(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のＡＭＡ−１に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分であって、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球への侵入および／またはプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球内での成長を阻害し；モノクローナル抗体、ヒトＢ細胞培養物から得られる抗体、組換え抗体、合成抗体またはそれらの抗原結合性部分であり；配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２および配列番号３のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）ならびに配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２および配列番号６のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有する単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項２】
前記軽鎖可変領域が配列番号１３を含み、前記重鎖可変領域が配列番号１４を含む、請求項１に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項３】
配列番号１３または配列番号１４のいずれかに対して、少なくとも９０％のパーセント配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含む、請求項１に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項４】
複数種の異なるプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物のＡＭＡ−１、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物株３Ｄ７、ＨＢ３、ＦＣＲ３およびＫ１を含めた、複数種の異なる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物のＡＭＡ−１に結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項５】
プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球への侵入および／またはプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球内での成長を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％阻害する、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項６】
前記抗原結合性部分が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖Ｆｖ断片またはそれらの多量体である、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性部分をコードする単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
前記核酸分子が、抗体の可変領域またはその一部をコードし；前記可変領域の軽鎖可変領域が、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２および配列番号３のＣＤＲ３を含み、重鎖可変領域が、配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２および配列番号６のＣＤＲ３を含む、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
配列番号７、配列番号８および配列番号９ならびに／または配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２を含む、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
請求項７から１０のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性部分を含む医薬組成物または診断用組成物。
【請求項１４】
少なくともさらなる抗体またはその抗原結合性部分を含む、請求項１３に記載の医薬組成物または診断用組成物。
【請求項１５】
請求項１から６のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性部分を生成する方法であって、（ａ）前記抗体またはその抗原結合性部分をコードする核酸を含む核酸コンストラクトを準備するステップと、（ｂ）前記核酸コンストラクトを宿主細胞内に導入するか、または前記核酸コンストラクトを真核細胞もしくは原核細胞から得られる無細胞溶解液に添加するステップと、（ｃ）前記宿主細胞を、前記抗体または前記その抗原結合性部分の発現を可能にする条件下で維持するステップと、任意選択で、（ｄ）前記抗体または前記その抗原結合性部分の単離および／または精製および／または処理を行うステップとを含む方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞が、植物細胞であり、特に、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）もしくはタバコ（Nicotiana tabacum）に由来するか、または前記宿主細胞が、真核細胞株、特に、ＣＨＯ細胞株もしくはＨＥＫ２９３細胞株であるか、または前記宿主細胞が、微生物、特に、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において提供する技術は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物、特に、マラリア寄生生物である熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対する新規のヒト抗体に関する。本開示は、頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）に対する抗体に関する。これらの抗体は、例えば、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のシゾントおよびメロゾイトに対して高い親和性を有し、メロゾイトの赤血球への再侵入を阻害し、それにより、寄生生物の増殖を中和する。
【０００２】
本開示の抗体は、完全長の抗体またはその抗原結合性部分であり得る。さらに、本開示の抗体またはその抗原結合性部分を、結合性ドメインおよびエフェクタードメインを含む複合体中の細胞特異的結合性ドメインとして使用することもできる。また本開示は、前記抗体および複合体をコードする核酸分子、核酸を含有するベクター、宿主細胞、ならびにそのような抗体の調製および生成のための方法；そのような抗体をマラリアの治療のために使用するための組成物および方法も包含する。
【背景技術】
【０００３】
世界の人口の半分に相当する約３３億人がマラリアのリスクを有する。この結果、２０１２年には、約２０７万人がマラリアを発症し、およそ６２７，０００人が死亡した（World Health Organization 2013）。マラリアは、とりわけアフリカにおいて重大な問題であり、アフリカでは、小児期の死亡５例のうち１例（２０％）がこの疾患の影響によるものである。マラリアによる発熱を、アフリカの小児は平均して一人当たり年１．６〜５．４回経験する。
【０００４】
マラリアという疾患は、ヒトにおいては、５種のプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物：熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）（熱帯熱マラリアを引き起こす）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）（三日熱マラリアを引き起こす）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）（三日熱マラリアを引き起こす）、二日熱マラリア原虫（Plasmodium knowlesi）（二日熱マラリアを引き起こす）、および四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）（四日熱マラリアを引き起こす）により引き起こされる。これらの種はそれぞれ、雌のハマダラカ属（Anopheles）の蚊を介してヒトに伝染し、これらの蚊は、スポロゾイト段階のプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物を伝染させる。スポロゾイトは、ヒトの血流に進入すると、肝臓の細胞、すなわち、肝細胞中に局在する。１〜２週間後に、感染した肝細胞が破裂し、メロソーム（merosome）を放出する。これらのメロソームは、メロゾイトを放出する前に、血流中を短時間循環する。次いで、これらは、赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｏｒ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）に付着し、そこに侵入することによって、マラリアの赤血球期を開始する。生活環のうちの赤血球段階が始まり、この段階が、マラリアの病変形成および病態の直接の原因となる。マラリアに特徴的な発熱、貧血、循環の変化および免疫病理学的現象は主として、赤血球の破裂ならびに寄生生物抗原およびヘモゾインに対する宿主の免疫応答の結果である。これらの理由から、プラスモディウム属（Plasmodium）の生活環のうちの赤血球段階は、受動的または能動的ワクチンの開発およびマラリアの治療にとって非常に重要である。
【０００５】
熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）が引き起こすマラリア（また、悪性マラリア、熱帯熱原虫マラリアまたは熱帯熱マラリアとも呼ばれている）は、マラリアの最も危険な形態であり、最も高い率で合併症および死亡が生じる。マラリアによる死亡はほとんど全て、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）が引き起こす。
【０００６】
前世紀の６０年代にアジアで、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に、既存の抗マラリア薬であったクロロキンに対する耐性が出現し、その後全世界に広がるに至った。さらに、過去１０年の間に、マラリア寄生生物には、ほとんどのその他の抗マラリア薬に対する耐性も生じている。このことは、公衆衛生の大きな脅威になっている。有病率および抗マラリア薬耐性の程度が増加し続けることを信じる十分な根拠がある。さらに、多くの抗マラリア薬、例えば、メフロキンは、毒性の副作用があることでも悪名高い。現在、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）によるマラリアに対して推奨されている治療は、アルテミシンに基づく組合せ療法である。しかし、世界の種々の地域、例えば、ケニアおよびカンボジアで、この療法に対してもまた耐性が生じ始めている（Borrmann et al. 2011；Node, Sachet, and Satimai 2009）。
【０００７】
原則として、適切な特異性および活性を有する、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対する抗体が、抗マラリア薬として望ましい。いくつかの理由から、ヒト抗体は、ヒトの療法において使用する場合、非ヒト抗体およびヒト化キメラ抗体よりも好都合であろう：ヒト抗体は、非ヒト部分を含有する抗体よりも、ヒトにおいて免疫学的応答を誘発する可能性が低い。非ヒト部分に対するこうした免疫応答により、そのような抗体を用いる反復療法の可能性が排除される。結論として、ヒト抗体は、治療レジメンとして複数回使用することができる。さらに、ヒト抗体は、ヒトにおいて「外来」抗体として認識される可能性がより低い。この結果、中和、または身体からのヒト抗体の非ヒト抗体もしくは部分的なヒト抗体よりも緩慢な排除が生じる。したがって、非ヒト抗体または部分的なヒト抗体よりも、ヒト抗体を低い用量で投与することができ、または治療レジメンを低い頻度で行うことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の成長および／または侵入を阻害するため、特に、マラリアに感染している個体を治療するために、新規のヒト抗体を利用することができれば、極めて好都合であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物について予防、治療および／または診断／検出を行うため、特に、マラリアを予防、治療および／または診断する処置のための、新規の単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分に関する。
【００１０】
第１の態様では、本開示の実施形態は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のＡＭＡ−１に結合する単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分に関する。
【００１１】
特に、単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のＡＭＡ−１または複数種の異なるプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物のＡＭＡ−１に結合し；前記抗体またはその抗原結合性部分は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球への侵入および／またはプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球内での成長を阻害し；特に、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、モノクローナル抗体、ヒトＢ細胞培養物から得られる抗体、組換え抗体、合成抗体またはそれらの抗原結合性部分である。
【００１２】
特に、本開示の実施形態は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のＡＭＡ−１に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分に関し；前記抗体またはその抗原結合性部分は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球への侵入および／またはプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球内での成長を阻害し；単離された抗体またはその抗原結合性部分は、モノクローナル抗体、ヒトＢ細胞培養物から得られる抗体、組換え抗体、合成抗体またはそれらの抗原結合性部分であり；前記単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２および配列番号３のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）ならびに配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２および配列番号６のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有する。
【００１３】
第２の態様では、本開示の実施形態は、配列番号１５を含む、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のＡＭＡ−１に特異的に結合し、かつ／または配列番号１６を含む、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のＡＭＡ−１のドメインＩに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分に関する。
【００１４】
さらなる態様では、本開示の実施形態は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有し、配列番号１、２、３、４、５および６から選択される配列を有する少なくとも２つのポリペプチドを含む単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分に関し；抗体は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の成長を阻害する。
【００１５】
さらに、本開示の実施形態は、単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分にも関し；軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）は、配列番号１３に示す配列を有するポリペプチドを含む（図４に示す）。
【００１６】
さらに、本開示の実施形態は、単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分にも関し；重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、配列番号１４に示す配列を有するポリペプチドを含む（図４に示す）。
【００１７】
さらに、本開示の実施形態は、単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分にも関し；軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）は、配列番号１３に示す配列を有するポリペプチドを含み、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、配列番号１４に示す配列を有するポリペプチドを含む。
【００１８】
さらに別の態様では、本開示の実施形態は、前記単離した抗体またはそれらの抗体の断片／部分をコードする核酸、ならびにそのような核酸を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。
【００１９】
他の態様では、本開示は、本明細書の記載に従う単離された抗体またはその抗体の断片／部分を含む組成物に関し；組成物は、治療および／または診断の適用例に有用であり得るか、またはそうした適用例において使用することができる。１つの好都合な実施形態では、組成物を、マラリア、特に、熱帯熱マラリアの治療のために、治療用組成物として使用する。
【００２０】
したがって、本開示の実施形態は、本開示に従う抗体またはその抗原結合性部分を含む医薬組成物または診断用組成物に関する。特に、前記組成物は、少なくともさらなる抗体またはその抗原結合性部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示に従う単離された抗体またはその抗原結合性部分を別の抗体またはその抗原結合性部分と組み合わせて、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球への侵入および／またはプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の成長を相乗的に阻害することができる。
【００２１】
さらなる態様では、本開示の実施形態は、抗体またはそれらの抗体の断片／部分を宿主細胞中で生成するための方法に関し、当該方法は、宿主細胞を、ＤＮＡコンストラクトであって、好都合には、宿主細胞中で転写活性を示すプロモーターを含むＤＮＡコンストラクトを用いて形質転換するステップと、形質転換された宿主細胞を、前記抗体を発現させるのに適切な培養培地中で培養するステップ（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）と、抗体またはそれらの抗体断片を生成するステップとにより行う。当該方法はまた、生成した抗体またはそれらの抗体の断片／部分を回収または単離するステップと、任意選択で、前記抗体またはそれらの抗体の断片／部分を処理するステップも含むことができる。
【００２２】
さらなる態様では、本開示は、特異的結合性ドメインおよびエフェクタードメインとしての、本開示に従う抗体またはその抗原結合性部分を含む、精製された複合体；そのような複合体を薬理学的に許容できる担体または希釈剤と組み合わせて含む医薬品；ならびにそのような複合体の、マラリア、特に、熱帯熱マラリアを治療するための使用に関する。
【００２３】
本開示を詳細に記載する前に、本開示は開示する特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は特定の実施形態を記載するためのものに過ぎず、それらには制限する意図はないことも理解されたい。単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、そうでないことが文脈から明らかに特定されない限り、単数および／または複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。さらに、数値により限界が定められているパラメーターの範囲を示す場合には、そうした範囲はこれらの限界の値を含むとみなすことも理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）のアノテートされたアミノ酸配列（配列番号１５）を示す図である。
【図２】抗体ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１の組換えＡＭＡ−１に対する結合活性および特異性についてのＥＬＩＳＡアッセイから得られた結果を示すグラフである。
【図３】免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）により、組換え抗体ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）シゾントに対する結合を示す図である。
【図４】ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１の完全な重鎖可変領域（配列番号１４）および完全な軽鎖可変領域（配列番号１３）を示す図であり、フレームワーク領域および相補性決定領域が強調されている。Ｋａｂａｔの定義に従うＣＤＲ領域およびフレームワーク領域（図４Ａ）ならびにＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔ分析に従うＣＤＲ領域およびフレームワーク領域（図４Ｂ）を示す（重鎖配列：配列番号１４；軽鎖配列：配列番号１３）。
【図５】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定したＫＤ値の結果を示す図である。
【図６】ＳＰＲ競合分析により実施したエピトープのペアワイズ結合アッセイを示す図である。
【図７】寄生生物株３Ｄ７に対する成長阻害アッセイ（ＧＩＡ）の結果を示すグラフであり、本明細書に開示する抗体ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１を使用して、ラット起源（４Ｇ２）およびマウス起源（１Ｆ９）の、報告のある抗体と比較した。
【図８】寄生生物株３Ｄ７、ＨＢ３、Ｋ１およびＦＣＲ３に対する成長阻害アッセイ（ＧＩＡ）の結果を示すグラフである。
【図９】成長阻害アッセイ（ＧＩＡ）を使用して、抗体ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１と抗体ｈｕＭＡｂ−抗ＭＳＰ１０．１との相乗的反応性を示すアイソボログラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本出願は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の頂端膜抗原（ＡＭＡ−１）の抗原ドメインに特異的であり、寄生生物に結合する高い親和性ならびにプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球への侵入および／もしくはプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球内での成長を阻害する機能的能力により特徴付けられる、治療ならびに／または診断に有用な単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分を開示する。これらの特徴により、そうした抗体または抗原結合性部分は、強力な治療剤および／または診断剤としてとりわけ有用となる。
【００２６】
驚くべきことに、発明者らは、本開示に従う新たな完全ヒト抗体、例えば、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１の活性は、これまでに公知のその他の抗ＡＭＡ−１抗体よりも高い成長阻害活性を示すことを見出した。このヒト抗体は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物を３２μｇ／ｍｌのＩＣ５０を示す濃度で阻害する。ラットＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１抗体である４Ｇ２は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）株３Ｄ７に対して、１０６μｇ／ｍｌ超のＩＣ５０を有し、マウスＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１抗体である１Ｆ９は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）株３Ｄ７に対して、２９０μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有する（図７および表７）。
【００２７】
抗体１Ｆ９は、本明細書に開示する抗体ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１と同じドメインに結合する。抗体１Ｆ９は、寄生生物株３Ｄ７に対してのみ阻害性であり、寄生生物株ＨＢ３、ＦＣＲ３およびＫ１に対しては阻害活性を示さない。ここに、本発明者らは、３Ｄ７、ＨＢ３、ＦＣＲ３およびＫ１を含めた、複数種の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物株に対して高い反応性を示す抗体を開示している（図８および表８）。
【００２８】
したがって、いくつかの好都合な実施形態では、本開示に従う単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分は、複数種の異なるプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物のＡＭＡ−１、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物株３Ｄ７、ＨＢ３、ＦＣＲ３およびＫ１を含めた、複数種の異なる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物のＡＭＡ−１に結合する。
【００２９】
抗体が、特定の抗原にその他の抗原に優先して結合する場合には、その抗体は、当該の特定の抗原に特異的である。特に、抗体が、当該の特定の抗原以外の分子に対しては顕著な結合性を全く示さない場合があり、特異性を、標的抗原とその他の非標的抗原との間の親和性の差により定義することができる。抗体はまた、いくつかの抗原が有する場合がある特定のエピトープに特異的であり得、この場合には、抗体が、そうしたエピトープを有する種々の抗原に結合することが可能である。例えば、抗体と抗原との二量体複合体についての解離定数が、１μＭ、好ましくは、１００ｎＭ、最も好ましくは、１ｎＭ以下である場合に、特異的な結合が存在し得る。
【００３０】
抗体は、４つのポリペプチド鎖から構成される免疫グロブリン分子であり、２つの重（Ｈ）鎖（完全長の場合、約５０〜７０ｋＤａ）および２つの軽（Ｌ）鎖（完全長の場合約２５ｋＤａ）が、ジスルフィド結合により相互接続している。軽鎖は、カッパおよびラムダに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンに分類され、重鎖により、抗体のアイソタイプがそれぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとして定義される。
【００３１】
それぞれの重鎖が、重鎖可変領域（本明細書では、ＨＣＶＲと略す）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡの場合には３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成され、ＩｇＭおよびＩｇＥの場合には４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）から構成される。それぞれの軽鎖が、軽鎖可変領域（本明細書では、ＬＣＶＲと略す）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＨＣＶＲ領域およびＬＣＶＲ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域およびフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域にさらに細分することができ、前者は後者の間に介在する。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲはそれぞれ、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、それらは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並ぶ。各ドメインに対するアミノ酸の帰属は、周知の慣例に従う（Chothia and Lesk 1987；Chothia et al. n.d.；Kabat et al. 1992）。特定の抗原に結合する抗体が機能を発揮する能力は、主としてＣＤＲにより決定される。
【００３２】
したがって、第１の態様では、本開示は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の抗原ＡＭＡ−１に特異的なアミノ酸配列を含む、単離された抗体、好ましくは、単離された組換えヒト抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【００３３】
好都合な実施形態では、本開示の抗体は、配列番号１５に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド中に含まれるエピトープに特異的である。特に、本開示の抗体は、ＡＭＡ−１のドメインＩ（配列番号１６）に特異的である。好都合な実施形態では、配列番号１５は、寄生生物株３Ｄ７の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）抗原ＡＭＡ−１の配列に相当する（Ｇｅｎｂａｎｋエントリー：ＸＭ＿００１３４７９７９）。好都合な実施形態では、抗体は、ＡＭＡ−１の変異形に特異的である。好都合な実施形態では、本開示に従う単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分は、Ｇｅｎｂａｎｋ番号：Ｕ３３２７４（株３Ｄ７）、ＥＵ５８６３９０（株ＦＣＲ−３）、Ｕ３３２７７（株ＨＢ３）、Ｕ３３２７９（株Ｋ１）またはＤＱ２１８４２４（株Ｄｄ２）を有するプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物を含めた、種々の／異なるプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物に由来するＡＭＡ−１に結合する。
【００３４】
さらなる態様では、本開示の実施形態は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有し、表１に列挙する配列番号１、２、３、４、５および６から選択される配列を有する少なくとも２つのポリペプチドを含む、単離された抗体、単離された組換えヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分に関し；抗体は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の成長を阻害する。完全な抗体の可変領域を、図４に示す。ここでは、重鎖および軽鎖に属するＣＤＲ領域１、２および３を、下線で示す。
【００３５】
この本開示は、頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）に結合する単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分を提供する。好ましくは、本発明のヒト抗体は、組換え、成長阻害性のヒトＡＭＡ−１抗体である。
【００３６】
表１は、抗体の重鎖および軽鎖の相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列を示す。
【００３７】
【表１】
0006630430.tif 000002
【００３８】
別の好都合な実施形態では、本開示は、少なくとも１つのポリペプチド、好ましくは、少なくとも２、３、４、５または６つのポリペプチドを含む単離されたヒト抗体、好ましくは、単離された組換えヒト抗体またはその抗原結合性部分を提供し、これらのポリペプチドは、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１のＶＨのＣＤＲ１（配列番号４）、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１のＶＨのＣＤＲ２（配列番号５）、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１のＶＨのＣＤＲ３（配列番号６）、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１のＶＬのＣＤＲ１（配列番号１）、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１のＶＬのＣＤＲ２（配列番号２）またはヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１のＶＬのＣＤＲ３（配列番号３）として示す配列からなる群から選択される配列を有し；前記ポリペプチドは、好ましくは、前記抗体中で、本明細書の表１に示すＣＤＲの位置と同じ位置において存在する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ＬＣＶＲは、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１のＶＬのＣＤＲ１（配列番号１）、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１のＶＬのＣＤＲ２（配列番号２）またはヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１のＶＬのＣＤＲ３（配列番号３）として示す配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、本開示は、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１のＶＬのＣＤＲ１（配列番号１）、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１のＶＬのＣＤＲ２（配列番号２）またはヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１のＶＬのＣＤＲ３（配列番号３）として示す配列を有するポリペプチドを含むＬＣＶＲを含み、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１のＶＨのＣＤＲ１（配列番号４）、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１のＶＨのＣＤＲ２（配列番号５）、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１のＶＨのＣＤＲ３（配列番号６）として示す配列を有するポリペプチドを含むＨＣＶＲをさらに含む、ヒト抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【００４０】
本開示の好都合な実施形態によれば、ＬＣＶＲのＣＤＲ１ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＬＣＶＲのＣＤＲ２ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＬＣＶＲのＣＤＲ３ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【００４１】
本開示の別の好都合な実施形態によれば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ１ドメインおよび配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインが提供される。いくつかの実施形態では、ＬＣＶＲのＣＤＲ１ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲのＣＤＲ３ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣＶＲのＣＤＲ２ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲのＣＤＲ３ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【００４２】
本開示の好都合な実施形態によれば、ＨＣＶＲのＣＤＲ１ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＨＣＶＲのＣＤＲ２ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＨＣＶＲのＣＤＲ３ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。本開示の別の好都合な実施形態によれば、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ１ドメインおよび配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインが提供される。いくつかの実施形態では、ＨＣＶＲのＣＤＲ１ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＶＲのＣＤＲ３ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＶＲのＣＤＲ２ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含み、ＨＣＶＲのＣＤＲ３ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【００４３】
別の実施形態では、ＬＣＶＲは、配列番号１に示す配列を有するポリペプチドを含み、ＨＣＶＲは、配列番号４に示す配列を有するポリペプチドを含むか、またはＬＣＶＲは、配列番号１に示す配列を有するポリペプチドを含み、ＨＣＶＲは、配列番号５に示す配列を有するポリペプチドを含むか、またはＬＣＶＲは、配列番号１に示す配列を有するポリペプチドを含み、ＨＣＶＲは、配列番号６に示す配列を有するポリペプチドを含むか、またはＬＣＶＲは、配列番号２に示す配列を有するポリペプチドを含み、ＨＣＶＲは、配列番号４に示す配列を有するポリペプチドを含むか、またはＬＣＶＲは、配列番号２に示す配列を有するポリペプチドを含み、ＨＣＶＲは、配列番号５に示す配列を有するポリペプチドを含むか、またはＬＣＶＲは、配列番号２に示す配列を有するポリペプチドを含み、ＨＣＶＲは、配列番号６に示す配列を有するポリペプチドを含むか、またはＬＣＶＲは、配列番号３に示す配列を有するポリペプチドを含み、ＨＣＶＲは、配列番号４に示す配列を有するポリペプチドを含むか、またはＬＣＶＲは、配列番号３に示す配列を有するポリペプチドを含み、ＨＣＶＲは、配列番号５に示す配列を有するポリペプチドを含むか、またはＬＣＶＲは、配列番号３に示す配列を有するポリペプチドを含み、ＨＣＶＲは、配列番号６に示す配列を有するポリペプチドを含む。
【００４４】
好都合な実施形態では、本開示に従う抗体を、本明細書では、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１と呼ぶ。ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１は、配列番号１、２、３、４、５および６を有する配列を有するポリペプチドまたはそれらのバリアント、突然変異体、改変形態、相同体もしくは誘導体、特に、保存的突然変異を有するポリペプチドを含むＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを有する。
【００４５】
本開示のさらなる実施形態は、単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分に関し；軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）は、配列番号１、２および３を含む、配列番号１３に示す配列を有するポリペプチドを含む。
【００４６】
さらに、本開示の実施形態は、単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分に関し；重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、配列番号４、５および６を含む、配列番号１４に示す配列を有するポリペプチドを含む。
【００４７】
さらに、本開示の実施形態は、単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分に関し、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）は、配列番号１３に示す配列を有するポリペプチドを含み、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、配列番号１４に示す配列を有するポリペプチドを含む（図４を参照されたい）。
【００４８】
上記で論じた重鎖可変領域を、ガンマ１、ガンマ２、ガンマ３、ガンマ４、ミュー、アルファ１、アルファ２、デルタまたはイプシロンのアイソタイプの定常領域を含めた、任意の適切な定常領域、および任意の人工的な定常領域と組み合わせることができる。
【００４９】
好都合な実施形態では、本開示の抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する。代わって、本開示の抗体は、ＩｇＧ３重鎖定常領域を有する。
【００５０】
完全な抗体に加えて、抗体の断片もまた、適切な抗原（例として、ＡＭＡ−１）に結合する能力を有し得、したがって、本開示は、これらもまた包含する。
【００５１】
例えば、全抗体の断片が結合性抗原として機能を発揮することができることが示されている。結合性断片の例が、（ｉ）ＬＣＶＲ、ＨＣＶＲ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＨＣＶＲおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＨＣＶＲドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al. 1989）；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの連結されているＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（ＨＣＶＲドメインとＬＣＶＲドメインとがペプチドリンカーにより連結されており、このリンカーにより、これら２つのドメインがつながって、抗原結合部位を形成することが可能になる）（Bird et al. 1988；Huston et al. 1988）；（ｖｉｉｉ）二特異性単鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、ならびに（ｉｘ）遺伝子融合により構築される多価または多重特異性の断片である「ダイアボディ」（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット；Holliger, Prospero, and Winter 1993）である。Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子またはダイアボディ分子は、ＨＣＶＲドメインとＬＣＶＲドメインとを連結するジスルフィド架橋を組み込むことによって安定化させることができる（Reiter et al. 1996）。また、ＣＨ３ドメインに合体させたｓｃＦｖを含むミニボディも作製することができる（Hu et al. 1996）。さらに、ナノボディを、開示されている配列情報に基づいて生成することもできる（Harmsen and De Haard 2007）。
【００５２】
好都合な実施形態では、単離された抗原結合性部分は、Ｆａｂ断片である。代わって、単離された抗原結合性部分は、Ｆ（ａｂ’）２断片であっても、または単鎖Ｆｖ断片であってもよい。
【００５３】
用語「抗体」は、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖が、ジスルフィド結合により相互接続している、４つのポリペプチド鎖から構成される免疫グロブリン分子を含む。それぞれの重鎖が、重鎖可変領域（本明細書では、ＨＣＶＲまたはＶＨと略す）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。それぞれの軽鎖が、軽鎖可変領域（本明細書では、ＬＣＶＲまたはＶＬと略す）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域およびフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域にさらに細分することができ、前者は後者の間に介在する。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、それらは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並ぶ。本開示によれば、用語「抗体」は、これらに限定されないが、組換え抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、ミニボディ、ダイアボディ、トリボディ、ならびに本開示に従う抗体の抗原結合性部分を含む抗体断片、例として、上記で言及したＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２および単一ドメイン抗体を含む。好都合な実施形態では、用語「抗体」は、組換え抗体、特に、組換えヒト抗体またはその抗原結合性部分を指す。この用語はまた、例えば、ハイブリドーマ細胞中で生成される、モノクローナル抗体のような単離された抗体も含む。好都合な実施形態では、本開示に従う単離されたヒト抗体は、モノクローナル抗体である。
【００５４】
用語「合成抗体」は、本明細書で使用する場合、組換えＤＮＡ技術を使用して生成させる抗体、例えば、バクテリオファージにより発現させる抗体等を意味する。また、この用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子であって、抗体タンパク質を発現させるＤＮＡ分子または抗体を特定するアミノ酸配列を合成することによって生成されるに至った抗体も意味すると解釈すべきであり；こうしたＤＮＡまたはアミノ酸の配列は、当技術分野で利用可能かつ周知である、ＤＮＡまたはアミノ酸の配列を合成する技術を使用して得られている。
【００５５】
上記に記載したように、抗体の「抗原結合性部分」という用語（すなわち、「抗体の一部」）は、抗原（例えば、ＡＭＡ−１）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の断片を含む。抗原に結合する抗体の機能は完全長の抗体の断片がもたらすことができることが示されている。抗体の「抗原結合性部分」という用語に属する結合性断片の例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結されている２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al. 1989）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、すなわち、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によりコードされているが、これらを、組換えの方法を使用して、合成リンカーにより合体させることもでき、このリンカーにより、それらのドメインを単一のタンパク質鎖として作製することが可能になり、この場合、ＶＬ領域とＶＨ領域とが対形成して、一価の分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である）（Bird et al. 1988；Huston et al. 1988）。そのような単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合性部分」という用語に属するものとする。また、単鎖抗体のその他の形態、例として、ダイアボディも包含される。ダイアボディは、二価の二重特異性抗体であり、この場合、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを、単一のポリペプチド鎖上に発現させるが、短じか過ぎて、同じ鎖上のこれら２つのドメイン間で対形成することができないリンカーを使用し、それにより、これらのドメインに、別の鎖の相補的なドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を作り出す（Holliger et al. 1993；Poljak 1994）。その上さらに、抗体またはその抗原結合性部分は、抗体または抗体の一部と１つまたは複数のその他のタンパク質またはペプチドとが共有結合性または非共有結合性につながることにより形成されるより大きな免疫接着分子（immunoadhesion molecule）の一部であり得る。そのような免疫接着分子の例として、ストレプトアビジンコア領域を使用するｓｃＦｖ四量体分子の作製（Kipriyanov et al. 1995）、ならびにシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグを使用する二価のビオチン化ｓｃＦｖ分子の作製（Kipriyanov et al. 1994）が挙げられる。抗体の一部を、全抗体から従来の技法を使用して、例として、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片をそれぞれ、全抗体のパパインまたはペプシンによる消化等を使用して調製することができる。さらに、本明細書の記載に従って、抗体、抗体の一部および免疫接着分子を、標準的な組換えＤＮＡの技法を使用して得ることもできる。好ましい抗原結合性部分は、完全なドメインまたは完全なドメインの対である。
【００５６】
好都合な実施形態では、本開示に従う抗体またはそれらの抗原結合性部分は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。好都合な実施形態では、抗体は、組換え抗体である。いくつかの例では、抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する。代わって、本開示に従う抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２または単鎖Ｆｖ断片のような抗原結合性部分である。
【００５７】
用語「ヒト抗体」は、Ｋａｂａｔらによる記載に従うヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変領域および定常領域を有する抗体を含む（Kabat et al. 1992）。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発またはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞突然変異により導入された突然変異）を、例えば、ＣＤＲ、特に、ＣＤＲ３中に含むことができる。突然変異は、好ましくは、本明細書に記載する「選択的な突然変異誘発のアプローチ」を使用して導入する。ヒト抗体は、アミノ酸残基、例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされない、活性を増強するアミノ酸残基で交換されている少なくとも１つの位置を有し得る。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の一部ではないアミノ酸残基で交換されている位置を２０個まで有し得る。その他の実施形態では、位置が、１０個まで、５つまで、３つまでまたは２つまで交換されている。好ましい実施形態では、下記に詳細に記載するように、これらの交換は、ＣＤＲ領域内にある。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用する場合、別の哺乳動物種、例として、マウスの生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされている抗体は含まないことを意図する。さらに、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用する場合、（ｉ）インタクトな抗体、（ｉｉ）実質的にインタクトな抗体、（ｉｉｉ）抗原結合部位を含む、抗体の一部、あるいは（ｉｖ）Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片またはＦ（ａｂ’）２を含む、抗体の一部であって、ヒト生殖系列免疫グロブリン領域またはその組換え形態および／もしくは突然変異形態中に存在する、核酸配列情報によりコードされる可変領域および定常領域を有する、抗体の一部（前記抗体がヒト細胞中で生成されるか否かは問わない）でもある。用語「ヒト抗体」はまた、工学的に操作されて、単鎖ＦＶ断片の形態をとるヒト抗体も含む。突然変異は、逆突然変異により処理することができる。
【００５８】
用語「逆突然変異」は、ヒト抗体の体細胞突然変異アミノ酸の一部または全部を、相同な生殖系列抗体配列に由来する、対応する生殖系列残基で交換するプロセスを指す。本発明のヒト抗体の重鎖配列および軽鎖配列をそれぞれ、ＶＢＡＳＥデータベース中の生殖系列配列と整列させて、最も高い相同性を示す配列を同定する。本発明のヒト抗体中の差を、そのような異なるアミノ酸をコードするヌクレオチドの定義された位置を突然変異させることによって生殖系列配列に戻す。逆突然変異のための候補としてこうして同定された各アミノ酸の役割を、抗原結合性における直接的または間接的な役割について検討すべきであり、突然変異させるとヒト抗体の何らかの望ましい特徴に影響を及ぼすことが見出されたアミノ酸はいずれも、最終的なヒト抗体中に含めてはならない；例として、選択的な突然変異誘発のアプローチにより同定された、活性を増強するアミノ酸は、逆突然変異に付さない。逆突然変異に付すアミノ酸の数を最小限に留めるために、最も近い生殖系列配列とは異なるが、第２の生殖系列配列中の対応するアミノ酸と同一であることが見出されたアミノ酸の位置は、第２の生殖系列配列が、問題のアミノ酸の両側において、少なくとも１０個、好ましくは、１２個のアミノ酸が、本発明のヒト抗体の配列と同一であり、一繋がりになっているならば、維持することができる。逆突然変異は、抗体の最適化の任意の段階で行うことができ；好ましくは、逆突然変異は、選択的な突然変異誘発のアプローチの直前または直後に行う。より好ましくは、逆突然変異は、選択的な突然変異誘発のアプローチの直前に行う。
【００５９】
句「組換えヒト抗体」は、組換えの手段により調製、発現、創出または単離されるヒト抗体、例として、宿主細胞中にトランスフェクトした組換え発現ベクターを使用して発現させる抗体（下記のセクションＩＩでさらに記載する）、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体（実施例に記載する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子が導入されている動物（例えば、マウス）から単離される抗体（Taylor et al. 1992）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列のその他のＤＮＡ配列へのスプライシングが関与する任意のその他の手段により調製、発現、創出もしくは単離される抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する（Kabat et al. 1992）。しかし、特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの突然変異誘発（またはヒトＩｇ配列の遺伝子が導入されている動物を使用する場合には、ｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異誘発）に付され、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来および関連するが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト抗体の生殖系列レパートリー内に天然には存在しない場合がある配列である。しかし、特定の実施形態では、そのような組換え抗体は、選択的な突然変異誘発のアプローチもしくは逆突然変異または両方の結果である。
【００６０】
「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を示すその他の抗体を実質的に含有しない抗体を含む（例えば、ＡＭＡ−１に特異的に結合する単離された抗体は、ＡＭＡ−１に特異的に結合しない抗体を実質的に含有しない）。さらに、単離された抗体は、その他の細胞材料および／または化学物質も実質的に含有しない場合がある。
【００６１】
用語「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」は、阻害しようとする事象、例えば、これらに限定されないが、細胞への侵入、細胞分裂、細胞の成長、増殖、活性、疾患または状態を含めた事象の進行または重症度の中和、拮抗、禁止、予防、拘束、緩慢化、途絶、停止または反転を意味する。
【００６２】
好都合な実施形態では、本開示に従う抗体またはそれらの抗原結合性部分は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物のヒト赤血球への侵入を阻害する。上記で言及したように、赤血球への侵入は、対象のマラリア寄生生物への感染における主要な事象である。
【００６３】
「侵入を阻害する抗体」は、ＡＭＡ−１に結合することによって、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物のヒト赤血球への侵入の阻害をもたらす抗体を含む。ヒト赤血球への侵入のこうした阻害を、当技術分野で公知の標準的なアッセイのいくつかのうちの１つまたは複数により測定することができる（実施例５を参照されたい）。
【００６４】
好都合な実施形態では、本開示に従う抗体またはそれらの抗原結合性部分はさらに、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物の成長を阻害することもでき、すなわち、増殖を中和する。
【００６５】
「成長を阻害する抗体」は、ＡＭＡ−１に結合することによって、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物の成長の阻害をもたらす抗体を含む。
【００６６】
好都合な実施形態では、本開示に従う単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物の赤血球への侵入および／またはプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物の赤血球内での成長を、５％〜１００％、好ましくは、１０％〜９０％、より好ましくは、２０％〜８０％、より好ましくは、３０％〜７０％、より好ましくは、４０％〜６０％の範囲で阻害する。
【００６７】
好都合な実施形態では、本開示に従う単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物の赤血球への侵入および／またはプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物の赤血球内での成長を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、特に、少なくとも６０％阻害する。特に、本開示に従う単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物の成長を、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、特に、１００％阻害する（図７を参照されたい）。さらなる実施形態では、記載するヒト抗体は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物の成長を、５ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、５００μｇ／ｍｌ未満、２００μｇ／ｍｌ未満、特に、１００μｇ／ｍｌ未満の濃度で、５０％阻害する（ＩＣ５０）。さらに、いくつかの好都合な実施形態では、記載するヒト抗体は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物の成長を、０．０５ｍｇ／ｍｌ超、０．０６ｍｇ／ｍｌ、０．０７ｍｇ／ｍｌ、０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．０９ｍｇ／ｍｌ、特に、０．１ｍｇ／ｍｌ超の濃度で、５０％阻害する（ＩＣ５０）。試験される株全ての成長を、０．１ｍｇ／ｍｌ超、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度、特に、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で、５０％阻害する（ＩＣ５０）ことができる。
【００６８】
用語「エピトープ」は、本明細書で使用する場合、タンパク質分子の、抗体が結合することができる領域を指す。「免疫原性エピトープ」を、タンパク質全体が免疫原である場合には、抗体の応答を惹起する、タンパク質の部分と定義し、このことは、例えば、Ｇｅｙｓｅｎらが過去に記載している（Geysen et al. 1984）。抗体の「抗原結合性部分」は、本明細書で使用する場合、エピトープと相互作用するかまたはエピトープに結合する、抗体の領域を指し、エピトープに抗体は結合し、この場合、抗原結合性部分は抗体内に含まれる。抗原結合性部分は、完全長抗体の状況以外でも存在し得、それが依然としてエピトープと相互作用するかまたはエピトープに結合するか否かを問わず、依然として、抗体の抗原結合性部分であるとみなされる。
【００６９】
用語「改変形態」または「バリアント」は、抗体またはその抗原結合性部分が改変されているが、同じ機能的特徴を保持することを意味する。
【００７０】
用語「融合タンパク質」は、追加のアミノ酸配列をＣ末端および／またはＮ末端で共有結合性に融合させることによって得られる抗体、抗原結合性部分または任意のそのバリアントを含む。追加のアミノ酸配列の供給源および組成は、任意の生存する生物もしくはウイルスから天然に得てもよく、または非天然であってもよい。特に、融合タンパク質は、生成方法または構造のいずれかにより定義される「組換え」ポリペプチドであり得る。その生成方法に言及する場合には、例えば、生成物は、組換え核酸の技法の使用が関与するプロセスにより作製される。構造に言及する場合には、組換えのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、異なる供給源に由来する配列を含有する。特に、この用語は、天然には相互に隣接することも作動可能に連結することもない２つ以上の断片を含む配列を生成することによって作製されるポリペプチドを包含する。したがって、例えば、任意の天然には存在しないベクターを用いて細胞を形質転換することによって作製される生成物が包含される。
【００７１】
用語「相同ポリペプチド」は、本開示によれば、本開示に従うＬＣＶＲ、ＨＣＶＲまたはＣＤＲに対して少なくとも７０％、または好ましくは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％もしくは９９％の配列同一性を有する任意の抗体またはその抗原結合性部分を含む。
【００７２】
用語「突然変異」は、単一もしくは複数のヌクレオチドのトリプレットの置換もしくは交換、１つもしくは複数のコドンの挿入もしくは欠失、異なる遺伝子間の相同もしくは異種の組換え、コード配列のいずれかの末端における追加のコード配列の融合、または追加のコード配列の挿入、あるいはこれらの方法の任意の組合せを指し、これらの方法により、所望のタンパク質をコードするポリ核酸配列が得られる。したがって、用語「突然変異」はまた、上記に記載した変化のうちの１つまたは複数により改変されたポリ核酸配列がコードするポリペプチド配列中の変化も全て指す。以下の表３に従って、アミノ酸残基は、１文字コードまたは３文字コードのいずれかに略される。
【００７３】
句「接触位置」は、抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３中のアミノ酸の位置であって、抗体−抗原間の公知の構造２６個のうちの１つにおいて抗原に接触するアミノ酸が占有する位置を含む。ＣＤＲのアミノ酸が、抗体−抗原の複合体の公知の解明されている構造２６個のうちのいずれかをとって抗原に接触するならば、そのアミノ酸は接触位置を占めるとみなすことができる。接触位置は、非接触位置よりも、抗原に接触するアミノ酸により占有される高い確率を有する。好ましくは、接触位置は、２６個の構造のうちの３つ超（１１．５パーセント超）をとって抗原に接触するアミノ酸を含有する、ＣＤＲの位置である。最も好ましくは、接触位置は、２５個の構造のうちの８つ超（３２パーセント超）をとって抗原に接触するアミノ酸を含有する、ＣＤＲの位置である。
【００７４】
用語「高頻度突然変異が生じる位置」は、抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３領域中の位置であって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の親和性成熟の間に体細胞高頻度突然変異が高い頻度または確率で起きるとみなされている位置を占有するアミノ酸残基を含む。「体細胞高頻度突然変異の高い頻度または確率」は、残基がｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の親和性成熟の間に体細胞高頻度突然変異を受ける機会が５〜約４０パーセントである頻度または確率を含む。記述するこの範囲内の全ての範囲、例えば、５〜約３０パーセント、例えば、５〜約１５パーセント、例えば、１５〜約３０パーセントもまた、本発明の一部をなすものとすることを理解すべきである。
【００７５】
用語「核酸分子」または「核酸」は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはＬＮＡ起源の任意の一本鎖または二本鎖の核酸分子を示すものとする。
【００７６】
用語「核酸分子のバリアント」は、本明細書では、構造および生物学的活性が請求する配列のうちの１つに従う核酸分子に実質的に類似する核酸分子を指す。
【００７７】
用語「核酸分子の相同体」は、請求する配列のうちの１つに従う核酸分子と比較して、配列に１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換または別の方法による化学的改変が生じている核酸分子を指し、ただし、相同体は、後者と実質的に同じ結合特性を常に保持する。
【００７８】
用語「改変」は、本明細書で使用する場合、例えば、アミノ酸配列中の特定の位置におけるアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失、ならびにポリペプチド上の特定の位置のリン酸化、パルミトイル化のようなアセチル化、メチル化、硫酸化、グリコシル化；イソプレニル化、ファルネシル化のような脂質付加、脂肪酸部分の付与、糖化および／もしくはユビキチニル化、またはそれらの組合せを指す。
【００７９】
用語「改変する」は、本明細書で使用する場合、抗体またはそれらの抗原結合性部分中の１つまたは複数のアミノ酸を変化させることを含む。１つまたは複数の位置においてアミノ酸を付加する、置換するまたは欠失させることによって、変化をもたらすことができる。公知の技法、例として、ＰＣＲ突然変異誘発を使用して、変化をもたらすことができる。
【００８０】
【表２】
0006630430.tif 000003
【００８１】
本明細書において、改変するのに適切な位置を同定するが、いずれの特定の改変も示唆しない場合には、その位置に存在するアミノ酸残基を、任意のアミノ酸残基で置換することができることを理解されたい。したがって、例えば、２０位にあるアラニンの改変について言及するが、特定しない場合には、アラニンを、欠失させるかまたは任意のその他のアミノ酸残基（すなわち、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶのうちのいずれか１つ）で置換することができることを理解されたい。
【００８２】
用語「保存的突然変異」または「保存的置換」はそれぞれ、最初の突然変異に対する保存的突然変異であると当業者であればみなすアミノ酸の突然変異を指す。「保存的」は、この文脈では、アミノ酸の特徴に関して類似するアミノ酸を意味する。例えば、特定の位置において、突然変異によって、非脂肪族のアミノ酸残基（例えば、Ｓｅｒ）が脂肪族のアミノ酸残基（例えば、Ｌｅｕ）により置換される場合であれば、同じ位置における、異なる脂肪族のアミノ酸（例えば、ＩｌｅまたはＶａｌ）による置換を、保存的突然変異と呼ぶ。さらなるアミノ酸の特徴は、残基のサイズ、疎水性、極性、電荷、ｐＫ値および当技術分野で公知のその他のアミノ酸の特徴を含む。したがって、保存的突然変異は、例として、塩基性による塩基性の置換、酸性による酸性の置換、極性による極性の置換等が挙げられる。こうして誘導されたアミノ酸のセットは、構造的な理由で保存されている可能性が高い。これらのセットを、ベン図の形で記載することができる（Livingstone and Barton 1993；Taylor 1986）。保存的置換を、例えば、下記の表４に従って作製することができ、表４により、アミノ酸の一般に認められているベン図のグループ分けを示す。
【００８３】
【表３】
0006630430.tif 000004
【００８４】
用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖のＤＮＡならびにＲＮＡ分子を含む、任意の長さおよび任意の配列の任意の遺伝子材料に相当し、これらには、調節エレメント、構造遺伝子、遺伝子の群、プラスミド、全ゲノムおよびそれらの断片が含まれる。
【００８５】
２つのアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に関する「パーセント配列同一性」は、配列を最適に整列させる場合に、これら２つの配列のうち、同一である残基のパーセントを指す。したがって、アミノ酸配列の８０％の同一性は、２つの最適に整列させたポリペプチド配列のうち、８０％のアミノ酸が同一であることを意味する。パーセント同一性を、例えば、２つの分子間で配列情報を直接比較することによって決定することができ、これは、配列を整列させ、これら２つの整列させた配列間のマッチの正確な数を数え、短い方の配列の長さにより除算し、結果に１００を乗じることによって行われる。容易に利用可能なコンピュータープログラム、例として、ＡＬＩＧＮ（Dayhoff 1979）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、を使用して、分析を援助することができ；ＡＬＩＧＮは、ペプチドを分析するために、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎの局地的相同性アルゴリズムが改作されている（Smith and Waterman 1981）。ヌクレオチド配列の同一性を決定するためのプログラムが、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、８版（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラムにおいて利用可能であり、これらもまた、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを利用している。これらのプログラムは、製造元が推奨し、上記で言及したＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載されているデフォルトパラメーター５を用いて容易に利用される。配列類似性を決定するのに適切であるアルゴリズムの例が、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、以前に記載された（Altschul et al. 1990）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアが、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に利用可能である。同様に、パーセント相同性を決定するためのコンピュータープログラムもまた、容易に利用可能である。
【００８６】
また、本開示は、本開示のポリヌクレオチドに由来する分子全て、および遺伝子がコードするアミノ酸配列と比較した、翻訳後プロセシングによる、本出願に記載するそれらのバリアント全てを含むことも理解される。これらの翻訳後修飾は、ネイティブの宿主または任意の適切な発現宿主による生成／発現の間に生じる場合には、Ｎ末端配列、例として、リーダー配列および／もしくはプロ配列のタンパク質分解性の切断、Ｃ末端伸長部のタンパク質分解性の除去、Ｎ−および／もしくはＯ−グリコシル化、脂質付加、アシル化、脱アミド化、ピログルタメートの形成、リン酸化ならびに／またはその他、あるいは任意のそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。これらの翻訳後修飾は、本明細書で探索する場合、酵素の物理的または酵素的な特性に影響を及ぼす場合または及ぼさない場合がある。
【００８７】
用語「単離された」は、核酸またはタンパク質（例えば、抗体）に関して使用する場合、同定され、天然の供給源中では当該の核酸配列またはタンパク質に通常付随する少なくとも１つの混入物質（それぞれ、核酸またはタンパク質）から分離されている核酸配列またはタンパク質を指す。単離された核酸またはタンパク質は、自然界において見出される形態または状況とは異なる形態または状況で存在する。対照的に、単離されていない核酸またはタンパク質は、自然界において存在する状態で見出される。好ましくは、「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を示すその他の抗体を実質的に含有しない抗体である。
【００８８】
また、ヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分は、本開示によれば、ファージディスプレイライブラリー中で生成することもできる（Hoogenboom and Winter 1992）。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技法もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用可能な技法に属する（Boerner et al. 1991；Reisfeld et al. 1985）。
【００８９】
また、組換えヒト抗体も、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの突然変異誘発（またはヒトＩｇ配列の遺伝子が導入されている動物を使用する場合には、ｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異誘発）に付すことができ、したがって、組換え抗体のＨＣＶＲ領域およびＬＣＶＲ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＨＣＶＲ配列およびＬＣＶＲ配列に関連する配列に由来するが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト抗体の生殖系列レパートリー内に天然には存在しない場合がある配列である。
【００９０】
用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を含む。１つのタイプのベクターが、「プラスミド」であり、これは、その中に追加のＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターが、ウイルスベクターであり、この場合は、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲーションすることができる。特定のベクターは、その中に導入される宿主細胞中における自律的複製が可能である（例えば、細菌性の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中に導入されると、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、それにより、宿主のゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、それらに作動可能に連結されている遺伝子の発現を導くことも可能である。そのようなベクターを、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡの技法において有用な発現ベクターはしばしば、プラスミドの形態をとる。プラスミドが最も一般的に使用される形態のベクターであることから、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」を交換可能に使用することができる。しかし、本開示は、同等の機能を果たすその他の形態の発現ベクター、例として、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含むものとする。
【００９１】
句「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、その中に組換え発現ベクターを導入してある細胞を含む。そのような用語は、特定の主題の細胞のみならず、そのような細胞の子孫も指すことを意図することを理解すべきである。特定の改変が、突然変異または環境的影響のいずれかに起因して後代に生じる場合があることから、そのような子孫は、実際には親細胞と同一でないことがあるが、本明細書で使用する場合には依然として、用語「宿主細胞」の範囲に含まれる。
【００９２】
宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、天然の、偶発的なまたは意図的な突然変異および／または変化に起因して、子孫は必ずしも、元々の親細胞と（形態学的な状態または全ＤＮＡの相補体として）完全には同一でない場合がある。宿主細胞は、本開示の組換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクションまたは感染を行った細胞を含む。また、本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ぶこともできる。好ましくは、宿主細胞は、細菌、アグロバクテリア（agrobacteria）、植物または哺乳動物であり；宿主細胞が、植物である場合には、好ましくは、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）植物またはそのＢＹ２細胞であり、哺乳動物である場合には、好ましくは、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯまたはＨＥＫ２９３細胞である。
【００９３】
多種多様な宿主発現系を使用して、本開示の抗体を発現させることができ、これらには、原核生物（細菌）ならびに真核生物の発現系（例として、酵母、バキュロウイルス、植物、哺乳動物細胞およびその他の動物細胞、トランスジェニック動物ならびにハイブリドーマ細胞）が含まれ、ファージディスプレイ発現系も含まれる。適切な細菌発現ベクターの例が、ｐＵＣｌ１９（Ｓｆｉ）であり、適切な真核生物発現ベクターは、改変してＤＨＦＲ選択系を弱めたｐｃＤＮＡ３．１ベクターである。適切な真核生物発現ベクターについての別の例が、ｚｅｏｃｉｎ耐性およびＩＲＥＳ部位を有する、改変されたｐＭＳベクターである（Stocker et al. 2003）。適切な発現ベクターについての別の例が、ｐＴＴベクター系であり、これは、改善されたＣＭＶ発現カセットおよびＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞中における複製を増強するためのｏｒｉＰ部位を有する（Durocher et al. 2002）。植物発現ベクターの例が、ｐＴＲＡｋｔであり、これを、アグロバクテリア（agrobacteria）中に電気穿孔し、続いて、タバコ植物中に浸潤させる（Boes et al. 2011）。その他の抗体発現系もまた、当技術分野で公知であり、本明細書で企図される。
【００９４】
さらに、ＥＢＶ形質転換ヒトリンパ芽球様Ｂ細胞株を、発現系として使用することもでき、または抗体もしくはそれらの結合性部分を、無細胞のタンパク質合成系、例えば、大腸菌（Escherichia coli）抽出物に由来する系中で発現させることもできる。
【００９５】
したがって、本開示はまた、単離された抗体またはそれらの抗原結合性部分を生成する方法も含み、これらの方法は、
（ａ）抗体またはその抗原結合性部分をコードする核酸を含む核酸コンストラクトを準備するステップと、
（ｂ）核酸コンストラクトを、真核細胞または原核細胞から得られる無細胞溶解液に添加するステップと、
（ｃ）溶解液から、単離された抗体またはその抗原結合性部分を単離／精製するステップと、任意選択で、
（ｄ）前記抗体またはその抗原結合性部分の単離および／または精製および／または処理を行うステップと
を含む。
【００９６】
本開示に従う抗体またはその抗原結合性部分は、宿主細胞中における免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の遺伝子の組換え発現により調製することができる。抗体を組換えにより発現させるためには、宿主細胞に、抗体の免疫グロブリンの軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ断片を有する１つまたは複数の組換え発現ベクターをトランスフェクトし、結果として、軽鎖および重鎖が、宿主細胞中で発現される。好ましくは、その中で宿主細胞が培養される培地中に、組換え抗体を分泌させ、そこから、抗体を回収することができる。組換えＤＮＡの標準的な方法を使用して、抗体の重鎖および軽鎖の遺伝子を得、これらの遺伝子を組換え発現ベクター中に組み込み、ベクターを宿主細胞中に導入する。そのような標準的な組換えＤＮＡ技術は、以前に記載され（Ausubel et al. 1989；Sambrook et al. 1989）、Ｂｏｓｓらにより米国特許第４，８１６，３９７号明細書に記載されている（Boss et al. 1984）。
【００９７】
ＨＣＶＲをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、ＨＣＶＲ領域をコードする単離されたＤＮＡを、完全長の重鎖の遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域の遺伝子の配列は、当技術分野で公知である（Kabat et al. 1992）。これらの領域を含むＤＮＡ断片を、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、Ｋａｂａｔの記載（上記）に従うＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの定常領域および任意のそれらのアロタイプのバリアントであり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１の定常領域である。代わって、抗原結合性部分は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片または単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）であり得る。Ｆａｂ断片の重鎖遺伝子を得るには、ＨＣＶＲをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１の定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することができる。
【００９８】
ＬＣＶＲをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、ＬＣＶＲ領域をコードする単離されたＤＮＡを、完全長の軽鎖の遺伝子（およびＦａｂの軽鎖の遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域の遺伝子の配列は、当技術分野で公知である（Kabat et al. 1992）。これらの領域を含むＤＮＡ断片を、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダの定常領域であり得る。
【００９９】
ｓｃＦｖ遺伝子を作り出すためには、ＨＣＶＲをコードするＤＮＡ断片およびＬＣＶＲをコードするＤＮＡ断片を、柔軟なリンカー、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結し、結果として、ＨＣＶＲ配列およびＬＣＶＲ配列を、柔軟なリンカーによりＬＣＶＲ領域およびＨＣＶＲ領域が合体し、隣接する単鎖のタンパク質として発現させることができる。例が、Ｂｉｒｄら、ＨｕｓｔｏｎらおよびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらにより公開された（Bird et al. 1988；Huston et al. 1988；McCafferty et al. 1990）。
【０１００】
本開示の抗体またはその抗原結合性部分を発現させるために、上記の記載に従って得られる、部分的なまたは完全長の軽鎖および／または重鎖をコードするＤＮＡを、遺伝子が転写配列および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように発現ベクター中に挿入することができる。この文脈では、用語「作動可能に連結する」は、ベクター中に抗体遺伝子をライゲーションし、結果として、ベクター内の転写配列および翻訳制御配列が、それらに意図される、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する機能を果たすことを意味する。発現ベクターおよび発現を制御する配列は、使用する発現宿主細胞に適合するように選ぶ。抗体の軽鎖遺伝子および抗体の重鎖遺伝子は、別個のベクター中に挿入することができ、またはより典型的には、両方の遺伝子を、同じ発現ベクター中に挿入する。標準的な方法により、抗体遺伝子を発現ベクター中に挿入する。加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体の軽鎖および／または重鎖の分泌を促進するシグナルペプチドもコードすることができる。シグナルペプチドが、抗体鎖の遺伝子のアミノ末端にインフレームに作動可能に連結するように、ヒト抗体の軽鎖および／または重鎖の遺伝子をベクター中にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンのシグナルペプチドであっても、または異種のシグナルペプチドであってもよい。
【０１０１】
抗体の重鎖および／または軽鎖の遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中における抗体鎖の遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。用語「調節配列」は、必要に応じて、抗体鎖の遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよびその他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。調節配列の選択を含めた、発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、タンパク質の所望する発現レベルのような要因に依存する場合がある。哺乳動物宿主細胞の発現に好ましい調節配列は、哺乳動物細胞中でタンパク質の発現の高いレベルを導くウイルス性のエレメントを含み、例として、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルスの主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマウイルスに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーが挙げられる。
【０１０２】
本発明の組換え発現ベクターは、抗体の重鎖および／または軽鎖の遺伝子ならびに調節配列に加えて、追加の配列、例として、宿主細胞中におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製開始点）および１つまたは複数の選択マーカー遺伝子も有することができる。選択マーカー遺伝子により、その中にベクターが導入されるに至った宿主細胞の選択が促進される。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、その中にベクターが導入されるに至った宿主細胞に対して、薬物、例として、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートに対する耐性を付与する。
【０１０３】
選択マーカー遺伝子についてのさらなる例として、（ＤＨＦＲ−マイナス宿主細胞中において、メトトレキセートによる選択／増幅と共に使用するための）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、（Ｇ４１８による選択のための）ｎｅｏ遺伝子、およびＧＳ陰性細胞株（例として、ＮＳＯ）中における選択／増幅のためのグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）が挙げられる。
【０１０４】
軽鎖および／または重鎖の発現のために、宿主細胞中に、標準的な技法、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション等により、重鎖および／または軽鎖をコードする発現ベクターをトランスフェクトする。
【０１０５】
宿主細胞が原核生物または真核生物のいずれであっても、本開示の抗体または抗体断片を発現させることが理論的には可能であるが、真核細胞が好ましく、哺乳動物宿主細胞が最も好ましい；その理由は、そのような細胞は、適切に折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性がより高いからである。本発明の組換え抗体を発現させるのに好ましい哺乳動物宿主細胞には、ＤＨＦＲ選択マーカー、例えば、以前に記載されたＤＨＦＲ選択マーカー（Kaufman and Sharp 1982）と共に使用するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub and Chasin 1980）が挙げられる）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３およびＳＰ２／０細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞中に導入する場合、宿主細胞中における抗体の発現、または、より好ましくは、その中で宿主細胞を成長させる培養培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間にわたり宿主細胞を培養することによって、抗体を生成する。標準的な精製方法を使用して、宿主細胞および／または培養培地から抗体を回収することができる。
【０１０６】
また、宿主細胞を使用して、インタクトな抗体の部分または断片、例えば、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ分子を生成することもできる。上記の手順についての変更形態は本開示の範囲に属することが理解される。例えば、本開示の抗体の軽鎖または重鎖のいずれか（しかし、両方ではない）をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトするのが望ましい場合がある。
【０１０７】
また、植物細胞を改変して、本開示の抗体またはその抗原結合性部分を発現する遺伝子導入植物を作り出すこともできる。
【０１０８】
本開示のさらなる態様は、宿主細胞中において本明細書の記載に従う核酸分子から抗体またはその結合性部分を発現させる方法；本明細書の記載に従うポリペプチドを、前記ポリペプチドを生成するのに適切な培養条件下で発現することが可能な宿主細胞；融合タンパク質を生成する方法であって、そのような宿主細胞を適切な条件下で培養するステップを含み、細胞培養物から前記融合タンパク質を単離するステップをさらに含むことができ、単離された融合タンパク質を、（例えば、別のタンパク質、または賦形剤もしくは担体であり得る）適切なさらなる構成成分と混合するステップをさらに含むことができる方法に関する。
【０１０９】
上記で論じたように、本開示によれば、ポリペプチドは、望ましい系のベクターコンストラクトのいずれかにおいて生成することができ、発現系は、当技術分野で周知であり、本明細書で提供するポリペプチドの使用を組み込むように改作することができる。例えば、遺伝子導入植物による生成は公知であり、コンストラクトの生成および植物の生育は、当技術分野で公知の技法に従って改作することができる。
【０１１０】
上記を考慮すると、本開示の別の実施形態は、本開示の抗体および抗体の一部の組換え発現のために使用することができる核酸、ベクター、および宿主細胞組成物に関する。本開示は、好ましくは、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１の１つまたは複数のＣＤＲをコードする領域を含む単離された核酸を提供し、さらにより好ましくは、それらのＣＤＲが、発現させたタンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合性部分）中で、それらが抗体ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１中で存在する抗体構造内のＣＤＲ部位と同じ部位に存在する（表１を参照されたい）。
【０１１１】
さらなる実施形態は、少なくとも２つのドメイン、すなわち、１つのエフェクタードメインおよび１つの結合性ドメインを含む異種の複合体とみなすことができる複合体に関する。
【０１１２】
好都合な実施形態では、本開示は、特異的結合性ドメインとしての少なくとも１つの本開示の抗体またはその抗原結合性部分および少なくとも１つのエフェクタードメインから形成される複合体に関し、抗体またはその抗原結合性部分は、ＡＭＡ−１、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のＡＭＡ−１のドメインＩ（配列番号１６）に対する結合活性を示し、エフェクタードメインは、細胞傷害性試薬をエフェクター機能として有する。特に、複合体は、結合性ドメインおよびエフェクタードメインを含む融合タンパク質を含む。
【０１１３】
特定の実施形態では、現在の開示において使用するための、細胞を標的とする部分としての結合性ドメインは、本開示に従う組換え抗体またはそれらの抗原結合性部分である。本開示に従う抗体の抗原結合性部分は、モノクローナル抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、ミニボディ、ダイアボディ、トリボディ、および抗体断片、例として、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２または単一ドメイン抗体中に含めることができる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のアポトーシスを誘発する。代わって、所望のエフェクター機能または抗寄生生物作用を惹起することが可能なその他の分子、例えば、抗寄生生物作用を示す酵素を、抗体の抗原結合性領域にカップリングさせることもできる。例えば、そのような抗体の使用により、別の場合には毒性を示す薬物または物質に、標的選択性が付与され得る。
【０１１５】
したがって、さらなる態様では、本開示は、組換えヒト抗体またはその抗原結合性部分をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を提供する。そのような核酸分子は、組換えのベクター、好ましくは、複製可能なベクターの形態をとることができる。
【０１１６】
そのようなベクターは、二本鎖または一本鎖をなす、線状または環状の形態の任意のプラスミド、コスミドまたはファージであり得、これらは、自己伝播性であってももしくはなくてもよく、または可動性であってももしくはなくてもよく；これらは、細胞ゲノム内に組み込まれるかまたは染色体外に存在することによって、原核生物または真核生物の宿主を形質転換することができる（例えば、複製開始点を有する自律的に複製するプラスミド）。細菌、例えば、古細菌、植物、植物細胞、真菌を含めた、任意の適切な宿主を使用することができる。
【０１１７】
一般的にいえば、当業者が、組換え遺伝子発現のために、ベクターを構築し、プロトコールを設計することは十分に可能である。さらなる詳細については、例えば、Molecular Cloning : a Laboratory Manual : 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press（またはこれより新しい版）、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992を参照されたい；これらは、参照により本明細書に組み込まれている。好ましいベクターは、プラスミドのｐＭＳ、ｐＴＴおよびｐＴＲＡｋｔを含む（Boes et al. 2011；Durocher et al. 2002；Stocker et al. 2003）。
【０１１８】
抗体は、そこから抗体が発現する細胞により培地中に分泌されることが好ましい。
【０１１９】
本発明のさらなる態様は、宿主細胞中において本明細書に記載する核酸分子から本明細書の記載に従う抗体またはその抗原結合性部分を発現させる方法；本明細書の記載に従う抗体を、前記抗体を生成するのに適切な培養条件下で発現することが可能な宿主細胞；抗体を生成する方法であって、そのような宿主細胞を適切な条件下で培養するステップを含み、細胞培養物から前記抗体を単離するステップをさらに含むことができ、単離された抗体を、（例えば、別の抗体、または賦形剤もしくは担体であり得る）適切なさらなる構成成分と混合するステップをさらに含むことができる方法に関する。
【０１２０】
哺乳動物細胞に、任意の適切な技法、例として、リポフェクションによりトランスフェクトすることができる。代わって、標準的なリン酸カルシウムトランスフェクションまたはエレクトロポレーションを使用することもでき、これらは、当業者により十分理解されている。これらの発現系から生成された組換え抗体および本開示の核酸分子は、好ましくは、実質的に純粋または均一な形態で提供される。
【０１２１】
組換え抗体を、任意の適切な方法、ｍＡＢ  ｓｅｌｅｃｔまたはＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用する親和性クロマトグラフィーにより精製することができる。これに、任意選択で、ゲルろ過のステップ、例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００を使用するステップを続けることができる。
【０１２２】
その上さらなる態様では、本開示は、核酸分子および核酸分子の使用に関し、これらの核酸分子は、
ａ）本開示に従う抗体もしくはその抗原結合性部分をコードする核酸分子、
ｂ）本開示に従う抗体もしくはその抗原結合性部分の改変形態、好ましくは、その中で１つもしくは複数のアミノ酸残基が保存的に置換されている改変形態をコードする核酸分子、
ｃ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および／もしくは配列番号１２として示す核酸分子のほんの一部、バリアント、相同体、誘導体もしくは断片である核酸分子、
ｄ）本開示に従う単離された抗体もしくはその抗原結合性部分の断片をコードする核酸分子、
ｅ）ストリンジェントな条件下でａ）〜ｄ）の核酸分子のうちのいずれかにハイブリダイズすることが可能である核酸分子、
ｆ）ストリンジェントな条件下でａ）〜ｅ）の核酸分子のうちのいずれかの相補体にハイブリダイズすることが可能である核酸分子、
ｇ）ａ）〜ｆ）の核酸分子のうちのいずれかに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、本開示の抗体もしくはその抗原結合性部分をコードする核酸分子、
ｈ）ａ）〜ｆ）の核酸分子のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、本開示の抗体もしくはその抗原結合性部分をコードする核酸分子、または
ｉ）ａ）〜ｈ）の核酸分子のうちのいずれかの相補体
からなる群から選択される。
【０１２３】
ヌクレオチドまたは核酸が中位のストリンジェンシー、より好ましくは、高いストリンジェンシー、さらにより好ましくは、非常に高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることが可能である場合に、ヌクレオチドまたは核酸は上記のヌクレオチドのうちの１つにハイブリダイズするとみなされる。
【０１２４】
本開示の核酸分子は、表５に列挙する配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および／または配列番号１２をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１２５】
表５は、抗体の重鎖および軽鎖の相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）の核酸配列を示す。
【０１２６】
【表４】
0006630430.tif 000005
【０１２７】
いくつかの実施形態は、本開示に従う抗体またはその抗原結合性の部分もしくは複数部分をコードする単離された核酸分子に関する。軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む抗体の可変領域のような、抗体またはその抗原結合性部分の複数部分または複数断片をコードする核酸配列は、ベクターのような単一の核酸分子に位置することができる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合性部分の複数部分または複数断片は、異なるベクターのような異なる核酸分子に位置することができる。
【０１２８】
特に、核酸分子は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択される核酸配列を含む。したがって、核酸分子は、抗体の可変領域またはその一部をコードし；前記可変領域の軽鎖可変領域は、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２および配列番号３のＣＤＲ３を含み、重鎖可変領域は、配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２および配列番号６のＣＤＲ３を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号７、配列番号８および配列番号９ならびに／または配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２を含む。
【０１３０】
特に、本開示は、本明細書の記載に従うポリペプチドまたはその相同体もしくは誘導体をコードする核酸配列を含むプラスミド、ベクター系またはベクターの組合せを提供する。
【０１３１】
本開示の抗体またはそれらの抗原結合性部分および複合体を、「薬学的に許容できる担体」と共に使用することができ、それらには、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗細菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、矯味矯臭剤、色素、それらに類似する材料、およびそれらの組合せが含まれ、これらは、当業者であれば公知であろう。
【０１３２】
特定の実施形態では、非ヒト動物、例として、イヌへの投与のために処方される薬学的に許容できるが、（例えば、政府の規制に起因して）ヒトへの投与のためには許容されないであろう担体を使用するのが望ましい場合があるが、薬学的に許容できる担体は、好ましくは、ヒトへの投与のために処方される。従来の担体はいずれも、活性成分と不和合性でない限り、治療用組成物または医薬組成物中でのそれらの使用を企図する。
【０１３３】
対象に投与する本開示の組成物の実際の投与量は、身体的および生理的な因子、例として、体重、状態の重症度、治療される疾患のタイプ、以前または同時の治療介入、患者の特発性により、かつ投与経路により決定することができる。いずれにしても、投与に関与する担当医が、個々の対象について、組成物中の活性成分の濃度および適切な用量を決定する。
【０１３４】
好都合な実施形態では、本開示に従う抗体またはそれらの抗原結合性部分、および複合体を使用して、マラリア、特に、熱帯熱マラリアを予防または治療するための医薬品を調製する。
【０１３５】
図１は、頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）の配列を示す。ドメインＩ、ＩＩおよびＩＩが、ボックスによりマークされている。
【０１３６】
図２は、ＥＬＩＳＡアッセイの結果、特に、頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）のドメインＩ（配列番号１６）に対する、配列番号１〜配列番号６を含むヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１抗体の反応性を示す。ピキア・パストリス（Pichia pastoris）中で生成した組換えＡＭＡ−１を、そのネイティブの形態および還元（変性）させた形態で、ＥＬＩＳＡプレート上で終夜インキュベートした。多少の免疫を獲得しているドナーから得られた血漿の反応性および未精製の植物抽出物から得られた組換えヒト抗体ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１の反応性を定量化した。多少の免疫を獲得している血漿の、ネイティブのタンパク質に対する反応性への相対的な反応性として、活性を示す。
【０１３７】
図３は、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）による、組換え抗体ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ１．１の結合性を示す。寄生生物株３Ｄ７から得られた成熟シゾントを、スライド上に固定し、マウス抗ＭＳＰ４抗体２．４４、続いて、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ４８８を用いて（Ａ）、組換えヒト抗ＡＭＡ−１抗体であるヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ１．１、続いて、ヤギ抗ヒトＣｙ３を用いて（Ｂ）共染色した。ＤＮＡ染色剤のヘキスト３３３４２を使用して、核を共染色した（Ｃ）。明視野画像を含む３つの画像のオーバーレイを、Ｄに示す。画像は、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８共焦点顕微鏡上で撮影した。二次抗体は単独では、いずれの反応も示さない（データ未公開）。
【０１３８】
図４は、完全な重鎖および軽鎖の可変領域を示し、フレームワーク領域および相補性決定領域が強調されている。配列を、Ｋａｂａｔの定義に従って分析し（図４Ａ）、ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴを使用して分析した（図４Ｂ）。
【０１３９】
図５は、実施例３に記載する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定したＫＤ値の結果を示す。
【０１４０】
図６は、実施例３に記載するＳＰＲ競合分析により実施したエピトープのペアワイズ抗体結合アッセイを示す。抗体１Ｄ７を、チップの表面上に固定化させた。続いて、抗原ＡＭＡ−１を結合させた（Ａ）。Ｂ〜Ｄではそれぞれ、固定化されたＡＭＡ−１に対する、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ１．１（１μｇ／ｍｌ）、ｍＡｂ１Ｆ９（１０μｇ／ｍｌ）およびｍＡｂ４Ｇ２（１μｇ／ｍｌ）の個々の結合性を示す。続いて、ペアワイズ抗体結合アッセイを実施した。ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ１．１（１μｇ／ｍｌ）対ｍＡｂ４Ｇ２（１μｇ／ｍｌ）（Ｆ）のペアワイズ結合性、およびヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ１．１（１０μｇ／ｍｌ）とｍＡｂ１Ｆ９（１０μｇ／ｍｌ）とのペアワイズ結合活性（Ｇ）を試験した。（Ｈ）では、ＡＭＡ−１に対する、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ１．１単独の１０μｇ／ｍｌの濃度における結合性を示す。
【０１４１】
図７は、実施例５に記載する寄生生物株３Ｄ７に対する成長阻害アッセイ（ＧＩＡ）の結果を示し、抗体ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ１．１を使用して、げっ歯類起源の抗体である４Ｇ２（ラット）および１Ｆ９（マウス）と比較した。
【０１４２】
図８は、実施例５に記載する寄生生物株３Ｄ７、ＨＢ３、Ｋ１およびＦＣＲ３に対する成長阻害アッセイ（ＧＩＡ）の結果を示す。
【０１４３】
図９は、実施例６に記載する成長阻害アッセイの結果を示し、抗体ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１と抗体ｈｕＭＡｂ−抗ＭＳＰ１０．１とを組み合わせた。
【実施例】
【０１４４】
以下の方法および実施例は例示のために限って提供するのであって、いかなる場合であっても、これらにより本開示の範囲を制限する意図はない。
【０１４５】
方法および実施例
以下の実施例では、本開示に従う抗体の結合および阻害についての特性の決定を含めて、本開示の材料および方法を提供する。これらの実施例は、例示のためのものに過ぎず、いかなる場合であっても、本開示を制限するものであると解釈してはならないことを理解すべきである。本明細書に引用する刊行物、特許および特許出願は全て、それらの全体が全ての目的で参照により明細書に組み込まれている。
【実施例１】
【０１４６】
メモリーＢ細胞の不死化およびＶ遺伝子の増幅
多少の免疫を獲得しているガーナ人の一人の成人から、血液の５０ｍｌを採血し、ＰＢＭＣを密度勾配遠心分離により単離した。ＰＢＭＣは、１０％のＤＭＳＯを含有するＦＣＳ中に凍結保存し、使用するまで−１５０℃で保った。
【０１４７】
メモリーＢ細胞を、エプスタイン・バーウイルス（Epstein Barr Virus）（ＥＢＶ）による形質転換により、標準的な手順に従って不死化させた（Fraussen et al. 2010）。Ｂ細胞培養物の安定な成長を得たら、細胞を、１０％のＦＣＳ、１０ｍＭのヘペスおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含有するＲＰＭＩ中に維持した。上清を収集し、抗原ＡＭＡ−１に対する特異性についてアッセイした。対応するＥＢＶ形質転換抗体生成Ｂ細胞を収集した。Ｃｅｌｌｓ−Ｄｉｒｅｃｔキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、１００〜１０００個の細胞からｃＤＮＡを直接調製した。ｃＤＮＡからＶ遺伝子を、ネステッドＰＣＲにより、以前に記載されたプライマーを使用して増幅した（Tiller et al. 2008）。
【０１４８】
標準的な手順に従って、植物発現ベクターｐＴＲＡｋｔ発現ベクター系中に、重鎖定常ドメインアロタイプＩｇＧ１ｍ１７，１および軽鎖のカッパ鎖定常ドメインを含有する増幅配列をクローニングした。クローニングした重鎖配列および軽鎖配列について、配列決定した。ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ（ＶＱＵＥｒｙ  ａｎｄ  ＳＴａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇにおいてアクセス可能）を使用して、得られた配列を分析した（Brochet et al. 2008）。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ製のＶ−ＱＵＥＳＴツールは、生殖系列配列の内部抗体配列に対して、クエリー抗体配列を整列させる。このツールはまた、フレームワーク領域および分化抗原群領域１〜３に対応する抗体の領域の帰属を行う。ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴから得られた結果に従って、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１を定義するＣＤＲ領域を割り当てた。
【０１４９】
ガーナ人のドナーから、１．１×１０７個の生存ＰＢＭＣを回収した。細胞を解凍した後の生存率は６０％であった。選別プロセスにおいて、１４，０００個の抗原陽性Ｂ細胞を単離した。ＥＢＶを用いてメモリーＢ細胞を形質転換してから、細胞が３週間後にはクラスターに成長し、これを継代培養した。試験した上清のＥＬＩＳＡの結果によれば、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）抗原に特異的であるとして選別した１４９個のウエルのうちの１つが、ＡＭＡ−１に対して反応性であった。図１に、ＡＭＡ−１の配列を示す。
【０１５０】
Ｖ−遺伝子のレスキューの後に、ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ分析から、重鎖可変領域配列はＩＧＨＶ４ファミリーに属し（８９％の同一性）、軽鎖可変領域はＩＧＫＶ２ファミリーに属する（９８％の同一性）ことが明らかになった。したがって、３つのＣＤＲは全て、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて強力な親和性成熟のプロセスを経ている。抗体から得られた完全な可変ドメインを、図４に示す。重鎖および軽鎖のいずれかに属するＣＤＲ領域１〜３を、下線で示す。
【実施例２】
【０１５１】
ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）中での組換え抗体の発現
抗体の組換え発現を、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）中で、以前の記載に従って実施した（Boes et al. 2011）。基本的に、軽鎖抗体配列または重鎖抗体配列のいずれかを含有するｐＴＲＡｋｔベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０ＲＫ）内に電気穿孔した。コロニーＰＣＲにより、対応するベクタープライマーであるＰＳ５（ＡＴＣＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴＣＴ）およびＰＳ３（ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＡ）を使用して、良好な形質転換を制御した。陽性のクローンを拾い、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＹＥＢ培地中で、ＯＤをおよそ２〜４に維持しながら培地体積を増加させて成長させた。体積が１リットルに達したら、アグロバクテリア（agrobacteria）を、１００μＭのアセトシリンゴンを含有する浸潤培地（最終濃度：２ｇ／ｌのグルコース、５０ｇ／ｌのスクロースおよび０．５ｇ／ｌのＦｅｒｔｙ  Ｍｅｇａ  ２；ｐＨ５．６）中に希釈して、１の最終ＯＤを得、１時間インキュベートした。最適に発現させるために、アグロバクテリア（agrobacterium）混合物に、サイレンシング抑制因子ｐ１９を発現するアグロバクテリア（agrobacteria）を１：４の比で混合した。続いて、真空浸潤により、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）植物全体を５分間浸潤させた。加湿チャンバー中に、浸潤させた植物を室温で５日間保った。インキュベーション期間が過ぎたら、ブレンダー中で、植物タンパク質全体を、２体積のＰＢＳ中に１分間混合することによって抽出した。植物デブリを遠心分離により排除してから、Ｍａｂ−Ｓｅｌｅｃｔ（商標）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で製造元の使用説明に従って、抗体を精製した。抗体を溶出させた後、ＰＢＳに対して透析し、一定分量に分けて、４℃および−２０℃で保存した。
【０１５２】
上記で言及したように、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１抗体を、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）中で完全長抗体として発現させ、続いて、精製した。典型的には、発現させた抗体の収率の変動は、１ｋｇの植物材料当たり５０〜２００ｍｇであった。抗体コンストラクトの純度および構造的完全性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元性および非還元性条件下で確認した（データ未公開）。
【実施例３】
【０１５３】
抗体の特異性の決定
抗体の特異性を、標準的なＥＬＩＳＡの手順で推定した。手短に述べると、３Ｄ７から組換えにより生成したＡＭＡ−１は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）中で生成したが、これを、１μｇ／ｍｌの濃度にて４℃で終夜コーティングした。加えて、抗体が線状エピトープまたは立体構造エピトープのいずれに結合しているかを比較検討するために、抗原を、５ｍＭのＤＴＴを使用して還元し（５６℃、４５分）、１４ｍＭのヨードアセトアミドを用いてアルキル化し（室温、３０分）、最後に、５ｍＭのＤＴＴを使用してクエンチしてからコーティングした。ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いる室温での１時間のブロッキングのステップの後に、一次抗体またはヒト血漿を、表示した希釈度で添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を使用する３回の洗浄ステップの後に、二次ヤギ抗ヒトＩｇＧ−アルカリホスファターゼ（Ｈ＋Ｌ特異的、Ｐｒｏｍｅｇａ）（ＰＢＳ中の１：５０００）を添加し、これもまた、室温で１時間インキュベートした。最後の洗浄ステップ（ＰＢＳ／１％Ｔｗｅｅｎ中で、３×１分）の後に、結合している抗体を、ｐＮＰＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｎ２７６５）を使用して可視化した。Ｂｉｏｔｅｋ  Ｅｐｏｃｈ分光光度計を使用して、４０５ｎｍの波長で、反応性を定量化した。
【０１５４】
ここに提示する、単離されたヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１抗体は、ネイティブの標的抗原であるＡＭＡ−１に対する高い結合特異性を示している（図２）。このこととは対照的に、この抗体は、還元／アルキル化された抗原には結合していない。したがって、抗体の反応がＡＭＡ−１抗原の立体構造エピトープに特異的であることを決定することができた（図２）。
【０１５５】
結合アッセイを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置上で、プロテインＡ捕捉アッセイおよび試行用緩衝液としてのＨＢＳ−ＥＰを使用して２５℃で実施した（Rosenberg et al. 2013）。全ての抗体を試行用緩衝液中に希釈して、同等の捕捉レベルを得た。注入時間を１８０秒に設定し、解離を６００秒間記録した。プロテインＡの表面を、３０ｍＭのＨＣｌを３０秒間パルス添加することによりにより再生した。抗体について、二重参照のために、緩衝液の注入を使用した。抗体のＫＤの値を、単純な結合モデル（１：１のラングミュア）についての曲線適合法に従って計算した。個々の測定値を、図５に示す。親和性測定の結果を、表６に要約する。
【０１５６】
【表５】
0006630430.tif 000006
【０１５７】
抗体ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１の結合性ドメインを見積もるために、ペアワイズ抗体結合アッセイを、結合性エピトープが公開されている３つの抗体（１Ｄ７、４Ｇ２および１Ｆ９）を使用して実施した。第１に、抗体１Ｄ７を、ＣＭ５−Ｓ−Ｓｅｒｉｅｓセンサーチップ上に固定化した。第２のステップで、希釈したＡＭＡ−１を、抗体に１８０秒間結合させた。第３のステップとして、抗体４Ｇ２、抗体１Ｆ９またはヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１のうちのいずれかを注入して、直接的な結合を比較検討した。これらの個々の抗体結合アッセイの後に毎回、プロテインＡの表面を、３０ｍＭのＨＣｌを３０秒間パルス添加することにより再生した。
【０１５８】
見込みのあるエピトープのオーバーラップを決定するために、ＡＭＡ−１を結合させた後に、抗体ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１を系内に注入した。続いて、抗体４Ｇ２または抗体１Ｆ９を注入して、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１に類似するエピトープに対する競合的結合について比較検討した。
【０１５９】
実験の結果を、図６に要約する。抗体１Ｆ９、抗体４Ｇ２およびヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１は、抗体１Ｄ７により固定化されているＡＭＡ−１に結合した。このことから、試験した抗体はいずれも抗体１Ｄ７とは競合的結合を起こさなかったが示されている。最初に、抗体ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１を結合させた場合、抗体４Ｇ２はＡＭＡ−１に依然として結合することができた。このこととは対照的に、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１を抗原上に固定化した場合には、ＡＭＡ−１に対する抗体１Ｆ９の結合は（９０％超だけ）低下した。このことから、両方の抗体のエピトープは、オーバーラップするか、または少なくとも非常に近接していることが示されている。
【実施例４】
【０１６０】
免疫蛍光顕微鏡法
免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）を、以前の記載に従って実施した（Roestenberg et al. 2008）。熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物を、ＲＰＭＩ＋２５ｍＭのヘペス中で３回洗浄し、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中に再懸濁させ、スライド上に塗抹し、１００％のメタノール中で−２０℃にて固定した。加湿チャンバー中で、一次抗体であるヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１およびモノクローナルマウス抗ＭＳＰ４抗体２．４４を、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ中で２５μｇ／ｍｌの濃度にて室温で１時間インキュベートした。続いて、スライドを、ＰＢＳを用いて４×洗浄した。二次のヤギ−抗ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ６４７（Ｄｉａｎｏｖａ、番号１０９−６０５−００３）およびヤギ−抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（Ｄｉａｎｏｖａ、番号１１１−５４５−００３）を、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ中で１：１００の希釈度にて室温で１時間インキュベートした。最後の洗浄ステップの後に、スライドを、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍを使用して封入し、続いて、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８共焦点顕微鏡を使用して分析した。
【０１６１】
ＡＭＡ−１は、極帽（ミクロネーム）およびメロゾイトの表面に局在する。免疫蛍光アッセイにおいて、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１は、頂端部の端にある領域を強力に染色する。さらに、メロゾイトの表面上に、ぼんやりとした染色も検出可能である。ＩＦＡにおいて、抗体ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１の染色とマウスＭＳＰ４抗体の表面染色とが部分的に同時局在する（図３を参照されたい）。
【実施例５】
【０１６２】
成長阻害アッセイ（ＧＩＡ）
試験しようとする抗体を、プロテインＡカラムを使用して精製した。溶出液をろ過滅菌した。続いて、抗体を濃縮し、緩衝液を、２５％のヘペスを含有するＲＰＭＩに交換した。濃度を、ブラッドフォードアッセイにより、抗体の標準物質と比べて推定した。
【０１６３】
プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の成長を阻害する可能性を、標準化されたプロトコールを使用して試験した。熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物株３Ｄ７Ａ、ＨＢ３、ＦＣＲ３およびＫ１（ＭＲ４により提供された）を、１０％のＡｌｂｕｍａｘ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５ｍＭヘペス、１２μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１００μＭのヒポキサンチンを補充したＲＰＭＩ培地中の５％未満の寄生虫血、４％のヘマトクリットの培養液として、３７℃ならびに５％ＣＯ２、５％Ｏ２および９０％Ｎ２で維持した。培養液を毎日定期的に維持し、寄生虫血について、ギムザ染色により推定した。アッセイにおいて使用した赤血球は、１５人のマラリア無感作の血液ドナーから得て混合した、３週間未満のものであった。赤血球は、ＳＡＧ−マンニトール中に４℃で保存した。寄生生物を、侵入後の１〜１６時間の時間のウィンドウ内に、１０％のソルビトールによる処置により同調化した。アッセイのために、同調化が侵入から３６〜４０時間後に非常に進んでいる培養液のみを使用した。
【０１６４】
０．１％の寄生虫血および２％のヘマトクリットを最終的に得るために、９６ウエルプレート中で、寄生生物および新鮮なＲＢＣならびに抗体を適切に混合した。バックグランドの対照のために、培養液中に、寄生生物を加えずに、ＲＢＣのみを寄生生物と同じ条件下で保った。寄生生物の成長をモニターするための成長の対照を、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物を添加物なしで培養することによって得た。全ての試料を、三つ組で測定した。陰性対照として、マラリア無感作のウサギおよびヒトの血漿に由来する、精製された抗体を試験した。完全な侵入阻害の陽性対照のために、ＥＤＴＡ（４ｍＭの最終濃度）およびＢＧ９８ウサギ抗ＡＭＡ−１ポリクローナル抗体を使用した。試験しようとする抗体は、組換えヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１であった。
【０１６５】
プレートを、３７℃、９５％の湿度、５％ＣＯ２、５％Ｏ２および９０％Ｎ２で４０〜４４時間インキュベートした。収集時に、ウエルを、冷ＰＢＳを用いて１回洗浄し、凍結した。寄生生物の成長を、Ｍａｌｓｔａｔ（商標）アッセイにより推定した（Makler et al. 1993）。３０分後に、分光光度計を使用して６５５ｎｍの波長において、吸光度を測定した。阻害能力を、以下の式により推定した。
【０１６６】
【数１】
0006630430.tif 000007
【０１６７】
ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１の阻害能力を試験するために、上記で言及した成長阻害アッセイを、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１を用いて実施した。この組換え抗体は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の成長を、効率的に最大１００％阻害する（図７）。ＩＣ５０値を、非線形適合モデルにより、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアパッケージを使用して推定した。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍａｌａｒｉａ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙと比較した、標準化した試料から得られた結果により、アッセイの再現性が確認される。抗体ＢＧ９８は、マラリア寄生生物の侵入および成長を８５〜１００％だけ阻害する。陰性対照（マラリア無感作の血液ドナーから精製されたＩｇＧ）は、６ｍｇ／ｍｌの最大濃度においても、阻害作用を全く示さなかった（データ未公開）。種々の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）株における、開示する抗体のＩＣ５０値を、表７に要約する。
【０１６８】
このデータから、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１の特異性が確認される。今回初めて、ＡＭＡ−１に対するヒト組換え抗体を提示する。また、今回初めて、ＡＭＡ−１に特異的な組換えヒト抗体が寄生生物の成長を効率的に阻害することができることも示す。このことは、治療または予防のための受動的ワクチンとして使用される、この抗体の可能性を支持する。
【実施例６】
【０１６９】
その他のモノクローナル抗マラリア抗体との相乗活性
抗体ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１の相乗的な阻害活性の可能性を検討するために、この抗体を、抗体ｈｕＭＡｂ−抗ＭＳＰ１０．１（欧州特許出願公開第２６９２３５７号明細書）と組み合わせて試験した。抗体を、実施例５の記載に類似する様式で調製し、ＩＣ５０を、単独の各抗体について決定した（実施例５および欧州特許出願公開第２６９２３５７号明細書）。相乗活性を、チェッカーボード法による組合せの原理を使用して定量化した。抗体、すなわち、ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１とｈｕＭＡｂ−抗ＭＳＰ１０．１とを、それらの個別のＩＣ５０値の濃度に関して、以下の比：４：１、２：１、１：１、１：２および４：１で混合した。それぞれの組合せについて、一連の希釈物を調製した。これらの組合せ全てを使用するＧＩＡおよびＩＣ５０値の計算を、実施例５と同様に実施した。使用された各抗体の個々のＩＣ５０の濃度に対する、組合せ中で各抗体が使用された相対濃度を、アイソボログラムとしてプロットした（図９）。単独で適用された抗体のＩＣ５０値（＝ｘ軸およびｙ軸上の１００％）間を結ぶと、相加性を示す線が得られる。この線の下にある値は相乗活性を示し、この線の上にある値は拮抗活性を示す。図９に、これらの抗体は強力な相乗効果を示すことを明らかに認めることができる。
【０１７０】
このデータにより、抗体ヒトＭＡｂ−抗ＡＭＡ−１．１の強力な活性が確認されており、異なるエピトープに対する抗体を加える場合に得られる可能性がある相乗活性により、適用性が強力に増強される。
【０１７１】
【表６】
0006630430.tif 000008
【０１７２】
【表７】
0006630430.tif 000009
【０１７３】
本開示の好都合な実施形態は以下に関する：
−  プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のＡＭＡ−１に結合する単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分；
−  プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物のＡＭＡ−１のドメインＩ、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のＡＭＡ−１のドメインＩ（配列番号１６）、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）株３Ｄ７（Ｇｅｎｂａｎｋ番号：Ｕ３３２７４）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）株ＦＣＲ−３（Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＥＵ５８６３９０）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）株ＨＢ３（Ｇｅｎｂａｎｋ番号：Ｕ３３２７７）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）株Ｋ１（Ｇｅｎｂａｎｋ番号：Ｕ３３２７９）または熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）株Ｄｄ２（Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＤＱ２１８４２４）のドメインＩに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合性部分。ただし、
−  単離された抗体またはそれらの抗原結合性部分は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球への侵入および／またはプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球内での成長を阻害することができ、特に、種々の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）株、例として、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）株３Ｄ７、ＨＢ３、ＦＣＲ−３およびＫ１の侵入を阻害する。
−  単離された抗体またはそれらの抗原結合性部分は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球への侵入および／またはプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球内での成長を、５％〜１００％、好ましくは、１０％〜９０％、より好ましくは、２０％〜８０％、より好ましくは、３０％〜７０％、より好ましくは、４０％〜６０％の範囲で阻害することができる。
−  単離された抗体またはそれらの抗原結合性部分は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球への侵入および／またはプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球内での成長を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、特に、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％阻害することができる。
−  単離された抗体またはそれらの抗原結合性部分は、ヒトＢ細胞培養物から得られる抗体、組換え抗体、合成抗体またはそれらの抗原結合性部分であり得る。
−  単離された抗体またはそれらの抗原結合性部分は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有し、配列番号１、２、３、４、５および６から選択される配列を有する少なくとも２つのポリペプチドまたはそれらの相同ポリペプチドを含むことができる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本開示に従う単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分は、以下の特徴を有する：
ａ）プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の侵入もしくは成長を阻害し、
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ１を有し、
ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ３を有し、
−  さらに、配列番号２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ２および配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ２も有し得、かつ／もしくは
−  さらに、配列番号３のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ３および配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ１も有し得る。
または、
ａ）プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の侵入および／もしくは成長を阻害し、
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ１を有し、
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ２を有し、
−  さらに、配列番号２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ１も有し得、かつ／もしくは
−  さらに、配列番号３のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ３および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ３も有し得る。
または、
ａ）プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の侵入および／もしくは成長を阻害し、
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ１を有し、
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ１を有し、
−  さらに、配列番号２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ２および配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ２も有し得、かつ／もしくは
−  さらに、配列番号３のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ３および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ３も有し得る。
または、
ａ）プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の侵入および／もしくは成長を阻害し、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ２を有し、
ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ３を有し、
−  さらに、配列番号１のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ１および配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ２も有し得、かつ／もしくは
−  さらに、配列番号３のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ３および配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ１も有し得る。
または、
ａ）プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の侵入および／もしくは成長を阻害し、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ２を有し、
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ２を有し、
−  さらに、配列番号１のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ１および配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ１も有し得、かつ／もしくは
−  さらに、配列番号３のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ３および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ３も有し得る。
または、
ａ）プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の侵入および／もしくは成長を阻害し、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ２を有し、
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ１を有し、
−  さらに、配列番号１のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ１および配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ２も有し得、かつ／もしくは
−  さらに、配列番号３のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ３および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ３も有し得る。
または、本開示に従う単離されたヒト抗体もしくはその抗原結合性部分は、
ａ）プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の侵入および／もしくは成長を阻害し、
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ３を有し、
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ２を有し、
−  さらに、配列番号１のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ１および配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ１も有し得、かつ／もしくは
−  さらに、配列番号２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ３も有し得る。
または、
ａ）プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の侵入および／もしくは成長を阻害し、
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ３を有し、
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ１を有し、
−  さらに、配列番号２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ２および配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ２も有し得、かつ／もしくは
−  さらに、配列番号１のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲ１および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ３も有し得る。
【０１７５】
本開示に従う単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分において、ＬＣＶＲは、配列番号１、２および３のアミノ酸配列を含むことができ、ＨＣＶＲは、配列番号４、５および６のアミノ酸配列を含むことができ、あるいは、
ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、もしくは接触位置もしくは高頻度突然変異が生じる位置において１つもしくは複数のアミノ酸置換を有するそれらの相同ポリペプチドもしくは突然変異体を含み、
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、もしくは接触位置もしくは高頻度突然変異が生じる位置において１つもしくは複数のアミノ酸置換を有するそれらの相同ポリペプチドもしくは突然変異体を含むか、または
−  配列番号１３のポリペプチドを含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および配列番号１４のポリペプチドを含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、もしくはそれらの相同ポリペプチドを有し得、特に、単離された抗体もしくはその抗体断片は、配列番号１３もしくは１４のいずれかに対して、少なくとも８０％のパーセント配列同一性、特に、８５％のパーセント配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含む。
【０１７６】
本開示に従う単離されたヒト抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥの定常領域からなる群から選択される重鎖定常領域を含むことができ、特に、抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３であり得る。
【０１７７】
本開示に従う単離されたヒト抗体の抗原結合性部分は、
−  Ｆａｂ断片またはその多量体
−  Ｆ（ａｂ’）２断片またはその多量体
−  単鎖Ｆｖ断片またはその多量体
であり得る。
【０１７８】
さらに、本開示は、以下に関する：
−  ａ）本開示に従う単離された抗体もしくはその抗原結合性部分をコードする核酸分子、
ｂ）本開示に従う単離された抗体もしくはその抗原結合性部分の改変形態であって、好ましくは、１つもしくは複数のアミノ酸残基が保存的に置換されている改変形態をコードする核酸分子、
ｃ）本開示に従う単離された抗体もしくはその抗原結合性部分の断片をコードする核酸分子、
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）〜ｃ）の核酸分子のうちのいずれかにハイブリダイズすることが可能である核酸分子、
ｅ）ストリンジェントな条件下でａ）〜ｄ）の核酸分子のうちのいずれかの相補体にハイブリダイズすることが可能である核酸分子、
ｆ）ａ）〜ｅ）の核酸分子のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、抗体もしくはその抗原結合性部分をコードする核酸分子、または
ｇ）ａ）〜ｆ）の核酸分子のうちのいずれかの相補体
からなる群から選択される単離された核酸分子。
−  本開示に従うヌクレオチド分子を含むベクター。
−  本開示に従うベクターを含む宿主細胞。
−  本開示に従う抗体またはその抗原結合性部分を含む組成物であって、好ましくは、医薬組成物および／または診断用組成物である組成物。
−  本開示に従う抗体またはその抗原結合性部分および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。ただし、
−  医薬組成物は、追加の薬剤、特に、治療剤をさらに含むことができる。
−  本開示に従う単離された抗体またはその抗原結合性部分の、マラリア、特に、熱帯熱マラリアの予防および／または治療における使用。
−  特異的結合性ドメインおよびエフェクタードメインとしての、本開示に従う単離された抗体またはその抗原結合性部分を含む、精製された複合体であって、好ましくは、結合性ドメインおよびエフェクタードメインを含む融合タンパク質を含む複合体。ただし、
−  エフェクタードメインは、毒性物質であっても、または治療剤であってもよい。
−  本開示に従う複合体をコードする核酸分子。
−  本開示に従う単離された抗体またはその抗原結合性部分を生成する方法であって、
（ａ）抗体またはその抗原結合性部分をコードする核酸を含む核酸コンストラクトを準備するステップと、
（ｂ）核酸コンストラクトを宿主細胞内に導入するステップと、
（ｃ）宿主細胞を、抗体またはその抗原結合性部分の発現を可能にする条件下で維持するステップと
を含む方法。ただし、
−  宿主細胞は、植物細胞であり得る。
−  植物は、藻類、蘚類、単子葉植物および／または双子葉植物からなる群から選択することができる。
−  植物は、オランダミツバ属（Apium）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アブラナ属（Brassica）、トウガラシ属（Capsium）、ニンジン属（Daucus）、オオムギ属（Hordeum）、アキノノゲシ属（Lactuca）、トマト属（Lycopersicon）、タバコ属（Nicotiana）、イネ属（Oryza）、ペチュニア属（Petunia）、シロガラシ属（Sinapis）、ナス属（Solanum）、コムギ属（Triticum）、すなわち、コムギ、またはトウモロコシ属（Zea）からなる群からの属から選択することができる。
−  植物は、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）またはタバコ（Nicotiana tabacum）であり得る。
−  抗体またはそれらの抗原結合性部分は、単離および／または精製することができる。
【０１７９】
さらに、本開示は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のＡＭＡ−１に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分にも関し；前記抗体またはその抗原結合性部分は、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球への侵入および／またはプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球内での成長を阻害し；特に、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、モノクローナル抗体、ヒトＢ細胞培養物から得られる抗体、組換え抗体、合成抗体またはそれらの抗原結合性部分である。
【０１８０】
さらなる実施形態は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のＡＭＡ−１のドメインＩ（配列番号１６）に特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分に関し；前記抗体またはその抗原結合性部分は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物の赤血球への侵入および／または熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物の赤血球内での成長を阻害する。
【０１８１】
本開示に従う単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列を有するポリペプチドを含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）ならびに配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される配列を有するポリペプチドを含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、またはそれらの相同ポリペプチドを有し得る。
【０１８２】
さらに、本開示に従う単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分において、ＬＣＶＲは、配列番号１、２および３のアミノ酸配列を含むこともでき、ＨＣＶＲは、配列番号４、５および６のアミノ酸配列またはそれらの相同ポリペプチドを含むこともできる。
【０１８３】
さらに、開示する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１５のポリペプチドを含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および配列番号１４のポリペプチドを含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含むこともできる。
【０１８４】
単離された抗体またはその抗体断片は、配列番号１４または１３のいずれかに対して、少なくとも８０％のパーセント配列同一性、特に、少なくとも８５％のパーセント配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含むことができる。
【０１８５】
本開示によれば、抗原結合性部分は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖Ｆｖ断片またはそれらの多量体であり得る。
【０１８６】
本開示は、さらに、
ａ）本開示に従う単離された抗体もしくはその抗原結合性部分をコードする核酸分子、
ｂ）本開示に従う単離された抗体もしくはその抗原結合性部分の改変形態であって、好ましくは、１つもしくは複数のアミノ酸残基が保存的に置換されている改変形態をコードする核酸分子、
ｃ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１もしくは配列番号１２として提示する核酸分子のほんの一部、バリアント、相同体、誘導体もしくは断片である核酸分子、
ｄ）本開示に従う単離された抗体もしくはその抗原結合性部分の断片をコードする核酸分子、
ｅ）ストリンジェントな条件下でａ）〜ｄ）の核酸分子のうちのいずれかにハイブリダイズすることが可能である核酸分子、
ｆ）ストリンジェントな条件下でａ）〜ｅ）の核酸分子のうちのいずれかの相補体にハイブリダイズすることが可能である核酸分子、
ｇ）ａ）〜ｆ）の核酸分子のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、抗体もしくはその抗原結合性部分をコードする核酸分子、または
ｈ）ａ）〜ｇ）の核酸分子のうちのいずれかの相補体
からなる群から選択される単離された核酸分子を対象とする。
【０１８７】
いくつかの好都合な実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２、ならびに遺伝暗号の縮重により可能になるそれらのバリアントからなる群から選択される配列を有する少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む。
【０１８８】
さらに、本開示に従うヌクレオチド分子を含むベクターおよびベクターを含む宿主細胞も開示する。
【０１８９】
さらに、本開示に従う抗体またはその抗原結合性部分および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物、ならびに単離された抗体またはその抗原結合性部分の、マラリア、特に、熱帯熱マラリアの予防および／または治療における使用も開示する。
【０１９０】
実施例で使用した寄生生物株のｇｅｎｅｂａｎｋ番号は、３Ｄ７−Ｕ３３２７４、ＦＣＲ３−ＥＵ５８６３９０、ＨＢ３−Ｕ３３２７７、Ｋ１−Ｕ３３２７９およびＤＤ２−ＤＱ２１８４２４である。
本願発明は次の態様を含む。
（１）プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のＡＭＡ−１に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分であって、プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球への侵入および／またはプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球内での成長を阻害し；モノクローナル抗体、ヒトＢ細胞培養物から得られる抗体、組換え抗体、合成抗体またはそれらの抗原結合性部分であり；配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２および配列番号３のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）ならびに配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２および配列番号６のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有する単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分。
（２）前記軽鎖可変領域が配列番号１３を含み、前記重鎖可変領域が配列番号１４を含む、上記（１）に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分。
（３）配列番号１３または配列番号１４のいずれかに対して、少なくとも８０％のパーセント配列同一性、特に、少なくとも８５％のパーセント配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含む、上記（２）に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分。
（４）複数種の異なるプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物のＡＭＡ−１、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物株３Ｄ７、ＨＢ３、ＦＣＲ３およびＫ１を含めた、複数種の異なる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物のＡＭＡ−１に結合する、上記（１）から３のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分。
（５）プラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球への侵入および／またはプラスモディウム属（Plasmodium）寄生生物の赤血球内での成長を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、特に、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％阻害する、上記（１）から（４）のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分。
（６）前記抗原結合性部分が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖Ｆｖ断片またはそれらの多量体である、上記（１から５のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合性部分。
（７）上記（１）から（６）のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性の部分もしくは複数部分をコードする単離された核酸分子。
（８）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択される核酸配列を含む、上記（７）に記載の単離された核酸分子。
（９）前記核酸分子が、抗体の可変領域またはその一部をコードし；前記可変領域の軽鎖可変領域が、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２および配列番号３のＣＤＲ３を含み、重鎖可変領域が、配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２および配列番号６のＣＤＲ３を含む、上記（７）に記載の単離された核酸分子。
（１０）配列番号７、配列番号８および配列番号９ならびに／または配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２を含む、上記（７）に記載の単離された核酸分子。
（１１）上記（７）から（１０）のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子またはその複数部分を含むベクターまたはベクターの組合せ。
（１２）上記（１１）に記載のベクターまたはベクターの組合せを含む宿主細胞。
（１３）上記（１）から（６）のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性部分を含む医薬組成物または診断用組成物。
（１４）少なくともさらなる抗体またはその抗原結合性部分を含む、上記（１３）に記載の医薬組成物または診断用組成物。
（１５）上記（１）から（６）のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性部分を生成する方法であって、（ａ）前記抗体またはその抗原結合性部分をコードする核酸を含む核酸コンストラクトを準備するステップと、（ｂ）前記核酸コンストラクトを宿主細胞内に導入するか、または前記核酸コンストラクトを真核細胞もしくは原核細胞から得られる無細胞溶解液に添加するステップと、（ｃ）前記宿主細胞を、前記抗体または前記その抗原結合性部分の発現を可能にする条件下で維持するステップと、任意選択で、（ｄ）前記抗体または前記その抗原結合性部分の単離および／または精製および／または処理を行うステップとを含む方法。
（１６）前記宿主細胞が、植物細胞であり、特に、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）もしくはタバコ（Nicotiana tabacum）に由来するか、または前記宿主細胞が、真核細胞株、特に、ＣＨＯ細胞株もしくはＨＥＫ２９３細胞株であるか、または前記宿主細胞が、微生物、特に、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、上記（１５）に記載の方法。
【０１９１】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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