(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトチミジンキナーゼ１（ＴＫ１）の血清形態に結合することが可能なモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントであって、
ｉ）前記ヒトＴＫ１のＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）エピトープへの特異性を有し、かつ
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメイン相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を有するＶＨドメインＣＤＲ２；および
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を有するＶＨドメインＣＤＲ３；
を有するアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメイン、並びに
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインＣＤＲ１；
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）を有するＶＬドメインＣＤＲ２；および
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を有するＶＬドメインＣＤＲ３、
を有するアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン
を有するか、
ｉｉ）前記ヒトＴＫ１のコンホメーション依存エピトープへの特異性を有し、かつ
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を有するＶＨドメインＣＤＲ１；
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を有するＶＨドメインＣＤＲ２；および
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を有するＶＨドメインＣＤＲ３；
を有するアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメイン、並びに
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）を有するＶＬドメインＣＤＲ１；
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）を有するＶＬドメインＣＤＲ２；および
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を有するＶＬドメインＣＤＲ３、
を有するアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン
を有するか、または、
ｉｉｉ）前記ヒトＴＫ１のＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のうちの少なくとも１つのエピトープへの特異性を有し、かつ
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を有するＶＨドメインＣＤＲ１；
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）を有するＶＨドメインＣＤＲ２；および
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）を有するＶＨドメインＣＤＲ３；
を有するアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメイン、並びに
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）を有するＶＬドメインＣＤＲ１；
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）を有するＶＬドメインＣＤＲ２；および
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）を有するＶＬドメインＣＤＲ３、
を有するアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン
を有する、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメント。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体またはフラグメントが、ヒト組換えＴＫ１およびヒトＴＫ１の細胞形態に結合することが可能である、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはフラグメント。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体またはフラグメントが、アミノ酸配列ＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦＡＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有するペプチドに結合することが可能である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはフラグメント。
【請求項４】
第一のキャリアタンパク質に連結したアミノ酸配列ＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦＡＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有するペプチドを含む第一のペプチドコンジュゲート、または前記第一のキャリアタンパク質とは異なる第二のキャリアタンパク質に連結したアミノ酸配列ＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦＡＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有する前記ペプチドを含む第二のペプチドコンジュゲートにより非ヒト動物を免疫化すること；
前記第一のペプチドコンジュゲートまたは前記第二のペプチドコンジュゲートに関する血中力価を有する前記非ヒト動物から、脾細胞を単離すること；
前記脾細胞を黒色腫と融合させることにより、ハイブリドーマを形成させること；
前記第一のペプチドコンジュゲートでの免疫化により得られたハイブリドーマからの上清を、前記第二のペプチドコンジュゲートへの力価についてスクリーニングすること、および前記第二のペプチドコンジュゲートでの前記免疫化により得られたハイブリドーマからの上清を、前記第一のペプチドコンジュゲートへの力価についてスクリーニングすること；
前記第一のペプチドコンジュゲートに、前記第二のペプチドコンジュゲートに、そしてヒト組換えＴＫ１に結合することが可能なモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを選択すること；ならびに
前記選択されたハイブリドーマの上清から前記モノクローナル抗体を単離すること、
を含む工程により得ることができる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはフラグメント。
【請求項５】
単離された身体試料中の細胞および／または血清ＴＫ１のレベルを測定する方法であって、
前記単離された身体試料を、請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはフラグメントと接触させること；および
結合されたモノクローナル抗体またはフラグメントの量を検出すること、
を含む、方法。
【請求項６】
単離された身体試料中の細胞および／または血清ＴＫ１のレベルを測定するキットであって、
固体担体に固定された、請求項１〜４のいずれか１項に記載の第一のモノクローナル抗体と；
請求項１〜４のいずれか１項に記載の第二のモノクローナル抗体と、
を含み、
前記第一のモノクローナル抗体が、
ｉ）ヒトＴＫ１のＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）；
ｉｉ）前記ヒトＴＫ１のコンホメーション依存エピトープ；ならびに、
ｉｉｉ）前記ヒトＴＫ１のＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のうちの少なくとも１つ、
からなる群から選択される第一のエピトープへの特異性を有し、
前記第二のモノクローナル抗体が、前記群から選択される第二の異なるエピトープへの特異性を有する、キット。
【請求項７】
前記キットがサンドイッチアッセイキットである、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記キットが酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）キットである、請求項６または７に記載のキット。
【請求項９】
前記第二のモノクローナル抗体が、共有結合により付着されたビオチンまたは共有結合により付着されたストレプトアビジンもしくはアビジンを有する、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されたストレプトアビジンもしくはアビジン、またはＨＲＰ標識ビオチンと；
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質および２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）基質からなる群から選択されるＨＲＰ基質と、
をさらに含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記固体担体としてマイクロタイタープレートをさらに含む、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１２】
前記固体担体としてアガロースビーズまたは磁気ビーズをさらに含む、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３】
前記第一のモノクローナル抗体が、前記ヒトＴＫ１のＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）および前記ヒトＴＫ１の前記コンホメーション依存エピトープのうちの一方から選択される前記第一のエピトープへの特異性を有し、
前記第二のモノクローナル抗体が、前記ヒトＴＫ１のＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）および前記ヒトＴＫ１の前記コンホメーション依存エピトープのうちの他方から選択される前記第二のエピトープへの特異性を有する、
請求項６〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１４】
対象における腫瘍の再発の可能性を決定する方法（医師の判断を除く）であって、
請求項５に記載の方法または請求項６〜１３のいずれか１項に記載のキットを用いて、前記対象から単離された身体試料中の血清ＴＫ１のレベルを測定すること；および
前記単離された身体試料中の血清ＴＫ１の前記レベルを、健常対象集団を代表する血清ＴＫ１のレベル、または前記対象で過去に測定された血清ＴＫ１のレベルと比較することにより対象における腫瘍の再発の可能性を決定すること、
を含む、方法。
【請求項１５】
対象における細胞増殖を測定する方法であって、
請求項５に記載の方法または請求項６〜１３のいずれか１項に記載のキットを用いて、前記対象から単離された身体試料中の血清ＴＫ１のレベルを測定すること；および
前記単離された身体試料中の血清ＴＫ１の前記レベルに基づいて、前記細胞増殖を測定すること、
を含む、方法。
【請求項１６】
悪性疾患に罹患した対象において増殖工程の応答を測定する方法であって、
請求項５に記載の方法または請求項６〜１３のいずれか１項に記載のキットを用いて、前記対象から単離された身体試料の血清ＴＫ１のレベルを測定すること；および
前記単離された身体試料の血清ＴＫ１の前記レベルに基づいて、前記増殖工程の応答を測定すること、
を含む、方法。
【請求項１７】
対象の炎症、感染、または腫瘍細胞増殖のレベルを測定する方法であって
請求項５に記載の方法または請求項６〜１３のいずれか１項に記載のキットを用いて、前記対象から単離された身体試料の血清ＴＫ１のレベルを測定すること；および
前記単離された身体試料の血清ＴＫ１の前記レベルに基づいて、炎症、感染、または腫瘍細胞増殖の前記レベルを測定すること、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記単離された身体試料が、細胞試料、組織試料、血液試料、血清試料、脳脊髄液試料、肋膜液試料、滑液試料、および腹腔液試料からなる群から選択される、前記請求項５、１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明の実施形態は、一般に、モノクローナル抗ＴＫ１抗体、そのようなモノクローナル抗ＴＫ１抗体の使用を含むキットおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
チミジンキナーゼ１、ＴＫ１（ＡＴＰ：チミジン５’−ホスホトランスフェラーゼ、ＥＣ２．７．１．２１）は、ＤＮＡ前駆体合成に関与する酵素である。ＴＫ１の形態は、悪性腫瘍のヒトおよび動物の血清中にも高レベルで存在する。それゆえ血清ＴＫ１活性の測定は、複数の異なる悪性疾患で、しかし主に白血病およびリンパ腫の例で、モニタリングおよび診断目的で用いられてきた。
【０００３】
さらに、ＴＫ１は、血中で測定され得る増殖マーカに過ぎず、日常的検査室テストとして利用可能ならば、大きな臨床利益を提供する可能性がある［１〜８］。
【０００４】
血清ＴＫ１活性は、数十年間は放射性基質１２５Ｉ−ｄＵｒｄ（ＰＲＯＬＩＦＩＧＥＮ（登録商標） ＴＫ−ＲＥＡ、ＤｉａＳｏｒｉｎ  Ｉｎｃ）を用いて測定されてきたが、このラジオエンザイムアッセイは、限定的な使用を有し、悪性血液癌の場合のみで使用されてきた［１、２、６］。非放射測定ＴＫ１活性アッセイ（ＴＫ  ＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）アッセイ、ＤｉａＳｏｒｉｎ  Ｉｎｃ．）が、近年になり利用可能になった。これは、感受性のあるロバストなアッセイであり、特に治療のモニタリングおよび再発の予測のために、血液癌のヒトおよびイヌにおける臨床的に貴重な情報を提供してきた［８、９］。
【０００５】
過去１５年間で、ヒトＴＫ１への抗体が利用可能になり、異なる血液および固形腫瘍、乳癌［５、１０、１１］、ならびに複数の他の形態の固形および血液腫瘍［１１、１２］において、ＴＫ１活性と対照的に、ＴＫ１タンパク質レベルの決定を可能にした。
【０００６】
ＴＫ１タンパク質の測定は、主にＴＫ１のＣ末端部分に対して生成された抗ＴＫ１抗体に基づくドットブロット手順に依存する［３、５、１０〜１３］。抗体生成のこの方策を選択する主な理由は、Ｃ末端領域がＴＫ１の細胞周期調節に関与するからである［１４〜１６］。それは、有糸分裂の際にＴＫ１の分解を開始するための認識配列を含み、これが抗体生成を可能にする露出された領域であると推定されてきた［３、８、１３、２０、２３〜２５］。ドットブロットアッセイは、複数の試験での使用に成功してきたが［５、１０〜１３］、その大きな限界は、それが臨床実験を実践する場合の日常的方法でないということである。現在、市販される異なる抗ＴＫ１抗体調製物は６種よりも多く存在し、組換えおよび細胞ＴＫ１と反応するものが複数示された（ｗｗｗ．ａｃｒｉｓ−ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ｃｏｍ）。しかし、現在において、日常的臨床診療で血清ＴＫ１の抗体に基づくアッセイは存在しない。
【０００７】
血清ＴＫ１のための感受性がありロバストなアッセイを確立することが困難な主な理由は、おそらく血中に存在するＴＫ１の複雑で可変的な形態に関係するであろう。近年になり、ヒトおよびイヌＴＫ１酵素の両方を用いて、ＴＫ１の組換え体、細胞および血清形態を特徴づける複数の試験が実施された［１７］。ＴＫ１が複数のオリゴマー複合体に存在し、重要なこととしてこれらの複合体の１つのサブフラクションのみに酵素活性があることが見出された。これは、固形腫瘍疾患患者の血清ＴＫ１に特にあてはまる。オリゴマー化は、血中で起こるジスルフィド架橋の形成に関係すると思われるが、おそらく腫瘍細胞が分解してＴＫ１が血流に輸送される場合にもそうなるであろう。還元剤での治療は、血清ＴＫ１複合体の一部の再構成に導くが［２、１７］、免疫アッセイ構築でのこれらの事実の結論はこれまででていない。血中ＴＫ１タンパク質の主要部分が酵素的に不活性であるという事実は、ＴＫ１酵素活性測定が固形腫瘍疾患の場合にはあまり効果的でないという説明になり得る［１８］。したがって、臨床使用への十分な感受性を持って血清ＴＫ１を測定し得る日常的インビトロ診断手順を確立することが強く求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
概要
ヒトＴＫ１の血清形態に結合することが可能なモノクローナル抗体またはフラグメントを提供することを目的とする。
【０００９】
この目的および他の目的は、本明細書に開示される実施形態により満たされる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
該実施形態の態様は、ヒトチミジンキナーゼ１（ＴＫ１）の血清形態に結合することが可能なモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントに関する。該モノクローナル抗体またはフラグメントは、
ヒトＴＫ１のＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と；
ヒトＴＫ１のＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のうちの少なくとも１つと；
ヒトＴＫ１のコンホメーション依存エピトープと、
からなる群から選択されるエピトープへの特異性を有する。
【００１１】
該実施形態の別の態様は、身体試料中の細胞および／または血清ＴＫ１材料のレベルを測定する方法に関する。該方法は、身体試料を先に記載のモノクローナル抗体またはフラグメントと接触させることを含む。該方法は、結合されたモノクローナル抗体またはフラグメントの量を検出することも含む。
【００１２】
該実施形態のさらなる態様は、身体試料中の細胞および／または血清ＴＫ１のレベルを測定するキットに関する。該キットは、固体担体に固定された、または固体担体に固定されることを意図した、先に記載の第一のモノクローナル抗体を含む。該キットは、先に記載された第二のモノクローナル抗体も含む。この態様において、第一のモノクローナル抗体は、
ヒトＴＫ１のＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と；
ヒトＴＫ１のＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のうちの少なくとも１つと；
ヒトＴＫ１のコンホメーション依存エピトープと、
からなる群から選択される第一のエピトープへの特異性を有する。第二のモノクローナル抗体は、この群から選択される第二の異なるエピトープへの特異性を有する。
【００１３】
該実施形態のさらに別の態様は、対象における腫瘍の再発の可能性を推定する方法に関する。該方法は、先に記載された方法またはキットを用いて、対象の身体試料中の血清ＴＫ１材料のレベルを測定することを含む。該方法はまた、身体試料中の血清ＴＫ１材料のレベルを、健常対象集団を代表する血清ＴＫ１材料のレベル、または対象で過去に測定された血清ＴＫ１材料のレベルと比較することを含む。
【００１４】
該実施形態のさらなる態様は、対象における細胞増殖を測定する方法に関する。該方法は、先に記載された方法またはキットを用いて、該対象の身体試料中の血清ＴＫ１材料のレベルを測定することを含む。該方法はまた、身体試料中の血清ＴＫ１材料のレベルに基づいて、細胞増殖を測定することを含む。
【００１５】
該実施形態のさらに別の態様は、悪性疾患に罹患した対象において増殖工程の応答を測定する方法に関する。該方法は、先に記載された方法またはキットを用いて、対象の身体試料中の血清ＴＫ１材料のレベルを測定することを含む。該方法はまた、身体試料中の血清ＴＫ１材料のレベルに基づいて、増殖工程の応答を測定することを含む。
【００１６】
該実施形態のさらなる態様は、対象の炎症、感染、または腫瘍細胞増殖のレベルを測定する方法に関する。該方法は、先に記載された方法またはキットを用いて、対象の身体試料中の血清ＴＫ１材料のレベルを測定することを含む。該方法はまた、身体試料中の血清ＴＫ１材料のレベルに基づいて、炎症、感染、または腫瘍細胞増殖のレベルを測定することを含む。
【００１７】
該実施形態のさらに別の態様は、アミノ酸配列ＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、またはＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）からなる単離されたペプチドに関する。
【００１８】
該実施形態のさらなる態様は、ヒトＴＫ１の血清形態に結合することが可能なモノクローナル抗体を生成する方法に関する。該方法は、第一のキャリアタンパク質に連結したアミノ酸配列ＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦＡＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有するペプチドを含む第一のペプチドコンジュゲート、または第一のキャリアタンパク質とは異なる第二のキャリアタンパク質に連結したアミノ酸配列ＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦＡＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有する該ペプチドを含む第二のペプチドコンジュゲートで、非ヒト動物を免疫化することを含む。該方法はまた、第一のペプチドコンジュゲートまたは第二のペプチドコンジュゲートに関する血中力価を有する非ヒト動物から脾細胞を単離することを含む。該方法は、脾細胞を黒色腫と融合させることによりハイブリドーマを形成させることをさらに含む。該方法は、追加として、第二のペプチドコンジュゲートへの力価について、第一のペプチドコンジュゲートでの免疫化から得られたハイブリドーマからの上清をスクリーニングすること、および第一のペプチドコンジュゲートへの力価について、第二のペプチドコンジュゲートでの免疫化から得られたハイブリドーマからの上清をスクリーニングすること、を含む。該方法は、第一のペプチドコンジュゲートに、第二のペプチドコンジュゲートに、そしてヒトｒＴＫ１に結合することが可能なモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを選択することをさらに含む。該方法は、追加として、選択されたハイブリドーマの上清からモノクローナル抗体を単離することを含む。
【００１９】
該実施形態のモノクローナル抗体およびフラグメントは、ヒトＴＫ１の血清形態に結合することが可能なことに関して優れた特性を有し、それゆえ、試料中のヒトＴＫ１の血清形態のレベルを測定することを含む様々なキットおよび方法で用いられ得る。
【００２０】
該実施形態を、さらなる目的およびその利点と一緒に、以下の説明を添付の図面と共に参照することにより最良に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】抗ＸＰＡ２１０ペプチドハイブリドーマからの上清と、組換えＴＫ１調製物と、健常者および癌患者からの血清と、を用いたドットブロットアッセイの結果を示す。骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、血液細胞の骨髄分類の非効果的生成を含む様々な血液学的医療状態の集合的分類であり、前白血病としても公知である。ＣＡ−１２５は、この例において、卵巣癌に罹患した疑いのある患者を示す。
【図２】Ｕ．ウレアリチカム／パルバム（Ｕ．ｕｒｅｏｌｙｔｉｃｕｍ／ｐａｖｒｅｕｍ）（現在の命名法）およびヒトＴＫ１の配列類似性および３Ｄ構造に基づく四量体複合体のＴＫ１のＣ末端領域に関する構造モデルを示す［１９、２０］。Ａと標識された領域は、アミノ酸１９５〜２０７を表す。Ｂと標識された領域は、アミノ酸２０８〜２１６を表し、おそらく屈曲した領域を含んでいる。Ｃと標識された領域、即ちアミノ酸２１５〜２２２は、該タンパク質の端部近くに予測されたＣ末端αへリックスを含む。Ａ、ＢおよびＣ領域は、酵素複合体の表面に向かって露出している可能性があり、抗体生成に適した抗原部位になり得る。
【図３】サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの設計実施形態の略図である。
【図４】ＴＫ  ＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）アッセイ（ＤｉａＳｏｒｉｎ  Ｉｎｃ．）で測定された、健常な血液ドナー１０名および前立腺癌と診断された患者２８名の血清に関するＴＫ活性値を示す。
【図５】ＸＰＡ２１０−Ａｒ１およびＸＰＡ２１０−Ａｒ２抗体に基づいてサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで測定された、健常な血液ドナー１０名および前立腺癌と診断された患者２８名の血清に関する吸光度値を示す。
【図６Ａ−６Ｄ】ハイブリドーマ細胞を生成するＸＰＡ２１０−Ａｒ１（図６Ｂ）、ＸＰＡ２１０−Ａｒ２（図６Ｃ）およびＸＰＡ２１０−Ａｒ３（図６Ｄ）の総ＲＮＡのアガロースゲル電気泳動を示す。図６Ａは、図６Ｂ〜６ＤのレーンＭにもあるＤＮＡマーカＭａｒｋｅｒ  ＩＩＩを示し、そのうちレーンＲは、各ハイブリドーマ細胞の総ＲＮＡを示す。
【図７Ａ−７Ｃ】ハイブリドーマ細胞を生成するＸＰＡ２１０−Ａｒ１（図７Ａ）、ＸＰＡ２１０−Ａｒ２（図７Ｂ）およびＸＰＡ２１０−Ａｒ３（図７Ｃ）のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を示す。レーンＭ：ＤＮＡマーカＭａｒｋｅｒ  ＩＩＩ、レーン１：ＶＨ、およびレーン２：ＶＬ。
【図８Ａ】組換えヒトＴＫ１とＸＰＡ２１０−Ａｒ１（図８Ａ）、およびＸＰＡ２１０−Ａｒ２（図８Ｂ）との相互作用のＡｔｔａｎａ２０００測定の結果を示す。１：１結合モデルを用いて曲線フィッティングを実施し、計算した定数は結合速度（Ｋａ）、解離速度（Ｋｄ）、親和性（ＫＤ）、質量拡散速度（ｋｔ）および最大シグナル（Ｂｍａｘ）である。
【図８Ｂ】組換えヒトＴＫ１とＸＰＡ２１０−Ａｒ１（図８Ａ）、およびＸＰＡ２１０−Ａｒ２（図８Ｂ）との相互作用のＡｔｔａｎａ２０００測定の結果を示す。１：１結合モデルを用いて曲線フィッティングを実施し、計算した定数は結合速度（Ｋａ）、解離速度（Ｋｄ）、親和性（ＫＤ）、質量拡散速度（ｋｔ）および最大シグナル（Ｂｍａｘ）である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
本発明の実施形態は、一般に、モノクローナル抗チミジンキナーゼ１（抗ＴＫ１）抗体または抗体フラグメント、およびそのようなモノクローナル抗ＴＫ１抗体または抗体フラグメントの使用を含む方法およびキットに関する。
【００２３】
該実施形態のモノクローナル抗ＴＫ１抗体およびフラグメントは、これらのモノクローナル抗ＴＫ１抗体およびフラグメントがヒトＴＫ１の血清形態に結合することが可能であるため、診断および臨床ツールとして非常に有用である。
【００２４】
当該技術分野で公知のモノクローナル抗ＴＫ１抗体がある。これらの抗体は、ヒト組換えＴＫ１（ｒＴＫ１）に、そして様々な度合いで、サイトゾルＴＫ１とも呼ばれるヒトＴＫ１の細胞形態に結合することが可能であるが、それらは、血清または血液試料などの身体試料中のヒトＴＫ１の血清形態に結合し得ることに関しては効率的でない。
【００２５】
ヒトのＴＫ１は、特定の分子の存在、例えばアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の有無に応じて；タンパク質の濃度、即ち高濃度または低濃度に応じて；タンパク質の型、即ちネイティブまたは組換えＴＫ１に応じて；そしてタンパク質の部位、即ち血清または細胞質に応じて、様々な形態で存在する。
【００２６】
一般にサイトゾルおよび組換えヒトＴＫ１は、ＡＴＰの存在下、または高濃度では四量体として生じ、ＡＴＰの非存在下または低濃度では二量体として生じる。サイトゾルおよび組換えヒトＴＫ１の四量体形態は、高いＴＫ１活性を有するが、二量体形態は、低いＴＫ１活性を有する［２６］。
【００２７】
ヒト血清ＴＫ１は、明らかに対照的に、オリゴマーなどの、またはそのようなオリゴマーを含む高分子量複合体の形態で、血清ＴＫ１活性を有し、二量体および四量体形態は、非常に低い血清ＴＫ１活性を有するか、または血清ＴＫ１活性が欠如している。
【００２８】
市販の抗ＴＫ１抗体（Ａｂｃａｍの３Ｂ３．Ｅ１１；ＡｂｎｏｖａのクローンＦ１２であるＭ０２；Ａｂｎｏｖａのウサギモノクローナル抗体であるＥＰＲ３１９４およびＥＰＲ３１９３）は、血清ＴＫ１と十分に反応しない。これらの抗ＴＫ１抗体は、ヒト組換えＴＫ１を基にして作製される。このことは、本明細書で提示される実験結果と合わせると、ヒト組換えＴＫ１を基にしたモノクローナル抗ＴＫ１抗体の作製が一般に不十分であり、典型的には十分な結合強度でＴＫ１の血清形態に結合することが可能な抗ＴＫ１抗体を生成しないことを示している。
【００２９】
さらに、ＴＫ１タンパク質の同じ部分に対して生じたモノクローナル抗ＴＫ１抗体は、本明細書で示されるＴＫ１の血清形態に関して非常に異なる特異性および結合特性を有するであろう。このことは、ＴＫ１タンパク質の一部の第一のエピトープを認識するモノクローナル抗ＴＫ１抗体と、ＴＫ１タンパク質の同じ部分にある第二の異なるエピトープを認識する別のモノクローナル抗ＴＫ１抗体の両者が、ＴＫ１タンパク質の同じ一般的部分に対して生じたとしても、ＴＫ１タンパク質の一部の第一のエピトープを認識するモノクローナル抗ＴＫ１抗体はヒトＴＫ１の血清形態に結合することが可能であるが、ＴＫ１タンパク質の同じ部分にある第二の異なるエピトープを認識する別のモノクローナル抗ＴＫ１抗体がＴＫ１の血清形態に十分に結合しないことを意味している。
【００３０】
異なるモノクローナル抗ＴＫ１抗体の結合特性における多様性の説明を試みれば、おそらく、それがヒトＴＫ１の血清形態に結合する能力を有することにおいて効率的であるヒトＴＫ１内の特別なエピトープに特異性を有する唯一のモノクローナル抗ＴＫ１抗体ということであろう。本発明の実施形態は、ヒトＴＫ１の血清形態に結合することが可能な所望の特性を備えたモノクローナル抗ＴＫ１抗体および抗体フラグメントの形成を可能にするそのような特別なエピトープを同定した。
【００３１】
それゆえ、本明細書に記載されたモノクローナル抗ＴＫ１抗体の特有の性質は、おそらく少なくとも一部がエピトープ結合特性によるものと思われる。
【００３２】
したがって該実施形態の一態様は、ヒトＴＫ１の血清形態に結合することが可能なモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントに関する。該モノクローナル抗体またはフラグメントは、
・ヒトＴＫ１のＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と；
・ヒトＴＫ１のＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のうちの少なくとも１つと；
・ヒトＴＫ１のコンホメーション依存エピトープと、
からなる群から選択されるエピトープへの特異性を有する。
【００３３】
本明細書で提示される実験データは、先に提示された群のエピトープが、ヒトＴＫ１の血清形態に結合することが可能なモノクローナル抗ＴＫ１抗体またはフラグメントを生成することに関係して、ヒトＴＫ１における重要なエピトープであることを示している。
【００３４】
エピトープＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）は、ヒトＴＫ１のアミノ酸２１３〜２２２に対応する。このエピトープは、一般に本明細書では十量体または十量体ペプチドを表す。
【００３５】
一方で、先に提示された群の第二のエピトープは、アミノ酸番号２０５〜２１６に及ぶヒトＴＫ１の部分に存在する３つの関連の配列を含む。これらの関連の配列は、本明細書では概してペプチド７と表されるＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、本明細書では概してペプチド８と表されるＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、および本明細書では概して十二量体または十二量体ペプチドと表されるＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）である。
【００３６】
これらのエピトープ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜５）は、ヒトＴＫ１のＣ末端領域に存在する。ＴＫ１のこのＣ末端領域は、ＴＫ１の細胞周期調節に関与し、有糸分裂の際にＴＫ１の分解を開始するための認識配列を含む。
【００３７】
これらのエピトープは、ヒトＴＫ１のＣ末端部分にあるより長い配列ＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦＡＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の一部でもある。このより長い配列は、本明細書では概してＸＰＡ２１０、三十一量体、または三十一量体ペプチドと表される。
【００３８】
先に提示された群の第三のエピトープは、ヒトＴＫ１のコンホメーション依存エピトープである。このことは、該コンホメーション依存エピトープへの特異性を有するモノクローナル抗ＴＫ１抗体またはフラグメントが、ヒトＴＫ１のいずれか１つ短い、即ち１０〜１２アミノ酸長のペプチド部分への任意の異なる結合を示さないということを意味している。明らかに対照的なこととして、モノクローナル抗ＴＫ１抗体またはフラグメントの結合は、この場合、ヒトＴＫ１の一次配列内では互いに隣接せず抗原ドメインの特定の三次元（３Ｄ）コンホメーションにより形成され得る複数の、即ち少なくとも２つの領域からなるエピトープまたは抗原ドメインに依存するコンホメーションであろう。したがって、ヒトＴＫ１の３Ｄ構造において、これらの多重領域は、互いに隣接または接近して存在し、一緒になってコンホメーション依存エピトープを構成または形成しているのであろう。
【００３９】
好ましい実施形態において、該コンホメーション依存エピトープは、ヒトＴＫ１のＣ末端部分に存在するコンホメーション依存エピトープである。更に好ましい実施形態において、該コンホメーション依存エピトープは、アミノ酸番号１９５〜アミノ酸番号２２５に及ぶヒトＴＫ１のＣ末端部分、即ちＸＰＡ２１０に対応するヒトＴＫ１の部分に存在するコンホメーション依存エピトープである。
【００４０】
したがって３Ｄタンパク質構造を形成させるためのヒトＴＫ１の一次アミノ酸配列のフォールディングが、Ｃ末端に、好ましくはＣ末端のＸＰＡ２１０に対応する部分に、多重領域を互いに接近してもたらすことで、これらの領域がヒトＴＫ１の一次配列において互いに隣接しないとしても、コンホメーション依存エピトープの形成が可能になる。
【００４１】
好ましい実施形態において、該実施形態のモノクローナル抗体またはフラグメントは、ヒトＴＫ１の血清形態のみならず、ヒト組換えＴＫ１（ｒＴＫ１）にも結合することが可能である。
【００４２】
好ましい実施形態において、該実施形態のモノクローナル抗体またはフラグメントは、ヒトＴＫ１の血清形態のみならずヒトＴＫ１の細胞形態、即ちサイトゾルＴＫ１にも結合することが可能である。
【００４３】
好ましい実施形態において、該実施形態のモノクローナル抗体またはフラグメントは、ヒトＴＫ１の血清形態のみならず、ヒトｒＴＫ１およびヒトＴＫ１の細胞形態にも結合することが可能である。
【００４４】
こうして、該実施形態のモノクローナル抗体およびフラグメントは、ＴＫ１の異なる形態、即ち好ましくはヒトＴＫ１の血清および細胞形態ならびにヒトｒＴＫ１に結合し得るため、非常に多方面での使用を有する。モノクローナル抗体およびフラグメントのこれらの結合特性は、モノクローナル抗体およびフラグメントが特異性を有する選択されたエピトープの同定によるものと考えられる。ヒトＴＫ１のＣ末端部分に結合する他のモノクローナル抗ＴＫ１抗体は、ヒトｒＴＫ１および／またはヒトＴＫ１の細胞形態に結合し得るかもしれないが、ヒトＴＫ１の血清形態に十分に結合しない。これは、本発明のモノクローナル抗体またはフラグメントに特有の性質である。
【００４５】
モノクローナル抗体またはフラグメントは、好ましくはアミノ酸配列ＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦＡＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有するペプチド、即ちＸＰＡ２１０にも結合することが可能である。
【００４６】
該実施形態のモノクローナル抗体またはフラグメントは、好ましくは以下のステップを含む工程により得るなど、ある工程により得ることができる。
【００４７】
第一のキャリアタンパク質、好ましくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に連結したアミノ酸配列ＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦＡＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有するペプチドを含む第一のペプチドコンジュゲート、または第一のキャリアタンパク質とは異なる第二のキャリアタンパク質、好ましくはキーホールリンペットシアニン（ＫＬＨ）に連結したアミノ酸配列ＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦＡＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有するペプチドを含む第二のペプチドコンジュゲートにより非ヒト動物を免疫化するステップ。
【００４８】
該非ヒト動物は、非限定的にマウス、ラット、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ハムスター、ウサギおよびウマをはじめとする抗体生成に伝統的に用いられる様々な動物から選択され得る。特定の実施形態において、非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物である。
【００４９】
脾細胞が、第一のペプチドコンジュゲートまたは第二のペプチドコンジュゲートに関する血中力価（抗体力価）を有する非ヒト動物から単離される。
【００５０】
一般に複数の非ヒト動物が、第一のペプチドコンジュゲートまたは第二のペプチドコンジュゲートにより免疫化される。そのような例では、第一のペプチドコンジュゲートまたは第二のペプチドコンジュゲートに関して高い血中力価を示すそれらの非ヒト動物が同定される。脾細胞は、その後、これらの同定された非ヒト動物から単離される。
【００５１】
血中力価を示す非ヒト動物は、該非ヒト動物の血液または血清が第一のペプチドコンジュゲートまたは第二のペプチドコンジュゲートに結合する、より好ましくは第一および第二のペプチドコンジュゲートのペプチドＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦＡＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に結合する抗体を含むことを示唆している。
【００５２】
その後、単離された脾細胞を当該技術分野で周知の技術に従って黒色腫と融合させることにより、ハイブリドーマが形成される。
【００５３】
第一のペプチドコンジュゲートでの免疫化により得られたハイブリドーマからの上清を、第二のペプチドコンジュゲートへの力価（抗体力価）についてスクリーニングする。それ相応に、第二のペプチドコンジュゲートでの免疫化により得られたハイブリドーマからの上清を、第一のペプチドコンジュゲートへの力価（抗体力価）についてスクリーニングする。
【００５４】
このスクリーニングは、各免疫化で用いられたＢＳＡまたはＫＬＨなどのキャリアタンパク質に対して生成される抗体を回避するために実施される。
【００５５】
その後、第一のペプチドコンジュゲートに、そして第二のペプチドコンジュゲートに結合することが可能なモノクローナル抗体を生成する１つまたは複数のハイブリドーマが、選択される。特定の実施形態において、第一のペプチドコンジュゲートに、第二のペプチドコンジュゲートに、そしてヒトｒＴＫ１に結合することが可能なモノクローナル抗体を生成する少なくとも１つのハイブリドーマが選択される。
【００５６】
その後、該実施形態のモノクローナル抗体が、選択されたハイブリドーマの上清から単離される。
【００５７】
一実施形態において、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、
・ＤＹＥＭＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
・ＡＩＨＰＧＹＧＧＴＡＹＮＱＫＦＫＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
・ＦＩＴＫＦＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
・ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＦＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
・ＬＶＳＫＬＤＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；および
・ＷＱＧＴＨＦＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。
【００５８】
特定の実施形態において、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを有する。
【００５９】
特定の実施形態において、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を有する。該モノクローナル抗体またはフラグメントは、好ましくは、同じくまたはあるいはアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を有する。
【００６０】
特定の実施形態において、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有するＶＨ  ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７を有するＶＨ  ＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を有するＶＨ  ＣＤＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を有するＶＬ  ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０を有するＶＬ  ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１を有するＶＬ  ＣＤＲ３を有する。
【００６１】
この特定の実施形態によるモノクローナル抗体は、本明細書ではＸＰＡ２１０−Ａｒ１と表される。
【００６２】
別の実施形態において、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、
・ＤＹＥＭＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
・ＡＩＬＰＧＳＧＧＴＡＹＮＱＫＦＫＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
・ＬＩＴＴＦＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
・ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
・ＬＶＳＫＬＤＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；および
・ＷＱＧＴＨＦＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを有する。
【００６３】
特定の実施形態において、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを有する。
【００６４】
特定の実施形態において、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を有する。該モノクローナル抗体またはフラグメントは、好ましくは、同じくまたはあるいはアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を有する。
【００６５】
特定の実施形態において、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有するＶＨ  ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２を有するＶＨ  ＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３を有するＶＨ  ＣＤＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４を有するＶＬ  ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０を有するＶＬ  ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１を有するＶＬ  ＣＤＲ３を有する。
【００６６】
この特定の実施形態によるモノクローナル抗体は、本明細書ではＸＰＡ２１０−Ａｒ２と表される。
【００６７】
さらなる実施形態において、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、
・ＳＧＹＳＷＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
・ＹＩＨＹＳＧＳＴＴＹＮＰＳＬＫＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
・ＷＧＴＧＨＷＹＦＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
・ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＴＮＹＡＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
・ＧＴＮＮＲＶＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；および
・ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを有する。
【００６８】
特定の実施形態において、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを有する。
【００６９】
特定の実施形態において、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を有する。該モノクローナル抗体またはフラグメントは、好ましくは、同じくまたはあるいはアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０への少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を有する。
【００７０】
特定の実施形態において、該モノクローナル抗体またはフラグメントは、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５を有するＶＨ  ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６を有するＶＨ  ＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７を有するＶＨ  ＣＤＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を有するＶＬ  ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９を有するＶＬ  ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０を有するＶＬ  ＣＤＲ３を有する。
【００７１】
この特定の実施形態によるモノクローナル抗体は、本明細書ではＸＰＡ２１０−Ａｒ３と表される。
【００７２】
該実施形態の該モノクローナル抗体のフラグメントは、ヒトＴＫ１の血清形態に結合することが可能なモノクローナル抗体の任意のフラグメントであり得、一本鎖抗体、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント、ｄｉ−ｓｃＦｖフラグメント、およびＣＤＲ領域からなる群から選択され得る。
【００７３】
該実施形態の該モノクローナル抗体またはフラグメントは、好ましくは先に記載されたハイブリドーマの上清から単離されるなど、単離されたモノクローナル抗体またはフラグメントである。
【００７４】
該モノクローナル抗体は、ヒトＴＫ１の血清形態に結合することが可能なヒト化モノクローナル抗体またはキメラモノクローナル抗体であり得る。
【００７５】
モノクローナル抗体の特異性は、親和性および／または結合活性に基づいて測定され得る。抗原とモノクローナル抗体の解離のための平衡定数（Ｋｄ）により表される親和性は、抗原決定基とモノクローナル抗体の抗原結合部位との結合強度の尺度である。Ｋｄの値が小さい程、抗原決定基とモノクローナル抗体との結合強度が強い。あるいは該親和性は、親和性定数（Ｋａ）として表すこともでき、これは１／Ｋｄである。当業者には明白な通り、親和性は、該当する特異的抗原に応じて、それ自体が公知の手法で決定することができる。
【００７６】
結合活性とは、モノクローナル抗体と関連の抗原との結合強度の尺度である。結合活性は、抗原決定基とモノクローナル抗体上の抗原結合部位との親和性、およびモノクローナル抗体上に存在する関連の結合部位の数の両方に関係する。
【００７７】
典型的にはモノクローナル抗体は、１０−５〜１０−１２モル／リットル（Ｍ）以下、好ましくは１０−７〜１０−１２Ｍ以下、より好ましくは１０−８〜１０−１２Ｍの解離定数（Ｋｄ）で、即ち１０５〜１０１２Ｍ−１以上、好ましくは１０７〜１０１２Ｍ−１以上、より好ましくは１０８〜１０１２Ｍ−１の解離定数（Ｋａ）で、抗原に結合するであろう。
【００７８】
一般に１０−４Ｍ超の任意のＫｄ値（または１０４Ｍ−１未満の任意のＫａ値）が、一般に非特異的結合を示すと見なされる。
【００７９】
好ましくは該実施形態の該モノクローナル抗体またはフラグメントは、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５ｎＭ未満の親和性でヒトＴＫ１の血清形態および／または組換え形態に結合するであろう。本明細書で提示される予備結合試験から、該実施形態の該モノクローナル抗体が、組換えヒトＴＫ１への結合に関して５ｎＭ未満のＫＤ値、一部ではさらに１ｎＭ未満のＫＤ値に対応する親和性を有することが示される。
【００８０】
抗原または抗原決定基へのモノクローナル抗体の特異的結合は、例えばスキャッチャード分析、ならびに／またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイなどの競合結合アッセイをはじめとするそれ自体が公知の任意の適切な手法、ならびに当該技術分野でそれ自体が公知のそれらの異なる変法で測定され得る。
【００８１】
該実施形態の別の態様は、身体試料中の細胞および／または血清ＴＫ１材料のレベルを測定する方法に関する。該方法は、該身体試料を、該実施形態によるモノクローナル抗体またはフラグメントと接触させることを含む。該方法はまた、結合されたモノクローナル抗体またはフラグメントの量を検出することを含む。
【００８２】
結合されたモノクローナル抗体またはフラグメントの量を検出するための任意の先行技術の技法を、本発明の方法で用いることができる。例えば該検出は、直接的でも間接的でもよく、蛍光または発色シグナルを発生してもよい。直接的検出は、典型的には標識にコンジュゲートされたモノクローナル抗体またはフラグメントの使用を含む。間接的検出は、モノクローナル抗体またはフラグメントの宿主の種に対して生じた標識二次抗体を使用する。
【００８３】
エピトープへの抗体結合の視覚化のために一般に用いられる標識としては、フルオロフォア、および可溶性基質を発色性最終生成物に変換する酵素が挙げられる。
【００８４】
身体試料は、好ましくは細胞試料、組織試料、血液試料、血清試料、脳脊髄液試料、肋膜液試料、滑液試料、および腹腔液試料からなる群から選択される。好ましい実施形態において、該身体試料は、体液試料であり、好ましくは血液試料、血清試料、脳脊髄液試料、肋膜液試料、滑液試料、および腹腔液試料からなる群から選択される。特定の実施形態において、該身体（体液）試料は、血液試料または血清試料である。
【００８５】
したがって、該実施形態のモノクローナル抗体およびフラグメントは、身体試料中の細胞および／または血清ＴＫ１材料のレベル、即ち量を測定するために用いられ得る。該実施形態のモノクローナル抗体およびフラグメントは、潜在的にさらなるタンパク質、補因子または分子に結合されているなど、二量体、四量体、およびオリゴマーなどの様々な形態で細胞または血清ＴＫ１に結合することが可能であり、それによりそれらのレベルの測定が可能であると考えられる。したがってそれにより細胞および／または血清ＴＫ１材料は、様々な形態の細胞および／または血清ＴＫ１を包含する。
【００８６】
特定の実施形態において、該方法は、身体試料中の血清ＴＫ１材料のレベルを測定する方法である。
【００８７】
別の実施形態において、該方法は、身体試料中の細胞ＴＫ１材料のレベルを測定する方法である。
【００８８】
さらなる実施形態において、該方法は、身体試料中の細胞ＴＫ１材料および血清ＴＫ１材料のレベルを測定する方法である。
【００８９】
該実施形態のさらなる態様は、身体試料中の細胞および／または血清ＴＫ１材料のレベルを測定するキットに関する。該キットは、固体担体に固定された、または固体担体に固定されることを意図した、実施形態による第一のモノクローナル抗体を含む。該キットは、該実施形態による第二のモノクローナル抗体も含む。
【００９０】
該キットの第一のモノクローナル抗体は、ヒトＴＫ１のＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と；ヒトＴＫ１のＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のうちの少なくとも１つと；ヒトＴＫ１のコンホメーション依存エピトープと、からなる群から選択される第一のエピトープへの特異性を有する。第二のモノクローナル抗体は、この群から選択される第二の異なるエピトープへの特異性を有する。
【００９１】
したがって該キットの２つのモノクローナル抗体は、両者ともヒトＴＫ１の血清形態に結合することが可能で、好ましくはヒトＴＫ１の細胞形態にも結合することが可能である。しかし、該キットの２つのモノクローナル抗体は、先に提示された群から選択される異なるエピトープへの特異性を有する。
【００９２】
一実施形態において、第一のモノクローナル抗体は、ヒトＴＫ１のＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）およびヒトＴＫ１のコンホメーション依存エピトープのうちの一方から選択される第一のエピトープへの特異性を有し、第二のモノクローナル抗体は、ヒトＴＫ１のＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）およびヒトＴＫ１のコンホメーション依存エピトープのうちの他方から選択される第二のエピトープへの特異性を有する。
【００９３】
別の実施形態において、第一のモノクローナル抗体は、ヒトＴＫ１のＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と、ヒトＴＫ１のＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のうちの少なくとも１つと、の一方から選択される第一のエピトープへの特異性を有し、第二のモノクローナル抗体は、ヒトＴＫ１のＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と、ヒトＴＫ１のＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のうちの少なくとも１つと、の他方から選択される第二のエピトープへの特異性を有する。
【００９４】
さらなる実施形態において、第一のモノクローナル抗体は、ヒトＴＫ１のＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のうちの１つと、ヒトＴＫ１のコンホメーション依存エピトープと、の一方から選択される第一のエピトープへの特異性を有し、第二のモノクローナル抗体は、ヒトＴＫ１のＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のうちの１つと、ヒトＴＫ１のコンホメーション依存エピトープと、の他方から選択される第二のエピトープへの特異性を有する。
【００９５】
第一の特定の実施形態において、第一のモノクローナル抗体はＸＰＡ２１０−Ａｒ１であり、第二のモノクローナル抗体はＸＰＡ２１０−Ａｒ２である。第二の特定の実施形態において、第一のモノクローナル抗体はＸＰＡ２１０−Ａｒ２であり、第二のモノクローナル抗体はＸＰＡ２１０−Ａｒ１である。第三の特定の実施形態において、第一のモノクローナル抗体はＸＰＡ２１０−Ａｒ１であり、第二のモノクローナル抗体はＸＰＡ２１０−Ａｒ３である。第四の特定の実施形態において、第一のモノクローナル抗体はＸＰＡ２１０−Ａｒ３であり、第二のモノクローナル抗体はＸＰＡ２１０−Ａｒ１である。第五の特定の実施形態において、第一のモノクローナル抗体はＸＰＡ２１０−Ａｒ２であり、第二のモノクローナル抗体はＸＰＡ２１０−Ａｒ３である。第六の特定の実施形態において、第一のモノクローナル抗体はＸＰＡ２１０−Ａｒ３であり、第二のモノクローナル抗体はＸＰＡ２１０−Ａｒ２である。
【００９６】
特定の実施形態において、該キットは、サンドイッチアッセイキットである。このことは、該キットが細胞および／または血清ＴＫ１材料の異なるエピトープに結合するモノクローナル抗体を使用し、それにより第一および第二のモノクローナル抗体の両方が、同じ細胞および／または血清ＴＫ１複合体または分子に同時に結合し得ることを意味する。
【００９７】
特定の実施形態において、該キットは、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）キット、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡである。
【００９８】
サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、第一のモノクローナル抗体がいわゆる捕捉抗体として結合された固体担体の表面を調製することにより、身体試料中の細胞および／または血清ＴＫ１材料を検出することができる。好ましい実施形態において、既知量の第一のモノクローナル抗体が、固体担体の表面に結合されている。該表面の任意の非特異的結合部位が、場合により、しかし好ましくは遮断されている。身体試料が、その後、該表面に塗布され、それによりそこに存在する任意の細胞および／または血清ＴＫ１材料が、固定された第一のモノクローナル抗体によって捕捉される。非結合材料は、好ましくは１回または複数回の洗浄ステップにより除去される。その後、第二のモノクローナル抗体が添加されて、第一のモノクローナル抗体により捕捉された任意の細胞および／または血清ＴＫ１材料への結合が可能になる。
【００９９】
結合された第二のモノクローナル抗体の量は、その後、直接的または間接的検出法で測定される。例えば標識または酵素を、第二のモノクローナル抗体に直接的に、またはビオチン−ストレプトアビジンもしくはビオチン−アビジンリンクなどのリンクを介して間接的に付着させることができる。あるいは、酵素に標識または結合されていて、第二のモノクローナル抗体に特異的に結合する二次抗体を使用することが可能である。
【０１００】
こうして一実施形態において、第二のモノクローナル抗体は、共有結合で付着したビオチンを有する。あるいは第二のモノクローナル抗体は、共有結合で付着したストレプトアビジンまたはアビジンを有する。
【０１０１】
該キットは、好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されたストレプトアビジンまたはＨＲＰ標識アビジンも含む。あるいは該キットは、ＨＲＰ標識ビオチンを含む。該キットは、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質または２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）基質などのＨＲＰ基質も含む。そのような場合、身体試料中の細胞および／または血清ＴＫ１材料のレベルは、ＨＲＰによる発色性基質から検出可能な有色生成物への変換を検出する分光光度法により決定され得る。
【０１０２】
一実施形態において、該キットは、第一のモノクローナル抗体が固定された、または固定されることを意図した固体担体として、マイクロタイタープレート（ＭＣＰ）も含む。図３は、一実施形態による第一および第二のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの概念の略図である。
【０１０３】
該キットは、必ずしもＥＬＩＳＡキットである必要はない。別の実施形態において、該キットは、第一のモノクローナル抗体がカラム内のゲルマトリックスまたはビーズなどの固定相に結合したアフィニティークロマトグラフィーを用いる。例えば、該ゲルマトリックスまたはビーズは、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）などのアガロースで作製され得る。
【０１０４】
そのような場合、身体試料に存在する細胞および／または血清ＴＫ１材料は、固定された第一のモノクローナル抗体への結合を通してカラムに封入される。洗浄に続いて、結合された細胞および／または血清ＴＫ１材料は、溶出されて、第二のモノクローナル抗体を利用して検出され得る。例えば溶出された細胞および／または血清ＴＫ１材料の量は、ウェスタンブロットを利用し、そして直接的または間接的検出法を利用したＴＫ１検出のために第二のモノクローナル抗体を用いて測定することができる。
【０１０５】
該固体担体は、代わりにＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）などの磁気ビーズであり得る。
【０１０６】
本発明の実施形態のキットは、身体試料中の細胞および／または血清ＴＫ１材料のレベルを測定するための、先に記載された方法で用いることができる。
【０１０７】
該実施形態のさらなる態様は、対象における腫瘍の再発の可能性を推定する方法に関する。該方法は、該実施形態による方法またはキットを用いて、対象からの身体試料中の血清ＴＫ１材料のレベルを測定することを含む。身体試料中の血清ＴＫ１材料のレベルは、その後、健常対象集団の代表する血清ＴＫ１材料のレベル、または対象において過去に測定された血清ＴＫ１材料のレベルと比較される。
【０１０８】
健常者の集団に関連するレベルよりも高い測定レベルは、対象において腫瘍再発の可能性が高いことを示している。同様に、過去の治療後の対象に関連するレベルよりも高い測定レベルは、対象において腫瘍再発の可能性が高いことを示している。ＴＫ１材料の測定レベルに基づく腫瘍再発の可能性を推定するより多くの情報については、［２４、２５］を参照されたい。
【０１０９】
該実施形態のさらに別の態様は、対象における細胞増殖を測定する方法に関する。該方法は、該実施形態による方法またはキットを用いて、対象からの身体試料中の血清ＴＫ１材料のレベルを測定することを含む。該方法はまた、身体試料中の血清ＴＫ１材料のレベルに基づいて細胞増殖を測定することを含む。
【０１１０】
特定の実施形態において、正常細胞または腫瘍細胞の増殖レベルが測定され、対象が正常もしくはベースライン細胞増殖を有するか、または上昇した細胞増殖を有するかを決定するために、血清ＴＫ１材料の測定レベルと比較される。
【０１１１】
本発明の方法は、対象に適用される様々な治療をモニタリングするツールとして使用することができる。例えば該方法を用いて、対象における抗増殖または抗腫瘍治療をモニタリングすることができる。そのような場合、該方法を用いて、選択された抗増殖または抗腫瘍治療が対象の細胞増殖を低減する上で所望の効果を有するかどうかを検証することができる。該治療が所望の効果を有さない、即ち細胞増殖における有意な減少が検出されない場合には、別の、または改良された抗増殖または抗腫瘍治療が、代わりに対象に適用され得る。
【０１１２】
該実施形態のさらなる態様は、悪性疾患に罹患した対象における増殖工程の応答を測定する方法に関する。該方法は、該実施形態による方法またはキットを用いて、対象からの身体試料中の血清ＴＫ１材料のレベルを測定することを含む。該方法はまた、身体試料中の血清ＴＫ１材料のレベルに基づいて増殖工程の応答を測定することを含む。そのような増殖工程の応答の例は、免疫反応または免疫反応の応答であり得る。一実施形態において、増殖工程の少なくとも１つの他のバイオマーカを、測定に用いることもできる。
【０１１３】
該実施形態のさらに別の態様は、対象の炎症、感染または腫瘍細胞増殖のレベルを測定する方法に関する。該方法は、該実施形態による方法またはキットを用いて、対象からの身体試料中の血清ＴＫ１材料のレベルを測定することを含む。該方法はまた、身体試料中の血清ＴＫ１材料のレベルに基づいて炎症、感染または腫瘍細胞増殖のレベルを測定することを含む。一実施形態において、炎症、感染または腫瘍細胞増殖の少なくとも１つの他のバイオマーカを、測定に用いることもできる。
【０１１４】
乳房腫瘍、肺腫瘍および膀胱腫瘍などの腫瘍細胞の増殖を、特に本発明の方法により測定およびモニタリングしてもよい。
【０１１５】
該実施形態によるモノクローナル抗体を用いる方法およびキットの先に記載された実施形態において、該対象は、好ましくはヒト対象であり、該身体試料は、好ましくは適切な身体試料のこれまでに記載された群から選択される。
【０１１６】
該実施形態のさらなる態様は、アミノ酸ＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）またはＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）からなる単離されたペプチドに関する。そのような単離されたペプチドは、抗体結合のためのエピトープとして非常に適している。該単離されたペプチドは、ヒトＴＫ１の血清形態に、好ましくはヒト組換えＴＫ１およびヒトＴＫ１の細胞形態に結合することが可能なモノクローナル抗ＴＫ１抗体またはフラグメントを調製するために用いられてもよい。
【０１１７】
該実施形態のさらに別の態様は、ヒトＴＫ１の血清形態に結合することが可能なモノクローナル抗体を生成する方法に関する。該方法は、第一のキャリアタンパク質に連結したアミノ酸配列ＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦＡＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有するペプチドを含む第一のペプチドコンジュゲート、または第一のキャリアタンパク質とは異なる第二のキャリアタンパク質に連結したアミノ酸配列ＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦＡＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有する該ペプチドを含む第二のペプチドコンジュゲートで、非ヒト動物を免疫化することを含む。該方法はまた、第一のペプチドコンジュゲートまたは第二のペプチドコンジュゲートに関する血中力価を有する非ヒト動物から脾細胞を単離することを含む。該方法は、脾細胞を黒色腫と融合させることによりハイブリドーマを形成することをさらに含む。該方法は、追加として、第二のペプチドコンジュゲートの力価について、第一のペプチドコンジュゲートでの免疫化から得られたハイブリドーマからの上清をスクリーニングすること、および第一のペプチドコンジュゲートの力価について、第二のペプチドコンジュゲートでの免疫化から得られたハイブリドーマからの上清をスクリーニングすること、を含む。該方法は、第一のペプチドコンジュゲートに、第二のペプチドコンジュゲートに、そしてヒトｒＴＫ１に結合することが可能なモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを選択することをさらに含む。該方法は、追加として、選択されたハイブリドーマの上清からモノクローナル抗体を単離することを含む。
【０１１８】
一実施形態において、ハイブリドーマの選択は、第一のペプチドコンジュゲートに、第二のペプチドコンジュゲートに、ヒトｒＴＫ１に、そして癌に罹患したヒト対象から得られた血清試料に存在するＴＫ１に結合することが可能なモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを選択することを含む。
【０１１９】
一実施形態において、該方法は、癌に罹患したヒト対象から得られた血清試料に存在するＴＫ１に結合することが可能な単離されたモノクローナル抗体を選択することを含む。
【０１２０】
したがって好ましい実施形態において、該方法は、ＴＫ１の血清形態に結合することが可能なモノクローナル抗体を得るための選択を含む。この選択は、ハイブリドーマを選択すること、または単離されたモノクローナル抗体の間で選択すること、のいずれかによって行われ得る。
【０１２１】
実施例
本発明の実施例は、３つの独特なモノクローナル抗ＴＫ１抗体の設計および多段階単離を示す。該モノクローナル抗ＴＫ１抗体は、組換えＴＫ、細胞ＴＫ１および血清ＴＫ１を認識することが可能である。さらに、ＴＫ１アミノ酸配列内のエピトープ結合領域を含む特有のモノクローナル抗ＴＫ１抗体を得るための免疫化、選択および最終的スクリーニング手順を開示する。健常な血液ドナーの試料および異なる型の癌疾患の患者からの試料を用いたこれらのモノクローナル抗ＴＫ１抗体のうちの２つに基づくサンドイッチＥＬＩＳＡの設計および実施も説明する。
【０１２２】
実施例１：ヒトＴＫ１のＣ末端領域に対するマウスモノクローナル抗体の調製
ヒトＴＫ１タンパク質配列［１９］から開始して以下の配列ＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦＡＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含むヒトＴＫ１のＣ末端領域に対するマウスモノクローナル抗体の免疫化および選択を、２つの例で実施した。
【表１】
0006715770.tif 000002
【０１２３】
先に提示された配列は、ヒトＴＫ１のＣ末端（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）と、マウス（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、ラット（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、ニワトリ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）およびイヌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）における対応するヒトＴＫ１配列で免疫化するために用いられた配列との比較を示している。
【０１２４】
最初のアプローチでは、等量のペプチドおよびキャリアタンパク質を用いた標準法によりグルタルアルデヒド（２．３％）で架橋することによりウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に連結されたペプチドで、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化した。マウスを最初、コンジュゲート（フロイント完全アジュバント中）２００μｇで免疫化し、３回の追加免疫（フロイント不完全アジュバント中にそれぞれ１００μｇ）の後、その抗原への血中力価が高いマウスから脾細胞を単離し、マウス黒色腫細胞株ＳＰ２／０と融合させた。得られたハイブリドーマを複数回のサブクローニングに供し、細胞を含むウェルからの上清を、ペプチド抗原（０．０５μｇ／ウェル、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）でコーティングされた９６ウェルプレートを含むＥＬＩＳＡアルカリホスファターゼ検出システム（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州所在）を用いてスクリーニングした。陽性のウェルからの最高力価を有する上清を、さらに合計３〜５回サブクローニングして、上清をテストした。最後に、三十一量体ペプチドおよびヒト組換えＴＫ１への力価が高い７つの候補モノクローナルハイブリドーマクローンを同定した。細胞ストックを確定して、培養物を増殖させ、上清の多量のバッチを調製し、それを凍結乾燥してドットブロットアッセイおよびＥＬＳＩＡアッセイでテストした。この手順から、本明細書でＸＰＡ２１０−Ａｒ１と表されるモノクローナル抗体の単離ができた。
【０１２５】
Ｃ末端ペプチドへのモノクローナル抗体を得るための第二のアプローチでは、３つの異なる抗原を用いた：ｉ）先に記載されたＢＳＡに連結されたＸＰＡ２１０ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｉｉ）類似の架橋法によりキーホールリンペットシアニン（ＫＬＨ）に連結されたＸＰＡ２１０ペプチド、およびｉｉｉ）ヒトｒＴＫ１。ｒＴＫ１の生成および構造特性は、［２０］に記載されている。マウスを最初、フロイント完全アジュバント中のペプチドコンジュゲートまたはｒＴＫ１  １００μｇで免疫化し、３回の追加免疫（フロイント不完全アジュバント中にそれぞれ１００μｇ）の後、その抗原への血中力価が高いマウスから脾細胞を単離し、マウス黒色腫細胞株ＳＰ２／０と融合させた。得られたハイブリドーマ上清を、１μｇ／ウェル  ペプチド抗原と共に本質的に先に記載された通りのシステムを用いてスクリーニングした。ペプチドＢＳＡコンジュゲートでの免疫化から得られたハイブリドーマ上清を、ウェル中のペプチドＫＨＬコンジュゲートでスクリーニングして、逆にペプチドＫＨＬ免疫化についても同様にスクリーニングした。このスクリーニングは、各免疫化で用いられるキャリアタンパク質に対する抗体生成を回避するように設計された。陽性のウェルの力価が最高の上清を、５回サブクリーニングした。ペプチドコンジュゲートおよびヒトｒＴＫ１の両方が陽性のハイブリドーマのみを選択した。組換えＴＫ１免疫化のみの場合、ＴＫ１タンパク質を選択に用いた。各例で、ペプチドコンジュゲートおよびｒＴＫ１への力価が高い１０の候補モノクローナルハイブリドーマクローンを同定した。細胞ストックを確定し、培養物を増殖させて、上清の多量のバッチを調製して凍結乾燥し、以下に記載される複数のアッセイでテストした。
【０１２６】
サンドイッチＥＬＩＳＡ手順に適したモノクローナル抗体対を同定するために、複数の二次スクリーニング法を、以下の実施例に記載された通り利用した。
【０１２７】
実施例２：ドットブロット高感度ケミルミネッセンス（ＥＣＬ）免疫検出
この手順を本質的に［２１］に記載された通り実施した。要約すると、ペプチド３〜５μｌ（３〜３００ｐｇ／スポット）、ヒトｒＴＫ１（０．０２〜０．２ｎｇ／スポット）または血清試料を、ニトロセルロース膜に直接塗布した。膜を１０％脱脂乳を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で４時間ブロックし、上清または他の一次抗ＴＫ１抗体を添加した後、室温（ＲＴ、２３〜２５℃）で一晩インキュベートした。ビオチン化二次抗マウスＩｇＧ抗体と共にＲＴで１時間インキュベートした後、膜をアビジン−ＨＲＰ−ストレプトアビジンを含むＴＢＳ緩衝液中でインキュベートし、その後、ＥＣＬ基質（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加した。膜上の単一スポットのケミルミネッセンス強度を、２〜４分間暴露されたフィルム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で検出した。複数の血清試料もまた、健常対照および異なる腫瘍疾患の患者の両方からの膜に塗布した。
【０１２８】
ペプチド抗原、ｒＴＫ１、既知の高血清ＴＫ１レベルの腫瘍患者の血清、および最小限に健常者からの血清と明白に反応したハイブリドーマのみを、更なるＥＬＩＳＡ開発のための高ランク候補物質とした。これらの結果の例を、抗体ＸＰＡ２１０−Ａｒ２およびＸＰＡ２１０−Ａｒ３について図１に示している。
【０１２９】
実施例３：免疫親和性磁気ビーズアッセイ
該アッセイを、二段階で実施した。最初に、ドットブロットアッセイの結果（実施例２）に基づいて選択された抗ＸＰＡ２１０抗体を、ヒトｒＴＫ１、または血清ＴＫ１レベルの高い血液癌に罹患した患者の血清試料と反応させた。第二段階で、抗原抗体複合体に結合する磁気ビーズ含有抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、次にその混合物が磁場に供し、反応溶液から取り出すことができた。非結合ＴＫ１タンパク質を、酵素活性測定により検出した。
【０１３０】
異なる濃度（１０ｎｇ、５ｎｇ）のヒトｒＴＫ１および血液癌患者の血清３０μｌを、ＴＢＳ  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）＋２％ＢＳＡ  ２７０μｌで希釈して、精製モノクローナル抗ＴＫ１抗体（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．１％ＢＳＡ＋２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４に溶解）４μｇまたは選択されたハイブリドーマからの各上清５０μｌと混和した。その後、これらの試料を４℃で２時間、穏やかに撹拌し、続いて洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中の予備洗浄されたヒツジ抗マウス磁気（Ｄｙｎａ）ビーズ７０μｌを添加し、さらに１時間インキュベートした。その後、試料の試験管を磁気上に２分間置き、非結合材料２０μｌを除去して、ＴＫ１活性を測定した。ＴＫ１活性は、［２２］に記載された改変３Ｈ−Ｔｈｄアッセイで測定した。非結合画分の活性を、任意のハイブリドーマ上清と反応しない、ビーズで処理された対照試料と比較した。９つの選択されたハイブリドーマからの上清の結果を、表１に示す。
【０１３１】
選択された抗体のほとんどが、ヒトｒＴＫ１と反応し、予測通りＴＫ１活性の大部分に結合したが、患者試料の血清ＴＫ１との相互作用の場合、ＴＫ１活性の多くが非結合のままであった（９７〜３１％）。後者の結果に基づいて、５つの候補ハイブリドーマを選択し、増殖させて、より多量のＩｇＧを単離および精製した。これらの候補抗体を、その後、以下の実施例に記載されたアッセイでテストした。
【表２】
0006715770.tif 000003
【０１３２】
実施例４：モノクローナル抗ＴＫ１抗体候補を用いたエピトープマッピング分析
選択されたモノクローナル抗体が結合するアミノ酸領域を決定するために、ビオチン化された１０のアミノ酸標的ペプチドを用いたＰｅｐｓｃａｎ分析を実施した。その手順は、実施例１に関連して示されたＴＫ１配列の１９３〜２２６の領域を表す１４の十量体アミノ酸ペプチドの組み合わせの合成に基づいている。各ペプチドは、８つのアミノ酸オーバーラップおよび２つのアミノ酸ギャップを有し、それにより１４の異なるペプチドの組み合わせが得られる（表２参照）。全長ペプチド全体も含まれており、これらのペプチド全てを、ストレプトアビジンをコーティングしたマイクロタイタープレートに固定した。１時間の吸着ステップの後、プレートをＰＢＳ、１％ＢＳＡおよび０．１％  Ｔｗｅｎ２０で洗浄した。その後、異なる抗体をおよそ５μｇ／ｍｌで添加し、プレートを１時間インキュベートした後、３回洗浄した。その後、ＨＲＰコンジュゲートを添加して、１時間インキュベートした。その後、プレートを同じ緩衝液で６回洗浄した。最後に、１００μｌ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を用いて吸光度を測定した（一連の抗体での１回のテスト結果を表２に示す）。
【表３】
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【０１３３】
表２の結果は、様々な抗体の結合に必要な最小アミノ酸配列の同定を可能にする。三十一量体ペプチド（ＸＰＡ２１０）が抗原として用いられる場合には、先の手順により選択されたハイブリドーマを生成する抗体には３つの主な型が存在することが明らかと思われる。
【０１３４】
ＸＰＡ２１０−Ａｒ１、Ｓｕｐ−５８４およびＳｕｐ−５８３により例示された１つの型は、領域：ＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）に結合し、したがってこれらのアミノ酸は、該抗原ドメイン内に含まれる。
【０１３５】
Ｓｕｐ−１６５（ＸＰＡ２１０−Ａｒ３）およびＳｕｐ−１６８により例示される別のドメインは、おそらく抗原ドメインとしてアミノ酸ＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を含むペプチド７（ＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４））およびペプチド８（ＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５））に結合する。これらの抗体は、三十一量体ＸＰＡ２１０との反応性が最初の型よりも低いため、１０アミノ酸ペプチドをより好むようである。
【０１３６】
最後に、１４の十量体ペプチドのいずれかへの任意の異なる結合を示さなかったＳｕｐ−５５３、Ｓｕｐ−１１１９およびＳｕｐ−１６２（ＸＰＡ２１０−Ａｒ２）により例示された群がある。この結果から、それらの結合がコンホメーション依存性であり、一次配列内に隣接せず抗原ドメインの特定の３Ｄコンホメーションにより形成された複数の領域からなることが強く示唆される。
【０１３７】
さらに、この群および他の２つの群の抗体は、全て全長三十一量体ペプチド（ＸＰＡ２１０）およびヒトｒＴＫ１と反応した。
【０１３８】
したがって、このデータから、モノクローナル抗体ＸＰＡ２１０−Ａｒ１が三十一量体（ＸＰＡ２１０）のＣ末端部分のドメインを認識することが強く示される。二次配列の予測から、この領域がαへリックスを形成することが示唆される。不幸にも、ＴＫ１四量体のこの領域の直接的な構造データが存在せず、細菌ウレアプラズマ・ウレアリチカム／パルバムＴＫ１構造［２０］とヒトｒＴＫ１の間の配列および構造相同性に基づくモデルから、図２に示されたＣ末端構造が示唆される。ＸＰＡ２１０領域全体は、おそらくターン領域（図２でＢと標識）であり、Ｃ末端にαへリックスを有する（図２でＣと標識）。エピトープマッピング結果の可能な解釈によれば、ＸＰＡ２１０−Ａｒ１様のエピトープがＣ末端αへリックスに関係し、ＸＰＡ２１０−Ａｒ３エピトープがＴＫ１の細胞周期分解のためのユビキチン化シグナル配列として働くＫＥＮ配列に非常に接近した屈曲ドメインに関係する、ということになる［１５］。最後に、ＸＰＡ２１０−Ａｒ２エピトープは、コンホメーション依存性であり、三十一量体領域の３Ｄ構造全体の異なる領域により形成され得る。したがって、異なる結合特性を有するモノクローナル抗体が、適切なサンドイッチ免疫アッセイ対を形成する可能性がある。
【０１３９】
実施例５：サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ
試料と相互作用する「キャッチャー」として働く、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）のウェルに結合させた第一のモノクローナル抗ＴＫ１抗体を含むサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの概要を、図３に示す。第二のモノクローナル抗ＴＫ１抗体を、第二のステップで添加して、試料中に存在してウェルに固定された第一のモノクローナル抗ＴＫ１抗体に結合させたＴＫ１に、第二のモノクローナル抗ＴＫ１抗体を結合させる。第二のモノクローナル抗ＴＫ１抗体を、ビオチン化により修飾するが、それは、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンに関してレポータ複合体と非常に効率的に相互作用して、容易に測定可能な発色反応を生じ得ることを意味している。サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの標準手順の概要を以下に表す：
１．バイアル中の等容量（７０μｌ）の試料および試料希釈緩衝液をピペットで注入して、ボルテックス処理する；
２．２３〜２５℃で３０分間インキュベートする；
３．試料と試料希釈緩衝液との混合物１００μｌ／ウェルを添加する；
４．２５℃、６５０ｒｐｍで振とうしながら２時間インキュベートする；
５．ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）３５０μｌで４回洗浄する；
６．試薬緩衝液中のビオチン標識された抗ＴＫ１抗体１００μｌ／ウェルを添加する；
７．２５℃、６５０ｒｐｍで振とうしながら１時間インキュベートする；
８．ＰＢＳＴ  ３５０μｌで４回洗浄する；
９．ストレプトアビジン  ポリ−ＨＲＰ  １００μｌ／ウェルを添加する；
１０．２５℃、６５０ｒｐｍで振とうしながら３０分間インキュベートする；
１１．ＰＢＳＴ  ３５０μｌで４回洗浄する；
１２．ＴＭＢ基質  １００μｌ／ウェルを添加する；
１３．１５分間インキュベートする；
１４．停止溶液  １００μｌ／ウェルを添加する；
１５．４５０ｎｍで吸光度を読み取る。
【０１４０】
最初のテストのセットアップで、モノクローナル抗体ＸＰＡ２１０−Ａｒ１を「キャッチャー」として選択し、ポリクローナル抗ＸＰＡ２１０抗体をディテクターとしてニワトリの体内で生成させた［１３、２３］。このセットアップを用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡが図３に示された通り設計され得ることを検証した。その後、ポリクローナル抗ＸＰＡ２１０抗体を、本明細書に開示された通り選択された第二のモノクローナル抗ＴＫ１抗体で置き換えた。
【０１４１】
第二のモノクローナル抗体を選択するための第一のアッセイにおいて、実施例４で得られた精製された新しい候補抗体を、キャッチャーとしてＭＴＰウェルに吸着させて、ＸＰＡ２１０−Ａｒ１抗体を、ディテクターとして用いた。その結果から、癌患者の血清で陽性結果を与えた候補抗体の上清はＳｕｐ−１６２（ＸＰＡ２１０−Ａｒ２）およびＳｕｐ−１６５（ＸＰＡ２１０−Ａｒ３）の２つのみであったが、候補抗体の５つ全てが、三十一量体ペプチド（ＸＰＡ２１０）コンジュゲートおよびヒトｒＴＫ１と反応したことが示された。最高の反応性は、ＸＰＡ２１０−Ａｒ２で観察され、この抗体の多量の調製物を生成してビオチン化し、ディテクター抗体として用いた。ＸＰＡ２１０−Ａｒ１は、ＸＰＡ２１０  ＥＬＩＳＡでのキャッチャー抗体として用いた（図３）。このアッセイおよび様々な臨床試料での最終結果を、図６に示す。
【０１４２】
実施例６：サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの感受性および特異性
ここでは、ＸＰＡ２１０−Ａｒ１およびＸＰＡ−Ａｒ２モノクローナル抗体を用いて実施例５に記載された通り実施されたプロトタイプのＥＬＩＳＡで得られた結果を示す。テストされた試料は、異なる疾患ステージの前立腺がん患者からの血清２８種であった（Ｂｉｏｔｈｅｍｅ  Ｉｎｃから購入）。参照法として、ＴＫ  ＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）活性アッセイを用い、結果を図４に示す。図５にはＥＬＩＳＡアッセイの結果を示し、この場合、直接の吸光度値を表す。
【０１４３】
ＴＫ  ＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイを用いた健常な血液ドナー１０名からの血清中のＴＫ１活性およびタンパク質レベルを測定することにより、２つのアッセイのカットオフ値を推定した。９０％特異性でのＴＫ  ＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）アッセイの感受性は、０．２９と計算された。このことは、１０のうち１の偽陽性を許容するカットオフ（血液ドナーの値に基づく）では、ＴＫ  ＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）アッセイが真陽性の２９％を同定し得るということを意味する（癌患者の血清値に基づく）。ＥＬＩＳＡアッセイの場合、感受性は０．７５であった。したがって、酵素活性を測定するＴＫ１活性アッセイと比較して、ＥＬＩＳＡアッセイには固形腫瘍疾患患者を同定する有意に高い能力がある。
【０１４４】
前立腺癌患者からの血清２８種と乳癌患者の血清２８種とを合わせた群を並行してテストした場合、２つのアッセイで得られた値の間には有意な相関（ｒ＝０．８５）があった。固形腫瘍患者の血中に不活性の血清ＴＫ１が高割合で存在するというのが［１７、１８］、おそらく先に記載された結果への１つの説明であろう。
【０１４５】
実施例７：モノクローナル抗ＴＫ１抗体のＣＤＲ領域の配列決定
総ＲＮＡを凍結ハイブリドーマ細胞から抽出し、ｃＤＮＡをＲＮＡから合成した。その後、ＲＴ−ＰＣＲを実施して、抗体の可変領域（重鎖および軽鎖）を増幅させて、その後、別々に標準クローニングベクターにクローニングして配列決定した。
【０１４６】
ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１５５９６−０２６）の技術マニュアルに従って、総ＲＮＡをハイブリドーマ細胞から単離した。総ＲＮＡをアガロースゲル電気泳動により分析した。より詳細には、試料の単離された総ＲＮＡを、１．５％アガロース／ＧｅｌＲｅｄ（商標）ゲルでＤＮＡマーカであるＭａｒｋｅｒ  ＩＩＩ（ＴＩＡＮＧＥＮ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＤ１０３）と並べて泳動させた。図６Ａは、ＤＮＡマーカＭａｒｋｅｒ  ＩＩＩの電気泳動アガロースゲルを示しているが、図６Ｂ〜６Ｄは、ＤＮＡマーカＭａｒｋｅｒ  ＩＩＩ（レーンＭ）と、ＸＰＡ２１０−Ａｒ１（図６Ｂ）、ＸＰＡ２１０−Ａｒ２（図６Ｃ）およびＸＰＡ２１０−Ａｒ３（図６Ｄ）が生成したハイブリドーマ細胞の総ＲＮＡを含む対応する電気泳動アガロースゲルを示している。
【０１４７】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１８０８０−０５１）の技術マニュアルに従って、アイソタイプ特異性抗センスプライマーまたはユニバーサルプライマーを用いて総ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＶＨおよびＶＬの抗体フラグメントを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＲＡＣＥの標準操作手順に従って増幅させた。
【０１４８】
より詳細には、各試料のＰＣＲ産物４μｌを、図７Ａ〜７Ｃに示された１．５％アガロース／ＧｅｌＲｅｄ（商標）ゲルで、ＤＮＡマーカＭａｒｋｅｒ  ＩＩＩと並べて泳動させた。ＰＣＲ産物を精製して、更なる使用まで−２０℃で貯蔵した。図７Ａ〜７ＣのレーンＭはＤＮＡマーカＭａｒｋｅｒ  ＩＩＩを示し、レーン１および２は、それぞれＸＰＡ２１０−Ａｒ１（図７Ａ）、ＸＰＡ２１０−Ａｒ２（図７Ｂ）およびＸＰＡ２１０−Ａｒ３（図７Ｃ）のＶＨおよびＶＬフラグメントに対応している。
【０１４９】
標準的分子クローニング手順を利用して、増幅された抗体フラグメントを別々に標準クローニングベクターにクローニングした。
【０１５０】
コロニーＰＣＲスクリーニングを実施して、正しいサイズの挿入物を有するクローンを同定した。正しいサイズの挿入物を有する単一コロニー５つ以上を、各抗体フラグメントについて配列決定した。より詳細には、正しいＶＨおよびＶＬ挿入サイズを有する５つの単一コロニーを、配列決定のために送付した。５つの異なるクローンのＶＨおよびＶＬ遺伝子は、ほぼ同一であることが見出された。以下に列挙されるコンセンサス配列は、各ハイブリドーマ細胞により生成された抗体の配列であると思われる。
【表４】
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【０１５１】
実施例８：モノクローナル抗ＴＫ１抗体のアイソタイプ同定
ハイブリドーマ細胞株ＸＰＡ２１０−Ａｒ１からのモノクローナル抗ＴＫ１抗体を、アイソタイピングアッセイに用い、それをＳＢＡ  Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．５３００−０５）の技術マニュアルに従って実施した。モノクローナル抗体ＸＰＡ２１０−Ａｒ１のアイソタイプは、ＩｇＧ１重鎖およびＫ軽鎖であると決定された。以下の表３を参照されたい。
【表５】
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【０１５２】
先に表された実施例には、臨床上関係する十分な特異性および感受性のある日常的インビトロ診断アッセイを確立するために用いられ得るモノクローナル抗ＴＫ１抗体の対の生成および選択が開示されている。そのような抗体対ＸＰＡ２１０−Ａｒ１およびＸＰＡ２１０−Ａｒ２の免疫化、選択および特徴づけを記載し、健常な血液ドナー、ならびに乳癌および前立腺がんの患者からの試料によるプロトタイプのサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを実施して、利用可能なＴＫ  Ｌｉａｉｓｏｎアッセイよりも高感度の期待のできる結果を生じた。
【０１５３】
最初の選択方法は、酵素の細胞周期調節に関与するＣ末端ドメインを表すＴＫ１の選択された領域を有するペプチドコンジュゲートに基づいた。
【０１５４】
３つのモノクローナル抗体が選択されたが、それらの独特の特性は、それらがヒトＴＫ１の血清形態に効率的に結合することである。これが独特であるのは、他の複数の抗体が抗原ペプチドおよびヒトｒＴＫ１に結合し得るが、これらの３つの抗体のみがヒト血清を利用したサンドイッチ免疫アッセイ形式で機能し得るためである。
【０１５５】
抗体の２つ(ＸＰＡ２１０−Ａｒ１およびＸＰＡ２１０−Ａｒ３)をペプチド−ＢＳＡコンジュゲートで得て、１つ(ＸＰＡ２１０−Ａｒ２)はペプチドＫＬＨコンジュゲートで生成させた。４つのクローンが最初に選択されたのにも関わらず、この能力を示すヒトｒＴＫ１での免疫化により得られることが見出された所望の特徴を有する抗体は、存在しなかった。この結果は、現在、市販のモノクローナル抗ＴＫ１抗体が複数あり、それでもこれらの抗体に基づく臨床使用に開発されたアッセイがない、という事実によるものである。
【０１５６】
市販のモノクローナル抗体の４つ（Ａｂｃａｍの３Ｂ３．Ｅ１１；  Ｍ０２、Ａｂｎｏｖａ のｃｌｏｎｅ  Ｆ１２；  ＡｂｎｏｖａのウサギＭａｂ  ＥＰＲ３１９４およびＥＰＲ３１９３）を、本明細書に記載されたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ形式でテストしたが、それらのいずれも、血清ＴＫ１と十分に反応することができなかった。それゆえ、ｒＴＫ１に基づく適切なモノクローナル抗体の生成は、非効率的のようであり、血液中で見出されたＴＫ１タンパク質の複雑なオリゴマー構造に関係する可能性がある。
【０１５７】
本明細書に記載されたモノクローナル抗ＴＫ１抗体の独特の性質は、おそらく一部として、それらのエピトープ結合特性が異なっていて、効率的免疫検出については相補的になるためであろう。
【０１５８】
開示されたプロトタイプのＥＬＩＳＡアッセイでは、ＸＰＡ２１０−Ａｒ１およびＸＰＡ２１０−Ａｒ２を用いた。あるいはこれらの抗体の１つを、ＸＰＡ２１０−Ａｒ３と交換することができた。さらに、免疫アッセイの改善されたアッセイのため、または特殊な適用のためには、おそらくＸＰＡ２１０−Ａｒ３の利用可能性が、非常に有益であろう。これらのモノクローナル抗ＴＫ１抗体の存在は、機能的ＥＬＩＳＡアッセイの一必要条件である。
【０１５９】
実施例９：組換えＴＫ１と、ＸＰＡ２１０−Ａｒ１およびＸＰＡ２１０−Ａｒ２との相互作用の結合試験
組換えＴＫ１と、サンドイッチＥＬＩＳＡ手順で用いられた２つのモノクローナル抗体との相互作用の結合特性を測定するために、予備結合試験を、表面共鳴センサー技術で、より具体的にはＡｔｔａｎａ２００デュアルチャネルコンティニュアスフローシステムにより実施した。この方法は、水晶振動子マイクロバランス法に基づいており、抗体−抗原相互作用の結合特性に関係する生物学的関連性の高い情報を提供する。
【０１６０】
図８Ａおよび８Ｂに示された実験において、ＬＮＢカルボキシルセンサーチップを用い、それをアミンカップリング手順でＭｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｃａｐｔｕｒｅキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と予備反応させた。リガンドはＸＰＡ２１０−Ａｒ１およびＸＰＡ２１０−Ａｒ２であり、それらを、１０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ４．５中の５０μｇ／ｍｌ抗体溶液の２回の注射により抗マウス抗体を有する表面に捕捉させた。捕捉抗体を含まない同一処理されたチップを、陰性対照として用いた。１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｐｈ７．４で２０μｇ／ｍｌに希釈された純粋な組換えＴＫ１を、２５μｌ／分で表面に注射した。結合時間は８４秒であり、解離をさらに３００秒間測定した。組換えＴＫ１を含まない緩衝液をブランクとして注射し、試料注射シグナルから差し引いた。
【０１６１】
反応速度の測定を、２０μｇ／ｍｌから１．２５μｇ／ｍｌの５種の組換えＴＫ１濃度での一連の注射により実施し、ＸＰＡ２１０−Ａｒ１およびＸＰＡ２１０−Ａｒ２の結果をそれぞれ図８Ａおよび８Ｂに示す。図８Ａおよび８Ｂに示された二重参照データのフィッティングされた曲線から反応速度定数を計算するために、１：１結合モデルを用いた。予備結合試験により示された結果から、組換えＴＫ１とＸＰＡ２１０−Ａｒ１（ＫＤ＝０．６５）およびＸＰＡ２１０−Ａｒ２（ＫＤ＝４．１２ｎＭ）とのナノモル（ｎＭ）親和性が実証された。さらにその結果から、ＸＰＡ２１０−Ａｒ１と組換えＴＫ１の間に、ＸＰＡ２１０−Ａｒ２と組換えＴＫ１の間の相互作用に比較して有意に強い相互作用があると考えられることが示される。
【０１６２】
先に記載された実施形態は、本発明の数例の例示的実施例として理解されなければならない。本発明の範囲を逸脱することなく、様々な改良、組み合わせおよび変更が施され得ることは、当業者に理解されよう。特に、異なる実施形態にある異なる部分的解決法を、技術的に可能な限り、他の形態で組み合わせることができる。
【０１６３】
参考資料
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［５］  Ｈｅ，  Ｑ．，  Ｚｏｕ，  Ｌ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｐ．Ａ．，  Ｌｉｕ，  Ｊ．Ｘ．，  Ｓｋｏｇ，  Ｓ．，  Ｆｏｒｎａｎｄｅｒ，  Ｔ．，  ２０００．  Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉ−ＴＫ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ  １５，  １３９−１４６．
［６］  Ｈａｌｌｅｋ，  Ｍ．，  Ｌａｎｇｅｎｍａｙｅｒ，  Ｉ．，  Ｎｅｒｌ，  Ｃ．，  Ｋｎａｕｆ，  Ｗ．，  Ｄｉｅｔｚｆｅｌｂｉｎｇｅｒ，  Ｈ．，  Ａｄｏｒｆ，  Ｄ．，  Ｏｓｔｗａｌｄ，  Ｍ．，  Ｂｕｓｃｈ，  Ｒ．，  Ｋｕｈｎ−Ｈａｌｌｅｋ，  Ｉ．，  Ｔｈｉｅｌ，  Ｅ．，  Ｅｍｍｅｒｉｃｈ，  Ｂ．，  １９９９．  Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ａ  ｓｕｂｇｒｏｕｐ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ，  ｎｏｎｓｍｏｌｄｅｒｉｎｇ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｂｌｏｏｄ  ９３，  １７３２−１７３７．
［７］  Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，  Ｋ．Ｌ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｆ．，  Ｌｉ，  Ｈ．，  Ｆｕｊａ，  Ｄ．Ｇ．，  Ｍｕｒｒａｙ，  Ｂ．Ｋ．，  ２００７．  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  −  Ａ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｉｎ  ＡＬＬ  ａｎｄ  ＡＭＬ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２１，  ５６０−５６３．
［８］  ｖｏｎ  Ｅｕｌｅｒ，  Ｈ．，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｓ．，  ２０１１．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ  ｔｈｙｍｉｄｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｃａｎｉｎｅ  ｔｕｍｏｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｇｙ  ９，  １−１５．
［９］  Ｏｈｒｖｉｋ，  Ａ．，  Ｌｉｎｄｈ，  Ｍ．，  Ｅｉｎａｒｓｓｏｎ，  Ｒ．，  Ｇｒａｓｓｉ，  Ｊ．，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｓ．，  ２００４．  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｎｏｎｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５０，  １５９７−１６０６．
［１０］  Ｈｅ，  Ｑ．，  Ｆｏｒｎａｎｄｅｒ，  Ｔ．，  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｈ．，  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｕ．，  Ｈｕ，  Ｇ．Ｚ．，  Ｒｕｔｑｖｉｓｔ，  Ｌ．Ｅ．，  Ｓｋｏｇ，  Ｓ．，  ２００６．  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｏｒ  ｌｏｃｏ−ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６，  ４７５３−４７５９．
［１１］  Ｈｅ，  Ｑ．Ｍ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｐ．Ｇ．，  Ｚｏｕ，  Ｌ．，  Ｌｉ，  Ｈ．Ｘ．，  Ｗａｎｇ，  Ｘ．Ｑ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｓ．，  Ｆｏｒｎａｎｄｅｒ，  Ｔ．，  Ｓｋｏｇ，  Ｓ．，  ２００５．  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  （Ｓ−ＴＫ１）  ｉｓ  ａ  ｍｏｒｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｔｈａｎ  ｉｔｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １４，  １０１３−１０１９．
［１２］  Ｈｅ，  Ｅ．，  Ｘｕ，  Ｘ．Ｈ．，  Ｇｕａｎ，  Ｈ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｙ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｚ．Ｈ．，  Ｐａｎ，  Ｚ．Ｌ．，  Ｔａｎｇ，  Ｌ．Ｌ．，  Ｈｕ，  Ｇ．Ｚ．，  Ｌｉ，  Ｙ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｍ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｊ．，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｓ．，  Ｆｏｒｎａｎｄｅｒ，  Ｔ．，  Ｓｋｏｇ，  Ｓ．，  ２０１０．  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ，  ｌｕｎｇ，  ａｎｄ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  ２９，  ３５２−３５８．
［１３］  Ｗｕ，  Ｃ．，  Ｙａｎｇ，  Ｒ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｊ．，  Ｂａｏ，  Ｓ．，  Ｚｏｕ，  Ｌ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｐ．，  Ｍａｏ，  Ｙ．，  Ｗｕ，  Ｊ．，  Ｈｅ，  Ｑ．，  ２００３．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ＩｇＹ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒａｉｓｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７７，  １５７−１６９．
［１４］  Ｓｈｅｒｌｅｙ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｋｅｌｌｙ，  Ｔ．Ｊ．，  １９８８．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６３，  ８３５０−８３５８．
［１５］  Ｋｅ，  Ｐ．Ｙ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｃ．−Ｆ．，  ２００４．  Ｍｉｔｏｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｎａｐｈａｓｅ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ／ｃｙｃｌｏｓｏｍｅ−ＣＤＨ１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４，  ５１４−５２６.
［１６］  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｓ．，  Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，  Ｂ．，  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｋ．，  Ｅｋｌｕｎｄ，  Ｈ．，  ２００２．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅｓ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５９，  １３２７−１３４６．
［１７］  Ｓｈａｒｉｆ，  Ｈ．，  Ｋｉｒａｎ  Ｋｕｍａｒ，  Ｊ．，  Ｗａｎｇ，  Ｌ．，  Ｈｅ，  Ｅ．，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｓ．，  ２０１２．  Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，  ｃｅｌｌｕｌａｒ，  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  １  ｆｒｏｍ  ｄｏｇｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３，  １２．
［１８］  Ｋｉｒａｎ  Ｋｕｍａｒ  Ｊ，  Ｓｈａｒｉｆ，  Ｈ．，  Ｗｅｓｔｂｅｒｇ，  Ｓ．，  ｖｏｎ  Ｅｕｌｅｒ，  Ｈ．，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ，  Ｓ．，  ２０１３．  Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｓｅｒａ  ｆｒｏｍ  ｄｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．  Ｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９７，  ８５４−８６０．
［１９］  Ｆｌｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｆ．，  Ｂｒａｄｓｈａｗ  Ｊｒ．，  Ｈ．Ｄ．，  Ｔｒａｉｎａ−Ｄｏｒｇｅ，  Ｖ．，  Ｓｌａｇｅｌ，  Ｖ．，  Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ，  Ｐ．Ｌ．，  １９８７．  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ．  Ｇｅｎｅ  ５２，  ２６７−２７７．
［２０］  Ｗｅｌｉｎ  Ｍ，  Ｋｏｓｉｎｓｋａ  Ｕ，  Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ  ＮＥ，  Ｃａｒｎｒｏｔ  Ｃ，  Ｚｈｕ  Ｃ，  Ｗａｎｇ  Ｌ，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  Ｓ，  Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｂ，  Ｅｋｌｕｎｄ  Ｈ，  ２００４．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｙｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｏｒｉｇｉｎ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，  １０１，  １７９７０−１７９７５．
［２１］  Ｗｕ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｍａｏ，  Ｙ．Ｒ．，  Ｈｕ，  Ｌ．Ｘ．，  Ｗａｎｇ，  Ｎ．，  Ｗｕ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｈｅ，  Ｑ．，  Ｓｋｏｇ，  Ｓ．，  ２０００．  Ａ  ｎｅｗ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｍａｒｋｅｒ：  Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０，  ４８１５−４８２０．
［２２］  Ｓｈａｒｉｆ，  Ｈ．，  ｖｏｎ  Ｅｕｌｅｒ，  Ｈ．，  Ｗｅｓｔｂｅｒｇ，  Ｓ．，  Ｈｅ，  Ｅ．，  Ｗａｎｇ，  Ｌ．，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ，  Ｓ．，  ２０１２，．  Ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  （ＴＫ１）  ｔｏ  ｍｏｎｉｔｏｒ  ｃａｎｉｎｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．  Ｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９４，  ４０−４７．
［２３］  Ｇａｓｐａｒｒｉ，  Ｆ．，  Ｗａｎｇ，  Ｎ．，  Ｓｋｏｇ，  Ｓ．，  Ｇａｌｖａｎｉ，  Ａ．，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｓ．，  ２００９．Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ａｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｇ１  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ａｓｓａｙｓ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８８，  ７７９−７８５．  
［２４］  ＷＯ２００４／１００７６０号
［２５］  ＷＯ２００８／１４２６６４号
［２６］  Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｂ．，  ２００９．  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｔｅｔｒａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＴＫ１  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒｍ  ｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ｉｎ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｒｉｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ，  ｏｒ  ｈｉｇｈ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ．  ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２７６，  ５７１−５８０
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
0006715770.tif 000021
【図８Ｂ】
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【配列表】
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