなる。それらの標識の検出は一次（非標識）抗体（抗ＤＩＧ／抗ＤＮＰ／抗ＢＩＯ）によって行われ、それらの一次抗体は二次ポリマー化酵素結合抗体（ＨＲＰポリマー／ＡＰポリマー／βＧＡＬ）ならびに基質（ＡＰ−ＲＥＤ／ＨＲＰ−ＧＲＥＥＮ／βＧＡＬ−ＢＬＵＥ）の酵素反応によって検出され、その酵素反応は強い恒久的な赤色（Ｒ）、緑色（Ｇ）、および青色（Ｂ）のシグナルの形成につながり、例えば４０倍のドライレンズを使用する光学顕微鏡観察によりそれらのシグナルを表示することができる。
【０１９４】
図１１はＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ社の五連ＦＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＥＲＢＢ２，  ＥＧＦＲ，  ＦＧＦＲ１，  ＭＥＴ  ＆  ＳＯＸ２  ＦｉｖｅＣｈｅｃｋ（商標）ＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用するＥＲＢＢ２領域の増幅を検出するためのＦＩＳＨ分析を示している。そのプローブは、ＥＲＢＢ２遺伝子の領域１７ｑ１１．２−ｑ１２、ＥＧＦＲ遺伝子の領域７ｐ１２、ＦＧＦＲ１遺伝子の領域８ｐ１１．２３−ｐ１１．２２、ＭＥＴ遺伝子の領域７ｑ３１、およびＳＯＸ２遺伝子の領域３ｑ２６．３−ｑ２７に対する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍでの吸光、および５２８ｎｍでの発光）、ならびにＥＧＦＲ遺伝子の領域とＳＯＸ２遺伝子の領域に対する青色標識ポリヌクレオチド（４２６ｎｍでの吸光、および４８０ｎｍでの発光）、ＦＧＦＲ１遺伝子の領域に対するゴールデンイエロー標識ポリヌクレオチド（５３２ｎｍでの吸光、および５５３ｎｍでの発光）、およびＭＥＴ遺伝子の領域とＳＯＸ２遺伝子の領域に対する赤色標識ポリヌクレオチド（５８０ｎｍでの吸光、および５９９ｎｍでの発光）からなる。
【０１９５】
適切なシングルバンドパスフィルターセットをすると、９点の個々の緑色シグナルおよび複数の個々の緑色シグナルの面積に匹敵する１点の緑色シグナルクラスター（図１１Ａ参照）、４点の青色シグナル（図１１Ｂ参照）、２点のゴールデンイエローシグナル（図１１Ｃ参照）、および４点の赤色シグナル（図１１Ｄ参照）が表示される。
【０１９６】
それらの画像のスーパーインポーズ（図１１Ｅ参照）は、一点の単独の緑色シグナルと緑色シグナルクラスターが異なる色のシグナルと共局在していない（矢印）ことを示している。その単一の緑色シグナルは非増幅ＥＲＢＢ２遺伝子であり、緑色シグナルクラスターはＥＲＢＢ２遺伝子増幅を表している。共局在による緑色／青色混合シグナルは２コピーのＥＧＦＲ遺伝子を特定し、共局在による緑色／ゴールデンイエロー混合シグナルは２コピーのＦＧＦＲ１遺伝子を特定し、共局在による緑色／赤色混合シグナルは２コピーのＭＥＴ遺伝子を特定し、共局在による緑色／青色／赤色混合シグナルは２コピーのＳＯＸ２遺伝子を特定する（図１１Ｅ参照）。
【実施例】
【０１９７】
本発明の方法の特徴をさらに証明するため、以下に記載されるインサイチュハイブリダイゼーションをさらに実施した。
【０１９８】
実施例１：ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ社の五連ＦＩＳＨプローブ「ＳＰＥＣ  ＥＲＢＢ２，  ＥＧＦＲ，  ＦＧＦＲ１，  ＭＥＴ  ＆  ＳＯＸ２  ＦｉｖｅＣｈｅｃｋ（商標）ＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用する様々な細胞種における複数の数的異常を検出するためのＦＩＳＨ分析
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺癌標本および乳癌標本であって、以前にＥＲＢＢ２遺伝子の増幅がそれぞれ診断されていない標本と診断された標本の３〜５μｍ厚の切片を被覆ガラス支持体上に配置し、５８℃で一晩にわたって焼き付けたものに対してＦＩＳＨを実施した。
【０１９９】
パラフィンを除くため、それらの標本を最初に７０℃のホットプレート上で１０分間にわたって加熱し、その後で２回にわたって１００％キシレン中でそれぞれ１０分間、室温（ＲＴ）で保温した。その後、濃度低下エタノールシリーズ（ＲＴで９６％、９６％、９０％、７０％の変性エタノール中においてそれぞれ５分間）と超純水（２回にわたってＲＴでそれぞれ２分間）中での定温放置により標本を再水和した。細胞の透過処理のため、この後に加熱前処理用クエン酸溶液（ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ）中における９８℃で１５分間にわたる加熱前処理が続き、その後に超純水中におけるＲＴでそれぞれ２分間の２回の追加保温ステップが続く。ペプシン溶液（ペプシンソリューション、ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ）を標本に滴下し、その後に加湿チャンバー内において３７℃で２５分間にわたって保温することによりタンパク質分解性前処理を行った。その後のウォッシュバッファーＳＳＣ（ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ）内での５分間にわたる保温の後、標本を脱水した（超純水、７０％、９０％、９６％のエタノール中においてＲＴでそれぞれ１分間）。標本の風乾後、それぞれ１０μｌのＦＩＳＨプローブＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＥＲＢＢ２，  ＥＧＦＲ，  ＦＧＦＲ１，  ＭＥＴ  ＆  ＳＯＸ２  ＦｉｖｅＣｈｅｃｋ（商標）ＮＧ−ＦＩＳＨプローブ（ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ）をピペットによってそれらの切片に直接アプライした。
【０２００】
そのプローブは５本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに基づく混合物であり、その混合物は、ＥＲＢＢ２遺伝子の領域１７ｑ１１．２−ｑ１２、ＥＧＦＲ遺伝子の領域７ｐ１２、ＦＧＦＲ１遺伝子の領域８ｐ１１．２３−ｐ１１．２２、ＭＥＴ遺伝子の領域７ｑ３１、およびＳＯＸ２遺伝子の領域３ｑ２６．３−ｑ２７に対する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍでの吸光、および５２８ｎｍでの発光）、ならびにＥＧＦＲ遺伝子の領域とＳＯＸ２遺伝子の領域に対する青色標識ポリヌクレオチド（４２６ｎｍでの吸光、および４８０ｎｍでの発光）、ＦＧＦＲ１遺伝子の領域に対するゴールデンイエロー標識ポリヌクレオチド（５３２ｎｍでの吸光、および５５３ｎｍでの発光）、およびＭＥＴ遺伝子の領域とＳＯＸ２遺伝子の領域に対する赤色標識ポリヌクレオチド（５８０ｎｍでの吸光、および５９９ｎｍでの発光）からなった。その後、空気の泡が無いようにカバーグラスをかけ、端をＦｉｘｏｇｕｍ（Ｍａｒａｂｕ）で封止した。ホットプレート上で標本を７５℃で１０分間にわたって変性した後に 加熱オーブン中の３７℃の予熱加湿チャンバー内においてハイブリダイゼーションを一晩（約１６時間）にわたって行った。
【０２０１】
ハイブリダイゼーション後、Ｆｉｘｏｇｕｍを取り外し、標本をガラスキュベット内の洗浄バッファー（１×ウォッシュバッファーＡ、ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ）中において３７℃で３分間にわたって保温した。カバーグラスを取り除いた後、洗浄バッファー（１×ウォッシュバッファーＡ、ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ）中において３７℃でそれぞれ５分間のストリンジェントな洗浄を２回行った。その後、濃度上昇エタノールシリーズ中で標本を脱水（ＲＴで７０％、９０％、９６％中においてそれぞれ１分間）し、そして乾燥し、そのときに試料を直射光から保護した。対比染色用色素（２０μｌのＤＡＰＩ  ＤｕｒａＴｅｃｔソリューション（ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ））をアプライした後、空気の泡が無いようにカバーガラスをかけ、標本を光から保護してＲＴで少なくとも３０分間にわたって定温放置した。
【０２０２】
その後、適切なフィルターセット（Ｓｐ．  Ｇｒｅｅｎ  ＨＣ  ｍＦＩＳＨフィルターセット、Ｓｐ．  Ｒｅｄ  ＨＣ  ｍＦＩＳＨフィルターセット、Ｓｐ．  Ａｑｕａ  ＨＣ  ｍＦＩＳＨフィルターセット、ＺｙＧｏｌｄ  ＨＣ  ｍＦＩＳＨフィルターセット（全て、ＡＨＦ  Ａｎａｌｙｓｅｎｔｅｃｈｎｉｋ  ＡＧ））を使用して蛍光顕微鏡（ＨＸＰ  １２０Ｖ照明ユニットを装着したＡｘｉｏ  Ｓｃｏｐｅ．Ａ１、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＧｍｂＨ）による評価を行った。
【０２０３】
このようにして、緑色フィルターを使用するとＥＲＢＢ２増幅が無い標本では細胞核中にそれぞれ１０点の緑色シグナルが見出された（ＥＲＢＢ２増幅の場合ではより多くの緑色シグナルが見られる（図１１Ａ参照）。ＺｙＧｏｌｄフィルターを使用すると（図１１Ｃに見られるように）細胞核当たりそれぞれ２点のゴールデンイエローシグナルが見られ、それらのシグナルの空間的位置が２点の緑色シグナルの空間的位置と同じであった。赤色フィルターを使用すると（図１１Ｄに見られるように）細胞核当たりそれぞれ４点の赤色シグナルが見られ、それらのシグナルの空間的位置が４点の緑色シグナルの空間的位置と同じであった。水色フィルターを使用すると（図１１Ｄに見られるように）細胞核当たりそれぞれ４点の水色シグナルが見られ、それらのシグナルの空間的位置が４点の緑色シグナルの空間的位置と同じであり、同様にそれぞれ２点のシグナルについては２点の赤色シグナルと同じでもあった。次のようにシグナルパターンを解釈することができた。局在が別の色のシグナルと空間的に同じではない２点の緑色シグナルによって二倍体細胞の２コピーのＥＲＢＢ２遺伝子が特定された。局在が２点の水色シグナルと空間的に同じである２点の緑色シグナルによって２コピーのＥＧＦＲ遺伝子が特定され、局在が２点のゴールデンイエローシグナルと空間的に同じである２点の緑色シグナルによって２コピーのＦＧＦＲ１遺伝子が特定され、局在が２点の赤色シグナルと空間的に同じである２点の緑色シグナルによって２コピーのＭＥＴ遺伝子が特定され、局在が２点の赤色シグナルおよび２点の水色シグナルと空間的に同じである２点の緑色シグナルによって２コピーのＳＯＸ２遺伝子が特定された。
【０２０４】
ＥＲＢＢ２増幅を有する標本の細胞核では、９点の緑色シグナルに加え、分けることができないほど近接している約１５点のシグナルからなる緑色シグナルクラスターまたはシグナルパターンが観察されたことを除き、上記のシグナルパターンと同様のシグナルパターンが示された（図１１Ａ参照）。この緑色シグナルパターンは異なる色のシグナルと共局在せず、したがってＥＲＢＢ２遺伝子増幅を表した。
【０２０５】
実施例２：ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ社の四重ＦＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１ブレイク・アパート・シングルミックスＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用する様々な細胞種におけるＡＬＫ領域およびＲＯＳ１領域の転座を検出するためのＦＩＳＨ分析
Ｈｅｌａ細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２（商標））、ＨＣＣ７８細胞株（ゲッティンゲンのシルトハウス教授により提供された）、およびＨ３１２２細胞株（ゲッティンゲンのシルトハウス教授により提供された）のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）細胞の３〜５μｍ厚の切片を被覆ガラス支持体上に配置し、５８℃で一晩にわたって焼き付けたものに対してＦＩＳＨを実施した。
【０２０６】
パラフィンを除くため、それらの標本を最初に７０℃のホットプレート上で１０分間にわたって加熱し、その後で２回にわたって１００％キシレン中でそれぞれ１０分間、室温（ＲＴ）で保温した。その後、濃度低下エタノールシリーズ（ＲＴで９６％、９６％、９０％、７０％の変性エタノール中においてそれぞれ５分間）と超純水（２回にわたってＲＴでそれぞれ２分間）中での定温放置により標本を再水和した。細胞の透過処理のため、この後に加熱前処理用クエン酸溶液（ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ）中における９８℃で１５分間にわたる加熱前処理が続き、その後に超純水中におけるＲＴでそれぞれ２分間の２回の追加保温ステップが続いた。ペプシン溶液（ペプシンソリューション、ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ）を標本に滴下し、その後に加湿チャンバー内において３７℃で１５分間にわたって保温することによりタンパク質分解性前処理を行った。その後の洗浄緩衝液（ウォッシュバッファーＳＳＣ、ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ）内での５分間にわたる保温の後、標本を脱水した（超純水、７０％、９０％、９６％のエタノール中においてＲＴでそれぞれ１分間）。標本の風乾後、それぞれ１０μｌのＦＩＳＨプローブＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１ブレイク・アパート・シングルミックスＮＧ−ＦＩＳＨプローブ（ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ）をピペットによってそれらの切片に直接アプライした。
【０２０７】
そのプローブは４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに基づく混合物であり、その混合物は、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の近位に位置する配列と６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の近位に位置する配列に対する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍでの吸光、および５２８ｎｍでの発光）、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の遠位に位置する配列と６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の遠位に位置する配列に対するオレンジ色標識ポリヌクレオチド（５４７ｎｍでの吸光、および５７２ｎｍでの発光）、ならびに領域６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の近位に位置する配列に対する青色標識ポリヌクレオチド（４２６ｎｍでの吸光、および４８０ｎｍでの発光）からなった。その後、空気の泡が無いようにカバーグラスをかけ、端をＦｉｘｏｇｕｍ（Ｍａｒａｂｕ）で封止した。ホットプレート上で標本を７５℃で１０分間にわたって変性した後に加熱オーブン中の３７℃の予熱加湿チャンバー内においてハイブリダイゼーションを一晩（約１６時間）にわたって行った。
【０２０８】
ハイブリダイゼーション後、Ｆｉｘｏｇｕｍを取り外し、標本をガラスキュベット内の洗浄バッファー（１×ウォッシュバッファーＡ、ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ）中において３７℃で３分間にわたって保温した。
カバーグラスを取り除いた後、洗浄バッファー（１×ウォッシュバッファーＡ、ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ）中において３７℃でそれぞれ５分間のストリンジェントな洗浄を２回行った。その後、濃度上昇エタノールシリーズ中で標本を脱水（ＲＴで７０％、９０％、９６％のエタノール中においてそれぞれ１分間）し、そして風乾し、そのときに試料を直射光から保護した。対比染色用色素（２０μｌのＤＡＰＩ  ＤｕｒａＴｅｃｔソリューション、ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ）をアプライした後、空気の泡が無いようにカバーガラスをかけ、標本を光から保護してＲＴで少なくとも３０分間にわたって定温放置した。
【０２０９】
その後、適切なフィルターセット（Ｄｕａｌｂａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ  ／  Ｏｒａｎｇｅ−Ｒｅｄフィルターセット、ＡＨＦ  Ａｎａｌｙｓｅｎｔｅｃｈｎｉｋ；Ｓｐ．  Ａｑｕａ  ＨＣ  ｍＦＩＳＨフィルターセット、ＡＨＦ  Ａｎａｌｙｓｅｎｔｅｃｈｎｉｋ）を使用して蛍光顕微鏡（ＨＸＰ  １２０Ｖ照明ユニットを装着したＡｘｉｏ  Ｓｃｏｐｅ．Ａ１、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＧｍｂＨ）による評価を行った。
【０２１０】
このようにして、オレンジ色／緑色二重フィルターをＨｅＬａ細胞株の細胞核に使用すると分析した核の大部分においてそれぞれ６点のオレンジ色／緑色融合シグナルが見られ、個々の緑色シグナルおよび／またはオレンジ色シグナルは見られなかった。水色フィルターを使用すると細胞核当たりそれぞれ３点の水色シグナルが見られ、それらの水色シグナルの空間的位置は前記融合シグナルの空間的位置と同じであった。そのシグナルパターンは３コピーのＡＬＫ遺伝子および３コピーのＲＯＳ１遺伝子として解釈され、文献と一致した。ＡＬＫまたはＲＯＳ１の転座は存在しなかった。
【０２１１】
ＡＬＫ遺伝子の転座が文献に記載されている細胞株Ｈ３１２２の細胞核では，オレンジ色／緑色二重フィルターを使用すると分析した核の大部分においてそれぞれ７点のオレンジ色／緑色融合シグナルと単一のオレンジ色シグナルが見られた。水色フィルターを使用すると細胞核当たりそれぞれ２点の水色シグナルが見られ、それらの水色シグナルの空間的位置が前記融合シグナルのうちの２つと同じであった。そのシグナルパターンは１コピーが転座の影響を受けている６コピーのＡＬＫ遺伝子、および２コピーのＲＯＳ１遺伝子として解釈され、文献と一致した。
【０２１２】
ＲＯＳ１遺伝子の転座が文献に記載されている細胞株ＨＣＣ７８の細胞核では、オレンジ色／緑色二重フィルターを使用すると分析した核の大部分においてそれぞれ４点のオレンジ色／緑色融合シグナル、２点の個々のオレンジ色シグナル、および２点の個々の、すなわち後者から分離した緑色シグナルが見られた。水色フィルターを使用すると細胞核当たりそれぞれ４点の水色シグナルが見られ、それらの水色シグナルの空間的位置が前記融合シグナルのうちの２つ、および２点の分離した緑色シグナルと同じであった。そのシグナルパターンは２コピーが転座の影響を受けている４コピーのＲＯＳ１遺伝子、および２コピーのＡＬＫ遺伝子として解釈され、文献と一致した。
【０２１３】
実施例３：ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ社の四重ＦＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１ブレイク・アパート・シングルミックスＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用する６ｑ２２にあるＲＯＳ１領域の転座を検出するためのＦＩＳＨ分析
ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ社の四重ＦＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１ブレイク・アパート・シングルミックスＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用して６ｑ２２にあるＲＯＳ１領域の転座を検出するためのＦＩＳＨ分析を実施した。そのプローブは４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに基づく混合物であり、その混合物は、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の近位に位置する配列と６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の近位に位置する配列に対する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍでの吸光、および５２８ｎｍでの発光）、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の遠位に位置する配列と６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の遠位に位置する配列に対するオレンジ色標識ポリヌクレオチド（５４７ｎｍでの吸光、および５７２ｎｍでの発光）、ならびに領域６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の近位に位置する配列に対する青色標識ポリヌクレオチド（４２６ｎｍでの吸光、および４８０ｎｍでの発光）からなった。
【０２１４】
適切なフィルターセットを使用すると、再構成されていないＲＯＳ１遺伝子および／またはＡＬＫ遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは緑色−オレンジ色蛍光融合シグナルとして現れ、再構成されたＲＯＳ１遺伝子および／またはＡＬＫ遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは分離した緑色および分離したオレンジ色シグナルとして現れた。このとき、ＲＯＳ１特異的緑色シグナルは青色蛍光シグナルと共局在し、それにより再構成されていないＲＯＳ１遺伝子がオレンジ色シグナルおよび緑色／青色蛍光混合シグナルから構成された。再構成されていないＡＬＫ遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは緑色−オレンジ色蛍光融合シグナルとして現れ、青色蛍光シグナルを含む混合シグナルを有しなかった（図９Ａ）。ＲＯＳ１転座の影響を受けた６ｑ２２座位は分離した緑色シグナルおよび分離したオレンジ色シグナルを特徴とした（図９Ａ矢印）。このとき、分離した緑色シグナルが青色シグナルと重なった（図９Ｂの青色シグナル）。この緑色／青色混合シグナルは転座の影響を受けた遺伝子としてＡＬＫではなくＲＯＳ１を示した。適切なフィルターセットを使用して前記シグナルパターンを容易に可視化することができた。
【０２１５】
実施例４：ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ社の四重ＣＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＤｏｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１ブレイク・アパート・シングルミックスＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用する２ｐ２３にあるＡＬＫ領域の転座を検出するためのＣＩＳＨ分析
さらに、ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ社の四重ＣＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＤｏｔ  ＳＰＥＣ  ＡＬＫ  ＆  ＲＯＳ１ブレイク・アパート・シングルミックスＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用して２ｐ２３にあるＡＬＫ領域の転座を検出するためのＣＩＳＨ分析を実施した。そのプローブは４本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに基づく混合物であり、その混合物は、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の近位に位置する配列と６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の近位に位置する配列に対するジゴキシゲニン標識ポリヌクレオチド、２ｐ２３にあるＡＬＫ切断点領域の遠位に位置する配列と６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の遠位に位置する配列に対するＤＮＰ標識ポリヌクレオチド、ならびに領域６ｑ２２にあるＲＯＳ１切断点領域の遠位に位置する配列に対するビオチン標識ポリヌクレオチドからなった。それらの標識の検出は一次（非標識）抗体（抗ＤＩＧ／抗ＤＮＰ／抗ＢＩＯ）によって行われ、それらの一次抗体は二次ポリマー化酵素結合抗体（ＨＲＰポリマー／ＡＰポリマー／βＧＡＬ）ならびに基質（ＡＰ−ＲＥＤ／ＨＲＰ−ＧＲＥＥＮ／βＧＡＬ−ＢＬＵＥ）の酵素反応によって検出され、その酵素反応は強い恒久的な赤色、緑色、および青色のシグナルの形成につながり、例えば４０倍のドライレンズを使用する顕微鏡観察によりそれらのシグナルを表示することが可能であった。
【０２１６】
ＡＬＫ遺伝子またはＲＯＳ１遺伝子の再構成または転座を持たない二倍体細胞核または二染色体性細胞核はそれぞれ赤色シグナルと緑色シグナルからなる２点のシグナルを示し、それらのシグナルは分けることができないほど近接しており、または部分的に重複もしくは混合しており、２コピーのＡＬＫ遺伝子に特異的であった（図１０）。さらに、それぞれ赤色シグナル，緑色シグナル，および青色シグナルからなり、且つ、分けることができないほど近接しており、または部分的に重複もしくは混合しており、２コピーのＲＯＳ１遺伝子に特異てきな２点のシグナルが見出された。
【０２１７】
ＲＯＳ１アレルではなくＡＬＫ遺伝子の再構成または転座を有する二倍体細胞核または二染色体性細胞核は再構成されていないＡＬＫアレルに特異的な赤色−緑色シグナルを示した（図１０）。さらに、それらの細胞核は個々の緑色シグナルおよび再構成されたＡＬＫアレルに特異的である前者から分離した個々の赤色シグナルを示した（図１０、矢印「Ｇ」＝緑色および「Ｒ」＝赤色）。さらに、２コピーのＲＯＳ１遺伝子に特異的である２点の赤色−緑色−青色シグナルが見出された。
【０２１８】
ＡＬＫアレルではなくＲＯＳ１遺伝子の再構成または転座を有する二倍体細胞核または二染色体性細胞核は再構成されていないＲＯＳ１アレルに特異的な赤色−緑色−青色シグナルを示した。さらに、それらの細胞核は個々の緑色シグナルおよび再構成されたＲＯＳ１アレルに特異的である前者から分離した個々の赤色−青色シグナル、ならびに２コピーのＡＬＫ遺伝子に特異的である２点の赤色−緑色シグナルを示した。
【０２１９】
実施例５：ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ社の五連ＦＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＥＲＢＢ２，  ＥＧＦＲ，  ＦＧＦＲ１，  ＭＥＴ  ＆  ＳＯＸ２  ＦｉｖｅＣｈｅｃｋ（商標）ＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用するＥＲＢＢ２領域の増幅を検出するためのＦＩＳＨ分析
最後に、ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ社の五連ＦＩＳＨプローブ「ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  ＳＰＥＣ  ＥＲＢＢ２，  ＥＧＦＲ，  ＦＧＦＲ１，  ＭＥＴ  ＆  ＳＯＸ２  ＦｉｖｅＣｈｅｃｋ（商標）ＮＧ−ＦＩＳＨプローブ」を使用してＥＲＢＢ２領域の増幅を検出するためのＦＩＳＨ分析を実施した。そのプローブは５本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに基づく混合物であり、その混合物は、ＥＲＢＢ２遺伝子の領域１７ｑ１１．２−ｑ１２、ＥＧＦＲ遺伝子の領域７ｐ１２、ＦＧＦＲ１遺伝子の領域８ｐ１１．２３−ｐ１１．２２、ＭＥＴ遺伝子の領域７ｑ３１、およびＳＯＸ２遺伝子の領域３ｑ２６．３−ｑ２７に対する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍでの吸光、および５２８ｎｍでの発光）、ならびにＥＧＦＲ遺伝子の領域とＳＯＸ２遺伝子の領域に対する青色標識ポリヌクレオチド（４２６ｎｍでの吸光、および４８０ｎｍでの発光）、ＦＧＦＲ１遺伝子の領域に対するゴールデンイエロー標識ポリヌクレオチド（５３２ｎｍでの吸光、および５５３ｎｍでの発光）、およびＭＥＴ遺伝子の領域とＳＯＸ２遺伝子の領域に対する赤色標識ポリヌクレオチド（５８０ｎｍでの吸光、および５９９ｎｍでの発光）からなった。
【０２２０】
適切なシングルバンドパスフィルターセットをすると、９点の個々の緑色シグナルおよび複数の個々の緑色シグナルの面積に匹敵する１点の緑色シグナルクラスター、４点の青色シグナル、２点のゴールデンイエローシグナル、および４点の赤色シグナルが見出された。
【０２２１】
それらの画像のスーパーインポーズは、一点の単独の緑色シグナルと緑色シグナルクラスターが異なる色のシグナルと共局在していない（矢印）ことを示した。その単一の緑色シグナルは非増幅ＥＲＢＢ２遺伝子であり、緑色シグナルクラスターはＥＲＢＢ２遺伝子増幅を表した。共局在による緑色／青色混合シグナルは２コピーのＥＧＦＲ遺伝子を特定し、共局在による緑色／ゴールデンイエロー混合シグナルは２コピーのＦＧＦＲ１遺伝子を特定し、共局在による緑色／赤色混合シグナルは２コピーのＭＥＴ遺伝子を特定し、共局在による緑色／青色／赤色混合シグナルは２コピーのＳＯＸ２遺伝子を特定した。
【０２２２】
本発明のその他の態様：
第１態様：
第１態様によると、本発明は、直接的または間接的に標識された核酸断片（プローブ）に基づいた、（複数の）構造的および／または数的染色体異常を検出（および識別）するために細胞内の複数の異なる染色体領域またはＤＮＡ領域を検出する方法であって、４〜２４本の座位特異的プローブを１〜２４種の異なる標識のうちの１つでそれぞれ標識し、且つ、また同時に少なくとも１本の座位特異的プローブを少なくとも１種の追加標識（最大で６種の追加標識）で標識し、それにより混合シグナルがこれらの混合標識によって生じ、所望により、同じ混合標識を有する個々のプローブを個々の標識の異なる比率に基づいて生じる異なる混合シグナルによって識別することもでき、染色体異常の場合の異常シグナルパターンを、影響を受けた座位に明確に割り当てることができ、すなわち、異常の影響を受けた座位をその混合シグナルパターンに基づいて特定することができ、ａ）プローブの全ての断片、または所望によりプローブの個々の断片のみを複数の標識で標識する、および／またはｂ）同一の断片を異なる標識で標識する、および／またはｃ）交互に断片を異なる標識で標識する場合に混合シグナルが生じることができ、前記断片をスーパーインポーズすることもでき、または前記断片がゲノム領域に最大で２Ｍｂｐの長さを有することもできることを特徴とする前記方法に関する。
【０２２３】
第２態様：
追加の態様によると、本発明は、同時に少なくとも２本、所望により３本、所望により４本、所望により５本、所望により６本、所望により７本、所望により８本、所望により９本、および所望により１０本の座位特異的プローブを少なくとも１種の追加標識、最大で６種の追加標識で標識することによりこれらの混合標識によって混合シグナルが生じる第１態様に記載の方法に関する。
【０２２４】
第３態様：
追加の態様によると、本発明は、少なくとも５〜２４本、所望により６〜２４本、所望により７〜２４本、および所望により８〜２４本の座位特異的プローブを１〜２４種の異なる標識のうちの１つでそれぞれ標識する第１態様に記載の方法に関する。
【０２２５】
第４態様：
追加の態様によると、本発明は、直接的または間接的に標識された核酸断片（プローブ）に基づいた、構造的染色体異常を検出するために細胞内の複数の異なる染色体領域またはＤＮＡ領域を検出するための方法であって、
標識Ａで標識された第１プローブ（プローブ１）および標識Ｂで標識された第２プローブ（プローブ２）が切断点領域１に隣接し、それらのプローブが融合シグナルＡ−Ｂを形成すること、および
同じ原理に基づいて２〜１２本の追加のプローブ（プローブ３〜１４）が１〜６つの追加の切断点領域（切断点領域２〜７）に隣接し、それらも融合シグナルＡ−Ｂをそれぞれ形成すること、および
同時に前述のプローブうちの少なくとも１本の追加のプローブを追加の標識でも、特に標識Ｃ〜Ｆから選択される標識でも標識するか、または所望によりこれらの標識の相互に異なる比率で標識し，それによりそれらのプローブが特定の融合および混合シグナルＡ−Ｂ／Ｘを形成し、
ａ）Ｘである標識Ｃおよび／または標識Ｄおよび／または標識Ｅおよび／または標識Ｆはそれぞれ異なる比率であってよく、およびｂ）特定の融合および混合シグナルＡ−Ｂ／Ｘが染色体異常の場合に変化して新しい分離した混合シグナルＡ／ＸまたはＢ／Ｘが形成され、ｃ）加えて、所望により（プローブペアに追加の標識Ｘが使用されていない場合に）特定の融合シグナルが変化して新しい分離したシグナルＡまたはＢが形成され、ｄ）影響を受けた切断点領域がこれらの変化したシグナルパターンに基づいて明確に検出され得る
ことを特徴とする前記方法に関する。
【０２２６】
第５態様：
追加の態様によると、本発明は、直接的または間接的に標識された核酸断片（プローブ）に基づいた、構造的染色体異常を検出するために細胞内の複数の異なる染色体領域またはＤＮＡ領域を検出するための方法であって、
標識Ａで標識された第１プローブ（プローブ１）および標識Ｂで標識された第２プローブ（プローブ２）が切断点領域１に隣接し、それらのプローブが融合シグナルＡ−Ｂを形成すること、および
標識Ａで標識された第３プローブ（プローブ３）および標識Ｂで標識された第４プローブ（プローブ４）が切断点領域２に隣接し、これも融合シグナルＡ−Ｂを形成し、且つ、プローブ３および／またはプローブ４が同時に追加の標識Ｃでも標識され、それにより融合シグナルＡ−Ｂ／Ｃを形成し、
前述のシグナルが染色体異常の場合に変化して分離したシグナルＡおよび／またはシグナルＢ（切断点１）または融合シグナルＡ／Ｃおよび／またはＢ／Ｃ（切断点２）が形成される
を特徴とする前記方法に関する。
【０２２７】
第６態様：
追加の態様によると、本発明は、適切なフィルターを使用すると標識Ａおよび／または標識Ｂだけを用いることでシグナルＡおよび／またはシグナルＢだけがまず考慮され、およびＡおよび／またはＢの異常なシグナルパターンが存在する場合にのみ影響を受けた染色体領域の明確のために追加の標識Ｃ〜Ｆが考慮される、前述の態様のいずれか１つに記載の方法に関する。
【０２２８】
第７態様：
追加の態様によると、本発明は、座位特異的プローブによって検出されるゲノム領域が５Ｍｂｐ未満、所望により２Ｍｂｐ未満、所望により１Ｍｂｐ未満、所望により７５０ｋｂ未満、所望により５００ｋｂ未満、所望により２５０ｋｂ未満、所望により１００ｋｂ未満、所望により１０ｋｂ未満、および所望により１ｋｂ未満である、前述の態様のいずれか１つに記載の方法に関する。
【０２２９】
第８態様：
追加の態様によると、本発明は、異なる標識を有する複数の同じプローブであって、所望により少なくとも９０％、所望により少なくとも８０％、所望により少なくとも７０％、所望により少なくとも６０％、および所望により少なくとも５０％一致する場合に同じものであると見なされるそれらの同じプローブを一本のプローブの混合標識の代わりに使用する、前述の態様のいずれか１つに記載の方法に関する。
【０２３０】
第９態様：
追加の態様によると、本発明は、悪性腫瘍、好ましくは癌腫、好ましくは肉腫、および好ましくは白血病において染色体異常が検出され得ることが好ましい、前述の態様のいずれか１つに記載の方法に関する。
【０２３１】
第１０態様：
追加の態様によると、本発明は、プローブがポリヌクレオチド、修飾型ポリヌクレオチド、または修飾型核酸断片、またはオリゴヌクレオチド、または修飾型オリゴヌクレオチドである、前述の態様のいずれか１つに記載の方法に関する。
【０２３２】
第１１態様：
追加の態様によると、本発明は、標識が色素、色素基質、化学発光色素（例えばアクリジニウム）、放射性同位体、スピン標識、酵素（例えばアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、大豆ペルオキシダーゼおよび／またはβガラクトシダーゼ）、ハプテン（例えばジゴキシゲニン、ビオチン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、ローダミン、ブロモデオキシウリジン、アセチルアミノフルオレン、トリニトロフェノール、トリニトロフェノール誘導体、エストラジオール、および／またはＤＮＰ）、カンタムドット、ビーズ、アミノヘキシル類、ピレン類および蛍光色素（例えばフルオレセイン、フルオレセイン誘導体、５（６）−カルボキシフルオレセイン、クマリン、クマリン誘導体、ローダミン、ローダミン誘導体、テトラメチルローダミン、リサミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡ、ＴＲＩＴＣ、ＩＲ色素、Ａｌｅｘａ色素、Ｄｙｏｍｉｃｓ色素、フィコエリトリン類、カスケードブルー、オレゴングリーン４８８、パシフィックブルーおよび／またはローダミングリーン）からなる群より選択される、前述の態様のいずれか１つに記載の方法に関する。
【０２３３】
第１２態様：
追加の態様によると、本発明は、完全可視光領域、赤外線領域、および紫外線領域向けの、好ましくは緑色、オレンジ色／赤色、赤色、金色、および青色の発光領域向けの直接的に組み込まれた蛍光色素を使用するＦＩＳＨ法によって本方法が実施される、前述の態様のいずれか１つに記載の方法に関する。
【０２３４】
第１３態様：
追加の態様によると、本発明は、抗体結合アルカリホスファターゼ、抗体結合ペルオキシダーゼ、および抗体結合βガラクトシダーゼと組み合わせてビオチン、ジゴキシゲニンおよびＤＮＰを使用するＢｒＩＳＨ法によって本方法が実施される、前述の態様のいずれか１つに記載の方法に関する。
【０２３５】
第１４態様：
追加の態様によると、本発明は、遺伝子ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＮＲＧ１、ＮＴＲＫ１、ＣＡＲＳ、ＥＭＬ４、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＫＩＦ５Ｂ、ＴＧＦ、ＢＣＲ、ＡＢＬ、ＡＬＫ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＩＲＣ３、ＣＣＮＤ１、ＥＧＲ１、ＥＴＶ６、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＩＧＨ、ＫＭＴ２Ａ、ＭＹＣ、ＰＭＬ、ＲＡＲＡ、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ１Ｔ１、ＥＷＳＲ１、ＣＨＯＰ、ＦＵＳ、ＣＯＬ１Ａ１、ＤＤＩＴ３、ＪＡＺＦ１、ＮＲ４Ａ３、ＦＯＸＯ１、ＦＵＳ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＰＤＧＦＢ、ＳＳ１８、ＴＦＥ３、ＵＳＰ６、ＷＴ１、ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ１、ＡＬＫ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤ２７４、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＥＧＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＳＲ１、ＥＴＶ１、ＦＧＦ３、４、１９、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨＩＴ（ＲＣＣ）、ＫＲＡＳ、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＴ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＯＸ２、ＴＥＲＴ、ＴＯＰ２Ａ、ＴＰ５３、ＴＹＭＳおよび／またはＶＨＬが染色体異常について検査される、前述の態様のいずれか１つに記載の方法に関する。
【０２３６】
第１５態様：
追加の態様によると、本発明は、直接的または間接的に標識された核酸断片（プローブ）に基づいた、好ましくは複数の構造的および／または数的染色体異常を検出および識別するために細胞内の複数の異なる染色体領域またはＤＮＡ領域を検出するための調製物であって、
４〜２４本の座位特異的プローブが１〜２４種の異なる標識のうちの１つでそれぞれ標識されており、且つ
同時に少なくとも１本の座位特異的プローブが少なくとも１種の追加標識、最大で６種の追加標識でも標識されており、それによりこれらの混合標識によって混合シグナルが生じ、所望により、同じ混合標識を有する個々のプローブを個々の標識の異なる比率に基づいて生じる異なる混合シグナルによって識別することもでき、それにより染色体異常の場合の異常シグナルパターンを、影響を受けた座位に明確に割り当てることができ、且つ／またはそれにより異常の影響を受けた座位をその混合シグナルパターンに基づいて特定することができ、ａ）プローブの全ての断片、または所望によりプローブの個々の断片のみを複数の標識で標識する、および／またはｂ）同一の断片を異なる標識で標識する、および／またはｃ）交互に断片を異なる標識で標識する場合に混合シグナルが生じることができ、前記断片をスーパーインポーズすることもでき、または前記断片がゲノム領域に最大で２Ｍｂの長さを有することもできる
前記調製物に関する。
【０２３７】
第１６態様：
追加の態様によると、本発明は、プローブが第１態様から第１３態様に従って構成される、第１５態様に記載の調製物に関する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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