(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿由来細胞からの誘導ベータ細胞を生成する方法であって、
（ａ）尿由来細胞を提供することと、
（ｂ）第１の期間にわたって、胚体内胚葉誘導剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、及びビタミンＣを含む有効量の小分子初期化因子の組み合わせを含む一次誘導培養培地中で前記尿由来細胞を培養することによって、ステップ（ａ）で提供された前記尿由来細胞を誘導して、誘導内胚葉細胞を得ることと、
（ｃ）第２の期間にわたって、二次誘導培養培地中で前記誘導内胚葉細胞を培養することによって、ステップ（ｂ）で得られた前記誘導内胚葉細胞を誘導して、誘導膵臓前駆細胞を得ることと、
（ｄ）第３の期間にわたって、三次誘導培養培地中で前記膵臓前駆細胞を培養することによって、ステップ（ｃ）で得られた前記誘導膵臓前駆細胞を誘導して、誘導ベータ細胞を得ることと、を含み、
（ｃ）（ｉ）前記第２の期間が、第１の部分及び第２の部分からなり、
前記二次誘導培地が、前記第２の期間の第１の部分においては、ＰＫＣ活性剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＳＨ）阻害剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）作動薬、ビタミンＣ、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤、及びＰｄｘ１誘導剤；ならびに、前記第２の期間の第２の部分においては、ＰＫＣ活性剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＳＨ）阻害剤、ビタミンＣ、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤、及びＰｄｘ１誘導剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子を含む；又は
（ｃ）（ii）前記第２の期間が、第１の部分、第２の部分、及び第３の部分からなり、
前記二次誘導培地が、前記第２の期間の前記第１の部分においては、ビタミンＣ；前記第２の期間の第２の部分においては、ビタミンＣ、ＲＡＲ作動薬、ＳＳＨ阻害剤、ＰＫＣ活性剤、及びＢＭＰ誘導剤；ならびに、前記第２の期間の第３の部分においては、ビタミンＣ、ＲＡＲ作動薬、及びＳＳＨ阻害剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子を含む；
（ｄ）（ｉ）前記三次誘導培地が、ＭＥＫ阻害剤、ビタミンＣ、及びｎｏｔｃｈ阻害剤を含む；又は
（ｄ）（ii）前記第３の期間が、第１の部分、第２の部分、及び第３の部分からなり、
前記三次誘導培地が、前記第３の期間の前記第１の部分においては、ビタミンＣ、ＲＡＲ作動薬、ＳＳＨ阻害剤、ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＡＬＫ受容体阻害剤、及びトリヨードチロニン；前記第３の期間の前記第２の部分においては、ビタミンＣ、ＲＡＲ作動薬、ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＡＬＫ受容体阻害剤、及びトリヨードチロニン；ならびに、前記第３の期間の前記第３の部分においては、ビタミンＣ及びトリヨードチロニンからなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子を含む；
ここで前記方法が、小分子ではない初期化因子の使用を除外する、前記方法。
【請求項２】
前記一次誘導培地が、有効量のＩＤＥ１、塩化リチウム、及びビタミンＣを含み、
前記二次誘導培地が、
前記第２の期間の第１の部分においては、有効量のインドラクタムＶ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、ビタミンＣ、レチノイン酸、Ａ８３−０１、及びＢＲＤ７５５２、ならびに
前記第２の期間の第２の部分においては、有効量のインドラクタムＶ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、ビタミンＣ、Ａ８３−０１、及びＢＲＤ７５５２、を含み、
前記三次誘導培地が、有効量のＳＢ２０３５８０、ビタミンＣ、及びＤＡＰＴを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一次誘導培地が、有効量のＩＤＥ１、塩化リチウム、及びビタミンＣを含み、
二次誘導培地は、
第２の期間の第１の部分においては、有効量のビタミンＣ、
第２の期間の第２の部分においては、有効量のビタミンＣ、ＲＡ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、インドラクタムＶ、及びドルソモルフィン、ならびに
第２の期間の第３の部分においては、有効量のビタミンＣ、ＲＡ、及びシクロパミン−ＫＡＡＤを含み、
三次誘導培地は、
第３の期間の第１の部分においては、有効量のビタミンＣ、ＲＡ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、ＤＡＰＴ、Ａ８３−０１、及びトリヨードチロニン、
第３の期間の第２の部分においては、有効量のビタミンＣ、ＲＡ、ＤＡＰＴ、Ａ８３−０１、及びトリヨードチロニン、ならびに
前記第３の期間の第３の部分においては、有効量のビタミンＣ及びトリヨードチロニンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
尿由来細胞から誘導内胚葉細胞を生成する方法であって、
（ａ）尿由来細胞を提供することと、
（ｂ）第１の期間にわたって、胚体内胚葉誘導剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、及びビタミンＣを含む有効量の小分子初期化因子の組み合わせを含む一次誘導培養培地中で前記尿由来細胞を培養することによって、ステップ（ａ）で提供された前記尿由来細胞を誘導して、誘導内胚葉細胞を得ることと、を含む、方法。
【請求項５】
尿由来細胞から誘導膵臓前駆細胞を生成する方法であって、
（ａ）尿由来細胞を提供することと、
（ｂ）第１の期間にわたって、胚体内胚葉誘導剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、及びビタミンＣを含む有効量の小分子初期化因子の組み合わせを含む一次誘導培養培地中で前記尿由来細胞を培養することによって、ステップ（ａ）で提供された前記尿由来細胞を誘導して、誘導内胚葉細胞を得ることと、
（ｃ）第２の期間にわたって、二次誘導培養培地中で前記誘導内胚葉細胞を培養することによって、ステップ（ｂ）で得られた前記誘導内胚葉細胞を誘導して、誘導膵臓前駆細胞を得ることと、を含み、
（ｃ）（ｉ）前記第２の期間が、第１の部分及び第２の部分からなり、
前記二次誘導培地が、前記第２の期間の第１の部分においては、ＰＫＣ活性剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＳＨ）阻害剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）作動薬、ビタミンＣ、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤、及びＰｄｘ１誘導剤；ならびに、前記第２の期間の第２の部分においては、ＰＫＣ活性剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＳＨ）阻害剤、ビタミンＣ、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤、及びＰｄｘ１誘導剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子を含む；又は
（ｃ）（ii）前記第２の期間が、第１の部分、第２の部分、及び第３の部分からなり、
前記二次誘導培地が、前記第２の期間の前記第１の部分においては、ビタミンＣ；前記第２の期間の第２の部分においては、ビタミンＣ、ＲＡＲ作動薬、ＳＳＨ阻害剤、ＰＫＣ活性剤、及びＢＭＰ誘導剤；ならびに、前記第２の期間の第３の部分においては、ビタミンＣ、ＲＡＲ作動薬、及びＳＳＨ阻害剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子を含む、前記方法。
【請求項６】
前記尿由来細胞が対象の尿試料から得られる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）が、適切な組織培養培地中で前記尿由来細胞を培養することによって、前記尿由来細胞を増殖させることをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記尿由来細胞がヒト細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞を誘導する方法、及び本方法によって誘導される細胞に関する。特定の形態において、本開示はベータ細胞を誘導することに関する。
【０００２】
参照による引用
以下の同時係属中の特許出願が本明細書内で参照される：
ＷＯ２０１３／０８６５７０として公開された、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ」のＰＣＴ／ＡＵ２０１２／００１５２５。
この出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
真性糖尿病（ＤＭ）、または単に糖尿病という用語は、膵臓が十分なインスリンを生成しないため、あるいは対象内の細胞がインスリンに対して非感受性または「抵抗性」である（即ち、生成されるインスリンに対して適切に反応しない）ために、対象が「高血糖」を有する代謝性疾患の群を指す。これらの疾患の典型的な症状は、多尿（即ち、頻尿）、多飲（即ち、のどの渇きの増大）、及び過食（即ち、空腹感の増大）であり、２つの主な型、つまり１型ＤＭ及び２型ＤＭがある。１型ＤＭは、体がインスリンを生成することができないことから生じ、現在における医学的介入は、対象が、通常は注射またはインスリンポンプのいずれかによって、インスリンを投与することを必要とする。一方、２型ＤＭは、インスリン抵抗性、つまり細胞がインスリンを適切に使用することができない状態から生じ、時に絶対的インスリン欠乏と組み合わさる。主要ホルモンとして、インスリンは、血液から大半の細胞（主に筋肉及び脂肪細胞であり、中枢神経系細胞ではない）内へのグルコースの取り込みを制御する。したがって、インスリンの欠乏またはインスリン受容体における非感受性は、あらゆる種類のＤＭにおいて中心的な役割を果たす。
【０００４】
ＤＭは、世界中で推定２億８５００万人の患者が罹患する（これらの患者のうち約９０％が２型糖尿病）深刻な医学的問題である。心配なことに、ＤＭの発生率は急速に増大しており、２０３０年までに、罹患した患者の現数は２倍になると予測されている（Ｗｉｌｄら、２００４）。したがって、望ましくは現在の標準的な治療選択肢よりも低侵襲かつ有効である、ＤＭの代替的な治療法を特定する必要がある。この点に関して、患者内に新しいインスリン分泌膵臓細胞（即ち、ベータ膵島細胞またはベータ細胞）を生成するために幹細胞治療の使用の可能性について多数の研究が行われてきた。最近の報告では、ハーバード大学のグループが、完全に成熟したグルコース反応性ベータ細胞をヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）及びヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の両方から生成し、これらを糖尿病マウスモデルへ移植して、この疾患のマウスを数日以内に「治癒した」（Ｐａｇｌｉｕｃａら、２０１４）。さらには、まもなく、Ｖｉａｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（サンディエゴ、ＣＡ、米国）の競合グループが、免疫防御性カプセル内に含有されたいくらか成熟度の低いＥＳ細胞由来膵島細胞の移植に関する臨床試験を始める予定である（Ｄ’Ａｍｏｕｒら、２００６）。加えて、インスリン分泌ベータ細胞は、ラット及びヒト神経幹細胞などの他の幹細胞タイプから生成されており（Ｈｏｒｉら、２００５、及びＫｕｗａｂａｒａら、２０１１）、また、小分子誘導剤、つまり５−アザシチジン（ＡｚａＣ）を使用してヒト線維芽細胞（成熟細胞型）から誘導されている（Ｐｅｎｎａｒｏｓｓａら、２０１３）。
【０００５】
幹細胞の誘導及び／または成熟細胞からの未成熟細胞型は、それが容易に入手可能かつ比較的非侵襲の自家細胞源から治療上重要な細胞を生成する可能性を提供することから、本出願人らの大きな関心の対象である。しかしながら、一般的には、細胞をｉＰＳＣに初期化するためのプロトコルは、細胞に、ポリペプチド初期化因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を導入すること、またはポリペプチド初期化因子（例えば、Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆｌ）、Ｓｏｘファミリー（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１８など）、Ｍｙｃファミリー（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−ｍｖｃ、Ｌ−ｍｙｃ）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｆｌ５など）、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８などの、転写因子、及び初期化と関連付けられる他の因子）を直接導入することを伴う。そのようなポリヌクレオチド分子またはポリペプチド初期化因子は、ウイルストランスフェクションベクター（例えば、レトロウイルス）もしくはプラスミドを使用する遺伝物質として細胞に導入され得るか、または、ｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ、あるいはポリペプチド（例えば、組換ポリペプチド）として導入され得る。そのようなウイルストランスフェクションベクター、ならびに／または外因性でかつ潜在的に発がん性の転写因子及び初期化に関連付けられる関連因子（例えば、がんを誘導する可能性がある）に関連付けられるリスクについて多くの懸念がなされており、それがこれまで治療におけるｉＰＳＣの使用にいくらかの制限を引き起こしてきた。
【０００６】
近年、研究により、初期化プロセスにおいて幹細胞誘導の効率性及び多様性を向上させるために、様々な小分子が、特定のポリペプチドまたはポリヌクレオチド初期化因子と置き換えるために（より少ない転写因子が誘導において使用され得るように）使用され得る方法が明らかになった（例えば、Ｓｈｉら、２００８、Ｈｕａｎｇｆｕら、２００８、及びＭａｈｅｒａｌｉ＆Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ、２００９を参照されたい）。そのような研究に興味を引かれ、本出願人は、以前に、小分子のみを使用してｉＰＳＣを生成することが可能であり得るかどうかを決定する実験を行った。１つ以上の小分子の選択を使用することで、それらの研究は、ｉＰＳＣを生成することには成功しなかったが、線維芽細胞などの体細胞の神経幹細胞（小分子誘導神経幹（ＳＭＩＮＳ）細胞と呼ばれる）などの複能性細胞への誘導に成功した。ＳＭＩＮＳの生成のプロトコルは、ＰＣＴ／ＡＵ２０１２／００１５２５（ＷＯ２０１３／０８６５７０）に記載され、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００７】
本開示につながる研究において、本出願人は、小分子のみを使用する（それによりポリペプチド初期化因子、及びポリペプチド初期化因子をコードするポリヌクレオチド分子の使用を回避する）同様のプロトコルが、インスリンを分泌する能力があるベータ細胞などの細胞の生成のために開発され得るかどうかを特定することを目指した。望ましくは、本出願人は、変異原性であることが知られる上記の小分子誘導剤（即ち、ＡｚａＣ）などの他の点で有害な分子の使用を回避するプロトコルを目指した。
【発明の概要】
【０００８】
本開示の第１の態様に従って、尿由来細胞から誘導ベータ細胞を生成する方法であって、
（ａ）尿由来細胞を提供することと、
（ｂ）第１の期間にわたって、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む一次誘導培養培地中で尿由来細胞を培養することによって、ステップ（ａ）で提供された尿由来細胞を誘導して、誘導内胚葉細胞を得ることと、
（ｃ）第２の期間にわたって、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む二次誘導培養培地中で誘導内胚葉細胞を培養することによって、ステップ（ｂ）で得られた誘導内胚葉細胞を誘導して、誘導膵臓前駆細胞を得ることと、
（ｄ）第３の期間にわたって、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む三次誘導培養培地中で膵臓前駆細胞を培養することによって、ステップ（ｃ）で得られた誘導膵臓前駆細胞を誘導して、誘導ベータ細胞を得ることと、を含む、方法が提供される。
【０００９】
ある実施形態において、一次誘導培地は、胚体内胚葉誘導剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、及びビタミンＣからなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む。
【００１０】
ある実施形態において、一次誘導培地は、胚体内胚葉誘導剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、及びビタミンＣを含む、有効量の小分子初期化因子（複数可）の組み合わせを含む。
【００１１】
ある実施形態において、二次誘導培地は、ＰＫＣ活性剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＳＨ）阻害剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）作動薬、ビタミンＣ、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤、及びＰｄｘ１誘導剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む。
【００１２】
ある実施形態において、二次誘導培地は、ＰＫＣ活性剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＳＨ）阻害剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）作動薬、ビタミンＣ、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤、Ｐｄｘ１誘導剤、及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）誘導剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む。
【００１３】
ある実施形態において、第２の期間は第１の部分及び第２の部分からなり、ここで二次誘導培地は、
第２の期間の第１の部分においては、ＰＫＣ活性剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＳＨ）阻害剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）作動薬、ビタミンＣ、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤、及びＰｄｘ１誘導剤、ならびに
第２の期間の第２の部分においては、ＰＫＣ活性剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＳＨ）阻害剤、ビタミンＣ、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤、及びＰｄｘ１誘導剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む。
【００１４】
ある実施形態において、第２の期間は、第１の部分、第２の部分、及び第３の部分からなり、ここで二次誘導培地は、
第２の期間の第１の部分においては、ビタミンＣ、
第２の期間の第２の部分においては、ビタミンＣ、ＲＡＲ作動薬、ＳＳＨ阻害剤、ＰＫＣ活性剤、及びＢＭＰ誘導剤、ならびに
第２の期間の第３の部分においては、ビタミンＣ、ＲＡＲ作動薬、及びＳＳＨ阻害剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む。
【００１５】
ある実施形態において、第３の誘導培地は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、ビタミンＣ、及びｎｏｔｃｈ阻害剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む。
【００１６】
ある実施形態において、三次誘導培地は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、ビタミンＣ、ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＡＬＫ受容体阻害剤、トリヨードチロニン、ＲＡＲ作動薬、及びＳＳＨ阻害剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む。
【００１７】
ある実施形態において、胚体内胚葉誘導剤はＩＤＥ１である。ある実施形態において、ＧＳＫ阻害剤は塩化リチウムである。ある実施形態において、ＰＫＣ活性剤はインドラクタムＶである。ある実施形態において、ＳＳＨ阻害剤はシクロパミン−ＫＡＡＤである。ある実施形態において、ＲＡＲ作動薬はレチノイン酸である。ある実施形態において、ＡＬＫ受容体阻害剤はＡ８３−０１である。ある実施形態において、Ｐｄｘ−１誘導剤はＢＲＤ  ７５５２である。ある実施形態において、ＭＥＫ阻害剤はＳＢ２０３３５８０である。ある実施形態において、ｎｏｔｃｈ阻害剤はＤＡＰＴである。ある実施形態において、ＢＭＰ誘導剤はドルソモルピンである。
【００１８】
ある実施形態において、
一次誘導培地は、有効量のＩＤＥ１、塩化リチウム及びビタミンＣを含み、
二次誘導培地は、
第２の期間の第１の部分においては、有効量のインドラクタムＶ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、ビタミンＣ、レチノイン酸、Ａ８３−０１、及びＢＲＤ  ７５５２、ならびに
第２の期間の第２の部分においては、有効量のインドラクタムＶ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、ビタミンＣ、Ａ８３−０１、及びＢＲＤ７５５２、を含み、
第３の誘導培地は、有効量のＳＢ２０３５８０、ビタミンＣ、及びＤＡＰＴを含む。
【００１９】
ある実施形態において、
一次誘導培地は、有効量のＩＤＥ１、塩化リチウム及びビタミンＣを含み、
二次誘導培地は、
第２の期間の第１の部分においては、有効量のビタミンＣ、
第２の期間の第２の部分においては、有効量のビタミンＣ、ＲＡ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、インドラクタムＶ、及びドルソモルフィン、ならびに
第２の期間の第３の部分においては、有効量のビタミンＣ、ＲＡ、及びシクロパミン−ＫＡＡＤを含み、
三次誘導培地は、
第３の期間の第１の部分においては、有効量のビタミンＣ、ＲＡ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、ＤＡＰＴ、Ａ８３−０１、及びトリヨードチロニン、
第３の期間の第２の部分においては、有効量のビタミンＣ、ＲＡ、ＤＡＰＴ、Ａ８３−０１、及びトリヨードチロニン、ならびに
第３の期間の第３の部分においては、有効量のビタミンＣ及びトリヨードチロニンを含む。
【００２０】
ある実施形態において、尿由来細胞は対象の尿試料から得られる。ある実施形態において、尿由来細胞はヒト細胞である。
【００２１】
ある実施形態において、ステップ（ａ）は、適切な組織培養培地中で尿由来細胞を培養することによって、尿由来細胞を増殖させることをさらに含む。
【００２２】
ある実施形態において、本方法は、小分子ではない初期化因子の使用を除外する。
【００２３】
第２の態様において、本開示は、尿由来細胞から誘導内胚葉細胞を生成する方法であって、
（ａ）尿由来細胞を提供することと、
（ｂ）第１の期間にわたって、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む一次誘導培養培地中で当該尿由来細胞を培養することによって、ステップ（ａ）で得られた尿由来細胞を誘導して、誘導内胚葉細胞を得ることと、を含む、方法を提供する。
【００２４】
第３の態様において、本開示は、尿由来細胞から誘導膵臓前駆細胞を生成する方法であって、
（ａ）尿由来細胞を提供することと、
（ｂ）第１の期間にわたって、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む一次誘導培養培地中で当該尿由来細胞を培養することによって、ステップ（ａ）で得られた尿由来細胞を誘導して、誘導内胚葉細胞を得ることと、
（ｃ）第２の期間にわたって、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む二次誘導培養培地中で当該誘導内胚葉細胞を培養することによって、ステップ（ｂ）で得られた誘導内胚葉細胞を誘導して、誘導膵臓前駆細胞を得ることと、を含む方法を提供する。
【００２５】
第４の態様において、本開示は、内胚葉細胞から誘導膵臓前駆細胞を生成する方法であって、
内胚葉細胞を提供することと、
ある期間にわたって、ＰＫＣ活性剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＳＨ）阻害剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）作動薬、ビタミンＣ、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤、及びＰｄｘ１誘導剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む誘導培養中で当該内胚葉細胞を培養することによって、得られた内胚葉細胞を誘導して、誘導膵臓前駆細胞を得ることと、を含む方法を提供する。
【００２６】
第５の態様において、本開示は、膵臓前駆細胞から誘導ベータ細胞を生成する方法であって、
膵臓前駆細胞を提供することと、
マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、ビタミンＣ、及びｎｏｔｃｈ阻害剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む誘導培養培地中で当該膵臓前駆細胞を培養することによって、得られた膵臓前駆細胞を誘導して、誘導ベータ細胞を得ることと、を含む方法を提供する。
第６の態様において、本開示は、本開示の態様のいずれか１つの方法を使用して得られる細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】（ａ）ＣＤ１３発現、（ｂ）ヒト核抗原（ＨＮＡ）発現、（ｃ）ＤＡＰＩ、及び（ｄ）統合された画像用に染色された、３５歳のヒト男性ドナー（「Ｍ−３５」）から採取したヒト尿細胞（ＨＵＣ）の蛍光顕微鏡画像（スケールバー：１００μｍ）を提供する。
【図２】（ａ）ベミンチン（ｖｅｍｉｎｔｉｎ）、及び（ｂ）Ｅカドヘリン用に染色された、３５歳ヒト男性ドナー（「Ｍ−３５」）から採取したヒト尿細胞（ＨＵＣ）の蛍光顕微鏡画像（スケールバー＝１００μｍ）を提供する。
【図３】アクチビンＡ、ＬｉＣｌ、及びビタミンＣを含有する一次誘導培地での６日間の一次誘導の（ａ）前及び（ｂ）後の３５歳ヒト男性ドナー（「Ｍ−３５」）の尿から採取した細胞の顕微鏡画像（スケールバー：１００μｍ）を提供する。
【図４】アクチビンＡ、ＬｉＣｌ、及びビタミンＣを含有する一次誘導培地での６日間の一次誘導の前（第１のカラム）及び後（第２のカラム）の、（ａ）Ｓｏｘ１７及び（ｂ）Ｆｏｘａ２に対して陽性の３５歳ヒト男性ドナー（「Ｍ−３５」）の尿から採取した細胞のパーセンテージのグラフ結果を提供する（ＡＩ＝誘導後）。
【図５】アクチビンＡ、ＬｉＣｌ、及びビタミンＣを含有する一次誘導培地での６日間の一次誘導、ならびに１日間はインドラクタムＶ、Ｌ−グルタミン、及びＢ２７、レチノイン酸（ＲＡ）、ビタミンＣ（ＶＣ）、及びＡ８３−０１、次いで７日間はビタミンＣ及びＡ８３−０１を含有する二次誘導培地中での二次誘導後のヒト尿から採取した細胞の顕微鏡画像（スケールバー＝１００μｍ）を提供する。
【図６】アクチビンＡ、ＬｉＣｌ、及びビタミンＣを含有する一次誘導培地での６日間の一次誘導、ならびに１日間はインドラクタムＶ、Ｌ−グルタミン、Ｂ２７、レチノイン酸（ＲＡ）、ビタミンＣ（ＶＣ）、及びＡ８３−０１、次いで７日間はビタミンＣ及びＡ８３−０１を含有する二次誘導培地中での二次誘導後、さらにＰｄｘ１−ｃｙ３−インスリン−４８８レンチウイルスに感染させた、ヒト尿から採取した細胞の（ａ）位相差画像及び（ｂ）蛍光顕微鏡画像（スケールバー＝１００μｍ）を提供する。
【図７】アクチビンＡ、ＬｉＣｌ、及びビタミンＣを含有する一次誘導培地での６日間の一次誘導、１日間はインドラクタムＶ、ＲＡ、ビタミンＣ、及びＡ８３−０１、次いで３日間はインドラクタムＶ、ビタミンＣ、及びＡ８３−０１を含有する二次誘導培地中での二次誘導、ならびにＳＢ２０３５８０及びビタミンＣを含有する三次誘導培地での９日間の三次誘導後の、ヒト尿から採取した細胞の蛍光顕微鏡画像（スケールバー＝１００μｍ）を提供する。
【図８】胚体内胚葉（ＩＤＥ）１の誘導剤、塩化リチウム、及びビタミンＣを含有する一次誘導培地での６日間の一次誘導、１日間はシクロパミン−ＫＡＡＤ、インドラクタムＶ、ＲＡ、ビタミンＣ、Ａ８３−０１、及びＢＲＤ  ７５５２（ｐＨは７．４に調節される）、次いで６日間はシクロパミン−ＫＡＡＤ、インドラクタムＶ、ビタミンＣ、Ａ８３−０１、及びＢＲＤ  ７５５２（ｐＨは７．４に調節される）を含有する二次誘導培地での二次誘導、ならびにＳＢ２０３５８０、ビタミンＣ、及びＤＡＰＴを含有する三次誘導培地での９日間の三次誘導後の、ヒト尿から採取した細胞の位相差画像（スケールバー＝１００μｍ）を提供する。
【図９】ＩＤＥ１、塩化リチウム、及びビタミンＣを含有する一次誘導培地での６日間の一次誘導、１日間はシクロパミン−ＫＡＡＤ、インドラクタムＶ、ＲＡ、ビタミンＣ、Ａ８３−０１、及びＢＲＤ  ７５５２（ｐＨは７．４に調節される）、次いで６日間はシクロパミン−ＫＡＡＤ、インドラクタムＶ、ビタミンＣ、Ａ８３−０１、及びＢＲＤ  ７５５２（ｐＨは７．４に調節される）を含有する二次誘導培地での二次誘導、ならびにＳＢ２０３５８０及びビタミンＣを含有する三次誘導培地での９日間の三次誘導後の、（ａ）Ｃ−ペプチド、（ｂ）インスリン、（ｃ）ＤＡＰＩ、及び（ｄ）統合された画像用に染色された、蛍光顕微鏡画像（スケールバー＝５０μｍ）を提供する。
【図１０】ＩＤＥ１、塩化リチウム、及びビタミンＣを含有する一次誘導培地での６日間の一次誘導、１日間はシクロパミン−ＫＡＡＤ、インドラクタムＶ、ＲＡ、ビタミンＣ、Ａ８３−０１、及びＢＲＤ  ７５５２（ｐＨは７．４に調節される）、次いで６日間はシクロパミン−ＫＡＡＤ、インドラクタムＶ、ビタミンＣ、Ａ８３−０１、及びＢＲＤ  ７５５２（ｐＨは７．４に調節される）を含有する二次誘導培地での二次誘導、ならびにＳＢ２０３５８０及びビタミンＣを含有する三次誘導培地での９日間の三次誘導後の、Ｃ−ペプチド、インスリン、及びＤＡＰＩ用に染色された、統合された蛍光顕微鏡画像（スケールバー＝５０μｍ）を提供する。
【図１１】ＩＤＥ１、ＬｉＣｌ、及びビタミンＣを含有する一次誘導培地での６日間の一次誘導、１日間はシクロパミン−ＫＡＡＤ、インドラクタムＶ、ＲＡ、ＶＣ、Ａ８３−０１、ＢＲＤ  ７５５２、続いて６日間はシクロパミン−ＫＡＡＤ、インドラクタムＶ、ＶＣ、Ａ８３−０１、及びＢＲＤ  ７５５２（ｐＨは７．４に調節される）を含有する二次誘導培地での二次誘導、ならびにＳＢ２０３５８０、ＶＣ、及びＤＡＰＴを含有する９日間の三次誘導培地の後の、（ａ）インスリン、（ｂ）Ｃ−ペプチド、（ｃ）ＤＡＰＩ、及び（ｄ）統合用に染色された、ヒト尿から採取した細胞の蛍光顕微鏡画像（スケールバー＝５０μｍ）を提供する。
【図１２】誘導（白色カラム）前と、ＩＤＥ１、ＬｉＣｌ、及びビタミンＣを含有する一次誘導培地での６日間の一次誘導、１日間はシクロパミン−ＫＡＡＤ、インドラクタムＶ、ＲＡ、ＶＣ、Ａ８３−０１、ＢＲＤ  ７５５２（ｐＨは７．４に調節される）、続いて６日間はシクロパミン−ＫＡＡＤ、インドラクタムＶ、ＶＣ、Ａ８３−０１、及びＢＲＤ  ７５５２（ｐＨは７．４に調節される）を含有する二次誘導培地での二次誘導、ならびにＳＢ２０３５８０、ＶＣ、及びＤＡＰＴを含有する９日間の三次誘導培地の後（黒色カラム）の、ヒト尿から採取した細胞における（ａ）ＰＤＸ１、（ｂ）膵島（ＩＳＬ）、及び（ｃ）ＮＧＮ３  ｍＲＮＡの相対的な遺伝子発現レベルのグラフ表示を提供する。
【図１３】（Ａ）三次誘導後の細胞（「ＩＢＣと称される）、（Ｂ）ヒト膵島細胞、及び（Ｃ）尿細胞において放出されるＣ−ペプチド（ｎｇ／ｍｌ／３００００細胞）のグラフ表示を提供し、ここで「０」試料は、培養培地上清を指し、「１−２」は、低（２ｍＭ）グルコースでの第１の細胞刺激後に得られる試料を指し、「１−２０」は、高（２０ｍＭ）グルコースでの第１の細胞刺激後に得られる試料を指し、「２−２」は、低（２ｍＭ）グルコースでの第２の刺激細胞後に得られる試料を指し、「２−２０」は、高（２０ｍＭ）での第２の細胞刺激後に得られる試料を指す。
【図１４】一次誘導プロトコル（「ＩＢＣステージ１」と称される）後の細胞、ヒト膵島細胞、もしくは尿細胞の（Ａ）ｓｏｘ１７もしくは（Ｂ）Ｆｏｘａ２発現、二次誘導プロトコル（「ＩＢＣステージ２」と称される）後の細胞、ヒト膵島細胞、もしくは尿細胞の（Ｃ）Ｐｄｘ１もしくは（Ｄ）ＮＧＮ３発現、または三次誘導プロトコル（「ＩＢＣステージ３」と称される）後の細胞、ヒト膵島細胞、もしくは尿細胞の（Ｅ）インスリンもしくは（Ｆ）ソマトスタチン（ＳＳＴ）発現のためのｑ−ＰＣＲ後の遺伝子発現レベルのグラフ表示を提供する。
【図１５】三次誘導後の細胞のＦＡＣＳヒストグラムを提供するものであり、（Ａ）が生細胞のゲーティングを表し、（Ｂ）が抗インスリン抗体を使用した染色を示し、（Ｃ）が抗Ｃ−ペプチド抗体を使用した染色を示す。
【図１６】（Ａ）オクルジン（ＯＣＬ）、（Ｂ）ＫＲＴ７、（Ｃ）ＮＲ３Ｃ２、（Ｄ）Ｌ１ＣＡＭ、（Ｅ）ＳＬＣ２Ａ１、及び（Ｆ）ビメンチンについて、３つの異なる尿細胞試料及び線維芽細胞試料のｑ−ＰＣＲ後の遺伝子発現レベルのグラフ表示を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本出願人は、３つの誘導ステップを使用してベータ細胞を尿由来細胞などの体細胞から効率的に誘導するための新規でかつ安全な方法を特定しており、それぞれのステップが誘導のための少なくとも１つの小分子初期化分子（複数可）を含む少なくとも１つの誘導培養培地を利用する。いくつかの実施形態において、本方法は、小分子ではない初期化因子（複数可）の使用を除外する。有利に、本方法は、潜在的に有害なウイルストランスフェクションベクターの組み込み及び／または発がん性転写因子などのポリヌクレオチドまたはポリペプチド初期化因子の導入の懸念を減少させ、変異原性であることが知られる上記の小分子誘導剤（即ち、ＡｚａＣ）などの他の点で有害な分子の使用を回避することを目指す。加えて、この方法は、容易に入手可能であり、かつ非侵襲的方法により採取され得る細胞を利用することから特に有利である。したがって、この方法は、真性糖尿病（ＤＭ）などのインスリン欠乏または非感受性に関与する疾患を有する対象のための個別の細胞ベースの治療の適合に向けての重要なステップを表し得る。
【００２９】
本開示の第１の態様に従って、尿由来細胞から誘導ベータ細胞を生成する方法であって、
（ａ）尿由来細胞を提供することと、
（ｂ）第１の期間にわたって、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む一次誘導培養培地中で当該尿由来細胞を培養することによって、ステップ（ａ）で提供された尿由来細胞を誘導して、誘導内胚葉細胞を得ることと、
（ｃ）第２の期間にわたって、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む二次誘導培養培地中で当該誘導内胚葉細胞を培養することによって、ステップ（ｂ）で得られた誘導内胚葉細胞を誘導して、誘導膵臓前駆細胞を得ることと、
（ｄ）第３の期間にわたって、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む三次誘導培養培地中で当該膵臓前駆細胞を培養することによって、ステップ（ｃ）で得られた誘導膵臓前駆細胞を誘導して、誘導ベータ細胞を得ることと、を含む、方法が提供される。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「小分子」という用語は、当業者によって理解されるように、生物学的機能を有する低分子量の化合物を指すと理解されるものとする。定義上は、小分子は、それが極小のオリゴマー（例えば、２つまたはおそらくは３つのモノマーからなる）でない限りは、ポリマーではない。したがって、小分子は、遺伝子、プライマー、トランスポゾン、または他のＤＮＡポリヌクレオチド分子などのポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、タンパク質またはポリペプチドをコードするＲＮＡポリヌクレオチド分子（例えば、二本鎖ＲＮＡ、ｍＲＮＡ（即ち、センスＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの相補体（即ち、ＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖））、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子もしくは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子、または他のＲＮＡポリヌクレオチド分子、もしくはポリペプチド、またはこれらのポリヌクレオチドもしくはポリペプチド分子のいずれかのフラグメントではないが、ただし当該フラグメントがジヌクレオチド、ジペプチド、もしくはトリペプチドなどのモノマーまたは極小オリゴマーである場合を除く。本開示の小分子は、典型的には、有機化合物であるが、塩化リチウムまたは酪酸ナトリウムなど、いくつかの無機化学物質が、本開示の小分子であってもよい。小分子の分子量上限は、一般的には、およそ８００ｇ／モル（即ち、およそ８００ダルトン）であると見なされる。しかしながら、当業者は、小分子がおよそ９００ｇ／モルの分子量上限を有し得ることを理解する。小分子は、一般的に、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子などのバイオポリマーに特定の様式で結合し、そのポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子の活性または機能を変化させる（例えば、特定の酵素の機能を活性化または阻害するなど）。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「初期化因子」という用語は、細胞が異なる細胞型または表現型に転換するように、細胞「初期化」、即ち、分化、及び／または脱分化、及び／または分化転換と関連付けられる分子を指すことが意図される。初期化因子は、一般的に、細胞分化、脱分化、及び／または分化転換と関連付けられる遺伝子の発現に影響を与える。転写因子は、初期化因子の例である。
【００３２】
当業者は、本明細書で使用される場合、「分化」が、あまり特殊化していない細胞（即ち、より高い細胞能力を有するよりナイーブな細胞）がより特殊化した細胞型（即ち、より低い細胞能力を有するあまりナイーブでない細胞）になるプロセスを指すこと、「脱分化」という用語が、より特殊化した細胞があまり特殊化していない細胞型（即ち、より高い細胞能力を有するナイーブな細胞）になるプロセスを指し、「分化転換」という用語が、特定の細胞型の細胞が、その「細胞能力」または「ナイーブ性」レベルを著しく変化させることなく別の細胞型に転換するプロセスを指すことを理解する。理論に拘束されることを望むものではないが、細胞が、それらの「細胞能力」または「ナイーブ性」レベルを著しく変化させることなく、１つの系統コミット細胞型または最終分化した細胞型から別の系統コミット細胞型または最終分化した細胞型へ転換するときに、細胞は「分化転換する」と考えられる。本明細書で使用される場合、「細胞能力」という用語は、細胞が異なる系統の細胞に分化する能力を指すと理解されるものとする。例えば、多能性細胞（例えば、幹細胞）は、３つの胚葉、即ち、内胚葉（内部胃壁、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、または外胚葉（表皮系組織及び神経系）のいずれかの細胞に分化する可能性を有し、したがって、高い細胞能力を有し、複能性細胞（例えば、幹細胞または特定の種類の誘導幹細胞）は、複数であるが限られた数の系統（造血性幹細胞、心臓の幹細胞、または神経幹細胞など）から細胞をもたらす能力を有し、多能性細胞よりも比較的低い細胞能力を有する。特定の系統にコミットした細胞または最終分化した細胞は、依然として低い細胞能力を有する。当該技術分野で既知の分化転換の特定の例としては、線維芽細胞の、筋肉細胞（Ｄａｖｉｓら、１９８７）、神経（Ｖｉｅｒｂｕｒｃｈｅｎら、２０１０）、ベータ細胞（Ｐｅｎｎａｒｏｓｓａら、２０１３）、または心筋細胞（Ｅｆｅら、２０１１）への、膵外分泌細胞からベータ細胞（Ｚｈｏｕら、２００８）への変換などが挙げられる。
【００３３】
したがって、細胞は、よりナイーブな細胞へ分化され得る（例えば、最終分化した細胞が複能性または多能性に分化され得る）か、または細胞は、あまりナイーブでない細胞に脱分化され得る（例えば、複能性または多能性細胞が系統コミット細胞または最終分化した細胞に分化され得る）。しかしながら、ある実施形態において、細胞は、１つの細胞型（または表現型）から別の細胞型（または表現型）へ、例えば、同様の細胞能力レベルで、転換または分化転換され得る。したがって、本開示の実施形態において、本開示の誘導ステップは、本開示の細胞を初期化して、分化、脱分化、及び／または分化転換し得る。本開示の実施形態において、本開示の誘導ステップは、細胞を初期化して分化転換し得る。
【００３４】
「ポリヌクレオチドまたはポリペプチド初期化因子」は、本明細書で使用される場合、分化、脱分化、及び／または分化転換と関連付けられるポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子を指すと理解されるものとする。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド初期化因子は、例えば、遺伝子、プライマー、トランスポゾン、または他のＤＮＡポリヌクレオチド分子、タンパク質もしくはペプチドをコードするＲＮＡポリヌクレオチド分子（例えば、二本鎖ＲＮＡ、ｍＲＮＡ（即ち、センスＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの相補体（即ち、ＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖））、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子もしくは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子、または他のＲＮＡポリヌクレオチド分子、もしくはポリペプチド、またはこれらのポリヌクレオチドもしくはポリペプチド分子のいずれかのフラグメントであり得る（ただし当該フラグメントがジヌクレオチド、ジペプチド、もしくはトリペプチドなどのモノマーまたは極小オリゴマーでないことを条件とする）ことが理解される。
【００３５】
例えば、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチド初期化因子を使用した分化、脱分化、及び／または分化転換によって、特定の型の細胞を初期化または誘導して別の型の細胞にする方法は、当業者に知られている。そのような方法は、１つ以上の転写因子（複数可）または細胞初期化に関連付けられる他のポリペプチド（複数可）をコードする遺伝物質の導入に依存し得る。例えば、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３、及びＭａｆＡ、またはそれらの機能的フラグメントは、本開示の細胞の細胞分化、脱分化、及び／または分化転換を誘導することができるペプチドをコードすることがよく知られる。当業者に知られるいくつかの方法において、初期化遺伝子（上記の遺伝子など）によってコードされる外因性ポリペプチド（例えば、組換ポリペプチド）を、例えば本開示の細胞を誘導するために細胞と接触させる。当業者は、他の遺伝子が細胞の初期化と関連付けられ得ること、そのような遺伝子（またはそれらの機能的フラグメント）をコードする外因性分子及びコードされたポリペプチドもまた、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド初期化因子（例えば、細胞初期化と関連付けられる別の遺伝子の発現レベルにその後影響を与えるポリヌクレオチドまたはポリペプチド）であると見なされることを理解する。例えば、ｐ５３不活性化を減少させる外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチド後成的遺伝子サイレンサーの導入が、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を誘導する効率性を増大させることが示されている。したがって、細胞初期化または細胞プログラミング効率性を増大させることに直接的または非直接的に関与し得る後成的サイレンサー及び他の遺伝子またはタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチド初期化因子を構成すると見なされる。当業者は、細胞初期化を阻害することに関与する遺伝子の発現をノックダウンすることができるＲＮＡｉ分子（またはＲＮＡｉ分子をコードする遺伝物質）など、細胞初期化に影響を与える他の方法が存在することを理解する。したがって、細胞初期化と関連付けられるか、または細胞初期化を増進する、いかなる外因性ポリヌクレオチド分子またはポリペプチド分子も、本明細書に記載されるような外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチド初期化因子であると理解されるものとする。
【００３６】
理解されるように、「小分子初期化因子」という用語は、本明細書で定義されるような小分子である初期化因子を指す。そのような小分子は、本明細書の他の場所で詳細に記載される。
【００３７】
本開示のいくつかの実施形態において、本方法は、小分子ではない初期化因子（複数可）の使用を除外する。しかしながら、本方法は、ＲＰＭＩ、腎上皮基本培地（ＲＥＢＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｆ１２、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ（ジペプチド、Ｌ−アラニン−Ｌ−グルタミン）、Ｂ２７、ヘパリン、プロゲステロン、プトレシン、ラミニン、ニコチンアミド、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、セレン、エタノールアミン、ヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ヒドロコルチゾン、エピネフリン、ノルマシン（ｎｏｒｍａｃｉｎ）、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、及びアムホテリシンなど、培養培地、血清、血清代替物、サプリメント、抗生物質などの「ルーチン」組織培養成分を利用し得ることが理解される。これらの典型的な組織培養成分（及び組織培養で日常的に使用される他の同様の組織培養成分）は、本開示の目的のための小分子初期化分子ではないことが理解される。実際、これらの成分は、本明細書で定義されるような小分子でも、及び／または本明細書で定義されるような初期化因子のいずれでもない。
【００３８】
したがって、ある実施形態において、本開示は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチド初期化因子（複数可）を用いた細胞（複数可）の培養ステップを伴わない。したがって、ある実施形態において、本開示の方法は、例えば、誘導ベータ細胞を生成すること、または別の方法で、本開示の細胞を誘導して分化、脱分化、及び／または分化転換させることに関与するトランスポゾン、ウイルス遺伝子導入ベクター（レトロウイルスベクターなど）、プラスミド、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ペプチド、またはそれらの分子のいずれかのフラグメントを導入することによる、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチド初期化因子（複数可）の導入を伴わない。
【００３９】
即ち、ある実施形態において、本方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチド初期化因子（複数可）なしで起こる。したがって、ある実施形態において、本開示の方法は、ポリペプチド転写因子、分化、脱分化、及び／または分化転換を誘導することに特に関連付けられる他のポリペプチド因子、ポリペプチド転写因子をコードするポリヌクレオチド配列、分化、脱分化、及び／または分化転換を誘導することに特に関連付けられる他のポリペプチド因子をコードするポリヌクレオチド配列、ｍＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ならびにそれらのフラグメントの追加なしに、細胞を初期化するために小分子のみを利用することが理解される。とりわけ、ある実施形態において、本開示の方法は、ｐｄｘ１、ｎｇｎ３、及び／またはＭａｆＡなどからなる群より選択される１つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにそれらの機能的フラグメントの追加を含まない。代わりに、本方法は、細胞の初期化を誘導するために有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を利用し得る。これにもかかわらず、本明細書内の他の場所で記載されるように、ある実施形態において、本開示は、ポリペプチドアクチビンＡ及び／またはＮｏｄａｌ（もしくはそれらの活性フラグメント、または当該ポリペプチドもしくはそれらの活性フラグメントをコードするポリヌクレオチド）を初期化因子（複数可）として利用することをさらに含む。この実施形態において、アクチビンＡ及びＮｏｄａｌは小分子ではないことが当業者により理解される。
【００４０】
「誘導」という用語は、「誘導細胞」に関連して本明細書で使用される場合、組織培養における特定の因子の適用に起因してインビトロで変化した細胞を指すことが意図され、誘導細胞は、インビボで、または代替的に、いくつかの場合においては、典型的な組織培養技術（即ち、初期化因子の適用を伴わない）後にインビトロで見られるであろうものと同様または同じ細胞型である表現型特性（例えば、形態及び／または細胞型特異マーカーの発現）を有することが理解される。即ち、誘導細胞は、異なる細胞型であるか、または異なる表現型を有するように初期化されている。例えば、誘導ベータ細胞は、インビボで見られるベータ細胞と同様の形態を有し得、かつそれと同じペプチドもしくは遺伝細胞マーカーを発現し得、誘導内胚葉細胞は、インビボで見られる内胚葉細胞と同様の形態を有し得、かつそれと同じペプチドもしくは遺伝細胞マーカーを発現し得、及び／または誘導膵臓前駆細胞は、インビボで見られる膵臓前駆細胞と同様の形態を有し得、かつそれと同じペプチドまたは遺伝細胞マーカーを発現し得る。
【００４１】
「本開示の細胞」という語句は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載されるような尿由来細胞、誘導内胚葉細胞、誘導膵臓前駆細胞、及び／または誘導ベータ細胞を指すことが意図される。「本開示の誘導細胞」という語句は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載されるような誘導内胚葉細胞、誘導膵臓前駆細胞、及び／または誘導ベータ細胞を指すことが意図される。
【００４２】
「有効量」という用語は、例えば、小分子初期化因子に関連して本明細書で使用される場合、本開示の細胞内で効果を誘発する、初期化因子の任意の好適な量である。例えば、有効量は、本明細書に記載されるような細胞の初期化を促進するか、またはそれに貢献するのに十分な量であり得る。有効量の小分子初期化因子を構成する好適な濃度範囲の例は、本明細書の他の場所に記載される。しかしながら、本明細書に記載される濃度は、本開示の方法で使用される小分子初期化因子の量が細胞内で効果を誘発するのに好適である限りは、様々でありかつ依然として本発明の範囲内にあることが理解される。
【００４３】
多くの小分子初期化因子が当業者に知られている。小分子初期化因子は、典型的には、細胞初期化などに関与するポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子などのバイオポリマーに特定の様式で結合し、そのポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子の活性または機能を変化させ（例えば、細胞初期化に関与する特定の酵素の機能を活性化または阻害するなど）、及びこの様式では、細胞初期化を誘導する。本開示の小分子初期化因子（複数可）は、１０００ｇ／モル未満の分子量を有する。ある実施形態において、本開示の小分子初期化因子（複数可）は、９００ｇ／モル未満の分子量を有する。ある実施形態において、小分子初期化因子（複数可）は、８００ｇ／モル未満の分子量を有する。ある実施形態において、小分子初期化因子（複数可）は、７００ｇ／モルの未満の分子量を有する。ある実施形態において、小分子初期化因子（複数可）は、６００ｇ／モル以下の分子量を有する。
【００４４】
小分子初期化因子は、Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ（Ｇ９ａ  ＨＭＴａｓｅ）阻害剤（複数可）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（複数可）、ＭＥＫ阻害剤（複数可）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（複数可）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤（複数可）、ビタミンＣ、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤（複数可）、胚体内胚葉（ＩＤＥ）の誘導剤、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）誘導剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＳＨ）阻害剤、レチノイン酸受容体活性剤、ＰＤＸ１誘導剤、ｎｏｔｃｈ阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、及びトリヨードチロニンを含むことで知られる。これらの小分子の多くは、上で述べたＰＣＴ／ＡＵ２０１２／００１５２５に記載される。
【００４５】
本開示の実施形態において、本方法は、胚体内胚葉（ＩＤＥ）の誘導剤を初期化因子として利用する。ＩＤＥは、ペプチドアクチビンＡ及びＮｏｄａｌならびに小分子ＩＤＥ１及びＩＤＥ２（Ｂｏｒｏｗｉａｋら、２００９）を含む。ＩＤＥ１及びＩＤＥ２は、Ｓｍａｄ２のリン酸化によって証明されるように、ＴＧＦ−βシグナルの活性化を部分的に介して機能する（Ｂｏｒｏｗｉａｋら、２００９）。本開示での使用に好適なＩＤＥは、アクチビンＡ、Ｎｏｄａｌ、ＩＤＥ１（１−［２−［（２−カルボキシフェニル）メチレン］ヒドラジド］ヘプタン酸、分子量＝３０６．３１ｇ／モル）、ＩＤＥ２（ヘプタン二酸−１−（２−シクロペンチリデンヒドラジド）、分子量＝２４０．３ｇ／モル）などを含む。アクチビンＡ及びＮｏｄａｌは小分子ではないが、それにもかかわらず、本開示の実施形態においてＩＤＥとして使用され得る。しかしながら、代替的な実施形態において、本開示は、小分子ではない初期化因子の使用を除外する。ある実施形態において、ＩＤＥはアクチビンＡである。ある実施形態において、ＩＤＥはＩＤＥ１である。本開示での使用に好適なＩＤＥとしては、表１に示されるものが挙げられ得る。しかしながら、当業者は、表１のリストが網羅的ではないこと、及び他の小分子ＩＤＥが本開示での使用に好適であり得ることを理解する。
【００４６】
【表１】
0006715845.tif 000002
【００４７】
当業者は、有効量のＩＤＥが、例えば、特定の選択されたＩＤＥまたは用いられるＩＤＥの組み合わせによって様々であり得ることを理解する。実施形態において、ＩＤＥは、５ｎＭ〜５０ｍＭの濃度範囲で使用され得る。いくつかの実施形態において、ＩＤＥは、約５ｎＭ〜５０ｎＭ、５０ｎＭ〜５００ｎＭ、０．５μＭ〜５μｍ、５μｍ〜５０μｍ、５０μｍ〜５００μｍ、及び／または５ｍＭ〜５０ｍＭから選択される濃度範囲で使用され得る。５ｎＭ〜５０ｍＭ、０．０１μｍ〜１００μＭ、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、または０．０５ｍＭ〜２ｍＭ。しかしながら、一般的には、ＩＤＥは、５ｎＭ〜５０ｍＭ、または０．０１〜１０μｍの範囲の濃度で提供される。ある実施形態において、アクチビンＡの場合、濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲、または１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲、またはおよそ１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌであり得る。別の実施形態において、ＩＤＥ１の場合、濃度は、５ｎＭ〜５ｍＭの範囲、１μｍ〜１ｍＭの範囲、または１０μｍ〜１．０μｍの範囲であり得る。典型的には、有効量のＩＤＥは、本明細書の他の場所で詳細説明されるような本開示の細胞の培養に好適な培養培地中に提供される。
【００４８】
本開示の実施形態において、本方法は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤を小分子初期化因子として利用する。本開示での使用に好適なＧＳＫ３阻害剤としては、塩化リチウム（ＬｉＣｌ、分子量＝４２．３９）、ＣＨＩＲ９８０１４（２，６−ピリジンジアミン、Ｎ６−［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］−３−ニトロ−、分子量＝４８６．３１ｇ／モル）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、分子量＝３７１．２２ｇ／モル）、ＴＷＳ  １１９（３−［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ］フェノール、分子量＝３１８．３３ｇ／モル）、及びビスインドリルマレイミドＩ（ＢＩＭ）が挙げられる。１つのＧＳＫ３阻害剤の例は、塩化リチウムである。塩化リチウムはＧＳＫ−３βを阻害することが分かっているが、他のタンパク質キナーゼを阻害することは報告されていない。ある実施形態において、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ  ９９０２１であり得る。他の好適なＧＳＫ３阻害剤としては、表２に示されるものが挙げられ得る。しかしながら、当業者は、表２のリストが網羅的ではないこと、及び他の小分子ＧＳＫ３阻害剤が本開示での使用に好適であり得ることを理解する。
【００４９】
【表２】
0006715845.tif 000003
【００５０】
当業者は、ＧＳＫ３阻害剤の有効量が、例えば、特定の選択されたＧＳＫ３阻害剤または用いられるＧＳＫ３阻害剤の組み合わせによって様々であり得ることを理解する。実施形態において、ＧＳＫ阻害剤は、５ｎＭ〜５０ｍＭの濃度範囲で使用され得る。いくつかの実施形態において、ＧＳＫ阻害剤は、約５ｎＭ〜５０ｎＭ、５０ｎＭ〜５００ｎＭ、０．５μＭ〜５μｍ、５μｍ〜５０μｍ、５０μｍ〜５００μｍ、及び／または５ｍＭ〜５０ｍＭ。５ｎＭ〜５０ｍＭ、０．０１μｍ〜１００μＭ、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、または０．０５ｍＭ〜２ｍＭから選択される濃度範囲で使用され得る。ある実施形態において、塩化リチウムは、０．０１ｍＭ〜１００μＭの範囲、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、または約０．０５ｍＭ〜２ｍＭの範囲で使用され得る。しかしながら、一般的に、ＧＳＫ３阻害剤（複数可）は、０．０１μＭ〜１００ｍＭ、または０．１μｍ〜１０ｍＭ、または約０．３μｍ〜１．０ｍＭの範囲の濃度で本開示の細胞（複数可）の培養のために提供される。典型的には、有効量のＧＳＫ３阻害剤（複数可）は、本開示の細胞の培養に好適な培養培地中に提供される。
【００５１】
本開示の実施形態において、本方法は、小分子初期化因子ビタミンＣ（Ｖｃ、（Ｒ）−５−（（Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル）−３，４−ジヒドロキシフラン−２（５Ｈ）−オン、アスコルビン酸及びＬ−アスコルベートとしても知られる、分子量＝１７６．１２ｇ／モル）を利用する。Ｖｃは、コラーゲンプロリルヒドロキシラーゼ、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、プロリルヒドロキシラーゼ、及びヒストンデメチラーゼを含む、ジオキシゲナーゼによって引き起こされる反応における補因子である（Ｓｈｉ、２００７）。当業者は、Ｖｃの有効量が、例えば、用いられる小分子初期化因子（複数可）阻害剤の特定の組み合わせ、及び初期化を受ける特定の細胞（複数可）によって様々であり得ることを理解する。実施形態において、Ｖｃは、５ｎＭ〜５０ｍＭの濃度範囲で使用され得る。いくつかの実施形態において、Ｖｃは、約５ｎＭ〜５０ｎＭ、５０ｎＭ〜５００ｎＭ、０．５μＭ〜５μｍ、５μｍ〜５０μｍ、５０μｍ〜５００μｍ、及び／または５ｍＭ〜５０ｍＭから選択される濃度範囲で使用され得る。ある実施形態において、Ｖｃは、１μＭ〜１０ｍＭ、または１０μｍ〜１ｍＭ、または約０．１ｍＭ〜０．５ｍＭの範囲の濃度で細胞（複数可）の培養のために提供される。典型的には、有効量のＶｃは、本開示の細胞の培養に好適な培養培地中に提供される。
【００５２】
本開示の実施形態において、本方法は、ソニックヘッジホッグ（ＳＳＨ）阻害剤を小分子初期化因子として利用する。本開示での使用に好適なＳＳＨ阻害剤としては、表３に示されるものが挙げられ得る。しかしながら、当業者は、表３のリストが網羅的ではないこと、及び他の小分子ＳＳＨ阻害剤が本開示での使用に好適であり得ることを理解する。１つのＳＳＨ阻害剤の例は、ＫＡＡＤ−シクロパミン（Ｎ−［２−［（３’Ｒ，７’ａＲ）−３’，６’，１０，１１ｂ−テトラメチル−３−オキソスピロ［１，２，４，６，６ａ，６ｂ，７，８，１１，１１ａ−デカヒドロベンゾ［ａ］フルオレン−９，２’−３，３ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロフロ［３，２−ｂ］ピリジン］−４’−イル］エチル］−６−（３−フェニルプロパノイルアミノ）ヘキサンアミド、分子量＝．６９７．９９）である。ＫＡＡＤ−シクロパミンは、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄを標的とすることで知られるソニックヘッジホッグ阻害剤である（Ｐａｓｃａ  ｄｉ  Ｍａｇｌｉａｎｏ＆Ｈｅｂｒｏｋ、２００３）。ヘッジホッグシグナルは、胚形成だけでなく、がんの進行にも関与する。
【００５３】
【表３】
0006715845.tif 000004
【００５４】
当業者は、ＳＳＨ阻害剤の有効量が、例えば、特定の選択されたＳＳＨ阻害剤または用いられるＳＳＨ阻害剤の組み合わせによって様々であり得ることを理解する。実施形態において、ＳＳＨ阻害剤は、５ｎＭ〜５０ｍＭの範囲で使用され得る。いくつかの実施形態において、ＳＳＨ阻害剤は、約５ｎＭ〜５０ｎＭ、５０ｎＭ〜５００ｎＭ、０．５μＭ〜５μｍ、５μｍ〜５０μｍ、５０μｍ〜５００μｍ、及び／または５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で使用され得る。ある実施形態において、ＫＡＡＤ−シクロパミンは、０．００１μｍ〜１００μｍ、または約０．１μｍ〜１０μｍの範囲の濃度で本開示の細胞（複数可）の培養のために提供される。典型的には、有効量のＳＳＨ阻害剤（複数可）は、本開示の細胞の培養に好適な培養培地中に提供される。
【００５５】
本開示の実施形態において、本方法は、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性剤を小分子初期化因子として利用する。本開示での使用に好適なＰＫＣ活性剤としては、表４に示されるものが挙げられ得る。しかしながら、当業者は、表４のリストが網羅的ではないこと、及び他の小分子ＰＫＣ活性剤が本開示での使用に好適であり得ることを理解する。１つのＰＫＣ活性剤の例は、インドラクタムＶ（（２Ｓ，５Ｓ）−１，２，４，５，６，８−ヘキサヒドロ−５−（ヒドロキシメチル）−１−メチル−２−（１−メチルエチル）−３Ｈ−ピロロ［４，３，２−ｇｈ］−１，４−ベンゾジアゾニン−３−オン、分子量＝３０１．３８ｇ／モル）である。
【００５６】
【表４−１】
0006715845.tif 000005
【表４−２】
0006715845.tif 000006
【００５７】
当業者は、ＰＫＣ活性剤の有効量が、例えば、特定の選択されたＰＫＣ活性剤または用いられるＰＫＣ活性剤の組み合わせによって様々であり得ることを理解する。実施形態において、ＰＫＣ活性剤は、５ｎＭ〜５０ｍＭの濃度範囲で使用され得る。いくつかの実施形態において、ＰＫＣ活性剤は、約５ｎＭ〜５０ｎＭ、５０ｎＭ〜５００ｎＭ、０．５μＭ〜５μｍ、５μｍ〜５０μｍ、５０μｍ〜５００μｍ、及び／または５ｍＭ〜５０ｍＭ。５ｎＭ〜５０ｍＭ、０．０１μｍ〜１００μＭ、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、または０．０５ｍＭ〜２ｍＭから選択される濃度範囲で使用され得る。ある実施形態において、インドラクタムＶは、０．００１μＭ〜１００μＭ、または０．０１μｍ〜１０μｍ、または約０．１μｍ〜１．０μｍの範囲の濃度で本開示の細胞（複数可）の培養のために提供される。典型的には、有効量のＰＫＣ活性剤（複数可）は、本開示の細胞の培養に好適な培養培地中に提供される。
【００５８】
本開示の実施形態において、本方法は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）作動薬を小分子初期化因子として利用する。本開示での使用に好適なＲＡＲ作動薬としては、表５に示されるものが挙げられ得る。しかしながら、当業者は、表５のリストが網羅的ではないこと、及び他の小分子ＲＡＲ作動薬が本開示での使用に好適であり得ることを理解する。１つのＲＡＲ作動薬の例は、レチノイン酸（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキセン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエン酸、分子量＝３００．４４ｇ／モル）である。
【００５９】
【表５】
0006715845.tif 000007
【００６０】
当業者は、ＲＡＲ作動薬の有効量が、例えば、特定の選択されたＲＡＲ作動薬または用いられるＲＡＲ作動薬の組み合わせによって様々であり得ることを理解する。実施形態において、ＲＡＲ作動薬は、５ｎＭ〜５０ｍＭの範囲で使用され得る。いくつかの実施形態において、ＲＡＲ作動薬は、約５ｎＭ〜５０ｎＭ、５０ｎＭ〜５００ｎＭ、０．５μＭ〜５μｍ、５μｍ〜５０μｍ、５０μｍ〜５００μｍ、及び／または５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で使用され得る。ある実施形態において、レチノイン酸が、０．０５μＭ〜５０μＭ、または約０．５μｍ〜５μｍの範囲の濃度で本開示の細胞（複数可）の培養のために提供される。典型的には、有効量のＲＡＲ作動薬（複数可）は、本開示の細胞の培養に好適な培養培地中に提供される。
【００６１】
本開示の実施形態において、本方法は、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤を小分子初期化因子として利用する。好適なＡＬＫ受容体阻害剤としては、主に、ＴＧＦ−βＩ型受容体ＡＬＫ５、Ａｃｔｉｖｉｎ／Ｎｏｄａｌ受容体ＡＬＫ４、及びｎｏｄａｌ受容体ＡＬＫ７を阻害するものが挙げられる。このタイプの阻害剤の例は、３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド（Ａ８３−０１としても知られる、分子量＝４２１．５２ｇ／モル）、及び４−（５−ベンゾール［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン（ｐｙｒｌｄｉｎ）−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド水和物、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物、４−［４−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−５−（２−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物（ＳＢ４３１５４２としても知られる、分子量＝３８４．４ｇ／モル）である。Ａ８３−０１は、ＡＬＫ４、５、及び７（ＩＣ５０値は、それぞれ１２、４５、及び７．５ｎＭである）を強力に阻害し、ＡＬＫ１、２、３、及び６を弱く阻害し、Ｓｍａｄ２のリン酸化の阻害を介してＴＧＦ−β誘導ＥＭＴを阻害するようである（Ｔｏｊｏら、２００４）。この小分子はまた、ラット及びヒトｉＰＳ細胞をマウスＥＳ細胞様自己再生状態にするために使用されている（Ｌｉら、２００９）。本開示での使用に好適なＡＬＫ受容体阻害剤としては、表６に示されるものが挙げられ得る。しかしながら、当業者は、表６のリストが網羅的ではないこと、及び他の小分子ＡＬＫ受容体阻害剤が本開示での使用に好適であり得ることを理解する。１つのＡＬＫ受容体阻害剤の例は、Ａ８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド、分子量＝４２１．５）である。
【００６２】
【表６】
0006715845.tif 000008
【００６３】
当業者は、ＡＬＫ受容体阻害剤の有効量が、例えば、特定の選択されたＡＬＫ受容体阻害剤または用いられるＡＬＫ受容体阻害剤の組み合わせによって様々であり得ることを理解する。実施形態において、ＡＬＫ受容体阻害剤は、５ｎＭ〜５０ｍＭの範囲で使用され得る。いくつかの実施形態において、ＡＬＫ受容体阻害剤は、約５ｎＭ〜５０ｎＭ、５０ｎＭ〜５００ｎＭ、０．５μＭ〜５μｍ、５μｍ〜５０μｍ、５０μｍ〜５００μｍ、及び／または５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で使用され得る。ある実施形態において、Ａ８３−０１は、１ｎＭ〜１ｍＭ、または約０．１μｍ〜１００μｍ、または約１〜１０μｍの範囲の濃度で本開示の細胞（複数可）の培養のために提供される。典型的には、有効量のＡＬＫ受容体阻害剤（複数可）は、本開示の細胞の培養に好適な培養培地中に提供される。
【００６４】
本開示の実施形態において、本方法は、膵臓または十二指腸ホメオボックス１（Ｐｄｘ１）誘導剤を小分子初期化因子として利用する。インスリンプロモーター因子１としても知られるＰｄｘ１は、膵臓発生及びベータ細胞成熟に必要な転写因子である。本開示での使用に好適なＰｄｘ１誘導剤としては、表７に示されるものが挙げられ得る。しかしながら、当業者は、表７のリストが網羅的ではないこと、及び他の小分子Ｐｄｘ１誘導剤が本開示での使用に好適であり得ることを理解する。１つのＰｄｘ１誘導剤の例は、ＢＲＤ  ７５５２（メチル［２，３−Ｏ−ビス（ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−カルバモイル）］−４−Ｏ−（４−エトキシカルボニル−フェニルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド、分子量＝７１１．６３ｇ／モル）である。
【００６５】
【表７】
0006715845.tif 000009
【００６６】
当業者は、Ｐｄｘ１誘導剤の有効量が、例えば、特定の選択されたＰｄｘ１誘導剤または用いられるＰｄｘ１誘導剤の組み合わせによって様々であり得ることを理解する。実施形態において、Ｐｄｘ１誘導剤は、５ｎＭ〜５０ｍＭの範囲で使用され得る。いくつかの実施形態において、Ｐｄｘ１誘導剤は、約５ｎＭ〜５０ｎＭ、５０ｎＭ〜５００ｎＭ、０．５μＭ〜５μｍ、５μｍ〜５０μｍ、５０μｍ〜５００μｍ、及び／または５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で使用され得る。ある実施形態において、ＢＲＤ  ７５５２は、０．０１μｍ〜１００μｍ、または約１μｍ〜１０μｍ範囲の濃度で本開示の細胞（複数可）の培養のために提供される。典型的には、有効量のＰｄｘ１誘導剤（複数可）は、本開示の細胞の培養に好適な培養培地中に提供される。
【００６７】
本開示の実施形態において、本方法は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼまたはＭＥＫ）阻害剤を小分子初期化因子として利用する。ＭＥＫ阻害剤は、ＭＥＫ（ＥＲＫ１／２）シグナル経路をブロックするためにＭＥＫを標的とする化合物である。本開示での使用に好適なＭＥＫ阻害剤としては、表８に示されるものが挙げられ得る。しかしながら、当業者は、表８のリストが網羅的ではないこと、及び他の小分子ＭＥＫ阻害剤が本開示での使用に好適であり得ることを理解する。１つのＭＥＫ阻害剤の例は、ＳＢ  ２０３５８０（４−（４’−フルオロフェニル）−２−（４’−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４’−ピリジル）−イミダゾール、分子量＝３７７．４４ｇ／モル）である。
【００６８】
【表８−１】
0006715845.tif 000010
【表８−２】
0006715845.tif 000011
【００６９】
当業者は、ＭＥＫ阻害剤の有効量が、例えば、特定の選択されたＭＥＫ阻害剤または用いられるＭＥＫ阻害剤の組み合わせによって様々であり得ることを理解する。実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、５ｎＭ〜５０ｍＭの範囲で使用され得る。いくつかの実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、約５ｎＭ〜５０ｎＭ、５０ｎＭ〜５００ｎＭ、０．５μＭ〜５μｍ、５μｍ〜５０μｍ、５０μｍ〜５００μｍ、及び／または５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で使用され得る。ある実施形態において、ＳＢ  ２０３５８０は、０．１μｍ〜１００μｍ、または約１μｍ〜１０μｍの範囲の濃度で本開示の細胞（複数可）の培養のために提供される。典型的には、有効量のＭＥＫ阻害剤（複数可）は、本開示の細胞の培養に好適な培養培地中に提供される。
【００７０】
本開示の実施形態において、本方法は、ｎｏｔｃｈ阻害剤を小分子初期化因子として利用する。本開示での使用に好適なｎｏｔｃｈ阻害剤としては、表９に示されるものが挙げられ得る。しかしながら、当業者は、表９のリストが網羅的ではないこと、及び他の小分子ｎｏｔｃｈ阻害剤が本開示での使用に好適であり得ることを理解する。１つのｎｏｔｃｈ阻害剤の例は、ＤＡＰＴ（Ｎ−［（３，５−ジフルオロフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル−２−フェニル］グリシン−１，１−ジメチルエステル、分子量＝３００．４４ｇ／モル）である。ＤＡＰＴはまた、Ｎｏｔｃｈシグナルをブロックする。
【００７１】
【表９】
0006715845.tif 000012
【００７２】
当業者は、ｎｏｔｃｈ阻害剤の有効量が、例えば、特定の選択されたｎｏｔｃｈ阻害剤または用いられるｎｏｔｃｈ阻害剤の組み合わせによって様々であり得ることを理解する。実施形態において、ｎｏｔｃｈ阻害剤は、５ｎＭ〜５０ｍＭの範囲で使用され得る。いくつかの実施形態において、ｎｏｔｃｈ阻害剤は、約５ｎＭ〜５０ｎＭ、５０ｎＭ〜５００ｎＭ、０．５μＭ〜５μｍ、５μｍ〜５０μｍ、５０μｍ〜５００μｍ、及び／または５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で使用され得る。ある実施形態において、ＤＡＰＴは、０．０５μＭ〜５０μＭ、または約０．５μｍ〜５μｍの範囲の濃度で本開示の細胞（複数可）の培養のために提供される。典型的には、有効量のｎｏｔｃｈ阻害剤（複数可）は、本開示の細胞の培養に好適な培養培地中に提供される。
【００７３】
本開示の実施形態において、本方法は、ｎｏｔｃｈ阻害剤を小分子初期化因子として利用する。本開示での使用に好適なｎｏｔｃｈ阻害剤としては、表９に示されるものが挙げられ得る。しかしながら、当業者は、表９のリストが網羅的ではないこと、及び他の小分子ｎｏｔｃｈ阻害剤が本開示での使用に好適であり得ることを理解する。１つのｎｏｔｃｈ阻害剤の例は、ＤＡＰＴ（Ｎ−［（３，５−ジフルオロフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル−２−フェニル］グリシン−１，１−ジメチルエステル、分子量＝３００．４４ｇ／モル）である。ＤＡＰＴはまた、Ｎｏｔｃｈシグナルをブロックする。
【００７４】
本開示の実施形態において、本方法は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤を小分子初期化因子として利用する。本開示での使用に好適なＢＭＰ阻害剤としては、表１０に示されるものが挙げられ得る。しかしながら、当業者は、表１０のリストが網羅的ではないこと、及び他の小分子ｎｏｔｃｈ阻害剤が本開示での使用に好適であり得ることを理解する。１つのＢＭＰ阻害剤の例は、ドルソモルフィン（６−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン、分子量＝３９９．４９）である。
【００７５】
【表１０】
0006715845.tif 000013
【００７６】
当業者は、ＢＭＰ阻害剤の有効量が、例えば、特定の選択されたＢＭＰ阻害剤または用いられるＢＭＰ阻害剤の組み合わせによって様々であり得ることを理解する。実施形態において、ＢＭＰ阻害剤は、５ｎＭ〜５０ｍＭの範囲で使用され得る。いくつかの実施形態において、ｎｏｔｃｈ阻害剤は、約５ｎＭ〜５０ｎＭ、５０ｎＭ〜５００ｎＭ、０．５μＭ〜５μｍ、５μｍ〜５０μｍ、５０μｍ〜５００μｍ、及び／または５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で使用され得る。ある実施形態において、ＢＭＰ阻害剤は、０．５μｍ〜５００μｍ、または約５μｍ〜５０μｍの範囲の濃度で本開示の細胞（複数可）の培養のために提供される。典型的には、有効量のＢＭＰ阻害剤（複数可）は、本開示の細胞の培養に好適な培養培地中に提供される。
【００７７】
本開示の実施形態において、本方法は、化学名３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニン、Ｏ−（４−ヒドロキシ−３−ヨードフェニル）−３，５−ジヨード−Ｌ−チロシンであり、３，３’，５−トリヨードチロニン、３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩及びリオチロニンとしても知られる、小分子初期化因子トリヨードチロニン（Ｔ３）（分子量＝６５０．９７ｇ／モル）を利用し、その類似体はリバースＴ３を含む。Ｔ３は、成長及び発育、代謝、体温、ならびに心拍数など、人体における多くの生理的プロセスに関与する甲状腺ホルモンである。Ｔ３は、甲状腺ホルモン核受容体に結合し、次いで甲状腺ホルモン核受容体が応答エレメントに結合し、様々な遺伝子の転写を活性化または阻害する。それは、ベータ細胞の成熟と関連付けられると考えられている。当業者は、Ｔ３の有効量が、例えば、用いられる小分子初期化因子（複数可）阻害剤の特定の組み合わせ、及び初期化を受ける特定の細胞（複数可）によって様々であり得ることを理解する。実施形態において、Ｔ３は、５ｎＭ〜５０ｍＭの濃度範囲で使用され得る。いくつかの実施形態において、Ｔ３は、約５ｎＭ〜５０ｎＭ、５０ｎＭ〜５００ｎＭ、０．５μＭ〜５μｍ、５μｍ〜５０μｍ、５０μｍ〜５００μｍ、及び／または５ｍＭ〜５０ｍＭから選択される濃度範囲で使用され得る。ある実施形態において、Ｔ３は、５ｎＭ  μｍ〜０．５ｍＭ、または０．０５μｍ〜５０μｍ、または約０．５μｍ〜５μｍの範囲の濃度で細胞（複数可）の培養のために提供される。典型的には、有効量のＴ３は、本開示の細胞の培養に好適な培養培地中に提供される。
【００７８】
したがって、ある実施形態において、胚体内胚葉誘導剤はＩＤＥ１である。ある実施形態において、ＧＳＫ阻害剤は塩化リチウムである。ある実施形態において、ＰＫＣ活性剤はインドラクタムＶである。ある実施形態において、ＳＳＨ阻害剤はシクロパミン−ＫＡＡＤである。ある実施形態において、ＲＡＲ作動薬はレチノイン酸である。ある実施形態において、ＡＬＫ受容体阻害剤はＡ８３−０１である。ある実施形態において、Ｐｄｘ−１誘導剤はＢＲＤ  ７５５２である。ある実施形態において、ＭＥＫ阻害剤はＳＢ２０３３５８０である。ある実施形態において、ｎｏｔｃｈ阻害剤はＤＡＰＴである。ある実施形態において、ＢＭＰ阻害剤はドルソモルフィンである。
【００７９】
他の実施形態において、小分子初期化因子は、例えば、ＲＧ１０８などのＤＮＡメチラーゼ阻害剤及び／または酪酸ナトリウムなどのＨＤＡＣ阻害剤など、任意の他の好適な小分子初期化分子であり得る。ＲＧ１０８及び他の好適なＤＮＡメチラーゼ阻害剤、ならびに同様に、酪酸ナトリウム及び他のＨＤＡＣ阻害剤は、ＰＣＴ／ＡＵ２０１２／００１５２５（ＷＯ２０１３／０８６５７０）に詳細に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８０】
本開示の実施形態において、一次誘導培地は、胚体内胚葉誘導剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、及びビタミンＣからなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む。ある実施形態において、一次誘導培地は、胚体内胚葉誘導剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、及びビタミンＣを含む。ある実施形態において、一次誘導培地は、胚体内胚葉誘導剤を含む。ある実施形態において、一次誘導培地は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤を含む。ある実施形態において、一次誘導培地はビタミンＣを含む。ある実施形態において、一次誘導培地は、胚体内胚葉誘導剤及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤を含む。ある実施形態において、一次誘導培地は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤及びビタミンＣを含む。ある実施形態において、一次誘導培地は、胚体内胚葉誘導剤及びビタミンＣを含む。実施形態において、胚体内胚葉誘導剤はＩＤＥ１である。ある実施形態において、ＧＳＫ阻害剤は塩化リチウムである。
【００８１】
したがって、ある実施形態において、一次誘導培地は、ＩＤＥ１、塩化リチウム、及びビタミンＣを含む。しかしながら、一実施形態において、胚体内胚葉誘導剤は小分子ではない。ある実施形態において、胚体内胚葉誘導剤は、アクチビンＡまたはＮｏｄａｌである。したがって、ある実施形態において、一次誘導培地は、塩化リチウム及びビタミンＣから選択される小分子初期化因子（複数可）を含み、一次誘導培地は、アクチビンＡまたはＮｏｄａｌをさらに含む。ある実施形態において、一次誘導培地は、ＣＨＩＲ９９０２１などのＧＳＫ阻害剤をさらに含み得る。
【００８２】
本開示の実施形態において、二次誘導培地は、ＰＫＣ活性剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＳＨ）阻害剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）作動薬、ビタミンＣ、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤、及びＰｄｘ１誘導剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む。ある実施形態において、二次誘導培地は、ＰＫＣ活性剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＳＨ）阻害剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）作動薬、ビタミンＣ、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤、Ｐｄｘ１誘導剤、及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）誘導剤を含む。ある実施形態において、二次誘導培地はＰＫＣ活性剤を含む。ある実施形態において、二次誘導培地は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）作動薬、ビタミンＣ、及びアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤を含む。ある実施形態において、二次誘導培地は、ビタミンＣ及びアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤を含む。ある実施形態において、二次誘導培地は、ＰＫＣ活性剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＳＨ）阻害剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）作動薬、ビタミンＣ、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤を含む。ある実施形態において、二次誘導培地は、ＰＫＣ活性剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＳＨ）拮抗薬、ビタミンＣ、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤を含む。ある実施形態において、二次誘導培地はビタミンＣを含む。ある実施形態において、二次誘導培地は、ビタミンＣ、ＲＡＲ作動薬、ＳＳＨ阻害剤、ＰＫＣ活性剤、及びＢＭＰ誘導剤を含む。ある実施形態において、二次誘導培地は、ビタミンＣ、ＲＡＲ作動薬、及びＳＳＨ阻害剤を含む。
【００８３】
したがって、ある実施形態において、二次誘導培地はインドラクタムＶを含む。ある実施形態において、二次誘導培地は、レチノイン酸、ビタミンＣ、及びＡ８３−０１を含む。ある実施形態において、二次誘導培地は、ビタミンＣ及びＡ８３−０１を含む。ある実施形態において、二次誘導培地は、インドラクタムＶ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、レチノイン酸、ビタミンＣ、及びＡ８３−０１を含む。ある実施形態において、二次誘導培地は、インドラクタムＶ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、ビタミンＣ、及びＡ８３−０１を含む。ある実施形態において、二次誘導培地は、インドラクタムＶ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、レチノイン酸、ビタミンＣ、Ａ８３−０１、及びＢＲＤ７５５２を含む。ある実施形態において、二次誘導培地は、インドラクタムＶ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、ビタミンＣ、Ａ８３−０１、及びＢＲＤ７５５２を含む。ある実施形態において、二次誘導培地はビタミンＣを含む。ある実施形態において、二次誘導培地は、ビタミンＣ、ＲＡ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、インドラクタムＶ、及びドルソモルフィンを含む。ある実施形態において、二次誘導培地は、ビタミンＣ、ＲＡ、及びシクロパミン−ＫＡＡＤを含む。
【００８４】
本開示の実施形態において、第３の誘導培地は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、ビタミンＣ、及びｎｏｔｃｈ阻害剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む。ある実施形態において、第３の誘導培地は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、ビタミンＣ、及びｎｏｔｃｈ阻害剤を含む。ある実施形態において、第３の誘導培地は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、及びビタミンＣを含む。ある実施形態において、第３の誘導培地は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤を含む。ある実施形態において、第３の誘導培地はビタミンＣを含む。ある実施形態において、第３の誘導培地はｎｏｔｃｈ阻害剤を含む。ある実施形態において、第３の誘導培地は、ビタミンＣ、ＲＡＲ作動薬、ＳＳＨ阻害剤、ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＡＬＫ受容体阻害剤、及びトリヨードチロニンを含む。ある実施形態において、第３の誘導培地は、ビタミンＣ、ＲＡＲ作動薬、ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＡＬＫ受容体阻害剤、及びトリヨードチロニンを含む。ある実施形態において、第３の誘導培地は、ビタミンＣ、ＡＬＫ受容体阻害剤、及びトリヨードチロニンを含む。ある実施形態において、第３の誘導培地は、ビタミンＣ及びトリヨードチロニンを含む。
【００８５】
したがって、ある実施形態において、第３の誘導培地は、ＳＢ２０３５８０及びビタミンＣを含む。ある実施形態において、第３の誘導培地は、ＳＢ２０３５８０、ビタミンＣ、及びＤＡＰＴを含む。ある実施形態において、第３の誘導培地は、ビタミンＣ、ＲＡ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、ＤＡＰＴ、Ａ８３−０１、及びトリヨードチロニンを含む。ある実施形態において、第３の誘導培地は、ビタミンＣ、ＲＡ、ＤＡＰＴ、Ａ８３−０１、及びトリヨードチロニンを含む。ある実施形態において、第３の誘導培地は、ビタミンＣ、Ａ８３−０１、及びトリヨードチロニンを含む。ある実施形態において、第３の誘導培地は、ビタミンＣ及びトリヨードチロニンを含む。
【００８６】
しかしながら、誘導培地のうちのいずれか１つは、本明細書に記載されるか、またはＰＣＴ／ＡＵ２０１２／００１５２５（ＷＯ２０１３／０８６５７０）に記載されるようなさらなる小分子のいずれかを含み得ることが理解される。
【００８７】
ある実施形態において、本開示の尿由来細胞は、通常の健康な対象の尿試料から得られた細胞である。理論に拘束されることを望むものではないが、尿由来細胞は、泌尿器系、例えば、腎臓、尿管、膀胱、及び／または尿道に由来し得、しばしば、上皮及び／または線維芽細胞である。尿由来細胞はまた、本明細書内では「尿細胞」と称される。本明細書内でＨＵＣと呼ばれるヒト尿由来細胞は、ヒト細胞マーカーであるヒト核抗原（ＨＮＡ）の発現によって特徴づけられ得、いくつかの細胞は、ＣＤ１３（腎細胞マーカー）、ならびにベミンチン（線維芽細胞マーカー）及び／またはＥ−カドヘリン（上皮細胞マーカー）を発現する。これは、ヒト尿由来細胞が細胞の不均質混合物であり得ることを示す。しかしながら、本開示の尿由来細胞は、ヒトまたは他の動物由来（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、及び非ヒト霊長類）のものであり得る。ある実施形態において、ＨＵＣは、細胞マーカーＨＮＡ、ＣＤ１３、ベミンチン、及びＥ−カドヘリンに対して陽性の不均質細胞調製物であるが、すべてのＨＵＣがこれらの細胞マーカーのすべてを同時発現するわけではないことが当業者により理解される。
【００８８】
本開示の誘導内胚葉細胞は、一次誘導ステップ後に細胞の大部分がより丸みを帯びた形態を示すため、尿由来細胞と比較して変化した形態を示し得る。さらに、本開示の誘導内胚葉細胞は、共に内胚葉マーカーである細胞マーカーＦｏｘａ２及びＳｏｘ１７を発現し得る。
【００８９】
本開示の誘導膵臓前駆細胞は、一部の細胞が膵島細胞様の形態を有して、膵臓前駆体マーカーＰｄｘ１及びＮＫＸ６．１を発現し得る。ある実施形態において、誘導膵臓前駆細胞はまた、ＮＧＮ３及び／またはＮＫＸ２．２を発現する。Ｐｄｘ１、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、及びＮＫＸ２．２は、膵臓前駆細胞マーカーである。
【００９０】
本開示の誘導ベータ細胞は、アップレギュレートしたレベルのベータ細胞マーカーであるインスリン及び／またはＣ−ペプチドを有し、一部の細胞が膵島細胞様の形態を有する。Ｃ−ペプチド及びインスリンは、共にベータ細胞マーカーである。ある実施形態において、誘導ベータ細胞は、インスリンを分泌する。
【００９１】
本開示の細胞は、尿からの単離、または当業者に既知の方法を使用した誘導ステップのいずれかの後に、例えば、無菌ＰＢＳ中で洗浄され得るが、当業者は、様々な他の溶液または培養培地が細胞を洗浄するのに適切であることを理解する。
【００９２】
ある実施形態において、尿由来細胞は、例えば尿試料の遠心分離後に、尿試料の細胞ペレットから得られる。ある実施形態において、次いで細胞は、洗浄され、適切な細胞培養培地中に再懸濁され、任意に誘導前増殖ステップにおいて培養され得る。したがって、細胞は、当業者によく知られているような一次細胞を培養するのに好適な任意の組織培養培地中に再懸濁及び培養され得る。
【００９３】
ある実施形態において、尿由来細胞は、本明細書内の他の場所で詳細説明されるように、培養中、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ−１２、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐ／ｓ）、ノルマシン、及びＲＥＧＭ  Ｓｉｎｇｌｅｑｕｏｔキット（ｈＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、エピネフリン、インスリン、トリヨードチロニン、トランスフェリン、ＧＡ−１０００（ゲンタマイシン／アムホテリシン））より各試薬５０μｌを含む「ＨＵＣ１培地」中で、増殖される。ある実施形態において、尿由来細胞は、ＨＵＣ１培地中で、適切な期間にわたって、例えば２日間培養されるが、当業者は、例えば、１日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日など、他の期間が好適であることを理解するものとする。ある実施形態において、ＨＵＣ１培地は毎日変更される。ある実施形態において、尿由来細胞は、本明細書内の他の場所で詳細説明されるように、腎上皮基本培地（ＲＥＢＭ）、０．５％ＦＢＳ、ｐ／ｓ、ＲＥＧＭ  Ｓｉｎｇｌｅｑｕｏｔキット（ｈＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、エピネフリン、インスリン、トリヨードチロニン、トランスフェリン、ＧＡ−１０００（ゲンタマイシン／アムホテリシン））より各試薬５０μｌを含む「ＨＵＣ２培地」中に再懸濁及び培養される。しかしながら、当業者は、様々な他の培地が、尿由来細胞を培養するためのＨＵＣ２培地と容易に置き換わることを理解する。ある実施形態において、尿由来細胞は、ＨＵＣ２培地中で、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、３週間、４週間など、適切な期間にわたって培養される。ある実施形態において、尿由来細胞は、ＨＵＣ２培地中で、細胞コロニーが出現するまで、例えば、１日〜１４日、または４〜８日間培養される。ある実施形態において、ＨＵＣ２培地は毎日変更される。ある実施形態において、尿由来細胞は、最初にＨＵＣ１培地中で培養され、次いでＨＵＣ２培地中で培養される。ある実施形態において、尿由来細胞は、ＨＵＣ１培地中で２日間培養され、次いでＨＵＣ２培地中で、細胞コロニーが出現するまで、例えば、４〜８日間培養される。しかしながら、当業者によって容易に理解されるように、他の培養期間が好適であり得る。加えて、尿由来細胞は、腎上皮細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ）またはケラチノサイト無血清培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）：マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１：１比）などの他の好適な細胞培養培地中で培養され得る。
【００９４】
ある実施形態において、誘導ステップのそれぞれ、及び任意に、誘導前増殖ステップにおける細胞の培養は、本明細書の他の場所に記載されるような本開示の細胞の増殖、または誘導もしくは初期化を促進するのに好適な期間にわたって行われる。当業者によって理解されるように、培養の期間は、どの細胞型が培養されているか、及びある実施形態においては、誘導ステップ中、どの初期化因子が本方法において使用されているかによって様々であり得る。本開示の第１、第２、または第３の期間のそれぞれ、または任意に選択的な誘導前増殖ステップの期間は独立して、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日から選択され得る。しかしながら、いくつかの場合において、期間は、当業者によって理解されるように、例えば、およそ２週間、３週間、４週間など、より長くてもよい。具体的には、当業者は、いくつかの状況下では、培養期間の長さが、培養期間の成果に大きな影響を与えることなく、培養期間の長さによって、ある程度、例えば、１日、または２日、または３日だけ修正され得ることを理解する。ある実施形態において、培養培地は、必要に応じて、または当業者によって理解される最適な頻度で変更され得る。例えば、培養培地は、毎日、または２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日毎に１度変更され得るか、または３週間、４週間毎に変更され得る。しかしながら、ある実施形態において、培養培地は、当該期間中に変更されない。
【００９５】
本明細書に記載される第１、第２、または第３の期間のそれぞれは、２つ以上の時間の部分に任意に分割され得ること、および異なる誘導培地が、所与の期間の異なる部分に適用され得ることが理解される。
【００９６】
ある実施形態において、第１の期間は６日である。ある実施形態において、第１の期間は７日である。ある実施形態において、第１の期間は５日である。
【００９７】
ある実施形態において、第２の期間は４日である。ある実施形態において、第２の期間は７日である。ある実施形態において、第２の期間は８日である。ある実施形態において、第２の期間は９日である。ある実施形態において、第２の期間は１０日である。ある実施形態において、第２の期間は１１日である。ある実施形態において、第２の期間は１２日である。
【００９８】
ある実施形態において、第２の期間は、第１の部分及び第２の部分からなる。ある実施形態において、第２の期間の第１の部分は、１日を含む。しかしながら、当業者は、第１の部分が、２日、３日、４日、５日、６日などを含み得ることを理解する。したがって、第２の期間の第２の部分は、第２の期間の残りの差分を含み得る。ある実施形態において、第２の期間は、第１の部分及び第２の部分及び第３の部分からなる。ある実施形態において、第２の期間の第１の部分は２日を含む。しかしながら、当業者は、第１の部分が、１日、３日、４日、５日、６日などを含み得ることを理解する。ある実施形態において、第２の期間の第２の部分は２日を含む。しかしながら、当業者は、第２の部分が、１日、３日、４日、５日、６日などを含み得ることを理解する。ある実施形態において、第２の期間の第３の部分は５日を含む。しかしながら、当業者は、第１の部分が、１日、２日、３日、４日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日などを含み得ることを理解する。
【００９９】
ある実施形態において、第２の誘導ステップは、第２の期間の第１の部分においては、第２の期間の第２の部分と比較して異なる二次誘導培地を、及び適切な場合には、第２の期間の第３の部分においては、第２の期間の第１または第２の部分と比較して異なる二次誘導培地を利用し得る。例えば、ある実施形態において、二次誘導培地は、第２の期間の第１の部分においては、ＰＫＣ活性剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＳＨ）阻害剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）作動薬、ビタミンＣ、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤、及びＰｄｘ１誘導剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含み得る。ある実施形態において、二次誘導培地は、第２の期間の第２の部分においては、ＰＫＣ活性剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＳＨ）阻害剤、ビタミンＣ、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体阻害剤、及びＰｄｘ１誘導剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含み得る。代替的な例において、二次誘導培地は、第２の期間の第１の部分においては、有効量のビタミンＣを含み得る。ある実施形態において、二次誘導培地は、第２の期間の第２の部分においては、ビタミンＣ、ＲＡＲ作動薬、ＳＳＨ阻害剤、ＰＫＣ活性剤、及びＢＭＰ誘導剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含み得る。ある実施形態において、二次誘導培地は、第２の期間の第３の部分においては、及び／またはビタミンＣ、ＲＡＲ作動薬、及びＳＳＨ阻害剤からなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含み得る。しかしながら、他の小分子初期化因子（複数可）を含む二次誘導培地が、本明細書の他の場所に記載されるように、第２の期間の第１の部分、第２の部分、または第３の部分において使用されてもよい。
【０１００】
ある実施形態において、第３の期間は８日である。ある実施形態において、第３の期間は９日である。ある実施形態において、第３の期間は１０日である。ある実施形態において、第３の期間は１２日である。ある実施形態において、第３の期間は１４日である。ある実施形態において、第３の期間は２１日である。ある実施形態において、第３の期間は２８日である。しかしながら、当業者は、第３の期間が、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１１日、１３日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２９日、３０日、５週間などを含み得ることを理解する。
【０１０１】
ある実施形態において、第３の期間は、第１の部分及び第２の部分からなる。ある実施形態において、第３の期間は、第１の部分、第２の部分、及び第３の部分からなる。ある実施形態において、第３の期間の第１の部分は１日を含む。ある実施形態において、第３の期間の第１の部分は２日を含む。ある実施形態において、第３の期間の第１の部分は４日を含む。しかしながら、当業者は、第１の部分が、３日、５日、６日などを含むことを理解する。したがって、第３の期間の第２の部分及び／または第３の部分は、第３の期間の残りの差分を含み得る。ある実施形態において、第３の期間の第２の部分は１日を含む。ある実施形態において、第３の期間の第２の部分は２日を含む。ある実施形態において、第３の期間の第２の部分は３日を含む。ある実施形態において、第３の期間の第２の部分は４日を含む。ある実施形態において、第３の期間の第２の部分は５日を含む。しかしながら、当業者は、第３の期間の第２の部分が、６日、７日、８日などを含むことを理解する。ある実施形態において、第３の期間の第３の部分は１４日を含む。しかしながら、当業者は、第３の期間の第３の部分が、１日、２日、３日、４日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２９日、３０日、５週間などを含み得ることを理解する。
【０１０２】
ある実施形態において、第３の誘導ステップは、第３の期間の第１の部分においては、第３の期間の第２の部分と比較して異なる三次誘導培地を、及び適切な場合には、第３の期間の第３の部分においては、第３の期間の第１または第２の部分と比較して異なる三次誘導培地を利用し得る。例えば、ある実施形態において、三次誘導培地は、第３の期間の第１の部分においては、ビタミンＣ、ＲＡＲ作動薬、ＳＳＨ阻害剤、ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＡＬＫ受容体阻害剤、及びトリヨードチロニンからなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含み得る。ある実施形態において、三次誘導培地は、第３の期間の第２の部分においては、ビタミンＣ、ＲＡＲ作動薬、ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＡＬＫ受容体阻害剤、及びトリヨードチロニンからなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含み得る。ある実施形態において、三次誘導培地は、第３の期間の第３の部分においては、ビタミンＣ、ＡＬＫ受容体阻害剤、及びトリヨードチロニンからなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含み得る。ある実施形態において、三次誘導培地は、第３の期間の第３の部分においては、ビタミンＣ及びトリヨードチロニンからなる群より選択される、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含み得る。しかしながら、他の小分子初期化因子（複数可）を含む三次誘導培地が、本明細書の他の場所に記載されるように、第３の期間の第１の部分、第２の部分、または第３の部分において使用されてもよい。
【０１０３】
本開示の誘導ステップのいずれか（またはすべて）の期間は、本開示の範囲から逸脱することなく様々であり得ることが理解される。さらに、誘導ステップの期間（複数可）のいずれか１つ（またはすべて）は部分に分割され得、本開示の範囲から逸脱することなく、期間の第１の部分においては、期間の第２の部分と比較して、及び任意に期間の第３の部分と比較して異なる、本明細書に記載されるような少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）（またはそれらの組み合わせ）を含有する、異なる誘導培地を有することが理解される。
【０１０４】
本開示において、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）のそれぞれが、「基本」培養培地に添加されて、本明細書に記載されるような誘導培養培地を形成し得る。誘導ステップ、及び懸濁液中での本開示の誘導細胞の任意のさらなる継代または培養で使用される基本培養培地は、当業者によく知られている細胞型など特定の細胞型の成長をサポートする任意の好適な培地であり得る。ある実施形態において、基本培養培地は、２％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩを含む。ある実施形態において、基本培養培地は、Ｌ−グルタミン及びＢ２７を補足したＤＭＥＭを含む。ある実施形態において、基本培養培地は、プロゲステロン、プトレシン、ラミニン、ニコチンアミド、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、及びＢ２７を補足したＤＭＥＭを含む。ある実施形態において、基本培養培地は、ｂＦＧＦ、Ｄ−グルコース、ＮａＨＣＯ３、ＢＳＡ、インスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン（ＩＴＳ−Ｘ）、及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌ−アラニン−Ｌ−グルタミンジペプチド）を補足したＭＣＤＢ１３１培地を含む。ある実施形態において、基本培養培地は、ＭＣＤＢ１３１培地、ＥＧＦ、Ｄ−グルコース、ＮａＨＣＯ３、ＢＳＡ、ＩＴＳ−Ｘ  １：２００、Ｇｌｕｔａｍａｘ、及びヘパリンを含む。ある実施形態において、基本培養培地は、１０％ＦＢＳを補足したＣＭＲＬ  １０６６を含む。これらの培地及びサプリメントのすべては、市販されており、当業者によく知られている。しかしながら、当業者は、様々な他の培地が本開示の細胞の培養に適切であること、さらには、当業者によって理解されるように、本開示の範囲から逸脱することなく、様々な他のサプリメントが基本培養培地に添加されて細胞の成長を最適化し得ることを理解する。
【０１０５】
ある実施形態において、一次誘導培養培地に使用される基本培養培地は、２％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩである。しかしながら、他の培養培地は、当業者によって理解されるように、尿由来細胞を誘導して内胚葉様細胞にするための基本培養培地として適切であり得る。ある実施形態において、二次誘導培養培地に使用される基本培養培地は、Ｌ−グルタミン及びＢ２７を補足したＤＭＥＭである。ある実施形態において、二次誘導培養培地に使用される基本培養培地は、ｂＦＧＦ、Ｄ−グルコース、ＮａＨＣＯ３、ＢＳＡ、インスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン（ＩＴＳ−Ｘ）、及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌ−アラニン−Ｌ−グルタミンジペプチド）を補足したＭＣＤＢ１３１培地である。しかしながら、他の培養培地は、当業者によって理解されるように、内胚葉様細胞を誘導して膵臓前駆様細胞にするための基本培養培地として適切であり得る。ある実施形態において、三次誘導培養培地に使用される基本培養培地は、プロゲステロン、プトレシン、ラミニン、ニコチンアミド、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、及びＢ２７を補足したＤＭＥＭである。ある実施形態において、三次誘導培養培地に使用される基本培養培地は、ＭＣＤＢ１３１培地、ＥＧＦ、Ｄ−グルコース、ＮａＨＣＯ３、ＢＳＡ、ＩＴＳ−Ｘ  １：２００、Ｇｌｕｔａｍａｘ、及びヘパリンである。ある実施形態において、三次誘導培養培地に使用される基本培養培地は、１０％ＦＢＳを補足したＣＭＲＬ  １０６６である。しかしながら、などの他の培養培地は、当業者によって理解されるように、膵臓前駆様細胞を誘導してベータ様細胞にするための基本培養培地として適切であり得る。
【０１０６】
本開示の実施形態において、得られた誘導ベータ細胞は、本明細書に記載されるような三次誘導培養培地中で培養される。しかしながら、他の培養培地は、当業者によって理解されるように、誘導ベータ細胞を培養するのに適切であり得る。
【０１０７】
ある実施形態において、少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）存在下での本開示の細胞（複数可）の誘導の各ステップは、任意に、例えば、少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）またはそれらの組み合わせを含む培養培地中での細胞（複数可）の第１の培養、続いて、少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）またはそれらの組み合わせを含まない、同じまたは異なる好適な培養培地中での少なくとも第２の培養を含む単一の誘導培養サイクルで独立して実施され得る。ある実施形態において、誘導サイクルは、上記のように少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）の存在下での第１の培養、続いて、小分子初期化因子（複数可）を含まない培養培地中での第２及び第３の培養を含む。これらの誘導サイクルのそれぞれは、任意に、必要に応じて繰り返され得ることが理解される。
【０１０８】
本開示の誘導ベータ細胞は、有利に、インスリンを生成するために使用され得る。実際、糖尿病などのインスリン欠乏と関連付けられる疾患を治療するための個別の細胞療法の方法において、本開示の誘導ベータ細胞を使用することが最終的に可能であり得る。代替的に、本開示の誘導ベータ細胞は、有利に、糖尿病を治療するための薬剤候補をスクリーニングするために使用され得る。当業者は、本開示の誘導ベータ細胞が他の用途を有し得ることを理解する。
【０１０９】
第２の態様において、本開示は、尿由来細胞から誘導内胚葉細胞を生成する方法であって、
（ａ）対象の尿試料から尿由来細胞を得ることと、
（ｂ）第１の期間にわたって、有効量の少なくとも１つの小分子初期化因子（複数可）を含む一次誘導培養培地中で当該尿由来細胞を培養することによって、ステップ（ａ）で得られた尿由来細胞を誘導して、誘導内胚葉細胞を得ることと、を含む方法を提供する。
【０１１０】
本開示の誘導内胚葉細胞は、有利に、膵、肝、腸、及び／または肺細胞系統に分化転換され得る。
【０１１１】
ある実施形態において、本方法は、当業者に知られる任意の方法を使用して、得られた誘導内胚葉細胞を膵臓前駆細胞に誘導するさらなるステップを含む。例えば、内胚葉細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）、またはＰａｇｌｉｕｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）に記載される方法を使用して、誘導されて誘導膵臓前駆細胞になり得る。
【０１１２】
ある実施形態において、本方法は、当業者に知られる任意の方法を使用して、得られた誘導内胚葉細胞を誘導して誘導膵臓前駆細胞にするさらなるステップを含み、及び当業者に知られる任意の方法を使用して、誘導膵臓前駆細胞を誘導して誘導ベータ細胞にする依然としてさらなるステップを含む。例えば、内胚葉細胞は、当業者に知られる任意の方法を使用したベータ細胞において記載される方法を使用して、誘導されて誘導膵臓前駆細胞になり得る。例えば、誘導内胚葉細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）、またはＰａｇｌｉｕｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）に記載される方法を使用して、誘導されて誘導ベータ細胞になり得る。
【０１１３】
第３の態様において、本開示は、尿由来細胞から誘導膵臓前駆細胞を生成する方法であって、
（ａ）対象の尿試料から尿由来細胞を得ることと、
（ｂ）本明細書に記載されるような一次誘導培養培地中で当該尿由来細胞を培養することによって、ステップ（ａ）で得られた尿由来細胞を誘導して、誘導内胚葉細胞を得ることと、
（ｃ）本明細書に記載されるような二次誘導培養培地中で当該誘導内胚葉細胞を培養することによって、ステップ（ｂ）で得られた誘導内胚葉細胞を誘導して、誘導膵臓前駆細胞を得ることと、を含む方法を提供する。
【０１１４】
本開示の誘導膵臓前駆細胞は、有利に、例えば、Ｉ型もしくはＩＩ型糖尿病などの疾患の治療または遺伝子療法用途のために、機能的な膵島細胞塊、またはおそらくは人工膵臓を生成するために使用され得る。本開示の誘導膵臓前駆細胞は、代替的に、膵臓前駆細胞生物学及び／もしくは分化の研究を促進するため、ならびに／または薬剤開発及び創薬のために使用され得る。
【０１１５】
ある実施形態において、本方法は、当業者に知られる任意の方法を使用して、得られた誘導膵臓前駆細胞を誘導して誘導ベータ細胞にするさらなるステップを含む。例えば、誘導内胚葉細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）、またはＰａｇｌｉｕｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）に記載される方法を使用して、誘導されて誘導ベータ細胞になり得る。
【０１１６】
第４の態様において、本開示は、内胚葉細胞から誘導膵臓前駆細胞を生成する方法であって、
内胚葉細胞を得ることと、
本明細書に記載されるような二次誘導培養培地中で当該誘導内胚葉細胞を培養することによって、得られた内胚葉細胞を誘導して、誘導膵臓前駆細胞を得ることと、を含む方法を提供する。
【０１１７】
ある実施形態において、内胚葉細胞は、対象からの単離後に得られ得るか、またはそれらは、当業者に知られる任意の方法によって誘導され得る。
【０１１８】
第５の態様において、本開示は、膵臓前駆細胞から誘導ベータ細胞を生成する方法であって、
膵臓前駆細胞を得ることと、
本明細書に記載されるような三次誘導培地中で当該膵臓前駆細胞を培養することによって、得られた膵臓前駆細胞を誘導して、誘導ベータ細胞を得ることと、を含む方法を提供する。
【０１１９】
ある実施形態において、膵臓前駆細胞は、対象からの単離後に得られ得るか、またはそれらは、当業者に知られる任意の方法によって誘導され得る。
【０１２０】
第２、第３、第４、及び第５の態様の方法は、適切な場合、本開示の第１の態様について本明細書に記載されるような実施形態を使用して実施され得る。
【０１２１】
第６の態様において、本開示は、本開示の第１、第２、第３、第４、または第５の態様の方法を使用して得られる細胞を提供する。
【０１２２】
本開示は、これより、以下の非限定的な実施例及び添付の図面を参照して説明される。
【実施例】
【０１２３】
実施例１  ヒト尿細胞（ＨＵＣ）の単離及び特徴づけ
材料及び方法
培地
ＨＵＣ１培地−４４．１５ｍｌダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ−１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号１５１４０−１２２）、５ｍｌウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．５ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（ｐ／ｓ、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｌ  ５０μｇ／ｍｌのノルマシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ  カタログ番号ａｎｔ−ｎｒ−２）、及びＲＥＧＭ  Ｓｉｎｇｌｅｑｕｏｔキット（Ｌｏｎｚａ  カタログ番号ＣＣ−４１２７、即ち、ｈＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、エピネフリン、インスリン、トリヨードチロニン、トランスフェリン、ＧＡ−１０００（３０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１５μｇ／ｍｌアムホテリシンを含有する）、及びＦＢＳ）より各試薬５０μｌを含有した５０ｍｌのＨＵＣ１。
【０１２４】
ＨＵＣ２培地−５０ｍｌのＨＵＣ２培地は、４８．９５ｍｌ腎上皮基本培地（ＲＥＢＭ、成長因子なし）（Ｌｏｎｚａ  カタログ番号ＣＣ−３１９１）、０．２５ｍｌＦＢＳ、０．５ｍｌ  ｐ／ｓ、１００μｌ  ５０μｇ／ｍｌノルマシン、及び上記の７つのＳｉｎｇｌｅｑｕｏｔキット試薬のそれぞれ５０μｌを含有する。
【０１２５】
ヒト尿細胞の単離及び初期誘導前培養
尿試料を、典型的には１５０〜２００ｍｌの試料体積で、３５歳ヒト男性ドナー（「Ｍ−３５」）及び３７歳ヒト女性ドナー（「Ｆ−３７」）から採取した。次いで、試料を５０ｍｌチューブに移し、４００ｇで１０分間室温で遠心分離した。次いで、上清を注意深く廃棄して、チューブ内におよそ１ｍｌ以下の尿を残した。ヒト尿細胞（ＨＵＣ）を含有するペレットを個別に再懸濁させ、同じ試料採集に由来する再懸濁させたペレットのすべてを単一の５０ｍｌチューブ内に溜めた。次に、ノルマシン及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有する約１０ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を上記のように添加して、尿道内に存在する汚染菌類または通性嫌気性細菌の成長を防いだ。次いで、試料を再度４００ｇで１０分間遠心分離し、上清を注意深く廃棄し、それにより約０．２ｍｌの試料のみを残した。残渣試料に、約１ｍｌのＨＵＣ１培地を添加して、細胞ペレットを再懸濁させた。次いで、およそ０．２５ｍｌの細胞のアリコートを、０．１％ゼラチンＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で事前にコーティングされた４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）の各ウェル内に播種し、３０分間３７℃でインキュベートし、３７℃で１日目（Ｄ１）及び２日目（Ｄ２）の間培養した。３日目（Ｄ３）に、ＨＵＣ１培地をＨＵＣ２培地と置き換え、その後、細胞コロニーが出現するまで（典型的には、４〜８日間）、毎日（ＨＵＣ２培地と）置き換えた。
【０１２６】
免疫細胞化学（ＩＣＣ）
コロニーからの細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。ＰＢＳでさらに洗浄（２回）した後、次いで固定した細胞を０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で２０分間透過処理した。次いで透過処理した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１％ＦＢＳ及び４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ溶液中に１時間閉じ込めた。一次抗体（表１１に示される）をブロッキング緩衝液中に希釈し、室温で１時間、または４℃で一晩適用した。次いで細胞を、ＰＢＳ、及び１０μｇ／ｍｌの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）蛍光染料を室温で１時間適用された適切な蛍光二次抗体（１：１０００、Ｃｙ３またはＡｌｅｘａ−４８８、表１２を参照されたい）で３回洗浄した。
【０１２７】
【表１１】
0006715845.tif 000014
【０１２８】
【表１２】
0006715845.tif 000015
【０１２９】
ＨＵＣの特徴づけ
ヒト核抗原（ＨＮＡ、ヒト細胞マーカー）、ＣＤ１３（腎尿細管細胞マーカー）、ベミンチン（線維芽細胞マーカー）、及びＥ−カドヘリン（上皮細胞マーカー）の細胞発現を、上記のようにＩＣＣによって検査した。
【０１３０】
結果及び考察
細胞をヒト尿試料から単離し、特徴づけした。結果を図１に示す。具体的には、図１は、ＨＵＣ−Ｍ−３５細胞がＨＮＡ陽性であったこと（細胞がヒト由来であることを確認）、及び一部はＣＤ１３に対して陽性であったこと（細胞のうちの少なくとも一部が腎細胞であることを示す）を示す。ＨＵＣ−Ｍ−３５細胞の多くが、線維芽細胞マーカー、ベミンチンを発現し、一部の細胞が上皮マーカー、Ｅ−カドヘリンを発現することも分かり（図２）、これは、ＨＵＣ−Ｍ−３５培養が混合細胞を含有することを示す。同様に、Ｐ６でのＨＵＣ−Ｆ−３７細胞は、ＣＤ１３陽性、ＨＮＡ陽性、Ｅ−カドヘリン陽性、及びビメンチン陽性であった。
【０１３１】
実施例２  アクチビンＡ、塩化リチウム、及びビタミンＣでの一次誘導後の細胞の特徴づけ
材料及び方法
一次誘導
ＨＵＣ−Ｍ−３５  Ｐ５細胞を、実施例１に記載されるように調製し、次いで、ｍａｔｒｉ−ｇｅｌでコーティングされたウェル（Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標）ＬＤＥＶ−Ｆｒｅｅ、ｈＥＳＣ−Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ、Ａ１４１３３０２、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で、５ｘ１０４／ｃｍ２の密度で、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号  １１８７５−０８５）、０．２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌ  アクチビンＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  アクチビンＡ、３３８−ＡＣ−０１０、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、１ｍＭ  ＬｉＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐｔｙ．Ｌｔｄ，カタログ番号Ｌ４４０８）、０．２ｍＭ  ビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐｔｙ．Ｌｔｄ，カタログ番号Ａ４４０３）、及びｐ／ｓ（上記のような）を含有する一次誘導培地中、６日間（２日毎に変更）培養した。次いで、培養した細胞を特徴づけし、特に、細胞形態を位相差顕微鏡によって検査し、Ｆｏｘａ２（内胚葉細胞マーカー）及びＳｏｘ１７（内胚葉細胞マーカー）の発現を一次誘導の前後にＩＣＣによって比較した。
【０１３２】
結果及び考察
ＨＵＣ−Ｍ−３５  Ｐ５細胞を上記のような一次誘導培地中で培養した。細胞形態が著しく変化したことが分かり（Ｐ６でのＨＵＣ−Ｍ−３５由来細胞の形態を一次誘導後の同じ細胞と比較した図３を参照されたい）、細胞がもはや尿細胞ではないことを示す。具体的には、誘導前、尿細胞は細胞の混合物を含んでおり、一部は丸みを帯びた形態を有し、一部は多角の形態を有し、一部は紡錘形の形態を有していた。一次誘導ステップ後、細胞の大部分の形態は丸みを帯びていた。一次誘導前後のＨＵＣ−Ｍ−３５由来の細胞の蛍光顕微鏡写真より、両方の種類の細胞が、内胚葉マーカーＳｏｘ１７及びＦｏｘａ２に対して陽性であることが分かった。しかしながら、Ｓｏｘ１７／Ｆｏｘａ２陽性細胞の数は、一次誘導後に著しく増加し、これらのマーカーが一次誘導プロトコルによってアップレギュレートされることを示す。図４は、一次誘導プロトコルが、Ｓｏｘ１７の発現においては細胞のおよそ７５％からおよそ９５％の細胞への増加、及びＦｏｘａ２発現においてはおよそ１２％からおよそ８９％への増加を促進することを示す。この結果は、一次誘導ステップがヒト尿細胞を内胚葉細胞に誘導することを示す。
【０１３３】
実施例３  アクチビンＡ、塩化リチウム、ビタミンＣ、ＣｈＩＲ９９２０１、ホルスコリン、酪酸ナトリウム、及びＲＧ１０８での一次誘導後の細胞の特徴づけ
材料及び方法
一次誘導
ＨＵＣ−Ｍ−３５  Ｐ５細胞を、実施例１に記載されるように調製し、次いで実施例２に記載される一次誘導法を使用して誘導したが、ただしその実施例に記載される一次誘導培地の内容物に加えて、この場合の一次誘導培地は、小分子ＣｈＩＲ９９２０１（ＣＨ、３μｍ）、ホルスコリン（Ｆ、１０μｍ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢ、０．２ｍＭ）、及びＲＧ１０８（ＲＧ、０．０４μｍ）（すべてＳｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃより入手）を含んでいた。加えて、一次誘導ステップを６日ではなく７日間行った。一次誘導培地が小分子を含まない比較誘導も実施した。細胞のＦｏｘａ２発現を、実施例２に記載されるように一次誘導ステップ前後に検査した。
【０１３４】
結果及び考察
実施例２に記載されるようにアクチビンＡ、塩化リチウム、及びビタミンＣを含有する一次誘導培地中で７日後、細胞の９１．８％がＦｏｘａ２に対して陽性であった。一次誘導培地が小分子ＣＨ、Ｆ、ＮａＢ、及びＲＧを含むとき、細胞の８８．５％がＦｏｘ２ａ陽性であった。この結果は、追加の小分子ＣｈＩＲ９９２０１、ホルスコリン、酪酸ナトリウム、及びＲＧ１０８が、試験した組み合わせにおいて、尿細胞からの内胚葉細胞の誘導を阻害することを示す。
【０１３５】
実施例４  インドラクタムＶでの二次誘導後の細胞の特徴づけ
材料及び方法
二次誘導
ＨＵＣ−Ｍ−３５  Ｐ５細胞を実施例２に記載される一次誘導プロトコルを使用して調製した。次いで、細胞を、上記のように、ＤＭＥＭ、３３０ｎｍ  インドラクタムＶ、１×２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２５０３０−０８１）、１×Ｂ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７５０４０４４）、及びｐ／ｓを含有する二次誘導培地中で４日間培養した。結果として生じる細胞の形態を位相差顕微鏡によって検査した。
【０１３６】
結果及び考察
二次誘導後、大半の細胞は、丸みを帯びた形態を有することが観察され、一部の細胞は膵島細胞形態を有するようであった。
【０１３７】
実施例５  インドラクタムＶ、レチノイン酸、ビタミンＣ、及びＡ８３−０１を使用した二次誘導後の細胞の特徴づけ
材料及び方法
二次誘導
ＨＵＣ−Ｍ−３５  Ｐ５細胞を実施例２に記載される一次誘導プロトコルを使用して誘導した。次いで細胞を、実施例４に記載される二次誘導培地に、１日間は２μｍレチノイン酸（ＲＡ）、０．２ｍＭビタミンＣ（ＶＣ）、及び２．５ｍＭ  Ａ８３−０１、次いで７日間は０．２ｍＭ  ビタミンＣ及び２．５μΜ  Ａ８３−０１を加えて、培養した。結果として生じる細胞の形態を位相差顕微鏡で分析した。
【０１３８】
結果及び考察
典型的な結果として生じる細胞の形態を図５Ａ及び５Ｂに示す。二次誘導プロトコル後、膵島様形態を有する細胞が明白に観察され、異なる種類の膵島形態も目に見えた。
【０１３９】
実施例６  二次誘導後にｐｄｘ１−ｃｙ３−インスリン−４８８レンチウイルスに感染した細胞の特徴づけ
材料及び方法
レンチウイルス感染
Ｐｄｘ１−ｃｙ３−インスリン−４８８レンチウイルス（Ｓｚａｂａｔら、２００９）は、Ｐｄｘ１プロモーターの制御下で蛍光マーカー（Ｃｙ３）に融合されるインスリンをコードする。ＨＵＣを実施例５に記載されるように誘導し、次いで細胞を５０μＬのＰｄｘ１−ｃｙ３−インスリン−４８８レンチウイルスの存在下で１０ｍｇ／ｍｌポリブレンを含有するＤＭＥＭ中で２４時間培養することによって感染させた。
【０１４０】
結果及び考察
Ｐｄｘ１は膵臓転写因子であり、したがって、膵臓細胞マーカーである。図６に示されるように、この実施例で誘導された細胞は、膵島細胞形態を有する。さらに、図６Ｂは、強力な蛍光染色を示し、Ｐｄｘプロモーターが、細胞中で活性であり、インスリン−４８８融合遺伝子を発現したレンチウイルスの発現を引き起こすことを示す。これは、細胞が膵臓様であることを示す。
【０１４１】
実施例７  インドラクタムＶでの二次誘導後の細胞の特徴づけ
材料及び方法
一次および二次誘導
細胞を実施例１に記載されるように調製し、次いで実施例２に記載されるように一次誘導、続いて実施例５に記載されるように二次誘導を行った。次いで、細胞を実施例１に記載されるように特徴づけした。具体的には、細胞形態を位相差顕微鏡によって検査し、ＮＫＸ６．１（膵臓前駆細胞マーカー）及びＰＤＸ１（膵臓前駆細胞マーカー）の発現を検査した。
【０１４２】
結果及び考察
結果として生じる細胞は、膵臓前駆体マーカーＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現することが観察された。これもまた、細胞が膵臓様であることを示す。
【０１４３】
実施例８  ＳＢ２０３５８０及びビタミンＣでの三次誘導後の細胞の特徴づけ
材料及び方法
三次誘導
細胞を実施例１に記載されるように調製し、次いで実施例２に記載されるように一次誘導、続いて実施例５に記載されるように二次誘導を行った。その後、次いで細胞を、ＤＭＥＭ、２０ｎｍプロゲステロン、１００μｍプトレシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ、カタログ番号Ｐ−５７８０）、１μｇ／ｍｌ  ラミニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｌ２０２０−１ＭＧ）、１０ｍＭ  ニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｎ−３３７６）、２５μｇ／ｍｌ  インスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｉ−１８８２）、５０μｇ／ｍｌ  トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ−１１４７）、３０ｎＭ  亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ−５２６１）、１×Ｂ２７、５μｍ  ＳＢ２０３５８０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ８３０７）、及び０．２ｍＭ  ビタミンＣ、及びｐ／ｓ（上記のような）を含有する三次誘導培地中で９日間培養した。細胞を、インスリン（ベータ細胞マーカー）及びＣ−ペプチド（ベータ細胞マーカー）の発現を検査することによって特徴づけした。
【０１４４】
結果及び考察
結果として生じる細胞のうち、一部は明白にベータ細胞マーカーであるインスリン（細胞の４１％）を発現しており、一部はＣ−ペプチド（細胞の３６．５％）を発現していた（図７）。これらの結果は、細胞がここではベータ様であることを示す。
【０１４５】
実施例９  アクチビンＡと置き換わるＩＤＥ１での代替的な一次誘導後の細胞の特徴づけ
材料及び方法
一次誘導
ＨＵＣ−Ｍ−３５及びＨＵＣ−Ｆ−３５細胞を単離及び培養し、実施例２に記載されるような一次誘導を行ったが、ただし一次誘導培地は、アクチビンＡの代わりに誘導剤確定内胚葉ＩＤＥ１を用いた（Ｂｏｒｏｗｉａｋら、２００９）。即ち、一次誘導培地は、ＲＰＭＩ  １６４０培地、０．２％ＦＢＳ、１００μｍ  ＩＤＥ１（Ｊｏｍａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ、カタログ番号４０１５）、１ｍＭ  ＬｉＣｌ、及び０．２ｍＭ  ビタミンＣを含有していた。細胞をこの培地中で６日間培養した。誘導細胞を、内胚葉細胞マーカーＦｏｘａ２及びＳｏｘ１７の発現について分析した。
【０１４６】
結果及び考察
ＨＵＣ１−Ｍ−３５及びＨＵＣ−Ｆ−３５細胞由来の細胞の１００％が、それぞれＦｏｘａ２及びＳｏｘ１７を発現することが分かった。これは、アクチビンＡの代わりにＩＤＥ１を使用した一次誘導プロトコルが細胞を誘導して内胚葉様にすることに成功したことを示す。
【０１４７】
実施例１０  最初にシクロパミン−ＫＡＡＤ、インドラクタムＶ、レチノイン酸、ビタミンＣ、Ａ８３−０１、及びＢＲＤ  ７５５２、続いてシクロパミン−ＫＡＡＤ、インドラクタムＶ、ビタミンＣ、Ａ８３−０１、及びＢＲＤ  ７５５２での代替的な二次誘導後の細胞の特徴づけ
材料及び方法
二次誘導Ａ
ＨＵＣ−Ｍ−３５細胞を実施例９に記載されるような一次誘導プロトコルを使用して誘導した。次いで、細胞を、ＤＭＥＭ、０．２５μｍ  シクロパミン−ＫＡＡＤ（Ｓａｐｐｈｉｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ、カタログ番号ａｂ１４２１４６）、３３０ｎｍ  インドラクタムＶ、１×２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×Ｂ２７、２μｍ  レチノイン酸（ＲＡ）、０．２ｍＭ  ビタミンＣ（ＶＣ）、２．５μｍ  Ａ８３−０１、及び５μｍ  ＢＲＤ  ７５５２を含有する二次誘導培地中で、ｐＨを７．４に調節して、１日間培養した。これに続いて、細胞を、ＤＭＥＭ、０．２５μｍ  シクロパミン−ＫＡＡＤ、３３０ｎｍ  インドラクタムＶ、１×Ｌ−グルタミン、１×Ｂ２７、０．２ｍＭ  ビタミンＣ、２．５μｍ  Ａ８３−０１、及び５μｍ  ＢＲＤ  ７５５２を含有する別の二次誘導培地中で、ｐＨを７．４に調節して、３日間培養した。ＩＣＣを使用して、細胞をＮｋｘ６．１及びＰＤｘ１の発現によって特徴づけした。
【０１４８】
二次誘導Ｂ
代替的な実験において、細胞を実施例９に記載されるような一次誘導プロトコルを使用して誘導した。次いで、細胞を、ＤＭＥＭ、０．２５μｍ  シクロパミン−ＫＡＡＤ、３３０ｎｍ  インドラクタムＶ、１×２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×Ｂ２７、２μｍ  レチノイン酸（ＲＡ）、０．２ｍＭ  ビタミンＣ（ＶＣ）、２．５μｍ  Ａ８３−０１、及び５μｍ  ＢＲＤ  ７５５２を含有する二次誘導培地中で、ｐＨを７．４に調節して、１日間培養した。次いで、細胞を、ＤＭＥＭ、０．２５μｍ  シクロパミン−ＫＡＡＤ、３３０ｎｍ  インドラクタムＶ、１×Ｌ−グルタミン、１×Ｂ２７、０．２ｍＭ  ビタミンＣ、２．５μｍ  Ａ８３−０１、及び５μｍ  ＢＲＤ  ７５５２を含有する別の二次誘導培地中で、ｐＨを７．４に調節して、６日間培養した。
【０１４９】
結果及び考察
両方の二次誘導プロトコルからの結果として生じる細胞が、膵臓前駆体マーカーＮＫｘ６．１及びＰｄｘ１を発現した。これは、二次誘導プロトコルがシクロパミン−ＫＡＡＤを含むとき、ヒト尿細胞由来の細胞が、記載されるような一次誘導及び二次誘導後に膵臓様であることを示す。
【０１５０】
実施例１１  ＳＢ２０３５８０、ビタミンＣ、及びＤＡＰＴでの代替的な三次誘導後の細胞の特徴づけ
材料及び方法
三次誘導
ＨＵＣ−Ｆ−３７及びＨＵＣ−Ｍ−３５細胞を（独立して）、実施例１に記載されるように単離及び培養し、実施例９に記載されるように一次誘導を行い、次いで実施例１０に記載されるように二次誘導を行った。次いで、細胞を、ＤＭＥＭ、２０ｎｍ  プロゲステロン、１００μｍ  プトレシン、１μｇ／ｍｌ  ラミニン、１０ｍＭ  ニコチンアミド、２５μｇ／ｍｌ  インスリン、５０ｕｇ／ｍｌ  トランスフェリン、３０ｎＭ  亜セレン酸ナトリウム、１×Ｂ２７、５μｍ  ＳＢ２０３５８０、０．２ｍＭ  ビタミンＣ、及び１μｍ  ＤＡＰＴ（ＧＳＩ−ＩＸ、ＬＹ−３７４９７３、Ｎ−［２Ｓ−（３，５−ジフルオロフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル−２−フェニル−１，１−ジメチルエステル−グリシンとしても知られる、Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｄｉｒｅｃｔ）からなる三次誘導培地中で、ｐＨ７．４で、９日間培養した。細胞を実施例１に記載されるように特徴づけした。具体的には、細胞形態を位相差顕微鏡によって検査し、Ｃ−ペプチド（ベータ細胞マーカー）、インスリン（ベータ細胞マーカー）、及びＤＡＰＩの発現をＩＣＣによって比較した。
【０１５１】
結果及び考察
図８に示されるように、ＨＵＣ−Ｆ−３７由来の一部の細胞は三次誘導中に死亡し、その他のものは膵島様形態を示しており、それはベータ様の細胞と一貫している。図９Ａは、細胞のおよそ１００％がベータ細胞マーカーであるｃ−ペプチドを発現したことを示し、図９Ｂは、細胞のおよそ１００％がインスリンを発現することを示す。したがって、これらの細胞はベータ様である。しかしながら、図１０は、図９のものと同じ皿の異なる領域の顕微鏡写真である。図１０から明らかであるように、結果は、一部の細胞がＣ−ペプチド及びインスリン陰性であり、皿全体で一貫していない。これは、細胞の混合集団が存在し得ることを示唆する。同様の結果が、ＨＵＣ−Ｍ−３５由来の細胞を検査したときに見られる。具体的には、いくつかの膵島様細胞が見られ、Ｃ−ペプチド陽性及びインスリン陽性細胞が観察される。
【０１５２】
実施例１２  代替的なプロトコル及び上の実施例からの結論
材料及び方法
上の実施例から最適化されたプロトコルを以下のように決定した。ＨＵＣ細胞を、実施例１に記載されるように得て、培養し、ｍａｔｒｉ−ｇｅｌコーティングされた皿上に、５ｘ１０４／ｃｍ２の密度で播種し、次いで以下のような誘導プロトコルを使用して培養した：
一次誘導（６日）：
・培地：ＲＰＭＩ＋０．２％ＦＢＳ、
・小分子初期化因子：１００μｍ  ＩＤＥ１、１ｍＭ  ＬｉＣｌ、０．２ｍＭ  ビタミンＣ（ＶＣ）、
二次誘導（ステップ１、１日）
・培地−ＤＭＥＭ＋１×Ｌ−グルタミン＋１×Ｂ２７、
・小分子初期化因子：０．２５μｍ  シクロパミン−ＫＡＡＤ、３３０ｎｍ  インドラクタムＶ、２μｍ  ＲＡ、０．２ｍＭ  ＶＣ、２．５μｍ  Ａ８３−０１、５μｍ  ＢＲＤ  ７５５２、続いて
二次誘導（ステップ２、６日）
・培地：ＤＭＥＭ＋１×Ｌ−グルタミン＋１×Ｂ２７（ｐＨ７．４）、
・小分子初期化因子：０．２５μｍ  シクロパミン−ＫＡＡＤ、３３０ｎＭ  インドラクタムＶ、０．２ｍＭ  ＶＣ、２．５μ  Ｍ  Ａ８３−０１、５μｍ  ＢＲＤ  ７５５２、
三次誘導（９日）：
・培地：ＤＭＥＭ＋２０ｎＭ  プロゲステロン＋１００μＫ  プトレシン＋１μｇ／ｍｌ  ラミニン＋１０ｍＭ  ニコチンアミド＋２５μｇ／ｍｌ  インスリン＋５０ｕｇ／ｍｌ  トランスフェリン＋３０ｎＭ  亜セレン酸ナトリウム＋１ｘＢ２７、ｐＨ７．４、
・小分子初期化因子：５μｍ  ＳＢ２０３５８０＋０．２ｍＭ  ＶＣ＋１μｍ  ＤＡＰＴ。
【０１５３】
結果及び考察
一次誘導後、結果として生じる誘導細胞は、非常に高レベルのＳｏｘ１７及びＦｏｘａ２を発現し、最大で細胞の１００％がＳｏｘ１７及びＦｏｘ２ａ陽性である。アクチビンＡは、一次誘導培地中でＩＥＤ１によって置き換えられ得る。
【０１５４】
二次誘導後、大半の細胞は、ＮＫＸ６．１及びＰｄｘ１を発現するが、ＮＧＮ３は発現しない。したがって、結果をさらに最適化するためには、より長い誘導時間が必要とされ得る。
【０１５５】
三次誘導後、誘導細胞は膵島様形態を形成し、一部の細胞はインスリン及びＣ−ペプチド陽性である。これらの細胞はインスリン分泌細胞であることが予測される。
【０１５６】
実施例１３  代替的なプロトコルの独立検証
材料及び方法
実施例に記載されるような方法、具体的には実施例１２に記載される誘導プロトコルを使用した方法を、別の機関で異なる研究者によって繰り返したが、ただし細胞をゼラチンでコーティングしたプレート上で培養した。ＨＵＣ細胞を３５歳ヒト女性（Ｆ３５）及び３２歳ヒト女性（Ｆ３２）から得た。細胞の密度が５ｘ１０４細胞／ｃｍ２に達したときに一次誘導を開始した。培養中のＨＵＣ細胞（即ち、非誘導）を陰性対照として使用した。ＩＣＣを使用して実施例１に記載されるように細胞特徴を検査した。
【０１５７】
定量ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してオンカラムＤＮＡ消化で全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）をＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってｃＤＮＡに変換した。表１３に記載されるプライマー及び標準的な方法を使用してＰＣＲを実施した。Ｍｏｕｓｅ  Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ及びＮＳＣ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＴ  ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  ａｒｒａｙを行った。
【０１５８】
【表１３−１】
0006715845.tif 000016
【表１３−２】
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【表１３−３】
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【０１５９】
結果及び考察
尿由来細胞株の生成
２種類の細胞がｐ０で観察されたが、細胞コロニーが混合されると（ｐ１から）ＩＩ型細胞が優勢になる。初期の継代では、大半の細胞は、小さな丸または三角形の形態を有するが、高次の継代（ｐ５〜ｐ２０にわたって）では、大きな丸の形状が生成される。したがって、ｐ５〜ｐ１０の細胞が通常は使用される。得られたＨＵＣの特徴は、上記の尿由来細胞株と同様であった。
【０１６０】
一次誘導
いくつかの細胞を一次誘導後に位相差顕微鏡によって可視化しながら凝集させた。これらの凝集を３ステップ誘導プロセスを通して維持した。さらに、全３ステップ誘導プロトコル中、細胞は良好に成長した。一次誘導後の細胞を、抗ＦＯＸＡ２及び抗ＳＯＸ１７抗体を用いて胚体内胚葉細胞マーカーについて検査した。ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７の両方が、処置した細胞内で強力に発現されたが、これらのマーカーは、制御細胞内でも弱く発現された。したがって、一次誘導前後の細胞のｍＲＮＡ試料は、アップレギュレーションを確認するために検査される。
【０１６１】
二次誘導
二次誘導の６日目には、細胞凝集体のサイズは、二次誘導の２日目よりも著しく大きかった。細胞は良好に成長していた。誘導され、かつ主に凝集された細胞を、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１に対する特定の抗体を使用するために強力に染色した。細胞凝集体は、細胞マーカーＰＤＸ１、ＮＸＫ６．１、及びＮＧＮ３に対して強力に染まった。陰性制御細胞は、ＰＤＸ１に対して陰性であり、ＮＸ６．１及びＮＧＮ３に対して弱い陽性であり、細胞凝集体を有しなかった。
【０１６２】
三次誘導
三次誘導プロセス後にも凝集されたままであった多数の凝集された細胞群が存在した。凝集された細胞の一部は、第３のステップで離脱される傾向があり、それは、Ｐｅｎｎａｒｏｓｓａら、２０１３に示されるものと同様である。多数の細胞は、それらが４％ＰＦＡで固定されたときに離脱された。これは、ゼラチンがコーティング材として使用されたためであり得るが、誘導はまた、ｍａｔｒｉ−ｇｅｌコーティングされた皿上でも行われていた。三次誘導ステップ後、インスリン発現及びＣ−ペプチドを検査した。細胞の一部（３６．６±５％）がインスリン及びＣ−ペプチドを発現した（図１１）。インスリン発現はまた、代替的な抗インスリン抗体（Ｈ−８６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−９１６８）使用して確認した。したがって、三次誘導後、細胞内のインスリン発現は、異なる種類のヒトインスリン特異抗体によって検出された。定量ＲＴ−ＰＣＲの結果はまた、三次誘導後の細胞が、陰性制御細胞と比較して膵臓系統にコミットしている（図１２）ことを示した。ＰＤＸ１、Ｎｇｎ３、及びＩＳＬ（別のベータ細胞マーカー）のｍＲＮＡ発現レベルは、誘導細胞内でアップレギュレートされ、誘導細胞が膵臓系統にコミットしていることを示した。
【０１６３】
実施例１４  Ｃ−ペプチド放出アッセイ
材料及び方法
ＨＵＣ細胞を実施例１２に記載されるように誘導した。培養培地を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗い流し、次いで１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補足したＭＣＤＢ  １３１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、２０ｍＭ  Ｄ−グルコースで１時間及び２４時間刺激した。グルコース依存性Ｃ−ペプチド放出を、ヒトＣ−ペプチド  ＥＬＩＳＡキット（ＥＩＡａｂ、Ｅ０４４７ｈ）を用いて、製造者の指示に従って分析した。
【０１６４】
結果及び考察
誘導細胞は、およそ１４５ｎｇ／ｍｌの濃度でＣ−ペプチドを放出した。２０ｍＭ  Ｄ−グルコースによる１時間及び２４時間の刺激の間に違いはなかった。したがって、グルコースとの１時間のインキュベーションは、誘導ベータ細胞がｃ−ペプチドを分泌することができることを確証するのに十分である。
【０１６５】
実施例１５  ３ステップ二次誘導（第１のステップ：ビタミンＣ、第２のステップ：ビタミンＣ、ＲＡ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、インドラクタムＶ、及びドルソモルフィン、第３のステップ：ビタミンＣ、ＲＡ、及びシクロパミン−ＫＡＡＤ）、及び代替的な３ステップ三次誘導（第１のステップ：ビタミンＣ、ＲＡ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、ＤＡＰＴ、Ａ８３−０１、及びトリヨードチロニン、第２のステップ：ビタミンＣ、ＲＡ、ＤＡＰＴ、Ａ８３−０１、及びトリヨードチロニン、第３のステップ：ビタミンＣ、Ａ８３−０１、及びトリヨードチロニン）でのさらなる代替的なプロトコル後の細胞のインキュベーション
材料及び方法
Ｓ２培地は、ＭＣＤＢ１３１培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋８ｍＭ  Ｄ−グルコース＋１．２３ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３＋２％ＢＳＡ、インスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン（ＩＴＳ−Ｘ）１：５０＋２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌ−アラニン−Ｌ−グルタミンジペプチド、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋０．２５ｍＭ  ビタミンＣ＋１％ｐ／ｓを含有し、Ｓ３培地は、ＭＣＤＢ１３１培地＋８ｍＭ  Ｄ−グルコース＋１．２３ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３＋２％ＢＳＡ＋ＩＴＳ−Ｘ  １：２００＋２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ＋０．２５ｍＭ  ビタミンＣ＋１％ｐ／ｓを含有し、Ｓ５培地は、ＭＣＤＢ１３１培地＋２０ｍＭ  Ｄ−グルコース＋１．７５４ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３＋２％ＢＳＡ＋ＩＴＳ−Ｘ１：２００＋２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ＋０．２５ｍＭ  ビタミンＣ＋１％ｐ／ｓ＋ヘパリン  １０μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｈ３１４９、１ｍｇ＝１００単位）を含有し、Ｓ６培地は、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＶＷＲ、１６７７７）を補足したＣＭＲＬ  １０６６（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、９９−６０３−ＣＶ）＋１％ｐ／ｓを含有する。ＣＭＲＬ  １０６６培地は、ビタミンＣの一形態である０．２８ｍＭ  アスコルビン酸を含有することに留意されたい。１０％ＦＢＳ及び１％ｐ／ｓの添加後、ビタミンＣの濃度はおよそ０．２５ｍＭである。
【０１６６】
一次及び二次誘導
ＨＵＣ細胞を実施例１に記載されるように単離及び培養し、実施例９に記載されるように一次誘導を行った（即ち、一次誘導培地は、ＲＰＭＩ  １６４０培地、０．２％ＦＢＳ、１００μｍ  ＩＤＥ１、１ｍＭ  ＬｉＣｌ、及び０．２ｍＭ  ビタミンＣを含有しており、細胞をこの培地中で６日間培養した）。次いで細胞は以下のように二次誘導を受けた：細胞を、Ｓ２培地（ビタミンＣを含む）及び１００ｎｇ／ｍｌ基本線維芽細胞因子（ｂＦＧＦ）中で２日間、次いで１００ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、２００ｎＭ  ＲＡ、０．２５μｍ  シクロパミン−ＫＡＡＤ、ならびに３０ｎｍ  インドラクタムＶ及び１０μｍ  ドルソモルフィン（Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｄｉｒｅｃｔ）を含有するＳ２培地（ビタミンＣを含む）中で２日間、さらに次いで１００ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、１００ｎＭ  ＲＡ、及び０．２５μｍ  シクロパミン−ＫＡＡＤを含有するＳ３培地（ビタミンＣを含む）中で５日間インキュベートした。
【０１６７】
三次誘導
二次誘導後、次いで細胞は以下のように三次誘導を受けた。細胞を、１００ｍＭ  ＲＡ、０．２５μｍ  シクロパミン−ＫＡＡＤ、１μｍ  ＤＡＰＴ、２．５μｍ  Ａ８３−０１、１μｍ  トリヨードチロニン（Ｔ３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩、カタログ番号Ｔ６３９７）、及び２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを含有するＳ５培地（ビタミンＣを含む）中で４日間、次いで２５ｍＭ  ＲＡ、１μｍ  ＤＡＰＴ、２．５μｍ  Ａ８３−０１、１μｍ  Ｔ３、及び２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを含有するＳ５培地（ビタミンＣを含む）中で３日間、さらに次いで２．５μｍ  Ａ８３−０１及び１μｍ  Ｔ３を含有するＳ６培地（ビタミンＣを含む）中で１４日間インキュベートした。
【０１６８】
結果及び考察
細胞が三次誘導プロトコルの最後の１４日間のインキュベーションステップにおいては繁栄していないことが観察された。したがって、最後の１４日間のインキュベーションステップにおけるＡ８３−０１なしのプロトコルで再試験することを決定した。
【０１６９】
実施例１６  ３ステップ二次誘導（第１のステップ：ビタミンＣ、第２のステップ：ビタミンＣ、ＲＡ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、インドラクタムＶ、及びドルソモルフィン、第３のステップ：ビタミンＣ、ＲＡ、及びシクロパミン−ＫＡＡＤ）、及び３ステップ三次誘導（第１のステップ：ビタミンＣ、ＲＡ、シクロパミン−ＫＡＡＤ、ＤＡＰＴ、Ａ８３−０１、及びトリヨードチロニン、第２のステップ：ビタミンＣ、ＲＡ、ＤＡＰＴ、Ａ８３−０１、及びトリヨードチロニン、第３のステップ：ビタミンＣ及びトリヨードチロニン）後の細胞の特徴づけ
材料及び方法
細胞を実施例１５に記載されるように誘導したが、ただしＡ８３−０１を三次誘導プロトコルの最後のインキュベーションステップから省いた。
【０１７０】
細胞特徴づけ
細胞のアリコートを、一次、二次、及び三次誘導プロトコルのそれぞれの後に取り出し、上の免疫細胞化学をプロトコル使用して特徴づけし、具体的には、一次誘導プロトコル後に、細胞を胚体内胚葉マーカーＳｏｘ１７及びＦｏｘａ２の存在について試験し、二次誘導プロトコル後に、細胞を膵臓マーカーＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＮＧＮ３の存在について試験し、ならびに三次誘導プロトコル後に、細胞をインスリン及びＣ−ペプチドの存在について試験した。誘導プロトコルの各ステップ後の細胞はまた、ｃＤＮＡ合成に使用される５００ｎｇの全ＲＮＡを用いて、上記のように定量ＲＴ−ＰＣＴ（ｑ−ＰＣＲ）を受けた。三次誘導プロトコルから生じる細胞も、上記のようにＣ−ペプチド発現について試験した。また、標準的な技術及び上記の抗体を使用して、細胞を、ＦＡＣＳ分析によってインスリン及びＣ−ペプチド発現について検査した。
【０１７１】
Ｃ−ペプチド放出
三次誘導後、培養培地を採取し（試料「０」）、次いで細胞をクレブス緩衝液（０．１２６Ｍ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１．２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨを７．２に調節）で２回洗浄し、次いで低（２ｍＭ）グルコースを含有するクレブス緩衝液中で２時間インキュベートして、残渣ｃ−ペプチドを除去した。次いで、細胞をクレブス緩衝液で２回洗浄し、次いで低（２ｍＭ）グルコースを含有するクレブス緩衝液中で３０分インキュベートした。３０分後、上清を採取した（試料「１−２」）。細胞を上記のように２回洗浄し、高（２０ｍＭ）グルコースを含有するクレブス緩衝液中で３０分インキュベートし、上清を採取した（試料「１−２０」）。細胞を上記のように２回洗浄し、低（２０ｍＭ）グルコースを含有するクレブス緩衝液中で３０分インキュベートし、上清を採取した（試料「２−２」）。細胞を上記のように２回洗浄し、高（２０ｍＭ）グルコースを含有するクレブス緩衝液中で３０分インキュベートし、上清を採取した（試料「２−２０」）。最後に、細胞数を、ＴＣ−２０自動細胞カウンタ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって数えた。各試料においてａを使用してＣ−ペプチドレベルを測定したＣ−ペプチドを、ＥＩＡＡＢのヒトＣ−ペプチドＥＬＩＳＡキットによって、製造者の指示に従って試験した。誘導プロトコルを受けなかった尿由来細胞、及びヒト膵島細胞（Ｐｒｏｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を対照として並行して検査した。高グルコース試料及び低グルコース試料のそれぞれについて、結果は、第１及び第２の試料の平均±標準偏差として示される。
【０１７２】
結果及び考察
二次誘導プロトコル後、免疫細胞化学実験は、細胞が、ＮＫＸ６．１に対して１００％陽性、３３．８％ＮＧＮ３陽性、及び２３．１％ＰＤＸ１陽性（データは示されない）であることを示した。これは、膵臓前駆様細胞の存在を確認し、膵臓前駆細胞が誘導されたことを示す。
【０１７３】
三次誘導後、免疫細胞化学実験は、細胞の８５±２．５％が、Ｃ−ペプチド及びインスリンに対して二重陽性であることを示した。この結果は、ベータ様細胞の存在を確認し、ベータ細胞が誘導されたことを示す。
【０１７４】
図１３Ａに示されるように、三次誘導プロトコル後の細胞（誘導ベータ細胞（ＩＢＣ）と称される）培養培地試料から放出されるＣ−ペプチドは、３．８６ｎｇ／ｍｌ／３００００細胞、２ｍＭ  グルコース試料中では１．３９±０．０５ｎｇ／ｍｌ／３０，０００細胞であったが、２０ｍＭ  グルコース試料中では３．０４±１．０４であった。一方、図１３Ｂに示されるように、ヒト膵島培養培地からのＣ−ペプチドは、１．８１ｎｇ／ｍｌ／３００００細胞であったが、それは２ｍＭ  グルコース試料中では、１．８４±０．０１、及び２０ｍＭ  グルコース試料中では２．０１±０．０１であった。尿細胞培養培地試料から放出されるＣ−ペプチドは、０．０４ｎｇ／ｍｌ／３００００細胞であったが、Ｃ−ペプチドは、２ｍＭグルコース試料のいずれにおいても検出されず、２０ｍＭ  グルコース試料中では０．１３±０．０２ｎｇ／ｍｌ／３００００細胞であった。このデータは、三次誘導プロトコル後の誘導ベータ細胞が、ヒト膵島細胞と同じくらい、またはそれ以上のＣ−ペプチドを放出することができること、尿由来細胞（即ち、誘導プロトコルなし）が非常に低いまたは検出不可能なレベルのＣ−ペプチドを放出することを示す。このデータは、三次誘導プロトコルがベータ細胞様である細胞を生成することを確認し、細胞が誘導ベータ細胞であるというさらなるサポートを提供する。
【０１７５】
図１４Ａ及び１４Ｂに示されるように、一次誘導プロトコルは、Ｓｏｘ１７及びＦｏｘａ２遺伝子の発現を尿細胞と比較してそれぞれ６倍及び２１倍増加させた（ｑ−ＰＣＲによって決定される）細胞（「ＩＢＣステージ１」と称される）をもたらし、細胞が胚体内胚葉様であることを確認し、したがって細胞が誘導胚体内胚葉細胞であることを示した。二次誘導プロトコル後、細胞（「ＩＢＣステージ２」と称される）は、図１４Ｃ及び１４Ｄにそれぞれ示されるように、尿細胞と比較して２倍及び８倍高いＰｄｘ１及びＮＧＮ３発現を有し、細胞が膵臓前駆様であることを確認し、したがって細胞が誘導膵臓前駆細胞であることを示した。三次誘導プロトコル後、細胞（「ＩＢＣステージ３」と称される）は、尿細胞と比較して１７５１倍及び２６倍多いインスリン及びソマトスタチン（ＳＳＴ）をそれぞれ発現した（図１４Ｅ及び１４Ｆ）。さらに、三次誘導プロトコル後の細胞は、ヒト膵島細胞と同様のレベルのインスリン、及びおよそヒト膵島細胞の２倍のソマトスタチンを発現した。このデータは、三次誘導プロトコル後の細胞がベータ細胞様であることを示し、したがって細胞が誘導ベータ細胞であることを示す。
【０１７６】
図１５Ｂは、三次誘導後、細胞の１２．１４％がインスリン発現に対して陽性であったことを示し、図１５Ｃは、細胞の８．４３％がＣ−ペプチド発現に対して陽性であったことを示す。図１５Ａは、標準的な方法に従って適用される生細胞のゲーティングを示す。
【０１７７】
したがって、このさらに代替的なプロトコルもまた、尿由来細胞を最終的にベータ様細胞に誘導することに成功した。誘導プロトコルは以下の通りである：
一次誘導（６日）：
・培地：ＲＰＭＩ＋０．２％ＦＢＳ、
・小分子初期化因子：１００μｍ  ＩＤＥ１、１ｍＭ  ＬｉＣｌ、０．２ｍＭ  ビタミンＣ（ＶＣ）、
二次誘導（ステップ１、２日）
・培地：ＭＣＤＢ１３１培地＋ｂＦＧＦ＋８ｍＭ  Ｄ−グルコース＋１．２３ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３＋２％ＢＳＡ、インスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン（ＩＴＳ−Ｘ）１：５０＋２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌ−アラニン−Ｌ−グルタミンジペプチド＋１％ｐ／ｓ、
・小分子初期化因子：０．２５ｍＭ  ビタミンＣ、
二次誘導（ステップ２、２日）
・培地：ＭＣＤＢ１３１培地＋ｂＦＧＦ＋８ｍＭ  Ｄ−グルコース＋１．２３ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３＋２％ＢＳＡ、インスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン（ＩＴＳ−Ｘ）１：５０＋２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌ−アラニン−Ｌ−グルタミンジペプチド＋１％ｐ／ｓ、
・小分子初期化因子：０．２５ｍＭ  ビタミンＣ、２００ｎＭ  ＲＡ、０．２５μｍ  シクロパミン−ＫＡＡＤ、ならびに３０ｎｍ  インドラクタムＶ及び１０μｍ  ドルソモルフィン、
二次誘導（ステップ３、５日）
・培地：ＭＣＤＢ１３１培地＋ｂＦＧＦ＋８ｍＭ  Ｄ−グルコース＋１．２３ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３＋２％ＢＳＡ＋ＩＴＳ−Ｘ  １：２００＋２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ＋０．２５ｍＭ  ビタミンＣ＋１％ｐ／ｓ、
・小分子初期化因子：０．２５ｍＭ  ビタミンＣ、１００ｎＭ  ＲＡ、及び０．２５μｍ  シクロパミン−ＫＡＡＤ、
三次誘導（ステップ１、４日）
・培地：ＭＣＤＢ１３１培地＋２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ  ＋２０ｍＭ  Ｄ−グルコース＋１．７５４ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３＋２％ＢＳＡ＋ＩＴＳ−Ｘ１：２００＋２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１％ｐ／ｓ＋１０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、
・小分子初期化因子：１００ｍＭ  ＲＡ、０．２５μｍ  シクロパミン−ＫＡＡＤ、１μｍ  ＤＡＰＴ、２．５μｍ  Ａ８３−０１、１μｍ  トリヨードチロニン、
三次誘導（ステップ２、３日）
・培地：ＭＣＤＢ１３１培地＋２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ＋２０ｍＭ  Ｄ−グルコース＋１．７５４ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３＋２％ＢＳＡ＋ＩＴＳ−Ｘ  １：２００＋２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１％ｐ／ｓ＋１０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、
・小分子初期化因子：２５ｍＭ  ＲＡ、１μｍ  ＤＡＰＴ、２．５μｍ  Ａ８３−０１、１μｍＴ３、
三次誘導（ステップ３、１４日）
・培地：１０％ＦＢＳを補足したＣＭＲＬ  １０６６（ビタミンＣを含む）、
・小分子初期化因子：１μｍ  Ｔ３
【０１７８】
実施例１７  尿細胞の特徴づけ
材料及び方法
３つの異なるヒト尿細胞試料及び標準的な技術を使用して単離された一次線維芽細胞を、ｃＤＮＡ合成のために使用される５００ｎｇ全ＲＮＡを用いて、上記のようにｑ−ＰＣＲ（ｔａｑｍａｎプライマーを使用）によって特徴づけした。
【０１７９】
結果及び考察
１つの尿細胞株のみが上皮マーカーＫＲＴ７（図１６Ａ）を発現したが、その一方で３つすべての尿細胞株が上皮マーカーオクルジン（ＯＣＬ、図１６Ｂ）を発現した。尿細胞株のすべてが、腎尿細管マーカーＮＲ３Ｃ２（図１６Ｃ）及びＬ１ＣＡＭ（図１６Ｄ）、ならびに可変レベルの腎尿細管マーカーＳＬＣ２Ａ１（図１６Ｅ）を発現した。すべての尿細胞株が、低レベルの線維芽細胞マーカービメンチン（図１６Ｆ）を発現した。これは、異なる個体から得られる尿細胞にばらつきがあることを示し、また、尿細胞が混合された由来のものであることを示す。
【０１８０】
結論として、本明細書に記載されるプロトコルは、実施形態において、一次誘導プロトコルを使用して尿由来細胞から誘導胚体内胚葉細胞へ、二次プロトコルを使用して誘導膵臓前駆体へ、及び本明細書に記載される三次プロトコルを使用して誘導ベータ細胞へと、細胞を分化転換することができる。
【０１８１】
本明細書及び続く特許請求の範囲の全体にわたって、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という言葉、ならびに「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、述べられた整数または整数の群の包含を暗示するが、任意の他の整数または整数の群の除外ではないことが理解される。
【０１８２】
本明細書内のいかなる先行技術に対する言及は、そのような先行技術が技術常識の一部を形成するといういかなる形態の提案の認容として取られるものではなく、またそのように取られるべきではない。
【０１８３】
本発明は、その使用において記載される特定の用途に制限されないことが当業者によって理解される。本発明は、本明細書に記載または描写される特定の要素及び／または機能に関する好ましい実施形態において制限されることもない。本発明は開示される実施形態（複数含）に制限されず、以下の請求項によって明記及び定義される本発明の範囲から逸脱することなく、多数の再編成、変形形態、及び代替物が可能であることが理解される。
【表１４】
0006715845.tif 000019
【図１】
0006715845.tif 000020
【図２−３】
0006715845.tif 000021
【図４】
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【図５−６】
0006715845.tif 000023
【図７−８】
0006715845.tif 000024
【図９−１０】
0006715845.tif 000025
【図１１】
0006715845.tif 000026
【図１２】
0006715845.tif 000027
【図１３】
0006715845.tif 000028
【図１４Ａ−Ｂ】
0006715845.tif 000029
【図１４Ｃ−Ｄ】
0006715845.tif 000030
【図１４Ｅ−Ｆ】
0006715845.tif 000031
【図１５】
0006715845.tif 000032
【図１６Ａ−Ｂ】
0006715845.tif 000033
【図１６Ｃ−Ｄ】
0006715845.tif 000034
【図１６Ｅ−Ｆ】
0006715845.tif 000035
【配列表】
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