(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍微細環境の試験管内での模倣方法であって、前記方法が：
細胞培養容器に培養培地を加えること；
前記細胞培養容器内の多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くこと；
前記多孔性膜の第２の表面上に内皮細胞を播くこと；
ここで、前記第１の表面が前記細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように前記細胞培養容器にて前記多孔性膜を懸濁させ、それによって前記細胞培養容器内で前記少なくとも１つの腫瘍細胞型を含む下容量部と内皮細胞を含む上容量部を定義する；および
前記多孔性膜の第２の表面上に播かれた内皮細胞に剪断応力を適用することによって前記少なくとも１つの腫瘍細胞型に剪断応力を間接的に適用すること、
を含み、前記剪断応力は流動装置によって誘導される前記培養培地の流れから生じ、前記流れは前記腫瘍細胞が前記腫瘍微細環境にて生体内で間接的にさらされる流れを模倣する、模倣方法。
【請求項２】
前記流れは時変性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多孔性膜の前記第１の表面上に少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を堆積させ、前記少なくとも１つの細胞外マトリクス成分上に前記少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くこと；または
少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む溶液にて少なくとも１つの腫瘍細胞型を懸濁させて前記少なくとも１つの腫瘍細胞型と前記少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創り出し、前記多孔性膜の前記第１の表面上に前記懸濁液を堆積させること；
をさらに含み、
前記少なくとも１つの細胞外マトリクス成分が、任意にコラーゲン、フィブロネクチン、および／またはヒト胎盤などの生物供給源から精製された脱細胞化された細胞外マトリクスを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記内皮細胞が：
微小血管内皮細胞（任意に肺微小血管内皮細胞、乳腺微小血管内皮細胞、膵臓微小血管内皮細胞、前立腺微小血管内皮細胞、卵巣微小血管内皮細胞、結腸微小血管内皮細胞、真皮微小血管内皮細胞、またはそれらの組み合わせ）、大血管内皮細胞、内皮前駆細胞、またはそれらの組み合わせ；
腫瘍に由来する内皮細胞；
中に腫瘍が存在する臓器若しくは組織に由来する内皮細胞；
肺、乳房、結腸、直腸、前立腺、膀胱、骨、膵臓、肝臓、胆管、卵巣、精巣、子宮、胎盤、脳、軟骨、平滑筋、横紋筋、体腔の膜表層、線維組織、血管、リンパ管、リンパ節、脂肪組織、脳の神経性結合組織、腎臓、下垂体、副甲状腺、甲状腺、気管支表層、副腎髄質、胃、大腸、小腸、頸動脈小体、化学受容体系、皮膚、胆嚢の腫瘍、またはそれらの組み合わせに由来する内皮細胞；および／または
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する細胞、
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍に対する効果について薬剤又は化合物を調べる試験管内の方法であって、前記方法が：
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法に従って前記腫瘍の微細環境を模倣すること；
前記培養培地に薬剤または化合物を添加すること；および
前記薬剤または化合物に直接的にまたは間接的に暴露される前記少なくとも１つの腫瘍細胞型に前記剪断応力を間接的に適用すること、
を含み、前記薬剤または化合物の存在下での少なくとも１つの腫瘍細胞型における変化が、前記薬剤または化合物が前記腫瘍に対して効果を有することを示す、方法。
【請求項６】
さらに、前記少なくとも１つの細胞外マトリクス成分上に、または前記多孔性膜の前記第１または第２の表面上に、少なくとも１つの間質細胞型を播くこと；または
前記少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む前記溶液に前記腫瘍細胞型と共に少なくとも１つの間質細胞型を懸濁させて、前記少なくとも１つの間質細胞型、前記少なくとも１つの腫瘍細胞型、および前記少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創り出し、前記多孔性膜の前記第１の表面上に前記懸濁液を堆積させること、
を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの間質細胞型が：
線維芽細胞（任意にヒト肺線維芽細胞株Ｈｓ８８８Ｌｕ）、免疫細胞（任意にマクロファージ、リンパ球、樹状細胞、またはそれらの組み合わせ）、周皮細胞、炎症性細胞（任意にＢ細胞、Ｔ細胞またはそれらの組み合わせ）、またはそれらの組み合わせ；および／または
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する細胞、
を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、前記少なくとも１つの腫瘍細胞型と前記少なくとも１つの間質細胞型を順次播くことを含む請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの間質細胞型を播くこと、次いで、前記播かれた間質細胞型の上に前記少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くことを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記剪断応力の適用の際の、前記少なくとも１つの腫瘍細胞型、前記少なくとも１つの間質細胞型、若しくは前記内皮細胞における前記腫瘍微細環境のマーカーのレベル若しくは局在または前記培養培地における前記腫瘍微細環境のマーカーのレベルの、前記剪断応力の適用の非存在下での前記少なくとも１つの腫瘍細胞型、前記少なくとも１つの間質細胞型若しくは前記内皮細胞における前記腫瘍微細環境のマーカーのレベル若しくは局在または前記培養培地における前記腫瘍微細環境のマーカーのレベルと比べた変化が、前記腫瘍微細環境の模倣を裏付ける請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞培養容器が、容器内または前記上容量部と前記下容量部を定義する前記細胞培養容器の部分内で注入口および排出口を含む；および／または
さらに、前記細胞培養容器の内外に、前記上容量部の内外に、または前記下容量部の内外に培養培地を潅流することを含む、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの腫瘍細胞型が：
癌腫、肉腫、リンパ腫、腺癌、混合中胚葉性腫瘍、癌肉腫、奇形癌、またはそれらの組み合わせに由来する細胞；
肺、乳房、結腸、直腸、前立腺、膀胱、骨、膵臓、肝臓、胆管、卵巣、精巣、子宮、胎盤、脳、軟骨、平滑筋、横紋筋、体腔の膜表層、線維組織、血管、リンパ管、リンパ節、脂肪組織、脳の神経性結合組織、腎臓、下垂体、副甲状腺、甲状腺、気管支表層、副腎髄質、胃、大腸、小腸、頸動脈小体、化学受容体系、皮膚、胆嚢の腫瘍、またはそれらの組み合わせに由来する細胞；
非小細胞肺腺癌の細胞、乳癌の細胞、膵臓癌の細胞、前立腺癌の細胞、卵巣癌の細胞、結腸癌の細胞、またはそれらの組み合わせを含む不死化細胞株；
生検、腫瘍切除、採血、またはそれらの組み合わせによって対象から得られる初代腫瘍細胞、ここで、前記初代腫瘍細胞は、任意にステージＩの腫瘍、ステージＩＩの腫瘍、ステージＩＩＩの腫瘍またはステージＩＶの腫瘍から得られる；および／または
ヒト対象に由来する腫瘍を担うヒト化マウスに由来する腫瘍細胞、
を含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌腫に由来する細胞が、腺癌に由来する細胞、扁平上皮癌に由来する細胞、腺扁平上皮癌に由来する細胞、またはそれらの組み合わせに由来する細胞を含む；
肉腫に由来する細胞が、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、中皮肉腫（中皮腫）、線維肉腫、血管肉腫（任意に、血管内皮腫、リンパ管肉腫、またはそれらの組み合わせ）、脂肪肉腫、神経膠腫、星状細胞腫、粘液肉腫、間葉腫瘍、混合中胚葉性腫瘍、またはそれらの組み合わせに由来する細胞を含む；
リンパ腫に由来する細胞がホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、またはそれらの組み合わせに由来する細胞を含む；
前記不死化細胞株が、ヒト非小細胞肺腺癌の細胞株Ａ５４９、ヒト乳癌の細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト膵臓癌の細胞株ＢｘＰＣ−３、ヒト前立腺癌の細胞株ＤＵ１４５、ヒト前立腺癌の細胞株ＬＮＣａＰ、ヒト卵巣癌の細胞株ＳＫＯＶ−３、ヒト直腸癌の細胞株ＣＯＬＯ−２０５またはそれらの組み合わせを含む；および／または
前記ヒト化マウスが、非肥満糖尿病性重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウス、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγヌル（ＮＯＧ）マウスまたはＮＯＤ  ＳＣＩＤ  ＩＬ−２Ｒγノックアウト（ＮＳＧ）マウスを含む、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの腫瘍細胞が、結合組織の腫瘍、内皮または中皮の腫瘍、リンパ組織の腫瘍、筋肉の腫瘍、上皮組織の腫瘍、神経組織の腫瘍、アミン前駆体の取り込み及び脱カルボシキル化（ＡＰＵＤ）の系の腫瘍、神経堤に由来する細胞の腫瘍、生殖腺の腫瘍、またはそれらの組み合わせに由来する請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記結合組織の腫瘍が、成人の線維組織、胚性（粘液腫）の線維組織、脂肪組織、軟骨組織、骨、脊索、線維性組織球腫の腫瘍またはそれらの組み合わせを含む；
前記内皮または中皮の腫瘍が、血管腫瘍、リンパ管腫瘍、中皮腫瘍またはそれらの組み合わせを含む；
前記リンパ組織の腫瘍が、形質細胞腫、ホジキン腫瘍、非ホジキン腫瘍、またはそれらの組み合わせを含む；
前記筋肉の腫瘍が、平滑筋腫瘍、横紋筋腫瘍、またはそれらの組み合わせを含む；
前記上皮組織の腫瘍が、重層扁平組織の腫瘍、腺上皮の腫瘍、移行上皮の腫瘍、胎盤腫瘍、精巣腫瘍、またはそれらの組み合わせを含む；
前記神経組織の腫瘍が、グリア細胞の腫瘍、神経細胞の腫瘍、髄膜の腫瘍、神経鞘の腫瘍、またはそれらの組み合わせを含む；
前記アミン前駆体の取り込み及び脱カルボシキル化（ＡＰＵＤ）の系の腫瘍が、下垂体腫瘍、副甲状腺腫瘍、甲状腺腫瘍、気管支表層腫瘍、副腎髄質腫瘍、膵臓腫瘍、胃または腸の腫瘍、頸動脈小体の腫瘍、または化学受容体系の腫瘍、またはそれらの組み合わせを含む；
前記神経堤に由来する細胞の腫瘍が、色素産生細胞の腫瘍、末梢神経系のシュワン細胞の腫瘍、メルケル細胞の腫瘍、またはそれらの組み合わせを含む；および／または
前記生殖腺の腫瘍が、卵巣の腫瘍、精巣の腫瘍、精上皮腫、未分化胚細胞腫、絨毛腫、胚性癌腫、内胚葉洞腫瘍、奇形癌腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫瘍、男化腫瘍、顆粒膜／卵胞膜腫瘍、門細胞腫、脂質細胞腫瘍、またはそれらの組み合わせを含む、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記成人の線維組織の腫瘍が線維腫または線維肉腫を含む；
前記胚性（粘液腫）の線維組織の腫瘍が粘液腫または粘液肉腫を含む；
前記脂肪組織の腫瘍が脂肪腫または脂肪肉腫を含む；
前記軟骨組織の腫瘍が軟骨腫または軟骨肉腫を含む；
前記骨の腫瘍が骨腫または骨肉腫を含む；
前記脊索の腫瘍が軟骨腫を含む；
前記線維性組織球腫が悪性線維性組織球腫を含む；
前記血管の腫瘍が、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫または血管肉腫を含む；
前記リンパ管腫瘍がリンパ管腫またはリンパ管肉腫を含む；
前記中皮腫瘍が中皮腫を含む；
前記平滑筋の腫瘍が平滑筋種または平滑筋肉腫を含む；
前記横紋筋の腫瘍が横紋筋腫または横紋筋肉腫を含む；
前記重層扁平組織の腫瘍が乳頭腫、脂漏性角化症、皮膚付属器腫瘍、扁平上皮癌または類表皮癌を含む；
前記腺上皮の腫瘍が肝臓の腺上皮の腫瘍（任意に、肝細胞腺腫または肝細胞癌）、腎臓の腺上皮の腫瘍（任意に、尿細管腺腫、腎細胞癌または副腎腫）、または胆管の腺上皮の腫瘍（任意に、胆管腺腫または胆管癌）を含む；
前記移行上皮の腫瘍が移行細胞乳頭腫または移行細胞癌を含む；
前記胎盤腫瘍が胞状奇胎または絨毛腫を含む；
前記精巣腫瘍が精上皮腫または胎児性細胞癌を含む；
前記グリア細胞の腫瘍が神経膠腫または膠芽細胞腫を含む；
前記神経細胞の腫瘍が神経節細胞腫、神経芽細胞腫または髄芽細胞腫を含む；
前記髄膜の腫瘍が髄膜腫を含む；
前記神経鞘の腫瘍がシュワン鞘腫、神経鞘腫、神経線維腫、髄膜腫または神経線維肉腫を含む；
前記下垂体腫瘍が好塩基球腺腫、好酸球腺腫または色素嫌性腺腫を含む；
前記副甲状腺腫瘍が副甲状腺腺腫または副甲状腺癌を含む；
前記甲状腺腫瘍が甲状腺のＣ細胞過形成または髄質癌を含む；
前記気管支表層腫瘍が気管支カルチノイドまたは燕麦細胞癌を含む；
前記副腎髄質腫瘍が褐色細胞腫を含む；
前記膵臓腫瘍が島細胞腺腫、インスリノーマ、ガストリノーマまたは島細胞癌を含む；
前記胃または腸の腫瘍がカルチノイドを含む；
前記頸動脈小体の腫瘍、化学受容体系の腫瘍が化学受容体腫、傍神経節腫またはカルチノイドを含む；
前記色素産生細胞の腫瘍が母斑または黒色腫を含む；
前記末梢神経系のシュワン細胞の腫瘍がシュワン鞘腫または神経鞘腫を含む；および／または
前記メルケル細胞の腫瘍がメルケル細胞腫瘍を含む、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、外から添加された細胞外マトリクスの実質的な非存在下で前記細胞型を培養することを含む請求項１〜２及び４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記培養培地が、血清、血液、血液細胞、血液成分、免疫細胞、馴化培養培地、またはそれらの組み合わせを含む請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記血液細胞が血小板、赤血球、またはそれらの組み合わせを含む；
前記血液成分が、凝固因子、リポタンパク質、トリグリセリド、またはそれらの組み合わせを含む；
前記免疫細胞が、Ｂ細胞、樹状細胞、顆粒球、先天性のリンパ系細胞、巨核球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞またはそれらの組み合わせを含む；および／または
前記馴化培養培地が、腫瘍細胞を含む培養物、内皮細胞を含む培養物、間質細胞型を含む培養物、またはそれらの組み合わせに由来する馴化培養培地を含む、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記血清、血液、血液細胞、血液成分、または免疫細胞がヒトまたはヒト以外の動物（任意にマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、鳥類または魚類）、に由来する請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
試験管内での腫瘍転移の模倣方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法に従って培養された前記少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞を、臓器または組織をモデル化する試験管内の系に導入することを含む、前記模倣方法。
【請求項２２】
前記臓器または組織をモデル化する試験管内の系が、肝臓、膵臓、骨、肺、血管、リンパ系、脳、筋肉、膀胱、腎臓、腸、結腸、胆嚢、皮膚または骨をモデル化する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記臓器または組織をモデル化する試験管内の系が肝臓をモデル化し、前記肝臓をモデル化する試験管内の系が培養培地と多孔性膜を含む別の細胞培養容器を含み、肝細胞が前記多孔性膜の第１表面上に播かれ、前記第１の表面が前記細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように前記別の細胞培養容器にて前記多孔性膜を懸濁させ、それによって前記細胞培養容器内で前記肝細胞を含む下容量部と前記多孔性膜の第２の表面を含む上容量部を定義し；剪断応力が前記上容量部における前記多孔性膜の前記第２の表面に適用され、前記剪断応力は前記肝細胞が生体内でさらされる流れを模倣し；前記前記別の細胞培養容器が前記上容量部と前記下容量部を定義する前記細胞培養容器の部分内にて注入口をさらに含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
肝臓をモデル化する試験管内の系に前記少なくとも１つの腫瘍細胞型の前記細胞を導入することが、前記肝臓をモデル化する試験管内の系の前記下容量部に少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞を移すことを含むか、または
前記肝臓をモデル化する試験管内の系に前記少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞を導入することが、前記肝臓をモデル化する試験管内の系の前記上容量部に前記少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞を移すことを含み、任意に、前記試験管内の系の前記下容量部への前記少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞の移動を評価することを含む、
請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
薬剤または化合物を腫瘍の転移に対する効果について調べる試験管内の方法であって、前記方法が
請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法に従って腫瘍の転移を試験管内で模倣すること；および
前記培養培地に薬剤または化合物を加えること、を含み、
前記薬剤または化合物の存在下での前記臓器または組織をモデル化する試験管内の系における前記少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞の変化が、前記薬剤または化合物が腫瘍の転移に対する効果を有することを示す、方法。
【請求項２６】
前記培養培地における前記薬剤または化合物の濃度が生体内で効果を達成する前記薬剤または化合物の濃度範囲の範囲内である請求項５〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記培養培地における前記薬剤または化合物の濃度が前記薬剤または化合物についての生体内での治療用Ｃｍａｘの濃度範囲の範囲内である請求項５〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記培養培地における前記薬剤または化合物の濃度が前記薬剤または化合物についての生体内での治療用Ｃｍａｘとほぼ同じである請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記培養培地における前記薬剤または化合物の濃度が、前記薬剤または化合物についての生体内での治療用Ｃｍａｘの濃度範囲よりも約２倍〜約２０倍低い請求項５〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法がさらに、前記薬剤または化合物を前記上容量部及び前記下容量部の少なくとも一方に潅流させることを含む請求項５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１３年１０月２１日に出願された米国特許仮出願第６１／８９３，４０２号の利益を主張し、その全体は参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府のライセンスへの権利
本発明は、国立衛生研究所の国立癌研究所によって授与された契約番号ＨＳＮ２６１２０１３０００２４Ｃのもとで政府の支援によって行われた。政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は一般に腫瘍の微細環境を試験管内で模倣する方法に関する。本発明はまたそのような系で薬剤または化合物を調べ、有望な抗癌剤標的を特定する方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
生体内では、腫瘍の微細環境は、腫瘍細胞、内皮細胞のような血管細胞、及び線維芽細胞のような間質細胞を含む複数の細胞型を含有する複雑な環境である。加えて生体内では、これらの細胞は血流及び種々の生物輸送条件にさらされる。生体内では、腫瘍における微細血管の細胞は血流によって影響を受け、物理的に及び拡散性因子を介しての双方で腫瘍細胞及び非腫瘍細胞と連絡を取り合う。加えて、腫瘍の脈管構造は、異常であり、無秩序な分岐、低い流速及び漏れやすい血管を特徴とするので、腫瘍細胞を標的とする抗癌療法に対する主要な輸送バリアとして働く。腫瘍細胞、内皮細胞及び間質細胞の間での相互作用は各細胞型に影響を与え、血管形成及び腫瘍細胞増殖の増加をもたらし、このクロストークが腫瘍細胞の抗癌剤への応答性を決定することにおいて重要な因子であり得る。
【０００５】
腫瘍細胞の固定した単一培養物を用いた従来の試験管内での腫瘍モデルは生体内の腫瘍の生物学を適正にモデル化することはできない。現在の試験管内の腫瘍モデルは生体内での抗癌療法の有効性及び安全性を適正に予測することもない。固定した条件下で行われた従来の試験管内の試験は一般に、腫瘍微細環境の成分の提示を欠くために薬剤に対する感受性を上手く予測できない。さらに、従来のモデルは生体内で応答を生じる濃度では薬剤または化合物に対する応答を示さないことが多く、代わりに同じ応答を誘導するのにさらに高い濃度の薬剤または化合物を必要とする。従って、試験管内で生体内の腫瘍微細環境を正確に模倣する方法に対するニーズが当該技術に存在する。そのような方法は有効性及び安全性についての抗癌剤の前臨床スクリーニングの精度を改善するであろう。
【発明の概要】
【０００６】
腫瘍の微細環境を試験管内で模倣する方法が提供される。該方法は、細胞培養容器に培養培地を加えること及び細胞培養容器内の表面上に少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くことを含む。剪断応力が少なくとも１つの腫瘍細胞型に間接的に適用され、剪断応力は流動装置によって誘導される培養培地の流れから生じ、該流れは腫瘍微細環境にて生体内で腫瘍が間接的にさらされる流れを模倣する。流れは時変性である。
【０００７】
腫瘍の微細環境を試験管内で模倣する別の方法も提供される。細胞培養容器に培養培地を加えること及び細胞培養容器内の多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くことを含む方法。多孔性膜の第２の表面に剪断応力を適用することによって剪断応力が少なくとも１つの腫瘍細胞型に間接的に適用され、剪断応力は流動装置によって誘導される培養培地の流れから生じ、該流れは腫瘍微細環境にて生体内で腫瘍が間接的にさらされる流れを模倣する。
【０００８】
腫瘍の微細環境を試験管内で模倣するさらに別の方法も提供される。該方法は、細胞培養容器に培養培地を加えること及び細胞培養容器内の多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの腫瘍細胞型または間質細胞型を播くことを含む。間質細胞型が多孔性膜の第１の表面上に播かれる場合、少なくとも１つの腫瘍細胞型が細胞培養容器内の表面上に存在する。多孔性膜の第２の表面に剪断応力を適用することによって剪断応力が少なくとも１つの腫瘍細胞型に間接的に適用され、剪断応力は流動装置によって誘導される培養培地の流れから生じ、該流れは腫瘍微細環境にて生体内で腫瘍が間接的にさらされる流れを模倣する。
【０００９】
腫瘍の微細環境を試験管内で模倣するさらなる方法も提供される。該方法は細胞培養容器に培養培地を加えること及び細胞培養容器内の第１の多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの間質細胞型を播くことを含む。播かれた間質細胞型の上に第２の多孔性膜を置くので、第２の多孔性膜の第１の表面が播かれた間質細胞に接触する。少なくとも１つの腫瘍細胞型を第２の多孔性膜の第２の表面上に播く。第１の多孔性膜の第２の表面に剪断応力を適用することによって剪断応力を少なくとも１つの腫瘍細胞型に間接的に適用し、剪断応力は流動装置によって誘導される培養培地の流れから生じ、該流れは腫瘍微細環境にて生体内で腫瘍が間接的にさらされる流れを模倣する。
【００１０】
腫瘍に対する効果について薬剤または化合物を調べる試験管内の方法が提供される。該方法は、腫瘍の微細環境を模倣することと、薬剤または化合物を培養培地に加えることとを含む。薬剤または化合物に直接または間接的に暴露された少なくとも１つの腫瘍細胞型に剪断応力が間接的に適用される。薬剤または化合物の存在下での少なくとも１つの腫瘍細胞型における変化が薬剤または化合物が腫瘍に対して効果を有することを示す。
【００１１】
腫瘍の転移を試験管内で模倣する方法も提供される。方法は、上述の方法のいずれかに従って培養された少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞を、臓器または組織をモデル化する試験管内の系に導入することを含む。
【００１２】
腫瘍の転移を試験管内で模倣する別の方法も提供される。該方法は、上述の方法のいずれかに従って培養された少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞を動物に導入することを含む。
【００１３】
腫瘍の転移を試験管内で模倣するさらに別の方法も提供される。該方法は、細胞培養容器に培養培地を加えることと、細胞培養容器内の多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの細胞型を播くこととを含み、その際、第１の表面が細胞培養容器内の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内にて少なくとも１つの細胞型を含む下容量部と多孔性膜の第２の表面を含む上容量部を定義する。剪断応力を少なくとも１つの細胞型に間接的に適用し、剪断応力は流動装置によって誘導される培養培地の流れから生じ、該流れは生体内で細胞が間接的にさらされる流れを模倣する。ヒトまたはヒト化動物に由来する腫瘍細胞が上容量部または下容量部に導入される。
【００１４】
腫瘍の転移に対する効果について薬剤または化合物を調べる試験管内の方法が提供される。該方法は、試験管内で腫瘍の転移を模倣することと、培養培地に薬剤または化合物を加えることとを含む。薬剤または化合物の存在下にて臓器または組織をモデル化する試験管内の系での少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞における変化が薬剤または化合物が腫瘍の転移に対して効果を有することを示す。
【００１５】
腫瘍を有する対象に投与される化学療法レジメンを選択する方法が提供される。該方法は腫瘍に対する効果について試験管内で薬剤または化合物を調べること、または腫瘍の転移に対する試験管内の効果について薬剤または化合物を調べることを含み、その際、少なくとも１つの腫瘍細胞型は対象の腫瘍に由来する腫瘍細胞を含む。方法はさらに、試験管内の試験の結果に基づいて対象に薬剤または化合物を投与するかどうかを決定することを含む。
【００１６】
他の目的及び特長は、一部は明らかであり、一部は下文で指摘されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】円錐平板装置及び腫瘍細胞への剪断応力の間接的適用を示す図である。
【００１８】
【図２】細胞培養容器上に載り、上容積部と下容積部を潅流する流入配管と流出配管を固定するクリップの斜視図である。
【００１９】
【図３】細胞培養容器における２つのクリップの位置決めを示す図である。
【００２０】
【図４】（Ａ）肺病変を持つと診断された患者における中心気管支動脈のドップラー超音波検査画像を示す図である。（Ｂ）ヒトの肺病変のドップラー流のシグナルの壁剪断応力の算出（ダイン／ｃｍ２）を示す図である。（Ｃ）肺病変における例となる動脈血供給の模式図を示す。「ＰＡ」は肺動脈を表し、「ｃＢＡ」は中心気管支動脈を表し、「ｐＢＡ」は末梢気管支動脈を表す。
【００２１】
【図５】腫瘍の微細環境を試験管内で模倣する方法を説明する模式図である。
【００２２】
【図６】同上。
【００２３】
【図７】同上。
【００２４】
【図８】同上。
【００２５】
【図９】同上。
【００２６】
【図１０】同上。
【００２７】
【図１１】腫瘍の転移を試験管内で模倣するのに使用することができる、肝臓をモデル化する例となる系を示す図である。
【００２８】
【図１２】（Ａ）〜（Ｄ）少なくとも１つの腫瘍細胞型を含む細胞培養容器から培養培地をポンプで取り出し、肝臓をモデル化する試験管内の系に入れることによって腫瘍の転移を試験管内でモデル化する例となる構成を示す図である。
【００２９】
【図１３】（Ａ）〜（Ｃ）血行動態の剪断応力のもとで図９にて示す方法を用いて培養されたヒトの皮膚微細血管内皮細胞（Ａ）、ヒトの線維芽細胞（Ｂ）及びＡ５４９ヒトの非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍細胞（Ｃ）の蛍光顕微鏡像を示す図である。（Ｄ）〜（Ｆ）外から加えられた細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の実質的に非存在下で血行動態剪断応力のもとで図９にて示す方法を用いて培養されたＡ５４９腫瘍細胞の蛍光顕微鏡像を提供し（Ｄ）、その際、Ａ５４９腫瘍細胞はコラーゲンの層の上に播かれた（Ｅ）、またはＡ５４９腫瘍細胞をコラーゲンの層の上に播き、コラーゲンが実質的に腫瘍細胞を取り囲むように、播かれたＡ５４９腫瘍細胞の上にコラーゲンの別の層を堆積させた（Ｆ）（「コラーゲンサンドイッチ」）。
【００３０】
【図１４−１】（Ａ）二次元静置条件下でまたは図９にて示した方法を用いてＡ５４９腫瘍細胞の細胞増殖を測定するアッセイの結果を提供する図である。（Ｂ）静置二次元培養（「試験管内」）、本明細書で記載される試験管内の腫瘍微細環境（「試験管内の腫瘍微細環境」）及び異種移植にて培養した腫瘍細胞の増殖速度における質的差異の模式図である。
【００３１】
【図１４−２】（Ｃ）外から加えられた細胞外マトリクスの実質的に非存在下（マトリクスなし）で血行動態剪断応力のもとで図９にて示す方法を用いて培養されたＡ５４９腫瘍細胞の増殖を測定するアッセイからの結果を提供し、その際、Ａ５４９腫瘍細胞はコラーゲンの単層上に播かれた（「コラーゲン層」）、またはＡ５４９腫瘍細胞をコラーゲンの層の上に播き、コラーゲンが実質的に腫瘍細胞を取り囲むように、播かれたＡ５４９腫瘍細胞の上にコラーゲンの別の層を堆積させた（「コラーゲンサンドイッチ」）。
【００３２】
【図１５】多孔性膜の反対側に播いた腫瘍細胞の存在下（「腫瘍細胞」）または非存在下（「腫瘍細胞なし」）で培養され、且つ血行動態剪断応力のもとで培養された内皮細胞の透過性を評価する透過性アッセイの結果を提供する図である。
【００３３】
【図１６】静置二元条件下（「プラスチック」）で、異種移植にて、または外から加えられた細胞外マトリクスの実質的に非存在下（「ＮＣ」または「コラーゲンなし」）で血行動態剪断応力のもとで図９にて示す方法を用いて増殖させたＡ５４９腫瘍細胞における１４，１５９遺伝子の発現及びクラスタリングを示す系統樹（Ａ）及びヒートマップ（Ｂ）を提供し、その際、Ａ５４９腫瘍細胞はコラーゲンの単層上に播かれた（「ＣＬ」または「コラーゲン層」）、またはＡ５４９腫瘍細胞をコラーゲンの層の上に播き、コラーゲンが実質的に腫瘍細胞を取り囲むように、播かれたＡ５４９腫瘍細胞の上にコラーゲンの別の層を堆積させた（「ＣＳ」または「コラーゲンサンドイッチ」）。
【００３４】
【図１７】静置二次元培養（「プラスチック」）と比べた、異種移植にて、または外から加えられた細胞外マトリクスの実質的に非存在下（ＮＣ）またはコラーゲンサンドイッチ（ＳＣ）にて血行動態剪断応力のもとで図９にて示す方法を用いて増殖させたＡ５４９腫瘍細胞におけるＡ５４９腫瘍細胞の異種移植と静置二次元培養との間で差次的に発現される７９３５遺伝子の発現及びクラスタリングを示す系統樹（図１７Ａ）及びヒートマップ（Ｂ）を提供する。
【００３５】
【図１８】静置二次元培養（「プラスチック」）と比べた、異種移植にて、または外から加えられた細胞外マトリクスの実質的に非存在下（ＮＣ）またはコラーゲンサンドイッチ（ＳＣ）にて血行動態剪断応力のもとで図９にて示す方法を用いて増殖させたＡ５４９腫瘍細胞における京都遺伝子ゲノム百科事典（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）（ＫＥＧＧ）データベースでの「非小細胞肺癌」で注釈を付けられた４８遺伝子の発現及びクラスタリングを示す系統樹（図１８Ａ）及びヒートマップ（図１８Ｂ）を提供する。
【００３６】
【図１９】（Ａ，Ｂ）シスプラチン、ＭＫ２２０６またはセルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）の存在下でのＡ５４９腫瘍細胞の増殖の阻害を示す結果を提供する。
【００３７】
【図２０−１】（Ａ〜Ｆ）静置条件下または制御された血行動態の存在下で培養された肝細胞の蛍光顕微鏡像を示す。
【００３８】
【図２０−２】同上。
【００３９】
【図２０−３】同上。
【００４０】
【図２１】（Ａ）制御された血行動態のもとで培養された肝細胞の蛍光顕微鏡像を示す。（Ｂ）生体内の肝臓の蛍光顕微鏡像を示す。（Ｃ）制御された血行動態のもとで培養された肝細胞の透過電子顕微鏡像を示す。
【００４１】
【図２２】（Ａ〜Ｂ）静置条件下または制御された血行動態のもとで培養された肝細胞におけるアルブミン及び尿素の分泌のデータを示す図である。
【００４２】
【図２３】（Ａ〜Ｄ）静置条件下または制御された血行動態のもとで培養された肝細胞についての代謝遺伝子の発現を示す図である。
【００４３】
【図２４】（Ａ〜Ｂ）静置条件下または制御された血行動態のもとで培養された肝細胞についてのチトクロームｐ４５０活性のデータを示す図である。（Ｃ）制御された血行動態のもとで培養された肝細胞における輸送体活性についてのアッセイから得られた蛍光顕微鏡像を示す。
【００４４】
【図２５】試験管内の脂肪肝モデルについての遺伝子発現データを示す図である。
【００４５】
【図２６】試験管内の脂肪肝モデルについての遺伝子発現データを示す図である。
【００４６】
【図２７】（Ａ〜Ｂ）健常条件下または脂肪肝疾患を模倣する条件下で培養された肝細胞の蛍光顕微鏡像を示す。
【００４７】
【図２８】高グルコース／高インスリンの条件下で培養された肝細胞の透過電子顕微鏡像を示す。
【００４８】
【図２９】（Ａ〜Ｂ）健常条件下または脂肪肝疾患を模倣する条件下で培養された肝細胞における総脂質及び総トリグリセリドを測定するアッセイから得られたデータを示す。
【００４９】
【図３０】（Ａ〜Ｂ）健常条件下または脂肪肝疾患を模倣する条件下で培養された肝細胞についての遺伝子発現データを示す図である。
【００５０】
【図３１】（Ａ〜Ｂ）健常条件下または脂肪肝疾患を模倣する条件下で培養された肝細胞についての代謝遺伝子の発現データ及びチトクロームｐ４５０活性のデータを示す図である。
【００５１】
【図３２】（Ａ〜Ｃ）ピオグリタゾンの存在下または非存在下にて健常条件下または脂肪肝疾患を模倣する条件下で培養された肝細胞の蛍光顕微鏡像を示す。
【００５２】
【図３３】ピオグリタゾンの存在下または非存在下にて健常条件下または脂肪肝疾患を模倣する条件下で培養された肝細胞における総トリグリセリドを測定するアッセイから得られた結果を示す図である。
【００５３】
【図３４】ピオグリタゾンの存在下または非存在下にて健常条件下または脂肪肝疾患を模倣する条件下で培養された肝細胞についての代謝遺伝子の発現データを示す図である。
【００５４】
【図３５】（Ａ〜Ｃ）フェノバルビタールまたはリファンピシンの存在下にて制御された血行動態条件下または静置条件下で培養された肝細胞についてのチトクローム活性のデータを示す図である。
【００５５】
【図３６】（Ａ）生体内の血漿Ｃｍａｘ濃度でのクロルプロマジンに対して制御された血行動態条件下で培養された肝細胞の毒性反応を示す蛍光顕微鏡像を示す。（Ｂ）制御された血行動態条件下または静置条件下で培養され、種々の濃度のクロルプロマジンに暴露された肝細胞についての毒性用量反応を示す図である。
【００５６】
【図３７】制御された血行動態条件下で培養された肝細胞にてクロルプロマジンに応答する酸化ストレス関連の毒性遺伝子（図３７Ａ）及び代謝遺伝子（図３７Ｂ）の上方調節を示す図である。
【００５７】
【図３８】クロルプロマジンに応答する、制御された血行動態条件下または静置条件下で培養された肝細胞におけるｍｉＲＮＡ１２２の放出によって測定される急性毒性データを示す図である。
【００５８】
【図３９】トログリタゾンによる処理に応答した制御された血行動態条件下で培養された肝細胞における亜致死性毒性及び胆汁鬱滞性変化を示す蛍光顕微鏡像を示す。
【００５９】
【図４０】トログリタゾンによる処理に応答した制御された血行動態条件下で培養された肝細胞における酸化ストレス関連遺伝子及びＭＲＰ３及びＭＲＰ４遺伝子の上方調節を示す図である。
【００６０】
【図４１】（Ａ）制御された血行動態条件下で培養されたイヌ肝細胞の分極形態の保持を示す蛍光顕微鏡像を示す。（Ｂ）制御された血行動態条件下または静置条件下で培養されたイヌ肝細胞におけるＣＹＰ１Ａ１及びＣＹＰ３Ａ１の発現を示す遺伝子発現データを示す図である。
【００６１】
【図４２】制御された血行動態条件下で培養された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する肝細胞における分極形態の保持を示す蛍光顕微鏡像を示す。
【００６２】
【図４３】（Ａ〜Ｃ）制御された血行動態条件下で培養されたｉＰＳＣ由来の肝細胞における代謝遺伝子及び分化遺伝子の発現を示す遺伝子発現データを示す図である。
【００６３】
対応する参照文字は図面全体を通して対応する部分を指す。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
本発明は腫瘍の微細環境を試験管内で模倣する方法を提供する。製薬業界及び生物製薬業界によって腫瘍生物学の標準の試験管内モデルとして現在使用されている静置単独培養モデルとは対照的に、本発明の方法は腫瘍の微細環境を再現し、内皮細胞バリア、腫瘍増殖、細胞増殖、細胞移動、細胞浸潤、及び腫瘍細胞の抗癌療法への応答性の変化を含む癌の多数の様相を評価するのに使用され得る。
【００６５】
腫瘍の微細環境を試験管内で模倣する方法が提供される。方法は、細胞培養容器に培養培地を加えることと、細胞培養容器内の表面上に少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くことと、少なくとも１つの腫瘍細胞型に剪断応力を間接的に適用することとを含む。剪断応力は流動装置によって誘導される培養培地の流れから生じる。流れは腫瘍細胞が腫瘍の微細環境に試験管内で間接的にさらされる流れを模倣する。流れは時変性である。
【００６６】
少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を細胞培養容器内の表面上に堆積させることができ、少なくとも１つの細胞外マトリクス上に少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くことができる。或いは、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む溶液に少なくとも１つの腫瘍細胞型を懸濁させて少なくとも１つの腫瘍細胞型と少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創ることができる。次いで懸濁液を細胞培養容器内の表面上に堆積させることができる。剪断応力を少なくとも１つの細胞外マトリクス成分と少なくとも１つの腫瘍細胞型に間接的に適用することができる。
【００６７】
方法はさらに、多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くことと、多孔性膜の第２の表面に剪断応力を適用することによって少なくとも１つの腫瘍細胞型に剪断応力を間接的に適用することとを含む。
【００６８】
腫瘍の微細環境を試験管内で模倣する別の方法も提供される。方法は細胞培養容器に培養培地を加えることと、細胞培養容器内の多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くことと、多孔性膜の第２の表面に剪断応力を適用することによって少なくとも１つの腫瘍細胞型に剪断応力を間接的に適用することとを含む。剪断応力は流動装置によって誘導される培養培地の流れから生じる。流れは腫瘍細胞が腫瘍の微細環境に試験管内で間接的にさらされる流れを模倣する。
【００６９】
腫瘍の微細環境を試験管内で模倣するさらに別の方法が提供される。方法は、細胞培養容器に培養培地を加えることと、細胞培養容器内の多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの腫瘍細胞型または間質細胞型を播くこととを含む。間質細胞型が多孔性膜の第１の表面上に播かれる場合、少なくとも１つの腫瘍細胞型が細胞培養容器内の表面上に存在する。多孔性膜の第２の表面に剪断応力を適用することによって少なくとも１つの腫瘍細胞型に剪断応力が間接的に適用され、剪断応力は流動装置によって誘導される培養培地の流れから生じ、流れは腫瘍細胞が腫瘍の微細環境に試験管内で間接的にさらされる流れを模倣する。
【００７０】
少なくとも１つの腫瘍細胞型が多孔性膜の第１の表面上に播かれる方法のいずれでも、第１の表面が細胞培養容器に底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させることができ、それによって細胞培養容器内にて少なくとも１つの腫瘍細胞型を含む下容量部と多孔性膜の第２の表面を含む上容量部を定義する。剪断応力は容器の上容量部にて多孔性膜の第２の表面に適用される。
【００７１】
加えて、少なくとも１つの腫瘍細胞型が多孔性膜の第１の表面上に播かれる方法のいずれでも、方法はさらに、多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を堆積させることと、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分上に少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くことを含む。或いは、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む溶液に少なくとも１つの腫瘍細胞型を懸濁させて少なくとも１つの腫瘍細胞型と少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創ることができ、懸濁液を多孔性膜の第１の表面上に堆積させることができる。第１の表面が細胞培養容器に底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内にて少なくとも１つの細胞外マトリクス成分及び少なくとも１つの腫瘍細胞型を含む下容量部と多孔性膜の第２の表面を含む上容量部を定義する。剪断応力は容器の上容量部にて多孔性膜の第２の表面に適用される。
【００７２】
方法はさらに、多孔性膜の第２の表面上に内皮細胞を播くことと、播かれた内皮細胞に剪断応力を適用することとを含む。少なくとも１つの腫瘍細胞型が多孔性膜の第１の表面上に播かれる。
【００７３】
方法はさらに、多孔性膜の第２の表面上に少なくとも１つの間質細胞型を播くことと、播かれた間質細胞型に剪断応力を適用することとを含む。
【００７４】
少なくとも１つの間質細胞型が多孔性膜の第２の表面上に播かれる方法では、方法はさらに多孔性膜の第２の表面上に内皮細胞を播くことを含む。少なくとも１つの間質細胞型は播く前に内皮細胞と混合することができ、方法は少なくとも１つの間質細胞型と内皮細胞の播かれた混合物に剪断応力を適用することを含む。或いは、少なくとも１つの間質細胞型及び内皮細胞は多孔性膜の第２の表面上に順次播くことができる。たとえば、方法は多孔性膜の第２の表面上に少なくとも１つの間質細胞型を播くことと、播かれた間質細胞型の上に内皮細胞を順次播くことと、播かれた内皮細胞に剪断応力を適用することとを含む。或いは、方法は、多孔性膜の第２の表面上に内皮細胞を播くことと、播かれた内皮細胞の上に少なくとも１つの間質細胞型を順次播くことと、播かれた間質細胞型に剪断応力を適用することとを含む。
【００７５】
少なくとも１つの腫瘍細胞型が多孔性膜の第１の表面上に播かれる方法では、多孔性膜は第１の多孔性膜であることができ、方法は、第１の多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くことを含む。少なくとも１つの間質細胞型は第１の多孔性膜の第２の表面上に播かれる。第２の多孔性膜は、第２の多孔性膜の第１の表面が播かれた間質細胞に接触するように、播かれた間質細胞型の上に置かれる。剪断応力は第２の多孔性膜の第２の表面に適用される。
【００７６】
少なくとも１つの細胞外マトリクス成分、または少なくとも１つの腫瘍細胞型と少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を多孔性膜の第１の表面上に堆積させることを含む方法では、多孔性膜は第１の多孔性膜であることができ、方法はさらに、第１の多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を堆積させることと、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分の上に少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くこととを含む。或いは、方法はさらに、第１の多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの腫瘍細胞型と少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を堆積させることを含むことができる。いずれの方法もさらに、第１の多孔性膜の第２の表面上に少なくとも１つの間質細胞型を播くことと、第２の多孔性膜の第１の表面が播かれた間質細胞に接触するように、播かれた間質細胞型の上に第２の多孔性膜を置くことと、第２の多孔性膜の第２の表面に剪断応力を適用することとを含む。
【００７７】
多孔性膜が上述の第１の多孔性膜である方法では、方法はさらに、第２の多孔性膜の第２の表面上に内皮細胞を播くことと、播かれた内皮細胞に剪断応力を適用することとを含むことができる。
【００７８】
多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの腫瘍細胞型または間質細胞型を播くことを含む方法では、多孔性膜は第１の多孔性膜であり、方法はさらに第１の多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの間質細胞型を播くことを含むことができる。第２の多孔性膜は播かれた間質細胞型の上に置かれ、第２の多孔性膜の第１の表面は播かれた間質細胞に接触するようになる。少なくとも１つの腫瘍細胞型が第２の多孔性膜の第２の表面上に播かれる。第１の多孔性膜の第２の表面に剪断応力を適用することによって剪断応力は少なくとも１つの腫瘍細胞型に間接的に適用される。
【００７９】
本発明はまた、腫瘍の微細環境を試験管内で模倣する別の方法も対象とする。方法は、細胞培養容器に培養培地を加えることと、細胞培養容器内の第１の多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの間質細胞型を播くこととを含む。第２の多孔性膜は播かれた間質細胞型の上に置かれ、第２の多孔性膜の第１の表面は間質細胞に接触するようになる。少なくとも１つの腫瘍細胞型は第２の多孔性膜の第２の表面上に播かれる。第１の多孔性膜の第２の表面に剪断応力を適用することによって剪断応力は少なくとも１つの腫瘍細胞型に間接的に適用され、剪断応力は流動装置によって誘導される培養培地の流れから生じ、該流れは腫瘍の微細環境にて生体内で腫瘍が間接的にさらされる流れを模倣する。
【００８０】
第１の多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの間質細胞型を播くことを含む方法では、第１の多孔性膜の第１の表面が細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて第１の多孔性膜を懸濁させることができ、それによって細胞培養容器内にて少なくとも１つの腫瘍細胞型、第２の多孔性膜及び少なくとも１つの間質細胞型を含む下容量部と第１の多孔性膜の第２の表面を含む上容量部を定義する。剪断応力は容器の上容量部にて第１の多孔性膜の第２の表面に適用される。
【００８１】
第１の多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの間質細胞型を播くことを含む方法では、方法はさらに、第２の多孔性膜の第２の表面上に少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を堆積させることと、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分の上に少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くことを含むことができる。或いは、方法はさらに、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む溶液に少なくとも１つの腫瘍細胞型を懸濁させて少なくとも１つの腫瘍細胞型と少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創ることと、第２の多孔性膜の第２の表面上に懸濁液を堆積させることとを含むことができる。
【００８２】
第１の多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの間質細胞型を播くことを含む方法では、方法はさらに、第１の多孔性膜の第２の表面上に内皮細胞を播くことと、播かれた内皮細胞に剪断応力を適用することとを含むことができる。
【００８３】
第２の多孔性膜の使用を含む方法では、方法はさらに、播かれた間質細胞型の上に第２の多孔性膜を置くのに先立って少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む溶液に第２の多孔性膜を浸漬することを含むことができる。
【００８４】
内皮細胞を播くことを含む方法では、方法はさらに、内皮細胞と共に少なくとも１つの腫瘍細胞型を同時に播くことを含むことができる。同時に播くことは、播くことに先立って内皮細胞と少なくとも１つの腫瘍細胞型を混合することを含むことができる。或いは、同時に播くことは、少なくとも１つの腫瘍細胞型と内皮細胞と順次播くことを含むことができる。たとえば、同時に播くことは、少なくとも１つの腫瘍細胞型を播き、その後、内皮細胞を播くことを含むことができる。或いは、内皮細胞を播き、その後、少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くことを含むことができる。
【００８５】
少なくとも１つの腫瘍細胞型を内皮細胞と同時に播くことを含む方法のいずれでも、同時に播くことは、約１００：１〜約３：１の比で内皮細胞と少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くことを含むことができる。たとえば、同時に播くことは、約５０：１〜約１０：１の比で内皮細胞と少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くことを含むことができる。
【００８６】
少なくとも１つの腫瘍細胞型を内皮細胞と同時に播くことを含む方法のいずれでも、少なくとも１つの腫瘍細胞型は本明細書で記載される腫瘍細胞型のいずれかであることができる。これらの方法では、少なくとも１つの腫瘍細胞型は好ましくは膠芽細胞腫に由来する細胞を含む。
【００８７】
細胞が多孔性膜の上に播かれる方法のいずれでも、多孔性膜、第１の多孔性膜または第２の多孔性膜は、培養培地の流体連通及び多孔性膜の対向側に播かれた細胞間の物理的な相互作用及び連通を可能にするように適合させることができる。
【００８８】
本発明はまた、腫瘍に対する効果について薬剤または化合物を調べる試験管内の方法にも関する。方法は、腫瘍の微細環境を模倣することと、培養培地に薬剤または化合物を加えることと、薬剤または化合物に直接的にまたは間接的に暴露される少なくとも１つの腫瘍細胞型に剪断応力を間接的に適用することとを含む。薬剤または化合物の存在下での少なくとも１つの腫瘍細胞型における変化が薬剤または化合物が腫瘍に対する効果を有することを示す。腫瘍の微細環境は、上述の腫瘍の微細環境を模倣する試験管内の方法によって模倣することができる。
【００８９】
腫瘍の微細環境が試験管内で模倣されることを確認するために、腫瘍の微細環境のマーカーのレベルまたは局在を本発明の方法と剪断応力の適用がない同じ方法との間で比較することができる。剪断応力を適用した際の少なくとも１つの腫瘍細胞型、少なくとも１つの間質細胞型または内皮細胞におけるマーカーのレベルまたは局在を、剪断応力の適用の非存在下での少なくとも１つの腫瘍細胞型、少なくとも１つの間質細胞型または内皮細胞におけるマーカーのレベルまたは局在と比較する。或いは、剪断応力を適用した際の培養培地におけるマーカーのレベルを剪断応力の適用の非存在下での培養培地におけるマーカーのレベルと比較する。たとえば、マーカーが腫瘍の存在に関連すると知られており、腫瘍が生体内に存在する場合、その濃度が血清で高くなると知られているならば、剪断応力の適用の非存在下での培養培地におけるマーカーのレベルと比べて剪断応力を適用した際の本発明の方法の培養培地におけるマーカーのレベルの上昇は、本発明の試験管内の方法によって腫瘍の微細環境が模倣されることを裏付ける。
【００９０】
上記の方法のいずれでも、細胞培養容器は注入口と排出口を含むことができる。注入口と排出口は、細胞培養培地、薬剤、化合物、及び他の成分を細胞培養容器に潅流で出し入れするのに使用することができる。
【００９１】
注入口と排出口は、上容量部と下容量部を定義する細胞培養容器の部分の中にあることができる。
【００９２】
方法のいずれも細胞培養容器の中に及びその外に培養培地を潅流することを含むことができる。たとえば、方法は、上容量部の中に及びその外に培養培地を潅流すること及び／または下容量部の中に及びその外に培養培地を潅流することを含むことができる。
【００９３】
腫瘍の微細環境を試験管内で模倣する方法のいずれ、第１の細胞培養容器にて腫瘍の微細環境を試験管内で模倣することと、第２の細胞培養容器にて腫瘍の微細環境を試験管内で模倣することと、第１の細胞培養容器にて培養された少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞を第２の細胞培養容器に移すこととを含むことができる。移すことは、第１の細胞培養容器にて培養された少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞を第２の細胞培養容器に手動で移すことを含むことができる。或いは、第１の細胞培養容器の排出口を第２の細胞培養容器の注入口に接続することができ、方法はさらに、少なくとも１つの腫瘍細胞型を含む培養培地を第１の細胞培養容器からポンプで取り出して第２の細胞培養容器に入れることを含むことができる。
【００９４】
本明細書で記載される腫瘍の微細環境を試験管内で模倣する方法のいずれでも、方法はさらに、臓器または組織をモデル化する試験管内の系で培養された細胞を細胞培養容器に導入することを含むことができる。
【００９５】
細胞型
上述の方法のいずれも、さらに、細胞培養容器内の表面上に、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分上に、または多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの間質細胞型を播くことを含むことができる。或いは、少なくとも１つの間質細胞型は腫瘍細胞型とともに少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む溶液に懸濁されて少なくとも１つの間質細胞型、少なくとも１つの腫瘍細胞型及び少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創ることができ、該懸濁液を細胞培養容器内の表面上に、または多孔性膜の第１の表面上に堆積させることができる。
【００９６】
少なくとも１つの腫瘍細胞型が第１の多孔性膜の第１の表面上に播かれる方法については、方法はさらに第１の多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの間質細胞型を播くことを含むことができる。或いは、方法はさらに、少なくとも１つの間質細胞型を腫瘍細胞型とともに少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む溶液に懸濁させて少なくとも１つの間質細胞型、少なくとも１つの腫瘍細胞型及び少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創ることと、該懸濁液を第１の多孔性膜の第１の表面上に堆積させることとを含むことができる。
【００９７】
少なくとも１つの腫瘍細胞型が第２の多孔性膜の第２の表面上に播かれる方法については、方法はさらに第２の多孔性膜の第２の表面上に少なくとも１つの間質細胞型を播くことを含むことができる。或いは、方法はさらに、少なくとも１つの間質細胞型を腫瘍細胞型とともに少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む溶液に懸濁させて少なくとも１つの間質細胞型、少なくとも１つの腫瘍細胞型及び少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創ることと、該懸濁液を第２の多孔性膜の第２の表面上に堆積させることとを含むことができる。
【００９８】
上述の方法のいずれも、さらに、１以上の追加の細胞型を細胞培養容器の表面上に、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分上に、多孔性膜の第１の若しくは第２の表面上に、第１の多孔性膜の第１の若しくは第２の表面上に、または第２の多孔性膜の第１のまたは第２の表面上に播くことと、上容量部内での培養培地にてまたは下容量部内での培養培地にて１以上の追加の細胞型を懸濁させることとを含むこともできる。
【００９９】
少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む溶液に少なくとも１つの腫瘍細胞型を懸濁させることを含む方法のいずれでも、方法はさらに、１以上の追加の細胞型を少なくとも１つの腫瘍細胞型と共に、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む溶液に懸濁させて１以上の追加の細胞型、少なくとも１つの腫瘍細胞型及び少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創ることと、該懸濁液を細胞培養容器の表面上に、多孔性膜の第１の表面上に、第１の多孔性膜の第１の表面上に、または第２の多孔性膜の第２の表面上に堆積させることとを含むことができる。
【０１００】
本発明の方法で使用するための細胞型には初代細胞及び不死化細胞が含まれる。少なくとも１つの腫瘍細胞型、内皮細胞、少なくとも１つの間質細胞型、または１以上の追加の細胞型は不死化細胞を含むことができる。少なくとも１つの腫瘍細胞型、内皮細胞、少なくとも１つの間質細胞型、または１以上の追加の細胞型は初代細胞を含むことができる。
【０１０１】
細胞型のいずれも、動物、たとえば、遺伝子操作された動物、またはヒトに由来する細胞を含むことができる。
【０１０２】
本発明の方法のいずれでも、方法はさらに細胞型（単数）または細胞型（複数）を培養するステップを含むことができる。
【０１０３】
方法にて使用することができる少なくとも１つの腫瘍細胞型、内皮細胞、少なくとも１つの間質細胞型、または１以上の追加の細胞型は以下でさらに記載される。
【０１０４】
腫瘍細胞
少なくとも１つの腫瘍細胞型は、癌腫、肉腫、リンパ腫、腺癌、混合中胚葉性腫瘍、癌肉腫、奇形癌、またはそれらの組み合わせに由来する細胞を含むことができる。
【０１０５】
癌腫に由来する細胞は、腺癌に由来する細胞、扁平上皮癌に由来する細胞、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１０６】
肉腫に由来する細胞は、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、中皮肉腫（中皮腫）、線維肉腫、血管肉腫（たとえば、血管内皮腫、リンパ管肉腫、それらの組み合わせに由来する）、脂肪肉腫、神経膠腫、星状細胞腫、粘液肉腫、間葉腫瘍、混合中胚葉性腫瘍、またはそれらの組み合わせに由来する細胞を含むことができる。
【０１０７】
リンパ腫に由来する細胞は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、またはそれらの組み合わせに由来する細胞を含むことができる。
【０１０８】
少なくとも１つの腫瘍細胞型は、結合組織の腫瘍、内皮または中皮の腫瘍、リンパ組織の腫瘍、筋肉の腫瘍、上皮組織の腫瘍、神経組織の腫瘍、アミン前駆体の取り込み及び脱カルボシキル化（ＡＰＵＤ）の系の腫瘍、神経堤に由来する細胞の腫瘍、生殖腺の腫瘍、またはそれらの組み合わせに由来することができる。
【０１０９】
少なくとも１つの腫瘍細胞型が結合組織の腫瘍に由来する場合、腫瘍は、成人の線維組織の腫瘍（たとえば、線維腫または線維肉腫）、胚性（粘液腫）の線維組織の腫瘍（たとえば、粘液腫または粘液肉腫）、脂肪組織の腫瘍（たとえば、脂肪腫または脂肪肉腫）、軟骨組織の腫瘍（たとえば、軟骨腫または軟骨肉腫）、脊索の腫瘍（たとえば、軟骨腫）、線維性組織球腫の腫瘍（たとえば、悪性線維性組織球腫）またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１１０】
少なくとも１つの腫瘍細胞型が内皮または中皮の腫瘍に由来する場合、腫瘍は、血管腫瘍（たとえば、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫または血管肉腫）、リンパ管腫瘍（たとえば、リンパ管腫、リンパ管肉腫）、中皮腫瘍（たとえば、中皮腫）またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１１１】
少なくとも１つの腫瘍細胞型がリンパ系組織の腫瘍に由来する場合、腫瘍は、形質細胞腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１１２】
少なくとも１つの腫瘍細胞型が筋肉の腫瘍に由来する場合、腫瘍は平滑筋の腫瘍（たとえば、平滑筋種または平滑筋肉腫）、横紋筋の腫瘍（たとえば、横紋筋腫または横紋筋肉腫）またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１１３】
少なくとも１つの腫瘍細胞型が上皮組織の腫瘍に由来する場合、腫瘍は、重層扁平組織の腫瘍（たとえば、乳頭腫、脂漏性角化症、皮膚付属器腫瘍、扁平上皮癌または類表皮癌）、腺上皮の腫瘍（たとえば、肝臓、腎臓または胆管の腺上皮の腫瘍）、移行上皮の腫瘍（たとえば、移行細胞乳頭腫または移行細胞癌）、胎盤腫瘍（たとえば、胞状奇胎または絨毛腫）、精巣腫瘍（たとえば、精上皮腫または胎児性細胞癌）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。腺上皮の腫瘍が肝臓の腺上皮の腫瘍である場合、腫瘍は肝細胞腺腫または肝細胞癌を含むことができる。腺上皮の腫瘍が腎臓の腺上皮の腫瘍である場合、腫瘍は尿細管腺腫、腎細胞癌または副腎腫を含むことができる。腺上皮の腫瘍が胆管の腺上皮の腫瘍である場合、腫瘍は胆管腺腫または胆管癌を含むことができる。
【０１１４】
少なくとも１つの腫瘍細胞型が神経組織の腫瘍に由来する場合、腫瘍はグリア細胞の腫瘍（たとえば、神経膠腫又は膠芽細胞腫）、神経細胞の腫瘍（たとえば、神経節細胞腫、神経芽細胞腫または髄芽細胞腫）、髄膜の腫瘍（たとえば、髄膜腫）、神経鞘の腫瘍（たとえば、シュワン鞘腫、神経鞘腫、神経線維腫、髄膜腫または神経線維肉腫）またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１１５】
少なくとも１つの腫瘍細胞型がアミン前駆体の取り込み及び脱カルボシキル化（ＡＰＵＤ）の系の腫瘍に由来する場合、腫瘍は、下垂体腫瘍（たとえば、好塩基球腺腫、好酸球腺腫または色素嫌性腺腫）、副甲状腺腫瘍（たとえば、副甲状腺腺腫または副甲状腺癌）、甲状腺腫瘍（たとえば、甲状腺のＣ細胞過形成または髄質癌）、気管支表層腫瘍（たとえば、気管支カルチノイドまたは燕麦細胞癌）、副腎髄質腫瘍（たとえば、褐色細胞腫）、膵臓腫瘍（たとえば、島細胞腺腫、インスリノーマ、ガストリノーマまたは島細胞癌）、胃または腸の腫瘍（たとえば、カルチノイド）、頸動脈小体の腫瘍、化学受容体系の腫瘍（たとえば、化学受容体腫、傍神経節腫またはカルチノイド）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１１６】
少なくとも１つの腫瘍細胞型が神経堤に由来する細胞の腫瘍に由来する場合、腫瘍は、色素産生細胞の腫瘍（たとえば、母斑または黒色腫）、末梢神経系のシュワン細胞の腫瘍（たとえば、シュワン鞘腫または神経鞘腫）、メルケル細胞の腫瘍（たとえば、メルケル細胞腫瘍）またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１１７】
少なくとも１つの腫瘍細胞型が生殖器腫瘍に由来する場合、腫瘍は、卵巣の腫瘍、精巣の腫瘍、精上皮腫、未分化胚細胞腫、絨毛腫、胚性癌腫、内胚葉洞腫瘍、奇形癌腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫瘍、男化腫瘍、顆粒膜／卵胞膜腫瘍、門細胞腫またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１１８】
少なくとも１つの腫瘍細胞型は、肺、乳房、結腸、直腸、前立腺、膀胱、骨、膵臓、肝臓、胆管、卵巣、精巣、子宮、胎盤、脳、軟骨、平滑筋、横紋筋、体腔の膜表層、線維組織、血管、リンパ管、リンパ節、脂肪組織、脳の神経性結合組織、腎臓、下垂体、副甲状腺、甲状腺、気管支表層、副腎髄質、胃、大腸、小腸、頸動脈小体、化学受容体系、皮膚、胆嚢の腫瘍、またはそれらの組み合わせに由来することができる。
【０１１９】
少なくとも１つの腫瘍細胞型は、不死化細胞を含むことができる。たとえば、少なくとも１つの腫瘍細胞型は、非小細胞肺癌の細胞、乳癌の細胞、膵臓癌の細胞、前立腺癌の細胞、卵巣癌の細胞、直腸癌の細胞、またはそれらの組み合わせを含む不死化細胞株を含むことができる。たとえば、不死化細胞株はヒト非小細胞肺腺癌の細胞株Ａ５４９、ヒト乳癌の細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト膵臓癌の細胞株ＢｘＰＣ−３、ヒト前立腺癌の細胞株ＤＵ１４５、ヒト前立腺癌の細胞株ＬＮＣａＰ、ヒト卵巣癌の細胞株ＳＫＯＶ−３、ヒト直腸癌の細胞株ＣＯＬＯ−２０５またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１２０】
少なくとも１つの腫瘍細胞型は初代細胞を含むことができる。たとえば、腫瘍細胞型は生検、腫瘍切除、採血またはそれらの組み合わせによって対象から得られた初代細胞を含むことができる。採血を用いて初代腫瘍から脱落している及び循環系に存在する癌細胞を得ることができる。初代腫瘍細胞はステージＩの腫瘍、ステージＩＩの腫瘍、ステージＩＩＩの腫瘍またはステージＩＶの腫瘍から得ることができる。
【０１２１】
少なくとも１つの腫瘍細胞型は、たとえば、ヒト化マウスのような、ヒト対象に由来する腫瘍を担っているヒト化動物に由来する腫瘍細胞を含むことができる。たとえば、ヒト化マウスは、非肥満糖尿病性重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウス、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγヌル（ＮＯＧ）マウスまたはＮＯＤ  ＳＣＩＤ  ＩＬ−２Ｒγノックアウト（ＮＳＧ）マウスであることができる。
【０１２２】
内皮細胞
内皮細胞は、微細血管内皮細胞、大血管内皮細胞、内皮前駆細胞、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１２３】
内皮細胞は腫瘍に由来することができる。たとえば、少なくとも１つの腫瘍細胞型が動物の腫瘍に由来する細胞を含む場合、内皮細胞は同一腫瘍に由来することができる。
【０１２４】
内皮細胞はまた腫瘍が存在する臓器または組織に由来することもできる。たとえば、少なくとも１つの腫瘍細胞型が動物の腫瘍に由来する細胞を含む場合、内皮細胞は存在する臓器または組織に由来することができる。従って、たとえば、少なくとも１つの腫瘍細胞型が肺の腫瘍に由来する細胞を含むのであれば、内皮細胞は、その動物の肺組織または異なる動物の肺組織に由来する内皮細胞を含むことができる。
【０１２５】
内皮細胞は、肺、乳房、結腸、直腸、前立腺、膀胱、骨、膵臓、肝臓、胆管、卵巣、精巣、子宮、胎盤、脳、軟骨、平滑筋、横紋筋、体腔の膜表層、線維組織、血管、リンパ管、リンパ節、脂肪組織、脳の神経性結合組織、腎臓、下垂体、副甲状腺、甲状腺、気管支表層、副腎髄質、胃、大腸、小腸、頸動脈小体、化学受容体系、皮膚、胆嚢、またはそれらの組み合わせに由来する内皮細胞を含むことができる。
【０１２６】
たとえば、内皮細胞は、肺の微細血管の内皮細胞、乳腺の微細血管の内皮細胞、膵臓の微細血管の内皮細胞、前立腺の微細血管の内皮細胞、卵巣の微細血管の内皮細胞、結腸の微細血管の内皮細胞、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１２７】
内皮細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する細胞を含むことができる。
【０１２８】
間質細胞
少なくとも１つの間質細胞型は、線維芽細胞、免疫細胞、周皮細胞、炎症性細胞、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１２９】
少なくとも１つの間質細胞型が線維芽細胞を含む場合、線維芽細胞は胎児性間質線維芽細胞、たとえば、ヒトの胎児性間質線維芽細胞株ＩＭＲ−９０を含むことができる。或いは、線維芽細胞はヒトの肺線維芽細胞株Ｈｓ８８８Ｌｕを含むことができる。
【０１３０】
少なくとも１つの間質細胞型が免疫細胞を含む場合、免疫細胞はマクロファージ、リンパ球、樹状細胞またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１３１】
少なくとも１つの間質細胞型が炎症性細胞を含む場合、炎症性細胞はＢ細胞、Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１３２】
少なくとも１つの間質細胞型は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する細胞を含むことができる。
【０１３３】
少なくとも１つの間質細胞型は播くのに先立って少なくとも１つの腫瘍細胞型と混合することができる。たとえば、少なくとも１つの間質細胞型は約０．１：１〜約３：１の比、約０．２：１〜約２：１の比、約０．２５：１の比または約１：１の比で少なくとも１つの腫瘍細胞型と混合することができる。
【０１３４】
或いは、方法は、少なくとも１つの腫瘍細胞型と少なくとも１つの間質細胞型を順次播くことを含むことができる。たとえば、方法は少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くことと、その後、播いた腫瘍細胞型の上に少なくとも１つの間質細胞型を播くこととを含むことができる。或いは、方法は、少なくとも１つの間質細胞型を播くことと、その後、播いた間質細胞型の上に少なくとも１つの腫瘍細胞型を播くこととを含むことができる。
【０１３５】
追加の細胞型
本明細書で記載される方法はさらに、１以上の追加の細胞型を細胞培養容器の表面上に、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分上に、多孔性膜の第１のまたは第２の表面上に、第１の多孔性膜の第１のまたは第２の表面上に、または第２の多孔性膜の第１のまたは第２の面上に播くこと；または上容量部内での培養培地にて若しくは下容量部内での培養培地にて１以上の追加の細胞型を懸濁させることを含むこともできる。
【０１３６】
少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む溶液に少なくとも１つの腫瘍細胞型を懸濁させることを含む方法のいずれでも、方法はさらに、１以上の追加の細胞型を少なくとも１つの腫瘍細胞型と共に、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む溶液に懸濁させて１以上の追加の細胞型、少なくとも１つの腫瘍細胞型及び少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創ることと、細胞培養容器の表面上に、多孔性膜の第１の表面上に、第１の多孔性膜の第１の表面上に、または第２の多孔性膜の第２の表面上に該懸濁液を堆積させることとを含むことができる。
【０１３７】
１以上の追加の細胞型は、線維芽細胞、免疫細胞、周皮細胞、炎症性細胞、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１３８】
１以上の追加の細胞型が線維芽細胞を含む場合、線維芽細胞は胎児性間質線維芽細胞、たとえば、ヒトの胎児性間質線維芽細胞株ＩＭＲ−９０を含むことができる。或いは、線維芽細胞はヒトの肺線維芽細胞株Ｈｓ８８８Ｌｕを含むことができる。
【０１３９】
１以上の追加の細胞型が免疫細胞を含む場合、免疫細胞はマクロファージ、リンパ球、樹状細胞またはそれらの組み合わせを含むことができる。たとえば、免疫細胞はリンパ球を含むことができ、リンパ球は上容量部内の培養培地に懸濁させることができる。
【０１４０】
１以上の追加の細胞型が炎症性細胞を含む場合、炎症性細胞はＢ細胞、Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１４１】
細胞外マトリクス成分
１以上の細胞外マトリクス成分は細胞培養容器内の表面上に播かれる細胞型によって（たとえば、少なくとも１つの腫瘍細胞型によって）産生され得る。細胞外マトリクスが細胞培養容器内の表面上に播かれる細胞型（単数）または細胞型（複数）によって産生される場合、該細胞外マトリクスは本明細書では「内在性の」細胞外マトリクスと呼ばれる。
【０１４２】
対照的に、１以上の細胞外マトリクス成分が本明細書で記載される方法の間に細胞培養容器内の表面上に堆積される場合、該細胞外マトリクスは、「外来性の」または「外から加えられた」細胞外マトリクスと呼ばれる。
【０１４３】
本明細書で記載される方法は、外から加えられた細胞外マトリクスの実質的な非存在下で細胞型（単数）または細胞型（複数）を培養することを含むことができる。「外から加えられた細胞外マトリクスの実質的な非存在」は、方法が、細胞培養容器内の表面上に細胞外マトリクス成分を堆積させることを含まないこと、または細胞外マトリクス成分を含む溶液に１以上の細胞型を懸濁させて細胞型と少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創り、該懸濁液を細胞培養容器内の表面上に堆積させることを含まないことを意味する。しかしながら、方法が第１と第２の多孔性膜の使用を含む場合、方法は、播かれた間質細胞型上に第２の多孔性膜を置くのに先立って少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を含む溶液にて第２の多孔性膜を浸漬することを含むことができる。特定の理論に束縛されないで、この浸漬ステップが実施されると、細胞外マトリクス成分は多孔性膜によって吸収され、膜への細胞の付着に役立つが、細胞培養容器への非常に少量の細胞外マトリクスの添加しか生じないと考えられる。従って、この浸漬ステップが実施される場合でさえ、細胞は「外から加えられた細胞外マトリクスの実質的な非存在」下で培養することができる。「外から加えられた細胞外マトリクスの実質的な非存在」下で培養することには、外来性の細胞外マトリクスを何があっても細胞培養容器に加えることを含まない方法も含まれる。
【０１４４】
本発明の方法で使用するための細胞外マトリクス成分は、コラーゲン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、またはそれらの組み合わせを含むことができる。細胞外マトリクス成分は好ましくは、腫瘍細胞、内皮細胞、間質細胞及び／または１以上の追加の細胞型の生体内環境に存在する細胞外マトリクス成分の型である。
【０１４５】
たとえば、細胞外マトリクス成分がコラーゲンを含む場合、該コラーゲンは、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩ型、コラーゲンＩＩＩ型、コラーゲンＩＶ型、コラーゲンＶ型、コラーゲンＶＩ型、コラーゲンＶＩＩ型、コラーゲンＶＩＩＩ型、コラーゲンＩＸ型、コラーゲンＸ型、コラーゲンＸＩ型、コラーゲンＸＩＩ型、コラーゲンＸＩＩＩ型、コラーゲンＸＩＶ型、コラーゲンＸＶ型、コラーゲンＸＶＩ型、コラーゲンＸＶＩＩ型、コラーゲンＸＶＩＩＩ型、コラーゲンＸＩＸ型、コラーゲンＸＸ型、コラーゲンＸＸＩ型、コラーゲンＸＸＩＩ型、コラーゲンＸＸＩＩＩ型、コラーゲンＸＸＩＶ型、コラーゲンＸＸＶ型、コラーゲンＸＸＶＩ型、コラーゲンＸＸＶＩＩ型、コラーゲンＸＸＶＩＩＩ型、またはそれらの組み合わせを含む。細胞外マトリクス成分がコラーゲンを含む場合、コラーゲンの濃度は好ましくは約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも約２ｍｇ／ｍｌである。
【０１４６】
細胞外マトリクス成分は、生物供給源（たとえば、ヒトの胎盤）から精製された脱細胞化された細胞外マトリクスを含むことができる。
【０１４７】
細胞外マトリクス成分は、細胞培養容器内の細胞型（単数）または細胞型（複数）によって（たとえば、少なくとも１つの腫瘍細胞型によって）分泌され得る。
【０１４８】
細胞外マトリクス成分は、細胞培養容器内の表面上に播かれた線維芽細胞、軟骨細胞、または骨芽細胞によって分泌され得る。
【０１４９】
細胞外マトリクス成分は好適に生体内の腫瘍の微細環境の剛性を模倣する。たとえば、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分は、約０．１ｋＰａ〜約２５ｋＰａ、約０．１５ｋＰａ〜約１５ｋＰａ、または約３ｋＰａ〜約１２ｋＰａのヤング率を有することができる。
【０１５０】
少なくとも１つの細胞外マトリクス成分は均一ではないヤング率を有することができる。たとえば、２以上の異なる型の細胞外マトリクス成分または２以上の濃度の単一の細胞外マトリクス成分を細胞培養容器内の表面上にまたは多孔性膜の表面上に堆積させて均一ではないヤング率を有する細胞外マトリクスの層を創ることができる。細胞外マトリクスのヤング率は、細胞培養容器内の表面の全域にてまたは多孔性膜の表面の全域にて線形勾配で変化することができる。或いは、細胞外マトリクスのヤング率は、細胞培養容器内の表面上にてまたは多孔性膜の表面上にて同心の勾配で変化することができる。
【０１５１】
本発明の方法はまた、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分が少なくとも１つの腫瘍細胞型を実質的に取り囲むように少なくとも１つの腫瘍細胞型の最上部に少なくとも１つの細胞外マトリクス成分の追加の層を堆積させることとを含むこともできる。少なくとも１つの細胞外マトリクス成分の追加の層は、細胞培養容器内の表面上に、多孔性膜の第１の表面上に、第１の多孔性膜の第１の表面上に、または第２の多孔性膜の第２の表面上に堆積させた少なくとも１つの細胞外マトリクス成分のヤング率とは異なるヤング率を有することができる。或いは、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分の追加の層は、細胞培養容器内の表面上に、多孔性膜の第１の表面上に、第１の多孔性膜の第１の表面上に、または第２の多孔性膜の第２の表面上に堆積させた少なくとも１つの細胞外マトリクス成分のヤング率と実質的に同一のヤング率を有することができる。少なくとも１つの細胞外マトリクス成分の追加の層のヤング率も均一ではない可能性がある。
【０１５２】
１以上の外来性の細胞外マトリクス成分の追加を含む方法のいずれでも、方法は単層または多重層のＥＣＭの追加を含むことができる。
【０１５３】
１以上の外来性の細胞外マトリクス成分の追加を含む方法のいずれでも、外来性の細胞外マトリクスは単一のＥＣＭタンパク質または複数のＥＣＭタンパク質の混合物を含むことができる。たとえば、外来性の細胞外マトリクスはコラーゲン、フィブロネクチン及び／またはラミニンの混合物を含むことができる。
【０１５４】
細胞培養培地
本発明の方法では標準の培養培地を使用することができる。培養培地の組成は培養される特定の細胞型に応じて変化するであろう。
【０１５５】
培養培地に追加の成分を含めることもできる。たとえば、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＧＦ−βのような脂質生成に影響を与えることが知られる因子を培養培地に加えることができる。生体内では、これらの因子はマクロファージによって分泌される。
【０１５６】
培養培地は、血清、血液、血液細胞、血液成分、免疫細胞、馴化培養培地、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１５７】
血清、血液、血液細胞、血液成分、または免疫細胞はヒトまたは動物（たとえば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、鳥類または魚類）に由来することができる。
【０１５８】
免疫細胞は、Ｂ細胞、樹状細胞、顆粒球、先天性リンパ系細胞、巨核球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１５９】
血液細胞は血小板、赤血球、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１６０】
血液成分は凝固因子、リポタンパク質、トリグリセリド、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１６１】
馴化培養培地は腫瘍細胞を含む培養物、内皮細胞を含む培養物、間質細胞を含む培養物、またはそれらの組み合わせに由来する馴化培養培地を含むことができる。
【０１６２】
流動装置
培養培地の流れを誘導することが可能である好適な流動装置を用いて剪断応力を適用することができ、その際、流れは、培養される細胞型（単数）または細胞型（複数）が腫瘍の微細環境にて生体内でさらされる流れを模倣する。たとえば、流動装置は円錐平板装置または平行平板流動装置であることができる。
【０１６３】
流動装置は実質的に、円錐平板流動装置に関する教示に関してそのそれぞれの内容が参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ７，８１１，７８２及びＨａｓｔｉｎｇｓら，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ−ｐｒｏｎｅ  ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｉｍｉｎｇ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２９３：１８２４−３３（２００７）にて記載されたような円錐平板装置であることができる。そのような装置の一例が図１にて描かれている。装置２００は、電子指示のセットを受信する電子コントローラと、電子コントローラによって操作されるモーター２２０と、モーターに操作可能に接続された、モーターによって駆動される剪断応力アプリケータを備える。剪断応力アプリケータはモーターに連結される円錐７を備えることができ、円錐はモーターによって直接駆動することができる。モーターは円錐をいずれかの方向（時計回りまたは反時計回り）に回転させる。装置はさらに装置の円錐７を上げたり下げたりするＺ軸のマイクロメータ２１０を備える。
【０１６４】
円錐平板装置は細胞培養容器１、たとえば、ペトリディッシュ（たとえば、直径７５ｍｍのペトリディッシュ）を収容する。円錐７は細胞培養容器の内部に嵌めこむように適合させることができる。従って、たとえば、直径７５ｍｍのペトリディッシュと共に使用するように適合させた装置では、円錐は約７１．４ｍｍの直径を有する。円錐は一般に浅い円錐角を有する。たとえば、円錐の表面とペトリディッシュ内の表面との間の角度はおよそ０．５〜２°（たとえば、１°）である。
【０１６５】
装置２００の円錐７が細胞培養容器１における培養培地３に沈められ、モーター２２０によって回転されると、円錐は培養培地上で回転応力を発揮し、これが今度は細胞培養容器内にまたは細胞培養容器に懸濁させた多孔性膜１１の表面上に播かれた細胞に剪断応力を適用する。たとえば、細胞６を多孔性膜の第１の表面上に播くことができ、円錐を用いて、図１の挿入図で示すように膜の反対表面に剪断応力を適用することができる。
【０１６６】
多孔性膜１１と支持体１０を含む細胞培養挿入体４を用いて多孔性膜を細胞培養容器にて懸濁させることができる。細胞培養挿入体は細胞培養容器の内部に嵌め込むように適合させる。細胞培養挿入体は好適には細胞培養容器の高さより低い高さを有するので、細胞培養挿入体が細胞培養容器に入れられる場合、細胞培養挿入体の支持体部分は細胞培養容器の外周に接触し、細胞培養容器内の懸濁させた位置で多孔性膜を保持する。たとえば、挿入体は挿入体の外周の周りで伸びる周縁を有することができ、その際、挿入体の周縁は次いで細胞培養容器の外周に接触して細胞培養容器にて挿入体を懸濁させる。種々のサイズの細胞培養挿入体がいくつかの製造元（たとえば、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ挿入体を製造しているＣｏｒｎｉｎｇ；Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ；及びＴｈｉｎＣｅｒｔ）から市販されている。多孔性膜は、好適な多孔性材料（たとえば、ポリエステル、ポリカーボネート、コラーゲンを被覆したポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＥＥ）またはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ））から作製することができ、種々の厚さ及び孔サイズを有することができる。
【０１６７】
円錐平板装置はまた、細胞培養容器を安全に保持する台座２４０を含むこともできる。装置はまた、以下でさらに記載されるように、細胞培養容器ディッシュ上に載り、上容積部及び下容積部を潅流するのに使用される流入配管と流出配管を固定するクリップを含むこともできる。
【０１６８】
流れは予め測定された血行動態パターンに由来することができ、電子指示のセットにモデル化することができる。剪断応力は電子指示のセットに基づく。
【０１６９】
流動装置は細胞培養容器の上容量部での培養培地において配置されるように適合させた物体及び物体を回転するように適合させたモーターを含むことができる。物体は円錐の表面または平坦な表面を有することができる。
【０１７０】
細胞培養容器にて培養培地に接触して物体の円錐または平坦な表面を配置するために流動装置を適合させることができる。
【０１７１】
流動装置は電子指示を受信するための電子コントローラを含むことができる。モーターは電子コントローラによって操作される。モーターに操作可能に接続された剪断応力アプリケータはモーターによって駆動される。好ましくは、剪断応力アプリケータはモーターに連結された円錐または円板を含む。
【０１７２】
流動装置は細胞培養容器と併せて使用される。細胞培養容器は、細胞培養培地、薬剤、化合物、及び他の成分を潅流で細胞培養容器に出し入れするための注入口及び排出口を含むことができる。
【０１７３】
注入口及び排出口はクリップによって細胞培養容器に固定することができる。図２はクリップを示す。各クリップ３００は３つの部分、すなわち図２で示される本体３０１と２片の薄い金属配管３０２及び３０３で構成される。クリップ３００はネジ３０４によって外側から細胞培養容器の側面に固定することができる。たとえば、２つのクリップをネジ３０４によって外側から容器の側面に連結し、締め付けることができる。本体３０１は、処理されたステンレス鋼金属と連結及びアクセスの目的でディッシュの端付近の角度で構成される。クリップ当たり２片の薄い金属配管（３０２及び３０３）は曲げられて、円錐の回転を遮ることなく効率的に培地を供給し、排出するためにディッシュへのアクセスを提供する。本体３０１のいずれかの側面上での位置決めネジ３０５は金属配管３０２、３０３を本体に固定し、培養培地にて正しい深さにそれが延びるように金属配管を定位置で保持する。次いで柔軟な配管が金属配管上を滑り、それを用いて培地を潅流で細胞培養容器から出し入れする（たとえば、機械的な蠕動ポンプを介して供給源のボトルから容器へ）。
【０１７４】
図３は細胞培養容器１に配置された２つのクリップ３００を示す。図３で示す構成では、多孔性膜１１を細胞培養容器にて懸濁させる。図３はまた円錐平板流動装置の円錐７と培養培地３も示す。
【０１７５】
円錐平板装置の円錐が回転するにつれて、流体は細胞培養容器の上容量部内で同心状に輸送される。加えて、円錐の回転は、多孔性膜を介して、及び多孔性膜上に播かれた細胞及び／または多孔性膜上に堆積させた細胞外マトリクス成分を介して、細胞培養培地の下向きの流れを生じる。
【０１７６】
血行動態パターン
流れは予め測定された血行動態パターンに由来することができる。
【０１７７】
血行動態パターンは腫瘍の脈管構造に由来することができる。
【０１７８】
血行動態パターンは、毛細血管、細動脈、動脈、細静脈または静脈の少なくとも一部に由来することができる。
【０１７９】
血行動態パターンは臓器の少なくとも一部に由来することができる。たとえば、血行動態パターンは肝臓、腎臓、肺、脳、膵臓、脾臓、大腸、小腸、心臓、骨格筋、眼、舌、生殖器、または臍帯に由来することができる。
【０１８０】
血行動態パターンは超音波データの解析に由来することができる。
【０１８１】
血行動態パターンは磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）データの解析に由来することができる。
【０１８２】
流れまたは血行動態パターンは時変性であることができる。
【０１８３】
流れまたは血行動態のパターンは、たとえば、遺伝子操作された動物のような動物またはヒトに由来することができる。好ましくは、血行動態パターンはヒトに由来する。
【０１８４】
たとえば、図４Ａは肺病変を持つと診断された患者における中心気管支動脈のドップラー超音波検査画像を示す。単相でインピーダンスの低い流れシグナルは悪性病変を示す。図４Ｂはヒトの肺病変のドップラー流のシグナルの壁剪断応力の算出（ダイン／ｃｍ２）を示す。図４Ｃは肺病変における例となる動脈血供給の模式図を提供する。
【０１８５】
少なくとも１つの腫瘍細胞型に適用される剪断応力は約０．１ダイン／ｃｍ２〜約２００ダイン／ｃｍ２であることができる。たとえば、少なくとも１つの腫瘍細胞型に適用される剪断応力は約０．１ダイン／ｃｍ２〜約１００ダイン／ｃｍ２であることができる。
【０１８６】
剪断応力は約１秒−１〜約１０００秒−１の速度で適用することができる。
【０１８７】
腫瘍微細環境を試験管内で模倣する例となる方法
図５〜図１０は腫瘍の微細環境を試験管内で模倣する例となる方法を説明する模式図である。図５〜図１０のそれぞれでは、細胞培養容器１は培養培地３を含有する。
【０１８８】
図５〜８では、細胞培養容器は多孔性膜１１も含有する。多孔性膜の第１の表面が細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内にて、腫瘍細胞５を含む下容量部２３と多孔性膜の第２の表面を含む上容量部２５を定義する。図５〜８で示す多孔性膜は細胞培養容器の中に収まるように適合させた細胞培養挿入体の多孔性膜であることができる。
【０１８９】
図５〜８では、多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの細胞外マトリクス成分（ＥＣＭ）９が存在する。細胞外マトリクス成分は細胞培養容器内に播かれた細胞によって内在性に産生され得る。或いは、外来性の細胞外マトリクスを本明細書で記載される方法のいずれかによって多孔性膜の第１の表面上に堆積させることができる。細胞外マトリクスは、細胞培養容器内に播かれた細胞によって産生される内在性の細胞外マトリクス及び外から添加される細胞外マトリクスの双方を含むことができる。
【０１９０】
図５〜８では、腫瘍細胞５も多孔性膜の第１の表面上に存在し、ＥＣＭによって実質的に取り囲まれる。図６及び７では、腫瘍細胞５と間質線維芽細胞１５も多孔性膜の第１の表面上に存在し、ＥＣＭによって実質的に取り囲まれる。図６では、間質線維芽細胞及び腫瘍細胞は順次播かれ、間質線維芽細胞が最初に播かれ、播かれた間質線維芽細胞の上に腫瘍細胞が播かれる。図７では、播くのに先立って間質線維芽細胞及び腫瘍細胞は互いに一緒に混合される。
【０１９１】
図５〜８のそれぞれでは、内皮細胞１３が多孔性膜の第２の表面上に播かれる。図８では、間質線維芽細胞１５も多孔性膜の第２の表面上に播かれる。図８では、間質線維芽細胞及び内皮細胞は順次播かれ、間質線維芽細胞が先ず多孔性膜の第２の表面上に播かれ、播かれた間質線維芽細胞の上に内皮細胞が播かれる。或いは、図には示していないが、間質線維芽細胞及び内皮細胞は播くのに先立って互いに一緒に混合される。
【０１９２】
図９及び図１０は２つの多孔性膜を使用する方法を示す。図９では、間質線維芽細胞１５が先ず第１の多孔性膜１１の第１の表面上に播かれる。第１の多孔性膜の第１の表面が細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内にて、腫瘍細胞５を含む下容量部２３と多孔性膜の第２の表面を含む上容量部２５を定義する。第１の多孔性膜１１は細胞培養容器の中に収まるように適合させた細胞培養挿入体の多孔性膜であることができる。第２の多孔性膜１２は播かれた間質細胞型の上に置かれ、第２の多孔性膜の第１の表面は播かれた間質線維芽細胞に接触するようになる。ＥＣＭ９は第２の多孔性膜の第２の表面上に存在する。ＥＣＭは細胞培養容器内で播かれた細胞によって内在性に産生され得る。或いは、ＥＣＭは本明細書で記載される方法のいずれかによって第２の多孔性膜の第２の表面上に堆積させることができる。ＥＣＭは、細胞培養容器内に播かれた細胞によって産生される内在性のＥＣＭ及び外から添加されるＥＣＭの双方を含むことができる。腫瘍細胞５も第２の多孔性膜の第２の表面上に存在し、実質的にＥＣＭによって取り囲まれる。内皮細胞１３は第１の多孔性膜の第２の表面上に播かれる。
【０１９３】
図１０では、ＥＣＭ９は第１の多孔性膜１１の第１の表面上に存在する。多孔性膜の第１の表面が細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内にて、腫瘍細胞５を含む下容量部２３と多孔性膜の第２の表面を含む上容量部２５を定義する。第１の多孔性膜は細胞培養容器の中に収まるように適合させた細胞培養挿入体の多孔性膜であることができる。ＥＣＭは細胞培養容器内で播かれた細胞によって内在性に産生され得る。或いは、ＥＣＭは本明細書で記載される方法のいずれかによって第１の多孔性膜の第１の表面上に堆積させることができる。ＥＣＭは、細胞培養容器内に播かれた細胞によって産生される内在性のＥＣＭ及び外から添加されるＥＣＭの双方を含むことができる。腫瘍細胞５も第１の多孔性膜の第１の表面上に存在し、実質的にＥＣＭによって取り囲まれる。間質線維芽細胞１５が第１の多孔性膜の第２の表面上に播かれる。第２の多孔性膜１２が、第２の多孔性膜の第１の表面が播かれた間質線維芽細胞に接触するように播かれた間質線維芽細胞の上に置かれる。内皮細胞１３が第２の多孔性膜の第２の表面上に播かれる。
【０１９４】
図５〜図１０はまた、細胞培養培地、薬剤、化合物及び他の成分を潅流で細胞培養容器に出し入れするのに使用することができる注入口１７及び排出口１９も示す。
【０１９５】
円錐平板流動装置の円錐７も図５〜図１０にて示す。円錐は、点線の環状矢印で表すように上容量部内で培養培地の同心の流れを誘導する。培地の流れは、次いで内皮細胞に剪断応力を適用する。細胞培養容器の底に向かった下向きを指す点線の矢印は、剪断応力の適用及び細胞培養容器への培養培地の潅流での出し入れの際に生じる多孔性膜を介した培地、薬剤及び他の成分の下向きの輸送を表す。
【０１９６】
腫瘍の転移を模倣する方法
本発明はさらに腫瘍の転移を模倣する方法に関する。腫瘍の転移を模倣する方法には腫瘍の転移を試験管内で模倣する方法及び腫瘍の転移を動物で模倣する方法が含まれる。
【０１９７】
腫瘍の転移を試験管内で模倣する方法
腫瘍の転移を試験管内で模倣する方法が提供される。方法は、上述の方法のいずれか１つに従って培養された少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞を、臓器または組織をモデル化する試験管内の系に導入することを含む。たとえば、臓器または組織をモデル化する試験管内の系は、肝臓、膵臓、骨、肺、血管、リンパ系、脳、筋肉、膀胱、腎臓、腸、結腸、胆嚢、皮膚または骨をモデル化する試験管内の系であることができる。
【０１９８】
肝臓をモデル化する試験管内の系は、その双方の内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載されており、それは、「肝臓をモデル化する試験管内の系」と題される節、実施例１２〜１４及び図２０〜４３にて本明細書で記載されている。ＵＳ２０１３／０３０９６７７にて記載された肝臓をモデル化する試験管内の系は、培養培地と多孔性膜を含有する細胞培養容器を含み、その際、肝細胞は多孔性膜の第１の表面上に播かれ、第１の表面が容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように別の細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって容器内で肝細胞を含む下容量部と多孔性膜の第２の表面を含む上容量部を定義する。剪断応力が上容量部における多孔性膜の第２の表面に適用され、剪断応力は肝細胞が生体内でさらされる流れを模倣する。細胞培養容器はさらに上容量部と下容量部を定義する細胞培養容器の部分内で注入口を含む。細胞培養容器はまた上容量部と下容量部を定義する細胞培養容器の部分内で排出口も含む。
【０１９９】
従って、腫瘍の転移を試験管内で模倣する方法では、肝臓をモデル化する試験管内の系は培養培地と多孔性膜を含む別の細胞培養容器を含むことができる。肝細胞が多孔性膜の第１の表面上に播かれ、第１の表面が容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように別の細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって容器内で肝細胞を含む下容量部と多孔性膜の第２の表面を含む上容量部を定義する。剪断応力が上容量部における多孔性膜の第２の表面に適用され、剪断応力は肝細胞が生体内でさらされる流れを模倣する。別の細胞培養容器はさらに上容量部と下容量部を定義する細胞培養容器の部分内で注入口を含む。
【０２００】
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された肝細胞をモデル化する試験管内の系では、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分（たとえば、コラーゲン）を多孔性膜の第１の表面上に播くことができ、肝細胞を少なくとも１つの細胞外マトリクス成分上に播くことができる。少なくとも１つの細胞外マトリクス成分の追加の層を肝細胞の最上部に堆積させることができ、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分は実質的に肝細胞を取り囲むこととなる。
【０２０１】
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された肝細胞をモデル化する試験管内の系では、類洞内皮細胞を多孔性膜の第２の表面上に播くことができる。たとえば、肝星細胞、クッパー細胞またはそれらの組み合わせのような追加の非実質細胞型も多孔性膜の第１のまたは第２の表面上に播くことができる。
【０２０２】
図１１は、肝臓をモデル化する例となる試験管内の系を説明する模式図を提供する。細胞培養容器１’は培養培地３’を含有する。細胞培養容器は多孔性膜１１’も含有する。多孔性膜の第１の表面が細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内で肝細胞を含む下容量部２３’と多孔性膜の第２の表面を含む上容量部２５’を定義する。多孔性膜は細胞培養容器の中に収まるように適合させた細胞培養挿入体の多孔性膜であることができる。細胞外マトリクス成分（ＥＣＭ）９’が多孔性膜の第１の表面上に存在する。肝細胞１００及びクッパー細胞１２０も多孔性膜の第１の表面上に存在し、ＥＣＭによって実質的に取り囲まれる。ＥＣＭは細胞培養容器内に播かれた細胞によって内在性に産生され得る。或いは、外来性のＥＣＭを本明細書で記載される方法のいずれかによって多孔性膜の第１の表面上に堆積させることができる。ＥＣＭは細胞培養容器内に播かれた細胞によって産生される内在性のＥＣＭ及び外から添加されるＥＣＭの双方を含むことができる。類洞内皮細胞１１０は多孔性膜の第２の表面上に播かれる。
【０２０３】
図１１はまた、細胞培養培地、薬剤、化合物及び他の成分を潅流で細胞培養容器に出し入れするのに使用することができる注入口１７’及び排出口１９’も示す。
【０２０４】
図１１はまた、円錐平板流動装置の円錐７’も示す。円錐は、点線の環状矢印で表すように上容量部内で培養培地の流れを誘導する。培地の流れは、次いで内皮細胞に剪断応力を適用する。細胞培養容器の底に向かった下向きを指す点線の矢印は、剪断応力の適用及び細胞培養容器への培養培地の潅流での出し入れの際に生じる多孔性膜を介した培地、薬剤及び他の成分の輸送を表す。
【０２０５】
腫瘍の転移を試験管内で模倣する方法では、肝臓をモデル化する試験管内の系の下容量部または上容量部に少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞を移すことによって肝臓をモデル化する試験管内の系に少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞を導入することができる。少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞を、肝臓をモデル化する試験管内の系の上容量部に導入する場合、方法はさらに、肝臓をモデル化する試験管内の系の下容量部への少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞の移動を評価することを含むことができる。上容量部から下容量部への腫瘍細胞の移動を評価することは、上及び下のチャンバーにおける細胞を固定し、上容量部及び下容量部における細胞の顕微鏡画像表示を行うことによって、及び／または腫瘍細胞が分子追跡子（たとえば、放射性プローブ、蛍光タンパク質または比色追跡子）で標識される上容量部及び下容量部における細胞を選別することによって達成することができる。
【０２０６】
移すことは、肝臓をモデル化する試験管内の系の下容量部または上容量部に少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞を手動で移すことを含むことができる。たとえば、トリプシン処理によって、または存在するならばＥＣＭの酵素消化によって少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞を細胞培養容器内のまたは多孔性膜の表面から取り外すことができる。次いでピペットを用いて、少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞を、肝臓をモデル化する試験管内の系の上容量部または下容量部に移すことができる。或いは、少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞を含有する細胞培養容器の上容量部または下容量部から培養培地をピペットで肝臓をモデル化する試験管内の系の上容量部または下容量部に入れることができる。
【０２０７】
或いは、移すことは、少なくとも１つの腫瘍細胞型を含有する細胞培養容器内の上容量部または下容量部の外に細胞培養培地をポンプで出し、肝臓をモデル化する試験管内の系の細胞培養容器内の上容量部または下容量部の中にポンプで入れることを含むことができる。これは試験管内での腫瘍細胞による遠位臓器の播種を模倣する。そのような方法は図１２（Ａ）〜（Ｄ）にて説明されている。図１２（Ａ）では、たとえば、配管２１を用いて、少なくとも１つの腫瘍細胞型５を含む細胞培養容器１の下容量部２３内の排出口１９を、肝臓をモデル化する試験管内の系の細胞培養容器１’の下容量部２３’における注入口１７’に接続する。配管を介して培養培地をポンプで汲み上げ、少なくとも１つの腫瘍細胞型の細胞を肝臓をモデル化する試験管内の系の下容量部に移す。図１２（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）は類似するが、少なくとも１つの腫瘍細胞型５を含有する細胞培養容器の下容量部２３から培養培地をポンプで汲み上げ、肝臓をモデル化する試験管内の系の細胞培養容器１’の上容量部２５’に入れることが関与し（図１２Ｂ）、少なくとも１つの腫瘍細胞型５を含有する細胞培養容器１の上容量部２５から培養培地ををポンプで汲み上げ、肝臓をモデル化する試験管内の系の細胞培養容器１’の下容量部２３’に入れることが関与し（図１２Ｃ）、または少なくとも１つの腫瘍細胞型５を含有する細胞培養容器１の上容量部２５から培養培地ををポンプで汲み上げ、肝臓をモデル化する試験管内の系の細胞培養容器１’の上容量部２５’に入れることが関与する（図１２Ｄ）。
【０２０８】
従って、少なくとも１つの腫瘍細胞型を含む細胞培養容器はさらに下容量部を定義し、且つ少なくとも１つの腫瘍細胞型を含有する細胞培養容器の部分内に排出口を含むことができる。排出口は肝臓をモデル化する試験管内の系の別の細胞培養容器における注入口に接続される。移すことは、少なくとも１つの腫瘍細胞型を含む細胞培養容器の下容量部の外に培養培地をポンプで汲み上げ、肝臓をモデル化する試験管内の系の別の細胞培養容器の上容量部または下容量部に入れることを含む。
【０２０９】
或いは、少なくとも１つの腫瘍細胞型を含む細胞培養容器はさらに上容量部を定義する細胞培養容器の部分内に排出口を含むことができる。排出口は肝臓をモデル化する試験管内の系の別の細胞培養容器における注入口に接続される。移すことは、細胞培養容器の上容量部の外に培養培地をポンプで汲み上げ、肝臓をモデル化する試験管内の系の別の細胞培養容器の上容量部または下容量部に入れることを含む。
【０２１０】
本発明はさらに腫瘍の転移を試験管内で模倣する別の方法に関する。方法は、細胞培養容器に培養培地を加えることと、細胞培養容器内の多孔性膜の第１の表面上に少なくとも１つの細胞型を播くこととを含み、その際、第１の表面が細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内で少なくとも１つの細胞型を含む下容量部と多孔性膜の第２の表面を含む上容量部を定義する。剪断応力が少なくとも１つの細胞型に間接的に適用され、剪断応力は流動装置によって誘導される培養培地の流れから生じ、該流れは生体内で腫瘍が間接的にさらされる流れを模倣する。ヒトまたはヒト化動物に由来する腫瘍細胞は上容量部または下容量部に導入される。
【０２１１】
少なくとも１つの細胞型は肝細胞または平滑筋細胞を含むことができる。
【０２１２】
方法はさらに多孔性膜の第２の表面上に第２の細胞型を播くことを含むことができる。第２の細胞型は内皮細胞を含むことができる。
【０２１３】
腫瘍細胞がヒト化動物に由来する場合、ヒト化動物は好適には、ヒト化マウス、たとえば、非肥満糖尿病性重症複合免疫不全（ＮＯＤ ＳＣＩＤ）マウス、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγヌル（ＮＯＧ）マウスまたはＮＯＤ  ＳＣＩＤ  ＩＬ−２Ｒγノックアウト（ＮＳＧ）マウスである。
【０２１４】
本発明はさらに腫瘍の転移に対する効果について薬剤又は化合物を調べる試験管内の方法に関する。方法は、上述の方法のいずれかによって腫瘍の転移を試験管内で模倣することと、培養培地に薬剤または化合物を加えることとを含む。薬剤または化合物の存在下での臓器または組織をモデル化する試験管内の系にて少なくとも１つの細胞型の細胞における変化が薬剤または化合物が腫瘍の転移に対して効果を有することを示す。
【０２１５】
腫瘍の転移の試験管内での模倣を確認するために、腫瘍転移のマーカーのレベルまたは局在における変化を、本発明の方法と剪断応力の適用の非存在下での同じ方法との間で比較することができる。剪断応力の適用の際の少なくとも１つの細胞型におけるマーカーのレベルまたは局在を、剪断応力の適用の非存在下での少なくとも１つの細胞型におけるマーカーのレベルまたは局在と比較することができる。或いは、剪断応力の適用の際の培養培地におけるマーカーのレベルを、剪断応力の適用の非存在下での培養培地におけるマーカーのレベルと比較することができる。たとえば、マーカーが腫瘍の転移に関連することが知られ、その濃度が生体内での転移の間に血清で上昇することが知られているのであれば、剪断応力の適用の非存在下での培養培地におけるマーカーのレベルと比較した剪断応力の適用を伴った本発明の方法の培養培地におけるマーカーのレベルの上昇は、腫瘍の転移が本発明の試験管内の方法によって模倣されることを裏付けている。
【０２１６】
動物にて腫瘍の転移を模倣する方法
本発明はまた、腫瘍の転移を模倣する方法も提供する。方法は上述の方法のいずれかに従って培養された少なくとも１つの細胞型の細胞を動物に導入することを含む。動物は、哺乳類、たとえば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギまたはヒツジであることができる。或いは、動物は鳥類または魚類であることができる。
【０２１７】
動物がマウスである場合、マウスは好適にはヒト化マウスであり、少なくとも１つの腫瘍細胞型はヒトの腫瘍細胞型を含む。ヒト化マウスは、非肥満糖尿病性重症複合免疫不全（ＮＯＤ  ＳＣＩＤ）マウス、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγヌル（ＮＯＧ）マウスまたはＮＯＤ  ＳＣＩＤ  ＩＬ−２Ｒγノックアウト（ＮＳＧ）マウスであることができる。
【０２１８】
オーダーメイド医療
本発明は、腫瘍を有する対象に投与される化学療法計画を選択する方法を提供する。方法は、本明細書で記載される方法のいずれかに従って、腫瘍に対する効果について薬剤または化合物を試験管内で調べること、または腫瘍の転移に対する効果について薬剤または化合物を試験管内で調べることを含む。少なくとも１つの腫瘍細胞型は対象の腫瘍に由来する腫瘍細胞を含む。方法はさらに、試験管内の試験の結果に基づいて対象に薬剤または化合物を投与するかどうかを決定することを含む。
【０２１９】
方法はさらに試験管内の試験の結果に基づいて対象に投与される薬剤または化合物の用量を選択することを含むことができる。選択される用量は、試験管内の試験の結果に基づいて対象にて治療効果があり且つ安全であると予測される用量であるであろう。
【０２２０】
方法はさらに、試験管内の試験の結果に基づいて対象に投与される薬剤または化合物の投与率を選択することを含むことができる。選択された比率は、試験管内の試験の結果に基づいて対象にて治療効果があり且つ安全であると予測される比率であるであろう。
薬剤及び化合物
【０２２１】
腫瘍に対する効果について、または本明細書で記載される腫瘍の転移に対する効果について薬剤または化合物を調べる試験管内の方法のいずれでも、少なくとも１つの腫瘍細胞型を薬剤または化合物に直接または間接的に暴露することができる。少なくとも１つの腫瘍細胞型を含有するまたはそれに接触する細胞培養培地に薬剤または化合物を添加することによって少なくとも１つの腫瘍細胞型を薬剤または化合物に直接暴露することができる。たとえば、少なくとも１つの腫瘍細胞型が多孔性膜の第１の表面上に播かれ、且つ第１の表面が細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内で少なくとも１つの腫瘍細胞型を含む下容量部と多孔性膜の第２の表面を含む上容量部を定義する場合、下容量部における細胞培養培地に薬剤または化合物を添加することによって少なくとも１つの腫瘍細胞型を薬剤または化合物に直接暴露することができる。たとえば、薬剤または化合物が膜の孔を介して拡散するのに十分に小さい場合、または腫瘍細胞が上容量部に移動している場合、上容量部に薬剤または化合物を添加することも結果的に薬剤または化合物に少なくとも１つの腫瘍細胞型を直接暴露することができる。或いは、少なくとも１つの腫瘍細胞型は薬剤または化合物に間接的に暴露され得る。たとえば、薬剤または化合物が上容量部に加えられ、薬剤または化合物が膜の孔を介して拡散しない場合、少なくとも１つの腫瘍細胞型は間接的に薬剤または化合物に暴露されることになるが、多孔性膜の第２の表面上に播かれた内皮細胞に対する効果を発揮し、それが今度は内皮細胞に少なくとも１つの腫瘍細胞型に対する効果を発揮させる（たとえば、多孔性膜を介して拡散し、少なくとも１つの腫瘍細胞型に対する効果を有する因子の内皮細胞による分泌、または多孔性膜の孔を介した内皮細胞の少なくとも１つの腫瘍細胞型との物理的相互作用）。
【０２２２】
培養培地における薬剤または化合物の濃度は、生体内での効果を達成する薬剤または化合物の濃度範囲の範囲内であることができる。たとえば、培養培地における薬剤または化合物の濃度は、薬剤または化合物についての生体内の治療上のＣｍａｘ（たとえば、薬剤または化合物についての生体内の治療上の血漿Ｃｍａｘ）の濃度範囲の範囲内であることができる。培養培地における薬剤または化合物の濃度は、薬剤または化合物についての生体内の治療上のＣｍａｘ（たとえば、薬剤または化合物についての生体内の治療上の血漿Ｃｍａｘ）とほぼ同じであることができる。
【０２２３】
或いは、培養培地における薬剤または化合物の濃度は、生体内での効果を達成する薬剤または化合物の濃度範囲より低くてもよい。これは、生体内での多数の固形腫瘍で認められる薬剤浸透のさらに低い程度を模倣する。たとえば、培養培地における薬剤または化合物の濃度は、薬剤または化合物についての生体内の治療上のＣｍａｘ（たとえば、薬剤または化合物についての生体内の治療上の血漿Ｃｍａｘ）の濃度範囲よりも約２倍〜約２０倍低く、約５倍〜約１５倍低くまたは約１０倍低くてもよい。
【０２２４】
薬剤または化合物の効果は、毒性効果、保護効果、病的効果、疾患を促進する効果、炎症効果、酸化効果、小胞体ストレス効果、ミトコンドリアストレス効果、アポトーシス効果、壊死効果、自己貪食性効果、免疫原性細胞死効果、フェロトーシス効果、リモデリング効果、増殖性効果、血管形成に対する効果、タンパク質の活性に対する効果、または遺伝子の発現に対する効果を含むことができる。「増殖性効果」という用語は増殖の刺激及び増殖の阻害の双方を包含する。同様に、血管形成に対する効果は血管形成の刺激及び血管形成の阻害の双方を包含する。
【０２２５】
効果がタンパク質の活性に対する効果を含む場合、効果はタンパク質の阻害またはタンパク質の活性化を含むことができる。
【０２２６】
効果が遺伝子の発現に対する効果を含む場合、効果は遺伝子の発現の上昇または遺伝子の発現の低下を含むことができる。
【０２２７】
腫瘍または腫瘍の転移に対する効果について薬剤または化合物を調べる試験管内の方法を用いて抗癌活性について候補分子をスクリーニングすることができる。
【０２２８】
腫瘍または腫瘍の転移に対する効果について薬剤または化合物を調べる試験管内の方法を用いて抗癌活性を有することが知られているまたはそれが疑われる薬剤または化合物を調べることができる。
【０２２９】
薬剤または化合物は、少なくとも１つの細胞型におけるタンパク質または遺伝子の機能を阻害する、活性化するまたは変化させることが可能であり得る。
【０２３０】
薬剤は抗癌剤を含むことができる。抗癌剤には、たとえば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生剤、トポイソメラーゼ阻害剤、コルチコステロイド、抗微小管剤、キナーゼ阻害剤、経路阻害剤、分化誘導剤、ホルモン療法、免疫療法、Ｌ−アスパラギナーゼ、キレート剤、ＡＴＰ模倣体、生物医薬品、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０２３１】
抗癌剤がアルキル化剤を含む場合、アルキル化剤は、アルトレタミン、ベンダムスチン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、サイクロホスファミド、ダカルバジン、イフォスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、オキサラプラチン、パリフォサミド、ストレプトゾシン、テモゾロミド、チオテパ、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２３２】
抗癌剤が代謝拮抗剤を含む場合、代謝拮抗剤は、アザチオプリン、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メソトレキセート、ネララビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、プララトレキセート、ラルチトレキセド、チオグアニン、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２３３】
抗癌剤が抗腫瘍抗生剤を含む場合、抗腫瘍抗生剤は、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン、リファムピシン、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２３４】
抗癌剤がトポイソメラーゼ阻害剤を含む場合、トポイソメラーゼ阻害剤は、アムサクリン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テニポシド、ミトキサントロン、エチリノテカン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、アモナフィド、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２３５】
抗癌剤がコルチコステロイドを含む場合、コルチコステロイドは、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、コルチゾールコハク酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２３６】
抗癌剤が抗微小管剤を含む場合、抗微小管剤は、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、イキサベピロン、エリブリンメシル酸塩、カバジタキセル、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２３７】
抗癌剤がキナーゼ阻害剤を含む場合、キナーゼ阻害剤は、受容体または非受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤、セリン／スレオニン−特異的なキナーゼ阻害剤、または二重特異性キナーゼ阻害剤を含むことができる。
【０２３８】
キナーゼ阻害剤は、表皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体阻害剤、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体阻害剤、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体阻害剤、またはｒｈｏキナーゼ阻害剤を含むことができる。
【０２３９】
キナーゼ阻害剤が受容体または非受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤を含む場合、受容体または非受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤は、アファチニブ、アレクチニブ、アリセルチブ、アムタチニブ、アパチニブ、アキシチニブ、バフェチニブ、バラセルチブ、バリシチニブ、ボスチニブ、ブリバニブ、ブパルリシブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、セニセルチブ、コビメチニブ、クレノラニブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダコミチニブ、ダヌセルチブ、デサチニブ、ドビチニブ、エピチニブ、エルロチニブ、フォレチニブ、フォスタマチニブ、ガルニセルチブ、ゲフィチニブ、イブルチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、レスタウルチニブ、リニファニブ、リンシチニブ、マシチニブ、モメロチニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、ネラチニブ、ニロチニブ、ニンテダニブ、オランチニブ、パクリチニブ、パゾパニブ、ペリチニブ、ピマセルチブ、ポナチニブ、ポジオチニブ、キザルチニブ、レファメチニブ、レゴラフェニブ、ルキソリチニブ、セルメタニブ、ソラフェニブ、スルファチニブ、スニチニブ、タンズチニブ、テラチニブ、セリアチニブ、チバンチニブ、トファシチニブ、トラメチニブ、バンデタニブ、バタリニブ、ベムラフェニブ、ボラセルチブ、ボリチニブ、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２４０】
キナーゼ阻害剤がセリン／スレオニン特異的なキナーゼ阻害剤を含む場合、キナーゼ阻害剤はＭＫ２２０６を含むことができる。
【０２４１】
抗癌剤が経路阻害剤を含む場合、経路阻害剤は、Ｂ細胞リンパ腫２（Ｂｃｌ−２）ファミリー阻害剤（たとえば、ナビトクラックス、オバトクラックス、オブリメルソンまたはシナクラルセット）、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ−９０）阻害剤（たとえば、タネスピマイシン、レタスピマイシンまたはガネテスピブ）、プロテアソーム阻害剤（たとえば、ボルテゾニブ、カルフィルゾニブ、オプロゾニブ、イキサゾニブ、マロゾニブまたはデランゾニブ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（たとえば、フラボピリドール、アルボシジブ、ジナシクリブ、セリシクリブまたはパルボシクリブ）、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の阻害剤（たとえば、イニパリブ、ベリパリブ、オラパリブ、ルカパリブまたはニラパリブ）、ラパマイシンの哺乳類標的（ｍＴＯＲ）の阻害剤（たとえば、デフォロリムス、エベロリムス、シロリムスまたはテムシロリムス）、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の阻害剤（たとえば、ベリノスタット、エンチノスタット、モセチノスタット、パノビノスタット、ロミデプシンまたはボリノスタット）、ヘッジホッグ経路の阻害剤（たとえば、バリデギブまたはビスモデギブ）、ｒｈｏキナーゼ阻害剤（たとえば、Ｙ２７６３２）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２４２】
抗癌剤が分化誘導剤を含む場合、分化誘導剤は、レチノイド、トレチノイン、ベキサロテン、亜ヒ酸、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２４３】
抗癌剤がホルモン療法を含む場合、ホルモン療法は、選択的アンドロゲン受容体調節因子（ＳＡＲＭ）（たとえば、エノボサルム）、アンドロゲン受容体アンタゴニスト（たとえば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミドまたはエンザルタミド）、選択的エストロゲン受容体調節因子（ＳＥＲＭ）（たとえば、タモキシフェン、トレミフェンまたはラロキシフェン）、エストロゲン受容体アンタゴニスト（たとえば、フルベストラント）、プロゲスチン（たとえば、メゲストロール酢酸塩）、エストロゲン（たとえば、エストラムスチン）、アロマターゼ阻害剤（たとえば、アナストロゾール、エキセメスタンまたはレトロゾール）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニストまたは類似体（たとえば、リュープロリド、ゴセレリン、アバレリックス、デガレリックスまたはトリプトレリン）、ケトコナゾール、アビラテロン、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２４４】
抗癌剤が免疫療法を含む場合、免疫療法は、モノクローナル抗体（たとえば、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、アバゴボマブ、またはエタラシズマブ）、非特異的な免疫療法または補助剤（たとえば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターフェロン−α、インターフェロン−α２ｂ、ペグインターフェロンα−２ｂ、アバタセプトまたはアルデスロイキン）、免疫調節剤（たとえば、タリドミドまたはレナリドミド）、癌ワクチン（たとえば、シプリューセル−Ｔまたはカルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン）、標的化免疫療法（たとえば、ブレンツジマブ、セツキシマブ、イブリツモマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、トシツムマブ、トレスツズマブ、トレミリムマブ、シルツキシマブ、トシリズマブ、カナキヌマブ、リリルマブ、ニボルマブ、ピリジズマブ、またはラムブロリズマブ）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２４５】
抗癌剤がキレート剤を含む場合、キレート剤は、ペニシルアミン、ジヒドロ塩化トリエチレンテトラアミン、ＥＤＴＡ、ＤＭＳＡ、メシル酸デフェロキサミンまたはバチマスタットを含むことができる。
【０２４６】
抗癌剤が生物医薬品を含む場合、生物医薬品は、合成多糖類；合成の、部分合成の若しくはヒト化した免疫グロブリン；または組換え治療用タンパク質を含むことができる。
【０２４７】
薬剤または化合物は、放射線造影剤、放射線同位元素、プロドラッグ、抗体断片、抗体、生きている細胞、治療用薬剤送達のミクロスフェア、マイクロビーズ、ナノ粒子、ゲル、または細胞を含浸させたゲル、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２４８】
本明細書で記載される腫瘍に対する効果または腫瘍の転移に対する効果について薬剤または化合物を調べる試験管内の方法のいずれでも、培養培地に薬剤または化合物を加えることは、薬剤または化合物を含む抗体／薬剤複合体または放出調節剤形を培養培地に加えることを含む。
【０２４９】
放出調節剤形は経口の放出調節剤形を含むことができる。
【０２５０】
放出調節剤形は放出調節ポリマー（たとえば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、カラーギーナン、キトサン、ヘパリン、デンプン、キサンタンゴム、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリエチレンオキシド、ポロキサマー、プルロニクス、ポリメタクリレート、ポリシアル酸、またはそれらの組み合わせ）であることができる。
【０２５１】
方法は、上容量部及び下容量部の少なくとも一方に薬剤または化合物を潅流することを含むことができる。
【０２５２】
細胞型及び細胞培養培地の分析
本発明の方法と剪断応力の適用の非存在下での同じ方法との間で腫瘍の微細環境のマーカーまたは腫瘍転移のマーカーのレベルまたは局在を比較することが関与する本発明の方法では、マーカーは、細胞増殖、細胞浸潤、血管形成、腫瘍形成、細胞単層完全性、内皮細胞のバリア機能、透過性、炎症、細胞死、アポトーシス、壊死、収縮、細胞の移動またはそれらの組み合わせのマーカーを含むことができる。
【０２５３】
マーカーのレベルの変化は少なくとも１つの腫瘍細胞型または内皮細胞におけるマーカーのレベルの上昇であることができる。
【０２５４】
マーカーのレベルの変化は少なくとも１つの腫瘍細胞型または内皮細胞におけるマーカーのレベルの低下であることができる。
【０２５５】
マーカーは、ＶＥ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、アクチンまたはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２５６】
マーカーが血管形成のマーカーを含む場合、血管形成のマーカーは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、アンギオポイエチン−１（ＡＮＧ１）、アンギオポイエチン−２（ＡＮＧ２）、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）、胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２５７】
マーカーが細胞増殖のマーカーを含む場合、細胞増殖のマーカーは、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＭＫＩ６７、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２５８】
マーカーが細胞浸潤のマーカーを含む場合、細胞浸潤のマーカーは、ビメンチン（ＶＩＭ）、カドヘリン１（ＣＤＨ−１）、カドヘリン２（ＣＤＨ−２）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２５９】
マーカーが炎症のマーカーを含む場合、炎症のマーカーはインターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ＮＦ−κＢ、内皮酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）、Ｋｒｕｐｐｌｅ様因子２（ＫＬＦ２）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２６０】
本明細書で記載される方法はさらに細胞密度、単層完全性、透過性またはそれらの組み合わせについて内皮細胞を分析することを含むことができる。
【０２６１】
本明細書で記載される方法はさらに少なくとも１つの腫瘍細胞型、内皮細胞、少なくとも１つの間質細胞型、または１以上の追加の細胞型の形態を分析することを含むこともできる。
【０２６２】
本明細書で記載される方法はさらに、サイトカインの分泌、ケモカインの分泌、液性因子の分泌、微粒子の分泌、増殖因子の分泌、細胞表面からのタンパク質の脱落、化合物の代謝体、免疫細胞、酸化窒素の分泌、血管拡張性タンパク質、血管収縮性タンパク質、ｍｉＲＮＡ、分泌されたタンパク質、または分泌された生体物質について培養培地を分析することを含むこともできる。たとえば、細胞表面からのタンパク質の脱落について培養培地を分析することができ、タンパク質は、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）、Ｅ−セレクチン、または細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）を含む。代わりにまたはさらに、硝酸塩または亜硝酸塩の濃度を測定することによって酸化窒素の分泌について培養培地を分析することができる。
【０２６３】
培養培地に薬剤または化合物を加える方法のいずれでも、方法はさらに、毒性について少なくとも１つの腫瘍細胞型、内皮細胞、少なくとも１つの間質細胞型を分析すること、または薬剤または化合物から生じる炎症、透過性、適合性、細胞接着、細胞リモデリング、細胞移動または表現型の調節について１以上の追加の細胞型を分析することを含むことができる。
【０２６４】
また、培養培地に薬剤または化合物を加える方法のいずれでも、方法はさらに、培地が薬剤または化合物を含むある時間、剪断応力を適用した後の細胞型の少なくとも１つを、培地が薬剤または化合物を含まないその時間、剪断応力を適用した後の細胞型の少なくとも１つと比較して細胞型の少なくとも１つに対する薬剤または化合物の効果を判定することを含むことができる。
【０２６５】
本明細書で記載される方法のいずれも、さらに薬剤標的を特定することを含むことができる。たとえば、薬剤標的は、薬剤または化合物に直接または間接的に暴露された少なくとも１つの腫瘍細胞型からタンパク質または核酸を単離し、適当なスクリーニングを行って潜在的な薬剤標的を特定することによって特定することができる。スクリーニング方法には、プロテオミクス解析またはリン酸化スクリーニング、ｍＲＮＡの解析（たとえば、次世代ＲＮＡ配列決定または遺伝子アレイ）、ＤＮＡの解析、ＤＮＡのメチル化のスクリーニング、及び細胞内または細胞外のｍｉＲＮＡの解析（たとえば、ｍｉＲＮＡアレイ）が挙げられる。シグナルの調節（たとえば、遺伝子の上昇した発現または低下した発現）は候補薬剤標的の特定を示す。
【０２６６】
本明細書で記載される方法のいずれも、さらに、薬剤送達モダリティのための標的として、少なくとも１つの腫瘍細胞型、少なくとも１つの間質細胞型、内皮細胞または１以上の追加の細胞型の表面タンパク質を特定することを含むことができる。薬剤送達モダリティは、抗体／薬剤複合体、ナノ粒子（たとえば、脂質ナノ粒子）、化学複合体（たとえば、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ））またはそれらの組み合わせを含むことができる。タンパク質、抗体、ペプチドまたは核酸分子（たとえば、ＲＮＡｉ分子）をナノ粒子または化学複合体に複合体化するまたは組み入れることができる。薬剤送達モダリティのための標的である表面タンパク質は、本明細書で記載される腫瘍の微細環境を模倣する方法のいずれかに従って培養された腫瘍細胞、間質細胞、内皮細胞または１以上の追加の細胞型から細胞膜分画を単離し、細胞膜分画をスクリーニングして薬剤送達モダリティのための可能性のある標的を特定することによって特定することができる。スクリーニング方法には、プロテオミクス解析またはリン酸化スクリーニング、ｍＲＮＡの解析（たとえば、次世代ＲＮＡ配列決定または遺伝子アレイ）、ＤＮＡの解析、ＤＮＡのメチル化のスクリーニング、及び細胞内または細胞外のｍｉＲＮＡの解析（たとえば、ｍｉＲＮＡアレイ）が挙げられる。シグナルの調節（たとえば、遺伝子の上昇した発現または低下した発現）は薬剤送達モダリティのための候補標的の特定を示す。
【０２６７】
肝臓をモデル化する試験管内の系
上で言及したように、肝臓をモデル化する試験管内の系はＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載されている。これらの出版物で記載された肝臓をモデル化する試験管内の系を、生体内での病態条件または生理的条件を模倣する方法で使用することができる。製薬業界及び生物製薬業界によって標準の試験管内モデルとして現在使用されている静置モデルとは異なって、ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された方法は培養された細胞に対して剪断力を適用し、種々の因子の生体内での病的濃度または生理的濃度を用いて生体内での病的状態または生理的状態を再現する。たとえば、標準の静置モデルで使用される濃度と比べて有意に低下しているインスリンとグルコースの生体内での生理的濃度で肝細胞を維持することができる試験管内肝細胞モデルが記載される。さらに高い濃度のインスリンとグルコースがそのようなモデルで使用されると、肝細胞は脂肪肝疾患の多数の特徴を呈する。
【０２６８】
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９は、試験管内での病的状態（たとえば、肝臓の病的状態）を模倣する方法を記載している。方法は、細胞培養容器に培養培地を加えることと、培養培地に少なくとも１つの因子を加えることと、細胞培養容器内の少なくとも１つの表面上に少なくとも１つの細胞型を播くことと、少なくとも１つの播かれた細胞型に剪断力を適用することとを含む。剪断力は流動装置によって誘導される培養培地の流れから生じる。流れは、少なくとも１つの細胞型が生体内の病的状態でさらされる流れを模倣する。
【０２６９】
培養培地における因子の濃度は、病的状態で認められる因子の生体内での濃度範囲の範囲内であることができる。或いは、培養培地における因子の濃度は、薬剤または化合物の投与の結果生体内で生じることになる因子の濃度範囲の範囲内であることができる。
【０２７０】
生体内での病的状態が模倣されることを確認するために、方法と剪断力の適用の非存在下での同じ方法との間で病的状態のマーカーのレベルにおける変化を比較することができる。剪断力の適用の際の少なくとも１つの播かれた細胞型または培養培地におけるマーカーのレベルを、剪断力の適用の非存在下での少なくとも１つの播かれた細胞型または培養培地におけるマーカーのレベルと比較する。たとえば、マーカーが病的状態と関連することが知られ、且つ、その濃度は状態が生体内で存在する場合、血清で上昇することが知られているのであれば、剪断力の適用の非存在下での培養培地におけるマーカーのレベルと比べた剪断力の適用を伴った方法の培養培地におけるマーカーのレベルにおける上昇は、試験管内の方法によって生体内の病的状態が模倣されることを裏付けている。
【０２７１】
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９はまた、病的状態に対する効果について薬剤または化合物を調べる試験管内の方法も記載している。方法は、病的状態を模倣することと、培養培地に薬剤または化合物を加えることと、薬剤または化合物に暴露された少なくとも１つの播かれた細胞型に剪断力を適用することとを含む。薬剤または化合物の存在下での、少なくとも１つの播かれた細胞型における変化は薬剤または化合物が病的状態に対して効果を有することを示す。
【０２７２】
薬剤または化合物を調べるこの試験管内の方法では、上述のような病的状態を模倣する試験管内の方法によって病的状態を模倣することができる。
【０２７３】
薬剤または化合物を調べる試験管内の方法の病的状態も、病的状態を有する対象（単数）または対象（複数）に由来する初代細胞または不死化細胞を播き、細胞培養培地にて細胞を培養することによって模倣することができる。
【０２７４】
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９はまた、試験管内で生理的状態（たとえば、健常な肝臓）を模倣する方法も記載している。方法は、細胞培養容器に培養培地を加えることと、培養培地に少なくとも１つの因子を加えることと、細胞培養容器内の少なくとも１つの表面上に少なくとも１つの細胞型を播くことと、少なくとも１つの播かれた細胞型に剪断力を適用することとを含む。剪断力は流動装置によって誘導される培養培地の流れから生じる。流れは、少なくとも１つの細胞型が生体内の生理的状態でさらされる流れを模倣する。
【０２７５】
培養培地における因子の濃度は、生理的状態で認められる因子の生体内での濃度範囲の範囲内であることができる。或いは、培養培地における因子の濃度は、薬剤または化合物の投与の結果生体内で生じることになる因子の濃度範囲の範囲内であることができる。
【０２７６】
生体内での生理的状態が模倣されることを確認するために、方法と剪断力の適用の非存在下での同じ方法との間で生理的状態のマーカーのレベルにおける変化を比較することができる。剪断力の適用の際の少なくとも１つの播かれた細胞型または培養培地におけるマーカーのレベルを、剪断力の適用の非存在下での少なくとも１つの播かれた細胞型または培養培地におけるマーカーのレベルと比較する。たとえば、マーカーが生理的状態と関連することが知られ、その濃度が、状態が生体内で存在する場合、血清で上昇することが知られているのであれば、剪断力の適用の非存在下での培養培地におけるマーカーのレベルと比べた剪断力の適用を伴った方法の培養培地におけるマーカーのレベルにおける上昇は、試験管内の方法によって生体内の生理的状態が模倣されることを裏付けている。
【０２７７】
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９はまた、生理的状態に対する効果について薬剤または化合物を調べる試験管内の方法も記載している。方法は、生理的状態を模倣することと、培養培地に薬剤または化合物を加えることと、薬剤または化合物に暴露された少なくとも１つの播かれた細胞型に剪断力を適用することとを含む。薬剤または化合物の存在下での、少なくとも１つの播かれた細胞型における変化は薬剤または化合物が生理的状態に対して効果を有することを示す。
【０２７８】
薬剤または化合物を調べるこの試験管内の方法では、上述のような生理的状態を模倣する試験管内の方法によって生理的状態を模倣することができる。
【０２７９】
薬剤または化合物を調べる試験管内の方法の生理的状態も、初代細胞または不死化細胞を播き、細胞培養培地にて細胞を培養することによって模倣することができる。
【０２８０】
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９はまた、効果（たとえば、肝臓の病的状態に対するまたは健常な肝臓に対する効果）について薬剤または化合物を調べる試験管内の方法も記載している。方法は、細胞培養容器に培養培地を加えることと、細胞培養容器内の少なくとも１つの表面上に少なくとも１つの細胞型を播くことと、培養培地に薬剤または化合物を加えることと、薬剤または化合物に暴露された少なくとも１つの播かれた細胞型に剪断力を適用することとを含む。培養培地における薬剤または化合物の濃度は、生体内で効果を達成する薬剤または化合物の濃度範囲の範囲内である。剪断力は流動装置によって誘導される培養培地の流れから生じる。流れは、少なくとも１つの細胞型が生体内でさらされる流れを模倣する。薬剤または化合物の存在下での少なくとも１つの播かれた細胞型における変化は薬剤または化合物が効果を有することを示す。
【０２８１】
効果は病的状態（たとえば、肝臓の病的状態）に対する効果であることができる。或いは、効果は生理的状態（たとえば、健常な肝臓）に対する効果であることができる。
【０２８２】
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された上記方法のいずれでも、方法はさらに、サイトカインの分泌、ケモカインの分泌、液性因子の分泌、微粒子の分泌、増殖因子の分泌、細胞表面からのタンパク質の脱落、化合物の代謝体、免疫細胞、酸化窒素の分泌、血管拡張性タンパク質、血管収縮性タンパク質、ｍｉＲＮＡ、分泌されたタンパク質、または分泌された生体物質について細胞培養培地を分析することを含むことができる。硝酸塩または亜硝酸塩の濃度を測定することによって酸化窒素の分泌について細胞培養培地を分析することができる。
【０２８３】
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された上記方法のいずれでも、方法はさらに、細胞型（単数）または細胞型（複数）を培養するステップを含むことができる。
【０２８４】
薬剤または化合物が培養培地に添加されているＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された上記方法のいずれでも、方法はさらに、培地が薬剤または化合物を含むある時間剪断力を適用した後の細胞型の少なくとも１つを、培地が薬剤または化合物を含まないその時間剪断力を適用した後の細胞型の少なくとも１つと比較して細胞型の少なくとも１つに対する薬剤または化合物の効果を判定するステップを含むことができる。
【０２８５】
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９は、健常な肝臓に対する効果について薬剤または化合物が調べられる方法を記載している。そのような方法では、因子はインスリン及びグルコースを含み、肝細胞は細胞培養培地内の表面上に播かれ、剪断力は播かれた肝細胞に間接的に適用される。
【０２８６】
たとえば、肝細胞は多孔性膜の第１の表面上に播くことができる。次いで、第１の表面が細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内で下容量部と上容量部を定義する。下容量部は肝細胞を含み、上容量部は多孔性膜の第２の表面を含む。剪断力は容器の上容量部にて多孔性膜の第２の表面に適用される。
【０２８７】
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された方法では、細胞培養培地にて懸濁させた多孔性膜の使用は細胞を播くことにおいて好まれる。剪断力が播かれた細胞に、または多孔性膜の表面に適用される場合（たとえば、播かれた細胞がない膜表面に剪断が適用される場合）、剪断力は培養培地が上容量部から下容量部に潅流するのを可能にすることができる。そのような潅流は都合よく上容量部から下容量部への因子の輸送に影響を与え、逆もまた同様である。
【０２８８】
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９は、肝臓の病的状態または生理的状態を試験管内で模倣する方法を記載している。方法は、細胞培養容器に培養培地を加えることと、培養培地に少なくとも１つの因子を加えることと、細胞培養容器内の少なくとも１つの表面上に少なくとも１つの肝細胞型を播くことと、少なくとも１つの播かれた肝細胞型に剪断力を適用することとを含む。剪断力は流動装置によって誘導される培養培地の流れから生じる。流れは、少なくとも１つの肝細胞型が生体内の病的状態または生理的状態でさらされる流れを模倣する。
【０２８９】
この方法では、病的状態を模倣するための培養培地における因子の濃度は病的状態で認められる因子の生体内での濃度範囲の範囲内であることができる。或いは、この方法では、病的状態を模倣するための培養培地における因子の濃度は、薬剤または化合物の投与の結果生体内で生じることになる因子の濃度範囲の範囲内であることができる。さらなる代替として、この方法では、病的状態を模倣するための培養培地における因子の濃度は、剪断力のもとである時間試験管内で模倣された病的状態を維持することが可能であり得るが、因子の同じ濃度は剪断力の非存在下ではその時間試験管内で模倣された病的状態を維持することが不可能である。
【０２９０】
この方法では、生理的状態を模倣するための培養培地における因子の濃度は、生理的状態で認められる因子の生体内での濃度範囲の範囲内であることができる。或いは、この方法では、生理的状態を模倣するための培養培地における因子の濃度は、薬剤または化合物の投与の結果生体内で生じることになる因子の濃度範囲の範囲内であることができる。さらなる代替として、この方法では、生理的状態を模倣するための培養培地における因子の濃度は、剪断力のもとである時間試験管内で模倣された生理的状態を維持することが可能であり得るが、因子の同じ濃度は剪断力の非存在下ではその時間試験管内で模倣された生理的状態を維持することは不可能である。
【０２９１】
この方法では、剪断力の適用の非存在下での少なくとも１つの播かれた肝細胞型または培養培地における病的状態または生理的状態のマーカーのレベルと比較した、剪断力の適用の際の少なくとも１つの播かれた肝細胞型または培養培地におけるマーカーのレベルの変化は病的状態または生理的状態の模倣を裏付ける。
【０２９２】
或いは、この方法では、少なくとも１つの播かれた肝細胞型は肝細胞を含み、肝細胞におけるグルカゴン、インスリンまたはグルコースの基質に対する応答性は生理的状態の模倣を裏付ける。グルコースの基質は、たとえば、グリセロール、乳酸塩、ピルビン酸塩またはそれらの組み合わせ（たとえば、乳酸塩とピルビン酸塩の組み合わせ）であることができる。
【０２９３】
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９はまた、病的状態または生理的状態（たとえば、肝臓の病的状態または生理的状態）に対する効果について薬剤または化合物を調べる試験管内の方法も記載している。方法は、病的状態または生理的状態を模倣することと、培養培地に薬剤または化合物を加えることと、薬剤または化合物に暴露される少なくとも１つの播かれた肝細胞型に剪断力を適用することとを含む。薬剤または化合物の存在下での少なくとも１つの播かれた肝細胞型における変化は、薬剤または化合物が病的状態または生理的状態に対する効果を有することを示す。
【０２９４】
薬剤または化合物を調べるこの試験管内の方法では、上で直接記載されたような病的状態または生理的状態を模倣する試験管内の方法によって病的状態を模倣することができる。
【０２９５】
薬剤または化合物を調べる試験管内の方法の病的状態または生理的状態は、病的状態を有する対象（単数）または対象（複数）に由来する初代細胞または不死化細胞を播くことと、細胞培養培地にてその細胞を培養することによって模倣することができる。
【０２９６】
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９はまた、試験管内で肝臓の病的状態または生理的状態を模倣する方法も記載している。方法は、細胞培養容器に培養培地を加えることと、細胞培養容器内の表面上に少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を堆積させることと、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分上に肝細胞を播くことと、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分及び肝細胞に剪断力を間接的に適用することとを含む。剪断力は流動装置によって誘導される培養培地の流れから生じる。流れは、肝細胞が生体内の病的状態または生理的状態でさらされる流れを模倣する。
【０２９７】
肝細胞が多孔性膜上に播かれる方法では、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を多孔性膜の第１の表面上に播くことができ、その後、肝細胞を少なくとも１つの細胞外マトリクス成分上に播くことができる。任意で、非実質肝細胞（たとえば、類洞内皮細胞）を多孔性膜の第２の表面上に播くことができ、剪断力を非実質肝細胞に適用することができる。
【０２９８】
細胞外マトリクス成分の堆積が関与する方法では、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を多孔性膜の第１の表面上に堆積させることができる。肝細胞型（たとえば、肝細胞）がその後、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分上に播かれる。第１の表面が細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内で下容量部と上容量部を定義する。下容量部は少なくとも１つの細胞外マトリクス成分及び肝細胞型（たとえば、肝細胞）を含み、上容量部は多孔性膜の第２の表面を含む。剪断力は容器の上容量部における多孔性膜の第２の表面に適用される。任意で、非実質肝細胞（たとえば、類洞内皮細胞）を多孔性膜の第２の表面上に播くことができ、剪断力を非実質肝細胞に適用することができる。
【０２９９】
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９はまた、試験管内で肝臓の病的状態または生理的状態を模倣する別の方法も記載している。方法は、細胞培養容器に培養培地を加えることと、多孔性膜の第１の表面上に肝細胞を播くこととを含む。第１の表面が細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内で肝細胞を含む下容量部と多孔性膜の第２の表面を含む上容量部を定義する。剪断力は容器の上容量部における多孔性膜の第２の表面に適用され、剪断力は流動装置によって誘導される培養培地の流れから生じる。流れは、肝細胞が生体内の病的状態または生理的状態でさらされる流れを模倣する。流動装置は容器の上容量部における培養培地に配置されるように適合させた本体と、本体を回転させるように適合させたモーターを含む。好ましくは、本体は円錐表面を有する。容器の中で且つ細胞培養培地に接触して本体の円錐表面を位置付けるために流動装置を適合させることも好まれる。
【０３００】
方法はさらに、多孔性膜の第２の表面上に非実質肝細胞を播くことを含むことができ、その際、剪断応力は非実質肝細胞に適用される。非実質肝細胞は類洞内皮細胞、肝星細胞、クッパー細胞、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０３０１】
肝臓の病的状態または生理的状態を模倣する試験管内の方法では、方法における病的状態または生理的状態のマーカーのレベルの変化を剪断力の適用の非存在下での同じ方法と比較することができる。剪断力の適用の非存在下での肝細胞または培養培地におけるマーカーのレベルと比べた剪断力の適用の際の肝細胞または培養培地のいずれかにおけるマーカーのレベルの変化が、病的状態または生理的状態の模倣を裏付ける。たとえば、剪断力の適用の非存在下での肝細胞または非実質肝細胞または培養培地におけるマーカーのレベルと比べた剪断力の適用の際の肝細胞または非実質肝細胞または培養培地におけるマーカーのレベルの変化は、病的状態または生理的状態の模倣を裏付ける。
【０３０２】
或いは、少なくとも１つの播かれた肝細胞型が肝細胞を含む場合、グルカゴン、インスリンまたはグルコースの基質に対する反応性は生理的状態の模倣を裏付ける。グルコースの基質は、たとえば、グリセロール、乳酸塩、ピルビン酸塩またはそれらの組み合わせ（たとえば、乳酸塩とピルビン酸塩の組み合わせ）であることができる。
【０３０３】
病的状態
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された方法を用いて模倣することができる肝臓の病的状態には、脂肪肝疾患、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、肝線維症、細菌感染、ウイルス感染、肝硬変、及びアルコール性肝疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０４】
病的状態が脂肪肝疾患である場合、細胞型は肝細胞、非実質肝細胞、またはそれらの組み合わせを含むことができる。非実質肝細胞は類洞内皮細胞、肝星細胞、クッパー細胞、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０３０５】
病的状態が脂肪肝疾患である場合、流れまたは血行動態のパターンは正常な対象、脂肪肝疾患を有する対象、または脂肪肝疾患に対して遺伝子操作された動物に由来することができる。
【０３０６】
病的状態が脂肪肝疾患であり、多孔性膜が使用される場合、肝細胞を多孔性膜の第１の表面上に播くことができる。第１の表面が細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内で肝細胞を含む下容量部と多孔性膜の第２の表面を含む上容量部を定義する。剪断力は上容量部における多孔性膜の第２の表面に適用される。任意で、非実質肝細胞を多孔性膜の第２の表面上に播くことができ、剪断力は上容量部における非実質肝細胞に適用される。任意で、細胞外マトリクス成分を多孔性膜の第１の表面上に堆積させることができ、その後肝細胞を細胞外マトリクス成分上に播くことができる。
【０３０７】
病的状態が脂肪肝疾患であり、多孔性膜が使用される場合、非実質肝細胞を多孔性膜の第２の表面上に播くことができる。多孔性膜の第１の表面が細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内で多孔性膜の第１の表面を含む下容量部と非実質肝細胞を含む上容量部を定義する。剪断力は上容量部における非実質肝細胞に適用される。任意で、細胞外マトリクス成分を多孔性膜の第１の表面上に堆積させることができ、その後肝細胞を細胞外マトリクス成分上に播くことができる。
【０３０８】
血管の病的状態が脂肪肝疾患である場合、因子はインスリン、グルコースまたはそれらの組み合わせを含むことができる。たとえば、因子はインスリン；グルコース；またはインスリンとグルコースを含むことができる。
【０３０９】
病的状態が糖尿病である場合、細胞型は膵臓β細胞、膵臓α細胞またはそれらの組み合わせを含むことができ、因子はインスリン、グルコース、またはインスリンとグルコースを含むことができる。
【０３１０】
生理的状態
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された方法を用いて模倣することができる生理的状態には、当該病的状態に相当する生理的状態が挙げられる。たとえば、脂肪肝疾患に相当する生理的状態は健常な肝臓の状態であり、アテローム性硬化症に相当する生理的状態はアテローム性保護状態であることができる。
【０３１１】
流動装置
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された方法で使用することができる流動装置は、「流動装置」と題する節で上文にて記載されたのと同じである。
【０３１２】
血行動態パターン
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された方法で使用することができる血行動態パターンは病的状態または疾患を促進する状態を有する対象（単数）または対象（複数）に由来することができる。疾患を促進する状態は、萎縮、結石、分離芽腫、病的収縮、病的拡張、憩室、過形成、ポリープ、脱出、破裂、動静脈瘻、または突起（たとえば、左動脈の突起）を含むことができる。
【０３１３】
血行動態パターンは動脈、細動脈、静脈、細静脈、または臓器の少なくとも一部に由来することができる。
【０３１４】
血行動態パターンが動脈または細動脈の少なくとも一部に由来する場合、動脈または細動脈は、頸動脈、胸部動脈、腹部動脈、肺動脈、大腿動脈、腎輸出動脈、腎輸入動脈、冠状動脈、気管支動脈、内胸動脈、大脳動脈、大動脈、毛細血管前細動脈、肝動脈、前大脳動脈、中大脳動脈、後大脳動脈、脳底動脈、外頸動脈、内頸動脈、椎骨動脈、鎖骨下動脈、大動脈弓、腋窩動脈、内胸部動脈、上腕動脈、深部上腕動脈、橈側反回動脈、上腹壁動脈、下行大動脈、下腹壁動脈、骨間動脈、橈骨動脈、尺骨動脈、掌側手根弓、背側手根弓、表在性または深部性の掌側弓、指動脈、大腿回旋動脈の下行分岐、下行膝動脈、上膝動脈、下膝動脈、前脛骨動脈、後脛骨動脈、腓骨動脈、深部足底弓、弓状動脈、総頸動脈、肋間動脈、左または右胃動脈、腹腔動脈、脾臓動脈、総肝動脈、上腸間膜動脈、腎動脈、下腸間膜動脈、精巣動脈、総腸骨動脈、内腸骨動脈、外腸骨動脈、大腿回旋動脈、貫通枝、深部大腿動脈、膝窩動脈、背側中足動脈、または背側指動脈を含むことができる。
【０３１５】
血行動態パターンが静脈または細静脈の少なくとも一部に由来する場合、静脈または細静脈は、毛細血管後細静脈、伏在静脈、肝門脈、上大静脈、下大静脈、冠状静脈、テベジウス静脈、表在性静脈、穿通枝静脈、系統的静脈、肺静脈、頸静脈、Ｓ状静脈洞、外頸静脈、内頸静脈、下甲状腺静脈、鎖骨下静脈、内胸部静脈、腋窩静脈、橈側皮静脈、上腕静脈、肋間静脈、尺骨皮静脈、肘正中皮静脈、胸腹壁静脈、尺骨静脈、前腕正中皮静脈、下腹壁静脈、深部掌側弓、表在性掌側弓、掌側指静脈、心臓静脈、下大静脈、肝静脈、腎静脈、腹部大静脈、精巣静脈、総腸骨静脈、貫通枝、外腸骨静脈、内腸骨静脈、外陰部静脈、深部大腿静脈、大伏在静脈、大腿静脈、副伏在静脈、上膝静脈、膝窩静脈、下膝静脈、大伏在静脈、小伏在静脈、前または後脛骨静脈、深部足底静脈、背側静脈弓、または背側指静脈を含むことができる。
【０３１６】
血行動態パターンが臓器の少なくとも一部に由来する場合、臓器は、肝臓、腎臓、肺、脳、膵臓、脾臓、大腸、小腸、心臓、骨格筋、眼、舌、生殖器または臍帯を含むことができる。血行動態パターンは好ましくは肝臓に由来する。
【０３１７】
血行動態パターンは超音波データの解析に由来することができる。
【０３１８】
血行動態パターンは磁気共鳴画像（ＭＲＩ）のデータの解析に由来することができる。
【０３１９】
流れまたは血行動態パターンは時変性であることができる。
【０３２０】
流れまたは血行動態パターンは病的状態から生じる身体変化から生じ得る。
【０３２１】
流れまたは血行動態のパターンは、流れまたは血行動態のパターンが薬剤投与のない対象についての流れまたは血行動態のパターンに比べて対象への薬剤投与の直接的なまたは間接的な効果として変化している対象に由来することができる。
【０３２２】
流れまたは血行動態のパターンは、たとえば、遺伝子操作された動物のような動物、またはヒトに由来することができる。好ましくは、パターンはヒトに由来する。
【０３２３】
細胞型
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された方法で使用することができる細胞型には初代細胞及び不死化細胞が含まれる。初代細胞または不死化細胞は、病的状態または生理的状態を有する少なくとも１人の対象から単離された細胞、病的状態のリスク因子を有する少なくとも１人の対象から単離された細胞、病的状態に関連する単一ヌクレオチド多型を持つ少なくとも１人の対象から単離された細胞、薬剤毒性に関連する特定された遺伝子型を持つ少なくとも１人の対象から単離された細胞、または薬剤毒性に関連する単一ヌクレオチド多型を持つ少なくとも１人の対象から単離された細胞を含むことができる。
【０３２４】
生理的状態が関与する試験管内の方法で使用される初代細胞または不死化細胞は、生理的状態を有する少なくとも１人の対象から単離された細胞、病的状態のリスク因子を有する少なくとも１人の対象から単離された細胞、病的状態に関連する単一ヌクレオチド多型を持つ少なくとも１人の対象から単離された細胞、薬剤毒性に関連する特定された遺伝子型を持つ少なくとも１人の対象から単離された細胞、または薬剤毒性に関連する単一ヌクレオチド多型を持つ少なくとも１人の対象から単離された細胞を含む。
【０３２５】
病的状態が関与する試験管内の方法で使用される初代細胞または不死化細胞は、病的状態を有する少なくとも１人の対象から単離された細胞、病的状態のリスク因子を有する少なくとも１人の対象から単離された細胞、病的状態に関連する単一ヌクレオチド多型を持つ少なくとも１人の対象から単離された細胞、薬剤毒性に関連する特定された遺伝子型を持つ少なくとも１人の対象から単離された細胞、または薬剤毒性に関連する単一ヌクレオチド多型を持つ少なくとも１人の対象から単離された細胞を含むことができる。
【０３２６】
病的状態が関与する試験管内の方法で使用される初代細胞または不死化細胞は、病的状態を有さない少なくとも１人の対象から単離された細胞、病的状態のリスク因子を有さない少なくとも１人の対象から単離された細胞、病的状態に関連する単一ヌクレオチド多型を伴わない少なくとも１人の対象から単離された細胞、薬剤毒性に関連する特定された遺伝子型を伴わない少なくとも１人の対象から単離された細胞、または薬剤毒性に関連する単一ヌクレオチド多型を伴わない少なくとも１人の対象から単離された細胞を含むことができる。
【０３２７】
病的状態が関与する試験管内の方法で使用される初代細胞または不死化細胞は、異なる病的状態を有する少なくとも１人の対象から単離された細胞、異なる病的状態のリスク因子を有する少なくとも１人の対象から単離された細胞、または異なる病的状態に関連する単一ヌクレオチド多型を持つ少なくとも１人の対象から単離された細胞を含むことができる。
【０３２８】
細胞が病的状態のリスク因子を有する少なくとも１人の対象から単離される場合、リスク因子には、喫煙、年齢、性別、人種、エピジェネティックな刷り込み、病的状態に関連する特定された遺伝子型、病的状態に関連する特定された単一ヌクレオチド多型、糖尿病、高血圧症、アテローム性硬化症、アテローム性硬化症のプラークの破裂、アテローム性硬化症のプラークのびらん、胸部大動脈瘤、大脳動脈瘤、腹部大動脈瘤、大脳動脈瘤、心不全、卒中、マルファン症候群、頸動脈内膜中膜肥厚、心房細動、腎疾患、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、肺動脈疾患、肺高血圧症、高脂血症、家族性高コレステロール血症、末梢動脈疾患、動脈血栓症、静脈血栓症（たとえば、深部静脈血栓症）、血管再狭窄、血管石灰化、心筋梗塞、肥満、高トリグリセリド血症、低αリポタンパク質血症、脂肪肝疾患、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、肝線維症、細菌感染、ウイルス感染、肝硬変、肝線維症、またはアルコール性肝疾患を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０３２９】
初代細胞には幹細胞（たとえば、成人幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、または骨髄由来の幹細胞）または幹様細胞に由来する細胞系列を挙げることができる。幹細胞または幹様細胞に由来する細胞系列は、内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、肝細胞、ニューロン細胞、内分泌細胞、膵臓β細胞、膵臓α細胞、または骨格筋細胞を含むことができる。
【０３３０】
初代細胞は病的状態を有する対象に由来する人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）を含むことができる。たとえば、病的状態を有する対象からのｉＰＳＣに由来する細胞は、家族性高コレステロール血症、グリコーゲン貯蔵疾患Ｉ型、Ｗｉｌｓｏｎ病、Ａ１抗トリプシン欠乏症、Ｃｒｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｊａｒ症候群、進行性家族性遺伝性胆汁鬱滞、または遺伝性チロシン血症Ｉ型を有する対象からのｉＰＳＣに由来する肝細胞を含むことができる。或いは、病的状態を有する対象からのｉＰＳＣに由来する細胞は、ハッチンソン・ギルフォード早老症、ウイリアムス−ボイレン症候群、ファブリー病、スザック症候群、全身性毛細血管漏出症候群、グライヒ症候群、血管内乳頭状内皮過形成、鎌状細胞病、または肝静脈閉塞性疾患を有する対象からのｉＰＳＣに由来する血管細胞（たとえば、ｉＰＳＣに由来する平滑筋細胞、ｉＰＳＣに由来する内皮細胞、またはｉＰＳＣに由来する心内膜細胞）を含むことができる。
【０３３１】
方法で使用するための細胞型には血管細胞及び肝細胞が挙げられる。
【０３３２】
方法で使用するための特定の細胞型には、内皮細胞、肝細胞、非実質肝細胞、内皮前駆細胞、幹細胞及び循環幹細胞が挙げられる。非実質肝細胞には、肝星細胞、類洞内皮細胞及びクッパー細胞が挙げられる。好ましくは、特定の細胞型には内皮細胞、幹細胞、類洞内皮細胞、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。
【０３３３】
方法で使用するための細胞型は、たとえば、遺伝子操作した動物に由来する細胞のような動物の細胞型であることができる。動物の細胞型は好ましくはヒトの細胞型である。ヒトの細胞型は、年齢、性別、人種、エピジェネティクス、疾患、国籍、１以上の単一ヌクレオチド多型の存在または非存在、本明細書で記載されるようなリスク因子、または病的状態若しくは生理的状態に関連する幾つかの他の特徴に基づいて選択することができる。
【０３３４】
方法で適用される剪断力は少なくとも１つの播かれた細胞型に間接的に適用することができる。
【０３３５】
方法で適用される剪断力は少なくとも１つの播かれた細胞型に直接適用することができる。
【０３３６】
細胞型、たとえば、細胞外マトリクス成分のような追加の成分、及び多孔性膜は方法における培養培地の中にある（すなわち、培養培地で覆われる）。
【０３３７】
方法はさらに、薬剤または化合物から生じる毒性、炎症、透過性、適合性、細胞接着、細胞リモデリング、細胞移動、または表現型の調節について少なくとも１つの細胞型を分析することを含むことができる。
【０３３８】
細胞培養培地
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された方法では標準の細胞培養培地を使用することができる。
【０３３９】
生体内での因子の濃度
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された方法で使用するための因子の生理的な生体内濃度は当該技術で周知であり、生体内濃度を決定する方法も同様である。因子の生体内濃度を決定する方法は米国薬局方及び他の文献にて利用可能である。
【０３４０】
因子の報告された生体内での濃度範囲は、範囲を決定するのに使用される方法、因子が得られる供給源（たとえば、全血または血清）、患者の医学的状態（すなわち、患者が病的状態または生理的状態を有するかどうか）、及び正常な睡眠と食事のスケジュールに対する時刻に応じて変化することができる。しかしながら、文献で報告された生体内での生理的な濃度範囲の外側の濃度が濃度を決定するために報告された方法を用いた生体内での病的な濃度であることは当業者に既知である。同様に、文献で報告された生体内での病的な濃度範囲のさらに低い端点より低いまたはさらに高い端点より高い濃度は、濃度を決定するために報告された方法を用いた生体内での生理的な濃度であるということになり；生体内での生理的な濃度がさらに低い端点を下回るまたはさらに高い端点を上回るかどうかは因子に左右されるであろう。
【０３４１】
細胞外マトリクス成分
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された方法で使用するための細胞外マトリクス成分は、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、またはそれらの組み合わせを含むことができる。コラーゲンは好まれる細胞外マトリクス成分であり、好ましくは、特定の病的状態または生理的状態のために播かれる細胞型（単数）または細胞型（複数）の生体内環境に存在するコラーゲンの型である。
【０３４２】
細胞外マトリクス成分は、細胞培養容器内の表面上に播かれた線維芽細胞、軟骨細胞、または骨芽細胞によって分泌され得る。
【０３４３】
薬剤または化合物
薬剤または化合物の試験に関与するＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された方法で使用するための薬剤または化合物は任意の薬剤または化合物を含むことができる。
【０３４４】
培養培地における薬剤または化合物の濃度は好適には生体内で効果を達成する薬剤または化合物の濃度範囲の範囲内である。たとえば、培養培地における薬剤または化合物の濃度は好適には、薬剤または化合物の生体内での治療用Ｃｍａｘの濃度範囲の範囲内である。
【０３４５】
血清
培養培地に因子を加えること、または培養培地に薬剤若しくは化合物を加えることが関与するＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された方法のいずれでも、培養培地に因子を加えるステップまたは培養培地に薬剤若しくは化合物を加えるステップは、培養培地に対象に由来する血清を加えることを含むことができ、その際、血清は因子、薬剤または化合物を含む。
【０３４６】
対象は、たとえば、遺伝子操作された動物のような動物、またはヒトであることができる。好ましくは、血清はヒト対象に由来する。
【０３４７】
血清は生理的状態を有する対象または病的状態を有する対象に由来することができる。たとえば、血清が病的状態を有する対象に由来する場合、病的状態は、進行した炎症、アテローム性硬化症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、高血圧症、高血圧性脳症、高血圧性網膜症、脂肪肝疾患、高血圧症、心不全、卒中、マルファン症候群、頸動脈内膜中膜肥厚、心房細動、腎疾患、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、高脂血症、高コレステロール血症、糖尿病、アテローム性硬化症のプラークの破裂、アテローム性硬化症のプラークのびらん、胸部大動脈瘤、大脳動脈瘤、腹部大動脈瘤、大脳動脈瘤、肺動脈疾患、肺高血圧症、末梢動脈疾患、動脈血栓症、静脈血栓症（たとえば、深部静脈血栓症）、血管再狭窄、血管石灰化、心筋梗塞、肥満、高トリグリセリド血症、低αリポタンパク質血症、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、肝線維症、細菌感染、ウイルス感染、肝硬変、肝線維症、またはアルコール性肝疾患を含むことができる。
【０３４８】
生理的状態または病的状態に対する効果
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された効果について薬剤または化合物を調べる方法では、効果は、生理的状態に対する効果または病的状態に対する効果を含むことができる。たとえば、生理的状態または病的状態に対する効果は、毒性効果、保護効果、病的効果、疾患を促進する効果、炎症効果、酸化効果、小胞体ストレス効果、ミトコンドリアストレス効果、アポトーシス効果、壊死効果、リモデリング効果、増殖性効果、たとえば、タンパク質の阻害若しくはタンパク質の活性化のようなタンパク質の活性に対する効果、または、たとえば、遺伝子の発現の上昇若しくは遺伝子の発現の低下のような遺伝子の発現に対する効果であることができる。
【０３４９】
流動装置のための複数の細胞型の配置
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された方法はさらに、細胞容器の内外に培養培地、因子、薬剤または化合物を潅流させることを含むことができる。
【０３５０】
細胞培養容器内の表面が細胞培養容器にて懸濁させた多孔性膜を含む場合、方法はさらに、多孔性膜の第１の表面上に第１の細胞型を播くことを含む細胞培養容器内の表面上に少なくとも１つの細胞型を播くステップと、任意で多孔性膜の第２の表面上に第２の細胞型を播くことを含むことができ、その際、第１の表面が細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内で第１の細胞型を含む下容量部と任意の第２の細胞型を含む上容量部を定義する。多孔性膜は、培養培地の流体連通と、第１の細胞型の細胞と任意の第２の細胞型の細胞との間での物理的な相互作用及び連通とを可能にするように適合させることができる。剪断力は、上容量部における第２の細胞型または多孔性膜の第２の表面に適用される。方法はさらに、上容量部の内外に培養培地を潅流すること及び下容量部の内外に培養培地を潅流することを含むことができる。方法はさらに、上容量部及び下容量部の少なくとも一方に薬剤または化合物を潅流することを含むことができる。
【０３５１】
細胞培養容器内の表面が細胞培養容器にて懸濁させた多孔性膜を含む場合、方法はさらに、多孔性膜の第１の表面上に第１の細胞型を任意で播くことを含む細胞培養容器内の表面上に少なくとも１つの細胞型を播くステップと、多孔性膜の第２の表面上に第２の細胞型を播くことを含むことができ、その際、第１の表面が細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内で任意の第１の細胞型を含む下容量部と第２の細胞型を含む上容量部を定義する。多孔性膜は、培養培地の流体連通と、任意の第１の細胞型の細胞と第２の細胞型の細胞との間での物理的な相互作用及び連通とを可能にするように適合させることができる。剪断力は、上容量部における第２の細胞型に適用される。方法はさらに、上容量部の内外に培養培地を潅流すること及び下容量部の内外に培養培地を潅流することを含むことができる。方法はさらに、上容量部及び下容量部の少なくとも一方に薬剤または化合物を潅流することを含むことができる。
【０３５２】
細胞培養容器における注入口及び排出口は、上容量部及び下容量部を定義する細胞培養容器の一部の範囲内にあることができる。
【０３５３】
この節で記載される方法はさらに、薬剤または化合物から生じる毒性、炎症、透過性、適合性、細胞接着、細胞リモデリング、細胞移動、または表現型の調節について第１の細胞型または第２の細胞型の少なくとも一方を分析することを含むことができる。
【０３５４】
これらの方法はさらに、容器の表面上に、または多孔性膜の第１の表面または第２の表面上に第３の細胞型を播くこと、または下容量部内の培養培地にて第３の細胞型を懸濁させることを含むことができる。
【０３５５】
これらの方法はさらに、容器の表面上に、または多孔性膜の第１のまたは第２の表面上に第４の細胞型を播くこと、上容量部内の培養培地にて第４の細胞型を懸濁させること、または下容量部内の培養培地にて第４の細胞型を懸濁させることを含むことができる。
【０３５６】
これらの方法はさらに、容器の表面上に、または多孔性膜の第１のまたは第２の表面上に第５の細胞型を播くこと、上容量部内の培養培地にて第５の細胞型を懸濁させること、または下容量部内の培養培地にて第５の細胞型を懸濁させることを含むことができる。
【０３５７】
第１、第２、第３、第４及び第５の細胞型は、細胞型に関して上記節で記載されたような種々の初代細胞型または不死化細胞型であることができる。
【０３５８】
これらの組み合わせのそれぞれでは、第３の細胞型の細胞、第４の細胞型の細胞または第５の細胞型の細胞を容器の底面に接着させることができる。
【０３５９】
定義
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された方法に関して、「因子」という用語は、病的状態または生理的状態の作出に寄与する生物物質を意味する。好ましくは、因子は、剪断力の適用の非存在下での少なくとも１つの播かれた細胞型または培養培地における病的状態または生理的状態のマーカーのレベルと比べて、剪断力の適用の際、少なくとも１つの播かれた細胞型または培養培地における病的状態または生理的状態のマーカーのレベルの変化を提供する。
【０３６０】
「病的状態」という用語は、疾患の客観的なまたは主観的な兆候を含む異常な身体構造上の状態または生理的な状態を意味する。
【０３６１】
「生理的状態」という用語は、病的ではない正常な医学的状態を意味し、身体または組織または臓器の正常な機能または状態を特徴とするまたはそれらに従う医学的状態であることができる。
【０３６２】
生理的な肝臓モデル
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された方法を用いて肝臓の生理的な試験管内モデルを創ることができる。そのような方法では、肝細胞が細胞培養容器内の表面上に播かれ、剪断力は播かれた肝細胞に間接的に適用される。たとえば、肝細胞は好適に多孔性膜の第１の表面に播かれ、その際、第１の表面が細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内で肝細胞を含む下容量部と多孔性膜の第２の表面を含む上容量部を定義する。剪断力は容器の上容量部における多孔性膜の第２の表面に適用される。従って、装置における細胞の配置は肝小葉の生体内での微細構造に基づく。
【０３６３】
生体内の肝小葉では、類洞内皮細胞のフィルタリング層及び細胞外マトリクスの層によって畝状の肝細胞が類洞血流から分離される。細胞外マトリクスの層は、肝細胞の足場を提供し、シグナル伝達に関与し、サイトカイン及び増殖因子のリザーバを提供する。肝細胞は分極した形態を有し、毛細胆管が肝細胞層に存在する。類洞の血流及び間質の血流は酸素及び栄養の輸送を提供する。
【０３６４】
図１１は、試験管内の肝臓モデルで使用され、上記で記載された例となる配置を示す。多孔性膜は、肝臓に存在する類洞内皮細胞のフィルタリング層に類似して作用する。肝細胞は、それらが生体内にあることになるので流れの直接効果から遮蔽される。細胞培養容器内の上容量部及び下容量部における注入口及び排出口によって培養培地の連続的な潅流及び細胞培養培地の内外への薬剤または化合物の潅流を可能にする。剪断力の適用は、間質の流れ及び多孔性膜を介した溶質の輸送を調節する制御された血行動態を創り出す。ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された試験管内のモデルでは、肝細胞はその分極した形態及び毛細胆管を維持する。
【０３６５】
１以上の細胞外マトリクス成分（たとえば、コラーゲンゲル）の少なくとも１つの層を好適に多孔性膜の第１の表面上に堆積させることができる。次いで肝細胞が細胞外マトリクス成分上に播かれる。次いで細胞外マトリクス成分の１以上の追加の層を肝細胞の上に堆積させることができるので、肝細胞は細胞外マトリクス成分によって実質的に取り囲まれる。細胞外マトリクス成分は好適にはヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、またはそれらの組み合わせを含む。たとえば、細胞外マトリクス成分はコラーゲンを含むことができる。
【０３６６】
１以上の追加の細胞型を細胞培養容器内の表面上に播くことができ、または培養培地に懸濁させることができる。たとえば、非実質肝細胞を好適に多孔性膜の第２の表面上に播き、剪断力は播かれた非実質肝細胞に適用される。非実質肝細胞は肝星細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。肝細胞及び非実質肝細胞は好適には、動物の肝臓、たとえば、ヒトの肝臓から単離された初代細胞である。或いは、肝細胞及び／または非実質肝細胞は不死化細胞である。
【０３６７】
生理的な血流値の範囲に由来する剪断力を多孔性膜の第２の表面に、または播かれた非実質肝細胞に連続して適用しながら、培地を好適には多孔性膜の両側に連続して潅流する。多孔性膜の第２の表面に適用される剪断力は肝臓の洞様毛細血管を介して生体内で生じる流れを模倣する。剪断率は好適には、約０．１ダイン／ｃｍ２〜約３．０ダイン／ｃｍ２、約０．２ダイン／ｃｍ２〜約２．５ダイン／ｃｍ２、約０．３ダイン／ｃｍ２〜約１．０ダイン／ｃｍ２または約０．４ダイン／ｃｍ２〜約０．８ダイン／ｃｍ２である。たとえば、剪断率は約０．６ダイン／ｃｍ２であることができる。或いは、剪断率は約２．０ダイン／ｃｍ２であることができる。
【０３６８】
生理的な試験管内の肝臓モデルでは、培養培地には１以上の因子が存在する。剪断力のもとである時間生理的な肝臓状態を試験管内で模倣することを維持することが可能である濃度で、１以上の因子を培地に加えることができ、その際、これらの因子の同じ濃度は剪断力の非存在下ではその時間生理的な肝臓状態を試験管内で模倣することを維持することは不可能である。たとえば、因子はインスリン、グルコースまたはインスリンとグルコースの組み合わせを含んでもよい。グルコース及びインスリンは、静置培養で通常使用される濃度（約１７．５ｍＭのグルコースと約２μＭのインスリン）と比べて低下した濃度で好適に存在する。たとえば、グルコースは約５ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で、または約５.５ｍＭ〜約７ｍＭの濃度で、たとえば、約５．５ｍＭの濃度で培養培地に存在してもよい。インスリンは、約０．０５ｎＭ〜約５ｎＭ、たとえば、約０．１ｎＭ〜約３ｎＭまたは約０．５〜２．５ｎＭの濃度で、たとえば、約２ｎＭの濃度で培養培地に存在してもよい。１以上の因子は、剪断力の適用の前にまたはそれと同時に培養培地に好適に添加される。
【０３６９】
１以上の因子の濃度は好適には少なくとも約７日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約３０日間、またはそれ以上、生理的な肝臓の状態を試験管内で模倣することを維持することが可能である。
【０３７０】
生理的な肝臓の状態を模倣することは多数の方法によって評価することができる。一般に、剪断力の適用の非存在での肝細胞または非実質肝細胞または培養培地における生理的な肝臓の状態のマーカーのレベルと比べた剪断力の適用の際の肝細胞または非実質肝細胞または培養培地における生理的な肝臓の状態のマーカーのレベルの変化は、生理的な肝臓の状態の模倣を裏付ける。たとえば、生理的な肝臓の状態の模倣は、生理的な状態で肝臓を維持するのに関与する遺伝子またはタンパク質の発現について肝細胞または非実質肝細胞（たとえば、肝細胞にて、代謝遺伝子、及びインスリン／グルコース／脂質の経路の遺伝子）を調べること；脂質の蓄積について肝細胞を調べること；分化した機能における変化について肝細胞または非実質肝細胞（たとえば、肝細胞にて、尿素及びアルブミンの分泌）を調べること；代謝活性（たとえば、肝細胞にて、チトクロームｐ４５０アッセイを用いて）または輸送体活性について肝細胞または非実質肝細胞を調べること；または形態的な変化について肝細胞または非実質肝細胞を調べることによって評価することができる。肝臓の生理的な状態は、生体異物、栄養素、増殖因子またはサイトカインに対する肝細胞または非実質肝細胞の応答を、同じ生体異物、栄養素、増殖因子またはサイトカインに対する生体内の肝臓の応答と比較することによって評価することもできる。
【０３７１】
以下の実施例１２にてさらに記載されるように、静置条件下で培養された肝細胞とは異なって、ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された生理的な試験管内の肝臓モデルで培養された肝細胞はグルカゴン、インスリン及びグルコースの基質に対する応答性を維持する。従って、グルカゴン、インスリン及びグルコースの基質に対する応答性を用いて（たとえば、糖新生アッセイを用いて）生理的な肝臓の状態の模倣を評価することができる。好適なグルコースの基質には、グリセロール、乳酸塩、ピルビン酸塩またはそれらの組み合わせ（たとえば、乳酸塩とピルビン酸塩の組み合わせ）が挙げられる。さらに、肝細胞はグルカゴンに対する反応性を維持するので、グルカゴン受容体と相互作用する薬剤（たとえば、グルカゴン受容体アンタゴニスト）の試験管内の試験に生理的な試験管内の肝臓モデルを使用することができる。
【０３７２】
加えて、ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された生理的な試験管内の肝臓モデルで培養された肝細胞は、静置培養系よりも生体内の及び臨床的なＣｍａｘレベルにはるかに近い濃度で薬剤に対する誘導反応及び毒性反応を示す。従って、このモデルは、生体内での効果を達成する薬剤または化合物の濃度範囲の範囲内での濃度にて薬剤または化合物を試験管内で調べるのに使用することができる。
【０３７３】
脂肪肝
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された方法を用いて脂肪肝疾患の試験管内モデルを創り出すこともできる。肝細胞内での脂質の調節は複雑で動的な過程である。トリグリセリドの蓄積は、高脂肪食からの高脂肪酸の摂取、高い末梢脂質分解、または高いデノボ脂質生成の結末として生じ得る。インスリン及びグルコースは、高いデノボ脂質生成の重要な調節因子であり、トリグリセリドの合成を刺激すると共にβ酸化により脂肪酸代謝を阻害することによって肝細胞内でのトリグリセリド含量の上昇に寄与する。
【０３７４】
非アルコール性の脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、インスリン抵抗性の存在下で肥満、ＩＩ型糖尿病及びメタボリックシンドロームと相関する。ＮＡＦＬＤは、治療しないままでは炎症性の変化（脂肪性肝炎）及び肝硬変に進行する肝脂肪変性（肝臓における過剰な脂肪の蓄積）を特徴とする。多数の動物モデルが高血糖／高インスリン血症の環境を介して（たとえば、脂質生成を刺激する低脂肪／高炭水化物餌の使用を介して）脂肪変性を誘導する。しかしながら、現在の試験管内の肝細胞モデルは、多分、静置条件下の培養で肝細胞を維持するのに必要とされるインスリン／グルコースの超生理的レベルのために、同じことを誘導する適当なインスリン／グルコースの応答を欠いている。そのような試験管内モデルは、静置培養条件下での肝細胞の損傷したインスリン応答性及び試験管内での迅速な脱分化のために、インスリン及びグルコースを介して肝細胞にて脂肪の変化を誘導することができない。
【０３７５】
それに反して、生理的な肝臓モデルに関して上述のように、制御された肝臓由来の血行動態と輸送の存在下で培養された肝細胞は生理的なグルコース及びインスリンのレベルで分化した機能、形態及び応答を保持する。この系では、高濃度のインスリン及びグルコース（「疾患環境」）を導入することが肝細胞における脂肪の変化を誘導する。従って、制御された血行動態及び輸送は肝細胞にてインスリン及びグルコースに対してさらに生理的な応答を生じ、それによって、通常、糖尿病のインスリン抵抗性の条件下で当初見られるような高インスリン、高血糖の環境における脂肪変性に関連する脂肪の変化を誘導する。加えて、制御された血行動態及び輸送の存在下で培養された肝細胞は静置培養系よりも生体内の及び臨床的なＣｍａｘのレベルにはるかに近い濃度で薬剤に対する誘導反応及び毒性反応を示す。従って、この系は脂肪肝疾患の試験管内モデルを提供する。
【０３７６】
このモデルでは、生理的な肝臓モデルについて上で述べたのと同じ方法で肝細胞が一般に播かれる。肝細胞は細胞培養容器内の表面上に播かれ、剪断力は播かれた肝細胞に間接的に適用される。たとえば、肝細胞は好適には多孔性膜の第１の表面上に播かれ、その際、第１の表面が細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内で肝細胞を含む下容量部と多孔性膜の第２の表面を含む上容量部を定義する。剪断力は容器の上容量部における多孔性膜の第２の表面に適用される。
【０３７７】
１以上の細胞外マトリクス成分の少なくとも１つの層を好適には多孔性膜の第１の表面上に堆積させることができる。次いで肝細胞が細胞外マトリクス成分上に播かれる。次いで細胞外マトリクス成分の１以上の追加の層を肝細胞の上に堆積させることができるので、肝細胞は細胞外マトリクス成分によって実質的に取り囲まれる。細胞外マトリクス成分は好適には、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、またはそれらの組み合わせを含む。たとえば、細胞外マトリクス成分はコラーゲンを含むことができる。
【０３７８】
１以上の追加の細胞型を細胞培養容器内の表面上にまたは培養培地に懸濁させた表面上に播くことができる。たとえば、非実質肝細胞は好適には多孔性膜の第２の表面上に播かれ、剪断力は播かれた非実質肝細胞に適用される。非実質肝細胞は類洞内皮細胞、肝星細胞、クッパー細胞、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。肝細胞及び非実質肝細胞は好適には、動物の肝臓から、たとえば、ヒトの肝臓から単離された初代細胞である。或いは、肝細胞及び／または非実質肝細胞は不死化した細胞である。
【０３７９】
生理的な血流値に由来する剪断力が多孔性膜の第２の表面または播かれた非実質肝細胞に適用されながら、培地は好適には多孔性膜の両側で連続して潅流される。多孔性膜の第２の表面に適用される剪断力は生体内で生じる肝類洞を介した流れを模倣する。剪断率は好適には、約０．１ダイン／ｃｍ２〜約３．０ダイン／ｃｍ２、約０．２ダイン／ｃｍ２〜約２．５ダイン／ｃｍ２、約０．３ダイン／ｃｍ２〜約１．０ダイン／ｃｍ２または約０．４ダイン／ｃｍ２〜約０．８ダイン／ｃｍ２である。たとえば、剪断率は約０．６ダイン／ｃｍ２であることができる。或いは、剪断率は約２．０ダイン／ｃｍ２であることができる。
【０３８０】
試験管内の脂肪肝モデルでは、１以上の因子が培養培地に存在する。これら１以上の因子は、剪断力のもとである時間試験管内で脂肪肝疾患の模倣を維持することが可能である濃度で培地に加えられ、同じ濃度の因子は、剪断力の非存在下ではその時間脂肪肝疾患の模倣を維持することが不可能である。因子は、たとえば、インスリン、グルコースまたはそれらの組み合わせを含んでもよい。グルコースは好適には、約１０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１２ｍＭ〜約２０ｍＭ、または約１４ｍＭ〜約１８ｍＭ、たとえば、約１７．５ｍＭの濃度で培養培地に存在する。インスリンは好適には、約１μＭ〜約３μＭ、約１．５μＭ〜約２．５μＭ、または約１．８μＭ〜約２．２μＭ、たとえば、約２μＭの濃度で培養培地に存在する。１以上の因子は好適には剪断力の適用の前にまたはそれと同時に培養培地に添加される。
【０３８１】
１以上の因子の濃度は好適には試験管内での脂肪肝疾患の模倣を少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも３０日間、またはそれ以上維持することが可能である。
【０３８２】
脂肪肝疾患を模倣することはいくつかの方法によって評価することができる。一般に、剪断力の適用の非存在下での肝細胞または非実質肝細胞または培養培地における脂肪肝疾患のマーカーのレベルに比べて剪断力の適用の際の肝細胞または非実質肝細胞または培養培地における脂肪肝疾患のマーカーのレベルの変化は、脂肪肝疾患の模倣を裏付ける。たとえば、脂肪肝疾患の模倣は、脂肪肝疾患の状態に関与する遺伝子（たとえば、肝細胞における、代謝の及びインスリン／グルコース／脂質の経路の遺伝子）の発現について肝細胞または非実質肝細胞を調べること；脂質の蓄積について肝細胞を調べること（たとえば、肝細胞にてトリグリセリドのレベルを測定すること、または脂肪滴を視覚化すること）；分化した機能における変化について肝細胞または非実質肝細胞を調べること（たとえば、肝細胞にて尿素及びアルブミンの分泌を測定すること）；代謝活性における変化について肝細胞または非実質肝細胞を調べること（たとえば、肝細胞にてチトクロームｐ４５０アッセイを用いて）、または形態変化について肝細胞または非実質肝細胞を調べることによって評価することができる。脂肪肝の変化に対する後遺症は、肝細胞の酸化状態における変化及び取り囲んでいる細胞外マトリクスの組成と量における変化を測定することによって評価することもできる。
【０３８３】
ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された方法は以下の実施例１２〜１４によってさらに説明される。
【０３８４】
定義
本明細書で記載される本発明の目的では、「血行動態」という用語は、当該の腫瘍または組織にて生体内の血流を模倣する血流を意味する。たとえば、腫瘍の微細血管における血流の場合、加速度／減速度、流れ反転、前方基本流等は動脈の血行動態の流れを特徴づける幾つかのパラメータである。たとえば、肝臓のようないくつかの組織では、一定の血流を用いて生体内での血行動態を特徴付けてもよい。
【０３８５】
「対象」という用語は動物（たとえば、遺伝子操作された動物またはヒト）を意味する。動物には、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、霊長類、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、鳥類または魚類、または通常医学研究で使用される任意の動物を挙げることができる。
【０３８６】
本発明を詳細に記載してきたが、添付のクレームにて定義される本発明の範囲を逸脱することなく改変及び変化が可能であることは明らかであろう。
【実施例】
【０３８７】
以下の非限定の実施例を提供して本発明をさらに説明する。
【０３８８】
実施例１：播く方法及び培養方法
播くのに使用した多孔性膜は、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ細胞培養インサートの多孔性膜（Ｃｏｒｎｉｎｇで特注のポリカーボネート、１０μｍまたは１８μｍの膜厚及び０．４μｍの孔径、７５ｍｍのインサート直径）であった。細胞を播くためのインサートを調製するために多孔性膜の両面をゼラチン（０．１４％の無菌水溶液）で被覆した。多孔性膜は培養にて細胞型を分離するが、膜の孔を介して細胞／細胞の相互作用が生じるのを可能にする。
【０３８９】
以下の細胞型を使用した：ヒト線維芽細胞（Ｈｓ８８８Ｌｕ肺線維芽細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）ＣＣＬ−２１１）、ｄｔｕｍｏｒ細胞（Ａ５４９ヒト非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍細胞、ＡＴＣＣ  ＣＬ−１８５）、及びヒト皮膚微細血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣａｄ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ｃ−０１１−５Ｃ）。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍＬのペニシリン（Ｐ），１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌ−ｇｌｕｔ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＮａＰ）、１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ，ＨｙＣｌｏｎｅ  ＳＨ３０２３８．０１１）及び４．５ｇ／ＬのＤ−グルコースを含有するＤＭＥＭベース（フェノールレッドを含まない）にてこれら細胞株のそれぞれを維持し、継代し、播いた。
【０３９０】
３．０×１０３個／ｃｍ２の播種密度で細胞培養インサートの多孔性膜の下面上にヒト線維芽細胞を播き、３７℃で５％ＣＯ２の加湿チャンバーにて少なくとも２時間接着させた。
【０３９１】
三者混合培養を生成するために、二次多孔性膜を７５ｍｍのインサート（ＴＲＡＮＳＷＥＬＬポリカーボネート、Ｃｏｒｎｉｎｇで特注のポリカーボネート、１０μｍまたは１８μｍの膜厚及び０．４μｍの孔径）から切り出し、１．０ｍＬのコラーゲン溶液（１×ＰＢＳ中２．０ｍｇ／ｍＬのラット尾のコラーゲン、ｐＨ７．４）を含有する１００ｍｍディッシュに膜を浸漬し、膜の両面を濡らし、過剰のコラーゲン溶液を膜から落とすことによってコラーゲン溶液にて事前に濡らした。細胞培養インサートの多孔性膜の下面上に播いた線維芽細胞の上に二次膜を置き、３７℃で５％ＣＯ２の加湿チャンバーにて１時間接着させ、コラーゲンを固化させた。間質線維芽細胞と腫瘍細胞を分離する二次膜は以下で記載されるＲＮＡｓｅｑトランスクリプトミクスを行うのに必要だったが、たとえば、図５〜８で描かれた構造で示されるように省略することができる。
【０３９２】
３つの播種条件を使用した：（１）外から添加されたＥＣＭを実質的に含まない播種構成（本明細書での実施例及び図面では「コラーゲンなし」、「ＮＣ」、「ＥＣＭなし」または「マトリクスなし」と呼ばれる）；（２）外から添加されたコラーゲンの層の上に腫瘍細胞が播かれる播種構成（本明細書での実施例及び図面では「コラーゲン層」または「ＣＬ」と呼ばれる）；及び（３）外から添加されたコラーゲンの層の上に腫瘍細胞が播かれ、コラーゲンが実質的に腫瘍細胞を取り囲むようにコラーゲンの追加の層が播かれた腫瘍細胞の上に播かれる播種構成（本明細書での実施例及び図面では「コラーゲンサンドイッチ」または「ＣＳ」と呼ばれる）。
【０３９３】
播種構成が外来性のＥＣＭを実質的に含まない実験では、腫瘍細胞が対向面の二次膜（すなわち、線維芽細胞と接触しない面）に直接播かれた。この構成では、細胞培養容器に添加された外来性のＥＣＭのみが、二次膜が浸漬されたコラーゲンだった。
【０３９４】
コラーゲン層またはコラーゲンサンドイッチが所望であった実験では、９００μＬのコラーゲン溶液（１×ＰＢＳ中２．０ｍｇ／ｍＬのラット尾のコラーゲン、ｐＨ７．４）を均一に適用して二次膜の対向面（すなわち、線維芽細胞と接触しない面）を事前に濡らし、３７℃で５％ＣＯ２の加湿チャンバーにて１時間接着させ、コラーゲンを固化させた。これによっておよそ２００ミクロンの厚さのコラーゲン層を生成した。コラーゲンのこの濃度は腫瘍の微細環境の剛性を模倣する剛性を伴ったゲルを作出する。
【０３９５】
次いで、３．０×１０３個／ｃｍ２の播種密度で二次膜の表面のコラーゲン層上にヒト腫瘍細胞を播き、３７℃で５％ＣＯ２の加湿チャンバーにて少なくとも２時間接着させた。細胞が接着した後、細胞培養インサートを反転させ、１５ｍＬのＤＭＥＭベース（フェノールレッドを含まない）＋１０％ＦＢＳ、Ｐ／Ｓ、Ｌ−ｇｌｕｔ、ＮａＰ、ＮＥＡＡ及びＤ−グルコースを含有する１００ｍｍ培養ディッシュに入れた（９ｍＬの培養培地が下容量部にあり、６ｍＬの培養培地が下容量部にあった）。
【０３９６】
コラーゲンサンドイッチが所望である場合（すなわち、細胞培養インサートの多孔性膜の下面上に播かれた細胞をコラーゲンが実質的に取り囲む、播く条件）、追加の９００μＬのコラーゲン溶液（１×ＰＢＳ中２．０ｍｇ／ｍＬのラット尾のコラーゲン、ｐＨ７．４）を腫瘍細胞の上に均一に適用して３７℃で５％ＣＯ２の加湿チャンバーにて１時間固化させた。これによって、細胞培養インサートの多孔性膜の下面上に播かれた細胞の上にコラーゲンのおよそ２００ミクロンの厚さの層を生成した。コラーゲンのこの上の層が固化した後、細胞培養インサートを反転させ、１５ｍＬのＤＭＥＭベース（フェノールレッドを含まない）＋１０％ＦＢＳ、Ｐ／Ｓ、Ｌ−ｇｌｕｔ、ＮａＰ、ＮＥＡＡ及びＤ−グルコースを含有する１００ｍｍ培養ディッシュに入れた（９ｍＬの培養培地が下容量部にあり、６ｍＬの培養培地が下容量部にあった）。
【０３９７】
あらゆる構成において、線維芽細胞と腫瘍細胞の播種に続いて、３７℃で５％ＣＯ２の加湿チャンバーにて細胞を４８時間増殖させた。次いで５.０×１０４個／ｃｍ２の播種密度で細胞培養インサートの多孔性膜の上面にヒトの内皮細胞を播き、静置条件下で３７℃で５％ＣＯ２の加湿チャンバーにて２４時間接着させた。得られた三者混合培養の播種構成を図９で説明する。
【０３９８】
内皮細胞が接着した後、実験的な血行動態と輸送のための三者混合培養を調製した。腫瘍細胞と、線維芽細胞と、内皮細胞との三者混合培養は、静置条件下（静置制御について）で維持され、または円錐平板装置に入れられ、円錐は上容量部に下げられ、円錐を回転させて内皮細胞に剪断力を適用した。剪断に供された培養では、輸送は、図９にて示すように、上容量部及び下容量部における注入口１７及び排出口１９を介して細胞培養ディッシュの上容量部及び下容量部双方の内外に細胞培養培地を潅流することによって系において制御された。薬剤が使用される実験では、薬剤は、血管区画を表す上容量部に添加された。
【０３９９】
良性腫瘍及び悪性腫瘍双方に由来する組織検体とのカラードップラー超音波検査の相関は、一定の流量が悪性肺癌の真の血管新生をさらに代表することを示唆している（Ｈｓｕら，２００７；Ｈｓｕら．１９９６；Ｇｏｒｇら．２００３）。末梢気管支動脈の血流のさらなる特徴である単相低インピーダンスの波形を三者混合培養への適用に選択した。この領域の血流は図４で説明するように、遅く、有意な収縮／拡張の変化を欠く。対比のために、肺動脈の近くの肺病変に由来する剪断応力パターンを図４で説明する。
【０４００】
実施例２：試験管内の腫瘍微細環境三者混合培養にて培養された細胞の形態
上述のように且つ図９で説明したように調製された三者混合培養物を血行動態剪断応力の７日後に室温（ＲＴ）にて２０分間４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定し、カルシウムとマグネシウムを伴ったリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、処理されるまで４℃で保存した。試料を０．１％Ｔｒｉｔｏｎで２０分間透過化し、室温にて１時間、Ｆ−アクチンを染色するＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ４８８（蛍光染料）標識したファロイジン（１：１００；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＴＯ−ＰＲＯ−３染色（１：２０００；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＦＬＵＯＲＯＭＯＵＮＴ  Ｇ（水性検体培地、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて試料をカバーグラスの間で標本にした。２０倍の油浸対物レンズを用いたＮｉｋｏｎ  ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ共焦点顕微鏡によって画像を撮った。
【０４０１】
共焦点顕微鏡像を図１３にて提供する。図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃは、コラーゲンサンドイッチ播種条件で播いたヒトの皮膚微細血管内皮細胞（図１３Ａ）、ヒト線維芽細胞（図１３Ｂ）及びヒトのＡ５４９ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞（図１３Ｃ）を示す。図１３Ｄ、１３Ｅ及び１３Ｆは、３つの異なる播種条件：ＥＣＭなし（図１３Ｄ）、コラーゲン層（図１３Ｅ）及びコラーゲンサンドイッチ（図１３Ｆ）のもとでのＡ５４９腫瘍細胞の形態を示す。コラーゲンサンドイッチにおけるＡ５４９細胞の表現型は回転楕円体であったのに対してＥＣＭなしの条件ではＡ５４９細胞は互いに積み重なるが、球形を形成しない。
【０４０２】
実施例３：試験管内の腫瘍微細環境三者混合培養における腫瘍細胞の増殖
腫瘍の毛細血管血行動態に暴露した場合の複数のマトリクス条件でヒトの肺癌細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）の増殖速度を測定した。細胞は図９で示したように播いた。３×１０３個／ｃｍ２の当初の播種密度で細胞培養インサートの多孔性膜上にＨｓ８８８Ｌｕヒト肺線維芽細胞を播いた。実施例１にて上述のように二次膜を適用し、次いで３×１０３個／ｃｍ２の当初密度で実施例１にて上述のように３つのマトリクス条件：（１）二次膜に直接播かれた細胞（マトリクスなし）；（２）コラーゲンの単層上に播かれた細胞（コラーゲン層）；または（３）コラーゲンサンドイッチの播かれた細胞；のそれぞれにてＡ５４９腫瘍細胞を播いた。静置環境における４８時間のインキュベートの後、５×１０４個／ｃｍ２の当初播種密度で細胞培養インサートの多孔性膜の上面上に皮膚微細血管の内皮細胞を播いた。静置条件下で、または血行動態の流れと輸送に供して、培養物を７日まで培養した。静置培養については、製造元（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の指示書に従ってＣＹＱＵＡＮＴ細胞増殖アッセイキットを用いて、播種の時（０日目）及び２、４及び７日目に細胞の数を測定した。血行動態の流れと輸送に供した培養については、培養物を血行動態の流れと輸送に供した日（（０日目）及び血行動態の流れと輸送の２、４及び７日目に細胞の数を測定した。データを図１４Ａ及び１４Ｃに示し、それは３つのマトリクス条件のそれぞれについて２つ組培養物に由来する細胞の平均数として提示される。各条件について、マトリクスなしで且つ血行動態の流れと輸送の非存在下でのプラスチック二次元（２Ｄ）組織培養ディッシュで増殖したＡ５４９の増殖速度と増殖速度を比較した。
【０４０３】
図１４Ａに示すように、血行動態の流れは、静置２Ｄ培養に比べてコラーゲンサンドイッチにおける三者混合培養で増殖したＡ５４９の増殖速度を減衰させた。静置２Ｄ培養で増殖する細胞の倍加時間と、細胞株に由来する異種移植腫瘍におけるそれである生体内腫瘍の倍加時間（Ｃｉｆｏｎｅ，１９８２）または患者における腫瘍増殖の速度との間に長く続く食い違いがある。静置２Ｄ培養で増殖するＡ５４９ＮＳＣＬＣ細胞の増殖速度と血行動態条件に供した三者混合培養を比較した場合、血行動態条件に供した三者混合培養における腫瘍細胞の増殖は静置２Ｄ系での増殖に比べて低下した（図１４Ａ）。静置２Ｄ条件におけるＡ５４９細胞の増殖速度は血行動態条件に供した三者混合培養よりもフェーズＩＩでは８倍速かった。血行動態条件に供した三者混合培養におけるＡ５４９細胞の増殖速度はＡ５４９の異種移植の速度を依然上回る（Ｂａｓｕら，２０１１；Ｃｈｏｕら，２００８；Ｌｉら．２０１３）が、血行動態条件に供した三者混合培養における増殖速度は静置２Ｄ培養よりも生理的速度に近かった。１４Ｂ。図１４Ｂは、静置二次元培養（「静置」）、血行動態条件に供した三者混合培養（「試験管内の腫瘍微細環境」）及び異種移植にて増殖したＡ５４９細胞の間での増殖速度における質的な差異を示す。図１４Ｂにおける暗く陰影をつけた球形は出発腫瘍サイズを表し、明るく陰影をつけた領域及び矢印は時間をかけた腫瘍の増殖を表す。
【０４０４】
図１４Ｃは、増殖の低下が調べた３つのマトリクス条件すべてで起きたことを説明する。従って、細胞外マトリクスではなく血行動態の流れ及び輸送が増殖速度に影響を与える推進寄与因子であると思われる。
【０４０５】
実施例４：内皮細胞の細胞密度及び単層の完全性の評価
多孔性膜上の内皮細胞を固定し、内皮接合タンパク質ＶＥカドヘリンについて免疫染色し、共焦点顕微鏡によって単層を調べることによって、実施例１にて上述した方法に従って培養された内皮細胞の内皮細胞密度及び単層の完全性を評価することができる。
【０４０６】
実施例５：腫瘍細胞の形態的評価
実施例１にて上述の方法を用いて培養された腫瘍細胞の形態を評価するために、Ｅ−カドヘリンについて及び蛍光標識したファロイジンを用いてアクチンについて多孔性膜上の腫瘍細胞を免疫染色することによって腫瘍細胞の形態を確定することができる。多孔性膜の孔を介した侵襲性構造（浸潤突起）の拡張を定量するために、培養物を固定し、Ｅ−カドヘリン（腫瘍細胞について）及びＶＥ−カドヘリン（内皮細胞について）について免疫染色し、多孔性膜の断面を共焦点顕微鏡によって分析することができる。
【０４０７】
実施例６：内皮細胞単層の透過性
生体内の腫瘍／脈管構造の領域では、腫瘍細胞からの多数の増殖因子の分泌のために、血管透過性の上昇が生じる（Ｍｕｋａｉｄａら，２０１２；Ｂｒａｄｆｏｒｄら，２０１３）。実施例１にて上述の三者混合培養系における内皮細胞のバリア機能を腫瘍細胞が変えることを実証するために、透過性アッセイを行って内皮単層の透過性の上昇を測定した。このアッセイでは、西洋ワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を上容量部に加え、腫瘍細胞の存在下及び非存在下にてＨＲＰの蓄積を、経時測定した。
【０４０８】
実施例１で記載されたように、且つ図９で説明したように腫瘍細胞／線維芽細胞／内皮細胞の共培養を確立した後、既知の質量の低分子量ＨＲＰを上容量部に加え、拡散させた。１５〜６０分間のインキュベート時間に続いて、培地試料を下容量部から取り出した。この過程の間、内皮細胞に対する剪断応力の適用を継続した。内皮細胞、多孔性膜、線維芽細胞及びＡ５４９腫瘍細胞を介して拡散したＨＲＰをグワイアコール酸化によって検出した。剪断応力に供された（腫瘍細胞なしで、多孔性膜上で増殖させた）内皮細胞単独培養を対照として並行してアッセイした。
【０４０９】
このアッセイの結果を図１５にて提供するが、それはＮＳＣＬＣ  Ａ５４９細胞が内皮細胞の透過性を高めることを実証している。ＮＳＣＬＣ  Ａ５４９細胞の非存在及び存在におけるＨＲＰの相対的な蓄積を示す。図１５では、「腫瘍細胞なし」が内皮細胞の単独培養を示し、「腫瘍細胞」が腫瘍細胞／線維芽細胞／内皮細胞の共培養を示す。
【０４１０】
実施例７：試験管内の腫瘍微細環境の三者混合培養における腫瘍細胞のトランスクリプトーム特性
次世代のＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）を用いて、３つの異なる条件下：（１）静置二次元培養にて；（２）胸腺欠損ヌードマウスの皮下で増殖させた異種移植片にて；及び（３）実施例１で上述のように、且つ血行動態条件に供して生成された三者混合培養にて増殖させたＡ５４９腫瘍細胞のトランスクリプトームを比較した。血行動態条件下で２、４及び７日間増殖させた腫瘍細胞からＲＮＡを単離した。この比較は、血行動態条件に供した三者混合培養のトランスクリプトームは、試験管内の静置２Ｄ培養よりも生体内異種移植にさらに密接に類似することを示した。
【０４１１】
３つの異なるマトリクス構成のもとで、実施例１で上述されたような且つ図９で説明されたような三者混合培養にて増殖させたＡ５４９  ＮＳＣＬＣ細胞に由来する逆行鎖ライブラリ調製物を用いてＲＮＡｓｅｑデータを生成した。試料ごとに、およそ２００万の５０ｂｐ末端の読み取りを配列決定した。Ｂｏｗｔｉｅアライナ（Ｌａｎｇｍｅａｄら．２００９）を用いてヒトゲノムのｈｇ１９アセンブリにおける既知のアイソフォームのカリフォルニア大学サンタクルーズ校（ＵＣＳＣ）の注釈に対して生の配列読み取りを並べた。ｅＸｐｒｅｓｓツール（Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＰａｃｈｔｅｒ，２０１２）を用いてアイソフォーム当たりの読み取りカウントの推定値を計算した。各遺伝子についてのアイソフォーム全体にわたる推定されたカウントを合計することによって遺伝子をもとにしたカウントを生成した。実験全体にわたって低いカウントの遺伝子は下流の解析では考慮しなかった。具体的には、５試料より少ない試料での１００万当たり少なくとも２カウントのレベルで検出される遺伝子は捨てた。低いシグナルの遺伝子をフィルターにかけた後、Ｍ値のトリム平均（ＴＭＭ）法（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及びＯｓｈｌａｃｋ，２０１０）を用いてライブラリのサイズを正規化した。
【０４１２】
異種移植試料にてマウスＲＮＡからヒトＲＮＡを区別するために、我々はＲａｓｋａｔｏｖら，２０１２によって採用されたものに類似する戦略を用いた。生の読み取りをヒトｈｇ１９及びマウスｍｍ１０のトランスクリプトームに対して同時に並べた。次いでｅＸｐｒｅｓｓを用いて各転写物（ヒト及びマウス）について配列比較を定量した。マウスの転写物について計算されたｅＸｐｒｅｓｓ推定値はすべて捨て、ヒト転写物についての推定値を下流の解析に使用した。
【０４１３】
ｅｄｇｅＲ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，２０１０）を用いて、フィルターにかけ且つＴＭＭで正規化された存在量推定値にて遺伝子に基づいた差次的発現解析を行った。ＮＳＣＬＣの遺伝子セットは、京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）データベース（Ｏｇａｔａら、１９９９）に由来する。遺伝子セットは、ＡＫＴ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＡＳＳＦ１、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＥＭＬ４、ＧＲＢ２、ＨＲＡＳ、ＡＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＤＰＫ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＬＣＧ１、ＰＬＣＧ２、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＧ、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＲＡＦ１、ＲＡＲＢ、ＣＣＮＤ１、ＲＸＲＡ、ＲＸＲＢ、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＢＲＡＦ、ＴＧＦＡ、ＲＡＳＳＦ５、ＰＩＫ３Ｒ３、ＦＯＸＯ３、ＢＡＤ、ＣＡＳＰ９、ＲＢ１、ＳＴＫ４から成る。
【０４１４】
ＲＮＡｓｅｑのトランスクリプトームのプロファイリングを図１６〜１８で示す。図１６は、シグナルの閾値に達する１４，１５９遺伝子すべての遺伝子を中心に据えたｌｏｇ２発現値に基づく試料のクラスター形成を示す系統樹（図１６Ａ）及び色分け地図（図１６Ｂ）を提供する。上述のように生成され、且つ血行動態条件に供された三者混合培養にて増殖させたＡ５４９細胞はマトリクス条件に基づいてクラスター形成した。「ＣＬ」＝コラーゲン層、「ＣＳ」＝コラーゲンサンドイッチ、ＮＣ＝コラーゲンなし。異種移植試料が、７日目のコラーゲンなしの条件を除いて別々にクラスター形成したということは、コラーゲンの非存在下での装置における時間の増加は他の培養条件に比べて異種移植組織のトランスクリプトーム特性をさらに忠実に繰り返すことを示唆している。平均連結基準と、距離測定基準としてのＳｐｅａｒｍａｎの順位相関とを用いて階層的クラスター形成を行った。
【０４１５】
図１７は、５％の偽発見率（ＦＤＲ）で異種移植とプラスチック条件との間で差次的に発現される７９３５遺伝子のｌｏｇ２の倍率変化に基づいた試料のクラスター形成を示す系統樹（図１７Ａ）及び色分け地図（図１７Ｂ）を提供する。異種移植試料は、外来性のコラーゲンを含有しない血行動態条件に供された三者混合培養に由来する試料とクラスター形成する。このことは、異種移植と静置二次元培養との間でのトランスクリプトームの差異が外来性コラーゲンの非存在下でさらに上手く再現されることを示す。平均連結基準と、距離測定基準としてのＳｐｅａｒｍａｎの順位相関とを用いて階層的クラスター形成を行った。「ＣＳ」＝コラーゲンサンドイッチ、「ＮＣ」＝コラーゲンなし、「プラスチック」＝静置２Ｄ培養。
【０４１６】
図１８は、ＫＥＧＧデータベースにて「非小細胞肺癌」で注釈を付けられるこのデータセットにおける４８遺伝子のｌｏｇ２の倍率変化（静置２Ｄ培養（「プラスチック」）に対する馴化）に基づいた試料のクラスター形成を示す系統樹（図１８Ａ）及び色分け地図（図１８Ｂ）を提供する。異種移植試料は、コラーゲンを含有しない血行動態条件に供された三者混合培養に由来する試料とクラスター形成する。このことは、疾患の表現型に高度に関連する遺伝子の転写反応がコラーゲンの存在下よりもコラーゲンの非存在下で異種移植にさらに類似することを示している。平均連結基準と、距離測定基準としてのＳｐｅａｒｍａｎの順位相関とを用いて階層的クラスター形成を行った。ＣＳ＝コラーゲンサンドイッチ、ＮＣ＝コラーゲンなし、「プラスチック」＝静置２Ｄ培養。その発現が色分け地図における列で示される、データセットにおける４８の遺伝子は上の列から下の列に向かって、ＥＧＦ、ＲＸＲＢ、ＣＡＳＰ９、ＣＤＫ４、ＲＡＳＳＦ５、ＰＲＫＣＡ、ＦＯＸＯ３、ＲＡＲＢ、ＰＩＫ３Ｒ２、ＭＡＰＫ３、ＲＸＲＡ、ＡＫＴ２、ＧＲＢ２、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＡＫＴ１、ＲＡＳＳＦ１、ＨＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＭＬ４、ＳＴＫ４、ＮＲＡＳ、ＭＡＰＫ１、ＲＡＦ１、ＭＡＰ２Ｋ１、ＰＤＰＫ１、ＰＩＫ３ＣＢ、ＴＧＦＡ、ＢＡＤ、ＰＬＣＧ２、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ１、ＰＲＫＣＧ、ＥＧＦＲ、ＣＤＫ６、ＰＬＣＧ１、ＥＲＢＢ２、ＰＩＫ３Ｒ３、ＳＯＳ２、ＰＩＫ３Ｒ１、ＫＲＡＳ、ＳＯＳ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＣＮＤ１、ＰＩＫ３ＣＤ、Ｅ２Ｆ３、ＡＫＴ３、及びＲＢ１である。
【０４１７】
実施例８：内皮細胞及び腫瘍細胞の分子活性のプロファイリング
生体内の腫瘍／脈管構造の領域では、腫瘍細胞の増殖及び浸潤は腫瘍細胞に極めて近接した内皮細胞によって調節される。実施例１に記載された方法に従って培養された内皮細胞及び腫瘍細胞双方の定性的な及び定量的な遺伝子発現及びサイトカイン分泌のプロファイルを生成することができる。そのようなアッセイを用いて血管形成因子及び腫瘍形成因子の発現をモニターし、そのようなアッセイは、たとえば、次世代のｍＲＮＡ配列決定及びサイトカインや増殖因子の分泌プロファイリングを用いて測定されるような腫瘍の分子活性のマーカーを増強することによって、腫瘍に由来する血行動態の流れのもとで培養された内皮細胞が腫瘍細胞の分子署名を変えることを実証する。
【０４１８】
上記実施例１で記載されたように三者混合培養を確立した後、解析のために内皮細胞及び腫瘍細胞からｍＲＮＡを採取することができる。表１は、生体内の腫瘍微細環境で調節されることが知られている内皮細胞及び腫瘍細胞双方における遺伝子を載せている。遺伝子のこのパネルは実施例１で記載された三者混合培養の当初の分子評価として役立って、共培養系における異型の細胞／細胞の情報伝達及び血行動態の流れと輸送が腫瘍微細環境の分子活性に影響を与えることを実証する。表１（右）はまた、ＶＥＧＦのような血管形成因子や血管タンパク質の定性的な及び定量的な解析を行うことが可能である多重化構築基盤（ＭＡＧＰＩＸ）を用いてプロファイリングされる一連のサイトカイン及び増殖因子も載せている。系の設計の故に、培地は解析用に別々に内皮細胞層及び腫瘍細胞層からリアルタイムで回収することができる。
【表１】
0006684706.tif 000002
【０４１９】
最少限で５回の反復によるベースラインの分子活性を再現した後、実施例１にて上述のように培養された内皮細胞及び腫瘍細胞にて次世代の配列決定に基づいたｍＲＮＡのトランスクリプトミクス（ＲＮＡｓｅｑ）を行い、以下の対照：（１）静置共培養系、（２）腫瘍細胞の非存在下での腫瘍に由来する剪断応力に供された内皮細胞；（３）単独培養での腫瘍細胞及び（４）生体内の腫瘍と比較することができる。２７，０００超の臨床転帰、７，８００超の経路／薬剤の反応、及び癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）に由来する１１，０００超の試料を含む多種多様なヒト腫瘍試料から得られた７３，０００超の癌発現プロファイルに対してこれらの結果を比較し、対照させる。これによって共培養の腫瘍微細環境系の偏りのない評価が提供される。
【０４２０】
実施例９：試験管内の腫瘍微細環境の三者混合培養における抗癌剤の試験
実施例１で上述し、且つ図９にて示されたように生成された三者混合培養にて増殖させたＡ５４９腫瘍細胞に対する抗癌剤の効果を評価した。以下の薬剤：ＮＳＣＬＣに対する最先端の化学療法剤であるシスプラチン（Ｒｏｓｓｉら，２０１２；国立癌研究所，非小細胞肺癌の治療（ＰＤＱ（登録商標）））；及びＮＳＣＬＣ及び他の癌に対する臨床試験中であるＭＥＫ（ＡＺＤ６２４４／セルメチニブ）及びＡＫＴ（ＭＫ−２２０６）の２つの実験的小分子アロステリック阻害剤（Ｌｅｉｊｅｎら，２０１１；国立癌研究所，ＡＤＺ６２４４の無作為フェーズＩＩ試験；Ｙａｐら，２０１１；国立癌研究所，進行性非小細胞肺癌患者の治療におけるＭＫ２２０６及びエルロチニブ塩酸塩）を選択した。調べた３つの薬剤のそれぞれについて、及び血行動態条件に供した三者混合培養にて臨床的に関連するヒト患者のＣｍａｘで増殖阻害が起きた。
【０４２１】
静置２Ｄ条件下でのＡ５４９腫瘍細胞の増殖についてのこれら３つの薬剤のＩＣ５０は癌患者で使用される臨床的に関連する用量に近似しない。シスプラチンについては、生体内でのＣｍａｘは３μＭなので、ＮＳＣＬＣ患者が受け取る臨床用量を表す（Ｕｒｉｅｎら，２００５）。しかしながら、公開された結果による静置２Ｄ培養におけるＡ５４９細胞についてのシスプラチンのＩＣ５０は６μＭから６０μＭ以上に及ぶ（Ａｎｄｒｉａｎｉら，２００６；Ｚｈａｎｇら，２０１３；Ｚｈａｎｇら，２００３；Ｂａｒｒら，２０１３）。従って、シスプラチンは、ＮＳＣＬＣ患者にて生体内で達成可能であるものより２倍から２０倍高い濃度にて試験管内で日常的に使用される。同様に、静置２Ｄ培養におけるＡＺＤ６２４４／セルメチニブ及びＭＫ２２０６についてのＡ５４９のＩＣ５０は患者にて達成される用量よりも有意に高い（Ｙｅｈら，２００７；Ｍｅｎｇら，２０１０）。ＡＺＤ６２４４／セルメチニブについては、Ｃｍａｘは１．４μＭであり、静置２ＤのＩＣ５０は５μＭであり、３．５倍高くなる。ＭＫ２２０６については、Ｃｍａｘは１６０ｎＭであり、静置２ＤのＩＣ５０は３μＭであり、ほぼ１９倍高くなる。Ｃｍａｘ及び静置２ＤのＩＣ５０におけるこれらの差異は静置２Ｄ条件における作業に直面する主な障壁を説明するのに役立ち；生理的ではない薬剤濃度が生物効果には必要であることが多い。
【０４２２】
表２は、シスプラチン、ＭＫ２２０６及びＡＺＤ６４２２についてのヒト及びマウスの試験管内Ｃｍａｘ及び静置培養でのＩＣ５０、並びに血行動態条件に供した三者混合培養で調べた薬剤の濃度を要約する。
【表２】
0006684706.tif 000003
【０４２３】
表２に載せたＡ５４９細胞株についてのシスプラチン、ＭＫ２２０６及びＡＺＤ６２４４／セルメチニブのＩＣ５０濃度は上述のように文献から引用し、それぞれ６μＭ超、３μＭ及び５μＭであると推定された。マウスにおける最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）は査読文献における有効性試験から引用された薬物力学データを用いて推定した。シスプラチンについては、定常状態の血漿Ｃｍａｘは１０μＭ超であると決定された（Ｊｏｈｎｓｓｏｎら，１９９５）。ＭＫ２２０６については、定常状態の血漿Ｃｍａｘは５４０ｎＭであると測定された（Ｐｉｏｖａｎら，２０１３）。ＡＺＤ６２４４／セルメチニブについては、定常状態の血漿Ｃｍａｘは５．５μＭであると決定された（Ｄｅｎｔｏｎ及びＧｕｓｔａｆｓｏｎ，２０１１）。ヒトにおける最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）は確立された治療投与パラダイムを用いた臨床試験の薬物力学データによって推定した。シスプラチンについては、定常状態の血漿Ｃｍａｘは３μＭであると決定された（Ｓａｌａｓら，２００６；Ｕｒｉｅｎら，２００５）。ＭＫ２２０６については、定常状態の血漿Ｃｍａｘは１６０ｎＭであると決定された（Ｈｕｄｉｓら，２０１３；Ｙａｐら，２０１１）。ＡＺＤ６２４４／セルメチニブについては、定常状態の血漿Ｃｍａｘは１．４μＭであると決定された（Ａｄｊｅｉら，２０１１；Ｏ’Ｎｅｉｌら，２０１１）。
【０４２４】
上述のヒトＣｍａｘ用量を用いたビヒクル対照（「Ｖｅｈ」）、シスプラチン、ＭＫ２２０６及びＡＺＤ６２４４に対する応答にてヒト肺癌細胞株Ａ５４９の増殖速度を決定した。実施例１で上に述べ、図９で示したように、外から添加したＥＣＭの非存在下で且つ腫瘍毛細血管血行動態に供した三者混合培養を調製した。ビヒクル対照または薬剤を内皮細胞層のための流入培地に加え、上容量部に潅流させた。血行動態の流れ及び輸送のもとで７日間まで薬剤の存在下または非存在下で三者混合培養を維持した。製造元（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）の指示書に従ってＱＵＡＮＴ−ＩＴ  ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ  ｄｓＤＮＡアッセイキットを用いて７日目に細胞数を測定した。データは２つ組の細胞の平均数として図１９Ａ及び１９Ｂにて提示する。
【０４２５】
図１９Ａはビヒクル対照（「Ｖｅｈ」）、シスプラチン、ＭＫ２２０６またはＡＺＤ６２４４で処理したＡ５４９腫瘍細胞の細胞数を示す。図１９Ｂはビヒクル対照（「Ｖｅｈ」）、シスプラチン、ＭＫ２２０６またはＡＺＤ６２４４で処理したＡ５４９腫瘍細胞の相対的な細胞増殖を示す。シスプラチンはＡ５４９の増殖を４８％阻害し、ＭＫ２２０６は４４％阻害し、ＡＺＤ６４２２／セルメチニブは７８％阻害した。これらのデータは、血行動態条件に供した三者混合培養における腫瘍細胞の増殖が治療上関連する濃度にて確立された化学療法剤（シスプラチン）及び実験的な小分子阻害剤（ＭＫ２２０６、ＡＺＤ６４２２）の双方に応答することを示している。
【０４２６】
まとめると、これらのデータは、血行動態条件に供した三者混合培養における腫瘍細胞の増殖がヒト患者の生理的な用量にて確立された化学療法剤及び実験的な小分子阻害剤の双方に応答することを示している。表２で示すように、シスプラチン、ＡＺＤ６２４４／セルメチニブ及びＭＫ２２０６についての治療用量でのマウスのＣｍａｘがヒト患者のＣｍａｘよりも高いことに気付くことが重要である。マウスでは、ＡＺＤ６４２２／セルメチニブのＣｍａｘは５．５μＭであり（Ｍｅｎｇら，２０１０，Ｃｈｕｎｇら，２００９）、それは静置２ＤのＩＣ５０と同等である。ＭＫ２２０６については、マウスのＣｍａｘは５４０ｎＭであり（Ｍｅｎｇら，２０１０）、それはヒト患者のＣｍａｘよりも５倍高い。シスプラチンは１０〜１００μＭに及ぶマウスＣｍａｘを有し（Ａｎｄｒｉａｎｉら，２００６；Ｚｈａｎｇら，２００３；Ｂａｉｎら，２００７）、それはヒト患者のＣｍａｘを超過し、静置２ＤのＩＣ５０と同等またはそれより高い。従って、血行動態条件に供した培養は、生理的用量で実験薬を調べることについてマウスの異種移植試験より優れている可能性がある。
【０４２７】
実施例１０：試験管内の腫瘍微細環境の三者混合培養における抗癌剤のさらなる試験
実施例１で上述されたように生成された三者混合培養にて増殖させた腫瘍細胞、間質線維芽細胞及び／または微細血管内皮細胞に対するその効果について追加の抗癌剤を調べることができる。ヒトにおける生体内の治療Ｃｍａｘの濃度範囲の範囲内である培養培地における濃度で三者混合培養に抗癌剤を導入することができる。たとえば、抗増殖性化学療法剤であるカルボプラチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＥＧＦＲ阻害剤であるエルロチニブ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を調べることができる。これら２つの薬剤は肺癌の治療に一般的に使用され、その薬物動態は臨床試験を介して特徴がはっきりしており、それら双方は肺癌患者の生存を改善することが示されている。カルボプラチンは迅速に分裂する細胞を無差別に殺傷する従来の化学療法剤であるのに対してエルロチニブは広く毒性ではない標的化療法である。
【０４２８】
薬剤を内皮細胞のための流入培地に加え、上容量部に潅流させることができる。先ず、薬剤を２つの用量で内皮細胞に適用することができ、最高の用量はヒトで達成される生体内にＣｍａｘのレベル（たとえば、カルボプラチンについては３７μｇ／ｍＬ；エルロチニブについては１μｇ／ｍＬ）であり、１０倍低い用量は生体内の多くの固形腫瘍で見られる低い程度の薬剤浸透を模倣する。次いで広い範囲の用量を用いて各薬剤の応答プロファイルを生成する。二次元対照として、組織培養処理したディッシュ上にＡ５４９細胞を播き、各薬剤の存在下で微細血管内皮細胞に由来する馴化培地にて培養し、３日後、細胞の計数を行うことができる。三次元対照として、６穴ディッシュのウェルの底における三次元コラーゲンマトリクスにＡ５４９細胞を播き、現在の試験管内の三次元腫瘍モデルに類似する、ウェルに挿入された細胞培養インサートの多孔性膜の上面に内皮細胞を播くことができる。上記実施例で記載された評価項目を用いて抗癌剤の効果、たとえば、細胞の生存率、腫瘍細胞の浸潤、内皮細胞の透過性、ＲＴ−ＰＣＲ、ｍＲＮＡの配列決定、及びサイトカインや増殖因子のプロファイリングを評価することができる。
【０４２９】
追加の抗癌剤を同様の方法で調べることができ、用量反応曲線を生体内モデルにおける薬剤についての用量反応曲線と比較することができる。そのような薬剤には、たとえば、ＶＥＧＦ阻害剤、ベバシズマブ及びＶＥＧＦＲ阻害剤のような血管形成阻害剤が挙げられる。
【０４３０】
実施例１１：肝臓への腫瘍転移のモデル
脈管構造を介した腫瘍細胞の遠位臓器への転移は癌の死亡率の主要な原因である。その豊富な血液供給のために、肝臓は腫瘍転移の一般的な部位である。ヒトの腫瘍細胞（たとえば、Ａ５４９腫瘍細胞または膵臓腫瘍細胞）を静置２Ｄ条件下または異種移植片として実施例１にて上述された方法に従って培養する。次いで腫瘍細胞を取り出し、試験管内の肝臓モデル系、たとえば、双方のその内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載されたような試験管内の肝臓モデル系に加える。たとえば、ＵＳ２０１３／０３０９６７７及びＰＣＴ２０１３／０１５８９３９にて記載された試験管内の肝臓モデル系では、肝細胞はコラーゲンゲルに挟まれ、多孔性膜の第１の表面上に播かれる。任意で類洞内皮細胞を多孔性膜の第２の表面上に播く。追加の非実質肝細胞を任意で多孔性膜の第１または第２の表面上に播く。次いで、肝臓における生体内での血流を模倣する剪断応力を多孔性膜の第２の面上の非実質肝細胞に適用し、培養培地を上容量部及び下容量部の内外に潅流させる。図１１はそのような系の模式図を提供する。
【０４３１】
腫瘍細胞を三者混合培養、異種移植または２Ｄ静置培養から取り出し、この試験管内の肝臓系に加える。腫瘍細胞を直接、肝細胞を含有する下容量部、または類洞内皮細胞及び／または非実質肝細胞を任意で含有する上容量部に導入する。後者の場合、肝細胞を含有する下容量部への腫瘍細胞の移動を評価する。試験管内の肝臓モデルにおける腫瘍細胞の増殖も評価される。
【０４３２】
或いは、実施例１にて上述されたような腫瘍細胞と間質線維芽細胞と微細血管内皮細胞を含有する共培養系を、腫瘍モデル共培養の下容量部または上容量部から培養培地を図１２Ａ〜Ｄで示すような試験管内の肝臓モデルの下容量部または上容量部に移すのに使用される配管によって試験管内の肝臓モデル系に連結する。これによって生体内での腫瘍細胞による遠位臓器への播種を模倣する腫瘍転移のモデルを創り出す。
【０４３３】
抗癌剤の非存在下での試験管内の転移の増殖と比較して、抗癌剤の存在下での試験管内の肝臓モデルにおける試験管内の転移の増殖を測定することによって抗癌剤の有効性を評価することができる。
【０４３４】
実施例１２：生理的な試験管内の肝臓モデル
生体内で代謝表現型を、経時維持する生理的なパラメータがないことがある程度原因で、静置肝細胞培養法は試験管内と生体内の乏しい相関を伴う。生理的な血行動態及び輸送を復元することは、標準の静置肝細胞のコラーゲンゲル構成に比べて試験管内の肝細胞の表現型及び機能を保持する。
【０４３５】
生体内の肝臓循環に類似する流体の動態及び輸送を伴った細胞性の肝細胞系を再現するために、試験管内のヒトに由来する血行動態血流力への血管内皮細胞の暴露を再現することによって生体内の血管細胞表現型を再確立するのに広範に使用されている円錐平板装置に基づく技術を採用した。この技術はＵＳ７，８１１，７８２に記載されている。生体内の肝臓循環値を反映する血行動態の流れ及び輸送を適用するラットの肝臓単独培養系を設計するように技術を適合させ、改変した。装置における細胞の構成は、内皮細胞のフィルター層によって類洞血流から肝細胞の束が分離される肝小葉の生体内の微細構造に基づく。この設計は、細胞培養容器にて懸濁させた多孔性のポリカーボネート膜を使用し、初代ラット肝細胞は多孔性膜の一方の面上のコラーゲンゲルにて挟まれる。多孔性膜は、肝臓に存在する類洞内皮細胞のフィルター層に類似して作用する。培地は多孔性膜の両面に連続して潅流される一方で、生理的な血流値の範囲に由来する血行動態力は多孔性膜の非細胞性の面に連続して適用される。５％ＣＯ２と３７℃で制御された環境に設定全体を収容する。流れに基づく培養系を効果的に創り出し、それによって、生体内でそうであるように肝細胞を流れの直接的な影響から遮断する。肝臓類洞の微細構造に類似するように設計された系にて血行動態を反復することは、生体内の肝臓のそれに類似する分化した肝臓の表現型及び代謝上の表現型の安定な保持を生じる。
【０４３６】
方法
（ｉ）動物の手術及び肝細胞の単離
実験で使用された動物はすべてＨｅｍｏＳｈｅａｒの動物実験委員会によって認可されたプロトコールに従って処理した。２０ｍＬ／分の流速を用いたＳｅｇｌｅｎの２ステップコラゲナーゼ潅流法（Ｓｅｇｌｅｎ，その内容が参照によって本明細書に組み入れられるＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ａｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｇｎｅｓｉｓ，Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，５（２−３）：５５１−５６０（１９７９））の改変によって肝細胞をオスＦｉｓｃｈｅｒラット（２５０ｇ〜３５０ｇ）から単離した。手短には、イソフルランでラットを麻酔し、その後、腹腔を切開し、流出のために門脈で切除を行いながら下大静脈にカニューレを入れた。肝臓を２ステップで潅流し、先ず、Ｃａ＋＋を含まない緩衝液で血液を洗い出し、細胞間接合を壊し、その後、Ｃａ＋＋を含有する緩衝液におけるコラゲナーゼで細胞外コラーゲンマトリクスを消化した。肝臓を好適に潅流した後、無菌のフードにてペトリディッシュ内でそれを切除し、被膜を取り除いた。２回の連続した６５ｇの遠心分離とそれぞれ９０％ＰＥＲＣＯＬＬ（ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）で被覆した直径１５〜３０ｎｍ（水中では２３％ｗ／ｗ）のコロイド状シリカ粒子；細胞を単離するのに使用することができる密度勾配を確立するのに使用される）による１０分間の遠心が続く１０分間の洗浄サイクルによって濃縮された肝細胞集団（約９５％の純度）を得た。トリパンブルー排除試験によって肝細胞の生存率を測定し、８５％を超える生存率の細胞を使用する。
【０４３７】
（ｉｉ）細胞培養及び装置の操作条件
［肝細胞の培養培地］図２０〜２４で示すデータについては、ラット肝細胞の培養培地は、高グルコース（１７．５ｍＭ）を含有し、ウシ胎児血清（播種時では１０％及び２４時間後の維持のためには２％に低下させた）によって補完されたＤＭＥＭ／Ｆ１２の基礎培地を含有した。培地はまた、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ＩＴＳ（インスリン濃度２μＭｏｌ）、１％のＮＥＡＡ、１％のＧＬＵＴＡＭＡＸ及びデキサメタゾン（播種時１μＭ及び２４時間後の維持については２５０ｎＭ）も含有した。
【０４３８】
表６及び図３８及び３９で示すデータについては、ラット肝細胞の培養培地は、低グルコース（５．５ｍＭ）を含有し、ＨＥＰＥＳ（３％ｖ／ｖ）とウシ胎児血清（播種時では１０％及び２４時間後の維持のためには２％に低下させた）によって補完されたＤＭＥＭ／Ｆ１２の基礎培地を含有した。培地はまた、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ＩＴＳ（インスリン濃度２ｎＭｏｌ）、１％のＮＥＡＡ、１％のＧＬＵＴＡＭＡＸ及びデキサメタゾン（播種時１μＭ及び２４時間後の維持については１００ｎＭ）も含有した。
【０４３９】
ヒトまたはイヌの肝細胞を培養するために、培養培地は、低グルコース（５．５ｍＭ）を含有し、ＨＥＰＥＳ（３％ｖ／ｖ）とウシ胎児血清（播種時では１０％及び２４時間後の維持のためには２％に低下させた）によって補完されたＤＭＥＭ／Ｆ１２の基礎培地を含有した。培地はまた、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ＩＴＳ（インスリン濃度２ｎＭｏｌ）、及びデキサメタゾン（播種時１μＭ及び２４時間後の維持については１００ｎＭ）も含有した。
【０４４０】
［コラーゲンの被覆及び播種］無菌の蒸留水におけるラット尾のＩ型コラーゲン、１０×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び０．２Ｎの水酸化ナトリウムを所定の比（１ｍＬにするには、成分はそれぞれ４４０μＬ、３７５μＬ、１００μＬ及び８５μＬである）で混合することによってコラーゲン溶液を作製した。
【０４４１】
静置条件に供される培養については、１００ｍｍの組織培養処理した無菌の細胞培養ディッシュを７μＬ／ｃｍ２のコラーゲン溶液で被覆した。制御された血行動態に供される培養については、７５ｍｍのＴＲＡＮＳＷＥＬＬＳ（ポリカーボネート，厚さ１０μｍ及び孔直径０．４μｍ，Ｎｏ．３４１９，Ｃｏｒｎｉｎｇ）の多孔性膜の下面を７μＬ／ｃｍ２のコラーゲン溶液で被覆した。溶液を１時間でゲルにした後、表面をＤＰＢＳで洗浄し、１２５，０００個／ｃｍ２の播種密度で肝細胞を播き、４時間後、コラーゲンゲルの第２の層を加えた。１時間後、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬＳを反転し、細胞培養ディッシュに入れ、培地を加えた（下容量部に９ｍＬ及び上容量部に６ｍＬ）。静置培養で使用される組織培養ディッシュには７ｍＬの培地を加えた。２４時間後、培地を維持培地（２％ＦＢＳを含有する）に交換し、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬＳを含有する細胞培養ディッシュを円錐平板装置に入れた。上容量部におけるＴＲＡＮＳＷＥＬＬの多孔性膜の表面に制御された血行動態を適用した。
【０４４２】
凍結保存したヒトの肝細胞を供給業者（Ｋａｌｙ−Ｃｅｌｌ，Ｆｒａｎｃｅ）から入手し、業者の処方したプロトコールのように融解した。ヒト肝細胞を播くために、ラット肝細胞について上で記載されたものに類似する手順に従い、限定された細胞播種領域を用いた。コラーゲンの第２の層を上述のように適用した。
【０４４３】
ビーグル犬から新しく単離したイヌ肝細胞を供給業者（Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）から入手し、業者の処方したプロトコールのように処理した。イヌ肝細胞を播くために、ラット肝細胞について上で記載されたものに類似する手順に従ったが、限定された細胞播種領域を用いた。コラーゲンの第２の層を上述のように適用した。
【０４４４】
［操作条件］文献からの類洞を横切る圧力勾配（ΔＰ）、類洞の半径（ｒ）及び類洞の長さ（ｌ）についての参照値を用いて、円筒を通るニュートン流体の圧力が駆動する流れの式：
【化１】
0006684706.tif 000004
に基づいて典型的な肝臓類洞についてダイン／ｃｍ２（τ）での剪断応力を算出した。当初の最適化過程の一部として、文献から予測された値の一桁の範囲内で変化量を生じる培地の粘度と円錐速度を変えることによって得られる適用される剪断応力の条件の範囲は、膜を横切る西洋ワサビペルオキシダーゼ色素の異なる輸送プロファイルに相関すると見込まれた。培養７日の肝細胞の遺伝子発現プロファイルについてこれらを調べた（データは示さず）。静置培養と剪断を適用せずに単純に潅流したものとに間で差異は認められず、遺伝子発現プロファイルに基づいて、この実施例で記載された実験全てについて０．６ダイン／ｃｍ２の操作剪断率が選択された。
【０４４５】
（ｉｉｉ）表現型、機能、代謝及び毒性のパラメータの評価
［ＲＴ−ＰＣＲ］培養期間の終了時（７または１４日）に健常条件及び脂肪変性条件もとで実行された装置からの肝細胞からＲＮＡを抽出し、このＲＮＡでＲＴ−ＰＣＲを行うことによって代謝遺伝子、毒性遺伝子及びインスリン／グルコース／脂質経路の遺伝子における変化を評価した。ＴＲＡＮＳＷＥＬＬＳを装置から取り出し、ＰＢＳで洗浄した後、多孔性膜から細胞を剥ぎ取った。ＰＵＲＥＬＩＮＫ  ＲＮＡミニキット（細胞から全ＲＮＡを精製するためのキット）を用いて全ＲＮＡを単離し、ＩＳＣＲＩＰＴ  ｃＤＮＡ合成キット（ｃＤＮＡ合成キット）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。代謝遺伝子ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ２、ＭＤＲ、及びＧＳＴ、並びにインスリン／グルコース／脂質経路の遺伝子ＧＰＡＴ、ＡＣＣ１、ＩＲＳ−２、ＰＰＡＲ−γ、ＳＲＥＢＰ、ＣｈＲＥＢＰ、ＬＸＲ、ＳＣＤ１、ＣＰＴ１についてプライマーを設計した。プライマーの配列を表３にて以下で示す。
【表３】
0006684706.tif 000005
【０４４６】
ＩＱ  ＳＹＢＲグリーンスーパーミックス（ＲＴ−ＰＣＲ用のＰＣＲ試薬混合物）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ及びＣ１０００サーマルサイクラーを伴ったＣＦＸ９６リアルタイムシステム（ＲＴ−ＰＣＲ検出システム及びサーマルサイクラー）によってＲＮＡの発現を解析した。ＲＮＡのデータをβ２−ミクログロブリンの内在性発現に対して正規化し、健常培養と比べた相対量として報告した。
【０４４７】
代謝及び毒性の実験で評価されたヒトの遺伝子にはＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＧＳＴＡ１、ＵＧＴ１Ａ１、ＧＳＲ、ＳＯＲＤ、ＴＸＮＲＤ１、及びＡＰＥＸ１が含まれた。これらについてのプライマーの配列を表４にて示す。代謝について評価されたイヌの遺伝子にはＣＹＰ１Ａ１及びＣＹＰ３Ａ１２（プライマーの配列は表５にて示す）が含まれた。
【表４】
0006684706.tif 000006
【表５】
0006684706.tif 000007
【０４４８】
［尿素及びアルブミンのアッセイ］種々の時点で静置培養及び装置から回収した培地をアルブミンについてラット特異的なＥＬＩＳＡに基づいたキット（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて製造元のプロトコールのようにアッセイした。標準の比色アッセイ（ＱＵＡＮＴＩＣＨＲＯＭ尿素アッセイキット，ＤＩＵＲ−５００，Ｇｅｎｔａｕｒ）を用いて培地試料から尿素を推定した。潅流させた培地の容積及び当初播いた細胞の数に基づいた比較のために、システム間の測定はすべて１００万個の細胞／日当たりの比率に正規化した。
【０４４９】
［ウエスタンブロット］制御された血行動態の適用に続いて、新鮮な１５０ｍＭのＤＴＴとプロテアーゼ阻害剤（ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ）＋１ｍＭのＰＭＳＦ＋２００ｍＭのＤＴＴ）を含有する１５０μＬの１×ＲＩＰＡにてタンパク質用にＴＲＡＮＳＷＥＬＬの多孔性膜の播かれた表面の１／３（約１８０万個の細胞）を回収した。氷上にて１秒パルスで５回、試料を超音波処理し、３０分間氷上で静置し、冷却微量遠心機にて１７，０００×ｇで１０分間遠心分離した。Ａ６６０ｎｍタンパク質試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質測定を行った。試料を７０℃で１０分間茹で、次いで７．５％ＴＧＸゲル（既製のポリアクリルアミドゲル、ＢｉｏＲａｄ）上で泳動した後、０．２μｍのＰＶＤＦ膜に湿式で移し、室温にて５％無脂肪乳で１０分間ブロックした。ウサギ抗ＵＧＴ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：５００希釈）にて４℃で一晩膜をインキュベートした。二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ヤギ抗ウサギＨＲＰ、１：５０００希釈）のインキュベートは室温で１時間だった。ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ  ＷＥＳＴ  ＰＩＣＯ（西洋ワサビペルオキシダーゼの化学発光基質、Ｐｉｅｒｃｅ）試薬を用いて化学発光シグナルを発生させ、Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  ＡＬＰＨＡＥＡＳＥ画像化システムを用いて捕捉した。正規化については、マウス抗β−アクチン（Ｓｉｇｍａ、Ａ１９７８、１：２０００希釈）についてゲルを探査し、その後、ヤギ抗マウスＨＲＰ二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−２００５、１：１０，０００希釈）で処理した。
【０４５０】
［免疫染色及び胆汁活性染色］使用した抗体：Ｈｎｆ４ａ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−８９８７）、Ｅ−カドヘリン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−７１００９）及び抗−ＭＲＰ２（Ａｂｃａｍ、ａｂ３３７３）。実験設計の選択された時点にて、静置培養物及び制御された血行動態に供された培養物を１×ＰＢＳで穏やかに洗浄し、その後、それらを４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。免疫染色するまで試料をＰＢＳにて４℃で保存した。免疫染色については、試料を先ず０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ（非イオン性界面活性剤）で２０分間透過化し、次いでＰＢＳで洗浄し、５％ヤギ血清でブロックした。一次抗体とのインキュベートは１：１００の希釈で１時間だった。１％ＢＳＡを伴ったＰＢＳで３回洗浄した後、１：５００の希釈で二次抗体をさらに１時間添加した。次いで試料をＰＢＳ＋１％ＢＳＡで洗浄し、次いで共焦点画像表示のために標本作製した。
【０４５１】
細管状接合部での胆汁活性の画像化については、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬの多孔性膜の切片をＰＢＳで洗浄し、１０μＭの二酢酸カルボキシ−２,７−ジクロロフルオレセイン（ＣＤＦＤＡ）を含有する培地と共に１０分間インキュベートした。次いで試料をＰＢＳで洗浄し、共焦点画像表示のためにスライドグラスに載せた。
【０４５２】
［透過電子顕微鏡］実施例１３で以下にて説明するように透過電子顕微鏡観察を行った。
【０４５３】
［チトクローム活性のアッセイ］静置条件下または制御された血行動態の条件下で円錐平板装置にて肝細胞を５日間培養し、次いで０．１％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはチトクローム酵素の既知の誘導因子（３−メチルコラントレン及びデキサメタゾン）で４８時間処理した。大まかに２ｃｍ２の面積の多孔性膜の断片を切り出し、相当する静置培養と並行して標準の２４穴プレートに移した。製造元が推奨する濃度での市販のＰ４５０−ＧＬＯキット（発光チトクロームｐ４５０アッセイ用のキット）に由来する基質を含有する５００μＬの肝細胞培地とともに細胞をインキュベートした。４時間後、培地を９６穴プレートに移し、チトクロームｐ４５０活性を反映する発光代謝体について製造元のプロトコールのようにアッセイした。同じ多孔性膜断片または静置ウェルにおける細胞のＡＴＰ含量を、製造元のプロトコールを用いたＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯアッセイ（蛍光細胞の生存アッセイ用のキット）によって推定し、チトクロームの値をＡＴＰ含量に対して正規化した。
【０４５４】
ヒト肝細胞のＣＹＰ活性及び誘導応答を評価するために、円錐平板装置にて細胞を播き、培養し、上述の操作条件下で制御された血行動態に７日間供した後、または静置条件下（対照）で７日間培養した後、０．１％ＤＭＳＯまたは既知のＣＹＰ誘導因子薬、フェノバルビタール（静置用で５００μＭ及び装置用で５０μＭ）またはリファンピシン（静置用で２５μＭ及び装置用で２．５μＭ）に７２時間暴露した。次いで肝細胞をＣＹＰ基質のカクテル［（エトキシレゾフィン（１０μＭ）、ミダゾラム（３μＭ）、ブフラロール塩酸塩（１０μＭ）、（Ｓ）−メフェニトイン（５０μＭ）、ブプロピオン塩酸塩（１００μＭ）、及びジクロフェナクナトリウム（１０μＭ）］を含有する培地と共に４時間インキュベートした。次いで培養上清を回収し、代謝体の形成についてＨＰＬＣによって解析し、特異的なＣＹＰ酵素の比活性を評価した。値はすべて細胞のタンパク質含量に対して正規化した。
【０４５５】
［糖新生アッセイ］上述のように単離され、播かれたラットの初代肝細胞を制御された血行動態のもとで円錐平板装置にて７日間培養した。肝細胞をＰＢＳで洗浄し、調節性ホルモン、インスリン（２ｎＭ）またはグルカゴン（１００ｎＭ）の存在下または非存在下で基質のグリセロール（２ｍＭ）または乳酸塩（２０ｍＭ）及びピルビン酸塩（２ｍＭ）を加えた、グルコースを含まない培地でインキュベートした。４時間後、上清を回収し、製造元の指示書のように比色ＡＭＰＬＥＸＲＥＤキット（グルコース／グルコースオキシダーゼのアッセイキット、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてグルコース含量についてアッセイした。グルコースの値は細胞溶解物のタンパク質含量に対して正規化した。
【０４５６】
［ＭＴＴアッセイ］ヒト肝細胞の毒性反応を評価するために、上述の操作条件を用いた制御された血行動態条件下で円錐平板装置にて細胞を播き７日間、培養し、または静置条件下（対照）で７日間培養した後、０．１％ＤＭＳＯまたは既知の毒性薬剤クロルプロマジン（０．１μＭ、１μＭ及び１０μＭ）に７２時間暴露した。次いで１ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ試薬（チアゾリルブルー臭化テトラゾリウム）を含有する培地と共に肝細胞を１時間インキュベートし、その後、細胞をＤＭＳＯにて溶解し、形成されたフォルマザンブルー色素を放出させた。溶液を９６穴プレートに移し、５９５ｎｍにて吸光度を読み取った。
【０４５７】
［生死染色］ヒト肝細胞の毒性反応を評価するために、上述の操作条件を用いた制御された血行動態条件下で円錐平板装置にて細胞を播き７日間、培養し、または静置条件下（対照）で７日間培養した後、０．１％ＤＭＳＯまたは既知の毒性薬剤クロルプロマジン（０．１μＭ、１μＭ及び１０μＭ）に７２時間暴露した。処理期間の終了時、肝細胞をＰＢＳで洗浄し、２μＭのカルセインＡＭ及び４μＭのエチジウムホモ二量体−１（ＥｔｈＤ−１）の濃度でＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率／細胞傷害性試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて３０分間インキュベートした。次いでガラススライドの間で細胞を標本にし、共焦点顕微鏡を用いて画像表示した。
【０４５８】
［ｍｉＲＮＡ１２２アッセイ］上述の操作条件を用いて、ラット肝細胞を制御された血行動態条件下で円錐平板装置にて播き７日間培養し、または静置条件下（対照）で７日間培養した。次いで肝細胞をＰＢＳで洗浄し、２つの異なる濃度（１μＭ及び１０μＭ）での既知の毒性薬剤クロルプロマジン（ＣＰＺ）を伴ったまたは伴わない無血清肝細胞培地にて４時間インキュベートした。細胞からの上清を回収し、ＭＩＲＮＥＡＳＹ血清／血漿キット（マイクロＲＮＡを抽出するためのキット、Ｑｉａｇｅｎ）を用いてマイクロＲＮＡの抽出を行った。ＭＩＳＣＲＩＰＴＩＩ  ＲＴキット（ｃＤＮＡを調製するためのキット、Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを調製し、製造元の指示書に従ってＭＩＳＣＲＩＰＴ  ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  ＰＣＲキット（ｃＤＮＡを定量するためのキット、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて試料を定量した。
【０４５９】
結果
（ｉｉ）制御された血行動態は、従来の静置単独培養条件に比べて肝細胞の表現型、分極した形態及び輸送体の局在を維持する。
新しく単離されたラットの初代肝細胞を入手し、多孔性膜上のコラーゲンゲルサンドイッチに播いた。１日後、培養を３７℃のＣＯ２インキュベータにて標準の静置条件下で継続した、または血行動態流れ技術に導入し、０．６ダイン／ｃｍ２の所定の間接的な剪断率での制御された血行動態のもとで維持した。培地は静置培養では４８時間ごとに交換し、装置では連続的に潅流した。７日後、培養物を取り出し、４％のパラホルムアルデヒドで固定した後、肝細胞の分化マーカー、Ｅ−カドヘリンとＨＮＦ−４αに対する抗体で免疫染色し、共焦点顕微鏡によって視覚化した。静置コラーゲンゲルサンドイッチ培養におけるＥ−カドヘリンの染色パターン（図２０Ａ）は、形態学的解析（隣接するグラフ）によって確認され、定量された高いレベルの細胞質Ｅ−カドヘリンを示し、表在性の膜分布を壊した。制御された血行動態のもとでは（図２０Ｂ）、肝細胞は、Ｅ−カドヘリンの異なる表在性の膜局在と低い細胞質レベルを特徴とするさらに分化した形態を示した。ＨＮＦ４αの染色パターンは、制御された血行動態のもとでの細胞が、生体内で見られるものに類似して核に限定された染色を保持した（図２０Ｄ）一方で、７日までのさらに拡散した染色パターンを有する静置培養における細胞による局在パターン（図２０Ｃ）ではっきり分かる差異を示した。コラーゲンゲルサンドイッチにおける培養の５〜７日後に出現する輸送体多剤耐性タンパク質−２（ＭＲＰ−２）の分極形態と細管状の局在は１４日までの静置培養で失われる（図２０Ｅ）が、細管状のネットワークパターンは制御された血行動態のもとで安定であり、広範囲である（図２０Ｆ）。生体内のラット肝臓の切片（図２１Ｂ）と一緒にＭＲＰ−２及びＨＮＦ−４αについて同時染色された制御された血行動態のもとで維持された１４日目の培養（図２１Ａ）は非常に類似した染色パターンを示す。制御された血行動態のもとでの７日目の培養の透過電子顕微鏡像（図２１Ｃ）は、毛細胆管及び密着結合の存在を確認することに加えて、たとえば、粗面小胞体及び滑面小胞体及びミトコンドリアのような細胞内成分の保持を明らかにしている。
【０４６０】
（ｉｉ）制御された血行動態は１４日にわたる静置培養に比べてコラーゲンゲル構成におけるラット肝細胞の肝細胞特異的な機能の保持を生じる
静置条件下または制御された血行動態（０．６ダイン／ｃｍ２）のもとで肝細胞を２週間培養し、４、７、１１及び１４日目に培地を採取した。尿素及びアルブミンについてのアッセイを培地で行い、値は、播いた細胞の当初の数に基づいて１００万個の細胞当たりの２４時間にわたる産生率に対して正規化した。１４日間にわたる種々の時点での培地試料から推定され且つμｇ／１０６個の播いた肝細胞／日として表された分泌されたアルブミンによって反映される肝細胞の機能（図２２Ａ）は、静置培養（点線）に比べて制御された血行動態（実線）のもとで有意に高いレベル（３〜４倍）を示した（７日目：９７．９６±１１．３４対２５．８４±８．２２，ｐ＝０．００００１；１４日目：８７．８０±８．６２対３３．９３±４．３９，ｐ＝０．０００１）。制御された血行動態（実線）のもとでμｇ／１０６個の播いた肝細胞／日として表された肝細胞による尿素の分泌（図２２Ｂ）は培養の２週間にわたって一貫して静置培養（点線）よりも４〜５倍高いことも見いだされた（７日目：６２２．７８±３３．９６対１３９．７６±１３．３７，ｐ＝２．７×１０−９；１４日目：６６７．７１±８４．３７対１７８．６８±６．１３，ｐ＝１×１０−６）。
【０４６１】
（ｉｉｉ）制御された血行動態は静置培養に比べてフェーズＩ及びフェーズＩＩの代謝遺伝子及びタンパク質の発現を差次的に調節する
静置条件下または制御された血行動態（０．６ダイン／ｃｍ２）のもとで肝細胞を７日間培養した。これらの条件に由来する７日目のＲＮＡ試料で選択した代謝遺伝子（表３）についてＱＲＴ−ＰＣＲを行った。値はすべて７日目の静置培養に対して正規化した。制御された血行動態のもとで培養された肝細胞は、静置培養よりも一貫して高く（ｎ＝１１、静置培養に比べた倍率変化：Ｃｙｐ１Ａ１  約５４，ｐ＝０．０００３；Ｃｙｐ１Ａ２  約６４，ｐ＝０．００５，Ｃｙｐ２Ｂ１  約１５，ｐ＝０．００１：図２３Ａ，Ｃｙｐ２Ｂ２  約２．７，ｐ＝０．０９及びＣｙｐ３Ａ２  約４，ｐ＝０．０７５：図２３Ｂ）、且つ生体内のレベルに近い遺伝子発現レベルを生じた。興味深いことに、静置培養では時間をかけて上昇することが知られるフェーズＩＩの酵素ＧＳＴのＰｉサブユニットの遺伝子の発現レベルは、静置培養（図２３Ｃ）に比べて生体内の肝臓（−４．９倍、ｐ＝０．１５２）及び制御された血行動態のもとで培養された肝細胞（−２．３倍、ｐ＝０．０２５）双方で低かった。
【０４６２】
静置条件下または制御された血行動態（０．６ダイン／ｃｍ２）のもとで肝細胞を培養した。細胞培養を４、７、１１及び１４日目で停止させ、方法の節で記載されたように細胞溶解物を得、総タンパク質に対して正規化し、等量試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、泳動した後、フェーズＩＩ酵素ＵＧＴ１Ａ１及びβ−アクチン（正規化用）に対する抗体で探査した。ウエスタンブロット（図２３Ｄ）は、ＵＧＴ１Ａ１が培養の２週間にわたってあらゆる時点で静置条件に比べて制御された血行動態のもとで上方調節されることを明らかにしている。同じ実験では、制御された血行動態のもとでの１４日間の培養に由来するＴＲＡＮＳＷＥＬＬの多孔性膜の一部を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＨＮＦ−４a及び細管状輸送体タンパク質ＭＲＰ−２について染色したが、それは、肝細胞間の細管状結合に沿ってＭＲＰ−２の保持及び局在を明らかにしている（図２１Ａ）。装置から取り出した後、膜の残りを切り出し、直ちに基質二酢酸カルボキシ−２,７−ジクロロフルオレセイン（ＣＤＦＤＡ）と共にインキュベートした。２０分間の時間窓にわたって共焦点顕微鏡によって細胞を画像化し、基質のカルボキシ−２,７−ジクロロフルオレセイン（ＣＤＦ）への分解及び胆汁細管状構造へのその活性のある分泌（図２１Ｃで見られる）を観察した。パターンはＭＲＰ−２及びＨＮＦ−４ａに対する抗体で免疫染色した生体内の肝臓の切片試料のそれに非常に類似した（図２１Ｂ）。
【０４６３】
（ｉｖ）制御された血行動態のもとで培養されたラット肝細胞は、さらに生体内のような濃度で静置培養よりも高いレベルの基本的な及び誘導性のチトクロームｐ４５０活性を示す
代謝遺伝子及び代謝タンパク質の増加が代謝活性の変化につながったことを検証するために、ラット初代肝細胞を前に記載されたように制御された血行動態（０．６ダイン／ｃｍ２）のもとで円錐平板装置にて、及び静置コラーゲンゲル培養にて培養した。５日後、それらを未処理のままにした、または０．１％のＤＭＳＯ、１Ａ／１Ｂ誘導因子３−コラントレン（３−ＭＣ、静置培養では１μＭ及び制御された血行動態のもとでは０．１μＭ）または３Ａ誘導因子デキサメタゾン（静置培養では５０μＭ及び制御された血行動態のもとでは０２．５μＭ）で処理した。４８時間後、７日目に、異なる作用剤で処理した相当する静置培養と並行して、大まかに２．０ｃｍ２の面積である制御された血行動態のもとで培養された肝細胞を含有する装置からの多孔性膜の断片を切り出し、標準の２４穴プレートに移し、Ｃｙｐ  ｐ４５０酵素の基質で処理した。市販のＰ４５０−ＧＬＯキットを用いて７日目にチトクロームｐ４５０アッセイを行った。４時間後、培地を９６穴プレートに移し、チトクロームｐ４５０の活性を反映する発光性代謝体についてアッセイした。生細胞の正確な表現を得、且つ総タンパク質の測定に対するコラーゲンゲルの交絡効果を回避するために、値は、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯアッセイによって評価された細胞のＡＴＰ含量に対して標準化した。
【０４６４】
未処理の培養におけるチトクロームｐ４５０酵素の基本的な活性レベル（図２４Ａ）は静置培養に比べて制御された血行動態によって上方調節された（１Ａ  約１５倍、１Ｂ  約９倍及び３Ａ  ５倍）。基本活性の高いレベルにもかかわらず、制御された血行動態のもとでは、従来の誘導因子に対する応答（図２４Ｂ）は上手く維持された（ＤＭＳＯ対３−ＭＣに対する１Ａ／１Ｂの応答−４．８７対１３３．０６；ＤＭＳＯ対デキサメタゾンに対する３Ａの応答−１１．６４対５７．５３）。
【０４６５】
制御された流れのもとで言及された高い遺伝子発現を確認するために先ずＣｙｐ活性を測定した一方で、静置培養を誘導するのに推奨される濃度である５０μＭのデキサメタゾンはこの系では毒性だった。その結果、デキサメタゾンの濃度は、誘導性の応答を得るためにラットにおいて生体内で見られる血漿濃度に上手く相関するレベルである１μｇ／ｍＬに低下させた。同様に３−ＭＣについての誘導性の応答も制御された血行動態もとでは１０倍低いレベルで見られた。
【０４６６】
制御された血行動態もとでの輸送体活性の存在を確認するために、装置からのＴＲＡＮＳＷＥＬＬフィルター断片を基質二酢酸カルボキシ−２,７−ジクロロフルオレセイン（ＣＤＦＤＡ）と共にインキュベートした。化合物を蛍光形態であるＣＤＦ、カルボキシ−２,７−ジクロロフルオレセインに分解し、それが能動的に細管状空間に分泌されたということは能動的な細管輸送を実証している（図２４Ｃ）。
【０４６７】
上述のデータは、生体内で見られるものにさらに類似するその表現型を復元するために肝細胞を制御された血行動態に暴露する効果を評価するために実施された実験の結果である。これらの実験は、静置コラーゲンゲル培養と並んで比較するのを可能にし、制御された血行動態の選択的な利益を特定するために静置培養で日常的に使用される標準の培地処方を用いた。これらの実験の過程では、これらの制御された血行動態の条件下で培養された肝細胞は向上した生体内様の表現型及び機能を実証し、たとえば、デキサメタゾン及び３−ＭＣのような誘導因子にさらに応答性だった。しかしながら、静置系でのアッセイに日常的に使用されるグルコース（１７．５ｍＭ）及びインスリン（２μＭ）の濃度で培養された肝細胞にて脂質の若干の蓄積も観察された。肝細胞が本明細書で記載されるような制御された血行動態の条件下で培養される場合、健常な個体の生体内で観察される濃度に類似するグルコース及びインスリンのはるかに低い濃度を使用することができることが発見された。データは、これら低濃度のグルコース（５．５ｍＭ）及びインスリン（２ｎＭ）が肝細胞の機能及び代謝活性をさらに高めることを示している。さらに、以下の実施例でさらに説明されるような脂肪肝疾患のモデルを創り出すためにさらに高い濃度のグルコース及びインスリンを含有する培地にて肝細胞を制御された血行動態の条件下で培養することができる。
【０４６８】
（ｖ）制御された血行動態のもとで培養されたラット初代肝細胞はインスリン及びグルカゴンへの応答性を示す
上述のように単離し、播いたラット初代肝細胞を制御された血行動態のもとで円錐平板装置にて７日間培養した後、ＰＢＳで洗浄し、調節性ホルモンであるインスリン（２ｎＭ）またはグルカゴン（１００ｎＭ）の存在下または非存在下で基質のグリセロール（２ｍＭ）または乳酸塩（２０ｍＭ）及びピルビン酸塩（２ｍＭ）と共にインキュベートした。ＡＭＰＬＥＸＲＥＤアッセイによって４時間後上清にて測定されたグルコースのレベルは、基質の非存在下ではインスリンはグルコースのレベルを２７％低下させる一方でグルカゴンはそれを５１％上昇させることを示した。基質グリセロールの存在下では、肝細胞によって産生されるグルコースは６７％増加した。グルカゴンの添加はグルコースのレベルをさらに１５％高めた一方で、インスリンはグルコースのレベルを３８％低下させた。乳酸塩及びピルビン酸塩を基質として使用した場合、肝細胞によって産生されるグルコースはグルカゴンの存在下で８０％増加した一方で、インスリンはグルコースのレベルを２５％低下させた。これらのデータを表６にて要約する。
【表６】
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【０４６９】
（ｉｖ）制御された血行動態のもとで培養された凍結保存ヒト肝細胞は生体内レベルの濃度でフェノバルビタール及びリファンピシンに対する誘導応答を示す。
ヒト肝細胞を、上述した操作条件下の制御された血行動態のもとで円錐平板装置にて、または静置条件下で（対照）７日間培養した後、既知のＣＹＰ誘導性薬剤、フェノバルビタール（静置条件では５００μＭ及び制御された血行動態の条件では５０μＭ）またはリファンピシン（静置条件では２５μＭ及び制御された血行動態の条件では２．５μＭ）に７２時間暴露した。次いで肝細胞をＰＢＳで洗浄し、上述のようなＣＹＰ基質のカクテルを含有する培地と共に４時間インキュベートした。次いで培養上清を回収し、特定のＣＹＰ酵素の比活性を評価する代謝体の形成について解析した。結果を細胞のタンパク質含量に対して標準化し、ピコモル／分／タンパク質のｍｇとして表した。０．１％ＤＭＳＯによるビヒクル処理の対照は、静置条件に比べて制御された血行動態の条件下では高いレベルのＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ３Ａ４を示した（それぞれタンパク質の７．７対４．６、４．６対０．５及び７．６対０．７ピコモル／分／ｍｇ）。静置条件下での高い濃度（５００μＭ）に比べて制御された血行動態の条件下での低い濃度（５０uＭ）のフェノバルビタールによる処理もＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ３Ａ４の匹敵するまたは高いレベルの酵素活性を生じた（それぞれタンパク質の４５．９対３４．３、１６．３対０．９及び１６．３対３．８ピコモル／分／ｍｇ）。同様に、静置条件下での高い濃度（２５μＭ）に比べて制御された血行動態の条件下での低い濃度（２．５μＭ）のリファンピシンによる処理もＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ３Ａ４の匹敵するまたは高いレベルの酵素活性を生じた（それぞれタンパク質の８７．３対１３１．１、１．４対１６．０及び１１．５対２３．１ピコモル／分／ｍｇ）。これらの結果を図３５にて示す。
【０４７０】
（ｖｉｉ）制御された血行動態のもとで培養された凍結保存ヒト肝細胞は生体内レベルの濃度でクロルプロマジンに対して毒性応答を示す
上述のように融解し、播かれた凍結保存のヒト初代肝細胞を制御された血行動態のもとで円錐平板装置にて、または静置条件下で（対照）７日間培養した後、異なる濃度（０．１μＭ、１μＭ及び１０μＭ）のクロルプロマジンまたはビヒクル対照に７２時間暴露した。エチジウム／カルセイン染色によって肝細胞にて生死染色を行った。肝細胞はまたＭＴＴ試薬とも１時間インキュベートして生存率を評価した。追加の断片からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行って選択した毒性遺伝子及び代謝遺伝子を評価した。静置条件下で培養した肝細胞は調べた濃度すべてにてどんな毒性も示さなかった。しかしながら、制御された血行動態のもとで培養された肝細胞は１μＭで３０．３％の毒性及び１０μuＭで４６．４％の毒性といった用量依存性の毒性を示した（図３６Ｂ）。１μＭでは、制御された血行動態の装置のもとで培養された肝細胞への毒性も生死染色によって検出された（図３６Ａ）。
【０４７１】
ＲＴ−ＰＣＲは、静置対照に比べて制御された血行動態の条件下での１μＭクロルプロマジンでの酸化ストレスに関連する毒性遺伝子の上方調節を明らかにした（グルタチオン還元酵素（ＧＳＲ）については８．３倍、チオレドキシン１（ＴＸＮＲＤ１）については５．５倍、ソルビトール脱水素酵素（ＳＯＲＤ）については６．９倍、及びＡＰＥＸヌクレアーゼ（多機能ＤＮＡ修復酵素）については２．８倍）。付随して、特定の代謝遺伝子も静置対照に比べて制御された血行動態の条件下では上方調節された（チトクロームｐ４５０ファミリー１メンバーＡ２（ＣＹＰ１Ａ２）については１７．８倍、チトクロームｐ４５０ファミリー１メンバーＡ１（ＣＹＰ１Ａ１）については８．４倍、及びチトクロームｐ４５０ファミリー２メンバーＢ６（ＣＹＰ２Ｂ６）については５．６倍）。これらの結果を図３７に示す。図３７で示す結果はＫａｌｙＣｅｌｌ  Ｄｏｎｏｒ  ＃Ｂ０４０３ＶＴに由来するヒト初代肝細胞を使用した。
【０４７２】
これらのデータは、制御された血行動態の条件下でヒト初代肝細胞が臨床的な血漿Ｃｍａｘ濃度でクロルプロマジンに対して毒性反応を見せることを示している。これらの毒性反応は酸化ストレスに関連する遺伝子及び特定の代謝遺伝子の上方調節に関連している。
【０４７３】
（ｖｉｉｉ）制御された血行動態のもとで培養されたラット初代肝細胞は、生体内レベルの濃度でのクロルプロマジンの暴露に応答して急性毒性を示し、且つｍｉＲＮＡ１２２を放出する
上述のように単離され、播かれたラット初代肝細胞を制御された血行動態の条件下での円錐平板装置にて、または静置条件下で７日間培養した。肝細胞をＰＢＳで洗浄し、直ちにビヒクル（蒸留水）またはクロルプロマジン（１μＭ）と共に４時間インキュベートした。上清を回収し、上述のようにｍｉＲＮＡ１２２のレベルを測定した。静置条件下では、１μＭでのクロルプロマジンはビヒクル対照に比べて上清におけるｍｉＲＮＡ１２２のレベルに変化を生じないことが分かった。それに反して、制御された血行動態の条件下で培養し、クロルプロマジン（１μＭ）と共に４時間インキュベートした肝細胞は有意に高いレベル（ビヒクル対照の６倍）でｍｉＲＮＡを放出した。これらの結果を図３８にて示す。
【０４７４】
（ｉｘ）制御された血行動態のもとで培養されたラット初代肝細胞は、生体内レベルの濃度でのトログリタゾンの暴露に応答して亜致死性の毒性を示し、胆汁鬱滞性の変化を示す
上述のように単離され、播かれたラット初代肝細胞を制御された血行動態の条件下での円錐平板装置にて５日間培養した後、４μＭまたは４０uＭのトログリタゾンに４８時間暴露した。肝細胞をＰＢＳで洗浄し、直ちに基質１０uＭの二酢酸カルボキシ−２,７−ジクロロフルオレセイン（ＣＤＦＤＡ）と共にインキュベートした。基質の高度に蛍光性のＭｒｐ−２基質カルボキシ−２,７−ジクロロフルオレセイン（ＣＤＦ）への加水分解及び毛細胆管構造へのその能動的な分泌を可能にする非蛍光性基質ＣＤＦＤＡへの２０分間の暴露の間に共焦点顕微鏡によって細胞を画像化表示した。４uＭのトログリタゾンは視覚的に拡張した細管状構造を伴った細管状パターンの変化を生じることが見いだされた。これらの変化は４０uＭのトログリタゾンでさらにはるかに顕著であり、広範だった（図３９）。制御された血行動態の条件下で培養された場合の生体内／臨床的な血漿Ｃｍａｘでのトログリタゾンに対するラット肝細胞の毒性反応は酸化ストレスに関連する遺伝子の上方調節及びＭＲＰ３遺伝子とＭＲＰ４遺伝子の代償性の上方調節に関連した（図４０）。
【０４７５】
（ｘ）制御された血行動態のもとで培養されたイヌ初代肝細胞は静置培養に比べて分極形態の保持を示し、重要な代謝遺伝子の高い発現を示す
新しく単離されたイヌ初代肝細胞を、ヒト肝細胞について上述のものに類似する操作条件下で制御された血行動態の条件のもとでの円錐平板装置にて培養し、または静置条件下（対照）で培養した。７日後、培養物を固定し、それぞれアクチン細胞骨格及び核についてファロイジン及びＤｒａｑ５によって染色した。細胞からＲＮＡを回収し、特定の代謝遺伝子についてＲＴ−ＰＣＲを行った。イヌ肝細胞は、７日目で多角形形状の分極形態を保持し、静置対照よりも有意に高いレベルでＣＹＰ１Ａ１及びＣＹＰ３Ａ１２を発現する（それぞれ６．７倍及び７．４倍）ことが分かった。これらの結果は図４１にて示す。
【０４７６】
実施例１３：脂肪肝疾患の試験管内モデル
非アルコール性の脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は肝不全の最も一般的な原因であり、肥満、インスリン抵抗性及び２型糖尿病に関連する。脂肪肝における変化は、肝細胞内での脂肪小胞の早期の蓄積（肝臓脂肪症）からその後の肝臓の代謝機能の喪失及び炎症性の変化へと進行し、最終的には線維症及び肝硬変につながる。脂肪肝疾患の動物生体内モデルは、糖尿病を反映する高血糖及び高インスリン血症を誘導する高脂肪餌または低脂肪高炭水化物餌を上手く使用してトリグリセリドの蓄積を誘導している。しかしながら、試験管内のモデルは通常、遊離の脂肪酸（オレイン酸、パルミチン酸またはリノール酸）の過剰負荷のみを用いて脂肪の変化を誘導し、疾患の病態形成で重要な役割を担い得る高レベルのグルコース及びインスリンに対する肝細胞のデノボ応答を捕捉しないかもしれない。肝細胞の静置培養はまた、顕著に低下したインスリン応答を有することが知られ、標準の培養培地は通常、基本的な肝細胞の生存及び機能のために高い生理的ではないレベルのホルモンを必要とする。それに反して、本明細書で記載されるモデルは、薬剤及びホルモンに対するさらに生理的な応答を保ち、グルコース及びインスリンの生体内の濃度レベルに近い濃度で我々が基本的な肝機能を維持するのを可能にし（実施例１２で上述のように）、さらに、高レベルのグルコース及びインスリンを特徴とする糖尿病のような環境を創り出すことによって脂肪肝で見られる病的な応答を我々が引き出すのを可能にする。
【０４７７】
方法
（ｉ）動物の手術及び肝細胞の単離
実施例１２で上述のように動物の手術及び肝細胞の単離を行った。
【０４７８】
（ｉｉ）細胞培養及び装置の操作条件
［健常な肝細胞の培養培地］健常な肝細胞の培養培地は、ウシ胎児血清（播種時１０％で２４時間後維持のために２％に低下させた）で補完した低グルコース（５．５ｍＭ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２の基本培地を含有した。さらに、培地は、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、及びセレニウム；２ｎＭのインスリン濃度）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％ＧＬＵＴＡＭＡＸ（Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含有する培地補助剤）、及びデキサメタゾン（図２５及び２６に示すデータについては播種時１μＭ及び２４時間後維持のために２５０ｎＭ；図２７〜３４で示すデータについては実験全体を通して１００ｎＭ）を含有した。
【０４７９】
［脂肪肝の変化を誘導する培地（「脂肪肝培地」）］脂肪肝の変化を誘導するのに使用された培養培地は、ウシ胎児血清（播種時１０％で２４時間後維持のために２％に低下させた）で補完した高グルコース（１７.５ｍＭ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２の基本培地を含有した。培地はまた、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ＩＴＳ（インスリン濃度、２μＭ）、１％ＮＥＡＡ、１％ＧＬＵＴＡＭＡＸ、及びデキサメタゾン（図２５及び２６に示すデータについては播種時１μＭ及び２４時間後維持のために２５０ｎＭ；図２７〜３４で示すデータについては実験全体を通して１００ｎＭ）を含有した。
【０４８０】
［コラーゲンの被覆及び播種］実施例１２で上述のようにコラーゲン溶液を作製した。７５ｍｍのＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（ポリカーボネート，厚さ１０μｍ及び孔直径０．４μｍ，Ｎｏ．３４１９，Ｃｏｒｎｉｎｇ）の多孔性膜の下表面を３００μＬのコラーゲン溶液で被覆した。１時間で溶液をゲルにした後、表面をＤＰＢＳで洗浄し、１２５，０００個の生細胞／ｃｍ２の播種密度で肝細胞を播き、４時間後、コラーゲンゲルの第２の層を加えた。１時間後、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬを反転し、細胞培養ディッシュに入れ、培地を加えた（下容量に９ｍＬ及び上容量部に６ｍＬ）。２４時間後（すなわち、実験の２日目）、培地を維持培地（上述した健常培地または脂肪肝培地）に交換し、ペトリディッシュを円錐平板血行動態流体装置に入れ、制御された血行動態を上容量部におけるＴＲＡＮＳＷＥＬＬの多孔性膜の表面に適用した。一部の実験では、維持培地は０．１％ＤＭＳＯビヒクル中の１．５μＭのピオグリタゾンまたは０．１％ＤＭＳＯビヒクルだけを含有した。制御された血行動態のもとで細胞を７日目まで培養し、その時点で以下に記載するアッセイを用いて肝細胞を調べた。
【０４８１】
［操作条件］剪断応力は実施例１２で上述のように算出した。培地の粘度及び円錐速度を変え、文献から予測された値の桁の範囲内で変化量を生じることによって生成された、適用される剪断応力条件の範囲（０．１〜６ダイン／ｃｍ２）を用いた。これらは、膜を横切る参照色素である西洋ワサビペルオキシダーゼの色素の異なる輸送プロファイルと相関した。培養は７日間行い、脂肪肝の変化について評価した。
【０４８２】
（ｉｉｉ）脂肪肝の変化の測定
健常対照に対する脂肪肝モデルで生じる変化を調べるために以下を評価した：
（ａ）代謝遺伝子及びインスリン／グルコース／脂質経路の遺伝子における変化（ＲＴ−ＰＣＲ）、
（ｂ）オイルレッドアッセイ、ナイルレッド染色及び総トリグリセリドの測定による肝細胞内での細胞内脂質の蓄積、
（ｃ）肝細胞の分化した機能における変化（尿素及びアルブミンの分泌）、
（ｄ）代謝活性における変化（チトクロームｐ４５０アッセイ）及び
（ｅ）透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）による肝細胞内での形態的変化。
【０４８３】
ＲＴ−ＰＣＲ及び尿素とアルブミンのアッセイを実施例１２で上述のように行った。
【０４８４】
［染色法］ＰＢＳにて希釈した０．１％ＴｒｉｔｏｎＸにて肝細胞ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ膜切片を２０分間透過化し、各５分でＰＢＳにて３回洗浄した。次いで、ＰＢＳにおける５％ヤギ血清、０．２％のブロット等級の脱脂粉乳ブロッキング剤、及び１％ＢＳＡにて４５分間、試料をブロックした。次いでＰＢＳ中０．１％ＢＳＡで試料を３回洗浄し、１：５０００希釈のナイルレッド（１ｍＭストック）、１：１０００のＤＲＡＱ５（蛍光ＤＮＡ染料；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、１：５００のＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ４８８を結合させたファロイジン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＰＢＳ中１％ＢＳＡと共に３０分間インキュベートし、光から保護した。試料を、各５分でＰＢＳ中０．１％ＢＳＡにて３回洗浄し、ＰＲＯＬＯＮＧ  ＧＯＬＤ褪色防止標本培地（褪色防止試薬；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてスライドグラス上で標本にした。ニコンＣ１＋共焦点システム顕微鏡にて試料を画像化した。
【０４８５】
［透過画像顕微鏡（ＴＥＭ）］健常条件下または脂肪症条件下で７日間培養された肝細胞を含有するＴＲＡＮＳＷＥＬＬからの多孔性膜の断片をＰＢＳで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド及び２％グルタールアルデヒドを含有する溶液にて１時間固定した。次いで、バージニア大学画像化センターにてＴＥＭ用に処理されるように試料を送付した。肝細胞内の脂質の蓄積、たとえば、ミトコンドリア及び滑面小胞体及び粗面小胞体のような細胞内小器官の出現、分極形態の保持、及び毛細胆管についてＴＥＭ画像を評価した。
【０４８６】
［オイルレッドアッセイ］市販の脂肪症熱量測定アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を適合させ、改変することによって肝細胞内の細胞内脂質の蓄積を評価した。培養期間の終了時に、健常条件下及び脂肪症条件下での装置に由来する肝細胞を含有する２ｃｍ２の大きさの多孔性膜の断片をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。次いで多孔性膜の断片をＰＢＳで洗浄し、完全に乾燥させ、２４穴プレートにて３００μＬのオイルレッドＯ希釈標準液と共に２０分間インキュベートした。次いで、多孔性膜の断片を蒸留水で７〜８回洗浄し、その後、脂肪症熱量測定アッセイキットで提供された洗浄液で５分で２回洗浄した。色素抽出溶液（３００μＬ）を各ウェルに加え、プレートを一定の撹拌のもとで軌道振盪器にて１５〜３０分間インキュベートした。次いで溶液を透明な９６穴プレートに移し、分光光度計にて４９０ｎｍ〜５２０ｎｍで吸光度を読みとった。
【０４８７】
［総トリグリセリドの測定］市販の熱量測定アッセイキット（Ｃａｙｍａｎトリグリセリド熱量測定アッセイキット、カタログ番号１００１０３０３）を用いてトリグリセリド含量を評価した。処理の終了時、ラバーポリスマンとＰＢＳで擦り取ることによって多孔性膜から細胞を回収し、その後、それらを遠心分離した（２，０００×ｇで４℃にて１０分間）。トリグリセリドアッセイキットの冷却希釈した標準希釈液１００μＬに細胞ペレットを再懸濁させ、１秒バーストで２０回超音波処理した。次いで細胞懸濁液を１０，０００×ｇで４℃にて１０分間遠心分離した。上清を取り出し、製造元のプロトコールのようにアッセイに使用し、同じ試料に由来するタンパク質含量に対して正規化した。
【０４８８】
［チトクローム活性のアッセイ］健常条件下及び脂肪症条件下で円錐平板装置にて肝細胞を７日間培養した。大まかに面積２ｃｍ２の多孔性膜断片を切り出し、対応する静置培養と共に標準の２４穴プレートに移した。製造元が推奨した濃度で市販のＰ４５０−ＧＬＯキットに由来する基質を含有する健常肝細胞培地５００μＬと共に細胞をインキュベートした。４時間後、培地を９６穴プレートに移し、製造元のプロトコールのようにチトクロームｐ４５０活性を反映する発光性代謝体についてアッセイした。次いで、製造元のプロトコールを用いたＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯアッセイによって同じ多孔性膜断片または静置ウェルにおける細胞のＡＴＰ含量を推定し、チトクロームの値をＡＴＰ含量に対して正規化した。
【０４８９】
結果
［ナイルレッド染色］図２７Ａ及び２７Ｂは、健常培地（図２７Ａ）及び脂肪肝培地（図２７Ｂ）で培養した肝細胞のナイルレッド、ファロイジン及びＤＲＡＱ５による染色を示す。図２７Ｂに見ることができるように、脂肪肝培地（高濃度のグルコース及びインスリンを含有する）で培養された肝細胞は多数の脂質液滴を蓄積する。
【０４９０】
［透過電子顕微鏡］脂肪肝培地で培養された肝細胞を透過電子顕微鏡によっても調べた。図２８にて示すように、これらの条件下で培養された肝細胞は脂質を蓄積する。画像の左側の肝細胞にて大きな脂質液滴が示されている。２つの肝細胞間のギャップ結合が示され、分極形態を明らかにしている。
【０４９１】
［総脂質及び総トリグリセリド］図２９に示されるように、総脂質（図２９Ａ）及び総トリグリセリド（図２９Ｂ）は双方とも、肝臓由来の血行動態の存在下で高グルコース／高インスリンの脂肪肝条件下にて培養された肝細胞において有意に増加した。オイルレッドＯによる定量は、健常培養に比べて疾患培養では総脂質が約３倍上昇することを示した。
【０４９２】
［遺伝子発現］グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ)はトリグリセリド合成に関与する重要な酵素であり、脂肪症及び脂肪肝で上方調節され、それに寄与することが知られている。図２５で示すように、装置にて制御された血行動態のもとで培養されたラット初代肝細胞は、高インスリン（２μＭ）及び高グルコース（１７．５ｍＭ）の病的状態に暴露した場合（ｎ＝９）、培地における健常な生理的レベルのインスリン（２ｎＭ）及びグルコース（５．５ｍＭ）もとで培養されたものに比べて有意に高いＧＰＡＴ遺伝子の発現（ｐ＝０．０４）を示した。結果は、コラーゲンゲルサンドイッチにおける標準の静置培養（２μＭのインスリン及び１７．５ｍＭのグルコース）に対する倍率上昇として表す。
【０４９３】
低濃度のデキサメタゾンを含有する健常培地または脂肪肝培地にて制御された血行動態のもとで培養された肝細胞について、同様の結果を図３０Ｂにて示す。高インスリン／高グルコース（脂肪肝）の培地で培養された肝細胞は、低レベルのインスリン及びグルコースを含有する健常培地で培養された肝細胞に比べて有意に高いレベルのＧＰＡＴの発現を示した。図３０Ａにて示すように、高インスリン／高グルコースの培地にて制御された血行動態のもとで培養された肝細胞はまた、健常培地で培養された肝細胞に比べて、脂質形成に関与する別の重要な遺伝子であるステロール調節要素結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）の有意に高いレベルの発現も示した。
【０４９４】
これら脂肪症の変化は付随する代謝変化を伴った。重要な代謝遺伝子すべてのうちで、チトクロームｐ４５０  ３Ａファミリーは薬剤の大半の代謝に関与する。図２６にて示すように、培地における健常な生理的レベル（ｎ＝６）のインスリン（２ｎＭ）及びグルコース（５．５ｍＭ）を伴った装置にて制御された血行動態のもとで培養された肝細胞は、高インスリン（２μＭ）及び高グルコース（１７．５ｍＭ）のレベルでの病的状態（ｎ＝９）のもとで培養されたものに比べて重要な代謝酵素、チトクロームｐ４５０  ３ａ２の有意に高い発現レベル（Ｃｙｐ３Ａ２、ｐ＝０．０３）を示した。制御された流れのもとでの健常なレベル及び病的な脂肪肝のレベルは双方とも、コラーゲンゲルサンドイッチにおける静置培養（２μＭのインスリン及び１７．５ｍＭのグルコース）よりも何倍も高かった。
【０４９５】
同様に、図３１Ａにて示すように、薬剤代謝に関与する多数のフェーズＩの酵素は低い及び高いグルコース／インスリンの条件下で差次的に調節される。血行動態の流れのもとで、健常培地の条件下での肝細胞はＣｙｐ１ａ１、Ｃｙｐ２ｂ１、２ｂ２，Ｃｙｐ３ａ２の高いレベルのｍＲＮＡを発現した（それぞれ、従来の静置培養よりも２０、９０、３０及び４０倍高い）のに対して、脂肪肝培地で培養された肝細胞におけるＣｙｐ２ｂ２及びＣｙｐ３ａ２のレベルは健常培地に比べて９倍及び１２倍低下した。
【０４９６】
［Ｃｙｐ活性］図３１Ｂにて示すように、ＣＹＰ３Ａ２及びＣＹＰ１Ａ１の活性もｐ４５ＧＬＯアッセイによって測定すると健常条件に比べて、高インスリン／グルコースの脂肪肝の条件下では3〜６倍低下した。
【０４９７】
［ピオグリタゾン処理］高インスリン／グルコース脂肪肝培地によって誘導された脂質の蓄積及び代謝の変化を反転できるかどうかを判定するために脂肪肝モデルにて、脂肪症を治療するのに使用される薬剤であるピオグリタゾンを調べた。ピオグリタゾンは、生体内でのピオグリタゾンについて観察された治療上のＣｍａｘに基づいて選択された濃度である１．５μＭの濃度にて培地に添加された。ピオグリタゾンは、病的状態で代謝遺伝子の発現を回復しながら、脂質の蓄積及びトリグリセリド含量を減らすのに有効であった。図３２にて示すように、ナイルレッドの染色は、生体内での治療上の濃度でのピオグリタゾンによる処理が脂肪症の状態での脂質液滴の形成を減らすことを示している。ピオグリタゾンはまた、高インスリン／グルコース培地で培養された肝細胞の総トリグリセリド含量を健常な条件下で培養された肝細胞で見られるものに類似するレベルに低下させた（図３３）。さらに、図３４にて示すように、ピオグリタゾンは、高インスリン／グルコース条件によって低下させられるＣｙｐ３Ａ２のような代謝遺伝子の発現を回復させた。
【０４９８】
結論
要約すれば、生体内様の肝細胞の表現型及び応答を保ち、高グルコース／インスリンの環境の存在下で病的な脂肪症の変化を誘導することによって肝脂肪症のモデルを創り出す系を開発した。制御された血行動態のもとでのラット肝細胞はインスリン及びグルコースに対するその応答を保持し、血行動態の流れのもとで培養された肝細胞は高いグルコース及びインスリンの（病的な）状態で培養すると脂肪症の変化を発症する。脂肪症には２つの重要な遺伝子（ＳＲＥＢＰ及びＧＰＡＴ）の上方調節と共にデノボ脂質形成が介在し、脂質蓄積及びトリグリセリド含量の上昇は代謝遺伝子の発現及び活性の付随する低下を伴う。ＰＰＡＲ−γアゴニストであるピオグリタゾンによる処理は高いグルコース及びインスリンの条件下での脂質の蓄積及び代謝活性の喪失を防ぐのに役立つ。これらのデータは、そのために現在何も存在していない食事で誘導される非アルコール性の脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の新規で且つ重要な新しい試験管内モデルを実証している。
【０４９９】
実施例１４：人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するヒト肝細胞系
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する肝細胞は、薬剤応答における変動を排除すること及び遺伝子型の変異を検討することについて解決の可能性を提供するが、それらが標準の静置培養系で示す胎児表現型及び不適切な代謝プロファイルの理由で、幅広い支持は得られていない。実施例１２で上述したデータは、静置培養の条件下では迅速に脱分化することが知られるラット及びヒトの初代肝細胞が制御された血行動態の条件下で培養されると成熟した分化した表現型を安定的に保持し、さらに生理的な薬剤及びホルモンへの応答を生じることを明らかにしている。たとえば、流れ、血行動態及び輸送のような生理的特性が維持されれば、ｉＰＳＣは同様に応答し、分化した肝臓の表現型及びそれらが生体内で示す薬剤への応答を示すことが発見された。
【０５００】
方法
（ｉ）ｉＰＳＣ由来の肝細胞
ｉＰＳＣ由来の肝細胞はＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入した。
【０５０１】
（ｉｉ）ｉＰＳＣ由来の肝細胞の培養培地
ｉＰＳＣ由来の肝細胞の静置培養用の培養培地は供給業者の推奨どおりだった。円錐平板装置にて制御された血行動態の条件下で培養される細胞については、播種の時点では、ウシ胎児血清（１０％）及びデキサメタゾン（１μＭ）で補完されたＷｉｌｌｉａｍｓＥ培地の基本培地を用いた。ＦＢＳを含有しないが、ウシ血清アルブミン（０．１２５％）で補完された維持培地を２４時間後使用した。培地はまたゲンタマイシン（２５μｇ／ｍｌ）、ＩＴＳ（インスリン濃度、２ｎＭ）、１％ＮＥＡＡ、１％ＧＬＵＴＡＭＡＸ、ＨＥＰＥＳ（３０ｍＭ）及びデキサメタゾン（１００ｎＭ）も含有した。
【０５０２】
（ｉｉｉ）コラーゲン被覆及び播種
ヒト初代肝細胞については、コラーゲン被覆及び播種の条件は実施例１２で上述したものと同一だった。推奨された培地を用い、供給業者のプロトコールどおりにｉＰＳＣ由来の肝細胞を分離し、播いた。ｉＰＳＣ由来の肝細胞を静置条件下で培養し、または制御された血行動態の条件下での培養のために２４時間後、円錐平板装置に移した。
【０５０３】
結果
（ｉ）制御された血行動態の条件下で培養された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する肝細胞は、分極形態を保持し、静置培養に比べて重要な代謝遺伝子の高い発現を示す
制御された血行動態のもとで円錐平板装置にて１０日間培養されたｉＰＳＣ由来の肝細胞は、分極形態を保持し（図４２）、静置培養に比べて重要な代謝遺伝子の高い発現を示す（ＣＹＰ１Ａ１について１０４倍、ＣＹＰ１Ａ２について９１倍、ＣＹＰ３Ａ４について８．８倍、ＣＹＰ２Ｂ６について８．２倍、ＣＹＰ２Ｃ９について２．３倍及びＣＹＰ２Ｄ６について２．３倍）。構成的なアンドロスタン受容体ＣＡＲの発現は静置条件下で培養された細胞より６．０倍高く、肝臓特異的なタンパク質アルブミンの発現は静置条件下で培養された細胞より２．２倍高かった。これらの結果は図４３に示す。
【０５０４】
参考文献
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Ｇｏｒｇ  Ｃ，  Ｓｅｉｆａｒｔ  Ｕ，  Ｇｏｒｇ  Ｋ，  Ｚｕｇｍａｉｅｒ  Ｇ．  Ｃｏｌｏｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  ｓｏｎｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｌｅｓｉｏｎｓ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｕａｌ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｓｕｐｐｌｙ  ｂｙ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ  Ｏｆｆ  Ｊ  Ａｍ  Ｉｎｓｔ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ．  ２００３  Ｏｃｔ；２２（１０）：１０３３−９．
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Ｈｕｄｉｓ  Ｃ，  Ｓｗａｎｔｏｎ  Ｃ，  Ｊａｎｊｉｇｉａｎ  ＹＹ，  Ｌｅｅ  Ｒ，  Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  Ｓ，  Ｌｅｈｍａｎ  Ｒ，  Ｃｈａｎｄａｒｌａｐａｔｙ  Ｓ，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｎ，  Ｇａｊｒｉａ  Ｄ，  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｊ，  Ｓｈａｈ  Ｊ，  Ｓｈａｎｎｏｎ  Ｋ，  Ｔｅｔｔｅｈ  Ｅ，  Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＤＭ，  Ｍｏｒｅｎｏ  Ｃ，  Ｙａｎ  Ｌ，  Ｈａｎ  ＨＳ．  （２０１３）  Ａ  ｐｈａｓｅ  １  ｓｔｕｄｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ＡＫＴ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  （ＭＫ−２２０６）  ａｎｄ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＨＥＲ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５（６）：Ｒ１１０．  ＰＭＩＤ：  ２４２５２４０２．
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Ｈｓｕ  Ｗ−Ｈ，  Ｙｕ  Ｙ−Ｈ，  Ｔｕ  Ｃ−Ｙ，  Ｈｓｕ  Ｊ−Ｙ，  Ｃｈｅｎ  Ｃ−Ｙ，  Ｃｈｅｎ  Ｃ−Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｌｏｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  ＵＳ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｖｅｓｓｅｌ  ｓｉｇｎａｌ：  ａ  ｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｅｎｉｇｎ  ｌｅｓｉｏｎｓ．  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．  ２００７  Ｍａｒ；３３（３）：３７９−８８．
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Ｈｓｕ  ＷＨ，  Ｉｋｅｚｏｅ  Ｊ，  Ｃｈｅｎ  ＣＹ，  Ｋｗａｎ  ＰＣ，  Ｈｓｕ  ＣＰ，  Ｈｓｕ  ＮＹ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｌｏｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｏｒａｃｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ．  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｅｃｔｅｄ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  １９９６  Ｊｕｎ；１５３（６  Ｐｔ  １）：１９３８−５１．
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Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ”ＭＫ２２０６  ａｎｄ  Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｉｎ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｗｈｏ  Ｈａｖｅ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｄ  Ａｆｔｅｒ  Ｐｒｅｖｉｏｕｓ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ”  ［ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ  ｏｎ  ２０１４−０９−０９］．    Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ＜ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０１２９４３０６＞
【０５２４】
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ”Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  （ＰＤＱＲ）”  ［ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ  ２０１４−０７−０２］．    Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ＜ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃａｎｃｅｒｔｏｐｉｃｓ／ｐｄｑ／ｔｒｅａｔｍｅｎｔ／ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌｌｕｎｇ／ｈｅａｌｔｈｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ／ｐａｇｅ１１＞
【０５２５】
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ”Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＡＺＤ６２４４  （Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）  ＭＥＫ−Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｗｉｔｈ  Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ  ｉｎ  ＫＲＡＳ  Ｗｉｌｄ  Ｔｙｐｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  （ＮＳＣＬＣ）  ａｎｄ  ａ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＡＺＤ６２４４  Ｗｉｔｈ  Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ  ｉｎ  Ｍｕｔａｎｔ  ＫＲＡＳ  Ａｄｖａ．．．，”  ［ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ  ２０１４−０９−０９］．  Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ＜ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ｓｔｕｄｙ／ＮＣＴ０１２２９１５０＞．
【０５２６】
Ｏｇａｔａ  Ｈ，  Ｇｏｔｏ  Ｓ，  Ｓａｔｏ  Ｋ，  Ｆｕｊｉｂｕｃｈｉ  Ｗ，  Ｂｏｎｏ  Ｈ，  Ｋａｎｅｈｉｓａ  Ｍ．  （１９９９）  ＫＥＧＧ：  Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２７：２９−３４．
【０５２７】
Ｏ’Ｎｅｉｌ  ＢＨ，  Ｇｏｆｆ  ＬＷ，  Ｋａｕｈ  ＪＳ，  Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ  ＪＲ，  Ｂｅｋａｉｉ−Ｓａａｂ  ＴＳ，  Ｌｅｅ  ＲＭ，  Ｋａｚｉ  Ａ，  Ｍｏｏｒｅ  ＤＴ，  Ｌｅａｒｏｙｄ  Ｍ，  Ｌｕｓｈ  ＲＭ，  Ｓｅｂｔｉ  ＳＭ，  Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＤＭ．  （２０１１）  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  １／２  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｓｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２９：２３５０−２３５６６．  ＰＭＩＤ：  ２１５１９０１５．
【０５２８】
Ｐｉｏｖａｎ  Ｅ，  Ｙｕ  Ｊ，  Ｔｏｓｅｌｌｏ  Ｖ，  Ｈｅｒｒａｎｚ  Ｄ，  Ａｍｂｅｓｉ−Ｉｍｐｉｏｍｂａｔｏ  Ａ，  Ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ＡＣ，  Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｒｔｉｎ  Ｍ，  Ｐｅｒｅｚ−Ｇａｒｃｉａ  Ａ，  Ｒｉｇｏ  Ｉ，  Ｃａｓｔｉｌｌｏ  Ｍ，  Ｉｎｄｒａｃｃｏｌｏ  Ｓ，  Ｃｒｏｓｓ  ＪＲ，  ｄｅ  Ｓｔａｎｃｈｉｎａ  Ｅ，  Ｐａｉｅｔｔａ  Ｅ，  Ｒａｃｅｖｓｋｉｓ  Ｊ，  Ｒｏｗｅ  ＪＭ，  Ｔａｌｌｍａｎ  ＭＳ，  Ｂａｓｓｏ  Ｇ，  Ｍｅｉｊｅｒｉｎｋ  ＪＰ，  Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ  Ｃ，  Ｃａｌｉｆａｎｏ  Ａ，  Ｆｅｒｒａｎｄｏ  ＡＡ．  （２０１３）  Ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂｙ  ＡＫＴ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２４（６）：７６６−７７６．  ＰＭＩＤ：  ２４２９１００４
【０５２９】
Ｒａｓｋａｔｏｖ  ＪＡ，  Ｎｉｃｋｏｌｓ  ＮＧ，  Ｈａｒｇｒｏｖｅ  ＡＥ，  Ｍａｒｉｎｏｖ  ＧＫ，  Ｗｏｌｄ  Ｂ，  Ｄｅｒｖａｎ  ＰＢ．  （２０１２）  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｂｙ  ａ  ｐｙｒｒｏｌｅ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，  １０９：１６０４２−４５．
【０５３０】
Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｐａｃｈｔｅｒ  Ｌ  （２０１２）．  Ｓｔｒｅａｍｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １０：７１−７３．
【０５３１】
Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＭＤ  ａｎｄ  Ｏｓｈｌａｃｋ  Ａ．  （２０１０）  Ａ  ｓｃａｌｉｎｇ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｄａｔａ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，  １１：Ｒ２５
【０５３２】
Ｒｏｓｓｉ  Ａ，  Ｄｉ  Ｍａｉｏ  Ｍ，  Ｃｈｉｏｄｉｎｉ  Ｐ，  Ｒｕｄｄ  ＲＭ，  Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｈ，  Ｓｋａｒｌｏｓ  ＤＶ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ−  ｏｒ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：  ｔｈｅ  ＣＯＣＩＳ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｄａｔａ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  Ｏｆｆ  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１２  Ｍａｙ  １０；３０（１４）：１６９２−８．
【０５３３】
Ｓａｌａｓ  Ｓ，  Ｍｅｒｃｉｅｒ  Ｃ，  Ｃｉｃｃｏｌｉｎｉ  Ｊ，  Ｐｏｕｒｒｏｙ  Ｂ，  Ｆａｎｃｉｕｌｌｉｎｏ  Ｒ，  Ｔｒａｎｃｈａｎｄ  Ｂ，  Ｍｏｎｊａｎｅｌ−Ｍｏｕｔｅｒｄｅ  Ｓ，  Ｂａｃｉｕｃｈｋａ−Ｐａｌｍａｒｏ  Ｍ，  Ｄｕｐｕｉｓ  Ｃ，  Ｙａｎｇ  Ｃ，  Ｂａｌｔｉ  Ｍ，  Ｌａｃａｒｅｌｌｅ  Ｂ，  Ｄｕｆｆａｕｄ  Ｆ，  Ｄｕｒａｎｄ  Ａ，  Ｆａｖｒｅ  Ｒ．  （２００６）  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｒｕｇ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｄｏｓｅ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｉｎ  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｂａｓｅｄ  ｕｐｏｎ  ｔｏｔａｌ  ｐｌａｔｉｎｕｍ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ２８（４）：５３２−９．  ＰＭＩＤ：  １６８８５７２１．
【０５３４】
Ｕｒｉｅｎ  Ｓ，  Ｂｒａｉｎ  Ｅ，  Ｂｕｇａｔ  Ｒ，  Ｐｉｖｏｔ  Ｘ，  Ｌｏｃｈｏｎ  Ｉ，  Ｖａｎ  Ｍ−ＬＶ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｌａｔｉｎｕｍ  ａｆｔｅｒ  ｏｒａｌ  ｏｒ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ：  ａ  ｐｈａｓｅ  １  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ３２  ａｄｕｌｔ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００５  Ｊａｎ；５５（１）：５５−６０．
【０５３５】
Ｙａｐ  ＴＡ，  Ｙａｎ  Ｌ，  Ｐａｔｎａｉｋ  Ａ，  Ｆｅａｒｅｎ  Ｉ，  Ｏｌｍｏｓ  Ｄ，  Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｍａｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｒａｌ  ｐａｎ−ＡＫＴ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＭＫ−２２０６  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  Ｏｆｆ  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１１  Ｄｅｃ  １０；２９（３５）：４６８８−９５．
【０５３６】
Ｙｅｈ  ＴＣ，  Ｍａｒｓｈ  Ｖ，  Ｂｅｒｎａｔ  ＢＡ，  Ｂａｌｌａｒｄ  Ｊ，  Ｃｏｌｗｅｌｌ  Ｈ，  Ｅｖａｎｓ  ＲＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＲＲＹ−１４２８８６  （ＡＺＤ６２４４），  ａ  Ｐｏｔｅｎｔ，  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｋｉｎａｓｅ  １／２  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００７  Ｍａｒ  １；１３（５）：１５７６−８３．
【０５３７】
Ｚｈａｎｇ  Ｙ−Ｘ，  Ｙｕｅ  Ｚ，  Ｗａｎｇ  Ｐ−Ｙ，  Ｌｉ  Ｙ−Ｊ，  Ｘｉｎ  Ｊ−Ｘ，  Ｐａｎｇ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＭＳＨ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｍｉＲ−２１  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  Ａ５４９  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ．  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  Ｂｉｏｍｅｄｅｃｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．  ２０１３  Ｍａｒ；６７（２）：９７−１０２．
【０５３８】
Ｚｈａｎｇ  Ｐ，  Ｇａｏ  ＷＹ，  Ｔｕｒｎｅｒ  Ｓ，  Ｄｕｃａｔｍａｎ  ＢＳ．  Ｇｌｅｅｖｅｃ  （ＳＴＩ−５７１）  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  （Ａ５４９）  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００３  Ｊａｎ  ３；２（１）：１．
【０５３９】
本発明の要素またはその好まれる実施形態を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び「ｓａｉｄ」は１以上の要素があることを意味するように意図される。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」及び「ｈａｖｉｎｇ（有する）」という用語は、包含的であり、列記された要素以外の追加の要素があり得ることを意味するように意図される。
【０５４０】
上記を考慮して、本発明の幾つかの目的が達成され、他の有利な結果が達成されることが理解されるであろう。
【０５４１】
本発明の範囲から逸脱することなく、上記の方法で種々の変更が行われ得るので、上記の記載に含有され、添付の図面で示される事柄はすべて、例示説明として解釈され、限定的な意味で解釈されるものではないことが意図される。
【図１】
0006684706.tif 000009
【図２】
0006684706.tif 000010
【図３】
0006684706.tif 000011
【図４】
0006684706.tif 000012
【図５】
0006684706.tif 000013
【図６】
0006684706.tif 000014
【図７】
0006684706.tif 000015
【図８】
0006684706.tif 000016
【図９】
0006684706.tif 000017
【図１０】
0006684706.tif 000018
【図１１】
0006684706.tif 000019
【図１２】
0006684706.tif 000020
【図１３】
0006684706.tif 000021
【図１４−１】
0006684706.tif 000022
【図１４−２】
0006684706.tif 000023
【図１５】
0006684706.tif 000024
【図１６】
0006684706.tif 000025
【図１７】
0006684706.tif 000026
【図１８】
0006684706.tif 000027
【図１９】
0006684706.tif 000028
【図２０−１】
0006684706.tif 000029
【図２０−２】
0006684706.tif 000030
【図２０−３】
0006684706.tif 000031
【図２１】
0006684706.tif 000032
【図２２】
0006684706.tif 000033
【図２３】
0006684706.tif 000034
【図２４】
0006684706.tif 000035
【図２５】
0006684706.tif 000036
【図２６】
0006684706.tif 000037
【図２７】
0006684706.tif 000038
【図２８】
0006684706.tif 000039
【図２９】
0006684706.tif 000040
【図３０】
0006684706.tif 000041
【図３１】
0006684706.tif 000042
【図３２】
0006684706.tif 000043
【図３３】
0006684706.tif 000044
【図３４】
0006684706.tif 000045
【図３５】
0006684706.tif 000046
【図３６】
0006684706.tif 000047
【図３７】
0006684706.tif 000048
【図３８】
0006684706.tif 000049
【図３９】
0006684706.tif 000050
【図４０】
0006684706.tif 000051
【図４１】
0006684706.tif 000052
【図４２】
0006684706.tif 000053
【図４３】
0006684706.tif 000054
【配列表】
0006684706000001.app