(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロウイルス感染に対する免疫原を生産する方法であって、
（ａ）ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞の第一培養物においてコクサッキーウイルスＡ６（ＣＶＡ６）のウイルス粒子を生産し、ＣＶＡ６感染に対する免疫原としての量で、前記第一培養物から前記ＣＶＡ６ウイルス粒子を収集するステップ；または
（ｂ）ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞の第二培養物においてコクサッキーウイルスＡ１０（ＣＶＡ１０）のウイルス粒子を生産し、ＣＶＡ１０感染に対する免疫原としての量で、前記第二培養物から前記ＣＶＡ１０ウイルス粒子を収集するステップ；または
（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）を行うステップ
を含む、方法。
【請求項２】
多価免疫原性組成物を形成するために前記ＣＶＡ６ウイルス粒子および前記ＣＶＡ１０ウイルス粒子を組み合わせるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多価免疫原性組成物を形成するために前記ＣＶＡ６ウイルス粒子もしくは前記ＣＶＡ１０ウイルス粒子または両方をＣＶＡ６およびＣＶＡ１０以外のエンテロウイルスＡの追加的なウイルス粒子と組み合わせるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０以外のエンテロウイルスＡは、コクサッキーウイルスＡ２（ＣＶＡ２）、コクサッキーウイルスＡ３（ＣＶＡ３）、コクサッキーウイルスＡ４（ＣＶＡ４）、コクサッキーウイルスＡ５（ＣＶＡ５）、コクサッキーウイルスＡ７（ＣＶＡ７）、コクサッキーウイルスＡ８（ＣＶＡ８）、コクサッキーウイルスＡ１２（ＣＶＡ１２）、コクサッキーウイルスＡ１４（ＣＶＡ１４）、コクサッキーウイルスＡ１６（ＣＶＡ１６）、エンテロウイルスＡ７１（ＥＶＡ７１）、エンテロウイルスＡ７６（ＥＶＡ７６）、エンテロウイルスＡ８９（ＥＶＡ８９）、エンテロウイルスＡ９０（ＥＶＡ９０）、エンテロウイルスＡ９１（ＥＶＡ９１）、エンテロウイルスＡ９２（ＥＶＡ９２）、エンテロウイルスＡ１１４（ＥＶＡ１１４）およびエンテロウイルスＡ１１９（ＥＶＡ１１９）からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０以外のエンテロウイルスＡは、ＣＶＡ１６およびＥＶＡ７１ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記追加的なウイルス粒子は、ＨＥＫ２９３細胞の第三培養物から生産および収集される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＶＡ６またはＣＶＡ１０ウイルス粒子は、精製もしくは不活性化または両方がさらに行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記精製は、ショ糖勾配ゾーン超遠心分離によって行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記不活性化は、ホルマリン処理によって行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記追加的なウイルス粒子は、精製および／または不活性化される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
エンテロウイルス感染に対する多価免疫原性組成物を調製する方法であって、
（ａ）ＨＥＫ２９３細胞の第一培養物においてＣＶＡ６のウイルス粒子を生産し、前記第一培養物から前記ＣＶＡ６ウイルス粒子を収集するステップと；
（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞の第二培養物においてＣＶＡ１０のウイルス粒子を生産し、前記第二培養物から前記ＣＶＡ１０ウイルス粒子を収集するステップと；
（ｃ）ＨＥＫ２９３細胞の第三培養物においてＣＶＡ１６のウイルス粒子を生産し、前記第三培養物から前記ＣＶＡ１６ウイルス粒子を収集するステップと；
（ｄ）ＨＥＫ２９３細胞の第四培養物においてＥＶＡ７１のウイルス粒子を生産し、前記第四培養物から前記ＥＶＡ７１ウイルス粒子を収集するステップと；
（ｅ）前記多価免疫原性組成物を形成するために、前記ＣＶＡ６ウイルス粒子、前記ＣＶＡ１０ウイルス粒子、前記ＣＶＡ１６ウイルス粒子、および前記ＥＶＡ７１ウイルス粒子を組み合わせるステップと
を含む方法。
【請求項１２】
前記ＣＶＡ６ウイルス粒子、前記ＣＶＡ１０ウイルス粒子、前記ＣＶＡ１６ウイルス粒子、および前記ＥＶＡ７１ウイルス粒子は、精製および不活性化される、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテロウイルス感染に対する免疫原としてのウイルス粒子およびヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を使用することにより同ウイルス粒子を生産する方法に関する。本発明は、ヒトに使用するためのエンテロウイルス感染に対する免疫原性組成物、およびエンテロウイルス感染またはそれによって引き起こされる疾患、特に手足口病（ＨＦＭＤ）に対する免疫応答を誘導する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）のエンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）は、プラス鎖ＲＮＡを含む小さなノンエンベロープウイルスの属である。エンテロウイルス属は現在、エンテロウイルスＡ型（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  Ａ）、エンテロウイルスＢ型（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  Ｂ）、エンテロウイルスＣ型（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  Ｃ）、エンテロウイルスＤ型（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  Ｄ）、エンテロウイルスＥ型（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  Ｅ）、エンテロウイルスＦ型（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  Ｆ）、エンテロウイルスＧ型（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  Ｇ）、エンテロウイルスＨ型（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  Ｈ）、エンテロウイルスＪ型（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  Ｊ）、ライノウイルスＡ型（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  Ａ）、ライノウイルスＢ型（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  Ｂ）、およびライノウイルスＣ型（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  Ｃ）の１２の種を含む。これらのウイルスは腸管に感染するが、様々なタイプの疾患を引き起こしうる。典型的なエンテロウイルス疾患は、髄膜炎、麻痺、心筋炎、手足口病（ＨＦＭＤ）、ヘルパンギーナ、胸膜痛、肝炎、発疹、および肺炎を含む呼吸器疾患である。ヒトに用いられる唯一のエンテロウイルスワクチンは、エンテロウイルスＣ型に属するポリオウイルスのワクチンである。現在では、非ポリオエンテロウイルスに対するワクチンは、ヒトに使用するには入手不可能である。
【０００３】
エンテロウイルスは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、タンパク質コード領域、３’ＵＴＲを含むＲＮＡゲノムを有し、可変長ポリＡトラクトが３’末端の端に位置する。ＲＮＡゲノムサイズは７．４Ｋｂｐであり、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がポリタンパク質をコードする。ポリタンパク質は、３つの領域、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３に細分される。Ｐ１は４つのウイルス構造タンパク質ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１をコードする一方で、Ｐ２およびＰ３は７つの非構造タンパク質２Ａ〜２Ｃおよび３Ａ〜３Ｄをコードする。コクサッキーウイルス（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ）は、Ａ群の２３種類の血清型（１〜２２、２４）およびＢ群の６種類の血清型（１〜６）に分けられる（非特許文献１）。最近、ヒトスカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）が、ＥＶ７１およびＣＶＡ１６感染の重要な受容体として同定された（非特許文献２）。
【０００４】
Ｔａｉｗａｎ  Ｓｅｎｔｉｎｅｌ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅに基づき、台湾において主要なエンテロウイルス血清型の疫学が系統的に検査され、エンテロウイルス感染がモニタリングされた（非特許文献３）。この情報は、流行するエンテロウイルス血清型、特に主に手足口病（ＨＦＭＤ）として現れるＣＶＡ１６およびＥＶ７１が毎年様々であることを示す。ＣＶＡ１６およびＥＶ７１と対照的に、Ｅ３０、Ｅ６、Ｅ１１、ＣＢ３、ＣＢ４、ＣＢ５、ＣＶＡ４、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０を含む他の一般的に広まる血清型が２０００〜２００５年の間にＨＦＭＤの流行を引き起こしたことが特定された。この研究は、公衆衛生に重要な影響を持つこれらの血清型の繰り返される周期的な流行パターンも示す。これらの異なる遺伝子型および／または血清型サブグループの間にいかなるレベルの交差防御が存在するかは不明である（非特許文献３）。Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｔａｉｗａｎからのデータによれば、２００１〜２００８年の台湾において、ＣＶＡ１６およびＥＶ７１に加えてＣＶＡ６が通常上位５つの最も一般的なエンテロウイルス血清型に含まれる（非特許文献４）。
【０００５】
シンガポールでは、２００１〜２００７年の間にＣＶＡ６および／もしくはＣＶＡ１０またはＣＶＡ１６によって非ＥＶ７１ＨＦＭＤ活性のいくつかの高いピークが引き起こされたことが分かった（非特許文献５）。主な血清型はＣＶＡ１０（３９．９％）およびＣＶＡ６（２８％）であり、次いでＣＶＡ１６（１７．５％）およびＥＶ７１（６．３％）であった。スペインでは、２０１０〜２０１２年の間にＨＦＭＤの幾度かの流行および散発があった。患者のうち５３人（６６％）においてエンテロウイルスが検出された。最も多い遺伝子型はＣＶＡ６であり、次いでＣＶＡ１６およびＥＶ７１であったが、他の少数の遺伝子型も特定された。興味深いことに、２０１０年の間には、ＣＶＡ１６が最初はＨＦＭＤの唯一の原因病原体であったが、年末までにＣＶＡ６が優勢になり、２０１１年の間にはＣＶＡ１６は検出されなかった。しかし２０１２年には、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１６の両方が同時に広まった。２０１２年の間にはＥＶ７１がＨＦＭＤ症状に関連したのは３件の症例のみであった（非特許文献６）。台湾で近年ＣＶＡ６  ＨＦＭＤの流行が生じ、一部の患者はＨＦＭＤの後に爪甲脱落症および落屑が見られた（非特許文献７）。現在の疫学的結果を見ると、ＨＦＭＤの最も一般的な病原体はＣＶＡ１６、ＥＶ７１、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０である（非特許文献８）。
【０００６】
ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０が感染の間に神経疾患を引き起こす傾向は低いが、これらのウイルスはエリトマトーデス、口腔の内疹および爪甲脱落症を誘発しうる。従来技術によって、ホルマリン不活性化ＥＶ７１ワクチンが開発されている（非特許文献９および非特許文献１０）が、これらはＣＶＡ１６感染に対しては保護効果がないことが分かっている（非特許文献１１）。ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０に関しては、ヒト用ワクチン生産のためにウイルス粒子を増殖させるための適切な細胞系を報告する従来技術文献はない。
【０００７】
特許文献１は、弱毒化突然変異を保つ能力が向上された、ワクチンまたはベクターとしての使用のための修正されたウイルスゲノムを提供する。特許文献２は、精製されたＥＶ７１ウイルスＢ型およびＣ型ならびにＣｏｘＡ１６ウイルスを不活性化することによって得られる手足口病ワクチンを開示する。特許文献３は、ＥＶ７１感染に対する免疫原性組成物（例えばワクチン）および関連の方法を提供する。
【０００８】
エンテロウイルスＡ、特にＣＶＡ６もしくはＣＶＡ１０またはその両方に対するワクチン候補を開発する必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第９９／５３０３４号
【特許文献２】国際公開第２０１０１３９１９３（Ａ１）号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１２００４５４６８（Ａ１）号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｋｉｎｐｅ  ＤＭ．およびＨｏｗｌｅｙ  ＰＭ著、（２００１年）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．第４版、第１８章
【非特許文献２】Ｙａｍａｙｏｓｈｉ  Ｓ、Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｙ、Ｌｉ  Ｊ、Ｈａｎａｇａｔａ  Ｎ、Ｍｉｎｏｗａ  Ｔ、Ｔａｋｅｍｕｒａ  Ｔ、Ｋｏｉｋｅ  Ｓ著、（２００９年）Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂ２  ｉｓ  ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ７１．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１５（７）：７９８‐８０１．
【非特許文献３】Ｔｓｅｎｇ  ＦＣ、Ｈｕａｎｇ  ＨＣ、Ｃｈｉ  ＣＹ、Ｌｉｎ  ＴＬ、Ｌｉｕ  ｃｃ、Ｊｉａｎ  ＪＷ、Ｈｓｕ  ＬＣ、Ｗｕ  ＨＳ、Ｙａｎｇ  ＪＹ、Ｃｈａｎｇ  ＹＷ、Ｗａｎｇ  ＨＣ、Ｈｓｕ  ＹＷ、Ｓｕ  ＩＪ、Ｗａｎｇ  ＪＲ著、（２００７年）Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｔａｉｗａｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ２０００  ａｎｄ  ２００５：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｎｔｉｎｅｌ  ｐｈｙｓｉｃｉａｎ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｄａｔａ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．７９（１２）：１８５０‐６０．
【非特許文献４】Ｌｏ  ＳＨ、Ｈｕａｎｇ  ＹＣ、Ｈｕａｎｇ  ＣＧ、Ｔｓａｏ  ＫＣ、Ｌｉ  ＷＣ、Ｈｓｉｅｈ  ＹＣ、Ｃｈｉｕ  ＣＨ、Ｌｉｎ  ＴＹ著、（２０１１年）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  Ａ６  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｉｎ  ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｔａｉｗａｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ２００４  ａｎｄ  ２００９．Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ．４４（４）：２５２‐７．
【非特許文献５】Ａｎｇ  ＬＷ、Ｋｏｈ  ＢＫ、Ｃｈａｎ  ＫＰ、Ｃｈｕａ  ＬＴ、Ｊａｍｅｓ  Ｌ、Ｇｏｈ  ＫＴ著、（２００９年）Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｈａｎｄ，ｆｏｏｔ  ａｎｄ  ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，２００１‐２００７．Ａｎｎ  Ａｃａｄ  Ｍｅｄ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ．３８（２）：１０６‐１２．
【非特許文献６】Ｃａｂｒｅｒｉｚｏ  Ｍ、Ｔａｒｒａｇｏ  Ｄ、Ｍｕｎｏｚ‐Ａｌｍａｇｒｏ  Ｃ、Ｄｅｌ  Ａｍｏ  Ｅ、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ‐Ｇｉｌ  Ｍ、Ｅｉｒｏｓ  ＪＭ、Ｌｏｐｅｚ‐Ｍｉｒａｇａｙａ  Ｉ、Ｐｅｒｅｚ  Ｃ、Ｒｅｉｎａ  Ｊ、Ｏｔｅｒｏ  Ａ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｉ、Ｅｃｈｅｖａｒｒｉａ  ＪＥ、Ｔｒａｌｌｅｒｏ  Ｇ著、（２０１３年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ７１，ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  Ａ１６  ａｎｄ  Ａ６  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈａｎｄ，ｆｏｏｔ  ａｎｄ  ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｓｐａｉｎ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ．２０１３年８月２４日．
【非特許文献７】Ｗｅｉ  ＳＨ、Ｈｕａｎｇ  ＹＰ、Ｌｉｕ  ＭＣ、Ｔｓｏｕ  ＴＰ、Ｌｉｎ  ＨＣ、Ｌｉｎ  ＴＬ、Ｔｓａｉ  ＣＹ、Ｃｈａｏ  ＹＮ、Ｃｈａｎｇ  ＬＹ、Ｈｓｕ  ＣＭ著、（２０１１年）Ａｎ  ｏｕｔｂｒｅａｋ  ｏｆ  ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  Ａ６  ｈａｎｄ，ｆｏｏｔ，ａｎｄ  ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｏｎｙｃｈｏｍａｄｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｔａｉｗａｎ，２０１０．ＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２０１１年１２月１４日；１１：３４６．
【非特許文献８】Ｋａｍｉｎｓｋａ  Ｋ、Ｍａｒｔｉｎｅｔｔｉ  Ｇ、Ｌｕｃｃｈｉｎｉ  Ｒ，Ｋａｙａ  Ｇ、Ｍａｉｎｅｔｔｉ  Ｃ著、（２０１３年）Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  Ａ６  ａｎｄ  Ｈａｎｄ，Ｆｏｏｔ  ａｎｄ  Ｍｏｕｔｈ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｔｈｒｅｅ  Ｃａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｏｆ  Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｃｈｉｌｄ‐ｔｏ‐Ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ａｄｕｌｔ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ．
【非特許文献９】Ｃｈｏｕ  ＡＨ、Ｌｉｕ  ｃｃ、Ｃｈａｎｇ  ＪＹ、Ｊｉａｎｇ  Ｒ、Ｈｓｉｅｈ  ＹＣ、Ｔｓａｏ  Ａ、Ｗｕ  ＣＬ、Ｈｕａｎｇ  ＪＬ、Ｆｕｎｇ  ＣＰ、Ｈｓｉｅｈ  ＳＭ、Ｗａｎｇ  ＹＦ、Ｗａｎｇ  ＪＲ、Ｈｕ  ＭＨ、Ｃｈｉａｎｇ  ＪＲ、Ｓｕ  ＩＪ、Ｃｈｏｎｇ  Ｐ著、Ｆｏｒｍａｌｉｎ‐ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＥＶ７１  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｒｏｓｓ‐ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｕｂｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  Ｂ１，Ｂ４，Ｂ５  ａｎｄ  Ｃ４Ａ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３年；８（１１）：ｅ７９７８３．
【非特許文献１０】Ｚｈｕ他著、２０１３年
【非特許文献１１】Ｃｈｏｎｇ他著、２０１２年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、エンテロウイルスをヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞で培養することによって、エンテロウイルスＡ、特にＣＶＡ６またはＣＶＡ１０のウイルス粒子を生産する技術を開発する。ＨＥＫ２９３細胞におけるウイルス粒子の収率は、特にベロ細胞を使用する従来技術と比較して予想外に高く、エンテロウイルス感染に対する免疫応答を誘導するのに有効である。このように生産されたウイルス粒子は、有効な免疫原として使用でき、エンテロウイルス感染に対する免疫原性組成物を、特にヒト用に調製するのに有用である。
【００１２】
一態様では、本発明は、エンテロウイルス感染に対する免疫原を生産する方法であって、
（ａ）ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞の第一培養物においてコクサッキーウイルス（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ）Ａ６（ＣＶＡ６）のウイルス粒子を生産し、第一培養物からＣＶＡ６ウイルス粒子を収集するステップ、または
（ｂ）ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞の第二培養物においてコクサッキーウイルスＡ１０（ＣＶＡ１０）のウイルス粒子を生産し、第二培養物からＣＶＡ１０ウイルス粒子を収集するステップ、または
（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）を行うステップ
を含む、方法を提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、ＣＶＡ６ウイルス粒子もしくはＣＶＡ１０ウイルス粒子または両方を含む、エンテロウイルス感染に対する免疫原性組成物を提供する。
【００１４】
エンテロウイルス感染またはそれによって引き起こされる疾患に対するヒト用ワクチンを製造するための、本明細書に記載される免疫原性組成物の使用も提供される。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、エンテロウイルス感染に対する免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載されるＣＶＡ６ウイルス粒子もしくはＣＶＡ１０ウイルス粒子または両方を含む有効量の免疫原性組成物を必要な対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１６】
一部の実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞の培養物から生産および収集されたＣＶＡ６ウイルス粒子およびＣＶＡ１０ウイルス粒子は、多価免疫原性組成物を形成するために一緒に組み合わされる。
【００１７】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＶＡ６ウイルス粒子およびＣＶＡ１０ウイルス粒子は、多価免疫原性組成物を形成するためにＣＶＡ６およびＣＶＡ１０以外のエンテロウイルスＡの追加的なウイルス粒子とさらに組み合わされる。
【００１８】
一部の実施形態では、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０以外のエンテロウイルスＡは、コクサッキーウイルスＡ２（ＣＶＡ２）、コクサッキーウイルスＡ３（ＣＶＡ３）、コクサッキーウイルスＡ４（ＣＶＡ４）、コクサッキーウイルスＡ５（ＣＶＡ５）、コクサッキーウイルスＡ７（ＣＶＡ７）、コクサッキーウイルスＡ８（ＣＶＡ８）、コクサッキーウイルスＡ１２（ＣＶＡ１２）、コクサッキーウイルスＡ１４（ＣＶＡ１４）、コクサッキーウイルスＡ１６（ＣＶＡ１６）、エンテロウイルスＡ７１（ＥＶＡ７１）、エンテロウイルスＡ７６（ＥＶＡ７６）、エンテロウイルスＡ８９（ＥＶＡ８９）、エンテロウイルスＡ９０（ＥＶＡ９０）、エンテロウイルスＡ９１（ＥＶＡ９１）、エンテロウイルスＡ９２（ＥＶＡ９２）、エンテロウイルスＡ１１４（ＥＶＡ１１４）、およびエンテロウイルスＡ１１９（ＥＶＡ１１９）からなる群より選択される。
【００１９】
ある実施例では、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０以外のエンテロウイルスＡは、ＣＶＡ１６およびＥＶ７１ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２０】
ある実施例では、本発明によるウイルス粒子は、ＨＥＫ２９３細胞の培養物から生産および収集される。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明のウイルス粒子は、細胞培養物から収集された後、精製および／または不活性化される。
【００２２】
一部の実施形態では、精製は、ショ糖勾配ゾーン超遠心分離によって行われる。
【００２３】
一部の実施形態では、不活性化は、ホルマリン処理によって行われる。
【００２４】
本発明によるＨＥＫ２９３細胞の培養物から生産されるエンテロウイルスＡのウイルス粒子に対する抗体も提供される。
【００２５】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細が以下の説明に記載される。本発明の他の特徴または利点は、以下のいくつかの実施形態の詳細な説明、および添付の特許請求の範囲から明らかになる。
【００２６】
以上の概要および以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面と合わせて読めばよりよく理解される。本発明を例示するために、図面には現在好ましい実施形態が示される。しかし、本発明は図示された正確な準備および手段に制限されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＲＤおよびベロ細胞培養物がＣＶＡ６、ＣＶＡ１０、ＣＶＡ１６およびＥＶ７１に感染することを示した図である（感染後５日）。
【図２】ＣＶＡ６またはＣＶＡ１０またはＣＶＡ１６またはＥＶ７１のいずれかに感染させたベロ細胞培養物において発現されたウイルスタンパク質の、ドットブロットアッセイによるモノクローナル抗体（Ｎ１およびＭＡＢ９７９）を用いた検出を示した図である。
【図３】ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０の両方がＨＥＫ２９３細胞だけに感染したことを示した図である（感染後６日）。
【図４】（Ａ）はショ糖勾配ゾーン超遠心分離によるＣＶＡ６ウイルス精製を示した図である。（Ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析される各画分の銀染色を示した図である。
【図５】（Ａ）はショ糖勾配ゾーン超遠心分離によるＣＶＡ１０ウイルス精製を示した図である。（Ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析される各画分の銀染色を示した図である。
【図６】ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０の空粒子（６Ａおよび６Ｂ）と、ホルマリン不活性化した完全粒子（６Ｃおよび６Ｄ）のいくつかの不規則な二十面体粒子構造体が類似していたことを示した図である。
【図７】ＣＶＡ６、ＣＶＡ１０およびＥＶＡ７１ウイルス粒子のタンパク質バンドを示した図である。
【図８】ドットブロッティングアッセイによるウイルスとマウス抗血清との間の認識を示した図である。４つのホルマリン不活性化ウイルス粒子（ＣＶＡ６、ＣＶＡ１０、ＣＶＡ１６およびＥＶ７１）を、ドットブロッティングのためにニトロセルロースメンブレン上に直接落とした。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
別段の定めがない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【００２９】
本発明は、コクサッキーウイルス株ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０が、ＥＶＡ７１およびＣＶＡ１６と異なり、ベロ細胞、ＭＲＣ−５細胞およびＭＤＣＫ細胞等のヒト用ワクチン生産において使用される細胞系に感染しないが、その一方でこれらのウイルス（ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０）がＨＥＫ２９３細胞で良好に複製したという予想外の発見に少なくとも部分的に基づく。ウイルス力価（ｖｉｒｕｓ  ｔｉｔｌｅ）は、１０６〜１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌに達しうる。したがって、本発明者らは世界で初めてＨＥＫ２９３細胞で増殖させた様々なＣＶ株の生産、精製および特徴付けを記載し、ひいてはＨＥＫ２９３細胞においてエンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）Ａ、特にＣＶＡ６およびＣＶＡ１０のウイルス粒子を生産する技術を提供する。本発明のウイルス粒子は、有効な免疫原として使用でき、ＣＶＡ６もしくはＣＶＡ１０またはその両方を含むか、または例えばＣＶＡ１６またはＥＶＡ７１などのＣＶＡ６またはＣＶＡ１０以外のエンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）Ａをさらに含むエンテロウイルス感染に対する免疫原性組成物を、特にヒト用に調製するのに有用である。
【００３０】
本明細書の説明および請求項の全体にわたって、「含む」という語およびこの語のバリエーションの「含んでいる」や「含んだ」等は、「含むが限定されない」の意味であり、例えば、他の添加物、成分、整数またはステップを排除することを意図していない。
【００３１】
本明細書において使用されるところの、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈から別段の指定がない限り、複数の参照物も含む。
【００３２】
本明細書において使用されるところの、種エンテロウイルスＡは、以下の血清型を含む：コクサッキーウイルスＡ２（ＣＶＡ２）、コクサッキーウイルスＡ３（ＣＶＡ３）、コクサッキーウイルスＡ４（ＣＶＡ４）、コクサッキーウイルスＡ５（ＣＶＡ５）、コクサッキーウイルスＡ６（ＣＶＡ６）、コクサッキーウイルスＡ７（ＣＶＡ７）、コクサッキーウイルスＡ８（ＣＶＡ８）、コクサッキーウイルスＡ１０（ＣＶＡ１０）、コクサッキーウイルスＡ１２（ＣＶＡ１２）、コクサッキーウイルスＡ１４（ＣＶＡ１４）、コクサッキーウイルスＡ１６（ＣＶＡ１６）、エンテロウイルスＡ７１（ＥＶＡ７１）、エンテロウイルスＡ７６（ＥＶＡ７６）、エンテロウイルスＡ８９（ＥＶＡ８９）、エンテロウイルスＡ９０（ＥＶＡ９０）、エンテロウイルスＡ９１（ＥＶＡ９１）、エンテロウイルスＡ９２（ＥＶＡ９２）、エンテロウイルスＡ１１４（ＥＶＡ１１４）、およびエンテロウイルスＡ１１９（ＥＶＡ１１９）。
【００３３】
本明細書において使用されるところの、「ウイルス粒子」という用語は、空粒子、完全粒子またはサブ粒子を含みうる、完全にまたは部分的に組み立てられたウイルスのカプシドを意味することができる。
【００３４】
本明細書において使用されるところの、「空粒子」という用語は、核酸、ベクターまたはプラスミドを含まない、したがって感染性のないウイルス粒子を指す。
【００３５】
本明細書において使用されるところの、「完全粒子」という用語は、遺伝物質および４つのカプシドタンパク質（すなわちＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４）を含むウイルス粒子を指す。一般に、ＶＰ１は分子量が３２〜３５ｋＤａ（配列番号４、５または６）、ＶＰ２は分子量が２４〜２８ｋＤａ（配列番号７、８または９）、ＶＰ３は分子量が２４〜２８ｋＤａ（配列番号１０、１１または１２）、ＶＰ４は分子量が６〜８ｋＤａ（配列番号１３、１４または１５）である。
【００３６】
本明細書において使用されるところの、「サブ粒子」という用語は、ウイルス空粒子の非感染性サブ粒子を指す。特に、サブ粒子は、完全粒子と異なるカプシドタンパク質組成物を有するウイルス粒子を指す。例えばサブ粒子は、（１）ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４より少ないカプシドタンパク質を含むことができ、（２）ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４より多くのカプシドタンパク質を含むことができ、および／または（３）１つ以上の完全にプロセシングされていないカプシドタンパク質を含むことができる。
【００３７】
本明細書において使用されるところの、「抗原」とは、液性および／または細胞性抗原特異的応答を生じる宿主の免疫系を刺激する１つ以上のエピトープを含む粒子または分子を指す。「抗原」という用語は、「免疫原」と互換可能に使用される。適切な細胞と接触した結果、抗原は、感受性または免疫応答状態を誘導し、感作対象の抗体または免疫細胞とｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで明白な様式で反応する。抗原は、生物中の抗体によって特異的に認識され、結合されることができる。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に関連する抗原も、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）の表面上の受容体によって認識および結合されることができ、これによりＴ細胞の活性化が生じる。本明細書において使用されるところの、「エピトープ」という用語は、特定の抗体分子またはＴ細胞受容体が結合する抗原上の部位を指す。この用語は、本明細書において「抗原決定基」または「抗原決定基部位」と互換可能に使用される。
【００３８】
本明細書において使用されるところの、「免疫応答」または「免疫原性応答」という用語は、対象における抗原に応答する免疫系の任意の反応を指す。脊椎動物における免疫応答の例には、抗体産生、細胞性免疫の誘導および補体活性化が含まれるがこれに限定されない。同じ抗原による後続の刺激に対する免疫応答は、二次免疫応答とも呼称されるが、一次免疫応答の場合より急速である。「免疫原性」という用語は、宿主動物における１つの抗原または複数の抗原に対する免疫応答を生み出す能力をいう。この免疫応答が、特定の感染性生物に対するワクチンによって誘起される防御免疫の基礎を形成する。
【００３９】
本明細書において使用されるところの、「抗体」という用語は、特定のアミノ酸配列を有し、抗原または密接に関係する抗原群だけに結合する免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子の少なくとも１つの免疫学的に活性な部分を指す。抗体の例には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥが含まれる。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例には、抗体をペプシン等の酵素で処理することによって生成されうるＦａｂおよびＦ（ａｂ）’２フラグメントが含まれる。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でありうる。「モノクローナル抗体」とは、抗原結合部位を一種のみ含み、特定のエピトープと免疫反応できる抗体分子集団をいう。「ポリクローナル抗体」とは、抗原結合部位を複数種含み、ポリペプチド上の複数のエピトープと免疫反応できる抗体分子集団をいう。
【００４０】
本明細書において使用されるところの、「アジュバント」という用語は、それ自体は特定の抗原性効果を有しないが、免疫系を刺激し、免疫原性組成物に対する免疫応答を増加させることができる、ワクチン等の免疫原性組成物に加えられる物質を指す。アジュバントの例は、ミョウバン沈殿物、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル−リピドＡ／トレハロースジコリノミコラートアジュバント、コリネバクテリウムパルヴムおよびｔＲＮＡを含む油中水乳剤、ならびに、リポソーム、リポ多糖（ＬＰＳ）、抗原の分子ケージ、細菌細胞壁成分、ならびに二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド含有ＤＮＡ等のエンドサイトーシスされた核酸を含む進化的に保存された分子の特定のセットを摸倣することによって免疫応答を増加させるタスクを達成するその他の物質を含むが、これらに限定されない。他の例は、コレラトキシン、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定エンテロトキシン、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、免疫刺激配列オリゴデオキシヌクレオチド、および水酸化アルミニウムを含む。組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達を促進するポリマーも含みうる。Ａｕｄｒａｎ他、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：１２５０−５，２００３年、およびＤｅｎｉｓ−Ｍｉｚｅ他、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２５：１２−２０，２００３年参照。あるいは、本明細書に記載される抗原は、アジュバントを用いずにワクチンで使用されることもできる。
【００４１】
本明細書において使用されるところの、「有効量」という用語は、所望の効果を与える量を指し、所望の効果は、任意に治療効果または予防効果である。例えば、有効量は、そのレシピエントにおいて病原体（例えばエンテロウイルス）に対する免疫応答を生成または誘導するのに十分な活性薬剤の量である。治療上有効量は、投与経路および頻度、当該医薬品を受ける個体の体重および種、ならびに投与目的等の様々な理由より変動しうる。当業者は、本明細書の開示、確立された方法、および自身の経験に基づいて各場合における投与量を決定しうる。
【００４２】
一態様では、本発明は、エンテロウイルス感染に対する免疫原を生産する方法であって、
（ａ）ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞の第一培養物においてコクサッキーウイルスＡ６（ＣＶＡ６）のウイルス粒子を生産し、第一培養物からＣＶＡ６ウイルス粒子を収集するステップ、または
（ｂ）ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞の第二培養物においてコクサッキーウイルスＡ１０（ＣＶＡ１０）のウイルス粒子を生産し、第二培養物からＣＶＡ１０ウイルス粒子を収集するステップ、または
（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）を行うステップ
を含む方法を提供する。
【００４３】
特に、ＨＥＫ２９３細胞においてウイルス粒子を生産するために、細胞を所望のエンテロウイルスに接触させ、その結果ＨＥＫ２９３細胞のウイルス感染が生じる。感染細胞を、ウイルス粒子の生産を可能にするのに十分な期間培養する。それから、このように生産されたウイルス粒子が収集され、これがエンテロウイルス感染に対する免疫原として働きうる。より具体的には、感染の前に、培養から約３〜７日後に約１０５〜１０６細胞／ｍＬの密度に達するまで細胞を培養し、それから細胞を、約１０−２〜１０−５のＭＯＩ（感染多重度）でウイルスに感染させ、約３〜７日間培養する。それからウイルス粒子を培養上清から採取および収集し、濃縮、精製および／または不活性化等の次の手順を行う。
【００４４】
一部の実施形態では、細胞培養は無血清培地で行われる。
【００４５】
一部の実施形態では、細胞培養は、ローラボトル、セルファクトリおよび／またはバイオリアクタで行われる。
【００４６】
特に、本発明の方法は、多価免疫原性組成物を形成するためにＣＶＡ６ウイルス粒子およびＣＶＡ１０ウイルス粒子を組み合わせるステップをさらに含む。
【００４７】
一部の実施形態では、本発明の方法は、多価免疫原性組成物を形成するためにＣＶＡ６ウイルス粒子もしくはＣＶＡ１０ウイルス粒子または両方をＣＶＡ６およびＣＶＡ１０以外のエンテロウイルスＡの追加的なウイルス粒子と組み合わせるステップを含む。
【００４８】
ある実施形態では、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０以外のエンテロウイルスＡは、コクサッキーウイルスＡ２（ＣＶＡ２）、コクサッキーウイルスＡ３（ＣＶＡ３）、コクサッキーウイルスＡ４（ＣＶＡ４）、コクサッキーウイルスＡ５（ＣＶＡ５）、コクサッキーウイルスＡ７（ＣＶＡ７）、コクサッキーウイルスＡ８（ＣＶＡ８）、コクサッキーウイルスＡ１２（ＣＶＡ１２）、コクサッキーウイルスＡ１４（ＣＶＡ１４）、コクサッキーウイルスＡ１６（ＣＶＡ１６）、エンテロウイルスＡ７１（ＥＶＡ７１）、エンテロウイルスＡ７６（ＥＶＡ７６）、エンテロウイルスＡ８９（ＥＶＡ８９）、エンテロウイルスＡ９０（ＥＶＡ９０）、エンテロウイルスＡ９１（ＥＶＡ９１）、エンテロウイルスＡ９２（ＥＶＡ９２）、エンテロウイルスＡ１１４（ＥＶＡ１１４）およびエンテロウイルスＡ１１９（ＥＶＡ１１９）からなる群より選択される。
【００４９】
ある実施形態では、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０以外の追加的なウイルス粒子のエンテロウイルスＡは、ＣＶＡ１６およびＥＶ７１ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００５０】
特定の実施形態では、ＣＶＡ６もしくはＣＶＡ１０または他のエンテロウイルスＡのウイルス粒子は、ＨＥＫ２９３細胞の培養物から生産される。特に、これらの異なるエンテロウイルスのウイルス粒子は、ＨＥＫ２９３細胞の個別の培養物から別々に生産されて収集され、それから多価免疫原性組成物を形成するために、収集されたウイルス粒子が一緒に組み合わせられる。
【００５１】
１つのある実施形態では、本発明は、エンテロウイルス感染に対する多価免疫原性組成物を調製する方法であって、
（ａ）ＨＥＫ２９３細胞の第一培養物においてＣＶＡ６のウイルス粒子を生産し、第一培養物からＣＶＡ６ウイルス粒子を収集するステップと、
（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞の第二培養物においてＣＶＡ１０のウイルス粒子を生産し、第二培養物からＣＶＡ１０ウイルス粒子を収集するステップと、
（ｃ）ＨＥＫ２９３細胞の第三培養物においてＣＶＡ１６のウイルス粒子を生産し、第三培養物からＣＶＡ１６ウイルス粒子を収集するステップと、
（ｄ）ＨＥＫ２９３細胞の第四培養物においてＥＶＡ７１のウイルス粒子を生産し、第四培養物からＥＶＡ７１ウイルス粒子を収集するステップと、
（ｅ）多価免疫原性組成物を形成するために、ＣＶＡ６ウイルス粒子、ＣＶＡ１０ウイルス粒子、ＣＶＡ１６ウイルス粒子、およびＥＶＡ７１ウイルス粒子を組み合わせるステップと
を含む方法を提供する。
【００５２】
一部の実施例では、各タイプのエンテロウイルスのウイルス粒子は、実質的に等しい重量比で組み合わせられる。例えば、本発明の多価免疫原性組成物は、ＣＶＡ６ウイルス粒子、ＣＶＡ１０ウイルス粒子、ＣＶＡ１６ウイルス粒子およびＥＶＡ７１ウイルス粒子の４つのタイプのエンテロウイルスのウイルス粒子を、約１：１：１：１の重量比で含むことができる。比率は、必要に応じて調節されることができる。
【００５３】
「多価免疫原性組成物」という用語は、２つ以上のウイルス株または血清型に対して特異的な免疫応答を生じるように宿主の免疫応答を刺激することができることを意味する。
【００５４】
一部の実施形態では、ＣＶＡ６もしくはＣＶＡ１０ウイルス粒子または他のウイルス粒子（例えばＣＶＡ１６またはＥＶＡ７１ウイルス粒子）は、精製もしくは不活性化または両方がさらに行われる。
【００５５】
一部の実施形態では、精製は、液体クロマトグラフィ精製、ショ糖勾配超遠心精製またはこれらの組み合わせによって行われる。精製は、ショ糖勾配超遠心精製によって行われるのが好ましい。ショ糖勾配超遠心精製において１０〜６０％のショ糖密度勾配が使用されるのがより好ましい。
【００５６】
特に、ウイルスの完全粒子の画分、空粒子の画分および／またはサブ粒子の画分を得るために精製が行われる。
【００５７】
一部の実施形態では、完全粒子の画分は、３５〜４５％のショ糖勾配で特定されることができる。
【００５８】
一部の実施形態では、空粒子の画分は、２５〜３５％のショ糖勾配で特定されることができる。
【００５９】
一部の実施形態では、サブ粒子の画分は、２５％未満のショ糖勾配で特定されることができる。
【００６０】
一部の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、（ｉ）ＣＶＡ６の完全粒子の画分、空粒子の画分、サブ粒子の画分またはこれらの任意の組み合わせ、（ｉｉ）ＣＶＡ１０の完全粒子の画分、空粒子の画分、サブ粒子の画分またはこれらの任意の組み合わせ、（ｉｉｉ）ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０以外のエンテロウイルスＡ（例えばＣＶＡ１６またはＥＶＡ７１）の完全粒子の画分、空粒子の画分、サブ粒子の画分またはこれらの任意の組み合わせ、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含むことができる。
【００６１】
特定の実施形態では、ウイルスのサブ粒子の画分は通常除去されることができ、完全粒子の画分および空粒子の画分が収集される。
【００６２】
一部の実施形態では、エンテロウイルスの空粒子は、ウイルスの組み立ておよびパッケージングの間に完全にプロセシングされていないＰ１ポリペプチドを有し、６５〜９５ｋＤａの分子量を有することが検出される。一部の実施形態では、エンテロウイルスの完全粒子は、ＶＰ１（３２〜３５ｋＤａ）、ＶＰ２（２４〜２８ｋＤａ）、ＶＰ３（２４〜２８ｋＤａ）およびＶＰ４（６〜８ｋＤａ）を有することが検出される。
【００６３】
特に、収集されたウイルス粒子は、例えばホルマリン処理によって不活性化される。ある実施例では、ホルムアルデヒドでの処理は、約２０〜４５℃で２〜２０日間である。
【００６４】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、精製されたエンテロウイルス粒子の量を決定するステップをさらに含む。
【００６５】
上述の免疫原または組成物の有効量は、非経口的に、例えば皮下注射または筋肉注射で投与されうる。あるいは、坐薬および経口製剤を含む他の投与様式が望ましいこともある。坐薬の場合、結合剤および担体は、例えばポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドを含みうる。経口免疫原または組成物は、医薬品等級のサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常用いられる賦形剤を含みうる。これらの免疫原または組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放製剤または粉末の形をとる。
【００６６】
本発明の免疫原または免疫原性組成物から調製されるワクチンは、投与製剤に適した様式で、治療上有効で、保護的かつ免疫原性を有する量で投与されうる。投与される量は、例えば個体の免疫系が抗体を合成し、必要な場合には細胞性免疫応答を生じる能力を含め、治療される対象による。投与が必要な活性成分の正確な量は、医師の判断による。しかし、適切な投与量範囲は当業者が容易に決定可能であり、本発明のポリペプチドのマイクログラムのオーダーでありうる。初回投与および追加用量に関する適切な投与計画も可変的であるが、初回投与とそれに続く後続投与とを含みうる。ワクチンの投与量は、投与経路にも依存し、宿主の大きさによっても変化する。
【００６７】
公知技術の方法によってウイルスに感染しやすい対象（特に幼児）を特定し、本発明の組成物を投与しうる。組成物の用量は、例えば、具体的な抗原、アジュバントが同時投与されるか否か、同時投与されるアジュバントのタイプ、投与の様式および頻度に依存し、当業者が決定しうる。投与は、当業者の決定で必要に応じて繰り返されうる。例えば、プライミング用量の後に、週１回の間隔で３回の追加用量が続きうる。追加接種が初回免疫化の４〜８週間後に行われ、８〜１２週目に同じ製剤を使用して二回目の追加接種が行われうる。組成物により誘起されたウイルスに対する免疫応答を試験するため、対象から血清またはＴ細胞がとられうる。タンパク質または感染に対する抗体または細胞障害性Ｔ細胞のアッセイの方法は、公知技術である。必要に応じてさらなる追加接種が行われうる。ポリペプチド／タンパク質の量、組成物の用量、および投与頻度を変化させることによって、最大限の免疫応答を誘起するために免疫化プロトコルが最適化されうる。大規模投与の前に、有効性試験が望ましい。有効性試験においては、ヒト以外の対象（例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ、ブタ、ウシまたはサル）に、経口または非経口経路で本発明の組成物が投与されうる。初回投与の後または任意の追加投与の後に、組成物の有効性を試験するために、試験対象および（偽投与を受けた）対照対象の両方がウイルスに曝されうる。
【００６８】
さらなる実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、薬学的に許容可能なアジュバントをさらに含む。アジュバントは、リン酸アルミニウムを含むのが好ましい。
【００６９】
別の態様では、本発明は、有効量の本発明の免疫原または免疫原性組成物を必要な対象に投与するステップを含む、エンテロウイルス感染に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００７０】
ある実施形態では、エンテロウイルス感染は、コクサッキーウイルスＡ２（ＣＶＡ２）、コクサッキーウイルスＡ３（ＣＶＡ３）、コクサッキーウイルスＡ４（ＣＶＡ４）、コクサッキーウイルスＡ５（ＣＶＡ５）、コクサッキーウイルスＡ６（ＣＶＡ６）、コクサッキーウイルスＡ７（ＣＶＡ７）、コクサッキーウイルスＡ８（ＣＶＡ８）、コクサッキーウイルスＡ１０（ＣＶＡ１０）、コクサッキーウイルスＡ１２（ＣＶＡ１２）、コクサッキーウイルスＡ１４（ＣＶＡ１４）、コクサッキーウイルスＡ１６（ＣＶＡ１６）、エンテロウイルスＡ７１（ＥＶＡ７１）、エンテロウイルスＡ７６（ＥＶＡ７６）、エンテロウイルスＡ８９（ＥＶＡ８９）、エンテロウイルスＡ９０（ＥＶＡ９０）、エンテロウイルスＡ９１（ＥＶＡ９１）、エンテロウイルスＡ９２（ＥＶＡ９２）、エンテロウイルスＡ１１４（ＥＶＡ１１４）およびエンテロウイルスＡ１１９（ＥＶＡ１１９）からなる群より選択されるエンテロウイルスＡによって引き起こされる。
【００７１】
本明細書で用いられるところの「対象」とは、ヒトまたはヒト以外の哺乳類である。ヒト以外の哺乳類には、霊長類、有蹄類、イヌおよびネコが含まれるがこれらに限定されない。
【００７２】
特に、本発明の方法は、エンテロウイルス感染に対する防護効果を提供すること、したがってエンテロウイルス感染によって生じる疾患、特に手足口病（ＨＦＭＤ）を予防または治療するのに有効である。
【００７３】
前述の配列のうちの１つを有するペプチドまたは本明細書に記載されるウイルス粒子に選択的に結合する単離された抗体も提供される。上述の免疫原または免疫原性組成物で動物を免疫化するステップであって、これにより動物において抗体を生産する免疫応答が誘起される、ステップと、動物から抗体または抗体を産生する細胞を単離するステップによって、抗体を生産する方法がさらに提供される。
【実施例】
【００７４】
本研究では、コクサッキーウイルス株ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０が、ＥＶ７１およびＣＶＡ１６と異なり、ベロ細胞、ＭＲＣ−５細胞およびＭＤＣＫ細胞等のヒト用ワクチン生産において使用される細胞系に感染しないことが分かる。これに対し、これらのウイルス（ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０）は、ＨＥＫ２９３細胞において良好に複製した。したがって、本発明者らは世界で初めてＨＥＫ２９３細胞で増殖させた様々なＣＶ株の生産、精製および特徴付けを記載する。感染に１０−２〜１０−５の感染多重度（ＭＯＩ）を使用したときには、ＣＶウイルス力価は、感染後６日以内に１ｍＬあたり＞１０６組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）であることが分かった。採取したウイルス濃縮物をショ糖勾配ゾーン超遠心分離により精製すると、２つのＣＶウイルス画分が分離、検出された。２５〜３５％ショ糖画分で検出されたウイルス粒子は、ウイルス感染力およびＲＮＡ含有量が低かった。３５〜４５％ショ糖画分から得られたウイルス粒子は、ウイルス感染力およびＲＮＡ含有量が高いことが分かり、４つのウイルスタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４）からなることが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で示された。これらの２つのウイルス画分をホルマリン不活性化し、感染性粒子画分は、ＣＶ株特異的中和抗体応答を誘導できることがマウス免疫原研究で分かった。しかし、これらの抗血清は、ＥＶ７１およびＣＶＡ１６は中和できなかった。一方で、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０の両方の感染性粒子または非感染性粒子を接種したウサギは、中和抗体応答を生成できたが、これらの抗体もＥＶ７１およびＣＶＡ１６感染を中和できなかった。これらの結果は、エンテロウイルスの異なる血清型（ｄｉｆｆｅｒ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ）間の交差反応が弱く、有用かつ強力な多価エンテロウイルスワクチンとして開発し混合するために様々なウイルスからの組成物が必要であることを示唆する。
【００７５】
材料および方法
倫理的記載
全ての実験を、ＮＨＲＩのＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒのガイドラインに従って行った。動物使用プロトコルは、ＮＨＲＩ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって検証、承認されている（承認プロトコルＮｏ．ＮＨＲＩ−ＩＡＣＵＣ−０９８０３３−Ａ、ＮＨＲＩ−ＩＡＣＵＣ−１０１０４２−ＡおよびＮＨＲＩ−ＩＡＣＵＣ−１０１０５０−ＡＣ）。
【００７６】
細胞、培地およびウイルス
ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）によって得る。アフリカミドリザル腎臓（ベロ）、ＭＤＣＫおよび横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞は、Ｔａｉｗａｎ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｔａｉｗａｎ  ＣＤＣ）またはＮＨＲＩ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｅｎｔｅｒから提供を受けた。オリジナル細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得る。これらの細胞系を培養するために、本発明者らは、ＶＰ−ＳＦＭ、ダルベッコ改変イーグル培地＋１０％ＦＢＳおよび他の適切な無血清培地を使用する。Ｔａｉｗａｎ  ＣＤＣから、ＥＶ７１ウイルスの臨床単離株、Ｅ５９株（遺伝子型Ｂ４）を得た。Ｔａｉｗａｎ  ＣＤＣまたはＪｅｎ−Ｒｅｎ  Ｗａｎｇ教授（ＮＣＫＵ）からＣＶＡ６、ＣＶＡ１０およびＣＶＡ１６単離株を得た。感染ＲＤ細胞の上清から感染後３日（ＤＰＩ）でＣＶＡ６、ＣＶＡ１０およびＣＶＡ１６ウイルスストックを収集する。ＴＣＩＤ５０アッセイによりウイルスストックの力価を決定し、これらのストックを−８０℃で保管する。ＲＤ細胞はヒト用ワクチン生産用でないため、ベロおよびＭＤＣＫ細胞系に感染できなかったＣＶＡ６およびＣＶＡ１０を増殖させるためにＧＭＰグレード認定ＨＥＫ２９３細胞系を用いた。抽出したウイルスＲＮＡを、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用して増幅した。本発明において使用されるオリゴヌクレオチドプライマ配列は、合理的に設計され、テキストで利用できる。増幅したＤＮＡを、ＡＢＩ３７３０ＸＬ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて配列決定した。ＶＰ１のヌクレオチド配列および本明細書に報告される４つ全ての構造ウイルスタンパク質のアミノ酸配列が、テキストで報告されている。
【００７７】
ウイルス培養
エンテロウイルス（ＥＶ７１、ＣＶＡ１６、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０）を、ベロ細胞またはＨＥＫ２９３細胞で、無血清ＶＰ−ＳＦＭ培地、ダルベッコ改質イーグル培地＋１０％ＦＢＳおよび他の適切な無血清培地を使用してＴフラスコ（Ｔ−ｆｌａｋ）内で培養した。細胞密度は、培養６日後に１〜２．５×１０６細胞／ｍＬに達した。細胞を、１０−２〜１０−５のＭＯＩでウイルスに感染させた。感染後６日（ＤＰＩ）で培養上清からウイルスを採取および収集した。
【００７８】
ショ糖勾配超遠心を用いたウイルス粒子の精製
ウイルス培養上清を、Ｔフラスコ培養物から採取した。０．６５μｍフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ドイツ）を通して細胞デブリを除去し、上清を１００Ｋ  ＴＦＦカプセル（Ｐａｌｌ）で２０倍に濃縮した。Ｈｉｔａｃｈｉ  ＣＰ８０超遠心機内のゾーナルロータを用いてウイルス粗濃縮物（約５０ｍＬ）を１０〜６０％の連続ショ糖勾配上にロードし、３２，０００ｒｐｍで３時間遠心分離した。１０〜６０％のショ糖の画分を収集し（画分あたり５０ｍＬ）、ｐＨ７．４で１ＬのＰＢＳを３回交換して個別に透析し（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、台湾、台北）、４℃で保管した。精製ウイルス画分の感染力を、組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）アッセイによって評価した。画分に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析も行った。ウイルスを含むと特定された画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ１００Ｋチューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州ビレリカ）を用いてダイアフィルトレーションによって濃縮し、３，０００ｘｇで遠心分離し、４℃で保管した。精製ウイルス画分の全タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイによって決定した。精製ウイルス画分の半分（１５ｍＬ）を−８０℃で０．５ｍＬアリコートにて保管し、もう半分は１／４０００（ｖ／ｖ）ホルマリンにより３７℃で３日間不活性化し、４℃で保管した。
【００７９】
下表４および５の不活性化ＥＶ−７１粒子は、Ｌｉｕ他、ＰＬｏｓ Ｏｎｅ．６（５）：ｅ２０００５に記載のように調製し、下表４および５の不活性化ＣＶＡ１６粒子は、Ｃｈｏｎｇ他、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１２年．７（１１）：ｅ４９９７３に記載のように調製した。
【００８０】
ウイルス力価の決定
ＴＣＩＤ５０終末点（ｍｅｄｉａｎ  ｅｎｄｐｏｉｎｔ）を用いてウイルス力価を決定した。段階希釈したウイルスサンプル（１０−１〜１０−８）を９６ウェルプレートで成長させたＲＤ細胞に加え、各希釈に６つの反復試験サンプルを使用した。９６ウェルプレートを、３７℃で６日間インキュベートし、感染ＲＤ細胞の細胞変性効果（ＣＰＥ）をカウントすることによりＴＣＩＤ５０値を測定した。Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法を用いてＴＣＩＤ５０値を計算した。
【００８１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびドットブロッティング
精製ウイルス画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）において、製造者により推奨されるプロトコルにしたがって行った。ドットブロッティングでは、４つのホルマリン不活性化ウイルス粒子（ＣＶＡ６、ＣＶＡ１０、ＣＶＡ１６およびＥＶ７１）を、ＢＡ８５ニトロセルロースメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ）上に直接落とした。その後メンブレンを、４℃でＰＢＳ中５％の脱脂乳に一晩浸漬した。ＭＡＢ９７９（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）およびマウス抗ウイルス血清を、２時間室温で結合させた。その後メンブレンを、１５ｍＬのアッセイバッファで５回洗浄した。１：５，０００の希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ロバ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を含む１ｍＬのＰＢＳバッファを加えることにより、ウイルス粒子に対する各抗体の結合を検出した。室温で１時間インキュベート後、メンブレンをアッセイバッファで６回洗浄し、ドライブロットした。ＴＭＢ基質溶液（ＫＰＬ）を加えることによってドットを明らかにした。
【００８２】
動物免疫原性研究
異なる量の不活性化ウイルス粒子を、免疫化の前に、リン酸アルミニウムにより室温で３時間吸着した。６匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（生後６〜８週）の群を、０．２ｍＬ（０．５μｇ＋６０μｇミョウバン）のいずれかで筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫化した。ウサギを、０．５ｍＬ（２．５μｇ＋３００μｇミョウバン）で筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫化した。全ての動物を、プライミングの後２週間間隔で同じ用量で２回ブーストした。免疫化したマウスおよびウサギを、最終ブーストの１週後に放血させ、血清を収集してウイルス中和を分析するために用いた。
【００８３】
ウイルス中和アッセイ
免疫マウスから血清サンプルを収集し、５６℃で３０分間不活性化した。各血清サンプルをマイクロチューブに加え、新鮮な細胞培養培地で２倍に段階希釈した。それから４００μＬの２００−ＴＣＩＤ５０ウイルス懸濁液を、４００μＬの段階希釈した血清を含む各チューブに加えた。４℃で１８〜２４時間インキュベート後、１００μＬの段階希釈したサンプルを、ＲＤ細胞を含む９６ウェルプレートに加えた。９６ウェルプレート中の培養物を３７℃で７日間インキュベートし、感染細胞のＣＰＥをカウントすることによりＴＣＩＤ５０値を測定した。Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法を用いてウイルス力価の５０％減少を生じた血清希釈の逆数として５０％中和阻害量（ＩＤ５０）を計算した。
【００８４】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるウイルス粒子の特徴付け
不活性化したウイルス粒子を、ホルムバール被覆およびカーボン蒸着２００−メッシュ銅グリッド上に堆積させた。サンプルを１５分間室温で銅グリッド上に保ち、それから濾紙を用いて余分のサンプルを除去した。ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄後、銅グリッドを２％のリンタングステン酸溶液で２分間染色し、それから濾紙を用いてリンタングステン酸溶液を除去した。染色したグリッドを３〜７日間乾燥させ、ＪＥＭ−２１００Ｆ透過型電子顕微鏡下で観察した。
【００８５】
実施例１：ＨＦＭＤワクチン開発のための多価免疫原性成分の論理的根拠
無血清のベロ細胞ベースのホルマリン不活性化全ウイルスＥＶ７１ワクチンが開発、生産され、ヒト臨床試験で試験されている（Ｗｕ他、２００４年；Ｌｉｕ他、２００７年；Ｌｉｕ他、２０１１年；Ｃｈａｎｇ他、２０１２年；Ｃｈｏｕ他、２０１２年；Ｌｉ他、２０１２年；Ｃｈｅｎｇ他、２０１３年；Ｚｈｕ他、２０１３年）。驚いたことに、予想外の結果により、ＥＶ７１ワクチンが細胞培養アッセイにおいてＣＶＡ１６感染を防げないことが示された（Ｃｈｏｕ他、２０１３年）。本発明者らによるＣＶＡ１６ワクチン候補の最近の研究からも、マウスおよびウサギ抗ＣＶＡ１６抗血清がいずれもＥＶ７１を中和できないことが示された（Ｃｈｏｎｇ他、２０１２年）。これらのウイルス株（ＥＶ７１、ＣＶＡ６、ＣＶＡ１０およびＣＶＡ１６）のタンパク質配列を並べて分析すると、Ｐ１ペプチドに基づく類似率は、Ｐ１配列の６５〜８０％の類似率であることが分かる（表１）。ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０等の他の最も一般的なエンテロウイルス株によって引き起こされるＨＦＭＤを克服するために、異なるエンテロウイルス株を含むＨＦＭＤワクチンの多価免疫原性成分が緊急に必要である。
【００８６】
【表１】
0006774149.tif 000002
【００８７】
実施例２：コクサッキーウイルスＡ群株に関する新規なバイオプロセスの確立
ヒト多価ＨＦＭＤワクチン開発のための製造バイオプロセスを調査した。文献（Ｌｉｕ  他、２００７年；Ｃｈｏｕ他、２０１２年）に公開されたＥＶ７１ワクチン開発のための現在のバイオプロセスに基づくと、驚いたことに、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０はＲＤ細胞においては感染および複製するが、無血清培地で成長させたベロ細胞においては感染および複製しなかった（図１）。しかし、ＲＤ細胞はヒト用ワクチン生産用にはＨＥＫ２９３細胞ほど優れていない。表２および表３も参照。
【００８８】
【表２】
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【００８９】
ベロ細胞培養においてウイルスタンパク質が発現および生産されていないことを確認するために、２つのモノクローナル抗体（ＥＶ７１およびＣＶＡ１６のＶＰ１およびＶＰ２に対してそれぞれ特異的なＮ１およびＭＡＢ９７９）を用いて、ＣＶＡ６またはＣＶＡ１０で感染させたベロ細胞培養物中のウイルス成分を検出した。結果から、ドットブロット分析においてＣＶＡ６およびＣＶＡ１０のウイルスタンパク質が検出されないことが示された（図２）。したがって、無血清ベロ細胞ベースワクチンのコンセプトは、多価ＨＦＭＤワクチンを製造するために適用することができない。
【００９０】
実施例３：ＨＥＫ２９３細胞培養物を用いたウイルス培養
ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０はベロ細胞に感染できず、ＲＤ細胞はヒト用ワクチン生産用ではないため、ＭＤＣＫ、ＭＲＣ−５、ＣＨＯおよびＨＥＫ２９３等の他の考えられるＧＭＰグレード認定細胞系をＣＶＡ６および／またはＣＶＡ１０を増殖させるために試験し、使用した。驚いたことに、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０のいずれも、ＨＥＫ２９３細胞のみに感染した（図３）。
【００９１】
生化学的および免疫学的特徴付けのために十分なＣＶＡ６およびＣＶＡ１０を得るために、これらのウイルスをＨＥＫ２９３細胞で培養した。細胞密度は、培養の６日後に１〜２．５×１０６細胞／ｍＬに達した。細胞を１０−２〜１０−５のＭＯＩでウイルスに感染させた。感染後６日（ＤＰＩ）で細胞培養上清からウイルスを採取および収集した。表３を参照。
【００９２】
【表３】
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【００９３】
ＥＶ７１がＨＥＫ２９３細胞に感染したときには、ウイルス力価は０．５〜１．６×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬに達した。
【００９４】
結果に基づき、製造バイオプロセスは、懸濁液バイオリアクタ、マイクロキャリアバイオリアクタおよびウェーブバイオリアクタを含むいくつかのバイオリアクタシステムを使用しうる。
【００９５】
実施例４：ショ糖勾配ゾーン超遠心分離によるＣＶウイルス粒子精製
７ＤＰＩまたは８ＤＰＩで培養上清からウイルスを採取および収集した。０．６５μｍおよび０．２２μｍメンブレンを通じたマイクロフィルトレーションによって細胞デブリを除去し、タンジェンシャルフローフィルタ（ＴＦＦ）カセット内の１００ｋＤａカットオフダイアフィルトレーションメンブレンを用いてウイルスバルクを２０倍に濃縮した。それから濃縮されたウイルスバルクを、ゾーナルロータを用いて１０〜６０％の連続ショ糖勾配上にロードし、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＣＰ８０超遠心機において３２，０００ｒｐｍで３時間遠心分離した。ショ糖勾配画分を収集し、図４および５に示すように、感染力ＲＤ細胞（ウイルスＴＣＩＤ５０）アッセイおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。図４Ａおよび５ＡにＣＶＡ６およびＣＶＡ１０につきそれぞれ示すように、ウイルス抗原を含む第一領域は画分１０〜１６にあり、これは２５〜３５％のショ糖を含み、感染力が低いかまたは無いことがＴＣＩＤ５０アッセイで決定された。生化学的特性、ウイルス特性、免疫学的特性に基づき、これらのウイルス粒子を偽／欠損ウイルス粒子または空粒子と定義した。ウイルスタンパク質を含む第二領域は、感染性ウイルス画分１７〜２２内に同時に存在することが分かった。生化学的特性、ウイルス特性、免疫学的特性に基づき、これらの感染性ウイルス粒子を真正ウイルス粒子または完全粒子と定義した。２５〜３５％ショ糖勾配の空ウイルス粒子画分および３５〜４５％ショ糖勾配の完全粒子画分を特定した。精製ウイルス画分の感染力を、ウイルスＴＣＩＤ５０アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析によって再び評価した。ゾーン遠心分離精製ＣＶウイルス粒子をプールし、Ａｍｉｃｏｎ１００Ｋチューブを用いたダイアフィルトレーションによって濃縮し、３０００×ｇで遠心分離した。各プールされたウイルス粒子画分を、ＰＢＳで個別に透析した。精製ウイルスバルクの全タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイで決定する。精製ウイルスを、４℃で０．５ｍＬアリコートにて保管する。
【００９６】
実施例５：透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるＣＶウイルス粒子の生物物理学的特徴付け
ＣＶ空粒子および完全粒子の物理構造を、ＴＥＭ分析により明らかにした。バイオセイフティのため、精製ウイルス溶液をホルマリン溶液（ｖ／ｖ１：４０００希釈）によって３７℃で３日間個別に不活性化した。材料および方法にて説明したような調製の後、両サンプルをＴＥＭで分析すると、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０の空粒子にいくつかの不規則な二十面体粒子構造を有することが分かった（図６Ａおよび６Ｂ）。ホルマリン不活性化完全粒子（図６Ｃおよび６Ｄ）は類似し、ホルマリン不活性化によって両方のウイルス完全粒子の二十面体構造が破壊されたことが考えられる。両ＣＶウイルス粒子は直径が約３０〜３５ｎｍであることが分かり、これはピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）科のＥＶ７１およびＣＶＡ１６［３０〜３５］に非常に類似する。
【００９７】
実施例６：ＣＶＡ１６ウイルス粒子のウイルスタンパク質組成
ショ糖勾配ゾーン超遠心分離およびＴＥＭ生物物理学的分析の両方から、２つのタイプのＣＶウイルス粒子が存在することが示された。空粒子は、異なる分子量（ＭＷ）の多数のタンパク質バンドを含むことが示された（図７、レーン１および３）。一部の高分子量タンパク質は、ウイルス組み立ておよびパッケージングの間にＰ１ポリペプチドが完全にプロセシングされなかった可能性が高いことを示す。興味深いことに、ＥＶ７１およびＣＶＡ１６空粒子には見られない低いＭＷ＜１７ｋＤａの多数のタンパク質バンドが観察された。完全粒子ウイルスタンパク質を分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析すると、ＥＶ７１感染性粒子に見られるものと類似するＭＷを持つ４つの主要タンパク質バンドを含むことが分かった（図７、レーン２および４）。これらの４つの主要タンパク質バンドは、その予測タンパク質配列に基づきヒトエンテロウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１（３２〜３５ｋＤａ）、ＶＰ２（２４〜２８ｋＤａ）、ＶＰ３（２４〜２８ｋＤａ）、およびＶＰ４（６〜８ｋＤａ）に対応する（図７、レーン２および４）。まとめると、これらの結果は、２つのウイルス粒子が異なるタンパク質組成を有することを示す。さらに、完全にプロセシングされていないウイルスタンパク質によって構築された未熟カプシドもなお粒子構造を形成することができる（以下参照）。
【００９８】
実施例７：ＣＶウイルス粒子の免疫原性研究
これらの２つのタイプのホルマリン不活性化ＣＶウイルス粒子が強力かつ有効な免疫応答を生成できるか否かを調査することが重要である。異なる量の不活性化ＣＶ粒子を、免疫化の前に、リン酸アルミニウムにより室温で３時間吸着した。６匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（生後６〜８週）の群を、０．２ｍＬ（０．５μｇ＋６０μミョウバン）のいずれかで筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫化した。４匹のウサギを、０．５ｍＬ（２．５μｇ＋３００μｇミョウバン）で筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫化した。全ての動物を、プライミングの後２週間間隔で同じ用量で２回ブーストした。免疫化したマウスおよびウサギを、最終ブーストの１週間後に放血させ、血清を収集してウイルス中和を分析するために用いた。
【００９９】
ＣＶＡ６のホルマリン不活性化完全粒子または空粒子で免疫化したマウス群からのマウス抗血清は、ＣＶＡ６ウイルス特異的中和抗体応答を生成した（表４）。これは、ＲＤ  ＴＣＩＤ５０アッセイにおいてＣＶＡ６特異的抗血清がＣＶＡ６感染のみを中和し、ＥＶ７１、ＣＶＡ１０またはＣＶＡ１６感染に対しては中和しないことを意味する。予想通り、空粒子から誘発したマウス抗血清の平均ウイルス中和力価（１／３２）は、完全粒子抗血清から得られたもの（１／４２７）より１０倍低かった。ＣＶＡ６と異なり、ＣＶＡ１０のホルマリン不活性化空粒子または完全粒子で免疫化したマウスでは、それぞれＣＶＡ１０特異的ウイルス中和が誘導されないか（＜１／８）、または非常に低かった（１／１１）（表４）。ホルマリン不活性化ＣＶＡ１６完全粒子はマウスおよびウサギの免疫原性研究の両方で強いＣＶＡ１６特異的中和抗体応答を誘起できることが分かったことから、これは驚きであった。以前のＥＶ７１研究では、ホルマリン不活性化ＥＶ７１完全粒子から生成されたマウス抗血清のＥＶ７１特異的中和力価が、約１／２０００であることも分かった。現在の結果に基づくと、ホルマリン不活性化は、ＣＶＡ１０の一部の中和エピトープを破壊し、それが弱いウイルス中和抗体応答を引き起こしうる。これは、ＥＶ７１ウイルス株のウイルス中和エピトープがホルマリン等の化学不活性化、ＵＶおよび熱処理に対して非常に敏感であるという本発明者らの以前の研究によって支持される。現在の結果に基づけば、中和抗体応答を強化するためにＣＶＡ１０の投与量を増加すべきである。
【０１００】
ホルマリン不活性化ＣＶＡ１０が本当に弱い免疫原であるのか否か、または弱い抗体応答がマウスの免疫原性の問題に起因するものかを調査するために、２つのウサギの群（群あたり３匹のウサギ）を、ミョウバンとともに調製した２．５μｇのホルマリン不活性化ＣＶＡ１６粒子により２週間毎に３回、筋肉内免疫化した。ホルマリン不活性化完全粒子で免疫化した２匹のウサギから得た抗血清は、１／３２および１／１６の中和力価を有することが分かり（表５に示すように平均力価１／２６）、ミョウバンとともに調製したホルマリン不活性化空粒子の同一量で免疫化したウサギからの抗血清は、ＣＶＡ１０ウイルスに対して同様の中和力価（１／１６および１／３２）を有することが分かった（表５）。これらの中和力価は、以前の研究でＥＶ７１完全粒子から得られた力価と比較して非常に低かった。これらの抗ＥＶ７１力価は、マウスおよびウサギの免疫原性研究からそれぞれ約１／２０００および１／３２，０００であることが分かった。
【０１０１】
これらの弱い中和抗体応答を引き起こした要因が何であるかを調査する上で、ホルマリン処理されたＣＶＡ１０のビリオンを含む溶液中に明らかなウイルス粒子集塊は観察されなかったことから、ワクチン沈降は除外することができる。ホルマリン不活性化プロセスによって一部の重要なウイルス中和エピトープが破壊される可能性が最も高いと考えられる。
【０１０２】
ＣＶＡ６ウイルスに対して生成されたウサギ中和抗体がＥＶ７１を交差中和できるか否かを決定することが重要である。マウス抗ＣＶＡ６抗体と同様に、ウサギ抗血清を中和アッセイにおいて試験し、１／８希釈でＥＶ７１に対して不活性であることが分かった（表５および６）。現在の結果は、ホルマリン不活性化ＣＶＡ６ワクチン候補に対する中和抗体応答がウイルス特異的であることを示す。本発明者らの以前の結果から、ホルマリン不活性化ＥＶ７１ワクチン候補が、ＣＶＡ１６に対する交差中和活性が無いかまたは低いＥＶ７１特異的中和抗体応答を誘導することも示された。これらの結果を合わせると、ＨＦＭＤを引き起こすヒトエンテロウイルスに対する多価ＥＶ７１／ＣＶＡ６／ＣＶＡ１０／ＣＶＡ１６ワクチンが開発され、試験されるべきである。
【０１０３】
実施例８：ＥＶ７１、ＣＶＡ６、ＣＶＡ１０およびＣＶＡ１６からのウイルス粒子を含む多価ＨＦＭＤワクチン候補の免疫原性研究
ＥＶ７１およびＣＶＡ１６ウイルス粒子を配合したホルマリン不活性化ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０完全粒子が、４つのウイルス全てに対して強力かつ有効な免疫応答を生成できるか否かにを調査することが重要である。異なる量の不活性化粒子を、免疫化の前に、リン酸アルミニウムにより室温で３時間吸着した。６匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（生後６〜８週）の群を、０．２ｍＬ（０．５μｇの各ウイルス粒子＋６０μｇのミョウバン）のいずれかで筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫化した。４匹のウサギを、０．５ｍＬ（２．５μｇの各ウイルス粒子＋３００μｇのミョウバン）で筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫化した。全ての動物を、プライミングの後２週間間隔で同じ用量で２回ブーストした。免疫化したマウスおよびウサギを、最終ブーストの１週後に放血させ、血清を収集してウイルス中和を分析するために用いた。
【０１０４】
多価ホルマリン不活性化完全粒子で免疫化したマウス群からのマウス抗血清は、４つ全てのウイルスに対してウイルス中和抗体応答を生成した（表４）。これは、ＲＤ  ＴＣＩＤ５０アッセイにおいて抗血清がＣＶＡ１０感染を中和するだけでなく、ＥＶ７１、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１６感染に対しても中和することを意味する。この結果は、多価ホルマリン不活性化完全粒子が抗ＣＶＡ１０ウイルス中和抗体応答を強化しうることも示す（表４）。
【０１０５】
【表４】
0006774149.tif 000005
【０１０６】
【表５】
0006774149.tif 000006
【０１０７】
実施例９：ウイルス粒子で免疫化したマウスの抗血清の認識
ドットブロット分析を用いて、ウイルスと抗血清との間の認識を確認した。５つの群のマウス抗血清を用いて、ＣＶＡ６、ＣＶＡ１０、ＣＶＡ１６およびＥＶ７１ウイルス粒子を検出した。対照群では２つのモノクローナル抗体（ＥＶ７１およびＣＶＡ１６のＶＰ１およびＶＰ２に対してそれぞれ特異的なＮ１およびＭＡＢ９７９）を用いてウイルス成分を検出した。結果を図８に示す。ＣＶＡ６空粒子で免疫化したマウスの抗血清は、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０ウイルス粒子を認識した。しかし、ＣＶＡ６完全粒子で免疫化したマウスの抗血清は、ＣＶＡ６ウイルス粒子だけを認識した。ＣＶＡ１０においても類似の結果が観察された。ＣＶＡ１０空粒子で免疫化したマウスの抗血清は、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０ウイルス粒子を認識し、ＣＶＡ１０完全粒子で免疫化したマウスの抗血清は、ＣＶＡ１０ウイルス粒子だけを認識した。多価完全粒子で免疫化したマウスの抗血清は、ＣＶＡ６、ＣＶＡ１０、ＣＶＡ１６およびＥＶ７１ウイルス粒子を認識した。しかし、このマウス抗血清はＣＶＡ１６ウイルス粒子の認識が弱かった。Ｎ１モノクローナル抗体は、ＥＶ７１ウイルス粒子を強く認識し、他の株は認識しなかった。ＭＡＢ９７９モノクローナル抗体は、ＥＶ７１およびＣＶＡ１６ウイルス粒子を強く認識した。これらの結果から、異なるウイルス粒子で免疫化したマウスの抗血清の認識が、非常に異なる特徴を示すことが分かった。
【０１０８】
本発明は、細胞ベースのエンテロウイルスワクチン（好ましくはＨＦＭＤワクチン）開発のための重要な情報を提供する。特に、ＨＦＭＤを除去するために、多価ＥＶ７１／ＣＶＡ６／ＣＶＡ１０／ＣＶＡ１６ワクチン製剤が必要である。
【０１０９】
まとめると、本発明は、ＥＶ７１およびＣＶＡ１６に対して誘起されたマウス抗体が細胞培養アッセイにおいてＣＶＡ６およびＣＶＡ１０感染を中和できなかったことに少なくとも部分的に基づく。本発明は、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０の両方が血清を含むかまたは含まないベロ細胞培養物において複製しないことから、ＣＶＡ６および／またはＣＶＡ１０ワクチン候補を開発するためにＥＶ７１ワクチン開発において用いられる製造バイオプロセスが有用でないことを発見した。ヒト用ワクチン製造のために使用されるＭＤＣＫ、ＭＲＣ−５およびＣＨＯ細胞系等の異なる細胞基質が試験され、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０複製に非常に不足であることが分かっている。本発明では、組換えアデノウイルスワクチン生産に使用されているＨＥＫ２９３細胞を試験し、ＣＶＡ６およびＣＶＡ１０の両方の複製に優れた細胞基質であると分かる。したがって本発明は、ＨＥＫ２９３細胞からＣＶＡ６もしくはＣＶＡ１０または他のエンテロウイルスＡのウイルス粒子を生産する技術を開発し、ＣＶＡ６もしくはＣＶＡ１０またはその両方のウイルス粒子、任意にＣＶＡ６およびＣＶＡ１０以外のエンテロウイルスＡ、特にＣＶＡ１６もしくはＥＶＡ７１またはその両方の追加的なウイルス粒子を含む、ヒト用のエンテロウイルス感染に対する免疫原性組成物を提供する。
【０１１０】
特に、ＣＶＡ６またはＣＶＡ１０から精製した感染性ウイルス粒子は、同種ウイルスに対して強力な中和抗体応答を誘起できたが、他のウイルスＣＶＡ１６および／またはＥＶ７１は中和できないと分かる。したがって本発明者らは、ＥＶ７１、ＣＶＡ６、ＣＶＡ１０およびＣＶＡ１６感染に対する防御免疫応答を誘導し、それによって引き起こされる疾患、特にＨＦＭＤを予防するのに有用な、ＥＶ７１、ＣＶＡ６、ＣＶＡ１０およびＣＶＡ１６ウイルス粒子を含む多価ワクチンを特に開発する。
【０１１１】
配列情報
＞ＣＶＡ６＿Ｍ０７４６（８７０Ａ．Ａ．）（配列番号１）
ＭＧＡＱＶＳＴＱＫＳＧＳＨＥＴＫＮＶＡＴＥＧＳＴＩＮＦＴＮＩＮＹＹＫＤＳＹＡＡＳＡＳＲＱＤＦＡＱＤＰＡＫＦＴＲＰＶＬＤＴＩＲＥＶＡＡＰＬＱＳＰＳＶＥＡＣＧＹＳＤＲＶＡＱＬＴＶＧＮＳＴＩＴＴＱＥＡＡＮＩＶＬＳＹＧＥＷＰＥＹＣＰＳＴＤＡＴＡＶＤＫＰＴＲＰＤＶＳＶＮＲＦＹＴＬＳＴＫＳＷＫＴＥＳＴＧＷＹＷＫＦＰＤＶＬＮＤＴＧＶＦＧＱＮＡＱＦＨＹＬＹＲＳＧＦＣＭＨＶＱＣＮＡＳＫＦＨＱＧＡＬＬＶＡＡＩＰＥＦＶＶＡＡＳＳＲＡＭＫＰＮＧＱＧＬＹＰＤＦＡＨＴＮＰＧＫＮＧＱＥＦＲＤＰＹＶＬＤＡＧＩＰＬＳＱＡＬＶＹＰＨＱＷＩＮＬＲＴＮＮＣＡＴＩＩＭＰＹＶＮＡＬＰＦＤＳＡＬＮＨＳＮＦＧＬＶＶＩＰＩＳＰＬＫＹＣＮＧＡＴＴＥＶＰＩＴＬＴＩＡＰＬＮＳＥＦＳＧＬＲＱＡＩＫＱＧＦＰＴＥＬＫＰＧＴＮＱＦＬＴＴＤＤＧＴＳＰＰＩＬＰＧＦＥＰＴＰＬＩＨＩＰＧＥＦＴＳＬＬＤＬＣＱＩＥＴＩＬＥＶＮＮＴＴＧＴＴＧＶＳＲＬＬＩＰＶＲＡＱＮＮＶＤＱＬＣＡＳＦＱＶＤＰＧＲＮＧＰＷＱＳＴＭＶＧＱＩＣＲＹＹＴＱＷＳＧＳＬＫＶＴＦＭＦＴＧＳＦＭＡＴＧＫＭＬＩＡＹＴＰＰＧＳＡＱＰＡＴＲＥＡＡＭＬＧＴＨＩＶＷＤＦＧＬＱＳＳＶＴＬＶＩＰＷＩＳＮＴＨＦＲＡＶＫＴＧＧＶＹＤＹＹＡＴＧＩＶＴＩＷＹＱＴＮＦＶＶＰＰＤＴＰＴＥＡＮＩＩＡＬＧＡＡＱＫＮＦＴＬＫＬＣＫＤＴＤＥＩＱＱＴＡＥＹＱＮＤＰＩＴＮＡＶＥＳＡＶＳＡＬＡＤＴＴＩＳＲＶＴＡＡＮＴＡＡＳＴＨＳＬＧＩＧＲＶＰＡＬＱＡＡＥＴＧＡＳＳＮＡＳＤＥＮＬＩＥＴＲＣＶＭＮＲＮＧＶＮＥＡＳＶＥＨＦＹＳＲＡＧＬＶＧＶＶＥＶＫＤＳＧＴＳＬＤＧＹＴＶＷＰＩＤＶＭＧＦＶＱＱＲＲＫＬＥＬＳＴＹＭＲＦＤＡＥＦＴＦＶＳＮＬＮＮＳＴＴＰＧＭＬＬＱＹＭＹＶＰＰＧＡＰＫＰＤＳＲＫＳＹＱＷＱＴＡＴＮＰＳＶＦＡＫＬＳＤＰＰＰＱＶＳＶＰＦＭＳＰＡＴＡＹＱＷＦＹＤＧＹＰＴＦＧＥＨＫＱＡＴＮＬＱＹＧＱＣＰＮＮＭＭＧＨＦＡＩＲＴＶＳＥＳＴＴＧＫＮＶＨＶＲＶＹＭＲＩＫＨＶＲＡＷＶＰＲＰＬＲＳＱＡＹＭＬＫＮＹＰＴＹＳＱＴＩＴＮＴＡＴＤＲＡＳＩＴＴＴＤＹＥＧＧＶＰＡＮＰＱＲＴＳ
＞ＣＶＡ１０＿Ｍ２０１４（８６２Ａ．Ａ．）（配列番号２）
ＭＧＡＱＶＳＴＱＫＳＧＳＨＥＴＧＮＶＡＴＧＧＳＴＩＮＦＴＮＩＮＹＹＫＤＳＹＡＡＳＡＴＲＱＤＦＴＱＤＰＫＫＦＴＱＰＶＬＤＳＩＲＥＬＳＡＰＬＮＳＰＳＶＥＡＣＧＹＳＤＲＶＡＱＬＴＶＧＮＳＳＩＴＴＱＥＡＡＮＩＶＬＡＹＧＥＷＰＥＹＣＰＤＴＤＡＴＡＶＤＫＰＴＲＰＤＶＳＶＮＲＦＹＴＬＤＳＫＭＷＱＥＮＳＴＧＷＹＷＫＦＰＤＶＬＮＫＴＧＶＦＧＱＮＡＱＦＨＹＬＹＲＳＧＦＣＬＨＶＱＣＮＡＳＫＦＨＱＧＡＬＬＶＡＶＩＰＥＦＶＩＡＧＲＧＳＮＴＫＰＮＥＡＰＨＰＧＦＴＴＴＦＰＧＴＴＧＡＴＦＨＤＰＹＶＬＤＳＧＶＰＬＳＱＡＬＩＹＰＨＱＷＩＮＬＲＴＮＮＣＡＴＶＩＶＰＹＩＮＡＶＰＦＤＳＡＩＮＨＳＮＦＧＬＩＶＩＰＶＳＰＬＫＹＳＳＧＡＴＴＡＩＰＩＴＩＴＩＡＰＬＮＳＥＦＧＧＬＲＱＡＶＳＱＧＩＰＡＥＬＲＰＧＴＮＱＦＬＴＴＤＤＤＴＡＡＰＩＬＰＧＦＴＰＴＰＴＩＨＩＰＧＥＶＨＳＬＬＥＬＣＲＶＥＴＩＬＥＶＮＮＴＴＥＡＴＧＬＴＲＬＬＩＰＶＳＳＱＮＫＡＤＥＬＣＡＡＦＭＶＤＰＧＲＩＧＰＷＱＳＴＬＶＧＱＩＣＲＹＹＴＱＷＳＧＳＬＫＶＴＦＭＦＴＧＳＦＭＡＴＧＫＭＬＶＡＹＳＰＰＧＳＡＱＰＡＮＲＥＴＡＭＬＧＴＨＶＩＷＤＦＧＬＱＳＳＶＳＬＶＩＰＷＩＳＮＴＨＦＲＴＡＫＴＧＧＮＹＤＹＹＴＡＧＶＶＴＬＷＹＱＴＮＹＶＶＰＰＥＴＰＧＥＡＹＩＩＡＭＧＡＡＱＤＮＦＴＬＫＩＣＫＤＴＤＥＶＴＱＱＡＶＬＱＧＤＰＶＥＤＩＩＨＤＡＬＧＮＴＡＲＲＡＩＳＳＡＡＮＶＥＳＡＡＮＴＴＰＳＳＨＲＬＥＴＧＲＶＰＡＬＱＡＡＥＴＧＡＴＳＮＡＴＤＥＮＭＩＥＴＲＣＶＶＮＲＮＧＶＬＥＴＴＩＮＨＦＦＳＲＳＧＬＶＧＶＶＮＬＴＤＧＧＴＤＴＴＧＹＡＴＷＤＩＤＩＭＧＦＶＱＬＲＲＫＣＥＭＦＴＹＭＲＦＮＡＥＦＴＦＶＴＴＴＥＮＧＥＡＲＰＹＭＬＱＹＭＹＶＰＰＧＡＰＫＰＴＧＲＤＡＦＱＷＱＴＡＴＮＰＳＶＦＶＫＬＮＤＰＰＡＱＶＳＶＰＦＭＳＰＡＳＡＹＱＷＦＹＤＧＹＰＴＦＧＱＨＰＥＴＳＮＴＴＹＧＬＣＰＮＮＭＭＧＴＦＡＶＲＶＶＳＲＥＡＳＱＬＫＬＱＴＲＶＹＭＫＬＫＨＶＲＡＷＶＰＲＰＩＲＳＱＰＹＬＬＫＮＦＰＮＹＤＳＳＫＶＴＮＳＡＲＤＲＳＳＩＫＱＡＮＭ
＞ＣＶＡ１６＿５０７９（８６２Ａ．Ａ．）（配列番号３）
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【０１１２】
【表６−１】
0006774149.tif 000007
【０１１３】
【表６−２】
0006774149.tif 000008
【０１１４】
参考文献
【０１１５】
【表７−１】
0006774149.tif 000009
【０１１６】
【表７−２】
0006774149.tif 000010
【０１１７】
【表７−３】
0006774149.tif 000011
【図１】
0006774149.tif 000012
【図２】
0006774149.tif 000013
【図３】
0006774149.tif 000014
【図４】
0006774149.tif 000015
【図５】
0006774149.tif 000016
【図６】
0006774149.tif 000017
【図７】
0006774149.tif 000018
【図８】
0006774149.tif 000019
【配列表】
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