(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  二水素ホスフェートである化合物、またはその医薬的に許容される塩。
【化１】
0006629738.tif 000042
【請求項２】
（Ｓ）−４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  ２−アミノ−３−メチルブタノエート  塩酸塩である化合物、またはその医薬的に許容される塩。
【化２】
0006629738.tif 000043
【請求項３】
（Ｓ）−４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  ２−アミノプロパノアート  塩酸塩である化合物、またはその医薬的に許容される塩。
【化３】
0006629738.tif 000044
【請求項４】
（Ｓ）−２−アミノ−４−（４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェノキシ）−４−オキソブタン酸  塩酸塩である化合物、またはその医薬的に許容される塩。
【化４】
0006629738.tif 000045
Ｉ
【請求項５】
４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  二水素ホスフェートである化合物、またはその医薬的に許容される塩。
【化５】
0006629738.tif 000046
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年１月９日に出願された米国仮特許出願第６１／９２５，４０５号の優先権を主張するものであり、その全体は参照により本明細書に引用される。
【背景技術】
【０００２】
本開示は概して塩を含む式Ｉの化合物、並びに当該化合物を用いた組成物および方法に関する。化合物はＮＲ２Ｂ  ＮＭＤＡ受容体のリガンドであり、中枢神経系の様々な障害の治療に有用であり得る。
【０００３】
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩（ＮＭＤＡ）受容体はイオンチャネルであり、中枢神経系における興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸塩の結合により開閉する。それらは、鬱病、神経障害性疼痛、アルツハイマー病およびパーキンソン病を含む多くの神経疾患の発症に重要な役割を果たすと考えられている。機能的なＮＭＤＡ受容体は、主に２つのＮＲ１および２つのＮＲ２サブユニットから成る四量体構造である。ＮＲ２サブユニットはさらに４つの個々のサブタイプ、すなわちＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、ＮＲ２ＣおよびＮＲ２Ｄに細分され、脳全体にわたって特異的に分布している。ＮＭＤＡ受容体、特にＮＲ２Ｂサブユニットを含むチャネルのアンタゴニストまたはアロステリック調節因子は、主要な抑鬱障害を治療するための治療薬として研究されてきた（G. Sanacora, 2008, Nature Rev. Drug Disc. 7: 426-437）。
【０００４】
ＮＲ２Ｂ受容体は、グルタミン酸塩の結合部位の他に、さらなるリガンド結合部位を含む。ケタミンのような非選択的ＮＭＤＡアンタゴニストは小孔遮断薬（ｐｏｒｅ  ｂｌｏｃｋｅｒ）であり、チャネルを通したＣａ＋＋の輸送を妨げる。ケタミンは、ヒト臨床試験において静注薬物として迅速かつ持続的な抗鬱特性が実証されている。さらに、有効性はケタミンを繰り返し間欠的に注入しても保持されていた（Zarate et al., 2006, Arch. Gen. Psychiatry 63: 856-864）。しかし、このクラスの薬物には、解離性（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ）効果を含むＣＮＳ副作用があるため、治癒的価値は限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アロステリックで非競合的な結合部位もまた、ＮＲ２ＢのＮ末端ドメイン内に同定されている。トラキソプロジルのような、この部位に選択的に結合する薬剤は、ヒト臨床試験において静注薬物として、持続性の抗鬱反応および改善された副作用プロファイルを示した（Preskorn et al., 2008, J. Clin. Psychopharmacol., 28: 631-637、およびF. S. Menniti, et al., 1998, CNS Drug Reviews, 4, 4, 307-322）。しかしながら、このクラスからの薬物の開発は、バイオアベイラビリティの低さ、薬物動態の乏しさ、およびｈＥＲＧイオンチャネルを含む他の薬理学的標的に対する選択性の欠如により妨げられてきた。ｈＥＲＧイオンチャネルを遮断すると、潜在的に致死性のトルサード・ド・ポワントを含む不整脈をもたらし得ることから、このチャネルに対する選択性は極めて重要である。従って、主要な抑鬱障害の治療において、好ましい耐容性プロファイルを有する、効果的でＮＲ２Ｂ選択的な負のアロステリック調節因子を開発する臨床的必要性が満たされずに残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ＮＲ２Ｂ受容体アンタゴニストは、ＰＣＴ公開公報ＷＯ  ２００９／００６４３７に開示されている。
【０００７】
本発明は技術上の利点をもたらし、例えば、化合物は新規であり、ＮＲ２Ｂ受容体のリガンドであり、中枢神経系の様々な障害の治療に有用であり得る。さらに、化合物は、例えば、その作用機序、結合、阻害効果、標的選択性、溶解性、安全性プロファイルまたはバイオアベイラビリティの１つ以上に関して、製薬学的用途上の利点をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の説明
本発明のある態様は、式Ｉ：
【化１】
0006629738.tif 000002
Ｉ
［式中：
Ａｒ１は、フェニルまたはインダニルであり、シアノ、ハロ、アルキル、ハロアルキルおよびハロアルコキシから選ばれる０〜３の置換基で置換されており；
Ａｒ２は、１のＯＲ置換基で置換されており、かつ、シアノ、ハロ、アルキル、ハロアルキルおよびハロアルコキシから選ばれる０〜３の置換基でもまた置換されているフェニルであり；
Ｒは、アルキルエステル、アミノ酸エステル、アルコキシエステル、ホスホン酸、ホスホン酸アルキルエステル、アルコキシホスホノナート（ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｎａｔｅ）酸、アルコキシホスホノナート  アルキルエステル、アルキルカルバメート、アミノ酸カルバメート、アルキルホスホロアミダート、アリールホスホロアミダートおよびスルファメートから成る群から選ばれるプロドラッグ部分であり；
Ｘは、結合またはＣ１−Ｃ３アルキレンであり；
ｎは、１または２であり；
環Ａは、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ホモピペリジニルまたはホモピペラジニルであり、ハロ、アルキル、ヒドロキシまたはアルコキシから選ばれる０〜４の置換基で置換されている］
の化合物、またはその医薬的に許容される塩である。
【０００９】
本発明の別の態様は、式：
【化２】
0006629738.tif 000003
［式中、Ｒは、アルキルエステル、アミノ酸エステル、アルコキシエステル、ホスホン酸、ホスホン酸アルキルエステル、アルコキシホスホノナート酸、アルコキシホスホノナート  アルキルエステル、アルキルカルバメート、アミノ酸カルバメート、アルキルホスホロアミダート、アリールホスホロアミダートおよびスルファメートから成る群から選ばれるプロドラッグ部分である］
の化合物、またはその医薬的に許容される塩である。
【００１０】
合成法
式Ｉの化合物は、下記のもの、および当該技術分野の技術範囲内の変法を含む、当該技術分野で既知の方法により調製してもよい。一部の試薬および中間体は、当該技術分野で既知である。他の試薬および中間体は、すぐに利用できる物質を用いて、当該技術分野で既知の方法により調製することができる。化合物の合成を記載するのに用いられる可変基（例えば番号が付けられた「Ｒ」置換基）は、化合物の調製方法を説明するためだけのものであり、請求項または本明細書の他の項において用いられる可変基と混同されない。以下の方法は説明のためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。スキームは、当該技術分野で既知の妥当な変法を包含する。
【００１１】
スキーム１は、実施例１、すなわち（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−イル）−１−（４−メチルベンジル）ピロリジン−２−オンの有効な合成を示している。ヒドロキシラクタム１は光学的に純粋な形態で市販されている。ヒドロキシラクタム１を保護し、Ｎ−アルキル化すると、ラクタム４を生成させることができる。ヒドロキシル基をメタンスルホニルクロライドで脱保護し、活性化すると、ラクタム５がもたらされる。別に、化合物６は、市販の４−ベンジルオキシブロモベンゼンと、市販のｔｅｒｔ−ブチル  ４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−５，６−ジヒドロピリジン−１（２Ｈ）−カルボキシレートとの間の鈴木カップリング反応により調製することができる。６を系中で調製したボランで処理し、続いて酸化すると、トランスのラセミのアルコール７の生成がもたらされる。アルコール７は個々のエナンチオマーに分離することができ、フェノールを、標準的な条件下で水素化により脱保護（ｕｎｍａｓｋ）すると、置換フェノール８を調製することができる。ｄｅｏｘｏ−ｆｌｕｏｒ試薬でフッ素化すると、選択的にトランスのフッ化アリール９が得られ、塩酸でＢｏｃ基を脱保護すると、ピペリジンが塩酸塩として得られる。塩基性条件下で簡単な抽出を行うと、ピペリジン１０が遊離塩基として得られる。穏和な塩基性条件下でピペリジン１０とラクタム５とを慎重に反応させると、（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−イル）−１−（４−メチルベンジル）ピロリジン−２−オン、すなわち実施例１の表題化合物が得られる。
スキーム１．（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−イル）−１−（４−メチルベンジル）ピロリジン−２−オンの合成。
【化３】
0006629738.tif 000004
【００１２】
実施例１の化合物は、当該技術分野で既知の方法を用いて、様々なプロドラッグに変換することができる。それ故、スキーム２に従って、フェノールを、ＰＯＣｌ３、ピリジン、およびＤＭＡＰで処理し、続いて水性加水分解を行うと、実施例２、すなわち実施例１の二水素ホスフェートエステルが得られる。
スキーム２．実施例２、すなわち実施例１の化合物のホスホン酸プロドラッグの合成。
【化４】
0006629738.tif 000005
【００１３】
同様に、実施例１の化合物とＢｏｃ−保護したアミノ酸とを、当該技術分野で既知の様々な方法を用いて、しかし好ましくは、ジシクロヘキシルカルボジイミドと４−ジメチルアミノピリジンを用いて反応させると、エステル１１が得られる。酸、好ましくはＨＣｌ中でＢｏｃ基を開裂させると、実施例３および４の化合物を含むエステルが得られる。
スキーム３．アミノ酸プロドラッグの合成
【化５】
0006629738.tif 000006
【００１４】
同様の方法で、Ｂｏｃ−保護したアスパラギン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１２）を、脱保護した側鎖を介して、実施例１の化合物とカップリングさせると、エステル１３を得ることができる。ここでもＨＣｌで脱保護すると、実施例５の化合物が得られる。
スキーム４．側鎖カルボン酸を介して結合したアスパラギン酸プロドラッグの合成
【化６】
0006629738.tif 000007
【００１５】
具体的な態様の説明
スキーム中で用いられる略語は概して当該技術分野で用いられる慣習に従う。明細書および実施例中で用いられる化学略語は以下のように定義される：「ＮａＨＭＤＳ」はナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドであり；「ＤＭＦ」はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドであり；「ＭｅＯＨ」はメタノールであり；「ＮＢＳ」はＮ−ブロモスクシンイミドであり；「Ａｒ」はアリールであり；「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸であり；「ＬＡＨ」は水素化アルミニウムリチウムであり；「ＢＯＣ」はｔ−ブトキシカルボニルであり；「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドであり；「ｈ」は時間であり；「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルであり；「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランであり；「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸であり；「Ｅｔ２Ｏ」はジエチルエーテルであり；「ＤＭＡＰ」は４−ジメチルアミノピリジンであり；「ＤＣＥ」は１，２−ジクロロエタンであり；「ＡＣＮ」はアセトニトリルであり；「ＤＭＥ」は１，２−ジメトキシエタンであり；「ＨＯＢｔ」は１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物であり；「ＤＩＥＡ」はジイソプロピルエチルアミンであり；「Ｎｆ」はＣＦ３（ＣＦ２）３ＳＯ２−であり；「ＴＭＯＦ」はオルトギ酸トリメチルである。
【００１６】
本明細書で用いられる略語は以下のように定義される：「１×」は１回であり、「２×」は２回であり、「３×」は３回であり、「℃」はセ氏温度であり、「ｅｑ」は当量であり、「ｇ」はグラムであり、「ｍｇ」はミリグラムであり、「Ｌ」はリットルであり、「ｍＬ」はミリリットルであり、「μＬ」はマイクロリットルであり、「Ｎ」は規定であり、「Ｍ」はモル濃度であり、「ｍｍｏｌ」はミリモルであり、「ｍｉｎ」は分であり、「ｈ」は時間であり、「ｒｔ」は室温であり、「ＲＴ」は保持時間であり、「ａｔｍ」は雰囲気であり、「ｐｓｉ」はポンド／平方インチであり、「ｃｏｎｃ．」は濃縮であり、「ｓａｔ」または「ｓａｔｄ．」は飽和であり、「ＭＷ」は分子量であり、「ｍｐ」は融点であり、「ｅｅ」はエナンチオマー過剰率であり、「ＭＳ」または「Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ」は質量分析であり、「ＥＳＩ」はエレクトロスプレーイオン化質量分析であり、「ＨＲ」は高分解能であり、「ＨＲＭＳ」は高分解能質量分析であり、「ＬＣＭＳ」は液体クロマトグラフィー質量分析であり、「ＨＰＬＣ」は高圧液体クロマトグラフィーであり、「ＤＣＭ」はジクロロメタンであり、「ＲＰ  ＨＰＬＣ」は逆相ＨＰＬＣであり、「ＴＬＣ」または「ｔｌｃ」は薄層クロマトグラフィーであり、「ＳＦＣ」は超臨界流体クロマトグラフィーであり、「ＮＭＲ」は核磁気共鳴分光学であり、「１Ｈ」はプロトンであり、「  」はデルタであり、「ｓ」はシングレットであり、「ｄ」はダブレットであり、「ｔ」はトリプレットであり、「ｑ」はカルテットであり、「ｍ」はマルチプレットであり、「ｂｒ」はブロードであり、「Ｈｚ」はヘルツであり、並びに「Ｒ」、「Ｓ」、「Ｅ」および「Ｚ」は当業者によく知られている立体化学表記である。
【００１７】
ＬＣ／ＭＳデータは、以下の条件を用いて取得した：
【００１８】
条件Ａ：Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｃ１８  ５０×２．１ｍｍ，２．７μｍ  ｃｏｌｕｍｎで、１．７分間かけて０〜１００％Ｂのグラジエント、続いて１．３分間１００％Ｂを流速１ｍＬ／分で用いた。溶媒Ａ：１０ｍＭ  ＮＨ４ＣＯＯＨ／水：アセトニトリル（９８：２）；溶媒Ｂ＝１０ｍＭ  ＮＨ４ＣＯＯＨ／水：アセトニトリル（２：９８）。
【００１９】
条件Ｂ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ１８  ２．０×５０ｍｍ，５μｍ  ｃｏｌｕｍｎで、４分間かけて０〜１００％Ｂのグラジエントを流速０．８ｍＬ／分で用いた。溶媒Ａ＝１０％ＭｅＯＨ／９０％水／０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝９０％ＭｅＯＨ／１０％水／０．１％ＴＦＡ。
【実施例】
【００２０】
中間体の合成
中間体Ａ．ｔｅｒｔ−ブチル  ４−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）−５，６−ジヒドロピリジン−１（２Ｈ）−カルボキシレート
【化７】
0006629738.tif 000008
市販の１−（ベンジルオキシ）−４−ブロモベンゼン（１０４ｇ，３９５ｍｍｏｌ）、および市販のｔｅｒｔ−ブチル  ４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−５，６−ジヒドロピリジン−１（２Ｈ）−カルボキシレート（１４７ｇ，４７４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１１００ｍＬ）溶液を窒素で２分間パージした。水（１１００ｍＬ）、続いて炭酸ナトリウム（１２６ｇ，１１８６ｍｍｏｌ）、およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（２７．４ｇ，２３．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を窒素で５分間パージし、次いで９０℃まで加熱し、１６時間撹拌した。反応混合物を室温まで降温させ、１Ｌの酢酸エチルで希釈した。層を分離し、水層を２５０ｍＬの酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を集め、２００ｍＬのブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で蒸発させ、黄色がかった白色固体を得た。生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、６％酢酸エチル／石油エーテルを用いて溶出し、１２９ｇ（８８％）の所望の生成物を得た。ＬＣ／ＭＳ  ＲＴ（条件Ａ）＝２．７３２分、（Ｍ−Ｈ）＋＝３６４．０。1H NMR (300MHz, chloroform-d) δ 7.49 - 7.30 (m, 5H), 7.27 (d, J=10.7 Hz, 2H), 6.99 - 6.87 (m, 2H), 6.03 - 5.87 (m, 1H), 5.07 (s, 2H), 4.05 (d, J=2.6 Hz, 2H), 3.62 (t, J=5.7 Hz, 2H), 2.49 (br. s., 2H), 1.49 (s, 9H)。
【００２１】
中間体Ｂ．（±）−ｒｅｌ−（３Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ４−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）−３−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキシレート
【化８】
0006629738.tif 000009
水素化ホウ素ナトリウム（１５．５ｇ，４１０ｍｍｏｌ）をＴＨＦに溶解し、溶液を０℃まで冷却した。三フッ化ホウ素エーテラート（５２．３ｍＬ，４２４ｍｍｏｌ）を溶液に加え、混合物を室温まで昇温させ、３０分間撹拌した。次いで、ｔｅｒｔ−ブチル  ４−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）−５，６−ジヒドロピリジン−１（２Ｈ）−カルボキシレート（５０ｇ，１３７ｍｍｏｌ，中間体Ａ）のＴＨＦ（５００ｍＬ）溶液を加え、反応混合物を室温で２時間撹拌した。次いで１００ｍＬの水を混合物にゆっくりと加えた（注意：泡立ちが観察された）。混合物を１００ｍＬのエタノールおよび水酸化ナトリウム（２２８ｍＬ，１０％水溶液，０．６８４ｍｏｌ）で希釈し、過酸化水素（２０．５ｍＬ，０．６８４ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を還流温度まで加熱し、１６時間撹拌した。混合物を１０℃まで冷却し、１ＬのＤＣＭで希釈した。次いで１．５Ｌの１．５Ｎ  ＨＣｌでｐＨを７に調整した。次いで層を分離し、水層を５００ｍＬのＤＣＭでさらに２回抽出した。有機層を集め、２×１Ｌの水および２００ｍＬのブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で蒸発させ、黄色がかった白色固体を得た。固体を、５００ｍＬの石油エーテルを用いて粉末にし、ろ過により単離し、４６．５グラム（８８％，ＨＰＬＣによると純度９９．０％）の生成物を得た。ＬＣ／ＭＳ  ＲＴ（条件Ａ）＝２．３７２分、（Ｍ＋Ｈ）＋＝３８２．０。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.47 - 7.42 (m, 2H), 7.42 - 7.36 (m, 2H), 7.36 - 7.28 (m, 1H), 7.14 (d, J=9.0 Hz, 2H), 6.92 (d, J=9.0 Hz, 2H), 5.07 (s, 2H), 4.74 (d, J=5.5 Hz, 1H), 4.10 (br. s., 1H), 3.94 (br. s., 1H), 3.46 - 3.35 (m, 1H), 2.47 - 2.31 (m, 2H), 1.70 - 1.61 (m, 1H), 1.55 - 1.45 (m, 2H), 1.42 (s, 9H)。
【００２２】
中間体Ｃ．（３Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ４−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）−３−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキシレート
【化９】
0006629738.tif 000010
ラセミのｒｅｌ−（３Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ４−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）−３−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキシレート（１１２ｇ，中間体Ｂ）を、分取超臨界流体クロマトグラフィーを用いて以下の条件下で個々のエナンチオマーに分離した：Ｔｈａｒ  ＳＦＣ−２５０機器をＬｕｘ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−２（２５０×２１ｍｍ），５μｍ  ｃｏｌｕｍｎと共に用い、６０％ＣＯ２および４０％の０．３％ジエチルアミン／メタノール溶液を流速１００．０ｇ／分で用いて溶出した。サンプルは７４ｍｇ／ｍＬで注入した。分析ＳＦＣをＬｕｘ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−２（２５０×４．６ｍｍ），５μｍ  ｃｏｌｕｍｎ上で実施し、５５％ＣＯ２および４５％の０．３％ジエチルアミン／メタノール溶液を流速３．０ｇ／分で用いて溶出した。回収されたものは、保持時間が２．４９分であるピーク１（５０．０ｇ）であり、所望の（３Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ４−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）−３−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキシレートに相当する。解析データはラセミ体のものと一致した。
【００２３】
中間体Ｄ．（３Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ３−ヒドロキシ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−カルボキシレート
【化１０】
0006629738.tif 000011
（３Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ４−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）−３−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキシレート（２６ｇ，６７．８ｍｍｏｌ，中間体Ｃ）のメタノール（２６０ｍＬ）溶液を、耐圧瓶内にて、１．６グラムの１０％パラジウム炭素（１３．６ｍｍｏｌ）で処理した。５０ｐｓｉの水素を導入し、反応混合物を１６時間撹拌した。混合物をセライトに通してろ過し、濃縮し、粗生成物を得ると（１８．９ｇ，６４．４ｍｍｏｌ）、さらなる精製をせずに進めるのに十分な純度があった。ＬＣ／ＭＳ  ＲＴ（条件Ｂ）＝２．９７０分、（ｔ−ブチルが失われたＭ＋Ｈ）＋＝２３８．０。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9.10 (br. s., 1H), 7.01 (d, J=8.5 Hz, 2H), 6.65 (s, 2H), 4.70 (d, J=5.0 Hz, 1H), 4.09 (br. s., 1H), 3.93 (br. s., 1H), 3.17 (s, 2H), 2.79 - 2.63 (m, 1H), 2.34 (br. s., 1H), 1.68 - 1.57 (m, 1H), 1.44 (br. s., 1H), 1.42 (s, 9H)。
【００２４】
中間体Ｅ．（３Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−カルボキシレート
【化１１】
0006629738.tif 000012
（３Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ３−ヒドロキシ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−カルボキシレート（１５．５ｇ，６１．４ｍｍｏｌ，中間体Ｄ）のアセトニトリル（２７０ｍＬ）溶液を０℃まで冷却した。溶液に、撹拌しながら、ビス（２−メトキシエチル）アミノサルファートリフルオライドの５０％トルエン溶液（Ｄｅｏｘｏ−ｆｌｕｏｒ，５８．４ｍＬ，１５９ｍｍｏｌ）を滴下ロートにより６５分間かけて滴下した。滴下した後、反応混合物を０℃で３０分間撹拌し、次いで室温にし、さらに２時間撹拌した。次いで飽和塩化アンモニウム溶液（１５０ｍＬ）を加え、混合物を１５０ｍＬのＤＣＭで２回抽出した。有機層を集め、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、粗生成物を得た。生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（１．５ｋｇのシリカ）により精製し、０〜１５％アセトン／ヘキサンのグラジエントを用いて溶出し、１１．９ｇ（７５％）の所望の（３Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−カルボキシレートを得た。ＬＣ／ＭＳ  ＲＴ（条件Ｂ）＝３．２９５分、（ｔ−ブチルが失われ、フッ素が脱離したＭ＋Ｈ）＋＝２２０．０。1H NMR (400MHz, chloroform-d) δ 7.15 (d, J=8.6 Hz, 2H), 6.83 (dt, J=8.6, 2.0 Hz, 2H), 4.59 - 4.48 (m, 1H), 4.47 - 4.37 (m, 1H), 4.23 - 4.12 (m, 1H), 2.88 - 2.68 (m, 3H), 1.96 - 1.84 (m, 1H), 1.80 - 1.66 (m, 1H), 1.51 (s, 9H)。
【００２５】
中間体Ｆ．４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロピペリジン−４−イル）フェノール
【化１２】
0006629738.tif 000013
（３Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−カルボキシレート（１２．０ｇ，４０．６ｍｍｏｌ，中間体Ｅ）の無水ジオキサン（８０ｍＬ）溶液を、ＨＣｌ（４Ｍ  １，４−ジオキサン溶液，４０．６ｍＬ，１６２ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を室温で６時間撹拌し、次いで真空下で蒸発させ、所望の生成物のＨＣｌ塩を得た。さらなる精製をせずに、ＨＣｌ塩をＣＨＣｌ３に懸濁し、８０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３溶液を加えた。有機層を分離し、水層をＣＨＣｌ３（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を集め、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、表題化合物を得た（７．１ｇ，３６．４ｍｍｏｌ，９０％）。ＬＣ／ＭＳ  ＲＴ（条件Ｂ）＝１．００８分、ＬＣ／ＭＳ  （Ｍ＋Ｈ）＋＝１９６．２。
【００２６】
中間体Ｇ．（Ｓ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−２−オン
【化１３】
0006629738.tif 000014
市販の（Ｓ）−３−ヒドロキシピロリジン−２−オン（５ｇ，４９．５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１９８ｍｌ）溶液を、撹拌しながら、ＤＭＡＰ（０．１９９ｇ，１．６３２ｍｍｏｌ）、イミダゾール（６．７３ｇ，９９ｍｍｏｌ）、およびＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（８．９４ｇ，５９．３ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、次いで飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄した。有機層を濃縮し、クルードな反応生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、５０％酢酸エチル／石油エーテルを用いて溶出した。白色固体として所望の生成物を単離した（８．１ｇ，７６％）。ＬＣ／ＭＳ  （Ｍ＋Ｈ）＋＝２１６．２。1H NMR (400MHz, chloroform-d) δ 6.40 (br. s., 1H), 4.26 (t, J=7.8 Hz, 1H), 3.42 - 3.34 (m, 1H), 3.29 - 3.21 (m, 1H), 2.36 (dtd, J=12.7, 7.3, 3.3 Hz, 1H), 2.07 - 1.96 (m, 1H), 0.91 (s, 9H), 0.15 (d, J=7.0 Hz, 6H)。
【００２７】
中間体Ｈ．（Ｓ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−１−（４−メチルベンジル）ピロリジン−２−オン
【化１４】
0006629738.tif 000015
（Ｓ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−２−オン（５ｇ，２３．２２ｍｍｏｌ，中間体Ｇ）を無水ＴＨＦ（４６．４ｍｌ）に溶解し、反応混合物を窒素雰囲気下にて０℃まで冷却した。次いで水素化ナトリウム（１．３９３ｇ，３４．８ｍｍｏｌ）を一度に加え、反応混合物を５分間撹拌した後、１−（ブロモメチル）−４−メチルベンゼン（５．３７ｇ，２９．０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（４６．４ｍｌ）溶液を滴下した。反応液を０℃で５分間撹拌し、次いで冷却槽を取り外し、混合物を室温まで一晩昇温させた。反応を水（１００ｍＬ）で慎重にクエンチし、次いで酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。次いで集めた有機層をブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥した（ＭｇＳＯ４）。溶媒を真空下で留去し、粗生成物を得て（９．６ｇ，油状物）、次いでシリカゲルクロマトグラフィー（３３０ｇのシリカ）により精製し、０％〜２０％酢酸エチル／ヘキサンのグラジエントを用いて溶出し、６．５３ｇ（８８％）の所望の生成物を得た。ＬＣ／ＭＳ（条件Ｂ）、ＲＴ＝４．３２０分、（Ｍ＋Ｈ）＋＝３２０．３。1H NMR (400MHz, chloroform-d) δ 7.15 (s, 4H), 4.42 (s, 2H), 4.37 (t, J=7.6 Hz, 1H), 3.32 - 3.18 (m, 1H), 3.10 (dt, J=9.7, 7.5 Hz, 1H), 2.36 (s, 3H), 2.29 (dtd, J=12.6, 7.6, 3.1 Hz, 1H), 1.97 - 1.84 (m, 1H), 0.95 (s, 9H), 0.20 (d, J=10.3 Hz, 6H)。
【００２８】
中間体Ｉ．（Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−（４−メチルベンジル）ピロリジン−２−オン
【化１５】
0006629738.tif 000016
ＨＣｌ（４Ｍ  １，４−ジオキサン溶液，２５．５ｍＬ，１０２ｍｍｏｌ）を、室温で一度に、（Ｓ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−１−（４−メチルベンジル）ピロリジン−２−オン（６．５３ｇ，２０．４ｍｍｏｌ，中間体Ｈ）の無水ＤＣＭ（２０．４ｍＬ）溶液に加えた。わずかな発熱があった。反応混合物を室温で２時間撹拌し、次いで真空下で蒸発させた。残渣をＤＣＭ（１００ｍＬ）に入れ、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１００ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、次いで溶液をＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮し、残渣を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（１２０ｇのシリカ）により精製し、４０％〜１００％酢酸エチル／ヘキサンのグラジエントを用いて溶出し、３．７３ｇ（８９％）の所望の生成物を得た。ＬＣ／ＭＳ（条件Ｂ）、ＲＴ＝２．３３８分、（Ｍ＋Ｈ）＋＝２０６．２。1H NMR (400 MHz, chloroform-d) δ 7.26 - 7.02 (m, 4H), 4.43 (d, J=3.5 Hz, 2H), 4.41 - 4.37 (m, 1H), 3.66 (d, J=2.6 Hz, 1H), 3.34 - 3.05 (m, 2H), 2.41 (dddd, J=12.8, 8.4, 6.6, 2.2 Hz, 1H), 2.34 (s, 3H), 1.93 (dq, J=12.8, 8.8 Hz, 1H)。
【００２９】
中間体Ｊ．（Ｓ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル  メタンスルホネート
【化１６】
0006629738.tif 000017
トリエチルアミン（０．５０９ｍｌ，３．６５ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下にて０℃で、冷却した（Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−（４−メチルベンジル）ピロリジン−２−オン（０．５ｇ，２．４３６ｍｍｏｌ，中間体Ｉ）の無水ＤＣＭ（１２．１８ｍｌ）溶液に加えた。次いでメタンスルホニルクロライド（０．１９８ｍＬ，２．５６ｍｍｏｌ）を滴下し、反応液を０℃で１５分間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１０ｍＬ）でクエンチした。混合物を室温まで昇温させ、水層を分離し、ＤＣＭ（２×）で抽出した。集めた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下で蒸発させ、白色固体を得て（０．７３ｇ）、次いでシリカゲルクロマトグラフィー（４０ｇのシリカ）により精製し、０％〜５０％酢酸エチル／ヘキサンのグラジエントを用いて溶出し、白色固体として０．６３ｇ（９１％）の所望の生成物を得た。
【００３０】
中間体Ｋ．（Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−１−（４−（ジフルオロメチル）ベンジル）ピロリジン−２−オン
【化１７】
0006629738.tif 000018
６０％水素化ナトリウム／鉱油（２３２ｍｇ，５．３１ｍｍｏｌ）分散物を、０℃で、撹拌した（Ｓ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ピロリジン−２−オン（７６２ｍｇ，３．５４ｍｍｏｌ，中間体Ｇ）のＴＨＦ（７ｍＬ）溶液に加えた。１５分後、１−（ブロモメチル）−４−（ジフルオロメチル）ベンゼン（９８０ｍｇ，４．４３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（７ｍＬ）溶液を、反応混合物に加えた。得られた混合物を室温で６時間撹拌した。反応を数グラムの氷のペレットで慎重にクエンチした。得られた混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。集めた有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮した。クルードな反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０〜３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を用いて精製し、白色固体として所望の生成物を得た（４４０ｍｇ，３５％収率）：ＬＣＭＳ  （Ｍ＋Ｈ）＋  ３５６．３；1H NMR (500MHz, chloroform-d) δ 7.49 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.35 (d, J=7.9 Hz, 2H), 6.65 (br. t, J=1.0 Hz, 1H), 4.56 - 4.44 (m, 2H), 4.38 (t, J=7.5 Hz, 1H), 3.27 (ddd, J=9.7, 8.7, 3.4 Hz, 1H), 3.13 (dt, J=9.7, 7.4 Hz, 1H), 2.36 - 2.27 (m, 1H), 1.98 - 1.90 (m, 1H), 0.96 (br. s., 9H), 0.22 - 0.20 (m, 3H), 0.20 - 0.18 (m, 3H)。
【００３１】
中間体Ｌ．（Ｓ）−１−（４−（ジフルオロメチル）ベンジル）−３−ヒドロキシピロリジン−２−オン
【化１８】
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４Ｍ  ＨＣｌ／ジオキサン（０．６２ｍＬ，２．５ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で、撹拌した（Ｓ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−１−（４−（ジフルオロメチル）ベンジル）ピロリジン−２−オン（４４０ｍｇ，１．２４ｍｍｏｌ，中間体Ｋ）のジクロロメタン（１．２４ｍＬ）溶液に加えた。反応混合物を２時間撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮し、所望の生成物（３６８ｍｇ，定量的な収率）を得た：ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋  ２４２．１。
【００３２】
中間体Ｍ．（Ｓ）−１−（４−（ジフルオロメチル）ベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル  メタンスルホネート
【化１９】
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トリエチルアミン（０．３１９ｍＬ，２．２９ｍｍｏｌ）、およびメタンスルホニルクロライド（０．１３１ｍＬ，１．６８ｍｍｏｌ）を、０℃で、撹拌した（Ｓ）−１−（４−（ジフルオロメチル）ベンジル）−３−ヒドロキシピロリジン−２−オン（３６８ｍｇ，１．５３ｍｍｏｌ，中間体Ｌ）のジクロロメタン（７．６３ｍＬ）溶液に加えた。反応混合物を０℃で１時間撹拌した。得られた混合物を水で希釈し、水性混合物をジクロロメタンで抽出した。集めた有機層を１０％炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮した。クルードな物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０〜１００％ＥｔＯＡｃ）を用いて精製した。純粋なフラクションを集め、真空下で濃縮し、白色固体として所望の生成物を得た（３２２ｍｇ，６６％収率）：ＬＣ−ＭＳ  （Ｍ＋Ｈ）＋  ３２０．１；1H NMR (500MHz, chloroform-d) δ 7.53 (d, J=7.9 Hz, 2H), 7.38 - 7.33 (m, 2H), 6.67 (br. t, J=1.0 Hz, 1H), 5.27 (dd, J=8.2, 7.5 Hz, 1H), 4.60 - 4.49 (m, 2H), 3.41 - 3.35 (m, 1H), 3.33 (s, 3H), 3.27 (dt, J=9.9, 7.3 Hz, 1H), 2.64 - 2.55 (m, 1H), 2.27 (ddt, J=13.9, 8.9, 7.1 Hz, 1H)。
【００３３】
中間体Ｎ．ｔｅｒｔ−ブチル  ４−ヒドロキシ−４−（４−メトキシフェニル）ピペリジン−１−カルボキシレート
【化２０】
0006629738.tif 000021
市販のｔｅｒｔ−ブチル  ４−オキソピペリジン−１−カルボキシレート（２．０ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）、およびジエチルエーテル（３０ｍｌ）の混合物を０℃まで冷却した。この混合物に、４−メトキシフェニル）マグネシウム  ブロマイド（０．５Ｍ  ジエチルエーテル溶液，３０ｍＬ，１５ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。滴下が完了した後、反応混合物を室温まで昇温させ、２時間撹拌した。次いで反応混合物を１５０ｍｌの氷冷した水でゆっくりとクエンチし、次いで得られた混合物を３×１５０ｍｌのＤＣＭで抽出した。有機層を集め、乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３０：７０  酢酸エチル：ヘキサン）により精製し、所望の生成物を得た（３．０ｇ，１００％収率）：ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ−ＡＰＩ）：ｍ／ｚ  ３０５．５（Ｍ−Ｈ）＋；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.37 (q, J=1.0 Hz, 2H), 6.86 (q, J=1.0 Hz, 2H), 4.94 (s, 1H), 3.82 (d, J=11.5 Hz, 2H), 3.73 (s, 3H), 3.13 (br. s, 2H), 1.75 (td, J=12.9, 4.8 Hz, 2H), 1.56 (d, J=12.3 Hz, 2H), 1.41 (s, 9H)。
【００３４】
中間体Ｏ．４−（４−メトキシフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン  塩酸塩
【化２１】
0006629738.tif 000022
ｔｅｒｔ−ブチル  ４−ヒドロキシ−４−（４−メトキシフェニル）ピペリジン−１−カルボキシレート（７００ｍｇ，２．２７ｍｍｏｌ，中間体Ｎ）、およびＨＣｌ／ジオキサン（４．０ｍＬ，１６ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３時間撹拌した。クルードな塊を真空下で濃縮し、固体残渣を３×１０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、非極性不純物を除去した。微細な固体として所望の塩を集めた（４８０ｍｇ，９３％）。ＬＣＭＳ（ＥＳ−ＡＰＩ）  ｍ／ｚ  １９０．２（Ｍ＋Ｈ）＋；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.37 (d, J=9.0 Hz, 2H), 6.98 (d, J=9.0 Hz, 2H), 6.08 - 5.98 (m, 1H), 5.11 (s, 1H), 3.97 (br. s., 1H), 3.52 (s, 1H), 3.32 (s, 3H), 2.47 - 2.37 (m, 1H)。
【００３５】
中間体Ｐ．
４−（４−メトキシフェニル）ピペリジン  塩酸塩
【化２２】
0006629738.tif 000023
４−（４−メトキシフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン，ＨＣｌ（３．００ｇ，１３．３ｍｍｏｌ，中間体Ｏ）のメタノール（２０ｍＬ）溶液に、撹拌しながら、１０％パラジウム炭素（１．４ｇ）を加え、反応混合物を２０ｐｓｉの水素下にて１２時間撹拌した。反応混合物をセライトパッドに通してろ過し、酢酸エチルで洗浄し、集めた有機画分を濃縮し、白色固体を得た（２．０ｇ，７０％収率）：ＬＣＭＳ（ＥＳ−ＡＰＩ）、ｍ／ｚ  １９２．１（Ｍ＋Ｈ）＋；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.13 - 8.36 (m, 2H), 7.14 (d, J=8.7 Hz, 2H), 6.90 (d, J=8.7 Hz, 2H), 3.73 (s, 3H), 3.07 - 2.87 (m, 4H), 2.87 - 2.65 (m, 4H)。
【００３６】
中間体Ｑ．２，４−ジブロモ−Ｎ−（４−フルオロベンジル）ブタンアミド
【化２３】
0006629738.tif 000024
ＴＥＡ（８．９１ｍＬ，６３．９ｍｍｏｌ）、および２，４−ジブロモブタノイル  クロライド（５．０７ｍＬ，３８．４ｍｍｏｌ）を、連続して０℃で、市販の（４−フルオロフェニル）メタンアミン（４．０ｇ，３２．０ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル（１５ｍＬ）溶液に加えた。反応混合物を室温まで昇温させ、さらに２４時間撹拌した。反応混合物をろ過した。固体をジエチルエーテルで洗浄した。ろ液を真空下で濃縮し、２，４−ジブロモ−Ｎ−（４−フルオロベンジル）ブタンアミドを含むクルードな混合物を得た（８．０ｇ，７１％収率）：ＬＣＭＳ（ＥＳ−ＡＰＩ）、ｍ／ｚ  ３５４、３５６（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００３７】
中間体Ｒ．３−ブロモ−１−（４−フルオロベンジル）ピロリジン−２−オン
【化２４】
0006629738.tif 000025
６０％ＮａＨ／鉱油（１．７０ｇ，４２．５ｍｍｏｌ）分散物を、０℃で、撹拌した２，４−ジブロモ−Ｎ−（４−フルオロベンジル）ブタンアミド（１０．０ｇ，２８．３ｍｍｏｌ，中間体Ｑ）のＴＨＦ（２５ｍＬ）溶液に加えた。反応混合物を室温まで昇温させ、さらに２時間撹拌した。反応混合物を氷で慎重にクエンチし、水で希釈した。得られた混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。集めた有機層を水、次いでブライン溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムでし、ろ過し、真空下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を用いて精製し、所望の生成物を得た（５．９０ｇ，６４％収率）：ＬＣＭＳ（ＥＳ−ＡＰＩ）、ｍ／ｚ  ２７２．４、２７４．３（Ｍ＋Ｈ）＋；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.12 - 2.27 (m, 1 H) 2.56 - 2.68 (m, 1 H) 3.27 (dd, J=7.78, 3.26 Hz, 2 H) 4.29 - 4.38 (m, 1 H) 4.40 - 4.57 (m, 1 H) 4.73 (dd, J=7.03, 3.01 Hz, 1 H) 7.04 - 7.35 (m, 4 H)。
【００３８】
中間体Ｓ．１−（４−フルオロベンジル）−３−（４−（４−メトキシフェニル）ピペリジン−１−イル）ピロリジン−２−オン
【化２５】
0006629738.tif 000026
ＴＥＡ（０．７６８ｍＬ，５．５１ｍｍｏｌ）を、撹拌した３−ブロモ−１−（４−フルオロベンジル）ピロリジン−２−オン（０．３ｇ，１．１０ｍｍｏｌ，中間体Ｒ）、および４−（４−メトキシフェニル）ピペリジン  塩酸塩（０．２７６ｇ，１．２１３ｍｍｏｌ，中間体Ｐ）のアセトニトリル（１０ｍＬ）溶液に加えた。反応混合物を密封し、化学用電子レンジ（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｍｉｃｒｏｗａｖｅ）内にて１００℃で１時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、真空下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃで希釈した。有機混合物を水およびブライン溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮し、１−（４−フルオロベンジル）−３−（４−（４−メトキシフェニル）ピペリジン−１−イル）ピロリジン−２−オンを含むクルードな混合物を得た（０．３５ｇ，８３％収率）：ＬＣＭＳ（ＥＳ−ＡＰＩ）、ｍ／ｚ  ３８３．２  （Ｍ＋Ｈ）＋。
【００３９】
実施例１．（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−イル）−１−（４−メチルベンジル）ピロリジン−２−オン
【化２６】
0006629738.tif 000027
４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロピペリジン−４−イル）フェノール（７．１０ｇ，３６．４ｍｍｏｌ，中間体Ｆ）およびＤＩＥＡ（１６ｍＬ，９２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１００ｍＬ）溶液を８０℃まで加熱した。この溶液を、（Ｓ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル  メタンスルホネート（１０．５ｇ，３７．０ｍｍｏｌ，中間体Ｊ）のアセトニトリル（８０ｍＬ）溶液を、４時間かけて滴下して処理した。滴下が完了した後、反応混合物を８０℃で１６時間撹拌した。次いで反応混合物を室温まで降温させ、体積を回転蒸発により８０ｍＬに減少させた。次いで飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（１００ｍＬ）を加え、層を分離した。水層をＤＣＭ（２×１００ｍＬ）で抽出し、有機層を集め、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（７５０ｇのシリカゲル）により精製し、０％〜２０％溶媒Ｂ／溶媒Ａのグラジエントを用いて溶出した（ここに、溶媒Ｂ＝２０％メタノール／ＤＣＭ、溶媒Ａ＝ＤＣＭである）。生成物を含むフラクションを集めた。溶媒を留去し、９．３グラムの所望の生成物を得て、ＬＣ／ＭＳ分析（条件Ｂ）によると純度は９７％であった。このようにして得られた生成物（８．５ｇ）をアセトン：ヘキサン（１：５，２００ｍＬ）中でスラリーにし、固体生成物をろ過により単離し、風乾した。慎重なＳＦＣ分析により、不純物が生成物中に２．１％存在することが示された。Ｃｅｌｌ４  ０．４６×２５ｃｍ  ５μｍ  ｃｏｌｕｍｎを用いて、４５％メタノール／ＣＯ２を３ｍＬ／分で用いて溶出すると、所望の生成物は３．８００分に溶出し、望ましくない不純物は４．８４８分に溶出した。次いで生成物をさらに、Ｃｅｌｌ４  ３×２５ｃｍ  ５μｍ  ｃｏｌｕｍｎを用いて、１．５ｍＬの８０ｍｇ／ｍＬ溶液を１５０ｍＬ／分で注入して、ＳＦＣクロマトグラフィーにより精製した。活性のあるフラクションを濃縮して、白色粉末として７．８２グラム（２０．４ｍｍｏｌ，５６％）、純度＞９９．７％の実施例１を得た。ＬＣ／ＭＳ（条件Ｂ）、ＲＴ＝２．５１２分、（Ｍ＋Ｈ）＋＝３８３．３。19F NMR δ -182.83。1H NMR (400MHz, chloroform-d) δ 7.20 - 7.08 (m, 6H), 6.98 - 6.78 (m, 2H), 5.68 (s, 1H), 4.77 - 4.54 (m, 1H), 4.53 - 4.34 (m, 2H), 3.68 (t, J=8.8 Hz, 1H), 3.41 - 3.29 (m, 1H), 3.28 - 3.09 (m, 2H), 2.82 (d, J=10.8 Hz, 1H), 2.74 - 2.54 (m, 2H), 2.47 (td, J=9.9, 3.6 Hz, 1H), 2.34 (s, 3H), 2.19 - 1.94 (m, 2H), 1.92 - 1.80 (m, 2H)。13C NMR (101MHz, chloroform-d) δ 172.4, 154.9, 137.5, 133.3, 133.0, 129.5, 128.7, 128.3, 115.5, 92.6, 90.8, 65.0, 54.4, 54.2, 48.7, 48.0, 47.8, 46.8, 43.7, 31.7, 31.6, 21.1, 19.6。
【００４０】
実施例２．４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  二水素ホスフェート．
【化２７】
0006629738.tif 000028
（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−イル）−１−（４−メチルベンジル）ピロリジン−２−オン（１００ｍｇ，０．２６１ｍｍｏｌ，実施例１）のジクロロメタン（１０ｍＬ）懸濁液に、ピリジン（０．１０６ｍＬ，１．３１ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１６０ｍｇ，１．３１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を−２０℃まで冷却した。冷却した溶液にＰＯＣｌ３（０．１２２ｍＬ，１．３１ｍｍｏｌ）を滴下し、次いで反応混合物を室温まで昇温させ、１時間撹拌した。水（１０ｍＬ）を加え、混合物を１．５時間撹拌した。次いで層を分離し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発乾固した。粗生成物をＳｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ８（３００×１７ｍｍ）７ｍＭ  ｃｏｌｕｍｎ上でＨＰＬＣにより精製し、２０％Ｂ〜５０％Ｂのグラジエントを用いて１５ｍＬ／分で７分間かけて溶出した（ここに、溶媒Ａ＝１０ｍＭ  酢酸アンモニウム／水（ｐＨ４．５）、溶媒Ｂ＝アセトニトリルである）。生成物のＲＴ＝２．２分。適切なフラクションから白色固体として所望の生成物（５．８ｍｇ，４．７％）を凍結乾燥により単離した。ＬＣＭＳ（条件Ａ）  ＲＴ＝１．７２０分、（Ｍ＋Ｈ）＋＝４６３．２。1H NMR (400MHz, methanol-d4) δ 7.29 - 7.16 (m, 8H), 4.74 (br. s., 1H), 4.61 - 4.34 (m, 2H), 4.01 (t, J=8.3 Hz, 1H), 3.82 - 3.62 (m, 1H), 3.35 (m, 2H), 3.05 (br. s., 2H), 2.79 (br. s., 2H), 2.34 (s, 4H), 2.18 (br. s., 1H), 2.02 - 1.87 (m, 1H), 1.83 (br. s., 1H)。19F NMR (376 MHz, methanol-d4) δ -185.143。31P NMR (162 MHz, methanol-d4) δ -4.260。
【００４１】
実施例３．（Ｓ）−４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  ２−アミノ−３−メチルブタノエート  塩酸塩．
【化２８】
0006629738.tif 000029
ステップ３Ａ．（Ｓ）−４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  ２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノエート．
【化２９】
0006629738.tif 000030
（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−イル）−１−（４−メチルベンジル）ピロリジン−２−オン（０．０２ｇ，０．０５２ｍｍｏｌ，実施例１）のＤＣＭ（３ｍＬ）溶液に、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタン酸（０．０５９ｇ，０．２７２ｍｍｏｌ）、続いてＤＣＣ（０．０３２ｇ，０．１５７ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（６．３９ｍｇ，０．０５２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。次いで水（１０ｍＬ）を加え、層を分離した。水層をＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出し、有機層を集め、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物を分取ＴＬＣにより精製し、３５％酢酸エチル／石油エーテルを用いて溶出し、精製産物、すなわち（Ｓ）−４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  ２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノエートを得た（２７ｍｇ，７９％）。ＬＣ／ＭＳ（条件Ａ）  ＲＴ＝２．５２３分、（Ｍ＋Ｈ）＋＝５８２．２。1H NMR (400MHz, methanol-d4) δ 7.36 (d, J=8.5 Hz, 2H), 7.18 (s, 4H), 7.08 (d, J=8.5 Hz, 2H), 4.80 - 4.59 (m, J=10.0, 10.0, 5.0 Hz, 1H), 4.51 (d, J=15.0 Hz, 1H), 4.39 (d, J=15.0 Hz, 1H), 4.23 (dd, J=8.3, 6.3 Hz, 1H), 3.72 (t, J=8.8 Hz, 1H), 3.56 - 3.40 (m, 1H), 3.32 - 3.22 (m, 2H), 2.86 - 2.61 (m, 2H), 2.47 (td, J=10.0, 5.0 Hz, 1H), 2.34 (s, 3H), 2.32 - 2.23 (m, 1H), 2.22 - 2.01 (m, 2H), 1.88 (dd, J=9.5, 4.0 Hz, 2H), 1.74 (dt, J=13.4, 3.8 Hz, 1H), 1.50 (s, 9H), 1.42 - 1.30 (m, 1H), 1.09 (dd, J=10.0, 7.0 Hz, 6H)。19F NMR (376 MHz, methanol-d4) δ -184.32。
【００４２】
ステップ３Ｂ．（Ｓ）−４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  ２−アミノ−３−メチルブタノエート  塩酸塩．
【化３０】
0006629738.tif 000031
（Ｓ）−４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  ２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノエート（０．０２５ｇ，０．０４３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１．５ｍＬ）溶液に、−２０℃で、ＨＣｌ／ジエチルエーテル（２．５ｍｌ，２．５０ｍｍｏｌ，１．０Ｍ）を加えた。反応混合物を１０分間かけてゆっくりと室温まで昇温させ、次いで室温で１９時間撹拌した。次いで溶媒を真空下で留去し、淡黄色半固体を得た。次いで粗生成物を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより、Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８（２５０×２０ｍｍ）５μｍ  ｃｏｌｕｍｎ上で、１０％溶媒Ｂ〜７５％溶媒Ｂのグラジエントを１５ｍＬ／分で１２分間かけて用いて精製した（ここに、溶媒Ａ＝０．０５％ＨＣｌ／水、溶媒Ｂ＝アセトニトリルである）。活性のあるフラクションを凍結乾燥により濃縮し、黄色がかった白色固体として１０．２ｍｇ（４４％）の（Ｓ）−４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  ２−アミノ−３−メチルブタノエート  塩酸塩、すなわち実施例２の表題化合物を得た。ＬＣ−ＭＳ（方法Ａ）  ＲＴ＝２．２０分、（Ｍ＋Ｈ）＋＝４８２．２。1H NMR: (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.64 - 8.78 (m, 3 H) 7.38 - 7.46 (m, 2 H) 7.23 (d, J=8.53 Hz, 2 H) 7.18 (s, 4 H) 5.04 - 5.26 (m, 1 H) 4.42 (d, J=9.54 Hz, 3 H) 4.17 - 4.23 (m, 2 H) 3.29 - 3.40 (m, 4 H) 3.19 - 3.28 (m, 2 H) 2.30 (s, 6 H) 2.04 - 2.19 (m, 2 H) 1.11 (dd, J=12.55, 7.03 Hz, 6 H)。19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -183.904。
【００４３】
実施例４．（Ｓ）−４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  ２−アミノプロパノアート  塩酸塩
【化３１】
0006629738.tif 000032
ステップ４Ａ．（Ｓ）−４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  ２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパノアート
【化３２】
0006629738.tif 000033
（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−イル）−１−（４−メチルベンジル）ピロリジン−２−オン（０．０３ｇ，０．０７８ｍｍｏｌ，実施例１）のＤＣＭ（５ｍＬ）溶液に、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパン酸（０．０７７ｇ，０．４０８ｍｍｏｌ）、続いてＤＣＣ（０．０４９ｇ，０．２３５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（９．５８ｍｇ，０．０７８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。次いで水（１５ｍＬ）を加え、層を分離した。水層をＤＣＭ（３×１５ｍＬ）で抽出し、有機層を集め、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物を分取ＴＬＣにより精製し、２０％酢酸エチル／石油エーテルを用いて溶出し、黄色がかった白色半固体として精製産物、すなわち（Ｓ）−４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  ２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパノアートを得た（０．０３２ｇ，０．０５８ｍｍｏｌ，７４％収率）。ＬＣ−ＭＳ（方法Ａ）  ＲＴ＝２．４０分、（Ｍ＋Ｈ）＋＝５５４．２。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.51 (d, J=7.0 Hz, 1H), 7.44 - 7.32 (m, J=8.5 Hz, 2H), 7.21 - 7.09 (m, 4H), 7.07 - 6.98 (m, J=8.5 Hz, 2H), 4.62 (d, J=4.5 Hz, 1H), 4.39 (d, J=15.1 Hz, 1H), 4.30 (d, J=15.1 Hz, 1H), 4.27 - 4.17 (m, 1H), 3.58 (t, J=8.5 Hz, 1H), 3.50 - 3.40 (m, 1H), 3.22 - 3.07 (m, 2H), 2.81 - 2.64 (m, 3H), 2.39 - 2.31 (m, 1H), 2.29 (s, 3H), 2.17 - 2.04 (m, 1H), 1.93 (dd, J=12.8, 8.3 Hz, 1H), 1.78 (br. s., 1H), 1.74 - 1.59 (m, 1H), 1.41 (s, 9H), 1.39 (d, J=2.5 Hz, 3H)。19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -180.172。
【００４４】
ステップ４Ｂ．（Ｓ）−４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  ２−アミノプロパノアート  塩酸塩
【化３３】
0006629738.tif 000034
（Ｓ）−４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  ２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパノアート（０．０３２ｇ，０．０５８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）溶液に、−２０℃で、ＨＣｌ／ジエチルエーテル（２．０ｍｌ，２．０ｍｍｏｌ，１．０Ｍ）を加えた。反応混合物を１０分間かけてゆっくりと室温まで昇温させ、次いで室温で１９時間撹拌した。次いで溶媒を真空下で留去し、淡黄色半固体を得た。次いで粗生成物を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより、Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８（２５０×２０ｍｍ）５μｍ  ｃｏｌｕｍｎ上で、１０％溶媒Ｂ〜４０％溶媒Ｂのグラジエントを１５ｍＬ／分で７分間かけて用いて精製した（ここに、溶媒Ａ＝０．０５％ＨＣｌ／水、溶媒Ｂ＝アセトニトリルである）。活性のあるフラクションを凍結乾燥により濃縮し、黄色がかった白色固体として４．７ｍｇ（１６％）の（Ｓ）−４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  ２−アミノプロパノアート  塩酸塩、すなわち実施例４の表題化合物を得た。ＬＣ−ＭＳ（方法Ａ）  ＲＴ＝１．７６２分、（Ｍ＋Ｈ）＋＝４５４。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.41 (d, J=9.0 Hz, 2H), 7.24 - 7.10 (m, 6H), 5.10 - 4.85 (m, 1H), 4.45 - 4.22 (m, 4H), 4.04 - 3.94 (m, 1H), 3.34 - 3.18 (m, 4H), 3.06 (d, J=12.0 Hz, 2H), 2.43 - 2.31 (m, 1H), 2.27 (s, 3H), 2.24 - 2.14 (m, 1H), 2.13 - 2.01 (m, 1H), 2.01 - 1.85 (m, 1H), 1.58 (d, J=7.0 Hz, 3H)。19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -183.778。
【００４５】
実施例５．（Ｓ）−２−アミノ−４−（４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェノキシ）−４−オキソブタン酸  塩酸塩
【化３４】
0006629738.tif 000035
ステップ５Ａ．（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブチル  ４−（４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル）２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）スクシネート
【化３５】
0006629738.tif 000036
（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−イル）−１−（４−メチルベンジル）ピロリジン−２−オン（０．０３ｇ，０．０７８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５ｍＬ）溶液に、（Ｓ）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−オキソブタン酸（０．１１８ｇ，０．４０８ｍｍｏｌ）、続いてＤＣＣ（０．０４９ｇ，０．２３５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（９．５８ｍｇ，０．０７８ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で１８時間撹拌した。次いで水（１５ｍＬ）を加え、層を分離した。水層をＤＣＭ（３×１５ｍＬ）で抽出し、有機層を集め、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物を分取ＴＬＣにより精製し、２５％酢酸エチル／石油エーテルを用いて溶出し、黄色がかった白色半固体として精製産物を得た（３７ｍｇ，６８％）。ＬＣ−ＭＳ（方法Ａ）  ＲＴ＝２．５５分、（Ｍ＋Ｈ）＋＝６５４．４。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.46 - 7.34 (m, 2H), 7.20 - 6.98 (m, 6H), 4.82 - 4.53 (m, 1H), 4.43 - 4.24 (m, 2H), 4.11 (d, J=14.1 Hz, 1H), 3.58 (t, J=8.8 Hz, 1H), 3.48 - 3.39 (m, 1H), 3.22 - 3.07 (m, 3H), 3.02 (dd, J=16.1, 6.5 Hz, 1H), 2.87 (dd, J=15.8, 7.8 Hz, 1H), 2.78 - 2.63 (m, 2H), 2.38 - 2.31 (m, 1H), 2.29 (s, 3H), 2.17 - 2.03 (m, 1H), 1.98 - 1.86 (m, 1H), 1.78 (br. s., 1H), 1.74 - 1.58 (m, 1H), 1.42 (s, 9H), 1.39 (s, 9H)。19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -180.707。
【００４６】
ステップ５Ｂ．（Ｓ）−２−アミノ−４−（４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェノキシ）−４−オキソブタン酸  塩酸塩
【化３６】
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（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブチル  ４−（４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル）２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）スクシネート（０．０３２ｇ，０．０４９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）溶液に、−２０℃で、ＨＣｌ／ジエチルエーテル（２．０ｍｌ，２．０ｍｍｏｌ，１．０Ｍ）を加えた。反応混合物を１０分間かけてゆっくりと室温まで昇温させ、次いで室温で１９時間撹拌した。次いで溶媒を真空下で留去し、淡黄色半固体を得た。次いで粗生成物を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより、ＹＭＣ  Ｔｒｉａｒｔ  Ｃ１８（１５０×１９ｍｍ）５μｍ  ｃｏｌｕｍｎ上で、１０％溶媒Ｂ〜４０％溶媒Ｂのグラジエントを１５ｍＬ／分で７分間かけて用いて精製した（ここに、溶媒Ａ＝０．０５％ＨＣｌ／水、溶媒Ｂ＝アセトニトリルである）。活性のあるフラクションを凍結乾燥により濃縮し、黄色がかった白色固体として１７ｍｇ（５７％）の（Ｓ）−２−アミノ−４−（４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェノキシ）−４−オキソブタン酸  塩酸塩、すなわち実施例５の表題化合物を得た。ＬＣ−ＭＳ（方法Ａ）  ＲＴ＝１．８０８分、（Ｍ＋Ｈ）＋＝４９８．２  1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.36 (d, J=8.5 Hz, 2H), 7.21 - 7.03 (m, 8H), 6.75 (d, J=8.5 Hz, 1H), 4.95 - 4.72 (m, 1H), 4.42 - 4.24 (m, 3H), 4.10 (t, J=5.3 Hz, 1H), 4.07 - 4.01 (m, 1H), 3.93 - 3.84 (m, 1H), 3.83 - 3.68 (m, 1H), 3.33 - 3.10 (m, 5H), 3.04 (br. s., 1H), 2.93 (br. s., 1H), 2.89 - 2.71 (m, 2H), 2.26 (s, 3H), 1.96 (br. s., 1H), 1.82 (br. s., 1H)。19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -180.707。
【００４７】
実施例６．（Ｒ）−１−（４−（ジフルオロメチル）ベンジル）−３−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−イル）ピロリジン−２−オン
【化３７】
0006629738.tif 000038
（Ｓ）−１−（４−（ジフルオロメチル）ベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル  メタンスルホネート（５００ｍｇ，１．５７ｍｍｏｌ，中間体Ｍ）のアセトニトリル（５．０ｍＬ）溶液を、１．５時間かけて、撹拌し８５℃に保った４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロピペリジン−４−イル）フェノール，塩酸塩（３６３ｍｇ，１．５７ｍｍｏｌ，中間体Ｆ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．０９ｍＬ，６．２６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（５．０ｍＬ）溶液に滴下した。滴下が完了した後、反応混合物を８５℃で１６時間撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を用いて精製し、１−（４−（ジフルオロメチル）ベンジル）−３−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−イル）ピロリジン−２−オンのジアステレオマーの混合物（ラクタムの立体中心の部分的なエピマー化）を得た（２３５ｍｇ，３５％収率）。ジアステレオマー混合物のサンプル（７８０ｍｇ）を、分取キラルＳＦＣ（カラム＝Ｌｕｘ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−２（２１×２５０ｍｍ，５μｍ）；アイソクラティックな溶媒＝２０％メタノール（１５ｍＭ  アンモニアを含む）／８０％ＣＯ２；温度＝３５℃；流速＝６０ｍＬ／分；注入量＝１．０ｍＬ（〜２０ｍｇ／ｍＬのＭｅＯＨ溶液）で１３分間隔でスタック；λ＝２１０ｎＭ；ピーク１＝１９．６分，ピーク２＝２４．５分）により分離し、実施例６の表題化合物（ピーク１，３８９ｍｇ）、および（Ｓ）−１−（４−（ジフルオロメチル）ベンジル）−３−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−イル）ピロリジン−２−オン（ピーク２，２４２ｍｇ）を得た。実施例６のデータ：ＬＣ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ４１９．３（Ｍ＋Ｈ＋）；1H NMR (500MHz, chloroform-d) δ 7.50 (d, J=7.9 Hz, 2H), 7.34 (d, J=7.9 Hz, 2H), 7.15 (d, J=8.5 Hz, 2H), 6.91 - 6.80 (m, 2H), 6.65 (t, J=56.4 Hz, 1H), 4.96 (s, 1H), 4.77 - 4.43 (m, 3H), 3.68 (t, J=8.8 Hz, 1H), 3.42 - 3.33 (m, 1H), 3.29 - 3.14 (m, 2H), 2.85 (d, J=10.4 Hz, 1H), 2.78 - 2.69 (m, 1H), 2.69 - 2.57 (m, 1H), 2.48 (td, J=9.9, 4.9 Hz, 1H), 2.21 - 2.11 (m, 1H), 2.04 (dq, J=13.0, 8.6 Hz, 1H), 1.94 - 1.82 (m, 2H))。実施例１１４のＰ−１の相対および絶対配置は単結晶Ｘ線解析により確認した。
【００４８】
実施例７．４−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−１−（（Ｒ）−１−（４−メチルベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  二水素ホスフェート．
【化３８】
0006629738.tif 000039
（Ｒ）−１−（４−（ジフルオロメチル）ベンジル）−３−（（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−イル）ピロリジン−２−オン（１００ｍｇ，０．２３９ｍｍｏｌ，実施例６で得た）のジクロロメタン（１０ｍＬ）懸濁液に、−２０℃でトリエチルアミン（０．２３３ｍｌ，１．６７ｍｍｏｌ）を加えた。冷却した溶液に−２０℃でＰＯＣｌ３（０．１１１ｍｌ，１．２０ｍｍｏｌ）を加え、次いで反応混合物を−２０℃で２〜３時間撹拌した。水（１０ｍＬ）を加え、混合物を１．５時間撹拌した。混合物をジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮した。粗生成物を、ＬＵＮＡ  Ｃ８（２５０ｍｍ×１９ｍｍ  ＩＤ）５μｍ  ｃｏｌｕｍｎ上で逆相分取ＨＰＬＣにより精製し、溶媒Ａ＝１０ｍＭ  酢酸アンモニウム／水（ｐＨ４．５）および溶媒Ｂ＝アセトニトリルのグラジエントを用いて溶出した。適切なフラクションから凍結乾燥により白色固体として実施例７の表題化合物を単離した（２１ｍｇ，１８％）。ＬＣＭＳ  （Ｍ＋Ｈ）＋＝４９９．２；1H NMR (400MHz, methanol-d4) δ ppm 7.55 (d, J=8.03 Hz, 2 H) 7.41 (d, J=8.03 Hz, 2 H) 7.21 (s, 4 H) 6.62 - 6.92 (m, 1 H) 4.51 - 4.64 (m, 3 H) 3.76 (t, J=8.78 Hz, 1 H) 3.43 - 3.51 (m, 1 H) 3.36 (d, J=6.02 Hz, 1 H) 3.26 - 3.30 (m, 1 H) 2.81 (br. s., 1 H) 2.70 - 2.78 (m, 1 H) 2.59 - 2.69 (m, 1 H) 2.48 (td, J=9.91, 4.77 Hz, 1 H) 2.17 - 2.27 (m, 1 H) 2.06 - 2.15 (m, 1 H) 1.80 - 1.89 (m, 2 H)。
【００４９】
実施例８．（Ｒ）−１−（４−フルオロベンジル）−３−（４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−イル）ピロリジン−２−オン
【化３９】
0006629738.tif 000040
１−（４−フルオロベンジル）−３−（４−（４−メトキシフェニル）ピペリジン−１−イル）ピロリジン−２−オン（３ｇ，７．９ｍｍｏｌ，中間体Ｓ）の乾燥ジクロロメタン（１００ｍＬ）溶液に、Ｎ２雰囲気下にて−７８℃で、１Ｍ  三臭化ホウ素／ジクロロメタン（３９ｍＬ，３９ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を撹拌しながら３時間かけて室温まで昇温させた。反応を水（３０ｍＬ）でクエンチし、有機層を分離し、水およびブラインで洗浄し、濃縮した。粗生成物を、１５％ＥｔＯＡｃ／石油エーテルを用いてシリカゲル上でフラッシュ・クロマトグラフィーにより精製し、ラセミの１−（４−フルオロベンジル）−３−（４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−イル）ピロリジン−２−オンを得た（２．１ｇ、７３％収率）；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.49 - 1.74 (m, 4 H) 1.90 - 2.11 (m, 2 H) 2.24 - 2.42 (m, 2 H) 2.65 - 2.80 (m, 2 H) 2.99 - 3.23 (m, 3 H) 3.40 - 3.54 (m, 1 H) 4.27 - 4.46 (m, 2 H) 6.61 - 6.70 (m, 2 H) 6.95 - 7.04 (m, 2 H) 7.17 - 7.31 (m, 4 H) 9.10 - 9.16 (m, 1 H)。ＬＣＭＳ（ＥＳ−ＡＰＩ）  ３６９．２  ｍ／ｚ  （Ｍ＋Ｈ）＋。ラセミ体の一部（４０ｍｇ）をＣｈｉｒａｌｐａｋ−ＩＡ  ２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ  ｃｏｌｕｍｎ上でＳＦＣにより分離し、３５％溶媒Ｂを用いて溶出した（ここに、溶媒Ａ＝ＣＯ２、溶媒Ｂ＝０．３％ＤＥＡ／メタノール、全流速は３ｍＬ／分である）。ピーク１のＲＴは４．３５分（１１ｍｇ）を示し、ピーク２のＲＴは６．２９分（１３ｍｇ）を示した。実施例８のデータ（ピーク２）：ＬＣ／ＭＳ  （Ｍ＋Ｈ）＋＝３６９．２；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.47 - 1.59 (m, 1 H) 1.65 - 1.75 (m, 1 H) 1.84 - 1.96 (m, 1 H) 2.03 - 2.12 (m, 1 H) 2.24 - 2.43 (m, 1 H) 2.63 - 2.72 (m, 2 H) 2.72 - 2.85 (m, 2H) 2.96 - 3.05 (m, 2 H) 3.09 - 3.23 (m, 2 H) 3.41 - 3.54 (m, 1 H) 4.23 - 4.50 (m, 2 H) 6.58 - 6.71 (m, 2 H) 6.96 - 7.10 (m, 2 H) 7.15 - 7.21 (m, 2 H) 7.26 - 7.34 (m, 2 H) 9.06 - 9.19 (m, 1 H)。
【００５０】
実施例９．（Ｒ）−４−（１−（１−（４−フルオロベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  二水素ホスフェート
【化４０】
0006629738.tif 000041
オキシ塩化リン（１．２７ｍＬ，１３．６ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１０ｍＬ）を入れた丸底フラスコに加えた。溶液を、氷／メタノール浴を用いて０℃未満に冷却した。（Ｒ）−１−（４−フルオロベンジル）−３−（４−（４−ヒドロキシフェニル）ピペリジン−１−イル）ピロリジン−２−オン（１．００ｇ，２．７１ｍｍｏｌ，実施例８）のＴＨＦ（１８ｍＬ）懸濁液を加えた。５分後、５℃未満の浴温で、トリエチルアミン（０．９４６ｍＬ，６．７９ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。反応混合物を０℃で９０分間撹拌した。１Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液（８．６９ｍＬ，８．６９ｍｍｏｌ）を滴下した。ｐＨを測定すると〜０であった。混合物を室温まで昇温させ、３時間撹拌した。クルードな反応混合物を真空下にて＜３０℃で濃縮し、透明な溶液を得た。溶液を、１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ〜１に粉末にした（ｔｒｉｔｕｒａｔｅｄ）。混合物を氷浴中で冷却した。半固体を粉砕した。全ての液体をデカンテーションで除いた。半固体を９０％エタノールに懸濁し、次いで真空ろ過により回収した。生成物は、（Ｒ）−４−（１−（１−（４−フルオロベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  二水素ホスフェートのＨＣｌ塩であると推定された（５６０ｍｇ，４２％）。２５％ナトリウム・メトキシドのメタノール溶液（２５０ｍｇ，１．１６ｍｍｏｌ）を、（Ｒ）−４−（１−（１−（４−フルオロベンジル）−２−オキソピロリジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）フェニル  二水素ホスフェート，ＨＣｌ（５６０ｍｇ，１．１６ｍｍｏｌ）のメタノールスラリーに加えた。混合物を透明になるまで撹拌し、次いで真空下で濃縮した。残渣を９０％エタノール／水に溶解し、冷蔵庫内で冷却した。固体沈殿を、真空ろ過を用いて回収した。固体を高真空下で乾燥し、実施例９の表題化合物を得た（２３０ｍｇ，１９％収率）。：ＬＣ／ＭＳ  （Ｍ＋Ｈ）＋＝４４９．２；1H NMR (500MHz, methanol-d4) δ 7.35 - 7.25 (m, 2H), 7.21 - 7.11 (m, 4H), 7.11 - 7.03 (m, 2H), 4.55 - 4.35 (m, 2H), 3.61 (t, J=8.8 Hz, 1H), 3.30 - 3.20 (m, 2H), 3.19 - 3.11 (m, 1H), 2.92 - 2.84 (m, 1H), 2.75 (td, J=11.1, 3.5 Hz, 1H), 2.55 - 2.41 (m, 2H), 2.23 - 2.13 (m, 1H), 2.12 - 2.00 (m, 1H), 1.84 - 1.70 (m, 4H)。31P NMR (202 MHz, methanol-d4) δ ppm -3.38。
【００５１】
生物学的方法
放射性リガンド結合アッセイ
ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体への結合を測定するための結合実験は、３Ｈ  Ｒｏ  ２５−６９８１を用いて、８〜１０週齢の雄のスプラーグドーリーラット（Ｈａｒｌａｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の前脳について実施した（Mutel V; Buchy D; Klingelschmidt A; Messer J; Bleuel Z; Kemp JA; Richards JG . Journal of Neurochemistry, 1998, 70(5):2147-2155）。ラットを、麻酔なしで断頭台を用いて断頭し（動物倫理委員会により承認された）、膜を調製するため、摘出した脳を急速凍結し、−８０℃で３〜６ヶ月間保存した。
【００５２】
膜を調製するため、ラットの前脳を、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ＫＯＨでｐＨを７．４に調整した）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）から成るホモジナイズ緩衝液中で、氷上で２０分間融解した。融解した脳を、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いてホモジナイズし、４８０００×ｇで２０分間遠心分離した。ペレットを冷却した緩衝液に再懸濁し、再びＤｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いてホモジナイズした。続いて、ホモジネートを等分し、急速凍結し、−８０℃で３〜４ヶ月以内保存した。
【００５３】
競合結合アッセイを実施するため、融解した膜ホモジネートを９６ウェルプレートの各ウェルに加えた（２０μｇ／ウェル）。実験化合物を１００％ＤＭＳＯで段階希釈し、アッセイプレートの各列に加えて所望の化合物濃度にし、アッセイプレート中のＤＭＳＯ濃度は最終反応体積の１．３３％に保った。次に、３Ｈ  Ｒｏ  ２５−６９８１（４ｎＭ）をアッセイプレートに加えた。室温で１時間インキュベートした後、膜結合放射性リガンドをＧＦ／Ｂフィルタープレート（０．５％ＰＥＩを用いて室温で１時間処理した）上に採取した。フィルタープレートを５０℃で２０分間乾燥し、ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  ２０と１０分間インキュベートし、最後にカウントをＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。非特異的結合を、ＭＫ−０６５７（この化合物の調製はＷＯ  ２００４  １０８７０５の実施例１に記載されている）を用いて測定した（４０μＭ）。ＣＰＭ値を％阻害に変換し、特別注文ソフトウェアを用いて濃度反応曲線をプロットした。各実験は少なくとも２回繰り返して実験化合物の最終の結合Ｋｉ値を得た。このアッセイを用いると、実施例１の化合物は結合Ｋｉが４ｎＭを示し、実施例６の化合物は結合Ｋｉが４ｎＭを示し、実施例８の化合物は結合Ｋｉが１．４ｎＭを示した。
【００５４】
生体外占有率アッセイ
このアッセイにより、実施例１の化合物は、投与した後に、動物において脳常在性ＮＲ２Ｂサブタイプ受容体を占有することが実証される。７〜９週齢の雄のＣＤ−１マウスに、１０％ジメチルアセトアミド、４０％ＰＥＧ−４００、３０％ヒドロキシプロピルベータシクロデキストリン、および３０％実験化合物を含む水から成る媒体を静脈投与し、投与１５分後に断頭術により前脳を摘出した。脳サンプルを直ちに急速凍結し、−８０℃で保存した。翌日、投与した脳サンプルを氷上で１５〜２０分間解凍し、続いて、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ＫＯＨでｐＨを７．４に調整した）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）から成る冷却したホモジナイズ緩衝液中で、ポリトロンを用いて１０秒間ホモジナイズした。クルードなホモジネートを、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いてさらにホモジナイズし、全ての動物から採取してホモジナイズした膜の一部を急速冷凍し、その後使用するまで−８０℃で保存した。ホモジナイズの全過程は氷上で実施した。
【００５５】
占有率を測定するため、最初に膜ホモジネートを氷上で融解し、次いで２５ゲージ針を用いてニードルホモジナイズした。ホモジナイズした膜（６．４ｍｇ／ｍＬ）を９６ウェルプレートに加え、続いて３Ｈ  Ｒｏ  ２５−６９８１（６ｎＭ）を加えた。反応混合物を振とう機で４℃で５分間インキュベートし、次いでＧＦ／Ｂフィルタープレート（０．５％ＰＥＩを用いて室温で１時間処理した）上に採取した。フィルタープレートを５０℃で２０分間乾燥し、ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  ２０と１０分間インキュベートし、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。各投与群または化合物群は４〜５匹の動物で構成した。コントロール群の動物には媒体を単独で投与した。各動物から採取した膜を３つずつアッセイプレートに加えた。非特異的結合を、媒体を投与した動物から採取した膜ホモジネートを入れたウェルに加えた１０μＭのＲｏ  ２５−６９８１を用いて測定した。各動物への化合物の投与ごとに、以下の式を用いて比カウント（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｕｎｔ）／分を％占有率に変換した：％占有率（動物Ａ）＝１００−（（動物Ａの比ＣＰＭ）／（コントロール群の平均ＣＰＭ）×１００）。
【００５６】
この手順を用いると、実施例１の化合物は、３ｍｇ／Ｋｇで静脈投与した後に、ＮＲ２Ｂ受容体の占有率が９５％を示した。薬物濃度は質量分析により通常の方法で測定した。この投与量での血漿中の薬物濃度は１１０６ｎＭであり、ホモジナイズした脳組織中の薬物濃度は１９８４ｎＭであった。実施例６の化合物は、３ｍｇ／Ｋｇで静脈投与した後に、ＮＲ２Ｂ受容体の占有率が９７％を示した。この投与量での血漿中の薬物濃度は１８００ｎＭであり、ホモジナイズした脳組織中の薬物濃度は２２００ｎＭであった。実施例８の化合物は、３ｍｇ／Ｋｇで静脈投与した後に、ＮＲ２Ｂ受容体の占有率が９６％を示した。この投与量での血漿中の薬物濃度は５７０ｎＭであり、ホモジナイズした脳組織中の薬物濃度は９００ｎＭであった。
【００５７】
ｈＥＲＧ電気生理学アッセイ
実験化合物を、ｈＥＲＧチャネルを安定に発現しているＨＥＫ２９３細胞におけるｈＥＲＧ活性について、パッチクランプ技術を用いて評価した。カバースリップで覆ったｈＥＲＧ発現細胞を実験チャンバー内に置き、室温で、１４０  ＮａＣｌ、４  ＫＣｌ、１．８  ＣａＣｌ２、１  ＭｇＣｌ２、１０  グルコース、１０  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４，ＮａＯＨ）から成る溶液（単位はｍＭ）を浸み込ませた。ホウケイ酸塩パッチピペットの先端抵抗は、１３０  ＫＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、１  ＣａＣｌ２、１０  ＥＧＴＡ、１０  ＨＥＰＥＳ、５  ＡＴＰ−Ｋ２（ｐＨ７．２，ＫＯＨ）を含む内部溶液で満たした時、２〜４Ｍオームであった。細胞を、全細胞形態にて、ｐＣｌａｍｐ（Ａｘｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）ソフトウェアで制御したＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ（Ａｘｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）パッチクランプ増幅器を用いて、−８０ｍＶで固定した。ギガシール（ｇｉｇａｓｅａｌ）が形成したら、以下の電圧プロトコルを繰り返し（０．０５Ｈｚ）適用してテール電流を記録した：−８０ｍＶから＋２０ｍＶへの２秒間の脱分極ステップ、続いて−６５ｍＶ（３秒間）への過分極ステップでテール電流を発生させ、次いで保持電位に戻す。化合物は、テール電流が安定化した後に加えた。テール電流を、最初に細胞外溶液単独（コントロール）の存在下で、続いて化合物の濃度を増大させた細胞外溶液中で記録した。各化合物濃度は２〜５分間適用した。各濃度でのパーセント阻害を、コントロール溶液の存在下で記録したピークテール電流に対するピークテール電流の減少として算出した。データ解析を、特別注文ソフトウェアを用いて実施した。様々な濃度でのパーセント阻害をプロットして濃度反応曲線を得て、続いて４パラメータ方程式にフィッティングしてｈＥＲＧ  ＩＣ５０値を算出した。この手順を用いると、実施例１の化合物はｈＥＲＧチャネルの弱い阻害剤であり、ＩＣ５０＝２８μＭである。実施例６の化合物はｈＥＲＧチャネルの弱い阻害剤であり、ＩＣ５０＝１３．５μＭである。
【００５８】
マウス強制水泳試験（ｍＦＳＴ）
強制水泳試験（ＦＳＴ）は、前臨床試験において抗鬱化合物を評価するのに用いられる動物モデルである。ＦＳＴを、Ｐｏｒｓｏｌｔらと類似の方法に変更を加えて実施した（Porsolt RD, Bertin A, Jalfre M. Behavioral despair in mice: a primary screening test for antidepressants. Arch Int Pharmacodyn Ther 1977; 229:327-36）。このパラダイムでは、マウスを、水で満たされており脱出できないシリンダー内で泳がせる。これらの条件下では、マウスは最初は脱出しようと試みるが、最終的には無動行動をとるようになるであろう；この行動は、受動的ストレス対処戦略または抑鬱様行動であると解釈される。水泳タンクはプラスチック製の箱の中に置いた。各タンクは互いに、シリンダーの高さまである不透明なプラスチックシートで分離した。１度に３匹のマウスを試験に供した。水泳セッションを、水（深さ２０ｃｍ，２４〜２５℃に保たれている）を入れた個々のガラスシリンダー（高さ４６ｃｍ×直径２０ｃｍ）内にマウスを入れることにより６分間実施した。この水位では、マウスの尾は容器の底に接触しない。マウスが水中でもがくことなく受動的に浮き続け、鼻端／頭部を水上に保ち、浮き続けるのに必要な動きしかしていない間は、常に無動であると判断した。合計６分間の試験中の無動時間を評価し、無動時間（秒）として表した。各マウスは１回のみ試験した。各セッションの終わりに、マウスは乾いた布で乾燥し、低体温症を予防するため熱ブランケット上に置いたホームケージに戻した。水は各試験の後に交換した。全ての試験セッションを、ビデオカメラ（Ｓｏｎｙ  Ｈａｎｄｉｃａｍ，Ｍｏｄｅｌ：ＤＣＲ−ＨＣ３８Ｅ；ＰＡＬ）を用いて記録し、Ｆｏｒｃｅｄ  Ｓｗｉｍ  Ｓｃａｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０ソフトウェアを用いて採点を行った（Ｃｌｅｖｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｔｏｎ，ＶＡ，ＵＳＡ；Hayashi E, Shimamura M, Kuratani K, Kinoshita M, Hara H. Automated experimental system capturing three behavioral components during murine forced swim test. Life Sci. 2011 Feb 28;88(9-10):411-7、およびYuan P, Tragon T, Xia M, Leclair CA, Skoumbourdis AP, Zheng W, Thomas CJ, Huang R, Austin CP, Chen G, Guitart X. Phosphodiesterase 4 inhibitors enhance sexual pleasure-seeking activity in rodents. Pharmacol Biochem Behav. 2011; 98(3):349-55を参照のこと）。ＮＣＥ試験について：水泳セッションの１５分前に、試験化合物を静注経路によりマウスに投与し、その後６分間無動時間を記録した。ＦＳＴの終わりに、マウスを迅速な断頭法により安楽死させ、血漿および脳サンプルを集め、その後分析するまで−８０℃下で保存した。マウス強制水泳アッセイにおいて、実施例１の化合物は、３０％ヒドロキシプロピルベータシクロデキストリン／７０％クエン酸緩衝液（ｐＨ４）の媒体に入れて、５ｍＬ／Ｋｇの投与量で静脈投与した。実施例１の化合物は、これらの条件下にて１ｍｇ／Ｋｇで、無動時間が統計的に有意な減少を示した。この投与量では、血漿中の薬物濃度は２６８＋／−１２８ｎＭ、脳内の薬物濃度は７４９＋／−２１５ｎＭであった。ＮＲ２Ｂ受容体の占有率は上記で報告したように測定し、７３％であると決定した。実施例６の化合物は、これらの同じ条件下にて１ｍｇ／Ｋｇで、無動時間が統計的に有意な減少を示した。血漿中の薬物濃度は３６０ｎＭであった。ＮＲ２Ｂ受容体の占有率は７９％である��決定した。