(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＸＮＬ１遺伝子のショートアイソフォーム、桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）をコードする第一の核酸及びＮＸＮＬ１遺伝子のロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦＬ）をコードする第二の核酸を含む、錐体の生存を促進することによる網膜変性疾患の処置のための医薬組成物。
【請求項２】
第一の核酸及び第二の核酸が、単一の発現ベクター中に含有される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＮＸＮＬ１遺伝子のショートアイソフォーム、桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）をコードする第一の核酸及びＮＸＮＬ１遺伝子のロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦＬ）をコードする第二の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項４】
発現ベクターが、ウイルスである、請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項５】
ウイルスが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
ＡＡＶが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９及びＡＡＶ７ｍ８からなる群において選択される、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
ＲｄＣＶＦのショートアイソフォームが、ヒトＲｄＣＶＦのショートアイソフォームであり、そして、ロングアイソフォームが、ヒトＲｄＣＶＦＬのロングアイソフォームである、請求項２〜６のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、錐体の生存を促進することによる網膜変性疾患の処置ための医薬組成物。
【請求項９】
網膜変性疾患が、網膜色素変性である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
静脈内注射による又は硝子体内注射による投与のためのもである、請求項８又は９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
第一の核酸及び第二の核酸が、別々の発現ベクターに含有される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
光受容器の変性障害を処置するための方法における使用のためのキットオブパーツであって、以下を含むキットオブパーツ：
−ＮＸＮＬ１遺伝子のショートアイソフォーム、桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）をコードする第一の核酸を含む第一の発現ベクター、及び
−ＮＸＮＬ１遺伝子のロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦＬ）をコードする第二の核酸を含む第二の発現ベクターを含むキットオブパーツ。
【請求項１３】
発現ベクターが、同時又は逐次的に投与される、請求項１２に記載のキットオブパーツ。
【請求項１４】
ＮＸＮＬ１遺伝子のロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦＬ）をコードする核酸を含む医薬組成物との組み合わせの使用のための、ＮＸＮＬ１遺伝子のショートアイソフォーム、桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）をコードする核酸を含む、錐体の生存を促進することによる網膜変性疾患の処置のための医薬組成物。
【請求項１５】
ＮＸＮＬ１遺伝子のショートアイソフォーム、桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）をコードする核酸を含む医薬組成物との組み合わせの使用のための、ＮＸＮＬ１遺伝子のロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦＬ）をコードする核酸を含む、錐体の生存を促進することによる網膜変性疾患の処置のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、神経変性障害に、より特定すると、神経変性障害を治療及び／又は予防するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
神経変性障害は、ニューロン変性を特徴とする広範な重度の衰弱性の病態を包含する。
【０００３】
網膜色素変性（ＲＰ）などの桿体錐体ジストロフィーは、桿体光受容器の進行性の死とそれに続く錐体の連続的な喪失を特徴とする、遺伝的に不均一な網膜変性疾患である。ＲＰは、遺伝性網膜変性の最も一般的な形態の１つであり、世界でおよそ１：３，５００人が罹患している（１）。ＲＰを引き起こす５４を超える突然変異がこれまでに同定されており、これらの突然変異の大部分は桿体特異的転写産物中にある。ＲＰ患者は、初期に、桿体機能不全の結果として低照度環境下での視力喪失と、それに伴う黄斑部錐体の媒介による視力の相対的な保存を呈する。しかしながら、疾患が進行するにつれ、桿体の一次喪失に続いて、錐体変性、そして、対応する錐体媒介性の視力の欠如が起こる。環境の大半が人工照明でありかつ多くの活動が高明瞭度の色覚に頼っている現代社会では、ＲＰ患者における錐体媒介性の視野の保持は、生活の質の大幅な向上を導くだろう。
【０００４】
桿体特異的突然変異によって引き起こされるＲＰサブセットにおける錐体の喪失はほとんど解明されていないが、必ずしも相互に排他的でない幾つかの機序が提唱されている。幾つかの仮定された機序は、錐体死が、周囲の桿体の、又は桿体との接触の喪失の結果として、網膜色素上皮（ＲＰＥ）若しくはミュラーグリア（Mueller glia）の変性からのエンドトキシンの放出の結果である、「隣接効果」を暗示する。あるいは、ミュラー細胞の活性化及び毒性分子の放出が役割を果たし得る。別の仮説は、桿体の代謝負荷が喪失するにつれ、脈絡膜の血液循環からＲＰＥによって光受容器層に送達される酸素又はレチノイドの量が過剰にかつ毒性となるという仮説である（２）。Punzo等は、網膜変性のネズミモデルにおいて、ラパマイシン経路のインスリン／哺乳動物標的によって駆動される、飢餓及び栄養の不均衡の結果として錐体が部分的に死滅するという証拠を示した（３）。加えて、桿体によって分泌される及び錐体生存に必要である生存因子の喪失が錐体喪失に寄与し得ると示唆されている（４，５）。
【０００５】
最後の仮説に一致して、ｒｄ１マウスにおいて、移植された健康な網膜組織が、グラフトされた組織から離れた領域で錐体生存を支援すると示されている（６，７）。
【０００６】
国際特許出願WO2008/148860A1号は、ニューロン生存を増加させることができ、かつ、ＲＰなどの神経変性障害を治療及び／又は予防するのに有用である、桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）及びＲｄＣＶＦ２と呼ばれる栄養因子のファミリーを記載している。
【０００７】
桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）は、当初、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするハイスループット法から、この救助効果の原因である候補分子として同定された（４）。桿体は、ＲｄＣＶＦを分泌し、それ故、桿体が死滅するにつれて、このパラクリン因子源が喪失し、そして、ＲｄＣＶＦレベルが減少する。ＲｄＣＶＦ、及びそれに似た分泌因子の発現の喪失は、それ故、桿体錐体ジストロフィーで観察される錐体変性の第二波に寄与し得る。ＲｄＣＶＦは、培養物（８）と劣性型及び優性型の網膜色素変性のマウス及びラットモデルに網膜下注射したとき（４，９）の両方において、錐体生存を媒介すると示されている。ＮＸＮＬ１（ＲｄＣＶＦをコードする遺伝子）の破壊は、マウス光受容器を、時間とともに光受容器機能不全及び錐体喪失にますます感受性にさせる（１０）。
【０００８】
ＮＸＮＬ１は、選択的スプライシングを通してＲｄＣＶＦの２つのアイソフォームをコードする。錐体生存を媒介するアイソフォームは、その対のより長い方の切断型（ＲｄＣＶＦＬ）であり、酵素機能を付与するＣ末端伸張を含む（１１）。ＲｄＣＶＦのアミノ酸の全てを含有するＲｄＣＶＦＬは、ＮＸＮＬ１遺伝子のエクソン１及び２によってコードされ、かつ、チオレドキシンファミリーのメンバーである（１２）。チオレドキシンは、細胞内の適切な還元環境を維持すること及びアポトーシス経路に関与することを含む多様な機能を有する。これらの機能は、チオレドキシンフォールド内の保存されているＣＸＸＣ触媒部位によって媒介されるチオオキシドレダクターゼ（thioloxidoreductase）反応を介して達成される（１３）。
【０００９】
しかしながら、依然として、神経変性障害のための追加の神経保護的処置が必要とされている。
【００１０】
発明の概要
本発明者等は、驚くべきことに、ＮＸＮＬ１遺伝子のショートアイソフォーム（ＲｄＣＶＦ）及びロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦＬ）を組み合わせることによって、相乗効果を得ることができたことを見いだした。
【００１１】
ここで、本発明は、網膜変性疾患を患っている患者を処置するための方法であって、前記患者に、治療有効量のＮＸＮＬ１遺伝子のショートアイソフォーム、桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）をコードする第一の核酸及びＮＸＮＬ１遺伝子のロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦＬ）をコードする第二の核酸を投与することからなる工程を含む方法に関する。
【００１２】
前記ショートアイソフォーム及びロングアイソフォームは、別個のベクターによって投与しても、単一のベクターによって投与してもよい。
【００１３】
したがって、一態様において、本発明はまた、桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）のショートアイソフォームをコードする第一の核酸及びＲｄＣＶＦのロングアイソフォームをコードする第二の核酸を含む発現ベクターに関する。
【００１４】
別の態様において、本発明はまた、光受容器の変性障害を処置するための方法における使用のためのキットオブパーツであって、以下：
−ショートアイソフォーム［桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）］をコードする第一の核酸を含む第一の発現ベクター、及び
−ロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦＬ）をコードする第二の核酸を含む第二の発現ベクターを含むキットオブパーツに関する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、網膜変性疾患を患っている患者を処置するための方法であって、前記患者に、治療有効量のショートアイソフォーム［桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）］をコードする第一の核酸及びロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦ）をコードする第二の核酸を投与することからなる工程を含む方法に関する。
【００１６】
前記ショートアイソフォーム及びロングアイソフォームは、別個のベクターによって投与しても、単一のベクターによって投与してもよい。
【００１７】
したがって、第一の態様において、本発明は、網膜変性疾患を患っている患者に、治療有効量のショートアイソフォーム［桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）］をコードする第一の核酸及びロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦＬ）をコードする第二の核酸を投与することからなる工程を含む、前記患者を処置するための方法であって、前記第一の核酸及び前記第二の核酸が単一の発現ベクター中に含有される、方法に関する。
【００１８】
本発明はまた、ショートアイソフォーム［桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）］をコードする第一の核酸及びロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦＬ）をコードする第二の核酸を含む発現ベクターに関する。
【００１９】
本明細書において使用される場合、桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）という用語は、チオレドキシン様６（Ｔｘｎｌ６）又はヌクレオレドキシン様１（ＮＸＮＬ１）遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。それは、任意の動物種のＲｄＣＶＦタンパク質を包含する。典型的には、本発明に係るＲｄＣＶＦタンパク質は、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒト以外の霊長類及びヒトを非限定的に含む、哺乳動物のＲｄＣＶＦタンパク質であることができる。
【００２０】
別段の定めがない限り、「ＲｄＣＶＦ」という用語は、ＮＸＮＬ１遺伝子のショートアイソフォームを指し、そして、「ＲｄＣＶＦＬ」又は「ＲｄＣＶＦ−Ｌ」という用語は、ＮＸＮＬ１遺伝子のロングアイソフォームを指す。
【００２１】
典型的には、マウスでは、ショートアイソフォーム（ＲｄＣＶＦ）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｑ９１Ｗ３８下で参照される１０９アミノ酸長のタンパク質である。ネズミのロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦ−Ｌ）は、Ｑ８ＶＣ３３下で参照される２１７アミノ酸長のタンパク質である。
【００２２】
本発明の一実施態様において、ＲｄＣＶＦのショートアイソフォームは、以下の配列を有する、ヒトＲｄＣＶＦのショートアイソフォーム（ｈＲｄＣＶＦ）である：
【００２３】
【表１】
0006684343.tif 000002
【００２４】
本発明の一実施態様において、ＮＸＮＬ１遺伝子のロングアイソフォームは、登録番号Ｑ９６ＣＭ４下で参照されかつ以下に示される配列を有する、ヒトＲｄＣＶＦＬのロングアイソフォーム（ｈＲｄＣＶＦＬ）である：
【００２５】
【表２】
0006684343.tif 000003
【００２６】
ＲｄＣＶＦタンパク質及びＲｄＣＶＦＬタンパク質の配列は、Chalmel et al. 2007, BMC Molecular Biology 2007, 8:74 及び国際特許出願WO2008/148860号に記載されている。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「ベクター」及び「発現ベクター」という用語は、互換的に使用され、発現ベクターを指す。本発明に係る発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、ファージなどの形態であってよい。
【００２８】
典型的には、本発明に係る発現ベクターは、ウイルスであることができる。
【００２９】
一実施態様において、発現ベクターは、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）である。
【００３０】
ＡＡＶは、遺伝子送達に好適なベクターとして当技術分野において広く記載されている。実際に、ＡＡＶは、非病原性であり、かつ、広範な組織特異性を提示する。典型的には、本発明に係るＡＡＶは、網膜細胞を標的化することができるＡＡＶである。
【００３１】
例は、限定されないが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ９及びＡＡＶ７ｍ８を含む。
【００３２】
一実施態様において、本発明に係るＡＡＶは、国際特許出願WO2012/158757号に記載されている方法に従って得られる。
【００３３】
本発明の文脈において、「〜を処置する（treating）」又は「処置（treatment）」という用語は、本明細書において使用される場合、このような用語が適用される障害若しくは病態又はこのような障害若しくは病態の１以上の症状（例えば、網膜変性疾患）の進行を反転、緩和、阻害すること、あるいは、該障害若しくは病態又はその１以上の症状を予防することを意味する。
【００３４】
「網膜変性疾患」という用語は、錐体変性と関連する全ての疾患を包含する。網膜変性疾患は、限定されないが、網膜色素変性、加齢黄斑変性、バルデ・ビードル症候群（Bardet-Biedel syndrome）、バッセン・コーンツヴァイク症候群、ベスト病、全脈絡膜萎縮（choroidema）、脳回状萎縮、レーバー先天性黒内障、レフサム病、シュタルガルト病又はアッシャー症候群を含む。
【００３５】
本発明の一実施態様において、網膜変性疾患は、網膜色素変性である。
【００３６】
本発明によれば、「患者」又は「それを必要とする患者」という用語は、網膜変性疾患を患っている又は患う可能性が高いヒト又はヒト以外の哺乳動物を意図する。
【００３７】
本発明によれば、組成物の「治療有効量」は、所望の生物学的効果を達成する、この場合では、ニューロン生存率を増加させるのに十分である、治療有効量である。有効投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康及び体重、併用処置の種類、もしあれば、処置の頻度、並びに所望される効果の性質に依存することが理解される。しかしながら、好ましい投与量は、当業者によって理解されかつ決定可能である通り、過度な実験なしに、個々の被験体に適合され得る。
【００３８】
本発明の発現ベクターは、静脈内投与又は眼内投与に好適であることができる。ある特定の実施態様において、発現ベクターは、硝子体内注射によって投与される。
【００３９】
一態様において、本発明はまた、ＮＸＮＬ１遺伝子のショートアイソフォーム［桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）］をコードする第一の核酸及びＮＸＮＬ１遺伝子のロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦ−Ｌ）をコードする第二の核酸を含む発現ベクターと薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物に関する。
【００４０】
理論に束縛されるものではないが、ショートアイソフォーム（ＲｄＣＶＦ）及びロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦ−Ｌ）の送達が、相乗効果を導くと考えられる。
【００４１】
一方で、ショートアイソフォーム（ＲｄＣＶＦ）は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）によって産生及び分泌され、細胞非自律性の機序によって錐体の細胞表面にあるＲｄＣＶＦ受容体を通して好気的解糖を刺激することによって錐体を保護する。
【００４２】
他方で、ロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦＬ）は、そのチオオキシドレダクターゼ機能に起因して、細胞自律的に酸化的損傷から錐体を保護する。
【００４３】
本発明の別の態様において、ショートアイソフォーム及びロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦ−Ｌ）は、別個のベクターによって投与され、これは同時又は逐次的に投与することができる。
【００４４】
それ故、本発明はまた、網膜変性疾患を患っている患者に、治療有効量のショートアイソフォーム（ＲｄＣＶＦ）をコードする第一の核酸及びロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦ−Ｌ）をコードする第二の核酸を投与する工程を含む、前記患者を処置するための方法であって、前記第一の核酸及び第二の核酸が別個の発現ベクターに含有される、方法に関する。
【００４５】
本発明はまた、光受容器の変性障害を処置するための方法における使用のためのキットオブパーツであって、以下を含むキットオブパーツに関する：
−ＮＸＮＬ１遺伝子のショートアイソフォーム［桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）］をコードする第一の核酸を含む第一の発現ベクター、及び
−ＮＸＮＬ１遺伝子のロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦ−Ｌ）をコードする第二の核酸を含む第二の発現ベクター。
【００４６】
本発明は、以下の実施例及び図面を通してさらに説明されよう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】２ｘＲｄＣＶＦベクター（プラスミドｐ８５７及びＡＡＶ  ＣＴ−３９）の概略図  カナマイシン：細菌におけるプラスミド選択  ５’ＩＴＲ  ＡＡＶ逆方向末端反復  ＣＭＶ／ＣＢＡプロモーターデルタ３９０：混合サイトメガロウイルス／ニワトリベータアクチン（偏在的で強いプロモーター）  ｈＲｄＣＶＦ：ヒトＲｄＣＶＦ  ｃＤＮＡ  ＢＧＨポリＡ：ｍＲＮＡの安定化  ｐＴＦ３、ｂｌａ  ｔｘｎターミネーター、ｒｐｎ  ｔｘｎターミネーター：プラスミド内の３”ＩＴＲの外部に位置する（すなわち、ｒＡＡＶゲノム内にない）転写ターミネーターと転写インシュレーターのセット。ｐＴＦ３は、ｂｌａ  ｔｘｎに組み込まれている。ＣＭＶ／ＣＢＡプロモーターデルタ３９０：混合サイトメガロウイルス／ニワトリベータアクチン（偏在的で強いプロモーター）  ｈＲｄＣＶＦ：ヒトＲｄＣＶＦ  ｃＤＮＡ  ＢＧＨポリＡ：ｍＲＮＡの安定化  ３’ＩＴＲ  ＡＡＶ逆方向末端反復。
【図２】ＲｄＣＶＦ−ＲｄＣＶＦＬベクター（プラスミドｐ８５３及びＡＡＶ  ＣＴ−３５）の概略図  該ベクターは、以下のエレメントを含有する：  カナマイシン：細菌におけるプラスミド選択  ５’ＩＴＲ  ＡＡＶ逆方向末端反復  ＣＭＶ／ＣＢＡプロモーターデルタ３９０：混合サイトメガロウイルス／ニワトリベータアクチン（偏在的で強いプロモーター）  ｈＲｄＣＶＦ：ヒトＲｄＣＶＦ  ｃＤＮＡ  ＢＧＨポリＡ：ｍＲＮＡの安定化  ｐＴＦ３、ｂｌａ  ｔｘｎターミネーター、ｒｐｎ  ｔｘｎターミネーター：プラスミド内の３”ＩＴＲの外部に位置する（すなわち、ｒＡＡＶゲノム内にない）転写ターミネーターと転写インシュレーターのセット。ｐＴＦ３は、ｂｌａ  ｔｘｎに組み込まれている。ＣＭＶ／ＣＢＡプロモーターデルタ３９０：混合サイトメガロウイルス／ニワトリベータアクチン（偏在的で強いプロモーター）  ｈＲｄＣＶＦＬ：ヒトＲｄＣＶＦＬ  ｃＤＮＡ  ＢＧＨポリＡ：ｍＲＮＡの安定化  ３’ＩＴＲ  ＡＡＶ逆方向末端反復。
【図３】ＡＡＶ２−ＧＦＰ対ＡＡＶ２ＲｄＣＶＦ／ＲｄＣＶＦＬ［ＣＴ３５］のｒｄ１マウス（ＰＮ１４）の網膜下注射後の錐体（ＰＮ４４）の密度。
【実施例】
【００４８】
実施例１：網膜変性において、ＡＡＶ−ＲｄＣＶＦは錐体を救助し、そして、ＡＡＶ−ＲｄＣＶＦＬは桿体を保護する。
実施例１は、以下の刊行物の本発明者等によって刊行された実験データに相当する：
【００４９】
Byrne LC, Dalkara D, Luna G, Fisher SK, Clerin E, Sahel JA, Leveillard T, Flannery JG., J Clin Invest., 2015 Jan;125(1):105-16. doi: 10.1172/JCI65654. Epub 2014 Nov 21.「Viral-mediated RdCVF and RdCVFL expression protects cone and rod photoreceptors in retinal degeneration」（以下の参考文献のリストの３２）。
【００５０】
本発明者等は、ＰＤＥ６（桿体特異的サイクリックＧＭＰホスホジエステラーゼ）のβ−サブユニットの突然変異から生じる桿体錐体ジストロフィーのよく特徴付けられたモデルであるｒｄ１０マウス中への遺伝子導入を介して、２つのＲｄＣＶＦアイソフォーム（ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬ）の発現の効果を評価することによってＮＸＮＬ１遺伝子の二機能性を研究する実験を記載する（１４，１５）。ｒｄ１０の網膜変性は、Ｐ１５−Ｐ２０によって光受容器の大部分を喪失する最も広く研究されている劣性網膜変性モデルのｒｄ１マウスの変性速度より遅い。ｒｄ１０マウスでは、桿体喪失は、Ｐ１８で始まり、Ｐ２５前後にピークを迎えるので、桿体喪失の主要段階が光受容器の最終分化と重複しない（１６）。ｒｄ１０マウスモデルは、遺伝子治療に適しており（１７，１８）、そして、このマウスモデルにおいて抗酸化処置が桿体喪失を遅らせると示されている（１９）。加えて、低照度条件で飼育することは、網膜変性の速度を遅らせると示されており、このことは、治療的処置の可能性を拡げる（１７）。
【００５１】
ここで、本発明者等は、ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬのＡＡＶ媒介性発現の効果を検討する。これらの研究は、２つの経路のウイルスベクター投与を使用する：Ｐ１での尾静脈を介したＡＡＶ９の全身注射、及びＰ１５での硝子体内注射。早期の全身注射は、桿体細胞死の主要段階の前に、かつ、桿体及び錐体変性に対する導入遺伝子の発現の効果を評価する機会の範囲内で安全に、ＡＡＶベクターによってコードされる導入遺伝子の発現の発生を変性過程の早期時点で可能にする。全身送達は、網膜への臨床的に意義のある送達様式ではない。それは、多くの他の組織に同時に感染すること、そして、免疫応答がこのアプローチに対して主要なバリアとなるからである。それ故、本発明者等はまた、硝子体から光受容器を形質導入する７ｍ８と呼ばれるＡＡＶの新規バリアントの硝子体内注射（眼内送達のための一般的に使用されている技術）の効果も検討した（２０）。
【００５２】
本発明者等は、ＲｄＣＶＦの２つのアイソフォームの発現が、桿体及び錐体生存に対して正の対比効果を有することをここに示す。全身注射及び硝子体内注射を介したＲｄＣＶＦの増加した発現は、錐体光受容器の構造的かつ機能的な救助をもたらしたが、桿体に対してはほとんど効果がなかった。ＲｄＣＶＦＬはそれ自体、錐体を大幅に救助することはなかったが、ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬの同時発現は、観察された救助効果を増大させた。対照的に、暗所で飼育したｒｄ１０動物の疾患過程早期のＲｄＣＶＦＬの発現は、桿体機能を持続させ、ロドプシンのレベルを増加させ、そして、細胞酸化ストレスの副生成物を減少させた。
【００５３】
これらの結果は、ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬが別々の補完的機序を通して光受容器を保護することを示唆し、かつ、原因となっている突然変異とは無関係に、様々な桿体錐体ジストロフィーを患っている患者の視力を持続させることができる広範に適用可能なウイルスベクター媒介性の遺伝子治療の概念実証を示す。
【００５４】
方法
動物
Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  ｒｄ１０マウス及びＰ２３ＨマウスをJackson Laboratories（Bar Harbor, MＥ）から得て、１２時間の明暗サイクルで飼育した（但し、暗所飼育のために暗箱に移動させた場合を除く）。全ての実験を、眼科及び視覚研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ声明（ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research）並びにカリフォルニア大学の実験動物管理室（Office of Laboratory Animal Care at the University of California）（Berkeley, CA）のガイドラインに準拠して行った。
【００５５】
ウイルスベクターの生産
マウス−ＲｄＣＶＦ、ＲｄＣＶＦＬ又はｅＧＦＰをコードするｃＤＮＡを担持するＡＡＶベクターを、プラスミドの共トランスフェクション法によって生産した（３１）。組換えＡＡＶをイオジキサノール勾配超遠心分離及びヘパリンカラムクロマトグラフィー（GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK）によって精製した。ウイルス溶離液をバッファ交換し、Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter UnitsでＰＢＳ中に濃縮し、そして、定量ＰＣＲによって標準曲線に対して滴定した。
【００５６】
アガロース区分及び共焦点顕微鏡検査
網膜を新たに切開し、直ちに４％パラホルムアルデヒド中に４℃で一晩置いた。レリーフ片（relief cut）を作製し、全網膜を５％アガロース中に包埋した。ビブラトーム（VT 1000S, Leica Microsystems）上で１５０μmの横断切片をカットした。次いで、この切片を、Vectashieldマウンティング媒体（Vector Laboratories, Burlingame California）で共焦点顕微鏡（LSM710, Carl Zeiss; Thornwood, NY）用のスライド上にマウンティングした。
【００５７】
血管内注射
出生後１日目の子供を固定し、そして、手術用顕微鏡を使用して尾静脈を可視化した。ベクター溶液１0μlを３／１０ccのインスリン注射器に吸引した。３０ゲージ針を静脈に挿入し、プランジャーを手動で押し下げた。合計５×１０１１のＤＮａｓｅ耐性粒子を注射した。静脈の白化に注目することによって正しい注射であったかを検証した。注射後、ケージに戻す前に、子供を３７℃の温熱パッド上で数分間回復させた。
【００５８】
硝子体内注射
腹腔内注射によってケタミン（７２mg/kg）及びキシラジン（６４mg/kg）でマウスに麻酔をかけた。３０  １／２ゲージの使い捨て針を、上角膜輪部の赤道及び後方にある強膜から硝子体腔へ通した。その後、視神経頭のすぐ上の針を直接観察しながら、体積１μlの合計５×１０１０のＤＮａｓｅ耐性粒子を硝子体腔に注射した。反対側の対照眼は、ＧＦＰをコードする遺伝子を担持するベクター又はＰＢＳを受けた。
【００５９】
暗所飼育
暗所飼育マウスは、防光箱（light-safe box）中、低照度赤色光下で出生及び飼育し、この箱を動物の管理のために短い期間だけ開口させ、これを赤色光下で行った。実験用の箱へは動物を遮蔽したケージに入れて出し入れした。
【００６０】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
動物を、ＣＯ２過剰摂取及び頸椎脱臼によって人道的に安楽死させた。各実験条件（ｎ＝５）において各マウスから１つの網膜を採取した。各網膜から別々にＲＮＡを抽出し（RNeasy micro kit, Qiagen, Valencia, CA）、ＤＮａｓｅ消化に供し、そして、得られたＲＮＡを使用してｃＤＮＡを作製した。ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を内部対照として使用し、そして、逆転写酵素なしの非ＲＴ対照を使用してゲノムＤＮＡが存在しないことを確認した。ＲｄＣＶＦ又はロドプシン用の検証プライマーを使用して、試料に対してｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＷＴのｃＤＮＡ標準曲線を使用したｑＲＴ−ＰＣＲの相対的な標準曲線法を使用してｍＲＮＡレベルを決定し、ＷＴに対する百分率として表した。個々の試料を、技術的反復として３連で流した。
【００６１】
眼底撮影
麻酔をかけた生きているマウスにおいて、ＧＦＰ発現をモニタリングするフィルタを備えた眼底カメラ（Micron II; Phoenix Research Labs Inc., Pleasanton, CA）で眼底撮像を実施した。プロパラカインの適用後、眼底撮像のためにフェニレフリン（２．５％）及び硫酸アトロピン（１％）で瞳孔を拡張させた。
【００６２】
ＥＲＧ
マウスを２時間暗順応させ、次いで、麻酔をかけ、続いて瞳孔拡張させた。マウスを３７℃の温熱パッド上に置き、そして、コンタクトレンズを両眼の角膜上に装着した。基準電極を前額部に、そして接地電極を尾部に挿入した。暗所視野条件下での網膜機能の実験のために、暗バックグラウンドで−３〜１log cd・s/m2の範囲のフラッシュ強度下にてＥＲＧを記録した（Espion E2 ERG system; Diagnosys LLC, Littleton, MA）。各刺激を一連の３回のフラッシュで提示した。明所視ＥＲＧの記録のために、マウスを最初に桿体飽和バックグラウンドに１０分間曝露させた。−０．９〜１．４log cd・s/m2の範囲の刺激を、明バックグラウンドで２０回提示した。桿体飽和バックグラウンドでの３０Hzの刺激の提示に続いてフリッカーＥＲＧを得た。刺激強度及びタイミングをコンピューター制御した。データをMatLab（v7.7; Mathworks, Natick, MA）で解析した。スチューデントｔ検定を使用してＥＲＧ振幅を比較した。
【００６３】
モザイク取得及び錐体定量化
網膜全組織標本を、０．５％ＢＳＡ、０．１％Triton X-100及び０．１％アジドを含有するＰＢＳ（ＰＢＴＡ）中の正常ロバ血清（Jackson ImmunoResearch Laboratories; West Grove, PA）（１：２０）を使用して、４℃で一晩ブロッキングし、連続撹拌のために回転器上に置いた。次いで、ヤギ抗Ｓ−オプシン（１：１００；Santa Cruz Biotechnologies; Santa Cruz, CA）、ウサギ抗Ｍ／Ｌ−オプシン（１：５００；Chemicon International; Temecula, CA）、及びマウス抗ロドプシン（１：１００；ブリティッシュコロンビア大学のRobert Molday医師からの寄贈）を含有する抗体カクテルをＰＢＴＡの溶液に加え、２日間インキュベートした。次いで、網膜調製物をＰＢＴＡ中で３×１５分間及び１時間洗浄し、その後、対応する二次フルオロフォアを加えて、４℃で一晩インキュベートした。最後に、試料をすすぎ、マウントし、そして、Vectashield（(Vector Labs; Burlingame, CA）でカバースリッピングした。４０×UPlanFLN（N.A. 1.3）油浸レンズを使用したOlympus Fluoview 1000走査型共焦点レーザ顕微鏡（Center Valley, PA）を使用して、マウス網膜の画像を調査及び収集した。自動ステージ（Applied Scientific Instrumentation: Eugene, OR）を用いて、ｚ軸に１μm間隔でかつｘ−ｙ方向に１０２４×１０２４の画素分解能で光学切片を撮った。次いで、これらのファイルを使用し、バイオイメージ解析ソフトウェアImago（Santa Barbara, CA）を使用して最大値投影を作成した。個々の画像の中で２０％の重なりでデジタル画像を撮り、そして、得られた約３００〜４００個の画像を、Imagoを使用して合成した。その後、Imarisソフトウェア（Bitplane AG, Zurich, Switzerland）及びPythonで書かれたカスタムソフトウェアを使用して錐体カウントを実施した。
【００６４】
ＴＢＡＲＳアッセイ
マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）濃度を、ＴＢＡＲＳアッセイ（Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA）を使用して決定した。３つの網膜を各アッセイの条件毎にプールし、アッセイを３回繰り返した。合計２５mgの音波処理した網膜組織を各アッセイに使用した。プロテアーゼインヒビターカクテルを含有する溶解緩衝液中で網膜を音波処理し、次いで遠心分離した。上清をＴＢＡＲＳアッセイに使用し、３連で調製した技術的反復を用いて製造業者の説明に従ってこのアッセイを実施した。公知の濃度のＭＤＡ試料を使用して標準曲線を作成し、そして、得られた曲線に対して試料のＭＤＡの濃度を決定した。
【００６５】
統計学
両側の対応のある又は対応のないスチューデントｔ検定を実験群の比較に使用した。０．０５未満のＰ値を統計学的に有意と見なし、星印によって表示する。０．０１未満のＰ値を二重星印によって表示する。エラーバーは、標準偏差を表示する。
【００６６】
結果
Ｐ１での尾静脈注射を介したＡＡＶ９２ＹＦの全身送達
本発明者等は、２つのチロシンからフェニルアラニンへの突然変異を有する自己相補性ＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９２ＹＦ）の静脈内（尾静脈）注射による早期のＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬ送達の治療効果を調べた。発生中の眼への眼内注射は、出生後一週目では実行不可能であるが、ＡＡＶ９２ＹＦは、Ｐ１で尾静脈に注射したときには血液−網膜バリアを横断し、網膜全体の高レベルの遺伝子発現を導くと示されている（２１）。全身送達は、かなりの数の桿体が喪失する前の、発生のかなり早期に網膜における発現の発生を導く。ＧＦＰの発現を駆動する普遍的なＣＡＧプロモーターを有するＡＡＶ９２ＹＦ（ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＧＦＰ）は早期の網膜発現をもたらし、これを、Ｐ８で網膜フラットマウント中にかつＰ１５で開眼後すぐにインビボ眼底画像によって視認できた。Ｐ３５での眼底画像は、網膜全体で強いＧＦＰ発現を示した。網膜フラットマウントは、多数の光受容器が形質導入されたことを明らかにした。Ｐ３５で、全ての網膜層、神経節細胞、ミュラーグリア、アマクリン細胞及び光受容器、並びにＲＰＥにおいて、ＧＦＰ発現が観察された。免疫標識なしで容易に視認できた類似の広範で強い発現パターンがＷＴ及びｒｄ１０の網膜で観察された。Ｐ１にＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦ、ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦＬ、又はＰＢＳを注射した標準的な明暗サイクルにて飼育されたｒｄ１０マウスから収集されたｍＲＮＡに対して実施したｑＲＴ−ＰＣＲは、ウイルスの静脈内注射がＰ３５での網膜において高レベルのＲｄＣＶＦ発現をもたらしたことを明らかにした。予想の通り、ＲｄＣＶＦ  ｍＲＮＡのレベルは、同齢のＰＢＳを注射したｒｄ１０動物ではＷＴと比較して大きく低下した（５％±５％ＷＴ）。対照的に、ＡＡＶ媒介性遺伝子送達後の発現のレベルは、ＷＴ動物では内因性のＲｄＣＶＦレベルと同程度であった（ＡＡＶ９２ＹＦ−ＲｄＣＶＦ＝７９％±３０％ＷＴ；ＡＡＶ９２ＹＦ−ＲｄＣＶＦＬ＝５９％±１３％ＷＴ）。ロドプシンｍＲＮＡ発現レベルは、条件全体で低いままであったが、このことは、Ｐ３５での処置動物及び未処置動物において桿体光受容器喪失率が似ていることを示している（ＡＡＶ９２ＹＦ−ＲｄＣＶＦ＝８％±３％ＷＴ；ＡＡＶ９２ＹＦ−ＲｄＣＶＦＬ＝１％±１％ＷＴ；ＰＢＳ  ６％±１％ＷＴ）。
【００６７】
ＡＡＶ媒介性送達からの導入遺伝子発現は、用量依存的である。ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＧＦＰの２Ｅ＋１１、５Ｅ＋１１又は１Ｅ＋１２ウイルス粒子を注射し、注射後１ヶ月目に撮像した動物は、ウイルス価が高くなるにつれてＧＦＰレベルが増加したことを示した。加えて、広範なＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦ力価を注射した動物からのｑＲＴ−ＰＣＲは、ウイルス粒子を多く注射するにつれてＲｄＣＶＦ発現が増加したことを示した。
【００６８】
錐体機能に対するＡＡＶ９２ＹＦ．ｓｃＣＡＧ．ＲｄＣＶＦの注射の効果
Ｐ１でマウスにＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦを静脈内注射し、その後、標準的な明暗サイクルで飼育した。次いで、明所視網膜電図（ＥＲＧ）を測定して、錐体機能に対するＲｄＣＶＦ発現の効果を決定した。代表的なＥＲＧトレースは、ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦＬ、ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＧＦＰ又はＰＢＳの注射と比較した、ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦを注射した眼から記録されたＥＲＧの向上した波形及び振幅を説明する。ＲｄＣＶＦのＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ媒介性発現は、ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦＬ（４６．７±６．４μV、ｐ＜０．００５）、ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＧＦＰ（４６．６±１４．９μV、ｐ＜０．０１）又はＰＢＳ（５６．５±４．６４μV、ｐ＜０．０１）を注射した動物と比較して、有意に高い振幅の明所視ＥＲＧｂ波（９７．１±１０．６７μV）をもたらした。ＷＴのｂ波振幅は、１５６．６±１１．４μVであった。ＥＲＧを条件毎に５匹の動物から記録した。データを平均±ＳＤとして提示する。また、錐体機能の尺度として明所視フリッカーＥＲＧも記録した。代表的なフリッカーＥＲＧトレースは、ＧＦＰを注射した動物と比較した、向上した振幅及び波形を説明する。
【００６９】
明所視ＥＲＧの救助は、用量依存的であり、このことは、有意な救助が起こるために必要なレベルのＲｄＣＶＦ発現が達成されるべきであることを示している。Ｅ＋１１  ｖｇの注射でＥＲＧ振幅はわずかに増加したが、その差に有意差はなく、一方で、Ｅ＋１２  ｖｇの注射は、より高いＥＲＧ振幅をもたらした。
【００７０】
導入遺伝子発現は、持続的であり、ＡＡＶ９−ｓｃＣＡＧ−ＧＦＰを注射した動物におけるＧＦＰ発現を、注射の１年後に撮像した網膜フラットマウントにおいて容易に視認することができる。ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦを注射したｒｄ１０動物において、ｑＲＴ−ＰＣＲは、注射の１年後のＲｄＣＶＦの上昇したレベルを明らかにする。
【００７１】
ＡＡＶ９２ＹＦ．ｓｃＣＡＧ．ＲｄＣＶＦを注射した動物における錐体密度
免疫蛍光標識した錐体外節の自動計測を使用して、錐体生存を定量する。過去にＥＲＧ記録に使用した動物由来の網膜全体をフラットマウントし、Ｓ−オプシン（青色の標識）及びＭ／Ｌ−オプシン（赤色の標識）に対する抗体で染色した。高解像度４０×ｚスタック画像を網膜全体にわたって収集し、登録し、そして、一緒にまとめてモザイクを作製した。網膜フラットマウントのモザイクは、ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦを注射した動物由来の全フラットマウントにおいて、Ｓ−オプシン及びＭ／Ｌ−オプシンの両方で標識されたより多い数の錐体を明らかにした。両タイプのより多い数の生存錐体が、最も重度の変性のある網膜の領域である、視神経頭近傍のより高い解像度画像に見られる。ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦ及びＰＢＳを注射した網膜における錐体密度の自動定量化は、処置した眼において、Ｓ−錐体及びＭ／Ｌ−錐体の両方の１mm2当たりの有意に多い数を明らかにした。Ｓ−錐体密度は：ＲｄＣＶＦで処置した眼：５５７３±２１１／mm2；ＰＢＳで処置した眼：２，９６１±９１７／mm2；ｐ＜０．０１、ＷＴ錐体：７４４６±８６８／mm2であった。Ｍ／Ｌ−錐体密度は：ＲｄＣＶＦで処置した眼：８７５５±１５７２／mm2；ＰＢＳで処置した眼：２６８２±２９３／mm2；ｐ＜０．０１；ＷＴ錐体  ９７６１±７８４／mm2であった。
【００７２】
ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦＬの全身注射の効果
動物を暗所で飼育することで、桿体喪失の速度を遅らせ、かつアポトーシス前の桿体におけるＲｄＣＶＦＬ発現の発生を可能にする。露光を低下させることは、過去に示されている通り光受容器の変性速度を遅らせた（１７）。Ｐ１でマウスにＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦＬ、ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＧＦＰ又はＰＢＳを注射した（各群ｎ＝６）。暗所視全視野ＥＲＧを毎週記録した。注射の３、４及び５週後に行った最大強度の光刺激からの記録は、３及び４週目にａ波振幅の類似の喪失を明らかにしたが、５週目にはこの改善はもはや見られなかった。この差は、注射後４週目にのみ統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦＬ又はＰＢＳを注射したマウスの第二の同腹子に対してより詳細な解析を実施した。この群で、注射の４週間後、より低い光強度（−１及び−２log cd・s/m2）で、ａ波振幅に最も有意差があることが認められた。代表的なＥＲＧトレースは、ＧＦＰ又はＰＢＳを注射した対照動物と比較した、ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦＬを注射した動物におけるａ波及びｂ波振幅の保存を説明する。明所視ＥＲＧのＥＲＧ記録は、ＲｄＣＶＦＬを発現する眼における錐体ＥＲＧの減少の遅延を明らかにし、これは、注射の５週間後に最も顕著であったが、この差は統計学的に有意ではなかった。
【００７３】
ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦＬを全身注射した暗所飼育動物におけるロドプシンｍＲＮＡに対するｑＲＴ−ＰＣＲ
Ｐ１でＡＡＶ９２ＹＦ−ＲｄＣＶＦＬ、ＧＦＰ、又はＲｄＣＶＦを注射し、完全な暗闇で飼育したＰ２８の動物から収集されたｍＲＮＡに対して実施したｑＲＴ−ＰＣＲは、ＡＡＶ９２ＹＦ−ＲｄＣＶＦＬを注射した動物においてロドプシンｍＲＮＡレベルの増加を明らかにしたが（８２％±２１％ＷＴ、ｐ＜０．０５）、ＰＢＳ（５６％±６％  ＷＴ）、ＡＡＶ９２ＹＦ−ＧＦＰ（５９％±１５％  ＷＴ）、又はＡＡＶ９２ＹＦ−ＲｄＣＶＦ（５７％±１６％  ＷＴ）では増加はなかった。これらの結果は、標準的な明暗サイクルで飼育した動物で測定したロドプシンｍＲＮＡレベルと一緒に、この比較的速い網膜変性モデル（出生後数週間で光受容器の喪失を始める）において短期間に発現の効果が観察される可能性についてのＲｄＣＶＦＬ送達の重要性を示す。なぜなら、ＡＡＶ９２ＹＦ−ＲｄＣＶＦＬを注射して明所で飼育した動物においてロドプシンｍＲＮＡのレベルに対する効果が観察されなかったためである。
【００７４】
脂質過酸化の測定
チオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）アッセイを使用して、ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦＬ、ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦ、ＡＡＶ９２ＹＦ−ｓｃＣＡＧ−ＧＦＰ又はＰＢＳで処置した網膜中の脂質過酸化副生成物マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）のレベルを決定した。３つのプールした網膜に対して試験を実施し、これを３回繰り返した。ＭＤＡレベルは、未処置の眼と比較して、ＲｄＣＶＦＬで処置した眼において１８％±０．９％減少した。
【００７５】
新規ウイルスバリアント７ｍ８の硝子体内注射
本発明者等は、出生後１５日目（Ｐ１５）の硝子体内注射後のＷＴ及びｒｄ１０マウスにおける新規ウイルスバリアント７ｍ８のウイルス親和性及び発現パターンを特徴付けた。７ｍ８は、硝子体内注射後に網膜外層を形質導入するよう開発されたＡＡＶ２のバリアントである（２０）。重要なことに、このバリアントは、網膜下注射なしで光受容器を形質導入し、これは、傷害応答及び栄養因子の放出を引き起こすことが示された（２２）。Ｐ１５でのＧＦＰをコードする自己相補性７ｍ８ベクターの硝子体内注射は、注射後の１週間後に強い発現をもたらし、これはまたＰ４５での眼底画像でも明確に視認できた。フラットマウントした網膜は、多数の光受容器が７ｍ８によって形質導入されることを示した。網膜断片の共焦点イメージングは、ＷＴ及びｒｄ１０マウスにおいて神経節細胞層（ＧＣＬ）、内顆粒層（ＩＮＬ）及び外顆粒層（ＯＮＬ）内にある細胞中のＧＦＰ発現を明らかにした。
【００７６】
７ｍ８の注射後のＲｄＣＶＦ発現のレベルを定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって評価した。ＲｄＣＶＦ、ＲｄＣＶＦＬ又はＧＦＰをコードするウイルスベクターを注射したＰ４５のｒｄ１０マウスにおけるｍＲＮＡレベルを定量化した。予想の通り、ＲｄＣＶＦ  ｍＲＮＡのレベルは、ＷＴと比較して、対照のＧＦＰ注射ｒｄ１０マウスにおいて低下した（４％±１％ＷＴ）。Ｐ１４での７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦ又は７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦＬの眼内注射は、より高いレベルのＲｄＣＶＦ  ｍＲＮＡをもたらした。レベルは、７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦを注射した動物では１２７％±３５％ＷＴであり、そして、７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦＬを注射した動物では９１％±１０％ＷＴであった。ロドプシンレベルは、測定した全ての網膜において一様に低かった（ＲｄＣＶＦ＝３％±１％ＷＴ；ＲｄＣＶＦＬ＝１％±１％ＷＴ；ＰＢＳ  １％±１％ＷＴ）。データを平均＋ＳＤとして提示し、条件毎の動物はｎ＝５である。
【００７７】
錐体構造及び機能に対するＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬの発現の効果
次に、本発明者等は、暗所で飼育したｒｄ１０マウスにおける錐体救助に対するＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬをコードする７ｍ８の眼内注射の効果を調べた。Ｐ１４での７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦＬの注射は、ＰＢＳ（６５±５μV）又はＧＦＰ（６９±７．３μV）を注射した眼と比較して、明所視ＥＲＧｂ波の振幅の小さな統計的に有意でない増加をもたらした（７４±４．８μV）。７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦの注射は、ＧＦＰ又はＰＢＳを注射した眼と比較して、明所視ＥＲＧｂ波振幅の振幅を有意に増加させた（８９±７．９μV、ｐ＜０．０５）。７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦ及び７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦＬの同時注射は、明所視ＥＲＧの大幅な救助をもたらし、これは、未処置の眼より５３％高く（９９．７５±５．７μV、ｐ＜０．０１）、ＲｄＣＶＦ単独より１７％高かった（ｐ＜０．０５）。全ての動物で、１つの眼に、７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＧＦＰ又はＰＢＳを内部対照として注射した。
【００７８】
７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦを注射した眼における錐体標識
抗−Ｓ及びＭ／Ｌ−オプシン抗体を使用して、７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦ又は７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＧＦＰを注射した眼における錐体集団を標識し、そして、高解像度４０×画像モザイクを作成した。標識は、錐体の数が、視神経頭に近い網膜の中心領域に最も顕著に増加したことを明らかにした。網膜全体にわたる標識した錐体の自動定量化は、反対側の７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＧＦＰを注射した目（Ｓ−錐体：１２５４±３２６、Ｍ／Ｌ−錐体  １１１２±４１９）と比較して、７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦを発現する眼においてＳ−及びＭ／Ｌ−オプシンを発現する錐体の増加を明らかにした（Ｓ−錐体：１６４４±４３６  ｐ＜０．０５、Ｍ／Ｌ−錐体：２２０５±２６４、ｐ＜０．０５）。
【００７９】
Ｐ２３ＨマウスにおけるＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬの発現の効果
次に、７ｍ８を使用して、ホモ接合又はヘテロ接合Ｐ２３Ｈマウス（優性網膜色素変性モデル）においてＲｄＣＶＦ又はＲｄＣＶＦＬを送達した。ＥＲＧ記録の定量化は、７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦの注射が、ＰＢＳを注射したホモ接合Ｐ２３Ｈ／Ｐ２３Ｈマウスと比較して明所視ＥＲＧ振幅の増加をもたらしたことを示した（ＲｄＣＶＦ：３９±１５．７μV、ＰＢＳ：１９±１１．３μV、ｎ＝６、Ｐ＜０．０１）。ヘテロ接合Ｐ２３Ｈ／＋マウスでは、７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦの注射は、対照のＧＦＰで処置した反対側の眼と比較して、処置後４ヶ月まで明所視ＥＲＧ記録の振幅の増加をもたらした（注射後１ヶ月、ＲｄＣＶＦ：１７５±２１．４μV対ＰＢＳ：１０７±１７．２μV、注射後４ヶ月、ＲｄＣＶＦ：７１．５±１８μV対ＰＢＳ：４５±１５．６μV、注射後６ヶ月、ＲｄＣＶＦ：２３．８±１４．９μV対ＰＢＳ：１８±１０．４μV）。対照的に、ＲｄＣＶＦＬでの処置は、測定したいずれの時点においても明所視ＥＲＧ記録の振幅のいかなる有意な変化ももたらさなかった（注射後１ヶ月、ＲｄＣＶＦＬ：１３５±４７．３μV対ＰＢＳ：１２０．２５±５３．７μV、注射後４ヶ月、ＲｄＣＶＦＬ：７２±３８μV対ＰＢＳ：７２．８±４５．２μV、注射後６ヶ月、ＲｄＣＶＦＬ：４７．２±５５．８μV対ＰＢＳ：３１±３２μV）。
【００８０】
結論
本発明者等は、ＲｄＣＶＦの送達戦略としてのＡＡＶベクターの有効性を実証し、そして、ＲｄＣＶＦの発現が桿体錐体ジストロフィーを有する患者において錐体の喪失を遅延させる有望な戦略であることを示す。
【００８１】
これらの結果は、血管内注射を介したＡＡＶの送達を使用した網膜における機能的な光受容器救助を初めて実証する。
【００８２】
ＡＡＶ９２ＹＦの全身送達と同様に、ＲｄＣＶＦをコードする７ｍ８の眼内注射は、錐体機能を救助し、かつ、錐体生存を持続させた。最後に、７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦの硝子体内投与後に観察される救助効果は、７ｍ８−ｓｃＣＡＧ−ＲｄＣＶＦＬの同時投与によって増強され、このことは、ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬの相乗活性を利用する共発現遺伝子治療戦略の潜在性を示唆している。
【００８３】
まとめると、これらの実験は、網膜における、異なる活性を有するＲｄＣＶＦの２つのアイソフォームをコードする二機能性遺伝子としてのＮＸＮＬ１の役割を支持している。ここで、ＲｄＣＶＦは、錐体生存を支援すると示され、一方で、ＲｄＣＶＦＬは、錐体に対して直接的な効果をほとんど有さないが、チオオキシドレダクターゼ活性を通して桿体機能を保護する。
【００８４】
実施例２：ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬの組み合わせは、相乗効果をもたらす
以下の構築物を産生し、ＡＡＶ２ベクターに導入した。
【００８５】
プロウイルスプラスミドｐ６１８及びそのエレメントは、WO2012158757A1として公開されている国際特許出願及び刊行物（３３）に記載されている。
【００８６】
２ｘＲｄＣＶＦ：プラスミドｐ８５７及びＡＡＶ  ＣＴ−３９
ＣＴ−３７（ＲｄＣＶＦスタッファー）と比較してＲｄＣＶＦの発現のレベルを増加するようにＰ８５７／ＣＴ３９を設計して、網膜色素変性（ＲＰ）を患っている患者において十分な錐体保護を達成した。
【００８７】
ＲｄＣＶＦ−ＲｄＣＶＦＬ：プラスミドｐ８５３及びＡＡＶ  ＣＴ−３５
このベクターは、ＲｄＣＶＦのショートアイソフォーム及びロングアイソフォームを同時発現することができる。
【００８８】
これらのベクターを使用して、ブタ網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞においてＲｄＣＶＦ及び／又はＲｄＣＶＦＬタンパク質を発現させることに成功した。これらの培養物の保護効果を、ニワトリ胚由来の錐体が豊富な培養物において評価し、非常に満足できるものであった。
【００８９】
また、この構築物を、網膜下注射後のｒｄ１マウスの錐体に対する保護効果について試験した。錐体の密度の有意な増加が観察された（図３を参照のこと）。
【００９０】
結論として、本発明者等は、単一の発現ベクター中のＮＸＮＬ１遺伝子のショートアイソフォーム及びロングアイソフォーム（ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬ）の組み合わせが、網膜におけるインサイチューの錐体生存率を高める際に相乗効果を提供することを示した。
【００９１】
本発明に係る組み合わせは、錐体変性及び他のニューロン変性を治療及び／又は予防するのに有用である。
【００９２】
参考文献
本出願を通して、種々の参考文献が、本発明が関連する分野の最新技術を記載している。これらの参考文献の開示は、参照によって本開示に組み入れられる。
【００９３】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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