(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α鎖の可変領域とβ鎖の定常領域との間に人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するαβヘテロ二量体Ｔ細胞受容体（TCR）であって、
前記TCRの人工的鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
TRAVの46番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸、
TRAVの47番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸、
TRAVの46番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸
、あるいは
TRAVの47番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸、
に取って代わったものである、ことを特徴とするαβヘテロ二量体TCR。
【請求項２】
前記TCRは、可溶性のものであることを特徴とする請求項1に記載のTCR。
【請求項３】
前記TCRはα鎖の可変ドメインおよびβ鎖の可変ドメインならびに膜貫通ドメイン以外のβ鎖の定常ドメインの全部または一部を含むが、α鎖の定常ドメインを含まず、前記TCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖とがヘテロ二量体を形成することを特徴とする請求項1又は2に記載のTCR。
【請求項４】
β鎖の定常ドメインにおける天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は別のアミノ酸に置き換えられたことを特徴とする請求項3に記載のTCR。
【請求項５】
β鎖の定常ドメインにおける天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基はアラニンまたはセリンに置き換えられたことを特徴とする請求項3に記載のTCR。
【請求項６】
前記TCRのβ鎖の定常ドメインのC末端で短く切断することによって天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が除去されたことを特徴とする請求項3に記載のTCR。
【請求項７】
前記TCRは（i）その膜貫通ドメイン以外のTCRのα鎖の全部または一部、および（ii）その膜貫通ドメイン以外のTCRのβ鎖の全部または一部を含み、
ここで、（i）および（ii）はいずれもTCR鎖の可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含むことを特徴とする請求項1又は2に記載のTCR。
【請求項８】
前記TCRのα鎖とβ鎖との定常ドメインの間に天然の鎖間ジスルフィド結合が存在しないことを特徴とする請求項7に記載のTCR。
【請求項９】
前記TCRのα鎖および/またはβ鎖の定常領域のC末端で短く切断することによって天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が除去されたことを特徴とする請求項8に記載のTCR。
【請求項１０】
前記TCRのα鎖および/またはβ鎖の定常領域における天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は別の残基に置き換えられたことを特徴とする請求項8に記載のTCR。
【請求項１１】
前記TCRのα鎖の定常領域とβ鎖の定常領域の間に人工的鎖間ジスルフィド結合を含有することを特徴とする請求項7〜10のいずれかに記載のTCR。
【請求項１２】
TCRのα鎖の定常領域とβ鎖の定常領域の間に人工的鎖間ジスルフィド結合を形成する
システイン残基は、
TRAC*01エクソン1の48TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の57S、
TRAC*01エクソン1の45TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の77S、
TRAC*01エクソン1の10YおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の17S、
TRAC*01エクソン1の45TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の59D、
TRAC*01エクソン1の15SおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の15E、
TRAC*01エクソン1の53RおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54S、
TRAC*01エクソン1の 89PおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の19A、あるいは
TRAC*01エクソン1の10YおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の20E、
に取って代わったものであることを特徴とする請求項11に記載のTCR。
【請求項１３】
前記TCRのα鎖および/またはβ鎖のC末端またはN末端に抱合体が結合していることを特徴とする請求項1〜12のいずれかに記載のTCR。
【請求項１４】
前記TCRと結合している抱合体は、検出可能なマーカー、治療剤、PK修飾部分またはこれらの組み合わせであることを特徴とする請求項13に記載のTCR。
【請求項１５】
前記TCRと結合している治療剤は、前記TCRのα鎖および/またはβ鎖のC末端またはN末端に連結した抗CD3抗体であることを特徴とする請求項14に記載のTCR。
【請求項１６】
請求項1〜15のいずれかに記載のTCRのα鎖およびβ鎖をコードする核酸配列またはその相補配列を含むことを特徴とする核酸分子。
【請求項１７】
請求項16に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１８】
宿主細胞または遺伝形質転換のエンジニアリング細胞であって、請求項17に記載のベクターを含むか、あるいは染色体に外来の請求項16に記載の核酸分子が組み込まれている細胞。
【請求項１９】
請求項1〜15のいずれかに記載のTCRを発現することを特徴とする分離された細胞。
【請求項２０】
請求項1〜15のいずれかに記載のT細胞受容体を製造する方法であって、
（i）請求項18に記載の宿主細胞を培養することによって、請求項1〜15のいずれかに記載のT細胞受容体のα鎖およびβ鎖を発現させる工程と、
（ii）前記のα鎖およびβ鎖を分離または精製する工程と、
(iii)前記のα鎖およびβ鎖をリフォールディングさせ、前記T細胞受容体を得る工程と、
を含む方法。
【請求項２１】
一つまたは複数の請求項1〜15のいずれかに記載のTCRを含むことを特徴とするT細胞受容体複合体。
【請求項２２】
請求項1〜15のいずれかに記載のTCRの使用であって、腫瘍、ウイルス感染または自己免疫疾患を治療する薬物の製造あるいはMHC-ペプチド複合体を検出する試薬の製造に使用されることを特徴とする使用。
【請求項２３】
薬学的に許容される担体と安全有効量の請求項1〜15のいずれかに記載のTCR、請求項19に記載の細胞または請求項21に記載のT細胞受容体複合体とを含むことを特徴とする薬物組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医薬の分野に属し、具体的に、安定した可溶性T細胞受容体およびその製法と使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
2種類だけの分子が特異的に抗原を認識することができる。その一つはイムノグロブリンまたは抗体で、もう一つはT細胞受容体（TCR）で、α鎖/β鎖またはγ鎖/δ鎖のヘテロ二量体の形態で細胞膜の表面に存在する糖タンパク質である。95％のT細胞において、TCRヘテロ二量体はα鎖とβ鎖からなるが、5％のT細胞はγ鎖とδ鎖からなるTCRを有する。天然のαβヘテロ二量体TCRはα鎖およびβ鎖を有し、α鎖およびβ鎖はαβヘテロ二量体TCRのサブユニットを構成する。TCRのα鎖およびβ鎖は一般的にそれぞれ二つの「ドメイン」を有するとされ、すなわち、TCRα鎖の可変ドメイン（Vα）およびTCRα鎖の定常ドメイン（Cα）、TCRβ鎖の可変ドメイン（Vβ）およびTCRβ鎖の定常ドメイン（Cβ）である。
【０００３】
TCRは、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）に提示された特異的抗原ペプチドの唯一の受容体で、このような外因性ペプチドまたは内因性ペプチドは細胞の異常発生の唯一の兆候であることがある。免疫系において、抗原特異的TCRとpMHC複合体の結合によってT細胞と抗原提示細胞（APC）が直接物理的に接触し、さらにT細胞およびAPCの両者のほかの細胞膜の表面の分子が互いに作用し、これによって一連の後続の細胞シグナル伝達やほかの生理反応が生じることで、異なる抗原に特異的なT細胞はその標的細胞に対して免疫反応を果たす。そのため、TCRは免疫系の細胞性免疫にとって非常に重要である。
【０００４】
免疫グロブリン（抗体）が抗原認識分子とされるように、TCRも診断および治療のための開発が可能である。可溶性TCRは幅広い用途を有し、TCR-pMHCの相互作用の研究だけでなく、感染を検出する診断ツールまたは自己免疫疾患のマーカーとしても有用である。同様に、可溶性TCRは治療剤（たとえば細胞毒性化合物または免疫刺激化合物）の特異的抗原を提示する細胞への送達、あるいはT細胞（たとえば自己免疫性ペプチド抗原と反応するT細胞）に対する抑制に使用することができる。また、可溶性TCRはほかの分子（たとえば抗CD3抗体）と結合して改めてT細胞に標的を向けることによって、特定の抗原を提示する細胞を標的とし、殺傷作用を果たすこともできる。
【０００５】
天然に存在するTCRは膜タンパク質で、その膜貫通領域によって安定し、可溶性TCRタンパク質を得る場合、TCRが膜と分離するとき、その元のリガンド（すなわちpMHC）との結合能を維持する安定した可溶性TCRを得るのは非常に困難である（Shinら,(1993)science259:1901）。その不安定性および低いタンパク質収量が治療剤または診断試薬の開発へのTCRまたはその断片の使用の主な障害になる。一部の文献では、細胞外領域だけまたは細胞外および細胞質領域だけを含む、短縮された形態のTCRが記載されているが、このようなTCRは、TCR特異的抗体によって認識されるが、収率が低く、かつ低濃度の場合、主要組織適合遺伝子複合体-ペプチド複合体を認識することができないことから、変性しやすく、安定性が不十分であることがわかる。当業者は安定した可溶性T細胞受容体の開発に取り組んでいる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、安定した可溶性ヘテロ二量体TCRおよびその使用を提供することにある。
本発明の第一の側面では、α鎖の可変領域とβ鎖の定常領域の間に人工的鎖間ジスルフ
ィド結合を含有する、αβヘテロ二量体TCRを提供する。
【０００７】
もう一つの好適な例において、前記TCRの人工的鎖間ジスルフィド結合は、α鎖の可変領域のFR2とβ鎖の定常領域の間に位置する。
もう一つの好適な例において、前記TCRの人工的鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、TRAVの46または47番目のアミノ酸残基に取って代わったものである。
【０００８】
もう一つの好適な例において、前記TCRの人工的鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、TRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60または61番目のアミノ酸残基に取って代わったものである。
【０００９】
もう一つの好適な例において、前記TCRの人工的鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
TRAVの46番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸、
TRAVの47番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸、
TRAVの46番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸、あるいは
TRAVの47番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸、
に取って代わったものである。
【００１０】
もう一つの好適な例において、前記TCRは可溶性のものである。
もう一つの好適な例において、前記TCRはα鎖の可変ドメインおよびβ鎖の可変ドメインならびに膜貫通ドメイン以外のβ鎖の定常ドメインの全部または一部を含むが、α鎖の定常ドメインを含まず、前記TCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖はヘテロ二量体を形成する。
【００１１】
もう一つの好適な例において、β鎖の定常ドメインにおける天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は別のアミノ酸、好ましくはアラニンまたはセリンに置き換えられた。
【００１２】
もう一つの好適な例において、前記TCRのβ鎖の定常ドメインのC末端で短く切断することによって天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が除去された。
もう一つの好適な例において、前記TCRは（i）その膜貫通ドメイン以外のTCRのα鎖の全部または一部、および（ii）その膜貫通ドメイン以外のTCRのβ鎖の全部または一部を含み、ここで、（i）および（ii）はいずれもTCR鎖の可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含む。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記TCRのα鎖とβ鎖の定常ドメインの間に天然の鎖間ジスルフィド結合が存在しない。
もう一つの好適な例において、前記TCRのα鎖および/またはβ鎖の定常領域のC末端で短く切断することによって天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が除去された。
【００１４】
もう一つの好適な例において、前記TCRのα鎖および/またはβ鎖の定常領域における天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は別の残基に置き換えられた。
もう一つの好適な例において、前記TCRのα鎖の定常領域とβ鎖の定常領域の間に人工的鎖間ジスルフィド結合を含有しない。
【００１５】
もう一つの好適な例において、TCRのα鎖の定常領域とβ鎖の定常領域の間に人工的鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
TRAC*01エクソン1の48TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の57S、
TRAC*01エクソン1の45TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の77S、
TRAC*01エクソン1の10YおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の17S、
TRAC*01エクソン1の45TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の59D、
TRAC*01エクソン1の15SおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の15E、
TRAC*01エクソン1の53RおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54S、
TRAC*01エクソン1の 89PおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の19A、あるいは
TRAC*01エクソン1の10YおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の20E、
に取って代わったものである。
【００１６】
もう一つの好適な例において、前記TCRのα鎖および/またはβ鎖のC末端またはN末端に抱合体が結合している。
もう一つの好適な例において、前記TCRと結合している抱合体は、検出可能なマーカー、治療剤、PK修飾部分またはこれらの組み合わせである。
【００１７】
もう一つの好適な例において、前記TCRと結合している治療剤は、前記TCRのα鎖またはβ鎖のC末端またはN末端に連結した抗CD3抗体である。
もう一つの好適な例において、前記TCRのTm値は≧45℃、好ましくは≧50℃、より好ましくは≧52℃、最も好ましくは≧55℃である。
【００１８】
本発明の第二の側面では、本発明の第一の側面に記載のTCRのα鎖および/またはβ鎖をコードする核酸配列またはその相補配列を含む核酸分子を提供する。
本発明の第三の側面では、本発明の第二の側面に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。
【００１９】
本発明の第四の側面では、宿主細胞または遺伝形質転換のエンジニアリング細胞であって、本発明の第三の側面に記載のベクターを含むか、あるいは染色体に外来の本発明の第二の側面に記載の核酸分子が組み込まれた細胞を提供する。
【００２０】
本発明の第五の側面では、分離された細胞であって、本発明の第一の側面に記載のTCRを発現する細胞を提供する。
本発明の第六の側面では、本発明の第一の側面に記載のT細胞受容体を製造する方法であって、
（i）本発明の第四の側面に記載の宿主細胞を培養することによって、本発明の第一の側面に記載のT細胞受容体のα鎖および/またはβ鎖を発現させる工程と、
（ii）前記のα鎖および/またはβ鎖を分離または精製する工程と、
(iii)前記のα鎖および/またはβ鎖をリフォールディングさせ、前記T細胞受容体を得る工程と、
を含む方法を提供する。
【００２１】
本発明の第七の側面では、T細胞受容体複合体であって、一つまたは複数の本発明の第一の側面に記載のTCRを含む複合体を提供する。
本発明の第八の側面では、本発明の第一の側面に記載のTCRの使用であって、腫瘍、ウイルス感染または自己免疫疾患を治療する薬物の製造あるいはMHC-ペプチド複合体を検出する試薬の製造における使用を提供する。
【００２２】
本発明の第九の側面では、薬学的に許容される担体と安全有効量の本発明の第一の側面
に記載のTCR、本発明の第五の側面に記載の細胞または本発明の第七の側面に記載のT細胞受容体複合体を含む薬物組成物を提供する。
【００２３】
本発明の第十の側面では、疾患を治療する方法であって、治療が必要な対象に本発明の第一の側面に記載のTCR、本発明の第五の側面に記載の細胞、本発明の第七の側面に記載のT細胞受容体複合体または本発明の第九の側面に記載の薬物組成物を施用することを含む方法を提供する。
【００２４】
好ましくは、前記の疾患は、腫瘍、自己免疫疾患およびウイルス感染性疾患を含む。
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１ａ】図1aおよび図1bはそれぞれTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメイン1G4TCR分子のα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列およびβ鎖のアミノ酸配列である。
【図１ｂ】図1aおよび図1bはそれぞれTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメイン1G4TCR分子のα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列およびβ鎖のアミノ酸配列である。
【図２ａ】図2aおよび図2bはそれぞれ図1aおよび図1bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図２ｂ】図2aおよび図2bはそれぞれ図1aおよび図1bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図３】図3は図1aおよび図1bで示されるTCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーカラムによる溶離曲線である。
【図４】図4は図1aおよび図1bで示されるTCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図５】図5は図1aおよび図1bで示されるTCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図６】図6は図1aおよび図1bで示されるTCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度の1G4TCR分子とその相応の抗原の結合曲線である。
【図７ａ】図7aおよび図7bはそれぞれTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメインJM22TCR分子のα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列およびβ鎖のアミノ酸配列である。
【図７ｂ】図7aおよび図7bはそれぞれTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメインJM22TCR分子のα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列およびβ鎖のアミノ酸配列である。
【図８ａ】図8aおよび図8bはそれぞれ図7aおよび図7bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図８ｂ】図8aおよび図8bはそれぞれ図7aおよび図7bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図９】図9は図7aおよび図7bで示されるTCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーカラムによる溶離曲線である。
【図１０】図10は図7aおよび図7bで示されるTCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図１１】図11は図7aおよび図7bで示されるTCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図１２】図12は図7aおよび図7bで示されるTCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のJM22TCR分子とその相応の抗原の結合曲線である。
【図１３ａ】図13aおよび図13bはそれぞれTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメインLC13TCR分子のα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列およびβ鎖のアミノ酸配列である。
【図１３ｂ】図13aおよび図13bはそれぞれTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメインLC13TCR分子のα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列およびβ鎖のアミノ酸配列である。
【図１４ａ】図14aおよび図14bはそれぞれ図13aおよび図13bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図１４ｂ】図14aおよび図14bはそれぞれ図13aおよび図13bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図１５】図15は図13aおよび図13bで示されるTCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーカラムによる溶離曲線である。
【図１６】図16は図13aおよび図13bで示されるTCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図１７】図17は図13aおよび図13bで示されるTCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図１８】図18は図13aおよび図13bで示されるTCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のLC13TCR分子とその相応の抗原の結合曲線である。
【図１９】図19はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメイン1G4分子のα鎖のアミノ酸配列である。
【図２０】図20は図19におけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図２１】図21はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメイン1G4TCRのα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーカラムによる溶離曲線である。
【図２２】図22はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメイン1G4TCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図２３】図23はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメイン1G4TCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図２４】図24はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度の1G4TCR分子とそれに相応する抗原の結合曲線である。
【図２５】図25はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインJM22分子のα鎖のアミノ酸配列である。
【図２６】図26は図25におけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図２７】図27はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインJM22TCRのα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーカラムによる溶離曲線である。
【図２８】図28はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインJM22TCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図２９】図29はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインJM22TCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図３０】図30はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のJM22TCR分子とそれに相応する抗原の結合曲線である。
【図３１】図31はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインLC13分子のα鎖のアミノ酸配列である。
【図３２】図32は図31におけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図３３】図33はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインLC13TCRのα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーカラムによる溶離曲線である。
【図３４】図34はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインLC13TCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図３５ａ】図35aおよび図35bはそれぞれIMGTで挙げられたTRBC1*01およびTRBC2*01のアミノ酸配列である。
【図３５ｂ】図35aおよび図35bはそれぞれIMGTで挙げられたTRBC1*01およびTRBC2*01のアミノ酸配列である。
【図３６】図36はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のLC13TCR分子とそれに相応する抗原の結合曲線である。
【図３７ａ】図37aおよび図37bはそれぞれTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメイン1G4TCR分子のα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列およびβ鎖のアミノ酸配列である。
【図３７ｂ】図37aおよび図37bはそれぞれTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメイン1G4TCR分子のα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列およびβ鎖のアミノ酸配列である。
【図３８ａ】図38aおよび図38bはそれぞれ図37aおよび図37bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図３８ｂ】図38aおよび図38bはそれぞれ図37aおよび図37bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図３９】図39は図37aおよび図37bで示されるTCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーカラムによる溶離曲線である。
【図４０】図40は図37aおよび図37bで示されるTCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図４１】図41は図37aおよび図37bで示されるTCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図４２】図42は図37aおよび図37bで示されるTCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のTCR分子とその相応の抗原の結合曲線である。
【図４３】図43はTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメイン1G4TCR分子のα鎖のアミノ酸配列である。
【図４４】図44は図43におけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図４５】図45はTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーカラムによる溶離曲線である。
【図４６】図46はTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図４７】図47はTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図４８】図48はTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のTCR分子とそれに相応する抗原の結合曲線である。
【図４９】図49はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーカラムによる溶離曲線である。
【図５０】図50はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図５１】図51はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図５２】図52はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のTCR分子とそれに相応する抗原の結合曲線である。
【図５３】図53はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーカラムによる溶離曲線である。
【図５４】図54はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図５５】図55はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図５６】図56はTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のTCR分子とそれに相応する抗原の結合曲線である。
【図５７】図57はTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーカラムによる溶離曲線である。
【図５８】図58はTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図５９】図59はTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図６０】図60はTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のTCR分子とそれに相応する抗原の結合曲線である。
【図６１】図61はTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーカラムによる溶離曲線である。
【図６２】図62はTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図６３】図63はTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図６４】図64はTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCRのα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のTCR分子とそれに相応する抗原の結合曲線である。
【図６５】図65は1G4 TCR分子α鎖の可変領域とβ鎖の定常領域の間の異なる位置に人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する3ドメイン可溶性タンパク質のゲル写真である。
【図６６】図66は異なるTCR分子α鎖の可変領域とβ鎖の定常領域の間に人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する3ドメイン可溶性タンパク質のゲル写真である。
【図６７】図67は1G4 TCR分子α鎖の可変領域とβ鎖の定常領域の間の異なる位置に人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する4ドメイン可溶性タンパク質のゲル写真である。
【図６８】図68は異なるTCR分子α鎖の可変領域とβ鎖の定常領域の間に人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する4ドメイン可溶性タンパク質のゲル写真である。
【発明の実施の形態】
【００２６】
具体的な実施形態
本発明者は幅広く深く研究したところ、意外に安定した可溶性T細胞受容体を得た。具体的に、本発明のTCRはαβヘテロ二量体で、かつ本発明のTCRのα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域の間に共役の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する。より具体的に、本発明のTCRの人工的鎖間ジスルフィド結合は、α鎖のFR2とβ鎖の定常領域の間に位置する。また、本発明は前記TCRの使用、およびその製造方法を提供する。
【００２７】
本発明を説明する前、方法および条件は変更することができるため、本発明は記載される具体的な方法および実験条件に限定されないと理解される。また、本明細書で用いられる用語は具体的な実施形態の説明だけを目的とし、かつその意図は限定性のものではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲だけに限定されると理解される。 
【００２８】
別途に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての技術と科学の用語はいずれも本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同様である。
本発明の実施またはテストにおいて本発明における記載と類似または等価の任意の方法と材料を使用することができるが、本明細書で好適な方法と材料が挙げられた。 
【００２９】
用語
T細胞受容体
天然のαβヘテロ二量体TCRはα鎖およびβ鎖を有し、α鎖およびβ鎖はαβヘテロ二量体TCRの二つのサブユニットを構成する。TCRのα鎖およびβ鎖は一般的にそれぞれ二つの「ドメイン」を有するとされ、すなわち、TCRα鎖の可変ドメイン（Vα）およびTCRα鎖の定常ドメイン（Cα）、TCRβ鎖の可変ドメイン（Vβ）およびTCRβ鎖の定常ドメイン（Cβ）である。天然TCRの膜近位領域のCα鎖とCβ鎖の間に1組のジスルフィド結合が存在し、本発明で「天然の鎖間ジスルフィド結合」と呼ぶ。本発明において、人工的に導入される、位置が天然の鎖間ジスルフィド結合の位置と異なる鎖間共役ジスルフィド結合を「人工的鎖間ジスルフィド結合」と呼ぶ。本発明において、用語「本発明のポリペプチド」、「本発明のTCR」、「本発明のT細胞受容体」は、入れ替えて使用することができ、いずれもα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域の間に本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含
有するヘテロ二量体TCRをいう。
【００３０】
広義的に、TCRのα鎖およびβ鎖は、それぞれ可変領域、連結領域および定常領域を含み、β鎖は、通常、さらに可変領域と連結領域の間に短い多変領域を含むが、この多変領域は通常連結領域の一部と見なされる。TCRのα鎖およびβ鎖は、一般的に、それぞれ二つの「ドメイン」、すなわち、可変ドメインと定常ドメインを有し、可変ドメインは連結する可変領域と連結領域で構成され、定常ドメインはさらに膜貫通領域および細胞質領域を含み、細胞質領域は短い。
【００３１】
本発明のTCRの命名法は国際免疫遺伝情報システム（IMGT）におけるTCRに対する命名法を使用する。すなわち、当該システムでは、「TRAC*01」はTCRのα鎖の定常領域を表し、ここで、「TR」はT細胞受容体の遺伝子を、「A」はα鎖の遺伝子を、Cは定常領域を、「01」は対立遺伝子1を表す。同様に、「TRBC1*01」または「TRBC2*01」はβ鎖の定常ドメインを表す。β鎖に二つの可能な定常領域の遺伝子「C1」および「C2」が存在する。
【００３２】
IMGTで提供されるTRAC*01とTRBC1*01またはTRBC2*01の配列は当業者に周知で得られるもので、たとえばIMGTの公開データベースで見つけることができる（http://www.imgt.org/）。
【００３３】
「TRAV」はTCRのα鎖の可変領域を、「TR」はT細胞受容体の遺伝子を、「A」はα鎖の遺伝子を、Vは可変領域をを表す。同様に、「TRBV」はTCRのβ鎖の可変領域を表す。各可変領域は3つのフレームワーク領域（framework regions、FR）およびフレームワーク領域に挟まれる3つのCDR（complementary determining region、相補性決定領域）、すなわちCDR1、CDR2およびCDR3を含む。CDR領域、特にCDR3によってTCRの多様性およびTCRとpMHC複合体の結合が決まる。3つのフレームワーク領域は、それぞれIMGTにおける位置番号が1-26であるFR1、IMGTにおける位置番号が39-55であるFR2、IMGTにおける位置番号が66-104であるFR3である。異なるTCR分子のフレームワーク領域は非常に類似し（K.Christopher Garciaら, Annu.Rev.Immunol.1999.17:369-397）、IMGTで提供されるTCRの可変領域のフレームワーク領域およびそのIMGTにおける位置番号は当業者に周知で得られるもので、たとえばIMGTの公開データベースで見つけることができる（http://www.imgt.org/）。
【００３４】
説明の便宜上、本発明において、TRAC*01とTRBC1*01またはTRBC2*01のアミノ酸配列の位置番号はN末端からC末端の順で位置に番号をつけ、たとえばTRBC1*01またはTRBC2*01では、N末端からC末端の順で60番目のアミノ酸はP（プロリン）で、本発明においてそれをTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60Pと表記してもよく、TRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸と表記してもよく、またたとえばTRBC1*01またはTRBC2*01では、N末端からC末端の順で60番目のアミノ酸はQ（グルタミン）で、本発明においてそれをTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61Qと表記してもよく、TRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸と表記してもよく、ほかもこのように表記する。TRBC1*01およびTRBC2*01のN末端からC末端のアミノ酸配列はそれぞれ図35aおよび35bに示す通りである。本発明において、可変領域TRAVとTRBVのアミノ酸配列の位置番号は、IMGTで示される位置番号に準ずる。たとえばTRAVにおけるあるアミノ酸は、IMGTで示される位置番号が46であれば、本発明においてそれをTRAVの46番目のアミノ酸と表記し、ほかもこのように表記する。このように、本発明に記載されるTRAVにおけるアミノ酸の位置はIMGTで示されるアミノ酸配列の位置番号に準じ、TRBC1*01またはTRBC2*01におけるアミノ酸の位置はそのN末端からC末端の順でつけられる位置番号である。注意すべきなのは、IMGTで示されるアミノ酸配列の位置番号は、アミノの配列をN末端からC末端の順でつける位置番号とは完全に一致するわけではないことである。
【００３５】
TCRのα鎖は唯一の定常領域TRAC*01を有し、β鎖の2種類の定常領域は僅かな違いだけ
で、TRBC1*01はそのエクソン1に4N、5Kおよび37Fを有するが、TRBC2*01はそのエクソン1に4K、5Nおよび37Yを有する。そのため、TCR分子のβ鎖の定常領域はTRBC1*01でもTRBC2*01でも基本的に違いがない。本発明の実施例で使用されたβ鎖の定常領域はTRBC2*01である。
【００３６】
安定性
用語「安定性」とは、タンパク質の安定性の任意の面である。再生能力、発現能力、タンパク質再生収率、熱安定性、凝集耐性、アンフォールディング耐性などの面を含み、好ましくはタンパク質再生収率および熱安定性の面をいう。
【００３７】
3ドメインTCR
用語「3ドメインTCR」とは、前記TCRがα鎖の可変ドメインおよびβ鎖の可変ドメインならびに膜貫通ドメイン以外のβ鎖の定常ドメインの全部または一部を含むが、α鎖の定常ドメインを含まず、α鎖の可変ドメインとβ鎖がヘテロ二量体を形成し、人工的鎖間ジスルフィド結合が前記TCRのα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域を連結する。
【００３８】
4ドメインTCR
用語「4ドメインTCR」とは、前記TCRが（i）その膜貫通ドメイン以外のTCRのα鎖の全部または一部、および（ii）その膜貫通ドメイン以外のTCRのβ鎖の全部または一部を含み、ここで、（i）および（ii）はいずれもTCR鎖の可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含み、α鎖とβ鎖がヘテロ二量体を形成し、人工的鎖間ジスルフィド結合が前記TCRのα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域を連結する。
【００３９】
発明の詳述
本発明は、TCRのα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域の間に共役の人工的鎖間ジスルフィド結合を導入することによって、安定した可溶性ヘテロ二量体のT細胞受容体を得た。具体的に、本発明のTCRの人工的鎖間ジスルフィド結合は、α鎖の可変領域（TRAV）のFR2とβ鎖の定常領域の間に位置する。より具体的に、人工的鎖間ジスルフィド結合が形成する位置は、TRAVの46番目または47番目のアミノ酸残基とβ鎖の定常領域の適切な位置の間に位置してもよい。同様に、人工的鎖間ジスルフィド結合が形成する位置は、TRBC1*01またはTRBC2*01のエクソン1の60番目または61番目のアミノ酸残基とα鎖の定常領域の適切な位置の間に位置してもよい。
【００４０】
本発明の好適な例において、本発明のTCRの人工的鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
TRAVの46番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸、
TRAVの47番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸、
TRAVの46番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸、あるいは
TRAVの47番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸、
に取って代わったものである。
【００４１】
好ましくは、TRAVの46番目のアミノ酸は、D、A、P、T、S、C、L、H、YまたはKでもよく、TRAVの47番目のアミノ酸は、G、N、S、R、W、AまたはKでもよい。
本発明の一つの好適な実施形態において、本発明のTCRは3ドメインTCRで、すなわち、前記TCRがα鎖の可変ドメインおよびβ鎖の可変ドメインならびに膜貫通ドメイン以外の
β鎖の定常ドメインの全部または一部を含むが、α鎖の定常ドメインを含まず、α鎖の可変ドメインとβ鎖がヘテロ二量体を形成し、人工的鎖間ジスルフィド結合が前記TCRのα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域を連結する。
【００４２】
好ましくは、本発明の3ドメインTCRのβ鎖は、膜貫通ドメイン以外の定常ドメインの全部を含む（すなわち、細胞外および細胞質のドメインを含む）。このような場合、β鎖における天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、ジスルフィド結合の形成に関与しないほかのアミノ酸残基、好ましくはアラニンまたはセリンに突然変異したことが好ましい。
【００４３】
より好ましくは、本発明の3ドメインTCRのβ鎖は、膜貫通ドメイン以外の定常ドメインの一部を含むが、このような場合、β鎖における天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、ジスルフィド結合の形成に関与しないほかのアミノ酸残基、好ましくはアラニンまたはセリンに突然変異したことが好ましい。あるいは、前記TCRのβ鎖の定常ドメインのC末端で短く切断することによって天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が除去されてもよい。好ましくは、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基から1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個またはそれ以上のアミノ酸の位置で短く切断し、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が除去されてもよい。
【００４４】
本発明のもう一つの好適な実施形態において、本発明のTCRは4ドメインTCRで、すなわち、前記TCRが（i）その膜貫通ドメイン以外のTCRのα鎖の全部または一部、および（ii）その膜貫通ドメイン以外のTCRのβ鎖の全部または一部を含み、ここで、（i）および（ii）はいずれもTCR鎖の可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含み、α鎖とβ鎖がヘテロ二量体を形成し、人工的鎖間ジスルフィド結合が前記TCRのα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域を連結する。
【００４５】
好ましくは、本発明の4ドメインTCRは、天然の鎖間ジスルフィド結合を含まない。一つは、本発明の4ドメインTCRのα鎖および/またはβ鎖は、膜貫通ドメイン以外の定常ドメインの全部を含んでもよい（すなわち、細胞外および細胞質のドメインを含む）。このような場合、各鎖における天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、ジスルフィド結合の形成に関与しないほかのアミノ酸残基、好ましくはアラニンまたはセリンに突然変異したことが好ましい。もう一つは、本発明の4ドメインTCRのα鎖および/またはβ鎖は、膜貫通ドメイン以外の定常ドメインの一部を含んでもよいが、このような場合、各鎖における天然のTCR鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、ジスルフィド結合の形成に関与しないほかのアミノ酸残基、好ましくはアラニンまたはセリンに突然変異した。より好ましくは、前記TCRのα鎖および/またはβ鎖の定常ドメインのC末端で短く切断することによって天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が除去された。好ましくは、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基から1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個またはそれ以上のアミノ酸の位置で短く切断し、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が除去されてもよい。しかし、もちろん、本発明のTCRに天然の鎖間ジスルフィド結合が含まれてもよい。
【００４６】
本発明の4ドメインTCRのα鎖およびβ鎖の定常ドメインの間にも人工的鎖間ジスルフィド結合を含み、上記人工的鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
TRAC*01エクソン1の48TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の57S、
TRAC*01エクソン1の45TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の77S、
TRAC*01エクソン1の10YおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の17S、
TRAC*01エクソン1の45TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の59D、
TRAC*01エクソン1の15SおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の15E、
TRAC*01エクソン1の53RおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54S、
TRAC*01エクソン1の 89PおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の19A、あるいは
TRAC*01エクソン1の10YおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の20E、
に取って代わったものでもよい。
【００４７】
注意すべき点は、TCR鎖の1本だけが天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を有し、当該システインが本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を有するTCR分子とほかの分子との連結に使用される場合もあることである。TCRのβ鎖に一つの遊離の未対合のシステイン残基が含まれる場合、本発明では、当該システインを別のアミノ酸、たとえばセリンまたはアラニンに突然変異させることが好ましい。
【００４８】
もちろん、TCRの定常ドメインは直接TCRとpMHCの結合に関与せず、定常ドメインのC末端である程度の数のアミノ酸残基を切断してもTCRの機能にほぼ影響しないため、本発明のTCRの各鎖はさらに短くてもよい。任意の適切な方法によって本発明のTCRとその相応の抗原の結合親和力（解離平衡定数KDに反比例する）を測定することができる。本発明の好適な例において、TCRとそれに相応するpMHCの結合はたとえば本発明の実施例4に記載のようにforteBIO Okeによって測定される。
【００４９】
本発明のTCR鎖にその機能性に影響しないように適量の突然変異を導入してもよい。突然変異の様態は、1〜6個（通常は1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、最も好ましくは1個）のアミノ酸の欠失、挿入および/または置換、ならびにC末端および/またはN末端への1個または複数（通常は5個以内、好ましくは3個以内、より好ましくは2個以内）のアミノ酸の付加を含むが、これらに限定されない。たとえば、本分野において、機能が近い、または類似のアミノ酸で置換する場合、通常、蛋白質の機能を変えることがない。C末端および/またはN末端への1つまたは2つ以上のアミノ酸の付加も、通常、蛋白質の構造と機能を変えることはない。
【００５０】
TCRのα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域の間に人工的鎖間ジスルフィド結合を導入することによって、安定した可溶性の本発明のT細胞受容体を得ることができる。さらに、本発明では、α鎖の可変領域およびβ鎖の定常領域におけるシステインに突然変異させて人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するのに適切な位置も同定された。本発明のTCRは、ヒトTCRだけでなく、当業者は本発明によって提供される情報に基づき、ほかの種の安定した可溶性TCRを得ることもできる。
【００５１】
ほかの種のTCRのα鎖の可変領域および/またはβ鎖の定常領域はヒトTCR鎖の相応する部分と100％の相同性を有さないかもしれないが、当業者は相応するTCRの同等の部分を同定して突然変異されるべきシステイン残基を得ることができる。たとえば、欧州バイオインフォマティクス研究所から得られるClustalWでほかの種のTCR鎖をヒトTCR鎖の相応する部分と比較し、相応の位置を得ることができる。
【００５２】
本発明は人工的鎖間ジスルフィド結合で連結されるヒトの安定した可溶性αβヘテロ二量体TCR、およびほかの哺乳動物の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結されるαβTCRを含み、前記哺乳動物はヤギ、ヒツジ、ブタ、マウスやラットを含むが、これらに限定されない。
【００５３】
もちろん、ここで、アミノ酸の名称は、世界中に汎用の一文字のアルファベットの表示を使用し、その相応するアミノ酸の名称の三文字のアルファベットの略称はそれぞれAla (A)、Arg (R)、Asn (N)、Asp (D)、Cys (C)、Gln (Q)、Glu (E)、Gly (G)、His (H)、Ile
(I)、Leu (L)、Lys (K)、Met (M)、Phe (F)、Pro (P)、Ser (S)、Thr (T)、Trp (W)、Tyr (Y)、Val (V)である。
【００５４】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドの活性断片、誘導体および類似物を含む。本発明のポリペプチドの断片、誘導体や類似物は、（i）1個または複数個の保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基）が置換されたポリペプチドでもよく、または（ii）1個または複数個のアミノ酸残基に置換基があるポリペプチドでもよく、、または（iii）本発明のTCRと他の化合物（例えば、ポリエチレングリコールようなポリペプチドの半減期を延ばす化合物）と融合したポリペプチドでもよく、または（iv）付加のアミノ酸配列がこのポリペプチドに融合したポリペプチド（リーダー配列、分泌配列または6Hisなどのタグ配列と融合して形成した融合蛋白質）でもよい。本明細書の開示に基づき、これらの断片、誘導体および類似物は当業者に公知の範囲に入っている。
【００５５】
1種類の好適な活性誘導体とは、5個以下、好ましくは3個以下、より好ましくは2個以下、最も好ましくは1個のアミノ酸が性質の類似または近似のアミノ酸で置換されてなるポリペプチドである。これらの保存的突然変異のポリペプチドは、表Aのようにアミノ酸の置換を行って生成することが好ましい。
【表Ａ】
0006640994.tif 000002
【００５６】
また、本発明は、本発明のTCRの類似物を提供する。これらの類似物と本発明の元のTCRのポリペプチドの違いは、アミノ酸配列の違いでもよく、配列に影響を与えない修飾形態の違いでもよく、あるいは両者でもよい。類似物は、さらに、天然L-アミノ酸と異なる残基（例えばD-アミノ酸）を有する類似物、および非天然または合成のアミノ酸（例えばβ、γ-アミノ酸）を有する類似物を含む。もちろん、本発明のポリペプチドは、上記で挙
げられた代表的なポリペプチドに限定されない。
【００５７】
修飾（通常は一次構造が変わらない）形態は、体内または体外のポリペプチドの化学的に誘導された形態、例えばアセチル化またはカルボキシ化を含む。修飾は、さらにグリコシル化、たとえばポリペプチドの合成および加工でまたはさらなる加工の工程でグリコシル化修飾を行ったポリペプチドも含む。このような修飾は、ポリペプチドをグルコシル化する酵素（たとえば哺乳動物のグリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素）に露出させることによって完成する。修飾形態は、さらにリン酸化アミノ酸残基（例えばリン酸チロシン、リン酸セリン、リン酸トレオニン）を有する配列を含む。さらに、修飾によって抗タンパク質加水分解性を向上させたポリペプチドまたは溶解性を改善したポリペプチドを含む。
【００５８】
本発明のポリペプチドは、薬学的にまたは生理学的に許容される酸または塩基から誘導される塩の様態で使用することもできる。これらの塩は、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、コハク酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、またはヒドロキシエタンスルホン酸のような酸で形成する塩を含むが、これらに限定されない。ほかの塩は、アルカリ金属或はアルカリ土類金属(例えばナトリウム、カリウム、カリシウム或はマグネシウム)と形成する塩、及びエステル、カルバメートまたはほかの通常の「プロドラッグ」の様態を含む。
【００５９】
本発明のポリペプチドは、多価複合体の様態で提供することができる。本発明の多価TCR複合体は、2個、3個、4個またはそれ以上のもう１つの分子と連結したT細胞受容体分ウィを含む。
【００６０】
また、本発明は、本発明のTCRをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のヌクレオチド全長配列或いは断片は、通常、PCR増幅法、組換え法又は人工合成の方法で得られるが、これらに限定されない。現在、本発明のポリペプチド（又はその断片、或いはその誘導体）をコードするDNA配列を全部化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このDNA配列を本分野で周知の各種の既知のDNA分子（たとえばベクター）や細胞に導入してもよい。
【００６１】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベクターまたはコード配列で遺伝子工学によって生成する宿主細胞にも関する。
コード配列
また、本発明は、本発明のTCRをコードするポリヌクレオチドに関し、本発明に係るT細胞受容体のα鎖および/またはβ鎖をコードするポリヌクレオチドも含む。
【００６２】
本発明のポリヌクレオチドは、DNA形態でもRNA形態でもよい。DNAは、コード鎖でも非コード鎖でもよい。たとえば、成熟ポリペプチドをコードするコード領域の配列は、配列番号3、4、7、8、11、12、14、16、18、21、22、24で示されるコード領域の配列と同様でもよく、あるいは縮重変異体でもよい。ここで用いられるように、「縮重変異体」とは本発明において配列番号1、2、5、6、9、10、13、15、17、19、20、23で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするが、上記と相応のコード領域の配列と違う核酸配列である。
【００６３】
本発明のヌクレオチド全長配列或いは断片は、通常、PCR増幅法、組換え法又は人工合成の方法で得られるが、これらに限定されない。現在、本発明のポリペプチド（又はその断片、或いはその誘導体）をコードするDNA配列を全部化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このDNA配列を本分野で周知の各種の既知のDNA分子（たとえばベク
ター）や細胞に導入してもよい。
【００６４】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベクターまたはコード配列で遺伝子工学によって生成する宿主細胞にも関する。
製造方法
人工的鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基の導入は、任意の適切な方法を使用してもよく、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるもの、制限酵素によるクローンまたはライゲーション非依存的なクローン化（LIC）方法を含むが、これらに限定されない。多くの標準の分子生物学教材ではこれらの方法が詳記されている。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の誘導および制限酵素によるクローンの詳細は、SambrookおよびRussell, (2001) 「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（Molecular Cloning-A Laboratory Manual）(第三版)CSHL出版社を参照する。LIC方法の詳細な情報はRashtchian,(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6を参照する。 
【００６５】
本発明のポリペプチドは、組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドでもよい。本発明のポリペプチドは、化学合成のものでもよく、組み換えのものでもよい。相応に、本発明のポリペプチドは、通常の方法で人工的に合成してもよく、組み換え方法で生産してもよい。
【００６６】
通常の組み換えDNA技術によって、本発明のポリヌクレオチドで組み換えの本発明のポリペプチドを発現または生産することができる。一般的に、以下の工程を含む。
（1）本発明のTCRポリペプチドをコードするポロヌクレオチド（または変異体）を使用し、あるいはこのポロヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを使用し、適切な宿主細胞を形質転換または形質導入する。
【００６７】
（2）適切な培地において宿主細胞を培養する。
（3）培地または細胞から本発明のTCRポリペプチドを分離し、精製する。
好ましくは、細菌、たとえば大腸菌において封入体の様態で発現させて体外でリフォールディングさせて本発明の安定した可溶性TCRを得ることができる。
【００６８】
薬物組成物および施用方法
本発明のTCRおよび本発明のTCRを移入したT細胞は、薬学的に許容される担体といっしょに薬物組成物で提供することができる。本発明のTCR、多価TCR複合体および細胞は、通常、無菌薬物組成物の一部として提供され、前記組成物は、通常、薬学的に許容される担体を含む。この薬物組成物は、任意の適切な様態でもよい（患者への投与に必要な方法によって決まる）。単位剤形で提供してもよいが、通常、密封の容器に入って提供され、キットの一部として提供してもよい。このようなキットは、取り扱い説明書を含むが、必ず必要なものではない。複数の前記単位剤形を含んでもよい。
【００６９】
本発明のTCRは単独で使用してもよく、抱合体と結合してもよく、好ましくは共役の様態で結合してもよい。前記抱合体は、検出可能なマーカー、治療剤、PK（タンパク質キナーゼ）修飾部分またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００７０】
診断の目的に使用される検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、MRI（磁気共鳴画像）またはCT（コンピューターX線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成させる酵素を含むが、これらに限定されない。
【００７１】
本発明のTCRと結合または抱合することができる治療剤は、以下のものを含むが、これらに限定されない。 1．放射性核種(Koppeら，2005，Cancer metastasis reviews，24，539)、2．生物毒素(Chaudharyら，1989，Nature，339，394；Epelら，2002，Cancer Immun
ology and Immunotherapy，51，565)、3．サイトカイン(Gilliesら，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Cardら，2004，Cancer Immunology and Immunotherapy， 53，345；Halinら，2003，Cancer Research，63，3202)、4．抗体Fc断片(Mosqueraら，2005，The Journal Of Immunology，174，4381)、5．抗体scFv断片 (Zhuら，1995，International
Journal of Cancer, 62, 319)、6．金ナノ粒子/ナノロッド(Lapotkoら，2005，Cancer letters，239，36；Huangら，2006，Journal of the American Chemical Society，128，2115)、7．ウイルス粒子(Pengら，2004，Gene therapy，11，1234)、8．リポソーム(Mamotら，2005，Cancer research，65，11631)、9．磁性ナノ粒子、10．プロドラッグ活性化酵素（たとえば、DT-ジアホラーゼ(DTD)またはビフェニル ヒドロラーゼ様蛋白質（BPHL））、化学治療剤（たとえば、シスプラチン）など。
【００７２】
本発明のTCRと結合する（好ましくは共役結合する）抗体またはその断片は、抗T細胞抗体またはNK細胞決定抗体、たとえば抗CD3抗体または抗CD28抗体または抗CD16抗体、好ましくは抗CD3抗体を含み、上記抗体またはその断片とTCRの結合はエフェクター細胞をより好適に標的細胞にターゲッティングさせる。
【００７３】
薬物組成物は、さらに、薬学的に許容される担体を含有してもよい。用語の「薬学的に許容される担体」とは、治療剤の投与のために使用される担体である。当該用語は、自身がその組成物を受ける個体に有害な抗体を誘導せず、且つ投与後過剰な毒性がないという条件を満足するような薬剤担体を指す。これらの担体は、本分野の技術者に熟知である。「レミントンの医薬科学」（Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Pub. Co.，N.J. 1991年））において、薬学的に允許される賦形剤に関する十分な検討が見つけられる。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、佐剤、及びその組合せを含むが、これらに限定されない。
【００７４】
治療性組成物において、薬学的に許容される担体は液体、例えば水、塩水、グリセリンやエタノールを含んでもよい。さらに、これらの担体には、補助的な物質、例えば湿潤剤或いは乳化剤、pH緩衝物質等が存在してもよい。
【００７５】
通常、治療性組成物は注射剤、例えば液体溶液または懸濁液に調製してもよく、注射直前に溶液または懸濁液に配合することに適する液体ビヒクルの固体形態に調製してもよい。
【００７６】
本発明の組成物によれば、通常の経路で投与することができ、眼内、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、或いは局部投与を含むが、これらに限られない。予防・治療する対象は、動物、特にヒトでよい。
【００７７】
本発明の薬物組成物が実際に治療に使用される場合、使用の状況に合わせて様々な異なる剤形の薬物組成物としてもよい。好ましくは、注射剤、経口投与剤などが挙げられる。
これらの薬物組成物は、通常の方法によって混合、希釈または溶解で配合することができ、かつ適切な薬物添加剤、たとえば賦形剤、崩壊剤、バインダー、潤滑剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤（isotonicities）、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤や溶解助剤などを添加することもあり、またこの配合過程は剤形に合わせて通常の方法で行うことができる。
【００７８】
また、本発明の薬物組成物は、徐放剤の様態で投与することもできる。たとえば、本発明のポリペプチドは、徐放重合体を担体とするピルまたはマイクロカプセルに配合し、さらにこのピルまたはマイクロカプセルを手術で治療される組織に移植することができる。徐放重合体の例として、エチレン-酢酸ビニル共重合体、ポリヒドロメタクリレート（polyhydrometaacrylate）、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース
、乳酸重合体、乳酸-グリコール酸共重合体などが挙げられ、好ましくは生分解可能な重合体、たとえば乳酸重合体および乳酸-グリコール酸共重合体が挙げられる。
【００７９】
本発明の薬物組成物が実際に治療に使用される場合、活性成分としての本発明のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の投与量は、治療される患者それぞれの体重、年齢、性別、症状の程度によって合理的に決定することができる。
【００８０】
本発明のTCRの用途
本発明のTCRは、薬物または診断試薬として有用である。修飾またはほかの改良によって薬物または診断試薬として使用されることに適する特徴を持たせることができる。この薬物または診断試薬は、多くの異なる疾患の治療または診断に使用することができ、前記疾患は、癌（たとえば腎臓癌、卵巣癌、頭部および頚部癌、睾丸癌、肺癌、胃癌、子宮頚癌、膀胱癌、前立腺癌やメラノーマなど）、自己免疫疾患、ウイルス感染性疾患、移植拒絶や移植片対宿主病を含むが、これらに限定されない。
【００８１】
本発明のTCRの特異性によって、薬物の部位特定または標的化投与を実現することで、多くの疾患の治療または診断の効果を向上させる。
癌に対し、腫瘍または転移癌の周囲を標的とすると、毒素または免疫刺激物の効果を向上させることができる。自己免疫疾患において、特異的に正常の細胞または組織に対する免疫反応を抑制し、または免疫抑制薬を徐々に放出させ、より長時間でより多い局部の効果を果たさせることで、被試者の全体の免疫力に対する影響を最小限にする。移植拒絶の防止において、同様の方法で免疫抑制の作用を最適化することができる。薬物が既存のウイルス性疾患、たとえばHIV、SIV、EBV、CMV、HCV、HBVに対し、薬物が感染細胞の周辺で放出され、または活性化機能を発揮することも有益である。
【００８２】
本発明のTCRは、T細胞の活性化の調整に有用で、本発明のTCRは特異的なpMHCと結合することによってT細胞の活性化を抑制する。T細胞が仲介する炎症および/または組織損傷に関する自己免疫疾患、たとえば1型糖尿病にこの方法が適用できる。
【００８３】
本発明のTCRは、細胞毒性剤を癌細胞に送達する目的、またはT細胞の形質移入に使用することによって、養子免疫治療と呼ばれる治療の過程で患者に投与し、HLA複合体を提示する腫瘍細胞を破壊するようにすることができる。
【００８４】
本発明のTCRは、診断試薬としても有用である。検出可能なマーカーで本発明のTCRを標識し、たとえば診断目的に適するマーカーで標識し、MHC-ペプチドとMHC-ペプチドに特異的な本発明のTCRの間の結合を検出することができる。蛍光標識されたTCR多量体はFACS分析に適し、TCRに特異的なペプチドを持つ抗原提示細胞の検出に使用することができる。
【００８５】
また、可溶性の本発明のTCRはほかの分子、好ましくは抗CD3抗体と結合して改めてT細胞に標的を向けることによって、特定の抗原を提示する標的細胞を標的として殺傷することもできる。
【００８６】
工業応用性
本発明の安定した可溶性T細胞受容体は、TCRとpMHC（ペプチド-主要組織適合遺伝子複合体）の間の相互作用の研究および疾患の診断と治療などの目的に使用することができる。
【００８７】
本発明の主な利点は以下の通りである。
（1）本発明は、安定した可溶性T細胞受容体を得、本発明のTCRは、好適に再生・リフ
ォールディング・精製され、かつその元のリガンドと特異的に結合できる。
【００８８】
（2）本発明のT細胞受容体は高いTm値を有する。
（3）本発明のT細胞受容体はタンパク質再生収率が高く、大規模製造が容易で、かつ生産コストの低下に有利である。    
【００８９】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を詳述する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、例えばSambrookおよびRussellら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（Molecular Cloning-A Laboratory Manual）（第三版）(2001) に記載の条件などの通常の条件に、或いは、メーカーのお薦めの条件に従う。 特に断らない限り、％と部は、重量で計算される。本発明の実施例で使用された実験材料は、特に説明しない限り、いずれも市販品として得られる。
【００９０】
実施例1  TRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメイン1G4分子のプライマー設計およびPCR突然変異
TCR分子1G4（抗原短鎖ペプチドHLA-A2/SLLMWITQC（配列番号25）、NY-ESO-1腫瘍特異的抗原に対するもの）のTRAVの46番目のアミノ酸をシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸をシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。
【００９１】
上記TCRのTRAVの46番目のアミノ酸をシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
5’-3’
GTGGTTTCGTCAAGATTGCGGTAAAGGTCTGACC  （配列番号26）
GGTCAGACCTTTACCGCAATCTTGACGAAACCAC   （配列番号27）
上記TCRのTRBC*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸をシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
【００９２】
5’-3’
GGTGTTTCTACCGATTGCCAGCCGCTGAAAGAAC   （配列番号28）
GTTCTTTCAGCGGCTGGCAATCGGTAGAAACACC     （配列番号29）
PCRの手順は以下の通りである。
【００９３】
1G4  TCRのα鎖の可変ドメインおよびβ鎖の遺伝子を含む発現プラスミドpET28a+（Novagene）はそれぞれ上記α鎖の可変ドメインおよびβ鎖のプライマーで以下のような突然変異を行った。各PCR点突然変異反応において、10〜30ngのプラスミドDNAを5μLの10×KOD plus緩衝液、5μLの2.5mM dNTP Mix、3μLの2mM MgSO4 、1単位のKOD plusポリメラーゼ（東洋紡上海生物科技有限公司）、10μMの上、下流プライマー1μLずつと混ぜ、最終的にH2Oで50μLまで追加した。均一に混合した後、Bio-Rad PCR装置に置いて反応させた。94℃で2min初期変性をさせた後、18サイクルの増幅（94℃で15sec変性、55℃で30secアニーリングおよび68℃で6min伸長）を行った。その後、10単位のDpnI制限酵素（New England Biolabs）で37℃で1時間消化した。10μLの消化物で感受性E.coli DH5α細菌を形質転換し、37℃で16時間生長させた。挑単一クローンを取って5mLのLB+カナマイシンで一晩培養した。メーカーの使用説明書に従ってZyppyプラスミドミニプレップキット（ZYMO RESEARCH）でプラスミドDNAを精製し、かつInvitrogen社によってシクエンシングされ、正確と同定されたら下流発現に供した。
【００９４】
本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する3ドメインTCR分子1G4のα鎖の可変ド
メインおよびβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はそれぞれ図1aおよび1bに、それに相応するヌクレオチド配列はそれぞれ図2aおよび2bに示し、導入したシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。
【００９５】
「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（Molecular Cloning-A Laboratory Manual）(第三版、SambrookおよびRussell)に記載の標準方法によってTCRのα鎖およびβ鎖の目的遺伝子配列を合成してそれぞれ発現ベクターpET28a+（Novagene）に挿入し、上下流のクローニングサイトはそれぞれNcoIおよびNotIである。挿入断片はシークエンシングによって正確と確認された。
【００９６】
実施例2  TCRの発現、リフォールディング、精製およびその測定結果
TCRタンパク質の発現       
TCRのα鎖の可変ドメインおよびβ鎖の発現プラスミドでそれぞれ大腸菌株BL21(DE3)を形質転換し、LBプレート（カナマイシン50 μg/ml）に塗布して37℃で一晩培養した。翌日、クローンを取って10 mlのLB液体培地（カナマイシン50 μg/ml）に接種して2〜3 h培養し、体積比1:100で1LのLB培地（カナマイシン50 μg/ml）に接種し、続いてOD600が0.5〜0.8になるまで培養した後、最終濃度が1mMのIPTGで目的タンパク質の発現を誘導した。4時間誘導した後、6000 rpmで10 min遠心して細胞を収集した。PBS緩衝液で菌体を1回洗浄し、そして菌体を分けて保存し、200 mlの細菌培養物に相当する菌体を取って5mlのBugBuster Master Mix （Novagen）で細菌を分解させ、6000gで15min遠心して封入体を収集した。その後、洗浄剤で4回洗浄することによって細胞破片および膜成分を除去した。その後、緩衝液、たとえばPBSで封入体を洗浄することによって洗浄剤および塩を除去した。最後に、封入体を6M塩化グアニジニウム緩衝溶液で溶解させ、そして封入体の濃度を測定し、それを-80℃で冷凍保存した。
【００９７】
TCRタンパク質のリフォールディング
-80℃超低温冷蔵庫から封入体を取り出して解凍し、最終濃度が10 mMになるようにジチオトレイトール（DTT）を入れ、ジスルフィド結合が完全に断裂するように37℃で30 minから1時間インキュベートした。その後、封入体サンプル溶液（9.2mgα鎖と10mgβ鎖）を200 mlの4℃に冷やしておいたリフォールディング緩衝液（100 mM Tris pH 8.1、400 mM L-アルギニン、2 mM EDTA、5 M 尿素、6.5mMシステアミン塩酸塩および1.87mMシスタミン二塩酸塩）に滴下し、4℃でゆっくり約30分間撹拌した。再生溶液を8倍体積の冷やしておいたH2Oで16〜20時間透析した。さらに8倍体積の20 mM Tris pH 8.0で2回透析し、4℃で約8時間透析を続け、透析後サンプルをろ過して以下の精製を行った。
【００９８】
TCRタンパク質の第一段階の精製
透析されたリフォールディング物(20 mM Tris pH 8.0において)は、GE Hitrap Qアニオン交換クロマトグラフィー充填カラム(GE Healthcare)を使用し、AKTA精製装置（GE Healthcare）において0〜600 mM NaClで勾配溶離を行った。クマシーブリリアントブルー染色のSDS-PAGEによって各成分を分析し、そして合併した。
【００９９】
TCRタンパク質の第二段階の精製
第一段階の精製で合併されたサンプル溶液を濃縮してこの段階の精製に供し、PBS緩衝液で平衡化しておいたSuperdex 100 160/300 GLゲルろ過クロマトグラフィー充填カラム（GE Healthcare）によってタンパク質を精製し、TRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を導入した3ドメインTCR分子の溶離曲線を図3に示す。クマシーブリリアントブルー染色のSDS-PAGEによってピークの成分を分析し、その還元と非還元ゲル画像を図65のレーン1とレーン6に示す。溶離ピークおよびゲル画像から、単一溶離ピークは人工的鎖間ジスルフィド結合で連結する可溶性TCR分子で、当該分子はSDSゲルにおいて単一バンドとして安定して存在し、還元された後別
々のα鎖の可変ドメインとβ鎖になったことがわかる。
【０１００】
HPLC法によるTCRタンパク質の純度の測定
TCRタンパク質は二段階の精製を経て合併した後、溶離画分の純度をHPLCによって検出した。条件は、 Agilent 1260、クロマトグラフィカラムBio SEC-3(300 A、φ7.8×300 mm)で、移動相が150 mMリン酸塩緩衝液で、流速0.5 mL/min、カラム温度25℃、紫外検出波長214 nmであった。TCR分子のSEC（サイズ排除クロマトグラフィー）スペクトルは図4に示す。本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する3ドメインTCR分子のHPLC溶離ピークは単一で対称的で、当該タンパク質の構造が安定して、凝集やアンフォールディングなどの現象がなく、純度が非常に高いことが示された。
【０１０１】
TCRタンパク質再生収率の計算
本発明におけるTCRタンパク質再生収率の計算方法は、
タンパク質再生収率（％）＝100×精製完成後得られたタンパク質の量（mg）/再生に使用された封入体の量（mg）である。上記計算方法に基づき、TRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目の間に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した1G4  TCR分子のタンパク質再生収率は49％であった。収率は高く、TCRのα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域の間に本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を有する3ドメインTCR分子は安定した可溶性のものであることが示された。
【０１０２】
実施例3  TCRのα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域に人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCRの安定性テスト
実施例2で得られた1G4 TCRタンパク質（濃度0.5 mg/ml）1 mlをPBSに透析し、米国TA（waters）社の示差走査熱量計（Nano DSC）によってTCRタンパク質に対して熱安定性を測定した。検出の温度範囲は10〜90℃で、昇温速度は1℃/minであった。透析外液PBSをコントロールとし、基準線を3回測定し、基準線が安定したら、タンパク質のサンプルを検出した。データを収集した後、分析ソフトTA_DSC_NanoAnalyzeによってTCRのTm値を測定し、そのDSCサーモグラムを得た。本発明のα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域に人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCRのDSCサーモグラムは、図5に示すように、そのTm値は53℃に達した。当該サーモグラムは、室温で、ひいては温度43〜44℃で、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子がいずれも正確なフォールディングを維持し、かつあるべき活性を持ったことを反映し、その安定性が高いことが示された。
【０１０３】
実施例4  結合の特徴付けおよび特異性の検出
forteBIO Okeリアルタイム分析システムによってTCRタンパク質とそれに相応する抗原pMHC複合体の結合活性を検出した。
【０１０４】
SAセンサーの表面に約2 nmのビオチン化したpMHC複合体を固定させ、さらに0.05 mMのビオチンを10 μL/minの流速で120 sチップを流させ、残ったストレプトアビジンの結合サイトをブロッキングした。動態学分析方法によってその親和力を測定し、PBST緩衝液（PBS+0.005％ ツイン20、pH 7.4）でTCRタンパク質をいくつかの異なる濃度（一般的に64、32、16、8、4、0 uM）に希釈し、それに相応するpMHCの親和力を測定した。Evaluationソフトによって1:1結合のモデルでフィッティングして動態学のパラメーターを計算した。
【０１０５】
上記pMHC複合体の製造過程は以下の通りである。
a．精製
100 mlの重鎖または軽鎖を誘導発現するE. coli菌液を収集し、4℃で8000 gで10 min遠心した後10 mlのPBSで菌体を1回洗浄し、さらに5 mlのBugBuster Master Mix Extraction
Reagents(Merck)で激しく振とうして菌体を再懸濁させ、そして室温で回転させて20 min
インキュベートした後、4℃で6000 gで15 min遠心し、上清を捨て、封入体を収集した。
【０１０６】
上記封入体を5 mlのBugBuster Master Mixに再懸濁させ、室温で回転して5 minインキュベートした。30 mlの10倍に希釈したBugBusterを入れ、均一に混合し、4℃で6000 gで15 min遠心した。上清を捨て、30 mlの10倍に希釈したBugBusterを入れて封入体を再懸濁させ、均一に混合し、4℃で6000 gで15 min遠心し、2回繰り返し、30 mlの20 mM Tris-HCl pH 8.0を入れて封入体を再懸濁させ、均一に混合し、4℃で6000 gで15 min遠心し、最後に20 mM Tris-HCl 8M尿素で封入体を溶解させ、SDS-PAGEによって封入体の純度を検出し、BCAキットによって濃度を測定した。
【０１０７】
b．再生
所要の短鎖ペプチド（北京賽百盛遺伝子技術有限公司）を合成して濃度が20 mg/mlになるようにDMSOに溶解させた。軽鎖および重鎖の封入体を8 M尿素、20 mM Tris pH 8.0、10
mM DTTで溶解させ、再生前に3 M塩化グアニジニウム、10 mM酢酸ナトリウム、10 mM EDTAを入れてさらに変性させた。短鎖ペプチドに25 mg/L（最終濃度）になるように再生緩衝液（0.4 M L-アルギニン、100 mM Tris pH 8.3、2 mM EDTA、0.5 mM 酸化型グルタチオン、5 mM 還元型グルタチオン、0.2 mM PMSF、4℃に冷却）を入れた後、順に20 mg/Lの軽鎖および90 mg/Lの重鎖（最終濃度、重鎖は3回に分けて8 h/回入れた）を入れ、再生は4℃で完成するまで少なくとも3日行われ、SDS-PAGEによって再生が成功したか検出した。
【０１０８】
c．再生後の精製
10体積の20 mM Tris pH 8.0で透析することによって再生緩衝液を置き換え、緩衝液を少なくとも2回置き換えることによって溶液のイオン強度を十分に低下させた。透析後0.45 μmの酢酸セルロースろ膜でタンパク質溶液をろ過した後、HiTrap Q HP（GE社）アニオン交換カラムにかけた（5 mlベッド体積）。Akta精製装置(GE社)を使用し、20 mM Tris pH 8.0で調製した0〜400 mM NaClの直線勾配液でタンパク質を溶離させ、pMHCが約250 mM NaClにおいて溶離し、各ピークの成分を収集し、SDS-PAGEによって純度を検出した。
【０１０９】
d．ビオチン化
Millipore限外ろ過チューブで精製されたpMHC分子を濃縮し、同時に緩衝液を20 mM Tris pH 8.0に置き換えた後、ビオチン化試薬として0.05 M Bicine pH 8.3、10 mM ATP、10 mM MgOAc、50 μM D-Biotin、100 μg/ml BirA酵素（GST-BirA）を入れ、室温で混合物を一晩インキュベートし、SDS-PAGEによって完全にビオチン化したか検出した。
【０１１０】
e．ビオチン化した複合体の精製
Millipore限外ろ過チューブでビオチン化標識されたpMHC分子を1 mlに濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィーによってビオチン化されたpMHCを精製し、Akta精製装置（GE社）を使用し、ろ過されたPBSでHiPrepTM 16/60 S200 HRカラム（GE社）を予め平衡化し、1 mlの濃縮されたビオチン化pMHC分子をかけた後、PBSで1 ml/minの流速で溶離させた。ビオチン化されたpMHC分子は約55 mlにおいて単峰として溶離して現れた。タンパク質を含有する成分を合併し、Millipore限外ろ過チューブで濃縮し、BCA法（Thermo）によってタンパク質濃度を測定し、プロテアーゼ阻害剤cocktail（Roche）を入れてビオチン化されたpMHC分子を分けて-80℃で保存した。
【０１１１】
異なる濃度の本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する1G4 TCR分子とそれに相応する抗原の結合曲線は図6に示す。当該結合曲線から、濃度の低下は本発明のTCR分子とそれに相応する抗原の結合に影響せず、低濃度のTCR分子は高濃度のTCR分子と同様の結合時間を示すことがわかり、側面から本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する可溶性3ドメインTCR分子が安定していることが示された。
【０１１２】
TCRタンパク質の特異性の検出
forteBIO Okeリアルタイム分析システムによってTCRタンパク質のそれに相応する抗原pMHC複合体に対する特異性を検出した。本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCRタンパク質の特異性の検出方法は、TCRに相応する抗原pMHC複合体（既にビオチン化されたもの）および選ばれたいくつかのほかの無関連の抗原pMHC複合体（既にビオチン化されたもの）をそれぞれSAセンサーの表面に載せた後、測定される各TCRタンパク質と相互作用させ、最後に、その相互作用による信号を分析した。
【０１１３】
上記測定方法では、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する1G4 TCRタンパク質はそれに相応する抗原だけと結合し、ほかの無関連の抗原のいずれとも相互作用がない。
【０１１４】
実施例5  TRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメインTCR分子
本実施例では、さらにTCR分子のTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成すると、安定した可溶性の3ドメインTCR分子が得られることが検証された。
【０１１５】
TCR分子JM22（抗原短鎖ペプチドHLA-A2/GILGFVFTL（配列番号30）、インフルエンザウイルス基質タンパク質由来のもの）およびLC13（抗原短鎖ペプチドHLA-B4405：EEYLKAWTF(配列番号31)）のTRAVの46番目のアミノ酸をシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸をシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。
【０１１６】
上記JM22  TCRのTRAVの46番目のアミノ酸をシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
5’-3’
GTGGTATCGTCAAGAATGCGGTGAAGGTCCGGTC     （配列番号32)
GACCGGACCTTCACCGCATTCTTGACGATACCAC     （配列番号33)
上記JM22  TCRのTRBC*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸をシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
【０１１７】
5’-3’
GGTGTTTCTACCGATTGCCAGCCGCTGAAAGAAC     （配列番号34)
GTTCTTTCAGCGGCTGGCAATCGGTAGAAACACC      （配列番号35)
上記LC13  TCRのTRAVの46番目のアミノ酸をシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
【０１１８】
5’-3’
CATTGGTACCGTCAGCTGTGCAGCCAAGGTCCGG       （配列番号36)
CCGGACCTTGGCTGCACAGCTGACGGTACCAATG      （配列番号37) 
上記LC13  TCRのTRBC*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸をシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
【０１１９】
5’-3’
GGTGTTTCTACCGATTGCCAGCCGCTGAAAGAAC   （配列番号38)
GTTCTTTCAGCGGCTGGCAATCGGTAGAAACACC    （配列番号39)
実施例1〜実施例4に記載の方法でTCRに対してPCR、再生および機能テストを行った。
【０１２０】
人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する本発明の3ドメインTCR分子JM22のα鎖の可変ド
メインおよびβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はそれぞれ図7aおよび7bに、それに相応するヌクレオチド配列はそれぞれ図8aおよび8bに示し、導入したシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。その溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図9および図66のレーン2（還元ゲル）およびレーン5（非還元ゲル）に示す。HPLC溶離ピークは、図10に示すように、単一で対称的なものである。タンパク質再生収率は25％に達した。そのTm値は54℃で、相応するDSCチャートは図11に示す。JM22分子とそれに相応する抗原の結合曲線は図12に示す。
【０１２１】
人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する本発明の3ドメインTCR分子LC13のα鎖の可変ドメインおよびβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はそれぞれ図13aおよび13bに、それに相応するヌクレオチド配列はそれぞれ図14aおよび14bに示し、導入したシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。その溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図15および図66のレーン1（還元ゲル）およびレーン4（非還元ゲル）に示す。HPLC溶離ピークは、図16に示すように、単一で対称的なものである。タンパク質再生収率も21％と相当高かった。そのTm値は60℃に達し、相応するDSCチャートは図17に示す。LC13分子とそれに相応する抗原の結合曲線は図18に示す。
【０１２２】
以上の数種の分子の溶離曲線およびSDSゲル画像から、溶離ピークの成分は本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結する可溶性TCR分子で、SDSゲルにおいて単一バンドとして安定して存在し、還元された後別々のα鎖の可変ドメインとβ鎖になったことがわかる。タンパク質再生収率もいずれも高かった。また、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結するTCR分子のTm値もいずれも高く、高い温度でいずれも正確なフォールディングを維持し、かつあるべき活性を保ち、その安定性が高いことが示された。同時に、TCR分子とその元のリガンドの結合曲線は、TCR濃度の低下がそのリガンドとの結合に影響しないことを示し、側面から本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子が安定していることが示された。特異性テストでは、これらの人工的鎖間ジスルフィド結合が導入された本発明のTCR分子はそれに相応する抗原だけと結合し、ほかの数種の無関連の抗原のいずれとも相互作用がなく、優れた特異性を示した。そのため、上記実験データによって、TRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合を導入することによって、安定した可溶性の本発明の3ドメインTCRタンパク質を得ることができることが証明された。
【０１２３】
実施例6  TRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCR分子
本実施例では、TCR分子のTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成すると、安定した可溶性の4ドメインTCR分子が得られることが検証された。
【０１２４】
それぞれTCR分子1G4（抗原短鎖ペプチドHLA-A2/SLLMWITQC、NY-ESO-1腫瘍特異的抗原に対するもの）、JM22（抗原短鎖ペプチドHLA-A2/GILGFVFTL、インフルエンザウイルス基質タンパク質由来のもの）およびLC13（抗原短鎖ペプチドHLA-B4405：EEYLKAWTF）のTRAVの46番目のアミノ酸をシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸をシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。突然変異に使用されたプライマーおよび工程は上記実施例を参照した。
【０１２５】
実施例1〜実施例4に記載の方法でTCRに対してPCR、再生および機能テストを行った。ちょっと異なるのは、実施例2のTCRリフォールディング工程で、使用されたTCRのα鎖とβ鎖の封入体の量はそれぞれ15mgおよび10mgであったところである。
【０１２６】
人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する本発明の4ドメインTCR分子1G4のα鎖およびβ
鎖の細胞外のアミノ酸配列はそれぞれ図19および1bに、それに相応するヌクレオチド配列はそれぞれ図20および2bに示し、導入したシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。その溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図21および図67のレーン1（還元ゲル）およびレーン6（非還元ゲル）に示す。HPLC溶離ピークは、図22に示すように、単一で対称的なものである。タンパク質再生収率は35％に達した。そのTm値は56℃で、相応するDSCチャートは図23に示す。LC13分子とそれに相応する抗原の結合曲線は図24に示す。
【０１２７】
人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する本発明の4ドメインTCR分子JM22のα鎖およびβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はそれぞれ図25および7bに、それに相応するヌクレオチド配列はそれぞれ図26および8bに示し、導入したシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。その溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図27および図68のレーン2（還元ゲル）およびレーン5（非還元ゲル）に示す。HPLC溶離ピークは、図28に示すように、単一で対称的なものである。タンパク質再生収率は20％に達した。そのTm値は53℃で、相応するDSCチャートは図29に示す。JM22分子とそれに相応する抗原の結合曲線は図30に示す。
【０１２８】
人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する本発明の4ドメインTCR分子LC13のα鎖の可変ドメインおよびβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はそれぞれ図31および13bに、それに相応するヌクレオチド配列はそれぞれ図32および14bに示し、導入したシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。その溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図33および図68のレーン1（還元ゲル）およびレーン4（非還元ゲル）に示す。HPLC溶離ピークは、図34に示すように、単一で対称的なものである。タンパク質再生収率も22％と相当高かった。そのTm値は60℃に達した。LC13分子とそれに相応する抗原の結合曲線は図36に示す。
【０１２９】
以上の数種の分子の溶離曲線およびSDSゲル画像から、溶離ピークの成分は本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結する可溶性4ドメインTCR分子で、SDSゲルにおいて単一バンドとして安定して存在し、還元された後別々のα鎖とβ鎖になったことがわかる。タンパク質再生収率もいずれも高かった。また、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結するTCR分子のTm値もいずれも高く、高い温度でいずれも正確なフォールディングを維持し、かつあるべき活性を保ち、その安定性が高いことが示された。同時に、TCR分子とその元のリガンドの結合曲線は、TCR濃度の低下がそのリガンドとの結合に影響しないことを示し、側面から本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子が安定していることが示された。特異性テストでは、これらの本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合が導入されたTCR分子はそれに相応する抗原だけと結合し、ほかの数種の無関連の抗原のいずれとも相互作用がなく、優れた特異性を示した。そのため、上記実験データによって、TRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合を導入することによって、安定した可溶性の本発明の4ドメインTCRタンパク質を得ることができることが証明された。
【０１３０】
実施例7  TRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメインTCR分子
本実施例では、TCR分子のTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成すると、安定した可溶性の本発明の3ドメインTCR分子が得られることが検証された。
【０１３１】
1G4  TCR分子のTRAVの47番目のアミノ酸をシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸をシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。
【０１３２】
上記TCRのTRAVの47番目のアミノ酸をシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
5’-3’
GTTTCGTCAAGATCCGTGCAAAGGTCTGACCAGC  （配列番号40）
GCTGGTCAGACCTTTGCACGGATCTTGACGAAAC   （配列番号41）
上記TCRのTRBC*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸をシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
【０１３３】
5’-3’
GTTTCTACCGATCCGtgcCCGCTGAAAGAACAG    （配列番号42）
CTGTTCTTTCAGCGGgcaCGGATCGGTAGAAAC     （配列番号43）
実施例1〜実施例4に記載の方法でTCRに対してPCR、再生および機能テストを行った。
【０１３４】
人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する本発明の3ドメインTCR分子のα鎖の可変ドメインおよびβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はそれぞれ図37aおよび37bに、それに相応するヌクレオチド配列はそれぞれ図38aおよび38bに示し、導入したシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。その溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図39および図65のレーン4（還元ゲル）およびレーン9（非還元ゲル）に示す。HPLC溶離ピークは、図40に示すように、単一で対称的なものである。タンパク質再生収率は36％に達した。そのTm値は52℃で、相応するDSCチャートは図41に示す。TCR分子とそれに相応する抗原の結合曲線は図42に示す。
【０１３５】
以上の溶離曲線およびSDSゲル画像から、溶離ピークの成分は本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結する可溶性3ドメインTCR分子で、SDSゲルにおいて単一バンドとして安定して存在し、還元された後別々のα鎖の可変ドメインとβ鎖になったことがわかる。タンパク質再生収率も高かった。また、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結するTCR分子のTm値が高く、高い温度でいずれも正確なフォールディングを維持し、かつあるべき活性を保ち、その安定性が高いことが示された。同時に、TCR分子とその元のリガンドの結合曲線は、TCR濃度の低下がそのリガンドとの結合に影響しないことを示し、側面から本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子が安定していることが示された。特異性テストでは、これらの本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合が導入されたTCR分子はそれに相応する抗原だけと結合し、ほかの数種の無関連の抗原のいずれとも相互作用がなく、優れた特異性を示した。そのため、上記実験データによって、TRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合を導入することによって、安定した可溶性の本発明の3ドメインTCRタンパク質を得ることができることが証明された。
【０１３６】
実施例8  TRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCR分子
本実施例では、TCR分子のTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成すると、安定した可溶性の本発明の4ドメインTCR分子が得られることが検証された。
【０１３７】
TCR分子のTRAVの47番目のアミノ酸をシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸をシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。突然変異に使用されたプライマーおよび工程は上記実施例を参照した。
【０１３８】
実施例1〜実施例4に記載の方法でTCRに対してPCR、再生および機能テストを行った。ちょっと異なるのは、実施例2のTCRリフォールディング工程で、使用されたTCRのα鎖とβ鎖の封入体の量はそれぞれ15mgおよび10mgであったところである。
【０１３９】
人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する本発明の4ドメインTCR分子のα鎖およびβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はそれぞれ図43および37bに、それに相応するヌクレオチド配列はそれぞれ図44および38bに示し、導入したシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。その溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図45および図67のレーン4（還元ゲル）およびレーン9（非還元ゲル）に示す。HPLC溶離ピークは、図46に示すように、単一で対称的なものである。タンパク質再生収率は43％に達した。そのTm値は56℃で、相応するDSCチャートは図47に示す。TCR分子とそれに相応する抗原の結合曲線は図48に示す。
【０１４０】
以上の溶離曲線およびSDSゲル画像から、溶離ピークの成分は本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結する可溶性4ドメインTCR分子で、SDSゲルにおいて単一バンドとして安定して存在し、還元された後別々のα鎖とβ鎖になったことがわかる。タンパク質再生収率も高かった。また、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結するTCR分子のTm値が高く、高い温度でいずれも正確なフォールディングを維持し、かつあるべき活性を保ち、その安定性が高いことが示された。同時に、TCR分子とその元のリガンドの結合曲線は、TCR濃度の低下がそのリガンドとの結合に影響しないことを示し、側面から本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子が安定していることが示された。特異性テストでは、これらの本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合が導入されたTCR分子はそれに相応する抗原だけと結合し、ほかの数種の無関連の抗原のいずれとも相互作用がなく、優れた特異性を示した。そのため、上記実験データによって、TRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合を導入することによって、安定した可溶性の本発明の4ドメインTCRタンパク質を得ることができることが証明された。
【０１４１】
実施例9  TRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメインTCR分子
本実施例では、TCR分子のTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成すると、安定した可溶性の本発明の3ドメインTCR分子が得られることが検証された。
【０１４２】
1G4  TCR分子のTRAVの46番目のアミノ酸をシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸をシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。突然変異に使用されたプライマーおよび工程は上記実施例を参照した。
【０１４３】
実施例1〜実施例4に記載の方法でTCRに対してPCR、再生および機能テストを行った。
人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する本発明の3ドメインTCR分子の溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図49および図65のレーン2（還元ゲル）およびレーン7（非還元ゲル）に示す。HPLC溶離ピークは、図50に示すように、単一で対称的なものである。タンパク質再生収率は37％に達した。そのTm値は48℃で、相応するDSCチャートは図51に示す。TCR分子とそれに相応する抗原の結合曲線は図52に示す。
【０１４４】
以上の溶離曲線およびSDSゲル画像から、溶離ピークの成分は本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結する可溶性3ドメインTCR分子で、SDSゲルにおいて単一バンドとして安定して存在し、還元された後別々のα鎖の可変ドメインとβ鎖になったことがわかる。タンパク質再生収率も高かった。また、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結するTCR分子のTm値が高く、高い温度でいずれも正確なフォールディングを維持し、かつあるべき活性を保ち、その安定性が高いことが示された。同時に、TCR分子とその元のリガンドの結合曲線は、TCR濃度の低下がそのリガンドとの結合に影響しないことを示し、側面から本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子が安定していることが示された。特異性テストでは、これらの本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合が導入されたTC
R分子はそれに相応する抗原だけと結合し、ほかの数種の無関連の抗原のいずれとも相互作用がなく、優れた特異性を示した。そのため、上記実験データによって、TRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合を導入することによって、安定した可溶性の本発明の3ドメインTCRタンパク質を得ることができることが証明された。
【０１４５】
実施例10  TRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCR分子
本実施例では、TCR分子のTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成すると、安定した可溶性の本発明の4ドメインTCR分子が得られることが検証された。
【０１４６】
1G4  TCR分子のTRAVの46番目のアミノ酸をシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸をシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。突然変異に使用されたプライマーおよび工程は上記実施例を参照した。
【０１４７】
実施例1〜実施例4に記載の方法でTCRに対してPCR、再生および機能テストを行った。ちょっと異なるのは、実施例2のTCRリフォールディング工程で、使用されたTCRのα鎖とβ鎖の封入体の量はそれぞれ15mgおよび10mgであったところである。
【０１４８】
人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する本発明の4ドメインTCR分子の溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図53および図67のレーン2（還元ゲル）およびレーン7（非還元ゲル）に示す。HPLC溶離ピークは、図54に示すように、単一で対称的なものである。タンパク質再生収率は38％に達した。そのTm値は50℃で、相応するDSCチャートは図55に示す。TCR分子とそれに相応する抗原の結合曲線は図56に示す。
【０１４９】
以上の溶離曲線およびSDSゲル画像から、溶離ピークの成分は本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結する可溶性4ドメインTCR分子で、SDSゲルにおいて単一バンドとして安定して存在し、還元された後別々のα鎖とβ鎖になったことがわかる。タンパク質再生収率も高かった。また、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結するTCR分子のTm値が高く、高い温度でいずれも正確なフォールディングを維持し、かつあるべき活性を保ち、その安定性が高いことが示された。同時に、TCR分子とその元のリガンドの結合曲線は、TCR濃度の低下がそのリガンドとの結合に影響しないことを示し、側面から本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子が安定していることが示された。特異性テストでは、これらの本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合が導入されたTCR分子はそれに相応する抗原だけと結合し、ほかの数種の無関連の抗原のいずれとも相互作用がなく、優れた特異性を示した。そのため、上記実験データによって、TRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合を導入することによって、安定した可溶性の本発明の4ドメインTCRタンパク質を得ることができることが証明された。
【０１５０】
実施例11  TRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した3ドメインTCR分子
本実施例では、TCR分子のTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成すると、安定した可溶性の本発明の3ドメインTCR分子が得られることが検証された。
【０１５１】
1G4  TCR分子のTRAVの47番目のアミノ酸をシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸をシステインに突然変異させることによって、人工的
鎖間ジスルフィド結合を形成させた。突然変異に使用されたプライマーおよび工程は上記実施例を参照した。
【０１５２】
実施例1〜実施例4に記載の方法でTCRに対してPCR、再生および機能テストを行った。
人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する本発明の3ドメインTCR分子の溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図57および図65のレーン3（還元ゲル）およびレーン8（非還元ゲル）に示す。HPLC溶離ピークは、図58に示すように、単一で対称的なものである。タンパク質再生収率は22％に達した。そのTm値は48℃で、相応するDSCチャートは図59に示す。TCR分子とそれに相応する抗原の結合曲線は図60に示す。
【０１５３】
以上の溶離曲線およびSDSゲル画像から、溶離ピークの成分は本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結する可溶性3ドメインTCR分子で、SDSゲルにおいて単一バンドとして安定して存在し、還元された後別々のα鎖の可変ドメインとβ鎖になったことがわかる。タンパク質再生収率も高かった。また、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結するTCR分子のTm値が高く、高い温度でいずれも正確なフォールディングを維持し、かつあるべき活性を保ち、その安定性が高いことが示された。同時に、TCR分子とその元のリガンドの結合曲線は、TCR濃度の低下がそのリガンドとの結合に影響しないことを示し、側面から本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子が安定していることが示された。特異性テストでは、これらの本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合が導入されたTCR分子はそれに相応する抗原だけと結合し、ほかの数種の無関連の抗原のいずれとも相互作用がなく、優れた特異性を示した。そのため、上記実験データによって、TRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合を導入することによって、安定した可溶性の本発明の3ドメインTCRタンパク質を得ることができることが証明された。
【０１５４】
実施例12  TRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した4ドメインTCR分子
本実施例では、TCR分子のTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成すると、安定した可溶性の本発明の4ドメインTCR分子が得られることが検証された。
【０１５５】
1G4  TCR分子のTRAVの46番目のアミノ酸をシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸をシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。突然変異に使用されたプライマーおよび工程は上記実施例を参照した。
【０１５６】
実施例1〜実施例4に記載の方法でTCRに対してPCR、再生および機能テストを行った。ちょっと異なるのは、実施例2のTCRリフォールディング工程で、使用されたTCRのα鎖とβ鎖の封入体の量はそれぞれ15mgおよび10mgであったところである。
【０１５７】
人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する本発明の4ドメインTCR分子の溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図61および図67のレーン3（還元ゲル）およびレーン8（非還元ゲル）に示す。HPLC溶離ピークは、図62に示すように、単一で対称的なものである。タンパク質再生収率は31％に達した。そのTm値は52℃で、相応するDSCチャートは図63に示す。TCR分子とそれに相応する抗原の結合曲線は図64に示す。
【０１５８】
以上の溶離曲線およびSDSゲル画像から、溶離ピークの成分は本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結する可溶性4ドメインTCR分子で、SDSゲルにおいて単一バンドとして安定して存在し、還元された後別々のα鎖とβ鎖になったことがわかる。タンパク質再生収率も高かった。また、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結するTCR分子のTm値
が高く、高い温度でいずれも正確なフォールディングを維持し、かつあるべき活性を保ち、その安定性が高いことが示された。同時に、TCR分子とその元のリガンドの結合曲線は、TCR濃度の低下がそのリガンドとの結合に影響しないことを示し、側面から本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子が安定していることが示された。特異性テストでは、これらの本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合が導入されたTCR分子はそれに相応する抗原だけと結合し、ほかの数種の無関連の抗原のいずれとも相互作用がなく、優れた特異性を示した。そのため、上記実験データによって、TRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合を導入することによって、安定した可溶性の本発明の4ドメインTCRタンパク質を得ることができることが証明された。
【０１５９】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５ａ】
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【図３５ｂ】
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【図３６】
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【図３７ａ】
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【図３７ｂ】
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【図３８ａ】
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【図３８ｂ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【配列表】
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