(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アオイ科（Malvaceae）フヨウ（ハイビスカス）属（Hibiscus L.）の植物の萼を、乳酸菌により発酵させて得られる発酵物からなる、酸化ストレスによるＤＮＡの酸化的損傷の抑制剤又は修復剤。
【請求項２】
アオイ科（Malvaceae）フヨウ（ハイビスカス）属（Hibiscus L.）の植物が、ローゼル（Hibiscus sabdariffa L.）である、請求項１に記載の抑制剤又は修復剤。
【請求項３】
外用剤又は経口剤である、請求項１又は２に記載の抑制剤又は修復剤。
【請求項４】
さらにヒートショックプロテインを含むことを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載の抑制剤又は修復剤。
【請求項５】
油性成分の含有量が５質量％以下であることを特徴とする、請求項４に記載の抑制剤又は修復剤。
【請求項６】
アオイ科（Malvaceae）フヨウ（ハイビスカス）属（Hibiscus L.）の植物の萼を、乳酸菌により発酵させて得られる発酵物、及び、ヒートショックプロテインを含む、酸化ストレスによる酵素活性の低下を抑制するために用いられる酵素活性化剤。
【請求項７】
アオイ科（Malvaceae）フヨウ（ハイビスカス）属（Hibiscus L.）の植物が、ローゼル（Hibiscus sabdariffa L.）である、請求項６に記載の酵素活性化剤。
【請求項８】
カスパーゼ、カタラーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、及びカリクレインから選ばれる１種以上を活性化させるための、請求項６又は７に記載の酵素活性化剤。
【請求項９】
カスパーゼ、カタラーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、及びカリクレインから選ばれる２種以上を同時に活性化させるための、請求項８に記載の酵素活性化剤。
【請求項１０】
外用剤又は経口剤である、請求項６〜９の何れかに記載の酵素活性化剤。
【請求項１１】
油性成分の含有量が５質量％以下であることを特徴とする、請求項６〜１０の何れかに記載の酵素活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素活性化剤及びＤＮＡの酸化的損傷の抑制剤又は修復剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体には様々な酵素が存在し、当該酵素の正常な働きにより正常な生体機能が維持されている。そのため、酵素活性の低下は、生体機能を低下させ、様々な疾患や症状の原因となり得る。
【０００３】
他方、活性酸素は、その酸化作用によってＤＮＡの損傷を誘発することが知られている（例えば特許文献１）。
【０００４】
ところで、アオイ科（Malvaceae）フヨウ（ハイビスカス）属（Hibiscus L.）の植物であるローゼル（Hibiscus sabdariffa L.）の萼を、乳酸菌により発酵させて得られる発酵物は、細胞損傷を抑制する作用を有すること、シミ、くすみ、小ジワ等に対する改善作用を有することが知られており、化粧料に配合することも提案されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−８９４８７号公報
【特許文献２】特開２００６−３４７９２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生体機能は、複数の酵素の正常な働きにより維持されている。そのため、生体機能の向上のために、特定の酵素に限らず複数の酵素の活性を向上させ得る成分の開発が望まれていた。
そこで、本発明は、新規な酵素活性化剤を提供することを第１の課題とする。
【０００７】
また、本発明者らは、酵素活性を向上させるためには、当該酵素を産生する遺伝子を形成するＤＮＡの損傷を抑制又は予防することが有効であることを見出した。
そこで、本発明は、新規なＤＮＡの酸化的損傷の抑制剤又は修復剤を提供することを第２の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意研究努力の結果、アオイ科（Malvaceae）フヨウ（ハイビスカス）属（Hibiscus L.）の植物の萼を乳酸菌により発酵させて得られる発酵物に、複数の酵素の活性を向上させる作用があることを見出した。
また、本発明者らは、同発酵物にＤＮＡの損傷を抑制又は予防する作用があることを見出した。
本発明者らは、以上の知見に基づいて、本発明を完成させた。
【０００９】
前記第１の課題を解決する本発明は、アオイ科（Malvaceae）フヨウ（ハイビスカス）属（Hibiscus L.）の植物の萼を、乳酸菌により発酵させて得られる発酵物からなる、酵素活性化剤である。
本発明の酵素活性化剤は、複数の酵素を活性化させる作用を有するため、生体機能を正常化させるのに有用である。
【００１０】
本発明の酵素活性化剤の好ましい形態では、アオイ科（Malvaceae）フヨウ（ハイビスカス）属（Hibiscus L.）の植物は、ローゼル（Hibiscus sabdariffa L.）である。
【００１１】
本発明の酵素活性化剤は、カスパーゼ、カタラーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、及びカリクレインから選ばれる1種以上を活性化させるために用いられることが好ましい。本発明の酵素活性化剤は、カスパーゼの中でもカスパーゼ−１４を、カリクレインの中でもカリクレイン-５を活性化させるために用いられることが、特に好ましい。
本発明の酵素活性化剤は、これらの酵素を活性化させるのに好適である。これらの酵素は、種々の生体機能に関与する酵素である。
【００１２】
特に、本発明の酵素活性化剤は、カスパーゼ、カタラーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、及びカリクレインから選ばれる２種以上を同時に活性化させるために用いられることが好ましい。
【００１３】
本発明の酵素活性化剤の好ましい形態は、外用剤又は経口剤である。
【００１４】
また、前記第２の課題を解決する本発明は、アオイ科（Malvaceae）フヨウ（ハイビスカス）属（Hibiscus L.）の植物の萼を、乳酸菌により発酵させて得られる発酵物からなる、ＤＮＡの酸化的損傷の抑制剤又は修復剤である。
【００１５】
本発明の抑制剤又は修復剤の好ましい形態では、アオイ科（Malvaceae）フヨウ（ハイビスカス）属（Hibiscus L.）の植物は、ローゼル（Hibiscus sabdariffa L.）である。
【００１６】
本発明の抑制剤又は修復剤の好ましい形態は、外用剤又は経口剤である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の酵素活性化剤は、種々の酵素を活性化する作用に優れる。
また、本発明のＤＮＡの酸化的損傷の抑制剤又は修復剤は、ＤＮＡの酸化的損傷の抑制又は修復の作用に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ハイビスカス発酵液を添加後に酸化ストレスを付与した場合の、ハイビスカス発酵液の添加濃度とカスパーゼ−１４の酵素活性の関係を示す図である。
【図２】ハイビスカス発酵液を添加後に酸化ストレスを付与した場合の、ハイビスカス発酵液の添加濃度とカリクレイン−５の酵素活性の関係を示す図である。
【図３】ハイビスカス発酵液を添加後に酸化ストレスを付与した場合の、ハイビスカス発酵液の添加濃度とカタラーゼの酵素活性の関係を示す図である。
【図４】ハイビスカス発酵液を添加後に酸化ストレスを付与した場合の、ハイビスカス発酵液の添加濃度とＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの酵素活性の関係を示す図である。
【図５】酸化ストレス付与後にハイビスカス発酵液を添加した場合の、ハイビスカス発酵液の添加濃度とカスパーゼ−１４の酵素活性の関係を示す図である。
【図６】酸化ストレス付与後にハイビスカス発酵液を添加した場合の、ハイビスカス発酵液の添加濃度とカタラーゼの酵素活性の関係を示す図である。
【図７】酸化ストレス付与後にハイビスカス発酵液を添加した場合の、ハイビスカス発酵液の添加濃度とＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの酵素活性の関係を示す図である。
【図８】ハイビスカス発酵液を添加後に酸化ストレスを付与した場合の、ハイビスカス発酵液の添加濃度とＤＮＡ酸化損傷指数の関係を示す図である。
【図９】酸化ストレス付与後にハイビスカス発酵液を添加した場合の、ハイビスカス発酵液の添加濃度とＤＮＡ酸化損傷指数の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜１＞本発明の有効成分
本発明の酵素活性化剤、及びＤＮＡの酸化的損傷の抑制剤又は修復剤は、アオイ科（Malvaceae）フヨウ（ハイビスカス）属（Hibiscus L.）の植物の萼を、乳酸菌により発酵させて得られる発酵物を有効成分として含有する。
本発明で用いるアオイ科フヨウ（ハイビスカス）属の植物としては、例えばローゼル（Hibiscus sabdariffa L.)、ムクゲ（Hibiscus syriacus)、フヨウ（Hibiscus mutabills)、モミジアオイ(Hibiscus coccineus）、オオハマボウ（Hibiscus tiliaceus）、フウリンブッソウゲ（Hibiscus schizopetalus)などが挙げられるが、ローゼル（Hibiscus sabdariffa L.）が好ましい。
【００２０】
発酵に用いられる乳酸菌としては、例えばラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum)、ラクトバシルス ブレビス（L. brevis)、ラクトバシルス カゼイ（L. casei)等のラクトバシルス（Lactobacillus）属の乳酸菌；カルノバクテリウム ディバージェンス（Carnobacterium divergens)、カルノバクテリウム ピシコーラ(Carnobacterium piscicola)等のカルノバクテリウム（Carnobacterium）属の乳酸菌；ロイコノストック メセンテロイズ（Leuconostoc mesenteroides)、ロイコノストック シトレウム（Leuconostoc citreum)等のロイコノストック（Leuconostoc）属の乳酸菌； ストレプトコッカス フェーカリス（Streptococcus faecalis)、ストレプトコッカス ピオジェネス（Streptococcus pyogenes)等のストレプトコッカス属の乳酸菌；エンテロコッカス カゼリフラバス（Enterococcus caseliflavus)、エンテロコッカス サルフレウス（Enterococcus sulfreus)等のエンテロコッカス（Enterococcus）属の乳酸菌；ラクトコッカス プランタラム（Lactococcus plantarum)、ラクトコッカス ラフィノラクティス（Lactococcus rafinolactis)等のラクトコッカス属の乳酸菌；ヴェイセラ コンフューザ（Weissella confusa)、ヴェイセラ カンドウレリ（Weissella kandleri)等のヴェイセラ属の乳酸菌；アトポビウム ミニュタム（Atopobium minutum)、アトポビウム パービュラス（Atopobiumparvulus)等のアトポビウム（Atopobium）属の乳酸菌；バゴコッカス フルビアリス（Vagococcus fluvialis）、バゴコッカス サーモニナラム（Vagococcus salmoninarum)等のバゴコッカス（Vagococcus）属の乳酸菌；ペディオコッカス ダムノサス（Pediococcus damnosus)、ペディオコッカス ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus)等のペディオコッカス（Pediococcus）属の乳酸菌等が挙げられる。それら乳酸菌のうちでも、極度の嫌気性でなく取り扱い易いという点から、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum)の使用が好ましい。
【００２１】
発酵物は、特許第５１２９４４０号公報に記載の方法により、必要に応じて乾燥、微細化したフヨウ（ハイビスカス）属植物の萼を、発酵媒体中に浸漬乃至懸濁させた懸濁液に、乳酸菌を植菌して発酵させることで製造することができる。
【００２２】
＜２＞酵素活性化剤
本発明の酵素活性化剤は、上述した発酵物を有効成分として含有する。
本発明の酵素活性化剤は、外用剤又は経口剤の形態とすることが好ましい。外用剤としては、例えば、化粧料、医薬部外品、皮膚外用医薬等の形態が挙げられる。また、それらの剤形は特に制限されない。中でも、酵素を活性化するためという用途との関係から、継続的に使用可能な化粧料の形態が好ましく、中でも、化粧水、美容液、乳液、クリーム、ジェル、サンケア品等の形態が好ましい。
また、経口剤としては、錠剤、顆粒剤、ドリンク剤等の剤形を有するサプリメントの形態が好ましい。
【００２３】
酵素活性化剤における発酵物の含有量は、外用剤の場合には、発酵物の乾燥質量を基準として、好ましくは０．００００１〜０．０５質量％、より好ましくは０．００１〜０．０２質量％である。発酵液としては好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．１〜５質量％である。
【００２４】
また、当該含有量は、経口剤の場合には、発酵物の乾燥質量を基準として、好ましくは０．００１〜５０質量％、より好ましくは０．０１〜３０質量％である。発酵液としては好ましくは０．１〜８０質量％、より好ましくは１〜５０質量％である。
また、剤形に応じて、１回あたりの摂取量が発酵物の乾燥質量として、１〜１０００ｍｇとなるような量、好ましくは１０〜２００ｍｇとなるような量を配合することが好ましい。
【００２５】
本発明の酵素活性化剤は、カスパーゼ、カタラーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、及びカリクレインから選ばれる１種以上を活性化させるために用いられることが好ましい。
【００２６】
カスパーゼは、細胞のアポトーシスの誘導に関与する酵素である。アポトーシスは種々の刺激に対する生体防御機構であり、その不全が、癌、自己免疫性疾患、ウイルス感染等の疾患の原因となるとされている。また、カスパーゼ−１４は、角層形成、ＮＭＦ（天然保湿因子）産生、皮膚の保湿、透明感の維持に重要な役割を果たしていること、カスパーゼ−１４の活性は、アトピー性皮膚炎や乾癬、接触性皮膚炎等において低下することが知られている。本発明の酵素活性化剤は、このように肌状態に対する関連性が強いカスパーゼ−１４を活性化させるために用いることが好ましい。
後述するように、本発明の酵素活性化剤は、カスパーゼを活性化させる作用に優れることから、癌、自己免疫性疾患、ウイルス感染、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触性皮膚炎等の予防、改善、治療のための剤や保湿剤として使用することができる。
【００２７】
カタラーゼは、過酸化水素を酸素と水に分解に関与する酵素であり、活性酸素による細胞障害の抑制に関与する。活性酸素による細胞障害に起因する疾患や症状としては、癌、動脈硬化、老化等が知られている。また、カタラーゼの阻害がメラニン産生を増加させることも報告されている。
後述するように、本発明の酵素活性化剤は、カタラーゼを活性化させる作用に優れることから、癌、動脈硬化等の予防、改善、治療のための剤、抗老化のための剤、メラニン産生抑制剤として使用することができる。
【００２８】
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、細胞の電子伝達系を担う酵素であり、ＡＴＰ合成や膜電位の維持に関与する。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、細胞活性の維持、細胞増殖及びアポトーシスの何れに対しても重要である。
後述するように、本発明の酵素活性化剤は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを活性化させる作用に優れることから、炎症、癌等の予防、改善、治療のための剤、抗老化のための剤として使用することができる。
【００２９】
カリクレインは、セリンプロテアーゼであり、表皮角層のバリア機能に関与する。表皮角化細胞では特にカリクレイン−５（トリプシン型セリンプロテアーゼ）とカリクレイン−７（キモトリプシン型セリンプロテアーゼ）が高発現していることが知られている。また、カリクレインは不要となった角化細胞の剥離に関与している。老化により活性が低下すると、老人性乾皮症などの症状が現れる。具体的には、カリクレイン−５の活性が低いと顔の皮膚の角層水分量や毛穴の目立ちや凹凸、色むらが悪化する。
本発明の酵素活性化剤は、カリクレインのうちカリクレイン−５を活性化させるために用いることが好ましい。
後述するように、本発明の酵素活性化剤は、カリクレインを活性化させる作用に優れることから、不要な角化細胞の蓄積の抑制剤、保湿剤、老人性乾皮症の予防、改善、治療のための剤として使用することができる。
【００３０】
本発明の酵素活性化剤は、カスパーゼ、カタラーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、カリクレインから選ばれる２種以上、好ましくは３種以上、さらに好ましくは全てを同時に活性化させるために用いられることが好ましい。本発明の酵素活性化剤は、上述した疾患や症状を複合的に予防、改善、治療することを可能とする。
そのため、本発明の酵素活性化剤は、肌状態の改善に有用である。特に、加齢、内的ストレス等の内的要因によって引き起こされる肌状態の低下に有用である。このような肌状態の低下は、肌の微細な凹凸、毛穴の目立ち、肌理、しわ、たるみ、しみ、くすみ、乾燥等の現象を含む。
なお、本発明の酵素活性化のメカニズムは明らかではないが、後述する実施例に示す通り、本発明の有効成分には、ＤＮＡ酸化的損傷を抑制する作用、及びＤＮＡ酸化的損傷を修復する作用が発見されていることから、これらの作用が、少なからず酵素活性化に寄与していることが推認される。
【００３１】
本発明の酵素活性化剤においては、油性成分の含有量が、５質量％以下、好ましくは１質量％以下、特に好ましくは含有しないことが好ましい。これは、油性成分が、酵素活性の阻害につながる場合があるためである。
ここで、油性成分とは、油脂類、ろう類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、及びエステル類等を含む。
本発明者らは、酵素活性を阻害する要因として、油性成分の存在が影響することを見出している。従って、内的要因により引き起こされる酵素活性の低下に有用である前記有効成分を含有し、かつ油性成分の含有量を低減することにより、酵素活性を有効に向上させることが可能となる。
【００３２】
また、本発明の酵素活性化剤を外用剤とする場合において、上記有効成分と、ヒートショックプロテイン及び／又はヒートショック因子とを組み合わせて含有することも好ましい。これは、ヒートショックプロテイン及び／又はヒートショック因子が、皮膚中の酵素活性を向上させる作用を有するためである。特に、当該成分は、紫外線等の外的要因により引き起こされる酵素活性の低下に対し有効であることから、内的要因により引き起こされる酵素活性の低下に有用である前記有効成分と組み合わせて使用する利点が大きい。このような成分として、ヒートショックプロテイン及び／又はヒートショック因子を含有する微生物抽出物が挙げられる。このような抽出物は、酵母や乳酸菌等の微生物を、４２〜４４℃にて１０〜４０分間熱ストレスを与えながら培養し、その後、培養液を遠心分離し、沈殿物を粉砕後、極性溶媒にて抽出することで製造することができる。極性溶媒としては、水、メタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、ポリプロピレングリコールなどが例示できる。また、抽出物は、ヒートショックプロテイン及び／又はヒートショック因子の遺伝子を組み込んだ大腸菌を培養していられる培養液を遠心分離し、沈殿物を粉砕後、極性溶媒にて抽出することによっても、製造することができる。
酵素活性化剤におけるヒートショックプロテイン及び／又はヒートショック因子を含有する微生物抽出物の含有量は、前記微生物抽出物の乾燥質量として、好ましくは０．０００１〜１０質量％、さらに好ましくは０．００１〜５質量％、特に好ましくは０．０１５〜３質量％である。
【００３３】
本発明の酵素活性化剤においては、ヒートショックプロテイン及び／又はヒートショック因子を、前記有効成分と組み合わせて含む形態とし、かつ油性成分の含有量を、前述したとおり低減した形態、さらには油性成分を含有しない形態とすることが特に好ましい。
このような形態の酵素活性化剤は、酵素活性を低下させ得る内的要因、外的要因を多面的に排除する作用を有するため、酵素の活性化に極めて有用である。
【００３４】
＜３＞ＤＮＡ酸化的損傷の抑制剤又は修復剤
本発明の抑制剤又は修復剤は、上述した発酵物を有効成分として含有する。
本発明のＤＮＡの酸化的損傷の抑制剤又は修復剤は、外用剤又は経口剤の形態とすることが好ましい。具体的な剤形については、前述した酵素活性化剤と同様である。
また、有効成分の好ましい含有量についても、前述した酵素活性化剤と同様である。
【００３５】
ＤＮＡの酸化的損傷によって引き起こされる疾患や症状としては、老化加速や癌化促進などが挙げられる。また、ＤＮＡの酸化的損傷は、酵素活性の低下の要因の一つであることから、本発明の抑制剤又は修復剤は、上述した疾患や症状にも有用である。
【００３６】
本発明の酵素活性化剤、及び本発明のＤＮＡの酸化的損傷の抑制剤又は修復剤は、有効成分以外に通常化粧料で使用される任意成分を発明の効果を損なわない範囲で含有することができる。かかる任意成分としては、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２−ペンタンジオール、２，４−ヘキシレングリコール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール等のポリオール、脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２−オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類、表面処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、表面処理されていても良い、酸化コバルト、群青、紺青、酸化亜鉛の無機顔料類、表面処理されていても良い、酸化鉄二酸化チタン焼結体等の複合顔料、表面処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類、レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類、ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類、ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ６塩酸塩，ビタミンＢ６トリパルミテート，ビタミンＢ６ジオクタノエート，ビタミンＢ２又はその誘導体，ビタミンＢ１２，ビタミンＢ１５又はその誘導体等のビタミンＢ類、α−トコフェロール，β−トコフェロール，γ−トコフェロール，ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類が挙げられる。
【実施例】
【００３７】
本試験で使用するハイビスカス発酵液は、特許第５１２９４４０号公報に記載の実施例の方法で作られたものを使用した。
【００３８】
＜試験例１＞酵素活性の測定
表皮細胞の培養系において、酸化ストレスを与える前にハイビスカス発酵液（被験物質）を添加した場合の酵素活性低下抑制作用を評価した。また、酸化ストレスを与えた後にハイビスカス発酵液（被験物質）を添加した場合の酵素活性回復作用を測定した。
【００３９】
＜１＞被験物質としてハイビスカス発酵液を添加した後に、酸化ストレスを与えた場合の酵素活性の測定
試験は、以下の方法で行った。
【００４０】
＜１−１＞酸化ストレスの付与
１）ヒト正常角化細胞（ＮＨＥＫ）をＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地により１．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種後、２４時間プレインキュベーションした。
２）プレインキュベーション後、培養上清を除去し、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＢ２により所定濃度に調製した被験物質含有培地を２００μＬ／ｗｅｌｌ添加し（酸化ストレスを与える前に添加）、４８時間培養した。
３）被験物質共存下にて４８時間培養後、終濃度が１５０μＭとなるようにＨ2Ｏ2を添加し、酸化ストレス処理を行った。
４）Ｈ2Ｏ2曝露後、培養上清を除去し、ＰＢＳ（−）にて洗浄後、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＢ２  ２００μＬ／ｗｅｌｌにてさらに４８時間ポストインキュベーションした。
５）ポストインキュベーション後、酵素活性測定を行った。酵素活性測定は、下記の方法にて行った。
【００４１】
＜１−２＞酵素活性の測定
（１）酵素液の調製
１）ポストインキュベーション後の細胞を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００水溶液１００μＬ／ｗｅｌｌにて溶解した。
２）細胞溶解液１００μＬ／ｗｅｌｌのうち、５０μＬ／ｗｅｌｌをタンパク質濃度測定に供した。タンパク質濃度はＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ(サーモフィッシャーサイエンティフィック製)を用いて測定した。
【００４２】
（２）カスパーゼ−１４活性測定
１）細胞溶解液５０μＬ／ｗｅｌｌに対し、アッセイバッファー(５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）＋６０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．０１％ＣＨＡＰＳ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡ＋２ｍＭ  ＤＴＴ＋１．５Ｍクエン酸ナトリウム)にて０．０４ｍＭに調製したＡｃ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＭＣＡ(メチルクマリンアミド)基質(ペプチド研究所製、３１８６−ｖ)を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加した。
２）３７℃で１０分間インキュベーション後、０．１Ｍモノクロロ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ ４．３）で反応を停止させ、遊離したＡＭＣ(アミノメチルクマリン)の蛍光強度(励起波長：３７０ｎｍ、蛍光波長：４６０ｎｍ)を測定した。
３）カスパーゼ−１４活性は、１ウェルタンパク質濃度あたりの蛍光強度とした。酵素の働きが高いほどＡＭＣの遊離が多くなるため蛍光強度が強くなる。
【００４３】
（３）カリクレイン−５活性測定
１）細胞溶解液５０μＬ／ｗｅｌｌに対し、アッセイバッファー(０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム（ｐＨ８．０）)にて２００μＭに調製したＢｏｃ−ＶＰＲ−ＭＣＡ基質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製、ＥＳ０１１）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加した。
２）３７℃で５分間インキュベーション後、０．１Ｍモノクロロ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）で反応を停止させ、遊離したＡＭＣの蛍光強度(励起波長：３７０ｎｍ、蛍光波長：４６０ｎｍ)を測定した。
３）カリクレイン−５の活性は、１ウェルタンパク質濃度あたりの蛍光強度とした。酵素の働きが高いほどＡＭＣの遊離が多くなるため蛍光強度が強くなる。
【００４４】
（４）カタラーゼ活性測定
１）細胞溶解液５０μＬ／ｗｅｌｌに対し、ＰＢＳ（−）により０．０１５ｍＭに調製したＨ2Ｏ2水溶液をカタラーゼ基質として５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３０分間撹拌した。
２）撹拌後、ＰＢＳ（−）にて調製した１１．４ｍＭフェノール３５μＬ／ｗｅｌｌ、１．７６ｍＭ  ４−アミノアンチピリン、２．０Ｕ／ｍＬペルオキシダーゼ１０μＬ／ｗｅｌｌを添加した。
３）混合液を５分間撹拌後、５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
４）Ｈ2Ｏ2は、フェノールおよび４−アミノアンチピリン存在下、ペルオキシダーゼの触媒反応により紅色キノン色素(５５０ｎｍ)を生成する。この吸光度を測定することによって残存しているＨ2Ｏ2量が算出できる。残存するＨ2Ｏ2量が少ないほどカタラーゼ活性が高いことを示していることから、１ウェルタンパク質濃度あたりのＨ2Ｏ2残存量をカタラーゼ活性の指標とした。
【００４５】
（５）ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性測定
１）細胞溶解液５０μＬ／ｗｅｌｌに対し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）にて調製した０．１２ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール(ＤＣＩＰ、東京化成工業製、Ｄ０３７５) 水溶液１００μＬ／ｗｅｌｌおよび１．５ｍＭ  ＮＡＤＨ水溶液５０μＬ／ｗｅｌｌを添加した。
２）３７℃で２０分間撹拌し、６００ｎｍにおける吸光度の減少量を測定した。
３）ＤＣＩＰが還元されると青色から無色に変化する性質を利用して１ウェルタンパク質濃度あたりの６００ｎｍにおける吸光度の減少量を算出し、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性とした。
【００４６】
結果を、表１〜４、及び図１〜４に示す。
表及び図から分かるように、酸化ストレスを与える前にハイビスカス発酵液を添加することにより、何れの酵素についても酸化ストレスによる酵素活性の低下の抑制が確認された。特に、カスパーゼ−１４については、顕著な活性低下の抑制効果が確認された。また、カタラーゼについては、濃度依存的な活性低下の抑制効果が観察された。
これより、ハイビスカス発酵液は、酸化ストレスによる酵素活性の低下を抑制する作用を有することが明らかとなった。
【００４７】
【表１】
0006630066.tif 000002
【００４８】
【表２】
0006630066.tif 000003
【００４９】
【表３】
0006630066.tif 000004
【００５０】
【表４】
0006630066.tif 000005
【００５１】
＜２＞酸化ストレスを与えた後に、被験物質としてハイビスカス発酵液を添加した場合の酵素活性の測定
試験は、以下の方法で行った。
【００５２】
酸化ストレスの付与による酵素活性への影響
１）Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地によりＮＨＥＫを１．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種後、２４時間プレインキュベーションした。
２）プレインキュベーション後、培養上清を除去し、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＢ２を２００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、48時間培養した。
３）４８時間培養後、終濃度が１５０μＭとなるようにＨ2Ｏ2を添加し、酸化ストレス処理を行った。
４）Ｈ2Ｏ2曝露後、培養上清を除去し、ＰＢＳ（−）にて１回洗浄後、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＢ２により所定濃度に調製した被験物質含有培地を２００μＬ／ｗｅｌｌ添加し（酸化ストレス後の添加）、４８時間ポストインキュベーションした。
５）ポストインキュベーション後、カスパーゼ-14、カタラーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの酵素活性測定を行った。酵素活性は、上記項目＜１−２＞に記載した方法により測定した。
【００５３】
結果を、表５〜７、及び図５〜７に示す。
表及び図から分かるように、酸化ストレスを与えた後にハイビスカス発酵液を添加することにより、何れの酵素についても活性の向上が確認された。特に、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼについては、顕著な活性向上が確認された。
これより、ハイビスカス発酵液は、酸化ストレスにより酵素活性が低下した状態から、酵素活性を回復させる作用を有することが明らかとなった。
【００５４】
【表５】
0006630066.tif 000006
【００５５】
【表６】
0006630066.tif 000007
【００５６】
【表７】
0006630066.tif 000008
【００５７】
＜試験例２＞ＤＮＡの酸化的損傷の測定
表皮細胞の培養系において、ＤＮＡ損傷を誘発する前に被験物質を添加した場合のＤＮＡ酸化損傷抑制効果を評価した。また、ＤＮＡ損傷を誘発した後に被験物質を添加した場合のＤＮＡ酸化損傷修復効果を評価した。
【００５８】
＜１＞ハイビスカス発酵液を被験物質としてあらかじめ添加した後に、酸化ストレスを与え細胞のＤＮＡ損傷を誘発した場合のＤＮＡ酸化損傷抑制効果の測定
具体的な方法は以下のとおりである。
【００５９】
正常ヒト皮膚由来表皮細胞（ＮＨＥＫ）を播種後、翌日各被験物質を含む培地を添加し、さらに２日間培養を行った。その後過酸化水素溶液を終濃度１５０μＭとなるよう添加して酸化ストレス処理を行いＤＮＡの酸化損傷を誘導した。その後抗体を用いた免疫的検出を行い、８−ＯＨｄＧの生成量を評価した。すなわち、過酸化水素を洗浄により除去した後、細胞を固定し、ＢＳＡによるブロッキングを行った後、８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体を添加し、４℃で一昼夜静置した。その後洗浄し、蛍光ラベルした二次抗体を添加してさらに暗所で一定時間静置した。その後洗浄し、蛍光顕微鏡による観察を行った。定量については、先ず二次抗体の蛍光ラベル（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８）をＥｘ＝４８５ｎｍ、Ｅｍ＝５２０ｎｍで測定し、その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２によるＤＮＡ染色を行い、Ｅｘ＝３５５ｎｍ、  Ｅｍ＝４６０ｎｍの測定を行った。それらの数値から次式によりＤＮＡの酸化損傷指数を算出した。
なお、陽性コントロールとして、水溶性ビタミンＥであるＴｒｏｌｏｘを添加した時の損傷抑制効果も評価した。
【００６０】
ＤＮＡ酸化損傷指数＝｛（８−ＯＨｄＧ抗体による免疫染色によって得られた蛍光強度（Ｅｘ＝４８５ｎｍ，Ｅｍ＝５２０ｎｍ）／Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色によって得られたＤＮＡの蛍光強度（Ｅｘ＝３５５ｎｍ，Ｅｍ＝４６０ｎｍ）｝＊１０００
なお、８−ＯＨｄＧは、８−ｈｙｄｒｏｘｙ−２’−ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅを意味し、ＤＮＡを構成する塩基の一つｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅの８位がヒドロキシル化された構造を持つＤＮＡ酸化損傷マーカーである。
【００６１】
結果を表８及び図８に示す。なお、図表中の数値は、酸化ストレス（＋）、被験物質非添加の時の値を１００とした時の相対値で示す。
【００６２】
【表８】
0006630066.tif 000009
【００６３】
評価の結果、酸化ストレスを与えた群においては、あらかじめ被験物質を添加した群は、被験物質を添加しない群に比較して、ＤＮＡ酸化的損傷指数が小さかった。また、ハイビスカス発酵液の添加濃度に応じて、ＤＮＡ酸化的損傷指数が低下した。以上の結果より、ハイビスカス発酵液がＤＮＡ酸化的損傷を抑制する作用を有することが確認された。
【００６４】
＜２＞酸化ストレスを与え細胞のＤＮＡ損傷を誘発した後に、ハイビスカス発酵液を添加した場合のＤＮＡ酸化損傷修復効果の測定
具体的な方法は以下のとおりである。
【００６５】
正常ヒト皮膚由来表皮細胞（ＮＨＥＫ）を播種後、翌日に過酸化水素溶液を終濃度１５０μＭとなるよう添加して酸化ストレス処理を行いＤＮＡの酸化損傷を誘導した。過酸化水素溶液を洗浄除去した後、被験物質（ハイビスカス発酵液）を含む培地に交換し、さらに3日間培養した。その後抗体を用いた免疫的検出を行い、８−ＯＨｄＧの生成量を評価した。すなわち、培地を除去後、細胞を固定し、ＢＳＡによるブロッキングを行った後、８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体を添加し、４℃で一昼夜静置した。その後洗浄し、蛍光ラベルした二次抗体を添加してさらに暗所で一定時間静置した。その後洗浄し、蛍光顕微鏡による観察を行った。定量については、先ず二次抗体の蛍光ラベル（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８）をＥｘ＝４８５ｎｍ、Ｅｍ＝５２０ｎｍで測定し、その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２によるＤＮＡ染色を行い、Ｅｘ＝３５５ｎｍ、Ｅｍ＝４６０ｎｍの測定を行った。それらの数値から次式によりＤＮＡの酸化損傷指数を算出した。
ＤＮＡ酸化損傷指数＝｛（８−ＯＨｄＧ抗体による免疫染色によって得られた蛍光強度（Ｅｘ＝４８５ｎｍ，Ｅｍ＝５２０ｎｍ）／Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色によって得られたＤＮＡの蛍光強度（Ｅｘ＝３５５ｎｍ,Ｅｍ＝４６０ｎｍ）｝＊１０００
なお、陽性コントロールとして、水溶性ビタミンＥであるＴｒｏｌｏｘを添加した時の損傷修復効果も評価した。
【００６６】
結果を表９及び図９に示す。なお、図表中の数値は、酸化ストレス（＋）、被験物質非添加の時の値を１００とした時の相対値で示す。
【００６７】
【表９】
0006630066.tif 000010
【００６８】
評価の結果、酸化ストレスを与えた群においては、ハイビスカス発酵液を添加した群は、当該発酵液を添加しない群に比較して、ＤＮＡ酸化的損傷指数が小さかった。また、ハイビスカス発酵液の添加濃度に応じて、ＤＮＡ酸化的損傷指数が低下した。以上の結果より、ハイビスカス発酵液がＤＮＡ酸化的損傷を修復する作用を有することが確認された。
【００６９】
＜実施例１＞外用剤
表１０に示す処方に従って、本発明の皮膚外用剤である化粧水を調製した。即ち、表に示す成分（イ）の混合物を室温で攪拌混合し均一溶液とした。成分（ロ）の混合物を７５℃に加熱し、攪拌混合し均一溶液とした。成分（イ）の混合物を攪拌しながら、室温まで冷却した成分（ロ）の混合物をゆっくり添加し、さらに（ハ）の成分を攪拌混合したものを添加して化粧水を得た。
なお、以下のＨＳＰ含有酵母エキスは、培養酵母に対して熱ストレス条件下（４４℃）にて４０分間熱ストレスを与え、ヒートショックプロテイン及びヒートショック因子を増加させ、その後、培養液を遠心分離し、沈殿物を粉砕後、水にて抽出して得た。
【００７０】
【表１０】
0006630066.tif 000011
【００７１】
＜実施例２＞外用剤
表１１に示す処方に従って、本発明の皮膚外用剤である紫外線防御化粧料（乳液）を調製した。すなわち、表１１の成分（イ）を７５℃に加熱し、ディスパーを用いて５０００ｒｐｍで４分間攪拌し、成分を均一に分散させた。さらに、成分（ロ）を７５℃に加熱、攪拌混合し、７５℃を保ちながら、成分（イ）に成分（ロ）を攪拌下、添加し乳化を行った。その後、室温まで冷却し、（ハ）を攪拌混合したものを添加し乳液を得た。
【００７２】
【表１１】
0006630066.tif 000012
【００７３】
＜実施例３＞経口剤（ドリンク剤）
以下に示す処方に従い、常法によりドリンク剤を調製した。
【００７４】
【表１２】
0006630066.tif 000013
【００７５】
＜実施例４＞経口剤（錠剤）
以下に示す処方に従い、常法により錠剤を調製した。
【００７６】
【表１３】
0006630066.tif 000014
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、化粧料やサプリメントに応用できる。
【図１】
0006630066.tif 000015
【図２】
0006630066.tif 000016
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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