(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性、高分子量および／または荷電有機化合物を抗体に結合するための方法であって、
ａ）少なくとも１つの受容体グルタミン残基を有する抗体を提供するステップと、
ｂ）前記抗体と、第１級アミンおよび反応基（Ｒ）を含むリンカーとを、ＴＧａｓｅの存在下、前記リンカーを介して前記反応基（Ｒ）に連結された受容体グルタミンを含む抗体を得るために十分な条件下で反応させるステップであって、前記反応混合物が有機溶媒を含まないか、あるいは５％（ｖ／ｖ）未満の有機溶媒を含有するステップと、
（ｃ）有機溶媒の存在下、任意選択で少なくとも５％（ｖ／ｖ）の有機溶媒の存在下、
（ｉ）前記リンカーを介して反応基（Ｒ）に連結された受容体グルタミンを含むステップ（ｂ）の抗体と、
（ｉｉ）対象の部分（Ｚ）および反応基Ｒと反応することができる反応基（Ｒ’）を含む化合物であって、前記（Ｚ）が、疎水性化合物、荷電有機化合物および／または少なくとも５００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する有機化合物である化合物と
を、前記リンカーを介して対象の部分（Ｚ）に連結された受容体グルタミンを含む抗体を得るために十分な条件下で反応させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
（Ｑ）−ＮＨ−Ｃ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｍ）ｚ）ｑ）ｒ      式ＩＶｂ
（式中、
Ｑは抗体または抗体断片中に存在するグルタミン残基であり、
Ｃは置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、任意選択で、前記鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドによって置換され、前記アルキルまたはヘテロアルキル鎖の原子の長さは、任意選択で２〜２０個の原子の鎖長を有し；
ＸはＮＨ、Ｏ、Ｓであるか、存在しないか、または結合であり、
Ｌは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数の原子において置換された１〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、
ｒは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｑは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｚは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
Ｖは独立して、存在しないか、結合または結合の連続であるか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、
Ｙは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系であり、
Ｍは（ＲＲ’）−Ｌ’−（Ｖ’−（Ｙ’−（Ｚ）ｚ’）ｑ’）ｒ’であり、
（ＲＲ’）は、反応性部分Ｒと相補的反応性部分Ｒ’との付加生成物であり、
Ｌ’は独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数の原子において置換された１〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、
Ｖ’は独立して、存在しないか、結合または結合の連続であるか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、
Ｙ’は独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系であり、
Ｚは独立して、反応基、薬物動態学的特性を改善する部分、治療的または診断的部分であり、各ＺはＹ’に直接カップリングされるか、またはＹ’が存在しない場合にはＶ’に直接カップリングされるか、またはＹ’およびＶ’がいずれも存在しない場合はＬ’に直接カップリングされ、
ｚ’、ｑ’およびｒ’はそれぞれ独立して、１、２、３または４の中から選択される整数である）
の構造を有する抗体が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｚが疎水性化合物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｚが、タキサン、アントラサイクリン、カンプトテシン、エポチロン、マイトマイシン、コンブレタスタチン、ビンカアルカロイド、窒素マスタード、マイタンシノイド、カリキアマイシン、デュオカルマイシン、ツブリシン、アマトキシン、ドラスタチンおよびアウリスタチン、エンジイン、ピロロベンゾジアゼピン、およびエチレンイミンからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｚがピロロベンゾジアゼピンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｚがアウリスタチンである、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／８３７，９３２号（あらゆる図面を含めてその全体が参照によって本明細書中に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、電子型式の配列表と共に出願されている。配列表は、２０１４年６月２０日に作成された「ＴＧａｓｅ１０  ＰＣＴ＿ＳＴ２５」という表題の２０ＫＢサイズのファイルで提供される。配列表の電子型式の情報は、参照によってその全体が本明細書中に援用される。
【０００３】
本出願は、化学、生化学、および医学の分野に関する。本明細書には、特に薬物による免疫グロブリンの機能化のための方法が開示される。また本明細書には、連結試薬、機能化抗体、医薬組成物、ならびに疾患および／または状態の治療方法も開示される。
【背景技術】
【０００４】
抗体薬物結合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）として一般に知られている対象の薬物に結合された免疫グロブリンは、治療法研究の有望な領域である。最近のＡＤＣ技術の発展は、細胞内切断を提供するリンカー技術に焦点を合わせているか、あるいはここ最近は、より大きい生体内安定性および低減した毒性を提供する切断不能なリンカーに合わせている。しかしながら、切断不能なリンカーに基づくアプローチの実現可能性は、切断可能なリンカーの場合よりも、細胞標的に大きく依存し得る。切断不能なリンカーを有するＡＤＣは内部移行されて、細胞内で分解されなければならないが、切断可能なリンカーを有する化合物は、細胞外の薬物放出および腫瘍細胞への薬物侵入によって内部移行が不十分な標的に対して活性であり得る。同様に、抗原陽性細胞のターゲティングによるバイスタンダー抗原陰性細胞の死滅（付加的な毒性）は恐らく切断可能なリンカーによってのみ可能である。結果として、一般に、全てのＡＤＣのための一般的なリンカー設計は存在せず、各抗体を別々に検討しなければならないと考えられる。さらに、毒素に連結された薬物の効力は、例えば、細胞型または特定の腫瘍細胞に応じて異なり得るので、所与の標的に対して様々な薬物を検査し、さらに特定のリンカー系と組み合わせて検査することも必要であり得る。従って、ＡＤＣの開発は依然として高価で時間のかかるプロセスであり、改善されたリンカー系が当該分野において必要とされている。
【０００５】
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）は、タンパク質を架橋することができるために、食品産業においてしばらくの間利用されている。このような利用は、定量的または化学量論的な形で架橋をする必要がなかった。ＴＧａｓｅは、グルタミンおよびリシン残基（抗体上のものを含む）を結合できることが示されている（例えば、Ｊｏｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４０，４７−５４；Ｍｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１９，２７１−２７８；Ｊｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４９：９９９５−９９９７）；Ｋａｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３３，４９２−４９６および米国特許出願公開第２０１１／０１８４１４７号明細書を参照。タンパク質を架橋するこれまでの試みにより、結合を生じさせるタンパク質モチーフが研究され、結合され得るペプチドが同定されたが、修飾のためのグルタミン残基のＴＧａｓｅによる選択を支配する規則はまだほとんど知られていない。さらに、異なる基質に応じるＴＧａｓｅの能力、またはＴＧａｓｅが定量的な形で結合する能力に対するその効果についてはほとんど分かっていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、ＴＧａｓｅを用いて、抗体上の受容体グルタミンを困難な基質により化学量論的に機能化する方法を提供する。本発明は、抗体内の受容体グルタミンの環境と、リシン誘導体ドナー基質の性質とが独立して、そして一緒に、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）介在性結合の効力に影響を与えるという知見から生じる。
【０００７】
ＴＧａｓｅをリシン誘導体リンカーと併用して、抗体に部分（例えば、化学物質）を結合させると、抗体内の受容体グルタミンに対して良くても部分的な結合しか提供されないことが発見された。結合は特に基質の性質に依存すると思われ、ビオチンなどのより小さく、非荷電かつ非疎水性の基質は既知の方法を用いて部分的にカップリングされ得るが、荷電基質などのいくつかの基質は全くカップリングされない。疎水性および／またはより大きい基質はカップリングが不十分であり、不均一な抗体混合物をもたらすと思われる。カップリング反応パラメータを最適化したが、低レベルのカップリング、従って生成物の均質性についての問題は解決できなかった。大きい、硬直性および／または疎水性の分子、特に多環または巨大環も含有するもの（一般的な細胞毒性薬物に沿って）は、高レベルでカップリングすることができなかった。
【０００８】
さらに、受容体グルタミンに対して＋２位置において負荷電アスパラギン酸基を回避する修飾Ｆｃドメインを使用すると、非常に改善されたカップリングが達成され得ることが発見された。Ｆｃドメインの修飾は、重鎖Ｎ２９７連結グリコシル化を消失させて、酵素（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）による脱グリコシル化が必要とされないように設計した。ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる脱グリコシル化は位置２９７（ＥＵインデックス）においてアスパラギンの側鎖を修飾し、これは、負荷電アスパラギン酸残基になる。重鎖ごとに１つの受容体グルタミン（残基２９５（ＥＵインデックス）における）を有するＮ２９７Ｓ突然変異体の使用により、Ｎ２９７Ｄ突然変異を有する抗体と比べてはるかにより高度のカップリングを有する抗体組成物が得られた。さらに、突然変異Ｎ２９７Ｒ、Ｎ２９７ＡおよびＮ２９７Ｓにより改善された結合が提供された。
【０００９】
さらなる実験では、疎水性および／またはより大きい基質（本実施例ではアウリスタチン薬物）をカップリングさせる場合、残基２９７（ＥＵ番号付け）は、天然に存在するＱ２９５部位よりもＴＧａｓｅに対して優れたアクセシビリティを提示し得ることが発見された。特に、より大きい基質の場合、反応部位に対する酵素および／またはリンカーのアクセシビリティは、カップリングを制限し得る要因になり得る。位置２９７において重鎖ごとに１つの受容体グルタミンを有するＱ２９５Ｘ＋Ｎ２９７Ｑ二重突然変異体へ結合される場合、高速でカップリングされ得る（実質的に完全なカップリング）。カダベリン−ダンシル（ｃａｄａｖａｒｉｎ−ｄａｎｓｙｌ）リンカーは残基２９５または２９７におけるカップリングの間で実質的な差異を示さず、それどころかカダベリン−ダンシル（ｃａｄａｖａｒｉｎ−ｄａｎｓｙｌ）は、例えば、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７ＳおよびＮ２９７Ｒ突然変異体との関連でＱ２９５に対するより優れたカップリングを示したので、アクセシビリティは、より小さい基質の場合には、大した要因ではない可能性がある。
【００１０】
さらに、カップリング環境は、溶媒によって強く影響される。図２６および図２７で実証されるように、ＴＧａｓｅカップリング反応混合物中の５％を超える、またはさらに１０％を超える有機溶媒の存在は、ＣＨ２ドメインのアミノ酸へのカップリングのためのＴＧａｓｅの活性を強く阻害する。従って、１つの態様では、カップリングプロセスは、ＴＧａｓｅカップリング反応混合物中の溶媒濃度が１０％（ｗ／ｗ）よりも低く、好ましくは５％（ｖ／ｖ）よりも低なるようにリンカー−薬物部分の調製を調整するように提供される。薬物部分を含むリンカーを用いる実質的に完全な直接カップリングは、溶媒濃度が低い（例えば、１％）プロセスを用いて達成することができた。
【００１１】
一実施形態では、より小さいリンカー基質が残基Ｑ２９５において抗体にカップリングされ、ここで、Ｑ２９５は＋２位置（すなわち、残基２９７）において非グリコシル化、非アスパラギン酸のアミノ酸残基によって隣接されており、任意選択で、この残基はアラニン、セリンまたはアルギニンである。好ましくは、カップリングは、トランスグルタミナーゼ酵素の存在下、受容体グルタミン残基を有する抗体と、第１級アミンを含む連結試薬とを反応させることによって実行され、ここで、溶媒（例えば、有機溶媒、極性溶媒、非極性溶媒、ＤＭＳＯ）は１０％（ｖ／ｖ）未満であり、任意選択で、さらに５％、４％、３％または２％（ｖ／ｖ）未満である。
【００１２】
一実施形態では、大きいおよび／または疎水性リンカー基質が残基２９７において抗体にカップリングされ、ここで、抗体は、Ｎ２９７Ｑ突然変異（および任意選択でさらにＱ２９５Ｘ突然変異）を含む。好ましくは、カップリングは、トランスグルタミナーゼ酵素の存在下、受容体グルタミン残基を有する抗体と、第１級アミンを含む連結試薬とを反応させることによって実行され、ここで、溶媒（例えば、有機溶媒、極性溶媒、非極性溶媒、ＤＭＳＯ）は１０％（ｖ／ｖ）未満であり、任意選択で、さらに５％、４％、３％または２％（ｖ／ｖ）未満である。
【００１３】
大きいおよび／または高度に疎水性のリンカー基質（例えば、ピロロベンゾジアゼピン部分を含むリンカー）を高濃度の有機溶媒なしに可溶化することができない一実施形態では、反応性部分を有するリンカーを用いる多段階カップリングプロセスが使用される。抗体がＮ２９７Ｑ突然変異を含む場合、反応性部分を有するリンカーは、例えば残基Ｑ２９５および／または残基２９７において抗体にカップリングされる。好ましくは、カップリングは、トランスグルタミナーゼ酵素の存在下、受容体グルタミン残基を有する抗体と、反応性部分（Ｒ）を有する連結試薬とを反応させることによって実行され、ここで、溶媒（例えば、有機溶媒、極性溶媒、非極性溶媒、ＤＭＳＯ）は存在しないか、あるいは１０％（ｖ／ｖ）未満、任意選択でさらに５％、４％、３％または２％（ｖ／ｖ）未満である。得られた抗体は次に、相補的反応基（Ｒ’）および疎水性薬物（例えば、ピロロベンゾジアゼピン部分）を含むリンカーと反応され、疎水性薬物（または他の対象の部分（ｍｏｉｅｔｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（Ｚ））に（例えば、ＲおよびＲ’の反応生成物を介して）カップリングされた抗体を生じる。相補的反応基（Ｒ’）および疎水性薬物を含むリンカーを用いる反応ステップは溶媒の存在下で実行することができ、例えば、溶媒（例えば、有機溶媒、極性溶媒、非極性溶媒、ＤＭＳＯ）が反応混合物中に存在し、溶媒は、２％、３％、４％、５％または１０％（ｖ／ｖ）よりも多く存在する。例えば、多段階アプローチの一例として図１０Ｂを参照されたい。
【００１４】
これらの位置（２９５または２９７）は、より保護される位置で薬物と結合する現存のＡＤＣ（例えば、ＡｄｃｅｔｒｉｓＴＭ）と比較して高度に露出されている。それにもかかわらず、条件的に切断可能なペプチド部分が含まれる場合でもリンカーは安定であり、水性条件下でＡｄｃｅｔｒｉｓＴＭよりも少ない凝集体を有した。本明細書中の抗体結合体組成物のいずれかの１つの態様では、組成物は実質的に凝集体を含まない。
【００１５】
改善されたカップリングをもたらすリンカーは、ＢＴＧ相互作用の部位に近接して、すなわち第１級アミンの近位に、スペーサー、および／または乏しい極性および／または多環もしくは巨大環（または一般的に構造的硬直性を付与する基）を提供し、そして／あるいはＢＴＧ介在性のカップリングを阻害する置換基からＢＴＧ相互作用の部位を遠ざけるスペーサーを提供した。このようなリンカーは、電荷および巨大環を有するより小さい化合物の、脱グリコシル化抗体に対する改善されたカップリング（７０％までの結合）を可能にした。リンカーは、より大きい分子の完全かつ化学量論的な結合を許容する多段階アプローチを可能にする反応性リンカーの設計も可能にした。
【００１６】
例としては、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのリンカーが挙げられ、任意選択で、（Ｃ）ｎ、Ｌ、ＶまたはＹ（およびこれらの任意の組み合わせ）のいずれかは、スペーサーとして機能し得る。一実施形態では、（Ｃ）ｎ、および／またはＬ基は線状炭化水素鎖を含み、一実施形態では、（Ｃ）ｎおよび／またはＬ基は複数の（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）基、任意選択で（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ基を含み、ここで、ｎは１〜２４の範囲の中から選択される整数であり、一実施形態では、（Ｃ）ｎおよび／またはＬ基は、アミノ酸残基（例えば、リシン残基）またはジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、もしくはオリゴペプチドを含む。一実施形態では、Ｖ基は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、またはオリゴペプチドを含み、任意選択でペプチドは細胞内で切断可能である。一実施形態では、（Ｃ）ｎはリシン残基または誘導体を含み、Ｖはジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、またはオリゴペプチドを含み、任意選択でＬは存在または不在である。任意選択で、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、またはオリゴペプチドは、負に荷電していない側鎖を有するアミノ酸残基（アスパラギン酸またはグルタミン酸以外のアミノ酸）を含む、あるいはこれらからなる。任意選択で、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、もしくはオリゴペプチドは、正荷電側鎖を有するアミノ酸残基、極性の非荷電側鎖を有するアミノ酸残基、および疎水性側鎖を有するアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基を含む、あるいはこれらからなる。
【００１７】
１つの態様では、本開示は、薬物、特にペプチドおよびポリペプチド、比較的大きい化学物質、負荷電化学物質、巨大環または１つもしくは複数の環状基を含む化学物質および／または疎水性化学物質、例えば典型的な細胞毒性薬物、例えば、天然源に由来するデュオカルマイシン、マイタンサノイド（ｍａｙｔａｎｓａｎｏｉｄ）、アルキル化剤、ピロロベンゾジアゼピン、アウリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）など（例えば、これらの類似体）、またはこれらの類似体もしくは誘導体による免疫グロブリンの機能化のために特に有用である、部位特異的な標識化および機能化アプローチを提供する。
【００１８】
本開示は、一実施形態では、対象の部分（Ｚ）を抗体に結合するための方法に関し、本方法は、
ａ）（例えば、組換え宿主細胞において）＋２位置において非グリコシル化、非アスパラギン酸のアミノ酸残基によって隣接された受容体グルタミン残基を（例えば、抗体の一次配列内に）含む抗体を作製するステップと、
ｂ）受容体グルタミン残基を含む前記抗体と、第１級アミンを含む連結試薬とを、受容体グルタミン残基と連結試薬（連結試薬の第１級アミンにおいて）との間に共有結合の形成を引き起こすことが可能なトランスグルタミナーゼ酵素の存在下、連結試薬に連結（共有結合）された受容体グルタミン残基を含む抗体を得るために十分な条件下で反応させるステップと
を含む。
【００１９】
本開示は、一実施形態では、対象の部分（Ｚ）を抗体に結合するための方法に関し、本方法は、
ａ）（例えば、組換え宿主細胞において）位置２９７（ＥＵ番号付け）に受容体グルタミン残基を（例えば、抗体の一次配列内に）含み、そして位置２９５（ＥＵ番号付け）にグルタミン以外の残基を含む抗体を作製するステップと、
ｂ）受容体グルタミン残基を含む前記抗体と、第１級アミンを含む連結試薬とを、受容体グルタミン残基と連結試薬（連結試薬の第１級アミンにおいて）との間に共有結合の形成を引き起こすことが可能なトランスグルタミナーゼ酵素の存在下、連結試薬に連結（共有結合）された受容体グルタミン残基を含む抗体を得るために十分な条件下で反応させるステップと
を含む。
【００２０】
一実施形態では、疎水性、高分子量または荷電有機化合物を抗体に結合するための方法が提供され、本方法は、
ａ）重鎖の位置２９７（ＥＵ番号付け）にグルタミン残基を含み、位置２９５（ＥＵ番号付け）の受容体グルタミンが欠けた抗体または抗体断片を提供するステップと、
ｂ）前記抗体と、対象の部分（Ｚ）を含む連結試薬とを、ＴＧａｓｅの存在下、連結試薬を介して前記対象の部分（Ｚ）に連結された受容体グルタミンを含む抗体を得るために十分な条件下で反応させるステップであって、（Ｚ）が疎水性化合物、荷電有機化合物および／または少なくとも５００、７００もしくは８００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する有機化合物であるステップと
を含む。任意選択で、前記抗体は、Ｎ２９７Ｑ置換およびＱ２９５Ｘ置換を含むヒト重鎖および軽鎖定常領域を含み、Ｘはグルタミン以外の任意のアミノ酸である。任意選択で、Ｘは、セリン、アラニン、グリシンまたはスレオニンである。任意選択で、Ｘはアスパラギンである。任意選択で、式ＩＶａまたはＩＶｂの抗体または組成物が得られる。任意選択で、有機溶媒（例えば、有機溶媒、極性溶媒、非極性溶媒、ＤＭＳＯ）は反応混合物中に存在しないか、あるいは１０％（ｖ／ｖ）未満、任意選択でさらに５％、４％、３％または２％（ｖ／ｖ）未満で存在する。
【００２１】
一実施形態では、疎水性、高分子量または荷電有機化合物を抗体に結合するための方法が提供され、本方法は、
ａ）グルタミン残基ドメインを（例えば、重鎖定常領域内、例えば位置２９５および／または２９７において）含む抗体または抗体断片を提供するステップと、
ｂ）前記抗体と、対象の部分（Ｚ）を含む連結試薬とを、ＴＧａｓｅの存在下、連結試薬を介して前記対象の部分（Ｚ）に連結された受容体グルタミンを含む抗体を得るために十分な条件下で反応させるステップであって、（Ｚ）が疎水性化合物、荷電有機化合物および／または少なくとも５００、７００もしくは８００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する有機化合物であり、反応混合物が有機溶媒を含まないか、あるいは１０％（ｖ／ｖ）未満、任意選択でさらに５％、４％、３％または２％（ｖ／ｖ）未満の有機溶媒を含有するステップと
を含む。任意選択で、前記抗体は、Ｎ２９７Ｑ置換およびＱ２９５Ｘ置換を含むヒト重鎖および軽鎖定常領域を含み、Ｘはグルタミン以外の任意のアミノ酸である。任意選択で、Ｘは、セリン、アラニン、グリシンまたはスレオニンである。任意選択で、Ｘはアスパラギンである。任意選択で、式ＩＶａまたはＩＶｂの抗体または組成物が得られる。
【００２２】
本開示は、一実施形態では、対象の部分（Ｚ）を抗体に結合するための方法に関し、本方法は、
ａ）重鎖の位置２９７（ＥＵ番号付け）に機能化受容体グルタミン残基を含み、位置２９５（ＥＵ番号付け）の受容体グルタミンが欠けた抗体または抗体断片を提供するステップと、
ｂ）前記抗体と、４０モル当量以下、任意選択で２０モル当量以下の、対象の部分（Ｚ）または反応基（Ｒ）を含む連結試薬とを、ＴＧａｓｅの存在下、連結試薬を介して前記対象の部分（Ｚ）または反応基（Ｒ）に連結された受容体グルタミンを含む抗体を得るために十分な条件下で反応させるステップと
を含む。任意選択で、前記抗体はＮ２９７Ｑ置換およびＱ２９５Ｘ置換を含み、Ｘはグルタミン以外の任意のアミノ酸であり、任意選択でＸは保存的な置換である。任意選択で、Ｘは、セリン、アラニン、グリシンまたはスレオニンである。任意選択で、Ｘはアスパラギンである。任意選択で、対象の部分（Ｚ）を含む連結試薬は式Ｉａの化合物である。任意選択で、反応基（Ｒ）を含む連結試薬は、式ＩｂまたはＩｃの化合物である。任意選択で、式ＩＶａまたはＩＶｂの抗体または組成物が得られる。
【００２３】
一実施形態では、連結試薬は対象の部分（Ｚ）を含み、Ｚは疎水性または荷電有機化合物であり、そして／あるいは少なくとも４００、５００、７００または８００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する有機化合物である。一実施形態では、連結試薬は、保護または非保護反応基（Ｒ）を含む。任意選択で、ステップ（ｂ）において、連結試薬、任意選択で、対象の部分（Ｚ）を含む連結試薬は、８０、４０、２０、１０、５、４、または３モル当量未満の量で抗体に提供される。一実施形態では、抗体は２つの受容体グルタミンを含み、対象の部分（Ｚ）を含む連結試薬は４０当量未満の量で抗体に提供され、任意選択で、２０〜４０当量の間または２０〜７５当量の間の量で抗体に提供される。一実施形態では、連結試薬は反応基（Ｒ）を含む。任意選択で、（例えば、本開示の多段階方法において）、対象の部分（Ｒ）を含む連結試薬は２〜４０モル当量の間または２〜２０モル当量の間の量で抗体に提供され、任意選択で、抗体は２つの受容体グルタミンを含む。任意選択で、対象の部分（Ｒ）を含む連結試薬は、４〜４０モル当量の間または４〜２０モル当量の間の量で抗体に提供され、任意選択で、抗体は４つの受容体グルタミンを含む。
【００２４】
従って、＋２位置において非アスパラギン酸残基によって隣接された受容体グルタミン残基を含む抗体もしくは抗体断片、またはＱ２９５Ｘ置換（ここで、ＸはＱ以外のアミノ酸である）およびＮ２９７Ｑ置換を含む抗体もしくは抗体断片が提供され、いずれの抗体の受容体グルタミン残基も、任意選択で連結試薬を介して、対象の部分を含む化合物によって機能化される。任意選択で、対象の部分は、ペプチド、ポリペプチド、有機化合物、薬物動態学的特性を改善する対象の部分、治療的部分または診断的部分である。任意選択で、対象の部分は疎水性または荷電有機化合物であり、そして／あるいは少なくとも４００、５００、７００または８００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する有機化合物である。任意選択で、＋２位置の残基は非アスパラギン酸残基である。一実施形態では、＋２位置の残基は非アスパラギン酸、非グルタミン残基である。一実施形態では、＋２位置の残基は非アスパラギン酸、非アスパラギン残基である。一実施形態では、＋２位置の残基は、非負荷電アミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸以外のアミノ酸）である。任意選択で、受容体グルタミンは抗体重鎖のＦｃドメイン内にあり、任意選択でさらにＣＨ２ドメイン内にある。任意選択で、抗体は重鎖Ｎ２９７連結グリコシル化を含まない。任意選択で、受容体グルタミンは位置２９５にあり、＋２位置の残基は、抗体重鎖の位置２９７（ＥＵインデックス番号付け）の残基である。任意選択で、受容体グルタミンは位置２９７にあり、＋２位置の残基は、抗体重鎖の位置２９９（ＥＵインデックス番号付け）の残基である。任意選択で、前記対象の部分はＮＨ−（Ｃ）ｎ基を含むリンカーを介して受容体グルタミン残基に共有結合され、ここで、（Ｃ）ｎは置換または非置換炭素鎖であり、この鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドによって任意選択で置換される、ｎは、２〜２００、任意選択で２〜１００、任意選択で２〜５０、任意選択で２〜２０の範囲の中からの整数である。
【００２５】
本開示は対象の部分（Ｚ）を抗体に結合するための方法に関し、本方法は、
ａ）カップリング酵素、例えばトランスアミダーゼの存在下で連結試薬（リンカー）と反応する少なくとも１つの受容体アミノ酸残基（例えば、天然に存在するアミノ酸）を（例えば、定常領域の一次配列内に）有する抗体を提供するステップと、
ｂ）前記抗体と、反応基（Ｒ）、任意選択で保護反応基または任意選択で非保護反応基を含む連結試薬（例えば、第１級アミンを含むリンカー）とを、受容体アミノ酸残基と連結試薬（Ｒ部分以外において）との間に共有結合の形成を引き起こすことが可能な酵素の存在下、連結試薬を介して反応基（Ｒ）に連結（共有結合）された受容体アミノ酸残基を含む抗体を得るために十分な条件下で反応させるステップと、
を含む。任意選択で、抗体または抗体断片の前記受容体残基は、＋２位置において非アスパラギン酸残基によって隣接されている。任意選択で、＋２位置の残基は非アスパラギン酸残基である。一実施形態では、＋２位置の残基は非アスパラギン酸、非グルタミン残基である。一実施形態では、＋２位置の残基は非アスパラギン酸、非アスパラギン残基である。一実施形態では、＋２位置の残基は、非負荷電アミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸以外のアミノ酸）である。任意選択で、受容体グルタミンは抗体重鎖のＦｃドメイン内にあり、任意選択でさらにＣＨ２ドメイン内にある。任意選択で、抗体は重鎖Ｎ２９７連結グリコシル化を含まない。任意選択で、受容体グルタミンは位置２９５にあり、＋２位置の残基は、抗体重鎖の位置２９７（ＥＵインデックス番号付け）の残基である。
【００２６】
１つの態様では、本開示は対象の部分（Ｚ）を抗体に結合するための方法に関し、本方法は、
ａ）＋２位置において非アスパラギン酸残基によって隣接された少なくとも１つの受容体グルタミン残基を有する抗体を提供するステップと、
ｂ）前記抗体と、反応基（Ｒ）を含む第１級アミンを含むリンカー（リシンベースのリンカー）とを、ＴＧａｓｅの存在下、前記リンカーを介して反応基（Ｒ）に連結（共有結合）された受容体グルタミンを含む抗体を得るために十分な条件下で反応させるステップと
を含む。任意選択で、抗体はヒト重鎖および軽鎖定常領域を有し、重鎖は残基２９５および／または２９７にグルタミンを含む。任意選択で、＋２位置の残基は非アスパラギン酸残基である。一実施形態では、＋２位置の残基は非アスパラギン酸、非グルタミン残基である。一実施形態では、＋２位置の残基は非アスパラギン酸、非アスパラギン残基である。一実施形態では、＋２位置の残基は、非負荷電アミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸以外のアミノ酸）である。任意選択で、受容体グルタミンは抗体重鎖のＦｃドメイン内にあり、任意選択でさらにＣＨ２ドメイン内にある。任意選択で、抗体は重鎖Ｎ２９７連結グリコシル化を含まない。任意選択で、受容体グルタミンは位置２９５にあり、＋２位置の残基は、抗体重鎖の位置２９７（ＥＵインデックス番号付け）の残基である。
【００２７】
１つの態様では、本開示は対象の部分（Ｚ）を抗体に結合するための方法に関し、本方法は、
ａ）ヒト重鎖および軽鎖定常領域を有する抗体を提供するステップであって、重鎖が、残基２９５のグルタミンおよびＮ２９７Ｘ突然変異を含み、Ｘがアラニン、セリンまたはアルギニンからなる群から選択されるステップと、
ｂ）前記抗体と、反応基（Ｒ）を含む第１級アミンを含むリンカー（リシンベースのリンカー）とを、ＴＧａｓｅの存在下、前記リンカーを介して反応基（Ｒ）に連結（共有結合）された受容体グルタミンを含む抗体を得るために十分な条件下で反応させるステップと
を含む。
【００２８】
１つの態様では、本開示は、疎水性、高分子量および／または荷電有機化合物を抗体に結合するための方法に関し、本方法は、
ａ）少なくとも１つの受容体グルタミン残基を有する抗体を提供するステップと、
ｂ）前記抗体と、反応基（Ｒ）を含む第１級アミンを含むリンカー（リシンベースのリンカー）とを、ＴＧａｓｅの存在下、前記リンカーを介して反応基（Ｒ）に連結（共有結合）された受容体グルタミンを含む抗体を得るために十分な条件下で反応させるステップであって、反応混合物が有機溶媒を含まないか、あるいは１０％（ｖ／ｖ）未満の有機溶媒を含有するか、あるいは５％、４％、３％または２％（ｖ／ｖ）未満の有機溶媒を含有するステップと、
（ｃ）有機溶媒（例えば、少なくとも２％、３％、４％、５％または１０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒）の存在下、
（ｉ）第１級アミンを含むリンカー（リシンベースのリンカー）を介して反応基（Ｒ）に連結された受容体グルタミンを含むステップ（ｂ）の抗体と、
（ｉｉ）疎水性、高分子量および／または荷電有機化合物、ならびに反応基Ｒと反応することができる反応基（Ｒ’）を含む化合物と
を、第１級アミンを含むリンカー（リシンベースのリンカー）を介して対象の部分（Ｚ）に連結された受容体グルタミンを含む抗体を得るために十分な条件下で反応させるステップと
を含む。
【００２９】
任意選択で、抗体または抗体断片の前記受容体グルタミン残基は、＋２位置において非アスパラギン酸残基によって隣接されている。任意選択で、＋２位置の残基は非アスパラギン酸残基である。一実施形態では、＋２位置の残基は非アスパラギン酸、非グルタミン残基である。一実施形態では、＋２位置の残基は非アスパラギン酸、非アスパラギン残基である。一実施形態では、＋２位置の残基は、非負荷電アミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸以外のアミノ酸）である。任意選択で、受容体グルタミンは抗体重鎖のＦｃドメイン内にあり、任意選択でさらにＣＨ２ドメイン内にある。任意選択で、抗体は重鎖Ｎ２９７連結グリコシル化を含まない。任意選択で、受容体グルタミンは位置２９５にあり、＋２位置の残基は、抗体重鎖の位置２９７（ＥＵインデックス番号付け）の残基である。任意選択で、受容体グルタミンは位置２９７にあり、抗体はＱ２９５Ｘ突然変異を含み、Ｘは任意のアミノ酸である。
【００３０】
第１級アミンを含むリンカー（リシンベースのリンカー）を介して反応基（Ｒ）に連結された受容体残基または受容体グルタミン残基を含む抗体はその後、対象の部分（Ｚ）を含む反応パートナーと反応されて、リンカーを介して対象の部分（Ｚ）に連結された受容体残基または受容体グルタミン残基を含む抗体を生じることができる。従って、一実施形態では、本方法はさらに、（ｃ）（ｉ）任意選択で固体担体に固定化された、第１級アミンを含むリンカー（リシンベースのリンカー）を介して反応基（Ｒ）に連結された受容体グルタミンを含むステップｂ）の抗体と、（ｉｉ）対象の部分（Ｚ）、および反応基Ｒと反応することができる反応基（Ｒ’）を含む化合物とを、第１級アミンを含むリンカー（リシンベースのリンカー）を介して対象の部分（Ｚ）に連結された受容体グルタミンを含む抗体を得るために十分な条件下で反応させるステップを含む。好ましくは、対象の部分（Ｚ）、および反応基Ｒと反応することができる反応基（Ｒ’）を含む前記化合物は、８０倍、４０倍、２０倍、１０倍、５倍または４モル当量未満で抗体に提供される。一実施形態では、抗体は２つの受容体グルタミンを含み、対象の部分（Ｚ）および反応基（Ｒ’）を含む化合物は、１０モル当量未満で抗体に提供される。一実施形態では、抗体は２つの受容体グルタミンを含み、対象の部分（Ｚ）および反応基（Ｒ’）を含む化合物は、５モル当量未満で抗体に提供される。一実施形態では、抗体は４つの受容体グルタミンを含み、対象の部分（Ｚ）および反応基（Ｒ’）を含む化合物は、２０モル当量未満で抗体に提供される。一実施形態では、抗体は４つの受容体グルタミンを含み、対象の部分（Ｚ）および反応基（Ｒ’）を含む化合物は、１０モル当量未満で抗体に提供される。一実施形態では、ステップ（ｂ）および／または（ｃ）は、水性条件下で実行される。任意選択で、ステップ（ｃ）は、式ＩＩの機能化受容体グルタミン残基を含む抗体のサンプルを固体担体に固定化して、固定化抗体を含むサンプルを提供することと、固定化抗体を含むサンプルを式ＩＩＩの化合物と反応させることと、任意選択で、任意の未反応化合物を回収して、このような回収された化合物を固定化抗体との反応のために固体担体へ再導入することと、抗体結合体を溶出させて、Ｚ部分を含む式ＩＶｂの抗体組成物を提供することとを含む。
【００３１】
本開示は、特に、対象の部分（Ｚ）を抗体に結合するための本開示の方法から得られる抗体１つ当たりの結合体数分布が狭い組成物を提供する。このような組成物は、ヒトの治療のために有利である。特に、１つの態様では、本開示は、抗体１つ当たりの結合体数の十分に画定された分布、特に狭い薬物−抗体比（ＤＡＲ）分布を有する抗体組成物（例えば、複数の四量体全長抗体の組成物）を提供する。特に、本方法は、実質的に完全な抗体の結合を可能にする。１つの態様では、本開示は、組成物中の抗体の大部分（例えば、抗体の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％）が、リンカー（例えば、式Ｉａ、ＩｂまたはＩｃのリンカー）を介して各重鎖の１つまたは２つの受容体グルタミンに結合された少なくとも１つの対象の部分を含む組成物を提供し、本組成物は、抗体１つ当たりの結合体の平均数（例えば、平均ＤＡＲ）の２倍よりも大きい、任意選択で１．５倍よりも大きいいくつかの対象の部分を含む抗体を実質的に含まない。本開示は、組成物中の抗体の大部分（例えば、抗体の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％）が、リンカーを介して重鎖内の受容体グルタミンに結合された少なくとも１つの対象の部分を含む組成物を提供し、本開示の組成物は、好ましくは、結合された軽鎖を有する抗体も含まない。例えば、本開示は、対象の部分（Ｚ）に共有結合した四量体抗体の組成物を提供し、本組成物は、２に近い（例えば、１．５〜２．０の間、または１．７〜２．０の間、１．８〜２．０の間、または１．９〜２．０の間の）平均ＤＡＲによって特徴付けられ、本組成物は、抗体１つ当たり２つを超える対象の部分を有する抗体を実質的に含まない。別の例では、本開示は、対象の部分（Ｚ）に共有結合した四量体抗体の組成物を提供し、本組成物は、４に近い（例えば、３．０〜４．０の間、または３．４〜４．０の間、または３．６〜４．０の間の）平均ＤＡＲによって特徴付けられ、本組成物は、抗体１つ当たり４つを超える対象の部分を有する抗体を実質的に含まない。任意選択で、組成物中の抗体または抗体断片の前記受容体グルタミン残基は、＋２位置において非アスパラギン酸残基によって隣接されている。任意選択で、＋２位置の残基は非アスパラギン酸残基である。一実施形態では、＋２位置の残基は非アスパラギン酸、非グルタミン残基である。一実施形態では、＋２位置の残基は非アスパラギン酸、非アスパラギン残基である。一実施形態では、＋２位置の残基は、非負荷電アミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸以外のアミノ酸）である。任意選択で、受容体グルタミンは抗体重鎖のＦｃドメイン内にあり、任意選択でさらにＣＨ２ドメイン内にある。任意選択で、抗体は重鎖Ｎ２９７連結グリコシル化を含まない。任意選択で、受容体グルタミンは位置２９５にあり、＋２位置の残基は、抗体重鎖の位置２９７（ＥＵインデックス番号付け）の残基である。
【００３２】
本開示の方法は、特定の出発抗体を考慮して、様々な薬物、スペーサーおよび／またはリンカーを迅速にスクリーニングする方法も提供する。本アプローチは均質な抗体を提供するのでこのような比較が可能になり、薬物化学量論は製造プロセスにおける利点を有するだけでなく、異なるリンカーおよび／または薬物の組み合わせによって機能化された抗体間での生物学的（例えば、細胞毒性）活性の直接的な比較も可能にする。
【００３３】
本技術はさらに、現在利用可能な方法と比較してより少量の基質（例えば、結合させる薬物または他の部分）が使用され得るという経済的利益を含む、改善された製造プロセスを提供する。特に、わずか２０、１０、５、４、３または２当量の対象の部分を使用することが可能であり、従って抗体は、薬物などの高価な試薬の節約を提供するであろう。
【００３４】
基質の量の減少は、より低濃度の薬物の使用を可能にし、これ次に、疎水性または他の水溶性に乏しい薬物に対してより低濃度の溶媒の使用を可能にするという点でも価値がある。従って、本技術はさらに、水性条件または低有機溶媒濃度（または実質的に有機溶媒負を含まない）条件下で、部分による抗体の機能化ためのプロセスを提供する。より高濃度での溶解のために有機溶媒を必要とする特定の薬物（例えば、疎水性薬物）は、本開示を用いて、実質的に有機溶媒を存在させずにカップリングされ得るので、本明細書中の実施形態のいずれかにおいて、本開示は、実質的に有機溶媒を含まない、そして／あるいは水性緩衝液（例えば、２０％、１０％、５％またはそれ以下の有機溶媒、例えばＤＭＳＯを含有する）における、薬物（例えば、疎水性薬物）によって機能化された抗体組成物（例えば、製造または生物学的中間体）を提供する。
【００３５】
図２６および図２７で実証されるように、ＴＧａｓｅカップリング反応混合物中の１０％を超える有機溶媒の存在は、ＣＨ２ドメインのアミノ酸へのカップリングためのＴＧａｓｅの活性を強く阻害する。一実施形態において、本開示の方法のいずれかは、水性緩衝液（例えば、実質的に有機溶媒を含ない、例えば、２０％、１０％、５％またはそれ以下の溶媒を含有し、例えば０．０１〜１０％の間の有機溶媒、例えば０．０１〜１０％の間のＤＭＳＯを含有する）中で実施される。本開示の方法のいずれかの一実施形態では、ＴＧａｓｅは、少なくとも２Ｕ／ｍｌ、４Ｕ／ｍｌ、または少なくとも６Ｕ／ｍｌ、または任意選択で２、４、５または６Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌの間、または任意選択で２、４、５または６Ｕ／ｍｌ〜２０Ｕ／ｍｌの間、または任意選択で２、４、５または６Ｕ／ｍｌ〜１２Ｕ／ｍｌの間、または任意選択で２、４、５または６Ｕ／ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌの間、または任意選択で２または４Ｕ／ｍｌ〜６Ｕ／ｍｌの間の濃度で提供される。本開示の方法のいずれかの一実施形態では、ＴＧａｓｅ介在性の反応は、中性ｐＨ（約ｐＨ７．４）で実行される。本開示の方法のいずれかの一実施形態では、ＴＧａｓｅ介在性の反応は約３７℃で実行される。
【００３６】
本技術はさらに、大きい、荷電または疎水性の対象の部分による完全な機能化を達成するための改善された製造プロセスを提供する。本開示の方法のいずれかの一実施形態では、ＴＧａｓｅ介在性の反応（例えば、本明細書に記載される方法のＴＧａｓｅ反応ステップ）は、４８時間未満、任意選択で２４時間未満、任意選択で２〜１８時間の間、２〜２４時間の間、２〜１８時間の間または４〜１８時間の間、任意選択で約３７℃において実行される。
【００３７】
本開示の特定の態様は、抗体（Ａｂ）の配列内のグルタミン残基（Ｑ）においてＴＧａｓｅの作用によってポリペプチドに取り付けることができる連結試薬に関する。連結試薬は、少なくとも１つの反応基（Ｒ）または対象の部分（Ｚ）に接続されるリシン誘導体（Ｌｙｓ）またはその機能的等価物を含む。リシン誘導体（Ｌｙｓ）または機能的等価物は一般的に、例えば、アルキルアミン、オキソアミンを含む、ＴＧａｓｅのための基質である任意の第１級アミン鎖を含むことができる。一実施形態では、複数の反応基、好ましくは非相補的反応基を連結試薬に取り付けることができる。反応基は、好ましくは、水に対して非感受性であるが、相補的試薬による非常に高転換の付加反応を選択的に受ける官能性である。リシン誘導体の機能的等価物は、２〜２０個の炭素鎖、またはＨ２ＮもしくはＨ２ＮＣＨ２（アミノメチレン）基を有するその機能的等価物、または炭素鎖の１つまたは複数の末端に位置するＨ２Ｎもしくはアミノメチレンから誘導可能な保護Ｈ２ＮもしくはＨ２ＮＣＨ２基を含み得る。炭素鎖の機能的等価物は３〜２０個の原子の鎖を含むことができ、ここで、第１級アミン以外の原子の１つまたは複数は炭素以外であってもよく、例えば、酸素、硫黄、窒素、または他の原子でよく、例えば、炭素鎖の１つまたは複数の末端に位置するＨ２ＮＯＣＨ２基、または保護Ｈ２ＮＯＣＨ２基を有し得る。酸素、硫黄、または窒素原子は、炭素鎖内のエーテル、エステル、チオエーテル、チオエステル、アミノ、アルキルアミノ、アミドまたはアルキルアミド官能性のものであり得る。
【００３８】
炭素鎖の１つの例示的な機能的等価物は、オリゴ（エチレンオキシド）鎖である。炭素鎖内の官能性は、反応基をＨ２ＮＨ２ＮＯＣＨ２もしくはＨ２ＮＣＨ２基または保護Ｈ２Ｎ、Ｈ２ＮＯＣＨ２もしくはＨ２ＮＣＨ２基にカップリングさせるために含有され得る。炭素鎖、またはその機能的等価物は置換または非置換であり得る。置換基は、アルキル基、アリール基、アルキルアリール基、カルボン酸基、アミド基、ヒドロキシ基、またはタンパク質のグルタミン残基との結合に対してアミノ基と競合しない、あるいは阻害しない任意の他の基であり得る。通常、置換基が存在する場合、その存在は、リシン誘導体をもたらすリシンのカルボン酸基などの便利な出発材料内にある。炭素鎖または機能的等価物の末端のアミンは、必然的に連結試薬内に含まれる。
【００３９】
リシンの機能的等価物のための出発材料の例は、α，ω−ジアミノアルカン、例えば、１，２−ジアミノエタン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン、１，８−ジアミノオクタン、１，９−ジアミノノナン、１，１０−ジアミノデカン、１，１１−ジアミノウンデカン、または１，１２−ジアミノドデカンであり得る。リシン誘導体の機能的等価物のための他の出発材料は、α，ω−ジアミノオリゴ（エチレンオキシド）、例えば、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２（式中、ｘは１〜６の範囲の中から選択される整数である）であり得る。α，ω−ジアミノオリゴ（エチレンオキシド）は単一のオリゴマーであってもよいし、あるいはオリゴマーの混合物であってもよく、この場合、ｘは平均サイズを定義する。例示的な保護Ｈ２ＮＣＨ２は、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（５−アミノペンチル）カルバマートのｔｅｒｔ−ブチルカルバマート保護アミン（Ｎ−Ｂｏｃ−カダベリン）である。
【００４０】
抗体に対する対象の部分（Ｚ）の直接（１段階）連結のために使用される連結試薬は、有利に、大きい、荷電または疎水性の対象の有機部分（Ｚ）を受容体グルタミンから遠ざけるためのスペーサーとしての役割を果たす要素を含み得る。スペーサーは、リシン誘導体またはその機能的等価物内で実施されてもよいし、あるいはリンカーのさらなる要素（例えば、Ｌ、Ｖおよび／またはＹ基）内で実施されてもよい。一実施形態では、スペーサーとしての役割を果たす要素は、構造ＮＨ−（Ｃ）ｎ−を有するリシン誘導体（Ｌｙｓ）またはその機能的等価物であり、式中、（Ｃ）ｎは置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、この鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドによって任意選択で置換され、ｎは１０よりも大きい整数、任意選択で１０〜２０の範囲の中からの整数である。一実施形態では、連結試薬は、スペーサーとしての役割を果たし、ＮＨ−（Ｃ）ｎ−基と対象の部分（Ｚ）との間に位置するＬ、Ｖおよび／またはＹ基を含む。ここで、Ｌは、１つまたは複数の原子において置換された１〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、任意選択で、炭素含有フレームワークは、線状炭化水素、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、グリカン、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、アミノ酸残基、ジペプチド、トリペプチドもしくはオリゴペプチド、または例えば任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる任意の二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）であり、Ｖは、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、任意選択で、事前の条件的変換に続いて、化学的、光化学的、物理的、生物学的、または酵素的プロセスによって切断または変換され得る（例えば、Ｖの切断は、後でまたは最終的にＶに連結される１つまたは複数の部分、例えばＺ部分の放出を最終的にもたらす）。いくつかの実施形態では、Ｖは、「Ｖ部分」という表題の以下のセクションに記載されるように、好ましくは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、またはオリゴペプチドであり、Ｙは、１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系（例えば、自己脱離性（ｓｅｌｆ−ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ）スペーサー系または非自己脱離スペーサー系）である。
【００４１】
一実施形態では、機能化受容体グルタミン残基を含む抗体または抗体断片が提供され、前記受容体グルタミン残基は、＋２位置において非アスパラギン酸残基によって隣接されており、機能化受容体グルタミン残基は、式ＩＶａ
（Ｑ）−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｚ）ｚ）ｑ）ｒ      式ＩＶａ
を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物であり、式中、
Ｑは抗体または抗体断片中に存在するグルタミン残基であり、
（Ｃ）ｎは置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、任意選択で、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドによって置換され、
ｎは、２〜２０の範囲の中から選択される整数であり、
ＸはＮＨ、Ｏ、Ｓであるか、存在しないか、または結合であり、
Ｌは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数の原子において置換された５〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、任意選択で、炭素含有フレームワークは、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された５〜３０個の炭素原子の線状フレームワークを含み、任意選択で、炭素含有フレームワークは、線状炭化水素、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、または任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）であり、
ｒは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｑは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｚは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
Ｖは独立して、存在しないか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、
Ｙは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系であり、
Ｚは、薬物動態学的特性を改善する部分、治療的部分または診断的部分である。
【００４２】
一実施形態では、前記受容体グルタミン残基は、＋２位置においてグルタミン以外の非アスパラギン酸残基によって隣接されており、任意選択で、前記受容体グルタミン残基は、＋２位置においてアラニン、ヒスチジンまたはセリンによって隣接されている。一実施形態では、前記受容体グルタミン残基は、位置＋２において正荷電側鎖を有するアミノ酸残基によって隣接されている。一実施形態では、前記受容体グルタミン残基は、位置＋２においてアルギニン残基によって隣接されている。一実施形態では、前記受容体グルタミン残基は、−１位置〜−４位置の任意の１つまたは複数において負荷電側鎖を有するアミノ酸残基によって隣接されている。一実施形態では、前記受容体グルタミン残基は、−１位置においてグルタミン酸残基によって隣接されている。一実施形態では、Ｚは、荷電有機化合物、疎水性有機化合物、および／または少なくとも４００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する有機化合物である。
【００４３】
一実施形態では、重鎖の位置２９７（ＥＵ番号付け）に機能化受容体グルタミン残基を含み、位置２９５（ＥＵ番号付け）の受容体グルタミンが欠けた抗体または抗体断片が提供され、機能化受容体グルタミン残基は、式ＩＶａ
（Ｑ）−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｚ）ｚ）ｑ）ｒ      式ＩＶａ
を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物であり、式中、
Ｑは抗体または抗体断片中に存在するグルタミン残基であり、
（Ｃ）ｎは置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、任意選択で、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドによって置換され、
ｎは、２〜２０の範囲の中から選択される整数であり、
ＸはＮＨ、Ｏ、Ｓであるか、存在しないか、または結合であり、
Ｌは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数の原子において置換された５〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、任意選択で、炭素含有フレームワークは、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された５〜３０個の炭素原子の線状フレームワークを含み、任意選択で、炭素含有フレームワークは、線状炭化水素、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、または任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）であり、
ｒは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｑは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｚは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
Ｖは独立して、存在しないか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、
Ｙは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系であり、
Ｚは薬物動態学的特性を改善する部分、治療的部分または診断的部分であり、ここで、Ｚは、電気的に負荷電の有機化合物、疎水性有機化合物、および／または少なくとも４００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する有機化合物である。
【００４４】
一実施形態では、抗体は、前記位置２９５にアスパラギン以外のアミノ酸を有する。一実施形態では、抗体は、前記位置２９５にセリン、アラニン、グリシンまたはスレオニン残基を有する。
【００４５】
一実施形態では、機能化受容体グルタミン残基を含む抗体または抗体断片が提供され、機能化受容体グルタミン残基は、式ＩＶａ
（Ｑ）−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｚ）ｚ）ｑ）ｒ      式ＩＶａ
を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物であり、式中、
Ｑは、抗体または抗体断片内に存在するグルタミン残基であり、
（Ｃ）ｎは置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、任意選択で、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドによって置換され、
ｎは、２〜２０の範囲の中から選択される整数であり、
ＸはＮＨ、Ｏ、Ｓであるか、存在しないか、または結合であり、
Ｌは、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された５〜３０個の炭素原子の線状フレームワークを含み、
ここで、ｎ、ＸおよびＬは、−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌが合わせて、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された１０〜３０個の原子、任意選択で１０〜３０個の炭素原子の線状フレームワークを含むように選択され、
ｒは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｑは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｚは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
Ｖは条件的に切断可能な部分であり、
Ｙは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系であり、
Ｚは薬物動態学的特性を改善する部分、治療的部分または診断的部分であり、ここで、Ｚは、電気的に負荷電の有機化合物、疎水性有機化合物、および／または少なくとも４００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する有機化合物である。
【００４６】
一実施形態では、機能化受容体グルタミン残基を含む抗体または抗体断片が提供され、機能化受容体グルタミン残基は、式ＩＶａ
（Ｑ）−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｚ）ｚ）ｑ）ｒ      式ＩＶａ
を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物であり、式中、
Ｑは、抗体または抗体断片の重鎖定常領域内に存在するグルタミン残基であり、
（Ｃ）ｎは置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、任意選択で、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドによって置換され、
ｎは、２〜２０の範囲の中から選択される整数であり、
ＸはＮＨ、Ｏ、Ｓであるか、存在しないか、または結合であり、
Ｌは、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された５〜３０個の炭素原子の線状フレームワークを含み、
ｒは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｑは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｚは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
Ｖは独立して、存在しないか、結合または結合の連続であるか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、
Ｙは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系であり、
Ｚは薬物動態学的特性を改善する部分、治療的部分または診断的部分であり、ここで、Ｚは、電気的に負荷電の有機化合物、疎水性有機化合物、および／または少なくとも４００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する有機化合物である。
【００４７】
本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、ｎ、ＸおよびＬは、−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌが合わせて、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された１０〜３０個の原子、任意選択で１０〜３０個の炭素原子の線状フレームワークを含むように選択され得る。
【００４８】
本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、（Ｃ）ｎは、Ｃ２〜５アルキル、任意選択で線状Ｃ２〜５アルキルを含む。本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、（Ｃ）ｎは、Ｃ５〜１０アルキル、任意選択で線状Ｃ５〜１０アルキルを含む。本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、（Ｃ）ｎは、Ｃ１１〜２０アルキル、任意選択で線状Ｃ１１〜２０アルキルを含む。本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、（Ｃ）ｎは（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ基を含み、ここで、ｎは２〜１０の範囲の中から選択される整数である。本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、Ｌは（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｘ基を含み、ここで、ｘは２〜１０の範囲の中から選択される整数である。本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、ＬはＣ２〜５アルキルを含む。本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、ＬはＣ５〜１０アルキルを含む。
【００４９】
本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、基−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ−は合わせて、構造（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｘを含み、ここで、ｘは４〜１０の範囲の中からの整数である。
【００５０】
本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、機能化受容体グルタミン残基は、構造：
【化１】
0006744212.tif 000002
を有する。
【００５１】
一実施形態では、機能化受容体グルタミン残基を含む抗体または抗体断片が提供され、前記受容体グルタミン残基は、＋２位置において非アスパラギン酸残基によって隣接されており、機能化受容体グルタミン残基は、式ＩＩ：
（Ｑ）−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｒ）ｚ）ｑ）ｒ      式ＩＩ
を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物であり、式中、
Ｑは抗体または抗体断片中に存在するグルタミン残基であり、
（Ｃ）ｎは置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、任意選択で、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドによって任意選択で置換され、
ｎは２〜２０の範囲の中からの整数であり、
ＸはＮＨ、Ｏ、Ｓであるか、存在しないか、または結合であり、
Ｌは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数の原子において置換された１〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、任意選択で、炭素含有フレームワークは、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された３〜３０個の炭素原子の線状フレームワークを含み、任意選択で、炭素含有フレームワークは、線状炭化水素、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、または任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）であり、
ｒは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｑは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｚは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
Ｖは独立して、存在しないか、結合または結合の連続であるか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、
Ｙは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系であり、
Ｒは反応性部分である。
【００５２】
一実施形態では、機能化受容体グルタミン残基を含む抗体または抗体断片が提供され、前記受容体グルタミン残基は、＋２位置において非アスパラギン酸残基によって隣接されており、機能化受容体グルタミン残基は、式ＩＶｂ
（Ｑ）−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｍ）ｚ）ｑ）ｒ      式ＩＶｂ
を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物であり、式中、
Ｑは抗体または抗体断片中に存在するグルタミン残基であり、
（Ｃ）ｎは置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、任意選択で、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドによって置換され、
ｎは、２〜２０の範囲の中から選択される整数であり、
ＸはＮＨ、Ｏ、Ｓであるか、存在しないか、または結合であり、
Ｌは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つまたは複数の原子において置換された１〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、任意選択で、炭素含有フレームワークは、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された３〜３０個の炭素原子の線状フレームワークを含み、任意選択で、炭素含有フレームワークは、線状炭化水素、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、または任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）であり、
ｒは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｑは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｚは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
Ｖは独立して、存在しないか、結合または結合の連続であるか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、
Ｙは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系であり、
Ｍは独立して、Ｒまたは（ＲＲ’）−Ｌ’−（Ｖ’−（Ｙ’−（Ｚ）ｚ’）ｑ’）ｒ’であり、
Ｒは反応性部分であり、
（ＲＲ’）は、Ｒと、相補的反応性部分Ｒ’との付加生成物であり、
Ｌ’は独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数の原子において置換された１〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、任意選択で、炭素含有フレームワークは、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された３〜３０個の炭素原子の線状フレームワークを含み、任意選択で、炭素含有フレームワークは、線状炭化水素、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、または任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）であり、
Ｖ’は独立して、存在しないか、結合または結合の連続であるか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、
Ｙ’は独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系であり、
Ｚは独立して、反応基、薬物動態学的特性を改善する部分、治療的または診断的部分であり、各ＺはＹに直接カップリングされるか、またはＹが存在しない場合にはＶに直接カップリングされるか、またはＹおよびＶがいずれも存在しない場合はＬに直接カップリングされ、
ｚ’、ｑ’およびｒ’はそれぞれ独立して、１、２、３または４の中から選択される整数である。
【００５３】
本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、前記受容体グルタミン残基は、位置＋２において正荷電側鎖を有するアミノ酸残基によって隣接されている。任意選択で、前記受容体グルタミン残基は、位置＋２においてアルギニン残基によって隣接されている。
【００５４】
一実施形態では、＋２位置において正荷電側鎖を有するアミノ酸残基によって隣接された受容体グルタミン残基を含む抗体または抗体断片が提供され、受容体グルタミン残基は、第１級アミンを含み、そして対象の部分を含むリンカーによって機能化され、任意選択で、対象の部分は反応基（Ｒ）である。
【００５５】
本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、前記受容体グルタミン残基は、−１位置〜−４位置の任意の１つまたは複数において負荷電側鎖を有するアミノ酸残基によって隣接されており、任意選択で、アミノ酸残基はグルタミン酸またはアスパラギン酸である。
【００５６】
一実施形態では、受容体グルタミン残基は、位置＋２においてアルギニン残基によって隣接されている。
【００５７】
一実施形態では、＋２位置のアミノ酸残基は受容体グルタミンである。
【００５８】
一実施形態では、＋２位置のアミノ酸残基はグルタミンではない。
【００５９】
一実施形態では、前記機能化受容体グルタミン残基は抗体重鎖内にあり、任意選択でＣＨ２ドメイン内にある。
【００６０】
一実施形態では、機能化受容体グルタミン残基は、位置２９５（ＥＵ番号付け）において抗体重鎖内にある。一実施形態では、抗体は、実質的にＮ連結グリコシル化が欠けた残基２９７においてアスパラギンを含む。一実施形態では、抗体は、アミノ酸残基Ｎ２９７においてＮ連結グリコシル化を欠いた抗体を産生する宿主細胞において産生される。
【００６１】
一実施形態では、機能化受容体グルタミン残基は、位置２９７（ＥＵ番号付け）において抗体重鎖内にある。
【００６２】
一実施形態では、抗体はＴ２９９Ｘ置換（ここで、Ｘはスレオニン以外の任意のアミノ酸）を含み、アミノ酸残基Ｎ２９７においてＮ連結グリコシル化の欠乏を生じる。
【００６３】
一実施形態では、重鎖の位置２９７（ＥＵ番号付け）において機能化受容体グルタミン残基を含み、位置２９５（ＥＵ番号付け）の受容体グルタミンが欠けた抗体または抗体断片が提供され、機能化受容体グルタミン残基は、式ＩＩ：
（Ｑ）−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｒ）ｚ）ｑ）ｒ      式ＩＩ
を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物であり、式中、
Ｑは抗体または抗体断片中に存在するグルタミン残基であり、
（Ｃ）ｎは置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、任意選択で、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドによって任意選択で置換され、
ｎは２〜２０の範囲の中からの整数であり、
ＸはＮＨ、Ｏ、Ｓであるか、存在しないか、または結合であり、
Ｌは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数の原子において置換された１〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、任意選択で、炭素含有フレームワークは、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された３〜３０個の炭素原子の線状フレームワークを含み、任意選択で、炭素含有フレームワークは、線状炭化水素、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、または任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）であり、
ｒは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｑは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｚは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
Ｖは独立して、存在しないか、結合または結合の連続であるか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、
Ｙは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系であり、
Ｒは反応性部分である。
【００６４】
一実施形態では、重鎖の位置２９７（ＥＵ番号付け）において機能化受容体グルタミン残基を含み、位置２９５（ＥＵ番号付け）の受容体グルタミンが欠けた抗体または抗体断片が提供され、機能化受容体グルタミン残基は、式ＩＶｂ
（Ｑ）−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｍ）ｚ）ｑ）ｒ      式ＩＶｂ
を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物であり、式中、
Ｑは抗体または抗体断片中に存在するグルタミン残基であり、
（Ｃ）ｎは置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、任意選択で、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドによって置換され、
ｎは、２〜２０の範囲の中から選択される整数であり、
ＸはＮＨ、Ｏ、Ｓであるか、存在しないか、または結合であり、
Ｌは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数の原子において置換された１〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、任意選択で、炭素含有フレームワークは、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された３〜３０個の炭素原子の線状フレームワークを含み、任意選択で、炭素含有フレームワークは、線状炭化水素、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、または任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）であり、
ｒは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｑは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｚは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
Ｖは独立して、存在しないか、結合または結合の連続であるか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、
Ｙは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系であり、
Ｍは独立して、Ｒまたは（ＲＲ’）−Ｌ’−（Ｖ’−（Ｙ’−（Ｚ）ｚ’）ｑ’）ｒ’であり、
Ｒは反応性部分であり、
（ＲＲ’）は、Ｒと、相補的反応性部分Ｒ’との付加生成物であり、
Ｌ’は独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数の原子において置換された１〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、任意選択で、炭素含有フレームワークは、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された３〜３０個の炭素原子の線状フレームワークを含み、任意選択で、炭素含有フレームワークは、線状炭化水素、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、または任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）であり、
Ｖ’は独立して、存在しないか、結合または結合の連続であるか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、
Ｙ’は独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系であり、
Ｚは独立して、反応基、薬物動態学的特性を改善する部分、治療的または診断的部分であり、各ＺはＹに直接カップリングされるか、またはＹが存在しない場合にはＶに直接カップリングされるか、またはＹおよびＶがいずれも存在しない場合はＬに直接カップリングされ、
ｚ’、ｑ’およびｒ’はそれぞれ独立して、１、２、３または４の中から選択される整数である。
【００６５】
本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、抗体はＮ２９７Ｑ置換およびＱ２９５Ｘ置換を含み、ここで、Ｘはグルタミン以外の任意のアミノ酸であり、任意選択でＸは保存的な置換である。任意選択で、Ｘは、セリン、アラニン、グリシンまたはスレオニンである。任意選択で、Ｘはアスパラギンである。
【００６６】
本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、ＲまたはＲ’基は、生体直交型反応に適合性の反応基、例えば、非保護または保護チオール、エポキシド、マレイミド、ハロアセトアミド、ｏ−ホスフェン芳香族（ｐｈｏｓｈｅｎｅａｒｏｍａｔｉｃ）エステル、アジド、フルミナート、スルホン酸エステル、アルキン、シアニド、アミノ−チオール、カルボニル、アルデヒド、オキシムおよびヒドラジンの形成が可能な一般的に任意の基、１，２，４，５−テトラジン、ノルボルネン、その他の染色（ｓｔａｉｎｅｄ）または別の方法で電子的に活性化されたアルケン、置換または非置換シクロアルキン、生体直交型環化付加反応により形成する一般的に任意の反応基、１，３−または１，５−二置換トリアゾール、逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応により反応することができる任意のジエンまたは歪んだ（ｓｔｒａｉｎｅｄ）アルケンジエノフィル、保護または非保護アミン、カルボン酸、アルデヒド、オキシアミンを含む部分である。
【００６７】
本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、（Ｃ）ｎ、Ｌおよび／またはＲは環状基を含まない。
【００６８】
本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、ｎは２〜１０の範囲の中からの整数であり、Ｌは存在せず、Ｒは環状基を含まない。
【００６９】
本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、Ｒはアジドである。任意選択で、Ｒ’は環状基を含む。
【００７０】
本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、ｎは１０〜２０の範囲の中からの整数であり、Ｒは環状基を含む。本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、Ｌは存在し、Ｒは環状基を含む。任意選択で、Ｒ’はアジドである。
【００７１】
一実施形態では、前記環状基は多環式基である。一実施形態では、前記環状基はシクロオクチンであり、任意選択で、置換または非置換ジベンジルシクロオクチンである。
【００７２】
本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、ｎは１０〜２０の範囲の中からの整数である。本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、（Ｃ）ｎは、（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｘ基を含むヘテロアルキル鎖であり、ここで、ｘは１〜６の範囲の中から選択される整数である。本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、ｎは２〜６の範囲の中からの整数であり、Ｌ、ＶまたはＹのうちの少なくとも１つは存在する。本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、ＮＨ−（Ｃ）ｎはＮＨ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−を含む。本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、（Ｃ）ｎは置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、窒素に隣接する炭素は非置換である。本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、（Ｃ）ｎは置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、窒素に隣接する炭素は非置換であり、窒素に隣接する炭素以外の鎖の任意の炭素は、エーテル、エステル、チオエーテル、チオエステル、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドのＯ、ＮまたはＳ原子によって任意選択で置換され、ここで、アルキルまたはヘテロアルキル鎖の長さであるｎは、２〜２０個の原子である。
【００７３】
本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、Ｌは、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された５〜３０個の炭素原子の線状炭素含有フレームワークを含む。任意選択で、Ｌは（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｘ基を含み、ここで、ｘは２〜１０の範囲の中から選択される整数である。
【００７４】
本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、基−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ−は合わせて、構造（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｘを含み、ここで、ｘは４〜１２の範囲の中からの整数である。
【００７５】
本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、Ｌは、
ａ）１つまたは複数の原子において任意選択で置換された２〜１５個の線状炭素原子、
ｂ）１つまたは複数の原子において任意選択で置換された３〜１５個の線状炭素原子、
ｃ）１つまたは複数の原子において任意選択で置換された５〜１５個の線状炭素原子、
ｄ）１つまたは複数の原子において任意選択で置換された５〜２０個の線状炭素原子、
ｅ）１つまたは複数の原子において任意選択で置換された３〜３０個の線状炭素原子、
ｆ）１つまたは複数の原子において任意選択で置換された５〜３０個の線状炭素原子、または
ｇ）１つまたは複数の原子において任意選択で置換された３、４、５または６個の線状炭素原子
の炭素フレームワークである。任意選択で、線状炭素原子の前記炭素含有フレームワークは非置換である。
【００７６】
本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、Ｖはジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、またはオリゴペプチドを含む。任意選択で、Ｖは条件的に切断可能な部分であり、事前の条件的変換に続いて、化学的、光化学的、物理的、生物学的、または酵素的プロセスによって切断または変換され得る。
【００７７】
本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、前記受容体グルタミン残基は、重鎖定常領域内にあるか、またはアミノ酸配列−Ｊ１−Ｊ２−Ｊ３−Ｊ４−Ｑ−Ｘ１−Ｘ２−を含むＴＧａｓｅ認識タグ内にある。ここで、Ｑは受容体グルタミンであり、Ｊ１、Ｊ２、Ｊ３、およびＪ４は、Ｊ１、Ｊ２、Ｊ３、およびＪ４のうちの１つまたは複数（または全て）が、負の電荷を有するアミノ酸残基である限りは任意のアミノ酸であり、Ｘ１は任意のアミノ酸であり、Ｘ２は、Ｄ（アスパラギン酸）以外のアミノ酸であり、任意選択で、Ｘ２はグルタミンではない。任意選択で、Ｘ２は非負荷電アミノ酸である。任意選択で、Ｘ２は正荷電側鎖である。任意選択で、Ｘ２は、セリン、アラニン、グリシンまたはスレオニンである。
【００７８】
本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、上記請求項のいずれかの抗体または抗体断片において、抗体は固形腫瘍癌抗原に結合する。本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、抗体は血液腫瘍癌抗原に結合する。本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、上記請求項のいずれかの抗体または抗体断片において、抗体は内部移行抗体であり、式ＩＶａまたはＩＶｂを有する機能化受容体グルタミン残基は、条件的に切断可能な部分（Ｖ）を含む。本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、上記請求項のいずれかの抗体または抗体断片において、抗体は非内部移行抗体であり、式ＩＶａまたはＩＶｂの要素Ｖは独立して、存在しないか、結合または結合の連続である、または切断不能な部分である。
【００７９】
１つの態様では、上記請求項のいずれかの複数の抗体を含む組成物が提供され、複数の抗体が同じ重鎖および／または軽鎖アミノ酸配列を共有し、前記組成物中の抗体の少なくとも９０％は、抗体１つ当たり（ｍ）個の機能化受容体グルタミン残基（Ｑ）を有し、ｍは、１、２、３、または４から選択される整数である。
【００８０】
１つの態様では、各重鎖に１つの受容体グルタミンを含む複数の抗体を含む組成物が提供され、組成物中の抗体の少なくとも８０％は、各重鎖に、式ＩＩまたはＩＶの構造を有する１つの機能化受容体グルタミン残基（Ｑ）を含む。１つの態様では、各重鎖に２つの受容体グルタミンを含む複数の抗体を含む組成物が提供され、組成物中の抗体の少なくとも８０％は、各重鎖に、式ＩＩまたはＩＶの構造を有する２つの機能化受容体グルタミン残基（Ｑ）を含む。任意選択で、凝集アッセイを用いて評価したときに、抗体の２％未満、任意選択で１％未満が可溶性凝集体として存在する。任意選択で、色素ベースの（ｄｙｅ−ｂａｓｅｄ）凝集アッセイを用いて評価したときに、抗体の０．５％未満が可溶性凝集体として存在する。任意選択で、ＳＥ−ＨＰＬＣベースの凝集アッセイを用いて評価したときに、抗体の１％未満が溶性凝集体として存在する。任意選択で、組成物は抗体断片を含まず、任意選択で、組成物は１％未満の抗体断片を含む。任意選択で、組成物は水溶液である。
【００８１】
１つの態様では、連結試薬、その薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、または一般式Ｉｂ：
Ｇ−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｒ）ｚ）ｑ）ｒ      式Ｉｂ
を有するタンパク質結合連結試薬、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物が提供され、式中、
ＧはＨ、アミン保護基、または結合時には、アミド結合を介して取り付けられた抗体または抗体断片であり、
（Ｃ）ｎは、置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、任意選択で、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドによって置換されており、
ｎは、２〜２０の範囲の中から選択される整数であり、
ＸはＮＨ、Ｏ、Ｓであるか、存在しないか、または結合であり、
Ｌは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数の原子において置換された１〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、任意選択で、炭素含有フレームワークは、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された５〜３０個の原子の線状フレームワークを含み、任意選択で、炭素含有フレームワークは、線状炭化水素、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、または任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）であり、
ｒは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｑは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｚは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
Ｖは独立して、存在しないか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、任意選択で、事前の条件的変換に続いて、化学的、光化学的、物理的、生物学的、または酵素的プロセスによって切断または変換されることが可能であり、
Ｙは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系であり、
Ｒは反応性部分である。
【００８２】
一実施形態では、以下の式ＩＩＩ
Ｒ’−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｍ）ｚ）ｑ）ｒ      式ＩＩＩ
の構造を有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物が提供され、式中、
Ｒ’は反応基であり、
Ｌは独立して、存在しないか、または１つもしくは複数の原子において置換された１〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、任意選択で、炭素含有フレームワークは、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された５〜３０個の原子の線状フレームワークを含み、任意選択で、炭素含有フレームワークは、線状炭化水素、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、または任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）であり、
Ｖは独立して、存在しないか、結合または結合の連続であるか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、
Ｙは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系であり、
Ｍは独立して、Ｒまたは（ＲＲ’）−Ｌ’−（Ｖ’−（Ｙ’−（Ｚ）ｚ’）ｑ’）ｒ’であり、
Ｒは反応性部分であり、
（ＲＲ’）は、Ｒと、相補的反応基Ｒ’との付加生成物であり、
Ｌ’は独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数の原子において置換された１〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、任意選択で、炭素含有フレームワークは、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された３〜３０個の炭素原子の線状フレームワークを含み、任意選択で、炭素含有フレームワークは、線状炭化水素、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、または任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）であり、
Ｖ’は独立して、存在しないか、結合または結合の連続であるか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、
Ｙ’は独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続であるか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系であり、
Ｚは独立して、反応基、薬物動態学的特性を改善する部分、治療的または診断的部分であり、各ＺはＹに直接カップリングされるか、またはＹが存在しない場合にはＶに直接カップリングされるか、またはＹおよびＶがいずれも存在しない場合はＬに直接カップリングされ、
ｚ’、ｑ’およびｒ’はそれぞれ独立して、１、２、３または４の中から選択される整数である。
【００８３】
一実施形態では、抗体結合体の評価方法が提供されており、本方法は、
ａ）第１のＸ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｌ’、Ｖ’、Ｙ’、（ＲＲ’）および／またはＺ部分を含む式ＩＩの第１の抗体組成物を提供するステップであって、前記第１の抗体組成物中の抗体の少なくとも７０％、８０％または９０％が、抗体１つ当たり（ｍ）個の機能化受容体グルタミン残基（Ｑ）を有し、ｍが１、２、３、または４から選択される整数であるステップと、
ｂ）第２のＸ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｌ’、Ｖ’、Ｙ’、（ＲＲ’）および／またはＺ部分を含む式ＩＩの第２の抗体組成物を提供するステップであって、前記第２の抗体が、前記第１の抗体のそれぞれのＸ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｌ’、Ｖ’、Ｙ’、（ＲＲ’）および／またはＺ部分とは異なる少なくとも１つのＸ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｌ’、Ｖ’、Ｙ’、（ＲＲ’）および／またはＺ部分を含み、前記第２の抗体組成物中の抗体の少なくとも７０％、８０％または９０％が、抗体１つ当たり（ｎ）個の機能化受容体グルタミン残基（Ｑ）を有し、ｎが１、２、３、または４から選択される整数であるステップと、
ｃ）第１および第２の抗体組成物を評価するステップと
を含む。任意選択で、ｎおよびｍは等しい。任意選択で、ｍおよびｎは２であり、あるいはｍおよびｎは４である。
【００８４】
一実施形態では、式ＩＩの少なくとも２つの抗体組成物を含むキットが提供されており、本キットは、第１の抗体組成物および第２の抗体組成物を別々の容器内に含み、第２の抗体組成物は、前記第１の抗体のそれぞれのＸ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｌ’、Ｖ’、Ｙ’、（ＲＲ’）および／またはＺ部分とは異なる少なくとも１つのＸ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｌ’、Ｖ’、Ｙ’、（ＲＲ’）および／またはＺ部分を有する抗体を含む。任意選択で、第１および第２の抗体組成物の抗体は、重鎖および／または軽鎖アミノ酸配列を共有する。
【００８５】
本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、抗体は全長抗体である。
【００８６】
本明細書に記載される実施形態の１つの態様では、抗体は抗体断片である。
【００８７】
一実施形態では、上記請求項のいずれかの抗体または組成物と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む医薬組成物が提供される。任意選択で、組成物はトレハロースおよびポリソルベート８０を含む。
【００８８】
一実施形態では、本明細書に記載される組成物（例えば、医薬組成物）を哺乳類に投与することを含む、疾患の治療方法が提供される。
【００８９】
一実施形態では、分析物の検出方法または疾患の診断方法が提供されており、本方法は、生体サンプル（例えば、個体から）を入手し、このサンプルを、診断的部分（Ｚ）を含む請求項１〜８４の抗体または組成物と接触させることを含み、そして任意選択でさらに、生体サンプル中の前記診断的部分の存在を検出することを含む。
【００９０】
治療または診断方法の一実施形態では、疾患は固形腫瘍である。治療または診断方法の一実施形態では、疾患は血液悪性腫瘍である。
【００９１】
本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、Ｚは疎水性化合物である。本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、Ｚは、少なくとも５００ｇ／ｍｏｌの分子量を含む有機化合物である。本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、Ｚは、少なくとも７００ｇ／ｍｏｌの分子量を含む有機化合物である。本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、Ｚは、１つまたは複数の環状基、任意選択で巨大環、多環式または三環式基を含む有機化合物である。本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、Ｚは負荷電化合物である。本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、Ｚは細胞毒性抗癌剤である。本明細書中の実施形態のいずれかの１つの態様では、Ｚは、タキサン、アントラサイクリン、カンプトテシン、エポチロン、マイトマイシン、コンブレタスタチン、ビンカアルカロイド、窒素マスタード、マイタンシノイド、カリキアマイシン、デュオカルマイシン、ツブリシン、アマトキシン、ドラスタチンおよびアウリスタチン、エンジイン、ピロロベンゾジアゼピン、およびエチレンイミンからなる群から選択される。
【００９２】
一実施形態では、結合された対象の部分（Ｚ）を含む抗体または抗体断片を調製するための方法が提供されており、本方法は、
（ａ）式ＩＩの反応性部分Ｒを含む機能化受容体グルタミンを含む抗体または抗体断片を固体担体に固定化して、固定化抗体を提供するステップであって、任意選択で、抗体含有サンプルを固体担体へ適用するステップを含むステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の固定化抗体または抗体断片と、対象の部分Ｚおよび反応パートナーＲ’を含む化合物（例えば、式ＩＩＩの化合物）とを反応させて、抗体−対象の部分の結合体を生じさせるステップであって、任意選択で、部分Ｚおよび反応基Ｒ’を含む化合物を固体担体へ適用するステップを含むステップと
を含む。任意選択で、本方法はさらに、任意の未反応材料を除去するための洗浄ステップを含む。任意選択で、本方法はさらに、部分Ｚおよび反応基Ｒ’を含む未反応化合物を回収し、そして前記化合物を固体担体に再度適用して、反応基（Ｒ）を含む抗体と、反応基（Ｒ’）を含む化合物との間の反応のより高度の完了を提供するステップを含む。任意選択で、本方法はさらに、固定化抗体結合体を固体担体から溶出させて、抗体結合体組成物を提供するステップを含む。任意選択で、得られる抗体−対象の部分の結合体は、式ＩＶｂの抗体または抗体断片である。
【００９３】
「式Ｉ」、「式ＩＩ」、「式ＩＩＩ」または「式ＩＶ」への言及は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、このような式Ｉ〜ＩＶから誘導される全ての化合物を指定し、例えば、式ＩはＩａ、Ｉｂおよび／またはＩｃへの言及を含み、式ＩＶはＩＶａおよびＩＶｂを含む、などである。
【００９４】
２０１２年１２月２１日に出願された「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」という表題の米国特許出願第１３／７２５，３８５号明細書の開示は、参照によってその全体が本明細書に援用される。
【００９５】
本明細書に開示される方法はいずれも、本出願（特に、「発明の詳細な説明」を含む）において記載される任意のステップを含むとさらに特徴付けることができる。本開示はさらに、本発明の方法のいずれかによって得ることができる抗体に関する。本開示はさらに、本開示の抗体の医薬品または診断用製剤に関する。本開示はさらに、治療または診断方法における式ＩＶの抗体の使用方法に関する。
【００９６】
本発明のこれらのおよび付加的な有利な態様および特徴は、本明細書の他の箇所でさらに記載され得る。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】チオ−マレイミド付加、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション、およびＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環化付加の反応スキームを示しており、この場合、単一の反応官能性を有する連結試薬の反応基は、治療的または診断的部分に取り付けられた相補的反応基と結合する。
【図２】Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環化付加およびクリック反応の反応スキームを示しており、この場合、連結試薬の反応基は、治療的部分、診断的部分、またはその他の部分を含む薬剤に取り付けられた相補的反応基と結合する。
【図３】例示的な連結試薬の調製およびそのタンパク質との結合を示しており、この場合、ＶおよびＹは存在せず、Ｒは、Ｓ−アセチル保護されたチオール、ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３から最終的に生成されるチオール（スルフヒドリル）反応基であり、ｒは０であり、ｑは０であり、ｚは１であり、Ｌは２つの炭素含有フレームワークＣ（Ｏ）ＣＨ２であり、ＸはＮＨであり、（Ｃ）ｎは（ＣＨ２）５であり、そしてＧは、（Ｈ３Ｃ）３ＣＯＣ（Ｏ）保護基からＨへ、そしてタンパク質のグルタミン残基の結合時には最終的にアミドへ変換される。
【図４】Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオエステル試薬から調製可能な単一のＳ−アセチル保護チオール反応基を有する、本明細書に開示される種々の実施形態に従う種々の例示的な連結試薬の調製を示す。
【図５】本明細書に開示される実施形態に従う例示的な連結試薬の調製、およびそのタンパク質との結合を示しており、この場合、ＶおよびＹは存在せず、Ｒはアジド反応基であり、ｒは０であり、ｑは０であり、ｚは１であり、Ｌは２つの炭素含有フレームワークＣ（Ｏ）ＣＨ２であり、ＸはＮＨであり、（Ｃ）ｎは（ＣＨ２）５であり、そしてＧは、（Ｈ３Ｃ）３ＣＯＣ（Ｏ）保護基からＨへ、そしてタンパク質のグルタミン残基の結合時には最終的にアミドへ変換される。
【図６】Ｎ−スクシンイミジル−アジド試薬から調製可能な単一のアジド反応基を有する、本明細書に開示される実施形態に従う種々の例示的な連結試薬の調製を示す。
【図７】本明細書に開示される実施形態に従う例示的な連結試薬の調製、およびそのタンパク質との結合を示しており、この場合、ＶおよびＹは存在せず、Ｒはアルキン反応基であり、ｒは０であり、ｑは０であり、ｚは１であり、Ｌは１つの炭素含有フレームワークＣＨ２であり、ＸはＮＨであり、（Ｃ）ｎは（ＣＨ２）４ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）であり、そしてＧは、（Ｈ３Ｃ）３ＣＯＣ（Ｏ）保護基からＨへ、そしてタンパク質のグルタミン残基の結合時には最終的にアミドへ変換される。
【図８】本明細書に開示される実施形態に従う例示的な連結試薬の調製、およびそのタンパク質との結合を示しており、この場合、Ｒはノルボルネン反応基であり、ｒは０であり、ｑは０であり、ｚは１であり、Ｌは１つの炭素含有フレームワークＣ（Ｏ）であり、ＸはＮＨであり、（Ｃ）ｎは（ＣＨ２）４ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）であり、そしてＧは、（Ｈ３Ｃ）３ＣＯＣ（Ｏ）保護基からＨへ、そしてタンパク質のグルタミン残基の結合時には最終的にアミドへ変換される。
【図９】本明細書に開示される連結試薬の種々の例を示す。
【図１０Ａ−１０Ｂ】結合抗体を調製するための一般的なスキームを示す。
【図１１】図３のＳ−アセチル−カダベリンリンカーから抗体結合体を調製するためのスキームを示しており、図中の「Ｒ」は対象の部分Ｚである。
【図１２】図５のアジド−カダベリンリンカーから抗体結合体を調製するためのスキームを示しており、図中の「Ｒ」は対象の部分Ｚである。
【図１３】図８のノルボルニル−カダベリンリンカーから抗体結合体を調製するためのスキームを示しており、図中の「Ｒ」は対象の部分Ｚである。
【図１４】図７のアルキン−リシンリンカーから抗体結合体を調製するためのスキームを示しており、図中の「Ｒ」は対象の部分Ｚである。
【図１５】異なる長さ（ｎ＝１または５個の炭素のいずれか）を有するＳ−アセチル保護カダベリンリンカー、およびマレイミド−ＤＯＴＡに連結された短いチオールリンカーを調製するためのスキームを示す。
【図１６Ａ−１６Ｃ】リンカーを調製するためのスキームを示す。
【図１７Ａ−１７Ｂ】１Ｕ／ｍＬ（左側）または６Ｕ／ｍＬのＢＴＧを用いてＤＯＴＡチオールリンカー５にカップリングされたｃｈＡＤＣ１重鎖のデコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）質量スペクトルを示す。
【図１８Ａ−１８Ｇ】ＢＴＧ濃度（１８Ａ）、ｐＨ（１８Ｂおよび１８Ｃ）、温度（１８Ｄおよび１８Ｅ）、および基質化学量論（１８Ｆおよび１８Ｇ）を含む、ＢＴＧカップリングのための最適化条件を示す。
【図１９Ａ】Ｃ２−ＤＯＴＡリンカーと比べて、ＢＴＧによる脱グリコシル化キメラ抗体重鎖Ｃ６−ＤＯＴＡリンカーの改善された酵素修飾を示す。
【図１９Ｂ】イオンクロマトグラム抽出物を示し、トリプシン消化の後、位置２９５にビオチン修飾グルタミンを含む脱アミド化ペプチドが示される。
【図１９Ｃ】位置２９５にビオチン修飾グルタミンを含む特異的Ｎ２９７脱アミド化トリプシンペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルおよび配列確認を示す。
【図２０Ａ】Ｃ６−マレイミド−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦにカップリングされたｃｈＡＤＣ１ｄｇｌのＭＳスペクトルを示す。
【図２０Ｂ】Ｃ６−マレイミド−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦにカップリングされたｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７ＳのＭＳスペクトルを示す。
【図２１Ａ−２１Ｂ】ＰＮＧａｓｅＦ−脱グリコシル化抗体に対するＣ６−ＤＯＴＡリンカーと比較して、ＢＴＧによるＣ６−ＤＯＴＡリンカーを用いたＮ２９７Ｓキメラ抗体重鎖の改善された酵素修飾を示す。
【図２２Ａ−２２Ｂ】短い（左側）および長い（右側）チオールリンカー、化合物４ａおよび４ｂにカップリングされたｃｈＡＤＣ１重鎖のデコンボリューション質量スペクトルを示す。図２２Ａのスペクトルは保護された短いリンカー化合物４ａを示し、図２２Ｂのスペクトルは脱保護された長いリンカー４ｂを示す。
【図２３Ａ−２３Ｃ】図２３Ａは、ＢＴＧ（上部）またはＢＴＧおよびビオチン−カダベリン（下部）と共にインキュベートされた非タグ化ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）のＬＣ−ＭＳ分析を示す。図２３Ｂは、ＢＴＧ（上部）またはＢＴＧおよびビオチン−カダベリン（下部）と共にインキュベートされたｍｙｃタグ化ナノボディのＬＣ−ＭＳ分析を示す。図２３Ｃは、ＢＴＧのみ（上部）またはＢＴＧおよびビオチン−カダベリン（中央）またはＢＴＧおよびダンシル−カダベリン（下部）と共にインキュベートされたｍｙｃタグ化二量体アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）のＬＣ−ＭＳ分析を示す。
【図２４Ａ−２４Ｂ】図２４Ａは、受容体グルタミンが＋２位置において負電荷を有するアミノ酸によって隣接されているＮ２９７Ｄ変異体を除いて、Ｑ２９５変異体の反応性リンカーに対する良好なカップリングを示す。２９７Ｄ変異体は、反応時間を延長しても、他の変異体のＤＡＲ付近に到達しなかった。図２４Ｂは、種々の突然変異体のカップリングの動態学を示しており、正電荷を有するアミノ酸（アルギニン）は、任意の他の変異体よりも速くカップリングされた。
【図２５】受容体グルタミンにつき１０当量のリンカーにおいて、大きい疎水性ＮＨ２−ＰＥＧ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥリンカーの結合について検査した単一および二重突然変異体を示す。二重突然変異体Ｑ２９５Ｎ＋Ｎ２９７ＱおよびＱ２９５Ｓ＋Ｎ２９７Ｑはいずれも、結合の完了のために、他の変異体のどれよりも高いプラトーに到達する（Ｑ２９５Ｎ＋Ｎ２９７ＱおよびＱ２９５Ｓ＋Ｎ２９７Ｑについて検査した最後の２つの時点は同じであり、従って図上に表示されない）。
【図２６Ａ−２６Ｂ】抗体ＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｓ（抗体１つ当たり２つのグルタミン）へのリンカーのＢＴＧ介在性カップリングに対する、有機溶媒１，２−プロパンジオール溶媒の濃度の増大の効果を示す。
【図２７Ａ−２７Ｂ】抗体ＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｓ（抗体１つ当たり２つのグルタミン）へのリンカーのＢＴＧ介在性カップリングに対する、有機溶媒１，２−プロパンジオール溶媒の濃度の増大の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９８】
序論
本開示によると、抗体の機能化は部位特異的であり、第１級アミン（例えば、リシンまたはリシン様部分の）と、抗体の受容体グルタミン残基とを介して、あるいはこれらの間で、トランスグルタミナーゼにより生じる。
【００９９】
本発明者らは、ここで、生理学的条件に近い条件下で、大きい化学分子（例えば、天然生成物誘導体またはポリマーである、デュオカルマイシン、アウリスタチン、カリケアマイシン（ｃａｌｃｈｅａｍｙｃｉｎ）などの細胞毒性薬物）による免疫グロブリンの部位特異的な機能化のための便利な方法を提示する。トランスグルタミナーゼファミリーの酵素活性は、ペプチド結合グルタミン残基のγ−カルボキサミド基と、種々の第１級アミンまたはリシン残基のε−アミノ基との間のアシル転移反応を触媒し、従って、化学的、酵素的、および物理的な分解に対して安定および抵抗性であるイソペプチド結合を形成する。ＴＧａｓｅの機能は特定のグルタミン残基にアルキルアミン誘導体を取り込むこと、あるいはその逆であるとすることができる。この特異性は以前に認識されており、種々の目的で既にうまく応用されている。
【０１００】
定義
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は１つまたは複数を意味し得る。特許請求の範囲で使用される場合に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語と共に使用される際、「ａ」または「ａｎ」という単語は、１つまたは１つよりも多いを意味し得る。本明細書で使用される場合、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも２番目またはそれ以上を意味し得る。
【０１０１】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、これは、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」によって置き換えることができる。
【０１０２】
「ＴＧａｓｅ」または「ＴＧ」と互換的に使用される「トランスグルタミナーゼ」という用語は、ペプチド結合グルタミンのγ−カルボキサミド基と、リシンのε−アミノ基またはアミノペンチル基などの構造的に関連する第１級アミン、例えば、ペプチド結合リシンとの間のアシル転移反応によってタンパク質を架橋し、ε−（γ−グルタミル）リシンイソペプチド結合をもたらすことができる酵素を指す。ＴＧａｓｅには、特に細菌トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）、例えばＥＣ参照番号ＥＣ２．３．２．１３を有する酵素（タンパク質−グルタミン−γ−グルタミルトランスフェラーゼ）が含まれる。
【０１０３】
「受容体グルタミン残基」という用語は、抗体のグルタミン残基に言及する場合、ＴＧａｓｅによって認識され、グルタミンと、リシンまたは構造的に関連する第１級アミン（例えば、アミノペンチル基など）との反応を介してＴＧａｓｅによって架橋され得るグルタミン残基を意味する。好ましくは、受容体グルタミン残基は、表面露出グルタミン残基である。
【０１０４】
「ＴＧａｓｅ認識タグ」という用語は、受容体グルタミン残基を含むアミノ酸の配列であって、ポリペプチド配列に組み込まれた（例えば、付加された）ときに、適切な条件下でＴＧａｓｅによって認識され、アミノ酸の配列内のアミノ酸側鎖と反応パートナーとの間の反応を介して、ＴＧａｓｅによる架橋をもたらす配列を指す。認識タグは、酵素認識タグを含むポリペプチド中に天然には存在しないペプチド配列であってもよい。
【０１０５】
本明細書中の「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、特に、所望の生物活性を示す限り、全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、および抗体断片（所望の生物活性を示す限り）を含む。抗体の作製に関連する種々の技術は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８）において提供される。
【０１０６】
「抗体断片」は、全長抗体の一部、好ましくはその抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ（通常、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメイン）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片（通常、ＶＨおよびＣＨ１ドメイン）、およびｄＡｂ（通常、ＶＨドメイン）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、およびＶ−ＮＡＲドメイン；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、およびカッパボディ（ｋａｐｐａ  ｂｏｄｙ）（例えば、Ｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １９９７；１０：９４９−５７を参照）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；および抗体断片から形成される多特異性抗体断片、および１つまたは複数の単離ＣＤＲまたは機能性パラトープ（ここで、単離ＣＤＲまたは抗原結合残基またはポリペプチドは機能性抗体断片を形成するように一緒に関連または連結され得る）が挙げられる。種々のタイプの抗体断片は、例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００５；２３，１１２６−１１３６；国際公開第２００５０４０２１９号パンフレット、ならびに米国特許出願公開第２００５０２３８６４６号明細書および同第２００２０１６１２０１号明細書において記載または概説されている。
【０１０７】
「可変領域」とは、本明細書で使用される場合、軽鎖（カッパおよびラムダを含む）および重鎖免疫グロブリン遺伝子座をそれぞれ構成するＶＬ（ＶｋａｐｐａおよびＶｌａｍｂｄａを含む）および／またはＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つまたは複数のＩｇドメインを含む抗体の領域を意味する。軽鎖または重鎖可変領域（ＶＬおよびＶＨ）は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる３つの超可変領域によって中断される「フレームワーク」または「ＦＲ」領域からなる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、例えばＫａｂａｔ（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｅ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）を参照）、およびＣｈｏｔｈｉａのように、正確に定義されている。構成要素の軽鎖および重鎖の結合フレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを配置および整列される役割を果たし、主として、抗原への結合に関与する。
【０１０８】
抗体の「定常領域」とは、本明細書で定義される場合、軽鎖または重鎖免疫グロブリン定常領域遺伝子の１つによってコードされる抗体の領域を意味する。「定常軽鎖」または「軽鎖定常領域」とは、本明細書で使用される場合、カッパ（Ｃｋａｐｐａ）またはラムダ（Ｃｌａｍｂｄａ）軽鎖によってコードされる抗体の領域を意味する。定常軽鎖は通常単一のドメインを含み、本明細書において定義される場合、ＣｋａｐｐａまたはＣｌａｍｂｄａの位置１０８〜２１４を指し、ここで番号付けは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）および／またはＥｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８−８５（１９６９）のＥＵインデックスに従う。「定常重鎖」または「重鎖定常領域」とは、本明細書で使用される場合、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥのような抗体のアイソタイプを定義するためにミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロン遺伝子によってコードされる抗体の領域を意味する。全長ＩｇＧ抗体については、定常重鎖は、本明細書において定義される場合、ＣＨ１ドメインのＮ末端〜ＣＨ３ドメインのＣ末端を指し、従って位置１１８〜４４７を含む。他に指示されない限り、定常領域内の番号付けは、Ｋａｂａｔ（１９９１）および／またはＥｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８−８５（１９６９）のＥＵインデックスに従う。
【０１０９】
「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」とは、本明細書で使用される場合、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、単離したこの領域、または全長抗体、抗体断片またはＦａｂ融合タンパク質との関連でのこの領域、または本明細書において概説される任意の他の抗体実施形態を指すことができる。
【０１１０】
「Ｆｖ」または「Ｆｖ断片」または「Ｆｖ領域」とは、本明細書で使用される場合、単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。
【０１１１】
「Ｆｃ」、「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」とは、本明細書で使用される場合、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。従って、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインと、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインと、これらのドメインへのフレキシブルヒンジＮ末端とを指す。ＩｇＡおよびＩｇＭについては、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧについては、図１に示されるように、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３、ならびにＣγ１およびＣγ２間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界域は変わり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、残基Ｃ２２６またはＰ２３０〜そのカルボキシル末端を含むと定義され、ここで、番号付けはＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従う。Ｆｃは、以下に記載されるように、単離したこの領域、またはＦｃポリペプチドとの関連でのこの領域を指すことができる。
【０１１２】
「全長抗体」とは、本明細書で使用される場合、可変領域および定常領域を含む、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。例えば、ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳類において、ＩｇＧアイソタイプの全長抗体は四量体であり、そして２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一の対からなり、各対は１つの軽鎖および１つの重鎖を有し、各軽鎖は免疫グロブリンドメインＶＬおよびＣＬを含み、各重鎖は免疫グロブリンドメインＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、およびＣγ３を含む。いくつかの哺乳類、例えばラクダおよびラマでは、ＩｇＧ抗体は２つの重鎖だけからなることができ、各重鎖は、Ｆｃ領域に接続された可変ドメインを含む。
【０１１３】
本明細書における「アミノ酸修飾」とは、ポリペプチド配列内のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を意味する。本明細書における好ましいアミノ酸修飾は置換である。本明細書における「アミノ酸修飾」とは、ポリペプチド配列内のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を意味する。本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」とは、タンパク質配列内の所定の位置のアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることを意味する。例えば、置換Ｙ５０Ｗは、位置５０のチロシンがトリプトファンで置換された親ポリペプチドの変異体を指す。ポリペプチドの「変異体」は、基準ポリペプチド、通常は天然または「親」ポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ポリペプチド変異体は、天然アミノ酸配列内の特定の位置に１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を有し得る。
【０１１４】
「保存的な」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、物理化学特性の類似した側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において知られており、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ−分枝状側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【０１１５】
「単離」分子は、組成物中の優勢的な種である分子である（それが属する分子の種類に関して見出される）（すなわち、組成物中の分子のタイプの少なくとも約５０％を構成し、通常は、組成物中の分子の種、例えばペプチドの少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれ以上を構成するであろう）。一般に、抗体分子の組成物は、組成物中の存在する全てのペプチド種との関連で、あるいは少なくとも、提唱される使用との関連で実質的に活性なペプチド種に関して、９８％、９８％、または９９％の抗体分子の均質性を示すであろう。
【０１１６】
「治療」または「治療する」は、文脈によって否定されない限り、疾患または障害の１つまたは複数の症状あるいは臨床的に関連する徴候の予防、緩和、管理、治癒または軽減を指す。例えば、疾患または障害の症状または臨床的に関連する兆候が同定されていない患者の「治療」は防止または予防的治療であるが、疾患または障害の症状または臨床的に関連する兆候が同定された患者の「治療」は、一般に、防止または予防的治療を構成しない。
【０１１７】
本明細書における「反応性部分」という用語は、事前の活性化または変換を必要とせずに別の部分とカップリングさせることができる部分を指す。
【０１１８】
「保護基」という用語は、第１の分子から第２の分子への変換の間、官能基、例えば、アミノ基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を一時的に保護またはブロックする（すなわち反応を防止することが意図される）基を指す。
【０１１９】
「薬物動態学的特性を改善する部分」という語句は、化合物（例えば、抗体）に関する場合、１つまたは複数の部分Ｚの薬物動態学的特性を、より優れた治療または診断効果が得られるな形で変化させる部分を指す。この部分は、例えば、水溶性を増大させる、循環時間を増大させる、あるいは免疫原性を低下させることができる。
【０１２０】
「連結基」という語句は、前記化合物の１つの構造要素を、前記の同じ化合物１つまたは複数の他の構造要素に連結する、化合物の構造要素を指す。
【０１２１】
「分枝の度合いを表す数」という語句は、右側の括弧の隣の下付き数字が、対応する左側の括弧のすぐ左側の部分に、括弧内の部分の単位がいくつ結合されるかを表すことを示すために使用される。例えば、Ａ−（Ｂ）ｂ（ｂは分枝の度合いを表す数である）は、ｂ個の単位Ｂが全てＡに直接結合されることを意味する。これは、ｂが２であれば、式はＢ−Ａ−Ｂに変換されることを意味する。
【０１２２】
「重合の度合いを表す数」という語句は、右側の括弧の隣の下付き数字が、括弧内の部分の単位が互いにいくつ結合されるかを表すことを示すために使用される。例えば、Ａ−（Ｂ）１（ｂは重合の度合いを表す数である）は、ｂが２のときに式がＡ−Ｂ−Ｂに変換されることを意味する。
【０１２３】
「同一性」または「同一」という用語は、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係において使用される場合、２つ以上のアミノ酸残基のストリング間のマッチの数によって決定されるようなポリペプチド間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処されるギャップアライメント（もしあれば）を用いた２つ以上の配列のより小さい部分間の同一のマッチの割合を測定する。関連ポリペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。このような方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）において記載されるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２４】
同一性を決定するための好ましいモデルは、検査される配列間に最大のマッチを与えるように設計される。同一性の決定方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法としては、ギャップを含むＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，上記）から公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用され得る。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、完全飽和（二重結合または三重結合がない）炭化水素基を含む直鎖または分枝状炭化水素鎖を指す。アルキル基は、例えば、１〜２０個の炭素原子を有し得る（本明細書において出現する場合はいつでも、「１〜２０」などの数値の範囲は、所与の範囲内のそれぞれの整数を指し、例えば、「１〜２０個の炭素原子」は、アルキル基が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子などからなることができ、そして２０個の炭素原子までを含むことを意味するが、本定義は、数値範囲が指定あれていない「アルキル」という用語の出現も包含する）。化合物のアルキル基は、「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」または類似の名称で指定され得る。単なる例として、「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」は、アルキル鎖中に１個〜４個の炭素原子が存在すること、すなわちアルキル鎖が、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔ−ブチルから選択されることを示す。典型的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第３級ブチル、ペンチルおよびヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。アルキル基は置換されてもよいし、非置換であってもよい。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」という用語は、１つまたは複数の炭素原子の代わりに１つまたは複数のへテロ原子、すなわち炭素以外の元素（酸素、硫黄、窒素、リンを含むがこれらに限定されない）を含有する直鎖または分枝状アルキル基を指す。
【０１２７】
基が「置換」されていると記載される場合はいつも、その基は表示される置換基の１つまたは複数によって置換されている。置換基が表示されていない場合、表示される「置換された」基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、（ヘテロアリシクリル）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ハロゲン、チオカルボニル、カルバミル、チオカルバミル、アミド、スルホンアミド、スルホンアミド、カルボキシ、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、シリル、スルフェニル、スルフィニル、スルホニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、トリハロメタンスルホニル、トリハロメタンスルホンアミド、アミノ、一置換アミノ基および二置換アミノ基、ならびにこれらの保護誘導体から個別におよび独立して選択される１つまたは複数の基によって置換され得ることが意味される。
【０１２８】
置換基の数が指定されていない（例えば、ハロアルキル）場合、１つまたは複数の置換基が存在し得る。例えば、「ハロアルキル」は、１つまたは複数の同じまたは異なるハロゲンを含み得る。別の例として、「Ｃ１〜Ｃ３アルコキシフェニル」は、１つまたは複数の同じまたは異なる、１個、２個または３個の原子を含有するアルコキシ基を含み得る。
【０１２９】
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、それが投与される生物に有意な刺激作用を引き起こさない、そして化合物の生物活性および特性を抑制しない、化合物の塩を指す。いくつかの実施形態では、塩は、化合物の酸付加塩である。薬学的な塩は、化合物を、ハロゲン化水素酸（例えば、塩酸または臭化水素酸）、硫酸、硝酸およびリン酸などの無機酸と反応させることによって得ることができる。薬学的な塩は、化合物を、脂肪族または芳香族カルボン酸またはスルホン酸、例えばギ酸、酢酸、コハク酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸またはナフタレンスルホン酸などの有機酸と反応させることによっても得ることができる。また薬学的な塩は、化合物を塩基と反応させて、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（ナトリウムまたはカリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウムまたはマグネシウム塩など）、例えば、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｃ１〜Ｃ７アルキルアミン、シクロヘキシルアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミンなどの有機塩基の塩、ならびにアルギニンおよびリシンなどのアミノ酸との塩などの塩を形成することによって得ることもできる。
【０１３０】
抗体の作製
抗体は、当該技術分野で知られている様々な技術によって作製することができる。通常、抗体は、抗体を得ることが所望されるポリペプチド、またはその断片もしくは誘導体、通常は免疫原性断片を含む免疫原（例えば、ヒトポリペプチド）による非ヒト動物、好ましくはマウスの免疫化によって作製される。抗原による非ヒト哺乳類の免疫化ステップは、マウスにおける抗体の産生を刺激するために当該技術分野で周知の任意方法で実行され得る（例えば、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８８）を参照。その全開示は参照によって本明細書中に援用される）。免疫化において使用される抗原に向かう抗体を発現するＢ細胞の産生をもたらす限り、他のプロトコルも使用され得る。また、非免疫化非ヒト哺乳類からのリンパ球が単離され、インビトロで成長され、次に細胞培養において免疫原に暴露され得る。次に、リンパ球は回収され、以下に記載される融合ステップが実行される。好ましいモノクローナル抗体に対して、次のステップは、抗体産生ハイブリドーマを形成するために、免疫化非ヒト哺乳類からの脾細胞の単離、そしてその後の、免疫化細胞を有する脾細胞の融合である。次に、ハイブリドーマコロニーは、ポリペプチド（抗体が所望される）に特異的に結合する抗体の産生についてアッセイされる。アッセイは、通常、比色分析ＥＬＩＳＡ型アッセイであるが、ハイブリドーマが成長されるウェルに適合可能な任意のアッセイが使用され得る。他のアッセイとしては、ラジオイムノアッセイまたは蛍光活性化細胞ソーティングがある。所望の抗体産生に対して陽性なウェルが調査され、１つまたは複数の別個のコロニーが存在するかどうかを決定する。２つ以上のコロニーが存在すれば、ただ１つの細胞だけが所望の抗体を産生するコロニーを生じさせたことを保証するために、細胞は再クローン化され、成長され得る。所望のモノクローナル抗体を産生するために十分な成長の後、モノクローナル抗体を含有する成長培地（または腹水流体）は細胞から分離され、その中に存在するモノクローナル抗体が精製される。精製は、通常、ゲル電気泳動、透析、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ−セファロースを用いるクロマトグラフィ、あるいはアガロースまたはセファロースビーズなどの固体担体に連結された抗マウスＩｇによって達成される（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，出版番号１８−１０３７−４６，Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＡＣ（その開示は参照によって本明細書に援用される）において全て記載される）。
【０１３１】
またヒト抗体は、免疫化のためにヒト抗体レパートリーを発現するように操作された遺伝子導入動物（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ  ｅｔ  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２（１９９３）２５５）を用いることによって、あるいはファージ提示法を用いる抗体レパートリーの選択によって産生され得る。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を免疫化のために使用することができる。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、その免疫グロブリン遺伝子機能性ヒト免疫グロブリン遺伝子によって置換されたマウスである。従って、このマウスによってによって、あるいはこのマウスのＢ細胞から作られるハイブリドーマにおいて産生される抗体は、既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは米国特許第６，１６２，９６３号明細書に記載されており、これは参照によってその全体が本明細書中に援用される。
【０１３２】
また抗体は、例えば、（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４１（１９８９）ｐ．５４４、その全開示は参照によって本明細書中に援用される）に開示されるように、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択によって産生することもできる。ファージ提示技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３）は、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、抗体を産生するために使用することができる。例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４；米国特許第５５６５３３２号明細書；米国特許第５５７３９０５号明細書；米国特許第５５６７６１０号明細書；米国特許第５２２９２７５号明細書を参照されたい。コンビナトリアルライブラリーがヒト由来の可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーを含む場合、コンビナトリアルライブラリーからの選択はヒト抗体をもたらすであろう。
【０１３３】
さらに、広範な抗体は科学および特許文献において（ＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列を含む）、あるいは市販の供給業者から入手可能である。抗体の例には、除去すべき標的細胞、例えば増殖性細胞または病態に寄与する細胞によって発現される抗原を認識する抗体が含まれる。例としては、腫瘍抗原、微生物（例えば、細菌）抗原またはウィルス抗原を認識する抗体が挙げられる。他の例としては、移植組織の拒絶反応を含む炎症性または自己免疫疾患に寄与する免疫細胞上に存在する抗原（例えば、Ｔ細胞（ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞）上に存在する抗原）が挙げられる。
【０１３４】
抗体は、通常、所定の抗原に向けられるであろう。本明細書で使用される場合、「細菌抗原」という用語は、インタクト、減弱または死滅細菌、任意の構造または機能性細菌タンパク質または炭水化物、または抗原性であるために十分な長さ（通常、約８個以上のアミノ酸）の細菌タンパク質の任意のペプチド部分を含むが、これらに限定されない。例としては、グラム陽性細菌抗原およびグラム陰性細菌抗原が挙げられる。細菌抗原は、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）種、特にヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）；ボレリア（Ｂｏｒｅｌｉａ）種、特にボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）；レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）種、特にレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）；マイコバクテリア  ｓ（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓ）種、特にＭ．ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）；スタフィロコックス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特にスタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）；ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、特にＮ．ゴノルホエアエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、特にリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；ストレプトコックス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、特にＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アガラクチアエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）；Ｓ．フエカリス（Ｓ．ｆａｅｃａｌｉｓ）；Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）、Ｓ．ニューモニアス（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ）；嫌気性ストレプトコックス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種；病原性カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種；ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種、特にヘモフィルス・インフルエンズエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚｕｅ）；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特にバチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、特にコリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；エリシペロスリクス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）種、特にエリシペロスリクス・ルシオパシアエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、特にＣ．ペルフリンゲンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、Ｃ．テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）；エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、特にエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、特にクレブシエラ・１Ｓ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  １Ｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）種、特にパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種；フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、特にフソバクテリウム・ヌクレアツム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）；ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特にストレプトバチルス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）；トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、特にトレポネーマ・ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）；レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）；病原性エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種；およびアクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、特にアクチノミセス・イスラエリィ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉ）からなる群から選択される細菌に由来する。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、「ウィルス抗原」という用語は、インタクト、減弱または死滅ホールウィルス、任意の構造または機能性ウィルスタンパク質、または抗原性であるために十分な長さ（通常、約８個以上のアミノ酸）のウィルスタンパク質の任意のペプチド部分を含むが、これらに限定されない。ウィルス抗原の源としては、レトロウィルス科（例えば、ヒト免疫不全ウィルス、例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも称される）、またはＨＩＶ−ＩＩＩ；および他の単離菌、例えばＨＩＶ−ＬＰ）；ピコルナウィルス科（例えば、ポリオウィルス、Ａ型肝炎ウィルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウィルス、ライノウィルス、エコーウィルス）；カリシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を引き起こす菌種）；トガウィルス科（例えば、ウマ脳炎ウィルス、風疹ウィルス）；フラビウィルス科（例えば、デングウィルス、脳炎ウィルス、黄熱ウィルス）；コロナウィルス科（例えば、コロナウィルス）；ラブドウィルス科（例えば、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス）；フィロウィルス科（例えば、エボラウィルス）；パラミクソウィルス科（例えば、パラインフルエンザウィルス、流行性耳下腺炎ウィルス、麻疹ウィルス、呼吸器多核体ウィルス）；オルトミクソウィルス科（例えば、インフルエンザウィルス）；ブニヤウィルス科（例えば、ハンタンウィルス、ブニヤウィルス、フレボウイルスおよびナイロウィルス）；アレナウィルス科（出血熱ウィルス）；レオウィルス科（例えば、レオウィルス、オルビウィルスおよびロタウィルス）；ボルナウィルス科；ヘパドナウィルス科（Ｂ型肝炎ウィルス）；パルボウィルス科（パルボウィルス）；パポバウィルス科（パピローマウィルス、ポリオーマウィルス）；アデノウィルス科（ほとんどのアデノウィルス）；ヘルペスウィルス科（単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウィルス、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウィルス）；ポックスウィルス科（Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ）（痘瘡ウィルス、ワクシニアウィルス、ポックスウィルス）；およびイリドウィルス科（例えば、アフリカブタ熱ウィルス）；ならびに未分類ウィルス（例えば、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウィルスの欠損サテライトであると考えられる）、Ｃ型肝炎；ノーウォークおよび関連ウィルス、およびアストロウイルス）からのウィルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「癌抗原」および「腫瘍抗原」という用語は互換的に使用され、癌細胞によって差別的に発現され、従って癌細胞を標的にするために利用され得る抗原（例えば、炭水化物、ポリペプチド、または抗原性であるために十分な長さ（通常、約８個以上のアミノ酸）の任意のペプチド）を指す。癌抗原は、潜在的に腫瘍特異的免疫応答を刺激できると思われる抗原である。これらの抗原のいくつかは正常細胞によりコードされるが、必ずしも発現されない。これらの抗原は、正常細胞内で通常はサイレントである（すなわち、発現されない）もの、特定の分化段階でのみ発現されるもの、および時間的に発現されるもの（胚抗原および胎児性抗原など）と特徴付けることができる。他の癌抗原は、変異細胞遺伝子、例えば、癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子）、抑制遺伝子（例えば、突然変異体ｐ５３）、内部欠失から生じる融合タンパク質、または染色体転座によってコードされる。さらに他の癌抗原は、ＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウィルス上にある遺伝子などのウィルス遺伝子によってコードされ得る。
【０１３７】
癌抗原は、通常、正常細胞の表面抗原であり、異常なときに過剰発現または発現される。理想的には、標的抗原は増殖性細胞（好ましくは、腫瘍細胞）においてのみ発現されるが、これは実際にはめったに観察されない。結果として、標的抗原は、通常、増殖性組織と健全な組織との間の差次的発現に基づいて選択される。抗体は、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ１９、ＣＤ３３、糖タンパク質ＮＭＢ、ＣａｎＡｇ、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ）、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ２）、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ３）、ＣＤ７９、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＢＣＭＡ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ７０、Ｅ−セレクチン、ＥｐｈＢ２、メラノトランスフェリン、Ｍｕｄ６およびＴＭＥＦＦ２を含む標的特異的な腫瘍関連抗原に対して増加されている。また癌抗原の例としては、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＰＤ−Ｌ１、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびその免疫原性エピトープＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ｚｅｔａ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥファミリー、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリー、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、ＭＵＣファミリー、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ヒトＥＧＦ様受容体ファミリーのメンバー、例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４または少なくとも１つのＨＥＲサブ単位で構成されるヘテロ二量体受容体など、ガストリン放出ペプチド受容体抗原、Ｍｕｃ−１、ＣＡ１２５、αｖβ３インテグリン、α５β１インテグリン、αＩＩｂβ３−インテグリン、ＰＤＧＦベータ受容体、ＳＶＥ−カドヘリン、ＩＬ−８、ｈＣＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１５、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニンおよびγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、ウィルス産物、例えば、ヒトパピローマウィルスタンパク質、ｉｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶコード化核内抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＣＴ−７、ならびにｃ−ｅｒｂＢ−２も挙げられるが、これは完全であることは意図しない。
【０１３８】
一実施形態では、特に、癌抗原を発現する細胞を死滅させる目的で抗体薬物結合体が使用される場合、癌抗原は、腫瘍細胞の表面で発現され、本明細書に記載される機能化グルタミンを有する抗体と結合されたときに細胞によって内部移行される抗原である。このような抗体は、特に、抗体薬物結合体が癌細胞内へ内部移行されると直ぐに切断される条件的に切断可能なリンカー（例えば、式Ｉ〜ＩＶのＶ基）を含むリンカーとの結合において使用するために十分適しているであろう。本明細書で使用される場合、「内部移行される」抗体、または「内部移行する」抗体は、哺乳類細胞上の抗原（例えば、癌抗原）に結合すると、細胞により取り込まれる（すなわち、細胞に侵入する）ものである。治療用途については、生体内の内部移行が考慮される。
【０１３９】
別の実施形態では、例えば、抗体薬物結合体が診断用途で使用される場合、癌抗原は、腫瘍細胞の表面で発現されるが、本明細書に記載される機能化グルタミンを有する抗体と結合されたときに細胞によって実質的に内部移行されない抗原である。このような抗体は、特に、細胞（例えば、癌細胞、感染細胞など）内に内部移行せず、従って検出することができる検出可能な部分（例えば、式Ｉ〜ＩＶのＺ基）を含むリンカーとの結合において使用するために十分適しているであろう。
【０１４０】
哺乳類細胞上の抗原との結合時に抗体が内部移行するか、あるいは抗原が細胞内内部移行を受けるかどうか（例えば、抗体による結合時に）は種々のアッセイによって決定することができる。例えば、生体内の内部移行を検査するために、検査抗体は標識化され、特定の細胞の表面で発現される標的抗原を有することが分かっている動物内に導入される。抗体は、放射性標識化されてもよいし、あるいは例えば蛍光または金粒子によって標識化されてもよい。このアッセイに適した動物には、標的抗原発現を発現する腫瘍移植片または異種移植片を含有するヌードマウス、またはヒト標的抗原をトランスフェクトした細胞が導入されたマウス、またはヒト標的抗原トランスジーンを発現する遺伝子導入マウスなどの哺乳類が含まれる。適切な対照には、検査抗体を受けなかった動物または無関係の抗体を受けた動物、および対象の細胞上の別の抗原に対する抗体（この抗体は、抗原への結合時に内部移行されることが分かっている）を受けた動物が含まれる。抗体は、例えば、静脈内注射によって動物に投与することができる。適切な時間間隔で、動物の組織切片を調製し、内部移行と、内部移行された抗体の細胞内での位置とについて光学顕微鏡または電子顕微鏡によって分析することができる。生体外の内部移行については、培地に添加した関連の抗体の存在下または非存在下で、組織培養皿において細胞をインキュベートし、所望の時点で微視的な分析のために処理することができる。細胞内の内部移行された標識の抗体の存在は、顕微鏡法によって、あるいは放射性標識化抗体が使用される場合にはオートラジオグラフィによって直接可視化することができる。任意選択で、顕微鏡法において、既知のポリペプチドまたは他の細胞成分との共局在化を評価することができ、例えば、エンドソーム／リソソームマーカーＬＡＭＰ−１（ＣＤ１０７ａ）との共局在化は、内部移行された抗体の細胞内局在化についての情報を提供することができる。あるいは、定量的な生化学的アッセイにおいて、標的抗原発現細胞を含む細胞の集団は、生体外または生体内で放射性標識化された検査抗体と接触され、細胞（生体内で接触される場合には、細胞は、適切な時間の後に単離される）はプロテアーゼで処理されるか、酸洗浄を受けて、細胞表面の非内部移行抗体が除去される。細胞は粉砕され、ホモジネートをシンチレーションカウンターに通過させることによって、各細胞バッチに関連してプロテアーゼ抵抗性の量、放射性カウント／分（ｃｐｍ）が測定される。放射性標識化抗体の既知の比活性に基づいて、粉砕細胞のシンチレーション計数から、細胞ごとに内部移行された抗体分子の数を推定することができる。例えば、培養皿またはフラスコ内の細胞培地に細胞を添加し、抗体に対する細胞の均一な暴露を保証するために抗体を培地と十分に混合することによって、細胞は生体外で、好ましくは溶液形態で、抗体と「接触」される。培地に添加する代わりに、所望される期間、試験管内のＰＢＳなどの等張液中で細胞を検査抗体と接触させることもできる。生体内では、検査抗体を投与する任意の適切な方法、例えば以下に記載される投与方法によって、患者に投与される場合に、細胞は抗体と接触される。
【０１４１】
細胞を死滅させるように設計される抗体結合体の場合、生体内で、標的抗原発現細胞への結合時に抗体の内部移行の速度が速いほど、例えば、細胞毒性の免疫複合体によって、標的抗原発現細胞に対する所望の殺細胞または成長阻害効果はより速く達成され得る。好ましくは、抗体の内部移行の動態学は、標的抗原発現標的細胞の急速な死滅を好むようなものである。従って、抗体は速い内部移行速度を示すことが望ましく、好ましくは、抗体の生体内投与から２４時間以内、より好ましくは約１２時間以内、さらにより好ましくは約１時間以内である。
【０１４２】
対象の抗体をコードするＤＮＡは、適切な宿主へのトランスフェクションのための適切な発現ベクター内に配置することができる。次に、宿主は、抗体、またはその変異体、例えば、そのモノクローナル抗体のヒト化バージョン、抗体の活性断片、抗体の抗原認識部分を含むキメラの抗体、または検出可能な部分を含むバージョンの組換え産生のために使用される。
【０１４３】
特定の実施形態では、ハイブリドーマまたは抗体を産生する他の細胞のＤＮＡは、発現ベクターへの挿入の前に、例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を、相同的な非ヒト配列の代わりに使用すること（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ｐｐ．６８５１（１９８４））によって、あるいは、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって修飾され得る。そのようにして、元の抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が作製される。
【０１４４】
ヒト化抗体も作製することができる。ヒト化抗体は、通常、マウス免疫グロブリン由来の特定の最小配列を含有する、特異的なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、「ｄａｂ」、または抗体の他の抗原結合サブシーケンス）である。大部分は、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、元の抗体（親またはドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されており、元の抗体の所望の特異性、親和性、および能力は保持される。親抗体のＣＤＲ（そのうちのいくつかまたは全てが非ヒト生物に由来する核酸によってコードされる）は、全体的または部分的に、ヒト抗体可変領域のベータ−シートフレームワークに移植され、移植されたＣＤＲによってその特異性が決定される抗体が作られる。このような抗体の作製は、例えば、国際公開第９２／１１０１８号パンフレット、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６に記載されている。
【０１４５】
抗体は、さらに、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（通常はヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，ｐｐ．５２２（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，ｐｐ．３２３（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２，ｐｐ．５９３（１９９２）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，ｐｐ．１５３４；および米国特許第４，８１６，５６７号明細書が参照され、これらの全開示は、参照によって本明細書中に援用される。
【０１４６】
ヒトアイソタイプの野生型全長ＩｇＧ抗体は、重鎖の残基２９５に保存受容体グルタミンを有し得る。これは、非グリコシル化形態においてＴＧａｓｅに利用し易く、従って最適な条件下、ＴＧａｓｅの存在下で式Ｉの化合物と反応し、抗体および式ＩＩの化合物から結合体を形成する。抗体は、重鎖の残基２９７のアスパラギンにおいてグリコシル化を欠いているであろう。
【０１４７】
ＴＧａｓｅの存在下で式Ｉの化合物と反応する付加的または代替的な部位は、抗体の操作によって付与することができる。化合物は、野生型または親抗体の１つまたは複数のアミノ酸がグルタミンアミノ酸で置き換えられた（によって置換された）グルタミン操作抗体、またはグルタミン残基が任意選択で他のアミノ酸残基と一緒に、野生型または親抗体に導入または付加された（例えば、グルタミン残基が抗体断片に付加された）グルタミン操作抗体を含む。
【０１４８】
ＴＧａｓｅに利用し易いグルタミンを提供する単一部位の突然変異は、抗体が２つ以上の操作された鎖を含む場合に結合され得る２つ以上の操作されたグルタミン残基をもたらし得ることに注意すべきである。例えば、単一部位の突然変異は、ＩｇＧ抗体の二量体の性質のために、四量体ＩｇＧ中に２つの操作されたグルタミン残基をもたらすであろう。操作されたグルタミン残基は任意の受容体グルタミンに加えて、抗体中に既に存在する（もしあれば）であろう。ＴＧａｓｅの存在下、適切な条件下で、式Ｉの化合物と反応するグルタミンアミノ酸残基は、通常は定常ドメインにおいて重鎖内に位置し得る。
【０１４９】
一実施形態では、アミノ酸位置２９７（ＥＵインデックス）のアスパラギンはグルタミン残基によって置換される。抗体は、Ｎ２９７Ｑ置換を有する定常領域を有し得る（Ｎ２９７Ｑ変異体抗体）。Ｎ２９７Ｑ置換および残基２９５（ＥＵインデックス）のグルタミンを有する抗体は、従って、重鎖あたり２つの受容体グルタミン、それにより２つの結合部位を有し得る。従って、４価の形態では、抗体当たり４つの結合体を有し得る。このような抗体は、特に、多段階方法による結合において使用するために十分適応されるであろう。抗体は式ＩｂまたはＩｃの化合物と反応して、式ＩＩの抗体を形成することができる。
【０１５０】
一実施形態では、アミノ酸位置２９７のアスパラギンは、非グルタミン残基によって置換される。抗体は、Ｑ２９５Ｘ（例えば、Ｑ２９５Ｘ／Ｎ２９７Ｑ）、Ｎ２９７Ｘ、Ｓ２９８Ｘおよび／またはＴ２９９Ｘ置換を有する定常領域を有し得る（Ｑ２９５Ｘ、Ｎ２９７Ｘ、Ｓ２９８Ｘおよび／またはＴ２９９Ｘ変異体抗体）。ここで、Ｘは任意のアミノ酸（グルタミンまたは残基Ｑ、２９７、２９８または２９９残基にそれぞれ天然に存在するＮ、ＳまたはＴ以外）であり、任意選択で、置換は保存的な置換である。Ｑ２９５Ｘを有する抗体は異なる位置に導入されたグルタミンを有することが理解されるであろう。例えば、抗体はＮ２９７Ｑ置換も有し得る。このような抗体は、位置２９５にグルタミンを含む（グルタミンはヒト定常領域に位置２９５において天然に存在する）が、他の受容体グルタミン残基を含まない場合、抗体が２つの重鎖を含むときには抗体当たり２つの結合体を有し得る。このような抗体は、さらに、位置２９５および２９７の受容体グルタミンを有する抗体において存在し得るような間隔の近い受容体グルタミン残基を持たないという利点を有するであろう。ここで、間隔の近い受容体残基は、反応性部分（Ｒ）を含むリンカーによって機能化されると、非保護反応基Ｒ間の望ましくない反応をもたらし得る。（Ｒ）基間のこのような望ましくない反応によって、これらは式ＩＩＩの化合物との反応に利用できなくなり、得られる式ＩＶｂの抗体の組成物は不均一性の増大を有するであろう。
【０１５１】
本明細書において示されるように、ＴＧａｓｅは、大きいおよび／または疎水性部分（例えば、Ｖ、ＹまたはＺ）を含むリンカーをＰＮＧａｓｅＦ−脱グリコシル化抗体に直接（単一のカップリング反応において）カップリングさせる能力の制限を提供する。Ｎ２９７グリコシル化抗体のＰＮＧａｓｅＦ処理はアスパラギンの脱アミド化をもたらし、従ってＮ連結グリカンの除去の後に、位置２９７（ＥＵ番号付け）においてアスパラギン酸残基が形成される（残基２９７は、ヒトＩｇＧ抗体の重鎖の位置２９５のグルタミンに対して＋２位置にある）。この負荷電アスパラギン酸残基は、大きいおよび／または疎水性部分を含むリンカーを連結させるＴＧａｓｅの能力に影響を与えると考えられ、得られる抗体−リンカー結合体組成物は不均一であり非機能化受容体グルタミンを有する抗体を特徴とする。しかしながら、＋２位置（受容体グルタミンに対してＣ末端）の残基に関して抗体を修飾することによって、ＴＧａｓｅは、組成物中の実質的に全ての抗体上の全ての受容体グルタミンを、大きいおよび／または疎水性部分を含むリンカーによって機能化できるようになる。その結果、位置＋２において非アスパラギン酸残基によって隣接される機能化受容体グルタミン残基を含む抗体は、特に１段階の結合反応スキームが使用される場合に、大きいおよび／または疎水性部分を含むリンカーのＴＧａｓｅ介在性結合のための有利な基質として使用することができる。
【０１５２】
従って、結合抗体を作製するための有利なアプローチは、出発材料としてＮ２９７連結グリコシル化（このようなＮ連結グリコシル化は、残基２９５へのＴＧａｓｅカップリングを妨害する）を欠いた抗体を提供することを含み得る。ここで、受容体グルタミンに対して＋２位置が非アスパラギン酸残基である。＋２位置の残基は、効率的なＴＧａｓｅ介在性結合を可能にする任意の適切なアミノ酸であり得る。任意選択で、＋２位置の残基は非負荷電アミノ酸、例えば、電気的に中性の任意のアミノ酸、セリンなどである。任意選択で、＋２位置の残基は、正荷電側鎖を有するアミノ酸、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸、および疎水性側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される。
【０１５３】
位置＋２において非アスパラギン酸残基によって隣接された機能化受容体グルタミン残基を含む抗体を作製するための１つのアプローチは、残基２９７のアスパラギンをアスパラギン酸に変換しない適切な方法によって、位置２９７にアスパラギンを有するが、Ｎ連結グリコシル化を欠いている抗体を作製することである。例えば、抗体は、Ｎ−グリコシルカ抗体をもたらさない宿主細胞（例えば、原核細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））において産生され得る。このような抗体は、通常、その重鎖において位置２９５にグルタミンおよび位置２９７に非グリコシル化アスパラギンを有するであろう。すなわち、受容体グルタミンに対して＋２位置の残基はアスパラギンである。
【０１５４】
＋２位置において非アスパラギン酸残基によって隣接された機能化受容体グルタミン残基を含む抗体の作製は、タンパク質の操作によって達成することもできる。例えば、重鎖残基２９５（ＥＵ番号付け）に天然に存在するグルタミンを有する抗体は、アスパラギンが欠失される、または異なるアミノ酸により置換されるような、残基２９７の修飾を含むことができる。有利に、アミノ酸位置２９７のアスパラギンは、非グルタミン、非アスパラギン酸残基（例えば、非負荷電アミノ酸、任意の保存的な置換、正荷電側鎖を有するアミノ酸、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸、疎水性側鎖を有するアミノ酸、例えば、セリン）によって置換される。従って、抗体はＮ２９７Ｘ置換を有する定常領域を有するであろう（Ｎ２９７Ｘ変異体抗体）。ここで、Ｘは、アスパラギン、グルタミンまたはアスパラギン酸以外のアミノ酸である。
【０１５５】
別の例では、重鎖残基２９５に天然に存在するグルタミンおよび残基２９７（ＥＵ番号付け）のアスパラギンを有する抗体は、残基２９５および２９７におけるにおいて、残基２９５のグルタミンが欠失される、または異なるアミノ酸（例えば、非負荷電アミノ酸）によって置換され、そして残基２９７のアスパラギンがグルタミン（これは次に、受容体グルタミンとしての役割を果たす）によって置換されるような修飾を含むことができる。従って、抗体はＱ２９５ＸおよびＮ２９７Ｑ置換を有する定常領域を有するであろう（Ｑ２９５Ｘ  Ｎ２９７Ｑ変異体抗体）。ここで、Ｘはグルタミン以外の任意のアミノ酸であり、任意選択で、置換は非負荷電アミノ酸である。
【０１５６】
別の例では、受容体グルタミン（例えば、重鎖残基２９５に天然に存在するグルタミン）および残基２９７（ＥＵ番号付け）のアスパラギンを有する抗体は、Ｆｃドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン）の非２９７残基（位置２９７ではない残基、ＥＵ番号付け）における修飾を含み、ここで、修飾はＮ２９７連結グリコシル化を抑制する。このような抗体は、残基２９７のアグリコシル化アスパラギンと共に受容体グルタミン（例えば、残基２９５において）を有するであろう。例えば、Ｎ２９７におけるアスパラギン連結グリコシル化の排除をもたらす修飾には、残基Ｔ２９９における置換（または、任意選択で、他の残基における付加的な置換、例えば、Ｔ２９９およびＳ２９８の両方における置換）が含まれる。例えば、Ｓａｚｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５（５１）：２０１６７−２０１７２において開示される突然変異のいずれかおよび突然変異の組み合わせを参照されたい。従って、例示的な抗体はＴ２９９Ｘ置換を有する定常領域を有することができる（Ｔ２９９Ｘ変異体抗体）。ここで、Ｘはスレオニン以外のアミノ酸であり、修飾はＮ２９７連結グリコシル化を抑制する。
【０１５７】
一実施形態では、抗体は、アミノ酸配列ＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱ−Ｘ１−Ｘ２−ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ（配列番号３）を含む重鎖定常領域を含む。ここで、Ｘ１はＹ（チロシン）またはＦ（フェニルアラニン）であり、Ｘ２はＤ（アスパラギン酸）以外のアミノ酸である。任意選択で、Ｘ２は、非負荷電アミノ酸、任意の保存的な置換、正荷電側鎖を有するアミノ酸、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸、疎水性側鎖を有するアミノ酸、例えばセリンである。
【０１５８】
一実施形態では、抗体は、アミノ酸配列ＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱ−Ｘ１−ＮＳ−Ｘ２−ＹＲＶＶＳＶＬＴ（配列番号４）を含む重鎖定常領域を含み、ここでＸ１はＹまたはＦであり、Ｘ２はＴ（スレオニン）以外のアミノ酸である。
【０１５９】
一実施形態では、抗体は、アミノ酸配列−Ｊ１−Ｊ２−Ｊ３−Ｊ４−Ｑ−Ｘ１−Ｘ２−を含む重鎖定常領域（例えば、定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン）を含み、ここで、Ｑは受容体グルタミンであり、Ｊ１、Ｊ２、Ｊ３、およびＪ４の１つまたは複数（または全て）が負電荷を有するアミノ酸残基、任意選択でグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸残基（Ｄ）である限り、Ｊ１、Ｊ２、Ｊ３、およびＪ４は任意のアミノ酸であり、Ｘ１は任意のアミノ酸（例えば、Ｙ（チロシン）またはＦ（フェニルアラニン）であり、Ｘ２はＤ（アスパラギン酸）以外のアミノ酸である。任意選択で、Ｘ２は非負荷電アミノ酸、任意の保存的な置換、正荷電側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルギニン）、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸、疎水性側鎖を有するアミノ酸、例えばセリンである。一実施形態では、Ｊ１およびＪ２はそれぞれ、負電荷を有するアミノ酸残基、任意選択でグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸残基（Ｄ）であり、任意選択で、Ｊ１およびＪ２の少なくとも１つはアスパラギン酸残基である。一実施形態では、Ｊ２およびＪ３はそれぞれ、負電荷を有するアミノ酸残基、任意選択でグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸残基（Ｄ）であり、任意選択で、Ｊ２およびＪ３の少なくとも１つはアスパラギン酸残基である。一実施形態では、Ｊ３およびＪ４はそれぞれ、負電荷を有するアミノ酸残基、任意選択でグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸残基（Ｄ）であり、任意選択で、Ｊ３およびＪ４の少なくとも１つはアスパラギン酸残基である。
【０１６０】
一実施形態では、抗体は、アミノ酸配列−Ｊ１−Ｑ−Ｘ１−Ｘ２−を含む重鎖定常領域（例えば、ＣＨ２ドメイン）を含み、ここで、Ｑは受容体グルタミンであり、Ｊ１は負電荷を有するアミノ酸残基、任意選択でグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸残基（Ｄ）であり、Ｘ１は任意のアミノ酸（例えば、Ｙ（チロシン）またはＦ（フェニルアラニン）であり、Ｘ２はＤ（アスパラギン酸）以外のアミノ酸である。任意選択で、Ｘ２は、非負荷電アミノ酸、任意の保存的な置換、正荷電側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルギニン）、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸、疎水性側鎖を有するアミノ酸、例えばセリンである。一実施形態では、抗体は、アミノ酸配列−Ｊ１−Ｑ−Ｘ１−Ｘ２−を含む重鎖定常領域（例えば、ＣＨ２ドメイン）を含み、ここで、Ｑは受容体グルタミンであり、Ｊ１は負電荷を有するアミノ酸残基、任意選択でグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸残基（Ｄ）であり、Ｘ１は任意のアミノ酸（例えば、Ｙ（チロシン）またはＦ（フェニルアラニン）であり、Ｘ２は正荷電側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルギニン）である。一実施形態では、抗体は、アミノ酸配列−Ｊ１−Ｊ２−Ｊ３−Ｊ４−Ｑ−Ｘ１−Ｘ２−を含むＴＧａｓｅ認識タグ（例えば、重鎖または軽鎖定常領域に挿入され、重鎖ＣＨ３ドメインのＣ末端または軽鎖ＣκまたはＣλドメインのＣ末端に融合される）を含み、ここで、Ｑは受容体グルタミンであり、Ｊ１、Ｊ２、Ｊ３、およびＪ４の１つまたは複数（または全て）が負電荷を有するアミノ酸残基、任意選択でグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸残基（Ｄ）である限り、Ｊ１、Ｊ２、Ｊ３、およびＪ４は任意のアミノ酸であり、Ｘ１は任意のアミノ酸（例えば、Ｙ（チロシン）またはＦ（フェニルアラニン）であり、Ｘ２はＤ（アスパラギン酸）以外のアミノ酸である。任意選択で、Ｘ２は、非負荷電アミノ酸、任意の保存的な置換、正荷電側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルギニン）、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸、疎水性側鎖を有するアミノ酸、例えばセリンである。一実施形態では、Ｊ１およびＪ２はそれぞれ、負電荷を有するアミノ酸残基、任意選択でグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸残基（Ｄ）であり、任意選択で、Ｊ１およびＪ２の少なくとも１つはアスパラギン酸残基である。一実施形態では、Ｊ２およびＪ３はそれぞれ負電荷を有するアミノ酸残基、任意選択でグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸残基（Ｄ）であり、任意選択で、Ｊ２およびＪ３の少なくとも１つはアスパラギン酸残基である。一実施形態では、Ｊ３およびＪ４はそれぞれ、負電荷を有するアミノ酸残基、任意選択でグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸残基（Ｄ）であり、任意選択で、Ｊ３およびＪ４の少なくとも１つはアスパラギン酸残基である。
【０１６１】
一実施形態では、抗体は、アミノ酸配列−Ｊ１−Ｑ−Ｘ１−Ｘ２−を含むＴＧａｓｅ認識タグ（例えば、重鎖または軽鎖定常領域に挿入され、重鎖ＣＨ３ドメインのＣ末端または軽鎖ＣκまたはＣλドメインのＣ末端に融合される）を含み、ここで、Ｑは受容体グルタミンであり、Ｊ１は負電荷を有するアミノ酸残基、任意選択でグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸残基（Ｄ）であり、Ｘ１は任意のアミノ酸（例えば、Ｙ（チロシン）またはＦ（フェニルアラニン）であり、Ｘ２はＤ（アスパラギン酸）以外のアミノ酸である。任意選択で、Ｘ２は非負荷電アミノ酸、任意の保存的な置換、正荷電側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルギニン）、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸、疎水性側鎖を有するアミノ酸、例えばセリンである。
【０１６２】
一実施形態では、抗体は、アミノ酸配列−Ｊ１−Ｑ−Ｘ１−Ｘ２−を含むＴＧａｓｅ認識タグ（例えば、重鎖または軽鎖定常領域に挿入され、重鎖ＣＨ３ドメインのＣ末端または軽鎖ＣκまたはＣλドメインのＣ末端に融合される）を含み、ここで、Ｑは受容体グルタミンであり、Ｊ１は負電荷を有するアミノ酸残基、任意選択でグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸残基（Ｄ）であり、Ｘ１は任意のアミノ酸（例えば、Ｙ（チロシン）またはＦ（フェニルアラニン）であり、Ｘ２は正荷電側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルギニン）である。一実施形態では、抗体は、配列番号６または８の重鎖定常領域アミノ酸配列、その少なくとも１０、２５、５０、１００のアミノ酸残基の断片、または上記の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、重鎖定常領域は、＋２位置において非アスパラギン酸残基によって隣接されたグルタミン残基を含む。任意選択で、＋２位置の残基はアスパラギン、グルタミンまたはアスパラギン酸以外のアミノ酸である。任意選択で、＋２位置の残基は非負荷電アミノ酸である。
【０１６３】
＋２位置のアスパラギン酸を欠いたこのような抗体は、大きいおよび／または疎水性部分を含むリンカーの効率的なＴＧａｓｅ媒介性結合のための基質を形成するであろう。
【０１６４】
操作された抗体は、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、部位特異的（またはオリゴヌクレオチド介在性）変異誘発による作製（Ｃａｒｔｅｒ（１９８５）ｅｔ  ａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔ．）７７：５１−５９；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２０２５２−２０２６０）、ＰＣＲ変異誘発（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０２：６７−７０；およびＶａｌｌｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７２３−７３３）、および以前に作製したポリペプチドをコードするＤＮＡのカセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３）を含むがこれらに限定されない、様々な方法によって作製することができる。変異誘発プロトコル、キット、および試薬は市販されており、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）である。また単一突然変異は、ＰＣＲベースの変異誘発によりテンプレートとして二本鎖プラスミドＤＮＡを用いて、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発によって生成され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）。また組換え抗体の変異体は、制限断片操作によって、または合成オリゴヌクレオチドによるオーバーラップエクステンションＰＣＲによって構築され得る。変異原性プライマーは、システインコドン置換をコードする。このような突然変異体システインで操作された抗体をコードするＤＮＡを生成するために作製するために標準的な変異誘発技術を使用することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．，１９９３）。
【０１６５】
抗体は、既知のオリゴペプチド合成方法論を用いて化学的に合成されてもよいし、あるいは組換え技術を用いて調製および精製されてもよい。生体外タンパク質合成は手動による技術を用いて実施されてもよいし、自動化により実施されてもよい。
【０１６６】
一実施形態では、１段階ＴＧａｓｅ介在性カップリング反応（例えば、式Ｉａ、ＩｂまたはＩｃのリンカーを用いる）において使用するための抗体の作製（製造）方法が提供され、本方法は、
（ａ）（ｉ）残基２９５の受容体グルタミン残基、および（ｉｉ）位置２９７のアスパラギンを重鎖内に有する親抗体を提供するステップと、
（ｂ）残基２９５に受容体グルタミン残基を有し、位置２９７のＮ連結グリコシル化を欠いている抗体を作製するために、前記親抗体の位置２９７に存在するアスパラギンを非グルタミン残基によって置換するステップと
を含む。任意選択で、位置２９７のアスパラギンを置換するアミノ酸は、アスパラギン酸以外の残基である。任意選択で、位置２９７のアスパラギンを置換するアミノ酸は正荷電残基、例えばアルギニンである。
【０１６７】
一実施形態では、１段階ＴＧａｓｅ介在性カップリング反応（例えば、式Ｉａ、ＩｂまたはＩｃのリンカーを用いる）において使用するための抗体の作製（製造）方法が提供され、本方法は、
（ａ）（ｉ）残基２９５の受容体グルタミン残基、および（ｉｉ）位置２９９のスレオニンを重鎖内に有する親抗体を提供するステップと、
（ｂ）残基２９５に受容体グルタミン残基を有し、位置２９７のＮ連結グリコシル化を欠いている抗体を作製するために、前記親抗体の位置２９９のスレオニンを修飾する（例えば、別のアミノ酸で置換する）ステップと
を含む。
【０１６８】
一実施形態では、１段階ＴＧａｓｅ介在性カップリング反応（例えば、式Ｉａ、ＩｂまたはＩｃのリンカーを用いる）において使用するための抗体の作製（製造）方法が提供され、本方法は、
（ａ）（ｉ）残基２９５のグルタミン残基、および（ｉｉ）位置２９７のアスパラギンを重鎖内に有する親抗体を提供するステップと、
（ｂ）受容体グルタミン残基を有し、残基２９７のＮ連結グリコシル化を欠いており、位置２９５の受容体グルタミンを欠いている抗体を作製するために、前記親抗体の位置２９５に存在するグルタミンを任意のアミノ酸（例えば、非グルタミン、保存的な置換、セリン、グリシン、アスパラギン、スレオニン以外）によって置換し、位置２９７のアスパラギンをグルタミンによって置換するステップと
を含む。
【０１６９】
本方法は、任意選択で、（ｃ）ＴＧａｓｅの存在下、適切な条件下で、ステップ（ｂ）の抗体を式Ｉの化合物（例えば、式Ｉａ、ＩｂまたはＩｃの化合物）と反応させ、その結果式ＩＩ、ＩＶａまたはＩＶｂの抗体が形成されるステップをさらに含んでいてもよい。
【０１７０】
一実施形態では、グルタミン操作抗体の作製（製造）方法が提供され、本方法は、
（ａ）グルタミン操作された抗体を作製するために、１つまたは複数の受容体グルタミン残基を親抗体に導入するステップと、
（ｂ）ＴＧａｓｅの存在下、適切な条件下で、グルタミン操作抗体を式Ｉの化合物（例えば、式Ｉａ、ＩｂまたはＩｃの化合物）と反応させ、その結果式ＩＩ、ＩＶａまたはＩＶｂの抗体が形成されるステップと、
を含む。
【０１７１】
グルタミン操作抗体の作製方法のステップ（ａ）は、
（ｉ）グルタミン操作抗体をコードする核酸配列を変異誘発することと、
（ｉｉ）グルタミン操作抗体を発現させることと、
（ｉｉｉ）グルタミン操作抗体を単離および精製することと
を含み得る。
【０１７２】
１つの例では、癌抗原は、様々な癌で発現されることが見出されているヒトＬ１−ＣＡＭ（ＣＤ１７１；Ｌ１細胞接着分子）である（例えば、Ｋａｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ，（２０１１）Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６（１），１３８−１４４を参照）。Ｌ１−ＣＡＭヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０２４００３．２およびＮＰ＿０７６４９３．１で開示されており、その開示は参照によって援用される。使用に適した抗Ｌ１−ＣＡＭ抗体の一例はｃｈＣＥ７由来の抗体であり、例えば配列番号１で示されるｃｈＣＥ７重鎖からのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２および−Ｈ３）を含む重鎖と、配列番号２で示されるｃｈＣＥ７重鎖からのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２および−Ｌ３）を含む軽鎖とを有し、任意選択で、前記ＣＤＲのいずれかは、抗体がＬＩ−ＣＡＭに対する特異的な結合を保持する限り、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸修飾をさらに含む。ｃｈＣＥ７は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合されたマウスＶＬおよびマウスＶＨで構成される（例えば、Ｊｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，４９，９９９５−９９９７を参照）。ｃｈＣＥ７は、任意選択で、オーバーラッピングポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）および標準分子生物学技術を用いてｃｈＣＥ７重鎖のＣＨ２ドメインに導入された特異的突然変異を含み（Ｑ２９５ＮおよびＮ２９７Ｑ変異体）、位置２９５および２９７に受容体グルタミンを有するｃｈＣＥ７  Ｎ２９７Ｑ変異体、および位置２９７に受容体グルタミンを有するｃｈＣＥ７ａｇｌＱ２９５Ｎ、Ｎ２９７Ｑ変異体が含まれる。
【０１７３】
例示的なヒト化ＣＥ７抗体は、配列番号１の残基３１〜３５に相当するＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１の残基５０〜６６に相当するＣＤＲ−Ｈ２配列、および配列番号１の残基９９〜１０９に相当するＣＤＲ−Ｈ３配列を含むＶＨドメインを含み、任意のＣＤＲは、任意選択で、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。例示的なヒト化ＣＥ７抗体は、同様または代替的に、配列番号２の残基２４〜３４に相当するＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号２の残基５０〜５６に相当するＣＤＲ−Ｌ２配列、および配列番号２の残基８９〜９５（または８９〜９７）に相当するＣＤＲ−Ｌ３配列を含むＶＬドメインを含んでいてもよく、任意のＣＤＲは、任意選択で、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。
【０１７４】
抗体の断片および誘導体（これらは、本出願で使用される場合、他に記載されない限り、あるいは文脈によって明確に否定されない限り「抗体（単数）」または「抗体（複数）」という用語により包含される）は、当該技術分野において知られている技術によって作製することができる。「断片」は、インタクト抗体の一部、通常、抗原結合部位または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体；（１）単鎖Ｆｖ分子と、（２）１つの軽鎖可変ドメインだけを含有する単鎖ポリペプチド、またはその断片（軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有し、関連の重鎖部分を含まない）と、（３）１つの重鎖可変領域だけを含有する単鎖ポリペプチド、またはその断片（重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有し、関連の軽鎖部分を含まない）とを含むがこれらに限定されない、近接するアミノ酸残基の中断されない１つの配列（本明細書では「単鎖抗体断片」または「単鎖ポリペプチド」と称される）からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片；ならびに抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。特に、ナノボディ、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体または「ｄＡｂ」が含まれる。
【０１７５】
抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡは、断片をコードするように修飾されてもよい。修飾ＤＮＡは次に発現ベクターに挿入され、適切な細胞を変換またはトランスフェクトするために使用され、その後、細胞は所望の断片を発現する。
【０１７６】
断片は、−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ部分（および任意選択でさらに、Ｖおよび／またはＹ部分）、任意選択でさらにＲまたはＲＲ’部分）を介して、対象の部分Ｚ、例えばポリマー分子、薬物、放射性部分に共有結合された一般に少なくとも１つ、２つ、またはそれ以上グルタミン残基に共有結合され得る可変領域ドメインを含み得る。可変領域は、超可変領域またはＣＤＲ配列、およびＦＲ配列を含むであろう。
【０１７７】
グルタミン残基の位置は、必要とされる抗体断片のサイズおよび性質に従って変更され得る。従って、１つの極端な例では、式Ｉのリシンベースのリンカーに結合される予定の受容体グルタミン残基は、可変領域ドメインのＣ末端アミノ酸に直接取り付けられてもよい。これは、例えば、上記のようにＶＨまたはＶＬ鎖のＣ末端であり得る。所望される場合、この例において、さらなる受容体グルタミン残基を含むさらなるアミノ酸が、第１のグルタミン残基のＣ末端に共有結合されてもよい。１つの例では、１つまたは複数の非グルタミン残基を含み、その後に受容体グルタミン残基（受容体グルタミン残基はタグの非グルタミン残基に対してＣ末端である）を含むペプチド「タグ」は、可変領域ドメインのＣ末端アミノ酸に直接取り付けられる。１つの例では、１つまたは複数のグルタミン残基を含み、その後に１つまたは複数の非グルタミン残基（非グルタミン残基は、タグ内のグルタミン残基に対してＣ末端である）を含むペプチド「タグ」は、可変領域ドメインのＣ末端アミノ酸に直接取り付けられる。ペプチドタグは任意の適切な長さを有することができ、例えば、タグは２〜５０の間、好ましくは２〜２０の間、または２〜１０の間のアミノ酸残基を含み得る。
【０１７８】
しかしながら、実際には、可変領域ドメインは、１つまたは複数の受容体グルタミン残基を含むか取り付けられた少なくとも１つの他の抗体ドメインまたはその断片に対してＣ末端アミノ酸で共有結合されることが、一般に好ましい。従って、例えば、ＶＨドメインが可変領域ドメインに存在する場合、これは、免疫グロブリンＣＨ１ドメインまたはその断片に連結され得る。同様に、ＶＬドメインはＣＫドメインまたはその断片に連結され得る。このようにして、例えば、断片はＦａｂ断片であってもよく、抗原結合ドメインは、そのＣ末端でそれぞれＣＨ１およびＣＫドメインに共有結合された関連のＶＨおよびＶＬドメインを含有する。ＣＨ１ドメインはさらなるアミノ酸で伸長されて、例えば、Ｆａｂ’断片で見られるようなヒンジ領域ドメインを提供する、あるいは抗体ＣＨ２およびＣＨ３ドメインなどのさらなるドメインを提供することができる。１つの例では、１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６）の非グルタミン残基を含み、その後にグルタミン残基（グルタミン残基は、タグ内の非グルタミン残基に対してＣ末端である）を含むポリペプチド「タグ」は、完全または切断型ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸に、あるいは完全または切断型ＣＫドメインのＣ末端アミノ酸に直接取り付けられる。１つの例では、１つまたは複数のグルタミン残基を含み、その後に１つまたは複数の非グルタミン残基（非グルタミン残基は、タグ内のグルタミン残基に対してＣ末端である）を含むポリペプチド「タグ」は、完全または切断型ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸に、あるいは完全または切断型ＣＫドメインのＣ末端アミノ酸に直接取り付けられる。
【０１７９】
本開示は、可変領域ドメインがモノマーであり、免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）可変ドメインを含むか、あるいは二量体であり、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＬダイマーを含有する抗体断片を提供する。ここで、ＶＨおよびＶＬ鎖は非共有結合で結合されても、共有結合されてもよく、断片（すなわち、ＶＬおよび／またはＶＨ）は、−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ部分（および任意選択でさらに、Ｖおよび／またはＹ部分、任意選択でさらにＬ’、Ｖ’、Ｙ’、および（ＲＲ’）部分）を介して、対象の部分Ｚ、例えばポリマー分子、薬物、放射性部分に共有結合される。好ましくは、各ＶＨおよび／またはＶＬドメインは、Ｃ末端アミノ酸において、少なくとも１つの他の抗体ドメインまたはその断片に共有結合される。
【０１８０】
一実施形態では、本開示は、重鎖および軽鎖を含む一価の抗体断片を提供し、ここで、前記重鎖はそのＣ末端でＣＨ１ドメインに共有結合されたＶＨドメインからなり；前記軽鎖は、そのＣ末端でＣＬドメインに共有結合された、ＶＨドメインに相補的なＶＬドメインからなり；前記ＣＨ１ドメインは、グルタミン残基を含むヒンジドメインを提供するために含み（例えば、ＣＨ１は伸長される）；そしてヒンジドメイン内のグルタミン残基は−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ部分を介して共有結合される。別の実施形態では、本開示は、重鎖および軽鎖を含む一価の抗体断片を提供し、ここで、前記重鎖はそのＣ末端でＣＨ１ドメインに共有結合されたＶＨドメインからなり；前記軽鎖は、そのＣ末端でＣＬドメインに共有結合された、ＶＨドメインに相補的なＶＬドメインからなり；前記ＣＬドメインは、グルタミン残基を含むヒンジドメインを提供するために含み（例えば、ＣＬは伸長される）；そしてヒンジドメイン内のグルタミン残基は−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ部分を介して共有結合される。
【０１８１】
一実施形態では、抗体断片は、−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ部分を介してポリマー（例えば、ＰＥＧ含有）に連結される。
【０１８２】
リシンベースのリンカー
本開示の特定の態様は、ＴＧａｓｅの作用により、ポリペプチド、例えば抗体（Ａｂ）の配列内のグルタミン残基（Ｑ）においてポリペプチドに取り付けることができる連結試薬に関する。連結試薬は、抗体上の受容体グルタミンへの結合のためのＴＧａｓｅ基質としての役割を果たす第１級アミン、例えば、少なくとも１つの反応基（Ｒ）に接続されるリシン誘導体（Ｌｙｓ）（リシンアミノ酸残基またはその機能的等価物を含むがこれらに限定されない）を含有する。一実施形態では、対象の部分（Ｚ）、および任意選択で１つまたは複数の他の基が連結試薬に取り付けられる。一実施形態では、多段階結合プロセスで使用するために、複数の反応基、好ましくは非相補的反応基を連結試薬に取り付けることができる。反応基は、好ましくは、水に対して非感受性であるが、相補的試薬による非常に高転換の付加反応を選択的に受ける官能性である。
【０１８３】
リシン誘導体は２〜２０アルキルまたはヘテロアルキル鎖、またはその機能的等価物でよく、アルキルまたはヘテロアルキル鎖の１つまたは複数の末端に位置するＨ２Ｎ、Ｈ２ＮＯＣＨ２、Ｈ２ＮＣＨ２（アミノメチレン）基または保護Ｈ２Ｎ、Ｈ２ＮＯＣＨ２、Ｈ２ＮＣＨ２基を有する。ヘテロアルキル鎖は３〜２０個の原子鎖でよく、１つまたは複数の非末端原子は炭素以外、例えば酸素、硫黄、窒素、または他の原子であり得る。酸素、硫黄、または窒素原子は、炭素鎖内のエーテル、エステル、チオエーテル、チオエステル、アミノ、アルキルアミノ、アミドまたはアルキルアミド官能性のものであり得る。
【０１８４】
ヘテロアルキル鎖は、オリゴ（エチレンオキシド）鎖であり得る。アルキルまたはヘテロアルキル鎖内の官能性は、反応基をＨ２Ｎ、Ｈ２ＮＯＣＨ２、Ｈ２ＮＣＨ２基または保護Ｈ２Ｎ、Ｈ２ＮＯＣＨ２、Ｈ２ＮＣＨ２基にカップリングさせるために含有され得る。アルキルまたはヘテロアルキル鎖は置換または非置換であり得る。置換基は、アルキル基、アリール基、アルキルアリール基、カルボン酸基、アミド基、ヒドロキシ基、またはタンパク質のグルタミン残基との結合に対してアミノ基と競合しない、あるいは阻害しない任意の他の基であり得る。通常、置換基が存在する場合、その存在は、リシン誘導体をもたらすリシンのカルボン酸基などの便利な出発材料内にある。アルキルまたはヘテロアルキル鎖のＨ２Ｎ、Ｈ２ＮＯＣＨ２、Ｈ２ＮＣＨ２末端は必然的に連結試薬内に含まれる。
【０１８５】
リシンの機能的等価物のための例示的な出発材料は、α，ω−ジアミノアルカン、例えば、１，２−ジアミノエタン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン、１，８−ジアミノオクタン、１，９−ジアミノノナン、１，１０−ジアミノデカン、１，１１−ジアミノウンデカン、または１，１２−ジアミノドデカンであり得る。リシン誘導体の機能的等価物のための他の出発材料は、α，ω−ジアミノオリゴ（エチレンオキシド）、例えば、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２（式中、ｘは１〜約６である）であり得る。α，ω−ジアミノオリゴ（エチレンオキシド）は単一のオリゴマーであってもよいし、あるいはオリゴマーの混合物であってもよく、この場合、ｘは平均サイズを定義する。例示的な保護Ｈ２ＮＣＨ２は、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（５−アミノペンチル）カルバマートのｔｅｒｔ−ブチルカルバマート保護アミン（Ｎ−Ｂｏｃ−カダベリン）である。
【０１８６】
連結試薬、その薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはタンパク質が結合した連結試薬は、一般式ＩａまたはＩｂを含むことができる。式Ｉａ（Ｚ基を有する）およびＩｂ（Ｒ基を有する）は次のように示されるか、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物である：
Ｇ−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｚ）ｚ）ｑ）ｒ      式Ｉａ、
Ｇ−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｒ）ｚ）ｑ）ｒ      式Ｉｂ。
式中、
Ｇは、Ｈ、アミン保護基、またはアミド結合を介して取り付けられた免疫グロブリン（Ａｂ）もしくは他のタンパク質であり、
（Ｃ）ｎは置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、任意選択で、窒素に隣接する炭素は非置換であり、任意選択で、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミド（例えば、エーテル、エステル、チオエーテル、チオエステル、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドのＯ、ＮまたはＳ原子を有する）によって置換されており、
ｎは、２〜２０、好ましくは３〜６の範囲の中から選択される整数であり、
ＸはＮＨ、Ｏ、Ｓであるか、または存在せず、
Ｌは結合であるか、または１つまたは複数の原子において置換された１〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、任意選択で、炭素含有フレームワークは、線状炭化水素、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、もしくはオリゴペプチド、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、または任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）であり、
ｒは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｑは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｚは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
Ｖは独立して、存在しないか、結合または結合の連続（Ｌが結合である場合）であるか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、任意選択で、事前の条件的変換に続いて、化学的、光化学的、物理的、生物学的、または酵素的プロセスによって切断または変換され得る（例えば、Ｖの切断は、後でまたは最終的にＶに連結される１つまたは複数の部分、例えばＺ部分の放出を最終的にもたらす）。いくつかの実施形態では、Ｖは、「Ｖ部分」という表題の以下のセクションに記載されるように、好ましくは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、またはオリゴペプチドであり、
Ｙは独立して、存在しないか、結合もしくは結合の連続（Ｖが結合または結合の連続である場合）であるか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系（例えば、自己脱離性スペーサー系または非自己脱離スペーサー系）であり、
Ｚは、薬物動態学的特性を改善する部分、治療的部分または診断的部分であり、
Ｒは反応性部分であり、好ましくは、非保護または保護チオール、マレイミド、ハロアセトアミド、ｏ−ホスフェン芳香族エステル、アジド、フルミナート、アルキン、シアニド、アントラセン、１，２，４，５−テトラジン、ノルボルネン、その他の染色または別の方法で電子的に活性化されたアルケン、任意選択で、保護または非保護アミン（Ｘが存在せず、かつＬ、Ｖ、またはＹが結合または結合の連続以外である場合）を含む部分である。代替の実施形態では、Ｒは、反応性部分、好ましくは、非保護または保護チオール、非保護または保護アミン、マレイミド、ハロアセトアミド、ｏ−ホスフェン芳香族エステル、アジド、フルミナート、アルキン、シアニド、アントラセン、１，２，４，５−テトラジン、ノルボルネン、その他の染色または別の方法で電子的に活性化されたアルケンを含む部分であるが、ただし、ｎ＝５かつＸ、Ｌ、ＶおよびＹが存在しない場合にはＲがアミンではないことを条件とする。任意選択で、ｎ＝４かつＸ、Ｌ、ＶおよびＹが存在しない場合、Ｒはアミンではない。式Ｉｂの化合物中に２つ以上のＲ基が存在する場合、Ｒ基は、好ましくは、どのＲ基も任意の他のＲ基に対する相補的試薬でないように適合性であり得る。
【０１８７】
（Ｃ）ｎ基は、例えば、直鎖、分枝状および／または環状Ｃ２〜３０アルキル、Ｃ２〜３０アルケニル、Ｃ２〜３０アルキニル、Ｃ２〜３０ヘテロアルキル、Ｃ２〜３０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜３０ヘテロアルキニルでよく、任意選択で、１つまたは複数の単素環芳香族化合物ラジカルまたは複素環化合物ラジカルが挿入されてもよく、特に、任意の直鎖または分枝状Ｃ２〜５アルキル、Ｃ５〜１０アルキル、Ｃ１１〜２０アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜５アルキル、−Ｏ−Ｃ５〜１０アルキル、−Ｏ−Ｃ１１〜２０アルキル、ＣＨ２−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）１〜１２−ＣＨ２または（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）１〜１２、アミノ酸、オリゴペプチド、グリカン、スルファート、ホスファートまたはカルボキシラートである。
【０１８８】
１つの例では、（Ｃ）ｎ基は、１つまたは複数のＯ原子によって置換された炭素含有フレームワークである。一実施形態では、窒素に隣接する炭素は、Ｏ原子によって置換される。一実施形態では、窒素に隣接する炭素は非置換である。一実施形態では、（Ｃ）ｎ基は、エチレンオキシド基、例えば、ＣＨ２−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２基または（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ（式中、ｎは１〜１０の整数である）であるか、またはこれらを含む。
【０１８９】
Ｌ基は炭素含有フレームワークであることができ、ここで、Ｌは線状炭化水素、対称または非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状または分枝状オリゴ糖（非対称分枝状または対称分枝状）、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、またはオリゴペプチド、他の天然オリゴマー、  任意の連鎖成長または逐次成長重合プロセスから得られる二量体、三量体、またはより多量体のオリゴマー（線状非対称分枝状または対称分枝状）である。例えば、Ｌは直鎖、分枝状および／または環状Ｃ２〜３０アルキル、Ｃ２〜３０アルケニル、Ｃ２〜３０アルキニル、Ｃ２〜３０ヘテロアルキル、Ｃ２〜３０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜３０ヘテロアルキニルを含むか、あるいはこれらでよく、任意選択で、１つまたは複数の単素環芳香族化合物ラジカルまたは複素環化合物ラジカルが挿入されてもよく、特に、任意の直鎖または分枝状Ｃ２〜５アルキル、Ｃ５〜１０アルキル、Ｃ１１〜２０アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜５アルキル、−Ｏ−Ｃ５〜１０アルキル、−Ｏ−Ｃ１１〜２０アルキル、ＣＨ２−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）１〜３０−ＣＨ２または（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）１〜３０、例えば、（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）１２、（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）１〜２４、アミノ酸、オリゴペプチド、グリカン、スルファート、ホスファート、カルボキシラートである。任意選択で、Ｌは存在しない。
【０１９０】
Ｌ、Ｖおよび／またはＹは、それぞれＶ、Ｙ、およびＺまたはＲ基のための取り付け部位をｒ、ｑおよび／またはｚ個有し、ここで、ｒおよびｑは分枝または重合の度合いを表す。取り付け部位は結合を含むこともできるし、あるいはアルケン、アルキン、エーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミン、アミド、アルキルアミド、または縮合もしくは付加反応によって容易に生成される他の官能基から選択される官能基を含むこともできる。
【０１９１】
１つの例では、Ｌ基の炭素含有フレームワークは、１つまたは複数のＯ原子によって任意選択で置換される。一実施形態では、Ｌ基は、１つまたは複数のエチレンオキシド基（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）を含む。任意選択で、Ｌ基は、（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ基を含む炭素フレームワークを含み、ここで、ｎは１〜１０の範囲の中から選択される整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）である。
【０１９２】
式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＶａおよびＩＶｂにおいて、連結基Ｌは、任意選択で１つまたは複数のＶおよび／またはＹ部分（存在する場合）を介して、アミノペプチジル部分−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘを反応基ＲまたはＺに連結する。Ｌは、Ｖ、Ｙ、ＲまたはＺを直接アミノペプチジル部分に接続する結合であってもよい。しかしながら、別の態様では、Ｌは、１つまたは複数の部分Ｖおよび／またはＹ反応性部分Ｒまたは対象の部分（Ｚ）を機能的に連結または離間させる連結基である。式Ｉｂ、Ｉｃ、ＩＩおよびＩＶｂにおいて、スペーシングはＢＴＧａｓｅカップリングの効率および完了を改善し、さらに、例えば、反応性部分がリシンベースのリンカー上に存在し、抗体にカップリングされ、そして反応パートナーと接触される場合に、反応性部分Ｒが反応パートナーにより近づき易くさせる。式ＩａおよびＩＶａにおいて、連結基Ｌは、任意選択で１つまたは複数のＶおよび／またはＹ部分（存在する場合）を介して、アミノペプチジル部分−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘを対象の部分（Ｚ）に連結する。Ｌは、Ｖ、ＹまたはＺを直接アミノペプチジル部分に接続する結合であってもよい。しかしながら、別の態様では、Ｌは、１つまたは複数の部分Ｖおよび／またはＹ反応性部分Ｚを機能的に連結または離間させる連結基である。式ＩａおよびＩＶａにおいて、スペーシングは、ＢＴＧａｓｅカップリングの効率および完了を改善し、高度に均質な化合物を提供する。式ＩＶａまたはＩＶｂの機能化受容体グルタミンを含む抗体において、スペーシングは、より優れたＶのアクセシビリティも提供することができ、これは、Ｖの酵素切断または変換の場合にＶが変換および／または切断される速度を改善し得る。
【０１９３】
Ｌおよび（Ｃ）ｎ基は、使用されるリンカーの全体構造に基づいて構成することができる。特に、本開示の多段階方法が使用され、リンカー（例えば、式Ｉａ、ＩｂまたはＩｃのリンカー）が大きい、荷電または疎水性部分（例えば、環状、多環式または巨大環状部分）を含まないまたは包含しない場合、Ｌ基は結合またはより短い炭素フレームワークであり得る。たとえば、Ｌは、非置換であるかまたは１つもしくは複数の原子において任意選択で置換された１、２、３、４、５、または６個の線状炭素原子の炭素フレームワークを表す、または含むことができる。好ましくは、Ｌがさらに他の基を含む場合、５〜２０個の線状炭素原子は、（Ｃ）ｎ基、または存在する場合にはＸ基に隣接され得る。
【０１９４】
リンカー（例えば、式Ｉａ、ＩｂまたはＩｃのリンカーまたは式ＩＩ、ＩＶａまたはＩＶｂの抗体）が大きい、荷電または疎水性部分（例えば、環状、多環式または巨大環状部分）を含む場合、例えば、Ｖ、Ｙおよび／またはＺが大きい、荷電または疎水性部分（例えば、環状、多環式または巨大環状部分）を含む場合、Ｌ基はより長い炭素フレームワークであり得る。例えば、Ｌは、
ａ）１つまたは複数の原子において任意選択で置換された２〜３０個の線状炭素原子、
ｂ）１つまたは複数の原子において任意選択で置換された２〜１５個の線状炭素原子、
ｃ）１つまたは複数の原子において任意選択で置換された５〜２０個の線状炭素原子、
ｄ）１つまたは複数の原子において任意選択で置換された５〜３０個の線状炭素原子、
ｅ）１つまたは複数の原子において任意選択で置換された５〜１５個の線状炭素原子、または
ｆ）１つまたは複数の原子において任意選択で置換された４、５または６個の線状炭素原子
の炭素フレームワークを表す、または含むことができる。
【０１９５】
好ましくは、５〜２０個の線状炭素原子は、（Ｃ）ｎ基（の連続）、または存在する場合にはＸ基に隣接し得る。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、Ｌは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１〜６アルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｌは、Ｃ１〜６アルコキシ−Ｃ１〜６アルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｌは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１〜６アルコキシ−Ｃ１〜６アルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｌは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１０〜２０アルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｌは、Ｃ１〜６アルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｌは、Ｃ１０〜２０ルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｌは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｌは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ２〜２０アルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｌは、−（Ｃ＝Ｏ）−基である。いくつかの実施形態では、Ｌは、
−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｓ−
【化２】
0006744212.tif 000003
−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ５−Ｓ−
【化３】
0006744212.tif 000004
−ＣＨ２−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）４−ＣＨ２−Ｓ−
【化４】
0006744212.tif 000005
の中から選択される。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸またはジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドもしくはオリゴペプチドであるか、またはこれらを含む。いくつかの実施形態では、Ｌは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、およびシトルリンの中から選択される。
【０１９８】
本開示の化合物のいずれか（例えば、式Ｉ、ＩＩおよび／またはＩＶのずれか）において、連結要素（Ｌ）は、任意選択で、少なくとも２．８オングストローム、３オングストローム、４オングストローム、５オングストローム、１０オングストローム、１５オングストローム、１８オングストローム、３０オングストローム、４０オングストロームまたは６０オングストロームの鎖長を有すると特徴付けることができる。任意選択で、Ｌは、１００オングストローム以下、任意選択で６０オングストローム以下の長さを有する。任意選択で、Ｌは、２．８、３、４、５、１０、２０または３０オングストローム〜６０オングストロームの間の長さを有すると特徴付けられる。任意選択で、Ｌは、２．８〜１９オングストロームの間、または４〜１９オングストロームの間の長さを有すると特徴付けられる。
【０１９９】
式Ｉａの化合物の例としては、本明細書中の表２に示される（Ｃ）ｎ、Ｘ、Ｌ、Ｖ、ＹおよびＺ基を有する化合物が挙げられるが、これらに限定されない。式Ｉｂの化合物の例としては、本明細書中の表３に示される（Ｃ）ｎ、Ｘ、Ｌ、Ｖ、ＹおよびＲ基を有する化合物が挙げられるが、これらに限定されない。（Ｓ）で示される表３中のＲ基は、保護反応基として存在する場合にはＳ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３でもあり得る。表中の記号（−）は、特定のＸ、Ｌ、ＶまたはＹ部分が存在しないことを示す。ＶおよびＹ基は、例えば、本明細書中の「Ｖ部分」および「Ｙ部分」という表題のセクションの任意の構造特徴を含むことができる。表２および３のそれぞれにおいて表される式ＩａおよびＩｂのＬ、Ｖおよび／またはＹ基は、それぞれＶ、Ｙ、およびＲまたはＺ基のための取り付け部位をｒ、ｑ、および／またはｚ個有することができ、ここで、ｒおよびｑは分枝または重合の度合いを表し、ｒ、ｑ、および／またはｚは、１、２、３または４から選択することができる。
【０２００】
化合物は、２つ以上のＬ部分を含有し得る。任意のＬ’部分は、Ｌ部分と同じようにして定義することができる。Ｌ部分は同一であっても同一でなくてもよい。Ｌが式（Ｉ）〜（ＶＩ）の化合物の水溶性に寄与するように、連結基Ｌは水溶性部分であってもよいし、あるいは１つまたは複数の水溶性部分を含有していてもよい。またＬは凝集を低減する部分であってもよいし、あるいは凝集を低減する１つまたは複数の部分を含有していてもよく、これらの部分は水溶性も増大させる部分であってもよいしそうでなくてもよい。
【０２０１】
Ｌは、例えば、線状リンカーまたは分枝状リンカーであり得る。１つの態様では、少なくとも２つ、３つ、４つまたはそれ以上のＶ、ＹまたはＲ部分（または適用可能な場合にはＺ）に接続できるように、Ｌ部分は分枝構造、任意選択でさらに樹状構造である。しかしながら、各Ｖ−Ｙ部分はＬ部分に一回だけ取り付けられる。分枝は、１つまたは複数の分枝原子（例えば、炭素、窒素、ケイ素、またはリンであり得る）において生じることができる。
【０２０２】
リシンベースのリンカーがＬ内に分枝を含む場合、Ｖおよび／またはＹに接続されるＬ内の分枝の数は、一般に、反応に利用可能な分枝の総数に等しくなるように調製されるであろう。すなわち、リシンベースのリンカーの調製において、化学的な転換は、好ましくは、完了するまで実行され、それにより、部位特異的なＴＧａｓｅ介在性の結合アプローチによって提供される制御された化学量論が保持されるであろう。従って、好ましくは、Ｌが分枝状である場合、抗体（または調製中のリシンベースのリンカー）の混合物の成分が、実質的に全て同じｒ値を有するように、化合物は、各Ｌ、ＶまたはＹがＲまたはＺ部分に接続されるように機能化されるであろう。例えば、抗体またはリシンベースのリンカーの９０％、９５％、９８％は同じｒ値を有することが指定され得る。一実施形態では、Ｌは、線状リンカーである。別の実施形態では、Ｌは分枝状リンカーである。
【０２０３】
本明細書に開示されるＬ部分の任意の１つは、式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、ＩＩ、ＩＶａ、およびＩＶｂにおいて使用され得る。本明細書に記載されるＬ部分の任意の１つは、本明細書に記載される（Ｃ）ｎ、Ｘ、Ｖ、Ｙ、Ｚ、Ｒ、Ｍ、ｚ、ｑ、およびｒ基のいずれかと組み合わせて使用することができる。本明細書に開示されるＬ’部分の任意の１つは、式ＩＩＩにおいて使用され得る。本明細書に記載されるＬ’部分の任意の１つは、本明細書に記載されるＲ’、Ｖ’、Ｙ’、Ｚ、ｚ’、ｑ’、およびｒ’基のいずれかと組み合わせて使用することができる。
【０２０４】
式Ｉａの例示的なリンカーには以下のものが含まれるが、これらに限定されない：
【化５】
0006744212.tif 000006
【化６】
0006744212.tif 000007
【化７】
0006744212.tif 000008
【０２０５】
式Ｉｂの例示的なリンカーには以下のものが含まれるが、これらに限定されない：
【化８】
0006744212.tif 000009
【０２０６】
反応性部分Ｒ
Ｒは反応性部分、例えば、非保護または保護された生体直交型反応に適合性の反応基、例えば、非保護または保護チオール、エポキシド、マレイミド、ハロアセトアミド、ｏ−ホスフェン芳香族エステル、アジド、フルミナート、スルホン酸エステル、アルキン、シアニド、アミノ−チオール、カルボニル、アルデヒド、オキシムおよびヒドラジンの形成が可能な一般的に任意の基、１，２，４，５−テトラジン、ノルボルネン、その他の染色または別の方法で電子的に活性化されたアルケン、置換または非置換シクロアルキン、生体直交型環化付加反応により形成する一般的に任意の反応基、１，３−または１，５−二置換トリアゾール、逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応により反応することができる任意のジエンまたは歪んだアルケンジエノフィル、保護または非保護アミン、カルボン酸、アルデヒド、またはオキシアミンを含む部分である。
【０２０７】
式の化合物中に２つ以上のＲ基が存在する場合、Ｒ基は、好ましくは、どのＲ基も任意の他のＲ基に対する相補的試薬でないように適合性であり得る。式Ｉ〜ＩＶのＬ、Ｖおよび／またはＹ基は、それぞれＶ、Ｙ、およびＲ基のための取り付け部位をｒ、ｑおよび／またはｚ個有することができ、ここで、ｒおよびｑは分枝または重合の度合いを表す。取り付け部位は結合を含むこともできるし、あるいはアルケン、アルキン、エーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミン、アミド、アルキルアミド、または縮合もしくは付加反応によって容易に生成される他の官能基から選択される官能基を含むこともできる。
【０２０８】
連結試薬の反応基は、治療的部分、診断的部分、または所望の機能のための任意の他の部分を含む薬剤に取り付けられた相補的反応基と共に、例えば、チオ−マレイミド（またはハロアセトアミド）付加、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション、Ｈｕｉｓｇｅｎ１，３−環化付加（クリック反応）、またはＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環化付加を受けるように選択することができる。
【０２０９】
任意選択で、２つ以上の適合性反応基が連結試薬に取り付けられ得る。
【０２１０】
一実施形態では、反応基はハロアセトアミド（例えば、ブロモ−アセトアミド、ヨード−アセトアミド、クロロ−アセトアミド）である。このような反応基は、マレイミド基による場合よりも生体内（および血清中）で安定であろう。
【０２１１】
一実施形態では、反応基は、「クリック」反応を受けることが可能な試薬である。例えば、１，３−双極子機能性化合物は環化反応においてアルキンと反応して、好ましくは触媒（例えば、Ｃｕ（Ｉ））を実質的に添加せずに、複素環化合物を形成することができる。少なくとも１つの１，３−双極子基が取り付けられた様々な化合物（３個の原子にわたって非局在化された４個の電子を含有する３原子π電子系を有する）は、本明細書に開示されるアルキンと反応させるために使用することができる。例示的な１，３−双極子基は、アジド、ニトリルオキシド、ニトロン、アゾキシ基、およびアシルジアゾ基を含むが、これらに限定されない。
【０２１２】
例としては、ｏ−ホスフェン芳香族エステル、アジド、フルミナート、アルキン（任意の歪んだシクロアルキンを含む）、シアニド、アントラセン、１，２，４，５−テトラジン、またはノルボルネン（または他の歪んだシクロアルケン）が挙げられる。
【０２１３】
一実施形態では、Ｒは末端アルキンまたはアジドを有する部分であり、このような部分は、例えば米国特許第７，７６３，７３６号明細書に記載されており、その開示は参照によって本明細書中に援用される。末端アルキンおよびアジド間のクリック反応の触媒として銅（および他の金属塩）を使用するための適切な反応条件は、米国特許第７，７６３，７３６号明細書において提供される。
【０２１４】
一実施形態では、Ｒは置換または非置換シクロアルキンである。好ましくは、複素環化合物を含むシクロアルキンは、Ｌ基が存在する連結試薬、好ましくはＬが、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された３〜３０、任意選択で５〜３０または５〜１５の線状炭素原子のｎ−アルキルまたはヘテロアルキル鎖である連結試薬において使用されるであろう。任意選択で、Ｌは、（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）１〜２４基または（ＣＨ２）ｘ１−（ＣＨ２−Ｏ−−ＣＨ２）１〜２４−（ＣＨ２）ｘ２−であり、式中、ｘ１およびｘ２は独立して、０〜２０の範囲の中から選択される整数である。本明細書において示されるように、Ｌ基の存在は、シクロアルキンが使用される場合に、高度のＴＧａｓｅ介在性カップリングを可能にする。
【０２１５】
特定の化合物を含むシクロアルキンは、例えば米国特許第７，８０７，６１９号明細書に記載されており、その開示は参照によって本明細書中に援用される。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、シクロアルキンは、式Ａ：
【化９】
0006744212.tif 000010
の化合物でよく、式中、
Ｒ１は、カルボニル、アルキルエステル、アリールエステル、置換アリールエステル、アルデヒド、アミド、アリールアミド、アルキルハロゲン化物、チオエステル、スルホニルエステル、アルキルケトン、アリールケトン、置換アリールケトン、およびハロスルホニルから選択され、
Ｒ１は、三重結合によって結合される２つの炭素以外のシクロオクチン基上の任意の位置であり得る。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、修飾シクロアルキンは式Ａを有し、式中、三重結合によって結合される２つの炭素以外のシクロオクチン環中の炭素原子の１つまたは複数は、１つまたは複数の電子吸引性基、例えばハロ（ブロモ、クロロ、フルオロ、ヨード）、ニトロ基、シアノ基、スルホン基、またはスルホン酸基によって置換される。従って、例えばいくつかの実施形態では、本修飾シクロアルキンは式Ｂ：
【化１０】
0006744212.tif 000011
を有し、式中、
Ｒ２およびＲ３のそれぞれは独立して、（ａ）Ｈ、（ｂ）ハロゲン原子（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、ヨード）、（ｃ）−Ｗ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚ（ここで、ｎは１〜４の整数（例えば、ｎ＝１、２、３、または４）であり、存在する場合、ＷはＯ、Ｎ、またはＳであり、Ｚはニトロ、シアノ、スルホン酸、またはハロゲンである）、（ｄ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｗ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ４（ここで、ｎおよびｍはそれぞれ独立して１または２であり、ＷはＯ、Ｎ、Ｓ、またはスルホニルであり、ＷがＯ、Ｎ、またはＳであれば、Ｒ４はニトロ、シアノ、またはハロゲンであり、そしてＷがスルホニルであれば、Ｒ４はＨである）、または（ｅ）−ＣＨ２）ｎ−Ｒ４（ここで、ｎは１〜４の整数（例えば、ｎ＝１、２、３、または４）であり、Ｒ４はニトロ、シアノ、スルホン酸、またはハロゲンである）であり、
Ｒ１は、カルボニル、アルキルエステル、アリールエステル、置換アリールエステル、アルデヒド、アミド、アリールアミド、アルキルハロゲン化物、チオエステル、スルホニルエステル、アルキルケトン、アリールケトン、置換アリールケトンおよびハロスルホニルから選択される。Ｒ１は、三重結合によって連結される２つの炭素以外のシクロオクチン基上の任意の位置であり得る。
【０２１８】
一実施形態では、Ｒは置換または非置換の複素環式の歪んだアルキンである。特定の化合物を含むシクロアルキンは、例えば米国特許第８，１３３，５１５号明細書に記載されており、その開示は参照によって本明細書中に援用される。一実施形態では、アルキンは式Ｃ：
【化１１】
0006744212.tif 000012
を有し、式中、
各Ｒ１は独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトラート、ニトライト、スルファート、およびＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはヘテロアルキルからなる群から選択され、；
各Ｒ２は独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトラート、ニトライト、スルファート、およびＣ１〜Ｃ１０有機基からなる群から選択され、Ｘは、Ｎ−Ｒ３Ｒ４、ＮＨ−Ｒ４、ＣＨ−Ｎ−ＯＲ４、Ｃ−Ｎ−ＮＲ３Ｒ４、ＣＨＯＲ４、またはＣＨＮＨＲ４を表し、そして各Ｒ３は水素または有機基を表し、Ｒ４はリンカーの連結部分Ｃ（または（Ｃ）ｎ）を表す。一実施形態では、ＲまたはＲ’は、以下のＤＢＣＯ（ジベンジシクロオクチル）基である：
【化１２】
0006744212.tif 000013
【０２１９】
本明細書において上記したものなどのアルキンは、環化反応において少なくとも１つの１，３−双極子機能性化合物（例えば、式ＩＩＩの化合物のＲ’部分として具体化される）と反応されて、好ましくは触媒（例えば、Ｃｕ（Ｉ））を実質的に添加せずに複素環化合物を形成することができる。少なくとも１つの１，３−双極子基が取り付けられた様々な化合物（３個の原子にわたって非局在化された４個の電子を含有する３原子π電子系を有する）は、本明細書に開示されるアルキンと反応させるために使用することができる。例示的な１，３−双極子基は、アジド、ニトリルオキシド、ニトロン、アゾキシ基、およびアシルジアゾ基を含むが、これらに限定されない。
【０２２０】
反応性部分ＲはＬ、または存在する場合にはＶまたはＹに結合され、反応性部分Ｒと接触されたときに高転換の付加反応を受ける反応パートナー、例えば式ＩＩＩの相補的試薬の適切な官能基（Ｒ’）と反応することができる。式ＩＩの抗体中に反応性部分Ｒが存在する場合、反応は式ＩＶの抗体の形成をもたらす。この反応では、部分ＲおよびＲ’は部分（ＲＲ’）に変換される。任意のＲ’部分は、共に反応させる部分において使用される場合にＲおよびＲ’が相補的である限りは、Ｒ部分と同じようにして定義することができる。
【０２２１】
化合物は、２つ以上の反応性部分Ｒを含有し得る。Ｒ部分は同一であっても同一でなくてもよい。本明細書に開示されるＲ部分の任意の１つは、式ＩｂおよびＩＩにおいて使用され得る。本明細書に記載されるＲ部分の任意の１つは、本明細書に記載される（Ｃ）ｎ、Ｘ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、ｚ、ｑ、およびｒ基のいずれかと組み合わせて使用することができる。本明細書に開示されるＲ’部分の任意の１つは、式ＩＩＩにおいて使用され得る。本明細書に記載されるＲ’部分の任意の１つは、本明細書に記載されるＬ’、Ｖ’、Ｙ’、Ｚ、ｚ’、ｑ’、およびｒ’基のいずれかと組み合わせて使用することができる。
【０２２２】
図１は、チオ−マレイミド付加、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション、およびＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環化付加の反応スキームを示しており、ここで、単一の反応官能性を有する連結試薬の反応基は、治療的または診断的部分に取り付けられた相補的反応基と結合する。
【０２２３】
図２は、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環化付加およびクリック反応の反応スキームを示しており、ここで、連結試薬の反応基は、治療的部分、診断的部分、またはその他の部分を含む薬剤に取り付けられた相補的反応基と結合する。
【０２２４】
図１および２には示されていないが、連結試薬のＨ２ＮＣＨ２基は、高転換の付加反応の前に、タンパク質（例えば、抗体）のグルタミン残基との反応を受けている可能性があること、あるいはアミノメチレンが保護状態にある可能性があることは理解されるべきである。あるいは、他の実施形態では、連結試薬のＨ２ＮＣＨ２基は、高転換の付加反応の前に、タンパク質（例えば、抗体）のグルタミン残基との反応を受けているか、あるいはアミノメチレンが保護状態であってもよく、この場合、連結試薬および反応パートナーを使用して、種々のＶ、Ｙ、および／またはＺ部分を有する、抗体へ結合する準備のできたリンカーの種々の組み合わせを便利に形成することができる。
【０２２５】
１つの実施形態に従う例示的な連結試薬の調製、およびそのタンパク質との結合は図３に示されており、この場合、ＶおよびＹは存在せず、Ｒは、Ｓ−アセチル保護チオール、ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３から最終的に生成されるチオール（スルフヒドリル）反応基であり、ｒは１であり、ｑは１であり、ｚは１であり、Ｌは２つの炭素含有フレームワークＣ（Ｏ）ＣＨ２であり、ＸはＮＨであり、（Ｃ）ｎは（ＣＨ２）５であり、そしてＧは、（Ｈ３Ｃ）３ＣＯＣ（Ｏ）保護基からＨへ、そしてタンパク質のグルタミン残基の結合時には最終的にアミドへ変換される。図４は、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオエステル試薬から調製可能な単一のＳ−アセチル保護チオール反応基を有する、種々の実施形態に従う種々の例示的な連結試薬の調製を示す。Ｓ−アセチルに加えて、ｐ−ヒドロキシフェニルアシル、２−キノリン、またはヒドラジンの付加によって脱保護することができるＨｑｍおよびＨｇｍ基を含む他のＳ−保護基を使用することができる。
【０２２６】
図５は、１つの実施形態に従う例示的な連結試薬の調製、およびそのタンパク質との結合を示しており、この場合、ＶおよびＹは存在せず、Ｒはアジド反応基であり、ｒは１であり、ｑは１であり、ｚは１であり、Ｌは２つの炭素含有フレームワークＣ（Ｏ）ＣＨ２であり、ＸはＮＨであり、（Ｃ）ｎは（ＣＨ２）５であり、そしてＧは、（Ｈ３Ｃ）３ＣＯＣ（Ｏ）保護基からＨへ、そしてタンパク質のグルタミン残基の結合時には最終的にアミドへ変換される。図６は、Ｎ−スクシンイミジル−アジド試薬から調製可能な単一のアジド反応基を有する種々の例示的な連結試薬の調製を示す。
【０２２７】
図７は、本発明の実施形態に従う例示的な連結試薬の調製、およびそのタンパク質との結合を示しており、この場合、ＶおよびＹは存在せず、Ｒはアルキン反応基であり、ｒは１であり、ｑは１であり、ｚは１であり、Ｌは１つの炭素含有フレームワークＣＨ２であり、ＸはＮＨであり、（Ｃ）ｎは（ＣＨ２）４ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）であり、そしてＧは、（Ｈ３Ｃ）３ＣＯＣ（Ｏ）保護基からＨへ、そしてタンパク質のグルタミン残基の結合時には最終的にアミドへ変換される。図８は、例示的な連結試薬の調製、およびそのタンパク質との結合を示しており、この場合、Ｒはノルボルネン反応基であり、ｒは１であり、ｑは１であり、ｚは１であり、Ｌは１つの炭素含有フレームワークＣ（Ｏ）であり、ＸはＮＨであり、（Ｃ）ｎは（ＣＨ２）４ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）であり、そしてＧは、（Ｈ３Ｃ）３ＣＯＣ（Ｏ）保護基からＨへ、そしてタンパク質のグルタミン残基の結合時には最終的にアミドへ変換される。
【０２２８】
この態様に従う連結試薬と共に実行することができる選択的および非常に高転換の付加反応は、非触媒または触媒反応であり得る。例えば、２＋４Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環化付加、チオ−マレイミド（またはハロアセトアミド）付加、およびＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションは、触媒を使用せずに実行され得る。その他の非常に高転換の付加反応、例えばクリック反応のいずれかは、Ｃｕ、Ｒｕ、Ｎｉ、Ｐｄ、およびＰｔ塩などの金属塩によって触媒され得る。
【０２２９】
式ＩＶの化合物のＭ中の連結基（ＲＲ’）は、式ＩＩの反応性部分Ｒが式ＩＩＩの化合物中の反応性部分Ｒ’と反応した場合に、Ｒの残りの部分を表す。この基（ＲＲ’）は次に、部分Ｚ（例えば、式ＩＶの化合物中に含まれる）をＬ、ＶまたはＹと連結する。残存する基は結合であり得る。
【０２３０】
Ｖ部分
Ｖ部分はリシンベースのリンカーに取り込まれ得る（例えば、任意選択でＹを介してＬに接続される）。しかしながら、Ｖ部分は、その代わりに、あるいはそれに加えて、リシンベースのリンカーに結合された抗体と反応されて対象の部分Ｚに結合された抗体を形成し得る、対象の部分Ｚを含む化合物（例えば、式ＩＩＩの化合物Ｒ’−Ｖ−Ｙ−Ｚ）に取り込まれてもよい。任意のＶ’部分は、Ｖ部分と同じようにして定義することができる。
【０２３１】
Ｖ部分は、切断不能または条件的に切断可能である（任意選択で、事前の条件的変換の後に）基である。後者の場合、例えば特定の条件下の化学的、光化学的、物理的、生物学的、または酵素的プロセスによってＹまたはＺ（Ｙが存在しないときには）から変換および／または切断されるように設計される。この条件は、例えば、Ｖの加水分解をもたらす水性環境に化合物を置く、あるいはＶを認識および切断する酵素を含有する環境に化合物を置く、あるいは、Ｖの還元をもたらす還元性条件下に化合物を置く、あるいは変換および／または切断をもたらす放射線、例えばＵＶ光と化合物を接触させる、あるいは変換および／または切断をもたらす熱と化合物を接触させる、あるいは変換および／または切断をもたらす減圧下に化合物を置く、あるいは変換および／または切断をもたらす昇圧または高圧下に化合物を置くことを含み得る。この条件はさらに、化合物を動物、例えば哺乳類に投与した後に満たされてもよいし、条件は、例えば内部要因（例えば、標的特異的酵素または低酸素）の存在、または外部要因（例えば、放射線、磁場）の適用によって化合物が例えば特定の臓器、組織、細胞、細胞内標的、または微生物標的に局在化されたときに満たされてもよいし、あるいは投与すると直ぐに条件た既に満たされていてもよい（例えば、酵素）。一般に、Ｖの変換は、直接または間接的に、Ｙ、またはＺ（Ｙが存在しない場合）からのＶの切断をもたらし得る。ＶをＹまたはＺから完全に切断するために、同じまたは異なる条件を必要とする２つ以上の別々の変換および／または切断が必要とされることも起こり得る。このようにして、選択性の増大を得ることができる。化合物は、２つ以上のＶ部分を含有していてもよい。これらのＶ部分は、同一でも同一でなくてもよく、変換および／または切断のために同一条件を必要としてもしなくてもよい。
【０２３２】
Ｖは、例えば、１〜２００個の原子の炭素含有フレームワーク、任意選択で、１つまたは複数の原子において置換された少なくとも１０個の原子、例えば、１０〜１００個の原子または２０〜１００個の原子の炭素含有フレームワークを含むことができ、任意選択で、炭素含有フレームワークは線状炭化水素であるか、または環状基、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、もしくはオリゴペプチド、またはより一般的に、任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる任意の二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）を含む。
【０２３３】
一般に、Ｖは、任意の直鎖、分枝状および／または環状Ｃ２〜３０アルキル、Ｃ２〜３０アルケニル、Ｃ２〜３０アルキニル、Ｃ２〜３０ヘテロアルキル、Ｃ２〜３０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜３０ヘテロアルキニルでよく、任意選択で、１つまたは複数の単素環芳香族化合物ラジカルまたは複素環化合物ラジカルが挿入されてもよく、特に、任意の直鎖または分枝状Ｃ２〜５アルキル、Ｃ５〜１０アルキル、Ｃ１１〜２０アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜５アルキル、−Ｏ−Ｃ５〜１０アルキル、−Ｏ−Ｃ１１〜２０アルキル、または（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）１〜２４または（ＣＨ２）ｘ１−（ＣＨ２−Ｏ−−ＣＨ２）１〜２４−（ＣＨ２）ｘ２−基（ここで、ｘ１およびｘ２は独立して、０〜２０の範囲の中から選択される整数である）、アミノ酸、オリゴペプチド、グリカン、スルファート、ホスファート、またはカルボキシラートである。任意選択で、Ｖは存在しなくてよい。いくつかの実施形態では、ＶはＣ２〜６アルキル基である。
【０２３４】
１つの態様では、化合物は、１つまたは複数の治療的および／または診断的部分Ｚを標的細胞に向けるために使用される。この場合、Ｖは、例えば、標的細胞の近くまたは標的細胞の内部（例えば、腫瘍細胞）に存在する酵素によって切断される基質分子を含有し得る。Ｖは、例えば、身体の他の部分と比べて高レベルで標的細胞の近くまたは内部に存在する酵素によって、あるいは標的細胞の近くまたは内部にのみ存在する酵素によって切断される基質を含有することができる。
【０２３５】
標的細胞特異性が標的部位におけるＶの選択的変換および／または切断だけに基づいて達成される場合、切断を（最終的に）引き起こす条件は、好ましくは、少なくともある程度は、標的細胞特異的でなければならないが、化合物中の別の標的特異的部分の存在は、例えば、ある程度の特異性で抗体が標的細胞上に存在する抗原を認識する場合にはこの要求を低減または除去する。例えば、抗体が標的細胞への特異的内部移行を引き起こす場合、他の細胞内に存在する酵素もＶを変換および／または切断し得る。一実施形態では、Ｖの変換および／または切断は、細胞内で生じる。別の実施形態では、Ｖの変換および／または切断は細胞外で生じる。
【０２３６】
一実施形態では、Ｖ部分は条件的に切断可能な部分である。
【０２３７】
一実施形態では、Ｖは、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の近くまたは内部に存在するプロテアーゼ、例えばプラスミン、カテプシン、カテプシンＢ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）、またはマトリックスメタロプロテイナーゼファミリーのメンバーによって認識されるアミノ酸配列からなるジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、またはオリゴペプチドを含有する。一実施形態では、本開示は、Ｖが、天然Ｌアミノ酸、非天然Ｄアミノ酸、または合成アミノ酸、またはペプチド模倣物、またはこれらの任意の組み合わせで構成されるジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、またはオリゴペプチド部分である結合体を提供する。一実施形態では、Ｖはペプチドである。別の実施形態では、Ｖはジペプチドである。別の実施形態では、Ｖはトリペプチドである。別の実施形態では、Ｖはテトラペプチドである。さらに別の実施形態では、Ｖはペプチド模倣物である。
【０２３８】
一実施形態では、Ｖは、酵素のための基質を含有する。
【０２３９】
別の実施形態では、Ｖは、腫瘍細胞の近くまたは内部に存在するベータ−グルクロニダーゼによって認識されるベータ−グルクロニドを含有する。
【０２４０】
一実施形態では、Ｖは、細胞外酵素のための基質を含有する。別の実施形態では、Ｖは、細胞内酵素のための基質を含有する。
【０２４１】
さらに別の実施形態では、Ｖは、リソソーム酵素のための基質を含有する。
【０２４２】
さらに別の実施形態では、Ｖは、セリンプロテアーゼプラスミンのための基質を含有する。
【０２４３】
さらに別の実施形態では、Ｖは、カテプシンの１つまたは複数、例えばカテプシンＢのための基質を含有する。Ｖが細胞外で切断される場合、１つまたは複数のＺ部分が細胞外で放出され得る。これは、これらのＺ部分が、活性化部位の周囲の細胞を直接作用または検出できるだけでなく、拡散（バイスタンダー効果）のために、活性化部位からいくらかより遠くにある細胞も作用または検出できるという利点を提供し得る。
【０２４４】
一実施形態では、本開示は、Ｖがトリペプチドを含む化合物を提供する。トリペプチドは、そのＣ末端を介してＹに連結され得る。一実施形態では、トリペプチドのＣ末端アミノ酸残基はアルギニン、シトルリン、およびリシンから選択され、トリペプチドの中間アミノ酸残基は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、シクロヘキシルグリシン、トリプトファンおよびプロリンから選択され、そしてトリペプチドのＮ末端アミノ酸残基は任意の天然または非天然アミノ酸から選択される。
【０２４５】
別の実施形態では、本開示は、Ｖがジペプチドを含む化合物を提供する。ジペプチドは、そのＣ末端を介してＹに連結され得る。一実施形態では、ジペプチドのＣ末端アミノ酸残基はアラニン、アルギニン、シトルリン、およびリシンから選択され、ジペプチドのＮ末端アミノ酸残基は任意の天然または非天然アミノ酸から選択される。一実施形態では、Ｖは、フェニルアラニン−リシンおよびバリン−シトルリンから選択される。
【０２４６】
（Ｃ）ｎ部分としてリシン残基、そして（Ｖ）部分としてバリン−シトルリンを含むリンカーの一例は以下に示される：
【化１３】
0006744212.tif 000014
【０２４７】
任意選択で、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、もしくはオリゴペプチドは、非負荷電側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸以外のアミノ酸）を含む、あるいはこれらからなる。任意選択で、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、もしくはオリゴペプチドは、正荷電側鎖を有するアミノ酸、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸、および疎水性側鎖を有するアミノ酸から選択されるアミノ酸を含む、あるいはこれらからなる。
【０２４８】
別の態様では、化合物は、Ｚの薬物動態学的特性を改善するために使用される。Ｖはこの場合、例えば、遍在性の酵素、例えば、循環して存在するエステラーゼによって、ｐＨ制御された分子内環化によって、または酸触媒、塩基触媒、もしくは非触媒による加水分解によって切断される基であるか、またはこれらを含有し得る。あるいはＶは、例えばジスルフィドであるか、またはこれらを含有し得る。従って、Ｖは、任意選択で、Ｌおよび／またはＹ（または、Ｙが存在しない場合はＺ）の接続原子と一緒に、例えばカルボナート、カルバマート、尿素、エステル、アミド、イミン、ヒドラゾン、オキシム、ジスルフィド、アセタール、またはケタール基を形成し得る。単にＺの薬物動態学的特性を改善する以外の目的で本発明の化合物が使用される場合、Ｖはこのような部分であってもよいし、このような部分を含有してもよく、そして／あるいは同一または類似の方法で変換および／または切断され得ることが理解される。
【０２４９】
化合物が他の目的（例えば、生体外診断アッセイ）で使用される場合、Ｖは上述の部分のいずれかであるか、またはこれらを含有してもよく、そしてＶの変換および／または切断は、上述のプロセスの任意の１つによって、または当業者に知られている任意の他の機能性変換または切断プロセスによって起こり得る。例えば、診断アッセイにおいて、Ｖは、酵素によって、還元によって、あるいは特定のｐＨよりも高いか低いｐＨにおいて、または特定のｐＨにおいて切断または変換され得る。
【０２５０】
Ｖが条件的に切断可能である場合、化合物は、Ｖの切断後、および任意選択的な事前の変換後に、少なくとも１つのＺを最終的に放出するように設計される。しかしながら、別のメカニズムによる化合物からのＺの放出は除外されない。
【０２５１】
任意の実施形態において、Ｖは、Ｖが変換および／または切断されるように設計された条件が満たされる前に、Ｖの早期の変換および／または切断を防止するための保護基を含有し得る。
【０２５２】
別の態様では、Ｖは、切断不能な部分である。これは、このようなＶ部分を含有する化合物が適用されることが計画される条件下で、Ｙから、またはＹが存在しない場合にはＺからＶを切断できないことを意味し、この方法ではＺを放出されることができないことが意味される。しかしながら、別のメカニズムによる化合物からのＺの放出は除外されない。Ｖが切断不能な部分である場合、Ｙは、任意選択で存在しなくてもよい。切断不能なＶ部分は、このようなＶ部分を含有する化合物が適用されることが計画される条件（例えば、生体内または生体外）下で切断できない任意の部分、または非常にゆっくりとしか切断できない任意の部分であり得る。例えば、生体内で適用される場合、使用される生体内モデルに存在する酵素によって、または加水分解によって、または前記モデルにおいて起こり得る他の生物学的プロセスの結果として、Ｖは切断されないか、あるいは非常にゆっくりしか切断されないであろう。従って、このようなＶは、任意選択で、Ｌおよび／またはＺの接続原子と一緒に、例えば、カルボニル基、アミド基、尿素基、エステル基、カルボナート基、カルバマート基、または任意選択で、置換メチレンオキシまたはメチレンアミノ基であり得る。１つまたは複数の部分Ｚが放出されることが必要とされない場合、Ｖは好ましくは切断不能であり得る。これは、例えば、Ｚがその治療的または診断的特性を発揮し得る前に放出される必要がない場合であり得る。
【０２５３】
一実施形態では、Ｖは、天然または非天然アミノ酸の１つの側鎖内の官能基を介してＬに接続される。別の実施形態では、ＶのＮ末端アミノ酸はそのアルファアミノ基を介してＬに接続される。
【０２５４】
本明細書に開示されるＶ部分のいずれか１つは、式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、ＩＩ、ＩＶａおよびＩＶｂにおいて使用され得る。本明細書に記載されるＶ部分のいずれか１つは、本明細書に記載される（Ｃ）ｎ、Ｘ、Ｌ、Ｒ、Ｙ、Ｚ、Ｍ、ｚ、ｑ、およびｒ基のいずれかと組み合わせて使用することができる。本明細書に開示されるＶ’部分のいずれか１つは、式ＩＩＩにおいて使用され得る。本明細書に記載されるＶ’部分のいずれか１つは、本明細書に記載されるＲ’、Ｖ’、Ｙ’、Ｚ、ｚ’、ｑ’、およびｒ’基のいずれかと組み合わせて使用することができる。
【０２５５】
スペーサー系Ｙ
スペーサー系Ｙは、存在する場合、Ｖおよび任意選択でＬを１つまたは複数の部分Ｒに、そして式ＩＩＩの化合物との反応の後、対象の部分Ｚに連結する。一実施形態では、Ｙは存在しない。別の実施形態では、Ｙは自己脱離スペーサー系である。スペーサー系Ｙは、例えば、Ｚまたは一般の化合物の特性を改善するため、適切なカップリング化学を提供するため、あるいはＶおよびＺ間に空間をつくるために化合物中に取り込むことができる。任意のＹ’部分は、Ｙ部分と同じようにして定義することができる。
【０２５６】
スペーサー系Ｙは、例えば、１〜２００個の原子の炭素含有フレームワーク、任意選択で、１つまたは複数の原子において置換された少なくとも１０個の原子、例えば１０〜１００個の原子または２０〜１００個の原子の炭素含有フレームワークを含むことができ、任意選択で、炭素含有フレームワークは線状炭化水素であるか、あるいは環状基、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、もしくはオリゴペプチド、またはより一般的に、任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる任意の二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）を含む。
【０２５７】
Ｙは、任意の直鎖、分枝状および／または環状Ｃ２〜３０アルキル、Ｃ２〜３０アルケニル、Ｃ２〜３０アルキニル、Ｃ２〜３０ヘテロアルキル、Ｃ２〜３０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜３０ヘテロアルキニルでよく、任意選択で、１つまたは複数の単素環芳香族化合物ラジカルまたは複素環化合物ラジカルが挿入されてもよく、特に、任意の直鎖または分枝状Ｃ２〜５アルキル、Ｃ５〜１０アルキル、Ｃ１１〜２０アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜５アルキル、−Ｏ−Ｃ５〜１０アルキル、−Ｏ−Ｃ１１〜２０アルキル、または（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）１〜２４または（ＣＨ２）ｘ１−（ＣＨ２−Ｏ−−ＣＨ２）１〜２４−（ＣＨ２）ｘ２−（ここで、ｘ１およびｘ２は独立して、０〜２０の範囲の中から選択される整数である）、アミノ酸、オリゴペプチド、グリカン、スルファート、ホスファート、またはカルボキシラートである。任意選択で、Ｙは存在しない。いくつかの実施形態では、ＹはＣ２〜６アルキル基である。
【０２５８】
化合物は２つ以上のスペーサー系Ｙを含有し得る。これらの部分Ｙは同一であっても同一でなくてもよい。いくつかの実施形態では、スペーサー系Ｙは、直接結合を介して１つまたは複数の他の自己脱離スペーサーに接続された自己脱離スペーサーである。本明細書中、単一の自己脱離スペーサーもスペーサー系と呼ばれ得る。スペーサー系は分枝状でも非分枝状でもよく、ＺおよびＶのための１つまたは複数の取り付け部位を含有する。単一の部分のみを放出することができる自己脱離スペーサーは、「単一放出スペーサー」と呼ばれる。２つ以上の部分を放出することができる自己脱離スペーサーは、「多重放出スペーサー」と呼ばれる。スペーサーは分枝状でも非分枝状でもよく、そして「電子カスケードスペーサ」と呼ばれる１，２＋２ｎ−脱離（ｎ＞／＝１）により自己脱離性である。スペーサーは、環状尿素誘導体の形成の際に環化プロセスによって脱離し、「ω−アミノアミノカルボニル環化スペーサー」と呼ばれる。
【０２５９】
スペーサー系Ｙは自己脱離性でも非自己脱離性でもよい。「自己脱離性」スペーサー単位は、別の加水分解ステップがなくても薬物部分の放出を可能にする。自己脱離性スペーサーが使用される場合、Ｖの切断または変換の後、ＹのＶに連結される側はブロック化されなくなり、１つまたは複数の部分Ｚの最終的な放出をもたらす。自己脱離スペーサー系は、例えば、国際公開第０２／０８３１８０号パンフレットおよび国際公開第２００４／０４３４９３号パンフレット（参照によってその全体が本明細書中に援用される）に記載されるもの、ならびに当業者に知られている他の自己脱離スペーサーでよい。特定の実施形態では、リンカーのスペーサー単位は、ｐ−アミノベンジル単位を含む。１つのこのような実施形態では、ｐ−アミノベンジルアルコールはアミド結合を介してアミノ酸単位に取り付けられ、ベンジルアルコールと細胞毒性薬との間にカルバマート、メチルカルバマート、またはカルボナートが作られる。一実施形態では、スペーサー単位はｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）である。自己脱離性スペーサー単位の例としては、さらに、ｐ−アミノベンジルアルコールに電子的に類似した芳香族化合物（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２５６０３０Ａｌ号明細書を参照）、例えば２−アミノイミダゾール−５−メタノール（ｍｅｔｈａｎｏｉ）誘導体（Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２３７）およびオルト−またはパラ−アミノベンジルアセタールなどが挙げられるが、これらに限定されない。スペーサーは、置換および非置換４−アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，２，２２３）および２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，５５．５８６７）などのアミド結合の加水分解の際に環化を受けるように使用することができる。グリシンのａ位置において置換されたアミン含有薬物の脱離（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９８４，２７，１４４７）は、自己犠牲（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）スペーサーの例でもある。
【０２６０】
「非自己脱離性」スペーサー単位は、抗体−対象の部分結合体の酵素的（例えば、タンパク質分解性）切断の際にスペーサー単位の一部または全てが部分Ｚに結合したままであるものである。非自己脱離性スペーサー単位の例としては、グリシンスペーサー単位およびグリシン−グリシンスペーサー単位が挙げられるがこれらに限定されない。配列特異的な酵素切断に感受性のペプチドスペーサーの他の組み合わせも考慮される。例えば、腫瘍細胞関連プロテアーゼによる、グリシン−グリシンスペーサー単位を含有する抗体−対象の部分結合体の酵素切断は、抗体−対象の部分結合体の残りの部分からのグリシン−グリシン−薬物部分の放出をもたらし得る。１つのこのような実施形態では、グリシン−グリシン−薬物部分は次に、腫瘍細胞内で別の加水分解ステップを受け、従ってグリシン−グリシンスペーサー単位が薬物部分から切断される。
【０２６１】
スペーサー系Ｙは、２つ以上のＶ部分に接続され得る。この場合、これらのＶ部分の１つの変換および／または切断は、１つまたは複数のＺ部分の放出を誘発し得る。異なる条件下で変換または切断されるＶ部分が同じＹに接続される場合、１つまたは複数のＺ部分の放出は、化合物がいくつかの異なる条件の１つの下に置かれたときに発生し得る。
【０２６２】
本明細書に開示されるＹ部分のいずれか１つは、式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、ＩＩ、ＩＶａおよびＩＶｂいおいて使用され得る。本明細書に記載されるＹ部分のいずれか１つは、本明細書に記載される（Ｃ）ｎ、Ｘ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｒ、Ｚ、Ｍ、ｚ、ｑ、およびｒ基のいずれかと組み合わせて使用することができる。本明細書に開示されるＹ’部分のいずれかは、式ＩＩＩにおいて使用され得る。本明細書に記載されるＹ’部分のいずれかは、本明細書に記載されるＲ’、Ｌ’、Ｖ’、Ｚ、ｚ’、ｑ’、およびｒ’基のいずれかと組み合わせて使用することができる。
【０２６３】
リシンベースのリンカーの抗体への結合
ＴＧファミリーの酵素は、１つのタンパク質のリシンドナー残基と、別のタンパク質の受容体グルタミン残基との間に、プロテイナーゼ抵抗性イソペプチド結合を形成することによって、共有結合性のタンパク質架橋を触媒し、アンモニアの放出を伴う。リシンベースのリンカーに結合される予定の抗体は、Ｎ連結グリコシル化を含んでいなくても含んでいてもよい（例えば、グリコシル化部位を含まない抗体、または修飾された全長抗体）。特に残基Ｑ２９５におけるＣＨ２ドメイン内の受容体グルタミンへの結合の場合、抗体は、Ｎ連結グリコシル化を含まないであろう。全長野生型ＩｇＧ抗体は、自然に、ＣＨ２ドメイン内のグルタミン残基へのＴＧａｓｅ介在性の結合を妨害および防止する重鎖の残基２９７にＮ連結グリコシル化を含む。脱グリコシル化は、任意の適切な方法に従って実行することができる。例えば、ＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ（１０Ｘ）：重量２．１ｇのＫＨ２ＰＯ４、９０ｇのＮａＣｌ、４．８ｇのＮａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏを１Ｌのガラス瓶に移し、これに１Ｌの体積まで水が添加される。ＰＢＳ１Ｘを得るために、１００ｍＬのＰＢＳ（１０Ｘ）を使用し、水を９００ｍＬの体積まで添加する。ｐＨを７．２に調整し、水を１Ｌまで満たす）中の抗体は、６単位／ｍｇタンパク質のフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）由来のＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）（Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と共に３７℃で一晩インキュベートされる。次に、酵素は、遠心分離−透析（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ＭＷＣＯ  ５０ｋＤａ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｉｎｋｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって除去される。生成物は、ＬＣ／ＭＳによって分析することができる。あるいは、抗体は、例えば、残基２９７、２９８および／または２９９（ＥＵ番号付け）におけるアミノ酸修飾の結果として、自然にＮ連結グリコシル化を含ないこともある。ＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ドメインに融合されたＴＧａｓｅ認識タグを含む）内の受容体グルタミンへの結合のために、抗体は、Ｎ連結グリコシル化を含まない必要はない（含み得る）。
【０２６４】
抗体およびリシンベースのリンカー基質が調製されたら、細菌トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）（例えば、ＥＣ２．３．２．１３、タンパク質−グルタミン−γ−グルタミルトランスフェラーゼを参照）の存在下で、これらを反応容器内で互いに接触させることによって反応させることができる。ＢＴＧは、抗体の受容体グルタミン残基と、連結試薬（連結試薬の第１級アミンにおいて）との間に適切な条件下で共有結合の形成を引き起こすことができるであろう。一実施形態では、ＴＧａｓｅは、Ｓ．モバラエンス（Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）に由来する。別の実施形態では、ＴＧａｓｅは、１、２、３、４、５、１０個またはそれ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入、欠失）を有する突然変異体ＴＧａｓｅであり、任意選択で、ＴＧａｓｅは、天然ＴＧａｓｅ、例えばＳ．モバラエンス（Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）由来のＴＧａｓｅと少なくとも８０％の配列同一性を有する。好ましい例は、ストレプトミセス・モバラエンシス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）に由来する組換え細菌トランスグルタミナーゼ（Ｚｅｄｉｒａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）である。
【０２６５】
ＴＧａｓｅ触媒反応は、数時間から１日間（例えば、一晩）穏やかな条件下で実行され得る。ストレプトミセス・モバラエンシス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）由来の組換えＢＴＧ（ＥＣ２．３．２．１３）（Ｚｅｄｉｒａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、通常、１〜２０Ｕ／ｍＬの間の濃度で使用される。リシンベースのリンカー基質は、４００〜６００ｍｏｌ／Ｌの間のリガンド濃度で抗体（１ｍｇ／ｍＬ）と反応され、抗体に対して６０〜９０倍過剰の基質、または任意選択でより低過剰の基質、例えば、受容体グルタミンに対して１〜２０倍、または１０〜２０倍過剰の基質が提供される。反応は、カリウムを含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ８）中、３７℃で実施される。４時間〜数日後（抗体およびリガンドによる）、定常状態条件が達成される。次に、過剰のリガンドおよび酵素は、遠心分離−透析（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ＭＷＣＯ  ５０ｋＤａ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｉｎｋｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて除去される。
【０２６６】
抗体（例えば、抗体の一次構造の一部、例えば、ペプチドタグを有する抗体断片を含む）上に存在する受容体グルタミンは適切な条件下でＴＧａｓｅによって認識され、リシンベースのリンカー（例えば、式Ｉの化合物）に共有結合されるであろう。結果は、式ＩＩの抗体である（受容体グルタミンは式Ｉの化合物により機能化される）。得られる抗体結合体は、任意の適切な方法を用いて分析することができる。好ましくは、結合抗体の化学量論は、リシンベースのリンカーの数、および／または該当する場合には、抗体に結合された対象の部分、そして特に組成物の均質性を評価するために、アップダウンアプローチを用いて液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により特徴付けることができる。ＬＣ／ＭＳ分析の前に結合体を還元することができ、軽鎖および重鎖は別々に測定される。
【０２６７】
対象の部分Ｚおよび反応基Ｒ’を含む反応パートナー
反応性部分Ｒを含むリシンベースのリンカー（例えば、式Ｉの化合物）が抗体に結合されたら（例えば、式ＩＩの抗体が得られる）、抗体は、部分Ｚおよび反応基Ｒ’を含む化合物と反応させることができ、それにより、抗体−対象の部分結合体が形成される。通常、結合抗体（例えば、式ＩＩの抗体）は脱保護ステップを受けて非保護反応基（Ｒ）を提供する。次に、抗体は、反応パートナーＲ’を含む化合物と反応される。
【０２６８】
Ｒ’は反応性部分、例えば、非保護または保護された生体直交型反応に適合性の反応基、例えば、非保護または保護チオール、エポキシド、マレイミド、ハロアセトアミド、ｏ−ホスフェン芳香族エステル、アジド、フルミナート、スルホン酸エステル、アルキン、シアニド、アミノ−チオール、カルボニル、アルデヒド、オキシムおよびヒドラジンの形成が可能な一般的に任意の基、１，２，４，５−テトラジン、ノルボルネン、その他の染色または別の方法で電子的に活性化されたアルケン、置換または非置換シクロアルキン、生体直交型環化付加反応により形成する一般的に任意の反応基、１，３−または１，５−二置換トリアゾール、逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応により反応することができる任意のジエンまたは歪んだアルケンジエノフィル、保護または非保護アミン、カルボン酸、アルデヒド、オキシアミンを含む部分である（このような基が、脱保護されたときにＲと反応する（Ｒ’が脱保護される場合）限り）。
【０２６９】
式の化合物中に２つ以上のＲ’基が存在する場合、Ｒ’基は、好ましくは、どのＲ’基も任意の他のＲ’基に対する相補的試薬でないように適合性であり得る。式Ｉ〜ＩＶのＬ’、Ｖ’および／またはＹ’基は、それぞれＶ’、Ｙ’、およびＲ’基のための取り付け部位をｒ、ｑおよび／またはｚ個有することができ、ここで、ｒおよびｑは分枝または重合の度合いを表す。取り付け部位は結合を含むこともできるし、あるいはアルケン、アルキン、エーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミン、アミド、アルキルアミド、または縮合もしくは付加反応によって容易に生成される他の官能基から選択される官能基を含むこともできる。
【０２７０】
一実施形態では、Ｒ’は、末端アルキンまたはアジドを有する部分である。
【０２７１】
一実施形態では、Ｒ’は、置換または非置換シクロアルキン、例えば式Ａ：
【化１４】
0006744212.tif 000015
の化合物であり、式中、
Ｒ１は、カルボニル、アルキルエステル、アリールエステル、置換アリールエステル、アルデヒド、アミド、アリールアミド、アルキルハロゲン化物、チオエステル、スルホニルエステル、アルキルケトン、アリールケトン、置換アリールケトンおよびハロスルホニルから選択される。
Ｒ１は、三重結合によって結合される２つの炭素以外のシクロオクチン基上の任意の位置であり得る。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、修飾シクロアルキンは式Ａを有し、三重結合によって結合される２つの炭素以外のシクロオクチン環内の炭素原子の１つまたは複数は、１つまたは複数の電子吸引性基、例えば、ハロ（ブロモ、クロロ、フルオロ、ヨード）、ニトロ基、シアノ基、スルホン基、またはスルホン酸基によって置換される。従って、例えば、いくつかの実施形態では、本修飾シクロアルキンは式Ｂ：
【化１５】
0006744212.tif 000016
を有し、式中、
Ｒ２およびＲ３のそれぞれは独立して、（ａ）Ｈ、（ｂ）ハロゲン原子（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、ヨード）、（ｃ）−Ｗ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚ（ここで、ｎは１〜４の整数（例えば、ｎ＝１、２、３、または４）であり、存在する場合、ＷはＯ、Ｎ、またはＳであり、Ｚはニトロ、シアノ、スルホン酸、またはハロゲンである）、（ｄ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｗ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ４（ここで、ｎおよびｍはそれぞれ独立して１または２であり、ＷはＯ、Ｎ、Ｓ、またはスルホニルであり、ＷがＯ、Ｎ、またはＳであれば、Ｒ４はニトロ、シアノ、またはハロゲンであり、そしてＷがスルホニルであれば、Ｒ４はＨである）、または（ｅ）−ＣＨ２）ｎ−Ｒ４（ここで、ｎは１〜４の整数（例えば、ｎ＝１、２、３、または４）であり、Ｒ４はニトロ、シアノ、スルホン酸、またはハロゲンである）であり、
Ｒ１は、カルボニル、アルキルエステル、アリールエステル、置換アリールエステル、アルデヒド、アミド、アリールアミド、アルキルハロゲン化物、チオエステル、スルホニルエステル、アルキルケトン、アリールケトン、置換アリールケトンおよびハロスルホニルから選択される。Ｒ１は、三重結合によって連結される２つの炭素以外のシクロオクチン基上の任意の位置であり得る。
【０２７３】
一実施形態では、Ｒは置換または非置換の複素環式の歪んだアルキンである。特定の化合物を含むシクロアルキンは、例えば米国特許第８，１３３，５１５号明細書に記載されており、その開示は参照によって本明細書中に援用される。一実施形態では、アルキンは式Ｃ：
【化１６】
0006744212.tif 000017
を有し、式中、
各Ｒ１は独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトラート、ニトライト、スルファート、およびＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはヘテロアルキルからなる群から選択され、
各Ｒ２は独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトラート、ニトライト、スルファート、およびＣ１〜Ｃ１０有機基からなる群から選択され、Ｘは、Ｎ−Ｒ３Ｒ４、ＮＨ−Ｒ４、ＣＨ−Ｎ−ＯＲ４、Ｃ−Ｎ−ＮＲ３Ｒ４、ＣＨＯＲ４、またはＣＨＮＨＲ４を表し、そして各Ｒ３は水素または有機基を表し、Ｒ４はリンカーの連結部分Ｃ（または（Ｃ）ｎ）を表す。一実施形態では、ＲまたはＲ’は、以下のＤＢＣＯ（ジベンジシクロオクチル）基である：
【化１７】
0006744212.tif 000018
【０２７４】
本明細書において上記したものなどのアルキンは、環化反応において少なくとも１つの１，３−双極子機能性化合物（例えば、式ＩａまたはＩｂの反応基Ｒにおいて具体化される）と反応されて、好ましくは触媒（例えば、Ｃｕ（Ｉ））を実質的に添加せずに複素環化合物を形成することができる。
【０２７５】
一実施形態では、Ｒ’が複素環化合物を含むシクロアルキンである場合、式ＩａまたはＩｂの連結試薬は非環状Ｒ基を含むことができ、任意選択でさらに、Ｌは結合であるか、またはＬ基としてより短い炭素フレームワークである。例えば、Ｒは非環状基であることができ、Ｌは、１つまたは複数の原子において任意選択で置換された１〜５個の線状炭素原子の炭素フレームワークを含むことができる。
【０２７６】
本明細書に開示されるＲ’部分の任意の１つは、式ＩＩＩにおいて使用され得る。本明細書に記載されるＲ’部分の任意の１つは、本明細書に記載されるＬ’、Ｖ’、Ｙ’、Ｚ、ｚ’、ｑ’、およびｒ’基のいずれかと組み合わせて使用することができる。
【０２７７】
抗体との反応において使用される（例えば、式ＩＩＩ）の化合物は、抗体に対して２〜２０の間（または４〜２０の間）のモル当量、任意選択で抗体に対して２〜１０の間（または４〜１０の間）のモル当量、任意選択で抗体に対して約２０、１０、５、４または２モル当量またはそれ以下のリガンド濃度で抗体（例えば、１ｍｇ／ｍＬ）と反応され得る。しかしながら、抗体に対してより高過剰（反応パートナー（例えば、式ＩＩＩ）の当量）（４０〜８０倍、６０〜９０倍）も使用可能であることは認識されるであろう。
【０２７８】
リシンベースのリンカー（しかし、対象の部分は持たない）に結合された抗体、例えば式ＩＩの抗体との反応において使用される式ＩＩＩの化合物、および得られた抗体結合体は、従って、１つまたは複数の対象の部分Ｚを含む。式ＩＩＩの化合物は、通常リシンベースのリンカーにどの要素が含まれているかに依存して、付加的に部分Ｖおよび／またはＹを含み得る。
【０２７９】
リシンベースのリンカーに結合された抗体（例えば、式ＩＩの抗体）との反応において使用される式ＩＩＩの化合物は、Ｙ’およびＶ’が存在しない場合にはリンカーＬ’に接続され、スペーサー系Ｙ’に接続され、またはＹ’が存在しない場合にはＶ’に接続された部分Ｚを含むであろう。従って、式ＩＩＩの化合物は、反応基Ｒ’に接続されるかまたは反応基Ｒ’を含む部分Ｚを含むことができ、任意選択で、スペーサー系Ｙ’を介して反応基Ｒ’に、またはＹ’が存在しない場合にはＶ’を介して反応基Ｒ’に、またはＶ’−Ｙ’を介して反応基Ｒ’に接続されるかこれらを含む部分Ｚを含むことができ、ここで、Ｚは好ましくはＹ’に接続され、Ｖ’はＲ’およびＹ’に接続される。
【０２８０】
式ＩＩＩの化合物は、同一であるかまたは互いに異なる１つ、２つまたはそれ以上のＺ部分、例えば異なる治療的部分および／または診断的部分を含有することができる。
【０２８１】
一実施形態では、式ＩＩの抗体は、対象の部分Ｚと、式Ｉｂ、ＩｃまたはＩＩの反応基Ｒと結合を形成することができる反応基Ｒ’とを含む式ＩＩＩの化合物と反応され、任意選択で、化合物はさらにＶ’および／またはＹ’基を含む。対象の部分Ｚおよび反応基Ｒ’を含む化合物は、好ましくは、以下の式ＩＩＩ
Ｒ’−Ｌ’−（Ｖ’−（Ｙ’−（Ｚ）ｚ’）ｑ’）ｒ’      式ＩＩＩ
の構造を含み、式中、
Ｒ’は反応基、例えば、式Ｉｂ、ＩｃまたはＩＩの反応基Ｒと少なくとも１つの結合を形成するために相補的な反応基であり、
Ｌ’は結合であるか、または１つまたは複数の原子において置換された１〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、任意選択で、炭素含有フレームワークは、線状炭化水素、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、または任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）であり、
Ｖ’は独立して、存在しないか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、任意選択で、化学的、光化学的、物理的、生物学的、または酵素的プロセスによって切断または変換可能であり、Ｖの切断は最終的に１つまたは複数のＺ部分の放出をもたらす。いくつかの実施形態では、Ｖは、「Ｖ部分」という表題の以下のセクションに記載されるように、好ましくは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、またはオリゴペプチドであり、
Ｙ’は独立して、存在しないか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー系（例えば、自己脱離性スペーサー系または非自己脱離スペーサー系）であり、
Ｚは独立して、Ｒ’との反応のための相補的反応基以外の反応基（任意選択で保護される）、薬物動態学的特性を改善する部分、治療的部分、または診断的部分であり、
ｑ’およびｒ’は、１、２、３または４の中から選択される整数であり、分枝の度合いを表し、
ｚ’は、１、２、３または４の中から選択される整数である。
【０２８２】
Ｚが反応基である場合、これは、非保護または保護チオール、マレイミド、ハロアセトアミド、ｏ−ホスフェン芳香族エステル、アジド、フルミナート、アルキン、シアニド、アントラセン、１，２，４，５−テトラジン、ノルボルネン、その他の染色または別の方法で電子的に活性化されたアルケン、または任意選択で、保護または非保護アミン（Ｘが存在せず、Ｌ、Ｖ、またはＹが結合または結合の連続以外である場合）を含む部分であり得る。代替の実施形態では、Ｚは、反応性部分、好ましくは、非保護または保護チオール、非保護または保護アミン、マレイミド、ハロアセトアミド、ｏ−ホスフェン芳香族エステル、アジド、フルミナート、アルキン、シアニド、アントラセン、１，２，４，５−テトラジン、ノルボルネン、その他の染色または別の方法で電子的に活性化されたアルケンを含む部分であり得る。好ましくは、ｎ＝５かつＸ、Ｌ、ＶおよびＹが存在しない場合、Ｒはアミンではない。好ましくは、ｎ＝４かつＸ、Ｌ、ＶおよびＹが存在しない場合、Ｒはアミンではない。
【０２８３】
部分Ｒ’はＺに、または任意選択でＶ’および／またはＹ’を介してＺに接続され、反応パートナー上の適切な官能基Ｒ、例えば、式Ｉｂ、ＩｃまたはＩＩのリシンベースのリンカー上の基Ｒと反応することができる。上記のように、反応性部分Ｒ’が反応基Ｒと反応するように設計される場合、式ＩｃまたはＩＶｂの化合物が形成される。
【０２８４】
Ｌ’基は炭素含有フレームワークであることができ、ここでＬは、対称または非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、オリゴ糖、他の天然オリゴマー、任意の連鎖成長または逐次成長重合プロセスから得られる二量体、三量体、またはより多量体のオリゴマーである。Ｌ’は、それぞれＶ’、Ｙ’、およびＲ’基のための取り付け部位をｒ’、ｑ’および／またはｚ’個有し、ここで、ｒ’およびｑ’は分枝または重合の度合いを表す。取り付け部位は結合を含むことができるか、またはアルケン、アルキン、エーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミン、アミド、アルキルアミド、または縮合もしくは付加反応によって容易に生成される他の官能基から選択される官能基を含むことができる。
【０２８５】
式（Ｉｃ）および（ＩＶｂ）の化合物のＭ中の連結基（ＲＲ’）は、反応性部分Ｒ’および反応性部分ＲのＲ’付加生成物を表す。この基は次に、好ましくはＭ（Ｌ’、Ｖ’、および／またはＹ’である）の（ＲＲ’）を介して、部分Ｚ）をＬ、ＶまたはＹと連結する。残りの基は結合であってもよい。しかしながら、通常、Ｌ’、Ｖ’、および／またはＹ’は連結基である。ＲＲ’は、チオ−マレイミド（またはハロアセトアミド）付加、例えば、Ｎ，Ｓ−二置換−３−チオ−ピロリジン−２，５−ジオン；Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション、例えば、Ｎ，３−またはＮ，４−置換−５−ジフェニルホスフィンオキシド−安息香酸アミド；Ｈｕｉｓｇｅｎ１，３−環化付加（クリック反応）、例えば、Ｎ，Ｓ−二置換−３−チオ−ピロリジン−２，５−ジオン、１，４−二置換−１，２，３−トリアゾール、３，５−二置換−イソオキサゾール、または３，５−二置換−テトラゾール；Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環化付加物、例えば、ＯもしくはＮ−置換−５−ノルボルネン−２−カルボン酸エステルもしくはアミド、Ｎ−置換−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド、ＯもしくはＮ−置換−７−オキソノルボルネン−５−カルボン酸エステルもしくはアミド、またはＮ−置換−７−オキソノルボルネン−５，６−ジカルボン酸イミドと、９−置換アントラセンまたは３−置換１，２，４，５−テトラジンとの間の２，４−環化付加生成物；または任意の高収率選択的アミド化またはイミド化反応の付加生成物であり得る。いくつかの反応およびＲＲ’反応生成物は、図１および２に示される。
【０２８６】
式ＩＩＩの化合物の例としては、本明細書中の表４に示されるＲ’、Ｌ’、Ｖ’、Ｙ’およびＺ基を有する化合物が挙げられるが、これらに限定されない。式ＩＩＩの化合物の例としては、本明細書中の表３に示されるＲ’、Ｌ’、Ｖ’、Ｙ’およびＺ基を有する化合物が挙げられるが、これらに限定されない。表中の記号（−）は、特定のＲ’、Ｌ’、Ｖ’、Ｙ’またはＺが存在しないことを示す。ＶおよびＹ基は、例えば、本明細書中の「Ｖ部分」および「Ｙ部分」という表題のセクションの任意の構造特徴を含むことができる。表４において表される式ＩＩＩのＬ、Ｖおよび／またはＹ基は、それぞれＶ、Ｙ、およびＲまたはＺ基のための取り付け部位をｒ’、ｑ’、および／またはｚ’個有することができ、ここで、ｒおよびｑは分枝または重合の度合いを表し、ｒ’、ｑ’、および／またはｚ’は、１、２、３または４から選択することができる。
【０２８７】
式Ｉａの化合物および式ＩＩＩの反応パートナーの非限定的な例は表５に示される。
【０２８８】
一実施形態では、式ＩＩの化合物を式ＩＩＩの化合物と反応させて、式ＩＶｂの化合物を得ることを含む方法が提供される。
【０２８９】
異なる構造の反応パートナー（すなわち、式ＩＩの機能化グルタミンを有する抗体および式ＩＩＩの化合物）が想定され得ることは認識されるであろう。例えば、いくつかの場合、特定のリンカーおよびスペーサー系を保持し、抗体に対するその効果について種々の部分Ｚを評価することが有利であり得る。この場合、リシンベースのリンカーはＬ−Ｖ−Ｙ−Ｒを含むことができ、反応パートナーはＶ−Ｙを含まない（例えば、反応パートナーはＲ’−Ｚを含む）であろう。構造の一例は表１に示される。また、Ｖ、Ｙおよび／またはＺ部分の例示的な評価方法も提供され、本方法は、（ａ）行１〜１０の式ＩＩの機能化グルタミンを有する抗体を、それぞれ行１〜１０の２つ、３つ、４つまたはそれ以上の式ＩＩＩの化合物（式ＩＩＩの化合物はそのＶ、Ｙおよび／またはＺ部分が異なる）と反応させるステップと、（ｂ）前記異なるＶ、Ｙおよび／またはＺ部分の抗体に対する効果（例えば、カップリングの収率および化学量論、生物活性、安定性または一般的に任意の薬理学的特性）を評価するステップとを含む。各行１〜１０のそれぞれについて、本方法は、列４の「例示的な評価方法」に従って評価するための方法であると特徴付けられ得る。
【０２９０】
【表１】
0006744212.tif 000019
【０２９１】
反応性部分Ｒが結合されたリシンベースのリンカーを有する抗体（例えば、式ＩｂまたはＩｃの化合物）と、部分Ｚおよび反応基Ｒ’を含む化合物とを反応させて、抗体−対象の部分結合体を形成するステップは、抗体を固体担体に結合することによって有利に実行することができる。このステップのための固体担体の使用は、異なる初期濃度および量の抗体サンプルを反応させ、次に活性の比較をすることを可能にし得る。また固体担体の使用は、機能化抗体の改善された精製を可能にする。最後に、このステップのための固体担体の使用は、製造効率の増大および／または反応の完了の増大を可能にする。何故なら、部分Ｚおよび反応基Ｒ’を含む化合物を回収し、次に固体担体に再導入することができるからであり、これは、細胞毒性薬物などの高価な試薬の損失を低減し得る。
【０２９２】
固体担体に基づく方法において使用される抗体の量は少量（例えば、１〜５００μｇ）の抗体であり得る。
【０２９３】
一般に、固体担体は、直接または間接的に抗体を可逆的に取り付けて、不要な材料、例えば過剰の試薬、汚染物質、および溶媒からの抗体の分離を可能にすることができる任意の適切な不溶性の機能化材料であり得る。固体担体の例としては、例えば、機能化高分子材料、例えば、アガロース、またはそのビード形態セファロース（登録商標）、デキストラン、ポリスチレンおよびポリプロピレン、またはこれらの混合物；マイクロ流体チャネル構造を含むコンパクトディスク；タンパク質アレイチップ；ピペットチップ；膜、例えば、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦ膜；および微小粒子、例えば、常磁性または非常磁性ビーズが挙げられる。いくつかの実施形態では、親和性媒体が固体担体に結合され、抗体は親和性媒体を介して間接的に固体担体に取り付けられるであろう。１つの態様では、固体担体はタンパク質Ａ親和性媒体またはタンパク質Ｇ親和性媒体を含む。「タンパク質Ａ親和性媒体」および「タンパク質Ｇ親和性媒体」はそれぞれ、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ（それぞれ）のＦｃ結合ドメインを含む天然または合成タンパク質、あるいはタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ（それぞれ）のＦｃ−結合ドメインの突然変異体または断片（この変異体または断片は抗体のＦｃ部分の親和性を保持する）が結合される固相を指す。
【０２９４】
本発明の方法は、反応性部分Ｒが結合されたリシンベースのリンカーを含む抗体（例えば、式ＩａまたはＩｂの化合物）を固体担体に固定化して固定化抗体を提供するステップを含むことができる。いくつかの実施形態では、固体担体は、抗体含有サンプル中に存在する量、よりも多くの抗体を結合する容量を有するであろう。あるいは言い換えると、固定化ステップ後に固体担体に結合された抗体の量は、固体担体の容量よりも少ないであろう。サンプルは一般的に抗体量に関して変動があるので、１つのサンプルからの固定化抗体の量には、別のものと比較して、対応する変動が存在するであろう。
【０２９５】
任意選択で結合される抗体の量を制限することことが可能であり、固体担体は、特定の量の抗体（例えば、５μｇまで、１０μｇまで、または１５μｇまでのタンパク質）に結合する容量しか有さないであろう。これらの実施形態では、固体担体に結合され得る最大量の抗体に関する制限はあるが、１つのサンプル中の固定化される抗体の量には、別のものと比較して依然として変動が存在し得る。これは、サンプルの１つまたは複数が固体担体の最大負荷容量よりも少ない少量の抗体を含有し得るからである。抗体を結合する容量が制限された固体担体を調製するための１つのアプローチは、より大量の樹脂スラリー（例えば、２０ｕＬ）が５ｕｇの抗体を結合するのに十分な容量しか含有しないように非常に低容量の樹脂を作ることである。代替のアプローチは、適切な体積の非機能化樹脂で樹脂を希釈することによって樹脂の有効な容量を低減することである。例えば、２０ｕｇ／ｕＬの結合容量を有するタンパク質Ｇ−セファロース樹脂は、１部のタンパク質Ｇ−セファロースを４０部の非機能化セファロースと混合することによって、０．５ｕｇ／ｕＬの有効結合容量を有する混合樹脂へ転換され得る。このような樹脂の希釈の実施において、いくつかの実施形態では、希釈剤は、親和性樹脂と同じベース材料から構成される樹脂であり、抗体を排除するために十分に小さい細孔サイズを有し、そして抗体結合体を調製するために使用される抗体または化学試薬と相互作用し得る任意の表面官能性が欠けているであろう。
【０２９６】
抗体は一般に、抗体含有サンプルを固体担体に適用するステップによって固体担体上に固定化される。所望される場合、固定化の後に洗浄ステップを実施して、細胞培養物の上澄みまたは抗体含有サンプル他の成分から固定化抗体を分離することができる。
【０２９７】
固体担体上に抗体が固定化されたら、結合抗体（例えば、式ＩＩの抗体）は、通常、脱保護ステップを受けて非保護の反応基（Ｒ）を提供し、次に抗体は、反応パートナーＲ’を含む化合物と反応される。次に、部分Ｚおよび反応基Ｒ’を含む化合物（例えば、式ＩＩＩの化合物）を固体担体へ適用して抗体−対象の部分結合体（例えば、式ＩＶｂの抗体）を生じさせることを含む反応ステップが実施される。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、部分Ｚおよび反応基Ｒ’を含む化合物は、モル過剰（反応基（Ｒ）に関してモル過剰）で提供されるであろう。
【０２９９】
還元抗体を、反応基（Ｒ’）を含む適切な量の化合物と接触させた後、洗浄ステップを実施して、任意の未反応材料を除去することができる。任意選択で、部分Ｚおよび反応基Ｒ’を含む未反応化合物が除去され、任意選択で、未反応化合物は、反応基（Ｒ）を含む抗体と、反応基（Ｒ’）を含む化合物の間の反応のより高度の完了を提供するために、固体担体に再度適用される。
【０３００】
続いて、固定化抗体結合体は固体担体から溶出され、抗体結合体組成物を提供することができる。タンパク質を固体担体から溶出させる方法は当該記述分野において知られており、当業者は、溶出のために適切な緩衝液を選択できるであろう。例えば、固体担体がタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ樹脂を含む実施形態では、抗体結合体は、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇカラムからの溶出のために標準的な低ｐＨ緩衝液を用いて溶出させることができる。
【０３０１】
部分Ｚ
部分Ｚは、ＹまたはＹ’へ、または不在のときにはＶまたはＶ’へ、または不在のときにはＬへ、または不在のときにはＸへ、または不在のときには（Ｃ）ｎへ接続され得る。Ｙ、ＶまたはＬへの接続は、任意選択で、ＲまたはＲＲ’を介してもよい。接続は、任意の適切な原子を介することができる。一実施形態では、Ｚは、酸素（例えば、ヒドロキシル基またはカルボキシル基から）、炭素（例えば、カルボニル基から）、窒素（例えば、第１級または第２級アミノ基から）、または硫黄（例えば、スルフヒドリル基から）を介してカップリングされる。一実施形態では、Ｚは、その治療能力または診断特性が少なくとも部分的に遮断または遮蔽されるような基を介してカップリングされる。化合物が動物、例えば哺乳類の疾患を治療または予防するために使用される場合、Ｚ部分は通常治療的部分である。化合物が診断を行うために使用される場合、あるいは生体外または生体内診断アッセイにおいて使用される場合、Ｚ部分は通常、診断的部分、例えば発色性、蛍光発生性、燐光発生性（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｇｅｎｉｃ）、化学発光性、または生物発光性化合物である。
【０３０２】
一実施形態では、Ｚ部分は化合物、好ましくは、少なくとも３００ｇ／ｍｏｌ、４００ｇ／ｍｏｌ、５００ｇ／ｍｏｌ、６００ｇ／ｍｏｌ、７００ｇ／ｍｏｌ、８００ｇ／ｍｏｌ、９００ｇ／ｍｏｌ、１０００ｇ／ｍｏｌまたは２０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する有機化合物である。
【０３０３】
一実施形態では、Ｚ部分は、疎水性特性を示す化合物であり、任意選択でさらに、少なくとも３００ｇ／ｍｏｌ、４００ｇ／ｍｏｌ、５００ｇ／ｍｏｌ、６００ｇ／ｍｏｌ、７００ｇ／ｍｏｌ、８００ｇ／ｍｏｌ、９００ｇ／ｍｏｌ、１０００ｇ／ｍｏｌまたは２０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。疎水性特性は、例えば、水溶性の低下、極性の低下、水素結合の可能性の低下、および／または油／水分配係数の低下によって決定され得る。本発明で開示される方法を使用して、対象の部分（Ｚ）が疎水性薬物を含む抗体結合体を生じさせることができる。本明細書で使用される場合、「疎水性」という用語は、大量の水からはじかれる分子の物理特性である。疎水性化合物は、非極性溶媒（有機溶媒を含むが、これに限定されない）中で可溶化され得る。疎水性は、飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、ならびに１つまたは複数の芳香族、脂環式または複素環式基によって置換された置換されたこれらの基を含むがこれらに限定されない無極性または非極性化学基を包含することによって付与され得る。逆に、「親水性」分子は水分子との水素結合が可能であり、従って、水および他の極性溶媒に可溶性である。「親水性」および「極性」という用語は互換的に使用することができる。親水性特性は、炭水化物、ホスファート、カルボン酸、スルファト（ｓｕｌｆａｔｏ）、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシおよび他の同様の基などの極性または荷電基の存在から得られる。
【０３０４】
疎水性分子は水溶性が不十分である、例えば、約１０ｍｇ／ｍｌ未満の溶解度を有する。いくつかの実施形態では、疎水性化合物は、水中で約１ｍｇ／ｍｌ未満の溶解度を有することができる。他の実施形態では、疎水性化合物は、約５０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ未満の水中の溶解度を有し、特定の実施形態では、約１μｇ／ｍｌまたは２．５μｇ／ｍｌである。他の実施形態では、疎水性化合物は、０．００１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、および１０ｍｇ／ｍｌを含むがこれらに限定されない約０．００１μｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの溶解度を有し、そして０．００１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの間の他の濃度を有することができる。
【０３０５】
本明細書に開示される方法を用いて配合することができる疎水性薬物の代表的な非限定的な例としては、タキサン、例えば、パクリタキセル（ＰＴＸ）、およびカンプトテシン（ＣＰＴ）、マイタンサノイド（ｍａｙｔａｎｓａｎｏｉｄ）、デュオカルマイシン、ドラスタチンおよびアウリスタチンが挙げられる。このような薬物は水中の溶解性が低く、例えば、ＰＴＸは、約１μｇ／ｍｌ未満の水中の溶解度を有し、ＣＰＴは約２．５μｇ／ｍｌの水溶性を有する。リンカーおよび修飾抗体は、有利に、疎水性薬物を抗体に連結することができる。
【０３０６】
他の実施形態では、ＴＧａｓｅに対して不十分な基質である（改善されたリンカーまたは修飾抗体の非存在下で）疎水性薬物を考慮して、Ｚ部分は、有利に、親水性薬物であり得る。親水性薬物の例としてはアマトキシンが挙げられる。アマトキシンは、アマニタ（Ａｍａｎｉｔａ）属から単離されるよう８個のアミノ酸で構成される環状ペプチドである。またアマトキシンには、様々な化学誘導体、−５天然化合物（環状、８個のアミノ酸）のマスター構造に従う構成要素で構成される半合成類似体および合成類似体、ヒドロキシル化アミノ酸の代わりに非ヒドロキシル化アミノ酸を含有する合成または半合成類似体、チオエーテルスルホキシド部分が、スルフィド、スルホンによって、またはアマニチンのカルバアナログ（ｃａｒｂａａｎａｌｏｇ）の場合のように硫黄とは異なる原子（例えば、炭素原子）によって、置換された合成または半合成類似体も含まれる。機能的に、アマトキシンは、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害するペプチドまたはデプシペプチドであると定義される。好ましいアマトキシンは、リンカー分子またはタンパク質と反応することができる官能基（例えば、カルボン酸基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオールまたはチオール捕獲基）を有するものである。アマトキシンは、例えば、欧州特許出願公開第１８５９８１１号明細書、ＰＣＴ国際公開第２０１０／１１５６３０号パンフレットおよび国際公開第２０１２／０４１５０４号パンフレットにおいて記載される。
【０３０７】
一実施形態では、Ｚ部分は、多環式基、三環（ｔｒｉｃｙｃｌｅ）または１つもしくは複数の巨大環を含む大きい化合物（例えば、少なくとも３００ｇ／ｍｏｌ、４００ｇ／ｍｏｌ、５００ｇ／ｍｏｌ、６００ｇ／ｍｏｌまたは７００ｇ／ｍｏｌの分子量）である。このような基は、多くの場合、疎水性および／または硬直性構造に特有である。巨大環（例えば、９個以上の原子を有する環）を含む細胞毒性薬物の例としては、マイタンシノイド、アマトキシン、エポチロンおよびタキサンが挙げられる。一実施形態では、Ｚ部分は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個の原子、または９〜２００個の間の原子の環を含む。一実施形態では、Ｚ部分は負電荷を有する化合物であり、任意選択でさらに、疎水性特性を示し、そして／あるいは少なくとも３００ｇ／ｍｏｌ、４００ｇ／ｍｏｌ、５００ｇ／ｍｏｌ、６００ｇ／ｍｏｌ、７００ｇ／ｍｏｌ、８００ｇ／ｍｏｌ、９００ｇ／ｍｏｌ、１０００ｇ／ｍｏｌまたは２０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。
【０３０８】
２つ以上のＺ部分が自己脱離スペーサー系ＹまたはＹ’に接続される場合、ＹまたはＹ’の自己脱離の際に少なくとも１つのＺが放出されるはずである。最初に放出される部分Ｚは、それ自体が完全に活性な部分ではない部分であってもよい。言い換えると、Ｚは、診断的または治療的能力が制限された部分、例えば、プロドラッグとしての役割を果たす部分であってもよい。このようなＺ部分は、完全に活性になるために、さらなる処理または代謝、例えば、加水分解、酵素切断、または酵素修飾（例えばリン酸化、還元、または酸化）を必要とし得る。一実施形態では、このようなさらなる処理は、例えば、完全に活性化される前にＺをその最終的な標的に到達させる、または生物学的障壁、例えば細胞膜または核膜を横切らせるように、Ｚに対して意図的に設計される。Ｚは、例えば、Ｚが細胞膜を横切れるようにする疎水性部分を含有し得る。この疎水性部分は次に細胞内で加水分解または他の方法で除去され得る。
【０３０９】
１つの態様では、Ｚ部分は、複数の薬物または診断的部分が連結される骨格（例えば、ポリマー）であり得る。例えば、Ｚは、複数の薬物分子を含むポリアセタール誘導体またはポリアセタール誘導体に基づくポリマーであってもよく（例えば、Ｙｕｒｋｏｖｅｔｓｋｉｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．１（５）：３７５−３８２および国際公開第２０１１／１２００５３号パンフレットを参照。その開示は参照によって本明細書中に援用される）、例えば、Ｚは、複数の細胞毒性抗癌剤を含む国際公開第２０１１／１２００５３号パンフレットの式Ｉのポリマー化合物であり得る。
【０３１０】
１つの態様では、１つまたは複数の部分Ｚはそれぞれ、治療薬または診断薬から選択される。
【０３１１】
別の実施形態では、１つまたは複数の部分Ｚはそれぞれ治療薬である。別の実施形態では、全ての部分Ｚはそれぞれ治療薬である。
【０３１２】
さらに別の実施形態では、部分Ｚはそれぞれ同じ治療的部分である。
【０３１３】
さらに別の実施形態では、部分Ｚは、少なくとも２つの異なる治療的部分を含む。
【０３１４】
部分Ｚには、例えば、抗悪性腫瘍薬、薬物、毒素（例えば、細菌または植物起源の酵素的に活性な毒素およびその断片、例えば、リシンおよびその断片など）、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体または抗体断片、合成または天然に存在するポリマー、核酸およびその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡおよびその断片、放射性核種、特に、放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子およびレポーター基、例えば、蛍光化合物、またはＮＭＲもしくはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物が含まれる。
【０３１５】
一実施形態では、１つまたは複数の部分Ｚはそれぞれ独立して、抗生物質、抗細菌薬、抗菌剤、抗炎症薬、抗感染症薬、抗自己免疫疾患薬、抗ウィルス薬、または抗癌剤、好ましくは細胞毒性抗癌剤から選択される。
【０３１６】
別の実施形態では、１つまたは複数の部分Ｚはそれぞれ抗癌剤である。さらなる実施形態では、１つまたは複数の部分Ｚはそれぞれヒドロキシル含有抗癌剤である。
【０３１７】
一実施形態では、Ｚはアルキル化剤であり、好ましくはＤＮＡアルキル化剤である。アルキル化剤は、生理学的条件（例えば、ｐＨ７．４、３７Ｃ、水溶液）下で水素原子をアルキル基で置換することができる化合物である。アルキル化反応は、通常、求電子性アルキル化剤を用いるＮ、ＯおよびＳヘテロ芳香族求核試薬による置換反応に関して説明されるが、マイケル付加反応も重要である。アルキル化剤の例としては、窒素および硫黄マスタード、エチレンイミン、メタノスルホナート（ｍｅｔｈａｎｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシン、ニトロソ尿素、白金含有剤、ＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩ介在性部位依存性アルキル化を達成する薬剤（例えば、ソロスペルミンおよび関連のビスフラノキサントン）、エクテナサイジンおよび他のまたは関連のＤＮＡ副溝アルキル化剤が挙げられる。
【０３１８】
一実施形態では、ＺはＤＮＡ副溝結合および／またはアルキル化剤、例えば、ピロロベンゾジアゼピン、デュオカルマイシン、またはこれらの誘導体である。
【０３１９】
さらなる実施形態では、１つまたは複数の部分Ｚはそれぞれ独立して、タキサン、アントラサイクリン、カンプトテシン、エポチロン、マイトマイシン、コンブレタスタチン、ビンカアルカロイド、窒素マスタード、マイタンシノイド、カリキアマイシン、デュオカルマイシン、ツブリシン、ドラスタチンおよびアウリスタチン、エンジイン、アマトキシン、ピロロベンゾジアゼピン、エチレンイミン、放射性同位体、治療用タンパク質およびペプチド、ならびに毒素またはこれらの断片からなる群から選択される。
【０３２０】
さらなる実施形態では、１つまたは複数の部分Ｚはそれぞれ独立して、シクロホスファミド、イホスファミド、クロランブシル、４−（ビス（２−クロロエチル）アミノ）フェノール、４−（ビス（２−フルオロエチル）アミノ）フェノール、Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）−ｐ−フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−フルオロ−エチル）−ｐ−フェニレンジアミン、カルムスチン、ロムスチン、トレオスルファン、ダカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、トポテカン、イニロテカン（ｉｎｉｒｏｔｅｃａｎ）、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ラルトテカン、カンプトテシン、クリスナトール、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、メトトレキセート、トリメトレキサート、ミコフェノール酸、チアゾフリン、リバビリン、ヒドロキシ尿素、デフェロキサミン、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、ドキシフルリジン、ラルチトレキセド、シタラビン、シトシンアラビノシド、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チオグアニン、ラロキシフェン、メゲストロール、ゴセレリン、酢酸ロイプロリド、フルタミド、ビカルタミド、ベルトポルフィン（ｖｅｒｔｏｐｏｒｆｉｎ）、フタロシアニン、光増感剤Ｐｃ４、デメトキシ−ヒポクレリンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、ロバスタチン、スタウロスポリン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシンＡ２、ブレオマイシンＢ２、ペプロマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、Ｎ−（５，５−ジアセトキシペンチル）ドキソルビシン、モルホリノドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン、タプシガルジン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、タリソマイシン、エスペラマイシン、酪酸、レチノイン酸、１，８−ジヒドロキシビシクロ［７．３．１］トリデカ−４−エン−２，６−ジイン−１３−オン、アングイジン、ポドフィロトキシン、コンブレタスタチンＡ−４、パンクラチスタチン、ツブリシンＡ、ツブリシンＤ、カルミノマイシン、ストレプトニグリン、酢酸エリプトミウム（ｅｌｌｉｐｔｍｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、マイタンシン、マイタンシノール、カリキアマイシン、メルタンシン（ＤＭ１）、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ−カリキアマイシン、カリキアマイシン−γ１Ｉ、カリキアマイシン−α２Ｉ、カリキアマイシン−α３Ｉ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＡ、ＣＣ−１０６５、ＣＢＩ−ＴＭＩ、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＢ２、センタナマイシン（ｃｅｎｔａｎａｍｙｃｉｎ）、ドラスタチン、アウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン、およびアマヌリン酸（ａｍａｎｕｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）およびこれらの誘導体から選択される。
【０３２１】
例示的なアウリスタチンの実施形態は、以下の式ＶおよびＶＩのいずれかの構造を含むＮ末端連結モノメチルアウリスタチン薬物部分を含む：
【化１８】
0006744212.tif 000020
式中、ＶおよびＶＩの波線は、化合物（例えば、式Ｉ、ＩＩまたはＩＶの化合物）のＬ、Ｌ’、Ｖ、Ｖ’、Ｙ、Ｙ’、（ＲＲ’）、Ｒ’または（Ｃ）ｎ基への共有結合部位を示し、各位置において独立して、
Ｒ２は、ＨおよびＣ１−Ｃ８アルキルから選択され、
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１〜Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１〜Ｃ８アルキル−（Ｃ３〜Ｃ８炭素環）、Ｃ３〜Ｃ８複素環およびＣ１〜Ｃ８アルキル−（Ｃ３〜Ｃ８複素環）から選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ３〜Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１〜Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１〜Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）、Ｃ３〜Ｃ８複素環およびＣ１〜Ｃ８アルキル−（Ｃ３〜Ｃ８複素環）から選択され、
Ｒ５は、Ｈおよびメチルから選択され、
あるいはＲ４およびＲ５は一緒に炭素環式環を形成し、式−（ＣＲａＲｂ）ｎを有し、ここで、ＲａおよびＲｂは独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルおよびＣ３〜Ｃ８炭素環から選択され、ｎは２、３、４、５および６から選択され、
Ｒ６は、ＨおよびＣ１〜Ｃ８アルキルから選択され、
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ３〜Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１〜Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１〜Ｃ８アルキル−（Ｃ３〜Ｃ８炭素環）、Ｃ３〜Ｃ８複素環およびＣ１〜Ｃ８アルキル−（Ｃ３〜Ｃ８複素環）から選択され、
各Ｒ８は独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ３〜Ｃ８炭素環およびＯ−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）から選択され、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ８アルキルから選択され、
Ｒ１０は、アリールまたはＣ３〜Ｃ８複素環から選択され、
Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ１２であり、ここで、Ｒ１２はＣ１〜Ｃ８アルキルであり、
Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、アリール、Ｃ３〜Ｃ８複素環、−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−Ｒ１４、または−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−ＣＨ（Ｒ１５）２から選択され、ｍは１〜１０００の範囲の整数であり、
Ｒ１３はＣ２〜Ｃ８アルキルであり、
Ｒ１４はＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであり、
Ｒ１５の各出現は独立して、Ｈ、ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ１６）２、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−Ｃ１〜Ｃ８アルキルであり、
Ｒ１６の各出現は独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、または−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨであり、
Ｒ１８は、−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−アリール、−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−（Ｃ３〜Ｃ８複素環）、および−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−（Ｃ３〜Ｃ８炭素環）から選択され、そして
ｎは、０〜６の範囲の整数である。
【０３２２】
一実施形態では、Ｒ３、Ｒ４およびＲ７は独立してイソプロピルまたはｓｅｃ−ブチルであり、Ｒ５は−Ｈまたはメチルである。例示的な実施形態では、Ｒ３およびＲ４はそれぞれイソプロピルであり、Ｒ５は−Ｈであり、Ｒ７はｓｅｃ−ブチルである。
【０３２３】
さらに別の実施形態では、Ｒ２およびＲ６はそれぞれメチルであり、Ｒ９は−Ｈである。
【０３２４】
さらに別の実施形態では、Ｒ８の各出現は−ＯＣＨ３である。
【０３２５】
例示的な実施形態では、Ｒ３およびＲ４はそれぞれイソプロピルであり、Ｒ２およびＲ６はそれぞれメチルであり、Ｒ５は−Ｈであり、Ｒ７はｓｅｃ−ブチルであり、Ｒ８の各出現は−ＯＣＨ３であり、Ｒ９は−Ｈである。
【０３２６】
一実施形態では、Ｚは−Ｏ−または−ＮＨ−である。
【０３２７】
一実施形態では、Ｒ１０はアリールである。
【０３２８】
例示的な実施形態では、Ｒ１０は−フェニルである。
【０３２９】
例示的な実施形態では、Ｚが−Ｏ−である場合、Ｒ１１は−Ｈ、メチルまたはｔ−ブチルである。
【０３３０】
一実施形態では、Ｚが−ＮＨである場合、Ｒ１１は−ＣＨ（Ｒ１５）２であり、ここで、Ｒ１５は−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ１６）２であり、Ｒ１６は−Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたは−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨである。
【０３３１】
別の実施形態では、Ｚが−ＮＨである場合、Ｒ１１は−ＣＨ（Ｒ１５）２であり、ここで、Ｒ１５は−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３Ｈである。
【０３３２】
式Ｖの１つの例示的なアウリスタチンの実施形態はＭＭＡＥであり、式中、波線は、化合物（例えば、式Ｉ、ＩＩまたはＩＶの化合物）のＬ、Ｌ’、Ｖ、Ｖ’、Ｙ、Ｙ’、（ＲＲ’）、Ｒ’または（Ｃ）ｎ基への共有結合を示す：
【化１９】
0006744212.tif 000021
【０３３３】
式ＶＩの例示的なアウリスタチンの実施形態はＭＭＡＦであり、式中、波線は、抗体−薬物結合体のリンカー（Ｌ）への共有結合を示す（米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号明細書およびＤｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｆｉｅｍ．１７：１１４−１２４を参照）：
【化２０】
0006744212.tif 000022
【０３３４】
その他の例示的なＺの実施形態には、ペンタペプチドアウリスタチン薬物部分のＣ末端にフェニルアラニンカルボキシ修飾を有するモノメチルバリン化合物（国際公開第２００７／００８８４８号パンフレット）、およびペンタペプチドアウリスタチン薬物部分のＣ末端にフェニルアラニン側鎖修飾を有するモノメチルバリン化合物（国際公開第２００７／００８６０３号パンフレット）が含まれる。
【０３３５】
他の薬物部分には以下のＭＭＡＦ誘導体が含まれ、式中、波線は、化合物（例えば、式Ｉ、ＩＩまたはＩＶの化合物）のＬ、Ｌ’、Ｖ、Ｖ’、Ｙ、Ｙ’、（ＲＲ’）、Ｒ’または（Ｃ）ｎ基への共有結合を示す：
【化２１】
0006744212.tif 000023
【化２２】
0006744212.tif 000024
【０３３６】
（Ｚ）部分としてのＭＭＡＦと共に、（Ｃ）ｎ部分としてリシン残基、（Ｖ）部分としてバリン−シトルリン、（Ｙ）部分としてＰＡＢを含むリンカーの一例は、以下に示される（化合物Ｉａ−１に相当する）：
【化２３】
0006744212.tif 000025
【０３３７】
一実施形態では、Ｚ部分はエポチロンまたはエポチロン誘導体である。エポチロンは、１６員環および可変置換基を有する環状分子であり、チューブリンに結合する細胞分裂阻害剤としての薬剤活性を有する。１４員、１５員または１８員環を有する変異体を含む種々のエポチロン誘導体が知られており、これも開発されている（例えば、国際公開第２０１１０８５５２３号パンフレット、国際公開第２００９１０５９６９号パンフレット）。エポチロンまたはエポチロン類似体または誘導体の例としては、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、１３−アルキル−エポチロンＣ誘導体、エポチロンＤ、ｔｒａｎｓ−エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、エポチロンのエフェクター結合体、サゴピロン（Ｓａｇｏｐｉｌｏｎｅ）、または文献においてイキサベピロン（ＢＭＳ−２４７５５０）、ＢＭＳ−３１０７０５、ＥＰＯ−９０６、パチュピロン（Ｐａｔｕｐｉｌｏｎｅ）、Ｋｏｓ−８６２、Ｋｏｓ−１５８４、Ｋｏｓ−１８０３およびＡＢＪ８７９と呼ばれるエポチロンのいずれか、ならびに薬学的に活性なこれらの塩が挙げられる。エポチロン、その前駆体および誘導体の製造は、一般的に、当業者に知られている方法に従って実行される。適切な方法は、例えば、独国特許第１９９０７５８８号明細書、国際公開第９８／２５９２９号パンフレット、国際公開第９９／５８５３４号パンフレット、国際公開第９９／２５１４号パンフレット、国際公開第９９／６７２５２号パンフレット、国際公開第９９／６７２５３号パンフレット、国際公開第９９／７６９２号パンフレット、欧州特許第９９／４９１５号明細書、国際公開第００／４８５号パンフレット、国際公開第００／１３３３号パンフレット、国際公開第００／６６５８９号パンフレット、国際公開第００／４９０１９号パンフレット、国際公開第００／４９０２０号パンフレット、国際公開第００／４９０２１号パンフレット、国際公開第００／７１５２１号パンフレット、国際公開第００／３７４７３号パンフレット、国際公開第００／５７８７４号パンフレット、国際公開第０１／９２２５５号パンフレット、国際公開第０１／８１３４２号パンフレット、国際公開第０１／７３１０３号パンフレット、国際公開第０１／６４６５０号パンフレット、国際公開第０１／７０７１６号パンフレット、米国特許第６２０４３８８号明細書、米国特許第６３８７９２７号明細書、米国特許第６３８０３９４号明細書、米国特許出願第０２／５２０２８号明細書、米国特許出願第０２／５８２８６号明細書、米国特許出願第０２／６２０３０号明細書、国際公開第０２／３２８４４号パンフレット、国際公開第０２／３０３５６号パンフレット、国際公開第０２／３２８４４号パンフレット、国際公開第０２／１４３２３号パンフレット、および国際公開第０２／８４４０号パンフレットに記載されている。さらに、エポチロンは、国際公開第９３／１０１０２号パンフレット、国際公開第９８／２５９２９号パンフレット、国際公開第９９／０２５１４号パンフレット、国際公開第９９／０７６９２号パンフレット、国際公開第９９／０２５１４号パンフレット、国際公開第９９／６７２５２号パンフレット、国際公開第００／４９０２１号パンフレット、国際公開第００／６６５８９号パンフレット、国際公開第００／７１５２１号パンフレット、国際公開第０１／０２７３０８号パンフレット、国際公開第０２／０８０８４６号パンフレット、国際公開第０３／０７４０５３号パンフレット、国際公開第２００４／０１４９１９号パンフレット記載されている。
【０３３８】
他の有用な治療法は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって保持される「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｂｏｏｋ」において説明されている。新しい薬物は絶えず発見および開発されており、これらも本明細書の化合物に取り込むことができる。
【０３３９】
キレート化金属は、２〜８（包括的）の配位数を有する二価または三価（ｄｉ−  ｏｒ  ｔｒｉｐｏｓｉｔｉｖｅ）金属のキレートを含む。このような金属の特定の例としては、テクネチウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ガリウム（Ｇａ）、イットリウム（Ｙ）、テルビウム（Ｔｂ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、およびスカンジウム（Ｓｃ）が挙げられる。一般に、金属は好ましくは放射性核種である。特定の放射性核種には、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５８Ｃｏ、６０Ｃｏ、６７Ｃｕ、１９５Ａｕ、１９９Ａｕ、１１０Ａｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、２０７Ｂｉ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８８Ｙ、９０Ｙ、１６０Ｔｂ、１５３Ｇｄおよび４７Ｓｃが含まれる。
【０３４０】
キレート化金属は、例えば，任意の適切な多座キレート剤、例えば非環式または環状ポリアミン、ポリエーテル、（例えば、クラウンエーテルおよびその誘導体）；ポリアミド；ポルフィリン；および炭素環式誘導体によってキレート化された上記のタイプの金属の１つであり得る。
【０３４１】
一般に、キレート剤のタイプは、使用される金属に依存し得る。キレート剤の１つの特に有用な群は、非環式および環状ポリアミン、特にポリアミノカルボン酸、例えばジエチレントリアミン五酢酸およびその誘導体、ならびに巨大環状アミン、例えば環状トリ−アザおよびテトラ−アザ誘導体（例えば、ＰＣＴ国際公開第９２／２２５８３号パンフレットに記載される）；ならびにポリアミド、特にデスフェリオキサミンおよびその誘導体である。
【０３４２】
その他のエフェクター分子は、例えば診断において有用な検出可能な物質を含み得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性核種、陽電子放出金属（陽電子放出断層撮影で使用するため）、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。診断として使用するために抗体に結合することができる金属イオンについては一般的に米国特許第４，７４１，９００号明細書が参照される。適切な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ；ストレプトアビジン、アビジンおよびビオチンを含む適切な補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルおよびフィコエリトブリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｂｒｉｎ）を含む適切な蛍光材料；ルミノールを含む適切な発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含む適切な生物発光材料；ならびに１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎおよび９９Ｔｃを含む適切な放射性核種が挙げられる。
【０３４３】
エフェクター分子として使用するための合成または天然に存在するポリマーには、例えば、任意選択で置換された直鎖もしくは分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン、またはポリオキシアルキレンポリマー、または分枝状もしくは非分枝状多糖、例えば、ホモ−またはヘテロ−多糖（ラクトース、アミロース、デキストランまたはグリコーゲンなど）が含まれる。
【０３４４】
上述の合成ポリマー上に存在し得る特定の任意選択的な置換基には、１つまたは複数のヒドロキシ、メチルまたはメトキシ基が含まれる。合成ポリマーの特定の例としては、任意選択で置換された直鎖または分枝鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）またはその誘導体、特に、任意選択で置換されたポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）またはその誘導体が挙げられる。このような化合物は、部分Ｚとして使用される場合、抗体の薬物動態学的特性を改善する部分として使用することができる。
【０３４５】
ポリマーのサイズは所望されるように変化され得るが、一般に、５００Ｄａ〜５０，０００Ｄａ、好ましくは５，０００〜４０，０００Ｄａ、そしてより好ましくは１０，０００〜４０，０００Ｄａおよび２０，０００〜４０，０００Ｄａの平均分子量範囲であろう。ポリマーサイズは、特に、意図される生成物の使用、例えば腫瘍などの特定の組織に局在化させる能力または循環半減期を延長する能力に基づいて選択され得る（概説については、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５を参照）。従って、例えば、生成物が循環から出て組織に侵入することを目的とする場合、例えば腫瘍の治療で使用するための場合には、小さい分子量のポリマー、例えば約５，０００Ｄａの分子量を有するポリマーを使用することが有利であり得る。生成物が循環内に残る用途の場合、より高分子量のポリマー、例えば２０，０００Ｄａ〜４０，０００Ｄａの範囲の分子量を有するポリマーを使用することが有利であり得る。
【０３４６】
特に好ましいポリマーには、ポリアルキレンポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）、または特に、メトキシポリ（エチレングリコール）またはその誘導体、そして特に、約１０，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａの範囲の分子量を有するものが含まれる。
【０３４７】
別の実施形態では、ｚ’は１に等しく、各Ｖ、ＹまたはＶ−Ｙ（任意のＶおよびＹがＶ’またはＹ’であることに関係なく）部分は、Ｚの官能基の対する単一の取り付け部位を含有する。
【０３４８】
別の実施形態では、１つのＶ（またはＶ’）、Ｙ、（またはＹ’）またはＶ−Ｙ（またはＶ’−Ｙ’、Ｖ−Ｙ’）部分は前記Ｖ、ＹまたはＶ−Ｙ部分の複数の官能基Ｒを介して２つ以上のＺ部分に取り付けられる。任意選択で、１つまたは複数のＶ（またはＶ’）部分は、ポリマー、任意選択でオリゴエチレングリコールもしくはポリエチレングリコールまたはこれらの誘導体を含む。
【０３４９】
本明細書に開示されるＺ部分の任意の１つは、式Ｉａ、ＩＩＩＩ、およびＩＶａにおいて使用され得る。本明細書に記載されるＺ部分の任意の１つは、本明細書に記載される（Ｃ）ｎ、Ｘ、Ｌ、Ｖ、Ｒ、Ｙ、Ｚ、Ｍ、ｚ、ｑ、およびｒ基のいずれかと組み合わせて使用することができる。本明細書に記載されるＺ部分の任意の１つは、本明細書に記載されるＲ’、Ｌ’、Ｖ’、Ｙ’、ｚ’、ｑ’、およびｒ’基のいずれかと組み合わせて使用することができる。
【０３５０】
抗体−Ｚ結合体
一実施形態では、連結試薬（例えば、式Ｉａ）は、反応基ＲおよびＲ’を含む反応ステップを必要とせずに抗体または抗体断片に直接結合される。１つの態様では、抗体または抗体断片は、以下の式ＩＶａ
（Ｑ）−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｚ）ｚ）ｑ）ｒ      式ＩＶａ
の機能化グルタミン残基またはその薬学的に許容可能な塩を含み、式中、
Ｑは、抗体または抗体断片中に存在するグルタミン残基であり、
（Ｃ）ｎは置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミド（例えば、エーテル、エステル、チオエーテル、チオエステル、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドのＯ、ＮまたはＳ原子）によって任意選択で置換され、
ｎは、２〜２０の範囲の中から選択される整数であり、
ＸはＮＨ、Ｏ、Ｓであるか、または存在せず、
Ｌは結合であるか、または１つまたは複数の原子において置換された好ましくは１〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、任意選択で、炭素含有フレームワークは、線状炭化水素、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、または任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）であり、
ｒは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｑは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｚは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
Ｖは独立して、存在しないか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、任意選択で、化学的、光化学的、物理的、生物学的、または酵素的プロセスによって切断または変換され得る（例えば、Ｖの切断は、後でまたは最終的にＶに連結される１つまたは複数の部分、例えばＺ部分の放出を最終的にもたらす）。いくつかの実施形態では、Ｖは、「Ｖ部分」という表題の以下のセクションに記載されるように、好ましくは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、またはオリゴペプチドであり、
Ｙは独立して、存在しないか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー（例えば、自己脱離性スペーサー系または非自己脱離スペーサー系）であり、
Ｚは対象の部分であり、任意選択で、薬物動態学的特性を改善する部分、または治療的部分もしくは診断的部分である。好ましくは、Ｚは細胞毒性抗癌剤、例えば、タキサン、アントラサイクリン、カンプトテシン、エポチロン、マイトマイシン、コンブレタスタチン、ビンカアルカロイド、窒素マスタード、マイタンシノイド、カリキアマイシン、デュオカルマイシン、ツブリシン、アマトキシン、ドラスタチンおよびアウリスタチン、エンジイン、放射性同位体、治療用タンパク質およびペプチド、ならびに毒素またはこれらの断片からなる群から選択される化合物である。
【０３５１】
一般に、各Ｚは、Ｙ、Ｙが存在しない場合はＶ、またはＹおよびＶがいずれも存在しない場合はＬに直接カップリングされる。
【０３５２】
（Ａｂ）が免疫グロブリンであり、（Ａｂ）がグルタミン（Ｑ）残基を介して連結試薬（例えば、式Ｉａの化合物）のＮＨに結合される場合、式ＩＶａが便宜上、（Ａｂ）−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｚ）ｚ）ｑ）ｒ（式ＩＶａ）としても表され得ることは認識されるであろう。
【０３５３】
式ＩＶａの抗体または抗体断片の例としては、アミド結合を介して（例えば、抗体または抗体断片の一次配列内の受容体グルタミン残基により）、化合物Ｉａ−１〜Ｉａ−２３からなる群から選択される化合物に取り付けられる抗体および断片が挙げられるが、これらに限定されない（ここで、前記化合物Ｉａ−１〜Ｉａ−２３のそれぞれの末端ＮＨ２−は、抗体または断片に取り付けられると、部分（（Ｑ）−ＮＨ−）によって置換され、Ｑは抗体または抗体断片中に存在するグルタミン残基である）。
【０３５４】
式ＩｂまたはＩＩＩの化合物と、リシンベースのリンカーに結合された抗体との反応から得られる抗体結合体は、部分ＺがＹ（またはＹ’）およびＶ（またはＶ’）が存在しない場合はリンカーＬ（またはＬ’）に、スペーサー系Ｙ（Ｙ’）に、あるいはＹ（またはＹ’）が存在しない場合はＶ（またはＶ）に接続された抗体結合体をもたらすであろう。任意選択で、前記接続はＭの連結基（ＲＲ’）を介する。
【０３５５】
反応から得られる結合体は、抗体上に存在する受容体グルタミン残基（Ｑ）を介してリシンベースのリンカーのＮＨ基に、そして任意選択的な連結基（ＲＲ’）、任意選択的なリンカー（ＶまたはＶ’）および／または任意選択的なスペーサー（ＹまたはＹ’）を介して１つまたは複数の部分（Ｚ）に結合（すなわち、共有結合）された抗体（Ａｂ）をもたらす。
【０３５６】
一実施形態では、（ＲＲ’）は結合抗体または抗体断片中に存在したままであり、この場合、式ＩＶは（Ｍ）部分を含むであろう。このような抗体または抗体断片は、以下の式ＩＶｂ
（Ｑ）−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｍ）ｚ）ｑ）ｒ      式ＩＶｂ
の機能化グルタミン残基、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物を含み、式中、
Ｑは、抗体または抗体断片中に存在するグルタミン残基であり、
（Ｃ）ｎは置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドによって任意選択で置換され、
ｎは、２〜２０の範囲の中から選択される整数であり、
ＸはＮＨ、Ｏ、Ｓであるか、または存在せず、
Ｌは結合であるか、または１つまたは複数の原子において置換された好ましくは１〜２００個の原子の炭素含有フレームワークであり、任意選択で、炭素含有フレームワークは、線状炭化水素、対称もしくは非対称分枝状炭化水素、単糖、二糖、線状もしくは分枝状オリゴ糖（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、他の天然線状もしくは分枝状オリゴマー（非対称分枝状もしくは対称分枝状）、または任意の連鎖成長もしくは逐次成長重合プロセスから得られる二量体、三量体、もしくはより多量体のオリゴマー（線状、非対称分枝状もしくは対称分枝状）であり、
ｒは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｑは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
ｚは、１、２、３または４の中から選択される整数であり、
Ｖは独立して、存在しないか、切断不能な部分または条件的に切断可能な部分であり、任意選択で、化学的、光化学的、物理的、生物学的、または酵素的プロセスによって切断または変換され得る（例えば、Ｖの切断は、後でまたは最終的にＶに連結される１つまたは複数の部分、例えばＺ部分の放出を最終的にもたらす）。いくつかの実施形態では、Ｖは、「Ｖ部分」という表題の以下のセクションに記載されるように、好ましくは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、またはオリゴペプチドであり、
Ｙは独立して、存在しないか、または１つもしくは複数のスペーサーで構成されたスペーサー（例えば、自己脱離性スペーサー系または非自己脱離スペーサー系）であり、
Ｍは独立して、Ｒまたは（ＲＲ’）−Ｌ’−（Ｖ’−（Ｙ’−（Ｚ）ｚ’）ｑ’）ｒ’であり、Ｌ’、Ｖ’、Ｙ’、ｚ’、ｑ’、およびｒ’のそれぞれは、式ＩＩＩにおいて定義される通りであり（または、それぞれＬ、Ｖ、Ｙ、ｚ、ｑおよびｒであると定義され）、
Ｚは対象の部分であり、任意選択で、薬物動態学的特性を改善する部分、または治療的部分もしくは診断的部分であり、Ｒは式Ｉに定義される通りであり、ここで各（ＲＲ’）は、式ＩのＲとその相補的な式ＩＩＩのＲ’の付加生成物である（例えば、図１および図２を参照）。
【０３５７】
従って、ＲＲ’は、例えば、チオ−マレイミド（またはハロアセトアミド）付加、例えば、Ｎ，Ｓ−二置換−３−チオ−ピロリジン−２，５−ジオン；Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション、例えば、Ｎ，３−またはＮ，４−置換−５−ジフェニルホスフィンオキシド−安息香酸アミド；Ｈｕｉｓｇｅｎ１，３−環化付加（クリック反応）、例えば、Ｎ，Ｓ−二置換−３−チオ−ピロリジン−２，５−ジオン、１，４−二置換−１，２，３−トリアゾール、３，５−二置換−イソオキサゾール、または３，５−二置換−テトラゾール；Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環化付加物、例えば、ＯもしくはＮ−置換−５−ノルボルネン−２−カルボン酸エステルもしくはアミド、Ｎ−置換−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド、ＯもしくはＮ−置換−７−オキソノルボルネン−５−カルボン酸エステルもしくはアミド、またはＮ−置換−７−オキソノルボルネン−５，６−ジカルボン酸イミドと、９−置換アントラセンまたは３−置換１，２，４，５−テトラジンとの間の２，４−環化付加生成物；または任意の高収率選択的アミド化またはイミド化反応の付加生成物であり得る。いくつかの反応および対応するＲＲ’反応生成物は図１および２に示される。
【０３５８】
ＲＲ’の例としては、
【化２４】
0006744212.tif 000026
が挙げられ、式中、（＊）は、−（Ｃ）ｎ、Ｘ、Ｌ、Ｌ’、Ｖ、Ｖ’、Ｙ、Ｙ’またはＺの取り付け部位を示す。ＲＲ’は、−（Ｃ）ｎ、Ｘ、Ｌ、Ｌ’、Ｖ、Ｖ’、Ｙ、Ｙ’またはＺ）へのその取り付けに関していずれかの配向であり得る。
【０３５９】
任意選択で、抗体結合体は、Ｒが反応性部分Ｒ’と反応したときに反応性部分Ｒの残りを表す基（ＲＲ’）を含み、ここで、基（ＲＲ’）は（ａ）ＬをＺ、ＶまたはＹへ、（ｂ）ＶをＺまたはＹへ、あるいは（ｃ）ＹをＺへ接続する。例えば、任意のＶ、Ｙおよび／またはＺは、（ＲＲ’）基を含むと特徴付けることができる。任意のＬ、Ｖ、ＹはそれぞれＬ’、Ｖ’またはＹ’であり得る。
【０３６０】
（Ａｂ）が免疫グロブリンであり、（Ａｂ）がグルタミン（Ｑ）残基を介して連結試薬（例えば、式ＩｂまたはＩｃの化合物）のＮＨに結合される場合、式ＩＶｂが便宜上、（Ａｂ）−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｍ）ｚ）ｑ）ｒとしても表され得ることは認識されるであろう。
【０３６１】
式ＩＶｂの抗体または抗体断片の例としては、
【化２５】
0006744212.tif 000027
【化２６】
0006744212.tif 000028
が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６２】
一実施形態では、グルタミン（Ｑ）は抗体重鎖の定常領域に存在する。一実施形態では、グルタミン（Ｑ）は位置２９５にある。一実施形態では、受容体グルタミン（Ｑ）は位置２９７にある（例えば、Ｎ２９７Ｑ置換）。一実施形態では、抗体は、非アスパラギン、非アスパラギン酸、非グルタミン残基による位置２９７のアスパラギンの置換を含む。
【０３６３】
一実施形態では、単一の表面露出受容体グルタミン（Ｑ）が抗体重鎖の定常領域に存在する。任意選択で、抗体は任意選択で２本の重鎖を含み、このような抗体は、抗体分子１つ当たり２つの式ＩＶの機能化受容体グルタミンを含むであろう。任意選択で、前記単一の受容体グルタミン（Ｑ）は位置２９５に位置する。一実施形態では、抗体は、前記単一のグルタミン（Ｑ）が位置２９５に位置するようにＮ２９７Ｑ置換を含む。一実施形態では、抗体は、Ｑ２９５置換（残基２９５のグルタミンが非グルタミン残基によって置換される）およびＮ２９７Ｑ置換を含み、前記単一のグルタミン（Ｑ）は位置２９７に位置する。
【０３６４】
一実施形態では、２つの表面露出受容体グルタミン（Ｑ）が抗体重鎖の定常領域に存在する。任意選択で、抗体は任意選択で２本の重鎖を含み、このような抗体は、抗体分子１つ当たり４つの式ＩＶの機能化受容体グルタミンを含むであろう。任意選択で、第１のグルタミン（Ｑ）は位置２９５に位置し、第２のグルタミン（Ｑ）は位置２９７に位置する（例えば、Ｎ２９７Ｑ置換）。
【０３６５】
化合物の使用
１つの態様では、本開示は、式ＩＩの抗体結合体を調製するための式Ｉの化合物の使用を提供する。
【０３６６】
別の態様では、本開示は、式ＩＶの抗体結合体を調製するための式ＩＩＩの化合物および／または式ＩＩの抗体結合体の使用を提供する。
【０３６７】
さらに別の態様では、本開示は、治療または診断を必要としている哺乳類の治療または診断のための診断薬、キットおよび／または医薬品を製造するための、本明細書に開示される化合物のいずれかの使用を提供する。一実施形態では、本開示は、哺乳類の腫瘍または感染症の治療のための医薬組成物を製造するための、上記で定義した化合物のいずれかの使用に関する。
【０３６８】
また本開示は、薬剤または薬剤中の活性成分もしくは活性物質としての、上記で定義した化合物のいずれかの使用を提供する。さらなる態様では、本開示は、経口的、局所的、または注射による投与のための固体または液体製剤を提供するために、上記で定義したような化合物を含有する医薬組成物を調製するための方法に関する。このような方法またはプロセスは、少なくとも、化合物を薬学的に許容可能なキャリアと混合するステップを含む。
【０３６９】
１つの態様では、本開示の化合物、または本明細書に開示される化合物を含む（医薬品）組成物を用いて、特定の効果を発揮することによって、所定の条件に作用するまたはそれを防止する、または特定の条件を検出する方法が提供される。
【０３７０】
一実施形態では、生体内または生体外で本明細書に開示される化合物を用いて、特定の条件の存在、例えば酵素の存在、特定のｐＨの存在、（生体）分子の存在、基質の存在、または特定の酸素濃度の存在を検出する方法が提供される。
【０３７１】
一実施形態では、前記酵素を含有する（可能性のある）サンプルを、１つまたは複数の診断的部分Ｚおよび前記（タンパク質分解性）酵素のための基質を含有する本明細書に開示される化合物と共にインキュベートし、前記Ｚ部分の放出を観察することによって、本明細書に開示される化合物を用いて生体外、例えば診断アッセイにおいて酵素を検出する方法が提供される。「酵素の決定」という語句は、定性分析、すなわち酵素の存在を検出し、それが存在するかどうかを決定すること、および定量分析、すなわち酵素を定量化し、サンプル中に存在する酵素活性を決定することの両方を意味する。また酵素は、決定すべき前記酵素によって切断可能な認識部位、例えば活性化部位を含有するそのプロ酵素によって間接的に決定することもできる。プロ酵素の切断は、このような場合、本明細書に開示される適切な化合物を用いて、得られる活性を観察することによって検出され得る。
【０３７２】
一実施形態では、本明細書に開示される化合物が使用される診断アッセイ方法（生体内または生体外）が提供される。
【０３７３】
さらなる実施形態では、本明細書に開示される化合物を用いることによって酵素の存在または量が決定される方法が提供される。
【０３７４】
一実施形態では、本明細書に開示される化合物を用いて、効果を発揮することによって、所定の条件、例えば、自己免疫疾患、微生物疾患、または癌などの疾患に作用するまたはそれを防止する方法が提供される。
【０３７５】
さらなる実施形態では、治療を必要としている哺乳類を治療する方法が提供され、本方法は、医薬組成物を治療的に有効な用量で哺乳類に投与することを含む。
【０３７６】
さらなる実施形態では、本明細書に開示される化合物を用いて、望ましくない（細胞）増殖を特徴とする病気を有する哺乳類を治療する方法が提供される。別の実施形態では、本開示は、腫瘍を有する哺乳類を本開示の化合物により治療する方法に関する。さらに別の実施形態では、本開示は、炎症性疾患を有する哺乳類を本開示の化合物により治療する方法に関する。さらに別の実施形態では、本開示は、自己免疫疾患を有する哺乳類を本開示の化合物により治療する方法に関する。さらに別の実施形態では、本開示は、細菌感染または微生物感染を有する哺乳類を本開示の化合物により治療する方法に関する。
【０３７７】
一実施形態では、哺乳類の癌の治療方法が提供され、本方法は、医薬組成物を治療的に有効な用量で哺乳類に投与することを含む。
【０３７８】
一実施形態では、化合物は、望ましくない増殖を特徴とする病気を治療するために使用される。別の実施形態では、本開示の化合物は、望ましくない（細胞）増殖を特徴とする病気を治療するために使用される。別の実施形態では、本開示の化合物は、腫瘍を治療するために使用される。さらに別の実施形態では、本開示の化合物は、炎症性疾患を治療するために使用される。さらに別の実施形態では、本開示の化合物は、自己免疫疾患を治療するために使用される。さらに別の実施形態では、本開示の化合物は、細菌感染または微生物感染を治療するために使用される。
【０３７９】
一実施形態では、抗体は、抗体が結合する抗原（例えば、腫瘍またはウィルス抗原）を発現する細胞内へ内部移行することができ、そして／あるいは前記抗原発現細胞上の抗原の内部移行を誘発する。一実施形態では、本開示の化合物は、内部移行の際に細胞に対して毒性である（すなわち、化合物は、細胞に対して毒性である部分Ｚを含む）。好ましくは、このような化合物は、細胞を死滅または排除する方法において使用することができ、好ましくは、前記細胞は腫瘍細胞である。
【０３８０】
本明細書中の任意の態様の一実施形態では、腫瘍は固形腫瘍、例えば癌腫であり、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺および皮膚の癌または癌腫が含まれる。本明細書中の任意の態様の一実施形態では、腫瘍は血液腫瘍である。
【０３８１】
また、上記で定義される本開示の化合物を含む医薬組成物も提供される。本開示の化合物は、医薬組成物として、薬剤キャリアと共に精製形態で投与され得る。好ましい形態は、意図される投与モードおよび治療または診断用途に依存する。薬剤キャリアは、本開示の化合物を患者に送達するために適切である、任意の適合性の非毒性物質であり得る。薬学的に許容可能なキャリアは当該技術分野において周知であり、例えば、水溶液、例えば（無菌）水または生理学的に緩衝された食塩水、または他の溶媒もしくは媒体、例えばグリコール、グリセロール、油、例えばオリーブ油、または注射用有機エステル、アルコール、脂肪、ワックス、および不活性固体が含まれる。薬学的に許容可能なキャリアはさらに、例えば、本開示の化合物を安定化する、またはその吸収を高めるための役割を果たす生理学的に許容可能な化合物を含有し得る。このような生理学的に許容可能な化合物には、例えば、炭水化物、例えば、グルコース、スクロースまたはデキストラン、酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸またはグルタチオン、キレート剤、低分子量タンパク質または他の安定剤もしくは賦形剤が含まれる。当業者は、生理学的に許容可能な化合物を含む薬学的に許容可能なキャリアの選択が、例えば、組成物の投与経路に依存することが分かるであろう。また薬学的に許容可能なアジュバント、緩衝剤、分散剤などが医薬組成物に取り込まれてもよい。
【０３８２】
経口投与の場合、活性成分は、カプセル、錠剤、および粉末などの固体剤形、またはエリキシル剤、シロップ、および懸濁液などの液体剤形で投与することができる。活性成分は、内非活性成分および粉末状キャリア、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ナトリウムサッカリン、タルカム、炭酸マグネシウムなどと一緒にゼラチンカプセル内にカプセル化され得る。望ましい色、味、安定性、緩衝能力、分散または他の既知の望ましい特徴を生じるために添加され得る付加的な非活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、酸化チタン、食用白色インクなどである。同様の希釈剤を使用して、圧縮錠剤を作ることができる。錠剤およびカプセルはいずれも、ある期間にわたって薬物の連続放出を提供するために、持続放出品として製造することができる。圧縮錠剤は、任意の不快な味を遮蔽し、錠剤を大気から保護するために衣錠またはフィルムコート錠であってもよいし、あるいは胃腸管における選択的崩壊のために腸溶錠であってもよい。経口投与のための液体剤形は、患者の受け入れを高めるために着色剤および風味剤を含有することができる。
【０３８３】
しかしながら、本開示の化合物は好ましくは非経口的に投与される。非経口投与のための本開示の化合物の調製は無菌でなければならない。殺菌は、任意選択で、凍結乾燥および再構成の前または後に、無菌ろ過膜によるろ過によって容易に達成される。本開示の化合物の投与のための非経口経路は、既知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、または病巣内経路による注射または注入に従う。本開示の化合物は、注入によって連続的に、あるいはボーラス注射によって投与されてもよい。
【実施例】
【０３８４】
材料および方法
抗体
ｃｈＡＤＣ１（またはｃｈｉｍＡＤＣ１）はヒト腫瘍抗原に特異的な抗体であり、ｃｈｉｍＡＤＣ１（またはｃｈＡＤＣ１）は、マウスで産生されてヒトＩｇＧ１アイソタイプに転換されたキメラ抗体である。ｃｈＣＥ７はヒトＬ１−ＣＡＭに対して特異的であり、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合されたマウスＶＬおよびマウスＶＨで構成される（例えば、Ｊｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，４９，９９９５−９９９７およびＫｎｏｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｅｒ  ｒｅｓ．，１３，６０３−６１１を参照）。ＳＧＮ−３５はヒトＣＤ３０に対して特異的であり、Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．１０１（１）：２２４−２３０および米国特許第７，０９０，８４３号明細書に記載されている。ｃｈＡＤＣ１、ＳＧＮ−３５およびｃｈＣＥ７は、アミノ酸残基２９５（Ｋａｂａｔ  ＥＵ）における重鎖ごとに１つの受容体グルタミン、すなわち全部で２つの受容体グルタミンを有する全長四量体抗体である。他に記載されない限り、ＢＴＧカップリング反応で使用されるＦｃ突然変異のないｃｈＡＤＣ１、ＳＧＮ−３５およびｃｈＣＥ７抗体は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて脱グリコシル化した。
【０３８５】
Ｆｃ突然変異体抗体
抗体ｃｈｉｍＡＤＣ１およびＳＧＮ−３５の、Ｎ２９７Ｓ突然変異を含有する変異体を構築した。従って、この抗体は、アミノ酸残基２９５（Ｋａｂａｔ  ＥＵ）において重鎖ごとに１つの受容体グルタミン、すなわち四量体抗体ごとに全部で２つの受容体グルタミンを有し、これをアグリコシル化した。
【０３８６】
抗体ｃｈｉｍＡＤＣ１、ＳＧＮ−３５およびｃｈＣＥ７の、Ｎ２９７Ｑ突然変異を含有する変異体も構築した。従って、これらの抗体はアミノ酸残基２９５および２９７（Ｋａｂａｔ  ＥＵ）において重鎖ごとに２つの受容体グルタミン、すなわち全部で４つの受容体グルタミンを有し、これをアグリコシル化した。Ｑ２９５ＮおよびＮ２９７Ｑ突然変異の両方を含有するｃｈＣＥ７のさらなる変異体も構築した。
【０３８７】
ｃｈｉｍＡＤＣ１およびＳＧＮ−３５については、γ１抗体のヒト定常領域においてＮ２９７ＳまたはＮ２９７Ｑ突然変異を有する２つの異なる配列は、ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成した。これらの２つの突然変異配列Ｎ２９７ＳおよびＮ２９７Ｑをそれぞれ設計した。
【０３８８】
Ｎ２９７Ｓ構築物のために合成された核酸およびアミノ酸配列（突然変異は下線が引かれる）は以下に示される：
【化２７】
0006744212.tif 000029
【０３８９】
Ｎ２９７Ｑ構築物のために合成された核酸およびアミノ酸配列（突然変異は下線が引かれる）は以下に示される：
【化２８】
0006744212.tif 000030
【０３９０】
次に、これらの配列をＡｐａＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素によりＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈクローニングベクターから消化し、同じ制限酵素で消化したベクターＢにクローン化した（Ｂ  Ｎ２９７ＳおよびＢ  Ｎ２９７Ｑ）。ｃｈＡＤＣ１抗体の可変ドメインの軽鎖および重鎖をＰＣＲにより増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｏｚｙｍｅ）を用いてＰＣＲの精製産物をベクターＢ  Ｎ２９７ＳおよびＮ２９７Ｑに一緒にクローン化し、バイシストロン性ベクターを構築した。次に、生成されたバイシストロン性ベクターを配列決定し、細胞トランスフェクションの前に検証した。ｃｈＡＤＣ１またはＳＧＮ−３０のＮ２９７ＳおよびＮ２９７ＱをコードするベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、ローリングボトル内で細胞を成長させて大量の抗体を作製し、これを回収した上澄みから精製した。
【０３９１】
ｃｈＣＥ７（抗−Ｌ１−ＣＡＭ抗体）については、重鎖および軽鎖からのｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位に別々にクローン化した。オーバーラッピングＰＣＲおよび標準分子生物学技術を用いて、特異的な突然変異Ｎ２９７ＱをｃｈＣＥ７重鎖のＣＨ２ドメインに導入した。Ｎ２９７Ｑ構築物の核酸およびアミノ酸配列は以下に示される（突然変異は下線が引かれる）：
【化２９】
0006744212.tif 000031
【０３９２】
さらに、Ｑ２９５Ｎ突然変異を含有する、アグリコシル化Ｎ２９７Ｑ変異体のさらに修飾された変異体を作製した（すなわち、Ｑ２９５Ｎ、Ｎ２９７Ｑを含有する）。抗体は、ＨＥＫ２９３細胞において作製した。重鎖および軽鎖含有プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に同時にトランスフェクトした。ｃｈＣＥ７を培養皿で作製し、タンパク質Ａセファロースカラムにおいて、回収した上澄みから精製した。
【０３９３】
リシンベースのリンカー
カダベリン−ダンシル、カダベリン−ビオチンおよびカダベリン−ＴＡＭＲＡは、Ｚｅｄｉｒａ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｃ２−ＳＡｃ、Ｃ６−ＳＡｃ、ＰＥＧ−４−ＳＡｃは、実施例１に記載されるように調製した。５−ＦＡＭカダベリン（フルオレセイン−５−カルボキサミド）は、Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ（Ｌｅ  Ｐｅｒｒａｙ  ｅｎ  Ｙｖｅｌｉｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。ＤＢＣＯ−アミン、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２、アジド−ＰＥＧ４−ＮＨ２およびアルキン−ＰＥＧ４−ＮＨ２は、Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，ＡＺ）から購入した。Ｃ２−ＳＨおよびＣ６−ＳＨチオールリンカーは、実施例１に記載されるようにその対応するジスルフィドの還元によって合成した。ＰＥＧ−４−ＳＨは、ナトリウムメトキシドによるＰＥＧ−４−ＳＡｃの酢酸基の切断によって合成した。ＭＭＡＦリンカーは、Ｃ６−ＳＨをマレイミド−バリン−シトルリン−ＰＡＢ−ＭＭＡＦと反応させ、続いてＢｏｃ−脱保護を行うことによって調製した。Ｃ２−ＤＯＴＡおよびＣ６−ＤＯＴＡリンカー（マレイミド−ＤＯＴＡにカップリングされたチオールリンカー）は、Ｃ２−ＳＨまたはＣ６−ＳＨをＤＯＴＡ−マレイミドと反応させた後、Ｂｏｃ脱保護を行うことによって調製した。同様の手順を用いて、Ｃ２−フルオレセイン（フルオレセインマレイミドにカップリングされたＣ２−チオールリンカー）を調製した。Ｃ２−Ｎ３およびＣ６−Ｎ３リンカーは、実施例１に記載されるように合成した。
【０３９４】
抗体の脱グリコシル化
ＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ（１０Ｘ）：重量２．１ｇのＫＨ２ＰＯ４、９０ｇのＮａＣｌ、４．８ｇのＮａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏを１Ｌのガラス瓶に移し、水を１Ｌの体積まで添加する。ＰＢＳ１Ｘを得るために、１００ｍＬのＰＢＳ（１０Ｘ）を使用し、水を９００ｍＬの体積まで添加する。ｐＨを７．２に調整し、１Ｌまで水を満たす）中の抗体を、６単位／ｍｇタンパク質のフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）由来のＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）（Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と共に３７℃で一晩インキュベートした。次に、遠心分離−透析（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ＭＷＣＯ  ５０ｋＤａ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｉｎｋｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって酵素を除去した。
【０３９５】
抗体の酵素修飾
ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍＬの脱グリコシル化抗体を、８０当量のリガンドおよび１Ｕ／ｍＬまたは＞１Ｕ／ｍＬの細菌トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧａｓｅ、Ｚｅｄｉｒａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に３７℃で一晩インキュベートした。遠心分離−透析（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ＭＷＣＯ  ５０ｋＤａ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｉｎｋｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって過剰のリガンドおよびＢＴＧａｓｅを除去した。
【０３９６】
保護チオールリンカーの脱保護
保護チオールリンカーの脱アセチル化のための方法は、公開された手順（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から適応される。０．５Ｍのヒドロキシルアミン、２５ｍＭのＥＤＴＡは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２〜８．５中で調製される。１ｍＬの抗体−リンカー結合体が、調製した０．５Ｍのヒドロキシルアミン１００〜２００μＬと混ぜ合わせられる。混合物は室温で２時間インキュベートされる。次に、脱塩カラム（ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム、５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、反応混合物を、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中に、精製される。
【０３９７】
脱保護抗体−リンカー結合体と、マレイミド機能化された対象の部分（Ｚ）とのカップリング
脱保護抗体−リンカー結合体と、マレイミド機能化毒素とのカップリングは、Ｊ．Ｒ．Ｊｕｎｕｔｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６，９２５と同様に実行される。ＳＨ基につき５当量のマレイミド機能化リガンドが、脱保護抗体−リンカー結合体と混ぜ合わせられる。反応はＲＴで１．５時間インキュベートされた後、ＰＢＳ中に脱塩される。
【０３９８】
アジド基を有する抗体−リンカー結合体と、アルキン機能化された対象の部分（Ｚ）とのカップリング
アミン−ＤＢＣＯ（５０μＭ、２部位−突然変異体のための最終濃度；１００μＭの最終濃度）を、アジド基を有する抗体−リンカー結合体（２０μＭ）に添加し、反応混合物を室温で０．５時間インキュベートすることによって、結合反応を実施した。混合物をＬＣ−ＭＳにより直接分析した。
【０３９９】
ＬＣ−ＭＳ分析
ＬＣ−ＭＳ分析は、Ｗａｔｅｒｓ  ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計において実施した。６５℃に加熱したＡｅｒｉｓ  ＷＩＤＥＰＯＲＥ  ＸＢ−Ｃ１８カラム（３．６μｍ、１００ｍｍ×２．１ｍｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）において、０．５ｍＬ／分の流速で、１５分間に２２％から５５％までのＡプラス５％溶媒Ｃの直線的な勾配を用いてサンプルのクロマトグラフィを行った（溶媒Ａ：アセトニトリル＋０．１％ギ酸、溶媒Ｂ：水＋０．１％ギ酸、溶媒Ｃ：２−プロパノール）。溶離液は、エレクトロスプレー源を用いてイオン化した。ＭａｓｓＬｙｎｘ４．１によりデータを収集し、ＭａｘＥｎｔ１を用いて逆重畳積分を実施した。ＬＣ−ＭＳ分析の前に、１０μｇの抗体をＤＴＴと混合した（最終濃度は２０ｍＭとすべきである）。Ｇｕａｎ−緩衝液（７．５ＭのＧｕａｎ−ＨＣｌ、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ８．５（濃ＮＨ４ＯＨ（２８％水溶液）の添加により調整））を、５０μＬの最終体積まで添加した。最後に、５μＬの混合物を注入した。
【０４００】
ＨＩＣ分析
疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）分析は、ＴＳＫｇｅｌ  Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲカラム、４．６×３５ｍｍ、２．５ｍｍ粒径（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２００シリーズＵＰＬＣシステムにおいて、１４分間に１００％移動相Ａ（２５ｍＭのリン酸カリウム１．５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４）から７０％移動相Ｂ（２５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０、２５％イソプロパノール）への直線的な勾配を用いて実行した。流速を１ｍＬ／分に設定し、カラム温度を３０℃に維持した。Ｄａｎｓｙｌカダベリン基質にカップリングされたｃｈＡＤＣ１ｄｇｌ（実施例３を参照）のＨＩＣ分析は、ＵＶ（２８０ｎｍ）および蛍光（２５０ｎｍにおけるλ励起、５３５ｎｍにおけるλ発光）による二重検出を用いて実施した。全体平均薬物負荷またはＤＡＲ（薬物抗体比）は、重み係数として成分ピークの積分面積および各ピークの薬物負荷を用いて、加重平均として計算される。
【０４０１】
ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析：酵素的に修飾された抗体にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）を行い、二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。ＴＢＳＴ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）中で２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により室温（ＲＴ）で２時間ブロッキングした後、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（１：２００００で希釈したＨｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）と共に膜を３０分間インキュベートした。膜を１５分間ＴＢＳＴで３回洗浄し、ＢｉｏｒａｄからのＩｍｍｕｎｅ−Ｓｔａｒ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃ  Ｋｉｔ化学発光基質を用いて抗体を検出した。
【０４０２】
トリプシン消化
０．１％のＲａｐｉｄｇｅｓｔ  ＳＦ（Ｗａｔｅｒｓ）および０．９６μｌの１ＭのＤＴＴを含有する１００μｌの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムｐＨ８．０中で、６．６７＊１０−９モルのタンパク質を５５℃で３０分間インキュベートした。サンプルをＲＴまで冷却した後、１．９２μｌの１Ｍのヨードアセトアミドを添加し、サンプルをＲＴで４０分間インキュベートした。次に、サンプルを５μｇのトリプシンにより３７℃で一晩消化し、１０％アセトニトリル中１％のギ酸で希釈（１：１ｖ／ｖ）し、ＡＣＥ  ３  Ｃ１８、１５０×３ｍｍカラムを用いてＥＳＩ−ＴＯＦ  ＬＣ−ＭＳにより分析した。
【０４０３】
実施例１：
スペーサー基を有する場合および有さない場合の新規のリシンベースのリンカーの合成
材料および方法
反応に使用した全ての溶媒は、無水グレードでＡｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（ｐｕｒｉｓｓ．、モレキュラーシーブ上で乾燥、Ｈ２Ｏ＜０．００５％）から購入し、他に記述されない限り、さらに精製ことなく使用した。抽出、カラムクロマトグラフィおよび薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）のための溶媒は、商用グレードで購入した。全ての非水性反応は、火力乾燥したガラス製品および標準的なシリンジ／セプタム技術を用いてアルゴン雰囲気下で実施した。市販の試薬は、さらに精製することなく使用した。一般に、反応を磁気的に攪拌し、Ｍｅｒｃｋ  ＴＬＣガラスシート（シリカゲル６０Ｆ２５４）で実施されるＴＬＣにより監視した。ＵＶ光（λ＝２５４ｎｍ）によって、あるいはアニスアルデヒド溶液またはＫＭｎＯ４溶液で染色し手から加熱することによってスポットを可視化した。生成物のクロマトグラフィ精製は、分取カラムクロマトグラフィ用Ｆｌｕｋａシリカゲル６０を用いて実施した。
【０４０４】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、室温において、ＣＤＣｌ３、ＣＤ３ＯＤまたはＤ２Ｏ中、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖ−４００またはＢｒｕｋｅｒ  Ａｖ−５００スペクトロメータのいずれかで記録した。測定される化学シフトはδ（ｐｐｍ）で報告され、溶媒の残留シグナルを内部標準として使用した（ＣＤＣｌ３ １Ｈ：δ＝７．２６ｐｐｍ、１３Ｃ：δ＝７７．０ｐｐｍ、ＣＤ３ＯＤ  １Ｈ：δ＝３．３１ｐｐｍ、１３Ｃ：δ＝４９．１ｐｐｍ、Ｄ２Ｏ  １Ｈ：δ＝４．８１ｐｐｍ）。全ての１３ＣＮＭＲスペクトルは、完全なプロトンデカップリングにより測定した。ＮＭＲスペクトルのデータは、以下のように報告される：ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｍ＝多重線、ｄｄ＝二重線の二重線、ｄｔ＝三重線の二重線、ｂｒ＝幅広いシグナル。カップリング定数Ｊはヘルツ（Ｈｚ）で報告される。高解像度質量分析（ＨＲＭＳ）は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ｍａｘｉｓ  ＥＳＩ−ＱＴＯＦまたはＶａｒｉａｎ  ＨｉＲｅｓＭＡＬＤＩ機器において実施した。
【０４０５】
使用した分析および分取ＨＰＬＣシステムは、Ｍｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｄ−７０００システムであった。分析分離のためにクロマトグラフィで使用したカラムは、Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ＸＢ−Ｃ１８（４．６×１５０ｍｍ、３μｍ）またはＸｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）のいずれかであり、１ｍｌ／分の流量で操作した。分取精製のためには、Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ＸＢ−Ｃ１８（２１．２×１５０ｍｍ、５μｍ）またはＸｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８（１０×１５０ｍｍ、５μｍ）のいずれかのカラムを使用し、それぞれ１５ｍｌ／分および４ｍｌ／分の流量で操作した。
【０４０６】
化合物１〜６および反応スキームは図１５に示される。化合物７〜９および反応スキームは図１６Ａに示される。化合物１０〜１３および反応スキームについては図１６Ｂが参照される。
【０４０７】
ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（２，２’−ジスルファンジイルビス（アセチル））ビス（アザンジイル））ビス（ペンタン−５，１−ジイル））ジカルバマート（１ａ）
ＤＭＦ（４．９ｍｌ）中の２，２’−ジスルファンジイル二酢酸（１６０ｍｇ、０．８７８ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル（５−アミノ−ペンチル）カルバマート（３９１ｍｇ、１．９３２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（９２０μｌ、５．２７ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でＨＢＴＵ（１．３３ｇ、３．５１ｍｍｏｌ）を液滴で添加した。５時間攪拌した後、茶色がかった溶液を酢酸エチル（８０ｍｌ）で希釈し、水（３×３０ｍｌ）および塩水（１×３０ｍｌ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム下で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。ＣＨＣｌ３／ＥｔＯＨ  ９５：５を用いるシリカにおけるフラッシュカラムクロマトグラフィによって粗生成物を精製して、４２０ｍｇ（８７％）の黄色の油を得た。これは、室温で静置すると凝固した。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．９１（ｂｒ，２Ｈ），４．６８（ｂｒ，２Ｈ），３．４４（ｓ，４Ｈ），３．２９（ｄｔ，Ｊ１＝７．２Ｈｚ，Ｊ２＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），３．１０（ｄｔ，Ｊ１＝７．７Ｈｚ，Ｊ２＝６．３Ｈｚ，４Ｈ），１．６４−１．３１（ｍ，３０Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１６８．５，１５６．１，７９．１，４２．６，４０．２，３９．８，２９．７，２８．８，２８．４，２３．９。Ｃ２４Ｈ４６Ｎ４Ｏ６Ｓ２に対して計算されるＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋５５１．２９３２、測定値５５１．２９２１。
【０４０８】
ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（６，６’−ジスルファンジイルビス（ヘキサノイル））ビス（アザンジイル））ビス（ペンタン−５，１−ジイル））ジカルバマート（１ｂ）
ＤＭＦ（４．７ｍｌ）中の６，６’−ジスルファンジイルジへキサン酸（２５０ｍｇ、０．８４９ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル（５−アミノ−ペンチル）カルバマート（４１２ｍｇ、２．０３８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．８９０ｍｌ、５．０９ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でＨＢＴＵ（１．２９ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）を液滴で添加した。２０時間攪拌した後、黄色がかった反応混合物を酢酸エチル（７０ｍｌ）で希釈し、冷ＨＣｌ  ０．１Ｎ（３×５０ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（飽和）（１×５０ｍｌ）水（１×５０ｍｌ）および塩水（１×５０ｍｌ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム下で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。ＣＨＣｌ３／ＥｔＯＨ  ９５：５を用いるシリカにおけるフラッシュカラムクロマトグラフィによって粗生成物を精製し、５２５ｍｇ（９３％）の化合物を黄色の粘着性固体として得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．８７（ｂｒ，２Ｈ），４．６４（ｂｒ，２Ｈ），３．２２（ｄｔ，Ｊ１＝７．３Ｈｚ，Ｊ２＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），３．０９（ｄｔ，Ｊ１＝８．１Ｈｚ，Ｊ２＝６．７Ｈｚ，４Ｈ），２．６５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．１６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），１．７３−１．５９（ｍ，８Ｈ），１．５５−１．４５（ｍ，８Ｈ），１．４２（ｓ，１８Ｈ），１．３７−１．２８（ｍ，４Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１７２．９，１５６．１，７９．０，４０．２，３９．２，３８．８，３６．５，２９．７，２９．１，２８．８，２８．４，２８．０，２５．３，２３．９。Ｃ３２Ｈ６２Ｎ４Ｏ６Ｓ２に対して計算されるＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋６６３．４１８４、測定値６６３．４１８５。
【０４０９】
ｔｅｒｔ−ブチル（５−（２−メルカプトアセトアミド）ペンチル）カルバマート（２ａ）
テトラヒドロフラン（７ｍｌ）および水（０．７４ｍｌ）の混合物中のジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（２，２’−ジスルファンジイルビス（アセチル））ビス（アザンジイル））ビス（ペンタン−５，１−ジイル））ジ−カルバマート（３９０ｍｇ、０．４７８ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でトリブチルホスフィン（５２８ｍｇ、２．４８ｍｍｏｌ）を液滴で１分以内に添加した。反応混合物を１時間攪拌してから、揮発性物質を３３℃において減圧下で除去した。粗生成物を５０ｍｌのベンゼンと共に１回共沸させて水の痕跡を除去し、ＣＨＣｌ３／ＥｔＯＨ  ９５：５を用いるシリカにおけるフラッシュカラムクロマトグラフィによって残渣を精製し、わずかに黄色の透明油を得た。ヘキサン／酢酸エチル  ２：８を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィによって生成物を再度精製して、酸化トリブチルホスフィン副産物を除去した。無色の油としての生成物の最終収量は１８０ｍｇ（９１％）であり、これは、−２５℃で貯蔵した後、白色固体に凝固した。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．７３（ｂｒ，１Ｈ），４．５７（ｂｒ，１Ｈ），３．２８（ｄｔ，Ｊ１＝７．６Ｈｚ，Ｊ２＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．２３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），３．１１（ｄｔ，Ｊ１＝８．１Ｈｚ，Ｊ２＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．８７（ｔ，３Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），１．６１−１．４７（ｍ，４Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ），１．４０−１．３０（ｍ，２Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１６９．１，１５６．１，７９．１，４０．２，３９．７，２９．７，２９．０，２８．４，２８．３，２３．９。Ｃ１２Ｈ２４Ｎ２Ｏ３Ｓに対して計算されるＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋２９９．１４００、測定値２９９．１４０８。
【０４１０】
ｔｅｒｔ−ブチル（５−（６−メルカプトヘキサンアミド）ペンチル）カルバマート（２ｂ）
テトラヒドロフラン（３ｍｌ）および水（０．３１ｍｌ、１７．２１ｍｍｏｌ）の混合物中のジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（６，６’−ジスルファンジイルビス（ヘキサノイル））ビス（アザンジイル））ビス（ペンタン−５，１−ジイル））ジ−カルバマート（１９６ｍｇ、０．２９６ｍｍｏｌの溶液に、室温でトリブチルホスフィン（２７２μｌ、１．０３５ｍｍｏｌ）を液滴で１分以内に添加した。反応混合物を１時間攪拌してから、３３℃において揮発性物質を減圧下で除去した。粗生成物を５０ｍｌのベンゼンと共に１回共沸させて水の痕跡を除去し、クロロホルム／エタノール  ９５：５を用いるシリカにおけるフラッシュカラムクロマトグラフィによって残渣を精製し、わずかに黄色の透明油を得た。ＮＭＲにより、化合物はトリブチルホスフィン酸化副産物で汚染されていることことが明らかになったので、ヘキサン／酢酸エチル  ２：８を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィによって粗生成物を再度精製し、１８０ｍｇ（９１％）の生成物を無色の油として得た。これは、−２５℃で貯蔵した後に凝固した。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．８８（ｂｒ，１Ｈ），４．５７（ｂｒ，１Ｈ），３．２３（ｄｔ，Ｊ１＝７．３Ｈｚ，Ｊ２＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．０９（ｄｔ，Ｊ１＝７．８Ｈｚ，Ｊ２＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．５２（ｄｔ，Ｊ１＝８．０Ｈｚ，Ｊ２＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．１６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ），１．６９−１．５７（ｍ，４Ｈ），１．５６−１．４６（ｍ，４Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ），１．３６−１．２８（ｍ，３Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１７２．８，１５６．１，７９．１，４０．２，３９．２，３６．５，３３．６，２９．７，２９．１，２８．４，２７．９，２５．１，２４．４，２３．９。Ｃ１６Ｈ３２Ｎ２Ｏ３Ｓに対して計算されるＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋３３３．２２０６、測定値３３３．２１９８。
【０４１１】
Ｓ−（２−（（５−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ペンチル）アミノ）−２−オキソエチル）エタンチオアート（３ａ）
脱気（凍結脱気（ｆｒｅｅｚｅ−ｐｕｍｐ−ｔｈａｗ））した酢酸エチル（２．７ｍｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル（５−（２−メルカプトアセトアミド）ペンチル）カルバマート（１８９ｍｇ、０．６８４ｍｍｏｌ）および乾燥炭酸カリウム（１８９ｍｇ、１．３６８ｍｍｏｌ）の混合物に、無水酢酸（７７ｍｇ、０．８２１ｍｍｏｌ）を添加し、反応を１６時間攪拌した。次に反応を酢酸エチル（３０ｍｌ）で希釈し、ろ過し、冷水（１×１５ｍｌ）および塩水（１×１５ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム下で乾燥させ、蒸発乾固させた。ＣＨＣ３／ＥｔＯＨ  ９６：４を用いるシリカにおけるフラッシュカラムクロマトグラフィによって粗生成物を精製し、１９２ｍｇ（８８％）の生成物を白色固体として得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．２２（ｂｒ，１Ｈ），４．５６（ｂｒ，１Ｈ），３．５１（ｓ，２Ｈ），３．２１（ｄｔ，Ｊ１＝７．１Ｈｚ，Ｊ２＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．０９（ｄｔ，Ｊ１＝７．６Ｈｚ，Ｊ２＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），１．５４−１．４５（ｍ，４Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ），１．３５−１．２６（ｍ，２Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１９０．５，１６８．０，１５６．０，７９．１，４０．３，３９．６，３３．１，３０．３，２９．６，２９．０，２８．４，２３．８。Ｃ１４Ｈ２６Ｎ２Ｏ４Ｓに対して計算されるＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋３４１．１５０５、測定値３４１．１５０６。
【０４１２】
Ｓ−（６−（（５−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ペンチル）アミノ）−６−オキソヘキシル）エタンチオアート（３ｂ）
脱気（凍結脱気）した酢酸エチル（２．２ｍｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル（５−（６−メルカプトヘキサンアミド）ペンチル）カルバマート（１８０ｍｇ、０．５４１ｍｍｏｌ）および乾燥炭酸カリウム（１５０ｍｇ、１．０８３ｍｍｏｌ）の溶液に、無水酢酸（６１μｌ、０．６５０ｍｍｏｌ）を添加し、反応を１６時間攪拌した。次に、反応を酢酸エチル（２０ｍｌ）で希釈し、ろ過し、冷水（１×１０ｍｌ）および塩水（１×１０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム下で乾燥させ、蒸発乾固させた。クロロホルム／エタノール  ９６：４を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィによって粗生成物を精製して、１８２ｍｇ（９０％）の白色固体を得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．６８（ｂｒ，１Ｈ），４．６１（ｂｒ，１Ｈ），３．２１（ｄｔ，Ｊ１＝７．３Ｈｚ，Ｊ２＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．０９（ｄｔ，Ｊ１＝７．７Ｈｚ，Ｊ２＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．８３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．３０（ｓ，１Ｈ），２．１４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．６７−１．４４（ｍ，８Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），１．４０−１．２７（ｍ，４Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１９６．０，１７２．８，１５６．１，７９．３，４０．２，３９．２，３６．４，３０．６，２９．７，２９．２，２９．１，２８．８，２８．４，２８．３，２５．１，２３．９。Ｃ１８Ｈ３４Ｎ２Ｏ４Ｓに対して計算されるＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋３７５．２３１２、測定値３７５．２３１２。
【０４１３】
Ｓ−（２−（（５−アミノペンチル）アミノ）−２−オキソエチル）エタンチオアート（４ａ）（Ｃ２−ＳＡｃリンカー）
ジクロロメタン（７．９ｍｌ）中のＳ−（２−（（５−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ペンチル）アミノ）−２−オキソエチル）エタンチオアート（１８９ｍｇ、０．５９４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（０．９２ｍｌ、１１．８７ｍｍｏｌ）を０℃において液滴で添加した。１０分間攪拌した後、反応混合物を室温に到達させ、１時間攪拌した。次に、トルエンを添加し（２０ｍｌ）、揮発性物質を減圧下で除去し、高真空下で３０分間残渣を乾燥させ、わずかに黄色の油を定量的に得た。これは、ＮＭＲで分析すると十分に純粋であった。油を水中に溶解させ、凍結乾燥して、白色固体を得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：３．６０（ｓ，２Ｈ），３．２０（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），２．９１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），１．７２−１．６１（ｍ，２Ｈ），１．５９−１．５０（ｍ，２Ｈ），１．４５−１．３５（ｍ，２Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１９６．３，１７０．８，４０．７，４０．４，３３．９，３０．１，２９．９，２８．２，２４．６。Ｃ９Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓに対して計算されるＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋２１９．１１６２、測定値２１９．１１７１。
【０４１４】
Ｓ−（６−（（５−アミノペンチル）アミノ）−６−オキソヘキシル）エタンチオアート（４ｂ）（Ｃ６−ＳＡｃリンカー）
ジクロロメタン（６．６ｍｌ）中のＳ−（６−（（５−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ペンチル）アミノ）−６−オキソヘキシル）エタンチオアート（１８７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（０．７７ｍｌ、５．３４ｍｍｏｌ）を０℃において液滴で添加した。１０分間攪拌した後、反応混合物を室温に到達させ、１時間攪拌した。揮発性物質を３０℃において減圧下で除去し、残渣をトルエンと共沸させ、高真空下で３０分間乾燥させた。凍結乾燥により白色固体（１８５ｍｇ）が得られ、これは、ＮＭＲにより十分に純粋であった。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ３．１８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．９２（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），２．８６（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．３０（ｓ，３Ｈ），２．１７（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．７２−１．５０（ｍ，８Ｈ），１．４５−１．３３（ｍ，４Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：１９７．７，１７６．２，４０．７，４０．０，３７．０，３０．６４，３０．６１，３０．０，２９．８，２９．４，２８．３，２６．６，２４．８。Ｃ１３Ｈ２６Ｎ２Ｏ２Ｓに対して計算されるＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋２７５．１７８８、測定値２７５．１７８５。
【０４１５】
２，２’，２’’−（１０−（２−（（２−（３−（（２−（（５−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ペンチル）アミノ）−２−オキソエチル）チオ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）三酢酸（５ａ）
ＤＯＴＡ−マレイミド（２５ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１ｍｌ）中に懸濁させ、トリエチルアミンを添加し（２２．５９μｌ、０．１６２ｍｍｏｌ）、５分攪拌した後、透明な無色の溶液が形成された。０．５ｍｌのアセトニトリル中のｔｅｒｔ−ブチル（５−（２−メルカプトアセトアミド）ペンチル）−カルバマート（１０．５４ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）の溶液を次に添加し、反応を１時間攪拌し、その時点でＨＰＬＣにより、出発材料の完全な消費が確認された。反応の監視に使用した溶媒系は次の通りである：水／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）、アセトニトリル（溶媒Ｂ）；０〜５分：０％Ｂ、５〜２０分：０〜５０％Ｂ、２０〜２５分：５０％Ｂ、２５〜３０分５０〜０％Ｂ；ＵＶ＝２１４ｎｍ；ｔＲ＝１８．３分。次に反応を３ｍｌの水で希釈し、以下の溶媒系：水／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）、アセトニトリル（溶媒Ｂ）；０〜５分：０％Ｂ、５〜２０分：０〜５０％Ｂを有する分取ＨＰＬＣにより精製した。生成物は約１７分溶出した；ＸＢ−Ｃ１８カラム；ＵＶ＝２１４ｎｍ。凍結乾燥の後に、生成物が白色固体として得られた（１９．７ｍｇ、７７％収率）。Ｃ３４Ｈ５８Ｎ８Ｏ１２Ｓに対して計算されるＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋８０３．３９、測定値８０３．４０。
【０４１６】
２，２’，２’’−（１０−（２−（（２−（３−（（６−（（５−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ペンチル）アミノ）−６−オキソヘキシル）チオ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）三酢酸（５ｂ）
アセトニトリル（３．５ｍｌ）中のＤＯＴＡ−マレイミド（８０ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（５２．５ｍｇ、０．５１９ｍｍｏｌ）の溶液に、アセトニトリル（１．５ｍｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル（５−（６−メルカプトヘキサンアミド）ペンチル）カルバマート（４０．６ｍｇ、０．１２２ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、反応混合物を室温で６時間攪拌した。次に溶媒の約半分を減圧下で除去し、水を添加し（３ｍｌ）、以下の溶媒系：水／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）、アセトニトリル（溶媒Ｂ）；０〜５分：０％Ｂ、５〜２０分：０〜５０％ｖ；ｔＲ＝１７．４分；ＵＶ＝２１４ｎｍ；ＸＢ−Ｃ１８カラムを用いる分取ＲＰ  ＨＰＬＣにより混合物を精製した。凍結乾燥の後に、生成物が白色固体として得られた（５８ｍｇ、５７％収率）。Ｃ３８Ｈ６６Ｎ８Ｏ１２Ｓに対して計算されるＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋８５９．４６、測定値８５９．３９。
【０４１７】
５−（３−（（２−（（５−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ペンチル）アミノ）−２−オキソエチル）チオ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）−２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸（５ｃ）：
ＤＭＦ（０．３ｍｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル（５−（２−メルカプトアセトアミド）ペンチル）カルバマート（１４．２２ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）の溶液を、５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸（１８．３２ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．２９μｍｏｌ）の溶液に添加し、透明な黄色溶液を室温で３時間攪拌した。この時間の後、反応を水（３ｍｌ）で希釈し、以下の溶媒系：水／０．１％ＨＣＯＯＨ（溶媒Ａ）、アセトニトリル（溶媒Ｂ）；０〜５分：３０％Ｂ、５〜２０分：３０〜８０％Ｂ；ＵＶ＝２５４ｎｍ；ｔＲ＝１５．４分；ＸＢ−Ｃ１８カラムを用いる分取ＲＰ  ＨＰＬＣにより精製した。凍結乾燥の後に、生成物が鮮黄色固体として得られた（２２ｍｇ、７３％収率）。Ｃ３６Ｈ３７Ｎ３Ｏ１０Ｓに対して計算されるＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋７０４．２３、測定値７０４．０５。
【０４１８】
２，２’，２’’−（１０−（２−（（２−（３−（（２−（（５−アミノペンチル）アミノ）−２−オキソエチル）チオ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）エチル）−アミノ）−２−オキソエチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）三酢酸（６ａ）（Ｃ２−ＤＯＴＡリンカー）
２，２’，２’’−（１０−（２−（（２−（３−（（２−（（５−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ペンチル）アミノ）−２−オキソエチル）チオ）−２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）三酢酸（１８ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン／ＴＦＡ  １：１（２．７ｍｌ）の混合物中に０℃溶解させた。反応混合物をこの温度で１０分間攪拌し、次に室温に到達させ、そこで１時間攪拌し、その時点でＨＰＬＣにより、出発材料の完全な消費が確認された。揮発性物質を２０℃において減圧下で除去し、粗生成物を高真空下で３０分間乾燥させた。残渣を１ｍｌの水に溶解させ、分取ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥後に、１２．７ｍｇ（８１％）の白色固体が提供された。使用した溶媒系は５ａの場合と同じであった（分析用および分取用ＨＰＬＣに対してそれぞれ、ｔＲ＝１２．８分およびｔＲ＝１１．６分）。１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ４．２６−２．８９（ｂｒ，２８Ｈ），４．０７（ｄｄ，Ｊ１＝９．１Ｈｚ，Ｊ２＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），３．５８（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１Ｈ），３．４２（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１Ｈ），３．３１（ｄｄ，Ｊ１＝１９．１Ｈｚ，Ｊ２＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），３．２２，（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．９９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．７４（ｄｄ，Ｊ１＝１９．１Ｈｚ，Ｊ２＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），１．７２−１．６４（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．５２（ｍ，２Ｈ），１．４４−１．３６（ｍ，２Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ１７８．８，１７８．１，１７１．３，１６３．０，１６２．７，１１７．４，１１５．１，５４．７，４０．３，３９．４，３９．３，３８．３，３７．１，３５．５，３４．５，２７．７，２７．６，２６．３，２２．９。
Ｃ２９Ｈ５１Ｎ８Ｏ１０Ｓに対して計算されるＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋７０３．３４、測定値７０３．３２。
【０４１９】
２，２’，２’’−（１０−（２−（（２−（３−（（６−（（５−アミノペンチル）アミノ）−６−オキソヘキシル）チオ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）エチル）−アミノ）−２−オキソエチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）三酢酸（６ｂ）（Ｃ６−ＤＯＴＡリンカー）
化合物５ｂ（４５ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン／ＴＦＡ  １：１（５．４ｍｌ）の混合物中に０℃で溶解させ、この温度で１０分間攪拌した後、反応混合物を室温に到達させ、２時間攪拌した。次に、揮発性物質を３０℃において減圧下で除去し、高真空下で３０分間の乾燥によりＴＦＡの痕跡を除去した。残渣を水（４ｍｌ）中に溶解させ、５ｂについて記載した方法を用いる分取ＲＰ  ＨＰＬＣにより精製した；ｔＲ＝１３．５分。Ｃ３３Ｈ５８Ｎ８Ｏ１０Ｓに対して計算されるＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋７５９．４１、測定値７５９．４０。
【０４２０】
５−（３−（（２−（（５−アミノペンチル）アミノ）−２−オキソエチル）チオ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）−２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸（６ｃ）（Ｃ２−フルオレセインリンカー）：
ジクロロメタン（２ｍｌ）中の５ｃ（１０ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）の氷冷懸濁液に、ＴＦＡ（２００μｌ、２．６０ｍｍｏｌ）を液滴で添加し、透明な鮮黄色溶液を０℃で１０分間攪拌した後、室温に到達させ、４０分間攪拌した。次に、トルエンを添加し、揮発性物質を減圧下で除去した。以下の系：水／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）、アセトニトリル（溶媒Ｂ）；０〜３分：５％Ｂ、３〜１０分：５〜２５％Ｂ、１０〜２０分：２５％Ｂ；ＵＶ＝２５４ｎｍ；ｔＲ＝１５．３分；Ｘｂｒｉｄｇｅカラムを用いるセミ分取ＲＰ  ＨＰＬＣによって粗生成物を精製した。凍結乾燥の後、生成物は鮮黄色固体として得られた（６．７ｍｇ、７８％収率）。Ｃ３１Ｈ２９Ｎ３Ｏ８Ｓに対して計算されるＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋６０４．１８、測定値６０４．０４。
【０４２１】
ＰＥＧリンカーの合成
化合物７〜９および反応スキームについては、図１６Ａが参照される。
【０４２２】
Ｓ−（２，２−ジメチル−４，１２−ジオキソ−３，１５，１８，２１，２４−ペンタオキサ−５，１１−ジアザヘキサコサン−２６−イル）エタンチオアート（７）
ＨＢＴＵ（４２１ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（４．５ｍｌ）中の２−オキソ−６，９，１２，１５−テトラオキサ−３−チアオクタ−デカン−１８−酸（３００ｍｇ、０．９２５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．３２ｍｌ、１．８５ｍｍｏｌ）の溶液にゆっくり添加し、得られた溶液を１５分間攪拌した。次に、ＤＭＦ（０．６ｍｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル（５−アミノペンチル）カルバマート（２２５ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）の溶液を液滴で添加し、反応を１４時間攪拌した。次に、反応を６０ｍｌの酢酸エチルで希釈し、水（２×２５ｍｌ）および塩水（１×２５ｍｌ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム下で乾燥させ、ろ過し、減圧下で蒸発させた。クロロホルム／エタノール９５：５を用いるシリカにおけるフラッシュカラムクロマトグラフィによって粗生成物を精製し、３８０ｍｇ（８１％）の生成物を単黄色の油として得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．５１（ｂｒ，１Ｈ），４．６６（ｂｒ，１Ｈ），３．７０（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），３．６５−３．５９（ｍ，１２Ｈ），３．５７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２１（ｄｔ，Ｊ１＝７．３Ｈｚ，Ｊ２＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．１２−３．０２（ｍ，４Ｈ），２．４４（ｔ，Ｊ＝５．８，２Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ），１．５３−１．４３（ｍ，４Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ），１．３６−１．２７（ｍ，２Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１９５．４，１７１．５，１５６，０，７８．９，７０．６，７０．５，７０．３，７０．２，７０．１，６９．７，６７．３，４０．３，３９．０，３６．９，３０．５，２９．６，２９．２，２８．７，２８．４，２４．０。Ｃ２３Ｈ４４Ｎ２Ｏ８Ｓに対して計算されるＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋５０９．２８９１、測定値５０９．２８８４。
【０４２３】
Ｓ−（２１−アミノ−１５−オキソ−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６−アザヘンイコシル（ａｚａｈｅｎｉｃｏｓｙｌ））エタンチオアート（８）（ＰＥＧ−４−ＳＡｃリンカー）
ジクロロメタン（９．７ｍｌ）中のＳ−（２，２−ジメチル−４，１２−ジオキソ−３，１５，１８，２１，２４−ペンタオキサ−５，１１−ジアザヘキサコサン−２６−イル）エタンチオアート（３７０ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、トリフルオロ酢酸（１．１ｍｌ、１４．５５ｍｍｏｌ）を添加した。１０分間攪拌した後、反応混合物を室温に到達させ、２時間攪拌した。次に揮発性物質を減圧下で除去し、その後高真空下で乾燥させた。薄黄色の油が得られ、ＮＭＲで明らかなように、これは十分に純粋であった（定量的な収率）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．７９（ｂｒ，１Ｈ），７．２３（ｂｒ，３Ｈ），２．３３（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），３．６９−３．５６（ｍ，１４Ｈ），３．３１（ｄｔ，Ｊ１＝７．５Ｈｚ，Ｊ２＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），３．０６（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），３．０３−２．９２（ｍ，２Ｈ），２．５８（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），１．７７−１．６５（ｍ，２Ｈ），１．６４−１．５１（ｍ，２Ｈ），１．４９−１．３８（ｍ，２Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１９５．７，１７４．０，７０．２，６９．９９，６９．９７，６９．９，６９．８，６９．６，６７．２，４０．０，３８．８，３５．８，３０．４，２８．１，２７．２，２６．０，２２．５。Ｃ１８Ｈ３６Ｎ２Ｏ６Ｓに対して計算されるＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋４０９．２３６７、測定値４０９．２３８１。
【０４２４】
Ｔｅｒｔ−ブチル（１−メルカプト−１５−オキソ−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６−アザヘンイコサン（ａｚａｈｅｎｉｃｏｓａｎ）−２１−イル）カルバマート（９）：
ナトリウムメトキシドの０．５Ｍメタノール溶液（１．８ｍｌ、０．９０４ｍｍｏｌ）を、脱気（凍結脱気）メタノール中の７（９２ｍｇ、０．１８１ｍｍｏｌ）の溶液に液滴で添加し、反応を室温で３時間攪拌下。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  １２０で中和した後、溶液をろ過し、蒸発乾固させた。クロロホルム／エタノール  ９５：５を用いるシリカにおけるフラッシュカラムクロマトグラフィによって粗生成物を精製し、透明な無色の油を得た（７５ｍｇ、８９％）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．４８（ｂｒ，１Ｈ），４．６４（ｂｒ，１Ｈ），３．７１（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．６６−３．６１（ｍ，１２Ｈ），３．６０（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，前の多重線と部分的に重複する），３．２２（ｑ，Ｊ１≒Ｊ２＝７．０，２Ｈ），３．０９（ｄｔ，Ｊ１＝６．４Ｈｚ，Ｊ２＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），２．６８（ｔｄ，，Ｊ１＝６．４Ｈｚ，Ｊ２＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），２．４５（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），１．５９（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），１．５５−１．４６（ｍ，４Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ），１．３７−１．３０（ｍ，２Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１７１．５，１５６．０，７９．０，７２．８，７０．６，７０．５，７０．３，７０．２，６７．３，４０．３，３９．１，３７．０，２９．６，２９．２，２８．４，２４．２，２４．０。
【０４２５】
アジドリンカーの合成
化合物１０〜１３および反応スキームについては、図１６Ｂが参照される。化合物１１ａおよび１１ｂは、文献において既に公開されている手順に従って合成した（１１ａについては、Ｂｒａｂｅｚ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，５４（２０），７３７５−７３８４、そして１１ｂについては、Ｋｕｉｌ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，７，４０８８−４０９４）。
【０４２６】
ｔｅｒｔ−ブチル（５−（２−アジドアセトアミド）ペンチル）カルバマート（１２ａ）：
ＤＭＦ（２．７ｍｌ）中の２−アジド酢酸（５０ｍｇ、０．４９５ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル（５−アミノ−ペンチル）カルバマート（１２０ｍｇ、０．５９４ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１２８ｍｇ、０．９８９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＴＵ（２２５ｍｇ、０．５９４ｍｍｏｌ）を室温でゆっくり添加した。３時間攪拌した後、淡黄色の溶液を酢酸エチル（３０ｍｌ）で希釈し、ＨＣｌ０．５Ｍ（３×１５ｍｌ）および飽和ＮａＨＣＯ３（１×１５ｍｌ）溶液、水（１×１５ｍｌ）および塩水（１×１５ｍｌ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム下で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。クロロホルム／ＥｔＯＨ  ９５：５を用いるシリカにおけるフラッシュカラムクロマトグラフィによって粗生成物を精製し、透明な無色の油（１２８ｍｇ、９１％）を得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．３５（ｂｒ，１Ｈ），４．５５（ｂｒ，１Ｈ），３．９７（ｓ，２Ｈ），３．２８（ｄｔ，Ｊ１＝７．２Ｈｚ，Ｊ２＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．１１（ｄｔ，Ｊ１＝７．８Ｈｚ，Ｊ２＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），１．６１−１．４７（ｍ，４Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ），１．４０−１．３１（ｍ，２Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１６６．５，１５６．０，７９．１，５２．７，４０．２，３９．２，２９．７，２９．０，２８．４，２３．９。
【０４２７】
Ｔｅｒｔ−ブチル（５−（６−アジドヘキサンアミド）ペンチル）カルバマート（１２ｂ）：
ＨＢＴＵ（２９０ｍｇ、０．７６４ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３ｍｌ）中の６−アジドへキサン酸（１００ｍｇ、０．６３６ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１６４ｍｇ、１．２７３ｍｍｏｌ）の溶液にゆっくり添加し、得られた溶液を１５分間攪拌した。次に、ＤＭＦ（０．５ｍｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル（５−アミノペンチル）カルバマート（１５４ｍｇ、０．７６４ｍｍｏｌ）の溶液を液滴で添加し、反応を３時間攪拌した。この時間の後、反応混合物を酢酸エチル（４０ｍｌ）で希釈し、ＨＣｌ０．５Ｍ（３×２０ｍｌ）および飽和ＮａＨＣＯ３（１×２０ｍｌ）溶液、水（１×２０ｍｌ）および塩水（１×２０ｍｌ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム下で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。クロロホルム／ＥｔＯＨ  ９５：５を用いるシリカにおけるフラッシュカラムクロマトグラフィによって粗生成物を精製し、透明な無色の油（１８９ｍｇ、８７％）を得た。
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．６１（ｂｒ，１Ｈ），４．５８（ｂｒ，１Ｈ），３．３０−３．２０（ｍ，４Ｈ），３．１０（ｄｔ，Ｊ１＝８．０Ｈｚ，Ｊ２＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．１６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．５６−１．４５（ｍ，４Ｈ），１．５６−１．４５（ｍ，４Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ），１．４１−１．２９（ｍ，４Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１７２．７，１５６．１，７９．１，５１．３，４０．２，３９．３，３６．５，２９．８，２９．２，２８．６，２８．４，２６．４，２５．２，２３．９。
【０４２８】
Ｎ−（５−アミノペンチル）−２−アジドアセトアミド（１３ａ）（Ｃ２−Ｎ３リンカー）：
ジクロロメタン（０．９ｍｌ）中の１２ａ（１９．２ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、トリフルオロ酢酸（１５３ｍｇ、１．３４６ｍｍｏｌ）を添加した。１０分間攪拌した後、反応混合物を室温に到達させ、２時間攪拌した。次にトルエン（４ｍｌ）を添加し、揮発性物質を減圧下で除去した。粗生成物をトルエンと再度共沸させ、ＴＦＡの痕跡を除去してから、ＨＶＰ下で３時間乾燥させて、薄黄色の油を得た（定量的な収率）。ＮＭＲで明らかなように、これは十分に純粋であった。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ３．８７（ｓ，２Ｈ），３．２４（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．９２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．７２−１．６３（ｍ，２Ｈ），１．６２−１．５３（ｍ，２Ｈ），１．４６−１．３６（ｍ，２Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ１７０．３，５３．１，４０．７，４０．１，３０．０，２８．３，２４．７。
【０４２９】
Ｎ−（５−アミノペンチル）−６−アジドヘキサンアミド（１３ｂ）（Ｃ６−Ｎ３リンカー）：
化合物１３ｂは、１３ａについて上記で説明したものと同様の手順（２２．８ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌの１２ｂから出発）に従って合成した。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ３．２９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．１９（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），２．９２（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），２．２０（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．７３−１．５１（ｍ，８Ｈ），１．４６−１．３５（ｍ，４Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ１７６．２，５２．５，４０．７，４０．０，３７．０，３０．１，２９．８，２８．３，２７．５，２６．７，２４．８。
【０４３０】
ＭＭＡＦ−６Ｃチオールリンカーの合成
化合物１４〜１５および反応スキームは図１６Ｃに示される。
【０４３１】
マレイミド−バリン−シトルリン−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ＋６Ｃチオールリンカー（Ｂｏｃ保護）（１４）
ＤＭＦ（０．６ｍｌ）中のマレイミド−バリン−シトルリン−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ（８．８ｍｇ、６．６１μｍｏｌ）の溶液に、６．６μｌのトリエチルアミンの０．１ＭのＤＭＦ溶液（０．６６μｍｏｌのＥｔ３Ｎ）を添加した後、アセトニトリル（０．３ｍｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル（５−（６−メルカプトヘキサンアミド）ペンチル）カルバマート（３ｍｇ、９．０２μｍｏｌ）の溶液を液滴で添加した。反応を３時間攪拌し、水（２ｍｌ）で希釈し、以下の系：水／５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（溶媒Ａ）、アセトニトリル（溶媒Ｂ）；０〜５分：４０％Ｂ、５−２０分：４０〜８０％Ｂ；ＵＶ＝２５４ｎｍ；ｔＲ＝１０．３分；Ｘｂｒｉｄｇｅカラムを用いるセミ分取ＲＰ  ＨＰＬＣにより精製した。凍結乾燥の後、生成物は白色固体として得られた（８．７ｍｇ、７９％収率）。
【０４３２】
マレイミド−バリン−シトルリン−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ＋６Ｃチオールリンカー（ＭＭＡＦ−６Ｃリンカー）（１５）
化合物１４（８ｍｇ、４．８１μｍ）をジクロロメタン／ＴＦＡ  ９５：５の氷冷溶液（８ｍｌ）中に溶解させた。反応混合物を室温に到達させ、４０分間攪拌し、その後、トルエンの添加により揮発性物質を減圧下で除去した。高真空下で溶媒の痕跡を除去し、以下の系：：水／５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（溶媒Ａ）、アセトニトリル（溶媒Ｂ）；０〜５分：３０％Ｂ、５〜２０分：３０〜７０％Ｂ；ＵＶ＝２５４ｎｍ；ｔＲ＝１１．７分；Ｘｂｒｉｄｇｅカラムを用いるセミ分取ＨＰＬＣによって残渣を精製した。凍結乾燥の後、生成物は白色固体として得られた（４．８６ｍｇ、６５％収率）。Ｃ７９Ｈ１２７Ｎ１３Ｏ１７Ｓに対して計算されるＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋７８１．９６７０、測定値７８１．９６６７。
【０４３３】
実施例２：
ＢＴＧは、大きい、疎水性および／または荷電ペイロードを有するリンカーを定量的な形で抗体とカップリングさせることができない
１．ダンシルおよびビオチンリンカーのカップリング
ビオチン−カダベリンおよびダンシルカダベリンの構造は以下に示される。
【化３０】
0006744212.tif 000032
【０４３４】
各重鎖に１つの可能な受容体グルタミンを有する抗体ｃｈＡＤＣ１を、ＰＮＧａｓｅＦ処理によって脱グリコシル化し、非修飾の脱グリコシル化重鎖について４８９４５Ｄａの質量を決定した。軽鎖は影響を受けないままであった（実測値２３３４１Ｄａ）。ビオチン−カダベリンおよびダンシルカダベリンのカップリング反応（１Ｕ／ｍＬのＢＴＧと共に標準条件を用いる）は成功したが、完了には至らなかった。
【０４３５】
ビオチン−カダベリンおよびダンシルカダベリンのカップリングが部分的でしかないことを考慮して、反応条件に影響を与える因子を検査する最初のステップで反応条件を調査した。容認される６Ｕ／ｍＬのＢＴＧを使用すると、重鎖１つにつき、正確に１つのビオチン−カダベリン（ＭＷ：３２８ｇ／ｍｏｌ；３２８−１７＝３１１Ｄａ；４８９４５＋３１１＝４９２５６Ｄａ、実測値４９２５７Ｄａ）、または１つのダンシル−カダベリン（ＭＷ：３３５ｇ／ｍｏｌ；３３５−１７＝３１８Ｄａ；４８９４５＋３１８＝４９２６３Ｄａ、実測値４９２６４Ｄａ）のいずれかを有する、ＰＮＧａｓｅＦ−脱グリコシル化抗体ｃｈＡＤＣ１の全ての重鎖の修飾が達成されることが分かった。
【０４３６】
２．ＤＯＴＡペイロードを有するリンカーのカップリングは不成功である
マレイミド−ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）にカップリングされたチオールリンカーの化学構造は、以下に示される（調製物については実施例１を参照）。分子量は構造の下に示される。
【化３１】
0006744212.tif 000033
【０４３７】
ＣｈＡＤＣ１抗体およびＤＯＴＡリンカーをＢＴＧの存在下で反応させて、抗体を修飾した。短いＤＯＴＡチオールリンカー（化合物５）を用いたＢＴＧによるｃｈｉｍＡＤＣ１重鎖の定量的な酵素修飾は達成できなかった（図１７Ａ：１Ｕ／ｍＬのＢＴＧ、非修飾ｃｈＡＤＣ１重鎖のみ、４８９４５Ｄａが見出された。図１７Ｂ：６Ｕ／ｍＬのＢＴＧ、重鎖１つにつき１つのＤＯＴＡチオールリンカーを有する修飾ｃｈＡＤＣ１重鎖の微小ピーク、ＭＷ７０２ｇ／ｍｏｌ、７０２−１７＝６８５Ｄａ、４８９４５＋６８５＝４９６３０Ｄａ、実測値４９６２９Ｄａ、を参照）。反応条件を調査したが、１Ｕ／ｍＬのＢＴＧ（予測）を用いても、６Ｕ／ｍＬのＢＴＧを用いても、完全なカップリングは有意に達成できなかった。長期のインキュベーション時間はカップリングの効率または完了に影響を与えることができなかった。ビオチンおよびダンシルと比べて、ＤＯＴＡはより高い分子量を有し、より硬直性の構造（巨大環を含有）を有し、特に、電気的に負に荷電されてＢＴＧ活性を妨害し得る。
【０４３８】
３．フルオレセインペイロードを有するリンカーのカップリングは不成功である
フルオレセインにカップリングされたリシンベースのリンカー（カダベリン）の化学構造は以下に示される。
【化３２】
0006744212.tif 000034
【０４３９】
ＣｈＡＤＣ１抗体およびカダベリン−フルオレセインリンカーをＢＴＧの存在下で反応させて、抗体を修飾した。軽鎖は影響を受けないままであった。短いフルオレセイン含有リンカーを用いたＢＴＧによるｃｈＡＤＣ１重鎖の定量的な酵素修飾は達成できず、非修飾ｃｈＡＤＣ１重鎖だけが見出された。反応条件の調査（実施例３を参照）の後、最適化条件を検査した（８０当量のリガンド、６Ｕ／ｍｌのＢＴＧ、１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ、３７℃で１８Ｈ）が、カップリングは達成できなかった。ビオチンおよびダンシルと比べて、フルオレセインはより高い分子量を有し、恐らくより硬直性かつ疎水性の構造を有し、特に多環、特に三環を含有し、およびＢＴＧ活性の部位の近くにさらなる環状基を含有する。
【０４４０】
４．ＤＢＣＯペイロードを有するリンカーのカップリングは不成功である
使用されるジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）リシンベースのリンカー（ＤＢＣＯ−アミン）の化学構造は以下に示される。
【化３３】
0006744212.tif 000035
【０４４１】
ＣｈＡＤＣ１抗体およびＤＢＣＯリシンベースのリンカーをＢＴＧの存在下で反応させて、抗体を修飾した。軽鎖は影響を受けないままであった。短いＤＢＣＯリシンベースのリンカーを用いたＢＴＧによるｃｈＡＤＣ１重鎖の定量的な酵素修飾は達成できず、非修飾ｃｈＡＤＣ１重鎖だけが見出された。反応条件の調査（実施例３を参照）の後、最適化条件を検査した（８０当量のリガンド、６Ｕ／ｍｌのＢＴＧ、１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ、３７℃）が、カップリングは達成できなかった。ビオチンおよびダンシルリンカーと比べて、ＤＢＣＯは恐らくより硬直性構造であり、特に多環、特に、ＢＴＧ活性の部位に近接して三環基を含有する。
【０４４２】
５．ＴＡＭＲＡペイロードを有するリンカーのカップリングは不成功である
ＴＡＭＲＡリシンベースのリンカーの化学構造は以下に示される。
【化３４】
0006744212.tif 000036
【０４４３】
ＣｈＡＤＣ１抗体およびＴＡＭＲＡリシンベースのリンカーをＢＴＧの存在下で反応させて、抗体を修飾した。軽鎖は影響を受けないままであった。短いＴＡＭＲＡリシンベースのリンカーを用いたＢＴＧによるｃｈｉｍＡＤＣ１重鎖の定量的な酵素修飾は達成できず、非修飾ｃｈＡＤＣ１重鎖だけが見出された。反応条件の調査（実施例３を参照）の後、最適化条件を検査した（８０当量のリガンド、６Ｕ／ｍｌのＢＴＧ、１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ、３７℃で１８時間）が、よくても部分的なカップリングしか達成できず、リンカーがカップリングされた全ての重鎖の約５０％であった。ビオチンおよびダンシルと比べて、ＴＡＭＲＡはより高い分子量を有し、恐らくより硬直性かつ疎水性の構造を有し、特に多環、特に三環を、およびＢＴＧ活性の部位に近接する環状基を含有する。
【０４４４】
６．アウリスタチンペイロードを有するリンカーのカップリングは不成功である
モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）と、バリン−シトルリンジペプチドスペーサー、６−炭素スペーサーおよびＰＡＢ自己脱離スペーサーとを含むリンカー（ＭＷ１５６２、Ｃ６−ＭＭＡＦリンカー）をＢＴＧの存在下で、最適化反応条件（８０当量のリガンド、６Ｕ／ｍｌのＢＴＧ、１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ、３７℃）を用いて反応させて、ｃｈＡＤＣ１またはｃｈＣＥ７抗体を修飾した。ＭＭＡＦリンカーを用いたＢＴＧによる重鎖の定量的な酵素修飾は達成できなかった。主に非修飾のｃｈＡＤＣ１またはｃｈＣＥ７重鎖が見出され、ｃｈＡＤＣ１については、非修飾重鎖に相当する大きいピーク（７０％）と、１つのＭＭＡＦリンカーを有する重鎖に相当する微小ピーク（３０％）とを有し、ｃｈＣＥ７については、非修飾重鎖に相当する大きいピーク（８１％）と、１つのＭＭＡＦリンカーを有する重鎖に相当する微小ピーク（１９％）とを有した。
【０４４５】
実施例３：
ＢＴＧの最適化反応条件の発見
スペーサーによる改善にもかかわらず、細胞毒性薬物を代表する大きいおよび／または疎水性の有機分子は、受容体グルタミンに対して、ＢＴＧにより定量的にカップリングさせる（完全なカップリング）ことができない。最適化反応が定量的カップリングを許容し得る可能性を調査するために、反応パラメータを調査した。
【０４４６】
実験は全て、ＰＮＧａｓｅ  Ｆにより脱グリコシル化したｃｈＡＤＣ１において実施した。抗体濃度は、全ての実験で１ｍｇ／ｍＬまでであった。実験は全て６Ｕ／ｍＬのＢＴＧを用いて実施した。全ての反応をＨＩＣ分析およびＬＣ−ＭＳにより監視した。時間周期の後、ＨＩＣ分析用サンプルを採取し、ＨＩＣに直接注入した。ＭＳ分析用サンプルは、反応を停止させるために凍結させた。
【０４４７】
まず、酵素濃度の効果を調べた。図１８Ａは、種々のＢＴＧａｓｅ濃度におけるｃｈＡＤＣ１の標識化を示す。ＢＴＧａｓｅに対する酵素濃度が増大すると、より高い標識化収率が得られた。次に、以下の反応条件の調査は、結合に対してプラトーが到達された最適化条件（６Ｕ／ｍｌのＢＴＧ、１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ、１８時間）を使用した。
【０４４８】
我々は次に、酵素の標識化に対する反応媒体のｐＨの効果を調べた。図１８Ｂおよび１８Ｃは、ＢＴＧ介在性の抗体の修飾により種々のｐＨ値で達成された標識化度を示す。最も効率的な標識化は、中性反応条件（ｐＨ７．４）で検出された。
【０４４９】
次に、温度の効果を調べた。図１８Ｄおよび１８Ｅは、種々の温度におけるｃｈＡＤＣ１の標識化を示す。３７℃において、より高い標識化収率が得られた。
【０４５０】
さらなる最適化パラメータとして、我々は基質化学量論の効果を調べた。図１８Ｆおよび１８Ｇは、様々な量のダンシル−カダベリン基質を用いた、ＢＴＧによるｃｈＡＤＣ１の標識化を示す。基質の量を増大させると、より高い標識化収率が得られた。ダンシル−カダベリン基質が４０ｅｑ／ｍＡｂよりも多い場合に抗体の最良の標識化が達成された。水性緩衝液（最大で１０％のＤＭＳＯを含有する）中のダンシル−カダベリンの溶解度が限られているために、より高い濃度を調べることができなかった。次に、さらなる実験では、他に記載されない限り、８０当量のリンカー（ｍＡｂのモル濃度に基づいてモル過剰）、６Ｕ／ｍｌのＢＴＧ、１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ、３７℃を使用した。当量（ｅｑ）は、本明細書中の実施例では、ｍＡｂのモル濃度に基づいたモル過剰として表されるが、当量は、抗体中の受容体グルタミン数の関数として表すこともでき、例えば、当量数は、２つの受容体グルタミンを有するｍＡｂ（例えば、各重鎖に１つ）の場合は２で、あるいは４つの受容体グルタミンを有するｍＡｂ（例えば、各重鎖に２つ）の場合は４で除される。
【０４５１】
実施例４：
ＢＴＧ介在性の直接カップリングのために改善されたリシンベースのリンカー
ＢＴＧカップリング部位（すなわち、第１級アミン）の近くの大きい、荷電または疎水性の基がＢＴＧカップリング効率に影響する、そしてこれを阻害する可能性を調べるために、スペーサーとして作用する線状炭素含有フレームワークを有するリンカーを検査した。
【０４５２】
１．スペーサー基を有するＤＯＴＡリンカーのカップリング
マレイミド−ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）にカップリングされたスペーサー含有チオールリンカーおよび短いリンカーの化学構造を比較した（調製については実施例１を参照）。分子量は構造の下に示される。
【化３５】
0006744212.tif 000037
【０４５３】
ＣｈＡＤＣ１抗体と、短いＤＯＴＡリンカー（実施例２パート３を参照、Ｃ２−ＤＯＴＡと称される）、または６−炭素スペーサーを含むＤＯＴＡリンカー（Ｃ６−ＤＯＴＡと称される）とをＢＴＧの存在下で反応させて、抗体を修飾した。反応条件の調査（実施例３を参照）の後、最適化条件を使用した（８０当量のリガンド、６Ｕ／ｍｌのＢＴＧ、１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ、３７℃で１８時間）。
【０４５４】
Ｃ２−ＤＯＴＡリンカーを用いたＢＴＧによるｃｈＡＤＣ１重鎖の定量的な酵素修飾は達成できず、主に非修飾ｃｈＡＤＣ１重鎖が見出され、非修飾重鎖に相当する大きいピーク（７０％）と、１つのＣ２−ＤＯＴＡを有する重鎖に相当する微小ピーク（３０％）とを有した。しかしながら、６−炭素スペーサーを含むＣ６−ＤＯＴＡリンカーは、著しく改善されたカップリングを達成し、１つのＣ６−ＤＯＴＡを有する重鎖に相当する大きいピーク（７０％）と、非修飾重鎖に相当する微小ピーク（３０％）とを有した。結果は、図１９Ａに示される。
【０４５５】
実施例５：
ＰＮＧａｓｅＦ処理はＮ２９７の脱アミド化を生じてＮ２９７Ｄを生成する
ＰＮＧａｓｅＦで処理したモノクローナル抗体は、Ｎ２９７連結グリコシル化を効率的に除去することが知られている。文献（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９５）１２：１８３−１９３）によると、ＰＮＧａｓｅによるアスパラギニルアミド結合の加水分解は、アスパラギン酸含有ポリペプチド鎖の形成をもたらすことができる。結果として、ＰＮＧａｓｅＦの触媒作用はＢＴＧのＱ２９５カップリング部位のすぐ近くに脱アミド化Ｎ２９７残基を生じることが可能である。
【０４５６】
ＰＮＧａｓｅＦによって誘発される脱アミド化反応の程度を調べるために、実施例３の手順に従ってカダベリン−ビオチンリンカーに酵素的に結合されたＰＮＧａｓｅＦ脱グリコシル化ｃｈＡＤＣ１の精製サンプルを、トリプシンペプチドマップ分析によって特徴付けた。標準的な消化／アルキル化プロトコルを用いてｃｈＡＤＣ１のトリプシンペプチドを生成し、ナノＬＣと結合したエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）タンデム質量分析によって分析した。分析は、Ｄｉｏｎｅｘからのｎａｎｏｍａｔｅ  ３０００と結合されたＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）においてＰＩＴ２プロテオミクスプラットフォーム（Ｆａｃｕｌｔｅ  ｄｅ  Ｐｈａｒｍａｃｉｅ  ｄｅ  ｌａ  Ｔｉｍｏｎｅ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）で実行した。ボトムアップＯｒｂｉｔｒａｐ分析のために選択される方法は、同時に、Ｏｒｂｉｔｒａｐセルにおける分解能３０，０００の１回の完全ＭＳと、ＬＴＱ  Ｖｅｌｏｓリニアトラップにおける１０回の依存性ＭＳ／ＭＳスキャンとで構成された。データベースの検索を可能にするＳｅｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりデータを分析した。
【０４５７】
正イオンモードで実施されたフルスキャンＬＣ−ＭＳ分析により、位置２９５のビオチン修飾グルタミン含む特異的なＮ２９７−脱アミド化トリプシンペプチド（ＴＫＰＲＥＥＱ２９５ＹＮ２９７ＳＴＹＲ）の存在が明らかになった［ｍ／ｚ＝１９８３．９５９２（ｚ＝１）；ｍ／ｚ＝９９２．４８３２（ｚ＝２）およびｍ／ｚ＝６６１．９９１２（ｚ＝３）］。特異的な脱アミド化トリプシンペプチドのジ−およびトリ−荷電擬似分子イオンに相当する抽出イオンクロマトグラム（２７．７０分にＥＩＣピーク）は図１９Ｂに示される。非脱アミド化ペプチド［ｍ／ｚ＝１９８２．９７５２（ｚ＝１）；ｍ／ｚ＝９９１．９９１２（ｚ＝２）およびｍ／ｚ＝６６１．６６３２（ｚ＝３）］は検出されず、従って、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理後のＮ２９７の脱アミド化は定量的であることが確認された。
【０４５８】
特異的なＮ２９７−脱アミド化トリプシンペプチド（ＴＫＰＲＥＥＱ２９５ＹＮ２９７ＳＴＹＲ）の完全な配列決定は、ＭＳ／ＭＳ分析によって得られた。二重荷電擬似分子イオンのＭＳ／ＭＳスペクトルは、関連の断片化パターンと共に図１９Ｃで提示される（それぞれＮまたはＣ末端における電荷保持によりアミド結合における断片化から得られるｂおよびｙイオン型）。
【０４５９】
カダベリン−ビオチンリンカーに結合されたＰＮＧａｓｅ  Ｆ脱グリコシル化ＣｈＡＤＣ１のペプチドマップ分析により、ＣＨ２ドメインのアスパラギン２９７（受容体グルタミンＱ２９５に対して＋２位置）の定量的な脱アミド化が明らかになった。
【０４６０】
実施例６：
重鎖内の受容体グルタミンの環境はＢＴＧカップリングに影響を与える
スペーサーによる改善にもかかわらず、細胞毒性薬物を代表する大きいおよび／または疎水性有機分子は、脱グリコシル化ｃｈＡＤＣ１の受容体グルタミンに、ＢＴＧにより定量的にカップリングさせる（完全なカップリング）ことができなかった。ＢＴＧ介在性カップリング部位における抗体のアミノ酸に関する環境がＢＴＧカップリング効率に影響し、これを阻害する可能性を調べるために、アミノ酸置換を有する修飾抗体を検査した。Ｎ２９７連結グリコシル化を除去するためにＰＮＧａｓｅＦで処理した抗体は、アスパラギンにおけるＰＮＧａｓｅＦ誘発性脱アミド化の結果として、残基２９７にアスパラギン酸を有するであろう。Ｎ２９７連結グリコシル化を回避し、次にアスパラギン酸または他の負荷電残基を回避したＮ２９７Ｓ置換を有する３つの抗体を作製した：ｃｈＡＤＣ１、ＳＧＮ−３５（抗ＣＤ３０）およびｃｈＣＥ７。
【０４６１】
非修飾（Ｎ２９７）、ＰＮＧａｓｅＦ−脱グリコシル化ｃｈＡＤＣ１抗体をＢＴＧの存在下で、最適化反応条件（８０当量のリガンド、６Ｕ／ｍｌのＢＴＧ、１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ、３７℃）を用いて、カダベリン−フルオレセインリンカーと反応させて、抗体を修飾した。カダベリン−フルオレセインリンカーを用いたＢＴＧによるｃｈＡＤＣ１重鎖の定量的な酵素修飾を達成することができなかった。ｃｈＡＤＣ１重鎖の修飾は部分的に見出されただけであり、実質的なピークは非修飾重鎖に相当した。しかしながら、Ｎ２９７Ｓ  ｃｈＡＤＣ１突然変異体抗体がＢＴＧの存在下でカダベリン−フルオレセインリンカーと反応される場合、高レベルのカップリングが観察され、１つのカダベリン−フルオレセインリンカーを有する重鎖に相当する大きいピーク（８０％）と、非修飾重鎖に相当する微小ピーク（２０％）とを有した。
【０４６２】
別の実験では、非修飾（Ｎ２９７）、ＰＮＧａｓｅＦ−脱グリコシル化ｃｈＡＤＣ１抗体をＢＴＧの存在下、最適化反応条件（８０当量のリガンド、６Ｕ／ｍｌのＢＴＧ、１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ、３７℃）を用いて、カダベリン−ＴＡＭＲＡリンカーと反応させて、抗体を修飾した。カダベリン−ＴＡＭＲＡリンカーを用いたＢＴＧによるｃｈＡＤＣ１重鎖の定量的な酵素修飾は、達成することができなかった。部分的に修飾されたｃｈＡＤＣ１重鎖が見出され、非修飾重鎖に相当する大きいピークを有した。しかしながら、修飾Ｎ２９７Ｓ  ｃｈＡＤＣ１抗体をカダベリン−ＴＡＭＲＡリンカーとＢＴＧの存在下で反応させると、定量的なカップリングが達成され、１つのカダベリン−ＴＡＭＲＡリンカーを有する重鎖に相当するピークを有し、カップリングされない重鎖はなかった。
【０４６３】
ＰＮＧａｓｅＦ処理は、ＰＮＧａｓｅＦ処理の後にアスパラギン酸が位置２９７に存在するように、位置２９７のアスパラギンの側鎖を修飾する。ＢＴＧ活性は負電荷により抑制されると考えられる。従って、１つの可能な説明は、受容体グルタミンに対して＋２位置のアミノ酸残基の負電荷が、特に抗体のＦｃドメインに関して、ＢＴＧのグルタミンに結合する能力を阻害することである。従って、この知見は、大きいおよび／または疎水性分子の抗体へのカップリングのために、＋２位置にアスパラギン酸がもはや存在しない修飾抗体を使用する可能性を開く。あるいはより一般的に、受容体グルタミンに隣接する（特に、＋２位置における）負電荷を回避するように抗体を修飾する可能性を開く。
【０４６４】
実施例７：
直接カップリングのためのスペーサーおよび修飾抗体定常領域の組み合わせ
基質の修飾環境（リンカーにおけるスペーサー基の使用により実行）と、ＢＴＧカップリング部位の修飾環境（Ｆｃドメイン突然変異体の使用により実行）との組み合わせがＢＴＧカップリングをさらに改善する能力を調査するために、非修飾または修飾キメラ抗体の両方を用いて、スペーサーを有するおよび有さない異なる環状基を含むリンカーを検査した。ＰＮＧａｓｅ脱グリコシル化により生じる負荷電アスパラギン酸の形成を回避するために、修飾抗体は残基Ｎ２９７の突然変異を含有した。また、Ｎ２９７と組み合わせてＱ２９５でも抗体を修飾し、Ｎ２９５、Ｑ２９７抗体を形成した。
【０４６５】
１．ＤＯＴＡ（負荷電ペイロード）
ＣｈＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｓ抗体および短いＤＯＴＡリンカー（実施例２パート３を参照、Ｃ２−ＤＯＴＡと呼ばれる）または６−炭素スペーサーを含むＤＯＴＡリンカー（Ｃ６−ＤＯＴＡと呼ばれる）をＢＴＧの存在下で、最適化反応条件（８０当量のリガンド、６Ｕ／ｍｌのＢＴＧ、１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ、３７℃）を用いて反応させ、抗体を修飾した。最適化反応条件については実施例３を参照されたい。
【０４６６】
Ｃ２−ＤＯＴＡを用いたＢＴＧによるｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｓ重鎖の酵素修飾は、ｃｈＡＤＣ１におけるＣ２−ＤＯＴＡ（ＰＮＧａｓｅＦ脱グリコシル化）で観察されるよりも完全であった（実施例４を参照）が、定量的なカップリングは達成できず、いくらかの非修飾ｃｈｉｍＡＤＣ１重鎖が残った（図２１Ａを参照）。しかしながら、Ｃ６−ＤＯＴＡリンカーと、ｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｓとの反応は、１つのＣ６−ＤＯＴＡによる全ての重鎖のほぼ定量的なカップリングを達成した（図２１Ｂを参照）。従って、改善されたリンカーおよびタンパク質環境の組み合わせは、ｃｈＡＤＣ１におけるＣ６−ＤＯＴＡ（ＰＮＧａｓｅＦ脱グリコシル化）（実施例４および図２１Ａを参照）（約７０％のカップリングしか観察されなかった）に対して観察されるカップリングを改善した。
【０４６７】
最適化反応条件（８０当量のリガンド、６Ｕ／ｍｌのＢＴＧ、１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ、３７℃）を使用し、ｃｈＣＥ７  Ｑ２９５Ｎ、Ｎ１９７Ｑ抗体およびＣ６−ＤＯＴＡリンカーを用いて実験を繰り返した。反応は、１つのＣ６−ＤＯＴＡによる全ての重鎖の高レベルのカップリングを達成し、１つのＣ６−ＤＯＴＡにより修飾された重鎖に相当する大きいピークを有した（８０％を上回る）。
【０４６８】
２．ＤＢＣＯ（多環／硬直性ペイロード）
別の実験では、「ＰＥＧ」スペーサーを含むジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）リシンベースのリンカー、および短いＤＢＣＯリンカーの化学構造を比較した（構造は以下に示される）。
【化３６】
0006744212.tif 000038
【０４６９】
ＣｈＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｓ抗体と、短いＤＢＣＯリンカーまたは１５原子ＰＥＧスペーサーを含むＤＢＣＯリンカーとをＢＴＧの存在下、最適化反応条件（８０当量のリガンド、６Ｕ／ｍｌのＢＴＧ、１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ、３７℃）を用いて反応させ、抗体を修飾した。最適化反応条件については実施例３を参照されたい。
【０４７０】
短いＤＢＣＯリンカーを用いたＢＴＧによるｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｓ重鎖の定量的な酵素修飾は達成できず、主に非修飾ｃｈＡＤＣ１重鎖が見出され、非修飾重鎖に相当する大きいピーク（７０％）と、１つの短いＤＢＣＯリンカーを有する重鎖に相当する微小ピーク（３０％）とを有した。しかしながら、１５−炭素ＰＥＧスペーサーを含むスペーサーを有するＤＢＣＯリンカーを反応させると、スペーサーを有する１つのＤＢＣＯリンカーによる全ての重鎖の実質的に定量的な（完全な）カップリングが達成された。
【０４７１】
３．細胞毒性薬（大きい、疎水性ペイロード）
検査したリンカーは、抗体薬物結合体中で使用される代表的な大きい細胞毒性薬物としてのモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）と、バリン−シトルリンジペプチドスペーサー、６−炭素スペーサーおよびＰＡＢ自己脱離スペーサーとを含んだ。構造は以下に示される。分子量は構造の下に示される。
【化３７】
0006744212.tif 000039
【０４７２】
非修飾（Ｎ２９７）、ＰＮＧａｓｅＦ脱グリコシル化ｃｈＡＤＣ１およびｃｈＣＥ７抗体と、ＭＭＡＦリンカーとをＢＴＧの存在下で、最適化反応条件（８０当量のリガンド、６Ｕ／ｍｌのＢＴＧ、１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ、３７℃）を用いて反応させて、抗体を修飾した。ＭＭＡＦリンカーを用いたＢＴＧによるｃｈＡＤＣ１重鎖の定量的な酵素修飾は、達成することができなかった。主に非修飾のｃｈＡＤＣ１またはｃｈＣＥ７重鎖が見出され、ｃｈＡＤＣ１については、非修飾重鎖に相当する大きいピーク（７０％）と、１つのＭＭＡＦリンカーを有する重鎖に相当する微小ピーク（３０％）とを有し、ｃｈＣＥ７については、非修飾重鎖に相当する大きいピーク（８１％）と、１つのＭＭＡＦリンカーを有する重鎖に相当する微小ピーク（１９％）とを有した。
【０４７３】
しかしながら、修飾Ｎ２９７Ｓ  ｃｈＡＤＣ１抗体をＭＭＡＦリンカーとＢＴＧの存在下で反応させると、定量的なカップリングが達成され、１つのＭＭＡＦリンカーを有する重鎖に相当する大きいピーク（９０％超）を有した。Ｃ６−マレイミド−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦにカップリングされたｃｈＡＤＣ１のＭＳスペクトルは図２０Ａに示され、Ｃ６−マレイミド−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦにカップリングされたｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７ＳのＭＳスペクトルは図２０Ｂに示される。
【０４７４】
最適化反応条件（８０当量のリガンド、６Ｕ／ｍｌのＢＴＧ、１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ、３７℃）を使用し、ｃｈＣＥ７  Ｑ２９５Ｎ、Ｎ２９７Ｑ抗体およびＭＭＡＦリンカーを用いて実験を繰り返した。反応は、１つのＭＭＡＦリンカーによる全ての重鎖の高レベルのカップリングを達成し、１つのＣ６−ＤＯＴＡにより修飾された重鎖に相当する大きいピーク（８６％〜９１％の間）と、９％〜１４％の非修飾重鎖に相当する微小ピークとを有した。
【０４７５】
ＰＮＧａｓｅＦ−脱グリコシル化ｍＡｂに対するＣ６−ＭＭＡＦリンカーの直接カップリングが完了まで後押しされ得るかどうかを検査するために、非常に好ましい反応条件を調査した。検査した条件は：ｍＡｂ（１ｍｇ／ｍＬ）、１６０当量過剰の２０ｍＭのＤＭＳＯ中の基質（ｍＡｂｍｐモル濃度に基づいたモル過剰）、６Ｕ／ｍＬのＢＴＧａｓｅ、２００ｕＬの反応体積、２つのインキュベーション期間（４０時間のＴ１または１１０時間のＴ２のいずれか）、各場合において３７℃であった。ＨＣ＋２×Ｃ６−ＭＭＡＦの量は、１６時間のインキュベーション時間と比べて観察され得る。ｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｑについては、Ｔ１およびＴ２間の違いは観察されず、ｃｈＣＥ７ａｇｌについては、Ｔ１およびＴ２間に小さい違いしか見られなかった。インキュベーション時間の増大は、ＰＮＧａｓｅＦ−脱グリコシル化抗体については、反応を完了まで後押ししない。
【０４７６】
実施例８：
アウリスタチンの直接カップリングのための改善されたプロセス
抗体への直接カップリングのための細胞毒性薬物基質をより少量で含むプロセスを開発するために、種々の量のＢＴＧおよび／またはリンカーを含む様々なプロセスを検査した。簡単に言うと、ｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７ＳおよびｃｈＳＧＮ３５  Ｎ２９７Ｓ（抗体１つ当たり２つのグルタミン）に対するＣ６−ＭＭＡＦリンカーの定量的なＢＴＧ介在性カップリングによって、抗体−リンカー結合体を形成した。種々の条件：ｍＡｂ（１ｍｇ／ｍＬ）、８０当量、４０当量、２０当量、１０当量過剰のＤＭＳＯ中２０ｍＭリンカー基質、４Ｕ／ｍＬ、２Ｕ／ｍＬのＢＴＧ、２００ｕＬの反応体積、３７℃で１８．５時間のインキュベーション時間。当量（ｅｑ）はｍＡｂのモル濃度に基づいたモル過剰として示され、従って、２つの受容体グルタミンを有するＮ２９７Ｓ抗体、８０当量は受容体グルタミン当たり４０倍のモル過剰に相当する。
【０４７７】
得られた抗体はＣ６−ＭＭＡＦにより機能化され、４０ｅｑのＣ６−ＭＭＡＦを用いる場合（すなわち、受容体グルタミン当たり２０当量のＣ６−ＭＭＡＦ）、全てのＢＴＧ濃度に対して最低限の非機能化リンカーしか残らなかったが、４０ｅｑ未満ではＣ６−ＭＭＡＦカップリングはもはや定量的ではなかった。さらに、８０当量のＣ６−ＭＭＡＦは、４Ｕ／ｍｌまたは２Ｕ／ｍｌのＢＴＧを使用する場合に、完全に近い機能化をもたらす。
【０４７８】
実施例９：
多段階プロセスのための改善されたリンカー
多段階プロセスがＢＴＧカップリングを改善する能力を調べるために、反応基を含む種々のリシンベースのリンカーを生成した。リシンベースのリンカーは、ＢＴＧを介して抗体に結合させことができ、その後、結合抗体と、リシンベースのリンカー上の反応基と反応することができる反応基を含む試薬とを反応させる。種々のリシンベースのリンカーは、ＢＴＧによる抗体への定量的なカップリングを可能にするように設計した。リンカーは、第１級アミン（ＢＴＧ取込みおよびカップリング部位）の近位に環状基、特に多環式または巨大環状基を欠いていた。
【０４７９】
第１のリンカーＣ２−ＳＡｃ（実施例１を参照）は、リシンベースの部分と、反応基としての保護チオールとを含み、以下のような構造を有する。
【化３８】
0006744212.tif 000040
【０４８０】
さらなるリンカーＣ６−ＳＡｃ（実施例１を参照）は、リシンベースの部分と、反応基としての保護チオールと、スペーサー基の役割を果たす付加的な線状炭素含有フレームワークとを含み、以下のような構造を有する。
【化３９】
0006744212.tif 000041
【０４８１】
さらなるリンカーＰＥＧ−ＳＡｃ（実施例１を参照）は、リシンベースの部分と、反応基としての保護チオールと、スペーサー基の役割を果たす付加的な線状炭素含有ＰＥＧフレームワークとを含み、以下のような構造を有する。
【化４０】
0006744212.tif 000042
【０４８２】
さらなるリンカーアジド−ＰＥＧ４−ＮＨ２は、線状炭素含有ＰＥＧフレームワークとして一緒に具体化されたリシンベースの部分およびスペーサー基と、反応基としてのアジドとを含み、以下のような構造を有する。
【化４１】
0006744212.tif 000043
【０４８３】
さらなるリンカーアルキン−ＰＥＧ４−ＮＨ２は、線状炭素含有ＰＥＧフレームワークとして一緒に具体化されたリシンベースの部分およびスペーサー基と、反応基としてのアルキンとを含み、以下のような構造を有する。
【化４２】
0006744212.tif 000044
【０４８４】
さらなるリンカーＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２は、線状炭素含有ＰＥＧフレームワークとして一緒に具体化されたリシンベースの部分およびスペーサー基と、反応基としてのアルキン  ジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）とを含み、以下のような構造を有する。
【化４３】
0006744212.tif 000045
【０４８５】
非修飾ｃｈＡＤＣ１およびｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｓ抗体および種々の反応性基含有リンカーをＢＴＧの存在下で、最適化反応条件（８０当量のリガンド、６Ｕ／ｍｌのＢＴＧ、１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ、３７℃）を用いて反応させて、抗体を修飾した。最適化反応条件については実施例３を参照されたい。
【０４８６】
各リンカーを用いたＢＴＧによるｃｈＡＤＣ１およびｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｓ重鎖の定量的な酵素修飾を観察することができた。反応条件において６Ｕ／ｍＬのＢＴＧを用いると、検査した種々のチオールリンカーを定量的および化学量論的に均一に、ｃｈＡＤＣ１の重鎖にカップリングすることが可能であった。分析のための調製は、以下のスキームで示される。ＭＳ測定のためのサンプルの調製（「ＬＣ−ＭＳ分析」を参照）中の塩基性ｐＨは保護チオール基の脱アセチル化を促進し得るので、ＭＳスペクトル（図２１）には２つのピークが出現するようである。短いチオールリンカー（ｎ＝１）では部分的な脱保護が起こったが、長いチオールリンカー（ｎ＝５）の場合は完全な脱保護が観察された。
【化４４】
0006744212.tif 000046
【０４８７】
スキーム（上記）：質量分析用サンプルの調製中の保護チオールリンカー１および３の脱アセチル化。短い（ｎ＝１）および長い（ｎ＝５）保護チオールリンカー、ならびに対応する脱保護リンカー２および４の分子量はいずれも構造の下に示される。
【０４８８】
図２２Ａおよび２２Ｂの結果は、短い（１Ａ）および長い（２Ｂ）チオールリンカーに連結されたｃｈＡＤＣ１重鎖のデコンボリューション質量スペクトルを示す。図２２Ａのスペクトル：保護された短リンカー１：２１８ｇ／ｍｏｌ、２１８−１７＝２０１Ｄａ、４８９４５＋２０１＝４９１４６Ｄａ、実測値４９１４５Ｄａ；脱保護された短リンカー２：１７６ｇ／ｍｏｌ、１７６−１７＝１５９Ｄａ、４８９４５＋１５９＝４９１０４、実測値４９１０３。図２２Ｂのスペクトル：脱保護された長リンカー４：２３２ｇ／ｍｏｌ、２３２−１７＝２１５Ｄａ、４８９４５＋２１５＝４９１６０Ｄａ、実測値４９１６０Ｄａ。
【０４８９】
次に、種々の抗体結合リンカーを反応パートナーと反応させて、最終化合物を得た。１つの一連の実験では、ｃｈＡＤＣ１に対するＳ−アセチル保護リンカーＣ６−ＳＡｃの定量的なＢＴＧ介在性カップリングと、その後の脱保護およびマレイミド機能化毒素による反応とによって、抗体−リンカー結合体を形成した。得られた抗体は毒素によってうまく機能化されており、機能化されなかったリンカーをわずかに伴った。
【０４９０】
別の一連の実験では、ｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｓに対するアジド−ＰＥＧ４−ＮＨ２リンカーの定量的なＢＴＧ介在性カップリングと、その後のＤＢＣＯ−アミンとの反応とによって、抗体−リンカー結合体を形成した。得られた抗体はＤＢＣＯ−アミンにより完全／定量的に機能化され、非機能化リンカーは残らなかった。
【０４９１】
実施例１０：
多段階プロセス重鎖当たり２つのグルタミンへの定量的なカップリングを達成する
我々は、各抗体重鎖にカップリングされるグルタミンの数を増大させるように多段階プロセスがＢＴＧカップリングを改善する能力を調査した。リシンベースのリンカーを、１段階または多段階の両方で位置２９５および２９７の両方に２つの可能な受容体グルタミンを有するように修飾された抗体に結合した。
【０４９２】
Ｎ２９７Ｑ置換を有する種々の抗体、ｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｑ、ＳＧＮ−３５  Ｎ２９７ＱおよびｃｈＣＥ７  Ｎ２９７Ｑを生成した。修飾抗体は、各重鎖の位置Ｑ２９５の１つの受容体グルタミンと、各重鎖の位置２９７の１つの受容体グルタミンとを含み、さらに、ＢＴＧによるカップリングの前にＮ２９７連結グリカンを除去するためにＰＮＧａｓｅＦ処理を必要としない。
【０４９３】
リンカーＣ２−ＳＡｃ、Ｃ６−ＳＡｃおよびＰＥＧ−ＳＡｃ（実施例８を参照）およびｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｑ、ＳＧＮ−３５  Ｎ２９７ＱおよびｃｈＣＥ７  Ｎ２９７Ｑの組み合わせをＢＴＧの存在下で、最適化反応条件（８０当量のリガンド、６Ｕ／ｍｌのＢＴＧ、１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ、３７℃）を用いて反応させて、抗体を修飾した。
【０４９４】
各リンカーを用いるＢＴＧによる非修飾ｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７ＱおよびＳＧＮ−３５  Ｎ２９７Ｑ重鎖の定量的（実質的に完全な）な酵素修飾を観察することができた。リンカーＣ２−ＳＡｃ、Ｃ６−ＳＡｃおよびＰＥＧ−ＳＡｃのそれぞれは、全ての重鎖上の２つのグルタミンへの完全なカップリングを提供した。同様に、アジド−ＰＥＧ４−ＮＨ２リンカーも、ｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｑの全ての重鎖上の２つのグルタミンへの完全なカップリングを提供した。
【０４９５】
比較のために、ＭＭＡＦリンカー（実施例６を参照）を、ＰＮＧａｓｅＦ−脱グリコシル化抗体ｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｑと、ＢＴＧの存在下、最適化反応条件（８０当量のリガンド、６Ｕ／ｍｌのＢＴＧ、１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ、３７℃）を用いて反応させた。しかしながら、ＭＭＡＦリンカーを用いたＢＴＧによる各重鎖上の両方のグルタミンの定量的な酵素修飾は、達成することができなかった。主に、単一のＭＭＡＦリンカーで修飾されたｃｈＡＤＣ１重鎖が見出され、ｃｈＡＤＣ１については、１つのＭＭＡＦリンカーを有する修飾重鎖に相当する大きいピーク（７５％）と、２つのＭＭＡＦリンカーを有する重鎖に相当する微小ピーク（２５％）とを有した。
【０４９６】
抗体重鎖当たり２つのグルタミンを有する修飾抗体と一緒に、抗体重鎖当たり２つの受容体グルタミンへの定量的なカップリングが可能な反応基を有するリンカーを使用すると、全抗体当たり４つの受容体グルタミンへ対象の部分をカップリングするための戦略が提供される。
【０４９７】
実施例１１：
クリック化学機能化のための改善されたプロセス
より少量の細胞毒性薬物基質を含むプロセスを開発するために、アジド−ＰＥＧ４−ＮＨ２リンカーによって機能化された抗体の反応パートナーの当量を低減した。簡単に言うと、ｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｓ（抗体１つ当たり２つのグルタミン）およびｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｑ（抗体１つ当たり４つのグルタミン）に対してアジド−ＰＥＧ４−ＮＨ２リンカーの定量的なＢＴＧ介在性カップリングを行い、その後、相補的反応基および細胞毒性の部分を有する反応パートナーと共にインキュベーションすることによって、抗体−リンカー結合体を形成した。
【０４９８】
受容体グルタミン当たりＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（構造は以下に示される）１．５当量を、室温で３時間、アジド−ＰＥＧ４−ＮＨ２リンカーに連結された抗体ｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７ＳまたはＮ２９７Ｑと反応させた後、サイズ排除クロマトグラフィにより精製した。得られた薬物抗体比（ＤＡＲ）は、ｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｓでは２．０であり、ｃｈＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｑでは４．０であった。
【化４５】
0006744212.tif 000047
【０４９９】
実施例１２：
クリック化学のための改善されたリンカーの安定性
水溶液中のペプチドおよびタンパク質の凝集温度を測定するために設計された熱シフト安定性アッセイを用いて、抗体の凝集傾向に対する種々のリンカーの効果を評価した。Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（ＮＹ）から入手可能な「ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｈｉｆｔ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ」キット（ＴＳＳＡ）を、製造業者の使用説明書に従って使用した。簡単に言うと、分析するサンプルを０から１００℃まで加熱し、温度の上昇に従って蛍光を読み取る。凝集温度に到達すると、サンプル蛍光の高度の上昇が検出される。この蛍光測定は、４８０ｎｍ励起分子ロータープローブを使用する。これは、広いｐＨ範囲（４〜１０）に適合性であり、通常の濃度で存在するポリソルベート８０などの界面活性剤に耐性である。
【０５００】
抗体ＳＧＮ−３５  Ｎ２９７ＱまたはＳＧＮ−３５  Ｎ２９７Ｓを、Ｓ−アセチル（Ｃ６またはＰＥＧリンカーのいずれか）、アジド（ＰＥＧリンカー上）またはシクロアルキンＤＢＣＯ（ＰＥＧリンカー上）のいずれかを有するリンカーと反応させ、評価した。リンカーは以下に示される。
【化４６】
0006744212.tif 000048
【０５０１】
水溶液中の抗体結合体の安定性研究の結果は表６に示される。
【０５０２】
【表２】
0006744212.tif 000049
【０５０３】
リンカーは許容可能な安定性を示したが、ほぼ７１℃（それぞれ７０．７℃および７０．９℃）の凝集温度を有するＳＧＮ−３５抗体（Ｎ２９７ＳおよびＮ２９７Ｑの両方）は、他の結合体と比較して特に凝集する傾向が低いことことが分かった。範囲の反対側では、疎水性ＤＢＣＯ基を有するリンカーは安定性がより低く、Ｎ２９７ＱおよびＮ２９７Ｓに対してそれぞれ６６．３℃および６７．８℃の凝集温度を有した。アジドおよびチオールリンカー（すなわち、疎水基がない）は全て、ＤＢＣＯリンカーよりも優れた安定性を有した。同じ抗体上のチオールリンカーに対するＣ６およびＰＥＧリンカー間の安定性は同等であった。さらに、４つのグルタミンを有するＮ２９７Ｑ抗体は、アジドリンカーを使用した場合、凝集温度の有意な違いを示さなかった。しかしながら、ＤＢＣＯリンカーについては、４つの受容体グルタミンを有する抗体に対して凝集温度の十分な程度の低下が観察され、これは、疎水性基を有する２つの間隔の近いリンカーが抗体の安定性に対して悪影響を有し得ることを示す。
【０５０４】
実施例１３：
スペーサーおよび切断可能なペプチド（Ｖ）部分を有するリンカーは安定かつ有効である
ペプチドリンカーおよび細胞毒性薬物のペイロードを有するリンカーに結合された種々の抗体の効果を、生体外の腫瘍モデルに対する安定性および効力について評価した。
【０５０５】
実施例１２と同様に、ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｈｉｆｔ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いる熱シフト安定性アッセイ（ＴＳＳＡ）により凝集傾向を評価した。
【０５０６】
凍結／融解（Ｆ／Ｔ）サイクル（ＡＤＣ生成物が−２０℃で少なくとも２時間凍結され、室温で少なくとも１時間融解される）を３回行った後に物理的安定性を測定し、最後の凍結／融解サイクルの２４時間後、そして振とう（ＡＤＣ生成物サンプルが「ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）」により３０００ｒｐｍで３分間振とうされる）の後に検査し、この振とう応力（ｓｈａｋｉｎｇ  ｓｔｒｅｓｓ）適用の２４時間後に試験した。測定は、凝集アッセイ（ＡＡ）を用いて行い、物理的応力後の可溶性凝集体の割合が示された。ＡＡアッセイは、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（ＮＹ）から入手可能なＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）タンパク質凝集アッセイを用いて、製造業者の使用説明書に従って実行した。ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）試薬は、分子ローター型フルオロフォアの一例である。フルオロフォアがその分子構造の中心軸のまわりに回転する能力によって引き起こされる周囲の溶液への発熱を通して励起状態が緩和するので、溶液中で色素は不十分なフルオロフォアである。ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）色素の場合、タンパク質凝集体の存在下、色素は凝集体の四次構造によって生じる空洞内に入り込むことができる。この状態では回転が制約され、その結果、蛍光量子収率の著しい増大が起こる。また、測定は、ＢＥＨ２００  ＳＥＣ  １．７μｍカラムを用いるＷＡＴＥＲＳ（登録商標）からのＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣで実施されるＳＥ−ＨＰＬＣによっても行った。ＳＥ−ＨＰＬＣは、可溶性および共有結合性／非共有結合性凝集体レベルおよび発生し得るタンパク質断片（ｐｒｏｔｅｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を評価するために使用される。
【０５０７】
化学安定性研究は、＋４０℃（熱応力加速分解貯蔵条件）における３カ月の貯蔵後に影響を受け得るＡＤＣ生成物の分子の完全性を監視した。ＢＥＨ２００  ＳＥＣ  １．７μｍカラムを用いるＷＡＴＥＲＳ（登録商標）からのＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣで実施されるＳＥ−ＨＰＬＣによって評価されるように、＋４０℃で貯蔵したサンプルを、＋５℃で貯蔵したサンプルと比較した。
【０５０８】
抗体を、ゴールドスタンダードの抗体−薬物結合体、ＡｄｃｅｔｒｉｓＴＭ、（マレイミドカプロイル−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥリンカーが結合された、ＳＧＮ−３５に基づく抗ＣＤ３０抗体）と比較した。
【０５０９】
しかしながら、ＡｄｃｅｔｒｉｓＴＭは、比較的遮蔽され得る抗体の領域内にあるシステインにおいてリンカーの結合のための部位を有しており、これは次に、凝集の傾向を低減する可能性がある。他方で、非グリコシル化抗体のＣＨ２領域内の残基２９５または２９７におけるグルタミンへの結合は非常に露出されたリンカーもたらすことが予期され、これは次に、凝集につながり得る。
【０５１０】
抗体ＳＧＮ−３５  Ｎ２９７ＱまたはＳＧＮ−３５  Ｎ２９７Ｓを、（１）Ｃ６またはＰＥＧリンカーのいずれか、Ｎ３−ＤＢＣＯ反応の生成物、バリン−シトルリン切断可能なリンカー、ＰＡＢスペーサー、およびアウリスタチン細胞毒性薬物を有するＣ６またはＰＥＧリンカー、または（２）ＰＥＧリンカー、バリン−シトルリン切断可能なリンカー、ＰＡＢスペーサー、およびアウリスタチン細胞毒性薬物を有するリンカー（ＮＨ２−ＰＥＧ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、以下に示される）と反応させた。
【化４７】
0006744212.tif 000050
【０５１１】
全てのＡＤＣ生成物は、以下の表７に示されるように完全に同じように配合した。
【０５１２】
【表３】
0006744212.tif 000051
【０５１３】
ＴＳＳＡ研究の結果は表８に示される。ＳＧＮ−３５抗体（Ｎ２９７ＳおよびＮ２９７Ｑの両方）は、最悪でもＡｄｃｅｔｒｉｓＴＭと同等の凝集傾向を示すことが分かる。重鎖ごとに単一の受容体グルタミンを有する抗体は、ＡｄｃｅｔｒｉｓＴＭと比較して改善された熱安定性を示し、アジド−ＤＢＣＯリンカーを使用した場合のＮ２９７Ｓ変異体の凝集温度はほぼ６８℃であり、ＮＨ２−ＰＥＧ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ結合体の凝集温度は６９℃を上回った。
【０５１４】
【表４】
0006744212.tif 000052
【０５１５】
物理的安定性研究の結果は表９に示される。全てのＳＧＮ−３５  Ｎ２９７ＳまたはＮ２９７Ｑ結合抗体（重鎖ごとに２つの受容体グルタミンを有するＮ２９７Ｑ変異体を含む）は、ＡｄｃｅｔｒｉｓＴＭと比較して、より低い割合の可溶性凝集体を示した。Ｎ２９７Ｓ変異体は特に、全ての時点および条件で非常に低レベルの可溶性凝集体を示した。さらに、ＳＧＮ−３５  Ｎ２９７ＳまたはＮ２９７Ｑ結合抗体のどれについても断片は観察されなかったが、ＡｄｃｅｔｒｉｓＴＭについては有意なレベルの断片が観察された。
【０５１６】
【表５】
0006744212.tif 000053
【０５１７】
５℃における化学安定性の結果は表１０に示される。全てのＳＧＮ−３５  Ｎ２９７ＳまたはＮ２９７Ｑ結合抗体（重鎖ごとに２つの受容体グルタミンを有するＮ２９７Ｑ変異体を含む）は、ＡｄｃｅｔｒｉｓＴＭと比較して、同様またはより低い割合の可溶性凝集体を示した。Ｎ２９７Ｓ変異体は特に、全ての時点および条件で非常に低レベルの可溶性凝集体を示した。さらに、ＳＧＮ−３５  Ｎ２９７ＳまたはＮ２９７Ｑ結合抗体のどれについても断片は観察されなかったが、ＡｄｃｅｔｒｉｓＴＭについては有意なレベルの断片が観察された。
【０５１８】
【表６】
0006744212.tif 000054
【０５１９】
ＣＤ３０発現ＫＡＲＰＡＳＳ−２９９細胞株に対する細胞毒性を測定することによって、抗体の効力を評価した。全ての抗体薬物結合体は、ＣＤ３０発現ＫＡＲＰＡＳＳ−２９９細胞の細胞増殖の阻害におい有効であったが、毒素を持たない負の対照ＳＧＮ−３５  Ｎ２９７ＳおよびＳＧＮ−３５  Ｎ２９７Ｑは効果がなかった。１０μｇ／ｍｌにおいて、全てのＳＧＮ−３５  Ｎ２９７ＳまたはＮ２９７Ｑ結合抗体は、ＡＤＣＥＴＲＩＳと同等の効果を有した。
【０５２０】
実施例１４：
単鎖ｍＡｂにおける基質配列タグのＢＴＧ介在性カップリング
使用した組換えタンパク質には、ｓｃＦｖ（ｍｙｃタグ化）；アフィボディ（二量体、ｍｙｃタグ化）；ナノボディ（ｍｙｃタグ化；非タグ化）が含まれた。使用したリガンドには、ビオチン−カダベリン（Ｚｅｄｉｒａ）；デスフェリオキサミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）が含まれた。酵素：ＭＴＧａｓｅ（Ｚｅｄｉｒａ）。Ｍｙｃ−Ｔａｇ配列：ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ。
【０５２１】
１．ビオチン−カダベリンによるナノボディの修飾
可能な受容体グルタミンを評価するために、組換えナノボディ（らくだ科動物由来の単一ＶＨドメイン）をＭＴＧａｓｅおよびビオチン−カダベリンと共にインキュベートし、結果をＬＣ−ＭＳにより分析した。結合体の分析により、非タグ化ナノボディの実質的な標識化が存在しないことが明らかになった（図２３Ａ）。従って、ＭＴＧは、ナノボディの骨格内に存在するグルタミンを機能化しない。
【０５２２】
対照的に、ＬＣ−ＭＳ分析により、酵素反応は、Ｃ末端ｍｙｃタグを有する同じナノボディの修飾をもたらすことが明らかになった（図２３Ｂ）。１５４２９の質量ピークは３１２Ｄａの正しい質量シフトを有する。従って、ＭＴＧは、ｍｙｃタグ配列内に存在する唯一のグルタミン機能化する。トリプシン消化の後、ビオチン修飾グルタミンを含む正しい質量を有するペプチドを同定することができた（表６）。
【０５２３】
２．ビオチン−カダベリンによる単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の修飾
ｍｙｃタグ化ｓｃＦｖを、ＭＴＧａｓｅおよびビオチン−カダベリンと共にインキュベートし、結果をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティングにより分析した。ストレプトアビジン−ＨＲＰによりビオチン化ｓｃＦｖを検出することができた（ＭＷ  ２８ｋＤａ）。より低分子量を有する分解生成物も検出された。トリプシン消化の後に、修飾ペプチドを同定することができた（表６）。
【０５２４】
３．ビオチン−カダベリンおよびダンシル−カダベリンによる二量体ｍｙｃタグ化アフィボディの修飾
ＬＣ−ＭＳ分析により、基質ビオチン−カダベリンおよびダンシル−カダベリンによるｍｙｃタグ化二量体アフィボディの定量的な修飾が示された（図２３Ｃ）。トリプシン消化の後、質量分析によって修飾ビオチン化ペプチドを同定した（表６）。
【０５２５】
【表７】
0006744212.tif 000055
【０５２６】
実施例１５：
小さい反応性リンカーのための操作された定常領域
ＢＴＧによる基質のカップリングに対する＋２位置の種々の残基の影響を評価するために、ＣＨ２ドメインにおいて種々の突然変異を含有する、抗体ｃｈｉｍＡＤＣ１の変異体を構築した。上記のＮ２９７Ｓ突然変異体の場合と同じ一般的な方法を用いてｃｈｉｍＡＤＣ１突然変異体を作製した。単一および二重突然変異体には、以下の：Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｑ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｈ、Ｎ２９７Ｒ、Ｑ２９５Ｎ＋Ｎ２９７Ｑ、Ｑ２９５Ｓ＋Ｎ２９７Ｑが含まれた。これらを、Ｎ２９７Ｓ変異体と共に、比較的小さい非疎水性基質ダンシル−カダベリンのＢＴＧカップリングに対する効果について比較した。使用したカップリング条件は、ｍＡｂ：０．５ｍｇ／ｍＬ；リンカー：ダンシル−カダベリン：２０当量／受容体グルタミン；ＢＴＧ：１Ｕ／ｍＬ；温度３７℃であり、評価した時点は７２時間にわたった。
【０５２７】
結果は図２４に示される。図２４Ａは、受容体グルタミンが＋２位置において負電荷を有するアミノ酸によって隣接されているＮ２９７Ｄ変異体を除いて、種々の突然変異体の良好なカップリングを示す。２９７Ｄ変異体は、反応時間を延長しても、他の変異体のＤＡＲ付近に到達しなかった。
【０５２８】
図２４Ｂは、種々の突然変異体のカップリングの動態学を示す。驚くことに、反応時間を延長した後、絶対ＤＡＲに小さい違いが生じるだけでなく、反応動態学の顕著な違いも観察された。特に、正電荷を有するアミノ酸（アルギニン）は、任意の他の変異体よりも速くカップリングされた。
【０５２９】
結果は、特にＣＨ２ドメインに関連して、受容体グルタミンに対して＋２位置に負電荷を有するアミノ酸は回避されるべきであることを示す。興味深いことに、＋２位置の正荷電アミノ酸は反応動態学を改善することができる。
【０５３０】
＋２位置の負電荷はカップリングに悪い影響を与えるが、−１〜−６位置の負電荷はそうではなく、それどころか好ましいカップリング環境を形成することができ、恐らく、正荷電残基が下流（例えば、＋２位置）にある場合には、より一層そうである。特に、ＣＨ２ドメインの受容体グルタミンに対して−１および−２位置の残基が負に荷電（グルタミン酸）した抗体（Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｈ、Ｎ２９７Ｒ、Ｎ２９７Ａ変異体）、ＣＨ２ドメインの受容体グルタミンに対して−３および−４位置の残基が負に荷電した抗体（Ｑ２９５Ｎ＋Ｎ２９７ＱおよびＱ２９５Ｓ＋Ｎ２９７Ｑ二重突然変異体）を用いて実験を行った。同様に、ＴＧａｓｅ認識配列を含有するタグ（実施例１４を参照）も、受容体グルタミンに対して−１位置に負荷電（グルタミン酸）残基を含有する。従って、＋２位置の負荷電残基（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）の不在と組み合わせて、受容体グルタミンに対して−１〜−４位置の負荷電残基（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）を含むことが可能であろう。さらに、正荷電残基アルギニンは、受容体グルタミンに対して＋２位置に位置することができる。
【０５３１】
実施例１６：
大きい疎水性リンカーのための操作された定常領域
突然変異体：Ｎ２９７Ｓ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｑ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｈ、Ｎ２９７Ｒ、Ｑ２９５Ｎ＋Ｎ２９７Ｑ、Ｑ２９５Ｓ＋Ｎ２９７Ｑを含む実施例１５のｃｈｉｍＡＤＣ１の単一および二重突然変異体を、大きい疎水性ＮＨ２−ＰＥＧ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥリンカーの結合について検査した。使用したカップリング条件は、ｍＡｂ：０．５ｍｇ／ｍＬ；リンカー：ダンシル−カダベリン：１０当量／受容体グルタミン；ＢＴＧ：１Ｕ／ｍＬ；温度３７℃であり、評価した時点は７２時間にわたった。
【０５３２】
結果は図２５に示される。驚くことに、異なるカップリングプラトーが観察された。小さいリンカーを用いると、突然変異体間で反応動態学の違いを観察することができるが、小さいリンカーのカップリングは、同様のレベル（違いが存在し得るとしても）のプラトーに到達する。しかしながら、大きい疎水性リンカーの場合、二重突然変異体Ｑ２９５Ｎ＋Ｎ２９７ＱおよびＱ２９５Ｓ＋Ｎ２９７Ｑはいずれも、結合の完了のために、他の変異体のどれよりも高いプラトーに達する（Ｑ２９５Ｎ＋Ｎ２９７ＱおよびＱ２９５Ｓ＋Ｎ２９７Ｑについて検査した最後の２つの時点は同じであり、従って図上に表示されない）。Ｑ２９５Ｎ＋Ｎ２９７ＱおよびＱ２９５Ｓ＋Ｎ２９７Ｑは、他の変異体の１．０〜１．４、そしてと比較して、Ｎ２９７Ｄの０．６未満と比較して、１．８のＤＡＲに達した。
【０５３３】
これらの結果は、最適以下の当量のリンカー−毒素基質（１０ｅｑ／受容体グルタミン）による反応条件を用いて得られたことに注意すべきである。Ｑ２９５Ｘ＋Ｎ２９７Ｑ変異体は、従って、抗体を機能化するために使用される毒素の当量を低減させるという点で有利である。アスパラギンおよびセリンはいずれもこれらの実験において残基２９５のグルタミンを置換するために使用されるが、他の残基、例えば、保存的な置換基（例えば、グリシン、スレオニン）またはアラニンがＱ２９５において置換されてもよい。疎水性であり、溶解性が低いことが多く、従って高濃度で使用できない細胞毒性薬物、あるいはＢＴＧカップリングと適合性でない有機溶媒を必要とする細胞毒性薬物に対して、これは、高度に均質な抗体組成物を得るための道を切り開く。
【０５３４】
実施例１７：
改善された結合プロセス
ＢＴＧに対する溶媒の影響を研究するために、異なる量の溶媒（ＤＭＳＯまたは１，２−プロパンジオール）を含む様々なプロセスを検査した。簡単に言うと、ｃｈｉｍＡＤＣ１  Ｎ２９７Ｓ（抗体１つ当たり２つのグルタミン）に対するシクロオクチン−Ｃ５ＮＨ２リンカーのＢＴＧ介在性カップリングによって、異なる条件（ｍＡｂ（５ｍｇ／ｍＬ）、ＤＭＳＯまたは１，２−プロパンジオール中の２０当量過剰のリンカー基質（反応体積の１．４〜３０％）、２Ｕ／ｍＬのＢＴＧ、１００μＬの反応体積、３７℃で４日間のインキュベーション時間）下で抗体−リンカー結合体を形成した。反応をＬＣ／ＭＳにより監視した。当量（ｅｑ）はｍＡｂのモル濃度に基づいたモル過剰として示され、従って２つの受容体グルタミンを有するＮ２９７Ｓ抗体の場合、２０当量は受容体グルタミン当たり２０倍のモル過剰に相当する。
【０５３５】
結果は、１，２−プロパンジオール溶媒については図２６Ａおよび２６Ｂに示され、ＤＭＳＯについては図２７Ａおよび２７Ｂに示される。１．４％（ｖ／ｖ）の溶媒はいずれも、受容体グルタミンに対する完全なカップリングをもたらした。５％（ｖ／ｖ）の溶媒はいずれも受容体グルタミンに対する高いカップリングをもたらした（ＤＡＲ約１．９または約９５％の受容体グルタミンに対する完全なカップリング）。しかしながら、１０％（ｖ／ｖ）の溶媒はいずれも、受容体グルタミンに対する完全なカップリング、大幅に低下したカップリングをもたらし、ＤＡＲは１．５以下であった。いくつかの細胞毒性薬物などの疎水性薬物は、ＴＧａｓｅを介して抗体にカップリングされることが難しい。これは、１つには、これらの薬物が溶液状態に保持されるために有機溶媒を必要とし、これは次にＴＧａｓｅに対する影響を有するからであり得る。アウリスタチン、または特に疎水性のもの、例えばピロロベンゾジアゼピンは、通常、有機溶媒を必要とする。我々の結果は、抗体に対する薬物の直接カップリングのために修正されたカップリング反応を提供し、有機溶媒は、１０％未満、好ましくは５％以下、または可能であればさらにそれ以下で使用される。我々はこの方法で、実質的に完全なカップリングにおいてわずか１％のＤＭＳＯを用いてアウリスタチンをカップリングした。例えば、溶媒の濃度を低減することが不可能である場合、代替手段は、反応基を用いる２段階アプローチを使用することであり、この場合、有機溶媒の非存在下でＴＧａｓｅカップリングが実行され、続いて溶媒の存在下で薬物による機能化が実行される。
【０５３６】
【表８】
0006744212.tif 000056
【０５３７】
【表９】
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【０５３８】
【表１０】
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【０５３９】
【表１１】
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【０５４０】
【表１２】
0006744212.tif 000060
【０５４１】
【表１３】
0006744212.tif 000061
【０５４２】
【表１４】
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【０５４３】
【表１５】
0006744212.tif 000063
【０５４４】
【表１６】
0006744212.tif 000064
【０５４５】
【表１７】
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【０５４６】
【表１８】
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【０５４７】
【表１９】
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【０５４８】
【表２０】
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【０５４９】
【表２１】
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【０５５０】
【表２２】
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【０５５１】
【表２３】
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【０５５２】
【表２４】
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【０５５３】
【表２５】
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【０５５４】
【表２６】
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【０５５５】
【表２７】
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【０５５６】
【表２８】
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【０５５７】
【表２９】
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【０５５８】
【表３０】
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【０５５９】
【表３１】
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【０５６０】
【表３２】
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【０５６１】
【表３３】
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【０５６２】
【表３４】
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【０５６３】
【表３５】
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【０５６４】
【表３６】
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【０５６５】
全ての表題および副題は本明細書において便宜上使用されるだけであり、決して本発明を限定すると解釈されてはならない。その全ての可能な変化形における上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書において他に記載されない限り、あるいは文脈によって他に明確に否定されない限り、本発明によって包含される。本明細書において他に記載されない限り、本明細書における値の範囲の詳説は範囲内に含まれるそれぞれ別の値に個々に言及する簡略方法の役割を果たすことを意図するだけであり、それぞれ別の値は、あたかも本明細書において個々に記載されたかのように本明細書に組み込まれる。他に記述されない限り、本明細書において提供される全ての正確な値は対応する概略値の代表する（例えば、特定の因子または測定値に関して提供される全ての正確な例示的な値は、適切な場合には「約」によって修飾される対応する概略値も提供すると考えることができる）。
【０５６６】
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において他に記載されない限り、あるいは文脈によって他に明確に否定されない限り、任意の適切な順序で実施することができる。
【０５６７】
本明細書において提供される任意および全ての例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、本発明をより良く明確にすることを意図するだけであり、他に記載されない限り、本発明の範囲に限定を及ぼさない。本明細書中の用語は、そうであると明確に記述されない限り、任意の要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
【０５６８】
本明細書における特許文献の引用および援用は便宜上行われるだけであり、このような特許文献の妥当性、特許性および／または法的強制力の任意の見解を反映しない。要素（単数または複数）への言及などの用語を用いる本発明の任意の態様または実施形態の本明細書中の記載は、他に記述されない限り、あるいは文脈により明白に否定されない限り、その特定の要素（単数または複数）「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「実質的に含む（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」本発明の同様の態様または実施形態に対する支持を提供することが意図される（例えば、特定の要素を含むと本明細書に記載される組成物は、他に記述されない限り、あるいは文脈により明白に否定されない限り、その要素からなる組成物も記載すると理解されるべきである）。
【０５６９】
本発明は、適用可能な法律によって許可される最大限の範囲まで、本明細書で提示される態様または特許請求の範囲において詳述される本主題の全ての修飾および等価物を含む。
【０５７０】
本明細書で引用される全ての刊行物および特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願がそれぞれ参照によって援用されると具体的におよび個別に示されたかのように、参照によってその全体が本明細書中に援用される。
【０５７１】
上記の本発明は理解を明瞭にするために図解および実施例によっていくらか詳細に記載されたが、本発明の教示を考慮すれば、特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、そこに特定の変化および修正がなされ得ることは、当業者には容易に認識されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【配列表】
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