(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)3〜7×105/cm2の密度で多能性細胞を準備する段階、
(b) 1〜5 μMの式
0006744223.tif 000010
の化合物を含むインスリン不含培地中で前記細胞を12〜48時間インキュベートする段階
(c) 1〜10μMのWnt-C59を含むインスリン不含培地中で前記細胞を24〜72時間インキュベートする段階
を含む、多能性幹細胞を心筋細胞に分化させるための方法。
【請求項２】
前記細胞が、段階と段階の間にインスリン不含培地中で24〜48時間インキュベートされる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
インスリンを含む培地中で前記細胞をインキュベートする段階(d)をさらに含む、請求項1または2のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
段階(b)、(c)および(d)の培地がアスコルビン酸を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記人工多能性幹細胞がヒト細胞である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記人工多能性幹細胞が、心臓細胞の機能不全に起因する疾患に罹患する対象から入手される、請求項5または6記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本願は、多能性幹細胞(PSC)を心筋細胞に分化させるための方法に関する。さらに、本願は、化学的に定義された培地誘導の一連の段階に基づき、ヒト胚性幹細胞(hESC)および人工多能性幹細胞(iPSC)を増殖性心筋細胞に分化させるための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
長年、様々な細胞培養系が前臨床医薬品開発において用いられている。しかしながら、株化細胞モデルは腫瘍原性組織または形質転換不死化細胞のいずれかに由来することから、株化細胞モデルは、薬学的に関連する疾患に特異的な生理機能を一部しか反映しない。具体的には、最終分化した心筋細胞は限定された増殖能を有していることが示されているため、それらは、医薬品開発のための細胞モデルを効果的に生じさせる能力を有しない。したがって、研究および医薬品開発において信頼性の高い細胞モデルとして用いることができるより疾患に関連するヒト細胞型が必要とされている。
【０００３】
ヒト胚性幹細胞(hESC)および人工多能性幹細胞(iPSC)は、心筋細胞、神経細胞、膵臓細胞など機能的なヒト細胞型を作製する非常に大きな機会を研究者に提供する。純粋なhESCおよびiPSCに由来するヒト心筋細胞(hESCM)培養物のインビトロでの分化のためのロバスト性を持つプロトコールは、初期のヒト心発生の理解を進歩させるためだけではなく、医薬品開発の前臨床段階における薬物有効性を試験し、臨床試験に入る前に心毒性を評価するための非形質転換ヒト細胞モデルとして心筋細胞を使用するための強力なツールを提示する。加えて、hESC由来のヒト心筋細胞は、心筋再生にクリティカルな経路を特定するための機会を開き、最終的には、幹細胞ベースの治療法を支持する臨床応用につながる可能性がある。
【０００４】
薬学的研究および開発のための細胞アッセイモデルの開発に関して、そのような分化プロトコールは、理想的には以下の基準を満たす細胞を生じる必要がある：(a)高いレベルの再現性を伴いロバスト性を有する；(b)多数の高度に純粋な細胞型を生じる；(c)短時間で分化することができる；(d)複数のスクリーニング活動に対してバッチを一致させるために凍結させることができる細胞を生じる；(e) モデル化疾患特異的な読み出しに関連する機能性および生理機能を備える。P. W. Burridge et alは、多能性細胞を心筋細胞に分化させるための先行技術のアプローチを概説する(P. Burridge, Keller, Gold, & Wu, 2012)。今までのところ、公知のプロトコールのいずれも上記基準を満たしていない。具体的には、公知のプロトコールを通じて得られた心筋細胞は、何らかの機能的特性を失わずに凍結および解凍することは困難である。
【０００５】
これらの要件を満たすために、発明者らは、多数の高度に純粋な心筋細胞(最大で95％)生じさせる新しい分化方法を開発した。この分化プロトコールは、定義された低分子を用いて、10日の期間で心筋細胞系列への分化を誘導する。その純度をさらに高めるために、心筋細胞に優先的な条件を用いて心筋細胞を再プレーティングすることにより、心筋細胞を濃縮する。さらに、心筋細胞はその後、凍結され、液体窒素下で保存され、再び解凍される。この心筋細胞は、薬学的研究および開発で用いられる複数のスクリーニング形式に準拠するよう試験されている。本発明は、先行技術のプロトコールと比較して、より短時間で収量の有意な増加を示す多能性幹細胞を心筋細胞に分化させるための改善された方法を提供する。新たな方法は、多能性幹細胞から胚様体または小細胞凝集塊を得る必要性を軽減させ、これまで公知の方法の低い再現性および標準化という主要な欠点を取り除く。その上、高い効率によって、製薬業界において創薬および安全性評価、再生医療での応用、ならびにインビトロでの疾患モデル化におけるこれらの定義された心筋細胞の大規模な使用が可能になる。
【発明の概要】
【０００６】
1. 本明細書において、以下の段階を含む、多能性幹細胞を心筋細胞に分化させるための方法が提供される：
(a)3〜7×105/cm2の密度で多能性細胞を準備する段階
(b)式
0006744223.tif 000002
の化合物を含むインスリン不含培地で前記細胞をインキュベートする段階。
【０００７】
1つの態様において、前記細胞は、0.3〜10μMの前記化合物を含むインスリン不含培地中でインキュベートされる。
【０００８】
1つの態様において、段階(b)は前記細胞を12〜48時間インキュベートする段階を含む。
【０００９】
1つの態様において、前記方法は、Wnt-C59を含むインスリン不含培地中で前記細胞をインキュベートする段階(c)をさらに含む。
【００１０】
1つの態様において、段階(c)は、1〜10μMのWnt-C59を含むインスリン不含培地中で前記細胞をインキュベートする段階を含む。
【００１１】
1つの態様において、段階(c)は、前記細胞を24〜72時間インキュベートする段階を含む。
【００１２】
1つの態様において、前記細胞は、段階と段階の間にインスリン不含培地中で24〜48時間インキュベートされる。
【００１３】
1つの態様において、前記方法は、インスリンを含む培地中で前記細胞をインキュベートする段階(d)をさらに含む。
【００１４】
1つの態様において、段階(b)、(c)および(d)の培地はアスコルビン酸を含む。
【００１５】
1つの態様において、多能性幹細胞は人工多能性幹細胞である。
【００１６】
1つの態様において、人工多能性幹細胞はヒト細胞である。
【００１７】
1つの態様において、人工多能性幹細胞は、心臓細胞の機能不全に起因する疾患に罹患する対象から入手される。
【００１８】
1つの態様において、上記態様のいずれかに記載の方法により入手される心筋細胞が提供される。
【００１９】
1つの態様において、上記態様のいずれかに記載の方法により入手される心筋細胞のバイオバンクが提供される。
【００２０】
1つの態様において、上記態様のいずれかに記載の方法により入手される心筋細胞、または心筋細胞のバイオバンクの心筋細胞が、心臓細胞の機能不全に起因する疾患についてのインビトロモデルとして用いられる。
【００２１】
1つの態様において、上記態様のいずれかに記載の方法により入手される心筋細胞、または心筋細胞のバイオバンクの心筋細胞を含む治療用組成物。
【００２２】
上記態様のいずれかは、単独でまたは組み合わせで存在しうる。
[本発明1001]
(a)3〜7×105/cm2の密度で多能性細胞を準備する段階、
(b)式
0006744223.tif 000003
の化合物を含むインスリン不含培地中で前記細胞をインキュベートする段階
を含む、多能性幹細胞を心筋細胞に分化させるための方法。
[本発明1002]
前記細胞が、0.3〜10μMの前記化合物を含むインスリン不含培地中でインキュベートされる、本発明1001の方法。
[本発明1003]
段階(b)が前記細胞を12〜48時間インキュベートする段階を含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
Wnt-C59を含むインスリン不含培地中で前記細胞をインキュベートする段階(c)をさらに含む、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
段階(c)が、1〜10μMのWnt-C59を含むインスリン不含培地中で前記細胞をインキュベートする段階を含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
段階(c)が、前記細胞を24〜72時間インキュベートする段階を含む、本発明1004または1005の方法。
[本発明1007]
前記細胞が、段階と段階の間にインスリン不含培地中で24〜48時間インキュベートされる、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
インスリンを含む培地中で前記細胞をインキュベートする段階(d)をさらに含む、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
段階(b)、(c)および(d)の培地がアスコルビン酸を含む、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記人工多能性幹細胞がヒト細胞である、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記人工多能性幹細胞が、心臓細胞の機能不全に起因する疾患に罹患する対象から入手される、本発明1010または1011の方法。
[本発明1013]
本発明1001〜1012のいずれかの方法により入手された心筋細胞。
[本発明1014]
本発明1001〜1012のいずれかの方法により入手された心筋細胞のバイオバンク。
[本発明1015]
心臓細胞の機能不全に起因する疾患についてのインビトロモデルとしての、本発明1001〜1012のいずれかの方法により入手された心筋細胞または本発明1014のバイオバンクの心筋細胞の使用。
[本発明1016]
本発明1001〜1012のいずれかの方法により入手された心筋細胞または本発明1014のバイオバンクの心筋細胞を含む治療用組成物。
[本発明1017]
本明細書に本質的に記載された方法および使用。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】FACS分析は、分化14日目に高濃度の心筋細胞を特定する。hESCおよびiPSCの両方とも同様の結果を生じる。A：ヒト胚性幹細胞由来の心筋細胞。B：ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞。
【図２】複数の心筋細胞分化のFACS分析は、プロトコールのロバスト性を証明する。
【図３】FACS分析は、精製法が心筋細胞の純度を改善することを示す。A：14日目に5.5×105/cm2心筋細胞で60％純度。B：追加の精製段階後に4.4×105/cm2心筋細胞で98％純度。
【図４】免疫蛍光染色 - 共焦点顕微鏡分析は細胞において、心筋細胞に典型的なαアクチニンおよびトロポニンTによる横紋パターンを明らかにする。緑(*)：αアクチニン、赤(#)：トロポニンT、青(+)：核。
【図５】xCELLigent分析 - イソプロテレノールは、多能性幹細胞由来の心筋細胞における拍動頻度を増大させる。
【図６】多能性幹細胞由来の心筋細胞は、分化の14日目および18日目に高い割合の解凍後生存心筋細胞数を示す。各実験において、4×106細胞を凍結した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、先行技術のプロトコールと比較して、より短時間でかつ増殖性心筋細胞の収量の有意な増加を示す、多能性幹細胞を心筋細胞に分化させるための改善された方法を提供する。
【００２５】
本明細書に開示された、ヒト胚性幹細胞(hESC)および人工多能性幹細胞(iPSC)を定義された心筋細胞に分化させるための新規な方法は、化学的に定義された培地誘導の一連の段階に基づき、分化を開始したわずか10日後に(またはそれより早く：8日後に)細胞拍動を生じさせる。
【００２６】
1つの態様において、多能性幹細胞を心筋細胞に分化させるための方法が提供され、該方法は、以下の段階を含む：
(a)3〜7×105細胞/cm2の密度で多能性細胞を準備する段階
(b)式
0006744223.tif 000004
3-(3-アミノ-フェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-ピロール-2,5-ジオン(CP21)
の化合物を含むインスリン不含培地中で前記細胞をインキュベートする段階。
【００２７】
多能性幹細胞は、3〜7×105細胞/cm2の密度で、すなわち、非常に高い密度で準備される。1つの態様において、細胞は、5.5×105細胞/cm2の密度で準備される。驚くべきことに、本方法の発明者らは、高密度で細胞を準備すると、分化効率および心筋細胞収量が向上することを発見した。
【００２８】
1つの態様において、高密度で準備された細胞は、段階(a)による分化を開始する前に適したバッファーまたは培地で洗浄されて、いかなる死細胞も除去される。
【００２９】
段階(b)の培地はインスリン不含培地である。以前の報告は、インスリン含有分化培地が心発生を阻止することを示していることから(Lian u. a., 2013)、段階(b)の初期分化培地におけるインスリンの欠如は重要である。
【００３０】
分化を開始するために、化合物21(3-(3-アミノ-フェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-ピロール-2,5-ジオン、本明細書では「化合物21」または「CP21」とも呼ばれる；例えば、L. Gong et al; Bioorganic& Medicinal Chemistry Letters 20 (2010), 1693-1696を参照)を含むインスリン不含培地中で細胞をインキュベートし、wnt経路を活性化する。心筋細胞分化を誘導するのに最適な化合物21の濃度は、細胞容器に付着させる多能性細胞の細胞密度に左右される。異なる細胞密度(1.8〜11×105/cm2 hESCまたはiPSC)および種々のCP21濃度(0〜10μM)を用いた複数の並行した分化実験において、5.5×105/cm2の細胞密度および2μMのCP21濃度を用いると、多能性幹細胞の心筋細胞への最も効率的な分化がもたらされることが見出された。5μMを上回るCP21濃度は、細胞生存性の低下を示した。先行技術のプロトコールは、効率的な分化のために高い濃度のWnt経路の他のモジュレーターを必要とすることから、これは驚くべき事である。
【００３１】
1つの態様において、分化方法の段階(b)は、0.3〜10μMのCP21、好ましくは0.5〜5μMのCP21を含む培地中で細胞をインキュベートする段階を含む。1つの好ましい態様において、分化方法の段階(b)は、2μMのCP21を含む培地中で細胞をインキュベートする段階を含む。
【００３２】
CP21インキュベーションの24時間後に、細胞は強い細胞死を示す。種々のCP21のインキュベーション時間の試験によって、24時間が心発生に最適であり、それより長いまたは短いインキュベーション時間は分化効率の低下をもたらすことが示された。
【００３３】
1つの態様において、段階(b)は、CP21を含むインスリン不含培地中で12〜48時間、好ましくは18〜24時間、細胞をインキュベートする段階を含む。
【００３４】
1つの好ましい態様において、段階(b)は、CP21を含むインスリン不含培地中で24時間、細胞をインキュベートする段階を含む。
【００３５】
1つの態様において、段階(b)の培地はアスコルビン酸を含む。基本培地へのアスコルビン酸の添加は、心筋細胞分化を改善することが示されている(Cao u. a., 2012)。
【００３６】
したがって、1つの態様において、段階(b)の培地は、CP21およびアスコルビン酸を含むインスリン不含培地である。1つのそのような態様において、培地は0.5〜5μMのCP21およびアスコルビン酸を含む。
【００３７】
1つの態様において、前記方法は、Wnt-C59を含むインスリン不含培地中で前記細胞をインキュベートする段階(c)をさらに含む。
【００３８】
Wnt-C59は、Wntシグナル経路を遮断する低分子である(WO2010101849、2-(4-(2-メチルピリジン-4-イル)フェニル)-N-(4-(ピリジン-3-イル)フェニル)アセトアミド)。Wnt-C59は非常に強力かつ高い選択性のWntシグナル伝達アンタゴニストである。それは、Porcupine(膜結合型O-アシルトランスフェラーゼ)によるWntタンパク質のパルミチル化を妨げ、それによって、Wntタンパク質分泌および活性を阻止する。
【００３９】
異なる濃度のwntリプレッサーWnt-C59(1〜10μM)を用いることによって、心筋細胞の有意な増加がもたらされた。最適濃度は2μMに特定された。Wnt-C59が添加されなかった場合、分化は心筋細胞をもたらさなかった。5μMを上回るWnt-C59の濃度は細胞死の増加を示した。1つの態様において、分化方法の段階(c)は、1〜10μM Wnt-C59を含む培地中で細胞をインキュベートする段階を含む。1つの好ましい態様において、分化方法の段階(c)は、2μM Wnt-C59を含む培地中で細胞をインキュベートする段階を含む。
【００４０】
wnt経路は非常に複雑であることから、異なる作用機序を示す他のWnt阻害剤を試験した。
【００４１】
駆虫性ニクロサミド(Chen et al, Biochemistry. 2009 Nov 3;48(43):10267-74.)は、Frizzled 1エンドサイトーシスを促進し、Dishevelled-2タンパク質を下方制御し、かつWnt3A刺激性のβカテニン安定化およびLEF/TCFレポーター活性を阻害する。
【００４２】
ピルビニウムは、インビトロでカゼインキナーゼ1(CK1)ファミリーメンバーの全てに結合してAxinの安定化およびβカテニンの代謝回転の増加をもたらすカゼインキナーゼ1α(CK1α)キナーゼ活性を選択的に増強することによる、Wntシグナル伝達の強力な阻害剤である(Thorne et al, Nat Chem Biol. 2010 Nov;6(11):829-36)。
【００４３】
駆虫性ニクロサミドおよびピルビニウムを、その心筋細胞分化を誘導する能力について試験した。WntC-59とは対照的に、他のWnt阻害剤はどちらも、心筋細胞の発生の成功をもたらさなかった。試験したWnt阻害剤の、多能性幹細胞を心筋細胞に分化させる効率の違いは、wnt分泌を阻止することによるwnt経路の特異的阻害が重要なメカニズムであるらしいことを示唆する。
【００４４】
1つの態様において、段階(c)は、Wnt-C59を含むインスリン不含培地中で24〜72時間、好ましくは48時間、細胞をインキュベートする段階を含む。
【００４５】
1つの態様において、段階(b)および(c)の前記インスリン不含培地は無血清培地である。1つの態様において、前記インスリン不含培地はRPMI1680(Gibco)である。
【００４６】
1つの態様において、細胞は、段階(b)および(c)それぞれの間にインスリン不含培地中で24時間から48時間、好ましくは48時間インキュベートされる。1つの態様において、前記培地は無血清培地である。別の態様において、前記培地はアスコルビン酸を含む。
【００４７】
1つの態様において、細胞は、段階(b)および(c)それぞれの間にアスコルビン酸を含むインスリン不含無血清培地中で24時間から48時間、好ましくは48時間インキュベートされる。
【００４８】
1つの態様において、上記態様のいずれかにより記載された多能性細胞の心筋細胞への分化のための方法は、インスリンを含む培地中で細胞をインキュベートする段階(d)をさらに含む。この後期段階では、インスリンは、心筋細胞およびその心臓前駆細胞の増殖を促進する。
【００４９】
1つの態様において、段階(d)は、インスリンを含む培地中で36〜60時間、好ましくは48時間、細胞をインキュベートする段階を含む。1つの態様において、前記培地は無血清培地である。別の態様において、前記培地はアスコルビン酸を含む。
【００５０】
増殖段階(d)で用いるのに適した培地は、例えば、DMEM、高グルコース＋L-グルタミン＋ピルビン酸塩およびカルニチン、タウリン、クレアチニン、BSA、ビタミンC、またはCellular Dynamics internationalからのiCell心筋細胞維持用培地である。
【００５１】
好ましくは、培地は各段階間に交換される、例えば、培地は、吸引または細胞を遠心分離し上清を廃棄すること等により取り除かれ、次いで、それに続く段階で用いられる培地が細胞に加えられる。1つの態様において、細胞は、それに続く段階の培地を加える前に適したバッファーまたは培地により洗浄されて、いかなる死細胞も除去される。細胞を洗浄するのに有用なバッファーまたは培地は当技術分野において公知である。細胞を洗浄するのに適した培地の一例は、リン酸緩衝食塩水(PBS)である。
【００５２】
1つの態様において、分化のための方法で有用である多能性細胞は、安定した成長および/または複製回数を可能にする条件下で培養される。例えば、細胞は、多能性培地中で成長し、複数回継代される。本明細書で用いられる「多能性培地」は、多能性を維持しながらの単層上の単一細胞としての多能性幹細胞の付着に有用な任意の化学的に定義された培地を指し、当技術分野において周知である。1つの態様において、多能性培地は、タンパク質キナーゼのうちRho関連コイルドコイル形成タンパク質セリン/スレオニンキナーゼ(ROCK)ファミリーの低分子阻害剤(本明細書では、ROCKキナーゼ阻害剤と呼ぶ)を含む無血清培地である。
【００５３】
1つの態様において、ROCKキナーゼ阻害剤は、1-(5-イソキノリンスルホニル)ホモピペラジン、N-ベンジル-2-(ピリミジン-4-イルアミノ)チアゾール-4-カルボキサミド、および(+)-(R)-trans-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロ-ヘキサンカルボキサミド二塩酸塩の群から選択される。
【００５４】
本明細書で有用なROCKキナーゼ阻害剤の例は、ファスジル(Fasudil)(1-(5-イソキノリンスルホニル)ホモピペラジン)、チアゾビビン(Thiazovivin)(N-ベンジル-2-(ピリミジン-4-10-イルアミノ)チアゾール-4-カルボキサミド)、およびY27632((+)-(R)-trans-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロ-ヘキサンカルボキサミド二塩酸塩、例えば、Tocris bioscienceのカタログ番号：1254)である。1つの好ましい態様において、ROCKキナーゼ阻害剤はY27632である。1つの態様において、多能性培地は、2〜20μM Y27632、好ましくは5〜10μM Y27632を含む無血清培地である。別の態様において、多能性培地は、2〜20μMファスジルを含む無血清培地である。別の態様において、多能性培地は、0.2〜10μMチアゾビビンを含む無血清培地である。
【００５５】
本明細書で提示した新たな方法によって、今回、最大で60〜98％の収率で多能性幹細胞からαアクチンおよびトロポニンTを発現する心筋細胞を分化させることが可能である。
【００５６】
1つの態様において、前記方法は、細胞を再プレーティングし、インスリン不含培地中でそれらをインキュベートする段階(e)をさらに含む。この段階は、心筋細胞の純度をさらに向上させる。1つの態様において、細胞は、再プレーティングされ、ウシ胎仔血清を追加したインスリン不含培地中で18〜32時間、好ましくは24時間インキュベートされる。1つのそのような態様において、培地はROCK阻害剤をさらに含む。1つの態様において、ROCK阻害剤はY-27632である。
【００５７】
本明細書に記載の方法により入手される心筋細胞は、複数の継代に増殖され、凍結および解凍後にその機能的特性を保持する。
【００５８】
本明細書で用いられる「分化させる」、「分化」という用語は、分化度が低い細胞を体細胞に変換させる、例えば、多能性幹細胞を心筋細胞に変換させるための1つまたは複数の段階を指す。多能性幹細胞の心筋細胞への分化は、本明細書に記載の方法により達成される。
【００５９】
本明細書で用いられる「幹細胞」という用語は、自己再生のための能力を有する細胞を指す。本明細書で用いられる「未分化幹細胞」は、広範囲の細胞型に分化する能力を有する幹細胞を指す。本明細書で用いられるように、本明細書で用いられる「多能性幹細胞」は、複数の細胞型の細胞を生じさせることのできる幹細胞を指す。多能性幹細胞(PSC)には、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞 (hiPSC)が含まれる。ヒト人工多能性幹細胞は、当技術分野において公知の方法により、例えば、4つの定義された因子(Sox2、Oct4、Klf4、c-Myc)の形質導入により、再プログラムされた細胞に由来しうる。ヒト体細胞は、健常な個体または患者から入手できる。これらのドナー細胞は任意の適した供給源から容易に入手できる。本明細書では、ヒト人体に対する侵襲的手法によらずにドナー細胞の単離を可能にする供給源、例えば、ヒト皮膚細胞、血液細胞または尿試料から入手可能な細胞が好ましい。ヒト多能性幹細胞が好ましいが、方法は、霊長類、齧歯類(例えば、ラット、マウス、ウサギ)およびイヌの多能性幹細胞など、非ヒト多能性幹細胞にも適用可能である。
【００６０】
本明細書で用いられる「心筋細胞」は、少なくとも細胞マーカートロポニンT(トロポニンTタイプ2(心臓)、遺伝子記号TNNT2、Entrez Gene：7139、UniProtKB：P45379)を発現する、好ましい態様では、細胞マーカーαアクチニン(ACTN2アクチニン、α2、遺伝子記号ACTN2、Entrez Gene：88、UniProtKB：P35609)も発現する細胞である。トロポニンTおよび/またはαアクチニンの発現は、当技術分野において公知の方法、例えば、実施例の段落に記載されているFACS分析により評価することができる。心筋細胞は、自発的な周期的収縮活動(「拍動」)を示しうる。これは、本発明の方法により入手された心筋細胞が適切なCa++濃度および電解質バランスを示す適当な組織培養環境中で培養されると、該細胞の、培養培地にいかなる追加成分の添加も必要としない、細胞の一軸に対する周期的な収縮、およびその後の収縮からの解放が観察されうることを意味する。加えて、本明細書に開示された方法により入手された細胞は、イオンチャネルまたは適切な電気生理など、心筋細胞の他の特徴も示しうる。
【００６１】
本明細書で用いられる「増殖性心筋細胞」は、αアクチニンおよびトロポニンTの発現を示し、かつ細胞分裂により増殖する細胞である。
【００６２】
「マーカーの発現」は、ある特定の遺伝子がmRNAに転写され、通常その後タンパク質(その遺伝子産物)に翻訳され、細胞においてある特定の機能を発揮することを意味する。マーカーの発現は、当技術分野において公知の方法により、RNAレベルまたはタンパク質レベルで検出および定量化されうる。本明細書では、例えば、マーカーに結合する抗体によってある特定のタンパク質の存在を試験することによる、タンパク質レベルでのマーカーの発現の検出が好ましい。
【００６３】
上記態様のいずれも、単独でまたは組み合わせで存在してもよい。
【００６４】
本発明の1つの態様において、患者特異的な心筋細胞または健常な個体特異的な心筋細胞を生じさせるための方法が提供される。この目的のために、患者または健常な個体から入手されたヒト人工多能性幹細胞(iPSC)が、本明細書に記載された方法によって心筋細胞に分化される。患者特異的なヒトiPSCは、当技術分野において公知の方法により、患者または健常な個体から入手された体細胞を多能性幹細胞に再プログラムすることにより得ることができる。例えば、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは脂肪細胞は、処置の必要がある個体または健常な個体からの皮膚生検によって入手され、当技術分野において公知の方法により人工多能性幹細胞に再プログラムされうる。人工多能性幹細胞のための供給源として適した他の体細胞は、血液試料から入手された白血球細胞または上皮細胞または尿試料から入手された他の細胞である。次いで、患者特異的な人工多能性幹細胞は、本明細書に記載された方法により、患者特異的な心筋細胞または健常な個体に特異的な心筋細胞に分化される。本発明の別の局面において、前記方法のいずれかにより産生される心筋細胞の集団が提供される。好ましくは、心筋細胞の集団は患者特異的である、すなわち、疾患を有する個体から得たiPSCに由来する。別の態様において、心筋細胞の集団は、健常な個体から入手される。
【００６５】
患者由来の心筋細胞は、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、不整脈原生右心室心筋症、冠動脈心疾患のような疾患の病態生理を研究するための疾患関連インビトロモデルになる。1つの態様において、この方法により入手された心筋細胞は、心臓細胞の機能不全、例えば、心肥大、拍動効率の低下、心筋細胞の横紋の組織崩壊、不十分なカルシウム処理により生じる疾患を回復させる、阻害するまたは予防する化合物のスクリーニングのために用いられる。好ましくは、本明細書に記載の発明の方法により入手される心筋細胞は疾患を有する対象に由来する。別の態様では、この方法により入手される心筋細胞は、心臓疾患、例えば上述の心臓疾患の処置のための新たな標的および化合物をスクリーニングおよび評価するために用いられる。好ましくは、本明細書に記載の発明の方法により入手される心筋細胞は、例えば、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、不整脈原生右心室心筋症、冠動脈心疾患のような疾患に罹患した個体に由来する。疾患を有する対象からの心筋細胞を分化させることは、ヒトの典型的バックグラウンド例における薬物安全性を初期評価するためのまたとない機会となる。別の態様において、この方法により入手される心筋細胞は、心臓のインビトロモデルとして用いられる。
【００６６】
本発明は、いずれもゼノフリー(xeno-free)条件で入手された患者特異的な心筋細胞、または移植に適した同じHLA型を示す健常な個体からの適合可能な細胞を供給するための高効率な方法を提供する。「ゼノフリー培養条件」は、ヒトおよび組換え起源の成分のみを含む、付着のための培地および基体を指す。よって、異種病原体による混入のリスクは回避され、腎臓細胞は再生医療での使用に安全である。本明細書に記載された方法による患者特異的人工多能性幹細胞(iPSC)の患者特異的心筋細胞への分化は、心筋細胞の自家供給源を作り出すための簡単にアクセスできかつ再現可能な技術である。細胞療法における自家のおよび/または適合可能な細胞の使用は、免疫拒絶の対象になるおそれがある非自家細胞の使用に対して大きな利点をもたらす。これに対して、自家細胞は重大な免疫反応を誘発する見込みはまずない。
【００６７】
本発明のさらなる好ましい局面において、患者特異的心筋細胞のバイオバンクの作製が想定される。1つの態様において、健常な個体および/または患者から入手された心筋細胞の異なる集団を含むバイオバンクが作製される。本明細書で用いられる「バイオバンク」という用語は、異なる個体または種から採取された生物学的試料のライブラリを意味する。検体および関連するデータの保管されたコレクションは、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、 不整脈原性右室心筋症、冠動脈心疾患に関連する疾患に対処することを目指す研究目的を意図する。別の態様において、バイオバンクは、脈管再生医療アプローチのために用いられる。
【００６８】
別の局面において、本発明は、前記の方法のいずれかにより産生された心筋細胞を含む、または前記の細胞集団のいずれかを含む治療用組成物を提供する。好ましくは、治療用組成物は、例えば、5％ヒト血清アルブミンを有するリン酸緩衝食塩水を含む、生理学的に適合する溶液をさらに含む。治療用組成物は、例えば、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、不整脈原生右心室心筋症、冠動脈心疾患などの疾患を処置する、予防する、または安定化するために用いられうる。例えば、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは脂肪細胞は、処置の必要がある個体または健常な個体からの皮膚生検により入手され、当技術分野において公知の方法( "Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors." Takahashi et al., 2007, Cell 131, 861-72)により人工多能性幹細胞に再プログラムされうる。人工多能性幹細胞の供給源として適した他の体細胞は、血液試料から入手された白血球細胞または上皮細胞または尿試料から入手された他の細胞である。次いで、患者特異的な人工多能性幹細胞は、本明細書に記載された方法により心筋細胞に分化され、回収され、個体に導入され、症状を処置する。本発明の方法により産生された心筋細胞は、疾患を有するまたは障害を受けた組織を交換するまたはそのような組織の通常の機能を補助するために用いられうる。
【００６９】
本発明の別の態様は、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、不整脈原生右心室心筋症、冠動脈心疾患に関連する疾患の治療のための心筋細胞のバイオバンクの使用である。バイオバンクは好ましくは、患者または健常な個体から入手された複数のHLA型を示す心筋細胞を含む。健常なドナーから入手された細胞を、適合可能なHLA型を示す処置の必要な個体に移植することは、異種細胞移植に通常伴う拒絶反応の重大な問題を未然に防ぐ。従来、拒絶は、シクロスポリンなどの免疫抑制剤または抗拒絶薬物の投与により予防または低減される。しかしながら、そのような薬物は、非常に高価であるばかりでなく、重大で有害な副作用、例えば、免疫抑制、発がん性、腎毒性を有する。本発明は、シクロスポリン、イムラン、FK-506、グルココルチコイド、およびラパマイシン、ならびにその誘導体などの抗拒絶薬物の必要性を取り除く、または少なくとも有意に低下させる。
【００７０】
本発明の治療法に関して、心筋細胞の哺乳動物への投与は、特定の様式の投与、用量、または投薬頻度に限定されることは意図されず；本発明は、筋肉内、静脈内、関節内、病巣内、皮下、または疾患を予防または処置するのに適切な投薬を提供するのに十分な任意の他の経路を含む、全ての様式の投与を企図する。心筋細胞は、単回投与または複数回投与で哺乳動物に投与されうる。複数回投与されるとき、投薬は、例えば、1週、1ヶ月、1年、または10年、他の投薬から間を空けられ得る。1つまたは複数の成長因子、ホルモン、インターロイキン、サイトカイン、低分子または他の細胞もまた、細胞の投与前、投与時、または投与後に投与され、それらの細胞を特定の細胞型へとさらに偏向させる。
【実施例】
【００７１】
材料および方法
CP21R7：3-(3-アミノ-フェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-ピロール-2,5-ジオン(本明細書において「化合物21」または「CP21」とも呼ばれる；L. Gong et al; Bioorganic& Medicinal Chemistry Letters 20 (2010), 1693-1696を参照)。
0006744223.tif 000005
【００７２】
Wnt-C59：2-(4-(2-メチルピリジン-4-イル)フェニル)-N-(4-(ピリジン-3-イル)フェニル)アセトアミド(Cellagen Technology, Cat. C7641-2s、WO2010101849)：
0006744223.tif 000006
【００７３】
ヒトESC：スウェーデンにおける全ての準拠法にしたがい、かつGoteborg UniversityおよびUppsala UniversityのLocal Research Ethics Committeeにより認可され、SA001、LOT CA001を2001年3月20日にGoteborg UniversityおよびCellartis AB Arvid Wallgrens Backe 20, SE-413 46 Goteborg, SWEDENにて単離した。胚供給源：IVFからの凍結された余剰物。ドナーの秘密保持：ドナーのプライバシーおよび秘密保持を守るために、胚ドナーに関する全ての識別名は除去している。よって、ドナーについての情報にはアクセスすることはできない。特に、供与はドナーにいかなる金銭的利益ももたらすものではなかった。発明者らは、hESCによる作業および異なる細胞株を派生させることについて承認を有している。担当する倫理委員会(Ethikkommission beider Basel)および公衆衛生のFederal officeが、発明者らの研究プロジェクトを承認している。(Ref-No: R-FP-S-1-0002-0000)。
【００７４】
ヒトiPSC：SBI System Biosciencesからカタログ番号：SC101A-1 ロット番号 110218-FF/ Life technologiesからカタログ番号：A13777 Gibco(登録商標) Episomal hiPSC Line。
【００７５】
ヒト多能性幹細胞は、TeSR1培地(Stem cell Technologies)中のhESC最適化マトリゲル(BD Bioscience)上でルーチン的に培養される。培養を4〜6日毎にStemPro Accutase(Invitrogen)を用いて継代する。生存度の増加のために、TeSR1培地は、酵素的解離の1時間前に10μM ROCK阻害剤を含む。
【００７６】
500 ml分化培地
0006744223.tif 000007
【００７７】
500 ml増殖培地
0006744223.tif 000008
【００７８】
本明細書において有用なさらなる試薬および材料：
Matrigel (BD Bioscience、Cat.354277)
mTeSR1培地 (Stemcell Technologies、Cat.05850)
Accutase (Innovative Cell Technologies、Cat.AT-104)
Rock阻害剤、Y-27632 (Millipore、Cat.SCM075)
RPMI培地 (Gibco by Life Technologies、Cat.61870)
アスコルビン酸(Sigma、Cat.A4544)
50×B-27(登録商標)Supplement Minus Insulin(Gibco by Life Technologies、Cat.0050129SA)
ペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco by Life Technologies、Cat.15070)
50×B27 インスリン含、ビタミンA不含(Gibco by Life Technologies、Cat.12587)
0.05％トリプシン/EDTA、1×(Gibco by Life Technologies、Cat.25300)
autoMACS Running Buffer (Miltenyi、Cat.130-091-221)
Inside Perm＋InsideFix (Miltenyi、Inside Stain Kit、Cat.130-090-477)
0.1％ゼラチン(Millipore、Cat.ES-006-B)
クライオジェニックバイアル(Corning#430659)
ミスターフロスティー凍結容器 (Thermo Scientific#5100-0001)
DMSO (Sigma#D2438)
ウシ胎仔血清(Invitrogen#16000044)
Falcon細胞培養用ディッシュ35×10 mm (BD#353001)
Falcon細胞培養用ディッシュ100×20  mm (BD#353003) 
6ウェルプレートCorning Costar (Sigma#CLS3516)
抗サルコメアαアクチニン[EA-53]抗体(Abcam、Cat.ab9465)
抗心臓トロポニンT抗体 (Abcam、Cat.ab45932)
Alexa Fluor(登録商標) 488およびロバ抗マウスIgG (H＋L) (Invitrogen、Cat.A21202)
Alexa Fluor(登録商標) 647ロバ抗ウサギIgG (H＋L) (Invitrogen、Cat.A31573)
Alexa Fluor(登録商標) 555ロバ抗ウサギIgG (H＋L) (Invitrogen、Cat.A31572)
Hoechst 33258、五水和物(ビスベンズイミド) (Molecular Probes、Cat.H3569)
【００７９】
ヒト胚性幹細胞(hESC)および人工多能性幹細胞(iPSC)からの心筋細胞の分化
ヒト胚性幹細胞(hESC)または人工多能性幹細胞(iPSC)を、マトリゲル(BD Bioscience, Cat.354277)でコーティングした56 cm2ディッシュにおいて37℃および5％CO2にて10 ml mTeSR1培地(Stemcell Technologies, Cat.05850)中で培養した。
【００８０】
心筋細胞分化を開始する前に、細胞を3〜4回継代し、多能性幹細胞が安定した成長および複製回数を示すことを確認した。
【００８１】
その多能性状態を保つことによって多能性幹細胞を増殖させるために、hESCまたはiPSCを以下で処理した：細胞を10 ml PBS-/-で1回洗い、その後、3 ml Accutase(Innovative Cell Technologies, Cat.AT-104)と共に37℃および5％CO2にて2〜3分間インキュベートして、細胞を剥離させた。
【００８２】
Accutaseの酵素反応を7 ml mTeSR1で停止させ、その後、500×gで3分間、細胞を遠心分離した。
【００８３】
細胞を10ml mTeSR1で再懸濁し、計数した。さらなる培養のために、新たにコーティングしたマトリゲルを有する56 cm2ディッシュ上に2×106細胞をプレーティングした。さらに、hESCまたはiPSCを10 ml mTeSR1および10μM Rock阻害剤、Y-27632(Millipore, Cat.SCM075)中で37℃および5％CO2にて培養した。続いて、10 ml mTeSR1培地を毎日交換し、継代前に多能性幹細胞を80％の密度まで培養した。
【００８４】
心筋細胞への分化の成功のために、5.5×105/cm2のhESCまたはiPSCを用いて多能性幹細胞を高密度にプレーティングした。多能性幹細胞について上記で説明したように継代および培養を行った。
【００８５】
24時間後(1日目)に、hESCまたはiPSCを180μl/cm2 PBS-/-で1回洗い、培養培地を180μl/cm2分化培地に交換した。
【００８６】
多能性幹細胞の心臓系列への分化を開始するために、培地は、2μMの化合物21(CP21)、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK3β)の低分子高選択性阻害剤を含んだ。
【００８７】
CP21とのインキュベーションの24時間後(2日目)に、上記のように細胞をPBS-/-で洗い、220 μl/cm2分化培地中で48時間培養した。
【００８８】
48時間後(4日目)に、上記のように細胞をPBS-/-で洗い、wnt分泌を遮断することによる強力なwntシグナル伝達阻害剤である2μMのWnt-C59(Cellagen Technology, Cat. C7641-2s, WO2010101849)を含む220 μl/cm2分化培地中で48時間培養した。
【００８９】
48時間後(6日目)に、上記のように細胞をPBS-/-で洗い、220 μl/cm2分化培地中で48時間培養した。
【００９０】
48時間後(8日目)に、上記のように細胞をPBS-/-で洗い、ただし今回はインスリン含、ビタミンA不含のB27 を含む、アスコルビン酸、ペニシリン-ストレプトマイシンを含む220 μl/cm2 RPMI培地(＝増殖培地)中で48時間培養した。
【００９１】
細胞の拍動によって視認できる最初の心筋細胞は分化の8日目に確認され、14日目までさらに増加した。
【００９２】
その後の培地交換は、220 μl/cm2増殖培地を用いて48時間毎に行った。
【００９３】
細胞の特徴付け
分化プロセスの効率を試験するために、分化の14日目に、心筋細胞に特異的な抗原を用いて細胞免疫組織化学的検査および蛍光活性化細胞選別(FACS)により、心筋細胞を特徴づけた。
【００９４】
蛍光活性化細胞選別(FACS)分析
細胞を180 μl/cm2 PBS-/-で洗い、37℃および5％CO2での100 μl/cm2 0.05％1×トリプリン/EDTA(Gibco by Life Technologies, Cat.25300)によって5〜10分間解離させた。
【００９５】
必要に応じて、培養容器から細胞を穏やかに擦り取り、ピペットで上下させ、次いで37℃および5％CO2にて5〜10分間インキュベートした。
【００９６】
その後、3倍量の増殖培地および10％ウシ胎仔血清(FBS)を加えた。
【００９７】
次いで、細胞を100μM細胞ストレーナーによりろ過し、計数した。
【００９８】
分析のために、懸濁状態の1×106細胞を1.5 ml管に移した。500×gで3分間の遠心分離の後、上清を取り除き、暗中室温で15分間の50 μlのInside Fix(Miltenyi, Inside Stain Kit, Cat.130-090-477)および50 μl PBS-/-によって細胞を固定した。
【００９９】
その後、100 μl autoMACS Running Buffer(Miltenyi, Cat.130-091-221)を加え、遠心分離した。上清を取り除き、細胞を100 μl Inside Perm(Miltenyi, Inside Stain Kit, Cat.130-090-477)で洗い、遠心分離し、上清を取り除いた。細胞をInside Permで1:100に希釈した抗サルコメアαアクチニン[EA-53]抗体(Abcam, Cat.ab9465)および抗心臓トロポニンT抗体(Abcam, Cat.ab45932)と共に4℃にて1時間インキュベートした。
【０１００】
その後、細胞を500 μl Running Bufferで洗い、遠心分離し、上清を取り除いた。細胞を二次抗体(Inside Permで1:1000)と共に室温にて10分間インキュベートした。以下の二次抗体を用いた：Alexa Fluor(登録商標)488ロバ抗マウスIgG(H＋L)(Invitrogen, Cat.A21202)およびAlexa Fluor(登録商標)647ロバ抗ウサギIgG(H＋L)(Invitrogen, Cat.A31573)。
【０１０１】
続いて、細胞を500μl Running Bufferで洗い、遠心分離後に、細胞を500μl Running Bufferで再懸濁し、蛍光活性化細胞選別(FACS)システムにより測定した。
【０１０２】
種々のCP21濃度を用いるヒト胚性幹細胞(hESC)および人工多能性幹細胞(iPSC)からの心筋細胞の分化
上記に記載のプロトコールを種々のCP21濃度で繰り返した。結果を下記の表に示す：(-)心筋細胞は得られなかった、(+)〜(+++)：得られた心筋細胞の量。
0006744223.tif 000009
【０１０３】
精製
心筋細胞の純度を向上させるために、濃縮段階を開発した。
【０１０４】
上記のように、細胞を180 μl/cm2 PBS-/-で洗い、37℃および5％CO2での100 μl/cm2 0.05％1×トリプシン/EDTA(Gibco by Life Technologies, Cat.25300)によって5〜10分間解離させた。
【０１０５】
必要に応じて、細胞を培養容器から穏やかに擦り取り、ピペットで上下させ、続いて、37℃および5％CO2にて5〜10分間インキュベートした。
【０１０６】
その後、3倍量の増殖培地および10％ウシ胎仔血清(FBS)を加えた。
【０１０７】
次いで、細胞を100μm細胞ストレーナーによりろ過し、計数した。
【０１０８】
130 μl/cm2の0.1％ゼラチン(Millipore, Cat.ES-006-B)でコーティングした新しいプレートを37℃で1時間インキュベートした。
【０１０９】
2.7×105/cm2の細胞を180μl/cm2増殖培地10％ウシ胎仔血清(FBS)中にプレーティングした。さらに、10μM Rock阻害剤を加えた。24時間後、220 μl/cm2培地をFBSおよびRock阻害剤を含まない増殖培地に交換した。培地を48時間毎に交換した。
【０１１０】
18〜21日目に、細胞をFACSにより分析し、以下の分析のために種々の形式で上記のように再び再プレーティングした：蛍光免疫染色、幹細胞由来の心筋細胞における拍動リズムおよび化合物の催不整脈作用を検出するためのxCELLigence。
【０１１１】
細胞をアッセイ条件に準拠するプレート形式に移した。10％ウシ胎仔血清(FBS)を加えた200 μl/cm2増殖培地中で、細胞を24時間付着させた。さらに、10μM Rock阻害剤を加えた。24時間後に、220 μl/cm2増殖培地をFBSおよびRock阻害剤を含まないものに変更した。培地を48時間毎に変更した。
【０１１２】
心筋細胞の凍結および解凍
14日目に、精製方法で記載しているように心筋細胞を再プレーティングした。18日目に、上記で概説しているように細胞を解離させ、続いて、そのαアクチニン発現およびトロポニンT発現についてFACSにより分析した。80％以上の心筋細胞を有する培養物を凍結プロトコールに供した。80％未満の心筋細胞を有する培養物は廃棄した。
【０１１３】
細胞を計数し、4×106細胞を、クライオジェニックバイアル当たり10％DMSOおよび10μM Y-27632を含む1 mlの冷やしたFBSと共に凍結させた。
【０１１４】
細胞を500×gで3分間遠心分離し、続いて、10％DMSOおよび10μM Y-27632を、追加したFBSで慎重に再懸濁した。心筋細胞の細胞懸濁物の1 mlアリコートを4℃に予め冷却したクライオジェニックバイアル内に充填し、-80℃にて24時間凍結させた。その後、クライオバイアルを液体窒素中で保存した。
【０１１５】
心筋細胞を解凍するために、バイアルをウォーターバス中で37℃にて1〜2分間インキュベートし、10％ウシ胎仔血清を加えた10 ml増殖培地内に、細胞を慎重に移した。細胞を300×gにて2分間遠心分離した。その後、10％ウシ胎仔血清および10μM Y-27632を加えた6 ml増殖培地でペレットを再懸濁し、0.1％ゼラチンでコーティングした6ウェルプレートの3ウェル上にプレーティングした。24時間後、細胞を、FBSおよびY-27632を含まない220 μl/cm2増殖培地に変えた。続いて、培地を3日毎に交換し、5〜7日後にアッセイ条件に準拠するプレート形式(例えば、心臓横紋の組織崩壊を検出するためのアッセイ：96ウェル形式；拍動頻度を記録するためのアッセイ：96ウェル形式)上に細胞をプレーティングした。
【０１１６】
xCELLigent心筋細胞拍動分析
イソプロテレノールは、心臓β1受容体を刺激することにより心拍数および心筋収縮性を向上させる。幹細胞由来の心筋細胞におけるこの催不整脈作用を検出するために、37℃にて1時間130 μl/cm2の0.1％ゼラチンでコーティングした特別なE-Plate Cardio 96(Roche, Cat. No. 05232368001)上に7×104/cm2の細胞をプレーティングした。上記のように細胞を2日間プレートに付着させ回収した後に、培地をiCell Cardiomyocytes Maintenance Medium(Cellular Dynamics, Cat. No.CMM-100-120-005)に交換した。xCELLigence RTCA Cardio System(Roche Applied Science)を用いて、細胞を測定した。プレーティングの7日後、細胞を3μM イソプロテレノールで処理し、直接測定した。各96ウェルプレートを12,9 msの解像度で測定した。最初の3分間は中断なしに測定され、その後の24時間にわたって、15分毎に1分間、細胞を測定した。
【０１１７】
免疫蛍光染色
免疫蛍光染色のために、室温で15分間、4％パラホルムアルデヒドによって、細胞を固定した。
【０１１８】
PBS-/-で細胞を洗った後に、細胞を、PBS-/-中10％ロバ血清および0.1％トリトン(ブロッキングバッファー)によって室温にて20分間ブロックおよび透過処理した。その後、細胞を、1:100希釈した一次抗体 抗サルコメアαアクチニン[EA-53]抗体(Abcam, Cat.ab9465)および抗心臓トロポニンT抗体(Abcam, Cat.ab45932)によって4℃にてブロッキングバッファー中で一晩染色した。
【０１１９】
細胞をPBS-/-で洗い、1:1000の二次抗体Alexa Fluor(登録商標)488およびロバ抗マウスIgG(H＋L)(Invitrogen, Cat.A21202)ならびにAlexa Fluor(登録商標)555ロバ抗ウサギIgG(H＋L)(Invitrogen, Cat.A31572)によって室温にて1時間ブロッキングバッファー中で染色した。複数回のPBS-/-洗い段階の後、1:1000希釈したHoechst 33258、五水和物(ビスベンズイミド) (Molecular Probes, Cat.H3569)によってPBS-/-中で、核を染色した。
【０１２０】
結果
分化後、細胞をその心筋細胞含量について分析した。図1は分化14日目の心筋細胞を定量化するFACS分析を図示する。
【０１２１】
αアクチニンおよびトロポニンT二重陽性細胞により特徴づけられる心筋細胞が平均で80〜90％得られた。図1では、細胞のある亜集団がαアクチニンについて単独陽性で染色された(5〜10％)。これは、より未成熟な心筋細胞の指標であり、このため、この集団はスコアリングに含まれない。この結果は、多能性幹細胞の供給源としてのhESC(図1A)またはiPSC(図1B)用いることとは無関係であった。5.5×105/cm2の多能性幹細胞で開始すると、分化プロトコールは平均で4〜5×105/cm2のαアクチニンおよびトロポニンT陽性心筋細胞を生じさせた。
【０１２２】
分化プロトコールのロバスト性を実証するために、発明者らは複数回の実験を行い、各培養中の心筋細胞の含有量を分析した。図2は、独立した10回の実験が、心筋細胞への95から40％の範囲の分化効率示すことを図示する。しかしながら、実験の大部分(10のうち7)は75％を上回る心筋細胞含有量を示し、これは許容可能な比率であった。60％以上の心筋細胞を生じる実験を先に進めた。60％未満の心筋細胞を示す分化は廃棄した。実験間の変動性は、分化の開始時の多能性幹細胞の品質および培養状態により引き起こされる可能性が最も高い。
【０１２３】
心筋細胞への純度をさらに向上させるために、さらなる精製段階を確立した。分化14日目に、細胞を剥離させ、FACSにより分析した。図3Aは、14日目に培養物が60％(5.4×105/cm2)心筋細胞を含む9×105/cm2の細胞を計数することを示す。精製方法が成功するには、αアクチン陽性細胞の最小パーセンテージは60％以上であるはずである。解離させた細胞を再プレーティングし(2.7×105/cm2)、増殖培地中で培養した。7日後に細胞を収集し、4.5×105/cm2の細胞を計数し分析した。図3Bは、精製段階後に培養物中の心筋細胞含有量が60から98％に増加することを示し、このことは、この方法を用いることによる4.4×105/cm2の高度に濃縮された心筋細胞の効率的な作製を実証する。その後、細胞は、アッセイ条件に準拠した培養形式に移された。
【０１２４】
さらなる特徴付けのために、心筋細胞を免疫蛍光により分析した。図4は、αアクチニン(緑)、トロポニンT(赤)および核特異的Hoechst染色(青)に対する抗体を用いる、27日目の心筋細胞の免疫蛍光染色を示す。図4における結果として生じる免疫蛍光は、心筋細胞に特徴的なαアクチニンおよびトロポニンT特異的な横紋を有する細胞を示す。
【０１２５】
心臓上のβ受容体の活性化は、心筋細胞において陽性変時作用を誘導する。多能性幹細胞由来の心筋細胞がβ受容体活性化に反応することを確認するために、心筋細胞をβ受容体アゴニストであるイソプロテレノールと共にインキュベートし、続いて、xCELLigenceシステムを用いて分析した。図5は、多能性幹細胞由来の心筋細胞を3μM イソプロテレノールと共にインキュベートした後に、拍動数は、未処理の対照と比較すると1分あたり45拍から60拍に増加したことを示す。この実験はさらに、この分化プロトコールにより生じた多能性幹細胞由来の心筋細胞が機能的なヒト心筋細胞に類似していることを実証した。
【０１２６】
心筋細胞の凍結および解凍は従来、解凍後の細胞回復が低レベルであるために難しかった。
【０１２７】
同じ細胞の大きなバッチを有することはアッセイ開発にとって重要であるため、発明者らは、多能性幹細胞由来の心筋細胞が冷凍庫中で保存され、その後解凍できるかどうかを試験した。発明者らは、分化した心筋細胞を異なる日齢(14日、18日および32日)で凍結することを試みた。図6に見られるように、より初期の分化段階で凍結した心筋細胞は、解凍後により高い細胞生存率を示す。一方で、分化の18日目に精製した後の解凍した細胞は、薬学的アッセイに細胞を使用するための最良の状態をもたらした。この段階では、細胞は、解凍後にはるかに高い純度を示し、心筋細胞は、アッセイ形式に準拠する細胞培養容器上に直接移すことができた。
【０１２８】
分化32日目に凍結した心筋細胞を解凍すると、生存率は非常に低く、多くの細胞が失われた。これは、この段階での細胞の増殖率の低さが解凍後の心筋細胞の低い復元性をもたらすためである。
【０１２９】
発明者らは、多能性細胞由来の心筋細胞を凍結するための最適時間が分化18日目の精製後であったことを突き止めた。この段階での復元率は、平均で85％を上回るαアクチニンおよびトロポニンT陽性細胞であり、心筋細胞は依然として増殖し、アッセイ開発のために細胞をさらに用いるための最適条件を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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