(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学システムであって、対向伝搬光ビームを使用して光トラップを形成するためのトラッピング光学系と、前記光トラップに捕捉される粒子を撮像する光シート用の光シート撮像光学系とを備え、前記対向伝搬光ビームの波長と、光シート撮像用に使用される光の波長は、互いに干渉しない、光学システム。
【請求項２】
請求項１に記載の光学システムであって、前記対向伝搬光ビームは、鏡で反射された単一光源からの光を利用して形成される、光学システム。
【請求項３】
請求項１に記載の光学システムであって、前記対向伝搬光ビームは、２つの異なる光源によって供給される、光学システム。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の光学システムであって、前記対向伝搬光ビームは、前記トラップ内での粒子運動（回転運動等）を可能とする、光学システム。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の光学システムであって、前記対向伝搬光ビームは、異なる強度であることにより、前記トラップ内での粒子運動（回転運動等）を生じさせる、光学システム。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の光学システムであって、前記対向伝搬光ビームは、異なる偏光であることにより、前記トラップ内での粒子運動（回転運動等）を生じさせる、光学システム。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の光学システムであって、前記対向伝搬光ビームは、平行で、かつ互いに空間的にオフセットされることにより、前記トラップ内での粒子運動（回転運動等）を生じさせ、または前記対向伝搬光ビームは、互いに非平行になるように不整列とすることにより、前記トラップ内での粒子運動（回転運動等）を生じさせる、光学システム。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の光学システムであって、微小流体装置を備え、前記粒子は、前記微小流体装置内に位置し、前記対向伝搬光ビームは、前記微小流体装置に光トラップを形成するように配置される、光学システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学的操作および例えば生体試料等の試料の撮像に関する。特に、本発明は、光トラップにおける光シート撮像に関する。
【背景技術】
【０００２】
光シート蛍光顕微鏡または選択的平面照明顕微鏡は、蛍光画像を被照射面に対して垂直に撮影する間、薄い光シートを利用して試料を照射する。この構成は、光シート蛍光顕微鏡に他の種類の顕微鏡よりも複数の利点をもたらす。即ち、第１に、試料の非照射部分は、光に曝露されずに、検出することができない。これにより、軸分解能および画像コントラストを強化し、かつ、試料が曝露される光変性および光毒性を減少させる。第２に、光シート蛍光顕微鏡の軸分解能は、主に、光シートの厚さによって決定され、これは、検出光学系から独立している。従って、良好な軸分解能を達成しつつ、大きな視野において低倍率の対物レンズを使用することができる。第３に、全面が同時に照射および撮像される故、撮像速度は、走査型共焦点顕微鏡と比較して強化される。これらの利点を有するため、光シート蛍光顕微鏡は、大きな試料の３Ｄ画像を作成し、また生体試料の長期間に亘るモニタリングにさえ好適である。このモダリティは、ベッセルビームまたはエアリービーム等のより先進的なビーム形状を利用することによって、助長することができる。
【０００３】
光シート蛍光顕微鏡において、試料の３Ｄスタックを記録するための現行方法は、試料を検出軸に沿って機械的に移動させるステップか、または光シートおよび検出対象を検出軸に沿って、互いに一定の距離で移動させるステップのいずれかを含む。いずれの方法においても、験体が検出軸に沿って機械的に走査される間に験体を保持するために、通常はジェルが使用される。ジェルと水との間において結果として得られるインフェースは、２つの媒体の間における屈折率の違いによる光学収差をもたらし、それ故、画像品質が低下する。更に、この閉じ込めモードを利用する長期間のモニタリングは、生体試料の成長を制限しかねない。また、海遊性微生物等の可動性験体においては、験体を麻酔するか、または十分な力で物理的に制約して、繊毛打を弱らせ、験体の運動を停止させなければならない。麻酔および／または物理的な力を使用することで、特に長い期間を必要とする場合、成長および生物の通常の機能を損ないかねない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明によれば、対向伝搬光ビームを使用して光トラップを形成するためのトラッピング光学系と、例えば光トラップに配置される細胞等の粒子を撮像する光シート用の光シート撮像光学系とを備える光学システムが提供される。光トラップは試料（例えば細胞）が歪まないような方法で、即ち、試料が自然な、歪んでいない状態でトラップ内に保持されるように試料を保持または配置可能とすることが好ましい。
【０００５】
デュアルビーム光ピンセットとも称される対向伝搬ビームトラップを使用すれば、微生物を非接触で汚染せずに取り扱って捕捉することが可能であり、また、いくつかの用途においては、（適度のビーム変位によって）微生物を空間移動および／または回転させることが可能である。
【０００６】
光トラップは、光シート蛍光顕微鏡において使用される独立したレーザ波長で操作される際、画像の品質に影響しない。更に、画像の品質を劣化させる媒体インタフェースも存在しない。
【０００７】
対向伝搬ビームは、単一光源からの光を利用して形成することができる。例えば、対向伝搬ビームは、鏡で反射された単一光源からの光を利用して形成することができる。
【０００８】
対向伝搬ビームは、２つの異なる光源によって供給されてもよい。
【０００９】
対向伝搬ビームは、トラップ内での粒子運動（回転運動等）を可能とするようにしてもよい。
【００１０】
対向伝搬ビームは、異なる強度であることにより、トラップ内での粒子運動（回転運動等）を生じさせてもよい。
【００１１】
対向伝搬ビームは、異なる偏光であることにより、トラップ内での粒子運動（回転運動等）を生じさせてもよい。
【００１２】
対向伝搬ビームは、オフセットまたは不整列とすることにより、トラップ内での粒子運動（回転運動等）を生じさせてもよい。
【００１３】
対向伝搬ビームは、微小流体装置に光トラップを形成するように配置することができる。
【００１４】
本発明の別の態様によれば、試料を対向伝搬ビーム光トラップに捕捉するステップと、例えば光トラップに配置される細胞等の試料を光シートにより撮像するために光シート撮像光学系を使用するステップとを含む試料の撮像方法が提供される。光トラップは、試料（例えば細胞）が歪まないような方法で、即ち、試料が自然な、歪んでいない状態でトラップ内に保持されるように、試料を保持または配置可能とすることが好ましい。
【００１５】
デュアルビーム光ピンセットとも称される対向伝搬ビームトラップを使用すれば、微生物を非接触で汚染せずに取り扱って捕捉することが可能であり、また、いくつかの用途においては、（適度のビーム変位によって）微生物を空間移動および／または回転させることが可能である。
【００１６】
光トラップは、光シート蛍光顕微鏡において使用される独立したレーザ波長で操作される際、画像の品質に影響を及ぼさない。更に、画像の品質を劣化させる媒体インタフェースも存在しない。
【００１７】
対向伝搬ビームは、単一光源からの光を利用して形成することができる。例えば、対向伝搬ビームは、鏡から反射された単一光源からの光を利用して形成することができる。
【００１８】
対向伝搬ビームは、２つの異なる光源によって供給されてもよい。
【００１９】
対向伝搬ビームは、トラップ内での粒子運動（回転運動等）を可能としてもよい。
【００２０】
対向伝搬ビームは、異なる強度であることにより、トラップ内での粒子運動（回転運動等）を生じさせてもよい。
【００２１】
対向伝搬ビームは、異なる偏光であることにより、トラップ内での粒子運動（回転運動等）を生じさせてもよい。
【００２２】
対向伝搬ビームは、オフセットまたは不整列とすることにより、トラップ内での粒子運動（回転運動等）を生じさせてもよい。
【００２３】
対向伝搬ビームは、微小流体装置に光トラップを形成するように配置することができる。
【００２４】
添付図面を参照して、本発明の多様な態様を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】一体化された光トラップシステムを有する光シート撮像システムの概略図である。
【図２】対向伝搬ビーム光トラップにおける粒子の概略図である。
【図３】図１のシステムを利用して捕捉され、撮像された一対のＢＹ−２細胞の一例の顕微鏡写真である。
【図４】（ａ）は、光学的に捕捉されたＳ．ラマルキーの幼虫の明視野画像の顕微鏡写真であり、（ｂ）〜（ｄ）は、光学的に捕捉されたＳ．ラマルキーの幼虫からの自己蛍光信号によって取得された幼虫の光シート画像の３例を示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、対向伝搬光ビームを使用して、光トラップおよび光トラップにおける粒子を撮像する光シート用の光シート撮像光学系を形成する。対向伝搬レーザビームトラップを形成するための技術は、当業者間においては周知である。この種の光トラップは、２つの緩やかにフォーカスされた対向伝搬レーザビームを使用して、ビームの焦点の間に大きな対象物を閉じ込める。ビームの伝搬方向に沿った光散乱力は、この方向に閉じ込めるために均衡を取りつつ、勾配力により他の２つの横方向への閉じ込めを可能にする。２つの焦点は、空間光変調器によって、または単純に異なる発散を有する２つのビームを結合することによって生成することができる。前者の方法は、堅牢かつ簡素な仕組みであるため有利であるが、空間光変調器の高いコスト故に制限される。それぞれが０．１程度しかない開口数を有する２つの光ファイバを使用して、トラッピングに十分な力を供給することができる。この対向伝搬レーザビーム構成は、単一ビームの伝搬軸線に沿った２つの焦点を生成し、ビームを鏡で反射させて対向伝搬構成を作り出すことによっても達成することができる。この配置においては、サイズが５０μｍ〜２００μｍの微生物を成功裏に捕捉することができた。
【００２７】
光トラップを使用すれば、試料をそのネイティブ媒体またはネイティブ環境に保持し、光学収差をもたらすことなく、試料を移動または回転させるための非接触性の方法を提供することができる。これの更なる利点は、低いパワー密度しか必要としない故、潜在的な光損傷を低減させる点にある。
【００２８】
図１は、光トラップおよび試料を撮像する光シート用のシステムを示す。このシステムは、２つの主要な部分、即ち、撮像する粒子を捕捉し保持するための光学系と、光トラップにあるときに粒子を撮像する光シート用の光学系と、を有する。光シートによる撮像のための光学系は、オープンアクセスプロジェクト（オープンＳＰＩＭ）に基づく。図１の右側は、撮像部を示し、左側は、試料チャンバ内に近赤外トラッピングレーザビームを供給するための光学系を示す。捕捉のために使用される光の波長と、撮像のために使用される光の波長は、両者間で干渉が生じないよう選択しなければならない。また、トラップは、試料が光学的な力によって歪まないように、かつ試料を自然かつ歪んでいない状態に保持しなければならない。
【００２９】
より具体的には、図１のシステムは、例えば波長が４８８ｎｍの、蛍光光シート撮像用に照明を供給するためのレーザ（Ｌ１）を有する。レーザビームは、焦点距離（ＦＬ）が２５ｍｍおよび１００ｍｍを有する４Ｘビームエキスパンダ（ＢＥ１）によってコリメートされ、かつ拡張される。調節可能なスリット（ＡＳ）は、ビーム幅を変化することにより、照明の開口数を制御可能とし、それによって光シートの厚さを制御することができる。ビームは、円筒レンズ（ＣＬ）によってステアリングミラー（ＳＭ１）上にフォーカスされ、続いて、リレーレンズの組み合わせ（ＲＬ１）を使用して、光シートが形成される照射対象（Ｏ１）の背面開口部にリレーされる。対象（Ｏ２）、チューブレンズ（ＴＬ）およびカメラ（ＣＡＭ）によって画像を照射面に対して垂直に撮影した。
【００３０】
ダイクロイックミラー（ＳＭ１）を通じて、第２光路を撮像システム内に一体化することによって、マクロトラップを達成した。例えば操作波長＝１０６０−１１００ｎｍを有する近赤外レーザ（Ｌ２）をファイバ（Ｆ）と共に導入する。ビームの偏光状態は、１／２波長板（ＨＷ）によって制御される。これにより、制御される２つのトラッピングビームの間におけるレーザのパワー分配が可能となる。レーザは、偏光ビームスプリッター（ＰＢＳ１）によって２つに分割される。続いて、ビームは、別の偏光ビームスプリッター（ＰＢＳ２）によって結合される。リレーレンズの組み合わせ（ＲＬ２）により、ビームをダイクロイックミラーに、続いて照射対象（Ｏ１）に供給する。
【００３１】
２つの偏光ビームスプリッターの間における光路のうちの一方において、レーザビームが拡張される（ＢＥ２）ことにより、照射対象の背面開口部を満たすことができる。他方の光路において、ビーム発散をレンズ（ＬＥ）によって変化させることにより、照射対象の背面開口部に進入するとビームが発散する。２つのビームは、同一の対象（Ｏ１）を通過し、約０．８ｍｍ離れた距離にある、同一軸線上にある２つのスポットにフォーカスされる。試料チャンバにおいて銀ミラーを使用して、ビームを再帰反射させることにより、対向伝搬トラップ構成を達成する。これは、図２に示す。焦点間距離は、ミラーを照射軸線に沿って移動させることによって調節可能である。この実施例において、試料は、ＦＥＰチューブ（エチレンプロピレン）に保持される。これは、水の屈折率と同様の屈折率を有する故、光学収差を大幅に避けることができる。手動による移動段階（Ｍ）の時に配置されるカスタマイズされたホルダによってチューブおよび銀ミラーを保持した。
【００３２】
撮像するために、図１のシステムを使用することにより、試料をトラップ内に安定／静止した状態に保持することができる。代替的に、対向伝搬レーザビームトラップを形成するビームの特性は、トラップ内での試料の運動を生じさせるために可変である。これは、少量の移動または回転運動であり得る。この運動は、例えばトラッピングビームの偏光を変化させることによって生じさせることができる。代替的または付加的に、ビームの整列は、トラップ内での運動を生じさせるために可変とし、例えば僅かにオフセットさせることができる。これの利点として、例えば、トラップ内の試料が光学的に移動可能（例えば、回転可能）となることにより、異なる位置において複数の光シート画像を撮影することができる点が挙げられる。
【００３３】
タバコＢＹ−２細胞および野生型Ｓ．ラマルキーの幼虫等の生体試料を図１のシステムにおいて捕捉し、撮像した。ＢＹ−２細胞株は、Ｔｈｅ  Ｊａｍｅｓ  Ｈｕｔｔｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＨＩ）から取得し、遺伝子組み換えして、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を安定的に発現した。一対の捕捉されたＢＹ−２細胞の一例を図３に示す。捕捉されたタバコ細胞は、検出軸線に沿って移動して、３Ｄ光シート蛍光顕微鏡の画像を形成した。細胞の移動は、ステアリングミラーをアクチュエータ（ＣＭＡ−１２ＣＣＣＬ，ニューポート）で自動的に走査することによって実施した。速度が８ｆｐｓで増加量が０．５μｍである４００のフレームが完全な３Ｄスタックのために撮影された。
【００３４】
Ｓ．ラマルキーの成体は、セントアンドリュースにおけるイーストサンズの岩から収集し、Ｇａｔｔｙ  Ｍａｒｉｎｅ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙにおけるＳｃｏｔｔｉｓｈ  Ｏｃｅａｎｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの循環式海水アクアリウムシステムにおいて、周辺海水温度にて保持した。幼虫は、成体の石灰質のハビテーションチューブから、チューブの後部を丈夫なピンセットで剥し、成虫を残りのチューブの後端から、前端部にあるブラント・プローブで押し出すことによって成体を取り除くことにより取得した。個々の虫は、多穴の皿において、少量（５００μＬ〜７５０μＬ）の０．１μｍの濾過された海水内に配置し、それらの生殖体を産めるようにした。複数の雌からの卵子および別個に収集した精子を濾過した海水のペトリ皿に採取した。これは、少なくとも２匹の雄からの精子を混合し、顕微鏡で運動性を確認したものである。卵子のペトリ皿に１滴または２滴の精子を添加し、１５分間に亘り、室温（２２℃未満）で受精を促進させた。続いて、卵子を４０μｍのセルストレーナー内に注入し、濾過したばかりの海水における複数の変化を通過させて、余分な精子を除去した。続いて、撮像する前に、約１７℃で１８時間に亘り、濾過した海水において成長するように幼虫を放置した。
【００３５】
生きているイバラカンザシ（以前はポマトセロス）ラマルキーの幼虫を捕捉し、それらがトラップ内を遊泳／移動する間、断面的な自家蛍光画像を撮影した。Ｓ．ラマルキーの幼虫は、泳ぎが力強く、通常はコルクネジのパターンに従う軌道で移動する。この成長における初期段階において、１ｍｍ／ｓ超の典型的な遊泳速度を観測した。これは、およそ１００μｍ／ｓ〜１５０μｍ／ｓで移動する捕捉された微生物の遊泳速度よりも非常に速い。従って、幼虫をトラップ領域に閉じ込めたが、幼虫はトラップの閉じ込めを突破しようと試みつつ、回転運動を続けていた。光シートおよび固定された検出対象を用いて、幼虫のこの回転運動により、図４に示すように幼虫の断面画像を記録することができる。特に、図４（ａ）は明視野像を示し、図４（ｂ）〜図４（ｄ）は光シート画像の３例を示すが、これらは、幼虫からの自家蛍光信号によって取得されたものである。この幼虫がまだ成長の初期段階にある故、特有の形態は比較的少ない。しかしながら、繊毛および陥入臓器等のいくつかの構造を識別することができる。
【００３６】
光シート顕微鏡は、大きな験体の３Ｄ画像を、光損傷および光変性を最小化しつつ形成するための強力なアプローチである。光シート顕微鏡を、対向伝搬レーザビーム構成を使用して試料を捕捉し、保持するのに光力を利用する光トラップシステムと一体化することによって、本発明は、光シート撮像における適用範囲および条件を極めて広げる可能性をもたらす。適用する際には、アガロースを避けてもよく、いくつかの実施例においては、薬品または他の化合物を試料に添加することもできる。
【００３７】
当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、開示した配置の変形形態も可能であることを理解されよう。例えば、対向伝搬レーザビームトラップは、微小流体装置において形成することができる。これにより、高スループットの撮像の可能性をもたらす。流れに浮遊する個々の試料（例えば細胞）は、トラップ領域内に移動させ、トラップに保持し、かつ光シート撮像素子を使用して撮像することができる。画像を取得すると、試料はトラップから解放され、かつトラップ領域から試料を離すための流路から解放されることで、トラップ内に別の試料／細胞を移動させて撮像することができる。従って、上述した特定の実施形態は、単なる例示であり、限定を目的とするものではない。当業者において、記載した操作を実質的に変化させることなく、マイナーな修正を加え得ることは、言うまでもない。
【図１】
0006715866.tif 000002
【図２】
0006715866.tif 000003
【図３（ａ）】
0006715866.tif 000004
【図３（ｂ）】
0006715866.tif 000005
【図４】
0006715866.tif 000006