(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘキシュロース６−リン酸シンターゼ、ホスホヘキシュロースイソメラーゼ、及びメタノール脱水素酵素をコードする外因性の遺伝子を含む形質転換体又はその無細胞抽出液をバイオマス由来物質に作用させる、メタノールの製造方法。
【請求項２】
ヘキシュロース６−リン酸シンターゼ、ホスホヘキシュロースイソメラーゼ、及びメタノール脱水素酵素が、メタノール資化性菌由来である、請求項１に記載のメタノールの製造方法。
【請求項３】
ヘキシュロース６−リン酸シンターゼ及びホスホヘキシュロースイソメラーゼが融合酵素として発現される、請求項１又は２に記載のメタノールの製造方法。
【請求項４】
メタノール資化性菌が、バチルス属細菌、メチロフィラス属細菌、マイコバクテリウム属細菌、及びメチロバチルス属細菌から選ばれるいずれかの菌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のメタノールの製造方法。
【請求項５】
形質転換体が、大腸菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、及び酵母から選ばれるいずれかの微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のメタノールの製造方法。
【請求項６】
バイオマス由来物質が糖類を含むバイオマス由来物質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のメタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタノール資化性菌由来の酵素を発現しうる形質転換体を利用したバイオマスからのメタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマスを利用してガソリンやディーゼルオイルなどのバイオ燃料を製造する技術が注目されている。微生物等を利用したバイオプロセスは、常温常圧で効率的な反応が可能であり、環境負荷が小さいという点で優れた方法である。
【０００３】
メタノールは、燃料をはじめ、さまざまな化学物質の合成原料（いわゆるＣ１ケミストリー）として汎用されている。石炭等の化石原料やバイオマスから、熱化学的方法により合成ガスを生成し、これをメタノールに変換し、精製することによるメタノールの製造方法は古くから知られており、現在もその改良が進められている（特許文献１、２、３）。バイオマスから変換されて得られたメタノールは、バイオメタノールとも呼ばれている。
【０００４】
バイオプロセスを用いたメタノールの製造方法としては、メタンからメタン資化性菌の遺伝子を利用してメタノールに変換する方法（特許文献４、５）が報告されている。
【０００５】
また、Ｘｉｎらは、メタン資化性菌の休止菌体を用いて二酸化炭素がメタノールに変換されること、及びメタン資化性菌を培養して予め細胞内にポリヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ：細胞内貯蔵物質)を蓄積させておいた場合にメタノールが効率的に生産されることを報告している（非特許文献１）。Ｘｉｎらの方法において用いられた二酸化炭素はバイオマス由来の化合物として得られるが、二酸化炭素からメタノールに変換される際の還元力を得るためには、予め細胞内にポリヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ：細胞内貯蔵物質)を蓄積させておくなどの工程が必要となる。
【０００６】
Ｍｕｌｌｅｒらは、Bacillus methanolcus由来のメチル化酵素（ヘキシュロース6-リン酸、ホスホヘキシュロースイソメラーゼ、メタノールデヒドロゲナーゼ）を導入した大腸菌を用いたメタノールの変換について報告している（非特許文献２）。
【０００７】
しかしながら、これまで、グルコースをはじめとする糖類などのバイオマス由来物質からバイオプロセスによりメタノールを生産する方法は知られていない。これが可能になれば、バイオプロセスによるバイオマス由来のメタノールの生産が可能になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−２４０８７８号
【特許文献２】特開２００５−７５７６１号
【特許文献３】特開２０１０−６７１０号
【特許文献４】特開２００５−１３０４８号
【特許文献５】特開２００５−９５００２号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J-Y, Xin et al. J. Basic Microbiol. (2007) 47: 426-435. Methanol production from CO2 by resting cells of the methanotrophic bacterium Methylosinus trichosporium IMV 3011.
【非特許文献２】Muller et al., Metablic Engineering 28 (2015) 190-201, Engineering Escherichia coli for methanol conversion.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、グルコースなどの糖類を含むバイオマス由来物質からバイオプロセスによりメタノールを生産するための手段を提供し、これによりバイオマスからのバイオメタノールの製造を可能にすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
メタノール資化性細菌のリブロースモノリン酸経路では、ヘキシュロース6-リン酸シンターゼによってホルムアルデヒドがリブロース5-リン酸と縮合し、生成したヘキシュロース6-リン酸（ＨＰＳ）がホスホヘキシュロースイソメラーゼ（ＰＨＩ）によって、解糖系代謝物であるフルクトース6-リン酸（Ｆ６Ｐ）へと異性化される。
【００１２】
発明者らは、リブロースモノリン酸経路の逆反応によるＦ６Ｐからのホルムアルデヒドの生成と、ホルムアルデヒドからのメタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）によるメタノール生成を組み合わせることにより、解糖系代謝物からのメタノールの生成が可能ではないかと考えた。そして、大腸菌に、リブロースモノリン酸経路の２種の酵素遺伝子(ＨＰＳ及びＰＨＩ)及びＭＤＨ遺伝子を導入した組換え体を作製し、本組換え体を、グルコースを炭素源として培養することにより、メタノールを生成させることに成功した。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（７）に関する。
（１）ヘキシュロース６−リン酸シンターゼ、ホスホヘキシュロースイソメラーゼ、及びメタノール脱水素酵素をコードする外因性の遺伝子を含む形質転換体又はその無細胞抽出液をバイオマス由来物質に作用させる、メタノールの製造方法。
（２）ヘキシュロース６−リン酸シンターゼ、ホスホヘキシュロースイソメラーゼ、及びメタノール脱水素酵素が、メタノール資化性菌由来である、上記（１）に記載の方法。
（３）ヘキシュロース６−リン酸シンターゼ及びホスホヘキシュロースイソメラーゼが融合酵素として発現される、上記（１）又は（２）に記載のメタノールの製造方法。
（４）メタノール資化性菌が、バチルス属細菌、メチロフィラス属細菌、マイコバクテリウム属細菌、及びメチロバチルス属細菌から選ばれるいずれかの菌である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のメタノールの製造方法。
（５）形質転換体が、大腸菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、及び酵母から選ばれるいずれかの微生物である、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載のメタノールの製造方法。
（６）バイオマス由来物質が糖類を含むバイオマス由来物質である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のメタノールの製造方法。
（７）ヘキシュロース６−リン酸シンターゼ、ホスホヘキシュロースイソメラーゼ、及びメタノール脱水素酵素をコードするメタノール資化性菌由来の遺伝子を含む形質転換体。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、グルコースなどのバイオマス由来物質からバイオプロセスによりメタノールを生産することができる。バイオプロセスは環境への負荷が小さく、得られるメタノールは、さまざまな化成品の合成原料として利用価値が高い。
【００１５】
従来、バイオプロセスを用いたバイオマスからのメタノールの生産では、酸化レベルの高い二酸化炭素を直接の原料とするため、別途還元力の生成と利用の仕組みを用意する必要があった。本発明では、グルコースを原料とすることにより、エネルギーの供給代謝が効率的であり、酸化還元バランスの調整がより容易になるという利点もある。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、メタノール資化性菌における、メタノール資化経路（リブロースモノリン酸経路）の概略を示す（略号：HPS：3-hexulose 6-phosphate synthase、PHI：6-phospho 3-hexuloisomerase、MDH：Methanol dehydrogenase、F6P：Fructose 6-phosphate、Hu6P：Hexulose 6-phosphate、Ru5P：Ribulose 5-phosphate、）
【図２】図２は、無細胞抽出液を用いた実験結果を示す。図中、中央の表は、その上に示した反応における酵素活性（比活性）を示す。下の画像は、ウェスタンブロッティングによるHPS-PHI、MDHの発現を示す。
【図３】図３は、連続反応活性の温度依存性（左：25℃、37℃、50℃）と、pH依存性（右：pH5.5、6.5、7.5）を示す。温度を上げていくと、それにともなって活性の上昇が見られたが、pHは測定範囲ではほとんど差は見られなかった。1 Unitは１分間に1μmolのNADHを減少させる反応を触媒する酵素量を示す。
【図４】図４は、休止菌体反応によるF6Pからのメタノール生成を、ガスクロマトグラフィーで分析した結果を示す。発現株ではメタノールのピークが8時間のインキュベートで大きくなったのに対し、非発現株ではそれが見られなかったことから、F6Pから実際にメタノールが生成したことが、強く示唆された。
【図５】図５は、菌体反応によるグルコースからのメタノール生成を、ガスクロマトグラフィーで分析した結果を示す。７日目にメタノールの生成が確認された。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、外因性（好ましくはメタノール資化性菌由来）のヘキシュロース６−リン酸シンターゼ、ホスホヘキシュロースイソメラーゼ、及びメタノール脱水素酵素を発現可能な形質転換体又はその無細胞抽出液を利用したメタノールの製造方法に関する。
【００１８】
（形質転換体）
本発明の形質転換体は、ヘキシュロース６−リン酸シンターゼ、ホスホヘキシュロースイソメラーゼ、及びメタノール脱水素酵素をコードする外因性（例えば、メタノール資化性菌由来）の遺伝子を含むことを特徴とする。
【００１９】
「ヘキシュロース６−リン酸シンターゼ（ＨＰＳ：3-hexulose 6-phosphate synthase）」及び「ホスホヘキシュロースイソメラーゼ（ＰＨＩ：6-phospho 3-hexuloisomerase）」は、メタノール資化性菌のメタノール資化経路のひとつであるリブロースモノリン酸経路の鍵となる酵素である（図１参照）。
【００２０】
前記経路において、ＨＰＳは、ホルムアルデヒドをリブロース５−リン酸（Ｒｕ５Ｐ）と縮合し、ヘキシュロース６−リン酸（Ｈｕ６Ｐ）を生成させ、ＰＨＩは、ヘキシュロース６−リン酸を、フルクトース６−リン酸（Ｆ６Ｐ）へと異性化する反応を触媒する。このＨＰＳとＰＨＩが触媒する反応は、特殊な補因子やエネルギーの投入を必要としないため、異種生物で機能させることが容易であるという利点がある。
【００２１】
「メタノール脱水素酵素（ＭＤＨ：Methanol dehydrogenase）」は、メタノールを還元してホルムアルデヒドを生成する反応を触媒する酵素である。メタノール資化経路では、ＭＤＨによりメタノールから生成したホルムアルデヒドが、前記リブロースモノリン酸経路によりＦ６Ｐへと変換される。
【００２２】
本発明に係る３つの酵素：ＨＰＳ、ＰＨＩ、ＭＤＨはメタノール資化性菌や一部のアーキアに存在する（由里本博也・阪井康能、生物工学  第91巻、第7号、384-387（2013））に存在する。好ましくは、前記酵素はメタノール資化性菌に由来する。メタノール資化性菌としては、リブロースモノリン酸経路を有する菌であれば特に限定されないが、好ましくはBacillus brevisやBacillus subtilis等のバチルス属細菌、Methylophilus methylotrophus等のメチロフィラス属細菌、Mycobacterium gastri等のマイコバクテリウム属細菌、Methylobacillus glycogenes、Methylobacilllus flagellatum等のメチロバチルス属細菌、メチロコッカス属細菌、メチロモナス属細菌、及びメチロバクター属細菌が挙げられる。より好ましくは、バチルス属細菌、メチロフィラス属細菌、マイコバクテリウム属細菌およびメチロバチルス属細菌が挙げられる。本発明の酵素はそれらのいずれに由来するものであってもよい。
【００２３】
３つの酵素は同一の菌に由来するものである必要はなく、異なる細菌に由来するものであってもよい。後述する実施例では、ＨＰＳとＰＨＩはMycobacterium gastri MB19株由来のものを、ＭＤＨはBacillus brevis S1株由来のものを使用している。
【００２４】
ＨＰＳ、ＰＨＩ、ＭＤＨをコードする遺伝子は、例えば、既知の配列情報に従い、プライマーを作製し、メタノール資化性菌のゲノムを増幅することにより得ることができる。あるいは、既知のアミノ酸情報にしたがい、ｃＤＮＡを合成して用いてもよい。導入する遺伝子は、使用する宿主に応じて適宜最適化してもよい。
【００２５】
本発明において、メタノール資化性菌に由来する酵素とは、メタノール資化性菌から単離された天然の酵素と同一のものに限定されず、本発明の目的に反しない範囲で、適当な変異を有する酵素であってもよい。
【００２６】
形質転換体に使用する宿主は、前記酵素を発現することができる限り、特に限定されない。宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ロドコッカス属細菌（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム属細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、放線菌などの細菌、酵母（サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））、糸状菌、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。これらの中でも、大腸菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、及びサッカロマイセス属酵母、キャンディダ属酵母及びピキア属酵母が好ましい。本発明において、宿主はより好ましくは大腸菌である。
【００２７】
大腸菌としては、例えば、大腸菌Ｋ１２株やＢ株、あるいはそれらの野生株由来の派生株であるＷ３１１０株、ＪＭ１０９株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ'）、Ｋ８０２株、Ｃ６００株、ＢＬ２１株などを挙げることができる。
【００２８】
本発明の形質転換体は、ＨＰＳ、ＰＨＩ、及びＭＤＨをコードする上記メタノール資化性菌由来の遺伝子を含む発現ベクターを、宿主に導入して作成される。発現ベクターは、本発明の遺伝子を発現可能な状態で含むものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。発現ベクターの構成については、次項で詳細に述べる。
【００２９】
宿主への発現ベクターの導入方法は、宿主に適した方法であれば特に限定されるものではない。利用可能な方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３０】
本発明において、導入された３つの酵素：ＨＰＳ、ＰＨＩ、ＭＤＨは、メタノール資化経路における反応とは逆の反応を触媒し、Ｆ６Ｐからホルムアルデヒドを経てメタノールを生成させる。
【００３１】
なお、本発明において、ＨＰＳとＰＨＩは融合酵素として発現されてもよい。
自然界において、一部の古細菌は、ＨＰＳ−ＰＨＩ融合酵素を有し、両酵素による連続した反応を触媒すること（Orita, I., et al. (2005) J Bacteriol 187, 3636-3642.）、その逆反応は核酸の生合成に必要な五炭糖の供給反応として機能することが知られている（Orita, I., et al. (2006) J Bacteriol 188, 4698-4704.）。またメタノール資化性細菌Mycobacterium gastri MB19株由来のＨＰＳとＰＨＩをもとに作成された人工融合酵素ＨＰＳ−ＰＨＩもまたホルムアルデヒドとＲｕ５ＰからのＦ６Ｐの生成反応を触媒することが知られている（Orita, I., et al. (2007) Appl Microbiol Biotechnol 76, 439-445.）。
本発明においても、ＨＰＳとＰＨＩを融合酵素として発現させることにより、Ｆ６Ｐからホルムアルデヒドを生成する連続反応を効率よく進行させることが期待できる。
【００３２】
（発現ベクター）
本発明は、ＨＰＳ、ＰＨＩ、及びＭＤＨをコードするメタノール資化性菌由来の遺伝子を含む発現ベクターも提供する。
【００３３】
本発明の発現ベクターは、それぞれＨＰＳ、ＰＨＩ、及びＭＤＨをコードする遺伝子を一緒又は別々に含む。「一緒又は別々に含む発現ベクター」とは、(i)１つのベクター内の同一又は異なるクローニング部位に３つの遺伝子が挿入された発現ベクター、(ii)２つのベクターのうちの一方のベクターに１つの遺伝子が挿入され、他方のベクターに残り２つの遺伝子が同一又は異なるクローニング部位に挿入された発現ベクター、(iii)３つのベクターに３つの遺伝子が１つずつ挿入された発現ベクター、の３つの態様を意味する。
【００３４】
ＨＰＳ及びＰＨＩをコードする遺伝子は融合され、融合タンパク質として発現されてもよい。そのような場合には、上記(i)又は(ii)の態様により、発現ベクターが構築される。
【００３５】
本発明の発現ベクターは、上記酵素をコードする遺伝子の上流に転写プロモーター、場合によっては下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することにより作製することができる。あるいは、発現ベクターに転写プロモーターおよび／またはターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーターおよび／またはターミネーターを利用して、その間に当該酵素をコードする遺伝子を挿入すればよい。
【００３６】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、ＳＤ配列やＫｏｚａｋ配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を遺伝子の上流に挿入することもできる。挿入にともない、遺伝子がコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。
【００３７】
本発明において使用されるベクターは、本発明の遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどが挙げられる。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス）、ｐＡＣＹＣ１８４（ニッポンジーン）、ｐＭＷ１１８（ニッポンジーン）、ｐＥＴシリーズベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）などを挙げることができる。また２以上の挿入箇所を有するベクターとしてはｐＥＴＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ）等を挙げることができる。必要に応じて、これらのベクターを改変したものを用いることもできる。
【００３８】
酵素が由来するメタノール資化性菌の例は前項に記載したとおりである。
【００３９】
本発明の発現ベクターは、前項記載の形質転換体の作成に使用されバイオマスからのメタノールの産生に利用される。
【００４０】
（メタノールの製造）
本発明は、ヘキシュロース６−リン酸シンターゼ、ホスホヘキシュロースイソメラーゼ、及びメタノール脱水素酵素をコードする外因性の遺伝子を含む形質転換体又はその無細胞抽出液をバイオマス由来物質に作用させる、メタノールの製造方法も提供する。
【００４１】
ヘキシュロース６−リン酸シンターゼ、ホスホヘキシュロースイソメラーゼ、及びメタノール脱水素酵素は、メタノール資化性菌由来であることが好ましく、前述した本発明の形質転換体を利用することができる。
【００４２】
「形質転換体」は、形質転換体（菌体又は細胞）を培養液から回収して用いてもよいし、形質転換体を含む培養液をそのまま用いてもよい。
【００４３】
無細胞抽出液は、培養後の菌体を、例えばリン酸ナトリウム緩衝液を加えてホモジナイザーなどで物理的に破砕した後、遠心（15,000rpm, 10min, 4℃）し、破砕できない菌体（細胞）が存在しないように上清を回収して得ることができる。
【００４４】
（バイオマス）
メタノールの原料となるバイオマス由来物質としては、糖類を含むものが好ましい。使用されるバイオマスとしては、例えば、糖質系バイオマス、デンプン系バイオマス、セルロース系バイオマスなどの、糖類を含むか、あるいは糖化可能なバイオマスが挙げられる。例えば、農業残留物、トウモロコシ茎葉、麦わら、バガス、もみ殻、稲わら；廃材および森林残留物、おがくず、紙くず／パルプ廃棄物、木材繊維；藻；クズ；石炭；セルロース、リグニン、草木、リグニン、セルロース、及びヘミセルロース等のリグノセルロースバイオマス；植物バイオマス；またはこれらの混合物を挙げることができる。
【００４５】
上記したバイオマスには、グルコースをはじめとする解糖系代謝物が豊富に含まれていることが望ましい。必要な場合には、適当な前処理を施し、バイオマス内のグルコース等の解糖系代謝物の含有量を高める。
【００４６】
生成したメタノールは、常法にしたがい、製造系から回収し、適宜濃縮、精製することができる。例えば、メタノールを含む培養液より菌体を分離除去した後、蒸留等によりメタノールを分別する。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４８】
本実施例では、メタノール資化性細菌におけるHPS-PHIの逆反応によるホルムアルデヒドの生成、およびBacillus brevis S1 (Bacillus methanolicus S1)株由来メタノール脱水素酵素（MDH）のホルムアルデヒド還元触媒活性を利用して、生物が広く利用している代謝中間体であるF6Pからのメタノール生成系の構築を目指した。人工融合酵素HPS-PHIが触媒する反応により基質F6Pからホルムアルデヒドを遊離させ、次いでMDHのホルムアルデヒドを還元する触媒活性によってメタノールを生成させることを目指した。以下に詳細を記載する。
【００４９】
1. B. brevis S1株のゲノムからのPCR反応によるmdh遺伝子増幅
抽出したB. brevis S1のゲノムを鋳型として、KOD FX Neo DNA ポリメラーゼ(TOYOBO)を用いてmdh遺伝子をPCR反応によって増幅した。MDHのC末端にHis-tagを付加するため、mdh-fw-NheIとmdh-rv-HindIII(Histag)をプライマーとして用いた。増幅された断片をpET23-a(+)にクローニングした（pETmdh-His)。(S1株mdh遺伝子配列は、B. methanolicus C1株の配列と同一：Accession No. M65004)
【００５０】
【表１】
0006663248.tif 000002
【００５１】
2. mdhおよびhps-phiを同時発現する大腸菌株の取得
pETmdh-Hisを鋳型とし、プライマーmdh-fw-NcoI、mdh-His-rv-EcoRIを用いてPCRで増幅した。このPCR産物と制限酵素NcoI、EcoRIを用いてpETDuet-1のふたつのマルチクローニングサイトの一方にmdh遺伝子を挿入し、pDmHを得た。
【００５２】
次にpEThps-phi（Orita, I., et al. (2007) Appl Microbiol Biotechnol 76, 439-445.）を鋳型とし、hps-phi配列をプライマーMhMp-BglII、MhMp-KpnIを用いてPCRで増幅した。このPCR産物と制限酵素BglII、KpnIを用いてpDmHのもう一方のマルチクローニングサイトにhps-phi遺伝子を挿入し、pDmHhpを得た。
【００５３】
pETDuet-1およびpDmHhpをそれぞれE. coli Rosetta (DE3)に形質転換し、E. coli [pETDuet]およびE. coli [pDmHhp]を得た。
【００５４】
【表２】
0006663248.tif 000003
【００５５】
3. 発現誘導
E. coli [pETDuet]およびE. coli [pDmHhp]のコロニーからそれぞれ5 mLのLB培地(アンピシリン50 μg/mL、クロラムフェニコール30 μg/mL)に植菌し、37℃で14時間30分、振とう培養した。その培養液から同じ組成の培地100 mL 2本ずつにODが0.05となるように植え継ぎ、さらに2時間30分、37℃で振とう培養した。ODが0.4〜0.6に達した時点で培養液を氷冷し、IPTGを0.5 mMになるように加えた。これを16℃でさらに16時間培養した。
【００５６】
4. 無細胞抽出液の調製
培養液を4℃、8,000 rpmで5分間遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を30 mLの0.9 % NaCl水溶液に懸濁した後、再度同様の遠心分離を行って上清を捨てる操作を2回繰り返し、菌体を洗浄した。洗浄した菌体をバッファー(A) 4 mLに懸濁し、フレンチプレスを用いて細胞破砕を行った。この菌体破砕液を4℃、10,000 gで10分間遠心分離し、上清を回収した。残ったペレットをバッファー(A) 2 mLに懸濁し、同様に細胞破砕と上清の回収を行った。得られた上清を合一し、透析によるバッファー置換を行った。透析後、透析膜中の液を回収し、これを無細胞抽出液とした。
【００５７】
【表３】
0006663248.tif 000004
【００５８】
5. HPS-PHI活性の測定
rHps-PhiのHPS-PHI活性を既報（前掲Orita, I., et al. (2007)）に従って測定した。すなわち、生成したF6Pをまずホスホグルコースイソメラーゼ(PGI)反応によりグルコース6-リン酸(G6P)に異性化し、G6Pから6-ホスホグルコノラクトン(PGL)の形成を行うグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ(G6PDH)反応に伴うNADPH増加量を、340 nmの吸光度を測定することにより評価した。
【００５９】
6. FRD活性の測定
MDHのホルムアルデヒドレダクターゼ(FRD)活性の測定法をScheme 1に示した。FRD活性は反応液中のNADH量の変化、すなわち340 nmの吸光度の減少を分光光度計で測定することで評価した。酵素単位は、1分間に1 μmolのNADHをNAD+に変化させる酵素量を 1 unit (U)とし、タンパク質1 mgあたりのunit数を比活性(U/mg protein)とした。測定は37 ℃で行った。
【００６０】
【表４】
0006663248.tif 000005
【００６１】
＜F6Pからのメタノールの生成＞
7. HPS-PHIおよびMDH同時発現大腸菌の無細胞抽出液によるメタノール生成反応
無細胞抽出液を用い、F6Pからメタノールを生成させられるかどうかを評価した。その測定法をScheme 2に示す。メタノール生成反応活性は、NADH量の減少を340 nmの吸光度を測定することで評価し、反応開始直後のNADH量の1分間あたりの減少率をもとに、6と同様に酵素比活性を算出した。
【００６２】
【表５】
0006663248.tif 000006
【００６３】
上記5〜7に記載した方法により測定したHPS-PHI活性、FRD活性、NADH量減少率に基づく連続反応における酵素比活性を、図２（中央の表）に示した。ウェスタンブロッティングにより、HPS-PHI、MDHの発現を確認した結果を、図２（下の電気泳動図）に示した。
【００６４】
また、連続反応による活性の温度依存性（25℃、37℃、50℃）とpH（pH5.5、6.5、7.5）依存性を調べ、その結果を図３に示した。温度を25℃、37℃、50℃と上げていくと、それにともなって活性の上昇が見られた。一方、pHは5.5、6.5、7.5という3つの条件で測定したが、この範囲ではほとんど差は見られなかった。
【００６５】
＜グルコースからのメタノールの生成＞
8. 休止菌体反応を用いたメタノール生成
発現誘導した培養液から20 OD unit分を分取し、4℃、8、000 rpmで5分間遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を10 mLの0.9 % NaCl水溶液に懸濁した後、再度同様の遠心分離を行って上清を捨てる操作を2回繰り返し、菌体を洗浄した。洗浄した菌体を5 mLのbuffer（100 mM KPB (pH 6.5), 5 mM MgCl2）に懸濁し、ODを約4に調整した。この菌体懸濁液500 μLとreaction solution (200 mM F6P, 3 mM NADH) 500 μLを混合し、これを休止菌体反応液とした。サーモシェーカーBSR-MSC100(Hangzhou Allsheng Instruments)を37℃、500 rpmに設定し、各休止菌体反応液の入ったチューブをセットして反応を開始させた。反応開始から1、2、4、8時間後に各チューブから100 μLをサンプリングし、氷上の微量遠心チューブに移した。これを4℃、15,000 rpmで1分間遠心分離して得た上清をガスクロマトグラフィー試料として-20℃で保存した。
【００６６】
9. ガスクロマトグラフィーによるメタノールの検出
反応液中のメタノールの検出をガスクロマトグラフィー（Shimadzu GC14B)
によって行った。カラムにはPorapak Qを用い、オーブン温度：120℃、インジェクション温度：180℃、ディテクション温度：180℃、測定時間6分間の条件で行った。
【００６７】
結果を図４に示す。基質として用いたF6Pには、不純物としてメタノールが混入していたため、70%アセトニトリルへの溶解と、遠心減圧処理を行った。これにより大部分のメタノールを除去できたが、メタノールのピークがわずかに残った。休止菌体反応の結果、発現株ではメタノールのピークが8時間のインキュベートで大きくなったのに対し、非発現株ではそれが見られず、HPS-PHIおよびMDHによって、F6Pから実際にメタノールが生成したことが、強く示唆された。
【００６８】
10.菌体反応によるグルコースからのメタノール生成
発現誘導した菌体を洗浄後、OD610 = 0.5, 1, 2となるようにM9培地（2％グルコース含）10mLに懸濁した。15 mLチューブで37℃ウォーターバス中で緩やかに振とうし、200 μLずつサンプリングし、培養上清中のメタノール濃度をガスクロマトグラフィーで測定した。結果を図５に示す。このように、7日後の培養上清にメタノール生成が認められた。
【００６９】
本発明は、グルコース等の解糖系代謝物からバイオプロセスによりメタノールを生産するための手段を提供し、これによりバイオマスからのバイオメタノールの製造を可能にすることを目的とする。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、バイオプロセスによるバイオマスからのメタノール生産に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
配列番号１：プライマー（mdh-fw-NheI）
配列番号２：プライマー（mdh-rv-HindIII(Histag)）
配列番号３：プライマー（mdh-fw-NcoI）
配列番号４：プライマー（mdh-His-rv-EcoRI）
配列番号５：プライマー（MhMp-BglII）
配列番号６：プライマー（MhMp-KpnI）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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