(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾された遺伝的ディスプレイ基質の遺伝子コーディングライブラリーに対して、修飾の遺伝子コーディングを行う方法であって、
（ａ）複数のライブラリーを製造する工程であって、各ライブラリーは可変な一連のペプチドをディスプレイし、各ライブラリーはサイレント遺伝子バーコードのシークエンシングによって同定可能であり、各バーコードは固有であるが、全バーコードが同一転写産物を産生することを特徴とする工程と、
（ｂ）各ライブラリーを異なる化学修飾または酵素修飾で修飾する工程と、
（ｃ）複数のライブラリーを含む混合ライブラリーを創出する工程であって、ペプチドは可変領域のシークエンシングによって同定可能であり、化学修飾または酵素修飾はサイレント遺伝子バーコードのシークエンシングによって同定可能であることを特徴とする工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記可変な一連のペプチドが、ランダム変異誘発により生成された、異なる化学的組成のペプチド配列のフォーカストサブセットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記修飾が、ディスプレイペプチドの任意の位置への異なる小分子の導入を含む化学修飾である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記修飾が、部位特異的化学的コンジュゲーションを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記小分子が、炭水化物、ビオチン、またはスルホンアミドである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記化学修飾が、Ｎ末端セリンでのオキシムの形成、またはシステインのアルキル化である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記化学修飾が、１種もしくは複数の架橋を使ってペプチドを大環状分子に変換するための、１種もしくは複数のリンカー、１種もしくは複数の架橋剤または１種もしくは複数の化学的ステープルを挿入する化学反応である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記化学修飾に使用される小分子が、ジアステレオマーまたはエナンチオマーである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記修飾が前記一連のペプチドの酵素修飾である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記基質が、ファージ、ｍＲＮＡ、リボソーム、細菌、または酵母である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記同一転写産物がペプチドリンカーである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドリンカーがＳｅｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含み、前記Ｘはいかなるアミノ酸でもよい、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子バーコードが互いのハミング距離（Ｈｄ）＝１以内に存在しない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子バーコードの互いのハミング距離（Ｈｄ）は２または３である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
複数のライブラリーを含む混合ペプチドディスプレイライブラリーであって、各ライブラリーは可変な一連のペプチドをディスプレイし、各ライブラリーはサイレント遺伝子バーコードを含み、各バーコードは固有であるが、全バーコードが同一転写産物を産生し、各ライブラリーは異なる化学修飾または酵素修飾で修飾されている、混合ペプチドディスプレイライブラリー。
【請求項１６】
薬剤標的を特定する方法であって、
（ａ）請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法により遺伝的にコードされた化学修飾または酵素修飾ペプチドライブラリーを作製するか、あるいは請求項１５に記載の混合ペプチドディスプレイライブラリーを提供し、
（ｂ）分子で前記ライブラリーをスクリーニングし、前記遺伝子バーコードおよび前記可変領域のシークエンシングにより化学修飾または酵素修飾されたペプチドを特定すること、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、組換えタンパク質技術の分野に関する。より具体的には、本出願は、遺伝的にコードされた化学修飾ペプチドライブラリーにおける化学修飾の遺伝子コーディング方法を記載する。
【背景技術】
【０００２】
小分子のライブラリーの生成および目的標的に特異的に結合する分子の選択は、薬剤の発見にとって重要である。各ライブラリーメンバーがＤＮＡまたはＲＮＡなどの情報テンプレートに連結されている遺伝的にコードされたライブラリーの作製は、大きな化学ライブラリーを、個々のライブラリーメンバーを別々の溶液および反応容器中に分離することなく、処理することを可能とする。遺伝的にコードされた分子の混合物から標的分子を選択し、その情報テンプレートを使って、選択した目的の分子を増幅することができる。
【０００３】
ファージディスプレイは、遺伝的にコードされたライブラリーの一例である。（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。ファージディスプレイは、タンパク質抗原、特に目的のヒトタンパク質の解析、ディスプレイおよび産生に使用される、よく知られた技術である。ファージディスプレイは、細菌性ウイルスであるファージが、その表面上に、ヒト抗体を含む種々のペプチドまたはタンパク質を露出または「ディスプレイ」するプロセスである。遺伝子操作により、目的のペプチドまたはタンパク質をファージ細胞表面タンパク質分子（通常は、遺伝子ＩＩＩタンパク質、ｇ３ｐ）に個々に結合させる。このようなファージ集団（ファージライブラリー）では、それぞれのファージが異なるペプチドまたはタンパク質−ｇ３ｐ融合体用の遺伝子を保持し、その融合体をファージ表面上に露出する。種々の選択手順により、目的の特異的標的分子に対する結合物質を「ディスプレイ」する「ファージ」を特定し、単離できる。これらの結合物質には、タンパク質の新しい機能または機能の機序を判定するためのそのタンパク質の相互作用相手、抗原を認識し、結合するペプチド（例えば、診断および治療標的に使用するための）、およびタンパク質−ＤＮＡ相互作用に関与するタンパク質（例えば、新規転写因子）が含まれる。
【０００４】
ファージディスプレイ技術は、医薬品および／または診断薬の発見および開発にとって極めて有用である。ファージディスプレイでは、全ファージが固定された標的分子に結合し、固定標的分子からファージを溶出することができる。ファージは感染性のまま残るので、そのＤＮＡを細菌細胞に注入し、増幅できる。しかし、ファージディスプレイの主な制限事項は、結合段階中のファージの非特異的吸着の発生であり、このために、数ラウンドにわたる濃縮ならびにそれぞれに適合させた洗浄および溶出条件を余儀なくされる。ファージディスプレイ法は通常、ライブラリーの作製に限定され、これはＤＮＡ−ＲＮＡ−タンパク質の直接情報伝達によりコードすることができる。これらの方法は通常、２０個のみの天然アミノ酸からなる、ペプチドの直鎖状配列に限定される。
【０００５】
ＲＮＡおよびリボソームディスプレイは、当該技術分野において既知の別の技術で、この技術は、情報テンプレートに基づいて、天然で作製されたペプチドのディスプレイを可能とする。ＲＮＡに結合したペプチドライブラリーの増幅には、ライブラリーを生成または再増幅するために、インビトロ翻訳系が必要となる。このような翻訳系の生成および使用は、高価で時間がかかる可能性がある。ファージ、酵母または細菌などの自己複製種を使用することにより、適切な資源が与えられた場合には、各ライブラリーメンバーが「自然に」増幅されるので、ライブラリーの増幅が簡略化される。例えば、ファージディスプレイライブラリーの場合、細菌を含む単純な培養液に１つのファージを添加することにより、非常に低コストで、ファージの任意の大集団を産生することができる。
【０００６】
小分子の遺伝子コーディングが１９９０年代に提案され（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、このようなコード化戦略の具体化が、ＬｅｒｎｅｒおよびＪａｎｄａ（Ｓｃｒｉｐｐｓ）、Ｌｕ（Ｈａｒｖａｒｄ）ならびにＨａｒｂｕｒｙ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ）などの種々のグループで進められた。小分子のコード化がこれらのグループで進められたが、この技術は、ポリペプチドディスプレイ技術よりも著しく複雑である。さらに、コード化戦略は、合成およびプロセス中の迅速なラウンド間の繰り返しの実現の観点から極めて困難となる可能性がある。
【０００７】
小分子ディスプレイ技術の別の例は、翻訳後酵素修飾または翻訳後化学修飾（ｃＰＴＭ）を介したペプチド由来分子のコード化ディスプレイの使用によるものである。通常、これらの方法は、ペプチド上での有機合成を用いて、ペプチド誘導体を作製する。任意の有機分子のディスプレイとは異なり、ペプチド由来分子のディスプレイは、容易に利用可能な遺伝的にコードされたペプチドライブラリーをベースにして築き上げるので、一般に、簡単である。
【０００８】
ペプチドライブラリー全体は、同一の化学修飾により修飾することができる。修飾ライブラリーからの選択と、ＤＮＡのシークエンシングにより、修飾ペプチド誘導体を作製できるペプチド配列が得られる。ファージディスプレイポリペプチドライブラリーをペプチド誘導体のライブラリーに変換することを含むいくつかの方法が存在する。
【０００９】
米国特許出願公開第２０１０／０３１７５４７号（ＷｉｎｔｅｒおよびＨｅｉｎｉｓ）は、システイン残基のアルキル化によるファージディスプレイの具体的修飾について記載している。
【００１０】
米国特許出願公開第２００９／０１３７４２４号（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．）は、アジドフェニルアラニン（ＡｚＰｈｅ）上の双極子環化付加によるファージディスプレペプチドライブラリーの具体的修飾について記載している。
【００１１】
ウェスタンブロットおよび質量分析法などの生化学的なバルク法を用いて、得られた生成物の量を定量化するか、または所望の反応生成物がうまく生成したことを判断する場合が多い。このキャラクタリゼーションがない場合には、合成は、信頼性または再現性があると主張することはできない。このようなペプチド誘導体ライブラリーの合成に用いられる反応は通常、１つのファージクローンまたは１つの精製されたペプチドを使用して検証されてきた。ライブラリーの実際の合成は通常、ペプチドに最適化された条件下で、キャラクタリゼーションすることなく行われるが、このような合成の効率はわかっていない。したがって、この方法によって生成されたライブラリーの質は通常、明らかでない。これらのライブラリーからの選択は、有用な非ペプチド分子を提供することができるが、全体的なこのような選択の効率はあきらかでない。反応のキャラクタリゼーションおよび改善は、新しい化学修飾ライブラリーの開発にとって重要である。
【００１２】
米国特許出願公開第２０１３／０５００８３号（Ｄｅｒｄａ  ｅｔ  ａｌ．）は、このような修飾の定量化および効率的修飾のための新しい戦略の選択方法について記載している。
【００１３】
ｍＲＮＡまたはファージディスプレペプチドのｃＰＴＭは、ｍＲＮＡ／ファージディスプレイと類似の利点を有し、同時に、従来のリボソーム合成の場合にはコード化できないリガンドの選択を可能とすることができる。ｃＰＴＭライブラリーの選択は、急速に成長している方法であり、リード発見学術研究グループ、ベンチャー企業（Ｐｅｐｔｉｄｒｅａｍ、Ｒａ  Ｐｈａｒｍａ、Ｂｉｃｙｃｌｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）および大きな医薬品会社（例えば、Ｐｆｉｚｅｒ５）により使用されてきた。薬剤発見では、ｃＰＴＭペプチドのディスプレイは、「小分子」および「生物学的」クラスの薬剤の利点を組み合わせるタイプの薬剤の開発を促進する。サイズが小さいため、ペプチド誘導体は、小分子と類似の組織透過性を持つことができ、同時に、遺伝的選択がこれらの分子の迅速な発見および最適化を可能とする。
【００１４】
ｃＰＴＭライブラリーに関する１つの問題は、修飾の遺伝子コーディングである。線形ペプチドライブラリーを環式分子に（Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｊａｆａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、二環式分子に（Ｈｅｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、またはグリコシル化（Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）分子に変換することは可能であるが、複数の修飾を同じライブラリーに対して行うことはできない。理由は、修飾の識別情報を追跡できないからである。
【００１５】
異なる修飾を有する同一のライブラリーのスクリーニングは知られているが、通常それは、異なるライブラリーの並行修飾、それらの並行パニングおよびプロセッシング、ならびに並行シークエンシングにより行われている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｓｃｈｌｉｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。２種以上の化学修飾がひとつのライブラリー中で組み合わされる場合には、このような混合ライブラリーは分析するのが困難である．理由は、通常、修飾ファージ粒子同士を識別することができないからである。遺伝的レベルでの修飾に関する情報はなく、また、このような修飾をコードまたはデコードするための明白な、汎用戦略はない。
【００１６】
薬剤の発見のために分子を特定する効果的な方法を提供する必要性が存在する。
【００１７】
この背景情報は、出願者が考えている既知の情報を本発明に可能な限り関連づけるために提供されている。前述のいずれかの情報が本発明に対する先行技術となることを承認することを必然的に意図するものではなく、そのように解釈されるべきものでもない。
【発明の概要】
【００１８】
本発明の目的は、遺伝的にコードされた化学修飾ペプチドライブラリーにおける化学修飾の遺伝子コーディング方法を提供することである。
【００１９】
本発明の一態様では、遺伝的にコードされた化学修飾ペプチドライブラリーの合成方法が提供され、該方法は、１種または複数の実質的に類似のペプチドリンカーをコードする第１の遺伝子配列のセットを、基質の複数の独立したベクター中に挿入すること；一連の可変ペプチドをコードする第２の遺伝子配列のセットを、それぞれのベクターに挿入すること；実質的に類似のリンカーおよび可変ペプチドを含む翻訳産物が合成されるように第１および第２セットの遺伝子配列を発現させ、増幅すること；修飾により一連の可変ペプチドを修飾すること；および一連の修飾可変ペプチドを組み合わせて、修飾が遺伝的にコードされるライブラリーを作製することを含む。
【００２０】
一実施形態では、第１の遺伝子配列のセットは、化学的に類似のまたは同一のアミノ酸を含むペプチド配列をコードするが、その第１の遺伝子配列のセットは、異なるヌクレオチドコドンによりコードされる。
【００２１】
一実施形態では、第２の遺伝子配列のセットは、異なる化学的組成のランダムペプチドライブラリーをコードするランダム遺伝的ライブラリーを含む。別の実施形態では、第２の遺伝子配列のセットは、例えば、ランダム変異誘発により生成されたものなどの、異なる化学的組成のペプチド配列のフォーカストサブセットをコードするフォーカスト遺伝子ライブラリーを含む。第２の遺伝子配列のセットは、炭水化物、ビオチン、スルホンアミド、および既知の生物活性を有するその他の小分子を含む小分子などの分子の化学構造をコードしてよい。サイレントバーコーディングによりコードされる化学修飾物質または架橋剤として使用される小分子は、ジアステレオマーまたはエナンチオマーである。
【００２２】
修飾は、一連のペプチドの化学修飾でも、または酵素修飾であってもよい。一実施形態では、化学修飾は、部位特異的化学的コンジュゲーション技術を使った、ディスプレイペプチドの任意の位置への異なる小分子の導入である。例えば、化学修飾は、Ｎ末端セリンでのオキシムの形成、システインのアルキル化、またはペプチドまたはタンパク質を特定の部位で修飾する任意の好適な方法とすることができる。反応には、１種もしくは複数の架橋を使ってペプチドを大環状分子に変換するための、１種もしくは複数のリンカー、１種もしくは複数の架橋剤または１種もしくは複数の化学的「ステープル」を含んでよい。したがって、一実施形態では、第２の遺伝子配列のセットは、リンカー、架橋剤または化学的ステープルの化学構造をコードしてよい。基質は、ファージ、ｍＲＮＡ、リボソーム、細菌、酵母または当該技術分野において既知の任意の他の遺伝的ディスプレイ技術とすることができる。
【００２３】
別の態様では、遺伝的にコードされた化学修飾ペプチドライブラリーを選択する方法が提供され、該方法は、１種または複数の実質的に類似のペプチドリンカーをコードする第１の遺伝子配列のセットを、基質の複数の独立したベクター中に挿入すること；一連の可変ペプチドをコードする第２の遺伝子配列のセットを、それぞれのベクターに挿入すること；１種または複数のペプチドライブラリーが合成されるように第１および第２セットの遺伝子配列を基質上に別々に発現させること；１種または複数のペプチドライブラリーそれぞれを別々に修飾すること；修飾ペプチドライブラリーを一緒にプールし、化学修飾が遺伝的にコードされたライブラリーを作製すること；および化学修飾ペプチドライブラリーをスクリーニングして、所望の化学修飾を有するペプチドを選択することを含む。
【００２４】
別の態様では、薬剤標的を特定する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載のように、遺伝的にコードされた化学修飾ペプチドライブラリーを調製することおよび分子でライブラリーをスクリーニングし、ペプチドリンカーをコードする配列および可変ペプチドをコードする配列のシークエンシングにより、化学修飾ペプチドを特定することを含む。
【００２５】
本出願の別の態様では、遺伝的にコードされた化学修飾ペプチドライブラリーの合成方法が提供され、該方法は、翻訳時に遺伝子配列が同一のまたは密接に関係したペプチド配列（「リンカー」）を産生するように、ペプチドリンカーをコードする重複する遺伝子配列のセットを、基質の複数の独立したベクター中に挿入すること；一連の多様なペプチド（「ライブラリー」）が翻訳時に発現されるように、遺伝的に多様なインサートをコードする第２の遺伝子配列のセットを、それぞれのベクターに挿入すること；翻訳産物が非可変リンカーを含み、可変ペプチドライブラリーが合成されるように、第１および第２セットの遺伝子配列を発現させ、増幅すること；および別々に修飾することによりそれぞれのペプチドライブラリーを修飾し、複数の修飾ライブラリーを組み合わせて、化学修飾が遺伝的にコードされたライブラリーを作製することを含む。
【００２６】
本出願は、同一の転写産物を導入する一連の遺伝子配列を作製することに関する。これは、本明細書において「サイレントバーコード」と呼ばれる。遺伝コードの重複性およびアミノ酸のトリヌクレオチドコード化が原因となり、多数のこのような配列を作製することができる。例えば、グリシン（Ｇｌｙ）は、４つの異なるコドン：ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、およびＧＧＡによりコードでき、（Ｇｌｙ）ｎ配列は、４ｎ個のコドンの組み合わせによりコードでき、ｎは、配列中のアミノ酸の数である。
【００２７】
本出願は、それらの化学的組成は同じであるが、「サイレントバーコード」の存在のために、遺伝子のシークエンシングにより区別できる、化学修飾ファージライブラリーを使用する。
【００２８】
異なる「サイレントバーコード」を保持する異なるファージが別々に産生され、異なる化学修飾により修飾される。これらのライブラリーを一緒にすることにより、ペプチド配列が可変領域のシークエンシングにより追跡でき、修飾が「サイレントバーコード」のシークエンシングにより追跡できる混合ライブラリーが生成される。
【００２９】
「サイレントバーコード」の位置は変えることができるが、ペプチドライブラリーをコードする可変遺伝領域の近傍にそれを配置するのが都合がよい。この近接により、その後のシークエンシングによる識別が容易になる。
【００３０】
サイレントバーコードは、少数（１００個未満）の修飾のコード化に特に実用的である。これは、修飾ペプチド選択に特に有利である。例えば、タンパク質上に２０〜５０個の既知の構造的に多様な天然のＰＴＭが存在する。この少数のＰＴＭが、高等生物中のタンパク質の構造的および機能的多様性を大きく高める。同様に、ｃＰＴＭペプチドのディスプレイでは、各修飾により、十億個の線形ペプチドを、十億個の環式または二環式変異体または修飾変異体に変換する。リンカーの性質を変えることにより、親ペプチド空間とは異なる変異体の選択を可能とする（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ａ〜ｂ。ポリペプチドのファージディスプレイライブラリーに特異的なコード化のためのスキームを提供する図である。ポリペプチドライブラリーのコード化およびスクリーニングに使用される任意の当技術分野で既知のプラットホームで、隣接するランダムおよびサイレントバーコードによる類似コード化を行うことができる。
【図２】サイレントバーコードの具体的例を示す図である。バーコード用の配列は、ヌクレオチドの単一の置換により１つのバーコードが別のバーコードに変換できず、したがって、エラーを導入する可能性を減らすように、選択される。換言すれば、バーコード配列同士は通常、互いのハミング距離（Ｈｄ）＝１内に存在しない。理想的には、互いのＨｄ＝２〜３の配列が選択される。
【図３】ａ〜ｈ。一致する標的に対する修飾および選択を示す図である。バーコード化ライブラリーは、予測される標的に対して選択される。選択強度は、ライブラリーを標的タンパク質に固定するリガンドの親和性に従う。
【図４】Ａ〜Ｄ。ファージディスプレイライブラリー上の化学修飾物質の存在の確認を示すグラフである。
【図５】Ａ〜Ｂ。レシオメトリック分析による選択ライブラリー中の濃縮物の分析を示す図である。
【図６】選択ライブラリー中で観察された配列選択性を示す図である。
【図７】Ａ〜Ｄ。混合修飾ライブラリー（ＭＩＸ）のパニングおよびディープシークエンシング後に特定されたペプチドのコピー数のボルケーノ分析を示すグラフである。
【図８】対応する標的に結合した代表的リガンドを示す図である。ペプチドスルホンアミドは、３０ｎｍの親和性で結合する。
【図９】炭酸脱水酵素に結合したスルホンアミドペプチド（ＳＡ−ＸＸＸＸ）の追加の生のＩＴＣデータを示す図である。
【図１０Ａ】スルホンアミド修飾ペプチドの分析データを示す図である。
【図１０Ｂ】スルホンアミド修飾ペプチドの分析データを示す図である。
【図１０Ｃ】スルホンアミド修飾ペプチドの分析データを示す図である。
【図１０Ｄ】スルホンアミド修飾ペプチドの分析データを示す図である。
【図１０Ｅ】スルホンアミド修飾ペプチドの分析データを示す図である。
【図１０Ｆ】スルホンアミド修飾ペプチドの分析データを示す図である。
【図１０Ｇ】スルホンアミド修飾ペプチドの分析データを示す図である。
【図１０Ｈ】スルホンアミド修飾ペプチドの分析データを示す図である。
【図１０Ｉ】スルホンアミド修飾ペプチドの分析データを示す図である。
【図１０Ｊ】スルホンアミド修飾ペプチドの分析データを示す図である。
【図１０Ｋ】スルホンアミド修飾ペプチドの分析データを示す図である。
【図１０Ｌ】スルホンアミド修飾ペプチドの分析データを示す図である。
【図１０Ｍ】スルホンアミド修飾ペプチドの分析データを示す図である。
【図１１】ａ〜ｂ。種々の遺伝的にコードされた単糖類を含むファージライブラリーの選択アッセイを示す図である。
【図１２】ガラクトース−３に対して、グリコペプチドの遺伝的にコードされたライブラリーから特定されたヒットの活性を示す図である。
【図１３】ガレクチン−３とラクトースとの相互作用を阻害するグリコペプチドの能力を測定する実験由来の生データを示すグラフである。
【図１４Ａ】炭水化物修飾ペプチドの分析データを示す図である。
【図１４Ｂ】炭水化物修飾ペプチドの分析データを示す図である。
【図１４Ｃ】炭水化物修飾ペプチドの分析データを示す図である。
【図１４Ｄ】炭水化物修飾ペプチドの分析データを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
特に断らなければ、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。
【００３３】
本明細書および請求項で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な記載がない限り、複数の参照対象を包含する。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、後に続くリストが非包括的であり、任意のその他の追加の適切な項目、例えば、必要に応じて１つまたは複数のさらなる特徴（単一または複数）、構成要素（単一または複数）および／または成分（単一または複数）を含んでも、または含まなくてもよいことを意味するものと理解される。
【００３５】
本出願は、ファージディスプレペプチドライブラリーの化学修飾を遺伝的にコードする方法を提供する。一実施形態では、これは、修飾の識別情報を翻訳上の「サイレントバーコード」中に割り付けることにより実現することができる。例えば、Ｇｌｙをコードする４つのコドンがあり、ランダムペプチドライブラリーをファージのｐＩＩＩタンパク質に連結するＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＧＧＧ）リンカーをコードするのに、３４＝８１通りの異なる方法がある。したがって、化学（翻訳）レベルで同一で、遺伝子レベルで識別可能な２１６ライブラリーを構築し、これらのライブラリーを別々に修飾し、さらにそれらをプールして、全てのｃＰＴＭが遺伝的に追跡できるｃＰＴＭライブラリーを生成可能である。
【００３６】
サイレントバーコードは、翻訳上活性でサイレントな領域、ファージアセンブリに使用されない補助タンパク質またはファージタンパク質から切除される配列（例えば、リーダー）を含む、ファージ内の任意の位置に導入することができる。しかし、特定の実施形態では、ＤＮＡ塩基シークエンシング法によりこれらの２つの領域の同時キャラクタリゼーションを可能とするために、可変領域の近位内にサイレントバーコードを配置するのが通常である。
【００３７】
例えば、ペプチド配列Ｓｅｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１０）をディスプレイしているファージが産生された。ここで、Ｘはアミノ酸で、ＳｅｒおよびＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの両方は、隠れたバーコード（ＨＢ）部分として機能する。図２に示すように、ランダムテトラアミノ酸ライブラリーに隣接した領域に導入されたサイレントバーコードの具体的例が示される。Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＫはＧまたはＴであり、ＮＮＫはランダムアミノ酸をコードするためによく使われるヌクレオチドの組み合わせである。
【００３８】
非修飾ライブラリー、および３種の異なる修飾を保持するライブラリーを組み合わせて、４種の別々のＮ末端部分（セリン、ビオチン、スルホンアミドおよびマンノース）を含むライブラリーを生成した。４種の標的−ストレプトアビジン、炭酸脱水酵素，ＣｏｎＡまたはＢＳＡ−に対するパニングおよびディープシークエンシングを実施し、シークエンシングにより修飾ペプチドの選択を容易に特徴付けることができることを示した（図３と４を参照）。
【００３９】
多重化サイレントバーコードを有するライブラリーのパニングは、単一ラウンドのパニングに限定されるが、しかし、ディープシークエンシングによる分析は、単一ラウンドのパニング由来であっても、有用なリガンドを特定することを可能とする。ディープシークエンシングを使ったパニングの１ラウンドの効率は、正規のＳａｎｇｅｒシークエンシングを使った複数ラウンドのスクリーニングの効率と同じとすることができることは、当該技術分野において公知である。
【００４０】
材料と試薬
特に記載のある場合を除き、化学試薬および溶媒は、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。２炭素リンカーを有するマンノースヒドロキシルアミンの合成は、以前記載した（Ｎｇ，ｅｔ  ａｌ．）。ペプチド合成用の試薬は、ＣｈｅｍＰｅｐから購入した。モデルペプチドは、後述の標準的Ｆｍｏｃ固相合成を使って合成した。反応をＴＬＣによりモニターした。ＴＬＣは、シリカゲル６０  Ｆ２５４（Ｍｅｒｋ）プレート上で行い、ＵＶ光（λ＝２５４ｎｍ）を使って、過マンガン酸カリウム、アニスアルデヒドを噴霧し、続けて加熱することにより、可視化した。シリカゲル６０（４６〜６３μｍ）を用い、ＩＳＣＯ  Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  Ｒｆ装置によりフラッシュカラムクロマトグラフィーを実施した。その後、ＩＫＡ  ＲＶ１０ロータリーエバポレーターを使って、溶媒の減圧下蒸発を行った。Ａｇｉｌｅｎｔ／Ｖａｒｉａｎ  ＶＮＭＲＳ  ２チャネル５００ＭＨｚまたはＡｇｉｌｅｎｔ／Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ  ２チャネル４００ＭＨｚ分光装置を用いて、プロトン（１Ｈ  ＮＭＲ）および炭素（１３Ｃ  ＮＭＲ）核磁気共鳴スペクトルを記録した。化学シフトは、デルタスケール上で、百万分率（ｐｐｍ）で与えられる。溶媒ピークを基準値として使用した。１Ｈ  ＮＭＲに対しては、ＣＤＣｌ３＝７．２４ｐｐｍ、１３Ｃ  ＮＭＲに対しては、ＣＤＣｌ３＝７７．１６ｐｐｍ。次の略語を使用した：ｓ、シングレット；ｄ、ダブレット；ｔ、トリプレット；ｑ、クアドルプレット；ｑｕｉｎ、クインテット；ｍ、マルチプレット；ｂ、ブロード；ｄｄ、ダブレットのダブレット；ｄｄｄ、ダブレットのダブレットのダブレット；ｔｄ、ダブレットのトリプレット。ウシ炭酸脱水酵素（ＢＣＡ）、ビオチンおよびリゾチームは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｎａｄａ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）から入手した。天然のコアストレプトアビジン、Ｓ４（野生型ストレプトアビジン残基１３〜１３９を含む、ＭＷ１３２７１Ｄａ）用のプラスミドは、Ｐ．Ｓｔａｙｔｏｎ教授（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）から送呈され、このタンパク質の発現は、下記に詳述する。
【００４１】
合成手順
【化１】
0006715831.tif 000002
【００４２】
４−［［１，３−ビス（オキシダニリデン）イソインドール−２−イル］オキシメチル］ベンゼンスルホンアミド（３’）
４−スルホンアミドベンジルブロミド（Ｇｕｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）（４６０ｍｇ、１．８４ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシフタルイミド（３６０ｍｇ、１．２当量）をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解した。Ｋ２ＣＯ３（２７６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を８０℃で３０分間撹拌後、酢酸エチルで希釈し、ＨＣｌで酸性化し、水で洗浄し、濃縮して大量の沈殿物（５２０ｍｇ、８５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４９８ＭＨｚ，メタノールｄ４）δｐｐｍ  ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ  ８．１Ｈｚ  ，ａｒｏｍ．），７．８２（ｓ，４Ｈ，芳香族）；７．７１（ｄ，２Ｈ，芳香族），４．８２（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，メタノールｄ４）δｐｐｍ  １６４．８７，１４５．６９，１３９．８９，１３５．９０，１３１．１６，１３０．２２，１２７．３２，１２４．３９，７９．７２．ＥＳＩ−ＭＳ  Ｃ１５Ｈ１３Ｎ２Ｏ５Ｓ（Ｍ＋Ｈ）＋としての計算値：３３３．０５４０、測定値：３３３．０５４９．
【００４３】
４−（アミノオキシメチル）ベンゼンスルホンアミド（３）
プリカーサー３’（２００ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）の熱ＭｅＯＨ（２ｍＬ）中の懸濁液に、ヒドラジン水和物（０．１ｍＬ）を加えた（Ｋｉｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．）。３０分後、混合物を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ−５％ＭｅＯＨ）を使って精製し、標記生成物を得た（１０５ｍｇ、６１％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４９８ＭＨｚ，メタノールｄ４）δｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ  ８．１Ｈｚ，芳香族）；７．５１（ｄ，２Ｈ，芳香族），４．７３（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６  ＭＨｚ，メタノールｄ４）δｐｐｍ  １４４．３２，１４３．７６，１２９．３７，１２７．２４，７７．７５．ＥＳＩ−ＭＳ  Ｃ７Ｈ９Ｎ２Ｏ３Ｓ（Ｍ−Ｈ）−としての計算値：２０１．０３３９、測定値：２０１．０３３９．
【００４４】
固体支持体上のペプチドの合成
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＡＭ樹脂（２００ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ／ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）をＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐ（登録商標）クロマトグラフィーカラム中に秤取した。カラムを真空マニホルド上にセッティングした。マニホルドに三方コックを取り付け、真空濾過による溶媒の排出および窒素バブリングによる樹脂の撹拌を可能とした（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。膨潤させるために、ＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）を乾燥樹脂に加えた。１５分後、溶媒を真空吸引により排出した。樹脂をＤＭＦ（３ｍＬ）で洗浄し、ＤＭＦ（３ｍＬ）中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを使って、Ｆｍｏｃ保護基を１分間切断した。新しいＤＭＦ（３ｍＬ）中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを使って、この処理を繰り返した。樹脂をＤＭＦ（４ｘ３ｍＬ）で洗浄した。ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．７３ｍｍｏｌ、４当量）およびＤＭＦ（１ｍＬ）中のＨＢＴＵ（２７６ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ、４当量）を樹脂に加え、続けて、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、０．２５ｍＬ、１．４６ｍｍｏｌ、８当量）を加えた。窒素で３０分間の撹拌後、真空吸引により試薬を取り出し、樹脂をＤＭＦ（４ｘ３ｍＬ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ脱保護、アミドカップリング、および洗浄ステップを上記のように連続して繰り返し、ペプチド配列を伸長させた。最終のＦｍｏｃ脱保護後、樹脂をＤＭＦ（５ｘ３ｍＬ）で洗浄し、続けて、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｘ３ｍＬ）で洗浄した。樹脂をマニホルド上に１０分間残し、真空下で乾燥させた。ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／フェノール／トリイソプロピルシラン［３ｍＬ、８５／５／５／５（ｖ／ｖ／ｗ／ｖ）］を含む切断反応混液を樹脂に加えた。カラムをロッカー上に２時間置いてペプチドを切断後、溶液を集め、樹脂をＴＦＡ（１ｍＬ）で濯いだ。合わせた切断混合物を５０ｍＬ遠心管中の氷冷ジエチルエーテル（２０ｍＬ）に滴加した。混合物を氷上で３０分間インキュベート後、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清をデカントし、沈殿物を冷ジエチルエーテル（１０ｍＬ）中に再懸濁した。遠心分離および洗浄ステップを２回繰り返した。沈殿物を風乾した後、減圧下に一晩おいた。典型的な収率：５０〜１５０ｍｇ。
【００４５】
粗製ペプチド（４０ｍｇ）をＤＭＦ（０．２５ｍＬ）および０．１％のＴＦＡ水溶液（０．２５ｍＬ）中に溶解した。この溶液をセミ分取Ｃ１８−ＨＰＬＣシステムに注入した。以下に示すように、溶媒Ａ（ＭＱ脱イオン水、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）と溶媒Ｂ（ＭｅＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）の勾配を１２ｍＬ／分の流速で流した。
【００４６】
時間（分） 溶出液Ｂ（％）
０                      ２
２                      ２
２６                    ３５
２７                    １００
２９                    １００
３０                    ２
【００４７】
ＭＡＬＤＩＴＯＦまたはＥＳＩ  ＬＣＭＳによる質量分析を使って、標的ペプチド含有画分を特定した。ＭｅＣＮを減圧下で蒸発させて除去した。水溶液を凍結乾燥してペプチドを白色粉末として得た（２０〜３２ｍｇ）。全ペプチドをペプチドコンジュゲートの合成に使用し、コンジュゲートの合成後、キャラクタリゼーションを行った。
【００４８】
スルホンアミドペプチドの合成
【化２】
0006715831.tif 000003
【００４９】
合成をＮｇらの記載（２０１２）からわずかに修正して、適応させた。Ｈ２Ｎ−ＳＷＹＫＬ−ＣＯＮＨ２ペプチド（配列番号１）を使った手順の一例では、ペプチド（６．９ｍｇ、１０μｍｏｌ、１当量）をＤＭＦ（０．２５ｍＬ）中に溶解し、続けて、２００ｍＭのＭＯＰＳ（０．２５ｍＬ、ｐＨ７．０）を加えた。この溶液を、過ヨウ素酸ナトリウム（６０μＬ、４２．６ｍｇ／ｍＬ、１２μｍｏｌ、１．２当量）の水溶液を含む、１．５ｍＬの微量遠心機チューブに加えた。反応混合物を室温で１０分間インキュベートした。酸化を停止するために、固体グルタチオン（ＧＳＨ、３７ｍｇ、１２０μｍｏｌ、１２当量）を加え、直ちに混合して、遊離ヨウ素の堆積を防いだ（ＧＳＨ添加時に少しの間、褐色が現れる）。室温で１０分間のインキュベーション後、ＤＭＦ（６０μＬ）に溶解した４−（アミノオキシメチル）ベンゼンスルホンアミド（３）（２．６ｍｇ、２０μｍｏｌ、２当量）を、反応混合物に加え、続けて２００ｍＭの酢酸アニリン（０．２５ｍＬ、ｐＨ４．７）を加えた。室温で３０分間、オキシムライゲーションを実施した。前記反応混合物をセミ分取Ｃ１８−ＨＰＬＣシステムに注入した。上記したように、粗製ペプチドでＨＰＬＣ精製を実施し、凍結乾燥後にふわふわした粉末として生成物を得た（４０〜７０％の単離収率）。以下に示すように、溶媒Ａ（ＭＱ脱イオン水、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）と溶媒Ｂ（ＭｅＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）の勾配を使って、Ｃ１８−ＨＰＬＣ分析システム（流速：１ｍＬ／分）で生成物の純度を測定した。
【００５０】
時間（分） 溶出液Ｂ（％）
０                      ２
２                      ２
１６                    ４０
１７                    １００
１９                    １００
２０                    ２
【００５１】
生成物ＳＡ−ＷＹＫＬ（配列番号２）を、ＬＣＭＳおよびＨＲＭＳ（ＥＳＩ）を使ってさらに特性を決定した。全てのスルホンアミドコンジュゲートの分析データを以降の記載で見ることができる。
【００５２】
サイレントバーコードファージディスプレイライブラリーの構築
このプロトコルは、Ｎｇらの記載から修正されている。下記の配列（３’→５’）を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドライブラリーのアンチセンス鎖は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。
３’−ＧＧＧＣＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＧＴＧＡＧＡＡＧＡ（ＮＮＭ）４ＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＧＣＣＧＧＣＣＣＧＣＧ−５’（配列番号３）
３’−ＧＧＧＣＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＧＴＧＡＧＡＡＧＡ（ＮＮＭ）４ＣＣＴＣＣＡＣＣＴＡＧＣＣＧＧＣＣＣＧＣＧ−５’（配列番号４）
３’−ＧＧＧＣＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＧＴＧＡＧＡＡＧＡ（ＮＮＭ）４ＣＣＧＣＣＡＣＣＧＡＧＣＣＧＧＣＣＣＧＣＧ−５’（配列番号５）
３’−ＧＧＧＣＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＧＴＧＡＧＡＴＣＡ（ＮＮＭ）４ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＧＣＣＧＧＣＣＣＧＣＧ−５’（配列番号６）
【００５３】
２００ｐｍｏｌのそれぞれのライブラリーを、３モル当量の配列５’−ＣＡＴＧＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＴＣ−３’（配列番号７）を有するショートプライマーを使ってアニールし、１ｘの用意された反応緩衝液中の１５Ｕクレノー断片（＃ＥＰ００５１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および５０μＭのｄＮＴＰにより伸長した。二本鎖ライブラリーを標準的エタノール沈殿により精製し、ＤＮアーゼ不含水またはＴＥ緩衝液中に再懸濁した。ライブラリーをＫｐｎＩおよびＥａｇＩ  ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ制限酵素（＃ＦＤ０５２４および＃ＦＤ０３３４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使って、製造元の推奨に従って処理し、２％ＥＧｅｌ（登録商標）ＳｉｚｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により精製した。Ｍ１３ＫＥバクテリオファージ二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を、ＧｅｎｅＪＥＴ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使って、Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイライブラリー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）由来の単一ファージクローンから単離し、製造業者のインストラクションに従って、ＫｐｎＩおよびＥａｇＩ  ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ制限酵素で同様に処理した。得られたＤＮＡを０．７％アガロースゲル精製、続けて、ＧｅｎｅＪＥＴ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）によるゲル抽出を行って精製した。１：３０のモル比のカットＭ１３ＫＥベクターおよびライブラリー二本鎖を４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）により１６℃で一晩連結した。連結したＤＮＡをエタノール沈殿で精製し、ＤＮアーゼ不含Ｈ２Ｏ中に再懸濁し、２５００Ｖ／４００オーム／４６μＦの設定によるＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（商標）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、２ｍｍのＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｃｕｖｅｔｔｅｓ（全てＢｉｏＲａｄから入手）ならびに市販のＦ（＋）ＴＧ１エレクトロコンピテント細胞および回収培地（Ｌｕｃｉｇｅｎ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使って形質転換した。形質転換細胞を用意された回収培地中に３７℃で１５分間回収した。４．５時間で２２５倍増幅。培養液の上清みからＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿によりファージを集め、力価を測定し、ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．４中に貯蔵した。
【００５４】
ファージライブラリーの化学修飾
このプロトコルは、Ｎｇらの記載（２０１５、２０１２）から修正した。約１０１１ＰＦＵ／ｍＬのファージライブラリー溶液を、０．０６ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム（例えば、１μＬの６ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムをＰＢＳ中の９９μＬのファージ中に）を使って、暗所、室温で５分間酸化し、０．５ｍＭのグルタチオン（例えば、１μの５０ｍＭグルタチオン）を使って室温で１０分間、反応を停止させた。酸化をモニターするために、少量の酸化ライブラリーをアミノオキシビオチンで処理し、以前に記載（Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）のように、ビオチンキャプチャーアッセイで捕捉した。通常、ファージライブラリーの６０％の画分がうまく酸化された。次に、酸化ファージライブラリーを等体積のヒドロキシルアミンコンジュゲート（４−（アミノオキシメチル）ベンゼンスルホンアミド、２−（アミノオキシ）エチル  α−Ｄ−マンノピラノシド、またはアミノオキシビオチン、２００ｍＭの酢酸アニリン緩衝液（ｐＨ４．７）中の２ｍＭ溶液）を使って修飾した。前記反応混合物を室温で１時間インキュベートし、続けて、ＭＯＰＳ緩衝液（４℃、１ｍＭ、ｐＨ７．３、１８時間にわたり３回緩衝液交換、１０Ｋ  ＭＷカットオフ）に対し透析して余剰試薬を除去した。反応効率を定量化するために、少量のライブラリーをアミノオキシビオチン、続けて、オキシムライゲーションで処理し、以前に記載（Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）のように、ビオチンキャプチャーアッセイで捕捉した。通常、ファージライブラリーの５５％の画分がこの試薬でうまく修飾された。
【００５５】
混合修飾ファージライブラリーのパニング
パニングプロトコルをＮｇらの記載からわずかに修正して、適応させた。
標的の調製：指定ウエルの平底９６ウエルのＣｏｓｔａｒプレートを、１００μＬのＭＯＰＳ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）中の１０μｇ／ｍＬのストレプトアビジン、コンカナバリンＡ、ウシ炭酸脱水酵素ＩＩまたはＢＳＡでコートした。標的をそれぞれ、３つずつのウエルにコートした。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。その後、プレートをブロッキング溶液（２％ｗ／ｖのＢＳＡ、２０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．４）で１時間ブロッキングし、４０５（商標）Ｔｏｕｃｈ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｗａｓｈｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）を使って、以下のように洗浄した：３００μＬの洗浄緩衝液（０．１％ｗ／ｖのツイーン−２０、２０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．４）の添加、続いて５秒の振盪および３０秒の浸漬を合計１０サイクル繰り返した。
【００５６】
ライブラリーの調製。上記のプロトコルを使ってパニングを行う前日に、ライブラリーを化学修飾した。次のライブラリーをモデルパニングアッセイに使用した。Ｂ１（Ｄ−マンノース）、Ｂ２（非修飾）、Ｂ３（ビオチン）、およびＢ４（スルホンアミド）。各ライブラリーを約１ｘ１０１１ＰＦＵ／ｍＬとして、ライブラリーを１：１：１：１の比率で組み合わせた。対照パニング実験では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４ライブラリーを個別に使用した。
【００５７】
パニングステップ。混合修飾ライブラリー（ＭＩＸ）または個別ライブラリー（Ｂ１〜Ｂ４）を結合バッファー（２％ｗ／ｖのＢＳＡ、０．２％ｗ／ｖのツイーン−２０、２０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．４）中で約１０９ＰＦＵ／ｍＬに希釈し、約１ｘ１０８ＰＦＵ／ウエルの濃度でウエル当たり１００μＬずつ分配した。室温で１時間のインキュベーション後、プレートを同じ洗浄プロトコルを使って再度洗浄した。溶出緩衝液（０．２Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２、０．１％ｗ／ｖのＢＳＡ）を９分間使って結合ファージをプレートから取り外し、溶出した溶液を１Ｍのトリス塩酸（ｐＨ９．１）で中和した。溶出ファージ溶液をプラーク形成アッセイにより定量化した。個別に修飾したライブラリーのパニング力価を使って、これらのライブラリー上の特異的修飾物質の存在を確認した（図４参照）。
【００５８】
ディープシークエンシングのための調製（ＭＩＸライブラリーのみ）。溶出ファージを、３ｍＬの１：１００希釈の対数期大腸菌Ｋ１２  ＥＲ２７３８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を補充したＬＢ培地中で、４．５時間増幅した。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍ１３  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使って、増幅ファージから単離し、それをＰＣＲによりＩｌｌｕｍｉｎａ対応短鎖ｄｓＤＮＡに変換した。簡単に説明すると、約１５０ｎｇのファージｓｓＤＮＡを、１ｘＰＣＲ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、１ｍＭのｄＮＴＰ、各プライマー当たり０．５μＭ、および合計５０μＬ中の、０．５μＬのＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）と混合した。順方向（Ｆ）および逆方向（Ｒ）プライマー配列、５’→３’：
Ｆ：
５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＧＧＴＣＴＣＧＧＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＸＸＸＸＣＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＣＴＣＴ−３’（配列番号８）
Ｒ：
５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＸＸＸＸＡＣＡＧＴＴＴＣＧＧＣＣＧＡ−３’（配列番号９）
【００５９】
プライマー配列中のＸＸＸＸは、１つのＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシング実験で複数の試料を追跡するために使用される４つのヌクレオチド長のバーコードを意味する。温度サイクルプロトコルを、次の通りとした：９５℃３０分に続けて９５℃１０秒を２５サイクル、６０．５℃１５秒および７２℃３０秒、その後、最終伸長の７２℃５分後に４℃保持。Ｉｌｌｕｍｉｎａ対応アダプターを使って、得られたｄｓＤＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑプラットホーム（Ｔｈｅ  Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｅ  ａｔ  Ｔｈｅ  Ｄｏｎｎｅｌｌｅｙ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｒｏｎｔｏ）によりシークエンシングし、この後のセクション（ディープシークエンシングデータの解析）で記載のように解析した。
【００６０】
ディープシークエンシングデータの解析
解析はＮｇら（２０１５）およびＭａｔｏｃｈｋｏら（２０１４）の記載からわずかに修正して、適応させた。生のＦＡＳＴＱデータを以前に記載（Ｍａｔｏｃｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．）からわずかに修正したＭａｔＬａｂスクリプトを使って処理し、有意に濃縮された配列のコピー数および濃縮比率を抽出した。
【００６１】
次の例は、特定のＤＮＡ配列に対する比率の計算を示す。各リードのコピー数は、１だけ補正し、ゼロで除算するのを回避し、次に、各列の配列の合計数で正規化した。補正および正規化リードは平均した。２つの平均正規化リード（式１．１と１．２）の比率として、Ｒを計算した。式１．３は、配列ＳＡ−ＷＹＫＬ（配列番号２）（ＳＡは、サイレントバーコードによりコードされたスルホンアミドである）の１つの比率の具体的計算例を示す。全ての配列合計数は、千リード単位であることに留意されたい（すなわち、４８６は、４８６，０００リードに相当する）。
【００６２】
【数１】
0006715831.tif 000004
【００６３】
本明細書で記載の実施例は、ファージ上でディスプレイされるペプチドライブラリーに重点が置かれているが、その他の、ＲＮＡ、ＤＮＡ、細菌、酵母および当該技術分野において既知の他のディスプレーシステム上でディスプレイされる遺伝的にコードされたペプチドライブラリーも同様に使用可能である。
【００６４】
実施例１−サイレントバーコードを有するペプチドライブラリーの具体的実施形態
普及している市販のＰｈ．Ｄ．−７またはＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリーで使われている、Ｍ１３ＫＥベクターを、本設計の基盤として使用した。しかし、他のファージ／ファージミドベクターおよび他のディスプレイプラットホームを使用してよい。
【００６５】
サイレントバーコードを有するライブラリーの作製には、異なる変異体のＳＸＸＸＸＧＧＧ（配列番号１０）リンカーを導入するためのファージライブラリークローニング：制限酵素クローニングに対する変更は必要なかった（特定のＤＮＡ配列に対しては図１を参照）。作製ステップが同じなので、多重作製および一度に５〜１０個のライブラリーの生成を行うことができる。
【００６６】
図２は、ランダムテトラアミノ酸ライブラリーに隣接した領域に導入されたサイレントバーコード（配列番号１１〜１６）の具体的例を示す。Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＫはＧまたはＴであり、ＮＮＫはランダムアミノ酸をコードするためによく使われるヌクレオチドの組み合わせである。
【００６７】
それぞれのｃＰＴＭによる修飾の効率を以前記載（Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）のように決定した。それぞれの修飾は、同じ結合形成プロセスを使用するために、修飾効率は類似していた。
【００６８】
Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングのための一本鎖ファージＤＮＡの調製では、修飾を必要としなかった。理由は、ライブラリーのＧＧＧおよびＳ領域は、相互に極めて接近して存在し、以前記載（Ｍａｔｏｃｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）のようにシークエンシングできるためである。
【００６９】
実施例２−明確なリガンド−標的対を使ったモデル選択アッセイによるバーコードの検証
この実施例は、実施例１で作製した、３種の特定のタンパク質を認識する３つのリガンドによる、４つのバーコード化ファージライブラリーの修飾について記載する。リガンド１は、ストレプトアビジン（標的１）を認識するビオチンである。リガンド２は、炭酸脱水酵素を認識するスルホンアミドである。リガンド３は、コンカナバリンＡ（標的３）を認識するマンノースである。修飾４は、いずれの修飾も存在しない（すなわち、非修飾ペプチドライブラリー）。標的４（ＢＳＡコートウエル）が導入され、これはいずれの修飾によっても特異的には認識されない。
【００７０】
標的１、２、３，および４に対して、修飾１、２、３、および４を含む混合ライブラリーをパニングした。図３は、遺伝的にコードされた化学修飾を有するファージライブラリーのモデル選択アッセイを示す。図３ａでは、ライブラリーファージを、Ｎ末端セリンのＮａＩＯ４酸化を介して化合物（図３ｂ）にコンジュゲートし、ＧＳＨを使った短時間の反応停止ステップとそれに続く化合物のオキシムライゲーションを実施した。図３ｃ〜３ｆは、代表的化学修飾：ＨＢ１−マンノース（図３ｃ）、ＨＢ２−修飾なし（図３ｄ）、ＨＢ３−ビオチン（図３ｅ）、およびＨＢ４−ストレプトアビジン（図３ｆ）。図３ｇは、固定されたストレプトアビジン、炭酸脱水酵素、ＣｏｎＡまたは非コートウエルと共にインキュベートし、続けて、すすぎ洗いステップおよび酸溶出を実施した、等比率のそれぞれの修飾ライブラリーを含む混合ライブラリーを示す。溶出ファージを増幅し、処理して一本鎖ファージＤＮＡを単離し、Ｉｌｌｕｍｉｎａによりシークエンシングした（「可変領域」、配列番号１０９〜１１５）。図３ｈは、積み重ね表現を使用して、ファージライブラリー中のバーコードの相対的存在量を示す。選択の前に、ライブラリーは、約２５：２５：２５：２５の比率の４つのバーコードを含んでいた。ストレプトアビジンで選択後、比率は、約１：９７：１：１であり、バーコード＃２が集団の優位を占め、一方、炭酸脱水酵素の選択では、比率９７：１：１：１が得られ、バーコード＃１が集団の優位を占める。バーコード＃１および＃２は、それぞれビオチンおよびスルホンアミドを有する集団をコードしている。いずれの修飾によっても認識されるはずがない、ブランク、ＢＳＡコートプレートに対する選択などの、無関係な標的に対する選択は、いずれのバーコードの濃縮も得られないか、またはこの濃縮が実験間で再現可能ではない。最終的に、ライブラリーがどの選択もなしに増幅される場合、バーコード化ファージライブラリーは安定であり、その組成は変化しない。
【００７１】
図４は、次の９６ウエルプレート上にコートした４種の標的−ストレプトアビジン、ウシ炭酸脱水酵素ＩＩ、コンカナバリンＡ、またはＢＳＡ（「ブランク」）に対する、ファージライブラリーのパニングにおける入力および出力力価の測定による、これらのファージディスプレイライブラリー上の化学修飾物質：ビオチン、スルホンアミド、Ｄ−マンノース、および無修飾の存在の確認を示す。ビオチンおよびスルホンアミド修飾ライブラリーは、同族標的（ストレプトアビジンおよび炭酸脱水酵素）によりコートされたウエル中で有意に濃縮される。マンノース修飾ライブラリーのＣｏｎＡ上での濃縮は、わずかで、以前に観察された結果（Ｎｇ，Ｓ．，２０１５）と類似であった。
【００７２】
図３ｈは、選択ライブラリー１、２、３、および４のディープシークエンシングは、「一致した」修飾を有するファージの大きな存在量を立証したことを示す。例えば、炭酸脱水酵素でパニングの場合、選択ファージライブラリーメンバーの９５％がスルホンアミドの存在を示すサイレントバーコードを保持していた。
【００７３】
図５は、ＢＣＡおよびストレプトアビジンに対するバーコード化ライブラリーの選択における（Ａ）比率とｐ値（「ボルケーノプロット」）の関係を示す。Ｒ＞３およびｐ＜０．０５を有するリガンドは、ＢＣＡに対するパニングで濃縮され、Ｒ＜０．３およびｐ＜０．０５のリガンドは、ストレプトアビジンに対するパニングで濃縮された。図の下の式は、各配列の正規化画分からの比率Ｒの計算を示す。２つの濃縮セットは、異なる化学修飾（ＢＣＡに対してはスルホンアミド（ＳＡ）およびストレプトアビジンに対してはビオチン（Ｂｉｏ））ならびに異なる配列モチーフを有する。図５は、選択配列（配列番号２および１７〜２７）のコピー数および比率を示す。（Ｂ）配列（配列番号２、２３および２５〜４３）は、ＢＣＡに対するパニングで有意に濃縮されたが、４種のＣｏｎＡ、ＢＳＡ、ストレプトアビジンに対する対照パニング実験または選択なしでの増幅実験では濃縮されなかった（全て３回繰り返し）。色分け地図は、ディープシークエンシングにより決定されたコピー数を表す。
【００７４】
図５は、ライブラリーの複数の修飾によるパニングは、特定の修飾物質のみならず、特定のペプチド配列も同様に濃縮することを示す。以前に報告した濃縮分析（Ｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５）を使って、ＳＡ−修飾ペプチドは、ＢＣＡに対するパニングで、無関係の標的（ＢＳＡ、ストレプトアビジンまたはＣｏｎＡ、図３Ａ）に対するパニングに比べて、有意に濃縮された（ｐ＜０．０５）配列として特定された。追加の対照として、我々は、増幅ライブラリーファージからパニングなしに出現した、成長が速い「寄生配列」（Ｍａｔｏｃｈｋｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を選別し、破棄した。それぞれの試験−対照対に対し、分析結果をボルケーノプロットとして示すことができる（図４は、ＢＣＡに対する選択と、ストレプトアビジンに対する選択とを比較する。追加のボルケーノプロットを図６に示す）。
【００７５】
図６は、同じ混合修飾ライブラリー（図３または図５からの）の炭酸脱水酵素（Ａ）（配列番号２、２３、２５〜３６、４０〜６４）およびストレプトアビジン（Ｂ）（配列番号１８，２０〜２２、６５〜１００）に対するパニングにおいて特定された、特定のＤＮＡ配列、ペプチドおよび配列モチーフを示す。数字は、それぞれのパニング実験における配列の正規化したコピー数を表す。「ブランク」は、標的でコートされていないウエルを意味する。「ナイーブ」は、選択前のライブラリーを意味し、「増幅」は、選択をせずに増幅されたライブラリーを意味する。「比率」は、平均コピー数値の比率を表す。
【００７６】
１２の異なるファージ集団のライブラリー中のＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングにより測定されたライブラリー中の配列コピー数（存在量）が示されている。それらの内の、最初の３つの列に示される３つは、スルホンアミド（ＳＡ）に対するパニングに由来し、次の３つはブランクのＢＳＡ被覆ウエルに対するパニングに由来し、さらなる３つの試料はナイーブ（未選択）ライブラリーを表し、最後の３つはどの選択もなしに増幅されたライブラリーを表す。ディープシークエンシングは、可変ペプチド領域中のペプチドモチーフを明らかにし、これは、化学修飾と相乗作用を示し、標的に対する増加した親和性をもたらすペプチド配列が存在することを示唆した。ＣＡ選択試料中の存在量を、その他の実験における存在量と比較することにより、ＣＡに対する選択で優先的に濃縮される配列が特定された。ＣＡペプチドに対する選択により、ＧＧＡＧＧＡＧＧＡバーコードを保持するペプチドが修飾されたことが観察され、これは、全てのペプチドがスルホンアミド（ＳＡ）により修飾されたことを示す。さらに、ＳＡで修飾された特定のペプチド配列のみが、再現性よく選択され、一方、ＳＡにより修飾されたその他のペプチドはそうではないことが観察される。特に、Ｗリッチペプチド配列は、炭酸脱水酵素に対しパニングしたＳＡ修飾ライブラリーに対し選択される。バーコードおよび標的が変化すると、ペプチド配列の性質は変化する。例えば、Ｈ−Ｐリッチモチーフは、ストレプトアビジンに対し選択されたビオチン修飾ペプチドに対しより優先的に選択される。
【００７７】
図７は、混合修飾ライブラリー（ＭＩＸ）のウシ炭酸脱水酵素（ＢＣＡ）および４つの追加の対照に対するパニングおよびディープシークエンシング後に特定されたペプチドのコピー数のボルケーノ分析を示すグラフである。（Ａ）：ＣｏｎＡに対するＭＩＸのパニングと比較したＢＣＡに対するＭＩＸのパニング；（Ｂ）：ストレプトアビジンに対するＭＩＸのパニングと比較したＢＣＡに対するＭＩＸのパニング；（Ｃ）：ＢＳＡに対するＭＩＸのパニングと比較したＢＣＡに対するＭＩＸのパニング；（Ｄ）：どのパニングもなしで増幅されるＭＩＸライブラリーと比較したＢＣＡに対するＭＩＸのパニング。各実験に対する正規化した比率（Ｒ）は、上述のように計算した。正規化したリードおよび片側不等分散スチューデントｔ検を使って、Ｐ値を計算した。青い線は、選択に使用される閾値：ｐ＜０．０５およびＲ＞３を画定する。これらの基準を満たす全ての配列は、スルホンアミドバーコードをディスプレイする。
【００７８】
図８は、ペプチド−スルホンアミド（左）およびカルボキシ−スルホンアミド（右）ならびに炭酸脱水酵素への結合の例を示す。結合定数は、それぞれ１．６ｕＭおよび３９ｎＭであり、ペプチド部分のスルホンアミドへの結合の３０倍の利点を示す。
【００７９】
結合アッセイ（等温滴定熱量測定）によるペプチド−スルホンアミドの試験により、選択配列は実際に、スルホンアミドそれ自体に優る利点を与えることが検証された。
【００８０】
図９は、炭酸脱水酵素に結合したスルホンアミドペプチド（ＳＡ−ＸＸＸＸ）の追加の反復実験の生のＩＴＣデータを示す。リガンド（２０〜９５μＭ）の炭酸脱水酵素の溶液（２．５〜１２μＭ）中への、３０℃における４分間隔での３０回の注入に対し得られた生データを示している。積分曲線は、ミクロカロリー／秒の単位の実験ポイントを示し、また、単一結合部位モデルに対するベストフィット（−）を示す。アッセイにより、ＳＡ−ＷＩＶＰ（配列番号２６）などの選別スクリーンで選択されたペプチドは、５ナノモルもの強力な親和性を有し、対照ペプチドＳＡ−ＧＧＧＧ（配列番号１０１）（１５０ナノモル）よりも有意に（３０倍）強力であることが立証される。
【００８１】
図１０は、スルホンアミド修飾ペプチドの分析データを示す。図１０ＡはＳＡ−ＷＹＫＬ（配列番号２）；図１０ＢはＳＡ−ＷＱＱＱ（配列番号２７）；図１０ＣはＳＡ−ＷＩＶＰ（配列番号２６）；図１０ＤはＳＡ−ＷＮＴＫ（配列番号２５）；図１０ＥはＳＡ−ＹＱＹＳ（配列番号２８）；図１０ＦはＳＡ−ＷＴＳＧ（配列番号３１）；図１０ＧはＳＡ−ＷＴＷＬ（配列番号３３）；図１０ＨはＳＡ−ＷＴＹＷ（配列番号３４）；図１０ＩはＳＡ−ＦＶＶＲ（配列番号１０２）；図１０ＪはＳＡ−ＴＲＰＡ（配列番号１０３）；図１０ＫはＳＡ−ＷＰＡＲ（配列番号３９）；図１０ＬはＳＡ−ＹＱＹＲ（配列番号１０４）；図１０ＭはＳＡ−ＧＧＧＧ（配列番号１０１）である。
【００８２】
実施例３−構造的に関連があるリガンド（１つの原子または１つのキラル中心が異なる単糖類）を使った選択アッセイによるバーコードシステムの検証
この実施例は、６種の構造的に関連するリガンド：グルコース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、マンノースショートリンカーおよびマンノースロングリンカー、による、実施例１で作製した６つのバーコード化ファージライブラリーの修飾について記載する。
【００８３】
図１１は、化学的コンジュゲーションにより導入された６種の遺伝的にコードされた炭水化物を有するファージライブラリーの選択アッセイを示す。図１１Ａは、Ｎ末端セリンのＮａＩＯ４酸化を介して化合物にコンジュゲートし、ＧＳＨを使った短時間の反応停止ステップとそれに続く化合物のオキシムライゲーションを実施したライブラリーファージを示す。グルコース（１）、ガラクトース（２）、ラムノース（３）、キシロース（４）、マンノースショートリンカー（５）およびマンノースロングリンカー（６）誘導体がライブラリーの修飾に使用された。図は、規定比率のそれぞれの修飾ライブラリーを含む混合ライブラリーを固定ガレクチン３と共にインキュベートし、続けて、洗浄ステップおよび酸溶出を行う、モデルパニングアッセイを示す。溶出ファージを増幅し、第２ラウンドの選択のために処理した。第２ラウンドでは、全てのバーコード化ライブラリーがガラクトース誘導体で一律に修飾された。ラウンド１およびラウンド２で、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングのために一本鎖ファージＤＮＡを単離した。図１１Ｂは、シークエンシングデータの分析を示す。ガレクチン３をコートしたウエルから溶出したファージは、対応するタンパク質標的に対し顕著な結合選択性を示した。溶出ファージの相対比率は、標的タンパク質に対する修飾の相対的結合親和性に対応する。
【００８４】
ガラクトース、グルコース、キシロースおよびラムノースで修飾した場合、実施例２で記載の手順に類似の選択およびディープシークエンシング手順を使ったヒトガレクチン−３タンパク質（Ｇａｌ３）に対するこれらのライブラリーのパニングにより、Ｇａｌ３に結合する単糖類と四量体ペプチドの組み合わせが明らかになった。単糖類の識別情報は、「サイレントバーコード」技術を使ってデコードされた。
【００８５】
ＥＬＩＳＡ様競合アッセイ（図１２、１３）を使って、ヒトガレクチン−３の炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）に対するこれらのグリコペプチドの結合活性およびラクトース結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の結合と競合するそれらの能力を検証した（図１２）。標準物質として、我々は、ラクトース、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭｅＧａｌ）および四糖類ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮＴ）などの既知のＧａｌ３リガンドを使用した。
【００８６】
この選別スクリーン中で、ＭｅＧａよりも有意に強力にＧａｌ３とラクトース−ＨＲＰとの相互作用を阻害し得るＧａｌおよびテトラペプチドの複数の組み合わせが発見された（図１１）。グリコペプチドＧａｌ−ＰＡＰＴ（配列番号１０５）が最も強力なヒットであった。固定ガレクチン−３プレートに対するＨＲＰ−Ｌａｃの結合を阻害するその能力は、ＬＮＴより５倍優れ、ラクトースより３０倍優れ、ＭｅＧａｌ活性より１５００倍超優れていた。
【００８７】
図１２は、ガラクトース−３に対して、グリコペプチドの遺伝的にコードされたライブラリーから特定されたヒットの活性の評価を示す。このアッセイは、可溶性ＨＲＰ−ラクトースと表面固定ガレクチン−３との間の相互作用の阻害における化合物の阻害定数（最大半量応答またはＥＣ５０の有効濃度として表される）を測定する。ガラクトース修飾グリコペプチドＧａｌ−ＰＡＰＴ（配列番号１０５）は、最強の阻害活性ＥＣ５０：０．０１４ｍＭを有し、この値は、いずれの対照のＥＣ５０より有意に小さい。この結果は、グルコースと四量体ペプチドの組み合わせ（Ｇｌｕ−ＳＩＹＧ；配列番号１０６）がＧａｌ３に結合し、ガレクチン３をコートしたウエル上のＨＲＰ−ラクトースの結合を、対照のＭｅＧａｌよりも１０倍高い抗力で阻害することを明らかにし、それはラクトースの親和性に類似であった（図１２）。
【００８８】
意外にも、キシロースおよびラムノースとペプチドとの組み合わせも同様に特異的にＧａｌ３に結合し、Ｇａｌ３とラクトース−ＨＲＰとの相互作用と競合できることも見出された。テトラペプチドに連結したキシロース、Ｘｙｌ−ＡＬＲＶ（配列番号１０７）は、ＭｅＧａｌと類似のＩＣ５０を有するＨＲＰ−Ｌａｃと競合する。図１３は、ペプチドＧａｌ−ＰＡＰＴ（配列番号１０５）およびＸｙｌ−ＡＬＲＶ（配列番号１０７）に対する、ＨＲＰ−Ｌａｃ競合実験由来の代表的生データを示す。競合活性は、ポリスチレン９６ウエルプレート上に１０μｇ／ｍＬの濃度でコートされたガレクチン−３に結合したＨＲＰ−ｌａｃコンジュゲートにより、発色の減少として定量化される。コンジュゲートＲｈａ−ＩＷＶＲ（配列番号１０８）は、ＨＲＰ−Ｌａｃコンジュゲートのガレクチン−３結合に対し、対照ＭｅＧａｌより４００倍さらに強力で、ラクトース対照より１０倍優れた阻害剤であった。この活性は、９７ナノモルのＫｄでガレクチン−３に結合すると報告されている、ＬＮＴと同じオーダーであった。
【００８９】
図１４は、グリカン−ペプチドコンジュゲート：Ｒｈａ−ＩＷＶＲ（配列番号１０８）（図１４Ａ）、Ｘｙｌ−ＡＬＲＶ（配列番号１０７）（図１４Ｂ）、Ｇｌｕ−ＳＩＹＧ（配列番号１０６）（図１４Ｃ）、Ｇａｌ−ＰＡＰＴ（配列番号１０５）（図１４Ｄ）、の化学構造およびキャラクタリゼーションを示す。
【００９０】
本明細書で言及した全ての出版物、特許および特許出願は、本発明が属する当業者の技術のレベルを示し、あたかもそれぞれの全ての出版物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれると示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９１】
本発明は前述のように記載されているが、その記載内容は様々な方法で変更可能であることは明らかであろう。このような変更は、本発明の趣旨および範囲からの乖離であると見なされるべきものではなく、また、当業者には明らかである全てのこのような修正は、次の請求項の範囲内に含まれることが意図されている。
【００９２】
参考文献
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【配列表フリーテキスト】
【００９３】
配列番号１：    スルホンアミドペプチド
１位はＨ２Ｎで修飾
５位はＣＯＮＨ２で修飾
配列番号２：    スルホンアミドペプチド産物
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号３：    ＤＮＡオリゴヌクレオチドライブラリーのアンチセンス鎖
２３位〜２４位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
２６位〜２７位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
２９位〜３０位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
３２位〜３３位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
配列番号４：    ＤＮＡオリゴヌクレオチドライブラリーのアンチセンス鎖
２３位〜２４位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
２６位〜２７位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
２９位〜３０位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
３２位〜３３位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
配列番号５：    ＤＮＡオリゴヌクレオチドライブラリーのアンチセンス鎖
２３位〜２４位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
２６位〜２７位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
２９位〜３０位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
３２位〜３３位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
配列番号６：    オリゴヌクレオチドライブラリーのアンチセンス鎖
２３位〜２４位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
２６位〜２７位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
２９位〜３０位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
３２位〜３３位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
配列番号７：    プライマー配列
配列番号８：    ディープシークエンシング用プライマー（フォワード）
６２位〜６５位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
配列番号９：    ディープシークエンシング用プライマー（リバース）
５９位〜６２位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
配列番号１０：  サイレントバーコードを有するライブラリーのためのペプチドリンカー
２位〜５位のＸａａはいかなる天然のアミノ酸でもよい
配列番号１１：  サイレントバーコード  （ＨＢ１）
４位〜５位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
７位〜８位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
１０位〜１１位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
１３位〜１４位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
配列番号１２：  サイレントバーコード（ＨＢ２）
４位〜５位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
７位〜８位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
１０位〜１１位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
１３位〜１４位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
配列番号１３：  サイレントバーコード（ＨＢ３）
４位〜５位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
７位〜８位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
１０位〜１１位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
１３位〜１４位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
配列番号１４：  サイレントバーコード（ＨＢ４）
４位〜５位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
７位〜８位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
１０位〜１１位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
１３位〜１４位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
配列番号１５：  サイレントバーコード（ＨＢ５）
４位〜５位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
７位〜８位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
１０位〜１１位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
１３位〜１４位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
配列番号１６：  サイレントバーコード（ＨＢ６）
４位〜５位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
７位〜８位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
１０位〜１１位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
１３位〜１４位のｎはａ，ｃ，ｇまたはｔ
配列番号１７：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号１８：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号１９：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号２０：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号２１：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号２２：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号２３：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号２４：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号２５：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号２６：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号２７：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号２８：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号２９：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号３０：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号３１：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号３２：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号３３：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号３４：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号３５：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号３６：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号３７：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号３８：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号３９：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号４０：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号４１：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号４２：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号４３：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号４４：  スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号４５：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号４６：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号４７：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号４８：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号４９：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号５０：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号５１：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号５２：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号５３：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号５４：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号５５：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号５６：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号５７：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号５８：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号５９：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号６０：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号６１：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号６２：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号６３：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号６４：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（炭酸脱水酵素を使用）
配列番号６５：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号６６：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号６７：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号６８：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号６９：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号７０：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号７１：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号７２：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号７３：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号７４：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号７５：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号７６：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号７７：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号７８：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号７９：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号８０：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号８１：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号８２：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号８３：  混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号８４：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号８５：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号８６：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号８７：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号８８：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号８９：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号９０：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号９１：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号９２：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号９３：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号９４：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号９５：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号９６：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号９７：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号９８：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号９９：  ビオチン修飾ペプチド
１位はビオチンで修飾
配列番号１００：混合修飾ライブラリーのパニングで同定された配列（ストレプトアビジンを使用）
配列番号１０１：対照ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号１０２：スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号１０３：スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号１０４：スルホンアミド修飾ペプチド
１位はスルホンアミドで修飾
配列番号１０５：ガラクトース修飾ペプチド
１位はガラクトースで修飾
配列番号１０６：グルコース修飾ペプチド
１位はグルコースで修飾
配列番号１０７：キシロース結合ペプチド
１位はキシロースと結合
配列番号１０８：ラムノース結合ペプチド
１位はラムノースと結合
配列番号１０９：ディープシークエンシング可変領域
配列番号１１０：ディープシークエンシング可変領域
配列番号１１１：ディープシークエンシング可変領域
配列番号１１２：ディープシークエンシング可変領域
配列番号１１３：ディープシークエンシング可変領域
配列番号１１４：ディープシークエンシング可変領域
配列番号１１５：ディープシークエンシング可変領域
【図１】
0006715831.tif 000005
【図２】
0006715831.tif 000006
【図３】
0006715831.tif 000007
【図４】
0006715831.tif 000008
【図５】
0006715831.tif 000009
【図６】
0006715831.tif 000010
【図７】
0006715831.tif 000011
【図８】
0006715831.tif 000012
【図９】
0006715831.tif 000013
【図１０Ａ】
0006715831.tif 000014
【図１０Ｂ】
0006715831.tif 000015
【図１０Ｃ】
0006715831.tif 000016
【図１０Ｄ】
0006715831.tif 000017
【図１０Ｅ】
0006715831.tif 000018
【図１０Ｆ】
0006715831.tif 000019
【図１０Ｇ】
0006715831.tif 000020
【図１０Ｈ】
0006715831.tif 000021
【図１０Ｉ】
0006715831.tif 000022
【図１０Ｊ】
0006715831.tif 000023
【図１０Ｋ】
0006715831.tif 000024
【図１０Ｌ】
0006715831.tif 000025
【図１０Ｍ】
0006715831.tif 000026
【図１１】
0006715831.tif 000027
【図１２】
0006715831.tif 000028
【図１３】
0006715831.tif 000029
【図１４Ａ】
0006715831.tif 000030
【図１４Ｂ】
0006715831.tif 000031
【図１４Ｃ】
0006715831.tif 000032
【図１４Ｄ】
0006715831.tif 000033
【配列表】
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