(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)含水ゲル化ポリマー、
b)ポリマーa)に封じ込められているグルコースポリマー、及び
c)ポリマーa)に封じ込められており、グルコースポリマーb)をグルコースに加水分解することが可能な少なくとも1つの酵素
を含む、時間制御型グルコース放出ヒドロゲル。
【請求項２】
前記ポリマーa)が、含水ゲル化絹タンパク質、含水ゲル化ダイズタンパク質、含水ゲル化乳タンパク質、含水ゲル化コムギタンパク質、含水ゲル化リネンタンパク質、含水ゲル化卵タンパク質、含水ゲル化アルブミン、含水ゲル化エラスチン、含水ゲル化ミオシン、含水ゲル化アクチン、含水ゲル化ミオグロビン、含水ゲル化ポリリジン、含水ゲル化ポリグルタミン、含水ゲル化自己集合性ペプチド、及びRGD配列を含む含水ゲル化タンパク質からなる群から選択されるタンパク質ポリマーである、請求項1に記載のヒドロゲル。
【請求項３】
RGD配列を含む前記タンパク質が、フィブリンである、請求項2に記載のヒドロゲル。
【請求項４】
前記ポリマーa)が、含水ゲル化ポリエチレンオキシド(PEO)、含水ゲル化ポリアクリル酸(PAA)、含水ゲル化ポリプロピレンオキシド(PPO)、含水ゲル化ポリエチルヒドロキシド(PEH)、含水ゲル化ポリビニルアルコール(PVA)、含水ゲル化N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)、含水ゲル化ポリアクリルアミド(PAM)、及び含水ゲル化ポリビニルスルホン(PVS)からなる群から選択される合成ポリマーである、請求項1に記載のヒドロゲル。
【請求項５】
前記グルコースポリマーb)が、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、マルトデキストリン、シクロデキストリンポリマー、イソマルトースポリマー、イコデキストリン、マルト-オリゴ糖、デキストラン、及びセルロースからなる群から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載のヒドロゲル。
【請求項６】
前記グルコースポリマーが、デンプンである、請求項5に記載のヒドロゲル。
【請求項７】
前記酵素が、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、デキストリナーゼ、マルトデキストリナーゼ、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、マルトヒドロラーゼ、セロビオシダーゼ、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載のヒドロゲル。
【請求項８】
前記酵素が、ポリマーa)中のポリマー粒子内に封じ込められている、請求項1から7のいずれか一項に記載のヒドロゲル。
【請求項９】
前記ポリマー粒子が、アルギネートポリマー粒子、キチンポリマー粒子、ゼラチンポリマー粒子、コラーゲンポリマー粒子、アルブミンポリマー粒子、ポリ(乳)酸(PLA) ポリマー粒子、ポリ(グリコール)酸(PGA) ポリマー粒子、ポリ(乳-コ-グリコール)酸(PLGA) ポリマー粒子、ポリヒドロキシブチレート(PHB) ポリマー粒子、ポリ(ヒドロキシブチレート-コ-バレレート)(PHBV) ポリマー粒子、ポリカプロラクトン(PCL) ポリマー粒子、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA) ポリマー粒子、及びポリ(シアノアクリレート)(PCA)ポリマー粒子からなる群から選択される、請求項8に記載のヒドロゲル。
【請求項１０】
少なくとも1つの生物学的材料を更に含み、前記材料は、前記ヒドロゲルに封じ込められている、請求項1から9のいずれか一項に記載のヒドロゲル。
【請求項１１】
請求項1から10のいずれか一項に記載のヒドロゲルを含み、及び薬学的に許容される添加剤を含む又は含まない、医療機器。
【請求項１２】
パッチ、包帯、又はインプラントである、請求項11に記載の医療機器。
【請求項１３】
医薬として使用するための、請求項1から10のいずれか一項に記載のヒドロゲル、又は請求項11又は12に記載の医療機器。
【請求項１４】
それを必要とする対象において組織再生の方法に使用するための、請求項1から10のいずれか一項に記載のヒドロゲル、又は請求項11又は12に記載の医療機器。
【請求項１５】
a)水溶性のゲル化可能なモノマー又はポリマー、
b)グルコースポリマー、及び
c)グルコースポリマーb)をグルコースに加水分解することが可能な少なくとも1つの酵素
を混合する工程を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載のヒドロゲルを調製する方法。
【請求項１６】
a)水溶性のゲル化可能なモノマー又はポリマー、
b)グルコースポリマー、
c)グルコースポリマーb)をグルコースに加水分解することが可能な少なくとも1つの酵素、及び
d)任意選択で、前記方法を行うための指示書
を含む、請求項15に記載の方法に使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
緒論
本発明は、一般に、時間制御的にグルコースを放出するヒドロゲルに、その医療用途に、及び前記ヒドロゲルを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースは、生細胞におけるエネルギー源及び代謝中間体としてのその役割について公知の、生物学において最も重要な炭水化物である。継続的な重度の低酸素症を生じている間葉系幹細胞(MSC)の生存能及び機能におけるグルコースの役割が、近年、骨組織工学に関連して研究されてきた。多能性間葉系幹細胞(MSC)は、多孔質足場にロードされるか又は直接投じられ、その後この足場がドナー患者に移植されたときに、骨形成性表現型を誘導する大きな可能性を実際示してきた。しかし、特に構造物内の酸化的ストレス、低酸素症、炎症及び既存の血管新生の欠失に起因する、組織構造物へ生着した後の移植細胞の大量死が、このような骨構造物の治療有効性を制限していた。
【０００３】
Deschepperら(2011; 2013)は、グルコース富化足場にロードされると、移植されたMSCの生存及び機能は大幅に向上し、したがって、これまで骨組織移植において遭遇してきたハードルを克服する道を開くことができることを実証するのに成功した。グルコースの存在により移植された組織構造物の末梢血管新生が高まることから、グルコースの存在は生存促進特性とともに血管新生促進特性も示すことが特に分かった。しかし、このような足場を用いても、長時間にわたってこの炭水化物対するMSCの需要と整合することができる速度で、制御された様式でグルコースを放出することは可能ではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Deschepper M, Oudina K, David B, Myrtil V, Collet C, Bensidhoum M, Logeart-Avramoglou D,and Petite H (2011). J Cell Mol Med.; 15(7):1505-14.
【非特許文献２】Deschepper M, Manassero M, Oudina K, Paquet J, Monfoulet LE, Bensidhoum M, LogeartAvramoglou D, and Petite H (2013). Stem Cells ;31 (3):526-35.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本発明は、放出されるグルコースの速度を数週間にわたって調整し、持効性とすることができる混合ヒドロゲルを提供することによって、上記制限に対処すること提案する。本明細書で提案されているヒドロゲルは、均質な構造、シネレシスがないこと、良好な機械的特性を更に提示している。
【０００６】
特に、本発明のヒドロゲルは、その液体相中にグルコースのポリマーと、前記ポリマーをグルコースに徐々に加水分解することが可能な酵素を含有している。このポリマーはいくつかの役割を果たし、細胞の浸透圧特性を変化させないグルコース源として作用するだけではなく、グルコース及び加水分解酵素双方の拡散速度を制限するビスコシゲン(viscosigen)剤としても作用する。このヒドロゲルは、細胞若しくは組織又はそれらの任意の派生物等の生体材料、及び加水分解酵素のリザーバーとしてのポリマー粒子を含有することも更に可能である。
【０００７】
したがって、本発明は、時間制御型グルコース放出ヒドロゲル、前記ヒドロゲルを含む医療機器、並びにそれらの生物医学的用途を初めて提供する。前記ヒドロゲルを調製する方法及びかかるヒドロゲルを調製するためのキットも提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ヒドロゲルに封じ込められたグルコースのバースト放出を制限するために、引き続いてグルコース送達の動態を制御するために試みられた様々な戦略を示す図である。  種々のアッセイが、グルコースをヒドロゲルに直接封じ込めるために実施されたが、グルコースをゲル相に直接保つことは不可能であることに直面し、サンゴ足場をベースとした様々な高分子電解質システムを可能性のあるリザーバーとして試験した。  基本的には、サンゴを20g/Lでグルコース溶液に2〜3時間の間浸漬した(pH6.0にて)(図1上では「グルコース」とされているサンプル)。次いで、サンゴ足場からのグルコース送達の制限を試みるため様々な後処理を行った:  i)ディープコーティング(deep-coating)又は蒸着を介してサンゴの周囲にPLLAのフィルムを成膜させた(図1上ではそれぞれ「グルコースディープコーティング」及び「グルコースPLLA」とされているサンプル)、  ii)交互積層法のおかげでPLLとPGAとの堆積からなる20層の薄膜をグルコースとインキュベートしたサンゴの周囲に作製した(図1上では「ナノフィルム」とされているサンプル)、  iii)L-B-L PLL/PGA、続いてディープ処理させた(deeped)か又は蒸着させたPLLAフィルムからなる20層の薄膜(それぞれ「ナノフィルムディープコーティング」及び「ナノフィルムPLLA」とされているサンプル)。
【図２】グルコースポリマーを含む本発明のヒドロゲルにより350時間を超えて多量のグルコースの一定した放出が可能であることを示す図である。  (A)グルコースポリマーを添加すると内部ヒドロゲルの粘度が高まり、グルコースバーストの遅延及び放出されたグルコースレベルの安定化の双方が可能となった。グルコースポリマーを含まないグルコースを含有するヒドロゲル(四角)はほぼ即時のバースト放出を呈したが、一方、先のヒドロゲルにグルコースポリマーを添加したところ(円)、送達を遅延させること並びにグルコース放出を大きく及び長くすることが可能となった。  (B)選択されたデンプンに対するグルコースの比較放出動態。グルコース送達の遅延及び放出されたグルコースの濃度は、それぞれグルコースポリマーとして、トウモロコシデンプン(円)よりコムギデンプン(四角)で高かった。  (C)ゲルに直接に封じ込められた酵素による時間の関数としての、4%コムギデンプンからのグルコース送達。理論的放出と実験による放出との比較。数学的モデルに対する結果(円)は実験上の結果(四角)に沿っていた。
【図３】グルコース送達の速度(四角)を延長するために、グルコースポリマーをグルコースに加水分解することが可能な酵素(本明細書ではα-アミノグルコシダーゼ)を封入しているナノ粒子を使用すると、酵素の徐々の及び一定した送達が可能となり、ヒドロゲルからのその放出が低減することを示す図である。実際、ナノ粒子内に酵素が封じ込められていないと、酵素は4日目にヒドロゲルから放出され始め(×印)、一方、酵素を封入しているナノ粒子を使用すると、この放出は防止される(円)。
【図４Ａ】時間の関数として前記グルコースポリマーを含む種々のヒドロゲルのレオロジー測定に基づいて、コメデンプン及びバレイショデンプンと比較して、トウモロコシデンプン及びコムギデンプンはヒドロゲルのレオロジー特性に対する影響が最も小さいことを示す図である。2%濃度(w/V)での、コメ(ひし形)、トウモロコシ(四角)、バレイショ(円)及びコムギ(三角)について、hFb/デンプン材料の貯蔵弾性率(図4A)。単純フィブリンヒドロゲルの貯蔵弾性率(黒線-図A)が参考として示された。
【図４Ｂ】時間の関数として前記グルコースポリマーを含む種々のヒドロゲルのレオロジー測定に基づいて、コメデンプン及びバレイショデンプンと比較して、トウモロコシデンプン及びコムギデンプンはヒドロゲルのレオロジー特性に対する影響が最も小さいことを示す図である。2%濃度(w/V)での、コメ(ひし形)、トウモロコシ(四角)、バレイショ(円)及びコムギ(三角)について、hFb/デンプン材料の損失弾性率(図4B)。単純フィブリンヒドロゲルの損失弾性率(黒線-図B)が参考として示された。
【図５】本発明のヒドロゲルは多量のグルコースポリマーを保持することができることを示す図である。利用可能なグルコース濃度が、ヒドロゲルに封じ込められた種々の供給源に由来する様々なデンプン濃度についてこの図に示されている。
【図６】本発明のヒドロゲルによりグルコースの一定した放出が可能となることを示す図である。A)350時間にわたる(時間の関数として、α-アミログルコシダーゼを封入しているナノ粒子を含有するhFb/4%デンプンインプラントからのグルコースの放出、トウモロコシデンプン(四角)、コムギデンプン(円)。点線は所望のグルコースレベルを示す)。B)260時間にわたる(時間の関数として、α-アミログルコシダーゼを封入しているナノ粒子を含有するhFb/2%デンプンインプラントからのグルコースの放出)。
【図７Ａ】本発明のヒドロゲルを使用して、ヒドロゲルに播種された細胞の生存を、特にインビトロ虚血状態において、改善させることができることを示す図である。hMSC、フィブリン、加熱デンプン、ナノ粒子及びデンプンを加水分解することが可能な酵素を含むヒドロゲルでは、フィブリンのみでできているヒドロゲルと比べて、虚血状態において7日後、hMSC生存能の改善が可能であった。
【図７Ｂ】本発明のヒドロゲルを使用して、ヒドロゲルに播種された細胞の生存を、特にインビトロ虚血状態において、改善させることができることを示す図である。hMSC、フィブリン、加熱デンプン、ナノ粒子及びデンプンを加水分解することが可能な酵素を含むヒドロゲルでは、フィブリンのみでできているか又はグルコースを5g/Lの濃度で含むヒドロゲルと比べて、hMSC生存能の改善が可能であった。
【図７Ｃ】本発明のヒドロゲルを使用して、ヒドロゲルに播種された細胞の生存を、特にインビトロ虚血状態において、改善させることができることを示す図である。フィブリン、加熱デンプン、ナノ粒子及びデンプンを加水分解することが可能な酵素を含むヒドロゲルでは、フィブリンのみでできているヒドロゲルと比べて、虚血状態において14日後、hMSCに限らず筋芽細胞及びヒト脂肪由来幹細胞(ADSC)の生存能の改善が可能であった。
【図８Ａ】本発明のヒドロゲルは、ヒドロゲル内にロードされた生物学的材料の生存を、特にインビボ虚血状態において、改善することを示す図である。フィブリン、酵素、加熱デンプン及び/又はナノ粒子/デンプンを加水分解することが可能な酵素を含むヒドロゲルをマウスに移植し、hCSMにより生じた生物発光強度を7日目(A)に測定した。
【図８Ｂ】本発明のヒドロゲルは、ヒドロゲル内にロードされた生物学的材料の生存を、特にインビボ虚血状態において、改善することを示す図である。フィブリン、酵素、加熱デンプン及び/又はナノ粒子/デンプンを加水分解することが可能な酵素を含むヒドロゲルをマウスに移植し、hCSMにより生じた生物発光強度を14日目(B)に測定した。
【図８Ｃ】本発明のヒドロゲルは、ヒドロゲル内にロードされた生物学的材料の生存を、特にインビボ虚血状態において、改善することを示す図である。フィブリン、酵素、加熱デンプン及び/又はナノ粒子/デンプンを加水分解することが可能な酵素を含むヒドロゲルをマウスに移植し、hCSMにより生じた生物発光強度を28日目(C)に測定した。
【図９】本発明のヒドロゲルは、インビボ虚血状態において、ヒドロゲル内にロードされた生物学的材料(hMSC)の生存を改善することを示す図である。(A)14日までの間のhMSCを含有するヒドロゲルの代表的な顕微鏡写真。(B)フィブリンを含有するヒドロゲル(白色)と比較したフィブリン/デンプン/AMGを含有するヒドロゲル(黒色)による14日間のヒドロゲル中の生存hMSCの定量化。x:二元配置ANOVA分析によるフィブリン/デンプン/AMGを含有するヒドロゲルとフィブリンを含有するヒドロゲルとの間の比較(p<0.05)。
【図１０】ヒドロゲル内部のサンゴ粒子の組込みを示す図である。
【図１１】長期保存(21日まで)後のゲルの成分を含むキットの安定性を示す図である。機械的特性(貯蔵弾性率及び損失弾性率はG'及びG")はD0、D7又はD21保存で同一である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書において他に定義しない限り、本発明に関して使用される科学技術用語は当業者であれば一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈により必要とされない限り、本明細書で使用される命名法及びヒドロゲルを調製する技法は、当技術分野において周知であり、且つ一般的に使用されているものである。
【００１０】
かかる技法は、Ahmed(2013)及びDas(2013)による等の文献において十分に説明されている。
【００１１】
本発明で提案されているヒドロゲルを使用してグルコースの制御された送達を達成することができる。
【００１２】
したがって、第1の態様では、本発明は、
a)含水ゲル化ポリマー、
b)ポリマーa)に封じ込められているグルコースポリマー、及び
c)ポリマーa)に封じ込められており、グルコースポリマーb)をグルコースに加水分解することが可能な少なくとも1つの酵素
を含む、時間制御型グルコース放出ヒドロゲルを対象とする。
【００１３】
均質な構造、良好な機械的特性及びシネレシス(液体相の漏出)が実質的にないことの他にも、本発明のヒドロゲルは、特異的加水分解酵素によりグルコースポリマーが徐々に分解するおかげで最大数週間持続しうるグルコースの持効性放出を可能とすることから、特に有益である。したがって、グルコースポリマーと合わせたこのような酵素の存在は、この時間制御型放出を達成するのに極めて重要である。実際、以下の実施例において示すように、酵素をヒドロゲルから削除し、グルコースポリマーをグルコースモノマーに置き換えると、グルコースの放出ははるかに短いタイムラインで行われ、重要な量のグルコースがほとんど即時放出された後、急速に少量のグルコースが放出され、このようなことは望ましくない。
【００１４】
したがって、ヒドロゲルの上記の成分a)、b)及びc)は、グルコース濃度の大きなピークに達することなく、長期間にわたってグルコースの満足な放出を達成するのに最小限の要素を表す。
【００１５】
このヒドロゲルは更に、下で更に説明するように生分解性ポリマーから製造することができ、このことが本ヒドロゲルを生物医学的用途に適するものとしている。
【００１６】
また、本発明の文脈において、前記含水ゲル化ポリマーは酵素c)により加水分解可能であるべきではなく、特に、グルコースへと前記酵素により加水分解可能であるべきではなく、又は少なくとも実質的に加水分解可能であるべきではないことを、当業者は容易に理解するであろう。
【００１７】
したがって、本発明の好ましい一実施形態によれば、時間制御型グルコース放出ヒドロゲルは上で定義したとおりであるが、ただし、前記含水ゲル化ポリマーa)は酵素c)により加水分解可能ではない。
【００１８】
本明細書で用語「ヒドロゲル」とは、水性環境において高い膨張能力を有する親水性ホモポリマー、コポリマー及び/又はマクロマーでできた不溶性三次元(3-D)ネットワークを指す。ゲルは、弾性固体であり且つ溶媒に非常に富んでいるという特性を有する。具体的には、ヒドロゲルにとって溶媒とは水である。上に示したように、本発明によるヒドロゲルは少なくとも3つの主要成分を含んでいる。本明細書で用語「含む(comprising)」又は「含有する、含む(containing)」は、列記された要素は必要であるか又は必須であること、しかし(別の)他の任意選択の要素は存在しても存在しなくてもよいことを意味する。
【００１９】
「時間制御型」、「長時間」、「持効性」放出又は送達とは、本明細書では対象の分子について線形又はほぼ線形の放出又は送達を意味する。上で説明したように、この効果はグルコースポリマーb)がグルコースへ加水分解酵素c)により徐々に分解されることよって本明細書において実現される。線形放出とは、時間経過とともに放出される対象の分子(すなわちグルコース)の量が所望の時間枠の間は比較的一定のままであることを意味する。本発明の文脈において、ヒドロゲル内のグルコースの放出は少なくとも2週間、多少なりとも一定を保つことが可能である。一般に、前記放出に先行してグルコース送達において初期バーストがある。当業者に周知のように、空間での分子の拡散は、次のようにフィックの第2法則に従って評価することができる:
【００２０】
【数１】
0006715851.tif 000002
【００２１】
式中
・Φは、[(分子の量)長さ-3]の次元の濃度であり、
・tは、時間[s]であり、
・Dは、[長さ2時間-1]の次元の拡散係数であり、
・xは、位置[長さ]である。
【００２２】
ヒドロゲルからの対象の分子の拡散を予測及び/又は測定するための更なる詳細が、本出願の実施例において、並びにLauffer MA(1961)によって、及びKlakら(2012、2013)によって提供されている。
【００２３】
「ゲル化ポリマー」とは、例えばゾル/ゲル相転移により、ゲルを形成するポリマーを意味する。したがって、「含水ゲル化ポリマー」とは、本明細書では、水が分散媒体である天然の、合成の、又は半合成のゲル化ポリマーを意味する。かかるポリマーは水溶性のゲル化可能なモノマー又はポリマーを使用することによって製造することができることを当業者は理解するであろう。用語ポリマーには、異なる2種のモノマーのユニット、又は異なる2種のポリマーのユニット等の少なくとも2種の異なる成分ユニットの共重合によって入手し得るコポリマーが含まれる。タンパク質又は多糖類等の天然由来のポリマーは非毒性及び生体適合性であるが、合成ポリマーでできたヒドロゲルの機械的及び動態特性はより容易に定めることができ且つ調節可能としうる。
【００２４】
本発明の文脈において、特に本発明のヒドロゲルが対象に移植される場合、生分解性の含水ゲル化ポリマーはインビボ用途に適する期間内に溶解できることから、このようなポリマーが特に好ましい。例えば、本発明による適切な生分解性ポリマーは、1年未満内、より好ましくは6ヶ月未満内で溶解することができる。それにもかかわらず、この期間は、移植の部位、及び/又は対象において処置することが必要な生物学的材料の損失のサイズ/性質に応じて異なることができる。
【００２５】
本発明による特に好ましい多糖の含水ゲル化ポリマーは生分解性であり、限定されないが、水に溶解し且つゲル化された、アルギン酸、ペクチン、キトサン、カラギナン、キチン、セルロース、カロース、ラミナリン、クリソラミナリン、キシラン、アラビノキシラン、マンナン、フコイダン、アラビノキシラン類、デキストラン、ガラクトマンナン、及びそれらの誘導体が含まれる。アルギン酸、ペクチン、キトサン、カラギナン、キチン、セルロース、カロース、ラミナリン、クリソラミナリン、キシラン、アラビノキシラン、マンナン、フコイダン、アラビノキシラン類、デキストラン、ガラクトマンナン、及びそれらの誘導体は実際に多糖の水溶性のゲル化可能なポリマーである。そのうえ、上で説明したように、前記多糖の含水ゲル化ポリマーは前記酵素c)により加水分解可能ではない。前記ポリマーが前記酵素によりヒドロゲル内で加水分解されないように、多糖の含水ゲル化ポリマー及び酵素c)の適切な組合せを選択することは当業者の技能の範囲内である。例示を目的とするが、当業者が、多糖の含水ゲル化ポリマーa)としてセルロースを使用することを望むなら、酵素c)としてセロビオシダーゼを選択することは回避すべきである。
【００２６】
本発明による特に好ましいタンパク質の含水ゲル化ポリマーは生分解性であり、限定されないが、水に溶解し且つゲル化された、絹フィブロイン等の絹タンパク質、ダイズタンパク質、カゼイン等の乳タンパク質、グロブリン、グリアジン又はグルテニン等のコムギタンパク質、リネンタンパク質、卵タンパク質、アルブミン、エラスチン、ミオシン、アクチン、ミオグロビン、ポリリジン、ポリグルタミン、自己集合性ペプチド、例えばHartgerinkら(2001)により、Zhaoら(2007)により及びTangら(2013)により記載されているもの、RGD配列を含むタンパク質、例えばフィブロネクチン、ビトロネクチン、ゼラチン、オステオポンチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、フィブリノーゲン、フォンヴィルブランド因子、並びにそれらの誘導体が含まれる。絹タンパク質、ダイズタンパク質、乳タンパク質、コムギタンパク質、リネンタンパク質、卵タンパク質、アルブミン、エラスチン、ミオシン、アクチン、ミオグロビン、ポリリジン、ポリグルタミン、自己集合性ペプチド、RGD配列を含むタンパク質、及びそれらの誘導体は実際にタンパク質の可溶性のゲル化可能なポリマーである。
【００２７】
より特定すると、本発明による好ましいタンパク質の含水ゲル化ポリマーはフィブリン及びゼラチンであり、より好ましくはフィブリンである。
【００２８】
フィブリンは、トロンビンにより加水分解されたフィブリノーゲンの重合により生じるタンパク質ネットワークであり、このネットワークは、損傷後に身体によって自然に産生されるが、組換えで操作することもできる。フィブリンは、それが血管系ギャップを閉塞する動的な三次元ネットワークを形成している場合、創傷治癒及び恒常性において重要な役割を果たしている。その関心はまた、ヒト間葉系間質細胞又は線維芽細胞等の種々の細胞の暫定的なマトリクスとして機能する能力にも依拠する。フィブリンゲルは、組織工学及び損傷した組織再生における臨床用途向けの有望な構造的及び生物学的特性を示し、すなわち、これはフィブリン糊の形態で使用することが可能で、組織接着閉鎖用に最適化されてきた(Rossoら、2005; Bensaidら、2002; Sperlingら、1997; Ronfardら、2000; Anituaら、2006; Linnesら2007)。本発明のヒドロゲルを生物医学的用途において使用する場合、例えば対象に移植する場合、疾患伝播並びに免疫原性応答のリスクを低減させるために、前記フィブリンは前記対象の血液サンプルから分離されたフィブリノーゲンから製造できるのが好ましい。
【００２９】
そのうえ、本発明の、タンパク質の含水ゲル化ポリマーa)がフィブリンである場合、前記ポリマーのタンパク質分解による崩壊を防止するために、本発明のヒドロゲルはアプロチニンを更に含むことができる。
【００３０】
他方、ゼラチンは、コラーゲンの不可逆性の加水分解形態であり、その天然三重らせん構造を単一鎖分子へとばらばらにすることによって形成される。その関心は、コラーゲンと比較してゼラチンは免疫原性を欠如していること、ゼラチンはRGD配列等の情報シグナル伝達能力を保持することができること、及び、最後は重要であるが、ゼラチンはインビボで完全に再吸収性であることに依拠している(Xiaら2004; Dainiakら2010)。
【００３１】
当業者であれば多数の薬学的に許容される合成の含水ゲル化ポリマーを使用することができる。「薬学的に許容される」とは、本明細書では、そのようなポリマーはヒドロゲルの他の成分と適合するとともに、そのレシピエントにとって有害ではないことを意味する。例示を目的とするが、かかるポリマーは、限定されないが、水に溶解し且つゲル化された、ポリエチレンオキシド(PEO)、ポリアクリル酸(PAA)、ポリ(プロピレンオキシド)(PPO)、ポリエチルヒドロキシド(PEH)、ポリビニルアルコール(PVA)、N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)、ポリアクリルアミド(PAM)、ポリビニルスルホン(PVS)、及びそれらの誘導体からなる群から選択することができる。ポリマーはまた、水に溶解し且つゲル化された、メチルメタクリレート、N-ビニルピロリドン(NVP)、ポリエチレングリコール(PEG)、及びそれらの誘導体からも合成できる。
【００３２】
或いは、当業者は、(a)タンパク質及び/又は(a)多糖及び/又は(a)合成の含水ゲル化ポリマーのコポリマー等の、上記の含水ゲル化ポリマーのコポリマーを使用することを所望することもできる。前記コポリマーは特に半合成ポリマーとすることができる。半合成ポリマーは、天然及び合成ポリマー双方の有益な特性を示すことから、特に興味深いことがある。本発明によるコポリマーとの例としては、限定されないが、上で定義した、メタクリル化、アクリル化、若しくはビニル化ペプチド又はメタクリル化、アクリル化、若しくはビニル化タンパク質、例えば、フィブリンとアクリレートの複合体、若しくはコラーゲンとアクリレートの複合体、又はトリブロックポリマーPEO-PPO-PEO若しくはPPO-PEO-PPOが挙げられる(Gargら、2012)。
【００３３】
好ましい一実施形態によれば、本発明の時間制御型グルコース放出ヒドロゲルは上で定義したとおりであるが、ただし、前記含水ゲル化ポリマーは多糖ではない。より好ましくは、前記含水ゲル化ポリマーはタンパク質ポリマー、合成ポリマー、又はそれらの組合せである。
【００３４】
ヒドロゲルを作製するのに適した水溶性のゲル化可能なポリマー及びそれらの合成方法に関する完全なレビューについては、当業者はAhmed(2013)を更に援用することができる。
【００３５】
ゲル中での酵素の拡散は、選択されたグルコースポリマーのビスコシゲンの特性のおかげで制限が可能である、すなわち、この粘度が高ければ高いほど、前記拡散は時間がかかる。
【００３６】
好ましい一実施形態よれば、グルコースポリマーb)は、少なくとも100kDaの、より好ましくは少なくとも200kDaの、最も好ましくは少なくとも300kDaの分子量を有する。この好ましい分子量は、ヒドロゲルが形成している間それの構造を維持することを可能とするとともに、ヒドロゲルからのグルコースポリマーの急速な放出を回避することに貢献する。
【００３７】
本発明の目的では、当業者であれは、特に好ましいグルコースポリマーを、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、マルトデキストリン、シクロデキストリンポリマー、イソマルトースポリマー、イコデキストリン、マルト-オリゴ糖、デキストラン、セルロース、プルラン、及びそれらの誘導体からなる群から選択することができる。本発明によるグルコースポリマーは、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、マルトデキストリン、シクロデキストリンポリマー、イソマルトースポリマー、イコデキストリン、マルト-オリゴ糖、デキストラン、セルロース、及びそれらの誘導体からなる群から選択されることがより好ましい。本発明によるマルト-オリゴ糖の例には、限定されないが、マルトヘプトース、マルトヘキソース、マルトペントース、マルトテトロース、又はマルトトリオースが含まれる。
【００３８】
本発明によるヒドロゲルのグルコースポリマーはデンプンであることが最も好ましい。実際、本発明者らによって実証されるように、デンプンはグルコースポリマーの優れた供給源であるばかりでなく、本発明のヒドロゲルシステムにおいてゲルからのその漏出を制限し且つグルコースの長時間放出に貢献するビスコシゲン特性も更に示す。デンプンはまた、その植物起源に依存して様々な粘度プロフィールを示すことができる(Janeら、1992; Seguchiら1994; Singhら、2005)、すなわち、降順でトウモロコシデンプン、コメデンプン及びバレイショデンプンを使用するよりもコムギデンプンを使用すると、ヒドロゲルの更に良好な均質性及びグルコースの一層の持効性放出が達成しうることを、本発明者らは実際に観察した。したがって、ヒドロゲルのグルコースポリマーb)はコムギデンプンであることが最も好ましい。本発明者らは、どの由来のデンプンを使用しても、ポリマーa)、特にフィブリンのゲル化は影響受けないことを更に発見して、本発明のヒドロゲルを得、したがって、このヒドロゲルは均質であるとともに実質的にシネレシスを有さないままである。
【００３９】
上に示したように、グルコースポリマーb)は、ポリマー鎖の連続するネットワークを形成するために含水ゲル化ポリマーa)中に「封じ込められている」又は「捕捉されている」、すなわち前記グルコースポリマーb)は、含水ゲル化ポリマーa)中に部分的に又は全体的に包埋されている。本発明のヒドロゲル中のグルコースポリマーb)の濃度は、好ましくは約0.5%(w/v)から約15%(w/v)、より好ましくは約0.75%(w/v)から約10%(w/v)、より好ましくは約0.85%(w/v)から約8%(w/v)、更により好ましくは約1%(w/v)から約4%(w/v)の範囲であり、最も好ましくは1%(w/v)から2%(w/v)である。それにもかかわらず、当業者は、この濃度がグルコースポリマー(例えば、デンプン、アミロース、アミロペクチン等)の性質に応じて上に示した範囲内で異なることができることを理解するであろう。
【００４０】
好ましい一実施形態によれば、本発明によるヒドロゲルは、グルコースポリマーb)に加えてグルコース(すなわちモノマーの形態で)を更に含む。実際、ヒドロゲル中にモノマーの形態にあるグルコースが存在すると、ヒドロゲルからの前記グルコースのほぼ即時のバースト放出を招くことができ、これに続いてグルコースポリマーb)が加水分解酵素c)で徐々に分解されることを通してグルコースのその他のモノマーの持効性放出が続くことになる。この好ましい実施形態は、絶対的に必要というわけではないが、例えば、それを必要とする対象に投与することが意図されている、ヒドロゲルに封じ込められた生物学的材料の生存及び適切な機能性を最大化するのに特に有益とすることができる。
【００４１】
グルコースの前記モノマーは、含水ゲル化ポリマーa)中に「封じ込められている」又は「捕捉されている」のがここでも好ましい。
【００４２】
ヒドロゲルのグルコースポリマーb)をグルコースに加水分解することが可能な酵素又は酵素の組合せを選択すること、換言すれば前記グルコースポリマーb)を特異的に加水分解する酵素又は酵素の組合せを選択することは当業者の技能の範囲内であると更に理解されるものとする。したがって、グルコースポリマーb)を加水分解することが可能な前記酵素は、好ましくは、選択された酵素の基質に依存して、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、デキストリナーゼ、マルトデキストリナーゼ、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、マルトヒドロラーゼ、セロビオシダーゼ、及びそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。
【００４３】
例えば、当業者は市販の任意の酵素を使用することができ、例えば、デンプン、アミロース、グリコーゲン、イソマルトース、アミロペクチン、又はシクロデキストリンをグルコースに加水分解させるためにグルカン1,4α-グルコシダーゼ(EC:3.2.1.3)又はα-グルコシダーゼ(EC:3.2.1.20)、イソマルトース又はマルトースをグルコースに加水分解させるためにスクロースα-グルコシダーゼ(EC:3.2.1.48)、シクロデキストリンをグルコースに加水分解させるためにシクロマルトデキストリナーゼ(EC:3.2.1.54)、デキストランをグルコースに加水分解させるためにグルカン1,6α-グルコシダーゼ(EC:3.2.1.70)、セルロースをセロビオース、セロペントース及び/又はセロトリオースへと、及び前記セロビオース、セロペントース及び/又はセロトリオースをグルコースへと連続的に加水分解するためにセルラーゼ(EC:3.2.1.4)及びグルカン1,4β-グルコシダーゼ(EC:3.2.1.74)の組合せ、デンプン、グリコーゲン又はマルト-オリゴ糖をマルトースへと、及び前記マルトースをグルコースへと連続的に加水分解するためにα-アミラーゼ(EC:3.2.1.1)及びグルカン1,4α-グルコシダーゼ(EC:3.2.1.3)の組合せ、デンプン、グリコーゲン又はマルト-オリゴ糖をマルトースへと、及び前記マルトースをグルコースへと連続的に加水分解するためにα-アミラーゼ(EC:3.2.1.1)及びスクロースα-グルコシダーゼ(EC:3.2.1.48)の組合せ、デンプン、アミロペクチン、アミロース、マルトデキストリンをマルトースへと、及び前記マルトースをグルコースへと連続的に加水分解するためにβ-アミラーゼ(EC:3.2.1.2)及びグルカン1,4α-グルコシダーゼ(EC:3.2.1.3)の組合せ、デンプン、アミロペクチン、アミロース、マルトデキストリンをマルトースへと、及び前記マルトースをグルコースへと連続的に加水分解するためにβ-アミラーゼ(EC:3.2.1.2)及びスクロースα-グルコシダーゼ(EC:3.2.1.48)の組合せ、アミロペクチンをマルトースへと、及び前記マルトースをグルコースへと連続的に加水分解するためにシクロマルトデキストリナーゼ(EC:3.2.1.54)及びグルカン1,4α-グルコシダーゼ(EC:3.2.1.3)の組合せ、アミロペクチンをマルトースへと、及び前記マルトースをグルコースへと連続的に加水分解するためにシクロマルトデキストリナーゼ(EC:3.2.1.54)及びスクロースα-グルコシダーゼ(EC:3.2.1.48)の組合せ、デンプンをマルトースへと、及び前記マルトースをグルコースへと連続的に加水分解するためにグルカン1,4α-マルトヒドロラーゼ(EC:3.2.1.133)及びグルカン1,4α-グルコシダーゼ(EC:3.2.1.3)の組合せ、デンプンをマルトースへと、及び前記マルトースをグルコースへと連続的に加水分解するためにグルカン1,4α-マルトヒドロラーゼ(EC:3.2.1.133)及びスクロースα-グルコシダーゼ(EC:3.2.1.48)の組合せ、セルロースをセロビオースへと、及び前記セロビオースをグルコースへと連続的に加水分解するためにセルロース1,4β-セロビオシダーゼ(EC:3.2.1.176)及びグルカン1,4β-グルコシダーゼ(EC:3.2.1.74)の組合せ、グリコーゲンをマルトースへと、及び前記マルトースをグルコースへと連続的に加水分解するためにプルラナーゼ(EC:3.2.1.41)及びスクロースα-グルコシダーゼ(EC: 3.2.1.48)の組合せ、グリコーゲンをマルトースへと、及び前記マルトースをグルコースへと連続的に加水分解するためにプルラナーゼ(EC:3.2.1.41)及びグルカン1,4α-グルコシダーゼ(EC: 3.2.1.3)の組合せ、グリコーゲンをマルトースへと、及び前記マルトースをグルコースへと連続的に加水分解するためにイソアミラーゼ(EC:3.2.1.68)及びスクロースα-グルコシダーゼ(EC:3.2.1.48)の組合せ、プルランをグルコース、マルトース及びマルトトリオースへと、及び前記マルトース及び前記マルトトリオースをグルコースへと連続的に加水分解するためにプルラナーゼ(EC:3.2.1.41)及びグルカン1,4α-グルコシダーゼ(EC:3.2.1.3)の組合せ、グリコーゲンをマルトースへと、及び前記マルトースをグルコースへと連続的に加水分解するためにイソアミラーゼ(EC:3.2.1.68)及びグルカン1,4α-グルコシダーゼ(EC:3.2.1.3)の組合せである。
【００４４】
したがって、本発明のグルコースポリマーb)がデンプンである場合、ヒドロゲルの酵素c)は上記のα-グルコシダーゼ、或いはα-アミラーゼ若しくはβ-アミラーゼ又はα-マルトヒドロラーゼとα-グルコシダーゼとの組合せが好ましい。
【００４５】
ヒドロゲルの酵素c)の濃度は、酵素活性が得られるようにセットするのが好ましく、好ましくは約1.10-6μmol.min-1.mg-1から約1.10-2μmol.min-1.mg-1、より好ましくは約1.10-5μmol.min-1.mg-1から約1.10-3μmol.min-1.mg-1、更により好ましくは約2.10-5μmol.min-1.mg-1から約7.10-4μmol.min-1.mg-1、また更により好ましくは約5.10-5μmol.min-1.mg-1から約5.10-4μmol.min-1.mg-1の範囲である。それにもかかわらず、酵素の濃度は加水分解されるグルコースポリマー(例えば、デンプン、アミロース、アミロペクチン等)の性質及び選択された加水分解酵素の性質に応じて上に示した範囲内で異なることができることを、当業者は理解するであろう。
【００４６】
上に列記した酵素は、体温(すなわちヒトにおいて約37℃)及び生理的pH(すなわちpH7.4)にて至適加水分解能力(すなわちそれらの特異的酵素活性)を提示するが、特に本発明のヒドロゲルを対象に移植する必要がある場合、このことはインビボ用途に極めて有利であることは、当業者にとってまた周知である。それ故、前記対象において移植するとグルコースポリマーb)を酵素によって容易に処理することができる。それにもかかわらず、これらの酵素は25℃から42℃の間で及び/又はpH7からpH7.5の間で構成されるpHにて、異なる効力ではあるが活性でありうる。
【００４７】
更に、上に示したように、前記酵素c)は、グルコースポリマーb)がグルコースに徐々に加水分解されることを可能とするために、含水ゲル化ポリマーa)中に「封じ込められている」又は「捕捉されている」、すなわち前記酵素は、含水ゲル化ポリマーa)中に部分的に又は全体的に包埋されている。
【００４８】
本発明の更なる有利な一実施形態では、ヒドロゲルの酵素c)はより具体的にはポリマーa)中のポリマー粒子d)内に封じ込められている。すなわち、前記酵素c)は、それ自身含水ゲル化ポリマーa)中に部分的に又は全体的に包埋されているポリマー粒子d)に封入されている(すなわちポリマー粒子により包囲されているか、又はそれに吸収されている)。ヒドロゲルにおいて少なくとも2種の酵素の組合せを使用して、グルコースポリマーb)の加水分解を行う場合、よって、前記酵素がポリマーa)中のポリマー粒子d)内に全て封じ込められていてもよく、一方の酵素がポリマーa)中のポリマー粒子d)内に封じ込められ且つ他方の酵素がポリマーa)内でフリーである(すなわちポリマー粒子d)内に封じ込められていない)としてもよい。それにもかかわらず、前者の実施形態が本明細書では好ましい。
【００４９】
ヒドロゲルの酵素c)をポリマー粒子に、より詳細にはナノ粒子に封入すると、最大で50〜70%だけグルコースポリマーb)からのグルコースの放出が大幅に持効性となることを、本発明者らは実際に観察した。そのような粒子へ封入すると、ヒドロゲル内の酵素の拡散速度が減速し、それによって局所的に作用することが可能な酵素の量が改変されるとともに、前記酵素はタンパク質分解から保護もされるので、このような持効性放出が可能である。そのうえ、ポリマー粒子の性質(分解性であるかないか)に応じて、酵素の拡散を前記粒子の自然な分解及び溶出によって更に促進することができる。特に、拡散に影響を及ぼし且つその半減期を決定する、このような粒子の劣化プロフィールは、粒子のサイズ、ポリマーの分子量、コポリマー比、親水性等などのパラメーターに左右される。酵素の放出(Sinhaら、2003)、したがってグルコースの放出を制御するために、このようなパラメーターを調整することは、当業者の技能の範囲内である。
【００５０】
本発明の文脈において、前記粒子の半減期が少なくとも2週、好ましくは3週、より好ましくは4週、5週、最も好ましくは6週であるようにこのようなパラメータを調整することがより特に好ましい。かかる半減期に到達するために、支配的に極めて重要なパラメーターはポリマー粒子のサイズである。
【００５１】
直径1〜700μmのポリマー粒子は、マイクロ粒子であると一般にみなされ、一方、直径1〜1000nmの粒子はナノ粒子といわれる。本発明の好ましい一実施形態によれば、ポリマー粒子d)はナノ粒子である。用語「ナノ粒子」には、固体の球状ナノ粒子である「ナノスフェア」、並びに液体又は半液体のナノ粒子である「ナノカプセル」が含まれる。ナノ粒子は、制御型薬物送達、組織工学の足場、生体接着剤、及び細胞培養マトリクスを含めて生物医学的用途において広範に使用されている。ポリマー粒子、特にマイクロ粒子及びナノ粒子の詳細なレビューについては、当業者はBaldminら(1998)、Oliveiraら(2011)、Steinbachら(2012)及びChengら(2012)を参照することができる。
【００５２】
上述のように、グルコースポリマーb)をグルコースにその後加水分解する酵素c)の所望の送達を達成するためにポリマー粒子のサイズを調整することは当業者の技能の範囲内である。粒径がより小さいと様々な表面積対容積比に起因して酵素放出の速度が変化するとともに、インビボ又はインビトロ用途に特に有用である、グルコースの細胞内取り込みが円滑化されることから、ナノ粒子等のより小さい粒径が一般に望ましい。したがって、本発明のヒドロゲルで使用されるポリマー粒子のサイズは10nmから1μmの間で、好ましくは100nmから400nmの間で構成されるのが好ましい。
【００５３】
ポリマー粒子は、合成由来並びに天然由来双方のいくつかの非生分解性ポリマー及び生分解性ポリマーから生産することができる。例示を目的とするが、本発明の目的に適した生分解性ポリマーは、限定されないが、アルギン酸、キチン、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、ポリ(乳)酸(PLA)、ポリ(グリコール)酸(PGA)、ポリ(乳-コ-グリコール)酸(PLGA)、ポリヒドロキシブチレート(PHB)、ポリ(ヒドロキシブチレート-コ-バレレート)(PHBV)、ポリカプロラクトン(PCL)、及びそれらの誘導体からなる群から選択することができ、一方、非生分解性ポリマーは、限定されないが、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)、ポリ(シアノアクリレート)(PCA)、及びそれらの誘導体からなる群から選択することができる。ポリマー粒子を形成するのに使用するポリマーはポリマーa)と異なることが好ましいことは、当業者は容易に理解するであろう。換言すれば、ポリマーa)が
-  アルブミンである場合、ポリマー粒子はアルブミン粒子とはしない、又は
-  ゼラチンである場合、ポリマー粒子はゼラチン粒子とはしない。
【００５４】
前記生分解性ポリマーはポリ(乳)酸(PLA)、ポリ(グリコール)酸(PGA)、ポリ(乳-コ-グリコール)酸(PLGA)、ポリヒドロキシブチレート(PHB)、ポリ(ヒドロキシブチレート-コ-バレレート)(PHBV)、ポリカプロラクトン(PCL)、及びそれらの誘導体からなる群から選択され、一方、非生分解性ポリマーは、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)、ポリ(シアノアクリレート)(PCA)、及びそれらの誘導体からなる群から選択されるのがより好ましい。
【００５５】
本発明の文脈において、特に本発明のヒドロゲルが対象に移植される場合、生分解性ポリマー粒子はインビボ用途に適する期間内において溶解することができることから、これが特に好ましい。
【００５６】
上に列記したポリマー粒子の内で、ポリ(乳-コ-グリコール)酸(PLGA)粒子が本発明の文脈において特に好ましく、PLGAナノ粒子が最も好ましい。PLGAは、薬物送達システムにおいて、生分解性、生体適合性であり、低毒性を呈し、容易に調整可能であり、薬物を劣化から保護し、持続的な薬物放出を提供し、且つ米国食品医薬品局(FDA)及び欧州医薬品庁(EMA)の認可を受けていることから、これは実際、魅惑的なポリマーである。PLGAはより詳細にはグリコリド及びラクチドの2種のコポリマーからできているが、グリコリド及びラクチドの比は異なることができ、そのことによってPLGAの様々な形態が提供され(例えばPLGA70:30とは、その組成が乳酸70%及びグリコール酸30%であるコポリマーを特定する)、且つPLGAは身体の水性環境等の水への曝露に続いて代謝の2種の天然副生成物へと(すなわち乳酸のモノマー及びグリコール酸のモノマーへと)分解することが可能である。その分解時間は、そのコポリマーの比に左右され、グリコリドユニットの含量が高ければ高いほど分解に要する時間は短い。酵素の放出速度、したがってグルコース送達を制御するためにPLGAコポリマーの比を調整することは、当業者の技能の範囲内である。したがって、PLGAコポリマーの比は85:15から50:50の比の間で選択されることが好ましい。特に興味深いのはPLGA50:50であり、これは最も早い分解時間(約2カ月)を呈する。PLGAの分子量は、対象の分子の放出速度に更に影響する場合もある。酵素放出の所望の速度、したがってグルコース送達の所望の速度を達成するためにこれの分子量を調整することは、当業者の技能の範囲内である。したがって、本発明の好ましい一実施形態では、PLGA粒子の分子量は10から100 000Daの間で、好ましくは30 000から60 000Daの間で構成される。
【００５７】
好ましい一実施形態によれば、ヒドロゲルのポリマー粒子d)の濃度は約0.5mg/mlから約10mg/ml、より好ましくは約0.75mg/mlから約5mg/ml、更により好ましくは約1mg/mlから約3mg/mlの範囲である。それにもかかわらず、ポリマー粒子d)の濃度は前記粒子の性質に応じて上に示した範囲内で異なることができることを、当業者は理解するであろう。
【００５８】
本明細書に記載のヒドロゲルのポリマーの全ては市販であるか、上述のように当技術分野で周知の方法を使用して化学的に合成できるかのいずれかである。
【００５９】
より好ましい一実施形態によれば、本発明のヒドロゲルは、
a)フィブリンヒドロゲル、
b)前記フィブリンヒドロゲルに封じ込められているデンプン、及び
c)前記フィブリンヒドロゲルに封じ込められているα-グルコシダーゼ
を含む。
【００６０】
前記α-グルコシダーゼc)は、前記フィブリンヒドロゲルにおいて、ナノ粒子等のポリマー粒子d)内に封じ込められているのが更により好ましい。好ましい実施形態とは上記のとおりである。具体的には、前記α-グルコシダーゼc)は、PLGAナノ粒子内に封じ込められているのが好ましい。
【００６１】
本発明のヒドロゲル中の、成分a)の成分c)に対する特に好ましい最終濃度及び成分d)のサイズパラメーターは以下のとおりである。
【００６２】
フィブリン濃度は、好ましくは約2.5mg/mlから約90mg/ml、より好ましくは約5mg/mlから約40mg/ml、更により好ましくは約10mg/mlから約25mg/mlの範囲であり、最も好ましくは18mg/mlである。
【００６３】
デンプン濃度は、好ましくは約1%(w/v)から約10%(w/v)、より好ましくは約2%(w/v)から約8%(w/v)、更により好ましくは約3%(w/v)から約7%(w/v)の範囲であり、なおより好ましくは1%、2%、3%又は4%(w/v)であり、最も好ましくは1%又は2%(w/v)である。
【００６４】
α-グルコシダーゼ濃度は、酵素活性を得るようにセットするが、好ましくは約1.10-5μmol.min-1.mg-1から約1.10-3μmol.min-1.mg-1、より好ましくは約2.10-5μmol.min-1.mg-1から約7.10-4μmol.min-1.mg-1、更により好ましくは約5.10-5μmol.min-1.mg-1から約5.10-4μmol.min-1.mg-1の範囲であり、最も好ましくは2.10-4μmol.min-1.mg-1である。
【００６５】
PGLAナノ粒子の濃度は、好ましくは約0.5mg/mlから約10mg/ml、より好ましくは約0.75mg/mlから約5mg/mlの間、更により好ましくは約1mg/mlから約3mg/mlの間の範囲であり、最も好ましくは2mg/mlである。
【００６６】
そのうえ、PGLAナノ粒子サイズは、好ましくは約1nmから約1000nm、より好ましくは約35nmから約800nm、更により好ましくは約65nmから約600nm、最も好ましくは約100nmから約400nmの範囲である。
【００６７】
上の好ましいパラメーターは、均質な且つ実質的にシネレシスを有さないヒドロゲルの形成を可能とする至適パラメーターとして本発明者らにより決定されたが、このようなヒドロゲルは持効性で少なくとも2週間グルコースを放出する。意外にも、デンプンの上記濃度が比較的高めでも、この特定の濃度は、デンプンの可溶化を妨げず、且つフィブリンと均質な混合ヒドロゲルの形成を可能とするばかりでなく前記ヒドロゲルからのデンプンの拡散を制限することも可能とする。
【００６８】
上で定義した濃度の内で本発明のヒドロゲル中で使用される各成分a)の各成分c)に対する濃度及び/又は成分d)のサイズを選択することは、当業者の技能の範囲内である。具体的には、成分a)の成分c)に対する様々な濃度範囲及び/又は成分d)のサイズを、必要に応じて、合わせることが可能であること、及び前記成分の至適濃度/サイズはヒドロゲルの使用に応じて異なることができることを、当業者は容易に理解するであろう。
【００６９】
例示を目的とするが、本発明のヒドロゲルを骨再生向けにより具体的に使用できる好ましい一実施形態では、前記ヒドロゲルは、フィブリン18mg/ml、デンプン4%、及びα-グルコシダーゼ活性2.10-4μmol.min-1.mg-1を含むが、前記酵素はPGLAナノ粒子内に封じ込められているのが好ましい。前記PGLAナノ粒子サイズは約100nmから約400nmの範囲であり、及び/又は前記PGLAナノ粒子濃度は2mg/mlであることがより好ましい。
【００７０】
上に示したように、このような濃度はヒドロゲル内の各成分の最終濃度を表す。すなわち、例えば、質量/容積百分率で示されたデンプンの最終濃度はヒドロゲル容積100mlに対するデンプンの質量(gで)を表す、一方、α-グルコシダーゼ濃度は、ヒドロゲル内で2.10-4μmol.min-1.mg-1のα-グルコシダーゼ活性に達するようにセットされる。
【００７１】
更に、本明細書で使用する用語「約(about)」とは、許容される誤差範囲に応じてこれらの濃度がある特定の範囲内で変化することができることを意味し、これは当業者であれば容易に決定することができる。好ましくは、この誤差範囲は10%であり、より好ましくは5%である。
【００７２】
先述のように、本発明のヒドロゲルは生物学的材料を組み込むことが可能であり、且つそれ故にそれを必要とする対象に移植が可能である組織再生足場として使用することができることを、本発明者らは実証した。具体的には、かかるヒドロゲルから送達されるグルコースの有益な特性のおかげで、対象内の移植された生物学的材料の並びにその周辺の組織及び細胞の生存及び適切な機能性を顕著に改善させることができる。
【００７３】
したがって、本発明の更なる有利な一実施形態では、本発明のヒドロゲルは少なくとも1つの生物学的材料を更に含むことができる。換言すれば、前記生物学的材料は本発明のヒドロゲルに封じ込められている。
【００７４】
「生物学的材料」とは、本明細書では、生物学的活性を有することができ、且つ生命の発生又は維持のために生体によって通常使用されている、有機材料を意味する。本発明の文脈において、前記材料は細胞、組織又はストローマからできていることが好ましく、これらは天然でも、合成でも、インビトロで操作されていてもよい。前記生物学的材料を含む本発明のヒドロゲルが、対象において移植目的で使用される場合、前記生物学的材料は、同種の(同一種)、異種の(異なる種)、自家の(同一対象)、又は同系の(一卵性双生児)由来とすることができる。
【００７５】
したがって、好ましい一実施形態によれば、前記生物学的材料は細胞、組織、ストローマ、これらの派生物、及びそれらの組合せからなる群から選択される。例えば、細胞は、限定されないが、軟骨細胞株、原始軟骨細胞、hMSC(ヒト間葉系幹細胞)若しくは骨髄由来MSC等の幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、又はニューロンから選択することができる。組織は、とりわけ、骨組織、軟骨、皮膚、心血管組織、平滑筋、脂肪組織又は神経から選択することができる。脂肪組織の間質血管細胞群(SVF)は本発明の文脈において好適である生物学的材料の更なる例であり、すなわち、これには特に前脂肪細胞、間葉系幹細胞(MSC)、内皮前駆細胞、T細胞、B細胞、肥満細胞並びに脂肪組織マクロファージを含めることができる。細胞又は組織の派生物はまた、ラピッドプロトタイプ足場(リン酸カルシウム又は炭酸カルシウムをベースとした、人工又は合成ポリマー)(Yangら、2002)、骨代用物又は軟骨代用物(例えば、脱灰骨マトリクス、ヒドロキシアパタイト等のセラミック、リン酸三カルシウム、サンゴ、生体活性ガラス、それらの組合せ等)、皮膚代用物(例えば、2〜3例を挙げるとbiobrane(登録商標)、transcyte(登録商標)、integra(登録商標)、alloderm(登録商標)、apligraf(登録商標)、dermagraft(登録商標)であり、これらは、とりわけSmith & Nephew社、Integra社、LifeCell社、Apligraf社、及びDermagraft社によって商業化されている)、心血管組織代用物(Zimmermanら、2003; Neal R.A.ら、2012; Lundbergら、2013; Liら、2013; Fernandezら、2014)、平滑筋代用物、又は神経代用物(Konofaosら、2013) 等も使用することもできる。
【００７６】
一旦作製されると、本発明のヒドロゲルは、それを必要とする患者に投与することが可能な医療機器において使用することができる。具体的には、上述のように、本発明のヒドロゲルは、その血管新生促進性の特性及び生存促進性の特性の恩恵を受けられる可能性がある患者にグルコースを送達するために、かかる機器において組み込むことができる。
【００７７】
それ故、本発明によるヒドロゲル及び任意選択で薬学的に許容される添加剤を含む、医療機器を提供することが本発明の別の態様である。
【００７８】
本明細書で使用する、用語「薬学的に許容される添加剤」とは、これは薬理学的な作用を有さないことから、不活性又は非活性の、したがって非毒性の成分を意味し、このような成分を、有効期間、適用部位での保持時間、消費者受容等などの組成物の特性を改善するために使用することができる。これには、限定されないが、表面活性剤(カチオン性、アニオン性、又は中性)、表面安定剤、他のエンハンサー、例えば、保存剤、湿潤剤又は乳化剤、溶媒、バッファー、塩溶液、分散媒体、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれ、すなわちこれらは生理学的に適合性である。
【００７９】
本発明による医療機器は、治療薬等の少なくとも1つの活性剤を更に含むことができる。例えば、本発明による適切な活性剤は、限定されないが、抗アポトーシス分子、例えばスタチン、インスリン、B細胞性リンパ腫2(BCL-2)、又は間質細胞由来因子1(SDF-1);増殖因子及びサイトカイン、例えば上皮増殖因子(EGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)又は血管内皮増殖因子(VEGF)、インスリン様増殖因子(IGF)、トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)、又は骨形成タンパク質(BMP);抗生物質、例えばアミノグリコシド類、アンサマイシン類、カルバペネム類、セファロスポリン類、グリコペプチド類、リンコサミド類、リポペプチド類、マクロライド類、モノバクタム類、ニトロフラン類、オキサゾリジノン類、ペニシリン類、ポリペプチド類、キノロン類、スルホンアミド類又はテトラサイクリン類等の種に属する抗生物質;消毒剤、例えばアルコール、第四級アンモニウム化合物、ホウ酸、ブリリアントグリーン、グルコン酸クロルヘキシジン、又は過酸化水素;血液凝固因子、例えばフィブリノーゲン、プロトロンビン、組織因子、カルシウム、プロアクセレリン因子、第VI因子、プロコンバーチン、抗血友病因子、クリスマス因子、スチュワート-プロワー因子、血漿トロンボプラスチン前駆物質、ハーゲマン因子、及びフィブリン安定化因子;パーフルオロカーボン(PFC)、又は組換え若しくは合成ヘモグロビン等の酸素運搬体;抗炎症剤、例えばステロイド系抗炎症薬(例えばグルココルチコイド)、非ステロイド系抗炎症薬(NSAID、例えばアスピリン、イブプロフェン、又はナプロキセン)、又は免疫選択性抗炎症誘導体(ImSAID);及びそれらの組合せ
からなる群から選択することができる。
【００８０】
本発明のヒドロゲルをそれを必要とする対象に移植する場合、又は創傷を治すために包帯又はパッチにおいて使用する場合、かかる活性剤は特にとりわけ有用とすることができる。したがって、本発明の好ましい一実施形態では、本発明のヒドロゲルを含む前記機器はパッチ又は包帯である。或いは、別の好ましい実施形態では、本発明のヒドロゲルを含む前記機器はインプラントである。
【００８１】
上述のように、本発明のヒドロゲル、又は前記ヒドロゲルを含む医療機器は、前記ヒドロゲルから放出されたグルコースの血管新生促進特性及び/又は生存促進特性の恩恵を受けられる可能性がある医療用途において使用することができる。血管新生により、損傷皮膚の治癒に限らず毛髪及び脂肪組織の成長、神経再生、並びに筋肉及び骨修復が円滑化することは、実際公知である。グルコースの生存促進性の特性はまた酸化的ストレスに対処する助けとなるが、この酸化的ストレスは、いくつかの病状及び外傷(がん、苔癬、組織損傷等)に関与しているとされているとともに、組織移植又は細胞移植の成功を妨げる恐れがある。
【００８２】
したがって、別の態様では、本発明は医薬として使用するためのヒドロゲル、又は上記の医療機器を提供する。上記の好ましい実施形態が準用される。
【００８３】
具体的には、本発明によるヒドロゲル又は医療機器により、症状又は状態を改善することができる速度でのグルコースの制御放出が可能となる。例えば、特定の医療用途又は化粧料用途(例えば皮膚の病変の治療、骨折の修復、骨喪失又は虚血の治療、皴等の軟組織のとじ込み等)に応じて、創傷治癒を促進し且つ/又は組織再生を助長するのに十分な治療有効量で前記グルコースを送達することができる。当技術分野で通常の方法により、例えば標的細胞又は動物に投与する用量を変化させて用量反応実験を行うことにより、送達するための、グルコースの所望の治療量決定することは当業者の技能の範囲内である。
【００８４】
したがって、本発明は、骨、軟骨、皮膚、心血管組織、平滑筋、又は脂肪組織再生の方法における等の、それを必要とする対象において組織再生の方法に使用するための、本発明のヒドロゲル又は医療機器に好ましくは関する。より正確には、本発明は、組織移植片等の組織再生医薬として使用するための、本発明のヒドロゲル又は医療機器に関する。「組織再生」とは、本明細書では、上で例示した組織等の、対象の生体を構成する1つ又は複数の組織の再生を意味する。
【００８５】
なお、本発明はまた、それを必要とする対象における皮膚の病変の治療に使用するための、本発明のヒドロゲル又は医療機器にも関するのが好ましい。より正確には、本発明は皮膚の病変を治療するための医薬を製造することについての、本発明のヒドロゲル又は医療機器の使用に関する。換言すれば、本発明は、それを必要とする対象に本発明のヒドロゲル又は医療機器を投与する工程を含む、それを必要とする対象における皮膚の病変を治療する方法に関する。本明細書で使用する用語「皮膚の病変」は、皮膚の発赤又は痛み、皮膚科学的に炎症を起こした皮膚、水疱及び開放創、熱傷、膿瘍及び皮膚潰瘍を包含する。
【００８６】
なお、本発明は、骨修復の促進に及び/又は骨喪失の治療に使用するための、本発明のヒドロゲル又は医療機器にも更に関するのが好ましい。より正確には、本発明は骨修復を促進し且つ/又は骨喪失を治療するための医薬を製造することについての、本発明のヒドロゲル又は医療機器の使用に関する。換言すれば、本発明は、それを必要とする対象に本発明のヒドロゲル又は医療機器を投与する工程を含む、それを必要とする対象における骨修復を促進し且つ/又は骨喪失を治療する方法に関する。「骨喪失」とは、骨量の低下を特に特徴とするあらゆる骨障害を意味する。前記喪失は、例えば骨粗鬆症又は歯周炎等の骨喪失障害から生じることがある。「骨修復」は、例えば骨髄穿刺若しくは患肢温存手術、又は骨折を招く外傷後に、骨量の低下がない場合でも必要な場合もある。
【００８７】
なお、有利には、本発明はまた、それを必要とする対象における虚血の、好ましくは局所的虚血の治療に使用するための、本発明のヒドロゲル又は医療機器にも関する。より正確には、本発明は虚血を治療するための医薬を製造することについての、本発明のヒドロゲル又は医療機器の使用に関する。換言すれば、本発明は、それを必要とする対象に本発明のヒドロゲル又は医療機器を投与する工程を含む、それを必要とする対象における虚血を治療する方法に関する。「虚血」とは、患部組織への血流の閉塞に起因する低酸素症をより詳細には意味する。局所的虚血の治療のため、好ましくは、前記ヒドロゲル又は前記医療機器を前記対象の虚血組織の領域に投与しうる。
【００８８】
本明細書で使用する用語「治療すること(treating)」、「治療(treatment)」又は「治療する(treat)」は、とりわけ、治療に干渉するもの及び/又は治療から生じるものを含めて、欠損、機能不全、疾患、又は他の有害なプロセスを予防すること、改善すること、阻害すること、又は治癒することを包含する。
【００８９】
なお、有利には、本発明は、それを必要とする対象に本発明のヒドロゲル又は機器を投与する工程を含む、皴を予防するか又は低減させる化粧法に関する。換言すれば、本発明は、皴を予防するか又は低減させるための本発明のヒドロゲル又は機器の化粧用の使用に関する。本文脈においては、化粧法は自然老化を予防するか低減させることを目的とし、したがって対象は健常対象である(すなわち健常者である)。
【００９０】
本発明によるヒドロゲル又は医療機器を個体へと投与する方法は当業者に周知である。かかる方法としては、限定されないが、接種又は注射又は移植(例えば、筋肉内、皮下、関節内等)、又は局所適用(例えば、創傷、熱傷等などの皮膚部分の上)が含まれる。投与方法は所望の適用に依存するであろう。前記ヒドロゲル又は医療機器を投与する好ましい方法は注射又は移植であり、より好ましくは注射である。それでもなお、好ましくは、例えば皮膚の病変を治療するには局所適用を選択することができる。
【００９１】
用語「対象」とは、本明細書全体を通じてヒト又は動物、好ましくはヒトを指す。
【００９２】
別の態様では、本発明は
a)水溶性のゲル化可能なモノマー又はポリマー、
b)グルコースポリマー、及び
c)グルコースポリマーb)をグルコースに加水分解することが可能な少なくとも1つの酵素
を混合する工程を含む、本発明のヒドロゲルを調製する方法に関する。
【００９３】
好ましい実施形態は上記のとおりである。
【００９４】
具体的には、上の方法には、成分a)を成分c)へ混合する工程、及び上で定義した少なくとも1つの生物学的材料及び/又は少なくとも1つの活性剤を混合する工程が有利には必要である。
【００９５】
「ゲル化可能なモノマー又はポリマー」とは、本明細書では、ゾル/ゲル相転移、すなわち液体溶液から固体ゲルへ転化することを生じるネットワークを形成することが可能なモノマー又はポリマーを意味する。かかるネットワーク形成(すなわちゲル化)は当技術分野で周知の方法で実施することができるが、その方法はモノマー/ポリマーの性質に応じて異なるであろう(De Gennes、1979; Paponら(2006))。例えば、前記モノマー/ポリマーのゲル化は温度を改変することにより、生理食塩水(例えばカルシウムイオン又はバリウムイオンを含有する溶液)を添加することにより、pHを改変することにより又は架橋することにより実行することができる。
【００９６】
かかるモノマー/ポリマーはしたがって、温度の上下等の熱処理に続いてゲルを形成することが可能な場合、「熱的にゲル化可能」とみなすことができる。かかるポリマーの例には、限定されないが、ゼラチン、ダイズタンパク質、オボアルブミン、コラーゲン、及びカラギナンが含まれる。
【００９７】
或いは、例えば、架橋を生じる金属カチオンとの化学反応を介して(例えばカゼイン、アルギン酸)、pHの改変により(例えばダイズタンパク質)、酵素改変により(例えばアルギン酸エピメラーゼを使用することによるアルギン酸、ペクチンメチルエステラーゼを使用することによるペクチン、トロンビンを使用することによるフィブリノーゲン、又はキモシン-ペプシンの使用)又は架橋により(例えばグルタルジアルデヒドを使用することによる、EDC/NHSを使用することによる、又はTgase、リシルオキシダーセを使用することによる)、ゲルを形成することが可能な場合、前記モノマー/ポリマーは「化学的にゲル化可能」ということができる。
【００９８】
上に示したように、フィブリンが本発明のヒドロゲルの特に好ましいタンパク質ポリマーa)である。フィブリンはトロンビンをフィブリノーゲンの溶液に添加することによって製造することができる。すなわち、そのためには、トロンビンをフィブリノーゲンアルファ鎖及びベータ鎖のN-末端をそれぞれフィブリノペプチドA及びBに切断する。次に、得られたフィブリンモノマーを端と端をつないで重合してプロトフィブリルを形成し、これは次に側方に会合してフィブリンファイバーを形成する。最終工程で、フィブリンファイバーは会合してフィブリンゲルを形成する。したがって、本発明のこの好ましい実施形態では、水溶性のゲル化可能なモノマーa)は有利にはフィブリノーゲンである。
【００９９】
故に、好ましい一実施形態によれば、本発明のヒドロゲルを調製する方法は、水溶性のゲル化可能なモノマー又はポリマーをゲル化する工程を更に含む。なお、有利には、上の方法は、成分a)からc)を混合する工程に先立ち、グルコースポリマーb)を別個に可溶化させる工程を更に含む。具体的には、グルコースポリマーb)がデンプンである場合は、デンプンの可溶化を約90℃にて実施し、続いて約122℃、1Pa(大気圧)にてオートクレーブする。均質なゲルを得るために、上記のように、デンプンがヒドロゲル中に高濃度で存在する場合、かかる条件は特に必須とすることができる。
【０１００】
そのうえ、当業者であれば、本発明の好ましい最終濃度等の上で提供した指示に基づいて、各成分の量を容易に決定することができる。
【０１０１】
なお、有利には、上の方法は、成分a)を成分c)に混合する工程に先立ち、当技術分野で周知のいくつかの技法を使用することによって、上で定義したように酵素c)をポリマー粒子に封入する工程を更に含むことができる。通常、選択されたポリマーの特性、送達する酵素の特徴、及び所望の放出プロフィールに応じて、特定の技法が選択される。製造方法の詳細なレビューについては、当業者はSinhaら(2003)及びSoppimathら(2001)を援用することができる。
【０１０２】
上の成分を混合する工程は、酵素c)の活性を変化させないか又はその構造を変性させない実験条件(温度、pH)で実施するのが好ましいことは、当業者は容易に理解するであろう。ヒドロゲルをインビボで使用する必要がある場合、例えばそれを必要とする対象に移植する必要がある場合、好ましくは、滅菌条件で製造されることも更に理解されるであろう。
【０１０３】
そのうえ、上に示したように、適切な又は所望の速度でグルコースを放出するために本発明のヒドロゲルを製造する実験条件を決定することは当業者の技能の範囲内である。
【０１０４】
フィブリン、デンプン及びナノ粒子内に封じ込められているα-グルコシダーゼからできているヒドロゲルを製造するための全詳細については下に更に記載の実施例において提供されている。
【０１０５】
本発明のヒドロゲルを製造するために、ゲルの成分を含むキットを提供することが有用であろう。したがって、別の態様では、本発明は、
a)水溶性のゲル化可能なモノマー又はポリマー、
b)グルコースポリマー、
c)グルコースポリマーb)をグルコース分子に加水分解することが可能な少なくとも1つの酵素、及び
d)任意選択で、前記方法を行うための指示書
を含む、上記方法において使用するためのキットに関する。
【０１０６】
好ましい実施形態は上記のとおりである。具体的には、上のキットは、前記酵素c)をポリマー粒子に封入するのに適したポリマー、及び/又は、上で定義した、少なくとも1つの生物学的材料及び/又は少なくとも1つの活性剤を更に含むことができる。
【０１０７】
上のキットはまた、上で定義した、水溶性のゲル化可能なモノマー又はポリマーのゲル化を促進するか又は円滑化することができる化合物を更に含むことができる。
【０１０８】
本明細書で使用する、用語「指示書」とは、本発明のヒドロゲルをいかに製造するかを連絡するために使用可能な、表現に関する出版物、記録、ダイヤグラム、又は他のいかなる媒体をも指す。前記指示書は、例えば、前記キットを収容する容器に取り付けることができる。
【０１０９】
本発明は、実施例を含む、下記の実験の詳細な説明に照らしてより理解され得る。それにもかかわらず、当業者であれば、この詳細な説明が限定的でなく、様々な改変、置換、削除及び変更が、本発明の範囲を逸脱せずに行われ得ることを理解するであろう。
【実施例】
【０１１０】
1.材料及び方法
1.1.フィブリンの可溶化
ラミナーフローフード下で、フィブリノーゲンを10mM、pH7.4のHepesバッファー中37°Cにて50mg.ml-1の濃度で可溶化させた。次いで、この溶液をタンパク質が完全に可溶化するまで、ゆっくりと進むことなく、37℃にて3h間インキュベートした。
【０１１１】
1.2.トロンビンの可溶化
PSM下で、トロンビンを、0.1%(w/v)のBSAを含む、10mM、pH6.5のHepesバッファー中37°Cにて100μ.ml-1の濃度で可溶化させた。生成する溶液をこの濃度で20℃にて保存するか又は20μ.ml-1に希釈するかのいずれかとした。
【０１１２】
1.3.デンプンの可溶化
8%(w/v)デンプン、300mM NaCl及び40mM CaCl2の懸濁液を10mM、pH7.4のHepesバッファー中に調製した。デンプンの可溶化は、この溶液を90℃にて2h間攪拌しながらインキュベートし、続いてオートクレーブ(121℃、1Pa)することによって行った。次いでデンプン溶液を一晩室温にて冷却した。
【０１１３】
1.4.ナノ粒子合成
ナノ粒子を二重エマルジョン法を使用して調製した。要約すると、ポリ(乳-コ-グリコール)酸(PLGA)を、0.5%(w/v)でジクロロメタンに溶解させ、カバーをし、室温にて1h間インキュベートした。濃縮α-アミログルコシダーゼ溶液(グルカン1,4α-グルコシダーゼ、EC: 3.2.1.3)をPLGA溶液に添加し、10sの超音波処理に3回供した。5%(w/v)ポリビニルアルコール(PVA)を、PVAを10mM、pH7.4のHepesに溶解させることにより前もって調製した。この溶液を攪拌下90℃にて2h間加熱し、室温に冷却した。
このPVA溶液を、PVA/第1のエマルジョンの容積比2:1で第1のエマルジョンに添加し、次いで10sの超音波処理に3回供した。この第2のエマルジョンをPVA/第2のエマルジョンの容積比50:3で、0.3%(w/v)PVA溶液に注いだ。次いでジクロロメタンを蒸発させるために、この溶液を攪拌下室温にて3h間放置した。生成するナノ粒子を12,000rpmで8min間遠心分離し、10mM、pH7.4のHepesに3回、再懸濁した。瞬時冷凍及び凍結乾燥後に、乾燥ナノ粒子を収集し、脱イオン水に再懸濁した。
【０１１４】
1.5.ゲル化手順
デンプン溶液をまず攪拌しながら90℃にて2h間加熱し、そしてフィブリノーゲン溶液及びトロンビン溶液を37℃にて15分間加熱し、一方、α-アミログルコシダーゼ溶液は室温に保った。
【０１１５】
デンプン溶液を最終容積に基づいて10mM、pH7.4のHepesバッファーの適切な容積と混合した。次いで、全ての溶液を室温に冷却した後、フィブリノーゲン(50mg.ml-1)及びフリーであるかナノ粒子に封じ込められているかのいずれかであるα-アミログルコシダーゼの適切な容積を添加した。ヒドロゲルの重合を、トロンビンを20μ.ml-1の濃度で混合物に導入することにより、続いて開始した。ゲルの各成分の最終濃度を4%(w/v)デンプン、0.5%(w/v)フィブリノーゲン及び2μ.ml-1トロンビンとしたが、α-アミログルコシダーゼの濃度は、グルコース放出の所望の量と適合させる必要があった。トロンビンを導入してすぐに、混合物を任意の乾燥を回避するように密封されたテフロン（登録商標）管状モールドに入れた。重合を37℃にて1h間実施した。重合後に、ヒドロゲルをニードルでモールドから取り出し、10mM、pH7.4のHepesバッファー中に保存した。
【０１１６】
1.6.グルコース「産生」のインビトロ分析
グルコース放出を調べるために、ヒドロゲルを10mM、pH7.4のHepesバッファー中でインキュベートした。バッファーの一画分又は総量を様々な時点で採取し、新鮮なHepesバッファー溶液で置き換えた。採取画分のグルコース濃度をSigma社製のGlucose(GO)アッセイキット(Product code GAGO-20)を使用して決定した。要約すると、放出されたグルコースをグルコースオキシダーゼによりグルコン酸と過酸化水素に酸化した。生成した過酸化水素はペルオキシダーゼの存在下で還元型O-ジアニシジンと反応して、酸化型O-ジアニシジンを形成した。酸化型O-ジアニシジンは次いで硫酸と反応して、より安定な桃色に呈色した生成物を形成した。540nmにて測定した桃色の強度は当初のグルコース濃度に比例していた。グルコース濃度は次いでグルコース標準液で作製した標準曲線を使用して決定した。
【０１１７】
1.7.細胞培養
ヒト間葉系幹細胞(hMSC)を、仏国生命倫理法を遵守して、Lariboisiere Hospital(仏国、パリ)において5人の成人ドナーから通常の骨手術中に不要な組織として入手した骨髄から分離した。これらの細胞は、文献報告から応用された手順を使用して患者各々の骨髄から分離し、特性評価を行い、継代1において等しい割合でプールし、標準細胞培養条件下で、すなわち37℃、5%CO2、95%大気の加湿した環境で、アルファ最小必須培地(Alpha Minimum Essential Medium)(αMEM; Dutscher社、Brumath、仏国)中で培養した。80〜85%のコンフルエンスで、細胞をトリプシン-EDTA(Sigma社)を使用してトリプシン処理し、継代培養した。細胞継代4〜5を実験に使用した。ADSCを同一条件で培養し、そして筋芽細胞の培養については特有な培地を使用した。
【０１１８】
1.8.インビボ実験
1.8.a)ヒト間葉系幹細胞(hMSC)の分離及びトランスダクション
以前に記載されたように(Friedensteinら、1987)、ヒト間葉系幹細胞(hMSC)を、Lariboisiere Hospital(仏国、パリ)において通常の骨手術中に入手した不要な組織の骨髄サンプルから分離した。継代4〜5にある、5人のドナーからのhMSCを、続くセクションにおいて記載される実験向けにプールした。各実験は6回反復で実施した。細胞の生存のインビボ評価のために、ホタルルシフェラーゼ(Luc)及び緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする融合遺伝子を含有する、rMLV-LTR-eGFP-lucレトロウイルスベクターによって、hMSCを遺伝的に改変した。
【０１１９】
1.8.b)hMSC細胞を含有するヒドロゲルの製造
ヒドロゲルを、トロンビンを添加せずに、移植前日に上記のように製造し、続いて3x105のGFP-Luc hMSC細胞と混合した。次いでトロンビンをこの混合物に添加し、次いでそれを37℃にて1h間インキュベートして、重合を行った。モールドから取り出した後、細胞含有ヒドロゲルをリン酸バッファー液(PBS)中で保存した。
【０１２０】
異なる4種のヒドロゲルをインビボ研究向けに作製した、すなわちヒドロゲルは
(i)細胞/フィブリン(n=6)
(ii)細胞/デンプン/フィブリン(n=6)
(iii)細胞/デンプン/フィブリン/アミログルコシダーゼ(n=6)、及び
(iv)細胞/デンプン/フィブリン/ナノ粒子に封入されているアミログルコシダーゼ(n=6)
を含有していた。
【０１２１】
1.8.c)  外科的手技
hMSc生存をマウス異所性モデル(8週齢の雄nu/nuマウス、Janvier社、St Berthevin、仏国)において評価した。全ての動物手順は院内出版ガイドライン(Directive du Conseil 24.11.1986. 86/609/CEE)に準拠して行った。
【０１２２】
ヌードマウス(nu/nu)(体重30g)をケタミン(Ketalar(登録商標)、ROCHE社)1mg/10g及びキシラジン(Rompun(登録商標)、BAYER社)0.1mg/10gを腹腔内注射して麻酔した。切開(それぞれ長さ5mm)を椎骨軸に沿って行い、別々の皮下ポケット(胸椎部位及び腰椎部位に)を鈍的切開により作製した。次いで細胞含有ヒドロゲルをマウスの皮下ポケットに無作為に移植し、皮膚縫合閉鎖術を断続性エチコン非吸収性バイクリル3-0縫合糸(Johnson and Johnson社、ベルギー)を使用して行った。
【０１２３】
1.8.d)インビボの細胞の生存の評価
細胞の生存を生物発光イメージングにより評価した。要約すると、移植を行って1、7及び14日後に、D-ルシフェリン(PBS中15mg/mL)0.1mlを(イソフルランを吸入させることにより)麻酔した各マウスの移植部位に局所注射した。次いで動物を生物発光イメージングシステム(Ivis Lumina II(登録商標)、Caliper Life Science社)の検出チャンバー内部に腹臥位で置いて、各インプラントの対象の領域について光子束をliving Image(登録商標)3.1ソフトウエア(Caliper Life Science社)を使用して定量化した。
【０１２４】
1.8.e)免疫組織学
生物発光評価に加えて、ヒドロゲルに残存する生存ヒト間葉系幹細胞を、免疫組織学を使用して検出した。要約すると、移植を行って1、3、7、10及び14日後に、ヒドロゲルを採取して、パラホルムアルデヒド4%に固定し、パラフィンに包埋した。5μm薄切片を、ヒト細胞の特異的マーカーであるβ2-ミクログロブリンを標的とする免疫組織学的解析(Dako kit、Envision社)向けに使用した。ヒドロゲル切片を顕微鏡的に解析し、各ヒドロゲルの免疫染色細胞の数を決定した。
【０１２５】
1.9.ヒドロゲルからのグルコース放出を測定するための数学的モデル
本モデルは、液体相における拡散の一般解に基づいた。このモデルはゲルネットワークに起因する立体障害を組み込むように改変された。それは以下のように、
【０１２６】
【数２】
0006715851.tif 000003
【０１２７】
動態(時間、t)及び空間条件(x)の双方を考慮したフィックの第2法則に基づいた。
【０１２８】
三次元モデルにおける本式の一般解は、
【０１２９】
【数３】
0006715851.tif 000004
【０１３０】
であるが、式中、n0は対象の拡散分子の初期濃度、Dは検討されている媒体中における拡散分子の拡散係数、xは拡散距離、及びnは距離xでの及び時間tでの分子濃度とした。
【０１３１】
算出は次のように実施した:
・拡散分子の濃度を100(無次元化数値)に正規化して、結果を%で表現した、その結果n0=100、
・流体力学的半径は文献から入手するか又は実験的に決定した(例えば動的光散乱法による)、
・拡散係数はStokes-Einsteinの式、
【０１３２】
【数４】
0006715851.tif 000005
【０１３３】
を使用して単純に算出し、式中
Dはm2.s-1で表されたが、κBはボルツマン定数であり、Tはケルビン温度、ηはPa.sでの粘度、及びrはmでの動力学的半径である、
・2.3mmに等しいx値を、スフェアとみなされたゲルの平均半径を拡散距離として使用した。
【０１３４】
ゲルネットワークの存在を考慮して、液体相の粘度を評価した。固体粒子の懸濁液の粘度を分散媒体の粘度ηsに関連付けるEinsteinの式からの導出を検討し、
η=ηs(1+2.5φ+6.2φ2)
式中、ηsはデンプン不在化の溶媒粘度(すなわち10-3Pa・sである水の粘度)及びφは固体体積分率とした。ここで、φは、固体ネットワークに全体的に係合したとみなされた、フィブリン濃度、1.8%とした。
【０１３５】
液体相粘度は、フィブリンゲルに封じ込められたデンプンの性質及び濃度で異なった。粘度は拡散の制約を調節するパラメーターであった。したがって、粘度ηについては、フィブリンゲルに使用したデンプンのそれぞれの種及び濃度に対してレオロジーによって測定した。次いで、拡散係数、Dについて、これらのデータからそれぞれの材料について算出した。
【０１３６】
そのうえ、ゲルの固体相の平均メッシュサイズを、容積ξ3がκBTに等しい弾性エネルギーを保存したと仮定して、Maxwellモデルを使用してゲルが準平衡点に達したときのレオロジーデータから評価した。ガウス再分配を使用するとこの関係は:
ξ3=κBT/G'
となり、式中、ξはメッシュサイズ及びG'はPaで表された貯蔵弾性率とした。103PaのG'値については、16.2nmの平均メッシュサイズが仮定された。この値を使用して、大分子の拡散に関する、固体ネットワークにより生じた立体障害の役割を評価した。流体力学的半径は、グルコースについては0.43nm、酵素については7nm及びナノ粒子については250nmであった。イオン相互作用が拡散を変化させる可能性もあるが、デンプンやグルコースは非電荷であるので、このパラメーターは計算から削除した。
【０１３７】
1.10.ヒドロゲル内部でのサンゴの分布の評価
サンゴ含有ヒドロゲルを、上記の「ゲル化手順」セクション(1.5)で説明したように製造した。要約すると、予熱したデンプン溶液を、最終容積に基づいて10mM、pH7.4のHepesバッファーの適切な容積と混合した。次いで、全ての溶液を室温に冷却した後、フィブリノーゲン(50mg.ml-1)を添加した。このとき、400mg/mlのサンゴ粒子(平均で600〜1000マイクロメーター)を添加し、混合物へ穏やかに混合した。続いてトロンビンを20μ.ml-1の濃度で混合物中に導入することによりヒドロゲルの重合を開始した。ゲルの各成分の最終濃度は、デンプンで4%(w/v)、フィブリノーゲンで0.5%(w/v)及びトロンビンで2μ.ml-1並びにサンゴで400mg/mlであった。トロンビンを導入してすぐ、混合物を任意の乾燥を回避するように密封されたテフロン（登録商標）管状モールドに入れた。重合を37℃にて1h間実施した。重合後に、ヒドロゲルをニードルでモールドから取り出し、マイクロスキャナー(Skyscan 1172、Bruker社、仏国)でイメージ化した。
【０１３８】
2.結果
2.1.グルコース又はデンプンを含有するヒドロゲルにおけるグルコース拡散のモデライゼーション(Modelisation)
幾つかの方法を展開して、ヒドロゲルに直接封じ込められたグルコースの放出を制限することを試み、且つ続いてグルコース送達の動態を制御した(図1)。しかし、上の図1の説明文に記載のように、実施した様々な後処理のいずれもがゲルからのグルコース送達を制限することに成功しなかった。実際、数秒後に、処理したゲルの全てにおいて約70μgから80μgのグルコースが放出され、その後それ以上グルコースは放出されなかった。グルコースの各測定後に上清を更新しなかった(対照的に、更なる全ての実験については、グルコースの各測定後に上清を更新することによってより長時間のタイムラインで実施したが)20時間の期間にわたってこのようなことを経験した。これ故、使用したシステムが何であれ、グルコースを効率的に封じ込めることでは、持効性でその送達を制御することはできない、と結論付けることができる。
【０１３９】
2.1.a)t=0での、ゲルに直接封じ込められたグルコース
長時間にわたるグルコースの一定した送達はインサイチュでのグルコースの規則的な産生に依存するということが、図2に例示されているグルコース拡散のモデライゼーションによって示された。実際、このモデライゼーションによって、グルコースの内部濃度を一定に維持するためにはグルコースの規則的なインサイチュ産生が必要であるが、t=0において高濃度のグルコースを導入することをからなる代替溶液は適切ではないということが分かった。
【０１４０】
以下の計算は前者の条件に基づいた(グルコースのインサイチュ産生=一定の又は疑似一定のグルコース濃度)。
【０１４１】
2.1.b)グルコース送達動態に対するデンプンの影響
図2Aに示すように、デンプン無しで、固定量のグルコースを含むヒドロゲルを使用すると、まず大きなバーストへと放出され、そして送達されたグルコースの量は極めて小さいという安定化した相が急速に後続するという、グルコースの放出がもたらされた。
【０１４２】
対照的に、(純粋なグルコースの代わりに)グルコースポリマーとしてデンプンを含有するヒドロゲルを使用すると、フィブリンゲルの内部粘度が大きくなるとともに、このゲルの粘度変化も減速した(図2A)。このことによってグルコースの送達が遅延すること並びにより高い及びより長いグルコースの放出がもたらされた。このヒドロゲルは、均質な構造、シネレシスがないこと及び良好な機械的特性も更に提示した、すなわちデンプンの存在はフィブリンのゲル化時間に影響を及ぼさず、且つフィブリンネットワークの特性を変化させなかった。
【０１４３】
したがって、ヒドロゲル中の重合グルコース源としてデンプンを添加することは、特にそのビスコシゲン特性にとって極めて重要であることが、これらの結果から分かった。それ故、選択すべきデンプンは、図2B及び図2Cで示されている実験結果で確認されたように、経時的に酵素的加水分解を機械的に支持することができなければならない。実際、コムギデンプンは、トウモロコシデンプンと比較して高い粘度を示し、且つ経時的により一定したグルコース送達をもたらした(図2B)。
【０１４４】
2.1.c)酵素の拡散
グルコースポリマーをグルコースに加水分解することが可能な(ここではα-アミログルコシダーゼ)非封入の酵素を含有するヒドロゲルを使用して得られた結果のモデライゼーションによって、前記酵素が4日後にゲルから放出されることが分かった(図3)。対照的に、ナノ粒子への酵素の封入によって更に長期の送達が可能となった(図3)。ナノ粒子は、その完全な状態を維持している限り、依然としてゲル内部に閉じ込められていたということに、更に留意すべきである(ナノ粒子とフィブリンメッシュとの間のサイズ比はおよそ10であった;NP=250nm/ゲルメッシュ=25nm)。
【０１４５】
ゲルの外側へのその自然拡散に起因する酵素の損失を補償する、ナノ粒子の至適分解動態をモデライゼーションによって更に決定した。前記動態を最適化するために、酵素の規則的な送達を調整されたナノ粒子の様々なプールを使用して得ることができる。実際、当業者に周知のように、特にナノ粒子においてシェルを形成するのに使用されるポリマー粒子のサイズ及び性質を調節して、数日から数週間まで対象の薬剤(酵素等の、本明細書で提案されているような)を送達することができる。
【０１４６】
2.2.本発明のヒドロゲルへのグルコースポリマーの導入
2.2.a)ヒドロゲルのレオロジーに及ぼすグルコースポリマーの影響
種々のデンプン源を封じ込めている材料の粘弾性特性を比較した。1Hzでの1%の強制変形、円錐/平板ジオメトリ(円錐:直径25mm、角度2°)、37℃にて、を試験条件とした。デンプンを添加すると、デンプン源に応じて材料の弾性は低下した。バレイショデンプンが最も大きいかく乱効果を示したが、トウモロコシデンプン及びコムギデンプンはヒドロゲルの機械的特性に対して弱い影響しか有していなかった(図4)。
【０１４７】
2.2.b)ヒドロゲルへの多量のグルコースポリマーの導入
種々の由来のデンプンを様々な濃度でフィブリンヒドロゲルに封じ込めることができた。デンプンの性質に応じて、デンプンの鎖長及び構造は異なり、ゲル内部のデンプン濃度はその多糖の可溶性によって制限された。
【０１４８】
所望のグルコース濃度は、≧3%の濃度を有するコメデンプン、コムギデンプン及びトウモロコシデンプンを使用して得られたが、バレイショデンプンでは少なくとも4%濃度で使用する必要があった(図5)。
【０１４９】
2.2.c)高濃度における且つ一定濃度におけるグルコース放出
フィブリンヒドロゲルに封じ込められた4%(w/V)のコムギデンプン又は4%(w/V)のトウモロコシデンプンのいずれかを使用すると、細胞への供給にとって高くて十分な濃度のグルコースが少なくとも2週間ゲルから放出された(図6A)。更に、2%デンプンのフィブリンヒドロゲルを使用すると11日にわたり制御性の放出を得ることができる(図6B)。
【０１５０】
2.3.本発明のヒドロゲルはインビトロで細胞の生存を改善した
hMSCをルシフェラーゼ(Luc)遺伝子レポーターで遺伝的に標識し、そして酵素の存在(2.10-4μmol.min-1.mg-1)又は非存在で及びナノ粒子の存在又は非存在で、フィブリン(18mg/ml)、加熱デンプン(4%)、を含有するヒドロゲル内に播種した(組織構造物当たり3.105細胞で)。
【０１５１】
次いで、hMSCLuc含有ヒドロゲルをグルコースを含まない培養培地で培養し(グルコース培地条件を除く)、ほぼ無酸素環境(pO2<0.1%)中で7日間インキュベートした。生存hMSCLucから発せられた生物発光(BLI)シグナル(光子/秒で表されている)を生物発光イメージングシステムを使用して、試験したヒドロゲルそれぞれについて測定した。各ヒドロゲルからのBLIシグナルを細胞含有フィブリンから得たものに対して正規化した(陰性対照)。
【０１５２】
グルコース含有培地の存在下で(陽性対照)、hMSCLucの生存能は6倍高まったが、デンプンの存在はエンプティ(無酵素)ナノ粒子を伴う場合又伴わない場合で、フィブリンヒドロゲルと比べて細胞生存能を有意に高めることはなかった。対照的に酵素が存在すると、hMSCLucの生存能は7日後で陽性対照と同じくらい良好であった(図7A)。
【０１５３】
しかし、生存能を長時間比較すると14日後の細胞の生存能は、本発明によるヒドロゲルにおいてフィブリンヒドロゲルと比べて100倍超で、及びグルコース含有ヒドロゲルと比べて2倍高まることが示された(図7B)。
【０１５４】
更に、本発明のヒドロゲルは脂肪由来幹細胞(ADSC)及び筋芽細胞の生存能を高めることができることもまた分かった(図7C)。
【０１５５】
2.4.本発明のヒドロゲルはインビボで細胞の生存を改善した
hMSCをルシフェラーゼ(Luc)遺伝子レポーターで遺伝的に標識した。酵素の存在(2.10-4μmol.min-1.mg-1)又は非存在で及びナノ粒子の存在又は非存在で、hMSCLuc(組織構造物当たり3.105細胞)、フィブリン(18mg/ml)、加熱デンプン(4%)、を含むヒドロゲルを、免疫不全(ヌード)マウスの背部に皮下移植した。生存hMSCLucにより発せられた生物発光(BLI)シグナル(光子/秒で表されている)を生物発光イメージングシステムを使用して移植後1日目及び14日目の両日においてマウスそれぞれにおいて測定した。
【０１５６】
酵素不在の場合、BLIシグナルは、したがってhMSC生存能は移植後7日目に劇的に低下した。対照的に、酵素が存在すると、生存hMSCLucにより発せられたBLIシグナルは、1日目と比べて高まり、このことは、hMSCLucは移植の7日間の期間にわたってヒドロゲル内で生存するとともに増殖したことを示している(図8A)。移植後14日目(図8B)及び28日目(図8C)、生存hMSCLucにより発せられたBLIシグナルはフィブリンヒドロゲルと比べて30倍超で高い。
【０１５７】
これらの結果はより低濃度のグルコースポリマー(例えば1%)でも観察された。更に、NP内に酵素を組み込むとhMSCLuc増殖が大きく改善された。
【０１５８】
更に、本発明のヒドロゲルは、インビボ虚血状態において、ヒドロゲル内にロードされた生物学的材料(hMSC)の生存を改善することも分かった。ヘマトキシリンで対比染色することで、宿主細胞によるヒドロゲルの浸潤を観察することができる(ヘマトキシリンによる染色、しかしベータ2-ミクログロブリンによる染色ではない)(図9A)。ベータ2-ミクログロブリン免疫染色(hMSC特異的)によって、ヒドロゲル中の生存hMSCの定量化で確認されたように、フィブリンを含有するヒドロゲルと比べた場合、フィブリン/デンプン/AMGを含有するヒドロゲルにおいて14日後で生存hMSCが有意に高まる(7.5倍)ことが分かった(図9B)。
【０１５９】
2.5.本発明のヒドロゲル内部へのサンゴの導入
ヒドロゲル内部へのサンゴの再分配について良好な均質性がコムギデンプンを含むヒドロゲルで得られた(図10)。
【０１６０】
2.6.キット成分の安定性
キット成分は、生成するヒドロゲルの良好な機械的特性で確認されたように28日にわたり良好な安定性を示した(図11)。酵素AMGの活性は、14日の保存後保持され、このことによりキット成分の長期保存が可能であった。
【０１６１】
3.結論
本発明者らは、比較的上昇した濃度のデンプンの存在下で均質な構造、シネレシスがないこと及び良好な機械的特性を提示するフィブリンとデンプンとの混合ヒドロゲルを開発することに成功した。最大60mg/mLのデンプン保持を達成することができた。
【０１６２】
より詳細には、前記ゲルは、デンプンをグルコースへ加水分解する酵素を封入しているナノ粒子を含有することが可能であり、このことにより、少なくとも16日間ほぼ線形にグルコースを拡散することが可能となった。ナノ粒子の存在によって酵素の活性は変化しなかった。
【０１６３】
本発明のヒドロゲルはまた、細胞等の生物学的材料を含むことができる。インビトロ及びインビボデータから、かかるゲルを使用して、虚血状態で細胞の生存を促進することが可能であったこと、したがって細胞再生又は組織再生を必要とする治療においてこれを使用することができることが分かった。
【０１６４】
デンプンがグルコースへと徐々に加水分解されることを可能とするこのような時間制御型放出システムは、低酸素状態における細胞活性に関して、直接の外来性グルコース送達と比べて、更に卓越した特性を示している。
(参考文献)
0006715851.tif 000006
0006715851.tif 000007
【図１】
0006715851.tif 000008
【図２】
0006715851.tif 000009
【図３】
0006715851.tif 000010
【図４Ａ】
0006715851.tif 000011
【図４Ｂ】
0006715851.tif 000012
【図５】
0006715851.tif 000013
【図６】
0006715851.tif 000014
【図７Ａ】
0006715851.tif 000015
【図７Ｂ】
0006715851.tif 000016
【図７Ｃ】
0006715851.tif 000017
【図８Ａ】
0006715851.tif 000018
【図８Ｂ】
0006715851.tif 000019
【図８Ｃ】
0006715851.tif 000020
【図９】
0006715851.tif 000021
【図１０】
0006715851.tif 000022
【図１１】
0006715851.tif 000023