(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子の物理的特性の決定を可能にするナノ粒子スクリーニングチップであって、複数の領域に分割された作用面を有する基板を備え、
（１）各領域は表面エネルギー成分（ｄ、ｂ、ａ）で規定される異なる表面特性を示し、各領域の表面の全自由エネルギーγＴＯＴは
γＴＯＴ＝γＬＷ＋２（γ＋γ−）０．５で定義され、
各成分は、
γＬＷ＝分散成分＝ｄ
γ＋＝電子受容体成分＝ｂ、
γ−＝電子供与体成分＝ａであり、
（２）各領域は複数の副領域を含み、各副領域は、異なる開口サイズ（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、...）を有するサブミクロンの穴または伸びた溝のアレイを含む、ナノ粒子スクリーニングチップ。
【請求項２】
前記領域の数は５〜１００個である、請求項１に記載のナノ粒子スクリーニングチップ。
【請求項３】
前記副領域の数は２〜１０個である、請求項１または２に記載のナノ粒子スクリーニングチップ。
【請求項４】
前記基板は、高度に平坦な基板である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子スクリーニングチップ。
【請求項５】
一次元誘電体ミラー、または、貴金属が前記基板上に堆積されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子スクリーニングチップ。
【請求項６】
少なくとも１つの領域の表面特性は、少なくとも１つの任意で官能化されたポリマーの１つ以上の層をプラズマ堆積させることで改変されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ粒子スクリーニングチップ。
【請求項７】
前記基板の表面特性は、高分子電解質の自己集合化を使用して更に改変されている、請求項６に記載のナノ粒子スクリーニングチップ。
【請求項８】
異なる表面特性を示す前記領域の多数は、疎水性を増加させるために、表面親水性層を有する１つ以上の疎水性層を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ粒子スクリーニングチップ。
【請求項９】
ナノ粒子をその物理的特性を決定するためにスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子スクリーニングチップの作用面上に溶液／懸濁液中のナノ粒子を供給する工程；
（ｂ）時間ｔの間、前記作用面上で溶液中の前記ナノ粒子をインキュベートし、その後に前記ナノ粒子スクリーニングチップをリンスする工程；および
（ｃ）前記ナノ粒子スクリーニングチップを光学顕微鏡検査によって分析することにより、前記ナノ粒子の物理的特性を決定する工程を含む、スクリーニング方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）において、インキュベーション時間ｔは、２秒〜６０分である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）および／または工程（ｂ）において、前記ナノ粒子を含有する溶液または懸濁液のｐＨおよび／または塩濃度が調整される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ナノ粒子の物理的特性の決定は、静電相互作用および下記２つの表面エネルギー成分を含む、表面エネルギーバランスを決定することにより、前記ナノ粒子の表面特性を算出することを更に含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法：
【数１】
0006684827.tif 000010
式中、ＡＢ（ＬＷ）は、酸−塩基（リフシッツ−ファンデルワールス）相互作用を表し、γｎ（ＡＢ）、γｌ（ＡＢ）、γｓ（ＡＢ）（γｎ（ＬＷ）、γｌ（ＬＷ）、γｓ（ＬＷ））は、ナノ粒子（ｎ）、溶液／懸濁媒体（ｌ）および領域の固体表面(ｓ)の表面エネルギーの酸塩基（リフシッツ−ファンデルワールス）成分である。
【請求項１３】
工程（ｃ）において、作用面の領域および副領域におけるナノ粒子の存在および位置の光学的な決定を可能にする専用の読取装置にナノ粒子スクリーニングチップが挿入され、
前記読取装置は、光源と；前記ナノ粒子スクリーニングチップを前記光源の前に保持するように構成された保持ポートと；前記作用面の反射像の測定を可能にする顕微鏡とを備える、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子スクリーニングチップ上でナノ粒子の存在および更なる物理的特性を光学的に決定するように構成されたナノ粒子スクリーニングチップ読取装置であって、
光源と；前記光源に対して前記ナノ粒子スクリーニングチップを保持するように構成された保持ポートと；光検出器および／または撮像装置とを備える、ナノ粒子スクリーニングチップ読取装置。
【請求項１５】
前記撮像装置は、作用面全体の反射像を測定できる顕微鏡である、請求項１４に記載のナノ粒子スクリーニングチップ読取装置。
【請求項１６】
工業製造プロセスのための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子スクリーニングチップ、請求項１４または１５に記載のナノ粒子スクリーニングチップ読取装置、または、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１７】
前記工業製造プロセスはナノメディシンの分野内のものである、請求項１６に記載のナノ粒子スクリーニングチップの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的にナノ粒子に関し、特に、ナノ粒子の所定の特性を迅速に決定するための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子（ＮＰ）とも呼ばれる純粋なナノ材料（ＮＭ）の生物システムとの相互作用を理解・制御するためには、それらを広範に特性解析（キャラクタライズ）することが肝要である。実際、ナノ材料は、多くの分野で利点があるが、生物に悪影響を与え得ることが明らかになってきている。
【０００３】
ナノ材料表面の疎水性は、例えば、細胞の取り込み、毒性、ナノ材料に対する免疫応答に重要な役割を果たすことが報告されている。また、表面疎水性が高いナノ材料は重度の溶血をもたらすことが示されている。表面疎水性を低減させたナノ材料は血漿タンパク質の吸着に影響を及ぼすとの情報もある。さらに、ナノ粒子ベースのワクチンアジュバントの開発において、ナノ材料の疎水性は免疫細胞との相互作用を変化させる重要な要素であると言われている。
【０００４】
信頼性のある再現可能なデータの決定が望ましい主要な特性は、これらは数例に過ぎないが、（１）ナノ材料のサイズおよびサイズ分布；（２）表面特性（表面電荷、疎水性）；および（３）光学的性質、機械的性質、磁気的性質であると思われる。
【０００５】
特に、表面電荷および疎水性特性は、ナノ材料の機能性および毒性に直接影響することが示されている。
【０００６】
ナノ材料特性の特性解析が可能な特性解析技術は複数存在するが、単一ステップで表面特性およびサイズ分布を決定できる方法は現在１つもない。
【０００７】
ナノ材料のサイズおよびサイズ分布は、光学／撮像技術の組み合わせを用いて決定することができるが、表面特性は、表面分析技術（ＸＰＳ［Ｘ線光電子分光法］、ＴｏＦ−ＳＩＭＳ[飛行時間型二次イオン質量分析法]）で決定することができる。これらの方法は非常に感度が高いものの、残念なことに、多大な時間を必要とし、また、高価な設備と専門知識を必要とする。
【０００８】
非常に多くの分野で消費者製品中のナノ材料が絶えず増加し、また、ナノ材料ベースの新規なナノメディシンが多数存在する。そのため、特定サイズ、表面化学、疎水性などのナノ材料特性の迅速な特性解析を可能にする新しいツールを早急に開発する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明は、ナノ粒子の複数の特性、特にサイズおよび好ましくはサイズ分布、表面電荷および／または酸性度および／または塩基性、疎水性および／または親水性を迅速かつ容易に同定および／または定量するための適切な装置およびスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明は、第１の態様において、ナノ粒子の物理的特性を決定するように構成されたナノ粒子スクリーニングチップであって、複数の領域（ａｒｅａ）に分割された作用面（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ）を有する基板を備え、各領域は表面エネルギー成分（ｄ、ｂ、ａ）で規定される異なる表面特性を示し、各領域の表面の全自由エネルギーγＴＯＴは
γＴＯＴ＝γＬＷ＋γＡＢ＝γＬＷ＋２（γ＋γ−）０．５
で定義され、
各成分は
γＬＷ＝分散成分＝ｄ、
γＡＢ＝酸塩基成分（γ＋＝電子受容体成分＝ｂ、γ−＝電子供与体成分＝ａで表される）であり、
各領域は複数の副領域（ｓｕｂ−ａｒｅａ）を含み、各副領域は、異なる公称開口サイズ（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、...）を有するサブマイクロメートルの穴または溝のアレイを含む、ナノ粒子スクリーニングチップを提案する。
【００１１】
本発明のナノ粒子スクリーニングチップにおいて、領域の数は５〜１００個が好ましく、１０〜５０個がより好ましく、副領域の数は２〜１０個が好ましく、３〜６個がより好ましい。
【００１２】
もちろん、上記領域および副領域の数は、所望される場合に（例えば、特に膨大な種類のナノ粒子を有する複雑なサンプルをより微細に分析するために）、上記の数よりも多くなるように選択することができる。しかしながら、領域および／または副領域の数が多いほど、捕捉および処理すべき情報の数は増える。
【００１３】
ナノ粒子スクリーニングチップの基板は、好ましくはガラスまたはシリコンから選択される高度に平坦な基板であることが好ましい。反射モードの暗視野顕微鏡法（下記参照）では、基板は更に、一次元誘電体ミラーまたは平坦な金や他の貴金属を基板上に堆積させる等により反射率が高くなるよう選択される。以下に示すように、上記決定のための、いわゆる暗視野セットアップが特に有利である。そのため、高反射性基板が特に好ましい。
【００１４】
本発明のナノ粒子スクリーニングチップでは、少なくとも１つの領域の表面特性（例えば、表面電荷、疎水性）が、対応する特性を有するナノ粒子を捕捉するように改変されている。このような表面特性の改変は、プラズマまたはイオンビーム処理、湿式化学法、ディップコーティング、スピンコーティング、自己組織化などの任意の適切な手段によって行うことができる。局所的な表面特性を改変するための特に好ましい手段は、制御された表面特性を有する少なくとも１つの任意に官能化されたポリマーの１つ以上の層をプラズマ堆積させることによるものである。非限定的な例は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）である。そして、例えば、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）（ＰＤＤＡ）、ポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＳＳ）や表面特性改変に通常使用される他の高分子電解質などの高分子電解質の分子自己集合化を使用することによって、基板の表面特性を微調整し、かつ適切に改変することができる。本発明の文脈において、これらのポリマーまたは高分子電解質が、ナノ粒子をそれらの物理的特性に応じて識別するのに適した表面特性を得るために、所望のとおりに組み合わせられ、あるいは必要とされ得ることは明らかである。
【００１５】
下記でより詳細に示されるように、本発明者らは、疎水性表面は、水性媒体中に含まれる疎水性ナノ粒子を、それらの疎水性に基づいて引き寄せないことがあることを発見した。驚くべきことに、疎水性層を親水性化合物の薄い（＜＜１００ｎｍ）表面層で覆うことによって疎水性ナノ粒子に対する全体的な親和性が著しく増加する。したがって、本発明に係るナノ粒子スクリーニングチップにおいて、領域のいくつかは、１つ以上の疎水性層を含む疎水性領域であり、その疎水性挙動を増加させる表面親水性層を更に含み得る。
【００１６】
第２の態様では、本発明は、ナノ粒子をその物理的特性を決定するためにスクリーニングする方法であって、
（ａ）本明細書に記載のナノ粒子スクリーニングチップの作用面上に溶液／懸濁液中のナノ粒子を供給する工程；
（ｂ）時間ｔの間、作用面上で溶液中のナノ粒子をインキュベートし、好ましくはその後にナノ粒子スクリーニングチップをリンスする工程；および
（ｃ）ナノ粒子スクリーニングチップを顕微鏡検査、好ましくは光学顕微鏡検査によって分析することにより、ナノ粒子の物理的特性を決定する工程を含む、スクリーニング方法を開示する。
【００１７】
本発明の第１の利点は、工程（ａ）におけるナノ粒子の供給が、所望によりまたは必要に応じて希釈後に、懸濁液または（コロイド）溶液（本発明の文脈においてナノ粒子が含まれ得る元の流体を含む）中で行われ得ることである。そのため、多くの用途では、複雑または時間の掛かる分析サンプル調製が不要である。適切な流体は、地表水、地下水、土壌浸出水、空中サンプルなどの環境から直接採取されるサンプル；尿、血液、血清、汗、涙、滑液、唾液などの動物または人体から直接採取されるサンプル；オイル、ジュースおよび他の飲料などの植物から直接採取されるサンプル；食品や、塗料、添加剤、潤滑剤、医薬品などの人造製品から直接採取されるサンプル；などの任意のサンプルである。所望によりまたは必要に応じて、これらのサンプルは適切な溶媒で希釈してもよい。好ましい用途では、ナノ粒子ベース製品をその工業製造プロセス中に定期的にスクリーニングする品質管理システムとして上記装置を使用し、ナノ材料の表面特性および平均サイズを確認する。これはナノメディシン製品の場合に特に興味深い。
【００１８】
工程（ｂ）におけるインキュベーションの目的は、ナノ粒子が作用面上に広がり、本明細書で更に記載するようにそれらの物理的特性に対応する領域および副領域に到達するのに十分な時間を、ナノ粒子に与えることである。したがって、良好な結果を得るために実際に必要とされる当該時間ｔは、所定の特性、中でも、ナノ粒子のサイズ／密度、ナノ粒子の溶媒／懸濁媒体との親和性、溶媒／懸濁媒体の粘度、温度などに応じて変動し得る。いずれにしても、適切なインキュベーションに必要な時間ｔは、かかる時間がナノ粒子の様々な表面との親和性を適切に規定する時間であることを知っている当業者により容易に決定され得る。多くの場合、時間ｔは２秒〜６０分であるが、より一般的には５秒〜４５分である。他の場合、例えば、特に媒体が粘性であったりナノ粒子が媒体と高い親和性を有する場合、インキュベーション時間ｔはより長くなるように（例えば最大２時間、またはそれ以上）選択され得る。
【００１９】
本明細書に提示される方法において、ナノ粒子を含有する溶液または懸濁液のｐＨおよび／または塩濃度は、工程（ａ）および／または工程（ｂ）において調整されることが好ましい。
【００２０】
以下にさらに説明するように、ナノ粒子の物理的特性の決定は、下記酸−塩基およびリフシッツ−ファンデルワールスの表面自由エネルギー成分（それぞれ、ΔＧＡＢａｄｈおよびΔＧＬＷａｄｈ）を決定することによってナノ粒子の表面特性を算出することを含み得る：
【数１】
0006684827.tif 000002
式中、ＡＢ（ＬＷ）は、酸−塩基（リフシッツ−ファンデルワールス）相互作用を表し、γｎ（ＡＢ）、γｌ（ＡＢ）、γｓ（ＡＢ）（γｎ（ＬＷ）、γｌ（ＬＷ）、γｓ（ＬＷ））は、ナノ粒子（ｎ）、溶液／懸濁媒体（ｌ）および領域の固体表面(ｓ)の表面エネルギーの酸塩基（リフシッツ−ファンデルワールス）成分である。
【００２１】
ナノ粒子の物理的特性の決定は、顕微鏡検査などの任意の適切な方法によって、スクリーニングチップ上のそれらの位置を決定することにより行うことができる。ある１つの領域内での位置は、ナノ粒子の表面特性（疎水性および電荷）を反映するが、特定の副領域内での位置はサイズおよび／またはサイズ分布の推測を可能とする。好ましくは、工程（ｃ）において、作用面の領域および副領域におけるナノ粒子の存在および位置の光学的な決定を可能にする専用の読取装置にナノ粒子スクリーニングチップを挿入する。この読取装置は、光源と；ナノ粒子スクリーニングチップを光源に対して保持するように構成された保持ポートと；作用面の画像、好ましくは暗視野顕微鏡による作用面の反射画像の測定を可能にし、より好ましくはＣＣＤカメラなどのカメラを更に組み込んだ顕微鏡とを備える。
【００２２】
本発明の更なる態様および実施形態は、本明細書に記載のナノ粒子スクリーニングチップ上でナノ粒子の存在および更なる物理的特性を光学的に決定するように構成されたナノ粒子スクリーニングチップ読取装置に関する。このような読取装置は、一般的に、光源と；光源の前でナノ粒子スクリーニングチップを保持するように構成された保持ポートと；（反射）光検出器および／または撮像装置とを備える。特定の一実施形態では、読取装置は作用面全体の反射像の測定を可能とする顕微鏡を備え、好ましくは、当該顕微鏡は暗視野構成で、有利にはＣＣＤカメラと組み合わせて、操作される。
【００２３】
この光学読取装置は、所定の視野（Ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  Ｖｉｅｗ；ＦｏＶ）および開口数（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ａｐｅｒｔｕｒｅ；ＮＡ）によって特徴付けられることが好ましい。ＮＡは検出光ビームの入射角を決定する。所定のＮＡに対して、平坦な領域（回折格子（グレーティング）がなく構造化されていない）は光を反射せず検出器で黒く見える。これに対して、回折格子を有する領域では、回折格子の幾何学的パラメータと穴（ナノ材料ありまたは無し）の屈折率の関数として、所定の波長で光反射される。
【００２４】
まとめると、本発明は、吸着キネティクスの研究を通じてナノ粒子特性の測定を可能にする方法および装置を、（とりわけ）提供するものであり、また、これは非常にエレガントかつ迅速に行われるものであると言える。
【００２５】
実際、平坦な表面の場合とは対照的に、現在、ナノ粒子の表面特性の決定は良好に行われておらず、例えば、様々な濃度での色素（Ｂｅｎｇａｌ  Ｒｏｓｅ）の吸着測定と、吸着色素の吸着平衡濃度の測定とを介して行われている。ｃを未吸着色素の濃度、ｃ０を総色素濃度としたとき、所定数のナノ粒子に対して様々なｃ０濃度について傾き（ｃ−ｃ０）／ｃ０を測定すると、当該傾きは疎水性の相対値を与える。しかし、この方法は全ての疎水性範囲ではうまくいかず、またＳＩ単位の疎水性値を与えない。
【００２６】
別の測定は、様々な疎水性の充填剤を用いたカラムに対するナノ粒子の吸着を測定することによって行うことができる。この場合も、ナノ粒子表面の表面エネルギー成分の絶対値は得られない。
【００２７】
これに対して、本発明では、ナノ粒子の例えば１６種類の表面への吸着率が自由エンタルピーに比例することを知って、ナノ粒子の表面エネルギー成分γＬＷおよびγＡＢを、拡張ＤＬＶＯ理論に基づく全自由エンタルピー計算のマルチパラメータ・フィッティングによって好ましく算出する。したがって、既知の表面エネルギー成分を有するこれらの１６種類の表面への吸着率を測定し、ナノ粒子表面に対する４つの未知数であるγＬＷ；γ＋およびγ−（γＡＢの２成分を表す）；ならびに自由エンタルピーに対する吸着率の傾きｓを用いて、吸着の自由エンタルピーを算出する。なお、静電相互作用は、存在する場合、表面およびナノ粒子のゼータ電位を測定して知ることができる。以下、添付の図面を参照して本発明の好適な実施形態について説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ナノ粒子スクリーニングチップの一実施形態の概略斜視図である。
【図２】ナノ粒子含有流体を供給中のナノ粒子スクリーニングチップの更なる一実施形態の概略断面図である。
【図３】ナノ粒子スクリーニングチップの更なる実施形態の概略図であり、異なる分散特性、酸−塩基特性および電荷特性を有する複数の領域（図３（Ａ）中、Ａ０１・・・で示されている）が示され、各領域の内部には異なる穴サイズの副領域（領域Ａ０１、Ａ０２およびＡ０３の内部に３つの長方形として示され、図示されていないが、各領域は同じかまたは同等の副領域を有することが好ましい）が存在する。
【図４】疎水性ナノ粒子の疎水性表面への結合を妨げる好ましくない条件、および、これらの条件をより好適化する方法の概略図である。
【図５】ナノ粒子の表面に対する結合キネティクスを示す図であり、曲線の傾きs（直線）は表面自由エネルギーバランスΔＧａｄｈに比例する。
【図６】開口３００ｎｍの溝を有する基板上の２００ｎｍのナノ粒子のＳＥＭ写真（Ａ）、および、開口１００ｎｍの溝を有する基板上の２００ｎｍのナノ粒子のＳＥＭ写真（Ｂ）である。
【図７】特に本発明のナノ粒子スクリーニングチップを用いて本明細書に記載の方法を実施するために使用可能な読取装置の概略セットアップである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明のさらなる詳細および利点は、添付の図面を参照して、いくつかの非限定的な実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００３０】
図１〜３に示すように、上記方法は、異なる表面特性を有する複数の領域１２が設けられた（作用）面１１を有する光反射性基板１０を備えるスクリーニングチップ１（検知チップとも呼ばれる）を使用することが好ましい。
【００３１】
図１および図３に概略的に示すように、各領域１２は、表面自由エネルギー成分の所定の値によって特徴付けられ、固体表面の全自由エネルギーは
γＴＯＴ＝γＬＷ＋γＡＢ＝γＬＷ＋２（γ＋γ−）０．５
で定義され、
各成分は
γＬＷ＝分散（リフシッツ−ファンデルワールス）成分＝ｄ、
γ＋＝電子受容体成分＝ｂ、
γ−＝電子供与体成分＝ａである。
【００３２】
このように、表面の各単一領域１２を３つの成分（トリプレットとも呼ばれる）（ｄ、ｂ、ａ）で規定することができる。そのため、検知チップ１の表面１１は、複数の領域１２によって特徴付けられ、各領域は異なる表面特性、すなわち表面エネルギー成分（ｄ、ｂ、ａ）を示す。
【００３３】
よって、懸濁液またはコロイド溶液中のナノ材料（ＮＭ）２０は、それらの表面特性に応じて、表面エネルギー値の等価なトリプレットによって特徴付けられる。
【００３４】
したがって、トリプレット（ｄ、ｂ、ａ）は任意の所定のＮＭ、（ｄ、ｂ、ａ）ＮＭに対して規定することができる。
【００３５】
図２に示すように、例えば液体セルによって検知チップの表面１１に沿って（水平矢印３０で示されるように）流れるＮＭ２０は、それらの表面特性（ｄ、ｂ、ａ）ＮＭに応じて、それぞれの領域Ａ＝Ａ（ｄ、ｂ、ａ）によって引き寄せられる（表面１１の方向を指す矢印で図示される）。異なる表面特性を有するＮＭは、引き寄せられず、更には反発（表面１１から離れる方向を指す矢印）されるため、それらの表面特性（ｄ、ｂ、ａ）ＮＭに対応する領域に到達するまで液体内に留まる。
【００３６】
この方法により、対応する表面特性を有する異なる領域に対するＮＭの親和性に応じて、ＮＭの（ｄ、ｂ、ａ）トリプレットが再構成されることになる。
【００３７】
さらに、センサチップ上の各領域１２は、図３（Ｂ）に示すように、サブミクロンの穴または溝１５のアレイで特徴付けられる、異なるより小さい領域（副領域１３）で構成される。各副領域１３は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、...、Ｓｎなどの異なる開口サイズＳを有する穴または溝１５で特徴付けられる。
【００３８】
各副領域１３は、特定の入射角および偏光角で可視光ビームが照射された際の特定の光学応答によって特徴付けられる。ナノ回折格子により、入射光は、ＮＭを含むかまたは含まない穴または溝１５の屈折率の関数として所与の波長で回折される。よって、回折光の波長を測定することによって、穴または溝１５内のＮＭ２０の存在をモニターすることができる。
【００３９】
したがって、ＮＭ２０は、チップ１の表面１１に沿って輸送されている間、疎水力または他の力によって表面に向かって引き寄せられる（または引き寄せられない）。引き寄せられたＮＭの中でも、穴の開口サイズＳよりも小さい直径を有するもののみが、穴または溝１５内に捕捉される。穴に捕捉されたＮＭは、ナノホールの屈折率を局所的に変化させ、回折格子の光学応答を変える。光学応答をモニターすることにより、特定のサイズＳｍｉｎ（穴サイズ）よりも小さい直径を有するＮＭを検出することができる。
【００４０】
上記光学読取装置は、好ましくは、暗視野（ＤＦ）構成の顕微鏡からなり、特に検知面全体の反射像を捕捉・測定可能なＣＣＤカメラを備える。
【００４１】
この光学読取装置は、所定の視野（ＦｏＶ）および開口数（ＮＡ）によって特徴付けられる。ＮＡは検出光ビームの入射角を決定する。所定のＮＡに対して、平坦な領域（回折格子がなく構造化されていない）は光を反射せず検出器で黒く見える。これに対して、回折格子を有する領域では、回折格子の幾何学的パラメータと穴（ナノ材料ありまたは無し）の屈折率の関数として、所定の波長で光反射される。
【００４２】
ＮＭが回折格子の穴を充填すると領域の反射色がそれに応じて変化するため、目視でまたはカメラセンサにより、穴の中のＮＭの存在を色の変化によってモニターすることができる。
【００４３】
別の一態様では、本発明は、特に、本明細書に記載の特徴を有する検知チップ（ナノ粒子スクリーニングチップ）に関する。
【００４４】
本発明者らによれば、本発明の主な利点は、提案する解決策によりＮＭを含むサンプルの迅速なスクリーニングが可能となることである。実際、上記センサによれば、サイズＳｍｉｎ未満のＮＭの存在を数秒以内で（また数百μｌなどの非常に限られたサンプル量で）検出することができる。さらに、１つの副領域内で異なるＳｍｉｎを使用すること（よって、大きさが異なる１または２以上の穴におけるＮＭの存在およびその割合）によってＮＭサイズ分布に関する情報が得られる。最小サイズと共に、当該装置はＮＭの表面特性を特性解析することができ、それらの酸性、塩基性または分散成分、ならびに、それらのサイズおよびサイズ分布を決定することができる。
【００４５】
以下、本発明の完成させる上で行ったいくつかの実験および考察について説明する。これらの実験は本発明を実施するためのさらなる指針を当業者のために提供するものである。以下の情報は、本発明を記載された特定の実施形態および結果に限定するものとして解釈されるべきではない。
【００４６】
実験および実験のセットアップ
【００４７】
Ａ）表面エネルギー成分の改変
【００４８】
表面疎水性を調整するために、様々なプラズマ堆積（ｐｌａｓｍａ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）によってシリコン基板（ガラスまたは他の平坦な表面でもよい）を改変した。ポリテトラフルオロエチレンを使用して疎水性表面を形成した。この堆積は、純粋なオクトフルオロシクロブタン（Ｃ４Ｆ８）をガス前駆体として、圧力３．２Ｐａ（２７ｍＴｏｒｒ）で５分間１４２Ｗの電力を印加して行った。また、２．１Ｐａ（１６ｍＴｏｒｒ）の圧力でガス前駆体としてアクリル酸を用い、４００Ｗのバイアス電力を５分間印加し、プラズマ重合アクリル酸を親水性表面として堆積させた。
【００４９】
層堆積による高分子電解質（ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ；ＰＥ）層
【００５０】
表面疎水性を調整するために、２種類の高分子電解質を層ごとに堆積させた。各高分子電解質を層ごとに自己集合化により堆積させるために、上記プラズマ改変基板を、２％ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）（ＰＤＤＡ）水溶液または２％ポリ（ナトリウム4-スチレンスルホネート）（ＰＳＳ）水溶液中で２分間、ＰＤＤＡ（正に帯電）から開始してＰＳＳ（負に帯電）と交互にインキュベートした。各工程の後、基板をミリＱ水でリンスし、窒素気流下で乾燥させた。
【００５１】
第１の研究は、直径２００ｎｍのポリスチレン（ＰＳ）粒子（Ｐｏｌｙｂｅａｄ（Ｒ）マイクロスフェア、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて行った。この市販粒子をモデルとして選択したのは、メーカーによって広範囲のサイズおよび表面官能性（様々な疎水性および電荷に対応）が提供されているからである。この未修飾粒子はスルホネート基によって安定化されており、負に帯電し、かつ疎水性である。
【００５２】
上記改変表面をこのモデル粒子と共にインキュベートして、粒子と表面との間の相互作用力に関連した結合を評価した。この実験は、粒子を元の濃度で分散させた水溶液中で１６種類の条件（塩濃度［ＮａＣｌ］＝０／１／１０／１００ｍＭ×ｐＨ＝２／４／７／１０）を用いて行った。インキュベーションは基板をこれらの様々な溶液中に３０分間完全に浸漬させて行った。その後、基板をミリＱ水で完全にリンスし、窒素流下で乾燥させた。最後に表面を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮像した。
【００５３】
同じ実験をヒドロキシル基で修飾したポリスチレン（ＰＳ）粒子について行った。この表面修飾は粒子に高い親水性を付与した。
【００５４】
化学改変した表面上へのＮＰの選択的な結合を研究するためにサンプルを２セット調製した。シリコンサンプルの第１のセットを、まず、ＰＴＦＥのプラズマ堆積層でコートし、次に、疎水性レベルを低下させるためにいくつかの高分子電解質（ＰＳＳ／ＰＤＤＡ）層でコートした。また、最初の層をＰＡＡとした第２のサンプルセットを調製した。これらのサンプルも表面疎水性を低下させるためにＰＥを堆積させて改変した。
【００５５】
特性解析の結果を表１および表２に示す。
【００５６】
【表１】
0006684827.tif 000003
【００５７】
【表２】
0006684827.tif 000004
【００５８】
表１に示されるように、ＰＴＦＥプラズマ堆積層がコートされたサンプルは疎水性が高く、接触角は１０６°であった。各高分子電解質層についての接触角測定は、第１の層の８０°（疎水性）から第６の層の２０°（高親水性）までの表面疎水性の低下を示した。エリプソメトリー（薄膜の誘電特性を調べる光学技術）により、各高分子電解質層の厚さを測定することができた。ＰＳＳ層は約０．７ｎｍの厚さであり、各ＰＤＤＡ層は１．４〜０．４ｎｍの間であり、最初の層が最も厚かった。ＡＦＭは粗さに関する情報を提供し、最初の３層では０．３から０．８に増加し、最後の３層では約０．８ｎｍで安定した。ｚ−電位を様々なｐＨについて測定した。すべての層、特に非改変のＰＴＦＥ層およびＰＳＳ層について、全ｐＨ範囲で負のｚ−電位が得られ、各ＰＤＤＡ層ではより中性付近で負のｚ−電位が得られた。この結果は、ＰＤＤＡが正に帯電しＰＤＤＡおよびＰＴＦＥが負に帯電することを知った上で説明することができる。
【００５９】
ＰＡＡ改変表面について行った実験（表２）は同じ傾向を示した。より親水性なＰＡＡのベース層では、高分子電解質層の親水性の増加、より重要である粗さの増加、および、全条件での負のゼータ電位を伴って同じ表面特性が得られ得る。第６の層は、異なる性質の２つの基板（ＰＴＦＥまたはＰＡＡ）で近い表面特性を得ることを可能にした。
【００６０】
ＰＴＦＥプラズマ堆積および層ごとの高分子電解質堆積による表面改変のＸＰＳ分析およびＴｏＦ−ＳＩＭＳ分析も行った（データ不図示）。ＸＰＳ実験による表面分析によりシリコン基板上にＰＴＦＥが存在することが示され、また、ＴｏＦ−ＳＩＭＳ実験によりこれらの観察を確認し、より表面感受的な分析で、ＰＴＦＥプラズマによるシリコン基板の被覆、および、ＰＴＦＥベース層の高分子電解質６層による被覆を確認した。
【００６１】
ナノ粒子の結合研究
【００６２】
疎水性ナノ粒子
【００６３】
ＰＴＦＥのプラズマ堆積によって改変したシリコン基板が高い疎水性を示すことを考慮して、様々な条件で疎水性粒子を用いた第１の実験を行った。疎水性粒子の疎水性表面との結合（疎水力により高いことが予測される）を評価するために、ｐＨおよびイオン強度の１６種類の条件でＰＳ粒子を表面とインキュベートした。次いで、表面をＳＥＭで分析し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてこれらの様々な条件について表面被覆率を算出した。これらの結果を表３に示す。
【００６４】
【表３】
0006684827.tif 000005
【００６５】
驚くべきことに、結合率は全ての条件で低かったが、低ｐＨおよび高塩濃度では結合が高くなる傾向が若干見られた。
【００６６】
疎水性ＰＴＦＥ表面に対するＮＰの結合率が低いのは、ＰＴＦＥ表面の濡れ性が悪く微小泡が形成され、この微小泡が表面と水懸濁液中の粒子との間の接触を妨げて疎水力の発生を妨げるためと推察される。
【００６７】
ＰＴＦＥ層の表面における負電荷および粒子の負電荷は、実際、低ｐＨおよび高イオン強度では減少し、これらの条件では、静電力による長距離の反発が大幅に減少し、より短い距離の疎水力を発生させることができる。
【００６８】
全ての条件で結合率が低いことを理解するために以下の仮説を提案する。表面と粒子との間の界面は複数の界面と考えるべきである。すなわち、粒子は水溶液中でインキュベートされるため、水は、基板−水界面および別の界面である粒子−水界面により基板−粒子相互作用に重要な役割を果たす 。高疎水性の基板を水に暴露すると接触を抑制するために微小気泡が生成されるが、同様のことが疎水性粒子の表面で起こると考えられる。これらの微小気泡は物理的なバリアを作り、疎水性相互作用が発生するのに十分近く粒子が表面に接近するのを防止し得る。気泡の存在を抑制して表面への水接触を可能とするために疎水性は減らすべきである。
【００６９】
この仮説を検証するために、高分子電解質層で改変したＰＴＦＥ表面で同じ実験を行った。（上記接触角測定からわかるように）高分子電解質層の数は疎水性に直接影響を及ぼすため、１０５°、７０°、５０°および２０°の接触角にそれぞれ対応する４つの異なる疎水性度が得られた。粒子とのインキュベーション後の表面を観察すると、接触角の減少に伴って重要である表面被覆が増加し、結合がより増加した。最小接触角について算出した、粒子による表面被覆率を表４に示す。
【００７０】
【表４】
0006684827.tif 000006
【００７１】
高分子電解質が無い場合の結果と比較すると、粒子による表面被覆は高分子電解質６層を用いた場合、劇的に増加する。さらに、上記で観察された傾向（ｐＨの低下およびイオン強度の増加に伴って、重要である結合率が増加する）が確認される。疎水性基板＋親水性表面層で得られた結合率と親水性基板での結合率とを比較し、かつ長距離相互作用理論を検証するために、高分子電解質による改変を行った上述のプラズマ堆積ＰＡＡと該改変行っていない上述のプラズマ堆積ＰＡＡを使用して他の実験を行った。疎水度は、高分子電解質を設けない場合の接触角約６０°から、高分子電解質６層を設けた場合の接触角２０°の範囲に調整した。先と同じ条件で疎水性ポリスチレン粒子とインキュベートした後の様々な表面をＳＥＭで観察した。（ａ）ＰＡＡ単独の表面被覆率、および（ｂ）高分子電解質（ＰＥ）６層を有するＰＡＡの表面被覆率の結果を表５に示す。
【００７２】
【表５】
0006684827.tif 000007
【００７３】
ＰＡＡ単独およびＰＡＡ＋ＰＥの両方で観察されるように、表面被覆率は、ほとんどの条件（塩濃度０〜１０、ＰＡＡ単独の全ｐＨ、ＰＡＡ＋ＰＥのｐＨ４〜１０）で非常に低い。上記で観察された傾向（イオン強度の増加およびｐＨの低下に伴って結合率が増加）は依然として存在するが、これらの極限条件下でのみ粒子結合が増加しているため、上記の場合よりもさらに傾向が高い。高分子電解質を有さないＰＡＡ基板およびＰＴＦＥ基板の結果（表３および表５ａ）を比較すると、最も高いイオン強度では、ＰＴＦＥは疎水性が高いため物理的バリアが存在するため、結合はＰＴＦＥよりもＰＡＡでより重要であることが推察される。しかしながら、主要な違いはＰＴＦＥ＋ＰＥとＰＡＡ＋ＰＥとの間にあると思われる（表４および表５ｂ）。事実、高分子電解質層を加えると疎水性基板上の結合を大きく増加させる一方、ＰＡＡ上に高分子電解質を設けた場合の変化は塩濃度と共にｐＨ２の場合のみで顕著であり、これは、親水性表面層は疎水性相互作用を発生させるだけであり、その結果、疎水性粒子は疎水性基板にのみ結合していることを示している。
【００７４】
長距離疎水性力と基板の疎水性の影響の概略的な相互作用モデルを図４に示す。
【００７５】
様々な条件による相互作用の理論モデルを示す図４に示されるように、第１の試験ケースでは、疎水性ＰＴＦＥは粒子を含む水性媒体と直接接触した。この条件では、水と親水性基板との接触を抑制する空気界面が生成され、これは粒子と基板との間の物理的相互作用を防止する。さらに、ｐＨの低下および／またはイオン強度の増加によって静電反発が回避されないと、より短い距離で作用する疎水性相互作用は発生し得ない。これに対して、低ｐＨおよび高塩濃度により静電反発力を最小限に抑え、かつ、疎水性基板の上面に表面親水性層を設けて物理的相互作用を可能とすることにより、疎水性粒子を疎水性基板に結合させる最も好ましい条件が得られる。この親水性層は、疎水性相互作用が長距離で発生するために十分に薄く（＜＜１００ｎｍ）なければならない。高分子電解質層を使用することは、この場合、疎水性基板の薄い被覆で高い親水性を得るための良い方法である。したがって、濡れ性とも呼ばれる表面疎水性／親水性度は、結合を促進するものではなく、疎水性相互作用の発生を可能にするものである。
【００７６】
親水性粒子
【００７７】
本研究の第２パートは、親水性粒子の上記基板上に対する結合の評価である。システムの機構が疎水性相互作用をベースにしていることを考慮すると、本研究の関心は、パターン化された領域に対する様々な結合応答によって粒子の疎水性の特性解析を可能にすることであると思われる。本研究の当該パートに使用した粒子は同じポリスチレン粒子であるが、親水性を付与するヒドロキシル基（ＯＨ）で修飾されものである。
【００７８】
ｐＨおよびイオン強度の１６種類の条件でＰＳ−ＯＨ粒子を様々な表面上でインキュベートした。ＳＥＭによる分析により、これらの様々な条件についての表面被覆率を算出することができた。ＰＴＦＥ、ＰＴＦＥ＋ＰＥ、ＰＡＡ、およびＰＡＡ＋ＰＥで得られた結果を表６に示す。
【００７９】
【表６】
0006684827.tif 000008
【００８０】
表からわかるように、親水性粒子の疎水性基板に対する結合率は、改変した基板でも未改変の基板でも、全ての条件で極めて低い（ほとんどの場合で＜１％）。親水性基板では、高分子電解質で改変した基板でも未改変の基板でも、先に観察されたように高塩濃度および低ｐＨでのみ顕著に結合があり、多くの条件で結合はなかった。これらの結果は予想された結果を確認するものであり、疎水性相互作用がないと親水性粒子は様々な表面に結合しなかった。
【００８１】
Ｂ）（未知の）ナノ粒子の表面自由エネルギーの決定方法
【００８２】
未知のナノ粒子サンプルの表面エネルギーを決定するための一般的な方法は、拡張ＤＬＶＯモデル（Van Oss et al., J. Colloid Interface Sci. 111, 378-390）と同様である。
【００８３】
溶液中のナノ粒子（多数のナノ粒子）が表面と密接に接触するとき、表面にナノ粒子（ＮＰ）を引き寄せたり、表面からＮＰを遠ざける様々な力が存在する。
【００８４】
これらの力は、
【００８５】
Ｆａｄｈ＝ＦＬＷ＋ＦＥＬ＋ＦＡＢに従い、ここで、
ＦＬＷ：リフシッツ−ファンデルワールス相互作用力（引性；近距離）
ＦＥＬ：静電相互作用力（引性または反発性；長距離）
ＦＡＢ：酸‐塩基相互作用力（疎水性相互作用）である。
【００８６】
リフシッツ−ファンデルワールス成分は常に引性であり、また常に存在する。
【００８７】
静電成分は引性または反発性であり得るが、いずれにせよ、塩濃度を増加させることにより完全に遮断できる。いずれの場合でも、その値はナノ粒子およびチップの活性表面のゼータ電位の測定から知ることができる。同じ電荷の２つの表面間では静電成分は反発性である。
【００８８】
ＡＢ力には疎水性相互作用が含まれる。
【００８９】
引力がＡＢ力「のみ」であると仮定すると、それらは長距離性（ＮＰが表面から数ｎｍにあるときに作用する）であり、かつ、強い（これは本実験条件によって制御される）。
【００９０】
ＮＰは表面に引き寄せられ、ＮＰは系の表面−液体−ＮＰの表面自由エネルギーを最小にする状況にある場合にのみ当該表面に留まる。定義等は下記のとおりである。
【００９１】
ｌ：液体      ｎ：ナノ粒子      ｓ：基板
【００９２】
界面自由エネルギー：
【００９３】
γｓｌ  既知
【００９４】
γｓｎ  測定される
【００９５】
γｎｌ  決定対象
【００９６】
接着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）の自由エネルギーΔＧａｄｈ＝γｎｌ−γｓｎ−γｓｌ
【００９７】
表面自由エネルギーバランス（ΔＧａｄｈ）は、液体、ＮＰと表面との界面を有する（ＮＰと表面の）界面エネルギー間のバランスである。
【００９８】
本研究は、γｎｌ（ＮＰの表面エネルギー成分、特にＬＷ−疎水性成分）を算出することを目的とする。
【００９９】
表面成分間の幾何学的関係は以下のように表すことができる：
【数２】
0006684827.tif 000009
式中、ＡＢ（ＬＷ）は、酸−塩基（リフシッツ−ファンデルワールス）相互作用を表し、γｎ（ＡＢ）、γｌ（ＡＢ）、γｓ（ＡＢ）（γｎ（ＬＷ）、γｎ（ＬＷ）、γｓ（ＬＷ））は、ナノ粒子（ｎ）、溶液／懸濁媒体（ｌ）および領域の固体表面(ｓ)の表面エネルギーの酸塩基（リフシッツ−ファンデルワールス）成分である。γｌ（ＡＢ）は文献から知ることができ、γＳ（ＡＢ）は各改変表面について知ることができる（装置の各領域について測定し、知ることができる）。γｎ（ＡＢ）は、本法により決定される、ＮＰからの未知パラメータである。
【０１００】
提示したシステムでは、ΔＧａｄｈは、表面上のナノ粒子の吸着キネティクスを測定することによって直接測定することができる。特に、ΔＧａｄｈは、吸着キネティクスの傾きｓに比例する（図５を参照）。
【０１０１】
したがって、本発明の方法の好ましい決定工程は、以下のようにまとめることができる：
（ａ）各表面の表面特性を測定して知る
（ｂ）各表面上のＮＰの吸着キネティクスを測定する
（ｃ）ＮＰの表面特性を算出する
【０１０２】
Ｃ）制御された様々な表面特性を有する領域の微細加工
【０１０３】
（上述のように）制御された表面特性によって特徴付けられる領域は、例えば、本発明者らによって設計された以下のマイクロ流体デバイス（ＭＦＤ）によって同じ表面上に微細にパターン化することができる。
１）疎水性／親水性を制御したＰＴＦＥ、ＰＡＡまたは任意の他のポリマーでチップ表面を改変する
２）チップ上面にＭＦＤをアプライする
３）ＭＦＤの各領域で表面特性を局所的に改変するために一定数の高分子電解質層を流す。
【０１０４】
Ｄ）物理フィルタ（補足フィーチャ）のナノ加工
【０１０５】
ナノ粒子の物理フィルタ、つまり捕捉構造（穴アレイまたは溝アレイ）はイオンビームミリングなどによりチップの表面上でナノ加工されるが、異なる加工技術を用いて同じ構造を作ることもできる。
【０１０６】
基本的な目的は以下のとおりである：
１）（穴または溝からなる）回折格子を作る
２）同じ回折格子がＮＰをフィルタリングする
３）回折格子サイズよりも小さいＮＰのみが回折格子内に収まる
４）回折格子の光学応答はＮＰが溝内側に配置されている場合にのみ変化する
５）これにより、選択されたサイズよりも小さい粒子を容易に検出することができる。
【０１０７】
例えば、以下のとおりである。
【０１０８】
３００ｎｍ幅の線（溝）を有する回折格子１に２００ｎｍのＮＰを供給する。
【０１０９】
１００ｎｍ幅の線を有する回折格子２に２００ｎｍのＮＰを供給する。
【０１１０】
２００ｎｍのＮＰは３００ｎｍの溝に入るが、１００ｎｍの溝上に留まることが明らかである（疎水性表面上のポリスチレン製ＮＰのＳＥＭ画像である図６（Ａ）および６（Ｂ）を参照）。
１）回折格子１の回折スペクトルの光学応答は溝内にＮＰが存在することによって変更される（図６（Ａ））
２）回折格子２の回折スペクトルの光学応答は溝上にＮＰが存在することによって変更される（図６（Ｂ））
【０１１１】
光学応答の変化は、ＮＰ吸着中にリアルタイムで追跡することができ、またキネティクス曲線を再構成してΔＧａｄｈを算出することができる（上記説明および図５を参照）。さらに、ＮＰサイズを高速スクリーニングすることができる。
【０１１２】
Ｅ）チップ表面上でＮＰをリアルタイム検出するための光学セットアップ例
【０１１３】
スクリーニングチップ上でＮＰを分析するための好ましいシステムは、基本的に、（チップの全ての領域を同時に検出するための）大視野の暗視野顕微鏡を備え、これは、回折格子の内部または外部のＮＰを検出することを可能にし、また検出はリアルタイムで行われ得る。
【０１１４】
システムの例を図７に示す。光源４１は、第１のレンズ系４２を通過し、ビームスプリッタ４３で反射されて照射瞳４４および第２のレンズ系４５を通ってナノ粒子スクリーニングチップ４６上に到達する光を出射する。スクリーニングチップ４６によって屈折された光は、照射瞳４４、スプリッタ４３、第３のレンズ系４７、カメラ４９の開口４８を通る。
【０１１５】
一例として、このようなシステムは、
Ｅｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ／Ｔｈｏｒｌａｂｓ社の
・レンズ系４２、４５として、２枚のＥｒｆｌｅ接眼レンズ４１−３４７
・ビームスプリッタ４３として、５０ｍｍビームスプリッタ・キューブ３２−７０４
・レンズ系４７用の３〜４枚のＰＣＸ（または無彩色ペア）レンズとレンズ搭載システム（ケージなど）、を備え得る。
カメラ４９は標準レンズ（ｆ〜１０ｍｍ）を有するＣＭＯＳカメラでよい。
−撮像ＮＡはカメラのレンズから調整可能である。
【０１１６】
スクリーニングチップ４６とビームスプリッタ４３との間には照射と撮像のための共通の経路があるため、画像への反射がいくつか存在し得る。実際には、照射瞳４４内のホールプレートを動かすことによって照射角度を調整することができる。
【符号の説明】
【０１１７】
１   ナノ粒子スクリーニングチップ
１０ 基板
１１ 作用面
１２ 領域
１３ 副領域
１５ サブミクロンの穴または溝
２０ ナノ粒子
３０ 液体の流れ
４０ 暗視野検出セットアップ
４１ 光源
４２ 第１のレンズ系
４３ ビームスプリッタ
４４ 照射瞳
４５ 第２のレンズ系
４６ サンプル／スクリーニングチップ
４７ 第３のレンズ系
４８ カメラレンズからの撮像ＮＡの調整
４９ カメラ
【図１】
0006684827.tif 000011
【図２】
0006684827.tif 000012
【図３（Ａ）】
0006684827.tif 000013
【図３（Ｂ）】
0006684827.tif 000014
【図４】
0006684827.tif 000015
【図５】
0006684827.tif 000016
【図６（Ａ）】
0006684827.tif 000017
【図６（Ｂ）】
0006684827.tif 000018
【図７】
0006684827.tif 000019