(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ウイルス剤と、免疫調節剤と、組換えＢ型肝炎ワクチンとからなる、ウイルス免疫療法用の組み合わせ医薬であって、抗ウイルス剤は、ポリエチレングリコール−ＩＦＮ−α  ２ａであり、免疫調節剤は、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）であり、組換えＢ型肝炎ワクチンは、遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチンであり、遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチンと組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）とは、１：１〜３０の重量比を有する、ウイルス免疫療法用の組み合わせ医薬。
【請求項２】
抗ウイルス剤、免疫調節剤および組換えＢ型肝炎ワクチンは、混合物としての投与または分離した方法での投与に適しており、投与は、皮下もしくは筋肉内注射によるか、または、それぞれ注射と組み合わせた経口投与によるか、または、異なる順序で異なる時間においてである、請求項１に記載のウイルス免疫療法用の組み合わせ医薬。
【請求項３】
抗ウイルス剤、免疫調節剤および組換えＢ型肝炎ワクチンの投与順序は、遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチンの投与の前に抗ウイルス剤が投与されるか、または、遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチンの投与の前に組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子が投与されるかである、請求項２に記載のウイルス免疫療法用の組み合わせ医薬。
【請求項４】
Ｂ型肝炎を処置するための医薬の製造における、請求項１に記載のウイルス免疫療法用の組み合わせ医薬の使用。
【請求項５】
Ｂ型肝炎は、慢性Ｂ型肝炎である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
組み合わせ医薬は、皮下もしくは筋肉内注射による投与、または、混合物としての投与、または、それぞれ注射と組み合わせた経口投与、または、異なる順序で異なる時間における投与に適している、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
投与中、遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチンの投与の前に抗ウイルス剤が投与される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
投与中、遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチンの投与の前に組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子が投与される、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
抗ウイルス剤と、免疫調節剤と、組換えＢ型肝炎ワクチンとからなる、ウイルス免疫療法用の医薬組成物であって、抗ウイルス剤は、ポリエチレングリコール−ＩＦＮ−α  ２ａであり、免疫調節剤は、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）であり、組換えＢ型肝炎ワクチンは、遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチンであり、遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチンと組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）とは、１：１〜３０の重量比を有する、ウイルス免疫療法用の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ医薬の分野に属し、新しい種類のウイルス免疫療法用の医薬組成物に関し、特に、持続性Ｂ型肝炎ウイルス感染を処置するのに使用されるウイルス免疫療法用の医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
既存の技術は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染により引き起こされ、血液および体液により伝染し、肝障害により特徴付けられる感染性疾患であるＢ型肝炎に関する。肝障害は、公衆衛生に対する深刻な問題であり、ヒトの健康に対して大きな脅威である。Ｂ型肝炎に感染した患者の一部は、慢性的な持続性感染症に進行するであろうこと、この状態が、肝硬変または原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）に変わる可能性があることが、研究により示されている。中国は、Ｂ型肝炎ウイルス感染の高伝染地域である。毎年３５万人が、Ｂ型肝炎関連疾患（例えば、肝硬変、ＨＣＣ等）で死亡しており、この集団での感染率は６０％であり、この集団におけるＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のキャリアの率は１０％である。現在、全世界において約３億人がＨＢｓＡｇキャリアであり、その１／３が中国在住であると推定される。したがって、Ｂ型肝炎の伝染は、中国における人口の質に影響を及ぼす重要な事項になってきている。
【０００３】
Ｂ型肝炎ワクチン接種が、Ｂ型肝炎を抑制または予防する最善の方法であることが実際に示されている。遺伝子組換えＢ型肝炎ワクチンは、１９８０年代から急速に開発されてきた。１９８１年以来、Ｍｅｒｃｋは、酵母において発現されたＢ型肝炎遺伝子Ｓタンパク質を含み、アラムアジュバントと共に使用する組換えワクチンを成功裏に開発し、市販しており、Ｂ型肝炎を世界的に予防および抑制するのに重要な役割を果たしてきた。現在、最も多く市販されているＢ型肝炎ワクチンは、アラムアジュバントと共に使用されるＢ型肝炎ウイルスＳ抗原に基づいている。
【０００４】
慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）患者では、肝細胞における持続的なＨＢＶ複製は、身体におけるウイルス特異的Ｔ細胞の枯渇およびウイルスの免疫回避を引き起こすであろう。ウイルスの免疫回避は、患者の免疫寛容をもたらし、ウイルス特異的ＣＴＬの機能を弱めるであろう。ＨＢＶ特異的Ｔ細胞の低応答は、ＨＢＶの持続性感染についての最も重要な原因の１つである場合があることが研究により証明されている。その具体的な分子メカニズムは、未だにわかっていない。メカニズムは、ウイルス抗原量、自然免疫の効率、抗原提示細胞の種類、Ｔヘルパー細胞および調節性Ｔ細胞の質および機能ならびに同時刺激分子の調節に関連する可能性があると予測される。
【０００５】
肝疾患および感染性疾患の中国医学会により公表されている慢性肝炎の予防および処置についてのガイドラインに基づくと、抗ウイルス剤処置に適するＨＢＶ患者には、抗ウイルス処置が提供されるべきである。現在、Ｂ型肝炎に対する抗ウイルス剤としては、アルファインターフェロン（α−ＩＦＮ）およびヌクレオシドアナログ、例えば、ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル等があげられる。これらは、適応症の範囲内の患者のＨＢＶ  ＤＮＡのコピー数を抑制することができるが、長期投与すると、容易に薬剤耐性を生じる。さらに、ヌクレオシドアナログの投与の中断は、疾患の再発さらには悪化をもたらしさえする。インターフェロンの長期投与は、その骨髄抑制作用による著しい副作用をもたらす。グリチルリチン、シリマリン、多不飽和レシチンおよびビシクロールの製剤は全て、種々のレベルで、抗炎症、抗酸化、肝細胞膜および細胞小器官の保護に対する効果を有し、臨床試験の結果により、それらが、肝臓の生化学的指標を改善することができるが、抗ウイルス治療に代わることはできないことが示されている。
【０００６】
現在、研究者は、効果的な免疫療法はＢ型肝炎キャリアの免疫系を刺激することによるものであるとは考えている。顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、多能性を有する造血細胞の重要な増殖因子の一種であり、種々の理由により引き起こされる白血球減少において、顕著な治癒効果を有する。活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、マスト細胞、内皮細胞および繊維芽細胞により主に産生されるＧＭ−ＣＳＦは、造血前駆体の増殖、分化および成熟を促進することができるだけでなく、他の細胞、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、繊維芽細胞、ケラチノサイト、皮膚の粘液細胞等に対する種々のレベルの刺激作用も有している。１９９３年に、Ｄｒａｎｏｆｆらは初めて、がんワクチンの免疫応答を向上させるための免疫アジュバントとしてＧＭ−ＣＳＦを使用した。ＧＭ−ＣＳＦの向上した免疫作用は、ＡＰＣによる抗原提示の向上した能力による可能性がある。樹状細胞（ＤＣ）と相互作用する場合、ＧＭ−ＣＳＦは、抗原提示を促進し［１］、ＩＬ−２産生を増大させ、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化させ、抗体分泌能を向上させ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を向上させ得る［２］。ＧＭ−ＣＳＦは、Ｔ細胞および内皮を活性化し、ＡＰＣの機能を向上させ、ＭＨＣ分子を上方制御し、分子を同時刺激し、生物の免疫調節に関与し、抗ウイルス剤の治療効果を向上させ得ることが、近年の研究から示されている。しかしながら、Ｈａｓａｎらは、ＧＭ−ＣＳＦが正常な個体に組換えＢ型肝炎ワクチンの注射直後に筋肉内注射された場合、ＧＭ−ＣＳＦが顕著なアジュバント作用を提供しなかった、すなわち、ＧＭ−ＣＳＦが、一次免疫応答を効果的に向上させることができなかったことを発見した［３］。Ｖ．Ｂｒｏｎｔｅは、全身性での高レベルのＧＭ−ＣＳＦが一時的なＴ細胞抑制を誘導し得ることを見出した［４］。前立腺がんワクチンについての第ＩＩ相臨床試験において、Ｓ．Ｊ．Ｓｉｍｍｏｎｓらは、全身性アジュバントとしてＧＭ−ＣＳＦを使用したが、ＤＣ−ポリペプチドの注射後の向上した臨床応答、または、顕著に向上した免疫応答を検出することができなかった。さらに、一部の患者において、投与に関連する副作用、例えば、局所反応、疲労、骨痛、筋肉痛および発熱が発生した［５］。このような結果は、免疫アジュバントとして作用するＧＭ−ＳＣＦが抗原特異的免疫応答を顕著に向上させることができたとする、一部の他の報告とは異なるものである。他の報告では、用量、投与期間およびＧＭ−ＣＳＦの免疫用量は、臨床的な免疫結果に密接に関連することが示されている。しかしながら、ＧＭ−ＣＳＦ免疫療法の用量および持続期間に関する研究は十分ではなく、免疫療法剤としてのＧＭ−ＣＳＦの投与プロトコルを最適化する体系的研究を行う必要がある。
【０００７】
ＨＢＶの処置としてインターフェロンを単独で使用することは、約２５％〜４０％の有効性を達成し得たことが報告されている。ラミブジンは、その比較的安全で、低価格であるため、ほとんどの領域におけるＨＢＶ感染用の処置として未だに第１選択であるが、急速に進行する薬剤耐性が主な欠点である［６］。アデホビルの使用量を増加させると、このような薬剤に対する薬剤耐性が主な問題となってくる。この問題は、一部の患者が単剤療法に応答しないこと、または、容易に薬剤耐性に進行してしまうことを示している。ＨＩＶ感染に対する組み合わせ療法が成功しており、ＨＢＶに対する単剤療法に関連する種々の問題があると考えて、より多くの研究者は、ＨＢＶに対する組み合わせ療法を研究し始めた［７］。ＧＭ−ＣＳＦとインターフェロンとの組み合わせ療法を行うと、インターフェロンの単剤療法に応答しなかったＨＢＶ患者の６０％が、最初の組み合わせ療法の最後に、低下したレベルのＨＢｅＡｇおよびＨＢＶ−ＤＮＡを有したが、一部の患者ではウイルスの再発を示したことを、Ｇｕｐｔａｎらは観察した［８］。インターフェロンとＢ型肝炎ワクチンとの６カ月の組み合わせ療法後に、インターフェロン単剤療法に応答しなかった個体の５０％（８／１９名）が、検出限界以下のＨＢＶ−ＤＮＡレベルを示したが、この治療後の持続性の応答率は、臨床試験において報告されなかったことを、Ｈｅｉｎｔｇｅｓらは観察した。ＨＢｓＡｇワクチン接種による直接処置により、ウイルスキャリアの２８．６％が、低下したレベルのウイルス複製を有し、ウイルスキャリアの２１．４％が、陰性のＨＢＶ−ＤＮＡを有したことが、一部の研究により報告されている。しかしながら、Ｄｉｋｉｃｉらは、免疫抵抗性を有する慢性ＨＢＶ感染小児のＢ型肝炎ワクチン接種群と非ワクチン接種群との間に、顕著な差異が無かったことを見出した。
【０００８】
中国特許出願公開１９９００４３号「Ｂ型肝炎ウイルスの処置または予防における組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の適用」には、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦと遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチンとの組み合わせ投与が、生物の体液性免疫応答を向上させ得ることが開示されている。遺伝子操作されたＨＢｓＡｇワクチン接種前の組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの投与は、動物における細胞性免疫を刺激し、Ｔ細胞分化を促進し、細胞因子、例えば、Ｔｈ１細胞におけるＩＦＮ−γ等の分泌を刺激し、ＩｇＧ２ａ抗体の産生を増大させ、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の機能を亢進し得る。これにより、ＨＢＶについての処置効果が達成される。近年、種々のサイトカインおよびケモカインが、動物モデルおよびヒト用のワクチンの研究のために、抗原認識およびＴ細胞増殖を促進する免疫アジュバントとして使用されている。現在、がんワクチンの免疫原性を増大させることに関して、ＧＭ−ＣＳＦが最も使用されているサイトカインアジュバントであることも報告されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍細胞内または周囲の正常な細胞に形質導入することによりサイトカインを放出させ得る。さらに、ＧＭ−ＣＳＦは、組換えタンパク質の形式で投与された動物または患者において、種々のワクチン接種で局所的または全身的に使用され得る。ただし、ＧＭ−ＣＳＦがヒトにおける抗ウイルスワクチン用の免疫アジュバントとして使用されるべきかどうかは、未だに論争下にある。正常な個体に組換えＢ型肝炎ワクチンを注射する直前に、ＧＭ−ＣＳＦを筋肉内注射することにより、ＧＭ−ＣＳＦが、顕著なアジュバント活性を提供することができないことを、Ｈａｓａｎらは見出した。このことは、ＧＭ−ＣＳＦが一次免疫応答を効果的に向上させ得ないことを示している［３］。アジュバントとして同じＧＭ−ＣＳＦを使用することによる結果の差異は、実際の適用における用量、注射部位および免疫化法に関連する場合がある。
【０００９】
上記に挙げた研究に基づいて、本願の発明者らは、ウイルス免疫療法用の新規な医薬組成物、特に、持続性Ｂ型肝炎感染についてのウイルス免疫療法用の医薬組成物を提供することを提案する。
【００１０】
本発明に関連する既存技術は、下記の通りである：
1.  van de Laar L, Coffer P, Woltman A: Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood 2012, 119(15):3383-3393.
2.  Wanjalla C, Goldstein E, Wirblich C, Schnell M: A role for granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in the regulation of CD8(+) T cell responses to rabies virus. Virology 2012, 426(2):120-133.
3.  Cruciani M, Mengoli C, Serpelloni G, Mazzi R, Bosco O, Malena M: Granulocyte macrophage colony-stimulating factor as an adjuvant for hepatitis B vaccination: a meta-analysis. Vaccine 2007, 25(4):709-718.
4.  Cytokines as natural adjuvants for vaccines.pdf.
5.  GM-CSF as a Systemic Adjuvant in a Phase II Prostate Cancer Vaccine Trial.pdf.
6.  Morrey J, Bailey K, Korba B, Sidwell R: Utilization of transgenic mice replicating high levels of hepatitis B virus for antiviral evaluation of lamivudine. Antiviral research 1999, 42(2):97-108.
7.  Paul N, Han S-H: Combination Therapy for Chronic Hepatitis B: Current Indications. Current hepatitis reports 2011, 10(2):98-105.
8.  Rajkumar CG, Varsha T, Seyed NK, Shiv KS: Efficacy of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or lamivudine combination with recombinant interferon in non-responders to interferon in hepatitis B virus-related chronic liver disease patients. Journal of Gastroenterology and Hepatology 2002, 17.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
この発明の目的は、ウイルス免疫療法用の新規な医薬組成物を提供することである。新規な医薬組成物は、特に、持続性Ｂ型肝炎感染のためのウイルス免疫療法用の医薬組成物に関する。この発明における医薬組成物は、Ｂ型肝炎の処置のための新規な免疫療法を提供し得る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この発明における医薬組成物は、抗ウイルス剤と、免疫調節剤と、組換えＢ型肝炎ワクチンとからなる。
【００１３】
この発明における医薬組成物は、Ｂ型肝炎の処置に使用することができ、慢性Ｂ型肝炎の処置に特に適している。記載された医薬組成物において、抗ウイルス剤、例えば、α−ＩＦＮ、ヌクレオシドアナログ等が、生物中のウイルス量を減少させるのに使用され、続けて、アジュバントとしてのＧＭ−ＣＳＦと共にＢ型肝炎ワクチンが投与されて、生物における効果的な免疫記憶保護反応を確立し、強力な抗体保護および細胞性免疫を生じさせ、ウイルスの再発を予防し、ウイルスの除去さえも達成し、ＨＢＶ再感染を予防する。
【００１４】
本発明において、抗ウイルス剤は、インターフェロンまたはヌクレオシドアナログ、例えば、ＩＦＮ−α  ３〜５ＭＵ、ＰＥＧ−ＩＦＮ−α  ２ａ、ＰＥＧ−ＩＦＮ−α  ２ｂ、ラミブジン（ＬＡＭ）、アデホビルジピボキシル（ＡＤＶ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、テルビブジン（ＬｄＴ）またはフマル酸テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）から選択される。
【００１５】
免疫調節剤は、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦから選択される。
【００１６】
組換えＢ型肝炎ワクチンは、遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチン、例えば、サブユニットタンパク質ワクチンである。
【００１７】
本発明は、下記技術および方法を採用する。遺伝子操作技術を使用して、インターフェロン遺伝子を大腸菌または酵母系中で発現させてタンパク質を得、ついで、タンパク質を精製し、アジュバントと共に配合して、抗ウイルス剤であるＩＦＮ−α（Ｉ型インターフェロン）を調製する。遺伝子操作技術を使用して、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子遺伝子を酵母系中で発現させてタンパク質を得、タンパク質を精製し、アジュバントと共に配合して、免疫調節剤であるｒｈＧＭ−ＣＳＦ（組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）を調製する。遺伝子操作技術を使用して、ヒトのＢ型肝炎抗原遺伝子を酵母系中で発現させてタンパク質を得、タンパク質を精製し、アジュバントと共に配合して、組換えＢ型肝炎表面抗原ワクチンを調製する。
【００１８】
本発明の医薬組成物におけるＩＦＮ−αおよびヌクレオシドアナログは全て、抗ウイルス剤として商業的に使用されている。
【００１９】
本発明の医薬組成物において、抗ウイルス剤の量は、臨床において従来から使用されている用量である。用量は、慢性肝炎の予防および処置のガイドラインを参照し得る。組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子に対する遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチンの重量比は、１：１〜３０である。
【００２０】
本発明では、抗ウイルス剤の用量および使用は、慢性肝炎の予防および処置のガイドラインを参照し得る。例えば、
１．３〜５ＭＵの通常型ＩＦＮ−α、このＩＦＮ−αは、患者の忍容性に応じて調節することができ、１週間に３回または２日１回、６カ月間皮下注射する。
２．１８０μｇのポリエチレングリコール−ＩＦＮ−α  ２ａを１週間に１回１年間皮下注射する。
３．１．０〜１．５μｇ／ｋｇのポリエチレングリコール−ＩＦＮ−α  ２ｂを１週間に１回１年間皮下注射する。
４．ラミブジン（ＬＡＭ）：１００ｍｇのラミブジンを１日１回経口投与する。
５．アデホビルジピボキシル（ＡＤＶ）：１０ｍｇのアデホビルジピボキシルを１日１回経口投与する。
６．エンテカビル（ＥＴＶ）：０．５ｍｇのエンテカビルを１日１回経口投与する。
７．テルビブジン（ＬｄＴ）：６００ｍｇのテルビブジンを１日１回経口投与する。
８．フマル酸テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）：ＴＤＦ（中国において未承認）は、アデホビルジピボキシルと類似する構造を有するが、腎臓に対する毒性が少ない。治療用量は、日量３００ｍｇである。
【００２１】
本発明の医薬組成物における抗ウイルス剤、免疫調節剤およびＨＢＶワクチンは、混合物としての投与または分離した方法での投与に適している。投与は、皮下もしくは筋肉内注射によるか、または、それぞれ注射と組み合わせた経口投与によるか、または、異なる順序で異なる時間においてである。
【００２２】
例えば、抗ウイルス剤は、遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチンの投与の前に投与することができ、または、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子は、遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチンの投与の前に投与することができる。
【００２３】
具体的には、別の態様において、本発明は、Ｂ型肝炎を処置するための、抗ウイルス剤（インターフェロンおよびヌクレオシドアナログ等）、免疫調節剤（組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）および組換えＢ型肝炎ワクチンの使用、特に、慢性Ｂ型肝炎を処置するための医薬の製造におけるそれらの使用を開示する。
【００２４】
使用において、抗ウイルス剤は、遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチンの投与の前に投与し得る。
【００２５】
使用において、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子は、遺伝子操作されたＨＢＶワクチンの投与の前に投与し得る。
【００２６】
慢性肝炎の予防および処置のガイドラインは、抗ウイルス剤の用量について参照され得る。組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子に対する遺伝子操作された組換えＢ型肝炎ワクチンの重量比は、１：１〜３０である。
【発明の効果】
【００２７】
この発明における医薬組成物は、抗ウイルス免疫実験に使用されており、その結果から、医薬組成物が持続性Ｂ型肝炎感染を処置するのに使用された場合、α−ＩＦＮおよびヌクレオシドアナログは、ウイルス量を減少させ得ることが示されている。免疫賦活作用を有するサイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦをアジュバントとして使用するＢ型肝炎ワクチンは、免疫応答を向上させ、生物が効果的な免疫記憶保護反応を確立するのを手助けし、強力な抗体保護および細胞性免疫を生じさせ、ウイルスを除去し、感染を予防することができる。本発明の一実施形態では、数多くの実験が、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子と遺伝子操作された組換えＢ型肝炎ワクチンとの種々の免疫組み合わせを使用して行われる。その結果から、Ｂ型肝炎ワクチンの注射の３日前の組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（動物あたりに１日２〜３０μｇ）のｉｎ  ｓｉｔｕ注射、続けて、遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチン接種（動物あたりに１μｇ）が、動物の樹状細胞の成熟を効果的に促進し、動物の細胞性免疫レベルを顕著に向上させ、抗体レベルを向上させ、ＴＨ１サイトカインを向上させ、ＩｇＧ２ａ抗体の産生を促進し、Ｔ細胞増殖および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）機能を向上させ得ることが示されている。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、慢性Ｂ型肝炎トランスジェニックマウスモデルへの、Ｂ型肝炎ワクチンの注射の３日前の組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（動物あたりに１日２〜３０μｇ）の注射、続けて、遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチン接種（動物あたりに１μｇ）の投与が、免疫寛容を効果的に打破し、より高いレベルの抗Ｂ型肝炎抗体を産生させ、細胞性免疫を向上させ、Ｂ型肝炎抗原を発現するマウス肝細胞を効果的に除去することができる。対照的に、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（動物あたりに１日２〜３０μｇ）と、遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチン（動物あたりに１μｇ）との同時注射は、マウスのＨＢＶ抗原に対する免疫寛容を望ましく打破することができない。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、抗ウイルス剤（組換えヒトインターフェロンＩ型）、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子および組換えＢ型肝炎ワクチンは、組み合わせで使用される。慢性Ｂ型肝炎トランスジェニックマウスへの、Ｂ型肝炎ワクチンの注射の４〜０日前の抗ウイルス剤の注射、および、Ｂ型肝炎ワクチンの注射の３日前の組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（動物あたりに１日２〜３０μｇ）の注射、続けて、遺伝子操作されたＢ型肝炎ワクチン接種（動物あたりに１μｇ）の投与は、より高い細胞性免疫応答を誘導し、Ｔ細胞の増殖を亢進させることができる。
【００３０】
本発明は、Ｂ型肝炎およびヒト免疫不全のウイルスに感染した患者を処置するための、Ｂ型肝炎およびヒト免疫不全用のワクチン組成物も提供する。ワクチン組成物は、抗ウイルス剤と、免疫調節剤と、Ｂ型肝炎ワクチンとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】定量的ＥＬＩＳＡを使用することによる実施形態１における測定を示す。Ａ．Ｂ型肝炎ワクチン免疫との組み合わせにおける組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子によりワクチン接種された、ＩｇＧおよびＩｇＧサブタイプ合計の測定。Ｂ．実施形態１におけるＨＢＶワクチンの免疫応答を向上させるための、Ｂ型肝炎ワクチンとの組み合わせにおける組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子によるＴリンパ球増幅の測定結果。Ｃ．免疫応答を向上させるための、ＨＢＶワクチンと組み合わせた組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子による免疫化に基づく、フローサイトメトリにより測定されたｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＴＬ反応。
【図２】実施形態１におけるＨＢＶワクチンの免疫応答を向上させるために、ＨＢＶワクチンの組み合わせでの組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子による免疫化に基づくフローサイトメトリにより測定された、ＣＤ４  Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４の発現およびＣＤ８  Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γの発現を示す。
【図３】実施形態２におけるトランスジェニックマウスでの、肝炎ワクチンと組み合わせた組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子により免疫寛容が打破されている、Ｂ型肝炎表面抗原トランスジェニックマウスのＢ型肝炎表面抗原抗体における変化、および、Ｂ型肝炎表面抗原の減少を示す。
【図４】Ａ．実施形態２におけるＢ型肝炎ワクチンと組み合わせた組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子により、Ｂ型肝炎表面抗原トランスジェニックマウスの免疫寛容が打破された後にフローサイトメトリにより測定された、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞におけるＩＬ−１０およびＩＦＮ−γの発現、Ｂ．実施形態２におけるＢ型肝炎ワクチンの免疫応答を向上させるために、Ｂ型肝炎ワクチンと組み合わせた組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子によるワクチン接種後のＤＴＨの測定を示す。
【図５】実施形態２におけるＢ型肝炎ワクチンと組み合わせた組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子により、Ｂ型肝炎表面抗原トランスジェニックマウスの免疫寛容が打破された後の、Ｂ型肝炎抗原トランスジェニックマウスの肝臓表面上のＢ型肝炎表面抗原の組織化学的染色、および、処置したトランスジェニックマウスの肝細胞におけるＢ型肝炎抗原発現の平均光学密度を示す。
【図６】Ａ．実施形態３におけるＢ型肝炎ワクチンの免疫応答を向上させるための、ＥＬＩＳＡにより測定された、Ｂ型肝炎ワクチンと組み合わせた抗ウイルス剤であるＩＦＮ−α  ２ａ、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子によるワクチン接種の合計ＩｇＧ、Ｂ．実施形態３におけるＢ型肝炎ワクチンの免疫応答を向上させるための、Ｂ型肝炎ワクチンと組み合わせた抗ウイルス剤であるＩＦＮ−α  ２ａ、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子によるワクチン接種によるＴリンパ球増幅の測定結果、実施形態３におけるＢ型肝炎ワクチンの免疫応答を向上させるための、フローサイトメトリにより測定された、Ｂ型肝炎ワクチンと組み合わせた抗ウイルス剤であるＩＦＮ−α  ２ａ、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子によりワクチン接種されたＣＤ４  Ｔ細胞におけるＩＬ−１７およびＩＦＮ−γの発現を示す。
【図７】実施形態５におけるＨＢｓＡｇレベルの低下を示す。同図において、縦軸は、ＨＢｓＡｇレベル（ＩＵ／ｍｌ）を表わし、横軸は、時間（２０１２年５月〜２０１３年３月）を表わす。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
下記実施形態は、本発明を限定することなく、本発明を詳細に説明する。特に断らない限り、以下の実施形態における実験手法は全て、標準的な手法である。特に断らない限り、下記実施形態におけるパーセントは全て、重量パーセントである。
【００３３】
特に断らない限り、本発明の実施形態における実験データは、各群における全てのマウスの平均である。
【実施例】
【００３４】
実施形態１
組換えＢ型肝炎ワクチンと組み合わせたＧＭ−ＣＳＦの免疫プロトコルは、組換えＢ型肝炎サブユニットワクチンに対して、Ｃ５７ＢＬ／６の免疫応答を向上させる。
【００３５】
材料および機器
材料：遺伝子操作された（ＣＨＯ）Ｂ型肝炎ワクチン（組換えＢ型肝炎ワクチン（ＣＨＯ））  １０μｇ／ｍｌ、注射用の組換えヒト顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子  ３００μｇ／バイアル、ＣＨＯにより発現された遺伝子操作された（ＣＨＯ）Ｂ型肝炎ワクチン保存液（ＨＢｓＡｇ保存液）、これらは全て、Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｎａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ、Ｊｉｎｔａｎ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄにより提供される。
【００３６】
主なキット機器：ＷＩＳＥＮＴ  ＩｎｃからのＲＰＭＩ１６４０培地、Ｔｉａｎｊｉｎ  ＴＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅからのウシ胎児血清、Ｓｉｇｍａからのマウス抗ウサギＩｇＧ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｓｉａｔｅｓ、Ｂｒｉｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡからのＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ。赤血球溶解バッファー：８．２９ｇ  ＮＨ４Ｃｌ、１ｇ  ＫＨＣＯ３、３７．２ｍｇ  Ｎａ２ＥＤＴＡを、脱イオン水に溶解させて、８００ｍｌの総容量を得た。そのｐＨ値を、７．２〜７．４に調節し、ついで、脱イオン水を添加して、１０００ｍｌの総容量を得た。溶液をろ過および滅菌し、室温で保存した。繊維ガラスカラム：繊維ガラスを、使い捨ての１ｍｌ  シリンジ内に充填して、Ｔ細胞単離に使用する線維ガラスカラムを得た。ＭＴＴ：購入したＭＴＴ粉末を、ＰＢＳに溶解させ（濃度を、５ｍｇ／ｍｌ、すなわち、０．５％  ＭＴＴとする）、ついで、ろ過および滅菌し、ついで、−２０℃において暗所で保存した。ＣｏｎＡ：ＣｏｎＡ粉末を、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地中において、６０μｇ／ｍｌの濃度に溶解させた。蛍光標識モノクローナル抗体：一般的に使用されるものとしては、ＢＤ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅおよびＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入される、ＦＩＴＣ、ＰＥおよびＡＰＣ標識モノクローナル抗体があげられる。ブロッキング抗体：抗Ｆｃ受容体抗体、Ｆｃ受容体は、免疫細胞の表面上に通常発現されており、抗体のＦｃフラグメントに結合し得る。ブロッキング抗体の機能は、免疫細胞表面Ｆｃ受容体への蛍光標識モノクローナル抗体のＦｃフラグメントの結合により生じる非特異的な結果をブロックすることである。固定バッファー：ＰＢＳ中の４％  パラホルムアルデヒド、透過性バッファー：１％  サポニン、Ｂ型肝炎表面抗原のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激ＣＴＬポリペプチドを、ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｌｔｄ．により合成した。Ｂ型肝炎表面抗体診断キットおよび標準を、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｋｉｎｇｈａｗｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＬＴＤ．から購入した。遠心分離器：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製、フローサイトメータ：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ。
【００３７】
動物および免疫化：体重１６〜１８ｇの、メスの６〜８週齢のＳＰＦ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｉｎａ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅから購入した。動物を、以下の表に列記されたように、１群あたり６匹のマウスを含む４群に分割した。生理食塩水に溶解させたワクチンまたはＧＭ−ＣＳＦを、動物あたりに１００ｕｌで、頸部皮下注射により注射し、動物を、１回目の免疫化の１４日後に１度ブーストした。
【００３８】
【表１】
0006629195.tif 000002
【００３９】
マウスからの血清収集：２００〜３００μＬのマウス眼底動脈血サンプルを、滅菌ガラスキャピラリで滅菌マイクロ遠心管内に収集した。血液サンプルを、室温で３０分間および４℃で２時間静置し、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を収集した。上清を、更なる使用のために−２０℃で保存した。
【００４０】
ＥＬＩＳＡにより測定した血清中の総ＩｇＧ力価
（１）抗原コーティング：９６ウェルマイクロプレート上に、１ｕｇ／ｍｌの抗原を１００ｕｌ／ウェルでコートし、４℃で一晩置いた。
（２）ブロッキング：プレートを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳに溶解した０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で、各回５分間継続させて３回洗浄した。ついで、５％スキムミルクを、１００μｌ／ウェルで３７℃において１時間使用して、プレートをブロックした。
（３）血清添加：プレートを、ＰＢＳＴで各回５分間継続させて３回洗浄した。未処置のマウス血清を対照として使用して、２倍系列希釈したマウス血清を１００μｌ／ウェルで添加した。ついで、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。
（４）二次抗体添加：プレートを、ＰＢＳＴで各回５分間継続させて３回洗浄した。各ウェルに、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１０００）を１００μｌ／ウェルで添加した。ついで、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。
（５）発色：プレートを、ＰＢＳＴで各回５分間継続させて３回洗浄した。基質であるＴＭＢを１００μｌ／ウェルで添加して、発色させた。ついで、プレートを、３７℃において暗所に１５分間置き、発色させた。
（６）反応停止：０．２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を、５０μｌ／ウェルで添加して、発色を停止させた。
（７）読取り：光学密度をＯＤ４５０ｎｍ／６２０ｎｍで測定した。サンプルウェルのＯＤ値が対照ウェルの２倍である場合、陽性と考えられる。
【００４１】
ＥＬＩＳＡにより測定した血清中におけるＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの濃度
（１）抗原コーティング：９６ウェルマイクロプレート上にウサギＩｇＧ（２μｇ／ｍｌ）およびＶＰ１抗原（１μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェルでコートした。ついで、プレートを、４℃で一晩置いた。
（２）ブロッキング：プレートを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳに溶解させた０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で、各回５分間継続させて３回洗浄した。３％  ＢＳＡ溶液を１００μｌ／ウェルで添加して、プレートを３７℃で１時間ブロックした。
（３）血清添加：プレートを、ＰＢＳＴで各回５分間継続させて３回洗浄した。マウス抗ウサギＩｇＧを２０ｎｇ／ｍｌから１０回連続２倍系列希釈で希釈した。マウス血清を１：１００で希釈した。ついで、両方を、１００μｌ／ウェルで、ウェルにトリプリケートで添加した。ついで、プレートを、３７℃で１時間インキュベートした。
（４）二次抗体添加：プレートを、ＰＢＳＴで各回５分間継続させて３回洗浄した。ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ（１：１０００）を、１００μｌ／ウェルでウェルに添加した。ついで、プレートを、３７℃で１時間インキュベートした。
（５）発色：プレートを、ＰＢＳＴで各回５分間継続させて３回洗浄した。基質であるＴＭＢを、１００μｌ／ウェルで添加して、発色させた。ついで、プレートを、３７℃において暗所に１５分間置き、発色させた。
（６）反応停止：０．２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を、５０μｌ／ウェルで添加して、発色を停止させた。
（７）読取り：光学密度を、ＯＤ４５０ｎｍ／６２０ｎｍで測定した。サンプルウェルのＯＤ値が対照ウェルの２倍である場合、陽性と考えられる。
（８）検量線をプロットし、抗体量を算出した。
【００４２】
Ｔ細胞増殖の手順
Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖活性を、ＭＴＴにより測定した。
（１）本実験に使用した全ての材料を、予め滅菌しておく必要がある。
（２）マウスを脱臼により屠殺にし、７０％エタノールに１５分間浸漬させた。
（３）マウスの脾臓を、無菌条件下において超清浄作業台上で取り出し、ＵＶ光により２０分間予め滅菌しておき、２ｍｌ  ＲＰＭＩ１６４０培地を含む細胞培養皿に入れた。
（４）銅スクリーンを焼き、冷却し、ついで、プレート内に入れた。脾臓を、滅菌シリンジで砕き、細胞懸濁液として調製した。ついで、細胞懸濁液を、１３ｍｌの細胞遠心管内にろ過した。
（５）遠心管をメンブランでシールし、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
（６）上清を廃棄し、ついで、２〜３ｍｌの赤血球溶解バッファーを、管内に添加して、細胞を懸濁させた。溶解の２分後、同量のＲＰＭＩ１６４０培地（またはウシ胎児血清）を添加して、反応を停止させた。管を、メンブランでシールし、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
（７）上清を廃棄し、ついで、３〜４ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地（２％ウシ胎児血清含有）を、管内に添加して、細胞を懸濁させた。
（８）細胞懸濁液を、３７℃においてガラス繊維でゆっくりろ過して、細胞とガラス繊維とを完全に組み合わせて、Ｂ細胞を除去した。
（９）血球計数チャンバを使用して、細胞の密度をカウントした。
（１０）細胞密度を、ＲＰＭＩ１６４０培地（２％ウシ胎児血清含有）で、３〜４×１０６個／ｍｌに調節した。
（１１）濃度調節した細胞懸濁液を、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで添加した。
（１２）抗原を滅菌し、特定の濃度に希釈した。ついで、２０μｌの刺激物質を、各ウェルに添加した（刺激物質の最終濃度を、ＣｏｎＡ  １０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、ＢＳＡ／ＯＶＡ  ２μｇ／ｍｌとした。刺激物質を希釈して、種々の濃度で添加することができる）。刺激物質を含まない対照細胞のみのウェルおよび培地のみのウェルを設定した。
（１３）細胞をインキュベータ内に入れ、３７℃での５％  ＣＯ２下において４８〜７２時間インキュベートした。ついで、ＭＴＴ法を、発色に使用した（２０μｌのＭＴＴを、各ウェル内に添加し、３〜４時間後にデータを読み取った）、実験サンプルＯＤ−培地ＯＤ。
（１４）上清を捨て、１５０μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに添加した。ついで、プレートを、振とうベッド上に置いて、低速で１０分間振とうさせて、結晶を完全に溶解させた。４９０ｎｍでのＯＤ値を、マイクロプレートリーダ（Ｍａｇｅｌｌａｎ、Ｔｅｃａｎ  Ａｕｓｔｒｉａ  ＧｍｂＨ）により測定した。
（１５）算出結果：ＳＩ＝（刺激したウェルのＯＤ−培地のみのＯＤ）／（未刺激のウェルのＯＤ−培地のみのＯＤ）。
【００４３】
表面および細胞内染色についての手順
（１）純粋なＴ細胞をマウスから１０％培地に単離し、細胞１×１０７個／ｍｌに希釈した。
（２）１００ｕｌの細胞および最終濃度１０μｇ／ｍｌでのショートペプチドを９６細胞プレートに添加した。最終濃度１０μｇ／ｍｌでのＣＤ２８モノ抗体も、同時刺激シグナルのために添加することができる。十分混合した後、混合物を、３７℃での５％ＣＯ２下においてインキュベートした。
（３）４〜６時間の刺激後、モネンシンタンパク質阻害剤を、２μｌ／ウェルで各ウェルに添加した。
（４）２時間のモネンシン阻害後、細胞を、２ｍｌのＰＢＳにより２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１００〜２００μｌのＰＢＳで再懸濁させた。非特異的結合染色を排除するために、精製ＦｃＩＩ／ＩＩＩ受容体抗体（ＣＤ１６／３２）を、１μｇ／１０６個の細胞の使用に応じて添加し、氷浴中において１５〜２０分間インキュベートし、２ｍｌのＰＢＳにより２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
（５）細胞を、４％パラホルムアルデヒドを含む２００μｌのＰＢＳ溶液に再懸濁させ、室温で１０〜１５分間インキュベートし、ついで、２ｍｌのＰＢＳにより２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
（６）細胞を、２００μｌの０．１％サポニンに再懸濁させ、４℃で１０分間インキュベートし、ついで、２ｍｌのＰＢＳにより２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
（７）表面分子および細胞内サイトカインを染色した。
２種類の蛍光抗体を、説明書に基づいて細胞に同時に添加し、氷浴中において２０〜３０分間インキュベートし、２ｍｌのＰＢＳにより２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞を、３００μｌのＰＢＳに再懸濁させた。細胞懸濁液を、機器による測定および分析専用のＦＡＣＳチューブ内に、銅スクリーンを通してろ過した。
【００４４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＴＬについての手順
脾臓細胞を、未処置のマウスの赤血球を破壊および単離することにより得た。
（１）脾臓細胞を、２つの培養皿に均等に分けた。一方の皿では、５０μｇのＴ細胞エピトープペプチドフラグメントをインキュベートした。一方、他方では、ペプチドフラグメントを添加せずにインキュベートした。各皿において１〜２ｍｌの容量で、皿を、３７℃での５％ＣＯ２下において４時間インキュベートした（この工程において、目的細胞数を、実験群の数に応じて増加させ得る）。
（２）細胞を、１５ｍｌのファルコンチューブ内に移し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
（３）低分子量ペプチドとインキュベートしていない目的細胞を、低濃度のＣＦＳＥ（０．５μＭ）で染色した。一方、低分子量ペプチドとインキュベートした目的細胞を、高濃度のＣＦＳＥ（５μＭ）で染色した。両方とも、３７℃において暗所で１５分間穏やかに振とうした。
（４）同量のウシ胎児血清を添加して、染色後の反応を停止させた。溶液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を廃棄した。ついで、細胞を、１０ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。
（５）低濃度および高濃度で染色した等量の目的細胞を互いに混合し、マウスあたりに細胞２×１０７個で、尾静脈から実験マウスに再度注射して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞の細胞傷害活性を行った。
（６）マウスを、注射の４時間後に屠殺にした。脾臓細胞を、暗所で単離した。
（７）サンプルを、銅スクリーンによりろ過し、機器による測定および分析専用のＦＡＣＳチューブ内に移した。
【００４５】
統計学的分析のために、ｔ−検定により結果を分析した。ｐ＜０．０５は、有意な差を示し、ｐ＜０．０１は、非常に有意な差を示す。
【００４６】
実験結果
１．ＧＭ−ＣＳＦがＨＢＶワクチンの体液性応答に影響を及ぼし得るかどうかを試験するために、ＧＭ−ＣＳＦを、ＨＢＶワクチンの先にまたはＨＢＶワクチンと同時に注射した。血清中におけるＨＢｓＡｇに対する総ＩｇＧを、ブースト免疫化の７日後に測定した。ＨＢＶワクチンのみを注射された群と比較して、ＧＭ−ＣＳＦと共に注射された群におけるＩｇＧレベルは、有意に向上していた（図１−Ａ）。ＩｇＧ２ａレベルは、免疫化前３日にＧＭ−ＣＳＦを注射された群において、有意に向上した（ｐ＜０．０５）。対照的に、ＩｇＧ１レベルは、ＧＭ−ＣＳＦとＨＢＶとを同時に注射された群において、有意に向上した（図１−Ａ）。ＧＭ−ＣＳＦによる前処置は、Ｔｈ１応答を向上させ、一方、ＧＭ−ＣＳＦとワクチンとの同時注射は、Ｔｈ２応答を向上させ得ることが、結果から示される。
【００４７】
２．異なる時間において注射されたＧＭ−ＣＳＦの、Ｂ型肝炎ワクチンのＴ細胞レベルでの効果
ＧＭ−ＣＳＦがＴ細胞応答に影響を及ぼし得るかどうかをさらに観察するために、マウスの脾臓細胞を、ブースト免疫化の１週間後に、無菌で取り出した。非特異的抗原対照としてＢＳＡ、陽性対照としてＣｏｎＡおよび陰性対照として培地を使用して、Ｔ細胞の増殖を、ｒＨＢｓＡｇ抗原で刺激した。Ｔ細胞増殖は、ＧＭ−ＣＳＦの事前注射された群において、有意に増大した。しかしながら、Ｔ細胞の増殖レベルは、ＧＭ−ＣＳＦとＨＢＶワクチンとを同時に注射された群では低かった（図１−Ｂ）。このことは、ＧＭ−ＣＳＦの前処置が、抗原特異的Ｔ細胞応答を促進し得たことを示している。
【００４８】
３．異なる時間において注射されたＧＭ−ＣＳＦの、Ｂ型肝炎ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＴＬレベルに対する効果
異なる時間において注射されたＧＭ−ＣＳＦのＣＴＬ応答における効果を理解するために、２回目の免疫化の７日後に、フローサイトメトリにより、ＣＴＬ応答を測定した。図１−Ｃに示されたように、目的細胞の特異的殺傷率は、ＧＭ−ＣＳＦを前処置した群において３０．０１％である。殺傷率は、１０．２６％の特異的殺傷率を有する免疫核酸ワクチン単独による群より非常に高い。一方、ＧＭ−ＣＳＦとＨＢＶとを同時に注射された群では、特異的殺傷率は、１３．６％である。ＧＭ−ＣＳＦの前処置は、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＴＬ応答のレベルを向上させ得たが、ＧＭ−ＣＳＦとＨＢＶとを同時に注射された群において明らかな変化が無かったことが、結果から示された。
【００４９】
４．異なる時間において注射されたＧＭ−ＣＳＦの、Ｂ型肝炎ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏサイトカインのレベルでの効果
サイトカインは、細胞の分化および増殖を調節し、細胞が機能するように誘導し得る。したがって、サイトカインは、免疫応答を調節するのに重要な役割を果たしている。この実験では、ＣＤ４＋Ｔ細胞における抗原特異的ＩＬ−４およびＩＦＮ−γならびにＣＤ８＋Ｔ細胞における抗原特異的ＩＦＮ−γの発現レベルを、細胞内サイトカイン染色により測定した。図２に示されるように、ＧＭ−ＣＳＦで前処置した群における（ＣＤ４＋細胞での）ＩＬ−４、ＩＦＮ−γおよび（ＣＤ８＋細胞での）ＩＦＮ−γのレベルは、ＨＢＶ単独注射群と比較して、有意に改善された。一方、ＧＭ−ＣＳＦとＨＢＶワクチンとを同時に注射された群において、対照群と比較して、ＩＦＮ−γの発現レベルは向上せず、ＩＬ−４の発現レベルのみが向上した。ＧＭ−ＣＳＦで前処置した群は、Ｔｈ１およびＴｈ２両方のサイトカイン発現を向上させ得るが、ＧＭ−ＣＳＦとＨＢＶワクチンとの同時注射は、Ｔｈ２の発現のみを誘導し得たことが、結果から示された。
【００５０】
実施形態２：組換えＢ型肝炎ワクチンと組み合わせたＧＭ−ＣＳＦは、免疫寛容を打破し、ＨＢｓＡｇトランスジェニックマウスにおいて、Ｂ型肝炎表面抗原に対する体液性免疫応答を誘導する。
【００５１】
材料および機器
ＨＢｓＡｇトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａ１ｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊｆ４Ｊ）を、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから購入した。Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒは、Ｆｕｄａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの加盟団体である。「Ｂ型肝炎表面抗原用酵素結合免疫吸着法診断キット」およびＢ型肝炎表面抗原標準を、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｋｉｎｇｈａｗｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＬＴＤから購入した。他の実験材料、主な試薬および機器は、実施形態１に列記されたのと同様である。
【００５２】
実験手法
動物群および免疫化
３５匹のＨＢｓＡｇトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａ１ｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊｆ４Ｊ）（５０００−１００００ｐｇ／ｍｌの本来のＨＢｓＡｇ濃度を有する）を、以下の表「実験免疫群」に列記されたように、１群あたり７匹のマウスを含む５つの群にランダムに分割した。各群において、生理食塩水に溶解させたワクチンまたはＧＭ−ＣＳＦを、動物あたりに１００μｌで頸部皮下注射により注射した。各群のマウスを、１回目、２回目および３回目の免疫化の間に１４日の間隔をあけて、ならびに、３回目と４回目との免疫化の間に８週の間隔をあけて、４回免疫化した。マウスの眼窩の血液を、２週間に１回収集し、トランスジェニックマウスの血清中のＢ型肝炎表面抗原およびＢ型肝炎表面抗原抗体の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【００５３】
【表２】
0006629195.tif 000003
【００５４】
ＨＢＶｓ抗原トランスジェニックマウスのＨＢＶｓ抗原レベルをＢ型肝炎表面抗原診断キットにより測定した。
【００５５】
１．抗原標準（２ｍｇ／ｍｌ）の希釈：２倍系列希釈を、１０＾６から行った。２ｕｌのＡＧを、ＰＢＳで２０ｕｌ（１０×）に希釈した。そこから、１０ｕｌを取り出し、ＰＢＳで１ｍｌに希釈した（１００×、２ｕｇ）。そこから、５００ｕｌを取り出し、ＰＢＳで１ｍｌに希釈した（２×、１ｕｇ）。２倍系列希釈を１４回続けた。最後の７回希釈およびＰＢＳ群を使用して、８点検量線を引いた。
【００５６】
２．血清の希釈：各サンプルについてのトリプリケートの細孔により、血清の１０×、５０×および１００×希釈を行った。
【００５７】
３．実験の要件に従って、ある量の反応ストライプを選択した。７５μｌの希釈サンプルを、１つの個々のウェルにおいて、陰性対照、陽性対照およびブランクのそれぞれと共に、各ウェルに添加した。
【００５８】
４．プレートをシールし、３７℃で６０分間インキュベートした。
【００５９】
５．プレートを取り出し、シールを除去した。５０μｌの酵素−基質複合体を、各ウェルに添加し、１０秒間振とうした。プレートをシールし、３７℃で３０分間インキュベートした。
【００６０】
６．プレートを取り出し、続けて、シールを除去し、５回洗浄して、乾燥させた。
【００６１】
７．発色液を、１：１のＡおよびＢの比で調製した。１００μｌの十分混合した発色液を、各ウェルに添加し、１０秒間振とうし、３７℃で３０分間インキュベートした。
【００６２】
８．５０μｌの停止液を、各ウェルに添加し、振とうして、十分混合させた。４５０ｎｍの波長および６３０ｎｍの参照波長においてマイクロプレートリーダにより、結果を測定した。
【００６３】
ＨＢＶｓ抗原トランスジェニックマウスにおけるＨＢＶｓ抗体レベルを、Ｂ型肝炎表面抗体診断キットにより測定した。
【００６４】
１．ＨＢｓＡｂ標準（４０ｍＩＵ）の希釈：２倍系列希釈を、元の標準液から７回行った。２倍系列希釈およびＰＢＳ群に基づいて、８点検量線を引いた。
【００６５】
２．血清の希釈：各サンプルについてのトリプリケートの細孔により、血清の１０×、５０×および１００×希釈を行った。
【００６６】
３．実験要求に応じて、特定量の反応ストライプを選択した。５０μｌの希釈サンプルを、１つの個々のウェルにおいて、陰性対照、陽性対照およびブランクのそれぞれと共に、対応する各ウェルに添加した。５０μｌの酵素−基質複合体を、各ウェルに添加し、１０秒間振とうした。ついで、プレートを密封紙でシールし、３７℃で３０分間インキュベートした。
【００６７】
４．プレートを取り出し、続けて、シールを除去し、５回洗浄して、乾燥させた。
【００６８】
５．発色液を、１：１のＡおよびＢの比で調製した。１００μｌの十分混合した発色液を、各ウェルに添加し、１０秒間振とうし、３７℃で３０分間インキュベートした。
【００６９】
６．５０μｌの停止液を、各ウェルに添加し、振とうして、十分混合させた。４５０ｎｍの波長および６３０ｎｍの参照波長においてマイクロプレートリーダにより、結果を測定した。
【００７０】
統計学的分析のために、ｔ−検定により結果を分析した。ｐ＜０．０５は、有意な差を示し、ｐ＜０．０１は、非常に有意な差を示す。
【００７１】
実験結果
１．組換えＢ型肝炎ワクチンとの組み合わせたＧＭ−ＣＳＦの戦略が、ＨＢｓＡｇトランスジェニックマウスにおける免疫寛容を打破し、Ｂ型肝炎表面抗原の体液性免疫応答を誘導し得るかどうかを試験するために、ＧＭ−ＣＳＦを、ＨＢＶワクチンの前またはＨＢＶワクチンと共に注射した。ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇに対する総ＩｇＧの濃度を、２週間に１回測定した。ＨＢＶを単独で注射された群と比較して、総ＩｇＧレベルは、３ＧＭ−ＣＳＦ＋ＨＢＶによる群において有意に向上した（図３）。Ｂ型肝炎表面抗原のレベルは、３日前にＧＭ−ＣＳＦを注射された群（３ＧＭ−ＣＳＦ＋ＨＢＶ）における４回目の免疫化の６週間後に、有意に低下した（ｐ＜０．０５）。３ＧＭ−ＣＳＦ＋ＨＢＶ群（すなわち、３日前にＧＭ−ＣＳＦを注射された群）は、トランスジェニックマウスの免疫寛容を打破し、ＨＢｓＡｇトランスジェニックマウスにおけるＢ型肝炎表面抗原の体液性免疫応答を誘導し、さらに、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を低レベルで維持し得たことが、結果から示された。一方、ＨＢＶワクチンを単独で注射された群およびＧＭ−ＣＳＦとＨＢＶとを同時に注射された群において、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体は、有意に増大しなかった。
【００７２】
実施形態３：組換えＢ型肝炎ワクチンと組み合わせたＧＭ−ＣＳＦの戦略は、ＨＢｓＡｇトランスジェニックマウスの免疫寛容を打破し、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原細胞の免疫応答を誘導し、肝臓におけるＢ型肝炎表面抗原を除去する。
【００７３】
材料および機器
ＨＢｓＡｇトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａ１ｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊｆ４Ｊ）を、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから購入した。Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒは、Ｆｕｄａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの加盟団体である。Ｂ型肝炎ウイルス表面Ｓ抗原に対する一次および二次免疫組織化学抗体を、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌｏｎｇ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃ．Ｃｏ．，Ｌｔｄから購入する。他の実験材料、主な試薬および機器は、実施形態１に列記されたのと同様である。
【００７４】
動物群および免疫化
３５匹のＨＢｓＡｇトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａ１ｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊｆ４Ｊ）（５０００−１００００ｐｇ／ｍｌの本来のＨＢｓＡｇ濃度を有する）を、以下の表に列記されたように、１群あたり７匹のマウスを含む５つの群にランダムに分割した。各群において、生理食塩水に溶解させたワクチンまたはＧＭ−ＣＳＦを、動物あたりに１００μｌで頸部皮下注射により注射した。各群におけるマウスを、それぞれ１４日の間隔をあけて３回免疫化した。遅延型過敏反応（ＤＴＨ）を、３回目の免疫化の１２日後に行った。マウスを、３回目の免疫化の１５日後に屠殺にした。脾臓を単離し、肝臓の免疫組織化学を行った。
【００７５】
【表３】
0006629195.tif 000004
【００７６】
遅延型過敏反応（ＤＴＨ）の検出
３回目の免疫化の１２日後に、実験群および対照群両方における全てのマウスについて、ｒＨＢｓＡｇ抗原（２μｇ）を、右後肢の足蹠に注射し、生理食塩水を、左後肢の足蹠に注射した。足蹠の厚みを、注射の２４、４８および７２時間後に、ノギスで測定し、次式：膨潤厚み（ｍｍ）＝右足蹠の厚み−左足蹠の厚みにより算出した。膨潤厚みの値は、遅延型過敏反応（ＤＴＨ）レベルを反映している。
【００７７】
フローサイトメトリによるサイトカイン発現レベルの測定は、実施形態１に列記したのと同様である。
【００７８】
組織学的測定
ＨＢｓＡｇトランスジェニックマウスを、最後の免疫化の１４日後に麻酔し、肝臓組織を固定化し、包埋し、切片化した。Ｈ＆Ｅ染色および免疫組織化学実験を個々に行った。免疫組織化学に使用した抗体を、抗ＨＢｓＡｇ抗体とした。
【００７９】
組織スライドの作製
（１）サンプリング：トランスジェニックマウスを、麻酔により屠殺にし、マウスの肝臓組織を取り出した。
（２）固定化：肝臓組織を、Ｂｏｕｉｎ液に直ちに入れた。
（３）脱水および透過性：低濃度から高濃度でのアルコールを使用して、組織を脱水した。
（４）パラフィン浸漬：組織を、パラフィンＩに５６℃〜５８℃で約１時間、パラフィンＩＩに５６℃〜５８℃で約１時間、および、パラフィンＩＩＩに５６℃〜５８℃で約１〜２時間浸漬した。
（５）包埋：組織のブロックを、内側にパラフィンが塗布された予め折りたたまれた小型の紙箱に入れた。
（６）パラフィンブロックのトリミング：パラフィンブロックを、パラフィンテープの形成を容易にするために、台形にトリミングした。
（７）切片：切片の厚みを、約８〜１０μｍとする。
（８）取付け：パラフィンテープを、３８℃に調節した温度の水浴伸長機に浮かべた。パラフィンテープを伸ばした後に、ガラススライドを使用して、パラフィンテープを回収し、顕微鏡観察下で観察して、組織の形態を確認および選択した。
（９）トースティング：取付けた切片を、４１℃より高く、５０℃より低い温度でのオーブンに、少なくとも４時間入れて、組織をスライドにしっかり取り付けた。
【００８０】
組織切片の免疫組織化学
（１）勾配におけるエタノールを使用して、良好な組織形態を有する切片を再水和し、ついで、ＰＢＳ（０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）で、各回５分間継続させて３回浸漬させた。
（２）抗原アンマスキング：切片を、クエン酸バッファーを含む容器に入れ、マイクロ波で高温において、５分×３回加熱した。液体が減少した場合、希釈した熱水を必要に応じて添加した。
（３）切片を、ブロッキングに使用した血清またはＢＳＡで、３７℃でのインキュベータ中で少なくとも１時間ブロックした。
（４）血清を、洗浄することなく排出した。適切な比に希釈した一次抗体を、切片を覆うのに使用し、ついで、２７℃で１時間または４℃で一晩ブロックした。
（５）切片を、各回５分間継続させて３回ＰＢＳで洗浄した。
（６）適切な比に希釈したビオチン標識二次抗体（１％ＢＳＡ−ＰＢＳを使用して希釈）を、切片に滴下し、ついで、２７℃で３０〜４０分間インキュベートした。
（７）切片を、各回５分間継続させて３回ＰＢＳで洗浄した。
（８）適切な比に希釈した三次抗体を、切片に滴下し、ついで、２７℃で３０分間インキュベートした。
（９）アルカリホスファターゼを使用して、暗所で発色させた。陽性のＡＰ発色の結果は、特定の赤色であるべきである。
（１０）切片を、水道水ですすいだ。
（１１）再染色：染色手順は、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリンを使用して１〜３分間染色し、弱酸溶液（１〜２滴の１Ｍ塩酸を希釈水に添加し得る）を使用して１分間鑑別し、続けて、水道水を使用して３分間すすぐというものである。エオシン−フロキシン染色を、１分間直接行った。
（１２）切片を脱水し、組織形態を観察するために、ドラフトで乾燥させた。
切片を、保存用ボックス中で保存し、写真撮影し、適切なスケール、カラー調節および適切に陽性の結果の選択で観察した。
【００８１】
統計学的分析のために、ｔ−検定により結果を分析した。ｐ＜０．０５は、有意な差を示し、ｐ＜０．０１は、非常に有意な差を示す。
【００８２】
実験結果
１．組換えＢ型肝炎ワクチン免疫化と組み合わせたＧＭ−ＣＳＦは、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原トランスジェニックマウスの遅延型過敏反応レベルを向上させた。遅延型過敏反応は、Ｔ細胞により媒介される免疫応答の一種である。組換えＢ型肝炎ワクチンとの組み合わせたＧＭ−ＣＳＦの免疫戦略がｉｎ  ｖｉｖｏでの強力な細胞性免疫レベルを誘導し得るかどうかを評価するために、遅延型過敏反応レベルを、ｉｎ  ｖｉｖｏ指標として使用した。実験群に基づいて、免疫化を行った。ＨＢｓＡｇトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａ１ｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊｆ４Ｊ）を３回免疫化した１２日後に、実験群および対照群からの全てのマウスについて、ｒＨＢｓＡｇを、右後肢の足蹠に注射し、生理食塩水を、左後肢の足蹠に注射した。右および左の足蹠厚みを、注射の２４、４８および７２時間後に測定した。Ｂ型肝炎ワクチンでのみ免疫化された群が、対照群より高いＤＴＨレベルを有し、一方、組換えＢ型肝炎ワクチンと組み合わせたＧＭ−ＣＳＦの免疫戦略による群（３＊ＧＭ−ＣＳＦ＋ＨＢＶおよび３０μｇ  ＧＭ−ＣＳＦ＋ＨＢＶの群）におけるＤＴＨレベルは、Ｂ型肝炎ワクチンを単独で注射された群と比較して、有意に向上したことが、図４−Ｂに示されている。このことは、組換えＢ型肝炎ワクチンと組み合わせたＧＭ−ＣＳＦの免疫戦略による群（３＊ＧＭ−ＣＳＦ＋ＨＢＶおよび３０μｇ  ＧＭ−ＣＳＦ＋ＨＢＶの群）が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの強力な細胞性免疫応答を誘導したことを示している。
【００８３】
２．組換えＢ型肝炎ワクチンと組み合わせたＧＭ−ＣＳＦの免疫戦略は、ＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介されるＤＴＨレベルを向上させ、ＣＤ８＋Ｔキラー細胞の活性を改善する可能性がある。ＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｔｃ１）およびＩＬ−１７を分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｔｃ１７）は、重要なＣＤ８＋Ｔキラー細胞の２つのグループである。免疫化マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７の発現が、この実験においてさらに検出された。３回目の免疫化の１５日後に、免疫化マウスの脾臓を、無菌条件下において取り出し、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのインキュベートのための、単一細胞懸濁液を調製するのに使用した。６時間のインキュベート後、細胞内サイトカインを染色し、サブタイプの細胞集合の変化について、フローサイトメトリにより分析した。図４−Ａに示されるように、組換えＢ型肝炎ワクチンと組み合わせたＧＭ−ＣＳＦの免疫戦略は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞により分泌されたＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７のレベルを向上させ得る。一方、３＊ＧＭ−ＣＳＦ＋ＨＢＶの免疫戦略は、Ｔｈ１およびＴｃ１の免疫応答を、おそらくより誘導するであろう。ＨＢＶと組み合わせた３０μｇ  ＧＭ−ＣＳＦの免疫戦略は、Ｔｈ１７、Ｔｃ１７の免疫応答をおそらくより誘導するであろう。
【００８４】
３．ＨＢｓＡｇトランスジェニックマウスを、最後の免疫化の１４日に麻酔した。肝臓組織を固定化し、包埋し、切片化した。Ｈ＆Ｅ染色および免疫組織化学実験を個々に行った。図５は、トランスジェニックマウスの肝臓におけるＢ型肝炎ウイルス表面抗原についての免疫組織化学写真および光学密度の統計学的写真である。トランスジェニックマウスの肝臓におけるＢ型肝炎ウイルス表面抗原は、３＊ＧＭ−ＣＳＦ＋ＨＢＶの免疫戦略下において、有意に除去されていることが示されている。ＨＢＶと組み合わせた３０μｇ  ＧＭ−ＣＳＦの免疫戦略を使用した群において、肝臓におけるＢ型肝炎ウイルス表面抗原がいくらか減少しているが、３＊ＧＭ−ＣＳＦ＋ＨＢＶの免疫戦略を使用した群ほど顕著な除去効果はない。ＧＭ−ＣＳＦ＋ＨＢＶ免疫化が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原トランスジェニックマウスの免疫寛容を打破し、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原トランスジェニックマウスにおける強力な体液性および細胞性の免疫応答を誘導し、血清および肝臓中のＢ型肝炎ウイルス表面抗原を効果的に除去したことが、結果から示された。
【００８５】
実施形態４：組換えＢ型肝炎ワクチンと組み合わせたＧＭ−ＣＳＦの免疫戦略において異なる時間において注射されたＩ型インターフェロンの効果
【００８６】
材料および機器：組換えヒトインターフェロンα  １ｂ（５０μｇ／ｍｌ／バイアル）を、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｔｒｉ−Ｐｒｉｍｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｔｄから購入した。他の実験材料、主な試薬および機器は、実施形態１、２および３に列記されたのと同様である。
【００８７】
実験動物および免疫化：体重１６〜１８ｇの６から８週齢のメスのＳＰＦ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｉｎａ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅから購入した。動物を、表１に列記されたように、１群あたり６匹のマウスを含む８群に分割した。各群において、生理食塩水に溶解させたワクチンまたはＧＭ−ＣＳＦを、動物あたりに１００ｕｌで、頸部皮下注射により動物にワクチン接種した。動物を、１回目の免疫化の１４日後にブーストした。５×１０４Ｕのインターフェロンを、実験群に基づいて、各動物に頸部皮下注射で注射した。
【００８８】
【表４】
0006629195.tif 000005
【００８９】
ＥＬＩＳＡによるＢ型肝炎表面抗原の検出、Ｔ細胞増殖の実験およびフローサイトメトリを使用したＴ細胞のサイトカインの検出法は全て、実施形態１を参照し得る。
【００９０】
ＣＦＳＥ法により測定したＴ細胞増殖
１．マウスを従来通り屠殺にし、７５％エタノールに５〜１０分間浸漬した。
【００９１】
２．マウスの脾臓を取り出し、６００ｕｌのＰＢＳまたはＲＰＭＩ１６４０培地に添加し、粉砕した。大きな組織を、銅スクリーンによりろ過した。１５００ｒｐｍで３分間の遠心分離後に、上清を廃棄した。
【００９２】
３．ＲＢＣによる赤血球溶解：７００ｕｌのＲＢＣ溶解細胞を、各チューブ内に２分間添加した（溶解期間は、厳密に制御されるべきである）。溶解を停止させるのに、７００ｕｌのＦＢＳを添加した。ついで、チューブを、１５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。１ｍｌの１６４０またはＰＢＳで、細胞を再懸濁させた。
【００９３】
４．細胞をカウントし、細胞の濃度を１×１０７個／ｍｌに調節した。
【００９４】
５．１ｕｌの１ｍＭ  ＣＦＳＥを含む５００ｕｌのＰＢＳ溶液を、５００ｕｌの再懸濁細胞に添加し、十分混和し１０回転倒させ、続けて、振とう機において、３７℃における暗所で１０分間染色させた。５００ｕｌのＦＢＳを添加して、染色を停止させ、続けて、２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。１５％  ＦＢＳ血清またはＰＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を添加して、３回洗浄した。
【００９５】
６．細胞をカウントし、細胞の濃度を、完全な培地で１×１０７個／ｍｌに調節した。ついで、細胞を、十分混合した。
【００９６】
７．細胞懸濁液を、ウェルあたりに５０μｌ（細胞５×１０５個／ウェル）で９６ウェルプレートに添加した。１群あたり３つの平行サンプルが存在する。
【００９７】
８．刺激物質の添加：完全な培地を使用することにより、最終濃度の２倍の濃度を有する培地（５０ｕｌの培地は、０．１ｕｌのＰＭＡ＝０．２μｇ／ｍｌ、０．１ｕｌのイオノマイシン＝２μｇ／ｍｌを含む）に、刺激物質を配合した（抗ＣＤ３の最終濃度を、２μｇ／ｍｌとし、抗ＣＤ２８の最終濃度を、０．１μｇ／ｍｌとした）。抗原刺激物質を、１０μｇ／ｍｌとした。
【００９８】
９．細胞を、３７℃で７２時間インキュベートし、フローサイトメトリにより測定した。ＣＤ８抗体を、測定前に染色し得る。
【００９９】
統計学的分析のために、ｔ−検定により結果を分析した。ｐ＜０．０５は、有意な差を示し、ｐ＜０．０１は、非常に有意な差を示す。
【０１００】
以下のことが、結果から示される。
１．Ｂ型肝炎表面抗原を、２回目の免疫化の後１４日に、ＥＬＩＳＡにより測定した。（図６−Ａ）ＨＢＶワクチンの注射の１日前でのＩＦＮ−α１ｂの注射は、対照群と比較して、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体レベルを有意に低下させ得ることが見出されている。特に、体液性免疫のレベルは、ＩＦＮ−α１ｂとＢ型肝炎ワクチンとの同時投与による群において有意に抑制された。Ｂ型肝炎ワクチン注射の１日前、または、同注射と同時のＩ型インターフェロンの投与は、Ｂ型肝炎ワクチンの体液性免疫レベルに影響を及ぼし得ることが証明されている。
【０１０１】
２．Ｔ細胞増殖（図６−Ｂ）を測定するＣＦＳＥ法およびＣＤ４  Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７（図６−Ｃ）の細胞内染色を測定するフローサイトメータにより、組換えＢ型肝炎ワクチンと組み合わせたＧＭ−ＣＳにより誘導されたＣＤ８細胞の免疫応答におけるインターフェロンの効果は有意ではなかったことが見出されている。
【０１０２】
実施形態５：Ｂ型肝炎ワクチンと組み合わせた抗ウイルス剤、インターフェロンおよびＧＭ−ＣＳＦの免疫戦略により処置した慢性Ｂ型肝炎患者における臨床的有効性の評価
【０１０３】
５６歳の男性患者（同患者の母は、ＨＢｓＡｇ陽性を示した）は、２００４年５月に、ＨＢｅＡｇ陽性の慢性Ｂ型肝炎と診断され、２００９年５月からエンテカビルで処置されている。ＨＢｅＡｇセロコンバージョンが２年後に観察された。患者は、２０１２年５月から、本発明の医薬組成物を投与されている。同投与は、Ｂ型肝炎ワクチンと組み合わせた顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を使用する免疫介入との組み合わせにおける、ポリエチレングリコールインターフェロンα−２ａ  １８０μｇ／週の皮下注射を含む。７５μｇのＧＭ−ＣＳＦを、連続３日間、１日１回筋肉内注射した。２０μｇのＢ型肝炎ワクチンを、４日目に同じ部位に注射した。この免疫介入プログラムを、インターフェロン処置の１、２、３、６、９および１２カ月目にそれぞれに１回使用した。ＧＭ−ＣＳＦを、インターフェロンの注射の２〜３日後に使用した。エンテカビル処置を、インターフェロン処置後３カ月で中止した。図７に示されたように、患者のＨＢｓＡｇは、陰性に変わり、抗ＨＢｓレベルは、上記介入の７カ月後に向上する傾向を有した。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明の利点は、以下の通りである。
１．既存技術と比較して、抗ウイルス剤は、ウイルス複製を一時的に阻害するのに本発明の医薬組成物に使用される。ついで、ワクチンに加えて免疫調節剤が、免疫化に使用される。免疫化は、Ｂ型肝炎ワクチンの免疫応答を効果的に向上させ、単独の抗ウイルス剤の薬剤耐性により引き起こされる応答欠如を避け、慢性ＨＢＶ感染の処置についての新たな方向性を導き得る。
２．実施形態１〜３に示されたように、既存の抗ウイルス療法と比較して、本発明における抗ウイルス剤の免疫組み合わせが、体液性および細胞性の免疫レベルを効果的に刺激し、免疫応答を有意に向上させ得る。
３．本発明における医薬組成物は、小さなコストで使用されるのに都合が良く、最少の副作用を有し、普及が容易である。
４．本発明における医薬組成物は、免疫寛容により刺激された抗体応答を打破し、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｃ１およびＴｃ１７の刺激を含む生物のＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞応答を刺激し、免疫応答により効果的にウイルスを除去できるだけでなく、治癒後の感染の再発も予防することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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