(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子からなり、食物アレルゲンの経口投与に適した医薬製品であって、
前記粒子のサイズ又は平均サイズが、１μｍ〜１０ｍｍであり、
前記粒子が、コアと胃易動性コーティング層とからなり、
前記コアが、ポリヒドロキシル化された化合物又は糖類で形成されており、かつ、マトリクス中に埋め込まれた食物アレルゲンからなる第１層で被覆されており、
前記胃易動性コーティング層が、６から８の間の中性ｐＨで安定であり、かつ、本質的には前記医薬製品が胃に到達した以降に、胃において分解するように設計されており、かつ、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、及びメチルメタクリレートに由来するカチオン性ポリマーからなり、
前記第１層が、前記胃易動性コーティング層で被覆されており、
胃においてアレルゲンを放出する、医薬製品。
【請求項２】
前記コアが、ラクトース、サッカロース、マンニトール、及びセルロースから選ばれた化合物で形成されている、請求項１に記載の医薬製品。
【請求項３】
前記コアが、球形の糖類で形成されている、請求項１に記載の医薬製品。
【請求項４】
前記セルロースが、微晶質セルロース球体である、請求項２に記載の医薬製品。
【請求項５】
前記マトリクスが、セルロース、（メタ）アクリレート、アルギネート、マルトデキストリン、シクロデキストリン、ゼラチン、ポビドン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び／又はキサンタンガム由来の（コ）ポリマーから選ばれた、１種又は数種の医薬として適合し得る（コ）ポリマーからなる、請求項１〜４のいずれか１つに記載の医薬製品。
【請求項６】
前記マトリクスが、セルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）からなる、請求項１〜４のいずれか１つに記載の医薬製品。
【請求項７】
前記医薬として適合し得る（コ）ポリマーが、水溶性ポリマーと非水溶性ポリマーとからなり、
前記水溶性ポリマーが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）又はヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）であり、前記非水溶性ポリマーが、メタクリレートポリマーである、請求項５に記載の医薬製品。
【請求項８】
前記医薬として適合し得る（コ）ポリマーが、ポビドンである、請求項５に記載の医薬製品。
【請求項９】
外層をさらに含み、
前記胃易動性コーティング層が、前記外層で被覆されている、請求項４〜８のいずれか１つに記載の医薬製品。
【請求項１０】
前記外層が、前記粒子における食物アレルゲンの総量に対して０．５重量％〜１５重量％の食物アレルゲンを含み、かつ、
前記第１層が、前記粒子における食物アレルゲンの総量に対して９９．５重量％〜８５重量％の食物アレルゲンを含む、請求項９に記載の医薬製品。
【請求項１１】
前記マトリクス、及び、存在するのならば前記外層が、香料、着色料、甘味料、テクスチャー化剤、及び／又は乳白剤から選ばれた１つもしくはそれ以上の添加剤を含む、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の医薬製品。
【請求項１２】
前記粒子のサイズ又は平均サイズが、１０μｍ〜１．５ｍｍである、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の医薬製品。
【請求項１３】
前記粒子のサイズ又は平均サイズが、５０μｍ〜１０００μｍである、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の医薬製品。
【請求項１４】
前記粒子が、本質的に球形である、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の医薬製品。
【請求項１５】
前記粒子の少なくとも５０％が、ｐＨ＝１で、５分間で溶解する、請求項１に記載の医薬製品。
【請求項１６】
前記粒子の少なくとも６０％が、ｐＨ＝１で、５分間で溶解する、請求項１に記載の医薬製品。
【請求項１７】
前記粒子が、口腔で溶解しない、請求項１に記載の医薬製品。
【請求項１８】
前記粒子において、
前記コアが、本質的に、直径９０μｍ〜１０００μｍの球形であり、
前記第１層が、前記粒子における食物アレルゲンの総量に対して７０重量％〜１００重量％の食物アレルゲンと、任意に、１つ又はそれ以上の添加剤及び賦形剤とを含み、
前記第１層が、均質で、前記コアの表面全体を被覆している、請求項１に記載の医薬製品。
【請求項１９】
前記食物アレルゲンが、食物抽出物、単離もしくは精製された食物アレルゲン、又はこれらの混合物である、請求項１〜１８のいずれか１つに記載の医薬製品。
【請求項２０】
前記食物アレルゲンが、熱処理した食物アレルゲンである、請求項１〜１９のいずれか１つに記載の医薬製品。
【請求項２１】
前記食物アレルゲンが、１００℃〜１３０℃の温度で熱処理した食物アレルゲンである、請求項２０に記載の医薬製品。
【請求項２２】
前記食物アレルゲンが、低脂肪のアレルゲン調剤である、請求項１〜２１のいずれか１つに記載の医薬製品。
【請求項２３】
前記食物が、落花生、ピーナッツ、ミルク、卵、木の実及び種、魚、貝、甲殻類、穀草、マメ科植物、又はこれらの組み合わせから選ばれる、請求項１〜２２のいずれか１つに記載の医薬製品。
【請求項２４】
前記食物アレルゲンが、ピーナッツ粉調剤である、請求項２３に記載の医薬製品。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１つに記載の医薬製品からなる、医薬組成物。
【請求項２６】
食物アレルゲンを、経口投与によって対象へ供給するのに使用するための、請求項１〜２４のいずれか１つに記載の医薬製品。
【請求項２７】
食物アレルゲンに対する対象の反応性を判定するのに使用するための、請求項１〜２４のいずれか１つに記載の医薬製品。
【請求項２８】
食物アレルゲンに対してアレルギー性を示す対象において、該食物アレルゲンに対する耐性を誘導するのに使用するための、請求項１〜２４のいずれか１つに記載の医薬製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食物アレルゲンの新規処方、及びその使用に関する。本発明は特に、上部消化管で溶解し、食道又は口腔へコントロールされたアレルゲンを曝露させることができる、新しい食物アレルゲン組成物を開示する。本発明の処方は、経口投与に適しており、食物アレルギーの経口免疫療法、アレルギー検査、及び食物チャレンジに用いることができ、食道及び口腔へのコントロールされた曝露にて、臨床反応性のしきい値が評価される。本発明は、あらゆる対象において、特にヒト対象において用いることができ、あらゆる食物アレルゲンに適用することができる。
【背景技術】
【０００２】
食物アレルギーは、２％以下の西洋人の、原因食物としてのピーナッツ、ミルク、卵、魚及び甲殻類、並びに木の実及び種についての主要な役割に、影響を与えている。食物アレルギーの診断は、病歴、インビトロ試験（血中のアレルゲン特異的ＩｇＥの存在下）、特定食物での皮膚反応性試験、インビボ誘発試験、又はこれらのアプローチの組み合わせに基づく。インビボ誘発試験は、二重盲検プラセボ対照法（ＤＢＰＣＦＣ）で行われ、これは、食物アレルギー診断の金字塔と考えられている（Ｓａｍｐｓｏｎ、２０１２）。
【０００３】
ＤＢＰＣＦＣの制限の１つは、食物チャレンジについて標準化された材料がないことである。患者は、食物の匂いのみに基づいて対象の症状を報告するので（偽陽性試験結果）、問題となっている食物の匂いを封じることは、困難なステップである。文献には、食物チャレンジ材料について種々のレシピが見られ、標準化の試みがいくつかなされている（Ｃｏｃｈｒａｎｅら、２０１２）。しかしながら、この段階では、市販されている製品はない。Ｎｏｗａｋは、近年、経口食物チャレンジ試験に関する国際ワークグループレポートを発表し、食物を封じるための種々のビヒクルの使用を詳述した。盲検のために選択されたオリジナルのチャレンジビヒクルは、不透明カプセルであった（Ｍａｙ  ＣＤ、１９７６）。これらは、いずれの食物も、特に添加物及びスパイスをほぼ隠すことができる効果的なものであるが、以下の重要な制限がある。
【０００４】
（１）食物を充分な量で投与することが困難である。
（２）乾燥食物等の加工食物を用いると、関連のあるアレルゲンを破壊する場合がある。
（３）患者が、大きな又は複数のカプセルを飲み込むことが困難な場合がある。
（４）消化に対するカプセルの耐性が大きい場合があり、その結果、遅延吸収となる（特に、通常は口中で、アレルギー性反応の一部が起こるかもしれない）。そして、３０〜６０分間といった長い服用間隔が必要になり、２時間を超える長い観察期間が必要になる。
【０００５】
これらの制限因子により、このような処方はＤＢＰＣＦＣに適していない。さらに、これらは多量のアレルゲンを含んでおり、これらが崩壊することにより、高レベルのアレルゲンが段階的に放出される。このような放出は、緩やかな放出とは対照的に危険であり、有害反応の発現を充分にモニタリングすることが考慮される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bradford MM. A rapid andsensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976 May 7; 72:248-54
【非特許文献２】Cochrane SA, Salt LJ,Wantling E, Rogers A, Coutts J, Ballmer-Weber BK, Fritsche P, Fernandez-RivasM, Reig I, Knulst A, Le TM, Asero R, Beyer K, Golding M, Crevel R, Clare MillsEN, Mackie AR. Development of a standardized low-dose double-blindplacebo-controlled challenge vehicle for the EuroPrevall project. Allergy.2012; 67(1):107-13
【非特許文献３】May CD. Objective clinicaland laboratory studies of immediate hypersensitivity reactions to foods inasthmatic children. J Allergy Clin Immunol 1976; 58:500-15
【非特許文献４】Nowak-Wegrzyn A, Assa'adAH, Bahna SL, Bock SA, Sicherer SH, Teuber SS; Work Group report: oral foodchallenge testing. J Allergy Clin Immunol. 2009 Jun; 123(6 Suppl):S365-83
【非特許文献５】Nowak-W?grzyn A, SampsonHA.Future therapies for food allergies.J Allergy Clin Immunol. 2011 Mar;127(3):558-73
【非特許文献６】Ridolo E, De Angelis GL,Dall’aglio P. Eosinophilic esophagitis after specific oral tolerance inductionfor egg protein. Ann Allergy Asthma Immunol 2011; 106:73-4
【非特許文献７】Rolinck-Werninghaus C,Staden U, Mehl A, Hamelmann E, Beyer K, Niggemann B.Specific oral toleranceinduction with food in children: transient or persistent effect on foodallergy? Allergy. 2005 Oct; 60(10):1320-2
【非特許文献８】Sampson HA, Gerth van WijkR, Bindslev-Jensen C, Sicherer S, Teuber SS, Burks AW, Dubois AE, Beyer K,Eigenmann PA, Spergel JM, Werfel T, Chinchilli VM. Standardizing double-blind,placebo-controlled oral food challenges: American Academy of Allergy, Asthma& Immunology-European Academy of Allergy and Clinical Immunology PRACTALLconsensus report. J Allergy Clin Immunol. 2012 Dec;130(6):1260-74
【非特許文献９】Sanchez-Garcia S, Rodriguez dR, Escudero C, Martinez-Gomez MJ,Ibanez MD. Possibleeosinophilic esophagitis induced by milk oral immuno- therapy. J Allergy ClinImmunol 2012; 129:1155-7
【非特許文献１０】Spergel JM, Andrews T,Brown-Whitehorn TF, Beausoleil JL, Liacouras CA.Treatment of eosinophilicesophagitis with specific food elimination diet directed by a combination ofskin prick and patch tests.Ann Allergy Asthma Immunol. 2005 Oct; 95(4):336-43
【非特許文献１１】Thoke, SB, 2012. A Seminaron Microencapsulation techniques and application. Dept of Pharmaceutics,University of Babhulgaon/Yeola, India
【非特許文献１２】Wasserman RL, Sugerman RW,Mireku-Akomeah AR, Gallucci A, Pence D, Long NA. Peanut oral immunotherapy(OIT) of food allergy (FA) carries a significant risk of eosinophilicesophagitis (EoE) [abstract]. J Allergy Clin Immunol 2011; 127: Abstract 28
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
既に入手可能な食物を選択することは、ＤＢＰＣＦＣにとって当然である（Ｓａｍｐｓｏｎら、２０１２）。しかしながら、既に入手可能な食物は、本当のアレルギー性反応に基づくよりも、むしろ、風味に基づく、また口腔アレルギー症候群（ＯＡＳ）に分類される反応に基づく、主観反応のきっかけとなる場合がある。このことは、偽陽性ＤＢＰＣＦＣ結果を導く。また、アレルゲンを正確な服用量で投与することも困難である。
【０００８】
このように、これまで、非遅延吸収で、かつ偽陽性反応を低減することが可能な手段はない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、新事実に基づき、食物アレルギーを検出／診断又は治療するための新規組成物及び方法に関する。また本発明は、アレルゲンを胃に供給し、口腔へのコントロールされた曝露又はバイパスを可能にする新規処方の使用に関する。
【００１０】
本発明は、食道又は口への実質的な曝露なしで食物アレルゲンを腸管免疫システムへ供給することによる、食物アレルギーの治療に用いられる。本発明はまた、胃及び／又は口腔（例えば、口中）で溶解するように処方されたアレルゲンを経口投与することによって、アレルギー性の対象において、食物アレルゲンに対する耐性を誘発させるために用いることができる。
【００１１】
本発明はまた、非遅延吸収で、かつ、風味認識なしの、改良された反応性試験（ＤＢＰＣＦＣ等）を提供する。本発明の製品は、胃の条件で直ちに溶解し、速攻吸収が可能であり、一方、口腔は、アレルゲン又は食物の風味に曝露されない。
【００１２】
したがって、本発明の目的の１つは、単一粒子（又は粒子）の形状で、食物アレルゲン及びマトリクスからなり、胃において溶解する、経口投与に適した製品を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、単一粒子（又は粒子）の形状で、食物アレルゲン及びマトリクスからなり、胃において食物アレルゲンを放出する、経口投与に適した製品を提供することである。
【００１４】
本発明の特定の実施態様により、単一粒子（又は粒子）の形状で、食物アレルゲン及びマトリクスからなり、口中で急速に溶解を開始し（製品の３０％を超える量が、口中で、２分間未満で溶解し、アレルゲンを即座に放出する）、胃において食物アレルゲンを放出する、経口投与に適した製品が提供される。
【００１５】
本発明の製品は、好適には、アレルゲンがマトリクス中に埋め込まれている粒子状製品である。第１の実施態様において、食物アレルゲンは、中性塊状コアを包囲する層を形成している。別の実施態様では、食物アレルゲンとマトリクスとは、顆粒として混合されている。
【００１６】
第１の実施態様において、製品は、中性ｐＨで安定な胃易動性コーティング内にカプセル封入されており、口腔及び食道へのアレルゲンの曝露がなく、胃において急速に溶解する。このような処方は特に、食物チャレンジ又はアレルギー診断の応用に好適である。
【００１７】
別の実施態様において、製品はカプセル封入されておらず、その表面上に食物アレルゲンのフラクションを含んでおり、口腔又は食道へ、コントロールされたアレルゲンが曝露される。このような処方は特に、ＯＩＴ応用に好適である。
【００１８】
本発明の別の目的は、前記のごとく定義した製品を対象に投与することからなる、該対象の消化管へ食物アレルゲンを供給する方法を提供することである。該方法により、口腔及び食道への、コントロールされた食物アレルゲンの曝露（例えば、高速曝露、制限付き曝露、曝露なし）が確実となる。
【００１９】
本発明はまた、食物アレルゲンに対する対象の反応性を判定する方法に関する。該方法は、経口ルートで対象にアレルゲンを曝露させることからなり、食物アレルゲンは、前記のごとく定義した製品として処方されている。
【００２０】
本発明はさらに、食物アレルゲンに対してアレルギーを示す対象において、食物アレルゲンに対する耐性を誘発させる方法を提供する。該方法は、経口投与によって対象に食物アレルゲンを投与することからなり、該食物アレルゲンは、前記のごとく定義した製品として処方されている。
【００２１】
本発明のまたさらなる目的は、経口投与により、食物アレルゲンに対する対象の反応性を判定するのに使用するための、前記のごとく定義した製品を提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、経口投与により、食物アレルゲンに対してアレルギーを示す対象において、該食物アレルゲンに対する耐性を誘発させるのに使用するための、前記のごとく定義した製品を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、前記のごとく定義した製品と、１種又は数種の医薬として適合し得るビヒクルもしくは賦形剤とからなる医薬組成物を提供することである。
【００２４】
本発明はまた、食物アレルゲン製品を製造する方法に関する。該方法は、
（i）食物を供給すること、
（ii）任意に、アレルゲンを強化又は精製して該食物を処理すること、
（iii）任意に、（i）又は（ii）の食物もしくはアレルゲンを加熱すること、及び
（iv）食物又はアレルゲンを、マトリクスと混合するか、もしくはマトリクスでコーティングすることにより、粒子を形成すること
からなる。
【００２５】
本発明は、あらゆる対象において、特にヒト対象において用いることができ、例えば、ピーナッツ（又は落花生）、ミルク、卵、穀草、木の実及び種、魚又は甲殻類、もしくはこれらの組み合わせといった、あらゆる食物アレルゲンに適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、中性コアからなり、コーティングなしの、本発明の処方の組成を示す図面である。
【図２】図２は、中性コアと、コーティングとからなる、本発明の処方の組成を示す図面である。
【図３】図３は、中性コアと、コーティングと、外層とからなる、本発明の処方の組成を示す図面である。
【図４】図４は、顆粒としてマトリクス中に埋め込まれたアレルゲンからなる、本発明の処方の組成を示す図面である。
【図５】図５は、顆粒としてマトリクス中に埋め込まれたアレルゲンからなり、外層を有する、本発明の処方の組成を示す図面である。
【図６】図６は、顆粒としてマトリクス中に埋め込まれたアレルゲンからなり、追加の香料及び／又は着色料及び／又は口当たり改良剤を添加した外層を有する、本発明の処方の組成を示す図面である。
【図７】図７は、ｐＨ＝１での、処方Ａ及びＢの溶解特性を示すグラフである。
【図８】図８は、ｐＨ＝１又はｐＨ＝８での、処方Ｄ及びＥの溶解特性を示すグラフである。
【図９】図９は、ｐＨ＝１又はｐＨ＝８での、処方Ｆ及びＨの溶解特性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、消化管でアレルゲンを放出し、風味、免疫原性、及び口腔への曝露をコントロールする新規処方に基づき、食物アレルギーを検出／診断又は治療するための新規組成物及び方法に関する。本発明は、非遅延吸収で、かつ、風味認識なしの、及び／又は、コントロールされた風味の、改良された反応性試験（ＤＢＰＣＦＣ等）を提供する。本製品は、胃の条件で直ちに溶解し、速攻吸収が可能であり、一方、口腔は、アレルゲン又は食物の風味に曝露されない。本発明により、また、食物アレルゲンは、食道又は口への曝露がコントロールされ、腸管免疫システムへ供給されて、食物アレルギーの治療がなされる。本発明は、本発明にしたがって処方されたアレルゲンを経口投与することによって、アレルギー性の対象において、食物アレルゲンに対する耐性を誘発させるために用いられる。
【００２８】
アレルギー性の対象を、問題となっている食物に経口ルートにて曝露させる（経口免疫療法、ＯＩＴ）ことによって、耐性を誘発することに関する多数のレポートが公開されてきている。しかしながら、多くの患者が好酸球性食道炎を生じ（ＥｏＥ、Ｒｉｄｏｌｏら、２０１１、Ｗａｓｓｅｒｍａｎら、２０１１、Ｓａｎｃｈｅｚら、２０１２）、アレルギー性の患者の人生のクオリティーに著しく衝撃を与える状況を作り出すので、ＯＩＴのこの形態は、臨床診療に適していない。さらに、ＯＩＴを中止することにより、ＥｏＥ症状が徐々に低減する一方、ＥｏＥ症状が消失するまで、規定食から食物を除去するのに４〜８週間を要する（Ｓｐｅｒｇｅｌら、２００５）。しかしながら、効果的なＯＩＴとして、食物は定期的に（例えば、毎日）摂取されるべきであり、毎日のスケジュールの中断は、生じた耐性の損失を導く（Ｒｏｌｉｎｃｋ−Ｗｅｒｎｉｎｇｈａｕｓら、２００５；Ｎｏｗａｋ−Ｗｅｇｒｚｙｎ及びＳａｍｐｓｏｎ、２０１１）。さらに、従来のＯＩＴにより、しばしば、一時的でより低い、局部的な反応性（すなわち、局部的なエネルギー欠乏）のみが生じる一方、脱感作又は耐性の誘発を達成するには、問題となっているアレルゲンをより多量に服用することが必要であり、この多量のアレルゲンは、前記のごとき臨床的な副作用の点から、経口投与が不可能である。
【００２９】
米国特許公開第２００５／０６３９９４号公報には、基本的に腸管投与によって、免疫原性を含む微生物を腸へ放出するための組成物が開示されている。国際公開第ＷＯ２０１１／０１８５０４号公報には、オイルドロップ処方が開示されており、国際公開第２００７／１１２７４７号公報には、胃又は腸で放出される、分離した明確な免疫原性を伴う複合処方が開示されている。これらの公報では、感作対象において、口腔がコントロールされたアレルゲンの曝露を受ける結果についての取り組みがなされていない。
【００３０】
本発明により、コントロールされた風味で、食道への食物の曝露をコントロールして、食物アレルゲンを腸管免疫システムへ急速に供給することができる、新規組成物及び方法が提供される。本発明の製品は、既定の組成物を有し、医薬適合性であり、本質的に風味がないか又は風味がコントロールされており、ＤＢＰＣＦＣにおける使用の際に、主観的な有害反応及び前記のごときＯＡＳが生じる機会を制限する。さらに、食道粘膜へのアレルゲンの曝露がコントロールされているので、製品において、より高い服用量となるアレルゲンを使用することができる。さらに、対象の感作が生じるリスクは、通常のアレルゲンを食道粘膜に接触させて観察したとおり（Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎら、２０１１）、非常に制限される。したがって、食道への食物の曝露をコントロールすることにより、好酸球性食道炎及び感作のリスクは避けられる。
【００３１】
このように、本発明により、アレルギーを示す患者への食物アレルゲンの投与に関する実質的な改良が提供され、反応性の判定及び脱感作の方法が改良される。
【００３２】
＜処方＞
以下に示すように、本発明は特に、特定の分解／溶解特性を伴う食物アレルゲンの新規処方の開発に係り、これらの処方は、アレルギーを示す患者における、耐性の誘発又は食物アレルゲンへの反応性の試験に特に有利である。
【００３３】
さらに特に、本発明により、粒子の形状で、食物アレルゲンとマトリクスとからなり、経口摂取に適した医薬製品及び医薬組成物が提供され、該組成物は、酸性条件下で溶解する。
【００３４】
本発明により、また、粒子の形状で、食物アレルゲンとマトリクスとからなり、経口摂取に適した組成物が提供され、該組成物は、胃において食物アレルゲンを放出する。
【００３５】
本発明により、また、粒子の形状で、食物アレルゲンとマトリクスとからなり、経口投与に適した組成物が提供され、該製品は、口中で急速に溶解を開始し（粒子の３０％を超える量が、口中で、２分間未満で溶解し）、胃において食物アレルゲンを放出する。このような溶解特性は、処方されていないアレルゲンの３〜５倍の速度というように、特に顕著である。
【００３６】
特定の実施態様において、本発明の製品又は粒子は、中性ｐＨで安定な胃易動性コーティングを含む。このような処方は、消化管において溶解するが、口腔内では溶解しない。したがって、口腔へのアレルゲンの曝露が妨げられる。このような処方は、本質的に非免疫原性で、本質的に風味がなく（又は、もしコーティングが規定の香料を含んでいるのならば、風味がコントロールされており）、食物チャレンジ試験に非常に順応し得る。
【００３７】
別の特定の実施態様において、本発明の製品又は粒子は、コントロールされた量の食物アレルゲンからなる外層を含む。このような処方は、消化管において溶解し、口腔へのアレルゲンの曝露が制限され、コントロールされる。このような組成物は、口中で溶解を開始し、本質的に風味がなく（又は、もし製品が規定の香料を含んでいるのならば、風味がコントロールされており）、ＯＩＴ又はアレルギー検出に非常に順応し得る。
【００３８】
別の特定の実施態様において、本発明の製品又は粒子は、コントロールされた量の香料及び／又は着色料及び／又は口当たり改良剤からなる外層を含む。このような処方は、口中で急速に溶解を開始し、口腔が高速で、コントロールされたアレルゲンに曝露されることを可能にする。このような組成物は、食物チャレンジ又はアレルギー検出に非常に順応し得る。
【００３９】
本発明の特定の製品は、粒子の形状で、食物アレルゲンからなる第１層で包囲された中性コアからなる。
【００４０】
別の特定の実施態様において、コアは、何らかの後続するアレルゲン含有層なしで、直接食物アレルゲンを含むことができる。
【００４１】
本発明の別の特定の製品は、粒子の形状で、好適には顆粒として、マトリクスに埋め込まれた食物アレルゲンからなる。
【００４２】
特定の実施態様において、本発明の製品は、胃易動性コーティングを含まない。このような製品は、カプセル封入されておらず、コントロールされた溶解、風味及び免疫原性が認められる。特に、直接造粒にて調製された、マトリクスに埋め込まれた食物アレルゲンからなる組成物により、非常に好適な分解特性が発現される。このような組成物は、風味及び外観をコントロールするために、例えば香料及び／又は着色料及び／又は甘味料及び／又はテクスチャー化剤及び／又は乳白剤及び／又は口当たり改良剤等の添加剤を含むように、さらに修飾される。本発明のこのような顆粒を得るのに適した他の技術には、特に限定がなく、流動造粒、圧縮又は押出しが含まれる。
【００４３】
別の特定の実施態様において、本発明の製品はさらに、中性ｐＨで安定な胃易動性コーティングを含む。このような組成物で、口腔へのアレルゲンの曝露は、本質的に妨げられ、好適な添加剤（例えば、香料）をコーティング中に加えることにより、該製品の風味をなくすか、又は風味をコントロールすることができる。このような製品は、特にＯＩＴに有用であり、そのうえ、食物チャレンジ、又はアレルギーの診断／検出に用いられる。このような製品は、それ自身における非免疫原性が必須で、分解においてのみ免疫原性となり、食物アレルゲンを放出する。すなわち、無傷の、非分解／非溶解形状で、該製品は非免疫原性であることが必須である。それは、アレルゲンが、組織に曝露されていないか、又は組織と充分に接触していないことが必須であるからで、アレルゲンが放出され、免疫原性反応を誘発し得るのは、溶解したとき又は溶解している間のみである。該組成物が経口で摂取されたとき、口腔へのアレルゲンの曝露が妨げられるので、この局面は重要である。この非免疫原性の特徴は、実施例で開示するような多くの適したシステムにおいて実証される。特に、組成物又は製品を免疫細胞もしくは抗体に曝露することにより、特定の反応が生じないことが実証される。好ましい実施態様において、免疫原性の欠乏は、口腔における検出可能な又は実質的な好酸性反応の不在によって実証される。
【００４４】
免疫原性の欠乏は、中性又は弱酸性のｐＨでの製品／組成物の安定性によって、口腔（口及び食道）において確実なものとなる。口中のｐＨは、実質中性であり（すなわち、６から８の間、特には６．５から７．５の間）、食道では、通常のｐＨは４から６の間、特には４．５から５．５の間である。本発明の組成物は、このようなｐＨ範囲で安定となるように設計され、これらのコンパートメントでは溶解しない。特に、好ましい実施態様において、本発明の組成物は、４から８の間、通常は６から８の間のｐＨで安定な胃易動性コーティングを含む。安定性とは、限定溶解は時間とともに除外されないが、本質的にこのようなｐＨで製品が溶解しないことを示す。特に、好ましくは、インビボにおいて３０分間後、ｐＨ＝７の水溶液中に溶解するのが、製品の１０％未満、より好ましくは５％未満であるとき、製品は中性ｐＨで安定である。
【００４５】
このようなコーティングを本発明の粒子に加えることにより、本質的に風味のない製品もまた調製することができる。治療患者の主観反応を妨げることができるので、食物の風味の欠乏は有利な特徴である。この点で、「風味のない」という用語は、製品が本質的に食物の風味を持っておらず、認識が困難であることを示す。
【００４６】
その代わりに、製品の風味は、例えば製品に香りを加える（コーティングで、又は他の層において）ことによってコントロールされる。このように、食物に関係なく、区別し得る風味を製品に与えることが可能であり、これにより、例えば優占的な風味によって食物の風味を隠すことができる。また、人工的な香りを用いて、問題となっている食物の風味を製品に与えることも可能である。このような方法で、製品及びプラセボの双方において、同様の手段で、風味／香りはコントロールされ、使用される。香料の例には、限定がないが、オレンジフレーバー、ピーナッツフレーバー、カラメルフレーバー、バニラフレーバー、バナナフレーバー、クエン酸フレーバー、レモンフレーバー、はちみつフレーバー、チョコレートフレーバー、バブルガムフレーバー、又はストロベリーフレーバーが含まれる。特別な香料の例には、オレンジフレーバー（Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ、スイス）、又はクエン酸フレーバー（Ｓｉｇｍａ−Ｆｌｕｋａ、スイス）が含まれる。
【００４７】
本発明のこれらの組成物又は製品は、好適には、酸性条件下で、好ましくは４未満のｐＨで溶解するように設計される。より好適には、このような条件下で、製品は急速に溶解し、高速でアレルゲンを放出する。この点で、提示のデータにより、驚くべきことに、食物アレルゲンは、遊離型の状態よりも本発明によって処方されたときに、酸性条件下で、より急速に溶解することが示されている。図７に示すとおり、酸性条件下で、処方Ａ及びＢは、未処方のピーナッツ粉よりも、より急速に溶解している。これらの結果は、まったく予期しなかったものであり、本発明の組成物に顕著な利点を与えるものである。セオリーのとおりではない１つの説明は、処方の間に、アレルゲンが最少量の水中に分散し、その後マトリクス又は賦形剤と混合する、ということである。乾燥すると、マトリクス又は賦形剤により、アレルゲンのより急速な溶解が可能になる。
【００４８】
本発明の別の組成物又は製品は、好適には、中性条件下で、好ましくは約ｐＨ＝８で急速に溶解を開始するように設計される。提示のデータにより、驚くべきことに、食物アレルゲンは、遊離型の状態よりも本発明によって処方されたときに、中性条件下で、より急速に溶解することが示されている。図９に示すとおり、中性条件下で、処方Ｈは、未処方のピーナッツ粉よりも、より急速に溶解している。これらの結果は、まったく予期しなかったものであり、本発明の組成物に顕著な利点を与えるものである。このような処方により、口中での溶解が高速で開始され、放出が胃まで進行する。摂取の際に、食物は、ぜん動運動によって食道から胃へ移送される前に、ほんの短時間だけ口中で保持されるので、口中でアレルゲンが速攻で放出されることは重要である。通常は、咀嚼、食塊形成、嚥下、及び胃への移送には、約２分間を要する。
【００４９】
さらに、前記カプセル封入されている、又はカプセル封入されていない本発明の粒子状製品は、その特性をさらにコントロールするために、さらに外層を含むことができる。この点で、該外層は、コントロールされた量の食物アレルゲンを含み、これにより、胃における多量の放出の前に、口腔内でコントロールされた免疫反応が開始される。特に、外層は、製品における食物アレルゲンの総量の０．５重量％〜１５重量％を含み、一方、第１層又は顆粒は、製品における食物アレルゲンの総量に対して９９．５重量％〜８５重量％の食物アレルゲンを含む。好適には、外層は、存在するのならば、製品における食物アレルゲンの総量の１重量％〜１０重量％、より好ましくは１重量％〜７重量％を含む。
【００５０】
加えて、外層は、存在するのならば、１つ又はそれ以上の香料及び／又は着色料及び／又は甘味料及び／又はテクスチャー化剤及び／又は乳白剤及び／又は口当たり改良剤等の、１つもしくはそれ以上の添加剤を含むことができ、必要に応じて、製品の風味及び外観がコントロールされる。
【００５１】
香料の例には、限定がないが、オレンジフレーバー、カラメルフレーバー、バニラフレーバー、バナナフレーバー、クエン酸フレーバー、レモンフレーバー、はちみつフレーバー、チョコレートフレーバー、バブルガムフレーバー、又はストロベリーフレーバーが含まれる。
【００５２】
着色料の例には、限定がないが、カラメル（この着色料は、ピーナッツ粉の色と一致するので、ピーナッツ粉処方に特に適している）、二酸化チタン（これは、乳白剤としても作用する）、又は赤色着色料Ｅｎｏｃｉａｎｉｎが含まれる。
【００５３】
本発明の製品は、例えば、粒子、粉末、微粒子、マイクロカプセル等の形状であればよい。
【００５４】
特定の実施態様において、製品は、食物アレルゲンを含むマイクロカプセル又は顆粒である。マイクロカプセル又は顆粒の異なる構造を用いることができ、この構造には、さらに１種又は数種の賦形剤が含まれていてもよい。最も好適には、マイクロカプセルには、以下の（i）、（ii）、及び／又は（iii）が含まれる。
（i）層で被覆された顆粒又は中性コア等のコア。該コアは、食物アレルゲンと、任意に、１種又は数種の賦形剤とを含む。
（ii）任意に、胃易動性コーティング。
（iii）任意に、賦形剤、添加剤、及び／又はコントロールされた量の食物アレルゲンを含む外層。
【００５５】
特定の実施態様において、製品は、コーティングされた顆粒又はマイクロカプセルからなり、これは、所定サイズの食物アレルゲンの顆粒を、賦形剤ありで又はなしで、胃易動性コートにてコーティングすることにより得られる。
【００５６】
別の特定の実施態様において、製品は、コーティングされていない顆粒又はマイクロカプセルからなり、これは、食物アレルゲンを、賦形剤ありで又はなしで、所定サイズに直接造粒することによって得られる。
【００５７】
別の特定の実施態様において、アレルゲンの顆粒は、所定サイズの粒子であり、これは、食物アレルゲンを、賦形剤ありで又はなしで、押出し成形によりペレット化し、次いで球状化することによって得られる。得られる顆粒は、均一で球状の粒子であり、胃易動性コートにてコーティングすることができる。別の実施態様において、食物アレルゲンの顆粒又は粒子は、中性コアからなり、これは、まず、賦形剤と組み合わせて又は組み合わせずに、食物アレルゲンにてコーティングされ、続いて、胃易動性コートにてコーティングされる。
【００５８】
本発明の特定の目的は、経口投与に適しており、食物アレルゲンからなる第１層で包囲された中性コアを有する粒子からなる製品を提供することである。該製品は、胃において溶解するか、又は胃において食物アレルゲンを放出する。このような製品の例は、処方Ａとして実施例に記載されている。中性コアは、糖類又は微晶質セルロース球体から得られ、後者は、非齲蝕原性であり、糖尿病にさらに適している。好適な実施態様において、組成物は、以下の原料（製品の総量に対する量（重量％））からなる（又は、混合することによって調製される）。
アレルゲン                              ３０〜３５％、
Ｐｏｖｉｄｏｎｅ  Ｋ３０（結合剤）      １５〜２０％、
コア（糖類）粒子（２５０〜３５５μｍ）  ４５〜５０％、及び
香料及び／又は着色料                    ０．１〜１％
【００５９】
本発明の別の特定の目的は、経口投与に適しており、マトリクス中に埋め込まれた食物アレルゲンの粒子からなる製品を提供することである。該製品は、胃において溶解するか、又は胃において食物アレルゲンを放出する。このような製品の例は、処方Ｄ及びＥとして実施例に記載されている。好適な実施態様において、組成物は、以下の原料（製品の総量に対する量（重量％））からなる（又は、混合することによって調製される）。
アレルゲン                      ５０〜６０％、
粉糖                            ３７〜４３％、
Ｐｏｖｉｄｏｎｅ  Ｋ２９−３２  １〜５％、及び
香料及び／又は着色料            ０．０〜１％
【００６０】
本発明の別の特定の目的は、経口投与に適しており、食物アレルゲンからなる第１層で包囲された中性コアと、中性ｐＨで安定なコーティング層とを有する粒子からなる製品を提供することである。該製品は、胃において溶解するか、又は胃において食物アレルゲンを放出する。このような製品の例は、処方Ｂとして実施例に記載されている。
【００６１】
本発明の別の特定の目的は、経口投与に適しており、マトリクス中に埋め込まれた食物アレルゲンの粒子からなる製品を提供することである。該粒子は、着色料及び／又は香料及び／又は口当たり改良剤からなる外層を含み、該製品は、口中で２分間後に、アレルゲンの少なくとも２５％、より好適には少なくとも３０％を放出する。このような製品の例は、処方Ｆ、Ｇ、及びＨとして実施例に記載されている。特定の実施態様において、本発明は、経口投与に適しており、マトリクス中に埋め込まれた食物アレルゲンの粒子からなる製品に関する。該粒子は、着色料及び／又は香料及び／又は口当たり改良剤からなる外層を含み、該マトリクスは、少なくとも粉糖、ポビドン（Ｐｏｖｉｄｏｎｅ）、及びアビセル（Ａｖｉｃｅｌ）を含み、該外層は、コロイド状二酸化ケイ素又はヒドロキシエチルセルロース又は香料を含む。好適な実施態様において、組成物は、以下の原料（製品の総量に対する量（重量％））からなる（又は、混合することによって調製される）。
アレルゲン                      ０．１〜７０％、
粉糖                            ３５〜６０％、
Ｐｏｖｉｄｏｎｅ  Ｋ２９−３２  ０〜３％、
Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０１        ０〜４５％、
着色料１                        ０．１〜２％、
乳白剤                          ０．５〜２０％、
香料１                          ０〜０．５％
好ましくは０．１〜０．５％、
ヒドロキシエチルセルロース      ０〜２％
好ましくは１〜２％、及び
コロイド状二酸化ケイ素          ０〜０．５％
好ましくは０．１〜０．５％
【００６２】
本発明の別の特定の目的は、経口投与に適しており、マトリクス中に埋め込まれた食物アレルゲンと、中性ｐＨで安定なコーティング層との粒子からなる製品を提供することである。該製品は、胃において溶解するか、又は胃において食物アレルゲンを放出する。
【００６３】
本発明の別の特定の目的は、経口投与に適しており、マトリクス中に埋め込まれた食物アレルゲンと、添加剤（例えば、香料及び／又は着色料及び／又は甘味料及び／又はテクスチャー化剤及び／又は乳白剤）を含む外層との粒子からなる製品を提供することである。該製品は、胃において溶解するか、又は胃において食物アレルゲンを放出する。このような製品の例は、処方Ｆとして実施例に記載されている。
【００６４】
本発明のさらなる特定の目的は、経口投与に適しており、食物アレルゲンを含む第１層で包囲された中性コアと、中性ｐＨで安定なコーティング層と、食物アレルゲン及び添加剤（例えば、香料及び／又は着色料及び／又は甘味料及び／又はテクスチャー化剤及び／又は乳白剤）を含む外層とを有する粒子からなる製品を提供することである。該製品は、胃において溶解するか、又は胃において食物アレルゲンを放出する。このような製品の例は、処方Ｃとして実施例に記載されている。
【００６５】
マトリクスは、医薬として適合し得る（コ）ポリマーから選ばれる、１種又は数種の化合物の混合物からなる。このようなポリマー又はコポリマーの例には、セルロース、（メタ）アクリレート、ビニルアルコール、アルギネート、マルトデキストリン、シクロデキストリン、ゼラチン、ポビドン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、キサンタンガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及び／又はカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）由来のポリマーが含まれる。特定の実施態様において、マトリクスは、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）等のセルロースからなる。別の特定の実施態様において、マトリクスは、水溶性ポリマー（例えば、ＣＭＣ又はＨＰＭＣ）と、非水溶性ポリマー（例えば、メタクリレートポリマー）とからなる。中性コアは、従来既知の、相溶性を有する糖類又は合成ポリマーのいずれかを含むことができる。
【００６６】
胃易動性コーティング材料は、本質的には製品が胃に到達した以降に、胃において分解するように設計されている。また、胃においてアレルゲンのほとんどが高速で放出されるように、製品は、急速に溶解するように設計されている。好適には、製品は、５未満のｐＨで、通常は１．２〜４．５のｐＨ範囲で溶解する。該コーティングは、例えば各種カチオン性（コ）ポリマー又はこれらの混合物等の、天然又は合成（コ）ポリマーからなる。このようなポリマーの例には、エチルセルロースに加えて、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、及びメチルメタクリレートに由来するカチオン性コポリマーが含まれる。その他の例は、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）である。このようなコポリマーは、例えば、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｅ  １２，５、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｅ１００、又はＥｕｄｒａｇｉｔ  ＥＰＯとして入手可能である。
【００６７】
製品の好適な放出プロフィルは、経口摂取後１０分間から２時間の間である。このような放出プロフィルで、本質的に、口腔（口又は食道）内で溶解が起こらず、本質的に、胃において全ての食物アレルゲンが放出される。
【００６８】
好適な実施態様において、製品の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％が、ｐＨ＝１で、５分間で溶解する。
【００６９】
前記のとおり、製品又は組成物は、キャリア材、充填剤、結合剤、又は滑剤等の１種又は数種の賦形剤を含んでいてもよい。好ましい賦形剤の例には、限定がないが、ポテト、コーン、小麦又は代替源からのデンプン、化工デンプン、ラクトース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、デキストローズ、キサンタンガムが含まれる。賦形剤の特定の例には、例えば、Ｐｏｖｉｄｏｎｅ  Ｋ３０、Ｍａｃｒｏｇｏｌ  ４０００、Ｔａｌｃ  Ｍｉｃｒｏａｃｅ  Ｐ−３、又はＰｏｖｉｄｏｎｅ  Ｋ２５が含まれる。通常は、食物アレルゲンは、前記１種又は数種の賦形剤と混合され、処置されて、所定の（平均）サイズの粒子を形成する。
【００７０】
さらに、前述のとおり、製品（例えば、マトリクス、コーティング又は外層）は、香料、着色料、甘味料、テクスチャー化剤、及び／又は乳白剤等の添加剤を含んでいてもよい。
【００７１】
本発明の製品における粒子は、球形、卵形、幾何学形等の種々の形状を有していてもよい。さらには、好適な実施態様において、該粒子の（平均）サイズは、１μｍから１０ｍｍの間、好適には１０μｍから１．５ｍｍの間、より好適には５０μｍから１０００μｍの間、さらに好適には５０μｍから９００μｍの間である。
【００７２】
特定の実施態様において、本発明の製品は、中性塊状コア、該塊状コアを被覆する第１層、及び該第１層を被覆するコーティングからなる。コアは、好ましくは球形で、平均直径が約９０μｍ〜１０００μｍである。コアは、ポリヒドロキシル化された化合物又は糖類（例えば、ラクトース、サッカロース、マンニトール、セルロース等）等の、適合し得るいずれかの材料で形成される。第１層は、食物アレルゲンと、任意に、１つもしくはそれ以上の賦形剤及び／又は添加剤とを含む。第１層は、好ましくは均質で、コアの表面全体を被覆している。コーティングもまた、均質で、第１層の表面全体を被覆している。コーティングは、通常は、製品の乾燥重量の０．５％〜２０％、好ましくは１％〜１５％の量を示す。
【００７３】
使用量に基づき、製品における食物アレルゲンの含有量は、製品の０．１重量％〜９９．５重量％であればよい。本発明の特定の製品には、製品の総重量に対して、４０重量％〜９５重量％、例えば４０重量％〜７０重量％の食物アレルゲンが含まれている（高服用製品）。本発明のさらなる特定の製品には、製品の総重量に対して、０．１重量％〜５重量％の食物アレルゲンが含まれている（低服用製品）。したがって、食物アレルゲン／（マトリクス及び賦形剤及び添加剤）の比は、アレルゲン服用量に基づいて、０．０１〜１００の範囲でればよい。
【００７４】
製品の調製のために、従来、例えばＴｈｏｋｅ（２０１２）によって検討されたような広範に亘る種々の技術が知られている。特に、物理的、物理化学的、又は化学的技術により、マイクロカプセル化が行われる。物理的技術の例には、遠心押出し、パンコーティング、噴霧乾燥、斜流又は振動ノズル、電気描画、電気噴霧、ブロー描画、又はブロー噴霧が含まれる。物理化学的技術の例には、コアセルベーション及びイオンチャンネル型ゲル化が含まれる。化学的技術の例には、ポリマー化又は溶媒蒸発が含まれる。
【００７５】
コーティングの代わりに、食物アレルゲンと適した賦形剤とを処方し、次いで、球状化と組み合わせて、又は組み合わせずに押出すことにより、顆粒を製造することができる。このように特定のコーティングがない粒子は、まだ、選択した賦形剤の分解特徴に起因して、コーティングされた粒子について先に記載したような分解特性を有する。
【００７６】
本発明のさらなる目的は、また、前記のごとく定義した製品又は組成物を製造する方法を提供することである。該方法は、
（i）食物アレルゲンを供給すること、
（ii）任意に、食物アレルゲンを処理及び／又は加熱すること、
（iii）任意に、食物アレルゲンを、１つもしくはそれ以上の賦形剤又は添加剤と組み合わせること、
（iv）平均サイズが１０μｍから１ｍｍの間の粒子として食物アレルゲンを処方すること、
（v）任意に、（iv）の粒子を胃易動性コートでコーティングすること、並びに
（vi）任意に、（iii）又は（iv）の粒子に、賦形剤及び／又は添加剤及び／又はコントロールされた量の食物アレルゲンを含む外層を加えること
からなる。
【００７７】
特定の実施態様において、食物アレルゲンは、溶液中で懸濁しており、これに賦形剤が任意に添加され、調製された溶液は、電気描画又は電気噴霧又はブロー描画又はブロー噴霧に供される。これにより、所定の平均サイズ及び分解プロフィルを有するマイクロカプセル化食物アレルゲン製品が形成される。
【００７８】
前記のとおり、マトリクスは、通常は高分子体又はその混合物である。また、マトリクスは、香料を含んでいてもよく、該香料は、処方された食物の香りであってもよく、そうでなくてもよい。例えば、ピーナッツであれば、製品には、オレンジフレーバー、ピーナッツフレーバー、カラメルフレーバー、バニラフレーバー、バナナフレーバー、クエン酸フレーバー、レモンフレーバー、はちみつフレーバー、チョコレートフレーバー、バブルガムフレーバー、又はストロベリーフレーバーが含まれていてもよい。
【００７９】
特定の実施態様において、食物がピーナッツであれば、ピーナッツアレルゲンは、内因性炭水化物、繊維、及び賦形剤の役割を果たすタンパク質を含んでいるので、食物アレルゲンと賦形剤とを組み合わせる必要はない。ピーナッツアレルゲンは、前記のごとき技術でコーティングされていてもよく、ピーナッツ材が所望の分解特性を有する賦形剤と組み合わされている場合は、コーティングは省略されてもよい。安定性、アレルゲン性、及び消化性の観点からピーナッツの特徴を管理するために、ピーナッツアレルゲンは、処方の前に加熱されてもよい。加熱処理は、６０℃から１８０℃の間、好ましくは８０℃から１５０℃の間、より好ましくは１００℃から１３０℃の間、最も好ましくは１１０℃から１２５℃の間で、ロースト、ボイル、又はフライによって、１５分間から２４時間の間、通常は、１時間、２時間、３時間、又は４時間等の０．５時間から５時間の間の時間で行うことができる。
【００８０】
本発明のさらなる目的は、プラセボ製品を製造する方法を提供することである。該方法は、
（i）１つ又はそれ以上の賦形剤を供給すること、
（ii）平均サイズが１０μｍから１ｍｍの間の粒子として賦形剤を処方すること、
（iii）任意に、（ii）の粒子を胃易動性コートでコーティングすること、及び
（iv）任意に、（ii）又は（iii）の粒子に、賦形剤及び／又は添加剤を含む外層を加えること
からなる。
【００８１】
特定の実施態様において、用いられる賦形剤は、食物アレルゲン製品の製造に用いられるものと同じである。さらに、好適な実施態様において、マトリクスは、食物アレルゲン製品に含まれるものと同じ香料を含む。
【００８２】
本発明のさらなる目的は、前記のごとく定義した数種の製品と、１つ又はそれ以上のビヒクルとからなる組成物を提供することである。
【００８３】
＜キット＞
本発明のさらなる目的は、１つ又はそれ以上の前記のごとき製品もしくは組成物と、コンテナー又はリーフレット又は取扱説明書とからなるキットを提供することである。該キットは、さらに、ブリスター、ボトル、容積測定スプーンセット、ボックス等の梱包手段を備えることができる。
【００８４】
本発明の特定のキットは、食物アレルゲンと同じ服用量を有する、本発明の数種の製品を含む。
【００８５】
本発明の別のキットは、２つのセパレート型コンテナーを備え、一方は、前記のごとく定義した１種又は数種の製品を含み、他方は、対応するプラセボ製品を含み、食物アレルゲン成分は賦形剤と交換されている。その結果、活性処方は、本質的にプラセボと区別がつかない。
【００８６】
＜食物アレルゲン＞
本発明は、限定がないが、落花生、ピーナッツ、ミルク、卵、木の実及び種（限定がないが、例えば、ヘーゼルナッツ、カシューナッツ、クルミ、ピーカンナッツ、ブラジルナッツ、マカダミアナッツ、クリ、ピスタチオ、ココナッツ、アーモンド、セサミ、マスタード）、魚、貝、甲殻類、穀草（限定がないが、例えば、小麦、コーン、オート麦、大麦、ライ麦、米、モロコシ、スペルト小麦）、マメ科植物（限定がないが、例えば、豆、インゲン豆、黒豆、三度豆、ひよこ豆、エンドウ豆、カウピー豆、レンズ豆、ハウチワ豆）、又はこれらの混合物等の、食物もしくは食物アレルゲンにて用いることができる。
【００８７】
「食物」という用語は、全体の、無傷の食物、もしくはその調製物又は抽出物を示す。食物は、例えば、天然の形状で、生で、もしくは調理された状態で、もしくは加熱された状態で、もしくは切断された状態で、もしくは配合又は混合された状態であればよい。
【００８８】
「アレルゲン」という用語は、食物中のアレルギー性反応に関わるいずれかの免疫原性分子をいう。アレルゲンには、例えば、脂質、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド等の種々の型がある。特定の実施態様において、アレルゲンは、天然の食物調剤、食物抽出物、もしくは精製タンパク質、ポリペプチド及び／又はペプチド組成物である。アレルゲンは、天然の状態であってもよく、人工的に製造されてもよい（例えば、遺伝子組み換え及び／又は酵素学的な技術によって、及び／又は、例えば、デノボ合成によって）。アレルゲンは、その安定性、免疫原性等を改良するために、構造的に変更又は修飾されてもよい。アレルゲンは、純正であってもよく、他の構成成分との混合状態であってもよい。アレルゲンは、数種の分子（例えば、抽出物）の混合物であってもよい。アレルゲンは、溶液又は乾燥物等の異なる状態で用いることができる。アレルゲンは、無傷で、天然の形状で、又はフラグメントで、変性された形状等で用いることができる。通常、組み合わせとしての数種のアレルゲン、及び／又は、コンジュゲート又は複合体としてのアレルゲンからなる調剤が用いられる。
【００８９】
特定の実施態様において、食物アレルゲンは、生又は天然の食物であるか、もしくはその抽出物である。
【００９０】
別の特定の実施態様において、食物アレルゲンは、加熱食物又は食物抽出物である。この点で、食物は、アレルゲンを放出する、変性させる、及び／又はその本質を明らかにするのに充分な条件下で加熱することにより、処理される。特定の実施態様において、食物又はその抽出物は、６０℃から１８０℃の間の温度で処理される。数種のアレルゲン調剤は、７０℃から１１０℃の間、一般には７０℃から８０℃の間の穏やかな加熱処理、又は、１００℃から１８０℃の間の高温処理に供される。また、加熱処理の継続時間を変化させることができる。もし、加熱温度が制限されるならば（例えば、ある温度での既知の変性による制限）、多少低い温度での加熱の継続時間が延長される。好適には、食物又はその抽出物は、８０℃から１５０℃の間、より好ましくは１００℃から１３０℃の間、最も好ましくは１１０℃から１２５℃の間の温度で、１５分間から２４時間の間、通常は、１時間、２時間、３時間、又は４時間等の０．５時間から５時間の間の時間で処理される。
【００９１】
アレルゲン調剤はまた、ロースト又はグリル又は凍結乾燥又は粉末化されてもよい。
【００９２】
抽出物は、無傷の食物から得られるか又は由来の、何らかの調剤であり、アレルゲンが豊富である。抽出物は、食物の溶解物、濃縮物、又はフラクションである。好適には、抽出物は、アレルゲンタンパク質が豊富である。
【００９３】
別の実施態様において、食物アレルゲンは、精製アレルゲンである。
【００９４】
好適な実施態様において、食物はピーナッツである。本発明に用いる好適なピーナッツアレルゲン調剤は、ローストピーナッツ又はピーナッツ粉又はその抽出物である。ピーナッツアレルゲンは、穏やかな温度で加熱されるか、及び／又は、低脂肪分についての処理又は選択がなされればよい。ピーナッツは、４０％以下の脂肪を含有している。ピーナッツ粉は、通常、コールドプレスによって調製され、その結果、脂肪は約２０％になる。本発明に用いる低脂肪粉は、脂肪分が２０％未満、好ましくは１５％未満、より好ましくは１２％又はそれ以下の粉末である。大がかりな脱脂により、５％程度の低い値を達成することができ、本質的に無脂肪粉（例えば、脂肪分０．１％〜１％）でさえも可能である。低脂肪粉の特例は、脂肪分１５％、１２％、７％、５％、又は２％の粉末である。低脂肪分で、穏やかな加熱処理が施されたピーナッツ調剤は、本発明に従って処方されたとき、驚くべき放出及び反応効果をもたらすことが、本発明によって示される。
【００９５】
一方、ピーナッツアレルゲンは、ピーナッツアレルゲン（Ａｒａ  ｈ１、Ａｒａ  ｈ２、Ａｒａ  ｈ３、Ａｒａ  ｈ４、Ａｒａ  ｈ５、Ａｒａ  ｈ６、Ａｒａ  ｈ７、Ａｒａ  ｈ８、Ａｒａ  ｈ９、Ａｒａ  ｈ１０、Ａｒａ  ｈ１１、Ａｒａ  ｈ１２、Ａｒａ  ｈ１３、Ａｒａ  ｈ１４、Ａｒａ  ｈ１５、Ａｒａ  ｈ１６、又はＡｒａ  ｈ１７等）、又はそのフラグメント、もしくは、単離又は精製されたピーナッツアレルゲン、又はそのフラグメントが豊富な調剤であってもよい。
【００９６】
別の好適な実施態様において、食物がミルクの場合、本発明に用いる好適なミルクアレルゲン調剤は、生ミルク、殺菌（例えば、低温殺菌）ミルク、乾燥ミルクパウダー、乳清パウダー、カゼインパウダー、又はその抽出物である。一方、ミルクについて、アレルゲンは、乳清タンパク質、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、及び／又はカゼイン、もしくはそのフラグメント、もしくは単離又は精製されたミルクアレルゲン、又はそのフラグメントが豊富な調剤であってもよい。
【００９７】
また別の好適な実施態様において、食物が卵の場合、本発明に用いる好適な卵アレルゲン調剤は、生卵、殺菌（例えば、低温殺菌）液状卵、乾燥卵パウダー、卵黄パウダー、卵白パウダー、又はその抽出物である。一方、卵について、アレルゲンは、卵白アルブミン、オボムコイド、ラクトフェリン、及び／又はリゾチーム、もしくはそのフラグメント、もしくは単離又は精製された卵タンパク質、又はそのフラグメントが豊富な調剤であってもよい。
【００９８】
好適な実施態様において、食物アレルゲンは、アジュバントなしで使用されるか、又は投与される。しかしながら、好ましくはないが、アレルゲンは、アジュバントと組み合わせてもよい。アジュバントとは、すなわち、例えば免疫システムを活性化又は促進し、免疫反応を強化する物質である。アジュバントの例には、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム等のミネラル塩；ＣｐＧオリゴヌクレオチド等の免疫賦活性ＤＮＡ又はＲＮＡ；抗体、又はタンパク質に結合しているトール様受容体等のタンパク質；例えばＱＳ２１等のサポニン；サイトカイン；ムラミルジペプチド誘導体；ＬＰＳ；ＭＰＬ、及び３Ｄ−ＭＰＬを含む誘導体；ＧＭＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）；イミキモド；コロイド状粒子；完全又は不完全フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）アジュバント；リビ（Ｒｉｂｉ）アジュバント；又は細菌毒素が含まれる。
【００９９】
＜反応性試験方法＞
本発明の別の局面は、食物アレルゲンに対する対象の反応性の試験、アレルギーの診断／検出、もしくは、食物アレルギーを、又は食物アレルギーを処置するための日常の臨床措置を処置する臨床研究のフレームワークにおける、対象の反応性の試験についての、本発明の製品又は組成物の使用に関する。
【０１００】
代表的には、本発明はインビボ誘発試験に関する。該試験は、前記のごとく定義した製品を有効量で対象に経口投与すること、及び、免疫反応を測定することからなる。好適には、該方法は、二重盲検プラセボ対照法（ＤＢＰＣＦＣ）で行われる。製品により、口腔へのコントロールされた曝露が可能となり、また食物アレルゲンの風味が隠されるか又はコントロールされるので、該方法により、何らかの主観的な又は有害な反応が妨げられる。
【０１０１】
本発明はまた、対象の食物アレルゲンへの反応性を判定するための方法に関する。該方法は、経口ルートによってアレルゲンを対象に曝露することからなる。このような食物アレルゲンの処方は、口腔へのコントロールされた曝露を確実にすることができ、消化管において溶解する。
【０１０２】
本発明はまた、一般に、対象に食物アレルゲンを投与する方法に関する。該方法は、胃において溶解するか、又は胃においてアレルゲンを放出し、口及び食道へのコントロールされた曝露を可能にする処方にて、食物アレルゲンを経口投与することからなる。
【０１０３】
反応性試験方法において、通常、０．１ｍｇから１０ｇの間の服用量で、１回で又は反復して、製品を投与する。通常、段階的に増量して服用させる方法が採用され、例えば、開始時は１ｍｇ〜５０ｍｇで、これを２ｇ〜５ｇまで増量する。このような服用は、対象の状態及び反応に基づいて専門家によって調整される。
【０１０４】
前記方法は、通常、投与に対する対象の反応を測定する又は観測する又はモニタリングする工程からなり、このような反応により、アレルギー性及び反応性の対象が示される。
【０１０５】
＜耐性誘発方法＞
本発明の別の局面は、食物に対してアレルギーを示す患者に耐性を誘発するための（又は、脱感作のための）、本発明の製品又は組成物の使用に関する。アレルギー性の対象を、経口ルートにて食物に曝露させる（経口免疫療法、ＯＩＴ）ことによって、耐性を誘発することに関する多数のレポートが公開されてきている。しかしながら、先に説明したように、多くの患者が好酸球性食道炎及び／又は経口反応を生じるので、これらのアプローチは、臨床診療に適していない。本発明により、従来技術の欠点が克服され、経口投与による効果的な脱感作が可能になる。
【０１０６】
前記方法は、通常、製品の反復投与からなり、アレルギー性患者において進行性の耐性又は脱感作を誘発する。治療の間、摂取食物アレルゲンの服用量が調整される。通常、食物アレルゲンは、０．１ｍｇから１０ｇの間、より好ましくは１ｍｇから３ｇの間の服用量で、経口にて摂取される。一般に、プロトコルでは、次第に服用量が増加し、服用は毎日又は１日おきである。対象において耐性が観測されるまで、数ヶ月又は数年に亘って治療を維持してもよい。耐性又は脱感作は、誘発試験によって変化し得る。
【０１０７】
治療の第１相において、製品の最も適した服用量は、異なる量の製品を用いること、例えば製品の量を増加させることによって決定することができる。続いて、治療の間、最適な服用量が維持され、定期的に調整される。数ヶ月に亘るアレルゲンの反復投与の結果、耐性という意味で、免疫細胞の反応に影響を与える免疫反応の媒体が放出される。アレルゲンへの反応性が消失したとき、又は極めて著しく低減したとき、治療は完了し、成功裏に行われたと考えられ得る。療養の成功は、経口誘発試験によって、又はアレルギー学において認められる他のいずれかの手段によって確認される。したがって、療養の継続時間は可変であり、アレルゲンへの臨床反応性の進化に依存する。
【０１０８】
前記方法は、アレルギーの第１免疫療法を、特に皮膚上の第１免疫療法を既に受けたアレルギー性の患者に用いることができる。このような組み合わせ療法により、さらなる実質的な利点がもたらされる。これは、特に、消化管のアレルギー性反応により、ＯＩＴの開始が困難な対象にとって重要である。このような場合、対象は、皮下の、舌下の、又は皮膚上の免疫療法から始めて、ＯＩＴが可能なアレルギー状態に到達した後、本発明にしたがってＯＩＴに変更するか、又は、本発明にしたがったＯＩＴで、別の免疫療法を開始する。
【０１０９】
本発明のさらなる局面及び利点は、本発明を反映した以下の実施例において開示される。
【実施例】
【０１１０】
＜実施例１＞食物アレルゲン処方
本発明にしたがった特定製品は以下のとおりである。
ラクトースコア                １ｇ
ピーナッツアレルゲン          １ｇ
ＨＰＭＣ                  １５０ｍｇ
サッカロースコア              １ｇ
ピーナッツアレルゲン          １ｇ
ＨＰＭＣ／メタクリレート  １５０ｍｇ
ピーナッツアレルゲン          ２ｇ
ＨＰＭＣ                  ２００ｍｇ
【０１１１】
＜実施例２＞処方Ａの調製
処方Ａの組成を以下の表に示す。
【０１１２】
【表１】
0006665159.tif 000002
【０１１３】
ピーナッツ粉を適量の水に懸濁させ、Ｐｏｖｉｄｏｎｅ及びカラメルフレーバーを、溶解が完了するまで撹拌下で添加する。底部噴霧挿入部を備えた、適した流動床装置（Ｇｌａｔｔ  ＧＰＣＧ−１）において、得られる懸濁液を糖類コア上に噴霧する。工程でのパラメータは以下のとおりである。
注入口温度：６０℃
製品温度：３７℃
空気体積：８０ｍ３／ｈ
噴霧圧力：２．５ｂａｒ
噴霧速度：１１ｇ／ｍｉｎ
【０１１４】
＜実施例３＞処方Ｂの調製
処方Ｂの組成を以下の表に示す。
【０１１５】
【表２】
0006665159.tif 000003
【０１１６】
タルクを適量のアセトン／イソプロパノール混合液に分散させ、懸濁液を均質化する（例えば、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーにて）。マクロゲルを適量の水に溶解させ、得られる溶液をＥｕｄｒａｇｉｔ溶液と混合する。タルク懸濁液を撹拌下で添加し、得られる懸濁液を、適したステンレス鋼メッシュスクリーンでろ過する。次いで、これを、底部噴霧挿入部を備えた、適した流動床装置（Ｇｌａｔｔ  ＧＰＣＧ−１）において、ステージＡで得られる球体上に噴霧する。工程でのパラメータは以下のとおりである。
注入口温度：３６℃
製品温度：３１℃
空気体積：９０ｍ３／ｈ
噴霧圧力：２．５ｂａｒ
噴霧速度：１２ｇ／ｍｉｎ
【０１１７】
＜実施例４＞処方Ｄ及びＥの調製
処方Ｄ及びＥの組成を、各々以下の表に示す。
【０１１８】
【表３】
0006665159.tif 000004
【０１１９】
【表４】
0006665159.tif 000005
【０１２０】
Ｐｏｖｉｄｏｎｅを適量の水に溶解させる。ピーナッツ粉及び糖類を、Ｓｔｅｐｈａｎ  ＵＭＣ−５ミキサー内で、５分間、３００ｒｐｍで混合し、さらに、Ｐｏｖｉｄｏｎｅ溶液ありで又はなしで、５分間、９００ｒｐｍで粒状にする。得られる顆粒を、１．６ｍｍメッシュサイズのステンレス鋼スクリーンを通して圧し、流動床乾燥装置（Ｒｅｔｓｃｈ）において、６０分間、４５℃で乾燥する。乾燥した時点で、顆粒を、０．８ｍｍメッシュサイズのステンレス鋼スクリーンを通して圧する。
【０１２１】
＜実施例５＞処方Ｆ、Ｇ、及びＨの調製（図６）
処方Ｆ、Ｇ、及びＨの組成を、各々以下の表に示す。
【０１２２】
【表５】
0006665159.tif 000006
【０１２３】
【表６】
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【０１２４】
【表７】
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【０１２５】
これらの処方における着色料１は、好適には、カラメル着色料、赤色着色料Ｅｎｏｃｉａｎｉｎ、インディゴイエロー、キノリンイエロー、キニザリングリーンから選ばれる。グリーン、バイオレット、ピンク、ブラウン等の他の色も可能である。医薬グレード（米国薬局方（ＵＳＰ）及びヨーロッパ薬局方（ＥＰ））着色料は、種々の国家（Ｎｉｇａｙ、フランス；Ｅｍｅｒａｌｄ、カリフォルニア州  アメリカ合衆国；Ｎａｒｍａｄａ、インド；Ｎｅｅｌｉｋｏｎ、フランス）から入手可能である。
【０１２６】
これらの処方における着色料２は、好適には、しかし必須ではなく、液体であり、着色料１と異なるか、又は全く同一であり、好適には、カラメル着色料、赤色着色料Ｅｎｏｃｉａｎｉｎ、インディゴイエロー、キノリンイエロー、キニザリングリーンから選ばれる。グリーン、バイオレット、ピンク、ブラウン等の他の色も可能である。医薬グレード（米国薬局方（ＵＳＰ）及びヨーロッパ薬局方（ＥＰ））着色料は、種々の国家（Ｎｉｇａｙ、フランス；Ｅｍｅｒａｌｄ、カリフォルニア州  アメリカ合衆国；Ｎａｒｍａｄａ、インド；Ｎｅｅｌｉｋｏｎ、フランス）から入手可能である。
【０１２７】
乳白剤は、いずれかの適した乳白剤であり、好適には、二酸化チタン（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ、フランス）、酸化鉄（赤、黄又は黒）、エリスロシン、もしくはリボフラビン（Ｐｒｏｑｕｉｍａｃ、スペイン）である。このような製品は、医薬グレード（米国薬局方（ＵＳＰ）及びヨーロッパ薬局方（ＥＰ））で入手可能である。
【０１２８】
これらの処方における香料１は、好適には、オレンジフレーバー（Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ、スイス）、クエン酸（Ｓｉｇｍａ−Ｆｌｕｋａ、スイス）、糖類、バナナ、レモン、カラメル、はちみつ、ストロベリー、チョコレート、又はバブルガムから選ばれる。このような製品は、医薬グレード（米国薬局方（ＵＳＰ）及びヨーロッパ薬局方（ＥＰ））で入手可能である。
【０１２９】
これらの処方における香料２は、好適には、しかし必須ではなく、液体であり、香料１と異なるか、又は全く同一であり、好適には、オレンジフレーバー（Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ、スイス）、クエン酸（Ｓｉｇｍａ−Ｆｌｕｋａ、スイス）、糖類、バナナ、レモン、カラメル、はちみつ、ストロベリー、チョコレート、又はバブルガムから選ばれる。このような製品は、医薬グレード（米国薬局方（ＵＳＰ）及びヨーロッパ薬局方（ＥＰ））で入手可能である。
【０１３０】
処方Ｆ、Ｇ、及びＨを調製する方法は、次のとおりである。着色料１を水に溶解させ、Ｐｏｖｉｄｏｎｅを添加する。溶解を促進させるために、アルコールを用いてもよい。スクロース、Ａｖｉｃｅｌ及び表示のピーナッツ粉、着色料２、並びに乳白剤を混合する。混合を促進させるために、全量の糖類で混合を開始するよりも、混合物に他の乾燥成分を添加する前に又は後に、糖類の一部が添加されてもよい。該混合物は、Ｐｏｖｉｄｏｎｅ及び着色料１の溶液を用いて湿っており、顆粒は、高速ミキサーを用い、５分間、９００ｒｐｍで形成される。得られる顆粒を、１．６ｍｍメッシュサイズのステンレス鋼スクリーンを通して圧し、流動床乾燥装置（Ｒｅｔｓｃｈ）において、６０分間、４５℃で乾燥する。乾燥した時点で、顆粒を、０．８ｍｍメッシュサイズのステンレス鋼スクリーンを通して圧する。続いて、乾燥した顆粒を、香料、ヒドロキシエチルセルロース、及びコロイド状二酸化ケイ素と混合する。
【０１３１】
＜実施例６＞胃の条件で溶解する処方
現在の米国及びヨーロッパ薬局方に記載の標準溶解装置（装置２、回転１００ｒｐｍ）にて、異なる溶解媒体中、３７℃に加熱して溶解試験を行った。処方（１ｇ粉末の等価）を、中性ｐＨの溶液（インキュベーションＡ、７５０ｍｌ）及び酸性溶液（インキュベーションＢ、ｐＨ＝１．２、２、３又は４、７５０ｍｌ）に溶解させ、穏やかに撹拌して懸濁状態を保持する。各時間（０、１５、３０、６０、９０及び１２０分）にサンプルを回収し、遠心分離して、溶解物（上清）から非溶解物（ペレット）を分離する。
【０１３２】
遠心分離したサンプルの上清を取り、それ自身の溶解流動物をブランクとして用いて、２８０ｎｍでの吸光度を測定し、タンパク質含量を決定する。あるいは、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて測定を行い、タンパク質濃度を決定する（Ｂｒａｄｆｏｒｄら、１９７６）。要するに、手順は以下のとおりである。既知濃度のウシ血清アルブミン（Ｂｉｏ−Ｒａｄより入手可能）の溶液を調製し、検量線を作成した。ブラッドフォード試薬（タンパク質アッセイ染料試薬、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製、２．５ｍｌ）を、サンプル又は検量線のための溶液（０．０５ｍｌ）と混合した。混合物を振盪し、室温で３０分間インキュベートして、光路長１ｃｍの分光光度計にて５９５ｎｍでの吸光度を読み取った。疑似低タンパク質濃度のサンプルについて、マイクロブラッドフォードアッセイを用いた（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより入手可能）。この試薬（０．４ｍｌ）を、サンプル（２０倍に希釈した上清０．４ｍｌ）又は検量線のための溶液（０．４ｍｌ）と混合した。混合物を振盪し、室温で１０分間インキュベートして、光路長１ｃｍの分光光度計にて５９５ｎｍでの吸光度を読み取った。検量線を用い、サンプル濃度を算出した。
【０１３３】
酸性条件下での処方Ａ及びＢの溶解特性を、図７に示す。図７に示すとおり、これら２つの処方は非常に急速に溶解しており、食物アレルゲン単独よりも尚更速い。
【０１３４】
酸性並びに中性条件下での処方Ｄ及びＥの溶解特性を、図８に示す。図８に示すとおり、これら２つの処方は非常に急速に溶解しており、実質、ピーナッツ粉単独よりも速い。
【０１３５】
処方Ｆ及びＨの溶解特性を、図９に示す。図９に示すとおり、処方Ｆは、口中で急速に溶解しており、処方されていないピーナッツ粉よりも尚更速い。このように、この処方は、ＯＩＴに効果的かつ有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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