(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５’−）テトラホスフェートおよび鉄イオンを含有する水溶液または親水性溶媒溶液から、鉄イオンを除去し、Ｐ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５’−）テトラホスフェートを精製する方法であって、
（１）キレート樹脂を用いたカラム精製工程、および
（２）キレート樹脂カラム精製後の溶液ｐＨを５．５以下に調整した後、Ｐ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５’−）テトラホスフェートを結晶化させる工程、又は
キレート樹脂カラム精製後の溶液を、塩化亜鉛賦活活性炭によって処理する工程
を含む、Ｐ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５’−）テトラホスフェートの精製方法。
【請求項２】
鉄イオンが３価の鉄イオンである、請求項１記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｐ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５’−）テトラホスフェートおよび鉄イオンを含有する水溶液または親水性溶媒溶液から、鉄イオンを除去し、当該鉄イオン濃度を低減させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
下記式［Ｉ］で表されるＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５’−）テトラホスフェート（以下「ＵＰ4Ｕ」と表記する）またはその塩は、ドライアイに伴う角結膜上皮障害の治療薬として用いられている。また、痰排出誘導作用を有し、去痰剤または肺炎治療薬としての開発が期待されている化合物である。【０００３】
【化１】
0006774663.tif 000002
【０００４】
従来ＵＰ4Ｕの合成法として、下記の方法が知られている。
（１）ウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）の脱水縮合反応により調製されるウリジン５’−環状トリリン酸と、ウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）とを反応させる方法（非特許文献１）、およびその改良法（特許文献１）。
（２）ピロリン酸をイミダゾールによって活性化してピロリン酸ジイミダゾリドを合成し、これをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの有機溶媒を用いた無水環境下でＵＭＰと縮合させる方法（特許文献２、非特許文献２）。
（３）下記式［ＩＩ］または［ＩＩＩ］で示されるリン酸活性化合物と、ＵＭＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰおよびピロリン酸から成る群より選択されるリン酸化合物またはその塩（ＵＴＰフリーを除く）とを、鉄（ＩＩ）イオンまたは鉄（ＩＩＩ）イオン等の金属イオンの存在下、水または親水性溶媒中で反応させることを特徴とする方法（特許文献３）。
（式［ＩＩ］中、Ｒ1は５’位で結合したウリジル基を、Ｘは複素環式基を、ｎは１または２の整数を示す。）
（式［ＩＩＩ］中、Ｘはイミダゾリル基、ベンズイミダゾリル基および１，２，４−トリアゾリル基から成る群より選択される１つの複素環式基を示す。）【０００５】
【化２】
0006774663.tif 000003
【０００６】
【化３】
0006774663.tif 000004
【０００７】
中でも（３）の方法を用いると、工業的な大量製造に適さないＵＴＰフリーの利用およびＵＴＰ塩の脱水操作を回避しつつ、しかも収率よくＵＰ4Ｕを合成できる。また、この方法は、副生成物をほとんど生成せず、親水性条件下で反応を行うことにより煩雑な脱水工程を省略できることなどから、ＵＰ4Ｕの工業的な大量合成にきわめて好適である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００８／０１２９４９
【特許文献２】ＷＯ２００８／０２４１６９
【特許文献３】ＷＯ２０１４／１０３７０４
【特許文献４】ＷＯ２０００／０２０４３０
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｉｏｏｒｇ．＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１１，１５７−１６０（２００１）
【非特許文献２】Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，Ｎｏ．９，７３０−７３８（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＵＰ4Ｕは医薬品原料として用いられる化合物であり、きわめて高度な不純物管理が求められる。したがって金属イオン濃度についても、十分な低値におさえることが必須である。一方、たとえば上記（３）の製造方法では、反応溶液中に触媒として鉄（ＩＩ）イオンまたは鉄（ＩＩＩ）イオン等の金属イオンを添加することから、反応終了後のＵＰ4Ｕ溶液には金属イオンが含有されている。このような場合、精製工程において金属イオンを除去する必要がある。【００１１】
ＵＰ4Ｕの精製法として従来、粗ＵＰ4Ｕ又はその塩を、陰イオン交換クロマトグラフィーと活性炭クロマトグラフィーとを用いて精製し、精製されたＵＰ4Ｕ又はその塩溶液を、所望によりｐＨ６〜９に調整後、６０℃以下の温度条件で親水性有機溶媒を加えて結晶を析出させることを特徴とするＵＰ4Ｕ又はその塩の結晶の製造法が知られている（特許文献４）。しかし、鉄イオンを含むＵＰ4Ｕ溶液中からの金属の除去効率等については検討されていない。【００１２】
一方、溶液中の鉄イオンを除去する方法としては、リン酸や苛性ソーダを用いて鉄イオン由来の沈殿を形成させ、当該沈殿を除去する方法、キレート樹脂や合成吸着樹脂を用いて鉄イオンを吸着除去する方法などが、常法として用いられる。しかしながら、本発明者は検討を行った結果、鉄イオンを含有するＵＰ4Ｕ反応液の鉄イオン濃度を低下させようとするとき、上に説明したような常法では、鉄イオンの濃度を十分に低減することができない場合があることを見出した。【００１３】
したがって本発明の課題は、ＵＰ4Ｕの精製法として容易かつ実践的な鉄イオン除去方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＵＰ4Ｕおよび鉄イオンを含む水溶液または親水性溶媒溶液から鉄イオンを除去するにあたり、キレート樹脂を用いたカラム精製工程と、従来知られている結晶化条件とは異なるｐＨ５．５以下での結晶化工程、又は塩化亜鉛賦活活性炭を用いた処理工程とを組み合わせることによって、ＵＰ4Ｕ反応液中の鉄イオンを十分に除去し、当該鉄イオンの残存濃度１０ｐｐｍ以下という非常に低い濃度まで低減させることができることを見出した。【００１５】
すなわち、本発明は、次の〔１〕及び〔２〕を提供するものである。
〔１〕Ｐ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５’−）テトラホスフェートおよび鉄イオンを含有する水溶液または親水性溶媒溶液から、鉄イオンを除去し、Ｐ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５’−）テトラホスフェートを精製する方法であって、
（１）キレート樹脂を用いたカラム精製工程、および
（２）キレート樹脂カラム精製後の溶液ｐＨを５．５以下に調整した後、Ｐ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５’−）テトラホスフェートを結晶化させる工程、又は
キレート樹脂カラム精製後の溶液を、塩化亜鉛賦活活性炭によって処理する工程
を含む、Ｐ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５’−）テトラホスフェートの精製方法。
〔２〕鉄イオンが３価の鉄イオンである、〔１〕記載の精製方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の精製方法を用いることにより、鉄イオンを触媒として用いる方法でも、触媒を用いない方法で製造されたＵＰ4Ｕと同等品質のＵＰ4Ｕを製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、キレート樹脂カラム処理の後に、各種樹脂を用いて再度キレート樹脂カラム処理を行ったときの、処理終了後溶液中における対ＵＰ4Ｕ鉄イオン濃度を示したものである。
【図２】図２は、キレート樹脂カラム処理の後に活性炭処理を行った時の、処理終了後溶液中における対ＵＰ4Ｕ鉄イオン濃度を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の方法は、ＵＰ4Ｕおよび鉄イオンを含有する水溶液または親水性溶媒溶液から、鉄イオンを除去し、当該鉄イオン濃度を低減させる方法に関するものである。
【００１９】
ＵＰ4Ｕおよび鉄イオンを含有する水溶液または親水性溶媒溶液は、ＵＰ4Ｕおよび鉄イオンを含有する限り限定されるものでない。たとえば、（１）下記式［ＩＩ］または［ＩＩＩ］で示されるリン酸活性化合物と、（２）ＵＭＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰおよびピロリン酸から成る群より選択されるリン酸化合物またはその塩（ＵＴＰフリーを除く）とを、（３）鉄（ＩＩ）イオンおよび鉄（ＩＩＩ）イオンからなる群より選択される金属イオンの存在下、水または親水性有機溶媒中で反応させることを特徴とする製造法（特許文献３）によって得られた合成反応液などを挙げることができる。
（式［ＩＩ］中、Ｒ1は５’位で結合したウリジル基を、Ｘは複素環式基を、ｎは１または２の整数を示す。）
（式［ＩＩＩ］中、Ｘはイミダゾリル基、ベンズイミダゾリル基および１，２，４−トリアゾリル基から成る群より選択される１つの複素環式基を示す。）
【００２０】
【化４】
0006774663.tif 000005
【００２１】
【化５】
0006774663.tif 000006
【００２２】
本発明の「鉄イオン」とは、鉄が塩の形態で溶液に添加されることによって、水または親水性有機溶媒中で金属イオンとなっているものをいう。塩の種類としては、ハロゲン化物、無機酸塩、有機酸塩等を提示することができる。さらなる具体例としては、（ｉ）ハロゲン化物の例として塩化第一鉄、塩化第二鉄、臭化第二鉄等を、（ｉｉ）無機酸塩の例として硫酸、硝酸、過塩素酸等の無機酸塩を、（ｉｉｉ）有機酸塩の例としてトリフルオロメタンスルホン酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、クエン酸塩等を有機酸塩を挙げることができる。塩は第一鉄塩であっても第二鉄塩であってもよいが、第二鉄塩が好ましく、中でも塩化第二鉄が特に好ましい。なお、用いる塩は、無水物であっても水和物であっても良い。
【００２３】
本発明のＵＰ4Ｕ溶液において、溶媒は水または親水性有機溶剤である。親水性有機溶剤としては、メタノール、エタノール等の炭素数６以下のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジオキサン等のエーテル類、アセトニトリル等のニトリル類、ジメチルホルムアミド等のアミド類等を使用することができる。
【００２４】
ＵＰ4Ｕ溶液中の鉄イオン濃度は、ＵＰ4Ｕに対して１０ｐｐｍ以上であるのが好ましく、６０ｐｐｍ以上であるのがより好ましく、６０ｐｐｍ以上１０％以下であるのがさらに好ましい。またＵＰ4Ｕ溶液中のＵＰ4Ｕ濃度は０．０１〜１０％が好ましく、０．１〜５％がより好ましく、１〜３％がさらに好ましい。
【００２５】
本発明の方法は、ＵＰ4Ｕ溶液から鉄イオンを除去する方法において、（１）キレート樹脂を用いたカラム精製工程と、（２）ｐＨ５．５以下で結晶化を行う工程、又は塩化亜鉛賦活化活性炭処理を行う工程とを含む、ＵＰ4Ｕの精製方法に関するものである。
【００２６】
（１）のキレート樹脂を用いたカラム精製工程では、常法にしたがってカラム精製を行えばよい。用いるキレート樹脂の種類としてはアミノリン酸型、イミノジ酢酸型、ポリアミン型、ビスピコリルアミン型、イソチオウロニウム型などの中から任意のものを用いればよい。中でもアミノリン酸型、イミノジ酢酸型のものが好ましい。
【００２７】
キレート樹脂の市販品としては、ＩＲＣ７４７（アミノリン酸基Ｎａ型、オルガノ株式会社製）、ＩＲＣ７４８（イミノジ酢酸基Ｎａ型、オルガノ株式会社製）、ＣＲ−１１（イミノジ酢酸基Ｎａ型、三菱化学株式会社製）、ＣＲ−２０（ポリアミン基遊離型、三菱化学株式会社製）、ＯＴ−７１（イミノジ酢酸基Ｎａ型、室町ケミカル社製）、ＸＭＳ−５６１２（アミノリン酸基Ｎａ型、室町ケミカル社製）、ＸＭＳ−５４１８（ビスピコリルアミン基ＳＯ４型、室町ケミカル社製）、ＸＭＳ−５４１３（イソチオウロニウム基Ｃｌ型、室町ケミカル社製）が挙げられる。
工程（１）は、具体的には、鉄イオンを含むＵＰ4Ｕ水溶液又は親水性有機溶媒溶液を、キレート樹脂を充填したカラムに通液し、通過した溶液を採取すればよい。
キレート樹脂を用いたカラム精製工程により、ＵＰ4Ｕ溶液中のＵＰ4Ｕに対する鉄イオン濃度は６０ｐｐｍ以下になる。
【００２８】
（２）の結晶化工程（２−１）では、まず（１）処理後の溶液に塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、酢酸等の酸を添加することで結晶化母液をｐＨ５．５以下に調整し、結晶化を行う。ここでｐＨは５．５以下であればよいが、２．５以上５．５以下がより好ましい。結晶化では、たとえば当該ＵＰ4Ｕ溶液に親水性有機溶媒を白濁するまで添加・撹拌したのち静置し、析出した結晶をろ過などによって取り出せばよい。親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール等炭素数６以下のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジオキサン等のエーテル類、アセトニトリル等のニトリル類、ジメチルホルムアミド等のアミド類等を例示することができ、特にアルコール類、好ましくはエタノールが挙げられる。このとき、結晶化の効率を向上させるため、親水性有機溶媒と同時に種結晶を添加しても良い。
【００２９】
（２）の塩化亜鉛賦活化活性炭を用いた処理工程（２−２）では、常法に従って活性炭処理を行なえばよい。すなわち、（１）処理後の溶液に塩化亜鉛賦活化活性炭を加えて３０分間〜２０時間ほど撹拌した後、ろ過等によって当該活性炭を取り除くなどの処理方法を行なえばよい。
【００３０】
本発明の方法で用いる活性炭の種別としては、水蒸気賦活されたものや、薬剤賦活されたものなどの中でも、塩化亜鉛賦活化されたものを用いることを特徴とする。活性炭の原料は木材、ヤシガラ、石炭などの中から選ぶことができる。形状は粉末、破砕状、顆粒状、円柱状、繊維状、シート状などの中から任意のものを選べばよい。塩化亜鉛賦活化活性炭の市販品としては、特製白鷺Ｍ６００（大阪ガスケミカル社製）等が挙げられる。
【００３１】
本発明の方法では、上記（１）キレート樹脂を用いたカラム精製工程および（２）ｐＨ５．５以下条件下での結晶化工程又は塩化亜鉛賦活化活性炭処理工程を、（１）、（２）の順で少なくとも１回ずつ行う。また本発明の方法は、上記工程（１）、（２）のほかに、イオン交換カラム等によるカラム精製を行う工程、他の活性炭処理を行う工程、再度の結晶化を行う工程などをさらに含んでいても良い。これらの工程は、工程（１）及び（２）の前後、及び中間に行うことができる。
【００３２】
本発明の方法による精製を行うことで、ＵＰ4Ｕ含有溶液中の鉄濃度をきわめて低い濃度に低下させることができ、たとえば処理後の対ＵＰ4Ｕ鉄含量１０ｐｐｍ以下というきわめて低い値に調整することが可能である。
【００３３】
本発明の方法において、工程（２）として塩化亜鉛賦活化活性炭処理工程による精製が完了した後は、必要に応じて結晶化処理などを行うことによって、ＵＰ4Ｕを高純度で取得することができる。結晶化の方法としては、たとえば公知の知見（特許文献４）等を用いることができる。
【実施例】
【００３４】
（参考例）
公知の方法（特許文献３）にしたがってＵＰ4Ｕを合成した。リン酸活性化合物としてピロリン酸ジイミダゾリド、リン酸化合物としてＵＭＰを用い、溶媒は水、触媒は塩化第二鉄を用いて縮合反応させた。（式［ＩＩＩ］、Ｘはイミダゾリル基。）【００３５】
【化６】
0006774663.tif 000007
【００３６】
縮合反応後の溶液を、キレート樹脂（ＩＲＣ７４８、オルガノ株式会社製）カラム処理に供した。キレート樹脂処理後の鉄イオン濃度は４０ｐｐｍであった。その後、既知法に従って結晶化を行っても鉄イオン濃度は４０ｐｐｍ以下とはならなかった。【００３７】
なお、鉄イオン濃度の定量は、ＪＩＳ  Ｋ  ０４００-５７-１０の１、１０−フェナントロリン吸光光度法を参考に行った。具体的な定量方法は下記の通りである。
（１）検体および検量線作成用の鉄標準液（Ｆｅ１００）を１０ｍＬメスフラスコに投入する。ブランク用に何も投入しない１０ｍＬメスフラスコも用意する。
（２）全てのメスフラスコに６．０Ｍ  ＨＣｌ溶液４００μＬ、１０％塩酸ヒドロキシルアミン溶液２００μＬを投入し、よく混和する。その後、３０分間以上静置する。
（３）０．５％  ｏ−Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ溶液２００μＬ、５０％酢酸アンモニウム溶液１ｍＬを添加し、１０ｍＬにメスアップする。
（４）よく撹拌し、１０分以上室温で静置する。その後、それぞれのＯＤ510を測定する。
（５）得られたＯＤ510の値から検量線を作成し、検体中の鉄イオン濃度を求める。【００３８】
（実施例１）キレート樹脂カラム処理と結晶化工程の組み合わせの検討
キレート樹脂カラム処理の後に再度脱鉄処理を追加する方法として、キレート処理液に対して結晶化を行い、結晶のみを分離することで、鉄の濃度を低下させることを検討した。【００３９】
検討は、ＵＰ4Ｕに対して鉄を３８ｐｐｍ含む模擬処理液を作成して行った。具体的には、まずＵＰ4Ｕ  ４８０ｇを脱イオン水に溶解し、２Ｌに調整した。そして当該溶液に塩化鉄（ＩＩＩ）溶液を添加し、対ＵＰ4Ｕ鉄含量３８ｐｐｍとした。当該溶液に塩酸を添加し、ｐＨを４．５、５．０、５，５、６．０、６．５、７．０になるように調整し、これを模擬処理液とした。【００４０】
それぞれの模擬処理液２００ｍＬを２５℃水浴中で撹拌した後、９５％エタノールを白濁するまで（約１２０ｍＬ）添加し、ＵＰ4Ｕの種結晶（２５ｍｇ）を加えて一晩撹拌した。結晶が十分析出したことを確認し、さらに９５％エタノールを約４０ｍＬ添加して撹拌した。ろ過にて結晶と上清を分離した。得られた結晶を１００ｍＬの脱イオン水に溶解し、鉄含量を測定した。
結果を表１に示す。【００４１】
【表１】
0006774663.tif 000008
【００４２】
上記表に示すように、キレート樹脂に続いて結晶化処理を行うとき、結晶化前液がｐＨ７．０で結晶化した後の鉄濃度は３８ｐｐｍで、鉄は除去されていなかった。一方、ｐＨ５．５以下で結晶化したときの結晶化後の鉄濃度は１０ｐｐｍ以下であり、ｐＨ５．５以下の低いｐＨ条件で結晶化を行うことにより、鉄濃度を非常に低い濃度まで低下させることができた。【００４３】
（実施例２）キレート樹脂カラム処理と別処理の組み合わせの検討
キレート樹脂カラム処理の後に再度脱鉄処理を追加する方法として、はじめのキレート処理液に対して再度鉄吸着剤（各種キレートカラム樹脂または各種活性炭）を投入し、鉄の濃度を低下させることを検討した。
検討は、鉄イオンを含む模擬処理液を作成して行った。具体的には、まずＵＰ4Ｕ  ４８０ｇを脱イオン水に溶解し、２Ｌに調整した。そして当該溶液に塩化鉄（ＩＩＩ）溶液を添加し、対ＵＰ4Ｕ鉄含量６０ｐｐｍとしたものを模擬処理液とした。【００４４】
ｐＨ２．０に調整した模擬処理液を、４．０ｍＬずつ１４本の試験管に量り取った。当該試験管中の模擬処理液に、キレート樹脂、あるいは粉末活性炭を各６０ｍｇずつ量り取り、模擬処理液の入った試験管に添加して撹拌した。撹拌開始から２０時間後に、当該処理液を１ｍＬ以上採取し、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過して樹脂や活性炭を取り除いた。ろ液１ｍＬを使用し、鉄含量を測定した。【００４５】
なお、試験に用いたキレートカラム樹脂の種別は、下記に挙げるとおりである；ＩＲＣ７４７（アミノリン酸基Ｎａ型、オルガノ株式会社製）、ＩＲＣ７４８（イミノジ酢酸基Ｎａ型、オルガノ株式会社製）、ＣＲ−１１（イミノジ酢酸基Ｎａ型、三菱化学株式会社製）、ＣＲ−２０（ポリアミン基遊離型、三菱化学株式会社製）、ＯＴ−７１（イミノジ酢酸基Ｎａ型、室町ケミカル社製）、ＸＭＳ−５６１２（アミノリン酸基Ｎａ型、室町ケミカル社製）、ＸＭＳ−５４１８（ビスピコリルアミン基ＳＯ４型、室町ケミカル社製）、ＸＭＳ−５４１３（イソチオウロニウム基Ｃｌ型、室町ケミカル社製）。【００４６】
また、活性炭の種別は下記の通りである；白鷺Ｐ（やし殻／水蒸気賦活、大阪ガスケミカル株式会社）、特製白鷺（木質／塩化亜鉛賦活、大阪ガスケミカル株式会社）、白鷺Ａ（木質／水蒸気賦活、大阪ガスケミカル株式会社）、ＦＰ−３（原料不明／水蒸気賦活、大阪ガスケミカル株式会社製）、太閤ＫタイプＡ（木質／賦活法不明、フタムラ化学株式会社製）。【００４７】
結果を表２、３および図１、２に示す。【００４８】
【表２】
0006774663.tif 000009
【００４９】
【表３】
0006774663.tif 000010
【００５０】
上記図１に示すように、キレート樹脂カラム処理液にキレート樹脂を投入した場合には、アミノリン酸基Ｎａ型であるＸＭＳ−５６１２（室町ケミカル社製）またはＩＲＣ７４７（オルガノ株式会社製）を用いた場合を除くと、鉄は除去されなかった。また、アミノリン酸基Ｎａ型樹脂で処理した場合でも、処理後の鉄濃度は１０ｐｐｍ以上であった。【００５１】
次に図２に示すように、キレート樹脂カラム処理液に活性炭処理を行うと、いずれの活性炭を用いた場合でも鉄濃度は低下していた。とくに、塩化亜鉛賦活活性炭を用いた場合では、処理後の鉄濃度は１０ｐｐｍ未満となっており、鉄濃度を非常に低い濃度まで低下させることができた。
【図１】
0006774663.tif 000011
【図２】
0006774663.tif 000012