(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i) 凍結乾燥したSEQ ID No: 1のポリペプチドを滅菌した精製水中に溶解して抗原性の水相を得る；
(ii) この抗原性の水相 1容量とモンタニド(登録商標) ISA 51 1容量とを、コネクターによって連結された2つのシリンジを含むデバイス中に装填する；
(iii) 全配合物を1つのシリンジから他方へ移し、次いで最初のシリンジに戻すサイクルを少なくとも3回行う（ここで、各サイクルは少なくとも6秒間続く）ことによって、配合物を前-乳化する；
(iv) さらなる移動サイクルを少なくとも20回行うことによって配合物を乳化する（ここで、各サイクルは長くても2秒間続く）
ことを含むヒト対象者に配列YLQVNSLQTVYLEYRQVPVYLEEITGYL (SEQ ID No: 1)のポリペプチドを投与するための油中水型エマルジョンを製造する方法。
【請求項２】
工程(i)が、SEQ No: 1のポリペプチドのライオケーキを、10〜40℃の温度で、滅菌した精製水で水和し、溶解が完了するまで待つことによって行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
水溶液中のペプチドの濃度が2〜20 mg/mlである、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
工程(ii)が、抗原性の水相 1容量を第1のシリンジ中に装填し、モンタニド(登録商標) ISA 51 1容量を第2のシリンジ中に装填し、次いでコネクターを介して2つのシリンジを結合することによって行われる、請求項1〜3のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
コネクターがI-コネクターである、請求項1〜4のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
工程(iii)において、3〜10サイクルが行われる、請求項1〜5のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
工程(iii)において、各サイクルが6〜30秒間続く、請求項1〜6のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
工程(iv)において、20〜40サイクルが行われる、請求項1〜7のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
工程(iv)において、各サイクルが0.5〜2秒間続く、請求項1〜8のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
SEQ ID No: 1の凍結乾燥されたポリペプチドの少なくとも1 mg、モンタニド(登録商標)ISA 51の少なくとも1 ml、2つのシリンジ、I-コネクターおよび請求項1〜9のいずれか一つによる方法を記載した使用説明書を含む、請求項1〜9のいずれか一つに記載の方法を行うためのキット。
【請求項１１】
各シリンジが2 mlシリンジである、請求項10に記載のキット。
【請求項１２】
注射用精製水のバイアルおよび／またはバイアルアダプターをさらに含む、請求項10または11に記載のキット。
【請求項１３】
エマルジョンを得た後、患者にワクチンを接種するための滅菌注射針をさらに含む、請求項10〜12のいずれか一つに記載のキット。
【請求項１４】
エマルジョンを形成する水相中にペプチドが精製水と一緒に含まれ、エマルジョン中のペプチドの濃度が1〜10 mg/mlの範囲にあり、エマルジョンのDv 50が3μm未満である、SEQ ID No: 1のポリペプチドとモンタニド(登録商標) ISA 51とを含む油中水型エマルジョン。
【請求項１５】
エマルジョンのDv 50が2μm未満である、請求項14に記載の油中水型エマルジョン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌ワクチンの分野に関する。具体的には、本発明は、3つのエピトープを含む最適化ポリペプチドとアジュバントとしてのモンタニド(Montanide)とを用いて、抗癌免疫療法で使用するためのワクチン製剤を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
WO2007073768 (Al)は、3つの汎用性腫瘍抗原由来の最適化潜在性ペプチド(TERT988Y、MAGE-A248V9およびHER-2/neu402y)を含む、配列Vx006 (YLQVNSLQTVYLEYRQVPVYLEEITGYL, SEQ ID No: 1)を有するポリペプチドを開示している。
3つのペプチドの単純な混合物および同じエピトープを含むが異なる順番で含む他のポリペプチドとは反対に、SEQ ID No: 1のポリペプチドは、腫瘍細胞によって発現される天然エピトープのTERT988、HER-2/neu402、MAGE-A248G9およびMAGE-A248D9に対して、多特異的CTL応答を引き起こす。腫瘍のほぼ100%は、3つの抗原の少なくとも一つを発現しているので、それによってVx006は、抗癌免疫療法の優れた候補品を構成している。
【０００３】
免疫アジュバントは、ワクチン製剤の有効性を増すためにワクチン製剤に加えられる物質である。アジュバントは、ワクチン接種によって誘導される免疫応答の強さおよび期間を増進させることができる。IFA(不完全フロインドアジュバント)は、研究で最も一般的に用いられるアジュバントの一つである。それは、非代謝オイルから調製される。IFAを有するワクチン製剤は、油中水型(W/O)エマルジョンである。IFAは、注入部位でのデポーの形成および抗体産生形質細胞の刺激により免疫応答を誘導する。
【０００４】
しかしながら、多くの場合に外科的介入を必要とする無菌性膿瘍を含む副作用、およびIFAが実験動物で発がん性であり得ることを示唆するいくつかの前臨床所見は、IFAをアジュバントとしたワクチンのさらなる臨床開発を妨げた。その結果、改良された仕様および品質管理手順を有するIFA型の無毒化されたアジュバントが利用可能になってきた。例えば、鉱油をベースとしたモンタニド(登録商標) ISA 51およびスクアレンをベースとしたモンタニド(登録商標) ISA 720 (SEPPIC, フランス)エマルジョンが、現在、癌、マラリアおよびHIVに対するワクチン研究で臨床開発中である。
【０００５】
しかしながら、W/O型エマルジョンは、注入部位に長く残り、局所反応を引き起こす傾向にあるので、これらのW/O型エマルジョンアジュバントの適用は、ヒトの治療ワクチンおよび癌ワクチンの分野に限定されている。非小細胞肺癌に対するワクチンの、モンタニド(登録商標) ISA 51 VGを用いるCIMAVax(登録商標) EGFワクチンが、第III相試験中であり、少なくともキューバで既に使用が許可されている。
【０００６】
モンタニド(登録商標) ISA 51は、高純度の鉱油(Drakeol 6VR)と界面活性剤(モノオレイン酸マンニド)との混合物である。2006年に、プリオン汚染の関連のため、モンタニド(登録商標) ISA 51の配合は、牛脂から単離されたオレイン酸から、オリーブから単離されたオレイン酸に変えられた(モンタニド(登録商標) ISA 51 VG)。
【０００７】
油中水型(W/O)乳化ワクチンを調製するのに用いられる工程は、高剪断混合機、ボルテックス、シリンジまたはシリンジとコネクター(T-またはI-コネクター)のような異なるデバイスを用いる、種々のプロトコールによって得られる。エマルジョンを得るために用いられる方法は、ワクチンの物理化学的パラメータおよびワクチン接種の効力に関して全く同等ではない。
【０００８】
古典的に、モンタニド(登録商標) ISA 51を用いて乳化されたペプチドを得るために、コネクター(IまたはT-コネクター)によって接続されたシリコーンフリーの2つのシリンジが用いられ、水の液滴を取り囲む油相中に取込むために高剪断される。
一般的に、ペプチドは生理食塩水(ほとんどの場合PBSかNaCl 0.9% 生理食塩水緩衝液)に溶解され、この溶液の1容量がモンタニド(登録商標) ISA 51の1容量と混合される。次いで、その混合物を、例えばI-コネクターによって接続されたシリコーンフリーの2つのシリンジからなるデバイスに装填し、それを20回の低速サイクル（すなわち、約4秒持続するサイクル）の乳化前工程、続いて40回の急速サイクルの乳化工程を行うために用いる。1サイクルは、第1のシリンジから他のシリンジへの全溶液（水相とアジュバント）の移動、続いてそのシリンジから元のシリンジへの全溶液の移動として定義される。
最近、AscarateilおよびKoziolは、自動W/O型乳化工程のために最適化された新しい装置で得られる結果を提示した(Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2013)。特許出願EP 2 322 132 Alに開示されたこのデバイスは、乳化工程の制御を可能にする自動クローズドシステムである。
【０００９】
本発明者らは、上記の古典的プロトコールによって、モンタニド(登録商標) ISA 51と、SEQ ID No: 1のポリペプチドを含む水相とを用いて、W/O型エマルジョンを得ようと試みた。そうしたとき、彼らは以下の実験の部に説明されている解明できない多くの困難に直面した。
ペプチド溶液とモンタニド(登録商標)とを用いてエマルジョンを得るための標準プロトコールが失敗したので、本発明者らは、乳化工程において多くのパラメータの変動を試みたが失敗に終わった。
最後に、彼らは、驚くべきことに、次の2つの条件：
− SEQ ID No: 1のポリペプチドは、生理食塩水の代わりに精製水に溶解させなければならない；そして
− 乳化前工程は、それぞれ少なくとも6秒間持続する、少なくとも2回の極めて遅いサイクルを含まなければならない
が満たされるだけで、SEQ ID No: 1のポリペプチドは、モンタニド(登録商標) ISA 51 VGを用いて乳化できることを見出した。
【００１０】
それゆえ、本発明は、次の工程：
(i) 精製水（注射用水）中に凍結乾燥したSEQ ID No: 1のポリペプチドを溶解することにより抗原性の水相を得る；
(ii) この抗原性の水相の1容量とモンタニド(登録商標) ISA 51の1容量とを、コネクターによって連結された2つのシリンジを含むデバイス中に装填する；
(iii) 全配合物を1つのシリンジから他方へ移動させ、次いで最初のシリンジに戻すサイクルを少なくとも3回行う（ここで、各サイクルは少なくとも6秒間続く）ことによって、配合物を前-乳化し；
(iv) 少なくとも15回のさらなる移動サイクル（ここで、各サイクルは長くても2秒間続く）を行うことによって、配合物を乳化する
ことを含む、配列YLQVNSLQTVYLEYRQVPVYLEEITGYL (SEQ ID No: 1)のポリペプチドをヒト対象者に投与するための油中水型エマルジョンを製造する方法に関する。
【００１１】
本明細書において、「モンタニド(登録商標) ISA 51」は、現在市販されているモンタニド(登録商標) ISA 51 VG、ならびにそれから（例えば、オリーブから単離されたオレイン酸を別の起源から単離されたもの、または合成物に置き換えることによって）誘導される生物学的に同等なあらゆるアジュバントを意味する。
【００１２】
工程(ii)において、水相と油相の50/50の比率は変えることができるということも留意されるべきである。実際、アジュバントは全溶液の60％まで占めることができる。それゆえ、他に特に断りがなければ、「水相の1容量とモンタニド(登録商標) ISA 51の1容量とを混合する」という語句は、「50/50〜40/60の間に含まれるW/O比で、水相とモンタニド(登録商標) ISA 51とを混合する」ことを意味する。
【００１３】
重要なことには、上記の方法を行うために用いられるシリンジは、モンタニド(登録商標)に適していなければならない。すなわち、それらはシリコンフリーおよびゴムフリー（すなわち、プランジャーにあらゆるゴムチップがない）でなければならないし、好ましくはラテックスフリーでもなければならない。
本発明を行うために用いることができるシリンジの例は：
− OR 2 ml Injekt(登録商標) (ドイツ、B-BraunからのRef: 4606701V)、
− OR 5 ml Injekt(登録商標) (ドイツ、B-BraunからのRef: 4606710V)、
− OR 2 ml Norm-Ject (ドイツ、Henke Sass Wolf GMBHからのRef: 4020.000V0)
− OR 5 ml Norm-Ject (ドイツ、Henke Sass Wolf GMBHからのRef: 4050.000V0)
である。
【００１４】
本発明による方法において、工程(i)は、SEQ No: 1のポリペプチドのライオケーキ(lyocake)を滅菌した精製水で水和し、溶解が完了するまで待つことによって行われる。この工程が10〜40℃の間の温度で行われるとき、ライオケーキの完全な溶解が得られるのに数秒〜2分が必要である。必要なら、2本の指でバイアルを挟み、1〜数秒間の緩い撹拌が適用され得る。この溶解工程は、より低い温度、例えば冷蔵庫中（1〜4℃）でも行われ得る。
【００１５】
特定の態様によれば、工程(i)は、0.5〜6 ml、好ましくは約1 mlまたは5 mlの容量の抗原性の水相が得られるように行われる。
特定の態様によれば、工程(i)は、抗原性の水相中のSEQ ID No: 1のペプチドの最終濃度が2〜20 mg/mlの間、好ましくは2〜10 mg/mlの範囲になるように行われる。
【００１６】
特定の態様において、工程(ii)は、最終の水相／モンタニド(登録商標) ISA 51の比が50/50〜40/60の間に含まれるように、第1のシリンジ中に抗原性の水相の1容量を、第2のシリンジ中にモンタニド(登録商標) ISA 51の少なくとも1容量を装填し、次いでコネクターによって2つのシリンジを架橋することによって行われる。バイアルから液体を移動させるための最も単純な方法は、シリンジと針を使用することである。しかしながら、この方法は、針で刺す危険性を有する。
別のより安全な解決策は、バイアルアダプター、例えばWest Pharmaceutical Services, Inc.またはPromepla (モナコ)からの13 mmまたは20 mmのバイアルアダプターを使用することである。例えば、工程(ii)は、次に記載のプロトコールに従って行うことができる。
【００１７】
・ブリスターパッケージによりバイアルアダプターを取り扱っている間に、バイアルアダプターパッケージからカバーを取り除く；
・バイアルにアダプターを取り付ける；ブリスターパッケージを用い、アダプターを取り扱う。スパイクが弾性の栓を貫通し、アダプターが適所にはめ込まれるまで、アダプターを押し下げることによりバイアルにアダプターを設置する。ブリスターパッケージを取り除き、破棄する；
・アダプターにシリンジをねじ込む；
・シリンジNo. 1に殺菌したモンタニド(登録商標) ISA 51 VGの1容量（一般的には1 ml）を抜き取り、脱気する。バイアルに栓をしたシリンジを保つ。
・新しいバイアルアダプターと第2のシリンジを用いて同じ操作を繰り返し、バイアルから抗原性の水溶液の1容量をシリンジNo. 2に抜き取る；
・アダプターからシリンジNo. 2を取り除き、コネクター上でそれを連結する；
・系から最大限の空気を排出するために、非常にゆっくりとプランジャーを押す（この工程は、シリンジNo. 2の代わりにシリンジNo. 1でも行うことができる）；
・系が乳化できるように、アダプターからシリンジNo. 1を取り除き、コネクターにそれをねじ込む。
【００１８】
好ましい態様によれば、工程(ii)で用いられるコネクターはI-コネクタ―である。そのようなコネクターの非限定的な例は次のとおりである。
− 特許出願EP 2 322 132 Alに開示された乳化で使用するためのGreen Peptide (日本)によって開発されたI-コネクター、
− Didanorm (フランス)からの参照コードDIDRACDLLFTのコネクター、
− Promepla (モナコ)からのI-コネクター(ref: ODG0015ST)、および
− Smiths medical (米国)からのI-コネクター(ref: MX494)、それは、約0.2 mlのプライミング(priming)容積および約5 cmの全長を有する、非-DEHP配合、ラテックスフリー、耐脂質、非-PVCコネクター。
【００１９】
既に述べたように、本発明の方法における乳化前工程（工程(iii)）は、少なくとも2回の遅いサイクルを含む。ここで、各サイクルは全配合物（抗原相＋アジュバント）を1つのシリンジから他のシリンジへ移し、次いで最初のシリンジに戻して、少なくとも6秒間維持する工程に相当する。好ましい態様において、この工程は3〜20サイクル、例えば3、4、5、6、7、8、9、10または20サイクルを含む。
これらの遅いサイクルは、それぞれ好ましくは6〜30秒間、より好ましくは8〜15秒間、さらにより好ましくは8〜12秒間、例えば8、9、10、11または12秒間続く。
注目すべきは、遅いサイクルが上記のように行われるとき、20回の遅いサイクルを含む典型的なプロトコールに反して、5回の遅いサイクルは乳化前工程として十分である。それゆえ、少なくとも乳化前工程が手動で行われるとき、工程(ii)のサイクルの回数は、好ましくは3〜8、より好ましくは4〜6、さらにより好ましくは5である。
【００２０】
本発明者らは、乳化前工程が正しく行われれば、速い移動サイクルがたとえ15〜20回より少なく行われたとしても、古典的な乳化工程が満足なエマルジョンを生成することを観察した。勿論、速いサイクルを、少なくとも20サイクル、少なくとも30サイクル、少なくとも40サイクル、60サイクルあるいはそれ以上のように、回数を増やして行うことができる。
先行するものにおいて、「急速な」または「速い」サイクルは、0.5〜2秒間、長くても2秒間、好ましくは1.5秒未満、より好ましくは1秒未満、さらにより好ましくは0.7秒未満（可能な限り速く）持続される。
【００２１】
本発明は、SEQ ID No: 1のVx006 ポリペプチドとモンタニド(登録商標) ISA 51とを含む油中水型エマルジョンを得るためのキットにも関する。
このキットは、SEQ ID No: 1の凍結乾燥したポリペプチドを少なくとも1 mg（例えば2 mgまたは10 mg）、モンタニド(登録商標) ISA 51を少なくとも1 ml（例えばモンタニド(登録商標) ISA 51を3 ml）、シリコン-およびゴム-フリーの2つのシリンジ、I-コネクターおよび特許請求の範囲のいずれかの請求項による方法を記載した使用説明書を含む。
キットは注射用精製水のバイアルおよび／またはバイアルアダプターも任意に含むことができる。エマルジョンを得た後、患者にワクチンを接種するための滅菌注射針も含まれ得る。キット中のシリンジは、例えば2 mlまたは5 mlシリンジであり得る。凍結乾燥されたVx006ポリペプチドは、滅菌水中のVx006の溶液で任意に置き換えられ得る。
【００２２】
本発明のもう1つの観点は、SEQ ID No: 1のポリペプチドとモンタニド(登録商標) ISA 51とを含む油中水型エマルジョンである。このエマルジョン中のペプチドの濃度は、1〜10 mg/mlの範囲にある。
【００２３】
エマルジョンは、DvXを含む異なるパラメータによって特徴付けられ得る。ここで、Xは0〜100の間に含まれ、それは試料X％容量についての最大粒子径（直径）である。例えば、Dv 50は、サンプル量の50％がそれ以下の最大粒子直径で存在し、Dv 90は、サンプル量の90％がそれ以下の最大粒子直径で存在する。
本発明によるエマルジョンの好ましい態様において、Dv 50は3μm未満、好ましくは2μm未満、より好ましくは約1.2μmである。そのようなエマルジョンに対して、Dv 90は通常5μm未満、好ましくは3μm未満、より好ましくは2μm未満である。
【００２４】
本発明は、以下の図および実施例によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図1は溶液中のVx006である。A：注射用蒸留水中；B：PBS緩衝液中；C：NaCl 0.9% 生理食塩水緩衝液中。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２６】
実施例は、次の材料と方法を用いて行われた。
ペプチド
ペプチドはBACHEM(バーゼル、スイス)によって合成された。Vx006 (SEQ ID No: 1)は、凍結乾燥前にアンモニウム溶液で調製された。
モンタニド(登録商標) ISA51 VG
モンタニド(登録商標) IS A51 VGはバッチ番号T 13420でSEPPIC(カストル、フランス)により供給された。
【００２７】
Micelle kunおよび乳化デバイス
Micelle kun(EP 2 322 132 Alに記載)の試作品をSEPPIC (カストル、フランス)で用いた。2mlのシリコーンフリーのシリンジはBBraun (参照コード4606701V)により製造され、市販されている。I-コネクターはディダクティック(didactic) GROUP (エテヌ、フランス) (参照コードRACDLLFTF)により製造され、市販されている。
【００２８】
エマルジョンの特徴付け
エマルジョンを特徴付けるために、2つの試験、滴下試験と液滴サイズの測定を共通して用いる。
滴下試験：滴下試験はエマルジョンのタイプ：W/O型（油相中の水相の液滴）またはO/W型（水相中の油(アジュバント)の液滴）を検査することができる。透明な水を有するビーカー中、水の表面にエマルジョンの１滴を置き、緩やかに撹拌する。
もしエマルジョンの液滴が表面に留まれば、それはW/O型エマルジョンである。
もしエマルジョンが水中に分散すれば、それはO/W型エマルジョンである。
【００２９】
液滴サイズ：分散相中の液滴サイズは、レーザー散乱粒度分布計によって検査された。エマルジョンの粒径はMalvern Mastersizer Sで測定された。
平均粒径は、
− Dv 50は、粒子の容量の50％がDv50より低いサイズを有することを意味する。
− DV 90は、粒子の容量の90％がDv90より低いサイズを有することを意味する。
【００３０】
実施例1：SEPPIC推奨プロトコールを用いるプラセボの乳化
モンタニド(登録商標) ISA 51 VGを乳化するには生理食塩水相を必要とする。生理食塩水緩衝液（例えばPBSとNaCl 0.9%)を使用すれば、精製水より希薄なエマルジョンを製造できることが知られている。
このことを実証するため、発明者らは、モンタニド(登録商標) ISA 51 VGを用いて5人の操作者によってそれぞれ製造されたエマルジョンを、精製水かNaCl 0.9％ 生理食塩水溶液のいずれかで比較した。プラセボ溶液の0.7 mlをシリコーンフリーのシリンジに、モンタニド(登録商標) ISA 51 VGの0.7 mlを第2のシリンジに装填した。I-コネクターに2つのシリンジを接続後、古典的プロトコール、すなわち20回の遅いサイクル、続いて40回の急速なサイクルを適用した。分散相中の液滴サイズをレーザー散乱粒度分布計によって検査した。エマルジョンの粒径はMalvern Mastersizer Sを用いて測定された。
【００３１】
表1は、水よりNaCl 0.9％の方がDv50およびDv90は有意に低いことを示している。モンタニド(登録商標)を有するNaCl 0.9％のエマルジョンで測定されたDv50およびDv90は、平均で0.5および1.1μmであったのに対して、水でのエマルジョンでは0.8および1.7μmであった。
さらに重要なことには、4℃で24時間後、モンタニド(登録商標)を用いたNaCl 0.9％のエマルジョンで測定されたDv50およびDv90は、水を用いたエマルジョン中で3.6および8.3μmであるのに対して、平均でそれぞれ1.1および1.5μmであったので、NaCl 0.9％の生理食塩水緩衝液で調製されたエマルジョンは、滅菌水を用いたエマルジョンよりずっと安定であった。これらの結果は、モンタニド(登録商標) ISA51 VGの製造者、SEPPICの推奨に合致している。
【００３２】
【表１】
0006630274.tif 000002
表1：精製水またはNaCl 0.9％ 生理食塩水緩衝液を用いてISA51 VGで調製されたエマルジョンの特徴 (ND：試験せず)
【００３３】
実施例2：Vx006の可溶化
Vx006はBACHEM (バーゼル、スイス)により製造された。臨床試験のため、GMPグレードで、10 mgの凍結乾燥ペプチドを含むバイアルとして製造された。
患者にワクチンを接種するため、1 mlの溶媒がライオケーキに加えられ、ペプチドを再懸濁させ、次いで溶液状態のペプチドの0.7 mlをシリコーンフリーのシリンジに、モンタニド(登録商標) ISA51VGの0.7 mlを第2のシリンジに装填する。次いで、乳化プロトコールのために、I-コネクターに両方のシリンジを接続する。
【００３４】
ペプチドの溶解性（例えば、Sigma-Aldrichtのウエブサイトに開示されている）を予測するのに、次の化学的ルールがあるけれども、実際には、ペプチドを可溶化することはかなりの難問であり得る。
1. 残基の全てが極めて疎水性(W、I、L、F、M、VまたはY)である極端な場合を除いて、5残基より短いペプチドは一般的に水性媒体に可溶性である。
2. ＞25％の荷電残基(E、D、K、RおよびH)ならびに＜25％の疎水性残基を含む親水性ペプチドも、荷電残基が配列全体にわたって満遍なく分布していれば、一般的に水性媒体に溶解する。
【００３５】
一般的に、ペプチドは0.1％ TFA／水および0.1％ TFA/ACN溶媒系で精製される。それゆえ、緩衝されていないか、または不十分に緩衝されている水溶液中にペプチドが溶解されていれば、生じるペプチド溶液は酸性であり得る。
他の可溶化手段を試みる前に、溶液のpHはおよそ中性でなければならない。酸性ペプチド(E+D残基＞K+R+H残基)および塩基性ペプチド(R+K+H残基＞E+D残基)はともに、酸性pHより中性pHでより可溶性である。
【００３６】
3. 50％〜75％の疎水性残基を含む疎水性のペプチドは、たとえ配列中に25％の荷電残基を含んでいても、水溶液中に不溶性であるか、部分的に溶けるだけであり得る。
DMF、アセトニトリル、イソプロピルアルコール、エタノール、酢酸、4〜8M GdnHClまたは尿素、DMSO (配列がC、WまたはMを含でいなければ)およびその他の同様な有機溶媒のような、より強力な溶媒の極少量中にこれらのペプチドをまず溶解し、次いで撹拌した水性緩衝溶液にその溶液をゆっくりと加える（滴下する）ことが最も良い。生じるペプチド溶液が混濁を示し始めたら、溶解限度に達した可能性があり、続行することは無駄であろう。
【００３７】
4. ＞75％の疎水性残基を含む極めて疎水性のペプチドは、一般的に水溶液中に溶解しないであろう。一般的に、これらのペプチドは、TFAおよびギ酸のような極めて強力な溶媒中にまず溶解することを要し、水性緩衝溶液中に加えられると、沈殿する。最終のペプチド溶液は、有機溶媒または変性剤のより高濃度を必要とするかもしれず、それは生細胞を含む生物学的研究に適用できないかもしれない。
【００３８】
5. S、T、E、D、K、R、H、N、QまたはYを極めて高い(＞75％)割合で含むペプチド配列は、広範な分子間水素結合ネットワークを形成することができ、高濃度の水溶液中でゲルを形成する傾向がある。これらのペプチドは、工程#3と同様に処理されなければならないかもしれない。
SEQ ID No: 1のVx006ペプチドは、15の疎水性残基（50〜75％の間）、4つの荷電残基（＜25％）、および上記のポイント5で挙げたリストの16の残基（＜75％）を含むので、理論的には、それは上記のポイント3に記載の処理を必要とするが、水中に部分的に溶解し得る。
【００３９】
SEPPICの推奨ならびにエマルジョンは（DMSO等の溶媒の使用を避けて）ヒトに投与するために調製されるという事実、上記の実施例1で示された結果および溶解性の予測に従って、Vx006をまず生理食塩水緩衝液中に希釈した。
2つの生理食塩水溶媒、NaCl 0.9％およびPBSを試験した。どちらの場合も、溶液中のペプチドは混濁し、可溶化は完全でなかった。さらに重要で驚くべきことには、数分後に、溶液は粘性になり、最終的にゲルを形成し、モンタニドを用いてペプチドを乳化することができなかった。
さらに、Seppicによって開発され、ヒトの注射およびモンタニドでの乳化に適したいくつかの溶媒の添加が、Vx006の製造開発の間に試験された。これらの溶媒は何れもVx006の可溶化に影響を及ぼさなかった。
【００４０】
一連の不成功の試験後に、発明者らはペプチドが注射用蒸留水に完全に溶解し、得られる可溶化されたペプチドのpH（pH約7）がヒトへの注射に適合していることを見出した。
それゆえ、ライオケーキを少量の精製水（1〜5 ml）で水和し、完全に溶解するまで（10秒〜数分）、室温（15〜25℃）で放置した。必要に応じて、溶解を早めるため、バイアルを緩やかにゆすることもできる。溶解は、低温（0〜10℃）でも行われ得る。溶液中のペプチドは完全に澄明であり、ゲルの形成は観察されなかった（図１）。
【００４１】
実施例3：モンタニド中でのVx006のエマルジョン化
次いで、精製水中10 mg/ml濃度のVx006の溶液を、モンタニド(登録商標) ISA51VGを用いて乳化した。まず初めに、溶液中のペプチド 0.7 mlをシリコーンフリーのシリンジに装填し、モンタニド(登録商標) ISA51VG 0.7 mlを第2のシリンジに装填した。両方のシリンジをI-コネクターに接続したあと、SEPPICによって推奨されている定型的なプロトコール、すなわち、遅いサイクル（4秒）20回、続いて急速なサイクル40回を適用した。エマルジョンを調製するために訓練された4人の操作者が、同一のプロトコールを適用した。
【００４２】
次いで、エマルジョンを評価するために滴下試験を行った。表2に示されるように、エマルジョンは、乳化の約25％で、油中水型（W/O）ではなくて、水中油型（O/W）のエマルジョンであった。
さらに、たとえペプチドを5倍に希釈（最終濃度2 mg/ml）しても、結果は同じのままであり、ペプチドの乳化能力は、ペプチドの濃度に依っているのではなくて、Vx006ペプチドの固有の特性に依っていることを示した。
水中油型エマルジョンはワクチン接種においてアジュバントの役割を果たさないので、そのような変動は臨床試験との関連で受け入れられない。そこで、発明者らは、Vx006を乳化するための確固としたプロトコールを定めるために、いくつかのパラメータを変更した。
【００４３】
【表２】
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表2：古典的なプロトコールを用いてのモンタニド ISA 51中でのVx006の乳化
【００４４】
操作者のバイアスを避けるため、制御された乳化工程を行うために考え出された自動装置である「Micelle kun」(EP 2 322 132 Al)を用いて、次の試験を行った。このデバイスの試作品はSEPPICによって提供された。
3つの遅いサイクルスピード、1サイクルが12秒に相当する「0」、1サイクルが6秒に相当する「5」および1サイクル当り4秒である「10」が試験された。次いで、20回の遅いサイクルと40回の急速なサイクルが適用された（「Micelle kun」は1サイクル当り0.7秒の一定スピードで急速なサイクルを行う）。最終的に、ペプチド濃度10 mg/mlおよび2 mg/mlの両方が試験された。
【００４５】
表3の結果は、「Micelle kun」はスピード「0」と「5」でW/Oエマルジョンを常に製造することができるが、スピード「10」ではできなかったことを示している。このことは、乳化前工程の間は極めて遅いサイクルを適用することの重要性を示している。
「Micelle kun」の供給業者は、当初は特有の「低」スピードを有する「Micelle kun」を製造することを構想したが、Vx006のような特定のペプチドを含むあらゆるペプチドを乳化するのに用いることができることを保証するために、SEPPICは「低」スピードが変化し、12秒もの長いサイクルに達することができることを要求したことに、留意することが重要である。
事実、SEPPICからの専門家は、SEQ ID No: lのペプチドと同じぐらい前-乳化工程のパラメータに敏感であるペプチドを扱う操作をしていなかった。
【００４６】
【表３】
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表3：Micelle kunを用いての種々の遅いサイクルスピードでのモンタニド(登録商標) ISA 51中でのVx006の乳化
【００４７】
病院でのワクチンの調製を単純化するため、本発明者らは、W/O型エマルジョンを得るために必要な遅いサイクルの最小回数を規定することを決めた。「Micelle kun」を用いて、遅いサイクルの回数を減らした。「Micelle kun」を用いて、Vx006とモンタニド(登録商標) ISA 51 VGとのW/O型エマルジョンを毎回得られるプロトコールは、極めて低スピード（スピード「0」）で5サイクル、続いて高スピードで40サイクルである（表4）。遅いサイクルが手動で極めて低スピード（1サイクル当り少なくとも10〜15秒）で行われるとき、3回だけの遅いサイクルで十分であり得ることは、注目すべきことである。
【００４８】
【表４】
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表4：遅いサイクルの最小回数の決定
【００４９】
最後に、規定されたプロトコールの信頼性を試験するため、3人の操作者が5回の極めて遅いサイクルと40回の急速なサイクルを適用した。
表5は、エマルジョンの100％がW/O型で、希薄であり、24時間安定であったことを示している。興味深いことに、Vx006でのエマルジョンは、ペプチドのないエマルジョンより安定である（以下の表5のデータと表1のデータとの比較）。
【００５０】
【表５】
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表5：手動で行われたプロトコール5＋40の信頼性
【００５１】
参考文献
Ascarateil and Koziol: New equipment optimized for emulsified vaccine preparation in the hospital. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2013 l(Suppl 1):P196.
【図１】
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【配列表】
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