(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着性止血製品を調製する方法であって、
多孔質固体基材を用意するステップと、
前記基材を、求電子的に活性化させたポリオキサゾリン（ＥＬ−ＰＯＸ）及び溶媒を含むコーティング液でコーティングして、コーティング済み基材を生成するステップであって、前記ＥＬ−ＰＯＸが少なくとも１０個の反応性求電子基を含有する、ステップと、
前記コーティング済み基材から前記溶媒を除去するステップと
を含み、
前記固体基材が、長さが１０〜２００ｍｍ、幅が５〜２００ｍｍ、厚さが０．５〜１０ｍｍであるシートの形態のメッシュ又はフォームである、方法。
【請求項２】
前記固体基材が、少なくとも２０体積％の多孔性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基材が、反応性求核基を含有する求核ポリマーを含む外表面を備える、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記求核ポリマーが、タンパク質、キトサン、及び合成ポリマー又は炭水化物ポリマーから選択され、かつ前記反応性求核基が、アミン、チオール、ホスフィン、及びこれらの組合せから選択され得る、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記コーティング液で前記基材をコーティングした後、前記溶媒を除去する前及び／又はその間に、前記ＥＬ−ＰＯＸの反応性求電子基が、共有結合の形成中に前記基材の表面に存在する求核ポリマーの反応性求核基と反応する、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記基材が、前記コーティング液を超音波ノズルで前記基材上に噴霧することによりコーティングされる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＬ−ＰＯＸが、カルボン酸エステル、スルホネートエステル、ホスホネートエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、ｐ−ニトロチオフェニルエステル、酸ハロゲン化物基、無水物、ケトン、アルデヒド、イソシアナート、チオイソシアナート、イソシアノ、エポキシド、活性化ヒドロキシル基、オレフィン、グリシジルエーテル、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スクシンイミジルカーボネート、スクシンイミジルカルバメート、スルホスクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルカーボネート、マレイミド（マレイミジル）、エテンスルホニル、イミドエステル、アセトアセテート、ハロアセタール、オルトピリジルジスルフィド、ジヒドロキシフェニル誘導体、ビニル、アクリレート、アクリルアミド、ヨードアセトアミド、及びこれらの組合せから選択される少なくとも２個の反応性求電子基を含有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記コーティング液が、２−プロパノール、エチルアルコール、メタノール、ジクロロメタン、アセトン、アニソール、１−ブタノール、２−ブタノール、酢酸ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、クメン、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、エチルエーテル、蟻酸エチル、ヘプタン、酢酸イソブチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、３−メチル−１−ブタノール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２−メチル−１−プロパノール、ペンタン、１−ペンタノール、１−プロパノール、酢酸プロピル、及びこれらの組合せから選択される少なくとも５０重量％の溶媒を含有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＥＬ−ＰＯＸが、前記コーティング液に溶解されており、前記コーティング液が、分散された、溶解されていない緩衝系を含有し、前記コーティング液が、７〜１１の範囲内の緩衝ｐＨ及び少なくとも１０ｍｍｏｌ．ｌ−１．ｐＨ−１の緩衝能を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＥＬ−ＰＯＸが、前記コーティング液に溶解されており、前記方法が、前記基材が前記ＥＬ−ＰＯＸ含有コーティング液でコーティングされる前に、前記基材を緩衝液で被覆することを含み、前記緩衝液が、７〜１１の範囲内の緩衝ｐＨ及び少なくとも１０ｍｍｏｌ．ｌ−１．ｐＨ−１の緩衝能を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記コーティング液に存在する前記ＥＬ−ＰＯＸの少なくとも８０重量％が、前記コーティング液で前記基材をコーティングした際に溶解されておらず、かつ前記コーティング液が溶解された又は溶解されていない緩衝系を含有し、前記コーティング液が、７〜１１の範囲内の緩衝ｐＨ及び少なくとも１０ｍｍｏｌ．ｌ−１．ｐＨ−１の緩衝能を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶媒を除去した後、前記ＥＬ−ＰＯＸが、平均して少なくとも１個の反応性求電子基を含有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
コーティング済みメッシュ、又はコーティング済みフォームから選択される接着性止血製品であって、
少なくとも５体積％の多孔性を有し、反応性求核基を含有する求核ポリマーを含む外表面を備える多孔質固体基材と、
前記固体基材の少なくとも一部を被覆する接着性コーティングであって、前記コーティングが、求電子的に活性化させたポリオキサゾリン（ＥＬ−ＰＯＸ）を含み、前記ＥＬ−ＰＯＸが、平均して少なくとも１０個の反応性求電子基を含有する、コーティングとを含む接着性止血製品。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の技術分野］
本発明は、多孔質固体基材と、求電子的に活性化させたポリオキサゾリン（ＥＬ−ＰＯＸ）を含有するコーティングとを含む、組織接着性止血製品に関する。この新規止血製品は、優れた生分解性、接着性、及び止血特性を示す。本発明により包含される止血製品の例として、止血メッシュ、止血フォーム、及び止血粉末が挙げられる。
【０００２】
また、多孔質固体基材を、求電子的に活性化させたポリオキサゾリン（ＥＬ−ＰＯＸ）でコーティングすることを含む、組織接着性止血製品を調製するための方法が提供される。
【０００３】
［発明の背景］
創傷被覆材は、世界的な創傷ケア市場の重要な部分を構成する。これらの製品は、創傷、出血、損傷した組織、及び出血している組織等の傷害の処置で広く使用されている。理想的な被覆材は、適正なコストで、過度の出血を防ぎ、迅速な治癒を促進し、患者にとっての不便が最小限であるべきである。
【０００４】
創傷被覆材の止血特性は、材料の生地及び多孔性により決定される。多孔性に関しては、被覆材の細孔は通常、非常に小さいので、それらは一見しただけでは肉眼で見えない。しかしながら、それらは皮膚の水分及び創傷蒸気の十分な蒸発を可能にするのみでなく、血液の吸収を可能にするのにも十分な大きさであるので、血液が凝固すると、被覆材は組織にしっかりと固定されるようになる。
【０００５】
創傷被覆材は、創傷の周囲の水分環境、細胞及び組織の再生を助けるための有効な酸素循環、並びに低い細菌負荷を維持することが可能であるべきである。手術中に使用され、体内に残る創傷被覆材は、生分解性かつ完全再吸収性であるべきである。
【０００６】
従来の組織接着性創傷被覆材として、フィブリンシーラント、シアノアクリレート含有シーラント、及び他の合成シーラント、並びに重合性モノマーが挙げられる。これらの組織接着剤は、毒性分解産物の放出、高いコスト、冷蔵保存の必要性、遅い治癒、限定された機械的強度、及び感染の危険性を含むいくつかの欠点のために、特定の用途にのみ好適である。それゆえ、ハイドロゲル組織接着剤が、反応性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）前駆体に基づいて開発された。しかしながら、これらのハイドロゲル組織接着剤は、あまりにも速く膨潤若しくは分解するか、又は十分な凝集力を欠き、これにより外科用接着剤としてのそれらの有効性を低減する。更に、かかるＰＥＧ含有材料の特性は、容易に制御することができない。
【０００７】
止血粉末は、広く使用されている止血製品の別の例である。血止め粉末としても知られる市販されている止血粉末の例として、吸着性止血ゼラチン粉末（Ｓｐｏｎｇｏｓｔａｎ（登録商標）粉末）、及びＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）としても知られるゼオライトのカルシウム吸着形態が挙げられる。これらの止血粉末は、重度の出血を停止させるために使用することができる。
【０００８】
米国特許第５，６１４，５８７号は、組織の付着、又は合成インプラント材料への組織の付着で有用なコラーゲン含有組成物を説明している。上記組成物は、フィブリル状コラーゲン、繊維解体剤、及びポリエチレングリコール等の多機能的活性化合成親水性ポリマーを含み、上記コラーゲン及び合成ポリマーは共有結合して、コラーゲン−合成ポリマーコンジュゲートを形成する。
【０００９】
国際公開第２００４／０２８４０４号は、乾燥状態で提供される、合成コラーゲン又は合成ゼラチン及び求電子性架橋剤からなる組織シーラントを説明している。この国際公開では、架橋剤は、求電子的に活性化させた（ＥＡ）ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はＰＥＧスクシンイミジルエステル等のＥＡ  ＰＥＧ誘導体、特にＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、ＰＥＧスクシンイミジルブタノエート、若しくはＰＥＧスクシンイミジルグルタレートを含む。適切なｐＨでこの組成物を湿らせると、２つの構成成分の間で反応が起こり、密閉特性を有するゲルが形成される。
【００１０】
米国特許出願公開第２０１１／０２５１５７４号は、生体材料のマトリックス、及び反応基を含む親水性ポリマー構成成分を含む、止血多孔質複合スポンジを説明しており、上記ポリマー構成成分で上記生体材料マトリックスの表面をコーティングするか、若しくは上記マトリックスを上記ポリマー材料で飽和させるか、又はこれらの両方である。好ましい実施形態では、上記ポリマーは、ポリアルキレンオキシドポリマー、より詳細には多求電子性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。上記マトリックス材料は、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、多糖（キトサン等）、合成生分解性生体材料（ポリ乳酸又はポリグリコール酸等）、及びこれらの誘導体から選択することができる。
【００１１】
米国特許出願公開第２０１０／０６９５７９号は、末端で活性化させたポリオキサゾリン（ＰＯＺ）化合物を説明しており、上記ＰＯＺ化合物は、その末端に単一の活性官能基を有するＰＯＺポリマーを含み、上記官能基は、標的分子上の基と反応して、標的分子−ＰＯＺコンジュゲートを創出することができ、上記標的分子と上記ＰＯＺ化合物との間の全ての結合は、加水分解に対し安定な結合である。
【００１２】
国際公開第２０１２／０５７６２８号は、天然組織に存在する求核試薬含有化学物質と反応することができる求電子基の存在のために、組織接着特性を有する架橋ポリオキサゾリンポリマーを説明している。
【００１３】
改善された特性を有する組織接着性止血製品を提供することが本発明の目的である。
【００１４】
［発明の概要］
本発明者らは、改善された特性を有する組織接着性止血製品が、
多孔質固体基材を用意するステップと、
上記基材を、求電子的に活性化させたポリオキサゾリン（ＥＬ−ＰＯＸ）及び溶媒を含むコーティング液でコーティングして、コーティング済み基材を生成するステップであって、上記ＥＬ−ＰＯＸが少なくとも２個の反応性求電子基を含有する、ステップと、
上記コーティング済み基材から上記溶媒を除去するステップと
を含む方法により生成することができることを発見した。
【００１５】
本発明者らは、ＥＬ−ＰＯＸが、本方法の手段により、驚くべきことに、基材の多孔質構造に悪い影響を与えることなく多孔質固体基材上に適用することができることを発見した。本方法は、基材の細孔構造を大部分無傷なまま残すため、多孔質基材が血液等の体液を吸収する能力が本質的に影響されないままである、ＥＬ−ＰＯＸコーティングの適用を可能にする。本方法により得られたＥＬ−ＰＯＸコーティング済み止血製品は、共有結合の形成中に、例えば組織に天然に存在するアミン基と反応することができる求電子反応基の存在のために、優れた接着特性を有する。
【００１６】
また、本発明は、コーティング済みメッシュ、コーティング済みフォーム、及びコーティング済み粉末から選択される組織接着性止血製品を提供し、上記止血製品は、
少なくとも５体積％の多孔性を有し、反応性求核基を含有する求核ポリマーを含む外表面を備える多孔質固体基材と、
上記固体基材の少なくとも一部を被覆する接着性コーティングであって、上記コーティングが、求電子的に活性化させたポリオキサゾリン（ＥＬ−ＰＯＸ）を含み、上記ＥＬ−ＰＯＸが、平均して少なくとも１個の反応性求電子基を含有する、接着性コーティングと
を含む。
【００１７】
上記止血製品のコーティングに含有されるＥＬ−ＰＯＸポリマーは、ＥＬ−ＰＯＸポリマーが、各々が求電子反応基のうちの１つ又は複数を有することができる多数のペンダント基を含有することができるという事実のために、多数の求電子反応基を有することができるという利点を提供する。したがって、上記止血製品の接着特性は、最適な求電子基密度を有するＥＬ−ＰＯＸを選択することにより、ある特定の用途のために最適化することができる。また、親水性／疎水性バランス及びより低い臨界共溶温度等のＥＬ−ＰＯＸの他の特性は、上記ペンダント基の濃度及び／又は特性を改変することにより好適に最適化することができる。
【００１８】
［発明の詳細な説明］
したがって、本発明の一態様は、組織接着性止血製品を調製する方法に関し、上記方法は、
多孔質固体基材を用意するステップと、
上記基材を、求電子的に活性化させたポリオキサゾリン（ＥＬ−ＰＯＸ）及び溶媒を含むコーティング液でコーティングして、コーティング済み基材を生成するステップであって、上記ＥＬ−ＰＯＸが、少なくとも２個の反応性求電子基を含有する、ステップと、
上記コーティング済み基材から上記溶媒を除去するステップと
を含む。
【００１９】
本明細書で使用される「組織接着性」という用語は、上記止血製品と組織との間での共有結合の形成のために、止血製品が組織に張り付く能力を指す。本組織接着性止血製品の場合、組織への接着は、水の存在を必要とする場合がある。
【００２０】
本明細書で使用される「多孔質」という用語は、別に示されない限り、止血製品が、製品への液体の進入を可能にする細孔及び／又は割れ目を含むことを意味する。
【００２１】
「多孔性」という用語は、基材又は止血製品の空隙（すなわち、「空の」）容積部の尺度を指し、総体積にわたる空隙の体積割合である。本発明の止血製品の多孔性は、気体吸着分析等の本分野で既知の方法により好適に測定することができる。気体吸着分析は、固体多孔質材料を様々な条件で気体又は蒸気に曝露し、試料体積における重量取り込み又は変化のいずれかを評価することを含む。これらのデータの分析は、骨格密度、多孔性、及び全細孔容積を含む上記固体の物理的性質についての情報を提供する。骨格密度は典型的には、ヘリウムピクノメトリー実験により評価され、閉鎖した多孔性がない場合の材料の真の固体密度を表す。基材が２つ以上の品目からなる場合、多孔性は個々の品目の平均多孔性を指すことが理解されるべきである。したがって、基材が多孔質粉末である場合、多孔性は、細孔により占有される多孔質粒子の体積の割合に等しい。
【００２２】
本明細書で使用される「平均細孔サイズ」という用語は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により測定される平均細孔直径を指す。好適な方法は、Ｆａｒａｊら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００７、１３、１０、２３８７〜２３９４ページで説明されている。
【００２３】
本明細書で使用される「吸水能」という用語は、多孔質固体基材が水を吸収する能力の尺度である。多孔質固体基材の吸水能は、乾燥多孔質基材の試料を計量し（重量＝Ｗｄ）、続いて上記多孔質基材を蒸留水（３７℃）に４５分間浸漬することにより測定される。次に、試料を水から除去し、基材の外側に張り付いている水を除去し、その後、試料を再び計量する（重量＝Ｗｗ）。吸水能＝１００％×（Ｗｗ−Ｗｄ）／Ｗｄ。吸水能は、基材の多孔性の指標、及び水の存在下で膨潤する基材の能力の指標である。
【００２４】
本明細書で使用される「ポリオキサゾリン」という用語は、ポリ（Ｎ−アシルアルキレンイミン）又はポリ（アロイルアルキレンイミン）を指し、ＰＯＸとも更に呼ばれる。ＰＯＸの例は、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）である。また、「ポリオキサゾリン」という用語は、ＰＯＸコポリマーを包含する。
【００２５】
「求電子基」という用語は、求核基からの求核攻撃を受けやすく、かつ共有結合の形成中にかかる求核基と反応することができる官能基を指す。求電子基は典型的には、正電荷を帯びた状態、及び／又は電子／不足の状態である。
【００２６】
「求核基」という用語は、求電子基からの求電子攻撃を受けやすく、かつ共有結合の形成中に求電子基と反応することができる官能基を指す。求核基は典型的には、電子が豊富であり、反応部位として働く非共有電子対を有する。
【００２７】
「活性させた」という用語は、別に示されない限り、新規反応性官能基を発生させるか、又は導入するためのポリマーの改変を指し、上記新規反応性官能基は、別の官能基との反応を受けて、共有結合を形成することができる。
【００２８】
本明細書で使用される「架橋した」という用語は、共有結合により分子間結合させたポリマー等の構成要素を指す。２つの架橋可能な構成要素間の共有結合は直接的であっても、結合基を通して間接的であってもよい。
【００２９】
本明細書で使用される「緩衝系」という用語は、水系で使用して、溶液をある特定の緩衝ｐＨに駆動することができる物質又は物質の組合せを指し、上記緩衝系は、この緩衝ｐＨでの変化を防ぐ能力を有する。
【００３０】
本明細書で使用される、液体の「緩衝ｐＨ」は、液体を蒸留水で１０倍希釈した後に測定される２０℃でのｐＨ値を指す。
【００３１】
本明細書で使用される「緩衝能」は、液体がｐＨ変化に抵抗する能力を指す。液体（コーティング液又は緩衝液）の緩衝能βは、蒸留水での１０倍希釈後に２０℃で測定され、ｍｍｏｌ．ｌ−１．ｐＨ−１で表される。緩衝能は、以下のように定義される：
【００３２】
【数１】
0006683398.tif 000002
式中、ｄｎは、添加した塩基の微分量であり、ｄ（ｐ［Ｈ＋］）は、水素イオン濃度の余対数における得られる微分変化である。
【００３３】
本発明に従って使用されるＥＬ−ＰＯＸは、繰り返し単位が以下の式（Ｉ）：
（ＣＨＲ１）ｍＮＣＯＲ２
により表されるポリオキサゾリンに由来することが好ましく、Ｒ２、及びＲ１の各々は独立して、Ｈ、任意選択で置換されるＣ１〜２２アルキル、任意選択で置換されるシクロアルキル、任意選択で置換されるアラルキル、任意選択で置換されるアリールから選択され、ｍは２又は３である。
【００３４】
好ましい実施形態に従って、ポリオキサゾリンはポリマーであり、２−アルキル−２−オキサゾリンのホモポリマーであることが更により好ましく、上記２−アルキル−２−オキサゾリンは、２−メチル−２−オキサゾリン、２−エチル−２−オキサゾリン、２−プロピル−２−オキサゾリン、２−ブチル−２−オキサゾリン、及びこれらの組合せから選択される。ポリオキサゾリンは、２−プロピル−２−オキサゾリンのホモポリマーであることが好ましく、２−エチル−オキサゾリンのホモポリマーであることがより好ましい。
【００３５】
ＥＬ−ＰＯＸは、側鎖に（ペンダント求電子基とも呼ばれる）、末端に、又はこれらの両方に、求電子基を有することができる。末端の、エンドキャップされたＥＬ−ＰＯＸの例は、ＣＨ３Ｏ−ＰＯＸ−Ｏ２Ｃ−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ２ＣＯ２−ＮＨＳ）３のようなスクシンイミジルスクシネートエステルである。側鎖活性化ＥＬ−ＰＯＸの例は、アルキル側鎖にＮＨＳ基を含有するＰＯＸである。ＥＬ−ＰＯＸの更に別の例は、ＮＨＳ−エステルで終端を官能化した星形ＰＯＸポリマーである。
【００３６】
ＥＬ−ＰＯＸに存在する求電子基は、カルボン酸エステル、スルホネートエステル、ホスホネートエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、ｐ−ニトロチオフェニルエステル、酸ハロゲン化物基、無水物、ケトン、アルデヒド、イソシアナート、チオイソシアナート（イソチオシアナート）、イソシアノ、エポキシド、活性化ヒドロキシル基、オレフィン、グリシジルエーテル、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スクシンイミジルカーボネート、スクシンイミジルカルバメート、スルホスクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルカーボネート、マレイミド（マレイミジル）、エテンスルホニル、イミドエステル、アセトアセテート、ハロアセタール、オルトピリジルジスルフィド、ジヒドロキシフェニル誘導体、ビニル、アクリレート、アクリルアミド、ヨードアセトアミド、及びこれらの組合せから選択されることが好ましい。ＥＬ−ＰＯＸに存在する求電子基は、カルボン酸エステル、酸塩化物基、無水物、ケトン、アルデヒド、イソシアナート、チオイソシアナート、エポキシド、活性化ヒドロキシル基、オレフィン、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スクシンイミジルカーボネート、スクシンイミジルカルバメート、スルホスクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルカーボネート、マレイミド、エテンスルホニル、及びこれらの組合せから選択されることがより好ましい。ＥＬ−ＰＯＸに存在する求電子基は、アルデヒド、イソシアナート、チオイソシアナート、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、マレイミド、及びこれらの組合せから選択されることが更により好ましい。ＥＬ−ＰＯＸに存在する求電子基は、イソシアナート、チオイソシアナート、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、マレイミド、及びこれらの組合せから選択されることが最も好ましい。
【００３７】
求電子基として使用することができるスルホネートエステルの例として、メシレート、トシレート、ノシレート、トリフレート、及びこれらの組合せが挙げられる。使用することができるオレフィンの例として、アクリレート、メタクリレート、エチルアクリレート、及びこれらの組合せが挙げられる。活性化ヒドロキシル基の例として、ｐ−ニトロフェニルクロロカーボネート、カルボニルジイミダゾール（例えば１，１−カルボニルジイミダゾール）、及び塩化スルホニルから選択される活性剤で活性化させたヒドロキシル基が挙げられる。
【００３８】
本方法で使用されるＥＬ−ＰＯＸは、少なくとも１０個の反応性求電子基を含有することが好ましい。ＥＬ−ＰＯＸは、少なくとも２５個の反応性求電子基を含有することがより好ましく、少なくとも３５個の反応性求電子基を含有することが更により好ましく、少なくとも５０個の反応性求電子基を含有することが最も好ましい。
【００３９】
本発明のＥＬ−ＰＯＸは、１つ又は複数のペンダント求電子基を含有することが有利である。典型的には、ＥＬ−ＰＯＸは、１００モノマー当たり３〜５０個のペンダント求電子基を含有し、１００モノマー当たり４〜３５個のペンダント求電子基を含有することがより好ましく、１００モノマー当たり少なくとも５〜２５個のペンダント求電子基を含有することが更により好ましい。
【００４０】
本発明に従って使用されるＥＬ−ＰＯＸは典型的には、１，０００〜１００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内の平均分子量を有し、５，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内はより好ましく、１０，０００〜３０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内は最も好ましい。
【００４１】
本発明の一実施形態では、多孔質固体基材は、デキストラン、アルギネート、酸化型セルロース、酸化型再生セルロース（ＯＲＣ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、及びこれらの組合せから選択される、少なくとも５０重量％の多糖を含有し、少なくとも８０重量％の上記多糖を含有することが最も好ましい。特に好ましい実施形態では、多孔質固体基材は、少なくとも５０重量％のＯＲＣを含有し、少なくとも８０重量％のＯＲＣを含有することが最も好ましい。
【００４２】
セルロースは、β−グルコシド結合を通して重合したグルコピラノースのホモ多糖である。酸化前に、セルロースは再生されないまま、非組織化繊維を有してもよく、又は再生されて組織化繊維を形成してもよい。セルロース繊維を四酸化二窒素で処理した場合、ヒドロキシル基はカルボン酸基に酸化され、ポリウロン酸を産生する。ポリウロン酸が酸化型セルロースの主要な構成成分である一方で、非酸化ヒドロキシル基は繊維性構成成分として残る。
【００４３】
本発明の更なる実施形態では、多孔質固体基材は、反応性求核基を含有する求核ポリマーを含む外表面を備える。多孔質固体基材は、少なくとも５重量％の求核ポリマーを含有することが好ましく、少なくとも１０重量％の求核ポリマーを含有することがより好ましく、少なくとも５０重量％の求核ポリマーを含有することがより好ましい。上記基材が上記求核ポリマーからなることが最も好ましい。
【００４４】
求核ポリマーは典型的には、少なくとも２個の求核基を含有し、少なくとも１０個の求核基を含有することがより好ましく、少なくとも２０個の求核基を含有することが最も好ましい。
【００４５】
求核ポリマーの求核基は、アミン基、チオール基、ホスフィン基、及びこれらの組合せから選択されることが好ましい。これらの求核基がアミン基であることがより好ましい。これらのアミン基が、第一級アミン基、第二級アミン基、及びこれらの組合せから選択されることが好ましい。
【００４６】
多孔質固体基材の外表面の求核ポリマーは、少なくとも１重量％の窒素含有量を有する窒素高含有ポリマーであることが好ましく、５〜１０重量％の窒素含有量はより好ましく、１５〜２５重量％の窒素含有量は最も好ましい。
【００４７】
求核ポリマーは、アミン、チオール、ホスフィン、及びこれらの組合せから選択される反応性求核基を含有する、タンパク質、キトサン、及び合成ポリマー又は炭水化物ポリマーから選択されることが好ましい。上記求核ポリマーは、コラーゲン、キトサン、及びこれらの組合せから選択されることがより好ましい。
【００４８】
本明細書で使用されるコラーゲンという用語は、加工誘導体を含むコラーゲンの全ての形態を指す。好ましいコラーゲンは、テロペプチド領域を有さず（「アテロペプチドコラーゲン」）、可溶性であり、フィブリル形態であっても、非フィブリル形態であってもよい。コラーゲンは、ミクロフィブリル状コラーゲン；Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、又はＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンの組合せ等の合成ヒトコラーゲンの群から選択することができる。また、熱、放射、又はグルタルアルデヒド等の化学剤を用いて架橋したコラーゲンを使用して、特に堅い架橋組成物を形成してもよい。乾燥した多孔質凍結乾燥コラーゲンスポンジは特に好ましい。
【００４９】
キトサンは、生分解性であり、非毒性であり、キチンの複雑な炭水化物誘導体（ポリ−［１３４］−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）であり、天然物質である。キトサンは、キチンの脱アセチル化形態である。一般的に、キトサンという総称は、脱アセチル化の程度が７０％を超える場合に適用され、キチンという総称は、脱アセチル化の程度がわずか、又は２０％未満である場合に使用される。１００％未満の脱アセチル化で、キトサン多糖は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びＤ−グルコサミンモノマー単位の両方を含有する直鎖状ブロックコポリマーである。
【００５０】
好ましい一実施形態に従って、多孔質固体基材の表面に存在する求核ポリマーの求核基はアミン基であり、ＥＬ−ＰＯＸに含まれる求電子基は、カルボン酸エステル、スルホネートエステル、ホスホネートエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、ｐ−ニトロチオフェニルエステル、酸ハロゲン化物基、無水物、ケトン、アルデヒド、イソシアナート、チオイソシアナート、イソシアノ、エポキシド、活性化ヒドロキシル基、グリシジルエーテル、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スクシンイミジルカーボネート、スクシンイミジルカルバメート、スルホスクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルカーボネート、イミドエステル、ジヒドロキシフェニル誘導体、及びこれらの組合せから選択される。
【００５１】
使用することができるスクシンイミジル誘導体の例として、スクシンイミジルグルタレート、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルスクシンアミド、スクシンイミジルカーボネート、ジスクシンイミジルスベレート、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、ビス（２−スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチルスルホン、及び３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジル−プロピオネート）が挙げられる。使用することができるスルホスクシンイミジル誘導体の例として、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ジチオビス−スルホスクシンイミジルプロピオネート、ジスルホ−スクシンイミジルタータレート；ビス［２−（スルホ−スクシンイミジルオキシカルボニルオキシエチルスルホン）］、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｃｌｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、ジチオビス−（スクシンイミジルプロピオネート）が挙げられる。ジヒドロキシフェニル誘導体の例として、ジヒドロキシフェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ドパミン、３，４−ジヒドロキシヒドロシンナミン酸（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｈｙｄｒｏｃｃｉｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）（ＤＯＨＡ）、ノルエピネフリン、エピネフリン、及びカテコールが挙げられる。
【００５２】
別の好ましい実施形態に従って、多孔質固体基材の外表面の求核ポリマーの求核基は、チオール基であり、ＥＬ−ＰＯＸに含有される求電子基は、ハロアセタール、オルトピリジルジスルフィド、マレイミド、ビニルスルホン、ジヒドロキシフェニル誘導体、ビニル、アクリレート、アクリルアミド、ヨードアセトアミド、スクシンイミジルエステル、スクシンイミジルカーボネート、スクシンイミジルカルバメート、スルホスクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルカーボネート、及びこれらの組合せから選択される。求電子基は、スクシンイミジルエステル、ハロアセタール、マレイミド、又はジヒドロキシフェニル誘導体、及びこれらの組合せから選択されることがより好ましい。求電子基は、マレイミド又はジヒドロキシフェニル誘導体、及びこれらの組合せから選択されることが最も好ましい。
【００５３】
本方法で使用される多孔質固体基材は、少なくとも５体積％の多孔性を有することが好ましい。基材がフォーム又はメッシュである場合、基材は、少なくとも５０体積％の多孔性を有することが好ましく、少なくとも７０体積％の多孔性を有することがより好ましく、少なくとも８５体積％の多孔性を有することが最も好ましい。基材が多孔質粉末である場合、多孔性は、少なくとも２０体積％であることが好ましく、少なくとも５０体積％であることがより好ましく、少なくとも７５体積％であることが最も好ましい。
【００５４】
本方法で使用される多孔質固体基材は、少なくとも２μｍの平均細孔サイズを有することが好ましい。基材がフォーム又はメッシュである場合、基材は、５〜５００μｍの平均細孔サイズ有することが好ましく、１０〜２００μｍの平均細孔サイズを有することが好ましい。基材が多孔質粉末である場合、平均細孔サイズは、４〜５０μｍであることが好ましく、６〜２５μｍであることがより好ましい。
【００５５】
多孔質固体基材は典型的には、少なくとも２５％の吸水能を有し、少なくとも１００％の吸水能を有することが好ましく、少なくとも２５０％の吸水能を有することがより好ましく、少なくとも１０００％の吸水能を有することが最も好ましい。
【００５６】
本方法で使用される多孔質固体基材は、メッシュ又はフォームの形態の物体であることが好ましく、上記物体は、コーティング済み基材の創傷被覆材としての適用を促進する形状、例えばシートを有する。典型的には、上記基材は、１０ｍｍ〜２００ｍｍの長さ、５ｍｍ〜２００ｍｍの幅、及び０．５ｍｍ〜１０ｍｍの厚さを有する。
【００５７】
本発明の一実施形態では、多孔質固体基材はメッシュである。メッシュの例は、織繊維又は不織繊維から製造されるシート又はガーゼである。メッシュに含有される繊維は、ゼラチン、コラーゲン、ＯＲＣ、又はこれらの組合せのような生体適合性及び生分解性ポリマーから製造されることが好ましい。
【００５８】
本発明の別の実施形態では、多孔質固体基材は固体フォームであり、ときにはスポンジと呼ばれることもある。固体フォームは、架橋ゼラチンから製造されることが好ましい（ゼルフォーム）。
【００５９】
本発明の更なる実施形態では、多孔質固体基材は粉末である。多孔質粉末は、ゼラチン又は多糖から製造されることが好ましい。好適な多糖は、デンプン、化工デンプン、アルギネート、キトサン、デキストラン、及びこれらの組合せである。使用される多糖は、化工デンプンであることが最も好ましい。
【００６０】
多孔質粉末は、流動性滅菌粉末の形態であることが好ましい。上記粉末は、微小多孔質粉末であることが有利である。
【００６１】
多孔質粉末は典型的には、１０〜２００μｍの範囲内の質量加重平均粒径を有し、２５〜１００μｍの範囲内はより好ましく、５０〜７５μｍの範囲内は最も好ましい。
【００６２】
本方法で使用されるコーティング液は、少なくとも５０重量％の溶媒を含有することが好ましく、少なくとも６０重量％の溶媒を含有することがより好ましく、少なくとも８０重量％の溶媒を含有することが最も好ましい。溶媒は、２−プロパノール、エチルアルコール、メタノール、ジクロロメタン、アセトン、アニソール、１−ブタノール、２−ブタノール、酢酸ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、クメン、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、エチルエーテル、蟻酸エチル、ヘプタン、酢酸イソブチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、３−メチル−１−ブタノール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２−メチル−１−プロパノール、ペンタン、１−ペンタノール、１−プロパノール、酢酸プロピル、及びこれらの組合せから選択されることが好ましい。溶媒は、２−プロパノール、エチルアルコール、メタノール、アセトン、及びこれらの組合せから選択されることがより好ましい。
【００６３】
コーティング液は、いくらかの水を好適に含有することがある。典型的には、コーティング液は、５重量％未満の水を含有し、１重量％未満の水を含有することがより好ましい。
【００６４】
本方法で使用されるコーティング液は、少なくとも１重量％のＥＬ−ＰＯＸを含有することが好ましい。コーティング液のＥＬ−ＰＯＸ含有量は、少なくとも５重量％であることがより好ましく、少なくとも１０重量％であることが更により好ましく、少なくとも２０重量％であることが最も好ましい。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態に従って、多孔質固体基材は、コーティング液を基材上に噴霧することによりコーティングされる。特に好ましい実施形態に従って、コーティング液は、超音波ノズルに通して基材上に噴霧される。発明者らは、超音波ノズルの使用により、多量のＥＬ−ＰＯＸを含有するコーティング液で、基材を均一にコーティングすることが可能になることを発見した。
【００６６】
溶媒は、蒸発によりコーティング済み基材から好適に除去することができる。蒸発は、減圧下で、例えば１ミリバール未満の圧力で行うことが好ましい。
【００６７】
或いは、溶媒は、コーティング済み基材を液化ガス又は超臨界流体と接触させることにより、コーティング済み基材から除去することができる。液化ガス又は超臨界流体は、少なくとも３０バールの圧力を有することが好ましい。
【００６８】
本発明の有利な実施形態に従って、多孔質固体基材は、本明細書で前に説明した求核ポリマーを含む外表面を備え、コーティング液で基材をコーティングした後、溶媒を除去する前及び／又はその間に、ＥＬ−ＰＯＸの反応性求電子基は、共有結合の形成中に求核ポリマーの反応性求核基と反応する。上記反応は、５０℃未満の温度で起こることが好ましく、１５〜２５℃の範囲内（環境条件）の温度で起こることがより好ましい。本方法のこの実施形態は、反応性求電子基と反応性求核基との間の反応が緩衝系の非存在下で起こり得るという利点を提供する。
【００６９】
本方法では、ＥＬ−ＰＯＸ中の反応性求電子基は、多孔質固体基材に存在する反応性求核基と、及び／又は本方法で使用される他の構成成分（例えば求核架橋剤）に存在する求核基と反応することができる。コーティング済み基材から溶媒を除去した後、ＥＬ−ＰＯＸは、平均して少なくとも１個の反応性求電子基をまだ含有し、少なくとも５個の反応性求電子基をまだ含有することがより好ましく、少なくとも４０個の反応性求電子基をまだ含有することが最も好ましい。これらの反応性求電子基は、例えば組織に天然に存在するアミン基と共有結合を形成することができるので、コーティング済み基材に接着特性を与える。
【００７０】
本方法で使用されるコーティング液は、溶解形態及び／又は分散形態のＥＬ−ＰＯＸを含有してもよい。
【００７１】
本発明の一実施形態に従って、コーティング液は完全溶解形態のＥＬ−ＰＯＸを含有し、コーティング液は分散させた緩衝系を更に含有する。コーティング液は、７〜１１の範囲内の緩衝ｐＨを有することが好ましく、８〜１０の範囲内はより好ましい。コーティング液の緩衝能は、少なくとも１０ｍｍｏｌ．ｌ−１．ｐＨ−１であることが好ましい。緩衝能は、少なくとも２５ｍｍｏｌ．ｌ−１．ｐＨ−１であることがより好ましく、緩衝能は、少なくとも５０ｍｍｏｌ．ｌ−１．ｐＨ−１であることが最も好ましい。
【００７２】
本発明の別の実施形態では、コーティング液は、完全溶解形態のＥＬ−ＰＯＸを含有し、本方法は、基材をＥＬ−ＰＯＸ含有コーティング液でコーティングする前に、多孔質固体基材を緩衝液で被覆することを含み、上記緩衝液は、緩衝系を含む。緩衝液は、７〜１１の範囲内の緩衝ｐＨを有することが好ましく、８〜１０の範囲内はより好ましい。緩衝液の緩衝能は、少なくとも１０ｍｍｏｌ．ｌ−１．ｐＨ−１であることが好ましい。緩衝能は、少なくとも２５ｍｍｏｌ．ｌ−１．ｐＨ−１であることがより好ましく、緩衝能は、少なくとも５０ｍｍｏｌ．ｌ−１．ｐＨ−１であることが最も好ましい。緩衝液が水性である場合、基材は、緩衝液での被覆後、コーティング液でのコーティング前に、乾燥させることが好ましい。このようにして、ＥＬ−ＰＯＸと基材との間の不必要な架橋、及びＥＬ−ＰＯＸの分解を最小限にすることができる。この実施形態は、ＥＬ−ＰＯＸが多孔質固体基材の細孔を貫通し、これらの細孔の内側でコーティングを形成することができるという利点を提供する。この実施形態に従って使用される緩衝液は、求核架橋剤を好適に含有することがあり、上記求核架橋剤は、少なくとも２個の反応性求核基を含有する。
【００７３】
また別の実施形態では、コーティング液に存在するＥＬ−ＰＯＸの少なくとも８０重量％は、コーティング液で多孔質固体基材をコーティングする際に溶解されていない。溶解されていないＥＬ−ＰＯＸに加えて、コーティング液は、溶解された緩衝系又は溶解されていない緩衝系を含有することが有利である。コーティング液は、７〜１１の範囲内の緩衝ｐＨを有することが好ましく、８〜１０の範囲内はより好ましい。コーティング液の緩衝能は、少なくとも１０ｍｍｏｌ．ｌ−１．ｐＨ−１であることが好ましい。緩衝能は、少なくとも２５ｍｍｏｌ．ｌ−１．ｐＨ−１であることがより好ましく、緩衝能は、少なくとも５０ｍｍｏｌ．ｌ−１．ｐＨ−１であることが更により好ましい。基材を溶解されていないＥＬ−ＰＯＸを含有するコーティング液でコーティングした後に、基材を、ＥＬ−ＰＯＸが可溶性である液体溶媒組成物で被覆することが好ましい。この実施形態は、ＥＬ−ＰＯＸが細孔に進入せず、かつＥＬ−ＰＯＸコーティング層が多孔質基材の表面上に濃縮されるという利点を提供する。特に好ましい実施形態に従って、液体溶媒組成物は、求核架橋剤を含有する。
【００７４】
好適に使用することができる求核架橋剤の例として、求核的に活性化させたＰＥＧ、求核的に活性化させたＰＯＸ、トリリジン、及びこれらの組合せが挙げられる。
【００７５】
求核架橋剤は、少なくとも３個の反応性求核基を含有することが好ましい。求核架橋剤の求核基は、アミン基、チオール基、ホスフィン基、及びこれらの組合せから選択されることが好ましい。これらの求核基は、アミン基であることがより好ましい。好ましい実施形態に従って、求核架橋剤に存在する求核基は、第一級アミン基である。
【００７６】
本発明の一実施形態では、求核架橋剤は、１，０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する低分子量ポリアミンであり、７００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量はより好ましく、４００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量は最も好ましい。求核架橋剤は、ジリジン；トリリジン；テトラリジン；ペンタリジン；ジシステイン；トリシステイン；テトラシステイン；ペンタシステイン；リジン、オルニチン、システイン、アルギニン、及びこれらの組合せ、及び他のアミノ酸残基から選択される２つ以上のアミノ酸残基を含むオリゴペプチド；スペルミン；トリス（アミノメチル）アミン；アルギニン；並びにこれらの組合せの群から選択されることが更により好ましい。
【００７７】
本発明の別の実施形態に従って、求核架橋剤は、少なくとも２つのアミン基を含む求核的に活性化させたＰＯＸ（ＮＵ−ＰＯＸ）；キトサン；キトサン誘導体（例えば国際公開第２００９／０２８９６５号で説明されるジカルボキシ誘導体化キトサンポリマー）；ポリエチレンイミン類；ポリビニルアミン；ポリアリルアミン；アミン官能化ポリ（メタ）アクリレート；アミン官能性部分を含有する多糖類、例えばアミノグリコシド、例えば４，６−ジ置換デオキシストレプトアミン（カナマイシンＡ、アミカシン、トブラマイシン、ジベカシン、ゲンタマイシン、シソマイシン、ネチルマイシン）、４，５−ジ置換デオキシストレプトアミン（ネオマイシンＢ、Ｃ、及びネオマイシンＥ（パロモマイシン））、及び非デオキシストレプトアミンアミノグリコシド、例えばストレプトマイシン；スチレン系樹脂；リジン、オルニチン、システイン、アルギニン、及びこれらの組合せ、及び他のアミノ酸残基から選択される２つ以上のアミノ酸残基を含むポリペプチド；並びにこれらの組合せの群から選択される高分子量ポリアミンである。天然源又は組換え体のアルブミンは、ポリペプチドとして好適に使用することができるポリペプチドの例である。アミン官能化ポリエチレングリコールは、求核架橋剤として好適に使用することができる高分子量ポリアミンの別の例である。
【００７８】
別の好ましい実施形態に従って、求核架橋剤に存在する求核基は、チオール（スルホヒドリル）基である。
【００７９】
本発明の一実施形態では、架橋ポリマーで使用される求核架橋剤は、１，０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する２つ以上のチオール基を含む低分子量ポリチオールであり、７００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量はより好ましく、４００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量は最も好ましい。求核架橋剤は、トリメルカプトプロパン、エタンジチオール、プロパンジチオール、２−メルカプトエチルエーテル、２，２’−（エチレンジオキシ）ジエタンチオール、テトラ（エチレングリコール）ジチオール、ペンタ（エチレングリコール）ジチオール、ヘキサエチレングリコールジチオール；チオール修飾ペンタエリスリトール、ジペンタエリスリトール、トリメチロールプロパン、又はジトリメチロールプロパン；少なくとも２つのシステイン単位を含有するオリゴペプチドの群から選択されることが更により好ましい。
【００８０】
本発明の別の実施形態に従って、架橋ポリマーで使用される求核架橋剤は、少なくとも２つのチオール基を含むＮＵ−ＰＯＸ；チオール官能化ポリ（メタ）アクリレート；チオール官能性部分を含有する多糖類；スチレン系樹脂；２つ以上のチオール基を含むポリペプチドの群から選択される高分子量ポリチオールである。
【００８１】
本明細書で前に定義する求核架橋剤は、コーティング液及び／又は緩衝液で好適に使用して、ＥＬ−ＰＯＸを、反応性求電子基を含有するポリマーを含む外表面を備える多孔質固体基材に共有結合することができる。求電子基を有する好適なポリマーは、ポリ（乳酸−共−グリコール酸）；硫酸コンドロイチン−ＮＨＳ；硫酸コンドロイチンスクシンイミジルスクシネート；アルギネート−ＮＨＳ；ヒアルロン酸−ＮＨＳ；メタクリレートモノマーを含有するＮ−ヒドロキシスクシンイミドカーボネートを含むコポリマー（Ｃｅｎｇｉｚら、２０１０、Ｊ．ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４８巻、第２１版、４７３７〜４７４６ページで説明するもの）；生物学的低分子量の少なくとも１つのカルボキシル基を改変することにより得られる生物学的低分子量誘導体；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、又はその誘導体（欧州特許第１５４８００４号で説明するもの）を有する２つ以上のカルボキシル基を有する化合物である。求核架橋剤は、コーティング液で使用されることが好ましい。
【００８２】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＥＬ−ＰＯＸ及び求核架橋剤は別々の流体中に存在するが、多孔質固体基材を同時にコーティングする。このことは、２つの超音波スプレイノズルを使用することにより好適に達成することができる。したがって、この有利な実施形態に従う方法は、
固体多孔質基材を用意することと、
第１の溶媒中にＥＬ−ＰＯＸを含む、コーティング液を用意することと、
緩衝系及び／又は求核架橋剤並びに第２の溶媒を含む、第２の液体を用意することと、
上記コーティング液を第１の超音波ノズルに通過させることにより、第１のスプレイ流を創出することと、
上記第２の液体を第２の超音波ノズルに通過させることにより、第２のスプレイ流を創出することと、
上記固体多孔質固体基材の表面の少なくとも一部を上記第１のスプレイ流及び上記第２のスプレイ流の両方に同時に曝露して、上記固体多孔質基材の上記部分を、上記ＥＬ−ＰＯＸ並びに上記求核架橋剤及び／又は上記緩衝系を含むコーティング混合物で被覆することと、
上記コーティング混合物から上記第１及び第２の溶媒を除去して、上記ＥＬ−ＰＯＸ及び上記求核架橋剤を含有する乾燥層で少なくとも部分的にコーティングされた多孔質固体基材を得ることと
を含む。
【００８３】
本方法のＥＬ−ＰＯＸは、ＰＶＰ−アクリル酸−ＮＨＳ又は（ポリ−（（Ｎ−ビニルピロリドン）５０−共−（アクリル酸）２５−共−（アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）２５）により好適に置換することができる。
【００８４】
求核架橋剤が上記で説明する二重スプレイ法で使用される場合、ＥＬ−ＰＯＸ及び求核架橋剤は、溶媒を除去する前、その間、又はその後に互いに反応して、架橋ポリマーを形成することができる。好ましい実施形態では、乾燥層に含まれる架橋ポリマーは、未反応の求電子基を含む。好適な溶媒は、本明細書で前に定義するとおりである。好ましい実施形態では、第１及び第２の溶媒は混和性であり、より好ましい実施形態では、第１及び第２の溶媒は同じである。
【００８５】
第２の液体が緩衝系を含有する場合、第２の液体は、７〜１１の範囲内の緩衝ｐＨを有することが好ましく、８〜１０の範囲内はより好ましい。第２の液体の緩衝能は、少なくとも１０ｍｍｏｌ．ｌ−１．ｐＨ−１であることが好ましい。緩衝能は、少なくとも２５ｍｍｏｌ．ｌ−１．ｐＨ−１であることがより好ましく、緩衝能は、少なくとも５０ｍｍｏｌ．ｌ−１．ｐＨ−１であることが最も好ましい。
【００８６】
本発明の別の態様は、コーティング済みメッシュ、コーティング済みフォーム、又はコーティング済み粉末から選択される接着性止血製品に関し、上記止血製品は、
少なくとも２０体積％の多孔性を有し、反応性求核基を含有する求核ポリマーを含む外表面を備える多孔質固体基材と、
上記固体基材の少なくとも一部を被覆する接着性コーティングであって、上記コーティングが平均して少なくとも１個の反応性求電子基を含有するＥＬ−ＰＯＸを含む、接着性コーティングと
を含む。この接着性止血製品は、本明細書で前に説明する方法により好適に得ることができる。
【００８７】
本明細書で前に説明するように、本止血製品は、組織に天然に存在する求核基と反応することができる求電子反応基の存在のために優れた接着特性を有する。加えて、この止血製品は、血液又は他の水性流体と接触した際に、ＥＬ−ＰＯＸの反応性求電子基が、共有結合の形成中に求核ポリマーの反応性求核基と反応するので、接着性コーティングが多孔質基材に固定されるという利点を提供する。
【００８８】
接着性止血材料のコーティングに存在するＥＬ−ＰＯＸは、多孔質固体基材に共有結合することができる。更に、ＥＬ−ＰＯＸは、架橋することができる。多孔質固体基材、ＥＬ−ＰＯＸ、及び求核ポリマーの好ましい形態は、本明細書で前に説明した。
【００８９】
止血製品のコーティング中のＥＬ−ＰＯＸは、５個の反応性求電子基を含有することが好ましく、２５個の反応性求電子基を含有することがより好ましく、５０個の反応性求電子基を含有することが最も好ましい。
【００９０】
基材は典型的には、止血製品の少なくとも１０重量％に相当し、少なくとも５０重量％に相当することがより好ましく、少なくとも７５重量％に相当することが最も好ましい。
【００９１】
ＥＬ−ＰＯＸ含有コーティングは典型的には、止血製品の５〜７５重量％に相当する。コーティングは、止血製品の１０〜５０重量％に相当することがより好ましく、１２〜２５重量％に相当することが最も好ましい。
【００９２】
コーティングは、２５〜１００重量％のＥＬ−ＰＯＸを含有することが好ましい。コーティングのＥＬ−ＰＯＸ含有量は、少なくとも５０重量％であることがより好ましく、少なくとも７５重量％であることが最も好ましい。
【００９３】
本発明は、接着性コーティングが、多孔質固体基材の細孔と相互接続する細孔を含有するコーティング済み止血製品の調製を可能にする。
【００９４】
特に好ましい実施形態に従って、接着性止血剤は、少なくとも５０％の細孔密度を有し、少なくとも８０％の細孔密度を有することがより好ましい。
【００９５】
本発明を、以下の非限定的な実施例により更に例示する。
【実施例】
【００９６】
実施例１
２５％ＮＨＳエステル単位を含有するＮＨＳ側鎖活性化ポリ［２−（プロピル／ＮＨＳ−エステル−エチル）−２−オキサゾリン］コポリマー（＝ＥＬ−ＰＯＸ、２５％ＮＨＳ）を、以下のように合成した：
ポリ［２−（プロピル／メトキシ−カルボニル−エチル）−２−オキサゾリン］コポリマー（重合度＝ＤＰ＝およそ１００）を、カチオン開環重合（ＣＲＯＰ）を利用することにより、７５％  ２−ｎ−プロピル−２−オキサゾリン（ｎＰｒｏｐＯｘ）及び２５％  ２−メトキシカルボニル−エチル−２−オキサゾリン（ＭｅｓｔＯｘ）を用いて合成した。２５％  ２−メトキシカルボニル−エチル基（１Ｈ−ＮＭＲ）を含有する統計的コポリマーを得た。２５％  ２−メトキシカルボニル−エチル基を含有する上記ポリマーを、水酸化ナトリウム（１Ｍ）を用いて加水分解し、２５％  ２−カルボキシ−エチル基（１Ｈ−ＮＭＲ）を有するコポリマーを得た。２−カルボキシ−エチル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）により活性化し、２−（プロピル／ＮＨＳ−エステル−エチル）−２−オキサゾリン］コポリマー（＝ＥＬ−ＰＯＸ、２５％ＮＨＳ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ及びＵＶ分光法によると、上記ポリマーは、２５％ＮＨＳ−エステル基を含有していた。
【００９７】
ウシコラーゲンスポンジを、Ｆａｒａｊら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００７、１３、１０、２３８７〜２３９４ページで説明されている手順に従って調製した。コラーゲンをウシの腱から抽出した。このようにして得られたコラーゲンスポンジは、９５％〜９８％の多孔性及び８０〜１００μｍの平均細孔サイズを有した。多孔性は、コラーゲンフィルム（空隙容積部を含まない）の密度をコラーゲンスポンジの密度と比較することにより計算した。細孔サイズは、Ｆａｒａｊら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００７、１３、１０、２３８７〜２３９４ページで説明されている方法に従って走査型電子顕微鏡を用いて測定した。
【００９８】
ＥＬ−ＰＯＸ、２５％ＮＨＳをアセトンに溶解した（１８０ｍｇ／ｍｌ）。溶液を凍結乾燥させたウシコラーゲンスポンジの上面に一滴ずつ均等に分布させた。コーティング直後に、スポンジを室温で真空下（１ミリバール）にて８時間乾燥させた。ＥＬ−ＰＯＸ、２５％ＮＨＳコーティング（１５ｍｇ／ｃｍ２）を有する接着性コラーゲンスポンジを得た。
【００９９】
ＥＬ−ＰＯＸ、２５％ＮＨＳとコラーゲン上に存在する求核アミン基との間の架橋の可能性を評価するために、コーティング済みコラーゲンスポンジをアセトンですすいだ。全てのＥＬ−ＰＯＸ、２５％ＮＨＳはアセトン抽出物中に回収された。これにより、ＥＬ−ＰＯＸの求電子基は、コーティング及び／又は乾燥中にコラーゲンのアミン基と反応しなかったことが示された。
【０１００】
コーティング済みコラーゲンスポンジの止血特性を、以下のように評価した：
１００μＬの新鮮なヘパリン添加全血を、コラーゲンスポンジのＥＬ−ＰＯＸ、２５％ＮＨＳコーティング済み側の上面に一滴ずつ添加した。
別のＥＬ−ＰＯＸ、２５％ＮＨＳコーティング済みスポンジを、血液でコーティングしたコラーゲンスポンジの上面に、ＥＬ−ＰＯＸコーティング済み側を血液に向けて置いた（「サンドイッチ法」）。
穏やかな圧力を、ガーゼを用いて１０秒間印加した。次に、上記サンドイッチを、水を含有するビーカーに入れ、水を２分間撹拌した。２つのコラーゲンスポンジはこれらの条件下で接着したままであり、スポンジから漏れた血液はなく、止血及び接着を示した。
【０１０１】
非コーティングコラーゲンスポンジを用いた対照実験では、スポンジは、水中で２０秒後に脱離し、水が赤色に変わり、止血されていないことを示した。
【０１０２】
実施例２
１５％ＮＨＳ−エステル基を含有するＮＨＳ側鎖活性化ポリ２−（プロピル／ヒドロキシ−エチル−アミド−エチル／ＮＨＳ−エステル−エチル−エステル−エチル−アミド−エチル）−２−オキサゾリン］ターポリマー（＝ＥＬ−ＰＯＸ、１５％ＮＨＳ）を、以下のように合成した：
ポリ［２−（プロピル／メトキシ−カルボニル−エチル）−２−オキサゾリン］コポリマー（ＤＰ＝＋／−１００）を、７０％  ２−プロピル−２−オキサゾリン及び３０％  ２−メトキシカルボニル−エチル−２−オキサゾリンを用いてＣＲＯＰの手段により合成した。３０％  ２−メトキシカルボニル−エチル基（１Ｈ−ＮＭＲ）を含有する統計的コポリマーを得た。第２に、３０％  ２−メトキシカルボニル−エチル基を含有する上記ポリマーをエタノールアミンと反応させて、３０％  ２−ヒドロキシ−エチル−アミド−エチル基（１Ｈ−ＮＭＲ）を有するコポリマーを得た。その後、２−ヒドロキシ−エチル−アミド−エチル基の部分を無水コハク酸と反応させて、１Ｈ−ＮＭＲによると、７０％  ２−プロピル基、１５％  ２−ヒドロキシ−エチル−アミド−エチル基、及び１５％  ２−カルボキシ−エチル−エステル−エチル−アミド−エチル基を有するターポリマーを得た。最後に、２−カルボキシ−エチル−エステル−エチル−アミド−エチル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）により活性化し、ＥＬ−ＰＯＸ、１５％ＮＨＳを得た。１Ｈ−ＮＭＲによると、上記ポリマーは、１５％ＮＨＳ−エステル基を含有した。
【０１０３】
ＥＬ−ＰＯＸ、１５％ＮＨＳ（１３０ｍｇ）、及び無水ホウ酸ナトリウム（４７ｍｇ）を計量し、イソプロパノール／２−ブタノンの溶液（１．６ｍＬ、ｖ／ｖ、１：１）を添加し、無水ホウ酸ナトリウムはイソプロパノール／２−ブタノン（ｖ／ｖ、１：１）中で不溶性であるので、微細懸濁液を得た。上記懸濁液を凍結乾燥したウシコラーゲンスポンジの上面に一滴ずつ均等に分布させた。コーティング直後に、上記スポンジを室温で真空下（１ミリバール）にて８時間乾燥させた。ＥＬ−ＰＯＸ、１５％ＮＨＳ、及び無水ホウ酸ナトリウムコーティング（１９ｍｇ／ｃｍ２）を有する接着性コラーゲンスポンジを得た。
【０１０４】
コーティング済みコラーゲンスポンジの止血特性を以下のように評価した：
１００μＬの新鮮なヘパリン添加全血を、コラーゲンスポンジのＥＬ−ＰＯＸ、１５％ＮＨＳ、及び無水ホウ酸ナトリウムコーティング済み側の上面に一滴ずつ添加した。
別のＥＬ−ＰＯＸ、１５％ＮＨＳ、及び無水ホウ酸ナトリウムコーティング済みスポンジを、血液でコーティングしたコラーゲンスポンジの上面に、ＥＬ−ＰＯＸコーティング済み側を血液に向けて置いた（「サンドイッチ法」）。
穏やかな圧力を、ガーゼを用いて１０秒間印加した。次に、上記サンドイッチを、水を含有するビーカーに入れ、水を３分間撹拌した。
２つのコラーゲンスポンジはこれらの条件下で接着したままであり、スポンジから漏れた血液はなく、止血及び接着を示した。
【０１０５】
実施例３
この実施例では、いくつかのポリマーを剪断強度について試験した。試料の概略を表１に示す。ポリマー（ＤＰ＝＋／−１００）を２−ｎ−プロピル−２−オキサゾリン、２−エチル−２−オキサゾリン、及び２−メトキシ−エチル−２−オキサゾリンのＣＲＯＰで合成した。試料１〜３として使用したＥＬ−ＰＯＸを、実施例１で説明する経路を介して事後改変した。試料４〜６として使用したＥＬ−ＰＯＸを、実施例２で説明する経路を介して合成した。全ての活性化ポリマーを１Ｈ−ＮＭＲ及びＵＶ分光法によりＮＨＳ含有量について分析した。ＰＥＧ４−アームＮＨＳ（ペンタエリスリトールポリ（エチレングリコール）エーテルテトラスクシンイミジルグルタレート、試料７）を、ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ社から得た。ウシコラーゲンスポンジ（５×７×１ｃｍ（ｂ×ｌ×ｈ））を対照（試料８）として試験した。全てのコーティング済みスポンジを実施例１で説明するように調製した。
【０１０６】
調製手順
多孔質コラーゲンスポンジを計量した（ｎ＝７）。
ＥＬ−ＰＯＸ溶液を、規定量のポリマーを有機溶媒（ジクロロメタン（ＤＣＭ）／イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）（ｖ／ｖ、１：１））に、３００ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるように溶解することにより調製した。
上記ＥＬ−ＰＯＸ溶液で、多孔質コラーゲンスポンジ（１４ｃｍ２）の一部を一滴ずつコーティングして、１５ｍｇ／ｃｍ２の目的とするコーティング密度を得た。コーティング済み多孔質コラーゲンスポンジを、真空オーブン（５ミリバール）内で室温にて一晩乾燥させた。
コーティング済み多孔質コラーゲンスポンジを再び計量し、コーティング密度を測定した。使用したポリマー及びコーティング密度の概略を、表１に示す。
【０１０７】
試験手順
これらのポリマーを、以下の手段で剪断強度について試験した：
構築物を５×１ｃｍ（ｂ×ｌ）の等しい片に切り分けた。
２００μＬのヘパリン添加ヒト血液を用いて、接着性の側が互いに向き合うように、コーティング済みの側を合わせた。分銅（１０ｇ）を標準化圧力として１０秒間印加した。
構築物を規定時間：１分間（ｔ１）又は１５分間（ｔ１５）、架橋させた。
規定時点で、構築物を剪断試験機（Ｚｗｉｃｋｙ  Ｒｏｅｌｌ、２０Ｎロードセル）に設置して、剪断強度を破損するまで測定した。
出力：測定された力（Ｎ）を、構築物の貼り合わせ面積（ｃｍ２）で割り、剪断強度（ｋＰａ）を得た。結果を表１に列挙する。
【０１０８】
【表１】
0006683398.tif 000003
【０１０９】
これらの結果から、以下のことを結論付けることができる：
ＥＬ−ＰＯＸポリマー（１〜６）は、架橋時間が長いほど高い剪断強度を示す。
ＥＬ−ＰＯＸポリマー（２及び５）は、ｔ１５で、ポリマーＰＥＧ４−アームＮＨＳ（７）より高い剪断強度値を示す。
対照試料（８）は、限定された剪断強度〜剪断強度なしを示し、架橋がＮＨＳ−エステル基によりもたらされることを示す。
【０１１０】
この実施例は、コラーゲンをコーティングするＥＬ−ＰＯＸは、血液の存在下で架橋することができ、コラーゲンをコーティングする同じ濃度のＰＥＧ４−アームＮＨＳより高い剪断強度をもたらすことを示す。
【０１１１】
実施例４
２０％ＮＨＳ−エステル基を含有するＮＨＳ側鎖活性化ポリ２−（プロピル／ヒドロキシ−エチル−アミド−エチル／ＮＨＳ−エステル−エチル−エステル−エチル−アミド−エチル）−２−オキサゾリン］ターポリマー（＝ＥＬ−ＰＯＸ、２０％ＮＨＳ）を、以下のように合成した：
ポリ［２−（プロピル／メトキシ−カルボニル−エチル）−２−オキサゾリン］コポリマー（ＤＰ＝＋／−１００）を、ＣＲＯＰの手段により７０％  ２−プロピル−２−オキサゾリン及び３０％  ２−メトキシカルボニル−エチル−２−オキサゾリンを用いて合成した。３０％  ２−メトキシカルボニル−エチル基（１Ｈ−ＮＭＲ）を含有する統計的コポリマーを得た。第２に、３０％  ２−メトキシカルボニル−エチル基を含有する上記ポリマーをエタノールアミンと反応させて、３０％  ２−ヒドロキシ−エチル−アミド−エチル基（１Ｈ−ＮＭＲ）を有するコポリマーを得た。次に、２−ヒドロキシ−エチル−アミド−エチル基の部分を無水コハク酸と反応させ、１Ｈ−ＮＭＲによると、７０％  ２−プロピル基、１０％  ２−ヒドロキシ−エチル−アミド−エチル基、及び２０％  ２−カルボキシ−エチル−エステル−エチル−アミド−エチル基を有するターポリマーを得た。最後に、２−カルボキシ−エチル−エステル−エチル−アミド−エチル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）により活性化し、ＥＬ−ＰＯＸ、２０％ＮＨＳを得た。１Ｈ−ＮＭＲによると、上記ポリマーは、２０％ＮＨＳ−エステル基を含有した。
【０１１２】
アルキル側鎖にプロピル及びアミン基を含有するアミン官能化ＮＵ−ＰＯＸを、ｎＰｒｏｐＯｘ及びＭｅｓｔＯｘのＣＲＯＰ、並びに続くメチルエステル側鎖のエチレンジアミンでのアミド化により合成して、ポリ（２−プロピル／アミノエチルアミドエチル−２−オキサゾリン）コポリマー（ＮＵ−ＰＯＸ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲによると、上記ポリマーは、２０％ＮＨ２を含有した。
【０１１３】
実施例１で説明するように調製したウシコラーゲンスポンジ（７×５×１ｃｍ）を使用した。これらの実験について、加熱プレートを備えるＥｘａｃｔａＣｏａｔ  ＳＣ超音波噴霧装置（Ｓｏｎｏ−Ｔｅｋ）を使用して、コラーゲンスポンジをコーティングした。
【０１１４】
試験４Ａ：溶液中のＥＬ−ＰＯＸ
ＩＰＡ／２−ブタノン（ｖ／ｖ、１：１）中のＥＬ−ＰＯＸ（ＥＬ−ＰＯＸ、２０％ＮＨＳ）の溶液（９０ｍｇ／ｍＬ）を、表２に示される設定に従って、超音波噴霧によりコラーゲン上に均一に分布させ、５ｍｇ／ｃｍ２のコーティング密度をもたらした。ＳＥＭ画像は、コラーゲンの多孔質構造が維持されていることを示した。
【０１１５】
構築物を片（２ｃｍ２）に切断し、実施例３で説明するようにｔ１５で剪断強度試験を用いて試験した。結果は１０．９＋／−３．３ｋＰａ（ｎ＝４）であり、優れた接着及び止血を示した。
【０１１６】
【表２】
0006683398.tif 000004
【０１１７】
試験４Ｂ：懸濁緩衝液を含むＥＬ−ＰＯＸ
懸濁したＨＥＰＥＳ緩衝液（１．７ｇ）を含むＩＰＡ／２−ブタノン（ｖ／ｖ、１：１）中のＥＬ−ＰＯＸの溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を、表２に示す設定に従って、超音波噴霧によりコラーゲン上に均一に分布させ、５ｍｇ／ｃｍ２のコーティング密度をもたらした。ＳＥＭ画像は、コラーゲンの多孔質構造が維持されていることを示した。構築物を片（２ｃｍ２）に切断し、実施例３で説明するようにｔ１５で剪断強度試験を用いて試験した。測定された平均剪断強度は、２．６＋／−０．８ｋＰａ（ｎ＝３）であり、優れた接着及び止血を示した。
【０１１８】
試験４Ｃ：（１）ＮＵ−ＰＯＸ及び緩衝液の溶液＋（２）ＥＬ−ＰＯＸの溶液
ＨＥＰＥＳ（１．７ｇ）を含む水中のＮＵ−ＰＯＸの溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を、表２に示す設定に従って、超音波噴霧によりコラーゲン上に均一に分布させた。溶媒を３０分間蒸発させた。この後、ＩＰＡ／２−ブタノン（ｖ／ｖ、１：１）中のＥＬ−ＰＯＸの溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）を、表２に示す設定に従って、超音波噴霧によりコーティング済みコラーゲンの上面上に均一に分布させた。コーティング後、５ｍｇ／ｃｍ２のコーティング密度（±４０重量％ＮＵ−ＰＯＸ及び±６０重量％ＥＬ−ＰＯＸ）を得た。ＳＥＭ画像は、コラーゲンの多孔質構造が維持されていることを示した。構築物を片（２ｃｍ２）に切断し、実施例３で説明するようにｔ１５で剪断強度試験を用いて試験した。測定された平均剪断強度は、３．９＋／−２．９ｋＰａ（ｎ＝２）であり、優れた接着及び止血を示した。
【０１１９】
試験４Ｄ：緩衝液の溶液（ＥＬ−ＰＯＸの懸濁液）
ＩＰＡ／ジエチルエーテル／トリエチルアミン（ｖ／ｖ／ｖ、５０：５０：１）中のＥＬ−ＰＯＸ懸濁液を、表２に示す設定に従って、超音波噴霧によりコラーゲン上に均一に分布させた。コーティング後、４ｍｇ／ｃｍ２のコーティング密度を得た。ＳＥＭ画像は、コラーゲンの多孔質構造が維持されていることを示した。構築物を片（２ｃｍ２）に切断し、実施例３で説明するように剪断強度試験を用いて試験した。測定された平均剪断強度は、４．２＋／−３．５ｋＰａ（ｎ＝３）であり、優れた接着及び止血を示した。
【０１２０】
加えて、超音波によりコーティングしたコラーゲンスポンジ４Ａ〜４Ｄの止血特性を以下のように評価した：
１００μＬの新鮮なヘパリン添加全血を、コラーゲンスポンジのＥＬ−ＰＯＸコーティング済み側の上面に一滴ずつ添加した。
別のＥＬ−ＰＯＸコーティング済みスポンジを、血液でコーティングしたコラーゲンスポンジの上面に、ＥＬ−ＰＯＸコーティング済み側を血液に向けて置いた（「サンドイッチ法」）。
穏やかな圧力を、ガーゼを用いて１０秒間印加した。次に、上記サンドイッチを、水を含有するビーカーに入れ、水を２分間撹拌した。
【０１２１】
上記２つのコラーゲンスポンジ４Ａ〜４Ｄは全て、これらの条件下で接着したままであり、スポンジから漏れた血液はなく、止血及び接着を示した。
【０１２２】
実施例５
ＮＨＳ側鎖活性化ポリ２−（プロピル／ヒドロキシ−エチル−アミド−エチル／ＮＨＳ−エステル−エチル−エステル−エチル−アミド−エチル）−２−オキサゾリン］ターポリマー（＝ＥＬ−ＰＯＸ、２０％ＮＨＳ）を、実施例２で説明するように合成した。
【０１２３】
ＥＬ−ＰＯＸ、２０％ＮＨＳをメタノール（１８０ｍｇ／ｍｌ）中に溶解した。上記溶液を酸化型再生セルロースパッチ（ＯＲＣ、Ｇｅｌｉｔａ−Ｃｅｌ）の上面に一滴ずつ均等に分布させた。コーティング直後に、上記パッチを室温で空気流下にて４時間乾燥させた。ＥＬ−ＰＯＸ、２０％ＮＨＳコーティング（１２ｍｇ／ｃｍ２）を有するＯＲＣを得た。
【０１２４】
コーティング済みＯＲＣの止血特性を以下のように評価した：
１００μＬの新鮮なヘパリン添加全血を、ＯＲＣ（１×１ｃｍ）のＥＬ−ＰＯＸ、２０％ＮＨＳコーティング済み側の上面に一滴ずつ添加した。
別のＥＬ−ＰＯＸ、２０％ＮＨＳコーティング済みＯＲＣを、血液でコーティングしたＯＲＣの上面に、ＥＬ−ＰＯＸコーティング済み側を血液に向けて置いた（「サンドイッチ法」）。
穏やかな圧力を、ガーゼを用いて１０秒間印加した。次に、上記サンドイッチを、水を含有するビーカーに入れ、水を５分間撹拌した。上記２つのＯＲＣ片は、これらの条件下で５分間接着したままであり、媒体は赤色に変わらなかった。
【０１２５】
非コーティングＯＲＣを用いた対照実験では、ＯＲＣは、撹拌中に水中で１分以内に脱離し、水が赤色に変わり、止血されていないことを示した。
【０１２６】
実施例６
ＮＨＳ側鎖活性化ポリ２−（プロピル／ヒドロキシ−エチル−アミド−エチル／ＮＨＳ−エステル−エチル−エステル−エチル−アミド−エチル）−２−オキサゾリン］ターポリマー（＝ＥＬ−ＰＯＸ、２０％ＮＨＳ）を、実施例２で説明するように合成した。キトサン粉末を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た（脱アセチル化度７５〜８５％、Ｍｎ  １０，０００）。デンプン粉末（ＨａｅｍｏＣｅｒ（登録商標））をＢｉｏＣｅｒ（ドイツ）から得た。
【０１２７】
粉末を、以下の手段でＥＬ−ＰＯＸ、２０％ＮＨＳ（ＥＬ−ＰＯＸ）で別々にコーティングした。
粉末（キトサン又はデンプン）を計量し、ＤＣＭ中のＥＬ−ＰＯＸの溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）でコーティングした。
懸濁液を減圧下で乾燥させた。
この後、乾燥したコーティング済み粉末を挽き、均一な微細粉末を形成した。コーティング済みキトサン粉末は、約２５重量％のＥＬ−ＰＯＸを含有する。コーティング済みデンプン粉末は、約１０重量％のＥＬ−ＰＯＸを含有する。
【０１２８】
対照として、挽いた非コーティングキトサン粉末、挽いた非コーティングデンプン粉末、及び挽いたＥＬ−ＰＯＸを試験した。
【０１２９】
ＥＬ−ＰＯＸコーティング済み粉末及び対照試料を、（１）炭酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９）又は（２）ヘパリン添加ヒト血液（ｐＨ７．４）と混合して、止血特性を評価した。これを以下の手段で試験した：上記粉末をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管で計量し、２５０μＬの緩衝液（１）又は血液（２）と混合した。ゲルが形成されるまで上記管を上下に反転させることにより、ゲル化時間を測定した。
【０１３０】
使用した材料の量及び架橋試験の結果を表３に示す。
【０１３１】
【表３】
0006683398.tif 000005
【０１３２】
これらの結果は、キトサンがＥＬ−ＰＯＸと架橋することができること（試料２）、及びデンプンがＥＬ−ＰＯＸと架橋することができないこと（試料７）を示す。ＥＬ−ＰＯＸでコーティングしたキトサン及びデンプンは両方とも、血液と架橋することができ（試料１及び１０）、一方で、非コーティングキトサン粉末及びデンプン粉末は緩衝液及び／又は血液の存在下でゲルを形成しなかった（試料３、４、８、及び９）。ＥＬ−ＰＯＸ粉末は、血液中のアミンと反応することによりゲルを形成することができ（試料５）、一方で、ＥＬ−ＰＯＸ粉末を緩衝液と混合した場合、ゲル形成は観察されなかった（試料６）。
【０１３３】
ＥＬ−ＰＯＸ含有ゲルは、水中で安定であることが分かった。それとは対照的に、２００ｍｇのデンプン又はキトサンを２５０μＬの血液に添加することにより調製した血液ゲルは、水中で安定ではなかった。
【０１３４】
実施例７
ＮＨＳ側鎖活性化ポリ２−（プロピル／ヒドロキシ−エチル−アミド−エチル／ＮＨＳ−エステル−エチル−エステル−エチル−アミド−エチル）−２−オキサゾリン］ターポリマー（＝ＥＬ−ＰＯＸ、２０％ＮＨＳ）を、実施例３で説明するように合成した。ＰＥＧ４−アームＮＨＳ（ペンタエリスリトールポリ（エチレングリコール）エーテルテトラスクシンイミジルグルタレート、ＥＬ−ＰＥＧ）を、ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ社から得た。ウシコラーゲンスポンジ（７×５×１ｃｍ）を実施例１で説明するように調製した。
【０１３５】
２つの塗布方法を比較した：（Ｉ）融解法及び（ＩＩ）コーティング液法。
【０１３６】
（Ｉ）融解法（比較実施例）
既知の量のポリマー粉末、ＥＬ−ＰＯＸ、２０％ＮＨＳ、及びＥＬ−ＰＥＧをコラーゲンスポンジの上面に均一に分布させて、表４に示すコーティング密度を得た。ＥＬ−ＰＯＸ、２０％ＮＨＳ、及びＥＬ−ＰＥＧを、事前に加熱したオーブン内で、表４に示す温度にて５分間加熱して、ポリマー粉末を融解した。この時間枠及び温度設定内では、ＥＬ−ＰＯＸ及びＥＬ−ＰＥＧ両方とも、安定なままであった。
【０１３７】
調製した構築物のＳＥＭ画像は、形成したポリマーフィルムがコラーゲン上部層の多孔質構造を密封していることを示した。
【０１３８】
【表４】
0006683398.tif 000006
【０１３９】
（ＩＩ）コーティング液法
ＥＬ−ＰＯＸ、２０％ＮＨＳ粉末を、ＩＰＡ／ＤＣＭ（ｖ／ｖ、１：１）中に溶解し（１５ｍｇ／ｍＬ）、溶液を滴下コーティングによりコラーゲンスポンジの上面に均等に分布させて、１２ｍｇ／ｃｍ２のコーティング密度を得た。上記スポンジを真空オーブン内で２時間乾燥させた。ＳＥＭ画像は、コラーゲンの多孔質構造が維持されていることを示した。
【０１４０】
コーティング済みコラーゲンスポンジの止血特性を、以下のように評価した：
１００μＬの新鮮なヘパリン添加全血を、コラーゲンスポンジのＥＬ−ＰＯＸ、２０％ＮＨＳ、又はＥＬ−ＰＥＧコーティング済み側の上面に一滴ずつ添加した。
別のコーティング済みスポンジを、血液でコーティングしたコラーゲンスポンジの上面に、コーティング済み側を血液に向けて置いた（「サンドイッチ法」）。
穏やかな圧力を、ガーゼを用いて１０秒間印加した。次に、上記サンドイッチを、水を含有するビーカーに入れ、水を１分間撹拌した。
【０１４１】
融解により調製したコラーゲンスポンジ（ＥＬ−ＰＯＸ及びＥＬ−ＰＥＧの両方）は、１分以内に脱離し、止血されておらず、かつ接着していないことを示した。滴下コーティングにより調製したコラーゲンスポンジ（ＥＬ−ＰＯＸを含む）は、１分間接着したままであり、止血及び接着を示した。
【０１４２】
この実施例は、適用方法がコラーゲン中の細孔のアクセス可能性に影響し、融解により得られたスポンジと液体でのコーティングにより得られたスポンジとの間の止血及び接着の差を説明することを示す。
【０１４３】
実施例８
外傷性肝臓及び脾臓破裂の処置は、外科医にとってはとても困難なものある。脾臓は優れた血液供給を有するので、脾臓の破壊は多くの場合、多量の腹部出血を伴う。
【０１４４】
ｎ＝１の麻酔したブタ（家畜ブタ、雄、体重範囲：４０ｋｇ、成体）で標準化組合せ貫通脾臓破裂を起こした。脾臓にアクセスするため、正中線開腹術を行った。外科用メスを用いて、ｎ＝３（Ｓ１〜Ｓ３）の被膜下標準化傷害（１０ｍｍ×１０ｍｍ）を作製した。
【０１４５】
３種類の止血製品を試験し、概略を表５に示す。
【０１４６】
【表５】
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【０１４７】
止血製品に穏やかな圧力を印加した。製品の適用後、止血までの時間を評価した。表６を参照のこと。
【０１４８】
【表６】
0006683398.tif 000008
【０１４９】
この実施例は、ブタの脾臓に対するＥＬ−ＰＯＸコーティング済みスポンジの止血効果を示す。表６の終点に基づいて、ＥＬ−ＰＯＸコーティング済みスポンジは、このモデルにおいて止血を達成するのに、参考製品（Ｈｅｍｏｐａｔｃｈ（商標））と同等に、かつ対照より良く機能した。更に、ＥＬ−ＰＯＸコーティング済みスポンジの血液吸収能は、参考製品の血液吸収能より優れていたことが観察された。したがって、ＥＬ−ＰＯＸコーティング済みスポンジで達成される止血は、血液凝固の迅速な開始により促進されていた。