(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性の進行を予防、治療および／または阻止するための医薬組成物であって、ＤＮアーゼ酵素を含み、かつ、前記神経変性は、血液または脳脊髄液または腸中における細胞外ＤＮＡの増大したレベルと関連する、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記神経変性が一次神経変性である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記細胞外ＤＮＡが原核生物由来である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記細胞外ＤＮＡがヒト由来である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＤＮアーゼが、患者の血液または脳脊髄液または腸中における細胞外ＤＮＡを破壊するのに十分な量で投与されるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＤＮアーゼが、ゲル電気泳動により測定される前記細胞外ＤＮＡの平均分子量を低下させるのに十分な量で投与されるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ＤＮアーゼが、組み換えＤＮアーゼ、ＤＮアーゼＩ、および延長された半減期を有するＤＮアーゼから選ばれるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＤＮアーゼが、ポリシアル酸とコンジュゲートしている、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ＤＮアーゼが、アクチン結合部位の改変により、アクチンに対する結合から保護されている、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＤＮアーゼが、静脈内、皮下または筋肉内経路により投与されるものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＤＮアーゼが、少なくとも１日の間、少なくとも０．０４ｍｇ／１ｋｇ／日の量で投与されるものである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ＤＮアーゼが、少なくとも１日の間、０．０５から１００００クニッツ単位／１ｋｇ／日の量で投与されるものである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ＤＮアーゼが、脳脊髄液中に投与されるか、経腸的に投与されるかまたは経口投与されるものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ＤＮアーゼが、１日に少なくとも０．１ｍｇの量で投与されるＤＮアーゼＩである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記神経変性が、アルツハイマー病、晩期発症型アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、統合失調症、または双極性障害と関連するものである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、その開示がその全体で参照により本明細書に組み込まれる２０１５年５月２２日出願の米国特許仮出願第６２／１６５，２５５号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、神経変性の進行を阻止するためならびに予防および治療のためのデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）酵素の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
神経変性は、ニューロンの死を含むニューロンの構造および／または機能の進行性喪失を伴う別個の臨床病理学的状態である。神経変性に至る分子経路は、高度に疾患特異的であり（例えば、アルツハイマー病患者中の脳における異常に折り畳まれたアミロイドベータおよびタウタンパク質の蓄積；パーキンソン病におけるα−シヌクレインの蓄積；ハンチントン病におけるハンチントン変異体の蓄積；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）におけるＴＤＰ−４３およびＦＵＳタンパク質凝集塊の蓄積；ミトコンドリアＤＮＡ変異の蓄積および老化における破壊されたミトコンドリア分裂機構）、疾患の進行したステージでニューロン細胞の死が生じる。アポトーシスを含むプログラムされた細胞死は、動物モデルおよび細胞系統に関する検討により示されるように（Radi E., et al., J Alzheimers Dis. 2014; 42）、疾患の後期のステージで神経変性の進行に非常に重要な役割を演じるように思われる。
【０００４】
神経変性に関係する臨床的徴候を含む疾患は、ほぼ３０００万人の人々を襲い、能力障害および死に至らしめる。神経変性は、通常進行性神経系機能不全に至り、しばしば、影響された神経系の中枢または末梢構造の萎縮と関連する。神経変性は、特定の機能的解剖系におけるニューロンの特定のサブセットに影響する不均一な臨床的および病理学的発現を有する神経の状態の大きい群と関連する。神経変性が臨床像および病像に大きい影響を有する障害のリストを下に示すが、これらに限定されない。
アルツハイマー病
高齢のアルツハイマー型の認知症
ピック病（大葉性萎縮）
ハンチントン病
運動失調を伴う認知症および／またはパーキンソン病の発現を組み合わせた多系統萎縮症
進行性核上性麻痺（スティール・リチャードソン・オルゼウスキー）
びまん性レヴィー小体病
皮質歯状黒質（Corticodentatonigral）変性
ハラーホルデン・スパッツ病
進行性家族性間代性筋痙攣
振戦麻痺（パーキンソン病）
線条体黒質変性
進行性核上麻痺
捻転ジストニア（捻転痙攣；変形性筋失調）
痙性斜頚および他の運動障害
家族性振戦
ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群
小脳皮質変性
オリーブ橋小脳萎縮（ＯＰＣＡ）
脊髄小脳変性（フリードリッヒ運動失調および関連障害）
中枢自律神経系の神経系機能不全症候群（シャイドレーガー症候群）
筋萎縮性側索硬化症
脊髄性筋萎縮
原発性側索硬化症
遺伝性痙攣性対麻痺
腓骨筋萎縮（シャルコ・マリー・ツース）
肥大間質性多発神経障害（デジュリーヌ・ソッタス）
慢性進行性神経障害の種々雑多な形態
網膜の色素変性（色素性網膜炎）
遺伝性光学萎縮（レーバー病）
双極性障害
癲癇
偏頭痛
統合失調症
【０００５】
伝統的に、神経変性のための新しい治療方式の探索は、ニューロンの細胞死を予防してニューロン細胞の機能性を改善するための、ニューロンの細胞の内側の分子経路の変調に集中した。ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性化因子（米国特許出願第２０１５／０１１９４６６号明細書）、サイクリン依存性タンパク質キナーゼ５阻害剤（米国特許出願第２０１５／０１１９３４８号明細書）、ニューロトロフィン模倣体（米国特許出願第２０１５／０１１１９０３号明細書）、セマフォリン−４Ｄ遮断薬（米国特許第２０１５／０１１０８００号明細書）、ミクロソームプロスタグランジンＥシンターゼ−１阻害剤（米国特許出願第２０１５／００８７６４６号明細書）、Ｎ−メチル−ｄ−アスパラターゼ（ＮＭＤＡ）受容体阻害剤が、神経変性性障害の治療に有用な活性物質として提案された。ＮＭＤＡ受容体阻害剤のメマンチンは、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病およびハンチントン病を含む多くの神経変性性障害の治療のために臨床的に使用されてきた。メマンチンは、緑内障、多発性硬化症、癲癇および神経障害疼痛を含む中枢神経系（ＣＮＳ）における過剰なＮＭＤＡ受容体活性化と関連する他の疾患のための治療としても有望なことを示す（J. Johnson et al., Current Opinion in Pharmacology, 2006, V6, pp. 61-67）。
【０００６】
循環する細胞外（「無細胞」ともいわれる）核酸は、６０年超前に発見された（Anker P., Circulating DNA in plasma or serum, Clin Chim Acta. 2001; 313(1-2): 143-6）。正常血漿試料中におけるＤＮＡレベルは、３．６から５．０ｎｇ／ｍｌで変化する濃度で非常に低い。正常血漿試料は、主として約１８０ｂｐのＤＮＡフラグメントおよび非常に少ない程度でそれより大きいフラグメント（例えば、５００ｂｐ以上のフラグメント）を含有する。循環細胞外ＤＮＡは、癌、感染、糖尿病、遅延型過敏性、および受胎能力を含む数種の疾患および状態において治療標的として記載されている（例えば、米国特許第８，９１６，１５１号明細書；第８，８７１，２００号明細書；第８，７９６，００４号明細書；第８，７１０，０１２号明細書；第８，５３５，６６３号明細書；第８，４３１，１２３号明細書；第８，３８８，９５１号明細書；第７，６１２，０３２号明細書；国際出願／イスラエル第２００７／００１２５０号パンフレット；国際出願／ＩＢ第２０１３／０５６３２１号パンフレットを参照されたい）。
【発明の概要】
【０００７】
背景技術の項で明記したように、当技術分野において、神経変性を治療するための新しい組成物および方法を開発する非常に大きい必要性がある。本発明は、このおよび他の必要性を、ＤＮアーゼ酵素に基づく組成物および方法を提供することにより指向する。
【０００８】
特に一態様において、本発明は、それを必要とする患者（例えば、ヒトまたは実験動物モデルなどの哺乳動物）における神経変性（例えば、一次神経変性）の進行を予防、治療、および／または阻止する方法であって、前記患者に治療的有効量のＤＮアーゼ酵素を投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
関連する態様において、本発明は、神経変性（例えば、一次神経変性）の進行を予防、治療および／または阻止することに使用するためのＤＮアーゼ酵素を含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、それを必要とする患者における神経変性の進行を予防、治療および／または阻止するためのＤＮアーゼ酵素の使用を提供する。
【００１１】
一実施形態において、神経変性は、患者の血液または脳脊髄液または腸中における細胞外ＤＮＡ（例えば、原核生物および／またはヒトの）の増大したレベルと関連しており、そのレベルは、対照レベル（例えば、年齢を合わせた健常個体の血液または脳脊髄液または腸中における細胞外ＤＮＡのレベルまたは数名の年齢を合わせた健常個体の血液または脳脊髄液または腸中における細胞外ＤＮＡの平均レベル）より高い。一実施形態において、神経変性は神経変性性障害と関連する。包含される神経変性性障害の例には、例えば、アルツハイマー病（例えば、晩期発症型アルツハイマー病）、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、およびハンチントン病が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、神経変性は、例えば、統合失調症または双極性障害などの神経系機能不全と関連する。
【００１２】
一実施形態において、ＤＮアーゼ酵素の治療的有効量は、患者の血液または脳脊髄液または腸中における前記細胞外ＤＮＡを破壊するのに十分な（例えば、前記細胞外ＤＮＡの平均分子量［例えば、ゲル電気泳動により測定される］を低下させるのに十分な）量である。
【００１３】
一実施形態において、前記ＤＮアーゼは組み換えＤＮアーゼである。一実施形態において、前記ＤＮアーゼはＤＮアーゼＩである。一実施形態において、前記ＤＮアーゼは、延長された半減期を有する（例えば、ポリシアル酸とコンジュゲートされるか、またはアクチン結合部位の改変により、アクチンに対する結合から保護されている；例えば、Gibson et al., (1992) J. Immunol. Methods, 155, 249-256を参照されたい）。
【００１４】
一実施形態において、前記ＤＮアーゼは、静脈内、皮下または筋肉内経路によって投与される。特定の一実施形態では、前記ＤＮアーゼはＤＮアーゼＩであり、少なくとも１日の間、少なくとも０．０４ｍｇ／１ｋｇ／日、または少なくとも１日の間、０．０５から１００００クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）単位／１ｋｇ／日の量で投与される。
【００１５】
別の実施形態において、前記ＤＮアーゼは、腸内（例えば、経口）投与される。特定の一実施形態では、前記ＤＮアーゼはＤＮアーゼＩであり、少なくとも１日の間、１日に１ｋｇ当たり少なくとも０．０４ｍｇ、または少なくとも１日の間、１日に１ｋｇ当たり０．０５から１００００クニッツ単位の量で投与される。
【００１６】
さらに別の実施形態では、前記ＤＮアーゼは、脳脊髄液中に投与される。特定の一実施形態では、前記ＤＮアーゼはＤＮアーゼＩであり、１日に少なくとも０．１ｍｇの量で投与される。
【００１７】
本発明のこれらのおよび他の態様は、当業者には以下の記載、請求項および図面で明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】頸動脈中への注射後におけるラット脳実質組織中の標識された細胞外ＤＮＡの蓄積を示す図である。
【図２】ＤＮアーゼの投与前（左欄）およびＤＮアーゼ治療の開始後１カ月（右欄）における患者血液の細胞外ＤＮＡの電気泳動図を示す図である。
【図３Ａ−Ｂ】重症のアルツハイマー病患者の脳中の左前頭葉と頭頂葉の領域の萎縮および広範囲の神経膠症を示すＴ１  ＭＲＩ像である。像（Ａ）および（Ｂ）は、脳室周囲の白色物質への緩やかな変化を有する最終ステージアルツハイマー病における体積減少を示す図である。（Ａ）頭頂領域の顕著な進行性の皮質萎縮を示す体長軸に沿ったＴ１  ＭＲＩである。（Ｂ）両横方向の顕著な萎縮を示す横向きのＴ１  ＭＲＩである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、細胞外ＤＮＡ（真核生物および原核生物両方の）が、神経変性（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、統合失調症、および双極性障害と関連する神経変性）を患う患者の血液および脳脊髄液（ＣＳＦ）中で上昇したレベルで存在することおよび前記細胞外ＤＮＡが血液脳関門（ＢＢＢ）を貫通して神経毒性をはたらかせることという予期せざる発見に基づく。本明細書でさらに示すように、ＤＮアーゼ酵素の投与は、神経変性の治療／改善をもたらして、循環細胞外ＤＮＡのレベルの低下を伴う。
【００２０】
定義
用語「神経変性」は、本明細書では、ニューロンの死を含むニューロンの構造および／または機能の進行性の喪失を伴う別個の臨床病理学的状態を指して使用される。神経変性は、一次性であっても二次性であってもよい。一次神経変性を含む疾患の例には、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度の認知障害（ＭＣＩ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、プリオンにより惹起された疾患、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、レヴィー小体認知症、血管性認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性外傷性脳障害（ＣＴＥ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＧＤ）、ピック病、オリーブ橋小脳萎縮（ＯＰＣＡ）、アルツハイマー型の高齢の認知症、進行性核上麻痺（スティール・リチャードソン・オルゼウスキー）、皮質歯状黒質変性、ハラーホルデン・スパッツ疾患、進行性家族性間代性癲癇、線条体黒質変性、捻転ジストニア（例えば、捻転痙攣；変形性筋失調）、痙性斜頚および他の運動障害、家族性振戦、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群、小脳皮質変性、脊髄小脳変性（例えば、フリードリッヒ運動失調および関連障害）、シャイドレーガー症候群、脊髄性筋萎縮、原発性側索硬化症、遺伝性痙攣性対麻痺、腓骨筋萎縮（シャルコ・マリー・ツース）、肥大間質性多発神経障害（デジュリーヌ・ソッタス）、慢性進行性神経障害、網膜の色素性変性（色素性網膜炎）、および遺伝性光学萎縮（レーバー病）が含まれるが、これらに限定されない。二次神経変性は、主として壊死により引き起こされる。二次神経変性を生じ得る状態の例は、新生物、浮腫、出血、脳卒中、外傷、免疫攻撃、低酸素症、被毒、代謝の欠陥、および感染によるニューロンの破壊を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
用語「細胞外ＤＮＡ」および「無細胞ＤＮＡ」は、患者の血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）または腸中に見出される細胞外ＤＮＡ（真核生物のまたは原核生物由来の）を指して互換的に使用される。
【００２２】
本明細書において使用する、用語「デオキシリボヌクレアーゼ」および「ＤＮアーゼ」は、ＤＮＡ骨格中のリン酸ジエステル連結の加水分解開裂を触媒する任意の酵素を指して使用される。広範囲のデオキシリボヌクレアーゼが知られており、本発明の方法で使用することができる。有用なＤＮアーゼの例として、例えば、ＤＮアーゼＩ（例えば、ヒト組み換えＤＮアーゼＩまたはウシ膵ＤＮアーゼＩ）、ＤＮアーゼＩの類似体（例えば、ＤＮアーゼＸ、ＤＮアーゼγ、およびＤＮＡＳ１Ｌ２など）、ＤＮアーゼＩＩ、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、およびアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。ＤＮアーゼＩは、ピリミジンヌクレオチドに隣接するリン酸ジエステル連結で優先的にＤＮＡを開裂して、３’の位置に遊離ヒドロキシル基がある５’，５’−ホスフェート末端のポリヌクレオチドを生じ、平均でテトラヌクレオチドを生成させる。ＤＮアーゼＩは、一本鎖のＤＮＡ、二重螺旋ＤＮＡ、および染色質に作用する。
【００２３】
用語「約」は、当業者により決定される特定の値に対して許容される誤差範囲内を意味して、それは一部その値がどのようにして測定または決定されたか、すなわち、測定系の限界に依存するであろう。例えば、「約」は、当技術分野において実施による許容される標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の±２０％まで、好ましくは±１０％まで、より好ましくは±５％まで、およびより好ましくはさらに±１％までの範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的系または過程に関して、用語は、好ましくは値の２倍以内の大きさのオーダー以内を意味することができる。特定の値が本出願および請求項で記載されている場合、特に断らない限り、用語「約」は、黙示的であり、この情況で特定の値に対して許容される誤差範囲以内を意味する。
【００２４】
本発明の関係で、神経変性または本明細書で挙げた特異的疾患状態のいずれかに関する限り、用語「治療する」、「治療」等は、上記の状態と関連する少なくとも１つの症状を軽減するかもしくは緩和すること、またはそのような状態の進行を遅延もしくは逆行させることを意味する。本発明の意味の内で、用語「治療する」は発症を抑止、遅延すること（すなわち、疾患の臨床的発現に先立つ時期）、および／または疾患を進行もしくは悪化させるリスクを減少させることも表す。
【００２５】
本明細書において用量または量に適用されて使用する用語「治療的に有効な」は、それを必要とする対象者に投与されたときに、所望の活性を生じさせるのに十分な化合物または医薬組成物の量を指す。本発明の関係の内で、用語「治療的に有効な」が、神経変性または前記神経変性と関連する特定の疾患の進行を予防するか、治療するおよび／または阻止するためのデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）の使用と関連して使用される場合に、それは、神経変性もしくはそのような疾患と関連する少なくとも１つの症状を軽減するかもしくは緩和するために、もしくは神経変性もしくはそのような疾患の進行を遅延させるかもしくは逆行させるために効果的なＤＮアーゼの量またはＤＮアーゼを含有する医薬組成物の量を指す。有効成分の組合せ（例えば、ＤＮアーゼと神経変性に関連する疾患の進行を予防、治療および／または阻止するために効果的な別の化合物との組合せ）が投与される場合、組合せの有効量は、個別に投与された場合に効果的であったであろう各成分の量を含んでも含まなくてもよいことに注意されたい。
【００２６】
本発明の組成物と関連して使用される語句「薬学的に許容される」は、生理学的に耐えられて、典型的には対象者（例えば、ヒトなどの哺乳類）に投与された場合に不都合な反応を生じないような分子の全体および組成物の他の成分を指す。好ましくは、本明細書において使用する、用語「薬学的に許容される」は、連邦または州の政府の規制当局により承認されているかまたは米国薬局方もしくは他の一般的に認められている薬局方で、哺乳動物に、さらに特にヒトに使用するためのリストに挙げられていることを意味する。
【００２７】
本明細書において使用する、用語「対象者」および「患者」は、任意の哺乳動物を指す。好ましい実施形態において、対象者／患者はヒトである。
【００２８】
この明細書および添付された請求項で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、前後関係が明確にそうでないことを規定していない限り、複数の物を含む。
【００２９】
本発明により、当技術分野内の従来の薬理学および分子生物学の技法が使用され得る。そのような技法は、文献で十分に説明されている。例えば、とりわけ、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York（本明細書では「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）； DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)); Transcription and Translation (B.D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照されたい。
【００３０】
本発明の治療の方法
下の実施例の項で示すように、血液および脳脊髄液（ＣＳＦ）中における原核生物および真核生物の両方の細胞外ＤＮＡレベルは、高齢の認知症、パーキンソン病およびアルツハイマー病患者における神経の状態の悪化を増大させる。ここでさらに示すように、血液およびＣＳＦ中の細胞外ＤＮＡの大部分は、腸内細菌のＤＮＡである（例えば、胃腸微生物叢から導かれた）。それ故、真核細胞または原核生物由来の細胞外ＤＮＡのモニタリングは、神経変性の予後または進行のモニタリングのために有用であり得る。モニタリングは、例えば、以下の：細胞外ＤＮＡの量の決定、細胞外ＤＮＡの型の決定（原核生物かまたは真核細胞か、例えば、ｒＲＮＡに基づいて決定される）、特異的ＤＮＡフラグメントの存在および／または量の決定（例えば、ＣｐＧモチーフ、ＣｐＧ様モチーフ、１６Ｓの超保存的領域、ｒｐｏＤ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはメタゲノムの分析を使用して決定される）の１つまたは複数を含むことができる。
【００３１】
ここでさらに記載するように、神経変性性障害を患う患者の腸、血液およびＣＳＦからの細胞外ＤＮＡは、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えることができる。このことは、ＢＢＢは、大きい核酸分子に対して不透過性と常に考えられていたので（Evers MM. Antisense oligonucleotides in therapy for neurodegenerative disorders. Adv Drug Deliv Rev. 2015）、予想外である。
【００３２】
ここでさらに記載するように、神経変性性障害を患う患者の腸、血液およびＣＳＦからの細胞外ＤＮＡは、ニューロンの細胞死およびアポトーシスを引き起こす。そのような細胞外ＤＮＡを破壊するＤＮアーゼ治療は、これらの患者における神経系機能を大きく改善する。改善のアセスメントは、ＭＭＳＥ、ＰＡＮＳＳ、身体機能、および／または機能的課題などの認知低下の広く受け入れられている臨床的診断の基準に従って実施した（例えば、Holmes et al., (1999) The British Journal of Psychiatry, 174(1), 45-50; Os et al., (2006) Acta Psychiatrica Scandinavica,113(2), 91-95; O'Shea et al., (2002) Physical therapy,82(9), 888-897; Rochester et al., (2004) 85(10), 1578-1585を参照されたい）。
【００３３】
一態様において、本発明は、それを必要とする対象者における神経変性の進行を予防、治療および／または阻止する方法であって、対象者に治療的有効量のＤＮアーゼ酵素（例えば、ＤＮアーゼＩ、ＤＮアーゼＩの類似体［例えば、ＤＮアーゼＸ、ＤＮアーゼγ、ＤＮＡＳ１Ｌ２など］、ＤＮアーゼＩＩ、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、またはアセチルコリンエステラーゼ）を投与することを含み、ＤＮアーゼ酵素の前記量は、神経変性の少なくとも１つ症状を予防するかまたは緩和することに効果的である、方法を提供する。
【００３４】
本発明の方法に有用なＤＮアーゼの用量は、神経変性の重症度および経過、以前のまたは同時併行の療法、患者の臨床歴およびＤＮアーゼに対する応答、ならびに主治医の裁量に依存する。好ましくは、そのような用量は、０．５から２０ｍｇ／ｋｇ／日または５００から２００００クニッツ単位（ＫＵ）／ｋｇ／日の範囲である。
【００３５】
本発明の方法によるＤＮアーゼ酵素の投与は、任意の適当な経路により実施することができる。投与の有用な経路の具体的な例として、脳脊髄液（ＣＳＦ）、腸内（例えば、経口）、直腸（例えば、浣腸による）、および鼻腔内への静脈内、皮下、筋肉内送達が含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明の方法により、ＤＮアーゼは、単独でまたは神経変性性疾患または他の包含される神経系不全（例えば、双極性障害、偏頭痛、統合失調症、癲癇）の進行の阻止または治療に有用な他の処置との組合せのいずれかで投与することができる。そのような追加の処理の例として、例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性化因子、サイクリン依存性タンパク質キナーゼ５阻害剤、ニューロトロフィン模倣体、セマフォリン−４Ｄ遮断薬、ミクロソームプロスタグランジンＥシンターゼ−１阻害剤、レボドパ、およびＮ−メチル−ｄ−アスパラターゼ（ＮＭＤＡ）受容体阻害剤（例えば、メマンチン）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明の医薬組成物
ある実施形態で、ＤＮアーゼ酵素は、薬学的に許容される担体または賦形剤と共に医薬組成物に剤形化することができる。
【００３８】
本発明の方法で使用される剤形は、単位剤形で便利に提供することができて、当技術分野において知られた方法によって調製することができる。担体材料と組み合わされて単独の投与形態を生じることができる有効成分の量は、治療されている対象者および投与の特定の様式に依存して変化するであろう。担体材料と組み合わされて単独の投与形態を生じることができる有効成分の量は、一般的に、治療効果を生じる化合物の量であろう。
【００３９】
一般的に、剤形は、液体担体、または細かく分割された固体担体、または両方を用いて調製することができて、次に、必要であれば製品を成形する。
【００４０】
非経口投与のために適当な医薬組成物は、ＤＮアーゼを、薬学的に許容される滅菌された等張の水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液またはエマルション、または使用直前に滅菌注射用溶液または分散液に再構成することができる滅菌散剤の１種または複数との組合せで含むことができて、それは抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、剤形を意図される受容者の血液と等張にする溶質、または懸濁剤または増粘剤を含有してもよい。開示の医薬組成物で使用することができる適当な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、および適当なそれらの混合物、オリーブ油などの植物油、およびエチルオレエートなどの注射用有機エステルを含む。適用な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合には要求される粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。
【００４１】
これらの組成物は、防腐剤、加湿剤、乳化剤および分散剤も含有することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗黴剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の包含により確実にすることができる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を、組成物中に含ませることが望ましいこともある。それに加えて、注射用薬学的形態の長引かされた吸収は、吸収を遅らせる活性物質、例えばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチンなどの活性物質の包含により成し遂げることができる。
【００４２】
注射用デポ形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中の１種または複数の有効成分のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより作製することができる。有効成分のポリマーに対する比、および使用される特定のポリマーの性質に応じて、有効成分の放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）が含まれる。デポ注射用剤形は、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に有効成分を捕捉することによっても調製することができる。
【００４３】
経口投与のための剤形は、カプセル、カシェ剤、ピル、錠剤、散剤、顆粒の形態で、または溶液もしくは懸濁液として水性もしくは非水性液体（例えば、うがい薬として、嚥下される組成物として、または浣腸として）で、または水中油または油中水液体エマルション等であることができて、各々所定量の１種または複数の有効成分を含有する。
【００４４】
経口投与のための固体剤形（カプセル、錠剤、ピル、糖衣錠、散剤、顆粒等）では、１種または複数の有効成分（例えば、神経変性性疾患の治療のためのＤＮアーゼおよび場合により別の化合物）を、１種または複数の薬学的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなど、および／または以下の任意のものと混合することができる：（１）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸など；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／またはアラビアゴムなど；（３）湿潤剤、例えばグリセロールなど；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカのデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケート、および炭酸ナトリウムなど；（５）溶解遅延剤、例えばパラフィンなど；（６）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物など；（７）加湿剤、例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなど；（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイト粘土など；（９）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物など；および（１０）着色剤。カプセル、錠剤およびピルの場合に、医薬組成物は緩衝剤も含むことができる。同様な型の固体組成物は、ラクトースすなわち乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を使用して、軟質および硬質の充填されたゼラチンカプセル中の充填剤として使用することもできる。
【００４５】
懸濁液は、１種または複数の有効成分に加えて、エトキシル化されたイソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、およびそれらの混合物などの懸濁剤を含有することができる。
【００４６】
本発明のＤＮアーゼ組成物は、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えるＤＮアーゼ送達を容易にする活性物質をさらに含むことができる。そのような有用な活性物質の例として、例えば、埋め込み可能な貯蔵器（Ｏｍａｙａ貯蔵器）、ＤＮアーゼのポリシアル化、機能化されたナノ担体（例えば、トランスフェリンまたはトランスフェリン受容体［ＴＲ］抗体でコートされたナノ粒子）、エキソソーム、リポソーム（例えば、抗体、トロイの木馬リポソーム［ＴＨＬ］などの標的分子でコートされたリポソーム）、抗体（例えば、トランスフェリン受容体［ＴＲ］またはインスリン受容体［ＨＩＲ］に対する抗体、ＢＢＢを移住するラマ単独ドメイン抗体（ｓｄＡｂ））、キメラペプチド（例えば、クニッツドメインを発現するタンパク質から誘導されるＡｎｇｉｏｐｅｐ）、低密度リポタンパク質受容体に関係するタンパク質１および２（ＬＲＰ−１および２）、ジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）、間充織幹細胞、受容体に関連するタンパク質、アポリポタンパク質Ｅ、メラノトランスフェリン／ｐ９７、その他が含まれるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００４７】
本発明は、以下の例によっても説明され明らかにされる。しかしながら、これらのおよび明細書中におけるどこの他の例の使用も、例示にすぎず、決して本発明またはどの例示された用語の範囲および意味も限定しない。同様に、本発明は、本明細書に記載されたいかなる特定の好ましい実施形態にも限定されない。実際、本発明の多くの改変および変形が、この明細書を読めば、当業者には明らかであり得て、そのような変形は、精神または範囲において本発明から逸脱することなく為すことができる。それ故、本発明は、これらの請求項が権利を与えられた等価事物の全範囲にわたって、添付された請求項の用語によってのみ限定されるべきである。
【実施例１】
【００４８】
血液およびＣＳＦからの細胞外循環ＤＮＡは、ニューロンの細胞死を促進する。
ニューロンを培養するために、大脳皮質を、胎生期（Ｅ）１５〜１７日のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの胚から取り出した。皮質の外植片を、細い針を使用して約２００〜４００μｍ２の断片に切り裂いて、パパイン解離系（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いてメーカーの使用説明書に従って解離させ、さらに、必要最小限の氷冷媒体（Ｇｉｂｃｏ）上に保った。ニューロンを、最初ポリ−Ｄ−リシン（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）で、続いてラミニン（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）（Ｇｉｂｃｏ）でコートされた直径１３ｍｍのガラスのカバースリップ上に固定して、加湿された８％ＣＯ２（ｖ／ｖ）雰囲気中３７℃で２４〜４８時間、１％（ｖ／ｖ）抗生物質−抗真菌剤を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。
【００４９】
細胞外ＤＮＡを、重症ステージのアルツハイマー病患者の血漿およびＣＳＦから、ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔをメーカーの使用説明書に従って使用して抽出した。ニューロンに対するそのような細胞外ＤＮＡの生物学的効果を評価するために、細胞外ＤＮＡの試料を皮質のニューロンの培養に加えた。４８時間培養した解離された皮質のニューロンでニューロンの細胞死を決定した。最初の期間の後で、細胞外ＤＮＡの試料（１００および２００ｍｋｇ／ｍｌ用量レベル）をさらに２４時間適用した。ニューロンの細胞死を、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により評価した。死んだ細胞の数に比例するルミネッセンスを、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＧｌｏＭａｘ９６ルミノメーターを使用して測定して、相対ルミネッセンス単位（ＲＬＵ）で表した。
【００５０】
アポトーシスマーカーのカスパーゼ３の誘発を、解離されて４８時間培養された皮質のニューロンで決定した。最初の期間の後、細胞外ＤＮＡ試料（１００および２００ｍｋｇ／ｍｌ用量レベル）をさらに２４時間適用した。次に細胞を４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定して、ＰＢＳで１：５００に希釈された開裂されたカスパーゼ３抗体（Ａｂｃａｍ）と１時間インキュベートした。細胞を洗浄して、カスパーゼ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のためにＰＢＳ中で１時間ヤギ抗ウサギポリクローナルＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８抗体とインキュベートした後、洗浄して計数した。
【００５１】
【表１】
0006745873.tif 000002
【００５２】
表１中のデータから、血液およびＣＳＦの両方からの細胞外ＤＮＡは、培養されたニューロンにおいて、用量依存性の様式で細胞傷害性およびアポトーシスマーカーカスパーゼ３の上方制御を誘導すると考えられる。ＤＮアーゼＩは、細胞外ＤＮＡにより誘導される毒性からニューロンを保護する。
【実施例２】
【００５３】
アルツハイマー病患者の血液およびＣＳＦ中の細菌の細胞外ＤＮＡの評価
細胞外ＤＮＡを、重症ステージのアルツハイマー病患者および健常な志願者（年齢および性を合わせた）の血漿およびＣＳＦから、ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔをメーカーの使用説明書に従って使用して抽出した。細菌の細胞外ＤＮＡの定量は、ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して行った。本発明者らは普遍的細菌ＤＮＡＰＣＲプライマー１３６９Ｆおよび１４９２Ｒ（細菌の１６ＳｒＲＮＡ）を使用した。
【００５４】
【表Ａ】
0006745873.tif 000003
閾値サイクルを下の表に示す。
【００５５】
【表２】
0006745873.tif 000004
表２中のデータからわかるように、重症ステージのアルツハイマー病患者の血清およびＣＳＦは、健常な志願者と比較して有意に多くの細菌のＤＮＡを含有する。
【実施例３】
【００５６】
血液からの細胞外循環ＤＮＡは血液脳関門を貫通する。
細胞外ＤＮＡを、高齢の認知症と診断された患者の血漿から、ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔを使用して抽出した。細胞外ＤＮＡのヨード化を、（Piatyszek A., et al., Analytical Biochemistry, 1988, V172, pp. 356-359）に記載されたようにＩｏｄｏ−Ｇｅｎ試薬を使用して実施した。標識された細胞外ＤＮＡの特異的活性は約３０ｍｋＣｉ／ｍｋｇであった。１ｍｌのＰＢＳ溶液中の標識された細胞外ＤＮＡの製剤（約３．０ｍｋＣｉ、１００ｎｇ）を、麻酔された雌Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの頸動脈の動脈中にゆっくり注入した（０．１ｍｌ／ｍｎ）。１時間で、ラットをクロロホルムで安楽死させて、脳を取り出し、ホルマリン溶液中で固定した。パラフィン切片をＩｌｆｏｒｄＬ４エマルションで染色した。脳中における標識された細胞外ＤＮＡの蓄積を、標準的視覚的組織オートラジオグラフィー技法を使用して検討した（図１）。注射された細胞外ＤＮＡのラット脳実質組織中における蓄積は、それが血液脳関門（ＢＢＢ）を貫通することを示す。
【実施例４】
【００５７】
高齢の認知症を治療するためのＤＮアーゼの使用
年齢７２の男性患者Ｋは、動作緩慢の緩やかな進展、短期記憶および注意力の悪化があって、４年前に高齢の認知症と診断された。以下の症状が徐々に進行した：自発性減退、主導性の欠如、感情不安定、傾眠。３年の間、該患者は、レボドパを服用してきた。中程度の好ましい効果が観察された。しかしながら、最後の１８の間に、前症状（prior symptom）がより顕著になり、運動低下症および体位障害も発現し始めた。
【００５８】
患者にウシ膵ＤＮアーゼＩ（Ｓａｍｓｏｎ  Ｍｅｄ、ロシア）を、２５００クニッツ単位／ｋｇの量で１日に３回、カプセルで経口投与した。ＤＮアーゼ治療の有効性を、１４および３０日後にミニメンタルステート検査の尺度（ＭＭＳＥ）を使用して評価した。検討結果を表３に示す。
【００５９】
【表３】
0006745873.tif 000005
【００６０】
患者からのヒト血液血漿ＤＮＡを、リアルタイムのＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを使用して、ＤＮアーゼ治療の２カ月前およびＤＮアーゼ治療の開始直前に、３種の異なったマーカー配列：ＡＬＵ（Ｊ１）、ｃ−ＭＹＣおよびｂ−ＧＬＯＢについて定量した（ＡＬＵプライマーは、ＧＴＣＡＧＧＡＧＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＣＣＣ（配列番号：３）であり、ｃ−ＭＹＣプライマーはＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＴＧＡＡＣＡＧＣＴＡＣ（配列番号：４）であり、ｂ−ＧＬＯＢプライマーはＧＧＴＴＧＧＣＣＡＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧ（配列番号：５）であった）。閾値サイクルを下の表に示す。
【００６１】
【表４】
0006745873.tif 000006
【００６２】
ＤＮアーゼ治療の前（左カラム）および治療開始後１カ月（右カラム）の患者の血液細胞外ＤＮＡの電気泳動図（アガロースゲル）を図２に示す。
【００６３】
上で示したように、高齢の認知症を患う患者における臨床的症状の進行には、血液中の循環細胞外ＤＮＡのレベルの上昇が伴う。血液細胞外ＤＮＡを破壊するＤＮアーゼ治療は、認知症症状に対して好ましい臨床的効果を有する。
【実施例５】
【００６４】
ＤＮアーゼを使用する双極性障害の増悪の軽減
患者Ｍ、年齢６３、男性。診断：基礎疾患−双極性障害の増悪、躁病の症状の発現。治療開始時に、いらつきの愁訴あり、絶叫する欲望、悪夢を有す。患者は高度に活動的で、全く突然に発現する脱制止で部屋を離れることがよくあったこと（絶えず質問して、しばしば歌い始めることがよくあった）および興奮性（繰り返される質問により直ぐにいらついた）が検査で明らかになった。
【００６５】
ＤＮアーゼ治療の開始前、陽性・陰性症状尺度興奮版（ＰＡＮＳＳ−ＥＣ）を使用するアセスメントの合計スコアは２９に達した。患者は、ヒト組み換えＤＮアーゼＩの１回限りの静脈注射（Ｃａｔａｌｅｎｔ、Ｍａｄｉｓｏｎ、米国）を、５０クニッツ単位／ｋｇの量で３時間かけて受けた。ＤＮアーゼ治療の後、症状の有意の軽減が観察されて、ＰＡＮＳＳ−ＥＣの合計スコアは８になり、精神運動性の興奮は観察できなかった。
【００６６】
それ故、双極性障害の増悪を治療する場合に、ＤＮアーゼの投与は好ましい効果を有した。
【実施例６】
【００６７】
統合失調症を治療するためのＤＮアーゼの使用
患者Ｌ、年齢３８、女性。診断：統合失調症、偏執症型、該疾患の発作性の経過、偏執症−幻覚性症候群。ＤＮアーゼ治療の前、患者は「頭の内側」で声が聞こえると訴えた。彼女は、彼女の仲間が彼女に毒を盛ろうとしているとも信じた。患者は、不自然な姿勢で坐り、上肢の著しい震えも観察され、動くと震えがひくこともよくあった。感情の障害ならびに思考障害が見出された（遅い思考、脱線、筋の通らないこと）。陽性・陰性症状尺度（ＰＡＮＳＳ）を使用するアセスメントの合計スコアは、それぞれ２４および２２になった。
【００６８】
患者は、ウシ膵ＤＮアーゼＩ（Ｓａｍｓｏｎ  Ｍｅｄ、ロシア）カプセルを経口で３０００クニッツ単位（ＫＵ）／ｋｇの量で１日に３回の服用を開始した。検討の結果を表５に示す。
【００６９】
【表５】
0006745873.tif 000007
それ故、ＤＮアーゼの投与は、統合失調症を治療する場合に好ましい効果を有する。
【実施例７】
【００７０】
アルツハイマー病を治療するためのＤＮアーゼの使用
患者Ｇ、年齢７７、男性。患者は、臨床データおよびＭＲＩ表示の変化に基づいてアルツハイマー病である診断された。診断された後１４カ月から開始して、患者は、メマンチンを服用し始めた。しかしながら、臨床的症状は悪化し続け、記憶障害は進行し、発話および筋肉運動協調の障害ならびに失見当識が発現し始めた。診断されて２０カ月後までに、患者は上記症状の進行の全てを有し、出歩くことを止めた。ＤＮアーゼ投与が開始された時までに、患者は無感覚であり、尿および便の失禁も観察された。
【００７１】
ウシ膵ＤＮアーゼＩ（Ｓａｍｓｏｎ  Ｍｅｄ、ロシア）が、カプセルで経口で、４０００クニッツ単位／ｋｇの量で２４時間に３回投与された。有効性を、ＭＭＳＥミニスケールを使用して、ＤＮアーゼ治療の開始後５日および３０日に評価した。検討の結果を表６に示す。
【００７２】
【表６】
0006745873.tif 000008
【００７３】
患者からのヒト血漿ＤＮＡを、従来のリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを使用して、ＤＮアーゼ治療の１カ月前、治療開始直前、およびＤＮアーゼ治療の開始後３０日の患者の細胞外ＤＮＡの合計分画で、３通りの異なったマーカー配列：ＡＬＵ（Ｊ１）、ｃ−ＭＹＣおよびｂ−ＧＬＯＢについて定量した（ＡＬＵプライマーはＧＴＣＡＧＧＡＧＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＣＣＣ（配列番号：３）であり、ｃ−ＭＹＣプライマーはＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＴＧＡＡＣＡＧＣＴＡＣ（配列番号：４）であり、ｂ−ＧＬＯＢプライマーは、ＧＧＴＴＧＧＣＣＡＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧ（配列番号：５）であった）。結果を表７に示す。
【００７４】
【表７】
0006745873.tif 000009
ＤＮアーゼ治療開始の５日後に早くも、認知に基づいた機能の有意の改善が観察された。発話および思考は、正常に戻り、患者は起床して着衣して介助なしで出歩けた。
【００７５】
それ故、ＤＮアーゼの投与は、アルツハイマー病の治療に好ましい効果を有した。ＤＮアーゼ治療の好ましい臨床的効果は、血液中の循環細胞外ＤＮＡレベルの低下と併行して進展する。
【実施例８】
【００７６】
アルツハイマー病のレヴィー小体変形の治療のためのＤＮアーゼの使用
７７歳の白人男性が、診療所を訪れる３０カ月前に、晩期発症型アルツハイマー病に二次性の認知症であったと診断され、挙動の混乱、認知の低下、および日常生活の活動に携わる能力の低下を示した。患者は、最初の診断の約１４カ月後に１日に１０ｍｇのメマンチンで治療を開始した（Reisberg et al., N Engl J Med. 2003; 348:1333-1341; Danysz et al., Br J Pharmacol. 2012; 167:324-352）が、彼の認知の状態は悪化し続けて急速に進み、進行性記憶消失症候群、失語症、動作緩慢、足を引きずる歩行、バランスの喪失、および尿失禁に加えて、攻撃性および脱制止のような挙動の変化も含まれた。さらに、患者には、２０ポンドの体重減少があり、それは通常アルツハイマー病患者における不良の予後を示すものである（Soto et al., Journal of Alzheimer’s Disease (2012) 28:647-654; Soto et al., J Am Geriatr Soc. 2015; 63:651-658; White et al., J Am Geriatr Soc.1998; 46:1223-1227）。頭部のＭＲＩの分析により、年齢相当の体積減少および脳室周囲の白色物質に軽度の変化が見られた（図３Ａ〜Ｂ）。
【００７７】
メマンチン治療の開始の１３カ月後に、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）およびＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｔｅｓｔ（ＦＡＳＴ）における患者の合計スコアはそれぞれ１０および５ポイントであった。彼は、時と場所に対する見当識、注意力、記憶、および空間視覚に関する構成でポイントを失い、患者は、課題の完成が目立って遅かった。患者は、歩行時に、折り返しおよび曲がり角を通り抜けるのに追加の困難を経験し、結果として転倒を繰り返し、変動する意識レベル、明らかな錯乱と意識清明の期間の間の交番を示した。しかしながら、幻視または幻聴は経験しなかった。
【００７８】
さらに３カ月後、メマンチン治療の開始後合計１６カ月で、患者は認知の機能のさらなる悪化を経験した。患者は、変動する意識レベルを有した。彼の認知は、明らかな錯乱と意識清明の期間の間で変動したが、しかしながら彼は幻視または幻聴は有しなかった。彼は、彼の名前、月日、曜日、年、または場所を記憶していることができず、家族のメンバーを認識することができなかった。追加の障害には、早口で不明瞭な発話、表現力の喪失、腸／膀胱制御の喪失、および介助なしで坐る、立つ、または歩くことができないことにより顕著な筋肉運動協調の欠如が含まれた。患者は、刺激に無反応になり、ＭＭＳＥスコアは３およびＦＡＳＴスコアは７になった。
【００７９】
１カ月後、患者の親族は、彼の継続されるメマンチン療法（毎日１０ｍｇ）と併行して、４０ｍｇのヒト組み換えＤＮアーゼＩ（１５００ＫＵ／ｍｇ；Ｓａｍｓｏｎ  Ｍｅｄ、ロシア）が経口で１日に３回与えられる治療について、インフォームドコンセントを提供した。ＤＮアーゼＩはよく耐えられて、有害なまたは予想外の事象は記録されなかった。
【００８０】
患者は、ＤＮアーゼＩ治療の２日目に始まる、かなりの認知改善を示し、時および所にある程度適応するようになり、再び家族のメンバーの名前を認識して記憶した。彼はさらに、靴ひもを結びボタンをはめようとすることを含めて、自分で身なりと調えることができるようになり、それに加えて独立して歩き、ひとりで食事でき、およびエクササイズバイクを使用することができるようになった。歩行に影響する神経の異常は有意に減少した。彼のＭＭＳＥスコアは、３から１６に劇的に上昇して、および彼のＦＡＳＴスコアは７から５に減少した。しかしながら、彼は、時と場所に対する見当識、記憶、および空間視覚に関する構成の測定についてのＭＭＳＥで低いスコアを続けた。
【００８１】
ＤＮアーゼＩ治療の開始の２カ月後（メマンチン治療の開始の１９カ月後）に、患者は、ＭＭＳＥスコアが１８およびＦＡＳＴスコアは４を示した。記憶における中程度の改善が観察されたが、空間視覚に関する構成は低下し続けた。彼は、さらによく話し、他人と交流し、親族を認識し、およびテレビジョンのプログラムに能動的に気をつけることができた。患者は、さらに、計算し、ピアノを演奏し、チェス、および独立の歩行を実行できるようになった。
【００８２】
上のデータは、ＤＮアーゼの投与が、アルツハイマー病の治療に好ましい効果を有することを示す。今述べた場合に、ＤＮアーゼＩを用いる治療が、患者が最終ステージを脱することを可能にして、認知における、およびほぼ独立で、歩行する、毎日の課題を実施する能力を含む挙動の機能における有意の改善を生じた。有意の回復が、認知のおよび運動機能の全ての分野で観察され、アルツハイマー病の症状を発生することに引き込まれた、ＤＮアーゼに感じやすい対象の可能性を示した。細菌由来のＤＮＡを含む無細胞ＤＮＡは、そのような１つの標的であり得る（Holdenrieder et al., Clin Chem. 2005; 51:1544-1546）。
【実施例９】
【００８３】
パーキンソン病の治療のためのＤＮアーゼの使用
年齢５８の女性患者Ｓは、パーキンソン病を７年間患ってきた。最後の５年、彼女はレボドパで治療されている。この検討の１カ月前には、患者の状態に大きな悪化、すなわち：右手の震えの有意の増大、全身性の舞踏アテトーゼの形態における両手の不随意の動きの外見、手足の剛直、朝起床する困難、頻繁な夜間の排尿（６〜７回）があった。
【００８４】
患者は、ウシ膵ＤＮアーゼＩ（ＳａｍｓｏｎＭｅｄ、ロシア）を、１５００クニッツ単位／ｋｇの量で、１日に３回、経口的にカプセルで服用を開始した。アセスメントは、パーキンソン病総合評価尺度（ＵＰＤＲＳ）を使用して行い、観察を６カ月間実施した。
【００８５】
患者からのヒト血漿ＤＮＡを、従来のリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを使用して、ＡＬＵ配列（ＴＰＡＬＵ１：ＧＴＡＡＧＡＧＴＴＣＣＧＴＡＡＣＡＧＧＡＣＡＧＣＴ（配列番号：６））について、患者の細胞外ＤＮＡの合計分画で、ＤＮアーゼ治療の１カ月前、治療の直前、および治療の開始の３カ月後に定量した。閾値サイクルを表８に示す。
【００８６】
【表８】
0006745873.tif 000010
ＤＮアーゼＩ服用の６カ月目までに、患者の状態の有意の改善が観察された。朝の運動不能、運動の剛性および両手の震えが減少し；夜間の排尿数が１晩に１回に低下した。
【００８７】
したがって、ＤＮアーゼ投与は、パーキンソン病の治療に好ましい効果を有したと考えられる。この好ましい効果は、血液中の循環細胞外ＤＮＡのレベルの低下と共に進展する。
【実施例１０】
【００８８】
筋萎縮性側索硬化症の治療のためのＤＮアーゼの使用
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の一般的に受け入れられているモデルである（Gurney, New England Journal of Medicine (1994) 331: 1721-1722）ＳＯＤ１酵素がノックアウトされて、Ｇ９３Ａ−ｈＳＯＤ１タンパク質が過発現したマウスで、検討を実施した。各１０匹の動物（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、メイン州）からなる動物の２群を形成した。動物を１室に収容して１２時間周期で光を当て、水および食料を自由に取れるようにした。ポリシアル化されたＤＮアーゼを国際公開／英国第２００７／００２８３９号パンフレットに記載されたようにして調製した。簡単に説明すると、２０モル過剰の酸化された２６ｋＤａポリシアル酸（ＰＳＡ）を緩衝液に溶解してｐＨを６．０に調節した。ヒト組み換えＤＮアーゼＩ（Ｃａｔａｌｅｎｔ）および次に５０ｍＭ（最終の濃度）シアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えて、ｐＨを再調節し、反応混合物を必要な体積にした。反応を３７±１℃で穏やかに振盪しながら１８時間実施した。ＤＮアーゼ−ＰＳＡコンジュゲートを、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）−フェニル−セファロースマトリックスを使用し、２．０Ｍ硫酸アンモニウムを含有する緩衝液で開始して、硫酸アンモニウムを含まない緩衝液で溶出させて精製した。次に溶出分画を、イオン交換マトリックスＱ−セファロースＦａｓｔ  Ｆｌｏｗに適用して、塩化ナトリウムを含有する緩衝液で溶出させた。コンジュゲートの精製をサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により確認した。
【００８９】
群１からのマウスは、治療を受けなかった（対照群）。群２からのマウスは、ヒトポリシアル化された組み換えＤＮアーゼＩを、５０ｍｇ／ｋｇ皮下に１日に１回受けた。動物の生存時間をアセスメントの基準として使用した。結果を表９に示す。
【００９０】
【表９】
0006745873.tif 000011
ＤＮアーゼＩの投与は、ＡＬＳを患うマウスの生存に好ましい効果を有したと考えられる。
【実施例１１】
【００９１】
全身性ＣＮＳ萎縮の治療のためのＤＮアーゼの使用
ハンチントン病を中枢神経系の全身性萎縮の例として選んだ。検討は、ハンチントン病の一般的に受け入れられているモデルであるグルタミンをコードする遺伝子のエクソン１を発現するＲ６／２トランスジェニックマウス（Miller et al., Neuroscience (2008) 153: 329-337）で実施した。各１０匹の動物（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からなる動物の３群を形成した。動物を１室に収容して１２時間周期で光を当て、水および食料を自由に取れるようにした。群１からのマウスは治療を受けなかった。群２からのマウスは、ヒト組み換えＤＮアーゼＩ（Ｃａｔａｌｅｎｔ、Ｍａｄｉｓｏｎ、米国）を２５０００ｍｇ／ｋｇの量で受け（２４時間当たり２回、筋肉内に）；群３からのマウスは、ＤＮアーゼを２５ｍｇ／ｋｇの量で受けた（週に１回、ＩＣＶボーラス注射技法を使用してＣＳＦ中に）。動物の生存時間をアセスメント基準として使用した。結果を表１０に示した。
【００９２】
【表１０】
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それ故、ＤＮアーゼＩの投与は、ハンチントン病の治療に好ましい効果を有した。
【００９３】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態による範囲に限定されるべきでない。実際、本明細書に記載されたこれらの事物に加えて、本発明の種々の改変が、前述の記載から当業者には明らかになるであろう。そのような改変は、添付された請求項の範囲内に入ることが意図されている。
【００９４】
全ての特許、出願、公開、試験方法、文献、および本明細書で挙げた他の資料は、明細書中に物理的に存在しているかのようにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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