(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを、ＥＺＨ２阻害剤により、がんにおいて、抗がん効果が生じる可能性があるのかどうかの指標とする方法であって、該方法は、該がんの試料における該ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを決定するステップを含み、該ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルが非存在であるか、またはＢＡＰ１の基準対照レベルと比較して低減されている場合、そのことは、抗がん効果を生じさせるための治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を該がんに投与するべきであることを示す、方法。
【請求項２】
前記がんが、悪性中皮腫、ブドウ膜黒色腫、腎細胞癌、皮膚黒色腫、肺がん、乳がん、卵巣がん、黒色腫でない皮膚がん、髄膜腫、胆管癌、平滑筋肉腫、神経内分泌腫瘍、膵臓がん、傍神経節腫、悪性線維性組織球腫、メラノサイトＢＡＰ１変異非定型皮内腫瘍（ＭＢＡＩＴ）、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、および膀胱がんからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを、免疫蛍光法により決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを、ウェスタンブロットにより決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを、ポリメラーゼ連鎖反応により決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを、該ＢＡＰ１バイオマーカーと特異的に結合する試薬を使用することにより検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記試薬が、抗体またはその抗原結合性断片である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記がんが、悪性中皮腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記がんが、ブドウ膜黒色腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記がんが、腎細胞癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記がんの試料中のＥＺＨ２の発現レベルを決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベル、ならびに、ＥＺＨ２およびＳＵＺ１２の少なくとも一方の発現レベルを、がんを有する被験体の処置を開始すべきかどうかについての指標とする方法であって、該方法は、該被験体由来の試料中の該ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベル、ならびに、ＥＺＨ２およびＳＵＺ１２の少なくとも一方の発現レベルを決定するステップを含み、該ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルが非存在であるか、もしくはＢＡＰ１の基準対照レベルと比較して低減されている場合、かつ、ＥＺＨ２の発現レベルがＥＺＨ２の基準対照レベルと比較して増大しており、かつ／または、ＳＵＺ１２の発現レベルがＳＵＺ１２の基準対照レベルと比較して増大する場合、そのことは、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を該被験体に投与することを含む該処置が開始されるべきであることを示す、方法。
【請求項１４】
前記がんが、悪性中皮腫である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記がんが、ブドウ膜黒色腫である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記がんが、腎細胞癌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベル、ならびに、ＳＵＺ１２、およびＥＺＨ２の少なくとも一方の発現レベルを、免疫蛍光法により決定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベル、ならびに、ＳＵＺ１２、およびＥＺＨ２の少なくとも一方の発現レベルを、ウェスタンブロットにより決定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを、ＥＺＨ２阻害剤により、がんにおいて、抗がん効果が生じる可能性があるのかどうかの指標とする方法であって、該方法は、該がんの試料中の該ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを決定するステップを含み、該ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルが、非存在であるか、またはＢＡＰ１の基準対照レベルと比較して低減されている場合、そのことは、該ＥＺＨ２阻害剤が、該がんに対して抗がん効果を有する可能性が高いことを示す、方法。
【請求項２０】
前記がんが、悪性中皮腫、ブドウ膜黒色腫、腎細胞癌、皮膚黒色腫、肺がん、乳がん、卵巣がん、黒色腫でない皮膚がん、髄膜腫、胆管癌、平滑筋肉腫、神経内分泌腫瘍、膵臓がん、傍神経節腫、悪性線維性組織球腫、メラノサイトＢＡＰ１変異非定型皮内腫瘍（ＭＢＡＩＴ）、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、および膀胱がんからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＢＡＰ１バイオマーカーが、ＢＡＰ１タンパク質バイオマーカーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＢＡＰ１バイオマーカーが、ＢＡＰ１核酸バイオマーカーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを、免疫蛍光法により決定する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを、ウェスタンブロットにより決定する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
ＢＡＰ１タンパク質バイオマーカーの発現レベルを、ＥＺＨ２阻害剤に対する、患者におけるがんの感受性の指標とする方法であって、該方法は、該患者由来の該がんの試料における該ＢＡＰ１タンパク質バイオマーカーの発現レベルを決定するステップを含み、該ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルが非存在であるか、またはＢＡＰ１の基準対照レベルと比較して低減されている場合、そのことは、該がんが、ＥＺＨ２阻害剤に対して感受性であることが予測されることを示す、方法。
【請求項２６】
前記がんが、悪性中皮腫、ブドウ膜黒色腫、腎細胞癌、皮膚黒色腫、肺がん、乳がん、卵巣がん、黒色腫でない皮膚がん、髄膜腫、胆管癌、平滑筋肉腫、神経内分泌腫瘍、膵臓がん、傍神経節腫、悪性線維性組織球腫、メラノサイトＢＡＰ１変異非定型皮内腫瘍（ＭＢＡＩＴ）、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、および膀胱がんからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＥＺＨ２阻害剤により、がんにおいて、抗がん効果が生じる可能性があるのかどうかを決定するためのキットであって、ＢＡＰ１バイオマーカーを検出するための手段を含むキット。
【請求項２８】
ＢＡＰ１バイオマーカーを検出するための前記手段が、１もしくは複数のパッケージングされたプライマー、プローブ、アレイ／マイクロアレイ、バイオマーカー特異的抗体、および／またはビーズを含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
ＢＡＰ１バイオマーカーを検出するための前記手段が、ＢＡＰ１バイオマーカーを検出するための１もしくは複数の抗体、またはその抗原結合性断片を含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項３０】
ＥＺＨ２の発現、Ｌ３ＭＢＴＬ２の発現、および／またはＳＵＺ１２の発現を検出するための１もしくは複数のプライマー、プローブ、アレイ／マイクロアレイ、バイオマーカー特異的抗体、および／またはビーズをさらに含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項３１】
がんを有する被験体を処置するための組成物であって、該組成物は、ＥＺＨ２阻害剤を含み、該組成物は、該被験体由来の該がんの試料においてＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルが非存在であるか、もしくはＢＡＰ１の基準対照レベルと比較して低減されている場合、かつ、該試料中のＥＺＨ２の発現レベルがＥＺＨ２の基準対照レベルと比較して増大し、かつ／または、ＳＵＺ１２の発現レベルがＳＵＺ１２の基準対照レベルと比較して増大する場合、該被験体に投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項３２】
ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを、がんを有する被験体において治療有効量のＥＺＨ２阻害剤による処置が開始されるべきかどうかについての指標とする方法であって、該方法は、該被験体由来の試料中のＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを決定するステップを含み、該ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルが非存在であるか、もしくはＢＡＰ１の基準対照レベルと比較して低減されている場合、そのことは、該処置が開始されるべきであることを示す、方法。
【請求項３３】
前記がんが、悪性中皮腫である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記がんが、ブドウ膜黒色腫である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記がんが、腎細胞癌である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを、免疫蛍光法により決定する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを、ウェスタンブロットにより決定する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
ＥＺＨ２阻害剤を含む、がんを有する被験体を処置するための組成物であって、該組成物は、該被験体由来の該がんの試料においてＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルが非存在であるか、もしくはＢＡＰ１の基準対照レベルと比較して低減されている場合、該被験体に投与されることを特徴とする、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１４年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／０１４，５９４号に対する優先権を主張する。この出願の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
助成金情報
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金番号Ｆ３１ＣＡ１８０６４２−０１下の政府助成によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
１．序説
本発明は、ＥＺＨ２阻害剤が被験体において抗がん効果を生じさせる可能性を評価するのに使用することができるバイオマーカーに関する。したがって、これらのバイオマーカーは、がん患者を処置する方法において使用することができる。
【背景技術】
【０００４】
２．発明の背景
ＢＲＣＡ１関連タンパク質１（ＢＡＰ１）とは、タンパク質からのユビキチンの除去に関与する、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼである。ＢＡＰ１は、ＢＲＣＡ１のＲＩＮＧフィンガードメインを介して、１型乳がん感受性タンパク質（ＢＲＣＡ１）に結合し、腫瘍抑制因子として作用することができる。ＢＡＰ１は、転写の調節、細胞周期および細胞成長の調節、ＤＮＡ損傷への応答、ならびにクロマチンダイナミクスに関与する。ゲノムシークエンシング研究は、におけるＢＡＰ１の生殖細胞系列変異が、悪性中皮腫、ブドウ膜黒色腫、および皮膚黒色腫を含むがんの危険性の増大を伴う、腫瘍素因症候群（ＴＰＤＳ）と関連しうることを示している。さらなる研究は、肺腺癌および腎細胞癌を含む他のがんと関連する、ＢＡＰ１生殖細胞系列変異を同定している。悪性中皮腫を有する多くの患者は、自身の疾患で死亡するので、ＢＡＰ１変異を有する一部の患者の予後は、極めて不良であり、有効な処置が確認されていない。腎細胞癌を有する患者におけるＢＡＰ１変異からは、予後不良が予測され、ブドウ膜黒色腫患者におけるＢＡＰ１変異からは、高危険性群および転移が予測される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ゼスト相同体２のエンハンサー（ＥＺＨ２）とは、そのメンバーが、ヒストンタンパク質のメチル化によって、遺伝子の転写状態の調節に関与する、ポリコーム群（ＰｃＧ）ファミリーのメンバーである。ＥＺＨ２を特異的にターゲティングする薬物が開発されており、様々な腫瘍を有する患者におけるこのような薬物の効果は、活発な調査領域をなしている。ＥＺＨ２阻害剤は現在、ＥＺＨ２活性化変異を有するリンパ腫患者において、臨床試験にかけられている。したがって、当技術分野では、ＢＡＰ１変異を有する患者のための処置と、ＥＺＨ２阻害剤を使用してがんを処置すべき場合を決定するのに有用なバイオマーカーとが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
３．発明の概要
本発明は、ＥＺＨ２阻害剤が被験体において抗がん効果を生じさせる可能性を評価するための１または複数のバイオマーカーの使用に関する。それは、少なくとも部分的には、ＢＡＰ１活性を喪失させると、ＥＺＨ２の発現および活性の上方調節が結果としてもたらされるという発見に基づく。
【０００７】
したがって、非限定的な実施形態では、本発明は、患者に由来する試料中において、１または複数のバイオマーカー、例えば、ＢＡＰ１バイオマーカーの存在を決定するためのアッセイ方法およびキットと、このような決定を、がん患者のための治療レジメンの選択およびがん患者の処置方法において使用する方法とを提供する。
【０００８】
本発明は、ＥＺＨ２阻害剤により、がんにおいて、抗がん効果が生じる可能性があるかどうかを決定するための方法を提供する。ある非限定的な実施形態では、方法は、がんの１または複数の細胞におけるＢＡＰ１バイオマーカーの発現を決定するステップを含み、ＢＡＰ１バイオマーカーが、がんにおいて非存在であるか、または基準対照レベルと比較して低レベルで発現する場合、抗がん効果を生じさせる治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与する。ある特定の非限定的な実施形態では、ＢＡＰ１バイオマーカーの発現を、免疫蛍光法、ウェスタンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、またはポリメラーゼ連鎖反応により決定することができる。ある特定の実施形態では、方法はさらに、試料中のＥＺＨ２、ＳＵＺ１２、および／またはＬ３ＭＢＴＬ２の発現レベルを決定するステップも含みうる。
【０００９】
本発明はさらに、がんを有する被験体を処置するための方法も提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、方法は、被験体からがんの試料を得るステップと、試料中において、ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベル、ならびに／またはＥＺＨ２および／もしくはＳＵＺ１２の発現レベルを決定するステップとを含み、ＢＡＰ１バイオマーカーが非存在であるか、もしくはＢＡＰ１の基準対照レベルより低レベルで発現し、かつ／またはＥＺＨ２および／もしくはＳＵＺ１２の発現が、ＥＺＨ２および／もしくはＳＵＺ１２の基準対照レベルと比較して増大する場合、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤による被験体の処置を開始する。
【００１０】
本発明はさらに、ＥＺＨ２阻害剤により、がんにおいて、抗がん効果が生じる可能性あるのかどうかを決定するための方法も提供する。ある非限定的な実施形態では、方法は、被験体からがんの試料を得るステップと、試料中において、ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを決定するステップとを含み、ＢＡＰ１バイオマーカーが、がんにおいて非存在であるか、または基準対照レベルと比較して低レベルで発現する場合、ＥＺＨ２阻害剤は、がんに対して抗がん効果を有する可能性が高い。ある特定の実施形態では、ＢＡＰ１バイオマーカーは、ＢＡＰ１タンパク質バイオマーカーである。ある特定の実施形態では、ＢＡＰ１バイオマーカーは、ＢＡＰ１核酸バイオマーカーである。
【００１１】
本発明はさらに、ＥＺＨ２阻害剤に対する、患者におけるがんの感受性を予測する方法も提供する。ある非限定的な実施形態では、方法は、患者からがんの試料を得るステップと、細胞を含む試料におけるＢＡＰ１タンパク質バイオマーカーの発現レベルを決定するステップとを含み、ＢＡＰ１バイオマーカーが非存在であるか、または発現レベルが基準対照レベルと比較して低減されている場合、がんは、ＥＺＨ２阻害剤に対して感受性であることが予測される。
【００１２】
ある特定の実施形態では、がんは、悪性中皮腫、ブドウ膜黒色腫、腎細胞癌、皮膚黒色腫、肺がん、乳がん、卵巣がん、黒色腫でない皮膚がん、髄膜腫、胆管癌、平滑筋肉腫（leiomysarcoma）、神経内分泌腫瘍、膵臓がん、傍神経節腫、悪性線維性組織球腫、メラノサイトＢＡＰ１変異非定型皮内腫瘍（ＭＢＡＩＴ）、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、または膀胱がんでありうる。
【００１３】
本発明は、ＥＺＨ２阻害剤により、がんにおいて、抗がん効果が生じる可能性があるかどうかを決定するためのキットを提供する。ある非限定的な実施形態では、キットは、ＢＡＰ１バイオマーカーを検出するための手段を含む。ある特定の実施形態では、ＢＡＰ１バイオマーカーを検出するための手段は、１もしくは複数のパッケージングされたプライマー、プローブ、アレイ／マイクロアレイ、バイオマーカー特異的抗体、および／またはビーズを含む。ある特定の実施形態では、ＢＡＰ１バイオマーカーを検出するための手段は、ＢＡＰ１バイオマーカーを検出するための１もしくは複数の抗体、またはその抗原結合性断片を含む。ある特定の実施形態では、キットは、ＥＺＨ２および／またはＳＵＺ１２の発現を検出するための１もしくは複数のプライマー、プローブ、アレイ／マイクロアレイ、バイオマーカー特異的抗体、および／またはビーズをさらに含む。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ＥＺＨ２阻害剤により、がんにおいて、抗がん効果が生じる可能性があるのかどうかを決定するための方法であって、該がんの１または複数の細胞におけるＢＡＰ１バイオマーカーの発現を決定するステップを含み、該ＢＡＰ１バイオマーカーが、該がんにおいて非存在であるか、または基準対照レベルと比較して低レベルで発現する場合、抗がん効果を生じさせるための治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与する、方法。
（項目２）
前記がんが、悪性中皮腫、ブドウ膜黒色腫、腎細胞癌、皮膚黒色腫、肺がん、乳がん、卵巣がん、黒色腫でない皮膚がん、髄膜腫、胆管癌、平滑筋肉腫、神経内分泌腫瘍、膵臓がん、傍神経節腫、悪性線維性組織球腫、メラノサイトＢＡＰ１変異非定型皮内腫瘍（ＭＢＡＩＴ）、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、および膀胱がんからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現を、免疫蛍光法により決定する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現を、ウェスタンブロットにより決定する、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現を、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより決定する、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現を、ポリメラーゼ連鎖反応により決定する、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現を、該ＢＡＰ１バイオマーカーと特異的に結合する試薬を使用することにより検出する、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記試薬が、抗体またはその抗原結合性断片である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記がんが、悪性中皮腫である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記がんが、ブドウ膜黒色腫である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記がんが、腎細胞癌である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
試料中のＥＺＨ２の発現レベルを決定するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
がんを有する被験体を処置するための方法であって、該被験体から該がんの試料を得るステップと、該試料中において、ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベル、ならびに／またはＥＺＨ２および／もしくはＳＵＺ１２の発現レベルを決定するステップとを含み、該ＢＡＰ１バイオマーカーが非存在であるか、もしくはＢＡＰ１の基準対照レベルより低レベルで発現し、かつ／またはＥＺＨ２および／もしくはＳＵＺ１２の発現が、ＥＺＨ２の基準対照レベルと比較して増大する場合、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤による該被験体の処置を開始する、方法。
（項目１４）
前記がんが、悪性中皮腫である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記がんが、ブドウ膜黒色腫である、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記がんが、腎細胞癌である、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記ＢＡＰ１バイオマーカー、ＳＵＺ１２、およびＥＺＨ２の発現を、免疫蛍光法により決定する、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記ＢＡＰ１バイオマーカー、ＳＵＺ１２、およびＥＺＨ２の発現を、ウェスタンブロットにより決定する、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
ＥＺＨ２阻害剤により、がんにおいて、抗がん効果が生じる可能性があるのかどうかを決定するための方法であって、被験体から該がんの試料を得るステップと、該試料中において、ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを決定するステップとを含み、該ＢＡＰ１バイオマーカーが、該がんにおいて非存在であるか、または基準対照レベルと比較して低レベルで発現する場合、該ＥＺＨ２阻害剤は、該がんに対して抗がん効果を有する可能性が高い、方法。
（項目２０）
前記がんが、悪性中皮腫、ブドウ膜黒色腫、腎細胞癌、皮膚黒色腫、肺がん、乳がん、卵巣がん、黒色腫でない皮膚がん、髄膜腫、胆管癌、平滑筋肉腫、神経内分泌腫瘍、膵臓がん、傍神経節腫、悪性線維性組織球腫、メラノサイトＢＡＰ１変異非定型皮内腫瘍（ＭＢＡＩＴ）、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、および膀胱がんからなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ＢＡＰ１バイオマーカーが、ＢＡＰ１タンパク質バイオマーカーである、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記ＢＡＰ１バイオマーカーが、ＢＡＰ１核酸バイオマーカーである、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現を、免疫蛍光法により決定する、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
前記ＢＡＰ１バイオマーカーの発現を、ウェスタンブロットにより決定する、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
ＥＺＨ２阻害剤に対する、患者におけるがんの感受性を予測する方法であって、該患者から該がんの試料を得るステップと、該試料を含む細胞におけるＢＡＰ１タンパク質バイオマーカーの発現レベルを決定するステップとを含み、該ＢＡＰ１バイオマーカーが非存在であるか、または発現レベルが基準対照レベルと比較して低減されている場合、該がんは、ＥＺＨ２阻害剤に対して感受性であることが予測される、方法。
（項目２６）
前記がんが、悪性中皮腫、ブドウ膜黒色腫、腎細胞癌、皮膚黒色腫、肺がん、乳がん、卵巣がん、黒色腫でない皮膚がん、髄膜腫、胆管癌、平滑筋肉腫、神経内分泌腫瘍、膵臓がん、傍神経節腫、悪性線維性組織球腫、メラノサイトＢＡＰ１変異非定型皮内腫瘍（ＭＢＡＩＴ）、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、および膀胱がんからなる群から選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
ＥＺＨ２阻害剤により、がんにおいて、抗がん効果が生じる可能性があるのかどうかを決定するためのキットであって、ＢＡＰ１バイオマーカーを検出するための手段を含むキット。
（項目２８）
ＢＡＰ１バイオマーカーを検出するための前記手段が、１もしくは複数のパッケージングされたプライマー、プローブ、アレイ／マイクロアレイ、バイオマーカー特異的抗体、および／またはビーズを含む、項目２７に記載のキット。
（項目２９）
ＢＡＰ１バイオマーカーを検出するための前記手段が、ＢＡＰ１バイオマーカーを検出するための１もしくは複数の抗体、またはその抗原結合性断片を含む、項目２７に記載のキット。
（項目３０）
ＥＺＨ２の発現、Ｌ３ＭＢＴＬ２の発現、および／またはＳＵＺ１２の発現を検出するための１もしくは複数のプライマー、プローブ、アレイ／マイクロアレイ、バイオマーカー特異的抗体、および／またはビーズをさらに含む、項目２７に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＢＡＰ１を喪失させたところ、ヒストンのＨ３Ｋ２７ｍｅ３が上方調節された。
【図２】ＥＺＨ２は、ＢＡＰ１変異体の中皮腫細胞において過剰発現した。
【図３】ＢＡＰ１の発現を獲得／喪失させると、ＰＲＣ２サブユニットの発現の変更が結果としてもたらされた。
【図４】ＥＺＨ２を阻害したところ、中皮腫異種移植片において腫瘍体積が減少した。
【図５Ａ−Ｌ】Ｂａｐ１の条件付き造血系欠失（conditional  hematopoietic  deletion）についての特徴付け。（ａ）ＴＣＧＡによるＡＭＬ（急性骨髄性白血病）患者、および（ｂ）ＴＣＧＡによる中皮腫患者における、ＢＡＰ１、ＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ２、およびＡＳＸＬ３の平均遺伝子発現を、正規化されたリードカウントについて、標準誤差を伴う数学的平均値として表した図である。（ｃ）Ｃ５７／Ｂ６Ｈマウスの、精製された造血細胞集団における、ｑＲＴ−ＰＣＲによるＢａｐ１の発現。ＬＴ−ＨＳＣ、長期造血幹細胞（ＨＳＣ）、（Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−）；ＳＴ−ＨＳＣ、短期ＨＳＣ（Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ４８＋）；ＭＰＰ、多能性（mulitpotent）前駆細胞、（Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ１５０−ＣＤ４８＋）；ＬＳＫ、Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃ−Ｋｉｔ＋；ＭＰ、骨髄系前駆細胞（Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１−ｃ−Ｋｉｔ＋）、ＧＭＰ、顆粒球マクロファージ前駆細胞（Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１−ｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋Ｆｃγ＋）；ＣＭＰ、骨髄球系共通前駆細胞（Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１−ｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋Ｆｃγｌｏ）；ＭＥＰ；マクロファージ・赤血球系前駆細胞（Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１−ｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ３４−ＦｃΥ−）、ＭＯＮＯ；単球（Ｍａｃ１＋Ｇｒ１−）、ＰＭＮ；（多形核好中球、Ｍａｃ１＋Ｇｒ１＋）、Ｔ細胞、ＣＤ３＋；およびＢ細胞、Ｂ２２０＋。（ｄ）ＥＵＣＯＭＭコンソーシアムから得たマウス胚性幹細胞における、Ｂａｐ１ターゲティングスキーム。キメラを作製した後で、マウスを、トランスジェニックＦＬＰＥマウスと交配させて、未成熟停止カセットを切り出した。次いで、マウスを、Ｍｘ１−Ｃｒｅトランスジェニックマウスと交配させた。遺伝子型を確認する遺伝子型決定スキームと、ｐｏｌｙＩｐｏｌｙＣ（ｐＩｐＣ）処理の４週間後における切出しである。ｐＩｐＣによる処理して切出しを誘導した後の、対照マウスおよびＢａｐ１  ＫＯマウスにおける、（ｅ）末梢血における白血球の計数、および（ｆ）フローサイトメトリーによる骨髄系細胞（Ｍａｃ１＋Ｇｒ１＋）の計数。ｐＩｐＣ誘導型切出しの後における、対照マウスおよびＢａｐ１  ＫＯマウスの骨髄における、（ｇ）末梢血におけるヘマトクリット百分率、および（ｈ）フローサイトメトリーによる赤血球前駆体（ＣＤ７１＋Ｔｅｒ１１９＋）の計数。（ｉ）対照細胞集団およびＢａｐ１  ＫＯ骨髄の骨髄系前駆細胞集団（Ｌｉｎ−ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ１−）の相対頻度。細胞は、系列陰性生細胞集団にゲーティングをかけた。（ｊ）対照マウスおよびＢａｐ１  ＫＯマウスにおける、骨髄の骨髄系前駆細胞集団（ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＭＥＰ）の相対定量。（ｋ）前駆体およびＧＭＰの拡大を裏付ける、実施例の対照動物および骨髄動物からのフロープロット。（ｌ）循環前駆細胞（Ｋｉ６７／ＤＡＰＩ染色）の、フローサイトメトリーによる計数を示す図であり；全ての実験について、ＣＯＮマウスはｎ＝５であり、Ｂａｐ１  ＫＯマウスはｎ＝８である。
【図６Ａ−Ｌ】Ｂａｐ１を欠失させると、Ａｓｘｌ１の喪失と比較した、分化経路の活性化、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３の増大がもたらされる。（ａ）Ｂａｐ１の条件付き欠失の３週間後における脾臓画像、ならびに対照（同腹Ｂａｐ１ｆ／ｆマウス、ＣＯＮ）骨髄、およびＢａｐ１ノックアウト（Ｍｘ１−Ｃｒｅ  Ｂａｐ１ｆ／ｆマウス、Ｂａｐ１  ＫＯ）骨髄についてのウェスタンブロットによる、Ｂａｐ１の欠失の検証。（ｂ）Ｂａｐ１  ＫＯマウスおよびＡｓｘｌ１  ＫＯマウスにおける、骨髄系前駆細胞による遺伝子発現を比較するベン図である、ｐ＜０．０５；比較は、遺伝子重複および同方向の遺伝子変化を含む。（ｃ）Ｂａｐ１  ＫＯマウスおよび対照マウス（ｎ＝３）から分取された顆粒球マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ；Ｌｉｎ−ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ１−ＣＤ３４＋Ｆｃγ＋）における、ＨｏｘＡクラスターについての定量的リアルタイムｑＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）。（ｄ）総ヒストンＨ３に対して正規化された、Ｂａｐ１  ＫＯおよび対照由来のｃ−Ｋｉｔ＋富化骨髄細胞から精製されたヒストンについての質量分析。（ｅ）Ｂａｐ１  ＫＯ骨髄および対照骨髄から精製されたヒストンにおける、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３および総Ｈ３についてのウェスタンブロット。（ｆ）ＣＯＮ試料およびＢａｐ１  ＫＯ試料において判定される、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３ブロードドメインの数。固有のブロードドメインおよび重複するブロードドメインを示すベン図である。（ｇ）ｃ−Ｋｉｔ富化骨髄細胞（ｎ＝２）における、正規化されたＨ３Ｋ２７ｍｅ３リードを示す箱髭図。（ｈ）ブロードドメイン密度を、ＣＯＮ試料中およびＢａｐ１  ＫＯ試料中の両方で判定された、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３ドメインからの距離の関数としてプロットする図。（ｉ）下方調節される遺伝子との遺伝子発現相関を裏付けるＧＳＥＡ。（ｊ）ＨＯＸＡ遺伝子座における、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３  ＣｈＩＰ−ｓｅｑについての局所的プロット。（ｋ）ｐ値と対比した比（ＫＯ／ＣＯＮ）により表示されるボルカノプロット内で表示される、分取されたＧＭＰ細胞におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３  ＣｈＩＰ−Ｓｅｑによるピーク判定。（ｌ）Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３結合性遺伝子およびＲＮＡ−Ｓｅｑに対する特定の遺伝子シグネチャーの有意性。統計学的解析は、スチューデントのｔ検定による＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５；報告値±ＳＥＭとして計算した。
【図７Ａ−Ｃ】Ｂａｐ１およびＡｓｘｌ１を喪失させると、反対の遺伝子発現変化が結果としてもたらされる。（ａ）対照対Ｂａｐ１  ＫＯマウスの顆粒球マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ；Ｌｉｎ−ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ１−ＣＤ３４＋Ｆｃγ＋）において差次的に発現する遺伝子のＲＮＡ−Ｓｅｑデータを示す図であり、細胞は、ＤＥＳｅｑ２により解析した（カットオフｐ値：ｐ＜０．０５）。ヒートマップは、発現の増大する遺伝子（赤）および減少する遺伝子（青）を示す。（ｂ）Ｂａｐ１  ＫＯおよびＡｓｘｌ１  ＫＯについてのＧＳＥＡ解析からの、ＦＤＲ＜０．２５に達している正に富化される遺伝子セットおよび負に富化される遺伝子セットの数（上）。ＲＮＡ−Ｓｅｑにより、Ｂａｐ１  ＫＯ骨髄系前駆細胞内と、Ａｓｘｌ１  ＫＯ骨髄系前駆細胞内とで、反対に富化される遺伝子セットを描示するベン図（下）。（ｃ）Ｂａｐ１  ＫＯおよびＡｓｘｌ１  ＫＯ前駆細胞において反対に富化され、統計学的に有意であるＨｏｘＡクラスター遺伝子セットについてのＧＳＥＡ。ｐ値およびＦＤＲ値を表示する。
【図８Ａ−Ｃ】Ｂａｐ１を欠失させると、ＰＲＣ２活性が増強される。（ａ）Ｂａｐ１  ＫＯマウスおよび対照マウスに由来する骨髄細胞から精製されたヒストンにおける総Ｈ３に対して正規化された、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３についてのＥＬＩＳＡ。（ｂ）遺伝子転写の開始部位（プロモーター、エクソン、イントロン、下流（±２ｋｂ）、遠位（２〜５ｋｂ）、および遺伝子間（＞５０ｋｂ））との関連で判定されるＨ３Ｋ２７ｍｅ３ブロードドメインの百分率。（ｃ）ＧＳＥＡを使用して、分取された骨髄集団由来の公表されたＲＮＡ−Ｓｅｑ（Lara-Astiasoら、２０１４年）を、Ｂａｐ１喪失後に差次的に下方調節され、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３によりマークされる遺伝子と比較することにより解析したこと。下方調節され、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３によりマークされる遺伝子が、造血前駆細胞集団だけと相関したことから、これらが、関与性の標的集団でありうることが示唆される。これらのデータは、Ｂａｐ１  ＫＯマウスモデルにおいて見られた前駆細胞の拡大を説明する。
【図９Ａ−Ｃ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＢＡＰ１を撹乱させると、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の変化がもたらされる。（ａ）２つの独立のＢＡＰ１  ｓｈＲＮＡを形質導入されたＳＥＴ２細胞についてのウェスタンブロットであって、精製されたヒストンにおけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルと、全細胞抽出物からのＢＡＰ１のノックダウンとを明らかにするウェスタンブロット。（ｂ）対照骨髄細胞およびＢａｐ１  ＫＯ骨髄細胞についてのメチルセルロースアッセイ。ＢＡＰ１  ｃＤＮＡ構築物を、対照細胞およびＢａｐ１欠失細胞へと再導入した。ヒストンについてのＥＬＩＳＡアッセイを、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３について実施した。ＢＡＰ１構築物の発現を評価する定量的ｑＰＣＲである。（ｃ）ＢＡＰ１およびデユビキチナーゼ変異体であるＢＡＰ１  Ｃ９１Ａの、Ｂａｐ１欠損マウス細胞内への再導入。ヒストンについてのウェスタンブロットを、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３および総Ｈ３について実施した。構築物の発現レベルを示す定量的ｑＰＣＲである。
【図１０Ａ−Ｄ】Ｂａｐ１／Ｅｚｈ２複合ＫＯマウスについての特徴付け。（ａ）多様なＢａｐ１／Ｅｚｈ２遺伝子型についての骨髄病態。（ｂ）表示の遺伝子型（ＣＤ７１、Ｔｅｒ１１９）にある赤血球系細胞についての、フローサイトメトリーによる染色および定量。（Ｉ〜ＩＶ）は、Ｉを最も未成熟な段階とし、ＩＶを最も成熟した段階とする、赤血球系の分化の段階を表示する。代表的フロープロットの右側の図は、これらの表現型の定量を示す。（ｃ）ｐＩｐＣの４週間後における、表示の遺伝子型についての脾臓サイズ。（ｄ）ｐＩｐＣの４週間後における、表示の遺伝子型についての白血球カウント。
【図１１Ａ−Ｋ】Ｂａｐ１の欠失により誘導される増殖は、Ｅｚｈ２の喪失によりレスキューされる。（ａ）Ｂａｐ１  ＫＯマウス、Ｅｚｈ２  ＫＯマウス、Ｂａｐ１／Ｅｚｈ２  ＫＯマウス、および対照マウスの骨髄から精製されたヒストンにおける、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルについてのウェスタンブロット。ｐＩｐＣの３週間後における、表示の遺伝子型のマウスからの（ｂ）脾臓の代表的画像、および（ｃ）脾臓重量の計量。Ｈｅｍａｖｅｔにより定量される、（ｄ）末梢白血球カウント、および（ｅ）ヘマトクリット百分率。フローサイトメトリーによる、（ｆ）骨髄系前駆細胞（Ｌｉｎ−ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ１−）、および（ｇ）成熟骨髄系細胞（Ｍａｃ１＋Ｇｒ１＋）の計数。（ｈ）Ｋｉ６７染色およびＤＡＰＩ染色を使用する、骨髄系前駆細胞における細胞周期解析（ｎ＝３／群）。（ｉ）５００ｍｇ／ｋｇのＥＰＺ０１１９８９で、１日２回、１６日間にわたり処置されたマウス（ｎ＝５／群）における、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルについてのウェスタンブロット。処置後における、（ｊ）脾臓重量、および（ｋ）白血球カウント。そうでないことが指示されない限りにおいて、ＣＯＮのｎ＝５、Ｅｚｈ２  ＫＯのｎ＝５、Ｂａｐ１  ＫＯのｎ＝８、およびＢａｐ１／Ｅｚｈ２  ＫＯのｎ＝１１であり、統計学的解析は、スチューデントのｔ検定による＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５；報告値±ＳＥＭとして計算した。
【図１２Ａ−Ｃ】Ｂａｐ１  ＫＯ動物におけるヒストン解析。（ａ）対照細胞およびＢａｐ１  ＫＯ細胞におけるｑＰＣＲにより評価される、ＥＺＨ２転写。細胞には、空ベクターまたはＢＡＰ１過剰発現構築物のいずれかを形質導入した。（ｂ）対照動物およびＢａｐ１  ＫＯ動物の、ｃ−ｋｉｔ富化骨髄細胞における、ヒストンについての質量分析、ｎ＝２。（ｃ）ＦＬＡＧタグ付けされたＢＡＰ１、ＡＳＸＬ１、およびＢｍｉ１を過剰発現させる２９３Ｔ細胞における、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１についてのＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ実験。
【図１３Ａ−Ｌ】ＢＡＰ１を枯渇させると、ＰＲＣ２成分の発現の増大、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１の増大、およびＬ３ＭＢＴＬ２の脱ユビキチン化がもたらされる。（ａ）ＳＥＴ２細胞における、内因性のＥＺＨ２およびＢＡＰ１の共免疫沈降に続く、ウェスタンブロット解析（ＤＮＡに依存する相互作用を阻害するベンゾナーゼの存在下で実施される）。（ｂ）ｑＲＴ−ＰＣＲによる、Ｂａｐ１、Ｅｚｈ２、およびＳｕｚ１２の、分取された顆粒球マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ；Ｌｉｎ−ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ１−ＣＤ３４＋Ｆｃγ＋）からの発現。（ｃ）Ｂａｐ１  ＫＯマウスおよび対照マウスに由来する骨髄細胞における、Ｂａｐ１およびＥｚｈ２についてのウェスタンブロット解析。（ｄ）ヒストンについての質量分析実験による、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１の定量。ＢＡＰ１野生型（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、Ｍｅｓｏ１０）細胞系および変異体（欠失であるＨ２２６；触媒性変異であるＨ２４５２）細胞系における、（ｅ）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ生存率アッセイにより評価される細胞生存率、および（ｆ）ＳＥＴＤ８の過剰発現実験のためのアネキシンＶアッセイ。（ｇ）ＳＥＴＤ８を過剰発現させるＢＡＰ１変異体細胞における、ＳＥＴＤ８およびＥＺＨ２についての定量的ｑＰＣＲ。（ｈ）ＢＡＰ１野生型細胞系における、ＳＥＴＤ８およびＥＺＨ２についてのウェスタンブロット解析。（ｉ）ＤＭＳＯまたは５、１０、２０μＭのＢＶＴ５９４で処理された細胞におけるＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ。（ｊ）ＢＡＰ１野生型細胞系（Ｍｅｔ５ａ、ＪＭＮ）、およびＢＡＰ１変異体中皮腫細胞系（Ｈ２２６、Ｈ２４５２、Ｈ２８）における、Ｌ３ＭＢＴＬ２およびＢＡＰ１の発現。（ｋ）Ｍｙｃ−Ｈｉｓタグ付けされたユビキチンを過剰発現させる２９３Ｔ細胞と、Ｌ３ＭＢＴＬ２  ｃＤＮＡを過剰発現させる２９３Ｔ細胞、ならびに種々のレベルのＢＡＰ１（０、５μｇ、２．５μｇ、１μｇ）。Ｎｉビーズにより共免疫沈降実験を行い、一連のストリンジェントな洗浄を行った。（ｌ）ＢＡＰ１の調節が、クロマチンおよび遺伝子発現に対する効果をもたらすことを描示するモデル。統計学的解析は、スチューデントのｔ検定による＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５；報告値±ＳＥＭとして計算した。
【図１４Ａ−Ｂ】ＢＡＰ１、ＡＳＸＬ１、ＨＣＦ−１、およびＯＧＴの結合についての解析。（ａ）ＢＡＰ１、ＡＳＸＬ１、ＨＣＦ−１、およびＯＧＴのＣｈＩＰ−Ｓｅｑについての、ｋ−ｍｅａｎｓクラスタリング解析。（ｂ）ＢＡＰ１結合性クラスターにおけるＨｏｍｅｒデノボモチーフ解析。
【図１５Ａ−Ｉ】Ｌ３ＭＢＴＬ２およびＢＡＰ１は、ＥＺＨ２を共調節する。（ａ）対照骨髄細胞内およびＢａｐ１  ＫＯ骨髄細胞における、Ｂａｐ１およびＬ３ｍｂｌｔ２の発現。（ｂ）ｑＰＣＲによる、ＧＭＰにおける、Ｌ３ｍｂｔｌ２の発現。（ｃ）２５ｕＭのＭＧ１３２で処理された、Ｈ２２６細胞およびＨ２４５２細胞についてのウェスタンブロット。不溶性画分は、２％のＳＤＳを含有する溶解緩衝液を使用して抽出した。（ｄ）Ｌ３ＭＢＴＬ２を過剰発現させる細胞系における、ＥＺＨ２の発現。（ｅ）１．９ｋＢのＥＺＨ２プロモーターを含有する構築物およびＲｅｎｉｌｌａ対照ベクターを、２９３Ｔ細胞へと、空ベクター、ＢＡＰ１発現ベクター、またはＬ３ＭＢＴＬ２発現ベクターと共に一過性にトランスフェクトする、ＥＺＨ２プロモーター活性アッセイ。これらの条件の各々において、ホタルルシフェラーゼ活性は、Ｒｅｎｉｌｌａ活性に対して正規化した。（ｆ）２つの独立のヘアピンを使用して、ＳＥＴ２細胞におけるＬ３ＭＢＴＬ２タンパク質をノックダウンしたこと。短時間および長時間にわたる曝露を含むウェスタンブロット解析を、Ｌ３ＭＢＴＬ２、ＥＺＨ２、およびアクチンについて行った。（ｇ）２９３Ｔ細胞における、Ｌ３ＭＢＴＬ２についてのＣｈＩＰに続く、ＥＺＨ２遺伝子座、ＳＵＺ１２遺伝子座、Ｅ２Ｆ６（陽性対照）遺伝子座、ＰＨＦ２０（陽性対照）遺伝子座、およびＭＯＲＣ３（陰性対照）遺伝子座におけるｑＰＣＲ。（ｈ）ＦＬＡＧ−Ｌ３ＭＢＴＬ２またはＦＬＡＧ−ＢＡＰ１を過剰発現させる２９３Ｔ細胞における、抗ＦＬＡＧ  ＣｈＩＰに続く、ＥＺＨ２遺伝子座におけるｑＰＣＲ。ＪＡＭ２は、陽性対照である。ＦＬＡＧの過剰発現を伴わない２９３Ｔ細胞と比較する。（ｉ）２９３Ｔ細胞における、Ｌ３ＭＢＴＬ２およびＢＡＰ１についてのウェスタンブロットに続く、それぞれのＩＰ。ＤＮＡ消化を示すように、アガロースＤＮＡゲルを組み入れた。
【図１６Ａ−Ｈ】ＢＡＰ１変異体の中皮腫細胞系モデルおよび異種移植片モデルは、ＥＺＨ２の阻害に対して感受性である。（ａ）ＴＣＧＡによる中皮腫患者における、ＥＺＨ２転写物の発現を、マッチさせた正常者と比較して示す図である。（ｂ）空ベクターまたはＥＺＨ２をターゲティングするヘアピンのいずれかを発現させる、ＢＡＰ１野生型細胞系および変異体細胞系における、アネキシンＶアッセイ。（ｃ）中皮腫細胞系におけるアネキシンＶ実験の定量。（ｄ）ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスへと植え込まれた、ＥＺＨ２ヘアピンを発現させる、Ｍｅｓｏ１０細胞系およびＨ２２６細胞系の腫瘍サイズ、ｎ＝６／群。（ｅ）１．２５μＭのＥＰＺ０１１９８９による２週間の処置の後における、２Ｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ生存率アッセイ。（ｆ）３週間の、１．２５μＭのＥＰＺ０１１９８９処置の後における、３Ｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ生存率アッセイ。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスへと植え込まれ、媒体（vehicle）または５００ｍｇ／ｋｇで１日２回のＥＰＺ０１１９８９で処置された、（ｇ）ＢＡＰ１変異体細胞（ＭＳＴＯ、およびＭｅｓｏ１０）、または（ｈ）野生型細胞（Ｈ２２６、およびＨ２４５２）による腫瘍サイズの形成。腫瘍は、毎週３回測定した、ｎ＝６／群。標的の阻害は、抽出された腫瘍におけるヒストンについてのウェスタンブロットにより評価した（それぞれの図において示される）。媒体およびＥＰＺ０１１９８９で処置されたＨ２４５２細胞の肺病態である。矢印は、バルクの転移腫瘍を指し示す。統計学的解析は、スチューデントのｔ検定による＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５；報告値±ＳＥＭとして計算した。
【図１７】ＰＲＣ２成分の発現は、分取集団および全骨髄において増大した。
【図１８】ＢＡＰ１  ＫＯマウスでは、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３が、局所的または全体的に増大した。ＢＡＰ１  ＫＯ動物におけるヒストンのメチル化は、対照骨髄およびＢＡＰ１  ＫＯ骨髄について、酸抽出を行うことに続く、ウェスタンブロットにより評価した。クロマチン免疫沈降シークエンシング（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ）はまた、ｃＫｉｔに富む骨髄についても遂行した。ＣｈＩＰ−Ｓｅｑを、ＲＮＡ−シークエンシングデータと重ね合わせることにより、ＢＡＰ１  ＫＯマウスにおいて下方調節される遺伝子はいっそう、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３によりマークされることが裏付けられた。ＢＡＰ１  ＫＯマウスでは、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３は、ＨＯＸＡ遺伝子座など、ＥＺＨ２標的遺伝子において増大することが観察された。
【図１９】ＢＡＰ１  ＫＯ細胞における、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２／３の上方調節は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ０／１を消費して生じた。
【図２０Ａ−Ｄ】ＢＡＰ１変異体細胞系は、ＥＺＨ２の阻害に対してより感受性である。（ａ）ＥＺＨ２を過剰発現させるＭｅｓｏ１０細胞系は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの脇腹への注射の後で、いっそう増殖した。（ｂ）ＥＺＨ２が、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞系およびＭｅｓｏ１０細胞系において過剰発現した。細胞系は、ＥＺＨ２の過剰発現により、ＥＺＰ０１１９８９に対していっそう感受性となった。（ｃ）ＢＡＰ１変異体細胞は、ＥＺＨ２阻害剤であるＧＳＫ１２６で処理されると、浸潤性を低下させた。（ｄ）ＧＳＫ１２６による処理に続く、Ｈ２２６細胞系における、Ｅカドヘリン発現の増大。
【図２１Ａ−Ｃ】ＢＡＰ１変異体の中皮腫細胞系モデルおよび異種移植片モデルは、ＥＺＨ２の阻害に対して感受性である。（ａ）１５０ｍｇ／ｋｇのＧＳＫ１２６または媒体で毎日処置された、Ｈ２４５２異種移植片の腫瘍体積（１群当たりｎ＝１０匹のマウス）。各群から５匹ずつのマウスを、１６日の処置の後に安楽死させて、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の枯渇について評価した。残りのマウスは、試験の残りの期間にわたり処置した。（ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏで処置されたマウスに由来する、１６日の処置の後における腫瘍におけるにＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルについての、ヒストンについてのＥＬＩＳＡおよびヒストンについてのウェスタンブロット解析。（ｃ）媒体で処置されたマウス、およびＧＳＫ１２６で処置されたマウスから抽出された腫瘍の、Ｈ＆Ｅ染色、Ｋｉ６７染色、およびＴＵＮＥＬ染色（１０倍の倍率）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
５．詳細な説明
明確さのためであり、限定を目的とするものではないが、本発明についての詳細な説明は、以下の小節：
（ｉ）ＢＡＰ１バイオマーカー；
（ｉｉ）ＥＺＨ２阻害剤；
（ｉｉｉ）がん標的；
（ｉｖ）バイオマーカーの検出；
（ｖ）使用方法；および
（ｖｉ）キット
へと分けられる。
【００１６】
５．１  ＢＡＰ１バイオマーカー
本明細書で使用される「バイオマーカー」という用語は、被験体における、本明細書でＢＡＰ１と表記されるＢＲＣＡ１関連タンパク質１の活性レベルと関連する、核酸およびタンパク質を含む。
【００１７】
本明細書で互換的に使用される、「患者」または「被験体」は、ヒトまたは非ヒト被験体を指す。非ヒト被験体の非限定的な例は、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、家禽、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、クジラなどを含む。
【００１８】
ある特定の非限定的な実施形態では、開示されるＢＡＰ１バイオマーカーは、核酸でありうる。例えば、限定を目的とするものではないが、バイオマーカーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、またはリボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、ｍＲＮＡでありうる。
【００１９】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＢＡＰ１核酸バイオマーカーは、ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＧ＿０３１８５９．１もしくはＮＭ＿００４６５６に示される配列を有するヒトＢＡＰ１核酸、またはＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＰ＿００４６４７に示されるアミノ酸配列を有するＢＡＰ１タンパク質分子をコードする核酸でありうる。
【００２０】
具体的で非限定的な実施形態では、ＢＡＰ１核酸バイオマーカーは、ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＭ＿０２７０８８に示される配列を有するマウスＢＡＰ１核酸、またはＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＰ＿０８１３６４．１に示されるアミノ酸配列を有するＢＡＰ１タンパク質分子をコードする核酸でありうる。
【００２１】
具体的で非限定的な実施形態では、ＢＡＰ１核酸バイオマーカーは、ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＭ＿００１１０７２９２．１に示される配列を有するラットＢＡＰ１核酸、またはＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＰ＿００１１００７６２．１に示されるアミノ酸配列を有するＢＡＰ１タンパク質分子をコードする核酸でありうる。
【００２２】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＢＡＰ１バイオマーカーは、タンパク質でありうる。
【００２３】
具体的で非限定的な実施形態では、ＢＡＰ１タンパク質バイオマーカーは、ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＰ＿００４６４７に示されるアミノ酸配列を有するヒトＢＡＰ１タンパク質でありうる。
【００２４】
具体的で非限定的な実施形態では、ＢＡＰ１タンパク質バイオマーカーは、ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＰ＿０８１３６４．１に示されるアミノ酸配列を有するマウスＢＡＰ１タンパク質でありうる。
【００２５】
具体的で非限定的な実施形態では、ＢＡＰ１タンパク質バイオマーカーは、ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＰ＿００１１００７６２．１に示されるアミノ酸配列を有するラットＢＡＰ１タンパク質でありうる。
【００２６】
ある特定の実施形態では、ＢＡＰ１バイオマーカーのレベルを、基準対照レベルと比較する。本明細書で互換的に使用される、ＢＡＰ１の「基準対照レベル」または「基準対照発現レベル」とは、例えば、基準対照試料を使用して確立することができる。基準対照試料の非限定的な例は、野生型のＢＡＰ１活性を有する正常細胞および／または健常細胞を含む。ある特定の実施形態では、ＢＡＰ１の基準対照レベルは、例えば、正常細胞、例えば、患者において、腫瘍に隣接して位置する良性細胞を使用して確立することができる。
【００２７】
本発明のある特定の非限定的な実施形態では、ＢＡＰ１バイオマーカーのレベルは、ＢＡＰ１機能を評価することにより評価することができ、この場合、ＢＡＰ１の発現レベルは、ＢＡＰ１機能のレベルに正比例する。非限定的な一例では、ＢＡＰ１の機能は、ＥＺＨ２の発現（例えば、ＥＺＨ２タンパク質の発現またはＥＺＨ２核酸の発現）の下方調節でありうる。例えば、限定を目的とするものではないが、ＢＡＰ１バイオマーカーのレベルは、被験体のがん細胞におけるＥＺＨ２の発現レベルを、ＥＺＨ２の基準対照レベルと比較して決定することにより決定することができる。ある特定の実施形態では、ＥＺＨ２の基準対照レベルは、野生型のＥＺＨ２活性および／もしくは正常なＥＺＨ２活性、ならびに／または正常なＢＡＰ１活性を有する、正常細胞および／または健常細胞を使用して確立することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、ＥＺＨ２は、ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＧ＿０３２０４３．１；ＮＭ＿００４４５６．４；ＮＭ＿００１２０３２４９．１；ＮＭ＿１５２９９８．２；ＮＭ＿００１２０３２４７．１、および／もしくはＮＭ＿００１２０３２４８．１に示される配列を有するヒトＥＺＨ２核酸、またはＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＰ＿００１１９０１７６．１；ＮＰ＿００１１９０１７７．１；ＮＰ＿００１１９０１７８．１；ＮＰ＿００４４４７．２；および／もしくはＮＰ＿６９４５４３．１に示されるアミノ酸配列を有するＥＺＨ２タンパク質分子をコードする核酸でありうる。具体的で非限定的な実施形態では、ＥＺＨ２は、ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＰ＿００１１９０１７６．１；ＮＰ＿００１１９０１７７．１；ＮＰ＿００１１９０１７８．１；ＮＰ＿００４４４７．２；および／またはＮＰ＿６９４５４３．１に示されるアミノ酸配列を有するヒトＥＺＨ２タンパク質でありうる。
【００２８】
非限定的な一例では、ＢＡＰ１の機能は、ＳＵＺ１２の発現（例えば、ＳＵＺ１２タンパク質の発現またはＳＵＺ１２核酸の発現）の調節でありうる。ある特定の非限定的な実施形態では、ＢＡＰ１バイオマーカーのレベルは、被験体のがん細胞におけるＳＵＺ１２の発現レベルを、ＳＵＺ１２の基準対照レベルと比較して決定することにより決定することができる。ある特定の実施形態では、ＳＵＺ１２の基準対照レベルは、野生型のＳＵＺ１２活性および／もしくは正常なＳＵＺ１２活性、ならびに／または正常なＢＡＰ１活性を有する、正常細胞および／または健常細胞を使用して確立することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、ＳＵＺ１２は、ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＭ＿０１５３５５．２に示される配列を有するヒトＳＵＺ１２核酸、またはＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＰ＿０５６１７０．２に示されるアミノ酸配列を有するＳＵＺ１２タンパク質分子をコードする核酸でありうる。具体的で非限定的な実施形態では、ＳＵＺ１２は、ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＰ＿０５６１７０．２に示されるアミノ酸配列を有するヒトＳＵＺ１２タンパク質でありうる。
【００２９】
本明細書で、基準対照発現レベルに照らした比較に言及する場合は、バイオマーカーを、同じ種における基準対照発現レベルと比べて評価する。例えば、ヒトＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルおよび／または存在を、ヒトＢＡＰ１の基準対照レベルと比較する。
【００３０】
特定の非限定的な実施形態では、ＢＡＰ１バイオマーカーの非存在および／または発現の低減とは、基準対照レベルと比べて、約９０％未満、約８０％未満、約７０％未満、約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満の発現の検出を意味する。
【００３１】
５．２  ＥＺＨ２阻害剤
ＥＺＨ２阻害剤の非限定的な例は、ＥＺＨ２の発現および／または活性を、阻害および／または低減する、化合物、分子、化学物質、ポリペプチド、タンパク質を含む。ＥＺＨ２阻害剤のさらなる非限定的な例は、Ｓ−アデノシルメチオニン競合的低分子阻害剤を含む。特定の非限定的な実施形態では、ＥＺＨ２阻害剤は、テトラメチルピペリジニル化合物に由来する。さらなる非限定的な例は、ＵＮＣ１９９９、３−デアザネプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）、ＥＩ１、ＥＰＺ−５６７６、ＥＰＺ−６４３８、ＧＳＫ３４３、ＥＰＺ００５６８７、ＥＰＺ０１１９８９、およびＧＳＫ１２６を含む。
【００３２】
ＥＺＨ２阻害剤のさらなる非限定的な例は、それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Garapaty-Raoら、Chemistry  and  Biology、２０巻：１〜１１頁（２０１３年）、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ２０１３／１３８３６１号、同第ＷＯ２０１３／０４９７７０号、および同第ＷＯ２００３／０７０８８７号、ならびに米国特許出願第ＵＳ２０１４／０２７５０８１号、同第ＵＳ２０１２／００７１４１８号、同第ＵＳ２０１４／０１２８３９３号、および同第ＵＳ２０１１／０２５１２１６号において記載されている。
【００３３】
ＥＺＨ２阻害剤のさらなる非限定的な例は、ＥＺＨ２の発現または活性を特異的に阻害する、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ分子、およびｓｉＲＮＡ分子を含む。ＥＺＨ２阻害剤の非限定的な一例は、ＥＺＨ２核酸配列の少なくとも一部分と相同なアンチセンス、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡの核酸配列を含み、この場合、ＥＺＨ２配列と比べた部分の相同性は、少なくとも約７５または少なくとも約８０または少なくとも約８５または少なくとも約９０または少なくとも約９５または少なくとも約９８パーセントであり、ここで、相同性パーセントは、例えば、ＢＬＡＳＴソフトウェアまたはＦＡＳＴＡソフトウェアにより決定することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、相補的な部分は、少なくとも１０ヌクレオチドまたは少なくとも１５ヌクレオチドまたは少なくとも２０ヌクレオチドまたは少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも３０ヌクレオチドを構成することが可能であり、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡ分子、またはｓｉＲＮＡ分子は、最大で１５、または最大で２０、または最大で２５、または最大で３０、または最大で３５、または最大で４０、または最大で４５、または最大で５０、または最大で７５、または最大で１００ヌクレオチドの長さでありうる。アンチセンス分子、ｓｈＲＮＡ分子、またはｓｉＲＮＡ分子は、ＤＮＡ、または、例えば、ホスホロチオエート残基であるがこれらに限定されない、非定型もしくは天然に存在しない残基を含みうる。
【００３４】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＥＺＨ２阻害剤を、単独で使用することもでき、１または複数の抗がん剤と組み合わせて使用することもできる。抗がん剤は、抗がん効果を有する任意の分子、化合物、または組成物でありうる。抗がん剤は、化学療法剤、放射線治療剤、サイトカイン、血管新生抑制剤、アポトーシス誘導剤、または抗体などの抗がん性免疫毒素を含むがこれらに限定されない。「〜と組み合わせた」とは、ＥＺＨ２阻害剤と、１または複数の抗がん剤とを、被験体へと、処置レジメンまたは処置計画の一部として投与することを意味する。これらの用語は、ＥＺＨ２阻害剤と、１または複数の抗がん剤とを、投与の前に物理的に組み合わせたり、それらを同じ時間枠により投与したりすることを要請するものではない。
【００３５】
５．３  がん標的
本明細書で開示される主題の対象となりうるがんの非限定的な例は、悪性中皮腫、ブドウ膜黒色腫、腎細胞癌、皮膚黒色腫、肺がん、乳がん、卵巣がん、黒色腫でない皮膚がん、髄膜腫、胆管癌（chlangiocarcinoma）、平滑筋肉腫、神経内分泌腫瘍、膵臓がん、傍神経節腫、悪性線維性組織球腫、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、メラノサイトＢＡＰ１変異非定型皮内腫瘍（ＭＢＡＩＴ）、および膀胱がんを含む。
【００３６】
５．４  バイオマーカーの検出
ＢＡＰ１核酸バイオマーカーである、ＥＺＨ２核酸、Ｌ３ＭＢＴＬ２核酸、またはＳＵＺ１２核酸の発現レベルを、定性的かつ定量的に検出および／または決定するための方法は、従来のｑＰＣＲおよびディジタルＰＣＲを含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、蛍光ｉｎ  Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）であるがこれらに限定されない）、ゲル電気泳動、シークエンシングおよび配列解析、マイクロアレイ解析、ならびに当技術分野で公知の他の技法を含むがこれらに限定されない。
【００３７】
ある特定の実施形態では、検出方法は、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ、蛍光ＰＣＲ、ＲＴ−ＭＳＰ（ＲＴメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応）、ＤＮＡのＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）検出、ラジオイムノアッセイ、またはＤＮＡの直接的な放射性標識化でありうる。例えば、限定を目的とするものではないが、核酸バイオマーカーは、ｃＤＮＡへと逆転写するのに続いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）にかけることもでき、米国特許第５，３２２，７７０号において記載されている通り、両方のステップに単一の酵素を使用することもでき、R.  L.  Marshallら、PCR  Methods  and  Applications、４巻：８０〜８４頁（１９９４年）により記載されている通り、バイオマーカーは、ｃＤＮＡへと逆転写するのに続いて、対称ギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）にかけることもできる。開示される方法における使用のためのプライマーの非限定的な例を、表１に示す。
【００３８】
ある特定の実施形態では、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、バイオマーカーのｍＲＮＡレベルを評価する。バイオマーカーｍＲＮＡおよび対照ｍＲＮＡのレベルは、がん組織内またはがん細胞内および隣接する良性組織において定量することができる。ある特定の実施形態では、１または複数のバイオマーカーのレベルは、生体試料において定量することができる。
【００３９】
ある非限定的な実施形態では、本発明の検出方法は、増幅に依拠せずに、例えば、標的配列のいかなるコピーもしくは複製を生成せずに、いかなるポリメラーゼの関与を伴わずに、またはいかなるサーマルサイクリングを必要とせずに実行することができる。ある特定の実施形態では、本発明の検出は、２００６年６月１９日に提出され、参照により本明細書に組み込まれる、米国出願第１１／４７１，０２５号において記載されている、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（商標）方法において示される原理を使用して実施することができる。
【００４０】
ある特定の実施形態では、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる視覚化を援用することができるが、ここでは、放射性標識されたアンチセンスＲＮＡプローブを、生体試料、例えば、生検試料の薄い切片とハイブリダイズさせ、洗浄し、ＲＮアーゼで切断し、オートラジオグラフィーのための感受性エマルジョンへと曝露する。試料は、試料の組織学的組成を明示するために、ヘマトキシリンで染色することができ、適切な光フィルターを用いる暗視野イメージングにより、顕色したエマルジョンを示す。また、ジゴキシゲニンなどの非放射性標識も使用することができる。
【００４１】
ある特定の非限定的な実施形態では、核酸バイオマーカーの発現の評価は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により実施することができる。ＦＩＳＨとは、細胞におけるＤＮＡまたはＲＮＡの特異的な領域を直接同定することが可能であり、したがって、組織試料中のバイオマーカーの発現の視覚的決定を可能とする技法である。ＦＩＳＨ方法は、より客観的なスコア付けシステム、および同じ試料中の全ての非新生物性細胞内に存在するバイオマーカー遺伝子のシグナルからなる、内蔵の内部対照（built-in  internal  control）の存在の利点を有する。ＦＩＳＨとは、比較的迅速かつ高感度であることが可能であり、また、自動化もなされうる、直接的なｉｎ  ｓｉｔｕ技法である。バイオマーカーの発現レベルを、ＦＩＳＨ単独で決定することが困難な場合は、免疫組織化学検査を、ＦＩＳＨ方法と組み合わせることができる。
【００４２】
ある特定の実施形態では、核酸バイオマーカーの発現は、ＤＮＡアレイ上、ＤＮＡチップ上、またはＤＮＡマイクロアレイ上で検出することができる。バイオマーカー（複数可）に対応するオリゴヌクレオチドを、チップ上に固定化し、次いで、これを、被験体から得られる生体試料、例えば、腫瘍試料の、標識された核酸とハイブリダイズさせる。陽性のハイブリダイゼーションシグナルは、バイオマーカー転写物を含有する試料について得られる。当技術分野では、ＤＮＡアレイを調製する方法およびそれらの使用が周知である（例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６１８，６７９６号；同第６，３７９，８９７号；同第６，６６４，３７７号；同第６，４５１，５３６号；同第５４８，２５７号；米国特許出願第２００３０１５７４８５号；ならびにSchenaら、１９９５年、Science、２０巻：４６７〜４７０頁；Gerholdら、１９９９年、Trends  in  Biochem.  Sci.、２４巻：１６８〜１７３頁；およびLennonら、２０００年、Drug  discovery  Today、５巻：５９〜６５頁を参照されたい）。また、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）も実施することができる（例えば、米国特許出願第２００３０２１５８５８号を参照されたい）。
【００４３】
ある特定の実施形態では、核酸バイオマーカー、例えば、ＢＡＰ１  ｍＲＮＡの発現レベルをモニタリングするには、ｍＲＮＡを、被験生体試料から抽出し、逆転写し、蛍光標識されたｃＤＮＡプローブを作製することができる。次いで、標識されたｃＤＮＡプローブを、バイオマーカーへとハイブリダイズすることが可能なマイクロアレイへと適用し、プローブのマイクロアレイへのハイブリダイゼーションを可能とし、スライドを走査して蛍光強度を測定することができる。この強度は、ハイブリダイゼーション強度およびバイオマーカーの発現レベルと相関する。
【００４４】
核酸バイオマーカーの検出のためのプローブの種類は、ｃＤＮＡ、リボプローブ、合成オリゴヌクレオチド、およびゲノムプローブを含む。使用されるプローブの種類は一般に、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためのリボプローブ、およびノーザンブロット法のためのｃＤＮＡなど、特定の状況により決まる。ある特定の非限定的な実施形態では、プローブは、特定のバイオマーカーＲＮＡに固有のヌクレオチド領域を指向する。プローブは、特定のバイオマーカーｍＲＮＡ転写物を差次的に認識するのに要請される程度に短くすることができ、例えば、１５塩基ほどの短さでありうる。また、少なくとも１７塩基、１８塩基、および２０塩基のプローブも使用することができる。ある特定の実施形態では、プライマーとプローブとは、厳密な条件下で、標的遺伝子に対応するヌクレオチド配列を有する核酸断片へと特異的にハイブリダイズする。本明細書で使用される「厳密な条件」という用語とは、配列の間に、少なくとも９５％または少なくとも９７％の同一性が存在する場合に限り、ハイブリダイゼーションが生じることを意味する。
【００４５】
プローブの標識化の形態は、放射性同位元素、例えば、３２Ｐ、および３５Ｓ、またはフルオロフォアの使用など、任意の適切な形態でありうる。放射性同位元素による標識化は、プローブが化学合成されたのであれ生合成されたのであれ、適切に標識された塩基の使用により達成することができる。
【００４６】
当業者には、タンパク質バイオマーカー、例えば、ＢＡＰ１タンパク質バイオマーカー、ＥＺＨ２タンパク質、Ｌ３ＭＢＴＬ２タンパク質、またはＳＵＺ１２タンパク質のレベルを検出および／または決定するための方法が周知であり、それらとしては、質量分析技法、１Ｄまたは２Ｄのゲルベースの解析システム、クロマトグラフィー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ウェスタンブロット法、免疫沈降、および免疫組織化学検査を含むがこれらに限定されない。これらの方法では、タンパク質を検出するために、抗体もしくは抗体同等物を使用するか、または生物物理的技法を使用する。また、抗体アレイまたはタンパク質チップも援用することができ、例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００３／００１３２０８号；同第２００２／０１５５４９３号、同第２００３／００１７５１５号；ならびに米国特許第６，３２９，２０９号、および同第６，３６５，４１８号を参照されたい。
【００４７】
ある特定の非限定的な実施形態では、タンパク質バイオマーカーの発現を測定するための検出方法は、生体試料、例えば、組織試料を、バイオマーカーに選択的に結合する抗体またはそのバリアント（例えば、断片）と接触させるステップと、抗体またはそのバリアントが、試料に結合するのかどうかを検出するステップとを含む。方法はさらに、試料を、二次抗体、例えば、標識された抗体と接触させるステップも含みうる。方法はさらに、例えば、１または複数の試薬を除去する、１または複数の洗浄ステップも含みうる。
【００４８】
ある特定の非限定的な実施形態では、ウェスタンブロット法を、バイオマーカータンパク質の発現レベルを検出および定量するために使用することができる。細胞を、溶解緩衝液中でホモジナイズして、溶解物を形成し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびニトロセルロースフィルターなどの膜へのブロッティングにかけることができる。次いで、抗体（非標識）を、膜と接触させ、標識（１２５Ｉ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼを含む適切な標識）されたプロテインＡまたは抗免疫グロブリンなどの二次免疫試薬でアッセイすることができる。また、クロマトグラフィーによる検出も使用することができる。ある特定の実施形態では、免疫検出は、増強化学発光システム（例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．製）を使用する、バイオマーカーに対する抗体により実施することができる。次いで、膜をはがし、対照タンパク質、例えば、アクチンに特異的な対照抗体で再ブロッティングすることができる。
【００４９】
免疫組織化学検査を使用して、例えば、生検試料中のバイオマーカーの発現および／または存在を検出することができる。適切な抗体を、例えば、細胞の薄層と接触させるのに続き、洗浄して、結合していない抗体を除去し、次いで、標識された二次抗体と接触させることができる。標識化は、蛍光マーカー、ペルオキシダーゼなどの酵素、アビジン、または放射性標識化によることができる。アッセイは、顕微鏡法を使用して、視覚的にスコア付けすることができ、結果は定量することができる。また、バイオマーカーについての免疫染色結果を測定するのに、機械ベースのシステムまたは自動イメージングシステムも使用することができる。
【００５０】
当技術分野では、免疫組織化学検査を伴う使用に適する、多様な自動式の試料加工システム、走査システム、および解析システムが利用可能である。このようなシステムは、自動式染色（例えば、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋシステム、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい）、ならびに顕微鏡による走査、コンピュータ化された画像解析、連続切片比較（試料の配向性およびサイズのばらつきについて制御する）、ディジタル報告書の作成、ならびに試料のアーカイブ化および追跡（組織切片を置いたスライドなど）を含みうる。従来の光学顕微鏡を、ディジタル画像加工システムと組み合わせて、免疫染色された試料を含む、細胞および組織についての定量的解析を実施する、細胞イメージングシステムが市販されている。例えば、ＣＡＳ−２００システム（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．）を参照されたい。
【００５１】
また、バイオマーカーに対する、標識された抗体も、イメージングの目的で、例えば、被験体の細胞におけるバイオマーカーの存在を検出するために使用することができる。適切な標識は、放射性同位元素、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、ならびにビオチンを含む。免疫酵素による相互作用は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの異なる酵素、またはＤＡＢ、ＡＥＣ、もしくはＦａｓｔ  Ｒｅｄなどの異なる色原体を使用して視覚化することができる。標識された抗体または抗体断片は、バイオマーカーを含有する細胞の場所に優先的に蓄積される。次いで、標識された抗体またはそのバリアント、例えば、抗体断片は、公知の技法を使用して検出することができる。
【００５２】
抗体は、天然であれ、合成であれ、全長であれ、その断片であれ、モノクローナルであれ、ポリクローナルであれ、検出されるバイオマーカーに、十分に強く、かつ、特異的に結合する、任意の抗体を含む。抗体のＫｄは、最大でも約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、および１０−１２Ｍでありうる。「〜に特異的に結合する」という語句は、例えば、抗体の、エピトープまたは抗原または抗原決定基への結合であって、結合が、同一または同様のエピトープ、抗原、または抗原決定基による第２の調製物（second  preparation）で置き換えられるか、またはこれと競合しうるような形での結合を指す。
【００５３】
使用しうる抗体およびその誘導体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、合成抗体および操作抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長動物化（ＣＤＲグラフト）抗体、ベニヤ化抗体、または単鎖抗体、ファージ（phase）産生抗体（例えば、ファージディスプレイライブラリーによる）のほか、抗体の機能的結合断片を包含する。例えば、バイオマーカーまたはその部分に結合することが可能な抗体断片であって、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、およびＦ（ａｂ’）２断片を含むがこれらに限定されない抗体断片を使用することができる。このような断片は、酵素による切断によって作製することもでき、組換え技法により作製することもできる。市販されているＢＡＰ１抗体の非限定的な例は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）製のＳＣ−８１３２、ＳＣ−４８３８６、ＳＣ−１３５７６、ＳＣ−２８２３６、ＳＣ−８１３３、およびＳＣ−２８３８３、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）製のＡｂ１６７２５０、ならびに、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）製のＨＰＡ０２８８１４を含む。市販されているＥＺＨ２抗体の非限定的な例は、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）製の型番３９９３３、３９８７５、および３９９０１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）製の０７−６８９、ならびに、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）製のＰＡ１−４６４７６およびＰＡ５−２４５９４を含む。市販されているＳＵＺ１２抗体の非限定的な例は、Ａｂｃａｍ製のＡｂ１２０７３を含む。市販されているＬ３ＭＢＴＬ２抗体の非限定的な例は、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ製の３９５６９を含む。
【００５４】
ある特定の非限定的な実施形態では、抗体以外のポリペプチドに特異的に結合する、ペプチドなどの作用物質（agent）を使用する。特異的に結合するペプチドは、当技術分野で公知の任意の手段、例えば、ペプチドファージディスプレイライブラリーにより同定することができる。一般に、バイオマーカーの存在を検出および／または定量するように、バイオマーカーポリペプチドを検出することが可能な作用物質を使用することができる。本明細書で規定される通り、「作用物質」とは、生体試料中のバイオマーカーを同定または検出することが可能な（例えば、バイオマーカーのｍＲＮＡ、バイオマーカーのＤＮＡ、バイオマーカーのタンパク質を同定または検出する）物質を指す。
【００５５】
加えて、バイオマーカーは、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ（飛行時間）、ＳＥＬＤＩ／ＴＯＦ、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー−質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）、キャピラリー電気泳動−質量分析、核磁気共鳴分析法、またはタンデム質量分析（例えば、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳなど）などの質量分析を使用して検出することができる。例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００３／０１９９００１号、同第２００３／０１３４３０４号、同第２００３／００７７６１６号を参照されたい。
【００５６】
当技術分野では、質量分析方法が周知であり、タンパク質などの生体分子を定量および／または同定するのに使用されている（例えば、Liら（２０００年）、Tibtech、１８巻：１５１〜１６０頁；Rowleyら（２０００年）、Methods、２０巻：３８３〜３９７頁；ならびにKusterおよびMann（１９９８年）、Curr.  Opin.  Structural  Biol.、８巻：３９３〜４００頁を参照されたい）。さらに、単離されたタンパク質の少なくとも部分的なデノボシークエンシングを可能とする質量分析技法も開発されている。Chaitら、Science、２６２巻：８９〜９２頁（１９９３年）；Keoughら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.、９６巻：７１３１〜６頁（１９９９年）；Bergman、EXS、８８巻：１３３〜４４頁（２０００年）において概説されている。
【００５７】
バイオマーカーまたは他の物質の存在の検出は、シグナル強度の検出を伴うことが典型的である。シグナル強度の検出は、ひいては、基材に結合するポリペプチドの量および特徴を反映しうる。例えば、ある特定の実施形態では、第１の試料のスペクトルによるピーク値のシグナル強度と、第２の試料のスペクトルによるピーク値のシグナル強度とを比較して（例えば、視覚的に、またはコンピュータ解析により）、特定のバイオマーカーの相対量を決定することができる。Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｗｉｚａｒｄプログラム（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）などのソフトウェアプログラムを使用して、質量スペクトルを解析する一助とすることができる。
【００５８】
試料中の核酸バイオマーカーおよび／またはタンパク質バイオマーカーの発現を決定するためのさらなる方法は、例えば、それらの全てが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２７１，００２号；米国特許第６，２１８，１２２号；米国特許第６，２１８，１１４号；および米国特許第６，００４，７５５号；ならびにWangら、J.  Clin.  Oncol.、２２巻（９号）：１５６４〜１６７１頁（２００４年）；およびSchenaら、Science、２７０巻：４６７〜４７０頁（１９９５年）において記載されている。
【００５９】
５．５  使用方法
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、ＥＺＨ２阻害剤により、がんにおいて、抗がん効果が生じる可能性があるのかどうかを決定する方法であって、ＢＡＰ１バイオマーカー、例えば、ＢＡＰ１核酸バイオマーカーおよび／またはＢＡＰ１タンパク質バイオマーカーの存在、非存在、および／または発現レベルを決定するステップを含む方法を提供する。ＢＡＰ１バイオマーカーの存在、非存在、および／または発現レベルを決定するための方法は、上記の５．４節に示されている。処置に適するがんは、上記の５．３節に記載されている。ＥＺＨ２阻害剤は、上記の５．２節に記載されている。
【００６０】
ある特定の実施形態では、本開示は、がんにおいて抗がん効果を生じさせる方法であって、がんの細胞が、ＢＡＰ１バイオマーカーを含有するのかどうかを決定するステップを含み、ＢＡＰ１バイオマーカーが、がんにおいて非存在であり、そして／または基準対照レベルと比較して低レベルで発現する場合、抗がん効果を生じさせるための治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与する方法を提示する。代替的に、ＢＡＰ１バイオマーカーが、基準対照レベルと比べて、同レベルまたは高レベルで発現することが見出される場合、ＥＺＨ２阻害剤ではない作用物質による代替的治療を施す。
【００６１】
「治療有効量」とは、抗がん効果、生存の延長、および／または再発までの期間の延長のうちの１または複数を達成することが可能な量を指す。
【００６２】
「抗がん効果」とは、がん細胞凝集塊の低減、がん細胞成長速度の低減、がん細胞増殖の低減、腫瘍塊の低減、腫瘍体積の低減、腫瘍細胞増殖の低減、腫瘍成長速度の低減、および／または腫瘍転移の低減のうちの１または複数を指す。ある特定の実施形態では、抗がん効果は、がんを有すると診断された患者における、完全寛解、部分寛解、安定な疾患（進行または再発を伴わない）、後の再発を伴う寛解、または無進行生存を指すことができる。
【００６３】
ある特定の実施形態では、本開示は、がんにおいて抗がん効果を生じさせる方法であって、がんの１または複数の細胞におけるＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを決定するステップを含み、ＢＡＰ１タンパク質バイオマーカーが、細胞において非存在であり、そして／または基準対照レベルと比較して低レベルで発現する場合、抗がん効果を生じさせるための治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与する方法を提供する。ある特定の実施形態では、基準対照とは、正常細胞、例えば、がんに隣接して位置する良性細胞におけるＢＡＰ１のレベルである。
【００６４】
ある特定の非限定的な実施形態では、がん試料中および／または基準対照試料中のＢＡＰ１のレベルは、両方の試料中に存在する核酸および／またはタンパク質、例えば、ハウスキーピング遺伝子および／またはハウスキーピングタンパク質など、比較を可能とする基準タンパク質または基準核酸に対して正規化することができる。例えば、限定を目的とするものではないが、基準タンパク質または基準核酸は、アクチンまたはチューブリンでありうる。
【００６５】
ある特定の非限定的な実施形態では、本開示は、ＥＺＨ２阻害剤に対する、患者におけるがんの感受性を予測する方法であって、患者からがんの試料を得るステップと、試料を含む細胞におけるＢＡＰ１タンパク質バイオマーカーの発現レベルを決定するステップとを含み、ＢＡＰ１タンパク質バイオマーカーが、非存在であるか、または基準対照レベルと比較して発現が低減される場合、がんは、ＥＺＨ２阻害剤に対して感受性であることが予測される方法を提示する。ある特定の実施形態では、患者のがんが、ＥＺＨ２阻害剤に対して感受性であることが予測される場合、患者はＥＺＨ２阻害剤で処置することができる。ある特定の実施形態では、患者のがんが、ＥＺＨ２阻害剤に対して感受性でないことが予測される場合、患者はＥＺＨ２阻害剤ではない作用物質で処置することができる。
【００６６】
ある特定の非限定的な実施形態では、本開示は、がんを有する被験体を処置するための方法を提示する。例えば、限定を目的とするものではないが、方法は、被験体からがんの試料を得るステップと、試料中において、ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベルを決定するステップとを含み、ＢＡＰ１バイオマーカーが非存在であるか、またはＢＡＰ１の基準対照レベルより低レベルで発現する場合、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤による被験体の処置を開始する。代替的に、ＢＡＰ１バイオマーカーが、基準対照レベルと比べて、同レベルまたは高レベルで発現することが見出される場合、被験体はＥＺＨ２阻害剤ではない作用物質で処置することができる。
【００６７】
ある特定の実施形態では、本発明の方法はさらに、試料中のＥＺＨ２、Ｌ３ＭＢＴＬ２、および／またはＳＵＺ１２の発現レベルを検出するステップも含みうる。例えば、限定を目的とするものではないが、ＥＺＨ２、Ｌ３ＭＢＴＬ２、および／またはＳＵＺ１２の、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現レベルを検出することができる。ある特定の実施形態では、がんを有する被験体を処置するための方法は、被験体からがんの試料を得るステップと、試料中において、ＢＡＰ１バイオマーカーの発現レベル、ならびにＥＺＨ２、Ｌ３ＭＢＴＬ２、および／もしくはＳＵＺ１２の発現レベルを決定するステップとを含み、ＢＡＰ１バイオマーカーが非存在であるか、またはＢＡＰ１の基準対照レベルより低レベルで発現し、ＥＺＨ２および／またはＳＵＺ１２の発現が、ＥＺＨ２および／またはＳＵＺ１２の基準対照レベルと比較して増大する（かつ／またはＬ３ＭＢＴＬ２の発現が、Ｌ３ＭＢＴＬ２の基準対照レベルと比較して減少する）場合、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤による被験体の処置を開始する。ある特定の実施形態では、試料は、ＥＺＨ２阻害剤による処置の前および後において回収することができ、試料のＥＺＨ２の発現レベルを比較することができる。
【００６８】
ある特定の非限定的な実施形態では、試料は、培養物における細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的流体（例えば、血液、血漿、血清、糞便、尿、リンパ液、腹水、乳管洗浄液、乳首吸引物、唾液、気管支肺胞洗浄液、涙液、および脳脊髄液）、および組織試料を含むがこれらに限定されない。試料の供給源は、固形組織（例えば、新鮮な臓器、凍結された臓器、および／もしくは保存された臓器、または腫瘍試料、組織試料、生検、もしくは吸引物由来）、血液もしくは任意の血液成分、体液（例えば、尿、リンパ、脳脊髄液、羊水、腹水、または間質液など）、または個体に由来する細胞であって、循環腫瘍細胞を含む細胞でありうる。ある特定の非限定的な実施形態では、試料を、腫瘍から得る。ある特定の実施形態では、試料は、患者に由来する試料である「臨床試料」でありうる。
【００６９】
５．６  キット
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、ＥＺＨ２阻害剤により、がんにおいて、抗がん効果が生じる可能性があるのかどうかを決定するためのキットであって、前節で示した、ＢＡＰ１バイオマーカーを検出するための手段を含むキットを提供する。前記キットはさらに、ＥＺＨ２阻害剤により、がんにおいて、抗がん効果が生じる可能性があるのかどうかを決定するキットの使用について記載する指示もしくは支援材料、および／またはこれについて記載するウェブサイトもしくは刊行物への参照も含みうる。
【００７０】
キットの種類は、パッケージングされたバイオマーカー特異的プローブおよびプライマーのセット（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ／プライマーセット）、アレイ／マイクロアレイ、バイオマーカー特異的抗体、バイオマーカー特異的ビーズを含むがこれらに限定されず、これらは、本発明の１または複数のバイオマーカーを検出するための１または複数のプローブ、プライマー、または他の試薬をさらに含有する。
【００７１】
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、ＥＺＨ２阻害剤により、がんにおいて、抗がん効果が生じる可能性があるのかどうかを決定するためのキットであって、ＢＡＰ１核酸バイオマーカーの存在を検出するための手段を含むキットを提供する。
【００７２】
具体的で非限定的な実施形態では、キットは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または核酸シークエンシングに適するオリゴヌクレオチドプライマー対であって、同定される核酸バイオマーカー（複数可）を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー対を含みうる。プライマー対は、上記で示したバイオマーカーと相補的なヌクレオチド配列を含むことが可能であり、前記バイオマーカーと選択的にハイブリダイズするのに十分な長さでありうる。代替的に、相補的なヌクレオチドは、十分に近接した特異的領域であって、ＰＣＲおよび／またはシークエンシングを実施するバイオマーカー位置に対して５’側および／または３’側の領域へと選択的にハイブリダイズしうる。複数のバイオマーカー特異的プライマーをキットに含めて、１つを超えるバイオマーカーを同時に検出することができる。キットはまた、１または複数のポリメラーゼ、逆転写酵素、およびヌクレオチド塩基も含むことが可能であり、この場合、ヌクレオチド塩基は、さらに検出可能に標識することもできる。
【００７３】
ある特定の非限定的な実施形態では、プライマーは、少なくとも約１０ヌクレオチド、もしくは少なくとも約１５ヌクレオチド、もしくは少なくとも約２０ヌクレオチドの長さ、および／または最大で約２００ヌクレオチド、もしくは最大で約１５０ヌクレオチド、もしくは最大で約１００ヌクレオチド、もしくは最大で約７５ヌクレオチド、もしくは最大で約５０ヌクレオチドの長さでありうる。プライマーの非限定的な例は、表１に提示する。例えば、限定を目的とするものではないが、本開示のプライマーは、表１に開示される配列のうちの１または複数を含みうる。
【００７４】
さらなる非限定的な実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーを、固体表面上、基材上、または支持体上、例えば、核酸マイクロアレイ上に固定化することができ、この場合、固体表面または支持体へと結合させた各オリゴヌクレオチドプライマーの位置は、既知であり、同定可能である。オリゴヌクレオチドは、ガラス、プラスチック、紙、ナイロン、もしくは他の種類の膜、フィルター、チップ、ビーズ、または他の任意の適切な固体支持体などの基材へと固定することができる。ポリヌクレオチドは、基材上で直接合成することもでき、基材から離れて合成し、次いで、基材へと固定することもできる。アレイは、公知の方法を使用して調製する。
【００７５】
具体的で非限定的な実施形態では、キットは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに適する、少なくとも１つの核酸プローブであって、同定されるバイオマーカー（複数可）を検出するための核酸プローブを含みうる。このようなキットは一般に、多様なバイオマーカーに対する特異性を有する、１または複数のオリゴヌクレオチドプローブを含む。複数のバイオマーカーを試験するための手段も、任意選択で、単一のキットに含めることができる。
【００７６】
ある特定の実施形態では、キットは、各々が、方法において活用される多様な試薬（典型的には、富化形態にある）であって、例えば、あらかじめ製作されたマイクロアレイ、バッファ、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、またはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、およびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびに本発明の１または複数のプローブおよびプライマー（例えば、ＲＮＡポリメラーゼと反応性のプロモーターへと連結された、適切な長さのｐｏｌｙ（Ｔ）またはランダムプライマー）を含む試薬のうちの１または複数を有する容器（方法の自動化された実装における使用に適するマイクロリッタープレート（microliter  plate）を含む）を含みうる。
【００７７】
非限定的な実施形態では、本発明は、ＥＺＨ２阻害剤により、がんにおいて、抗がん効果が生じる可能性があるのかどうかを決定するためのキットであって、ＢＡＰ１タンパク質バイオマーカーのレベルを検出するための手段を含むキットを提供する。
【００７８】
非限定的な実施形態では、キットは、同定されるバイオマーカー（複数可）の免疫検出のための、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合性断片を含みうる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方であって、バイオマーカーに特異的な抗体は、当業者に一般に公知である、従来の免疫技法を使用して調製することができる。キットの免疫検出試薬は、所与の抗体自体または抗原自体と会合させるか、またはこれらへと連結された、検出用標識を含みうる。このような検出用標識は、例えば、化学発光分子または蛍光分子（ローダミン、フルオレセイン、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはＲＯＸ）、放射性標識（３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、１４Ｃ、または１３１Ｉ）、または酵素（アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）を含む。
【００７９】
さらなる非限定的な実施形態では、カラムマトリックス、アレイまたはマイクロタイタープレートのウェルなどの固体支持体へと結合させた、１または複数のバイオマーカー特異的抗体も提供することができる。代替的に、支持体は、キットの別個のエレメントとして提供することもできる。
【００８０】
キットにおける測定手段が、アレイを援用する、ある特定の非限定的な実施形態では、上記で示したバイオマーカーのセットは、マイクロアレイ上で表されるバイオマーカーの種のうちの少なくとも１０パーセント、または少なくとも２０パーセント、または少なくとも３０パーセント、または少なくとも４０パーセント、または少なくとも５０パーセント、または少なくとも６０パーセント、または少なくとも７０パーセント、または少なくとも８０パーセントを構成しうる。
【００８１】
ある特定の非限定的な実施形態では、本開示のキットは、試料中のＥＺＨ２の発現レベルを検出するための１もしくは複数のプローブ、プライマー、抗体、または他の検出試薬を含有しうる。例えば、キットは、生体試料中のＥＺＨ２のタンパク質発現レベルを検出するための抗体またはその断片を含有しうる。
【００８２】
ある特定の非限定的な実施形態では、本開示のキットは、試料におけるＳＵＺ１２の発現レベルを検出するための１もしくは複数のプローブ、プライマー、抗体、または他の検出試薬を含有しうる。例えば、キットは、生体試料におけるＳＵＺ１２のタンパク質発現レベルを検出するための抗体またはその断片を含有しうる。
【００８３】
ある特定の非限定的な実施形態では、本開示のキットは、試料におけるＬ３ＭＢＴＬ２の発現レベルを検出するための１もしくは複数のプローブ、プライマー、抗体、または他の検出試薬を含有しうる。例えば、キットは、生体試料におけるＬ３ＭＢＴＬ２のタンパク質発現レベルを検出するための抗体またはその断片を含有しうる。
【００８４】
キットはさらに、がん試料中のバイオマーカーレベルと、基準対照試料中のバイオマーカーレベルとの間の比較を可能とするための手段も含有しうる。例えば、限定を目的とするものではないが、本開示のキットは、試料からの１または複数のバイオマーカーの発現レベルを正規化して、比較を可能とするのに使用しうる、基準タンパク質または基準ｍＲＮＡを検出するための１もしくは複数のプローブ、プライマー、抗体、または他の検出試薬を含有しうる。基準タンパク質、例えば、ハウスキーピングタンパク質の非限定的な例は、アルファ−チューブリンまたはベータ−チューブリン、アクチン、コフィリン、ビンクリン、およびＧＡＤＰＨを含む。
【００８５】
ある特定の非限定的な実施形態では、キットはさらに、キットを使用して、目的のバイオマーカーを検出するための指示も含みうる。例えば、指示は、本明細書で示されるＢＡＰ１バイオマーカーが、患者に由来するがん試料中に非存在であり、そして／または基準対照レベルと比較して発現が低度であることが、ＥＺＨ２阻害剤によりがんにおいて抗がん効果を生じさせる見込みの増大を示すことについて記載しうる。
【００８６】
ある特定の実施形態では、本開示のキットはさらに、１または複数のＥＺＨ２阻害剤も含みうる。ＥＺＨ２阻害剤の非限定的な例は、５．２節で開示されている。
【００８７】
以下の実施例は、本開示をより完全に例示するために提示されるものであり、その範囲を限定するものとしてはみなされないものとする。
【実施例】
【００８８】
６．実施例１：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＢＡＰ１の喪失は、ＥＺＨ２の発現および活性の増大を結果としてもたらす
【００８９】
本実施例では、ＢＡＰ１活性の喪失が、疾患状態を結果としてもたらす機構について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて調査した。
【００９０】
６．１．結果
ＳＥＴ２細胞に、ＢＡＰ１をターゲティングするｓｈＲＮＡを形質導入して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＢＡＰ１の発現を低減した。ウェスタンブロットにより検証されるＢＡＰ１の発現の低減は、Ｋ２７におけるヒストン３のトリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）の増大を結果としてもたらした（図１）。また、図９Ａも参照されたい。ＢａＦ３細胞におけるＢＡＰ１タンパク質の発現を枯渇させ、ＢＡＰ１の喪失は、ウェスタンブロットにより確認し、ヒストンについての質量分析を実施した。ＢａＦ３細胞におけるＢＡＰ１のノックダウンは、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の増大を明らかにした（図１）。
【００９１】
ＢＡＰ１は、悪性中皮腫内およびブドウ膜黒色腫内など、充実性腫瘍において高度に変異することが示されている（Carboneら、２０１２年）。ＢＡＰ１における変異、例えば、Ｈ２８ホモ接合性欠失、Ｈ２４５２ホモ接合性ミスセンス、およびＨ２２６欠失変異を有する中皮腫細胞では、ＥＺＨ２の発現の、野生型ＢＡＰ１活性を有する細胞と比較した上方調節が観察された（図２）。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、２９３Ｔ細胞におけるＢＡＰ１の過剰発現が、ＥＺＨ２およびＳＵＺ１２の発現の低減を結果としてもたらしたのに対し、ＢＡＰ１の発現の喪失は、ＳＵＺ１２の発現の上方調節を結果としてもたらした（図３）。
【００９２】
６．２．考察
上記で記載した通り、ＢＡＰ１タンパク質の発現の喪失は、ＥＺＨ２により付与される抑制性クロマチンマークであるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の増大を引き起こし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのがん細胞系のシステムにおけるＥＺＨ２およびＳＵＺ１２の発現を増大させた。ＥＺＨ２阻害剤は現在、ＥＺＨ２活性化変異を有するリンパ腫患者において、臨床試験にかけられている。したがって、ＢＡＰ１変異状態は、ＥＺＨ２阻害剤による処置に応答しうる患者を同定する一助となる可能性があり、これは、ＢＡＰ１変異体患者における生存を延長するのに有効でありうる。
【００９３】
７．実施例２：  ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＢＡＰ１の喪失は、ＥＺＨ２の発現および活性の増大を結果としてもたらす
【００９４】
７．１  方法および材料
プライマー：
【表１−１】
0006684230.tif 000002
【表１−２】
0006684230.tif 000003
【００９５】
動物：全ての動物は、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて飼育した。全ての動物手順は、Ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従い遂行され、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒにおけるＴｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓにより承認された。
【００９６】
Ｂａｐ１欠損マウスおよびＢａｐ１／Ｅｚｈ２欠損マウスの作製：Ｂａｐ１のエクソン６〜１２をターゲティングする胚性幹細胞は、Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍから得た。ｌａｃＺおよびネオマイシンカセットを含有する、Ｆｒｔで挟まれた未成熟停止カセットを上流に挿入した。ＥＳ細胞クローンを拡大し、初代胚盤胞へと注入した。作製されたマウスを、生殖細胞系列Ｆｌｐディリーター（deleter）（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と交配させて、Ｆｒｔで挟まれたカセットを切り出した。その後、これらのマウスを、ＩＦＮ−α誘導Ｍｘ１−ｃｒｅトランスジェニックマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と交配させて、造血系におけるＢａｐ１の誘導的喪失の効果を評価した。Ｂａｐ１  ｆｌ／ｆｌ、Ｂａｐ１  ｆｌ／＋、およびＢａｐ１＋／＋の同腹マウスを、プライマーである、ＢＡＰ１−ｕｐ（ａｃｔｇｃａｇｃａａｔｇｔｇｇａｔｃｔｇ（配列番号１））、ＢＡＰ１−ｄｏｗｎ（ｇａａａａｇｇｔｃｔｇａｃｃｃａｇａｔｃａ（配列番号２））を用いるＰＣＲであって、以下のパラメータ：９５℃で１０分間に続き、９４℃で１０秒間、６５℃で４０秒間、および７２℃で１分間にわたる４０サイクルに次いで、７２℃で５分間を使用するＰＣＲにより遺伝子型決定した。ＷＴ対立遺伝子が、３００ｂｐで検出されたのに対し、ｆｌｏｘ化された対立遺伝子は、５００ｂｐのＰＣＲで検出された。ＩＦＮ−α誘導後の切出しは、ｆｌｏｘ化され、切り出されるバンドを検出するプライマー：ＢＡＰ１−Ｆ（ａｃｔｇｃａｇｃａａｔｇｔｇｇａｔｃｔｇ（配列番号１））、ＢＡＰ１−Ｆ２（ｇｃｇｃａａｃｇｃａａｔｔａａｔｇａｔａ（配列番号３））、およびＢＡＰ１−Ｒ（ｃａｇｔｇｔｃｃａｇａａｔｇｇｃｔｃａａ（配列番号４））を有するＰＣＲであって、上記で列挙した同じＰＣＲパラメータを使用するＰＣＲにより確認した。Ｍｘ１−Ｃｒｅ−Ｂａｐ１  ｆ／ｆマウスを、Ｅｚｈ２  ｆ／ｆマウスと交配させた。Ｍｘ−ｃｒｅ  Ｂａｐ１ｆ／ｆ条件付きマウスおよびＢａｐ１ｆ／ｆ対照マウスに、１ｍｇ／ｍＬのｐｏｌｙＩ：ｐｏｌｙＣ溶液、２００μＬの、４回にわたる腹腔内注射を施した。切出しの２週間後において、ヘパリン処理されたマイクロヘマトクリット（icrohematocrit）毛細管（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する眼窩後方採血を介して、末梢血を回収した。切出しを確認し、標準的な製造元の指示に従い、ＨｅｍａＶｅｔを使用して、末梢血カウントを得た。ホルマリンで固定したパラフィン包埋組織切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。Ｂａｐ１の欠失は、ゲノム切出しＰＣＲおよびウェスタンブロット解析により確認した。尾部は、ｆｌｏｘ化され、切り出された、Ｅｚｈ２対立遺伝子についての、ｑＰＣＲベースの遺伝子型決定のために、Ｔｒａｎｓｎｅｔｙｘ遺伝子型決定サービス（Ｃｏｒｄｏｖａ、ＴＮ）に出した。切出しは、ウェスタンブロットにより確認した。
【００９７】
異種移植片およびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＥＰＺ０１１９８９の投与：１０週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの群の脇腹に、マトリゲルと培地との１：１混合物における中皮腫細胞系（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、Ｍｅｓｏ１０、Ｈ２２６、およびＨ２４５２）６〜１０×１０６個を皮下注射した。腫瘍が、およそ６０〜８０ｍｍ３のサイズに達したところで、媒体（水中に０．５％のＮａＣＭＣ＋０．１％のＴｗｅｅｎ−８０）またはＥＰＺ０１１９８９による処置を開始した。ＥＰＺ０１１９８９または媒体は、１日２回、５００ｍｇ／ｋｇの濃度で、実験期間にわたり、経口で施した。腫瘍体積は、キャリパーを使用して、３つの寸法で評価した。処置に続き、腫瘍または肺組織を抽出し、ウェスタンブロット法を利用して標的の阻害を評価した。植込みの後で腫瘍が形成されなかった場合（同じ群からの植込みを受けた動物の平均値より７５％小さい場合）、異種移植片実験においてマウスを除外するように、あらかじめ確立された基準を作成した。薬物試験からは、動物を除外しなかった。全ての異種移植片薬物研究では、腫瘍サイズを１０日間にわたり追跡し、この時点で、マウスを、腫瘍サイズについて無作為化した。Ｂａｐ１遺伝子ＫＯ  ＥＰＺ０１１９８９試験は、ｐｏｌｙＩ：ｐｏｌｙＣの３週間後におけるＣＢＣ解析を活用する無作為化により行い、ＷＢＣカウントの平均が、媒体群および処置群の両方において同等であることを確認した。１群当たり動物５匹ずつを、媒体（上記で記載した）または５００ｍｇ／ｋｇのＥＰＺ０１１９８９で、１日２回１６日間にわたり経口処置した。これらの実験では、試験実施者を盲検としなかった。
【００９８】
組織学的解析：マウスを屠殺し、剖検し、次いで、切除された組織試料を、４％のパラホルムアルデヒドで２４時間にわたり固定し、脱水し、パラフィンに包埋した。パラフィンブロックを、４μｍに切片化し、Ｈ＆Ｅ、Ｋｉ６７、Ｅカドヘリン、またはＴＵＮＥＬで染色した。Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ａ１顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用して、画像を収集した。
【００９９】
細胞培養物：２９３Ｔ細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および非必須アミノ酸を補充した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ヒト白血病細胞系（ＳＥＴ２）およびヒト中皮腫細胞系（ＪＭＮ、Ｍｅｔ５ａ、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、Ｈ２３７３、Ｈ２２６、Ｈ２４５２）を、１０％のＦＢＳを補充した、ＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。ＭＳＴＯ−２１１Ｈは、ＡＴＣＣから得たが、残りの中皮腫系は、Ｐｒａｓａｄ  Ａｄｕｓｕｍｉｌｌｉ氏から恵与された。
【０１００】
ＲＮＡの単離、ＳＭＡＲＴｅｒ増幅、Ｐｒｏｔｏｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅシークエンシング、および解析：ＦＡＣＳ  Ａｒｉａを使用して、骨髄細胞を、ＧＭＰ（Ｌｉｎ−ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ１−ＣＤ３４＋Ｆｃγ＋）について、ＦＡＣＳ分取した。細胞２００，０００〜５００，０００個からの総ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ  ＲＮＡ単離試薬（型番１５５９６−０２６、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して抽出した。ＲＮＡの品質は、増幅の前に、ＲＮＡ  ６０００  ｐｉｃｏキットおよびｂｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、各試料２０〜５０ｐｇずつを解析することにより確認した。その後、製造元により提供される指示に従い、ＳＭＡＲＴＥＲ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、型番６３４９４０）を使用して、１０ｎｇの高品質（ＲＩＮ＞８）総ＲＮＡを増幅した。増幅された材料を、１６サイクルのＰＣＲを用いるＩｏｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔ  ｖ２プロトコール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、全トランスクリプトームライブラリーの調製にかけた。試料をバーコード処理し、イオンワンタッチシステムＩＩおよびＩＯＮ  ＰＩ（商標）Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＯＴ２  ２００ｋｉｔ  ｖ２  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ＩＯＮ  ＰＩ（商標）ＩＯＮ  ＳＰＨＥＲＥ（商標）Ｐａｒｔｉｃｌｅ（ＩＳＰ）を調製した。２００ｂｐのバージョン２化学反応を使用して富化された粒子を、Ｐｒｏｔｏｎシークエンシングシステム上で配列決定した。試料１例当たりの平均７０００万〜８０００万リードを生成し、リードのうちの７６〜８２％を、ｍＲＮＡの塩基へとマッピングした。ＰＩＣＡＲＤ  Ｓａｍ２Ｆａｓｔｑを使用して、ＢＡＭによるＲＡＷ出力を変換して、ＦＡＳＴＱへと戻した。次いで、ｒｎａＳｔａｒを使用して、リードをまず、マウスゲノムへとマッピングした。使用されるゲノムは、ＥＮＳＥＭＢＬ（Ｍｕｓ＿ｍｕｓｃｕｌｕｓ．ＮＣＢＩＭ３７．６７）由来のジャンクションおよび、４９のリード突出（read  overhang）を有する、ＭＭ９であった。次いで、ＢＷＡ  ＭＥＭ（バージョン０．７．５ａ）を使用して、任意のマッピングされなかったリードを、ＭＭ９へとマッピングした。次いで、２つのマッピングされたＢＡＭをマージし、ソートし、ｈｔｓｅｑ−ｃｏｕｎｔ（−ｓオプションをｙとし、−ｍオプションをｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ−ｓｔｒｉｃｔとする）および同じ遺伝子モデル（Ｍｕｓ＿ｍｕｓｃｕｌｕｓ．ＮＣＢＩＭ３７．６７）を使用して、遺伝子レベルカウントを計算した。生データを、以下の受託番号：ＧＳＥ６１３６０で、ＧＥＯデータベースへとアップロードした。
【０１０１】
ヒストンの抽出、ヒストンについてのＥＬＩＳＡ、ヒストンについてのウェスタンブロット、およびヒストンについてのＬＣ／ＭＳ：ヒストンを、標準的な抽出技法により、または、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（４００２６）を使用して、一晩にわたり抽出した。ヒストンについてのＥＬＩＳＡは、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３標準曲線および総Ｈ３タンパク質に対して正規化された、トリメチルＫ２７  Ｅｌｉｓａ  Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ、５３１０６）を使用して行った。ヒストンについてのウェスタンブロットは、３〜５μｇのヒストンを用いて行った。ヒストンについてのＬＣ／ＭＳでは、既に記載されている通り２６、対照細胞およびＢａｐ１  ＫＯ細胞１２００万個を溶解させ、核を単離し、０．４ＮのＨ２ＳＯ４を使用して、ヒストンを抽出し、無水プロピオン酸を使用して、化学的に誘導体化した。次いで、ヒストンを、トリプシンで消化し、ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｕｌｔｒａ質量分析計へとカップリングさせた、ナノ液体クロマトグラフィー（内径７５μｍ、長さ１５ｃｍ、ＭａｇｉｃＣ１８ａｑ  ｍｅｄｉａを充填、ｄｐ３μ）で分離した。データは、Ｓｋｙｌｉｎｅ２７で解析し、相対的定量は、ピーク面積により実施した。
【０１０２】
クロマチンの調製および免疫沈降、ＣｈＩＰ  Ｌｉｂｒａｒｙの調製およびシークエンシング、ならびにＣｈＩＰ−Ｓｅｑデータの解析：ＥａｓｙＳｅｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１９７５６）を使用して、骨髄細胞を、ｃ−Ｋｉｔ＋細胞について富化した。細胞５×１０６個を、１％のメタノール非含有ホルムアルデヒド溶液で固定し、次いで、ＳＤＳ溶解緩衝液中に再懸濁させた。溶解物を、Ｅ２２０  ｆｏｃｕｓｅｄ−ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Ｃｏｖａｒｉｓ）で超音波処理して、１００〜５００塩基対の所望の断片サイズ分布とした。既に記載されている（Krivtsovら、２００８年）通り、細胞およそ４００，０００個に対して、抗トリメチルＨ３Ｋ２７（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９７３３）、抗モノメチルＨ４Ｋ２０（Ａｂｃａｍ、９０５１）、およびＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、２０２７）の各々を使用して、ＩＰ反応を実施した。ＣｈＩＰアッセイは、別の場所で記載されている（O'Geenら、２０１１年）通り、Ｄｉｒｅｃｔ  ＣｈＩＰプロトコールを使用して、ＳＸ−８Ｇ  ＩＰ−ＳＴＡＲ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）上で処理した。次いで、溶出させたクロマチン断片を脱架橋し、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、ＤＮＡ断片を精製した。
【０１０３】
製造元の指示に従い、ＮＥＢＮｅｘｔ  ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｓｅｔ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＴｒｕＳｅｑ  Ａｄａｐｔｏｒｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を、ＳＸ−８Ｇ  ＩＰ−ＳＴＡＲ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）上で使用して、バーコード処理されたライブラリーを、ＣｈＩＰにより富化されインプットされたＤＮＡから調製した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＴｒｕＳｅｑ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、ライブラリーを増幅し、次いで、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを使用して精製し、アダプター二量体を除去して、ＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上でマルチプレックス化した。
【０１０４】
デフォルトパラメータを使用するｂｏｗｔｉｅ２により、マウスアセンブリーｍｍ９にアラインする前に、「ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ」を使用して、リードを、品質トリミングおよびアダプタートリミングした。その後の解析の前に、アラインされたリードであって、開始位置および配向性が同じリードを、単一のリードへとまとめた。各リードを、平均ライブラリー断片サイズまで伸長させ、次いで、ＢＥＤＴｏｏｌｓスートを使用して密度を計算することにより、密度プロファイルを作製した。富化された領域は、デフォルトパラメータによるＭＡＣＳ１．４を使用して発見し、マッチさせたインプットライブラリーに対してスコア付けした。全てのゲノムブラウザートラックおよび読み取り密度表は、配列決定深度に対して正規化した。対照条件におけるＣｈＩＰ−ｓｅｑ試料とＫＯ条件におけるＣｈＩＰ−ｓｅｑ試料とを比較するため、マン−ホイットニーのＵ検定またはｔ検定を使用して、条件当たり３回反復のシグナルについて調べた。クラスター解析は、正規化されたカウントデータについて、ｋｍｅａｎｓクラスタリングパッケージを伴うＭａｔｌａｂにより実施した。モチーフ解析は、Ｈｏｍｅｒにより、ｆｉｎｄＭｏｔｉｆｓＧｅｎｏｍｅプログラムにデフォルトパラメータを使用して実施した。
【０１０５】
ウェスタンブロットおよび免疫沈降：ウェスタンブロットおよび免疫沈降実験のために、細胞を、以下の緩衝液：１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ、プロテアーゼアレスト（ＥＭＤ）、およびホスファターゼ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中に溶解させた。ベンゾナーゼの存在下で免疫沈降を実施するため、細胞を、ＢＣ−３００緩衝液：２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１０％のグリセロール、３００ｍＭのＫＣｌ、０．１％のＮＰ−４０に溶解させた。清明化させた溶解物を、ＭｇＣｌ２で処理して、２．５ｍＭとし、ベンゾナーゼを、１２５０Ｕ／ｍＬで添加した。溶解物を、回転させながら、１時間にわたりインキュベートし、５ｍＭのＥＤＴＡを添加することにより、反応を停止させた。免疫沈降実験を始める前に、臭化エチジウムゲルにおいて溶解物を泳動させることにより、ＤＮＡの消化を確認した。使用される抗体は、ＢＡＰ１（Ｃ−４；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−２８３８３）、ＥＺＨ２（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ、３９９３３、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ、３９９０１、またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、０７−６８９）、ＳＵＺ１２（Ａｂｃａｍ、Ａｂ１２０７３）、ＡＳＸＬ１（Ｎ−１３；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−８５２８３）、Ｌ３ＭＢＴＬ２（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ、３９５６９）、Ｍｙｃ−Ｔａｇ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２２７６）、チューブリン（Ｓｉｇｍａ、Ｔ９０２６）、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（Ａｂｃａｍ、６００２またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、０７−４４９）、Ｈ３（Ａｂｃａｍ、Ａｂ１７９１）、およびＨ４Ｋ２０ｍｅ１（Ａｂｃａｍ、Ａｂ９０５１）を含んだ。
【０１０６】
フローサイトメトリー解析および抗体：生きた骨髄および脾臓細胞の表面マーカー染色は、まず、塩化アンモニウム−重炭酸カリウム溶解緩衝液で細胞を溶解させ、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で細胞を洗浄することにより行った。細胞は、ＰＢＳにおける抗体により、氷上で２０分間にわたり染色した。造血幹細胞および前駆細胞の染色では、細胞を、ＣＤ４（ＲＭ４−５）、ＣＤ３（１７Ａ２）、Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、ＮＫ１．１（ＰＫ１３６）、Ｇｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５）、Ｃｄ１１ｂ（Ｍ１／７０）、およびＴｅｒ１１９を含む、系列カクテルで染色し、成熟系列の、解析からの除外を可能とした。細胞はまた、ｃ−Ｋｉｔ（２Ｂ８）、Ｓｃａ−１（Ｄ７）、ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ（２．４Ｇ２）、およびＣＤ３４（ＲＡＭ３４）に対する抗体でも染色した。成熟単核細胞の組成を評価するため、Ｍａｃ１、Ｇｒ−１、Ｂ２２０、およびＣＤ４／ＣＤ３を使用した。細胞周期解析は、細胞を、上記で記載した造血幹細胞と前駆細胞とのミックスと共に染色することにより行った。ＦＩＸ  ａｎｄ  ＰＥＲＭキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：型番ＧＡＳ−００３）を使用して、細胞を固定した。固定の後、細胞を、Ｋｉ６７で染色し、次いで、ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａにおける解析の前に、ＤＡＰＩで染色した。
【０１０７】
プラスミド：ヒトＦＬＡＧ−Ｌ３ＭＢＴＬ２のｃＤＮＡ全長クローンは、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｐｌａｓｍｉｄ２８２３２）から得た。Ｍｙｃ−Ｈｉｓタグ付けされたユビキチン構築物は、Ｘｕｅｊｕｎ  Ｊｉａｎｇ氏から恵与された。ＨＡ−ＦＬＡＧ  ＢＡＰ１のｃＤＮＡヒト全長クローンは、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｐｌａｓｍｉｄ２２５３９）から得た。３×ＦＬＡＧタグ付けされたＢＡＰ１構築物は、Ｍａｒｃ  Ｌａｄａｎｙｉ氏から恵与された。デユビキチナーゼ変異体構築物（Ｃ９１Ａ、Ｃ９１Ｓ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ部位特異的変異誘発キットを使用して作製し、全長ＤＮＡシークエンシングにより確認した。短鎖ヘアピンＲＮＡは、ＲＮＡｉ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＴＲＣ）から、ｐＬＫＯ．１ピューロマイシンベクターの状態で得た。短鎖ヘアピンの配列は、以下の通り：ヒトＢＡＰ１（ＴＲＣオリゴＩＤ：ＴＲＣＮ０００００７８７０２およびＴＲＣＮ０００００７８６９８）、マウスＢＡＰ１（ＴＲＣＮ０００００３０７１９およびＴＲＣＮ０００００３０７２０）、ヒトＬ３ＭＢＴＬ２（ＴＲＣＮ０００００２１７２４およびＴＲＣＮ０００００２１７２６）、およびルシフェラーゼ（ｓｈＬＵＣ）についてのｓｈＲＮＡをコードする、対照ｐＬＫＯ．１−ピューロマイシンベクターであった。
【０１０８】
ユビキチンアッセイ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０ｃｍのディッシュ内に播種し、２４時間後、４μｇのＭｙｃ−Ｈｉｓ−Ｕｂｉ発現構築物と、対照である、１μｇのＬ３ＭＢＴＬ２過剰発現構築物および／または１〜１０μｇのＢＡＰ１-ＧＦＰ過剰発現構築物とで形質導入した。トランスフェクションの４８時間後において、細胞を、グアニジンＨＣｌベースの溶解緩衝液：６Ｍのグアニジン、０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、および１０ｍＭのＢＭＥに溶解させた。Ｈｉｓ−Ｕｂｉタンパク質は、２０μＬのＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）による、室温で４時間にわたるインキュベーションにより精製した。ビーズは、４つの洗浄緩衝液：緩衝液Ａ：６Ｍのグアニジン、０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＢＭＥ、および０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ、緩衝液Ｂ：８Ｍの尿素、０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＢＭＥ、および０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ、緩衝液Ｃ：０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリス、ｐＨ６．３、１０ｍＭのＢＭＥ、および０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ、ならびに緩衝液Ｄ：０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリス、ｐＨ６．３、１０ｍＭのＢＭＥ、および０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １ｍＬずつにより、順次洗浄した。全ての緩衝液には、１５ｍＭのイミダゾールを補充した。Ｈｉｓタグ付けされたタンパク質は、イミダゾールを補充した、２倍濃度のＳＤＳ  Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液と共に煮沸することにより、ビーズから精製した。次いで、タンパク質を、ウェスタンブロットにより解析した。
【０１０９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏコロニー形成アッセイ：細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａを使用して、Ｌｉｎ−ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ１＋細胞について分取した。細胞１００個を、メチルセルロース（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  ＧＦ  Ｍ３４３４、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に、２つ組で蒔いた。蒔いてから１４日後においてコロニーをカウントし、ＰＢＳで洗浄することにより、コロニーを回収した。次いで、ＲＮＡ抽出およびヒストン抽出のために、細胞を溶解させた。
【０１１０】
一過性トランスフェクション：Ｘ−ｔｒｅｍｅ遺伝子トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）により、２９３Ｔ細胞を、表示の構築物でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８〜７２時間後において、タンパク質および／またはヒストンを抽出した。
【０１１１】
浸潤アッセイ：中皮腫細胞（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、Ｈ２３７３、Ｈ２２６、およびＨ２４５２）を、Ｔ７５フラスコ内に播種した（細胞１００，０００個）。１２時間後、蒔いた細胞を、ＧＳＫ１２６（０〜２μＭ）（Ｃｈｅｍｉｔｅｋ）で処理し、次いで、７日間にわたり放置して、増殖させた。次いで、処理された細胞２５０，０００個を、無血清培地中の、Ｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤チャンバー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番３５４４８０）の上部に入れる一方、下層チャンバーは、血清を有する培地を含有した。２２時間後、膜の底部の細胞を、クリスタルバイオレットで染色し、ＩｍａｇｅＪで定量した。
【０１１２】
ルシフェラーゼアッセイ：２９３Ｔ細胞を、ＥＶ、ＢＡＰ１、およびＬ３ＭＢＴＬ２構築物に加えて、ｐＧＬ３  ＥＺＨ２プロモーターレポーター構築物（Ｎａｏｍｉ  Ｇｏｌｄｆｉｎｇｅｒ氏から恵与された）およびＳｗｉｔｃｈｇｅａｒ  Ｒｅｎｉｌｌａ対照構築物で一過性にトランスフェクトした。ＤｕａｌＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞を、ルシフェラーゼ活性について評価した。細胞を、２４ウェルプレートに播種し、２００ｎｇのｐＧＬ３−ＥＺＨ２−ルシフェラーゼ、２００ｎｇのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ対照構築物、および５００ｎｇの実験構築物で共トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後において、細胞をインキュベートし、室温で１５分間にわたり溶解させ、ルミノメーターにより、ルシフェラーゼ活性を評価した。ホタルルシフェラーゼについてのリーディングは、Ｒｅｎｉｌｌａによるトランスフェクション対照に対して正規化した。
【０１１３】
統計学的解析：本文中に記載されない限りにおいて、ウェルチの補正を用いる、スチューデントのｔ検定を使用して、統計学的有意性を解析した。統計学的計算のためには、Ｐｒｉｚｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用した。誤差は、ＳＥＭを使用して計算し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５とした。
【０１１４】
７．２  結果
ゲノム研究により、異なる悪性腫瘍における、腫瘍抑制因子であるＡＳＸＬ１およびＢＡＰ１の体細胞変異が同定された。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＡＳＸＬ１の相同体であるＡｓｘと、ＢＡＰ１の相同体であるＣａｌｙｐｓｏとは、Ｈ２ＡＫ１１９Ｕｂを除去する複合体を形成する（Scheuermannら、２０１０年）。しかし、ＢＡＰ１−ＡＳＸＬ１複合体は、ＢＡＰ１変異体の形質転換において役割を有することが示されていない。骨髄系悪性腫瘍では、ＡＳＸＬ１の不活化変異が最も一般的である（Abdel-Wahabら、２０１１年；Bejarら、２０１１年；Gelsi-Boyerら、２００９年）のに対し、中皮腫（Bottら、２０１１年）、腎細胞癌（Pena-Llopisら、２０１２年）、および転移性ブドウ膜黒色腫（Harbourら、２０１０年）では、再発性のＢＡＰ１変異が一般に観察されていることから、ＢＡＰ１とＡＳＸＬ１とは、腫瘍の抑制において、顕著に異なる役割を有することが示唆される。これらの変異的プロファイルは、ＢＡＰ１とＡＳＸＬ１との、差次的な組織特異的発現によっては説明することができない（図５Ａ〜Ｃ）。本実施例では、ＢＡＰ１の喪失が、ＡＳＸＬ１に依存しない形質転換をもたらす機構を同定し、ＢＡＰ１変異体のがん細胞における治療的脆弱性を同定する。
【０１１５】
近年の研究は、Ｂａｐ１の体細胞性喪失が、造血系形質転換を促進しうることを示している（Deyら、２０１２年）。条件付きＢａｐ１欠失の、造血細胞における遺伝子発現およびクロマチン状態に対する影響について調査した（図５Ａ、Ｂ）。Ｂａｐ１の条件付き欠失は、図５Ｄに示されるスキームを使用して作製した。成体動物における誘導後に、造血組織におけるＢａｐ１の欠失を駆動するリコンビナーゼである、ＭＸ−Ｃｒｅを使用した。Ｂａｐ１の喪失は、脾腫（図６Ａ）、白血球増加症（図５Ｅ、Ｆ）、貧血（図５Ｇ、Ｈ）、および顆粒球マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）の拡大（図５Ｉ〜Ｋ）を伴う、完全に浸潤性の骨髄増殖性疾患をもたらした。例えば、Ｂａｐ１ノックアウト（ＫＯ）マウスでは、脾臓のサイズ、例えば、重量および長さが、ＢＡＰ１野生型マウスより大きいことが観察された（図６Ａ、１０Ｃ、および１１Ｃ）。また、Ｂａｐ１欠損骨髄系前駆細胞の増殖および細胞周期進行の増大も観察された（図５Ｌ）。ＲＮＡシークエンシング解析は、Ｂａｐ１欠損ＧＭＰで差次的に発現する遺伝子の大部分で、発現が低減されることを明らかにした（ｐ−ａｄｊ＜０．００１）（図７Ａ）。Ｂａｐ１  ＫＯ前駆細胞およびＡｓｘｌ１  ＫＯ前駆細胞において差次的に発現する遺伝子のセットの間では、著明な重複が観察されたが、多くの場合、遺伝子発現に対する、対向する逆の効果も観察された（図６Ｂ）。遺伝子セット富化解析（ＧＳＥＡ）は、Ｂａｐ１  ＫＯ前駆細胞およびＡｓｘｌ１  ＫＯ前駆細胞で富化される遺伝子セットであって、反対の影響を受ける遺伝子セットを同定した（Abdel-Wahabら、２０１３年）（図７Ｂ）。ＡＳＸＬ１のサイレンシングは、ＰＲＣ２活性の低減と符合する、ＨｏｘＡクラスター遺伝子の発現の増大をもたらした（Abdel-Wahabら、２０１２年）。これに対し、Ｂａｐ１欠損細胞では、ＨｏｘＡ遺伝子メンバーの発現の低減（図６Ｃ）と、ＨｏｘＡ遺伝子シグネチャーの発現の減少（図７Ｃ）とが観察された。これらのデータは、Ａｓｘｌ１の喪失とＢａｐ１の喪失とは、遺伝子調節に対して反対の効果を有することを裏付ける。
【０１１６】
ＡＳＸＬ１は、ＰＲＣ２複合体と直接的に相互作用し、ＡＳＸＬ１の枯渇は、全体的かつ部位特異的にＨ３Ｋ２７ｍｅ３を低減する（Abdel-Wahabら、２０１２年）。Ａｓｘｌ１の喪失とＢａｐ１の喪失との、遺伝子発現に対する分岐効果を踏まえ、Ｂａｐ１の欠失の、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に対する影響について調査した。ヒストンについての質量分析（図６Ｄ）、ウェスタンブロット（図６Ｅ）、およびＥＬＩＳＡ（図８Ａ）により、Ｂａｐ１  ＫＯ細胞におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルは増大した。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３についてのクロマチン免疫沈降シークエンシング（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ）は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３ブロードドメインの数の増大（Beguelinら、２０１３年）（図６Ｇ）、および増大したＨ３Ｋ２７ｍｅ３ブロードドメインの、近傍の遺伝子座への「拡大」（図６Ｈ）を伴う、Ｂａｐ１  ＫＯマウスにおける全体的増大（図６Ｆ）を明らかにした。このＨ３Ｋ２７ｍｅ３の増大および拡大は、Ｂａｐ１  ＫＯ細胞におけるＨｏｘＡ遺伝子座内で十分に例示されている（図６Ｉ）。Ｂａｐ１  ＫＯ細胞において、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３によりマークされる部位は主に、遺伝子プロモーター領域に生じ（図８Ｂ）、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３により占有されるプロモーターを伴う遺伝子が、抑制の増強について富化された（ＦＤＲ＜０．００１）（図６Ｊ）。精製ＧＭＰにおいても、同様な知見が観察された（図６Ｋ）。Ｂａｐ１  ＫＯに関連するＨ３Ｋ２７ｍｅ３による遺伝子の調節異常と、遺伝子の抑制とは、ＥＺＨ２依存性の調節、系列コミットメント／分化、および増殖に関与していた（図６Ｌ、図８Ｃ）。ＢＡＰ１のサイレンシングは、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３を増大させ（図９Ａ）、Ｂａｐ１欠損細胞におけるＢＡＰ１の再発現は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルを低減した（図９Ｂ）。これに対し、デユビキチナーゼ欠損ＢＡＰ１対立遺伝子は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３を低減しなかった（図９Ｃ）ことから、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の変更が、ＢＡＰ１触媒性活性に起因することが裏付けられた。
【０１１７】
次に、Ｅｚｈ２の喪失の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける形質転換に対する影響（Suら、２００３年）を調査することにより、ＰＲＣ２に媒介されるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の、ＢＡＰ１依存性形質転換に対する役割を評価した。Ｅｚｈ２の欠失は、Ｂａｐ１／Ｅｚｈ２欠損マウスにおけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルを、Ｂａｐ１ノックアウトマウスと比較して低減した（図１１Ａ）。Ｅｚｈ２の欠失は、Ｂａｐ１の喪失により誘導される骨髄系悪性腫瘍を無効化し（図１０Ａ）、脾腫（図１１Ｂ、Ｃ）、白血球増加症（図１１Ｄ）、および貧血（図１１Ｅ）を低減した。随伴するＢａｐ１／Ｅｚｈ２の喪失は、骨髄系前駆細胞の拡大を低減し（図１１Ｆ）、Ｍａｃ１＋Ｇｒ１＋骨髄系細胞の比率を低減し（図１１Ｇ）、赤血球系の分化（ＣＤ７１＋Ｔｅｒ１１９＋）を回復させた（図１０Ｂ）。Ｂａｐ１／Ｅｚｈ２欠損前駆細胞の増殖の減少が観察された（図１１Ｈ）。Ｅｚｈ２のハプロ不全が、Ｂａｐ１欠損骨髄増殖を低減するが、これを無効化しなかった（図１０Ｃ、１０Ｄ）ことは、Ｅｚｈ２に対する用量依存的な要請と符合する。Ｂａｐ１  ＫＯマウスの低分子阻害剤ＥＰＺ０１１９８９（Campbellら、２０１５年）による処置が、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、脾腫、および白血球カウントを減少させた（図１１Ｉ〜Ｋ）ことは、遺伝子データと符合する。これらのデータは、Ｂａｐ１欠損骨髄系の形質転換には、ＰＲＣ２の活性、および、具体的には、Ｅｚｈ２の活性が要請されることを裏付ける。
【０１１８】
次に、Ｂａｐ１の欠失が、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルを上昇させる機構について調査した。ＡＳＸＬ１とＢＡＰ１との間で報告されている相互作用、およびＡＳＸＬ１とＰＲＣ２との間で報告されている相互作用とは対照的に、ＢＡＰ１とＥＺＨ２との間の相互作用は、共ＩＰによっては同定されなかった（図１３Ａ）。Ｅｚｈ２およびＳｕｚ１２のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現の増大が観察された（図１３Ｂ、Ｃ）ことは、ＰＲＣ２の発現の調節におけるＢａｐ１の役割と符合する。加えて、Ｂａｐ１  ＫＯマウスの全骨髄から分取されたＬｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞（造血幹細胞を含有する集団）についての解析は、Ｓｕｚ１２およびＥｚｈ２  ＲＮＡの発現の、野生型ＢＡＰ１マウスと比較した有意な増大を示した（図１７）。さらに、全骨髄ウェスタンブロットは、Ｂａｐ１  ＫＯ細胞における、ＥＺＨ２およびＳＵＺ１２のタンパク質発現の、対照細胞と比較した増大も明らかにした（図１７）。Ｂａｐ１  ＫＯ骨髄細胞におけるＢＡＰ１の再発現は、Ｅｚｈ２  ｍＲＮＡの発現を、正常レベルへと低減した（図１２Ａ）。Ｂａｐ１の喪失は、他のヒストンマークも直接変更することが可能であり、次いで、これにより、ＥＺＨ２を含む、鍵となる標的遺伝子座におけるクロマチン状態が変更されることが仮定された。ヒストンについての質量分析は、Ｂａｐ１  ＫＯ細胞における、他の測定されたヒストンマーク（図１２Ｂ）と比較した、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１の顕著な減少（図１３Ｄ）を明らかにした。ＢＡＰ１の発現は、ＥＺＨ２遺伝子座におけるＨ４Ｋ２０ｍｅ１を増大させたが、ＡＳＸＬ１またはＢＭＩ１は、これを増大させなかった（図１２Ｃ）。したがって、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１マークの喪失は、ＢＡＰ１依存性の遺伝子発現において、重要な役割を有しうることが仮定された。ＳＥＴＤ８は、公知のメチルトランスフェラーゼで、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１を付与する唯一のものである（Nishiokaら、２００２年）。ＢＡＰ１変異体の中皮腫細胞（Ｈ２２６、Ｈ２４５２）におけるＳＥＴＤ８の発現が、アポトーシスを増大させ、増殖を低減したのに対し、野生型（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、およびＭｅｓｏ１０）細胞は、影響を受けなかった（図１３Ｅ、Ｆ）。中皮腫細胞におけるＳＥＴＤ８の過剰発現は、ＥＺＨ２のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を減少させた（図１３Ｇ、Ｈ）。ＢＡＰ１野生型細胞系は、ＳＥＴＤ８阻害剤（Blumら、２０１４年）（ＢＶＴ５９４）に対して、ＢＡＰ１変異体細胞系より感受性であった（図１３Ｉ）。
【０１１９】
ＢＡＰ１は、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１を調節するクロマチンモジュレーターを脱ユビキチン化することが仮定された。ＣｈＩＰ−Ｓｅｑデータの解析（Abdel-Wahabら、２０１３年；Deyら、２０１２年）は、Ｂａｐ１の占有を伴うが、Ａｓｘｌ１の結合は伴わない遺伝子のクラスター（クラスター１）を同定し、これをＥ−ｂｏｘモチーフについて富化した（図１４Ａ、Ｂ）。先行研究は、非定型ポリコームタンパク質である、Ｌ３ＭＢＴＬ１およびＬ３ＭＢＴＬ２は、Ｅ−ｂｏｘモチーフに結合し、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１に結合することが可能であり、これを維持することを示している（Guoら、２００９年；Qinら、２０１２年；Trojerら、２０１１年；Trojerら、２００７年）。Ｌ３ｍｂｔｌ１欠損マウスが、明白な表現型を持たない（Qinら、２０１０年）のに対し、Ｌ３ｍｂｔｌ２欠損マウスは、Ｂａｐ１の喪失と同様のタイミングで胎性致死である（Deyら、２０１２年；Qinら、２０１２年）。したがって、Ｂａｐ１の喪失が、Ｌ３ｍｂｔｌ２の発現の変更をもたらすのかどうかについて調査した。Ｌ３ｍｂｔｌ２のタンパク質の発現は、Ｂａｐ１  ＫＯ造血細胞（図１５Ａ、Ｂ）内、およびＢＡＰ１変異体の中皮腫細胞において、ＢＡＰ１野生型の中皮腫細胞（図１３Ｊ）と比較して低減されたが、ＲＮＡの発現は、低減されなかった。Ｌ３ＭＢＴＬ２のユビキチン化は、ＢＡＰ１を発現させる細胞では低減され（図１３Ｋ）、プロテアソーム阻害剤による処理は、ＢＡＰ１変異体細胞における、Ｌ３ＭＢＴＬ２の安定性を増大させた（図１５Ｃ）。Ｌ３ＭＢＴＬ２の発現は、ＢＡＰ１の共発現を伴う場合も、これを伴わない場合も、ＥＺＨ２タンパク質レベルを低下させ（図１５Ｄ）、ＢＡＰ１の発現またはＬ３ＭＢＴＬ２の過剰発現は、ＥＺＨ２のプロモーター活性を低減した（図１５Ｅ）。逆に、Ｌ３ＭＢＴＬ２のサイレンシングは、ＥＺＨ２の発現を増大させた（図１５Ｆ）。Ｌ３ＭＢＴＬ２およびＢＡＰ１を発現させる細胞では、ＥＺＨ２遺伝子座における、Ｌ３ＭＢＴＬ２およびＢＡＰ１についての富化が観察された（図１５Ｇ、Ｈ）。特定の理論に束縛されることなく述べると、これらのデータは、ＢＡＰ１とＬ３ＭＢＴＬ２とは、相互作用し（図１５Ｉ）、ＥＺＨ２遺伝子座を共占有することを示唆する。ＢＡＰ１の喪失は、Ｌ３ＭＢＴＬ２の安定性の低減と、ＥＺＨ２転写出力の増大とをもたらす（図１３Ｌ）。
【０１２０】
ＴＣＧＡデータの解析は、中皮腫において、ＥＺＨ２  ｍＲＮＡの発現が増大することを明らかにした（図１６Ａ）。次に、ＥＺＨ２の阻害が、ＢＡＰ１変異体の中皮腫細胞系の生存を阻害する場合があるかどうかについて評価した。ＥＺＨ２のサイレンシングが、ＢＡＰ１変異体細胞系におけるアポトーシスを誘導したのに対し、野生型細胞系は、増殖し続けた（図１６Ｂ、Ｃ）。ＥＺＨ２のサイレンシングは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＢＡＰ１変異体の腫瘍形成を無効化したが、野生型細胞系の腫瘍形成は無効化しなかった（図１６Ｄ）。ＢＡＰ１野生型細胞系におけるＥＺＨ２の過剰発現は、増殖（図２０Ａ）、およびＥＺＨ２の阻害に対する感受性（図２０Ｂ）を増大させた。ＢＡＰ１変異体細胞系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、２Ｄ培養物（図１６Ｅ）および３Ｄ培養物（図１６Ｆ）のいずれにおいても、ＥＺＨ２の阻害（ＥＰＺ０１１９８９）に対してより感受性であった。次に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＥＺＨ２の阻害の影響を評価した。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に対する同様の効果にもかかわらず、ＥＺＨ２の阻害が、ＢＡＰ１変異体の腫瘍サイズを、媒体で処置されたマウスと比較して有意に低減した（図１６Ｇ）のに対し、野生型の腫瘍は、ＥＺＨ２の阻害に対する応答性が小さかった／見られなかった（図１６Ｈ）。ＥＺＨ２の阻害が、転移の潜在性を有するＢＡＰ１変異体の中皮腫細胞系における肺転移を無効化した（図１６Ｇ）ことは、転移におけるＢＡＰ１／ＥＺＨ２の役割（Harbourら、２０１０年）と符合する。ＥＺＨ２の阻害は、浸潤を低減し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＥカドヘリン発現を増大させた（図２０Ｃ〜Ｄ）。次に、ＢＡＰ１阻害剤である、ＧＳＫ１２６を使用するＥＺＨ２の阻害の影響について評価した。ＢＡＰ１変異体の中皮腫細胞を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの脇腹へと注射し、次いで、腫瘍形成の後で、媒体または１５０ｍｇ／ｋｇのＧＳＫ１２６による処置を開始した。ＥＺＨ２の阻害は、腫瘍サイズを、媒体で処置されたマウスと比較して有意に低減した（図２１Ａおよび図４）。ＧＳＫ１２６による処置は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＢＡＰ１変異体細胞におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３を有意に減弱させた（図２１Ｂ）。病理学的解析は、ＥＺＨ２の阻害が、Ｋｉ６７染色の低減およびＴＵＮＥＬ染色の増大と関連することを明らかにした（図２１Ｃ）。これらのデータは、ＥＺＨ２が、ＢＡＰ１変異体のがん細胞における潜在的治療的標的を表すことを示す。
【０１２１】
ＥＺＨ２の発がん性変異の同定（Morinら、２０１０年；Morinら、２０１１年；Pasqualucciら、２０１１年）は、変異体特異的エピジェネティック療法の開発をもたらした。しかし、エピジェネティック調節因子における大半の変異は、機能喪失を結果としてもたらすために、扱いやすい直接的治療標的を表さない。ＥＺＨ２阻害剤は近年、臨床試験にかけられ（McCabeら、２０１２年）ており、開示されたデータは、ＢＡＰ１の喪失が、前臨床研究および臨床研究においてさらに探索すべきであるＰＲＣ２における変異特異的依存性を結果としてもたらすことを示唆する。これらのデータは、ＳＷＩ／ＳＮＦ変異体ラブドイド腫瘍におけるＰＲＣ２の阻害の役割を示唆する近年の研究（Alimovaら、２０１３年；Knutsonら、２０１３年）、およびＢＡＰ１変異が、ＳＷＩ／ＳＮＦ変異と互いに排他的であることを示す解析（Wilsonら、２０１０年）と共鳴する（resonate）。これらのデータは、エピジェネティック調節因子における変異についての詳細な研究を、異なる悪性コンテキストにおけるエピジェネティック状態に対する、変異体特異的効果を転換する（reverse）療法の開発についての情報を得るのに使用しうることを示唆する。
【０１２２】
７．３  考察
ＢＡＰ１とＡＳＸＬ１とは、相互作用して、ヒストンのＨ２Ａリシン１１９（Ｈ２ＡＫ１１９Ｕｂ）から、モノユビキチンを除去しうる、ポリコームデユビキチナーゼ複合体を形成する。しかし、ＢＡＰ１とＡＳＸＬ１とが、顕著に異なるがん型において変異することは、エピジェネティック状態の調節および悪性形質転換における独立の役割と符合する。本実施例では、Ｂａｐ１の喪失が、トリメチル化ヒストンＨ３リシン２７（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）の増大を結果としてもたらし、Ｅｚｈ２の発現を上昇させ、ポリコーム抑制性複合体２（ＰＲＣ２）標的の抑制を増強したことが裏付けられる。これらの知見は、Ａｓｘｌ１の喪失について見られる、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の低減と対照的である。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、Ｂａｐ１およびＥｚｈ２の条件付き欠失は、Ｂａｐ１の喪失単独により誘導される骨髄系前駆細胞の拡大を無効化する。Ｂａｐ１の喪失は、Ｈ４Ｋ２０モノメチル化（Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１）の顕著な減少を結果としてもたらす。Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１メチルトランスフェラーゼであるＳＥＴＤ８の発現が、ＥＺＨ２の発現を低減し、ＢＡＰ１変異体細胞の増殖を無効化することは、ＥＺＨ２の転写の調節におけるＨ４Ｋ２０ｍｅ１の役割と符合する。さらに、ＢＡＰ１を欠く中皮腫細胞が、ＥＺＨ２の薬理学的阻害に対して感受性であることから、ＢＡＰ１変異体の悪性腫瘍に対する新規の治療手法が示唆される。
【０１２３】
８．参考文献
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Trojer,  P.,  Li,  G.,  Sims,  R.J.,  3rd,  Vaquero,  A.,  Kalakonda,  N.,  Boccuni,  P.,  Lee,  D.,  Erdjument-Bromage,  H.,  Tempst,  P.,  Nimer,  S.D.,  et  al.  (2007).  L3MBTL1,  a  histone-methylation-dependent  chromatin  lock.  Cell  129,  915-928.
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【０１２４】
本明細書では、それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、多様な参考文献が引用されている。本明細書では、多様な核酸およびアミノ酸配列受託番号が引用されており、これらの受託番号により言及される完全な配列が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｌ】
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【図６Ａ−Ｌ】
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【図７Ａ−Ｃ】
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【図８Ａ−Ｃ】
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【図９Ａ−Ｃ】
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【図１０Ａ−Ｄ】
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【図１１Ａ−Ｋ】
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【図１２Ａ−Ｃ】
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【図１３Ａ−Ｌ】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１５Ａ−Ｉ】
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【図１６Ａ−Ｈ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ−Ｄ】
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【図２１Ａ−Ｃ】
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【配列表】
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