(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
αガラクトシルラクチュロース、βガラクトシルラクチュロース、αガラクトシルメリビオース、及びβガラクトシルメリビオースからなる群より選択される少なくとも１種のガラクトシルオリゴ糖を含有する、免疫グロブリンＡ分泌促進剤。
【請求項２】
ビフィズス菌非介在性免疫グロブリンＡ分泌促進剤である、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
前記ガラクトシルオリゴ糖の含有量が、前記免疫グロブリンＡ産生促進剤が含有するオリゴ糖１００質量％に対して８０質量％以上である、請求項１又は２に記載の剤。
【請求項４】
前記ガラクトシルオリゴ糖が、αガラクトシルラクチュロース、αガラクトシルメリビオース、及びβガラクトシルメリビオースからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれかに記載の剤。
【請求項５】
経口製剤形態である、請求項１〜４のいずれかに記載の剤。
【請求項６】
αガラクトシルラクチュロース、βガラクトシルラクチュロース、αガラクトシルメリビオース、及びβガラクトシルメリビオースからなる群より選択される少なくとも１種のガラクトシルオリゴ糖を含有する、粘膜免疫賦活剤。
【請求項７】
前記粘膜が腸粘膜である、請求項６に記載の剤。
【請求項８】
αガラクトシルラクチュロース、βガラクトシルラクチュロース、αガラクトシルメリビオース、及びβガラクトシルメリビオースからなる群より選択されるガラクトシルオリゴ糖の製造方法であって、
メリビオース及びラクチュロースからなる群より選択される糖受容体と、
ガラクトース供与体とを
ガラクトシダーゼの存在下で反応させる工程を含み、
製造対象である前記ガラクトシルオリゴ糖がβガラクトシルラクチュロースである場合は、前記ガラクトース供与体がラクチュロースであり、且つ反応液中の前記糖受容体及び前記ガラクトース供与体の合計含有量が、反応溶媒１００質量％に対して５０〜７０質量％であり、
製造対象である前記ガラクトシルオリゴ糖がαガラクトシルメリビオースである場合は、前記ガラクトシダーゼがアスペルギルス属に属する生物に由来するガラクトシダーゼである、
製造方法。
【請求項９】
前記反応時の温度が２０℃以上４０℃未満である、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
製造対象である前記ガラクトシルオリゴ糖がαガラクトシルラクチュロース、αガラクトシルメリビオース、又はβガラクトシルメリビオースであり、反応液中の前記糖受容体及び前記ガラクトース供与体の合計含有量が、反応溶媒１００質量％に対して２０〜８０質量％である、請求項８又は９に記載の製造方法。
【請求項１１】
製造対象である前記ガラクトシルオリゴ糖が、αガラクトシルラクチュロース、αガラクトシルメリビオース、及びβガラクトシルメリビオースからなる群より選択されるガラクトシルオリゴ糖である、請求項８〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
前記ガラクトシダーゼがアスペルギルス属に属する生物に由来する、請求項８〜１１のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンＡ分泌促進剤、及び該剤に含有されるガラクトシルオリゴ糖の効率的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体において、粘膜は、細菌やウイルス等の微生物、各種抗原、毒素等にさらされているので、これらに対する防御機構が存在する。その一つとして、腸管免疫等の粘膜免疫機構が知られている。例えば、腸粘膜においては、パイエル板の免疫細胞によって免疫グロブリンＡが分泌され、これにより、微生物の腸粘膜からの侵入阻止、毒素の中和、アレルゲンの侵入阻止、腸内共生菌の制御が行われている。したがって、免疫グロブリンＡの分泌を促進すれば、粘膜免疫が活性化され、病原体感染やその毒素による中毒等に対してより抵抗力が高まると考えられている。
【０００３】
一方、ガラクトシルラクトース等のガラクトシルオリゴ糖はヒト母乳に含まれる成分であり、その安全性は高いといわれている。特定のガラクトシルオリゴ糖は、ビフィズス菌増殖促進活性を有することが知られており（特許文献１）、また、ビフィズス菌は免疫グロブリンＡの分泌を促進するともいわれている。しかし、ガラクトシルオリゴ糖については、免疫を抑制することも報告されていることから（特許文献２及び３）、ガラクトシルオリゴ糖が免疫機構に対してどのような作用を有するかは、予測できないのが現状である。また、仮にガラクトシルオリゴ糖が免疫グロブリンＡの分泌を促進できるとしても、ビフィズス菌増殖を介する場合であれば、ビフィズス菌が少ない（或いは全くない）粘膜に対して、又はビフィズス菌の保持量が少ない（或いは全くない）高齢者や抗生物質服用者に対しては、その効果を見込むことはできない。
【０００４】
ガラクトシルオリゴ糖は、効率性等の観点からは酵素反応により製造することが望ましい。しかし、酵素反応では、目的の糖と分子量が近い副産物も生成され易く、この場合はカラムクロマトグラフィー等で目的の糖を高純度で精製することが困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−１４０１７８号公報
【特許文献２】特開２００３−０４０７７９号公報
【特許文献３】特表２０００−５１６５９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、安全性が高いといわれているガラクトシルオリゴ糖を有効成分とし、且つビフィズス菌等の細菌を介さずとも免疫グロブリンＡの分泌を促進できる剤を提供することを課題とする。さらには、該ガラクトシルオリゴ糖を、効率的に、且つ副産物（特に、目的の糖と分子量の近い糖）の生成を抑えて製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は鋭意研究を進めた結果、特定のガラクトシルオリゴ糖（αガラクトシルラクチュロース、βガラクトシルラクチュロース、αガラクトシルメリビオース、又はβガラクトシルメリビオース）がビフィズス菌の非存在下であっても、免疫細胞に直接作用することにより免疫グロブリンＡ（本明細書において、「IgA」と示すこともある。）の分泌を促進できることを見出した。さらに、特定の糖受容体とガラクトース供与体とをガラクトシダーゼの存在下で反応させることにより、これらのガラクトシルオリゴ糖を効率的に、且つ副産物の生成を抑えて製造できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、完成されたものである。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【０００８】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【０００９】
項１．  αガラクトシルラクチュロース、βガラクトシルラクチュロース、αガラクトシルメリビオース、及びβガラクトシルメリビオースからなる群より選択される少なくとも１種のガラクトシルオリゴ糖を含有する、免疫グロブリンＡ分泌促進剤．
項２．  ビフィズス菌非介在性免疫グロブリンＡ分泌促進剤である、項１に記載の剤．
項３．  前記ガラクトシルオリゴ糖の含有量が、前記免疫グロブリンＡ産生促進剤が含有するオリゴ糖１００質量％に対して８０質量％以上である、項１又は２に記載の剤．
項４．  前記ガラクトシルオリゴ糖が、αガラクトシルラクチュロース、αガラクトシルメリビオース、及びβガラクトシルメリビオースからなる群より選択される少なくとも１種である、項１〜３のいずれかに記載の剤．
項５．  経口製剤形態である、項１〜４のいずれかに記載の剤．
項６．  αガラクトシルラクチュロース、βガラクトシルラクチュロース、αガラクトシルメリビオース、及びβガラクトシルメリビオースからなる群より選択される少なくとも１種のガラクトシルオリゴ糖を含有する、粘膜免疫賦活剤．
項７．  前記粘膜が腸粘膜である、項６に記載の剤．
項８．  メリビオース及びラクチュロースからなる群より選択される糖受容体と、
ガラクトース供与体とを
ガラクトシダーゼの存在下で反応させる工程を含む、
αガラクトシルラクチュロース、βガラクトシルラクチュロース、αガラクトシルメリビオース、及びβガラクトシルメリビオースからなる群より選択されるガラクトシルオリゴ糖の製造方法．
項９．  前記反応時の温度が２０℃以上４０℃未満である、項８に記載の製造方法．
項１０．  反応液中の前記糖受容体及び前記ガラクトース供与体の合計含有量が、反応溶媒１００質量％に対して２０〜８０質量％である、項８又は９に記載の製造方法．
項１１．  製造対象である前記ガラクトシルオリゴ糖が、αガラクトシルラクチュロース、αガラクトシルメリビオース、及びβガラクトシルメリビオースからなる群より選択されるガラクトシルオリゴ糖である、項８〜１０のいずれかに記載の製造方法．
項１２．  前記ガラクトシダーゼがアスペルギルス属に属する生物に由来する、項８〜１１のいずれかに記載の製造方法．
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ビフィズス菌等の細菌を介さずとも免疫グロブリンＡの分泌を促進できる、免疫グロブリンＡ分泌促進剤を提供することができる。本発明の免疫グロブリンＡ分泌促進剤は、ガラクトシルオリゴ糖を有効成分として含有するので、安全性が高いと考えられる。また、有効成分であるガラクトシルオリゴ糖は口腔内のｐＨ低下を引き起こし難いことから、本発明の免疫グロブリンＡ分泌促進剤は経口摂取してもう触を引き起こし難い。さらに、有効成分であるガラクトシルオリゴ糖はビフィズス菌増殖活性をも有するので、本発明の免疫グロブリンＡ分泌促進剤は、粘膜免疫賦活による効果（抵抗力向上等）のみならず、腸内フローラ改善による効果（消化吸収促進、便通の改善、老化防止等）をも発揮することができる。
【００１１】
本発明によれば、有効成分であるガラクトシルオリゴ糖を、効率的に、且つ副産物（特に、目的の糖と分子量の近い糖）の生成を抑えて製造することが可能となる。これにより、免疫グロブリンＡ分泌促進活性が高い、有効成分であるガラクトシルオリゴ糖を、高純度で含有する免疫グロブリンＡ分泌促進剤を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】パイエル板細胞培養上清のIgAレベルの測定結果を示す（実施例５）。縦軸は、測定されたIgA濃度（ng / mL）を示す。ネガティブコントロールに対するP値が0.01以下を「**」で示す。
【図２】ビフィズス菌培養液の濁度の測定結果を示す（実施例６）。縦軸は、濁度(OD600)を示す。横軸は培養開始からの経過時間（単位：時間）を示す。
【図３】ビフィズス菌培養液の濁度の測定結果を示す（実施例６）。縦軸は、濁度(OD600)を示す。横軸は培養開始からの経過時間（単位：時間）を示す。
【図４】ビフィズス菌培養液の濁度の測定結果を示す（実施例６）。縦軸は、濁度(OD600)を示す。横軸は培養開始からの経過時間（単位：時間）を示す。
【図５】唾液及び糖の混合液のpH測定結果を示す（実施例７）。縦軸は、測定されたpHを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．免疫グロブリンＡ分泌促進剤
本発明は、αガラクトシルラクチュロース、βガラクトシルラクチュロース、αガラクトシルメリビオース、及びβガラクトシルメリビオースからなる群より選択される少なくとも１種のガラクトシルオリゴ糖を含有する、免疫グロブリンＡ分泌促進剤（本明細書において、「本発明の剤」と示すこともある）に関する。以下、これについて説明する。
【００１４】
αガラクトシルラクチュロースは、ガラクトースのアノマー炭素上の水酸基とラクチュロースの非還元末端の水酸基とがαグリコシド結合してなるガラクトシルオリゴ糖であり、この限りにおいて特に限定されない。
【００１５】
βガラクトシルラクチュロースは、ガラクトースのアノマー炭素上の水酸基とラクチュロースの非還元末端の水酸基とがβグリコシド結合してなるガラクトシルオリゴ糖であり、この限りにおいて特に限定されない。
【００１６】
αガラクトシルメリビオースは、ガラクトースのアノマー炭素上の水酸基とメリビオースの非還元末端の水酸基とがαグリコシド結合してなるガラクトシルオリゴ糖であり、この限りにおいて特に限定されない。
【００１７】
βガラクトシルメリビオースは、ガラクトースのアノマー炭素上の水酸基とメリビオースの非還元末端の水酸基とがβグリコシド結合してなるガラクトシルオリゴ糖であり、この限りにおいて特に限定されない。
【００１８】
有効成分であるガラクトシルオリゴ糖は、好ましくはαガラクトシルラクチュロース、αガラクトシルメリビオース、及びβガラクトシルメリビオースからなる群より選択される少なくとも１種である。ガラクトシルオリゴ糖は、より高い免疫グロブリンＡ分泌作用を有するという観点からは、好ましくはαガラクトシルラクチュロース、βガラクトシルラクチュロース、及びβガラクトシルメリビオースからなる群より選択される少なくとも１種であり、より好ましくはαガラクトシルラクチュロース、及びβガラクトシルメリビオースからなる群より選択される少なくとも１種であり、さらに好ましくはαガラクトシルラクチュロースである。ガラクトシルオリゴ糖は、う触原性が低いという観点から、好ましくはαガラクトシルラクチュロース、βガラクトシルラクチュロースからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１９】
ガラクトシルオリゴ糖は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
本発明の剤の用途は、本発明の効果を奏すれば特に限定されない。本発明の剤は、例えば医薬品、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメント等）、食品添加剤等に利用できる。また、本発明の剤は、腸管免疫療法、サプリメント療法等に好適に使用することができる。
【００２１】
本発明の剤の製剤形態は、特に限定されず、本発明の剤の用途に応じて、各用途において通常使用される製剤形態をとることができる。製剤形態としては、用途が医薬品、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメント等）等である場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）、注射剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などの非経口摂取に適した製剤形態（非経口製剤形態）が挙げられ、好ましくは経口製剤形態が挙げられる。また、用途が食品添加剤等である場合は、製剤形態として、例えば液剤、顆粒剤、散剤等が挙げられる。
【００２２】
本発明の剤は、有効成分であるガラクトシルオリゴ糖のみからなるものであってもよいし、この他に、用途あるいは製剤形態に応じて、他の成分が適宜配合されていてもよい。他の成分としては、特に制限されないが、例えば、アミノ酸類、アルコール類、多価アルコール類、糖類、ガム質、多糖類などの高分子化合物、界面活性剤、防腐・抗菌・殺菌剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、抗酸化剤、酵素成分、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動化剤、清涼化剤の他、ミネラル類、細胞賦活剤、滋養強壮剤、賦形剤、増粘剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、分散剤、吸着剤、崩壊補助剤、湿潤剤または湿潤調節剤、防湿剤、着色料、着香剤または香料、芳香剤、還元剤、可溶化剤、溶解補助剤、発泡剤、粘稠剤または粘稠化剤、溶剤、基剤、乳化剤、可塑剤、緩衝剤、光沢化剤などを挙げることができる。
【００２３】
本発明の剤が有効成分であるガラクトシルオリゴ糖以外の他の成分を含有する場合、ガラクトシルオリゴ糖の含有量は、本発明の剤の用途や製剤形態に応じて、その効果を発揮できる含有量である限り特に限定されない。含有量は、本発明の剤１００質量％に対して、例えば０．１〜９０質量％である。
【００２４】
後述の本発明の製造方法によって、有効成分であるガラクトシルオリゴ糖を、副産物（特に、目的の糖と分子量の近い糖）の生成を抑えて製造することができる。したがって、この方法を利用することにより、本発明の剤には、免疫グロブリンＡ分泌促進作用が高い有効成分であるガラクトシルオリゴ糖を、この作用が比較的低いと思われるその他のオリゴ糖の混入をより低減しつつも、より多く配合することが可能となる。この観点から、有効成分であるガラクトシルオリゴ糖の含有量は、本発明の剤が含有するオリゴ糖１００質量％に対して、例えば８０質量％以上、好ましくは９０質量％以上、より好ましくは９５質量％以上、さらに好ましくは９７質量％以上、よりさらに好ましくは９９質量％以上、特に好ましくは１００質量％である。
【００２５】
本発明の剤を、医薬品、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメント等）等として摂取させる場合、その摂取量は、症状、被摂取者の年齢、体重、製剤形態等に応じて適宜設定することができる。摂取量は、例えば、成人１日あたり、有効成分であるガラクトシルオリゴ糖の摂取量が０．０１ｇ〜１００ｇとなるような量が挙げられる。また、摂取は、１日１回でもよいが、複数回（例えば２〜４回）に分けて行ってもよい。
【００２６】
本発明の剤を、食品添加剤等として使用する場合、その添加量は、食品の種類等に応じて適宜設定することができる。添加量は、例えば、成人が１日に摂取する量の食品中の有効成分であるガラクトシルオリゴ糖が例えば０．０１ｇ〜１００ｇとなるような量が挙げられる。本発明の剤を食品に配合する方法は、食品の種類等に応じて適宜設定することができる。例えば、食品中に本発明の剤を混合してもよく、食品を、本発明の剤を含有する水溶液中に浸漬してもよく、または食品に本発明の剤を噴霧してもよい。噴霧する場合は、エタノールなどの揮発性溶媒に本発明の剤を混合して噴霧することができる。さらに本発明の剤は、例えば、食品を加熱して加工する場合、加熱の前後いずれの食品素材に対しても処理が行われてもよい。
【００２７】
本発明の剤は、粘膜（例えば、頬側粘膜、胃粘膜、腸粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宮内膜等、好ましくは腸粘膜）上への免疫グロブリンＡの分泌を促進することができる。これにより、粘膜免疫が活性化され、病原体感染やその毒素による中毒等に対してより抵抗力が高まる。この観点から、本発明の剤の有効成分は、粘膜（例えば、頬側粘膜、胃粘膜、腸粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宮内膜等、好ましくは腸粘膜）免疫賦活剤の有効成分としても有用である。また、本発明の剤の有効成分は、ビフィズス菌増殖活性をも有するので、ビフィズス菌増殖促進剤、腸内フローラ改善剤、消化吸収促進剤、便通改善剤、老化防止剤等の有効成分としても有用である。
【００２８】
本発明の剤の有効成分であるガラクトシルオリゴ糖は、ビフィズス菌等の細菌の非存在下であっても、免疫グロブリンＡ分泌促進作用を発揮することができる。このため、本発明の剤は、より好適には、細菌（好ましくはビフィズス菌）非介在性免疫グロブリンＡ分泌促進剤として用いることができる。ビフィズス菌非介在性免疫グロブリンＡ分泌促進剤として用いる場合、ビフィズス菌の保持量が少ない（或いは全くない）粘膜或いは検体（高齢者や抗生物質服用者）に対しても、効果的に免疫グロブリンＡの分泌を促進することができる。
【００２９】
２．ガラクトシルオリゴ糖の製造方法
本発明は、メリビオース及びラクチュロースからなる群より選択される糖受容体と、ガラクトース供与体とをガラクトシダーゼの存在下で反応させる工程を含む、αガラクトシルラクチュロース、βガラクトシルラクチュロース、αガラクトシルメリビオース、及びβガラクトシルメリビオースからなる群より選択されるガラクトシルオリゴ糖の製造方法（本明細書において、「本発明の製造方法」と示すこともある）に関する。以下、これについて説明する。
【００３０】
糖受容体は、製造対象のガラクトシルオリゴ糖に応じて適宜選択される。製造対象がαガラクトシルラクチュロース又はβガラクトシルラクチュロースである場合は、糖受容体としてラクチュロースが選択され、製造対象がαガラクトシルメリビオース又はβガラクトシルメリビオースである場合は、糖受容体としてメリビオースが選択される。
【００３１】
ガラクトシダーゼは、製造対象のガラクトシルオリゴ糖に応じて適宜選択される。製造対象がαガラクトシルラクチュロース又はαガラクトシルメリビオースである場合は、ガラクトシダーゼとしてαガラクトシダーゼが選択され、製造対象がβガラクトシルラクチュロース又はβガラクトシルメリビオースである場合は、ガラクトシダーゼとしてβガラクトシダーゼが選択される。
【００３２】
αガラクトシダーゼは、EC番号EC 3.2.1.22に分類される酵素であり、その限りにおいて特に限定されない。αガラクトシダーゼとしては、種々の生物由来のものを使用することができる。例えば、アスペルギルス属生物（好ましくはアスペルギルス ニガー）、コーヒー豆、Xanthomonas属生物（好ましくはXanthomonas manihotis）等に由来するαガラクトシダーゼが挙げられる。これらの中でも、製造対象であるガラクトシルオリゴ糖を、効率的に、且つ副産物（特に、目的の糖と分子量の近い糖）の生成を抑えて製造できるという観点から、好ましくはアスペルギルス属生物由来、より好ましくはアスペルギルス ニガー由来のαガラクトシダーゼが挙げられる。αガラクトシダーゼとしては１種単独を用いてもよいし、２種以上の組み合わせを用いてもよい。
【００３３】
βガラクトシダーゼは、EC番号EC 3.2.1.23に分類される酵素であり、その限りにおいて特に限定されない。βガラクトシダーゼとしては、種々の生物由来のものを使用することができる。例えば、アスペルギルス属生物（好ましくはアスペルギルス オリゼ）、ウシ（精巣、肝臓等）、大腸菌、Xanthomonas manihotis、Bacteroides fragilis、Jack bean、Streptococcus pneumonia、Kluyveromyces lactis、Xanthomonas sp等に由来するβガラクトシダーゼが挙げられる。これらの中でも、製造対象であるガラクトシルオリゴ糖を、効率的に、且つ副産物（特に、目的の糖と分子量の近い糖）の生成を抑えて製造できるという観点から、好ましくはアスペルギルス属生物由来、より好ましくはアスペルギルス オリゼ由来のβガラクトシダーゼが挙げられる。βガラクトシダーゼとしては１種単独を用いてもよいし、２種以上の組み合わせを用いてもよい。
【００３４】
ガラクトシダーゼは、担体に固定化されたガラクトシダーゼであってもよい。ガラクトシダーゼを担体に固定化する方法は、公知の方法を採用することができる。担体は、ガラクトシダーゼを固定化できる限りにおいて特に限定されず、例えばガラクトシダーゼに含まれるアミノ基とアミド結合できるカルボキシル基を有する担体が挙げられる。具体例としては、カルボキシル基をＮ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）でエステル化したセファロース（担体）の活性化エステル基と、ガラクトシダーゼのアミノ基とをアミド結合させることにより、担体にガラクトシダーゼを固定化することができる。また、他の具体例としては、担体を臭化シアンで活性化して、ガラクトシダーゼのアミノ基とアミド結合させる固定化方法等が挙げられる。
【００３５】
ガラクトース供与体は、ガラクトースを供与できる糖である限り特に限定されないが、例えばガラクトース、又は構成単糖としてガラクトースを含むオリゴ糖（好ましくは２糖）が挙げられる。このようなオリゴ糖は、本発明の製造方法で用いるガラクトシダーゼによって分解されてガラクトースを生じ得るオリゴ糖である限り特に限定されず、例えばガラクトースのアノマー炭素上の水酸基と単糖又はオリゴ糖の水酸基とがグリコシド結合してなるオリゴ糖が挙げられる。
【００３６】
本発明の製造方法で用いるガラクトシダーゼがαガラクトシダーゼである場合、ガラクトース供与体として用い得るオリゴ糖としては、例えばメリビオース、メリビウロース、ガラクトスクロース、α(1-2)ガラビオース、α(1-3)ガラビオース、α(1-6)ガラビオース、α(1-4)ガラビオース、メリビオサミン、N−アセチルメリビオサミン、α−ＰＮＰガラクトース等が挙げられ、本発明の製造方法で用いるガラクトシダーゼがβガラクトシダーゼである場合、ガラクトース供与体として用い得るオリゴ糖としては、例えばラクチュロース、ラクトース、ネオラクトース、β−ＰＮＰガラクトース、アロラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｎ−アセチルアロラクトサミン等が挙げられる。
【００３７】
これらの中でも、製造対象のガラクトシルオリゴ糖を、効率的に、且つ副産物（特に、目的の糖と分子量の近い糖）の生成を抑えて製造できるという観点から好ましいガラクトース供与体としては、製造対象がαガラクトシルラクチュロースの場合はガラクトースが挙げられ、製造対象がβガラクトシルラクチュロースの場合はラクチュロースが挙げられ（この場合、ラクチュロースはガラクトース供与体及び糖受容体の両方として機能する）、製造対象がαガラクトシルメリビオースの場合はメリビオースが挙げられ（この場合、メリビオースはガラクトース供与体及び糖受容体の両方として機能する）、製造対象がβガラクトシルメリビオースの場合はラクトースが挙げられる。
【００３８】
ガラクトース供与体としては１種単独を用いてもよいし、２種以上の組み合わせを用いてもよい。
【００３９】
反応は、適当な溶媒中で行う。溶媒としては、糖受容体及びガラクトース供与体を溶解させることができ、且つガラクトシダーゼが失活しない溶媒であれば特に限定されない。このような溶媒としては、例えば、水、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等が挙げられ、好ましくは水、酢酸緩衝液等が挙げられる。また、溶媒には、少量の有機溶媒が混入していてもよい。
【００４０】
反応温度は、ガラクトシダーゼが失活しない温度であれば特に限定されないが、製造対象のガラクトシルオリゴ糖を、効率的に、且つ副産物（特に、目的の糖と分子量の近い糖）の生成を抑えて製造できるという観点からは、ガラクトシダーゼの至適温度より低温であることが好ましい。より具体的には、反応温度としては、ガラクトシダーゼの至適温度よりも、例えば１０〜４０℃、好ましくは１５〜３５℃、より好ましくは２０〜３５℃、さらに好ましくは２３〜３２℃低い温度が挙げられる。同様の観点から、ガラクトシダーゼの至適温度が５５〜６０℃である場合、反応温度としては、例えば、１５℃〜５０℃、好ましくは２０〜４５℃、より好ましくは２０〜４０℃、さらに好ましくは２５〜４０℃、よりさらに好ましくは２５〜３５℃が挙げられる。
【００４１】
反応時間は、ガラクトシダーゼの酵素活性が十分に発揮できる限り特に限定されない。反応時間は、例えば１〜２００時間、好ましくは５〜２００時間、より好ましくは１０〜１７０時間である。製造対象のガラクトシルオリゴ糖を、効率的に、且つ副産物（特に、目的の糖と分子量の近い糖）の生成を抑えて製造できるという観点から好ましい反応時間は、製造対象がαガラクトシルラクチュロースの場合は１００〜２００時間（より好ましくは１３０〜２００時間、さらに好ましくは１５０〜１９０時間）、製造対象がβガラクトシルラクチュロースの場合は５〜５０時間（より好ましくは１２〜３６時間、さらに好ましくは１８〜３０時間）、製造対象がαガラクトシルメリビオースの場合は４０〜１５０時間（より好ましくは６０〜１３０時間、さらに好ましくは８０〜１２０時間）、製造対象がβガラクトシルメリビオースの場合は１〜２４時間（より好ましくは４〜１８時間、さらに好ましくは８〜１６時間）である。
【００４２】
反応ｐＨは、ガラクトシダーゼの酵素活性が十分に発揮される限り特に限定されない。反応ｐＨは、例えばｐＨ３〜１０、好ましくはｐＨ４〜６である。
【００４３】
ガラクトース供与体と糖受容体とが互いに異なる場合、反応における、ガラクトース供与体及び糖受容体のモル比は、ガラクトシダーゼによる酵素反応が起こる限り特に限定されない。該モル比は、製造対象のガラクトシルオリゴ糖を、効率的に、且つ副産物（特に、目的の糖と分子量の近い糖）の生成を抑えて製造できるという観点からは、例えば、ガラクトース供与体１モルに対して、糖受容体が、例えば０．５〜１５モル、好ましくは１〜１０モル、より好ましくは２〜８モル、さらに好ましくは３〜７モルである。
【００４４】
製造対象のガラクトシルオリゴ糖を、効率的に、且つ副産物（特に、目的の糖と分子量の近い糖）の生成を抑えて製造できるという観点から、反応液中の糖受容体及びガラクトース受容体の濃度が高いことが望ましい。より具体的には、反応液中の糖受容体及びガラクトース供与体の合計含有量は、反応溶媒１００質量％に対して、例えば２０〜８０質量％、好ましくは２５〜７５質量％、より好ましくは３０〜７０質量％である。該含有量は、特に、製造対象がαガラクトシルラクチュロースの場合は反応溶媒１００質量％に対して好ましくは３０〜５０質量％（より好ましくは３５〜４５質量％）、製造対象がβガラクトシルラクチュロースの場合は反応溶媒１００質量％に対して好ましくは５０〜７０質量％（より好ましくは５５〜６５質量％）、製造対象がαガラクトシルメリビオースの場合は反応溶媒１００質量％に対して好ましくは２５〜４５質量％（より好ましくは３０〜４０質量％）、製造対象がβガラクトシルメリビオースの場合は反応溶媒１００質量％に対して好ましくは３０〜５０質量％（より好ましくは３５〜４５質量％）である。
【００４５】
上記反応後、反応によって得られた製造対象のガラクトシルオリゴ糖を含む溶液を、さらに精製工程に供してもよい。精製手段は、公知の方法（分液、蒸留、クロマトグラフィー、再結晶等）を採用できる。本発明の製造方法によれば、製造対象のガラクトシルオリゴ糖を、副産物（特に、目的の糖と分子量の近い糖）の生成を抑えて製造することができるので、簡便な精製によって、目的の糖を高純度で得ることが可能である。
【実施例】
【００４６】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４７】
実施例１：αガラクトシルラクチュロースの合成
ガラクトース（350 mg, 1.94 mmol）、ラクチュロース（3.4 g, 9.9 mmol）を酢酸ナトリウムバッファー (pH= 4.0, 50 mM, 8.6 mL)に溶解した。続いて、α‐ガラクトシダーゼ（スミチームＡＧＳ：至適温度60℃、新日本化学工業株式会社製）0.6 mg ( 18 U)を加え、 30℃にて 168時間インキュベートした。反応終了後、100℃にて3分間加熱し酵素を失活し反応を停止した。その反応液を脱塩、フィルターし不溶成分を除去した後、GLサイエンス社製（HPLCシステムPLC761）、Inertsil Amide 5μm (14 x 250 mm) カラムに供し（カラム温度：40℃、溶離液：アセトニトリル/水＝7/3）、流速：9.5 mL / min）、検出はRIにて目的としたαガラクトシルラクチュロース（60.9 mg）を得た（収率：6.2％）。カラム精製においては、目的のαガラクトシルラクチュロースの他に副生成物が無く、容易に精製することができた。
【００４８】
実施例２：βガラクトシルラクチュロースの合成
ラクチュロース（2.6 g,  7.6 mmol）を酢酸ナトリウムバッファー (pH= 5.0, 50 mM, 4.2 mL)、β‐ガラクトシダーゼ（スミラクトL：至適温度55℃、新日本化学工業株式会社製）10 mg ( 100 U)を加え、 30℃にて 24時間インキュベートした。反応終了後、100℃にて3分間加熱し酵素を失活し反応を停止した。その反応液を脱塩、フィルターし不溶成分を除去した後、GLサイエンス社製（HPLCシステムPLC761）、Inertsil Amide 5μm (14 x 250 mm) カラムに供し（カラム温度：40℃、溶離液：アセトニトリル/水＝7/3、流速：9.5 mL / min）、検出はRIにて目的としたβガラクトシルラクチュロース（47.8 mg）を得た（収率：1.2％）。カラム精製においては、目的のβガラクトシルラクチュロースの他に副生成物が無く、容易に精製することができた。
【００４９】
実施例３：αガラクトシルメリビオースの合成
メリビオース（280 mg, 0.82 mmol）を蒸留水（700μL）に溶解した。次に、酢酸ナトリウムバッファー(pH= 5.0, 50 mM, 100μL)、α‐ガラクトシダーゼ（スミチームＡＧＳ：至適温度60℃、新日本化学工業株式会社製）0.104 mg ( 3 U)、を加え、 30℃にて 96時間インキュベートした。反応終了後、100℃にて3分間加熱し酵素を失活し反応を停止した。その反応液を脱塩、フィルターし不溶成分を除去した後、GLサイエンス社製（HPLCシステムPLC761）、Inertsil Amide 5μm (14 x 250 mm) カラムに供し（カラム温度：40℃、溶離液：アセトニトリル/水＝7/3、流速：9.5 mL / min）、検出はRIにて目的としたαガラクトシルメリビオース（75.9 mg）を得た（収率：1.8％）。カラム精製においては、目的のαガラクトシルメリビオースの他に副生成物が無く、容易に精製することができた。
【００５０】
実施例４：βガラクトシルメリビオースの合成
ラクトース（90 mg, 0.26 mmol）、メリビオース（450 mg, 1.32 mmol）を蒸留水（1.2 mL）に溶解した。次に、酢酸ナトリウムバッファー (pH= 5.0, 50 mM, 100μL)、β‐ガラクトシダーゼ（スミラクトL：至適温度55℃、新日本化学工業株式会社製）10 mg ( 100 U)、を加え、 30℃にて 12時間インキュベートした。反応終了後、100℃にて3分間加熱し酵素を失活し反応を停止した。その反応液を脱塩、フィルターし不溶成分を除去した後、GLサイエンス社製（HPLCシステムPLC761）、Inertsil Amide 5μm (14 x 250 mm) カラムに供し（カラム温度：40℃、溶離液：アセトニトリル/水＝7/3、流速：9.5 mL / min）、検出はRIにて目的としたβガラクトシルメリビオース（19.7 mg）を得た（収率：15％）。カラム精製においては、目的のβガラクトシルメリビオースの他に副生成物が無く、容易に精製することができた。
【００５１】
実施例５：IgA誘導活性試験
実施例１〜４で合成したガラクトシルオリゴ糖それぞれを、定法に従って培養（RPMI培地中、5% CO2、37℃）したマウスパイエル板細胞（Journal of Applied Microbiology 116, 980-989, 2013）（1.25 x 106 cells / mL）の培地（100μL）に、終濃度100μg /mLになるように添加し、5日間培養した。培養後、培地上清のIgAレベルをmouse IgA ELISA kit（Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA）を用いて測定した。なお、ガラクトシルオリゴ糖を添加しない場合（ネガティブコントロール）、及びガラクトシルオリゴ糖に代えて大腸菌由来のlipopolysaccharide (LPS)を終濃度5μg / mLになるように添加した場合（IgA誘導のポジティブコントロール）についても、同様に培地上清のIgAレベルを測定した。ネガティブコントロール及びポジティブコントロールについてはn = 3の、その他についてはn = 6の平均値を求め、標準誤差及びP値を求めた。測定結果を図１に示す。図１中、「saline」はネガティブコントロールを示し、「LPS」はポジティブコントロールを示し、「3」はβガラクトシルラクチュロースを示し、「4」はαガラクトシルラクチュロースを示し、「8」はαガラクトシルメリビオースを示し、「9」はβガラクトシルメリビオースを示し、「13」はメリビオースを示す。
【００５２】
図１に示されるように、実施例１〜４で合成したガラクトシルオリゴ糖を添加した場合、ネガティブコントロールに比べて培地中のIgAレベルが高かった。このことから、これらのガラクトシルオリゴ糖は、IgA分泌促進作用を有することが示唆された。また、本試験系はビフィズス菌等の他の細菌非存在下で行われていることから、このIgA分泌促進作用は細菌（ビフィズス菌等）非介在性の作用であることが示唆された。さらに、同じガラクトシルオリゴ糖に分類されるメリビオースはIgA分泌促進作用が全く見られなかった。このことから、実施例１〜４で合成したガラクトシルオリゴ糖のIgA分泌促進作用は、ガラクトシルオリゴ糖一般の性質ではなく、これらの糖に特有の性質であることが示唆された。
【００５３】
実施例６：ビフィズス菌増殖活性試験
96-well plateに、Basal Media (0.2 % yeast extract, 1.0 % peptone, 0.5 % sodium acetate, 0.2 % diammonium citrate, 0.02 % magnesium sulfate, 0.2 % dipotassium hydrogen phosphate, 0.1 % cysteine hydrochloride)172μLと、実施例１〜４で合成したガラクトシルオリゴ糖それぞれの10％水溶液20μLを添加（最終濃度1%）し、一晩嫌気状態で静置した。一方で、ビフィズス菌（B. longum JCM1222、B. animalis sbsp. Lactis JCM10602、又はB. breve JCM1192）の菌体を、OD600=0.1となるようにReducing reagent (2 % cysteine hydrochloride and 11 % sodium  carbonate)に懸濁して、菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液8μLを、一晩静置後の96-well plateに加え、37℃嫌気条件で培養開始した。経時的に濁度(OD600)を測定（48時間まで）した。なお、ガラクトシルオリゴ糖を添加しない場合（ネガティブコントロール）、及びガラクトシルオリゴ糖に代えてグルコースを添加した場合（ビフィズス菌増殖のポジティブコントロール）についても、同様に濁度を測定した。測定結果を図２〜４に示す。図２〜４中、「3」はβガラクトシルラクチュロースを示し、「4」はαガラクトシルラクチュロースを示し、「7」はβガラクトシルメリビオースを示し、「8」はαガラクトシルメリビオースを示す。
【００５４】
図２〜４に示されるように、実施例１〜４で合成したガラクトシルオリゴ糖を添加した場合、ネガティブコントロールに比べて一定時間経過後の濁度が高かった。このことから、これらのガラクトシルオリゴ糖は、ビフィズス菌増殖活性を有することが示唆された。
【００５５】
実施例７：う蝕原性試験
口腔内を水道水でゆすぎ、さらに蒸留水でうがいした後、唾液を回収した。αガラクトシルラクチュロース、βガラクトシルラクチュロース、スクロース、ラクチュロース、又はキシリトールの1％水溶液0.2 mLへ、新鮮な唾液0.6 mLとブレインハートインフュージョン培地（日水製薬株式会社製）0.2 mLを加えた。混合液を37℃で加温し、継時的にpH変化をpHメーター（コンパクトpHメーターB-71X、HORIBA社製）測定した。唾液中の口内細菌により有機物が代謝されて有機酸が生じると、混合液のpH低下するので、その場合は添加した糖にう触原性があると評価することができる。測定結果を図５に示す。
【００５６】
スクロースを添加した場合、5時間経過後にpHが大きく低下しているのに対し、α-ガラクトシルラクチュロース又はβガラクトシルラクチュロースを添加した場合は、虫歯になりにくい糖として知られているキシリトールと同様に、pHの低下が少なかった。このことより、α-ガラクトシルラクチュロース又はβガラクトシルラクチュロースは口内細菌により代謝されにくい、すなわち虫歯になりにくい糖鎖であることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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