(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）複製起点カセットのセットと、
（ｉｉ）選択可能マーカーカセットのセットと、
（ｉｉｉ）１つ又は２つ又はそれ以上の機能的カセットのセットと、
（ｉｖ）対象の配列を含む標的カセットと
を取得するステップと、ここで、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の各々のカセットが異なる器に入れられており、かつ、前記カセットは二本鎖ＤＮＡ分子であり、
（ｂ）複製起点カセット、選択可能マーカーカセット及び１つ又は２つ又はそれ以上の機能的カセットを、前記（ａ）のセットから選択するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で選択したカセットと前記標的カセットとの集合反応を行うステップと、ここで、前記カセットが、対象の宿主細胞に形質転換又はトランスフェクトすることができる生成物を生じるために互いにハイブリダイズする末端を含み、前記カセットの集合反応が、（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｖｉ）フラップエンドヌクレアーゼ（ただし、エキソヌクレアーゼ活性を有するものを除く）、及び（ｖｉｉ）ＤＮＡリガーゼを用いて行われ、ここで、前記カセットの集合反応は、制限酵素およびエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いずに行われ、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）の生成物を宿主細胞に導入するステップと、
（ｅ）前記１つ又は２つ又はそれ以上の選択された機能的カセット、前記標的カセット、前記複製起点カセット及び前記選択可能マーカーカセットを含むプラスミドを内部に有する形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を選択するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記１つ又は２つ又はそれ以上の機能的カセットのセットが、
プロモーターカセットのセット、
Ｎ末端精製タグカセットのセット、
Ｃ末端精製タグカセットのセット、
シャトル複製起点カセットのセット、
ターミネーターカセットのセット、
タンパク質発現エンハンサーカセットのセット、及び、
シャトル選択可能マーカーカセットのセット
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的カセットが、ポリペプチド又は調節ＲＮＡのコード配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記機能的カセットが異なる複数のプロモーターであり、前記コード配列が選択されたプロモーターに動作可能に連結したプラスミドが生じる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記選択されたプロモーターが、原核生物又は真核生物の宿主細胞において活性を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記機能的カセットが異なる複数のＮ末端精製タグをコードし、前記ポリペプチドとＮ末端精製タグとの融合物をコードするプラスミドが生じる、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記機能的カセットが異なる複数のＣ末端精製タグをコードし、前記ポリペプチドとＣ末端精製タグとの融合物をコードするプラスミドが生じる、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）において、各々の末端が、異なるカセットの他の１つの末端とハイブリダイズする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記複製起点カセットが、原核細胞及び真核細胞において動作可能である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記選択するステップ（ｂ）が、
（ｉ）同じ機能の第１の機能的カセットのセットから第１の機能的カセットを選択するステップと、
（ｉｉ）同じ機能の第２の機能的カセットのセットから第２の機能的カセットを選択するステップと、
を含み、前記第１の機能的カセット、前記第２の機能的カセット、前記標的カセット、前記複製起点カセット及び前記選択可能マーカーカセットを含む形質転換可能又はトランスフェクト可能な生成物が生じる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）複製起点カセットのセットと、
（ｉｉ）選択可能マーカーカセットのセットと、
（ｉｉｉ）１つ又は２つ又はそれ以上の機能的カセットのセットと、
（ｉｖ）対象の配列を含む標的カセットと
を含むキットであって、
前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の各々のカセットが異なる器に入れられており、かつ、
前記複製起点カセットのいずれか、前記選択可能マーカーカセットのいずれか及び前記機能的カセットのいずれかと、前記標的カセットとのハイブリダイゼーションにより、宿主細胞に導入することができる形質転換可能又はトランスフェクト可能な生成物が生じる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１２】
同じ機能の第１の機能的カセットのセットからの第１の機能的カセットと、
同じ機能の第２の機能的カセットのセットからの第２の機能的カセットと、
を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
１つ又は複数の機能的カセットのセットが異なるプロモーターのセットを含む、請求項１１又は１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記プロモーターが、原核生物又は真核生物の細胞において活性を有する、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
１つ又は複数の機能的カセットのセットが、Ｎ末端精製タグをコードするカセットのセットを含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１６】
１つ又は複数の機能的カセットのセットが、Ｃ末端精製タグをコードするカセットのセットを含む、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
１つ又は複数の機能的カセットのセットがターミネーターのセットを含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
合成生物学は、天然に見られない新たな細胞機能及び細胞系を設計及び構築することを目的とした生化学及びエンジニアリング科学の両方を用いる比較的新しい研究分野である。これらの野心的目標を達成するためには、設計の単純化及び分子クローニングツールの使用が最も重要である。
【発明の概要】
【０００２】
互いにハイブリダイズして、宿主細胞に導入することができる分子を生成する相補的な末端を含有する様々な既製のカセットを集合させることによって、様々なプラスミドを作製する方法が本明細書で提供される。このため、カセットを含有するプラスミド分子から構成される（composed of）所望の特性を有する宿主細胞の選択は、既存の分子クローニングツールに比べて顕著な改善を示す。該方法を行うためのキットも提供する。
【０００３】
当業者は添付の図面が例示のみを目的とすることを理解するであろう。図面は本教示の範囲を限定することを何ら意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】本方法に使用する構成要素の特徴の一部の概略図である。
【図２】本方法の一実施態様（implementation）の概略図である。
【図３】５つのカセットを含有するベクターを集合させることができる方法の概略図である。
【図４】例示的なタンパク質発現ベクター構築キットの、可能性のある構成要素の一部（Ｎ末端精製タグ）を示す図である。
【図５】例示的なタンパク質発現ベクター構築キットの、可能性のある構成要素の一部（Ｃ末端精製タグ）を示す図である。
【図６】例示的なタンパク質発現ベクター構築キットの、可能性のある構成要素の一部（Ｃ末端精製タグ及びＮ末端精製タグ）を示す図である。
【図７】バイシストロン性ベクターの作製に使用することができる例示的なキットの、可能性のある構成要素の一部を示す図である。
【図８】タンパク質相互作用スクリーニングベクターの作製に使用することができる例示的なキットの、可能性のある構成要素を示す図である。
【図９】タンパク質相互作用スクリーニングベクターの作製に使用することができる別のキットの、可能性のある構成要素を示す図である。
【図１０】選択されたカセットの可能な全ての組合せを含有するライブラリーを構築することができる方法を示す図である。
【図１１】カセット集合方法を用いたＰｆｕファージｐｏｌ遺伝子の作製を示す図である。
【図１２】無作為に選んだクローンのコロニーＰＣＲの結果を示す図である。レーンＭ−１ｋｂマーカー；上列、レーン１〜１６、正確なサイズのｐｏｌ遺伝子（４つのｐｏｌ断片＋ベクター；数え切れないほど多くのコロニー）；下列、レーン１〜８（ｐｏｌ断片なし＋ベクター；６０個のコロニー）；下列、レーン９〜１６（３つのｐｏｌ断片＋ベクター；３５個のコロニー）。
【図１３】概念実証／原理証明用の標的ベクターの概略図である。
【図１４】原理証明用クローンＡ、Ｂ及びＣの制限消化を示す図である。
【図１５】原理証明用クローンＡ、Ｂ及びＣの配列アラインメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
［定義］
例示的な実施形態をより詳細に記載する前に、本明細書に用いられる用語の意味及び範囲を説明及び規定する以下の定義を示す。
【０００６】
数値範囲は範囲を規定する数値を含むものである。他に指定のない限り、核酸は左から右に５’→３’方向、アミノ酸配列は左から右にアミノ→カルボキシ方向でそれぞれ記載される。
【０００７】
他に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994)、及びHale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991)は、当業者に本明細書で使用される多くの用語の一般的な意味を提示する。さらに、或る特定の用語を明確にする、また参照を容易にするために下記に規定する。
【０００８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈上明白に他の指示がない限り、単数表記（"a"、"an"および"the"）は複数の指示対象を含むことに留意すべきである。例えば、「カセット（a cassette）」という用語は１つ又は２つ又はそれ以上のカセット、すなわち単一のカセット及び複数の（少なくとも２つの）カセットを指す。請求項は任意の要素を除外するように作成され得ることに更に留意されたい。そのため、この記述は請求項の要素の列挙に関連した「単に（solely）」、「のみ（only）」等の排他的な専門用語の使用、又は「消極的な」限定の使用の先行詞としての役割を果たすことを意図する。
【０００９】
「ヌクレオチド」という用語は、既知のプリン塩基及びピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環塩基も含有する部分を含むことを意図する。かかる修飾としては、メチル化プリン又はピリミジン、アシル化プリン又はピリミジン、アルキル化リボース又は他の複素環が挙げられる。加えて、「ヌクレオチド」という用語は、ハプテン又は蛍光標識を含有し、従来のリボース糖及びデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も含有し得る部分を含む。修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドには糖部分の修飾、例えばヒドロキシル基の１つ又は複数がハロゲン原子又は脂肪族基に置き換えられ、エーテル、アミン等として官能基化された修飾も含まれる。
【００１０】
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書でヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される任意の長さ、例えば約２塩基超、約１０塩基超、約１００塩基超、約５００塩基超、１０００塩基超、最大約１００００又はそれ以上の塩基のポリマーを記載するために本明細書で区別なく使用され、酵素的又は合成的に生成することができ（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号及びそれに引用される参考文献に記載されるＰＮＡ）、２つの天然核酸と類似して配列特異的に天然核酸とハイブリダイズすることができ、例えばワトソン−クリック塩基対合相互作用に関与し得る。天然ヌクレオチドとしては、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、ウラシル（それぞれＧ、Ｃ、Ａ、Ｔ及びＵ）が挙げられる。ＤＮＡ及びＲＮＡはそれぞれデオキシリボース糖骨格及びリボース糖骨格を有するが、ＰＮＡの骨格はペプチド結合によって連結した反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から構成される。ＰＮＡでは、様々なプリン塩基及びピリミジン塩基がメチレンカルボニル結合によって骨格に連結する。インアクセシブル（inaccessible）ＲＮＡとしばしば称されるロックド核酸（ＬＮＡ）は修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素と４’炭素とを結び付ける特別な架橋で修飾される。この架橋はＡ型二重鎖に見られることが多い３’−エンド（Ｎｏｒｔｈ型）配座のリボースを「ロックする」。ＬＮＡヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのＤＮＡ残基又はＲＮＡ残基と所望される場合にいつでも混合することができる。「非構造核酸」又は「ＵＮＡ」という用語は、安定性の低下を伴って互いに結合する非天然ヌクレオチドを含有する核酸である。例えば、非構造核酸はＧ’残基及びＣ’残基を含有することができ、これらの残基は安定性の低下を伴って互いに塩基対合するが、それぞれ天然のＣ残基及びＧ残基と塩基対合する能力を保持するＧ及びＣの非天然形態、すなわち類似体に相当する。非構造核酸は、ＵＮＡの開示のために米国特許出願公開第２００５０２３３３４０号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されている。
【００１１】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、約２ヌクレオチド長〜２００ヌクレオチド長、最大５００ヌクレオチド長のヌクレオチドの一本鎖多量体を表す。オリゴヌクレオチドは合成されていても又は酵素的に作製してもよく、幾つかの実施形態では４ヌクレオチド長〜１５０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマ（すなわち、オリゴリボヌクレオチドであり得る）又はデオキシリボヌクレオチドモノマを含有し得る。オリゴヌクレオチドは例えば１０ヌクレオチド長〜２０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長、３１ヌクレオチド長〜４０ヌクレオチド長、４１ヌクレオチド長〜５０ヌクレオチド長、５１ヌクレオチド長〜６０ヌクレオチド長、６１ヌクレオチド長〜７０ヌクレオチド長、７１ヌクレオチド長〜８０ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長〜１００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長〜１５０ヌクレオチド長又は１５０ヌクレオチド長〜２００ヌクレオチド長であり得る。
【００１２】
「プライマー」という用語は、本明細書で使用される場合、精製制限消化物のように天然に発生するか又は合成的に生成されるかに関わらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼ等の誘導剤の存在下、好適な温度及びｐＨに置かれた場合に合成開始点として働くことが可能なオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは一本鎖であっても又は二本鎖であってもよく、誘導剤の存在下で所望の伸長生成物の合成を始動するのに十分な長さである必要がある。プライマーの正確な長さは温度、プライマーの供給源及び方法の使用を含む多くの要因に左右される。例えば診断用途については、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には１５個〜２５個又はそれ以上のヌクレオチドを含有するが、より少ないヌクレオチドを含有していてもよい。本明細書のプライマーは、特定の標的ＤＮＡ配列の種々の鎖に実質的に相補的となるように選択される。これは、プライマーがそれらのそれぞれの鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなくてはならないことを意味している。したがって、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片がプライマーの５’末端に付着し、プライマー配列の残りの部分が鎖に相補的であってもよい。あるいは、プライマー配列が鎖の配列とハイブリダイズするのに十分に相補的であり、それにより伸長生成物の合成の鋳型が形成されるという条件で、非相補的塩基又はより長い配列がプライマーに組み入れられていてもよい。
【００１３】
「ハイブリダイゼーション」又は「ハイブリダイズする」という用語は、標準的なハイブリダイゼーション条件下で核酸鎖が第２の相補的核酸鎖とアニールしてホモ二重鎖又はヘテロ二重鎖の安定な二重鎖を形成し、同じ標準的なハイブリダイゼーション条件下で非関連核酸分子とは安定な二重鎖を形成しないプロセスを指す。二重鎖の形成は、ハイブリダイゼーション反応における２つの相補的核酸鎖のアニーリングによって達成される。ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション反応が行われるハイブリダイゼーション条件（ハイブリダイゼーションストリンジェンシーとしばしば称される）の調整によって、２つの核酸鎖が実質的又は完全に相補的な特異的配列に或る特定数のヌクレオチドを含有する場合を除き、２つの核酸鎖間のハイブリダイゼーションにより安定な二重鎖、例えば標準ストリンジェンシー条件下で二本鎖（double-strandedness）の領域を保持する二重鎖が形成されるように、高度に特異的にすることができる。「標準ハイブリダイゼーション又は標準ストリンジェンシー条件」は、任意の所与のハイブリダイゼーション反応によって容易に決定される。例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York、又はSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸鎖が塩基対合によって相補鎖と結合する任意のプロセスを指す。
【００１４】
核酸は、中〜高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で２つの配列が互いに特異的にハイブリダイズする場合に、参照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であるとみなされる。中及び高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は既知である（例えば、Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons 1995、及びSambrook et al., Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, Third Edition, 2001 Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい）。高ストリンジェンシー条件の一例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、０．５％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍＬ変性キャリアＤＮＡ中、約４２℃でのハイブリダイゼーション、その後の２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ、室温で２回、０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ、４２℃で更に２回の洗浄が挙げられる。
【００１５】
「二重鎖」又は「二重鎖の（duplexed）」という用語は、本明細書で使用される場合、互いに塩基対合、すなわちハイブリダイズした２つの相補的なポリヌクレオチドを記載するものである。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「Ｔｍ」という用語は、二重鎖の半数がハイブリダイズしたままであり、二重鎖の半数が一本鎖へと解離するオリゴヌクレオチド二重鎖の融解温度を指す。オリゴヌクレオチド二重鎖のＴｍは、以下の式Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ率）−（６０／Ｎ）（ここで、Ｎは鎖長であり、［Ｎａ＋］は１Ｍ未満である）を用いて実験的に決定又は予測することができる。Sambrook and Russell (2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y., ch. 10)を参照されたい。オリゴヌクレオチド二重鎖のＴｍを予測する式は他にもあるが、１つの式で所与の条件又は条件のセットに概ね適切であり得る。
【００１７】
「溶液中に遊離した」という用語は、本明細書で使用される場合、別の分子に結合又は連結していないポリヌクレオチド等の分子を記載するものである。
【００１８】
「混合物」という用語は、本明細書で使用される場合、散在し、任意の特定の順序でない要素の組合せを指す。混合物は不均一であり、その種々の構成要素に空間的に分離可能でない。要素の混合物の例としては、同じ水溶液に溶解した多数の異なる要素、及びランダムな位置で（すなわち、特定の順序でない）固体支持体に付着した多数の異なる要素が挙げられる。混合物は、所在を特定できない。例示すると、当該技術分野で一般に知られるような空間的に分離した表面に結合したポリヌクレオチドのアレイは、表面に結合したポリヌクレオチド種が空間的に区別され、アレイが所在を特定できるものであるため、表面に結合したポリヌクレオチドの混合物ではない。
【００１９】
「ライゲートする」という用語は、本明細書で使用される場合、第１のＤＮＡ分子の５’末端の末端ヌクレオチドと第２のＤＮＡ分子の３’末端の末端ヌクレオチドとの酵素的に触媒された連結を指す。
【００２０】
「共有結合する」という用語は、２つの別個の分子間の共有結合の生成を指す。例えば、ライゲーションは共有結合の一種である。
【００２１】
「セット」及び「複数（plurality）」という用語は、少なくとも２個の成員を含有する集団を指すために区別なく使用される。或る特定の場合では（文脈に応じて）、複数又はセットは少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１００個、少なくとも１００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１０６個、少なくとも１０７個、少なくとも１０８個若しくは少なくとも１０９個又はそれ以上の成員を含み得る。
【００２２】
２つの核酸が「相補的」である場合、それらは高ストリンジェンシー条件下で互いにハイブリダイズする。「完全に相補的な」という用語は、核酸の１つの各々の塩基が他の核酸の相補的なヌクレオチドと塩基対合する二重鎖を記載するために使用される。多くの場合、相補的な２つの配列は少なくとも１０個、例えば少なくとも１２個又は１５個の相補的なヌクレオチドを有する。
【００２３】
「消化する」という用語は、核酸を制限酵素によって切断するプロセスを示すことを意図する。核酸を消化するには、制限酵素と該制限酵素の認識部位を含有する核酸とを、制限酵素が作用するのに好適な条件下で接触させる。市販の制限酵素の活性に好適な条件は既知であり、購入時にこれらの酵素とともに提供される。
【００２４】
「オリゴヌクレオチド結合部位」は、標的ポリヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする部位を指す。オリゴヌクレオチドがプライマーの結合部位を「提示する」場合、プライマーはそのオリゴヌクレオチド又はその相補体にハイブリダイズし得る。
【００２５】
「鎖」という用語は、本明細書で使用される場合、共有結合、例えばホスホジエステル結合によって互いに共有結合したヌクレオチドから構成される核酸を指す。
【００２６】
細胞において、ＤＮＡは通常は二本鎖形態で存在し、そのため本明細書で「トップ」鎖及び「ボトム」鎖と称される核酸の２つの相補鎖を有する。或る特定の場合では、染色体領域の相補鎖は「プラス」鎖及び「マイナス」鎖、「第１」鎖及び「第２」鎖、「コード」鎖及び「非コード」鎖、「ワトソン」鎖及び「クリック」鎖又は「センス」鎖及び「アンチセンス」鎖と称され得る。トップ鎖又はボトム鎖としての鎖の割当ては任意であり、いかなる特定の方向、機能又は構造を意味するものではない。幾つかの例示的な哺乳動物染色体領域（例えば、ＢＡＣ、アセンブリ、染色体等）の第１鎖のヌクレオチド配列は既知であり、例えばＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースに見ることができる。
【００２７】
「伸長する」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリメラーゼを用いたヌクレオチドの付加によるプライマーの伸長を指す。核酸とアニールするプライマーを伸長する場合、核酸は伸長反応の鋳型として働く。
【００２８】
「互いにハイブリダイズしない」という用語は、互いにハイブリダイズしない核酸に関連して本明細書で使用される場合、ストリンジェントな条件で互いにアニールしないように設計された配列を指す。互いにハイブリダイズしない例示的な配列（或る特定の出版物では「配列トークン」と呼ばれる場合もある）は、例えば米国特許出願公開第２００７０２５９３５７号及びBrenner et al (Proc. Natl. Acad. Sci. 1992 89:5381-3)（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されている。
【００２９】
「互いにハイブリダイズする」という用語は、互いにハイブリダイズする核酸に関連して本明細書で使用される場合、ストリンジェントな条件下で互いにアニールするように設計された配列を指す。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「フラップ切断反応」という用語は、フラップエンドヌクレアーゼによって重複依存的に基質が切断され、フラップを放出する反応を指す。フラップアッセイの原理は既知であり、例えばLyamichev et al. (Nat. Biotechnol. 1999 17:292-296)、Ryan et al (Mol. Diagn. 1999 4:135-44)及びAllawi et al (J Clin Microbiol. 2006 44: 3443-3447)に記載されている。
【００３１】
「フラップエンドヌクレアーゼ」又は略して「ＦＥＮ」という用語は、本明細書で使用される場合、鎖の一方に核酸の別の鎖によって押しのけられた、すなわち一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとの間の連結部に重複ヌクレオチドが存在するような一本鎖５’オーバーハング又は「フラップ」を含有する二重鎖を有するＤＮＡ構造に対して、構造特異的エンドヌクレアーゼとして働く核酸分解酵素類を指す。ＦＥＮは一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとの間の連結部のホスホジエステル結合の加水分解切断を触媒し、オーバーハング又はフラップを放出する。フラップエンドヌクレアーゼは、Ceska and Savers (Trends Biochem. Sci. 1998 23:331-336)及びLiu et al (Annu. Rev. Biochem. 2004 73: 589-615)によって概説されている。ＦＥＮは個別酵素、マルチサブユニット酵素であっても、又は別の酵素若しくはタンパク質複合体、例えばＤＮＡポリメラーゼの活性として存在していてもよい。フラップエンドヌクレアーゼは熱安定性であり得る。
【００３２】
「フラップエンドヌクレアーゼ基質」という用語は、本明細書で使用される場合、フラップエンドヌクレアーゼによって切断され、切断生成物を生じることができる核酸複合体を指す。かかる複合体は二重鎖の別の鎖によって押しのけられた一本鎖５’オーバーハング（「フラップ」）を含有する。
【００３３】
「カセット」という用語は、適切な状況の構築物中に存在する場合に機能的であるか又は機能的な生成物をコードする二本鎖ＤＮＡ分子を指す。プロモーター、ターミネーター、複製起点及びコード配列は、カセットの例である。カセットは、１つ又は複数の異なる構築物中の同等の状況に移動した場合に機能的であるという意味でモジュール式である。例えば、プロモーター（カセットの一種である）は或る構築物から別の構築物へと移動することができ、種々のコード配列の発現を誘導することができる。同様に、コード配列を様々な上流のプロモーターによって転写することができる。カセットはＰＣＲによって作製するか又は任意の他の方法によって合成することができる。全てではないが一部の場合では、カセットは動作可能に連結した２つ以上の機能的要素を含有し得る。例えば、プロモーターカセットは対象の配列に加えて５’非翻訳領域、リボソーム結合部位及びターミネーターを含有していてもよい。
【００３４】
「コード配列」という用語は、ポリペプチドをコードする配列及び機能的ＲＮＡ、例えば調節ＲＮＡをコードする配列を指す。
【００３５】
「カセットのセット」という文脈での「セット」という用語は、機能的に関連した少なくとも２つのカセット（例えば２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つ又はそれ以上のカセット）の群を指す。例えば、或るカセットのセットが種々のプロモーターを含有していてもよく、別のカセットのセットが種々のターミネーターを含有していてもよく、別のカセットのセットが種々の選択可能マーカーを含有していてもよく、更なるカセットのセットが種々の複製起点を含有していてもよい。
【００３６】
「複製起点カセットのセット」という用語は複製起点を含有する複数のカセットを指し、各々のカセットが単一の複製起点を含有し、異なる複製起点カセットが異なる複製起点を含有する。複製起点カセットのセットは、或る特定の場合に細菌複製起点カセット（高い又は低いコピー数を生じ得る）、酵母複製起点カセット及び哺乳動物複製起点カセットの１つ又は複数を含有し得る。
【００３７】
「選択可能マーカーカセットのセット」という用語は、選択可能マーカー（すなわち、タンパク質を含有する細胞の選択に使用することができるタンパク質）をコードする複数のカセットを指し、各々のカセットが単一の選択可能マーカーをコードし、異なる選択可能マーカーカセットが異なる選択可能マーカーを含有する。複製カセットの選択可能マーカーは１つ又は複数の細菌選択可能マーカーカセット、１つ又は複数の酵母選択可能マーカーカセット及び／又は１つ又は複数の哺乳動物選択可能マーカーカセットを含有し得る。例示的な選択可能マーカーは、例えばアンピシリン等の抗生物質に対して耐性を示すタンパク質をコードする。
【００３８】
「標的カセット」という用語は対象の配列を含むカセットを指す。場合によっては、標的カセットは、例えば標的カセットと少なくとも１つのプロモーターとを動作可能に連結することによって細胞で発現される生成物（例えば、タンパク質又はＲＮＡ生成物）をコードする。これに関連して、「対象の配列」という用語は対象の配列又は一連の配列を含むことを意図するものである。単一の対象の配列は、大規模な発現及び精製に所望される特定のタンパク質をコードし得る。一連の配列は、或る特定の場合に出発基質を対象の最終生成物、例えば精製化学中間体、抗生物質若しくはその誘導体、同化経路若しくは異化経路の一部若しくは全体、又は特異的転写回路へと変換することができる多数のタンパク質の発現を生じ得る。
【００３９】
「機能的カセットのセット」という用語は、機能的に関連した複数のカセットを指す。下記により詳細に記載するように、機能的カセットのタイプとしては、プロモーターカセット、ターミネーターカセット、シャトル選択可能マーカーカセット（すなわち、第１の複製起点カセットに加えてプラスミドに付加し、プラスミドを別の種で複製させることができる第２のカセット）、並びにＮ末端精製タグ、Ｃ末端精製タグ、タンパク質発現エンハンサー、対抗選択可能マーカー及びレポータータンパク質等をコードするカセットを含むタンパク質コード領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
「器」という用語は任意のタイプの容器、例えばチューブ又はバイアルを指す。これに関連して、マルチウェルプレート（例えば９６ウェルプレート）の異なるウェルは異なる器とみなすものとする。
【００４１】
「選択する」という用語は、複数のものから項目を特定した後、特定した項目を使用する行為を指す。「選択する」とは、項目を得る物理的行為を指す。
【００４２】
「カセットが、互いにハイブリダイズして環状生成物を生じる末端を含む」という用語は、カセットの集合を含有する環状ＤＮＡ分子を生じる形で互いにハイブリダイズするように設計された末端を含有するカセットの集合を指す。
【００４３】
「動作可能に連結した」という用語は、一方の機能が他方の影響を受けるような単一の核酸断片上の核酸配列の接続を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、コード配列と動作可能に連結している。
【００４４】
「形質転換された」及び「トランスフェクトされた」という用語は、宿主細胞中で自発的に複製されるプラスミド又は他のベクターを生じる外因性核酸の宿主細胞への導入を指す。エレクトロポレーション、熱ショック、ウイルス感染及び化学的（例えばリポソーム介在性）手段、並びに他の手段（例えば植物に対する注入、浸漬等）は、細胞を外因性核酸によって形質転換又はトランスフェクトすることができる例示的な方法である。
【００４５】
用語の他の定義は本明細書全体に見ることができる。
【００４６】
［例示的な実施形態の説明］
様々な実施形態を記載する前に、本開示の教示が記載される特定の実施形態に限定されず、そのため当然ながら変更することができることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の実施形態の説明のみを目的とし、本教示の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定を意図するものではないことも理解されたい。
【００４７】
本明細書で使用される節の見出しは構成のみを目的とし、記載の主題を限定すると何ら解釈されるものではない。本教示を様々な実施形態に併せて記載するが、本教示がかかる実施形態に限定されることは意図されない。それどころか、本教示は当業者に認識されるように様々な代替手段、変更及び均等物を包含する。
【００４８】
他に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本教示の実施又は試験に際して使用してもよいが、幾つかの例示的な方法及び材料をこれより記載する。
【００４９】
いかなる出版物の引用も出願日前のその開示のためであり、本発明の請求項が先行発明のためにかかる出版物に先行する権限を有しないことを認めるものと解釈すべきではない。さらに、提示の刊行日は実際の刊行日とは異なる可能性があり、別に確認する必要がある。
【００５０】
本開示を読む際に当業者に明らかなように、本明細書に記載及び説明される個々の実施形態は各々、本教示の範囲又は趣旨を逸脱することなく他の幾つかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離するか、又はそれと組み合わせることができる個別の構成要素及び特徴を有する。列挙されるいずれの方法も、列挙される事象の順序又は論理的に可能な任意の他の順序で行うことができる。
【００５１】
本明細書で言及される特許及び出版物に開示される全ての配列を含む全ての特許及び出版物は、引用することにより明示的に本明細書の一部をなすものとする。
【００５２】
本方法を記載する前に、本方法に使用される一部の構成要素の概要を、図１を参照して提示する。図１は複製起点カセットのセット２、選択可能マーカーカセットのセット４及び機能的カセットのセット６を示す。示されるように、各々のカセットは一方の末端に第１のヌクレオチド配列、もう一方の末端に第２のヌクレオチド配列を有し、第１及び第２の末端の配列は互いに異なる（例えばａ及びｂ、ｂ及びｃ又はｃ及びｄ）。幾つかの実施形態では、末端配列は４塩基対〜１００塩基対、例えば１２塩基対〜５０塩基対又は１５塩基対〜３０塩基対の長さの範囲とすることができ、互いに、又はカセットのいずれかにおいて任意の非末端配列に、ハイブリダイズするものではない（特異的ハイブリダイゼーションが所望される場合を除く）。或る特定の場合では、末端配列は幾つかのカセットを集合させた後の操作を容易にし得る制限酵素認識部位、プライマー結合部位及び／又はＴ７／Ｔ３プロモーター等の他の特徴を含有していてもよい。特定の場合では、末端配列はＴｍを適合しており、ここで「Ｔｍを適合した」という用語は規定の範囲内、例えば互いに５℃又は１０℃の範囲内のＴｍを有する配列のセットを指す。同様に示されるように、各々のカセットのセットにおいて、全てのカセットが一方の末端に同じ配列、もう一方の末端にそれとは異なるが同じ配列を有する。例えば、複製起点カセットのセット２の全てのカセットが一方の末端に配列ａ、他方の末端に配列ｂを有する。同様に、選択可能マーカーカセットのセット４の全てのカセットが一方の末端に配列ｂ、他方の末端に配列ｃを有し、機能的カセット６のセットの全てのカセットが一方の末端に配列ｃ、他方の末端に配列ｄを有する。示されるように、カセットの末端は或るカセットが別のカセットにハイブリダイズしてカセットの鎖７が生じるように設計される。カセットの鎖の末端は対象の配列を含む標的カセット８の末端に適合する。図１に示される実例では、標的カセットの末端がカセットの鎖の末端（同様に配列ａ及びｄを含有する）とハイブリダイズする配列ａ及びｄを含有する。全てのカセットの末端が互いにハイブリダイズすると、環状生成物が生じる。図１に示される一般的原理はより多くのカセット（例えば合計で４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個又はそれ以上のカセット）を含むように拡大することができる。いずれの集合においても、カセットの各々の末端が異なるカセットの一方の末端のみとハイブリダイズする。容易に明らかなように、カセットの順序は図面のいずれかに示されるものと異なっていてもよい。
【００５３】
図２を参照すると、本方法の一実施形態は、複製起点カセットのセット２、選択可能マーカーカセットのセット４、１つ又は２つ又はそれ以上の機能的カセットのセット６、及び対象の配列を含む標的カセット８を得ることを含み、各々のセットのカセットが異なる器に入れられる。この例で示されるように、各々のカセットのセットは３つの異なるカセットを含有する。しかしながら、実際には、各々のカセットのセットは２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個又はそれ以上のカセットを独立して含有することができる。本方法の次のステップは複製起点カセット、選択可能マーカーカセット及び１つ又は２つ又はそれ以上の機能的カセットを選択することを含む。示される実施形態では、単一の複製起点１０、単一の選択可能マーカー１２及び単一の機能的カセット１４が選択される。或る特定の実施形態では（下記でより詳細に論考されるように）、２つ以上の異なる機能的カセットのセット（例えば、１つのプロモーターカセットのセット及び１つの精製カセットのセット）を本方法に用いることができる。本方法の次のステップは選択されたカセットを標的カセットとともに集合させることを含み、カセットは互いにハイブリダイズして環状生成物１６を生じる末端を含む。言い換えると、カセットの末端の配列は、各々のカセットが他の２つのカセットとそれぞれが各末端でハイブリダイズしてカセットの環状鎖が生じる形で互いにハイブリダイズするように設計される。図２に示される実施形態では、４つのカセットが集合し、４つの異なる配列（１８、２０、２２及び２４）をカセットの末端に必要とする環状生成物１６を生じる。このステップでは、集合は或る特定の場合に、選択されたカセットと標的カセットとを単一の器で組み合わせ、１つ又は複数の集合タンパク質を添加し、少なくともカセットの末端が変性するように生成物を加熱し、次いでカセットの末端が互いにハイブリダイズして、集合タンパク質（複数でもよい）が適当な機能（複数でもよい）を果たすことが可能となるように生成物を冷却することを含む。広範なタンパク質を集合に使用することができる。幾つかの実施形態では、集合ステップにポリメラーゼ、「フラップエンドヌクレアーゼ」（ＦＥＮ）、リガーゼ又はポリメラーゼ促進因子（ＰＥＦ）が使用され得る。これらのタンパク質は単独で又は他の酵素と組み合わせて使用することができる。或る特定の場合では、タンパク質を互いに組み合わせて使用してもよい。例えば、或る特定の場合では、ポリメラーゼ及びＦＥＮ；ポリメラーゼ及びリガーゼ；ポリメラーゼ及びＰＥＦ；ポリメラーゼ、ＦＥＮ及びリガーゼ；ポリメラーゼ、ＦＥＮ及びＰＥＦ；ポリメラーゼ、リガーゼ及びＰＥＦ；又はポリメラーゼ、ＦＥＮ、リガーゼ及びＰＥＦを使用することができる。或る特定の場合では、使用されるタンパク質は熱安定性であり得る。幾つかの実施形態では、環状生成物を熱サイクリング集合条件に供して、いずれか１つのカセットのＤＮＡ分子の３’末端を、鋳型として隣接カセットを用いて伸長させる。多くの実施形態では、集合反応は制限酵素、アダプターライゲーションを用いず、平滑末端カセット集合生成物の連結を含まない。
【００５４】
下記でより詳細に論考されるように、本方法は様々な異なる形で実行することができる。例示的な一実施形態では、１つ又は複数の標的カセット、選択可能マーカーカセット、複製起点カセット、シャトルカセット及び機能的カセットを含有するベクターを集合させるが、複製起点カセットによりプラスミドが或る種（例えば大腸菌（E. coli））で複製することが可能になり、シャトルカセットにより同じプラスミドが別の種の細胞（例えば酵母又は哺乳動物細胞等）で複製することが可能になる。
【００５５】
本方法は、宿主細胞（例えば大腸菌等の細菌宿主細胞）を、酵素処理した生成物１９により形質転換することを含む。概して、選択可能マーカーカセット及び複製起点カセットは使用する宿主細胞に適合するように（すなわち、インビボでプラスミドへと集合した場合に抗生物質処理に生き残り、宿主細胞において複製することができるように）選択される。酵素処理した生成物１９の集合させたカセットの末端の正確な構造は、環状生成物１６の処理に用いられる酵素によって決まる。例えば、環状生成物をフラップエンドヌクレアーゼで処理する実施形態では、酵素処理した生成物１９は完全に二本鎖であってもよく、或る特定の場合では様々なカセットの末端間に一本鎖ニックを含有していてもよい。他の実施形態では（例えば、ポリメラーゼを集合に使用する場合）、カセットの末端を、鋳型として隣接カセットを用いて伸長させる。使用する酵素に応じて他の構造が可能である。本方法の次のステップは、１つ又は２つ又はそれ以上の選択された機能的カセット、標的カセット（複数でもよい）、複製起点カセット及び選択可能マーカーカセットを含むプラスミドを含む形質転換された宿主細胞を選択することを含み得る。このステップは、例えば従来のクローニングによって作製されたプラスミドを含む細胞をスクリーニングすることができるように任意の簡便な方法によって行うことができる。例えば、一実施形態では、酵素処理した生成物１９を細菌、酵母又は哺乳動物の宿主細胞に直接形質転換し、選択可能マーカーカセットによってコードされる選択可能マーカーを含有する細胞を選択する作用物質を用いて、形質転換された細胞を選択する。更なるスクリーニングを、コロニーのＰＣＲスクリーニング、又は「ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ」手順に続き、必要に応じて制限酵素消化を用いたプラスミドＤＮＡの精製によって行うことができる。
【００５６】
下記でより詳細に記載されるように、本方法は所望の結果に応じて様々な異なる形で実行することができる。幾つかの実施形態では、１つ又は２つ又はそれ以上の機能的カセットはプロモーターカセットのセット、Ｎ末端精製タグカセットのセット、Ｃ末端精製タグカセットのセット、シャトル複製起点カセットのセット、ターミネーターカセットのセット、タンパク質発現エンハンサーカセットのセット及びシャトル選択可能マーカーカセットのセットから選択される。この方法の使用者は、全てが様々な異なるプロモーター（原核生物及び真核生物）の制御下の多数の溶解性向上タグ及び／又は精製タグ（数ある中でもＧＳＴ、ＭＢＰ及びＮｕｓＡ等）に融合した同じ標的遺伝子配列（複数でもよい）、並びに得られるプラスミドが所望の宿主種において適切に機能することを可能にする複製起点及び選択可能マーカーを含有するベクター骨格を含有する幾つかの発現カセットを作製することが可能であるものとする。一実施形態では、このタイプのベクター構築方法は、最良の宿主（原核生物又は真核生物）、最良の溶解性向上タグ及び／又は精製タグ並びに最良のプロモーターを迅速にスクリーニングし、タンパク質の発現及び精製を最大限に高めることを可能にする。従来の制限酵素クローニング技法を用いるかかるベクター構築／発現スクリーニング方法は高度に労働集約的であり、想定し得る全ての構築物を作製するのに数週間かかる可能性がある。本明細書に記載されるカセットベースの方法は、構築を１つずつ行うか（すなわち、１つの反応／チューブで１つのベクター集合反応）、又は幾つかのベクターを単一の器にて集合させ、考え得るベクターのプールを下流の後続プロセスにおいてスクリーニングすることによって考え得る全ての構築物を１日足らずで集合させることを可能にする。いずれにせよ、単一の標的配列に対して多くの異なる発現プラスミドを作製及びスクリーニングするのに必要とされる時間が大幅に短縮されるため、従来のベクター構築方法に優る顕著な利点がエンドユーザーにもたらされる。
【００５７】
例示的な宿主としては、原核細胞及び真核細胞、例えばモネラ界（単細胞及びコロニー、真正細菌（bacteria [eubacteria]）及びシアノバクテリア（藍藻）を含む）；原生生物界（波動毛と呼ばれる９＋２繊毛及び鞭毛を有する単細胞原生生物、並びに単細胞及び多細胞（肉眼で見える）藻類）；菌界（繊毛及び真核生物（９＋２）鞭毛（波動毛）を有しない、多細胞、概して従属栄養の半数体及び二核性（dikaryotic [binucleate]）細胞）；植物界（主に独立栄養の半数体−２倍体生活環、親植物の雌性生殖器官に胚を保持する）；並びに動物界（細胞壁及び光合成色素を有さず、２倍体胞胚を形成する多細胞動物）が挙げられる。選択される様々なカセット（例えば選択可能マーカーカセット、複製起点カセット及びプロモーターカセット）は使用する宿主細胞において作用するものとする。
【００５８】
或る特定の実施形態では、標的カセットはポリペプチド又は調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ等の低分子ＲＮＡ）のコード配列を含み得る。一実施形態では、集合プロセスでプロモーターをコード配列に動作可能に連結し、それにより細胞におけるコード配列の転写及び考え得る翻訳をもたらすことができる。これらの実施形態では、機能的カセットは種々のプロモーターであってもよく、本方法によりコード配列が、選択されたプロモーターに、コード配列（ポリペプチドをコードする場合）が宿主細胞においてポリペプチドに適切に転写及び翻訳されるように動作可能に連結したプラスミドを得ることができる。これらの実施形態では、プロモーターカセットのセットは例えば、任意の種々のプロモーターのセット、例えば細菌細胞において活性を有する任意のプロモーター、哺乳動物細胞において活性を有するプロモーター及び酵母細胞において活性を有するプロモーターの任意の組合せであり得る。プロモーターカセットは、標的宿主細胞に基づいて選択することができる。
【００５９】
別の例示的な実施形態では、機能的カセットは種々のＮ末端精製タグをコードすることができ、本方法によりコード配列によってコードされるポリペプチドとＮ末端精製タグとの融合物をコードするプラスミドが得られる。同様に、機能的カセットは種々のＣ末端精製タグをコードすることができ、本方法によりポリペプチドとＣ末端精製タグとの融合物をコードするプラスミドが得られる。Ｎ末端精製タグ又はＣ末端精製タグは、数例を挙げると、例えばＡｒｇ−タグ、Ｂ−タグ（ブルータングウイルスのＶＰ７タンパク質領域）、カルモジュリン結合ペプチド、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、ＣＢＰ（セルロース結合ドメイン）、キチン結合ドメイン、ｃ−ｍｙｃ−タグ、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）、ＤｓｂＡ、ＦＬＡＧ−タグ、ガラクトース結合タンパク質、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＨＡＴ−タグ、Ｈｉｓ−タグ、ＨＳＶ−タグ、ＫＳＩ、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、ｌａｃリプレッサ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ｃＮｕｓＡ、ポリアスパラギン酸、ポリフェニルアラニン、Ｓ−タグ、ＳＢＰ−タグ、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ユビキチン、Ｔ７−タグ、Ｔ７遺伝子１０、チオレドキシン、Ｈｉｓ−パッチチオレドキシン、ｔｒｐＥ又はＤｓｂＡであり得る（Zhang et al., 1998, Protein Exp. Purif. 12: 159-165）。他の有用なタグを明らかに発見又は作製することができる。
【００６０】
幾つかの実施形態では、選択ステップは、（ｉ）同じ機能の第１の機能的カセットのセットから第１の機能的カセットを選択することと、（ｉｉ）同じ機能の第２の機能的カセットのセットから第２の機能的カセットを選択することとを含む（ここで、第１及び第２の機能的カセットのセットは異なる機能を有し、一方の機能的カセットがプロモーターのセットであり、他方が精製カセットのセット又はシャトル複製起点である）。これらの実施形態では、本方法により第１の機能的カセット、第２の機能的カセット、標的カセット、複製起点カセット及び選択可能マーカーカセットを含むプラスミドが生じ得る。
【００６１】
本方法の様々な実施態様を下記に説明する。
【００６２】
下記図３は、隣接カセットの末端の相補的ヌクレオチド配列を強調した（丸で示される）、集合を生じさせるベクター設計スキームを示す。上述のように、カセットは、いくつかの例を挙げると、複製起点、選択可能マーカー、様々な生物へのプラスミドの形質転換を可能にする「シャトル」配列、プロモーター、リボソーム結合部位、タンパク質溶解性タグ及び精製タグをコードするＤＮＡ配列を含み得る。カセットは、それらが相補的末端を保有する限りにおいて所望される任意の順序で集合する。カセットを混合し、インビトロ線形増幅又は他の酵素処理、続いて最終構造を機能的プラスミド構築物へとインビボで変換する宿主細胞への形質転換に供することができる。
【００６３】
下記表１は広範な設計を集合させ、並行して機能的に試験することにより、従来の構築方法を用いた最適化に必要とされる時間を大幅に短縮する例示的なキットの組み合わせの柔軟性を示す。
【００６４】
【表１】
0006745599.tif 000002
【００６５】
図４〜図１０は、上記で概略的に説明した方法を実行する様々な方法の例を提示する。
【００６６】
図４は、Ｎ末端精製タグを用いるタンパク質発現ベクター構築キットに使用することができる構成要素の一部を示す。図４に示されるプラスミドでは、エンドユーザーは標的カセット（対象の遺伝子（ＧＯＩ））を５’末端（切断部位）及び３’末端（ターミネーターの相補領域）の普遍的クローニング配列を付加して並べることができる。あるいは、対象の遺伝子（単数又は複数）を、複数のカセットの集合を可能にする適切な重複オリゴヌクレオチド配列を含有する増幅プライマーを用いたＰＣＲによって生成することができる。
【００６７】
図５は、Ｃ末端精製タグを用いるタンパク質発現ベクター構築キットに使用することができる構成要素の一部を示す。図５に示されるプラスミドでは、エンドユーザーは標的カセットを５’末端（切断部位）及び３’末端（ターミネーターの相補領域）の普遍的クローニング配列を付加して並べることができる。あるいは、対象の遺伝子（単数又は複数）を、複数のカセットの集合を可能にする適切な重複オリゴヌクレオチド配列を含有する増幅プライマーを用いたＰＣＲによって生成することができる。
【００６８】
図６は、Ｃ末端精製タグ及びＮ末端精製タグを用いるタンパク質発現ベクター構築キットに使用することができる構成要素の一部を示す。図６に示されるプラスミドでは、エンドユーザーは標的カセットを５’末端（切断部位）及び３’末端（ターミネーターの相補領域）の普遍的クローニング配列を付加して並べることができる。あるいは、対象の遺伝子（単数又は複数）を、複数のカセットの集合を可能にする適切な重複オリゴヌクレオチド配列を含有する増幅プライマーを用いたＰＣＲによって生成することができる。
【００６９】
図７は、バイシストロン性ベクターの作製に使用することができるキットの構成要素の一部を示す。この例では、エピトープ／親和性タグは配列の不一致を回避するために、同じタンパク質配列で異なるＤＮＡ配列であってもよい。また、切断部位は配列の不一致を回避するために同じタンパク質配列で異なるＤＮＡ配列であってもよい。切断部位はタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）及び様々な他の部位であり得る。あるいは、対象の遺伝子（単数又は複数）を、複数のカセットの集合を可能にする適切な重複オリゴヌクレオチド配列を含有する増幅プライマーを用いたＰＣＲによって生成することができる。
【００７０】
図８は、タンパク質相互作用スクリーニングベクターの作製に使用することができるキットの構成要素を示す。この例では、エンドユーザーは標的カセット及び遺伝子ライブラリーを、５’末端及び３’末端の普遍的クローニング配列を付加して並べることができる。エピトープ／親和性タグは配列の不一致を回避するために同じタンパク質配列で異なるＤＮＡ配列であってもよい。あるいは、対象の遺伝子（単数又は複数）を、複数のカセットの集合を可能にする適切な重複オリゴヌクレオチド配列を含有する増幅プライマーを用いたＰＣＲによって生成することができる。
【００７１】
図９は、タンパク質相互作用スクリーニングベクターの作製に使用することができる別のキットの構成要素を示す。この例では、エンドユーザーは標的カセット（ＧＯＩ）及び遺伝子ライブラリーを、５’末端及び３’末端の普遍的クローニング配列を付加して並べることができる。エピトープ／親和性タグは配列の不一致を回避するために同じタンパク質配列で異なるＤＮＡ配列であってもよい。あるいは、対象の遺伝子（単数又は複数）を、複数のカセットの集合を可能にする適切な重複オリゴヌクレオチド配列を含有する増幅プライマーを用いたＰＣＲによって生成することができる。図１０は、様々な領域を交換したベクターの作製に使用することができる別のキットの構成要素を示す。一実施形態では、カセットの全ての可能な組合せを含有するライブラリーを作製し、使用者に供給する。次いで、使用者はライブラリーをスクリーニングして、対象のクローンを同定することができる。
【００７２】
［キット］
上記の主題の方法を実施するためのキットも本開示によって提供される。主題のキットは、少なくとも複製起点カセットのセット；選択可能マーカーカセットのセット；１つ又は複数の機能的カセットのセット；及び対象の配列を含む標的カセットを含有し得る。これらのカセットの各々のカセットが異なる器に入れられ、標的カセットと複製起点カセットのいずれか、選択可能マーカーカセットのいずれか及び機能的カセットのいずれかとのハイブリダイゼーションにより、対象の宿主細胞に導入することができる生成物が生じる。或る特定の場合では、キットは同じ機能の第１の機能的カセットのセット；及び同じ機能の第２の機能的カセットのセットを含有し得る（ここで、第１及び第２の機能的カセットのセットは異なる機能を有し、例えば一方がプロモーターのセットであり、他方が精製カセットのセット又はシャトル複製起点である）。例えば、機能的カセットのセットは細菌細胞、哺乳動物細胞若しくは酵母細胞において活性を有する種々のプロモーターのセット、又はＮ末端若しくはＮ末端精製タグをコードするカセットのセットを含む機能的カセットのセットを含み得る。キットに含まれ得るカセットの更なる詳細は上記で説明している。カセットに加えて、キットは試薬、例えば緩衝剤、酵素及び上記の方法を行うのに必要な他の試薬を含有していてもよい。キットの様々な構成要素が別個の容器に入れられていてもよく、又は或る特定の適合する構成要素が所望に応じて単一の容器で予め合わせられていてもよい。
【００７３】
上述の構成要素に加えて、主題のキットは、主題の方法を実施するためのキットの構成要素の使用説明書及びサンプル分析の説明書を更に含み得る。主題の方法を実施するための説明書は概して、好適な記録媒体に記録されている。例えば、説明書は紙又はプラスチック等の基体に印刷されている。そのため、説明書は添付文書として、キット又はその構成要素の容器のラベル（すなわち、パッケージ又はサブパッケージに付随する）等でキットに含まれ得る。他の実施形態では、説明書は好適なコンピュータ可読記憶媒体、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット等に存在する電子記憶データファイルとして含まれる。更に他の実施形態では、実際の説明書はキットに含まれず、遠隔供給源から、例えばインターネット経由で説明書を得るための手段が提供される。この実施形態の一例は、説明書を閲覧することができる及び／又は説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、この説明書を得るための手段も好適な基体に記録される。
【００７４】
幾つかの略語が本開示に見られる：グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ)、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、セルロース結合タンパク質（ＣＢＰ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）。他の略語は文中で説明される。
【００７５】
上述の実施形態は明確な理解を目的として説明及び例示のために幾らか詳細に記載したが、当業者には上記の教示に鑑みて、添付の特許請求の範囲の趣旨又は範囲を逸脱することなく或る特定の変更及び修飾を行うことができることが容易に明らかである。
【実施例】
【００７６】
本教示の態様は以下の実施例に鑑みて更に理解することができるが、これは本教示の範囲を限定するものと何ら解釈すべきではない。
【００７７】
［実施例１］
原理証明のためのカセット集合実験を以下のように行った。ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）（Ｐｆｕ）ファージポリメラーゼ遺伝子（ｐｏｌ）を、ＰＣＲによっておよそ４つの等しい５００ヌクレオチド長セグメントに分けた。ＰＣＲプライマーは、ベクター及びセグメント♯２とアニールすることを可能にする末端配列を有するセグメント♯１を増幅するように設計した。セグメント♯２のＰＣＲプライマーは、セグメント♯１とセグメント♯３との重複を可能するものであった。セグメント♯３のＰＣＲプライマーは、セグメント♯２とセグメント♯４との重複を可能するものであった。最後に、ＰＣＲプライマーを、図１１に示されるようにセグメント♯４がセグメント♯３及びベクターの他の末端と重複するように設計した。この実証実験では、個々のポリメラーゼセグメントを精製しなかった。５’及び３’末端がそれぞれセグメント♯１及び♯４と重複する配列を含むようにベクターを増幅した。増幅したポリメラーゼセグメントと線状ベクター骨格とを、ほぼ等しいモル比で混合し、その後表２に記載のように線形増幅を行った。
【００７８】
【表２】
0006745599.tif 000003
【００７９】
標準的な大腸菌の形質転換手順を行い、プレーティングした細菌を３７℃で一晩インキュベートした。対照は或る線形増幅反応からのセグメント♯１の除外及び別の線形増幅反応における４つ全てのセグメントの除外を含むものであった。ｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡを陽性形質転換対照とした。表３に各々の反応１〜４により形質転換したコロニーを集計する。
【００８０】
【表３】
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【００８１】
次いで、選択された推定ポリメラーゼクローンに対してコロニーＰＣＲを行い、反応サンプルをアガロースゲルで泳動し、正確なポリメラーゼサイズの挿入断片が生成するかを決定した（図１２）。正確なサイズの挿入断片を、線状化したベクター及び４つ全てのポリメラーゼセグメントを含有する反応混合物の形質転換により生じた１６個の無作為に選んだクローンから増幅した（反応３）（上列、レーン１〜１６）。４つ全てのセグメントを欠いた反応混合物（１）の形質転換により生じた細菌コロニー（合計６０個）は、増幅生成物を生じなかった（下列、レーン１〜８）。セグメント♯１を欠いた反応混合物（２）の形質転換により生じた細菌コロニー（合計３５個）は、４つ全てのポリメラーゼセグメントを含有するクローンに由来する増幅挿入断片よりもおよそ５００ｂｐ小さいサイズの８つのうち１つの増幅生成物を生じた（下列、セット９〜１６のレーン１１）。この結果は、この増幅反応に４つではなく３つのセグメントしか存在しないということによって部分的に説明される。
【００８２】
クローン１及び１６（図１２、上列）並びにクローン１１（図１２、下列）に由来する挿入断片を単離し、シークエンシングした。クローン１及び１６による配列データは、真のＰｆｕ  ｐｏｌ遺伝子配列と同一であった。クローニングした挿入断片１１に由来する配列の調査により、セグメント♯３の遊離末端とベクターの遊離末端との間で平滑末端ライゲーション反応が生じることが示唆された。
【００８３】
［実施例２］
原理証明のためのベクター集合実験を以下のように行った。選択可能マーカー（ＳＭ）カセット（アンピシリン耐性）、大腸菌複製起点カセット（ｐ１５Ａ）、シャトルカセット、付加的な要素のカセット及びＧＯＩカセットの５つのカセットを作製した。
【００８４】
各々のカセットは、図１３に示されるような３０８８ｂｐの環状プラスミドを作製する集合ワークフロー（すなわちＳＭ−ｐ１５Ａ−シャトル−ＡＥ−ＧＯＩ−ＳＭ）において次のカセットの末端と同一の独自の配列を５’末端及び３’末端に含有するものであった。
【００８５】
この原理証明実験のために、個々のカセットをＰＣＲによって増幅し、ゲル精製して、最終集合反応におけるあらゆる親ベクター汚染を排除した。増幅したカセットをほぼ等しいモル比で混合した後、表１に記載の熱サイクリングを行った。５つのカセットのうち４つのみを含有する対照反応も試験した。
【００８６】
【表４】
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【００８７】
標準的な大腸菌の形質転換手順を行い、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する寒天プレートに細菌コロニーをプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。表２に両方の反応から回収された形質転換体の数を記録する。
【００８８】
【表５】
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【００８９】
ＰｓｔＩ及びＸｈｏＩのいずれかによる制限消化を３つの推定クローンに対して行い、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒで分析した。３つ全てのクローンが、両方の制限酵素に対して期待されたバンドパターンをもたらした（図１４）。３つ全てのクローンを完全に配列検証し、５つ全てのカセットが期待される順序で集合することが確認された（図１５）。ゲル精製カセットの種々のバッチを用いたその後の集合により、この初回の原理証明の結果が確認され、プロセスがロバストかつ再現可能であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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