(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼疾患の局所治療における使用のための、シリビニンまたはソラフェニブまたはクルクミンまたはラタノプロストから選択される有効成分を含有する製剤であって、前記有効成分は、場合によりアミノ基を有するイヌリンポリマー、キトサンおよびカチオン性界面活性剤から選択される粘膜付着性物質の存在下で、
（１）固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）型およびナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）型の脂質ナノ粒子系、
（２）カリックスアレーンベースのナノ粒子系、
（３）両親媒性イヌリンコポリマーに基づいたミセルおよびナノ粒子系
に組み込まれている、製剤であって、
前記ナノ粒子系は、０．５未満の多分散指数で５０から２００ｎｍの範囲の平均直径を有する、製剤。
【請求項２】
前記眼疾患は神経変性眼疾患である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記脂質ナノ粒子系は、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、脂肪族アルコール、脂肪酸（Ｃ１０−Ｃ２２）、脂肪アルコールとの脂肪酸エステル、ペグ化ベヘン酸のモノ−、ジ−およびトリグリセリドの混合物、ペグ化カプリル酸およびカプロン酸のモノ−、ジ−およびトリグリセリドから選択される脂質からなる、請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
前記系は、シリビニン、ソラフェニブ、クルクミン、ラタノプロストから選択される有効成分を１から１５％ｗ／ｗの範囲の量で組み込んでいる、請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
神経変性眼疾患は、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、黄斑浮腫、血管新生緑内障、黄斑浮腫、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、ブドウ膜炎、眼内炎、網膜炎、脈絡膜炎、脈絡網膜炎、全身性疾患の網膜合併症から選択される、請求項２に記載の製剤。
【請求項６】
前記カリックスアレーンベースのナノ粒子系に用いられる化合物が、下記式（Ａ）の化合物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製剤：
【化１】
0006744862.tif 000019
（式中、
Ｒは、ＣＨ３、（ＣＨ２）ｘＣＨ３、（ＣＨ２）ｘＯＨであり、
Ｒ１は、ＣＨ３、（ＣＨ２）ｘＣＨ３、（ＣＨ２）ｘＯＨであり、
ここで、
ｘは１〜３であり、
ｎは４、６、８であり、
ｍは２〜１５であり、
かつ、Ｒ＝Ｒ１＝ＣＨ３である場合、ｍは２〜９とは異なる）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、眼疾患を治療するための製品およびそれを含有する製剤の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
制御されていない血管新生は、固形腫瘍、関節リウマチ、乾癬ならびに眼に関するレベルにおいて角膜血管新生、加齢黄斑変性（ＡＲＭＤまたはＡＭＤ）、黄斑浮腫、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）および血管新生緑内障などの種々の疾患の病因に関与する。
【０００３】
加齢に関連する多くの他の慢性疾患のようなＡＭＤは多因子起源を有し、その発症は、遺伝子関連因子と生活様式関連因子の好ましくない組み合わせによって引き起こされる。
【０００４】
ＣＮＶの治療における抗ＶＥＧＦ（最初はがん療法のために開発された）で行われた研究により、ＣＮＶの治療におけるペガプタニブ（Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）およびラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の使用が導かれた。ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）もまた、現在、ＡＭＤの治療において認可外で使用されている。
【０００５】
また、ＡＭＤの治療は、脈絡膜血管新生の治療（抗ＶＥＧＦの硝子体内注射および光線力学的療法）に制限されるだけではなく、酸化防止剤、抗炎症薬を有する多くの物質の使用および完全に症状の出ている疾患を導くプロセスの異なるレベルで作用でき、疾患の発症を予防でき、進行した形態へのその進行を遅延でき、組織損傷を低減でき、抗ＶＥＧＦ薬の作用を増強できる神経保護作用も含むことが考慮されるべきである。
【０００６】
糖尿病性網膜症（ＤＲ）は１型および２型糖尿病の最も重篤で頻繁な細小血管合併症の１つであり、それは、多くの場合、黄斑浮腫および二次的網膜硝子体新血管形成（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｖｉｔｒｅｏｕｓ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）の発症に起因して失明につながるため、患者の生活の質に顕著に影響を与える。
【０００７】
現在利用可能なＤＲに対する療法は、網膜疾患の血管新生プロセスおよび炎症プロセスを対照にすることを目的とし、結果として、一部の症例において、それらは疾患の進行を遅延させる。
【０００８】
緑内障は、視神経組織の進行性消失につながり、その頭部を露出させ、失明を生じる視神経症である。ブドウ膜炎は、虹彩、毛様体および脈絡膜からなる眼の中膜（血管）の一部または全ての炎症である。
【０００９】
後部ブドウ膜炎を治療するための現在利用可能な治療手段は、視覚器官を犠牲にして非常に重要な二次的影響（眼内炎、網膜浮腫など）を及ぼさない、硝子体内注射またはインプラントである（非特許文献１）。
【００１０】
過去２０年にわたって、硝子体内注射は、他の投与経路と比べて、典型的に、網膜および硝子体において高濃度での到達を可能にするため、非常に有益であるとみなされている。それにも関わらず、硝子体内経路は、網膜剥離、眼内炎および硝子体内出血などの、患者にとっての深刻なリスクと関連している。さらに、この投与経路は、治療効果を確実にするために薬物の反復注射を必要とし、これは多くの場合、患者にとって十分に耐容されない。
【００１１】
したがって、現在利用可能な治療は有効性／副作用比の現在の不均衡のために十分ではない。
【００１２】
この理由のために、硝子体内に埋め込み可能な非生分解性の制御放出系（Ｖｉｔｒａｓｅｒｔ（登録商標）、Ｒｅｔｉｓｅｒｔ（登録商標））が開発されているが、それらは硝子体内注射に関連した同じリスクならびにインプラントのための手術の必要性および拒絶の可能性を有する。
【００１３】
リスクと有益性との間の譲歩は、眼周囲の投与経路（球周囲、後方強膜近傍（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｊｕｘｔａｓｃｌｅｒａｌ）、眼球後方の眼球鞘下および結膜下）を使用して得られ、それらは安全であるが、硝子体内より効果が低い。
【００１４】
これらの投与経路は従来の注射可能な製剤の使用を利用し、薬物に対して耐性が低い障壁を形成する強膜線維組織を介する拡散によって有効成分を標的部位（硝子体および網膜）に到達させる。注射された薬物は、いずれの場合でも、前部（房水の流出）または後部（網膜および体循環）経路を介して排出され、不十分な患者のコンプライアンス（疼痛、白内障、網膜剥離、眼内炎および硝子体内出血）と関連した複数回の投与を必要とする。
【００１５】
したがって、現在、眼の後部の疾患の治療は、望ましくない作用と関連した薬物送達系のみである。
【００１６】
近頃、ナノ粒子型の進歩した薬物送達系が薬物送達の最前線であることも知られている。
【００１７】
固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）およびナノ構造脂質系（ＮＬＣ）などの脂質の性質のナノ粒子系は、生体適合性の脂質（純粋なトリグリセリド、グリセリド、ワックスの複合混合物）からなるコロイド系であり、レシチンおよびポロキサマーなどの非毒性界面活性剤により安定化される。それらは１００から５００ｎｍのサイズである。室温で、粒子は固体状態である。
【００１８】
脂質ナノ粒子が、従来の医薬形態と比べて増加した眼球前方の保持時間に起因して眼においていくつかの薬物の生物学的利用能を増加させ、それにより反復した、および頻繁な滴下注入を回避することは既に示されている（非特許文献２）。
【００１９】
イヌリンは様々な植物および果物から抽出可能な天然の多糖である。それは、時々、その還元末端でグルコース分子と結合するβ−（２−１）グルコ−フラノシド結合を介して結合したＤ−フルクトース単位の直鎖からなる炭水化物である。多くの有益な特性（毒性の不在、生体適合性、水への溶解性および腸内細菌叢に対するプロバイオティクス効果）を有するという事実に起因して、イヌリンは数え切れないほどの用途に使用されており（非特許文献３、非特許文献４）、それらのうちの多くは生物医学分野である。
【００２０】
最近、ヒドロゲル、ナノ粒子、高分子バイオコンジュゲートおよび高分子ミセルなどの新規の薬物送達系（ＤＤＳ）を得るために、多数の研究者はイヌリンの化学修飾に焦点を当てている。これは、第一級アミンによる側鎖の化学的修飾であり、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性鎖、セラミドなどの疎水性分子とのコンジュゲーションを得るために使用されている。
【００２１】
カリックスアレーンは低コストでも合成するのが容易な環状ポリフェノールであり、それは、優れた合成の多用途性、異なるレベルでのそれらの官能化しやすい性質ならびに最終的に細胞毒性および免疫原性の低い程度によって特徴付けられる。
【００２２】
近年、カリックス［４］アレーンが、インビトロおよびインビボの両方でのそれらの誘導体によって示される低い細胞毒性（非特許文献５）および免疫原性（非特許文献６）によって支持される生物医学用途のための新規の分子プラットフォームとして熱心に調査されている。
【００２３】
カリックスアレーン骨格の適した官能化は、抗炎症性、抗腫瘍性、抗菌性およびワクチン模倣活性を誘導体に与える（非特許文献７、非特許文献８、特許文献１、特許文献２）。
【００２４】
それらの疎水性空洞内で薬物を複合化する能力のためのシクロデキストリンと同様の水溶性カリックスアレーンが、製薬業界のための賦形剤として提案されているが、水媒体中でナノ構造系を集合させることができる両親媒性のカリックスアレーンは有望な薬物送達系である（非特許文献９、非特許文献１０、特許文献３、特許文献４）。それらのいくつかは、酸化還元電位、温度（非特許文献１１）、ｐＨ（非特許文献１２）、酵素活性（非特許文献１３）の変化などの外部刺激に応じて薬物を放出するように適切に操作されている。細胞膜に浸透するカリックスアレーン誘導体の能力（非特許文献１４、非特許文献１５）および標的細胞の表面上に存在する相補的受容体を認識し、それと結合するホーミング基でカリックスアレーン骨格を官能化する能力もまた、カリックスアレーンを標的化薬物送達のための有望な系にする（非特許文献１６）。
【００２５】
シリビニンは、シリバム・マリアナム（Ｓｉｌｙｂｕｍ  ｍａｒｉａｎｕｍ）に含まれる約１：１の割合の２つのジアステレオ異性体ＡおよびＢの混合物である。臨床分野におけるその主な用途は、アルコールによって引き起こされた肝疾患、肝硬変、テングダケ中毒（Ａｍａｎｉｔａｐｏｉｓｏｎｉｎｇ）、ウイルス性肝炎および薬物性肝疾患の治療である。
【００２６】
【化１】
0006744862.tif 000002
【００２７】
他方で、シリビニンの生物学的利用能および有効性は、その低い水溶性（４３０ｍｇ／Ｌ）に起因してかなり限定されていることが知られている。
【００２８】
シリビニンはヒトにおける悪性神経膠腫の予防および治療のための効果的な薬剤であるようである（非特許文献１７）。
【００２９】
さらに、特にＡＭＤでのシリビニンの抗血管形成活性がインビトロで、およびシリマリンベースの調製剤の経口投与後に示されている。
【００３０】
上記を考慮して、眼疾患、特に黄斑変性症および糖尿病性網膜症などの神経変性疾患の治療的処置において医師の役に立ち得る新規医薬製剤の可能性は、そのインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での利用可能性を改良するために官能化されたシリビニンなどの化合物に対する興味を増加させている。
【００３１】
記載される全てのナノ構造系と共に広範に研究されているシリビニンに加えて、天然起源で、低い水溶性、容易な化学的および酵素的分解、低い生物学的利用能によって特徴付けられていない他の有効成分、例えばソラフェニブ、クルクミン、ラタノプロストが、これらのナノ構造製剤のいくつかと共に調べられた。
【００３２】
ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ）
【化２】
0006744862.tif 000003
は、抗ＶＥＧＦ作用が広く見られる複数の標的（ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ；これは実際にマルチキナーゼ阻害と定義される）に対して作用するジアリール尿素であり、腫瘍において証明された抗血管形成作用を提供し（特許文献５、Ｂａｙｅｒ）、それは肝細胞がんの治療のために欧州において承認された最初の抗腫瘍剤（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）錠剤）である。
【００３３】
網膜疾患の療法におけるソラフェニブの治療指数は、眼のレベルにおいて局所投与を使用することによって増加させることができ、このように全身の副作用の発生を制限しながら、薬理作用を得ることができる。さらに、局所投与により、全身投与によるものと同じ効果を有するのに必要とされる用量と比較して制限された用量の使用が可能となるので、最終製品のコストの減少が可能となる。
【００３４】
クルクミン
【化３】
0006744862.tif 000004
は、料理に関する業界ならびに胆道疾患および一部の炎症状態におけるその治療特性のために医薬の両方に使用されるアジアの植物であるウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ  Ｌｏｎｇａ）の根茎から抽出された黄色いポリフェノール（ジフェルロイルメタン）である。
【００３５】
ラタノプロスト
【化４】
0006744862.tif 000005
はビマトプロストのような有効成分であり、トラボプロストはプロスタグランジン類似体の一部である。プロスタグランジン類似体は、最近、開放角緑内障の治療に使用されている局所使用のための薬物のクラスであり、最初、それらは、それらの長期間の効果についての情報の不足に起因して第一の治療として推奨されていなかった。プロスタグランジンによる長期間の治療に関連する副作用の中で、主要なものとしては、虹彩色素の変化、まつげの肥厚および伸長、黄斑浮腫の発症に関するものがある（非特許文献１８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／００５６４８２号
【特許文献２】国際公開第２００５１２３６６０  Ａ２号
【特許文献３】欧州特許第１２９３２４８  Ａ１号
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１０／０１８５０２２  Ａ１９号
【特許文献５】欧州特許第１１４０８４０Ｂ１号
【非特許文献】
【００３７】
【非特許文献１】Ｔａｙｌｏｒ  Ｓ．Ｒ．  Ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｗ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｕｖｅｉｔｉｓ，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ．２０１０；２２４  Ｓｕｐｐｌ  １：４６−５３
【非特許文献２】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，２３８  ２４１−２４５（２００２）
【非特許文献３】Ｋｏｌｉｄａ  Ｓ，Ｇｉｂｓｏｎ  ＧＲ．Ｊ  Ｎｕｔｒ２００７；１３７：２５０３Ｓ−２５０６Ｓ
【非特許文献４】Ｇｏｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ａｓｐｅｃｔｓ  ２０１１；３９１：１０１−１０４
【非特許文献５】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２００４，２７３，５７
【非特許文献６】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９９，１０，６１３
【非特許文献７】Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００９，６，３０６
【非特許文献８】Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２０１３，４２，３６６
【非特許文献９】Ｊ．Ｓｃｉ．Ｉｎｄ．Ｒｅｓ．２０１２，７１，２１
【非特許文献１０】Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２０１３，４２，３６６
【非特許文献１１】ＡＣＳＮＡＮＯ，２０１１，５，２８８０
【非特許文献１２】Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｅ，２００７，７３，０５１９０４
【非特許文献１３】ＲＳＣ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，２０１３，３，８０５８
【非特許文献１４】Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１２，４８，１１２９
【非特許文献１５】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，２８９２
【非特許文献１６】Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１５，１３，３２９８
【非特許文献１７】Ｒａｎａ  Ｐ．Ｓｉｎｇｈ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００５
【非特許文献１８】Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＣＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  ａｎａｌｏｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｌａｕｃｏｍａ  ａｎｄ  ｏｃｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ；Ａｎｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，２００２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３８】
神経変性眼疾患の治療における使用のためのＳＬＮおよびＮＬＣ脂質ナノ粒子系に組み込まれ、場合により粘膜付着性であるカリックスアレーンに基づいたシリビニン、または両親媒性イヌリンコポリマーに基づいたミセルおよびナノ粒子系に組み込まれたシリビニンを含有する局所投与用の製剤が記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、遊離シリビニンの溶解曲線と比較した、インキュベーション時間の関数としてｐＨ７．４にてＰＢＳ中でＳＬＮ−Ａによって放出されたシリビニンの百分率を示す。
【図２】図２は、インキュベーション時間の関数としてｐＨ７．４にてＰＢＳ中でＩＮＵ−ＤＥＴＡおよびキトサンで被覆されたＮＬＣ−Ｂ系によって放出されたシリビニンの百分率、ならびに遊離シリビニンの溶解曲線を示す。
【図３】図３は、遊離シリビニンの溶解曲線と比較した、インキュベーション時間の関数としてｐＨ７．４にてＰＢＳ中でＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧの高分子ミセルによって放出されたシリビニンの百分率を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、異なる濃度でのインキュベーションの４時間後（４Ａ）の１６ＨＢＥ細胞株でのＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧの空ミセルの細胞適合性プロファイルを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、異なる濃度でのインキュベーションの２４時間後（４Ｂ）の１６ＨＢＥ細胞株でのＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧの空ミセルの細胞適合性プロファイルを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＩＮＵＣ８ＰＥＧ−ソラフェニブ系、空担体ＩＮＵＣ８ＰＥＧおよびトシル酸ソラフェニブで２０時間前処理し、その後、Ｈ２Ｏ２で損傷させるように曝露したＡＲＰＥ−１９細胞に対する効果を示す；培地中へのＬＤＨ放出の定量。
【図５Ｂ】図５Ｂは、３時間Ｈ２Ｏ２で損傷させ、ＩＮＵＣ８ＰＥＧ−ソラフェニブ系（Ｃ８ＰＥＧＳｏｒ）、空担体ＩＮＵＣ８ＰＥＧ（Ｃ８ＰＥＧ）およびトシル酸ソラフェニブ（Ｓｏｒ）で２０時間、後処理したＡＲＰＥ−１９に対する効果を示す；培地中へのＬＤＨ放出の定量。
【図６Ａ】図６Ａは、ＩＮＵＣ８ＰＥＧ−ソラフェニブ系、空担体ＩＮＵＣ８ＰＥＧおよびシリビニンで２０時間前処理し、次いでＨ２Ｏ２で損傷するように曝露したＡＲＰＥ−１９網膜細胞に対する効果を示す；培地中へのＬＤＨ放出の定量。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｈ２Ｏ２で３時間損傷させ、ＩＮＵＣ８ＰＥＧ−シリビニン系（Ｃ８ＰＥＧＳｉｂ）、空担体ＩＮＵＣ８ＰＥＧ（Ｃ８ＰＥＧ）およびシリビニン（Ｓｉｂ）で２０時間、後処理したＡＲＰＥ−１９網膜細胞に対する効果を示す；培地中へのＬＤＨ放出の定量。
【図７】図７は、Ｈ２Ｏ２を使用していない試料（対照Ｃ）またはＨ２Ｏ２を使用した試料（Ｈ）、およびＩＮＵＣ８ＰＥＧ（１μＭおよび１０μＭ）で処理した試料またはこれで処理していない試料、ＩＮＵＣ８ＰＥＧＳｌｂ（１μＭおよび１０μＭ）で処理した試料またはＳｌｂ（１μＭおよび１０μＭ）で処理した試料で実施した代表的なウェスタンブロッティングを示し、抗ＰＡＲＰ−１  １：８００一次抗体を使用した（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。バンド（ヒストグラム）の濃度測定分析はβ−アクチンに対して正規化した。
【図８】図８は、インキュベーション時間の関数としてｐＨ７．４にてＰＢＳ中でカリックスアレーンナノ粒子によって放出されたシリビニンの百分率を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、カリックスアレーン−シリビニン系（ＣａｌｉｘＳｌｂ）、空担体（ｃａｌｉｘ）およびシリビニン単独で２０時間前処理し、その後、５０μＭのＦｅＳＯ４に曝露したＡＲＰＥ−１９網膜細胞に対する効果を示す；培地中へのＬＤＨ放出の定量。
【図９Ｂ】ＦｅＳｏ４  ５０μＭで５時間処理し、カリックスアレーン−シリビニン系（ＣａｌｉｘＳｌｂ）、空担体（ｃａｌｉｘ）およびシリビニン（Ｓｌｂ）単独で２０時間、後処理したＡＲＰＥ−１９網膜細胞に対する効果を示す；培地中へのＬＤＨ放出の定量。
【図１０】図１０Ａ／Ｂは、ＦｅＳＯ４を使用していない試料（ＣＴＲ）またはＦｅＳＯ４を使用した試料（Ｆｅ）およびＣａｌｉｘ（１μＭ）で処理した試料またはこれで処理していない試料、ＣａｌｉｘＳｌｂ（１μＭ）で処理した試料またはＳｌｂ（１μＭ）で処理した試料で実施した代表的なウェスタンブロッティングを示す。抗ＶＥＧＦ  １：１００一次抗体を使用し（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）（１０Ａ）、代表的なウェスタンブロッティングを、ＦｅＳＯ４を使用していない試料（ＣＴＲ）またはＦｅＳＯ４を使用した試料（Ｆｅ）およびＣａｌｉｘ（０．１μＭおよび１μＭ）で処理した試料またはこれで処理していない試料、ＣａｌｉｘＳｌｂ（０．１μＭおよび１μＭ）で処理した試料またはＳｌｂ（０．１μＭおよび１μＭ）で処理した試料で実施した。抗カテプシンＤ１：２００一次抗体を使用した（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）。バンド（ヒストグラム）の濃度測定分析をβ−アクチンに対して正規化した（図１０Ｂ）。
【図１１】図１１は、有効成分クルクミンに対するカリックスアレーン系の保護効果を示し、これに関して、０．１ＭのＰＢＳおよび無血清培地中で３０分で９０％の分解を比較のために示す。
【図１２】図１２は、クルクミン、カリックスアレーン系およびカリックスアレーン−クルクミン系による処理後のＳＩＲＣ角膜細胞での細胞毒性試験の結果を示す。
【図１３】図１３は、クルクミン、カリックスアレーンおよびカリックスアレーン−クルクミンのＪ７４４マクロファージでの細胞毒性試験ＭＩＴアッセイの結果を示す。
【図１４】図１４は、ＬＰＳで刺激し、クルクミン、カリックスアレーン系およびカリックスアレーン−クルクミン系による処理にさらす前のＪ７４４マクロファージの生存率を示す。
【図１５】図１５は、クルクミン、カリックスアレーン系およびカリックスアレーン−クルクミン系による、クルクミンの存在下でＬＰＳからのストレスに供されたＪ７４４マクロファージにおける構成タンパク質ＩｋＢαの分解の減少を示す。
【図１６】図１６は、クルクミン、カリックスアレーン１およびカリックスアレーン−クルクミンの存在下でＬＰＳからのストレスに供されたＪ７４４マクロファージにおけるＮＦｋＢの減少を示す。
【図１７】図１７は、ＬＰＳからのストレスに供されたＪ７４４マクロファージにおけるｉＮＯおよびＣＯＸ２の発現ならびにクルクミン、カリックスアレーン１およびカリックスアレーン−クルクミンによる処理の存在下でのそれらの減少を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ブドウ膜炎のモデルにおける、カリックスアレーン系に組み込まれているか、または組み込まれていないシリビニン、カリックスアレーン系に組み込まれているか、または組み込まれていないクルクミンで処理した動物の房水における組織学的スコアの結果を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ブドウ膜炎のモデルにおける、カリックスアレーン系に組み込まれているか、または組み込まれていないシリビニン、カリックスアレーン系に組み込まれているか、または組み込まれていないクルクミンで処理した動物の房水におけるタンパク質アッセイの結果を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、単回投与後の高張性のモデルにおける眼圧の減少の傾向を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、カリックスアレーン−ラタノプロスト系およびラタノプロストを含有する市販の製品ＩＯＰＩＺＥの長期処置後の高張性のモデルにおける眼圧の減少の傾向を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、
（１）ＳＬＮ（固体脂質ナノ粒子）およびＮＬＣ（ナノ構造脂質担体）型の脂質ナノ粒子系、
（２）カリックスアレーンベースのナノ構造系、
（３）両親媒性のイヌリンコポリマーに基づいたミセルおよびナノ粒子系
に組み込まれたシリビニンを含有する局所適用のための製剤を用いて上記の欠点を克服し、対象の眼疾患のために使用の根拠を有する他の有効成分の組み込みおよび放出の例は下記に提供される。前記製剤は、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、緑内障などの神経変性眼疾患の治療のための治療有効用量で硝子体または網膜まで有効成分を送達できる。本発明はさらに、上記で定義されるシリビニンを組み込んでいるナノ粒子系の調製方法に関する。
【００４１】
特に、本明細書以下に記載される一般的手順はＳＬＣおよびＮＬＣ型の系の調製に従った。
【００４２】
脂質相（固体脂質または液体脂質と固体脂質との混合物からなる）は、その融点を約５〜１０℃超えて融解される。
【００４３】
シリビニンはエタノールのアリコートにおいて可溶化され、次いで磁性撹拌下で溶融した脂質混合物に加えられる。
【００４４】
次いでシリビニンを含有する高温脂質混合物を、同じ温度で事前に加熱した、水、界面活性剤もしくは界面活性剤の混合物を含有する水溶液中で沈殿させ（沈殿法）、または水、界面活性剤もしくは界面活性剤の混合物を含有する水溶液で乳化させる。後者の場合、得られたプレエマルションは、２から５℃の温度に冷却された水もしくは水性媒体中に分散され（マイクロエマルション法）、または高圧均質化に供される（高圧高温均質化法）。全ての場合、得られたナノエマルションは室温に冷却され、次いで蒸留水に対する完全透析（ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ  ｄｉａｌｙｓｉｓ）（ＣＯＭＷ  １２０００−１４０００）により精製される。その後、抗凍結剤がナノ粒子分散に加えられ、それは遠心分離（１０℃にて１０分間４０００ｒｐｍ）に供され得る。最後に、凍結乾燥後、固体脂質ナノ粒子が回収され、後の特徴付けのためにフリーザーに保存され、および／または粘膜付着性ポリマーで被覆される。後者の場合、０．１％水溶液中のＩＮＵ−ＥＤＡおよびＩＮＵ−ＤＥＴＡポリマーおよびキトサンがナノ粒子懸濁液に加えられ、室温にて磁性撹拌下で３０分間インキュベートされる。
【００４５】
上記の脂質相は、例えば、トリステアリン、トリパルミチン、カプリル／カプリン酸トリグリセリド（Ｍｙｇｌｉｏｌ）などのトリグリセリド；プレシロール（Ｐｒｅｃｉｒｏｌ）ＡＴＯ  ５（ジステアリン酸グリセリル）などのジグリセリド；モノステアリン酸グリセリンなどのモノグリセリド；セチルアルコールなどの脂肪族アルコール；脂肪酸（Ｃ１０−Ｃ２２）；脂肪アルコールとの脂肪酸エステル、例えばパルミチン酸セチル；ペグ化され、およびされていないベヘン酸のモノ−、ジ−およびトリグリセリドの混合物、例えばＣｏｍｐｒｉｔｏｌ  ＨＤ−５−ＡＴＯ（ＰＥＧ−８ベヘネートおよびトリベヘニン）およびＣｏｍｐｒｉｔｏｌ  ８８８ＡＴＯ（モノ−、ジ−およびトリベヘネートの混合物）；ペグ化されたカプリル酸およびカプロン酸のモノ−、ジ−およびトリグリセリド、例えばＡｃｃｏｃｏｎ  ＣＣ−６から選択される脂質からなる。プロセスにおいて界面活性剤／共界面活性剤として使用される物質は、例えばＥｐｉｋｕｒｏｎ  ２００などのレシチンを含む非イオン性界面活性剤；ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールブロックコポリマー、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ；Ｔｗｅｅｎなどのペグ化ソルビタン誘導体；ポリエチレングリコールとの脂肪アルコールエーテル、例えばＢｒｉｊ；胆汁塩を含むイオン性界面活性剤、例えばタウロコール酸ナトリウム；塩化セチルピリジニウムおよび臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウムを含む第四級アミンから選択され得る。
【００４６】
プロセスにおいて抗凍結剤として使用される物質は、例えば、ラクトースおよびトレハロースなどの糖；ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのポリマーから選択され得る。
【００４７】
プロセスにおいて粘膜付着性を与えるために使用される物質は、例えば、アミン基を有するイヌリンポリマー（ＩＮＵ−ＥＤＡおよびＩＮＵ−ＤＥＴＡ）、低分子量ポリマー（キトサン）およびカチオン性界面活性剤（ＣＣＰおよびＤＤＡＢ）から選択される。
【００４８】
さらなる実施形態によれば、本発明は、以下の式（Ｉ）または（ＩＩ）
【化５】
0006744862.tif 000006
（式中、Ｒは−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ３であり、ここでｐは０から１９の範囲である）
【化６】
0006744862.tif 000007
（式中、Ｒは−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ３であり、ここでｐは０から１９の範囲であり、ｎは９から４５０の範囲である）
のイヌリンベースのコポリマーを含有する眼に関する使用のための製剤およびそのようなコポリマーに関する。
【００４９】
上記に与えられる式（Ｉ）および（ＩＩ）のイヌリンベースのコポリマーは、脂肪族鎖Ｃ８によるまたはＣ８およびＰＥＧの鎖によるイヌリンの官能化によって得られる。両親媒性を有するこれらのコポリマーは、凝集してミセルまたはナノ粒子を形成して、柔軟性のあるおよび異なる量の薬物を組み込み、それを長時間および制御された時間、活性形態で放出することができ、さらに、それらは、高い生体適合性があり、眼科用製剤を容易に作製できることが証明されている。
【００５０】
製剤は、ソラフェニブまたはシリビニンなどの特定の量の有効成分をＤＭＦ中のポリマー溶液に加えることによって得られる。次いで得られた溶液は真空下で乾燥され、超音波処理によってｐＨ７．４にてＰＢＳ中で分散され、サイクル（１０分の３サイクル）を回される。その後、分散物は２５℃にて１８時間オービタルシェーカーに入れられ、次いで１０００Ｄａの公称カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を用いて水に対して透析される。
【００５１】
最終的に、得られた分散物は凍結乾燥される。
【００５２】
本発明のさらなる実施形態によれば、それは、両親媒性のカリックスアレーンベースのナノ構造系を含有する眼科用途のための製剤を指す。
【００５３】
このような系において、粘膜付着性を与えることに加えて、複数の正電荷のリガンド単位の存在は細胞表面上に存在する相補的受容体の分子認識によって角膜および網膜上皮の横断を促進できる。
【００５４】
特に、本発明は、一般式（Ａ）
【化７】
0006744862.tif 000008
（式中、
Ｒ＝ＣＨ３、（ＣＨ２）ＸＣＨ３、（ＣＨ２）ＸＯＨであり、
Ｒ１＝ＣＨ３、（ＣＨ２）ＸＣＨ３、（ＣＨ２）ＸＯＨであり、
ここで、
ｘ＝１〜３であり、
ｎ＝４、６、８であり、
ｍ＝２〜１５であり、
Ｒ＝Ｒ１＝ＣＨ３である場合、ｍは２〜９とは異なる）
の新規担体を得るために、コリンを含むアルコキシアミンにより官能化されたカリックス［４］アレーン誘導体からなるカチオン性巨大分子を含む局所眼科用途のための製剤に関し、これはまた、公知の有効成分を送達することに加えて、有効成分の生物活性を増強できるそれら独自の生物活性を提供する。
【００５５】
見られ得るように、式Ａは、カリックスアレーンの上部縁に存在する極性基の構造の疎水性尾部の長さにおいて（ＣＨ２基の数を示す、ｍ＝２〜１５）、大員環（ｎ＝４、６、８）を形成するフェノール単位の数が異なるカリックスアレーン誘導体を表す（ＲおよびＲ１＝ＣＨ３、（ＣＨ２）ｘＣＨ３、（ＣＨ２）ｘＯＨであり、ここでｘ＝１〜３であり、ならびにそれらの組み合わせである）。
【００５６】
上記のカリックスアレーン化合物は新規であり、それらはまた、本発明の対象であり、これらの化合物は、眼疾患の処置に使用される、荷電の大きな多用性ならびに低い水溶性、容易な化学分解および酵素分解、低い生物学的利用能、天然起源または非天然起源によって特徴付けられる有効成分の放出を示す。
【００５７】
ターゲティング分子としてのコリンは、コリン担体が存在する場合、角膜上皮、血液網膜関門および網膜上皮の横断を誘導し、促進する（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００６、５８、１１３６）。
【００５８】
また、この場合、上記のイヌリンベースのコポリマーと同様に、カリックスアレーン系が、シリビニンまたはクルクミン／ラタノプロストなどの他の有効成分を組み込み、放出することができるナノ凝集体を形成する能力を示すことが見出された。
【００５９】
生体適合性および調製の容易さは、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中へのカリックスアレーン誘導体の簡単な溶解、過剰な有効成分の添加（相溶解法）、１５分間の超音波処理、２５℃での２〜３日間の撹拌、遠心分離およびＧＨＰ０．２μｍフィルターでの濾過によって得られる製剤を特徴付ける。本発明において得られるナノ粒子系は、０．５未満の多分散指数で５０から２００ｎｍの範囲の平均直径を有する。薬学的有効量の有効成分は記載されるナノ粒子に組み込まれる。特に、本発明において得られるナノ粒子系は１から１５％ｗ／ｗの範囲の薬物負荷を有する。本発明のさらなる特徴および利点は、非限定的な例とされる、これらのいくつかの実施形態の以下の説明からより明らかになるであろう。
【００６０】
ＳＬＮ（固体脂質ナノ粒子）およびＮＬＣ（ナノ構造脂質担体）型の脂質ナノ粒子系、または粘膜付着性であるか、もしくは粘膜付着性でない、カリックスアレーンベースのナノ構造系、または両親媒性イヌリンコポリマーに基づいたミセルおよびナノ粒子系におけるシリビニンまたはソラフェニブまたはクルクミンまたはラタノプロストから選択される有効成分を含有する本発明に係る製剤は、ＣＮＶ、ＡＭＤ、黄斑浮腫、血管新生緑内障、黄斑浮腫、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、ブドウ膜炎、眼内炎、網膜炎、脈絡膜炎、脈絡網膜炎、全身性疾患の網膜合併症などの神経変性眼疾患を治療するための有効成分の局所投与を可能にする。
【００６１】
製剤は、通常、凍結乾燥固体製剤の形態であり、脂質に組み込まれた有効成分に加えて、上記のポリマーまたはカリックスアレーンナノ構造、また、界面活性剤および／または抗凍結剤ならびに眼科製剤に一般に使用される他の賦形剤などの成分を含有し得る。
【実施例】
【００６２】
実施例１
シリビニンを含有するＳＬＮ（ＳＬＮ−Ａ）の調製
Ｃｏｍｐｒｉｔｏｌ  ＨＤ−５−ＡＴＯで調製し、シリビニンを負荷した本発明のＳＬＮ対象物を用いた手順およびこれにより得た実験データを本明細書以下に記載する。
【００６３】
ＳＬＮ−Ａの調製
ＳＬＮ−Ａを高圧高温均質化法により調製した。２００ミリグラムのＣｏｍｐｒｉｔｏｌ  ＨＤ５ＡＴＯをその融点（６５〜７０℃）を約５〜１０℃超えて溶融した。薬物（６８ｍｇ）をエタノール（０．５ｍＬ）のアリコートに可溶化し、次いで磁性撹拌下で溶融した脂質混合物に加えた。次いで薬物を含有する高温脂質混合物を、以前に同じ温度で加熱したＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８界面活性剤の水溶液（１００ｍＬ中に６０ｍｇ）中で乳化した。得られたプレエマルションを、６５〜７０℃の温度にて高温水浴に入れたＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ−Ｃ５機器（Ａｖｅｓｔｉｎ）を使用して高圧均質化に供する（４サイクルにて７５００±２５００ｐｓｉ）。得られたナノエマルションを室温に冷却し、次いで蒸留水に対する透析（ＣＯＭＷ  １２０００−１４０００）によって精製する。その後、抗凍結剤トレハロース（脂質：抗凍結剤重量比＝１：１ｗ／ｗ）をナノ粒子分散物に加え、これを遠心分離（１０℃にて１０分間４０００ｒｐｍ）に供した。最後に、Ｍｏｄｕｌｙｏ凍結乾燥機を使用した凍結乾燥後、ＳＬＮを回復させ、後の特徴付けのために冷凍室に保存した。
【００６４】
ＳＬＮ−Ａ系のサイズ決定およびゼータ電位測定
調製したＳＬＮ−Ａ系の平均直径および多分散指数（ＰＤＩ）は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳＰ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用して光子相関分光法（ＰＣＳ）によって決定した。各試料を好適には、ＮａＣｌ水溶液０．９％ｗ／ｗで分析のために希釈し、０．２μｍのフィルターで濾過し、読み取りを入射線に対して１７３°の角度で行い、３連で分析した。
【００６５】
Ｈｅ−Ｎｅレーザーを備えたＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳＰ（Ｍａｌｖｅｒｎ）、電力＝４．０ｍＷ、波長＝６３３ｎｍを使用したレーザードップラー速度計測および光散乱解析（Ｍ３−ＰＡＬＳ技法）の原理に従ってゼータ電位を測定した。平均直径、ＰＤＩおよびゼータ電位について得られた結果を表１に与える。
【００６６】
【表１】
0006744862.tif 000009
【００６７】
ＳＬＮ−Ａの薬物負荷（ＤＬ％）の決定
ＳＬＮ−Ａ試料に負荷したシリビニンの量を決定するために、以前に凍結乾燥に供した１０ｍｇの組成物をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した。次いで有機溶液をメタノールで処理して脂質を沈殿させ、有効成分を抽出した。次いで得られた懸濁液を０．４５μｍのフィルターで濾過し、ＨＰＬＣにより分析した。ＤＬ％（脂質＋有効成分からなる、凍結乾燥に供した１００ｍｇの物質を考慮して、ＳＬＮに負荷した有効成分の百分率として表した）に関して得た結果は８．５％ｗ／ｗであることを見出した。
【００６８】
ｐＨ７．４でのＳＬＮ−Ａからのシリビニンの放出
本発明に記載した系を、０から１２時間の範囲のインキュベーション時間で、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液を使用して３７℃にてインビトロでの放出研究に供した。得られた結果は、本発明の系が、１２時間以内に最大７．８％ｗ／ｗ以下で薬物をゆっくり放出することを示す。ｐＨ７．４および３７℃でのインキュベーション後の薬物の放出および溶解プロファイルを図１に示す。
【００６９】
記載した系は安定である。すなわち、それは、ｐＨ７．４にて外部媒体に薬物を非常にゆっくり放出し、このことは、この系を含有するナノ粒子によって病理学的部位への有効成分の送達を最適化するために有益であり得る。
【００７０】
実施例２
シリビニンを含有するＮＬＣ（ＮＬＣ−Ｂ）の調製
非限定的な例として、Ｃｏｍｐｒｉｔｏｌ  ＨＤ−５−ＡＴＯ、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４およびＡｃｃｏｎｏｎ  ＣＣ−６で調製し、シリビニンを負荷した本発明のＮＬＣ対象物を用いた手順およびこれにより得た実験データを本明細書以下に記載する。
【００７１】
ＮＬＣ−Ｂの調製
ＮＬＣ−Ｂを溶媒沈殿−蒸発法により調製した。Ｃｏｍｐｒｉｔｏｌ  ＨＤ５ＡＴＯ（２５０ｍｇ）をその融点（６５〜７０℃）を約５〜１０℃超えて溶融し、薬物（３０ｍｇ）を溶融した脂質に加えた。Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４（１００ｍｇ）およびＡｃｃｏｎｏｎ  ＣＣ−６（１００ｍｇ）をエタノール（２．０ｍＬ）に可溶化し、次いで磁性撹拌下で溶融した脂質混合物に加えた。次いで薬物および界面活性剤を含有する高温脂質混合物を、以前に同じ温度で加熱した界面活性剤タウロコール酸ナトリウムを含有する高温水溶液（１００ｍＬ中に１００ｍｇ）中で沈殿させ、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ（１３．５００ｒｐｍ）を使用して均質化に供した。依然として撹拌下で、高温ナノ粒子懸濁液を、その温度が１０℃の値に達するまで氷浴に入れた。次いで得られたナノ粒子を、３日間、蒸留水に対する透析（ＣＯＭＷ  １２０００−１４０００）によって精製し、次いで抗凍結剤トレハロースを加える（脂質：抗凍結剤重量比＝１：２ｗ／ｗ）。最後に、Ｍｏｄｕｌｙｏ凍結乾燥機を使用した凍結乾燥後、ＮＬＣを回復させ、後のイヌリン誘導体（ＩＮＵ−ＤＥＴＡ）およびキトサンによる被覆のために冷凍室に保存した。ＩＮＵ−ＤＥＴＡによる被覆の場合、９ｍＬの透析したナノ粒子懸濁液（４．３ｍｇ／ｍＬの濃度）を、磁性撹拌下で１時間、１ｍＬの０．１％ＩＮＵ−ＤＥＴＡとインキュベートした。低分子量（５０００Ｍｗ）キトサンによる被覆の場合、トレハロースを追加した９ｍＬの透析し、凍結乾燥したナノ粒子（０．１６５ｍｇ／ｍＬの濃度）を、磁性撹拌下で３０分間、１ｍＬの０．１％キトサンとインキュベートした。次いで被覆したナノ粒子を凍結乾燥し、後の特徴付けのために粉末として保存した。
【００７２】
ＮＬＣ−Ｂ系のサイズ決定およびゼータ電位測定
調製したＩＮＵ−ＥＤＡおよびキトサンで被覆したＮＬＣ−Ｂ系の平均直径および多分散指数（ＰＤＩ）は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳＰ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用して光子相関分光法（ＰＣＳ）によって決定した。各試料を好適には、ＮａＣｌ水溶液０．９％ｗ／ｗで分析のために希釈し、０．２μｍのフィルターで濾過し、読み取りを入射線に対して１７３°の角度で行い、３連で分析した。
【００７３】
Ｈｅ−Ｎｅレーザーを備えたＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳＰ（Ｍａｌｖｅｒｎ）、電力＝４．０ｍＷ、波長＝６３３ｎｍを使用したレーザードップラー速度計測および光散乱解析（Ｍ３−ＰＡＬＳ技法）の原理に従ってゼータ電位を測定した。平均直径、ＰＤＩおよびゼータ電位について得られた結果を表２に与える。
【００７４】
【表２】
0006744862.tif 000010
【００７５】
ＩＮＵ−ＤＥＴＡおよびキトサンで被覆したＮＬＣ−ＢのＤＬ％の決定
ＩＮＵ−ＤＥＴＡおよびキトサンで被覆したＮＬＣ−Ｂ試料に負荷したシリビニンの量を決定するために、以前に凍結乾燥に供した２ｍｇの組成物を８ｍＬのエタノール（ＥｔＯＨ）に高温溶解し、３分間超音波処理した。次いで得られた溶液を５．００μｍの再生したセルロースフィルタで濾過し、ＨＰＬＣにより分析した。
【００７６】
ＤＬ％（脂質＋有効成分からなる、凍結乾燥に供した１００ｍｇの物質を考慮して、ＮＬＣに負荷した有効成分の百分率として表した）に関して得た結果は、ＩＮＵ−ＤＥＴＡで被覆したＮＬＣ−Ｂについて６．０５％ｗ／ｗであり、キトサンで被覆したＮＬＣ−Ｂについて３．０７％ｗ／ｗであることを見出した。
【００７７】
ｐＨ７．４でのＩＮＵ−ＤＥＴＡおよびキトサンで被覆したＮＬＣ−Ｂからの有効成分の放出
本発明に記載したＩＮＵ−ＤＥＴＡおよびキトサンで被覆したＮＬＣ−Ｂ系を、０から１２時間の範囲のインキュベーション時間で、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液を使用して３７℃にてインビトロでの放出研究に供した。得られた結果は、本発明の両方の系が、ＩＮＵ−ＤＥＴＡで被覆したＮＬＣ−Ｂについて１２時間以内に最大５０％ｗ／ｗ以下、およびキトサンで被覆したＮＬＣ−Ｂについて１２時間以内に最大３０％ｗ／ｗ以下で薬物をゆっくり放出することを示す。ｐＨ７．４および３７℃でのインキュベーション後の２つの被覆した系からの薬物シリビニンの放出および溶解プロファイルを図２に示す。
【００７８】
ＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧ２０００に基づいた高分子ミセルの調製
非限定的な例として、ＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧ２０００に基づき、シリビニンまたはソラフェニブを負荷した本発明の高分子ミセル対象物を用いた手順およびこれにより得た実権データを本明細書以下に記載する。
【００７９】
ＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧ２０００コポリマーの臨界凝集濃度（ＣＡＣ）の決定
ＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧ２０００コポリマーの生成を、文献に既に存在している手順に従って良好な収率で実施した。ＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧ２０００コポリマーのＣＡＣは、蛍光プローブとしてピレンを使用して蛍光分光分析によって決定した。２０μＬのアセトン中のピレンの溶液（６．０×１０−５Ｍ）をバイアルに入れ、乾燥するまでオービタルシェーカーにおいて３７℃で蒸発させた。その後、濃度を増加させ、１×１０−５から５ｍｇ／ｍＬの範囲の２ｍＬのコポリマーの水溶液を、６．０×１０−７Ｍに等しいピレンの最終濃度を得るようにピレン残留物を含有するバイアルに加えた。このように得た分散物を、プローブをミセルと平衡にするために一定の撹拌下で３７℃にて２４時間維持した。ピレンの発光スペクトルおよび励起スペクトルは、以下の波長、それぞれ３７３ｎｍおよび３３３ｎｍを使用して記録した。結果は表３に示す。
【００８０】
【表３】
0006744862.tif 000011
【００８１】
シリビニンまたはソラフェニブを負荷したＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧの高分子ミセルの調製
シリビニンおよびソラフェニブを負荷した高分子ミセルは乾式複合体形成法（混練）によって調製した。詳細には、２００ｍｇのＩＮＵ−Ｃ８またはＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧを、乳鉢および乳棒を使用して薬物（５０ｍｇ）と乾式混合し、エタノール（５ｍＬ）の存在下で粉砕した。その後、エタノールの蒸発後に得られ、薬物を均一に分散させた、ポリマーによって形成された乾燥マトリクスを、ユニマー（ｕｎｉｍｅｒ）の自己凝集および得られたミセルの疎水性コア内の薬物の組み込みを促進するために、ゆっくりと水和させ、機械的撹拌下に置いた。
【００８２】
得られた分散物を超音波処理に供し、サイクルを回した（１０分の３サイクル）。その後、分散物を２０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、５μｍのカットオフを有するシリンジフィルターで濾過して、組み込まれていない薬物を除去した。最後に、得られた分散物を液体窒素中で凍結し、凍結乾燥した。
【００８３】
ＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧ２０００の高分子ミセルのＤＬ％の決定
シリビニンを負荷したまたはソラフェニブを負荷した３ｍｇのミセルをメタノール（５ｍＬ）に分散させ、分散を１０分間超音波処理し、次いで４時間激しく撹拌した。この時間の後、０．２μｍのカットオフを有するシリンジフィルターを使用して分散物を濾過し、最後にフィルターをメタノール（５ｍＬ）で洗浄して１０ｍＬの最終体積を得た。抽出手順から得たメタノール中の６００μＬの溶液でシリビニンを決定するために、ＨＰＬＣ分析のために使用する溶出混合物の組成に適合するように４００μＬの１％酢酸（ｖ／ｖ）を加えた。その結果として、ミセルから抽出した薬物の量を、溶出相として１％（ｖ／ｖ）（６０：４０）にてＣ６−フェニル、メタノール：酢酸カラムを使用してＨＰＬＣ分析により決定した。流速は０．６５ｍＬ／分に設定し、溶出液を２８８ｎｍにてモニターした。
【００８４】
ソラフェニブの測定のために、抽出手順から得た１ｍＬのメタノール中の溶液を、ミセルに組み込まれた薬物の量を測定するためにＨＰＬＣによって直接分析した。ＨＰＬＣ分析は、溶出相としてＣ６−フェニルメタノール：水（ｖ／ｖ）（９０：１０）カラムを使用して実施した。流速を１ｍＬ／分に設定し、溶出液を２６６ｎｍにてモニターした。
【００８５】
結果を表４に示す。ＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧの高分子ミセルの平均サイズおよびゼータ電位の測定。
ミセルのサイズ分布は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを使用した動的光散乱測定によって測定した。これらの測定は１７３°の固定角および２５℃の温度にて行った。ミセルの水溶液（２ｍｇ／ｍＬ）は５μｍのカットオフを有するセルロース膜フィルターによる濾過後に分析した。平均流体力学直径および多分散指数（ＰＤＩ）は相関関数の累積的分析を使用して得た。ゼータ電位（ｍＶ）は、電気泳動移動度によって、およびＫ・ａ＞＞１（ここで、Ｋおよびａはそれぞれデバイ・ヒュッケル（Ｄｅｂｙｅ−Ｈｕｃｋｅｌ）パラメーターおよび粒径である）と仮定してスモルコフスキー（Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｙ）の関係式を使用して算出した。結果を表４に示す。見られ得るように、全てのコポリマーは疎水性薬物であるソラフェニブおよびシリビニンを組み込むことができる。
【００８６】
【表４】
0006744862.tif 000012
【００８７】
放出研究
得られた系の、組み込まれた薬物を放出する能力を評価するために、適切な量のＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧ（１５ｍｇ）の高分子ミセルをＰＢＳ、ｐＨ７．４（５ｍＬ）中に分散させ、１ｋＤａの公称カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する浮遊透析膜Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒに移した。薬物を負荷したミセル分散物および薬物単独を含有する透析膜をｐＨ７．４にてＰＢＳ（５０ｍＬ）中に浸漬し、Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  ８０８Ｃオービタルシェーカーインキュベーターモデル４２０において連続撹拌下（１００ｒｐｍ）で３７℃にて２４時間インキュベートした。定期的な時間間隔にて、外部媒体のアリコート（１ｍＬ）を透析膜の外側から採取し、等量の新鮮な媒体と置き換えた。採取した試料を凍結乾燥させ、メタノール：酢酸１％（ｖ／ｖ）に懸濁し、放出した薬物の量を測定するためにＨＰＬＣによって分析した。例として、系に組み込んだ有効成分シリビニンの放出グラフを示す。得られた全ての放出データを、同じ手順を使用して得たシリビニン単独（０．２５ｍｇ）の拡散プロファイルと比較した（図３）。希釈プロセスを考慮してデータを補正した。各実験は３連で行い、結果は、標準誤差±５％に従っていることが見出された。グラフから見られ得るように、シリビニンを負荷したＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧの高分子ミセルは遊離シリビニンの拡散と比較して非常に遅い放出動力学を示す（シリビニンの５％ｗ／ｗ未満が１２時間のインキュベーション後に放出される）。同様の放出プロファイルもまた、有効成分ソラフェニブについて得た。
【００８８】
安定性研究
シリビニンまたはソラフェニブを負荷したＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧのミセルの安定性を、４℃および２５℃にて１、２および３ヶ月間、新たに凍結乾燥した系をインキュベートすることによって評価した。特に、新たに調製し、凍結乾燥した試料は、１、２および３ヶ月間、制御した温度で保存した。インキュベーション期間後、試料を再蒸留水（２ｍｇ／ｍＬ）中に分散させ、その平均直径、多分散指数およびゼータ電位を評価するために動的光散乱測定によって分析した。別々に、３ｍｇの試料をメタノール（５ｍＬ）に分散させ、分散物を最初に１０分間超音波処理し、２時間撹拌し、最後に５μｍのカットオフを有するシリンジフィルターで濾過し、追加の５ｍＬのメタノールで希釈した。抽出した有効成分の量は、薬物負荷の測定について記載されたのと同じ手順を使用してＨＰＬＣ分析によって測定した。
【００８９】
得られた結果は、調製したミセルおよび負荷した薬物の両方が長期間の保存の間、良好な物理的安定性を有することを示す。例として、表５は、平均直径、ＰＤＩおよびゼータ電位の変化を評価するために動的光散乱測定、ならびに薬物負荷および負荷した薬物の安定性を評価するためにＨＰＬＣ分析によって得た、シリビニンまたはソラフェニブを負荷したＩＮＵ−Ｃ８ミセルに関連する安定性データを示す。
【００９０】
【表５】
0006744862.tif 000013
【００９１】
インビトロでの細胞適合性研究
ＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧの空ミセルの生体適合性を、市販のキット（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎアッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用したＭＴＳアッセイによってヒト気管支上皮（１６ＨＢＥ）細胞株で評価した。細胞を２・１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に懸濁し、１０％ｖｏｌ／ｖｏｌのウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ｖｏｌ／ｖｏｌの抗生物質（１０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００００Ｕ−１ｍＬのペニシリン）で濃縮し、標準的な条件下（３７℃にて９５％ＲＨおよび５％ＣＯ２）でインキュベートした。インキュベーションの２４時間後、培地を除去し、０．０２５、０．０５、０．１、０．２５、０．５および１ｍｇ／ｍＬに等しい濃度でＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧの空ミセルを含有する２００μＬの新鮮な培地と置き換えた。インキュベーションの４および２４時間後、ＤＭＥＭ中のミセルの分散物を除去し、細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で１回洗浄し、１００μＬの新鮮な培地および２０μＬのＭＴＳ溶液で３７℃にて２時間インキュベートした。ＤＭＥＭのみでインキュベートした細胞を陰性対照として使用した。結果は、対照細胞と比較した細胞生存率の減少パーセントとして表した（図４ａおよび４ｂ）。全ての実験は３連で行った。
【００９２】
行った研究により、試験した高分子ミセルが、良好な細胞適合性を有し、ヒト気管支上皮細胞株に対してインビトロで細胞傷害性効果を呈示しないことが示される。この結果により、これらの系はインビボ薬物送達についての効果的な系として有用である可能性がある。研究した空系および有効成分負荷の生体適合性をまた、ＡＲＰＥ−１９網膜細胞およびＳＩＲＣ角膜上皮細胞でも確認した。
【００９３】
シリビニンまたはトシル酸ソラフェニブとコンジュゲートしたミセル担体ＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ−ＰＥＧを、２０時間の前処理に曝露した網膜細胞に対する保護効果について評価し、次いでＨ２Ｏ２で損傷させて酸化的ストレスを誘導した。空およびコンジュゲートＩＮＵＣ８ＰＥＧ担体はＰＥＧを有さない担体より高い保護作用を示すが、シリビニンまたはソラフェニブとコンジュゲートした担体ＩＮＵＣ８ＰＥＧのみが、ＰＥＧの存在に起因して、より高い濃度にてＬＤＨ放出の減少を引き起こすことができる。例として、図５Ａおよび図６はそれぞれ、有効成分ソラフェニブまたはシリビニンとコンジュゲートした系の実験による試験データを示す。
【００９４】
後処置プロトコルにおいて、Ｈ２Ｏ２により３時間損傷させ、続いてシリビニンまたはソラフェニブとコンジュゲートしたＩＮＵ−Ｃ８およびＩＮＵ−Ｃ８−ＰＥＧ系による処置にさらした網膜細胞は、損傷が誘導された障害を反転する両方の担体の良好な能力を示す。しかしながら、いずれかの有効成分とコンジュゲートしたＩＮＵＣ８ＰＥＧ系が、Ｈ２Ｏ２により誘導されるストレスを阻害するのに、より効果的である。例として、図５Ｂおよび図６Ｂは、有効成分ソラフェニブまたはシリビニンのそれぞれとコンジュゲートした系の実験による試験データを示す。
【００９５】
ＩＮＵＣ８ＰＥＧ系、空またはシリビニンとのコンジュゲートによる後処理にさらした網膜細胞の溶解物は、ＰＡＲＰ−１タンパク質、環境ストレスに応答してＤＮＡ修復に関与する１１６ｋＤａのポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの発現についてウェスタンブロッティングによって分析した（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｏｖｅｒｌｏａｄ  Ｉｓ  Ａ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｔｅｐ  Ｉｎ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｏｆ  Ａｒｐｅ−１９  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｂｙ  Ｈｉｇｈ−Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  Ｈ２Ｏ２  Ｇｕａｎｇ−Ｙｕ  Ｌｉら、（２０１０）  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。インビボおよびインビトロで、ＰＡＲＰ−１は、アポトーシスに関与する２４ｋＤａのＤＮＡ結合ドメインおよび８９ｋＤａの触媒ドメインを形成しているカスパーゼ３およびカスパーゼ７によって処理される（Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｏｆ  Ｐｏｌｙ  （ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｉｎ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｆ．Ｊ  Ｏｌｉｖｅｒら、（１９９８）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）。図７は、Ｈ２Ｏ２による処理後のＰＡＲＰ−１タンパク質の減少を示し、これにより細胞アポトーシス状態を確認する。反対に、コンジュゲートした担体で処理した試料において、ＰＡＲＰ−１のより高い発現を、遊離担体およびＳｌｂ自体と比較して観察する。酸化的損傷によって誘導されたアポトーシスを阻害する、ＳｌｂとコンジュゲートしたＩＮＵＣ８ＰＥＧの能力を、Ｈ２Ｏ２で処理した試料において用量依存的に確認する。遊離Ｓｌｂによる後処理はアポトーシスプロセスを減少させるが、コンジュゲートした担体より低い効率である。
【００９６】
実施例４
カリックスアレーンナノ粒子の調製
例として、シリビニン、クルクミンまたはラタノプロストを負荷したカリックス［４］アレーン誘導体（化合物１）による手順およびこれにより得られた実験データが、本明細書以下に記載される。
【００９７】
調製
大員環の下端において４つのドデシル脂肪族鎖および上端においてコリンの４つの極性頭部基を有する両親媒性のカリックス［４］アレーン誘導体（化合物１）を、同様の誘導体に関する文献に記載された手順を適合して良好な収率で合成した。化合物はＮＭＲ分光法および質量分析により特徴付けた。
【化８】
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【００９８】
ナノ凝集体におけるカリックスアレーン誘導体の構築は自発的に起こる。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の簡単な溶解は、表６に示されるサイズ、多分散指数およびゼータ電位を有するナノ凝集体を含有するコロイド溶液を生じる。薬物負荷は、過剰な薬物（モル比１：５）を底体としてコロイド溶液に加えることによって実施した。混合物は１５分間超音波に曝露し、２５℃、２００ｒｐｍにて２〜３日間、振盪器で撹拌した。その後、４０００ｒｐｍにて３０分間の遠心分離およびＧＨＰ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ０．２μｍフィルターでの濾過により、シリビニンを負荷したナノ粒子のコロイド溶液を得る。抗凍結剤を添加せず、標準的な凍結乾燥機を使用したこの溶液の凍結乾燥により、白色粉末を得、これを水に再懸濁し、薬物を負荷したナノ粒子のコロイド溶液を回復させる。ＧＨＰ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ０．２μｍフィルターでのコロイド溶液の再濾過およびその後のＤＬ％を決定するためのＨＰＬＣ分析により、凍結乾燥後に系が組み込まれた薬物負荷を保持していることが示される（表６）。
【００９９】
サイズ決定およびゼータ電位測定
シリビニンを負荷したおよび負荷していないカリックスアレーンナノ粒子の平均直径、多分散指数（ＰＤＩ）およびゼータ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ−９０（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用して測定し、読み取りを入射線に対して９０°の角度で行い、３連で分析した。平均直径、ＰＤＩおよびゼータ電位について得た結果を表６に与える。
【０１００】
【表６】
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【０１０１】
カリックスアレーンナノ粒子の薬物負荷（ＤＬ％）の決定
１ｍｇ／ｍＬのカリックスアレーンナノ粒子を含有するコロイド溶液中で負荷したシリビニンの量を決定するために、溶液のアリコートをメタノールで希釈し、ＨＰＬＣにより分析した。２８８ｎｍでのシリビニンの吸収バンドを考慮して薬物の量を測定した。ＰＢＳ中のシリビニンの３２７ｎｍバンドを考慮してＵＶ分光計にて薬物の量も測定した。
【０１０２】
ＤＬ％（負荷した有効成分の重量と、負荷した有効成分の重量＋ナノ粒子の重量とのパーセント比として表した）に関して得た結果は１０〜１１％に等しいことが見出された。
【０１０３】
ｐＨ７．４でのＰＢＳ中のカリックスアレーンＮＰからのシリビニンの放出
ｐＨ７．４でのリン酸緩衝液中のシリビニンの放出を、透析による０から１２時間の範囲のインキュベーション時間で３７℃にてインビトロで調べた。得られた結果は、系が、１２時間以内に最大６．５％ｗ／ｗ以下で薬物をゆっくり放出することを示した（図７）。持続放出は、病理部位における薬物送達の目的のために有益であり得る。
【０１０４】
ｐＨ７．４でのＰＢＳ中でシリビニンを負荷したカリックスアレーンナノ粒子の安定性研究
シリビニンを負荷したカリックスアレーンナノ粒子の安定性は、２５℃にてＰＢＳ中でコロイド溶液を維持することによって評価した。調製物からの７および１４日における対照は、実質的に変化していないサイズ、ＰＤＩおよびＤＬ％の値を示す（表１０）。製剤の安定性は、重要な薬理（例えば、眼底における病理部位への到達）および工業化要件である。
【０１０５】
【表７】
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【０１０６】
ＡＲＰＥ−１９細胞においてシリビニンとコンジュゲートしたカリックスアレーン−コリン担体の予備調査後、０．０１〜１μＭの範囲に含まれ、２０時間インキュベートした遊離またはＳｌｂとコンジュゲートした担体の濃度は毒性を生じなかったことを決定した。次いで、コンジュゲートした系および空の系の効果を、細胞酸化還元状態の変化がある、酸化的障害として化合物ＦｅＳＯ４を使用して試験した。インキュベーションの２４時間にわたって、細胞を２０時間前処理し、次いで３時間５０μＭのＦｅＳＯ４による損傷にさらした［「前処理」２０時間の薬物＋３時間の損傷］。生存試験を、問題の担体の毒性および損傷からの保護の能力を評価し、培養培地中でＬＤＨの放出を評価するために行った。図８Ａは、５０μＭのＦｅＳＯ４による損傷に供したまたは供していないＡＲＰＥ細胞におけるＳｌｂとコンジュゲートした担体（ＣａｌｉｘＳｌｂ）、空担体（Ｃａｌｉｘ）およびシリビニン単独（Ｓｌｂ）の用量曲線を示す。ＳｌｂはＬＤＨの放出を減少させるが、ＣａｌｉｘＳｌｂおよび空（Ｃａｌｉｘ）は、ＡＲＰＥ−１９細胞のＬＤＨの放出を有意に変化させないことに留意されたい。反対に、細胞がＦｅＳＯ４（５０μＭ）に曝露されると、ＣａｌｉｘＳｌｂは、ＬＤＨの放出を減少させるのに良好な可能性を示し、ＣａｌｉｘおよびＳｌｂの個々で処理した試料中に観察されない効果である。これらの結果は、ｃａｌｉｘおよびＳｌｂが、酸化還元状態の変化に対する保護に対して細胞を一緒に調製できることを示唆する。後の実験において、カリックスアレーンベースの化合物による後処理の効果を試験した。したがって、細胞を５０μＭのＦｅＳＯ４で５時間処理し、様々な化合物と２０時間インキュベートした。図８Ｂに示されるように、ＣａｌｉｘＳｌｂは後処理の条件においてさえ損傷に対して保護し、酸化還元状態の変化から個々に保護できる２つの化合物の相乗作用として効果を確認する。
【０１０７】
図９ＡはＶＥＧＦのウェスタンブロット分析を示し、これは、ＦｅＳＯ４による損傷後の可溶性ＶＥＧＦの発現レベルの減少を示し、この減少は、空Ｃａｌｉｘ、Ｓｌｂおよび１μＭの濃度のＣａｌｉｘＳｌｂでのＣａｌｉｘＳｌｂによって無効にされる。実際に、ＣａｌｉｘＳｌｂ自体はＶＥＧＦのレベルを増加させることができる。これらの結果は、ＡＲＰＲＥ細胞の低酸素条件下でのＶＥＧＦ分泌の阻害および薬物による前処理に関するＬｉｎら（Ｓｉｌｉｂｉｎｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＶＥＧＦ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ＰＩ−３  ｋｉｎａｓｅ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ  ｐａｔｈｗａｙ  ＣＨ  Ｌｉｎら、（２０１３）  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）によって報告された観察と一致する。分泌の欠如は、血管新生プロセスの減少に付随する、（自己分泌シグナル伝達）の自己調節因子として作用できない遊離ＶＥＧＦの欠如を導く。
【０１０８】
カテプシンＤは、活性断片を生成するために処理されるプレ−プロ−酵素（ｐｒｅ−ｐｒｏ−ｅｎｚｙｍｅ）として小胞体内で合成される細胞内アスパルチルプロテアーゼである。それが存在する細胞環境によれば、それは、異なる機構を介してアポトーシスを誘導または阻害できる。４８ｋＤａの断片は活性中間型であり、それから２つのさらなる活性断片が生成され、したがってその減少はタンパク質分解プロセスの活性化と関連し、逆も同様に、その増加はアポトーシスの阻害の指標である。酸化的ストレスの存在下で、カテプシンＤの活性化はカスパーゼ８を活性化でき、次にカスパーゼ３を活性化でき、細胞死を導く（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ  ｉｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、Ａ．  Ｍｉｎａｒｏｗｓｋａら、（２００７）  Ｆｏｌｉａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｃｙｔｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ）（Ｃａｓｐａｓｅ−８−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎｓ  Ｈ．Ｋ．  Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら、（２００７）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ）。図９Ｂに示されるように、ＦｅＳＯ４への細胞の曝露の結果、カテプシンＤの４８ｋＤａバンドの減少が生じる。ＣａｌｉｘまたはＳｌｂによる後処理により、カテプシンＤの発現レベルが増加するが、タンパク質のより多くの増加が、ＣａｌｉｘＳｌｂで処理した試料において観察され、カテプシンＤが関与するアポトーシスプロセスの阻害として検出される、保護活性に関するコンジュゲートの増強効果が確認される。
【０１０９】
カリックスアレーン担体化合物（１）は、それ自体で、種々の疎水性分子を負荷するのに役立ち、本発明において一例として、シリビニンに加えて、クルクミンおよびラタノプロストをそれに負荷した。上記の有効成分は、低い水溶性、容易な化学および酵素分解、低いバイオアベイラビリティによって特徴付けられる。クルクミンおよびシリビニンは、炎症からがんに及ぶ種々の病態において使用される天然物質であり、ラタノプロストは、世界中で依然として不可逆的失明の主な原因の病態である、緑内障の治療において使用されるプロスタグランジンＦ２α類似体である。
【０１１０】
また、これらの有効成分に関して、ナノ凝集体化合物（１）における有効成分の負荷は、相溶解度法により１０％以上の薬物負荷を生じる。有効成分の用量はＨＰＬＣ分析およびＵＶ分光法によって分析した。
【０１１１】
有効成分を負荷したナノ凝集体（化合物１）をＤＬＳおよびゼータ電位測定によって特徴付け、ナノ寸法、多分散指数および表面負荷は薬物送達系に適したままであることが示された（表１１）。
【０１１２】
【表８】
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【０１１３】
カリックスアレーン１は、水性媒体中でクルクミンおよびシリビニンの溶解度を少なくとも１０倍増加させる。
【０１１４】
カリックスアレーン１は溶媒としてのＰＢＳ中でクルクミンを保護し、０．１ＭのＰＢＳで、および無血清培地中で３０分で８０〜９０％の分解を示す（図１０）。
【０１１５】
カリックスアレーン１は、室温にて６ヶ月にわたって溶媒としてのＰＢＳ中でラタノプロストを分解から保護する（表１２）。これは、現在市場にあるものと異なり、コールドチェーンから放出され、防腐剤を含まない、革新的な製剤の生産を可能にするので興味深い結果である。
【０１１６】
【表９】
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【０１１７】
カリックスアレーン１、有効成分を負荷したカリックスアレーンおよび有効成分単独のコロイド溶液を細胞傷害性について試験した：ＳＩＲＣ角膜細胞（図１１）、Ｊ７７４マクロファージ（図１２）およびＡＲＰＥ網膜細胞。この結果により、試験した全ての細胞種類に対してカリックスアレーンおよびカリックスアレーン−有効成分の組み合わせの良好な生体適合性が示された。カリックスアレーン１、カリックスアレーン−クルクミンおよびクルクミン単独のコロイド溶液の抗炎症活性を、ＬＰＳによる損傷によって炎症ストレスに供したＪ７７４細胞でインビトロにおいて試験した。特に、Ｊ７７４細胞を、１０μｇ／ｍＬの濃度にて２４時間、リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激し、ＬＰＳによる刺激は、亜硝酸塩の放出およびニトロソ化ストレスもない場合、ＮＦκＢ核移行およびサイトカイン産生などの炎症プロセスの活性化を誘導する。次いで細胞生存率を、ＬＰＳ（２４時間１０μｇ／ｍＬ）による刺激および異なる濃度で研究されている送達系の２時間の前処理後に評価した。ＬＰＳによる刺激後の細胞生存率は５０％減少し、クルクミン、担体およびクルクミンに関連した担体などの試験した物質による処理は細胞生存率を回復でき、損傷した細胞に対して既に毒性があるように見える、より高い濃度を除いて、それをほぼ対照レベルまで回復する（図１３）。次いで送達系の抗炎症活性をウェスタンブロット分析によって評価した。まず、ＩκＢαの分解（図１４）およびその結果として生じる核へのＮＦκＢ転移（図１５）を観察し、このことは、サイトカインをコードする遺伝子などの炎症性遺伝子の産生および活性化を導く。この結果は、ＬＰＳ（３０分間１０μｇ／ｍＬ）による刺激が、ＩκＢαの分解およびその後のＮＦκＢの核への転移を有意に増加させることを示す（これらのレベルは図１５に見られ得るように有意に増加する）。反対に、送達系による前処理はＩκＢαの分解およびＮＦκＢ転移を有意に減少させ得る（図１５）。ＮＦκＢ活性化はシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）などのタンパク質および炎症性メディエーターならびに誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の産生を伴い、その結果として亜硝酸塩の産生を増加させる。ウェスタンブロット分析により、ＬＰＳ（２４時間１０μｇ／ｍＬ）による刺激が、ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２の両方のレベルを有意に増加させたことが観察された。クルクミン、担体およびクルクミンと結合した担体による前処理は、ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２のレベルを有意におよび用量依存的に減少させる（図１６）。
【０１１８】
カリックスアレーン誘導体は、担体としてその作用を実施するだけでなく、ＬＰＳによる炎症ストレスにさらされたマクロファージに対して抗炎症活性も有する。行った試験は、クルクミンを負荷したカリックスアレーン＞＞カリックスアレーン＞＞クルクミン単独の抗炎症活性を示した。
【０１１９】
目的の眼の部位に対する有効成分を負荷したカリックスアレーン系の有効性を検証することを目的として、ブドウ膜炎モデルを用いてインビボで実験を行った。ブドウ膜炎は、０．２ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４中に希釈したサルモネラミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）由来の２００ｉｇのＬＰＳエンドトキシンの後足への単回の皮下注射によって１６０〜１８０ｇのＬｅｗｉｓラットにおいて誘導した。対照群は後足に０．２ｍＬのＰＢＳのみを受けた。ラットを処置群（カリックスアレーン系、カリックスアレーン−シリビニン、シリビニン単独、カリックスアレーン−クルクミンおよびクルクミン単独）に分け、ブドウ膜炎の誘導前の３日間、局所投与によって前処置し、後の時点で、屠殺をエンドトキシンの注射の１６時間後に一部の動物で、７２時間後にその他の動物で行った。組織学的および免疫組織化学的分析のために眼を摘出した。房水もまた、タンパク質投与のために得た。ＬＰＳを注射した動物由来の眼組織の組織学的分析により、好中球の強力な浸潤と共に重度のブドウ膜炎の兆候が示された。担体のみで処置した動物において、炎症の程度は減少しなかった。シリビニンによる処置は、顕著ではないが、眼炎症を減少させ、一方で、カリックスアレーン＋シリビニン系の結合は損傷を減少させたことが示された。
【０１２０】
しかしながら、クルクミン、特にカリックスアレーン＋クルクミンの組み合わせによる処置は、組織学的損傷を顕著に減少させた。眼炎症は偽の群において観察されなかった。
【０１２１】
さらに、１６時間および７２時間における群の間で顕著な差は観察されなかった。例として、７２時間において種々の群に対して記録した組織学的スコアをまとめたグラフを示す（図１７Ａ）。ＬＰＳの注射の１６および７２時間後、ＬＰＳを注射した動物の房水において増加したレベルのタンパク質を観察した。担体のみによる処置は眼組織においてタンパク質レベルの減少を生じなかった。シリビニンで処置した動物は、顕著ではないが、ある傾向を示し、一方で、カリックスアレーン＋シリビニン系の組み合わせは、房水におけるタンパク質のレベルを顕著に減少させた。しかしながら、クルクミンおよびカリックスアレーン＋シリビニン系の組み合わせが、眼組織におけるタンパク質の減少に最も効果的であると判明した。１６時間および７２時間に採取した試料は、実験した全ての群において同様の傾向を示し、例として、種々の処置群に対して７２時間において見出されたタンパク質用量のグラフを示す（図１７Ｂ）。
【０１２２】
ラタノプロストを負荷したカリックスアレーン系の有効性を検証するために、強膜上静脈焼灼（ＥＶＣ）によってＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットにおいて誘導した高眼圧症モデルを用いてインビボでの実験を設定した。
【０１２３】
処置は１２μＬ／眼（左眼）を注入することによって１日１回実施し、実行プロトコルは、有効成分を有する担体系の時間経過の間、単回投与の処置を含み、その間に眼内圧（ＩＯＰ）の測定値を１時間、３時間、５時間、７時間、２４時間、３０時間および４８時間において得、そして７連続日にわたって長期投与し、その間にＩＯＰの測定値を次の注入前に２４時間ごとに評価した。
【０１２４】
各々１０匹からなる各処置群について行い、異なる時点において記録した平均ＩＯＰ測定値を、以前に算出したベースラインの平均値と比較した。グラフ（図１８Ａ／Ｂ）は、異なる時点での時間経過後の単回投与後（図１８Ａ）および７日にわたる長期処置後（図１８Ｂ）の両方で、市販の製品（ＩＯＰＩＺＥ）と比較して、Ｃａｌｉｘ＋ラタノプロストで処置すると、眼圧（ＩＯＰ）を低下させる傾向を示す。
【０１２５】
２つの処置についての圧力変動の傾向はかなり類似しており、カリックスアレーン−ラタノプロスト系および製品ＩＯＰＩＺＥの両方の場合において、投与直後の最初の時間の間、ＩＯＰの顕著な増加からなるランタノプロストの逆説的効果が観察され、文献で公知であるこの効果はラットに特有であり（Ｌａｔａｎｏｐｒｏｓｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ：ｄｉｒｅｃｔ  ｏｒ  ｉｎｄｉｒｅｃｔ？  Ｈｕｓａｉｎ  Ｓら  Ｊ  Ｏｃｕｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．（２００８）；Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｌａｔａｎｏｐｒｏｓｔ  ｏｎ  ｒｏｄｅｎｔ  ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ．Ｈｕｓａｉｎ  Ｓら  Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．（２００６））、次いで圧力の段階的な低下が起こり、２４時間後にのみそのピークに到達し、次いで増加する傾向がある。２４時間ごとの投与による長期処置により、ＩＯＰの低下が可能となり、これはカリックスアレーン−ラタノプロスト系での４日目付近でその最も高い屈曲点に到達する。市販の製品と比較してカリックスアレーン系は、有効成分の有効性を維持しながら、コールドチェーンから製剤を放出する利点、防腐剤なしに製剤を配合する利点を与える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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