(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レバウジオシドＶ：
【化１】
0006774945.tif 000022
およびレバウジオシドＷ：
【化２】
0006774945.tif 000023
からなる群から選択される甘味料を含む経口摂取可能製品であって、飲料製品および摂取可能製品からなる群から選択される、経口摂取可能製品。
【請求項２】
前記甘味料を５ｐｐｍ〜１００ｐｐｍ含む、請求項１に記載の経口摂取可能製品。
【請求項３】
前記甘味料が唯一の甘味料である、請求項１または２に記載の経口摂取可能製品。
【請求項４】
少なくとも１つの追加的な甘味料をさらに含む、請求項１または２に記載の経口摂取可能製品。
【請求項５】
前記少なくとも１つの追加的な甘味料が、ステビア抽出物、ステビオール配糖体、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ＡｃｅＫ、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン（ＮａｒＤＨＣ）、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＶ、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、Ｌ−アラニン、グリシン、羅漢果、ヘルナンズルチン、フィロズルチン、トリロブタイン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の経口摂取可能製品。
【請求項６】
炭水化物、ポリオール、アミノ酸またはその塩、ポリアミノ酸またはその塩、糖酸またはその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、着香剤、香味成分、収斂化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの添加剤をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の経口摂取可能製品。
【請求項７】
前記摂取可能製品が、食品、栄養補助食品、医薬品、健康補助食品、歯科用衛生学的組成物、可食ゲル組成物、化粧品および卓上用香味料からなる群から選択されるか、または前記飲料製品が、炭酸飲料製品および非炭酸飲料製品からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の経口摂取可能製品。
【請求項８】
製品の甘味を増強させる方法であって、
レバウジオシドＶ：
【化３】
0006774945.tif 000024
およびレバウジオシドＷ：
【化４】
0006774945.tif 000025
からなる群から選択される甘味料５ｐｐｍ〜１００ｐｐｍを、飲料製品および摂取可能製品からなる群から選択される製品に添加することを含み、前記甘味料が、前記甘味料を含まない対応する製品と比較して前記製品の甘味を増強させる、方法。
【請求項９】
前記甘味料が唯一の甘味料である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
追加的な甘味料を添加することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
甘味付けした製品を調製する方法であって、飲料製品および摂取可能な製品からなる群から選択される製品を準備することと、レバウジオシドＶ：
【化５】
0006774945.tif 000026
およびレバウジオシドＷ：
【化６】
0006774945.tif 000027
からなる群から選択される甘味料５ｐｐｍ〜１００ｐｐｍを前記製品に添加することと、を含む方法。
【請求項１２】
炭水化物、ポリオール、アミノ酸またはその塩、ポリアミノ酸またはその塩、糖酸またはその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、着香剤、香味成分、収斂化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの添加剤を前記製品に添加することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの追加的な甘味料を添加することをさらに含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの追加的な甘味料が、ステビア抽出物、ステビオール配糖体、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ＡｃｅＫ、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン（ＮａｒＤＨＣ）、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＶ、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、Ｌ−アラニン、グリシン、羅漢果、ヘルナンズルチン、フィロズルチン、トリロブタイン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１０月３日に出願され、「ＮＯＮ−ＣＡＬＯＲＩＣ  ＳＷＥＥＴＥＮＥＲＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＺＩＮＧ」と題する米国仮特許出願第６２／０５９，４９８号、および２０１４年１２月３１日に出願され、「ＮＯＮ−ＣＡＬＯＲＩＣ  ＳＷＥＥＴＥＮＥＲＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＺＩＮＧ」と題する米国仮特許出願第６２／０９８，９２９号（その開示は、これによりその全体が参照により組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
配列表の提出のためのサポートにおける陳述
配列表のハードコピーおよび「１９４５２３８２＿１．ｔｘｔ」という名のファイル（６０，６０１バイトのサイズである（ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ  ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）  ＥＸＰＬＯＲＥＲにおいて測定））を含む配列表のコンピュータ可読形態が本明細書で提供され、本明細書で参照により組み込まれる。この配列表はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１２から構成される。
【０００３】
本開示は、一般に天然甘味料に関する。より特定的には、本開示はノンカロリー甘味料およびノンカロリー甘味料を合成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ステビオール配糖体はステビア・レバウディアナの葉から単離される天然産物である。ステビオール配糖体は、高甘味度、低カロリー甘味料として広く使用されており、スクロースより著しく甘い。天然甘味料として、異なるステビオール配糖体は異なる程度の甘味および後味を有する。ステビオール配糖体の甘味は、スクロースより著しく高い。例えば、ステビオシドは、より苦い後味を有するスクロースよりも１００〜１５０倍甘い。レバウジオシドＣはスクロースよりも４０〜６０倍甘い。ズルコシドＡはスクロースよりも約３０倍甘い。
【０００５】
天然起源のステビオール配糖体は同じ基本ステビオール構造を共有するが、Ｃ１３およびＣ１９位での炭水化物残基（例えば、グルコース、ラムノースおよびキシロース残基）の含量が異なる。公知の構造を有するステビオール配糖体としては、ステビオール、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦおよびズルコシドＡが挙げられる（例えば、表１を参照されたい）。他のステビオール配糖体はレバウジオシドＭ、レバウジオシドＮおよびレバウジオシドＯである。
【表１】
0006774945.tif 000002
0006774945.tif 000003
0006774945.tif 000004
0006774945.tif 000005
【０００６】
乾燥重量に基づき、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、およびズルコシドＡは、それぞれ、葉に含まれるステビオール配糖体の総重量の９．１、３．８、０．６、および０．３％を占め、一方、他のステビオール配糖体はずっと低い量で存在する。ステビア・レバウディアナ植物からの抽出物は市販されており、これは典型的には、ステビオシドおよびレバウジオシドＡを第一化合物として含む。他のステビオール配糖体は典型的には、ステビア抽出物中に微量成分として存在する。例えば、市販の調製物中のレバウジオシドＡの量は総ステビオール配糖体含量の約２０％〜９０％超で変動し得るが、レバウジオシドＢの量は総ステビオール配糖体の約１〜２％であり、レバウジオシドＣの量は約７〜１５％であり、ならびにレバウジオシドＤの量は約２％である可能性がある。
【０００７】
ステビオール配糖体の大半はステビオールのいくつかのグリコシル化反応により形成され、それらの反応は典型的には、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）により、ウリジン５’−ジホスホグルコース（ＵＤＰ−グルコース）を糖部分の供与体として使用して触媒される。植物中のＵＧＴは、グルコース残基をＵＤＰ−グルコースからステビオールに転移させる酵素の非常に多様な群を構成する。例えば、ステビオシドのＣ−１３−Ｏ−グルコースのＣ−３’のグリコシル化によりレバウジオシドＡが得られ；ステビオシドの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’のグリコシル化によりレバウジオシドＥが得られる。レバウジオシドＡ（Ｃ−２’−１９−Ｏ−グルコースで）またはレバウジオシドＥ（Ｃ−３’−１３−Ｏ−グルコースで）のさらなるグリコシル化によりレバウジオシドＤが生成される。（図１）。
【０００８】
代替甘味料は、糖分の多い食品および飲料の消費と関連する多くの疾患への関心のために、ますます注目を集めている。人工甘味料が使用可能であるが、ズルチン、サイクラミン酸ナトリウムおよびサッカリンなどの多くの人工甘味料は、それらの安全性に関する懸念のために、いくつかの国により禁止されまたは制限されている。よって、天然起源のノンカロリー甘味料がますます好まれている。ステビア甘味料の使用の普及に対する主な障害の１つは、それらの望ましくない味覚特質である。したがって、甘味効力と香味プロファイルの最良の組み合わせを提供するための、代替甘味料およびそれらの製造方法を開発することが必要である。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、一般に、天然甘味料に関する。より特定的には、本開示は、ノンカロリー甘味料およびノンカロリー甘味料を合成するための方法に関する。
【００１０】
合成レバウジオシドＶ．１つの態様では、本開示は、下記化学構造から構成される合成レバウジオシド（レバウジオシドＶ）に向けられる：
【化１】
0006774945.tif 000006
【００１１】
合成レバウジオシドＷ．１つの態様では、本開示は、下記化学構造から構成される合成レバウジオシド（レバウジオシドＷ）に向けられる：
【化２】
0006774945.tif 000007
【００１２】
レバウジオシドＧからレバウジオシドＶを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＧからレバウジオシドＶを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＧと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＨＶ１  ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み、スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）を含むまたは含まない、反応混合物を調製すること；ならびに、反応混合物を、レバウジオシドＶを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＧにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。
【００１３】
レバウジオシドＧからレバウジオシドＶを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＧからレバウジオシドＶを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＧと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ（ＥＵＧＴ１１）、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホ（ｄｉｐｏｓｐｈｏ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含み、スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）を含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに、反応混合物を、レバウジオシドＶを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＧにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。
【００１４】
レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＶを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＶを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＫＡと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホ（ｄｉｐｏｓｐｈｏ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含み、スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）を含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに、反応混合物を、レバウジオシドＶを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＫＡにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。
【００１５】
ルブソシドからレバウジオシドＶを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドＶを合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）、ＨＶ１およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホ（ｄｉｐｏｓｐｈｏ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含み、スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）を含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに、反応混合物を、レバウジオシドＶを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりルブソシドにカップリングされ、レバウジオシドＫＡが生成される。連続して、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＫＡにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。グルコースが共有結合によりルブソシドにカップリングされ、レバウジオシドＧが生成される。連続して、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＧにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。
【００１６】
ルブソシドからレバウジオシドＶを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドＶを合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）、ＥＵＧＴ１１およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホ（ｄｉｐｏｓｐｈｏ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに、反応混合物を、レバウジオシドＶを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりルブソシドにカップリングされ、レバウジオシドＫＡが生成され、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＫＡにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。グルコースが共有結合によりルブソシドにカップリングされ、レバウジオシドＧが生成され、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＧにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。
【００１７】
レバウジオシドＶからレバウジオシドＷを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＶからレバウジオシドＷを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＶと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホ（ｄｉｐｏｓｐｈｏ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＷを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＶにカップリングされ、レバウジオシドＷが生成される。
【００１８】
レバウジオシドＧからレバウジオシドＷを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＧからレバウジオシドＷを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＧと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素およびＨＶ１からなる群より選択されるウリジンジホスホ（ｄｉｐｏｓｐｈｏ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含み；スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＷを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、ＨＶ１により、グルコースが、共有結合によりレバウジオシドＧにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。連続して、ＵＧＴ７６Ｇ１により、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＶにカップリングされ、レバウジオシドＷが生成される。
【００１９】
レバウジオシドＧからレバウジオシドＷを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＧからレバウジオシドＷを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＧと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＥＵＧＴ１１、およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含む反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＷを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、ＥＵＧＴ１１により、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＧにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。連続して、ＵＧＴ７６Ｇ１により、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＶにカップリングされ、レバウジオシドＷが生成される。
【００２０】
レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＷを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＷを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＫＡと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）、およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホ（ｄｉｐｏｓｐｈｏ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＷを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＫＡにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。連続して、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＶにカップリングされ、レバウジオシドＷが生成される。
【００２１】
ルブソシドからレバウジオシドＷを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドＤを合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＨＶ１、およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＷを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含む。
【００２２】
ルブソシドからレバウジオシドＷを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドを合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＥＵＧＴ１１、およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＷを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含む。
【００２３】
ルブソシドからステビオシドおよびレバウジオシドＫＡの混合物を生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからステビオシドおよびレバウジオシドＫＡの混合物を合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＥＵＧＴ１１およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、ステビオシドおよびレバウジオシドＫＡの混合物を生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりルブソシドのＣ２’−１９−Ｏ−グルコースにカップリングされ、レバウジオシドＫＡが生成され；グルコースが共有結合により、ルブソシドのＣ２’−１３−Ｏ−グルコースにカップリングされ、ステビオシドが生成される。
【００２４】
ルブソシドからレバウジオシドＫＡを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドＫＡを合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＨＶ１とを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＫＡを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合により、ルブソシドのＣ２’−１９−Ｏ−グルコースにカップリングされ、レバウジオシドＫＡが生成される。
【００２５】
ルブソシドからレバウジオシドＧを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドＧを合成するための方法に向けられる。該方法はルブソシドと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＧを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりルブソシドのＣ３’−１３−Ｏ−グルコースにカップリングされ、レバウジオシドＧが生成される。
【００２６】
レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＥを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＥを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＫＡと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＨＶ１  ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＥを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＫＡのＣ２’１３−Ｏ−グルコースにカップリングされ、レバウジオシドＥが生成される。
【００２７】
レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＥを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＥを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＫＡと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＥＵＧＴ１１およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＥを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＫＡのＣ２’１３−Ｏ−グルコースにカップリングされ、レバウジオシドＥが生成される。
【００２８】
ルブソシドからレバウジオシドＥを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドＥを合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＥＵＧＴ１１およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロース合成融合酵素の群からのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＥを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりルブソシドにカップリングされ、レバウジオシドＫＡおよびステビオシドの混合物が生成される。連続して、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＫＡおよびステビオシドにカップリングされ、レバウジオシドＥが生成される。
【００２９】
ルブソシドからレバウジオシドＥを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドＥを合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＨＶ１  ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；反応混合物を、レバウジオシドＥを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることであって、グルコースが共有結合によりルブソシドにカップリングされ、レバウジオシドＫＡが生成されること；ならびにさらに、レバウジオシドＫＡをＨＶ１と共にインキュベートし、レバウジオシドＥを生成させることを含む。
【００３０】
ルブソシドからレバウジオシドＤ２を生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドＤ２を合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＥＵＧＴ１１およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素の群からのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；反応混合物を、ステビオシドおよびレバウジオシドＤ２の混合物を生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることであって、グルコースが共有結合によりルブソシドにカップリングされ、ステビオシドおよびレバウジオシドＫＡの混合物が生成されること；さらに、ステビオシドおよびレバウジオシドＫＡの混合物をＥＵＧＴ１１と共にインキュベートし、レバウジオシドＥを生成させることであって、グルコースが共有結合によりステビオシドおよびレバウジオシドＫＡにカップリングされ、レバウジオシドＥが生成されること；ならびにさらに、レバウジオシドＥをＥＵＧＴ１１と共にインキュベートし、レバウジオシドＤ２を生成させることであって、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＥにカップリングされ、レバウジオシドＤ２が生成されることを含む。
【００３１】
レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＤ２を生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＤ２を合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＫＡと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＥＵＧＴ１１およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；反応混合物を、レバウジオシドＤ２を生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることであって、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＫＡにカップリングされ、レバウジオシドＥが生成されること；さらに、レバウジオシドＥの混合物をＥＵＧＴ１１と共にインキュベートし、レバウジオシドＤ２を生成させることであって、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＥにカップリングされ、レバウジオシドＤ２が生成されることを含む。
【００３２】
レバウジオシドＥからレバウジオシドＺを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＥからレバウジオシドＺを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＥと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＨＶ１およびスクロースシンターゼとを含む反応混合物を調製すること；反応混合物を、レバウジオシドＺを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＥのＣ２’−１３−Ｏ−グルコースにカップリングされ、レバウジオシドＺ１が生成される。グルコースが共有結合によりレバウジオシドＥのＣ２’−１９−Ｏ−グルコースにカップリングされ、レバウジオシドＺ２が生成される。
【００３３】
レバウジオシドＤからレバウジオシドＭを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＤからレバウジオシドＭを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＤと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される基質と、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＭを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＤにカップリングされ、レバウジオシドＭが生成される。
【００３４】
ステビオシドからレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ステビオシドからレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭを合成するための方法に向けられる。該方法は、ステビオシドと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される基質と、ＨＶ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＭを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含む。ある一定の実施形態では、グルコースが共有結合によりステビオシドにカップリングされ、レバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＥが生成される。連続して、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＥにカップリングされ、レバウジオシドＤが生成され、ならびにグルコースが共有結合によりレバウジオシドＤにカップリングされ、レバウジオシドＭが生成される。
【００３５】
レバウジオシドＡからレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＡと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される基質と、ＨＶ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＭを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＡにカップリングされ、レバウジオシドＤが生成され、ならびにグルコースが共有結合によりレバウジオシドＤにカップリングされ、レバウジオシドＭが生成される。
【００３６】
レバウジオシドＥからレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＥからレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＥと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される基質と、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＭを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＥにカップリングされ、レバウジオシドＤが生成され、ならびにグルコースが共有結合によりレバウジオシドＤにカップリングされ、レバウジオシドＭが生成される。
【００３７】
別の態様では、本開示は、甘味量の、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、およびそれらの組み合わせから選択されるレバウジオシドを含む経口摂取可能製品に向けられ、ここで、経口摂取可能製品は、飲料製品および摂取可能製品からなる群より選択される。
【００３８】
別の態様では、本開示は、甘味量の、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、およびそれらの組み合わせから選択されるレバウジオシドを含む飲料製品に向けられる。レバウジオシドは、飲料製品中に、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、低濃度、例えば、１００ｐｐｍ未満のレバウジオシドは、１０，０００〜３０，０００ｐｐｍの濃度を有するスクロース溶液に等しい甘味を有する。
【００３９】
別の態様では、本開示は、甘味量の、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、およびそれらの組み合わせから選択されるレバウジオシドを含む摂取可能製品に向けられる。レバウジオシドは摂取可能製品中に、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、低濃度、例えば、１００ｐｐｍ未満のレバウジオシドは、１０，０００〜３０，０００ｐｐｍの濃度を有するスクロース溶液に等しい甘味を有する。
【００４０】
別の態様では、本開示は、下記化学構造から構成される甘味料に向けられる：
【化３】
0006774945.tif 000008
【００４１】
別の態様では、本開示は、下記化学構造から構成される甘味料に向けられる：
【化４】
0006774945.tif 000009
【００４２】
前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、レバウジオシドＶまたはレバウジオシドＷまたはレバウジオシドＧまたはレバウジオシドＫＡまたはレバウジオシドＭは唯一の甘味料とすることができ、製品は、約１％〜約４％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液に等しい甘味度を有する。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、経口摂取可能製品はさらに、追加の甘味料を含むことができ、ここで、製品は約１％〜約１０％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液に等しい甘味度を有する。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、製品中の全ての甘味成分は高甘味度甘味料とすることができる。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、製品中の全ての甘味成分は、天然高甘味度甘味料とすることができる。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、追加の甘味料は、下記から選択される１つ以上の甘味料とすることができる：ステビア抽出物、ステビオール配糖体、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＤ２、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ＡｃｅＫ、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン（ＮａｒＤＨＣ）、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）、ルブソシド、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＶ、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、Ｌ−アラニン、グリシン、羅漢果、ヘルナンズルチン、フィロズルチン、トリロブタイン、およびそれらの組み合わせ。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、飲料製品および摂取可能製品はさらに、下記から選択される１つ以上の添加物を含むことができる：炭水化物、ポリオール、アミノ酸またはその塩、ポリアミノ酸またはその塩、糖酸またはその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、着香剤、香味成分、収斂化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、およびそれらの組み合わせ。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、レバウジオシドＶは製品中に添加される前には約５０重量％〜約１００重量％の純度を有する。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、Ｗは、製品中に添加される前には、約５０重量％〜約１００重量％の純度を有する。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、製品中のレバウジオシドＶはレバウジオシドＶ多形またはアモルファスレバウジオシドＶである。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、製品中のレバウジオシドＶはレバウジオシドＶ立体異性体である。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、製品中のレバウジオシドＷはレバウジオシドＷ多形またはアモルファスレバウジオシドＷである。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、製品中のレバウジオシドＷはレバウジオシドＷ立体異性体である。
【００４３】
本開示の他の態様は、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、およびレバウジオシドＧから選択される合成レバウジオシドを製品中に、または飲料製品および摂取可能製品を製造するための成分中に含有させることにより、飲料製品および摂取可能製品を調製する方法に関し、ここで、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、およびレバウジオシドＧから選択されるレバウジオシドは製品中に、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍの濃度で存在する。本開示の他の態様は、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍの、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、およびレバウジオシドＧから選択される合成レバウジオシドを飲料製品および摂取可能製品中に添加することにより飲料製品および摂取可能製品の甘味を増強させるための方法に関し、ここで、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、およびレバウジオシドＧから選択される、添加される合成レバウジオシドは、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、およびレバウジオシドＧから選択される合成レバウジオシドを含まない対応する飲料製品および摂取可能製品と比べて、飲料製品および摂取可能製品の甘味を増強させる。
【００４４】
前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、レバウジオシドＶは唯一の甘味料であり、製品は、約１％〜約４％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液に等しい甘味度を有する。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、レバウジオシドＫＡは唯一の甘味料であり、製品は、約１％〜約４％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液に等しい甘味度を有する。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、レバウジオシドＧは唯一の甘味料であり、製品は、約１％〜約４％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液に等しい甘味度を有する。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、レバウジオシドＷは唯一の甘味料であり、製品は、約１％〜約４％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液に等しい甘味度を有する。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、レバウジオシドＭは唯一の甘味料であり、製品は、約１％〜約４％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液に等しい甘味度を有する。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、前記方法はさらに、追加の甘味料を添加することを含み、ここで、製品は約１％〜約１０％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液に等しい甘味度を有する。
【００４５】
本開示の他の態様は、下記により甘味飲料製品または甘味摂取可能製品を調製するための方法に関する：ａ）１つ以上の甘味料を含む飲料製品または摂取可能製品を提供すること；ならびにｂ）約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍの、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、およびレバウジオシドＧ、およびそれらの組み合わせから選択される合成レバウジオシドを飲料製品または摂取可能製品中に添加すること。
【００４６】
前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、方法は、１つ以上の添加物を飲料製品または摂取可能製品に添加することをさらに含む。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、経口摂取可能製品は、１つ以上の添加物をさらに含む。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、１つ以上の添加物は下記から選択される：炭水化物、ポリオール、アミノ酸またはその塩、ポリアミノ酸またはその塩、糖酸またはその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、着香剤、香味成分、収斂化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、およびそれらの組み合わせ。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、製品中の全ての甘味成分は高甘味度甘味料である。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、製品中の全ての甘味成分は天然高甘味度甘味料である。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、甘味料は下記から選択される：ステビア抽出物、ステビオール配糖体、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＤ２、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ＡｃｅＫ、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン（ＮａｒＤＨＣ）、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）、ルブソシド、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＶ、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、Ｌ−アラニン、グリシン、羅漢果、ヘルナンズルチン、フィロズルチン、トリロブタイン、およびそれらの組み合わせ。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、レバウジオシドＶは製品中に添加される前には約５０重量％〜約１００重量％の純度を有する。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、製品中のレバウジオシドＶはレバウジオシドＶ多形またはアモルファスレバウジオシドＶである。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、レバウジオシドＷは、製品中に添加される前には、約５０重量％〜約１００重量％の純度を有する。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、製品中のレバウジオシドＷはレバウジオシドＷ多形またはアモルファスレバウジオシドＷである。
【００４７】
下記詳細な説明を考慮すれば、本開示はよりよく理解され、上記で明記されたもの以外の特徴、態様および利点が明らかになるであろう。そのような詳細な説明は、下記図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ステビオールからのステビオール配糖体生合成経路を示す。
【図２】矢印で示されるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析精製組換えタンパク質を示す：Ａ：ＨＶ１、Ｂ：ＵＧＴ７６Ｇ１、Ｃ：ＥＵＧＴ１１、Ｄ：ＡｔＳＵＳ１、Ｅ：ＵＧＴ７６Ｇ１−ＳＵＳ１（ＧＳ）、Ｆ：ＥＵＧＴ１１−ＳＵＳ１（ＥＵＳ）。
【図３】ルブソシドからレバウジオシドＫＡ（「Ｒｅｂ  ＫＡ」）およびレバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）を生成させるＨＶ１触媒反応を示す。Ａ−Ｃ：ルブソシド（「Ｒｕｂ」）、ステビオシド（「Ｓｔｅ」）およびレバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）標準のＨＰＬＣ保持時間を示す。ＨＶ１単独により、６時間（Ｄ）、１２時間（Ｆ）および２４時間（Ｈ）で酵素的に生成されたＲｅｂ  ＫＡ；ＵＧＴ−ＳＵＳ（ＨＶ１−ＡｔＳＵＳ１）カップリング系により６時間（Ｅ）、１２時間（Ｇ）および２４時間（Ｉ）で酵素的に生成されたＲｅｂ  ＫＡおよびＲｅｂ  Ｅ。
【図４】ＨＶ１によるＲｅｂ  ＥのレバウジオシドＺへの変換を示す。（Ａ）：レバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）のＨＰＬＣ保持時間を示す。ＨＶ１−ＡｔＳＵＳ１カップリング系におけるＨＶ１により、３時間（Ｂ）、７時間（Ｃ）、２４時間（Ｄ）および４４時間（Ｅ）で酵素的に生成されたレバウジオシドＺ（「ＲｅｂＺ」）。
【図５】ＨＶ１によるＲｅｂ  ＫＡのＲｅｂ  Ｅへの変換を示す。（Ａ−Ｂ）：レバウジオシドＫＡ（「Ｒｅｂ  ＫＡ」）およびレバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）標準のＨＰＬＣ保持時間を示す。ＨＶ１単独により１２時間で酵素的に生成されたＲｅｂ  Ｅ（Ｃ）；ＵＧＴ−ＳＵＳ（ＨＶ１−ＡｔＳＵＳ１）カップリング系により１２時間で酵素的に生成されたＲｅｂ  Ｅ（Ｄ）。
【図６】ルブソシドからＲｅｂ  ＫＡおよびステビオシドを生成させるＥＵＧＴ１１触媒反応を示す。（Ａ−Ｆ）：ルブソシド（「Ｒｕｂ」）、ステビオシド（「Ｓｔｅ」）、レバウジオシドＧ（「Ｒｅｂ  Ｇ」）、レバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）、レバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）およびレバウジオシドＤ２（「Ｒｅｂ  Ｄ２」）標準のＨＰＬＣ保持時間を示す。ＥＵＧＴ１１単独による、１２時間（Ｇ）および４８時間（Ｊ）での酵素反応；ＵＧＴ−ＳＵＳ（ＥＵＧＴ１１−ＡｔＳＵＳ１）カップリング系による１２時間（Ｈ）および４８時間（Ｋ）での酵素反応；ＥＵＳ融合タンパク質による１２時間（Ｉ）および４８時間（Ｌ）での酵素反応。
【図７】ＥＵＧＴ１１およびＥＵＳ融合タンパク質による、Ｒｅｂ  ＫＡのＲｅｂ  ＥおよびＲｅｂ  Ｄ２への変換を示す。（Ａ−Ｃ）：レバウジオシドＫＡ（「Ｒｅｂ  ＫＡ」）、レバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）、およびレバウジオシドＤ２（「Ｒｅｂ  Ｄ２」）標準のＨＰＬＣ保持時間を示す。ＥＵＧＴ１１単独による１２時間（Ｄ）および４８時間（Ｇ）での酵素反応；ＵＧＴ−ＳＵＳ（ＥＵＧＴ１１−ＡｔＳＵＳ１）カップリング系による１２時間（Ｅ）および４８時間（Ｈ）での酵素反応；ＥＵＳ融合タンパク質による１２時間（Ｆ）および４８時間（Ｉ）での酵素反応。
【図８】インビトロでのレバウジオシドＧのＵＧＴ７６Ｇ１生成を示す。（Ａ−Ｂ）：ルブソシド（「Ｒｕｂ」）およびレバウジオシドＧ（「Ｒｅｂ  Ｇ」）標準のＨＰＬＣ保持時間を示す。ＵＧＴ７６Ｇ１単独による１２時間（Ｃ）および２４時間（Ｆ）での酵素反応；ＵＧＴ−ＳＵＳ（ＥＵＧＴ１１−ＡｔＳＵＳ１）カップリング系による１２時間（Ｄ）および２４時間（Ｇ）での酵素反応；ＧＳ融合タンパク質による１２時間（Ｅ）および４８時間（Ｈ）での酵素反応。
【図９】レバウジオシドＫＡからステビオール配糖体Ｒｅｂ  ＶおよびＲｅｂ  Ｗを生成させるＵＧＴ７６Ｇ１触媒反応を示す。（Ａ−Ｄ）：ルブソシド（「Ｒｕｂ」）、レバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）、レバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）およびレバウジオシドＫＡ（「Ｒｅｂ  ＫＡ」）標準のＨＰＬＣ保持時間を示す。ＵＧＴ７６Ｇ１単独による６時間（Ｅ）および１２時間（Ｈ）での酵素反応；ＵＧＴ−ＳＵＳ（ＵＧＴ７６Ｇ１−ＡｔＳＵＳ１）カップリング系による６時間（Ｆ）および１２時間（Ｉ）での酵素反応；ＧＳ融合タンパク質による６時間（Ｇ）および１２時間（Ｊ）での酵素反応。
【図１０】インビトロでのＲｅｂ  ＶのＲｅｂ  ＷへのＵＧＴ７６Ｇ１変換を示す。（Ａ−Ｂ）：Ｒｅｂ  ＶおよびＲｅｂ  ＷのＨＰＬＣ保持時間を示す。（Ｃ）：ＵＧＴ７６Ｇ１−ＡｔＳＵＳ１カップリング系による６時間での酵素反応。
【図１１】Ｒｅｂ  ＧのＲｅｂ  ＶへのＨＶ１変換を示す。（Ａ−Ｃ）：レバウジオシドＧ（「Ｒｅｂ  Ｇ」）、レバウジオシドＡ（「Ｒｅｂ  Ａ」）およびレバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）標準のＨＰＬＣ保持時間を示す。ＨＶ１単独による１２時間（Ｄ）および２４時間（Ｆ）での酵素反応；ＵＧＴ−ＳＵＳ（ＨＶ１−ＡｔＳＵＳ１）カップリング系による１２時間（Ｅ）および２４時間（Ｇ）での酵素反応。
【図１２】Ｒｅｂ  ＧのＲｅｂ  ＶへのＥＵＧＴ１１変換を示す。（Ａ−Ｄ）：レバウジオシドＧ（「Ｒｅｂ  Ｇ」）、レバウジオシドＡ（「Ｒｅｂ  Ａ」）、レバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）およびレバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）標準のＨＰＬＣ保持時間を示す。ＥＵＧＴ１１単独による１２時間（Ｅ）および２４時間（Ｈ）での酵素反応；ＵＧＴ−ＳＵＳ（ＥＵＧＴ１１−ＡｔＳＵＳ１）カップリング系による１２時間（Ｆ）および２４時間（Ｉ）での酵素反応；ＥＵＳ融合酵素による１２時間（Ｇ）および２４時間（Ｊ）での酵素反応。
【図１３】組換えＨＶ１ポリペプチド、組換えＵＧＴ７６Ｇ１、ＧＳ融合酵素、および組換えＡｔＳＵＳ１の組み合わせにより触媒される、ルブソシドからのＲｅｂ  Ｗのインビトロ生成を示す。（Ａ−Ｆ）：ルブソシド（「Ｒｕｂ」）、ステビオシド（「Ｓｔｅ」）、レバウジオシドＧ（「Ｒｅｂ  Ｇ」）、レバウジオシドＡ（「Ｒｅｂ  Ａ」）、レバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）およびレバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）の標準を示す。ＨＶ１、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＡｔＳＵＳ１により、６時間（Ｇ）、１２時間（Ｉ）および２４時間（Ｋ）で酵素的に生成されたＲｅｂ  Ｗ；ＨＶ１およびＧＳ融合タンパク質により、６時間（Ｈ）、１２時間（Ｊ）および２４時間（Ｌ）で酵素的に生成されたＲｅｂ  Ｗ。
【図１４】組換えＥＵＧＴ１１ポリペプチド、組換えＵＧＴ７６Ｇ１、ＧＳ融合酵素、および組換えＡｔＳＵＳ１の組み合わせにより触媒される、ルブソシドからのＲｅｂ  Ｗのインビトロ生成を示す。（Ａ−Ｅ）：ルブソシド（「Ｒｕｂ」）、ステビオシド（「Ｓｔｅ」）、レバウジオシドＧ（「Ｒｅｂ  Ｇ」）、レバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）およびレバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）の標準を示す。ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＡｔＳＵＳ１により１２時間（Ｆ）および４８時間（Ｈ）で酵素的に生成されたＲｅｂ  Ｗ；ＥＵＧＴ１１およびＧＳ融合タンパク質により１２時間（Ｇ）および４８時間（Ｉ）で酵素的に生成されたＲｅｂ  Ｗ。
【図１５】組換えＨＶ１ポリペプチド、組換えＵＧＴ７６Ｇ１、ＧＳ融合酵素および組換えＡｔＳＵＳ１の組み合わせにより触媒される、Ｒｅｂ  ＧからのＲｅｂ  Ｗのインビトロ生成を示す。Ａ−Ｄは、レバウジオシドＧ（「Ｒｅｂ  Ｇ」）、レバウジオシドＡ（「Ｒｅｂ  Ａ」）、レバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）、レバウジオシドおよびレバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）の標準を示す。ＨＶ１、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＡｔＳＵＳ１により、６時間（Ｅ）、１２時間（Ｇ）および３６時間（Ｉ）で酵素的に生成されたＲｅｂ  ＶおよびＲｅｂ  Ｗ；ＨＶ１およびＧＳ融合タンパク質により、６時間（Ｆ）、１２時間（Ｈ）および３６時間（Ｊ）で酵素的に生成されたＲｅｂ  ＶおよびＲｅｂ  Ｗ。
【図１６】組換えＥＵＧＴ１１ポリペプチド、組換えＵＧＴ７６Ｇ１、ＧＳ融合酵素、および組換えＡｔＳＵＳ１の組み合わせにより触媒される、Ｒｅｂ  ＧからのＲｅｂ  Ｗのインビトロ生成を示す。（Ａ−Ｄ）：レバウジオシドＧ（「Ｒｅｂ  Ｇ」）、レバウジオシドＡ（「Ｒｅｂ  Ａ」）、レバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）およびレバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）の標準を示す。ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＡｔＳＵＳ１により１２時間（Ｅ）および４８時間（Ｇ）で酵素的に生成されたＲｅｂ  Ｗ；ＥＵＧＴ１１およびＧＳ融合タンパク質により１２時間（Ｆ）および４８時間（Ｈ）で酵素的に生成されたＲｅｂ  Ｗ。
【図１７】Ｒｅｂ  ＶおよびＲｅｂ  Ｇの構造を示す。
【図１８】Ｒｅｂ  Ｖの重要なＴＯＣＳＹおよびＨＭＢＣ相関を示す。
【図１９】Ｒｅｂ  ＷおよびＲｅｂ  Ｖの構造を示す。
【図２０】Ｒｅｂ  Ｗの重要なＴＯＣＳＹおよびＨＭＢＣ相関を示す。
【図２１】ステビオール配糖体の生合成経路を示す。
【図２２】ＵＧＴ７６Ｇ１およびＧＳ融合酵素により触媒される、Ｒｅｂ  ＤからＲｅｂ  Ｍのインビトロ生成を示す。（Ａ−Ｂ）：レバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）およびレバウジオシドＭ（「Ｒｅｂ  Ｍ」）標準のＨＰＬＣ保持時間を示す。ＵＧＴ７６Ｇ１単独による３時間（Ｃ）および６時間（Ｆ）での酵素反応；ＵＧＴ−ＳＵＳ（ＵＧＴ７６Ｇ１−ＡｔＳＵＳ１）カップリング系による３時間（Ｄ）および６時間（Ｇ）での酵素反応；ＧＳ融合酵素による３時間（Ｅ）および６時間（Ｈ）での酵素反応。
【図２３】ＵＧＴ７６Ｇ１およびＧＳ融合酵素により触媒される、Ｒｅｂ  ＥからＲｅｂ  ＤおよびＲｅｂ  Ｍのインビトロ生成を示す。（Ａ−Ｃ）：レバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）、レバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）およびレバウジオシドＭ（「Ｒｅｂ  Ｍ」）標準のＨＰＬＣ保持時間を示す。ＵＧＴ７６Ｇ１単独による３時間（Ｄ）、１２時間（Ｇ）および２４時間（Ｊ）での酵素反応；ＵＧＴ−ＳＵＳ（ＵＧＴ７６Ｇ１−ＡｔＳＵＳ１）カップリング系による３時間（Ｅ）、１２時間（Ｈ）および２４時間（Ｋ）での酵素反応；ＧＳ融合酵素による３時間（Ｆ）、１２時間（Ｉ）および２４時間（Ｌ）での酵素反応。
【図２４】組換えＨＶ１、組換えＵＧＴ７６Ｇ１、ＧＳ融合酵素、および／または組換えＡｔＳＵＳ１の組み合わせにより触媒される、ステビオシドからＲｅｂ  ＤおよびＲｅｂ  Ｍのインビトロ生成を示す。（Ａ−Ｄ）：ステビオシド（「Ｓｔｅ」）、レバウジオシドＡ（「Ｒｅｂ  Ａ」）、レバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）およびレバウジオシドＭ（“Ｒｅｂ  Ｍ）標準のＨＰＬＣ保持時間を示す。ＨＶ１およびＵＧＴ７６Ｇ１による、ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング系における６時間（Ｅ）、１２時間（Ｈ）および２４時間（Ｋ）での酵素反応；ＨＶ１およびＧＳ融合酵素による６時間（Ｆ）、１２時間（Ｉ）および２４時間（Ｌ）での酵素反応。ＵＧＴ７６Ｇ１およびＨＶ１による６時間（Ｇ）、１２時間（Ｊ）および２４時間（Ｍ）での酵素反応。
【図２５】組換えＨＶ１、組換えＵＧＴ７６Ｇ１、ＧＳ融合酵素、および／または組換えＡｔＳＵＳ１の組み合わせにより触媒される、レバウジオシドＡからＲｅｂ  ＤおよびＲｅｂ  Ｍのインビトロ生成を示す。（Ａ−Ｃ）：レバウジオシドＡ（「Ｒｅｂ  Ａ」）、レバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）およびレバウジオシドＭ（「Ｒｅｂ  Ｍ」）標準のＨＰＬＣ保持時間を示す。ＨＶ１およびＵＧＴ７６Ｇ１による、ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング系における、６時間（Ｄ）、１２時間（Ｇ）および２４時間（Ｊ）での酵素反応；ＨＶ１およびＧＳ融合酵素による、６時間（Ｅ）、１２時間（Ｈ）および２４時間（Ｋ）での酵素反応。ＵＧＴ７６Ｇ１およびＨＶ１による６時間（Ｆ）、１２時間（Ｉ）および２４時間（Ｊ）での酵素反応。
【図２６】Ｒｅｂ  Ｍの構造を示す。
【図２７】Ｒｅｂ  Ｍの重要なＴＯＣＳＹおよびＨＭＢＣ相関を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本開示は、様々な改変および別の形態を許容可能であるが、その特定の実施形態が図面において例として示されており、本明細書において以下詳細に記載される。しかしながら、特定の実施形態の記載は、添付の特許請求の範囲により規定される本開示の精神および範囲内に包含される全ての改変、等価物および代替案に及ぶように、本開示を制限することを意図しないことが理解されるべきである。
【００５０】
別に規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本開示が属する分野の当業者により普通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載されるものに類似する、またはこれに等価な任意の方法および材料が本開示の実施または試験において使用され得るが、好ましい材料および方法が以下で記載される。
【００５１】
「相補的」という用語は、当業者により理解されるその通常のかつ習慣的な意味に従い使用され、限定はされないが、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を説明するために使用される。例えば、ＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、対象技術はまた、添付の配列表において報告されている全配列に相補的な単離された核酸断片ならびにそれらの実質的に同様の核酸配列を含む。
【００５２】
「核酸」および「ヌクレオチド」という用語は、当業者により理解されるそれらの個々の通常のかつ習慣的な意味に従い使用され、限定はされないが、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖形態のいずれかのそのポリマーを示すために使用される。具体的に制限されない限り、その用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然起源のヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。別記されない限り、特定の核酸配列はまた、暗に、その保存的に改変されたまたは縮重バリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明確に指示された配列を包含する。
【００５３】
「単離された」という用語は、当業者により理解されるその通常のかつ習慣的な意味に従い使用され、単離された核酸または単離されたポリペプチドとの関連で使用される場合、限定はされないが、人の手により、その自然の環境から離れて存在し、よって、自然の産物ではない核酸またはポリペプチドを示すために使用される。単離された核酸またはポリペプチドは精製形態で存在することができ、または、例えば、トランスジェニック宿主細胞内などの非天然環境において存在することができる。
【００５４】
「インキュベートする」および「インキュベーション」という用語は、本明細書では、２つ以上の化学的または生物学的実体（例えば、化学化合物および酵素）を混合し、それらを、ステビオール配糖体組成物を生成させるのに有利な条件下で相互作用させるプロセスを示す。
【００５５】
「縮重バリアント」という用語は、参照核酸配列から、１つ以上の縮重コドン置換により異なっている残基配列を有する核酸配列を示す。縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成させることにより、達成することができる。核酸配列およびその縮重バリアントの全ては同じアミノ酸またはポリペプチドを発現する。
【００５６】
「ポリペプチド」「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、当業者により理解されるそれらの個々の通常のかつ習慣的な意味に従い使用され；３つの用語は時として同じ意味で使用され、限定はされないが、そのサイズまたは機能に関係なく、アミノ酸、またはアミノ酸類似体のポリマーを示すために使用される。「タンパク質」はしばしば、比較的大きなポリペプチドに関して使用され、「ペプチド」はしばしば、小さなポリペプチドに関して使用されるが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は重なっており、変化する。「ポリペプチド」という用語は本明細書では、別記されない限り、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を示す。「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は本明細書では、ポリヌクレオチド産物に言及する場合同じ意味で使用される。よって、例示的なポリペプチドは、ポリヌクレオチド産物、天然起源のタンパク質、相同体、オルソログ、パラログ、断片および前記の他の等価物、バリアント、および類似体を含む。
【００５７】
「ポリペプチド断片」および「断片」という用語は、参照ポリペプチドに関連して使用される場合、当業者にとってそれらの通常のかつ習慣的な意味に従い使用され、限定はされないが、アミノ酸残基が参照ポリペプチド自体と比べて欠失しているが、残りのアミノ酸配列は参照ポリペプチドにおける対応する位置と通常同一であるポリペプチドを示すために使用される。そのような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端、あるいは両方で起こり得る。
【００５８】
ポリペプチドまたはタンパク質の「機能的断片」という用語は、全長ポリペプチドまたはタンパク質の一部であり、および全長ポリペプチドまたはタンパク質と、実質的に同じ生物活性を有し、または実質的に同じ機能を実行する（例えば、同じ酵素反応を実行する）ペプチド断片を示す。
【００５９】
「バリアントポリペプチド」「改変アミノ酸配列」または「改変ポリペプチド」という用語は、同じ意味で使用され、参照ポリペプチドと、１つ以上のアミノ酸だけ、例えば、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、および／または付加により異なるアミノ酸配列を示す。一態様では、バリアントは参照ポリペプチドの能力のいくつかまたは全てを保持する「機能的バリアント」である。
【００６０】
「機能的バリアント」という用語はさらに保存的に置換されたバリアントを含む。「保存的に置換されたバリアント」という用語は、参照ペプチドと１つ以上の保存的アミノ酸置換により異なり、参照ペプチドの活性のいくつかまたは全てを維持するアミノ酸配列を有するペプチドを示す。「保存的アミノ酸置換」はアミノ酸残基の機能的に同様の残基との置換である。保存的置換の例としては、１つの非極性（疎水性）残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンの、別のものとの置換；１つの荷電または極性（親水性）残基の別のものとの、例えばアルギニンとリジン間、グルタミンとアスパラギン間、スレオニンとセリン間の置換；１つの塩基性残基、例えばリジンまたはアルギニンの別のものとの置換；または１つの酸性残基、例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸の別のものとの置換；あるいは、１つの芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの別のものとの置換が挙げられる。そのような置換は、タンパク質またはポリペプチドのみかけの分子量または等電点にほとんど、または全く影響しないと予想される。「保存的に置換されたバリアント」という句はまた、残基が、化学的誘導体化残基と置き換えられたペプチドを含み、ただし、得られたペプチドが参照ペプチドの本明細書で記載される活性をある程度または全て維持することを条件とする。
【００６１】
「バリアント」という用語は、対象技術のポリペプチドとの関連で、参照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、およびさらに１００％同一なアミノ酸配列を有する機能的に活性なポリペプチドをさらに含む。
【００６２】
「相同」という用語は、その文法的形態およびスペリングバリエーションの全てにおいては、「共通の進化的起源」を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の関係を示し、スーパーファミリー由来のポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよび異なる種由来の相同ポリヌクレオチドまたはタンパク質が含まれる（Ｒｅｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ５０：６６７，  １９８７）。そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、パーセント同一性または保存された位置での特異的アミノ酸もしくはモチーフの存在の観点に関係なく、それらの配列類似性により反映される配列相同性を有する。例えば、２つの相同ポリペプチドは、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、およびさらに１００％同一なアミノ酸配列を有することができる。
【００６３】
対象技術のバリアントポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列をアライメントし、必要に応じて、最大パーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後、配列同一性の部分として保存的置換を考慮せずに、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージを示す。
【００６４】
パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアライメントは、当技術分野における技術の範囲内にある様々な方法で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができ、比較される配列の全長にわたって最大アライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムが挙げられる。例えば、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２を使用することにより決定され得る。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムはｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．からダウンロードされ得る。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ２は、いくつかの検索パラメータを使用し、ここで、それらの検索パラメータの全てがデフォルト値に設定され、例えば、アンマスクｙｅｓ、ストランド＝全て、予想発生１０、最小低複雑長さ（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｌｅｎｇｔｈ）＝１５／５、マルチパスｅ値＝０．０１、マルチパスに対する定数＝２５、最終ギャップアライメントに対するドロップオフ＝２５およびスコアリング行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２が含まれる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２がアミノ酸配列比較のために使用される状況では、あるアミノ酸配列Ｂに対する、これとの、これに対抗するあるアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（あるいは、あるアミノ酸配列Ｂに対する、これとの、またはこれに対抗するある一定の％アミノ酸配列同一性を有する、または含むあるアミノ酸配列Ａと呼ぶことができる）は下記の通り計算され：分数Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、ＡおよびＢのそのプログラムのアライメントにおいて、配列アライメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２により同一マッチとしてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性に等しくないことが認識されるであろう。
【００６５】
この意味で、アミノ酸配列「類似性」を決定するための技術は当技術分野でよく知られている。一般に、「類似性」は、適切な場所での２つ以上のポリペプチドの正確なアミノ酸対アミノ酸比較を示し、ここで、アミノ酸は同一であり、または同様の化学的および／または物理的性質、例えば電荷または疎水性を有する。そのように呼ばれる「パーセント類似性」はその後、比較されたポリペプチド配列間で決定され得る。核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技術はまた、当技術分野でよく知られており、その遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること（通常、ｃＤＮＡ中間体を介する）およびその中でコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれを第２のアミノ酸配列と比較することを含む。一般に、「同一性」は、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸対応を示す。２つ以上のアミノ酸配列のように、２つ以上のポリヌクレオチド配列は、それらの「パーセント同一性」を決定することにより比較することができる。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列解析パッケージ、バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  マディソン，  Ｗｉｓ．から入手可能）において使用可能なプログラム、例えば、ＧＡＰプログラムは、それぞれ、２つのポリヌクレオチド間の同一性ならびに２つのポリペプチド配列間の同一性および類似性の両方を計算することができる。配列間の同一性または類似性を計算するための他のプログラムは当業者により知られている。
【００６６】
参照位置「に対応する」アミノ酸位置は、アミノ酸配列をアライメントすることにより同定される、参照配列とアライメントする位置を示す。そのようなアライメントは、手作業で、またはよく知られた配列アライメントプログラム、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ２、Ｂｌａｓｔ２、などを使用することにより実施することができる。
【００６７】
特に指定がない限り、２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列のパーセント同一性は、２つの配列より短い方の全長にわたる、同一アミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージを示す。
【００６８】
「コード配列」は、当業者により理解されるその通常のかつ習慣的な意味に従い使用され、限定はされないが、特異的アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示すために使用される。
【００６９】
「好適な調節配列」は、当業者により理解されるその通常のかつ習慣的な意味に従い使用され、限定はされないが、コード配列の上流（５’非コード配列）、その中、または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響するヌクレオチド配列を示すために使用される。調節配列はプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含み得る。
【００７０】
「プロモーター」は、当業者により理解されるその通常のかつ習慣的な意味に従い使用され、限定はされないが、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を示すために使用される。一般に、コード配列はプロモーター配列に対し３’に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子から誘導され得、または自然で見出される異なるプロモーターから誘導される異なるエレメントから構成され得、またはさらには合成ＤＮＡセグメントを含み得る。異なるプロモーターは、異なる細胞型において、または発達の異なる段階で、または異なる環境条件に応じて、遺伝子の発現を調整することができることが、当業者により理解される。ほとんどの細胞型において、ほとんどの時間で遺伝子を発現させるプロモーターは普通、「構成的プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全には規定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片は同一プロモーター活性を有し得ることが、さらに認識される。
【００７１】
「作動可能に連結された」という用語は、１つの機能が他のものに影響されるような単一核酸断片上の核酸配列の関連を示す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響を与えることができる場合、コード配列と作動可能に連結されている（すなわち、コード配列は、プロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結させることができる。
【００７２】
「発現」という用語は、本明細書では、当業者により理解されるその通常のかつ習慣的な意味に従い使用され、限定はされないが、対象技術の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を示すために使用される。「過剰発現」は、正常または非形質転換生物における生成のレベルを超える、トランスジェニックまたは組換え生物における遺伝子産物の生成を示す。
【００７３】
「形質転換」は、当業者により理解されるその通常のかつ習慣的な意味に従い使用され、限定はされないが、ポリヌクレオチドの標的細胞中への導入を示すために使用される。導入されたポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムまたは染色体ＤＮＡ中に組み込むことができ、遺伝学的に安定な遺伝が得られ、またはこれは宿主染色体と関係なく複製することができる。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」生物と呼ばれる。
【００７４】
「形質転換」「トランスジェニック」および「組換え」という用語は、本明細書で宿主細胞に関連して使用される場合、当業者により理解されるそれらの通常のかつ習慣的な意味に従い使用され、限定はされないが、異種核酸分子が導入された宿主生物の細胞、例えば植物または微生物細胞を示すために使用される。核酸分子は安定に、宿主細胞のゲノム中に組み込むことができ、または核酸分子は染色体外分子として存在することができる。そのような染色体外分子は自己複製可能である。形質転換細胞、組織、または被験体は、形質転換プロセスの最終生成物だけでなく、そのトランスジェニック後代を包含することが理解される。
【００７５】
「組換え」「異種」および「外因性」という用語は、本明細書でポリヌクレオチドに関連して使用される場合、当業者により理解されるそれらの通常のかつ習慣的な意味に従い使用され、限定はされないが、特定の宿主細胞に対し外来性である起源に由来する、あるいは、同じ起源由来である場合、その元の形態から改変されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列または遺伝子）を示すために使用される。よって、宿主細胞中の異種遺伝子は、特定の宿主細胞にとって内在性であるが、例えば、部位特異的突然変異誘発または他の組換え技術の使用により改変されている遺伝子を含む。用語はまた、天然起源のＤＮＡ配列の非天然起源の複数のコピーを含む。よって、用語は細胞に対し外来性または異種である、またはエレメントが通常見出されない宿主細胞内の位置または形態以外において細胞に対し相同であるＤＮＡセグメントを示す。
【００７６】
同様に、「組換え」「異種」および「外因性」という用語は、本明細書でポリペプチドまたはアミノ酸配列に関連して使用される場合、特定の宿主細胞に対して外来性である起源に由来する、あるいは、同じ起源由来である場合、その元の形態から改変されたポリペプチドまたはアミノ酸配列を意味する。よって、組換えＤＮＡセグメントは宿主細胞において発現され、組換えポリペプチドが生成され得る。
【００７７】
「プラスミド」「ベクター」および「カセット」という用語は、当業者により理解されるそれらの通常のかつ習慣的な意味に従い使用され、限定はされないが、しばしば、細胞の中央代謝の一部ではなく、通常環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である遺伝子を運搬する染色体外エレメントを示すために使用される。そのようなエレメントは、任意の起源に由来する、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、直鎖または環状の一本または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、この場合、多くのヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を、適切な３’非翻訳配列と共に細胞中に挿入することができる、特有の構成中に連結または組み換えられている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有する特異ベクターを示す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて、外来性宿主においてその遺伝子の増強された発現を可能にするエレメントを有する特異ベクターを示す。
【００７８】
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当技術分野でよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９  （以後、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ならびにＳｉｌｈａｖｙ，  Ｔ．  Ｊ．，  Ｂｅｎｎａｎ，  Ｍ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，  Ｌ．  Ｗ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８４；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版，１９８７により記載され；その各々の全体は、これにより、参照により本明細書に、それらがこれと一致する程度まで組み込まれる。
【００７９】
本明細書では、「合成の」または「有機合成された」または「化学的に合成された」または「有機合成すること」または「化学的に合成すること」または「有機合成」または「化学合成」は、一連の化学反応により化合物を調製することを示すために使用され；これは、化合物を、例えば、自然源から抽出することを含まない。
【００８０】
「経口摂取可能製品」という用語は、本明細書では、人または動物の口と接触する任意の飲料、食品、健康補助食品、栄養補助食品、医薬組成物、歯科用衛生学的組成物および化粧品を示し、口内に取り入れられ、その後、口から排出される物質、および飲まれ、食され、嚥下され、または別様に消化される物質；ならびに一般に許容される範囲の濃度で使用された場合、ヒトまたは動物が消費するのに安全である物質が含まれる。
【００８１】
「食品」という用語は、本明細書では、下記を示す：果実、野菜、ジュース、肉製品、例えばハム、ベーコンおよびソーセージ；卵製品、果実濃縮物、ゼラチンおよびゼラチン様製品、例えばジャム、ゼリー、貯蔵食料、など；乳製品、例えばアイスクリーム、サワークリーム、ヨーグルト、およびシャーベット；アイシング、糖蜜を含むシロップ；トウモロコシ、コムギ、ライ麦、ダイズ、カラスムギ、コメおよびオオムギ製品、穀類製品、ナッツミートおよびナッツ製品、ケーキ、クッキー、菓子類、例えばキャンディ、ガム、果物風味ドロップ、およびチョコレート、チューインガム、ミント、クリーム、アイシング、アイスクリーム、パイおよびパン。「食品」はまた、香辛料、例えばハーブ、スパイスおよび調味料、うま味調味料、例えばグルタミン酸ナトリウムを示す。「食品」はさらに、下記を示し、これらをも含む：調製されたパッケージ製品、例えばダイエット用甘味料、液体甘味料、卓上用香味料、水で再構成されると、非炭酸飲料を提供する粒状香味ミックス、インスタントプリン用ミックス、インスタントコーヒーおよびティー、コーヒー用クリーム、麦芽乳ミックス、ペット用食品、家畜用食品、タバコ、およびベーキング用途用の材料、例えばパン、クッキー、ケーキ、パンケーキ、ドーナツなどの調製のための粉末ベーキングミックス。「食品」はまた、スクロースをほとんど、または全く含まないダイエット用または低カロリー食品および飲料を示す。
【００８２】
本明細書では、「立体異性体」という用語は、それらの原子の空間における配向のみが異なる個々の分子の全ての異性体に対する一般用語である。「立体異性体」は鏡像異性体およびお互いの鏡像ではない１を超えるキラル中心を有する化合物の異性体（ジアステレオマー）を含む。
【００８３】
本明細書では、「アモルファスレバウジオシドＶ」という用語は、レバウジオシドＶの非晶質固体形態を示す。本明細書では、「アモルファスレバウジオシドＷ」という用語は、レバウジオシドＷの非晶質固体形態を示す。
【００８４】
本明細書では、「甘味度」という用語は、個体、例えば、ヒトにより観察または経験される甘味感覚の相対強度、または、例えばＢｒｉｘスケールでの、テイスターにより検出される甘味の程度または量を示す。
【００８５】
本明細書では、「甘味を増強させる」という用語は、レバウジオシドＶおよび／またはレバウジオシドＷを含まない対応する経口摂取可能製品と比べて、本開示の飲料製品または摂取可能製品の１つ以上の甘味特性の知覚を、その性質および品質を変化させずに、増加させ、増大させ、強化し、強調し、強め、かつ／または増強する、レバウジオシドＶおよび／またはレバウジオシドＷの効果を示す。
【００８６】
本明細書では、「異味（複数可）」という用語は、本開示の飲料製品または摂取可能製品において、特質上または通常、見出されない味覚の量または程度を示す。例えば、異味は、消費者に対する甘味摂取可能品の望ましくない味覚、例えば、苦味、甘草様味覚、金属味、嫌悪味、渋味、遅延した甘味発生、長引く甘い後味、等々、などである。
【００８７】
本明細書では、「ｗ／ｖ−％」という用語は、そのような化合物を含む本開示の液体経口摂取可能製品１００ｍｌ毎の化合物、例えば糖、（グラムで表される）の重量を示す。本明細書では、「ｗ／ｗ−％」という用語は、そのような化合物を含む本開示の経口摂取可能製品の１グラム毎の化合物、例えば糖（グラムで表される）の重量を示す。
【００８８】
本明細書では、「ｐｐｍ」という用語は、パート（パーツ）パーミリオンを示し、重量によると、例えば、そのような化合物を含む本開示の経口摂取可能製品１キログラムあたりの化合物、例えばレバウジオシドＶおよび／またはレバウジオシドＷ（ミリグラムで表される）の重量（すなわち、ｍｇ／ｋｇ）、またはそのような化合物を含む本開示の経口摂取可能製品１リットルあたりの化合物、例えばレバウジオシドＶおよび／またはレバウジオシドＷ（ミリグラムで表される）の重量（すなわち、ｍｇ／Ｌ）であり；または体積によると、例えば、そのような化合物を含む本開示の経口摂取可能製品１リットルあたりの化合物、例えばレバウジオシドＶおよび／またはレバウジオシドＷ（ミリリットルで表される）の体積（すなわち、ｍｌ／Ｌ）である。
【００８９】
本開示によれば、ノンカロリー甘味料およびノンカロリー甘味料を合成するための方法が開示される。また、本開示によれば、酵素および酵素を使用してノンカロリー甘味料を調製する方法が開示される。
【００９０】
合成ノンカロリー甘味料：合成レバウジオシドＶ
１つの態様では、本開示は、合成ノンカロリー甘味料に向けられる。合成ノンカロリー甘味料は合成レバウジオシド型ステビオール配糖体であり、「レバウジオシドＶ」という名称が与えられている。レバウジオシドＶ（「Ｒｅｂ  Ｖ」）は、アグリコンステビオールに連結されたその構造内に４つのβ−Ｄ−グルコシル単位を有するステビオール配糖体であり、ステビオールアグリコン部分は、エーテル結合の形態のＣ−１３のＧｌｃβ１−３−Ｇｌｃβ１単位およびエステル結合の形態のＣ−１９位の別のＧｌｃβ１−２−Ｇｌｃβ１単位を有する。
【００９１】
レバウジオシドＶは、大規模１Ｄおよび２Ｄ  ＮＭＲならびに高分解能質量スペクトルデータおよび加水分解研究に基づいて、分子式がＣ４４Ｈ７０Ｏ２３であり、ＩＵＰＡＣ名が１３−［（３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］エント−カウル−１６−エン−１９−オイック酸−（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）エステルである。
【００９２】
合成ノンカロリー甘味料：合成レバウジオシドＷ
１つの態様では、本開示は、合成ノンカロリー甘味料に向けられる。合成ノンカロリー甘味料は、合成レバウジオシド型ステビオール配糖体であり、「レバウジオシドＷ」という名称が与えられている。レバウジオシドＷ（「Ｒｅｂ  Ｗ」）はアグリコンステビオールに連結されたその構造内に５つのβ−Ｄ−グルコシル単位を有するステビオール配糖体であり、ステビオールアグリコン部分は、エーテル結合の形態のＣ−１３のＧｌｃβ１−３−Ｇｌｃβ１単位を有し、かつエステル結合の形態のＣ−１９位のＧｌｃβ１−２（Ｇｌｃβ１−３）−Ｇｌｃβ１単位を有する。
【００９３】
レバウジオシドＷは分子式がＣ５０Ｈ８０Ｏ２８であり、ＩＵＰＡＣ名が１３−［（３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］エント−カウル−１６−エン−１９−オイック酸−［（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）エステルである。
【００９４】
合成ノンカロリー甘味料：合成レバウジオシドＫＡ
１つの態様では、本開示は、合成ノンカロリー甘味料に向けられる。合成ノンカロリー甘味料は合成レバウジオシド型ステビオール配糖体であり、「レバウジオシドＫＡ」という名称が与えられている。レバウジオシドＫＡ（「Ｒｅｂ  ＫＡ」）はアグリコンステビオールに連結されたその構造内に３つのβ−Ｄ−グルコシル単位を有するステビオール配糖体であり、ステビオールアグリコン部分は、エーテル結合の形態のＣ−１３のＧｌｃβ１単位を有し、エーテル結合の形態のＣ−１９のＧｌｃβ１−２−Ｇｌｃβ１単位を有す。レバウジオシドＫＡは、大規模１Ｄおよび２Ｄ  ＮＭＲならびに高分解能質量スペクトルデータおよび加水分解研究に基づいて、分子式がＣ３８Ｈ６０Ｏ１８であり、ＩＵＰＡＣ名が１３−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ］エント−カウル−１６−エン−１９−オイック酸−（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）エステルである。
【００９５】
合成ノンカロリー甘味料：合成レバウジオシドＧ
１つの態様では、本開示は、合成ノンカロリー甘味料に向けられる。合成ノンカロリー甘味料は合成レバウジオシド型ステビオール配糖体であり、「レバウジオシドＧ」という名称が与えられている。レバウジオシドＧ（「Ｒｅｂ  Ｇ」）はアグリコンステビオールに連結されたその構造内に３つのβ−Ｄ−グルコシル単位を有するステビオール配糖体であり、ステビオールアグリコン部分はエーテル結合の形態のＣ−１３のＧｌｃβ１−３−Ｇｌｃβ１単位およびエーテル結合の形態のＣ−１９のＧｌｃβ１単位を有する。
【００９６】
レバウジオシドＧは、大規模１Ｄおよび２Ｄ  ＮＭＲならびに高分解能質量スペクトルデータおよび加水分解研究に基づいて、分子式がＣ３８Ｈ６０Ｏ１８であり、ＩＵＰＡＣ名が１３−［（３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］エント−カウル−１６−エン−１９−オイック酸−β−Ｄ−グルコピラノシル）エステルである。
【００９７】
合成ノンカロリー甘味料：合成レバウジオシドＭ
１つの態様では、本開示は、合成ノンカロリー甘味料に向けられる。合成ノンカロリー甘味料は合成レバウジオシド型ステビオール配糖体であり、「レバウジオシドＭ」という名称が与えられている。レバウジオシドＭ（「Ｒｅｂ  Ｍ」）はアグリコンステビオールに連結されたその構造内に６つのβ−Ｄ−グルコシル単位を有するステビオール配糖体であり、ステビオールアグリコン部分は、エーテル結合の形態のＣ−１３位のＧｌｃβ１−２（Ｇｌｃβ１−３）−Ｇｌｃβ１単位およびエステル結合の形態のＣ−１９位のＧｌｃβ１−２（Ｇｌｃβ１−３）−Ｇｌｃβ１単位を有する。
【００９８】
レバウジオシドＭは、大規模１Ｄおよび２Ｄ  ＮＭＲならびに高分解能質量スペクトルデータおよび加水分解研究に基づいて、分子式がＣ５６Ｈ９０Ｏ３３であり、ＩＵＰＡＣが１３−［（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］エント−カウル−１６−エン−１９−オイック酸−［（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）エステルである。
【００９９】
ステビオール配糖体を合成する方法
レバウジオシドＧからレバウジオシドＶを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＧからレバウジオシドＶを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＧと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＨＶ１  ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み；スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）を含むまたは含まない反応混合物を調製すること、ならびに反応混合物を、レバウジオシドＶを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＧにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。
【０１００】
レバウジオシドＧからレバウジオシドＶを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＧからレバウジオシドＶを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＧと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＥＵＧＴ１１、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホ（ｄｉｐｏｓｐｈｏ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含み；スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）を含むまたは含まない反応混合物を調製すること、ならびに反応混合物を、レバウジオシドＶを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＧにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。
【０１０１】
レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＶを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＶを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＫＡと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホ（ｄｉｐｏｓｐｈｏ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含み；スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）を含むまたは含まない反応混合物を調製すること、ならびに反応混合物を、レバウジオシドＶを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＫＡにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。
【０１０２】
ルブソシドからレバウジオシドＶを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドＶを合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）、ＨＶ１およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホ（ｄｉｐｏｓｐｈｏ）グリコシルトランスフェラーゼ（複数可）（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含み；スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）を含むまたは含まない反応混合物を調製すること、ならびに反応混合物を、レバウジオシドＶを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりルブソシドにカップリングされ、レバウジオシドＫＡが生成される。連続して、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＫＡにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。
【０１０３】
ルブソシドからレバウジオシドＶを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドＡおよびレバウジオシドＶの混合物を合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）、ＥＵＧＴ１１およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホ（ｄｉｐｏｓｐｈｏ）グリコシルトランスフェラーゼ（複数可）（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含み；スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに、反応混合物を、レバウジオシドＶを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりルブソシドにカップリングされ、レバウジオシドＫＡが生成され、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＫＡにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。グルコースが共有結合によりルブソシドにカップリングされ、レバウジオシドＧが生成される。連続して、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＧにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。
【０１０４】
レバウジオシドＶからレバウジオシドＷを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＶからレバウジオシドＷを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＶと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホ（ｄｉｐｏｓｐｈｏ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含み；スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること、ならびに反応混合物を、レバウジオシドＷを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＶにカップリングされ、レバウジオシドＷが生成される。
【０１０５】
レバウジオシドＧからレバウジオシドＷを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＧからレバウジオシドＷを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＧと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素およびＨＶ１からなる群より選択されるウリジンジホスホ（ｄｉｐｏｓｐｈｏ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含み；スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＷを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、ＨＶ１により、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＧにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。連続して、ＵＧＴ７６Ｇ１により、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＶにカップリングされ、レバウジオシドＷが生成される。
【０１０６】
レバウジオシドＧからレバウジオシドＷを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＧからレバウジオシドＷを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＧと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＵＧＴ７６Ｇ１、ＥＵＧＴ１１、およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含む反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＷを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、ＥＵＧＴ１１により、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＧにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。連続して、ＵＧＴ７６Ｇ１により、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＶにカップリングされ、レバウジオシドＷが生成される。
【０１０７】
レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＷを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＷを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＫＡと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）、およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホ（ｄｉｐｏｓｐｈｏ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ）とを含み；スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＷを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＫＡにカップリングされ、レバウジオシドＶが生成される。連続して、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＶにカップリングされ、レバウジオシドＷが生成される。
【０１０８】
ルブソシドからレバウジオシドＷを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドを合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＵＧＴ７６Ｇ１、ＨＶ１、およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼとを含み；スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること、ならびに反応混合物を、レバウジオシドＷの混合物を生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含む。
【０１０９】
ルブソシドからレバウジオシドＷを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドを合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＵＧＴ７６Ｇ１、ＥＵＧＴ１１、およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼとを含み；スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること、ならびに反応混合物を、レバウジオシドＷを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含む。
【０１１０】
ルブソシドからステビオシドおよびレバウジオシドＫＡの混合物を生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからステビオシドおよびレバウジオシドＫＡの混合物を合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＥＵＧＴ１１およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み；スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、ステビオシドおよびレバウジオシドＫＡの混合物を生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりルブソシドのＣ２’−１９−Ｏ−グルコースにカップリングされレバウジオシドＫＡが生成され；グルコースが共有結合により、ルブソシドのＣ２’−１３−Ｏ−グルコースにカップリングされ、ステビオシドが生成される。
【０１１１】
ルブソシドからレバウジオシドＫＡを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドＫＡを合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＨＶ１  ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み；スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＫＡを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりルブソシドのＣ２’−１９−Ｏ−グルコースにカップリングされレバウジオシドＫＡが生成される。
【０１１２】
ルブソシドからレバウジオシドＧを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドＧを合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＵＧＴ７６Ｇ１およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み；スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＧを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりルブソシドのＣ３’−１３−Ｏ−グルコースにカップリングされ、レバウジオシドＧが生成される。
【０１１３】
レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＥを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＥを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＫＡと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＨＶ１  ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み；スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＥを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＫＡのＣ２’１３−Ｏ−グルコースにカップリングされ、レバウジオシドＥが生成される。
【０１１４】
レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＥを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＥを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＫＡと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＥＵＧＴ１１およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素の群からのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み；スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＥを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＫＡのＣ２’１３−Ｏ−グルコースにカップリングされ、レバウジオシドＥが生成される。
【０１１５】
ルブソシドからレバウジオシドＥを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドＥを合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＥＵＧＴ１１およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロース合成融合酵素の群からのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み；スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；反応混合物を、レバウジオシドＥを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりルブソシドにカップリングされ、レバウジオシドＫＡおよびステビオシドの混合物が生成される。連続して、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＫＡおよびステビオシドにカップリングされ、レバウジオシドＥが生成される。
【０１１６】
ルブソシドからレバウジオシドＥを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドＥを合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＨＶ１  ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み；スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；反応混合物を、レバウジオシドＥを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることであって、グルコースが共有結合によりルブソシドにカップリングされ、レバウジオシドＫＡが生成されること；ならびに、さらに、レバウジオシドＫＡをＨＶ１と共にインキュベートし、レバウジオシドＥを生成させることを含む。
【０１１７】
ルブソシドからレバウジオシドＤ２を生成させる方法．別の態様では、本開示は、ルブソシドからレバウジオシドＤ２を合成するための方法に向けられる。該方法は、ルブソシドと；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と；ＥＵＧＴ１１およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロース合成融合酵素の群からのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み；スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；反応混合物を、レバウジオシドＤ２を生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることであって、グルコースが共有結合によりルブソシドにカップリングされ、ステビオシドおよびレバウジオシドＫＡの混合物が生成されること；さらにステビオシドおよびレバウジオシドＫＡの混合物をＥＵＧＴ１１と共にインキュベートし、レバウジオシドＥを生成させることであって、グルコースが共有結合によりステビオシドおよびレバウジオシドＫＡにカップリングされ、レバウジオシドＥが生成されること；ならびにさらに、レバウジオシドＥをＥＵＧＴ１１と共にインキュベートし、レバウジオシドＤ２を生成させることであって、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＥにカップリングされレバウジオシドＤ２が生成されることを含む。
【０１１８】
レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＤ２を生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＫＡからレバウジオシドＤ２を合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＫＡと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質と、ＥＵＧＴ１１およびＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素からなる群より選択されるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；反応混合物を、レバウジオシドＤ２を生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることであって、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＫＡにカップリングされ、レバウジオシドＥが生成されること；さらに、レバウジオシドＥの混合物をＥＵＧＴ１１と共にインキュベートし、レバウジオシドＤ２を生成させることであって、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＥにカップリングされレバウジオシドＤ２が生成されることを含む。
【０１１９】
レバウジオシドＥからレバウジオシドＺを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＥからレバウジオシドＺを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＥ；スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）およびウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群より選択される基質；ならびにＨＶ１  ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ；ならびにスクロースシンターゼを含む反応混合物を調製すること、反応混合物を、レバウジオシドＺを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＥにカップリングされ、レバウジオシドＺが生成され、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＥのＣ２’−１３−Ｏ−グルコースにカップリングされ、レバウジオシドＺ１が生成される。グルコースが共有結合により、レバウジオシドＥのＣ２’−１９−Ｏ−グルコースにカップリングされ、レバウジオシドＺ２が生成される。
【０１２０】
レバウジオシドＤからレバウジオシドＭを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＤからレバウジオシドＭを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＤと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される基質と、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＭを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含み、グルコースが共有結合によりレバウジオシドＤにカップリングされ、レバウジオシドＭが生成される。
【０１２１】
ステビオシドからレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭを生成させる方法．別の態様では、本開示は、ステビオシドからレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭを合成するための方法に向けられる。該方法は、ステビオシドと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される基質と、ＨＶ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとを含み、スクロースシンターゼを含むまたは含まない反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＤおよび／またはレバウジオシドＭを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含む。例えば、実施形態では、反応混合物はレバウジオシドＤを生成させるのに十分な時間の間インキュベートされ得、レバウジオシドＤを含む反応混合物がさらにインキュベートされ（例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１および／または融合酵素と共に）、レバウジオシドＭが生成される。ある一定の実施形態では、反応混合物はＨＶ１およびＵＧＴ７６Ｇ１を含む。他の実施形態では、反応混合物はＨＶ１および融合酵素を含む。
【０１２２】
ある一定の実施形態では、グルコースが共有結合によりステビオシドにカップリングされ、レバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＥが生成される。例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１または融合酵素により、グルコースは、共有結合でステビオシドにカップリングされ得、レバウジオシドＡが生成され、かつ／またはＨＶ１により、グルコースは、共有結合でステビオシドにカップリングされ得、レバウジオシドＥが生成される。連続して、ＨＶ１により、グルコースは、共有結合でレバウジオシドＡにカップリングされ得、レバウジオシドＤが生成され、かつ／またはＵＧＴ７６Ｇ１または融合酵素により、グルコースは、共有結合でレバウジオシドＥにカップリングされ得、レバウジオシドＤが生成される。ＵＧＴ７６Ｇ１または融合酵素により、グルコースはさらに、共有結合によりレバウジオシドＤにカップリングされ得、レバウジオシドＭが生成される。
【０１２３】
レバウジオシドＡからレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭを合成するための方法に向けられる。該方法は、レバウジオシドＡ、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される基質、ならびにＨＶ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを、スクロースシンターゼありまたはなしで含む反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＤおよび／またはレバウジオシドＭを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含む。例えば、実施形態では、反応混合物（例えば、ＨＶ１を含む）は、レバウジオシドＤを生成させるのに十分な時間の間インキュベートされ得、レバウジオシドＤを含む反応混合物はさらにインキュベートされ（例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１および／または融合酵素と共に）、レバウジオシドＭが生成される。ある一定の実施形態では、反応混合物は、ＨＶ１およびＵＧＴ７６Ｇ１を含む。他の実施形態では、反応混合物はＨＶ１および融合酵素を含む。
【０１２４】
グルコースが共有結合によりレバウジオシドＡにカップリングされ、レバウジオシドＤが生成される。例えば、ＨＶ１により、グルコースは、共有結合でレバウジオシドＡにカップリングされ得、レバウジオシドＤが生成される。連続して、ＵＧＴ７６Ｇ１または融合酵素により、グルコースは、共有結合でレバウジオシドＤにカップリングされ得、レバウジオシドＭが生成される。
【０１２５】
レバウジオシドＥからレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭを生成させる方法．別の態様では、本開示は、レバウジオシドＥからレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭを合成するための方法に向けられる。方法は、レバウジオシドＥ、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される基質、ならびにＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ−スクロースシンターゼ融合酵素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを、スクロースシンターゼありまたはなしで含む反応混合物を調製すること；ならびに反応混合物を、レバウジオシドＤおよび／またはレバウジオシドＭを生成させるのに十分な時間の間インキュベートすることを含む。例えば、実施形態では、反応混合物（例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１および／または融合酵素を含む）は、レバウジオシドＤを生成させるのに十分な時間の間インキュベートされ得、レバウジオシドＤを含む反応混合物はさらにインキュベートされ得、レバウジオシドＭが生成される。
【０１２６】
グルコースが共有結合によりレバウジオシドＥにカップリングされ、レバウジオシドＤが生成される。例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１または融合酵素により、グルコースは、共有結合でレバウジオシドＥにカップリングされ得、レバウジオシドＤが生成される。連続して、ＵＧＴ７６Ｇ１または融合酵素により、グルコースは、共有結合でレバウジオシドＤにカップリングされ得、レバウジオシドＭが生成される。
【０１２７】
ステビオール配糖体の大半はステビオールのいくつかのグリコシル化反応により形成され、これらの反応は典型的には、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）により、ウリジン５’−ジホスホグルコース（ＵＤＰ−グルコース）を糖部分の供与体として使用して触媒される。植物中、ＵＧＴはグルコース残基をＵＤＰ−グルコースからステビオールに転移させる酵素の非常に多様な群である。
【０１２８】
ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７６Ｇ１）は、１，３−１３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を有するＵＧＴであり、関連する配糖体（レバウジオシドＡおよびＤ）を生成させる。驚いたことに、かつ予想外に、ＵＧＴ７６Ｇ１はまた１，３−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を有し、ルブソシドからレバウジオシドＧを生成させ、レバウジオシドＤからレバウジオシドＭを生成させることが発見された。ＵＧＴ７６Ｇ１は、レバウジオシドＫＡをＲｅｂ  Ｖに変換させることができ、続けて、Ｒｅｂ  Ｗを形成させることができる。特に好適なＵＧＴ７６Ｇ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する。
【０１２９】
ＥＵＧＴ１１（ＷＯ２０１３０２２９８９号において記載）は、１，２−１９−Ｏ−グルコースおよび１，２−１３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を有するＵＧＴである。ＥＵＧＴ１１は、ステビオシドからレバウジオシドＥおよびレバウジオシドＡからレバウジオシドＤの生成を触媒することが知られている。驚いたことに、かつ予想外に、ＥＵＧＴ１１をインビトロで使用して、新しい酵素活性（β１，６−１３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性）により、レバウジオシドＥからレバウジオシドＤ２を合成することができることが発見された（米国特許出願番号第１４／２６９，４３５号、Ｃｏｎａｇｅｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）。ＥＵＧＴ１１は１，２−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を有し、ルブソシドからレバウジオシドＫＡを生成させる。特に好適なＥＵＧＴ１１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列を有する。
【０１３０】
ＨＶ１は、１，２−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を有するＵＧＴであり、関連するステビオール配糖体（レバウジオシドＥ、ＤおよびＺ）を生成させる。驚いたことに、かつ予想外に、ＨＶ１はまた、１，２−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を有し、ルブソシドからレバウジオシドＫＡを生成させることが発見された。ＨＶ１はまた、Ｒｅｂ  ＧからＲｅｂ  ＶおよびＲｅｂ  ＫＡからＲｅｂ  Ｅに変換させることができる。特に好適なＨＶ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列を有する。
【０１３１】
前記方法はさらに、スクロースシンターゼをウリジンジホスホ（ＵＤＰ）グリコシルトランスフェラーゼを含む反応混合物に添加することを含むことができる。スクロースシンターゼは、ＮＤＰ−グルコースとＤ−フルクトースの間の化学反応を触媒し、ＮＤＰおよびスクロースを生成させる。スクロースシンターゼはグリコシルトランスフェラーゼである。この酵素クラスの系統名はＮＤＰ−グルコース：Ｄ−フルクトース２−α−Ｄ−グルコシルトランスフェラーゼである。普通に使用される他の名称としては、ＵＤＰグルコース−フルクトースグルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンテターゼ、スクロース−ＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ、スクロース−ウリジン二リン酸グルコシルトランスフェラーゼ、およびウリジンジホスホグルコース−フルクトースグルコシルトランスフェラーゼが挙げられる。スクロースシンターゼのウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼを含む反応混合物への添加により「ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング系」が生成される。ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング系では、ＵＤＰ−グルコースはＵＤＰおよびスクロースから再生させることができ、これにより余分のＵＤＰ−グルコースの反応混合物への添加を省く、または反応混合物中のＵＤＰを使用することが可能になる。好適なスクロースシンターゼは、例えば、シロイヌナズナ属スクロースシンターゼ１；シロイヌナズナ属スクロースシンターゼ３；ならびにリョクトウスクロースシンターゼとすることができる。特に好適なスクロースシンターゼは、例えば、シロイヌナズナ属スクロースシンターゼ１とすることができる。特に好適なシロイヌナズナ属スクロースシンターゼ１は、シロイヌナズナスクロースシンターゼ１（ＡｔＳＵＳ１）であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸配列を有する。
【０１３２】
別の態様では、ウリジンジホスホ（ｄｉｐｏｓｐｈｏ）グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は前記方法において使用され得る。特に好適なウリジンジホスホ（ｄｉｐｏｓｐｈｏ）グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素はＵＧＴ−ＳＵＳ１融合酵素とすることができる。ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼは、スクロースシンターゼドメインに結合されたウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素とすることができる。特に、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素はスクロースシンターゼドメインに結合されたウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含む。加えて、ＵＧＴ−ＳＵＳ１融合酵素はスクロースシンターゼ活性を有し、よって、ＵＤＰおよびスクロースからＵＤＰ−グルコースを再生させることができる。特に好適なＵＧＴ−ＳＵＳ１融合酵素は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のアミノ酸配列を有するＵＧＴ７６Ｇ１−ＡｔＳＵＳ１融合酵素（「ＧＳ」と命名）とすることができる。別の特に好適なＵＧＴ−ＳＵＳ１融合酵素は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸配列を有するＥＵＧＴ１１−ＳＵＳ１（「ＥＵＳ」と命名）とすることができる。
【０１３３】
好適なスクロースシンターゼドメインは、例えば、シロイヌナズナ属スクロースシンターゼ１；シロイヌナズナ属スクロースシンターゼ３；ならびにリョクトウスクロースシンターゼとすることができる。特に好適なスクロースシンターゼドメインは、例えば、シロイヌナズナ属スクロースシンターゼ１とすることができる。特に好適なシロイヌナズナ属スクロースシンターゼ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸配列を有する、シロイヌナズナスクロースシンターゼ１（ＡｔＳＵＳ１）である。
【０１３４】
ＵＧＴ７６Ｇ１−ＡｔＳＵＳ１（「ＧＳ」）融合酵素は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で明記されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％およびさらに１００％同一なポリペプチド配列を有することができる。好適なことに、ＵＧＴ−ＡｔＳＵＳ１融合酵素のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に対して少なくとも８０％の同一性を有する。より好適なことに、ＵＧＴ−ＡｔＳＵＳ１融合酵素のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で明記されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、およびさらに１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１３５】
単離された核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で明記される核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、およびさらに１００％の配列相同性を有する核酸配列を有する、ＵＧＴ−ＡｔＳＵＳ１融合酵素のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。好適なことに、単離された核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で明記されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。より好適なことに、単離された核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で明記されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、およびさらに１００％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を有するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。よって、単離された核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の機能的断片、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の機能的バリアント、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に対して、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、およびさらに１００％の配列同一性を有する他の相同ポリペプチドをコードするそれらのヌクレオチド配列を含む。当業者により知られているように、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列は、例えば、細菌および酵母などの好適な宿主生物における発現のためにコドン最適化され得る。
【０１３６】
ＥＵＧＴ１１−ＳＵＳ１（「ＥＵＳ」）融合酵素は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で明記されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％およびさらに１００％同一なポリペプチド配列を有することができる。好適なことに、ＥＵＧＴ１１−ＳＵＳ１融合酵素のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する。より好適なことに、ＥＵＧＴ１１−ＳＵＳ１融合酵素のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で明記されたアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、およびさらに１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１３７】
単離された核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で明記された核酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、およびさらに１００％の配列相同性を有する核酸配列を有する、ＥＵＧＴ１１−ＳＵＳ１融合酵素のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。好適なことに、単離された核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で明記されたアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥＵＧＴ１１−ＳＵＳ１融合酵素のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。より好適なことに、単離された核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で明記されたアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、およびさらに１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＥＵＧＴ１１−ＳＵＳ１融合酵素のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。よって、単離された核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の機能的断片、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の機能的バリアント、または、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、およびさらに１００％の配列同一性を有する他の相同ポリペプチドをコードするそれらのヌクレオチド配列を含む。当業者により知られているように、ＥＵＧＴ１１−ＳＵＳ１をコードする核酸配列は、例えば、細菌および酵母などの好適な宿主生物における発現のためにコドン最適化され得る。
【０１３８】
経口摂取可能製品
別の態様では、本開示は、飲料製品および摂取可能製品からなる群より選択される、甘味量のレバウジオシドＶを有する経口摂取可能製品に向けられる。別の態様では、本開示は、飲料製品および摂取可能製品からなる群より選択される、甘味量のレバウジオシドＷを有する経口摂取可能製品に向けられる。別の態様では、本開示は、飲料製品および摂取可能製品からなる群より選択される、甘味量のレバウジオシドＫＡを有する経口摂取可能製品に向けられる。別の態様では、本開示は、飲料製品および摂取可能製品からなる群より選択される、甘味量のレバウジオシドＧを有する経口摂取可能製品に向けられる。別の態様では、本開示は、飲料製品および摂取可能製品からなる群より選択される、甘味量のレバウジオシドＭを有する経口摂取可能製品に向けられる。
【０１３９】
経口摂取可能製品は約１％（ｗ／ｖ−％）〜約４％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液に等しい甘味度を有することができる。
【０１４０】
経口摂取可能製品は約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍのレバウジオシドＶを有することができる。経口摂取可能製品は約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍのレバウジオシドＷを有することができる。経口摂取可能製品は約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍのレバウジオシドＫＡを有することができる。経口摂取可能製品は約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍのレバウジオシドＧを有することができる。経口摂取可能製品は約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍのレバウジオシドＭを有することができる。
【０１４１】
レバウジオシドＶは経口摂取可能製品中の唯一の甘味料とすることができる。レバウジオシドＷは経口摂取可能製品中の唯一の甘味料とすることができる。レバウジオシドＫＡは経口摂取可能製品中の唯一の甘味料とすることができる。レバウジオシドＧは経口摂取可能製品中の唯一の甘味料とすることができる。レバウジオシドＭは経口摂取可能製品中の唯一の甘味料とすることができる。
【０１４２】
経口摂取可能製品はまた、少なくとも１つの追加の甘味料を有することができる。少なくとも１つの追加の甘味料は、例えば、天然高甘味度甘味料とすることができる。追加の甘味料は下記から選択することができる：ステビア抽出物、ステビオール配糖体、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＤ２、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ＡｃｅＫ、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン（ＮａｒＤＨＣ）、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）、ルブソシド、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＶ、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、Ｌ−アラニン、グリシン、羅漢果、ヘルナンズルチン、フィロズルチン、トリロブタイン、およびそれらの組み合わせ。
【０１４３】
経口摂取可能製品はまた、少なくとも１つの添加物を有することができる。添加物は、例えば、炭水化物、ポリオール、アミノ酸またはその塩、ポリアミノ酸またはその塩、糖酸またはその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、着香剤、香味成分、収斂化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、およびそれらの組み合わせとすることができる。
【０１４４】
１つの態様では、本開示は、甘味量のレバウジオシドＶを含む飲料製品に向けられる。１つの態様では、本開示は、甘味量のレバウジオシドＷを含む飲料製品に向けられる。１つの態様では、本開示は、甘味量のレバウジオシドＫＡを含む飲料製品に向けられる。１つの態様では、本開示は、甘味量のレバウジオシドＧを含む飲料製品に向けられる。１つの態様では、本開示は、甘味量のレバウジオシドＭを含む飲料製品に向けられる。
【０１４５】
飲料製品は、例えば、炭酸飲料製品および非炭酸飲料製品とすることができる。飲料製品はまた、例えば、ソフトドリンク、ファウンテン飲料、フローズン飲料；レディ・トゥ・ドリンク飲料；フローズンおよびレディ・トゥ・ドリンク飲料、コーヒー、紅茶、乳飲料、粉末ソフトドリンク、液体濃縮物、フレーバー・ウォーター、強化水、フルーツジュース、フルーツジュースフレーバードリンク、スポーツドリンク、およびエネルギードリンクとすることができる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本開示の飲料製品は、例えば、酸味料、フルーツジュースおよび／または野菜ジュース、パルプ、など、香味料、着色剤、保存剤、ビタミン、ミネラル、電解質、エリスリトール、タガトース、グリセリン、および二酸化炭素などの１つ以上の飲料成分を含むことができる。そのような飲料製品は、任意の好適な形態、例えば飲料濃縮物および炭酸、レディ・トゥ・ドリンク飲料で提供され得る。
【０１４７】
ある一定の実施形態では、本開示の飲料製品は、多くの異なる特定の製剤または構成物のいずれかを有することができる。本開示の飲料製品の製剤は、製品の意図される市場区分、その所望の栄養特性、香味プロファイル、などの因子によって、ある程度まで変動し得る。例えば、ある一定の実施形態では、一般に、さらなる成分を特定の飲料製品の製剤に添加することが選択肢となり得る。例えば、追加の（すなわち、より多くのおよび／または他の）甘味料を添加することができ、香味料、電解質、ビタミン、フルーツジュースまたは他のフルーツ製品、味物質、マスキング剤など、うま味調味料、および／または炭酸化は、典型的には味覚、食感、栄養特性、などを変えるために、任意のそのような製剤に添加され得る。実施形態では、飲料製品は、水、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍのレバウジオシドＶ、酸味料、および香味料を含むコーラ飲料とすることができる。実施形態では、飲料製品は、水、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍのレバウジオシドＷ、酸味料、および香味料を含むコーラ飲料とすることができる。実施形態では、飲料製品は、水、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍのレバウジオシドＭ、酸味料、および香味料を含むコーラ飲料とすることができる。例示的な香味料は、例えば、コーラ香味料、柑橘類香味料、およびスパイス香味料とすることができる。いくつかの実施形態では、二酸化炭素の形態での炭酸化が泡立ちのために添加され得る。他の実施形態では、保存剤は、他の成分、生成技術、所望の保存可能期間、などによって添加することができる。ある一定の実施形態では、カフェインは添加することができる。いくつかの実施形態では、飲料製品は特質上、炭酸水、甘味料、コーラ・ナッツ抽出物および／または他の香味料、カラメル着色剤、１つ以上の酸、および任意で他の成分を含む、コーラ風味の炭酸飲料とすることができる。
【０１４８】
飲料製品中に存在するレバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、またはレバウジオシドＧの好適な量は、例えば、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍとすることができる。いくつかの実施形態では、低濃度、例えば、１００ｐｐｍ未満のレバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、またはレバウジオシドＧは１０，０００ｐｐｍ〜３０，０００ｐｐｍの濃度を有するスクロース溶液に等しい甘味を有する。最終濃度は、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約９５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約９０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約８５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約８０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約７５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約７０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約６５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約６０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約５５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約５０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約４５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約４０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約３５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約３０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約２０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約１５ｐｐｍ、または約５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍの範囲である。あるいは、レバウジオシドＶまたはレバウジオシドＷは、本開示の飲料製品中に約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約１０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約１５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約２５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約３０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約３５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約４０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約４５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約５０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約５５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約６０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約６５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約７０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約７５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約８０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約８５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約９０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、または約９５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍの範囲の最終濃度で存在することができる。
【０１４９】
別の態様では、本開示は、甘味量のレバウジオシドＶを含む摂取可能品に向けられる。別の態様では、本開示は、甘味量のレバウジオシドＷを含む摂取可能品に向けられる。別の態様では、本開示は、甘味量のレバウジオシドＫＡを含む摂取可能品に向けられる。別の態様では、本開示は、甘味量のレバウジオシドＧを含む摂取可能品に向けられる。別の態様では、本開示は、甘味量のレバウジオシドＭを含む摂取可能品に向けられる。摂取可能品は、例えば、食品、栄養補助食品、医薬品、健康補助食品、歯科用衛生学的組成物、可食ゲル組成物、化粧品および卓上用香味料とすることができる。
【０１５０】
本明細書では、「健康補助食品（複数可）」は、食事を補充し、および、食事において欠如しているまたは十分な量で消費することができない栄養分、例えばビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸、アミノ酸、などを提供することが意図される化合物を示す。当技術分野で知られている任意の好適な健康補助食品が使用され得る。好適な健康補助食品の例は、例えば、栄養分、ビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸、ハーブ、植物、アミノ酸、および代謝産物とすることができる。
【０１５１】
本明細書では、「栄養補助食品（複数可）」は、薬用または健康効果を提供し得る任意の食品または食品の一部を含む化合物を示し、薬用または健康効果は疾患または障害（例えば、疲労、不眠、老化作用、記憶喪失、気分障害、心血管疾患および血液中の高レベルのコレステロール、糖尿病、骨粗鬆症、炎症、自己免疫障害、など）の防止および／または治療が挙げられる。当技術分野で知られている任意の好適な栄養補助食品が使用され得る。いくつかの実施形態では、栄養補助食品は食品および飲料に対するサプリメントとして、および、固体製剤、例えばカプセルまたは錠剤、液体製剤、例えば溶液または懸濁液であり得る、経腸または非経口用途のための医薬製剤として使用することができる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、健康補助食品および栄養補助食品は、保護親水コロイド（例えばガム、タンパク質、加工デンプン）、バインダ、膜形成剤、カプセル化剤／材料、壁／シェル材料、マトリクス化合物、コーティング、乳化剤、表面活性剤、可溶化剤（油、脂肪、ワックス、レシチン、など）、吸着剤、担体、フィラー、共化合物、分散剤、湿潤剤、加工助剤（溶媒）、流動化剤、味覚−マスキング剤、増量剤、ゼリー化剤、ゲル形成剤、抗酸化剤および抗菌薬をさらに含むことができる。
【０１５３】
本明細書では、「ゲル」は、粒子のネットワークが液体媒体の体積に及ぶコロイド系を示す。ゲルは主に液体から構成され、よって、液体と同様の密度を示すが、ゲルは液体媒体に及ぶ粒子のネットワークのために、固体の構造コヒーレンスを有する。この理由のために、ゲル一般に、固体、ゼリー様材料であるように見える。ゲルは、多くの用途で使用することができる。例えば、ゲルは食品、塗料、および接着剤中で使用することができる。食することができるゲルは「可食ゲル組成物」と呼ぶことができる。可食ゲル組成物は典型的には、軽食として、デザートとして、主食の一部として、または主食と共に食される。好適な可食ゲル組成物の例は、例えば、ゲルデザート、プディング、ジャム、ゼリー、ペースト、トライフル、アスピック、マシュマロ、グミ、などとすることができる。いくつかの実施形態では、可食ゲルミックスは一般に、粉末または顆粒状固体であり、これに流体が添加され、可食ゲル組成物が形成され得る。好適な流体の例は、例えば、水、乳製品流体、乳製品類似流体、ジュース、アルコール、アルコール飲料、およびそれらの組み合わせとすることができる。好適な乳製品流体の例は、例えば、乳、発酵乳、クリーム、流体乳清、およびそれらの混合物とすることができる。好適な乳製品類似流体の例は、例えば、大豆乳および乳成分を含まないコーヒー用クリームとすることができる。
【０１５４】
本明細書では、「ゲル化成分」という用語は、液体媒体内でコロイド系を形成することができる任意の材料を示す。好適なゲル化成分の例は、例えば、ゼラチン、アルギン酸塩、カラゲナン（ｃａｒａｇｅｅｎａｎ）、ガム、ペクチン、コンニャク、寒天、食品酢（ｆｏｏｄ  ａｃｉｄ）、レンネット、デンプン、デンプン誘導体、およびそれらの組み合わせとすることができる。可食ゲルミックスまたは可食ゲル組成物中で使用されるゲル化成分の量は、例えば、使用される特定のゲル化成分、使用される特定の流体塩基、およびゲルの所望の特性などの多くの因子によって、かなり変動し得ることは、当業者によく知られている。
【０１５５】
本開示のゲルミックスおよびゲル組成物は、当技術分野で知られている任意の好適な方法により調製することができる。いくつかの実施形態では、本開示の可食ゲルミックスおよび可食ゲル組成物は、ゲル化剤に加えて他の成分を使用して調製することができる。他の好適な成分の例は、例えば、食品酢、食品酢の塩、緩衝系、増量剤、捕捉剤、架橋剤、１つ以上の香味、１つ以上の色、およびそれらの組み合わせとすることができる。
【０１５６】
当技術分野で知られている任意の好適な医薬組成物が使用され得る。ある一定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍのレバウジオシドＶ、および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。ある一定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍのレバウジオシドＷ、および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。ある一定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍのレバウジオシドＫＡ、および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。ある一定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍのレバウジオシドＧ、および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。ある一定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍのレバウジオシドＭ、および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、生物学的効果を発揮する１つ以上の活性剤を含む医薬品を製剤化するために使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、生物学的効果を発揮する１つ以上の活性剤を含むことができる。好適な活性剤は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）。そのような組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  ＵＳＡに記載されるように、当技術分野でよく知られた手順に従い調製することができる。
【０１５７】
レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、またはレバウジオシドＧは、当技術分野で知られている任意の好適な歯科用および経口衛生組成物と共に使用することができる。好適な歯科用および経口衛生組成物の例は、例えば、練り歯磨き、トゥースポリッシュ、デンタルフロス、口腔洗浄薬、マウスリンス、歯磨剤（ｄｅｎｔｒｉｆｉｃｅ）、マウススプレー、マウスリフレッシャー、プラークリンス、歯科用鎮静薬、などとすることができる。
【０１５８】
摂取可能品中に存在するレバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、またはレバウジオシドＧの好適な量は、例えば、約５パーツ・パー・ミリオン（ｐｐｍ）〜約１００パーツ・パー・ミリオン（ｐｐｍ）とすることができる。いくつかの実施形態では、低濃度、例えば、１００ｐｐｍ未満のレバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、またはレバウジオシドＧは、１０，０００ｐｐｍ〜３０，０００ｐｐｍの濃度を有するスクロース溶液に等しい甘味を有する。最終濃度は約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約９５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約９０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約８５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約８０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約７５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約７０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約６５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約６０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約５５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約５０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約４５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約４０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約３５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約３０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約２０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約１５ｐｐｍ、または約５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍの範囲である。あるいは、レバウジオシドＶまたはレバウジオシドＷは、本開示の摂取可能製品中に、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約１０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約１５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約２５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約３０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約３５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約４０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約４５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約５０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約５５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約６０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約６５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約７０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約７５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約８０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約８５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約９０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、または約９５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍの範囲の最終濃度で存在することができる。
【０１５９】
ある一定の実施形態では、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍのレバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、またはレバウジオシドＧが食品組成物中に存在する。本明細書では、「食品組成物（複数可）」は、栄養価を有することができるが、その必要はなく、ヒトおよび動物による消費を目的とした任意の固体または液体の摂取可能な材料を示す。
【０１６０】
好適な食品組成物の例は、例えば、下記とすることができる：菓子組成物、例えばキャンディ、ミント、果物風味ドロップ、ココア製品、チョコレート、など；香辛料、例えばケチャップ、マスタード、マヨネーズ、など；チューインガム；穀類組成物；焼いた食品、例えばパン、ケーキ、パイ、クッキー、など；乳製品、例えば乳、チーズ、クリーム、アイスクリーム、サワークリーム、ヨーグルト、シャーベット、など；卓上用甘味料組成物；スープ；シチュー；インスタント食品；食肉、例えばハム、ベーコン、ソーセージ、ジャーキー、など；ゼラチンおよびゼラチン様製品、例えばジャム、ゼリー、貯蔵食料、など；果実；野菜；卵製品；アイシング；糖蜜を含むシロップ；軽食；ナッツミートおよびナッツ製品；ならびに動物飼料。
【０１６１】
食品組成物はまた、ハーブ、スパイスおよび調味料、天然および合成香味、ならびにうま味調味料、例えばグルタミン酸ナトリウムとすることができる。いくつかの実施形態では、食品組成物は、例えば、調製されたパッケージ製品、例えばダイエット用甘味料、液体甘味料、粒状香味ミックス、ペット用食品、家畜用食品、タバコ、およびベーキング用途用の材料、例えばパン、クッキー、ケーキ、パンケーキ、ドーナツなどの調製のための粉末ベーキングミックスとすることができる。他の実施形態では、食品組成物はまた、スクロースをほとんど、または全く含まないダイエット用および低カロリー食品および飲料とすることができる。
【０１６２】
前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、またはレバウジオシドＧは唯一の甘味料であり、前記製品は、約１％〜約４％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液に等しい甘味度を有する。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、摂取可能製品および飲料製品はさらに、追加の甘味料を含むことができ、ここで、製品は約１％〜約１０％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液に等しい甘味度を有する。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、製品中の全ての甘味成分は高甘味度甘味料である。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、製品中の全ての甘味成分は天然高甘味度甘味料とすることができる。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、追加の甘味料は、下記から選択される１つ以上の甘味料を含む：ステビア抽出物、ステビオール配糖体、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＤ２、レバウジオシドＦ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ＡｃｅＫ、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン（ＮａｒＤＨＣ）、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）、ルブソシドモグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＶ、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、Ｌ−アラニン、グリシン、羅漢果、ヘルナンズルチン、フィロズルチン、トリロブタイン、およびそれらの組み合わせ。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、摂取可能製品および飲料製品はさらに、下記から選択される１つ以上の添加物を含むことができる：炭水化物、ポリオール、アミノ酸またはその塩、ポリアミノ酸またはその塩、糖酸またはその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、着香剤、香味成分、収斂化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、およびそれらの組み合わせ。前記実施形態のいずれかと組み合わせることができるある一定の実施形態では、レバウジオシドＤ２は、製品中に添加される前には、約５０重量％〜約１００重量％の純度を有する。
【０１６３】
甘味料
別の態様では、本開示は、下記化学構造から構成される甘味料に向けられる：
【化５】
0006774945.tif 000010
【０１６４】
別の態様では、本開示は、下記化学構造から構成される甘味料に向けられる：
【化６】
0006774945.tif 000011
【０１６５】
別の態様では、本開示は、下記化学構造から構成される甘味料に向けられる：
【化７】
0006774945.tif 000012
【０１６６】
別の態様では、本開示は、下記化学構造から構成される甘味料に向けられる：
【化８】
0006774945.tif 000013
【０１６７】
別の態様では、本開示は、下記化学構造から構成される甘味料に向けられる：
【化９】
0006774945.tif 000014
【０１６８】
ある一定の実施形態では、甘味料はさらに、フィラー、増量剤および固化防止剤の少なくとも１つを含むことができる。好適なフィラー、増量剤および固化防止剤は当技術分野で知られている。
【０１６９】
ある一定の実施形態では、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、またはレバウジオシドＧ甘味料は、摂取可能製品および飲料製品を甘くする、かつ／またはその甘味を増強させるのに十分な最終濃度で含められ、および／または添加され得る。レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、またはレバウジオシドＧの「最終濃度」は、最終摂取可能製品および飲料製品中に（すなわち、全ての成分および／または化合物が添加され、摂取可能製品および飲料製品が生成された後）存在するレバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、またはレバウジオシドＧの濃度を示す。したがって、ある一定の実施形態では、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、またはレバウジオシドＧは、摂取可能製品および飲料製品を調製するために使用される化合物または成分に含まれる、かつ／または添加される。レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、またはレバウジオシドＧは単一化合物もしくは成分、または複数の化合物および成分中に存在し得る。他の実施形態では、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、またはレバウジオシドＧは摂取可能製品および飲料製品に含まれる、かつ／または添加される。ある一定の好ましい実施形態では、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、またはレバウジオシドＧは約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約９５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約９０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約８５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約８０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約７５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約７０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約６５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約６０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約５５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約５０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約４５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約４０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約３５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約３０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約２０ｐｐｍ、約５ｐｐｍ〜約１５ｐｐｍ、または約５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍの範囲の最終濃度で含まれる、かつ／または添加される。あるいは、レバウジオシドＶまたはレバウジオシドＷは、約５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約１０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約１５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約２５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約３０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約３５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約４０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約４５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約５０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約５５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約６０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約６５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約７０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約７５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約８０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約８５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約９０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、または約９５ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍの範囲の最終濃度で含まれる、かつ／または添加される。例えば、レバウジオシドＶまたはレバウジオシドＷは約５ｐｐｍ、約１０ｐｐｍ、約１５ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ、約２５ｐｐｍ、約３０ｐｐｍ、約３５ｐｐｍ、約４０ｐｐｍ、約４５ｐｐｍ、約５０ｐｐｍ、約５５ｐｐｍ、約６０ｐｐｍ、約６５ｐｐｍ、約７０ｐｐｍ、約７５ｐｐｍ、約８０ｐｐｍ、約８５ｐｐｍ、約９０ｐｐｍ、約９５ｐｐｍ、または約１００ｐｐｍ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の最終濃度で含まれる、かつ／または添加され得る。
【０１７０】
ある一定の実施形態では、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、またはレバウジオシドＧは摂取可能製品および飲料製品に含まれる、かつ／または添加される唯一の甘味料である。そのような実施形態では、摂取可能製品および飲料製品は、約１％〜約４％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液、約１％〜約３％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液、または約１％〜約２％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液に等しい甘味度を有する。あるいは、摂取可能製品および飲料製品は、約１％〜約４％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液、約２％〜約４％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液、約３％〜約４％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液、または約４％に等しい甘味度を有する。例えば、摂取可能製品および飲料製品は、約１％、約２％、約３％、または約４％（ｗ／ｖ−％）スクロース溶液（これらの値の間の任意の範囲を含む）に等しい甘味度を有し得る。
【０１７１】
本開示の摂取可能製品および飲料製品は、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＭ、またはレバウジオシドＧの混合物および１つ以上の本開示の甘味料を、望ましい甘味度、栄養的特性、味覚プロファイル、食感、または他の官能因子を達成するのに十分な比で含むことができる。
【０１７２】
下記非限定的な実施例を考慮すると、本開示はより完全に理解されるであろう。
【０１７３】
実施例
実施例１
この実施例では、全ての候補ＵＧＴ遺伝子の全長ＤＮＡ断片を合成した。
【０１７４】
具体的に、ｃＤＮＡを大腸菌発現のためにコドン最適化させた（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）。合成されたＤＮＡを細菌発現ベクターであるｐＥＴｉｔｅ  Ｎ−Ｈｉｓ  ＳＵＭＯ  Ｋａｎ  ベクターにクローン化した（Ｌｕｃｉｇｅｎ）。ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素（ＵＧＴ７６Ｇ１−ＡｔＳＵＳ１およびＥＵＧＴ１１−ＡｔＳＵＳ１）をコードするヌクレオチド配列のために、ＧＳＧ−リンカー（ヌクレオチド配列：ｇｇｔｔｃｔｇｇｔによりコードされる）を、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインをコードするヌクレオチド配列とシロイヌナズナ由来のスクロースシンターゼ１（ＡｔＳＵＳ１）をコードするヌクレオチド配列の間のフレームに挿入した。表２はタンパク質および配列識別子番号の概要を示す。
【表２】
0006774945.tif 000015
【０１７５】
各発現コンストラクトを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させ、これをその後、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地中、３７℃で、０．８〜１．０のＯＤ６００に到達するまで増殖させた。タンパク質発現を、１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導し、培養物をさらに１６℃で２２時間の間増殖させた。細胞を遠心分離により回収した（３，０００×ｇ；１０分；４℃）。細胞ペレットを収集し、直ちに使用するか、または−８０℃で貯蔵した。
【０１７６】
細胞ペレットを溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２５μｇ／ｍｌリゾチーム、５μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉ、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、および０．４％トリトンＸ−１００）中に再懸濁させた。細胞を超音波処理により４℃で破壊し、細胞デブリを遠心分離により浄化した（１８，０００×ｇ；３０分）。上清を平衡化（平衡化緩衝液：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール）Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）アフィニティーカラムにロードした。タンパク質試料のローディング後、カラムを、平衡化緩衝液で洗浄し、非結合汚染物質タンパク質を除去した。ＨｉｓタグＵＧＴ組換えポリペプチドを、２５０ｍＭイミダゾールを含む平衡化緩衝液により溶離させた。精製ＨＶ１（６１．４ｋＤ）、ＵＧＴ７６Ｇ１（６５．４ｋＤ）、ＡｔＳＵＳ１（１０６．３ｋＤ）、ＥＵＧＴ１１（６２ｋＤ）、ＵＧＴ７６Ｇ１−ＳＵＳ１（ＧＳ）（１５７．２５ｋＤ）およびＥＵＧＴ１１−ＡｔＳＵＳ１（１５５ｋＤ）融合タンパク質を、図２に示した。
【０１７７】
実施例２
この実施例では、候補ＵＧＴ組換えポリペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼ活性について、基質として試験されるステビオール配糖体を使用することによりアッセイした。
【０１７８】
典型的には、組換えポリペプチド（１０μｇ）を、２００μｌのインビトロ反応系において試験した。反応系は５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌステビオール配糖体基質、１ｍＭ  ＵＤＰ−グルコースを含む。反応を３０℃で実施し、２００μＬの１−ブタノールを添加することにより終結させた。試料を３回２００μＬの１−ブタノールで抽出した。プールした画分を乾燥させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析のために７０μＬの８０％メタノールに溶解した。ルブソシド（９９％、Ｂｌｕｅ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＣＡ）、精製Ｒｅｂ  Ｇ（９８．８％）、Ｒｅｂ  ＫＡ（９８．４％）およびＲｅｂ  Ｖ（８０％）を、インビトロ反応において基質として使用した。
【０１７９】
ＵＧＴに触媒されたグリコシル化反応を、スクロースシンターゼ（例えばＡｔＳＵＳ１）により触媒されるＵＤＰ−グルコース生成反応にカップリングさせた。この方法では、ＵＤＰ−グルコースがスクロースおよびＵＤＰから生成され、そのため、余分のＵＤＰ−グルコースの添加が省略され得る。アッセイでは、組換えＡｔＳＵＳ１をＵＧＴ反応系に添加し、ＵＤＰ−グルコースはＵＤＰから再生させることができる。ＡｔＳＵＳ１配列（Ｂｉｅｎｉａｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２００７，  ４９：  ８１０−８２８）を合成し、細菌発現ベクターに挿入した。組換えＡｔＳＵＳ１タンパク質を発現させ、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０１８０】
ＨＰＬＣ分析を、クォータナリポンプ、温度制御カラムコンパートメント、オートサンプラーおよびＵＶ吸光度検出器を含むＤｉｏｎｅｘ  ＵＰＬＣ  ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００システム（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて実施した。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ＮＨ２、Ｌｕｎａ  Ｃ１８またはＳｙｎｅｒｇｉ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰカラム（ガードカラムを有する）を、ステビオール配糖体のキャラクタリゼーションのために使用した。アセトニトリルを含む水またはＮａ３ＰＯ４緩衝液を、ＨＰＬＣ分析における定組成溶離のために使用した。検出波長を２１０ｎｍとした。
【０１８１】
実施例３
この実施例では、ＡｔＳＵＳ１を用いたまたは用いない全ての反応条件において、、組換えＨＶ１ポリペプチドを、糖部分をルブソシドに転移させ、レバウジオシドＫＡが生成させることについて分析した（“Ｍｉｎｏｒ  ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｌｅａｖｅｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ”．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  （２０１４），  ７７（５），  １２３１−１２３５）。
【０１８２】
図３に示されるように、ＡｔＳＵＳ１を用いたまたは用いない全ての反応条件において、組換えＨＶ１ポリペプチドは糖部分をルブソシドに転移させ、Ｒｅｂ  ＫＡを生成させた。ルブソシドはＲｅｂ  ＫＡおよびＲｅｂ  Ｅに、組換えＨＶ１によりＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応系において、完全に変換された（Ｇ、Ｉ）。しかしながら、組換えＨＶ１ポリペプチド単独で、ＡｔＳＵＳ１へのカップリングなしでは、一部のルブソシド（ｒｕｂｏｓｏｓｉｄｅ）のみがＲｅｂ  ＫＡに、２４時間後に（Ｈ）変換され、ＡｔＳＵＳ１はＵＧＴ−ＳＵＳカップリング系において変換効率を増強させたことが示された。ＨＶ１−ＡｔＳＵＳ１カップリング反応系では、生成されたＲｅｂ  ＫＡは、連続してＲｅｂ  Ｅに変換され得る。
【０１８３】
実施例４
この実施例では、ＨＶ１活性を、Ｒｅｂ  Ｅを基質として用いて分析した。
【０１８４】
Ｒｅｂ  Ｅ基質（０．５ｍｇ／ｍｌ）を、組換えＨＶ１ポリペプチド（２０μｇ）およびＡｔＳＵＳ１（２０μｇ）と共に、ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応系（２００μＬ）において、上記実施例で使用されるものと同様の条件下でインキュベートした。図４に示されるように、ＲｅｂＺが、組換えＨＶ１ポリペプチドおよびＡｔＳＵＳ１の組み合わせにより生成された。これらの結果から、ＨＶ１は、グルコース部分をＲｅｂ  Ｅに転移させ、ＲＺを形成させることができることが示された。図４は、レバウジオシドＺ（「ＲｅｂＺ」）は、組換えＨＶ１ポリペプチドおよび組換えＡｔＳＵＳ１により、ＨＶ１−ＡｔＳＵＳ１カップリング反応系において触媒され、レバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）から生成させることができることを示す。ＨＶ１はグルコースをＲｅｂ  Ｅに転移させＲｅｂＺ、６０：４０〜７０：３０の比のＲｅｂＺ１およびＲｅｂＺ２の混合物を生成させることができる（米国仮特許出願第６１／８９８，５７１号、Ｃｏｎａｇｅｎ  Ｉｎｃ．に譲渡）。
【０１８５】
実施例５
この実施例では、Ｒｅｂ  ＫＡのＲｅｂ  Ｅへの変換を確認するために、精製Ｒｅｂ  ＫＡ基質を、組換えＨＶ１と共に、ＡｔＳＵＳ１ありまたはなしでインキュベートした。図５に示されるように、Ｒｅｂ  Ｅは組換えＨＶ１ポリペプチドにより、両方の反応条件において生成された。しかしながら、ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応系におけるＡｔＳＵＳ１ポリペプチドは反応効率を増強することができる。全てのＲｅｂ  ＫＡ基質は、ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング系においてＲｅｂ  Ｅに完全に変換され得る（Ｄ）。
【０１８６】
実施例６
この実施例では、ＥＵＧＴ１１活性を、ルブソシドを基質として用いて分析した。
【０１８７】
図６に示されるように、ＥＵＧＴ１１は、ＡｔＳＵＳ１を用いたまたは用いない全ての反応条件において、糖部分をルブソシドに転移させ、Ｒｅｂ  ＫＡおよびステビオシドを生成させることができる。ＡｔＳＵＳ１はＵＧＴ−ＳＵＳカップリング系において変換効率を増強させた。ＨＶ１−ＡｔＳＵＳ１カップリング反応系では、Ｒｅｂ  Ｅは、ＥＵＧＴ１１により連続して変換され得る。ＥＵＳ融合タンパク質は同じ反応条件下でより高い活性を示した。生成されたＲｅｂ  ＫＡおよびステビオシドは全て、ＥＵＳにより４８時間で、Ｒｅｂ  Ｅに完全に変換された。Ｒｅｂ  Ｅは、連続してＲｅｂ  Ｄ２に変換され得る。
【０１８８】
実施例７
この実施例では、ＥＵＧＴ１１活性を、Ｒｅｂ  ＫＡを基質として用いて分析した。
【０１８９】
ＥＵＧＴ１１は１，２−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を有するＵＧＴであり、関連するステビオール配糖体を生成させる（ＰＣＴ公開出願ＷＯ２０１３／０２２９８９号、Ｅｖｏｌｖａ  ＳＡに譲渡）。例えば、ＥＵＧＴ１１は、ステビオシドからＲｅｂ  Ｅを生成させる反応を触媒することができる。ＥＵＧＴ１１はまた、１，６−１３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を有し、グルコース分子をレバウジオシドＥに転移させ、レバウジオシドＤ２を形成させることができる（ＵＳ特許出願番号第１４／２６９，４３５号、Ｃｏｎａｇｅｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）。実験では、我々は、ＥＵＧＴ１１はグルコース残基をＲｅｂ  ＫＡに転移させ、Ｒｅｂ  Ｅを形成させることができることを見出した。図７に示されるように、ＥＵＧＴ１１は、ＡｔＳＵＳ１用いた（Ｅ、Ｈ）、または用いない（Ｄ、Ｇ）全ての反応条件において、糖部分をＲｅｂ  ＫＡに転移させ、Ｒｅｂ  Ｅを生成させることができる。ＡｔＳＵＳ１はＵＧＴ−ＳＵＳカップリング系において変換効率を増強させた（Ｅ、Ｈ）。ＥＵＧＴ１１−ＡｔＳＵＳ１カップリング反応系（Ｅ、Ｈ）およびＥＵＳ融合反応系（Ｆ、Ｉ）では、全てのＲｅｂ  ＫＡが完全に変換され、生成されたＲｅｂ  Ｅは、連続してＲｅｂ  Ｄ２に変換され得る。
【０１９０】
実施例８
この実施例では、ＵＧＴ７６Ｇ１活性を、ルブソシドを基質として用いて分析した。
【０１９１】
ＵＧＴ７６Ｇ１は１，３−１３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を有し、グルコース分子をステビオシドに転移させ、レバウジオシドＡを形成させ、およびＲｅｂ  Ｅに転移させ、レバウジオシドＤを形成させることができる。実施例では、我々はＵＧＴ７６Ｇ１はグルコース残基をルブソシドに転移させレバウジオシドＧを形成させることができることを見出した。
【０１９２】
図８に示されるように、ＵＧＴ７６Ｇ１は、全ての反応条件において、ＡｔＳＵＳ１（Ｄ、Ｇ）を用いて、または（Ｃ、Ｆ）用いずに、糖部分をルブソシドに転移させ、Ｒｅｂ  Ｇを生成させることができる。ＡｔＳＵＳ１はＵＧＴ−ＳＵＳカップリング系において変換効率を増強させた。ＧＳ融合タンパク質は、同じ反応条件下でより高い活性を示した（Ｅ、Ｈ）。全てのルブソシドが、ＧＳにより１２時間でＲｅｂ  Ｇに完全に変換された（Ｅ）。
【０１９３】
実施例９
この実施例では、ＵＧＴ７６Ｇ１活性を、レバウジオシドＫＡを基質として用いて分析した。
【０１９４】
ＵＧＴ７６Ｇ１の酵素活性をさらに同定するために、インビトロアッセイを、レバウジオシドＫＡを基質として用いて実施した。驚いたことに、新規ステビオール配糖体（レバウジオシドＶ「Ｒｅｂ  Ｖ」）が早期に生成された。より遅い時間点で、反応において生成されたＲｅｂ  Ｖが別の新規ステビオール配糖体に変換された（レバウジオシドＷ「Ｒｅｂ  Ｗ」）。
【０１９５】
図９に示されるように、ＵＧＴ７６Ｇ１は、ＡｔＳＵＳ１を用いた（Ｆ、Ｉ）または用いない（Ｅ、Ｈ）全ての反応条件において、糖部分をＲｅｂ  ＫＡに転移させ、Ｒｅｂ  Ｖを生成させることができる。ＡｔＳＵＳ１はＵＧＴ−ＳＵＳカップリング系において変換効率を増強させた（Ｆ、Ｉ）。ＵＧＴ７６Ｇ１−ＡｔＳＵＳ１カップリング反応系（Ｉ）およびＧＳ融合反応系（Ｊ）において、生成されたＲｅｂ  Ｖは、１２時間でＲｅｂ  Ｗに完全に変換された。
【０１９６】
実施例１０
この実施例では、ＵＧＴ７６Ｇ１活性を、Ｒｅｂ  Ｖを基質として用いて分析した。
【０１９７】
基質としての精製Ｒｅｂ  Ｖを反応系に導入した。図１０に示されるようにＣ、Ｒｅｂ  Ｖは驚いたことにＵＧＴ７６Ｇ１組換えポリペプチドによりＵＧＴ−ＳＵＳ１カップリング系において６時間で、Ｒｅｂ  Ｗに完全に変換された。
【０１９８】
実施例１１
この実施例では、ＨＶ１活性を、Ｒｅｂ  Ｇを基質として用いて分析した。
【０１９９】
図１１に示されるように、組換えＨＶ１ポリペプチドは、ＡｔＳＵＳ１を用いたまたは用いない全ての反応条件において、糖部分をレバウジオシドＧに転移させ、Ｒｅｂ  Ｖを生成させた。Ｒｅｂ  Ｇは、組換えＨＶ１によりＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応系において、Ｒｅｂ  Ｖに完全に変換された（Ｅ、Ｇ）。しかしながら、組換えＨＶ１ポリペプチド単独で、ＡｔＳＵＳ１へのカップリングなしでは、２４時間後に、Ｒｅｂ  Ｇの一部のみがＲｅｂ  Ｖに変換され（Ｆ）、ＡｔＳＵＳ１はＵＧＴ−ＳＵＳカップリング系において変換効率を増強させたことが示された。
【０２００】
実施例１２
この実施例では、ＥＵＧＴ１１活性を、Ｒｅｂ  Ｇを基質として用いて分析した。
【０２０１】
図１２に示されるように、組換えＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、ＡｔＳＵＳ１を用いた（Ｆ、Ｉ）または用いない（Ｅ、Ｈ）全ての反応条件において、糖部分をレバウジオシドＧに転移させ、Ｒｅｂ  Ｖを生成させた。より多くのＲｅｂ  Ｇが、組換えＥＵＧＴ１１によりＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応系において、Ｒｅｂ  Ｖに変換された（Ｆ、Ｉ）。しかしながら、組換えＥＵＧＴ１１ポリペプチド単独で、ＡｔＳＵＳ１へのカップリングなしでは、Ｒｅｂ  Ｇの一部のみがＲｅｂ  Ｖに変換され（Ｅ、Ｈ）、ＡｔＳＵＳ１はＵＧＴ−ＳＵＳカップリング系において変換効率を増強させたことが示された。ＥＵＳ融合タンパク質は、同じ反応条件下でより高い活性を示した（Ｇ、Ｊ）。反応系内の全てのＲｅｂ  Ｇは、ＥＵＳにより２４時間でＲｅｂ  Ｖに完全に変換された（Ｊ）。
【０２０２】
実施例１３
この実施例では、ＵＧＴ７６Ｇ１と組み合わせたＨＶ１の活性を、ルブソシドを基質として用いて分析した。
【０２０３】
ルブソシド（Ｒｅｂｕｓｏｓｉｄｅ）基質を、組換えＨＶ１ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｇ１、およびＡｔＳＵＳ１と共に、ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応系において、上記実施例で使用されるものと同様の条件下でインキュベートした。生成物をＨＰＬＣにより分析した。図１３に示されるように、Ｒｅｂ  ＶおよびＲｅｂ  Ｗが、組換えＨＶ１ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｇ１、およびＡｔＳＵＳ１の組み合わせにより生成された。よって、組換えＨＶ１ポリペプチドは、１，２−１９−Ｏ−グルコースおよび１，２−１３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を示したが、これは、他のＵＧＴ酵素（例えばＵＧＴ７６Ｇ１、これは１，３−１３−Ｏ−グルコースおよび１，３−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を示した）と組み合わせて、ステビオール配糖体の複雑な、多段階生合成のために使用することができる。ＨＶ１組換えタンパク質をＧＳ融合タンパク質と反応系において組み合わせた場合、Ｒｅｂ  ＶおよびＲｅｂ  Ｗはまた、これらのＵＧＴ酵素により生成され、ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応はＧＳ融合タンパク質により生じ得ることが示された。
【０２０４】
実施例１４
この実施例では、ＵＧＴ７６Ｇ１と組み合わせたＥＵＧＴ１１の活性を、ルブソシドを基質として用いて分析した。
【０２０５】
ルブソシド（Ｒｅｂｕｓｏｓｉｄｅ）基質を、組換えＥＵＧＴ１１ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｇ１、およびＡｔＳＵＳ１と共にＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応系において上記実施例で使用されるものと同様の条件下でインキュベートした。生成物をＨＰＬＣにより分析した。図１４に示されるように、Ｒｅｂ  Ｗが、組換えＥＵＧＴ１１ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｇ１、およびＡｔＳＵＳ１の組み合わせにより生成された。よって、組換えＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、１，２−１９−Ｏ−グルコースおよび１，２−１３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を示したが、これは、他のＵＧＴ酵素（例えばＵＧＴ７６Ｇ１、これは１，３−１３−Ｏ−グルコースおよび１，３−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を示した）と組み合わせて、ステビオール配糖体の複雑な、多段階生合成のために使用することができる。ＥＵＧＴ１１組換えタンパク質をＧＳ融合タンパク質と反応系において組み合わせた場合、Ｒｅｂ  Ｗはまた、これらのＵＧＴ酵素により生成され、ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応はＧＳ融合タンパク質により生じ得ることが示された。
【０２０６】
実施例１５
この実施例では、ＵＧＴ７６Ｇ１と組み合わせたＨＶ１の活性を、Ｒｅｂ  Ｇを基質として使用して分析した。
【０２０７】
Ｒｅｂ  Ｇ基質を、組換えＨＶ１ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｇ１、およびＡｔＳＵＳ１と共にＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応系において、上記実施例で使用されるものと同様の条件下でインキュベートした。生成物をＨＰＬＣにより分析した。図１５に示されるように、Ｒｅｂ  ＶおよびＲｅｂ  Ｗが、組換えＨＶ１ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｇ１、およびＡｔＳＵＳ１の組み合わせにより生成された。１２時間後、全てのルブソシド基質がＲｅｂ  Ｖに変換され、３６時間後、全ての生成されたＲｅｂ  ＶがＲｅｂ  Ｗに変換された。よって、組換えＨＶ１ポリペプチドは１，２−１９−Ｏ−グルコースおよび１，２−１３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を示したが、これは、他のＵＧＴ酵素（例えばＵＧＴ７６Ｇ１、これは１，３−１３−Ｏ−グルコースおよび１，３−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を示した）と組み合わせて、ステビオール配糖体の複雑な、多段階生合成のために使用することができる。ＨＶ１組換えタンパク質をＧＳ融合タンパク質と反応系において組み合わせた場合、Ｒｅｂ  ＶおよびＲｅｂ  Ｗはまた、これらのＵＧＴ酵素により生成され、ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応はＧＳ融合タンパク質により生じ得ることが示された。
【０２０８】
実施例１６
この実施例では、ＵＧＴ７６Ｇ１と組み合わせたＥＵＧＴ１１の活性を、Ｒｅｂ  Ｇを基質として使用して分析した。
【０２０９】
Ｒｅｂ  Ｇ基質を、組換えＥＵＧＴ１１ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｇ１、およびＡｔＳＵＳ１と共にＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応系において、上記実施例で使用されるものと同様の条件下でインキュベートした。生成物をＨＰＬＣにより分析した。図１６に示されるように、Ｒｅｂ  Ｗが、組換えＥＵＧＴ１１ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｇ１、およびＡｔＳＵＳ１の組み合わせにより生成された。よって、組換えＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、１，２−１９−Ｏ−グルコースおよび１，２−１３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を示したが、これは、他のＵＧＴ酵素（例えばＵＧＴ７６Ｇ１、これは１，３−１３−Ｏ−グルコースおよび１，３−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を示した）と組み合わせて、ステビオール配糖体の複雑な、多段階生合成のために使用することができる。ＥＵＧＴ１１組換えタンパク質をＧＳ融合タンパク質と反応系において組み合わせた場合、Ｒｅｂ  Ｗはまた、これらのＵＧＴ酵素により生成され、ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応はＧＳ融合タンパク質により生じ得ることが示された。
【０２１０】
実施例１７
この実施例では、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＧＳ融合酵素活性を、Ｒｅｂ  Ｄを基質として用いて分析した。
【０２１１】
Ｒｅｂ  Ｄ基質を、組換えＵＧＴ７６Ｇ１と共に、上記実施例で使用されるものと同様の条件下でインキュベートした。生成物をＨＰＬＣにより分析した。図２２に示されるように、Ｒｅｂ  Ｍが、反応において、ＵＧＴ７６Ｇ１によりＡｔＳＵＳ１を用いて（図２２ＤおよびＧ）または用いずに生成された（図２２ＣおよびＦ）。よって、組換えＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドは１，３−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を示したが、これはレバウジオシドＭの生合成において使用することができる。Ｒｅｂ  Ｄは、組換えＵＧＴ７６Ｇ１によりＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応系において、Ｒｅｂ  Ｍに完全に変換された（図２２Ｇ）。しかしながら、組換えＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド単独で、ＡｔＳＵＳ１へのカップリングなしでは、６時間後に、Ｒｅｂ  Ｄの一部のみがＲｅｂ  Ｍに変換され（Ｆ）、ＡｔＳＵＳ１はＵＧＴ−ＳＵＳカップリング系において変換効率を増強させたことが示された。ＧＳ融合タンパク質は、同じ反応条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１−ＡｔＳＵＳ１カップリング反応と同様の活性を示した（Ｅ、Ｈ）。全てのＲｅｂ  Ｄが、ＧＳにより６時間で、Ｒｅｂ  Ｍに完全に変換され（Ｈ）、ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応はＧＳ融合タンパク質により生じ得ることが示された。
【０２１２】
実施例１８
この実施例では、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＧＳ融合酵素の活性を、Ｒｅｂ  Ｅを基質として用いて分析した。
【０２１３】
Ｒｅｂ  Ｅ基質を、組換えＵＧＴ７６Ｇ１またはＧＳ融合酵素と共に、上記実施例で使用されるものと同様の条件下でインキュベートした。生成物をＨＰＬＣにより分析した。図２３に示されるように、Ｒｅｂ  Ｄが、ＵＧＴ７６Ｇ１によりＡｔＳＵＳ１を用いて（図２３Ｅ、ＨおよびＫ）または用いずに（図２２Ｄ、ＧおよびＪ）、またＧＳ融合酵素により（図２３Ｆ、ＩおよびＬ）反応において生成された。さらに、Ｒｅｂ  Ｍが反応において生成されたＲｅｂ  Ｄから形成された。よって、組換えＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドは１，３−１３−Ｏ−グルコースおよび１，３−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を示したが、これはレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭの生合成において使用することができる。Ｒｅｂ  Ｅは、組換えＵＧＴ７６Ｇ１によりＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応系において２４時間後、Ｒｅｂ  Ｍに完全に変換された（図２３Ｋ）。しかしながら、組換えＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド単独でＡｔＳＵＳ１へのカップリングなしでは、２４時間後に、Ｒｅｂ  ＤのみがＲｅｂ  Ｅから完全に変換され（Ｊ）、ＡｔＳＵＳ１は、連続するＵＤＰＧ生成を通して、ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング系において変換効率を増強させたことが示された。ＧＳ融合タンパク質は、同じ反応条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１−ＡｔＳＵＳ１カップリング反応と同様の活性を示し（図２３Ｆ、ＩおよびＬ）、ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応はＧＳ融合タンパク質により生成され得ることが示された。
【０２１４】
実施例１９
この実施例では、ＵＧＴ７６Ｇ１と組み合わせたＨＶ１の活性を、ステビオシドを基質として使用して分析した。
【０２１５】
ステビオシド基質を、組換えＨＶ１ポリペプチドおよびＵＧＴ７６Ｇ１またはＧＳ融合酵素と共に、上記実施例で使用されるものと同様の条件下でインキュベートした。生成物をＨＰＬＣにより分析した。図２４に示されるように、Ｒｅｂ  Ａが、全ての反応において、組換えＨＶ１ポリペプチドおよびＵＧＴ７６Ｇ１の組み合わせにより生成された。さらに、Ｒｅｂ  ＤおよびＲｅｂ  Ｍが、組換えＨＶ１ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドおよびＡｔＳＵＳ１の組み合わせ（図２４Ｅ、ＨおよびＫ）または組換えＧＳ融合酵素およびＨＶ１ポリペプチドの組み合わせ（図２４Ｆ、ＩおよびＬ）を用いる反応において検出された。組換えＨＶ１ポリペプチドは１，２−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を示したが、これは、他のＵＧＴ酵素（例えばＵＧＴ７６Ｇ１、これは１，３−１３−Ｏ−グルコースおよび１，３−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を示した）と組み合わせて、レバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭの複雑な、多段階生合成のために使用することができる。結果から、ＡｔＳＵＳ１は、連続するＵＤＰＧ生成を通して、ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング系において変換効率を増強させたことも示された（図２４Ｅ、ＨおよびＫ）。ＧＳ融合タンパク質は、同じ反応条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１−ＡｔＳＵＳ１カップリング反応と同様の活性を示し（図２４Ｆ、ＩおよびＬ）、ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応はＧＳ融合タンパク質により生じ得ることが示された。
【０２１６】
実施例２０
この実施例では、ＵＧＴ７６Ｇ１と組み合わせたＨＶ１の活性をＲｅｂ  Ａを基質として使用して分析した。
【０２１７】
Ｒｅｂ  Ａ基質を、組換えＨＶ１ポリペプチドおよびＵＧＴ７６Ｇ１またはＧＳ融合酵素と共に、上記実施例で使用されるものと同様の条件下でインキュベートした。生成物をＨＰＬＣにより分析した。図２５に示されるように、Ｒｅｂ  Ｄが、全ての反応において、組換えＨＶ１ポリペプチドおよびＵＧＴ７６Ｇ１の組み合わせにより生成された。さらに、Ｒｅｂ  Ｍが、組換えＨＶ１ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドおよびＡｔＳＵＳ１の組み合わせ（図２５Ｄ、ＧおよびＪ）または組換えＧＳ融合酵素およびＨＶ１ポリペプチドの組み合わせ（図２５Ｅ、ＨおよびＫ）を用いる反応において検出された。組換えＨＶ１ポリペプチドは、１，２−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を示したが、これは、他のＵＧＴ酵素（例えばＵＧＴ７６Ｇ１、これは１，３−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を示した）と組み合わせて、レバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭの複雑な、多段階生合成のために使用することができる。結果から、ＡｔＳＵＳ１は、連続するＵＤＰＧ生成を通して、ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング系において変換効率を増強させたことも示された（図２５Ｄ、ＧおよびＪ）。ＧＳ融合タンパク質は、同じ反応条件下で、ＵＧＴ７６Ｇ１−ＡｔＳＵＳ１カップリング反応と同様の活性を示し（図２５Ｅ、ＨおよびＫ）、ＵＧＴ−ＳＵＳカップリング反応はＧＳ融合タンパク質により生じ得ることが示された。
【０２１８】
実施例２１
この実施例では、Ｒｅｂ  Ｖの構造をＮＭＲにより分析した。
【０２１９】
Ｒｅｂ  Ｖのキャラクタリゼーションのために使用する材料を、Ｒｅｂ  Ｇの酵素変換により生成させ、ＨＰＬＣにより精製した。ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＨＲＭＳ機器を用い、その分解能を３０ｋに設定して、ＨＲＭＳデータを生成させた。データを、ポジティブイオンエレクトロスプレーモードで、ｍ／ｚ１５０〜１５００にて走査した。ニードル電圧を４ｋＶに設定し；他の源条件は、シースガス＝２５、補助ガス＝０、スイープガス＝５（全てのガスは任意単位で流れる）、キャピラリー電圧＝３０Ｖ、キャピラリー温度＝３００℃、およびチューブレンズ電圧＝７５とした。試料を２：２：１アセトニトリル：メタノール：水（注入溶離液と同じ）で希釈し、５０マイクロリットルで射出させた。ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＤＲＸ５００ＭＨｚまたはＶａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ６００ＭＨｚ機器で標準パルスシークエンスを用いて取得した。１Ｄ（１Ｈおよび１３Ｃ）および２Ｄ（ＴＯＣＳＹ、ＨＭＱＣ、およびＨＭＢＣ）ＮＭＲスペクトルは、Ｃ５Ｄ５Ｎにおいて実施した。
【０２２０】
Ｒｅｂ  Ｖの分子式を、そのポジティブ高分解能（ＨＲ）質量スペクトルに基づいてＣ４４Ｈ７０Ｏ２３と推定した。そのスペクトルはｍ／ｚ９８９．４１９８で［Ｍ＋Ｎａ］＋に対応する付加イオンを示し；この組成は、１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルデータにより支持された。Ｒｅｂ  Ｖの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータは、δ０．９７および１．４０の２つのメチル一重線、環外二重結合のδ５．０６および５．７１の一重線としての２つのオレフィン性プロトン、δ０．７４−２．７２の間の９つのｓｐ３メチレンおよび２つのｓｐ３メチンプロトンの存在を示し、ステビア属から前に単離されたエント−カウランジテルペノイドに特徴的であった。エント−カウランジテルペノイドの基本骨格は、ＣＯＳＹおよびＴＯＣＳＹ研究により支持された。その研究は重要な相関を示した：Ｈ−１／Ｈ−２；Ｈ−２／Ｈ−３；Ｈ−５／Ｈ−６；Ｈ−６／Ｈ−７；Ｈ−９／Ｈ−１１；Ｈ−１１／Ｈ−１２。Ｒｅｂ  Ｖの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルはまた、δ５．０８、５．３８、５．５７、および６．２３で共鳴する４つのアノマープロトンの存在を示し；その構造内の４つの糖単位を示唆した。５％Ｈ２ＳＯ４によるＲｅｂ  Ｖの酸加水分解により、Ｄ−グルコースが得られ、これは、ＴＬＣによる標準品との直接比較により同定された。Ｒｅｂ  Ｖの酵素加水分解はアグリコンを提供し、これは、１Ｈ  ＮＭＲおよびｃｏ−ＴＬＣの標準化合物との比較によりステビオールとして同定された。δ５．０８（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、５．３８（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ）、５．５７（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ）、および６．２３（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）の、グルコース部分の４つのアノマープロトンについて観察された大きなカップリング定数はステビオール配糖体で報告されるそれらのβ−配向を示唆した。Ｒｅｂ  Ｖについての１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ値を、ＴＯＣＳＹ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣデータに基づいて割当て、表３に示す。
【表３】
0006774945.tif 000016
0006774945.tif 000017
【０２２１】
Ｒｅｂ  ＶのＮＭＲスペクトルデータおよび加水分解実験からの結果に基づき、その構造内に、アグリコンステビオールに連結された４つのβ−Ｄ−グルコシル単位が存在すると結論づけた。Ｒｅｂ  ＶのＲｅｂ  Ｇとの１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ値の厳密な比較により、エーテル結合の形態のＣ−１３の３−Ｏ−β−Ｄ−グルコビオシル単位および、第４のβ−Ｄ−グルコシル部分が割り当てられる、エステル結合の形態のＣ−１９位の別のβ−Ｄ−グルコシル単位を有するステビオールアグリコン部分の存在が示唆される（図１７）。β−Ｄ−グルコシル部分の糖Ｉの２−位での１Ｈおよび１３Ｃ化学シフトの両方での低磁場シフトは、この位置でのβ−Ｄ−グルコシル単位の存在を支持した。構造は、図１８に示される重要なＴＯＣＳＹおよびＨＭＢＣ相関によりさらに支持された。ＮＭＲおよび質量スペクトルデータならびに加水分解研究の結果に基づき、Ｒｅｂ  Ｇの酵素変換により生成されたＲｅｂ  Ｖの構造を１３−［（３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］エント−カウル−１６−エン−１９−オイック酸−（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）エステルと推定した。
【０２２２】
Ｒｅｂ  Ｖの酸加水分解．Ｒｅｂ  Ｖ（５ｍｇ）を含むＭｅＯＨ（１０ｍｌ）の溶液に、３ｍｌの５％Ｈ２ＳＯ４を添加し、混合物を２４時間還流させた。反応混合物をその後、飽和炭酸ナトリウムで中和し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（２×２５ｍｌ）で抽出し、糖を含む水性画分およびアグリコン部分を含むＥｔＯＡｃ画分を得た。水相を濃縮し、標準糖とＴＬＣ系ＥｔＯＡｃ／ｎ−ブタノール／水（２：７：１）およびＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／水（１０：６：１）を用いて比較し；糖をＤ−グルコースと同定した。
【０２２３】
Ｒｅｂ  Ｖの酵素加水分解．Ｒｅｂ  Ｖ（１ｍｇ）を１０ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５に溶解し、クロコウジカビ由来の粗ペクチナーゼ（５０μＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ２７３６）を添加した。混合物を５０℃で９６時間撹拌した。１の加水分解から反応中に沈殿した生成物を、そのｃｏ−ＴＬＣの標準化合物との比較および１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータによりステビオールと同定した。大規模１Ｄおよび２Ｄ  ＮＭＲならびに高分解能質量スペクトルデータおよび加水分解研究に基づいて、Ｒｅｂ  Ｖという名の化合物を、１３−［（３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］エント−カウル−１６−エン−１９−オイック酸−（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）エステルと確認した。
【０２２４】
実施例２２
この実施例では、Ｒｅｂ  Ｗの構造をＮＭＲにより分析した。
【０２２５】
Ｒｅｂ  Ｗのキャラクタリゼーションのために使用する材料をＲｅｂ  Ｖの酵素変換を使用して生成させ、ＨＰＬＣにより精製した。ＨＲＭＳデータをＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＨＲＭＳ機器を用い、その分解能を３０ｋに設定して生成させた。データを、ポジティブイオンエレクトロスプレーモードで、ｍ／ｚ１５０〜１５００にて走査した。ニードル電圧を４ｋＶに設定し；他の源条件は、シースガス＝２５、補助ガス＝０、スイープガス＝５（全てのガスは任意単位で流れる）、キャピラリー電圧＝３０Ｖ、キャピラリー温度＝３００℃、およびチューブレンズ電圧＝７５とした。試料を２：２：１アセトニトリル：メタノール：水（注入溶離液と同じ）で希釈し、５０マイクロリットルで射出させた。ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＤＲＸ５００ＭＨｚまたはＶａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ６００ＭＨｚ機器で標準パルスシークエンスを用いて獲得した。１Ｄ（１Ｈおよび１３Ｃ）および２Ｄ（ＴＯＣＳＹ、ＨＭＱＣ、およびＨＭＢＣ）ＮＭＲスペクトルは、Ｃ５Ｄ５Ｎにおいて実施した。
【０２２６】
Ｒｅｂ  Ｗの分子式を、そのポジティブ高分解能（ＨＲ）質量スペクトルに基づいてＣ５０Ｈ８０Ｏ２８と推定した。そのスペクトルはｍ／ｚ１１５１．４７０８で［Ｍ＋Ｎａ］＋に対応する付加イオンを示し；この組成は、１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルデータにより支持された。Ｒｅｂ  Ｗの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータは、δ０．９２および１．３９の２つのメチル一重線、環外二重結合のδ５．１０および５．７３の一重線としての２つのオレフィン性プロトン、δ０．７２−２．７２の間の９つのｓｐ３メチレンおよび２つのｓｐ３メチンプロトンの存在を示し、ステビア属から前に単離されたエント−カウランジテルペノイドに特徴的であった。エント−カウランジテルペノイドの基本骨格は、ＴＯＣＳＹ研究により支持された。その研究は重要な相関を示した：Ｈ−１／Ｈ−２；Ｈ−２／Ｈ−３；Ｈ−５／Ｈ−６；Ｈ−６／Ｈ−７；Ｈ−９／Ｈ−１１；Ｈ−１１／Ｈ−１２。Ｒｅｂ  Ｗの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルはまた、δ５．１０、５．３４、５．４１、５．８１、および６．１４で共鳴する５つのアノマープロトンの存在を示し；その構造内の５つの糖単位が示唆された。５％Ｈ２ＳＯ４によるＲｅｂ  Ｗの酸加水分解によりＤ−グルコースが得られ、これは、ＴＬＣによる標準品との直接比較により同定された。Ｒｅｂ  Ｗの酵素加水分解はアグリコンを提供し、これは、１Ｈ  ＮＭＲおよびｃｏ−ＴＬＣの標準化合物との比較によりステビオールとして同定された。δ５．１０（ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）、５．３４（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、５．４１（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、５．８９（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、および６．１４（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）のグルコース部分の５つのアノマープロトンについて観察された大きなカップリング定数はステビオール配糖体で報告されるそれらのβ−配向を示唆した［１−５、９−１３］。Ｒｅｂ  Ｗについての１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ値を、ＴＯＣＳＹ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣデータに基づいて割当て、表４に示す。
【表４】
0006774945.tif 000018
0006774945.tif 000019
【０２２７】
Ｒｅｂ  ＷのＮＭＲスペクトルデータおよび加水分解実験からの結果に基づき、その構造内に、アグリコンステビオールに連結された５つのβ−Ｄ−グルコシル単位が存在すると結論づけた。Ｒｅｂ  ＷのＲｅｂ  Ｖとの１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ値の厳密な比較により、エーテル結合の形態のＣ−１３の３−Ｏ−β−Ｄ−グルコビオシル単位および、第５のβ−Ｄ−グルコシル部分が割り当てられる、エステル結合の形態のＣ−１９位の２−Ｏ−β−Ｄ−グルコビオシル単位を有するステビオールアグリコン部分の存在が示唆された（図１９）。β−Ｄ−グルコシル部分の糖Ｉの３−位での１Ｈおよび１３Ｃ化学シフトの両方での低磁場シフトは、この位置でのβ−Ｄ−グルコシル単位の存在を支持した。構造は、図２０に示される重要なＴＯＣＳＹおよびＨＭＢＣ相関によりさらに支持された。ＮＭＲおよび質量スペクトルデータならびに加水分解研究の結果に基づき、Ｒｅｂ  Ｖの酵素変換により生成されたＲｅｂ  Ｗの構造を１３−［（３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］エント−カウル−１６−エン−１９−オイック酸−［（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）エステルと推定した。
【０２２８】
Ｒｅｂ  Ｗの酸加水分解．Ｒｅｂ  Ｗ（５ｍｇ）を含むＭｅＯＨ（１０ｍｌ）の溶液に、３ｍｌの５％Ｈ２ＳＯ４を添加し、混合物を２４時間還流させた。反応混合物をその後、飽和炭酸ナトリウムで中和し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（２×２５ｍｌ）で抽出し、糖を含む水性画分およびアグリコン部分を含むＥｔＯＡｃ画分を得た。水相を濃縮し、標準糖とＴＬＣ系ＥｔＯＡｃ／ｎ−ブタノール／水（２：７：１）およびＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／水（１０：６：１）を用いて比較し；糖をＤ−グルコースと同定した。
【０２２９】
Ｒｅｂ  Ｗの酵素加水分解．Ｒｅｂ  Ｗ（１ｍｇ）を１０ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５に溶解し、クロコウジカビ由来の粗ペクチナーゼ（５０μＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ２７３６）を添加した。混合物を５０℃で９６時間撹拌した。生成物が反応中に沈殿し、これを濾過し、その後、結晶化させた。Ｒｅｂ  Ｗの加水分解から得られた生成物を、そのｃｏ−ＴＬＣの標準化合物との比較および１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータによりステビオールと同定した。Ｒｅｂ  Ｗという名の化合物を、大規模１Ｄおよび２Ｄ  ＮＭＲならびに高分解能質量スペクトルデータおよび加水分解研究に基づいて、１３−［（３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］エント−カウル−１６−エン−１９−オイック酸−［（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）エステルと確認した。
【０２３０】
ＮＭＲ分析後、Ｒｅｂ  ＶおよびＲｅｂ  Ｗの構造を新規ステビオール配糖体として同定した。上記結果から、ＵＧＴ７６Ｇ１は１，３−１３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性だけでなく、１，３−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を有することがさらに証明された。
【０２３１】
実施例２３
この実施例では、Ｒｅｂ  Ｍの構造をＮＭＲにより分析した。
【０２３２】
Ｒｅｂ  Ｍのキャラクタリゼーションのために使用する材料をＲｅｂ  Ｄの酵素変換から生成させ、ＨＰＬＣにより精製した。ＨＲＭＳデータをＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＨＲＭＳ機器を用い、その分解能を３０ｋに設定して生成させた。データを、ポジティブイオンエレクトロスプレーモードで、ｍ／ｚ１５０〜１５００にて走査した。ニードル電圧を４ｋＶに設定し；他の源条件は、シースガス＝２５、補助ガス＝０、スイープガス＝５（全てのガスは任意単位で流れる）、キャピラリー電圧＝３０Ｖ、キャピラリー温度＝３００℃、およびチューブレンズ電圧＝７５とした。試料を２：２：１アセトニトリル：メタノール：水（注入溶離液と同じ）で希釈し、５０マイクロリットルで射出させた。
【０２３３】
ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＤＲＸ５００ＭＨｚまたはＶａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ６００ＭＨｚ機器で標準パルスシークエンスを用いて獲得した。１Ｄ（１Ｈおよび１３Ｃ）および２Ｄ（ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、およびＨＭＢＣ）ＮＭＲスペクトルは、Ｃ５Ｄ５Ｎにおいて実施した。
【０２３４】
化合物Ｒｅｂ  Ｍの分子式をそのポジティブ高分解能（ＨＲ）質量スペクトルに基づいて、Ｃ５６Ｈ９０Ｏ３３と推定した。そのスペクトルは、ｍ／ｚ１３４９．５９６４で［Ｍ＋ＮＨ４＋ＣＨ３ＣＮ］＋イオンを示し；この組成は、１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルデータにより支持された。Ｒｅｂ  Ｍの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、δ１．３５および１．４２の２つのメチル一重線、環外二重結合のδ４．９２および５．６５の一重線としての２つのオレフィン性プロトン、δ０．７７−２．７７の間の９つのメチレンおよび２つのメチンプロトンの存在を示し、ステビア属から前に単離されたエント−カウランジテルペノイドに特徴的であった。エント−カウランジテルペノイドの基本骨格は、ＣＯＳＹ（Ｈ−１／Ｈ−２；Ｈ−２／Ｈ−３；Ｈ−５／Ｈ−６；Ｈ−６／Ｈ−７；Ｈ−９／Ｈ−１１；Ｈ−１１／Ｈ−１２）およびＨＭＢＣ（Ｈ−１／Ｃ−２、Ｃ−１０；Ｈ−３／Ｃ−１、Ｃ−２、Ｃ−４、Ｃ−５、Ｃ−１８、Ｃ−１９；Ｈ−５／Ｃ−４、Ｃ−６、Ｃ−７、Ｃ−９、Ｃ−１０、Ｃ−１８、Ｃ−１９、Ｃ−２０；Ｈ−９／Ｃ−８、Ｃ−１０、Ｃ−１１、Ｃ−１２、Ｃ−１４、Ｃ−１５；Ｈ−１４／Ｃ−８、Ｃ−９、Ｃ−１３、Ｃ−１５、Ｃ−１６およびＨ−１７／Ｃ−１３、Ｃ−１５、Ｃ−１６）相関により支持された。Ｒｅｂ  Ｍの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルはまた、δ５．３３、５．４７、５．５０、５．５２、５．８５、および６．４３で共鳴するアノマープロトンの存在を示し；その構造内の６つの糖単位が示唆された。Ｒｅｂ  Ｍの酵素加水分解はアグリコンを提供し、これは、標準化合物とのｃｏ−ＴＬＣの比較によりステビオールとして同定された。５％Ｈ２ＳＯ４によるＲｅｂ  Ｍの酸加水分解はグルコースを提供し、これを、ＴＬＣによる標準品との直接比較により同定した。Ｒｅｂ  Ｍにおける選択したプロトンおよび炭素についての１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ値を、ＴＯＣＳＹ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ相関に基づいて割り当てた（表５）。
【０２３５】
Ｒｅｂ  ＭのＮＭＲスペクトルデータからの結果に基づき、その構造内に６つのグルコシル単位が存在すると結論づけた（図２６）。Ｒｅｂ  ＭのレバウジオシドＤとの１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの厳密な比較により、Ｒｅｂ  Ｍもまたステビオール配糖体であることが示唆され、これは、Ｃ−１３ヒドロキシルで、２，３−分枝グルコトリオシル置換基として結合した３つのグルコース残基および、追加のグルコシル部分が割り当てられる、Ｃ−１９のエステルの形態の２−置換されたグルコビオシル部分を有する。図２７で示される重要なＴＯＣＳＹおよびＨＭＢＣ相関は、糖ＩのＣ−３位での第６のグルコシル部分の配置を示唆した。δ５．３３（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、５．４７（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、５．５０（ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）、５．５２（ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）、５．８５（ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）および６．４３（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）のグルコース部分の６つのアノマープロトンについて観察された大きなカップリング定数は、ステビオール配糖体で報告されるそれらのβ−配向を示唆した。ＮＭＲおよび質量スペクトル研究の結果に基づき、文献から報告されたレバウジオシドＭのスペクトル値と比較して、酵素反応により生成されたＲｅｂ  Ｍの構造に、１３−［（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］エント−カウル−１６−エン−１９−オイック酸−［（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）エステルを割り当てた。
【表５】
0006774945.tif 000020
0006774945.tif 000021
【０２３６】
化合物１の酸加水分解：生成されたＲｅｂ  Ｍ（５ｍｇ）を含むＭｅＯＨ（１０ｍｌ）の溶液に、３ｍｌの５％Ｈ２ＳＯ４を添加し、混合物を２４時間還流させた。反応混合物をその後、飽和炭酸ナトリウムで中和し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（２×２５ｍｌ）で抽出し、糖を含む水性画分およびアグリコン部分を含むＥｔＯＡｃ画分を得た。水相を濃縮し、標準糖とＴＬＣ系ＥｔＯＡｃ／ｎ−ブタノール／水（２：７：１）およびＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／水（１０：６：１）を用いて比較し；糖をＤ−グルコースと同定した。
【０２３７】
化合物の酵素加水分解：生成されたＲｅｂ  Ｍ（１ｍｇ）を１０ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５に溶解し、クロコウジカビ由来の粗ペクチナーゼ（５０μＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ２７３６）を添加した。混合物を５０℃で９６時間撹拌した。１の加水分解から反応中に沈殿した生成物を、そのｃｏ−ＴＬＣの標準化合物との比較および１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータによりステビオールと同定した。
【０２３８】
レバウジオシド（ｒｅｂａｕｄｉｓｏｄｅ）Ｍ（Ｒｅｂ  Ｍ）という名の化合物を得、生物変換により生成させた。レバウジオシドＭ（Ｒｅｂ  Ｍ）に対する完全な１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル割当を、大規模１Ｄおよび２Ｄ  ＮＭＲならびに高分解能質量スペクトルデータに基づいて実施し、これにより、１３−［（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］エント−カウル−１６−エン−１９−オイック酸−［（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）エステルとしての構造が示唆された。
【０２３９】
実施例２４
この実施例では、ステビオール配糖体の生合成経路を記載する。
【０２４０】
図２１はルブソシドからのステビオール配糖体生合成の新規経路を示すスキームである。本明細書で記載されるように、組換えＨＶ１ポリペプチド（「ＨＶ１」）は１，２−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を含み、これは、第２のグルコシド部分をルブソシドの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させレバウジオシドＫＡ（「Ｒｅｂ  ＫＡ」）を生成させ；組換えＥＵＧＴ１１ポリペプチド（「ＥＵＧＴ１１」）は１，２−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を含み、これは第２のグルコシド部分をルブソシドの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させ、レバウジオシドＫＡを生成させ；あるいは第２のグルコース部分をルブソシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させ、ステビオシドを生成させ；組換えＵＧＴ７６Ｇ１酵素（「ＵＧＴ７６Ｇ１」）は１，３−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を含み、これは第２のグルコース部分をルブソシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−３’に転移させ、レバウジオシドＧ（「Ｒｅｂ  Ｇ」）を生成させる。ＨＶ１およびＥＵＧＴ１１はどちらも、第２の糖部分を、レバウジオシドＧの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させ、レバウジオシドＶ（「Ｒｅｂ  Ｖ」）を生成させ、または第２のグルコース部分をレバウジオシドＫＡの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させ、レバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）を生成させる。図２１はまた、組換えＵＧＴ７６Ｇ１酵素は、第３の糖部分をレバウジオシドＶのＣ−１９−Ｏ−グルコースのＣ−３’に転移させレバウジオシドＷ（「Ｒｅｂ  Ｗ」）を生成させる反応を触媒し、ならびにＥＵＧＴ１１は、第３のグルコース部分をレバウジオシドＥのＣ−１３−Ｏ−グルコースのＣ−６’に連続して転移させ、レバウジオシドＤ２を生成させることができることを示す。ＨＶ１は第３のグルコース部分をレバウジオシドＥのＣ−１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させ、レバウジオシドＺ１（「ＲｅｂＺ１」）を生成させることができ、かつ、第３のグルコース部分をレバウジオシドＥのＣ−１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させ、レバウジオシドＺ２（「ＲｅｂＺ２」）を生成させることができる。ＨＶ１およびＥＵＧＴ１１はどちらも、ステビオシドのＲｅｂ  Ｅへの変換およびレバウジオシドＡ（「Ｒｅｂ  Ａ」）のレバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）への変換を触媒することができる。ＵＧＴ７６Ｇ１は、第３のグルコース部分をレバウジオシドＥ（「Ｒｅｂ  Ｅ」）のＣ−１３−Ｏ−グルコースのＣ−３’に転移させ、レバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）を形成させることができる。ＵＧＴ７６Ｇ１はまた、ステビオシドのレバウジオシド（「Ｒｅｂ  Ａ」）への変換およびレバウジオシドＤ（「Ｒｅｂ  Ｄ」）のレバウジオシドＭ（「Ｒｅｂ  Ｍ」）への変換を触媒する。
【０２４１】
上記を考慮すると、本開示のいくつかの利点が達成され、他の有利な結果が得られることがわかるであろう。上記方法および系において本開示の範囲から逸脱せずに様々な変更が可能であるので、上記説明において含まれる、および添付の図面で示される全ての事項は、例示として解釈されるべきであり、制限する意味で解釈されるべきではないことが意図される。
【０２４２】
本開示または様々なバージョン、実施形態（複数可）またはその態様の要素を導入する場合、「１つの（ａ、ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」および「前記」という冠詞は、１つ以上の要素が存在することを意味することが意図される。「含む」、「含有する」および「有する」という用語は包括的であることが意図され、列挙された要素以外の追加の要素が存在し得ることが意味される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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