(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇａｓｄｅｒｍｉｎ  Ｄ（Ｇｓｄｍｄ）遺伝子の機能が欠損又は低下したマウスであり、体内に大腸癌特異的発癌物質及び大腸起炎物質を含む、大腸癌モデル動物。
【請求項２】
Ｇｓｄｍｄ遺伝子又はＧｓｄｍｄ遺伝子の発現調節領域に変異を有する請求項１に記載の大腸癌モデル動物。
【請求項３】
前記大腸癌が、大腸炎関連性大腸癌（Ｃｏｌｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）である請求項１又は２に記載の大腸癌モデル動物。
【請求項４】
Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下したマウスに、大腸癌特異的発癌物質及び大腸起炎物質を投与することを含む大腸癌モデル動物の製造方法。
【請求項５】
前記大腸癌が、大腸炎関連性大腸癌（Ｃｏｌｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）である請求項４に記載の大腸癌モデル動物の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の大腸癌モデル動物に被験物質を投与し、被験物質が投与された前記大腸癌モデル動物と、被験物質が投与されていない前記大腸癌モデル動物とを比較し、被験物質が投与された前記大腸癌モデル動物のほうが大腸癌に関連する表現型が抑制されていた場合、前記被験物質を大腸癌の治療又は予防に有効な物質であると判断することを含む、スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌モデル動物、大腸癌モデル動物の製造方法、抗癌剤、アレルギーモデル動物、アレルギーモデル動物の製造方法、及びスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸炎関連性大腸癌（Ｃｏｌｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  （ＣＡＣ））は、大腸癌（Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ）のサブタイプであり、潰瘍性大腸炎（Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）やクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）等の炎症性腸疾患に起因するとされる。慢性炎症は癌を発生させる主要なリスク因子の一つと広く認識されている。しかし、その発生のメカニズム等の理解はいまだ不十分である。
【０００３】
Ｇａｓｄｅｒｍｉｎ  Ｄ（Ｇｓｄｍｄ）は、Ｇａｓｄｅｒｍｉｎ（Ｇｓｄｍ）遺伝子ファミリーの一員である。マウスでは、ＧｓｄｍｄはＧｓｄｍｄサブファミリーに属する唯一の遺伝子であり、大腸等の腸の上皮において特異的に発現することが知られている（非特許文献１）。しかし、Ｇｓｄｍｄノックアウト（Ｇｓｄｍｄ−／−）マウスの腸管の形態に異常は報告されていなかった（非特許文献２）。近年では、Ｇｓｄｍｄ／ＧＳＤＭＤは、パイロトーシスの新規の制御因子であるとの報告もある（非特許文献２、３）。
【０００４】
また、近年アレルギーの発症が増加傾向にある。ある種のアレルギー性疾患では、体内の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の増加によって、アレルギー反応が生じている。ＩｇＥの生産は、インターロイキン−4（ＩＬ−４）等の特定のサイトカインにより促進されることが知られている。
アレルギーが重症化すると鼻炎や蕁麻疹などが生じて日常生活にも支障をきたす他、ショック症状を呈した場合には重篤な状態に至る可能性もある。そのため、アレルギーが生じるメカニズムの解明やアレルギーの治療について期待されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Tamura, M. et al. Members of a novel gene family, Gsdm, are expressed exclusively in the epithelium of the skin and gastrointestinal tract in a highly tissue-specific manner. Genomics 89, 618-29 (2007).
【非特許文献２】Fujii, T. et al. Gasdermin D (Gsdmd) is dispensable for mouse intestinal epithelium development. Genesis 46, 418-423 (2008).
【非特許文献３】Shi, J. et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature (2015).
【非特許文献４】Kayagaki, N. et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature (2015).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、大腸癌モデルとなる大腸癌モデル動物の提供、該大腸癌モデル動物の製造方法、該大腸癌モデル動物を利用するスクリーニング方法、及び抗癌剤の提供を課題とする。
【０００７】
また、本発明は、アレルギーモデル動物の提供、該アレルギーモデル動物の製造方法、及び該アレルギーモデル動物を利用するスクリーニング方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的組換えにより作製されたＧｓｄｍｄヌル（−／−）のノックアウトマウスが、大腸癌を発症することを見出し、本発明を完成させた。
また本発明者らは、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的組換えにより作製されたＧｓｄｍｄヌル（−／−）のノックアウトマウスで、アレルギーの発症に関連するインターロイキンの発現が高められていることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００９】
（１）Ｇａｓｄｅｒｍｉｎ  Ｄ（Ｇｓｄｍｄ）遺伝子の機能が欠損又は低下した非ヒト動物である大腸癌モデル動物。
（２）Ｇｓｄｍｄ遺伝子又はＧｓｄｍｄ遺伝子の発現調節領域に変異を有する前記（１）に記載の大腸癌モデル動物。
（３）体内に大腸癌特異的発癌物質及び大腸起炎物質を含む前記（１）又は（２）に記載の大腸癌モデル動物。
（４）前記大腸癌が、大腸炎関連性大腸癌（Ｃｏｌｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）である前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の大腸癌モデル動物。
（５）げっ歯類である前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の大腸癌モデル動物。
（６）Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下した非ヒト動物に、大腸癌特異的発癌物質及び大腸起炎物質を投与することを含む、大腸癌モデル動物の製造方法。
（７）前記大腸癌が、大腸炎関連性大腸癌（Ｃｏｌｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）である、前記（６）に記載の大腸癌モデル動物の製造方法。
（８）前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の大腸癌モデル動物に被験物質を投与し、被験物質が投与された前記大腸癌モデル動物と、被験物質が投与されていない前記大腸癌モデル動物とを比較し、被験物質が投与された前記大腸癌モデル動物のほうが大腸癌に関連する表現型が抑制されていた場合、前記被験物質を大腸癌の治療又は予防に有効な物質であると判断することを含む、スクリーニング方法。
（９）以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１以上のタンパク質を有効成分として含有する大腸癌の抗癌剤。
（Ｉ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における、第１アミノ酸〜第２７５アミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有し、大腸癌細胞の細胞障害活性を有するタンパク質
（ＩＩ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における、第１アミノ酸〜第２７５アミノ酸配列からなるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列を有し、大腸癌細胞の細胞障害活性を有するタンパク質
（ＩＩＩ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における、第１アミノ酸〜第２７５アミノ酸配列からなるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、大腸癌細胞の細胞障害活性を有するタンパク質
（１０）以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１以上のタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを有効成分として含有する大腸癌の抗癌剤。
（Ｉ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における、第１アミノ酸〜第２７５アミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有し、大腸癌細胞の細胞障害活性を有するタンパク質
（ＩＩ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における、第１アミノ酸〜第２７５アミノ酸配列からなるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列を有し、大腸癌細胞の細胞障害活性を有するタンパク質
（ＩＩＩ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における、第１アミノ酸〜第２７５アミノ酸配列からなるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、大腸癌細胞の細胞障害活性を有するタンパク質
（１１）Ｇａｓｄｅｒｍｉｎ  Ｄ（Ｇｓｄｍｄ）遺伝子の機能が欠損又は低下した非ヒト動物であり、アレルギー性疾患が発症されやすいアレルギーモデル動物。
（１２）Ｇｓｄｍｄ遺伝子又はＧｓｄｍｄ遺伝子の発現調節領域に変異を有する前記（１１）に記載のアレルギーモデル動物。
（１３）体内に大腸癌特異的発癌物質及び大腸起炎物質を含む前記（１１）又は（１２）に記載のアレルギーモデル動物。
（１４）前記アレルギー性疾患が、Ｉ型アレルギーの疾患である前記（１１）〜（１３）のいずれか一つに記載のアレルギーモデル動物。
（１５）げっ歯類である前記（１１）〜（１４）のいずれか一つに記載のアレルギーモデル動物。
（１６）Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下した非ヒト動物に、大腸癌特異的発癌物質及び大腸起炎物質を投与することを含むアレルギーモデル動物の製造方法。
（１７）前記大腸癌が、大腸炎関連性大腸癌（Ｃｏｌｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）である前記（１６）に記載のアレルギーモデル動物の製造方法。
（１８）前記（１１）〜（１５）のいずれか一つに記載のアレルギーモデル動物に被験物質を投与し、被験物質が投与された前記アレルギーモデル動物と、被験物質が投与されていない前記アレルギーモデル動物とを比較し、被験物質が投与された前記アレルギーモデル動物のほうがアレルギーに関連する表現型が抑制されていた場合、前記被験物質をアレルギー性疾患の治療又は予防に有効な物質であると判断することを含む、スクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、大腸癌モデルとなる大腸癌モデル動物を提供できる。また該大腸癌モデル動物の製造方法、及び該大腸癌モデル動物を利用するスクリーニング方法を提供できる。
また、本発明によれば、アレルギーモデル動物を提供できる。また該アレルギーモデル動物の製造方法、及び該アレルギーモデル動物を利用するスクリーニング方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例における、ＣＡＣ（ｃｏｌiｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）モデル動物の製造手順を模式的に示す概要図である。
【図２】ＡＯＭ−ＤＳＳ処理期間中のマウスの体重変化率の結果を示したグラフである。
【図３】１２週間のＡＯＭ−ＤＳＳ処理の後のマウスの遠位大腸を示す写真である。
【図４】１２週間のＡＯＭ−ＤＳＳ処理後のＷＴマウス及びＧｓｄｍｄ−／−マウスにおける、腫瘍数と、腫瘍サイズを示すドットプロットである。
【図５】ＷＴマウスとＧｓｄｍｄ−／−マウスに発生した大腸腺癌の、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された切片の画像である。
【図６】ＷＴ及びＧｓｄｍｄ−／−マウスのＣＡＣにおける、ＢｒｄＵの取り込み、及びｃｌｅａｖｅｄ  Ｃａｓｐａｓｅ−３（Ｃａｓｐ３）の染色結果を示す図である。
【図７】ＷＴマウス及びＧｓｄｍｄ−／−マウスから得られた大腸腺癌に対する免疫組織化学的検査、及び免疫ブロットの結果を示す画像である。
【図８】実施例における、急性炎症処理の手順を模式的に示す概要図である。
【図９】ＤＳＳ処理期間中のマウスの体重変化率を示したグラフである。
【図１０】急性炎症処理後の組織学的解析の結果を示す画像と、その組織学的スコアを示すグラフである。
【図１１】急性炎症処理後のＷＴマウス及びＧｓｄｍｄ−／−マウスの腸の長さの値を示すグラフである。
【図１２】急性炎症処理後のＷＴマウス及びＧｓｄｍｄ−／−マウスの腸の組織学的解析の結果を示す画像である。
【図１３】ＷＴ及びＧｓｄｍｄ−／−マウスの大腸の炎症部位における免疫組織学的解析の結果を示す画像である。
【図１４】ＷＴ及びＧｓｄｍｄ−／−マウスの大腸の炎症部位における免疫組織学的解析の結果を示す画像である。
【図１５】実施例で得られた、リアルタイム定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図１６】実施例で得られた、リアルタイム定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図１７】実施例で得られた、リアルタイム定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図１８】正常なヒトの大腸、及びＣＡＣの検体の組織学的解析の結果を示す画像と、そのＩＨＣの染色強度のスコアを示すグラフである。
【図１９】マウスの正常な大腸上皮と、急性炎症処理を受けたＣＡＣモデルマウスの大腸上皮の組織学的解析の結果を示す画像である。
【図２０】ＧＳＤＭＤ−ＮをコードするＤＮＡ配列が導入されたｃｏｌｏ−３２０細胞、及びコントロールの細胞を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
≪大腸癌モデル動物≫
本発明の大腸癌モデル動物は、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下した非ヒト動物である。
ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）とマウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のＧａｓｄｅｒｍｉｎ  Ｄ（ぞれぞれＧＳＤＭＤとＧｓｄｍｄ）は、Ｇｓｄｍｄサブファミリーに属する唯一の遺伝子である。マウスのＧｓｄｍｄは１５番染色体（１５Ｄ３）にマップされることが明らかにされている（非特許文献１）。Ｇｓｄｍ遺伝子ファミリー遺伝子は、４００〜５００アミノ酸からなるタンパク質をコードしている。Ｇｓｄｍファミリーの遺伝子は、転写因子として機能という報告もあり、Ｇｓｄｍｄも同様に転写因子として機能する可能性がある（Lunny, D. P. et al. Mutations in gasdermin 3 cause aberrant differentiation of the hair follicle and sebaceous gland. J Invest Dermatol 124, 615-21 (2005).)。
【００１３】
マウスのＧｓｄｍｄ遺伝子と、それがコードするタンパク質のアミノ酸配列が開示されている（Gene ID: 69146）。ヒトのＧＳＤＭＤ遺伝子と、それがコードするタンパク質のアミノ酸配列が開示されている（Gene ID: 79792）。Gene IDは、Geneデータベース（URL：ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）の登録番号を表す。
マウスのＧＳＤＭＤのアミノ酸配列を配列番号１に示す。マウスのＧＳＤＭＤをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。ヒトのＧＳＤＭＤのアミノ酸配列を配列番号３に示す。ヒトのＧＳＤＭＤをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号４に示す。
【００１４】
本明細書における非ヒト動物としては、ヒト以外の動物であれば特に制限されないが、哺乳類であることが好ましく、げっ歯類（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）であることがより好ましい。哺乳類に分類される動物としては、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等が挙げられる。げっ歯類に分類される動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等が挙げられる。
【００１５】
本発明の大腸癌モデル動物は、大腸癌に関連する表現型の少なくとも１つを示す。
大腸癌に関連する表現型としては、大腸における腫瘍の発生、腫瘍の発生率、腫瘍の発生数、腫瘍の大きさ、腫瘍の浸潤の度合い、大腸癌の進行度、大腸の細胞の分化異常、大腸の細胞の形態異常等が挙げられる。それらは、大腸における腫瘍の存在を示す腫瘍マーカーやその他の因子を確認することにより得られた情報であってもよい。大腸癌に関連する表現型は、本願実施例に記載のものも採用できる。
【００１６】
前記大腸癌は、大腸炎関連性大腸癌であってもよい。
大腸炎関連性大腸癌に関連する表現型としては、大腸粘膜における炎症、潰瘍、びらん等が挙げられる。それらは、大腸における大腸炎の存在を示す炎症マーカーやその他の因子を確認することにより得られた情報であってもよい。大腸炎関連性大腸癌に関連する表現型は、本願実施例に記載のものも採用できる。
【００１７】
本明細書におけるＧｓｄｍｄ遺伝子としては、上記の配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられ、その他、当該遺伝子のホモログ、バリアント、変異体を含む。
モデル動物となる動物におけるＧｓｄｍｄ遺伝子が公知の場合は、それをＧｓｄｍｄ遺伝子として選択すればよい。モデル動物となる動物におけるＧｓｄｍｄ遺伝子が公知ではない場合であっても、当業者であれば、モデル動物となる動物ゲノム情報のなかからＧｓｄｍｄ遺伝子を選択することができる。
【００１８】
Ｇｓｄｍｄ遺伝子、又は当該遺伝子のホモログ、バリアント、変異体としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列を有し、機能の欠損又は低下により大腸癌発生の原因となるタンパク質、
（ｂ）配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列を有し、機能の欠損又は低下により大腸癌発生の原因となるタンパク質、
（ｃ）配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、機能の欠損又は低下により大腸癌発生の原因となるタンパク質
【００１９】
ここで、欠失、置換、又は付加されていてもよいアミノ酸の数としては、１〜３０個が好ましく、１〜２０個が好ましく、１〜１０個が好ましく、１〜７個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましく、１〜３個が特に好ましく、１〜２個が最も好ましい。
ここで、アミノ酸配列との同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。アミノ酸配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ（参照URL：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）により求めることができる。パラメーターはたとえばscore = 100、wordlength = 12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００２０】
ここで、大腸癌発生の原因となるとは、機能の欠損又は低下が生じているモデル動物と、機能の欠損又は低下が生じていない動物（モデル動物の野生型（ＷＴ）等のコントロールとなる動物）と比較して、機能の欠損又は低下が生じているモデル動物のほうが、大腸癌に関連する表現型の程度が増すことを意味する。
【００２１】
Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が喪失しているとは、Ｇｓｄｍｄ遺伝子がコードするタンパク質が本来有する機能が完全に失われている状態のことをいう。Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が低下しているとは、Ｇｓｄｍｄ遺伝子がコードするタンパク質が本来有する機能が部分的に失われている状態のことをいう。
【００２２】
Ｇｓｄｍｄ遺伝子がコードするタンパク質が本来有する機能が部分的に失われている場合には、その喪失の程度が、モデル動物と、モデル動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物とを比較し、モデル動物に大腸癌に関連する表現型と認められる状態（コントロールとの差異）がより強く表れる程度であればよい。
【００２３】
本明細書中において、大腸とは、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ状結腸、及び直腸を含む。
【００２４】
本発明のモデル動物に係る大腸癌としては、大腸炎関連性大腸癌（Ｃｏｌｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）が挙げられる。大腸炎関連性大腸癌における大腸炎としては、潰瘍性大腸炎（Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）及びクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）が挙げられる。
【００２５】
Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能の欠損又は低下は、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の発現が消失又は低下することによっても生じ得る。Ｇｓｄｍｄ遺伝子の発現が消失しているとは、モデル動物となる動物において、Ｇｓｄｍｄ遺伝子産物が消失していることをいう。Ｇｓｄｍｄ遺伝子の発現が低下しているとは、モデル動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物と比較して、Ｇｓｄｍｄ遺伝子産物の量が低下していることをいう。Ｇｓｄｍｄ遺伝子の発現が低下している場合には、低下の程度は、モデル動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物と比較して、モデル動物に、上記に示すような大腸癌に関連する表現型と認められる状態（コントロールとの差異）がより強く表れる程度であればよい。
【００２６】
Ｇｓｄｍｄ遺伝子の発現の消失又は低下は、例えば、Ｇｓｄｍｄ遺伝子に対するＲＮＡｉを生じさせる核酸や、アンチセンス核酸をモデル動物に導入し発現させることで、生じさせることができる。標的の遺伝子に対するこれらの核酸の設計、導入、及び発現は、公知の手法を用いて行うことができる。
【００２７】
本発明のモデル動物は、Ｇｓｄｍｄ遺伝子又はＧｓｄｍｄ遺伝子の発現調節領域に変異が導入されて、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下している状態にあることが好ましい。係るモデル動物は、遺伝子工学的手法により、遺伝情報が改変された遺伝子改変動物のことを指し、例えば、トランスジェニックマウス、ノックアウトマウス等が挙げられる。
【００２８】
導入される変異は、Ｇｓｄｍｄ遺伝子がコードするタンパク質が本来有する機能を完全又は部分的に失わせるものであってもよく、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の発現を消失又は低下させるものであってもよい。
【００２９】
Ｇｓｄｍｄ遺伝子には、タンパク質をコードする領域であるエクソンのほか、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の発現を消失又は低下させる、又は前記Ｇｓｄｍｄ遺伝子がコードするタンパク質の機能を欠損又は低下させることができる場合にはイントロンも含まれる。
Ｇｓｄｍｄ遺伝子の発現調節領域とは、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の発現を調節するゲノムＤＮＡ上の領域であって、例えば、プロモーターである。
【００３０】
導入される変異としては、欠失、置換、又は付加が挙げられる。
Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能の欠損又は低下は、例えば、ゲノムＤＮＡ上のＧｓｄｍｄ遺伝子又はＧｓｄｍｄ遺伝子の発現調節領域に該当するＤＮＡの、全部又は一部を欠失させることで達成可能である。また、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能の欠損又は低下は、例えば、ゲノムＤＮＡ上のＧｓｄｍｄ遺伝子又はＧｓｄｍｄ遺伝子の発現調節領域に該当するＤＮＡに、本来とは異なる配列の核酸を置換又は付加させることで、達成可能である。
【００３１】
遺伝子に変異を導入する手法は公知であり、種々の遺伝子工学的手法により行うことができる。例えば、相同組み換え技術等による遺伝子ターゲッティング、遺伝子改変、ノックアウト、ノックダウン、ノックイン、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系等による部位特異的組換え等の手法を用いて行うことができる。また、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓやＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）等のゲノム編集技術を用いても行うことができる。
【００３２】
本発明に係るモデル動物は、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下したことのみによっても、頻度は低いものの大腸癌に関連する表現型を示す。しかし、本発明者らは、アゾキシメタン（ＡＯＭ）及びデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を投与されたＧｓｄｍｄ  ノックアウト（Ｇｓｄｍｄ−／−）マウスが、非常に高頻度で、大腸癌を発症することを見出した。
【００３３】
一態様において、本発明に係るモデル動物は、その体内に大腸癌特異的発癌物質を含む。大腸癌特異的発癌物質としては、例えば、ＡＯＭ、２−Ａｍｉｎｏ−１−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｐｈｅｎｙｌｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＰｈＩＰ）、１，２−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ（ＤＭＨ）等が挙げられる。
一態様において、本発明に係るモデル動物は、その体内に大腸起炎物質を含む。大腸起炎物質としては、例えば、ＤＳＳ、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）、オキサゾロン（Ｏｘａｚｏｌｏｎｅ）等が挙げられる。
【００３４】
一態様において、本発明に係るモデル動物は、その体内に大腸癌特異的発癌物質及び/又は大腸起炎物質を含む。大腸癌特異的発癌物質及び大腸起炎物質は、組み合わせて用いられてもよい。一態様において、本発明に係るモデル動物は、その体内に大腸癌特異的発癌物質及び大腸起炎物質を含む。好ましい大腸癌特異的発癌物質及び大腸起炎物質の組み合わせとしては、ＡＯＭ及びＤＳＳの組み合わせが挙げられる。一態様において、本発明に係るモデル動物は、その体内にＡＯＭ及びＤＳＳを含む。
【００３５】
体内に大腸癌特異的発癌物質及び大腸起炎物質を含むモデル動物は、大腸炎関連性大腸癌のモデル動物として有用である。
【００３６】
ＡＯＭ及びＤＳＳが、大腸炎関連性大腸癌を誘発させることは従来知られていた。しかし、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能の欠損又は低下が大腸炎関連性大腸癌の発症を増強させることは、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能の欠損又は低下によってもたらされる従来知られていない新たな効果である。
【００３７】
本発明に係るモデル動物は、大腸癌に関連する表現型を示す。そのため大腸癌発症のメカニズムの解明や、その治療等に有用な物質の探索、治療方法などの開発に対して大変に有用である。
【００３８】
本発明の一態様として、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下した非ヒト動物を、大腸癌モデル動物として使用する方法が挙げられる。
【００３９】
≪アレルギーモデル動物≫
本発明のアレルギーモデル動物は、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下した非ヒト動物である。
以下、本発明のアレルギーモデル動物について説明するが、前記大腸癌モデル動物と同一の構成について説明を省略する。
【００４０】
本発明のアレルギーモデル動物は、アレルギーに関連する表現型の少なくとも1つを示す。
アレルギーは、発症メカニズムの違いによりＩ〜Ｖ型に分類されている。そのなかでＩ型アレルギーは、即時型アレルギーとも呼ばれ、動物体内でのＩｇＥ抗体の産生が関与する。Ｉ型アレルギーの疾患としては、例えば、食物アレルギー、花粉症、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎等が挙げられる。
本発明のアレルギーモデル動物は、Ｉ型アレルギーに関連する表現型の少なくとも1つを示してもよい。Ｉ型アレルギーに関連する表現型としては、発疹、鼻炎、結膜炎、涙目、気管支炎、咳、呼吸困難等が挙げられる。
【００４１】
その他、動物体内でＩ型アレルギーの発症メカニズムに関連する因子又は細胞の存在を表現型として解析してもよい。当該因子又は細胞としては、ＩｇＥ、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２細胞）、抗体産生細胞に対してＩｇＥの産生を刺激するＩＬ−４の他、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等のＴｈ２サイトカインや、Ｔｈ２サイトカインの生産を誘導するＩＬ−２５、ＩＬ−３３等が挙げられ、これらの因子又は細胞は、Ｉ型アレルギーで増加又は活性化することが知られている。したがって、これらの因子又は細胞の増加又は活性化を、Ｉ型アレルギーに関連する表現型として扱うことができる。
アレルギー性疾患が発症された状態の場合の他に、これらの因子又は細胞のうち一以上が増加した状態にあると、アレルギー性疾患が発症されやすい状態となる。実施例において示されるように、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損したマウスのＩＬ−４、ＩＬ−２５、ＩＬ−３３の発現量は、野生型マウスのこれらの発現量と比較し、有意に増加していた。
【００４２】
本発明のアレルギーモデル動物は、アレルギーに関連する表現型に加えて、さらに大腸癌に関連する表現型の少なくとも１つを示してもよい。
大腸癌に関連する表現型としては、大腸における腫瘍の発生、腫瘍の発生率、腫瘍の発生数、腫瘍の大きさ、腫瘍の浸潤の度合い、大腸癌の進行度、大腸の細胞の分化異常、大腸の細胞の形態異常等が挙げられる。それらは、大腸における腫瘍の存在を示す腫瘍マーカーやその他の因子を確認することにより得られた情報であってもよい。大腸癌に関連する表現型は、本願実施例に記載のものも採用できる。
【００４３】
Ｇｓｄｍｄ遺伝子、又は当該遺伝子のホモログ、バリアント、変異体としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列を有し、機能の欠損又は低下によりアレルギー発生の原因となるタンパク質、
（ｂ）配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列を有し、機能の欠損又は低下によりアレルギー発生の原因となるタンパク質、
（ｃ）配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、機能の欠損又は低下によりアレルギー発生の原因となるタンパク質
【００４４】
ここで、欠失、置換、又は付加されていてもよいアミノ酸の数としては、１〜３０個が好ましく、１〜２０個が好ましく、１〜１０個が好ましく、１〜７個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましく、１〜３個が特に好ましく、１〜２個が最も好ましい。
ここで、アミノ酸配列との同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。アミノ酸配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ（参照URL：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）により求めることができる。パラメーターはたとえばscore = 100、wordlength = 12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００４５】
ここで、アレルギー発生の原因となるとは、機能の欠損又は低下が生じているモデル動物と、機能の欠損又は低下が生じていない動物（モデル動物の野生型（ＷＴ）等のコントロールとなる動物）と比較して、機能の欠損又は低下が生じているモデル動物のほうが、アレルギーに関連する表現型の程度が増すことを意味する。
【００４６】
Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が喪失しているとは、Ｇｓｄｍｄ遺伝子がコードするタンパク質が本来有する機能が完全に失われている状態のことをいう。Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が低下しているとは、Ｇｓｄｍｄ遺伝子がコードするタンパク質が本来有する機能が部分的に失われている状態のことをいう。
【００４７】
Ｇｓｄｍｄ遺伝子がコードするタンパク質が本来有する機能が部分的に失われている場合には、その喪失の程度が、モデル動物と、モデル動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物とを比較し、モデル動物にアレルギーに関連する表現型と認められる状態（コントロールとの差異）がより強く表れる程度であればよい。
【００４８】
Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能の欠損又は低下は、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の発現が消失又は低下することによっても生じ得る。Ｇｓｄｍｄ遺伝子の発現が消失しているとは、モデル動物となる動物において、Ｇｓｄｍｄ遺伝子産物が消失していることをいう。Ｇｓｄｍｄ遺伝子の発現が低下しているとは、モデル動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物と比較して、Ｇｓｄｍｄ遺伝子産物の量が低下していることをいう。Ｇｓｄｍｄ遺伝子の発現が低下している場合には、低下の程度は、モデル動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物と比較して、モデル動物に、上記に示すようなアレルギーに関連する表現型と認められる状態（コントロールとの差異）がより強く表れる程度であればよい。
【００４９】
本発明に係るモデル動物は、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下したことのみによっても、アレルギーに関連する表現型を示す。本発明者らは、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を投与されたＧｓｄｍｄ  ノックアウト（Ｇｓｄｍｄ−／−）マウス、並びにアゾキシメタン（ＡＯＭ）及びデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を投与されたＧｓｄｍｄ  ノックアウト（Ｇｓｄｍｄ−／−）マウスが、野生型のマウスと比較して有意にアレルギーに関連する表現型を示すことを見出した。
【００５０】
一態様において、本発明に係るモデル動物は、その体内に大腸癌特異的発癌物質を含む。
一態様において、本発明に係るモデル動物は、その体内に大腸起炎物質を含む。
【００５１】
一態様において、本発明に係るモデル動物は、その体内に大腸癌特異的発癌物質及び/又は大腸起炎物質を含む。大腸癌特異的発癌物質及び大腸起炎物質は、組み合わせて用いられてもよい。一態様において、本発明に係るモデル動物は、その体内に大腸癌特異的発癌物質及び大腸起炎物質を含む。好ましい大腸癌特異的発癌物質及び大腸起炎物質の組み合わせとしては、ＡＯＭ及びＤＳＳの組み合わせが挙げられる。一態様において、本発明に係るモデル動物は、その体内にＡＯＭ及びＤＳＳを含む。
【００５２】
体内に大腸癌特異的発癌物質及び大腸起炎物質を含むモデル動物は、アレルギーモデル動物として有用である。
【００５３】
ＡＯＭ及びＤＳＳが、大腸炎関連性大腸癌を誘発させることは従来知られていた。しかし、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能の欠損又は低下がアレルギーに関連する表現型を示すことは、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能の欠損又は低下によってもたらされる従来知られていない新たな効果である。
【００５４】
本発明に係るモデル動物は、アレルギーに関連する表現型を示す。そのためアレルギーのメカニズムの解明や、その治療等に有用な物質の探索、治療方法などの開発に対して大変に有用である。
【００５５】
本発明の一態様として、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下した非ヒト動物を、アレルギー性疾患が発症されやすいアレルギーモデル動物として使用する方法が挙げられる。アレルギーモデル動物は、例えば、アレルギー性疾患の原因となるアレルゲンで処理し、使用することができる。
【００５６】
≪モデル動物の製造方法≫
本発明の大腸癌モデル動物の製造方法は、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下した非ヒト動物に、大腸癌特異的発癌物質及び/又は大腸起炎物質を投与することを含む。
本発明のアレルギーモデル動物の製造方法は、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下した非ヒト動物に、大腸癌特異的発癌物質及び/又は大腸起炎物質を投与することを含む。
以下、本発明の大腸癌モデル動物の製造方法及び本発明のアレルギーモデル動物の製造方法について、本発明のモデル動物の製造方法として説明する。
【００５７】
大腸癌特異的発癌物質及び大腸起炎物質は、組み合わせて用いられてもよい。一態様において、本発明のモデル動物の製造方法は、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下した非ヒト動物に、大腸癌特異的発癌物質及び大腸起炎物質を投与することを含む。好ましい大腸癌特異的発癌物質及び大腸起炎物質の組み合わせとしては、ＡＯＭ及びＤＳＳの組み合わせが挙げられる。一態様において、本発明のモデル動物の製造方法は、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下した非ヒト動物に、アゾキシメタン（ＡＯＭ）及びデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を投与することを含む。
【００５８】
Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下した非ヒト動物としては、本発明のモデル動物が挙げられ、上記の≪モデル動物≫で挙げられたものを例示できる。なお、本製造方法によって本発明のモデル動物を製造することができるが、本発明のモデル動物は、本製造方法によって得られたものに限定されない。
【００５９】
以下、本発明に係るモデル動物の製造方法の一実施形態について説明する。
まず、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下した非ヒト動物を用意する。
次いで、該非ヒト動物に大腸癌特異的発癌物質及び／又は大腸起炎物質を投与する。大腸癌特異的発癌物質、大腸起炎物質としては、上記の≪モデル動物≫で挙げられたものを例示できる。
これらの物質の動物への投与形態は、種々の方法から適宜選択すればよく、例えば、皮下注射、腹腔内注射、飼料添加による経口投与等が挙げられる。例えば、マウスの場合、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下したマウスに、大腸癌特異的発癌物質及び／又は大腸起炎物質５〜２０ｍｇ／ｋｇ（体重）を、週１〜２回、約３〜１５週間投与して飼育することが挙げられる。
以上の手順により、大腸炎関連性大腸癌に関連する表現型を示すモデル動物を製造できる。
また以上の手順により、アレルギーに関連する表現型を示すモデル動物を製造できる。
【００６０】
一態様として、本発明のアレルギーモデル動物の製造方法は、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の機能が欠損又は低下した非ヒト動物に、アレルギー性疾患の原因となるアレルゲンを投与又は暴露することを含む。
【００６１】
≪スクリーニング方法≫
（大腸癌）
本発明のスクリーニング方法は、本発明の大腸癌モデル動物に被験物質を投与し、被験物質が投与された前記大腸癌モデル動物と、被験物質が投与されていない前記大腸癌モデル動物とを比較し、被験物質が投与された前記大腸癌モデル動物のほうが大腸癌に関連する表現型が抑制されていた場合、前記被験物質を大腸癌の治療又は予防に有効な物質であると判断することを含む。
本発明のモデル動物としては、上記の≪モデル動物≫で挙げられたものを例示できる。
【００６２】
大腸癌モデル動物に被験物質を投与する方法は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、経口投与等が挙げられる。
スクリーニング方法において、上記比較は同一条件下で行われるものとする。すなわち、比較は、被験物質の投与の有無以外について、被験物質の有効性を判断可能な程度の同一条件下で飼育されたモデル動物についてなされるものとする。
【００６３】
被験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液等が挙げられる。
【００６４】
大腸癌の治療又は予防に有効な物質であると判断された物質は、大腸癌の治療剤又は予防剤の有効成分となり得る。
また被験物質の代わりに該被験物質を含む被験試料を投与し、前記被験試料を大腸癌の治療又は予防に有効な試料であると判断してもよい。
【００６５】
本発明のスクリーニング方法は、大腸癌に関連する表現型を指標にして行う。大腸癌に関連する表現型としては、上記の≪大腸癌モデル動物≫で挙げられたものを例示できる。表現型が抑制されていた場合としては、例えば、腫瘍の発生数の低下していた場合、腫瘍マーカーの値の低下していた場合等が挙げられる。
【００６６】
（アレルギー）
本発明のスクリーニング方法は、本発明のアレルギーモデル動物に被験物質を投与し、被験物質が投与された前記アレルギーモデル動物と、被験物質が投与されていない前記アレルギーモデル動物とを比較し、被験物質が投与された前記アレルギーモデル動物のほうがアレルギーに関連する表現型が抑制されていた場合、前記被験物質をアレルギーの治療又は予防に有効な物質であると判断することを含む。
本発明のモデル動物としては、上記の≪モデル動物≫で挙げられたものを例示できる。
【００６７】
アレルギーモデル動物に被験物質を投与する方法は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、経口投与等が挙げられる。
スクリーニング方法において、上記比較は同一条件下で行われるものとする。すなわち、比較は、被験物質の投与の有無以外について、被験物質の有効性を判断可能な程度の同一条件下で飼育されたモデル動物についてなされるものとする。
【００６８】
被験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液等が挙げられる。
【００６９】
アレルギーの治療又は予防に有効な物質であると判断された物質は、アレルギーの治療剤又は予防剤の有効成分となり得る。
また被験物質の代わりに該被験物質を含む被験試料を投与し、前記被験試料をアレルギーの治療又は予防に有効な試料であると判断してもよい。
【００７０】
本発明のスクリーニング方法は、アレルギーに関連する表現型を指標にして行う。アレルギーに関連する表現型としては、上記の≪アレルギーモデル動物≫で挙げられたものを例示できる。表現型が抑制されていた場合としては、例えば、ＩＬ−４の発現量低下していた場合等が挙げられる。
【００７１】
≪大腸癌の抗癌剤≫
本発明の大腸癌の抗癌剤は、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１以上のタンパク質を有効成分として含有する。
（Ｉ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における、第１アミノ酸〜第２７５アミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有し、大腸癌細胞の細胞障害活性を有するタンパク質
（ＩＩ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における、第１アミノ酸〜第２７５アミノ酸配列からなるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列を有し、大腸癌細胞の細胞障害活性を有するタンパク質
（ＩＩＩ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における、第１アミノ酸〜第２７５アミノ酸配列からなるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、大腸癌細胞の細胞障害活性を有するタンパク質
【００７２】
ここで、欠失、置換、又は付加されていてもよいアミノ酸の数としては、１〜３０個が好ましく、１〜２０個が好ましく、１〜１０個が好ましく、１〜７個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましく、１〜３個が特に好ましく、１〜２個が最も好ましい。
ここで、アミノ酸配列との同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。アミノ酸配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ（参照URL：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）により求めることができる。パラメーターはたとえばscore = 100、wordlength = 12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００７３】
ここで、タンパク質が大腸癌細胞の細胞障害活性を有しているかは、タンパク質が投与又は発現された大腸癌細胞と、タンパク質が投与又は発現されていない大腸癌細胞とを比較し、タンパク質が投与又は発現された大腸癌細胞で、大腸癌細胞の細胞数が減少した場合又は増加しない場合、投与されたタンパク質が細胞障害活性を有しているといえる。例えば、大腸癌細胞が細胞死する場合も、投与されたタンパク質が細胞障害活性を有しているといえる。
【００７４】
前記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のタンパク質は、大腸癌細胞の細胞障害活性を有する範囲において、前記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のタンパク質からなるものであってもよく、また、前記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のタンパク質に他の物質が付加されたものであってもよい。他の物質としては、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、糖、糖鎖、核酸、ポリヌクレオチド等が挙げられる。
【００７５】
また、本発明の大腸癌の抗癌剤は、上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１以上のタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを有効成分として含有する。発現ベクターとしては、、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又はレンチウイルスベクター等の遺伝子治療用ベクターが挙げられる。
【００７６】
抗癌剤は、上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１以上のタンパク質のみからなるものであってもよく、その他成分と組み合わせて製剤化されてもよい。例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの各種形態が挙げられる。
【００７７】
これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤と適宜組み合わせることができる。また、大腸癌細胞の細胞障害活性を有するその他の成分が更に配合されてもよい。
【００７８】
本発明の抗癌剤を、大腸癌患者へと投与する投与方法としては、大腸癌への注射等による局所投与、経口投与、静脈注射等が挙げられる。また、大腸癌細胞の細胞障害活性を有するその他の成分と併用して投与されてもよい。
【実施例】
【００７９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８０】
アゾキシメタン（ＡＯＭ）とデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を用いたＣＡＣ発生の増強モデルにおいて、ＣＡＣの発生におけるＧｓｄｍｄの関与を評価した。
図１は、実施例におけるモデル動物の製造手順を模式的に示す概要図である。このモデルでは、マウスは変異原としてＡＯＭを注射された後、２．５％のＤＳＳ処理を繰り返し受けた。
図２は、ＡＯＭ−ＤＳＳ処理期間中のマウスの体重変化率を示したグラフである。データは、平均値±ＳＤで表される［ＷＴ，ｎ＝１８；Ｇｓｄｍｄ−／−，ｎ＝１４、＊＊ｐ＜０．０１］。最初の回のＤＳＳ処理の後、Ｇｓｄｍｄ−／−マウスは、野生型（ＷＴ）のマウスと比べて、体重の減少率の軽減を示した。
図３は、１２週間のＡＯＭ−ＤＳＳ処理の後のマウスの遠位大腸を示す写真である。ＡＯＭ注射から１２週間後、Ｇｓｄｍｄ−／−マウスでは、ＷＴのマウスと比べて、大腸癌の数が劇的に増加していた。肉眼で識別できる程度の大きさの大腸癌も多数確認された。
図４（ａ）（ｂ）は、１２週間のＡＯＭ−ＤＳＳ処理後のＷＴマウス及びＧｓｄｍｄ−／−マウスにおける、腫瘍数（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｏ．／ｍｏｕｓｅ）と、腫瘍サイズ（ｍｍ２）を示すドットプロットである。バーは平均値を表す［ＷＴ，ｎ＝１８；Ｇｓｄｍｄ−／−，ｎ＝１４；ＷＴ  ｔｕｍｏｒ，  ｎ＝９４；  Ｇｓｄｍｄ−／−  ｔｕｍｏｒ，  ｎ＝１３０］。Ｇｓｄｍｄ−／−マウスの腫瘍の発生率と腫瘍のサイズの値は、ＷＴのマウスのものと比べて優位に高かった。
図５は、ＷＴマウスとＧｓｄｍｄ−／−マウスに発生した大腸腺癌の、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された切片の画像である。病理組織学的分析により、ＷＴマウス及びＧＳＤＭＤ−／−マウスの両方で、ＡＯＭ−ＤＳＳ処理によって腺癌が誘導されたことがわかる。
これらの結果から、Ｇｓｄｍｄが欠損すると、大腸炎関連性大腸癌の発生が、増加することが示された。ＧｓｄｍｄはＣＡＣにおける腫瘍の発生及び腫瘍の成長において、明確な役割を果たすことが示された。
【００８１】
ＷＴとＧｓｄｍｄ−／−のマウスとのあいだで、腫瘍の成長に違いがみられたため、各マウスにおいて１０〜２０ｍｍ２のサイズの範囲にある大腸癌の腫瘍を選び、腫瘍の細胞増殖及びアポトーシスについて調べた。
図６（ａ）（ｂ）は、ＷＴ及びＧｓｄｍｄ−／−マウスのＣＡＣにおける、ＢｒｄＵの取り込み、及びｃｌｅａｖｅｄ  Ｃａｓｐａｓｅ−３（Ｃａｓｐ３）の結果を示す図である。データは、平均値±ＳＤで表される［ｎ＝３、＊＊ｐ＜０．０１］。ＷＴとＧｓｄｍｄ−／−マウスの腫瘍とで、ＢｒｄＵを取り込んだ細胞の比率の違いは見られなかった。一方で、ｃｌｅａｖｅｄ  Ｃａｓｐａｓｅ−３の検出により識別されたアポトーシス細胞の数は、ＷＴマウスに比べ、Ｇｓｄｍｄ−／−マウスで有意に減少していた。これらの結果から、腫瘍の発生において、Ｇｓｄｍｄは細胞増殖ではなくアポトーシスを特異的に促進させることが示された。
【００８２】
２つの主要なシグナルカスケードであるＮＦ−κＢシグナリングとＳｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ３  （Ｓｔａｔ３）シグナリングパスウェイの活性化が、ＣＡＣの発生に重要であるとの報告がされてきた。そこで、それらのシグナリングが、Ｇｓｄｍｄ−／−マウスの腫瘍において影響されているかどうかを、免疫組織化学的解析及び免疫ブロットにより調べた。
図７（ａ）は、ＷＴマウス及びＧｓｄｍｄ−／−マウスから得られた大腸腺癌に対する、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ１（ｐ−Ｓｔａｔ１）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ３（ｐ−Ｓｔａｔ３）及びｐｈｏｓｐｈｏ−Ｉｋｋβ（ｐ−ＩＫＫβ）の免疫組織化学的検査の結果を示す画像である。図７（ｂ）は、記載のタンパク質に対する、ＷＴ及びＧｓｄｍｄ−／−マウスから得られた大腸腺癌のライセートに対する免疫ブロットの結果を示す画像である。各腫瘍（Ｔ）は別々の個体から得られた同サイズの腫瘍である。
ＷＴとＧｓｄｍｄ−／−マウスとでは、ＮＦ−κＢシグナリングとＳｔａｔ３シグナリングに目立った違いは観察されなかった。一方、アポトーシス細胞の減少と一致して、Ｇｓｄｍｄ−／−マウスの腫瘍では、リン酸化されたＳｔａｔ１の量も減少していた。つまり、ＡＯＭ−ＤＳＳ処理されたＧｓｄｍｄ−／−マウスは、ＣＡＣのアポトーシスが減少しており、ＳＴＡＴ１シグナリングがダウンレギュレーションされていた。このことは、腫瘍細胞において、ＧｓｄｍｄがアポトーシスとＳｔａｔ１シグナリングを制御していることを示している。
【００８３】
腫瘍の発生率の増加は、ＤＳＳ処理によって誘導された急性炎症に対する感受性によるものと推測した。この可能性を検証するため、マウスを２．５％ＤＳＳで７日間処理し、その後Ｈ２Ｏを与えて３日間飼育し、急性炎症を誘導した。図８は、実施例における急性炎症処理の手順を模式的に示す概要図である。
図９は、ＤＳＳ処理期間中のマウスの体重変化率を示したグラフである。データは、平均値±ＳＤで表される［ＷＴ，ｎ＝５；Ｇｓｄｍｄ−／−，ｎ＝５、＊＊ｐ＜０．０１］。確かに、ＤＳＳ処理されたＧｓｄｍｄ−／−マウスは、ＷＴのマウスと比べて有意な体重の減少率の軽減を示した。
【００８４】
図１０（ａ）は、急性炎症処理後の組織学的解析の結果を示す画像であり、図１０（ｂ）はその組織学的スコアを示すグラフである。［ＷＴ，ｎ＝５；Ｇｓｄｍｄ−／−，ｎ＝５、＊＊ｐ＜０．０１］。図１１は、急性炎症処理後のＷＴマウス及びＧｓｄｍｄ−／−マウスの腸の長さの値を示すグラフである。図１２は、急性炎症処理後のＷＴマウス及びＧｓｄｍｄ−／−マウスの腸の組織学的解析の結果を示す画像である。炎症による腸の長さの収縮の程度はＧｓｄｍｄ−／−マウスにおいて低減されていた。組織学的解析によれば、Ｇｓｄｍｄ−／−マウスでは、ＷＴのマウスと比較して、急性炎症による大腸組織の破壊の程度は、期待のとおり中程度であった。
【００８５】
図１３及び図１４（ａ）（ｂ）は、ＷＴ及びＧｓｄｍｄ−／−マウスの大腸の炎症部位における、ｃｌｅａｖｅｄ−Ｃａｓｐａｓｅ３  （Ｃａｓｐ−３）及びｐ−Ｓｔａｔ１に対する免疫組織学的解析の結果を示す画像である。ＡＯＭ−ＤＳＳ処理を受けたマウスのＣＡＣと同様、ＤＳＳ処理されたＧｓｄｍｄ−／−マウスでも、アポトーシス細胞とＳｔａｔ１活性の低下が確認された。この結果は、Ｇｓｄｍｄの欠損により炎症反応が弱められたことを支持している。このことから、Ｇｓｄｍｄの機能は、炎症への応答におけるＳｔａｔ１の働きに付随し、アポトーシスを制御するものであることが示唆された。
【００８６】
Ｇｓｄｍｄ−／−マウスにおける炎症反応の低減の根底にあるパスウェイ又は遺伝子を知るため、無処置の大腸に対してマイクロアレイ解析を行った。１３の遺伝子が２倍以上の発現増加しており、１５の遺伝子が３倍以上の発現低下していることが判明した。
急性炎症が生じた大腸及びＣＡＣを用い、無処置の大腸において顕著に発現抑制された遺伝子と、炎症性サイトカインの発現レベルとを、リアルタイム定量ＰＣＲを用いて調べた。
図１５及び図１６は、図に記載の遺伝子に対するリアルタイム定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。値はＲｐｓ１８遺伝子の発現量に対する相対値である。図１５及び１６中、（Ｄ０）は無処置の大腸の結果を表し、（Ｄ７＋３）は７日間ＤＳＳ処理し、その後３日間Ｈ２Ｏを与えて飼育したマウスの急性炎症の大腸の結果を表し、（ＡＯＭＤＳＳ）は図１に示す手順によるＡＯＭ及びＤＳＳ処置による大腸腺癌の結果を表す［＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１］。
Ｇｓｄｍｄ−／−マウスにおけるＬｙ６遺伝子の発現低下が、一貫して、急性炎症が生じた大腸及びＣＡＣの両方で検出された。これらの発現データからは、ＧｓｄｍｄはＬｙ６遺伝子の遺伝子制御に関与することが、少なくとも示唆された。Ｌｙ６遺伝子は、ＧＰＩアンカー型の細胞表面糖タンパク質をコードしており、Ｌｙ６遺伝子の発現は、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）の刺激に応答して、Ｓｔａｔ１がＬｙ６のプロモーターに直接結合することによって誘導されることが知られている（Flanagan,  K. et al. Intestinal epithelial cell up-regulation of LY6 molecules during colitis results in enhanced chemokine secretion. J Immunol 180, 3874-81 (2008)、及びKhan, K. D. et al. Induction of the Ly-6A/E gene by interferon alpha/beta and gamma requires a DNA element to which a tyrosine-phosphorylated 91-kDa protein binds. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 6806-10 (1993)）。Ｉｆｎｇの発現は、Ｇｓｄｍｄ−／−の無処置の大腸において増加しており、一方で、Ｌｙ６の発現は低下していた。
【００８７】
上記の結果から、Ｇｓｄｍｄの欠損は、ＩＦＮγ刺激への不応答をもたらすものであり、ＩＦＮγ応答遺伝子の発現低下を引き起こすものと仮定した。ＩＦＮγが、Ｓｔａｔ１の活性化を介し、直接Ｃａｓｐ−１遺伝子の発現を誘導することは、よく知られている。この仮説を検証するため、ＩＦＮγの処理の有無による、ＷＴとＧｓｄｍｄ−／−マウスの脾細胞におけるＣａｓｐ−１の遺伝子発現を比較した。
図１７（ａ）（ｂ）は、Ｇｓｄｍｄ遺伝子と、Ｃａｓｐ１遺伝子に対するリアルタイム定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。値は、Ｒｐｓ１８遺伝子の発現量に対する相対値である［＊＊ｐ＜０．０１］。ＷＴマウスでは、ＩＦＮγ処理によりＣａｓｐ−１の発現が劇的に発現上昇していた。一方Ｇｓｄｍｄ−／−マウスでは、そのようなＣａｓｐ−１の発現上昇は観察されなかった。これらのデータから、ＧｓｄｍｄはＩＦＮγ−Ｓｔａｔ１シグナリングを制御していることが示された。
【００８８】
図１６に示されるように、Ｇｓｄｍｄ−／−マウスでは、アレルギーに関連が知られるＩＬ−２５、ＩＬ−３３、ＩＬ−４の発現が、それぞれ上記（Ｄ０）、（Ｄ７＋３）、（ＡＯＭＤＳＳ）の条件において、ＷＴのマウスと比較して有意に増加していた。
【００８９】
次に、患者から得られた大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ）の検体における、ＧＳＤＭＤの発現を調べた。
図１８（ａ）（ｂ）は、大腸癌患者の大腸の正常領域と癌領域の検体の組織学的解析の結果を示す画像と、そのＩＨＣの染色強度のスコアを示すグラフである［＊＊ｐ＜０．０１］。興味深いことに、ヒトのＣＡＣにおいては、ＧＭＤＭＤタンパク質の発現はほとんど抑制されていた。
図１９は、マウスの正常な大腸上皮と、急性炎症処理を受けたＣＡＣのモデルマウスの大腸上皮の組織学的解析の結果を示す画像である。マウスにおいて、Ｇｓｄｍｄは同様に大腸上皮の先端部で発現していた。ヒトの大腸癌の検体での場合と同様に、ＣＡＣのモデルマウスにおいても、Ｇｓｄｍｄタンパク質の減少がみられた。これらのデータは、ＧＳＤＭＤの発現はＣＡＣの進行に密接に関連していることを示している。
【００９０】
Ｇｓｄｍｄは、カスパーゼ１（Ｃａｓｐ−１）により切断され、Ｇｓｄｍｄタンパク質のＮ末端部分が、マクロファージ等において、炎症に関連した細胞死、パイロトーシスを誘導することが知られている（非特許文献３，４）。Ｇｓｄｍｄはカスパーゼ１（Ｃａｓｐ−１）の基質として機能するが、今回示したデータからは、ＧｓｄｍｄはＣａｓｐ−１の制御因子としても機能することが示唆された。
【００９１】
ヒトＧＳＤＭＤタンパク質のＮ末端側部分であり、配列番号３で表されるアミノ酸配列における、第１アミノ酸〜第２７５アミノ酸配列からなるタンパク質をヒトＧＳＤＭＤ−Ｎと名付けた。
ヒトＧＳＤＭＤ−ＮをコードするＤＮＡ配列をｐｃＤＮＡベクターに挿入し、得られた発現ベクターをヒト大腸ガン（colon carcinoma）由来の細胞株（Ｃｏｌｏ−３２０）に導入し、ＧＳＤＭＤ−ＮにＭｙｃ−Ｈｉｓタグペプチドが連結されたタンパク質を発現させた。
【００９２】
ヒトＧＳＤＭＤタンパク質のＣ末端側部分であり、配列番号３で表されるアミノ酸配列における、第２７６アミノ酸〜第４８４アミノ酸配列からなるタンパク質をヒトＧＳＤＭＤ−Ｃと名付けた。
ヒトＧＳＤＭＤ−ＣをコードするＤＮＡ配列をｐｃＤＮＡベクターに挿入し、得られた発現ベクターをヒト大腸ガン（colon carcinoma）由来の細胞株（Ｃｏｌｏ−３２０）に導入し、ＧＳＤＭＤ−ＣにＭｙｃ−Ｈｉｓタグペプチドが連結されたタンパク質を発現させた。
【００９３】
コントロールとして、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）をコードするＤＮＡ配列をｐｃＤＮＡベクターに挿入し、得られた発現ベクターをヒト大腸ガン（colon carcinoma）由来の細胞株（Ｃｏｌｏ−３２０）に導入し、ＧＦＰにＭｙｃ−Ｈｉｓタグペプチドが連結されたタンパク質を発現させた。
【００９４】
結果を図２０に示す。ＧＳＤＭＤ−Ｎを導入されたｃｏｌｏ−３２０細胞では、膨潤（ｓｗｅｌｌｉｎｇ）・破裂（ｂｕｒｓｔ）した細胞が観察された。ＧＳＤＭＤ−Ｃが導入されたｃｏｌｏ−３２０細胞、及びＧＦＰが導入されたｃｏｌｏ−３２０細胞では導入の影響は認められなかった。
これらの結果から、ヒトＧＳＤＭＤ―Ｎタンパク質の導入により、細胞死が誘導されることが明らかとなった。
【００９５】
以下、上記の実施例における、実験方法、及び使用された各種材料の詳細を記載する。
【００９６】
（マウス）
Ｇｓｄｍｄ  ノックアウト（Ｇｓｄｍｄ−／−）マウスは、既報（非特許文献２）に記載のとおり作製し、Ｃ５７ＢＬ／６系統のバックグラウンドに戻し交配したものである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは日本クレアから購入し、使用したすべてのマウスは、６〜８週齢の雄である。全ての動物実験は、順天堂大学静岡病院の実験動物委員会の承認を受けた。
ターゲッティングベクターは、ｐＬｏｘＦＮＦＤＴプラスミドにコンストラクトした。ｐＬｏｘＦＮＦＤＴプラスミドは、推定プロモーター領域及びＥｘｏｎ  １−２、３’末端に１つのｌｏｘＰサイトを含むｐｇｋ−Ｎｅｏｒカセットからなる８．９Ｋｂの長さのｌｏｎｇ  ａｒｍと、Ｅｘｏｎ  ３−４からなる１．４ｋｂの長さのｓｈｏｒｔ  ａｒｍと、Ｄｉｐｈｔｅｒｉａｔｏｘｉｎ−Ａフラグメントカセットと、を含む。ここでは、コンディショナル又はコンベンショナルなＧｓｄｍｄ遺伝子の破壊を目的とし、上記のｌｏｎｇ  ａｒｍのＥｘｏｎ  １の１．９５  ｋｂ上流に追加のｌｏｘＰサイトを導入したものを用いた。ターゲッティングベクターは、Ｉ−ＳｃｅＩで直線化し、その後（Ｂ６×ＣＢＡ／Ｊ）Ｆ１マウス由来のＴＴ２  胚性幹（ＥＳ）細胞へとエレクトロポレーションした。相同組み換えのため、Ｇ４１８耐性のＥＳコロニーをＰＣＲにより選抜し、陽性のクローンを８細胞期胚と凝集させて代理の雌に移植した。生殖細胞系列への伝達が確認された雌のキメラマウスは、Ｂ６及びＣＡＧ−Ｃｒｅ  トランスジェニックマウスとかけあわせた。ノックアウトアリルのヘテロ接合体（Ｇｓｄｍｄ＋／−）が得られ、それらを交雑させてホモ接合体（Ｇｓｄｍｄ−／−）を作製した。
【００９７】
（生検組織）
ヒトの大腸癌の生検組織は、順天堂大学静岡病院で治療を受けた患者から得たものである。実験は、順天堂大学静岡病院の倫理委員会の承認を受けた。
【００９８】
（大腸癌の誘発）
大腸癌の誘発は、既報（Neufert, C. et al. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc 2, 1998-2004 (2007)）の方法に基づき行った。マウスに、腹腔内に体重１ｋｇあたり１０ｍｇのアゾキシメタン（ＡＯＭ）を注入した。次いで、マウスを２．５％でデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を含む飲用水にて１週間飼育し、その後、通常の水で３週間飼育した。当該ＤＳＳ処理サイクルを２度行った。大腸組織の採取と、腫瘍の評価は、ＡＯＭ注入から１２週間後に行った。大腸の腫瘍は実態顕微鏡で観察し、評価した。
【００９９】
（急性炎症の誘発）
マウスを、２．５％ＤＳＳを含む飲用水にて１週間飼育した後、通常の水に切り替えて、飼育した。通常の水に切り替えてから３日後に、マウスから大腸組織を採取した。
【０１００】
（組織学実験）
大腸組織は、パラフィン包埋の前に、ホスファターゼインヒビター及びパラホルムアルデヒド４％を含む固定液で、４℃で一晩固定した。脱パラフィン処理された切片（５μｍｍ）に対し、ヘマトキシリン・エオシン染色、又は免疫組織化学処理を行った。免疫組織化学処理に際しては、切片は０．０１Ｍのクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）で１０５℃、１５分間処理した後、室温で２時間放置した。
使用した一次抗体を、以下に示す：
Anti-Cleaved Caspase-3 (Asp175) (1:800, #9664, Cell signaling technology), 
anti-Phospho-Stat1 (Ser727) (1:800, #8826, Cell signaling technology), 
anti-Phospho-Stat3 (Tyr705) (1:600, #9145, Cell signaling technology),
anti-Phospho-IKK a/b (Ser176/180) (1:150, #2697, Cell signaling technology),
anti-GSDMD (1:50, #3F12-1B2, Abnova),
anti-GSDMD (1:50, orb37999, biorbyt)
これらの抗体の検出は、適切な二次抗体を使用し、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｋｉｔ  （Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と、ペルオキシダーゼの基質としてＤＡＢ（Ｓｉｇｍａ）と、を用いて可視化した。
【０１０１】
（細胞増殖の定量）
マウスの腹腔内に、２時間前に体重１ｋｇあたり１００ｍｇのＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ）注入した。ＢｒｄＵが取り込まれた細胞を検出するため、脱パラフィン処理した切片を、２Ｎ  ＨＣｌに３７℃で３０分間処理した。その後、切片をＰＢＳで洗浄した後、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２度洗浄した。さらに切片を０．１％トリプシンで３７℃３分間処理した後、洗浄した。ＢｒｄＵが取り込まれた細胞の免疫学的検出は、上記のａｎｔｉ−ＢｒｄＵ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。
【０１０２】
（イムノブロッティング）
組織を、低温の低浸透圧溶解バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＫＣｌ，０．５ｍＭ  ＤＴＴ，０．０５％  ＮＰ−４０）にプロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉ，Ｒｏｃｈｅ）及びｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｉｈｉｂｉｔｏｒｓ（ＰｈｏｓＳＴＯＰ，Ｒｏｃｈｅ）を加えた溶液中で溶解し、４℃において３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られた上清は、細胞質画分として使用した。得られたペレットは、抽出バッファー（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，  １．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５ｍＭ  ＤＴＴ，２６％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に再懸濁してホモジナイズし、氷上で３０分間静置した後、４℃、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清を核画分として用いた。タンパク質の濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）付属の指示書に沿って求めた。各レーンに、等量に調整された各タンパク質のサンプルを加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロースに転写し、イムノブロットを行った。
使用した抗体を、以下に示す：
anti-Phospho-Stat1 (Ser727) (1:800), 
Stat1(1:1000, #9172, Cell signaling technology),
anti-Phospho-Stat3 (Tyr705) (1:2000),
anti-Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (1:1000,#3033, Cell signaling technology),
anti-NF-κB p65 (1:1000,#8242, Cell signaling technology),
anti-Caspase-1 (1:1000, #06-503, Millipore),
anti-b-Actin (1:1000, #8242, Cell signaling technology),
anti-Caspase-1 (1:1000, #06-503, Millipore)
タンパク質のバンドは、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＧＥ  Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ  Ｊａｐａｎ）を用いてケミルミネッセンスにより可視化した。
【０１０３】
（大腸上皮炎症の形態学的基準によるスコアリング）
以下の４つの形態学的特徴に対し、盲検的に、総合スコアを用いた形態学的スコアリングを行った。炎症（スコア０：正常、スコア１：粘膜固有層に限局した炎症細胞、スコア２：粘膜下層にまで及んだ炎症細胞、スコア３：凝集と粘膜下層の拡大が認められる炎症細胞）、形態（スコア０：正常、スコア１：杯状細胞の減少、スコア２：腸陰窩の散在、スコア３：腸陰窩の消失）、潰瘍形成（スコア０：存在せず、スコア１：存在する）、リンパ濾胞（スコア０：存在せず、スコア１：存在する）。各形態学的特徴について、重み付けされたスコアの総合を、フィールドのパーセンテージの合計により算出した（０％：０、０．１〜２５％：１、２６〜５０％：２、５１〜７５％：３、７６〜１００％：４）。スコアの範囲は０〜４０である。
【０１０４】
（大腸上皮炎症の形態学的基準によるスコアリング）
染色強度及びフィールドの割合に対し、盲検的に、総合スコアを用いたスコアリングを行った。強い強度の染色をスコア３とし、中程度の染色をスコア２とし、弱い染色をスコア１とし、陰性のものをスコア０とした。
各染色強度について、重み付けされたスコアの総合を、フィールドのパーセンテージの合計により算出した（０％：０、０．１〜２５％：１、２６〜５０％：２、５１〜７５％：３、７６〜１００％：４）。スコアの範囲は０〜１６である。
【０１０５】
（遺伝子発現解析）
マイクロアレイ解析に、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）処理された大腸組織から、ＲＮＡｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。アレイは、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０  ａｒｒａｙを用いた。ＲＮＡの増幅産物は、製品に添付のプロトコルに沿って合成した。データは、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で解析した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ解析のため、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いてＤｎａｓｅ処理されたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５００ｎｇから、ｃＤＮＡを合成した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ定量ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（ＴａＫａＴａ）を使用し、ＳＹＢＲ  ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて行った。
【０１０６】
（大腸からの腸上皮細胞及びリンパ球の単離）
腸上皮細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ（ＩＥＣｓ））及びリンパ球は、既報（Weigmann, B. et al. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nat Protoc 2, 2307-11 (2007)）の記載に沿って、単離した。大腸は長軸方向に開き、脂肪組織及びデブリ除去のため、冷やしたＰＢＳで数回洗浄した。大腸を５ｍｍの断片に切断し、３７℃で１５分間、ＨＢＳＳ（５％  ＦＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ添加されたもの）中でインキュベートし、上皮細胞を分離した。ボルテックスの後、培地を含んだ組織片を、１００μｍのセルストレーナーを通過させた。通過した画分を遠心分離し、腸上皮細胞（ＩＥＣｓ）を集めた。セルストレーナー上に残った組織片を、ＰＢＳ（５％  ＦＢＳ、１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｔｙｐｅ  ＶＩＩＩ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＤｎａｓｅＩ添加されたもの）で、さらに３７℃、４５分間培養した。ボルテックスの後、セルストレーナーで濾過し、パーコール（ＧＥ  ｈｅｌｔｈｃａｒｅ）を用いて密度勾配遠心により、粘膜固有層単核細胞（ＬＰＭＣｓ）を濃縮した。
【０１０７】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【図１】
0006745450.tif 000002
【図２】
0006745450.tif 000003
【図３】
0006745450.tif 000004
【図４】
0006745450.tif 000005
【図５】
0006745450.tif 000006
【図６】
0006745450.tif 000007
【図７】
0006745450.tif 000008
【図８】
0006745450.tif 000009
【図９】
0006745450.tif 000010
【図１０】
0006745450.tif 000011
【図１１】
0006745450.tif 000012
【図１２】
0006745450.tif 000013
【図１３】
0006745450.tif 000014
【図１４】
0006745450.tif 000015
【図１５】
0006745450.tif 000016
【図１６】
0006745450.tif 000017
【図１７】
0006745450.tif 000018
【図１８】
0006745450.tif 000019
【図１９】
0006745450.tif 000020
【図２０】
0006745450.tif 000021
【配列表】
0006745450000001.app