(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(1)又は(2)に示すペプチドが固定化されてなる電極を含む、アミロイドβペプチドを測定用のバイオセンサ：
(1)配列番号１に示すアミノ酸配列を含むペプチド。
(2)配列番号１に示すアミノ酸配列における第３〜７位以外のアミノ酸残基内、１〜４個のアミノ酸残基が、置換、欠失、又は挿入されてなるアミノ酸配列を含み、Ａβを凝集させる作用を有するペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、下記(3)又は(4)に示すペプチドである、請求項１に記載のバイオセンサ：
(3)配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド。
(4)配列番号２に示すアミノ酸配列において、第８〜１２位以外のアミノ酸残基内、１〜４個のアミノ酸残基が、置換、欠失、付加、又は挿入されてなるアミノ酸配列からなり、Ａβと凝集させる作用を有するペプチド。
【請求項３】
アルツハイマー型認知症の診断に使用される、請求項１又は２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
下記(1)又は(2)に示すペプチドが固定化されてなる電極を含むバイオセンサを用いて、アミロイドβペプチドを測定する方法であって：
(1)配列番号１に示すアミノ酸配列を含むペプチド。
(2)配列番号１に示すアミノ酸配列における第３〜７位以外のアミノ酸残基内、１又は数個が置換、欠失、又は挿入されてなるアミノ酸配列を含み、Ａβを凝集させる作用を有するペプチド。
前記バイオセンサにおけるペプチドが固定化された電極に対して試料溶液を接触させる第１工程、
前記第１工程で試料溶液に接触させた電極に対して、銅２価イオンを接触させ、電流値を測定する第２工程、及び
前記第２工程で測定した電流値に基づいて、試料溶液中のアミロイドβペプチド量を求める第３工程。
【請求項５】
前記試料溶液が、血漿又はその希釈液である、請求項４に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気化学的手法により、簡便、短時間、且つ高精度でアミロイドβペプチドを測定するためのバイオセンサ及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病の原因物質と考えられているアミロイドβペプチド（以下、「Ａβ」と表記することもある）の検出法については、測定対象の重要性からこれまで様々な技術が開発されている。最も一般的なものは、蛍光測定法やELISA法等の手法によるものである。蛍光測定は、Ａβ線維に特異的に結合する蛍光色素チオフラビンＴ（ThT）を用い、線維量に比例する蛍光強度により定量する手法であり、Ａβに関する学術論文の多くでこの手法が用いられている。しかしながら、蛍光測定法で測定できるのは、線維状のＡβのみであり、また検出感度も低く、ｍＭレベルに止まっている。一方、ELISA法は、Ａβ抗体を利用した方法で感度も高いが、抗体との反応時間・信号増幅時間が１〜２日必要であり、かつ抗体を必要とするため比較的費用がかさむという欠点がある。
【０００３】
そこで、異なった原理に基づいたＡβの測定法として表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法等の分子間相互作用解析装置を用いた方法が報告されている。例えば、非特許文献１には、ＳＰＲを抗体と共に用いることにより０．０２〜５ｎＭのＡβを測定することが可能になることが開示されている。また、非特許文献２には、抗体を用いず３〜３０ｍＭのＡβを検出したことが報告されている。しかしながら、前者の方法では抗体を用いるため費用が嵩み、後者の方法は感度がそれほど高くないという欠点がある。
【０００４】
更に、電気化学的手法によるＡβの測定の試みも報告されている。例えば、非特許文献３では、Ａβに含まれるチロシン残基の酸化還元を測定することによって、Ａβの検出が試みられている。しかしながら、非特許文献３では、０．７・ｇ／ｍＬのＡβまで検出で
きると見積もられているが、定量性は得られていない。また、非特許文献４では、抗体で修飾した金電極上でのｐ−アミノフェノールの酸化還元を用いて、ｐＭレベルのＡβ４２及び全Ａβ量を検出した報告もあるが、この方法では、特殊な抗体を用いる必要があるため、１測定当たりの費用が高額になるという欠点がある。
【０００５】
更に、従来、Ａβの測定法として、Ａβを安定同位体により標識、分離し、質量分析により定量する方法（特許文献１）、アミロイドモノマーを認識する抗体を担持した金属コロイドを使用する方法（特許文献２）、βシート状Ａβオリゴマーが固定化されているバイオチップを用いる方法（特許文献３）等も提案されている。
【０００６】
このように、Ａβの測定法はこれまでも数多く報告されているが、高感度測定の多くは特別な抗体を必要としていた。また、測定するための装置については、ＳＰＲや質量分析計等の高価なものが必要である方法も多い。一方、比較的安価な装置で測定できる電気化学的手法では、長時間の測定時間が必要であったり、感度や定量性が不十分であったりするため、迅速・簡便・高精度の３つの条件を満たす方法は開発されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ning Xia et al., Anal. Chem., 82, 10151 (2010)
【非特許文献２】Jungki Ryu et al., Anal. Chem., 80, 2400 (2008)
【非特許文献３】M. Vestergaard et al., J. Am. Chem. Soc., 127, 11892 (2005)
【非特許文献４】Lin Liu et al., Biosens. Bioelectron., 51, 208 (2014)
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−１５７１２４号公報
【特許文献２】特開２０１１−１２２９２８号公報
【特許文献３】特開２０１４−１３１９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、電気化学的手法により、簡便、短時間、且つ高精度でＡβを測定するためのバイオセンサを提供することである。また、本発明の他の目的は、当該バイオセンサを利用したＡβの測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、HDKLVFFYEVHH（配列番号１）又はその改変配列を含むペプチドを固定化した電極を使用することにより、簡便、短時間、且つ高精度でＡβを電気化学的手法により測定することが可能になることを見出した。より具体的には、前記電極にＡβを接触させると、Ａβが前記ペプチド上に凝集し、更に銅２価イオンを添加すると、Ａβ量に応じた電気化学的信号が発せられ、当該電気化学的信号を検出することにより、簡便、短時間、且つ高精度でのＡβの定量が可能になることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  下記(1)又は(2)に示すペプチドが固定化されてなる電極を含む、アミロイドβペプチドを測定用のバイオセンサ：
(1)配列番号１に示すアミノ酸配列を含むペプチド。
(2)配列番号１に示すアミノ酸配列における第３〜７位以外のアミノ酸残基内、１又は数個が置換、欠失、又は挿入されてなるアミノ酸配列を含み、Ａβを凝集させる作用を有するペプチド。
項２．  前記ペプチドが、下記(3)又は(4)に示すペプチドである、項１に記載のバイオセンサ：
(3)配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド。
(4)配列番号２に示すアミノ酸配列において、第８〜１２位以外のアミノ酸残基内、１又は数個が置換、欠失、付加、又は挿入されてなるアミノ酸配列からなり、Ａβと凝集させる作用を有するペプチド。
項３．  アルツハイマー型認知症の診断に使用される、項１又は２に記載のバイオセンサ。
項４．  項１〜３のいずれかに記載のバイオセンサを用いて、アミロイドβペプチドを測定する方法であって、
前記バイオセンサにおけるペプチドが固定化された電極に対して試料溶液を接触させる第１工程、
前記第１工程で試料溶液に接触させた電極に対して、銅２価イオンを接触させ、電流値を測定する第２工程、及び
前記第２工程で測定した電流値に基づいて、試料溶液中のアミロイドβペプチド量を求める第３工程。
項５．  前記試料溶液が、血漿又はその希釈液である、項４に記載の測定方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のバイオセンサによれば、抗体を使用することなく、比較的安価な装置で測定できる電気化学的手法によって、簡便且つ短時間でＡβを定量することができる。しかも、本発明のバイオセンサによれば、０．５μＭ程度という極めて低濃度のＡβであっても定量することができるので、Ａβの検出感度が極めて高く、その測定精度も卓越している。
【００１３】
また、血漿中のＡβは、アルツハイマー型認知症のバイオマーカーであることが知られているので、本発明のバイオセンサは、アルツハイマー型認知症の診断用途にしようすることにより、その診断精度の向上や早期発見に寄与することができる。
【００１４】
本発明のバイオセンサは、電気化学的手法を利用しているので、現在実用化されているような家庭用血糖値センサと同様、小型化することにより、家庭用のＡβセンサとして普及させることもできる。
【００１５】
更に、本発明のバイオセンサは、使用後に洗浄することにより初期化でき、しかも測定と洗浄を繰り返し行っても、Ａβの測定精度を維持できるので、従来のＡβの測定法に比べて、Ａβの測定に要するトータルコストを大幅に低減することも可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】参考例１において、AFPP及びAFPPcysのＡβに対する凝集促進効果を評価した結果を示す図である。
【図２】実施例１において、AFPPcys固定化電極を用いてＡβの測定を行った結果を示す図である。
【図３】実施例３において、AFPPcys固定化電極を用いて、０．１〜５μＭのＡβの測定を行った結果を示す図である。
【図４】実施例４において、AFPPcys固定化電極を用いたＡβの測定及び洗浄を繰り返し行い、洗浄後の再利用がＡβ測定精度に及ぼす影響を評価した結果を示す図である。
【図５】実施例５において、AFPPcys固定化電極を用いてアミリンの測定を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書において、配列表以外では、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現している。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
【００１８】
また、本明細書において、アミノ酸配列は、左側がＮ末端、右側がＣ末端となるように配列を表示している。
【００１９】
１．Ａβ測定用バイオセンサ
本発明は、バイオセンサは、Ａβを電気化学的手法によって測定するために使用されるバイオセンサであって、配列番号１に示すアミノ酸配列又はその改変配列を含むペプチドが固定されている電極を含むことを特徴とする。以下、本発明のバイオセンサについて詳述する。
【００２０】
（ペプチド）
本発明のバイオセンサにおいて電極に固定化されるペプチドは、下記(1)又は(2)に示すペプチドである。下記(1)又は(2)に示すペプチドは、Ａβを効率的に捕捉して凝集させる作用を有しており、当該ペプチドをＡβ測定用バイオセンサに使用することにより、簡便、短時間、且つ高精度でのＡβの定量が可能になる
(1)配列番号１に示すアミノ酸配列（HDKLVFFYEVHH）を含むペプチド。
(2)配列番号１に示すアミノ酸配列（HDKLVFFYEVHH）における第３〜７位以外のアミノ酸残基内、１又は数個が置換、欠失、又は挿入されてなるアミノ酸配列を含み、Ａβを凝集させる作用を有するペプチド。
【００２１】
前記(1)のペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるものであってもよいが、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１又は数個のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
【００２２】
前記(1)のペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端にアミノ酸残基を付加する場合、付加されるアミノ酸残基の数については、特に制限されないが、例えば、Ｎ末端側の場合であれば１〜１０個、好ましくは１〜６個、更に好ましくは４〜６個が挙げられ；Ｃ末端側の場合であれば１〜１０個、好ましくは１〜５、更に好ましくは１〜３個が挙げられる。
【００２３】
前記(2)のペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列の３〜７位のアミノ酸残基（KLVFF）はＡβの凝集促進作用に大きく寄与しているため、これらのアミノ酸残基は保存される。
【００２４】
前記(2)のペプチドにおいて、置換、欠失、又は挿入されているアミノ酸残基は、配列番号１に示すアミノ酸配列における第１、２、及び８〜１２のアミノ酸残基であればよいが、第１、１１、及び１２位のヒスチジン残基は当該ペプチドの構造変化を誘起させる役割に寄与し得るので、Ａβの高い測定精度を維持させる上で、第１、１１、及び１２位のヒスチジン残基は、置換、欠失、又は挿入されていないことが望ましい。
【００２５】
また、前記(2)のペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列に改変（置換、欠失、付加、又は挿入）が導入されるアミノ酸残基の数については、１又は数個の範囲内であり、且つＡβと凝集させる作用を有することを限度として特に制限されないが、具体的には１〜４個、好ましくは１〜３個、更に好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個が挙げられる。
【００２６】
前記(2)のペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列に対してアミノ酸置換がなされている場合、当該アミノ酸置換は、保存的置換であることが好ましい。アミノ酸置換としては、具体的には、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
【００２７】
前記(2)のペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して置換、欠失、又は挿入されてなるアミノ酸配列からなるものであってもよいが、当該アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に更に１又は数個のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
【００２８】
前記(2)ペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して置換、欠失、又は挿入されてなるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端にアミノ酸残基を付加する場合、付加されるアミノ酸残基の数については、特に制限されないが、例えば、Ｎ末端側の場合であれば１〜１０個、好ましくは１〜６個、更に好ましくは４〜６個が挙げられ；Ｃ末端側の場合であれば１〜１０個、好ましくは１〜５、更に好ましくは１〜３個が挙げられる。
【００２９】
本発明で使用されるペプチドは、前述するアミノ酸配列を有し、Ａβを凝集させる作用を有するものであることを限度として、構成するアミノ酸残基数については特に制限されないが、構成するアミノ酸残基数として、例えば１４〜３０、好ましくは１７〜２５、更に好ましくは１８〜２０が挙げられる。
【００３０】
また、本発明で使用されるペプチド（前記(1)又は(2)のペプチド）の好適な一例として、下記(3)又は(4)に示すペプチドが挙げられる。
(3)配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド。
(4)配列番号２に示すアミノ酸配列において、第８〜１２位以外のアミノ酸残基内、１又は数個が置換、欠失、付加、又は挿入されてなるアミノ酸配列からなり、Ａβと凝集させる作用を有するペプチド。
【００３１】
前記(3)のペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端側にDAEFRが付加され、且つC末端側にQKが付加されているアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００３２】
前記(4)のペプチドにおいて、置換、欠失、付加又は挿入されているアミノ酸残基は、配列番号２に示すアミノ酸配列における第８〜１２（即ち、配列番号１に示すアミノ酸配列の３〜７位のアミノ酸残基に相当）以外のアミノ酸残基であればよいが、第６、１６、及び１７位のヒスチジン残基は、当該ペプチドの構造変化を誘起させる役割に寄与し得るので、Ａβの高い測定精度を維持させる上で、第６、１６、及び１７位のヒスチジン残基は、置換、欠失、付加又は挿入されていないことが望ましい。また、前記(4)のペプチドにおいて、配列番号２に示すアミノ酸配列の第６〜１７位のアミノ酸残基（配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１２位のアミノ酸残基に相当）についても、Ａβの高い測定精度を維持させる上で、置換、欠失、付加又は挿入されていないことが望ましい。
【００３３】
前記(4)のペプチドにおいて、配列番号２に示すアミノ酸配列に改変（置換、欠失、付加、又は挿入）が導入されるアミノ酸残基の数については、１又は数個の範囲内であり、且つＡβと凝集させる作用を有することを限度として特に制限されないが、具体的には１〜１０個、１〜９個、１〜８個、又は１〜７個、好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１又は２個が挙げられる。
【００３４】
前記(4)のペプチドにおいて、配列番号２に示すアミノ酸配列に対してアミノ酸置換がなされている場合、当該アミノ酸置換は、保存的置換であることが好ましい。保存的置換の具体的態様については、前記の通りである。
【００３５】
本発明で使用されるペプチドは、そのアミノ酸配列に基づいて、公知のペプチド合成法によって製造することができる。
【００３６】
（電極）
本発明のバイオセンサに使用される電極の構成素材については、導電性を示し、且つ前記ペプチドを固定化できることを限度として特に制限されないが、例えば、金、白金、パラジウム、ニッケル、ルテニウム、イリジウム等の金属電極;ＩＴＯ(Tin-doped indium oxide)等の金属酸化物電極；グラッシーカーボン等の炭素電極等が挙げられる。これらの中でも好ましくは金属電極、更に好ましくは金電極が挙げられる。
【００３７】
（電極へのペプチドの固定化）
本発明のバイオセンサにおいて、前記ペプチドの電極への固定化は、電極の素材に応じて公知のペプチド固定化方法によって行うことができる。
【００３８】
例えば、金や白金等の金属電極に前記ペプチドを固定化する場合であれば、前記ペプチドの末端にシステイン等のチオール基を有する化合物を結合させ、当該チオール基と電極を構成する金属原子とを結合させて、金属−Ｓ結合（例えば、金電極の場合には、Ａｕ−Ｓ結合）を形成させることにより、自己集積化（ＳＡＭ）膜を形成させる方法が挙げられる。また、チオール基を有する化合物に代えて、ジスルフィド基を有する化合物を使用することによっても、金属電極に前記ペプチドを固定化することができる。
【００３９】
また、例えば、グラッシーカーボン電極に前記ペプチドを固定化する場合であれば、グラッシーカーボン電極の表面を高温下での空気酸化又はクロム酸溶液処理により、カルボキシル基を形成させた後に、カルボキシル基を塩化チオニルにより酸塩化物に変換し、前記ペプチドのアミノ基とアミド結合を形成させる方法が挙げられる。
【００４０】
本発明のバイオセンサにおいて、電極に固定化する前記ペプチドの量については、特に制限されないが、例えば電極１ｃｍ2当たり、前記ペプチドが０．５〜４０μｇ程度、好ましくは１〜２０μｇ程度、更に好ましくは１〜１０μｇ程度となる量が挙げられる。
【００４１】
本発明のバイオセンサでは、前記ペプチドのＮ末端側が電極と結合する態様で固定化されていてもよく、また前記ペプチドのＣ末端側が電極と結合する態様で固定化されていてもよい。より一層高精度にＡβを測定するという観点から、前記ペプチドのＮ末端側が電極と結合する態様で固定化されていることが好ましい。即ち、本発明の好適な一態様としては、前記ペプチドのＮ末端にシステインが結合され、当該システインのチオール基が電極上で金属−Ｓ結合を形成することにより、前記ペプチドが電極上に固定化されている態様が挙げられる。
【００４２】
（他の構成部材）
本発明のバイオセンサは、前記ペプチドが固定化された電極を作用極として使用して電気化学的分析器を構成すればよい。即ち、本発明のバイオセンサでは、前記ペプチドが固定化された電極（作用極）と共に、更に、対極と、発生した電流値を測定する電流測定装置とを備えていればよい。
【００４３】
また、本発明のバイオセンサは、作用極と対極を備えて二電極法による測定を行えるように構成されていてもよいが、更に参照電極を備えて三電極法による測定を行えるように構成されていてもよい。
【００４４】
また、本発明のバイオセンサにおいて、前記ペプチドが固定化された電極には、電極と試料溶液が接触し易くなるように、前記ペプチドが固定化された電極上で試料溶液を保持させるセルが設けられていてもよい。
【００４５】
２．Ａβの測定方法
本発明のＡβの測定方法は、前記バイオセンサを用いてＡβを測定する方法であり、以下の第１工程〜第３工程を含むことを特徴とする。
第１工程：前記バイオセンサの前記ペプチドが固定化された電極に対して試料溶液を接触させる。
第２工程：前記第１工程で試料溶液に接触させた電極に対して、銅２価イオンを接触させ、電流値を測定する。
第３工程：前記第２工程で測定した電流値に基づいて、試料溶液中のＡβ量を求める。
【００４６】
以下、本発明のＡβの測定方法について説明する。
【００４７】
（試料溶液）
本発明のＡβの測定方法において、測定対象となる試料溶液については、Ａβの測定、特に定量が求められるものである限り、特に制限されず、例えば、組織抽出液、培養上清、脳脊椎液、血漿等の生体由来試料；Ａβを含む試薬；これらの希釈液等が挙げられる。前述するように、血漿中のＡβはアルツハイマー型認知症のバイオマーカーであるため、測定対象となる試料溶液として、好ましくは血漿又はその希釈液が挙げられる。
【００４８】
（第１工程）
本発明のＡβの測定方法では、先ず、前記センサの前記ペプチドが固定された電極に対して試料溶液を接触させる（第１工程）。本第１工程によって、試料溶液に含まれるＡβが、電極に固定された前記ペプチド上に凝集する。
【００４９】
本第１工程において電極に試料溶液を接触させるには、例えば、前記ペプチドが固定化された電極に試料サンプルを添加して、当該電極を試料サンプルで覆えばよい。
【００５０】
本第１工程では、電極に対して試料溶液を接触させた状態で、３７℃程度で３０〜６０分間程度静置又は振盪すればよい。
【００５１】
（第２工程）
前記第１工程後に、試料溶液に接触させた電極に、銅２価イオンを接触させ、電流値を測定する（第２工程）。前記第１工程後にＡβが凝集している電極に対して銅２価イオンを接触させると、当該Ａβが銅２価イオンと結合し、銅２価イオンと電極間で電流が発生する。
【００５２】
第２工程によって銅２価イオンを接触させる前に、前記第１工程後の電極を洗浄することにより、電極上で凝集しなかったＡβを除去しておくことが望ましい。
【００５３】
第２工程において銅２価イオンを接触させるには、具体的には、水溶性の２価銅化合物を溶解させた銅２価イオン水溶液を電極上に添加すればよい。
【００５４】
銅２価イオン水溶液の調製に使用される水溶性の２価銅化合物としては、例えば、硫酸銅、塩化銅、酢酸銅等が挙げられる。これらの水溶性の２価銅化合物は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、銅２価イオン水溶液における銅２価イオン濃度については、後述する銅２価イオンの接触量を充足できる範囲で適宜設定すればよいが、例えば０．１〜１ｍＭ、好ましくは０．１〜０．２ｍＭとなるように調整されていればよい。
【００５５】
前記銅２価イオン水溶液に使用される溶媒については、水酸化銅の形成による沈殿が生じないようにｐＨを７程度に調整されていればよく、例えばTris/HCl緩衝溶液が好適に使用される。
【００５６】
また、第２工程において、接触させる銅２価イオンの量については、特に制限されないが、例えば、電極１ｃｍ2当たり、銅２価イオンが０．１〜１マイクロモル、好ましくは０．１〜０．３マイクロモルとなる量が挙げられる。
【００５７】
このように銅２価イオンを接触させることにより、銅２価イオンが前記ペプチド上で凝集したＡβに結合し、銅２価イオンと電極間で電流が流れる。第２工程では、このようにして発生した電流値を測定する。
【００５８】
（第３工程）
前記第２工程で測定した電流値に基づいて、試料溶液中のＡβ量を求める（第３工程）。試料溶液中のＡβ量と前記第２工程で測定した電流値は比例関係にあるので、前記第２工程で測定した電流値から、試料溶液中のＡβ量が定量される。
【００５９】
第３工程では、具体的には、予め濃度既知の標準試料溶液を用いて、Ａβ濃度と電流値の相関を示す標準曲線を作成しておき、当該標準曲線を用いて、前記第２工程で測定した電流値から試料溶液中のＡβ量を定量すればよい。
【００６０】
また、電極上に固定している前記ペプチド自体にも銅２価イオンが結合して微弱な電流を発生させ得るので、前記第２工程では、別途、試料溶液を添加せずに前記と同操作を行い、銅２価イオンを接触させた際のバックグランド電流値を測定しておくことが望ましい。この場合、試料溶液を接触させた場合に測定された電流値から、当該バックグランド電流値を差し引いた値を用いて、試料溶液中のＡβ量が求めることにより、Ａβ量の定量精度を高めることができる。
【００６１】
（初期化）
また、前記バイオセンサは、一旦Ａβの測定を行った後に、前記ペプチドが固定化された電極を洗浄することによって、凝集しているＡβと当該Ａβに結合している銅２価イオンを除去できるので、繰り返し使用することができる。
【００６２】
前記ペプチドが固定化された電極を一旦使用した後に洗浄する方法としては、キレート剤を含むキレート剤水溶液で洗浄した後に、アルカリ水溶液で洗浄する方法が挙げられる。
【００６３】
前記キレート剤水溶液に含まれるキレート剤の種類については、銅２価イオンを除去できるものであることを限度として特に制限されないが、例えば、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸ナトリウム、ニトリロ三酢酸ナトリウム、クエン酸等が挙げられる。これらのキレート剤は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、キレート剤水溶液中のキレート剤の濃度としては、例えば０．１〜１ｍＭ、好ましくは０．１〜０．３ｍＭが挙げられる。
【００６４】
キレート剤水溶液による洗浄後、アルカリ水溶液による洗浄前に、必要に応じて電極を水洗することにより、電極に残存しているキレート剤水溶液を洗い流してもよい。
【００６５】
前記キレート剤水溶液による洗浄方法については、特に制限されないが、例えば、前記キレート剤溶液で電極を濯ぐ方法、前記キレート剤溶液中に電極を浸漬させる方法等が挙げられる。
【００６６】
また、前記アルカリ水溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリが添加され、ｐＨが９〜１２、好ましくは１０〜１１に調整されているものであればよい。
【００６７】
前記アルカリ水溶液による洗浄方法については、特に制限されないが、例えば、前記アルカリ溶液で電極を濯ぐ方法、前記アルカリ溶液中に電極を浸漬させる方法等が挙げられる。
【００６８】
アルカリ水溶液で洗浄した電極は、水洗してアルカリ水溶液を十分に洗い流すことにより、再利用することができる。
【実施例】
【００６９】
次に、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
【００７０】
参考例１：Ａβに対する凝集促進効果の確認
配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「AFPP」と表記する）と、当該AFPPのN末端にシステインを結合させたペプチド（以下、「AFPPcys」と表記する）を合成し、これらのペプチドを用いて、Ａβの凝集促進効果を確認した。具体的には、ｐＨ７．０に調整したＮ−エチルモルフォリン緩衝溶液に対して、Ａβを１０μＭ、AFPPを１０μＭ、Ａβを５μＭ且つAFPPを１０μＭ、AFPPcysを１０μＭ、又はＡβを５μＭ且つAFPPcysを５μＭとなるように添加し、同時にアミロイド線維検出に用いられる蛍光色素チオフラビンＴ（ThT）を５０μＭとなるように添加した。これを室温で８時間静置し、経時的に蛍光強度（４８７ｎｍ）の測定を行った。
【００７１】
得られた結果を図１に示す。図１から明らかなように、Ａβ単独では蛍光強度の増大は認められなかったが、ＡβとAFPP又はAFPPcysとを共存させた場合には、短時間で蛍光強度の増大が認められた。即ち、この結果から、AFPP及びAFPPcysは、Ａβの凝集を促進させる作用があり、短時間でＡβを凝集させ得ることが明らかとなった。
【００７２】
実施例１：AFPPcys固定化電極によるＡβの測定
AFPPcysを固定化した金電極を用いて、Ａβの測定を行った。具体的には、先ず、電極を５０μＭのAFPPcysを含むＮ−エチルモルフォリン緩衝溶液（ｐＨ７．０）４００μｌ中に浸し、一晩静置することによってAFPPcysを金電極上に固定した。次いで、５μＭのＡβを含むＮ−エチルモルフォリン緩衝溶液（ｐＨ７．０）４００μｌを当該金属電極に固定化させたAFPPcysの上に添加し、室温で６０分間静置したその後、電極上に２００μＭの塩化銅を含むＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．０）４００μｌを添加した後に、サイクリックボルタンメトリーの測定を行い、電流値の測定を行った。また、Ａβを含む液を添加しなかったこと以外は、前記と同条件で測定を行い、バックグランド電流値の測定も行った。
【００７３】
得られた結果を図２に示す。図２に示されているように、AFPPcysにも銅２価イオンが結合するので、バックグラウンド電流値が観測されたものの、Ａβが存在する場合は明らかに電流値の上昇が認められた。即ち、この結果から、AFPPcysを固定した電極と銅２価イオンを使用することにより、電気化学的なＡβ測定が可能になることが明らかとなった。
【００７４】
実施例２：AFPPcys固定化電極によるＡβの定量
AFPPcysを固定化した金電極を用いて、Ａβの定量を行った。具体的には、先ず、前記実施例１と同様の方法で、AFPPcysを固定した金電極を作製した。次いで、０〜５μＭのＡβを含むＮ−エチルモルフォリン緩衝溶液（ｐＨ７．０）４００μｌを当該金属電極に固定化させたAFPPcysの上に添加し、室温で６０分間静置した。次いで、電極をＮ−エチルモルフォリン緩衝溶液（ｐＨ７．０）で洗浄した。洗浄した電極上に、２００μＭの塩化銅を含むＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．０）４００μｌを添加し、過剰の銅２価イオンをＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．０）で洗浄した後に、サイクリックボルタンメトリーの測定を行い、電流値の測定を行った。
【００７５】
得られた結果を図３に示す。図３に示すように、Ａβが０．１〜５μＭの範囲で観察される電流値がＡβの濃度と比例していることから、AFPPcysを固定した金電極を使用することによって、０．１〜５μＭという低濃度のＡβであっても、高精度な定量が可能になることが分かった。
【００７６】
実施例３：洗浄による電極初期化の評価
AFPPcysを固定した金電極の繰り返し使用が、測定精度に与える影響を評価するために、以下の試験を行った。先ず、前記実施例１と同様の方法で、AFPPcysを固定した金電極を作製した。次いで、以下の操作１、洗浄１、操作２、及び洗浄２を１サイクルとして、合計６サイクルを繰り返し行った。なお、最後の１サイクルは操作１のみを行った。
操作１：２００μＭの塩化銅を含むＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．０）４００μｌを前記金属電極に固定化させたAFPPcysの上にした後に、サイクリックボルタンメトリーの測定を行い、電流値の測定を行った。
洗浄１：操作１で電流値の測定に使用した金電極を２０μＭのエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを含むＴｒｉｓ緩衝液に１０分間浸漬した後に、超純水で洗浄した。更に、洗浄後の電極を１０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液に１０分間浸漬した後に、超純水で洗浄した。
操作２：洗浄１で洗浄した金属電極のAFPPcysの上に５μＭのＡβを含むＮ−エチルモルフォリン緩衝溶液（ｐＨ７．０）４００μｌを添加し、室温で６０分間静置した。その後、電極上に２００μＭの塩化銅を含むＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．０）４００μｌを添加した後に、サイクリックボルタンメトリーの測定を行い、電流値の測定を行った。
洗浄２：操作２で電流値の測定に使用した金電極に対して、前記洗浄１と同条件で、エチレンジアミン四酢酸ナトリウムを含むTris緩衝液による洗浄と、１０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液による洗浄を行った。
【００７７】
合計６サイクルを繰り返し行った際に、操作１及び２において、測定された電流値を図４に示す。この結果より、AFPPcysを固定した金電極は、洗浄後も再現性良く電流応答が得られており、洗浄して繰り返し使用しても、高い精度をもってＡβを定量できることが分かった。
【００７８】
実施例４：類似ペプチド（アミリン）の影響の評価
Ａβと同様、アミロイド線維を形成することが知られているアミリンを試料として使用して、AFPPcysの凝集選択性を検討した。具体的には、Ａβの代わりに、アミリンを使用したこと以外は、実施例１と同条件で電流値の測定を行った。
【００７９】
得られた結果を図５に示す。アミリンは、Ａβと同様、銅２価イオンが結合することが知られているが、AFPPcysを固定した金電極に接触させても、観測される電流値には影響を与えなかった。このことは、金電極上に固定されたAFPPcysは、アミリンを凝集させていない、又は凝集させたが凝集体には銅２価イオンが配位していないことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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