(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を精製するための繊維の充填床を含むハウジングであって、
前記充填床が、第１のクロマトグラフィー媒体と第２のクロマトグラフィー媒体とのブレンドを有し、
前記第１のクロマトグラフィー媒体がアニオン交換クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含み、且つ前記第２のクロマトグラフィー媒体がカチオン交換クロマトグラフィー若しくは疎水性相互作用クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含むか、又は
前記第１のクロマトグラフィー媒体がカチオン交換クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含み、且つ前記第２のクロマトグラフィー媒体が疎水性相互作用クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含む、
前記ハウジング。
【請求項２】
前記第１のクロマトグラフィー媒体中の繊維がアニオン交換クロマトグラフィー又はカチオン交換クロマトグラフィーを可能にする表面ペンダント型官能基を付加することによって誘導体化されたものであり、
前記第２のクロマトグラフィー媒体中の繊維がカチオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーを可能にする表面ペンダント型官能基を付加することによって誘導体化されたものである、請求項１に記載のハウジング。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体含有溶液からの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、抗体断片および低分子量物質の分離に適する新しいタイプのイオン交換吸着剤に関する。本発明は、特に、目的の生体分子および不純物を分離することにより生物試料を精製する方法に関し、該方法は、試料を、繊維からなる上記クロマトグラフィー媒体に接触させるステップを含み、上記繊維は、イオン交換クロマトグラフィーおよび／または疎水性相互作用を可能とする官能基を有する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は医薬用途に使用されるために、極めて高い純度が必要とされている（非特許文献１）。
【０００３】
一般に、現在の市場に出ている大部分の治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の製造には、哺乳動物細胞培養が用いられている。これらの抗体薬の製造は通常、抗体を細胞外液中に分泌するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の懸濁液を含むバイオリアクター中で開始される。その後、得られた抗体は、細胞、壊死組織片、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、脂質、ＤＮＡ、ウイルス、細菌、抗体凝集体などを取り除くための清澄化、濾過、および精製を含む一連のプロセスに供される。多くの場合、この一連のプロセスは下流プロセス（ＤＳＰ）と呼ばれる。
【０００４】
最もよく用いられるＤＳＰは、１つまたは２つの結合−溶出クロマトグラフィー精製ステップに続けて、１つまたは２つのフロースルーポリッシングステップを含む（図１、標準的ｍＡｂ精製スキーム）。典型的な下流の精製プロセスには、多孔質ビーズベースクロマトグラフィー媒体を満たした充填カラムまたは膜ベース装置が用いられる。これらの単位操作は、直列に繋げて用いられ、それぞれは、フロースルーポリッシングまたは結合／溶出キャプチャーモードにより特定の不純物を取り除くことを目的としている。
【０００５】
ポリッシング媒体の主目的の１つは、ＨＣＰの濃度を１０ｐｐｍ未満まで（ｍＡｂ濃度に対して）低下させることである。種々の治療用生体分子の商業規模の精製は、現状では、ビーズベースクロマトグラフィー樹脂を使って実現されている。バイオ医薬品製造業者は、最も一般的には、このフロースルーポリッシングステップで単純なアニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー媒体を使用する。ＡＥＸ媒体は、酸性ＨＣＰ、ＤＮＡ、エンドトキシン、およびウイルスを除去するために用いられる。しかし、塩基性ＨＣＰ、生成物凝集体およびフラグメントなどの正電荷不純物の除去には効果が弱い場合が多い。
【０００６】
モノクローナル抗体は、治療薬および診断薬として重要性が増し続けている。候補ｍＡｂに対し、ハイブリドーマライブラリーを選別するプロセスは、時間を浪費し、かつ労働集約的である。好適なｍＡｂを発現するハイブリドーマ細胞株が樹立されると、さらなる特性評価のために、十分なｍＡｂを製造するための精製法が開発されなければならない。
【０００７】
従来の精製方法は、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィー、ならびにイオン交換クロマトグラフィーの使用を含む。精製抗体は、脱塩され、透析を使って生物学的緩衝液中に入れ替えられる。通常、全プロセスの完了には数日間を要し、複数のｍＡｂが同時に評価される場合には、特に面倒になることがある。
【０００８】
したがって、近年、種々の新規ポリッシング吸着剤が開発されており、これらは、より広い範囲の不純物の除去を可能とするより大きな能力および親和力を示す。これらの吸着剤には、アニオン交換（ＡＥＸ）材料（例えば、特許文献１）およびカチオン交換（ＣＥＸ）材料（例えば、特許文献２）の両方の、いわゆる、「混合モード」リガンド、が含まれる。しかし、樹脂上のこれらの高性能のリガンドのより高いコストにより、単回使用または使い捨て型のプロセスに対するそれらの採用が妨げられている。
【０００９】
一般に、適用されたビーズベース吸着剤は、高気孔率および大きな表面積を示し、生産規模（例えば、１０，０００リットル）の生体分子のバッチ処理に対し、材料に十分な吸着能力を与える。特許文献から、この技術的応用として、混床固定相において使用されるこのようなビーズベース媒体の多数の例が知られている。
【００１０】
特許文献３としても発行されているＪＰ０１−１０１７８（旭化成工業株式会社）、では、多官能性モジュールが開示され、これには、単一装置内のカチオン、アニオンおよび微粒子を除去するための、ＡＥＸとＣＥＸの多孔質中空繊維膜の組み合わせが含まれる。
【００１１】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．は、単一カラム中で第２のタイプのクロマトグラフィー媒体上へのアフィニティクロマトグラフィー媒体の層化を含み、それにより、目的の親和力結合タンパク質の溶出プロセス中に、第２の下層クロマトグラフィー媒体が上層アフィニティクロマトグラフィー媒体からの任意の浸出親和性リガンドを捕捉する、多媒体アフィニティカラムを開発した（特許文献４）。
【００１２】
Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（特許文献５）は、不純な混合物からの核酸の単離のための混床固相を開発した。含まれる２つの相のそれぞれは、異なる溶液条件下で、標的核酸と結合およびそれを放出する能力を有する。
【００１３】
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．およびＥｂａｒａ  Ｃｏｒｐ．により出願されたさらなる特許出願（特許文献６）では、電気脱塩モジュールが開示され、イオン交換手段がアニオン交換繊維の織物およびカチオン交換繊維の織物が向かい合わせに配置された組立品からなる。
【００１４】
混床クロマトグラフィーは、単一装置中に一緒に組み合わされた２種以上の異なる吸着媒体を用いる。それにより、適用される種々の異なる相互作用が、単一装置内のタンパク質溶液の分析および精製のために使用可能となる。ＲａｓｓｉおよびＨｏｒｖａｔｈは、ＡＥＸ樹脂およびＣＥＸ樹脂からなる混床カラムが直列に連結された２つの別々のカラムと類似のタンパク質の分離をもたらすことを示した（非特許文献２）。これらのシステムを使って、彼らは、単一樹脂のみを用いた場合には同時に溶出するはずの、いくつかの異なるタンパク質の混合物を溶解することができた。
【００１５】
混床クロマトグラフィーは、種々の高存在量および低存在量のタンパク質の両方からなるために特に分析が難しいプロテオームの分析を含むいくつかの異なる用途に適用されてきた（非特許文献３）。
【００１６】
クロマトグラフィー樹脂などの分離材料は通常、最小限の流動不均一性を備えた効率的カラム充填を可能とする球状構造を示す。ビーズ間の隙間の空間は、クロマトグラフィーカラム内の対流輸送のための流路を提供する。これにより、大きな床厚のクロマトグラフィーカラムの、最小限の圧力低下で高線速度による駆動が可能となる。これらの要因の組み合わせにより、クロマトグラフィー樹脂が、生体分子の大規模精製に必要な効率、高透過性、および十分な結合能力を示すことが可能となる。
【００１７】
ビーズベースクロマトグラフィーでは、大部分の吸着に利用可能な表面積はビーズの内部にある。したがって、物質輸送速度が通常、細孔内拡散により制御されるので、分離プロセスは本質的に遅い。この拡散抵抗を最小化し、付随的に動的結合能力を最大化するために、小さい直径のビーズを用いることができる。しかし、小さい直径のビーズの使用の代償として、カラムの圧力低下が増大する。したがって、分取クロマトグラフ分離の最適化は、効率／動的能力（小さいビーズが有利）と、カラムの圧力低下（大きなビーズが有利）との間の妥協を必要とする場合が多い。
【００１８】
クロマトグラフィー媒体は通常、極めて高コスト（１０００ドル／Ｌを超える）であり、大規模生産用カラムにはかなりの量が必要となる。その結果、バイオ医薬品製造業者は、クロマトグラフィー樹脂を何百回も再生することになる。これらの再生サイクルのそれぞれは、相当量の媒体を消費し、それぞれのステップでは、それぞれの洗浄、滅菌、およびカラム充填操作に関連する追加のコストが発生する。
【００１９】
上記で示したように、特許文献にいくつかの技術が記載され、官能化繊維状媒体および／または複合材料をベースにしたバイオ医薬品分離用として市販されている。ほとんどのものは、繊維マトリックス中に多孔質ゲルを組み込むことに依存しており、ゲルは、適度な結合能力を得るために必要な表面積を提供する。しかし、このような構造では、一般に、ゲル位置および質量の不十分な均一性により不十分な効率がもたらされる（表面部の貫通孔および溶出フロント）。さらに、たとえ小さい床厚であっても、流れに対する抵抗が大きくなり得、わずかな圧力負荷下でのゲル圧縮によっても度々問題が悪化する。
【００２０】
採用された別の手法は、繊維マトリックス内への粒子の組み込みであり、粒子は多くの場合多孔質で、元々吸着機能を有する。例は、活性炭およびシリカゲルである。
【００２１】
目的
現在の下流プロセス（ＤＳＰ）は複雑で高価である。このことが、産業界がこれらのプロセスを縮小、単純化し、プロセスコストを減らすための新規技術の開発に興味を示す理由である。したがって、使用後にカラムを洗浄し、貯蔵するために必要な時間および緩衝液を省くことにより、製造コストを下げる安価な使い捨て型の吸着媒体を開発することが１つの目的である。また、より広範囲の種々の不純物を標的とすることにより、吸着媒体の性能を高めることも１つの目的である。
【００２２】
さらに、カスタマイズできる組成のリガンド化学を有し、吸着媒体が所与のフィード中に存在する特定の不純物混合物を標的にするように正確に調節できるのが望ましい。これは、樹脂および膜ベース吸着媒体を使って達成するには難題である。
【００２３】
また、床透過性および達成可能流量を犠牲にすることなく、生体分子クロマトグラフィー適用のために高表面積繊維とペンダント型吸着性官能基との組み合わせを提供するのが望ましい。
【００２４】
これに加えて、イオン交換材料として、または疎水性分離装置材料として使用できるように、従来の手順で誘導体化できる安価、製造可能で、既知組成の担体材料を提供することも本発明の１つの目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】米国特許第７，７１４，１１２号明細書
【特許文献２】米国特許第７，３８５，０４０号明細書
【特許文献３】特許第２６６０２６１号公報
【特許文献４】米国特許第８，０５３，５６５号明細書
【特許文献５】米国特許第６，２７０，９７０号明細書
【特許文献６】国際公開第２００５／０１１８４９号
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Ａ．Ｊｕｎｇｂａｕｅｒ，Ｇ．Ｃａｒｔａ，ｉｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｃａｌｅ−Ｕｐ；ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（Ｇｅｒｍａｎｙ）２０１０．
【非特許文献２】ｅｌ  Ｒａｓｓｉ，Ｚ．；Ｈａｒｖａｔｈ，Ｃ．；“Ｔａｎｄｅｍ  ｃｏｌｕｍｎｓ  ａｎｄ  ｍｉｘｅｄ−ｂｅｄ  ｃｏｌｕｍｎｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”；Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．１９８６，３５９，２５５−２６４．
【非特許文献３】Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ，Ｅ．；Ｒｉｇｈｅｔｔｉ，Ｐ．Ｇ．；“Ｍｉｘｅｄ−ｂｅｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｓ  ａ  ｗａｙ  ｔｏ  ｒｅｓｏｌｖｅ  ｐｅｃｕｌｉａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｓｉｔｕａｔｉｏｎｓ”，Ｊ．Ｃｈｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ２０１１，８９７，８２７−８３５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
先行技術の欠点は、本明細書で開示の実施形態により対処され、該実施形態は、クロマトグラフィー用、特に、イオン交換クロマトグラフィー用の吸着媒体、具体的には、この媒体を使って生物試料を精製するための該当する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本明細書で開示の、目的の生体分子および不純物を分離することによる生物試料の精製方法は、試料を、イオン交換クロマトグラフィーおよび／または疎水性相互作用を可能とする官能基を有する繊維からなるクロマトグラフィー媒体と接触させるステップと、非結合化学種を除去するためにまたは上記目的の生体分子を抽出するために、洗浄するステップとを含む。
【００２９】
詳細には、本発明による、目的の生体分子および不純物を含む試料を精製する方法は、一般に、
ａ）試料を用意するステップ、
ｂ）上記試料を、イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含む第１のクロマトグラフィー媒体と接触させるステップと、
ｃ）上記第１の繊維媒体を洗浄して非結合化学種を除去するステップと、
ｄ）上記第１の繊維媒体を洗浄して上記目的の生体分子を抽出するステップと、
ｅ）上記目的の生体分子を、イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含む第２のクロマトグラフィー媒体と接触させるステップと、
ｆ）上記第２の繊維媒体を洗浄して非結合化学種を除去するステップと、
ｇ）上記第２の繊維媒体を洗浄して上記目的の生体分子を抽出するステップと、を含み、
但し、ステップｂ）およびｅ）において異なる官能基を持つ繊維媒体が使用される。
【００３０】
ステップｂ）で、適用される試料が、アニオン交換クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含む第１のクロマトグラフィー媒体と接触され、ステップｅ）で、疎水性相互作用クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含むクロマトグラフィー媒体が使用される。しかし、この方法はまた、変更された形態でも実施可能であり、その場合、ステップｂ）で、上記試料が、カチオン交換クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含む第１のクロマトグラフィー媒体と接触され、ステップｅ）で、疎水性相互作用クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含むクロマトグラフィー媒体が使われる。この方法の別の実施形態では、ステップｂ）で、疎水性相互作用クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含むクロマトグラフィー媒体が使われ、ステップｅ）における上記イオン交換クロマトグラフィーがアニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィーである。しかし、適用される生物試料の性質に応じて、ステップｂ）でアニオン交換クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含むクロマトグラフィー媒体を使用し且つステップｅ）における上記第２のクロマトグラフィー媒体がカチオン交換クロマトグラフィーであることも可能であり、その逆であることもまた可能である。
【００３１】
別の実施形態では、本発明の方法のステップは、以下の通りである。
ａ）試料を用意するステップ、
ｂ）上記試料を、イオン交換クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含む第１のクロマトグラフィー媒体とイオン交換クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含む第２のクロマトグラフィー媒体との混合物と接触させるステップ、
ｃ）クロマトグラフィー媒体の上記混合物を洗浄して、非結合化学種を除去するステップ、および
ｄ）クロマトグラフィー媒体の上記混合物を洗浄して、上記目的の生体分子を抽出するステップ。
ここで、上記第１のクロマトグラフィー媒体は、アニオン交換クロマトグラフィーであり、上記第２のクロマトグラフィー媒体は、カチオン交換クロマトグラフィーであり、または逆であってもよい。
【００３２】
本発明の方法の別の変形形態は、
ａ）試料を用意するステップ、
ｂ）上記試料を、疎水性相互作用クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含む第１のクロマトグラフィー媒体とイオン交換クロマトグラフィーを可能とする官能基する繊維を含む第２のクロマトグラフィー媒体との混合物と接触させるステップ、
ｃ）クロマトグラフィー媒体の上記混合物を洗浄して、非結合化学種を除去するステップ、
および
ｄ）クロマトグラフィー媒体の上記混合物を洗浄して、上記目的の生体分子を抽出するステップ、を含むものである。
【００３３】
イオン交換クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含む第２のクロマトグラフィー媒体は、カチオン交換クロマトグラフィーであってもよく、アニオン交換クロマトグラフィーであってもよい。
【００３４】
本発明はまた、繊維の充填床を含むハウジングに関し、上記充填床は、第１の層および第２の層を有し、上記第１の層がイオン交換クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含み、上記第２の層が疎水性相互作用クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含む。上記イオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーであってもよく、カチオン交換クロマトグラフィーであってもよい。本発明によるハウジングの特定の実施形態は、繊維の充填床を含み、上記充填床は、第１の層および第２の層を有し、上記第１の層が疎水性相互作用クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含み、上記第２の層がイオン交換クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含む。上記イオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーであってもよく、カチオン交換クロマトグラフィーであってもよい。本発明の別の実施形態では、ハウジングは、繊維の充填床を含み、上記充填床は、第１のクロマトグラフィー媒体と第２のクロマトグラフィー媒体との混合物を有し、上記第１のクロマトグラフィー媒体は疎水性相互作用クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含み、上記第２のクロマトグラフィー媒体はイオン交換クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含む。含まれるイオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーであってもよく、カチオン交換クロマトグラフィーであってもよい。
【００３５】
目的の生体分子および不純物を含む試料を精製するための本発明の方法はまた、試料を、イオン交換クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含む第１のクロマトグラフィー媒体と接触させるステップ、および試料を、イオン交換クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含む第２のクロマトグラフィー媒体と接触させるステップにより実施されてもよい。好ましくは第１のクロマトグラフィー媒体はカチオン交換繊維であり、上記第２のクロマトグラフィー媒体はアニオン交換繊維である。本方法の別の好ましい実施形態では、上記第１のクロマトグラフィー媒体はアニオン交換繊維であり、上記第２のクロマトグラフィー媒体はカチオン交換繊維である。この方法のクロマトグラフィー媒体は、上記第１の官能基がフロースルーモードで精製を可能とするように、および上記第２の官能基がフロースルーモードで精製を可能とするように選択される。本発明の方法の別の実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、上記第１の官能基が結合／溶出モードで精製を可能とするように、および上記第２の官能基が結合／溶出モードで精製を可能とするように選択される。しかし、精製にとって有利であることが明らかになれば、上記第１の官能基がフロースルーモードで精製を可能とし、上記第２の官能基が結合／溶出モードで精製を可能とするように本方法を修正することもできる。
【００３６】
さらに、目的の生体分子および不純物を含む試料を精製するための本発明の方法はまた、試料を、イオン交換クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含む第１のクロマトグラフィー媒体と接触させるステップ、および試料を、疎水性相互作用クロマトグラフィーを可能とする官能基を有する繊維を含む第２のクロマトグラフィー媒体と接触させるステップにより実施されてもよい。本発明の方法のこの実施形態では、好ましくは第１のクロマトグラフィー媒体はカチオン交換繊維であり、上記第２のクロマトグラフィー媒体は疎水性相互作用クロマトグラフィー繊維である。別の理由で、目的の生体分子により必要とされる場合には、上記第１のクロマトグラフィー媒体はアニオン交換繊維であり、上記第２のクロマトグラフィー媒体は疎水性相互作用クロマトグラフィー繊維である。上記第１の官能基のみでなく、上記第２の官能基もフロースルーモードで精製を可能とする場合には、良好な精製結果が達成される。必要があり、またそれが有利な場合には、上記第１の官能基が結合／溶出モードでの精製を可能とし、上記第２の官能基が結合／溶出モードでの精製を可能とするクロマトグラフィー媒体を選択してよい。本発明の方法の別の実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、第１の官能基がフロースルーモードで精製を可能とするように、および上記第２の官能基が結合／溶出モードで精製を可能とするように選択されてよい。さらに、本発明の方法の特定の実施形態では、上記第１のクロマトグラフィー媒体および上記第２のクロマトグラフィー媒体は、様々に官能化された繊維の混合物として配置される、または上記第１のクロマトグラフィー媒体および上記第２のクロマトグラフィー媒体は、層として配置される。層状化クロマトグラフィー媒体の対応する実施形態は、以下でさらに詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、結合−溶出クロマトグラフィー精製ステップに続いて、フロースルーポリッシングステップを含むＤＳＰを採用した標準的ｍＡｂ精製スキームを示している。
【図２】図２は、タンデム型クロマトグラフィー（ＣＥＸ媒体およびＨＩＣ）によるｍＡｂ精製の分離方法の概略フロースキームを示し、次のステップを含む。  ｉ．プロテインＡ後のｍＡｂ装填（導電率３ｍＳ、ｐＨ５）  ｉｉ．高塩ｍＡｂ溶出（導電率３０〜１００ｍＳ、ｐＨ５）、このステップで、生成物ｍＡｂが上層のＣＥＸ媒体層から溶出されるが、下層のＨＩＣ媒体層に結合する。  ｉｉｉ．低塩ｍＡｂ溶出（導電率３ｍＳ、ｐＨ５）、このステップで、生成物ｍＡｂが低イオン強度溶出液による溶出により、下層のＨＩＣ媒体層から溶出される。
【図３】図３は、フロースルー精製後のｍＡｂ０４プロテインＡフィードからのＨＣＰ除去をバーチャートの形で示す。この場合、実施例５由来の記載媒体が使用される（ＡＥＸ繊維、ＣＥＸ繊維、およびＡＥＸおよびＣＥＸ媒体両方の混合物）。
【図４】図４は、０．４Ｍの硝酸セリウム（ＩＶ）アンモニウムの存在下で、選択された反応性メタクリル酸モノマー（（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ポリ（プロピレングリコール）−モノエスアクリレート、（フェニル）メタクリレート、（ｎ−ブチル）メタクリレート、（ｎ−ヘキシル）メタクリレート））で改質された翼状ナイロン繊維媒体の表面を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
開示クロマトグラフィー媒体は、高表面積を有する成形されたまたは多孔質繊維から誘導される。特定の実施形態では、成形繊維は、フィブリル構造または隆起構造を示す。特定の実施形態による高表面積繊維の例は、Ａｌｌａｓｓｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）から市販されている「翼状」繊維である。 翼状または極めて多孔質であってよい好適な繊維は、１ｇ当たり約１〜１４平方メートルの範囲の表面積を示す。
【００３９】
また、本明細書で開示のように、繊維状材料は、例えば、高表面積繊維にカチオン交換またはアニオン交換官能性を与える表面ペンダント型官能基を付加する方法で誘導体化される。このペンダント型官能基は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）などの生体分子のイオン交換クロマトグラフ精製に有用である。
【００４０】
本明細書で開示のクロマトグラフ交換材料は、少なくとも１〜１４ｍ2／ｇの範囲の高表面積を有し、さらには、それらの表面に官能基、すなわち、少なくともアニオン交換基、カチオン交換基または疎水性相互作用官能性を有する基を含む不織ポリマー繊維を含み、官能基は、混合されてまたはそのままで同じ繊維に表面に結合されてよく、様々に官能化された繊維は、相互に組み合わされてもよく、混合されてもよい。実施した官能化に応じて、本発明の材料は、アニオン交換またはカチオン交換吸着剤であるイオン交換材料である。本発明の別の実施形態では、官能化クロマトグラフ交換体材料は、既にイオン基により官能化されている同じ繊維の表面上に、または別の繊維表面上に疎水性相互作用官能基を含んでよい。
【００４１】
これは、本発明のクロマトグラフ交換体材料が異なる官能基を有する繊維を含んでもよい、または異なる官能基を有する繊維の混合物を含んでもよいことを意味する。好ましい実施形態では、本発明の材料は、一緒に混合され、クロマトグラフ媒体内で異なる官能基の均一に分散した混合物を示す。クロマトグラフ媒体の組成は、特定の用途に対する２つの異なるタイプの繊維の相対量を変えることにより、制御できる。例えば、５０％のアニオン交換体繊維（ＡＥＸ繊維）および５０％のカチオン交換体繊維（ＣＥＸ繊維）からなるクロマトグラフ媒体を特定の用途向けに作製可能である。別の例では、２５％のＡＥＸ繊維および７５％のＣＥＸ繊維からなるクロマトグラフ媒体を作製して、別の用途の特定の分離ニーズに対処可能である。
【００４２】
代替的実施形態では、本発明の材料は層構造を有し、異なる層が同じ繊維から作製でき、または各層が異なった官能性を有してもよい。したがって、異なる官能基を有する層が交互してもよい。これらの層は、特定の配列で、必要に応じて、数回交互してもよく、または同じ官能基を有する複数層が直接的に続けて数回繰り返されて、所望の層厚みが生成される。
【００４３】
クロマトグラフ交換体材料を形成する繊維は、１〜１４ｍ2／ｇの範囲の高表面積を有する繊維であり、８〜３２個の深いチャネルを有する軽量翼状繊維または高多孔度の繊維をベースにしたものである。翼状繊維は、均一な直線状輪郭を有する翼の間の８〜３２個の深いチャネルを特徴とするコアを共押出成形することにより作製され得る。高多孔度繊維も、クロマトグラフ交換体材料として使用できる。一般に、０．５ｍｍ〜５ｃｍの範囲の長さを有する繊維が本発明のクロマトグラフ交換体材料に使用される。本発明によるクロマトグラフ交換体材料は、０．５ｍｍ〜２．５ｃｍの範囲の長さを有する繊維から構成されるのが好ましい。特に好ましいのは、０．５ｍｍ〜２ｍｍの範囲の長さを有する繊維を含むクロマトグラフ交換体材料である。
【００４４】
クロマトグラフ交換体材料が、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ（エチレンオキシド）、ポリエステル、ポリプロピレン、メチル、メタクリレート、（ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ（プロピレングリコール）モノメタクリレート、（フェニル）メタクリレート、（ｎ−ブチル）メタクリレート、（ｎ−ヘキシル）メタクリレート、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、およびポリアミドの群から選択されるポリマーから作製された繊維を含む場合に、有利であることが明らかになった。
【００４５】
本明細書で開示のクロマトグラフ交換体材料により、生体液の分離および精製方法において大きく改善された特性を有する新規装置を製造できる。したがって、該当する装置もまた本発明の対象である。実験から、クロマトグラフ交換体材料を含む装置で、繊維がポリアミド、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）またはポリプロピレン（ＰＰ）から作製され、特にアクリルモノマーで誘導体化された繊維を含む装置が特に好適するということが明らかになった。アクリルモノマーは、２−ヒドロキシルエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、アクリルアミド、アクリル酸、アクリロニトリル、メチルメタクリレートおよびグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）の群から選択されてよい。これらのアクリルモノマーは、そのままの、またはこれらを組み合わせた誘導体化に使用できる。特に好ましいのは、繊維がグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）または２−ヒドロキシルエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）およびグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）の組み合わせで誘導体化されている対応する装置である。本発明により、これらの装置は、このような誘導体化繊維から作製され、次に、該繊維が官能基を含む化合物またはリガンドとの反応により改質されるのが好ましい。上記官能基は、アミノ、カルボキシル、ヒドロキシル、エポキシ、スルホプロピル、スルホン酸、およびスルフヒドリル基から選択される。
【００４６】
新規装置は、極めて安価な繊維および方法を使って製造され得るので、それらは使い捨て型の装置として作製できる。
【００４７】
本発明の目的はまた、生物試料から標的作用物質を分離する方法であり、該方法は、
ａ）標的作用物質を含む試料を用意するステップと、
ｂ）試料を本明細書で開示のクロマトグラフ交換体材料と接触させるステップと、
ｃ）標的作用物質を高表面積繊維と結合させ、それにより、試料から分離するステップと、を含む。
次のステップ（ｄ）では、ステップ（ｃ）から得られた試料が収集され得るか、またはステップ（ｃ）から得られた試料がステップ（ｄ）で回収され、次のステップ（ｅ）で、繊維から標的作用物質を引き離すように標的作用物質と繊維との間の結合を妨害する溶出用溶液を使って、不織布繊維状材料に結合した標的作用物質を不織布材料を通して溶出することにより収集される。この方法の特定の実施形態では、不織布材料は、シートに圧縮されるか、またはカラム中に充填して圧縮される。
【００４８】
この方法は、標的作用物質が、タンパク質、ペプチド、脂質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、有機分子、無機分子、細胞、ウイルス、細菌、毒素またはプリオンである分離方法に特に好適する。
【００４９】
上述のクロマトグラフィー媒体は、成形繊維から誘導してもよい。特定の実施形態では、成形繊維は、フィブリル構造または隆起構造を示すことが明らかになった。これらの隆起は、通常の繊維と比べて繊維の表面積を大幅に増加させることができる。したがって、通常、床透過性の著しい低下および対応する流速低下をもたらす繊維直径を縮小させることなく、高表面積が得られる。
【００５０】
特定の実施形態による高表面積繊維の一例は、Ａｌｌａｓｓｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から市販されている「翼状」繊維である（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ；Ａｌｌａｓｓｏ  Ｗｉｎｇｅｄ  Ｆｉｂｅｒ（登録商標））。これらの繊維はナイロンから作製され、極めて軽量であり、１ｇ当たり約１〜１４平方メートルの範囲の同じ合計表面積を有する。これらの繊維は、特殊設計スピンパックを通して共押出される成形コアポリマーおよび犠牲ポリマーを含む。コアは、均一な直線状輪郭を有する翼の間の８〜３２個の深いチャネルを特徴とする。被覆ポリマーは、繊維形成中にチャネルを埋め、最終生成物の仕上げ中に溶解される。
【００５１】
既に言及したように、以前の高多孔度繊維も本発明に適用可能である。
【００５２】
これまでに、イオン性および疎水性相互作用の両方を含む混合官能基を有する繊維材料を使えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）生体分子のクロマトグラフ精製を簡略化した条件下で処理して改善された結果を得ることができることが明らかになった。
【００５３】
このように、表面ペンダント型官能基を付加して、例えば、高表面積繊維にＣＥＸ、ＡＥＸ、または疎水性相互作用官能性を与える方法が開発される。
【００５４】
好適な官能化高表面積繊維の製造のために、ナイロンから作製されるＡｌｌａｓｓｏ社製のＷｉｎｇｅｄ  Ｆｉｂｅｒｓ（翼状繊維）が適用できるのみでなく、少なくとも１ｇ当たり１〜１４平方メートルの範囲の高表面積を示す他の繊維も使用してよい。例えば、高多孔度繊維も同様に適用してよい。このような繊維は、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００２，３５，８４５６−８４６６中でＳ．Ｍｅｇｅｌｓｋｉらによって開示され、ポリスチレン、ポリカーボネート、またはポリ（エチレンオキシド）から紡糸される。しかし、ポリエステル、ポリプロピレン（ＰＰ）、メチルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ（プロピレングリコール）モノメタクリレート、（フェニル）メタクリレート、（ｎ−ブチル）メタクリレート、（ｎ−ヘキシル）メタクリレート、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、またはポリアミドの対応する繊維も同様にこの目的に使用できる。繊維の好ましい基は、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、またはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）から作製される。
【００５５】
これらの改質高表面積繊維を使用することにより、ペンダント型ＡＥＸおよびＣＥＸリガンドを有する繊維によるクロマトグラフィー媒体を使用する代替のモードの精製を提供し得る。本発明の一実施形態では、ＡＥＸ繊維およびＣＥＸ繊維媒体の両方が混合されて単一装置に充填される。この形式は、この手法による操作上の単純さおよびプロセステンプレートの圧縮に対する潜在能力の点で有利である。
【００５６】
別の実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィー用の繊維媒体の設計に対する有利な性質が明らかになった。このタイプの繊維媒体は、いわゆる「タンデム型クロマトグラフィー」で有用である。この場合には、１個のみのクロマトグラフィーカラムが用意され、このクロマトグラフィーカラム内に、２つの異なるタイプの繊維クロマトグラフィー媒体が別個の層として配置される。
【００５７】
この特殊配置は、第１の層に配置したＣＥＸ繊維媒体を使った結合／溶出精製に続く溶出を行い、その後、同じクロマトグラフィーカラム内またはその他の好適な装置内の第２の層に配置した上述のＨＩＣ繊維媒体を有する疎水性相互作用クロマトグラフィー精製によりモノクローナル抗体フィード流が精製される場合の用途に好適する。
【００５８】
本明細書で記載のタイプの繊維ベースイオン交換体の混床の組み合わせは、別の予想外の利点を有することが明らかになった。特に、種々のイオン交換または疎水性相互作用クロマトグラフィーリガンド官能基を有する繊維媒体は、容易に層構造中に配置できるが、ビーズベースのシステムでは、この形式は容易には実現できない。
【００５９】
混床クロマトグラフィーは、組み換え細胞由来の治療用タンパク質の精製にとって特に強力な方法である。理由は、これらの供給源が多種多様の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物を含むためである。これらのタンパク質不純物は、単一のタイプのクロマトグラフィー媒体を使った場合には、低濃度時に除去するのが特に困難である。１つの手法は、いくつかの異なる吸着媒体を一連のカラムに配置することである。しかし、これは、下流プロセスのデッドボリュームおよび複雑さを著しく増加させることになる。単一の装置中に異なる吸着媒体を組み合わせることにより、単一ステップで異なる不純物を除去することが可能となる。
【００６０】
意外にも、ＡＥＸ官能化繊維媒体およびＣＥＸ官能化繊維媒体からなる混床クロマトグラフィー装置は、抗体溶出からの残留ＨＣＰのフロースルー除去に極めて効率的である。混合繊維床は、正および負電荷ＨＣＰの両方の除去を可能とする。官能化繊維の相対的低コストにより、それらを単回使用、使い捨て型の用途に使用することが可能となる。
【００６１】
表面改質クロマトグラフィー媒体をハウジング内で別々のバンドに層化する本発明により、単一クロマトグラフィーカラムまたはその他の好適なクロマトグラフィー装置を使って、改善された分離および精製結果が得られる。「層化」は、最初に媒体をカラムに適用し、媒体を高密度に圧縮して下層を形成することにより実現される。その後、第２の層をカラムに適用し、媒体を高密度に圧縮して、上層が形成される。最終的に、クロマトグラフィーカラムまたはその他の好適なクロマトグラフィー装置上への上部流量分配ヘッダーの設置により、層化媒体を第３の最も高い密度に圧縮することができる。２つの直交モード分離を可能とする、ＣＥＸリガンド（例えば、実施例３で開示のような）および疎水性相互作用クロマトグラフィーリガンド（例えば、実施例６で開示のような）の２つのタイプの異なるリガンドを有する繊維ベースクロマトグラフィー媒体を含む層状カラムを含む単一カラムを提供可能である。図２では、第１の層のＣＥＸ繊維媒体が第２の層のＨＩＣ繊維媒体の上に設置される「タンデム型クロマトグラフィー」用の層状媒体カラムが開示される。この形式は、最初にプロテインＡ後溶出プール（ｍＡｂフィード）を層状カラムの上部に適用することにより、例えば、モノクローナル抗体プロセス流の精製で使用できる。
【００６２】
一実施形態では、ｍＡｂフィードは、低導電率（通常、３ｍＳ／ｃｍ）であり、適切な緩衝系で調節後、ｐＨ５を有する（図２）。このｍＡｂフィード溶液は、カラムに装填され、最初にＣＥＸ繊維媒体層と接触し、イオン交換相互作用によりｍＡｂが繊維媒体に結合する。繊維媒体は適切な緩衝液で洗浄され、全ての非結合ＨＣＰ、ＤＮＡまたはその他の不純物が除去される。洗浄後、高導電率（３０〜１０００ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ５）の溶出緩衝液がカラムに加えられ、ＣＥＸ層からｍＡｂが溶出される。溶出ｍＡｂがＨＩＣ繊維媒体により占められたカラムのゾーンに移動するに伴い、疎水性相互作用によりｍＡｂがＨＩＣ媒体に結合する（ＣＥＸ媒体層からの溶出のために使用される緩衝液の高イオン強度のために）。繊維媒体は適切な高イオン強度の緩衝液で再度洗浄され、カラムのＨＩＣ繊維媒体部分から全ての非結合ＨＣＰまたはその他の不純物が除去される。最終的に、低いイオン強度（３ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ５）の溶出緩衝液がカラムに加えられ、ＨＩＣ層からｍＡｂが溶出される。このステップ後の単離ｍＡｂ生成物は、低導電率を有し、その後のＡＥＸベースポリッシング操作に対して、わずかなｐＨ調節しか必要ない。
【００６３】
図２は、タンデム型クロマトグラフィー（ＣＥＸ媒体およびＨＩＣ）によるｍＡｂ精製の一例である上記分離方法の概略フローを示し、次のステップを含む。
ｉ．プロテインＡ後のｍＡｂ装填（導電率３ｍＳ、ｐＨ５）
ｉｉ．高塩ｍＡｂ溶出（導電率３０〜１０００ｍＳ、ｐＨ５）、このステップで、生成物ｍＡｂが上層のＣＥＸ媒体層から溶出されるが、下層のＨＩＣ媒体層に結合する。
ｉｉｉ．低塩ｍＡｂ溶出（導電率３ｍＳ、ｐＨ５）、このステップで、生成物ｍＡｂが低イオン強度溶出液による溶出により、下層のＨＩＣ媒体層から溶出される。
【００６４】
この時点で、溶出したｍＡｂは、溶液導電率を下げるために希釈する必要もなく、その後のＡＥＸポリッシング操作への準備完了状態になっている。
【００６５】
前述のように、本明細書で記載の解決策は、使い捨て型を含み、低材料コストで実施し得る、安価なｍＡｂ分離方法を提供する。これに加えて、液体量の反復削減ならびにｐＨ値および導電率の調節を行いながら別のカラムおよび選別装置で実施する必要があった異なるプロセスステップが、結合部位への基質の対流輸送が起こる単一カラム中で実施される手順に圧縮される。
【００６６】
高表面積繊維の表面官能化は、２ステッププロセスによっても達成することができる。好適な官能化プロセスは、国際公開第２０１２／０１５９０８Ａ号で開示のグラフト重合である。この官能化は、繊維表面、例えば、ナイロン６、ポリアミドから作製された翼状繊維の表面へのペンダント型アリル基の結合で開始される。このステップでは、繊維は、水酸化ナトリウム水溶液の存在下、５０℃で１２時間、アリルグリシジルエーテルで処理される。この繊維表面の官能化の第１ステップは、上述の特許出願に開示のように、またはエピクロロヒドリンまたは（メタ）アクリルグリシジルエステルなどの別の好適なモノマーによる変更条件下で、実施することができる。ペンダント型アリル基はその後、ペンダント型アクリルアミドポリマー官能基のための結合点としての、繊維表面上の固定部位として機能する。アクリルアミドモノマーの溶液重合のための条件が提供され、繊維表面上のペンダント型アリル基が溶液中で成長するポリマー鎖に結合する。このようにして、その後、アリル官能化繊維が、約８０℃で約４時間、２−アクリルイミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルイミドおよび過硫酸アンモニウムの水溶液で処理され得る。この温度に加熱時に、過硫酸塩の分解により、アクリルモノマーのフリーラジカル重合が開始される。この反応では、スルホン酸基を含むカチオン交換体が収容される。これらの条件下で、繊維表面上のペンダント型アリル基は、ペンダント型アクリルポリマー官能基のための結合点として機能可能であり、アクリルポリマーは、繊維表面に共有結合する。
【００６７】
高表面積繊維の表面改質にセリウムイオンレドックスグラフト重合を用いてもよい。これらの条件下で、酸は、ＨＮＯ3であってよく、Ｃｅ（ＶＩ）イオンは、（硝酸セリウム（ＩＶ）アンモニウムなどの）塩により提供される。この場合、反応時間は遥かに短く、温度はより低い。
【００６８】
一般に、セリウムイオンレドックスグラフト化反応は、ＭｉｎｏおよびＫａｉｚｅｒｍａｎ［Ｍｉｎｏ，Ｇ．，Ｋａｉｚｅｒｍａｎ，Ｓ．Ｊ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１，２４２−２４３（１９５８）およびＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３８，３９３−４０１（１９５９）］に従って処理され、この反応は硝酸水溶液中で実施される。この反応は、水溶液に可溶性のモノマーを使って実施できる。水溶性でないモノマーが使われる場合には、ジオキサンまたはテトラヒドロフランなどの好適な可溶化剤により、溶解度を改善できる。
【００６９】
後続反応ステップでは、官能化繊維と、メタノール中の５０重量％トリメチルアミン（水性の）溶液と単純に混合することにより、例えば、ポリ（グリシジルメタクリレート）で改質された表面官能化繊維をアニオン交換体に変換できる。
【００７０】
適切に適合されたグラフト化反応により、および適切な反応物質の使用により、架橋しないで、種々の官能基を保持するポリマー鎖を適用繊維の表面に共有結合することが可能である。
【００７１】
用語の「官能基」は、活性結合、加水分解性結合、水和性結合、水素結合を形成させるイオノゲン（イオン化可能）電荷保持（カチオン性またはアニオン性）基などが包含された用語である。このような基の例は、−ＯＨおよび／または−ＣＯ−および／または−ＮＨ2および／または−ＳＯ3-および／または−ＳＯ4-および／または−ＰＯ4-および／または−ＳＯ2Ｃｌおよび／または−ＮＨ4+および／または−ＣＯＮＨおよび／または−ＣＨＯおよび／または−ＣＯＯＨおよび／または−ＣＯＯ-および／または−ＳＨである。
【００７２】
したがって、アニオン交換クロマトグラフィー用の好適な官能基は、例えば、四級アンモニウム基、例えば、４級ヒドロキシプロピルジエチルアミノエチル基、４級トリメチルアミノエチル基、またはジエチルアミノエチル基である。官能基のイオン解離の程度に応じて、アニオン交換体は、強、中、弱塩基アニオン交換体として分類できる。
【００７３】
本発明の別の実施形態では、適用繊維は、酸性基を有するカチオン交換体として、官能化される。カチオン交換クロマトグラフィー用の好適な官能基は、例えば、スルホメチル基、スルホプロピル基、またはカルボキシメチル基である。
【００７４】
疎水性相互作用クロマトグラフィー用に好適な基は、例えば、タンパク質と弱い相互作用を可能とするエーテルおよびメチルリガンドなどのアルキルおよびアリールリガンド、またはより強く相互作用を示すブチルもしくはオクチルリガンド、フェニル、またはその他のアリールリガンドである。
【００７５】
少なくとも１個の水素原子の官能基による置換は、メチレン、エチレン、プロピレンまたはブチレン架橋または対応するアルコキシまたはアリールを介して間接的に作製できる。
【００７６】
前述のように、官能基は、好適なグラフトポリマーにより適用繊維の表面に結合できる。一般に、グラフト重合は、好適な開始剤の存在下で既知の方法により実施される。該開始剤は、セリウム（ＩＶ）イオン（硝酸セリウムアンモニウム：（ＮＨ4）2Ｃｅ（ＮＯ3）6）、セリウム（ＩＶ）サルフェート、硫酸セリウムアンモニウム、鉄（ＩＩ）−過酸化水素（Ｆｅ2+−Ｈ2Ｏ2：フェントン試薬）、コバルト（ＩＩＩ）アセチルアセトネート錯塩、Ｃｏ（ＩＩ）−モノ過硫酸カリウム、亜硫酸ナトリウム−過硫酸アンモニウムなどのレドックス開始剤、またはアゾビスイソブチロニトリル（Ｃ8Ｈ12Ｎ4：ＡＩＢＮ）、過硫酸カリウム（Ｋ2Ｓ2Ｏ8：ＫＰＳ）、過硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2Ｓ2Ｏ8：ＡＰＳ）、および過酸化ベンゾイル（Ｃ14Ｈ10Ｏ4：ＢＰＯ）などのフリーラジカル発生剤であってよい。
【００７７】
例えば、グラフト重合は、好適なセリウム（ＩＶ）塩のアクリル酸およびメタクリル酸などの酸性モノマーを使って処理できる。このようなモノマー酸が、中性のモノマー、例えば、メチルメタクリレート、メチルアクリレートおよびアクリロニトリルなどと組み合わされる場合、たとえ中性のモノマーが比較的低い比率であっても、繊維上のグラフト化が極めて容易に起こる。得られたグラフトコポリマーは弱酸性で、高容量のカチオン交換体である。
【００７８】
用いられる繊維および誘導体化に使用されるモノマーの化学的性質に応じて、異なる反応および機構が起こり得、適切な表面改質のための可能な手法は、
−原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）
−ＵＶ開始フリーラジカル重合
−熱開始フリーラジカル重合
−アニオン重合
−カチオン重合
−ガンマ線開始フリーラジカル重合
−遷移金属触媒重合
−可逆的付加フラグメンテーション連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）である。
【００７９】
グラフト重合を実施するための種々の好適なモノマーが存在する。生成される材料の望ましい特性に応じて、種々のモノマーを適用してよい。
【００８０】
正電荷をグラフトテンタクル中に導入するために、下記の群からモノマーが選択できる：
２−（アクリロイルアミノエチル）トリメチルアンモニウムクロリド、
３−（アクリロイルアミノプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、
２−（ジエチルアミノエチル）アクリルアミド、
２−（ジエチルアミノエチル）メタクリルアミド、
２−（ジメチルアミノエチル）アクリルアミド、
２−（ジメチルアミノエチル）メタクリルアミド、
３−（ジエチルアミノプロピル）アクリルアミド、
３−（ジエチルアミノプロピル）メタクリルアミド、
３−（ジエチルアミノプロピル）アクリルアミド、
３−（ジエチルアミノプロピル）メタクリルアミド、
２−（メタクリロイルアミノエチル）トリメチルアンモニウムクロリド、
３−（アクリロイルアミノプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩、
［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］ジメチル（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド分子内塩、
２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、
２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、
２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩、
２−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート、
２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレート。
【００８１】
次の群から選択されるモノマーを使用することにより、テンタクル中に負電荷を生成できる：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、
２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム塩溶液、
２−アクリルアミドエタンスルホン酸、
カルボキシメチルアクリルアミド；カルボキシエチルアクリルアミド、
カルボキシプロピルアクリルアミド、
カルボキシメチルメタクリルアミド、
カルボキシエチルメタクリルアミド、
カルボキシプロピルメタクリルアミド、
アクリル酸、
メタクリル酸、
３−スルホプロピルメタクリレートカリウム塩。
【００８２】
また、下記の群から選択されるモノマーを使用することにより、生成されたテンタクル中に疎水基が導入される：
Ｎ−ベンジル−２−メチルアクリルアミド、
Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、
Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、
Ｎ，Ｎ−ジエチルメタクリルアミド、
メチルメタクリレート、
エチルメタクリレート、
ヒドロキシエチルメタクリレート、
プロピルメタクリレート、
ｎ−ブチルメタクリレート、
イソブチルメタクリレート、
ｓｅｃ−ブチルメタクリレート、
ｔｅｒｔ−ブチルメタクリレート、
ヘキシルメタクリレート、
ラウリルメタクリレート、
イソボルニルメタクリレート、
ベンジルメタクリレート、
１−ナフチルメタクリレート、
２−ナフチルメタクリレート、
２−エチルヘキシルメタクリレート、
シクロヘキシルメタクリレート、
３，３，５−トリメチルシクロヘキシルメタクリレート、
フェロセニルメチルメタクリレート、
フェニルメタクリレート。
【００８３】
当業者なら、ここで列挙したもの以外の、より好適し、このような状況下でモノマーとしての役割を果たすことができ、生成したポリマー鎖中に正または負電荷を導入するのに好適する化学化合物を知っている。
【００８４】
本発明による分離材料の製造のための好適な繊維は、任意の長さおよび直径であってよく、好ましくは、切断もしくは短繊維または不織布である。繊維は、一体構造物として一緒に結合されている必要はないが、個々の別々の実体として効果的に機能することができる。繊維は、長さが不定の糸もしくはモノフィラメントなどの連続長の形態であってよく、または繊維は、不織布もしくは織布などの繊維状材料を細断することにより（例えば、短繊維）、または不織布もしくは織物を細断することにより、連続長繊維を個別片に切断することにより、結晶成長法により、等々で、より短い個々の繊維の形にしてもよい。繊維は、熱可塑性ポリマー、例えば、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリアミド、熱可塑性ウレタン、ポリスチレン、コポリエステル、または液晶ポリマーから作製されるのが好ましい。
【００８５】
本明細書で記載の目的に使われるのが好ましい繊維は、繊維の断面寸法の最大幅より遥かに大きい長さを有し、密な塊を形成しない。これらの繊維は数メリメートルから数センチメートルの範囲の長さであるのが好ましい。本発明の目的のために、使われる繊維は、０．５ｍｍ〜５ｃｍの範囲の長さを有し、より好適するのは、０．５ｍｍ〜２．５ｃｍの範囲の長さを有する対応する繊維である。特に好適するのは、約０．５ｍｍ〜２ｍｍの範囲の長さを有する繊維である。
【００８６】
特定の実施形態では、繊維の断面長は約１μｍ〜約１００μｍであり、断面幅は約１μｍ〜約１００μｍである。１つの好適な繊維の断面長は約２０μｍであり、断面幅は約１０μｍである。繊維の断面長は約１０〜２０μｍであるのが好ましい。
【００８７】
特定の実施形態では、繊維断面は、全体として翼状の形をしており、本体領域が実質的に長手方向軸を規定し、複数の突起部が本体領域から外向きに放射状に伸びている。突起部は、繊維の長さに沿って延びる共線形チャネルのアレイを形成し、該チャネルは繊維当たり、通常２０〜３０個である。特定の実施形態では、突起部の長さは、本体領域の長さより短い。特定の実施形態では、繊維断面は、全体として翼状の形をしており、中間領域は、繊維の中心を下方に向かう長手方向軸を含み、およびこの中間領域から伸びる複数の突起部を有する。特定の実施形態では、複数の突起部は、中間領域からほぼ放射状に伸びている。この構成の結果、これらの突起部によって複数のチャネルが画定される。突起部間の好適なチャネル幅は、約２００〜約１０００ｎｍの範囲である。好適な繊維は、米国特許出願公開第２００８／０１０５６１２号に開示されており、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８８】
少なくとも１ｍ2／ｇ〜約１４ｍ2／ｇまたはさらに大きい範囲の表面積を有する繊維が好適する。さらに、好ましくは少なくとも２０ｍ2／ｇの表面積を有する繊維、またより好ましくは少なくとも２５ｍ2／ｇの表面積、またさらに好ましいのは少なくとも３０ｍ2／ｇの表面積を有する繊維が好適する。これは、翼状繊維ならびに高多孔度繊維に当てはまる。したがって、この範囲の表面積を有する繊維が使われるのが好ましいが、遥かに大きい表面積を有する繊維も、本発明による分離材料の作製に適用してよい。
【００８９】
好適な繊維には、米国特許仮出願第６２／０４４，６３０号に記載のものなどの多孔質繊維が含まれる。この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
多孔質繊維は、高表面積を有してもよいが、細孔が、グラフト重合により官能化可能であって、しかし、それにより後の分離プロセスにおいて有効性およびアクセシビリティが制限されない大きさであることが極めて重要である。さらに、応用時に、これらの多孔質繊維が必要な安定性を有し、それにより、圧縮されたクロマトグラフィーカラム中での使用に好適することが重要である。
【００９１】
特定の実施形態では、製品が直ぐに使用できる状態で到着した時に使用者による充填が必要でないように、繊維は、適当な出入口および寸法を有する装置または容器に圧縮状態で容易に充填することができる。また、繊維は、不織布産業において一般的な、スパンボンド法（連続フィラメント）または湿式載置法（カット繊維）法によって作製される不織布シート素材などの予備成形された床形式で使用できる。好適な予備成形繊維形態としては、シート、マット、ウェブ、モノリスなどが挙げられる。
【００９２】
成形繊維媒体は、多孔質クロマトグラフィービーズと比べて、その形態の性質によって特定の利点を提供する。通常、ビーズベースのクロマトグラフィーでは、分離プロセスの律速段階は、拡散によって制御される、多孔質ビーズの深さへの吸着質（溶質）の侵入である。タンパク質などの高分子の場合には、この拡散輸送が比較的遅い可能性がある。本明細書に開示の高表面積繊維では、結合部位は、主に繊維の外側に露出しているため、フロー流中の吸着質分子によるアクセスは容易である。この手法によって提供される迅速な輸送は、短い滞留時間（速い流速）を可能にし、それによって、模擬移動床システムなどの手段による媒体の迅速な循環を可能にする。処理速度は、生物製剤の生産において重要なパラメーターであるため、本明細書で記載の繊維ベースのクロマトグラフィー媒体は、従来のビーズベースの媒体と比べて、特定のプロセス上の利点を有する。
【００９３】
床高さ１〜５ｃｍで、約０．１〜０．４ｇ／ｍｌの間の、好ましくは、約０．３２ｇ／ｍｌの好適なカラム充填密度が、クロマトグラフィー評価において許容可能な性能実現のための十分な流れの均一性を提供する。本明細書で開示の実施形態の表面官能化繊維媒体は、充填床形式において高透過性を示す。
【００９４】
本明細書で記載の、この新規表面官能化繊維媒体の特定の利点はその汎用性にある。使用繊維およびそれらの誘導体化に応じて、種々の標的分子、例えば、タンパク質、特にプロテインＡ、ペプチド、脂質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、有機分子、無機分子、細胞、ウイルス、細菌、毒素またはプリオンなどの分離および精製が可能である。特に、生体液に適用される分離プロセスでは、本明細書で記載の材料の特性が特に有利で、効果的であることが明らかになった。
【００９５】
略語：
ＡＥＸ  アニオン交換クロマトグラフィー媒体
ａｑ．  水性の
ＡｒＩＳ−ＡｒＩＲ  黄色ブドウ球菌中の毒性遺伝子発現の制御因子である２成分系
ＣＥＸ  カチオン交換クロマトグラフィー媒体
ＣＨＯ  チャイニーズハムスター卵巣
ＣＶ  カラム容積
ＤＩ  脱イオン水
ＤＮＡ  デオキシリボ核酸
ＤＳＰ  下流プロセス
Ｆａｂ  抗原結合断片（Ｆａｂ断片）は、抗原に結合する抗体の領域である。
Ｆｃ領域  （フラグメント、結晶性）領域、抗体のクラスに応じて、２つまたは３つの定常ドメインに寄与する２つの重鎖からなる。
ＧＭＡ  グリシジルメタクリレート
ＨＣＰ  宿主細胞タンパク質
ＨＩＣ  疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＩｇＧ  免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、またはガンマグロブリン、クラスＧの抗体（免疫グロブリン）
ＬＲＶ  「ｌｏｇ除去値」、この用語は、精製ステップの装填物中の不純物の質量の、生成物プール中の不純物の質量に対する比のｌｏｇ（底を１０とする）を意味する。
ｍＡｂ  モノクローナル抗体
Ｑ−官能化  四級アンモニウム（Ｑ）を使った表面官能化
【００９６】
表の簡単な説明
表１：床厚およびカラム容積、圧力および流量、透過性および速度の点から見たＡＥＸ繊維、ＣＥＸ繊維またはＡＥＸおよびＣＥＸ繊維の両方の混合物を充填されたカラムの特性。
表２：特性、フロースルー、繊維上のｍＡｂの装填、ｍＡｂの回収、ＨＣＰ濃度およびＨＣＰのＬＲＶから見たＡＥＸ繊維媒体、ＣＥＸ繊維媒体および混合ＡＥＸ／ＣＥＸ繊維媒体カラムを使ったｍＡｂ０４のフロースルー精製データ。
【００９７】
本記載は、当業者が本発明を広い範囲にわたり適用するのを可能とする。したがって、さらなる補足説明がない場合であっても、当業者なら上記説明を最も広い範囲で使用可能であることが想定されている。
【００９８】
不明確なことがあれば、引用された刊行物および特許文献を参照することは当然のことである。したがって、これらの文献は、本明細書の開示内容の一部と見なされる。
【００９９】
よりよき理解のため、また、本発明を例示するために、以降で、本発明の保護の範囲内にある実施例が示される。これらの実施例は、可能な変形物を例示する役割も果たす。しかし、記載された本発明の原理の全体的妥当性のために、実施例は本出願の保護範囲をこれらの実施例のみに縮小するのは妥当ではない。
【０１００】
さらに、所与の実施例において、また説明の残りの部分においても、組成物中に存在する成分の量は、常に必ず合計して、組成物全体を基準にして、１００重量％または１００モル％になり、たとえ高い値が示されたパーセント範囲で生ずることがあっても、これを超えることはあり得ないことは、当業者にとって当然のことである。特に指示がない限り、％データは、比率の場合を除いて、重量％またはモル％である。比率は、例えば、混合物中の特定の体積比の溶媒が使用される、溶出液の調製のためなどに、体積データで示される。
【０１０１】
実施例および説明ならびに請求項中の所与の温度は、常に℃で表される。
【実施例１】
【０１０２】
非改質ナイロン繊維のグラフト重合
５００ｍｌのボトルに、Ａｌｌａｓｓｏ社製ナイロン繊維１０ｇおよび水（４６６ｍＬ）を入れる。１４ｍｌの１Ｍ  ＨＮＯ3（１４．４ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、続けて１．２ｍｌの０．４Ｍの１Ｍ  ＨＮＯ3中硝酸セリウム（ＩＶ）アンモニウム溶液（０．４８０ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を１５分間撹拌する。３．３９ｇのグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ、２４ｍｍｏｌ）を加える。ここで、撹拌した反応混合物を１時間、３５℃に加熱する。室温に冷却後、固形物を脱イオン水（３ｘ３００ｍＬ）で洗浄し、湿った材料を次のステップですぐに使用する。
【実施例２】
【０１０３】
エポキシ官能化繊維のＱ官能化（ＡＥＸ繊維媒体）
２Ｌのボトルに、水（５００ｍｌ）およびメタノール中５０重量％トリメチルアミン（水性の）溶液（５００ｍｌ）と共に、実施例１からの湿ったＧＭＡ官能化繊維を入れる。混合物を室温で１８時間攪拌する。その後、繊維固形物を、０．５Ｍ硫酸中０．２Ｍアスコルビン酸溶液（３×４００ｍｌ）、脱イオン水（３×４００ｍｌ）、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液（３×４００ｍｌ）、脱イオン水（３×４００ｍｌ）およびエタノール（１×４００ｍｌ）で洗浄する。続けて、材料をオーブン内に入れ、４０℃で４８時間乾燥させる。
収量：１１．７４ｇの白色の繊維状固形物を得る。
【実施例３】
【０１０４】
非改質ナイロン繊維のグラフト重合（ＣＥＸ繊維媒体）
１０００ｍｌのボトルに、Ａｌｌａｓｓｏ社製ナイロン繊維１０ｇおよび水（４６０ｍｌ）を入れる。２９．８ｍｌの１Ｍ  ＨＮＯ3溶液（３０ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、続けて７．４６ｍｌの１Ｍ  ＨＮＯ3中０．４Ｍ硝酸セリウム（ＩＶ）アンモニウム溶液（３．００ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を１５分間撹拌する。次に、６１．５ｇの３−スルホプロピルメタクリレートカリウム塩（３−ＳＰＭＡ、２５０ｍｍｏｌ）を加え、得られた撹拌反応混合物を１８時間、３５℃に加熱する。室温に冷却後、それぞれのボトルからの繊維固形物を、脱イオン水（３×３００ｍｌ）、０．５Ｍ硫酸中０．２Ｍアスコルビン酸溶液（３×３００ｍｌ）、脱イオン水（３×３００ｍｌ）、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液（３×３００ｍｌ）、脱イオン水（３×３００ｍｌ）およびエタノール（１×３００ｍｌ）で洗浄する。その後、作製した材料をオーブン内に入れ、４０℃で乾燥させる。
収量：１１．３８ｇの白色の繊維状固形物を得る。
【実施例４】
【０１０５】
混合イオン交換媒体のカラム充填
０．３５ｇの記載繊維媒体（表１参照）の２５ｍＭトリスｐＨ８中スラリーを、６．６ｍｍＩＤ  Ｏｍｎｉｆｉｔカラムに加える。繊維媒体を床深さ３．０ｃｍ（カラム容量１．０３ｍｌ、繊維充填密度０．３５ｇ／ｍｌ）に圧縮する。繊維床透過性は、２５ｍＭトリスｐＨ８の緩衝液を流速２．０ｍｌ／分でカラムに流し、電子圧力トランスデューサーによりカラム圧力降下を測定することによって評価する。繊維床透過性の値も表１に示す。
【０１０６】
【表１】
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【実施例５】
【０１０７】
ＡＥＸ繊維、ＣＥＸ繊維またはＡＥＸおよびＣＥＸ繊維の両方の混合物によるｍＡｂ０４プロテインＡ溶出液からのＨＣＰ除去の比較
ｍＡｂ０４の細胞培養液を清澄化した後、プロテインＡカラムクロマトグラフィーを使って７．２ｍｇ／ｍｌの濃度で捕捉した。次に、ｍＡｂ０４プロテインＡ溶出液のｐＨを貯蔵用トリス塩基を使ってｐＨ５に調製した後、Ｓｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ  ０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＥｘｐｒｅｓｓＰＬＵＳ膜（１Ｌ、カタログ番号：ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，０１８２１，ＵＳＡ）を通して濾過した。トリス塩基を用いて、溶液のｐＨを使用直前にｐＨ７．０に調整した。次に、得られた溶液を、Ｓｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ  ０．２２ｍｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＬＵＳ膜（１Ｌ、カタログ番号：ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，０１８２１，ＵＳＡ）を通して濾過した。
【０１０８】
官能化繊維を含む３種のカラムを、実施例４の記載と同様にして調製した。第１の１ｍｌのカラムは、実施例２由来の四級アンモニウムリガンドで官能化されたＡＥＸ繊維（ロットＩＤ＃ＪＡ７６５４−１６３Ｂ）から構成した。第２の１ｍｌのカラムは、実施例３由来のスルホネートリガンドで官能化されたＣＥＸ繊維（ロットＩＤ＃ＪＡ７６５４−１３１）から構成した。第３の１ｍｌのカラムは、実施例２由来の四級アンモニウムリガンドで官能化されたＡＥＸ繊維（ＪＡ７６５４−１６３Ｂ）および実施例３由来のスルホネートリガンドで官能化されたＣＥＸ繊維（ＪＡ７６５４−１３１）の等量混合物から構成した（実施例４参照）。３種のカラムを緩衝液（２５ｍＭのトリス、ｐＨ７）で平衡化させる。
【０１０９】
１２０ｍｌのプロテインＡ溶出プールを０．３３ｍｌ／分の流速でそれぞれのカラムに通し、それぞれの繊維充填カラム中で３分間の滞留時間を与える。各カラムから３つの４０ｍｌ画分を収集する。カラムを通過した８０ｍｌおよび１２０ｍｌ後の溶出プール組成を表すプール試料を分析用に提出する。溶液の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度を分析する。ＨＣＰ分析は、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，ＵＳＡ）から市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｆ５５０）を使って、製造業者のプロトコルに従って実施される。ＩｇＧ濃度は、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）プロテインＡ分析カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣシステムを使って測定される。結果は表３および図３にまとめられている。
【０１１０】
実験結果は、ＡＥＸおよびＣＥＸ繊維を含む混床カラムの組み合わせが、ｌｏｇ除去値（ＬＲＶ）約１．６ＬＲＶを示し、より大きなＨＣＰ除去を達成したことを示す。これは、ＡＥＸ繊維のみを含むカラムで観察された約０．９のＨＣＰのＬＲＶおよびＣＥＸ繊維のみを含むカラムで観察された約０．６のＨＣＰのＬＲＶを遥かに凌ぐ。両繊維の混合物を含むカラムによるより大きな量のＨＣＰ除去は、このカラムが、異なる特性のＨＣＰを吸着する２種の異なるリガンドを有するという事実に起因すると思われる。ＡＥＸ官能化繊維は、より低い等電点を有するタンパク質によく認められる、表面上に負電荷部位を有する不純物に結合することができる。ＣＥＸ官能化繊維は、より高い等電点を有するタンパク質によく認められる、表面上に正電荷領域を有する不純物に結合することができる。
【０１１１】
【表２】
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図３は、実施例５由来の記載媒体を使ったフロースルー精製後のｍＡｂ０４プロテインＡフィードからのＨＣＰの除去を示す。
【実施例６】
【０１１２】
疎水性相互作用クロマトグラフィーリガンドを有する繊維媒体
実施例１および３に記載の繊維表面改質手順およびメタクリレートモノマーまたは下記を含む群から選択されるその他の重合可能な官能基を使って、上述の疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体を調製できる：
メチルメタクリレート、
ヒドロキシエチルメタクリレート、
ポリ（プロピレングリコール）モノメタクリレート、
（フェニル）メタクリレート、
（ｎ−ブチル）メタクリレート、
（ｎ−ヘキシル）メタクリレート。
【０１１３】
実施例１および３に記載のセリウムイオンレドックス重合手順を使って、この実施例で開示の反応性メタクリル酸モノマーでＡｌｌａｓｓｏ社製ナイロン繊維媒体の表面を直接改質できる（図４参照）。グラフト重合および好適な洗浄手順（これも実施例１および３に記載）後、この段階で、繊維媒体は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）用の適切な疎水性リガンド官能性を示す。媒体は、この段階でクロマトグラフィーカラムまたは上述のその他のタンデム型クロマトグラフィー用途用装置に充填する用意ができている。
図４は、本発明の繊維媒体に好適する各種ＨＩＣリガンドおよびＡｌｌａｓｓｏ社製ナイロン繊維媒体の表面への結合のためのプロセスを示す図である。
ｉ：（ヒドロキシエチル）メタクリレート、ポリ（プロピレングリコール）モノエタクリレート、（フェニル）メタクリレート、（ｎ−ブチル）メタクリレート、（ｎ−ヘキシル）メタクリレートを含む群から選択されるメタクリレートモノマー、Ａｌｌａｓｓｏ社製ナイロン繊維、０．４Ｍ硝酸セリウム（ＩＶ）アンモニウム、硝酸、水を使い、実施例１および３で用いた表面改質手順に従った、３５℃、１８時間でのＡｌｌａｓｓｏ社製繊維媒体表面の改質。
【実施例７】
【０１１４】
疎水性相互作用クロマトグラフィー用のポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）リガンドで改質した繊維媒体
ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ、１．６９ｇ、１３ｍｍｏｌ）および水（２３２．５ｍｌ）を５００ｍｌのボトル中に加える。その後、５．００ｇのＡｌｌａｓｓｏ社製のナイロン繊維（Ｗｉｎｇｅｄ  ｆｉｂｅｒ（登録商標））をこの溶液に加える。１ＭのＨＮＯ3溶液（７．２１ｍｌ、７．２ｍｍｏｌ）をこの反応混合物に加え、続いて１ＭのＨＮＯ3中の０．４Ｍ硝酸セリウム（ＩＶ）アンモニウム溶液（０．６０１ｍｌ、０．２４０ｍｍｏｌ）を加える。上記反応混合物を１時間、３５℃に加熱する。室温まで冷却後、固形物を、０．５Ｍ硫酸中の０．２Ｍアスコルビン酸溶液（３×１００ｍｌ）、脱イオン水（３×１００ｍｌ）、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液（３×１００ｍｌ）、脱イオン水（３×１００ｍｌ）およびエタノール（１×１００ｍｌ）で洗浄する。材料をオーブン内に入れ、４０℃で１２時間乾燥する。
収量：５．５８ｇの白色繊維状固形物を得る。
【図１】
0006665184.tif 000004
【図２】
0006665184.tif 000005
【図３】
0006665184.tif 000006
【図４】
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