(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
0006744293.tif 000028
［式中、
Ｒ１は、水素又はＣ１−７−アルキルであり、そして
Ｒ２は、水素又はＣ１−７−アルキルであるか；又は
Ｒ１及びＲ２は、これらが結合している窒素及び炭素原子と一緒になって、ヒドロキシ又はハロゲンで場合により置換されている５員複素環を形成し；
Ｒ３は、Ｃ１−７−アルキルである］
で示されるオキシトシン類似体、又はそのエナンチオマー若しくは光学異性体を製造するための方法であって、式ＩＩ：
【化２】
0006744293.tif 000029
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、上記のとおりであり、そして
Ｒ４は、ヒドロキシ保護基であり；
Ｒ５は、Ｆｍｏｃであり；
Ｒ６は、アリル又はｔ−ブチルであり；
Ｒ７は、アミド保護基であり；そして
Ｒ８は、アミド保護基である］
で示される樹脂に結合したペプチド前駆体、又はそのエナンチオマー若しくは光学異性体を、
以下の方法：
ａ）Ｒ６がアリルである場合
ａ１）アリル基Ｒ６が開裂され、後続の工程において
ａ２）Ｆｍｏｃ基Ｒ５が開裂され、その後
ａ３）環の環化が樹脂上で実行され、さらなる工程において
ａ４）全体の脱保護及び樹脂からの開裂が実行され、そして場合により
ａ５）そのように得られた式Ｉで示されるオキシトシン類似体が精製及び単離される；
に従うか、又は以下の方法：
ｂ）Ｒ６がｔ−ブチルである場合；
ｂ１）Ｆｍｏｃ基Ｒ５が開裂され、その後
ｂ２）全体の脱保護及び樹脂からの開裂が実行され、さらなる工程において
ｂ３）環の環化が溶液中で実行され、次に場合により
ｂ４）そのように得られた式Ｉで示されるオキシトシン類似体が単離及び精製される
に従って処理することを含む、方法。
【請求項２】
オキシトシン類似体が、式Ｉａ：
【化３】
0006744293.tif 000030
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、請求項１に定義されるとおりである］
を有し、そして、式ＩＩで示される樹脂に結合したペプチド前駆体が、式ＩＩａ：
【化４】
0006744293.tif 000031
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、請求項１に定義されるとおりである］
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１が、水素又はＣ１−４−アルキルであり、そして
Ｒ２が、水素又はＣ１−４−アルキルであるか；又は
Ｒ１及びＲ２が、これらが結合している窒素及び炭素原子と一緒になって、ヒドロキシ又はハロゲンで場合により置換されているプロリンのピロリジン環を形成し；
Ｒ３が、ｎ−ブチル又はｉ−ブチルを表し；
Ｒ４が、ｔ−ブチル、アリル、トリチル、２−クロロトリチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ｔ−ブチルジフェニルシリル又はｔ−ブチルジメチルシリルであり；
Ｒ５が、Ｆｍｏｃであり；
Ｒ６が、アリル又はｔ−ブチルであり；
Ｒ７が、トリチル、２−クロロトリチル又は４−メチルトリチルであり；そして
Ｒ８が、トリチル、２−クロロトリチル又は４−メチルトリチルである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１が、水素又はメチルであり、そして
Ｒ２が、水素であるか、又は
Ｒ１及びＲ２が、これらが結合している窒素及び炭素原子と一緒になって、ヒドロキシ又はフッ素で場合により置換されているプロリンのピロリジン環を形成し；
Ｒ３が、ｎ−ブチル又はｉ−ブチルを表し；
Ｒ４が、ｔ−ブチルであり；
Ｒ５が、Ｆｍｏｃであり；
Ｒ６が、アリルであり；
Ｒ７が、トリチルであり；そして
Ｒ８が、トリチルである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
式ＩＩで示される樹脂に結合したペプチド前駆体が、樹脂上での、それぞれのＦｍｏｃ保護アミノ酸の繰り返しＦｍｏｃ開裂及びカップリングによって製造される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
Ｆｍｏｃ開裂が、有機溶媒中のピペリジン又は４−メチル−ピペリジンの溶液を用いて実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｆｍｏｃカップリングが、有機アミン塩基及び有機溶媒の存在下、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ）、（７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＡＯＰ）、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢｒｏＰ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＣＴＵ）、（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウムヘキサフルオロホスファート（ＣＯＭＵ）、テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスファート（ＴＦＦＨ）、２−ヒドロキシ−ピリジン（ＨＯＰｙ）又は４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）から選択されるカップリング剤を使用して実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
樹脂が、４−［（２，４−ジメトキシフェニル）Ｆｍｏｃ−アミノメチル］フェノキシアセトアミドメチル樹脂である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
工程ａ１）において、アリル基Ｒ６が、パラジウム若しくはロジウム化合物又はヒドラジンの存在下で開裂され；
工程ａ２）において、Ｆｍｏｃ基Ｒ５が、有機溶媒中のピペリジン又は４−メチル−ピペリジンの溶液を用いて開裂され；
工程ａ３）において、環の環化が、有機アミン塩基の存在下、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ）、（７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＡＯＰ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＣＴＵ）、（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウムヘキサフルオロホスファート（ＣＯＭＵ）、２−ヒドロキシ−ピリジン（ＨＯＰｙ）又は４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）から選択される環化剤を使用して樹脂上で実行され；
工程ａ４）において、全体の脱保護及び樹脂からの開裂が、トリフルオロ酢酸及びスカベンジャーの存在下で実行され；
工程ａ５）において、場合により、そのように得られた式Ｉで示されるオキシトシン類似体が精製及び単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｂ１）において、Ｆｍｏｃ基Ｒ５が、有機溶媒中のピペリジン又は４−メチル−ピペリジンの溶液を用いて開裂され；
工程ｂ２）において、全体の脱保護及び樹脂からの開裂が、トリフルオロ酢酸及びスカベンジャーの存在下で実行され；
工程ｂ３）において、環の環化が、有機アミン塩基の存在下、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ）、（７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＡＯＰ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＣＴＵ）、（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウムヘキサフルオロホスファート（ＣＯＭＵ）、２−ヒドロキシ−ピリジン（ＨＯＰｙ）又は４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）から選択される環化剤を使用して溶液中で実行され；
工程ｂ４）において、場合により、そのように得られた式Ｉで示されるオキシトシン類似体が単離及び精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
有機アミン塩基が、ピリジン、イミダゾール、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン又は１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタンから選択される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
式Ｉａ：
【化５】
0006744293.tif 000032
［式中、
Ｒ１は、水素又はＣ１−４−アルキルであり、そして
Ｒ２は、水素又はＣ１−４−アルキルであるか；又は
Ｒ１及びＲ２は、これらが結合している窒素及び炭素原子と一緒になって、ヒドロキシ又はハロゲンで場合により置換されているプロリンのピロリジン環を形成し；
Ｒ３は、ｎ−ブチル又はｉ−ブチルである］
で示されるオキシトシン類似体、又はそのエナンチオマー若しくは光学異性体を製造するための請求項１に記載の方法であって、式ＩＩａ：
【化６】
0006744293.tif 000033
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、上記のとおりであり、そして
Ｒ４は、ｔ−ブチル、アリル、トリチル、２−クロロトリチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ｔ−ブチルジフェニルシリル又はｔ−ブチルジメチルシリルであり；
Ｒ５は、Ｆｍｏｃであり；
Ｒ６は、ｔ−ブチルであり；
Ｒ７は、トリチル、２−クロロトリチル又は４−メチルトリチルであり；そして
Ｒ８は、トリチル、２−クロロトリチル又は４−メチルトリチルである］
で示される樹脂に結合したペプチド前駆体を、
以下の方法：
ｂ１）Ｆｍｏｃ基Ｒ５が、有機溶媒中のピペリジン又は４−メチル−ピペリジンの溶液を用いて開裂され；
ｂ２）全体の脱保護及び樹脂からの開裂が、トリフルオロ酢酸及びスカベンジャーの存在下で実行され；
ｂ３）環の環化が、有機アミン塩基の存在下、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ）、（７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＡＯＰ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＣＴＵ）、（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウムヘキサフルオロホスファート（ＣＯＭＵ）、２−ヒドロキシ−ピリジン（ＨＯＰｙ）又は４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）から選択される環化剤を使用して溶液中で実行され；
ｂ４）場合により、そのように得られた式Ｉａで示されるオキシトシン類似体が単離及び精製される
に従って処理することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式Ｉ：
【化１】
0006744293.tif 000002
［式中、
Ｒ１は、水素又はＣ１−７−アルキルであり、そして
Ｒ２は、水素又はＣ１−７−アルキルであるか；又は
Ｒ１及びＲ２は、これらが結合している窒素及び炭素原子と一緒になって、ヒドロキシ又はハロゲンで場合により置換されている５員複素環を形成し；
Ｒ３は、Ｃ１−７−アルキルである］
で示されるオキシトシン類似体、並びにその対応するエナンチオマー及び／又はそれらの光学異性体の新規製造方法に関する。
【０００２】
式Ｉで示されるオキシトシン類似体は、オキシトシン受容体アゴニストとして作用し、神経障害、例えば自閉症、ストレス（心的外傷後ストレス障害を含む）、不安症（不安障害及び鬱病を含む）、統合失調症、精神障害及び記憶喪失、アルコール禁断症、薬物依存症の処置に、並びに、プラダー・ウィリー症候群（Prader-Willi Syndrome）の処置に使用される可能性を有する（ＰＣＴ国際公開公報第２０１４／０９５７７３号）。
【０００３】
ＰＣＴ国際公開公報第２０１４／０９５７７３号に記載されている方法に従うオキシトシン類似体の製造は、以下の工程によって特徴付けられる：
ｘ１）式Ｘ：
【化２】
0006744293.tif 000003
で示される樹脂に結合したペプチド前駆体からのＦｍｏｃの開裂
ｘ２）アリル基の開裂、後続の工程において
ｘ３）樹脂上での環の環化
ｘ４）全体の脱保護及び樹脂からの開裂
ｘ５）精製及び単離。
【０００４】
当技術分野において公知のこの方法は、低い全収率及び生成物選択性の問題を抱えていることが見出された。
【０００５】
それゆえ、本発明の目的は、所望のオキシトシン類似体の収率及び選択性に関してその合成法を改良することであった。
【０００６】
その目的は、本明細書以下に概説するとおりの本発明の製造方法によって達成され得る。
【０００７】
式Ｉ：
【化３】
0006744293.tif 000004
［式中、
Ｒ１は、水素又はＣ１−７−アルキルであり、そして
Ｒ２は、水素又はＣ１−７−アルキルであるか；又は
Ｒ１及びＲ２は、これらが結合している窒素及び炭素原子と一緒になって、ヒドロキシ又はハロゲンで場合により置換されている５員複素環を形成し；
Ｒ３は、Ｃ１−７−アルキルである］
で示されるオキシトシン類似体、並びにその対応するエナンチオマー及び／又はそれらの光学異性体の製造方法であって、式ＩＩ：
【化４】
0006744293.tif 000005
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、上記のとおりであり、そして
Ｒ４は、ヒドロキシ保護基であり；
Ｒ５は、Ｆｍｏｃであり；
Ｒ６は、アリル、ｔ−ブチル、１−アダマンチル、４−｛Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル］アミノ｝ベンジル又はフェニルイソプロピルであり；
Ｒ７は、アミド保護基であり；そして
Ｒ８は、アミド保護基である］
で示される樹脂に結合したペプチド前駆体、並びにその対応するエナンチオマー及び／又はそれらの光学異性体を、
以下の方法：
ａ）Ｒ６がアリル又は４−｛Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル］アミノ｝ベンジルである場合
ａ１）アリル基又は４−｛Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル］アミノ｝ベンジル基Ｒ６が開裂され、後続の工程において
ａ２）Ｆｍｏｃ基Ｒ５が開裂され、その後
ａ３）環の環化が樹脂上で実行され、さらなる工程において
ａ４）全体の脱保護及び樹脂からの開裂が実行され、そして場合により
ａ５）そのように得られた式Ｉで示されるオキシトシン類似体が精製及び単離される；
に従うか又は以下の方法：
ｂ）Ｒ６がｔ−ブチル、１−アダマンチル又はフェニルイソプロピルである場合；
ｂ１）Ｆｍｏｃ基Ｒ５が開裂され、その後
ｂ２）全体の脱保護及び樹脂からの開裂が実行され、さらなる工程において
ｂ３）環の環化が溶液中で実行され、次に場合により
ｂ４）そのように得られた式Ｉで示されるオキシトシン類似体が単離及び精製される
に従って処理することを含む製造方法。
【０００８】
以下の定義は、本明細書において本発明を記載するために使用される様々な用語の意味及び範囲を説明及び定義するために明記される。
【０００９】
用語「Ｃ１−７−アルキル」は、１〜７個の炭素原子、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜２個の炭素原子の分岐又は直鎖の一価の飽和脂肪族炭化水素基に関する。この用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、又はｔ−ブチル、ペンチル及びその異性体、ヘキシル及びその異性体並びにヘプチル及びその異性体のような基によってさらに例示される。
【００１０】
同様に、用語「Ｃ１−４−アルキル」は、１〜４個の炭素原子の分岐又は直鎖の一価の飽和脂肪族炭化水素基に関し、その優先度及びそれぞれの例は上述される。
【００１１】
用語「Ｃ１−４−アルキルオキシ」は、酸素原子に結合されたＣ１−４−アルキル鎖に関する。この用語は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｉ−ブトキシ及びｔ−ブトキシのような基によってさらに例示される。
【００１２】
用語「Ｃ１−４−アルキルオキシカルボニル」は、カルボニル基に結合されたＣ１−４−アルコキシ鎖に関し、これは、カルボニル基に結合された上に概説した特定のアルコキシ基によってさらに例示される。
【００１３】
用語「Ｃ２−４−アルケニル」は、少なくとも１個の二重結合を含有する、２〜４個の炭素原子を含有する不飽和の直鎖又は分岐炭素鎖に関する。この用語は、ビニル、アリル並びにブテニル及びその異性体のような基によってさらに例示される。
【００１４】
用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を指す。
【００１５】
Ｒ１及びＲ２とこれらが結合している窒素及び炭素原子とが一緒になって形成される用語「５員複素環」は、ヒドロキシ又はハロゲンで場合により置換されているピロリジン環、具体的にはヒドロキシ又はフッ素によって置換されているプロリンのピロリジン環を表す。
【００１６】
用語「アミド保護基」は、アミド基の反応性を妨げるために従来使用される酸又はルイス酸センシティブ置換基を指す。好適な酸又はルイス酸センシティブアミド保護基は、Isidro-Llobet A., Alvarez, M. and Albericio F., “Amino Acid-Protecting Groups”, Chem. Rev. 2009, 109, 2455-2504., Chan W. C. and White P. D. “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”, Oxford University Press and Green T., “Protective Groups in Organic Synthesis”, 4th Ed. by Wiley Interscience, 2007, Chapter 7, 696 ff. に記載されている。それゆえ、好適なアミド保護基は、トリチル、Ｔｍｏｂ（２，４，６−トリメトキシベンジル）、Ｘａｎ（９−キサンテニル）、Ｃｐｄ（シクロプロピルジメチルカルビニル）、Ｍｂｈ（４，４’−ジメトキシベンズヒドリル）又はＭｔｔ（４−メチルトリチル）から選択され得る。
【００１７】
置換基Ｒ４のために使用される用語「ヒドロキシ保護基」は、ヒドロキシ基の反応性を妨げるために従来使用される任意の置換基を指す。好適なヒドロキシ保護基は、Isidro-Llobet A., Alvarez, M. and Albericio F., “Amino Acid-Protecting Groups”, Chem. Rev. 2009, 109, 2455-2504., Chan W. C. and White P. D. “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”, Oxford University Press, Green T., “Protective Groups in Organic Synthesis”, Chapter 1 , John Wiley and Sons, Inc.,1991, 10-142 に記載されており、Ｃ１−４−アルキル（フェニル又はハロゲン化フェニルで場合により置換されている）；Ｃ２−４−アルケニル；シリル（Ｃ１−４−アルキル又はフェニル又はＣ１−４−アルキルオキシカルボニルで場合により置換されている）から選択され得る。
【００１８】
螺旋の結合：
【化５】
0006744293.tif 000006
は、
【化６】
0006744293.tif 000007
又は
【化７】
0006744293.tif 000008
を表し、したがって、分子のキラリティーを示す。
【００１９】
化学構造内にキラル炭素が存在する場合は必ず、そのキラル炭素と関連する全ての立体異性体が、純粋な立体異性体並びにその混合物として、その構造に包含されることが意図される。
【００２０】
本発明の特定の実施態様において、オキシトシン類似体は、式Ｉａを有する：
【化８】
0006744293.tif 000009
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、上記のとおりである］
【００２１】
Ｒ１は、具体的には水素又はＣ１−４−アルキル、より具体的には水素又はメチルである。
【００２２】
Ｒ２は、具体的には水素又はＣ１−４−アルキル、より具体的には水素である。
【００２３】
Ｒ１及びＲ２は、これらが結合している窒素及び炭素原子と一緒になって、具体的にはプロリンのピロリジン環（ヒドロキシ又はハロゲンで、具体的にはヒドロキシ又はフッ素で場合により置換されている）を形成する。
【００２４】
Ｒ３は、具体的にはｎ−ブチル又はｉ−ブチルを表す。
【００２５】
さらにより具体的なオキシトシン類似体は、以下に列挙される：
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（１）
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（２）
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｓａｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（３）
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｓａｒ−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（４）
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−trans−４−フルオロ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（５）
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−trans−４−ヒドロキシ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（６）。
【００２６】
式ＩＩで示される樹脂に結合したペプチド前駆体は、以下の式を有する：
【化９】
0006744293.tif 000010
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、上記のとおりである］
【００２７】
Ｒ１は、具体的には水素又はＣ１−４−アルキル、より具体的には水素又はメチルである。
【００２８】
Ｒ２は、具体的には水素又はＣ１−４−アルキル、より具体的には水素である。
【００２９】
Ｒ１及びＲ２は、これらが結合している窒素及び炭素原子と一緒になって、具体的にはプロリンのピロリジン環（ヒドロキシ又はハロゲンで、具体的にはヒドロキシ又はフッ素で場合により置換されている）を形成する。
【００３０】
Ｒ３は、具体的にはｎ−ブチル又はｉ−ブチルを表す；
【００３１】
Ｒ４は、具体的にはｔ−ブチル、アリル、トリチル、２−クロロトリチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ｔ−ブチルジフェニルシリル又はｔ−ブチルジメチルシリルであるが、より具体的にはｔ−ブチルである；
【００３２】
Ｒ５は、Ｆｍｏｃである；
【００３３】
Ｒ６は、具体的にはアリル、１−アダマンチル、４−｛Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル］アミノ｝ベンジル、フェニルイソプロピル又はｔ−ブチルであるが、より具体的にはアリルである；
【００３４】
Ｒ７は、具体的にはトリチル、２−クロロトリチル、４−メチルトリチルであるが、より具体的にはトリチルである；そして
【００３５】
Ｒ８は、具体的にはトリチル、２−クロロトリチル、４−メチルトリチルであるが、より具体的にはトリチルである。
【００３６】
式ＩＩで示される樹脂に結合したペプチド前駆体は、通常は所望のＦｍｏｃ保護アミノ酸の繰り返しＦｍｏｃ開裂及び繰り返しカップリングによる、当業者に公知の固相ペプチド合成法を使用して製造され得る。
【００３７】
原則として、固相ペプチド合成に、具体的にはＦｍｏｃ固相ペプチド合成に好適な市販のアミド樹脂が使用され得る。有用な樹脂は、例えば、Chan W. C. and White P. D. “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”, Oxford University Press に記載されている。例えば、Agilent Technology社のＰＬ−Ｒｉｎｋ樹脂（４−［（２，４−ジメトキシフェニル）Ｆｍｏｃ−アミノメチル］フェノキシアセトアミドメチル樹脂）が本発明の方法に特に好適であることが見出された。
【００３８】
Ｆｍｏｃ開裂は、好適な有機溶媒中のピペリジン誘導体の溶液で起こり得る。有利には、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はＮ−メチルピロリドン中のピペリジン又は４−メチルピペリジン溶液が適用され得る。
【００３９】
樹脂上でのＦｍｏｃ保護アミノ酸とのカップリングは、有機アミン塩基及び好適な有機溶媒の存在下で、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ）、（７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＡＯＰ）、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢｒｏＰ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＣＴＵ）、（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウムヘキサフルオロホスファート（ＣＯＭＵ）、テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスファート（ＴＦＦＨ）、２−ヒドロキシ−ピリジン（ＨＯＰｙ）又は４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）から選択されるカップリング剤を用いて行われ得る。
【００４０】
有機アミン塩基としてのピリジン及び有機溶媒としてのＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドの存在下でのＨＯＢｔ、ＨＯＰｙ及びＤＩＣが好ましいカップリング剤であることが見出された。
【００４１】
式Ｘ：
【化１０】
0006744293.tif 000011
で示されるＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂は、例えば、ＰＬ−Ｒｉｎｋ樹脂上で、以下のＦｍｏｃ保護アミノ酸の繰り返しＦｍｏｃ開裂及び繰り返しカップリングによって記載の順序で構築され得る：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ。
【００４２】
上に概説したように、本発明の方法は、方法ａ）（ここで、Ｒ６は、アリル又は４−｛Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル］アミノ｝ベンジルである）に従うことができる。この場合、本方法は、以下の工程によって特徴付けられる：
ａ１）アリル又は４−｛Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル］アミノ｝ベンジル基Ｒ６が開裂され、後続の工程において
ａ２）Ｆｍｏｃ基Ｒ５が開裂され、その後
ａ３）環の環化が樹脂上で実行され、さらなる工程において
ａ４）全体の脱保護及び樹脂からの開裂が実行され、そして場合により
ａ５）そのように得られた式Ｉで示されるオキシトシン類似体が精製及び単離される。
【００４３】
工程ａ１）におけるアリル又は４−｛Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル］アミノ｝ベンジル基の開裂は、通常、パラジウム若しくはロジウム化合物又はヒドラジンの存在下で実施される。好適なパラジウム又はロジウム化合物は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、酢酸パラジウム／トリフェニルホスフィン、酢酸パラジウム／亜リン酸トリエチル、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウムジクロリド又はトリス（トリフェニルホスフィン）ロジウムクロリドから選択され得る。好ましくは、パラジウム化合物、さらにより好ましくはテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムが使用される。
【００４４】
加えて、フェニルシラン、ピロリジン、モルホリン又はＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオロアセトアミドなどのスカベンジャー、具体的にはフェニルシランが通常存在する。
【００４５】
反応は、原則として、塩化メチレン、アセトニトリル又はテトラヒドロフランなどの好適な有機溶媒中、室温で起こり得る。
【００４６】
工程ａ２）におけるＦｍｏｃ開裂は、好適な有機溶媒中、ピペリジン又は４−メチル−ピペリジンを用いて、上に概説したように実施され得る。
【００４７】
工程ａ３）における環の環化は、有機アミン塩基の存在下、便宜上ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ）、（７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＡＯＰ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウラニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＣＴＵ）、（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウムヘキサフルオロホスファート（ＣＯＭＵ）、２−ヒドロキシ−ピリジン（ＨＯＰｙ）又は４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）から選択される環化剤を使用して樹脂上で実行される。
【００４８】
好適な有機アミン塩基は、ピリジン、イミダゾール、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン又は１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタンから選択され得る。
【００４９】
好ましい実施態様において、環化工程ａ３）は、ＰｙＢＯＰ又はＰｙＡＯＰを用いて、有機アミン塩基としてＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、イミダゾール又はＮ−メチルモルホリンの存在下、０℃〜２５℃の間の温度で実施され得る。
【００５０】
工程ａ４）における全体の脱保護及び樹脂からの開裂は、トリフルオロ酢酸／水及び好適なスカベンジャー（チオアニソール、アニソール、フェノール、トリイソプロピルシラン、トリエチルシラン、エタンジチオール又はジチオトレイトールなど）の存在下、通常０℃〜２５℃の間の温度で実行され得る。トリイソプロピルシランが好ましいスカベンジャーであることが見出された。
【００５１】
工程ａ５）において、粗オキシトシン類似体は、樹脂を濾別し、濾液から溶媒を除去し、そしてさらに残留物をメチルｔ−ブチルエーテル、２−メチルテトラヒドロフランなどの好適な有機溶媒中又はそれらの混合物中に取り、そして最後の濾過及び乾燥によって単離され得る。
【００５２】
粗オキシトシン類似体は、水性アセトニトリルなどの好適な有機溶媒及びトリフルオロ酢酸、酢酸又は酢酸アンモニウムなどの好適な添加剤を用いた、溶液中での分取ＨＰＬＣによってさらに精製され得る。
【００５３】
次いで、得られたフラクションを凍結乾燥させて、式Ｉで示される純粋なオキシトシン類似体を得ることができる。
【００５４】
代替的に、本発明の方法は、方法ｂ）（ここで、Ｒ６は、ｔ−ブチル、１−アダマンチル又はフェニルイソプロピルである）に従うことができる。この場合、本方法は、以下の工程によって特徴付けられる：
ｂ１）Ｆｍｏｃ基Ｒ５が開裂され、その後
ｂ２）全体の脱保護及び樹脂からの開裂が実行され、さらなる工程において
ｂ３）環の環化が溶液中で実行され、次に場合により
ｂ４）そのように得られた式Ｉで示されるオキシトシン類似体が単離及び精製される。
【００５５】
工程ｂ１）におけるＦｍｏｃ開裂は、上記の工程ａ２）について記載したとおりに行われ得る。
【００５６】
工程ｂ２）における全体の脱保護及び樹脂からの開裂は、工程ａ４）に上述したとおりに実施され得る。工程ａ４について記載した好ましい実施態様を工程ｂ２）に同様に適用する。
【００５７】
工程ｂ３）における環の環化は、溶液中で実行されるが、上記の工程ａ３）に列挙した環化剤及び有機アミン塩基を用いて起こり得る。工程ａ３について記載した好ましい実施態様を工程ｂ３）に同様に適用する。
【００５８】
工程ｂ４）における単離及び精製は、工程ａ５）に記載したものと同様の方法で行われ得る。工程ａ５について記載した好ましい実施態様を工程ｂ４）に同様に適用する。
【００５９】
本発明の特定の実施態様において、代替方法ａ）よりも代替方法ｂ）が好まれる。
【実施例】
【００６０】
略称
ＳＰＰＳ＝固相ペプチド合成、ＰＬ−Ｒｉｎｋ樹脂＝Agilent Technology社の４−［（２，４−ジメトキシフェニル）Ｆｍｏｃ−アミノメチル］フェノキシアセトアミドメチル樹脂（ＰＬ１４６７−４７４９：０．３２mmol/g ７５−１５０−１０−６ｍ；ＰＬ１４６７−４７９９：０．５５mmol/g ７５−１５０−１０−６ｍ；ＰＬ１４６７−４６８９：０．９６mmol/g １５０−３００−１０−６ｍ）、Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル、Ｇｌｙ＝グリシン、Ｌｅｕ＝ロイシン、Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）＝アリル保護グルタミン酸、Ｇｌｕ（ｔＢｕ）＝tert−ブチル保護グルタミン酸、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）＝トリチル保護アスパラギン、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）＝トリチル保護グルタミン、Ｉｌｅ＝イソロイシン、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）＝tert−ブチル保護チロシン、Ｓａｒ＝Ｎ−メチルグリシン、Ｐｒｏ＝プロリン、Ｎｌｅ＝ノルロイシン、ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＨＯＢｔ＝１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＨＯＰｙ＝２−ヒドロキシ（hyxroxy）−ピリジン、ＤＩＣ＝Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、ＮＥＰ＝Ｎ−エチルピロリドン、ＰｙＢＯＰ＝（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート、ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン、ＭｅＯＨ＝メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２＝ジクロロメタン、ＭＴＢＥ＝メチルtert−ブチルエーテル、ＭｅＴＨＦ＝２−メチルテトラヒドロフラン、ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸、ＭｅＣＮ＝アセトニトリル、ＰｙＡＯＰ＝（７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート、ＨＢＴＵ＝Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウラニウムヘキサフルオロホスファート、ＨＡＴＵ＝１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスファート、ＨＣＴＵ＝Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート、ＣＯＭＵ＝（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウムヘキサフルオロホスファート、ＤＭＴＭＭ＝４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド、ＮＭＰ＝１−メチル−２−ピロリジノン、ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド、ＤＭＩ＝１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、ＤＭＰＵ＝１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン、ＮＭＭ＝Ｎ−メチルモルホリン、ＤＭＡＰ＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン、ＤＩＰＥＡ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ＤＢＵ＝１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、ＤＡＢＣＯ＝１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン。
【００６１】
比較例
比較実験を、ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（１）の製造について、国際公開公報第２０１４／０９５７７３号（固相環化）の合成の記載と同様にして、かつ以下のスキーム１に概説するとおりに実行した：
【００６２】
【化１１】
0006744293.tif 000012
【００６３】
合成パフォーマンスを、生成物（１）の収率及び以下のスキーム２に示す式で表される二量体副生成物に対する比率に基づいて測定した：
【００６４】
【化１２】
0006744293.tif 000013
【００６５】
ａ）Ｆｍｏｃ開裂：
ＳＰＰＳリアクター（１００mL；ペプチドシンセサイザーCS136XT ex CSBio）に、ＰＬ−Ｒｉｎｋ樹脂（ロード．０．５５mmol/g、５．００ｇ、２．７５mmol）及びＤＭＦ中２０％ピペリジン（５０．０mL）を投入した。次に、混合物を２５℃で１０分間撹拌した。溶媒を排出させた後、別のＤＭＦ中２０％ピペリジン（５０．０mL）を加え、混合物を２５℃で３０分間撹拌した。溶媒を排出させた後、得られた樹脂をＤＭＦ（８×５０．０mL）で洗浄して、ｄｅＦｍｏｃ−ＰＬ−Ｒｉｎｋ樹脂を生成した。
【００６６】
ｂ）Ｆｍｏｃ−ＡＡ−誘導体とのカップリング：
ｄｅＦｍｏｃ−ＰＬ−Ｒｉｎｋ樹脂に、０．３５M ＨＯＢｔ／ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの溶液（３２．０mL、１１．２mmol）、ＤＭＦ中０．９２M ＤＩＣ（１６．０mL、１４．７mmol）及びＤＭＦ中１０％ピリジン（１６．０mL、１９．８mmol）を加え、２５℃で３時間撹拌した。溶媒を排出させた後、得られた樹脂をＤＭＦ（４×５０．０mL）で洗浄して、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−樹脂を生成した。
【００６７】
Ｆｍｏｃ開裂及びＦｍｏｃ−ＡＡ−誘導体カップリング工程を、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの代わりに以下のＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体：Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを用いて８回繰り返して、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂を生成した。サンプルを樹脂から開裂して（以下参照）、正確な質量を確認した。ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  １２１１．８  （Ｍ＋Ｈ）＋
【００６８】
ｃ）Ｆｍｏｃ開裂：
末端ＧｌｙのＦｍｏｃ開裂を、上述したとおりに実施して、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂を生成した。サンプルを樹脂から開裂して（以下のビヒクル）、正確な質量を確認した。ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  ９８９．８  （Ｍ＋Ｈ）＋
【００６９】
ｄ）アリル開裂：
Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂に、ＣＨ２Ｃｌ２（５０．０mL）中のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（１５９mg、０．１３８mmol）及びフェニルシラン（３．４０mL、２７．６mmol）の溶液を加えて、２５℃で３０分間撹拌した。溶媒を排出させた後、この工程をもう１回繰り返して、ＤＭＦ（２×５０．０mL）で洗浄した。ＤＭＦ（５０．０mL）中のジチオカルバミン酸ナトリウム（２５０mg）及びＤＩＰＥＡ（０．２５０mL）の溶液を加え、混合物を２５℃で１５分間撹拌した。溶媒を排出させた後、この工程をもう１回繰り返した。溶媒を排出させた後、得られた樹脂をＤＭＦ（４×５０．０mL）で洗浄して、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂を生成した。サンプルを樹脂から開裂して（以下のビヒクル）、正確な質量を確認した。ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  ９４９．７  （Ｍ＋Ｈ）＋
【００７０】
ｅ）樹脂上での環化：
ＮＥＰ（６０．０mL）中のＰｙＢＯＰ（２．３６ｇ、４．５４mmol）及びＤＩＰＥＡ（２．４０mL、１３．８mmol）の溶液をＨ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂に加え、混合物を２５℃で４時間撹拌した。溶媒を排出させた後、得られた樹脂をＤＭＦ（４×５０．０mL）、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５０．０mL）及びＭｅＯＨ（３×５０．０mL）で洗浄した。樹脂を、１０mbar、２５℃で１日乾燥させて、ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂（８．６０ｇ）を与えた。
【００７１】
ｆ）全体の脱保護及び樹脂開裂：
ＴＦＡ（４０．０mL）及び水（１０．０mL）中のトリイソプロピルシラン（２．８０mL）の予冷（１０〜１５℃）溶液に、ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂（８．６０ｇ）を加えて、２５℃で３時間撹拌した。樹脂を濾別し、濾液を真空下で濃縮した。残留物をＭＴＢＥ（１００mL）に加え、混合物を２５℃で１５時間撹拌した。混合物を濾過して、ケーキをＭＴＢＥ（５０．０mL）で洗浄し、続いて乾燥させて、粗ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２  １（２．０１ｇ、アッセイ１１．３wt%、全収率９％）を白色の固体として純度１５．９％で与えた（ＨＰＬＣ面積％、ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）。１／二量体の比は、８．５であった。
【００７２】
【表１】
0006744293.tif 000014
【００７３】
実施例１（固相環化）
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（１）
【００７４】
【化１３】
0006744293.tif 000015
【００７５】
ａ）Ｆｍｏｃ開裂：
ＳＰＰＳリアクター（１００mL；ペプチドシンセサイザーCS136XT ex CSBio）に、ＰＬ−Ｒｉｎｋ樹脂（ロード．０．５５mmol/g、５．００ｇ、２．７５mmol）及びＤＭＦ中２０％ピペリジン（５０．０mL）を投入した。次に、混合物を２５℃で１０分間撹拌した。溶媒を排出させた後、別のＤＭＦ中２０％ピペリジン（５０．０mL）を加え、混合物を２５℃で３０分間撹拌した。溶媒を排出させた後、得られた樹脂をＤＭＦ（８×５０．０mL）で洗浄して、ｄｅＦｍｏｃ−ＰＬ−Ｒｉｎｋ樹脂を生成した。
【００７６】
ｂ）Ｆｍｏｃ−ＡＡ−誘導体とのカップリング：
ｄｅＦｍｏｃ−ＰＬ−Ｒｉｎｋ樹脂に、０．３５M ＨＯＢｔ／ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの溶液（３２．０mL、１１．２mmol）、ＤＭＦ中０．９２M ＤＩＣ（１６．０mL、１４．７mmol）及びＤＭＦ中１０％ピリジン（１６．０mL、１９．８mmol）を加え、２５℃で３時間撹拌した。溶媒を排出させた後、得られた樹脂をＤＭＦ（４×５０．０mL）で洗浄して、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−樹脂を生成した。
【００７７】
Ｆｍｏｃ開裂及びＦｍｏｃ−ＡＡ−誘導体カップリング工程を、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの代わりに以下のＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体：Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを用いて８回繰り返して、Ｘ（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂）を生成した。サンプルを樹脂から開裂して（以下参照）、正確な質量を確認した。ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  １２１１．８  （Ｍ＋Ｈ）＋
【００７８】
ｃ）アリル開裂：
Ｘ（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂）に、ＣＨ２Ｃｌ２（５０．０mL）中のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（１５９mg、０．１３８mmol）及びフェニルシラン（３．４０mL、２７．６mmol）の溶液を加えて、２５℃で３０分間撹拌した。溶媒を排出させた後、この工程をもう１回繰り返して、ＤＭＦ（２×５０．０mL）で洗浄した。ＤＭＦ（５０．０mL）中のジチオカルバミン酸ナトリウム（２５０mg）及びＤＩＰＥＡ（０．２５０mL）の溶液を加え、混合物を２５℃で１５分間撹拌した。溶媒を排出させた後、この工程をもう１回繰り返した。溶媒を排出させた後、得られた樹脂をＤＭＦ（４×５０．０mL）で洗浄して、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂を生成した。サンプルを樹脂から開裂して（以下のビヒクル）、正確な質量を確認した。ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  １１７１．８  （Ｍ＋Ｈ）＋
【００７９】
ｄ）Ｆｍｏｃ開裂：
末端ＧｌｙのＦｍｏｃ開裂を、上述したとおりに実施して、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂を生成した。サンプルを樹脂から開裂して（以下のビヒクル）、正確な質量を確認した。ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  ９４９．７  （Ｍ＋Ｈ）＋
【００８０】
ｅ）樹脂上での環化：
ＮＥＰ（６０．０mL）中のＰｙＢＯＰ（２．３６ｇ、４．５４mmol）及びＤＩＰＥＡ（２．４０mL、１３．８mmol）の溶液を（Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂に加え、混合物を２５℃で４時間撹拌した。溶媒を排出させた後、得られた樹脂をＤＭＦ（４×５０．０mL）、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５０．０mL）及びＭｅＯＨ（３×５０．０mL）で洗浄した。樹脂を、１０mbar、２５℃で１日乾燥させて、ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂（９．１７ｇ）を与えた。
【００８１】
ｆ）全体の脱保護及び樹脂開裂：
ＴＦＡ（４０．０mL）及び水（１０．０mL）中のトリイソプロピルシラン（２．５０mL）の予冷（１０〜１５℃）溶液に、ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂（９．１７ｇ）を加えて、２５℃で３時間撹拌した。樹脂を濾別し、濾液を真空下で濃縮した。残留物をＭＴＢＥ（１００mL）に加え、混合物を２５℃で１５時間撹拌した。混合物を濾過して、ケーキをＭＴＢＥ（５０．０mL）で洗浄し、続いて乾燥させて、粗ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２  １（２．３９ｇ、アッセイ４０．９wt%、全収率３８％）を白色の固体として純度６２．７％で与えた（ＨＰＬＣ面積％、ＨＰＬＣ法：Aquity UPLC BEH130 C18 カラム、１５０×２．１mm；移動相、Ａ：水中０．０５％ＴＦＡ、Ｂ：ＭｅＣＮ中０．０５％ＴＦＡ；流速：０．１３mL／分を４０分間、０．２５mL／分を１５分間；アイソクラティック９０／１０（Ａ／Ｂ）を３分間、９０／１０（Ａ／Ｂ）〜６２／３８（Ａ／Ｂ）のグラジエントを３７分以内、６２／３８（Ａ／Ｂ）〜１０／９０（Ａ／Ｂ）のグラジエントを５分以内、アイソクラティック１０／９０（Ａ／Ｂ）を１０分間。Temp：６０℃、ＵＶ：２１４nm）。１／二量体の比は、２１．９であった。
【００８２】
保持時間：２３．２分（ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２）、１８．８分（Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２）、２６．１分（二量体）
【００８３】
精製及び単離：
粗ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を水−ＭｅＣＮ（１０−１）に溶解し、濾過した。濾液を同量の水で希釈した。溶液を、Kromasil-C18-100 カラム上での分取ＨＰＬＣによって精製した（２５０×８０mm、粒径１０um、Ａ：０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ：ＭｅＣＮ；流速：３００mL／分；アイソクラティック９５／５（Ａ／Ｂ）を２分間、９５／５（Ａ／Ｂ）〜８０／２０（Ａ／Ｂ）のグラジエントを１分以内、８０／２０（Ａ／Ｂ）〜７７／２３（Ａ／Ｂ）のグラジエントを１７分以内、７７／２３（Ａ／Ｂ）〜１０／９０（Ａ／Ｂ）のグラジエントを１分以内、アイソクラティック１０／９０（Ａ／Ｂ）を７分間、１０／９０（Ａ／Ｂ）〜９５／５（Ａ／Ｂ）のグラジエントを１分以内、アイソクラティック９５／５（Ａ／Ｂ）６分間。フラクションを回収し、凍結乾燥させて、純粋なｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２  １（０．７０８ｇ）を白色の粉末として純度９９．２％で生成した（ＨＰＬＣ面積％、ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）。純粋な１において二量体は観察されなかった。ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  ９３１．０  （Ｍ＋Ｈ）＋
【００８４】
実施例２（溶液相環化）
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（１）
【００８５】
【化１４】
0006744293.tif 000016
【００８６】
ａ）Ｆｍｏｃ開裂：
ＳＰＰＳリアクター（１００mL）に、ＰＬ−Ｒｉｎｋ樹脂（ロード．０．５５mmol/g、５．００ｇ、２．７５mmol）及びＤＭＦ中２０％ピペリジン（５０mL）を投入した。次に、混合物を２５℃で１０分間撹拌した。溶媒を排出させた後、別のＤＭＦ中２０％ピペリジン（５０．０mL）を加え、混合物を２５℃で３０分間撹拌した。溶媒を排出させた後、得られた樹脂をＤＭＦ（８×５０．０mL）で洗浄して、ｄｅＦｍｏｃ−ＰＬ−Ｒｉｎｋ−樹脂を生成した。
【００８７】
ｂ）Ｆｍｏｃ−ＡＡ誘導体のカップリング：
ｄｅＦｍｏｃ−ＰＬ−Ｒｉｎｋ樹脂に、０．３５M ＨＯＢｔ／ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの溶液（３２．０mL、１１．２mmol）、ＤＭＦ中０．９２M ＤＩＣ（１６．０mL、１４．７mmol）及びＤＭＦ中１０％ピリジン（１６．０mL、１９．８mmol）を加え、２５℃で３時間撹拌した。溶媒を排出させた後、得られた樹脂をＤＭＦ（４×５０．０mL）で洗浄して、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−樹脂を生成した。
【００８８】
Ｆｍｏｃ開裂及びＦｍｏｃ−ＡＡ−誘導体カップリング工程を、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの代わりに以下のＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体：Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを用いて８回繰り返して、Ｘ（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂）を生成した。サンプルを樹脂から開裂して（以下参照）、正確な質量を確認した。ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  １１７１．８  （Ｍ＋Ｈ）＋
【００８９】
ｃ）Ｆｍｏｃ開裂：
末端ＧｌｙのＦｍｏｃ開裂を上述したとおりに実施した。溶媒を排出させた後、得られた樹脂をＤＭＦ（８×５０．０mL）、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５０．０mL）及びＭｅＯＨ（３×５０．０mL）で洗浄した。樹脂を、１０mbar、２５℃で１日乾燥させて、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂（１０．８ｇ）を与えた。
【００９０】
ｄ）全体の脱保護及び樹脂開裂：
ＴＦＡ（４０．０mL）及び水（１０．０mL）中のトリイソプロピルシラン（２．５０mL）の予冷（１０〜１５℃）溶液にＨ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂（１０．８ｇ）を加えて、２５℃で３時間撹拌した。樹脂を濾別し、濾液を真空下で濃縮した。残留物をＭｅＴＨＦ（１００mL）に加え、混合物を２５℃で１５時間撹拌した。混合物を濾過して、ケーキをＭｅＴＨＦ（５０．０mL）で洗浄し、続いて乾燥させて、ＬＰ１（Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２）（３．６０ｇ）を白色の固体として純度６７．４％で与えた（ＨＰＬＣ面積％、ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）。ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  ９４９．７  （Ｍ＋Ｈ）＋
【００９１】
ｅ）溶液中での環化：
ＮＥＰ（６０．０mL）中のＬＰ１（Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２）（３．５０ｇ）及びＤＩＰＥＡ（３．１３mL、１８．４mmol）の混合物にＰｙＢＯＰ（１．９２ｇ、３．６９mmol）を加え、２５℃で１時間撹拌した。完全な変換のために、別のＰｙＢＯＰ（０．９６０ｇ、１．８４mmol）を加え、同温度で１時間撹拌した。得られた混合物をＭＴＢＥ／ＭｅＴＨＦ溶液（４００mL／１００mL）の溶液に加え、２５℃で１５時間撹拌した。混合物を濾過して、ケーキをＭＴＢＥ（５０．０mL）で洗浄し、続いて乾燥させて、粗ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２  １（４．３０ｇ、アッセイ１８．０wt%、全収率３１％）を白色の固体として純度５６．６％で与えた（ＨＰＬＣ面積％、ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）。１／二量体の比は、１５．１であった。
【００９２】
ｆ）精製及び単離：
粗ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を水−ＭｅＣＮ（１０−１）に溶解し、不溶解物を濾別した。濾液を同量の水で希釈した。溶液を、Kromasil-C18-100 カラム上での分取ＨＰＬＣによって精製した（２５０×８０mm、粒径１０um、Ａ：０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ：ＭｅＣＮ；流速：３００mL／分；アイソクラティック９５／５（Ａ／Ｂ）を２分間、９５／５（Ａ／Ｂ）〜８０／２０（Ａ／Ｂ）のグラジエントを１分以内、８０／２０（Ａ／Ｂ）〜７７／２３（Ａ／Ｂ）のグラジエントを１７分以内、７７／２３（Ａ／Ｂ）〜１０／９０（Ａ／Ｂ）のグラジエントを１分以内、アイソクラティック１０／９０（Ａ／Ｂ）を７分間、１０／９０（Ａ／Ｂ）〜９５／５（Ａ／Ｂ）のグラジエントを１分以内、アイソクラティック９５／５（Ａ／Ｂ）を６分間。フラクションを回収し、凍結乾燥させて、純粋なｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２  １（４４４mg）を白色の粉末として純度９９．７％で生成した（ＨＰＬＣ面積％、ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）。純粋な１中に二量体は存在しなかった。ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  ９３１．０
【００９３】
実施例３ａ−ｇ（カップリング試薬の最適化）：
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（１）
実施例２と同様の方法で、表２に列挙したとおりのカップリング試薬を用いて環化を実施した。
【００９４】
【表２】
0006744293.tif 000017
【００９５】
実施例４ａ−ｇ（溶媒の最適化）：
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（１）
実施例２と同様の方法で、表３に列挙したとおりの溶媒を用いて環化を実施した。
【００９６】
【表３】
0006744293.tif 000018
【００９７】
実施例５ａ−ｇ（塩基の最適化）：
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（１）
実施例２と同様の方法で、表４に列挙したとおりの塩基を用いて環化を実施した。
【００９８】
【表４】
0006744293.tif 000019
【００９９】
実施例６ａ−ｄ（樹脂ローディング／アミノ酸当量の比較）：
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（２）
【０１００】
【化１５】
0006744293.tif 000020
【０１０１】
実施例２と同様の方法で、Ｆｍｏｃ−ＡＡ−酸：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを用いて純粋な環状ペプチド２を合成した。
合成スケール：９．６０mmol（ロード：実施例６ａ−ｄを参照；樹脂３０．０ｇ）
収率：４０％（精製後）
純度：９８．２％（ＨＰＬＣ面積％、ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）
保持時間：２９．８分（ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）
ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  ９７１．５  （Ｍ＋Ｈ）＋
【０１０２】
直鎖ペプチド中間体ＬＰ２（Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２）の純度及び収率を、表５に列挙するとおりの樹脂ローディング／アミノ酸当量を用いて決定した。
【０１０３】
【表５】
0006744293.tif 000021
【０１０４】
実施例７
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（２）
実施例７を、塩基としてＮ−メチルモルホリンを用いて環化を実施した以外は実施例２と同様の方法で実施した。
【０１０５】
ａ）Ｆｍｏｃ開裂：
ＳＰＰＳリアクター（２５０mL；ペプチドシンセサイザーCS536XT ex CSBio）に、ＰＬ−Ｒｉｎｋ樹脂（ロード．０．５５mmol/g、１０．０ｇ、５．５０mmol）及びＤＭＦ中２０％ピペリジン（１００mL）を投入した。次に、混合物を２５℃で１０分間撹拌した。溶媒を排出させた後、別のＤＭＦ中２０％ピペリジン（１００mL）を加え、混合物を２５℃で３０分間撹拌した。溶媒を排出させた後、得られた樹脂を（８×１００mL）ＤＭＦで洗浄して、ｄｅＦｍｏｃ−ＰＬ−Ｒｉｎｋ−樹脂を生成した。
【０１０６】
ｂ）Ｆｍｏｃ−ＡＡ誘導体のカップリング：
ｄｅＦｍｏｃ−ＰＬ−Ｒｉｎｋ樹脂に、０．３５M ＨＯＢｔ／ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの溶液（６４．０mL、２２．４mmol）、ＤＭＦ中０．９２M ＤＩＣ（３２．０mL、２９．４mmol）及びＤＭＦ中１０％ピリジン（３２．０mL、３９．６mmol）を加え、２５℃で３時間撹拌した。溶媒を排出させた後、得られた樹脂をＤＭＦ（４×１００mL）で洗浄して、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−樹脂を生成した。
【０１０７】
Ｆｍｏｃ開裂及びＦｍｏｃ−ＡＡ−誘導体カップリング工程を、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの代わりに以下のＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体：Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを用いて８回繰り返して、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂を生成した。サンプルを樹脂から開裂して（以下のビヒクル）、正確な質量を確認した。ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  １２１１．１  （Ｍ＋Ｈ）＋
【０１０８】
ｃ）Ｆｍｏｃ開裂：
末端ＧｌｙのＦｍｏｃ開裂を上述したとおりに実施した。溶媒を排出させた後、得られた樹脂をＤＭＦ（８×１００mL）、ＣＨ２Ｃｌ２（３×１００mL）及びＭｅＯＨ（３×１００mL）で洗浄した。樹脂を、１０mbar下、２５℃で１日乾燥させて、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂（１８．６ｇ）を与えた。サンプルを樹脂から開裂して（以下のビヒクル）、正確な質量を確認した。ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  ９８９．７  （Ｍ＋Ｈ）＋
【０１０９】
ｄ）全体の脱保護及び樹脂開裂：
ＴＦＡ（４８．０mL）及び水（１２．０mL）中のトリイソプロピルシラン（３．００mL）の予冷（１０〜１５℃）溶液に、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−樹脂（６．００ｇ）を加えて、２５℃で３時間撹拌した。樹脂を濾別し、濾液を真空下で濃縮した。残留物をＭｅＴＨＦ（１２０mL）に加え、混合物を２５℃で１５時間撹拌した。混合物を濾過して、ケーキをＭｅＴＨＦ（６０．０mL）で洗浄し、続いて乾燥させて、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２  ＬＰ２（１．８４ｇ）を白色の固体として純度８７．３％で与えた（ＨＰＬＣ面積％、ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）。保持時間：２３．９分（ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）；  ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  ９８９．７  （Ｍ＋Ｈ）＋
【０１１０】
溶液中での環化：
Ｎ−エチルピロリドン（３．６０mL）中のＨ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２  ＬＰ２（３００mg）及びＮＭＭ（０．１６７mL、１．５２mmol）の混合物にＰｙＢＯＰ（２３７mg、０．４５５mmol）を加え、２５℃で１時間撹拌した。完全な変換のために、別のＰｙＢＯＰ（４７．４mg、０．０９１０mmol）を加え、同温度で１時間撹拌した。得られた混合物をＭＴＢＥ（２４．０mL）及びＭｅＴＨＦ（６．００mL）の溶液に加え、次に、２５℃で１５時間撹拌した。混合物を濾過して、ケーキをＭＴＢＥ（１５．０mL）で洗浄した。ケーキを水／ＭｅＣＮ（１０／１、３．３mL）に溶解し、不溶解物を濾別した。濾液を凍結乾燥させて、粗ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２  ２（３１３mg、アッセイ５４．０wt%、全収率６０％）を白色の固体として純度７１．４％で与えた（ＨＰＬＣ面積％、ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）。ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  ９７１．５  （Ｍ＋Ｈ）＋
【０１１１】
実施例８
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｓａｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（３）：
【化１６】
0006744293.tif 000022
実施例２と同様の方法で、Ｆｍｏｃ−ＡＡ−酸：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを用いて純粋な環状ペプチド３を合成した。
合成スケール：９．６０mmol（ロード．０．３２mmol/g、樹脂３０．０ｇ）
収率：４１％（精製後）
純度：９８．９％（ＨＰＬＣ面積％、ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）
保持時間：２７．６分（ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）
ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  ９４５．５  （Ｍ＋Ｈ）＋
【０１１２】
実施例９
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−Ｓａｒ−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（４）
【化１７】
0006744293.tif 000023
実施例２と同様の方法で、Ｆｍｏｃ−ＡＡ−酸：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを用いて純粋な環状ペプチド４を合成した。
合成スケール：９．６０mmol（ロード．０．３２mmol/g、樹脂３０．０ｇ）
収率：４１％（精製後）
純度：９９．２％（ＨＰＬＣ面積％、ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）
保持時間：２５．９分（ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）
ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  ９４５．５  （Ｍ＋Ｈ）＋
【０１１３】
実施例１０
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−trans−４−フルオロ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（５）
【化１８】
0006744293.tif 000024
実施例２と同様の方法で、Ｆｍｏｃ−ＡＡ−酸：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−trans−４−フルオロ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを用いて純粋な環状ペプチド５を合成した。
合成スケール：９．６０mmol（ロード．０．３２mmol/g、樹脂３０．０ｇ）
収率：３９％（精製後）
純度：純度９８．８％（ＨＰＬＣ面積％、ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）
保持時間：２５．７分（ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）
ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  ９８８．５  （Ｍ＋Ｈ）＋
【０１１４】
実施例１１
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−trans−４−ヒドロキシ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（６）
【化１９】
0006744293.tif 000025
実施例２と同様の方法で、Ｆｍｏｃ−ＡＡ−酸：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−trans−４−tert−ブトキシ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを用いて純粋な環状ペプチド６を合成した。
合成スケール：９．６０mmol（ロード．０．３２mmol/g、樹脂３０．０ｇ）
収率：２２％（精製後）
純度：純度９８．７％（ＨＰＬＣ面積％、ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）
保持時間：２３．３分（ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）
ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  ９８７．５  （Ｍ＋Ｈ）＋
【０１１５】
実施例１２（固相環化）
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−trans−４−フルオロ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（５）
【化２０】
0006744293.tif 000026
CSBio社のCS536XTペプチドシンセサイザーを用いた実施例１と同様の方法で、Ｆｍｏｃ−ＡＡ−酸：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−trans−４−フルオロ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを用いて純粋な環状ペプチド５を合成した。合成全体を通して、Ｆｍｏｃ開裂のために、ＤＭＦ中２０％ピペリジンの代わりにＤＭＦ中１０％４−メチル−ピペリジンを使用し、直線状配列の全てのアミノ酸カップリングを、ＨＯＢｔの代わりにＨＯＰｙを用いて実施した。樹脂上での最後のＰｙＢＯＰにより促進される環化工程において、塩基としてＤＩＰＥＡの代わりに４−メチルモルホリンを使用し、溶媒としてＮＥＰの代わりにＤＭＦ中で環化を実行した。粗ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−trans−４−フルオロ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２の分取ＨＰＬＣ精製をKromasil-C18-100 カラム上で実施した（２５０×４．６mm、粒径１０um、Ａ：２０mM ＮＨ４ＯＡｃ  ｐＨ５、Ｂ：ＭｅＣＮ；流速：１mL／分；アイソクラティック９０／１０（Ａ／Ｂ）を１分間、９０／１０（Ａ／Ｂ）〜８０／２０（Ａ／Ｂ）のグラジエントを１分以内、８０／２０（Ａ／Ｂ）〜７５／２５（Ａ／Ｂ）のグラジエントを１０分以内、７５／２５（Ａ／Ｂ）〜１０／９０（Ａ／Ｂ）のグラジエントを１分以内、１０／９０（Ａ／Ｂ）からのグラジエントを５分間、１０／９０（Ａ／Ｂ）〜９０／１０（Ａ／Ｂ）のグラジエントを０．１分以内、アイソクラティック９０／１０（Ａ／Ｂ）を６．９分間。回収したフラクションを水で希釈し（１：１）、調整済（水／ＡＣＮ  ９０／１０）のKromasil C18-100-10 カラム（２５０×４．６mm）上でのローディングによって濃縮／脱塩し、その後、水／ＡＣＮ（１：１）で溶出させた。回収したフラクション（ＵＶ２８０nm、閾値１０００mAu）を回転蒸発させてＡＣＮを除去し、その後、凍結乾燥させて、純粋なペプチドを白色の凍結乾燥生成物として生成した。
合成スケール：５．５０mmol（ローディング  ０．５５mmol/g、樹脂１０．０ｇ）
収率：３４％（精製後）
純度：純度９８．８％（ＨＰＬＣ面積％、ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）
保持時間：２５．３分（ＨＰＬＣ法は実施例１を参照）
ＭＳ  （ｍ／ｚ）：  ９８９．５  （Ｍ＋Ｈ）＋
【０１１６】
実施例１３（固相環化）
ｃ［Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ］−trans−４−フルオロ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（５）
【化２１】
0006744293.tif 000027
実施例１３と同様の方法で、樹脂上での直鎖ペプチドの合成全体を通してＨＯＰｙの代わりにＨＯＢｔを用いて純粋な環状ペプチド５を合成した。
合成スケール：５．５０mmol（ローディング  ０．５５mmol/g、樹脂１０．０ｇ）
収率：２５％（精製後）