(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｏ−ホスホセリン（O-phosphoserine、OPS）に対する耐性を有する、Ｏ−ホスホセリンを生産する微生物ＫＣＣＭ１１８１５Ｐ。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物を培地で培養する段階；及び
前記微生物またはその培地からＯ−ホスホセリン（O-phosphoserine）を回収する段階を含む、Ｏ−ホスホセリンを生産する方法。
【請求項３】
ａ）請求項１に記載の微生物を培地で培養してＯ−ホスホセリン（O-phosphoserine）を生産する段階；及び
ｂ）Ｏ−ホスホセリンスルフヒドラーゼ（O-Phosphoserine sulfhydrylase、OPSS）またはそれを発現する微生物の存在下で、前記ａ）段階で生産されたＯ−ホスホセリンまたはそれを含む培地を硫化物と反応させる段階を含む、システインまたはその誘導体を生産する方法。
【請求項４】
前記硫化物が、Ｎａ２Ｓ、ＮａＳＨ、（ＮＨ４）２Ｓ、Ｈ２Ｓ及びＮａ２Ｓ２Ｏ３からなる群から選択される１つ以上である、請求項３に記載のシステインまたはその誘導体を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、Ｏ−ホスホセリンを生産する微生物及び前記微生物を用いてＯ−ホスホセリン、システインまたはシステイン誘導体を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−システインは、すべての生物体の硫黄代謝において重要なアミノ酸であって、毛髪のケラチンなどの生体内タンパク質、グルタチオン、ビオチン、メチオニン、及びその他の硫黄を含有した代謝産物の合成に用いられるだけでなく、コエンザイムＡ生合成の前駆物質として用いられる。
【０００３】
微生物を用いてＬ−システインを生産する方法では、１）微生物を用いてＤ,Ｌ−ＡＴＣ（D,L−２−aminothiazoline-4-carboxylic acid）を生物学的に転換する方法（非特許文献１）、２）大腸菌を用いた直接発酵法でＬ−システインを生産する方法が知られている（特許文献１及び非特許文献２）。３）また、微生物を用いてＯ−ホスホセリン（O-phosphoserine、以下「ＯＰＳ」）を発酵生産した後、Ｏ−ホスホセリンスルフヒドラーゼ（O-phosphoserine sulfhydrylase、以下「ＯＰＳＳ」）の触媒作用下で硫化物と反応してＬ−システインに転換させる方法が知られている（特許文献２）。
【０００４】
この時、前記３）の方法でシステインを生産するために、前駆体であるＯＰＳを生産する必要がある。一例として、微生物内でＬ−セリンの生合成経路の酵素であるＳｅｒＡ、ＳｅｒＣ及びＳｅｒＢの活性調節を介してＯＰＳを生産できる（非特許文献３〜５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】欧州登録特許ＥＰ０８８５９６２Ｂ
【特許文献２】韓国登録特許公報第１０−１３８１０４８号
【特許文献３】米国公開公報第２０１２−０１９００８１号
【特許文献４】韓国登録特許公報第１０−１２８２６７号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ryu OH et al., Process Biochem., 32:201-209, 1997
【非特許文献２】Wada M and Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006
【非特許文献３】Ahmed Zahoor, Computational and structural biotechnology journal, vol 3, 2012 october
【非特許文献４】Wendisch VF et al., Curr Opin Microbiol. 2006 Jun, 9(3):268-74
【非特許文献５】Peters-Wendisch P et al., Appl Environ Microbiol. 2005 Nov, 71(11):7139-44.
【非特許文献６】Mino K and Ishikawa K, FEBSletters, 551: 133-138, 2003;
【非特許文献７】Burns KE et al., J. Am. Chem. Soc.,127: 11602-11603, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、ＯＰＳ生産微生物を開発するために鋭意努力した結果 、ＯＰＳに対する耐性度がより向上され、ＯＰＳを高収率で生産できる微生物を開発し、本出願を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願の一つの目的は、Ｏ−ホスホセリン（O-phosphoserine、ＯＰＳ）を生産する微生物を提供することにある。
【０００９】
本出願の他の一つの目的は、前記ＯＰＳを生産する微生物を培地で培養する段階、及び前記微生物またはその培地からＯＰＳを回収する段階を含む、ＯＰＳの生産方法を提供することにある。
【００１０】
本出願の別の目的は、ａ）前記ＯＰＳを生産する微生物を培地で培養してＯＰＳを生産する段階；及びｂ）Ｏ−ホスホセリンスルフヒドラーゼ（O-phosphoserine sulfhydrylase、ＯＰＳＳ）またはそれを発現する微生物の存在下で、前記ａ）段階で生産されたＯＰＳまたはそれを含む培地を硫化物と反応させる段階を含む、システインまたはその誘導体を生産する方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１１】
本出願のＯＰＳ生産微生物は、高濃度のＯＰＳに耐性を有し、ＯＰＳを高効率で生産できて、Ｌ−システイン合成などに有用に用いられる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
前記目的を達成するための本出願の一つの態様は、Ｏ−ホスホセリン（O-phosphoserine、ＯＰＳ）を生産する微生物である。
【００１３】
本出願において、用語、「Ｏ−ホスホセリン（O-phosphoserine、以下「ＯＰＳ」）」は、セリン及びリン酸（phosphoric acid）のエステル化合物であって、いくつかのタンパク質の構成要素である。特に、前記ＯＰＳはＬ−システインの前駆体であって、ＯＰＳスルフヒドラーゼ（ＯＰＳ sulfhydrylase、ＯＰＳＳ）の触媒作用下で硫化物と反応してシステインに転換されうる（特許文献２）。
【００１４】
本出願において、用語、「ＯＰＳ生産」は、ＯＰＳを微生物内で作り出すだけでなく、微生物内のＯＰＳを微生物の外、例えば、培地に排出することも含む概念である。
【００１５】
本出願において、用語、「ＯＰＳを生産する微生物」は、ＯＰＳを生物体内で生産できる原核または真核微生物の菌株であって、具体的には、遺伝的操作によるか、自然突然変異によってＯＰＳを培地または微生物体内に蓄積できる微生物を意味する。具体的には、本出願において、前記ＯＰＳ生産微生物はＯＰＳに対する耐性が強い菌株で、高濃度のＯＰＳでも細胞生長の阻害を少なく受けながらもＯＰＳ生産能の優れた、受託番号ＫＣＣＭ１１８１５Ｐで寄託されたエシェリキア・コリを含んでもよい。
【００１６】
一例として、前記微生物は、さらにＯＰＳの細胞内への流入または分解能力を減少させた微生物であってもよい。
【００１７】
前記のようなＯＰＳ生産微生物に対する内容は、前記に記述された内容のほかに、特許文献２または特許文献３などに開示された内容が本出願の参考資料として用いられてもよい。
【００１８】
本出願の他の一つの態様は、前記ＯＰＳを生産する微生物を培地で培養する段階、及び前記微生物またはその培地からＯ−ホスホセリンを回収する段階を含む、ＯＰＳを生産する方法である。
【００１９】
本出願において、用語、「培養」は、前記微生物を適当に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当業界で知られている適当な培地と培養条件で行われてもよい。このような培養過程は選択される菌株に応じて当業者が容易に調整して用いてもよい。具体的には、前記培養は、回分式、連続式、及び流加式であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００２０】
前記培地に含まれる炭素源として、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、でん粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油などのオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれてもよく、これらの物質は個別に、または混合物として用いられてもよいが、これに制限されるものではない。前記培地に含まれる窒素源として、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆ミールのような有機窒素源、及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムのような無機窒素源が含まれてもよく、これらの窒素源は単独または組み合わせて用いられてもよい。しかし、これに制限されるものではない。前記培地に含まれるリン源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応されているナトリウム含有塩が含まれてもよいが、これらに制限されるものではない。また、培地には硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含んでもよく、その他に、アミノ酸、ビタミン及び適切な前駆体などが含まれてもよい。これらの培地または前駆体は培養物に回分式または連続式で添加されてもよいが、これに限定されるものではない。
【００２１】
培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を培養物に適切な方法で添加して培養物のｐＨを調整してもよい。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生産を抑制してもよい。また、培養物の好気状態を維持するために培養物内に酸素または酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために気体を注入しないか、もしくは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入してもよい。培養物の温度は、通常、２７〜３７℃、具体的には、３０〜３５℃であってもよい。培養期間は、所望の有用物質の生産量が収得できるまで持続してもよく、具体的には、１０〜１００時間であってもよい。しかし、これに限定されるものではない。
【００２２】
本出願の微生物が生育するのに適した条件は、当業者が容易に調整して使用してもよい。例えば、これに限定されるものではないが、培地にグリシンまたはセリンがさらに含まれてもよい。グリシンは、精製されたグリシン、グリシンを含むイースト抽出物、トリプトンの形態で提供されてもよく、培養液に含まれる濃度は、通常、０．１〜１０ｇ／Ｌ、具体的には、０．５〜３ｇ／Ｌであってもよい。また、セリンは、精製されたセリン、セリンを含有する酵母抽出物、トリプトンなどの形態で提供されてもよく、培養液に含まれる濃度は、通常、０．１〜５ｇ／Ｌ、具体的には、０．１〜１ｇ／Ｌであってもよい。
【００２３】
本出願は、前記培養段階で生産されたＯＰＳをさらに回収及び精製してもよく、その方法は、培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などによって当該分野で公知の適合した方法を用いて培地から目的とするＯＰＳを回収することができ、これに限定されない。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが用いられてもよく、当該分野で公知の適合した方法を用いて培地または微生物から、目的とするＯＰＳを回収してもよい。
【００２４】
本出願の別の一態様は、ａ）前記ＯＰＳを生産する微生物を培地で培養してＯＰＳを生産する段階；及びｂ）ＯＰＳスルフヒドラーゼ（O-phosphoserine sulfhydrylase、ＯＰＳＳ）またはそれを発現する微生物の存在下で、前記ａ）段階で生産されたＯＰＳまたはそれを含む培地を硫化物と反応させる段階を含む、システインまたはその誘導体を生産する方法である。
【００２５】
本出願において、用語、「ＯＰＳスルフヒドラーゼ（O-phosphoserine sulfhydrylase、ＯＰＳＳ）」は、ＯＰＳにチオールグループ（thiol、group、SH基）を提供して前記ＯＰＳをシステインに転換する反応を触媒するポリペプチドを意味する。前記酵素は、アエロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatics）、トリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）（非特許文献６及び７）で初めて明らかになった。また、前記ＯＰＳＳは、野生型ＯＰＳＳタンパク質だけでなく、前記ＯＰＳＳをコードするポリヌクレオチド配列の一部の配列が欠失、置換または付加された配列であって、野生型ＯＰＳＳタンパク質の生物学的活性と同等またはそれ以上の活性を示す変異体タンパク質も含まれてもよく、例えば、特許文献２及び特許文献４に開示されたＯＰＳＳタンパク質及びその変異体タンパク質もすべて含まれてもよい。しかし、これに限定されるものではない。
【００２６】
前記硫化物は、当該技術分野で通常使用される固形だけではなく、ｐＨ、圧力、溶解度の違いにより液体または気体の形態で提供されて、硫化物（sulfide、S2-）、チオ硫酸（thiosulfate、S2O32-）などの形態でチオールグループ（thiol group、SH基）に転換されうるすべての硫化物であれば利用可能である。具体的には、チオールグループをＯＰＳに提供するＮａ２Ｓ、ＮａＳＨ、Ｈ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ、ＮａＳＨ及びＮａ２Ｓ２Ｏ３を用いてもよい。前記反応は、１つのＯＰＳ反応基に１つのチオール基を提供して、１つのシステインもしくはシステイン誘導体を製造する反応であり、前記反応時の硫化物の添加量は、ＯＰＳモル濃度の０．１〜３倍であってもよく、具体的には、１〜２倍であってもよい。
【００２７】
また、本出願では、さらに前記段階ｂ）の反応段階を介して生産されたシステインまたはその誘導体を回収する段階を含む。この時、当該分野で公知の適合した反応を利用して反応液から目的とするシステインまたはその誘導体を分離及び精製して回収してもよい。
【００２８】
また、前記製造されたシステインはまた、当業界に公知された化学的合成反応を介してシステインの水素原子または特定原子団を変形させることで、様々なシステイン誘導体で生産されうる。
【００２９】
本出願において、用語、「誘導体」は、目的産物の製造過程で一緒に得られる副産物であって、目的産物と類似の化合物、目的産物の前駆体、任意の化合物の一部を化学的に変化させて得られる類似化合物を含む概念であり、通常は化合物中の水素原子または特定原子団が他の原子または原子団によって置換された化合物を意味する。
【００３０】
本出願において、用語、「システイン誘導体」は、その前駆体を含みシステインの水素原子または特定原子団が他の原子または原子団によって置換された化合物を意味する。その例として、システインのアミン基（−ＮＨ２）の窒素原子またはチオール基（−ＳＨ）の硫黄原子に他の原子または原子団が付着された形態であってもよく、その例としてＮＡＣ（N-acetylcysteine）、ＳＣＭＣ（S- Carboxymetylcysteine）、ＢＯＣ−ＣＹＳ（ＭＥ）−ＯＨ、（Ｒ）−Ｓ−（２−アミノ−２−カルボキシエチル）−Ｌ−ホモシステイン、（Ｒ）−２−アミノ−３−スルホプロピオン酸、Ｄ−２−アミノ−４−（エチルチオ）酪酸、３−スルフィノ−Ｌ−アラニン、Ｆｍｏｃ-Ｃｙｓ（Ｂｏｃ−メチル）−ＯＨ、セレノ−Ｌ−システイン、Ｓ−（２−チアゾリル）−Ｌ−システイン、Ｓ−（２−チエニル）-Ｌ−システイン、 Ｓ−（４−Ｔｏｌｙｌ）−Ｌ−システインなどがあるが、これに制限されない。システインは、アセチル化剤（acetylation agent）と反応してＮＡＣ（N-acetylcysteine）に簡単に合成され、塩基性条件下では、ハロ酢酸（haloacetic acid）と反応してＳＣＭＣ（S-Carboxymetylcysteine）に合成される。前記システイン誘導体は、主に製薬原料であって、鎮咳剤、咳緩和剤、気管支炎、気管支喘息や咽喉炎などの治療剤として用いられる。
【００３１】
本出願の別の一態様は、Ｏ−ホスホセリン（O-phosphoserine、ＯＰＳ）に対する耐性を有する、微生物ＫＣＣＭ１１８１５ＰのＯ−ホスホセリン生産の用途である。
【００３２】
前記用途において、Ｏ−ホスホセリンに対する耐性を有する、Ｏ−ホスホセリンを生産する微生物ＫＣＣＭ１１８１５Ｐは、先に説明した通りである。
【００３３】
前記で説明したように、本出願のＯ−ホスホセリンを生産する微生物は、ＯＰＳに対する耐性が強く、高濃度のＯＰＳでも細胞生長阻害を少なく受けて、優れたＯＰＳ生産能を有する。
【００３４】
以下、本出願の実施例により詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。
【実施例】
【００３５】
実施例１：人工変異法による変異株の選別
Ｏ−ホスホセリン（O-phosphoserine、ＯＰＳ）の生産能が向上された微生物変異株を得るために、下記のような方法で微生物の変異を誘導した。
【００３６】
具体的には、親菌株である大腸菌Ｗ３１１０野生型をＬＢ液体培地に接種して、３７℃で１２時間培養した。その後、前記培養液１ｍｌを１００ｍｌの液体培地に接種して３７℃で５時間３０分間培養した後、培養液５０ｍｌを回収した。回収した培養液を１００ｍＭクエン酸緩衝溶液（citric buffer）で洗浄した後、最終濃度が２００ｍｇ／Ｌになるように添加して、ＮＴＧ（N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine）を４５分間処理し、１００ｍＭリン酸緩衝溶液（phosphate buffer）で洗浄した。
【００３７】
次に、ＯＰＳ生産菌株を得るためにＭ９最小培地にＫＨ２ＰＯ４ ２０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌを添加して凝固させた後、前記ＮＴＧが処理された菌株を塗抹した。この時、Ｍ９最小培地での死滅率は９７％であった。次に３７℃で１２時間培養してＯＰＳを生産する変異株を獲得した。
【００３８】
前記の方法で得られた変異株は、大腸菌ＣＡ０７−０３４８と命名した。２０１６年２月２６日付でブダペスト条約下の寄託機関である韓国微生物保存センターに寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１８１５Ｐを与えられた。
【００３９】
<Ｍ９最小培地の組成>
Ｎａ２ＨＰＯ４６．７８ｇ／Ｌ、 ＫＨ２ＰＯ４３ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ 1ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、アガロース１５ｇ／Ｌ
【００４０】
実施例２：ＯＰＳ生産用変異株のＯＰＳ生産性の調査
前記実施例１で得られた変異株である大腸菌ＣＡ０７−０３４８のＯＰＳ生産性を確認するために、次の実験を行った。
【００４１】
ＯＰＳの生合成経路を強化するために、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ＳｅｒＡ*（Ｇ３３６Ｖ）−（ＲＢＳ）ＳｅｒＣ（特許文献２）のベクターを通常用いる電気パルス方法でＷ３１１０野生型菌株と前記ＣＡ０７−０３４８菌株に形質転換した。それぞれの菌株をＬＢ固体培地にそれぞれ塗抹した後、３３℃の培養器で一晩培養した。ＬＢ固体培地で一晩培養した菌株を下記２５ｍｌの力価培地に接種した後、これを３４．５℃温度の培養器で、２００ｒｐｍで３０時間培養した。培養終了後、液体高速クロマトグラフィーを用いてＯＰＳの生産量を測定し、実験した各菌株に対する培養液中のＯＰＳ濃度は下記表１に示した。
【００４２】
本実施例２で用いた力価培地の組成は下記の通りである。
【００４３】
＜力価培地＞
グルコース５０ｇ／Ｌ、酵母抽出物０．３ｇ／Ｌ、グリシン２．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４６ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４１７ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｍｇ／Ｌ、 ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｏ３ ３０ｇ／Ｌ
【００４４】
【表１】
0006744997.tif 000002
【００４５】
前記表１に示すように、Ｗ３１１０野生型菌株はＯＰＳを全く生産できなかったが、本出願による変異株ＣＡ０７−０３４８は１．２３ｇ／Ｌの濃度でＯＰＳを生産することを確認した。また、形質転換して生合成経路を強化した場合にも、野生型はＯＰＳを全く生産できなかったが、ＣＡ０７−０３４８菌株は２．３ｇ／Ｌの濃度でＯＰＳを生産し、形質転換前よりＯＰＳ生産量が増加することを確認した。
【００４６】
実施例３：ＯＰＳ生産用変異株のＯＰＳ耐性度の調査
前記実施例１で得られたＯＰＳ生産変異株である大腸菌ＣＡ０７−０３４８のＯＰＳ耐性度を確認するために、下記のような方法で培養を行った。
【００４７】
ＬＢ培地２ｍｌを含有する１５ｍｌの使い捨てチューブに親菌株である大腸菌Ｗ３１１０及び前記変異株を接種した後、３７℃で１２時間、２００ｒｐｍで振とう培養し種培養液を得た。培養された菌株をリン酸緩衝溶液（phosphate buffered saline）で１回洗浄した後、スクリーニング培地５ｍｌを含有する５０ｍｌの使い捨てチューブに１００μｌの種培養液を接種し、３７℃で２０時間、２００ｒｐｍで培養した。
【００４８】
本実施例３で用いたスクリーニング培地の組成は下記の通りである。
【００４９】
＜スクリーニング培地＞
グルコース１０ｇ／Ｌ、ＬＢ１００ｇ／Ｌ、Ｈ３ＰＯ４１ｇ／Ｌ、ＯＰＳ１００ｇ／Ｌ、ＫＯＨ ０．２７Ｍ、ＮａＯＨ ０．２７Ｍ、ｐＨ ７．０
【００５０】
培養終了後、分光光度計を用いて光学密度（Optical Density、以下ＯＤ）を測定し、実験した各菌株に対する培養液のＯＤは下記の表２に示した。
【００５１】
【表２】
0006744997.tif 000003
【００５２】
その結果、前記表２に示すように、親菌株である大腸菌Ｗ３１１０は１００ｇ／ＬのＯＰＳが含まれた培地（スクリーニング培地）で２０時間培養したときに測定されたＯＤ値が０．２０であったが、本出願による変異株大腸菌ＣＡ０７−０３４８は測定されたＯＤ値が０．３９であり、生長速度が約２倍程度速いことを確認した。
【００５３】
前記の結果は、変異株大腸菌ＣＡ０７−０３４８がＯＰＳ１００ｇ／Ｌに対する耐性を有し、結果的に細胞生長阻害を少なく受けることを意味し、本出願の微生物はＯＰＳ大量生産に非常に有用に使用されうる。
【００５４】
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【００５５】
0006744997.tif 000004