(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下に与えられた式（１ａ）である２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体、ならびに／または、そのラセミ体、鏡像異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、および、薬学的に許容可能な塩。
【化１】
0006715921.tif 000015
【請求項２】
薬物または診断試薬として用いるための、請求項１に記載の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体。
【請求項３】
癌、特に固形腫瘍の診断または処置に使用するための、請求項１に記載の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体。
【請求項４】
前記固形腫瘍は乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、甲状腺癌、肺癌、肝臓癌、膵癌、胃癌、黒色腫（皮膚癌）、リンパ腫、および神経膠腫を含む群より選択される、請求項３に記載の使用のための２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体。
【請求項５】
特に癌の検出または診断に用いるため、特に固形腫瘍の検出または診断に用いるための、請求項１に記載の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体を含む診断用組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体を活性成分として含む、医薬組成物。
【請求項７】
癌の処置、特に固形腫瘍の処置に用いるための、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
薬物または診断試薬の製造のため、特に癌の検出もしくは診断のための診断試薬または癌、特に固形腫瘍の処置のための薬物の製造のための、請求項１に記載の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キナーゼ阻害剤および癌治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は世界的に主要な死因であり、その根底の機構の理解および効率的な標的療法の開発が最も重要である。癌細胞が増殖および生存に対する正常な生理学的制約を逃れるための主要な機構として、キナーゼ活性の調節不全が出現した。過去２０年のうちに、キナーゼは学術的および産業的研究における薬物発見の中心的標的となった。たとえば癌などの疾患における調節不全キナーゼは、多様な小分子阻害剤によって対処されており、たとえばエルロチニブおよびゲフィチニブなどの例を含むいくつかのキナーゼ阻害剤が同定されて、ＦＤＡにより認可されている。
【０００３】
プロテインキナーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）ＢまたはＡｋｔ（ＰＫＢ／Ａｋｔ）はセリン／スレオニンキナーゼであり、たとえばホルモンおよび増殖因子などの多様な刺激に露出された細胞において活性化される。プロテインキナーゼＡｋｔは、触媒キナーゼドメインに加えて制御性プレクストリン相同（ＰＨ：ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメインを特徴とし、これによって増殖因子刺激の際の膜付着および上流のキナーゼホスホイノシチド依存性キナーゼ１（ＰＤＫ１：ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ−１）を介したリン酸化による活性化が可能である。Ａｋｔの活性化機構はまだ完全に特徴付けられていないが、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ：ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３−ｋｉｎａｓｅ）の下流で起こる。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達は、癌の特徴を含む細胞プロセスのほとんどに介在する。したがって、Ａｋｔ調節不全は腫瘍性形質転換および悪性化、ならびにたとえば乳癌、前立腺癌、およびＵＤ  ４０７７６／ＳＡＭ：ＡＬ結腸直腸癌などのさまざまな固形腫瘍の化学療法および放射線療法に対する抵抗性の増加に直接関連する。この目的のために、選択的小分子阻害剤を用いた調節不全Ａｋｔの化学的調節は、多様な形の癌になった患者の処置に対する有望な展望を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
したがって本発明の根底にある目的は、Ａｋｔキナーゼを阻害する化合物を提供することであった。
【０００５】
この課題は、下に与えられた一般式（Ｉ）に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体、ならびに／またはそのラセミ体、鏡像異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、および薬学的に許容可能な塩および／もしくはエステルによって解決され、
【０００６】
【化１】
0006715921.tif 000002
【０００７】
ここで
Ａは、６から１４の鎖長を有し、かつ少なくとも１つの５員環から１０員環部分を含むリンカーであり、
Ｒ１は、水素、直鎖Ｃ１−Ｃ５−アルキル、分岐鎖Ｃ３−Ｃ５−アルキル、および／またはＣ３−Ｃ７−シクロアルキルを含む群より選択され、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同じであるか、もしくは互いに独立に、水素、ＣＮ、ＣＦ３、直鎖Ｃ１−Ｃ５−アルキル、分岐鎖Ｃ３−Ｃ５−アルキル、および／もしくはＣ３−Ｃ７−シクロアルキルを含む群より選択されるか、または
Ｒ２とＲ３とは、それらが付着する炭素原子の間で三重結合を形成し、
Ｒ５は、水素、直鎖Ｃ１−Ｃ５−アルキル、分岐鎖Ｃ３−Ｃ５−アルキル、および／またはＣ３−Ｃ７−シクロアルキルを含む群より選択され、
ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５のアルキルおよびシクロアルキル基は、Ｏ、Ｎおよび／もしくはＳを含む群より選択される１つもしくはそれ以上のヘテロ原子を含むか、ならびに／または１つもしくはそれ以上のハロゲンで置換されてもよい。
【０００８】
驚くべきことに、本発明に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、類似の特徴を有する他のプロテインキナーゼよりもセリン／スレオニンキナーゼＡｋｔの方に高い力価および選択性を伴って結合し、特にＡｋｔ２およびＡｋｔ３よりもＡｋｔ１に対するアイソフォーム選択性を示すことが見出された。２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、高い配列および構造相同性を明らかにするキナーゼに影響することなく、Ａｋｔアイソフォームを排他的に標的とする優れた選択性プロファイルを示した。
【０００９】
消化管間葉性腫瘍細胞を用いて、細胞環境におけるＡｋｔ１に対する特定の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体の選択性が実証される一方で、たとえばｃ−ＫＩＴおよびＥｒｋ１／２などのさらなる発癌性プロテインキナーゼが残った。２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体はさらに、さまざまな癌株細胞におけるＡｋｔの細胞透過性エフェクターであることが実証された。これらの観察は、さらなる医薬品化学アプローチに２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体を用いるという見通しを導入する。特に、２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は共有結合的に調節する抗癌薬の開発に寄与し得る。
【００１０】
本発明に従う「アルキル」という用語は、直鎖または分岐鎖アルキル基を意味するものと理解されるべきである。本明細書において用いられる「直鎖Ｃ１−Ｃ５−アルキル」という用語は、１から５の炭素原子を有する直鎖基を示す。直鎖Ｃ１−Ｃ５−アルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、およびｎ−ペンチルを含む群より選択されてもよい。好ましい直鎖Ｃ１−Ｃ５−アルキル基は、メチルおよびエチルより選択される。好ましい分岐鎖「Ｃ３−Ｃ５−アルキル」は、イソブチル、ｔｅｒｔ．−ブチル、ｓｅｃ．−ブチル、および／またはイソペンチルより選択される。最も好ましい分岐鎖「Ｃ３−Ｃ５−アルキル」は、イソプロピルである。
【００１１】
本発明に従う「Ｃ５−Ｃ７−シクロアルキル」という用語は、５員から７員の飽和環を意味するものと理解されるべきである。好ましいシクロアルキル基は、シクロペンチルおよび／またはシクロヘキシルを含む群より選択される。
【００１２】
本発明に従う「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素、好ましくはフッ素、塩素または臭素を意味するものと理解されるべきである。
【００１３】
２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、Ａｋｔキナーゼに対する優れた選択性および高い力価を示す。Ａｋｔキナーゼの共有結合的およびアロステリックな阻害が提供されると考えられる。２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン構造は、Ａｋｔキナーゼのプレクストリン相同（ＰＨ：ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメインとのアロステリックな相互作用を提供すると考えられる。２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン構造は、有利には特に効果的な結合親和性を示した。２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体で処理したＡｋｔキナーゼ分子のトリプシン消化および質量分析はさらに、Ａｋｔキナーゼの位置２９６および３１０の２つの非触媒性Ａループシステイン（Ｃｙｓ２９６およびＣｙｓ３１０）が、２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体によって共有結合的に修飾されることを示した。この共有結合的相互作用は、反応性アルケニルまたはアルキニル基を提供する構造の部分によって提供されると考えられる。
【００１４】
Ａｋｔキナーゼの共有結合的およびアロステリックな阻害を提供する２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体の部分は、リンカーＡを介して接続される。リンカーＡは６から１４の鎖長を有し、かつ少なくとも１つの５員環から１０員環部分を含む。
【００１５】
本発明に従う「５員環から１０員環部分」という用語は、安定な５員から７員の単環式の環、または７員から１０員の二環式の環を示し、これは飽和でも不飽和であってもよく、かつＮ、Ｏおよび／もしくはＳを含む群より選択される１から３のヘテロ原子を含むか、ならびに／または１つもしくはそれ以上のハロゲン、たとえば塩素もしくはフッ素などで置換されてもよい。「５員環から１０員環部分」という用語は、５員または６員の複素環式の環がベンゼン環に融合された二環式の基を含む。
【００１６】
５員環から１０員環部分は、ベンゼン、フラン、テトラヒドロフラン、チオフェン、テトラヒドロピラン、ピロール、ピロリジン、イミダゾール、１，２，４−トリアゾール、ピペリジン、ピペラジン、ピリジン、ピリミジン、モルホリン、またはアザシクロヘプタンを含む群より選択されてもよい。さらに好ましい複素環は、フラン−２−イル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロピラン−２−イル、１，３−ジオキソラン−５−イル、ピロール−１−イル、ピロール−２−イル、ピロリジン−１−イル、イソキサゾール−３−イル、イソキサゾール−４−イル、１，２−ジ−チアゾリン−５−イル、イミダゾール−１−イル、１，２，４−トリアゾール−１−イル、１，３，４−トリアゾール−１−イル、チオフェン−２−イル、ピペリジン−１−イル、ピペリジン−４−イル、ピリジン−２−イル、ピリジン−３−イル、ピリジン−４−イル、ピリミジン−２−イル、ピリミジン−４−イル、ピリミジン−５−イル、モルホリン−１−イル、アザシクロヘプタン−１−イル、および／またはベンゾ−１，２，３−チアジアゾール−７−イルを含む群より選択される。
【００１７】
５員環から１０員環部分は、飽和または不飽和６員環であってもよい。この６員環はＮ、Ｏおよび／もしくはＳを含む群より選択される１から３のヘテロ原子を含むか、ならびに／または１つもしくはそれ以上のハロゲン、たとえば塩素もしくはフッ素などで置換されてもよい。６員環はベンゼン、ピペリジン−１−イル、ピペリジン−４−イル、ピペラジン（ｐｉｐｅｒｒａｚｉｎ）−１−イル、およびピペラジン−４−イルより選択されてもよい。リンカーＡは２つの６員環を含んでもよい。リンカーＡは６員環と５員環とを含んでもよいし、６員環と二環式の基とを含んでもよい。
【００１８】
環部分は、有利にはリンカーＡの安定性を提供する。リンカーＡは少なくとも１つの環部分を含んでもよいし、２つまたは３つの環部分を含んでもよい。リンカーＡは、Ａｋｔキナーゼとの共有結合的およびアロステリックな相互作用のために設計された分子の部分を接続する。リンカーＡはさらに、キナーゼとの適切かつ独立した相互作用を確実にするための部分の特定の距離を提供する。６から１４の炭素またはヘテロ原子の鎖長が有効であることが示された。鎖長は好ましくは６から１２の炭素もしくはヘテロ原子の範囲、または７から１０の範囲、または８から９の範囲であってもよい。５員環から１０員環部分は、６から１４の炭素またはヘテロ原子の鎖長に加えられるのではなく、この鎖長に含まれることが理解されるべきである。
【００１９】
２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体の好ましい実施形態において、Ａは以下に与えられる構造要素（Ａ１）から（Ａ１２）を含む群より選択される。
【００２０】
【化２】
0006715921.tif 000003
【００２１】
特定的に別様に述べられない限り、アラビア数字で示された化合物、基、または置換基は、ローマ数字または数字と文字とを組み合わせた名称で示される化合物、基、または置換基とは異なり、すなわち化合物、基、または置換基は異なる化合物、基、または置換基である。
【００２２】
２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、置換基Ｒ１からＲ５を含む。Ｒ１は水素、直鎖Ｃ１−Ｃ５−アルキル、分岐鎖Ｃ３−Ｃ５−アルキル、および／またはＣ３−Ｃ７−シクロアルキルを含む群より選択され、このアルキルおよびシクロアルキル基はＯ、Ｎおよび／もしくはＳを含む群より選択される１つもしくはそれ以上のヘテロ原子を含むか、ならびに／または１つもしくはそれ以上のハロゲンで置換されてもよい。Ｒ１は５員または６員のシクロアルキル基であってもよい。好ましくは、Ｒ１は水素または直鎖Ｃ１−Ｃ３−アルキル基である。より好ましくは、Ｒ１は水素またはメチルである。
【００２３】
加えて、Ｒ５は水素、直鎖Ｃ１−Ｃ５−アルキル、分岐鎖Ｃ３−Ｃ５−アルキル、および／またはＣ３−Ｃ７−シクロアルキルを含む群より選択され、このアルキルおよびシクロアルキル基はＯ、Ｎおよび／もしくはＳを含む群より選択される１つもしくはそれ以上のヘテロ原子を含むか、ならびに／または１つもしくはそれ以上のハロゲンで置換されてもよい。Ｒ５は５員または６員のシクロアルキル基であってもよい。好ましくは、Ｒ５は水素または直鎖Ｃ１−Ｃ３−アルキル基である。より好ましくは、Ｒ５は水素またはメチルである。
【００２４】
２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体の好ましい実施形態において、Ｒ１およびＲ５は同じであるか、または互いに独立に、水素および／またはメチルを含む群より選択される。最も好ましい実施形態において、Ｒ１およびＲ５は水素である。
【００２５】
置換基Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同じであるか、または互いに独立に、水素、ＣＮ、ＣＦ３、直鎖Ｃ１−Ｃ５−アルキル、分岐鎖Ｃ３−Ｃ５−アルキル、および／またはＣ３−Ｃ７−シクロアルキルを含む群より選択され、ここでアルキルおよびシクロアルキル基はＯ、Ｎおよび／もしくはＳを含む群より選択される１つもしくはそれ以上のヘテロ原子を含むか、ならびに／または１つもしくはそれ以上のハロゲンで置換されてもよい。Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つまたは２つがＣＮまたはＣＦ３であってもよい。Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は直鎖Ｃ１−Ｃ３−アルキル基、好ましくはメチルまたはエチルであってもよい。Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の１つまたはそれ以上が、少なくとも１つの窒素原子を含む分岐鎖Ｃ３−Ｃ５−アルキル、たとえば−（ＣＨ２）−Ｎ（ＣＨ３）２などであってもよい。Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の１つまたはそれ以上が、１つまたはそれ以上の塩素原子で置換された分岐鎖Ｃ３−Ｃ５−アルキルであってもよい。２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体の好ましい実施形態において、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は水素である。
【００２６】
代替的実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、それらが付着する炭素原子の間で三重結合を形成する。この結果、炭素原子の間に三重結合が得られる。
【００２７】
好ましい実施形態において、２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、下に示される式（１ａ）、（２８）、（２９）、（３０）、（３１）、（３２）、および／もしくは（３３）、ならびに／またはそのラセミ体、鏡像異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、および薬学的に許容可能な塩および／もしくはエステルを含む化合物の群より選択される。
【００２８】
【化３】
0006715921.tif 000004
【００２９】
特に好ましい実施形態において、２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、式（１ａ）、（３０）、および／または（３２）を含む化合物の群より選択される。これらはＡｋｔキナーゼの阻害に対する特に良好な最大半量阻害濃度および解離定数を示した。最も好ましい２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、式（１ａ）に従う化合物である。
【００３０】
さらに好ましい実施形態において、２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、下に示される式（３４）、（３５）、（３６）、（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、および／もしくは（４１）、ならびに／またはそのラセミ体、鏡像異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、および薬学的に許容可能な塩および／もしくはエステルを含む化合物の群より選択される。
【００３１】
【化４】
0006715921.tif 000005
【００３２】
実施形態において、２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、蛍光ラベルまたはたとえば１８Ｆなどの放射性核種を含む。蛍光または放射性ラベルは、医学的使用のために特に好適である。
【００３３】
蛍光ラベルまたは放射性核種を含む２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体の例は、下に示される式（４２）、（４３）、および／もしくは（４４）、ならびに／またはそのラセミ体、鏡像異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、および薬学的に許容可能な塩および／もしくはエステルを含む群より選択される。
【００３４】
【化５】
0006715921.tif 000006
【００３５】
さらに好ましい実施形態において、２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、下に示される式（４５）、（４６）、（４７）、（４８）、（４９）、および／もしくは（５０）、ならびに／またはそのラセミ体、鏡像異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、および薬学的に許容可能な塩および／もしくはエステルを含む化合物の群より選択される。
【００３６】
【化６】
0006715921.tif 000007
【００３７】
式（４６）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体が特に好ましい。
【００３８】
本明細書に記載される化合物は、１つまたはそれ以上の不斉中心を含有するため、立体異性体（立体配置異性体）を生じることがある。本発明は、こうした生じ得るすべての立体異性体、ならびにそれらの混合物およびそれらの薬学的に許容可能な塩を含む。
【００３９】
本発明に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、その溶媒和物、水和物、ならびに薬学的に許容可能な塩およびエステルの形で使用可能であってもよい。「薬学的に許容可能な塩」という用語は、薬学的に許容可能な無毒性の塩基または酸から調製された塩を示す。薬学的に許容可能な塩は、無機塩基および有機塩基を含む薬学的に許容可能な無毒性の塩基、有機アニオン、有機カチオン、ハロゲン化物、またはアルカリから簡便に調製され得る。薬学的に許容可能な塩という用語は、アルカリ金属塩および遊離酸または遊離塩基の付加塩を含む。好適な薬学的に許容可能な塩基付加塩は、金属塩および有機塩を含む。無機塩基に由来する好ましい塩は、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、およびナトリウム塩を含む。薬学的に許容可能な有機無毒性塩基に由来する塩は、一級、二級、および三級アミンの塩を含む。２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、塩酸塩またはマレイン酸塩の形で用いられてもよい。
【００４０】
本発明のさらなる局面は、薬物または診断試薬として用いるための、本発明に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体に関する。
【００４１】
２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、キナーゼＡｋｔの強力な共有結合−アロステリック阻害剤である。２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、ＡｋｔキナーゼＰＨドメインに対する顕著な選択性と、Ａｋｔキナーゼに共有結合する標的不可逆モジュレーターであることの薬理学的および治療的利益とを組み合わせており、これは優れた薬物−標的滞留時間および力価の増加を含む。ＰＨドメイン依存的な共有結合−アロステリック阻害剤のこれらの特徴によって、治療または診断用の使用のためにＡｋｔキナーゼを標的とすることが可能になる。Ａｋｔシグナル伝達は、癌の特徴を含む細胞プロセスのほとんどに介在する。
【００４２】
したがって本発明の特定の局面は、癌の診断または処置に用いるための、本発明に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体に関する。２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、白血病（血液癌）を含むさまざまな癌に対して有用であるが、特に固形腫瘍に対して使用するためのものである。本明細書において用いられる「固形腫瘍」という用語は、臓器系において増殖し、かつ体内のどこでも発生し得る癌細胞の固形質量を示す。本明細書において用いられる固形腫瘍という用語は、血液癌を示さない。実施形態において、固形腫瘍は乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、甲状腺癌、肺癌、肝臓癌、膵癌、胃癌、黒色腫（皮膚癌）、リンパ腫、および神経膠腫を含む群より選択される。
【００４３】
薬物または診断試薬として用いるために、２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は組成物中で使用されるか、または組成物に含まれてもよい。本発明のさらなる局面は、本発明に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体を含む診断用組成物に関する。こうした診断用組成物は特に癌の検出または診断に使用するためのものであり、特に固形腫瘍の検出または診断に使用するためのものである。
【００４４】
２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、Ａｋｔキナーゼに特異的に結合して、サンプルに存在する癌性細胞を標識する。２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体はラベリングを含んでもよく、そのラベルによって提供されるシグナルの存在または不在を定めることによって、Ａｋｔキナーゼと結合した２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体を検出できることを提供する。たとえば、２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、たとえば蛍光色素などの蛍光ラベルでラベルされてもよい。たとえば蛍光色素などによって提供される蛍光ラベリングは、蛍光もしくはレーザー走査型顕微鏡またはフローサイトメトリによる２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体の可視化を提供できる。さらに、２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体をたとえば１８Ｆなどの放射性核種でラベルして、放射線量測定によって検出できる。
【００４５】
腫瘍細胞中のＡｋｔキナーゼを認識することによって癌を検出または診断するために有用であることに加えて、２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体はＡｋｔキナーゼを阻害するため、治療のために使用することもできる。したがって別の局面において、本発明は、本発明に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体を活性成分として含む医薬組成物に関する。この医薬組成物は癌の処置、特に固形腫瘍の処置に用いるために特に好適である。
【００４６】
２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体を、薬学的に許容可能な担体に溶解または分散させることができる。「薬学的または薬理学的に許容可能な」という用語は、たとえばヒトなどの対象に適切に投与されたときに、有害な（ａｄｖｅｒｓｅ）反応、アレルギー反応、またはその他の有害（ｕｎｔｏｗａｒｄ）反応を生じない分子実体および組成物を示す。医薬担体は、たとえば固体、液体、または気体などであり得る。好適な担体およびアジュバントは固体または液体であってもよく、医薬調合物に対する調合技術において通常使用される物質に対応する。組成物に対して、簡便な医薬媒体が使用されてもよい。たとえば水、緩衝剤、グリコール、油、およびアルコールなどが用いられて、たとえば溶液などの液体調製物を形成してもよい。組成物は、たとえば固体、液体、または気体などであり得る医薬担体を含んでもよい。好適な担体は好ましくは液体であり、医薬調合物に対する調合技術において通常使用される物質に対応する。組成物、特に医薬組成物は、当業者に周知の標準的な製薬技術を用いて無菌条件下で生成されてもよい。
【００４７】
加えて本発明は、薬物または診断試薬の製造のため、特に癌の検出もしくは診断のための診断試薬または癌、特に固形腫瘍の処置のための薬物の製造のための、本発明に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体の使用に関する。
【００４８】
本発明のさらなる局面は、癌または癌の素因を検出または診断する方法に関し、この方法は、対象から得られる細胞、組織、またはサンプルにおける、本発明に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体と、Ａｋｔキナーゼ、特にＡｋｔ１との結合を検出するステップを含む。
【００４９】
本明細書において用いられる「サンプル」という用語は、腫瘍細胞を含有する可能性のある任意の材料を示し、それは任意の液体もしくは流体サンプルまたは固体材料、特にたとえば患者またはテスト対象などの生物学的供給源に由来するサンプルを含む。サンプルという用語は特に生物学的材料、たとえば細胞または組織、生物学的流体または上清などを示す。生物学的材料は、好ましくはヒトである癌の対象から、たとえば外科的切除または生検などによって取り出された組織検体であってもよい。生物学的材料は、たとえば血液、血清、血漿、唾液、痰、および尿などの体液であってもよい。
【００５０】
この方法は、本発明に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体を、腫瘍細胞を含有し得るサンプルと接触させるステップを含む。サンプルは、たとえば癌の対象などの生物学的供給源に由来していてもよい。サンプルはたとえば、好ましくはヒトである癌の対象から、たとえば外科的切除または生検などによって単離された細胞または組織検体などを含み得る。加えてサンプルは、たとえば血液、血清、血漿、唾液、痰、および尿などの体液であってもよい。２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体を用いることによってサンプルにおける癌を検出または診断する方法は、特定的にはインビボまたはエクスビボの方法である。
【００５１】
本発明のさらなる局面は、癌、特に固形腫瘍を処置する方法に関し、この方法は、治療上有効な量の本発明に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体を対象に投与するステップを含む。
【００５２】
対象はヒトの対象および動物の対象の両方を含み、特にたとえばヒトの対象または医学的目的のためのマウスもしくはラットなどの哺乳動物の対象を含む。本明細書において、「治療上有効な量」という用語は、対象における臨床的に有意な条件の改善をもたらすために十分な量または用量を意味するために用いられる。
【００５３】
癌は白血病（血液癌）を含む。特に、癌とは固形腫瘍を示す。固形腫瘍は乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、甲状腺癌、肺癌、肝臓癌、膵癌、胃癌、黒色腫（皮膚癌）、リンパ腫、および神経膠腫を含む群より選択されてもよい。
【００５４】
別様に定義されない限り、本明細書において用いられる技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。
【００５５】
以下の実施例は本発明をより詳細に示す働きをするが、本発明の限定を構成するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】実施例１に従う本発明の実施形態に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体と、実施例２に従う比較のための化合物との合成の概要を示す図である。
【図２ａ】実施例３に従う比較のための化合物の合成の概要を示す図である。図２ａはステップ３．２．１から３．２．８を示す。
【図２ｂ】実施例３に従う比較のための化合物の合成の概要を示す図である。図２ｂはステップ３．２．９を示す。
【図３】実施例１から４の化合物と、対照とのｉＦＬｉＫ結合分析を示す図である。３回の独立した測定から得られた代表的な結果が示されており、データは４つ組の測定値の平均±ｓ．ｄ．を示す。
【図４】実施例１から４の化合物の活性に基づくスクリーニングを示す図である。３回の独立した測定から得られた代表的な結果が示されており、データは４つ組の測定値の平均±ｓ．ｄ．を示す。
【図５】実施例１（図５ａ）および実施例２（図５ｂ）およびＭＫ−２２０６（図５ｃ）の化合物の、時間依存的な活性に基づくスクリーニングの結果を示す図である。データは２つ組の測定値の平均±ｓ．ｄ．を示す。
【図６】式（１ａ）（図６ａ）および（２ａ）（図６ｂ）に従う化合物に対するインキュベーション時間に対してプロットされたＩＣ５０値を示す図である。３回の独立した測定から得られた代表的な結果が示されており、３つ組の測定値からｋｉｎａｃｔ、Ｋｉおよびｋｉｎａｃｔ／Ｋｉに対する平均±ｓ．ｄ．を算出した。
【図７】式（１ａ）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体の濃度１μＭにおける１００の異なるプロテインキナーゼのパネルのスクリーニングの阻害を示す図である。示されるデータは、評価されるキナーゼに対する２回の独立した測定の平均％阻害を示す。
【図８】異なる濃度の式（１ａ）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体およびＡｋｔ阻害剤ＭＫ２２０６による乳癌（ＢＴ４７４）および前立腺癌（ＰＣ−３）細胞の処置の際の、Ａｋｔ１およびリン酸化Ａｋｔ１、ならびにＧＳＫ３βおよびリン酸化ＧＳＫ３βのウエスタンブロットを示す図である。ロード対照としてβ−アクチンを用いた。
【図９】異なる濃度の式（１ａ）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体、Ａｋｔ阻害剤ＭＫ２２０６およびＧＳＫ６９０６９３、ならびにイマチニブによる消化管間葉性腫瘍細胞（ＧＩＳＴ−Ｔ１）の処置の際の、キナーゼのウエスタンブロットを示す図である。ロード対照としてβ−アクチンを用いた。
【図１０】式（１ａ）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体をマウスにそれぞれ静脈内（ｉ．ｖ．（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ）、２ｍｇ／ｋｇ）、腹腔内（ｉ．ｐ．（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ）、２０ｍｇ／ｋｇ）および経口（ｐ．ｏ．（ｐｅｒｏｒａｌｌｙ）、２０ｍｇ／ｋｇ）注射した後の濃度時間プロファイルを示す図である。
【図１１】式（１ａ）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体の存在下で共結晶化されたＡｋｔ１の、２．５Åの解像度まで精密にされた結晶構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
別様に述べられない限り、化学物質はアクロス（Ａｃｒｏｓ）、フルカ（Ｆｌｕｋａ）、メルク（Ｍｅｒｃｋ）、またはシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から購入して、さらなる精製なしに使用した。
【００５８】
＜実施例１＞
式（１ａ）に従う化合物の合成：Ｎ−（２−オキソ−３−（１−（４−（５−オキソ−３−フェニル−５，６−ジヒドロ−１，６−ナフチリジン−２−イル）ベンジル）ピペリジン−４−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−イル）アクリルアミド
【００５９】
ステップ１．１  ５−クロロ−６−ニトロ−１−（ピペリジン−４−イル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−オン（４）の合成
５−クロロ−１−（ピペリジン−４−イル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−オン（３）（２ｇ、８．０ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロベンゼン（４０ｍＬ）に溶解し、上記撹拌溶液に７０％硝酸（１ｇ、１６．０ｍｍｏｌ）を室温（ＲＴ（ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）、２０±２℃）にて滴下して加えた。６０℃にて２ｈ撹拌した後、反応混合物をＲＴに冷却した。ろ過によって沈殿した結晶を分離し、ジエチルエーテル（２×５０ｍＬ）および水で洗浄した。粗生成物を高温エタノールから再結晶化し、高真空にて１ｈ乾燥することによって、表題の化合物（４）を淡黄色の固体（１．５１ｇ、６４％）として与えた。
【００６０】
ステップ１．２  ６−アミノ−１−（ピペリジン−４−イル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−オン（５）の合成
ステップ１．１の５−クロロ−１−（ピペリジン−４−イル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−オン（４）（２ｇ、６．７ｍｍｏｌ）と、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．２ｇ）とをエタノール（４０ｍＬ）に溶解し、８０℃にて３０ｍｉｎ撹拌させた。ＲＴにて上記撹拌反応塊（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍａｓｓ）にギ酸アンモニウム（４．０ｇ、６７ｍｍｏｌ）を加えた。８０℃にて３０ｍｉｎ撹拌した後、反応混合物をＲＴに冷却し、セライトのパッドでろ過した。過剰な溶剤を除去し、粗塊（ｃｒｕｄｅ  ｍａｓｓ）をフラッシュクロマトグラフィー（５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）溶剤系によって精製して、化合物６−アミノ−１−（ピペリジン−４−イル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−オン（５）をオフホワイト色の固体（０．９７ｇ、６２％）としてもたらした。
【００６１】
ステップ１．３  ｔｅｒｔ−ブチル（２−オキソ−３−（ピペリジン−４−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−イル）カルバメート（６）の合成
（Ｂｏｃ）２Ｏ（０．８８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（３４．２ｍＬ）溶液を、ステップ１．２の６−アミノ−１−（ピペリジン−４−イル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−オン（５）（０．９ｇ、３．８ｍｍｏｌ）を１０％ＡｃＯＨ（３４．２ｍＬ）に入れた撹拌溶液に滴下して加え、ＲＴにて一晩撹拌させた。反応混合物をジエチルエーテル（２×２５ｍＬ）で洗浄し、水溶液を２Ｎ  ＮａＯＨ（５ｍＬ）で塩基性化し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層をかん水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、過剰な溶剤を除去した。粗塊をフラッシュクロマトグラフィー（４％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）溶剤系によって精製して、表題の化合物ｔｅｒｔ−ブチル（２−オキソ−３−（ピペリジン−４−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−イル）カルバメート（６）を淡黄色の液体（１．０５ｇ、７９％）としてもたらした。
【００６２】
ステップ１．４  ４−（５−オキソ−３−フェニル−５，６−ジヒドロ−１，６−ナフチリジン−２−イル）ベンズアルデヒド（７）の合成
Ｚ．ファング（Ｆａｎｇ）、Ｊ．Ｒ．シマード（Ｓｉｍａｒｄ）、Ｄ．プレンカー（Ｐｌｅｎｋｅｒ）、Η．Ｄ．ヌグイェン（Ｎｇｕｙｅｎ）、Ｔ．ファン（Ｐｈａｎ）、Ｐ．ウォレ（Ｗｏｌｌｅ）、Ｓ．バウマイスター（Ｂａｕｍｅｉｓｔｅｒ）、Ｄ．ロー（Ｒａｕｈ）、ＡＣＳケミカル・バイオロジー（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）２０１５、１０、２７９〜２８８に記載される手順に従って、４−（５−オキソ−３−フェニル−５，６−ジヒドロ−１，６−ナフチリジン−２−イル）ベンズアルデヒド（７）を合成した。
【００６３】
ステップ１．５  ｔｅｒｔ−ブチル（２−オキソ−３−（１−（４−（５−オキソ−３−フェニル−５，６−ジヒドロ−１，６−ナフチリジン−２−イル）ベンジル）ピペリジン−４−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−イル）カルバメート（８）の合成
ｔｅｒｔ−ブチル（２−オキソ−３−（ピペリジン−４−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−イル）カルバメート（６）（０．５ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびステップ１．４の４−（５−オキソ−３−フェニル−５，６−ジヒドロ−１，６−ナフチリジン−２−イル）ベンズアルデヒド（７）（０．４９ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を、ドライＭｅＯＨ（２０ｍＬ）、ＴＥＡ（２滴）、およびＡｃＯＨ（２滴）に溶解し、７５℃にて４ｈ撹拌させた。次いでＮａＢＨ３ＣＮ（０．３１ｇ、１．５ｍｍｏｌ）をＲＴにて加え、反応塊を一晩撹拌させた。減圧下で溶剤を蒸発させ、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（２〜４％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製して、表題の化合物ｔｅｒｔ−ブチル（２−オキソ−３−（１−（４−（５−オキソ−３−フェニル−５，６−ジヒドロ−１，６−ナフチリジン−２−イル）ベンジル）ピペリジン−４−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−イル）カルバメート（８）を淡黄色の液体（０．４６ｇ、５１％）としてもたらした。
【００６４】
ステップ１．６  ２−（４−（（４−（６−アミノ−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−１−イル）ピペリジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−フェニル−１，６−ナフチリジン−５（６Ｈ）−オン（９）の合成
ステップ１．５のＴｅｒｔ−ブチル（２−オキソ−３−（１−（４−（５−オキソ−３−フェニル−５，６−ジヒドロ−１，６−ナフチリジン−２−イル）ベンジル）ピペリジン−４−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−イル）カルバメート（８）（２００ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２５ｍＬ）に溶解し、４Ｎ  ＨＣｌのジオキサン（５ｍＬ）溶液を氷浴によって０℃にて滴下して加え、ＲＴにて一晩撹拌させた。沈殿をろ過してＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で洗浄し、水（２０ｍＬ）に溶解した。水層をｓａｔ  ＮａＨＣＯ３によって塩基性化し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、かん水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。過剰な溶剤を除去し、粗残留物をフラッシュクロマトグラフィー（７％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製して、表題の化合物９を淡黄色の固体（１２０ｍｇ、収率７５％）として得た。
【００６５】
ステップ１．７  Ｎ−（２−オキソ−３−（１−（４−（５−オキソ−３−フェニル−５，６−ジヒドロ−１，６−ナフチリジン−２−イル）ベンジル）ピペリジン−４−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−イル）アクリルアミド（１ａ）の合成
Ν，Ν−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ：Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（０．０９６ｍＬ、０．５５ｍｍｏｌ）を、ステップ１．６の２−（４−（（４−（６−アミノ−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−１−イル）ピペリジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−フェニル−１，６−ナフチリジン−５（６Ｈ）−オン（９）（０．０６ｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に入れた撹拌溶液に、氷浴によって０℃にて加えた。上記撹拌反応混合物にアクリロイルクロライド（０．０８４ｍＬ、０．１１ｍｍｏｌ）を０℃にて滴下して加え、ＲＴにて１６ｈ反応させた。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３でクエンチし、生成物をＣＨ２Ｃｌ２（３×２０ｍＬ）で抽出した。複合有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥してろ過した。真空中で溶剤を除去して粗生成物を得て、その粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（８％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製して、表題の化合物１ａ（０．０３５ｇ、５３％）（Ｒｆ＝０．３５、８％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）をオフホワイト色の固体としてもたらした。この合成の概要を図１に示す。
【００６６】
比較例２
Ｎ−（２−オキソ−３−（１−（４−（５−オキソ−３−フェニル−５，６−ジヒドロ−１，６−ナフチリジン−２−イル）ベンジル）ピペリジン−４−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−イル）プロピオンアミド（１ｂ）の合成
ＤＩＰＥＡ（０．０５ｍＬ、０．２７ｍｍｏｌ）を、ステップ１．６の２−（４−（（４−（６−アミノ−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−１−イル）ピペリジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−フェニル−１，６−ナフチリジン−５（６Ｈ）−オン（９）（０．０３ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に入れた撹拌溶液に、氷浴によって０℃にて加えた。上記撹拌反応混合物にプロピオニルクロライド（０．００５ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を０℃にて滴下して加え、ＲＴにて１６ｈ反応させた。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３でクエンチし、生成物をＣＨ２Ｃｌ２（３×２０ｍＬ）で抽出した。複合有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥してろ過した。真空中で溶剤を除去して粗生成物を得て、その粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（８％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製して、表題の化合物１ｂ（０．０１９ｇ、５７．５％）（Ｒｆ＝０．４、８％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）をオフホワイト色の固体としてもたらした。
【００６７】
比較例３
式（２ａ）に従う化合物の合成：
ステップ３．１．１  ｔｅｒｔ−ブチル４−アジドピペリジン−１−カルボキシレート（１１）の合成
５０ｍＬの２口丸底フラスコにＤＭＳＯ（５ｍＬ）およびｔｅｒｔ−ブチル４−ブロモピペリジン−１−カルボキシレート（１０）（１．０１ｇ、３．８２ｍｍｏｌ）を入れた。その後、溶液が透明になって出発材料が溶解するまでＲＴにて撹拌した。次いでアジ化ナトリウム（１．２当量、０．３０１ｇ、４．６４ｍｍｏｌ）を加え、無色の反応混合物を６０℃にて１８ｈ撹拌した。反応混合物を蒸留Ｈ２Ｏで希釈し、生成物をＥｔＯＡｃ（５×８０ｍＬ）で抽出した。次いで複合有機層をかん水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥してろ過した。真空中で溶剤を除去して粗生成物を得て、その粗生成物をＣＣ（５％から２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、表題の化合物（１１）（０．７６２ｇ、３．３７ｍｍｏｌ、８８％）（Ｒｆ＝０．４７、１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を無色の油としてもたらした。
【００６８】
ステップ３．１．２  ４−アジドピペリジン−１−イウムクロライド（１２）の合成
１口丸底フラスコに、ステップ３．１．１のｔｅｒｔ−ブチル４−アジドピペリジン−１−カルボキシレート１１（０．７１４ｇ、３．１６ｍｍｏｌ）および４Ｍ  ＨＣｌを１，４−ジオキサン（６ｍＬ）に入れた溶液を入れた。反応混合物をＲＴにて２３ｈ撹拌した後、真空中で溶剤を除去して粗製の表題化合物１２（０．５０８ｇ、３．１２ｍｍｏｌ、９９％）を淡黄色の固体としてもたらした。
【００６９】
ステップ３．１．３  Ｎ−（３−エチニルフェニル）アクリルアミド（１４）の合成
シュレンクチューブにジクロロメタン（ＤＣＭ：ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）（１５ｍＬ）、３−エチニルアニリン１３（０．２０ｍＬ、０．２２ｇ、１．９ｍｍｏｌ）およびトリエタノールアミン（ＴＥＡ：ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（４．５当量、１．２０ｍＬ、０．８７１ｇ、８．６１ｍｍｏｌ）を入れた。無色の反応混合物を氷浴によって０℃に冷却し、アクリロイルクロライド（４．５当量、０．７０ｍＬ、０．７８ｇ、８．６ｍｍｏｌ）を滴下する態様で加えた。反応混合物は時間とともに不透明な黄色になった。アクリロイルクロライドの添加後、反応混合物をＲＴにて１８ｈ撹拌させた。反応を水性ＮａＨＣＯ３の飽和溶液でクエンチし、生成物をＤＣＭ（３×１５０ｍＬ）で抽出した。複合有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥してろ過した。真空中で溶剤を除去して粗生成物を得て、その粗生成物をＣＣ（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、表題の化合物１４（０．３１７ｇ、１．８５ｍｍｏｌ、９７％）（Ｒｆ＝０．２０、２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を淡黄色の固体としてもたらした。
【００７０】
ステップ３．１．４  Ｎ−（３−エチニルフェニル）プロピオンアミド（１５）の合成
５０ｍＬの２口丸底フラスコにＤＣＭ（５０ｍＬ）、３−エチニルアニリン１３（０．２０ｍＬ、０．２２ｇ、１．９ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（５．１当量、１．３５ｍＬ、０．８９０ｇ、９．６９ｍｍｏｌ）を入れた。無色の反応混合物を氷浴によって０℃に冷却し、プロピオニルクロライド（５．１当量、０．８５ｍＬ、０．９１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を滴下する態様で加えた。反応混合物は時間とともに乳白色になった。プロピオニルクロライドの添加後、反応混合物をＲＴにて１７ｈ撹拌させた。反応を水性ＮａＨＣＯ３の飽和溶液でクエンチし、生成物をＤＣＭ（４×５０ｍＬ）で抽出した。複合有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥してろ過した。真空中で溶剤を除去して粗生成物を得て、その粗生成物をＣＣ（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、表題の化合物１５（０．３３１ｇ、１．９１ｍｍｏｌ、定量的）（Ｒｆ＝０．６９、４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を淡黄色の固体としてもたらした。
【００７１】
ステップ３．２．１  ２−（４−ブロモフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン（１８）の合成
１００ｍＬの３口丸底フラスコに２，４’−ジブロモアセトフェノン１７（６．０８ｇ、２１．９ｍｍｏｌ）、２−アミノピリジン１６（１．１当量、２．３１ｇ、２４．５ｍｍｏｌ）、および脱気したアセトン（４５ｍＬ）を入れた。反応フラスコに還流冷却器を装備し、反応混合物を８０℃にて３ｈ加熱した。この時間中に追加のアセトン（２０ｍＬ）を加えた。その後反応混合物を室温に冷却し、２５０ｍＬの１口丸底フラスコに移した。真空中で溶剤を除去し、反応混合物にＨＢｒ（４５ｍＬ）およびＭｅＯＨ（９０ｍＬ）を加えた。反応フラスコに再び還流冷却器を装備し、反応混合物を８０℃にて１ｈ加熱した。氷浴によって反応混合物を０℃に冷却した。次いで白色の沈殿を焼結漏斗でろ過し、蒸留Ｈ２Ｏで洗浄し、真空下で乾燥して、粗製の表題化合物１８（５．６９ｇ、２０．８ｍｍｏｌ、９５％）（Ｒｆ＝０．３６、４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を白色の固体としてもたらし、さらなる精製は行わなかった。
【００７２】
ステップ３．２．２  ４−（イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−２−イル）ベンゾニトリル（１９）の合成
１０〜２０ｍＬのマイクロ波バイアルにステップ３．２．１の２−（４−ブロモフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン１８（１．０１ｇ、３．７１ｍｍｏｌ）、ＣｕＣＮ（１．５当量、０．５００ｇ、５．５８ｍｍｏｌ）、および脱気したＤＭＦ（１２ｍＬ）を入れた。バイアルをマイクロ波リアクタに入れ、１６０℃にて３０ｍｉｎ加熱して試薬を溶解した。次いでそれを２００℃にて４ｈ加熱した。反応混合物をＲＴに冷却し、エチレンジアミン（５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２０ｍＬ）で希釈した。ＤＣＭ（１０×５０ｍＬ）による抽出を行い、複合有機層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥してろ過した。真空中で溶剤を除去し、暗い茶色の粗製材料をＣＣ（５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンおよび１％ＴＥＡ）によって精製して、まだ不純な表題の化合物１９（０．７８６ｇ）をもたらした。次いでその化合物１９を第２ラウンドのＣＣ（５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンおよび１％ＴＥＡ）によってさらに精製して、表題の化合物１９（０．４９８ｇ、２．２７ｍｍｏｌ、６１％）（Ｒｆ＝０．３２、４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を淡黄色の固体としてもたらした。
【００７３】
ステップ３．２．３  ４−（３−ブロモイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−２−イル）ベンゾニトリル（２０）の合成
５０ｍＬの１口丸底フラスコに、ステップ３．２．２の４−（イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−２−イル）ベンゾニトリル１９（０．２０３ｇ、０．９２５ｍｍｏｌ）およびＭｅＣＮ（２ｍＬ）を入れた。ＮＢＳ（２．０当量、０．３３０ｇ、１．８５ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（５ｍＬ）に溶解し、３回に分けて反応フラスコに加えた。ＮＢＳの添加の間に沈殿が形成され、反応混合物をＲＴにて１０ｍｉｎ撹拌し、真空中で溶剤を除去して黄色の固体を得て、それを飽和水性ＮａＨＣＯ３で希釈し、ＤＣＭ（４×５０ｍＬ）で抽出した。複合有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥してろ過し、真空中で溶剤を除去した。黄色の粗製材料をＣＣ（３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、まだ不純な表題の化合物２０（０．３１２ｇ）をもたらした。次いでその化合物２０を第２ラウンドのＣＣ（３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によってさらに精製して、表題の化合物２０（０．１８１ｇ、０．６０８ｍｍｏｌ、６６％）（Ｒｆ＝０．４７、４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）をオフホワイト色の固体としてもたらした。
【００７４】
ステップ３．２．４  ４−（３−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−２−イル）ベンゾニトリル（２２）の合成
Ｓ．マーハドゥール（Ｍａｒｈａｄｏｕｒ）、Ｍ．−Ａ．バジン（Ｂａｚｉｎ）、Ｐ．マーチャンド（Ｍａｒｃｈａｎｄ）、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．）２０１２、５３、２９７〜３００に記載されるとおりに、シュレンクチューブにステップ３．２．３の４−（３−ブロモイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−２−イル）ベンゾニトリル２０（０．３１４ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）、フェニルボロン酸２１（１．２当量、０．１５９ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（２．４当量、０．３５６ｇ、２．５７ｍｍｏｌ）、およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（５ｍｏｌ％、０．０６３ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を入れ、次いで排気してＮ２を充填した。脱気した１，４−ジオキサン（２ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１ｍＬ）を加え、それを再び排気してＮ２を充填した。反応混合物を１１０℃にて２．５ｈ加熱し、次いで室温に冷却した。透明な黄色の反応混合物をＨ２Ｏ（７５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（６×７５ｍＬ）で抽出した。複合有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥してろ過し、真空中で溶剤を除去した。粗製材料をＣＣ（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、表題の化合物２２（０．２４５ｇ、０．８３０ｍｍｏｌ、７９％）（Ｒｆ＝０．４１、４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）をオフホワイト色の固体としてもたらした。
【００７５】
ステップ３．２．５  ４−（３−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−２−イル）ベンズアルデヒド（２３）の合成
５０ｍＬの２口丸底フラスコにステップ３．２．４の４−（３−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−２−イル）ベンゾニトリル２２（０．２６１ｇ、０．８８３ｍｍｏｌ）、ギ酸（６．５ｍＬ）、およびラネーニッケル（ＲａＮｉ：Ｒａｎｅｙ  ｎｉｃｋｅｌ）を入れた。反応混合物を９０℃にて２８ｈ加熱した。次いでそれをＲＴに冷却し、次いで脱脂綿でろ過し、飽和水性ＮａＨＣＯ３（２００ｍＬ）で希釈した。ＥｔＯＡｃ（５×７５ｍＬ）による抽出を行い、複合有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥してろ過し、真空中で溶剤を除去した。黄色の粗製材料をＣＣ（２０％から４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、表題の化合物２３（０．１７２ｇ、０．５７７ｍｍｏｌ、６５％）（Ｒｆ＝０．３２、４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を濃い黄色の油／固体としてもたらした。
【００７６】
ステップ３．２．６  ［４−（３−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−２−イル）フェニル］メタノール（２４）の合成
５０ｍＬの１口丸底フラスコにステップ３．２．５の４−（３−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−２−イル）ベンズアルデヒド２３（０．１７０ｇ、０．５６９ｍｍｏｌ）およびＭｅＯＨ（３．５ｍＬ）を入れた。不透明な黄色の反応混合物を氷浴によって０℃に冷却し、水素化ホウ素ナトリウム（２．１当量、０．０４５ｇ、２．３０ｍｍｏｌ）を加えた。結果として得られた透明な黄色の反応混合物を０℃の温度にて３０ｍｉｎ撹拌した。反応をＲＴに冷却し、真空中で溶剤を除去して淡黄色の油を得て、それに蒸留Ｈ２Ｏを加えた。ＥｔＯＡｃ（４×１５０ｍＬ）を用いて抽出を行い、複合有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥してろ過した。真空中で溶剤を除去して粗生成物を得て、その粗生成物をＣＣ（４０％から５０％から８０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、表題の化合物２４（０．１３５ｇ、０．４４９ｍｍｏｌ、７９％）（Ｒｆ＝０．１１、５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を白色の固体としてもたらした。
【００７７】
ステップ３．２．７  ２−［４−（クロロメチル）フェニル］−３−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン（２５）の合成
５０ｍＬの２口丸底フラスコにステップ３．２．６の［４−（３−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−２−イル）フェニル］メタノール２４（０．１２１ｇ、０．４０３ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（５ｍＬ）を入れた。反応混合物に四塩化炭素（２．５ｍＬ）およびトリフェニルホスフィン（２．１当量、０．２２３ｇ、０．８５０ｍｍｏｌ）を加え、反応フラスコに還流冷却器を装備した。その後、反応混合物を９０℃にて２１ｈ加熱した。次いで追加のトリフェニルホスフィン（２．０当量、０．２１６ｇ、０．８２３ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、それを９０℃にてさらに５ｈ加熱した。反応混合物を蒸留Ｈ２Ｏで希釈し、生成物をＥｔＯＡｃ（３×１５０ｍＬ）で抽出した。次いで複合有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥してろ過し、真空中で溶剤を除去して粗生成物を得て、その粗生成物をＣＣ（３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、表題の化合物２５（０．１４９ｇ、まだ不純）（Ｒｆ＝０．４０、４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を黄色の油としてもたらした。
【００７８】
ステップ３．２．８  ２−｛４−［（４−アジドピペリジン−１−イル）メチル］フェニル｝−３−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン（２６）の合成
５０ｍＬの２口丸底フラスコに４−アジドピペリジン−１−イウムクロライド１２（１．７当量、０．１１４ｇ、０．７０２ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１ｍＬ）、およびＴＥＡ（１．８当量、０．１０ｍＬ、０．０７３ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を入れた。これらをＲＴにてともに撹拌し、次いでステップ３．２．７の２−［４−（クロロメチル）フェニル］−３−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン２５（０．１２８ｇ、０．４０３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解したものを加えた。反応混合物を６０℃にて２．５ｈ加熱した。反応混合物をＲＴに冷却し、蒸留Ｈ２Ｏで希釈した。生成物をＥｔＯＡｃ（３×１５０ｍＬ）で抽出し、次いで複合有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥してろ過した。真空中で溶剤を除去して粗生成物を得て、その粗生成物をかん水で希釈し、ジエチルエーテルで抽出し、次いでＣＣ（８０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、表題の化合物２６（０．１１５ｇ、０．２８２ｍｍｏｌ、２ステップで７０％）（Ｒｆ＝０．１２、８０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を濃い黄色の油としてもたらした。
【００７９】
ステップ３．２．９  Ｎ−［３−（１−｛１−［４−（３−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−２−イル）ベンジル］ピペリジン−４−イル｝−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）フェニル］アクリルアミド（２ａ）の合成
シュレンクチューブにステップ３．２．８の２−｛４−［（４−アジドピペリジン−１−イル）メチル］フェニル｝−３−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン２６（０．０３８ｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）、ステップ３．１．３のＮ−（３−エチニルフェニル）アクリルアミド１４（２．２当量、０．０３５ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．１当量、０．０５０ｍＬ、０．０３７ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）、およびＭｅＣＮ（１．５ｍＬ）を入れた。不透明な黄色の反応混合物を２５℃に加熱して内容物を溶解し、反応混合物はほぼ透明な黄色になった。ＣｕＩ（２８ｍｏｌ％、５ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を加え、反応を２５℃にて１５ｈ撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、脱脂綿プラグでろ過し、真空中で濃縮した。結果として得られた橙色の粗製材料をＣＣ（１％から２．５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、表題の化合物２ａ（０．０６８ｇ、定量的）（Ｒｆ＝０．１９、ＥｔＯＡｃ）を淡黄色の固体としてもたらした。
【００８０】
特徴付けに対して、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）およびジエチルエーテルは１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおいて見られ、生成物の過剰な質量をもたらしていた。それは、真空下でのさらなる乾燥の前は元々油であった化合物によってトラップされていた。生化学的評価に送られたサンプルは、高い表面積対体積の比率のために広げられ、真空下でさらに乾燥されて、完全に乾燥したサンプルであることを確実にした。２Ｄ  ＮＯＥＳＹスペクトルを得て、１，５−二置換１，２，３−トリアゾールではなく、必要とされる１，４−二置換１，２，３−トリアゾールが合成されたことを確認した。このＮＭＲスペクトルはトリアゾールプロトンとピペリジニルプロトンとの相関を示し、１，４−二置換１，２，３−トリアゾールの合成が成功したことを確認した。１，５−二置換１，２，３−トリアゾールのトリアゾールプロトンは、ピペリジニルプロトンと相関するには遠すぎるであろう。この合成の概要を図２ａおよび図２ｂに示す。
【００８１】
比較例４
Ｎ−［３−（１−｛１−［４−（３−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−２−イル）ベンジル］ピペリジン−４−イル｝−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）フェニル］プロピオンアミド（２ｂ）の合成
２５ｍＬの１口丸底フラスコに、ステップ３．２．８の２−｛４−［（４−アジドピペリジン−１−イル）メチル］フェニル｝−３−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン２６（０．０３８ｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）、ステップ３．１．４のＮ−（３−エチニルフェニル）プロピオンアミド１５（２．０当量、０．０３３ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）、およびＣｕＩ（２８ｍｏｌ％、５ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を入れた。その後、ＭｅＣＮ（１．５ｍＬ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．１当量、０．０５０ｍＬ、０．０３７ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を加え、不透明な黄色の反応混合物を２５℃にて２１ｈ撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、脱脂綿プラグでろ過し、真空中で濃縮した。結果として得られた橙色の粗製材料をＣＣ（０．５％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）によって精製して、まだ不純な表題の化合物２ｂをもたらし、次いでこの化合物２ｂを第２ラウンドのＣＣ（０．５％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）によってさらに精製して、表題の化合物２ｂ（１６ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ、２９％）（Ｒｆ＝０．０７３、０．５％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）を淡黄色の半固体としてもたらした。
【００８２】
方法
プラスミド構築：
Ｈｉｓ６タグ付き全長野生型（ｗｔ：ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）Ａｋｔ１と、突然変異体全長Ａｋｔ１（Ｅ４９Ｃ、Ｃ２９６Ｓ、Ｃ３１０Ｓ、Ｃ３４４Ｓ）とをコードする遺伝子を合成によって生成した（ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）、レーゲンスブルク（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））。その後、それらの遺伝子をｐＲＥＮ４４２７−ＨＩＳ−ＤＥＳＴベクターにクローニングし、Ｓｆ９細胞（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））においてＢａｃＭａｇｉｃ（商標）キット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標））を用いてバキュロウイルスに導入した。タンパク質の発現、精製およびラベリングは、標準的プロトコルに従って行われた。
【００８３】
生化学的アッセイ：
Ｚ．ファング、Ｊ．Ｒ．シマード、Ｄ．プレンカー、Ｈ．Ｄ．ヌグイェン、Ｔ．ファン、Ｐ．ウォレ、Ｓ．バウマイスター、Ｄ．ロー、ＡＣＳケミカル・バイオロジー（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）２０１５、１０、２７９〜２８８に記載されるとおりに、ｉＦＬｉＫおよびＨＴＲＦ調査を行った。
【００８４】
ＨＴＲＦ実験に対するすべての試薬は、シスビオ・バイオアッセイズ（Ｃｉｓｂｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）、フランス（Ｆｒａｎｃｅ）より購入した。データ分析のためにＯｒｉｇｉｎＰｒｏ  ９．１Ｇソフトウェア（オリジンラボ社（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ノースハンプトン（Ｎｏｒｔｈｈａｍｐｔｏｎ）、ＭＡ）が用いられ、次の４パラメータロジスティック等式を用いて、データをＳ字状の用量−応答モデルに適合させた。
【００８５】
【数１】
0006715921.tif 000008
【００８６】
（Ａ１：底部漸近線；Ａ２：頂部漸近線；ＩＣ５０：最大半量阻害濃度；ｐ：ヒル係数）
【００８７】
共有結合プローブ化合物の動力学的特徴付け：
「生化学的アッセイ」において説明されるとおりに、活性化全長Ａｋｔ１によって時間依存的ＩＣ５０測定を行った。簡単にいうと、１２の異なるインキュベーション時間に対するＩＣ５０値を定めた後に、それぞれに対してプロットした。Ｂ．Ｆ．クリッペンドルフ（Ｋｒｉｐｐｅｎｄｏｒｆｆ）、Ｒ．ニューハウス（Ｎｅｕｈａｕｓ）、Ｐ．リエノー（Ｌｉｅｎａｕ）、Ａ．レイチェル（Ｒｅｉｃｈｅｌ）、Ｗ．ホイジンガ（Ｈｕｉｓｉｎｇａ）、ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・スクリーニング（Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．）２００９、１４、９１３〜９２３に記載される文献の手順に従って、データを分析した。基質濃度を２５０ｎＭ、対応する基質ＫＭを１５０ｎＭと定めるＸＬｆｉｔ（バージョン５．４．０．８、ＩＤＢＳ、ミュンヘン（Ｍｕｎｉｃｈ）、ドイツ）によって、Ｋｉおよびｋｉｎａｃｔを算出した。
【００８８】
質量分析：
精製した全長ｗｔＡｋｔ１を冷水下で解凍し、最終濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように貯蔵用緩衝剤（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）で希釈した。それぞれの混合物２０μＬを２モル濃度当量の式（１ａ）および（２ａ）の化合物（１０ｍＭ、ＤＭＳＯ中）とそれぞれ混合した。対照測定のために、等体積のＤＭＳＯを含有するサンプルを個別に調製した。氷上で３０分間のインキュベーションの後、サーモフィニガン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）ＬＴＱ線形イオントラップ（Ｌｉｎｅａｒ  Ｉｏｎ  Ｔｒａｐ）質量分析計に接続されたアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００シリーズＨＰＬＣシステムを用いたＥＳＩ−ＭＳによって、サンプルを分析した。したがって、ヴィダック（Ｖｙｄａｃ）２１４ＴＰ  Ｃ４  ５ｕカラム（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ）を用いて６μＬのサンプルが注入および分離され、５分間の２０％の溶剤Ｂから始めて、その後１４ｍｉｎにわたる最大９０％の溶剤Ｂの勾配（流速２１０μＬ／ｍｉｎ）が続き、ここで０．１％ＴＦＡの水溶液を溶剤Ａ、０．１％ＴＦＡのアセトニトリル溶液を溶剤Ｂとした。カラムを９０％の溶剤Ｂによって２分間洗浄した後、１ｍｉｎのうちに溶剤Ａの濃度を８０％に増やし、カラムをさらに５分間洗浄した。完全な実験の間、７００ｍ／ｚから２０００ｍ／ｚの質量範囲を走査し、ＭａｇＴｒａｎおよびｍＭａｓｓ（バージョン５．５．０）ソフトウェアによって生データをデコンボリューションおよび分析した。
【００８９】
ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ測定のために、サンプルを変性させてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、クーマシーブリリアントブルーで染色し、Ａ．シェフチェンコ（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ）、Ｈ．トマス（Ｔｏｍａｓ）、Ｊ．ハブリス（Ｈａｖｌｉｓ）、Ｊ．Ｖ．オルセン（Ｏｌｓｅｎ）、Ｍ．マン（Ｍａｎｎ）、ネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．）２００６、１、２８５６〜２８６０に記載される標準的なトリプシンインゲル消化プロトコルに従って調製した。その後、サンプルを解凍し、２０μＬの０．１％ＴＦＡ水溶液に溶解し、室温にて１５ｍｉｎ超音波処理し、分析の直前に１５０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離した。３μＬのサンプルをプレカラムカートリッジにロードし、０．１％ＴＦＡ水溶液を溶出剤として用いて３０μＬ／ｍｉｎの流速で５ｍｉｎ脱塩した。分析全体の間に、サンプルをプレカラムからナノＨＰＬＣカラムに逆流させた。溶出剤Ａとして０．１％ギ酸水溶液を、溶出剤Ｂとして０．１％ギ酸のアセトニトリル溶液を用い、かつ４０℃のカラム温度を用いた、５％Ｂから始まって３５ｍｉｎ後（流速３００ｎＬ／ｍｉｎ）に３０％Ｂの最終組成となる勾配を用いて溶出を行った。溶剤Ｂのパーセンテージを５ｍｉｎのうちに６０％に、追加の５ｍｉｎのうちに９５％に増加し、カラムをさらに５ｍｉｎ洗浄し、システムの出発条件および平衡に１４ｍｉｎ流し戻すことによって、ナノＨＰＬＣカラムを洗浄した。完全な勾配サイクルの間に、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ分析に対する典型的なＴＯＰ１０ショットガンプロテオミクス法を用いた。全走査ＭＳ実験に対して、ｍ／ｚ３００から１６５０の質量範囲を７００００の解像度で走査した。ＭＳ／ＭＳ実験の後に、最も強い少なくとも２倍の荷電イオンの解像度１７５００を伴う、最大１０の高エネルギ衝突解離（ＨＣＤ：ｈｉｇｈ  ｅｎｅｒｇｙ  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）ＭＳ／ＭＳ走査を行った。コックス（Ｃｏｘ）、Ｍ．マン（Ｍａｎｎ）、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）２００８、２６、１３６７〜１３７２に記載されるＭａｘＱｕａｎｔを用いて、データ評価を行った。偽発見率の決定のためのデコイデータベースを用いて、ペプチドおよびタンパク質レベルに対する１％の偽発見率を用いて、Ａｋｔ１配列および混入データベースに対してスペクトルを検索した。データベース検索に対して、タンパク質のメチオニンの酸化およびＮ末端アセチル化、システインのカルバミドメチル化、ならびにシステインの人工的修飾を可変修飾として定めた。
【００９０】
細胞培養：
ＧＩＳＴ−Ｔ１は、タカヒロ・タグチ（Ｔａｋａｈｉｒｏ  Ｔａｇｕｃｈｉ）（高知大学（Ｋｏｃｈｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、高知（Ｋｏｃｈｉ）、日本（Ｊａｐａｎ））によって、Ｈ．ナカタニ（Ｎａｋａｔａｎｉ）、Ｍ．コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）、Ｔ．ジン（Ｊｉｎ）、Ｔ．タグチ（Ｔａｇｕｃｈｉ）、Ｔ．スギモト（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ）、Ｔ．ナカノ（Ｎａｋａｎｏ）、Ｓ．ハマダ（Ｈａｍａｄａ）、Ｋ．アラキ（Ａｒａｋｉ）、キャンサー・サイエンス（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．）２００５、９６、１１６〜１１９に記載されるとおりに、ＫＩＴエキソン１１の５７ｂｐ欠失を含むヒト未処置転移性ＧＩＳＴから確立され、ＤＭＥＭ高グルコース培地（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ドイツ）に１０％ＦＢＳ（バイオクロム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）、ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ）、ドイツ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰｅｎＳｔｒｅｐ：ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、および１％Ｌ−グルタミンを補った培地において、３７℃および５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で培養された。
【００９１】
ヒト腺管乳癌細胞（ＢＴ４７４）およびヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３）をＡＴＣＣ（ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、メリーランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＵＳＡ）から購入し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ライフ・テクノロジーズ、ドイツ）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）；バイオクロム、ベルリン、ドイツ）を補った培地において培養し、３７℃および５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにおいて維持した（Ｃ２００、ラボテクト・インキュベーター（Ｌａｂｏｔｅｃｔ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）、ゲッティンゲン（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）、ドイツ）。
【００９２】
ウエスタンブロッティング：
ＧＩＳＴ−Ｔ１細胞に対して、Ａ．デュエンシング（Ｄｕｅｎｓｉｎｇ）、Ｆ．メデイロス（Ｍｅｄｅｉｒｏｓ）、Ｂ．マッコナーティー（ＭｃＣｏｎａｒｔｙ）、Ｎ．Ｅ．ジョセフ（Ｊｏｓｅｐｈ）、Ｄ．パニグラヒー（Ｐａｎｉｇｒａｈｙ）、Ｓ．シンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）、Ｃ．Ｄ．フレッチャー（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ）、Ｇ．Ｄ．デメトリ（Ｄｅｍｅｔｒｉ）、Ｊ．Ａ．フレッチャー、オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）２００４、２３、３９９９〜４００６に記載される標準的なプロトコルに従って、株細胞単層からタンパク質ライセートを調製した。バイオ・ラッドタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ）（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、ＣＡ）によって、タンパク質濃度を定めた。Ｂ．Ｐ．ルビン（Ｒｕｂｉｎ）、Ｓ．シンガー、Ｃ．ツァオ（Ｔｓａｏ）、Ａ．デュエンシング、Ｍ．Ｌ．ルクス（Ｌｕｘ）、Ｒ．ルイズ（Ｒｕｉｚ）、Ｍ．Ｋ．ヒバード（Ｈｉｂｂａｒｄ）、Ｃ．Ｊ．チェン（Ｃｈｅｎ）、Ｓ．シャオ（Ｘｉａｏ）、Ｄ．Ａ．ツベソン（Ｔｕｖｅｓｏｎ）、Ｇ．Ｄ．デメトリ、Ｃ．Ｄ．フレッチャー、Ｊ．Ａ．フレッチャー、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）２００１、６１、８１１８〜８１２１に記載されるとおりに、電気泳動およびイムノブロッティングを行った。ＦＵＪＩ  ＬＡＳ３０００システムとともにサイエンス・ラボ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂ）２００１  ＩｍａｇｅＧａｕｇｅ  ４．０ソフトウェア（フジフィルム・メディアル・システムズ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  Ｍｅｄｉａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、スタンフォード（Ｓｔａｍｆｏｒｄ）ＣＴ、ＵＳＡ）を用いて、化学ルミネセンスによって可視化されるタンパク質発現およびリン酸化の変化を捕捉および定量化した。
【００９３】
６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、８０ｍＭ  ＤＴＴ、および０．０１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルーの中で、ＢＴ４７４およびＰＣ−３細胞を９５℃にて１０ｍｉｎ溶解した（１００μＬの溶解緩衝剤当り３５０．０００細胞）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、製造者のマニュアル（Ｂ４４、バイオメトラ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）、ゲッティンゲン、ドイツ）に従うファストブロット（Ｆａｓｔｂｌｏｔ）を用いてＰＶＤＦ膜（ロス（Ｒｏｔｈ）、カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）、ドイツ）にブロットした。５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳によるブロッキングの後、膜をそれぞれの一次抗体（β−アクチンに対して１：２０．０００、その他すべての抗体に対して１：１０００）とともに４℃にて一晩インキュベートした。洗浄後、膜を二次抗体（抗ＩｇＧ−ＨＲＰ  １：２０００、ＣＳＴ、フランクフルト（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ）、ドイツ）とともに室温にて１ｈインキュベートし、再び洗浄し、ＦＵＳＩＯＮソロ（Ｓｏｌｏ）（ペクラボ（ｐｅｑｌａｂ）、エアランゲン（Ｅｒｌａｎｇｅｎ）、ドイツ）および製造者のプロトコル（ＧＥヘルスケア／アマシャム・バイオサイエンシズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）、ドイツ）に従う適切なＥＣＬプライム（Ｐｒｉｍｅ）ウエスタンブロッティング検出試薬を用いて、化学ルミネセンスイメージングによってモニタした。
【００９４】
抗体：
Ａｋｔ、ホスホ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８  ＆  Ｓｅｒ４７３）、ＧＳＫ−３β、ホスホ−ＧＳＫ−３β（Ｓｅｒ９）、ｐ４２／４４マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ：ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）、ホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、Ｓ６リボソームタンパク質、ホスホ−Ｓ６リボソームタンパク質（Ｓｅｒ２３５／２３６）、４Ｅ−ＢＰ１，ホスホ−４Ｅ−ＢＰ１（Ｓｅｒ６５）に対して特異的なウサギ抗体、ならびにＨＲＰ結合抗ウサギおよび抗マウス二次抗体を、セル・シグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）（フランクフルト、ドイツ；ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、ＭＡ）より購入した。マウス抗β−アクチン抗体は、シグマアルドリッチ（ダイゼンホーフェン（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）、ドイツ；セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ＭＯ）より得られた。ＫＩＴおよびホスホ−ＫＩＴ（Ｔｙｒ７０３）に対するウサギポリクローナル抗体は、それぞれＤＡＫＯ（カーピンテリア（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ）、ＣＡ）およびセル・シグナリング（ビバリー、ＭＡ）からのものであった。
【００９５】
＜実施例５＞
キナーゼにおける界面蛍光ラベル（ｉＦＬｉＫ：ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌａｂｅｌｓ  ｉｎ  Ｋｉｎａｓｅｓ）システムを用いたＡｋｔキナーゼ阻害の動力学的分析
蛍光ラベルした全長Ａｋｔ１に関する解離速度を定めるために、キナーゼにおける界面蛍光ラベル（ｉＦＬｉＫ）システムを用いて、式（１ａ）、（１ｂ）、（２ａ）および（２ｂ）に従う化合物に動力学的分析を受けさせた。ｉＦＬｉＫ調査は、０．１ｎＭから１２．５μΜの範囲の濃度を用いて、「生化学的アッセイ」において説明されるとおりに行われた。さらに式（１ａ）、（１ｂ）、（２ａ）および（２ｂ）の化合物に対して、比較のために公知のアロステリックＡｋｔ阻害剤ＭＫ−２２０６（セレックケム（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ））およびＡＴＰ競合的阻害剤ＧＳＫ６９０６９３（セレックケム）を用いた。フルオロフォアラベル組み換えＡｋｔ１の最終濃度は２００ｎＭであった。
【００９６】
図３は、化合物の結合分析の結果を示す。図３から分かるとおり、式（１ａ）および（２ａ）に従う化合物は、ＭＫ−２２０６と類似の結合特徴を示した。しかし式（２ａ）の化合物は、蛍光ラベルＡｋｔ１に対して式（１ａ）の化合物よりも低い親和性を示した。一方、式（１ｂ）および（２ｂ）に従う化合物は、類似の親和性で突然変異全長Ａｋｔ１に結合した。
【００９７】
次の表１は、式（１ａ）、（１ｂ）、（２ａ）および（２ｂ）に従う化合物ならびにＡｋｔ阻害剤ＭＫ−２２０６およびＧＳＫ６９０６９３に対する最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）および解離定数（Ｋｄ）を示す。
【００９８】
表１：最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）および解離定数（Ｋｄ）：
【００９９】
【表１】
0006715921.tif 000009
【０１００】
ｎ．ｒ．＝１００μＭまで応答なし（ｎｏ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）
【０１０１】
この結果は、本発明の式（１ａ）に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体および参照阻害剤ＭＫ−２２０６に対して類似の結合親和性を示した（それぞれ５８±８ｎＭおよび６９±１３ｎＭ）。式（２ａ）に従う化合物は、Ａｋｔ１に対して有意に低い結合親和性を示した（７９５±１７６ｎＭ）。しかし、式（１ｂ）および（２ｂ）に従う対応物は、類似のＫｄ値を有した（それぞれ６２±１２ｎＭおよび７９７±１８０ｎＭ）。これらの結果は、これらの調査に用いられた全長Ａｋｔタンパク質が、両方のＡループシステインを含むすべての溶剤に露出するシステインをセリンに置換することによって共有結合形成を防ぐことによる部位特異的フルオロフォアラベリングのための突然変異を起こしているという事実と一致した。
【０１０２】
これらの結果は、２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体が、イミダゾ−１，２−ピリジンコアを有する比較例３および４の式（２ａ）および（２ｂ）の化合物よりもかなり良好な最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）および解離定数（Ｋｄ）を示すことを示す。
【０１０３】
加えて、式（２８）、（２９）、（３０）、（３１）、（３２）および（３３）に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体にも、ｉＦＬｉＫシステムを用いた動力学的分析を受けさせた。式（２７）の化合物は下に与えた構造を有する。
【０１０４】
【化７】
0006715921.tif 000010
【０１０５】
これは式（３２）の化合物に類似しているが、アルケニル基を有さないためにＡｋｔと共有結合を形成できない。
【０１０６】
次の表２は、式（２８）、（２９）、（３０）、（３１）、（３２）および（３３）に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体の最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）および解離定数（Ｋｄ）を示す。
【０１０７】
表２：最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）および解離定数（Ｋｄ）：
【０１０８】
【表２】
0006715921.tif 000011
【０１０９】
これらの結果は、式（２８）、（２９）、（３０）、（３１）、（３２）および（３３）に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体もＡｋｔの有用な阻害剤であり、特に式（３０）および（３２）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体が良好な最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）および解離定数（Ｋｄ）を示したことを示す。
【０１１０】
＜実施例６＞
活性に基づく調査を用いた動力学的分析
活性化全長ｗｔＡｋｔ１（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を使用した活性に基づく調査において、マイケル受容体として機能する反応性アルケニル基の影響の可能性をさらに評価し、阻害力価をさらに評価した。実施例５と同様に、式（１ａ）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体ならびに式（１ｂ）、（２ａ）および（２ｂ）の化合物、ならびに公知のアロステリックＡｋｔ阻害剤ＭＫ−２２０６およびＡＴＰ競合的阻害剤ＧＳＫ６９０６９３を比較のために用いた。０．００１ｎＭから１２．５μΜの範囲の濃度を用いた。組み換えＡｋｔ１の最終濃度は１２０ｐＭであった。
【０１１１】
図４は、活性に基づくスクリーニングの結果を示す。図４から分かるとおり、アルケニル基を含む式（１ａ）および（２ａ）の化合物は、全長ｗｔＡｋｔ１に対してそれぞれそれらの対応物（１ｂ）および（２ｂ）よりも高い阻害力価を示した。特に、式（１ａ）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体は、参照阻害剤ＧＳＫ６９０６９３（ＡＴＰ競合的阻害剤）およびＭＫ−２２０６（アロステリック、ＰＨドメイン依存性阻害剤）よりも強力にＡｋｔ１を阻害した。
【０１１２】
式（２ａ）の化合物は、参照阻害剤ＭＫ−２２０６およびＧＳＫ６９０６９３に比べて穏やかにＡｋｔキナーゼ活性を阻害したが（それぞれ３７２±４８ｎＭ対７±１ｎＭおよび２±１ｎＭ）、式（１ａ）に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体はｎＭ以下の最大半量阻害濃度を示した（０．２±０．１ｎＭ）。これに対し、Ａｋｔ１の最大半量阻害を誘発するために、それぞれ１０倍および４倍高い濃度の式（１ｂ）および（２ｂ）の化合物が必要であった。このことは、それらの力価が高くなった理由として、式（１ａ）に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体および式（２ａ）の化合物によるＡｋｔの共有結合修飾を示唆する。
【０１１３】
＜実施例７＞
時間依存的な活性に基づくスクリーニング
１×１０−４ｎＭから１２．５μＭの範囲の濃度の式（１ａ）に従う化合物と、１×１０−３ｎＭから１２．５μＭの範囲の濃度の式（１ｂ）に従う化合物およびアロステリックＡｋｔ阻害剤ＭＫ−２２０６とを、活性化全長ｗｔＡｋｔ１とともにそれぞれ１０、３０、６０、または３００分間インキュベートし、一方で酵素および停止反応の持続時間は一定に保った。組み換えＡｋｔ１の最終濃度は１２０ｐＭであった。
【０１１４】
図５は、時間依存的な活性に基づくスクリーニングの結果を示す。図５ａから分かるとおり、式（１ａ）の化合物は、共有結合モードの作用を示す時間依存的用量応答曲線を示す。図５ｂおよび図５ｃにそれぞれ示されるとおり、ＭＫ−２２０６および式（１ｂ）の化合物に対する違いは観察されず、したがって可逆的な結合機構および動的平衡結合が示された。
【０１１５】
これらの時間依存的ＩＣ５０の決定はさらに、式（１ａ）に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体に対する共有結合モードの作用を示した。
＜実施例８＞
【０１１６】
ｋｉｎａｃｔ／Ｋｉの決定による動力学的特徴付け
式（１ａ）および（２ａ）に従う化合物を、１分から１２０分の範囲の期間だけ活性化全長ｗｔＡｋｔ１（ミリポア）とともにインキュベートし、一方で酵素および停止反応の持続時間は一定に保った。算出されたＩＣ５０値をインキュベーション時間に対してプロットし、上述のとおりにｋｉｎａｃｔおよびＫｉを定めるために文献に記載されるとおりにデータを適合させた。
【０１１７】
図６は、図６ａにおいては式（１ａ）、図６ｂにおいては（２ａ）に従う化合物に対するインキュベーション時間に対してプロットされたＩＣ５０値を示す。３回の独立した測定から得られた代表的な結果が示されており、３つ組の測定値からｋｉｎａｃｔ、Ｋｉおよびｋｉｎａｃｔ／Ｋｉに対する平均±ｓ．ｄ．を算出した。ｋｉｎａｃｔ／Ｋｉは、式（１ａ）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体に対して３．２９±０．４０μΜ−１ｓ−１、式（２ａ）に従う化合物に対して０．００２３±０．０００３μΜ−１ｓ−１と算出された。
【０１１８】
ｋｉｎａｃｔ／Ｋｉの決定による化合物の動力学的特徴付けは、親和性および共有結合複合体形成の両方に関して、式（２ａ）の化合物よりも式（１ａ）の化合物に対して有意に向上した阻害プロファイルを示した。
【０１１９】
＜実施例９＞
ＥＳＩ−ＭＳを用いたＡｋｔ１に対する結合特性の決定
「質量分析」において説明したとおり、Ａｋｔ１に対するそれぞれの結合特性を調査するためにＥＳＩ−ＭＳを用いた。質量分析の結果は、組み換え野生型Ａｋｔ１を式（１ａ）および（２ａ）に従う化合物で処理した結果、ＤＭＳＯで処理した対照Ａｋｔ１に比べて、それぞれ５８７Ｄａおよび５７２Ｄａの対応する単一ラベルＡｋｔ１と同等の質量増加がもたらされることを示した。これらの結果は、活性に基づく調査において観察された傾向と相関する、予測される共有結合モードをさらに実証するものである。
【０１２０】
＜実施例１０＞
ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析を用いたＡｋｔ１に対する結合特性の決定
「質量分析」において説明したとおり、式（１ａ）および（２ａ）に従う化合物で処理したＡｋｔのトリプシン消化後にＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析を用いて、Ａｋｔ１に対する結合をさらに定めた。
【０１２１】
全長ｗｔＡｋｔ１をＳｆ９昆虫細胞内で発現し、ＡＫＴＡピュアＦＰＬＣシステムによって精製した。精製タンパク質を、２倍モル濃度過剰の式（１ａ）および（２ａ）に従う化合物とともにそれぞれインキュベートし、標準的なプロトコルに従うＳＤＳ−ＰＡＧＥの後にトリプシンで消化した。式（１ａ）および（２ａ）に従う化合物の両方によって修飾されたＣｙｓ２９６およびＣｙｓ３１０を含有するペプチドフラグメントを、配列カバレッジ＞９０％によって識別した。このことは、式（１ａ）および（２ａ）に従う化合物がＣｙｓ２９６およびＣｙｓ３１０においてＡｋｔ１と共有結合することを支持するものである。
【０１２２】
動力学的分析は、本発明に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体が、Ａｋｔキナーゼに対する有望な生化学的阻害力価を提供することを示す。さらに質量分析は、式（１ａ）に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体が、Ｃｙｓ２９６およびＣｙｓ３１０においてＡｋｔをさらに共有結合的に修飾するＡｋｔキナーゼのアロステリック阻害剤として作用することを示した。よって、アルケニル基が全長Ａｋｔの酵素的に不活性な立体構造を安定化すると考えられる。
【０１２３】
＜実施例１１＞
Ａｋｔキナーゼに対する式（１ａ）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体の選択性の決定
本発明に従う式（１ａ）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体に対して、ａ）ＡＧＣキナーゼファミリーのメンバー、ｂ）ＰＨドメインを特徴とするキナーゼ、および／またはｃ）活性化ループにシステインを含むキナーゼに焦点を合わせて、類似の特徴を有する他のプロテインキナーゼを超えるＡｋｔ１に対する選択性を調べた。これらの基準に適合する１００の異なるプロテインキナーゼを評価した。
【０１２４】
１μＭの化合物濃度において、１００の異なるプロテインキナーゼのパネルに対して式（１ａ）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体をスクリーニングした。測定は２つ組で行われ、ＳｅｌｅｃｔＳｃｒｅｅｎ（登録商標）キナーゼ・プロファイリング・サービシズ（Ｋｉｎａｓｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）（ライフ・テクノロジーズ）の活性に基づくＺ’ＬＹＴＥ（登録商標）キナーゼアッセイを用いて、各個々のキナーゼの特に明白なＡＴＰ  ＫＭにおいて行われた。図７は、プロファイリングデータの表を示す。示されるデータは、評価されるキナーゼに対する２回の独立した測定の平均％阻害を示す。
【０１２５】
図７から分かるとおり、キナーゼのパネル内で、Ａｋｔアイソフォーム１、２および３のみが、１μＭの濃度の式（１ａ）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体においてそれぞれ９８％、９６％、および８３％阻害によって有意に対処された。残り９７のキナーゼは４０％未満しか阻害されず、キナーゼＭＡＰ４Ｋ５が３７％阻害によって４位に順位付けされた。
【０１２６】
結論として、本発明の化合物は、高い配列および構造的相同性を示すキナーゼに影響することなく、Ａｋｔアイソフォームを排他的に標的とする優れた選択性プロファイルを示した。
【０１２７】
＜実施例１２＞
癌細胞におけるＡｋｔ阻害の決定
前立腺癌（ＰＣ３）、乳癌（ＢＴ４７４）、および消化管間葉性腫瘍（ＧＩＳＴ−Ｔ１）株細胞を用いた細胞の調査において、式（１ａ）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体によるＡｋｔキナーゼの阻害をさらに調査した。
【０１２８】
これらの株細胞は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路に遺伝学的病変（ＰＣ３：ＰＴＥＮ−／−、ＢＴ４７４：ＰＩ３Ｋ  ｍｕｔ、ＨＥＲ２＋；ＧＩＳＴ  Ｔ１：ｃ−ＫＩＴ  ｍｕｔ）を有し、基礎ホスホ−Ａｋｔレベルに相違を示す。これらの株細胞をウエスタンブロット分析に対するモデル系として使用して、式（１ａ）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体の細胞侵入効果と、細胞Ａｋｔ１および下流のＧＳＫ３βリン酸化状態に対するその影響との両方を調査した。細胞培養、ウエスタンブロッティングは上述と同様に行った。
【０１２９】
前立腺癌（ＰＣ３）および乳癌（ＢＴ４７４）細胞を、０．０１μΜ、０．１μΜ、０１μΜ、および１０μΜの濃度の式（１ａ）の化合物および参照化合物としてのＭＫ−２２０６のそれぞれとともに２４時間インキュベートした。対照はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）で処理した。
【０１３０】
図８は、結果として得られた前立腺癌（ＰＣ３）および乳癌（ＢＴ４７４）細胞におけるＡｋｔ１およびリン酸化Ａｋｔ１、ならびにＧＳＫ３βおよびリン酸化ＧＳＫ３βのウエスタンブロットを示す。ロード対照としてβ−アクチンを用いた。図８から分かるとおり、ウエスタンブロットは、ＰＣ３およびＢＴ４７４癌株細胞におけるＴｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３の両方におけるｐＡｋｔ１の感受性の用量依存的減少を示す。この結果は、式（１ａ）の共有結合−アロステリック阻害剤が、Ａｋｔ１の発現レベルに影響することなく乳癌（ＢＴ４７４）および前立腺癌（ＰＣ−３）細胞において用量依存的態様でＡｋｔ１の脱リン酸化を引き起こすことを示す。これらの結果は、臨床的候補のＭＫ２２０６と類似の式（１ａ）の化合物による処理の際にＡｋｔ１基質のＧＳＫ３βのリン酸化が減少することと相関した。
【０１３１】
消化管間葉性腫瘍細胞（ＧＩＳＴ−Ｔ１）細胞を、それぞれ０．００１μΜ、０．００５μΜ、０．０１μΜ、０．０５μΜ、および０．１μΜの濃度の式（１ａ）の化合物とともに２４時間インキュベートした。参照化合物として１μΜ  ＭＫ−２２０６、１μΜ  ＧＳＫ６９０６９３、および０．１μΜイマチニブを用いた。対照はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処理した。
【０１３２】
図９は、結果として得られたＫＩＴ依存性ＧＩＳＴ−Ｔ１細胞における定められたキナーゼのウエスタンブロットを示す。消化管間葉性腫瘍細胞（ＧＩＳＴ−Ｔ１）は、恒常的に活性のＫＩＴに関する高い基礎ｐＡｋｔ１レベルを示す。ＫＩＴ阻害に対する正の対照として、イマチニブを用いた。図９から分かるとおり、式（１ａ）の化合物による処理は、低いナノモル濃度における細胞ｐＡｋｔ１レベルを低減させ、これは下流の標的Ｓ６および４ＥＢＰ１のリン酸化の減少と相関する。他の関連プロテインキナーゼｃ−ＫＩＴおよびＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）のリン酸化は、式（１ａ）の化合物による処理に影響されなかった。ＫＩＴに対して、成熟グリコシル化形および未成熟形を表す２つのバンドがみられる。ＭＡＰＫに関して、これらのバンドはＥｒｋ１およびＥｒｋ２に関する。
【０１３３】
このウエスタンブロットは、式（１ａ）の化合物が癌細胞におけるＡｋｔ１リン酸化を損なうことを実証する。さらに、ＫＩＴ依存性のＧＩＳＴ−Ｔ１細胞を用いて、この結果は細胞環境におけるＡｋｔ１に対する式（１ａ）の化合物の選択性を実証し、一方でたとえばｃ−ＫＩＴおよびＥｒｋ１／２などのさらなる発癌性プロテインキナーゼを残すことを示す。
【０１３４】
前立腺癌、乳癌、および消化管間葉性腫瘍細胞における結果は、式（１ａ）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体が、さまざまな癌株細胞におけるＡｋｔの細胞透過性のエフェクターであることを実証する。
【０１３５】
これらの観察は、特に異常に活性化されたＡｋｔを伴う腫瘍に対する共有結合的調節を行う抗癌薬の開発、およびさらなる医薬品化学アプローチに２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体を用いるという見通しを導入する。
【０１３６】
＜実施例１３＞
Ａｋｔキナーゼ阻害の生化学的分析
野生型Ａｋｔ１および癌関連突然変異体Ａｋｔ１＿Ｅ１７Ｋの阻害に対する１４の物質の阻害力価を実施例６で説明したのと同様に定め、ここでの実験設定の唯一の相違点は、一連の化合物希釈物の調製のために、手動調製の代わりにＥＣＨＯ５２０液体操作システム（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ラボサイト社（Ｌａｂｃｙｔｅ  Ｃｏｒｐ．））を使用することであった。Ｅ１７Ｋ突然変異を有する全長Ａｋｔ１タンパク質は、バイオゾル（Ｂｉｏｚｏｌ）から購入した。位置１７のグルタミンのリジンによる置換は、プロテインキナーゼの過剰な活性化をもたらすだけでなく、参照分子ＭＫ−２２０６に対して示されるとおり、可逆的アロステリック阻害剤に対する抵抗性も伴う。しかし、ＡＴＰ競合的Ａｋｔ阻害剤、たとえばＧＤＣ−００６８（セレックケム）などは、このＡｋｔの突然変異形に対する力価の低減を示さない。
【０１３７】
次の表３は、野生型Ａｋｔ１および突然変異体Ａｋｔ１＿Ｅ１７Ｋに対する、式（１ａ）、（２８）から（３３）、（３６）、（４５）、（４６）、（４７）、（４８）、（４９）、および（５０）に従う化合物、ならびにＡｋｔ阻害剤ＭＫ−２２０６およびＧＤＣ−００６８の最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。
【０１３８】
表３：野生型Ａｋｔ１およびＡｋｔ１＿Ｅ１７Ｋに対する最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）：
【０１３９】
【表３】
0006715921.tif 000012
【０１４０】
表３にみられるとおり、共有結合−アロステリックＡｋｔ阻害剤についての阻害の減少は、可逆的アロステリック阻害剤よりも顕著ではなかった。したがって、本発明の化合物は抵抗性を克服して有効かつ選択的にＡｋｔ１＿Ｅ１７Ｋに対処するための新たな戦略を表すものかもしれない。
【０１４１】
表１および表２と比べたときのＩＣ５０値の相違は、一連の化合物希釈物の調製のために用いた非接触の超音波液体操作システムＥＣＨＯ５２０（ラボサイト）の適用によって生じている。
【０１４２】
＜実施例１４＞
野生型Ａｋｔ１および突然変異体Ａｋｔ１＿Ｅ１７Ｋに対する動力学的パラメータ（Ｋｉ、ｋｉｎａｃｔ）の決定
化合物の動力学的特徴付けを実施例８で説明したのと同様に行い、ここでの実験設定の唯一の相違点は、一連の化合物希釈物の調製のために、手動調製の代わりにＥＣＨＯ５２０液体操作システム（ラボサイト社）を使用することであった。次の表４は、Ａｋｔ１に対する式（１ａ）、（３０）から（３３）、（３６）、（４５）、および（４６）に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体の動力学的パラメータ（Ｋｉ、ｋｉｎａｃｔ）を示す。
【０１４３】
表４：活性化全長Ａｋｔ１に対する共有結合阻害剤に対する動力学的パラメータＫｉ、ｋｉｎａｃｔ、およびｋｉｎａｃｔ／Ｋｉ：
【０１４４】
【表４】
0006715921.tif 000013
【０１４５】
表４にみられるとおり、本発明の化合物の動力学的特徴付けは、可逆的な酵素−阻害剤複合体の形成（Ｋｉ）、ならびに反応性システイン２９６および３１０と、本発明の化合物の弾頭部分との間の共有結合の形成（ｋｉｎａｃｔ）における相違を明らかにした。式１ａ、３０、３２、３３、および４６の最も強力な阻害剤に対して、０．１１０〜０．１３４μΜ−１ｓ−１の範囲の類似の速度の不可逆的酵素不活性化が観察され、一方で解離定数（Ｋｉ）のより強く明白な相違を観察できた（１．０〜１８．９ｎＭ）。よって、本発明の化合物の阻害効率は、不可逆的な付加物形成の速度よりも酵素へのリガンドの初期の可逆的結合の方により依存するようである。
【０１４６】
図６と比べたときの動力学的パラメータＫｉ、ｋｉｎａｃｔ、およびｋｉｎａｃｔ／Ｋｉ値の相違は、一連の化合物希釈物の調製のために用いた非接触の超音波液体操作システムＥＣＨＯ５２０（ラボサイト）の適用によって生じている。
【０１４７】
加えて、表５は突然変異体Ａｋｔ１＿Ｅ１７Ｋに対する式（１ａ）および（３３）に従う２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体の動力学的パラメータ（Ｋｉ、ｋｉｎａｃｔ）を示す。
【０１４８】
表５：活性化全長突然変異体Ａｋｔ１＿Ｅ１７Ｋに対する共有結合阻害剤に対する動力学的パラメータＫｉ、ｋｉｎａｃｔ、およびｋｉｎａｃｔ／Ｋｉ：
【０１４９】
【表５】
0006715921.tif 000014
【０１５０】
表５にみられるとおり、式（１ａ）および（３３）の２つの最も強力な阻害剤は、突然変異体Ａｋｔ１−Ｅ１７Ｋに対して（それぞれ０．１２９ｓ−１および０．１０５ｓ−１）野生型Ａｋｔ１に対するもの（それぞれ０．１１６ｓ−１および０．１１０−１）と類似の不活性化速度（ｋｉｎａｃｔ）を示す。しかし、突然変異体Ａｋｔ１＿Ｅ１７Ｋタンパク質に対する親和性（Ｋｉ）の低減（それぞれ９４ｎＭおよび１３９ｎＭ）の結果、Ａｋｔ１＿Ｅ１７Ｋに対する生化学的力価（ＩＣ５０）の有意な損失がもたらされる。これらの結果は、可逆的阻害剤に対する力価のより顕著な損失とよく一致している。なぜなら、これらのリガンドは標的タンパク質に対するそれらの親和性のみに依存するからである。
【０１５１】
＜実施例１５＞
マウスモデルにおける薬物動態学的パラメータの評価
最大耐用量（ＭＴＤ：ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  ｄｏｓｅ）および薬物動態学的（ＰＫ：ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ）パラメータを定めるために、最良のＩＣ５０（１ｈプレインキュベーション時間において）ならびにＡｋｔ１に対する最高の親和性（Ｋｉ）および妥当な反応性（ｋｉｎａｃｔ）を示したリード化合物１ａをマウスモデルにおいて評価した。したがって、増加する濃度の化合物１ａをＰＢＳ／ＰＥＧ２００（６０：４０）に溶解したものを、ＲｊＯｒｌ：ＳＷＩＳＳマウス（ジャンビエル・ラブス（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ））に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射して、ＭＴＤ２０ｍｇ／ｋｇにした。ＰＫプロファイリングのために、ＣＤ１マウスをプローブ化合物１ａによって、それぞれ２ｍｇ／ｋｇを用いて静脈内（ｉ．ｖ．）処置、２０ｍｇ／ｋｇを用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）処置、および２０ｍｇ／ｋｇを用いて経口（ｐ．ｏ．）処置した。５、１５、４５、および１３５分後に血液サンプルを集め、１５０００×ｇ、４℃にて１０分間の遠心分離によって血漿を分離した。血液の凝固を防ぐために、血漿にＥＤＴＡを加えた。特定の血漿サンプル中の化合物濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって次のとおりに定めた。
【０１５２】
２．５μＬブランクＤＭＳＯおよび内部標準（グリセオフルビン、１μＭ）を含有する８０μＬの氷冷アセトニトリルを２０μｌの血漿に加えた後、１３０００ｒｐｍ（４℃）にて１０ｍｉｎ遠心分離することによって、サンプルおよびブランクを調製した。６５μＬの上清を６５μＬのＬＣ−ＭＳグレードの水で希釈した。サンプルをろ過して（ミリポアＭＳＲＬＮ０４５０親水性）、ＬＣ−ＭＳ測定を受けさせた。分析物ストック溶液（１０ｍＭ、ＤＭＳＯ中）をＤＭＳＯで希釈して、次の濃度のＤＭＳＯストック溶液を得た。１０、５、２．５、１、０．５、０．２５、０．１、０．０５、０．０２５、０．０１、０．００５、０．００２５μΜ。２．５μＬの対応するＤＭＳＯストック溶液を２０μＬのブランク血漿に加えた後、内部標準を含有する８０μＬの氷冷アセトニトリルを加えた。サンプルを１３０００ｒｐｍにて４℃で１０ｍｉｎ遠心分離した。６５μＬの上清を６５μＬのＬＣ−ＭＳグレードの水で希釈して、ＬＣ−ＭＳ分析を受けさせた。２．５μＬのＤＭＳＯストック溶液（５、０．５、および０．０５μΜ）を２０μＬの血漿に加えることによって、３つの異なるＱＣ（ｎ＝３）の組を調製した。その後、サンプルを上述のとおりに取り扱った。島津（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ＬＣ２０ＡＤＸＲ溶剤運搬ユニット（Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｕｎｉｔ）、島津ＳＩＬ３０ＡＣＭＰオートサンプラー、およびＡＢＳｃｉｅｘ  Ｑｔｒａｐ５５００  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムを用いて、すべてのサンプルを分析した。したがって、６０℃にてアジレント・ポロシェル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ）Ｃ１８、２．７μｍカラム（２．１ｍｍ×５０ｍｍ）を用いて２μＬのサンプルが注入および分離され、０．３ｍｉｎの５％の溶剤Ｂから始めて、その後０．６ｍｉｎにわたる最大１００％の溶剤Ｂの勾配（流速１ｍＬ／ｍｉｎ）が続き、ここで０．１％ギ酸の水溶液を溶剤Ａ、０．１％ギ酸のアセトニトリル溶液を溶剤Ｂとした。Ａｎａｌｙｓｔ  １．６．２ソフトウェア（サイエックス（Ｓｃｉｅｘ））を用いてデータ評価を行った。
【０１５３】
図１０は、それぞれの濃度時間プロファイルを示す。図１０から分かるとおり、濃度時間プロファイルは、注入の直後（ｉ．ｖ．、１．０５μΜ）、４５ｍｉｎ後（ｉ．ｐ．、１．１５μΜ）、および１５ｍｉｎ後（ｐ．ｏ．、０．６２μΜ）に式（１ａ）の化合物の最大血漿濃度を示した。これらの知見は、良好な生物学的利用率（ｐ．ｏ．１０．８％；またはｉ．ｐ．４７．７％）を示す。
【０１５４】
＜実施例１６＞
タンパク質Ｘ線結晶学
化合物の予測された結合モードの確認および可視化の両方のために、タンパク質Ｘ線結晶学を行った。したがって、式（１ａ）の化合物の存在下でＡｋｔ１を共結晶化し、得られた結晶をスイス・ライト・ソース（Ｓｗｉｓｓ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ）（パウル・シェラー研究所（Ｐａｕｌ  Ｓｃｈｅｒｒｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ）、フィリンゲン（Ｖｉｌｌｉｎｇｅｎ））にて分析した。集められた回折データをＸＤＳで処理し、プログラムスカラ（Ｓｃａｌａ）を用いて調整した。複合結晶構造を２．５Åの解像度まで精密にした。
【０１５５】
図１１は、化合物（１ａ）の存在下で共結晶化されたＡｋｔ１の、２．５Åの解像度まで精密にされた結晶構造を示す。図１１は、Ｃｙｓ２９６の側鎖に対する式（１ａ）の２，３−ジフェニル−１，６−ナフチリジン−５−オン誘導体の共有結合形成を確証するものである。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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