(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
地盤に添加するためのウレアーゼ生成微生物の製造方法であり、
栄養源及び尿素を含む第一の培養液中でウレアーゼを生成する微生物を増殖させることと、
第一の培養液から前記微生物を分離することと、
第一の培養液から分離した前記微生物と、栄養源及び尿素を含む第二の培養液とを混合することと、
第二の培養液中で前記微生物を増殖させることと、を含む集積培養工程を有し、
前記集積培養工程は、第一の培養液及び第二の培養液のアンモニア濃度が１００００ｐｐｍ以下となる条件で行われる、ウレアーゼ生成微生物の製造方法。
【請求項２】
前記集積培養工程で増殖させた前記微生物を、尿素を含む培養液に添加して、前記微生物を増殖させる大量培養工程をさらに含む、請求項１に記載のウレアーゼ生成微生物の製造方法。
【請求項３】
前記微生物は、前記微生物を地盤に添加して前記地盤を改良するために使用されるものであり、かつ前記地盤から採取した微生物を培養して増殖させた微生物である、請求項１又は請求項２に記載のウレアーゼ生成微生物の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のウレアーゼ生成微生物の製造方法によりウレアーゼ生成微生物を製造する工程と、前記ウレアーゼ生成微生物を地盤に添加する工程とを含む、地盤改良方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウレアーゼ生成微生物の製造方法及び地盤改良方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、尿素を加水分解によりアンモニウムイオンと炭酸イオンとに分解する酵素であるウレアーゼの地盤改良技術への応用が検討されている。例えば、ウレアーゼによる尿素の分解によって分解された炭酸イオンとセメント中のカルシウムイオンとを反応させて地盤中に炭酸カルシウムを析出させて地盤の強度を向上させる方法、炭酸カルシウムの析出により地盤中の重金属を不溶化する方法等が検討されている。
【０００３】
ウレアーゼを地盤改良に応用する手段として、土壌中に生息するウレアーゼ生成微生物の利用が検討されている。例えば、特許文献１では土壌から採取したサンプルから培養したウレアーゼ生成微生物を用いて炭酸カルシウムの生成を試みている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−４５３３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまで報告されているウレアーゼ生成微生物の培養方法の多くは試薬等としての少量の使用を目的としたものであり、地盤改良等に使用できる程度に大量にウレアーゼ生成微生物を製造するのに適した方法については充分に検討されていないのが実情である。
本発明は、ウレアーゼ生成微生物の大量製造に適したウレアーゼ生成微生物の製造方法及び地盤改良方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するための手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞栄養源及び尿素を含む第一の培養液中でウレアーゼを生成する微生物を増殖させることと、
第一の培養液から前記微生物を分離することと、
第一の培養液から分離した前記微生物と、栄養源と、尿素とを含む第二の培養液とを混合することと、
第二の培養液中で前記微生物を増殖させることと、を含む集積培養工程を有し、
前記集積培養工程は、第一の培養液及び第二の培養液のアンモニア濃度が１００００ｐｐｍ以下となる条件で行われる、ウレアーゼ生成微生物の製造方法。
【０００７】
＜２＞前記集積培養工程で増殖させた前記微生物を、尿素を含む培養液に添加して、前記微生物を増殖させる大量培養工程をさらに含む、＜１＞に記載のウレアーゼ生成微生物の製造方法。
【０００８】
＜３＞前記微生物は、前記微生物を地盤に添加して前記地盤を改良するために使用されるものであり、かつ前記地盤から採取した微生物を培養して増殖させた微生物である、＜１＞又は＜２＞に記載のウレアーゼ生成微生物の製造方法。
【０００９】
＜４＞＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のウレアーゼ生成微生物の製造方法により製造されたウレアーゼ生成微生物を地盤に添加する工程を含む、地盤改良方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ウレアーゼ生成微生物の大量製造に適したウレアーゼ生成微生物の製造方法及び地盤改良方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本明細書において組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計量を意味する。
【００１２】
＜ウレアーゼ生成微生物の製造方法＞
本発明のウレアーゼ生成微生物の製造方法は、
栄養源及び尿素を含む第一の培養液中でウレアーゼを生成する微生物を増殖させることと、
第一の培養液から前記微生物を分離することと、
第一の培養液から分離した前記微生物と、栄養源及び尿素を含む第二の培養液とを混合することと、
第二の培養液中で前記微生物を増殖させることと、を含む集積培養工程を有し、
前記集積培養工程は、第一の培養液及び第二の培養液のアンモニア濃度が１００００ｐｐｍ以下となる条件で行われる。
【００１３】
本発明のウレアーゼ生成微生物の製造方法によれば、ウレアーゼ生成微生物を大量に製造することができる。すなわち本発明は、ウレアーゼ生成微生物を大量に製造するのに適した条件を検討した結果、集積培養工程においてウレアーゼ生成微生物の増殖に伴って生成されるアンモニアの濃度を１００００ｐｐｍ以下に抑えることが有効であることを見出しなされたものである。ウレアーゼ生成微生物の製造効率の観点からは、集積培養工程における第一の培養液及び第二の培養液のアンモニア濃度は７０００ｐｐｍ以下であることが好ましく、５０００ｐｐｍ以下であることがより好ましい。
【００１４】
本発明においてウレアーゼ生成微生物とは、ウレアーゼを生成する微生物を意味し、その種類は特に制限されない。ウレアーゼ生成微生物として具体的には、バチルス、スポロサルシナ、スポロラクトバチルス、クロストリジウム、デスルホトマキュルム等を含む属から選択される細菌が挙げられる。
【００１５】
本発明の方法により製造したウレアーゼ生成微生物を地盤改良に使用する場合、外来微生物の混入により現場の環境に影響が生じる可能性を排除する観点からは、地盤改良の対象地から採取した土壌中のウレアーゼ生成微生物を用いて集積培養工程を行うことが好ましい。
【００１６】
（集積培養工程）
集積培養工程は、（１）栄養源及び尿素を含む第一の培養液中でウレアーゼを生成する微生物を増殖させることと、（２）第一の培養液から前記微生物を分離することと、（３）第一の培養液から分離した前記微生物と、栄養源及び尿素を含む第二の培養液とを混合することと、（４）第二の培養液中で前記微生物を増殖させることと、を含む。
【００１７】
集積培養工程は、第二の培養液中で前記微生物を増殖させた後にさらに（５）第二の培養液から前記微生物を分離することと、（６）第二の培養液から分離した前記微生物と、栄養源及び尿素を含む第三の培養液とを混合することと、を含んでもよく、同様の工程をさらに繰り返してもよい。
【００１８】
集積培養工程において、第一の培養液と第二の培養液とは異なっていても、一部が共通していてもよい。第一の培養液と第二の培養液の一部が共通している場合としては、例えば、第一の培養液の一部を除去した残りであるウレアーゼ生成微生物を含む第一の培養液に水、栄養源、尿素等を添加したものを第二の培養液として使用する場合が挙げられる。必要に応じて第三の培養液等を使用する場合も同様である。
【００１９】
第一の培養液及び第二の培養液中でウレアーゼ生成微生物を増殖させる方法は特に制限されず、公知の方法により行うことができる。例えば、培養液温度が１０℃〜３５℃の範囲、望ましくは２０℃〜３０℃の条件で行うことができる。必要に応じて第三の培養液等を使用する場合も同様である。
【００２０】
第一の培養液からウレアーゼ生成微生物を分離する方法は特に制限されない。例えば遠心分離、膜分離等が挙げられる。必要に応じて第二の培養液からウレアーゼ生成微生物を分離する場合も同様である。
【００２１】
第一の培養液から分離したウレアーゼ生成微生物と、第二の培養液とを混合する方法は特に制限されない。例えば、第一の培養液から分離したウレアーゼ生成微生物を第二の培養液に添加しても、第一の培養液から分離したウレアーゼ生成微生物に第二の培養液を添加してもよい。必要に応じて第三の培養液等を使用する場合も同様である。
【００２２】
第一の培養液及び第二の培養液に含まれる栄養源は特に制限されず、有機物、無機塩等を栄養源として使用することができる。
【００２３】
有機物として具体的には、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、魚エキス、ペプトン、スクロース、トリプトン、グルコース、ジャガイモ抽出液、廃糖蜜、コンポスト廃液のしぼり汁等が挙げられる。
【００２４】
無機塩として具体的には、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４等のリン酸塩、ＮＨ４Ｃｌ等のアンモニア塩、ＫＮＯ３、ＮＨ４ＮＯ３等の硝酸塩、微量金属元素溶液等が挙げられる。本発明の方法では栄養源を１種単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２５】
本発明の方法では、栄養源が酵母エキスを含むことが好ましい。栄養源が酵母エキスを含むことで、ウレアーゼ生成微生物の製造効率が上昇する傾向にある。その理由は明らかではないが、ウレアーゼ生成微生物の増殖率が向上するほか、ウレアーゼ生成微生物を培養液から分離する際に酵母エキスがキャリアとして働き、培養液中に浮遊しているウレアーゼ生成微生物を取り込んで培養液からの分離を効率よく行うことができるためと推測される。
【００２６】
第一の培養液及び第二の培養液に含まれる栄養源の濃度は特に制限されず、培養条件、栄養源の種類等に応じて設定できる。栄養源が酵母エキスである場合の濃度は、ウレアーゼ生成微生物の増殖を促進する観点からは１ｇ／Ｌ以上であることが好ましく、５ｇ／Ｌ以上であることがより好ましく、１０ｇ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。酵母エキスが高濃度では微生物の吸収速度が頭打ちになるため、効率性の観点からは５０ｇ／Ｌ以下であることが好ましい。
【００２７】
第一の培養液及び第二の培養液に含まれる尿素の濃度は特に制限されず、培養条件等に応じて設定できる。尿素の濃度は、ウレアーゼ生成微生物の優先化を促進するための観点からは０．０５ｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。分解副生物であるアンモニアの蓄積による微生物の増殖阻害の抑制、及び培養液の悪臭抑制の観点からは、尿素の濃度は０．４ｍｏｌ／以下であることが好ましく、０．３ｍｏｌ／以下であることがより好ましい。
【００２８】
（大量培養工程）
本発明のウレアーゼ生成微生物の製造方法は、集積培養工程で増殖させたウレアーゼ生成微生物を、尿素を含む培養液に添加して、ウレアーゼ生成微生物を増殖させる大量培養工程をさらに含むことが好ましい。
【００２９】
本発明のウレアーゼ生成微生物の製造方法が集積培養工程と、大量培養工程とを含むことで、ウレアーゼ生成微生物を簡便な方法で大量に培養することができる。すなわち、集積培養工程においてウレアーゼ生成微生物を所望の濃度にまで増殖させた培養液を大量培養工程で用いることで、ウレアーゼ生成微生物を含む培養液を静置するのみでウレアーゼ生成微生物を大量に得ることができる。さらに、ウレアーゼ生成微生物を地盤改良等に利用する場合、集積培養工程は屋内等で行い、大量培養工程は集積培養工程で得られたウレアーゼ生成微生物を含む培養液を現場に移動してタンク等に投入して行うことで、ウレアーゼ生成微生物を含む大量の培養液を現場に運搬することなく大量のウレアーゼ生成微生物を調達することができる。
【００３０】
大量培養工程では、集積培養工程で増殖させたウレアーゼ生成微生物を、尿素を含む培養液に添加して、ウレアーゼ生成微生物を増殖させる。大量培養工程で使用する培養液は、尿素を少なくとも含むことでウレアーゼ生成微生物を増殖させることができるが、栄養源をさらに含んでもよい。大量培養工程で使用する培養液が栄養源を含む場合は、上述した栄養源を用いることができる。
【００３１】
大量培養工程においてウレアーゼ生成微生物を増殖させる方法は特に制限されない。例えば、培養液温度が１５℃〜３５℃の条件で行うことができる。培養液の尿素の濃度としては、例えば、ウレアーゼ生成微生物の優先化を促進するための観点からは０．０５ｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましい。分解副生物であるアンモニアの蓄積による微生物の増殖阻害の抑制、及び培養液の悪臭抑制の観点からは、尿素の濃度は０．４ｍｏｌ／以下であることが好ましく、０．３ｍｏｌ／以下であることがさらに好ましい。
【００３２】
＜地盤改良方法＞
本発明の地盤改良方法は、本発明のウレアーゼ生成微生物の製造方法により製造されたウレアーゼ生成微生物を地盤に添加する工程を含む。
【００３３】
本発明の地盤改良方法においてウレアーゼ生成微生物を地盤に添加する方法は特に制限されない。ある実施態様では、例えば、ウレアーゼ生成微生物を水、セメント及び尿素と混合し、得られた混合物を土壌中にポンプで圧送して土壌と混合する。これにより、ウレアーゼによる尿素の分解によって分解された炭酸イオンとセメント中のカルシウムイオンとが反応して炭酸カルシウムが析出する。炭酸カルシウムはセメントと親和性を有する硬質の成分であるため、地盤の強度を向上させることができる。
【００３４】
またある実施態様では、ウレアーゼ生成微生物を尿素及び塩化カルシウムとともに地盤中に混合し、炭酸カルシウムの析出により形成されるカルサイト中に地盤中の砒素等の有害金属イオンを捕捉させることによって有害金属を固定化（地下水への溶出抑制）することができる。
【００３５】
本発明の地盤改良方法では、集積培養工程で増殖させたウレアーゼ生成微生物を用いても、大量培養工程で増殖させたウレアーゼ生成微生物を用いてもよい。また、増殖させたウレアーゼ生成微生物を含む培養液をそのまま用いても、所望の濃度に希釈して用いてもよい。
【実施例】
【００３６】
以下、具体例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３７】
＜集積培養工程＞
（参考例）
土壌試料（富津市において採取）に滅菌した蒸留水を質量比（土壌試料：蒸留水）が１：１０となるように加え、２分間激しく振とうした。１０分間静置後、上澄みを採取した。この上澄みを培養液に質量比（上澄み：培養液）が１：１００となるように加え、３０℃のインキュベータ内で３日間培養を行った。培養開始から３日後、培養液のウレアーゼ活性、アンモニア濃度、濁度、ＴＯＣ（全有機炭素）及びｐＨを測定した。結果を表１の「ＥＣ変化率」、「アンモニア濃度」、「濁度」、「ＴＯＣ」及び「ｐＨ」の欄にそれぞれ示す。
【００３８】
培養液は、滅菌した蒸留水に食品添加物用酵母エキス（富士食品工業社製、商品名「ＹＰ−２１ＣＭ」）を濃度が２０．０ｇ／Ｌとなるように添加し、農業資材用尿素を濃度が０．１５ｍｏｌ／Ｌとなるように添加して調製した。
【００３９】
培養液のウレアーゼ活性の測定は、ＥＣ（電気伝導度）の変化率の測定により行った。具体的には、０．５０ｍｏｌ／Ｌの尿素水溶液４０ｍＬに培養液１０ｍＬを添加し、スターラーで撹拌しながら２分ごとにＥＣを２０分間測定し、１分間あたりのＥＣ変化率を求めた。
【００４０】
ＥＣの値が上昇することは、ウレアーゼによる分解で尿素が減少していることを意味する。参考例で測定した１分間あたりのＥＣ変化率は０．００６（ｍＳ／ｃｍ／ｍｉｎ）であった。この値は、ウレアーゼ活性の高い微生物として知られているＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉｉのＥＣ変化率（０．０１〜０．０２６（ｍＳ／ｃｍ／ｍｉｎ））の半分程度であり、ナタ豆より抽出したウレアーゼの濃度を２００ｍｇ／Ｌとしたときの値にほぼ相当する。よって、この値をウレアーゼ活性の有無の判定基準とすることができる。
【００４１】
培養液の濁度（ＦＴＵ）は、遠心分離前の培養液について透過光・散乱光演算方式濁度計（ＨＡＣＨ社製）により測定した。濁度が高いことは、培養液中に浮遊しているウレアーゼ生成微生物の量が多いことを意味する。
【００４２】
培養液のＴＯＣは、触媒燃焼式ＴＯＣ計（島津製作所製、商品名「ＴＯＣ−Ｖ」）により測定した。ＴＯＣが高いことは、酵母エキス等の栄養源が培養液中に十分に存在することを意味する。
【００４３】
培養液のアンモニア濃度は、遠心分離によりウレアーゼ生成微生物を含む沈殿物から分離した上澄みについて、サリチル酸法（ＨＡＣＨ社製のポータブル水質分析計、商品名「ＤＲ８９０」を使用）により測定した。遠心分離は、培養液を５０ｍＬの遠沈管に入れて３５００ｒｐｍ、２０分間の条件で行った。上澄みのアンモニア濃度の上昇は、ウレアーゼによる尿素の分解が進んでいることを意味する。
【００４４】
（実施例１）
（１）滅菌した蒸留水に食品添加物用酵母エキス（富士食品工業社製、商品名「ＹＰ−２１ＣＭ」）を濃度が２０ｇ／Ｌとなるように添加し、さらに農業資材用尿素を濃度が０．１５ｍｏｌ／Ｌとなるように添加して、第一の培養液を調製した。これを用いて、参考例と同じ条件でウレアーゼ生成微生物の培養を３日間行った。その後、参考例と同様にしてウレアーゼ活性、濁度、ＴＯＣ及びｐＨを測定した。結果を表１に示す。
【００４５】
（２）次いで、第一の培養液を５０ｍＬの遠沈管に入れて遠心分離を３５００ｒｐｍで２０分間行い、上澄みを除去して、第一の培養液からウレアーゼ生成微生物を含む沈殿物を分離した。さらに、除去した上澄みのアンモニア濃度を参考例と同様にして測定した。測定結果を表１の「アンモニア濃度」の「上澄み」の欄に示す。
【００４６】
（３）次いで、第一の培養液と同じ組成の第二の培養液（５０ｍＬ）をウレアーゼ生成微生物を含む沈殿物に加えた。沈殿物の質量が、遠心分離前の培養液全体の質量の３０分の１程度であったため、第二の培養液添加後のアンモニア濃度を（２）で測定した上澄みのアンモニア濃度の３０分の１程度と推計し、その値を表１の「アンモニア濃度」の「培養液添加後」の欄に示す。さらに、上記と同じ条件で３日間の培養を行った。その後、上記と同様にしてウレアーゼ活性、濁度、ＴＯＣ及びｐＨを測定した。結果を表１に示す。
【００４７】
（４）以上の（２）及び（３）の工程をさらに３回繰り返し、各回でウレアーゼ活性、アンモニア濃度、濁度、ＴＯＣ及びｐＨを測定した。結果を表１に示す。
【００４８】
（実施例２）
培養液中の酵母エキスの濃度を６．７ｇ／Ｌとした以外は実施例１の（１）〜（４）と同様にしてウレアーゼ生成微生物の培養を行い、ウレアーゼ活性、アンモニア濃度、濁度、ＴＯＣ及びｐＨを測定した。結果を表１に示す。
【００４９】
（比較例１）
酵母エキスを培養液に添加しなかった以外は実施例１の（１）〜（４）と同様にしてウレアーゼ生成微生物の培養を行い、ウレアーゼ活性、アンモニア濃度、濁度、ＴＯＣ及びｐＨを測定した。結果を表１に示す。
【００５０】
（比較例２）
実施例２において（２）及び（３）の工程を行わない以外は同様にして培養を行い、３日後、６日後、９日後及び１２日後にそれぞれウレアーゼ活性、アンモニア濃度、濁度、ＴＯＣ及びｐＨを測定した。
【００５１】
【表１】
0006715431.tif 000002
【００５２】
表１の結果に示されるように、酵母エキスの濃度が２０ｇ／Ｌとなるように培養液に添加した実施例１では、遠心分離及び培養を繰り返すことでＥＣ変化率が上昇し、ウレアーゼ生成微生物が集積的に増殖していることが確認された。
これに対して酵母エキスを培養液に添加しなかった比較例１では、遠心分離及び培養を繰り返してもＥＣ変化率が上昇せず、ウレアーゼ生成微生物の集積的な増殖は認められなかった。遠心分離を行わずに培養を行った比較例２でも、６日目から９日目にかけてＥＣ変化率が低下し、ウレアーゼ生成微生物の集積的な増殖は認められなかった。
【００５３】
＜大量培養工程＞
尿素及び酵母エキスを濃度がそれぞれ０．１５ｍｏｌ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌとなるように添加した精製水（２０Ｌ）に、実施例２において遠心分離・培養工程を計４回行った後の培養液を２０ｍＬ添加し、ウレアーゼ活性、アンモニア濃度及びｐＨを上記と同じ方法で測定した。次いでこれを２５℃〜３０℃の暗所に静置し、１２日後に上記と同じ方法でウレアーゼ活性、アンモニア濃度及びｐＨを測定した。結果を表２に示す。
【００５４】
【表２】
0006715431.tif 000003
【００５５】
表２の結果に示されるように、大量培養開始から１２日後にはウレアーゼ活性（ＥＣ変化率）が判定基準である０．００６（ｍＳ／ｃｍ／ｍｉｎ）に達していた。アンモニア濃度も上昇しており、ウレアーゼ生成微生物が増殖して尿素の分解が進んだことが確認された。
【００５６】
以上より、本発明の方法はウレアーゼ生成微生物の大量製造に適していることが分かった。