(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳エフェクター本体と、
３アミノ酸ペプチドモチーフである、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ＲＬＳ）を含む脳標的化ペプチドとを含み、脳標的化ペプチドは、配列番号８の配列を含む、血液脳関門シャトル。
【請求項２】
脳エフェクター本体と、リンカーと、３アミノ酸ペプチドモチーフを含む脳標的化ペプチドとを含み、ここで、該リンカーが、エフェクター本体を、請求項１に記載される３アミノ酸ペプチドモチーフを含む脳標的化ペプチドに結合させている、請求項１の血液脳関門シャトル。
【請求項３】
脳エフェクター本体が、神経障害薬、神経栄養因子、成長因子、酵素、細胞傷害性薬剤、脳標的に対する抗体、脳標的に対するモノクローナル抗体、脳標的に対するペプチドからなる群より選択される、請求項１〜２のいずれか一項記載の血液脳関門シャトル。
【請求項４】
脳標的が、β−セクレターゼ１、Ａβ、上皮成長因子、上皮成長因子レセプター２、タウ、リン酸化タウ、アポリポタンパク質Ｅ４、αシヌクレイン、αシヌクレインのオリゴマー性フラグメント、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質、ロイシンリッチリピートキナーゼ２、パーキン、プレセニリン２、γセクレターゼ、デスレセプター６、アミロイド前駆タンパク質、ｐ７５ニューロトロフィンレセプター、及びカスパーゼ６から成る群より選択される、請求項３の血液脳関門シャトル。
【請求項５】
脳エフェクター本体が、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載の血液脳関門シャトル。
【請求項６】
脳エフェクター本体が、脳標的に対する完全長抗体を含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の血液脳関門シャトル。
【請求項７】
脳エフェクター本体が、Ａβに対する完全長抗体である、請求項６の血液脳関門シャトル。
【請求項８】
脳エフェクター本体が、リン酸化タウに対する完全長抗体である、請求項６の血液脳関門シャトル。
【請求項９】
脳エフェクター本体が、αシヌクレインに対する完全長抗体である、請求項６の血液脳関門シャトル。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項記載の血液脳関門シャトルと薬学的な担体とを含む、医薬製剤。
【請求項１１】
医薬品としての使用のための請求項１〜９のいずれか一項記載の血液脳関門シャトル。
【請求項１２】
医薬品の製造における、請求項１〜９のいずれか一項記載の血液脳関門シャトルの使用。
【請求項１３】
前記医薬品が神経変性疾患の処置用である、請求項１２の使用。
【請求項１４】
血液脳関門を横断して脳エフェクター本体を輸送するための、請求項１〜９のいずれか一項記載の血液脳関門シャトル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分子医薬と、治療剤又は診断剤の標的化送達の分野に関する。より具体的には、本発明は、生物の脳脊髄液（ＣＳＦ）及び脳を標的化するペプチドに関する。
【０００２】
背景
例えば低い脳透過性を有する大型バイオ治療薬又は小分子薬などの神経障害薬の脳透過及び／又はＣＳＦ透過は、神経血管ユニット（ＮＶＵ）中の他の細胞成分と一緒に広範囲で不透過性の血液脳関門（ＢＢＢ）又は血液−ＣＳＦ関門ＢＣＳＦＢ（ＢＣＳＦＢ）によって厳密に制限されている。この障壁を克服するための多くの戦略が試験されており、一つは、脳毛細血管内皮上に発現された内因性レセプターによって仲介されるトランスサイトーシス経路を利用することである。脳へのバイオ治療薬及び診断薬のレセプター介在性送達を可能にするために、モノクローナル抗体又はペプチドなどの組換えタンパク質がこれらのレセプターに対して設計されている。しかし、脳内皮細胞（ＢＥＣ）内への誤分類及びＢＥＣ中のある細胞小器官（特にバイオ治療薬の分解に導く細胞小器官）内の蓄積度を最小化する一方で脳への取り込みを最大化するための戦略は、まだ探求されていない。
【０００３】
モノクローナル抗体及び他のバイオ治療薬は、中枢神経系（ＣＮＳ）における病態の処置に莫大な治療潜在性を有する。しかし、脳内へのそれらの経路は、ＢＢＢによって阻止される。以前の研究から、血流中に注射されたＩｇＧの非常にわずかな割合（約０．１％）しかＣＮＳ区画中に透過できないことが明らかにされた（Felgenhauer, Klin. Wschr. 52: 1158-1164 (1974)）。ＣＮＳ中の抗体が低濃度であるせいで、これにより確かにあらゆる薬理作用が制限される。脳脊髄液（ＣＳＦ）はＣＮＳ中のニューロンと直接接触している。
【０００４】
それ故、生物の脳に標的化する神経障害薬の送達システムが必要である。
【０００５】
発明の要約
第一の態様では、本発明は、脳エフェクター本体と、
【表１】
0006640099.tif 000002
からなる群より選択された３アミノ酸ペプチドモチーフを含む脳標的化ペプチドとを含む、血液脳関門シャトルを提供する。
【０００６】
血液脳関門シャトルの特定の一実施態様では、３アミノ酸ペプチドモチーフを含む脳標的化ペプチドは、１〜２５個の３アミノ酸ペプチドモチーフ、特に１〜１５個、より特定すると１〜１０個、さらにより特定すると１〜５個の３アミノ酸ペプチドモチーフを含む。
【０００７】
血液脳関門シャトルの特定の一実施態様では、脳シャトルは、脳エフェクター本体と、リンカーと、３アミノ酸ペプチドモチーフを含む脳標的化ペプチドとを含み、該リンカーは、エフェクター本体を、３アミノ酸ペプチドモチーフを含む脳標的化ペプチドに結合させる。
【０００８】
血液脳関門シャトルの特定の一実施態様では、３アミノ酸ペプチドモチーフを含む脳標的化ペプチドは、配列番号１〜３６、好ましくは配列番号１、６及び８からなる群より選択される。
【０００９】
血液脳関門シャトルの特定の一実施態様では、脳エフェクター本体は、神経障害薬、神経栄養因子、成長因子、酵素、細胞傷害性薬剤、脳標的に対する抗体、脳標的に対するモノクローナル抗体、脳標的に対するペプチドからなる群より選択される。
【００１０】
血液脳関門シャトルの特定の一実施態様では、脳標的は、β−セクレターゼ１、Ａβ、上皮成長因子、上皮成長因子レセプター２、タウ、リン酸化タウ、アポリポタンパク質Ｅ４、αシヌクレイン、αシヌクレインのオリゴマー性フラグメント、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質、ロイシンリッチリピートキナーゼ２、パーキン、プレセニリン２、γセクレターゼ、デスレセプター６、アミロイド前駆タンパク質、ｐ７５ニューロトロフィンレセプター、及びカスパーゼ６からなる群より選択される。
【００１１】
血液脳関門シャトルの特定の一実施態様では、脳エフェクター本体が、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドからなる群より選択される。
【００１２】
血液脳関門シャトルの特定の一実施態様では、脳エフェクター本体は、脳標的に対する完全長抗体、好ましくは完全長ＩｇＧを含む。
【００１３】
血液脳関門シャトルの特定の一実施態様では、エフェクター本体は、Ａβに対する完全長抗体である。
【００１４】
血液脳関門シャトルの特定の一実施態様では、エフェクター本体は、リン酸化タウに対する完全長抗体である。
【００１５】
血液脳関門シャトルの特定の一実施態様では、エフェクター本体は、αシヌクレインに対する完全長抗体である。
【００１６】
第二の態様では、本発明は、本発明の血液脳関門シャトルと薬学的担体とを含む、医薬製剤を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、医薬品としての脳シャトルの使用、特に、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の処置のための、及び神経炎症性疾患、特に多発性硬化症の処置のための、脳シャトルの使用を提供する。
【００１８】
本発明の態様は、送達しようとする薬剤に共有結合で結合させた、脳標的化ペプチドを含むＢＢＢシャトルを含む。該薬剤は、薬物、化学療法剤、放射性同位体、アポトーシス誘発剤、血管新生抑制剤、ホルモン、酵素、サイトカイン、成長因子、細胞傷害性薬剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のＦａｂフラグメント、抗体のより小さなフラグメント、造影剤、生存因子、アポトーシス抑制剤、ホルモン拮抗剤、又は抗原であり得る。本発明のさらなる態様では、血管新生抑制剤は、トロンボスポンジン、アンジオスタチン５、色素上皮由来因子、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター、組織メタロプロテアーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、血小板第４因子、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−Ｂ、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭＩ ０１、マリマスタット（manmastat）、ポリ硫酸ペントサン、アンジオポエチン２（Regeneron社）、インターフェロン−α、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ １４５１ ５６Ｅ、１６Ｋプロラクチンフラグメント、リノミド、サリドマイド、ペントキシフィリン（pentoxifylhne）、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ポリアミン、プロテアソーム阻害剤、キナーゼ阻害剤、シグナル伝達ペプチド、アキュテイン（accutin）、シドホビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板第４因子、及びミノサイクリンからなる群より選択され得る。さらに別の態様では、サイトカインは、インターロイキンＩ（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ（ＩＦ−γ）、ＩＦ−ａ、ＩＦ−、腫瘍壊死因子−ｃｔ（ＴＮＦ−ｃｔ）、又はＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）からなる群より選択され得る。本発明のまたさらなる実施態様では、該薬剤は、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微粒子、磁気ビーズ、酵母細胞、哺乳動物細胞、又は細胞であり得る。特定の態様では、ウイルスは、レンチウイルス、パポバウイルス、サルウイルス４０、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、又はヘルペスウイルスである。該薬剤はまた、真核生物発現ベクター、より好ましくは遺伝子療法ベクターであってもよい。
【００１９】
本発明の脳標的化ペプチドは、固相支持体、例えばアレイ又はビーズに付着されていてもよい。本発明の実施態様はまた、
【表２】
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からなる群より選択されたペプチドモチーフを模倣した配列を含む単離されたペプチド模倣体、又は、配列番号１〜配列番号３６からなるペプチドを模倣した配列を含むペプチド模倣体を含み得、該ペプチドは、ＣＳＦ及び脳において豊富である。
【００２０】
さらなる実施態様は、本明細書に記載のように又は本明細書に記載の本発明の方法に従って本発明の脳標的化ペプチドを得、該ペプチドを薬剤に作動可能なように結合させ、そして被験体にペプチドに連結させた薬剤を投与することによって、被験体におけるＣＳＦ及び脳、又はその脈管構造への該薬剤の送達を標的化する方法を含む。被験体は、霊長類、サル、ヒト、マウス、イヌ、ネコ、ラット、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、又はブタであり得るがこれらに限定されない。該薬剤は、薬物、化学療法剤、放射性同位体、アポトーシス誘発剤、血管新生抑制剤、酵素、ホルモン、サイトカイン、成長因子、細胞傷害性薬剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のＦａｂフラグメント、造影剤、抗原、生存因子、アポトーシス抑制剤、ホルモン拮抗剤、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、ホルモン、微粒子、磁気ビーズ、マイクロデバイス、酵母細胞、哺乳動物細胞、細胞、又は発現ベクターであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】インビボでのファージディスプレイスクリーニング及びＣＳＦ試料採取の図による説明。どの選択操作でも、ファージを静脈内投与し（尾静脈）、続いてＣＳＦ及び血液から回収し、増幅させ、プールし、そして次の選択操作に使用する。全てのその後の操作における特定のファージペプチドクローンの回収量の増加は、ＣＳＦを選択的に標的化するペプチドの選択を反映する。
【図１Ｂ】また、血中及びＣＳＦ中のファージの動態が、最初の選択操作についてのプラーク形成単位（ｐｆｕ）に基づいて示されている。
【図２Ａ】ファージライブラリーの静脈内投与後のＣＳＦ及び血中における選択。各々の選択操作について、全てのトリペプチドモチーフをＣＳＦから単離されたファージから抽出し、これをプールしてシークエンスにかけた。図は、ＣＳＦ及び血液中において特定のペプチドモチーフが豊富であることを示す。選択は、血液区画と比較してＣＳＦ区画においてはるかにより強い。
【図２Ｂ】ファージライブラリーの静脈内投与後のＣＳＦ及び血中における選択。各々の選択操作について、全てのトリペプチドモチーフをＣＳＦから単離されたファージから抽出し、これをプールしてシークエンスにかけた。図は、ＣＳＦ及び血液中において特定のペプチドモチーフが豊富であることを示す。選択は、血液区画と比較してＣＳＦ区画においてはるかにより強い。
【図２Ｃ】ファージライブラリーの静脈内投与後のＣＳＦ及び血中における選択。各々の選択操作について、全てのトリペプチドモチーフをＣＳＦから単離されたファージから抽出し、これをプールしてシークエンスにかけた。図は、ＣＳＦ及び血液中において特定のペプチドモチーフが豊富であることを示す。選択は、血液区画と比較してＣＳＦ区画においてはるかにより強い。
【図２Ｄ】ファージライブラリーの静脈内投与後のＣＳＦ及び血中における選択。各々の選択操作について、全てのトリペプチドモチーフをＣＳＦから単離されたファージから抽出し、これをプールしてシークエンスにかけた。図は、ＣＳＦ及び血液中において特定のペプチドモチーフが豊富であることを示す。選択は、血液区画と比較してＣＳＦ区画においてはるかにより強い。
【図３】図３は、ラットにおける４回の操作にわたる全体的なインビボでの選択戦略を示す。２つの分岐から始まり、最終の４回目の選択操作時に３匹の異なる動物へと合流する。
【図４】インビボでの４回の選択操作後のＣＳＦ及び血中における具体的なファージクローン。図は、空ファージと比較してファージ粒子上で強化されたペプチドのいくつかに関するデータを示す。はるかにより多くのファージクローン（プラーク形成単位（ｐｆｕ）に基づいて）が、空ファージと比較してＣＳＦに見られた。
【図５】特定のファージクローンが、脳内の脈管構造に結合する。特定のファージクローンを静脈内投与して、インビボでの標的化を可能とした。続いて、免疫組織化学的検査を使用して、脳血管及び毛細血管に特異的に結合するファージを検出した。空ファージには染色は全く観察されなかったが、特に配列番号１、配列番号６、及び配列番号８のクローンは、皮質内の脳毛細血管において強力で特異的な染色を示した。
【図６Ａ】Ｂ：ＣＳＦにおいて豊富だったストレプトアビジン（ＳＡ）に連結された特定のペプチド。合成され、Ｎ末端ビオチンを通してＳＡに連結された、１つの特定のペプチド（配列番号８）が、対照の混合ペプチドよりも、ＣＳＦにおいてより高い濃度で見られる。Ａ：これはまた、配列番号８のペプチドがＴ７ファージ上にディスプレイされる場合にも該当する。Ｃ：図はまた、脳血管マーカーのレクチンとコロニー形成している配列番号８のファージクローンについての脳内の毛細血管での染色を示す。
【図６Ｂ】Ｂ：ＣＳＦにおいて豊富だったストレプトアビジン（ＳＡ）に連結された特定のペプチド。合成され、Ｎ末端ビオチンを通してＳＡに連結された、１つの特定のペプチド（配列番号８）が、対照の混合ペプチドよりも、ＣＳＦにおいてより高い濃度で見られる。Ａ：これはまた、配列番号８のペプチドがＴ７ファージ上にディスプレイされる場合にも該当する。Ｃ：図はまた、脳血管マーカーのレクチンとコロニー形成している配列番号８のファージクローンについての脳内の毛細血管での染色を示す。
【図６Ｃ】Ｂ：ＣＳＦにおいて豊富だったストレプトアビジン（ＳＡ）に連結された特定のペプチド。合成され、Ｎ末端ビオチンを通してＳＡに連結された、１つの特定のペプチド（配列番号８）が、対照の混合ペプチドよりも、ＣＳＦにおいてより高い濃度で見られる。Ａ：これはまた、配列番号８のペプチドがＴ７ファージ上にディスプレイされる場合にも該当する。Ｃ：図はまた、脳血管マーカーのレクチンとコロニー形成している配列番号８のファージクローンについての脳内の毛細血管での染色を示す。
【図７Ａ】配列番号８を有する脳シャトルペプチドは、脳内ＢＡＣＥ１ペプチド抑制活性を増強する。ビオチニル化ＢＡＣＥ１抑制性ペプチドを単独で（図７Ｂ）又は配列番号８を有する同じようにビオチニル化された脳シャトルペプチドと組合せたもの（図７Ａ）を、ストレプトアビジンに予め付着させ、続いて、少なくとも３匹の大槽にカニューレを挿入した各ラットに静脈内注入した（１kgあたりストレプトアビジン１０mg）。ＢＡＣＥ１ペプチド阻害剤により媒介されるＡβ４０の低減は、指定した時点での血中（黒色の三角／丸）及びＣＳＦ（灰色の三角／丸）におけるＡβ１−４０のＥＬＩＳＡによって測定された。より見やすくするために、１００％での点線がグラフに描かれている。（７Ａ）３：１の比の配列番号８を有する脳シャトルペプチドとＢＡＣＥ１抑制性ペプチドに予め付着させたストレプトアビジンを注射されたラットにおける血液中（黒い三角）及びＣＳＦ（灰色の三角）中でのＡβ４０の低減率。（７Ｂ）ＢＡＣＥ１抑制性ペプチド（四量体でのディスプレイ）のみに予め付着させたストレプトアビジンを注射されたラットにおける血液中（黒い丸）及びＣＳＦ（灰色の丸）中でのＡβ４０の低減率。
【図７Ｂ】配列番号８を有する脳シャトルペプチドは、脳内ＢＡＣＥ１ペプチド抑制活性を増強する。ビオチニル化ＢＡＣＥ１抑制性ペプチドを単独で（図７Ｂ）又は配列番号８を有する同じようにビオチニル化された脳シャトルペプチドと組合せたもの（図７Ａ）を、ストレプトアビジンに予め付着させ、続いて、少なくとも３匹の大槽にカニューレを挿入した各ラットに静脈内注入した（１kgあたりストレプトアビジン１０mg）。ＢＡＣＥ１ペプチド阻害剤により媒介されるＡβ４０の低減は、指定した時点での血中（黒色の三角／丸）及びＣＳＦ（灰色の三角／丸）におけるＡβ１−４０のＥＬＩＳＡによって測定された。より見やすくするために、１００％での点線がグラフに描かれている。（７Ａ）３：１の比の配列番号８を有する脳シャトルペプチドとＢＡＣＥ１抑制性ペプチドに予め付着させたストレプトアビジンを注射されたラットにおける血液中（黒い三角）及びＣＳＦ（灰色の三角）中でのＡβ４０の低減率。（７Ｂ）ＢＡＣＥ１抑制性ペプチド（四量体でのディスプレイ）のみに予め付着させたストレプトアビジンを注射されたラットにおける血液中（黒い丸）及びＣＳＦ（灰色の丸）中でのＡβ４０の低減率。
【００２２】
本発明の実施態様の詳細な説明
定義
「血液脳関門」又は「ＢＢＢ」は、脳毛細血管内皮形質膜内のタイトジャンクションによって形成される、末梢循環と脳及び脊髄との間の生理学的関門をいい、尿素（６０ダルトン）などの非常に小さな分子であっても脳内への分子の輸送を制限する密着関門を作る。脳内のＢＢＢ、脊髄内の血液−脊髄関門、及び網膜内の血液−網膜関門は、ＣＮＳ内の近接毛細血管関門であり、本明細書において、まとめて血液脳関門又はＢＢＢと呼ばれる。ＢＢＢは、関門が毛細血管内皮細胞よりもむしろ上衣細胞から構成される血液−ＣＳＦ関門（脈絡叢）も包含する。
【００２３】
「脳エフェクター本体」は、ＢＢＢを横断して脳に輸送されるべき分子を表す。エフェクター本体は、典型的には、脳に送達されることが望まれる特徴的な治療活性を有する。エフェクター本体には、例えばペプチド、タンパク質、酵素、及び抗体、特に脳標的に対するモノクローナル抗体又はそのフラグメントなどの神経障害薬及び神経活性薬剤及び細胞傷害性薬剤が含まれる。
【００２４】
本明細書において使用される「脳標的化ペプチド」は、
【表３】
0006640099.tif 000004
からなる群より選択された少なくとも１つの３アミノ酸ペプチドモチーフを含む。本発明の脳標的化ペプチド内の３アミノ酸ペプチドモチーフは、連続的であっても及び／又は重複していてもよいことが理解されなければならない。例えば、重複モチーフの場合、脳標的化ペプチドにおいて、最初の３アミノ酸モチーフの２番目のアミノ酸は、２番目の３アミノ酸モチーフの最初のアミノ酸であってもよく、及び／又は、最初のアミノ酸モチーフの３番目のアミノ酸は、３番目のアミノ酸モチーフの最初のアミノ酸であってもよい。
【００２５】
本明細書において使用される「神経障害」は、ＣＮＳを冒す、及び／又はＣＮＳに病因を有する疾患又は障害をいう。例示的なＣＮＳ疾患又は障害には、非限定的に、ニューロパチー、アミロイドーシス、癌、眼疾患又は障害、ウイルス又は微生物感染、自己免疫、炎症、虚血、神経変性疾患、発作、行動障害、及びリソソーム蓄積病が挙げられる。本出願のために、血液−網膜関門によって残りの身体から普通は隔離されている眼がＣＮＳに含まれることを理解されたい。神経障害の具体例には、非限定的に、神経変性疾患（非限定的にレビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ−ドレイガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、タウオパチー（非限定的にアルツハイマー病及び核上性麻痺を含む）、プリオン病（非限定的に、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト−ヤコブ症候群、クールー、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病、慢性消耗病、及び致死性家族性不眠症を含む）、球麻痺、運動ニューロン疾患、及び神経系ヘテロ変性障害（nervous system heterodegenerative disorder）（非限定的にカナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥーレット症候群、メンケス縮れ毛症候群、コケイン症候群、ハラーフォルデン−シュパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ−ナイハン症候群、及びウンフェルリヒト−ルントボルク症候群を含む）、認知症（非限定的にピック病、及び脊髄小脳失調症を含む）、癌（例えば、体内の他の場所の癌に起因する脳転移を含む、ＣＮＳ及び／又は脳の癌）、多発性硬化症（再発寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、及び二次性進行型多発性硬化症）が挙げられる。
【００２６】
「神経障害薬」は、１つ以上の神経障害を処置する薬物又は治療剤である。本発明の神経障害薬には、非限定的に、小分子化合物、抗体、ペプチド、タンパク質、１つ以上のＣＮＳ標的の天然リガンド、１つ以上のＣＮＳ標的の天然リガンドの改変版、アプタマー、干渉核酸（すなわち低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、リボザイム、及び小分子、又は任意の前述の活性フラグメントが挙げられる。本発明の例示的な神経障害薬は本明細書に記載されており、それらには、それ自体がＣＮＳ抗原又は標的分子であるか、或いはＣＮＳ抗原又は標的分子（例えば、非限定的にはアミロイド前駆タンパク質若しくはその部分、アミロイドβ、β−セクレターゼ、γ−セクレターゼ、タウ、α−シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ＤＲ６、プレセニリン、ＡｐｏＥ、神経膠腫若しくは他のＣＮＳ癌のマーカー、及びニューロトロフィン）を特異的に認識及び／又はそれに作用する（すなわち阻害、活性化、若しくは検出する）、抗体、アプタマー、タンパク質、ペプチド、干渉核酸及び小分子、並びに、前述のいずれかの活性フラグメントが含まれるがこれらに限定されない。神経障害薬、及び処置するためにそれらを使用することができる対応する障害の非限定的な例は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、慢性脳損傷（神経発生）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、抗上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）抗体及び脳癌、（ＥＧＦＲ）−抗体、グリア細胞系由来神経因子（ＧＤＮＦ）及びパーキンソン病、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及び筋萎縮性側索硬化症、うつ、リソソーム酵素及び脳のリソソーム蓄積病、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）及び筋萎縮性側索硬化症、ニューレグリン−１及び統合失調症、抗ＨＥＲ２抗体（例えばトラスツズマブ）及びＨＥＲ２陽性癌からの脳転移である。
【００２７】
「造影剤」は、化合物の存在及び／又は位置を直接又は間接的に検出可能にする１つ以上の特性を有する化合物である。そのような造影剤の例には、検出を可能にするラベル本体を組み入れているタンパク質及び小分子化合物が挙げられる。
【００２８】
「ＣＮＳ抗原」又は「脳標的」は、抗体又は小分子を用いて標的化できる、脳を含むＣＮＳ中に発現される抗原及び／又は分子である。そのような抗原及び／又は分子の例には、非限定的にβ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥｌ）、アミロイドβ（Ａβ）、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子レセプター２（ＨＥＲ２）、タウ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、α−シヌクレイン、ＣＤ２０、ＴＲＥＭ２ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、γセクレターゼ、デスレセプター６（ＤＲ６）、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィンレセプター（ｐ７５ＮＴＲ）、及びカスパーゼ６が挙げられる。一実施態様では、抗原はＢＡＣＥｌである。
【００２９】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的に、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び（所望の生物学的活性を示す限り）抗体フラグメントを網羅する。
【００３０】
本明細書における「抗体フラグメント」は、抗原と結合する能力を保持するインタクトな抗体の一部を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ディアボディ；線状抗体；例えば一本鎖Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどの一本鎖抗体分子、並びに抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。「一本鎖Ｆａｂ」形式は、例えばHust M. et al. BMC Biotechnol. 2007 Mar 8;7:14に記載されている。
【００３１】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体をいい、すなわち、その集団を含む個々の抗体が、モノクローナル抗体の産生中に発生し得る可能性のある変異体（そのような変異体は一般に少量存在する）を除き、同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合する。種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対する。モノクローナル抗体は、それらの特異性に加えて、他の免疫グロブリンが混入していない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明により使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495（1975）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって製造することができるか、又は組換えＤＮＡ法によって製造することができる（例えば米国特許第４，８１６，５６７号参照）。「モノクローナル抗体」は、また、Clackson et al., Nature, 352:624-628（1991）及びMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 （1991）に記載されている技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離することができる。本明細書におけるモノクローナル抗体の具体例には、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体（その抗原結合性フラグメントを含む）が挙げられる。本明細書におけるモノクローナル抗体には、具体的に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から得られたか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りは、別の種から得られた又は別の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに、所望の生物学的活性を示す限りそのような抗体のフラグメントが挙げられる（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984)）。本明細書における関心対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えばヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界ザル）由来の可変ドメイン抗原結合性配列とヒト定常領域配列とを含む「霊長類化」抗体が挙げられる（米国特許第５，６９３，７８０号）。
【００３２】
本明細書に使用される「細胞傷害性薬剤」という用語は、細胞機能を阻害若しくは妨げる、及び／又は細胞の死滅若しくは破壊を引き起こす物質をいう。細胞傷害性薬剤には、非限定的に放射性同位体（例えばＡｔ２１１、I１３１、I１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は化学療法薬（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他のインターカレート剤）；成長阻害剤；核酸分解酵素などの酵素及びそのフラグメント；抗生物質；細菌、真菌、植物又は動物起源の小分子毒素又は酵素活性毒素などの毒素（そのフラグメント及び／又は変異体を含む）が挙げられる。
【００３３】
薬剤、例えば医薬製剤の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な用量及び時間において有効な量をいう。
【００３４】
本明細書において使用される「リンカー」は、本発明の血液脳関門シャトルの異なる本体を共有結合で連結する化学リンカー又はペプチドリンカーをいう。リンカーは、例えば脳エフェクター本体を本発明の脳標的化ペプチドに連結する。
【００３５】
１〜２０個のアミノ酸がペプチド結合により繋がったものから構成されるペプチドリンカーを使用することができる。ある実施態様では、アミノ酸は、２０種の天然アミノ酸より選択される。ある他の実施態様では、１つ以上のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリジンより選択される。他の実施態様では、リンカーは化学リンカーである。ある実施態様では、該リンカーは、少なくとも２５アミノ酸長、好ましくは３２〜５０アミノ酸長のアミノ酸配列を有する一本鎖ペプチドである。一実施態様では、該リンカーは（ＧｘＳ）ｎであり、但し、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン（ｘ＝３、ｎ＝８、９若しくは１０、及びｍ＝０、１、２若しくは３）又は（ｘ＝４及びｎ＝６、７若しくは８、及びｍ＝０、１、２若しくは３）であり、好ましくはｘ＝４、ｎ＝６又は７及びｍ＝０、１、２又は３であり、より好ましくはｘ＝４、ｎ＝７、及びｍ＝２である。一実施態様では、該リンカーは（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１７）である。一実施態様では、該リンカーは（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２（配列番号１３）である。
【００３６】
コンジュゲーションは、多様な化学リンカーを使用して行なわれ得る。例えば、脳シャトルペプチドと脳エフェクター本体を、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミダートＨＣｌなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベラートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トルエン２，６−ジイソシアナートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）のような多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用してコンジュゲーションさせることができる。リンカーは、脳への送達時にエフェクター本体の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al, Cancer Res. 52: 127-131 (1992)；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
【００３７】
共有結合的コンジュゲーションは、直接的又はリンカーを介してのいずれかであり得る。ある実施態様では、直接コンジュゲーションは、タンパク質融合体の構築による（すなわち、脳標的化ペプチド及びエフェクター本体をコードし、単一タンパク質として発現される２つの遺伝子の遺伝子融合による）。ある実施態様では、直接コンジュゲーションは、脳シャトルペプチドの２つの部分の１つにある反応基と、脳エフェクター本体上の対応する基又はアクセプターとの間の共有結合の形成による。ある実施態様では、直接コンジュゲーションは、コンジュゲーションされるべき２つの分子の一方を改変（すなわち遺伝子改変）することにより、適切な条件下でコンジュゲーションされるべき他の分子と共有結合を形成する反応基（非限定的な例として、スルフヒドリル基又はカルボキシル基）を含めることによる。非限定的な一例として、所望の反応基（すなわちシステイン残基）を有する分子（すなわちアミノ酸）を、例えば脳シャトルペプチドに導入し、神経薬とジスルフィド結合を形成させ得る。タンパク質への核酸の共有結合的コンジュゲーションの方法も、当技術分野において公知である（すなわち光架橋、例えばZatsepin et al. Russ. Chem. Rev. 74: 77-95（2005）参照）。コンジュゲーションは、また、多様なリンカーを使用して行うことができる。例えば、脳シャトルペプチドとエフェクター本体とを、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミダートＨＣｌなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベラートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トルエン２，６−ジイソシアナートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用してコンジュゲーションさせることができる。ペプチド結合によって繋がった１〜２０個のアミノ酸から構成されるペプチドリンカーも使用することができる。そのようなある実施態様では、アミノ酸は、２０種の天然アミノ酸より選択される。他のそのようなある実施態様では、１つ以上のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリジンより選択される。リンカーは、脳に送達されるとエフェクター本体の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al, Cancer Res. 52: 127-131（1992）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
【００３８】
「医薬製剤」という用語は、その中に含有される活性成分の生物学的活性を有効にさせるような剤形であり、かつその製剤が投与される被験体に容認できないほど毒性である追加的な成分を含有しない、調製物をいう。
【００３９】
「薬学的に許容され得る担体」は、医薬製剤中の活性成分以外の成分であって、被験体に対して無毒性である成分をいう。薬学的に許容され得る担体には、非限定的に、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、又は保存剤が挙げられる。
【００４０】
本明細書において使用される「処置」（及び「処置する」又は「処置すること」などのその文法的変形）は、処置される個体の自然経過を変えようとする臨床的介入をいい、予防のため、又は臨床病理の経過中のいずれかに行うことができる。望ましい処置効果には、非限定的に、疾患の発生又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接又は間接的病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患の進行速度の低下、病状の改善又は緩和、及び寛解又は予後改善が挙げられる。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発生を遅延又は疾患の進行を減速するために使用される。
【００４１】
「ファージディスプレイライブラリー」という用語は、ランダムな異種ペプチドがファージキャプシドタンパク質中に入るように工学操作されて、ファージ表面上に提示されている、複数のファージをいう。特定の態様では、該ペプチドは、該ペプチドのシステイン残基によって拘束され得る。該方法はさらに、第二の被験体から単離されたファージを、少なくとも１つの第三の被験体に投与し、第三の被験体に由来するＣＳＦをはじめとする１つ以上の組織又は液体の試料を得、そして第三の被験体のＣＳＦをはじめとする組織又は液体から単離されたファージによって提示されるペプチド配列を同定することを含み得る。特定の態様では、ファージの投与は注射により、好ましくは静脈内注射による。被験体は哺乳動物であり得、特定の態様では哺乳動物はげっ歯類、非ヒト霊長類、又はヒトである。該方法はさらに、ある被験体の試料から単離されたファージを増幅した後に、さらに他の被験体へと投与することを含み得る。増幅は、ファージ核酸の全部又は一部のＰＣＲによる増幅、続いて、増幅したフラグメントを第二のファージへとクローニング、及び／又は、ファージ宿主生物、例えばファージ複製を支持する細菌を通してのファージの増幅を包含し得る。
【００４２】
「インビボでの脳脊髄液（ＣＳＦ）の試料採取」という用語は、被験体のＣＳＦ試料を具体的に得ることをいう。被験体は哺乳動物であり得、特定の態様では哺乳動物はげっ歯類、非ヒト霊長類、又はヒトである。試料は、本出願において具体的に記載されているような大槽に挿入されたカニューレを使用して得られる。
【００４３】
「同時に」という用語は、ＣＳＦからの試料の採取に適応した時間間隔（数分から数時間から数日間）で試料を得ることを意味するために使用され得る。本発明の他の実施態様は、本明細書に記載の方法によって同定された単離されたペプチドを含む。
【００４４】
「ペプチドモチーフ」という用語は、特定の組織又はレセプターに標的化するか若しくは結合する能力を有するか、又は、ＢＢＢ若しくはＢＣＳＦＢを横断して輸送される能力を有する、３アミノ酸ペプチド配列をいう。
【００４５】
本明細書において使用される「選択的に結合する」は、他の細胞又は物質への結合を決して排除するものではないが、標的組織、標的器官、標的脈管構造、又はその受容体への優先的な結合を意味する。選択的結合は、選択されていない組織／標的と比較して、選択された組織／標的に対して２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上の選択性を含み得る。
【００４６】
本明細書において使用される「脳標的化ペプチド」は、ＣＳＦ及び／又は脳又はその脈管構造に対する選択的な局在化によって特徴付けられる、本明細書において定義されているような少なくとも１つのペプチドモチーフを含むペプチドである。脳標的化ペプチドは、１つを超えるペプチドモチーフを含み得、該ペプチドモチーフは連続的であっても、又はモチーフではないアミノ酸配列によって隔離されていてもよい。
【００４７】
選択的な局在化は、例えば、以下に開示された方法によって決定され得、推定標的化ペプチド配列はタンパク質に組み込まれて、ファージの外表面上に提示される。様々なアミノ酸配列を有するこのような複数の標的化ペプチドを発現するように遺伝子工学操作されたこのようなファージライブラリーを被験体に投与した後、１つ以上の被験体から得られたＣＳＦ又は脳を回収し、液体又は器官内に又はそれに伴って見られるファージを同定する。標的化ペプチド配列を発現しているファージは、それが対照の液体又は器官と比較してその液体又は器官により多くの結合又は局在を示す場合に、液体又は器官に選択的に局在していると判断される。好ましくは、標的化ペプチドの選択的局在により、対照の液体又は器官と比較して、標的の液体又は器官においてファージ又はペプチドが２倍以上豊富となるべきである。対照器官と比較して、標的の液体又は器官において少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又はそれ以上豊富となる選択的局在がより好ましい。あるいは、標的の又は選択された液体又は器官から回収されたファージを、さらなるスクリーニングのために第二、第三、第四、又はそれ以上の被験体に注射又はそれと接触させた場合に、その選択的局在化を示す標的化ペプチド配列を発現しているファージは、好ましくは、対照の液体又は器官と比較して、標的の液体又は器官において増加した豊富度を示す。推定標的ペプチドを発現しているファージの選択的局在化又は結合を決定するための別の代替的な手段は、非特異的ペプチドを発現しているか又は推定標的ペプチドを全く発現しないように遺伝子工学操作された対照ファージと比較して、標的の液体又は器官において、好ましくは２倍、より好ましくは３倍、又は以上の豊富度を示す。選択的局在化を決定するためのさらに別の手段は、標的ペプチドを発現しているファージの標的の液体又は器官への局在化が、標的ペプチド配列を含有している合成ペプチドの共投与によって少なくとも部分的に遮断されるというものである。
【００４８】
脳脊髄液のインビボでの選択
インビボでのファージディスプレイによる血管マッピングにより、様々な脈管構造内で選択的に発現された生化学的「アドレス」が明らかとなる。このタイプのアプローチは、薬剤を特定の組織へと送達するために使用することのできるリガンドシステム及びレセプターシステムを発見するために使用されている（Arap et al, 1998, Pasqualini et al, 1996, Arap et al, 2002, Kolonin et al, 2001, Pasqualini et al, 2000）。このスクリーニングアプローチは、コンビナトリアルライブラリー（Ｍ１３をベースとしたファージベクターにディスプレイされる）に由来する短いリガンドペプチドが全身投与後に特定の器官に標的化する能力に基づく（Pasqualini et al, 2000）。組織及び疾患状態を標的化するペプチドが単離され、いくつかの場合では、対応する血管レセプターが同定された（Arap et al, 1998, Pasqualini et al, 1996, Arap et al, 2002, Kolonin et al, 2001, Rajotte and Ruoslahti, 1999, Kolonin, et al, 2002, Kolonin et al, 2004）。特に、研究者は、癌患者におけるファージディスプレイライブラリーの使用を報告した。インターロイキン−１１様ペプチドとして同定されたリガンドモチーフの１つ、及び、インターロイキン−１１レセプターへのその標的化は、ヒト前立腺癌における治療薬の標的化送達のための可能性ある戦略として活用されている（Zurita et al, 2004）。インビボでのファージディスプレイランダムペプチドライブラリーの選択の重要な工程は試料採取戦略であり、したがってどのようにどこでファージを回収するかである。好ましくは、インビボでの選択戦略は、組織又はレセプターへの結合に基づくだけではなく、例えば細胞障壁を超えての輸送のような機能的な工程も含むべきである。これは、目的が、血液脳関門（ＢＢＢ）又は血液ＣＳＦ関門（ＢＣＳＦＢ）の関与する新規な輸送システムを同定することである場合には特に重要である。
【００４９】
特定の場合において、結合に依存するだけでなく、細胞膜を超えての輸送にも依存する、高度に濃縮された試料を得ることを所望し得る。これらの状況では、典型的なスクリーニング手順は最適ではなく、したがって本明細書に記載の手順は、医薬品、標的化剤、又は診断剤への開発に受け入れられる特徴を有する標的化ペプチドを同定するより効率的な方法を提供する。本明細書に記載の方法は、選択されたファージ集団をさらに濃縮し、結合特性及び輸送特性の両方に基づいて様々なペプチドを選択するために使用される。単一の生存している被験体における１回の選別により、ペプチドの亜集団が選択されるが、この集団は選択的な輸送ペプチドについて濃縮される必要がある。本発明者らは、例えばヒト被験者において使用され得る、標的化ペプチドの濃縮を行なうための改良された方法を提供する。「被験体」は、一般的には哺乳動物をいう。特定の好ましい実施態様では、被験体は、げっ歯類、霊長類、サル、又はヒトである。より好ましい実施態様では、被験体はヒトである。
【００５０】
標的化ペプチドの同定
本発明は、ＣＳＦ、脳、又は関連した脈管構造への組成物の局在化のために使用することができる、１つ以上の脳標的化ペプチド又は分子標的を同定するための方法を含む。被験体の液体及び器官を、Ｎ個の残基（Ｎは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個以上の残基であり得る）を有するペプチドについて、いくつかのペプチドモチーフを生じるランダムファージライブラリーからスクリーニングする。一例では、トリペプチドモチーフ
【表４】
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を含む様々なクローンが、ＣＳＦ及び脳において、高い頻度、選択的な標的化又は結合、及び存在を示した。オンラインタンパク質データベースにおいて入手可能な配列と、選択されたペプチドモチーフとの比較により、多くの候補タンパク質が、これらのペプチドモチーフと相同な又は類似した配列を共有することが示唆される。これらのモチーフを取り囲む機序の研究が、ＣＳＦ液及び脳、及び関連した脈管構造、並びにそれらの組合せを標的化するための、ペプチド及び標的の同定のための新規プラットフォームを提供するために探究されている。所見はまた、新規に同定されたモチーフがリードペプチド模倣薬として働き得、様々な治療部分の直接送達のために最適化させることができるという、重要な臨床的意義も有する。１つの方法は、ファージライブラリーを静脈内注射することを含み、数分後に試料を回収する。
【００５１】
「ファージディスプレイライブラリー」は、その外表面上に一連の推定標的化ペプチドを発現するように遺伝子工学操作されたファージの集合である。好ましい実施態様では、推定標的化ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ファージキャプシドタンパク質をコードする遺伝子のインフレーム内に挿入する。他の好ましい実施態様では、推定標的化ペプチド配列は、一部には２０種類全てのアミノ酸のランダムな混合物であり、一部には非ランダムである。特定の好ましい実施態様では、ファージディスプレイライブラリーの推定標的化ペプチドは、標的化ペプチド配列内の一定の位置に又はランダムな位置に１つ以上のシステイン残基を示す。システインは、例えば、環式ペプチドを作製するために使用され得る。様々な器官、組織、又は細胞型に選択的に結合する標的化ペプチドは、「バイオパニング」によって単離され得る（Pasqualini and Ruoslahti, 1996, Pasqualini, 1999）。簡潔に言えば、推定標的化ペプチドを含有しているファージライブラリーを動物に投与し、ファージを含有している器官、組織、液体、又は細胞型の試料を回集する。溶菌ファージを利用する好ましい実施態様では、ファージを、細菌のバイオパニングの操作の各回の間にインビトロで増殖させ得る。細菌をファージによって溶菌することにより、特定の挿入断片を示す複数のコピーのファージを分泌する。標的分子に結合するか又は特定の液体若しくは組織に輸送されたファージを、標的液体及び器官から収集し、次いで宿主細菌においてそれらを増殖させることによって増幅させることができる。所望であれば、増幅されたファージを宿主に投与することができ、液体及び器官の試料を再度回集することができる。バイオパニングの複数回の操作を、選択的な結合物質及び輸送体の集団が得られるまで行なうことができる。ペプチドのアミノ酸配列は、ファージゲノム中の標的化ペプチド挿入断片に対応するＤＮＡをシークエンスすることによって決定される。次いで、同定された標的化ペプチドを、標準的なタンパク質化学技術によって合成ペプチドとして産生することができる。このアプローチは、循環中の標的化ペプチドを、その標的の性質に関する予備知識を全く必要とすることなく、網羅的な機能的アッセイにおいて検出することを可能とする。一旦候補標的が標的化ペプチドのレセプターとして同定されると、それを標準的な生化学的方法を使用することによって単離、精製及びクローニングすることができる。特定の実施態様では、サブトラクションプロトコールを使用して、バックグラウンドのファージ結合をさらに減少させることができる。サブトラクションの目的は、関心対象の組織以外の組織に結合するファージをライブラリーから除去することである。代替的な実施態様では、ファージライブラリーを、選択された液体、組織、又は器官を有さない被験体に対してプレスクリーニングし得る。ファージディスプレイ技術は、バクテリオファージを遺伝子的に操作することを含み、よって、小さなペプチドをその表面上に発現させることができる（Smith and Scott, 1985 and 1993）。この技術の可能性ある適用範囲は極めて広く、ファージディスプレイされるペプチドライブラリーの構築、及び、ライブラリーを使用してペプチドリガンドを単離するというスクリーニング方法の開発において過去十年間においてかなりの進歩が見られた。例えば、ペプチドライブラリーの使用は、炎症反応に関与する抗体又は細胞接着を媒介するインテグリンなどの、多くのタンパク質内の相互作用部位及びレセプター−リガンド結合モチーフを特徴付けることを可能とした。この方法はまた、ペプチド模倣薬又は造影剤の開発に対する先導役としての役目を果たす新規ペプチドリガンドを同定するためにも使用され（Arap et al, 1998a）、ペプチドの他に、一本鎖抗体などのより大きなタンパク質ドメインも、ファージ粒子の表面上にディスプレイさせることができる（Arap et al, 1998a）。
【００５２】
ファージディスプレイ系の選択
マウスで行なわれた以前のインビボでの選択試験は、ｆＵＳＥ５ベクターにおいて遺伝子ＩＩＩ被包タンパク質との融合タンパク質として発現されるランダムペプチドライブラリーを優先的に使用した（Pasqualini and Ruoslahti, 1996）。輸送体ペプチドを同定するために使用された好ましいファージ系は、Ｔ７ファージ系である。Ｔ７ファージ粒子は非常に小さく（約５０nmの直径）、細胞を通って天然の細胞小器官の細胞内選別を使用して輸送されることを可能とする。Ｍ１３ファージ系は、サイズが有意により大きく、細胞への取り込み及び細胞内選別を妨げ得る。したがって、血液脳関門（ＢＢＢ）及び血液ＣＳＦ関門（ＢＣＳＦＢ）などの細胞膜によって保護された液体及び器官における標的ペプチドの濃縮は妨げられる。所与のライブラリーに存在する個々のクローンの数及び多様性は、インビボでの選択の成功のための重要な因子である。欠陥のあるファージクローンを過剰提示する可能性がより低い、一次ライブラリーを使用することが好ましい。全てのファージクローンの比率が等しく高い多様性を有する一次ライブラリーを使用することが好ましい。ライブラリーの調製は、１０８〜１０９個のプラーク形成単位（ｐｆｕ）/mlとなるように最適化されるべきである。ある実施態様では、容積増幅戦略を、各回の選択操作の間に適用する。直鎖状、環状、又は二環式ペプチドを示すファージライブラリーを、本発明の範囲内で使用し得る。しかし、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個以上の残基を示すファージライブラリーが好ましい。環式ライブラリーも好ましい。しかし、同族合成ペプチドの産生も可能であるが、ジスルフィド橋の配置が異なる複数の配座異性体に因り複雑であり得る。
【００５３】
標的化送達
脈管構造に標的化するペプチドを、細胞傷害性薬物又はアポトーシス誘発性ペプチドと結合させることにより、親化合物よりも効果的でより毒性の少ない化合物が得られる。
【００５４】
本発明は、ＣＳＦ液及び脳の選択的標的化のための方法及び組成物を記載する。標的化ペプチドのための「レセプター」は、標的化ペプチドに直接的に又は間接的に結合する、任意の分子又は巨大分子複合体を含むがこれらに限定されない。レセプターの非限定的な例としては、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、エピトープ、脂質、炭水化物、多分子構造、及び１つ以上の分子の特異的コンフォメーションが挙げられる。好ましい実施態様では、「レセプター」は、標的組織又は器官内の細胞表面上に存在する、天然に存在する分子又は分子の複合体である。好ましくは、「レセプター」は、組織、器官、血流、又はその脈管構造上に又はその中に存在する、天然に存在する分子又は分子の複合体である。より好ましくは、「レセプター」は、細胞上に内部移行し、経細胞輸送機序を使用して細胞の反対側へと輸送される、輸送レセプターである。特定の実施態様では、治療剤を、例えばＣＳＦ及び脳への選択的送達のために標的化ペプチド又は融合タンパク質に付着させ得る。使用に適した薬剤又は因子は、脳疾患に対して処置の効果を有するあらゆる化合物又は生物学的製剤を含み得る。化学療法剤及び投与法、用量などは当業者には周知であり（例えば、"Physicians’ Desk Reference", Goodman & Oilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics"及び"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th ed, pp 1035-1038及び1570-1580を参照されたい、どちらも関連部分が参照により本明細書に組み入れられる）、本明細書の開示に鑑みて本発明と組み合わせ得る。用量の幾分かの変更が、処置される被験体の容態に応じて必然的に行なわれるであろう。投与責任者がいずれにしても個々の被験体に対する適切な用量を決定するだろう。
【００５５】
医薬組成物
臨床適用を考える場合、医薬組成物発現ベクター、ウイルスストック、タンパク質、抗体、及び目的とする適用に適した剤形の薬物を調製することが必要であり得る。一般的に、これは、ヒト又は動物に対して有害である可能性がある不純物を実質的に含まない組成物を調製することを包含する。一般的には、送達ベクターを安定化し、標的細胞による取り込みを可能とする適切な塩及び緩衝液を使用することを所望するだろう。組換え細胞を患者に導入する場合には緩衝液も使用される。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体又は水性媒体に溶解又は分散させた、有効量のタンパク質、ペプチド、抗体、融合タンパク質、組換えファージ、及び／又は発現ベクターを含み得る。「薬学的に又は薬理学的に許容される」という語句は、動物又はヒトに投与された場合に有害反応、アレルギー反応、又は他の望ましくない反応を生じない分子本体及び組成物をいう。本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張化剤、及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野において周知である。あらゆる従来の媒体又は薬剤が本発明のタンパク質又はペプチドと非適合性でない限り、治療組成物へのその使用が考えられる。補助活性成分もまた該組成物に取り込まれ得る。本発明の活性組成物は、古典的な医薬調製物を含み得る。本発明に記載のこれらの組成物の投与は、標的の液体、組織、又は器官がその経路を介して到達可能である限り、任意の一般的な経路を介する。これは、経口、鼻腔、頬側、直腸、膣内、又は局所を含む。あるいは、投与は、同所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、又は静脈内投与により得る。このような組成物は通常、上記された薬学的に許容される組成物として投与されるだろう。注射用途に適した剤形は、無菌水溶液又は分散液、及び、無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、シリンジが容易に扱える程度まで流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から防御されていなければならない。担体はまた、例えば、水、エタノール、（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、及び植物油を含有する、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張化剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の吸収延長は、組成物中に、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどを使用することによってもたらされ得る。無菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、適切な溶媒中に、必要であれば上記に列挙された他の様々な成分と共に取り込み、その後、滅菌濾過することによって調製される。一般的には、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体及び上記に列挙された成分の中からの必要とされるその他の成分とを含有する無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより、以前に滅菌濾過されたその溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。
【００５６】
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を実証するために含められる。以下の実施例に開示された技術は、本発明者らによって本発明の実施においてよく機能することが発見された技術を示し、したがって、その実施のための好ましい形態を構成すると考えられ得ることが当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に鑑みて、多くの変更を、開示された具体的な実施態様に行なうことができ、依然として本発明の精神及び範囲から逸脱することなく似たような又は類似した結果を得ることができることを理解すべきである。
【００５７】
実施例１：大槽へのカニューレの手術による留置
大槽（ＣＭ）に、Sarna et al.（1983）(Waring et al. 2010, 192 249-253)（Sarna et al. 1983, 383-388）によって以前に記載された方法の改変形を使用してカニューレを挿入した。麻酔したウィスターラット（２００〜３５０ｇ）を定位脳手術装置上に載せ、剃った頭頂部から肩甲骨間部まで正中切開を行なった。頭頂部に２つの穴を開け、取り付けねじを穴にしっかり固定した。外後頭陵に追加の穴を開け、これを使用してカニューレを大槽に定位的に誘導した。歯科用セメントをカニューレ及びねじの周辺に塗布して、適所に固定した。セメントが乾燥した後、皮膚創傷を４/０のsupramid糸を用いて縫合した。カニューレが上手に配置されると、脳脊髄液（ＣＳＦ）が自然発生的に流れる。ラットを定位脳手術装置から取り出し、適切な術後の鎮痛処置を受け、ＣＳＦ中に血液の兆候が観察されなくなるまで少なくとも１週間は回復させた。全ての動物手順は、施設動物実験当局（institutional animal care authorities）（認可番号２４７４）によって全て承認された。
【００５８】
実施例２：麻酔していない成体ラットからのＣＳＦ及び血液の連続的な収集
大槽にカニューレを挿入された起きているラットを手で優しく握った。マンダリンをカニューレから取り出し、自然発生的に流れているＣＳＦ １０μlを収集した。血液による汚染又は変色の兆候が全くない透明なＣＳＦ試料のみを本試験に含めた。なぜなら、カニューレの開存性が最終的に損なわれるからである。平行して尾の先端の小さな切開から血液１０〜２０μLを、ヘパリン（シグマアルドリッチ社）を含有しているチューブに収集した。ＣＳＦ及び血液を、バクテリオファージの静脈内注射後の様々な時点で収集した。全てのＣＳＦ試料を収集する前に、カテーテルのデッド容量を示す１０〜１５μLの液体を廃棄した。
【００５９】
実施例３：Ｔ７ファージペプチドライブラリーの工学操作
ライブラリーを、T7Select System Manual（Novagen）（Rosenberg et al. InNovations 6, 1-6 1996）に概略が示されているようにT7Select 10-3bベクターを使用して構築した。簡潔に言えば、ランダムな１２−ｍｅｒ挿入断片ＤＮＡを、以下の形式で合成した：
【表５】
0006640099.tif 000006
【００６０】
ＮＨＨコドンを使用することにより、挿入断片内の２つの終止コドン及びアミノ酸の過剰提示を回避した。Ｎは人の手で混ぜ合わせた等モル比の各ヌクレオチドを意味し、Ｈは人の手で混ぜ合わせた等モルのアデニン及びシトシンの両方のヌクレオチドである。一本鎖領域を、クレノウ緩衝液（New England Biolabs）中でｄＮＴＰ（Novagen）及びクレノウ酵素（New England Biolabs）と共に３７℃で３時間インキュベートを続けることによって二本鎖ＤＮＡへと変換した。反応後、二本鎖ＤＮＡをＥｔＯＨを用いての沈降によって回収した。得られたＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（両方共にRoche）を用いて消化した。次いで、消化され精製された（QIAquick, Qiagen）挿入断片を、予め消化しておいたＴ７ベクターのインフレーム内に、キャプシド１０Ｂ遺伝子のアミノ酸３４８の後に、ライゲート（Ｔ４リガーゼ、New England Biolabs）した。ライゲーション反応液を１６℃で１８時間インキュベートし、続いてインビトロでのパッケージングにかけた。ファージへのインビトロでのパッケージングを、T7Select 10-3bクローニングキット（Novagen）に添付された説明書に従って行ない、パッケージング溶液を、Ｅ．ｃｏｌｉ（BLT5615, Novagen）を使用して溶菌するまで１回増幅させた。溶菌液を遠心分離にかけ、力価を測定し、−８０℃でグリセロースストック液として凍結させた。
【００６１】
実施例４：ＰＣＲファージの同定
ブロスで又はプレートで増殖させたファージの可変領域は、社内で設計された４５４/Roche−アンプリコン融合プライマーを使用したＰＣＲ増幅の直接的な対象であった。正方向の融合プライマーは、可変領域（ＮＮＫ）１２（鋳型特異的）、ＧＳ ＦＬＸチタニウムアダプターＡ、及びライブラリーに重要な４塩基の配列（ＴＣＡＧ）にフランキングする配列を含有する：
【表６】
0006640099.tif 000007
【００６２】
逆方向融合プライマーはまた、捕獲用ビーズ上への付着のためのビオチン、及び、エマルジョンＰＣＲ中のクローン性増幅に必要とされるＧＳ ＦＬＸチタニウムアダプターＢを有する。
【表７】
0006640099.tif 000008
【００６３】
次いで、アンプリコンを、４５４ＧＳ ＦＬＸチタニウムプロトコールに従って４５４／Rocheパイロシークエンスにかけた。マニュアルサンガーシークエンス（Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNAアナザイラ）のために、Ｔ７ファージＤＮＡをＰＣＲ増幅し、以下のプライマー対を用いてシークエンスした：
【表８】
0006640099.tif 000009
【００６４】
個々のファージプラークの挿入断片を、Roche Fast Start DNAポリメラーゼキットを使用して（製造業者の説明書に従って）ＰＣＲ増幅した。ホットスタート（９５℃で１０分間）、並びに９５℃で５０秒間、５０℃で１分間、及び７２℃で１分間の３５回の増幅サイクルを行なった。
【００６５】
実施例５：ファージの調製、適用、及び選択
ライブラリーからのファージ、ｗｔファージ、ＣＦＳ及び血液から回収したファージ、又は個々のクローンを、ブロス培地（ＴＢ培地）（Sigma Aldrich）又は５００cm2のプレート（Thermo Scientific）上のいずれかの大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ５６１５中で３７℃で４時間かけて増殖させた。プレートをトリス−ＥＤＴＡ緩衝溶液（Fluka Analytical）で濯ぐか又は滅菌済みピペットチップを用いてプラークを拾い上げるかのいずれかによって、ファージをプレートから抽出した。ファージを、１回の操作のポリエチレングリコールによる沈降（ＰＥＧ８０００）（Promega）によって培養上清又は抽出緩衝液のいずれかから回収し、トリス−ＥＤＴＡ緩衝溶液に再度懸濁した。
【００６６】
増殖したファージは、静脈内（i.v.）注射（５００μL／動物）前にエンドトキシン除去ビーズ（Miltenyi Biotec）を使用して２〜３回の操作のエンドトキシン除去を受けた。指定の時点で収集されたＣＳＦ及び血液試料中のファージ含量は、製造業者の説明書（(T7Select Systemマニュアル）に従ってプラーク計数アッセイによって決定された。ファージの選択は、精製ライブラリーの尾静脈注射（i.v.）によって、又は、以前の選択操作のＣＳＦから回収されたファージの再注射によって行なわれた。続いて、ＣＳＦ及び血液試料を、注射から１０分後、３０分後、６０分後、９０分後、１２０分後、１８０分後、及び２４０分後に収集した。合計で４回の操作のインビボでのパニングを行ない、その中で２つの選択分岐を保持し、最初の３回の選択操作中に別々に分析した。最初の２回の選択操作の全てのＣＳＦから回収したファージ挿入断片を、４５４／Rocheパイロシークエンスにかけ、最後の２回の選択操作の全てのＣＳＦから回収したクローンを、マニュアルでシークエンスした。初回の選択操作の全ての血液から収集したファージもまた４５４／Rocheパイロシークエンスにかけた。
【００６７】
実施例６：フィルター及び処理解読データ
Roche-454生データを、ベンダーソフトウェア（http://454.com/my454/documentation/gs-flx system/emanuals/Part_C/wwhelp/wwhimpl/js/html/wwhelp.htm#href=PartC.1.087.html#9003035）を使用することによって、バイナリ標準フローグラム形式（sff, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/trace.cgi?cmd=show&f=formats&m=doc&s=format#sff）からヒトで解読可能なピアソン形式（fasta, http://emboss.sourceforge.net/docs/themes/SequenceFormats.html）へと変換する。さらなるヌクレオチド配列処理を、以下に記載されているように、社内で開発したＣ−プログラム及びスクリプト（公表されていないソフトウェアパッケージ）を用いて行なう。
【００６８】
一次データ分析は、厳密な多工程のフィルター手順からなる。有効な１２ｍｅｒの挿入断片ＤＮＡ配列を含有していない解読値をフィルターで除去するために、解読値を、１つのアラインメントあたり２つまでのミスマッチを可能とするグローバルNeedleman-Wunschアラインメントを実施することによって、ヌクレオチド配列GTGATGCTCGGGGATCCGAAT TCT（配列番号４５）として定義された開始タグ、終止タグTAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA（配列番号４６）、及びバックグラウンド挿入断片CCTGC AGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC（配列番号４７）に対して連続的にアラインさせる（Needleman et al, 1970）。したがって、開始タグ又は終止タグを含まない解読値、及び、バックグラウンド挿入断片を含有している解読値、すなわち、許容される数のミスマッチを超えたアラインメントがライブラリーから除去される。残りの解読値については、開始タグで始まり、終止タグの前で終わるＮ−ｍｅｒのＤＮＡ配列ストレッチを、元来の解読配列から切り出し、さらに処理する（以下において「挿入断片」と命名する）。挿入断片の翻訳時に、５’末端から最初の終止コドン後の部分は、挿入断片から除去される。さらに、３’末端で不完全なコドンに至るヌクレオチドも除去された。バックグラウンド配列のみを含有している挿入断片を除外するために、アミノ酸パターン「ＰＡＧ」で始まる翻訳された挿入断片も同様に除去される。翻訳時に３アミノ酸よりも短い長さのペプチドはライブラリーから廃棄される。最後に、挿入断片ライブラリーの重複が除去され、各々の独特な挿入断片の頻度を計算する。この分析の結果は、ヌクレオチド配列（挿入断片）のリスト及びその（解読）頻度からなる。
【００６９】
実施例７：配列類似性によるＮ−ｍｅｒＤＮＡ挿入断片のグループ分け
Roche-454に特異的なシークエンスのエラー（例えばホモポリマーストレッチをシークエンスする問題）を克服し、あまり些細ではない重複性（例えばシークエンスエラーに起因する）を除去するために、以前にフィルターにかけたＮ−ｍｅｒ挿入断片ＤＮＡ配列（挿入断片）を、以下のように定義された反復アルゴリズムによって類似の挿入断片（２つまでのミスマッチが許容される）に分類する：挿入断片は主に、その頻度（最も高いものから最も低いものまで）、第二に、頻度が等しい場合には、その長さ（最長から最短まで）によって分類される。結果として、最も頻度が高く最も長い挿入断片が第一の「グループ」を規定し、「グループの頻度」は、挿入断片の頻度と等しくなるように設定された。続いて、分類したリストにおける全ての残りの挿入断片を、ペアワイズNeedleman-Wunschアラインメントによってグループに加えることを試みる。アラインメントにおけるミスマッチ、挿入、又は欠失の数が２の閾値を超えない場合、挿入断片をグループに加え、したがって、挿入断片の頻度をグループの頻度の合計に加える。グループに加えられた挿入断片は使用したとしてフラグが付され、さらなる処理から排除される。挿入断片の配列を既存のグループに加えることができない場合、挿入断片を使用して、対応する挿入断片の頻度を有する新しいグループを作り、したがって、そのフラグを付けたものを「使用された」と設定する。全ての挿入断片配列を新たなグループを形成するために使用したか又は既存のグループに含めることができた場合に、反復を終了する。結局、ヌクレオチドから構成されるグループ分けされた挿入断片は、ペプチド配列（ペプチドライブラリー）へと翻訳される。この分析の結果は、「グループ分けされた挿入断片」、及び、１つの挿入断片あたりにシークエンスされた数に相当するその対応する頻度のリストである。
【００７０】
実施例８：モチーフの作成及び標準化：
独特なペプチドのリストに基づいて、全ての可能なアミノ酸パターンを含有しているライブラリーを以下のように作成する。長さ３の全ての可能なアミノ酸パターン（例えば「ＡＢＣ」）をペプチドから抽出し、その逆のパターン（例えば「ＣＢＡ」）と一緒に、全ての可能なパターンを含有している普遍的なモチーフライブラリーに加える。この高度に重複したモチーフライブラリーを分類し、重複性を除去する。次いで、ライブラリー中の各モチーフを、それがペプチドライブラリーに存在するかどうかを反復試験する。これが事実である場合、モチーフが見られるペプチドの頻度を加え、モチーフライブラリーのモチーフに割り当てる。これらの頻度は「モチーフ数」と呼ばれる。モチーフ作成の結果は、存在している全ての３アミノ酸パターン（モチーフ）及びその対応するモチーフ数を含有している２次元アレイであり、これはシークエンス解読値の数の指標であり、これにより、上記に詳述されているような解読値のフィルター、グループ分け、及び翻訳時に対応するモチーフがもたらされる。
【００７１】
最後に、１つの試料あたりのモチーフ数を、以下の式
【数１】
0006640099.tif 000010
（式中、ｎｉは、モチーフｉを含有する解読値の数である）
を使用して標準化した。したがって、ｖｉは、モチーフｉを含有する試料中の解読値（又はペプチド）の頻度％を示す。標準化されていないモチーフ数のＰ値をフィッシャーの正確確率検定を用いて計算した。
【００７２】
実施例９：ＣＳＦからの試料採取を使用してラットにおいてインビボで４回選択操作した後のトリペプチドモチーフの的中：
本発明は、ＣＳＦ、脳、又は関連した脈管構造への組成物の局在化のために使用することができる、１つ以上の標的化ペプチド又は分子標的の同定法を構成する。被験体の液体及び器官をＸ（Ｎ）（Ｎは７、８、９、１０、１１、１２又はそれ以上の残基であり得る）について、いくつかのペプチドモチーフを生じるランダムファージライブラリーからスクリーニングする。一例では、様々なクローン（トリペプチドモチーフ
【表９】
0006640099.tif 000011
を含む）が、ＣＳＦ及び脳において高い頻度、選択的な結合、及び存在を示した。
【００７３】
実施例１０：ＣＳＦからの試料採取を使用してラットにおいてインビボで４回選択操作した後のペプチドの的中
合計して９２４回のシークエンス（短い解読値、１回しか見られなかった解読値、及び配列を全く与えなかったシークエンスを含む）。各ペプチドの頻度は、合計で９２４回のシークエンス操作に関連している。
【００７４】
【表１０】
0006640099.tif 000012
0006640099.tif 000013
【００７５】
実施例１１：
ＣＮＳにおけるペプチドにより媒介される薬理学的作用を調べるために、本発明者らは、配列番号８を有する脳シャトルペプチドを、ストレプトアビジン（ＳＡ）を有するＢＡＣＥ１ペプチド阻害剤（どちらもビオチニル化されている）と、２つの異なる比で混合した実験を行なった。１つの試料に対しては、本発明者らはＢＡＣＥ１ペプチド阻害剤のみを使用し、他の試料に対しては本発明者らはＢＡＣＥ１ペプチド阻害剤と、配列番号８を有する脳シャトルペプチドを１：３の比で使用し、脳送達を促進する、配列番号８を有する大半の脳シャトルペプチドと単一のＢＡＣＥ１ペプチド阻害剤との混合物を有するコンジュゲートしたＳＡ複合体の一部を生成する。２つの試料を静脈内注射し、血液及びＣＳＦ中のアミロイド−βペプチド４０（Ａβ４０）のレベルを決定した。予想された通り、両方の試料において、血液中のＡβ４０レベルは実質的に減少していた。しかし、配列番号８を有する脳シャトルペプチドと、ＳＡにコンジュゲートしたＢＡＣＥ１ペプチド阻害剤との混合物を含む試料のみが、ＣＳＦにおける明確なＡβ４０の減少を誘導した（図７Ａの灰色の線を参照）。このデータは、配列番号８を有する脳シャトルペプチドが、大型タンパク質（ＳＡ）をＣＮＳに輸送し、ＳＡにコンジュゲートしたＢＡＣＥ１ペプチド阻害剤による薬理作用を誘導することができることを示す。
【００７６】
方法
ストレプトアビジン−ペプチド−ＢＡＣＥ１阻害剤複合体の機能性を、製造業者のプロトコール（和光、２９４−６４７０１）に従ってＡβ（１−４０）のＥＬＩＳＡによって評価した。簡潔に言えば、ＣＳＦ試料を、標準的な希釈剤（１：２３）で希釈し、捕獲抗体ＢＮＴ７７でコーティングされた９６穴プレート上で４℃で一晩インキュベートした。５回の洗浄工程の後、ＨＲＰにコンジュゲートしたＢＡ２７抗体を加え、４℃で２時間インキュベートし、続いて５回の洗浄工程を行なった。Ａβ（１−４０）を室温で３０分かけてのＴＭＢ溶液中でのインキュベーションによって検出した。停止溶液を用いて発色を停止した後に４５０nmでの吸光度を解読した。血漿試料は、Ａβ（１−４０）ＥＬＩＳＡの前に固相抽出を受けた。血漿を９６穴プレート中の０．２％ＤＥＡ（Sigma）に加え、室温で３０分間インキュベートした。ＳＰＥプレート（Oasis, 186000679）を１００％メタノールで、次いで水で洗浄した後、血漿試料をＳＰＥプレートに加え、全ての液体を除去した。試料を洗浄し（５％メタノール、次いで３０％メタノール）、２％ＮＨ４ＯＨ／９０％メタノールで溶出した。一定のＮ２気流下で５５℃で９９分間溶出液を乾燥させた後、試料を標準的な希釈剤で復元し、Ａβ（１−４０）を上記に示されているように測定した。
【００７７】
参考文献
【表１１】
0006640099.tif 000014
0006640099.tif 000015
0006640099.tif 000016
【図１Ａ】
0006640099.tif 000017
【図１Ｂ】
0006640099.tif 000018
【図２Ａ】
0006640099.tif 000019
【図２Ｂ】
0006640099.tif 000020
【図２Ｃ】
0006640099.tif 000021
【図２Ｄ】
0006640099.tif 000022
【図３】
0006640099.tif 000023
【図４】
0006640099.tif 000024
【図５】
0006640099.tif 000025
【図６Ａ】
0006640099.tif 000026
【図６Ｂ】
0006640099.tif 000027
【図６Ｃ】
0006640099.tif 000028
【図７Ａ】
0006640099.tif 000029
【図７Ｂ】
0006640099.tif 000030
【配列表】
0006640099000001.app