(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水酸基含有生分解性高分子と水酸基含有リン酸カルシウム化合物とによりイソシアネートを介して形成された複合体であって、
該イソシアネートがイソシアネート基を１分子中に２個以上有しており、該イソシアネートの１のイソシアネート基と、該水酸基含有生分解性高分子の水酸基とがウレタン結合を形成し、かつ、該イソシアネートの他のイソシアネート基と、該水酸基含有リン酸カルシウム化合物の水酸基とがウレタン結合を形成していて、そして
該イソシアネートがポリメリックメチレンジフェニルジイソシアネートである、複合体。
【請求項２】
水酸基含有生分解性高分子がポリ（Ｌ−乳酸）である、請求項１記載の複合体。
【請求項３】
水酸基含有リン酸カルシウム化合物が水酸アパタイトである、請求項１又は２記載の複合体。
【請求項４】
水酸基含有リン酸カルシウム化合物が多孔体である、請求項１〜３のいずれか１項記載の複合体。
【請求項５】
ポリオール型生分解性オリゴマーと水酸基含有リン酸カルシウム化合物とによりイソシアネートを介して形成された複合体であって、該イソシアネートがイソシアネート基を１分子中に２個以上有しており、該イソシアネートの１のイソシアネート基と、該ポリオール型生分解性オリゴマーの水酸基とがウレタン結合して、オリゴマーが鎖長伸長していて、かつ、該イソシアネートの他のイソシアネート基と、該水酸基含有リン酸カルシウム化合物の水酸基とがウレタン結合している複合体。
【請求項６】
水酸基含有生分解性高分子と水酸基含有リン酸カルシウム化合物とをイソシアネートを介して結合させる工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の複合体の製造方法。
【請求項７】
（工程１）イソシアネートのイソシアネート基と水酸基含有リン酸カルシウム化合物の水酸基とをウレタン結合させることによりイソシアネート−水酸基含有リン酸カルシウム化合物複合体を得る工程；及び
（工程２）工程１で得られた複合体のイソシアネート部分のイソシアネート基とポリオール型生分解性オリゴマーの水酸基とをウレタン結合させて鎖長伸長させる工程
を含む、請求項５記載の複合体の製造方法。
【請求項８】
水酸基含有リン酸カルシウム化合物が多孔体である、請求項６又は７記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項記載の複合体を含む、人工骨材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水酸基含有生分解性高分子と水酸基含有リン酸カルシウム化合物との間の接着性が高い複合体、ならびにその複合体の製法及び人工骨材料としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の骨疾患の増加に伴い、医療目的に合致した人工骨材料の開発が注目を集めている。人工骨材料としては、高強度である金属材料が多く用いられてきたが、金属と骨では特性が異なるため、生体が自身の身体の一部と認識せず、10〜20年の間に劣化が進行する。そのため、人工骨材料として、骨の無機成分であり生体親和性のある材料である水酸アパタイトなどのバイオセラミックスを応用する例が1985年を境に急増している。
【０００３】
人工骨として開発が手がけられてきた主なバイオセラミックスとして、アルミナ（Al2O3）、ジルコニア（ZrO2）などの生体不活性セラミックス；水酸アパタイト、バイオガラス、及び結晶化ガラスＡ−Ｗなどの生体活性セラミックス；β-リン酸三カルシウム（Ca3(PO4)2）及び炭酸カルシウム（CaCO3）などの生体吸収性セラミックスなどが挙げられる。しかし、これらバイオセラミックスを人工骨などの骨材料として使用するには、剛直さの改善、すなわち弾性率を低下させ、靱性を向上させることが求められている。しかし、このような性質の改善にはセラミックス単独では困難であるので、有機材料、特に高分子材料との複合化を行うことで材料同士の機械的特性を活かした改善を図ることが現在進められている。
【０００４】
例えば、水酸アパタイトは、高い骨伝導能及び骨接合性を有するなど、骨充填材として優れた性質を有しているものの、硬く脆いことから単独での荷重部位への応用は困難とされていた。
そのため、水酸アパタイトに柔軟性を有する高分子材料を複合化させ、機械的特性を高める手法が注目されている。中でも、ポリ乳酸のような生分解性高分子は、優れた生体適合性を有し、生体内において徐々に無毒な低分子へ分解されることから、水酸アパタイトとの複合化に広く用いられている。
例えば、リパーゼを触媒に用い、気孔率40%の多孔性水酸アパタイト中においてＬ−ラクチドのin situ重合を行い、ポリ（Ｌ−乳酸）／水酸アパタイト複合体を作製したことが報告されている（非特許文献１）。こうして作製された複合体は人工骨材料として注目されている。
【０００５】
このような複合体では、ポリ（Ｌ−乳酸）が生体内で加水分解されて骨芽細胞と入れ替わることにより、複合体と自家骨とが一体化するが、ポリ（Ｌ−乳酸）と水酸アパタイトとの間の接着性が低いと、生体中で骨芽細胞と入れ替わる前にポリ（Ｌ−乳酸）と水酸アパタイトとの解離が生じてしまうこと、それに伴い複合体の機械的特性が低下することが問題であった。
そのような問題を解決するため、多水酸化開始剤を用いることで、ポリ（Ｌ−乳酸）と水酸アパタイトの界面接着性を向上させたポリ（Ｌ−乳酸）／水酸アパタイト複合体の作製が報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】杉山奈未他：人工骨材料への応用を目指したポリ（Ｌ−乳酸）/水酸アパタイト複合体のin situ合成，高分子論文集(Kobunshi Ronbunshu), Vol. 70, No. 5, pp. 185-192 (May, 2013)
【非特許文献２】佐藤信吾他：2015年第5回CSJ化学フェスタ(2015年10月13-15日)、タワーホール船堀，ポスター(P6-110)，多水酸化開始剤を用いたPLLA/HAp複合体の作製と評価(III)−界面接着性の改善−，予稿集発行日（web）2015年9月24日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、人工骨材料として有用である、水酸基含有生分解性高分子と水酸基含有リン酸カルシウム化合物との間の接着性が高い水酸基含有生分解性高分子／水酸基含有リン酸カルシウム化合物複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討の結果、水酸基含有生分解性高分子及び水酸基含有リン酸カルシウム化合物の両方に相互作用するイソシアネートを架橋剤として使用することによって、水酸基含有生分解性高分子と水酸基含有リン酸カルシウム化合物との間の接着性が向上することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、水酸基含有生分解性高分子と水酸基含有リン酸カルシウム化合物とによりイソシアネートを介して形成された複合体に関する。
また、本発明は、水酸基含有生分解性高分子と水酸基含有リン酸カルシウム化合物とをイソシアネートを介して結合させることを含む、前記複合体の製造方法にも関する。
さらに、本発明は、前記複合体を含む人工骨材料にも関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の複合体は、水酸基含有生分解性高分子と水酸基含有リン酸カルシウム化合物との界面接着性に優れており、また、生体適合性及び機械的特性にも優れている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】CDCl3中のHD-OLLA-1の1H NMRスペクトルを示す。
【図２】CDCl3中のHD-OLLA-1の拡大1H NMRスペクトルを示す。
【図３】HD-OLLA-1のFT-IRスペクトルを示す。
【図４】HD-OLLA-1のTG曲線を示す。
【図５】HD-OLLA-1のDSC曲線（２回目の加熱）を示す。
【図６】CDCl3中のPDI-PLLA-2の1H NMRスペクトルを示す。
【図７】CDCl3中のPDI-PLLA-2の拡大1H NMRスペクトル（6.6-7.0 ppm）を示す。
【図８】CDCl3中のPMDI-PLLA-2の1H NMRスペクトルを示す。
【図９】CDCl3中のPMDI-PLLA-2の拡大1H NMRスペクトル（6.6-7.0 ppm）を示す。
【図１０】HD-OLLA及びPDI-PLLA-2のFT-IRスペクトルを示す。
【図１１】HD-OLLA及びPMDI-PLLA-2のFT-IRスペクトルを示す。
【図１２】PDI-PLLA-2のTG曲線を示す。
【図１３】PMDI-PLLA-2のTG曲線を示す。
【図１４】PDI-PLLA-2のDSC曲線を示す。
【図１５】PMDI-PLLA-2のDSC曲線を示す。
【図１６】CDCl3中のPMDI-PLLA/HAp-2中のPMDI-PLLAの1H NMRスペクトルを示す。
【図１７】CDCl3中のPMDI-PLLA/HAp-2中のPMDI-PLLAの拡大1H NMRスペクトルを示す。
【図１８】PMDI-PLLA/HAp-2のFT-IRスペクトル（ATR法）を示す。
【図１９】(a) HD-OLLA-1及び (b) PMDI-PLLA/HAp-2のFT-IRスペクトル（ATR法）を示す。
【図２０】(a) HD-OLLA-1及び (b) PMDI-PLLA/HAp-2の拡大FT-IRスペクトル（ATR法）を示す。
【図２１】PMDI-PLLA/HAp-2のSEM画像を示す。
【図２２】PMDI-PLLA/HAp-2のTG曲線を示す。
【図２３】PMDI-PLLA/HAp-2のDSC曲線を示す。
【図２４】p-HAp及びPMDI-PLLA/HAp-1〜3の機械特性(n=5)を示すグラフである。
【図２５】37℃でのPBS浸漬時間の関数としてPLLA/HAp複合体及びPMDI-PLLA/HAp-2の曲げ強度(n=3)を示すグラフである。
【図２６】37℃でのPBS浸漬時間の関数としてPLLA/HAp複合体及びPMDI-PLLA/HAp-2の曲げ強度(n=3)の変化率％を示すグラフである。
【図２７】37℃でのPBS浸漬時間の関数としてPLLA/HAp複合体及びPMDI-PLLA/HAp-2の重量変化率％(n=3)を示すグラフである。
【図２８】PBS浸漬後のPMDI-PLLA/HAp-2中のPLLAの分子量の変化(n=3)を示すグラフである。
【図２９】PMDI-PLLA/HAp-2上でのMC3T3-E1細胞の短期増殖曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の複合体では、水酸基含有生分解性高分子と水酸基含有リン酸カルシウム化合物とが、イソシアネートを介して複合化している。詳細には、本発明の複合体では、イソシアネートのイソシアネート基と、水酸基含有生分解性高分子の水酸基とがウレタン結合を形成し、また、該イソシアネートの他のイソシアネート基と、水酸基含有リン酸カルシウム化合物の水酸基とがウレタン結合を形成している。
例えば、本発明の複合体は、下記式：
ＣＰ−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＩＳＯ−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−ＰＯＬ
（式中、ＣＰは水酸基含有リン酸カルシウム化合物残基を表し；
ＩＳＯはイソシアネート残基を表し；
ＰＯＬは水酸基含有生分解性高分子残基を表す）
で表され得る。
なお、水酸基含有リン酸カルシウム化合物残基は、水酸基含有リン酸カルシウム化合物においてイソシアネートとのウレタン結合に関与した水酸基を除いた部分構造を意味し、イソシアネート残基は、イソシアネートにおいて水酸基含有リン酸カルシウム化合物及び水酸基含有生分解性高分子とのウレタン結合に関与したイソシアネート基を除いた部分構造を意味し、水酸基含有生分解性高分子残基は、水酸基含有生分解性高分子においてイソシアネートとのウレタン結合に関与した水酸基を除いた部分構造を意味する。
【００１２】
本発明の水酸基含有生分解性高分子は、水酸基（−OH基）を有している、生分解性の高分子化合物であれば、特に制限されない。本発明の水酸基含有生分解性高分子は、代表的には、脱水縮合という反応系で高分子化され、そのため構造単位が加水分解可能な結合で繋がれ、生体によって代謝される構造を有している。本発明の水酸基含有生分解性高分子は、例えば、人工骨材料に用いられる場合、骨芽細胞によって新たな骨組織が形成されると不要になるから、骨形成と同時に分解するような材料、例えば、生体内で分解する非酵素分解型が好ましい。すなわち、非酵素分解型の水酸基含有生分解性高分子は、水と接触することにより、特に酵素の助けを借りることなく、徐々に加水分解されてオリゴマー又はモノマーとなり、生体内で体液によって非特異的に加水分解を受けることが可能となるので、生体内に埋入しても、やがて消滅して残留、蓄積を生じない点で好ましい。
なお、本発明の水酸基含有生分解性高分子は、以下の４つの条件を有するのが好ましい。
(1)  免疫原性、毒性を持たない
(2)  適度な分解速度を有する
(3)  分解して生ずるオリゴマーや低分子が毒性を示さずに代謝・排出される
(4)  加工しやすく適度な力学特性を有する
【００１３】
このような非酵素分解型の水酸基含有生分解性高分子は、生体吸収性高分子とも呼ばれるが、例えば、脂肪族ポリエステル及びポリカーボネートなどの合成高分子で、水酸基を有しているもの、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、水酸基の導入により修飾された合成高分子、ならびにこれらのブロック共重合体及びランダム共重合体などの共重合体などが挙げられる。このような共重合体として、乳酸とグリコール酸との共重合体、例えば、ポリ（ラクチド−co−グリコリド）共重合体、及び乳酸とカプロラクトンとの共重合体などが例示される。
上記の水酸基の導入により修飾された合成高分子として、例えば、ポリ−ε−カプロラクトン（PCL）などのポリラクトン、ポリジオキサノン、ポリアミノ酸、ポリアンハイドライド、及びポリオルソエステルなどの水酸基を有していない合成高分子であって、合成時に適切な開始剤を使用することにより、水酸基が末端に導入されて修飾されたものが挙げられる。
本発明の非酵素分解型の水酸基含有生分解性高分子として、ポリ乳酸が好ましい。
【００１４】
本発明のポリ乳酸は、乳酸を単位とした、脂肪族ポリエステルの一つであり、生体吸収性高分子として利用され得るものであれば、特に制限されない。
乳酸は光学異性体であるＬ体とＤ体が存在するので、本発明のポリ乳酸も、Ｌ体からなるポリ（Ｌ−乳酸）、Ｄ体からなるポリ（Ｄ−乳酸）、Ｌ体とＤ体とからなるポリ（ＤＬ−乳酸）が存在する。乳酸が光学活性体であることから、本発明のポリ乳酸において、その分子構造は多様となり得る。さらに、本発明のポリ乳酸は、構成単位に占めるＬ体とＤ体の比率により結晶性から非結晶性までの幅広い構造を取り得る。例えば、ポリ（Ｌ−乳酸）とポリ(Ｄ−乳酸)を混合して得られるステレオコンプレックス型ポリ乳酸、乳酸のＤ、Ｌ連鎖が規則的に配列したヘテロタクト構造を有するポリ乳酸、乳酸のＤ、Ｌ連鎖がブロック状に配置したステレオブロック型ポリ乳酸なども、本発明のポリ乳酸に包含される。
光学異性以外にも、ポリ乳酸の環状モノマーであるラクチドは種々の開始剤又は架橋剤を用いた反応及び様々な環状モノマーとの共重合が可能であるため、本発明のポリ乳酸も多様な分子構造を取ることが可能となり、合成に関しても多くの報告が発表されている。
本発明のポリ乳酸は、結晶性に優れるという点で、Ｌ−乳酸、またはＤ−乳酸を単位としたポリ（Ｌ−乳酸）、またはポリ（Ｄ−乳酸）が好ましい。
【００１５】
本発明の水酸基含有生分解性高分子は、公知の方法で製造することができ、例えば、ポリ乳酸の場合、乳酸を縮合重合する方法、又はラクチドを開環重合する方法がある。高分子量のポリ乳酸を得る場合には、ラクチドを開環重合する方法が好ましい。
【００１６】
本発明の水酸基含有リン酸カルシウム化合物は、水酸基（−OH基）を有しているリン酸カルシウム化合物であれば、特に制限されず、例えば、Ca10(PO4)6(OH)2-nXn（式中、nは0又は1を表し、XはF又はClを表す）で表され得る。
本発明の水酸基含有リン酸カルシウム化合物は、導入する水酸基含有生分解性高分子及び架橋剤と相互作用する点が豊富に存在するという点で、Ca10(PO4)6(OH)2で表され得る水酸アパタイトが好ましい。
本発明の水酸基含有リン酸カルシウム化合物は、骨親和性の高さ、細胞の浸潤しやすさ、骨伝導能の高さからバイオマテリアルとして利用され得る。例えば、水酸基含有リン酸カルシウム化合物を人工骨材料として骨欠損部に埋入すると、その表面を新生骨が覆い、破骨細胞による吸収と骨芽細胞による再生が繰り返され、長い時間をかけて自家骨に完全に置換される。そのため、水酸基含有リン酸カルシウム化合物は、再手術による取り出しが不要な人工骨材料として有用である。
歯や骨の主成分はＣａやＰであるが、そのほかにも様々なイオンが含まれており、炭酸イオンやマグネシウム、ナトリウムなどが挙げられる。そのため、本発明の水酸基含有リン酸カルシウム化合物のCa2+、PO43-、及びOH-サイトには、これらの微量な元素が置換していてもよい。したがって、本発明の水酸基含有リン酸カルシウム化合物は、下記式：
[(Ca)10-lMl][(PO4)6-mZm][(OH)2-nXn]
（式中、
ｌは0〜9のいずれかの整数を表し；
ｍは0〜5のいずれからの整数を表し；
ｎは0又は1、好ましくは0を表し；
Ｍは、それぞれ独立して、例えば、Na、Mg、Ba、K、Zn、又はAlを表し；
Ｚは、それぞれ独立して、例えば、SO4又はCO3を表し；
Ｘは、それぞれ独立して、例えば、F又はClを表す）
でも表され得る。
【００１７】
本発明の水酸基含有リン酸カルシウム化合物は公知の方法で製造することができる。例えば、水酸アパタイトの合成法として、三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、及び水を1000℃以上で反応させる固相反応法；塩素アパタイトの元素置換を1000℃以上で行わせる転化反応法；300〜700℃の水熱条件下で結晶育成を行う水熱反応法；ブルッシャイトを水中で沸騰加熱するリフラックス法；ブルッシャイトや三リン酸カルシウムを100℃以下で加水分解しアパタイトに転換する加水分解法；及びカルシウム塩水溶液とリン酸塩水溶液を混合しpH8〜10の塩基性条件下で反応させる沈殿反応法などが挙げられる。
【００１８】
本発明の水酸基含有リン酸カルシウム化合物は繊維状又は多孔体であることができる。
繊維状の水酸基含有リン酸カルシウム化合物は、公知の方法で製造することができ、例えば、繊維状の水酸アパタイトは、pHを塩基性条件下に置き、硝酸カルシウムとリン酸水素二アンモニウムをCa／P比が1.67になるように水溶液を作製し、80℃で24時間、90℃で72時間加熱し、結晶を成長させる均一沈殿法によって得ることができる。これはＸ線の回折によりｃ軸方向に結晶の繊維が伸長した形状であることは認められている。
多孔体の水酸基含有リン酸カルシウム化合物も、公知の方法で製造することができ、例えば、繊維状の水酸基含有リン酸カルシウム化合物を加圧成形するなどして製造することができる。
本発明では、水酸基含有リン酸カルシウム化合物の多孔体が、その孔の中で本発明の水酸基含有生分解性高分子とイソシアネートを介して結合していることで、優れた生体適合性と機械的特性を有する人工骨材料を提供し得る点で、好ましい。
【００１９】
本発明のイソシアネートは、水酸基含有生分解性高分子と水酸基含有リン酸カルシウム化合物との架橋剤として使用できるものであれば、特に制限されず、例えば、イソシアネート基（−NCO基）を１分子中に２個以上有しているものが挙げられる。そのようなイソシアネートとしては、例えば、メチレンジフェニルジイソシアネート（MDI）、フェニレンジイソシアネート（好ましくは1,4−フェニレンジイソシアネート）、ポリメリックメチレンジフェニルジイソシアネート（PMDI）、トリレンジイソシアネート（TDI）、リジンジイソシアネート（LDI）、水添トリレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート（HDI）、キシリレンジイソシアネート（XDI）、水添キシリレンジイソシアネート、ナフチレンジイソシアネート（NDI）、ビフェニレンジイソシアネート、2,4,6−トリイソプロピルフェニルジイソシアネート（TIDI）、ジフェニルエーテルジイソシアネート、トリジンジイソシアネート（TODI）、イソホロンジイソシアネート（IPDI）、4,4’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート（HMDI）、テトラメチルキシリレンジイソシアネート（TMXDI）、2,2,4−トリメチルヘキサメチレンジイソシアネート（TMHDI）、1,12−ジイソシアネートドデカン（DDI）、ノルボルナンジイソシアネート（NBDI）、2,4−ビス−（8−イソシアネートオクチル）−1,3−ジオクチルシクロブタン（OCDI）、及び2,2,4(2,4,4)−トリメチルヘキサメチレンジイソシアネート（TMDI）などが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
好ましくは、沸点、融点が適切で、取扱いが容易であるという点から、1,4−フェニレンジイソシアネート及びポリメリックメチレンジフェニルジイソシアネートが挙げられ、特にポリメリックメチレンジフェニルジイソシアネートが挙げられる。
【００２０】
本発明の複合体は、水酸基含有生分解性高分子と水酸基含有リン酸カルシウム化合物とを、イソシアネートを介して結合させることで製造することができる。詳細には、本発明の複合体は、イソシアネートのイソシアネート基と、水酸基含有生分解性高分子の水酸基とをウレタン結合させ、該イソシアネートの他のイソシアネート基と、水酸基含有リン酸カルシウム化合物の水酸基とをウレタン結合させることで製造することができる。
例えば、以下のＡ法又はＢ法で、本発明の複合体を製造することができる。
すなわち、Ａ法は、
（工程１）イソシアネートのイソシアネート基と水酸基含有生分解性高分子の水酸基とをウレタン結合させることによりイソシアネートと水酸基含有生分解性高分子との複合体（イソシアネート−水酸基含有生分解性高分子複合体）を得る工程；及び
（工程２）工程１で得られた複合体のイソシアネート部分のイソシアネート基と水酸基含有リン酸カルシウム化合物の水酸基とをウレタン結合させる工程
を含む、本発明の複合体の製造方法である。
Ｂ法は、
（工程１）イソシアネートのイソシアネート基と水酸基含有リン酸カルシウム化合物の水酸基とをウレタン結合させることによりイソシアネートと水酸基含有リン酸カルシウム化合物との複合体（イソシアネート−水酸基含有リン酸カルシウム化合物複合体）を得る工程；
（工程２）工程１で得られた複合体のイソシアネート部分のイソシアネート基と水酸基含有生分解性高分子の水酸基とをウレタン結合させる工程
を含む、本発明の複合体の製造方法である。
【００２１】
あるいは、本発明の複合体は、前述の方法で、水酸基含有生分解性高分子の代わりにポリオール型生分解性オリゴマーを使用して、イソシアネート基と当該ポリオール型生分解性オリゴマーの水酸基とをウレタン結合させて、オリゴマーを鎖長伸長させることで製造することもできる。この場合、得られた複合体はポリオール残基を含み得る。したがって、本発明の複合体はポリオール残基を含んでいてもよい。ここで、ポリオール残基とは、ポリオールにおいて、生分解性オリゴマーとの結合に関与した水酸基の水素原子を除いた部分構造を意味し、例えば、ポリオールをQ-(OH)aで表した場合、そのポリオール残基は、例えば、−Qb−Q−(OH)a-bで表すことができる（式中、Qはポリオールの骨格又は主鎖を表し、a及びbはそれぞれ独立して２以上の整数であり、a≧bである）で表され得る。
例えば、以下のＣ法又はＤ法で、本発明の複合体を製造することができる。
すなわち、Ｃ法は、
（工程１）イソシアネートのイソシアネート基とポリオール型生分解性オリゴマーの水酸基とをウレタン結合させて、オリゴマー部分を鎖長伸長させることによりイソシアネート−水酸基含有生分解性高分子複合体を得る工程；
（工程２）工程１で得られた複合体のイソシアネート部分のイソシアネート基と水酸基含有リン酸カルシウム化合物の水酸基とをウレタン結合させる工程
を含む、本発明の複合体の製造方法である。
Ｄ法は、
（工程１）イソシアネートのイソシアネート基と水酸基含有リン酸カルシウム化合物の水酸基とをウレタン結合させることによりイソシアネート−水酸基含有リン酸カルシウム化合物複合体を得る工程；及び
（工程２）工程１で得られた複合体のイソシアネート部分のイソシアネート基とポリオール型生分解性オリゴマーの水酸基とをウレタン結合させて鎖長伸長させる工程
を含む、本発明の複合体の製造方法である。
【００２２】
本発明の複合体の製造方法は、Ｄ法が好ましく、特に水酸基含有リン酸カルシウム化合物が多孔体であるＤ法が好ましい。とりわけ、水酸基含有リン酸カルシウム化合物の多孔体の孔中において行われるＤ法が好ましい。
【００２３】
本発明においてポリオール型生分解性オリゴマーとは、ポリオールの水酸基と生分解性オリゴマーの−COOH基などの官能基とがエステル結合などの結合をしたもので、水酸基（−OH基）を有していれば、特に制限されない。
【００２４】
前記のポリオールとして、ヘキサンジオール、例えば1,6−ヘキサンジオール、シクロヘキサンジオール、例えば1,4−シクロヘキサンジオール、エリスリトール、例えばmeso-エリスリトール、イノシトール、例えばmyo-イノシトールなどが例示される。好ましくは、ヘキサンジオール、特に1,6−ヘキサンジオールである。
【００２５】
前記の生分解性オリゴマーは、生分解性のオリゴマーであれば、特に制限されない。前記の生分解性オリゴマーは、代表的には、脱水縮合という反応系でオリゴマー化され、そのため構造単位が加水分解可能な結合で繋がれ、生体によって代謝される構造を有している。前記の生分解性オリゴマーは、イソシアネートを用いて鎖長伸長されて人工骨材料に用いられる場合、骨芽細胞によって新たな骨組織が形成されると不要になるから、骨形成と同時に分解するような材料、例えば、生体内で分解する非酵素分解型が好ましい。すなわち、非酵素分解型の生分解性オリゴマーは、その鎖長伸長したものが、水と接触することにより、特に酵素の助けを借りることなく、徐々に加水分解されてオリゴマー又はモノマーとなり、生体内で体液によって非特異的に加水分解を受けることが可能となるので、生体内に埋入しても、やがて消滅して残留、蓄積を生じない点で好ましい。
なお、本発明の生分解性オリゴマーは、その鎖長伸長したものが、以下の４つの条件を有するのが好ましい。
(1)  免疫原性、毒性を持たない
(2)  適度な分解速度を有する
(3)  分解して生ずるオリゴマーや低分子が毒性を示さずに代謝・排出される
(4)  加工しやすく適度な力学特性を有する
【００２６】
このような生分解性オリゴマーは、例えば、本発明の水酸基含有生分解性高分子のオリゴマーが挙げられ、例えば、オリゴ乳酸、グリコール酸オリゴマー、ヒドロキシ酪酸オリゴマー、リンゴ酸オリゴマー、水酸基の導入により修飾されたオリゴマー、ならびにこれらのブロックコオリゴマー及びランダムコオリゴマーなどのコオリゴマーなどが挙げられる。このようなコオリゴマーとして、乳酸とグリコール酸とのコオリゴマー、例えば、ポリ（ラクチド−co−グリコリド）コオリゴマー、及び乳酸とカプロラクトンとのコオリゴマーなどが例示される。
上記の水酸基の導入により修飾されたオリゴマーとして、例えば、ε−カプロラクトンオリゴマーなどのラクトンオリゴマー、ジオキサノンオリゴマー、アミノ酸オリゴマー、及びオルソエステルオリゴマーなどの水酸基を有していないオリゴマーであって、合成時に適切な開始剤を使用することにより、水酸基が末端に導入されて修飾されたものが挙げられる。
このような生分解性オリゴマーとしてオリゴ乳酸が好ましい。
【００２７】
本発明のポリオール型生分解性オリゴマーとして、ポリオールの水酸基とオリゴ乳酸の−COOH基とがエステル結合したものであるポリオール型オリゴ乳酸が好ましい。このようなポリオール型オリゴ乳酸として、以下のものが例示される。
【化１】
0006744623.tif 000002
【００２８】
ポリオール型生分解性オリゴマーとして、直鎖のポリオール部分の両末端の水酸基にそれぞれ生分解性オリゴマーの−COOH基などの官能基がエステル結合などの結合をしたものが好ましく、特に1,6−ヘキサンジオールの両末端の水酸基と結合した生分解性オリゴマー、とりわけ1,6−ヘキサンジオール−オリゴ乳酸が好ましい。
【００２９】
ポリオール型生分解性オリゴマーは公知の方法で製造することができる。例えば、ポリオール型オリゴ乳酸の場合、前記ポリオールを開始剤に用いて、オクチル酸スズなどの慣用の触媒でラクチドを開環重合させることで得ることができる。例えば、両末端に水酸基を有するジオール型のオリゴ乳酸は、両末端に水酸基を有するジオール、例えば、1,6−ヘキサンジオールを開始剤に用いて、オクチル酸スズなどの慣用の触媒でラクチドを開環重合させることで得ることができる。
【００３０】
本発明の複合体を製造する際、水酸基含有リン酸カルシウム化合物は、繊維状であっても多孔体であってもよいが、優れた生体適合性と機械的特性を有する人工骨材料が得られる点で、多孔体が好ましい。
【００３１】
本発明の人工骨材料は、本発明の複合体を含むが、生体適合性を増すために、他の生体適合性を有する材料、例えば、二相性リン酸カルシウム(BCP)と複合化させたり、表面を被覆させたりすることが好ましい。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３３】
製造例１  繊維状水酸アパタイト（f-HAp）の合成
(1)  試薬
使用した試薬を以下に示す。
・硝酸カルシウム四水和物 Ca(NO3)2・4H2O  （和光純薬工業株式会社  特級）
・リン酸水素二アンモニウム (NH4)2HPO4  （和光純薬工業株式会社  特級）
・尿素 (NH2)2CO  （和光純薬工業株式会社  特級）
・硝酸 HNO3（和光純薬工業株式会社  特級）
※上記の試薬は精製せず、そのまま用いた。
・エタノール C2H5OH  （日本アルコール販売株式会社）
※上記の試薬は常圧蒸留により精製して使用した（b.p.：78℃）。
【００３４】
(2)  合成
合成は、既報（Aizawa, M.; Howell, F, S.; Itatani, K.; Yokogawa, Y.; Nishizawa, K.; Toriyama, M.; Kameyama, T. J. Ceram. Soc. Jpn. 2000, 108, 249；Aizawa, M.; Poter, A, E.; Best, S, M.; Bonfield, W. Biomaterials 2000, 26, 3427）を参考に行った。硝酸カルシウム四水和物39.44 g（0.1670 mol/L）、尿素30.02 g（0.4998 mol/L）をそれぞれ量り取り、ビーカーで精製水に溶解した（溶液１）。リン酸水素二アンモニウム13.20 g（0.09995 mol/L）をビーカーで精製水に溶解したものに、硝酸9 mLを加えて攪拌した(溶液２)。溶液１及び２を1Lの精製水で希釈した。中央に還流冷却管、片側に温度計を取り付けた三つ口セパラブルフラスコ内に試料溶液を入れ、セパラブルフラスコをテフロン（商標）テープで固定し、アルミブロック中で合成を行った。80℃で24時間加熱し、続いて90℃で72時間加熱することによりリン酸オクタカルシウム(OCP)含有f-HApを合成した。合成終了後、セパラブルフラスコ内の側面に付着した硬い粒子を除去して繊維状の柔らかいf-HApをビーカーに移し、精製水400cm3で2回、エタノール400 mLで２回穏やかに攪拌して洗浄し、吸引ろ過により回収した。
【００３５】
製造例２  水酸アパタイト多孔体（p-HAp）の作製
前記製造例１で得たf-HApを細かく裂いて、その1.2 gを量りとり、成形器に入れた。これを15-20MPaで一軸加圧成形し、円板状成形体（直径約20 mm、厚さ約2.0 mm）を作製した。作製した成形体を、光洋サーモシステム社製1700℃ボックス炉KBF314Nを用いて1200℃で5時間焼成し、p-HApを得た。焼成したp-HApは放冷し、室温まで冷却した。焼成条件を以下に示した。
[焼成条件]
焼成温度：1200℃
焼成時間：5時間
昇温、降温速度：10 ℃/min
【００３６】
製造例３  ジオール型オリゴ乳酸の合成
(1)  試薬
使用した試薬を以下に示す。
・ジ(2-エチルヘキサン酸)スズ(II)  （Stannous octoate, Sn(Oct)2；Alfa Aesar technical grade）
※市販品をそのまま用いた。
・トルエン  （和光純薬工業株式会社  特級）
※溶媒精製装置 (ミツワ理化学工業株式会社、Glass Contour)で精製したものをアルゴン置換したのちに使用した。
【００３７】
(2)  合成
【００３８】
【化２】
0006744623.tif 000003
（上記式中、nはそれぞれ独立に約2〜約150である）
【００３９】
合成は既報（Wang, L.; Jing, X.; Cheng, H.; Hu, X.; Yang, L.; Huang, Y. Ind. Eng. Chem. Res. 2012, 51, 10731-10741.；Nakayama, Y.; Yamaguchi, R.; Tsutsumi, C.; Shiono, T. Polym. Degrad. Stabil. 2008, 93, 117-124；Lee, J.; Bae, Y. H.; Sohn, Y. S.; Jeong, B. Biomacromolecules 2006, 7, 1729-1734）を参考に行った（スキーム１）。両末端が水酸基である1,6-ヘキサンジオール−オリゴ乳酸（HD-OLLA）の合成を表１の仕込み比により行った。Ｌ−ラクチド（LLA）、1,6-ヘキサンジオール、オクチル酸スズ（Sn(Oct)2）をグローブボックス内で重合管に仕込んだ後、重合管を真空ラインにつなぎ、真空脱気を4回繰り返して十分反応溶液中の空気を除いたのちに、シェイカーを用いて80℃で24時間加熱撹拌した。重合管内のトルエン溶液中に含まれる白色の副生成物を除去するために孔径0.1μmの疎水性メンブランフィルター(T010A047A)を用いて吸引ろ過を行った。その後、合成したHD-OLLAを含むろ液をメタノールに2回再沈殿を行った。生成した白色沈殿を孔径0.1μmの疎水性メンブランフィルター(T010A047A)を用いて吸引ろ過してサンプル瓶に回収し、40℃で一晩減圧乾燥することで、表１に示すとおりHD-OLLA-1〜5を得た。
【００４０】
【表１】
0006744623.tif 000004
【００４１】
(3)  同定・評価
上で得られたHD-OLLAの同定・評価を以下のとおり行った。
(ア)  1H NMR測定
HD-OLLA-1の1H NMR測定の結果を図１及び２に示した。HD-OLLAの(a)-(e)に起因するピークを観察した。積分比の実測値は理論値と一致した。図１より、4.35 ppmに末端OH基に隣接するメチン基に起因するピークを観察した。図２においてピーク(c)は1,6-ヘキサンジオールで観察された3.75 ppm付近（データは示さない）から4.13 ppm付近にシフトしたことから、1,6-ヘキサンジオールはオリゴ乳酸と結合していることがわかった。
【００４２】
HD-OLLA-1〜5は、いずれも以下の構造式で表され、nが異なる、すなわち分子量が異なるだけである。
【化３】
0006744623.tif 000005
（式中の(a)-(e)はそれぞれ1H NMRスペクトル中のピークに対応し；nはそれぞれ独立に約2〜約150である）
【００４３】
(イ)  FT-IR測定
HD-OLLA-1のFT-IR測定の結果を図３に示した。帰属は表２に示した。3,020-2,920 cm-1にC-H伸縮振動、1,740 cm-1にC=O伸縮振動、1,450及び1,360 cm-1にC-H変角振動、1,180-1,050 cm-1にC-O伸縮振動に起因するピークを観察した。これより、HD-OLLAの合成を確認した。
【００４４】
【表２】
0006744623.tif 000006
【００４５】
(ウ)  ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）測定
HD-OLLA-1〜5のGPC測定の結果を表３に示す。重量平均モル質量（Mw）が5,000 gmol-1程度、分散度（Mw / Mn）が1.12-1.17となり、分子量の制御が可能であった。なお、Mnは数平均分子量を表す。
【００４６】
【表３】
0006744623.tif 000007
【００４７】
(エ)  示差熱熱重量同時測定（TG-DTA測定）
図４にHD-OLLA-1のTG-DTA測定の結果を示す。HD-OLLA-1の熱分解温度は222℃であった。
【００４８】
(オ)  示差走査熱量（DSC）測定
HD-OLLA-1のDSC測定の結果を図５に示した。HD-OLLA-1の結晶化エンタルピーは-35.5mJmg-1、融解エンタルピーは14.2 mJmg-1であり、結晶化度は20.9%であった。
【００４９】
なお、本発明において、結晶化度は、既報（辻秀人、筏義人, ポリ乳酸 -医療・製剤・環境のために-, 株式会社高分子刊行会, 1997, 37, 64, 65）に従い、DSC測定より以下の式で求めた。
【数１】
0006744623.tif 000008
Xc：結晶化度(%)
ΔHc：結晶化エンタルピー (J g-1)
ΔHm：融解エンタルピー (J g-1)
ΔHm(100%)：完全結晶融解エンタルピー
CPLLA: 複合体中のPLLA導入率 (%)
これより、ΔHmの理論値であるポリ（Ｌ−乳酸）（PLLA）のΔHm(100%)は、既報（Kobayashi, A.; Uyama, H.; Ohmae, M. Bull. Chem. Soc. Jpn. 2001, 74, 613）により93 mJ mg-1 である。これを用いて結晶化度を算出した。
【００５０】
製造例４  イソシアネート−ポリ（Ｌ乳酸）複合体
(1)  試薬
使用した試薬を以下に示す。
・1,4-フェニレンジイソシアネート (東京化成工業株式会社)
※市販品をそのまま用いた。
・ポリメリックメチレン ジフェニルジイソシアネート (Ardrich)
※市販品をそのまま用いた（Mw=1,000、Mw/Mn=1.55）。
【００５１】
(2)  合成
【００５２】
【化４】
0006744623.tif 000009
（上記式中、nはそれぞれ独立に約2〜約150であり、mはそれぞれ独立に約5〜約15であり、合成条件によっては、100程度まで可能である）
【００５３】
【化５】
0006744623.tif 000010
（上記式中、nはそれぞれ独立に約2〜約150であり、mはそれぞれ独立に約5〜約15であり、合成条件によっては、100程度まで可能である）
【００５４】
イソシアネートとして1,4-フェニレンジイソシアネート(PDI)及びポリメリックメチレン ジフェニルジイソシアネート(PMDI)をそれぞれ用いたHD-OLLAの鎖長伸長による1,4-フェニレンジイソシアネート−ポリ（Ｌ−乳酸）複合体（PDI-PLLA）及びポリメリックメチレン ジフェニルジイソシアネート−ポリ（Ｌ−乳酸）複合体（PMDI-PLLA）の製造を行った（スキーム２及び３）。グローブボックス内で10mLナスフラスコに製造例３の方法に従って得た、Mnが4100〜4700、Mwが4800〜5300の範囲のHD-OLLAを加え、アルミブロック180℃でHD-OLLAが完全に融解するまで攪拌した。その後、PDI又はPMDIを加え、10分間加熱撹拌を行うことで鎖長伸長を行った。仕込み比を表４に示した。得られた複合体をクロロホルムに溶解させた後にメタノールに再沈殿した。生成した白色沈殿を孔径0.1μmの疎水性メンブランフィルター(T010A047A)を用いて吸引ろ過してサンプル瓶に回収し、40℃で一晩減圧乾燥することで、表４に示すとおりPDI-PLLA-1〜2及びPMDI-PLLA-1〜2を得た。
【００５５】
【表４】
0006744623.tif 000011
【００５６】
(3)  同定・評価
上で得られたPDI-PLLA又はPDI-PLLAの同定・評価を以下のとおり行った。
(ア)  1H NMR測定
PDI-PLLA-2の1H NMRの結果を図６及び７に示す。HD-OLLA由来の(a)-(c)のピークが観察された。既報（Balaji, S.; Sharad, P. Adv. Mat. Lett. 2012, 3, 161-171）より、芳香環と結合したウレタン結合のN-Hに起因するピークは6.7-6.8 ppm付近に観察されることが報告されている。図７においてPDI-PLLA-2のウレタン結合に起因するピーク(d)が観察されたことからPDI-PLLAの合成を確認した。
【００５７】
PDI-PLLA-1及び2は、いずれも以下の構造式で表され、n又はmが異なる、すなわち分子量が異なるだけである。
【化６】
0006744623.tif 000012
（式中の(a)〜(d)はそれぞれ1H NMRのスペクトル中のピークに対応し、nはそれぞれ独立に約2〜約150であり、mはそれぞれ独立に約5〜約15であり、合成条件によっては、100程度まで可能である）
【００５８】
PMDI-PLLA-2の1H NMRの結果を図８及び９に示す。HD-OLLA由来の(a)-(c)のピークに加え、6.8 ppm付近にPMDI-PLLA-2のウレタン結合に起因するピーク(e)が観察されたことからPMDI-PLLAの合成を確認した。
【００５９】
PMDI-PLLA-1及び2は、以下の構造式で表され、n又はmが異なる、すなわち分子量が異なるだけである。
【化７】
0006744623.tif 000013
（式中の(a)〜(e)はそれぞれ1H NMRのスペクトル中のピークに対応し、nはそれぞれ独立に約2〜約150であり、mはそれぞれ独立に約5〜約15であり、合成条件によっては、100程度まで可能である）
【００６０】
(イ)  FT-IR測定
PDI-PLLA-2及び比較としたその合成に使用したHD-OLLAのFT-IR測定の結果を図１０に、帰属は表５に示した。帰属は既報（Irusta, L.; Iruin, J. Vib. Spectroc. 2005, 39, 144-150）を参考に行った。PDI-PLLA-2のウレタン結合に起因するN-H伸縮振動のピークを3,400-3,300 cm-1に、N-H変角振動のピークを1,530 cm-1付近に観察した。HD-OLLAに起因するC-H伸縮振動のピークを3,000-2,960 cm-1に、C=O伸縮振動のピークを1,750 cm-1に、C-H変角振動のピークを1,450及び1,360 cm-1に、C-O伸縮振動のピークを1,180-1,080 cm-1に観察した。これより、PDIによるHD-OLLAの鎖長伸長を確認した。
【００６１】
【表５】
0006744623.tif 000014
【００６２】
PMDI-PLLA-2及び比較としたその合成に使用したHD-OLLAのFT-IR測定の結果を図１１に、帰属は表６に示した。PMDI-PLLA-2のウレタン結合に起因するN-H伸縮振動のピークを3,400-3,300 cm-1に、N-H変角振動のピークを1,530 cm-1 付近に観察した。HD-OLLAに起因するC-H伸縮振動のピークを3,000-2,960 cm-1に、C=O伸縮振動のピークを1,750 cm-1に、C-H変角振動のピークを1,450及び1,360 cm-1に、C-O伸縮振動のピークを1,180-1,080 cm-1に観察した。これより、PMDIによるHD-OLLAの鎖長伸長を確認した。
【００６３】
【表６】
0006744623.tif 000015
【００６４】
(ウ)  ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）測定
PDI-PLLA-1及び-2ならびにPMDI-PLLA-1及び2のGPC測定の結果を表７に示す。いずれのサンプルにおいても、合成に用いたHD-OLLAの分子量よりも大きい分子量となっていたため、HD-OLLAの鎖長伸長が確認された。PDIを用いて合成したサンプルはPMDIを用いたサンプルと比較して分子量が大きい傾向にあった。
【００６５】
【表７】
0006744623.tif 000016
【００６６】
(エ)  示差熱熱重量同時測定（TG-DTA測定）
図１２にPDI-PLLA-2のTG-DTA測定の結果を示す。PDI-PLLA-2の熱分解温度は241℃であり、HD-OLLAと比較して上昇した。
また、図１３にPMDI-PLLA-2のTG-DTA測定の結果を示す。PMDI-PLLA-2の熱分解温度は251℃であり、HD-OLLAと比較して上昇した。
【００６７】
(オ)  示差走査熱量（DSC）測定
PDI-PLLA-2のDSC測定を行い、測定結果を図１４に示した。この測定結果より、製造例３の項目(3)(オ)の場合と同様に、PDI-PLLA-2の結晶化度（Xc）を式（1）より求めた。結晶化度と合わせて融点（Tm）及びガラス転移温度（Tg）をまとめたものを表８に示した。
【００６８】
【表８】
0006744623.tif 000017
【００６９】
PMDI-PLLA-2のDSC測定を行い、測定結果を図１５に示した。この測定結果より、製造例３の項目(3)(オ)の場合と同様に、PMDI-PLLA-2の結晶化度（Xc）を式（1）より求めた。結晶化度と合わせて融点（Tm）及びガラス転移温度（Tg）をまとめたものを表９に示した。
【００７０】
【表９】
0006744623.tif 000018
【００７１】
製造例５  イソシアネート−水酸アパタイト複合体の作製
(1)  試薬
使用した試薬を以下に示す。
・Tetrahydrofran Super dehydrated (THF 超脱水) (和光純薬工業株式会社、有機合成用)
※市販品をそのまま使用した。
【００７２】
(2)  作製
製造例２で得たp-HAp内にイソシアネートを導入した。イソシアネートは吸湿性が高いため、グローブボックス内で50mLのナス形フラスコ内にイソシアネートを超脱水THFに溶解させたものを入れ、得られたイソシアネート溶液中にp-HApを浸漬した。そのナス型フラスコを真空ライン内で液体窒素を用いて凍結し、10-2 Torrまで真空引きを行った。その後、フラスコ内のイソシアネート溶液を融解した。この操作を3回繰り返すことにより、p-HAp内にイソシアネート溶液を導入した。その後、減圧乾燥することで、表１０に示すとおりのPDI-HAp-1〜3及びPMDI-HAp-1〜3を作製した。仕込み比は表１０に示した。
【００７３】
【表１０】
0006744623.tif 000019
【００７４】
製造例６  イソシアネート−ポリ（Ｌ−乳酸）／水酸アパタイト複合体の作製
(1)  作製
製造例３の方法に従って得た、Mwが4900〜5400で、Mw/Mnが1.10〜1.19の範囲のHD-OLLAを、製造例５で得たPDI-HAp-1〜3及びPMDI-HAp-1〜3内に導入し、加熱処理を行うことで、1,4-フェニレンジイソシアネート−ポリ（Ｌ−乳酸）／水酸アパタイト（PDI-PLLA/HAp）複合体及びポリメリックメチレン ジフェニルジイソシアネート−ポリ（Ｌ−乳酸）／水酸アパタイト（PMDI-PLLA/HAp）複合体を作製した。すなわち、真空ラインを用いて50mLナスフラスコ内で上記HD-OLLAを上記イソシアネート−水酸アパタイト複合体内に導入した。ナスフラスコを真空ライン内で液体窒素を用いて凍結させた後、10-4 Torrまで真空引きを行った。その後、ナスフラスコ内のHD-OLLAを溶融させた。この操作を3回繰り返すことにより、各イソシアネート−水酸アパタイト複合体内にHD-OLLAを導入し、窒素雰囲気下、180℃で10分間塊状重合することにより表１１に示すとおりPDI-PLLA/HAp-1〜3及びPMDI-PLLA/HAp-1〜3の複合体を作製した。仕込み比及び反応条件は表１１に示した。
【００７５】
【表１１】
0006744623.tif 000020
【００７６】
(2)  同定・評価
上で得られたPMDI-PLLA/HAp複合体の同定・評価を以下のとおり行った。
(ア)  1H NMR測定
図１６にはPMDI-PLLA/HAp-2中のPMDI-PLLAの1H NMRの測定結果、図１７にはその拡大した結果を示す。製造例４の結果から、PMDIとHD-OLLAが反応し、ウレタン結合を形成すると6.8ppm付近にウレタン結合のプロトンに起因するピークが観察される。図１７より、PMDI-PLLA/HAp-2中のPMDI-PLLAにおいても、ウレタン結合のプロトンに起因するピークが観察されたため、複合体におけるPMDI-PLLAの合成が確認された。
【００７７】
(イ)  FT-IR測定
PMDI-PLLA/HAp-2のFT-IR測定（ATR法）の結果を図１８に、帰属は表１２に示した。PMDI-PLLA/HAp-2及び比較としたHD-OLLA-1のFT-IR測定の結果を図１９に、その拡大図を図２０に示した。PMDI-PLLAのウレタン結合に起因するN-H伸縮振動のピークを3,400-3,300 cm-1に、N-H変角振動のピークを1,530 cm-1付近に観察した。HD-OLLAに起因するC-H伸縮振動のピークを3,000-2,960 cm-1に、C=O伸縮振動のピークを1,750 cm-1に、C-H変角振動のピークを1,450及び1,360 cm-1に、C-O伸縮振動のピークを1,180-1,080 cm-1に観察した。これより、PMDIによるHD-OLLAの鎖長伸長を確認した。
なお、ATR法では、サンプルを乳鉢ですり潰したものを測定試料として用いた。
【００７８】
【表１２】
0006744623.tif 000021
【００７９】
(ウ)  走査型電子顕微鏡（SEM）観察
SEM台にカーボン両面テープを貼り、サンプルを貼り付け固定した。JEOL JEC-3000FC AUTO FINE COATERを用いてPt蒸着を行い観察試料とした。装置には走査型電子顕微鏡(SEM) (日立製作所 S-4500)を用いた。
[測定条件]
加速電圧 : 1.0-2.0 kV
測定倍率 : 200, 400, 1000倍
W.D. : 5 cm
プローブ電流 : high
コンデンサレンズ : 1
【００８０】
図２１に、PMDI-PLLA/HAp-2の断面のSEM観察の結果を示した。これよりHAp多孔体中にPMDI-PLLAが充填されていることを確認した。
【００８１】
(エ)  ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）測定
PMDI-PLLA/HAp-1〜3のPMDI-PLLAのGPC測定の結果を表１３に示した。PMDI-PLLA/HAp-1〜3では、いずれの複合体でもHD-OLLAの鎖長伸長が進行しており、PMDI-PLLA/HAp-2において最大の分子量となった。
なお、複合体内のポリマーのPMDI-PLLAの分子量に関しては、複合体の断片をTHFに一晩浸漬しポリマーを溶出させた後に、溶液をサンプレップ (MILLIPORE MillexFH 13, 0.20 μm)をつけたシリンジを用いて濾過し、測定試料として用いた。
【００８２】
【表１３】
0006744623.tif 000022
【００８３】
(オ)  示差熱熱重量同時測定（TG-DTA測定）
表１４、図２２にPMDI-PLLA/HAp-1〜3のTG-DTA測定の結果を示した。なお、図２２にはPMDI-PLLA/HAp-2の結果のみを示した。複合体中のPLLAは500℃以下で全て熱分解するが、HApは残存する。これを利用して、500℃における重量減少率からPMDI-PLLA導入率を算出した。
PMDI-PLLA/HAp-1〜3の熱分解温度（Td）は220℃前後であった。PMDI-PLLAの導入率は10-15%であり、ややばらつきが生じた。これはHD-OLLAの分子量が数千程度であり、溶融しても粘性を有するため、気孔内への導入が難しくなったためである。前述のSEM観察の結果から、p-HAp内がPLLAで充填されている様子を確認できたことから、充填率の減少が複合体に与える影響は小さいと判断した。
【００８４】
【表１４】
0006744623.tif 000023
【００８５】
(カ)  示差走査熱量（DSC）測定
図２３にPMDI-PLLA/HAp-2のDSC測定の結果を示した。これより、製造例３の場合と同様に、各複合体の結晶化度（Xc）を式（1）より算出した。また、PMDI-PLLA/HAp-1〜3中のPLLAの結晶化度とガラス転移温度（Tg）をまとめたものを表１５に示した。
【００８６】
【表１５】
0006744623.tif 000024
【００８７】
試験例１  機械的特性評価
(1)  三点曲げ強度測定
BUEHLER社製 ISOMET（商標）低速切断機を用いて、サンプルを幅2.5 mmに切断し、#600、#1200、#2000の耐水研磨紙（三共理化学株式会社製）で研磨した。その後、エタノールで3分間超音波洗浄を行い、40℃で一晩減圧乾燥した。このサンプルを、A&Dテンシロン万能試験機（RTG-1210）を用いて三点曲げ強度試験を行った。
[測定条件]
クロスヘッドスピード：0.5 mm・min-1
支点間距離：10 mm
ロードセル容量：1 kN
【００８８】
得られた最大荷重より、既報（Aizawa, M.; Howell, F, S.; Itatani, K.; Yokogawa, Y.; Nishizawa K.; Toriyama, M.; Kameyama, Y. J. Ceram. Soc. Japan 2000, 108, 249）に従い、以下の式（2）を用いて三点曲げ強度（σｆ）を求めた。
【数２】
0006744623.tif 000025
σｆ：三点曲げ強度(Pa)
Ｐ：試験片が破壊するまでの最大荷重(N)
Ｓ：三点曲げ支点間距離(m)
Ｂ：試験片の厚さ(m)
Ｗ：試験片の幅(m)
【００８９】
上記で得られた最大荷重と変位から、既報（Aoki, H. Ishiyaku Euro America 1994, 2, 176）に従い、以下の式（3）を用いて曲げ弾性率（Ｅ）を算出した。
【数３】
0006744623.tif 000026
Ｅ：曲げ弾性率(GPa)
ε：歪み
【００９０】
式（2）と式（3）から算出した複合体の三点曲げ強度試験と曲げ弾性率の結果を表１６、図２４に示した。比較としてp-HApの三点曲げ試験と曲げ弾性率の結果も記載した。生体骨に類似した曲げ強度と曲げ弾性率はそれぞれ30-190 Mpa、10-18 GPaである（Sa´nchez, V. B. F.; Mathot, G. V.; Poel, J. L. Macromolecules 2007, 40, 7989-7997）。
PMDI-PLLA/HAp-2において最大の曲げ強度、曲げ弾性率となり、それぞれ54±0.26 MPa、8.9±0.17 GPaであった。曲げ弾性率をp-HApと同程度に保ちながら、曲げ強度を向上させることが可能であった。
【００９１】
【表１６】
0006744623.tif 000027
【００９２】
試験例２  加水分解性試験（接着性試験）
12wellプレートにサンプルを入れ、エチレンオキシドガス(EOG)で滅菌した。測定装置は、全自動酸化エチレンガス滅菌器イオジェルクSA-160 (エルクコーポレーション)を用いた。
[滅菌条件]
コース: B
温度: 40℃
標準トータル時間: 22時間
【００９３】
p-HApを用いて作製した各複合体に関して加水分解性試験を行った。複合体を切断して試験片とし、試験片1つ当たりを12wellのマルチプレート上に置き、PBS 2mLに浸漬させ、7日間37℃、5%CO2を含むインキュベーター内で保管した。1-28日間の浸漬後、試験片をPBSから回収し、室温で一晩減圧乾燥した。PBSは1日置きに交換した。
【００９４】
(1)  三点曲げ強度試験
PBS浸漬後の従来のPLLA/HAp複合体、架橋剤を導入したPMDI-PLLA/HAp-2の三点曲げ強度測定の結果をそれぞれ表１７及び１８ならびに図２５に示す。
図２５において従来のPLLA/HAp複合体は、浸漬1日後にp-HApと同程度まで曲げ強度が低下した。一方で、イソシアネートを架橋剤として導入したPMDI-PLLA/HAp-2においてはPBS浸漬後も曲げ強度を維持することが可能であった。
初期強度の差を除くため、図２６には初期強度を100%として算出した曲げ強度の保持率を示す。
【００９５】
【表１７】
0006744623.tif 000028
【００９６】
【表１８】
0006744623.tif 000029
【００９７】
(2)  重量減少測定(電子天秤、TG-DTA測定)
電子天秤により測定したPBS浸漬前後の各浸漬時間における従来のPLLA/HAp複合体、架橋剤を導入したPMDI-PLLA/HAp-2の重量の測定結果を表１９及び２０ならびに図２７に示す。
従来のPLLA/HAp複合体では、前記の三点曲げ強度試験において観察された機械的強度の低下と同様に、複合体内からのPLLAの流出に伴う重量減少が観察された。一方で、イソシアネートを導入したPMDI-PLLA/HAp-2においては重量減少は観察されなかった。したがって、イソシアネートのPMDIはHApとPLLA界面における架橋剤として機能することが明らかとなった。
【００９８】
【表１９】
0006744623.tif 000030
【００９９】
【表２０】
0006744623.tif 000031
【０１００】
(3)  ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）測定
複合体中のPLLAがHAp気孔内で分解しているか否かを調べるため、GPC測定による複合体中のPLLAの分子量測定を行った。PMDI-PLLA/HAp-2のPBS各浸漬時間に対するMwを表２１、図２８に示す。その結果、PMDI-PLLA/HAp-2においては、分子量の低下がほとんど生じておらず、これが機械的強度を保持した要因であると考えられる。
なお、複合体内のポリマーのPLLAの分子量に関しては、複合体の断片をTHFに一晩浸漬しポリマーを溶出させた後に、溶液をサンプレップ (MILLIPORE MillexFH 13, 0.20 μm)をつけたシリンジを用いて濾過し、測定試料として用いた。
【０１０１】
【表２１】
0006744623.tif 000032
【０１０２】
試験例３  in vitroにおける複合体の生体適合性評価
(1)  試薬
以下の試薬は精製せず、そのまま用いた。
・新生児C57BL/6 (細胞) マウス頭蓋冠由来の骨芽細胞様樹立株 MC3T3-E1
・Minimum Essential Medium Alpha Medium (α-MEM) (GIBCO)
・牛胎児血清(Fetal Bovine Serum, FBS) (GIBCO)
※市販のものを56℃で30分間加熱し、非働化したものを使用した。
・アクチナーゼ(タンパク質分解酵素) (科研製薬株式会社)
・炭酸水素ナトリウム NaHCO3 (和光純薬工業株式会社 和光特級)
・0.25%トリプシン (GIBCO)
【０１０３】
(2)  調製試薬の作製
・α-MEM(+)
正確に超純水1 Lを計りとり、撹拌しながら、Minimum Essential Medium Alpha Medium (α-MEM)粉末を少しずつ添加し、完全に溶解した。そこに炭酸水素ナトリウムを2.2 g加え、完全に溶解した。その後、クリーンベンチ内において、37 ℃に加温した非動化FBSをα-MEM 500 mLに対して55 mL添加し、その溶液をフィルター滅菌することによってα-MEM(+)を調製した。これを培地として用いた。Lot checkは、得られたα-MEM(+)を、6wellマルチウェルプレートに3箇所、各3 mLずつ添加し、37℃、CO2濃度5%のインキュベーター内で24時間静置した後、OLIMPUS製倒立顕微鏡IX70を用いて細菌の感染がないことを確認した。保存は4℃の冷蔵庫で行った。
・PBS(-)
透析膜(Biotech CE tube 20KD, Spectra/Por)の内側、外側の両面を精製水でよく洗浄し、精製水を加えた1 Lビーカーに浸けてスターラーで2時間攪拌した。
塩化ナトリウム(8.00 g)、塩化カリウム(0.20 g)、リン酸水素二ナトリウム(1.15 g)、リン酸二水素カリウム(0.20 g)をそれぞれ測りとり、精製水1 Lに溶解し、リン酸緩衝溶液(PBS)を作製した。
・アクチナーゼ溶液
クリーンベンチ内で、PBS(-)を50 mL量り取り、それをクリーンベンチの外に出した。攪拌しながら、アクチナーゼを0.05 g添加し、完全に溶解した。得られた溶液はテルモ製シリンジとMILIPORE製滅菌済み0.22 μLサンプレップを用いてフィルター滅菌し、50 mL遠沈管に入れて、4℃で保存した。
【０１０４】
(3)  MC3T3-E1細胞の培養方法
[細胞起こし]
50 mLの遠沈管2本に、それぞれα-MEM(+)を10 mL加えた。凍結保存された1.0×106cell mL-1のMC3T3-E1細胞懸濁液を37℃で解凍し、先の遠沈管のうちの1本に1滴ずつ振り混ぜながら加えた。得られた細胞懸濁液を、1000 rpmで5分間遠心分離した。上澄みを除去した後、1 mLのα-MEM(+)を添加し、細胞を懸濁した。これをもう片方の遠沈管に添加し、十分に懸濁させた後、10 mLシャーレに播種し、37℃、CO2濃度5%のインキュベーター内で細胞培養を行った。
[培地交換]
インキュベーターからMC3T3-E1細胞の入ったシャーレを取り出し、クリーンベンチ内において、チップのついたアスピレーターでα-MEM(+)を吸引した。その後、37 ℃に予備加温したα-MEM(+) 10 mLをシャーレ内に添加した。培地交換は1日置きに行い、培地交換の前後には、顕微鏡で細胞の形態を確認した。
[継代]
シャーレ中の細胞が70〜90%コンフルエントの状態となったとき、継代を行った。
まず、α-MEM(+)を吸引し、PBS(-) 10 mLを加えて洗浄した。その後、アクチナーゼ溶液を5 mL添加し、インキュベーター内で5 分間静置した。インキュベーターからシャーレを取り出し、α-MEM(+)を5 mL添加して良く懸濁した後、遠沈管に移して1000 rpmで5 分間遠心分離した。上澄みを除去した後、α-MEM(+)を1 mL加えて、細胞を懸濁させた。血球計数板を用いて細胞数を計測し、細胞溶液を2.0×104 個/mLになるようにα-MEM(+)で希釈して、10 mLシャーレに播種した。
[凍結保存]
継代と同様の操作により、1.0×106 cells/mLの細胞懸濁液を1 mL調製した後、ジメチルスルホキシド(サンプレップにより滅菌したもの)を、懸濁液に10 vol.%となる様に1滴ずつ添加し、分注した。-80℃の冷凍庫で24時間保存した後、液体窒素タンクにて保存した。
【０１０５】
(4)  初期付着試験
24 wellマルチウェルプレートを用いて、サンプル及びコントロールとしたマルチウェル上で、播種5時間における初期付着試験を行った。
24wellマルチウェルプレートに、EOG滅菌を施した各サンプルを置き、α-MEM(+)を1 mLずつ加え、37℃、CO2濃度5%のインキュベーターで24時間置くことにより、各サンプルの表面を洗浄した。
3継代目以降のMC3T3-E1細胞を用いて、継代と同様の操作により、5.0×104 cells/mLの細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を0.4 mL、α-MEM(+)を0.2 mLずつ各サンプルに播種した。このときコントロールとしたマルチウェルプレートには細胞懸濁液0.4 mLを播種した。インキュベーター内でこれらの培養を行った。
5時間経過後、インキュベーターからウェルプレートを取り出し、α-MEM(+)を除去し、PBS(-) 1 mLで洗浄した。その後、37 ℃に温めておいたトリプシン溶液をコントロールに0.4 mL、サンプルに0.6 mLを加え、インキュベーターで5分間静置し、細胞を浮遊させた。5分後、等量のα-MEM(+)を添加し、十分に懸濁した。その懸濁液をマイクロチューブに移し、さらに、完全に細胞を移すため、ウェル内をα-MEM(+) 0.2 mLで洗浄し、その懸濁液もマイクロチューブに移した。この溶液を、1000 rpm、5分間遠心分離した。上澄みを除去した後、500μL量のα-MEM(+)を加えて細胞懸濁液を調製し、血球計算盤を用いて細胞数を計測した。
【０１０６】
計数結果から、相対初期付着率を以下の式より算出した。
【数４】
0006744623.tif 000033
Ｎ５：  ５時間後、基材上に付着している細胞数
Ｎ０：  基材上に播種した細胞数
Ｎ５control：  ５時間後、対照試料上に付着している細胞数
Ｎ０control：  対照試料上に播種した細胞数
【０１０７】
(5)  短期細胞増殖曲線の作成
初期付着試験と同様の方法により、5時間、1、3、5、7日目の細胞数を計測することによって、短期細胞増殖曲線を作成した。
【０１０８】
本発明における生体適合性評価として、MC3T3-E1細胞を用いた複合体上における初期付着試験と短期細胞増殖曲線の作成を行った。MC3T3-E1細胞は、新生児C57BL/6マウス頭蓋冠由来の細胞であり、ほかの細胞系への分化能をほとんどもたない骨芽細胞様細胞株である。この細胞は、物質代謝、DNA複製・修復、分裂機構、細胞運動など基本的な細胞機能を有し、培養が容易、かつ性質が安定で入手しやすい細胞であるため、既に多くの培養例が報告されている。
初期付着は細胞を播種してから5時間後に材料上に接着している細胞の個数を計数することによって決定した。PMDI-PLLA/HAp-2を用いて骨芽細胞様細胞MC3T3-E1の短期細胞培養試験を行った。実験結果から得られた増殖曲線を図２９に、相対初期接着率及び倍加時間の結果を表２２に示した。
その結果、PMDI-PLLA/HAp-2に生体適合性が確認できた。また、データには示さなかったが、PMDI-PLLA/HAp-2はp-HApよりも初期接着率が優れていた。
【０１０９】
【表２２】
0006744623.tif 000034
【０１１０】
２種のイソシアネート化合物であるPDI及びPMDIを用いてHD-OLLAの鎖長伸長によるPLLA合成を行った。1H NMRからウレタン結合の形成が観察され、HD-OLLAの鎖長伸長を確認した。
PDIとPMDIを導入したPLLA/HAp複合体の作製も行った。PMDI-PLLA/HAp複合体においてはHD-OLLAの鎖長伸長が認められた。PMDI-HApのFT-IR測定の結果、PMDIはHApとイソシアネート基を介して相互作用することが明らかとなった。PMDI-PLLA/HAp複合体はp-HApと比較し、同程度の弾性率を保ちながら、高い曲げ強度を獲得した。
PMDI-PLLA/HAp複合体のPBS浸漬による接着性試験を行った。架橋剤を導入していない従来のPLLA/HAp複合体と比較して、架橋剤を導入した本発明の複合体では複合体内からのPLLAの流出、それに伴う複合体の機械的強度の低下を抑制することが確認され、PMDIはHApとPLLA界面の架橋剤として機能した。
PMDI-PLLA/HAp複合体のマウス骨芽様細胞MC3T3-E1細胞を用いた生体適合性試験を行った。当該複合体において細胞の成長が観察された。
以上の試験により、PLLAとHAp界面の接着性に優れた複合体が得られたことが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明の複合体は、水酸基含有生分解性高分子と水酸基含有リン酸カルシウム化合物との界面接着性に優れており、また、優れた生体適合性と機械的特性も有するので、骨充填、代替骨、及び骨再生などの人工骨材料として医学等の分野で利用することができる。
【図１】
0006744623.tif 000035
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
0006744623.tif 000049
【図１６】
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【図１７】
0006744623.tif 000051
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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