(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中のタンパク質凝集の量または比率を該溶液のタンパク質濃度に基づいて決定することにより、製剤において使用するためのタンパク質濃度を同定する方法であって、
タンパク質の濃度を増加させて含む複数の第一溶液を調製する工程と；
該複数の第一溶液に含まれる各溶液について観測可能な性質を測定する工程と；
該観測可能な性質に基づいて該複数の第一溶液の各濃度で該タンパク質の立体配座安定性に関するΔＧ値を決定する工程と；
ΔＧ値と該タンパク質の各濃度との相関図を作成する工程と；
該相関図を用いて凝集した該タンパク質の量または比率を決定する工程と；
ΔＧ値が最大になりΔＧ値のタンパク質濃度依存性が最小になるタンパク質濃度を特定する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記複数の第一溶液に含まれる各溶液は、緩衝剤の組成、緩衝強度、ｐＨ値、イオン強度、賦形剤の組成、賦形剤濃度、化学変性剤の組成、および化学変性剤濃度からなる群より選択される０〜３つの条件が異なる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質の濃度を段階的に増加させた複数の少なくとも第二溶液を提供する工程と；
該複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液について観測可能な性質を測定する工程と；
該観測可能な性質に基づいて該複数の少なくとも第二溶液の各濃度で該タンパク質の立体配座安定性に関するΔＧ値を決定する工程と；
該複数の少なくとも第二溶液でのΔＧ値と該タンパク質の各濃度との相関図を作成する工程と；
該相関図を用いて該複数の少なくとも第二溶液に存在する凝集した該タンパク質の量または比率を決定する工程と
をさらに含み、
該複数の少なくとも第二溶液は、緩衝剤の組成、緩衝強度、ｐＨ値、イオン強度、賦形剤の組成、賦形剤濃度、化学変性剤の組成、および化学変性剤濃度からなる群より選択される１つ以上の条件が前記複数の第一溶液と異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液は、緩衝剤の組成、緩衝強度、ｐＨ値、イオン強度、賦形剤の組成、賦形剤濃度、化学変性剤の組成、および化学変性剤濃度からなる群より選択される０〜３つの条件が異なる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の少なくとも第二溶液は、前記タンパク質の濃度が前記複数の第一溶液と同じである溶液を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の第一溶液に含まれる各溶液ならびに前記複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液について、ΔＧ値と緩衝剤の組成、緩衝強度、ｐＨ値、イオン強度、賦形剤の組成、および賦形剤濃度からなる群より選択される条件との相関図を作成する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
凝集した前記タンパク質の量または比率と、緩衝剤の組成、緩衝強度、ｐＨ値、イオン強度、賦形剤の組成、および賦形剤濃度からなる群より選択される条件との相関図を作成する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の第一溶液に存在する凝集した前記タンパク質の量または比率を前記複数の少なくとも第二溶液の場合と比較する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
１ｎｇ／ｍｌ以下の変性タンパク質または１ｎｇ／ｍｌ以下の凝集タンパク質を検出または定量する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
凝集した前記タンパク質の量または比率を２４時間以内に決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の第一溶液に含まれる各溶液は０．１μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌの前記タンパク質を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液は０．１μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌの前記タンパク質を含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記観測可能な性質は蛍光である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の少なくとも第二溶液は少なくとも化学変性剤濃度が前記複数の第一溶液と異なる、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記相関図を用いて前記複数の第一溶液に存在する変性した該タンパク質の量または比率ならびに凝集した該変性タンパク質の比率を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の少なくとも第二溶液に存在する変性した該タンパク質の量または比率ならびに凝集した該変性タンパク質の比率を決定する工程と；
前記複数の第一溶液に存在する凝集した該タンパク質あるいは変性した該タンパク質の量または比率を該複数の少なくとも第二溶液の場合と比較する工程と
をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
タンパク質凝集が最少になる医薬的に許容されるタンパク質製剤を調製する方法であって、
タンパク質の濃度を段階的に増加させた複数の第一溶液を提供し、該複数の第一溶液に含まれる各溶液について観測可能な性質を測定し、該観測可能な性質に基づいて該複数の第一溶液の各濃度で該タンパク質の立体配座安定性に関するΔＧ値を決定し、該複数の第一溶液でのΔＧ値と該タンパク質の各濃度との相関図を作成し、かつ該相関図を用いて該複数の第一溶液に存在する凝集した該タンパク質の量または比率を決定する工程と；
該タンパク質の濃度を段階的に増加させた複数の少なくとも第二溶液（該複数の少なくとも第二溶液は、緩衝剤の組成、緩衝強度、ｐＨ値、イオン強度、賦形剤の組成、賦形剤濃度、化学変性剤の組成、および化学変性剤濃度からなる群より選択される１つ以上の条件が該複数の第一溶液と異なる）を提供し、該複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液について観測可能な性質を測定し、該観測可能な性質に基づいて該複数の少なくとも第二溶液の各濃度で該タンパク質の立体配座安定性に関するΔＧ値を決定し、該複数の少なくとも第二溶液でのΔＧ値と該タンパク質の各濃度との相関図を作成し、かつ該相関図を用いて凝集した該タンパク質の量または比率を決定する工程と；
ΔＧ値と該タンパク質の各濃度の相関図を用いてΔＧ値が最大となりΔＧ値のタンパク質濃度依存性が最小となる該タンパク質の濃度を決定する工程と；
ΔＧ値が最大となりΔＧ値のタンパク質濃度依存性が最小となる該濃度の該タンパク質を含有し、タンパク質凝集を最少にする医薬的に許容されるタンパク質製剤を調製する工程と
を含む、方法。
【請求項１８】
さらにΔＧ値が最大になりΔＧ値のタンパク質濃度依存性が最小になる、緩衝剤の組成、緩衝強度、ｐＨ値、イオン強度、賦形剤の組成、および賦形剤濃度からなる群より選択される１つ以上の条件を選択する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数の少なくとも第二溶液は、少なくとも化学変性剤濃度が前記複数の第一溶液と異なる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質の複数の多様体の中から該タンパク質の安定な多様体を決定する方法であって、
第一のタンパク質多様体の濃度を段階的に増加させた複数の第一溶液を提供し、物理変性または化学変性を誘発し、該複数の第一溶液に含まれる各溶液について観測可能な性質を測定し、該観測可能な性質に基づいて該複数の第一溶液の各濃度で該第一のタンパク質多様体の立体配座安定性に関するΔＧ値を決定し、ΔＧ値と該第一のタンパク質多様体の各濃度との相関図を作成し、かつ該相関図を用いて凝集した該タンパク質の量または比率を決定する工程と；
少なくとも第二のタンパク質多様体の濃度を段階的に増加させた複数の少なくとも第二溶液を提供し、物理変性または化学変性を誘発し、該複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液について観測可能な性質を測定し、該観測可能な性質に基づいて該複数の少なくとも第二溶液の各濃度で該少なくとも第二のタンパク質多様体の立体配座安定性に関するΔＧ値を決定し、ΔＧ値と該少なくとも第二のタンパク質多様体の各濃度との相関図を作成し、かつ該相関図を用いて凝集した該タンパク質の量または比率を決定する工程とを含み、
該複数の第一溶液に含まれる各溶液は、緩衝剤の組成、緩衝強度、ｐＨ値、イオン強度、賦形剤の組成、賦形剤濃度、化学変性剤の組成、および化学変性剤濃度からなる群より選択される１つ以上の条件が異なり、該複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液は該１つ以上の条件が異なり、かつ
凝集タンパク質の量または比率がより低いタンパク質多様体を安定なタンパク質多様体と決定する、方法。
【請求項２１】
前記タンパク質多様体は異なるハイブリドーマクローンから得たモノクローナル抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質多様体は、１つ以上の糖化アミノ酸が異なるタンパク質を含むか、１つ以上の小分子の結合によって異なるタンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数の第一溶液に含まれる各溶液は少なくとも化学変性剤濃度が異なり、前記複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液は少なくとも化学変性剤濃度が異なる、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年７月２１日出願の米国特許仮出願第６２／０２６，９８４号および２０１４年８月７日出願の米国特許仮出願第６２／０３４，５０４号に基づく優先権および利益を主張する。これらの特許出願の全内容を参照により本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質凝集はタンパク質製剤（特に生物製剤）の長期安定性に影響する大きな問題である。多くの場合、凝集体は製剤に少量の変性タンパク質または部分変性タンパク質が存在することによって起こる。これらのタンパク質の立体配座は、たとえばタンパク質の疎水コアが溶媒にさらされたときに凝集しやすい。変性タンパク質が凝集すると、タンパク質の平衡は、変性し最終的に凝集した変性タンパク質の量が多い方へと徐々に移行する。他の状況では、天然状態そのものが凝集傾向を示す場合もある。すなわち、抗体薬物複合体（antibody drug conjugate; ADC）ではこの傾向が増幅される、というのも、結合した小分子薬物は多くの場合疎水性が高いためである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、タンパク質の凝集過程を認識し特性評価する新規な方法およびシステムが必要である。このような方法およびシステムは（１）凝集を最少にし長期安定性を伸ばすタンパク質製剤の特定および選択と（２）凝集傾向の最も低いタンパク質多様体の特定に非常に大きな利益をもたらすであろう。本願はこの必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、タンパク質の凝集過程を可能な限り初期に定量し特性評価する方法およびシステム、ならびにこのような新規方法およびシステムを（１）凝集を最少にし長期安定性を伸ばすタンパク質製剤の特定および選択と（２）凝集傾向の最も低いタンパク質多様体の特定のために使用することに関する。
【０００５】
本発明の第一の側面は、溶液のタンパク質濃度に基づいてこの溶液中のタンパク質凝集の量または比率を求める方法に関する。この方法は、（１）タンパク質の濃度を段階的に増加させた複数の第一溶液を提供する工程と；（２）複数の第一溶液に含まれる各溶液について観測可能な性質を測定する工程と；（３）この観測可能な性質に基づいて複数の第一溶液の各濃度でタンパク質の立体配座安定性に関するΔＧ値を決定する工程と；（４）ΔＧ値とタンパク質の各濃度との相関図を作成する工程と；（５）この相関図を用いて凝集タンパク質と変性タンパク質の両方または片方の量および／または比率を決定する工程とを含む。
【０００６】
本明細書で使用する場合、「変性」は、外部から何らかのストレスまたは反応物（強酸または強塩基、濃縮した無機塩、有機溶媒、放射線照射または熱など）が加わることにより、タンパク質が天然状態のときに有する四次構造、三次構造、および二次構造を失う過程である。一般に使用される化学変性剤としては、尿素および塩酸グアニジンが挙げられる。生細胞でタンパク質が変性すると、細胞活動が阻害される可能性があり、場合によっては細胞死が起こる可能性がある。生体内でも生体外でも、変性タンパク質は、立体配座の変化や溶解性の喪失をはじめ、疎水基の露出による凝集に及ぶ広範な特性を示す可能性がある。この過程では、折りたたまれていないタンパク質の露出した疎水性部分が他の折りたたまれていないタンパク質の露出した疎水性パッチ（あるタンパク質の表面に接触する可能性のある隣接する無極性原子の塊）と相互作用し、自然にタンパク質凝集を起こす可能性がある。
【０００７】
本明細書で使用する場合、「タンパク質凝集」は、タンパク質が細胞内または細胞外（生体外を含む）で集合する（すなわち蓄積して塊になる）現象である。医薬的に許容される製剤に含まれるタンパク質が凝集すると、その製剤の有効用量は減少し、望ましくない免疫応答を起こす可能性がある。タンパク質は天然状態で凝集する場合も変性状態で凝集する場合もある。
【０００８】
タンパク質の構造安定性および／または立体配座安定性を決定する熱力学的パラメータであるΔＧ値は、物理的または化学的な変性をもたらす作用因子の量の増加に対するタンパク質の耐性を評価することにより求められる。物理的な作用因子は温度または圧力である。このような場合、変性はタンパク質溶液の温度または圧力を連続的に上げることにより起こる。化学的な作用因子は尿素または塩酸グアニジンのような変性剤分子である。このような場合、タンパク質変性は変性剤の濃度を連続的に上げることにより起こる。タンパク質が変性すると、それに伴いそのタンパク質の何らかの観測可能な性質が変化する。その変化を分析することでΔＧ値を評価する。ある態様では、複数の溶液は化学変性剤を含まないか、検出可能量の変性タンパク質を生成するには不十分な濃度の化学変性剤を含む。
【０００９】
態様によっては、観測可能な性質は蛍光である。タンパク質が変性すると、そのタンパク質の何らかの測定可能な性質も変化する。一つのこのような性質はタンパク質の蛍光である。蛍光は、たとえば本来蛍光を発するアミノ酸（たとえばトリプトファン、チロシン、フェニルアラニンなど）による蛍光のようにタンパク質に固有であってもよく、蛍光標識を有するプローブによる蛍光のように外因性であってもよい。タンパク質の変性状態の検出および／またはΔＧ値の決定のための当技術分野で公知のその他の方法を用いてもよい。タンパク質変性の程度による影響を受けやすい観測可能な物理的性質や関連する計測手段は、蛍光分光法の他、多数存在する。これらの観測可能な性質は、特に紫外・可視分光法、円二色性、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、赤外分光法（ＩＲ）、示差走査熱量測定など（ただしこれらに限定するものではない）の様々な技術により測定可能である。
【００１０】
態様によっては、前記方法は、（１）タンパク質の濃度を段階的に増加させた複数の少なくとも第二溶液を提供する工程と；（２）複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液について観測可能な性質を測定する工程と；（３）この観測可能な性質に基づいて複数の少なくとも第二溶液の各濃度でタンパク質の立体配座安定性に関するΔＧ値を決定する工程と；（４）ΔＧ値とタンパク質の各濃度との相関図を複数の少なくとも第二溶液の各組について作成する工程と；（５）この相関図を用いて複数の少なくとも第二溶液に存在する凝集タンパク質と変性タンパク質の両方または片方の量および／または比率を決定する工程とをさらに含んでもよい。
【００１１】
ある態様では、前記方法は、複数の第一溶液の各濃度でのタンパク質の立体配座安定性に関するΔＧ値を複数の少なくとも第二溶液の場合と比較する工程を含む。
【００１２】
態様によっては、複数の少なくとも第二溶液は複数の第二溶液を含む。態様によっては、複数の少なくとも第二溶液は複数の第二溶液と複数の第三溶液を含む。態様によっては、複数の少なくとも第二溶液は複数の第二溶液と複数の第三溶液と複数の第四溶液とを含む。態様によっては、複数の少なくとも第二溶液は複数の第二溶液と複数の第三溶液と複数の第四溶液と複数の第五溶液とを含む。態様によっては、複数の少なくとも第二溶液は、複数の第二溶液と、複数の第三溶液と、複数の第四溶液と、複数の第五溶液と、それ以上の複数の溶液とを含む（たとえば複数の第六溶液、複数の第七溶液、複数の第八溶液、複数の第九溶液、複数の第十溶液、複数の第二十溶液、複数の第四十溶液、複数の第六十溶液、複数の第八十溶液、複数の第百溶液、および中間の任意の数の複数の溶液など）。ある態様には１０１組以上の複数の溶液が含まれる。
【００１３】
１組の複数の溶液は、溶液を作製するのに調整できる１つ以上（たとえば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ）の条件または因子が別の組の複数の溶液と異なってよい。態様によっては、このような条件または因子は、緩衝剤の組成、緩衝強度、ｐＨ値、イオン強度、賦形剤の組成、賦形剤濃度、化学変性剤の組成、および化学変性剤濃度からなる群より選択される。態様によっては、１組の複数の溶液は１つの条件または因子のみが別の組の複数の溶液と異なる。態様によっては、１組の複数の溶液は、緩衝剤の組成、緩衝強度、ｐＨ値、イオン強度、賦形剤の組成、賦形剤濃度、化学変性剤の組成、または化学変性剤濃度のみが別の組の複数の溶液と異なる。態様によっては、複数の少なくとも第二溶液の各組は、緩衝剤の組成、緩衝強度、ｐＨ値、イオン強度、賦形剤の組成、賦形剤濃度、化学変性剤の組成、または化学変性剤濃度のみが複数の第一溶液と異なる。態様によっては、複数の少なくとも第二溶液の各組は、化学変性剤濃度のみが複数の第一溶液と異なる。態様によっては、複数の少なくとも第二溶液の各組は複数の第一溶液よりも高濃度の化学変性剤を含む。態様によっては、複数の第一溶液は化学変性剤を含まないか、検出不可能な量または比率の変性タンパク質を生成する量の化学変性剤を含む。
【００１４】
１組の複数の溶液に含まれる各溶液は、溶液を作製するのに調整できる１つ以上（たとえば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ）の条件または因子（たとえば本明細書に記載の条件または因子）がその複数の溶液に含まれる別の溶液と異なってよい。態様によっては、１組の複数の溶液に含まれる各溶液は、緩衝剤の組成、緩衝強度、ｐＨ値、イオン強度、賦形剤の組成、賦形剤濃度、化学変性剤の組成、および化学変性剤濃度からなる群より選択される３つ以下の条件（たとえば０、１つ、２つ、３つの条件）が異なる。
【００１５】
一例では、複数の第一溶液に含まれる各溶液はｐＨ値が５．７でありＮａＣｌを０．９％、尿素を３Ｍ含有し、１組の複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液はｐＨ値が６．７でありＮａＣｌを０．９％、尿素を３Ｍ含有し、複数の第一溶液と複数の少なくとも第二溶液との違いはｐＨ値のみであってよいが、この例に限定されるものではない。別の例では、複数の第一溶液に含まれる各溶液はｐＨ値が５．７でありＮａＣｌを１．２％、尿素を３Ｍ含有し、１種の複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液はｐＨ値が６．７でありＮａＣｌを０．９％、尿素を４Ｍ含有し、複数の第一溶液と複数の少なくとも第二溶液との違いはｐＨ値と変性剤（すなわち尿素）の濃度であってよいが、この例に限定されるものではない。図１６に本発明で有用な模範的な溶液を示す。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「段階的に増加する濃度」は、本願の１組の複数の溶液（たとえば複数の第一溶液、複数の第二溶液、複数の第三溶液など）に含まれる溶液のある成分（たとえばタンパク質）が最低濃度から最高濃度まで増加する濃度範囲を有することを意味する。たとえば、１組の複数の溶液に含まれる溶液のタンパク質の濃度は、それぞれ０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌであってもよい。
【００１７】
２組以上の複数の溶液が同濃度のタンパク質を含有してもよい。態様によっては、複数の第一溶液と複数の少なくとも第二溶液はタンパク質の濃度が同じ溶液を含む。態様によっては、複数の第一溶液と複数の第二溶液はタンパク質の濃度が同じ溶液を含む。一例では、複数の第一溶液はタンパク質の濃度がそれぞれ０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌである１０種の溶液を含み、複数の少なくとも第二溶液の各組は複数の第一溶液の濃度に対応するタンパク質濃度、すなわち０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌをそれぞれ有する１０種の溶液を含むが、この例に限定されるものではない。
【００１８】
態様によっては、前記方法は、複数の第一溶液に含まれる各溶液と複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液について、タンパク質の立体配座安定性に関するΔＧ値と溶液を作製するのに調整できる１つ以上（たとえば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ）の条件または因子（たとえば本明細書に記載の条件または因子）との相関図を作成する工程をさらに含んでもよい。
【００１９】
ある態様では、前記方法はタンパク質（および／または他の組成成分）の濃度が同じであり化学変性剤（たとえば尿素や塩酸グアニジン）の濃度を段階的に増加させた複数の溶液（すなわち「化学変性剤溶液」）を提供する工程をさらに含んでもよい。段階的に増加する化学変性剤濃度とΔＧ値、変性タンパク質と凝集タンパク質の両方または片方の量および／または比率との相関性を（たとえばタンパク質変性を監視できる観測可能な性質を測定することによって）決定する。一例では、複数の溶液はタンパク質の濃度が同一であり尿素の濃度が０〜１０Ｍ（たとえば０Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３．０Ｍ、３．２５Ｍ、３．５Ｍ、３．７５Ｍ、４Ｍ、６Ｍ、８Ｍ）である１０種の溶液を含むが、この例に限定されるものではない。
【００２０】
態様によっては、前記方法は各タンパク質濃度のΔＧ値を比較してタンパク質が天然状態で凝集しているのか変性状態で凝集しているのかを決定する工程をさらに含んでもよい。
【００２１】
態様によっては、前記方法は異なる各濃度について変性したタンパク質の量と比率の両方または片方を決定する工程をさらに含んでもよい。態様によっては、前記方法は異なる各濃度について凝集タンパク質の量および／または比率を決定する工程をさらに含んでもよい。態様によっては、前記方法は異なる各濃度について変性タンパク質と凝集タンパク質の両方の量および／または比率を決定する工程をさらに含んでもよい。
【００２２】
態様によっては、前記方法は、複数の第一溶液の凝集タンパク質と変性タンパク質の両方または片方の量および／または比率を複数の少なくとも第二溶液の場合と比較する工程をさらに含んでもよい。
【００２３】
態様によっては、前記方法は、複数の第一溶液に含まれる各溶液と複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液について、凝集タンパク質の量および／または比率と溶液を作製するのに調整できる１つ以上（たとえば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ）の条件または因子（たとえば本明細書に記載の条件または因子）との相関図を作成する工程をさらに含んでもよい。態様によっては、前記方法は、複数の第一溶液に含まれる各溶液と複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液について、変性タンパク質の量および／または比率と溶液を作製するのに調整できる１つ以上（たとえば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ）の条件または因子（たとえば本明細書に記載の条件または因子）との相関図を作成する工程をさらに含んでもよい。態様によっては、前記方法は、複数の第一溶液に含まれる各溶液と複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液について、凝集タンパク質と変性タンパク質の両方の量および／または比率と溶液を作製するのに調整できる１つ以上（たとえば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ）の条件または因子（たとえば本明細書に記載の条件または因子）との相関図を作成する工程をさらに含んでもよい。
【００２４】
態様によっては、前記方法は、凝集タンパク質と変性タンパク質の両方または片方の量および／または比率と溶液を作製するのに調整できる１つ以上（たとえば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ）の条件または因子（たとえば本明細書に記載の条件または因子）との相関図を用いて凝集タンパク質と変性タンパク質の両方または片方の量および／または比率が最小になる１つ以上（たとえば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ）の条件または因子を決定することをさらに含んでもよい。
【００２５】
態様によっては、前記方法では２ｎｇ／ｍｌ以下の変性タンパク質（たとえば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１．５ｎｇ／ｍｌ、０．７５ｎｇ／ｍｌ〜１．２５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ未満、中間のすべての濃度）を検出してもよく、かつ／または２ｎｇ／ｍｌ以下（たとえば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１．５ｎｇ／ｍｌ、０．７５ｎｇ／ｍｌ〜１．２５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ未満、中間のすべての濃度）の凝集タンパク質を定量してもよい。
【００２６】
ΔＧ値を２４時間以内（たとえば２０時間未満、１８時間未満、１５時間未満、１２時間未満、１０時間未満、８時間未満、６時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、中間のすべての時間）に決定してもよい。
【００２７】
態様によっては、変性タンパク質と凝集タンパク質の両方の量および／または比率を２４時間以内（たとえば、２０時間未満、１８時間未満、１５時間未満、１２時間未満、１０時間未満、８時間未満、６時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、中間のすべての時間）に決定してもよい。
【００２８】
１組の複数の溶液は、それぞれ異なる濃度でタンパク質を含有する少なくとも３種〜２０種の溶液（３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種の溶液）を含んでよい。１組の複数の溶液に含まれる各溶液は、２００ｍｇ／ｍｌ未満（たとえば１００ｍｇ未満、５０ｍｇ／ｍｌ未満、２０ｍｇ／ｍｌ未満、１０ｍｇ／ｍｌ未満、５ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、中間の任意の濃度）のタンパク質を含有してよい。態様によっては、１種の溶液は０．１μｇ／ｍｌ以上２ｍｇ／ｍｌ未満（たとえば０．２μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、１μｇ／ｍｌ未満、２μｇ／ｍｌ未満、３μｇ／ｍｌ未満、４μｇ／ｍｌ未満、５μｇ／ｍｌ未満、１０μｇ／ｍｌ未満、２０μｇ／ｍｌ未満、５０μｇ／ｍｌ未満、１００μｇ／ｍｌ未満、２００μｇ／ｍｌ未満、５００μｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、中間の任意の濃度）のタンパク質を含有する。
【００２９】
複数種の溶液の１組またはそれ以上の組をタンパク質が変性かつ／または凝集する条件に供してもよい。態様によっては化学変性剤（たとえば尿素および塩酸グアニジン）で変性を誘発する。態様によっては熱で変性を誘発する。態様によっては、化学変性剤と熱を組み合わせて変性を誘発する。
【００３０】
ある態様では、本明細書に記載の方法を生体外または生体内で実施する。ある態様では、本明細書に記載の方法を生体外（すなわち設計・調製した非天然の溶液中）で実施する。ある態様では、溶液中の各成分／因子とその量を予め選択し、組み合わせて溶液を作製する。
【００３１】
態様によっては、前記方法は溶液中でΔＧ値のタンパク質濃度への依存性が最小になるタンパク質濃度を決定する工程をさらに含んでもよい。ある態様では、前記方法はΔＧ値が最大になりΔＧ値のタンパク質濃度依存性が最小となるタンパク質濃度を特定する工程をさらに含む。
【００３２】
ある態様では、前記方法は、複数の第一溶液でのΔＧ値と各タンパク質濃度との相関図を用いてその複数の第一溶液中の変性タンパク質と凝集した変性タンパク質の両方の量または比率を決定する工程をさらに含む。ある態様では、前記方法は、複数の少なくとも第二溶液でのΔＧ値と各タンパク質濃度との相関図を用いてその複数の少なくとも第二溶液に存在する変性タンパク質と凝集した変性タンパク質の両方の量または比率を決定する工程をさらに含む。ある態様は、複数の第一溶液に存在する凝集タンパク質あるいは変性タンパク質の量または比率を複数の少なくとも第二溶液の場合と比較する工程をさらに含む。
【００３３】
ある態様では、前記方法は、さらにΔＧ値が最大になりΔＧ値のタンパク質濃度依存性が最小になる１つ以上の条件（緩衝剤の組成、緩衝強度、ｐＨ値、イオン強度、賦形剤の組成、および賦形剤濃度からなる群より選択される）を選択する工程をさらに含む。
【００３４】
上記の側面はさらに、溶液中でΔＧ値のタンパク質濃度依存性が最小になるタンパク質濃度を有するタンパク質製剤（すなわち医薬的に許容されるタンパク質製剤）の調製方法をさらに提供する。ある態様では、前記製剤はタンパク質の立体配座安定性に関するΔＧ値が最大になりΔＧ値のタンパク質濃度依存性が最小になるタンパク質濃度を有する。ある態様では、前記製剤はタンパク質の立体配座安定性に関するΔＧ値が最大になりΔＧ値のタンパク質濃度依存性が最小になるタンパク質濃度および１つ以上の条件（緩衝剤の組成、緩衝強度、ｐＨ値、イオン強度、賦形剤の組成、および賦形剤濃度から選択される）を有する。ある態様では、タンパク質製剤の選択は、凝集タンパク質の量または比率が最小になり、かつ／または変性タンパク質の量または比率が最小になるような１つ以上の条件およびタンパク質濃度を選択する工程を含む。
【００３５】
本発明の一側面は、本明細書に記載の方法で決定した、１つ以上の条件（緩衝剤の組成、緩衝強度、ｐＨ値、イオン強度、賦形剤の組成、および賦形剤濃度から選択される）とタンパク質濃度（ΔＧ値のタンパク質濃度依存性が最小になり、かつ／あるいは凝集タンパク質の量または比率が最小になる）とを有するタンパク質製剤（たとえば医薬的に許容されるタンパク質製剤）である。ある態様では、前記製剤は、タンパク質の立体配座安定性に関するΔＧ値が最大になりΔＧ値のタンパク質濃度依存性が最小になるタンパク質濃度および１つ以上の条件を有する。前記タンパク質製剤は、凝集タンパク質と変性タンパク質の両方または片方の量または比率が最小になる１つ以上の条件およびタンパク質濃度を有してもよい。
【００３６】
本明細書で使用する場合、医薬的に許容されるタンパク質製剤は、安定（保存時も生体内でも）かつ患者が許容できる液状（たとえば水溶液）のタンパク質製剤である。患者はたとえば動物であり、哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。この医薬的に許容されるタンパク質製剤では、タンパク質を多様な化合物と組み合わせることで保存後に安定かつ有効な薬物治療を確実に行うことができる。このような化合物としては、可溶化剤、安定化剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、充填剤、粘度増強剤／低減剤、界面活性剤、キレート剤、リガンド、および免疫賦活剤が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００３７】
本発明の別の側面は、タンパク質の複数の多様体の中からそのタンパク質の安定な多様体を決定する方法に関する。この方法は、（１）第一のタンパク質多様体の濃度を段階的に増加させた複数の第一溶液を提供する工程と；（２）複数の第一溶液に含まれる各溶液について観測可能な性質を測定する工程と；（３）この観測可能な性質に基づいて複数の第一溶液の各濃度で第一のタンパク質多様体の立体配座安定性に関するΔＧ値を決定する工程と；（４）ΔＧ値と第一のタンパク質多様体の各濃度との相関図を作成する工程と；（５）この相関図を用いて凝集タンパク質の量または比率を決定する工程と；（６）少なくとも第二のタンパク質多様体の濃度を段階的に増加させた複数の少なくとも第二溶液を提供する工程と；（７）複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液について観測可能な性質を測定する工程と；（８）この観測可能な性質に基づいて複数の少なくとも第二溶液の各濃度で少なくとも第二のタンパク質多様体の立体配座安定性に関するΔＧ値を決定する工程と；（９）ΔＧ値と少なくとも第二のタンパク質多様体の各濃度との相関図を作成する工程と；（１０）この相関図を用いて凝集タンパク質の量または比率を決定する工程とを含み、ここで、ΔＧ値が最大でありΔＧ値のタンパク質濃度依存性が最小であり、かつ／または凝集タンパク質の量または比率がより低いタンパク質多様体を安定なタンパク質多様体と決定する。ある態様では、複数の第一溶液に含まれる各溶液は、緩衝剤の組成、緩衝強度、ｐＨ値、イオン強度、賦形剤の組成、賦形剤濃度、化学変性剤の組成、および化学変性剤濃度からなる群より選択される１つ以上の条件が異なり、複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液は、緩衝剤の組成、緩衝強度、ｐＨ値、イオン強度、賦形剤の組成、賦形剤濃度、化学変性剤の組成、および化学変性剤濃度からなる群より選択される１つ以上の条件が異なる。ある態様では、複数の第一溶液に含まれる各溶液は少なくとも化学変性剤濃度が異なり、複数の少なくとも第二溶液に含まれる各溶液は少なくとも化学変性剤濃度が異なる。
【００３８】
タンパク質多様体は１個以上のアミノ酸が異なるタンパク質であり、この違いがタンパク質の安定性（すなわち変性および／または凝集の傾向）に影響する可能性がある。タンパク質多様体の一例としては異なるハイブリドーマクローンから得たモノクローナル抗体が挙げられるが、この例に限定されるものではない。タンパク質多様体は、糖鎖修飾が異なるタンパク質や、小分子の結合（たとえば共有結合）によって改変されたタンパク質であってもよい。抗体薬物複合体はこのような改変タンパク質の例である。
【００３９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、文脈で明確な否定の指示がない限り、指示対象が複数である場合も含む。
【００４０】
特に明記するか文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する「または」「あるいは」という用語は包括的に理解され、文脈で明確に否定の指示がない限り「または」「あるいは」と「および」「ならびに」「かつ」の両方を含む。
【００４１】
特に明記するか文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する「約」という用語は、当技術分野の通常許容差の範囲内（たとえば平均値から２標準偏差以内）と理解される。「約」は、明記した値から１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と理解できる。文脈から明らかに他の意味であるとわかる場合を除き、本明細書に記載する数値はすべて「約」という用語で修飾されているものとする。
【００４２】
本明細書に記載する側面または態様は、いずれも本明細書に開示するその他の任意の側面または態様と組み合わせることができる。本開示について詳細な説明と共に記載したが、以上の記載は本開示を例示するものであり本開示の範囲を限定しないものとする。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。後述の特許請求の範囲にはその他の側面、利点、修正が含まれる。
【００４３】
特に他に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて本発明の属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本発明の実施には本明細書に記載するものと類似または同等の別のプローブ、組成物、方法、およびキットを用いることができるが、好ましい材料および方法を本明細書に示す。なお、本明細書で使用する専門用語は特定の態様の説明のみを目的とし、限定を意図するものではない。
【００４４】
本明細書で参照する特許文献および科学技術文献により、当業者が利用できる知識を証明する。本明細書で引用する米国特許および米国特許出願（公開・非公開を問わず）、米国以外の公開特許および公開特許出願、その他の公開されている参照文献、書類、原稿、および科学技術文献はすべて参照により援用される。
【００４５】
以上の説明から、本明細書に記載の発明に変更や修正を加えて様々な使用法や条件に用いてよいことは明らかである。このような態様も後述の請求項の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
本特許または出願のファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含んでいる。カラー図面による本特許または特許出願公開の写しは、請求に応じて、必要な手数料が支払われた場合に、米国特許商標庁により提供される。
【００４７】
【図１】図１は、天然状態（赤色）と変性状態（緑色）（折りたたまれていないか、一部が折りたたまれていない）との間のタンパク質の立体配座の平衡を示す。条件によっては変性状態で（天然状態でも）自己会合または凝集の傾向を示す場合がある。
【００４８】
【図２】図２はΔＧ値のタンパク質濃度依存性を示し、この依存性によってタンパク質の天然状態または変性状態での凝集傾向を定量的に評価できる。
【００４９】
【図３】図３はΔＧ値に影響する因子を示す。
【００５０】
【図４】図４（Ａ）は、ΔＧ値とＨＩＶ−１プロテアーゼ濃度との関連性を示すグラフを含む。ＨＩＶ−１プロテアーゼのΔＧ値はタンパク質濃度の増加に伴って増加する。図４（Ｂ）は、ΔＧ値とαキモトリプシン濃度との関連性を示すグラフを含む。αキモトリプシンのΔＧ値はタンパク質濃度の増加に伴って減少する。
【００５１】
【図５】図５は、ΔＧ値とトラスツズマブ濃度との関連性を示すグラフを含む。２種の製剤（トラスツズマブを５％デキストロース溶液に溶解したもの（青色）とトラスツズマブを０．９％ＮａＣｌ溶液に溶解したもの（緑色））から得たデータを示す。トラスツズマブのΔＧ値は、５％デキストロース溶液中のタンパク質濃度の増加に伴って増加する。
【００５２】
【図６Ａ−Ｂ】図６は、ΔＧ値とセツキシマブ濃度との関連性を示すグラフ（Ａ）、変性セツキシマブの比率とセツキシマブ濃度との関連性を示すグラフ（Ｂ）、凝集セツキシマブの比率とセツキシマブ濃度との関連性を示すグラフ（Ｃ）、および凝集変性セツキシマブの比率とセツキシマブ濃度との関連性を示すグラフ（Ｄ）を含む。各図について、青色で示すデータに関して用いた溶液は、赤色で示すデータに関して用いたものと同一の溶液にＬ−アルギニン（３００ｍＭ）を添加したものである。（Ａ）はセツキシマブのΔＧ値がタンパク質濃度の増加に伴って減少することを示している。
【図６Ｃ−Ｄ】図６は、ΔＧ値とセツキシマブ濃度との関連性を示すグラフ（Ａ）、変性セツキシマブの比率とセツキシマブ濃度との関連性を示すグラフ（Ｂ）、凝集セツキシマブの比率とセツキシマブ濃度との関連性を示すグラフ（Ｃ）、および凝集変性セツキシマブの比率とセツキシマブ濃度との関連性を示すグラフ（Ｄ）を含む。各図について、青色で示すデータに関して用いた溶液は、赤色で示すデータに関して用いたものと同一の溶液にＬ−アルギニン（３００ｍＭ）を添加したものである。（Ａ）はセツキシマブのΔＧ値がタンパク質濃度の増加に伴って減少することを示している。
【００５３】
【図７Ａ−Ｂ】図７は、モノクローナル抗体を２種類の製剤で試験した研究で得たデータを示すグラフを含む。これらのグラフは、ΔＧ値とモノクローナル抗体の濃度との関連性（Ａ）、変性モノクローナル抗体の比率とモノクローナル抗体の濃度との関連性（Ｂ）、凝集モノクローナル抗体の比率とモノクローナル抗体の濃度との関連性（Ｃ）、および凝集変性モノクローナル抗体の比率とモノクローナル抗体の濃度との関連性（Ｄ）を示す。（Ａ）はモノクローナル抗体のΔＧ値がタンパク質濃度の増加に伴って減少することを示している。
【図７Ｃ−Ｄ】図７は、モノクローナル抗体を２種類の製剤で試験した研究で得たデータを示すグラフを含む。これらのグラフは、ΔＧ値とモノクローナル抗体の濃度との関連性（Ａ）、変性モノクローナル抗体の比率とモノクローナル抗体の濃度との関連性（Ｂ）、凝集モノクローナル抗体の比率とモノクローナル抗体の濃度との関連性（Ｃ）、および凝集変性モノクローナル抗体の比率とモノクローナル抗体の濃度との関連性（Ｄ）を示す。（Ａ）はモノクローナル抗体のΔＧ値がタンパク質濃度の増加に伴って減少することを示している。
【００５４】
【図８】図８は、ｐＨ値が６．２５のモノクローナル抗体−Ａの製剤について、モノクローナル抗体−ＡのΔＧ値とタンパク質濃度との関連性（上段左）、変性モノクローナル抗体−Ａの比率とモノクローナル抗体−Ａの濃度との関連性（上段右）、凝集モノクローナル抗体−Ａの比率とモノクローナル抗体−Ａの濃度との関連性（下段左）、および凝集変性モノクローナル抗体−Ａの比率とモノクローナル抗体−Ａの濃度との関連性（下段右）を示す。
【００５５】
【図９】図９は、ｐＨ値が６．７５のモノクローナル抗体−Ａの製剤について、モノクローナル抗体−ＡのΔＧ値とタンパク質濃度との関連性（上段左）、変性モノクローナル抗体−Ａの比率とモノクローナル抗体−Ａの濃度との関連性（上段右）、凝集モノクローナル抗体−Ａの比率とモノクローナル抗体−Ａの濃度との関連性（下段左）、および凝集変性モノクローナル抗体−Ａの比率とモノクローナル抗体−Ａの濃度との関連性（下段右）を示す。
【００５６】
【図１０】図１０は、ｐＨ値が７．７５のモノクローナル抗体−Ａの製剤について、モノクローナル抗体−ＡのΔＧ値とタンパク質濃度との関連性（上段左）、変性モノクローナル抗体−Ａの比率とモノクローナル抗体−Ａの濃度との関連性（上段右）、凝集モノクローナル抗体−Ａの比率とモノクローナル抗体−Ａの濃度との関連性（下段左）、および凝集変性モノクローナル抗体−Ａの比率とモノクローナル抗体−Ａの濃度との関連性（下段右）を示す。
【００５７】
【図１１】図１１は、図８〜図１０の３種の製剤に関するΔＧ値を重ねたグラフである。グラフはモノクローナル抗体−ＡのΔＧ値がタンパク質濃度の増加に伴って減少することを示している。
【００５８】
【図１２】図１２は、図８〜図１０の３種の製剤に関する変性モノクローナル抗体−Ａの比率を重ねたグラフである。
【００５９】
【図１３】図１３は、図８〜図１０の３種の製剤に関する凝集モノクローナル抗体−Ａの比率を重ねたグラフである。
【００６０】
【図１４】図１４は、図８〜図１０の３種の製剤に関する凝集変性モノクローナル抗体−Ａの比率を重ねたグラフである。
【００６１】
【図１５】図１５は、製剤のｐＨ値とタンパク質濃度に基づくΔＧ値の変化を示す図である。理想的なタンパク質製剤は、溶媒に対するΔＧ値が最大、時間に対するΔＧ値が一定、タンパク質濃度に対するΔＧ値が一定である。特定のｐＨ値を有する製剤について、タンパク質濃度に対するΔＧ値のグラフを図に重ねた。ΔＧ値が最大であるがタンパク質濃度に有意に依存するタンパク質濃度（左の矢印）およびタンパク質濃度依存性が最小になるタンパク質濃度（右の矢印）を、重ねたグラフで特定した。後者のタンパク質濃度を「複数のパラメータからみた最適条件」と考える。
【００６２】
【図１６】図１６は、本発明に含んでもよい複数組の溶液（各組は複数種の溶液を含む）の例を示す図である（ただし、この例に限定されるものではない）。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
本発明は、タンパク質の凝集過程を可能な限り初期に認識し特性評価する方法およびシステム、ならびにこのような新規方法およびシステムを（１）凝集を最少にし長期安定性を伸ばすタンパク質製剤の特定および選択と（２）凝集傾向の最も低いタンパク質多様体の特定のために使用することに関する。
【００６４】
本発明は、凝集タンパク質の量を迅速に（たとえば２４時間以内に）定量できる方法を提供する。この新規手法はタンパク質の安定性のギブズエネルギー（ΔＧ）の濃度依存性に基づく。異なるタンパク質濃度でΔＧ値を測定することにより、変性状態または天然状態の凝集タンパク質の量を計算するのに必要な情報を得ることができる。一般に、ΔＧ値がタンパク質濃度の増加に伴って減少する場合、変性状態で凝集が起こり、ΔＧ値がタンパク質濃度の増加に伴って増加する場合、天然状態で凝集が起こる。ΔＧ値がタンパク質濃度の増加に伴って変化しない場合、凝集傾向はない。図２を参照のこと。ΔＧ値はタンパク質の構造安定性を測るものであるため、要するに目的はΔＧ値が最大であると同時にΔＧ値の濃度依存性が最小となる最良の製剤または最良のタンパク質多様体を特定することである。図３を参照のこと。ΔＧ値の濃度依存性の定量分析と、タンパク質溶液の調製後速やかに凝集を推定する方法を本明細書に開示する。構造安定性および凝集傾向を初期に知ることは、タンパク質凝集を最少にしタンパク質の長期安定性を伸ばすための具体的な処置を決める重要な情報となる。
【００６５】
タンパク質の天然状態の構造安定性が最も高く、凝集または他の望ましくない過程が予防される条件を特定することは、基本的なタンパク質科学と同様、タンパク質治療薬の開発、タンパク質製剤、製法開発条件（process development conditions）、品質管理にとって必須である。
【００６６】
タンパク質治療薬の分野では、凝集傾向の特定が重要である２つの段階がある。すなわち、（１）開発に最良のタンパク質多様体の選択（一般に開発可能性評価という）と（２）可能な限り長い有効期間を保証する製剤条件の特定である。生物製剤の長期安定性は、通常、変性タンパク質凝集体が発生しゆっくりと拡大して元のタンパク質の濃度が徐々に減少することによって阻害される。この過程により、生物活性タンパク質の量が減少することによって治療の効力が低減するだけでなく、免疫応答などの望ましくない副作用を誘発する可能性がある。最良のタンパク質多様体または最良の製剤を特定するには、変性タンパク質の濃度と凝集タンパク質の比率の両方を適時に測定できる必要がある。この情報を用いれば最適な安定性および凝集特性を有するタンパク質多様体または製剤を迅速に決定できる。
【００６７】
ここでは２種類の異なるタンパク質を考慮する。すなわち、変性状態で凝集しやすいタンパク質と天然状態で凝集しやすいタンパク質である。
【００６８】
Ｉ．変性状態の凝集
製剤またはタンパク質溶液を調製した直後に変性タンパク質の集合を直接測定するのは極めて難しい。調製直後の製剤に含まれる変性タンパク質の集合は非常に少ない（通常は総タンパク質量の０．０１％未満）ため、従来技術では検出できない。しかし、変性タンパク質の凝集は徐々に拡大し最終的にはタンパク質原料の実用可能性を損なうため、長期安定性にとって大きな障害である。変性状態の凝集の評価に一般に用いられる加速安定性試験または強制分解試験などの手法は、本質的には、変性し凝集したタンパク質の集合の蓄積を測定可能なレベルまで加速させることを目的としている。これらの手法は数ヶ月を要するうえ、凝集を加速するのに用いるストレスには実際の生活状況とは似ていないものもあるため完全には信用できない。タンパク質溶液を調製した直後の変性タンパク質の集合を定量するための別の方法は、天然の立体配座と変性後の立体配座の構造的平衡の評価による。安定性のギブズエネルギー（ΔＧo）を決定すれば、溶液中の変性タンパク質の量を非常に少量（＜＜総タンパク質の０．００１％）まで計算できる。また、凝集と立体配座の平衡は熱力学的に関連しているため、ΔＧo値のタンパク質濃度依存性が製剤中のタンパク質凝集の程度を評価するための重要な情報となることを示す。
【００６９】
図１は溶液中のタンパク質に生じる基本的な熱力学的平衡を示す。天然状態（赤色）は、最終的に不可逆的に凝集する傾向を有する変性状態（緑色）と平衡状態で存在する。変性タンパク質の集合または比率（Ｆ変性）は、変性タンパク質の総濃度（凝集していないものと凝集したものの合計）を総タンパク質濃度で割ったものに等しい：
【数１】
0006629831.tif 000002
（式中、ｊは変性凝集体の平均オリゴマー化度である）。
【００７０】
凝集がない場合、式１はより単純な周知の式になる：
【数２】
0006629831.tif 000003
この式は、任意の一定温度では単に安定性のギブズエネルギー（ΔＧo）の関数である。
Ｋ は平衡定数であり、これもΔＧo値によって決まる：
【数３】
0006629831.tif 000004
式２は、タンパク質が複数の遷移状態を示す状況に容易に一般化でき、各遷移状態は式１または式２に似た式で表される。
【００７１】
タンパク質凝集または自己会合がない場合、変性タンパク質の比率はΔＧo値（式２の右辺）にのみ依存し、タンパク質濃度には依存しない。
【００７２】
凝集が起こると状況は異なる、というのも凝集は濃度に依存する現象であるためである。理論に縛られるものではないが、変性タンパク質が凝集するとＫの値は増加し、天然状態の凝集ではＫの値は減少する。これらの変化はΔＧo値の大きさに影響する。凝集または自己会合の有無を評価する実験試験は、異なるタンパク質濃度でΔＧo値を測定することである。ΔＧo値が濃度に依存しない場合、凝集は存在しない。ΔＧo値が濃度の増加に伴って減少する場合、変性タンパク質の凝集が存在し、ΔＧoが濃度の増加に伴って増加する場合、天然状態のタンパク質の凝集が存在する。
【００７３】
実験でΔＧo値を決定する一つの方法は示差走査熱量測定（ＤＳＣ）である。この方法ではタンパク質を熱変性させる必要がある。多くのタンパク質（特に、ほとんどの生物製剤を含むモノクローナル抗体）の熱変性は不可逆過程であるため、ＤＳＣをこのようなタンパク質の熱力学的安定性の測定に利用することはできない。このように、ＤＳＣの使用は可逆的な温度変性を示すタンパク質に限られている。
【００７４】
ΔＧo値を実験で決定する十分に確立された方法は、化学変性剤（たとえば尿素や塩酸グアニジン）を用いてタンパク質の変性を測定することである。ギブズのエネルギーは化学変性剤濃度に対して単純な直線的依存を伴うことが実験により示されている。
【数４】
0006629831.tif 000005
（式中、ΔＧoは化学変性剤濃度が０のときのタンパク質安定性のギブズエネルギー、すなわち化学変性剤が存在しない場合の実験の温度条件および溶媒条件でのタンパク質の安定性であり、ｍはｍ値である。）
【００７５】
抗体の化学変性は通常、温度変性が存在しない条件では可逆的であり、したがってΔＧo値を決定できる。異なるタンパク質濃度で化学変性を起こすことができ、それによってΔＧ°値の濃度依存性を直接測定できる。
【００７６】
ギブズのエネルギーの濃度依存性
変性状態が凝集傾向を有する場合（図１）、凝集過程を現象の凝集定数で表すことができる：
【数５】
0006629831.tif 000006
（式中、ｊは凝集体の平均オリゴマー化度である）。ここで、見かけの（すなわち観測値の）平衡定数Ｋ見かけの値は変性タンパク質の総濃度（凝集していないものと凝集したものの合計）と天然状態のタンパク質の濃度との比で定義される：
【数６】
0006629831.tif 000007
【００７７】
これに対応し、見かけのギブズのエネルギーは以下のようになる：
【数７】
0006629831.tif 000008
【００７８】
式５では、
【数８】
0006629831.tif 000009
は、タンパク質濃度が０のときに推定されるギブズのエネルギーの値（実際には凝集が存在しない十分に低い濃度）に等しい。式５は、変性状態の凝集によってギブズのエネルギーの実測値（ΔＧ見かけの値）がタンパク質濃度の関数として減少することと、その減少の程度が凝集定数および凝集体の平均サイズに比例することを示す。タンパク質が天然状態で凝集する場合、ΔＧ見かけの値の濃度依存性は、マイナス記号がプラス記号に変わる以外は式５と似た式で表される。この場合、ギブズのエネルギーの実測値（ΔＧ見かけの値）はタンパク質濃度の増加に伴い増加する。
【００７９】
図４Ｂは、実験で得たΔＧ値のαキモトリプシン濃度依存性を示す。αキモトリプシンのΔＧ値はタンパク質濃度の増加に伴って減少する。したがって、αキモトリプシンは変性状態で凝集するタンパク質である。同様に、図６Ａには、セツキシマブについて実験で得たΔＧ見かけの値の濃度依存性を示す。この場合、変性状態で凝集するタンパク質に期待されるように、ΔＧ見かけの値はタンパク質濃度の増加に伴って減少する。
【００８０】
凝集タンパク質の集合
凝集タンパク質の比率は以下の標準式に従って計算される：
【数９】
0006629831.tif 000010
【００８１】
式５から、ΔＧ値の濃度依存性がわかれば項ｊＫj［Ｄ］j-1を単にΔＧの実測値で表すことができることが明らかである。
【００８２】
【数１０】
0006629831.tif 000011
（式中、
【数１１】
0006629831.tif 000012
である）。式７により、遊離変性タンパク質の濃度（［Ｄ］）、凝集定数、および平均凝集度を知る必要なく凝集タンパク質の比率を推定できる。同様に、変性タンパク質の比率Ｆ変性は、以下のように表すことができる：
【数１２】
0006629831.tif 000013
【００８３】
一般的な製剤状況では大部分のタンパク質は天然の立体配座であり、したがって変性タンパク質の比率は非常に低い。ΔＧ値が約８ｋｃａｌ／ｍｏｌの一般的なタンパク質の場合、変性タンパク質の比率は約１０-6である。長期安定性の観点から、重要な量は凝集変性タンパク質の比率（Ｆ変性のうちＦ凝集）である。凝集変性タンパク質は、最初はごくわずかな量であっても、吸収源として作用し長い時間を経て変性し凝集したタンパク質の濃度が高い側へ平衡を移行させる。この進行する凝集過程によって最終的に溶液は役に立たなくなるか、治療に実用的ではなくなる。凝集変性タンパク質の比率は以下の式で求められる：
【数１３】
0006629831.tif 000014
【００８４】
図６Ｂ〜Ｄは、セツキシマブに関する図６Ａのデータを分析して得られる３種の存在比率を示す。同様に、図７Ａはモノクローナル抗体について実験で得たΔＧ見かけの値の濃度依存性を示し、図７Ｂ〜Ｄは図７Ａのデータを分析して得られる３種の存在比率を示す。同様に、図８〜図１１はモノクローナル抗体−Ａについて実験で得たΔＧ見かけの値の濃度依存性を示し、図８〜図１０および図１２〜図１４はこれらの実験データを分析して得られる３種の存在比率を示す。
【００８５】
図に示すように、変性タンパク質と凝集タンパク質の量は、新たに調製した溶液に期待されるとおり非常に少ない。変性タンパク質の比率は約１０-6である。このようなわずかな量は従来技術（たとえばゲル濾過クロマトグラフィーおよび光散乱）では測定できないが、ΔＧ見かけの値を基に正確に計算できる。長期安定性の観点から、重要な所見は変性タンパク質の大部分が凝集していることである。０．１８ｍｇ／ｍｌという比較的低い濃度でも、９５％を超える変性タンパク質が凝集している。凝集傾向の高い変性タンパク質によって最終的に天然状態の有効なタンパク質の集合は激減し、結果的に長期安定性が低くなる。
【００８６】
望ましい製剤計画は、変性タンパク質の量が最小になると共に凝集変性タンパク質の比率が最小になるような計画である。熱力学的観点から、これはΔＧ見かけの値が最大になると共にこの値のタンパク質濃度依存性が最小になるよう調整された計画を意味する。図１５を参照のこと。
【００８７】
上記方法に従い、変性状態で凝集するタンパク質の場合、溶媒に対するΔＧ値が最大、時間に対するΔＧ値およびタンパク質濃度に対するΔＧ値が一定（すなわちタンパク質濃度依存性が最小となる）となる理想的なタンパク質製剤を決定できる。同様に、上記方法に従い、変性状態で凝集するタンパク質について、他のタンパク質多様体に比べて溶媒に対するΔＧ値が最大であり、時間に対するΔＧ値およびタンパク質濃度に対するΔＧ値が一定（すなわちタンパク質濃度依存性が最小）となるタンパク質多様体を決定できる。
【００８８】
ＩＩ．天然状態の凝集
天然状態が凝集傾向を有する場合（図１左）、凝集過程は、変性状態の凝集について先に述べたのと同様、現象の凝集定数ＫN,iによって表すことができる：
【数１４】
0006629831.tif 000015
（式中、ｉは天然状態の凝集体の平均オリゴマー化度である）。この場合、見かけの（すなわち観測値の）平衡定数Ｋ見かけの値は変性タンパク質の総濃度（凝集していないものと凝集したものの合計）と天然状態のタンパク質の濃度との比で定義される：
【数１５】
0006629831.tif 000016
【００８９】
これに対応し、見かけのギブズのエネルギーは以下のようになる：
【数１６】
0006629831.tif 000017
【００９０】
式１１では、
【数１７】
0006629831.tif 000018
は、タンパク質濃度が０のときに推定されるギブズのエネルギーの値（実際には凝集が存在しない十分に低い濃度）に等しい。式１１は、変性状態の凝集によってギブズのエネルギーの実測値（ΔＧ見かけの値）がタンパク質濃度の関数として増加することと、その増加の程度が凝集定数および凝集体の平均サイズに比例することを示す。この式はマイナス記号がプラス記号に変わっている以外は式５と同様である。
【００９１】
天然状態の凝集タンパク質の集合
【００９２】
凝集タンパク質の比率は以下の標準式に従って計算される：
【００９３】
【数１８】
0006629831.tif 000019
【００９４】
変性状態の凝集の場合と同様に、ΔＧ値の濃度依存性がわかれば項ｉＫN,i［Ｎ］i-1を単にΔＧの実測値で表すことができる：
【数１９】
0006629831.tif 000020
（式中、
【数２０】
0006629831.tif 000021
である）。式１３は式７と似ており、凝集定数と平均凝集度を知る必要なく天然状態の凝集タンパク質の比率を推定できる。同様に、変性タンパク質の比率Ｆ変性は以下のように表すことができる：
【数２１】
0006629831.tif 000022
【００９５】
一般的な製剤状況ではタンパク質の大部分は天然の立体配座であり、したがって変性タンパク質の比率は非常に低い。ΔＧ値が約８ｋｃａｌ／ｍｏｌの一般的なタンパク質の場合、変性タンパク質の比率は約１０-6である。長期安定性の観点から、重要な量は凝集変性タンパク質の比率（Ｆ変性のうちＦ凝集）である。
【００９６】
図４ＡはＨＩＶ−１プロテアーゼ濃度について実験で得たΔＧの濃度依存性を示す。ＨＩＶ−１プロテアーゼのΔＧ値はタンパク質濃度の増加に伴い増加する。したがって、ＨＩＶ−１プロテアーゼは天然状態で二量体であるタンパク質である。図５はトラスツズマブについて実験で得たΔＧ見かけの値の濃度依存性を示す。トラスツズマブは５％のデキストロースの存在下で凝集しやすいことが知られている。この場合、ΔＧ見かけの値は、天然状態で凝集するタンパク質に予測されるとおりタンパク質濃度の増加に伴って増加する。
【００９７】
望ましい製剤計画は、変性タンパク質の量が最小になると共に凝集変性タンパク質の比率が最小になるような計画である。熱力学的観点から、これはΔＧ見かけの値が最大になると共にこの値のタンパク質濃度依存性が最小になるよう調整された計画を意味する。
【００９８】
上記方法に従い、天然状態で凝集するタンパク質について、溶媒に対するΔＧ値が最大、時間に対するΔＧ値およびタンパク質濃度に対するΔＧ値が一定（すなわちタンパク質濃度依存性が最小となる）となる理想的なタンパク質製剤を決定できる。同様に、上記方法に従い、天然状態で凝集するタンパク質について、他のタンパク質多様体に比べて溶媒に対するΔＧ値が最大であり、時間に対するΔＧ値およびタンパク質濃度に対するΔＧ値が一定（すなわちタンパク質濃度依存性が最小）となるタンパク質多様体を決定できる。
【００９９】
本発明のシステムは、コントローラを備え処理部と記憶素子を有する装置を含んでもよい。記憶素子はＲＡＭ、ＤＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュＲＯＭ、ＥＥＲＯＭ、磁気媒体、またはコンピュータ可読のデータおよび指示の保存に適したその他の任意の媒体であってよい。指示は、少なくとも本明細書に記載の任意の式の計算を実行するために必要な指示であってよい。処理装置は専用のマイクロコントローラ、パーソナルコンピュータ、またはその他の任意の適切な計算装置であってよい。また、前記装置はポンプまたはサイフォンシステムを有し、それによって様々なウェルから正確な量の液体を抽出し、これらの液体を混合することができる（別のウェルで混合することが好ましい）。前記装置はさらに、製剤の蛍光を測定し記録する手段（たとえばカニューレを用いて市販の蛍光検出器に液体を引き入れるなど）を有する。前記装置はさらに、カニューレをある位置から別の位置へ移動して液体を第一のウェルから抜いて第二のウェルへ排出できる１つ以上の作動装置を含む。これらのカニューレを用いて、変性グラフの作成に必要な製剤を調製し、かつタンパク質製剤を緩衝剤に溶解した製剤を調製できる。
【０１００】
本発明に有用な方法、システム、および装置については、たとえば米国特許第８，８５９，２９５号、第８，６０９，０４０号および第９，０２９，１６３号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１２／００４５８４６号明細書などに既に記載されている。これらの各文献の全内容を参照により本明細書に援用する。
【０１０１】
【表１】
0006629831.tif 000023
【表２】
0006629831.tif 000024
【表３】
0006629831.tif 000025
【図１】
0006629831.tif 000026
【図２】
0006629831.tif 000027
【図３】
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【図４】
0006629831.tif 000029
【図５】
0006629831.tif 000030
【図６Ａ−Ｂ】
0006629831.tif 000031
【図６Ｃ−Ｄ】
0006629831.tif 000032
【図７Ａ−Ｂ】
0006629831.tif 000033
【図７Ｃ−Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006629831.tif 000037
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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