(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ活性を有し、
親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼが配列番号２および５〜１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ａ．親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼと比較してより低い最適ｐＨ、
ｂ．親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼと比較して、基質Ｄ−フルクトースに対しより高い触媒効率、および
ｃ．親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼと比較して、６０℃でのより長い半減期、の特徴を有する、
以下のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼの変異体。
−配列番号４のアミノ酸配列、あるいは配列番号４と９０％以上の同一性を有し、かつ２１１位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列；
−Ｇ２１１Ｓ置換を有する配列番号５のアミノ酸配列、あるいは配列番号５と９０％以上の同一性を有し、かつ２１１位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列；
−Ｇ２１０Ｓ置換を有する配列番号６のアミノ酸配列、あるいは配列番号６と９０％以上の同一性を有し、かつ２１０位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列；
−Ｇ２１１Ｓ置換を有する配列番号７のアミノ酸配列、あるいは配列番号７と９０％以上の同一性を有し、かつ２１１位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列；
−Ｇ２１３Ｓ置換を有する配列番号８のアミノ酸配列、あるいは配列番号８と９０％以上の同一性を有し、かつ２１３位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列；
−Ｇ２２３Ｓ置換を有する配列番号９のアミノ酸配列、あるいは配列番号９と９０％以上の同一性を有し、かつ２２３位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列；
−Ｇ２１３Ｓ置換を有する配列番号１０のアミノ酸配列、あるいは配列番号１０と９０％以上の同一性を有し、かつ２１３位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列。
【請求項２】
配列番号４のアミノ酸配列、あるいは配列番号４と９５％以上の同一性を有し、２１１
位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列を、含むかまたはそれからなる請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
請求項１〜２に記載の変異体をコードする単離された核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項５】
請求項３に記載の核酸、または請求項４に記載の組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項６】
前記変異体をコードする核酸が染色体に組み込まれている請求項５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
一般に安全と認められる菌株である請求項５または６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
菌株がバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である請求項７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
バチロペプチダーゼＦをコードする遺伝子が不活性化されているバチルス・サブチリス菌株である請求項７または８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を培養する工程、および、任意選択により、得られた培養物から生成したＤ−プシコース３−エピメラーゼ変異体を回収する工程を含む、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ変異体の製造方法。
【請求項１１】
Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ活性に適した条件下で、請求項１〜２に記載の変異体をＤ−フルクトースと接触させる工程、および、任意選択により、生成したＤ−プシコースを回収する工程を含む、Ｄ−プシコースの製造方法。
【請求項１２】
前記Ｄ−フルクトースが、グルコースイソメラーゼによりＤ−グルコースから予めまたは同時に製造される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜２に記載のＤ−プシコース３−エピメラーゼ変異体と、追加の酵素とを含む、酵素組成物。
【請求項１４】
前記酵素がグルコースイソメラーゼである、請求１３に記載の酵素組成物。
【請求項１５】
請求項１〜２に記載のＤ−プシコース３−エピメラーゼ変異体、または請求項５〜９のいずれか一項に記載の宿主細胞の、Ｄ−プシコースを製造するための使用。
【請求項１６】
請求項７〜９のいずれか一項に記載に記載の宿主細胞の、食品を調製するための使用。
【請求項１７】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フルクトースからプシコースを調製するための、改良されたイソメラーゼ、特にＤ−プシコース−３−エピメラーゼ、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−アルロースとも呼ばれるＤ−プシコースは、フルクトースの希少な糖異性体である。食用キノコもしくはジャックフルーツ、小麦およびズイナ属（Ｉｔｅａ）などで天然に見出されるが、その濃度は極めて低い。
【０００３】
フルクトースとは反対に、ヒトにおけるプシコースの代謝は、一部は吸収され代謝エネルギーであり、一部は尿中および糞便中に変化せずに排泄される。
【０００４】
ノンカロリー性、血糖反応の低減に与えるプラスの作用、抗肥満作用など、生活習慣病を予防する物質としてのＤ−プシコースの特性が明らかにされてきている。さらに、Ｄ−プシコースの甘味はスクロースのそれの約７０％であるが（Ｏｓｈｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｓｉｃｏｓｅ  ｃｏｎｔｅｎｔｓ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｏｒｉｇｉｎ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｒｅｓ  １２：１３７−１４３）、エネルギーはスクロースの０．３％であり、理想的なショ糖の代替食品として提唱されている。それはまた、体脂肪の蓄積を減少させるために、肝臓の脂肪合成酵素および腸のα−グリコシダーゼの阻害剤としても用いることができる。それはさらに、活性酸素捕捉作用や神経保護作用などの重要な生理作用を示す。さらにそれは、食品の加工過程で、ゲル化挙動を改善し、また好ましい風味を生成する。
【０００５】
Ｄ−プシコースは市販の炭水化物製品や農産物中に極僅かな量が含まれているだけで、化学的な合成も難しい。したがって、Ｄ−タガトース３−エピメラーゼ（ＤＴＥａｓｅ）酵素ファミリー群を用いるエピマー化によるＤ−フルクトースとＤ−プシコースの相互変換が、Ｄ−プシコース生産の魅力的方法であるとの混乱を招いている。
【０００６】
これまでに、９種のＤＴＥａｓｅ酵素ファミリー源が報告されている。２０年前、シュードモナス・シコリイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ）由来のＤＴＥａｓｅが、ケトヘキソース（最適基質はＤ−タガトース）のＣ−３エピマー化活性を示すという特性を何森らが初めて明らかにした（Ｉｚｕｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９３，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７，１０３７−１０３９）。２００６年までに、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の、ケトヘキソースのＣ−３エピマー化活性を有する第２の酵素が同定され、Ｄ−プシコースに対する高い基質特異性によりＤ−プシコース３−エピメラーゼ（ＤＰＥａｓｅ）と名付けられた（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７２，９８１−９８５；米国特許出願公開第２０１０／０１９０２２５号明細書、国際公開第２０１１／０４０７０８号パンフレット）。近年、それぞれロドバクター・セファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＳＫ０１１（ＤＴＥａｓｅ）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ３１，８５７−８６２）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）Ｈ１０（ＤＰＥａｓｅ）（Ｍｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
５９，７７８５−７７９２、中国特許第１０２３７３２３０号明細書）、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）５＿１＿３９ＢＦＡＡ（ＤＰＥａｓｅ）（Ｚ
ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４，１９０１−１９０６）、クロストリジウム・ボルテアエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔｅａｅ）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ００２５３−０１３−４９２４−８）、クロストリジウム・シンデンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃｉｎｄｅｎｓ）ＡＴＣＣ  ３５７０４（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８，ｅ６２９８７）、およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）ＢＮＬ１１００（Ｍｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒ  ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ１０５２９−０１３−１２３０−６）に由来する、別の６種のＤＴＥａｓｅ酵素ファミリーの特性が明らかにされた。さらに、Ｍａｒｕｔａらが、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）に属するＤＴＥａｓｅの生成源を開示した（米国特許出願公開第２０１１／０２７５１３８号明細書）。
【０００７】
タンパク工学的手法によるＤＴＥａｓｅ酵素ファミリーの改変については、唯一の参考文献がそれを報告している。ランダムおよび部位特異的変異技術を用い、Ｃｈｏｉら（２０１１，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７７，７３１６−７３２０）は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＤＰＥａｓｅのＩ３３Ｌ  Ｓ２１３Ｃ・２部位変異体を構築した。この変異体酵素は、野生型酵素と比較すると、最適温度、半減期、融点および触媒効率が上昇した。最適ｐＨは変化せず８．００のままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、この酵素は活性に最適なｐＨが８．０〜９．５であり、またｐＨ安定性は８．０〜１０．０であって、工業用途には適していない。
【０００９】
したがって、プシコースを使用する際のその希少性と生産コストの問題が依然としてあり、Ｄ−プシコースを工業的に生産する方法の改良が依然として求められている。
【００１０】
Ｄ−プシコースの工業的製造法を開発し、製造コストを削減するには、最適化されたＤＴＥａｓｅ酵素ファミリーは、弱酸および熱に安定でなければならず、基質Ｄ−フルクトースに対しより高い触媒効率と転換率を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼの変異体であって、親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼと比較して配列番号２の２１１位に対応する位置のグリシン残基のセリン残基による置換を含み、かつＤ−プシコース３−エピメラーゼ活性を有する変異体に関する。親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼは配列番号２および５〜１０からなる群から選択される配列と６０％またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することが好ましく、配列番号２および５〜１０からなる群から選択される配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することがより好ましい。
【００１２】
好ましい実施形態では、変異体は１つもしくは複数の以下の特徴を有する。
ａ．親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼと比較してより低い、好ましくは６〜７の範囲の最適ｐＨ、および／または
ｂ．親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼと比較して、基質Ｄ−フルクトースに対しより高い、好ましくは少なくとも２倍の触媒効率、および／または
ｃ．親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼと比較して、６０℃でのより長い半減期。
【００１３】
変異体は、配列番号２と３５％またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することが好ましく、６０％またはそれ以上の同一性を有することが好ましく、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有することがより好ましい。
【００１４】
変異体は、配列番号２および５〜１０からなる群から選択される配列と６０％またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することが好ましく、配列番号２および５〜１０からなる群から選択される配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することがより好ましい。
【００１５】
好ましい実施形態では、親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼはシュードモナス・シコリイ由来のＤ−タガトース３−エピメラーゼ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のＤ−プシコース３−エピメラーゼ、クロストリジウム属由来のＤ−プシコース３−エピメラーゼ、クロストリジウム・シンデンス由来のＤ−プシコース３−エピメラーゼ、クロストリジウム・ボルテアエ由来のＤ−プシコース３−エピメラーゼ、ルミノコッカス属由来のＤ−プシコース３−エピメラーゼおよびクロストリジウム・セルロリティカム由来のＤ−プシコース３−エピメラーゼから選択される。親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼが、クロストリジウム・セルロリティカム由来のＤ−プシコース３−エピメラーゼであることがより好ましい。
【００１６】
最も好ましい実施形態においては、変異体は、配列番号４のアミノ酸配列、あるいは配列番号４と９０％もしくは９５％、またはそれ以上の同一性を有し、かつ２１１位にセリン残基を有するアミノ酸配列を、含むかまたはそれからなる。
【００１７】
これに代わる好ましい実施形態では、変異体は、次のものを含むかまたはそれからなる。
−  Ｇ２１１Ｓ置換を有する配列番号５のアミノ酸配列、あるいは配列番号５と９０％もしくは９５％、またはそれ以上の同一性を有し、かつ２１１位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列；または
−  Ｇ２１０Ｓ置換を有する配列番号６のアミノ酸配列、あるいは配列番号６と９０％もしくは９５％、またはそれ以上の同一性を有し、かつ２１０位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列；または
−  Ｇ２１１Ｓ置換を有する配列番号７のアミノ酸配列、あるいは配列番号７と９０％もしくは９５％、またはそれ以上の同一性を有し、かつ２１１位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列；または
−  Ｇ２１３Ｓ置換を有する配列番号８のアミノ酸配列、あるいは配列番号８と９０％もしくは９５％、またはそれ以上の同一性を有し、かつ２１３位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列；または
−  Ｇ２２３Ｓ置換を有する配列番号９のアミノ酸配列、あるいは配列番号７と９０％もしくは９５％、またはそれ以上の同一性を有し、かつ２２３位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列；または
−  Ｇ２１３Ｓ置換を有する配列番号１０のアミノ酸配列、あるいは配列番号１０と９０％もしくは９５％、またはそれ以上の同一性を有し、かつ２１３位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列。
【００１８】
本発明の他の目的は、本発明の変異体をコードする単離された核酸である。本発明はさらに、本発明の変異体をコードする核酸を含む発現カセットまたは組換え発現ベクターに関する。本発明はまた、本発明の核酸、本発明の発現カセットまたは本発明の組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞に関する。本発明の変異体をコードする核酸は、宿主細胞
の染色体に組み込まれていることが好ましい。特定の実施形態では、宿主細胞はＧＲＡＳ（一般に安全と認められる）菌株、好ましくはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、バチロペプチダーゼＦをコードする遺伝子が不活性化されているバチルス・サブチリス菌株である。
【００１９】
本発明は、本発明の組換え宿主細胞を培養する工程、および、任意選択により、得られた培養物から、生成したＤ−プシコース３−エピメラーゼ変異体を回収または精製する工程を含むＤ−プシコース３−エピメラーゼ変異体の製造方法に関する。言い換えれば、本発明は、本発明のＤ−プシコース３−エピメラーゼ変異体を製造するための本発明の組換え宿主細胞の使用に関する。
【００２０】
本発明はまた、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ活性に適した条件下で、本発明の変異体をＤ−フルクトースと接触させる工程、および、任意選択により、生成したＤ−プシコースを回収する工程を含む、Ｄ−プシコースの製造方法に関する。任意選択により、Ｄ−フルクトースは、Ｄ−グルコースからグルコースイソメラーゼにより予めまたは同時に製造される。それで、本発明は、Ｄ−プシコースを製造するための、本発明のＤ−プシコース３−エピメラーゼ変異体、または本発明の組換え宿主細胞の使用に関する。
【００２１】
本発明の目的は、本発明のＤ−プシコース３−エピメラーゼ変異体と追加の酵素、特にグルコースイソメラーゼとを含む酵素組成物である。
【００２２】
最後に、本発明は、食品を調製するための本発明のＧＲＡＳ宿主細胞の使用、およびそのようなＧＲＡＳ宿主細胞を含む食品に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＤＴＥａｓｅ酵素ファミリーおよびそれらの相同体の多重配列アライメント。アミノ酸配列は、クロストリジウム・セルロリティカムＤＰＥａｓｅ（Ｃｌｃｅ−ＤＰＥａｓｅ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＣＬ７５３０４）、クロストリジウム属（Ｃｌｓｐ−ＤＰＥａｓｅ；ＹＰ＿００５１４９２１４．１）、クロストリジウム・シンデンスＤＰＥａｓｅ（Ｃｌｓｃ−ＤＰＥａｓｅ；ＥＤＳ０６４１１．１）、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＤＰＥａｓｅ（Ａｇｔｕ−ＤＰＥａｓｅ；ＡＡＬ４５５４４）、クロストリジウム・ボルテアエＤＰＥａｓｅ（Ｃｌｂｏ−ＤＰＥａｓｅ；ＥＤＰ１９６０２）、ルミノコッカス属ＤＰＥａｓｅ（Ｒｕｓｐ−ＤＰＥａｓｅ；ＺＰ＿０４８５８４５１）、シュードモナス・シコリイＤＴＥａｓｅ（Ｐｓｃｉ−ＤＴＥａｓｅ；ＢＡＡ２４４２９）およびロドバクター・セファロイデスＤＴＥａｓｅ（Ｒｈｓｐ−ＤＴＥａｓｅ；ＡＣＯ５９４９０）からのものであった。アライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラム（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて行った。示した配列の全てで同一のアミノ酸残基にはアスタリスク（＊）を付し、保存性の高い、または低い残基は、それぞれコロン（：）、またはドット（．）で示す。
【図２】クロストリジウム・セルロリティカムＤＰＥａｓｅの野生型とＧ２１１Ｓ変異体のｐＨプロファイルの比較。
【図３】精製したＧ２１１Ｓ  ＤＴＥａｓｅ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析と、クマシーブルーにより染色したタンパク質マーカー。レーン１、バチルス・サブチリス産生ＤＰＥａｓｅ；レーン２、タンパク質マーカー。
【図４】実施例２に記載の方法１（Ｃｒｅ／Ｌｏｘ組換え系）においてバチルス・サブチリス菌株にＤＰＥａｓｅ遺伝子を挿入するために使用されたプラスミドｐＤＧＩ−７Ｓ６−ＤＰＥの構築を示す。
【図５】ＤＰＥａｓｅ発現バチルス・サブチリス菌株を製造するための実施例２に記載の方法１の主要な工程を示す。
【図６】実施例２に記載の方法２（ｍａｚＦをベースとする系）においてバチルス・サブチリス菌株にＤＰＥａｓｅ遺伝子を挿入するために使用されたプラスミドｐＤＧＩ−ＤＰの構築。
【図７】ＤＰＥａｓｅ発現バチルス・サブチリス菌株を製造するための実施例２に記載の方法２の主要な工程を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明はＤ−プシコース３−エピメラーゼの改良変異体に関する。
【００２５】
定義
本明細書において、「ＤＰＥａｓｅ」および「ＤＴＥａｓｅ」という用語は、それぞれ「Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ」および「Ｄ−タガトース３−エピメラーゼ」の代わりとして使用し得る。そして、「ＤＰＥａｓｅ」および「ＤＴＥａｓｅ」は、それぞれ最適基質をＤ−プシコースおよびＤ−タガトースとするケトース３−エピメラーゼを意味する。
【００２６】
「親」という用語は、本発明の変異体を生成するために改変される酵素を意味する。親は天然に存在する（野生型）ポリペプチドまたはそのフラグメントの変異体であってよい。好ましい実施形態では、親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼは、配列番号２および５〜１０で示されるものから選択されるものである。
【００２７】
さらに、用語「ＤＰＥａｓｅ変異体」は、本発明で教示しているように、Ｄ−タガトース３−エピメラーゼの変異体を指すこともあり得る。同一性パーセント：２つのアミノ酸配列（Ａ）と（Ｂ）の間の「パーセント同一性」は、最適となるようにアライメントされた２つの配列を、比較のウィンドウを通じて比較することにより決定される。前記配列のアライメントは、良く知られた方法、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈのグローバルアライメントを求めるアルゴリズムを用いて行うことができる。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、各種置換、欠失および他の変異に割り当てられた類似性の尺度を用いて類似配列を見つける。全体のアライメントが得られれば、アライメントされた同一の全アミノ酸残基数を、配列（Ａ）と（Ｂ）のうち最も長い配列中に含まれる全残基数で除すことにより、同一性パーセントを得ることができる。配列同一性は、通常、配列解析ソフトウェアを用いて決定される。２つのアミノ酸配列の比較では、タンパク質のペアワイズシーケンスアライメントを行うために、例えば、ツール「Ｅｍｂｏｓｓ  ｎｅｅｄｌｅ」を使用することができるが、これは、欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）−欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）により提供され、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｗｅｂ／ｔｏｏｌｆｏｒｍ．ｅｂｉ？ｔｏｏｌ＝ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ＆ｃｏｎｔｅｘｔ＝ｐｒｏｔｅｉｎで、デフォルト設定：（Ｉ）Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２、（ｉｉ）Ｇａｐ  ｏｐｅｎ：１０、（ｉｉｉ）ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｄ：０．５、（ｉｖ）ｏｕｔｐｕｔ  ｆｏｒｍａｔ：ｐａｉｒ、（ｖ）ｅｎｄ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ：ｆａｌｓｅ、（ｖｉ）ｅｎｄ  ｇａｐ  ｏｐｅｎ：１０および（ｖｉｉ）ｅｎｄ  ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｄ：０．５を用いて利用することができる。
【００２８】
「約」という用語は、その値のプラスマイナス１０％の値を意味する。その値のプラスマイナス５％の値を意味することが好ましい。例えば、「約１００」は９０〜１１０を、好ましくは９５〜１０５を意味する。
【００２９】
「Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ活性」とは、Ｄ−フルクトースをＤ−プシコースに改変する酵素の能力をいう。この活性は、Ｄ−フルクトースから生成するＤ−プシコースの量を測定することによりアッセイすることができる。それは特に、実施例の項で詳述するようにして、またはＭｕら（２０１１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒ
ａｌ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５９，７７８５−７７９２；「Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｓｓａｙ」セクション、７７８７ページ）に開示されているようにして測定することができる。
【００３０】
Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ変異体
本発明は、親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ変異体であって、親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼと比較して配列番号２の２１１位に対応する位置のグリシン残基のセリン残基による置換を含み、かつＤ−プシコース３−エピメラーゼ活性を有する変異体に関する。
【００３１】
親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼは、配列番号２および５〜１０からなる群から選択される配列と６０％またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。特に、親は、配列番号２および５〜１０からなる群から選択される配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
【００３２】
驚いたことに、本発明者らは改良変異体として、クロストリジウム・セルロリティカム由来のＤＰＥａｓｅのＧ２１１Ｓ変異体を同定した。実際、この変異体は以下の利点を有している（表１および２参照）。
−  より低い最適ｐＨ、すなわち野生型ＤＰＥａｓｅの８．０の代わりに６．５、
−  ６０℃でのより長い半減期、すなわち６．８の代わりに７．２時間、および
−  Ｄ−フルクトースに対するより高いｋｃａｔ／Ｋｍ、すなわち６２．７の代わりに１５０．６。
【００３３】
本発明者らが知る限り、最適ｐＨが７．０未満のＤＰＥａｓｅが報告されたのはこれが最初である。さらに、最適ｐＨの低下は、安定性を改善させ、かつ触媒効率を大幅に増加させる。
【００３４】
したがって、ＤＰＥａｓｅ変異体は以下の１種または数種の特徴を有する。
ａ．親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼと比較して、より低い最適ｐＨ、好ましくは６〜７の範囲、および／または
ｂ．親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼと比較して、基質Ｄ−フルクトースに対しより高い触媒効率、好ましくは少なくとも５０、７５、１００、１２０％高い、より好ましくは少なくとも２倍、および／または
ｃ．６０℃でのより長い半減期、好ましくは少なくとも５、１０、１５もしくは２０分、またはそれ以上長い。
【００３５】
第１の実施形態では、ＤＰＥａｓｅ変異体は、項目ａ）およびｂ）、項目ａ）およびｃ）、項目ｂ）およびｃ）、または項目ａ）、ｂ）およびｃ）の要件を満たす。ＤＰＥａｓｅ変異体は、親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼと比較して、最適ｐＨがより低い、好ましくは６〜７の範囲であることが好ましい。したがって、ＤＰＥａｓｅ変異体は、項目ａ）およびｂ）、項目ａ）およびｃ）、または項目ａ）、ｂ）およびｃ）の要件を満たす。
【００３６】
さらに、変異体は、配列番号２および５〜１０からなる群から選択される親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼのアミノ酸配列と６０％またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。具体的には、変異体は、配列番号２および５〜１０からなる群から選択される配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００３７】
特定の実施形態では、変異体は、配列番号２の親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼの２
１１位に対応する位置のグリシン残基のセリン残基による置換を含み、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ活性を有し、かつ配列番号２および５〜１０からなる群から選択される配列と少なくとも６０、７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５、またはそれ以上の同一性を有する。さらに、変異体は上で開示したように、項目ａ）およびｂ）、項目ａ）およびｃ）、項目ｂ）およびｃ）、または項目ａ）、ｂ）およびｃ）の要件を満たすことができる。
【００３８】
本発明者らはさらに、シュードモナス・シコリイ由来のＤ−タガトース３−エピメラーゼ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のＤ−プシコース３−エピメラーゼおよびクロストリジウム・セルロリティカム由来のＤ−プシコース３−エピメラーゼ間のアミノ酸（ａａ）配列同一性が極めて低い（すなわち、シュードモナス・シコリイのＤＴＥａｓｅは、クロストリジウム・セルロリティカムのＤＰＥａｓｅと４１％のａａ同一性を有し、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＤＰＥａｓｅは、クロストリジウム・セルロリティカムのＤＰＥａｓｅと６０％のａａ同一性を有する）にもかかわらず、クロストリジウム・セルロリティカムのＤＰＥａｓｅのＧ２１１残基が保存されていることを強調した。さらに、図１に示すように、Ｇ２１１は８種の酵素のうち７種で保存されている（図１を参照）。
【００３９】
そこで、本発明は、配列番号２と３５％またはそれ以上、好ましくは６０％またはそれ以上、より好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するＤＰＥａｓｅ変異体に関する。本発明の全てのＤＰＥａｓｅ変異体が、配列番号２の２１１の残基に対応する位置でＧｌｙがＳｅｒに置換されていると明らかに理解される。
【００４０】
より具体的には、親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼは、シュードモナス・シコリイ由来のＤ−タガトース３−エピメラーゼ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のＤ−プシコース３−エピメラーゼ、クロストリジウム属由来のＤ−プシコース３−エピメラーゼ、クロストリジウム・シンデンス由来のＤ−プシコース３−エピメラーゼ、クロストリジウム・ボルテアエからのＤ−プシコース３−エピメラーゼ、ルミノコッカス属（由来のＤ−プシコース３−エピメラーゼおよびクロストリジウム・セルロリティカム由来のＤ−プシコース３−エピメラーゼから選択される。好ましい実施形態では、親Ｄ−プシコース３−エピメラーゼは、クロストリジウム・セルロリティカム、特に、クロストリジウム・セルロリティカム菌株Ｈ１０（ＡＴＣＣ  ３５３１９）由来のＤ−プシコース３−エピメラーゼである。
【００４１】
したがって、本発明は、Ｇ２１１Ｓ置換を有する配列番号２のアミノ酸配列（すなわち、配列番号４のアミノ酸配列）、または配列番号４と９０％もしくは９５％、またはそれ以上の同一性を有し、かつ２１１位にセリン残基を有するアミノ酸配列を有するかまたは含む、ＤＰＥａｓｅ変異体に関する。
【００４２】
あるいは、本発明はまた、Ｇ２１１Ｓ置換を有する配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５と９０％もしくは９５％、またはそれ以上の同一性を有し、かつ２１１番位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列を有するかまたは含む、ＤＰＥａｓｅ変異体に関する。
【００４３】
さらに、本発明はまた、Ｇ２１０Ｓ置換を有する配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６と９０％もしくは９５％、またはそれ以上の同一性を有し、かつ２１０位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列を有するかまたは含む、ＤＰＥａｓｅ変異体に関する。
【００４４】
あるいは、本発明はまた、Ｇ２１１Ｓ置換を有する配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号７と９０％もしくは９５％、またはそれ以上の同一性を有し、かつ２１１位にＳ
ｅｒ残基を有するアミノ酸配列を有するかまたは含む、ＤＰＥａｓｅ変異体に関する。
【００４５】
さらに、本発明はまた、Ｇ２１３Ｓ置換を有する配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８と９０％もしくは９５％、またはそれ以上の同一性を有し、かつ２１３位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列を有するかまたは含む、ＤＰＥａｓｅ変異体に関する。
【００４６】
あるいは、本発明はまた、Ｇ２２３Ｓ置換を有する配列番号９のアミノ酸配列、または配列番号７と９０％もしくは９５％、またはそれ以上の同一性を有し、かつ２２３位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列を有するかまたは含む、ＤＰＥａｓｅ変異体に関する。
【００４７】
最後に、本発明はまた、Ｇ２１３Ｓ置換を有する配列番号１０のアミノ酸配列、または配列番号１０と９０％もしくは９５％、またはそれ以上の同一性を有し、かつ２１３位にＳｅｒ残基を有するアミノ酸配列を有するかまたは含むＤＴＥａｓｅ変異体に関する。
【００４８】
任意選択により、変異体は１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個を越えないアミノ酸位で改変されている、例えば、変異体には１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸に置換、付加およびまたは欠失があり得る。
【００４９】
本発明はまた、さらにタグを含む本発明のＤＰＥａｓｅ変異体に関する。例えば、それは、Ｈｉｓタグ（Ｈｉｓ６）、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ（インフルエンザタンパク質のヘマグルチニンから誘導されるエピトープ）、ＭＹＣタグ（ヒトのプロト−オンコタンパク質ＭＹＣから誘導されるエピトープ）、またはＧＳＴタグ（小さなグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）などの、ＤＰＥａｓｅ変異体の精製または固定化の促進に適したタグを含むことができる。
【００５０】
最後に、本発明は固体支持体または担体に固定された、本発明のＤＰＥａｓｅ変異体に関する。ＤＰＥａｓｅは、アルギン酸塩、ａｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂またはＤｕｏｌｉｔｅ樹脂などの、任意の適切な支持体または担体、例えばビーズ上に固定化することができる。固定化手段は、当業者にはよく知られている。例えば、上記Ｃｈｏｉら、Ｌｉｍら（２００９，Ｐｏｒｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４，８２２−８２８）、および国際公開第２０１１／０４０７０８号パンフレットを参照されたい（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５１】
核酸、ベクターおよび宿主細胞
本発明は、本発明のＤＰＥａｓｅ変異体をコードする核酸、または本発明のＤＰＥａｓｅ変異体をコードする配列を含む核酸に関する。本発明はまた、本発明の核酸の発現カセットに関する。本発明はさらに、本発明の核酸または発現カセットを含むベクターに関する。ベクターは発現ベクターが好ましい。ベクターはプラスミドベクターが好ましい。さらに、本発明は、本発明の核酸、本発明の核酸の発現カセット、または本発明の核酸もしくは発現カセットを含むベクターを含む宿主細胞に関する。本発明のＤＰＥａｓｅ変異体をコードする核酸は、エピソーム配列として宿主細胞中に存在することができ、あるいは染色体中に組み込むことができる。本発明のＤＰＥａｓｅ変異体をコードする核酸は、宿主細胞中に１つまたは数個のコピーで存在することができる。
【００５２】
核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡもしくはｇＤＮＡ）、ＲＮＡ、またはこれらの２つの混合物であり得る。それは１本鎖の形態、２本鎖の形態、またはこれらの２つの混合物であり得る。それは、例えば、改変された結合、改変されたプリンもしくはピリミジン塩基、または改変された糖などを含む修飾ヌクレオチドを含むことができる。それは、化学合成、組換え、突然変異誘発など、当業者に知られた任意の方法で調製することができる。
【００５３】
発現カセットは、本発明のＤＰＥａｓｅ変異体の発現に必要な全ての要素、具体的には宿主細胞、特に考慮している宿主細胞における転写および翻訳に必要な要素を含んでいる。
【００５４】
宿主細胞は、原核生物または真核生物である得るが、好ましくは原核生物または下等真核生物であり、原核生物がより好ましい。特に、発現カセットはプロモーターおよびターミネーター、任意選択によりエンハンサーを含む。プロモーターは、選択した宿主細胞に応じて、原核生物または真核生物のプロモーターであり得る。好ましい原核生物のプロモーターの例として、Ｌａｃｌ、ＬａｃＺ、ｐＬａｃＴ、ｐｔａｃ、ｐＡＲＡ、ｐＢＡＤ、バクテリオファージＴ３またはＴ７のＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ラムダファージのＰＲまたはＰＬプロモーターが挙げられる。一般に、適切なプロモーターを選択するために、当業者はＳａｍｂｒｏｏｋらの研究（１９８９）またはＦｕｌｌｅｒらの手法（１９９６；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）を調べることが有利であろう。好ましい実施形態では、操作により強力なプロモーターをＤＰＥａｓｅ変異体のコード配列に結合させる。
【００５５】
本発明は、本発明のＤＰＥａｓｅ変異体をコードする核酸または発現カセットを含むベクターに関する。このベクターは発現ベクターであること、すなわち宿主細胞中で変異体を発現するのに必要な要素を含んでいることが好ましい。このベクターは自己複製可能なベクターである。宿主細胞は、原核細胞、例えばエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、または真核細胞であり得る。真核細胞は、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））または真菌（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）もしくはアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属の）などの下等真核細胞、あるいは昆虫、哺乳動物もしくは植物の細胞などの高等真核細胞であり得る。細胞は哺乳動物の細胞、例えばＣＯＳ、ＣＨＯであり得る（米国特許第４，８８９，８０３号明細書、同第５，０４７，３３５号明細書）。特定の実施形態では、細胞は非ヒト細胞および非胚性細胞である。
【００５６】
ベクターはプラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のｐＴｉプラスミドなどであり得る。ベクターは、複製開始点、多数のクローニングサイトおよび選択遺伝子からなる群から選択される１種以上の要素を含み得ることが好ましい。好ましい実施形態では、ベクターはプラスミドである。このベクターは自己複製可能なベクターである。原核ベクターの例としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：ｐＥＲ３２２、ｐＱＥ７０、ｐＭＡ５、ｐＵＣ１８、ｐＱＥ６０、ｐＵＢ１１０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＤ１０、ｐＨＶ１４、Ｙｅｐ７、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＢＲ３２２およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）。真核ベクターの例としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＰＩＣＺ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；およびｐＱＥ−３０（ＱＬＡｅｘｐｒｅｓｓ）。発現ベクターはプラスミドベクターが好ましい。
【００５７】
特に、エシェリキア・コリ中で発現させるためには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、λｇｔ．λＣおよびλｇｔ．λＢを使用できることが好ましい。一方、バチルス・サブチリス中で発現させるには、ｐＵＢ１１０、ｐＴ
Ｚ４、ｐＣ１９４、ρ１１、Φ１およびΦ１０５を使用できることが好ましい。プラスミド、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７およびｐＢＳ７は、２種以上の宿主中で組換え核酸を複製する場合に有用である。これらのベクターにコード核酸配列を挿入するには、この技術分野の従来法を使用することができる。
【００５８】
特定の実施形態では、ベクターは、本発明のＤＰＥａｓｅ変異体をコードする配列を、宿主細胞の染色体に組込むのに適した組込み型ベクターである。商業的に入手可能な組込み型ベクターの例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒからのバチルス・サブチリス（用のｐＭＵＴＩＮ４があるが、これが全てではない。
【００５９】
したがって、好ましい態様では、本発明は、本発明のＤＰＥａｓｅ変異体をコードする、染色体に組み込まれた核酸を有する宿主細胞に関する。宿主細胞の染色体は、ＤＰＥａｓｅ変異体をコードする核酸の１つまたは数個のコピー（例えば、２、３、４、または５個のコピー）を含むことができる。前記核酸は、当該技術分野で知られている任意の方法、例えば、相同的組換えまたはランダム組込みにより導入することができる。好ましい実施形態では、ＤＰＥａｓｅ変異体をコードする核酸は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ法（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００８，７４，５５５６−５５６２を参照）、またはｍａｚＦベースのシステムなどの任意の類似法により導入される。好ましい実施形態では、宿主細胞は抗生物質耐性遺伝子などの異種の選択遺伝子を含まない。例えば、ＤＰＥａｓｅ変異体をコードする核酸を、最初、異種の選択遺伝子とともに宿主細胞の染色体に導入することができ、その後、異種の選択遺伝子を宿主細胞の染色体から除去する。
【００６０】
宿主細胞は、エシェリキア・コリおよびＧＲＡＳ菌株からなる群の中で選択できることが好ましい。ＧＲＡＳ菌株は、無害の細菌、特にコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などの無害のコルネバクテリウム属の菌種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、およびバチルス・サブチリスなどの無害のバチルス属の菌種からなる群から選択されることが好ましい。非常に特定的な実施形態では、宿主細胞はエシェリキア・コリまたはバチルス・サブチリスであり、好ましくはバチルス・サブチリスである。
【００６１】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＧＲＡＳ菌株であって、前記菌株による活性なＤＰＥａｓｅの産生を増大させるように１つまたは数個の遺伝子が不活性化または活性化されているＧＲＡＳ菌株であり得る。
【００６２】
実際、本発明者らは、バチルス・サブチリス菌株において天然に産生するプロテアーゼの１つであるバチロペプチダーゼＦが、ＤＰＥａｓｅに対して加水分解活性を示し、それにより宿主細胞による活性なＤＰＥａｓｅの生産収量が減少するおそれがあることを示した。したがって、特定の実施形態では、宿主細胞は、ＤＰＥａｓｅを加水分解しやすいプロテアーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つが弱活性化されかまたは不活性化されたＧＲＡＳ菌株である。本明細書では、「弱活性化された遺伝子」を示す菌株とは、対応する野生型株に比較して、前記遺伝子の発現低下、または前記遺伝子がコードするタンパク質の活性低下を示す変異株をいう。遺伝子を弱活性化または不活性化させる方法は、当業者にはよく知られている。遺伝子の弱活性化は、例えば、
−  遺伝子の発現レベルが低下するような、またはコードするタンパク質の生物学的活性が変わるような、１つもしくは数個の変異（例えば挿入、削除、またはランダムもしくは定方向変異、例えばフレームシフト変異、点変異、もしくは停止コドンの挿入など）の遺伝子への導入。例えば、本発明との関連では、変異は、ＤＰＥａｓｅに対する加水分解活性が非常に低いプロテアーゼの産生をもたらし得る。
−  タンパク質の低生産生のものから得られた低強度プロモーターによる、遺伝子の天然
プロモーターの置換、
−  対応するメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質を不安定化する要素の使用、
−  遺伝子またはその一部の削除、特にノックアウト
により得ることができる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、弱活性化遺伝子がＤＰＥａｓｅを加水分解しやすいセリンエンドペプチダーゼをコードする遺伝子であるＧＲＡＳ菌株である。
【００６４】
いくつかの追加の実施形態では、宿主細胞は、バチロペプチダーゼＦをコードする遺伝子が弱活性化、または不活性化されているバチルス属の菌株、好ましくは、バチルス・サブチリス菌株である。いくつかの追加の実施形態では、宿主細胞は、バチロペプチダーゼＦをコードする遺伝子がノックアウトされているバチルス・サブチリス菌株である。そのようなノックアウトは、前記菌株のゲノム中の対応するゲノムＤＮＡを削除することにより得ることができる。例を挙げれば、バチルス・サブチリス中のバチロペプチダーゼＦ遺伝子（ｂｒｐ）の遺伝子ＩＤについては、Ｓｌｏｍａ  ｅｔ  ａｌ（１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，１４７０−１４７７）に記載されている。
【００６５】
本発明は、上記のように、本発明のＤＰＥａｓｅ変異体を産生するための、核酸、発現カセット、発現ベクターまたは宿主細胞の使用に関する。
【００６６】
本発明はまた、本発明の組換え宿主細胞を培養する工程、および、任意選択により、得られた培養物から、生成したＤ−プシコース３−エピメラーゼ変異体を回収および／または精製する工程を含む、本発明のＤＰＥａｓｅ変異体の製造方法に関する。好ましい実施形態では、宿主細胞はエシェリキア・コリおよびＧＲＡＳ菌株、特にバチルス・サブチリスから選択される。
【００６７】
任意選択により、宿主細胞はさらにグルコースイソメラーゼを産生する。
【００６８】
特定の実施形態では、本発明は、本発明のＤＰＥａｓｅ変異体を産生し、分泌する本発明の固定化宿主細胞に関する。
【００６９】
Ｄ−プシコースの製造
本発明は、Ｄ−プシコースを製造するための、本発明のＤＰＥａｓｅ変異体の使用、および本発明のＤＰＥａｓｅ変異体を使用することによってＤ−プシコースを製造する方法に関する。
【００７０】
第１の実施形態では、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼの活性に適した条件下で、ＤＰＥａｓｅ変異体をＤ−フルクトースと接触させる。Ｄ−フルクトースは、高フルクトースシロップ、特に高フルクトースコーンシロップとして提供することができる。そのような高フルクトースコーンシロップは、ＨＩ−ＳＷＥＥＴ（登録商標）の商品名でＲｏｑｕｅｔｔｅ  Ｆｒｅｒｅｓから商業的に入手することができる。
【００７１】
別の特定の実施形態では、Ｄ−グルコースを本発明のＤＰＥａｓｅ変異体とグルコースイソメラーゼとを含む酵素混合物と接触させる。グルコースイソメラーゼはキシロースイソメラーとも呼ばれ、ＥＣ．５．３．１．５に対応する。グルコースはグルコースシロップ、特にコーンシロップとして提供されることが好ましい。
【００７２】
別の代替法では、出発物質はグルコースまたはフルクトースに代えてデンプンであり得、酵素の混合物はさらにアルファ−アミラーゼおよび／またはグルコアミラーゼを含む。
【００７３】
本発明は、本発明のＤＰＥａｓｅ変異体および追加の酵素を含む酵素混合物に関する。酵素混合物は、本発明のＤＰＥａｓｅ変異体とグルコースイソメラーゼとを含むことが好ましい。任意選択により、酵素混合物はさらにα−アミラーゼおよび／またはグルコアミラーゼを含み得る。
【００７４】
Ｄ−プシコースの製造に適した条件は当業者が決めることができる。それら以下の特徴を含むことが好ましい。
−  温度：５０〜６０℃、好ましくは約５５℃；および／または
−  ｐＨ：５．５〜７．５、好ましくは６〜７、より好ましくは約６．５；および／または
−  好ましくはＣｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｎｉ２＋およびＭｇ２＋からなる群から、より好ましくはＣｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋およびＮｉ２＋からなる群から、さらに好ましくはＣｏ２＋およびＭｎ２＋からなる群から、最も好ましくはＣｏ２＋から選択される２価の金属イオンの存在下で；および／または
−  固定化ＴＤＥａｓｅを使用するときには、例えば４０〜８０ｍＭ、好ましくは約６０ｍＭのホウ酸塩の存在下で。
【００７５】
特定の実施形態では、本方法で使用する酵素は固定化される。本発明のＤＰＥａｓｅ変異体が固定化されることがより好ましい。任意選択により、グルコースイソメラーゼおよび本発明のＤＰＥａｓｅ変異体の両者を、またはＤＰＥａｓｅ変異体のみを固定化することができる。別の代替法では、酵素を固定化する代わりに、酵素を産生する微生物が固定化される。酵素または微生物は、例えば、アルギン酸塩、ａｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂またはＤｕｏｌｉｔｅ樹脂などの、任意の適切な支持体、例えばビーズ上に固定化することができる。
【００７６】
固定化した酵素または微生物を適切なカラムに充填することができ、グルコースまたはフルクトースの液またはシロップがカラムに連続的に導入される。
【００７７】
ＤＰＥａｓｅを支持体上に固定化し、Ｄ−プシコースを製造する方法は、当業者によく知られており、例えば国際公開第２０１１／０４０７０８号パンフレットに記載されている。
【００７８】
得られる生成物は、Ｄ−フルクトースとＤ−プシコースの混合物であり得、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトースおよびＤ−プシコースの混合物であることさえあり得る。
【００７９】
本発明の一態様は、食品を調製するための本発明のＧＲＡＳ宿主細胞の使用、およびそのようなＧＲＡＳ宿主細胞を含む食品に関する。食品はヒト用または動物飼料用である。例えば、食品は健康用食品、患者用食品、食品材料、健康用食品材料、患者用食品材料、食品添加物、健康用食品添加物、患者用食品添加物、飲料、健康用飲料、患者用飲料、飲料水、健康用飲料水、患者用飲料水、薬剤、薬剤原料、飼料、ならびに病気の家畜用および／または病気の動物用飼料であり得る。食品材料または食品添加物として使用する場合、それは、異常な炭水化物代謝および／または異常な脂質代謝を緩和するために使用することができる。それは、錠剤、カプセル、または飲料などに溶解させる粉末または顆粒などの固体調製物；ゼリーなどの半固体調製物；飲料水などの液体；使用前に希釈する高濃度溶液などの形態であり得る。
【実施例】
【００８０】
実施例１
発明者らは、部位特異的変異誘発により、２１１位（配列番号１）でＧｌｙをコードするコドンＧＧＣを、それぞれＧ２１１Ｓ置換、Ｇ２１１Ａ置換、Ｇ２１１Ｄ置換、Ｇ２１
１Ｔ置換、Ｇ２１１Ｗ置換およびＧ２１１Ｌ置換をコードするコドンＡＧＣ、ＧＣＣ、ＧＡＣ、ＣＧＣ、ＴＧＧおよびＣＴＣで置き換えることによって、クロストリジウム・セルロリティカムのＤＰＥａｓｅ変異体を調製した。
【００８１】
ＤＰＥａｓｅ変異体は、バチルス・サブチリス中で発現し、発現し、精製された（図３）。
【００８２】
基質Ｄ−プシコースに対する、クロストリジウム・セルロリティカム由来の野生型および変異型ＤＰＥａｓｅの酵素特性および動力学的パラメータを決定した。その結果を表１に示す。
【００８３】
Ｇ２１１Ｓ変異体は、野生型ＤＰＥａｓｅ（表１）のみならず他の既知の酵素（表２）と比較しても、良好な特性を示した。特に、それは、６〜８のｐＨ範囲で８０％超の活性を有する、弱酸に安定な酵素であり（図２）、約１５０．６の触媒効率と、５５℃で少なくとも１０時間の半減期および／または６０℃で少なくとも６．５時間の半減期を有する。さらに、宿主は食品グレードの微生物である。これらの属性は、食品グレードのＤ−プシコースの生物学的生産を、より効率的な生産サイクルおよびより低い生産コストで行うには重要である。
【００８４】
材料および方法
薬品および試薬
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）、ＰＣＲ用薬品、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびプラスミドのミニプレップキットは、Ｔａｋａｒａ（Ｄａｌｉａｎ、Ｃｈｉｎａ）から入手した。タンパク質精製用の樹脂、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗはＧＥ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。電気泳動試薬はＢｉｏ−Ｒａｄから購入した。酵素アッセイおよびキャラクタリゼーションに使用した、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および全ての薬品は、少なくとも分析グレードであり、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ
Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）およびＳｉｎｏｐｈａｒｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）から入手した。オリゴヌクレオチドは、Ｓａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）により合成された。
【００８５】
プラスミド、細菌の菌株および培養条件
プラスミドｐＥＴ−２２（＋）は、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αおよびエシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）は、Ｔｉａｎｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）から入手した。バチルス・サブチリスＷＢ６００およびプラスミドｐＭＡ５はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手した。細菌の菌株は、回転振盪機（２００ｒｐｍ）中において、３７℃でＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地により培養した。
【００８６】
エシェリキア・コリにおけるクロストリジウム・セルロリティカムのＤＰＥａｓｅ変異体の調製
（１）タンパク質改変のためのプライマー設計は以下のようにした。
フォワード変異原性プライマー：
【化１】
0006774875.tif 000002
（２）上記プライマーを用いたＰＣＲ手法によるプラスミドの増幅。
テンプレート：ｐＥＴ−Ｃｃ−ｄｐｅ
ＤＮＡポリメラーゼ：Ｐｆｕ
ＰＣＲプログラム：Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼにより、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で５分、その後７２℃で１０分の伸長工程からなる２０サイクルのＰＣＲ増幅を行った。
（３）ＰＣＲの後、１ｕｌのＤｐｎＩ制限酵素（１０Ｕ／μｌ）を２００μｌのＰＣＲ生成物に加え、３７℃で４時間のインキュベートし、テンプレートのＤＮＡを消化し除去する。
（４）ＤＮＡをＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより精製した。
（５）１６℃で１２時間、変異フラグメントの５’−リン酸化反応および連結反応を一緒に行った。反応系は以下の通りである。
【００８７】
【表１】
0006774875.tif 000003
【００８８】
（６）ＤＮＡをエシェリキア・コリＤＨ５αに形質転換した。形質転換体は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上、３７℃で選択した。
（７）プラスミドを抽出し、ヌクレオチド配列決定法により同定した。
（８）再構築したプラスミドをエシェリキア・コリＢＬ２１に形質転換した。
【００８９】
形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上、３７℃で選択した。
【００９０】
バチルス・サブチリス中におけるクロストリジウム・セルロリティカムのＤＰＥａｓｅ変異体の調製
（１）ＰＣＲ
異なる変異体遺伝子をバチルス・サブチリス発現プラスミドにサブクローニングすることに関しては、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を導入するために、フォワード
【化２】
0006774875.tif 000004
およびリバースプライマー
【化３】
0006774875.tif 000005
を設計した。異なるＤＰＥａｓｅ変異体遺伝子を有する、再構築ｐＥＴ−２２ｂ（＋）プラスミドを用い、Ｔａｑ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼにより、９４℃で１分、６０℃で１分および７２℃で１分、その後７２℃で１０分の最終伸長工程からなる、３５サイクルのＰＣＲ増幅を個別に行った。
（２）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、ＰＣＲ生成物を個別に精製する。（３）精製ＰＣＲ生成物およびバチルス・サブチリスの発現プラスミド、ｐＭＡ５を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにより消化した。
（４）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによりＤＮＡフラグメントとｐＭＡ５を結合させ、その後、その混合物をエシェリキア・コリ大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。
（５）形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上、３７℃で選択した。
（６）再構築されたプラスミドを抽出し、制限酵素による消化およびヌクレオチド配列決定法により同定した。
（７）野生型または変異体ＤＰＥａｓｅ遺伝子を有する、再構築したｐＭＡ５プラスミドを、電気穿孔法により個別にバチルス・サブチリスＷＢ６００に形質転換した。形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上、３７℃で選択した。
【００９１】
クロストリジウム・セルロリティカムのＤＰＥａｓｅ変異体の精製
組換えＤＰＥａｓｅ変異体を精製するために、遠心分離した細胞ペレットを溶解用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に懸濁させ、Ｖｉｂｒａ−Ｃｅｌｌ  ７２４０５超音波発生装置を用い、４℃で６分間の超音波処理（３秒の脈動、、増幅度９０）により崩壊させ、遠心分離（２００００ｇ、２０分、４℃）により細胞の破片を除去した。予めＮｉ２＋でキレート化し、結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で平衡化した、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂カラム（１．０ｃｍ×１０．０ｃｍ）に、細胞を含まない抽出物を適用した。結合していないタンパク質は、洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．５）によってカラムから溶出した。その後、溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．５）によって、ＤＰＥａｓｅ変異体をカラムから溶出した。活性画分をプールし、１０ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、４℃、４８時間の終夜透析を行った。続いて、５０ｍＭのＥＤＴＡ不含Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、酵素を透析した。
【００９２】
ＤＰＥａｓｅ試験
Ｄ−フルクトースから生成したＤ−プシコースの量を定量し、活性を測定した。１ｍＬの反応混合物は、Ｄ−フルクトース（５０ｇ／Ｌ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  Ｃｏ２＋および０．５μＭの酵素を含んだ。反応混合物を５５℃で２分間インキュベートし、１０分後、煮沸により反応を停止させた。ＨＰＬＣ法により生成したＤ−プシコースを定量した。酵素活性の１単位を、ｐＨ８．０、５５℃で、１μｍｏｌＤ−プシコース／ｍｉｎの生成を触媒した酵素の量と定義した。
【００９３】
温度およびｐＨの影響
３５〜７０℃の範囲で２分間、酵素試料を試験して酵素活性の最適温度を測定した。酵素活性の最適ｐＨを測定するために、２つの緩衝液系、すなわちリン酸ナトリウム（５０
ｍＭ、ｐＨ６．０〜７．０）およびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５〜９．０）を使用した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）中の酵素を各種温度でインキュベートすることにより、酵素の熱安定性を調べた。所定の時間間隔で試料を取り出し、標準試験条件で残留活性を測定した。ｐＨ安定性を調べるために、ｐＨ６．０〜９．０、４℃で最長２時間、酵素をインキュベートし、標準試験条件で、時間間隔を置いて残留酵素活性を測定した。
【００９４】
動力学的パラメータの決定
０．１ｍＭのＣｏ２＋および５〜２００ｍＭの基質を含有する、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で、５５℃での反応に対するＤＰＥａｓｅ変異体の動力学的パラメータを決定した。１０分後、煮沸により酵素反応を停止させ、ＨＰＬＣ分析によりＤ−プシコースの量を決定した。ラインウィーバー・バークの式および酵素濃度の定量化により、ミカエリス・メンテン定数（Ｋｍ）および基質に対するターンオーバー数（ｋｃａｔ）の値などの動力学的パラメータを得た。
【００９５】
分析方法
Ｄ−フルクトースおよびＤ−プシコースの濃度を、示差屈折率検出器およびＣａ２＋−炭水化物用カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｕｇａｒ−Ｐａｋ  １、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を具備したＨＰＬＣにより、カラムを８５℃、０．４ｍＬ／ｍｉｎの水で溶出して分析した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準物質に用い、ブラッドフォード法により決定した。Ｌａｅｍｍｌｉ法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。ゲル（１２重量／体積％のポリアクリルアミド）を、クマシーブリリアントブルーにより染色し、１０％（体積／体積）メタノール／１０％（体積／体積）酢酸の水性混合物で脱色した。
【００９６】
【表２】
0006774875.tif 000006
【００９７】
【表３】
0006774875.tif 000007
【００９８】
実施例２：染色体への組込み、およびＤ−プシコースエピメラーゼ産生微生物菌株の生産
本発明者らは、Ｄ−プシコースエピメラーゼを染色体に組込んだ５種の菌株を構築した。抗生物質の添加および菌株中の抗生物質耐性遺伝子（ＡＲＧ）を避けるために、ＡＲＧを挿入しない染色体組込みを行う２つの方法、すなわち、Ｃｒｅ／ＬｏｘおよびｍａｚＦをベースとした系により菌種を構築した。Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系は、ＡＲＧを染色体に組込んだ菌株を構築し、Ｃｒｅリコンビナーゼによりそれをノックアウトする（方法１）。他の方法は、ｍａｚＦ遺伝子を染色体に組込んだ菌株を構築し、ｐ４３−ＤＰＥ遺伝子によりそれをノックアウトする（方法２）。バチルス・サブチリスの３種の菌株、すなわち、１Ａ７５１、ＷＢ６００およびＷＢ８００を宿主株として使用した。
【００９９】
方法１．バチルス・サブチリスにおけるＣｒｅ／Ｌｏｘ系をベースとしたゲノム工学
１．１序論
Ｃｒｅ／Ｌｏｘ組換え系は、今日、強力なＤＮＡ組換えツールとして認められている簡素な２成分系である。Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系の一般的原理は、２つのｌｏｘＰ部位（これらの３４ｂｐの各標的ＤＮＡ配列は、中央の方向性のある８ｂｐからなるコアの両側に位置する２つの１３ｂｐからなる逆方向の繰り返し配列からなる）の間のＤＮＡを認識し、結合し、組換えるＣｒｅリコンビナーゼの能力に拠る。Ｃｒｅ／Ｌｏｘ組換え系を使用することによって、抗生物質耐性遺伝子（ＡＲＧ）をノックアウトした。
【０１００】
１．２方法
ＡＲＧのない染色体組込みがなされた菌株の構築は、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ組換え系に基づき、次のような複数の工程を含む（図４も参照）：
ａ．オーバーラップエクステンションＰＣＲ法によるプロモーターｐ４３を有するＤＰＥａｓｅコード遺伝子の切断
プロモーターｐ４３とＤＰＥａｓｅコード遺伝子をオーバーラップエクステンションＰＣＲ法により切断した。その後、ＰＣＲ生成ｐ４３−ＤＰＥカセットをｐＭＤ１９−Ｔにクローニングして、ｐＰ４３ＤＰＥを作った。
【０１０１】
ｂ．再構築プラスミドｐＤＧＩ−７Ｓ６−ＤＰＥを構築するための、ｐ４３ＤＰＥ遺伝子（ｐ４３ＤＰＥ）およびスペクチノマイシン耐性遺伝子（ｌｏｘ７１−ｓｐｃ−ｌｏｘ６６）のシャトルプラスミドベクターｐＤＧＩＥＦへの挿入。
プラスミドｐＤＧＩ−７Ｓ６−ＤＰＥを次のように構築した。両側にＳａｌＩおよびＸｍａＩを有するフラグメントを含むｌｏｘ７１−ｓｐｃ−ｌｏｘ６６カセットをｐ７Ｓ６からｐＤＧＩＥＦの対応する部位に転移させてｐＤＧＩ−７Ｓ６を得、その後、ＮｈｅＩ／ＳａｌＩ消化ｐＰ４３ＤＰＥをｐＤＧＩ−７Ｓ６の対応する部位にクローニングしてｐＤＧＩ−７Ｓ６−ＤＰＥを得た（図４）。
【０１０２】
ｃ．染色体組込みのための再構築プラスミドのバチルス・サブチリスへの形質転換。
ｐＤＧＩ−７Ｓ６−ＤＰＥプラスミドをＸｈｏ  Ｉにより線形化し、化学変換によりバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株（１Ａ７５１、ＷＢ６００、ＷＢ８００）に形質転換した［Ｋｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３，９７：６８０３−６８１１（宿主  １Ａ７５１）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，１４６：５４３−５４８（宿主  ＷＢ６００）；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  ２０１３，１２：７９（宿主  ＷＢ８００）］。バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アミラーゼ遺伝子相同アームを、組込みベクターおよび染色体ＤＮＡ間の相同組換えに使用した。染色体組込みにより、ｐ４３−ＤＰＥカセットおよびｌｏｘ７１−ｓｐｃ−ｌｏｘ６６カセットを染色体ＤＮＡに挿入した。
【０１０３】
ｄ．スペクチノマイシンによる組込みバチルス・サブチリスのスクリーニング。
スペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢプレート上で、組換え株をスクリーニングした。
【０１０４】
ｅ．ｐＴＳＣプラスミドのバチルス・サブチリス（７Ｓ６−ＤＰＥ）への形質転換、その後にエリスロマイシンによってスクリーニングした。
Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を有するｐＴＳＣプラスミドをバチルス・サブチリス（ｐＤＧＩ−７Ｓ６−ＤＰＥ）コンピテント細胞に形質転換した。バチルス・サブチリス（７Ｓ６−ＤＰＥ、ｐＴＳＣ）菌株をエリスロマイシン２００μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートでスクリーニングした。
【０１０５】
ｆ．エリスロマイシンおよびスペクチノマイシンによる組込みバチルス・サブチリス（ｌｏｘ−ＤＰＥ、ｐＴＳＣ）菌株のスクリーニング。
スペクチノマイシン耐性遺伝子がノックアウトされれば、菌株はエリスロマイシン２００μｇ／ｍＬおよびスペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢプレート上で増殖できないが、エリスロマイシン２００μｇ／ｍＬを含むＬＢプレート上では増殖できる。これに基づき、バチルス・サブチリス（ｌｏｘ−ＤＰＥ、ｐＴＳＣ）菌株をスクリーニングし、選択した。
【０１０６】
ｇ．エリスロマイシンによるバチルス・サブチリス（ｌｏｘ−ＤＰＥ）菌株のスクリーニング。
ｐＴＳＣは、プレートが４２℃でインキュベートされた場合に複製できない温度感受性プラスミドであった。ｐＴＳＣプラスミドがバチルス・サブチリス菌株中に欠失すると、菌株はエリスロマイシン２００μｇ／ｍＬを含むＬＢプレート上で増殖できない。４２℃で２日間インキュベート後、バチルス・サブチリス（ｌｏｘ−ＤＰＥ）菌株をＬＢプレートおよびエリスロマイシン２００μｇ／ｍＬを含むＬＢプレート上でスクリーニングし、選択した。
【０１０７】
ｈ．抗生物質耐性遺伝子のノックアウトの確認
抗生物質耐性遺伝子のノックアウトを確認するために２つの方法、ＰＣＲおよび抗生物質プレート上でのスクリーニングを用いた。ＰＣＲ増幅は、バチルス・サブチリスアミラーゼ相同アーム遺伝子を用いて行った。ＤＮＡフラグメントの配列を決定し、抗生物質耐性遺伝子配列とアライメントして、抗生物質耐性遺伝子がノックアウトされたことを確認した。それと同時に、抗生物質耐性遺伝子のプライマーも使用した。ＰＣＲ増幅ができないなら、構築した菌種に抗生物質耐性遺伝子は存在しない。他の試験方法は、抗生物質プレートによるスクリーニングであった。菌株が抗生物質プレート上で増殖できなかったなら、抗生物質耐性遺伝子はノックアウトされた。
【０１０８】
方法２．バチルス・サブチリスにおけるｍａｚＦをベースとしたゲノム工学
２．１序論
ｍａｚＦは、バチルス・サブチリスのマーカーなしの染色体操作のための新規なカウンターセレクション可能なマーカーとして使用することができるエシェリキア・コリ毒素遺伝子である。ｍａｚＦをキシロース誘導発現系の制御下に置いた。ｍａｚＦカセットを有するバチルス・サブチリス菌株は、キシロース含有培地で増殖することはできない。ｍａｚＦカセットをｐ４３−ＤＰＥカセットで置き換えれば、キシロース含有培地で増殖することができる。
【０１０９】
２．２方法
バチルス・サブチリスのマーカーなしの染色体組込みは、これに基づき、次のような複数の工程を含む（図７も参照）：
ａ．再構築プラスミドｐＤＧＩ−ＤＰＥを作るための、ｐ４３−ＤＰＥ遺伝子（ｐ４３−ＤＰＥ）のシャトルプラスミドベクターｐＤＧＩＥＦへの挿入。
プラスミドｐＤＧＩ−ＤＰＥを次のように構築した。両側にＸｍａ  ＩおよびＳａｌ  Ｉを有するフラグメントを含むｐ４３−ＤＰＥカセットをｐ４３ＤＰＥからｐＤＧＩＥＦの対応する部位に移入して、ｐＤＧＩ−ＤＰＥを得る。（図６）
【０１１０】
ｂ．染色体組込みのための再構築プラスミドｐＤＧＲＥＦのバチルス・サブチリスへの形質転換。
ｐＤＧＲＥＦプラスミドをＣｌａ  Ｉにより線形化し、化学変換によりバチルス・サブチリス菌株（１Ａ７５１、ＷＢ６００、ＷＢ８００）に形質転換した。バチルス・サブチ
リスアミラーゼ遺伝子相同アームを、組込みベクターおよび染色体ＤＮＡ間の相同組換えに使用した。染色体組込みにより、ｍａｚＦカセットを染色体ＤＮＡに挿入した。
【０１１１】
ｃ．スペクチノマイシンおよびキシロースによる組込みバチルス・サブチリスのスクリーニング。
スペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢプレート上で、組換え株をスクリーニングした。その後、陽性クローンを、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）−キシロース（２％）含有ＬＢプレートおよびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）含有ＬＢプレートにそれぞれ画線した。キシロース含有ＬＢプレートで増殖できなかった陽性クローンを次工程で使用した。
【０１１２】
ｄ．ｐＤＧＩ−ＤＰＥプラスミドのバチルス・サブチリス（ＲＥＦ）への形質転換、その後にキシロースによってスクリーニングした。
ｐ４３−ＤＰＥ遺伝子を有するｐＤＧＩ−ＤＰＥプラスミドをＸｈｏ  Ｉによって線形化し、バチルス・サブチリスコンピテント細胞に形質転換した。バチルス・サブチリス（ＤＰＥ）菌株を２％のキシロースを含有するＬＢプレートでスクリーニングした。
【０１１３】
結果
５種の菌株をこれらの２つの方法により選択した。バチルス・サブチリス菌株を選択後、実験室培地で培養した。酵素活性を実施例１で記載のようにして決定し、ＤＰＥａｓｅコード遺伝子が染色体ＤＮＡに挿入されたことを確認した。酵素活性を選択した全ての菌株で決定した。最も高い酵素活性は１Ａ７５１株で検出された。その酵素活性は、プラスミド依存バチルス・サブチリスで検出された初期の活性に近い０３．４５Ｕ／ｍＬに達した。
【０１１４】
【表４】
0006774875.tif 000008
【０１１５】
【表５】
0006774875.tif 000009
【図１】
0006774875.tif 000010
【図２】
0006774875.tif 000011
【図３】
0006774875.tif 000012
【図４】
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【図５】
0006774875.tif 000014
【図６】
0006774875.tif 000015
【図７】
0006774875.tif 000016
【配列表】
0006774875000001.app