(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃＧＭＰ作動性細胞標的の調節不全に関連する病理、状態又は障害を処置するための治療剤を含む、薬学的に許容されるナノ容器であって、
治療剤が、式ＩＩ：
【化１】
0006744046.tif 000017
（式中、Ｘ２が、水素、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、ＣＦ３、又は−ＮＲ９Ｒ１０若しくは−ＳＲ１１基であり、Ｒ９が水素であり、Ｒ１０及びＲ１１の両方が末端ＮＨ２又はＯＨ基を有するアルキル基であり、
Ｒ８が水素、（トリ）アルキルシリル基、又はアシル基であり、
Ｌが酸素、硫黄、ボラノ（ＢＨ３）若しくはさらに置換されたボラノ基であって、ＭがＯＨであるか、又は
ＬがＯＨであって、Ｍが酸素、硫黄、ボラノ（ＢＨ３）若しくはさらに置換されたボラノ基であり、
Ｋａｔ＋が、プロトン又は別の生理学的に許容される金属カチオン若しくはトリアルキルアンモニウムイオンである）
に従う環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェートアナログである、ナノ容器。
【請求項２】
グルタチオントランスポーターに対するリガンドにコンジュゲートされている、請求項１に記載のナノ容器。
【請求項３】
環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェートアナログが、式ＩＩＩ：
【化２】
0006744046.tif 000018
の環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェートアナログ、又は式ＩＩＩのアナログのナトリウム塩以外の他の薬学的に許容される塩である、請求項１又は２に記載のナノ容器。
【請求項４】
リガンドが、グルタチオン、Ｓ−（ｐ−ブロモベンジル）グルタチオン、ガンマ−（Ｌ−ガンマ−アザグルタミル）−Ｓ−（ｐ−ブロモベンジル）−Ｌ−システイニルグリシン、Ｓ−ブチルグルタチオン、Ｓ−デシルグルタチオン、還元型グルタチオンエチルエステル、グルタチオンスルホン酸、Ｓ−ヘキシルグルタチオン、Ｓ−ラクトイルグルタチオン、Ｓ−メチルグルタチオン、Ｓ−（４−ニトロベンジル）グルタチオン、Ｓ−オクチルグルタチオン、Ｓ−プロピルグルタチオン、ｎ−ブタノイルガンマ−グルタミルシステイニルグリシン、エタノイルガンマ−グルタミルシステイニルグリシン、ヘキサノイルガンマ−グルタミルシステイニルグリシン、オクタノイルガンマ−グルタミルシステイニルグリシン、ドデカノイルガンマ−グルタミルシステイニルグリシン、ＧＳＨモノイソプロピルエステル（Ｎ−（Ｎ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル）グリシン１−イソプロピルエステル硫酸塩一水和物）、並びに式Ｖ：
【化３】
0006744046.tif 000019
（式中、Ｚ＝ＣＨ２及びＹ＝ＣＨ２、又はＺ＝Ｏ及びＹ＝Ｃ＝Ｏであり、
Ｒｉ及びＲ２が独立して、Ｈ、直鎖若しくは分岐のアルキル（１〜２５Ｃ）、アラルキル（６〜２６Ｃ）、シクロアルキル（６〜２５Ｃ）、複素環（６〜２０Ｃ）、エーテル又はポリエーテル（３〜２５Ｃ）からなる群から選択され、ここでＲ１−Ｒ２は一緒になって、２〜２０Ｃ原子を有し、式ＶＩの残部と共に大環状分子を形成し、
Ｒ３が、Ｈ及びＣＨ３からなる群から選択され、
Ｒ４が、６〜８Ｃアルキル、ベンジル、ナフチル及び治療的に活性な環状グアノシン−３’，５’−モノホスホロチオエートからなる群から選択され、
Ｒ５が、Ｈ、フェニル、ＣＨ３−及びＣＨ２−フェニルからなる群から選択される）
のグルタチオン誘導体又はその薬学的に許容される塩からなる群から選択され、
好ましくは式Ｉの誘導体において、Ｒ３がＨであり、Ｒ４がベンジルであり、Ｒ５がフェニルである、請求項２又は３に記載のナノ容器。
【請求項５】
ナノ容器が、治療剤又は診断剤を封入するリポソームであり、グルタチオントランスポーターに対するリガンドは、コンジュゲーション剤の１端に結合されたビタミンＥ誘導体若しくはリン脂質とコンジュゲーション剤の他端に結合されたグルタチオントランスポーターに対するリガンドとを含む二官能性コンジュゲーション剤を介してリポソームにコンジュゲートされており、好ましくは、コンジュゲーション剤が約６〜２１０の重合数（ｎ）を有するポリエチレングリコールであり、より好ましくは、ポリエチレングリコールが１，０００〜５，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ容器。
【請求項６】
コンジュゲーション剤が、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール−マレイミド（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）を、マレイミド反応性チオール基を有するグルタチオン受容体に対するリガンドと反応させることにより取得可能であり、好ましくは、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬが約２，０００Ｄａの分子量を有する、請求項５に記載のナノ容器。
【請求項７】
グルタチオン受容体に対するリガンドが、グルタチオンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノ容器。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ容器と薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項９】
網膜色素変性症の処置に使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ容器。
【請求項１０】
全身又は局所的に投与される、請求項９に記載の使用のためのナノ容器。
【請求項１１】
ａ）硝子体内、静脈内、腹腔内及び動脈内経路のうちの少なくとも１つによる注射又は注入、並びに
ｂ）表面適用又は眼適用
のうちの少なくとも１つにより投与される、請求項１０に記載の使用のためのナノ容器。
【請求項１２】
０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇの用量で、１又は２日あたり１回投与される、請求項９に記載の使用のためのナノ容器。
【請求項１３】
０．０００５〜０．０２ｍｇ／ｋｇの用量で、２週間に１回又は６週間に１回、硝子体内投与される、請求項９に記載の使用のためのナノ容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学及び薬学の分野に関する。特に本発明は、標的化された薬物送達の分野に関する。本発明は、血液眼関門への及び血液眼関門を渡る、増強された結合、エンド−又はトランスサイトーシスを特異的に媒介する、グルタチオントランスポーターに対するリガンドに任意選択で連結された、ナノ容器に含まれた医薬品有効成分のコンジュゲートに関する。これらのコンジュゲートは、好ましくは、網膜の疾患を処置又は予防する方法に使用される。
【背景技術】
【０００２】
網膜色素変性症（Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ、ＲＰ）は、重度障害の遺伝性神経変性疾患群の１つである。典型的に、暗所条件下で見ることを可能にする桿体光受容体細胞が、疾患過程の最初で変性する。次いで、桿体の喪失により、明所の高解像度色覚の源である錐体光受容体細胞の二次的変性が引き起こされ、最後には、完全な失明に至る。
【０００３】
網膜色素変性症は、広範な異種セットの変異によって引き起こされ、現在、７０を超える遺伝子が特定されている（参考：ｒｅｔｉｎａｌ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｎｅｔｗｏｒｋ：ｈｔｔｐｓ：／／ｓｐｈ．ｕｔｈ．ｅｄｕ／ｒｅｔｎｅｔ）。原因となる変異の多くが明らかにされてきた一方で、後の変性機構についての情報は依然として非常にわずかしかない。これまでに知られる詳細は、ほとんどがヒト網膜色素変性症患者コホートと類似の遺伝子変異を示すモデル動物（通常は、齧歯類系である）に対する試験から得られたものである。
【０００４】
網膜色素変性症で変異している遺伝子は、大抵が光受容体機能と関連しているが、細胞機能全体に関係している遺伝子もある（Ｋｅｎｎａｎら、２００５、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２１、１０３−１１０）。分子ｃＧＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ  ｇｕａｎｏｓｉｎｅ−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、環状グアノシン−モノホスフェート）は、光受容体細胞が光を受けたときに同細胞内で生じる光伝達カスケードにおいて直接的な役割を果たしている。多くの場合に、網膜色素変性症の変異により、例えば、光受容体ｃＧＭＰ代謝に関与する酵素の遺伝子が影響を受ける状況において、光受容体にｃＧＭＰの過剰な蓄積が生じる（Ａｒａｎｇｏ−Ｇｏｎｚａｌｅｚら、２０１４  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．９、ｅ１１２１４２）。この状況は、ｃＧＭＰをＧＭＰに加水分解する光受容体酵素であるホスホジエステラーゼ６（錐体光受容体に関する遺伝子ＰＤＥ６Ｂ、ＰＤＥ６Ａ、ＰＤＥ６Ｇ及びＰＤＥ６Ｃ、ＰＤＥ６Ｈによってサブユニットがコードされている）の変異に当てはまる。Ｐｄｅ６ｂ遺伝子は、多くの実験で良く研究されているｒｄ１網膜色素変性症モデルマウスにおいて変異している。推定される一連の事象において、ＰＤＥ６Ｂ変異網膜におけるｃＧＭＰの蓄積は、実際の遺伝子欠損の直接的結果として生じ、したがって初期の機構的に根本的な変性要素とみられうる。次の（１つ又は複数の）工程において、増加したｃＧＭＰは、以下の４つの標的のうちの少なくとも１つを有すると予想されうる：１）ｃＧＭＰにより活性化されたときに特定のタンパク質をリン酸化するｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（プロテインキナーゼＧ；ＰＫＧ）、２）ｃＧＭＰにより活性化されたときＮａ＋及びＣａ２＋のｃＧＭＰ制御流入を可能にする環状ヌクレオチド開口性イオンチャネル（ＣＮＧＣ）、３）ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、並びに４）過分極活性化環状ヌクレオチド開口性（ＨＣＮ）チャネル。最初の２つのｃＧＭＰ標的は、光受容体変性に直接的に関連しているが（Ｐａｑｕｅｔ−Ｄｕｒａｎｄら、２００９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１０８、７９６−８１０；Ｐａｑｕｅｔ−Ｄｕｒａｎｄら、２０１１、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０、９４１−９４７）、他は既知のｃＧＭＰ標的であり、したがって潜在的に変性過程に関与している。初期の事象に直接的に関連していることから、ＰＫＧ及びＣＮＧＣは、たとえ下流の機構が依然としてほとんど解明されていなくても（Ｔｒｉｆｕｎｏｖｉｃら、２０１２、Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１２、５９８−６１２）、疾患駆動因子と考えることができる。
【０００５】
網膜色素変性症に対する様々な実験的処置アプローチが現在研究されており、様々な開発段階にあり、例えば、遺伝子治療、幹細胞研究、光遺伝学が挙げられる。しかしながら、現在のところ、臨床的に承認された利用可能な処置はない。
【０００６】
従前において、ある特定のｃＧＭＰ由来ＰＫＧ阻害剤、例えば、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＧＭＰＳが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ網膜色素変性症モデルマウスの両方において、ｒｄ１及びｒｄ２光受容体にいくらかの保護を与えることが見出された（Ｐａｑｕｅｔ−Ｄｕｒａｎｄら、２００９）。しかしながら、これらのＰＫＧ阻害剤は、テノン嚢下又は硝子体内注射によるＰＫＧ阻害剤の頻繁な再投与（つまり、２日ごと）を必要とすると考えられ、慢性疾患に対して実用的なものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在のところ、網膜色素変性症に対して利用可能な承認された予防又は処置方法はない。したがって、網膜色素変性症の適切な処置、特に投与様式のより簡便な処置が、当該分野で依然として必要とされている。したがって、本発明の目的は、網膜色素変性症を処置及び予防するための新規手段及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様では、本発明は、ｃＧＭＰ作動性細胞標的の調節不全に関連する病理、状態又は障害を処置又は診断するための治療剤又は診断剤を含む、薬学的に許容されるナノ容器であって、好ましくは、上記標的が、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ）、過分極活性化環状ヌクレオチド開口性（ＨＣＮ）チャネル、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、及びｃＧＭＰ開口性チャネル（ＣＮＧＣ）のうちの少なくとも１つである、ナノ容器に関する。ナノ容器は、グルタチオントランスポーターに対するリガンドにコンジュゲートされていることが好ましい。本発明によるナノ容器では、治療剤は、好ましくは、環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェートアナログであり、より好ましくは、式Ｉ：
【化１】
0006744046.tif 000002
（式中、Ｒ６及びＲ７の両方が水素であり、Ｘ１が−ＣＦ３又は−ＮＲ９Ｒ１０若しくは−ＳＲ１１基であり、Ｒ９が水素であり、Ｒ１０及びＲ１１の両方が末端ＮＨ２若しくはＯＨ基を有するアルキル基であるか、又はＲ１１が、
【化２】
0006744046.tif 000003
に示すように置換基Ｑを４位に有するフェニル基であり、
Ｑが、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−ＳＨ、ＮＨ２、ＮＯ２、−ＯＣＨ３、ＣＨ３若しくはＣＦ３であり、又は
Ｒ９及びＲ１０の両方が互いに接続して環を形成するアルキル基であり、Ｒ８が水素、（トリ）アルキルシリル基又はアシル基であり、
Ｌが酸素、硫黄、ボラノ（ＢＨ３）若しくはさらに置換されたボラノ基であって、ＭがＯＨであるか、又は
ＬがＯＨであって、Ｍが酸素、硫黄、ボラノ（ＢＨ３）若しくはさらに置換されたボラノ基であり、
Ｋａｔ＋が、プロトン又は別の生理学的に許容される金属カチオン若しくはトリアルキルアンモニウムイオンであり、或いは、
Ｒ６及びＲ７が一緒になって、スチリレン基であり、式ＩＩ：
【化３】
0006744046.tif 000004
による縮合三環式環系を形成し、
Ｘ２が、水素、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、ＣＦ３、−ＮＲ９Ｒ１０若しくは−ＳＲ１１基又は４−クロロフェニルチオ基であり、Ｒ９が水素であり、Ｒ１０及びＲ１１の両方が末端ＮＨ２又はＯＨ基を有するアルキル基であり、
Ｒ８が水素、（トリ）アルキルシリル基、又はアシル基であり、
Ｌが酸素、硫黄、ボラノ（ＢＨ３）若しくはさらに置換されたボラノ基であって、ＭがＯＨであるか、又は
ＬがＯＨであって、Ｍが酸素、硫黄、ボラノ（ＢＨ３）若しくはさらに置換されたボラノ基であり、
Ｋａｔ＋が、プロトン又は別の生理学的に許容される金属カチオン若しくはトリアルキルアンモニウムイオンである）
の環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェートアナログである。
【０００９】
特に式ＩＩＩ：
【化４】
0006744046.tif 000005
若しくは式ＩＶ：
【化５】
0006744046.tif 000006
の環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェートアナログ、又は式ＩＩＩ及びＩＶのアナログのナトリウム塩以外の他の薬学的に許容される塩が好ましい。
【００１０】
本発明によるナノ容器では、グルタチオントランスポーターに対するリガンドは、好ましくは、グルタチオン、Ｓ−（ｐ−ブロモベンジル）グルタチオン、ガンマ−（Ｌ−ガンマ−アザグルタミル）−Ｓ−（ｐ−ブロモベンジル）−Ｌ−システイニルグリシン、Ｓ−ブチルグルタチオン、Ｓ−デシルグルタチオン、還元型グルタチオンエチルエステル、グルタチオンスルホン酸、Ｓ−ヘキシルグルタチオン、Ｓ−ラクトイルグルタチオン、Ｓ−メチルグルタチオン、Ｓ−（４−ニトロベンジル）グルタチオン、Ｓ−オクチルグルタチオン、Ｓ−プロピルグルタチオン、ｎ−ブタノイルガンマ−グルタミルシステイニルグリシン、エタノイルガンマ−グルタミルシステイニルグリシン、ヘキサノイルガンマ−グルタミルシステイニルグリシン、オクタノイルガンマ−グルタミルシステイニルグリシン、ドデカノイルガンマ−グルタミルシステイニルグリシン、ＧＳＨモノイソプロピルエステル（Ｎ−（Ｎ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル）グリシン１−イソプロピルエステル硫酸塩一水和物）、並びに式Ｖ：
【化６】
0006744046.tif 000007
（式中、Ｚ＝ＣＨ２及びＹ＝ＣＨ２、又はＺ＝Ｏ及びＹ＝Ｃ＝Ｏであり、
Ｒｉ及びＲ２が独立して、Ｈ、直鎖若しくは分岐のアルキル（１〜２５Ｃ）、アラルキル（６〜２６Ｃ）、シクロアルキル（６〜２５Ｃ）、複素環（６〜２０Ｃ）、エーテル又はポリエーテル（３〜２５Ｃ）からなる群から選択され、ここでＲｉ−Ｒ２が一緒になって、２〜２０Ｃ原子を有し、式ＶＩの残部と共に大環状分子を形成し、
Ｒ３が、Ｈ及びＣＨ３からなる群から選択され、
Ｒ４が、６〜８Ｃアルキル、ベンジル、ナフチル及び治療的に活性な環状グアノシン−３’，５’−モノホスホロチオエートからなる群から選択され、
Ｒ５が、Ｈ、フェニル、ＣＨ３−及びＣＨ２−フェニルからなる群から選択される）
のグルタチオン誘導体又はその薬学的に許容される塩からなる群から選択されるリガンドであり、式Ｉの誘導体において、Ｒ３がＨであり、Ｒ４がベンジルであり、Ｒ５がフェニルであることが好ましい。
【００１１】
本発明による好ましいナノ容器は、治療剤又は診断剤を封入するリポソームであり、ここでグルタチオントランスポーターに対するリガンドが、コンジュゲーション剤の１端に結合されたビタミンＥ誘導体若しくはリン脂質とコンジュゲーション剤の他端に結合されたグルタチオントランスポーターに対するリガンドとを含む二官能性コンジュゲーション剤を介してリポソームにコンジュゲートされていることが好ましく、コンジュゲーション剤が約６〜２１０の重合数（ｎ）を有するポリエチレングリコールであることがさらに好ましく、ポリエチレングリコールが１，０００〜５，０００Ｄａの分子量を有することが最も好ましい。ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール−マレイミド（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）を、マレイミド反応性チオール基を有するグルタチオン受容体に対するリガンドと反応させることにより取得されうるコンジュゲーション剤が特に好ましく、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬが、約２，０００Ｄａの分子量を有することが好ましい。グルタチオン受容体の好ましいリガンドは、グルタチオンである。
【００１２】
第２の態様では、本発明は、本発明によるナノ容器と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００１３】
第３の態様では、本発明は、医薬として使用するための、本発明によるナノ容器又はナノ容器を含む医薬組成物に関する。
【００１４】
第４の態様では、本発明は、ｃＧＭＰ作動性細胞標的の調節不全に関連する病理、状態又は障害の処置に使用するための、本発明によるナノ容器又はナノ容器を含む医薬組成物であって、好ましくは、上記標的はｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ）、過分極活性化環状ヌクレオチド開口性（ＨＣＮ）チャネル、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）及びｃＧＭＰ開口性チャネルのうちの少なくとも１つである、ナノ容器又はナノ容器を含む医薬組成物に関する。上記ナノ容器又は組成物は、ａ）網膜色素変性症又は別の遺伝性網膜疾患、ｂ）代謝性又は神経変性疾患、症候群又は眼疾患の結果としての続発性網膜色素変性症、ｃ）糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症、黄斑円孔／パッカー、眼悪性病変、網膜芽腫、網膜剥離及び河川盲目症を含む網膜疾患、ｄ）神経性又は神経変性障害、嗅覚脱失、炎症性及び神経障害性疼痛、軸索再生及び脊髄損傷後回復、ｅ）マラリア、アフリカ睡眠病及びシャーガス病などの寄生虫疾患、並びにｆ）心血管疾患、高血圧、低血圧、狭心症、肺高血圧症、勃起不全、虚血発作、アテローム性動脈硬化、がん又は急性ショックのうちの少なくとも１つの処置に使用することが好ましい。
【００１５】
医薬として使用するための又は本発明による処置として使用するためのナノ容器又はナノ容器を含む医薬組成物は、全身的又は局所的に投与されることが好ましく、ここでナノ容器又はナノ容器を含む医薬組成物は、ａ）硝子体内、静脈内、腹腔内、及び動脈内経路のうちの少なくとも１つによる注射若しくは注入、並びにｂ）表面適用又は眼適用、のうちの少なくとも１つにより投与されることが好ましい。
【００１６】
本発明による処置は、ナノ容器又はナノ容器を含む医薬組成物の全身又は局所投与を含むことが好ましく、ａ）硝子体内、静脈内、腹腔内、及び動脈内経路のうちの少なくとも１つによる注射若しくは注入、並びにｂ）表面適用又は眼適用、のうちの少なくとも１つにより投与されることが好ましい。
【００１７】
ナノ容器は、好ましくは、０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇの用量で、１又は２日あたり１回投与される。代替的に、眼疾患に関して、ナノ容器は、コンジュゲートされた標的化リガンドを伴って又は伴わずに、２週間あたり１回又は６週間あたり１回、硝子体内注射されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１ａ】ＤＦ００３（Ｒｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳ）及びＬＰ−ＤＦ００３（実施例１に記載の通りに調製されたＧＳＨ−コンジュゲートリポソームに封入されたＲｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ保護効果を示す。ＤＦ００３は、１００ｎＭもの低濃度でｒｄ１光受容体様細胞死を有意に減少させた。この効果は、ＬＰ−ＤＦ００３によって増加し、１０ｎＭのＤＦ００３に相当する用量を得るために使用されたときも依然として有効であった。同時に、野生型（ｗｔ）光受容体様細胞は、使用された最も高い濃度（５０μＭ）でさえ、ＤＦ００３又はＬＰ−ＤＦ００３のいずれによっても影響を受けなかった。ｂ）同様に、ＤＦ００３は、器官型ｒｄ１網膜外植培養において光受容体死を減少させ、一方でｗｔ外植培養において毒性の徴候は示されなかった。
【図１ｂ】ＤＦ００３（Ｒｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳ）及びＬＰ−ＤＦ００３（実施例１に記載の通りに調製されたＧＳＨ−コンジュゲートリポソームに封入されたＲｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ保護効果を示す。ＤＦ００３は、１００ｎＭもの低濃度でｒｄ１光受容体様細胞死を有意に減少させた。この効果は、ＬＰ−ＤＦ００３によって増加し、１０ｎＭのＤＦ００３に相当する用量を得るために使用されたときも依然として有効であった。同時に、野生型（ｗｔ）光受容体様細胞は、使用された最も高い濃度（５０μＭ）でさえ、ＤＦ００３又はＬＰ−ＤＦ００３のいずれによっても影響を受けなかった。ｂ）同様に、ＤＦ００３は、器官型ｒｄ１網膜外植培養において光受容体死を減少させ、一方でｗｔ外植培養において毒性の徴候は示されなかった。
【図２ａ】ＬＰ−ＤＦ００３は、３種の様々な網膜色素変性症モデル動物において光受容体を保護する。光受容体の生存を、３種の異なるｉｎ  ｖｉｖｏ網膜色素変性症モデルマウス、つまり生後日数（ｐｏｓｔ−ｎａｔａｌ  ｄａｙ、ＰＮ）でＰＮ１４のｒｄ１マウス、並びにＰＮ３０のｒｄ２及びｒｄ１０マウスで評価した。緑色のバーは、野生型（ｗｔ）の状況、赤色のバーは未処置変異体の状況を表す。ａ）遊離ＤＦ００３で処置したｒｄ１動物は、未処置ｒｄ１と比較するとき、光受容体の生存に何らの改善も示さなかった。対照的に、ＬＰ−ＤＦ００３処置は、ＰＮ１４でｒｄ１光受容体を顕著に保存していた。ｂ）ＰＮ３０でｒｄ２マウスでは網膜色素変性症によりおよそ１５％の光受容体が消失し、一方で、同じ生後日数のｒｄ１０の網膜では、およそ８０％が失われる。ｒｄ２及びｒｄ１０動物の両方において、ＬＰ−ＤＦ００３を用いた処置は、生存光受容体の数を著しく増加させた。
【図２ｂ】ＬＰ−ＤＦ００３は、３種の様々な網膜色素変性症モデル動物において光受容体を保護する。光受容体の生存を、３種の異なるｉｎ  ｖｉｖｏ網膜色素変性症モデルマウス、つまり生後日数（ｐｏｓｔ−ｎａｔａｌ  ｄａｙ、ＰＮ）でＰＮ１４のｒｄ１マウス、並びにＰＮ３０のｒｄ２及びｒｄ１０マウスで評価した。緑色のバーは、野生型（ｗｔ）の状況、赤色のバーは未処置変異体の状況を表す。ａ）遊離ＤＦ００３で処置したｒｄ１動物は、未処置ｒｄ１と比較するとき、光受容体の生存に何らの改善も示さなかった。対照的に、ＬＰ−ＤＦ００３処置は、ＰＮ１４でｒｄ１光受容体を顕著に保存していた。ｂ）ＰＮ３０でｒｄ２マウスでは網膜色素変性症によりおよそ１５％の光受容体が消失し、一方で、同じ生後日数のｒｄ１０の網膜では、およそ８０％が失われる。ｒｄ２及びｒｄ１０動物の両方において、ＬＰ−ＤＦ００３を用いた処置は、生存光受容体の数を著しく増加させた。
【図３ａ】ＬＰ−ＤＦ００３は、ｉｎ  ｖｉｖｏでｒｄ１０動物における光受容体の生存度及び機能を保存する。マウスにおいて、網膜色素変性症は、中心（視神経＝０°）から周辺（９０°）へ進行する。ａ）ＬＰ−ＤＦ００３は、周辺部網膜の背側部分におけるｒｄ１０光受容体（ＯＮＬ）を救済し、遅い疾患進行を示した。ｂ）未処置（赤色）及びＬＰ−ＤＦ００３処置（オレンジ色）ｒｄ１０動物における代表的網膜電図検査（ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｐｈｉｃ、ＥＲＧ）応答である。成体野生型のトレース（緑色）を比較のために示している。棒グラフは、平均（ｎ＝７）ｂ波ＥＲＧ振幅が、処置されたｒｄ１０動物において４〜５倍大きいことを示す。
【図３ｂ】ＬＰ−ＤＦ００３は、ｉｎ  ｖｉｖｏでｒｄ１０動物における光受容体の生存度及び機能を保存する。マウスにおいて、網膜色素変性症は、中心（視神経＝０°）から周辺（９０°）へ進行する。ａ）ＬＰ−ＤＦ００３は、周辺部網膜の背側部分におけるｒｄ１０光受容体（ＯＮＬ）を救済し、遅い疾患進行を示した。ｂ）未処置（赤色）及びＬＰ−ＤＦ００３処置（オレンジ色）ｒｄ１０動物における代表的網膜電図検査（ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｐｈｉｃ、ＥＲＧ）応答である。成体野生型のトレース（緑色）を比較のために示している。棒グラフは、平均（ｎ＝７）ｂ波ＥＲＧ振幅が、処置されたｒｄ１０動物において４〜５倍大きいことを示す。
【図３ｃ】ＬＰ−ＤＦ００３は、ｉｎ  ｖｉｖｏでｒｄ１０動物における光受容体の生存度及び機能を保存する。マウスにおいて、網膜色素変性症は、中心（視神経＝０°）から周辺（９０°）へ進行する。ａ）ＬＰ−ＤＦ００３は、周辺部網膜の背側部分におけるｒｄ１０光受容体（ＯＮＬ）を救済し、遅い疾患進行を示した。ｂ）未処置（赤色）及びＬＰ−ＤＦ００３処置（オレンジ色）ｒｄ１０動物における代表的網膜電図検査（ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｐｈｉｃ、ＥＲＧ）応答である。成体野生型のトレース（緑色）を比較のために示している。棒グラフは、平均（ｎ＝７）ｂ波ＥＲＧ振幅が、処置されたｒｄ１０動物において４〜５倍大きいことを示す。
【図４】ＤＦ００３及びＬＰ−ＤＦ００３の薬物動態。成体ラットにおける薬物動態試験から、遊離ＤＦ００３に対してＬＰ−ＤＦ００３のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の大幅な延長が示された。遊離ＤＦ００３のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は約１５分である一方、ＬＰ−ＤＦ００３はおよそ２４時間の半減期を示した。
【図５ａ】ｉｎ  ｖｉｖｏのＳＬＯイメージングにより、網膜への送達成功が実証される。生後日数（ＰＮ）１０日で蛍光標識リポソーム薬物送達系を注射したマウスを、ｉｎ  ｖｉｖｏで走査レーザー検眼鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｌａｓｅｒ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｓｃｏｐｙ、ＳＬＯ）を使用して、ＰＮ１４及びＰＮ２０に解析した。表面適用（図示せず）並びに硝子体内（ａ）及びテノン嚢下（ｂ）注射では、標識の有意な網膜取込みは示されなかった。しかしながら、静脈内（ｃ）及び腹腔内（ｄ）注射では、両方とも、ＰＮ１４、つまり適用後４日で、網膜血管及び神経網膜の強力な蛍光標識がもたらされた。ＰＮ２０で、ほとんどの標識は消失したが、腹腔内注射後、一定の網膜パッチは依然としていくらかの蛍光を示した。
【図５ｂ】ｉｎ  ｖｉｖｏのＳＬＯイメージングにより、網膜への送達成功が実証される。生後日数（ＰＮ）１０日で蛍光標識リポソーム薬物送達系を注射したマウスを、ｉｎ  ｖｉｖｏで走査レーザー検眼鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｌａｓｅｒ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｓｃｏｐｙ、ＳＬＯ）を使用して、ＰＮ１４及びＰＮ２０に解析した。表面適用（図示せず）並びに硝子体内（ａ）及びテノン嚢下（ｂ）注射では、標識の有意な網膜取込みは示されなかった。しかしながら、静脈内（ｃ）及び腹腔内（ｄ）注射では、両方とも、ＰＮ１４、つまり適用後４日で、網膜血管及び神経網膜の強力な蛍光標識がもたらされた。ＰＮ２０で、ほとんどの標識は消失したが、腹腔内注射後、一定の網膜パッチは依然としていくらかの蛍光を示した。
【図５ｃ】ｉｎ  ｖｉｖｏのＳＬＯイメージングにより、網膜への送達成功が実証される。生後日数（ＰＮ）１０日で蛍光標識リポソーム薬物送達系を注射したマウスを、ｉｎ  ｖｉｖｏで走査レーザー検眼鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｌａｓｅｒ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｓｃｏｐｙ、ＳＬＯ）を使用して、ＰＮ１４及びＰＮ２０に解析した。表面適用（図示せず）並びに硝子体内（ａ）及びテノン嚢下（ｂ）注射では、標識の有意な網膜取込みは示されなかった。しかしながら、静脈内（ｃ）及び腹腔内（ｄ）注射では、両方とも、ＰＮ１４、つまり適用後４日で、網膜血管及び神経網膜の強力な蛍光標識がもたらされた。ＰＮ２０で、ほとんどの標識は消失したが、腹腔内注射後、一定の網膜パッチは依然としていくらかの蛍光を示した。
【図５ｄ】ｉｎ  ｖｉｖｏのＳＬＯイメージングにより、網膜への送達成功が実証される。生後日数（ＰＮ）１０日で蛍光標識リポソーム薬物送達系を注射したマウスを、ｉｎ  ｖｉｖｏで走査レーザー検眼鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｌａｓｅｒ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｓｃｏｐｙ、ＳＬＯ）を使用して、ＰＮ１４及びＰＮ２０に解析した。表面適用（図示せず）並びに硝子体内（ａ）及びテノン嚢下（ｂ）注射では、標識の有意な網膜取込みは示されなかった。しかしながら、静脈内（ｃ）及び腹腔内（ｄ）注射では、両方とも、ＰＮ１４、つまり適用後４日で、網膜血管及び神経網膜の強力な蛍光標識がもたらされた。ＰＮ２０で、ほとんどの標識は消失したが、腹腔内注射後、一定の網膜パッチは依然としていくらかの蛍光を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
第１の態様では、本発明は、血液眼関門への及び血液眼関門を渡る治療的に活性な薬剤及び／又は診断剤を標的化するためのナノ容器に関する。本発明のナノ容器は、ｃＧＭＰ作動性細胞標的の調節不全に関連する病理、状態又は障害を処置又は診断するための治療剤又は診断剤を含むことが好ましく、上記標的が、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ）、過分極活性化環状ヌクレオチド開口性（ＨＣＮ）チャネル、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、及びｃＧＭＰ開口性チャネル（ＣＮＧＣ）のうちの少なくとも１つであることが好ましい。治療剤又は診断剤は、有機小分子、タンパク質、例えば、酵素若しくは抗体、又は核酸、例えば、遺伝子治療ベクターでありうる。本発明によるナノ容器に含まれることになる好ましい治療剤は、環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェートアナログである。
【００２０】
好ましい実施形態では、本発明によるナノ容器は、グルタチオントランスポーターに対するリガンドにコンジュゲートされている。
【００２１】
「コンジュゲート」は、本明細書において、一緒に結合された２つの実体から構成されるとして定義される。２つの実体は、非特異的又は特異的タンパク質−タンパク質相互作用、共有結合、非共有結合、配位化学結合、及び／又は疎水性相互作用により、コンジュゲートされていることが好ましい。本発明の文脈において、第１の実体は、本明細書で下記に定義する治療剤又は診断剤を含む薬学的に許容される担体でありえ、一方で、第２の実体は、通常、本明細書で下記に定義する標的細胞上の受容体に対するリガンドである。
【００２２】
環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェートアナログ
本発明のナノ容器に含まれる環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェート（ｃＧＭＰ）アナログは、好ましくは、式Ｉ：
【化７】
0006744046.tif 000008
の環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェート（ｃＧＭＰ）アナログである。
【００２３】
Ｒ６及びＲ７の両方が水素であり、Ｘ１が−ＣＦ３又は−ＮＲ９Ｒ１０若しくは−ＳＲ１１基であり、Ｒ９が水素であり、Ｒ１０及びＲ１１の両方が、末端ＮＨ２若しくはＯＨ基を有するアルキル基であるか、又はＲ１１が、
【化８】
0006744046.tif 000009
に示すように置換基Ｑを４位に有するフェニル基であり、
Ｑが、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−ＳＨ、ＮＨ２、ＮＯ２、−ＯＣＨ３、ＣＨ３若しくはＣＦ３であり、又は
Ｒ９及びＲ１０の両方が互いに接続して環を形成するアルキル基であり、Ｒ８が水素、（トリ）アルキルシリル基又はアシル基であり、
Ｌが酸素、硫黄、ボラノ（ＢＨ３）若しくはさらに置換されたボラノ基であって、ＭがＯＨであるか、又は
ＬがＯＨであって、Ｍが酸素、硫黄、ボラノ（ＢＨ３）若しくはさらに置換されたボラノ基であり、
Ｋａｔ＋が、プロトン又は別の生理学的に許容される金属カチオン若しくはトリアルキルアンモニウムイオンであり、或いは、
Ｒ６及びＲ７が一緒になって、スチリレン基であり、式ＩＩ：
【化９】
0006744046.tif 000010
による縮合三環式環系を形成し、
Ｘ２が、水素、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、ＣＦ３、又は−ＮＲ９Ｒ１０若しくは−ＳＲ１１基又は４−クロロフェニルチオ基であり、Ｒ９が水素であり、Ｒ１０及びＲ１１の両方が末端ＮＨ２又はＯＨ基を有するアルキル基であり、Ｒ８が水素、（トリ）アルキルシリル基、又はアシル基であり、
Ｌが酸素、硫黄、ボラノ（ＢＨ３）若しくはさらに置換されたボラノ基であって、ＭがＯＨであるか、又は
ＬがＯＨであって、Ｍが酸素、硫黄、ボラノ（ＢＨ３）若しくはさらに置換されたボラノ基であり、
Ｋａｔ＋が、プロトン又は別の生理学的に許容される金属カチオン若しくはトリアルキルアンモニウムイオンである。
【００２４】
疎水性芳香族置換基を８位に有する式Ｉの環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェート化合物が好ましい。フェニルチオ基、例えば４−クロロフェニルチオ−又は４−ヒドロキシフェニルチオ基により８位が置換された化合物が、特に好ましい。
【００２５】
核酸塩基の８位にハロゲン又は４−クロロフェニルチオ基を有する式ＩＩによる構造も同様に好ましい。
【００２６】
好ましい金属カチオンは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋である。
【００２７】
環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェート化合物は、米国特許第５，６２５，０５６号に記載されるように、さらに修飾されてもよい。
【００２８】
さらに、本発明のナノ容器のための環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェートは、米国特許第５，６２５，０５６号、国際公開第２０１２／１３０８２９号、Ｓｅｋｈａｒら（１９９２、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４２：１０３〜１０８）及びＭｉｌｌｅｒら（１９７３、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：５３１０〜５３１９）に記載されるように取得してもよい。
【００２９】
エクアトリアル残基Ｌが硫黄である場合、対応する環状グアノシン−３’，５’−モノホスホロチオエート化合物（ｃＧＭＰＳ）は、リンにおいてＲｐ配置であり、エクアトリアル残基Ｌがボラノ基である場合、対応する環状グアノシン−３’，５’−モノボラノホスフェート化合物（ｃＧＭＰＢ）は、リンにおいてＳｐ配置である。
【００３０】
アキシアル残基Ｍが硫黄である場合、対応する環状グアノシン−３’，５’−モノホスホロチオエート化合物は、リンにおいてＳｐ配置であり、アキシアル残基Ｍがボラノ基である場合、対応する環状グアノシン−３’，５’−モノボラノホスフェート化合物は、リンにおいてＲｐ配置である。
【００３１】
本発明によるＳｐ配置ｃＧＭＰＳ化合物及びＲｐ配置ｃＧＭＰＢ化合物を含む環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェートは、プロテインキナーゼＧアイソザイム並びに環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェート開口性イオンチャネルの活性化因子と考えられる。
【００３２】
本発明によるＲｐ配置ｃＧＭＰＳ化合物及びＳｐ配置ｃＧＭＰＢ化合物は、プロテインキナーゼＧアイソザイムの阻害剤及び環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェート開口性イオンチャネルの活性化因子と考えられる。
【００３３】
本発明によれば、式ＩＩの化合物は、環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェート開口性イオンチャネルの阻害剤と考えられる。
【００３４】
本発明によれば、式ＩＩによるＳｐ配置ｃＧＭＰＳ化合物及び式ＩＩによるＲｐ配置ｃＧＭＰＢ化合物は、プロテインキナーゼＧアイソザイムの活性化因子である一方で、環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェート開口性イオンチャネルの阻害剤と考えられる。
【００３５】
本発明によれば、式ＩＩによるＲｐ配置ｃＧＭＰＳ化合物及び式ＩＩによるＳｐ配置ｃＧＭＰＢ化合物は、プロテインキナーゼＧアイソザイム及び環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェート開口性イオンチャネルの両方の阻害剤と考えられる。
【００３６】
本発明の好ましいナノ容器では、環状グアノシン−３’，５’−モノホスホロチオエートは、Ｒｐ配置であり、式ＩＩＩ：
【化１０】
0006744046.tif 000011
（式中、ナトリウムカチオンは、任意の他の薬学的に許容されるカチオンでありえ、例えば、プロトン又は別の生理学的に許容される金属カチオン若しくはトリアルキルアンモニウムイオンでありうる）の環状グアノシン−３’，５’−モノホスホロチオエートである。式ＩＩＩは、「β−フェニル−１，Ｎ２−エテノ」（ＰＥＴ）修飾を有する化合物も例示している。
【００３７】
この好ましい環状グアノシン−３’，５’−モノホスホロチオエートは、略式科学的名称のＲｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳとして、又は本明細書の実施例におけるＤＦ００３としても参照される。完全な科学的名称は、ＩＵＰＡＣ命名法に従って求められるナトリウム、３−［（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＳ）−７−ヒドロキシ−２−オキシド−２−スルファニリデン−４ａ，６，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，２−ｄ］［１，３，２］ジオキサホスフィニン−６−イル］−２−ブロモ−６−フェニル−５Ｈ−イミダゾ［１，２−ａ］プリン−９−オンである。Ｒｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳは、ＢＩＯＬＯＧ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｒｅｍｅｎ、ドイツ、から市販される（カタログ番号：Ｐ００７  ＣＡＳ番号：［１７２８０６−２０−１］）。好ましい実施形態では、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳは、遠隔装填によりリポソーム内に封入されており、Ｃａ２＋が、リポソーム内部の対カチオンとして最も好ましい（下記参照）。
【００３８】
本発明の別の好ましいナノ容器では、環状グアノシン−３’，５’−モノホスホロチオエートは、Ｒｐ配置であり、式ＩＶ：
【化１１】
0006744046.tif 000012
の環状グアノシン−３’，５’−モノホスホロチオエートである。
【００３９】
この好ましい環状グアノシン−３’，５’−モノホスホロチオエートは、略式の科学的名称のＲｐ−８−ｐＣＰＴ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳとしても参照される。Ｒｐ−８−ｐＣＰＴ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳは、ＢＩＯＬＯＧ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｒｅｍｅｎ、ドイツ、から市販される（カタログ番号：Ｃ０４６、ＣＡＳ番号：［１２６２７４９−６２−１］）。
【００４０】
本発明によれば、ナノ容器は、環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェート化合物で装填される。
【００４１】
好ましい実施形態からの化合物の選択は、調節される（１つ又は複数の）標的結合タンパク質によって支配される。
【００４２】
環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェート依存性プロテインキナーゼの活性化が本発明による課題である場合には、ナノ容器の好ましい装填は、リンにおいて何ら修飾を有しないｃＧＭＰ化合物、又はＳｐ配置ｃＧＭＰＳ化合物若しくはＲｐ配置ｃＧＭＰＢ化合物である。
【００４３】
環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェート依存性プロテインキナーゼの阻害が本発明による生物学的課題である場合には、ナノ容器の好ましい装填は、Ｒｐ配置ｃＧＭＰＳ化合物又はＳｐ配置ｃＧＭＰＢ化合物である。
【００４４】
環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェート開口性イオンチャネルの活性化が本発明による課題である場合は、ナノ容器の好ましい装填は、何らＰＥＴ修飾を有しないｃＧＭＰ化合物又はｃＧＭＰＳ化合物若しくはｃＧＭＰＢ化合物である。
【００４５】
環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェート依存性プロテインキナーゼ及び環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェート開口性イオンチャネルの同時活性化が本発明による課題である場合は、ナノ容器の好ましい装填は、ｃＧＭＰ化合物又は何らＰＥＴ修飾を有しないＳｐ配置ｃＧＭＰＳ化合物若しくはＲｐ配置ｃＧＭＰＢ化合物である。
【００４６】
環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェート依存性プロテインキナーゼ及び環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェート開口性イオンチャネルの同時阻害が本発明による課題である場合は、ナノ容器の好ましい装填は、ＰＥＴ修飾を有するＲｐ配置ｃＧＭＰＳ化合物又はＰＥＴ修飾を有するＳｐ配置ｃＧＭＰＢ化合物である。
【００４７】
活性化環状グアノシン−３’，５’−モノホスフェートアナログのさらなる例としては、８−ブロモグアノシン−３’，５’−環状モノホスフェート（８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ）、８−（２，４−ジヒドロキシフェニルチオ）グアノシン−３’，５’−環状モノホスフェート（８−ｏ，ｐＤＨＰＴ−ｃＧＭＰ）、８−（２−アミノフェニルチオ）グアノシン−３’，５’−モノホスフェート（８−ＡＰＴ−ｃＧＭＰ）、８−（４−ヒドロキシフェニルチオ）グアノシン−３’，５’−環状モノホスフェート（８−ｐＨＰＴ−ｃＧＭＰ）、８−（４−アミノフェニルチオ）グアノシン−３’，５’−モノホスフェート（８−ｐＡＰＴ−ｃＧＭＰ）、８−（４−クロロフェニルチオ）−β−フェニル−１，Ｎ２−エテノグアノシン−３’，５’−環状モノホスフェート（８−ｐＣＰＴ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰ）、８−（４−クロロフェニルチオ）グアノシン−３’，５’−環状モノホスフェート（８−ｐＣＰＴ−ｃＧＭＰ）、８−（２，４−ジクロロフェニルチオ）グアノシン−３’，５’−環状モノホスフェート（８−ｏ，ｐＤＣｌＰＴ−ｃＧＭＰ）、８−（４−メトキシフェニルチオ）グアノシン−３’，５’−環状モノホスフェート（８−ｐＭｅＯＰＴ−ｃＧＭＰ）、８−ブロモ−β−フェニル−１，Ｎ２−エテノグアノシン−３’，５’−環状モノホスフェート（８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰ）、８−ブロモ−（２−ナフチル−１，Ｎ２−エテノ）グアノシン−３’，５’−環状モノホスフェート（８−Ｂｒ−（２−Ｎ）ＥＴ−ｃＧＭＰ）、８−（４−ヒドロキシフェニルチオ）−β−フェニル−１，Ｎ２−エテノグアノシン−３’，５’−環状モノホスフェート（８−ｐＨＰＴ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰ）、８−（４−クロロフェニルチオ）−β−フェニル−１，Ｎ２−エテノグアノシン−３’，５’−環状モノホスフェート（８−ｐＣＰＴ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰ）、２−ナフチル−１，Ｎ２−エテノグアノシン−３’，５’−環状モノホスフェート（（２−Ｎ）ＥＴ−ｃＧＭＰ）、β−フェニル−１、Ｎ２−エテノグアノシン−３’，５’−環状モノホスフェート（ＰＥＴ−ｃＧＭＰ）、４−メトキシ−β−フェニル−１，Ｎ２−エテノグアノシン−３’，５’−モノホスフェート（ｐＭｅＯ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰ）及びその薬学的に許容される塩が挙げられ、ここでカチオンは、任意の生理学的に許容される金属カチオン又はトリアルキルアンモニウムイオンでありえ、例えば、ナトリウム又はカルシウム塩でありうる。
【００４８】
グルタチオントランスポーターに対する標的化のためのリガンド
本発明によるナノ容器は、トランスポーターを発現している細胞へ、細胞内へ及び／又は細胞を渡してナノ容器を標的化するための、グルタチオン（ＧＳＨ）トランスポーターに対するリガンドを含む。したがって、ＧＳＨトランスポーターは、リガンド及びリガンドを含むナノ容器の、トランスポーターを発現している標的細胞内への及び／又は同細胞を通じた特異的結合、エンドサイトーシス及びトランスサイトーシスのうちの少なくとも１つを媒介することが好ましい。トランスポーター又は受容体媒介送達は、近年開発された有望な標的化薬物送達技術の１つである。この技術は、薬物又は薬物担体にコンジュゲートされるリガンドに対する受容体／トランスポーターを発現している標的細胞に特異性の高い送達を行うという潜在的利点を有する。低分子量でポリペプチド及び核酸ベースの治療剤又は診断剤並びにこれらの治療剤又は診断剤を含むナノ容器の、細胞及び組織への特異的標的化は、トランスポーター／受容体媒介送達の使用を介して大きく増強されうる。
【００４９】
一実施形態では、本発明のナノ容器におけるリガンドは、血液組織関門、例えば、血液眼関門、つまり網膜及び虹彩、毛様体上皮及び網膜色素上皮（ＲＰＥ）の毛細血管の内皮によって生成されている関門の内皮細胞に発現しているＧＳＨトランスポーターに対するリガンドである。血液組織関門は、以下を含む：血液水性関門（ｂｌｏｏｄ−ａｑｕｅｏｕｓ  ｂａｒｒｉｅｒ）、虹彩の毛様体上皮及び毛細血管、血液網膜関門（ＢＲＢ）：網膜循環の非有窓性毛細血管、脈絡毛細血管から網膜への大分子の通過を抑制する網膜色素上皮細胞間のタイトジャンクション、血液精巣関門、血液胎盤関門、並びに血液ＣＮＳ関門、例えば、血液脳関門、血液脳脊髄液（ＣＳＦ）関門、軟膜血管ＣＳＦ関門、脳室上皮及びグリア境界膜、血液神経関門、及び血液脊髄関門。好ましいリガンドは、血液網膜関門の内皮細胞に発現しているＧＳＨトランスポーターに対するリガンドである。リガンドの使用により、網膜疾患の処置のための、網膜へ標的化された薬剤の特異的送達又は特異的に増強された送達が可能になる。さらに受容体媒介標的化は、薬物動態及び薬物体内分布特性を大きく向上させるために非特異的薬物送達系（タンパク質コンジュゲート、ＰＥＧ化、ナノ粒子、リポソームなど）と組み合わせてもよく、これにより、薬物が受容体発現細胞、組織及び器官、例えば、網膜、ＣＮＳ、血液脳関門（ＢＢＢ）、胎盤及び精巣などの特別な血液組織関門に保護されている細胞、組織及び器官へ、特異的に顕著に再指向化される。
【００５０】
したがって、好ましい実施形態では、本発明のナノ容器に組み込まれることになるリガンドは、標的細胞の内在性ＧＳＨトランスポーターに対するリガンドである。リガンドは、好ましくは脊椎動物標的細胞のＧＳＨトランスポーター、より好ましくは哺乳動物標的細胞のＧＳＨトランスポーター、最も好ましくはヒト標的細胞のＧＳＨトランスポーターに対するリガンドである。リガンドは、ＧＳＨトランスポーターに特異的に結合するリガンドであることが好ましい。リガンドは、Ｋａｎｎａｎら（２０００、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８５２（２）：３７４−８２）に記載のヒト脳血管性内皮細胞に存在するようなＮａ依存性ＧＳＨトランスポーターに特異的に結合することがより好ましい。用語「特異的結合」、例えば、リガンドのトランスポーターに対する特異的結合は、本明細書で使用するとき、非特異的相互作用と測定可能に異なっている結合を意味する。特異的結合は、例えば、分子（リガンド）の結合を、対照分子（対照リガンド）の結合と比較して決定することにより測定することができ、ここで、対照分子（対照リガンド）は、一般に、同様の構造を有するが結合活性を有しない分子であり、例えば、同様の大きさであるが特異的結合配列を欠失しているペプチドである。特異的結合は、リガンドが、受容体に対して、対照リガンドが有する親和性よりも測定可能に高い親和性を有する場合に存在する。結合の特異性は、例えば、標的に対する結合が既知の対照リガンドとの競合によって、決定することができる。用語「特異的結合」は、本明細書で使用するとき、低親和性及び高親和性特異的結合の両方を含む。特異的結合は、例えば、少なくとも約１０−４ＭのＫｄを有する低親和性標的化剤によって示すことができる。例えば、受容体が、リガンドに対して２以上の結合部位を有する場合、低親和性を有するリガンドは、微小血管内皮を標的化するために有用でありうる。また特異的結合は、高親和性リガンド、例えば、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、少なくとも約１０−１０ＭのＫｄを有するリガンドによって示すこともでき、少なくとも約１０−１１Ｍ又は１０−１２Ｍ以上のＫｄを有しうる。低親和性及び高親和性標的化リガンドの両方が、本発明のナノ容器に組み込まれるために有用である。
【００５１】
トランスポーターへのリガンドの特異的結合は、好ましくは、本明細書で上記に定義される通りである。別の実施形態では、リガンドは、Ｇａｉｌｌａｒｄら（２００１、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．１２（３）：２１５−２２２）に記載されるようなＢＢＢの細胞培養モデル（初代単離ウシ脳毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）を使用）、又はＷｉｓｎｉｅｗｓｋａ−Ｋｒｕｋら（２０１２、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．９６（１）：１８１−９０））に記載されるようなＢＲＢの細胞培養モデル（初代単離ウシ網膜内毛細血管内皮細胞（ＢＲＥＣ）を使用）、又は、例えば、ヒト大脳毛細血管内皮細胞株（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３）、ＲＢＥ４細胞、又はＭＤＣＫ細胞を標的細胞として使用する同様のモデルによりアッセイすることができる、標的細胞内へ及び／又は標的細胞を通じてエンドサイトーシス及び／又はトランスサイトーシスされるリガンドである。標的細胞内へ及び／又は標的細胞を通じてエンドサイトーシス及び／又はトランスサイトーシスされるリガンドは、本明細書において、ＢＣＥＣ又はＭＤＣＫ標的細胞に対してリガンドを添加した後１５、３０又は６０分又は１、２、４、８又は１８時間以下で測定するとき、ａ）ＧＳＨトランスポーターの発現が欠失している細胞、ｂ）過剰な遊離ＧＳＨで前処置されている細胞、及びｃ）ＧＳＨ部分を欠く参照化合物から選択される対照条件と比較して、少なくとも５、１０、２０又は５０％増強された速度で、標的細胞内へ及び／又は標的細胞を通じてエンドサイトーシス及び／又はトランスサイトーシスされるリガンドと定義される。代替的に、ＧＳＨトランスポーター標的化リガンドのエンドサイトーシス及び／又はトランスサイトーシスは、例えばリガンドにコンジュゲートされる近赤外色素又は放射活性標識を使用したｉｎ  ｖｉｖｏ生体イメージング技術により、所与の時間点でのリガンドのＣＮＳ滞留面積（関心領域（ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＲＯＩ）画素定量に基づく）が、適当な対照条件と比較（例えば、ＧＳＨ部分を欠く参照化合物と比較）して、少なくとも１０、２０又は５０％増強されることでアッセイされうる。
【００５２】
本発明に従って使用するための、ＧＳＨトランスポーターに結合する好ましいリガンドとしては、例えば、グルタチオン（ＧＳＨ又はガンマ−グルタミルシステイニルグリシン）、Ｓ−（ｐ−ブロモベンジル）グルタチオン、ガンマ−（Ｌ−ガンマ−アザグルタミル）−Ｓ−（ｐ−ブロモベンジル）−Ｌ−システイニルグリシン、Ｓ−ブチルグルタチオン、Ｓ−デシルグルタチオン、還元型グルタチオンエチルエステル、グルタチオンスルホン酸、Ｓ−ヘキシルグルタチオン、Ｓ−ラクトイルグルタチオン、Ｓ−メチルグルタチオン、Ｓ−（４−ニトロベンジル）グルタチオン、Ｓ−オクチルグルタチオン、Ｓ−プロピルグルタチオン、ｎ−ブタノイルガンマ−グルタミルシステイニルグリシン（略称ＧＳＨ−Ｃ４でも知られる）又はそのエタノイル、ヘキサノイル、オクタノイル若しくはドデカノイル誘導体（それぞれ略称ＧＳＨ−Ｃ２、ＧＳＨ−Ｃ６、ＧＳＨ−Ｃ８及びＧＳＨ−Ｃ１２でも知られる）、ＧＳＨモノイソプロピルエステル（Ｎ−（Ｎ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル）グリシン１−イソプロピルエステル硫酸塩一水和物又はＹＭ７３７でも知られる）並びに米国特許第６，７４７，００９号に記載の式Ｖ：
【化１２】
0006744046.tif 000013
（式中、Ｚ＝ＣＨ２及びＹ＝ＣＨ２、又はＺ＝Ｏ及びＹ＝Ｃ＝Ｏであり、
Ｒｉ及びＲ２が独立して、Ｈ、直鎖若しくは分岐のアルキル（１〜２５Ｃ）、アラルキル（６〜２６Ｃ）、シクロアルキル（６〜２５Ｃ）、複素環（６〜２０Ｃ）、エーテル又はポリエーテル（３〜２５Ｃ）からなる群から選択され、ここでＲ１−Ｒ２は一緒になって、２〜２０Ｃ原子を有し、式１の残部と共に大環状分子を形成し、
Ｒ３が、Ｈ及びＣＨ３からなる群から選択され、
Ｒ４が、６〜８Ｃアルキル、ベンジル、ナフチル及び治療的に活性な化合物からなる群から選択され、
Ｒ５が、Ｈ、フェニル、ＣＨ３−及びＣＨ２−フェニルからなる群から選択される）
のＧＳＨ誘導体又はその薬学的に許容される塩からなる群から選択されるリガンドが挙げられる。
【００５３】
好ましい実施形態では、上記式におけるＲ３がＨである。さらに好ましい実施形態では、上記式ＩＶにおけるＲ４がベンジルである。またさらに好ましい実施形態では、上記式ＩＶにおけるＲ５がフェニルである。
【００５４】
本発明の好ましい一実施形態では、リガンドは、Ｎ末端アミノ酸残基、つまりグルタミン酸残基のアミン基を介してコンジュゲート又は合成される。
【００５５】
本発明の別の好ましい実施形態では、リガンドは、Ｃ末端アミノ酸残基、つまりグリシン残基のカルボキシル基を介してコンジュゲート又は合成される。
【００５６】
本発明のさらに別の好ましい一実施形態では、リガンドは、システイン残基のチオール（ＳＨ）基を介してコンジュゲート又は合成される。
【００５７】
ナノ容器
本発明のナノ容器内のリガンドは、好ましくは、治療剤又は診断剤を含む薬学的に許容されるナノ容器にコンジュゲートされる。そのようなコンジュゲートでは、治療剤又は診断剤は、例えば、ナノ粒子、リポソーム又はナノゲルなどのナノ容器内に封入されていてもよく、リガンドは、そのようなナノ容器に、好ましくはコンジュゲートして結合されている。ナノ容器へのコンジュゲーションは、直接的であってもよく、又は周知のポリマーコンジュゲーション剤、例えば、スフィンゴミエリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）若しくは他の有機ポリマーのいずれかを介するものであってもよい。硝子体内注射ナノ容器では、コンジュゲートされるリガンドを有しないナノ容器も使用することができる。標的化（ＰＥＧ）リポソームを含む医薬組成物の製造の詳細は、例えば、米国特許第６，３７２，２５０号に記載されている。したがって、好ましい実施形態では、本発明によるナノ容器は、担体タンパク質、リポソーム、ポリプレックスシステム、リポプレックスシステム、及びポリエチレングリコールのうちの少なくとも１つである。
【００５８】
本発明による治療剤又は診断剤の封入及びリガンドへのコンジュゲーションのための好ましいナノ容器は、リポソームである。本発明のナノ容器で使用するために適切なリポソームとしては、ベシクル形成脂質で主に構成されているリポソームが挙げられる。リン脂質によって例示されるベシクル形成脂質は、水中で、生理学的ｐＨ及び温度で、自発的に二重層ベシクルに形成される。リポソームは、内部、つまり二重膜の疎水性領域と接触する疎水性部分と、外部、つまり二重膜の極性表面の方に向けられた頭部基部分とを有する、脂質二重層に組み込まれた他の脂質を含んでもよい。ベシクル形成脂質は、好ましくは、２つの炭化水素鎖、典型的にはアシル鎖と、極性又は非極性の頭部基とを有する。様々なジアシル合成ベシクル形成脂質及び天然ベシクル形成脂質があり、例えば、リン脂質、ジグリセリド、二脂肪鎖（ｄｉａｌｉｐｈａｔｉｃ）糖脂質、単一脂質、例えばスフィンゴミエリン及びスフィンゴ糖脂質、コレステロール及びそれらの誘導体があり、単独又は組合せ、及び／又はリポソーム膜硬化剤を含むもの又は含まないものがある。本明細書で定義されるとき、「リン脂質」は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、スフィンゴミエリン、プラスマロゲン及びホスファチジルコリン脂質誘導体を含み、ここで２つの炭化水素鎖は、典型的に約１４〜２２個の炭素原子長であり、様々な不飽和度を有する。
【００５９】
高転移温度を有する脂質の使用並びにコレステロール（ＣＨＯＬ）及び脂質コンジュゲート、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）の組込みにより、血液循環中又は細胞外環境における封入薬物の漏出が顕著に低下する。さらに脂質は、リポソームと血清タンパク質（オプソニン）との間の非特異的相互作用を減少させ、したがって細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞によるリポソームクリアランスを防止し、系と標的細胞との相互作用を最適化する循環時間を増加させる（Ａｌｌｅｎ、１９８７；Ｇａｂｉｚｏｎ、１９９２）。３７℃以上の相転移温度を有するリン脂質の例としては、例えば、水素添加精製卵ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ；相転移温度：５０〜６０℃）、水素添加精製大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ；相転移温度：およそ５５℃）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；相転移温度：およそ４１℃）、及びジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ；相転移温度：およそ５８℃）が挙げられる。これらのうちで、ＨＳＰＣがより好ましい。これらのリン脂質は、単独で又は２種以上の組合せで使用してもよい。本発明で使用するリポソームは、さらに安定化剤、例えばコレステロール又はコレステロール誘導体を含んでもよい。コレステロール誘導体とリン脂質との間のモル比は、好ましくは１：０．３〜３、より好ましくは１：１〜２．５、最も好ましくは１：１．２〜１．８、又は約１：１．５である。
【００６０】
リポソームの平均の大きさは、好ましくは５０〜２００ｎｍ、より好ましくは８０〜１５０ｎｍ、最も好ましくは１００〜１２０ｎｍであり、多分散度（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ、ＰｄＩ）は、０．２、０．１５又は０．１未満である。
【００６１】
リポソームは、２つの方法、つまり、受動及び能動（遠隔）装填により、有効成分を装填することができる。リポソーム脂質二重層は、半透過性の関門であり、荷電分子及び大きい非荷電の分子の拡散を阻止する一方で、小さい非荷電の物質を自由に透過させることができる。受動装填では、膜不透過性薬物は、リポソーム製造工程の間に水和液に溶解される。水溶液が脂質混合物に添加されると、脂質二重層が生じ、部分的に薬物溶液を封入してリポソームを形成する。薬物溶液のほとんどは外部溶液に残り、透析又はクロマトグラフィーにより除去する必要がある。受動封入は、リポソーム捕捉体積及び薬物溶解性により制限される。したがって、封入効率（ＥＥ）が低く、通常５％を超えない。しかし、原理的に、あらゆる有効成分を受動装填により封入することができる。それゆえ、能動（遠隔）装填が好ましい。能動装填では、例えば欧州特許第０８２５８５２号に記載されているように、薬物は、リポソームの形成後に能動的方法で封入され、これにより、１００％に近い効率での捕捉が可能となる。しかしながら、両親媒性、弱酸又は塩基性の薬物のみが遠隔装填に適する。これらの分子の封入は、イオン化された分子が、イオン化されていない種と比較して、膜透過しにくいという事実に基づく。それゆえ、ｐＨ勾配により薬物のリポソーム内イオン化を誘発し、化合物の捕捉を生じさせ、高いリポソーム内外薬物濃度比を導く。本明細書の実施例に示されるように、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳは、能動装填により、リポソーム内に効率的に封入させることができる。
【００６２】
リガンドは、本発明のナノ容器に、直接的に、又は任意のコンジュゲーション剤、好ましくはポリマーコンジュゲーション剤を介して、コンジュゲートさせることができる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、好ましいコンジュゲーション剤である。ＰＥＧは、好ましくは、約６〜２１０の重合数（ｎ）を有する。コンジュゲーション剤の分子量は、好ましくは３００〜５０，０００Ｄａ、より好ましくは７５０〜１０，０００Ｄａ、最も好ましくは１，０００〜５，０００Ｄａ、例えば、約２０００Ｄａである。
【００６３】
好ましいコンジュゲーション剤は、一端に脂質、他端にＧＳＨトランスポーターに対するリガンドを有する二官能性コンジュゲーション剤である。ＰＥＧの脂質端は、脂質二重層との相互作用により及び／又は脂質二重層内への挿入により、コンジュゲーション剤をリポソームへ付着させる。コンジュゲーション剤の脂質端は、ビタミンＥ誘導体又はリン脂質を含むことができる。好ましいビタミンＥ誘導体は、例えば、欧州特許第０５２９２８２０号に記載されている。コンジュゲーション剤の脂質端でのリン脂質は、以下の式を有しうる：
【化１３】
0006744046.tif 000014
【００６４】
式（ＶＩ）では、Ａｉが、スフィンゴシンであり、Ｒｉが、オクタノイル又はパルミトイルを含みうる。式（ＶＩＩ）では、Ａ２が、ホスホエタノールアミンであり、Ｒ２及びＲ３が、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル又はオレオイルを含みえ、Ｒ２及びＲ３が、同じであっても異なってもよい。ＰＥＧが、式（ＶＩ）によって表されるリン脂質誘導体に結合するとき、好ましくは約７５０〜５，０００Ｄａの分子量を有し、ＰＥＧが、式（ＶＩＩ）によって表されるリン脂質誘導体に結合するとき、好ましくは約３５０〜５，０００Ｄａの分子量を有する。
【００６５】
脂質端の反対側の端において、ＰＥＧは、好ましくは、ＧＳＨトランスポーターに対するリガンドに共有結合的に連結するためのカルボン酸、マレイミド又はアミドを含むように誘導体化される。好ましいコンジュゲーション剤は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリエチレングリコール−マレイミド（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）を、マレイミド反応性チオール基を有するＧＳＨ受容体に対するリガンドと反応させることにより取得される。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミドは、例えば１，０００、２，０００、３，４００、５，０００、１０，０００及び２０，０００の分子量で市販されており、中でもＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−マレイミドが好ましい。
【００６６】
５〜１０００のコンジュゲーション剤が、各リポソームにコンジュゲートされることが好ましい。少なくともおよそ１０、２０、３０又は４０のコンジュゲーション剤、及び２００、１００又は５０を超えないコンジュゲーション剤が、各リポソームにコンジュゲートされることがより好ましい。
【００６７】
ナノ容器の使用
さらなる態様では、本発明のナノ容器は、医薬として使用する。
本発明のナノ容器は、好ましくは、ｃＧＭＰ作動性細胞標的の調節不全に関連する病理、状態又は障害の処置及び／又は予防のために使用され、好ましくは、標的は、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ）及びｃＧＭＰ開口性チャネル（ＣＮＧＣ）のうちの少なくとも１つである。Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｎｎｅｒ（２０１２、Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、３８５：２４３−２５２）及びＷｏｌｆｅｒｔｓｔｅｔｔｅｒら（２０１３、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ２０１３、６：２６９−２８６）は、ＰＫＧ及びＣＮＧＣのうちの少なくとも１つ又は両方の阻害又は活性化が、特定の病理、状態又は障害の処置における適切な生物学的課題であるかを検討している。これに従って、様々なアナログに対して、上記に示した生物学的課題を実施することができるｃＧＭＰアナログが選択されうる。本明細書において、病理、状態又は障害の処置は、特に他のことが指示されない限り、明確に言及されていない場合でも、病理、状態又は障害の予防も含まれると理解されるべきである。
【００６８】
本発明のナノ容器は、網膜の疾患又は状態の処置又は予防のために使用することが好ましい。網膜の疾患及び状態は、ＰＫＧ及びＣＮＧＣのうちの少なくとも１つ、例えば、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳ及びＲｐ−８−ｐＣＰＴ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳを阻害するｃＧＭＰアナログを含む本発明のナノ容器で処置されることが好ましい。網膜の疾患及び状態としては、網膜の希少遺伝性疾患、例えば、網膜色素変性症、スターガルト（Ｓｔａｒｇａｒｄｔ）病、黄色斑眼底、若年性ベスト病、成人性偽卵黄様ジストロフィー（ａｄｕｌｔ  ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｆｏｖｅｏｍａｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（成人性卵黄様変性（ａｄｕｌｔ  ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ））、家族性ドルーゼン（ノースカロライナ黄斑ジストロフィー）、ビエッティ（Ｂｉｅｔｔｉ）結晶状ジストロフィー、進行性錐体ジストロフィー、アルポート（Ａｌｐｏｒｔ）症候群、家族性良性網膜色素斑、レーバー（Ｌｅｂｅｒ）先天性黒内障、先天性単色型色覚及び遺伝性黄斑ジストロフィーが挙げられる。
【００６９】
加えて、本発明のこれらのナノ容器、好ましくはＰＫＧ及びＣＮＧＣのうちの少なくとも１つ、例えば、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳ及びＲｐ−８−ｐＣＰＴ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳなどを阻害するｃＧＭＰアナログを含むナノ容器は、いくつかの代謝性及び神経変性疾患、様々な症候群、及び他の眼疾患で生じる続発性網膜色素変性症を処置するために使用することができ、例えば、網膜色素変性症及び聴覚損失は、特有の全身症状を有するアッシャー（Ｕｓｈｅｒ）症候群、ワールデンブルグ（Ｗａａｒｄｅｎｂｕｒｇ）症候群、アルストレム（Ａｌｓｔｒｏｍ）症候群、アルポート症候群、レフサム（Ｒｅｆｓｕｍ）症候群及び他の全身状態とも関連しており、低身長、腎機能不全及び多指症は、色素性網膜症と関連するとき、バルデ・ビードル（Ｂａｒｄｅｔ−Ｂｉｅｄｌ）症候群又はローレンス・ムーン（Ｌａｕｒｅｎｃｅ−Ｍｏｏｎ）症候群の一部の徴候であり、ムコ多糖症は、網膜色素変性症と関連している場合があり（例えば、ハーラー（Ｈｕｒｌｅｒ）症候群、シャイエ（Ｓｃｈｅｉｅ）症候群、サンフィリッポ（Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ）症候群）、並びにミトコンドリア障害カーンズ・セイヤー（Ｋｅａｒｎｓ−Ｓａｙｒｅ）症候群が挙げられる。上記で言及した疾患に加えて、フリードライヒ運動失調症、ムコ多糖症、筋ジストロフィー（筋緊張性ジストロフィー）、バッテン（Ｂａｔｔｅｎ）症候群、バッセン・コーンツヴァイク（Ｂａｓｓｅｎ−Ｋｏｒｎｚｗｅｉｇ）症候群、ホモシスチン尿症、シュウ酸症、眼及び網膜の外傷、網膜色素上皮変化を有する緑内障、末期クロロキン網膜症、末期チオリダジン網膜症、末期梅毒性視神経網膜炎、並びにがん関連網膜症が含まれる。本発明のこれらのナノ容器は、網膜の他の一般的疾患、例えば、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症、黄斑円孔／パッカー、眼悪性病変、例えば網膜芽腫、網膜剥離及び河川盲目症／オンコセルカ症を処置するために使用することもできる。
【００７０】
さらに、本発明のナノ容器は、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ）及びｃＧＭＰ開口性チャネル（ＣＮＧＣ）のうちの少なくとも１つの調節不全に関わる全く異なる状態、例えば、神経性又は神経変性障害、嗅覚脱失、炎症性及び神経障害性疼痛、軸索再生及び脊髄損傷後回復（Ｈｅｎｋｉｎら、２００８、Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｍｅｄ．３１：Ｅ７８−８４；Ｓｃｈｍｉｄｔｋｏら、２００８、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８：８５６８−７６；Ｔｅｒ−Ａｖｅｔｉｓｙａｎら、２０１４、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３４：７３７−４７；Ｓｅｎｔｕｒｋら、２０１４：Ｂｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７：１−６）を処置するために使用することができる。また心血管疾患、高血圧（ＰＫＧ活性化剤）、低血圧（ＰＫＧ阻害剤）、狭心症、肺高血圧症、勃起不全、虚血発作、アテローム性動脈硬化、急性ショック、及びがん（例えば、Ｗａｎｇら、２０１２、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：３５８７−３５９８；Ｋａｒａｋｈａｎｏｖａら、２０１４、Ｐａｎｃｒｅａｓ、４３：７８４−７９４；Ｆｒａｎｃｉｓら、２０１０、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．６２：５２５−６３を参照）を処置するために使用することもできる。さらに、寄生虫の生存がＰＫＧ活性に決定的に依存する特定の寄生虫疾患、例えばマラリア、睡眠疾患（アフリカ睡眠病）及びシャーガス病（Ｔａｙｌｏｒら、２０１０、Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｃｅｌｌ．９：３７−４５）が挙げられる。
【００７１】
別の態様では、本発明は、本発明のナノ容器（を含む医薬組成物）の治療的又は予防的有効量を、予防又は治療を必要とする対象に投与することによる、上記病理、状態又は障害のいずれかを処置又は予防する方法に関する。
【００７２】
本発明のナノ容器の、血液眼関門への及び血液眼関門を渡るＧＳＨ標的化により、ナノ容器の全身投与並びに治療剤及び／又は診断剤の網膜への効率的な送達が可能となる。したがって、本発明のナノ容器は、好ましくは、全身的に又は血流を通して投与される。代替的に、又は加えて、本発明のナノ容器は、局所的に投与されうる。
【００７３】
本発明のナノ容器は、非経口的に投与されることが好ましい。ナノ容器の投与のための非経口経路は、既知の方法に従い、例えば、好ましくは静脈内、腹腔内又は動脈内経路による注射又は注入である。代替的に、不必要な全身曝露を予防するために、ナノ容器、例えばリポソームを、例えば眼の後ろの脈絡毛細血管に直接送達させる上脈絡膜又は眼球後注射を使用してもよい。非経口投与の別の代替的経路は、硝子体内直接注射である。この場合に、ＧＳＨ−コンジュゲートされたナノ容器を使用してもよいが、標的化リガンドを有しないナノ容器、例えばＰＥＧ化リポソームを利用してもよく、その理由は、そのような場合にナノ容器は貯蔵所として作用し、封入された薬物を作用部位でゆっくりと放出することができ、それにより反復投与の必要性を減少させ、又は反復投与の頻度を減少させることを可能にする。
【００７４】
代替的に、又は加えて、ナノ容器は、表面適用又は眼適用により投与される。ナノ容器は、従来の点眼剤を使用して投与されることが好ましい。
【００７５】
さらなる態様では、本発明は、医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、本明細書で上記に定義されるナノ容器を含む。組成物は、好ましくはさらに、当該分野で一般的に知られる薬学的に許容される担体、媒体又は送達ビヒクルを含む。薬学的に許容される溶媒、安定化剤、浸透圧剤、緩衝剤、分散剤なども、医薬組成物に組み込むことができる。好ましい形態は、意図する投与様式及び治療適用に依存する。薬学的担体は、有効成分、つまり、本発明のナノ容器を、患者又は対象に送達させるために適切な任意の適合性のある非毒性物質でありうる。
【００７６】
非経口投与のためのナノ容器を用いた調製は、無菌でなければならない。滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前又は後の、無菌濾過膜を通じた濾過により容易に達成される。ナノ容器は、注入又はボーラス注射により連続的に投与される。静脈内注入のための典型的組成物は、任意選択で２０％アルブミン溶液により補足された１０〜５００ｍｌの無菌０．９％ＮａＣｌ又は５％グルコースと、必要量のナノ容器とを含むように構成されうる。代替的に、ナノ容器は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させてもよい。静脈内、腹腔内又は動脈内注射のための典型的な医薬組成物は、例えば、１〜１０ｍｌの無菌の生理学的緩衝水溶液と、必要量の本発明のナノ容器とを含むように構成される。非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は、当該分野で周知であり、様々な情報源において、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｅｄ．ＡＲ  Ｇｅｎｎａｒｏ、２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２０００、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、ＰＡ、ＵＳＡ；参照によりその全体が全ての目的のために組み込まれる）において詳細に記載されている。
【００７７】
本発明のナノ容器は、好ましくは、０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇの用量で、１又は２日あたり１回投与される。投与範囲は、１又は２日あたり１回で、少なくとも０．１、０．２、０．５、１、２、１０、２０、５０若しくは１００ｍｇ／ｋｇの下限、及び１又は２日あたり１回で１０００、５００、２００若しくは１００ｍｇ／ｋｇ以下の上限を有することが好ましい。示された用量は、ナノ容器に含まれる治療剤（例えば、ｃＧＭＰアナログ）の量に相当し、ナノ容器組成物全体には相当しない。代替的に、本発明のナノ容器は、２週間に１回又は６週間に１回、硝子体内投与される。硝子体内注射のための投与範囲は、６週間に１回で、少なくとも２５μｌ（２ｍｇ／ｍｌ）の下限、及び２週間に１回で、２００μｌ（４ｍｇ／ｍｌ）以下の上限を有することが好ましい。
【００７８】
治療適用について、本発明のナノ容器を含む医薬組成物を、上記の病理、状態又は障害に苦しむ患者に、症状の重症度を減少させる及び／又は症状のさらなる発生を予防若しくは停止させるために十分な量で投与する。これを達成するために十分な量は、「治療的」又は「予防的」有効量として定義される。有効量は、状態の重症度及び患者の健康の全身状態に依存する。
【００７９】
本明細書及び特許請求の範囲において、動詞「を含む」及びその結合語は、その後に続く項目が含まれるが、詳細に言及されていない項目が排除されないことを意味する、非限定的な観念で使用される。加えて、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への参照は、明確に要素が１つであること及び要素の１つのみであることを文脈が要求していない限り、２以上の要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００８０】
本明細書で引用される全ての特許及び参照文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８１】
以下の実施例は、例証の目的でのみ提供するものであり、本発明の範囲を限定することを何ら意図していない。
【実施例】
【００８２】
１．材料及び方法
１．１  ｃＧＭＰＳを封入するＧＳＨ−コンジュゲートされたリポソームの製造
最初に、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−マレイミド（ＮＯＦ、Ｇｒｏｂｂｅｎｄｏｎｋ、ベルギー、３６．７２ｍＬのＤＩ水中９１６ｍｇ）とグルタチオン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ、オランダ、４．４２ｍＬのＤＩ水中１４４ｍｇ）と（モル比１：１．５）を室温で２時間混合することによって、ミセルを調製した。次いで、ミセルを酢酸カルシウム水和物（５７．３６ｍＬのＤＩ水中４０９４ｍｇ、最終濃度２００ｍＭ）に加え、６０℃で３０分間維持した。
【００８３】
２８０８ｍｇのＨＳＰＣ（水素添加大豆ホスファチジルコリン、最終濃度２８ｍＭ）及び９１２ｍｇのコレステロール（最終濃度１８．６ｍＭ）を、血清ボトル中の３０．９６ｍＬのエタノールに溶解し、撹拌しながらミセルと混合し、水浴中で３０分間、６０℃でインキュベートした。最後に、リポソームを０．２／０．２μｍＰＣ膜（２回）、０．２／０．１μｍＰＣ膜（２回）及び０．１／０．１μｍＰＣ膜（２回）を使用して６０℃で押し出し、４℃で保存した。リポソームの大きさを、１ｍｌのＰＢＳで希釈した１０μＬのリポソーム懸濁液を用いて、動的光散乱法（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）により測定した。リポソームバッチの平均サイズは、１００〜１２０ｎｍ、ＰｄＩ＜０．１であった。大きさを測定した後、酢酸カルシウムリポソームを、非封入酢酸カルシウム水和物から、透析システムＴＦＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｇｅｎｔ  μＳｃａｌｅ及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎカセット５０ｃｍ２）を使用して精製した。リポソームを、７体積の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に対して透析した。バッチを、ＴＦＦシステムを用いた透析を使用して、初期体積１２０ｍＬまで濃縮し、脂質含量及び大きさを解析した。
【００８４】
酢酸カルシウムＧＳＨ−ＰＥＧ−リポソームにＤＦ００３（Ｒｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳ）を薬物／リン脂質モル比０．３で遠隔装填することにより、ＬＰ−ＤＦ００３を生成した。装填について、ＭｉｌｌｉＱ（４０ｍｇ／ｍＬ）に溶解した１体積のＤＦ００３を９体積のリポソーム（ＨＳＰＣ２０ｍｇ／ｍＬ、両方とも６０℃で事前に加温）と混合し、６０℃で４５分間インキュベートした。次いでバッチを４℃で保存し、精製し、解析した。精製は、ＴＦＦシステムを使用した透析によって行った。ＬＰ−ＤＦ００３リポソームを、１０体積の生理食塩水に対して透析し、３ｍｇ／ｍＬのＤＦ００３濃度に濃縮し、０．２μｍフィルターで無菌濾過（Ｃｏｒｎｉｎｇ無菌シリンジフィルター）し、４℃で保存した。封入されたＤＦ００３、つまりＬＰ−ＤＦ００３及び他のリポソーム成分をＨＰＬＣにより解析した。
【００８５】
Ｓｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳ及び８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰの遠隔装填による封入について、上述のＬＰ−ＤＦ００３の封入と本質的に同じ手順を適用する。
【００８６】
ＤＦ００１（Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＧＭＰＳ）、ＤＦ００２（Ｒｐ−８−ｐＣＰＴ−ｃＧＭＰＳ）及びＲｐ−８−ｐＣＰＴ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳの遠隔装填による封入も試験し、いくつかの実験条件（例えば、薬物−脂質比、外部リポソームｐＨ、内部リポソームｐＨ、及び内部リポソーム酢酸カルシウム濃度）の使用を選別して、これらの薬物の封入を促進及び持続させた。ＤＦ００３とは対照的に、ＤＦ００１、ＤＦ００２及びＲｐ−８−ｐＣＰＴ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳを遠隔装填により封入することはできなかった。
【００８７】
Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＧＭＰＳ、Ｒｐ−８−ｐＣＰＴ−ｃＧＭＰＳ、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳ（ＤＦ００３）及びＲｐ−８−ｐＣＰＴ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳは、ＢＩＯＬＯＧ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｒｅｍｅｎ、ドイツから取得した。
【００８８】
１．２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ網膜外植培養及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験のための動物
初代網膜細胞培養物の調製のための動物は、モデナ・レッジョ・エミリア（Ｍｏｄｅｎａ  ａｎｄ  Ｒｅｇｇｉｏ  Ｅｍｉｌｉａ）大学のＣＳＳＩ（Ｃｅｎｔｒａ  Ｓｅｒｖｉｚｉ  Ｓｔａｂｕｌａｒｉｏ  Ｉｎｔｅｒｄｉｐａｒｔｉｍｅｎｔａｌｅ）で飼育されたものであった。手順は、モデナ・レッジョ・エミリア大学の倫理委員会（Ｐｒｏｔ．Ｎ．１０６  ２２／１１／２０１２）及びイタリア衛生省（Ｉｔａｌｉａｎ  Ｍｉｎｉｓｔｅｒｏ  ｄｅｌｌａ  Ｓａｌｕｔｅ）により承認を受けた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ網膜外植試験のための動物は、ルンド（Ｌｕｎｄ）大学の臨床化学部門（ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で飼育されたものであった。我々は、ｒｄ１及びｒｄ２網膜色素変性症モデルマウスと共に対応する野生型（ｗｔ）対照も使用した。動物は、標準的な白色周期性照明下（ｗｈｉｔｅ  ｃｙｃｌｉｃ  ｌｉｇｈｔｉｎｇ）に飼育され、食事及び水は自由に摂取可能とし、性別に関係なく使用した。全ての手順は、スウェーデン動物実験及び倫理委員会（Ｓｗｅｄｉｓｈ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｅｔｈｉｃｓ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）に従って実施した。使用した動物の数を維持し、動物の苦痛が最小になるように努めた。
【００８９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験のための動物は、テュービンゲン眼科学研究所（Ｔｕｂｉｎｇｅｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の所内動物収容施設で、標準的な白色周期性照明下に飼育されたもので、食事及び水は自由に摂取可能とし、性別に関係なく使用した。Ｃ３Ｈ  ｒｄ１／ｒｄ１（ｒｄ１）及び対照Ｃ３Ｈ野生型（ｗｔ）マウスを最初にｉｎ  ｖｉｖｏ試験に用いた。ｒｄ１動物で成功裡に試験された後、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験を、交差モデル検証のために、さらにＲＤモデル動物へ拡張した。これらのさらなるモデル動物は、Ｃ３Ｈ  ｒｄ２／ｒｄ２（ｒｄ２又はｒｄｓ）、Ｃ５７Ｂｌ６Ｊ  ｒｄ１０／ｒｄ１０（ｒｄ１０）、Ｃ５７Ｂｌ６Ｊ  ｃｐｆｌ１／ｃｐｆｌ１（ｃｐｆｌ１）マウス、並びにＲｈｏ  Ｐ２３Ｈラットであった。全てのｉｎ  ｖｉｖｏ手順は、テュービンゲン大学（Ｔｕｂｉｎｇｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）学内倫理委員会（§４登録２９−０４−１０；３０−０６−１０；１１−０３−１１より；動物許可ＡＫ５／１２）及び眼科・視覚研究における動物の使用についてのＡＲＶＯ宣言（ＡＲＶＯ  ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  ｖｉｓｕａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従って実施した。
【００９０】
１．３  初代網膜細胞培養の調製、分化、及び処置
様々な用量のＤＦ００３及びＬＰ−ＤＦ００３を、ｒｄ１モデルマウス由来の網膜細胞の初代培養物に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。初代細胞の約２０〜３０％が、桿体光受容体（Ｄｅｍｏｎｔｉｓら、２０１２、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．７、ｅ３３３３８；Ｇｉｏｒｄａｎｏら、２００７、Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．１３、１８４２−１８５０）に分化されうる。成体ｗｔ及びｒｄ１マウス由来の網膜幹細胞を、２ｍｇ／ｍｌのディスパーゼ（２０分）、続いて１．３３ｍｇ／ｍｌのトリプシン、０．６７ｍｇ／ｍｌ、ヒアルロニダーゼ、及び０．１３ｍｇ／ｍｌのキヌレン酸（１０分）で処置した後の毛様体上皮から単離し、ＤＭＥＭ−Ｆ１２中に２０ｎｇ／ｍｌの塩基性ＦＧＦ、２μｇ／ｍｌのヘパリン、０．６％グルコース、Ｎ２ホルモンミックスを含む無血清培地で１週間培養し、ニューロスフェア（Ｇｉｏｒｄａｎｏら、２００７、上掲）を形成させた。次いで、網膜ニューロスフェアを、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを補足したＤＭＥＭ−Ｆ１２中細胞外マトリックス（ＥＣＭ、Ｓｉｇｍａ）で被覆したガラススライド上で４日間平板培養した。１％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ−Ｆ１２中で細胞を分化させた。ｒｄ１分化網膜細胞は、先に開示されているように（Ｓａｎｇｅｓら、２００６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３、１７３６６−１７３７１）、分化の１１日目で細胞死プログラムを活性化させた。分化の１０日目（細胞死経路の活性化の１日前）に、細胞を様々な用量のＬＰ−ＤＦ００３に曝露させた。ＬＰ−ＤＦ００３を用いた処置の１６時間後、細胞を、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定した。細胞死は、２μＭのエチジウムホモダイマーを用いて細胞を２分間染色し、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、Ｓｉｇｍａ）を用いて核を対比染色することにより評価した。スライドを、ｍｏｗｉｏｌｌ  ４−８８（Ｓｉｇｍａ）を用いてマウントし、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ４０蛍光顕微鏡で解析した。エチジウムホモダイマー陽性細胞を、各スライドで計数し、１スライドあたりの全細胞数（ＤＡＰＩ染色）に対する割合（％）として表した。対応Ｓｔｕｄｅｎｔｔ検定分析により、少なくとも３種の異なる未処置及び少なくとも３種の異なる処置ｒｄ１網膜細胞から誘導されたデータを比較した。
【００９１】
１．４  器官型網膜外植培養
生化学解析並びにモデル及びｗｔ組織間の比較について、我々は、典型的に、網膜変性の開始に相当する時期からの材料を使用している。網膜組織を、生後５日目（ＰＮ５）の動物から取得し、屠殺後、眼を眼球摘出し、網膜を網膜外植として培養する。簡単に述べると、網膜色素上皮（ＲＰＥ）がまだ付着している網膜を単離し、続いてＭｉｌｌｉｃｅｌｌ培養皿フィルターインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＢ、Ｓｏｌｎａ、スウェーデン；ＰＩＨＡ０３０５０）に移し、ＲＰＥ層を培養膜に向ける。次いで、外植をカスタムメードのＲ１６栄養培地中３７℃でインキュベートする。栄養培地は、１皿あたり１．５ｍｌの体積とし、培養期間中、通常（実際の培養パラダイムが別途要求しない限り）２日ごとに新鮮培地に置き換える。
【００９２】
ＰＮ５外植を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで２日間（ＤＩＶ）の培養条件とするように構成し、次いで目的の処置にかけた。この点で、処置パラダイムは、試験化合物の培地添加、２日ごと、４日間からなり、ＰＮ１１（短期処置として標識：ＰＮ５＋２ＤＩＶ＋４ＤＩＶとして標識）又はＰＮ１９（長期処置：ＰＮ５＋２ＤＩＶ＋１２ＤＩＶ）と同等になる。
【００９３】
外植培養期間の最後に、検体を、リン酸緩衝塩溶液中４％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で約２時間固定した。そのように固定した眼を、ソレンセン（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ）スクロース緩衝液で凍害保護し、クリオトームを使用して組織学的切片とし、１２μｍの凍結切片を顕微鏡スライド上に集めた。
【００９４】
１．５  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＲＤモデル動物に対する薬物試験
薬物又は薬物／ＤＤＳ組合せで処置する前に、動物をジエチルエーテルで麻酔した。全身処置では、リポソームＤＤＳ／薬物製剤を含有する０．９％ＮａＣｌ溶液を、麻酔動物の尾静脈内（尾部静脈；静脈内；ｉ．ｖ．；５０μｌ）又は腹膜内（腹腔内；ｉ．ｐ．；２００μｌ）のいずれかで注射した。ｒｄ１０マウスでは、局所硝子体内（ＩＶＴ）処置も試験した。ここで動物は、一方の眼の硝子体内に０．５μｌの注射を受け、他方の眼は未処置のまま、対側性対照とした。ｉ．ｐ．及びＩＶＴ処置の両方で、ＤＦ００３を含まないリポソーム製剤（つまり「空の」リポソーム）をさらなる対照として使用した。
【００９５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ処置では、最初にｒｄ１動物で実施し、後に他のモデル動物（ｒｄ２、ｒｄ１０、ｃｐｆｌ１、Ｒｈｏ  Ｐ２３Ｈ）まで拡張した。異なるＲＤモデルでは網膜変性の開始及び進行が異なることから、各モデルに応じた処置パラダイムとするように構成する必要があった。これらの処置パラダイムの詳細については、表１を参照。
【００９６】
処置後の様々な時間点（表１参照）で、ｉｎ  ｖｉｖｏ光干渉断層撮影（ＯＣＴ）及び走査レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）解析を使用して、網膜形態（ＯＣＴ）及び蛍光標識薬物（ＳＬＯ）又は薬物／ＤＤＳ組合せの直接的非侵襲的イメージングを行い、網膜における薬物の分布及び取込みを測定した。加えて、網膜機能を、網膜電図検査（ＥＲＧ）記録を使用して評価した。非侵襲性ｉｎ  ｖｉｖｏ実験後で処置後１〜１２日の間に、実験動物を二酸化炭素窒息により屠殺した。眼はすぐに眼球摘出し、４％ＰＦＡ中で２時間固定し、凍結切片又はホールマウント調製用に調製した。
【表１】
0006744046.tif 000015
【００９７】
１．６  光受容体細胞死及び生存の定量
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ処置実験についての読取りは、標準の組織化学組織染色で見られるように、細胞死マーカーＴＵＮＥＬで陽性染色された光受容体細胞の定量及び／又は生存光受容体の列の計数で構成した。いずれの場合においても、結果を顕微鏡及びデジタルカメラで取り、手動又は半自動で解析し、次いで、先に開示された原理（Ａｒａｎｇｏ−Ｇｏｎｚａｌｅｚら、２０１４、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．９、ｅ１１２１４２）で、記録されたデータの統計学的有意性について計算した。
【００９８】
２．結果
２．１  ＬＰ−ＤＦ００３による光受容体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ保護
２００を超える新規ｃＧＭＰアナログを生成し、このうち１４０を、無細胞アッセイでＰＫＧに結合する能力について試験した（Ｚｅｇｚｏｕｔｉら、２００９、Ａｓｓａｙ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．７、５６０−５７２）。これらのうち、強力なＰＫＧ結合を示した３３の化合物を、網膜色素変性症変異マウスから誘導された６６１Ｗ細胞株及び光受容体様細胞培養（Ｓａｎｇｅｓら、２００６、上掲）でさらにｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析して選択した。この細胞ベースのスクリーニングアッセイにより、網膜色素変性症変異により引き起こされる細胞死を減少させることができ、したがって光受容体保護活性を示した、１１の化合物を特定した。次いで、これらの１１の化合物を、野生型、ｒｄ１（Ｓａｎｙａｌ  ａｎｄ  Ｂａｌ  １９７３、Ｚ．Ａｎａｔ．Ｅｎｔｗｉｃｋｌｕｎｇｓｇｅｓｃｈ．１４２、２１９−２３８）又はｒｄ２マウス（Ｓａｎｙａｌ  ａｎｄ  Ｊａｎｓｅｎ  １９８１、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２１、２３−２６）のいずれかから誘導された器官型網膜外植培養（Ｓａｈａｂｏｇｌｕら、２０１３、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ＆  Ｄｉｓｅａｓｅ  ４）でさらに試験した。網膜組織培養により、有望な神経保護効果を有するｃＧＭＰアナログの数を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｒｄ１及びｒｄ２光受容体の細胞死を顕著に減少させることが分かった４つの化合物に絞り込んだ。
【００９９】
次いで、これらの４つの化合物を、ｉｎ  ｖｉｖｏでｒｄ１マウスにおいて試験し、これらの化合物のうちの１つをリポソーム（ＬＰ）送達系と組み合わせた。ＬＰ−ＤＦ００３は、ｒｄ１動物で最も顕著な保護効果を示し、次いで、２つの他のｉｎ  ｖｉｖｏ網膜色素変性症モデルマウス（ｒｄ２及びｒｄ１０マウス）で試験にかけた。別の長期試験（４ヶ月間）を、第４の網膜色素変性症モデルのＰ２３Ｈラットで実施した（データ示さず）。
【０１００】
異なる試験系で、ＤＦ００３は、以下の結果を生じた：ＤＦ００３は、細胞及び器官型網膜組織培養において疾患ｒｄ１光受容体の生存度を保存した（図１ａ、１ｂ）。両方の系で、野生型（ｗｔ）光受容体は、ＤＦ００３処置による影響を受けず、ＤＦ００３が最大５０μＭの濃度までこれらの細胞に毒性がないことが示された。ＬＰ−ＤＦ００３は、網膜色素変性症変異マウスから誘導された光受容体様細胞培養において、ＤＦ００３と比較して低い（ｌｏｗｅｄ）濃度で、改善された保護効果を示した（図１ａ）。
【０１０１】
器官型網膜外植において、ＤＦ００３の内部網膜における毒性の根拠は見出されなかった（データ示さず）。またＤＦ００３は、２つの他のモデル、つまり、１つはより遅く変性するｒｄ１０モデルであり、Ｐｄｅ６ｂ変異を有するがｒｄ１モデルとは別の位置に変異を有するモデル、並びに非常に異なった変異を保有しているにもかかわらず、さらに遅く変性するｒｄ２モデルマウス、における網膜外植における光受容体死も防止した。（データは示していないが、ｒｄ１０及びｒｄ１のｉｎ  ｖｉｖｏデータについて図２ａ及び２ｂを参照）。これらのモデルのさらなる詳細について下記も参照されたい。Ｓｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳについても同様の観察がなされた。
【０１０２】
ＤＦ００３のｉｎ  ｖｉｖｏのバイオアベイラビリティは、リポソーム製剤ＬＰ−ＤＦ００３で使用したとき、劇的に改善された（参考．項２．３；図４）。Ｓｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳのバイオアベイラビリティも、リポソームに封入するときに改善される。
【０１０３】
ＬＰ−ＤＦ００３のｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を評価するために、我々は、ヒト網膜色素変性症変異と類似の遺伝子欠失を保有する３種の異なる網膜色素変性症モデル動物を使用した。ｒｄ１マウスは、生後（ＰＮ）１８日まで桿体光受容体の急速な細胞死を生じるＰｄｅ６ｂ遺伝子機能喪失を有する網膜色素変性症モデル動物である（Ｓａｎｙａｌ  ａｎｄ  Ｂａｌ  １９７３、上記参照）。ＰＮ１４で、ｒｄ１の網膜は、ｗｔと比較して、光受容体の列の５０％超を失う（図２ａ）。ＤＦ００３の腹腔内注射（５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回）を介した全身投与は、ｒｄ１光受容体生存に効果を示さないが、同じ濃度のＬＰ−ＤＦ００３を用いた処置は、ｒｄ１光受容体の生存度を顕著に増加させた。
【０１０４】
ｒｄ２（ｒｄｓ）マウスは、別の網膜色素変性症モデルであり、生後最初の３ヶ月で桿体及び錐体光受容体の比較的遅い喪失が生じるＰｒｐｈ２遺伝子変異を有する（Ｓａｎｙａｌ  ａｎｄ  Ｊａｎｓｅｎ  １９８１、上記参照）。ＰＮ３０で、約１５％のｒｄ２光受容体が失われる。既にこの日数で、ＬＰ−ＤＦ００３（５０ｍｇ／ｋｇ、２日ごと）で処置したｒｄ２動物は、生存光受容体の列数の顕著な増加を示した（図２ｂ）。
【０１０５】
使用した第３のモデル動物は、Ｐｄｅ６ｂ遺伝子に点変異を保有するｒｄ１０マウスであった。このマウスにおいて、変性は、ｒｄ１変異網膜と比較して遅く、桿体光受容体の喪失はＰＮ１８に開始し、ＰＮ３０で約８０％が失われる。ｒｄ１０動物においても、ＬＰ−ＤＦ００３の腹腔内注射を介した全身投与（ｉ．ｐ．；５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回）により、ＰＮ３０での光受容体生存が顕著に増加した（図２ｂ）。ＤＦ００３を含まない対照リポソーム（「空の」リポソーム）を用いたｒｄ１０マウスの同じｉ．ｐ．処置では、未処置ｒｄ１０動物との有意な差異は何ら生じなかった。
【０１０６】
図２ａ及び２ｂに示されるデータから、光受容体の生存が、全体的に、ＬＰ−ＤＦ００３処置により改善されたことが確認された。齧歯類の網膜色素変性症モデルでは、光受容体の変性は中心から周辺に向けて進行するので、保護効果は、周辺でより顕著であった。この効果を、視神経、つまり網膜の中心からの離心率（ｅｃｃｅｎｔｒｉｃｉｔｙ）の関数として生存光受容体の量を示すいわゆるスパイダーダイアグラムで評価した。斯くして、ＬＰ−ＤＦ００３処置ｒｄ１０動物の網膜周辺では、生存光受容体が、未処置対照物の約２倍多く存在した（図３ａ）。
【０１０７】
より重要なことに、ｉ．ｐ．ＬＰ−ＤＦ００３は、ｒｄ１０動物におけるＥＲＧ記録によって評価されたように、網膜のｉｎ  ｖｉｖｏ機能性を強く改善した。ＥＲＧにおいて、光への電気的応答の陰性の振れ、いわゆるａ波は、光受容体の一次応答を反映する。後の陽性の振れ、いわゆるｂ波は、内部網膜の応答及び二次神経の活性化に相当する。成体ｗｔ動物は、−３５０μＶ（ａ波）から６００μＶ（ｂ波）の範囲のＥＲＧ応答を示すが、未処置のｒｄ１０動物のＥＲＧは、ＰＮ３０でほとんど消失する（最大ｂ波応答約３５μＶ）（図３ｂ）。対照的に、ｉ．ｐ．ＬＰ−ＤＦ００３は、強力に及び非常に有意にｒｄ１０のＥＲＧｂ波応答を改善し（約１８０μＶ）、この改善は網膜機能の改善の４〜５倍に相当した。
【０１０８】
ｒｄ１０動物を、硝子体内注射（ＩＶＴ）を介してＬＰ−ＤＦ００３で処置したとき、同様の結果が得られた。注射された眼は、生存光受容体の列数の顕著な増加を示した（処置４．６６±０．４５ＳＥＭ、対側：１．５７±０．１７ＳＥＭ、ｎ＝８、ｐ＝０．０００２）。この増加は、機能的ＥＲＧ応答の対応する増加を反映しており、ＰＮ３０は、処置された眼で、約２５０μＶへの非常に顕著な増加を示した。
【０１０９】
全体として、様々な網膜色素変性症モデル動物におけるＬＰ−ＤＦ００３処置の結果は非常に勇気づけられるものであり、ヒト網膜色素変性症の数種の異なる形態に対する変異非依存的な処置の開発におけるＬＰ−ＤＦ００３の有望性を強く際立たせるものである。
【０１１０】
リポソームに封入されたＳｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を、通常のＳｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳと上記モデル動物において比較するとき、Ｓｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰＳの封入による生物学的能力の改善が、ＤＦ００３とＬＰ−ＤＦ００３との比較で見られた改善と同様に観察される。
【０１１１】
２．２  薬理学
活性化合物ＤＦ００３は、ｃＧＭＰのアナログであり、ＰＫＧ活性を非常に特異的に阻害する。この阻害は特にＰＫＧ１ａ及びＰＫＧｉｐアイソフォームに当てはまる一方で、ＰＫＧ２はあまり阻害されない。２つの他の潜在標的ＣＮＧＣ及びプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）アイソフォーム１及び２の阻害定数は、ＰＫＧアイソフォームの阻害定数よりも２〜３ｌｏｇ単位高い（表２）。ｃＧＭＰ及びそのアナログは、ＰＫＧ及びＣＮＧＣを標的とするが、ＰＫＡ、ＰＤＥ又はさらにＨＣＮチャネル活性も干渉しうる。表に、これらの標的に対するＤＦ００３の阻害定数（Ｋ）及び（入手可能な場合に）ＩＣ５０値を示す。
【表２】
0006744046.tif 000016
【０１１２】
２．３  薬物動態
遊離ＤＦ００３又はＬＰ−ＤＦ００３のいずれかの単回注射を初回用量２０ｍｇ／ｋｇで受けた成体ラット（３ヶ月齢）において、薬物動態試験を実施した。結果を図４に示す。遊離ＤＦ００３は、非常に迅速に血流から排出されるが（推定半減期：１０〜１５分）、ＬＰ−ＤＦ００３を投与したときは、ＤＦ００３が高レベルで血流内に留まる。ここで推定半減期は、９０〜１００倍の半減期延長に相当する２４時間であった。
【０１１３】
リポソーム（例えば、ＤＦ００３含有）の網膜への最適な送達を確保するために、マウス及びラットの両方において、リポソーム薬物送達系に封入された化合物を、様々な適用パラダイムで試験した。これらのパラダイムには、表面適用（点眼剤）、眼内への硝子体内注射、眼周囲のテノン嚢内へのテノン嚢下注射、腹腔内注射、及び静脈内注射が含まれた。リポソーム送達系内において蛍光トレーサー化合物を使用することにより、化合物の送達を、走査レーザー検眼鏡（ＳＬＯ；図５ａ〜５ｄ）を使用して直接的に追跡することが可能であった。マウス及びラットにおいて、静脈内に適用された蛍光トレーサー（例えば、フルオレセイン）は、別様では数時間以内に血流から排除される。
【０１１４】
注目すべきことに、眼への又は眼内への直接適用では、薬物は網膜へ全く又はほとんど全く送達されないが、理由はおそらく、リポソームが眼の非網膜構造（例えば、硝子体）に強く接着するためである。対照的に、リポソームの全身投与では、静脈内注射及び腹腔内注射のいずれも、網膜における化合物の強力な取込みに至った。この理由は、一方で、血流中の循環が延長されたことにより（参考．図４）、及び他方で、血液眼関門を渡って神経網膜内に入る標的化されたトランスサイトーシスが促進されたことにより、説明されうる。リポソーム製剤を与えたマウスでは、蛍光トレーサーは、単回腹腔内注射後少なくとも４日間、ＳＬＯを介して網膜で直接的に視覚化することができ（図５ａ〜５ｄ）、ラットでは（図示せず）、トレーサーは、注射後少なくとも１０日間、検出可能であった。
【０１１５】
２．４．毒性学
最大２ヶ月間ＬＰ−ＤＦ００３（ｉ．ｐ．）で処置したマウス及びラット並びに未処置対照を、ｉｎ  ｖｉｖｏで死後にルーチン的に検査したが、薬物の毒性作用について何ら肉眼的証拠は見られなかった。
【０１１６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ処置動物は、挙動（例えば、感情鈍麻、円背、亀背）、被毛の外観（例えば、脱毛、油性被毛）、又は皮膚（例えば、変色、出血）において、何ら変化は示されなかった。ｉｎ  ｖｉｖｏの眼の試験で、異常（例えば、水晶体混濁、白内障）は見られなかったが、機能的ＥＲＧ試験では、ＬＰ−ＤＦ００３処置動物において、未処置対照と比較して良好な性能が明らかにされた。重要なことに、処置及び未処置動物は、生後の最初２ヶ月の間に正常な体重増加を示し、全体的に互いに区別できなかった（データ示さず）。同様に、内臓器官（心臓、肝臓、肺、腎臓、脳）の肉眼による死後検査において、ＬＰ−ＤＦ００３処置マウス及びラットに異常（器官の大きさ及び形態、呈色／還流）は見られなかった。マウスを最も高い用量のＬＰ−ＤＦ００３（２００μｌ  ｉ．ｐ．、毎日）で処置したとき、一部の動物の脾臓が対照よりも大きく見えたが、脂質の投与に関連する現象でありうる。この現象は動物に負の影響を与えていないようであったが、さらに評価し、薬物製剤における脂質濃度をこの現象を考慮して構成しうる。
【０１１７】
まとめるに、これらの予備データに基づいて、使用した実験条件下で動物に何らかの明確な及び強力な毒性学的作用があるとの根拠になるものはない。特に、ヒト適用において硝子体内注射が想定される場合には、適用されるＬＰ−ＤＦ００３の用量は、マウス及びラット実験で使用した用量の少なくとも４００〜１０００分の１の用量でありうる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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