(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する第1軽鎖および第1重鎖であって、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている、第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含む、多重特異性抗体。
【請求項２】
・第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されており、かつ
・第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換されている、
請求項1に記載の多重特異性抗体。
【請求項３】
i）第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、R、およびHから選択されるアミノ酸で置換され、
第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換されており、かつ
ii）第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸（好ましい一態様ではE）で置換され、かつ、第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、R、およびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで、一態様ではKで）置換されている、
請求項1または2のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項４】
抗体の三次構造において、第1重鎖のCH3ドメインと第2重鎖のCH3ドメインとが、それぞれの抗体CH3ドメインの間に位置する境界面を形成し、
第1重鎖のCH3ドメインと第2重鎖のCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列はそれぞれが、抗体の三次構造において該境界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、
一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換されており、それによって、境界面内で他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置するくぼみ内に配置されうる前記一方の重鎖のCH3ドメイン内に位置する突起を、境界面内に生成しており、かつ
他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、前記一方の重鎖のCH3ドメイン中に位置する境界面内の突起がその中に配置されうる前記他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置するくぼみを、境界面内に生成している、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項５】
元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択され、かつ
元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択される、
請求項4に記載の多重特異性抗体。
【請求項６】
導入されたシステイン残基によって一方の重鎖のCH3ドメインと他方の重鎖のCH3ドメインとの間にジスルフィド架橋が形成されうるように、
一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、第1のアミノ酸がシステインで置換され、かつ
他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、境界面内で前記第1のアミノ酸に面している第2のアミノ酸がシステインで置換されている、
請求項4または5に記載の多重特異性抗体。
【請求項７】
a）SEQ ID NO:32の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH Ang2＞）およびSEQ ID NO:33の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL Ang2＞）を含み、かつ
b）SEQ ID NO:31の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH VEGF＞）およびSEQ ID NO:30の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL VEGF＞）を含む、
ヒトアンジオポエチン-2およびヒトVEGFに特異的に結合する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項８】
a）SEQ ID NO:36の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH IL17＞）およびSEQ ID NO:37の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL IL17＞）を含み、かつ
b）SEQ ID NO:35の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH TWEAK＞）およびSEQ ID NO:34の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL TWEAK＞）を含む、
ヒトTWEAKおよびヒトIL17に特異的に結合する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項９】
a）SEQ ID NO:40の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH Her1Her3＞）およびSEQ ID NO:41の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL Her1Her3＞）を含み、かつ
b）SEQ ID NO:39の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH cMet＞）およびSEQ ID NO:38の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL cMet＞）を含む、
ヒトHer1、ヒトHer3、およびヒトcMetに特異的に結合する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１０】
・a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する、請求項1〜9のいずれか一項に定義する第1軽鎖、
b）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する、請求項1〜9のいずれか一項に定義する第1重鎖、
c）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する、請求項1〜9のいずれか一項に定義する第2軽鎖、および
d）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する、請求項1〜9のいずれか一項に定義する第2重鎖
をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
・該多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する工程、ならびに
・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程
を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を調製するための方法。
【請求項１１】
a）請求項1〜9のいずれか一項に定義する第1軽鎖、
b）請求項1〜9のいずれか一項に定義する第2軽鎖、
c）請求項1〜9のいずれか一項に定義する第1重鎖、または
d）請求項1〜9のいずれか一項に定義する第2重鎖
のアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項１２】
請求項11に記載の核酸を含み、宿主細胞において該核酸を発現させる能力を有するベクター。
【請求項１３】
a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する請求項1〜9のいずれか一項に定義する第1軽鎖をコードする核酸を含むベクター、
b）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する請求項1〜9のいずれか一項に定義する第1重鎖をコードする核酸を含むベクター、
c）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する請求項1〜9のいずれか一項に定義する第2軽鎖をコードする核酸を含むベクター、および
d）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する請求項1〜9のいずれか一項に定義する第2重鎖をコードする核酸を含むベクター
を含む宿主細胞。
【請求項１４】
少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた請求項1〜9のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を含む薬学的組成物。
【請求項１５】
医薬として使用するための、請求項1〜9のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規多重特異性抗体、それらの製造方法、これら抗体を含む薬学的組成物、およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
2種類以上の抗原に結合する能力を有する二重特異性抗体または多重特異性抗体などの改変タンパク質は、当技術分野において公知である。そのような多重特異性結合タンパク質は、細胞融合、化学的コンジュゲーション、または組換えDNA技法を使って作製することができる。
【０００３】
近年、例えばIgG抗体フォーマットと一本鎖ドメインとの融合による四価二重特異性抗体などといった、多種多様な組換え多重特異性抗体フォーマットが開発されている（例えばColoma, M.J., et. al., Nature Biotech. 15（1997）159-163、WO 2001/077342、およびMorrison, S.L., Nature Biotech. 25（2007）1233-1234を参照されたい）。
【０００４】
他にも、2種類以上の抗原に結合する能力を有するダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、およびいくつかの一本鎖フォーマット（scFv、Bis-scFv）など、もはや抗体コア構造（IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgM）が保たれていない新しいフォーマットが、いくつか開発されている（Holliger, P., et. al., Nature Biotech. 23（2005）1126-1136、Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74（2007）3-14、Shen, J., et. al., J. Immunol. Methods 318（2007）65-74、Wu, C., et al., Nature Biotech. 25（2007）1290-1297）。
【０００５】
上述のフォーマットはいずれも、抗体コア（IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgM）をさらにもう1つの結合タンパク質（例えばscFv）に融合するために、あるいは例えば2つのFabフラグメントまたはscFvを融合するために、リンカーを使用する（Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74（2007）3-14）。リンカーが二重特異性抗体のエンジニアリングにとって有利であることは明白だが、治療環境ではリンカーは問題も引き起こしうる。事実、これらの外来ペプチドは、リンカーそのものに対する免疫応答を引き出したり、タンパク質とリンカーとの間の接合部に対する免疫応答を引き出したりするかもしれない。そのうえ、これらのペプチドのフレキシブルな性質は、タンパク質分解的切断を受けやすくし、低い抗体安定性、凝集および免疫原性の増加に潜在的につながるかもしれない。加えて、例えば天然の抗体に対して高い類似度を維持することによってFc部分が媒介する補体依存性細胞傷害（CDC）または抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）などといったエフェクター機能を保ちたい場合もありうる。
【０００６】
したがって理想的には、（IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgMのような）天然の抗体と全体的構造がよく似ており、ヒト配列からの逸脱が最小限である二重特異性抗体の開発を目指すべきである。
【０００７】
1つのアプローチでは、天然の抗体によく似た二重特異性抗体が、その二重特異性抗体の所望の特異性を持つマウスモノクローナル抗体を発現する2つの異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合に基づくクアドローマ技術（Milstein, C, and Cuello, A.C., Nature 305（1983）537-540参照）を使って生産された。結果として得られるハイブリッド-ハイブリドーマ（すなわちクアドローマ）細胞株内では2つの異なる抗体の重鎖と軽鎖がランダムにペアリングするので、最大で10種類の異なる抗体種が生成するが、所望の機能的二重特異性抗体はそのうちの1つだけである。ミスペアリングした副生成物の存在と著しい生産収量の低減ゆえに、洗練された精製手法が必要になる（例えばMorrison, S.L., Nature Biotech. 25（2007）1233-1234参照）。一般に、組換え発現技法を使ったとしても、これと同じ、ミスペアリングした副生成物の問題は残る。
【０００８】
ミスペアリングした副生成物の問題を克服するための、「ノブ・イントゥ・ホール（knob-into-hole）技術」として知られているアプローチでは、CH3ドメインに変異を導入して接触境界面を修飾することによって、2つの異なる抗体重鎖のペアリングを強制することを目指す。一方の鎖では、「ホール」を作り出すために、嵩高いアミノ酸が短い側鎖を持つアミノ酸で置き換えられた。逆に、他方のCH3ドメインには、「ノブ」を作り出すために、大きな側鎖を持つアミノ酸が導入された。これら2つの重鎖（および2つの同一軽鎖、これらの軽鎖はどちらの重鎖にとっても適当である必要がある）を共発現させることにより、ホモ二量体形成（「ホール-ホール」または「ノブ-ノブ」）と対比して高収率のヘテロ二量体形成（「ノブ-ホール」）が観察された（Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9（1996）617-621、およびWO 96/027011）。ファージディスプレイアプローチを使用して2つのCH3ドメインの相互作用面をリモデリングすることと、ヘテロ二量体を安定化するためにジスルフィド架橋を導入することとによって、ヘテロ二量体のパーセンテージをさらに増加させることができた（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16（1998）677-681、Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270（1997）26-35）。ノブ・イントゥ・ホール技術の新しいアプローチは、例えばEP 1 870 459 A1に記載されている。このフォーマットは非常に魅力的だと思われるが、臨床に向けた進歩を物語るデータはまだない。この戦略の重要な制約の1つは、ミスペアリングと不活性分子の形成を防止するために、2つの親抗体の軽鎖が同一であることを必要とする点である。したがってこの技法は、第1抗原および第2抗原に対する2つの抗体から出発して3種類または4種類の抗原に対する組換え三重特異性または四重特異性抗体を容易に開発する基礎としては、適当でない。というのも、これらの抗体の重鎖および/または同一軽鎖のいずれかをまず最適化する必要があり、次に、さらに第3抗原および第4抗原に対する抗原結合ペプチドを加える必要があるからである。
【０００９】
WO 2006/093794は、ヘテロ二量体タンパク質結合組成物に関する。WO 99/37791には多目的抗体誘導体が記載されている。Morrison, S.L., et al., J. Immunol. 160（1998）2802-2808は、可変領域ドメインの交換がIgGの機能的特性に及ぼす影響に言及している。
【００１０】
WO 2013/02362はヘテロ二量体化ポリペプチドに関する。WO 2013/12733は、ヘテロ二量体型Fc領域を含むポリペプチドに関する。WO 2012/131555は、改変ヘテロ二量体型免疫グロブリンに関する。EP 2647707は改変ヘテロ二量体型免疫グロブリンに関する。
【００１１】
WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254およびSchaefer, W. et al., PNAS, 108（2011）11187-1191は、ドメイン交差が施された二価二重特異性IgG抗体に関する。
【００１２】
一方の結合アームにVL-VH/CL-CH1の入れ替えが施された多重特異性抗体（CrossMabFab）は、WO 2009/080251およびSchaefer, W. et al., PNAS, 108（2011）11187-1191に記載されており、第1抗原に特異的に結合する第1抗体の軽鎖と第2抗原に特異的に結合する第2抗体の間違った重鎖とのミスマッチが原因となる副産物形成を（そのようなドメイン交換を伴わないアプローチと比較すると）明らかに低減させる。しかし、それらの調製物は副生成物を全く含まないわけではない。副生成物プロファイルは、一方の結合アームにVL-VH/CL-CH1の入れ替えが施された多重特異性抗体の構造に依存する。主要副生成物は非機能的軽鎖二量体（Schaefer, W. et al., PNAS, 108（2011）11187-1191のSupplementのFig. S1Gも参照されたい）および非機能的重鎖二量体（Schaefer, W. et al., PNAS, 108（2011）11187-1191のSupplementのFig. S1Fも参照されたい）である。
【００１３】
それゆえに、多重特異性抗体の収量などを改良するために、不要な副生成物をさらに低減するためのアプローチは、今なお必要とされている。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する第1軽鎖および第1重鎖、ならびに第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖を含み、
・第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されているか、または
・第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている、
多重特異性抗体に関する。
【００１５】
本発明の一態様は、
・第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換されているか、または
・第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換されている、
多重特異性抗体に関する。
【００１６】
本発明の一態様は、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸（好ましい一態様ではE）で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで、一態様ではKで）置換されている多重特異性抗体に関する。
【００１７】
本発明のもう1つの局面は、本発明の多重特異性抗体を調製するための方法であって、以下の工程を含む方法である:
・a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第1軽鎖、
b）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第1重鎖、
c）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第2軽鎖、および
d）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第2重鎖
をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
・該多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程。
【００１８】
本発明のもう1つの局面は、本発明の多重特異性抗体をコードする核酸である。
【００１９】
本発明のもう1つの局面は、本発明の核酸を含み、該核酸を宿主細胞において発現させる能力を有するベクターである。
【００２０】
本発明のもう1つの局面は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。
【００２１】
本発明のもう1つの局面は、少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた本発明の多重特異性抗体を含む薬学的組成物である。
【００２２】
本発明のもう1つの局面は、細胞毒性作用物質にカップリングされた本発明の多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートである。
【００２３】
本発明のもう1つの局面は、薬学的組成物を製造するための、本発明の多重特異性抗体の使用である。
【００２４】
本発明のもう1つの局面は、医薬として使用するための、本発明の多重特異性抗体である。
【００２５】
本発明のもう1つの局面は、医薬として使用するための、少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた本発明の多重特異性抗体を含む薬学的組成物である。
【００２６】
本発明のもう1つの局面は、医薬を製造するための、本発明の多重特異性抗体の使用である。
【００２７】
本発明のもう1つの局面は、疾患を患っている患者を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に本発明の多重特異性抗体を投与することによる方法である。
【００２８】
本発明によれば、反対の電荷を持つアミノ酸をCH1ドメインおよびCLドメイン中の特別な位置に導入することにより、多重特異性抗体を生産する際の望ましくない副生成物の形成を低減することができる。これにより、所望の多重特異性抗体の収量を増加させることができる。
[本発明1001]
a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、R、およびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されているか、または
ii）第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、R、およびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている、
多重特異性抗体。
[本発明1002]
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、R、およびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されており、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換されているか、または
ii）第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、R、およびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換されている、
本発明1001の多重特異性抗体。
[本発明1003]
iii）第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、R、およびHから選択されるアミノ酸で置換され、
第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換されており、かつ
iv）第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸（好ましい一態様ではE）で置換され、かつ、第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、R、およびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで、一態様ではKで）置換されている、
前記本発明のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1004]
抗体の三次構造において、第1重鎖のCH3ドメインと第2重鎖のCH3ドメインとが、それぞれの抗体CH3ドメインの間に位置する境界面を形成し、
第1重鎖のCH3ドメインと第2重鎖のCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列はそれぞれが、抗体の三次構造において該境界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、
一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換されており、それによって、境界面内で他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置するくぼみ内に配置されうる前記一方の重鎖のCH3ドメイン内に位置する突起を、境界面内に生成しており、かつ
他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、前記一方の重鎖のCH3ドメイン中に位置する境界面内の突起がその中に配置されうる前記他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置するくぼみを、境界面内に生成している、
前記本発明のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1005]
元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択され、かつ
元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択される、
本発明1004の多重特異性抗体。
[本発明1006]
導入されたシステイン残基によって一方の重鎖のCH3ドメインと他方の重鎖のCH3ドメインとの間にジスルフィド架橋が形成されうるように、
一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、第1のアミノ酸がシステインで置換され、かつ
他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、境界面内で前記第1のアミノ酸に面している第2のアミノ酸がシステインで置換されている、
本発明1004または1005の多重特異性抗体。
[本発明1007]
a）SEQ ID NO:32の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH Ang2＞）およびSEQ ID NO:33の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL Ang2＞）を含み、かつ
b）SEQ ID NO:31の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH VEGF＞）およびSEQ ID NO:30の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL VEGF＞）を含む、
ヒトアンジオポエチン-2およびヒトVEGFに特異的に結合する、前記本発明のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1008]
a）SEQ ID NO:36の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH IL17＞）およびSEQ ID NO:37の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL IL17＞）を含み、かつ
b）SEQ ID NO:35の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH TWEAK＞）およびSEQ ID NO:34の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL TWEAK＞）を含む、
ヒトTWEAKおよびヒトIL17に特異的に結合する、本発明1001〜1006のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1009]
a）SEQ ID NO:40の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH Her1Her3＞）およびSEQ ID NO:41の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL Her1Her3＞）を含み、かつ
b）SEQ ID NO:39の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH cMet＞）およびSEQ ID NO:38の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL cMet＞）を含む、
ヒトHer1、ヒトHer3、およびヒトcMetに特異的に結合する、本発明1001〜1006のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1010]
・a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する、本発明1001〜1009のいずれかに定義する第1軽鎖、
b）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する、本発明1001〜1009のいずれかに定義する第1重鎖、
c）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する、本発明1001〜1009のいずれかに定義する第2軽鎖、および
d）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する、本発明1001〜1009のいずれかに定義する第2重鎖
をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
・該多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する工程、ならびに
・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程
を含む、本発明1001〜1009のいずれかの多重特異性抗体を調製するための方法。
[本発明1011]
a）本発明1001〜1009のいずれかに定義する第1軽鎖、
b）本発明1001〜1009のいずれかに定義する第2軽鎖、
c）本発明1001〜1009のいずれかに定義する第1重鎖、または
d）本発明1001〜1009のいずれかに定義する第2重鎖
のアミノ酸配列をコードする核酸。
[本発明1012]
本発明1011の核酸を含み、宿主細胞において該核酸を発現させる能力を有するベクター。
[本発明1013]
a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する本発明1001〜1009のいずれかに定義する第1軽鎖をコードする核酸を含むベクター、
b）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する本発明1001〜1009のいずれかに定義する第1重鎖をコードする核酸を含むベクター、
c）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する本発明1001〜1009のいずれかに定義する第2軽鎖をコードする核酸を含むベクター、および
d）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する本発明1001〜1009のいずれかに定義する第2重鎖をコードする核酸を含むベクター
を含む宿主細胞。
[本発明1014]
少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた本発明1001〜1009のいずれかの多重特異性抗体を含む薬学的組成物。
[本発明1015]
医薬として使用するための、本発明1001〜1009のいずれかの多重特異性抗体。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】図1は、一方の抗体結合アームにVL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施され、かつ一方のCH1/Clドメイン境界面に特異的アミノ酸置換を持つ、本発明の多重特異性抗体（CrossMAbFab）のいくつかの例を示す。図1a:一方の抗体結合アームにおけるVL-VH/CL-CH1ドメイン交換、および他方の（「非交差（uncrossed）」"）抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における特異的変異。
【図１Ｂ】図1b:一方の抗体結合アームにおけるVL-VH/CL-CH1ドメイン交換、および同じ（「交差（crossed）」）抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における特異的変異。
【図１Ｃ】図1c:一方の抗体結合アームにおけるVL-VH/CL-CH1ドメイン交換、および同じ（「交差」）抗体結合アームにおける特異的変異、および他方の（「非交差」）抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における追加の特異的変異。
【図１Ｄ】図1d:一方の抗体結合アームにおけるVL-VH/CL-CH1ドメイン交換、および同じ（「交差」）抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における特異的変異、および他方の（「非交差」）抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における追加の特異的変異。
【図１Ｅ】図1e:一方の抗体結合アームにおけるVL-VH/CL-CH1ドメイン交換、および他方の（「非交差」）抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における特異的変異、および両抗体結合アームのVH/VL境界面における追加の特異的変異。
【図１Ｆ】図1f:一方の抗体結合アームにおけるVL-VH/CL-CH1ドメイン交換、および同じ（「交差」）抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における特異的変異、および両抗体結合アームのVH/VL境界面における追加の特異的変異。
【図１Ｇ】図1g:一方の抗体結合アームにおけるVL-VH/CL-CH1ドメイン交換、および同じ（「交差」）抗体結合アームにおける特異的変異、および他方の（「非交差」）抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における追加の特異的変異、さらに両抗体結合アームのVH/VL境界面における特異的変異。
【図１Ｈ】図1h:一方の抗体結合アームにおけるVL-VH/CL-CH1ドメイン交換、および同じ（「交差」）抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における特異的変異、および他方の（「非交差」）抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における追加の特異的変異、さらに両抗体結合アームのVH/VL境界面における特異的変異。
【図１Ｉ】図1i:一方の抗体結合アームにおけるVL-VH/CL-CH1ドメイン交換、および他方の（「非交差」）抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における特異的変異、および重鎖ヘテロ二量体化を強制するためのCH3/CH3ドメイン境界面の修飾（例えばノブ・イントゥ・ホール技術のような修飾、または例えば各々の反対電荷を持つ荷電アミノ酸の置換のような代替ヘテロ二量体化技術）。
【図１Ｊ】図1j:一方の抗体結合アームにおけるVL-VH/CL-CH1ドメイン交換、および同じ（「交差」）抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における特異的変異、および重鎖ヘテロ二量体化を強制するためのCH3/CH3ドメイン境界面の修飾（例えばノブ・イントゥ・ホール技術のような修飾、または例えば各々の反対電荷を持つ荷電アミノ酸の置換のような代替ヘテロ二量体化技術）。
【図１Ｋ】図1k:一方の抗体結合アームにおけるVL-VH/CL-CH1ドメイン交換、および両抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における特異的変異（「非交差」結合アームでは二重変異）、および重鎖ヘテロ二量体化を強制するためのCH3/CH3ドメイン境界面の修飾（例えばノブ・イントゥ・ホール技術のような修飾、または例えば各々の反対電荷を持つ荷電アミノ酸の置換のような代替ヘテロ二量体化技術）。
【図１Ｌ】図1l:一方の抗体結合アームにおけるVL-VH/CL-CH1ドメイン交換、および両抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における特異的変異（「交差」結合アームでは二重変異）、および重鎖ヘテロ二量体化を強制するためのCH3/CH3ドメイン境界面の修飾（例えばノブ・イントゥ・ホール技術のような修飾、または例えば各々の反対電荷を持つ荷電アミノ酸の置換のような代替ヘテロ二量体化技術）。
【図１Ｍ】図1m:一方の抗体結合アームにおけるVL-VH/CL-CH1ドメイン交換、および他方の（「非交差」）抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における特異的変異、および両抗体結合アームのVH/VL境界面における追加の特異的変異、および重鎖ヘテロ二量体化を強制するためのCH3/CH3ドメイン境界面の修飾（例えばノブ・イントゥ・ホール技術のような修飾、または例えば各々の反対電荷を持つ荷電アミノ酸の置換のような代替ヘテロ二量体化技術）。
【図１Ｎ】図1n:一方の抗体結合アームにおけるVL-VH/CL-CH1ドメイン交換、および同じ（「交差」）抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における特異的変異、および両抗体結合アームのVH/VL境界面における追加の特異的変異、および重鎖ヘテロ二量体化を強制するためのCH3/CH3ドメイン境界面の修飾（例えばノブ・イントゥ・ホール技術のような修飾、または例えば各々の反対電荷を持つ荷電アミノ酸の置換のような代替ヘテロ二量体化技術）。
【図１Ｏ】図1o:一方の抗体結合アームにおけるVL-VH/CL-CH1ドメイン交換、両抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における特異的変異（「非交差」結合アームでは二重変異）、および両抗体結合アームのVH/VL境界面における追加の特異的変異、および重鎖ヘテロ二量体化を強制するためのCH3/CH3ドメイン境界面の修飾（例えばノブ・イントゥ・ホール技術のような修飾、または例えば各々の反対電荷を持つ荷電アミノ酸の置換のような代替ヘテロ二量体化技術）。
【図１Ｐ】図1p:一方の抗体結合アームにおけるVL-VH/CL-CH1ドメイン交換、および両抗体結合アームのCH1/CLドメイン境界面における特異的変異（「交差」結合アームでは二重変異）、および両抗体結合アームのVH/VL境界面における追加の特異的変異、および重鎖ヘテロ二量体化を強制するためのCH3/CH3ドメイン境界面の修飾（例えばノブ・イントゥ・ホール技術のような修飾、または例えば各々の反対電荷を持つ荷電アミノ酸の置換のような代替ヘテロ二量体化技術）。
【図２】一方の抗体結合アームにVL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施され、かつ1つのCH1/Clドメイン境界面に特異的アミノ酸置換を持たない多重特異性抗体、およびこの多重特異性抗体の副生成物の例。上側:第1抗体および第2抗体のFabフラグメントだけを含む、一方の抗体結合アームにVL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された多重特異性抗体（Fab-CrossFab（Fab））および主要副生成物、第1抗体の軽鎖（LC: VL-CL）と第2抗体の修飾軽鎖（LC*: VH-CH1）との間で形成された二量体。下側:一方の抗体結合アームにVL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施され、さらにFcフラグメントを含む多重特異性抗体（CrossMAbFab）、および主要副生成物、第1抗体の重鎖（HC: VH-CH1-CH2-CH3）と第2抗体の修飾重鎖（HC*: VL-CL-CH2-CH3）との間で形成された非機能的重鎖二量体。
【図３】CH1ドメインおよびCLドメイン中のアミノ酸置換の位置。図3A:アミノ酸位置147および213（Kabatナンバリングによる）を強調表示した、CH1ドメイン中の野生型（wt）アミノ酸配列（4種類のIgGアイソタイプが示されている）。図3B:アミノ酸位置123および124（Kabat EUインデックスナンバリングによる）に下線を付し強調表示した、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプのCLドメイン中の野生型（wt）アミノ酸配列。
【図４Ａ】図4は、抗Ang2-VEGF二重特異性抗体における荷電アミノ酸置換による副生成物の低減を示す。図4A:図4Bに結果を示す二重特異性抗体の配列（SEQ ID NO）。
【図４Ｂ】図4B:VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された本発明の抗Ang2-VEGF二重特異性抗体（CrossMAbFab）の例を使った、CH1/CL境界面における本発明の荷電アミノ酸置換による副生成物（非機能的重鎖二量体）の低減。
【図５Ａ】図5は、抗Tweak-IL17二重特異性抗体における荷電アミノ酸置換による副生成物の低減を示す。図5A:図5Bに結果を示す二重特異性抗体の配列（SEQ ID NO）。
【図５Ｂ】図5B:VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された本発明の抗Tweak-IL17二重特異性抗体（CrossMAbFab）の例を使った、CH1/CL境界面における本発明の単一荷電アミノ酸置換による副生成物（非機能的重鎖二量体）の低減。
【図６Ａ】図6は、抗Her1Her3-cMet三重特異性抗体における荷電アミノ酸置換による副生成物の低減を示す。図6A:図6Bに結果を示す二重特異性抗体の配列（SEQ ID NO）。
【図６Ｂ】図6B:VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された本発明の抗Her1Her3-cMet三重特異性抗体（CrossDAF-Fab）の例を使った、CH1/CL境界面における本発明の単一荷電アミノ酸置換による副生成物の低減。
【図７Ａ】図7は、抗Ang2-VEGF二重特異性抗体における荷電アミノ酸置換による副生成物の低減を示す。図7A:図7Bに結果を示す二重特異性抗体「Ang2VEGF 044」の配列（SEQ ID NO）。
【図７Ｂ】図7B:VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された本発明の抗Ang2-VEGF二重特異性抗体（CrossMAbFab）の例を使った、CH1/CL境界面における本発明の荷電アミノ酸置換（図4Aのアミノ酸配列）およびVL/VH境界面における追加の荷電アミノ酸置換による副生成物の低減。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
I）定義
用語「a」「an」および「the」は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、一般に複数の指示対象を包含する。
【００３１】
本明細書において「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、限定されるわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体フラグメントなどのさまざまな抗体構造を、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り包含する。
【００３２】
「多重特異性抗体」は、2種類以上の異なるエピトープ（例えば2種類、3種類、4種類またはそれ以上の異なるエピトープ）に結合する。エピトープは同じ抗原上にあっても異なる抗原上にあってもよい。多重特異性抗体の例は2種類のエピトープに結合する「二重特異性抗体」である。
【００３３】
抗体が2種類以上の特異性を有する場合、認識されるエピトープは単一の抗原に関連していても、2種類以上の抗原に関連していてもよい。
【００３４】
本明細書において使用する「価」という用語は、ある抗体分子における指定された数の結合部位の存在を表す。例えば天然抗体は2つの結合部位を有し、二価である。したがって「三価」という用語は、ある抗体分子における3つの結合部位の存在を表す。
【００３５】
「抗体特異性」とは、抗体による、抗原の特定エピトープの選択的認識を指す。例えば天然抗体は単一特異性である。本明細書において使用する「単一特異性抗体」という用語は、それぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する1つまたは複数の結合部位を有する抗体を表す。
【００３６】
エピトープは、抗原のうち、抗体によって結合される領域である。「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合能を有する任意のポリペプチド決定基を包含する。一定の態様においてエピトープ決定基は、アミノ酸、グリカン側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどといった、分子の化学的に活性な表面集団を包含し、一定の態様では、特異的三次元構造特徴、および/または特異的電荷特徴を有しうる。一定の態様において、ある抗体が、タンパク質および/または高分子の複雑な混合物において、そのターゲット抗原を優先的に認識する場合、その抗体は抗原に特異的に結合するという。
【００３７】
本明細書において使用する「結合」および「特異的結合」という用語は、インビトロアッセイにおける、好ましくは精製野生型抗原を使ったプラズモン共鳴アッセイ（BIAcore、GE-Healthcare、スウェーデン・ウプサラ）における、抗原のエピトープへの抗体の結合を指す。
【００３８】
抗原への抗体の結合のアフィニティーは、ka（抗体/抗原複合体を形成する抗体の会合に関する速度定数）、kD（解離定数）、およびKD（kD/ka）を使って定義される。一態様において、〜への結合、または〜に特異的に結合するとは、10-8mol/l以下、一態様では10-8M〜10-13mol/lの結合アフィニティー（KD）を意味する。したがって、本発明の多重特異性抗体は、それが特異的である各抗原に、10-8mol/l以下の結合アフィニティー（KD）で、例えば10-8〜10-13mol/lの結合アフィニティー（KD）で、一態様では10-9〜10-13mol/lの結合アフィニティー（KD）で、特異的に結合する。
【００３９】
FcγRIIIへの抗体の結合はBIAcoreアッセイ（GE-Healthcare、スウェーデン・ウプサラ）によって調べることができる。結合のアフィニティーは、ka（抗体/抗原複合体を形成する抗体の会合に関する速度定数）、kD（解離定数）、およびKD（kD/ka）を使って定義される。
【００４０】
本明細書において使用する「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。
【００４１】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および/または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来すると共に、重鎖および/または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
【００４２】
「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークまたはCDRが、親免疫グロブリンの特異性とは異なる特異性の免疫グロブリンのCDRを含むように修飾されている抗体を指す。好ましい一態様では、マウスCDRをヒト抗体のフレームワーク領域に移植することで、「ヒト化抗体」が調製される。例えばRiechmann, L., et al., Nature 332（1988）323-327、およびNeuberger, M.S., et al., Nature 314（1985）268-270を参照されたい。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、本発明の特性、とりわけC1q結合および/またはFc受容体（FcR）結合に関わる特性が生じるように、元の抗体の定常領域にさらなる修飾または改変が加えられた定常領域を持つものである。
【００４３】
本明細書において使用する用語「ヒト抗体」には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体が含まれるものとする。ヒト抗体は当分野の技術水準において周知である（van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5（2001）368-374）。ヒト抗体は、免疫化した時に、内在性免疫グロブリン生産を欠いた状態で、ヒト抗体の全レパートリーまたはその一部を生産する能力を有するトランスジェニック動物（例えばマウス）でも生産することができる。そのような生殖系列変異型マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの導入は、抗原チャレンジ時に、ヒト抗原の生産をもたらすであろう（例えばJakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90（1993）2551-2555、Jakobovits, A., et al., Nature 362（1993）255-258、Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7（1993）33-40を参照されたい）。ヒト抗体はファージディスプレイライブラリーでも生産することができる（Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227（1992）381-388、Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222（1991）581-597）。ヒトモノクローナル抗体の調製にはColeらの技法およびBoernerらの技法も利用することができる（Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77（1985）、およびBoerner, P., et al., J. Immunol. 147（1991）86-95）。本発明のキメラ抗体およびヒト化抗体について既に述べたように、本明細書において使用する用語「ヒト抗体」も、本発明の特性、とりわけC1q結合および/またはFcR結合に関わる特性が生じるように、例えば「クラススイッチング」、すなわちFc部分の改変または変異（例えばIgG1からIgG4への改変もしくは変異および/またはIgG1/IgG4変異）などによって、定常領域に修飾が加えられた上述の抗体を含む。
【００４４】
本明細書において使用する用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製、発現、作出または単離される全てのヒト抗体、例えばNS0細胞またはCHO細胞などの宿主細胞から単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体、または宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使って発現された抗体などを包含するものとする。そのような組換えヒト抗体は、再編成された形態の可変領域および定常領域を有する。本発明の組換えヒト抗体は、インビボ体細胞超変異を起こしている。したがって、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のVH配列およびVL配列に由来しそれに関係するものの、インビボでは、ヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しないかもしれない。
【００４５】
本明細書において使用する用語「結合部位」または「抗原結合部位」は、抗体分子の領域（1つまたは複数）であって、リガンド（例えば抗原またはその抗原フラグメント）が実際に結合し、かつ抗体に由来する領域を表す。抗原結合部位は、抗体重鎖可変ドメイン（VH）および/もしくは抗体軽鎖可変ドメイン（VL）、またはVH/VLのペアを含む。
【００４６】
所望の抗原に特異的に結合する抗原結合部位は、a）その抗原に特異的に結合する公知の抗体に由来するか、またはb）例えば抗原タンパク質もしくは核酸またはそれらのフラグメントなどを用いるデノボ免疫化法によって、またはファージディスプレイによって得られる、新しい抗体または抗体フラグメントに由来しうる。
【００４７】
本発明の抗体の抗原結合部位は、抗原に対する結合部位のアフィニティーにさまざまな程度に寄与する6つの相補性決定領域（CDR）を含有することができる。3つの重鎖可変ドメインCDR（CDRH1、CDRH2およびCDRH3）と、3つの軽鎖可変ドメインCDR（CDRL1、CDRL2およびCDRL3）がある。CDRおよびフレームワーク領域（FR）の範囲は、これらの領域が配列間の可変性に従って画定されている編集されたアミノ酸配列データベースとの比較によって決定される。本発明の範囲には、より少ないCDRで構成される（すなわち結合特異性が3つ、4つまたは5つのCDRによって決定される）機能的抗原結合部位も包含される。例えば、CDR6個の完全なセットに満たなくても、結合には十分な場合がある。場合によっては、VHドメインまたはVLドメインだけで十分であるだろう。
【００４８】
抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、どの脊椎動物種からのものも、それぞれの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2つの異なるタイプの一方に割り当てることができる。野生型軽鎖は、典型的には、2つの免疫グロブリンドメインを、すなわち通常は、抗原への結合にとって重要な1つの可変ドメイン（VL）と定常ドメイン（CL）とを含有する。
【００４９】
「重鎖」には、抗体のクラスまたはアイソタイプを定義づける異なるタイプがいくつか存在する。野生型重鎖は一連の免疫グロブリンドメインを含有し、通常は、抗原への結合にとって重要な1つの可変ドメイン（VH）と、いくつかの定常ドメイン（CH1、CH2、CH3など）を持つ。
【００５０】
「Fcドメイン」という用語は、本明細書では、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。例えば天然抗体の場合、Fcドメインは、IgG、IgAおよびIgDアイソタイプでは、抗体の2つの重鎖の第2および第3定常ドメインに由来する2つの同一タンパク質フラグメントで構成され、IgMおよびIgEのFcドメインは、各ポリペプチド鎖に3つの重鎖定常ドメイン（CHドメイン2〜4）を含有する。本明細書において使用する「Fcドメインを欠く」とは、本発明の二重特異性抗体がCH2、CH3およびCH4ドメインを含まないこと、すなわち定常重鎖がもっぱら1つまたは複数のCH1ドメインからなることを意味する。
【００５１】
本明細書において使用する「可変ドメイン」または「可変領域」は、抗原への抗体の結合に直接関与する軽鎖と重鎖のペアのそれぞれを表す。軽鎖の可変ドメインは「VL」と略記され、軽鎖の可変ドメインは「VH」と略記される。ヒト軽鎖およびヒト重鎖の可変ドメインは同じ全体構造を有する。各可変ドメインは4つのフレームワーク（FR）領域を含み、その配列は広く保存されている。FRは3つの「超可変領域」（または「相補性決定領域」、CDR）によって接続されている。各鎖上のCDRは、上述のフレームワークアミノ酸によって分離されている。それゆえに、抗体の軽鎖および重鎖は、N末端からC末端に向かって、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。FRはβシートコンフォメーションをとり、CDRはβシート構造を接続するループを形成しうる。各鎖中のCDRはFRによってそれぞれの三次元構造に保持され、他方の鎖からのCDRと一緒に「抗原結合部位」を形成する。とりわけ重鎖のCDR3は抗原結合に最も寄与する領域である。CDR領域およびFR領域は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）の標準的定義に従って決定される。
【００５２】
本願において使用する用語「定常ドメイン」または「定常領域」は、可変領域以外の抗体のドメイン全体を表す。定常領域は抗原の結合に直接的には関与しないが、さまざまなエフェクター機能を呈する。
【００５３】
抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、クラスIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMに分類され、これらのうちのいくつかはさらに、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4、IgA1およびIgA2などのサブクラスに分類されうる。異なる抗体クラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。5つの抗体クラスの全てに見いだすことができる軽鎖定常領域（CL）はκ（カッパ）およびλ（ラムダ）と呼ばれる。本明細書において使用される「定常ドメイン」は、サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のヒト抗体の定常重鎖領域および/または定常軽鎖カッパまたはラムダ領域に由来するヒト型である。そのような定常ドメインおよび領域は当分野の技術水準において周知であり、例えばKabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）に記載されている。
【００５４】
本明細書において使用する「三次構造」という用語は、本発明の抗体の幾何学的形状を指す。三次構造は、抗体ドメインを構成するポリペプチド鎖バックボーンを含むと共に、アミノ酸側鎖がいくつかの方法で相互作用し、結合している。
【００５５】
本明細書において使用する「アミノ酸」という用語は、カルボキシル基に対してα位にあるアミノ部分を有する有機分子を表す。アミノ酸の例には、アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンがある。使用されるアミノ酸は、いずれの場合も任意で、L型である。「正荷電」または「負荷電」アミノ酸という用語は、pH7.4におけるアミノ酸側鎖の電荷を指す。アミノ酸は、共通する側鎖の性質に従って、次のようにグループ分けすることができる:
（1）疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
（2）中性親水性: Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
（3）酸性: Asp、Glu;
（4）塩基性: His、Lys、Arg;
（5）鎖の配向に影響を及ぼす残基: Gly、Pro;
（6）芳香族: Trp、Tyr、Phe。
【００５６】
（表）特有の性質を有するアミノ酸
0006744292.tif 000002
【００５７】
本明細書において使用する場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）に記載のKabatナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、本明細書ではこれを「ナンバリングはKabatらに従う」という。具体的には、可変ドメインおよびカッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLについては、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）のKabatナンバリングシステム（647〜660頁参照）が使用され、本明細書ではこれを「ナンバリングはKabatに従う」というが、これとは別に、定常重鎖ドメイン（CH1、ヒンジ、CH2およびCH3）については、Kabat EUインデックスナンバリングシステム（661〜723頁参照）が使用され、本明細書ではこれを「ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う」という。
【００５８】
多重特異性抗体のポリペプチド鎖内のアミノ酸置換（または変異）は、抗体DNA中に適当なヌクレオチド変化を導入することによって、またはヌクレオチド合成によって調製される。しかしそのような修飾は、例えば上述のように、非常に限られた範囲でしか実行することができない。例えば修飾は、IgGアイソタイプおよび抗原結合などの上記抗体特徴を改変しないが、組換え生産の収量、タンパク質安定性をさらに改良するか、精製を容易にしうる。一定の態様では、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。
【００５９】
本発明の抗体は組換え手段によって生産される。抗体の組換え生産法は、当分野の技術水準において広く知られており、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質発現と、それに続く抗体の単離、そして通常は薬学的に許容される純度への精製を含む。宿主細胞中で前述の抗体を発現させるために、各（修飾）軽鎖および重鎖をコードする核酸を標準的方法によって発現ベクター中に挿入する。発現は、CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母細胞、または大腸菌（E. coli）細胞のような適当な原核宿主細胞または真核宿主細胞中で実行され、抗体は細胞（上清または溶解後の細胞）から回収される。抗体を組換え生産するための一般的方法は当分野の技術水準において周知であり、例えばMakrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17（1999）183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8（1996）271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16（2000）151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48（1998）870-880の総説に記載されている。
【００６０】
本明細書において可換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを包含する。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および/またはそれらの類似体、またはDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼによってもしくは合成反応によってポリマー中に組み込まれうる任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドおよびそれらの類似体を含みうる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド構成要素によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、ラベルへのコンジュゲーションなどといった、合成後に施される修飾を含みうる。他のタイプの修飾には、無修飾型のポリヌクレオチドの他に、例えば「キャップ」、類似体による天然ヌクレオチドの1つまたは複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合を持つもの（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）、荷電結合を持つもの（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部分、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなど）などを含有するもの、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレーターを含有するもの（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属（oxidative metal）など）、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えばアルファアノマー核酸など）がある。さらに、糖中に通常は存在するヒドロキシル基はいずれも、例えばホスホネート基、リン酸基で置き換えるか、標準的な保護基で保護するか、追加のヌクレオチドへの追加の結合を調製するために活性化するか、固形支持体または半固形支持体にコンジュゲートすることができる。5'および3'末端OHは、リン酸化するか、アミンまたは1〜20炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルは標準的保護基に誘導体化してもよい。ポリヌクレオチドは、当技術分野において一般に知られているリボース糖またはデオキシリボース糖の類似体、例えば2'-O-メチル-、2'-O-アリル-、2'-フルオロ-または2'-アジド-リボース、炭素環式糖類似体、α-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環状類似体、およびメチルリボシドなどの塩基ヌクレオシド類似体（basic nucleoside analog）も含有することができる。1つまたは複数のホスホジエステル結合を、代替連結基で置き換えてもよい。これらの代替連結基には、リン酸基がP（O）S（「チオエート」）、P（S）S（「ジチオエート」）、（O）NR2（「アミデート」）、P（O）R、P（O）OR'、CO、またはCH2（「ホルムアセタール」）で置き換えられている態様があるが、それらに限定されるわけではなく、ここで、各RまたはR'は独立してHであるか、任意でエーテル（-O-）結合を含有してもよい置換もしくは無置換アルキル（1〜20C）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジル（araldyl）である。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同一である必要はない。上記の記載は、RNAおよびDNAを含めて、本明細書において言及するすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
【００６１】
「単離された」核酸とは、その自然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、当該核酸分子を通常含有する細胞に含まれている核酸分子であるものの、染色体外に存在する核酸分子、またはその自然の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置にある核酸分子が含まれる。
【００６２】
本明細書において使用する「ベクター」という用語は、それが連結されたもう1つの核酸を増殖させる能力を有する核酸分子を指す。この用語は、自己複製性核酸構造としてのベクターおよび当該ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを包含する。この用語は、主に細胞へのDNAまたはRNAの挿入（例えば染色体組み込み）のために機能するベクター、主にDNAまたはRNAの複製のために機能するベクターの複製、およびDNAまたはRNAの転写および/または翻訳のために機能する発現ベクターを包含する。記載した機能を2つ以上提供するベクターも包含される。
【００６３】
「発現ベクター」は、それが機能的に連結された核酸の発現を指示する能力を有するベクターである。発現ベクターを適当な宿主細胞中に導入すると、発現ベクターは転写され、ポリペプチドに翻訳されうる。本発明の方法において宿主細胞を形質転換する場合は「発現ベクター」が使用される。したがって、本明細書に記載する宿主細胞の形質転換に関して「ベクター」という用語は、「発現ベクター」を意味する。「発現系」は通常、所望の発現産物を与えるように機能することができる発現ベクターを含む適切な宿主細胞を指す。
【００６４】
本明細書にいう「発現」は、核酸がmRNAに転写されるプロセスおよび/または転写されたmRNA（転写産物ともいう）が次にペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。転写産物およびコードされているポリペプチドを遺伝子産物と総称する。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、真核細胞における発現はmRNAのスプライシングを含みうる。
【００６５】
本明細書において使用する用語「形質転換」は、宿主細胞中にベクター/核酸を導入するプロセスを指す。強力な細胞壁障壁を持たない細胞を宿主細胞として使用するのであれば、トランスフェクションは例えばGraham and Van der Eh, Virology 52（1978）546以降に記載のリン酸カルシウム沈殿法などによって行われる。ただし、核注入による方法やプロトプラスト融合による方法など、DNAを細胞中に導入するための他の方法も使用しうる。原核細胞または強固な細胞壁構造を含む細胞を使用する場合、トランスフェクションの一方法は、例えば、Cohen, F.N, et al., PNAS 69（1972）7110以下参照に記載の塩化カルシウムを使ったカルシウム処理である。
【００６６】
本願において使用する用語「宿主細胞」は、本発明の抗体を作製するために改変することができる任意の種類の細胞系を表す。
【００６７】
本明細書において使用する表現「細胞」、「細胞株」および「細胞培養」は可換的に使用され、このような名称はいずれも子孫を包含する。したがって「形質転換体」および「形質転換細胞」という単語は、初代対象細胞とそこから派生した培養物を、その継代数にかかわらず包含する。また、全ての子孫は、意図的な突然変異または偶然の突然変異により、そのDNAの内容が正確には同一でないこともありうると理解される。元の形質転換細胞中で選択の対象としたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫は包含される。別個の指定が意図される部分は、その文脈から明らかになるであろう。
【００６８】
NS0細胞における発現は、例えばBarnes, L.M., et al., Cytotechnology 32（2000）109-123、Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73（2001）261-270に記載されている。一過性発現は、例えばDurocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30（2002）E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86（1989）3833-3837、Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89（1992）4285-4289、およびNorderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204（1997）77-87に記載されている。好ましい一過性発現系（HEK293）は、Schlaeger, E.-J.およびChristensen, K.により、Cytotechnology 30（1999）71-83に、そしてSchlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194（1996）191-199に記載されている。
【００６９】
宿主細胞によって生産された抗体は、重鎖のC末端からの1つまたは複数（特に1つまたは2つ）のアミノ酸の翻訳後切断を起こしうる。それゆえに、完全長重鎖をコードする特別な核酸分子の発現によって宿主細胞が生産した抗体は、完全長重鎖を含む場合も、完全長重鎖の切断変異体（本明細書では切断変異体重鎖ともいう）を含む場合もありうる。これは、重鎖の最後の2つのC末端アミノ酸がグリシン（G446）およびリジン（K447）である場合（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）に当てはまりうる。
【００７０】
したがって、CH3ドメインを含む重鎖のアミノ酸配列は、別段の表示がなければ、本明細書ではC末端グリシン-リジンジペプチドを除いて記載する。
【００７１】
本明細書に記載する薬学的組成物などの本発明の組成物は、本発明の抗体の集団を含む。抗体の集団は、完全長重鎖を有する抗体および切断変異体重鎖を有する抗体を含みうる。一態様において、抗体の集団は、抗体の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％または少なくとも90％が切断変異体重鎖を有する、完全長重鎖を有する抗体と切断変異体重鎖を有する抗体との混合物からなる。
【００７２】
細胞成分または他の夾雑物、例えば他の細胞核酸またはタンパク質を排除するために、アルカリ/SDS処理、CsClバンディング（banding）、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知の他の技法を含む標準的技法によって、抗体の精製（宿主細胞培養物から抗体を回収すること）が行われる。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York（1987）を参照されたい。例えば微生物タンパク質によるアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインAアフィニティークロマトグラフィーまたはプロテインGアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えばカチオン交換（カルボキシメチル樹脂）、アニオン交換（アミノエチル樹脂）および混合モード交換）、チオフィリック吸着（例えばベータ-メルカプトエタノールおよび他のSHリガンドによるもの）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（例えばフェニルセファロース、アザ-アレノフィリック樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸によるもの）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えばNi（II）アフィニティー材料およびCu（II）アフィニティー材料）、サイズ排除クロマトグラフィー、および電気泳動法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）といった、さまざまな方法が確立されており、タンパク質精製に広く使用されている（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75（1998）93-102）。
【００７３】
「薬学的組成物」という用語は、そこに含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態にあり、その組成物を投与される対象にとって許容できないほどに毒性な追加の構成要素を含有しない調製物を指す。本発明の薬学的組成物は、当技術分野において公知のさまざまな方法によって投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路および/または様式は、所望する結果に応じてさまざまであるだろう。一定の投与経路によって本発明の抗体を投与するには、抗体を、抗体の不活化を防止する材料でコーティングするか、抗体の不活化を防止する材料と同時投与することが必要になりうる。例えば抗体は、リポソームまたは希釈剤などの適当な担体に入れて、対象に投与することができる。薬学的に許容される希釈剤として食塩水および水性緩衝溶液が挙げられる。
【００７４】
「薬学的に許容される担体」は、薬学的製剤中の、活性成分以外の成分であり、これは対象にとって非毒性である。薬学的に許容される担体には、生理学的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などがある。好ましい一態様では、担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与（例えば注射または注入による投与）に適している。
【００７５】
本発明の薬学的組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤などの佐剤も含有しうる。微生物の存在の防止は、上記滅菌手法によっても、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることによっても、確実にすることができる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含めることも望ましいだろう。加えて、注射用医薬形態の長時間にわたる吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどといった、吸収を遅延させる薬剤を含めることによってもたらしうる。
【００７６】
本明細書において使用する「非経口投与」および「非経口的に投与される」という表現は、通常は注射による、経腸投与および外用以外の投与様式を意味し、例えば静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含むが、それらに限定されるわけではない。
【００７７】
選択した投与経路がなんであれ、適切な水和物型で使用しうる本発明の化合物および/または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に製剤化される。
【００７８】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物、および投与様式について、患者に対して有毒であることなく、所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分量が得られるように、変動させることができる。選択される投薬量レベルは、使用した本発明の特定組成物の活性、投与経路、投与時間、使用する特定化合物の排泄率、処置の継続時間、使用する特定組成物と併用される他の薬物、化合物および/または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康、および過去の病歴などといった、医療分野において周知のさまざまな薬物動態因子に依存するであろう。
【００７９】
組成物は、滅菌状態になければならず、その組成物を注射器で送達できる程度には流動性でなければならない。担体は、水の他、一態様において、等張性食塩溶液である。
【００８０】
適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散系の場合は要求される粒度を維持することによって、また界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、例えば糖類、マンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物に含めることが好ましい。
【００８１】
「イムノコンジュゲート」は、1つまたは複数の異種分子、例えば限定するわけではないが細胞毒性作用物質などにコンジュゲートされた抗体である。
【００８２】
本明細書において使用する「細胞毒性作用物質」という用語は、細胞の機能を阻害もしく防止し、かつ/または細胞死もしくは細胞破壊を引き起こす物質を指す。細胞毒性作用物質には、放射性同位体（例えばAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212およびLuの放射性同位体）;化学療法剤または化学療法薬（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン（adriamicin）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他のインターカレーター剤）、成長阻害性作用物質;酵素およびそのフラグメント、例えば核酸分解酵素;抗生物質;毒素、例えば細菌、真菌、植物または動物由来の小分子毒素または酵素活性毒素（それらのフラグメントおよび/または変異体を含む）;ならびに後述するさまざまな抗腫瘍性作用物質または抗がん性作用物質があるが、それらに限定されるわけではない。
【００８３】
本明細書において使用する「がん」という用語は、増殖性疾患、例えばリンパ腫、リンパ球性白血病、肺がん、非小細胞肺（NSCL）がん、気管支肺胞上皮（bronchioloalviolar）細胞肺がん、骨がん、膵がん、皮膚がん、頭部または頸部のがん、皮膚黒色腫または眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん（stomach cancer、gastric cancer）、大腸がん、乳がん、子宮がん、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、腟癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（CNS）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性神経膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、脳室上衣腫（ependymona）、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫およびユーイング肉腫を指し、上記のがんのいずれかの難治性型、または上記のがんの1種または複数種の組み合わせを含む。
【００８４】
本明細書にいう「ヒトVEGF」は、例えばLeung, D.W., et al., Science 246（1989）1306-9; Keck, P.J., et al., Science 246（1989）1309-12およびConnolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264（1989）20017-24に記載されている血管内皮成長因子（VEGF/VEGF-A）を指す。VEGFは、正常な血管新生および新血管形成ならびに腫瘍および眼内障害に関連する異常な血管新生および新血管形成の調節に関与する（Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18（1997）4-25; Berkman, R.A., et al., J. Clin. Invest. 91（1993）153-159; Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26（1995）86-91; Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53（1993）4727-4735; Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73（1996）931-934; およびDvorak, H., et al., Am. J. Pathol. 146（1995）1029-1039）。VEGFは、いくつかの供給源から単離されているホモ二量体型糖タンパク質である。VEGFは、内皮細胞に対して高度に特異的なマイトジェン活性を示す。
【００８５】
本明細書にいうヒト「ANG-2」は、Maisonpierre, P.C., et al, Science 277（1997）55-60およびCheung, A.H., et al., Genomics 48（1998）389-91に記載されているヒトアンジオポエチン-2（ANG-2）（ANGPT2またはANG2とも略記される）を指す。アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2は、血管内皮内に選択的に発現するチロシンキナーゼファミリーTieのリガンドとして発見された（Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407（2000）242-48）。現在、アンジオポエチンファミリーには、4種類の決定的メンバーがある。アンジオポエチン-3およびアンジオポエチン-4（Ang-3およびAng-4）は、マウスおよびヒトにおける同じ遺伝子座の広く分岐した対応物に相当しうる（Kim, I., et al., FEBS Let, 443（1999）353-56; Kim, I., et al., J Biol Chem 274（1999）26523-28）。
【００８６】
ヒトTWEAK（UniProtKB O43508、TNF関連弱アポトーシス誘導因子（TNF-related weak inducer of apoptosis））は、細胞表面会合II型膜貫通タンパク質である。TWEAKはChicheportiche, Y., et al., J. Biol. Chem. 272（1997）32401-32410、Marsters, S.A., et al., Curr. Biol. 8（1998）525-528、Lynch, C.N., et al., J. Biol. Chem. 274（1999）8455-8459に記載されている。TWEAKの活性型は可溶性ホモ三量体である。ヒトTWEAKとマウスTWEAKは受容体結合ドメインにおいて93％の配列同一性を示す。TWEAK受容体Fn14（線維芽細胞成長因子誘導性14kDaタンパク質）は、リガンド結合ドメイン中の単一システインリッチドメインからなる129aaのI型膜貫通タンパク質である。TWEAKのシグナリングはNF-KB経路活性化によって起こる。TWEAK mRNAはさまざまな組織で発現し、心臓、脳、骨格筋、および膵臓のような大半の主要臓器、脾臓、リンパ節、および胸腺のような免疫系に関係する組織に見いだされる。Fn14 mRNAは、心臓、脳、肺、胎盤、血管ECおよび平滑筋細胞に検出されている。TWEAKヌルおよびFn14ヌルノックアウトマウスは生存可能であり、健康であり、繁殖能力を有し、ナチュラルキラー細胞数が多く、強化された生得的炎症応答を示す。TWEAKは、アポトーシス、増殖、血管新生、虚血性半影、脳浮腫、多発性硬化症に関与する。
【００８７】
ヒトIL-17（IL17-A、CTLA-8、Swiss Prot Q16552、IL17ともいう）は、多発性硬化症の病理発生などと関係づけられたメモリーT細胞のサブセット（Th17と呼ばれるもの）によって生産される炎症誘発性サイトカインである。IL-17Aは、他の炎症性サイトカイン、ケモカインおよび接着分子の誘導に役割を果たす。IL-17A中和抗体で動物を処置すると、自己免疫性脳脊髄炎の疾患発生率および重症度が減少する（Komiyama, Y. et al., J. Immunol. 177（2006）566-573）。IL-17AはMS患者の脳脊髄液において過剰発現している（Hellings, P.W. et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28（2003）42-50、Matusevicius, D. et al., Multiple Sclerosis 5（1999）101-104、WO 2005/051422）。加えて、IL-17A中和抗体は、コラーゲン誘発性関節炎のマウス関節リウマチモデルの重症度および発生率を低減し、RA患者の炎症関節の滑液には高レベルのIL-17Aを検出することができる（Ziolkowska, M. et al., J. Immunol. 164（2000）2832-2838、Kotake, S., et al., J. Clin. Invest. 103（1999）1345-1352、Hellings, P.W. et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28（2003）42-50）。
【００８８】
II）本発明の態様の詳細な説明
一方の結合アームにVL-VH/CL-CH1の入れ替えが施された多重特異性抗体（CrossMabFab）は、WO 2009/080251およびSchaefer, W. et al, PNAS, 108（2011）11187-1191（これらは参考文献として本明細書に組み入れられる）に詳述されている。これらの抗体では、第1抗原に特異的に結合する第1抗体の軽鎖と第2抗原に特異的に結合する第2抗体の間違った重鎖とのミスマッチが原因となる副産物形成を（そのようなドメイン交換を伴わないアプローチと比較すると）かなり低減させることができる。しかし、それらの調製物は副生成物を全く含まないわけではない。副生成物プロファイルは、一方の結合アームにVL-VH/CL-CH1の入れ替えが施された多重特異性抗体の構造に依存する。Fabフラグメントだけを含む多重特異性抗体（Fab-CrossFab、例えばWO 2013/026835に記載されているもの）の場合、主要副生成物は非機能的軽鎖二量体である（Schaefer, W. et al, PNAS, 108（2011）11187-1191のSupplementの図S1Gも参照されたい）。少なくとも2つの異なる抗体のそれぞれのFc部分を含む多重特異性抗体の場合、主要副生成物は非機能的重鎖二量体である（Schaefer, W. et al, PNAS, 108（2011）11187-1191のSupplementの図S1Fも参照されたい）。
【００８９】
本発明は、収量を改良するために、CH1ドメインおよびCLドメイン中の特定アミノ酸をそれぞれ反対電荷を持つアミノ酸で置換することによって、不要な副生成物の形成をさらに低減するためのアプローチを提供する。多重特異性抗体の収量のさらなる改良および副生成物形成の低減は、多重特異性抗体のVHドメインおよびVLドメイン中の特定アミノ酸をさらに置換することによって達成することができる。
【００９０】
それゆえに、本発明は、
a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換されているか、または
ii）第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換されている、
多重特異性抗体に関する。
【００９１】
本発明の着想によれば、本発明の抗体は、上記および下記i）およびii）に示す修飾の一方だけを含む。したがって本発明の多重特異性抗体は、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換されているか、
または
ii）第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換されているか、
のどちらか一方を含むが、多重特異性抗体が、i）およびii）で述べた修飾の両方を含むことはないものとする。
【００９２】
一態様において、本発明は、
a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換されている
多重特異性抗体に関する。
【００９３】
一態様において、本発明は、
a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含み、
i）第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換されている、
多重特異性抗体に関する。
【００９４】
本発明の一態様において、負荷電アミノ酸は、EおよびDから選択される。本発明の一態様において、負荷電アミノ酸はEである。
【００９５】
本発明の一態様において、正荷電アミノ酸はK、RおよびHから選択される。本発明の一態様において、正荷電アミノ酸はKおよびRから選択される。本発明の一態様において、正荷電アミノ酸はKである。
【００９６】
本発明は、
a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されているか、または
ii）第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている、
多重特異性抗体にも関係する。
【００９７】
一態様において、本発明は、
a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている、
多重特異性抗体に関する。
【００９８】
一態様において、本発明は、
a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含み、
i）第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている、
多重特異性抗体に関する。
【００９９】
本発明の一態様では、定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている。
【０１００】
本発明の一態様では、定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換されている。
【０１０１】
本発明の一態様では、定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されている。
【０１０２】
本発明の一態様では、定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている。
【０１０３】
本発明の一態様では、定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、かつ定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されている。
【０１０４】
本発明の一態様では、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている。
【０１０５】
本発明の一態様では、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換されている。
【０１０６】
本発明の一態様では、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されている。
【０１０７】
本発明の一態様では、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている。
【０１０８】
本発明の一態様では、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されている。
【０１０９】
本発明の一態様では、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている。
【０１１０】
本発明の一態様では、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換されている。
【０１１１】
本発明の一態様では、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されている。
【０１１２】
本発明の一態様では、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている。
【０１１３】
本発明の一態様では、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されている。
【０１１４】
本明細書にいう「抗体の軽鎖」とは、N末端からC末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）および抗体軽鎖定常ドメイン（CL）を含むポリペプチドであり、VL-CLと略記される。本明細書にいう「抗体の重鎖」とは、N末端からC末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン（VH）および抗体定常重鎖ドメイン1（CH1）を含むポリペプチドである。本発明の好ましい一態様において、抗体の重鎖は、N末端からC末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン（VH）、抗体定常重鎖ドメイン1（CH1）、抗体重鎖定常ドメイン2（CH2）および抗体重鎖定常ドメイン3（CH3）を含み、VH-CH1-CH2-CH3と略記される。
【０１１５】
したがって本発明の多重特異性抗体において、該第1抗体に由来する該第1軽鎖では、軽鎖のドメインの連続的配置（CL-VL）が改変されずに保たれている。該第1抗体に由来する該第1重鎖では、重鎖のドメインの連続的配置（CH1-CLまたはCH3-CH2-CH1-CL）が改変されずに保たれている。該第1抗体に由来するFab領域はドメイン交差を含まないので、この領域を、本明細書では、本発明の多重特異性抗体の「非交差Fab領域」ともいう。
【０１１６】
本発明の一態様において、多重特異性抗体は、N末端からC末端に向かってVLドメインおよびCLドメインの連続的配置（すなわちN末端からC末端の方向にVL-CL）を含む第1軽鎖と、N末端からC末端に向かってVHドメインおよびCH1ドメインの連続的配置（すなわちN末端からC末端の方向にVH-CH1）を含む第1重鎖とを含み、第1軽鎖および第1重鎖は第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する。
【０１１７】
本発明の一態様において、多重特異性抗体は、N末端からC末端に向かってVLドメインおよびCLドメインの連続的配置（すなわちN末端からC末端の方向にVL-CL）を含む第1軽鎖と、N末端からC末端に向かってVHドメイン、CH1ドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインの連続的配置（すなわちN末端からC末端の方向にVH-CH1-CH2-CH3）を含む第1重鎖とを含み、第1軽鎖および第1重鎖は第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する。
【０１１８】
対照的に、該第2軽鎖（本明細書ではこれを「修飾第2軽鎖」または「LC*」ともいう）内では、元の可変ドメインVLが（元の）第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、かつ元の定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられている。それゆえに、修飾第2軽鎖は、該第2抗体に由来する第2重鎖のCH1ドメインおよびVHドメインでできている。その結果、該修飾第2軽鎖の軽鎖ドメインの連続的配置は（N末端からC末端に向かって）VH-CH1である。
【０１１９】
加えて、該第2重鎖（本明細書ではこれを「修飾第2重鎖」または「HC*」ともいう）内では、元の可変ドメインVHが（元の）第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、かつ元の定常ドメインCH1が（元の）第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている。それゆえに、修飾第2重鎖は、少なくとも、該第2抗体に由来する第2軽鎖のCLドメインおよびVLドメインの連続的配置を含む。その結果、該修飾第2重鎖の重鎖ドメインの連続的配置は（N末端からC末端に向かって）少なくともVL-CLである。
【０１２０】
要するに、該第2抗体に由来する該第2重鎖内および該第2軽鎖内では、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられ、定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられている。該第2抗体に由来するFab領域は上述のようにドメイン交差を含むので、この領域を本明細書では本発明の多重特異性抗体の「交差Fab領域」ともいう。したがって、本発明の多重特異性抗体は、少なくとも1つの非交差Fab領域と少なくとも1つの交差Fab領域とを含む。
【０１２１】
本発明の一態様において、本発明の多重特異性抗体の修飾重鎖は、（N末端からC末端の方向に）第2軽鎖のVLドメインおよびCLドメインの連続的配置からなる（ただし、本発明に関して上述した該VLドメインおよびCLドメイン中の特定アミノ酸置換は可能である）。したがってこの態様において、多重特異性抗体は、該第1抗体に由来する第1Fabフラグメント（非交差Fabフラグメント）および該第2抗体に由来する第2Fabフラグメント（交差Fabフラグメント）を含む少なくとも2つのFabフラグメントを含み、この態様の多重特異性抗体は該第1抗体および該第2抗体のそれぞれのFcドメインを含まない（したがって本多重特異性抗体はFcドメインを欠く）。一態様において、多重特異性抗体は2〜5個のFabフラグメントを含む。多重特異性抗体の一態様において、Fabフラグメントはペプチドリンカーを介して互いに接続される。本明細書において使用する「ペプチドリンカー」という用語は、アミノ酸配列を持つペプチド（好ましくは合成起源のもの）を表す。一態様において、ペプチドリンカーは、Fabフラグメントの1つを他のFabフラグメントのC末端またはN末端に接続することで本発明の多重特異性抗体を形成させるために使用される。好ましい一態様において、該ペプチドリンカーは、少なくとも5アミノ酸の長さ、一態様では5〜100アミノ酸の長さ、さらなる一態様では10〜50アミノ酸の長さを持つアミノ酸配列を有するペプチドである。一態様において、該ペプチドリンカーは（GxS）nまたは（GxS）nGmであり、ここで、G＝グリシン、S＝セリン、および（x＝3、n＝3、4、5もしくは6、かつm＝0、1、2もしくは3）または（x＝4、n＝2、3、4もしくは5、かつm＝0、1、2もしくは3）、一態様ではx＝4かつn＝2または3、さらなる一態様ではx＝4およびn＝2である。一態様において、該ペプチドリンカーは（G4S）2である。ペプチドリンカーは第1Fabフラグメントと第2Fabフラグメントとを接続するために使用される。一態様では、第1Fabフラグメントが、第2FabフラグメントのC末端またはN末端に接続される。Fcドメインを欠くこの態様の多重特異性抗体の例示的模式図を、図2（上側）に示す。図2（上側）の多重特異性抗体を本明細書では「Fab-CrossFab」ともいう。このフォーマットの多重特異性抗体は以前にWO 2013/026835に記載されている。
【０１２２】
本発明の一態様において、本発明の多重特異性抗体の修飾重鎖は、（N末端からC末端に向かって）該第2抗原に特異的に結合する該第2抗体に由来するVLドメイン、CLドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインの連続的配置を含む。したがってこの態様では、多重特異性抗体が、該第1抗体および該第2抗体のそれぞれのFc領域を含む。この態様の多重特異性抗体の例示的模式図を、図2（下側）に示す。図2（下側）の多重特異性抗体を本明細書では「CrossMAb-Fab」ともいう。
【０１２３】
本発明の一態様において、多重特異性抗体は、該第1抗原および第3抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する第1軽鎖および第1重鎖を含む。この態様は、以前に記載されたように（WO 2013/174873）、いわゆる二重作用性（dual-acting）Fab中の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインを含む。
【０１２４】
本発明の一態様において、多重特異性抗体はFcドメインを欠き、
a）N末端からC末端に向かってVLドメインおよびCLドメインの連続的配置（すなわちN末端からC末端の方向にVL-CL）を含む第1軽鎖、ならびにN末端からC末端に向かってVHドメインおよびCH1ドメインの連続的配置（すなわちN末端からC末端の方向にVH-CH1）を含む第1重鎖（ここで、第1軽鎖および第1重鎖は、第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する）と、b）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
とを含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換されているか、または
ii）第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換されている。
【０１２５】
本発明の一態様において、多重特異性抗体はFcドメインを欠き、
a）N末端からC末端に向かってVLドメインおよびCLドメインの連続的配置（すなわちN末端からC末端の方向にVL-CL）を含む第1軽鎖、ならびにN末端からC末端に向かってVHドメインおよびCH1ドメインの連続的配置（すなわちN末端からC末端の方向にVH-CH1）を含む第1重鎖（ここで、第1軽鎖および第1重鎖は、第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する）と、b）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
とを含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換されている。
【０１２６】
本発明の一態様において、多重特異性抗体はFcドメインを欠き、
a）N末端からC末端に向かってVLドメインおよびCLドメインの連続的配置（すなわちN末端からC末端の方向にVL-CL）を含む第1軽鎖、ならびにN末端からC末端に向かってVHドメインおよびCH1ドメインの連続的配置（すなわちN末端からC末端の方向にVH-CH1）を含む第1重鎖（ここで、第1軽鎖および第1重鎖は、第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する）と、b）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
とを含み、
i）第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換されている。
【０１２７】
本発明の一態様において、多重特異性抗体は
a）N末端からC末端に向かってVLドメインおよびCLドメインの連続的配置（すなわちN末端からC末端の方向にVL-CL）を含む第1軽鎖、ならびにN末端からC末端に向かってVHドメイン、CH1ドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインの連続的配置（すなわちN末端からC末端の方向にVH-CH1-CH2-CH3）を含む第1重鎖（ここで、第1軽鎖および第1重鎖は、第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する）と、b）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
とを含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換されているか、または
ii）第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換されている。
【０１２８】
本発明の一態様において、多重特異性抗体は
a）N末端からC末端に向かってVLドメインおよびCLドメインの連続的配置（すなわちN末端からC末端の方向にVL-CL）を含む第1軽鎖、ならびにN末端からC末端に向かってVHドメイン、CH1ドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインの連続的配置（すなわちN末端からC末端の方向にVH-CH1-CH2-CH3）を含む第1重鎖（ここで、第1軽鎖および第1重鎖は、第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する）と、b）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
とを含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換されている。
【０１２９】
本発明の一態様において、多重特異性抗体は、
a）N末端からC末端に向かってVLドメインおよびCLドメインの連続的配置（すなわちN末端からC末端の方向にVL-CL）を含む第1軽鎖、ならびにN末端からC末端に向かってVHドメイン、CH1ドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインの連続的配置（すなわちN末端からC末端の方向にVH-CH1-CH2-CH3）を含む第1重鎖（ここで、第1軽鎖および第1重鎖は、第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する）と、b）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
とを含み、
i）第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換されている。
【０１３０】
本発明の一態様は、上記の修飾に加えて、各他方の（すなわち第2重鎖または第1軽鎖の）CLドメインにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）が負荷電アミノ酸で置換されている多重特異性抗体に関する。124番目に導入された負電荷は、当該CLドメインと対応するCH1ドメインとのペアリング（どちらも第1抗体または第2抗体のどちらか一方に由来するドメイン）を支援する。これは、CLドメイン中の124番目（ナンバリングはKabatに従う）に導入された負荷電アミノ酸が、多重特異性抗体の三次構造において、対応するCH1ドメイン上の124番目の正荷電アミノ酸Kに面しているという事実による。結果として、CLドメイン中の123番目（ナンバリングはKabatに従う）のグルタミン酸（E）残基が原因となってこの環境に元々存在する負電荷が、第2の負荷電アミノ酸を導入することによって増強され、それによってCLとCH1のペアリングが改良される。この態様に従ってアミノ酸置換を行うことにより、多重特異性抗体の収量をさらに改良し、副生成物の形成をさらに減じることができる。
【０１３１】
本発明の一態様は、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は負荷電アミノ酸で置換されているか、または
ii）第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は負荷電アミノ酸で置換されている、
多重特異性抗体に関する。
【０１３２】
本発明の一態様は、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で置換されているか、または
ii）第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で置換されている、
多重特異性抗体に関する。
【０１３３】
本発明の一態様は、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は負荷電アミノ酸で置換されている、多重特異性抗体に関する。
【０１３４】
本発明の一態様は、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、多重特異性抗体に関する。
【０１３５】
本発明の一態様は、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、多重特異性抗体に関する。
【０１３６】
本発明の一態様では、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている。
【０１３７】
本発明の一態様では、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている。
【０１３８】
本発明の一態様は、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は負荷電アミノ酸で置換されている、多重特異性抗体に関する。
【０１３９】
本発明の一態様は、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は互いに独立して正荷電アミノ酸で置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、多重特異性抗体に関する。
【０１４０】
本発明の一態様は、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、多重特異性抗体に関する。
【０１４１】
本発明の一態様では、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている。
【０１４２】
本発明の一態様では、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている。
【０１４３】
本発明の一態様は、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている、多重特異性抗体に関する。
【０１４４】
本発明の一態様では、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換されている。
【０１４５】
本発明の一態様では、
・第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されているか、または
・第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されており、かつ
第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１４６】
本発明の一態様では、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１４７】
本発明の一態様では、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１４８】
本発明の一態様では、
・第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されているか、または
・第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されており、かつ
第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１４９】
本発明の一態様では、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１５０】
本発明の一態様では、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１５１】
本発明の一態様では、
・第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されているか、または
・第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されており、かつ第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換されている。
【０１５２】
本発明の一態様では、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換されている。
【０１５３】
本発明の一態様では、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換されている。
【０１５４】
本発明の一態様では、
・第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換されているか、または
・第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換されており、かつ
第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１５５】
本発明の一態様では、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１５６】
本発明の一態様では、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１５７】
本発明の一態様では、
・第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換されているか、または
・第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換されており、かつ
第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１５８】
本発明の一態様では、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１５９】
本発明の一態様では、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１６０】
本発明の一態様では、
・第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換されているか、または
・第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換されており、かつ
第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１６１】
本発明の一態様では、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１６２】
本発明の一態様では、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、KおよびRから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１６３】
本発明の一態様では、
・第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換されているか、または
・第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換されており、かつ
第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１６４】
本発明の一態様では、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１６５】
本発明の一態様では、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１６６】
本発明の一態様では、
・第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換されているか、または
・第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換されており、かつ
第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１６７】
本発明の一態様では、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１６８】
本発明の一態様では、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で置換されている。
【０１６９】
本発明の一態様では、
・第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換されているか、または
・第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換されており、かつ
第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換されている。
【０１７０】
本発明の一態様では、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換されている。
【０１７１】
本発明の一態様では、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はEで置換され、かつ第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）はKで置換されている。
【０１７２】
本発明の多重特異性抗体がFc領域および/または［ドメインVH-CH1-CH2-CH3を含む第1重鎖とドメインVL-CL-CH2-CH3を含む修飾第2重鎖］を含む場合、本発明のさらにもう1つの局面は、望ましくない副生成物（これは、例えば、第1重鎖ともう1つの第1重鎖とのミスペアリング、または第2重鎖ともう1つの第2重鎖とのミスペアリングによって形成されうる）と比較して所望の多重特異性抗体の比率を改良するためのアプローチを提供することである。本発明によれば、第1重鎖および第2重鎖のCH3ドメインのそれぞれにおけるアミノ酸置換によって、このアプローチをさらに支援することができる。以下のパラグラフでさらに詳述するこれらのアプローチによって、第1重鎖と修飾第2重鎖とのヘテロ二量体化が改良される。
【０１７３】
したがって本発明の一態様は、第1重鎖と修飾第2重鎖とのヘテロ二量体化を支援するために両CH3ドメインがそれぞれのアミノ酸置換によって相補的に改変されている、該第1抗体由来のCH3ドメインを含む第1重鎖と該第2抗体由来のCH3ドメインを含む第2重鎖とを含む本発明の多重特異性抗体である。
【０１７４】
ヘテロ二量体化を支援するためのCH3修飾については、いくつかのアプローチが、例えば参照により本明細書に組み入れられるWO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291に記載されている。通例、当技術分野において公知のアプローチでは、第1重鎖のCH3ドメインと第2重鎖のCH3ドメインはどちらも、1つの改変CH3ドメインを含む重鎖が同じ構造のもう1つの重鎖とはもはやホモ二量体化することができない（例えばCH3改変第1重鎖はもう1つのCH3改変第1重鎖とはもはやホモ二量体化することができず、CH3改変第2重鎖はもう1つのCH3改変第2重鎖とはもはやホモ二量体化することができない）ように、相補的に改変される。これにより、1つの改変CH3ドメインを含む重鎖は、相補的に改変されたCH3ドメインを含むもう1つの重鎖とヘテロ二量体化することを強制される。本発明のこの態様の場合、第1重鎖のCH3ドメインおよび第2重鎖のCH3ドメインは、第1重鎖と第2重鎖とがヘテロ二量体化することを強制され、第1重鎖および第2重鎖はもはや（例えば立体的な理由から）ホモ二量体化することができないように、アミノ酸置換によって相補的に改変される。
【０１７５】
上に言及し、本明細書に組み入れられた、当技術分野において公知の、重鎖ヘテロ二量体化を支援するためのさまざまなアプローチは、第1抗原に特異的に結合する第1抗体由来の「非交差Fab領域」と第2抗原に特異的に結合する第2抗体由来の「交差Fab領域」とを含む本発明の多重特異性抗体において、本発明に関して上述した特定のアミノ酸置換と組み合わせて使用されるさまざまな代替選択肢として考慮される。
【０１７６】
該第1抗体由来のCH3ドメインを含む第1重鎖と該第2抗体由来のCH3ドメインを含む第2重鎖とを含む本発明の多重特異性抗体の一態様において、第1重鎖および第2重鎖のCH3ドメインは、例えば参照により本明細書に組み入れられるWO 96/027011、Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9（1996）617-621、Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16（1998）677-681、およびWO 98/050431にいくつかの例を挙げて詳述されている、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」技術によって改変される。「ノブ・イントゥ・ホール」技術では、抗体の三次構造において第1重鎖のCH3ドメインと第2重鎖のCH3ドメインとの間に形成される境界面内で、各CH3ドメイン上の特定アミノ酸が、一方の重鎖のCH3ドメインには突起（「ノブ」）を、また他方の重鎖のCH3ドメインにはくぼみ（「ホール」）を、それぞれ生じるように改変される。多重特異性抗体の三次構造において、一方の重鎖のCH3ドメインに導入された突起は、他方の重鎖のCH3ドメインに導入されたくぼみの中に配置されうる。各重鎖は、そのCH3ドメイン中に「ノブ」を含むことができ、同時に他方の重鎖はそのCH3ドメイン中に「ホール」を含む。
【０１７７】
したがって一態様は、本発明の多重特異性抗体であって、抗体の三次構造において、第1重鎖のCH3ドメインと第2重鎖のCH3ドメインとが、それぞれの抗体CH3ドメインの間に位置する境界面を形成し、第1重鎖のCH3ドメインと第2重鎖のCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列はそれぞれが、抗体の三次構造において該境界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、
・一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、境界面内で他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置するくぼみ内に配置されうる前記一方の重鎖のCH3ドメイン中に位置する突起を、境界面内に生成しており、かつ
・他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、前記一方の重鎖のCH3ドメイン中に位置する境界面内の突起がその中に配置されうる前記他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置するくぼみを、境界面内に生成している、
本発明の多重特異性抗体に関する。この態様による多重特異性抗体を本明細書では「CH3（KiH）改変多重特異性抗体」ともいう（ここで「KiH」という略号は「ノブ・イントゥ・ホール技術」を意味する）。
【０１７８】
CH3（KiH）改変多重特異性抗体に関する本発明のこの態様によれば、以下にさらに詳述するCH3（KiH）改変多重特異性抗体の特徴および該CH3（KiH）改変多重特異性抗体のさまざまな態様を、上述した多重特異性抗体の態様のいずれかと組み合わせることができる。
【０１７９】
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択される。
【０１８０】
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択される。
【０１８１】
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択され、かつ元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択される。
【０１８２】
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はWで置換されており、かつ他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はSで置換され、368番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換され、407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はVで置換されている。
【０１８３】
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はWで置換され、409番目のアミノ酸R（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換され、370番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されており、かつ他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はSで置換され、368番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換され、407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はVで置換され、399番目のアミノ酸D（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、357番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換されている。
【０１８４】
「ノブ・イントゥ・ホール」技術による第1重鎖および第2重鎖のCH3ドメインの改変に加えて、ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体をさらに安定化する（Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270（1997）26-35、Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16（1998）677-681）。これにより、ジスルフィド架橋の追加導入は、本発明の多重特異性抗体の収量をさらに増加させる。
【０１８５】
それゆえに、本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様では、導入されたシステイン残基によって一方の重鎖のCH3ドメインと他方の重鎖のCH3ドメインとの間にジスルフィド架橋が形成されうるように、一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、第1のアミノ酸はシステインで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、境界面内で第1のアミノ酸に面している第2のアミノ酸はシステインで置換されている。
【０１８６】
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択され、かつ導入されたシステイン残基によって一方の重鎖のCH3ドメインと他方の重鎖のCH3ドメインとの間にジスルフィド架橋が形成されうるように、一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、第1のアミノ酸はシステインで置換されており、他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、境界面内で第1のアミノ酸に面している第2のアミノ酸はシステインで置換されている。
【０１８７】
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択され、かつ導入されたシステイン残基によって一方の重鎖のCH3ドメインと他方の重鎖のCH3ドメインとの間にジスルフィド架橋が形成されうるように、一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、第1のアミノ酸はシステインで置換され、他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、境界面内で第1のアミノ酸に面している第2のアミノ酸はシステインで置換されている。
【０１８８】
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択され、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択され、かつ導入されたシステイン残基によって一方の重鎖のCH3ドメインと他方の重鎖のCH3ドメインとの間にジスルフィド架橋が形成されうるように、一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、第1のアミノ酸はシステインで置換され、他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、境界面内で第1のアミノ酸に面している第2のアミノ酸はシステインで置換されている。
【０１８９】
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択され、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、356番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）または354番目のアミノ酸S（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のどちらか一方はCで置換されており、かつ他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、349番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はCで置換されている。
【０１９０】
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択され、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、356番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）または354番目のアミノ酸S（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のどちらか一方はCで置換されており、かつ他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、349番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はCで置換されている。
【０１９１】
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択され、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択され、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、356番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）または354番目のアミノ酸S（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のどちらか一方はCで置換されており、かつ他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、349番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はCで置換されている。
【０１９２】
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はWで置換され、356番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）または354番目のアミノ酸S（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のどちらか一方がCで置換されており、かつ他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はSで置換され、368番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換され、407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はVで置換され、349番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はCで置換されている。
【０１９３】
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はWで置換され、349番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はCで置換されており、かつ他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はSで置換され、368番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換され、407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はVで置換され、356番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）または354番目のアミノ酸S（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のどちらか一方がCで置換されている。
【０１９４】
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はWで置換され、409番目のアミノ酸R（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換され、370番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、356番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）または354番目のアミノ酸S（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のどちらか一方がCで置換されており、かつ他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はSで置換され、368番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換され、かつ407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はVで置換され、399番目のアミノ酸D（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、357番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、349番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はCで置換されている。
【０１９５】
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はWで置換され、409番目のアミノ酸R（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換され、370番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、349番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はCで置換されており、かつ他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はSで置換され、368番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換され、407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はVで置換され、399番目のアミノ酸D（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、357番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、356番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）または354番目のアミノ酸S（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のどちらか一方がCで置換されている。
【０１９６】
ヘテロ二量体化を強制するために多重特異性抗体の重鎖のCH3ドメインを修飾する方法は、「ノブ・イントゥ・ホール技術」に加えて、当技術分野では他にも知られている。これらの技術、とりわけWO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954およびWO 2013/096291に記載されているものを、本明細書では、本発明の多重特異性抗体と組み合わされる「ノブ・イントゥ・ホール技術」に代わる選択肢として考慮する。
【０１９７】
本発明の多重特異性抗体の一態様では、EP 1870459に記載のアプローチを使って、多重特異性抗体の第1重鎖と第2重鎖とのヘテロ二量体化が支援される。このアプローチは、両者間、すなわち第1重鎖と第2重鎖との間のCH3/CH3ドメイン境界面中の特別なアミノ酸位置に、反対の電荷を持つ荷電アミノ酸を導入することに基づく。
【０１９８】
したがってこの態様は、抗体の三次構造において第1重鎖のCH3ドメインと第2重鎖のCH3ドメインとがそれぞれの抗体CH3ドメイン間に位置する境界面を形成し、第1重鎖のCH3ドメインおよび第2重鎖のCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列がそれぞれに抗体の三次構造において該境界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、第1のアミノ酸は正電荷アミノ酸で置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、第2のアミノ酸は負荷電アミノ酸で置換されている、本発明の多重特異性抗体に関する。この態様による多重特異性抗体を、本明細書では、「CH3（＋/-）改変多重特異性抗体」ともいう（ここで「＋/-」はそれぞれのCH3ドメインに導入された反対電荷を持つアミノ酸を意味する）。
【０１９９】
本発明のCH3（＋/-）改変多重特異性抗体の一態様において、前記正荷電アミノ酸は、K、RおよびHから選択され、前記負荷電アミノ酸は、EまたはDから選択される。
【０２００】
本発明のCH3（＋/-）改変多重特異性抗体の一態様において、前記正荷電アミノ酸は、KおよびRから選択され、前記負荷電アミノ酸は、EまたはDから選択される。
【０２０１】
本発明のCH3（＋/-）改変多重特異性抗体の一態様において、前記正荷電アミノ酸はKであり、前記負荷電アミノ酸はEである。
【０２０２】
本発明のCH3（＋/-）改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、409番目のアミノ酸R（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換され、370番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、399番目のアミノ酸D（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、357番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換されている。
【０２０３】
本発明の多重特異性抗体の一態様では、WO2013/157953に記載のアプローチを使って、多重特異性抗体の第1重鎖と第2重鎖とのヘテロ二量体化が支援される。本発明のCH3改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換されている。本発明のCH3改変多重特異性抗体のもう1つの態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、351番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換されている。
【０２０４】
本発明のCH3改変多重特異性抗体のもう1つの態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、351番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換されている。加えて、次に挙げる置換の少なくとも1つが、他方の重鎖のCH3ドメインに含まれる: 349番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されている、349番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換されている、および368番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されている。一態様において、368番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されている。
【０２０５】
本発明の多重特異性抗体の一態様では、WO2012/058768に記載のアプローチを使って、多重特異性抗体の第1重鎖と第2重鎖とのヘテロ二量体化が支援される。本発明のCH3改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はYで置換され、407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換され、409番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はFで置換されている。もう1つの態様では、前述の置換に加えて、他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、411番目（本来はT）、399番目（本来はD）、400番目（本来はS）、405番目（本来はF）、390番目（本来はN）および392番目（本来はK）のアミノ酸の少なくとも1つが置換されている。好ましい置換は
・N、R、Q、K、D、E、およびWから選択されるアミノ酸による411番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）の置換、
・R、W、Y、およびKから選択されるアミノ酸による399番目のアミノ酸D（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）の置換、
・E、D、R、およびKから選択されるアミノ酸による400番目のアミノ酸S（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）の置換、
・I、M、T、S、V、およびWから選択されるアミノ酸による405番目のアミノ酸F（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）の置換、
・R、K、およびDから選択されるアミノ酸による390番目のアミノ酸N（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）の置換、ならびに
・V、M、R、L、F、およびEから選択されるアミノ酸による392番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）の置換
である。
【０２０６】
本発明のCH3改変多重特異性抗体（WO2012/058768に従って改変されたもの）のもう1つの態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はYで置換され、407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はVで置換され、409番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はFで置換されている。本発明のCH3改変多重特異性抗体のもう1つの態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換され、409番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はFで置換されている。最後に述べた態様では、該他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、392番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、411番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、399番目のアミノ酸D（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はRで置換され、かつ400番目のアミノ酸S（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はRで置換されている。
【０２０７】
本発明の多重特異性抗体の一態様では、WO 2011/143545に記載のアプローチを使って、多重特異性抗体の第1重鎖と第2重鎖とのヘテロ二量体化が支援される。本発明のCH3改変多重特異性抗体の一態様では、両重鎖のCH3ドメイン中のアミノ酸修飾が368番目および/または409番目に導入される。
【０２０８】
本発明の多重特異性抗体の一態様では、WO 2011/090762に記載のアプローチを使って、多重特異性抗体の第1重鎖と第2重鎖とのヘテロ二量体化が支援される。WO 2011/090762は、「ノブ・イントゥ・ホール」技術によるアミノ酸修飾に関する。本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はWで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換されている。本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体のもう1つの態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はYで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はTで置換されている。
【０２０９】
IgG2アイソタイプである本発明の多重特異性抗体の一態様では、WO 2011/090762に記載のアプローチを使って、多重特異性抗体の第1重鎖と第2重鎖とのヘテロ二量体化が支援される。
【０２１０】
本発明の多重特異性抗体の一態様では、WO 2009/089004に記載のアプローチを使って、多重特異性抗体の第1重鎖と第2重鎖とのヘテロ二量体化が支援される。本発明のCH3改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、392番目のアミノ酸KまたはN（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は負荷電アミノ酸で（好ましい一態様ではEまたはDで、好ましい一態様ではDで）置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、399番目のアミノ酸D、356番目のアミノ酸EもしくはD、または357番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は正荷電アミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで、好ましい一態様ではKで）置換されている（好ましい一態様では399番目または356番目のアミノ酸がKで置換されている）。さらなる一態様では、前述の置換に加えて、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、409番目のアミノ酸KまたはR（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は負荷電アミノ酸で（好ましい一態様ではEまたはDで、好ましい一態様ではDで）置換されている。さらにもう1つの態様では、前述の置換に加えて、または前述の置換に代えて、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、439番目のアミノ酸Kおよび/または370番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で（好ましい一態様ではEまたはDで、好ましい一態様ではDで）置換されている。
【０２１１】
本発明の多重特異性抗体の一態様では、WO 2007/147901に記載のアプローチを使って、多重特異性抗体の第1重鎖と第2重鎖とのヘテロ二量体化が支援される。本発明のCH3改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、253番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、282番目のアミノ酸D（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、322番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、239番目のアミノ酸D（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、240番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、292番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換されている。
【０２１２】
本発明の多重特異性抗体の一態様では、WO 2007/110205に記載のアプローチを使って、多重特異性抗体の第1重鎖と第2重鎖とのヘテロ二量体化が支援される。
【０２１３】
本発明の一態様において、多重特異性抗体は二重特異性抗体または三重特異性抗体である。本発明の好ましい一態様において、多重特異性抗体は二重特異性抗体である。
【０２１４】
本発明の一態様において、抗体は二価抗体または三価抗体である。本発明の一態様において、抗体は二価抗体である。
【０２１５】
本発明の一態様において、多重特異性抗体は、1つまたは複数の免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン定常領域を含む。免疫グロブリンクラスには、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEアイソタイプが含まれ、IgGおよびIgAの場合には、それらのサブタイプが含まれる。
【０２１６】
本発明の一態様において、多重特異性抗体はIgGタイプの抗体の定常ドメイン構造を有する。本発明のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、ヒトIgG1サブクラス、または変異L234AおよびL235Aを持つヒトIgG1サブクラスであることを特徴とする。本発明のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、ヒトIgG2サブクラスであることを特徴とする。本発明のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、ヒトIgG3サブクラスであることを特徴とする。本発明のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、ヒトIgG4サブクラスまたは追加の変異S228Pを持つヒトIgG4サブクラスであることを特徴とする。本発明のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、ヒトIgG1サブクラスまたはヒトIgG4サブクラスであることを特徴とする。本発明のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、変異L234AおよびL235A（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を持つヒトIgG1サブクラスであることを特徴とする。本発明のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、変異L234A、L235AおよびP329G（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を持つヒトIgG1サブクラスであることを特徴とする。本発明のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、変異S228PおよびL235E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を持つヒトIgG4サブクラスであることを特徴とする。本発明のさらなる一態様において、多重特異性抗体は、変異S228P、L235EおよびP329G（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を持つヒトIgG4サブクラスであることを特徴とする。
【０２１７】
一態様において、本明細書において特定するCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体は、追加のC末端グリシン-リジンジペプチド（G446およびK447、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を含む。一態様において、本明細書において特定するCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体は、追加のC末端グリシン残基（G446、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を含む。
【０２１８】
多重特異性抗体は組換え法によって調製される。したがって本発明は、本発明の多重特異性抗体を調製するための方法であって、以下の工程を含む方法にも関係する:
・a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第1軽鎖、
b）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第1重鎖、
c）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第2軽鎖、および
d）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第2重鎖
をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
・該多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程。
【０２１９】
本発明の方法の一態様において、宿主細胞は
a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する第1軽鎖であって、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）が、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで、好ましい一態様ではKで）互いに独立して置換されている第1軽鎖、
b）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する第1重鎖であって、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）が、EまたはDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）互いに独立して置換されている第1重鎖、
c）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖であって、第2軽鎖において、可変ドメインVLは第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLは第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられている第2軽鎖、および
d）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2重鎖であって、第2重鎖において、可変ドメインVHは第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1は第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている第2重鎖
をコードする核酸を含むベクターで形質転換される。
【０２２０】
本発明の方法の一態様において、宿主細胞は、
a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する第1軽鎖、
b）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する第1重鎖、
c）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖であって、第2軽鎖において、可変ドメインVLは第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLは第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、
第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで、好ましい一態様ではKで）互いに独立して置換されている、第2軽鎖、および
d）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2重鎖であって、第2重鎖において、可変ドメインVHは第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1は第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられており、
第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）互いに独立して置換されている、第2重鎖
をコードする核酸を含むベクターで形質転換される。
【０２２１】
本発明のもう1つの目的は、本発明の方法によって生産される多重特異性抗体である。
【０２２２】
本発明のもう1つの目的は、
a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する、請求項1〜9のいずれか一項に定義する第1軽鎖をコードする核酸を含むベクター、
b）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する、請求項1〜9のいずれか一項に定義する第1重鎖をコードする核酸を含むベクター、
c）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する、請求項1〜9のいずれか一項に定義する第2軽鎖をコードする核酸を含むベクター、および
d）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する、請求項1〜9のいずれか一項に定義する第2重鎖をコードする核酸を含むベクター
を含む宿主細胞である。
【０２２３】
本発明のもう1つの目的は、本発明の多重特異性抗体をコードする核酸である。
【０２２４】
一態様において、核酸は、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第1軽鎖をコードする。一態様において、核酸は、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）が、K、RおよびHから選択されるアミノ酸（一態様ではKおよびRから選択され、一態様ではアミノ酸はKである）で互いに独立して置換されている、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第1軽鎖をコードする。一態様において、核酸は、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）が、EおよびDから選択されるアミノ酸（一態様ではアミノ酸はEである）で置換されている、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第1軽鎖をコードする。
【０２２５】
一態様において、核酸は、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第1重鎖をコードする。一態様において、核酸は、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）が、EまたはDから選択されるアミノ酸（一態様においてアミノ酸はEである）で互いに独立して置換されている、本発明の多重特異性抗体に関して定義する第1重鎖をコードする。
【０２２６】
一態様において、核酸は、本発明の多重特異性抗体に関して定義する修飾第2軽鎖をコードする。一態様において、核酸は、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）が、EまたはDから選択されるアミノ酸（一態様においてアミノ酸はEである）で互いに独立して置換されている、本発明の多重特異性抗体に関して定義する修飾第2軽鎖をコードする。さらなる一態様において、核酸は、可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）が、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、本発明の多重特異性抗体に関して定義する修飾第2軽鎖をコードする。
【０２２７】
一態様において、核酸は、本発明の多重特異性抗体に関して定義する修飾第2重鎖をコードする。一態様において、核酸は、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）が、K、RおよびHから選択されるアミノ酸（一態様ではKおよびRから選択され、一態様ではアミノ酸はKである）で互いに独立して置換されている、本発明の多重特異性抗体に関して定義する修飾第2重鎖をコードする。さらなる一態様において、核酸は、定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）が、EおよびDから選択されるアミノ酸（一態様においてアミノ酸はEである）で置換されている、本発明の多重特異性抗体に関して定義する修飾第2重鎖をコードする。さらなる一態様において、核酸は、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）が、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで、好ましい一態様ではKで）置換されている、本発明の多重特異性抗体に関して定義する修飾第2重鎖をコードする。さらなる一態様において、核酸は、定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）が、EおよびDから選択されるアミノ酸で置換され、第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）が、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、本発明の多重特異性抗体に関して定義する修飾第2重鎖をコードする。
【０２２８】
一態様において、本発明の核酸は単離された核酸である。
【０２２９】
本発明のもう1つの目的は、本発明の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現させる能力を有する、発現ベクターである。
【０２３０】
本発明のもう1つの目的は、本発明の核酸を含む宿主細胞である。本発明のもう1つの目的は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞である。一態様において、宿主細胞はHEK293細胞またはCHO細胞である。
【０２３１】
本発明のもう1つの目的は、抗体が生産されるように本発明の宿主細胞を培養する工程を含む、抗体を生産する方法である。本方法の一態様において、本方法は、宿主細胞から抗体を回収する工程をさらに含む。
【０２３２】
本発明のもう1つの目的は、本発明の多重特異性抗体を含む薬学的組成物である。本発明の一局面は、少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた本発明の多重特異性抗体を含む薬学的組成物である。
【０２３３】
一態様において、本発明の抗体の集団を含む組成物（好ましい一態様では薬学的組成物）は、本明細書において特定するCH3ドメインを追加のC末端グリシン-リジンジペプチド（G446およびK447、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）と共に含む重鎖を含む抗体を含む。一態様において、本発明の抗体の集団を含む組成物は、本明細書において特定するCH3ドメインを追加のC末端グリシン残基（G446、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）と共に含む重鎖を含む抗体を含む。
【０２３４】
一態様において、上述の組成物は、本明細書において特定するCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体、本明細書において特定するCH3ドメインを追加のC末端グリシン残基（G446、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）と共に含む重鎖を含む抗体、および本明細書において特定するCH3ドメインを追加のC末端グリシン-リジンジペプチド（G446およびK447、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）と共に含む重鎖を含む抗体で構成される抗体の集団を含む。
【０２３５】
本発明のもう1つの目的は、細胞毒性作用物質にカップリングされた本発明の多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートである。
【０２３６】
本発明のもう1つの目的は、薬学的組成物を製造するための、本発明の多重特異性抗体の使用である。本発明のもう1つの目的は、少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた本発明の多重特異性抗体を調合する工程を含む、本発明の多重特異性抗体を含む薬学的組成物を製造するための方法である。
【０２３７】
本発明のもう1つの目的は、医薬として使用するための本発明の多重特異性抗体である。本発明のもう1つの目的は、がんの処置において使用するための本発明の多重特異性抗体である。本発明のもう1つの目的は、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎（psoratic arthritis）、筋疾患（例えば筋ジストロフィー）、多発性硬化症、慢性腎臓疾患、骨疾患（例えば多発性骨髄腫における骨変性）、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、および/または血管傷害の処置において使用するための本発明の多重特異性抗体である。
【０２３８】
本発明のもう1つの目的は、医薬として使用するための、少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた本発明の多重特異性抗体を含む薬学的組成物である。本発明のもう1つの目的は、がんの処置において使用するための、少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた本発明の多重特異性抗体を含む薬学的組成物である。本発明のもう1つの目的は、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患（例えば筋ジストロフィー）、多発性硬化症、慢性腎臓疾患、骨疾患（例えば多発性骨髄腫における骨変性）、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、および/または血管傷害の処置において使用するための、少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた本発明の多重特異性抗体を含む薬学的組成物である。
【０２３９】
本発明のもう1つの目的は、医薬として使用するための、細胞毒性作用物質にカップリングされた本発明の多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートである。本発明のもう1つの目的は、がんの処置において使用するための、細胞毒性作用物質にカップリングされた本発明の多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートである。本発明のもう1つの目的は、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患（例えば筋ジストロフィー）、多発性硬化症、慢性腎臓疾患、骨疾患（例えば多発性骨髄腫における骨変性）、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、および/または血管傷害の処置において使用するための、細胞毒性作用物質にカップリングされた本発明の多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートである。
【０２４０】
本発明のもう1つの目的は、医薬を製造するための、本発明の多重特異性抗体の使用である。本発明のもう1つの目的は、がんを処置するための医薬を製造するための、本発明の多重特異性抗体の使用である。本発明のもう1つの目的は、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患（例えば筋ジストロフィー）、多発性硬化症、慢性腎臓疾患、骨疾患（例えば多発性骨髄腫における骨変性）、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、および/または血管傷害を処置するための医薬を製造するための、本発明の多重特異性抗体の使用である。
【０２４１】
本発明のもう1つの目的は、疾患を患っている患者を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に本発明の多重特異性抗体を投与することによる方法である。本発明のもう1つの目的は、がんを患っている患者を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に本発明の多重特異性抗体を投与することによる方法である。本発明のもう1つの目的は、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患（例えば筋ジストロフィー）、多発性硬化症、慢性腎臓疾患、骨疾患（例えば多発性骨髄腫における骨変性）、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、および血管傷害を含む疾患の少なくとも1つを患っている患者を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に本発明の多重特異性抗体を投与することによる方法である。
【０２４２】
III）本発明の具体的態様
以下に本発明の具体的態様を列挙する。
【０２４３】
1. a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されているか、または
ii）第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている、
多重特異性抗体。
【０２４４】
2.第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換されている、態様1に記載の多重特異性抗体。
【０２４５】
3.第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換されている、態様1に記載の多重特異性抗体。
【０２４６】
4.i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されているか、または
ii）第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、
態様1に記載の多重特異性抗体。
【０２４７】
5.第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）が、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、態様2に記載の多重特異性抗体。
【０２４８】
6.第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）が、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、態様3に記載の多重特異性抗体。
【０２４９】
7.iii）第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、
第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されており、かつ
iv）第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸（好ましい一態様ではE）で置換され、第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで、一態様ではKで）置換されている、
前記態様のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２５０】
8.第1軽鎖の定常ドメインCLおよび第2重鎖の定常ドメインCLがカッパアイソタイプである、前記態様のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２５１】
9.第1軽鎖の定常ドメインCLはカッパアイソタイプであり、第2重鎖の定常ドメインCLはラムダアイソタイプである、態様1〜7のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２５２】
10.第1軽鎖の定常ドメインCLはラムダアイソタイプであり、第2重鎖の定常ドメインCLはカッパアイソタイプである、態様1〜7のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２５３】
11.第1軽鎖の定常ドメインCLおよび第2重鎖の定常ドメインCLがラムダアイソタイプである、態様1〜7のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２５４】
12.第1軽鎖にカッパイソタイプの定常ドメインCLを含み、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、123番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、かつ124番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで、さらなる好ましい一態様ではKで）置換されている、態様1〜9のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２５５】
13.第2重鎖にカッパイソタイプの定常ドメインCLを含み、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、123番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、かつ124番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで、さらなる好ましい一態様ではKで）置換されている、態様1〜8および態様10のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２５６】
14.第1軽鎖にラムダアイソタイプの定常ドメインCLを含み、第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、123番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、かつ124番目のアミノ酸Q（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換されている、態様1〜7、態様10および態様11のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２５７】
15.第2重鎖にラムダアイソタイプの定常ドメインCLを含み、第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、123番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、かつ124番目のアミノ酸Q（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換されている、態様1〜7、態様9および態様11のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２５８】
16.抗体の三次構造において、第1重鎖のCH3ドメインと第2重鎖のCH3ドメインとが、それぞれの抗体CH3ドメインの間に位置する境界面を形成し、第1重鎖のCH3ドメインと第2重鎖のCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列はそれぞれが、抗体の三次構造において該境界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、
・一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、界面内で他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置するくぼみ内に配置されうる前記一方の重鎖のCH3ドメイン内に位置する突起を、境界面内に生成し、
・他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、前記一方の重鎖のCH3ドメイン中に位置する境界面内の突起がその中に配置されうる前記他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置するくぼみを、境界面内に生成している、
前記態様のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２５９】
17.元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択され、かつ/または元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択される、態様16に記載の多重特異性抗体。
【０２６０】
18.一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はWで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はSで置換され、368番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換され、407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はVで置換されている、態様16または態様17のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２６１】
19.一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はWで置換され、409番目のアミノ酸R（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換され、370番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はSで置換され、368番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換され、407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はVで置換され、399番目のアミノ酸D（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、357番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換されている、態様16〜18のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２６２】
20.導入されたシステイン残基によって一方の重鎖のCH3ドメインと他方の重鎖のCH3ドメインとの間にジスルフィド架橋が形成されうるように、一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、第1のアミノ酸はシステインで置換され、他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、境界面内で第1のアミノ酸に面している第2のアミノ酸はシステインで置換されている、態様16〜19のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２６３】
21.一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、356番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）または354番目のアミノ酸S（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のどちらか一方はCで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、349番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はCで置換されている、態様20に記載の多重特異性抗体。
【０２６４】
22.一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、349番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はCで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、354番目のアミノ酸S（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はCで置換されている、態様20に記載の多重特異性抗体。
【０２６５】
23.二重特異性、三重特異性または四重特異性である、前記態様のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２６６】
24.二重特異性または三重特異性である、前記態様のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２６７】
25.二重特異性である、前記態様のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２６８】
26.二価または三価である、前記態様のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２６９】
27.二価である、前記態様のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２７０】
28.IgGタイプの抗体の定常ドメイン構造を有する、前記態様のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２７１】
29.ヒトIgG1サブクラスまたはヒトIgG4サブクラスである、前記態様のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２７２】
30.変異L234AおよびL235A（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を持つヒトIgG1サブクラスである、前記態様のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２７３】
31.変異S228PおよびL235E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を持つヒトIgG4サブクラスである、前記態様のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２７４】
32. P329G変異（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）をさらに含む、態様30または態様31に記載の多重特異性抗体。
【０２７５】
33.Fcドメインを欠く、態様1〜15、23〜27のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２７６】
34. a）SEQ ID NO:32の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH Ang2＞）およびSEQ ID NO:33の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL Ang2＞）を含み、かつ
b）SEQ ID NO:31の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH VEGF＞）およびSEQ ID NO:30の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL VEGF＞）を含む、
ヒトアンジオポエチン-2およびヒトVEGFに特異的に結合する、前記態様のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２７７】
35. a）第1抗体がSEQ ID NO:32の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH Ang2＞）およびSEQ ID NO:33の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL Ang2＞）を含み、かつ
b）第2抗体がSEQ ID NO:31の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH VEGF＞）およびSEQ ID NO:30の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL VEGF＞）を含む、
ヒトアンジオポエチン-2およびヒトVEGFに特異的に結合する、前記態様のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２７８】
36. a）好ましい一態様ではSEQ ID NO:32の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:33の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトアンジオポエチン-2に特異的に結合する第1抗体由来の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）好ましい一態様ではSEQ ID NO:31の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:30の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトVEGFに特異的に結合する第2抗体由来の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換されているか、または
ii）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換されている、
ヒトアンジオポエチン-2およびヒトVEGFに特異的に結合する二重特異性抗体。
【０２７９】
37. a）好ましい一態様ではSEQ ID NO:32の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:33の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトアンジオポエチン-2に特異的に結合する第1抗体由来の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）好ましい一態様ではSEQ ID NO:31の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:30の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトVEGFに特異的に結合する第2抗体由来の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換されている、
ヒトアンジオポエチン-2およびヒトVEGFに特異的に結合する二重特異性抗体。
【０２８０】
38. a）好ましい一態様ではSEQ ID NO:32の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:33の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトアンジオポエチン-2に特異的に結合する第1抗体由来の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）好ましい一態様ではSEQ ID NO:31の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:30の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトVEGFに特異的に結合する第2抗体由来の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換されている、
ヒトアンジオポエチン-2およびヒトVEGFに特異的に結合する二重特異性抗体。
【０２８１】
39.i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されているか、または
ii）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、
態様36に記載のヒトアンジオポエチン-2およびヒトVEGFに特異的に結合する二重特異性抗体。
【０２８２】
40. i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、
態様37に記載のヒトアンジオポエチン-2およびヒトVEGFに特異的に結合する二重特異性抗体。
【０２８３】
41. ii）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）が、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、
態様38に記載のヒトアンジオポエチン-2およびヒトVEGFに特異的に結合する二重特異性抗体。
【０２８４】
42.・第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されており、かつ・第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸（好ましい一態様ではE）で置換され、第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで、一態様ではKで）置換されている、
態様36〜41のいずれか1つに記載のヒトアンジオポエチン-2およびヒトVEGFに特異的に結合する二重特異性抗体。
【０２８５】
43. a）SEQ ID NO:36の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH IL17＞）およびSEQ ID NO:37の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL IL17＞）を含み、かつ
b）SEQ ID NO:35の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH TWEAK＞）およびSEQ ID NO:34の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL TWEAK ＞）を含む、
ヒトTWEAKおよびヒトIL17に特異的に結合する態様1〜33のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２８６】
44. a）第1抗体が、SEQ ID NO:36の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH IL17＞）およびSEQ ID NO:37の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL IL17＞）を含み、
b）第2抗体が、SEQ ID NO:35の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH TWEAK＞）およびSEQ ID NO:34の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL TWEAK ＞）を含む、
ヒトTWEAKおよびヒトIL17に特異的に結合する態様1〜33または態様43のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２８７】
45. a）好ましい一態様ではSEQ ID NO:35の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:34の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトIL17に特異的に結合する第1抗体由来の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）好ましい一態様ではSEQ ID NO:36の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:37の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトTWEAKに特異的に結合する第2抗体由来の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含み
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換されているか、または
ii）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換されている、
ヒトTWEAKおよびヒトIL17に特異的に結合する二重特異性抗体。
【０２８８】
46. a）好ましい一態様ではSEQ ID NO:35の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:34の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトIL17に特異的に結合する第1抗体由来の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）好ましい一態様ではSEQ ID NO:36の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:37の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトTWEAKに特異的に結合する第2抗体由来の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換されている、
ヒトTWEAKおよびヒトIL17に特異的に結合する二重特異性抗体。
【０２８９】
47. a）好ましい一態様ではSEQ ID NO:35の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:34の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトIL17に特異的に結合する第1抗体由来の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）好ましい一態様ではSEQ ID NO:36の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:37の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトTWEAKに特異的に結合する第2抗体由来の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換されている、
ヒトTWEAKおよびヒトIL17に特異的に結合する二重特異性抗体。
【０２９０】
48. i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されているか、または
ii）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、
態様45に記載のヒトTWEAKおよびヒトIL17に特異的に結合する二重特異性抗体。
【０２９１】
49. i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、
態様46に記載のヒトTWEAKおよびヒトIL17に特異的に結合する二重特異性抗体。
【０２９２】
50. i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、
態様47に記載のヒトTWEAKおよびヒトIL17に特異的に結合する二重特異性抗体。
【０２９３】
51.・第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されており、かつ・第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸（好ましい一態様ではE）で置換され、第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで、一態様ではKで）置換されている、
態様45〜50のいずれか1つに記載のヒトTWEAKおよびヒトIL17に特異的に結合する二重特異性抗体。
【０２９４】
52. a）SEQ ID NO:40の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH Her1Her3＞）およびSEQ ID NO:41の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL Her1Her3＞）を含み、かつ
b）SEQ ID NO:39の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH cMet＞）およびSEQ ID NO:38の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL cMet＞）を含む、
ヒトHer1、ヒトHer3およびヒトcMetに特異的に結合する、態様1〜33のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２９５】
53. a）第1抗体が、SEQ ID NO:40の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH Her1Her3＞）およびSEQ ID NO:41の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL Her1Her3＞）を含み、かつ
b）第2抗体が、SEQ ID NO:39の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH cMet＞）およびSEQ ID NO:38の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL cMet＞）を含む、
ヒトHer1、ヒトHer3およびヒトcMetに特異的に結合する、態様1〜33または態様52のいずれか1つに記載の多重特異性抗体。
【０２９６】
54. a）好ましい一態様ではSEQ ID NO:40の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:41の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトHer1およびヒトHer3に特異的に結合する第1抗体由来の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）好ましい一態様ではSEQ ID NO:39の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:38の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトcMetに特異的に結合する第2抗体由来の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換されているか、または
ii）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換されている、
ヒトHer1、ヒトHer3およびヒトcMetに特異的に結合する三重特異性抗体。
【０２９７】
55. a）好ましい一態様ではSEQ ID NO:40の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:41の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトHer1およびヒトHer3に特異的に結合する第1抗体由来の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）好ましい一態様ではSEQ ID NO:39の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:38の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトcMetに特異的に結合する第2抗体由来の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換されている、
ヒトHer1、ヒトHer3およびヒトcMetに特異的に結合する三重特異性抗体。
【０２９８】
56. a）好ましい一態様ではSEQ ID NO:40の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:41の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトHer1およびヒトHer3に特異的に結合する第1抗体由来の第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）好ましい一態様ではSEQ ID NO:39の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:38の可変軽鎖ドメインを含む、ヒトcMetに特異的に結合する第2抗体由来の第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖
を含み、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換されている、
ヒトHer1、ヒトHer3およびヒトcMetに特異的に結合する三重特異性抗体。
【０２９９】
57. i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されているか、または
ii）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、
態様54に記載のヒトHer1、ヒトHer3およびヒトcMetに特異的に結合する三重特異性抗体。
【０３００】
58. i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、
態様55に記載のヒトHer1、ヒトHer3およびヒトcMetに特異的に結合する三重特異性抗体。
【０３０１】
59. i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、
態様56に記載のヒトHer1、ヒトHer3およびヒトcMetに特異的に結合する三重特異性抗体。
【０３０２】
60.・第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されており、かつ
・第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸（好ましい一態様ではE）で置換され、第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで、一態様ではKで）置換されている、
態様54または59のいずれか1つに記載のヒトHer1、ヒトHer3およびヒトcMetに特異的に結合する三重特異性抗体。
【０３０３】
61.医薬として使用するための、前記態様のいずれか1つに記載の抗体。
【０３０４】
62.がんの処置において使用するための、態様1〜60のいずれか1つに記載の抗体。
【０３０５】
63.炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患（例えば筋ジストロフィー）、多発性硬化症、慢性腎臓疾患、骨疾患（例えば多発性骨髄腫における骨変性）、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、および/または血管傷害の処置において使用するための、態様1〜60のいずれか1つに記載の抗体。
【０３０６】
64.医薬、好ましい一態様ではがんを処置するための医薬、または炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患（例えば筋ジストロフィー）、多発性硬化症、慢性腎臓疾患、骨疾患（例えば多発性骨髄腫における骨変性）、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、および/もしくは血管傷害を処置するための医薬、を製造するための、態様1〜60のいずれか1つに記載の抗体の使用。
【０３０７】
65.態様1〜60のいずれか1つに記載の多重特異性抗体を調製するための方法であって、以下の工程を含む方法:
・a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する態様1〜60のいずれか1つに定義する第1軽鎖、
b）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する態様1〜60のいずれか1つに定義する第1重鎖、
c）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する態様1〜60のいずれか1つに定義する第2軽鎖、および
d）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する態様1〜60のいずれか1つに定義する第2重鎖
をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
・該多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程。
【０３０８】
66.多重特異性抗体、好ましい一態様では前記態様のいずれか1つに記載の多重特異性抗体、を調製する際の副生成物形成を低減するための方法であって、以下の工程を含む方法:
・a）第1抗原に特異的に結合する第1抗体に由来する第1軽鎖および第1重鎖、ならびに
b）第2抗原に特異的に結合する第2抗体に由来する第2軽鎖および第2重鎖であって、第2軽鎖では、可変ドメインVLが第2重鎖の可変ドメインVHで置き換えられ、定常ドメインCLが第2重鎖の定常ドメインCH1で置き換えられており、かつ第2重鎖では、可変ドメインVHが第2軽鎖の可変ドメインVLで置き換えられ、定常ドメインCH1が第2軽鎖の定常ドメインCLで置き換えられている、第2軽鎖および第2重鎖;
をコードする核酸であって、多重特異性抗体の副生成物の形成を低減するために、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されているか、または
ii）第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている
核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
・該多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程。
【０３０９】
67.多重特異性抗体の副生成物の形成を低減するために、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている、
態様66に記載の方法。
【０３１０】
68.多重特異性抗体の副生成物の形成を低減するために、
i）第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換され、かつ第2軽鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して置換されている、
態様66に記載の方法。
【０３１１】
69.多重特異性抗体の副生成物の形成を低減するために、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されているか、または
ii）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、
態様66に記載の方法。
【０３１２】
70.多重特異性抗体の副生成物の形成を低減するために、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換され、かつ第2重鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、
態様67に記載の方法。
【０３１３】
71.多重特異性抗体の副生成物の形成を低減するために、
i）第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目および123番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の定常ドメインCH1において、147番目および213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は、EまたはDから選択されるアミノ酸で互いに独立して（好ましい一態様ではEで）置換され、かつ第1軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されている、
態様68に記載の方法。
【０３１４】
72.多重特異性抗体の副生成物の形成を低減するために、以下のアミノ酸置換が含まれる、態様66〜71のいずれか1つに記載の方法:
・第1軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで互いに独立して、さらなる好ましい一態様ではKで）置換され、第1重鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではEで）置換されており、かつ
・第2重鎖の可変ドメインVLにおいて、38番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、EおよびDから選択されるアミノ酸（好ましい一態様ではE）で置換され、第2軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）は、K、RおよびHから選択されるアミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで、一態様ではKで）置換されている。
【０３１５】
73.態様65に記載の方法によって生産される多重特異性抗体。
【０３１６】
74. a）態様1〜60のいずれか1つに定義する第1軽鎖、
b）態様1〜60のいずれか1つに定義する第2軽鎖、
c）態様1〜60のいずれか1つに定義する第1重鎖、または
d）態様1〜60のいずれか1つに定義する第2重鎖
のアミノ酸配列をコードする核酸。
【０３１７】
75.態様74に記載の核酸を含み、宿主細胞において該核酸を発現させる能力を有するベクター。
【０３１８】
76.態様74に記載の核酸を含み、宿主細胞において該核酸を発現させる能力を有する、発現ベクター。
【０３１９】
77. 態様74に記載の核酸を含む宿主細胞。
【０３２０】
78.態様75に記載のベクターまたは態様76に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【０３２１】
79.少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた態様1〜60のいずれか1つに記載の多重特異性抗体を含む薬学的組成物。
【０３２２】
80.医薬として使用するための、態様79に記載の薬学的組成物。
【０３２３】
81.がんの処置において使用するための、態様79に記載の薬学的組成物。
【０３２４】
82.炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患（例えば筋ジストロフィー）、多発性硬化症、慢性腎臓疾患、骨疾患（例えば多発性骨髄腫における骨変性）、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、および/または血管傷害の処置において使用するための、態様79に記載の薬学的組成物。
【０３２５】
83.細胞毒性作用物質にカップリングされた態様1〜60のいずれか1つに記載の抗体を含むイムノコンジュゲート。
【０３２６】
84.医薬として使用するための、態様83に記載のイムノコンジュゲート。
【０３２７】
85.がんの処置または炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患（例えば筋ジストロフィー）、多発性硬化症、慢性腎臓疾患、骨疾患（例えば多発性骨髄腫における骨変性）、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、および/もしくは血管傷害の処置において使用するための、態様83に記載のイムノコンジュゲート。
【０３２８】
アミノ酸配列の説明
SEQ ID NO:1 VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された野生型（wt）重鎖（HC）＜VEGF＞
SEQ ID NO:2 VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された野生型（wt）軽鎖（LC）＜VEGF＞
SEQ ID NO:3 野生型（wt）重鎖（HC）＜Ang-2＞
SEQ ID NO:4 野生型（wt）カッパ軽鎖（LC）＜Ang-2＞
SEQ ID NO:5 K213E置換およびK147E置換を持つ重鎖（HC）＜Ang-2＞
SEQ ID NO:6 E123K置換およびQ124K置換を持つカッパ軽鎖（LC）＜Ang-2＞
SEQ ID NO:7 VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された、Q124E置換を持つ重鎖（HC）＜VEGF＞
SEQ ID NO:8 VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された、Q124E置換およびQ38E置換を持つ重鎖（HC）＜VEGF＞
SEQ ID NO:9 VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された、Q39K置換を持つ軽鎖（LC）＜VEGF＞
SEQ ID NO:10 K213E、K147EおよびQ39E置換を持つ重鎖（HC）＜Ang-2＞
SEQ ID NO:11 E123K、Q124KおよびQ38K置換を持つカッパ軽鎖（LC）＜Ang-2＞
SEQ ID NO:12 野生型（wt）ラムダ軽鎖（LC）＜Ang-2＞
SEQ ID NO:13 E123K置換およびE124K置換を持つラムダ軽鎖（LC）＜Ang-2＞
SEQ ID NO:14 VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された野生型（wt）重鎖（HC）＜TWEAK＞
SEQ ID NO:15 VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された野生型（wt）軽鎖（LC）＜TWEAK＞
SEQ ID NO:16 野生型（wt）重鎖（HC）＜IL17＞
SEQ ID NO:17 野生型（wt）カッパ軽鎖（LC）＜IL17＞
SEQ ID NO:18 K213E置換およびK147E置換を持つ重鎖（HC）＜IL17＞
SEQ ID NO:19 E123K置換およびQ124K置換を持つカッパ軽鎖（LC）＜IL17＞
SEQ ID NO:20 VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された、Q124E置換を持つ重鎖（HC）＜TWEAK＞
SEQ ID NO:21 VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された野生型（wt）重鎖（HC）＜cMet＞
SEQ ID NO:22 VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された野生型（wt）軽鎖（LC）＜cMet＞
SEQ ID NO:23 野生型（wt）重鎖（HC）＜Her1Her3＞
SEQ ID NO:24 野生型（wt）カッパ軽鎖（LC）＜Her1Her3＞
SEQ ID NO:25 VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された、Q124E置換を持つ重鎖（HC）＜cMet＞
SEQ ID NO:26 K213E置換およびK147E置換を持つ重鎖（HC）＜Her1Her3＞
SEQ ID NO:27 E123K置換およびQ124K置換を持つカッパ軽鎖（LC）＜Her1Her3＞
SEQ ID NO:28 K213D置換およびK147E置換を持つ重鎖（HC）＜Her1Her3＞
SEQ ID NO:29 E123R置換およびQ124K置換を持つカッパ軽鎖（LC）＜Her1Her3＞
SEQ ID NO:30 可変重鎖ドメイン＜VEGF＞289
SEQ ID NO:31 可変軽鎖ドメイン＜VEGF＞289
SEQ ID NO:32 可変重鎖ドメイン＜Ang-2＞289
SEQ ID NO:33 可変軽鎖ドメイン＜Ang-2＞289
SEQ ID NO:34 可変重鎖ドメイン＜TWEAK＞
SEQ ID NO:35 可変軽鎖ドメイン＜TWEAK＞
SEQ ID NO:36 可変重鎖ドメイン＜IL17＞
SEQ ID NO:37 可変軽鎖ドメイン＜IL17＞
SEQ ID NO:38 可変重鎖ドメイン＜cMet＞
SEQ ID NO:39 可変軽鎖ドメイン＜cMet＞
SEQ ID NO:40 可変重鎖ドメイン＜Her1Her3＞
SEQ ID NO:41 可変軽鎖ドメイン＜Her1Her3＞
SEQ ID NO:42 VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された、Q38E置換およびQ124E置換を持つ重鎖（HC）＜TWEAK＞
SEQ ID NO:43 VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された、Q39K置換を持つ軽鎖（LC）＜TWEAK＞
SEQ ID NO:44 K213E、K147E、およびQ39E置換を持つ重鎖（HC）＜IL17＞
SEQ ID NO:45 E123K、Q124KおよびQ38K置換を持つカッパ軽鎖（LC）＜IL17＞
SEQ ID NO:46 VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された、Q124E置換と野生型CH3とを持つ重鎖（HC）＜VEGF＞
SEQ ID NO:47 K231E置換、K147E置換および野生型CH3を持つ重鎖（HC）＜Ang-2＞
SEQ ID NO:48 VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された、野生型CH3を持つ重鎖（HC）＜VEGF＞
SEQ ID NO:49 VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された、E123K置換、Q124K置換を持つ重鎖（HC）＜VEGF＞
SEQ ID NO:50 VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された、K213E置換、K147E置換を持つ軽鎖（LC）＜VEGF＞
SEQ ID NO:51 Q124E置換を持つカッパ軽鎖（LC）＜Ang-2＞
【実施例】
【０３２９】
本発明の理解を助けるために以下の実施例を提供するが、本発明の真の範囲は本願特許請求の範囲に記載される。記載する手順には、本発明の本旨から逸脱することなく、変更を加えることが可能であると、理解される。
【０３３０】
以下のセクションにおいて、別途述べられていない限り、LC*は修飾された軽鎖＜CH1-VH＞を表し、HC*は修飾された重鎖＜CL-VL＞または＜CH3-CH2-CL-VL＞を表す。
【０３３１】
材料および一般的方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）に提供されている。抗体鎖のアミノ酸は、Kabat（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991））によるナンバリングに従ってナンバリングされ、言及される。
【０３３２】
組換えDNA技法
DNAの操作には、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているように、標準的方法を使用した。分子生物学用試薬は製造者の説明書に従って使用した。
【０３３３】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、化学合成によって作製されたオリゴヌクレオチドから調製した。唯一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた600〜1800bp長の遺伝子セグメントを、PCR増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによってアセンブルし、次に、表示した制限部位、例えばKpnI/SacIまたはAscI/PacIによって、pPCRScript（Stratagene）系pGA4クローニングベクターにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのDNA配列はDNA配列決定によって確認した。遺伝子合成フラグメントは、Geneart（ドイツ・レーゲンスブルク）に、所与の仕様書に従って発注された。
【０３３４】
DNA配列決定
DNA配列は、MediGenomix GmbH（ドイツ・マルティンストリート）またはSequiserve GmbH（ドイツ・ファターシュテッテン）において行われた両鎖シーケンスによって決定された。
【０３３５】
DNAおよびタンパク質の配列解析ならびに配列データ管理
配列の生成、マッピング、解析、アノテーションおよび図解には、GCG（Genetics Computer Group、ウィスコンシン州マディソン）のソフトウェアパッケージ・バージョン10.2およびInfomaxのVector NTl Advanceスイート・バージョン8.0を使用した。
【０３３６】
発現ベクター
記載する抗体の発現には、CMV-イントロンAプロモーターを持つcDNA編成またはCMV-イントロンAプロモーターを持たないcDNA編成に基づくか、CMVプロモーターを持つゲノム編成に基づく、一過性発現（例えばHEK293 EBNAまたはHEK293-Fにおける一過性発現）細胞用の発現プラスミドの変異体を応用した。
【０３３７】
これらのベクターは、抗体発現カセットの他に、
・大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、および
・大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子
を含有していた。
【０３３８】
抗体遺伝子の転写単位は、以下の要素で構成された:
・5'端のユニーク制限部位（1つまたは複数）
・ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・次に、cDNA編成の場合はイントロンA配列、
・ヒト抗体遺伝子の5'-非翻訳領域、
・免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・cDNAとしての、または免疫グロブリンエクソン-イントロン編成を持つゲノム編成としての、ヒト抗体鎖（野生型またはドメイン交換されたもの）
・ポリアデニル化シグナル配列を含む3'非翻訳領域、および
・3'端のユニーク制限部位（1つまたは複数）。
【０３３９】
後述の抗体鎖を含む融合遺伝子は、PCRおよび/または遺伝子合成によって作製され、公知の組換え法および組換え技法により、例えば各ベクター中のユニーク制限部位を使った一致する核酸セグメントの接続によってアセンブルされた。サブクローニングされた核酸配列は、DNA配列決定によって検証した。一過性トランスフェクション用に、形質転換大腸菌培養物からのプラスミド調製によって、大量のプラスミドを調製した（Nucleobond AX、Macherey-Nagel）。
【０３４０】
細胞培養技法
Current Protocols in Cell Biology（2000）, Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M.（eds.）, John Wiley & Sons, Inc.に記載されているように、標準的細胞培養技法を使用した。
【０３４１】
多重特異性抗体は、後述するように、付着培養したHEK293-EBNA細胞または懸濁培養したHEK29-F細胞において、各発現プラスミドの一過性共トランスフェクションによって発現させた。
【０３４２】
HEK293-EBNA系における一過性トランスフェクション
10％Ultra Low IgG FCS（ウシ胎児血清、Gibco（登録商標））、2mM L-グルタミン（Gibco（登録商標））、および250μg/mlジェネティシン（Gibco（登録商標））を補足したDMEM（ダルベッコ変法イーグル培地、Gibco（登録商標））中で培養した付着培養HEK293-EBNA細胞（エプスタイン・バーウイルス核抗原を発現するヒト胎児腎臓細胞株293; American type culture collection受託番号ATCC＃CRL-10852、ロット959218）における各発現プラスミド（例えば重鎖および修飾重鎖、ならびに対応する軽鎖および修飾軽鎖をコードするもの）の一過性共トランスフェクションによって、多重特異性抗体を発現させた。トランスフェクションには、FuGENE（商標）6 Transfection Reagent（Roche Molecular Biochemicals）を、FuGENE（商標）試薬（μl）対DNA（μg）の比率を4:1（3:1から6:1までの範囲）にして使用した。タンパク質は、（修飾および野生型）軽鎖および（修飾および野生型）重鎖コードプラスミドの等モル比を用いて、各プラスミドから発現させた。3日目に、4mMのL-グルタミン、グルコース［Sigma］およびNAA［Gibco（登録商標）］を細胞に供給した。トランスフェクション後の5〜11日目に、多重特異性抗体を含有する細胞培養上清を、遠心分離によって収穫し、-20℃で保存した。例えばHEK293細胞などにおけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般情報は、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75（2001）197-203に記載されている。
【０３４３】
HEK293-F系における一過性トランスフェクション
HEK293-F系（Invitrogen）を製造者の説明書に従って使用し、各プラスミド（例えば重鎖および修飾重鎖、ならびに対応する軽鎖および修飾軽鎖をコードするもの）の一過性トランスフェクションによって、多重特異性抗体を作製した。簡単に述べると、振とうフラスコまたは撹拌発酵槽において無血清FreeStyle（商標）293発現培地（Invitrogen）中で懸濁培養したHEK293-F細胞（Invitrogen）に、4つの発現プラスミドと293fectin（商標）またはfectin（Invitrogen）との混合物で、トランスフェクションを行った。2L振とうフラスコ（Corning）の場合、HEK293-F細胞を1.0E*6細胞/mLの密度で600mLに接種し、120rpm、8％CO2でインキュベートした。翌日、細胞に、約1.5E*6細胞/mLの細胞密度で、A）それぞれ重鎖または修飾重鎖および対応する等モル比の軽鎖または修飾軽鎖をコードするプラスミドDNA（1μg/mL）計600μgを含む20mLのOpti-MEM（Invitrogen）とB）20mlのOpti-MEM＋1.2mLの293fectinまたはfectin（2μl/mL）との混合物約42mLを使って、トランスフェクションを行った。発酵中は、グルコース消費量に応じて、グルコース溶液を加えた。分泌された抗体を含有する上清を5〜10日後に収穫し、抗体を上清から直接精製するか、上清を凍結して保存した。
【０３４４】
タンパク質量の決定
精製された抗体および誘導体のタンパク質濃度は、Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423に従い、アミノ酸配列に基づいて算出されるモル吸光係数を使用し、280nmにおける光学密度（OD）を決定することによって決定した。
【０３４５】
上清中の抗体濃度の決定
プロテインAアガロースビーズ（Roche）を用いる免疫沈降によって細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を見積もった。60μlのプロテインAアガロースビーズをTBS-NP40（50mM Tris、pH7.5、150mM NaCl、1％Nonidet-P40）中で3回洗浄した。次に、1〜15mLの細胞培養上清を、前もってTBS-NP40中で平衡化したプロテインAアガロースビーズに適用した。室温で1時間インキュベートした後、ビーズを、Ultrafree-MCフィルターカラム（Amicon）上、0.5mLのTBS-NP40で1回、0.5mLの2×リン酸緩衝食塩水（2×PBS、Roche）で2回、および0.5mLの100mMクエン酸Na pH5.0で手短に4回、洗浄した。35μlのNuPAGE（登録商標）LDS Sample Buffer（Invitrogen）を加えることによって、結合している抗体を溶出させた。試料の半分を、それぞれNuPAGE（登録商標）試料還元剤と混和するか、還元しないでおき、70℃で10分加熱した。その結果、5〜30μlを4-12％NuPAGE（登録商標）Bis-Tris SDS-PAGE（Invitrogen）（非還元SDS-PAGEにはMOPS緩衝液を使用し、還元SDS-PAGEにはNuPAGE（登録商標）酸化防止ランニング緩衝液添加物（Invitrogen）を含むMES緩衝液を使用した）に適用し、クーマシーブルーで染色した。
【０３４６】
アフィニティーHPLCクロマトグラフィーによって細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を定量的に測定した。簡単に述べると、Agilent HPLC 1100システムを使って、プロテインAに結合する抗体および誘導体を含有する細胞培養上清を、200mM KH2PO4、100mMクエン酸ナトリウム、pH7.4中のApplied Biosystems Poros A/20カラムに適用し、このマトリックスから200mM NaCl、100mMクエン酸、pH2.5で溶出させた。溶出したタンパク質をUV吸光度とピーク面積の積分によって定量した。精製標準IgG1抗体を標準とした。
【０３４７】
あるいは、サンドイッチIgG-ELISAによって細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を測定した。簡単に述べると、StreptaWell High Bind Strepatavidin A-96ウェルマイクロタイタープレート（Roche）を、0.1μg/mLのビオチン化抗ヒトIgGキャプチャ分子F（ab'）2＜h-Fcγ＞BI（Dianova）100μL/ウェルにより、室温で1時間、あるいは4℃で終夜、コーティングした後、200μL/ウェルのPBS、0.05％Tween（PBST、Sigma）で、3回洗浄する。各抗体含有細胞培養上清のPBS（Sigma）における希釈系列100μL/ウェルをウェルに加え、マイクロタイタープレート振とう器上、室温で1〜2時間インキュベートした。ウェルを200μL/ウェルのPBSTで3回洗浄し、結合している抗体を、0.1μg/mLのF（ab'）2＜hFcγ＞POD（Dianova）100μlを検出抗体として、マイクロタイタープレート振とう器上、室温で1〜2時間検出した。結合していない検出抗体を200μL/ウェルのPBSTで3回洗い流し、100μL/ウェルのABTSを加えることによって、結合している検出抗体を検出した。吸光度の決定は405nmの測定波長（参照波長492nm）においてTecan Fluor Spectrometerで行った。
【０３４８】
タンパク質精製
濾過した細胞培養上清から、標準的プロトコールを参照して、タンパク質を精製した。簡単に述べると、抗体をプロテインA Sepharoseカラム（GE healthcare）に適用し、PBSで洗浄した。抗体の溶出をpH2.8で達成した後、直ちに試料を中和した。凝集したタンパク質は、PBSにおける、または20mMヒスチジン、150mM NaCl pH6.0におけるサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200、GE Healthcare）によって、単量体型抗体から分離した。単量体型抗体フラクションをプールし、（必要なら）例えばMILLIPORE Amicon Ultra（30MWCO）遠心分離濃縮器を使って濃縮し、凍結し、-20℃または-80℃で保存した。試料の一部を、例えばSDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）または質量分析による、後続のタンパク質分析および分析的キャラクタリゼーション用に用意した。
【０３４９】
SDS-PAGE
NuPAGE（登録商標）Pre-Castゲルシステム（Invitrogen）を製造者の説明書に従って使用した。具体的には、10％または4-12％NuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）Bis-TRIS Pre-Castゲル（pH6.4）、およびNuPAGE（登録商標）MES（NuPAGE（登録商標）酸化防止ランニング緩衝液添加物を含む還元ゲル）またはMOPS（非還元ゲル）ランニング緩衝液を使用した。
【０３５０】
CE-SDS
純度と抗体完全性を、マイクロ流体Labchip技術（PerkinElmer, USA）を用いてCE-SDSで分析した。HT Protein Express試薬キットを製造者の説明書に従って用い、5μlのタンパク質溶液をCE-SDS分析用に調製し、HT Protein Express Chipを用いてLabChip GXIIシステム上で分析した。LabChip GXソフトウェアを用いてデータを分析した。
【０３５１】
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集状態およびオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）は、HPLCクロマトグラフィーによって行った。簡単に述べると、プロテインA精製抗体を、Agilent HPLC 1100システムで、300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4、pH7.5中のTosoh TSKgel G3000SWカラムに適用するか、Dionex HPLCシステムで、2×PBS中のSuperdex 200カラム（GE Healthcare）に適用した。溶出したタンパク質をUV吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。BioRad Gel Filtration Standard 151-1901を標準とした。
【０３５２】
質量分析
この項では、VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された多重特異性抗体（CrossMAbFab）の、その正しいアセンブリに重点をおいたキャラクタリゼーションを説明する。予想一次構造を、脱グリコシル化インタクトCrossMAb、および脱グリコシル化/制限LysC消化CrossMabの特別な場合には、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）によって分析した。
【０３５３】
CrossMAbFabを、1mg/mlのタンパク質濃度で、リン酸緩衝液またはTris緩衝液中、37℃において最大17時間、N-グリコシダーゼFによって脱グリコシル化した。プラスミン消化または制限LysC（Roche）消化は、100μgの脱グリコシル化CrossMAbFabを使って、Tris緩衝液pH8中、それぞれ室温で120時間、および37℃で40分行った。質量分析に先だって、Sephadex G25カラム（GE Healthcare）でのHPLCによって、試料を脱塩した。総質量は、TriVersa NanoMateイオン源（Advion）を装備したmaXis 4G UHR-QTOF MSシステム（Bruker Daltonik）でのESI-MSによって決定した。
【０３５４】
表面プラズモン共鳴（SPR）（BIACORE）を用いる、各抗原への多重特異性抗体の結合および結合アフィニティーの決定
以下の手順に従ってVEGF結合を評価した:
ヒトVEGFA-121への表示の抗体の結合を、表面プラズモン共鳴により、BIACORE（登録商標）T200計器（GE Healthcare）を使って調べた。10000（RU）前後の抗His抗体（1μg/mlの抗His抗体;注文コード:28995056; GE Healthcare Bio-Sciences AB、スウェーデン）を、GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使用することによって、SシリーズCM5チップ（GE Healthcare BR-1005-30）にpH5.0でカップリングした。固定化手順中は、HBS-N（10mM HEPES、150mM NaCl pH7.4、GE Healthcare）をランニング緩衝液として使用した。続く速度論的キャラクタリゼーションでは、試料緩衝液およびランニング緩衝液をpH7.4のPBS-T（0.05％Tween 20を含む10mMリン酸緩衝食塩水）とした。フローセルを25℃に、また試料ブロックを12℃に設定し、速度論的キャラクタリゼーションに先だってランニング緩衝液で2回プライミングした。
【０３５５】
0.5μg/ml溶液を5μl/分の流量で30秒間注入することによってVEFGA-121-Hisをキャプチャした。会合は、1000nMから開始する1:3の段階希釈液で、さまざまな溶液濃度の表示の抗体を、30μl/分の流量で180秒間注入することによって測定した。解離相は600秒まで監視し、試料溶液からランニング緩衝液に切り替えることによって誘発した。流速30μl/分のグリシンpH1.5溶液で60秒間洗浄することによって表面を再生した。抗His抗体表面から得られる応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。ブランク注入も差し引く（二重参照）。KDおよび他の速度論的パラメータの算出にはラングミュア1:1モデルを使用した。
【０３５６】
以下の手順に従ってAng-2結合を評価した:
ヒトAng-2-RBD-Fcへの表示の抗体の結合を、表面プラズモン共鳴により、BIACORE（登録商標）T200計器（GE Healthcare）を使って調べた。8000（RU）前後のヤギ抗ヒトF（ab'）2（10μg/ml抗ヒトF（ab）'2;注文コード:28958325; GE Healthcare Bio-Sciences AB、スウェーデン）を、GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使用することによって、SシリーズCM5チップ（GE Healthcare BR-1005-30）にpH5.0でカップリングした。固定化手順中は、HBS-N（10mM HEPES、150mM NaCl pH7.4、GE Healthcare）をランニング緩衝液として使用した。続く速度論的キャラクタリゼーションでは、試料緩衝液およびランニング緩衝液をpH7.4のPBS-T（0.05％Tween 20を含む10mMリン酸緩衝食塩水）とした。フローセルを25℃に、また試料ブロックを12℃に設定し、速度論的キャラクタリゼーションに先だってランニング緩衝液で2回プライミングした。
【０３５７】
5nM溶液を5μl/分の流量で25秒間注入することによって二重特異性抗体をキャプチャした。会合は、100nMから開始する1:3の段階希釈液で、さまざまな溶液濃度のヒトAng2-RBD-Fcを、30μl/分の流量で120秒間注入することによって測定した。解離相は180秒まで監視し、試料溶液からランニング緩衝液に切り替えることによって誘発した。流速30μl/分のグリシンpH2.1溶液で60秒間洗浄することによって表面を再生した。ヤギ抗ヒトF（ab'）2表面から得られる応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。ブランク注入も差し引く（二重参照）。見掛けのKDの算出にはラングミュア1:1モデルを使用した。
【０３５８】
IL-17結合は以下の手順に従って評価した:
GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使って、6000レゾナンスユニット（RU）前後の捕捉系（15μg/mlヤギ抗ヒトF（ab'）2、注文コード:28958325、GE Healthcare Bio-Sciences AB、スウェーデン）を、pH5.0でCM5チップ上にカップリングした。試料緩衝液およびシステム緩衝液はPBS-T（0.05％Tween 20を含む10mMリン酸緩衝食塩水）pH7.4とした。50nM溶液を10μl/分の流量で90秒間注入することによって二重特異性抗体を捕捉した。会合は、さまざまな溶液濃度のヒトIL17を、50nMから始まる1:1段階希釈液として、30μl/分の流量で3分間注入することによって測定した。解離相は最大10分間監視し、試料溶液からランニング緩衝液に切り替えることによって惹起した。流速30μl/分の10mMグリシンpH2.1溶液による60秒間の洗浄で、表面を2回再生した。ヤギ抗ヒトF（ab'）2表面から得られる応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。ブランク注入も差し引く（＝二重参照）。見掛けのKDおよび他の速度論的パラメータの算出には、ラングミュア1:1モデルを使用した。
【０３５９】
TWEAK結合は以下の手順に従って評価した:
センサー表面へのTWEAK分析物の強い非特異的結合ゆえに、TWEAKをリガンドとして使用する逆構成を選んだ。GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使って、100RU前後のTWEAKを、pH5.0でC1チップ表面に固定化した。試料緩衝液およびシステム緩衝液はPBS-T（0.05％Tween 20を含む10mMリン酸緩衝食塩水）pH7.4とした。会合は、さまざまな溶液濃度の二重特異性抗体を、50nMから始まる1:1段階希釈液として、30μl/分の流量で3分間注入することによって測定した。解離相は最大10分間監視し、試料溶液からランニング緩衝液に切り替えることによって惹起した。流速30μl/分の3M MgCl2溶液による30秒間の洗浄で、表面を3回再生した。ブランクカップリング表面から得られる応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。ブランク注入も差し引く（＝二重参照）。KDおよび他の速度論的パラメータの算出には、ラングミュア1:1モデルを使用した。
【０３６０】
実施例1A
一方の結合アームにVL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施され、CH1/CL境界面に2つの荷電アミノ酸置換を持つ、アンジオポエチン-2（ANG2）および血管内皮成長因子（VEGF）に結合する二価二重特異性抗体（CrossMAbFab）の作製および発現
最初の実施例では、ヒトアンジオポエチン-2（ANG2）およびヒト血管内皮成長因子（VEGF）に結合する二重特異性抗体を、一般的方法の項に述べたように古典的な分子生物学技法によって生成し、上述のようにHEK293細胞中で一過性に発現させた。
【０３６１】
これらの各二重特異性抗体の概略図を図1に示す。比較分析のために、CH1/CL境界面に荷電アミノ酸置換を持たない野生型（wt）VL-VH/CL-CH1ドメイン交換抗体を調製した。二重特異性抗体は、表1に示すアミノ酸配列をコードする核酸を含有する発現プラスミドを使って発現させた。
【０３６２】
（表１）VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された抗Ang2-VEGF二重特異性抗体Ang2VEGF-0289、Ang2VEGF-280、Ang2VEGF-111、Ang2VEGF_290およびAng2VEGF_279（CrossMAbFab）の軽鎖（LC）および重鎖（HC）のアミノ酸配列:野生型（wt）および荷電アミノ酸による置換のさまざまな組み合わせ
0006744292.tif 000003
†...Ang2VEGF_290およびAng2VEGF_279はラムダ軽鎖を持つAng2特異的抗体を含むが、表内の他の抗Ang2-VEGF二重特異性抗体はすべてカッパ軽鎖を含む。
【０３６３】
すべてのコンストラクトに、第1CH3ドメイン中の典型的ノブ（T366W）置換と第2CH3ドメイン中の対応するホール置換（T366S、L368AおよびY407V）とによるノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体化技術（ならびに2つの追加導入システイン残基S354C/Y349'C）（上記の各対応重鎖（HC）配列に含まれている）を使用した。
【０３６４】
実施例1B
一方の結合アームにVL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施され、CH1/CL境界面に2つの荷電アミノ酸置換を持つ、ANG2およびVEGFに結合する二価二重特異性抗体（CrossMAbFab）の精製およびキャラクタリゼーション
上記実施例1Aで発現させた二重特異性抗体を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとの併用によって、上清から精製した。二重特異性抗体はすべて良好な収量で生産することができ、安定である。得られた産物を、質量分析によって実体について特徴づけ、CE-SDSによる純度、単量体含量および安定性などの分析特性についても特徴づけた。
【０３６５】
予想一次構造は、一般的方法の項で述べたように、脱グリコシル化インタクトCrossMAbおよび脱グリコシル化/プラスミン消化あるいは脱グリコシル化/制限LysC消化CrossMAbのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）によって分析した。
【０３６６】
結果を表2aおよび図4に示す。
【０３６７】
（表２ａ）CH1/CL境界面中の荷電アミノ酸置換による副生成物としての非機能的重鎖二量体（HC）2形成の低減
0006744292.tif 000004
†...Ang2VEGF_290およびAng2VEGF_279はラムダ軽鎖を持つAng2特異的抗体を含むが、表内の他の抗Ang2-VEGF二重特異性抗体はすべてカッパ軽鎖を含む。‡...プロテインAクロマトグラフィー後。
【０３６８】
記載した実験の反復を表2bに要約する。
【０３６９】
（表２ｂ）CH1/CL境界面中の荷電アミノ酸置換による副生成物としての非機能的重鎖二量体（HC）2形成の低減（反復）
0006744292.tif 000005
†...Ang2VEGF_290およびAng2VEGF_279はラムダ軽鎖を持つAng2特異的抗体を含むが、表内の他の抗Ang2-VEGF二重特異性抗体はすべてカッパ軽鎖を含む; *プロテインA精製後; #プロテインAおよびSEC精製後。
【０３７０】
表2aおよび2bならびに図4の結果は、本発明について上でさらに詳細に説明したとおり、「非交差」側のCH1ドメイン（K213E、K147E）およびCLドメイン（E123K、Q124K）において反対電荷を持つ2つの荷電アミノ酸による置換を行うことにより、主要副生成物（非機能的重鎖二量体）の形成が、そのような置換を持たない野生型二重特異性抗体と比較して、強く低減することを示している。実験は、電荷置換が、カッパ軽鎖（試験した抗体Ang2VEGF-0289［wt］、Ang2VEGF-280、Ang2VEGF-111）ならびにラムダ軽鎖（試験した抗体Ang2VEGF_290［wt］およびAng2VEGF_279）で行われた場合に、副生成物形成を低減することを実証している。
【０３７１】
「交差」側のCLドメインに追加の荷電アミノ酸を導入することにより、副生成物の形成をさらに低減させることができる（試験した抗体Ang2VEGF-0289［wt］、Ang2VEGF-280［「交差」側に追加電荷なし］、Ang2VEGF-111［「交差」側に追加電荷あり］）。
【０３７２】
抗原結合:
多重特異性抗体の、それぞれのターゲット抗原、すなわちANG2およびVEGFへの結合を、一般的方法の項で述べたようにBiacore（登録商標）によって評価した。
【０３７３】
比較例として、VH/VLドメイン交換/入れ替えを含むが荷電アミノ酸置換を欠く、Ang2およびVEGFに特異的に結合する参照抗体（Ang2VEGF-0290抗体）を並行して評価した。
【０３７４】
アフィニティー測定は、表2bに要約した反復実験からの精製材料を使って行った。結果を表2cおよび2dに示す。
【０３７５】
（表２ｃ）表示した抗体のVEGFに対するアフィニティー
0006744292.tif 000006
【０３７６】
（表２ｄ）表示した抗体のAng2に対するアフィニティー
0006744292.tif 000007
【０３７７】
試験した抗体は、両方のターゲット、すなわちAng2およびVEGFに特異的に結合し、ナノモル濃度域の抗原アフィニティーを呈する。
【０３７８】
安定性:
抗体コンストラクトの安定性を評価するために、凝集開始温度を評価した。熱安定性測定は、表2bに要約した反復実験からの精製材料を使って行った。
【０３７９】
結果を表2eに示す。
【０３８０】
（表２ｅ）表示した抗体の凝集開始温度（Tagg）
0006744292.tif 000008
【０３８１】
実施例1C
一方の結合アームにVL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施され、CH1/CL境界面に2つの荷電アミノ酸置換を持つ、TNF様の弱いアポトーシス誘導因子（TNF-related weak inducer of apoptosis: TWEAK）およびインターロイキン-17（IL17）に結合する二価二重特異性抗体（CrossMAbFab）の作製および発現
第2の実施例では、ヒトのTNF様の弱いアポトーシス誘導因子（TWEAK）およびヒトインターロイキン-17（IL17）に結合する二重特異性抗体を、一般的方法の項に述べたように古典的な分子生物学技法によって生成し、上述のようにHEK293細胞中で一過性に発現させた。
【０３８２】
これらの各二重特異性抗体の概略図を図1aに示す。比較分析のために、CH1/CL境界面に荷電アミノ酸置換を持たない野生型（wt）VL-VH/CL-CH1ドメイン交換抗体を調製した。二重特異性抗体は、表3に示すアミノ酸配列をコードする核酸を含有する発現プラスミドを使って発現させた。
【０３８３】
（表３）VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された抗Tweak-IL17二重特異性抗体TweakIL17_101、TweakIL17_102、TweakIL17_103（CrossMAbFab）の軽鎖（LC）および重鎖（HC）のアミノ酸配列:野生型（wt）および荷電アミノ酸による置換のさまざまな組み合わせ
0006744292.tif 000009
*反復実験から得られるデータのみ
【０３８４】
すべてのコンストラクトに、第1CH3ドメイン中の典型的ノブ（T366W）置換と第2CH3ドメイン中の対応するホール置換（T366S、L368AおよびY407V）とによるノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体化技術（ならびに2つの追加導入システイン残基S354C/Y349'C）（上記の各対応重鎖（HC）配列に含まれている）を使用した。
【０３８５】
実施例1D
一方の結合アームにVL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施され、CH1/CL境界面に2つの荷電アミノ酸置換を持つ、TWEAKおよびIL17に結合する二価二重特異性抗体（CrossMAbFab）の精製およびキャラクタリゼーション
上記実施例1Cで発現させた二重特異性抗体を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとの併用によって、上清から精製した。二重特異性抗体はすべて良好な収量で生産することができ、安定である。得られた産物を、質量分析によって実体について特徴づけ、CE-SDSによる純度、単量体含量および安定性などの分析特性についても特徴づけた。
【０３８６】
予想一次構造は、一般的方法の項で述べたように、脱グリコシル化インタクトCrossMAbの、そしてさまざまな場合に脱グリコシル化/制限LysC消化CrossMAbの、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）によって分析した。
【０３８７】
結果を表4aおよび図5に示す。
【０３８８】
（表４ａ）プロテインAクロマトグラフィー後のCH1/CL境界面中の荷電アミノ酸置換による副生成物形成の低減
0006744292.tif 000010
【０３８９】
実験例の反復からのデータを表4bに要約する。
【０３９０】
（表４ｂ）プロテインAクロマトグラフィー後のCH1/CL境界面中の荷電アミノ酸置換による副生成物形成の低減
0006744292.tif 000011
*CE-SDSによる所望の分子の純度（主ピーク含有量）
【０３９１】
（表４ｃ）プロテインAおよび分取用サイズ排除クロマトグラフィー後のCH1/CL境界面中の荷電アミノ酸置換による副生成物形成の低減
0006744292.tif 000012
*CE-SDSによる純度（主ピーク含有量）
【０３９２】
表4a、4bおよび4cならび図5の結果は、本発明について上でさらに詳細に説明したとおり、「非交差」側のCH1ドメイン（K213E、K147E）およびCLドメイン（E123K、Q124K）において反対電荷を持つ2つの荷電アミノ酸による置換を行うことにより、主要副生成物（非機能的重鎖二量体）の形成が、そのような置換を持たない野生型二重特異性抗体と比較して、強く低減することを示している。「交差」側のCLドメイン（カッパ鎖）に追加の荷電アミノ酸を導入することにより、主要副生成物（非機能的重鎖二量体）の形成をさらに低減させることができる。残存する副生成物、すなわち非機能的重鎖二量体は、サイズ排除クロマトグラフィーによって、所望の分子から容易に分離することができる。
【０３９３】
抗原結合:
多重特異性抗体の、それぞれのターゲット抗原、すなわちTWEAKおよびIL-17への結合を、一般的方法の項で述べたようにBIAcore（登録商標）T200計器（GE Healthcare）を使った表面プラズモン共鳴（SPR）によって、25℃で評価した。
【０３９４】
比較例として、VH/VLドメイン交換/入れ替えを含むが荷電アミノ酸置換を欠く、TWEAKおよびIL-17に特異的に結合する参照抗体（TweakIL17_101抗体）を並行して評価した。
【０３９５】
アフィニティー測定は、表4dおよび4eに要約する反復実験からの精製材料を使って行った。
【０３９６】
（表４ｄ）表示した抗体のIL-17に対するアフィニティー
0006744292.tif 000013
【０３９７】
（表４ｅ）表示した抗体のTweakに対するアフィニティー
0006744292.tif 000014
【０３９８】
試験した抗体は、アミノ酸置換を欠く対応する抗体と同様に、両方のターゲット、すなわちTWEAKおよびIL-17に特異的に結合する。
【０３９９】
実施例1E
一方の結合アームにVL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施され、CH1/CL境界面に荷電アミノ酸置換を持つ、Her1およびHer3（二重作用性Fab［DAF］フォーマットで組み合わされたもの）ならびにMetがん原遺伝子（cMet）に結合する三重特異性抗体（CrossDAFFab）の作製および発現
第3の実施例では、ErbBファミリーのメンバーであるHer1およびHer3ならびにMetがん原遺伝子（cMet）に結合する三重特異性抗体を、一般的方法の項に述べたように古典的な分子生物学技法によって生成し、上述のようにHEK293細胞中で一過性に発現させた。このコンストラクトにおいて、Her1およびHer3に対する特異性は、WO2013/174873に開示されているいわゆる二重作用性Fab（DAF）フォーマットで組み合わされている。
【０４００】
これらの各多重特異性抗体の概略図を図1に示す。比較分析のために、CH1/CL境界面に荷電アミノ酸置換を持たない野生型（wt）VL-VH/CL-CH1ドメイン交換三重特異性抗体を調製した。多重特異性抗体は、表5に示すアミノ酸配列をコードする核酸を含有する発現プラスミドを使って発現させた。
【０４０１】
（表５）VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施された抗［Her1Her3］-cMet三重特異性抗体MetHER1（3）DAF_0002、MetHER1（3）DAF_0001、MetHER1（3）DAF_0003（CrossDAFFab）の軽鎖（LC）および重鎖（HC）のアミノ酸配列:野生型（wt）および荷電アミノ酸による置換のさまざまな組み合わせ
0006744292.tif 000015
【０４０２】
すべてのコンストラクトに、第1CH3ドメイン中の典型的ノブ（T366W）置換と第2CH3ドメイン中の対応するホール置換（T366S、L368AおよびY407V）とによるノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体化技術（ならびに2つの追加導入システイン残基S354C/Y349C）（上記の各対応重鎖（HC）配列に含まれている）を使用した。
【０４０３】
実施例1F
一方の結合アームにVL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施され、CH1/CL境界面に荷電アミノ酸置換を持つ、Her1Her3およびcMetに結合する三重特異性抗体（CrossDAFFab）の精製およびキャラクタリゼーション
上記実施例1Eで発現させた多重特異性抗体を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとの併用によって、上清から精製した。多重特異性抗体はすべて良好な収量で生産することができ、安定である。得られた産物を、質量分析によって実体について特徴づけ、SDS-PAGEによる純度、単量体含量および安定性などの分析特性についても特徴づけた。
【０４０４】
予想一次構造は、一般的方法の項で述べたように、脱グリコシル化インタクトCrossDAFおよび特別な場合には脱グリコシル化/制限LysC消化CrossDAFのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）によって分析した。
【０４０５】
結果を表6および図6に示す。
【０４０６】
（表６）CH1/CL境界面中の荷電アミノ酸置換による副生成物としての非機能的重鎖二量体（HC）2形成の低減
0006744292.tif 000016
【０４０７】
表6および図6の結果は、本発明について上でさらに詳細に説明したとおり、「非交差」側のCH1ドメイン（K213EまたはK213D、K147E）およびCLドメイン（E123KまたはE123R、Q124K）において反対電荷を持つ2つの荷電アミノ酸による置換を行い、「交差」側のCLドメインに追加の荷電アミノ酸を導入することにより、主要副生成物（非機能的重鎖二量体）の形成が、そのような置換を持たない野生型三重特異性抗体と比較して、強く低減することを示している。
【０４０８】
実施例2A
一方の結合アームにVL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施され、CH1/CL境界面に荷電アミノ酸置換を持ち、VH/VL境界面に荷電アミノ酸が導入されている、アンジオポエチン-2（ANG2）および血管内皮成長因子（VEGF）に結合する二価二重特異性抗体（CrossMAbFab）の作製および発現
ヒトアンジオポエチン-2（ANG2）およびヒト血管内皮成長因子（VEGF）に結合する二重特異性抗体を実施例1Aで述べたように生成した。二重特異性抗体は、表7に示すアミノ酸配列をコードする核酸を含有する発現プラスミドを使って発現させた。
【０４０９】
（表７）両VH/VL境界面に導入された追加の荷電アミノ酸を含む抗Ang2-VEGF二重特異性抗体Ang2VEGF-044の軽鎖（LC）および重鎖（HC）のアミノ酸配列
0006744292.tif 000017
【０４１０】
このコンストラクトでは、第1CH3ドメイン中の典型的ノブ（T366W）置換と第2CH3ドメイン中の対応するホール置換（T366S、L368AおよびY407V）とによるノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体化技術（ならびに2つの追加導入システイン残基S354C/Y349'C）（上記の各対応重鎖（HC）配列に含まれている）を使用した。
【０４１１】
実施例2B
一方の結合アームにVL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施され、CH1/CL境界面に2つの荷電アミノ酸置換を持ち、VH/VL境界面に荷電アミノ酸が導入されている、ANG2およびVEGFに結合する二価二重特異性抗体（CrossMAbFab）の精製およびキャラクタリゼーション
上記実施例1A（Ang2VEGF-0289［wt］、Ang2VEGF-280、Ang2VEGF-111）および実施例2A（Ang2VEGF_044）で発現させた二重特異性抗体を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとの併用によって、上清から精製した。二重特異性抗体はすべて良好な収量で生産することができ、安定である。得られた産物を、質量分析によって実体について特徴づけ、SDS-PAGEによる純度、単量体含量および安定性などの分析特性についても特徴づけた。
【０４１２】
予想一次構造は、一般的方法の項で述べたように、脱グリコシル化インタクトCrossMAbおよび特別の場合には脱グリコシル化/制限LysC消化CrossMAbのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）によって分析した。
【０４１３】
結果を表8および図7に示す。
【０４１４】
（表８）CH1/CL境界面中の荷電アミノ酸置換とVH/VL境界面における追加の荷電アミノ酸導入とによる副生成物としての非機能的重鎖二量体（HC）2形成の低減
0006744292.tif 000018
*...n.d.＝未決定
【０４１５】
表8および図7の結果は、「交差」側および「非交差」側のVHドメインに荷電アミノ酸を導入し、VLドメインに反対の電荷を持つアミノ酸を導入することによって、副生成物の形成を、さらに一層低減しうることを示している（試験した抗体Ang2VEGF-0289［wt］、Ang2VEGF-111［VH-VLドメイン中に追加の電荷なし］、Ang2VEGF-044［VH-VLドメイン中に追加の電荷あり］）。
【０４１６】
実施例3A
一方の結合アームにVL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施され、CH1/CL境界面に荷電アミノ酸置換を持ち、VH/VL境界面に荷電アミノ酸が導入されている、TWEAKおよびIL-17に結合する二価二重特異性抗体（CrossMAbFab）の作製および発現
ヒトTWEAKおよびヒトIL-17に結合する二重特異性抗体を実施例1Cで述べたように生成した。二重特異性抗体は、表9に示すアミノ酸配列をコードする核酸を含有する発現プラスミドを使って発現させた。
【０４１７】
（表９）両VH/VL境界面に導入された荷電アミノ酸を含む抗TWEAK-IL17二重特異性抗体TweakIL17_0128の軽鎖（LC）および重鎖（HC）のアミノ酸配列
0006744292.tif 000019
【０４１８】
このコンストラクトでは、第1CH3ドメイン中の典型的ノブ（T366W）置換と第2CH3ドメイン中の対応するホール置換（T366S、L368AおよびY407V）とによるノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体化技術（ならびに2つの追加導入システイン残基S354C/Y349C）（上記の各対応重鎖（HC）配列に含まれている）を使用した。
【０４１９】
実施例3B
一方の結合アームにVL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施され、CH1/CL境界面に2つの荷電アミノ酸置換を持ち、VH/VL境界面に荷電アミノ酸が導入されている、TWEAKおよびIL-17に結合する二価二重特異性抗体（CrossMAbFab）の精製およびキャラクタリゼーション
上記実施例1Cおよび実施例3Aで発現させた二重特異性抗体を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとの併用によって、上清から精製した。二重特異性抗体はすべて良好な収量で生産することができ、安定である。結果を表10に示す。
【０４２０】
（表１０）プロテインA精製後の所望の抗体の収量および分率
0006744292.tif 000020
*プロテインA精製後の分析用SECによって分析した所望の二重特異性抗体の分率
【０４２１】
抗体コンストラクトの安定性を評価するために、凝集開始温度を評価した。
【０４２２】
結果を表11に示す。
【０４２３】
（表１１）表示した抗体の凝集開始温度（Tagg）
0006744292.tif 000021
【０４２４】
抗体TweakIL17_0128の抗原結合を実施例1Dで述べたように評価した。
KD（TWEAK）＝＜0.1nM
KD（IL-17）＝0.1nM
【０４２５】
実施例4A
野生型CH3ドメインを含み、一方の結合アームにVL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施され、CH1/CL境界面に荷電アミノ酸置換を持つ、アンジオポエチン-2（ANG2）および血管内皮成長因子（VEGF）に結合する二価二重特異性抗体（CrossMAbFab）の作製および発現
重鎖ヘテロ二量体化戦略が表示した抗体の副生成物プロファイルに及ぼす影響を評価するために、CH3修飾を欠く抗体を生成した。
【０４２６】
ヒトアンジオポエチン-2（ANG2）およびヒト血管内皮成長因子（VEGF）に結合する二重特異性抗体を実施例1Aで述べたように生成した。二重特異性抗体は、表12に示すアミノ酸配列をコードする核酸を含有する発現プラスミドを使って発現させた。
【０４２７】
（表１２）表示した抗Ang2-VEGF二重特異性抗体の軽鎖（LC）および重鎖（HC）のアミノ酸配列
0006744292.tif 000022
【０４２８】
これらのコンストラクトでは野生型CH3ドメインを使用した。
【０４２９】
実施例4B
野生型CH3ドメインを含み、一方の結合アームにVL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施され、CH1/CL境界面に荷電アミノ酸置換を持つ、アンジオポエチン-2（ANG2）および血管内皮成長因子（VEGF）に結合する二価二重特異性抗体（CrossMAbFab）の精製およびキャラクタリゼーション
上記実施例4Aで発現させた二重特異性抗体を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとの併用によって、上清から精製した。抗体は良好な収量で生産することができ、安定である。重鎖二量体副生成物をCE-SDSによって分析したところ、CH3/CH3境界面内にノブ・イントゥ・ホール修飾を持つコンストラクトでも、それらを持たないコンストラクトでも、匹敵する比率の重鎖二量体が形成されることが示された。これは、CH1/CL境界面における荷電アミノ酸の導入が軽鎖ミスペアリング（すなわち間違った軽鎖の間違った重鎖とのミスペアリング）ゆえに形成される副生成物に及ぼす効果が、重鎖の正しいアセンブリを支援する変異（ここでは、重鎖-重鎖ミスペアリング、すなわち2つの同一重鎖の望ましくないペアリングを抑制するために、CH3/CH3境界面内のノブ・イントゥ・ホール修飾を使用した）の存在には依存せずに生じることを示している。
【０４３０】
（表１３ａ）プロテインAおよびSEC精製後の表示した抗体の収量、HC二量体および単量体含量
0006744292.tif 000023
†...コンストラクトはCH3/CH3境界面にノブ・イントゥ・ホール修飾を含む。
【０４３１】
予想どおり、CH3修飾を欠くコンストラクトは重鎖-重鎖ミスペアリングを原因とする単一特異性抗Ang2抗体および重鎖ホモ二量体などの副生成物を生じた。酵素的脱グリコシル化後に、変性および非還元条件下で、MSによってコンストラクトの副生成物プロファイルを定量した。Ang2またはVEGF特異的単一特異性抗体、重鎖ホモおよびヘテロ二量体、ならびに所望の二重特異性完全サイズ抗体の相対的含量を測定した。試料はプロテインAおよびSEC精製後に分析した。
【０４３２】
（表１３ｂ）表示した本発明の二重特異性抗体の副生成物プロファイルに対する重鎖ヘテロ二量体化戦略の影響
0006744292.tif 000024
【０４３３】
抗原結合は、上述の材料および方法の項で述べたように、BIACORE（登録商標）によって評価した。
【０４３４】
（表１４ａ）表示した抗体のVEGFに対するアフィニティー
0006744292.tif 000025
【０４３５】
（表１４ｂ）表示した抗体のANG2に対するアフィニティー
0006744292.tif 000026
【０４３６】
抗体コンストラクトの熱安定性を評価するために、凝集開始温度を評価した。
【０４３７】
結果を表14cに示す。
【０４３８】
（表１４ｃ）表示した抗体の凝集開始温度（Tagg）
0006744292.tif 000027
【０４３９】
実施例5A
VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施され、同じ結合アーム中のCH1/CL境界面に荷電アミノ酸置換を持つ、アンジオポエチン-2（ANG2）および血管内皮成長因子（VEGF）に結合する二価二重特異性抗体（CrossMAbFab）の作製および発現
ヒトアンジオポエチン-2（ANG2）およびヒト血管内皮成長因子（VEGF）に結合する二重特異性抗体を実施例1Aで述べたように生成した。二重特異性抗体は、表15に示すアミノ酸配列をコードする核酸を含有する発現プラスミドを使って発現させた。
【０４４０】
（表１５）表示した抗Ang2-VEGF二重特異性抗体の軽鎖（LC）および重鎖（HC）のアミノ酸配列
0006744292.tif 000028
【０４４１】
すべてのコンストラクトに、第1CH3ドメイン中の典型的ノブ（T366W）置換と第2CH3ドメイン中の対応するホール置換（T366S、L368AおよびY407V）とによるノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体化技術（ならびに2つの追加導入システイン残基S354C/Y349'C）（上記の各対応重鎖（HC）配列に含まれている）を使用した。
【０４４２】
実施例5B
VL-VH/CL-CH1ドメイン交換が施され、同じ結合アーム中のCH1/CL境界面に荷電アミノ酸置換を持つ、アンジオポエチン-2（ANG2）および血管内皮成長因子（VEGF）に結合する二価二重特異性抗体（CrossMAbFab）の精製およびキャラクタリゼーション
上記実施例5Aで発現させた二重特異性抗体をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとの併用によって、上清から精製した。抗体は良好な収量で生産することができ、安定である。
【０４４３】
（表１６ａ）プロテインAおよびSEC精製後の表示した抗体の収量および単量体含量
0006744292.tif 000029
【０４４４】
（表１６ｂ）プロテインAおよびSEC精製後の表示した抗体の副生成物
0006744292.tif 000030
#...HCヘテロ二量体に加えて、約x％のVEGF-HCホモ二量体が観察された。
【０４４５】
抗原結合は、上述のようにBIACORE（登録商標）によって評価した。
【０４４６】
（表１７ａ）表示した抗体のVEGFに対するアフィニティー
0006744292.tif 000031
【０４４７】
（表１７ｂ）表示した抗体のANG2に対するアフィニティー
0006744292.tif 000032
【０４４８】
抗体コンストラクトの熱安定性を評価するために、凝集開始温度を評価した。
【０４４９】
結果を表17cに示す。
【０４５０】
（表１７ｃ）表示した抗体の凝集開始温度（Tagg）
0006744292.tif 000033
【図１Ａ】
0006744292.tif 000034
【図１Ｂ】
0006744292.tif 000035
【図１Ｃ】
0006744292.tif 000036
【図１Ｄ】
0006744292.tif 000037
【図１Ｅ】
0006744292.tif 000038
【図１Ｆ】
0006744292.tif 000039
【図１Ｇ】
0006744292.tif 000040
【図１Ｈ】
0006744292.tif 000041
【図１Ｉ】
0006744292.tif 000042
【図１Ｊ】
0006744292.tif 000043
【図１Ｋ】
0006744292.tif 000044
【図１Ｌ】
0006744292.tif 000045
【図１Ｍ】
0006744292.tif 000046
【図１Ｎ】
0006744292.tif 000047
【図１Ｏ】
0006744292.tif 000048
【図１Ｐ】
0006744292.tif 000049
【図２】
0006744292.tif 000050
【図３】
0006744292.tif 000051
【図４Ａ】
0006744292.tif 000052
【図４Ｂ】
0006744292.tif 000053
【図５Ａ】
0006744292.tif 000054
【図５Ｂ】
0006744292.tif 000055
【図６Ａ】
0006744292.tif 000056
【図６Ｂ】
0006744292.tif 000057
【図７Ａ】
0006744292.tif 000058
【図７Ｂ】
0006744292.tif 000059
【配列表】
0006744292000001.app