(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質の高発現と消化酵素に対する耐性とを改良する遺伝子コンストラクトであって、
前記遺伝子コンストラクトにおいて、（ａ）シロイヌナズナの葉緑体由来のＲｂｃＳ（ｒｉｂｕｌｏｓｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ）全体遺伝子；及び（ｂ）目的タンパク質をコーディングする遺伝子が作動可能に順次に連結されている、遺伝子コンストラクト。
【請求項２】
前記目的タンパク質は、抗原、抗体、抗体断片、構造タンパク質、調節タンパク質、転写因子、毒素タンパク質、ホルモン、ホルモン類似体、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、輸送タンパク質、レセプター、レセプターの断片、生体防御誘導物質、貯蔵タンパク質、移動タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、及びレポータータンパク質で構成される群から選択されるいずれか一つ以上のタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項３】
前記遺伝子コンストラクトは、ＲｂｃＳ遺伝子の５’末端にプロモーター遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項４】
前記プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）に由来する３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）に由来する１９ＳＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター及びユビキチンタンパク質プロモーターから選択されることを特徴とする請求項３に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項５】
前記遺伝子コンストラクトは、目的タンパク質をコーディングする遺伝子の３’末端にタンパク質タッグ遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項６】
前記タンパク質タッグは、Ａｖｉタッグ、Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎタッグ、ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅタッグ、Ｅタッグ、ＦＬＡＧタッグ、ＨＡタッグ、Ｈｉｓタッグ、Ｍｙｃタッグ、Ｓタッグ、ＳＢＰタッグ、ＩｇＧ−Ｆｃタッグ、ＣＴＢタッグ、Ｓｏｆｔａｇ１タッグ、Ｓｏｆｔａｇ３タッグ、Ｓｔｒｅｐタッグ、ＴＣタッグ、Ｖ５タッグ、ＶＳＶタッグ及びＸｐｒｅｓｓタッグよりなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項５に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子コンストラクトを含む組換え発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換え発現ベクターで形質転換され、消化酵素に対する高い耐性を有し且つ目的タンパク質を高発現する形質転換植物体。
【請求項９】
前記植物は、稲、小麦、大麦、トウモロコシ、豆、ジャガイモ、アズキ、エンバク、キビ、高麗人参、ゴマ、サトウキビ、砂糖大根、エゴマ、ピーナッツ、菜の花を含む食糧作物類；シロイヌナズナ、白菜、大根、唐辛子、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、マクワウリ、カボチャ、長ネギ、タマネギ、ニンジンを含む野菜作物類；タバコを含む特用作物類；リンゴの木、梨の木、ナツメの木、桃、ブドウ、蜜柑、柿、スモモ、杏、バナナを含む果樹類；及びローズ、カーネーション、菊、百合、チューリップを含む花卉類から選択されることを特徴とする請求項８に記載の形質転換植物体。
【請求項１０】
請求項７に記載の組換え発現ベクターを製作する段階と、前記組換え発現ベクターを植物体に導入する段階とを含む、消化酵素に対する高い耐性を有し且つ目的タンパク質を高発現する形質転換植物体の製造方法。
【請求項１１】
前記組換え発現ベクターを植物体に導入する段階は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）媒介による方法、粒子ガン衝撃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｇｕｎ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、炭化ケイ素ホイスカー法（ｓｉｌｉｃｏｎ  ｃａｒｂｉｄｅ  ｗｈｉｓｋｅｒｓ）、超音波処理法（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）及びＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ）媒介性形質転換方法よりなる群から選択される一つ以上を使用することを特徴とする請求項１０に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項１２】
（ａ）請求項７に記載の組換え発現ベクターを製作する段階と、
（ｂ）前記組換え発現ベクターを植物に導入し、形質転換植物体を製造する段階と、
（ｃ）前記形質転換植物体を培養する段階と、
（ｄ）前記形質転換植物体又は培養液から目的タンパク質を分離精製する段階と、を含む、消化酵素に対する高い耐性を有する目的タンパク質の生産方法。
【請求項１３】
前記植物は、ゲノムに存在するＲｂｃＳ遺伝子が欠損された植物であることを特徴とする請求項１２に記載の目的タンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的タンパク質を発現する植物、その製造方法及びこれを利用した目的タンパク質の生産方法に関し、より詳細には、葉緑体に存在するタンパク質であるＲｂｃＳ（ｒｉｂｕｌｏｓｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ）に目的タンパク質を融合し、これを植物体に導入して大量生産する技術及びこれを利用したバイオ医薬品経口投与用組成物の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ医薬品（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）というのは、生体内に存在する物質を医薬品として使用することを言い、より広い意味としては、先端バイオ技術である遺伝子組換え、細胞融合、細胞培養等生物工学技術を基盤として生産された医薬品として定義できる。このようなバイオ医薬品は、蛋白質医薬品、治療用抗体、ワクチン、遺伝子治療剤及び細胞治療剤に分類される。
【０００３】
現在、大部分の組換えタンパク質は、動物細胞と昆虫細胞のような高等細胞を宿主に利用するか、酵母やバクテリアのような微生物を用いて生産されている。しかし、動物細胞の培養を用いた組換えタンパク質の生産は、培地価格が高くて、人間に感染され得るウイルス汚染可能性が高くて、牛血清由来タンパク質の流入可能性があるため、これらを除去するための別途の精製工程が必要であるという短所がある。また、バクテリアやイーストの場合、組換えタンパク質の大量生産が容易である利点があるが、タンパク質の合成後、変形過程が全然起きないか、人間とは非常に異なるため、糖蛋白質の生産には適していないという問題点がある。
【０００４】
これより、最近、組換えタンパク質の代替生産システムとして植物細胞培養が強調されている。植物細胞の場合、動物由来ウイルスや病源菌に感染されないだけでなく、動物由来物質の混入のおそれがないため、安全な生産システムとして考慮されている。
【０００５】
しかしながら、植物細胞の培養は、動物細胞を含む他の宿主に比べて相対的に低いタンパク質発現水準と遅い生長速度を示す。これより、植物由来バイオ医薬品の商業化のために、植物体から組換えタンパク質を生産する場合、導入遺伝子の発現効率を高めるための技術開発が求められているのが現況である。
【０００６】
なお、タンパク質医薬品は、注射剤形で人体に投与することが最も広く使用されており、タンパク質医薬品が最も効果的に作用できる方法であるが、患者に苦痛を与えることができるという問題がある。特に、糖尿のような代謝性疾患の場合、長期間定期的に注射を利用して投薬するため、患者の苦痛が非常に大きい。このような理由で、タンパク質医薬品の経口投与技術開発が切実に求められている。植物体から生産したバイオ医薬品の場合、タンパク質を純粋分離精製することなく、経口投与することが可能であるから、画期的な方法になり得るが、一方では、タンパク質医薬品を経口投与する場合、胃で分泌されるペプシン（ｐｅｐｓｉｎ）、腸で分泌されるトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）により分解されるという問題がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これより、本発明者は、葉緑体でタンパク質複合体を構成して安定的に存在するものと知られたＲｂｃＳ遺伝子が、植物細胞で目的タンパク質の発現を増加させ、この目的タンパク質とＲｂｃＳの融合タンパク質がＲｂｃＬと結合して巨大分子を形成することによって、胃に存在するペプシン（ｐｅｐｓｉｎ）によるタンパク質分解に対して抵抗性が大きく増大するという事実を確認することによって、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、目的タンパク質の高発現のためのＲｂｃＳ遺伝子断片及び遺伝子コンストラクトを提供することにある。
本発明の他の目的は、目的タンパク質の高発現のための組換え発現ベクターを提供することにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、目的タンパク質を高発現する形質転換植物体を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、目的タンパク質を高発現する形質転換植物体の製造方法を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、植物細胞で目的タンパク質の高発現のための発現ベクターを製作し、これを活用して植物体から目的タンパク質を大量生産する方法を提供することにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、目的タンパク質とＲｂｃＳペプチド断片が結合された融合タンパク質を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、目的タンパク質とＲｂｃＳペプチド断片が結合された状態で、５００〜８００ｋＤサイズの巨大複合体を形成し、消化器官内に存在するタンパク質分解酵素に抵抗性を有するようにする方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、目的タンパク質とＲｂｃＳペプチド断片が結合された融合タンパク質を有効成分として含む経口投与用薬学剤形組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、植物細胞内でその下流に位置する目的タンパク質の発現量を増進させることを特徴とするリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ小サブユニット（ＲｂｃＳ；ｒｉｂｕｌｏｓｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ）遺伝子断片を提供する。
【００１４】
前記の目的を達成するために、本発明は、（ａ）ＲｂｃＳ遺伝子及び（ｂ）目的タンパク質をコーディングする遺伝子が作動可能に順次に連結された目的タンパク質の高発現のための遺伝子コンストラクトを提供する。
【００１５】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記ＲｂｃＳ遺伝子は、配列番号１で表示されるポリヌクレオチド配列であることができる。
本発明の他の好ましい一実施例によれば、前記目的タンパク質は、抗原、抗体、抗体断片、構造タンパク質、調節タンパク質、転写因子、毒素タンパク質、ホルモン、ホルモン類似体、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、輸送タンパク質、レセプター、レセプターの断片、生体防御誘導物質、貯蔵タンパク質、移動タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、エックスプロイティブプロテイン（ｅｘｐｌｏｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及びレポータータンパク質で構成される群から選択されるいずれか一つ以上であることができるが、これに限定されない。
【００１６】
本発明の好ましい一実施例によれば、遺伝子コンストラクトは、ＲｂｃＳ遺伝子の５’末端にプロモーター遺伝子をさらに含むことができ、前記プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）に由来する３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）に由来する１９ＳＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター及びユビキチンタンパク質プロモーターから選択されるものであることができるが、これに限定されない。
【００１７】
本発明の好ましいさらに他の一実施例によれば、目的タンパク質をコーディングする遺伝子の３’末端にタンパク質タッグ遺伝子をさらに含むことができ、前記タンパク質タッグは、Ａｖｉタッグ、Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎタッグ、ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅタッグ、Ｅタッグ、ＦＬＡＧタッグ、ＨＡタッグ、Ｈｉｓタッグ、Ｍｙｃタッグ、Ｓタッグ、ＳＢＰタッグ、ＩｇＧ−Ｆｃタッグ、ＣＴＢタッグ、Ｓｏｆｔａｇ１タッグ、Ｓｏｆｔａｇ３タッグ、Ｓｔｒｅｐタッグ、ＴＣタッグ、Ｖ５タッグ、ＶＳＶタッグ及びＸｐｒｅｓｓタッグよりなる群から選択されるいずれか一つであることができるが、これに限定されない。
【００１８】
本発明は、また、前記遺伝子コンストラクトを含む組換え発現ベクターを提供する。
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、前記組換え発現ベクターで形質転換され、目的タンパク質を高発現する形質転換植物体を提供する。
【００１９】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記植物は、稲、小麦、大麦、トウモロコシ、豆、ジャガイモ、アズキ、エンバク、キビを含む食糧作物類；シロイヌナズナ、白菜、大根、唐辛子、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、マクワウリ、カボチャ、長ネギ、タマネギ、ニンジンを含む野菜作物類；高麗人参、タバコ、木化、ゴマ、サトウキビ、砂糖大根、エゴマ、ピーナッツ、菜の花を含む特用作物類；リンゴの木、梨の木、ナツメの木、桃、ブドウ、蜜柑、柿、スモモ、杏、バナナを含む果樹類；ローズ、カーネーション、菊、百合、チューリップを含む花卉類から選択されるものであることができるが、これに限定されない。
【００２０】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、組換え発現ベクターを製作する段階と、前記組換え発現ベクターを植物体に導入する段階とを含む目的タンパク質を高発現する形質転換植物体の製造方法を提供する。
【００２１】
本発明の好ましい一実施例において、前記組換え発現ベクターを植物体に導入する段階は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）媒介による方法、粒子ガン衝撃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｇｕｎ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、炭化ケイ素ホイスカー法（ｓｉｌｉｃｏｎ  ｃａｒｂｉｄｅ  ｗｈｉｓｋｅｒｓ）、超音波処理法（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）及びＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ）媒介性形質転換方法よりなる群から選択され得るが、これに限定されない。
【００２２】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、（ａ）前記組換え発現ベクターを製作する段階と、（ｂ）前記組換え発現ベクターを植物に導入し、形質転換植物体を製造する段階と、（ｃ）前記形質転換植物体を培養する段階と、（ｄ）前記形質転換植物体又は培養液から目的タンパク質を分離精製する段階とを含む目的タンパク質の生産方法を提供する。
【００２３】
本発明の好ましい一実施例において、前記組換え発現ベクターを、ゲノムに存在するＲｂｃＳ遺伝子が欠損された植物に導入し、形質転換植物体を製造し、これから目的タンパク質を効果的に生産できる。
【００２４】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、目的タンパク質及び目的タンパク質の５’末端に結合されたＲｂｃＳペプチド断片を含む融合タンパク質を提供する。
本発明の好ましい一実施例において、前記ＲｂｃＳペプチド断片は、配列番号２で表示されるアミノ酸配列であることができる。
【００２５】
本発明の好ましい一実施例において、前記融合タンパク質は、５００〜８００ｋＤの巨大複合体であることができる。融合タンパク質のサイズは、ＲｂｃＳペプチド断片に結合する目的タンパク質のサイズによって変わることができる。
【００２６】
本発明の好ましい一実施例において、前記融合タンパク質は、消化酵素に抵抗性を有することを特徴とする。
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、目的タンパク質の５’末端にＲｂｃＳペプチド断片が結合された融合タンパク質を有効成分として含む経口投与用薬学剤形組成物を提供する。
【００２７】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、目的タンパク質の５’末端にＲｂｃＳペプチド断片が結合された融合タンパク質を発現する形質転換植物体を有効成分として含む経口投与用薬学剤形組成物を提供する。
【００２８】
本発明の好ましい一実施例において、前記ＲｂｃＳペプチド断片は、配列番号２で表示されるアミノ酸配列であることができる。
【発明の効果】
【００２９】
したがって、本発明は、目的タンパク質を発現する植物、その製造方法及びこれを利用した目的タンパク質の生産方法を提供する。本発明によれば、植物体から高効率、高発現の目的タンパク質を収得でき、植物体を活用した産業用又は医療用タンパク質の大量生産に活用でき、特に、経口投与用タンパク質医薬品の生産及び生産されたタンパク質を純粋分離なしに経口投与用薬学剤形組成物として製造するのに活用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、本発明の一実施例によって製造したＲｂｃＳ融合コンストラクトの模式図である。
【図２】図２は、本発明の一実施例によって製造したＲｂｃＳ融合により目的タンパク質が植物細胞で高発現されることを確認したウェスタンブロット写真である。
【図３】図３は、本発明の一実施例によって製造したＲｂｃＳ融合タンパク質の発現が正常植物体よりＲｂｃＳ欠損突然変異体においてさらに高いことを確認したウェスタンブロット写真である。
【図４】図４は、本発明の一実施例によって製造した形質転換植物体においてＲｂｃＳ融合タンパク質の発現を確認したウェスタンブロット写真である。
【図５】図５は、本発明の一実施例によるＲｂｃＳタンパク質が融合された目的タンパク質（ＲｂｃＳ−ＦＬ：ｌｅｐｔｉｎ：ＨＡ）の濃度別ペプシン抵抗性効果実験結果である。
【図６】図６は、本発明の一実施例によるＲｂｃＳタンパク質が融合された目的タンパク質（ＲｂｃＳ−ＦＬ：ｌｅｐｔｉｎ：ＨＡ）の反応時間別ペプシン抵抗性効果実験結果である。
【図７】図７は、本発明の一実施例によるＲｂｃＳタンパク質が融合された目的タンパク質の複合体形成確認結果を示すＢｌｕｅ−Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ結果である。
【図８】図８は、本発明の一実施例によるＲｂｃＳ−ＦＬ：ｌｅｐｔｉｎ：ＨＡの消化管内の安定性確認結果である。
【図９】図９は、本発明の一実施例による融合タンパク質ＲＦｅＥｘ４ｆＧ１５の高発現を確認した結果である。
【図１０】図１０は、本発明の一実施例による融合タンパク質ＲＦｅＥｘ４ｆＧ１５のルビスコ複合体形成を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明をより詳しく説明する。
前述したように、本発明者は、植物細胞から目的タンパク質を大量で生産できる方法を考案するために、細胞内で目的タンパク質を安定化させることができるタンパク質ドメイン融合に着目し、シロイヌナズナの葉緑体でタンパク質複合体を構成して安定的に存在するものと知られたＲｂｃＳ遺伝子を分離し、前記ＲｂｃＳ遺伝子を融合すると、植物細胞で目的タンパク質の発現が増加されるという事実を確認した（実施例２参照）。
【００３２】
したがって、本発明は、植物細胞内でその下流に位置する目的タンパク質の発現量を増進させることを特徴とするＲｂｃＳ遺伝子断片を提供する。
前記ＲｂｃＳ遺伝子は、好ましくは、配列番号１の塩基配列よりなることができる。また、前記塩基配列の変異体が本発明の範囲内に含まれる。具体的に、前記遺伝子は、配列番号１の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。ポリヌクレオチドに対する“配列相同性の％”は、二つの最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域においてのポリヌクレオチド配列の一部は、二つの配列の最適配列に対する参照配列（追加又は削除を含まない）に比べて追加又は削除（すなわち、ギャップ）を含むことができる。
【００３３】
また、本発明は、（ａ）ＲｂｃＳ（ｒｉｂｕｌｏｓｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ）遺伝子；及び（ｂ）目的タンパク質をコーディングする遺伝子が作動可能に順次に連結された目的タンパク質の高発現のための遺伝子コンストラクトを提供する。
【００３４】
本発明の遺伝子コンストラクトは、ＲｂｃＳ遺伝子の５’末端にプロモーター遺伝子をさらに含むことができる。
本発明の遺伝子コンストラクトは、目的タンパク質をコーディングする遺伝子の３’末端にタンパク質タッグ遺伝子をさらに含むことができる。
【００３５】
本発明の遺伝子コンストラクトは、（ａ）プロモーター遺伝子；（ｂ）ｒｂｃＳ（ｒｉｂｕｌｏｓｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ）遺伝子；（ｃ）目的タンパク質をコーディングする遺伝子及び（ｄ）タンパク質タッグ遺伝子が作動可能に順次に連結されたものであることができる。
【００３６】
前記でプロモーターとしては、植物体内に挿入遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されないが、好ましくは、前記プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）に由来する３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）に由来する１９ＳＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター及びユビキチンタンパク質プロモーターから選択されるものであることができる。
【００３７】
前記ＲｂｃＳ遺伝子は、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ小サブユニットをコーディングする遺伝子であることができ、最も好ましくは、シロイヌナズナに由来する配列番号１で表示されるＲｂｃＳ遺伝子であることができる。
【００３８】
前記で目的タンパク質は、生産しようとするタンパク質を意味する用語であって、特定のタンパク質に限定されない。具体的に、目的タンパク質は、抗原、抗体、抗体断片、構造タンパク質、調節タンパク質、転写因子、毒素タンパク質、ホルモン、ホルモン類似体、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、輸送タンパク質、レセプター、レセプターの断片、生体防御誘導物質、貯蔵タンパク質、移動タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、エックスプロイティブプロテイン（ｅｘｐｌｏｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及びレポータータンパク質で構成される群から選択されるいずれか一つ以上であることができる。
【００３９】
本発明の一実施例では、前記目的タンパク質として、副甲状線ホルモン（ＰＴＨ；ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）又はレプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）を使用した。しかし、本発明の目的タンパク質は、ＬｅｐｔｉｎやＰＴＨに制限されない。本発明は、また、ヒト成長ホルモン、ＧＬＰ１、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４等のような多様な小さいペプチド性のホルモン等の大量発現に利用できる。かくして発現されたタンパク質は、ＲｂｃＳとの融合部位に特定タンパク質分解サイトを導入し、ＲｂｃＳから分離して純粋精製し得る。
【００４０】
また、本発明のタンパク質タッグ遺伝子は、タンパク質を分離精製するために、区分可能にするタッグであれば、これに制限しない。具体的に、タンパク質タッグは、Ａｖｉタッグ、Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎタッグ、ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅタッグ、Ｅタッグ、ＦＬＡＧタッグ、ＨＡタッグ、Ｈｉｓタッグ、Ｍｙｃタッグ、Ｓタッグ、ＳＢＰタッグ、ＩｇＧ−Ｆｃタッグ、ＣＴＢタッグ、Ｓｏｆｔａｇ１タッグ、Ｓｏｆｔａｇ３タッグ、Ｓｔｒｅｐタッグ、ＴＣタッグ、Ｖ５タッグ、ＶＳＶタッグ及びＸｐｒｅｓｓタッグよりなる群から選択されるいずれか一つ以上であることができる。
【００４１】
本発明は、また、前記遺伝子コンストラクトを含む組換え発現ベクターを提供する。
用語「組換え」は、細胞が異種の核酸を複製するか、前記核酸を発現するか又はペプチド、異種のペプチド又は異種の核酸により暗号化されたタンパク質を発現する細胞を指称するものである。組換え細胞は、前記細胞の天然形態では発見されない遺伝子又は遺伝子切片をセンス又はアンチセンス形態のうち一つで発現できる。また、組換え細胞は、天然状態の細胞で発見される遺伝子を発現できるが、前記遺伝子は、変形されたものであって、人為的な手段により細胞内に再導入されたものである。
【００４２】
本発明において、前記ＲｂｃＳ遺伝子配列は、組換え発現ベクター内に挿入され得る。用語「組換え発現ベクター」は、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス又は他のベクターを意味する。おおよそ、任意のプラスミド及びベクターは、宿主内で複製及び安定化できれば、使用され得る。前記発現ベクターの重要な特性は、複製原点、プロモーター、マーカー遺伝子及び翻訳調節要素（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を有するものである。
【００４３】
ＲｂｃＳ遺伝子配列及び適当な転写／翻訳調節信号を含む発現ベクターは、当業者に周知された方法により構築され得る。前記方法は、試験管内組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術及び生体内組換え技術等を含む。
【００４４】
前記ＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を導くために、発現ベクター内の適当なプロモーターに効果的に連結され得る。本発明による前記ＤＮＡ断片及び目的タンパク質を暗号化する遺伝子を植物細胞で発現させるための好適なベクターとしては、ｐＵＣ１９基盤プラスミド又はＴｉプラスミドベクターがある。
【００４５】
本発明の組換えベクターの好ましい例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのような適当な宿主に存在するとき、その自体の一部、いわゆるＴ−領域を植物細胞に転移させることができるＴｉ−プラスミドベクターである。他の類型のＴｉ−プラスミドベクターは、現在植物細胞、又は雑種ＤＮＡを植物のゲノム内に適当に挿入させる新しい植物が生産され得る原形質体であって、雑種ＤＮＡ配列を転移させるのに用いられている。Ｔｉ−プラスミドベクターの特に好ましい形態は、ＥＰ０１２０５１６Ｂ１号及び米国特許第４，９４０，８３８号に請求されたようないわゆるバイナリー（ｂｉｎａｒｙ）ベクターである。本発明によるＤＮＡを植物宿主に導入させるに用いられる他の好適なベクターは、二本鎖植物ウイルス（例えば、ＣａＭＶ）及び単鎖ウイルス、ゲミニウイルス等に由来できるもののようなウイルスベクター、例えば非完全性植物ウイルスベクターから選択され得る。このようなベクターの使用は、特に植物宿主を適当に形質転換することが難しいときに有利である。
【００４６】
前記好適なベクターの例としては、これに限定されないが、３２６ＧＦＰ又はｐＣＡＭＢＩＡ系のようなバイナリーベクターを使用することが好ましく、当業者なら、本発明による前記ＤＮＡ断片及び目的タンパク質を暗号化する遺伝子を植物細胞内で発現させることができるどんなベクターでも選択して使用し得る。
【００４７】
より具体的に、前記組換えベクターは、タンパク質発現に使用される従来のベクターを基本骨格にしてプロモーター、目的タンパク質の発現量を増進させる本発明による前記ＤＮＡ断片及び目的タンパク質を暗号化する遺伝子が順次に作動可能に連結された組換え発現ベクターである。
【００４８】
また、発現ベクターは、翻訳開始部位としてリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含むことができる。
発現ベクターは、好ましくは、一つ以上の選択性マーカーを含む。前記マーカーは、通常、化学的な方法で選択され得る特性を有する核酸配列であって、形質転換された細胞を非形質転換細胞から区別できるすべての遺伝子がこれに該当する。その例としては、グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）又はホスフィノトリシン （ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）のような除草剤抵抗性遺伝子、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール （ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のような抗生剤耐性遺伝子、ａａｄＡ遺伝子等があるが、これに限定されるものではない。
【００４９】
本発明の組換えベクターにおいて、プロモーターは、ＣａＭＶ３５Ｓ、アクチン、ユビキチン、ｐＥＭＵ、ＭＡＳ、ヒストンプロモーター、Ｃｌｐプロモーターであることができるが、これに制限されない。「プロモーター」という用語は、構造遺伝子からのＤＮＡアップストリームの領域を意味し、転写を開始するために、ＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ分子を言う。「植物プロモーター」は、植物細胞で転写を開始できるプロモーターである。「構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモーター」は、大部分の環境条件及び発達状態又は細胞分化の下で活性があるプロモーターである。形質転換体の選択が各種段階で各種組織により行われることができるため、構成的プロモーターが本発明において好ましい。したがって、構成的プロモーターは、選択可能性を制限しない。
【００５０】
本発明の組換えベクターにおいて、通常のターミネーターを使用でき、その例としては、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、イネアミラーゼＲＡｍｙ１Ａターミネーター、ファセオリンターミネーター、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトパイン（Ｏｃｔｏｐｉｎｅ）遺伝子のターミネーター、大腸菌のｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーター等があるが、これに限定されるものではない。ターミネーターの必要性に関して、このような領域が植物細胞においての転写の確実性及び効率を増加させるものと一般的に知られている。したがって、ターミネーターの使用は、本発明の内容において非常に好ましい。
【００５１】
本発明のベクターを、原核細胞に安定的に且つ連続的にクローニング及び発現させることができる宿主細胞は、当業界に公知されたいずれの宿主細胞をも利用でき、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９，Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１，Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＲ１，Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２，Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ，Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６，Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、バチルス・サブティリス、バチルス・チューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、そしてサルモネラ・ティフィムリウム、セラチア・マルセッセンス及び多様なシュードモナス種のような腸内菌と菌株等がある。
【００５２】
また、本発明のベクターを真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、ヒト細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ及びＭＤＣＫ細胞株）及び植物細胞等が利用され得る。宿主細胞は、好ましくは、植物細胞であり、前記植物は、稲、小麦、大麦、トウモロコシ、豆、ジャガイモ、アズキ、エンバク、キビを含む食糧作物類；シロイヌナズナ、白菜、大根、唐辛子、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、マクワウリ、カボチャ、長ネギ、タマネギ、ニンジンを含む野菜作物類；高麗人参、タバコ、木化、ゴマ、サトウキビ、砂糖大根、エゴマ、ピーナッツ、菜の花を含む特用作物類；リンゴの木、梨の木、ナツメの木、桃、ブドウ、蜜柑、柿、スモモ、杏、バナナを含む果樹類；ローズ、カーネーション、菊、百合、チューリップを含む花卉類から選択されるものであることができる。
【００５３】
本発明のベクターを宿主細胞内に運搬する方法は、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２方法、ハナハン方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７−５８０（１９８３））及び電気穿孔方法等により実施され得る。また、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リボソーム媒介形質感染法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法、及び遺伝子ボンバードメント等によりベクターを宿主細胞内に注入できる。
【００５４】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、前記組換え発現ベクターで形質転換され、目的タンパク質を高発現する形質転換植物体を提供する。
本発明の好ましい他の一実施例によれば、前記植物は、稲、小麦、大麦、トウモロコシ、豆、ジャガイモ、アズキ、エンバク、キビを含む食糧作物類；シロイヌナズナ、白菜、大根、唐辛子、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、マクワウリ、カボチャ、長ネギ、タマネギ、ニンジンを含む野菜作物類；高麗人参、タバコ、木化、ゴマ、サトウキビ、砂糖大根、エゴマ、ピーナッツ、菜の花を含む特用作物類；リンゴの木、梨の木、ナツメの木、桃、ブドウ、蜜柑、柿、スモモ、杏、バナナを含む果樹類；ローズ、カーネーション、菊、百合、チューリップを含む花卉類から選択されるものであることができる。
【００５５】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、組換え発現ベクターを製作する段階と、前記組換え発現ベクターを植物体に導入する段階とを含む目的タンパク質を高発現する形質転換植物体の製造方法を提供する。
【００５６】
前記植物発現ベクターの植物細胞又は植物体への導入は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）媒介による方法、粒子ガン衝撃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｇｕｎｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、超音波処理法（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）及びＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎ  ｇｌｙｃｏｌ）媒介性形質転換方法よりなる群から選択されたいずれか一つを使用できる。本発明の一実施例では、シロイヌナズナ原形質体の形質転換には、ＰＥＧ媒介性形質転換方法を、そしてシロイヌナズナ形質転換体の製作には、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）媒介による方法を使用した。
【００５７】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、組換えベクターで形質転換された植物を利用して目的タンパク質を大量生産する方法を提供する。
具体的に、本発明の目的タンパク質を生産する方法は、（ａ）前記組換え発現ベクターを製作する段階と、（ｂ）前記組換え発現ベクターを植物に導入し、形質転換植物体を製造する段階と、（ｃ）前記形質転換植物体を培養する段階と、（ｄ）前記形質転換植物体又は培養液から目的タンパク質を分離精製する段階とを含む。
【００５８】
本発明の目的タンパク質生産方法において、前記植物は、ゲノムに存在するＲｂｃＳ遺伝子が欠損された植物であることができる。
前記形質転換された植物細胞から目的タンパク質を生産する方法は、本発明による組換えベクターで植物細胞を形質転換させた後、目的タンパク質が発現されるように、適当な時間の間に培養した後、形質転換された細胞から収得できる。この際、前記目的タンパク質を発現させる方法は、当業界に公知された方法であれば、いずれも使用可能である。
【００５９】
前記方法において、シロイヌナズナで形質転換体を製作したが、これに限定されるものではなく、双子葉植物又は単子葉植物から分離した原形質体をいずれも本発明の方法で使用可能である。
【００６０】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、目的タンパク質及び目的タンパク質の５’末端に結合されたＲｂｃＳペプチド断片を含む融合タンパク質を提供する。
本発明の融合タンパク質は、５００〜８００ｋＤの巨大複合体を形成し、消化器官内のタンパク質分解酵素に対する抵抗性を有することを特徴とする。
【００６１】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、目的タンパク質の５’末端にＲｂｃＳペプチド断片が結合された融合タンパク質を有効成分として含む経口投与用薬学剤形組成物を提供する。
【００６２】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、目的タンパク質の５’末端にＲｂｃＳペプチド断片が結合された融合タンパク質を発現する形質転換植物体を有効成分として含む経口投与用薬学剤形組成物を提供する。
【００６３】
本発明の好ましい一実施例において、前記ＲｂｃＳペプチド断片は、配列番号２で表示されるアミノ酸配列であることができる。
以下、実施例により本発明を詳しく説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明だろう。
【００６４】
実施例１．組換え発現ベクター製作
本発明者は、発現ベクターとして、［３５Ｓプロモーター］−［ＲｂｃＳ遺伝子］−［目的タンパク質遺伝子］−［ＨＡタッグ］が作動可能に連結された遺伝子コンストラクトを使用した（図１）。発現ベクターに目的タンパク質をコーディングする遺伝子をクローニングした後、植物細胞で発現させると、ＲｂｃＳが融合された状態で発現され、葉緑体に移動して蓄積される。
【００６５】
本発明の一実施例において目的タンパク質としては、副甲状線ホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ＰＴＨ）を使用し、発現ベクターの製作方法は、下記の通りである。シロイヌナズナジェノミックＤＮＡを鋳型として「ＸｂａＩ−ＲｂｃＳ  Ｎ−ｔｅｒｍｉａｎｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」で構成された正方向プライマー（配列番号６）と「ＢａｍＨＩ−ＲｂｃＳ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」で構成された逆方向プライマー（配列番号７）を利用してＰＣＲ反応を行い、ＲｂｃＳ遺伝子を増幅した。また、ＰＴＨが含まれたプラスミドＤＮＡを鋳型として「ＢａｍＨＩ−ＰＴＨ  Ｎ−ｔｅｒｍｉａｎｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」で構成された正方向プライマー（配列番号８）と「ＸｈｏＩ−ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ−ＨＡ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」で構成された逆方向プライマー（配列番号９）を利用してＰＣＲ反応を行い、ＨＡ−タッグが融合されたＰＴＨ遺伝子を増幅した。前記増幅されたＰＣＲ産物をそれぞれＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ（一番目のＰＣＲ産物）及びＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ（二番目のＰＣＲ産物）で切断し、精製した。この二つのＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで切断した３２６ＧＦＰ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｏｈｉｏ，  ＵＳＡ）プラスミド内のカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（配列番号３）とＮＯＳ終結子との間にクローニングし、発現ベクターＲｂｃＳ：ＰＴＨ：ＨＡを製作した。
【００６６】
実施例２．ＲｂｃＳ融合ベクターのタンパク質発現効果比較
前記実施例１で製造された発現ベクターをシロイヌナズナ葉から分離した原形質体にＰＥＧ−媒介性形質転換方法で導入し、形質転換体を製造した後、これから発現されるＲｂｃＳ融合タンパク質の量をウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ    ｂｌｏｔ）分析方法で比較した。
【００６７】
具体的に、細胞溶解液３０μｇをＳＤＳ試料バッファーと混合して加熱し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動した。分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させ、５％スキムミルク（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）で遮断した。その後、ａｎｔｉ−ＨＡ抗体（１：１０００希釈）とともに反応させ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された２次抗体と反応させた。その後、ＥＣＬ溶液を製造社の方法によって処理した。
【００６８】
実施例３．植物細胞内でＲｂｃＳ融合によるタンパク質発現量分析
ＲｂｃＳ融合によるタンパク質発現量の増加を確認するために、ＰＴＨ：ＨＡの上部にＲｂｃＳ全体遺伝子（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ、配列番号１）を設置したプラスミド遺伝子を使用し、対照群としては、ＲｂｃＳ全体遺伝子の代わりに、ＲｂｃＳトランジットペプチド（ＲｂｃＳ  ｔｒａｎｓｉｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ、配列番号１０）をＰＴＨ：ＨＡの上部に設置したプラスミド遺伝子を使用した。これらの遺伝子をＰＥＧ媒介性形質転換方法でシロイヌナズナの葉から分離した原形質体に導入し、２４時間培養後、原形質体を収集、溶解し、定量した後、ウェスタンブロット分析を行った。
【００６９】
その結果、図２に示すように、シロイヌナズナ原形質体でＲｂｃＳ全体遺伝子を融合させたＰＴＨ：ＨＡの発現が、対照群であるＲｂｃＳトランジットペプチドを融合させたＰＴＨ：ＨＡの発現よりさらに高いものと現われた。これより、ＲｂｃＳ遺伝子を融合パートナーとして使用すると、目的タンパク質の発現量を向上させる効果があることが分かった。
【００７０】
実施例４．野生型植物とＲｂｃＳ遺伝子が欠損された植物においてＲｂｃＳ融合によるタンパク質発現量比較分析
ＲｂｃＳ遺伝子が欠損された植物においてＲｂｃＳ融合タンパク質の発現量を分析するために、ＲｂｃＳ遺伝子が欠損された突然変異シロイヌナズナを宿主細胞として使用した。
【００７１】
具体的に、野生型シロイヌナズナとＲｂｃＳ遺伝子が欠損された突然変異シロイヌナズナの葉からそれぞれ原形質体を分離し、ＲｂｃＳ全体遺伝子（配列番号１）を融合させたＰＴＨ：ＨＡ遺伝子をＰＥＧ媒介性形質転換方法で原形質体に導入した後、２４時間培養した後、原形質体を収集、溶解し、定量し、ウェスタンブロット分析を行った。
【００７２】
その結果、図３に示すように、ＲｂｃＳ全体遺伝子を融合させたＰＴＨ：ＨＡの発現が、野生型シロイヌナズナよりＲｂｃＳ遺伝子が欠損された突然変異体においてさらに高いものと現われた。これより、ＲｂｃＳ遺伝子が欠損された突然変異体においてＲｂｃＳ融合タンパク質を発現させる方法を活用して目的タンパク質の発現量を効率的に向上させることができることが分かった。
【００７３】
実施例５．ＲｂｃＳ融合タンパク質が発現される形質転換植物体の製作
ＲｂｃＳ融合により目的タンパク質の発現が向上した形質転換植物体を製造した。植物体形質転換用プラスミドは、下記のように製作した。まず、Ｌｅｐｔｉｎを含んでいるプラスミドＤＮＡを鋳型として「ＢａｍＨＩ−ｌｅｐｔｉｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉａｎｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」で構成された正方向プライマー（配列番号１２：ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＣＣＣＣＴＧ）と「ＸｈｏＩ−ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ−ＨＡ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」で構成された逆方向プライマー（配列番号１３：ｃｔｃｇａｇｔｃａｇｇａａｇｃｇｔａａｔｃｔｇｇａａｃａｔｃｇｔａｔｇｇｇｔａａｇｃｃｃｇｇｇｇｇｃａｔｔｃａｇｇｇｃｔａａｃａｔｃｃａａｃ）を利用してＰＣＲ反応を行い、ＨＡ−タッグが融合されたｌｅｐｔｉｎ遺伝子を増幅した。前記増幅されたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで切断し、精製した後、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで切断したＲｂｃＳ：ＰＴＨ：ＨＡプラスミドＤＮＡにクローニングし、ＲｂｃＳ：ｌｅｐｔｉｎ：ＨＡを製作した。
【００７４】
前記製造した組換えベクターにおいてＲｂｃＳ：Ｌｅｐｔｉｎ：ＨＡを含む領域を切断し、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターのマルチクローニングサイトにＸｂａＩとＥｃｏＲＩ制限酵素を利用して３５Ｓプロモーター−ＲｂｃＳ：Ｌｅｐｔｉｎ：ＨＡ：ＮＯＳ終結子形態の遺伝子コンストラクトをクローニングすることによって、形質転換用組換えベクターを製造した。その後、前記製造された形質転換用組換えベクターをアグロバクテリウム媒介形質転換方法を利用して形質転換された植物体を製造した。この際、製造された形質転換用ベクターの基本ベクターであるｐＣＡＢＩＡ１３００は、ハイグロマイシン耐性検査を用いて本発明の方法で形質転換された植物体を選別した。また、耐性検査で選別された植物体は、ウェスタンブロットを用いてタンパク質が良好に発現されるラインを探して、形質転換１世代を確保し（図４）、形質転換２世代では、ハイグロマイシン耐性検査を利用して「死ぬ個体：生き残った個体」が１：３の比率できれいに出るラインを選別し、これらのラインのうち形質転換３世代ですべて生き残る個体をホモ（ｈｏｍｏ）として選定し、ラインを維持することによって、形質転換された植物体ラインを確保した。図４に示されたように、形質転換体１〜５、８及び１１において様々なバンドが観察され、目的タンパク質（ＲｂｃＳ：Ｌｅｐｔｉｎ：ＨＡ）が高発現されることを確認した。
【００７５】
実施例６．ＲｂｃＳ融合タンパク質のペプシン抵抗性効果
前記実施例５のように、ＲｂｃＳ−ＦＬ：Ｌｅｐｔｉｎ：ＨＡの形質転換植物体を作製し、これを利用してインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でペプシンに対する抵抗性を調査した。
【００７６】
具体的に、当該形質転換植物体は、温室で約４週間栽培した後、葉を収穫し、凍結乾燥した後、細かく磨って、粉末状態で製作した。この粉末形態の形質転換植物体を各１０ｍｇずつ取って、ｐＨ２．０のバッファーと混合した後、０、２００、４００ｎｇ／μＬ濃度のペプシンを処理し、３７℃で３０分間反応させた。その後、ペプシンの活性を低めるために、氷に試料を約１０分間保持し、温度を低め、ｐＨ８．８の１．５Ｍ  Ｔｒｉｓバッファーを処理し、ｐＨを高めることによって、もう一度ペプシンの活性を低めた。その後、細胞を超音波分解（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）方法で破壊し、バッファーと混合して１０分間沸かした後、１４，０００ｒｐｍで残余物を除去した。その後、１００μｇに該当する試料を定量してＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ウェスタンブロットを行った。ペプシン処理による融合タンパク質の抵抗性を比較するための対照群として、ＥＲタンパク質であるＢｉＰ（ｃｈａｐｈｅｒｏｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、複合タンパク質を形成する葉緑体タンパク質であるＬｈｃｂ４（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ａ−ｂ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質を使用した。その結果、図５に示すように、ＲｂｃＳ全体遺伝子を融合させたＬｅｐｔｉｎタンパク質（ＲＦＬ−Ｌｅｐｔｉｎ）の場合、高い濃度で処理したペプシンとの反応においてＢｉｐより高い分解抵抗性を示し、さらに他の複合体を形成するＬｈｃｂ４とは同様の程度で分解抵抗性を示す。
【００７７】
前記でＲｂｃＳ融合タンパク質の濃度別ペプシン処理による分解抵抗性を確認し、引き続いて、４００ｎｇ／μＬペプシンに対する反応時間を３０分、１時間、２時間で多様にして、分解可否を確認した。その結果、図６に示すように、反応時間が長くなるにもかかわらず、相変らず他のタンパク質とは異なって分解抵抗性を示す。
【００７８】
実施例７．ＲｂｃＳ−Ｌｅｐｔｉｎの消化管内の安定性確認
消化管内でＲｂｃＳ−ＦＬ：ｌｅｐｔｉｎ：ＨＡタンパク質の安定性を測定するために、マウスに強制食餌した後、胃と小腸から食べ物を収得し、ウェスタンブロットを行った。
【００７９】
具体的に、ＲｂｃＳ−ＦＬ：Ｌｅｐｔｉｎ：ＨＡが形質転換された植物体の葉を液体窒素の下に凍結乾燥した後、細かく磨って、粉末状態で製作した。これをＰＢＳに懸濁し、消化管においての時間を正確に調節するために、ゾンド（ｚｏｎｅｄ）を利用してＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）の胃に８０ｍｇ（ｌｅａｆ乾燥重量基準）／個体を直接投与した。投与３０分後、胃と小腸から食べ物を収得し、ＲＩＰＡ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒに入れ、超音波粉砕を行った。遠心分離（１４，０００ｘｇ）を用いて細胞の残余物を除去し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質定量を用いて２０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングし、ウェスタンブロットを行った。ＨＡ抗体を利用して、ＲｂｃＳ−ＦＬ：ｌｅｐｔｉｎ：ＨＡの存在を確認した。
【００８０】
その結果、図７に示すように、胃から食べ物を収去したとき、大部分の個体で本来分子量のＲｂｃＳ−ＦＬ：ｌｅｐｔｉｎ：ＨＡが検出された。同時間に、小腸では、胃に比べて消化がさらに進行されたように見えるが、本来分子量のＲｂｃＳ−ＦＬ：ｌｅｐｔｉｎ：ＨＡ検出になった。これより、ＲｂｃＳが融合された目的タンパク質を経口投与したとき、消化管内で消化酵素により分解されず、安定的に存在することを確認できた。
【００８１】
実施例８．ＲｂｃＳ融合タンパク質のルビスコ複合体形成確認
前記実施例で製造したＲｂｃＳ−ＦＬ：Ｌｅｐｔｉｎ：ＨＡが、Ｌｅｐｔｉｎ遺伝子融合可否とかかわらず、相変らずルビスコ複合体（ｒｕｂｉｓｃｏ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成するかを確認するために、Ｂｌｕｅ−Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を実施した。
【００８２】
Ｂｌｕｅ−Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ分析は、重合体形態のタンパク質を確認する方法であって、具体的に、次のような過程を経た。形質転換植物体を温室で約４週間栽培した後、葉を収穫し、凍結乾燥した後、細かく磨って、粉末状態で製作した。この粉末形態の形質転換植物体を各１０ｍｇずつ取って、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファーに混合した後、超音波粉砕で細胞を破壊し、定量し、次に、非イオン洗剤（ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）であるｎ−ドデシルベータ−Ｄ−マルトシド（ｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ  β−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ）を添加して溶解した。その後、ＣＢＢ−Ｇ（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ−Ｇ２５０）とともに交ぜた後、４〜１６％濃度勾配のＢｌｕｅ−Ｎａｔｉｖｅゲルに電気泳動した後、前記実施例と同一の方法でウェスタンブロットを行った。
【００８３】
その結果、図８に示すように、融合タンパク質がルビスコ複合体を形成することを確認できた。
実施例９．他の目的タンパク質においてＲｂｃＳ融合タンパク質のルビスコ複合体形成確認
前記実施例８で確認したように、ＲｂｃＳが融合された目的タンパク質がルビスコ複合体（ｒｕｂｉｓｃｏ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成することをさらに明らかにするために、Ｌｅｐｔｉｎ以外に、他の目的タンパク質についても確認してみた。
【００８４】
具体的に、前記ＲｂｃＳ−Ｌｅｐｔｉｎ：ＨＡ組換えベクターにおいてＬｅｐｔｉｎ：ＨＡ部分を除去し、ｅｘｅｎｄｉｎ−４（配列番号１４）とＧＭ１結合ペプチド（Ｇ１５）（配列番号１６）が融合されたＤＮＡ断片を組換えした（ＲＦｅＥｘ４ｆＧ１５）。製造した組換えベクターをシロイヌナズナ葉から分離した原形質体にＰＥＧ媒介性形質転換方法で導入し、２４時間後に発現されるＲｂｃＳ融合タンパク質の量をウェスタンブロット分析方法で確認した。その結果、図９に示すように、目的融合タンパク質（ＲＦｅＥｘ４ｆＧ１５）が予想されたサイズ（２９ｋＤ）で過発現されることを確認できた。
【００８５】
また、目的融合タンパク質（ＲＦｅＥｘ４ＦＧ１５）がルビスコ複合体形成可否を確認するために、前記のような方法で組換えベクターを原形質体に導入した後、Ｂｌｕｅ  ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行った。その結果、図１０に示すように、元々２９ｋＤである融合タンパク質がＣＢＢ（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ）で４８０ｋＤ付近に見えるバンド（ｒｕｂｉｓｃｏ  ｃｏｍｐｌｅｘ）よりさらに大きいタンパク質複合体として確認され、これは、目的融合タンパク質が正常にルビスコ複合体を形成したことを意味する。これより、目的タンパク質の種類と関係なく、本発明のＲｂｃＳ断片を融合パートナーとして使用したとき、安定的にルビスコ複合体を形成できることを確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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