(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子が流れる流路上の第１スポット及び第２スポットに、それぞれ第１レーザ光及び第２レーザ光を照射するレーザユニットと、
前記第１スポットを撮像する第１撮像部と、
前記第２スポットを撮像する第２撮像部と、
前記第１スポットを通過する前記粒子を検出する第１検出器と、
前記第２スポットを通過する前記粒子を検出する第２検出器と、
前記第１検出器及び前記第２検出器が取得した信号に基づいて、前記粒子を検出する第１粒子検出部であって、前記第１撮像部及び前記第２撮像部に対して撮像タイミングを指示する撮像タイミング指示信号を発する第１粒子検出部と、
前記第１粒子検出部に対してシステム時間を発するシステム時間管理部と、
前記第１撮像部及び前記第２撮像部が撮像した画像を受信する画像記憶部と、
前記粒子が対象粒子であるか否かを判断するソート判断部と、
を有し、
前記第１撮像部及び前記第２撮像部は、前記撮像タイミング指示信号に基づいて、撮像した前記粒子の画像を切り出し、
前記第１粒子検出部は、前記第１撮像部及び前記第２撮像部に対して、前記粒子単位で付与した識別番号を送信し、
前記第１撮像部及び前記第２撮像部の各々は、切り出された前記粒子の画像と、前記粒子の前記識別番号と、を前記画像記憶部へ送信する、
イメージングフローサイトメーター。
【請求項２】
前記レーザユニットは、互いに異なる波長を有する前記第１レーザ光と前記第２レーザ光を照射する、
請求項１に記載のイメージングフローサイトメーター。
【請求項３】
前記第１撮像部及び前記第２撮像部の各々は、ラインセンサを有する、
請求項１又は２に記載のイメージングフローサイトメーター。
【請求項４】
前記第１撮像部及び前記第２撮像部は、前記流路の軸方向に沿って配置される、
請求項１〜３のいずれかに記載のイメージングフローサイトメーター。
【請求項５】
前記粒子の遅延時間を計算する遅延時間計算部と、
前記ソート判断部の判断結果に応じて、前記遅延時間計算部によって計算されたタイミングに合わせて前記粒子をソートするために、ソート信号を発するソート信号制御部と、
前記ソート信号に基づいて、前記対象粒子をソートするソート部と、
を更に有し、
前記遅延時間計算部は、前記第１検出器及び前記第２検出器が信号を取得したタイミングの前記システム時間に基づいて、前記粒子が前記ソート部に到達するまでの前記遅延時間を計算する、
請求項１〜４のいずれかに記載のイメージングフローサイトメーター。
【請求項６】
前記流路上において前記第１スポット及び前記第２スポットよりも下流に位置する検出位置を通過する前記粒子を検出する第２粒子検出部を更に有し、
前記遅延時間計算部は、前記粒子が前記第１スポット及び前記第２スポットを通過したシステム時間に基づいて計算される前記粒子の前記検出位置への到達予想時間と、前記第２粒子検出部によって検出された前記粒子の前記検出位置への到達時間とを比較し、
前記ソート信号制御部は、前記到達予想時間と前記到達時間との比較結果に基づき、前記ソート部が前記対象粒子をソートするタイミングを調整する、
請求項５に記載のイメージングフローサイトメーター。
【請求項７】
前記検出位置は、前記ソート部よりも下流に位置し、
前記第２粒子検出部は、粒子のソート成功率を算出し、
前記遅延時間計算部は、前記到達予想時間と前記ソート成功率に基づいて、前記ソート部が前記対象粒子をソートするタイミングを調整する、
請求項６に記載のイメージングフローサイトメーター。
【請求項８】
粒子が流れる流路上の第１スポット及び第２スポットに、それぞれ第１レーザ光及び第２レーザ光をレーザユニットが照射し、
前記第１スポットを通過する前記粒子を第１検出器が検出し、
前記第２スポットを通過する前記粒子を第２検出器が検出し、
前記第１検出器及び前記第２検出器が信号を取得する撮像タイミングに基づいて、前記第１スポットを第１撮像部が撮像するとともに前記第２スポットを第２撮像部が撮像し、撮像した前記粒子の画像を切り出し、
第１粒子検出部が、前記第１撮像部及び前記第２撮像部に対して、前記粒子単位で付与した識別番号を送信し、
前記第１撮像部及び前記第２撮像部の各々が、切り出された前記粒子の画像と、前記粒子の前記識別番号とを送信し、
前記粒子が対象粒子であるか否かをソート判断部が判断し、
前記第１検出器及び前記第２検出器が信号を取得したタイミングに基づいて、前記粒子がソート部に到達するまでの遅延時間を計算し、
前記ソート判断部の判断結果に応じて、前記粒子の遅延時間に基づいて前記ソート部が前記対象粒子をソートする、
ソート方法。
【請求項９】
粒子が流れる流路上の第１スポット及び第２スポットに、それぞれ第１レーザ光及び第２レーザ光をレーザユニットが照射し、
前記第１スポットを通過する前記粒子を第１検出器が検出し、
前記第２スポットを通過する前記粒子を第２検出器が検出し、
前記第１検出器及び前記第２検出器が信号を取得する撮像タイミングに基づいて、前記第１スポットを第１撮像部が撮像するとともに前記第２スポットを第２撮像部が撮像し、撮像した前記粒子の画像を切り出し、
第１粒子検出部が、前記第１撮像部及び前記第２撮像部に対して、前記粒子単位で付与した識別番号を送信し、
前記第１撮像部及び前記第２撮像部の各々が、切り出された前記粒子の画像と、前記粒子の前記識別番号とを送信し、
前記第１検出器及び前記第２検出器が信号を取得したタイミングに基づいて、前記粒子が前記流路上において前記第１スポット及び前記第２スポットよりも下流に位置する検出位置を通過するまでの到達予想時間を計算し、
前記検出位置を通過する前記粒子を検出して、前記粒子が前記検出位置に到達する到達時間を検出し、
前記到達時間に基づいて、前記到達予想時間を調整する、
キャリブレーション方法。
【請求項１０】
調整された前記到達予想時間に基づき、ソート部が前記粒子をソートするタイミングを調整する、
請求項９に記載のキャリブレーション方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、画像を用いて細胞などの対象物をソートするイメージングフローサイトメーター、ソート方法、及びキャリブレーション方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、細胞などの対象物をソートするフローサイトメーターは、対象物に由来する信号を検出する検出部と、検出部で得られた信号に基づいて、特定の対象物であるか否かを判断するソート判断部と、ソート判断部の判断結果に基づいて、対象物をソートするソー部とを有する（例えば、特許文献１）。対象物のソート精度を高めるためには、特定の対象物がソート部に到達するタイミングに合わせて、ソート部を動作させる必要がある。
【０００３】
従来のフローサイトメーターでは、ソート判断部が信号処理に要する時間は短く、概ね１ミリ秒以内である。現実的には、流路を流れる対象物は、対象物による速度ばらつきを有する。例えば、大きさが異なる細胞は、速度が異なる場合がある。また、同じ大きさの細胞であっても、流路内の中心付近を流れる細胞ほど速度が速くなる。
これに対し、検出部からソート部までの距離を短くすることにより、対象物の速度ばらつきの影響を抑制できる。そのため、従来のフローサイトメーターでは、対象物の速度ばらつきを考慮せず、対象物が検出部を通過してから、一定の遅延時間が経過したタイミングでソート部を動作させるのが一般的であった。
【０００４】
一方、画像を用いて特定の対象物であるか否かを判断するイメージングフローサイトメーターでは、必要な情報を取得するための信号処理時間が長くなる場合があり、例えば、２〜３２ミリ秒程度の時間を要する場合がある。この場合、検出部からソート部までの距離を長くする必要がある。対象物の速度ばらつきを考慮せず、対象物が検出部を通過してから、一定の遅延時間が経過したタイミングでソート部を動作させると、速度ばらつきの影響により、ソート精度が低下する。
【０００５】
このような速度ばらつきによるソート精度の低下を抑制するため、個々の対象物の速度を計測する速度計測部を有する構成が提案されている。例えば、特許文献１には、グレーティング（回折格子）を用いた速度計測部が開示されている。また、非特許文献１には、対象物が流れる流路の上流側と下流側にレーザースポットを配置し、対象物が各レーザースポットを通過するタイミングから、個々の対象物の速度を計測する構成が開示されている。
【０００６】
また、特許文献２には、対象物をタイムラプス撮像してフレーム毎の対象物の位置変化からその速度を計算し、個々の対象物がソート部に到達するタイミングを予想する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，５３２，０６１号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／１０５５０７号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】N. Nitta et al., Intelligent Image-Activated Cell Sorting. Cell 175, 266-276 (2018)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１のようにグレーティングを用いた速度計測部では、複数の対象物が近接した状態で流路を流れる場合、個々の対象物の速度を計測することが困難となる。
また、個々の対象物の速度を計測できたとしても、特許文献１では速度信号と細胞分類の計算を各々独立して行い、それらの結果を遅延処理回路に入力してソート部を制御するものである。そのため、カメラで撮像された個々の画像と速度計測部で計測された個々の対象物の速度とが、正確に１対１対応で紐付けされる確証がない。異なる対象物に由来する画像の処理結果と速度情報とが誤って紐付けられてしまうと、正確にソートできないため問題となる。具体的には、高いスループットで対象物を流路に流す場合には、個々の対象物の信号間隔が狭まり、場合によっては信号が重複して埋没し、紐付けにエラーを引き起こすことがある。あるいは、計測対象物が小さい場合など、カメラでは識別されたが速度検出部では検出できなかった場合も、信号の１対１対応にエラーを来たすことがある。
【００１０】
非特許文献１のように２つのレーザースポットを用いる構成によれば、近接する複数の対象物に対しても、個々の対象物の速度を計測できる。しかし、２つのレーザースポットを用いる構成では、速度検出のために２か所へのレーザ照射を、細胞の撮像に用いるレーザ照射とは別途に用意する必要があり、装置が大掛かりになる。さらに速度検出および細胞撮像の信号が発せられるタイミングは、各々のレーザースポットの位置に依存することからレーザースポットの位置が完全に一致していない限りタイミングにずれが生じる。このずれを合わせるためのキャリブレーションが必要となり、操作が煩雑となる。
【００１１】
また、フローサイトメーター中を流れる粒子の撮像や検出を行うためには通常、対物レンズを用いるが、対物レンズから得られる視野（field of view）には限りがある。非特許文献１の方法では、少なくとも速度計測用の２スポットと画像撮像用の１スポットを対物レンズの視野内に収める必要があるが、光の漏れこみなどを防ぐためにスポット間にはある程度の間隔をあける必要がある。そのため、特に画像撮像用に複数スポットを設定したい場合などは、対物レンズの視野中でのレーザースポットの場所の取り合いが課題となる。例えば、異なる波長の励起光を照射した際に得られる蛍光画像を別々に撮像したい場合、異なる波長の励起光ごとに位置を離してレーザースポットを設置することが考えられる。しかし、このような場合に、さらに速度検出用に２スポットを設定することは設計上の負担となる。
【００１２】
特許文献２では、撮像カメラが流路中を流れる細胞をタイムラプス撮像し、その一連の画像から細胞の追跡を行うことで確実な細胞分離を行う方法が開示されている。しかしながら、特許文献２に記載の方法では、一連のタイムラプス画像から細胞を追跡するために大きな計算負荷がかかる。さらに、細胞の追跡を行うために細胞選別部を含む広い視野での撮像を行う必要があることから、細胞画像を高い空間分解能で撮像するためには画面全体のピクセル数が非常に大きくなり情報処理の負荷が高くなる一方、ピクセル数を減らすと空間分解能が犠牲となるため、細胞の詳細な形態情報を得られなくなるなどの限界がある。
【００１３】
本発明は、簡易な構成で対象物の速度ばらつきを考慮したソート精度の高いイメージングフローサイトメーター、ソート方法、及びキャリブレーション方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の第１の観点は、
粒子が流れる流路上の第１スポット及び第２スポットに、それぞれ第１レーザ光及び第２レーザ光を照射するレーザユニットと、
前記第１スポットを撮像する第１撮像部と、
前記第２スポットを撮像する第２撮像部と、
前記第１スポットを通過する前記粒子を検出する第１検出器と、
前記第２スポットを通過する前記粒子を検出する第２検出器と、
前記第１検出器及び前記第２検出器が取得した信号に基づいて、前記粒子を検出する第１粒子検出部であって、前記第１撮像部及び前記第２撮像部に対して撮像タイミングを指示する撮像タイミング指示信号を発する第１粒子検出部と、
前記第１粒子検出部に対してシステム時間を発するシステム時間管理部と、
前記第１撮像部及び前記第２撮像部が撮像した画像を受信する画像記憶部と、
前記粒子が対象粒子であるか否かを判断するソート判断部と、
を有し、
前記第１撮像部及び前記第２撮像部は、前記撮像タイミング指示信号に基づいて、撮像した前記粒子の画像を切り出す、
イメージングフローサイトメーターである。
【００１５】
本発明の第２の観点は、
粒子が流れる流路上の第１スポット及び第２スポットに、それぞれ第１レーザ光及び第２レーザ光をレーザユニットが照射し、
前記第１スポットを通過する前記粒子を第１検出器が検出し、
前記第２スポットを通過する前記粒子を第２検出器が検出し、
前記第１検出器及び前記第２検出器が信号を取得する撮像タイミングに基づいて、前記第１スポットを第１撮像部が撮像するとともに前記第２スポットを第２撮像部が撮像し、撮像した前記粒子の画像を切り出し、
前記粒子が対象粒子であるか否かをソート判断部が判断し、
前記第１検出器及び前記第２検出器が信号を取得したタイミングに基づいて、前記粒子がソート部に到達するまでの遅延時間を計算し、
前記ソート判断部の判断結果に応じて、前記粒子の遅延時間に基づいて前記ソート部が前記対象粒子をソートする、
ソート方法である。
【００１６】
本発明の第３の観点は、
粒子が流れる流路上の第１スポット及び第２スポットに、それぞれ第１レーザ光及び第２レーザ光をレーザユニットが照射し、
前記第１スポットを通過する前記粒子を第１検出器が検出し、
前記第２スポットを通過する前記粒子を第２検出器が検出し、
前記第１検出器及び前記第２検出器が信号を取得したタイミングに基づいて、前記粒子が前記流路上において前記第１スポット及び前記第２スポットよりも下流に位置する検出位置を通過するまでの到達予想時間を計算し、
前記検出位置を通過する前記粒子を検出して、前記粒子が前記検出位置に到達する到達時間を検出し、
前記到達時間に基づいて、前記到達予想時間を調整する、
キャリブレーション方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、簡易な構成で対象物の速度ばらつきを考慮したソート精度の高いイメージングフローサイトメーター、ソート方法、及びキャリブレーション方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】第１実施形態のイメージングフローサイトメーターの構成図
【図２】（ａ）スポット周辺の流路の拡大図、（ｂ）レーザ光の強度プロファイル
【図３】撮像部の構成図
【図４】第２実施形態のイメージングフローサイトメーターの構成図
【図５】キャリブレーション方法の一例を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜第１実施形態＞
以下、図面を参照して、第１実施形態のイメージングフローサイトメーター１について説明する。図１は、本実施形態のイメージングフローサイトメーター１の構成図である。本実施形態のイメージングフローサイトメーター１は、流路１０を流れる粒子Ｐがソート対象となる対象粒子であるか否かを判断し、対象粒子をソートする。粒子Ｐは、例えば、ビーズ、細胞および細胞塊（血球細胞、骨髄細胞、リンパ球、循環がん細胞、血管内皮細胞、血小板、血小板凝集塊、卵子、精子、受精卵、スフェロイド、オルガノイドなど）、オルガネラ（染色体、葉緑体、ミトコンドリアなど）、微生物、寄生虫、花粉、藻（クラミドモナス、ユーグレナなど）である。多数の粒子Ｐは、流路１０を一定の方向（軸方向）に流れる。
【００２０】
イメージングフローサイトメーター１は、主に、レーザユニット２０と、検出ユニット３０と、第１粒子検出部７０と、撮像ユニット５０と、システム時間管理部６０と、画像解析部８１と、を有する。
【００２１】
レーザユニット２０は、少なくとも２つのレーザ光源を有する。本実施形態のレーザユニット２０は、第１レーザ光源２２ａと、第２レーザ光源２２ｂと、第３レーザ光源２２ｃと、を有する。各レーザ光源２２ａ、２２ｂ、２２ｃは、互いに異なる波長のレーザ光を照射することが好ましい。
【００２２】
第１レーザ光源２２ａは、流路１０上の第１スポット２５ａに、第１レーザ光を照射する。第２レーザ光源２２ｂは、流路１０上の第２スポット２５ｂに、第２レーザ光を照射する。第３レーザ光源２２ｃは、流路１０上の第３スポット２５ｃに、第３レーザ光を照射する。図２（ａ）は、スポット周辺の流路１０の拡大図を示す。
ここで、流路１０の内径Ｗ１は、約２００μｍである。各スポット２５ａ〜２５ｃは、流路１０の軸に直交する方向に延びる。流路１０の軸に直交する方向のスポット２５ａ〜２５ｃの幅は、例えば、８０μｍ〜１００μｍである。粒子Ｐの直径は、例えば、２０μｍである。
【００２３】
各スポット２５ａ〜２５ｃは、流路１０の軸方向に互いに離れて位置する。各スポット２５ａ〜２５ｃは、等間隔で配置されてもされなくてもよい。各スポット２５ａ〜２５ｃの配置については、後述する。
図２（ｂ）は、レーザ光の強度プロファイルの一例を示す。レーザ光は、流路１０の軸に直交する方向に一定の強度を有することが好ましい。
【００２４】
検出ユニット３０は、少なくとも２つの検出器を有する。本実施形態の検出ユニット３０は、第１検出器３２ａと、第２検出器３２ｂと、第３検出器３２ｃと、を有する。第１検出器３２ａは、第１スポット２５ａを粒子Ｐが通過した際に発せられる散乱光を検出する。同様に、第２、第３検出器３２ｂ、３２ｃは、それぞれ第２、第３スポット２５ｂ、２５ｃを粒子Ｐが通過した際に発せられる散乱光を検出する。
ここで、第１スポット２５ａと第２スポット２５ｂの間の距離Ｌ１は、第１撮像部５２ａ上のラインセンサ１００と第２撮像部５２ｂ上のラインセンサ１００の間の距離、および後述する結像光学系の光学倍率により決定されることから、これらの設計値から計算することができる。そのため、第１スポット２５ａと第２スポット２５ｂを粒子Ｐが通過するタイミング情報から、粒子Ｐの速度を粒子毎に計算できる。
【００２５】
第１粒子検出部７０は、検出ユニット３０が検出した散乱光に基づき、粒子Ｐが各スポット２５ａ〜２５ｃを通過するタイミングを検出する。ここで、後述するように、第１粒子検出部７０には、システム時間管理部６０からシステム時間が発せられている。そのため、第１粒子検出部７０は、粒子Ｐが各スポット２５ａ〜２５ｃを通過するタイミングのシステム時間を取得する。
【００２６】
第１粒子検出部７０は、検出された粒子Ｐに対し、粒子単位で識別番号を付与する。また、第１粒子検出部７０は、粒子Ｐが各スポット２５ａ〜２５ｃを通過するタイミングのシステム時間を、粒子Ｐに対して付与された識別番号とともに、後述する遅延時間計算部８０に出力する。
第１粒子検出部７０は、撮像ユニット５０に対し、各粒子Ｐの識別番号とともに撮像タイミング指示信号ＳＧ１を送信する。
【００２７】
撮像ユニット５０は、少なくとも２つの撮像部を有する。本実施形態の撮像ユニット５０は、第１撮像部５２ａと、第２撮像部５２ｂと、第３撮像部５２ｃと、第４撮像部５２ｄと、を有する。第１撮像部５２ａは、第１スポット２５ａを撮像する。同様に、第２、第３スポット５２ｂ、５２ｃは、それぞれ第２、第３スポット２５ｂ、２５ｃを撮像する。第４撮像部５２ｄについては、後述する。
【００２８】
第１〜第４撮像部５２ａ〜５２ｄと流路１０上の第１〜第４スポット２５ａ〜２５ｄとの間にはレンズを含む結像光学系が配置される。結像光学系は、第１〜第４スポット２５ａ〜２５ｄ上の画像を第１〜第４撮像部５２ａ〜５２ｄ上のラインセンサ１００に各々結像するように配置される。ここで、スポット２５ａ〜２５ｄの幅は、例えば、８０μｍ〜１００μｍである。第１〜第４撮像部５２ａ〜５２ｄ上のライセンサ１００の幅は、例えば、１０ｍｍ〜８０ｍｍである。結像光学系の倍率は、例えば、１００倍〜１０００倍である。
【００２９】
各撮像部５２ａ〜５２ｄは、第１粒子検出部７０からの撮像タイミング指示信号ＳＧ１に基づいて、粒子Ｐの画像Ｄ１を切り出す。また、各撮像部５２ａ〜５２ｄは、切り出された粒子Ｐの画像Ｄ１と、粒子Ｐの識別番号を、後述する画像記憶部８２へ送信する。
【００３０】
ここで、各スポット２５ａ〜２５ｃの配置について説明する。第１〜第３撮像部５２ａ〜５２ｃ、結像光学系、および流路１０は、流路１０中を流れる粒子Ｐの像が第１〜第３撮像部５２ａ〜５２ｃ上のラインセンサ１００（後述）に各々結像するように固定されていることが好ましい。この場合、各スポット２５ａ〜２５ｃを通過した粒子Ｐの像が第１〜第３撮像部５２ａ〜５２ｃ上のラインセンサ１００に結像するように、各スポット２５ａ〜２５ｃの位置を微調整する。これにより、各スポット２５ａ〜２５ｃ間の距離は、第１〜第３撮像部５２ａ〜５２ｃ上の各ラインセンサ１００の間の距離、および結像光学系の光学倍率によって決定される。これにより、流路１０を流れる粒子Ｐが各スポット２５ａ〜２５ｃを通過したタイミング差の計測値から各粒子Ｐの移動速度を計算できる。あるいはその逆に、流路１０を流れる粒子Ｐの移動速度が既知の場合は、その粒子Ｐが各スポット２５ａ〜２５ｃを通過するタイミング差を計算できる。
例えば、第１〜第３の各レーザ光に対して角度調整が可能なミラーをレーザユニット２２と流路１０との間に各々設置する。ミラーの角度を調整することにより、各スポット２５ａ〜２５ｃの位置を調整できる。
【００３１】
第１〜第４撮像部５２ａ〜５２ｄは、それぞれ同様の構成を有する。以下、図３を参照して、各撮像部の構成を説明する。図３は、第１撮像部５２ａの構成の一例を示す。第１撮像部５２ａは、ラインセンサ１００を有する。ラインセンサ１００は、例えば、アバランシェフォトダイオードアレイ（ＡＰＤアレイ）、フォトダイオードアレイ（ＰＤアレイ）、光電子増倍管アレイ（ＰＭＴアレイ）である。ラインセンサ１００は、受光した画像に応じて、各素子から信号電流もしくは信号電圧を出力する。この出力は全画素で並列であるが、複数の画素の出力を切り替えて時分割で後段に接続してもよい。
【００３２】
図３に示す例のラインセンサ１００は、ＡＰＤアレイである。ラインセンサ１００は、第１スポット２５ａが延びる方向に延びる。ＡＰＤアレイを使用する場合、ＡＰＤ制御高圧電源１１０が印加電圧を制御し、温度変化などによるゲイン特性などの変化に対して出力が一定となるよう制御する。ＡＰＤアレイ以外の受光素子を使用する場合、素子のバイアス電圧もしくはバイアス電流、ゲインなどを制御する制御回路を接続する。
【００３３】
ラインセンサ１００から出力された電流もしくは電圧は、アナログフロントエンド（ＡＦＥ）回路１０２で増幅され、ＡＤ変換が可能な電圧に変換される。必要な場合は、ＡＰＤアレイ１００とアナログフロントエンド回路１０２の間に、電流を電圧に変換して増幅するトランスインピーダンスアンプ（ＴＩＡ）回路を接続してもよい。アナログフロントエンド回路１０２は、ＡＰＤアレイ１００の全画素の出力に対して並列に接続されるが、複数の画素の出力を切り替えて時分割で後段に接続してもよい。
【００３４】
アナログフロントエンド回路１０２の出力は、電圧信号としてＡＤ変換器１０４に入力される。ＡＤ変換器１０４への入力はアナログフロントエンド回路１０２の全画素の出力に対して並列に接続されるが、複数のアナログフロントエンド回路１０２の出力を切り替えて時分割で後段のＡＤ変換器１０４に接続してもよい。
ＡＤ変換器１０４がアナログフロントエンド回路１０２の全画素の出力に対して並列に接続される場合、ＡＤ変換器１０４のサンプリングレートは、例えば、流路を粒子Ｐが通過する速度をＶｍ／ｓ、粒子の流れ方向における画像の１ピクセルの大きさをＸμmとすると、Ｖ／Ｘ×１０６ ｓａｍｐｌｅｓ／ｓ以上とする。
【００３５】
ＡＤ変換器１０４でデジタル信号に変換されたライン画像は、ＦＰＧＡ１０６に入力される。ＦＰＧＡ１０６は、画像バッファとなる内部メモリを搭載したＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｇａｔｅ Ａｒｒａｙ）や、ＦＰＧＡとＤＲＡＭ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）などの外部メモリを組み合わせた構成や、ＦＰＧＡを専用もしくは汎用の論理回路に置き換えた構成、マイクロプロセッサとメモリを組み合わせたコンピュータシステムでもよい。
【００３６】
ライン画像は一定時間分のデータがＦＰＧＡ１０６内に格納され、撮像タイミング信号ＳＧ１が入力されると、撮像タイミング信号ＳＧ１で指定されたタイミングからあらかじめ指定された周辺の一定時間で取得された画像が切り出されて、タイミング信号ＳＧ１に対応した時間情報もしくは撮像した粒子Ｐの識別番号が付加されて出力される。この際、ＦＰＧＡ１０６で２ライン以上の画像を積算などの演算処理により１ラインの画像に構成してデータのビット長を伸ばし、ダイナミックレンジを広げて出力してもよい。また、画像を圧縮してデータ量を低減してもよい。データの圧縮には、可変長符号化のほか、画像データの時間方向もしくは空間方向の冗長性を利用してもよい。また、ここで得られた画像を解析して、細胞の構造や形状に応じた特徴量などを演算し、画像に付加した情報もしくは画像とは独立した情報として識別番号と共に出力してもよい。
【００３７】
切り出された画像Ｄ１もしくは画像情報Ｄ１は、ネットワークインタフェース１０８からデータパケットとしてネットワークを経由して、画像記憶部８２（後述）へ出力される。ネットワークインタフェース１０８は、例えば、１Ｇｂイーサネット（ＧｂＥ）、１０Ｇｂイーサネットなどの帯域の異なるネットワークインタフェースである。もしくは、切り出された画像Ｄ１もしくは画像情報Ｄ１は、ＰＣＩｅや高速ＬＶＤＳなどの高速デジタルインタフェース、ＵＳＢなどの汎用インターフェースにより画像記憶部８２へ出力される。
【００３８】
なお、ラインセンサ１００の手前には、シリンドリカルレンズやレンズアレイを配置してもよい。これにより、集光効率を高めることができる。また、ラインセンサ１００の手前には、バンドパスフィルタを配置してもよい。これにより、特異性を高めることができる。また、ラインセンサ１００の手前には、スリットを配置してもよい。これにより、流れ方向の空間分解能を高めることができる。
【００３９】
システム時間管理部６０は、例えば、一定時間ごとに値が変化するシステムクロックと、システムクロックをカウントするカウンタから構成される。システム時間管理部６０は、システム全体のシステム時間を保持し、そのシステム時間を発する。システム時間管理部６０により発せられたシステム時間は、第１粒子検出部７０と、後述する第２粒子検出部７２と、後述するソート信号制御部８６に送信される。
【００４０】
画像解析部８１は、画像記憶部８２と、ソート判断部８４と、を有する。画像記憶部８２は、撮像ユニット５０が撮像した画像Ｄ１を各粒子Ｐの識別番号とともに受信する。画像記憶部８２は、画像Ｄ１を入力するネットワークインタフェースもしくは汎用のインターフェースを有し、画像バッファとなる内部メモリを搭載したＦＰＧＡや、ＦＰＧＡとＤＲＡＭなどの外部メモリを組み合わせた構成や、ＦＰＧＡを専用もしくは汎用の論理回路に置き換えた構成、マイクロプロセッサとメモリを組み合わせたコンピュータシステムでもよい。
【００４１】
ソート判断部８４は、粒子Ｐが対象粒子であるか否かを判断する。具体的には、ソート判断部８４は、画像記憶部８２から出力される粒子Ｐの画像を解析することにより、粒子Ｐが対象粒子であるか否かを判断する。そして、ソート判断部８４は、粒子Ｐの識別番号とともに判断結果を後述するソート信号制御部８６、記憶部８８へ出力する。
ソート判断部８４は、対象となる粒子の種類に応じて様々な画像解析方法を用いることが出来る。例えば、画像から１つ以上の特徴量を計算し、その分布から粒子Ｐを分類する方法、特徴量の分布に対してＳＶＭ（Support Vector Machine）などの機械学習により分類する方法、画像に対して深層学習を適用することで分類する方法などが用いられる。
このほか、ソート判断部８４は、米国特許第６，２１１，９５５号公報に記載されるように、細胞核内部の蛍光画像から輝点の有無により分類する方法を用いてもよい。
【００４２】
本実施形態のイメージングフローサイトメーター１は、更に、レーザ制御部２６と、第４検出器３４と、照明光源４０と、第２粒子検出部７２と、遅延時間計算部８０と、ソート信号制御部８６と、記憶部８８と、ソート部９０と、を有する。
【００４３】
照明光源４０は、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）である。照明光源４０は、流路１０を挟んで、撮像ユニット５０と反対側に配置される。照明光源４０からの光は、照明光源４０と流路１０との間に設置された照明光学系によって、流路１０上の第４スポット２５ｄに照射される。照明光学系は、例えば、一つ以上のレンズを含む。照明光学系は、例えば、ケーラー照明もしくはクリティカル照明などを用いることができる。照明光学系上にスリットやシリンドリカルレンズなどを配置することで、第４スポット２５ｄを流路１０の軸に直交する方向に延びるよう変形させることが望ましい。
【００４４】
第４撮像部５２ｄは、第４スポット２５ｄを撮像する。ここで第４撮像部５２ｄ、結像光学系、および流路１０は、流路１０中を流れる粒子Ｐの像が第４撮像部５２ｄのラインセンサ１００に各々結像するように固定されていることが好ましい。この場合、第４スポット２５ｄで照射された粒子が第４撮像部５２ｄに結像するように、第４スポット２５ｄの位置を微調整する。このように調整すると、第１〜第３スポット２５ａ〜２５ｃと第４スポット２５ｄと間の距離は、第１〜第３撮像部５２ａ〜５２ｄ上の各ラインセンサ１００の間の距離、および結像光学系の光学倍率によって決定される。このことを利用して、流路１０を流れる粒子Ｐが各スポットを通過したタイミングを計測することで、各粒子Ｐの移動速度を計算できる。あるいはその逆に、流路１０を流れる粒子Ｐの移動速度が既知の場合は、その粒子Ｐが各スポット２５ａ〜２５ｄを通過するタイミング差を計算できる。例えば、角度調整が可能なミラーもしくは位置調整が可能なスリットやレンズなどの光学素子が、照明光学系の光路上に設置される。それら光学素子の角度や位置を調整することによって、第４スポット２５ｄの位置を調整できる。あるいは、照明光源４０や照明光学系全体の位置を調整することも可能である。
【００４５】
第４検出器３４は、流路１０上の検出位置Ｘを流れる粒子Ｐを検出する。第４検出器３４は、例えば、カメラ、ストロボカメラ、レーザとディテクタである。カメラやストロボカメラは、検出位置Ｘの画像を取得し、その画像から粒子Ｐの通過を検出する。レーザとディテクタでは、レーザをディテクタに入射させて検出位置Ｘにおけるディテクタの信号を取得し、検出位置Ｘを粒子Ｐが通過したときの信号波形の変化から、粒子Ｐの通過を検出する。検出位置Ｘは、ソート位置の近くであることが好ましい。第４検出器３４は、検出信号を第２粒子検出部７２に出力する。
【００４６】
検出位置Ｘは、第１〜第４スポット２５ａ〜２５ｄよりも下流に位置する。検出位置Ｘはソート部９０と一致することが好ましいが、必ずしも検出位置Ｘがソート部９０と一致しなくてもよい。例えば、検出位置Ｘは、ソート部９０よりもわずかに上流又は下流に位置してもよい。
【００４７】
第２粒子検出部７２は、第４検出器３４が検出した散乱光もしくは蛍光に基づき、粒子Ｐが検出位置Ｘを通過したタイミングを検出する。また、第２粒子検出部７２は、システム時間管理部６０が発するシステム時間を受信する。そして、第４検出器３４において検出信号が検出されたタイミングのシステム時間（到達時間）を、第２粒子検出部７２は検出信号とともに記憶する。すなわち、各検出信号にはタイムスタンプが付与される。
【００４８】
第２粒子検出部７２は、第４検出器３４からの検出信号の入力と、システム時間管理部６０からのシステム時間の入力をリアルタイムに処理する。
第４検出器３４が画像を取得する場合、第２粒子検出部７２は、カメラからの画像とシステム時間の入力を有し、画像バッファとなる内部メモリを搭載したＦＰＧＡや、ＦＰＧＡとＤＲＡＭなどの外部メモリを組み合わせた構成や、ＦＰＧＡを専用もしくは汎用の論理回路に置き換えた構成、マイクロプロセッサとメモリを組み合わせたコンピュータシステムでもよい。例えば、画像を解析して画像内に粒子Ｐが含まれることが分かる場合、その画像が取得された時間に入力されたシステム時間を粒子Ｐの通過時間として粒子を検出することができる。第４検出器３４がディテクタのように時間方向に連続な信号を取得する場合、第２粒子検出部７２は、検出信号をデジタル信号に変換するＡＤＣ（Ａｎａｌｏｇ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）と、検出信号バッファとなる内部メモリおよび処理回路を搭載したＦＰＧＡで構成できる。検出信号バッファと処理回路については、ＦＰＧＡとＤＲＡＭなどの外部メモリを組み合わせた構成や、ＦＰＧＡを専用もしくは汎用の論理回路に置き換えた構成、マイクロプロセッサとメモリを組み合わせたコンピュータシステムでもよい。例えば、信号の変化が一定の閾値以上であった時間を粒子Ｐの通過時間として粒子Ｐを検出するなどの方法により、粒子を検出することができる。
【００４９】
第２粒子検出部７２は、粒子Ｐの通過に対応する検出信号に付与されたシステム時間（到達時間）を遅延時間計算部８０へ出力する。
【００５０】
レーザ制御部２６は、制御回路と、レーザ光を制御するためのドライバ回路と、を有する。レーザ制御部２６は、撮像に使用する各スポット２５ａ〜２５ｃに対応したレーザユニット２０の第１〜第３レーザ光源２２ａ〜２２ｃのＯＮ／ＯＦＦや、第１〜第３レーザ光の強度を制御する。
【００５１】
遅延時間計算部８０は、第１粒子検出部７０で検出された、粒子Ｐが第１スポット２５ａ及び第２スポット２５ｂを通過したシステム時間に基づき、粒子Ｐがソート部９０に到達するまでの遅延時間を計算する。具体的には、粒子Ｐが第１スポット２５ａを通過するシステム時間をｔ１、粒子Ｐが第２スポット２５ｂを通過するシステム時間をｔ２、第１スポット２５ａと第２スポット２５ｂの間の距離をＬ１、第１スポット２５ａとソート部９０との間の距離をＬ２とすると、遅延時間ΔＴは、ΔＴ＝（Ｌ２／Ｌ１）×（ｔ２−ｔ１）として求められる。この時、Ｌ１及びＬ２の値がいずれも既知である場合、それらの値を用いてもよい。上述したように、Ｌ１は設計値より求めることができるため、Ｌ２が不確定な場合は、係数Ａ＝Ｌ２／Ｌ１の値をキャリブレーションによって求めてもよい。
なお、上記の遅延時間ΔＴは、粒子Ｐが第１スポット２５ａを通過してから粒子Ｐがソート部９０に到達するまでの時間であるが、これに限られない。遅延時間ΔＴは、粒子Ｐが第２スポット２５ｂを通過してからソート部９０に到達するまでの時間でもよい。
【００５２】
遅延時間計算部８０は、粒子Ｐの識別番号とともに粒子Ｐの遅延時間をソート信号制御部８６へ出力する。
【００５３】
ソート信号制御部８６は、ソート判断部８４の判断結果に応じて、遅延時間計算部８０によって計算された粒子Ｐの遅延時間に基づいて計算されるタイミングで粒子Ｐをソートするために、必要となるソート信号を発する。
ソート信号制御部８６には、システム時間管理部６０からシステム時間が送信されているため、粒子Ｐがソート部９０に到達するタイミングに合わせて、ソート信号制御部８６はソート部９０に適切なソート信号を発する。
ソート信号を発する際に遅延時間に基づいて計算されたタイミングがシステム時間より後であれば、計算されたタイミングでのソートは成功であり、ソート信号が出力される。遅延時間に基づいて計算されたタイミングがシステム時間より前の場合は、ソートは不成功であり、ソート信号は出力されなくてもよい。このソート成否は、ソート信号制御部８６から記憶部８８に向けて出力される。
【００５４】
ソート信号は、例えば、パルス信号である。パルス信号は、対象粒子がソート部９０に到達したタイミングに合わせて発せられ、ソート部９０に伝達される。または、タイミングの情報を符号化した信号を、別途準備した信号線を用いて伝達してもよい。
また、ソート部９０が対象粒子を２種類以上に分けてソートする場合がある。例えば、２種類に分けてソートする場合（２−ｗａｙ ｓｏｒｔｉｎｇ）、４種類に分けてソートする場合（４−ｗａｙ ｓｏｒｔｉｎｇ）がある。そのような場合には、ソート判断部８４が対象粒子をさらに複数の異なる種類に分類し、その分類結果がソート信号に含まれる。その場合、例えば、パルス信号の振幅や符号などを用いて、分類結果をパルス信号に含ませることができる。
または、パルス信号と合わせて別途準備した信号線を用いて、分類結果をデジタル信号などとしてソート部９０に伝達してもよい。
さらに、ソート信号はソートのタイミングを開始時間としてソートを持続する時間幅を伝達してもよい。その場合、ソートを持続する時間幅を、パルス信号のパルス幅として伝達してもよいし、ソートを持続する時間幅を符号化した信号を別途準備した信号線を用いて伝達してもよい。
【００５５】
なお、粒子Ｐがソート部９０に到達するシステム時間は、遅延時間計算部８０、ソート信号制御部８６のいずれが計算してもよい。
ソート判断部８４の判断結果により、粒子Ｐが対象粒子である場合のみに、ソート信号制御部８６がソート信号を発してもよい。また、ソート判断部８４の判断結果により、粒子Ｐが対象粒子である場合と対象粒子ではない場合に、ソート信号制御部８６が異なるソート信号を発してもよい。
【００５６】
記憶部８８は、ソート判断部８４から受信した粒子Ｐの判断結果を、粒子Ｐの識別番号とともに記憶する。また、記憶部８８は、ソート判断部８４から発せられた判断結果により、ソート信号制御部８６が指定されたタイミングでソート信号を発することが出来たかどうか、粒子Ｐのソート結果を判断結果と合わせて記憶する。
【００５７】
ソート部９０は、ソート信号制御部８６から発せられるソート信号に基づいて、対象粒子をソートする。ソート部９０は、ソート信号で示されたタイミングに基づき、ソート信号制御部８６から受信、又は、ソート部９０内部に格納された、ソートウィンドウの情報（後述する図５のＷ１、Ｗ２）により、ソート方向の切り替えを制御する。ソート部９０は、例えば、ドロップレットソーターやオンチップソーターである。
【００５８】
ソート部９０は、例えば、M. J. Fulwyler, Science 150, 910-911 (1965)に開示されたドロップレットソーターでもよい。この場合、ソート部９０は、流路１０の先端に配置されたノズルを有し、ノズルより液滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）が一定周期で形成される。対象粒子を含む液滴が形成されるタイミングで対象粒子近傍の液体に電場を与えることで、対象粒子を含む液滴に対して選択的に荷電する。液滴が落下する軌跡の近傍に静電場を与えることで、荷電された対象粒子を含む液滴のみ選択的に、落下軌跡をずらすことができ、落下点に回収容器を設置することで対象粒子をソートできる。さらに、液滴に荷電する電荷の正負及び電荷量をコントロールし、液滴の軌跡を異なる方向や角度に振り分けることによって、２種類以上の種類の細胞を２つ以上の個別の容器に分けて回収することもできる。
【００５９】
ソート部９０は、例えば、非特許文献１に開示されたオンチップソーターでもよい。この場合、流路１０を跨ぐ形でデュアルメンブレンポンプ（ｄｕａｌ−ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｕｍｐ）を配置することで、対象粒子が通過するタイミングで流路１０に対して直交する方向に局所的な流れを引き起こして対象粒子の軌跡をずらし、下流に配置した分岐流路で異なる方向の流路に振り分けることで、対象粒子をソートする。デュアルメンブレンポンプについては、例えば、S. Sakuma et al., Lab on a Chip 17, 2760-2767, 2017に記載されている。
【００６０】
以下、本実施形態のイメージングフローサイトメーター１を用いたソート方法について説明する。まず、多数の粒子Ｐが流路１０を流れる。レーザユニット２０は、第１〜第３スポット２５ａ〜２５ｃに、それぞれ第１〜第３レーザ光を照射する。検出ユニット３０は、第１〜第３スポット２５ａ〜２５ｃを通過する粒子Ｐを検出する。第１粒子検出部７０は、検出ユニット３０が取得した信号に基づいて、粒子Ｐを検出する。また、第１粒子検出部７０は、撮像ユニット５０に対して、撮像タイミングを指示する撮像タイミング指示信号ＳＧ１を発する。この間、システム時間管理部６０は、第１粒子検出部７０に対して、システム時間を発する。
【００６１】
撮像ユニット５０は、第１〜第４スポット２５ａ〜２５ｄを撮像する。また、撮像ユニット５０は、撮像タイミング指示信号ＳＧ１に基づいて、撮像した粒子Ｐの画像Ｄ１を切り出す。画像記憶部８２は、撮像ユニット５０が撮像した粒子Ｐの画像Ｄ１を受信する。ソート判断部８４は、粒子Ｐが対象粒子であるか否かを判断する。
【００６２】
ソート信号制御部８６は、ソート判断部８４の判断結果に応じて、遅延時間計算部８０によって計算されたタイミングに合わせて粒子Ｐをソートするために、ソート信号を発する。ソート部９０は、ソート信号に基づいて、対象粒子をソートする。
遅延時間計算部８０は、検出ユニット３０が信号を取得したタイミングのシステム時間に基づいて、粒子Ｐがソート部９０に到達するまでの遅延時間を計算する。
【００６３】
このように、本実施形態のイメージングフローサイトメーター１やソート方法によれば、従来よりも簡易な構成で、粒子Ｐの速度ばらつきを考慮し、ソート精度を高めることができる。
【００６４】
＜第２実施形態＞
以下、第２実施形態のイメージングフローサイトメーター１について説明する。本実施形態のイメージングフローサイトメーター１は、第４検出器３４、第２粒子検出部７２、および遅延時間計算部８０の構成が第１実施形態とは異なる。それ以外の構成は１実施形態と同一である。本実施形態では、検出位置Ｘがソート部９０の下流に位置しており、粒子Ｐがソート部９０でソートされた際に起こる位置の変化を検出することができる。
【００６５】
第４検出器３４は、例えば、ＣＣＤカメラやＣＭＯＳカメラなどのエリアセンサーである。この場合、第４レーザ光を検出位置Ｘに照射し、検出位置Ｘを通過する粒子Ｐにレーザ光が照射されることにより発せられる散乱光や蛍光が第４検出器３４に入射するように各素子を配置した上で第４検出器３４の信号を取得し、粒子Ｐが通過した位置についての情報を得る。第４検出器３４は、検出信号を第２粒子検出部７２に出力する。レーザ光の代わりにストロボライトなど明視野検出のための照射でもよい。
【００６６】
第２粒子検出部７２は、粒子Ｐの通過位置から、ソート部においてソートされた粒子もしくはソートされなかった粒子の割合を取得し、その値を遅延時間計算部８０へ出力する。ここで、第４検出器３４は、個々の粒子Ｐに対してその通過位置情報を取得する必要はなく、多数の粒子Ｐに対する積算値として取得してもよい。例えば、ソート部９０においてソートされた粒子Ｐが検出位置Ｘ中の位置Ｘ１、ソートされなかった粒子Ｐが検出位置Ｘ中の位置Ｘ２で各々第４検出器３４によって検出される場合、位置Ｘ１および位置Ｘ２を通過した粒子の割合を多数の粒子の積算として取得することが考えられる。例えば、粒子Ｐが、レーザ光によって励起されて発せられる蛍光によって検出可能な場合、位置Ｘ１およびＸ２における粒子Ｐに由来する蛍光強度積算値の比を測定することで、ソートされた粒子Ｐ及びソートされなかった粒子Ｐの割合を調べることができる。
【００６７】
遅延時間計算部８０は、第２粒子検出部７２からソートされた粒子Ｐもしくはソートされなかった粒子Ｐの割合を取得することで、遅延時間計算方法の妥当性を評価する。例えば、すべての粒子Ｐがソートされる設定とした場合、ソートされた粒子Ｐの割合が１００％に最も近い遅延時間となるよう調整することで、ソートに適切な遅延時間を決めることができる。また、遅延時間の計算方法を変化させながら遅延時間計算方法の妥当性を評価し、最も妥当な遅延時間計算方法を探索することによって、遅延時間計算方法のキャリブレーションを行うこともできる。
【００６８】
＜第３実施形態＞
以下、第３実施形態のイメージングフローサイトメーター１について説明する。本実施形態のイメージングフローサイトメーター１は、第１実施形態のイメージングフローサイトメーター１において、更に遅延時間のキャリブレーション機能を有する。具体的には、イメージングフローサイトメーター１では、キャリブレーション用のビーズ（粒子Ｐ）を流路１０に流し、第１スポット２５ａ、第２スポット２５ｂを通過する粒子Ｐが、検出位置Ｘで検出される到達時間を測定する。これにより、第１スポット２５ａ、第２スポット２５ｂを通過する粒子Ｐから計算される粒子Ｐの到達予想時間のキャリブレーションを行う。
【００６９】
本実施形態のイメージングフローサイトメーターは、遅延時間計算部８０の構成が第１実施形態とは異なる。それ以外の構成は第１実施形態と同一である。
本実施形態の遅延時間計算部８０は、第１粒子検出部７０で検出された、粒子Ｐが第１スポット２５ａ、第２スポット２５ｂを通過したシステム時間ｔ１及びｔ２に基づき、粒子Ｐが検出位置Ｘに到達する時間（到達予想時間）を計算する。なお、検出位置Ｘとソート部９０との距離は既知である。
【００７０】
遅延時間計算部８０は、粒子Ｐの識別番号と、第２粒子検出部７２から出力される粒子Ｐの到達時間を紐付ける。具体的には、遅延時間計算部３６は、第１粒子検出部７０からの粒子Ｐの到達予想時間と、第２粒子検出部７２からの粒子Ｐの到達時間に基づいて、粒子Ｐの識別番号を紐付ける。
遅延時間計算部８０は、紐付けられた粒子Ｐの識別番号、到達予想時間、到達時間をセットで出力する。
【００７１】
遅延時間計算部８０は、粒子Ｐの到達予想時間、到達時間に基づいて、キャリブレーションを行う。図５は、キャリブレーション方法の一例を示す。横軸は、遅延時間計算部８０により計算されるスポット通過時間ΔＴを示す。ここで、粒子Ｐが第１スポット２５ａ及び第２スポット２５ｂを通過した時間（システム時間）をｔ１、ｔ２とすると、スポット通過時間ΔＴは（ｔ２−ｔ１）となる。縦軸は、粒子Ｐの到達時間Ｔを示す。
第１スポット２５ａと第２スポット２５ｂの間の距離をＬ１、第１スポット２５ａと検出位置Ｘの間の距離をＬ２とすると、粒子Ｐが等速運動をしている場合には、到達予想時間は（Ｌ２／Ｌ１）×（ｔ２−ｔ１）として求められる。ここでは係数Ａ＝Ｌ２／Ｌ１の値をキャリブレーションにより求めることで、ｔ１およびｔ２が与えられた際に到達予想時間を求めることができる。
【００７２】
遅延時間計算部８０は、粒子Ｐのスポット通過時間ΔＴと到達時間Ｔをプロットし、モデル式にフィッティングを行う。モデル式は、例えば、図５に示すような原点を通る直線であるが、これに限られない。原点を通る直線をモデル式とする場合、モデル式はＴ＝Ａ×ΔＴとなる。遅延時間計算部８０は、粒子Ｐのスポット通過時間ΔＴと到達時間Ｔのプロットから係数Ａを求めることにより、キャリブレーションを行う。
【００７３】
遅延時間計算部８０は、粒子Ｐの到達予想時間に代えて、又は、粒子Ｐの到達予想時間に加えて、ソートウィンドウをキャリブレーションしてもよい。ここで、ソートウィンドウとは、ソート部９０がソートを行う時間帯を示す。図５に示す例では、粒子Ｐのスポット通過時間がΔＴ１である場合、到達時間Ｔ１を含むソートウィンドウＹ１の時間帯において、ソートを行うことを示す。また、粒子Ｐのスポット通過時間がΔＴ２である場合、到達時間Ｔ２を含むソートウィンドウＹ２の時間帯において、ソートを行うことを示す。ソートウィンドウの幅（時間の長さ）は、粒子Ｐの遅延時間によらず一定でもよいし、粒子Ｐの遅延時間に依存して可変でもよい。一般に、粒子Ｐの速度が速い場合はスポット通過時間が短くなり、遅延時間が小さくなる。反対に、粒子Ｐの速度が遅い場合はスポット通過時間が長くなり、遅延時間が大きくなる。図５に示す例では、粒子Ｐのスポット通過時間が長くなり遅延時間が大きいほど、ソートウィンドウの幅が広くなる。遅延時間が大きいほど誤差も大きくなるため、ソートウィンドウの幅を広くすることでソート精度を高めることが出来るためである。
【００７４】
ソートウィンドウは、必ずしも測定された到達時間Ｔを中心としなくてもよい。遅延時間計算部８０は、粒子のスポット通過時間ΔＴと到達時間Ｔのプロットに基づき、ソートウィンドウを設定できる。
【００７５】
検出位置Ｘはソート部９０と一致することが好ましいが、必ずしも検出位置Ｘがソート部９０と一致しなくてもよい。例えば、検出位置Ｘは、ソート部９０よりもわずかに上流又は下流に位置してもよい。この場合、検出位置Ｘおよびソート部９０の位置のずれに合わせて、ソートウィンドウの中心位置を到達予想時間から適宜ずらして、粒子Ｐがソート部９０に到達するタイミングにソートウィンドウが設定されるように調整してもよい。また、ソート部９０の物理的な動作速度の限界から、ソート部９０に対してソート信号が発信されてから粒子Ｐがソートされるまでにはタイムラグが生じることがある。そのタイムラグをＢとすると、粒子Ｐがソート部９０に到達するタイミングでソートが行われるように、タイムラグＢの分だけソート信号発生タイミングを早めるように調整してもよい。
【００７６】
以下、本実施形態のイメージングフローサイトメーター１を用いたキャリブレーション方法及びソート方法について説明する。
まず、多数の粒子Ｐが流路１０を流れる。レーザユニット２０は、第１〜第３スポット２５ａ〜２５ｃに、それぞれ第１〜第３レーザ光を照射する。検出ユニット３０は、第１〜第３スポット２５ａ〜２５ｃを通過する粒子Ｐを検出する。第１粒子検出部７０は、検出ユニット３０が取得した信号に基づいて、粒子Ｐを検出する。また、第１粒子検出部７０は、撮像ユニット５０に対して、撮像タイミングを指示する撮像タイミング指示信号ＳＧ１を発する。この間、システム時間管理部６０は、第１粒子検出部７０に対して、システム時間を発する。
【００７７】
第２粒子検出部７２は、第４検出器３４が取得した信号に基づいて、粒子Ｐが検出位置Ｘを通過したタイミングを検出する。
遅延時間計算部８０は、粒子Ｐが第１スポット２５ａ及び第２スポット２５ｂを通過した時間（システム時間）に基づき、粒子Ｐが検出位置Ｘに到達する到達予想時間を計算する。
第２粒子検出部７２は、粒子Ｐの通過に対応する検出信号を検出し、粒子Ｐが検出位置Ｘに到達した到達時間を遅延時間計算部８０に出力する。
遅延時間計算部８０は、到達時間に基づいて、到達予想時間の計算式をキャリブレーションし調整する。そして、ソート信号制御部８６とソート部９０は、調整された到達予想時間に基づき、粒子Ｐをソートするタイミングを調整する。
【００７８】
このように、本実施形態のイメージングフローサイトメーター、ソート方法、キャリブレーション方法によれば、ソート精度をより高めることができる。
【００７９】
＜第４実施形態＞
以下、第４実施形態のイメージングフローサイトメーター１について説明する。本実施形態のイメージングフローサイトメーター１は、第２実施形態のイメージングフローサイトメーター１において、更に遅延時間のキャリブレーション機能を有する。具体的には、イメージングフローサイトメーター１では、キャリブレーション用のビーズ（粒子Ｐ）を流路１０に流し、第１スポット２５ａ、第２スポット２５ｂを通過する粒子Ｐが、検出位置Ｘで検出される到達時間を測定する。これにより、第１スポット２５ａ、第２スポット２５ｂを通過する粒子Ｐから計算される粒子Ｐの到達予想時間のキャリブレーションを行う。
【００８０】
本実施形態のイメージングフローサイトメーターは、第４検出器３４、第２粒子検出部７２、および遅延時間計算部８０の構成が第３実施形態とは異なる。それ以外の構成は第３実施形態と同一である。また、本実施形態のイメージングフローサイトメーターは、遅延時間計算部８０の構成が第２実施形態と異なり、それ以外の構成は第２実施形態と同一である。本実施形態では、検出位置Ｘがソート部９０の下流に位置しており、粒子Ｐがソート部９０でソートされた際に起こる位置の変化を検出することができる。そのため、粒子Ｐがソート部９０を通過するタイミングで、ソート部９０に対してソート信号を発する。そして、粒子Ｐがソートされたことによる位置ずれを起こす割合を評価することで、ソート部９０に対して発せられたソート信号のタイミングを評価することができる。このことを利用して、本実施形態では、粒子Ｐが検出されたのちにソート信号を発するまでの遅延時間を変化させながら、検出位置Ｘでのソートによる位置変化を評価することにより、最適な遅延時間を取得するためのキャリブレーションを行う。
【００８１】
本実施形態において、第２粒子検出部７２は流路１０内を流れる粒子Ｐの位置情報から粒子Ｐのソート成功率を算出して、その判定結果を遅延時間計算部８０に出力する。なお、第２粒子検出部７２がシステム時間管理部６０よりシステム時間を受け取ることは必須ではない。
【００８２】
遅延時間計算部８０は、粒子Ｐのソート部９０への到達予想時間、および粒子Ｐのソート結果判定に基づいて、キャリブレーションを行う。粒子Ｐが第１スポット２５ａ及び第２スポット２５ｂを通過した時間（システム時間）をそれぞれｔ１、ｔ２とすると、スポット通過時間ΔＴは（ｔ２−ｔ１）となる。第１スポット２５ａと第２スポット２５ｂの間の距離をＬ１、第１スポット２５ａとソート部９０の間の距離をＬ２とすると、粒子Ｐが等速運動をしている場合には、到達予想時間は（Ｌ２／Ｌ１）×（ｔ２−ｔ１）として求められる。なおソート信号を発生してから粒子Ｐがソートされるまでにはタイムラグが生じることがある。そのタイムラグをＢとすると、粒子Ｐを適切にソートするためには、ソート信号をＢだけ早く発する必要があり、到達予想時間に基づいた最適ソート信号発生タイミングは（Ｌ２／Ｌ１）×（ｔ２−ｔ１）―Ｂとして求められる。Ｌ１は設計値から計算することができるため、ここではＬ２およびＢの値をキャリブレーションにより求めることで、ｔ１およびｔ２が与えられた際にソート信号発生の最適遅延時間を求めることができる。キャリブレーションの具体的な方法としては、遅延時間計算部８０が係数Ｌ２およびタイムラグＢを一定の範囲で変化させつつ、流路１０を流れる個々の粒子に対してソート信号を発信するようにソート信号制御部８６に命令する。ソート信号制御部８６はソート部９０に信号を発し、ソート部９０はソートを試みる。第２粒子検出部７２は、各係数Ｌ２およびタイムラグＢについてソート成功率を計算して、遅延時間計算部８０にその判定結果を出力する。遅延時間計算部８０は、係数Ｌ２およびタイムラグＢとソート成功率との関係を取得し、そこからソート成功率が最大となる係数Ｌ２およびタイムラグＢを取得することにより、キャリブレーションを行う。
【符号の説明】
【００８３】
１  イメージングフローサイトメーター
１０  流路
２０  レーザユニット
２２ａ  第１レーザ光源
２２ｂ  第２レーザ光源
２２ｃ  第３レーザ光源
２５ａ  第１スポット
２５ｂ  第２スポット
２５ｃ  第３スポット
２５ｄ  第４スポット
２６  レーザ制御部
３０  検出ユニット
３２ａ  第１検出器
３２ｂ  第２検出器
３２ｃ  第３検出器
３４  第４検出器
４０  照明光源
５０  撮像ユニット
５２ａ  第１撮像部
５２ｂ  第２撮像部
５２ｃ  第３撮像部
５２ｄ  第４撮像部
６０  システム時間管理部
７０  第１粒子検出部
７２  第２粒子検出部
８０  遅延時間計算部
８１  画像解析部
８２  画像記憶部
８４  ソート判断部
８６  ソート信号制御部
８８  記憶部
９０  ソート部
１００  ＡＰＤ
１０２  ＡＦＥ
１０４  ＡＤＣ
１０６  ＦＰＧＡ
１０８  ＧｂＥ
１１０  ＡＰＤ制御高圧電源
Ｐ  粒子
ＳＧ１  撮像タイミング指示信号
Ｄ１  画像
【要約】      （修正有）【課題】簡易な構成で対象物の速度ばらつきを考慮したソート精度の高いイメージングフローサイトメーターを提供する。【解決手段】第1，第２スポットに、第１，第２レーザ光を照射するレーザユニット２０と、第１，第２スポットを撮像する第１，第２撮像部５２ａ，５２ｂと、第１，第２スポットを通過する粒子を検出する第１，第２検出器３２ａ，３２ｂと、第１，第２撮像部５２ａ，５２ｂに対して撮像タイミング指示信号ＳＧ１を発する第１粒子検出部７０と、第１，第２撮像部５２ａ，５２ｂが撮像した画像Ｄ１を受信する画像記憶部８２と、粒子が対象粒子であるか否かを判断するソート判断部８４と、を有し、第１，第２撮像部５２ａ，５２ｂは、撮像タイミング指示信号ＳＧ１に基づいて、撮像した粒子の画像Ｄ１を切り出す、イメージングフローサイトメーター１。【選択図】図１【図１】
0006745559.tif 000002
【図２】
0006745559.tif 000003
【図３】
0006745559.tif 000004
【図４】
0006745559.tif 000005
【図５】
0006745559.tif 000006