(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分泌可能なｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列と、Ｔ細胞共刺激融合タンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列とを含む発現ベクターを含む組成物であって、
対象に投与されると前記Ｔ細胞共刺激融合タンパク質が抗原特異的Ｔ細胞の活性化を増進し、
前記Ｔ細胞共刺激融合タンパク質は、ＯＸ４０Ｌ−Ｉｇ、もしくはＯＸ４０に結合するその一部、ＩＣＯＳＬ−Ｉｇ、もしくはＩＣＯＳに結合するその一部、４−１ＢＢＬ−Ｉｇ、もしくは４−１ＢＢＲに結合するその一部、ＴＬ１Ａ−Ｉｇ、もしくはＴＮＦＲＳＦ２５に結合するその一部、ＧＩＴＲＬ−Ｉｇ、もしくはＧＩＴＲに結合するその一部、ＣＤ４０Ｌ−Ｉｇ、もしくはＣＤ４０に結合するその一部、またはＣＤ７０−Ｉｇ、もしくはＣＤ２７に結合するその一部から選択される、組成物。
【請求項２】
前記ベクターが、ＤＮＡベースの哺乳動物の発現ベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質が、ｇｐ９６  ＫＤＥＬ（配列番号３）配列を欠く、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質中のＩｇタグが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＥのＦｃ領域を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｔ細胞共刺激融合タンパク質中のＩｇタグが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＥのＦｃ領域を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記発現ベクターが、ウイルスもしくはウイルス様粒子中に組み込まれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記発現ベクターが、ヒト腫瘍細胞中に組み込まれる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ヒト腫瘍細胞が、樹立されたＮＳＣＬＣ、膀胱癌、メラノーマ、卵巣癌、腎臓細胞癌、前立腺癌、肉腫、乳癌、扁平上皮癌、頭頸部癌、肝細胞癌、膵臓癌、または結腸癌細胞株からの細胞である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
対象を処置するための請求項１に記載の組成物であって、
前記対象は、分泌可能なｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列と、Ｔ細胞共刺激融合タンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列とを含む発現ベクターを含む組成物の有効量を投与され、前記Ｔ細胞共刺激融合タンパク質は、ＯＸ４０Ｌ−Ｉｇ、もしくはＯＸ４０に結合するその一部、ＩＣＯＳＬ−Ｉｇ、もしくはＩＣＯＳに結合するその一部、４−１ＢＢＬ−Ｉｇ、もしくは４−１ＢＢＲに結合するその一部、ＴＬ１Ａ−Ｉｇ、もしくはＴＮＦＲＳＦ２５に結合するその一部、ＧＩＴＲＬ−Ｉｇ、もしくはＧＩＴＲに結合するその一部、ＣＤ４０Ｌ−Ｉｇ、もしくはＣＤ４０に結合するその一部、またはＣＤ７０−Ｉｇ、もしくはＣＤ２７に結合するその一部から選択され、前記対象に投与されると前記Ｔ細胞共刺激融合タンパク質は抗原特異的Ｔ細胞の活性化を増進し、かつ
前記ベクターは、ウイルスもしくはウイルス様粒子中に組み込まれ、前記ベクターは、照射されているかまたは生存していて弱毒化しているヒト腫瘍細胞中に組み込まれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
対象における抗原特異的Ｔ細胞の活性化において使用するための、分泌可能なｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列と、Ｔ細胞共刺激融合タンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列とを含む発現ベクターを含む組成物であって、
前記Ｔ細胞共刺激融合タンパク質は、ＯＸ４０Ｌ−Ｉｇ、もしくはＯＸ４０に結合するその一部、ＩＣＯＳＬ−Ｉｇ、もしくはＩＣＯＳに結合するその一部、４−１ＢＢＬ−Ｉｇ、もしくは４−１ＢＢＲに結合するその一部、ＴＬ１Ａ−Ｉｇ、もしくはＴＮＦＲＳＦ２５に結合するその一部、ＧＩＴＲＬ−Ｉｇ、もしくはＧＩＴＲに結合するその一部、ＣＤ４０Ｌ−Ｉｇ、もしくはＣＤ４０に結合するその一部、またはＣＤ７０−Ｉｇ、もしくはＣＤ２７に結合するその一部から選択され、
前記対象は前記組成物の有効量を投与され、前記対象に投与されると前記Ｔ細胞共刺激融合タンパク質は抗原特異的Ｔ細胞の活性化を増進し、かつ
前記ベクターは、ウイルスもしくはウイルス様粒子中に組み込まれ、前記ベクターは、照射されているかまたは生存していて弱毒化しているヒト腫瘍細胞中に組み込まれる、組成物。
【請求項１１】
対象における抗原特異的Ｔ細胞の活性化のための医薬の製造における、分泌可能なｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列と、Ｔ細胞共刺激融合タンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列とを含む発現ベクターを含む組成物の使用であって、
前記対象は前記組成物の有効量を投与され、前記対象に投与されると前記Ｔ細胞共刺激融合タンパク質は抗原特異的Ｔ細胞の活性化を増進し、前記Ｔ細胞共刺激融合タンパク質は、ＯＸ４０Ｌ−Ｉｇ、もしくはＯＸ４０に結合するその一部、ＩＣＯＳＬ−Ｉｇ、もしくはＩＣＯＳに結合するその一部、４−１ＢＢＬ−Ｉｇ、もしくは４−１ＢＢＲに結合するその一部、ＴＬ１Ａ−Ｉｇ、もしくはＴＮＦＲＳＦ２５に結合するその一部、ＧＩＴＲＬ−Ｉｇ、もしくはＧＩＴＲに結合するその一部、ＣＤ４０Ｌ−Ｉｇ、もしくはＣＤ４０に結合するその一部、またはＣＤ７０−Ｉｇ、もしくはＣＤ２７に結合するその一部から選択され、かつ
前記ベクターは、ウイルスもしくはウイルス様粒子中に組み込まれ、前記ベクターは、照射されているかまたは生存していて弱毒化しているヒト腫瘍細胞中に組み込まれる、使用。
【請求項１２】
前記対象はヒト癌患者であり、かつ前記患者への前記組成物の投与が、前記患者における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の活性化または増殖を増大し、前記患者における前記腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の活性化または増殖が、前記投与の前の患者における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の活性化または増殖のレベルに比較して少なくとも２５％増大される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記対象は、腫瘍細胞によって産生される免疫抑制分子を阻害する薬剤と組み合わせて前記組成物を投与されるヒト癌患者であり、前記薬剤が、ＰＤ−１に対する抗体である、請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記対象はヒト癌患者であり、かつ前記ヒト癌患者への前記組成物の投与が、病原性抗原特異的Ｔ細胞の活性化または増殖を刺激するか、または前記Ｔ細胞共刺激分子が、ｇｐ９６−Ｉｇワクチン接種単独よりも高いレベルに前記対象における抗原特異的Ｔ細胞の活性化を増進する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年２月６日出願の米国特許仮出願第６２／１１３，１５３号および２０１５年６月１２日出願の同第６２／１７４，９４２号への優先権を主張するものであり、それらの全てが参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本文書は、特に、単一ベクターからワクチン（例えば、ｇｐ９６−Ｉｇ）およびＴ細胞共刺激分子を共発現するための材料および方法を含む、ワクチン接種およびＴ細胞共刺激を利用して対象における臨床状態を処置するための材料および方法に関する。
【０００３】
電子的手段で提出された文書ファイルの説明
本明細書と共に電子的手段で提出された文書ファイルの内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられる：配列表のコンピュータでの読み取り可能な書式のコピー（ファイル名：ＨＴＢ−０２１ＰＣ−ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；記録日：２０１６年２月４日；ファイルサイズ：７３ＫＢ）。
【背景技術】
【０００４】
背景
癌は、正常細胞の寿命を延長する長い期間の遺伝的不安定性から生じる疾患である。この期間の開始を特色づける触発的事象は細胞の型によって様々であるが、一般にはｐ５３もしくはＲｂなどの腫瘍抑制遺伝子中の突然変異の獲得、ＫＲＡＳもしくはｍｙｃなどの癌原遺伝子中の突然変異の獲得、またはＨＰＶ１６もしくはＥＢＶなどの発癌遺伝子ウイルスによる細胞の感染である。起源が何であれ、正常な成長の制御または細胞死経路を回避させる遺伝子中の突然変異を獲得する細胞は、さらなる突然変異を獲得する可能性がより高い。細胞が「十分な」、典型的には少なくとも６つの、突然変異を獲得すると、細胞はもはや、その発育を抑制するまたはアポトーシスを惹起する内在性のまたは外来性のシグナルに応答しなくなる。
【０００５】
腫瘍は宿主細胞から生じるため、身体の免疫系はそれらの細胞に対して最初は耐容性である。腫瘍原性突然変異の獲得は、免疫原性になるのに十分に非自己であるエピトープを含む変異タンパク質の生成を誘導する場合もあれば、そうでない場合もある。細胞が免疫原性突然変異を獲得する場合、免疫監視として知られる過程である宿主免疫系によって探索され、破壊され得る（Ｓｍｙｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００６，  ９０：１−５０）。ネズミでの研究により、免疫監視の仮説の裏づけがもたらされ（Ｄｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００２，  ３：９９１−９９８；  Ｓｈａｎｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２００１，  ４１０：１１０７−１１１１；およびＤｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４，  ２２：３２９−３６０）、いわゆる適応免疫応答に加えて自然免疫応答が、免疫原性腫瘍の拒絶を促進し得ることも示唆された（Ｕｎｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００８，  １０５：１６８６−１６９１；  Ｔａｉｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００６，  １２：２１４−２１９；およびＲａｕｌｅｔ  ａｎｄ  Ｇｕｅｒｒａ，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９，  ９：５６８−５８０）。ＮＫＧ２Ｄリガンド発現などのＮＫ活性化シグナルの発現誘導によって、または突然変異のもしくはウイルスの過程の結果として受けたＤＮＡ障害の後に、自然免疫応答が誘発され得る。免疫原性突然変異を獲得するいくつかの細胞は、抗自己免疫応答（ａｎｔｉ−ｓｅｌｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）をくじく正常な免疫調節系に関与する能力も得る（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７，  ２５：２６７−２９６）。宿主調節機構の活性化を駆動する経路は、ほとんど理解されていない。さらに他の細胞が、宿主免疫系の活性化を誘導する免疫原性ペプチドを全く生成することなく複数の発癌性突然変異を得る場合もある。それゆえ、それらの形質転換の間に免疫原性ペプチドを生成する腫瘍細胞は、生存するために抗腫瘍免疫応答を回避し続けなければならないが、免疫系を活性化せずに形質転換される腫瘍は、生存のためにそのような免疫調節機構に依存し得ない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
概要
１種または複数のチェックポイント阻害剤、１種または複数のワクチン、および１種または複数のＴ細胞共刺激分子の組み合わせまたは部分的組み合わせを含む併用療法は、免疫療法によって利益を受ける癌患者の基盤を拡大する可能性がある。ワクチンは、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度およびそれらのＣＤ８＋  Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原の数も増加させることにより、この応答に寄与し得る。Ｔ細胞共刺激分子は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の頻度をさらに増加させること、および／またはそれらの活性化を増進することにより、そしてＣＤ８＋  Ｔ細胞による腫瘍殺傷エフェクター分子の発現を増加させることによっても、応答を増強し得る。チェックポイント阻害剤との併用で用いられる場合、それは、腫瘍に浸潤できかつ浸潤が起こると様々なチェックポイント経路によって阻害されない、多様な高活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞を生成し得る。しかし、併用療法の成功への障壁は、それらが少なくとも３種の異なる薬物製品（ワクチン、Ｔ細胞共刺激物質、およびチェックポイント阻害剤）の投与を従来は必要とし、そのそれぞれが少なからぬコスト、そして場合により毒性を有する、ということである。
【０００７】
本文書は少なくとも一部が、ワクチン接種、例えばｇｐ９６−Ｉｇワクチン接種と、特にＯＸ４０、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＣＤ４０、ＣＤ２７、および／またはＧＩＴＲのうちの１種または複数のアゴニストでのＴ細胞共刺激と、の組み合わせが相乗的な抗腫瘍性の利益を提供するという発見に基づく。前臨床モデルによりＯＸ４０、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、およびＴＮＦＲＳＦ２５を標的とするアゴニスト抗体と組み合わせされるｇｐ９６−Ｉｇワクチンの独立の組成物が評価されており、機構的かつ抗腫瘍的な相補性に及ぼす様々な効果が実証された。本明細書に記載された材料および方法は、特に、それらが独立した製品を必要とせずに例えばｇｐ９６−Ｉｇでのワクチン接種およびＴ細胞共刺激の両方を実現し得る単一組成物を提供することにおいて、有利である。これらの材料および方法は、Ｔ細胞共刺激を提供するために、非限定的にＩＣＯＳＬ−Ｉｇ、４−１ＢＢＬ−Ｉｇ、ＴＬ１Ａ−Ｉｇ、ＯＸ４０Ｌ−Ｉｇ、ＣＤ４０Ｌ−Ｉｇ、ＣＤ７０−Ｉｇ、またはＧＩＴＲＬ−Ｉｇなどの融合タンパク質を含む共刺激分子を同時に発現するように遺伝的に修飾された単一のワクチンタンパク質（例えば、ｇｐ９６−Ｉｇ）発現ベクターを作製することによって、この目標を実現する。ベクター、およびそれらの使用のための方法は、抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化を増進するさらなる抗体療法を必要とせずに共刺激の利益を提供できる。したがって、併用免疫療法は、ワクチン／抗体／融合タンパク質レジメンの必要性を排除するためのベクター再改変（ｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）によって実現でき、このことは治療コストおよび全身毒性のリスクの両方を低減し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様において、本文書は、分泌可能なワクチンタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列と、Ｔ細胞共刺激融合タンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列とを含む発現ベクターであって、対象に投与されるとＴ細胞共刺激融合タンパク質が抗原特異的Ｔ細胞の活性化を増進する発現ベクターを特色とする。幾つかの実施形態において、本文書は、分泌可能なｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列と、Ｔ細胞共刺激融合タンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列とを含む発現ベクターであって、対象に投与されるとＴ細胞共刺激融合タンパク質が抗原特異的Ｔ細胞の活性化を増進する発現ベクターを特色とする。発現ベクターは、哺乳動物発現ベクターであり得る。一実施形態において、分泌可能なｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質は、ｇｐ９６  ＫＤＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）配列を欠いていてよい。ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質中のＴｇタグは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＥのＦｃ領域を含み得る。Ｔ細胞共刺激融合タンパク質は、とりわけ、ＯＸ４０Ｌ−ＩｇもしくはＯＸ４０に結合するその一部、ＩＣＯＳＬ−ＩｇもしくはＩＣＯＳに結合するその一部、４−１ＢＢＬ−Ｉｇもしくは４−１ＢＢＲに結合するその一部、ＴＬ１ＡもしくはＴＮＦＲＳＦ２５に結合するその一部、ＧＩＴＲＬ−ＩｇもしくはＧＩＴＲに結合するその一部、ＣＤ４０−ＩｇもしくはＣＤ４０に結合するその一部、またはＣＤ７０−ＩｇもしくはＣＤ２７に結合するその一部であり得る。Ｔ細胞共刺激融合タンパク質中のＩｇタグは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＥのＦｃ領域を含み得る。発現ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。
【０００９】
別の態様において、本文書は、分泌可能なｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質などの分泌可能なワクチンタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列と、Ｔ細胞共刺激融合タンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列とを含む発現ベクターを含有する組成物であって、対象に投与されるとＴ細胞共刺激融合タンパク質が抗原特異的Ｔ細胞の活性化を増進する組成物を特色とする。ベクターは、ＤＮＡを基剤とする哺乳動物発現ベクターであり得る。一実施形態において、分泌可能なｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質は、ｇｐ９６  ＫＤＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）配列を欠いていてよい。ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質中のＩｇタグは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＥのＦｃ領域を含み得る。Ｔ細胞共刺激融合タンパク質は、ＯＸ４０Ｌ−ＩｇもしくはＯＸ４０に結合するその一部、ＩＣＯＳＬ−ＩｇもしくはＩＣＯＳに結合するその一部、４−１ＢＢＬ−Ｉｇもしくは４−１ＢＢＲに結合するその一部、ＴＬ１ＡもしくはＴＮＦＲＳＦ２５に結合するその一部、ＧＩＴＲＬ−ＩｇもしくはＧＩＴＲに結合するその一部、ＣＤ４０−ＩｇもしくはＣＤ４０に結合するその一部、またはＣＤ７０−ＩｇもしくはＣＤ２７に結合するその一部であり得る。Ｔ細胞共刺激融合タンパク質中のＩｇタグは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＥのＦｃ領域を含み得る。発現ベクターは、ウイルスもしくはウイルス様粒子中に組み込まれ得るか、またはヒト腫瘍細胞（例えば、樹立された細胞株からのヒト腫瘍細胞、例えばＮＳＣＬＣ、膀胱癌、メラノーマ、卵巣癌、腎臓細胞癌、前立腺癌、肉腫、乳癌、扁平上皮癌、頭頸部癌、肝細胞癌、膵臓癌、または結腸癌細胞株）中に組み込まれ得る。
【００１０】
別の態様において、本文書は、分泌可能なワクチンタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列と、Ｔ細胞共刺激融合タンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列とを含む発現ベクターを含有する組成物を含む細胞であって、対象に投与されるとＴ細胞共刺激融合タンパク質が抗原特異的Ｔ細胞の活性化を増進する細胞を特色とする。幾つかの実施形態において、本文書は、分泌可能なｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列と、Ｔ細胞共刺激融合タンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列とを含む発現ベクターを含有する組成物を含む細胞であって、対象に投与されるとＴ細胞共刺激融合タンパク質が抗原特異的Ｔ細胞の活性化を増進する細胞を特色とする。様々な実施形態において、そのような細胞は、既製の治療としての使用に適し得る。様々な実施形態において、そのような細胞は、照射される。様々な実施形態において、そのような細胞は、生存していて弱毒化されている。様々な実施形態において、これらの細胞は、本発明の組成物のワクチンタンパク質（例えば、ｇｐ９６）によって介添えされ得る腫瘍抗原を発現する。様々な実施形態において、そのような細胞は、樹立された細胞株、例えば、樹立されたＮＳＣＬＣ、膀胱癌、メラノーマ、卵巣癌、腎臓細胞癌、前立腺癌、肉腫、乳癌、扁平上皮癌、頭頸部癌、肝細胞癌、膵臓癌、または結腸癌細胞株からのヒト腫瘍細胞に由来し得る。様々な実施形態において、そのような細胞は、樹立された前立腺癌細胞株に由来し得る。様々な実施形態において、そのような細胞は、樹立された肺癌細胞株に由来し得る。様々な実施形態において、そのような細胞は、樹立された膀胱癌細胞株に由来し得る。様々な実施形態において、そのような細胞は、樹立された肉腫細胞株に由来し得る。様々な実施形態において、そのような細胞は、樹立された繊毛癌細胞株に由来し得る。
【００１１】
別の態様において、本文書は、対象を処置するための方法を特色とする。方法は、例えば、分泌可能なｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質などの分泌可能なワクチンタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列と、Ｔ細胞共刺激融合タンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列とを含む発現ベクターであって、対象に投与されるとＴ細胞共刺激融合タンパク質が抗原特異的Ｔ細胞の活性化を増進する発現ベクターを含有する、本明細書に記載された組成物の有効量を対象に投与することを含み得る。ベクターは、ウイルスもしくはウイルス様粒子中に組み込まれ得るか、またはヒト腫瘍細胞内に組み込まれ得る。対象は、ヒト癌患者であり得る。ヒト患者への組成物の投与は、患者における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の活性化または増殖を増進し得る。例えば、患者における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の活性化または増殖は、投与前の患者における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の活性化または増殖のレベルに比較して、少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％）上昇し得る。方法は、組成物を、腫瘍細胞によって産生される免疫抑制分子を阻害する薬剤と組み合わせて、ヒト癌患者に投与することを含み得る。薬剤は、ＰＤ−１に対する抗体であり得る。対象は、急性または慢性の感染（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、またはマラリアによる感染）を有するヒトであり得る。ヒト患者への組成物の投与は、病原性抗原特異的Ｔ細胞の活性化または増殖を刺激し得る。Ｔ細胞共刺激分子は、対象における抗原特異的Ｔ細胞の活性化を、ｇｐ９６−Ｉｇワクチン接種単独よりも高いレベルに増進し得る。
【００１２】
他に断りがなければ、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料が、本発明を実践するために用いられ得るが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及された全ての発行物、特許出願、特許、および他の参考資料は、全体として参照により組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含み、本明細書が管理する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
【００１３】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に示されている。本発明の他の特色、目的、および利点は、それらの説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明白となろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】第一のカセット内のｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質と、第二のカセット内のＴ細胞共刺激融合タンパク質とをコードする、細胞を基にした組み合わせ生成物を作製するための、最初のｇｐ９６−Ｉｇベクターの再改変の略図である。ＩＣＯＳ−Ｆｃ、４−１ＢＢＬ−Ｆｃ、およびＯＸ４０Ｌ−Ｆｃを、説明のため示している。
【図２】１つの発現カセット中に分泌可能なｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質および、第二のカセット中にＴ細胞共刺激融合タンパク質（非限定的例示として、ＩＣＯＳＬ−ＩｇＧ４  Ｆｃ）をコードする哺乳動物発現ベクター（Ｂ４５）の略図である。
【図３】２つの分泌可能なタンパク質をコードするベクターでトランスフェクトされた同種腫瘍細胞の例示である。第一のタンパク質ｇｐ９６−Ｉｇは、細胞の外側で細胞由来抗原を介添えする分泌可能な二量体（平滑）を形成する。第二のタンパク質は、ワクチン細胞によって分泌され、Ｔ細胞表面上で付近にある共刺激受容体に自由に結合し得る、三量体の分泌可能なＴ細胞共刺激融合タンパク質（粗い）である。
【図４Ａ−４Ｇ】ｇｐ９６−Ｉｇ細胞ワクチンと組み合わされたＯＸ４０アゴニスト抗体は抗原特異的ＣＤ８増殖を促進するが、ＦＯＸＰ３＋  Ｔｒｅｇは影響を受けないままであることを示す。図４Ａ〜４Ｄは、ｇｐ９６−Ｉｇ細胞ワクチンの作用機序を示す。図４Ａにおいて、ワクチン細胞は細胞由来抗原と共にｇｐ９６−Ｉｇを分泌し、または図５、６、および８の場合にはワクチン細胞はｇｐ９６−Ｉｇをこのワクチン細胞株中で安定に発現される単一抗原ニワトリオボアルブミンと共に分泌する。図４Ｂにおいて、ｇｐ９６−Ｉｇ／抗原複合体はＡＰＣによって取り込まれ、抗原はＭＨＣクラスＩ分子に移入される。図４Ｃにおいて、抗原交差提示はＣＤ８＋特異的Ｔ細胞の活性化を誘導する。図４Ｄにおいて、腫瘍に関連して、活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞は離れた腫瘍上の共通の腫瘍抗原を認識して、それらを破壊できる。図４Ｅは、ＩｍＰＡＣＴ（本明細書で用いられる通り、これは、修飾された（例えば、ＫＤＥＬ欠失）ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質、または場合によりｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質を発現するように設計された改変細胞株を指す）を単独で、またはＩＣＯＳ、４−１ＢＢＬ、もしくはＯＸ４０のためのアゴニストＴ細胞共刺激抗体との組み合わせでワクチン接種した後の抗原特異的（ＯＴ−Ｉ）細胞増殖をプロットしたグラフである。データは、最初のワクチン接種後５日目および４０日目（それぞれ、プライムおよびメモリー）について示されている。後者はまた、２回目のブーストワクチン接種後５日目に対応する。ＩｍＰＡＣＴ／ＯＸ４０（ａｂ）の組み合わせだけが、単独でのＩｍＰＡＣＴよりも有意に大きなＯＴ−Ｉ増殖を生成した（＊、ｐ＜０．０５）。実験の反復が列挙されている。プロットされた値は平均であり、誤差はＳＥＭである。図４Ｅの各データセットについて、ヒストグラムの順は左から右に：ワクチンなし、ＩｍＰＡＣＴ単独、ＩｍＰＡＣＴ＋ＩＣＯＳ抗体、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０抗体、およびＩｍＰＡＣＴ＋４−１ＢＢ抗体である。図４Ｆは、全ＣＤ４＋細胞に対する割合％としてＦＯＸＰ３＋  Ｔｒｅｇをプロットしたグラフである。ＦＯＸＰ３＋細胞が増加から減少に変動したＩｍＰＡＣＴ／４−１ＢＢ処置マウス以外では、ＩｍＰＡＣＴ処置後のＴｒｅｇにおける有意な変動はなく、ＣＤ８＋増殖に対するそれらの特異性が強調された。実験の反復が列挙されている。プロットされた値は平均であり、誤差はＳＥＭである。図４Ｆの各データセットについて、ヒストグラムの順は左から右に、ワクチンなし、ＩｍＰＡＣＴ単独、ＩｍＰＡＣＴ＋ＩＣＯＳ抗体、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０抗体、およびＩｍＰＡＣＴ＋４−１ＢＢ抗体である。図４Ｇは、アジュバントＡｌｕｍに応答する第二のモデル系でのＯＴ−Ｉ／ＣＤ８およびＦＯＸＰ３＋細胞増殖をプロットした一対のグラフである。ここでも、ＩｍＰＡＣＴとＯＸ４０（ａｂ）の組み合わせは、ＦＯＸＰ３＋細胞の中等度の増加に加えて、有意なＯＴ−Ｉ増殖をもたらした。実験の反復が列挙されている。プロットされた値は平均であり、誤差はＳＥＭである。図４Ｇの各データセットについて、ヒストグラムの順は左から右に、ワクチンなし、ＩｇＧ対照、およびＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０抗体である。
【図５Ａ−５Ｄ】Ｔ細胞共刺激物質ＯＸ４０がＩｍＰＡＣＴ（ｇｐ９６−Ｉｇ）細胞ワクチンと相乗的に機能してＴ細胞を活性化し、抗原特異的ＣＤ８＋増殖を生成することを示す。図５Ａは、Ｔ細胞とＴ細胞活性化を促進する抗原提示細胞（ＡＰＣ）との間の、受容体（ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、および４−１ＢＢ）およびリガンド（ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、および４−１ＢＢＬ）の相互作用の略図である。図５Ｂは、ワクチン投与後の抗原特異的Ｔ細胞増殖（ＯＴ−Ｉ細胞）を追跡するために、単一抗原ニワトリオボアルブミンと共にｇｐ９６−Ｉｇ／ＨＬＡ−Ａ１（ＩｍＰＡＣＴ）を発現する細胞のクローン集団の選択を通して樹立されたワクチン細胞株を示す図解である。図５Ｃは、Ｔ細胞増殖の促進における相乗性についてＩｍＰＡＣＴと組み合わせてテストされたネズミＴ細胞共刺激物質アゴニスト抗体の列挙である（これらの抗体全てが、併用療法剤として様々な実施形態において有用である）。図５Ｄは、０日目のＩｍＰＡＣＴ単独、またはＯＸ４０、ＩＣＯＳ、もしくは４−１ＢＢのためのアゴニストＴ細胞共刺激抗体１００μｇと組み合わせたＩｍＰＡＣＴのいずれかでのワクチン接種後の４３日間のフローサイトメトリーによって検出された、−１日目に尾静脈注射を介してＧＦＰ標識された抗原特異的ＯＴ−Ｉ（ＣＤ８）細胞を播種されたＦＯＸＰ３−ＲＦＰレポーターマウスにおけるＯＴ−Ｉレベルをプロットしたグラフである。非ワクチン接種（ワクチンなし）マウスを、対照として並行して評価した。マウスは、３５日目に再度、ワクチンまたはワクチン／抗体の組み合わせでブーストされた。ワクチン接種日は、シリンジで示されている。初期（プライム）応答は５日目がピークであり、ワクチン／ＯＸ４０（ａｂ）処置マウスのみがブースト後に中等度のメモリー応答を示した（矢印）。プロットされた値は全てのＣＤ８＋細胞からのＯＴ−Ｉ細胞に対する平均割合％を表し、誤差はＳＥＭである。実験の反復の数および試料間の統計学的有意性について、図４Ａ〜Ｇも参照されたい。
【図６Ａ−６Ｃ】新しいワクチンベクター中へのＴ細胞共刺激物質ＯＸ４０ＬとＩｍＰＡＣＴの組み合わせ（「ＣｏｍＰＡＣＴ」）が、ＯＸ４０アゴニスト抗体の共投与と比較して、驚くほど優れた抗体特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖を生じたことを示す。図６Ａは、（ａ）ＯＸ４０アゴニスト抗体と組み合わせた最初のワクチンＩｍＰＡＣＴ（Ｇｐ９６−Ｉｇ）を、（ｂ）新しいワクチンＣｏｍＰＡＣＴ（この図ではＧｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）、と比較するための実験計画を表す。図６Ｂは、対照ワクチン、オボアルブミンを発現するワクチン、オボアルブミンおよびｇｐ９６−Ｉｇを発現するワクチン（ＩｍＰＡＣＴ）、ＯＸ４０アゴニスト抗体と組み合わせたＩｍＰＡＣＴ、またはＣｏｍＰＡＣＴによるプライマリー免疫付与後の抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖のピークを表す。図６Ｂにおける各データセットでは、ピークの順は左から右に、ワクチンなし、Ｏｖａのみの対照、ＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０アゴニスト抗体、およびＣｏｍＰＡＣＴである。図６Ｃは、−１日目にＯＴ−Ｉ（ＣＤ８）細胞を播種されたＦＯＸＰ３−ＲＦＰマウスを用いたＯＴ−Ｉ増殖タイムコース（図５Ｄと類似）をプロットしたグラフである。ＯＴ−Ｉ／ＧＦＰ細胞を、４６日間にわたりワクチンなし、Ｏｖａのみ対照細胞、ＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋１００μｇ  ＯＸ４０（ａｂ）、およびＣｏｍＰＡＣＴで処置され、０日目に初回ワクチン接種および３５日目にブーストされた（シリンジで示される）マウスにおいて、フローサイトメトリーによって分析した。プライム応答およびメモリー応答の両者は、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０（ａｂ）と比較した場合でも、ＣｏｍＰＡＣＴで処置されたマウスで最大であった。ＣｏｍＰＡＣＴマウスはまた、驚くべきことに、タイムコース（およそ７〜２０日目）全体を通して高いＯＴ−Ｉレベルを保持した。プロットされた値は平均を表し、誤差はＳＥＭである。実験の反復の数および試料群間の統計学的有意性について、図７Ａ〜７Ｆも参照されたい。
【図７Ａ−７Ｆ】ＣｏｍＰＡＣＴにおけるｇｐ９６−ＩｇとＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、または４−１ＢＢＬ発現の組み合わせが、高レベルのＣＤ８抗原特異的Ｔ細胞応答をもたらすことを示す。図７Ａ〜７Ｄは、図６Ｃで用いられたＣｏｍＰＡＣＴの３Ｔ３バージョンの特徴づけを示す。３Ｔ３細胞をニワトリオボアルブミン（Ｏｖａ）を発現するプラスミドでトランスフェクトし、１つの高発現クローンを樹立して、ワクチンベクター（ｇｐ９６−Ｉｇ単独、ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ、ｇｐ９６−Ｉｇ／ＩＣＯＳＬ、またはｇｐ９６−Ｉｇ／４−１ＢＢＬのいずれか）で再トランスフェクトするのに用いた。それゆえ、ワクチンは、同じＯｖａ親クローン中で樹立された。非ワクチン接種マウス（ワクチンなし）を、Ｏｖａのみを発現する細胞（追加の対照として）、ＩｍＰＡＣＴ（Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ）、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０アゴニスト抗体（ＯＸ４０（ａｂ））、ＣｏｍＰＡＣＴ（Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／ＩＣＯＳＬ）、ＣｏｍＰＡＣＴ（Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）、またはＣｏｍＰＡＣＴ（Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／１ＢＢＬ）で処置されたマウスと比較した。図７Ａは、ＥＬＩＳＡによって確認されたＯｖａ分泌をプロットしたグラフであり、分泌がＯｖａのみの対照と、ＩｍＰＡＣＴと、様々なＣｏｍＰＡＣＴ細胞との間で本質的に同一であることを示している。値は、最少で６回の反復の平均であり、誤差はＳＥＭである。図７Ａの各データセットについて、ヒストグラムの順は左から右に：Ｏｖａのみの対照、ＩｍＰＡＣＴ（３Ｔ３−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ）、ＣｏｍＰＡＣＴ（Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／ＩＣＯＳＬ）、ＣｏｍＰＡＣＴ（Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）、およびＣｏｍＰＡＣＴ（Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／１ＢＢＬ）である。図７Ｂは、ＥＬＩＳＡによって決定されたｇｐ９６−Ｉｇ分泌（ＩｇＧとして検出）をプロットしたグラフであり、同等のレベルを分泌した個々のＩｍＰＡＣＴおよびＣｏｍＰＡＣＴクローンが樹立されたことを示している。値は、最少で６回の反復の平均であり、誤差はＳＥＭである。図７Ｂの各データセットについて、ヒストグラムの順は左から右に：Ｏｖａのみの対照、ＩｍＰＡＣＴ（３Ｔ３−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ）、ＣｏｍＰＡＣＴ（Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／ＩＣＯＳＬ）、ＣｏｍＰＡＣＴ（Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）、およびＣｏｍＰＡＣＴ（Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／１ＢＢＬ）である。図７Ｃは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって確認されたＩＣＯＳＬ、ＯＸ４０Ｌ、または４−１ＢＢＬのｍＲＮＡ発現をプロットしたグラフであり、ＣｏｍＰＡＣＴ細胞中のみでの発現を示している。グラフの値は、最少で３回の異なる反復の平均であり、誤差はＳＥＭである。図７Ｃの各データセットについて、ヒストグラムの順左から右に：Ｏｖａのみの対照、ＩｍＰＡＣＴ（３Ｔ３−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ）、ＣｏｍＰＡＣＴ（Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／ＩＣＯＳＬ）、ＣｏｍＰＡＣＴ（Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）、およびＣｏｍＰＡＣＴ（Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／１ＢＢＬ）である。図７Ｄは、ＣｏｍＰＡＣＴ細胞におけるＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬおよび４−１ＢＢＬ発現の確認を示すウェスタンブロットを提供する。ＩｍＰＡＣＴおよびＣｏｍＰＡＣＴ細胞をブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）で１６時間処置して、タンパク質輸送および分泌を予防した。その後、細胞を回収し、溶解してＳＤＳ  ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット分析に供した。ブロットを、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２としても公知）、ＩＣＯＳＬ、または４−１ＢＢＬに対する抗体、およびローディング対照としてのヒストンＨ３またはアクチンＢ（ＡＣＴＢ）に対する抗体でプローブした。ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、および４−１ＢＢＬは、ＣｏｍＰＡＣＴ細胞のみで検出された。図７Ｅは、示されたプライマリー免疫付与後５日目のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞の頻度をプロットしたグラフである。図７Ｅの各データセットについて、ヒストグラムの順は左から右に：ワクチンなし、Ｏｖａのみの対照、ＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０抗体、およびＣｏｍＰＡＣＴ（この図では、Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）である。図７Ｆは、左に示される、４２日目（ブースト免疫付与後７日目）の末梢血中の抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＯＴ−Ｉ）の頻度と、末梢血中の同じ日のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞のピークをプロットした一対のグラフである。図６Ｃに示されるように、Ｏｖａのみを発現する細胞株、ＩｍＰＡＣＴ、ＯＸ４０（ａｂ）と組み合わせたＩｍＰＡＣＴおよびＣｏｍＰＡＣＴ（この場合、Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）でのワクチン接種後の抗原特異的（ＯＴ−Ｉ）細胞増殖が、初回ワクチン接種後５日目および４０日目（それぞれプライムおよびメモリー）で示される。後者はまた、２回目のブーストワクチン接種後５日目に対応する。ＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０（ａｂ）およびＣｏｍＰＡＣＴ処置マウスにおけるＯＴ−Ｉレベルは、Ｏｖａのみの対照処置マウスに比較して有意に上昇している。ＣｏｍＰＡＣＴ処置マウスはＯＴ−Ｉ細胞の最大増殖を示し、それはプライムおよびメモリー応答ポイントの両方でＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０（ａｂ）よりも有意に高い。実験の反復が列挙されており、誤差はＳＥＭである。図７Ｆの各データセットについて、ヒストグラムの順は左から右に：ワクチンなし、Ｏｖａのみの対照、ＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０抗体、およびＣｏｍＰＡＣＴ（この図では、Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）である。
【図８Ａ−８Ｅ】ＣｏｍＰＡＣＴは抗原特異的ＣＤ８＋増殖を誘起したが、ＯＸ４０抗体は非特異的Ｔ細胞活性化をもたらしたことを示す。図８Ａは、未処置の、またはＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０（ａｂ）、もしくはＣｏｍＰＡＣＴ（この図では、Ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）をワクチン接種されたマウスにおける単核（ＭＮＣ）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＯＴ−Ｉ、およびＯＴ−ＩＩ細胞の総数をプロットした一連のグラフである。図５Ｄおよび６Ｃと同様に、ＦＯＸＰ３−ＲＦＰレポーターマウスは、−１日目に尾静脈注射によってＯＴ−１細胞を播種され、０日目にワクチン接種されて、８日目に、腹腔洗浄液から得られた細胞のフローサイトメトリーを含む分析のために殺処分された。ＣｏｍＰＡＣＴ処置はロバストなＯＴ−Ｉ（ＣＤ８）特異的応答を生じたが、ＯＸ４０（ａｂ）処置は、ＦＯＸＰ３＋  ＣＤ４細胞を含む全てのＴ細胞サブタイプの増加をもたらした。プロットされた値は、最少で３匹のマウスの平均であり、誤差はＳＥＭである。図８Ａの各データセットについて、ヒストグラムの順は左から右に：未処置、ＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０抗体、およびＣｏｍＰＡＣＴ（この図では、Ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）である。図８Ｂは、プライマリー免疫付与後８日目の、それぞれメモリー前駆体細胞、短命のエフェクター細胞、およびメモリー細胞に対応するＣＤ１２７＋ＫＬＲＧ１−、ＣＤ１２７−ＫＬＲＧ１＋、およびＣＤ１２７＋ＫＬＲＧ１＋細胞の数をプロットした一連のグラフである。細胞は、脾臓（上のパネル）および腹腔（下のパネル）から得られた。図８Ｂの各データセットについて、ヒストグラムの順は左から右に：未処置、Ｏｖａのみ、ＩｍＰＡＣＴ、ＣｏｍＰＡＣＴ（Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／ＩＣＯＳＬ）、ＣｏｍＰＡＣＴ（Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）、およびＣｏｍＰＡＣＴ（Ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／１ＢＢＬ）である。図８Ｃは、ＩＮＦγ、ＴＮＦα、ＩＬ２、ＩＬ６、およびＩＬ５のレベルをプロットした一連のグラフである。全血清を８日目に、先の図８Ａに表される同じマウスから採取して、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＬＥＧＥＮＤＰＬＥＸ（商標）およびフローサイトメーターを用いるサイトカイン分析に供した。図８Ａのデータと一致して、ＯＸ４０（ａｂ）処置は、ＩＮＦγ、ＴＮＦαおよびＩＬ２のみならず、ＩＬ６およびＩＬ５の上昇したレベルを伴う非特異的全身免疫応答を生じた。プロットされた値は、最少で３匹のマウスの平均であり、誤差はＳＥＭである。図８Ｃの各データセットについて、ヒストグラムの順は左から右に：未処置、ＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０抗体、およびＣｏｍＰＡＣＴ（この図では、Ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）である。図８Ｄは、ＦＮγ、ＴＮＦα、およびグランザイム−Ｂ（ＧＺＭＢ）について遺伝子発現レベルをプロットした一連のグラフである。ｑＲＴ−ＰＣＲによるＴ細胞活性化遺伝子の分析は、内在性（ＯＴ−Ｉ−）および抗原特異的ＣＤ８（ＯＴ−Ｉ＋）細胞の両方を非特異的に活性化するＯＸ４０（ａｂ）に比較して、抗原特異的ＣＤ８（ＯＴ−Ｉ＋）細胞を活性化するのみであるＣｏｍＰＡＣＴの特異性を実証した。先の図８Ａの腹腔洗浄���から得られた細胞を、ＯＴ−Ｉ−およびＯＴ−Ｉ＋  ＣＤ８細胞の集団に選別した。全ＲＮＡを回収して逆転写し、ｑＰＣＲにより分析した。ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＧＺＭＢの遺伝子発現レベルを、最初のＩｍＰＡＣＴのみで処置された複製を１に設定し１８Ｓ  ｍＲＮＡに正規化して、示す。プロットされた値は、最少で３匹のマウスの平均であり、誤差はＳＥＭである。図８Ｄの各データセットについて、ヒストグラムの順は左から右に：ＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０抗体、およびＣｏｍＰＡＣＴ（この図では、Ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）である。図８Ｅは、マウスの脾臓細胞および腫瘍流出リンパ節（ＴＤＬＮ）におけるＦＯＸＰ３調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数を示す。図８Ｅの各データセットについて、ヒストグラムの順は左から右に：未処置、ＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０抗体、およびＣｏｍＰＡＣＴ（この図では、Ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）である。
【図９Ａ−９Ｃ】ＣｏｍＰＡＣＴ（この図では、Ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）処置は抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞活性化をもたらすが、ＯＸ４０（ａｂ）処置の共投与は、脾臓およびリンパ節の両方でのＦＯＸＰ３  Ｔｒｅｇの増加を含む非特異的免疫細胞活性化を誘起することを示す。図９Ａは、未処置、またはＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０（ａｂ）、もしくはＣｏｍＰＡＣＴをワクチン接種されたマウスについてＭＮＣ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＯＴ−Ｉ、およびＯＴ−ＩＩ細胞の総数をプロットした一連のグラフである。図５Ｄおよび６Ｃと同様に、ＦＩＲレポーターマウスは、−１日目に尾静脈注射によってＯＴ−Ｉ細胞を播種され、０日目にワクチン接種されて、８日目に、脾臓から得られた細胞のフローサイトメトリーを含む分析のために殺処分された。ＯＸ４０（ａｂ）処置マウスは、ＣＤ４／ＦＯＸＰ３＋細胞を含む全てのＴ細胞サブタイプの増加を示した。ＣｏｍＰＡＣＴ処置マウスは、ＯＸ４０（ａｂ）応答よりも有意に高い、ロバストなＯＴ−Ｉ（ＣＤ８）特異的応答を生じた。プロットされた値は、最少で３匹のマウスの平均であり、誤差はＳＥＭである。図９Ａの各データセットについて、ヒストグラムの順は左から右に：未処置、ＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０抗体、およびＣｏｍＰＡＣＴである。図９Ｂは、末梢リンパ節以外では図９Ａと同様の、未処置、またはＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０（ａｂ）、もしくはＣｏｍＰＡＣＴをワクチン接種されたマウスについてＭＮＣ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＯＴ−Ｉ、およびＯＴ−ＩＩ細胞の総数をプロットした一連のグラフである。図９Ｂの各データセットについて、ヒストグラムの順は左から右に：未処置、ＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０抗体、およびＣｏｍＰＡＣＴである。図９Ｃは、Ｔ細胞活性化遺伝子（ＡＣＴＢ、ＩＬ２、およびパーフォリン１（ＰＲＦ１））に関してｍＲＮＡ発現をプロットした一連のグラフである。ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＯＸ４０（ａｂ）で処置されたマウスにおける内在性のおよび抗原特異的なＯＴ−１  ＣＤ８細胞の両方の非特異的活性化に比べ、ＣｏｍＰＡＣＴで処置されたマウスにおける抗原特異的ＯＴ−１（ＣＤ８）活性化を明らかにした。先の図８Ａの腹腔洗浄液から得られた細胞を、ＯＴ−１＋およびＯＴ−１−  ＣＤ８細胞の集団に選別した。全ＲＮＡを回収して逆転写し、ｑＰＣＲにより分析した。ＡＣＴＢレベルは、細胞集団と処置との間で一致しており、対照として働いた。ＩＬ２レベルは、ＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０抗体、およびＣｏｍＰＡＣＴで処置されたマウスのＯＴ−１＋細胞において有意に上昇しており、全てのワクチン／組み合わせでの有意なＴ細胞活性化を示唆する。図８Ｃと一致して、ＰＲＦ１のレベルは、ＯＸ４０（ａｂ）で処置されたマウスのＯＴ−１−およびＯＴ−１＋  ＣＤ８画分の両方で非特異的に上昇したが、ＣｏｍＰＡＣＴ処置マウスのＯＴ−１＋細胞細胞で増加したのみであった。プロットされた値は、最少で３匹のマウスの平均であり、誤差はＳＥＭである。図９Ｃの各データセットについて、ヒストグラムの順は左から右に：ＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０抗体、およびＣｏｍＰＡＣＴである。
【図１０Ａ−１０Ｃ】腫瘍担持マウスにおいて、ＣｏｍＰＡＣＴ（この図では、Ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）処置が最大数の腫瘍浸潤リンパ球および腫瘍退縮をもたらしたことを示す。図１０Ａは、実験構成の略図である。ＢＡＬＢ／Ｃマウスに２×１０５  ＣＴ２６細胞を真皮下に接種して、０日目とした。６日目および１１日目に、マウスをワクチン接種しないか、またはＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ８６（ａｂ）、ＣｏｍＰＡＣＴ、もしくはＯＸ８６（ａｂ）単独でワクチン接種した。ワクチン処置は、１×１０６細胞および抗体１００μｇで構成された。図１０Ｂは、０日目での腫瘍接種に続く示された日での腫瘍面積をプロットしたグラフであり、試料群あたり最少で実験マウス５匹の平均と、ＳＥＭとして誤差がプロットされている。図１０Ｃは、試験２１日目の腫瘍面積をプロットしたグラフである。図１０Ｃの各データセットについて、ヒストグラムの順は左から右に：ワクチンなし、ＣＴ２６のみの対照、ＯＸ４０抗体のみ、ＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０抗体、およびＣｏｍＰＡＣＴである。
【図１１Ａ−１１Ｅ】ＣｏｍＰＡＣＴ（この図では、Ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）処置が、ＣＴ２６大腸癌モデルにおいて、ＣＤ８＋特異的腫瘍浸潤、腫瘍成長の妨害、増加した全生存率および有意な腫瘍拒絶をもたらしたことを示す。図１１Ａにおいて、０日目に５×１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞を、マウスの脇腹後部へ皮下注射することにより接種した。マウスは、非処置であるか、または４、７および１０日目にＣＴ２６親細胞、ＯＸ４０（ａｂ）単独、ＩｍＰＡＣＴ単独、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０（ａｂ）またはＣｏｍＰＡＣＴをワクチン接種された。マウスの１コホートを、腫瘍遺伝子分析のために１２日目に殺処分した。残りのマウスを３０日間モニタリングして、腫瘍面積および全生存率を測定した。図１１Ｂは、１２日目の腫瘍遺伝子発現の分析を示す。全ＲＮＡを切除された腫瘍から単離し、逆転写し、ｑＰＣＲによって分析した。値は、１８Ｓ  ｍＲＮＡに正規化して、最初の「未処置」のみの複製を１に設定した。図１１Ｂの各データセットについて、ヒストグラムの順は左から右に：未処置、ＣＴ２６のみの対照、ＯＸ４０抗体のみ、ＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０抗体、およびＣｏｍＰＡＣＴである。図１１Ｃにおいて、ＡＨ１−四量体／抗原特異的ＣＤ８＋細胞を処置マウスで分析した。図１１Ｃの各データセットについて、ピークの順は左から右に：未処置、ＣＴ２６のみの対照、ＯＸ４０抗体のみ、ＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０抗体、およびＣｏｍＰＡＣＴである。図１１Ｄは、初回腫瘍接種後に２１日間連日測定された腫瘍面積を示す。図１１Ｅにおいて、全生存は、３０日間のタイムコースで決定された。ＣｏｍＰＡＣＴ処置マウスの８０％は、実験基準により生存し、マウスの４７％（１５匹中７匹）は、確立した腫瘍を完全に拒絶した。１匹のＯＸ４０（ａｂ）のみで処置したマウスは、２４日目まで腫瘍を拒絶し、１匹のＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０（ａｂ）処置マウスは、２５日まで拒絶した。
【図１２Ａ−１２Ｄ】ＣｏｍＰＡＣＴ（この図では、Ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）が、アグレッシブなＢ１６．Ｆ１０−ｏｖａメラノーマモデルにおいて、抗原特異的ＣＤ８＋増殖、腫瘍成長の遅延、増加した全生存率および腫瘍拒絶を生成することを示す。図１２Ａにおいて、マウスは−１日目にＯＴ−Ｉ細胞５×１０５個を養子移入され、その後、０日目に５×１０５個のＢ１６．Ｆ１０−ｏｖａ腫瘍細胞を脇腹後部へ皮下注射で接種された。マウスは、未処置であるか、または４、７および１０日目にＢ１６．Ｆ１０−ｏｖａ親細胞、ＯＸ４０（ａｂ）単独、ＩｍＰＡＣＴ単独、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０（ａｂ）もしくはＣｏｍＰＡＣＴをワクチン接種された。図１２Ｂは、２５日のタイムコースにわたる処置に続く抗原特異的ＣＤ８＋（ＯＴ−Ｉ）増殖を示す。図１２Ｃにおいて、腫瘍面積を、初回腫瘍接種後２５日のタイムコース全体で測定した。図１２Ｄにおいて、全生存率を、３０日のタイムコースにわたり決定した。ＣｏｍＰＡＣＴ処置マウスのおよそ７８％が生存し、ＣｏｍＰＡＣＴ処置マウスの１１％が確立された腫瘍を完全に拒絶した。ＣｏｍＰＡＣＴ処置群のみが、完全な腫瘍拒絶動物を有した（９匹中１匹、またはおよそ１１％）。
【図１３】−１日目にＯＴ−１（ＣＤ８）細胞を播種されたＦＯＸＰ３−ＲＦＰマウスを用いた、ＯＴ−Ｉ増殖タイムコース（図５Ｄおよび６Ｃと類似）をプロットしたグラフである。ＯＴ−１／ＧＦＰ細胞を、０日目に初回ワクチン接種および３５日目にブーストで、４６日間にわたり、ワクチンなし、Ｏｖａのみの対照細胞、ＣｏｍＰＡＣＴ（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌまたはｇｐ９６−Ｉｇ／ＴＬ１Ａ）またはＣｏｍＰＡＣＴ２（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ＋ＴＬ１Ａ）で処置されたマウスにおいてフローサイトメトリーによって分析した。プロットされた値は平均を表し、誤差はＳＥＭである。ＣｏｍＰＡＣＴ２（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ＋ＴＬ１Ａ）は、ＣｏｍＰＡＣＴ−ＯＸ４０ＬおよびＣｏｍＰＡＣＴ−ＴＬ１Ａを含む組み合わせ注射（即ち、同じシリンジ中の２種の異なる細胞株）を表す。
【図１４】オボアルブミン特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＯＴＩ）の増殖および活性化に及ぼすＣｏｍＰＡＣＴの影響を示すグラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０日目に、ＩｍＰＡＣＴ単独またはＣｏｍＰＡＣＴ（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ）、ＣｏｍＰＡＣＴ（ｇｐ９６−Ｉｇ／４−ＩＣＯＳＬ）、もしくはＣｏｍＰＡＣＴ（ｇｐ９６−Ｉｇ／４−１ＢＢＬ）で免疫付与した。ＯＴ−Ｉの頻度を、示された日に末梢血でモニタリングした。
【図１５】ＣＴ２６大腸癌モデルにおける腫瘍成長速度に及ぼすＣｏｍＰＡＣＴの影響を示すグラフである。マウスは０日目に５×１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞を、脇腹後部での皮下注射により接種された。マウスは、非処置であるか、または４、７および１０日目にＣＴ２６親細胞、ＩｍＰＡＣＴ単独、ＩｍＰＡＣＴ＋ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト（４Ｃ１２ａｂ）、４Ｃ１２（ａｂ）単独、ＰＤ−１（ａｂ）単独、４Ｃ１２（ａｂ）＋ＰＤ−１（ａｂ）、ＣｏｍＰＡＣＴ（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌまたはｇｐ９６−Ｉｇ／ＴＬ１Ａ）、ＣｏｍＰＡＣＴ（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ）＋ＰＤ−１（ａｂ）、もしくはＣｏｍＰＡＣＴ２（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ＋ＴＬ１Ａ）をワクチン接種された。マウスを３０日間モニタリングして、腫瘍面積を測定した。ＣｏｍＰＡＣＴ２（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ＋ＴＬ１Ａ）は、ＣｏｍＰａＣＴ−ＯＸ４０ＬとＣｏｍＰａＣＴ−ＴＬ１Ａを含む組み合わせ注射（即ち、同じシリンジ中の２種の異なる細胞株）を表す。
【図１６】ＣＴ２６大腸癌モデルにおける全マウス生存率に及ぼすＣｏｍＰＡＣＴの影響を示すグラフである。マウスは、図１５に記載された通り、ＣＴ２６腫瘍細胞で処置されて、ワクチン接種された。
【図１７】ヒト前立腺特異的ワクチン（ＨＳ−１０２０、ＰＣ−３細胞株）によって産生されたヒトＯＸ４０Ｌの量を示すグラフである。
【図１８】ヒト肺特異的ワクチン（ＨＳ−１２０、ＡＤ１００細胞株）によって産生されたヒトＯＸ４０Ｌの量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
様々な分泌可能なタンパク質、即ち本明細書に記載されたワクチンタンパク質を用いてインビボで免疫応答を刺激することができる。例えば、分泌可能なヒートショックプロテインｇｐ９６−Ｉｇを基にした同種細胞ワクチンは、インビボでの抗原交差プライミングを通してフェムトモル濃度の腫瘍抗原への高頻度ポリクローナルＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を実現できる（Ｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７，  １７９（４）：２３１０−２３１７）。しかし、確立された腫瘍により複雑にされる複数の免疫抑制機構は、このワクチンアプローチの活性をくじく可能性がある。進行疾患の患者のための併用療法の潜在的使用を評価するために、長期確立Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマのマウスモデルにおけるＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、およびＬＡＧ−３遮断抗体の系統的比較を実施して（本明細書の実施例を参照）、他のチェックポイントとの比較で、ｇｐ９６−Ｉｇワクチン接種とＰＤ−１遮断との優れた組み合わせを実証した。相乗的な抗腫瘍性の利益は、ｇｐ９６−Ｉｇワクチン接種と、ＰＤ−１遮断と、ＯＸ４０のアゴニスト（例えば、ＯＸ４０リガンド−Ｉｇ（ＯＸ４０Ｌ−Ｉｇ）融合体、またはＯＸ４０に結合するその断片）、誘導性Ｔ細胞共刺激物質（ＩＣＯＳ）のアゴニスト（例えば、ＩＣＯＳリガンド−Ｉｇ（ＩＣＯＳＬ−Ｉｇ）融合体、またはＩＣＯＳに結合するその断片）、ＣＤ４０のアゴニスト（例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｉｇ融合タンパク質、またはその断片）、ＣＤ２７のアゴニスト（例えば、ＣＤ７０Ｌ−Ｉｇ融合タンパク質、またはその断片）、４−１ＢＢのアゴニスト（例えば、４−１ＢＢリガンド−Ｉｇ（４−１ＢＢＬ−Ｉｇ）融合体、または４−１ＢＢに結合するその断片）、ＴＮＦＲＳＦ２５のアゴニスト（例えば、ＴＬ１Ａ−Ｉｇ融合体、またはＴＮＦＲＳＦ２５に結合するその断片）、またはグルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）のアゴニスト（例えば、ＧＩＴＲリガンド−Ｉｇ（ＧＩＴＲＬ−Ｉｇ）融合体、またはＧＩＴＲに結合するその断片）の１種を用いるＴ細胞共刺激との三重の組み合わせから生じる得る。しかし、そのような三重の組み合わせの開発に関する情熱は、そのような治療の予想経費によって静められる。この問題を回避するために、ワクチンタンパク質発現ベクター（例えば、ｇｐ９６−Ｉｇ発現ベクター）を再改変して、Ｔ細胞共刺激タンパク質（例えば、ＩＣＯＳＬ−Ｉｇ、４−１ＢＢＬ−Ｉｇ、またはＯＸ４０Ｌ−Ｉｇ）を同時に発現させ、さらなる抗体療法を必要とせずに共刺激の利益を提供した。再改変されたベクターが、その使用方法と同様に、本明細書において提供される。ｇｐ９６−Ｉｇおよびこれらの共刺激融合タンパク質が同種細胞株によって分泌されると、抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化増進が観察された（本明細書の実施例を参照）。したがって併用免疫療法は、完全に分離されたワクチン／抗体／融合タンパク質レジメンの必要を排除するベクター再改変によって実現され得る。
【００１６】
ワクチンタンパク質
ワクチンタンパク質は、本発明において用途を見出す免疫応答を誘導し得る。様々な実施形態において、本発明は、分泌可能なワクチンタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列とＴ細胞共刺激融合タンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列とを含む発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターを含む組成物もまた、提供される。様々な実施形態において、そのような組成物は、対象における抗原特異的Ｔ細胞の活性化を増進することを含む、対象における免疫応答を刺激するために対象を処置する方法において利用される。本発明の組成物は、癌を含む様々な疾患の処置に用途を見出す。
【００１７】
小胞体（ＥＲ）中に局在するヒートショックプロテイン（ｈｓｐ）ｇｐ９６は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子へ向かうペプチドのシャペロンとして働く。腫瘍細胞から得られワクチンとして用いられるｇｐ９６は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）への腫瘍特異的ペプチドの輸送をおそらく通して、特異的腫瘍免疫を誘導し得る（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９，  １６３（１０）：５１７８−５１８２）。例えばｇｐ９６関連ペプチドは、樹状細胞（ＤＣ）によってＣＤ８細胞に交差提示される。
【００１８】
腫瘍細胞内へｇｐ９６−Ｉｇ  Ｇ１−Ｆｃ融合タンパク質をトランスフェクトすることによる抗腫瘍療法のためにワクチン接種システムが開発され、介在される腫瘍タンパク質との複合体でｇｐ９６−Ｉｇの分泌がもたらされた（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００８，  ３１（４）：３９４−４０１、およびそれに引用された参考資料を参照）。ｇｐ９６−Ｉｇを分泌する腫瘍細胞の非経口投与は、自然免疫系の活性化と併せて、ロバストな抗原特異的ＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）増殖を惹起する。腫瘍に分泌されるｇｐ９６は、ｇｐ９６分泌の部位にＤＣおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を動員させ、ＤＣ活性化を仲介する。さらに、ｇｐ９６およびその介在されるペプチドのエンドサイトーシスによる取り込みは、主要なＭＨＣクラスＩを介するペプチド交差提示、およびＣＤ４細胞と独立した強い同族ＣＤ８活性化を惹起する。
【００１９】
本明細書で提供されるベクターは、ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列を含む。ヒトｇｐ９６のコード領域は２，４１２塩基長（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）であり、アミノ末端の２１アミノ酸シグナルペプチドと、疎水性残基に富む潜在的膜貫通領域と、カルボキシ末端のＥＲ保持ペプチド配列と、を含む８０３アミノ酸タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）をコードする（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセション番号．Ｘ１５１８７；Ｍａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９０，  ８７：５６５８−５５６２参照）。ヒトｇｐ９６のＤＮＡおよびタンパク質配列は、以下の通りである：
【化１】
0006744318.tif 000002
0006744318.tif 000003
【００２０】
ｇｐ９６−Ｉｇ融合体配列をコードする核酸は、全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，６８５，３８４号に記載された方法を利用して生成され得る。幾つかの実施形態において、ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質のｇｐ９６部分は、野生型ｇｐ９６配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたヒト配列）の全てまたは一部を含有し得る。例えば分泌可能なｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｃ末端ＫＤＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）配列が欠如するように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の最初の７９９アミノ酸を含み得る。あるいは融合タンパク質のｇｐ９６部分は、野生型ポリペプチドに対する少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）の配列同一性を有するように、野生型ｇｐ９６配列の最初の７９９アミノ酸に比較して１つまたは複数の置換、欠失、または付加を含むアミノ酸配列を有し得る。
【００２１】
本開示全体で用いられる、核酸またはアミノ酸配列と、特定の配列同定番号によって参照される配列との配列同一性％は、以下の通り決定される。最初に、核酸またはアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．１４およびＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．１４を含むＢＬＡＳＴＺのスタンドアローンバージョンからのＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｂｌ２ｓｅｑ）プログラムを用いて、特定の配列同定番号で示される配列と比較する。このＢＬＡＳＴＺのスタンドアローンバージョンは、ｆｒ．ｃｏｍ／ｂｌａｓｔまたはｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．からオンラインで得ることができる。Ｂ１２ｓｅｑプログラムを使用する方法を説明する取扱説明書は、ＢＬＡＳＴＺに添付されたリードミーファイル中に見出すことができる。Ｂ１２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを用いて２つの配列間の比較を実施する。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために用いられ、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために用いられる。２つの核酸配列を比較するために、オプションが以下の通り設定されている：−ｉは、比較される第一の核酸配列を含むファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）に設定され；−ｊは、比較される第二の核酸配列を含むファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）に設定され；−ｐは、ｂｌａｓｔｎに設定され；−ｏは、任意の所望のファイル名（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）に設定され；−ｑは、−１に設定され；−ｒは、２に設定され；他のオプション全ては、デフォルト設定のままである。  例えば、以下のコマンドを用いて２つの配列間の比較を含む出力ファイルを作成できる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ  −ｉ  ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ  −ｊ  ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ  −ｐ  ｂｌａｓｔｎ  −ｏ  ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ  −ｑ  −１  −ｒ  ２。２つのアミノ酸配列を比較するために、Ｂ１２ｓｅｑのオプションは以下の通り設定される：−ｉは、比較される第一のアミノ酸配列を含むファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）に設定され；−ｊは、比較される第二のアミノ酸配列を含むファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）に設定され；−ｐは、ｂｌａｓｔｐに設定され；−ｏは、任意の所望のファイル名（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）に設定され；他のオプション全ては、デフォルト設定のままである。  例えば、以下のコマンドを用いて２つのアミノ酸配列間の比較を含む出力ファイルを作成できる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ  −ｉ  ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ  −ｊ  ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ  −ｐ  ｂｌａｓｔｐ  −ｏ  ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ。２つの比較された配列が相同性を共有する場合、指定された出力ファイルは、それらの相同性領域を整列された配列として提示する。２つの比較された配列が、相同性を共有しない場合、指定された出力ファイルは、整列された配列を提示しない。
【００２２】
整列されると、両配列中で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在する位置の数をカウントすることによって、マッチの数が決定される。配列同一性％は、マッチの数を、同定された配列（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）中に示された配列の長さで、または連結された長さ（例えば、同定された配列中に示される配列からの１００の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基）で割り、その後、得られた値に１００を掛けることにより決定される。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列と整列された時に２，２００のマッチを有する核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列に９１．２％同一である（即ち、２，０００÷２，４１２×１００＝９１．２）。配列同一性％の値は最も近い１０分の１に丸められることに留意されたい。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３、および７５．１４は、７５．１に切り下げられ、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８、および７５．１９は、７５．２に切り上げられる。長さの値が常に整数であることにも留意されたい。
【００２３】
したがって、幾つかの実施形態において、ｇｐ９６−Ｉｇ融合ポリペプチドをコードする核酸のｇｐ９６部分は、１つまたは複数の他の種からの保存的置換、非保存的置換、スプライスバリアント、アイソフォーム、相同体、および多型を含むように、１つまたは複数のアミノ酸位置で野生型ｇｐ９６ポリペプチドと異なるアミノ酸配列をコードし得る。
【００２４】
本明細書で定義される「保存的置換」は、別の生物学的に類似した残基によるアミノ酸残基の交換を意味する。典型的には、先に参照されたように、生物学的類似性は、保存されたアミノ酸による野生型配列上の置換を反映する。例えば、保存的アミノ酸置換は、特にそれらがポリペプチドまたはタンパク質中の残基の総数の１０％未満であれば、生物活性に及ぼす影響がほとんど、または全くないと予測される。保存的置換は、例えば、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似性に基づいて行われ得る。２０種の天然由来アミノ酸は、以下の６つの標準的アミノ酸群に分類することができる：（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ，Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。したがって、保存的置換は、あるアミノ酸を、先に示された６つの標準的アミノ酸群の同じ群の中に列挙される別のアミノ酸で交換することによって実行され得る。例えば、ＧｌｕによるＡｓｐの交換は、そのように修飾されたポリペプチドにおいて１つの負電荷を保持する。加えて、グリシンとプロリンは、α−ヘリックスを破壊するそれらの能力に基づいて、互いに置換され得る。保存的アミノ酸置換のさらなる例としては、１つの疎水性残基の、別の疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニンでの置換、または１つの極性残基の、別の極性残基での置換、例えばリシンによるアルギニンの置換、アスパラギン酸によるグルタミン酸の置換、もしくはアスパラギンによるグルタミンの置換などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「保存的置換」は、非置換の親アミノ酸残基の代わりの、置換されたアミノ酸残基の使用も含むが、但し置換されたポリペプチドに対して得られた抗体が非置換のポリペプチドとも免疫反応することが条件である。
【００２５】
本明細書で定義された「非保存的置換」は、あるアミノ酸の、先に示された６つの標準的アミノ酸群（１）〜（６）の異なる群に列挙される別のアミノ酸による交換と定義される。
【００２６】
様々な実施形態において、置換は、非古典的アミノ酸（例えば、セレノシステイン、ピロリシン、Ｎ−ホルミルメチオニンβ−アラニン、ＧＡＢＡ、δ−アミノレブリン酸、４−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、一般的アミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコスム（ｓａｒｃｏｓｍｅ）、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβメチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎ  α−メチルアミノ酸、および一般的なアミノ酸類似体）を含み得る。
【００２７】
突然変異は、コドン縮退を考慮することを含み、遺伝子コードを参照して本発明の融合タンパク質のヌクレオチド配列に施すこともできる。
【００２８】
ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質のＩｇ部分（「タグ」）は、例えば、免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ分子）の非可変部分を含み得る。典型的には、そのような部分は、免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。融合は、定常ドメインのＦｃ部分カルボキシル末端、または重鎖もしくは軽鎖のＣＨ１に隣接するアミノ末端側の領域を用いて行なうこともできる。Ｉｇタグは哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、またはラット）の免疫グロブリン由来であり得るが、ｇｐ９６−Ｉｇ融合体がヒトのためのインビボ使用を意図される場合には、ヒト免疫グロブリンが特に有用であり得る。
【００２９】
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖定常領域をコードするＤＮＡは、公知であるか、またはｃＤＮＡライブラリーから容易に入手可能である。例えば、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８０，  １９：２７１１−２７１９；  Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８０  １９：２７０２−２７１０；  Ｄｏｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８０，  ７７：６０２７−６０３１；  Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８２，  ７９：７８６２−７８６５；  Ｆａｌｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８２，  ２９８：２８６−２８８；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８４，  ２：２３９−２５６を参照されたい。多くの免疫試薬および標識系が免疫グロブリンの検出に使用可能であるため、ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質は、当該技術分野で知られる様々な免疫技術、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって容易に検出および定量できる。同様に、ペプチドタグが、容易に入手可能な抗体をもつエピトープであれば、そのような試薬を、先に言及された技術によって使用して、ｇｐ９６−Ｉｇ融合体を検出、定量、および単離できる。
【００３０】
様々な実施形態において、ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質および／または共刺激分子融合体は、リンカーを含む。様々な実施形態において、リンカーは、天然由来マルチドメインタンパク質に由来してよく、または例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられるＣｈｉｃｈｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ２２（２）：１５３−１６７，  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３），  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ６５（１０）：１３５７−１３６９に記載されるように、経験的なリンカーである。幾つかの実施形態において、リンカーは、全体の内容が参照により本明細書に組み入れられるＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３），  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ６５（１０）：１３５７−１３６９およびＣｒａｓｔｏ  ｅｔ．  ａｌ．，  （２０００），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １３（５）：３０９−３１２に記載されたものなどのリンカー設計データベースおよびコンピュータプログラムを用いて設計できる。
【００３１】
幾つかの実施形態において、リンカーは、ＰＥＧなどの合成リンカーである。
【００３２】
他の実施形態において、リンカーは、ポリペプチドである。幾つかの実施形態において、リンカーは、約１００未満のアミノ酸長である。例えばリンカーは、約１００未満、約９５未満、約９０未満、約８５未満、約８０未満、約７５未満、約７０未満、約６５未満、約６０未満、約５５未満、約５０未満、約４５未満、約４０未満、約３５未満、約３０未満、約２５未満、約２０未満、約１９未満、約１８未満、約１７未満、約１６未満、約１５未満、約１４未満、約１３未満、約１２未満、約１１未満、約１０未満、約９未満、約８未満、約７未満、約６未満、約５未満、約４未満、約３未満、または約２未満のアミノ酸長であり得る。幾つかの実施形態において、リンカーは、可撓性である。別の実施形態において、リンカーは、剛性である。様々な実施形態において、リンカーは、実質的にグリシンおよびセリン残基で構成される（例えば、約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９７％のグリシンおよびセリン）。
【００３３】
様々な実施形態において、リンカーは、抗体の（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２）を含む、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥの））  ヒンジ領域である。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥクラス抗体中で見出されるヒンジ領域は可撓性スペーサとして作用し、Ｆａｖ部分を空間中で自由に移動させる。定常領域とは対照的に、ヒンジドメインは構造的に多様であり、免疫グロブリンクラスおよびサブクラスの中で配列および長さの両方において様々である。例えば、ヒンジ領域の長さおよび可撓性は、ＩｇＧサブクラスの中で様々である。ＩｇＧ１のヒンジ領域はアミノ酸２１６〜２３１を含み、ヒンジ領域が自由に可撓性であるため、Ｆａｂ断片は対称軸を中心として回転でき、２つの重鎖間ジスルフィド架橋の最初のものを中心とする球内を移動できる。ＩｇＧ２はＩｇＧ１よりも短いヒンジを有し、１２のアミノ酸残基および４つのジスルフィド架橋を有する。ＩｇＧ２のヒンジ領域はグリシン残基を欠き、相対的に短く、かつ剛性のポリプロリン二重らせんを含み、追加の重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化される。これらの特性はＩｇＧ２分子の可撓性を制限する。ＩｇＧ３は、６２のアミノ酸を含み（２１のプロリンおよび１１のシステインを含む）、非可撓性のポリプロリン二重らせんを形成する、その特有の延長したヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍もの長さ）により他のサブクラスと異なる。ＩｇＧ３において、Ｆａｂ断片はＦｃ断片から相対的に離れており、分子により大きな可撓性を与えている。ＩｇＧ３中の延長したヒンジはまた、他のサブクラスと比較してより大きなその分子量の原因である。ＩｇＧ４のヒンジ領域はＩｇＧ１よりも短く、その可撓性はＩｇＧ１とＩｇＧ２の中間である。ヒンジ領域の可撓性は、報告によればＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２の順に低下する。
【００３４】
さらなる例示的リンカーとしては、配列ＬＥ、ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝１〜４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、（Ｇｌｙ）８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、（Ｇｌｙ）６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１〜３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２〜５）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、ＰＡＰＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、および（ＸＰ）ｎ（ここでＸは、任意のアミノ酸、例えばＡｌａ、ＬｙｓまたはＧｌｕを指す）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
様々な実施形態において、リンカーは、機能的であり得る。例えば非限定的に、リンカーは、本発明の組成物のフォールディングおよび／もしくは安定性を改善するように、発現を改善するように、薬物動態を改善するように、そして／または生物活性を改善するように機能し得る。別の実施例において、リンカーは、特定の細胞型または位置に組成物を標的させるように機能し得る。
【００３６】
幾つかの実施形態において、ｇｐ９６ペプチドは、ネズミＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合され得る（Ｂｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９６，  １５６：４４２−４４９）。ＩｇＧ１分子のこの領域は、通常はＩｇ分子内の他のシステインとのジスルフィド結合に関与する、３つのシステイン残基を含む。システインのいずれもが、タグとして機能するペプチドに必要とされないため、これらのシステイン残基の１つまたは複数は、別のアミノ酸残基、例えばセリンなどによって置換され得る。
【００３７】
当該技術分野で知られる様々なリーダー配列もまた、細菌および哺乳動物細胞からのｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質の効率的な分泌のために用いられ得る（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９８５，  １８４：９９−１０５参照）。リーダーペプチドは、意図する宿主細胞に基づいて選択され得、細菌、酵母、ウイルス、動物、および哺乳動物配列を含む得る。例えばヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄリーダーペプチドは、種々の哺乳動物細胞における使用に適する。哺乳動物細胞で使用される別のリーダーペプチドは、マウス免疫グロブリンκ鎖のＶ−Ｊ２−Ｃ領域から得ることができる（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８１，  ７８：５８１２−５８１６）。ペプチドタグまたはリーダーペプチドをコードするＤＮＡ配列は、公知であるか、またはライブラリーもしくは商標的な供給業者から容易に得ることができ、本明細書に記載された融合タンパク質に適する。
【００３８】
さらに、様々な実施形態において、本開示のｇｐ９６を１つまたは複数のワクチンタンパク質で置換できる。例えば、様々なヒートショックプロテインは、ワクチンタンパク質の１種である。様々な実施形態において、ヒートショックプロテインは、それらの断片、変種、突然変異体、誘導体または組み合わせを含む、低分子量ｈｓｐ、ｈｓｐ４０、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、およびｈｓｐ１１０ファミリーメンバーの１つまたは複数である（Ｈｉｃｋｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９：２６１５−２６２６；  Ｊｉｎｄａｌ，  １９８９，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９：２２７９−２２８３）。
【００３９】
Ｔ細胞共刺激
ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質に加えて、本明細書で提供される発現ベクターは、１つまたは複数の生物学的応答修飾物質をコードし得る。様々な実施形態において、本発明の発現ベクターは、１つまたは複数のＴ細胞共刺激分子をコードし得る。
【００４０】
様々な実施形態において、本発明の発現ベクターは、ロバストな抗原特異的ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞リンパ球（ＣＴＬ）増殖を可能にする。様々な実施形態において、本発明の発現ベクターはＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を選択的に増強し、腫瘍促進性（ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒ）であり得るＴ細胞型を実質的に増強せず、非限定的にＴｒｅｇ、１つまたは複数のチェックポイント阻害性受容体を発現するＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞、Ｔｈ２細胞およびＴｈ１７細胞を包含する。チェックポイント阻害性受容体は、未制御の免疫応答を予防または阻害する免疫細胞上で発現される受容体（例えば、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＭ−３）を指す。例えば、本発明の発現ベクターは、ＦＯＸＰ３＋調節Ｔ細胞を実質的に増強しない。幾つかの実施形態において、この選択的ＣＤ８  Ｔ細胞増強は、ｇｐ９６−Ｉｇ融合体とＴ細胞共刺激分子に対する抗体との併用療法で観察された非特異的Ｔ細胞増強と対照的である。
【００４１】
例えば、ベクターは、ＯＸ４０のアゴニスト（例えば、ＯＸ４０リガンド−Ｉｇ（ＯＸ４０Ｌ−Ｉｇ）融合体、またはＯＸ４０に結合するその断片）、誘導性Ｔ細胞共刺激物質（ＩＣＯＳ）のアゴニスト（例えば、ＩＣＯＳリガンド−Ｉｇ（ＩＣＯＳＬ−Ｉｇ）融合体、またはＩＣＯＳに結合するその断片）、ＣＤ４０のアゴニスト（例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｉｇ融合タンパク質、またはその断片）、ＣＤ２７のアゴニスト（例えば、ＣＤ７０Ｌ−Ｉｇ融合タンパク質またはその断片）、または４−１ＢＢのアゴニスト（例えば、４−１ＢＢリガンド−Ｉｇ（４−１ＢＢＬ−Ｉｇ）融合体、または４−１ＢＢに結合するその断片）をコードし得る。幾つかの実施形態において、ベクターは、ＴＮＦＲＳＦ２５のアゴニスト（例えば、ＴＬ１Ａ−Ｉｇ融合体、またはＴＮＦＲＳＦ２５に結合するその断片）、またはグルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）のアゴニスト（例えば、ＧＩＴＲリガンド−Ｉｇ（ＧＩＴＲＬ−Ｉｇ）融合体、またはＧＩＴＲに結合するその断片）、またはＣＤ４０のアゴニスト（例えば、ＣＤ４０リガンド−Ｉｇ（ＣＤ４０Ｌ−Ｉｇ）融合体、またはＣＤ４０に結合するその断片）、またはＣＤ２７のアゴニスト（例えば、ＣＤ２７リガンド−Ｉｇ（ＣＤ２７Ｌ−Ｉｇ）融合体、またはＣＤ４０に結合するその断片）をコードし得る。
【００４２】
ＩＣＯＳは、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対して若干の相同性を示し、抗原提示細胞の表面で発現されるＢ７−Ｈ２と相互作用する、誘導性Ｔ細胞共刺激受容体分子である。ＩＣＯＳは、細胞性および液性免疫応答の調節に関係づけられている。
【００４３】
４−１ＢＢはＴＮＦスーパーファミリーに属する２型膜貫通糖タンパク質であり、活性化Ｔリンパ球上で発現される。
【００４４】
ＯＸ４０（ＣＤ１３４またはＴＮＦＲＳＦ４とも称される）はＯＸ４０Ｌに関与するＴ細胞共刺激分子であり、抗原提示細胞および他の細胞型でしばしば誘導される。ＯＸ４０は、サイトカイン発現およびエフェクターＴ細胞の生存率を増大することが知られている。
【００４５】
ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）はＧＩＴＲＬに関与するＴ細胞共刺激分子であり、ＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞で優先的に発現される。ＧＩＴＲは、腫瘍微小環境内のＴｒｅｇの維持および機能において重要な役割を担う。
【００４６】
ＴＮＦＲＳＦ２５は、抗原刺激に続いてＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞で優先的に発現されるＴ細胞共刺激分子である。ＴＮＦＲＳＦ２５を介したシグナル伝達がＴＬ１Ａによって提供され、同族抗原依存的な様式でＩＬ−２受容体を介する増殖に対するＴ細胞感受性を増強するよう機能する。
【００４７】
ＣＤ４０は様々な抗原提示細胞上で見出される共刺激タンパク質でありそれらの活性化において役割を担う。ＴＨ細胞上のＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）のＣＤ４０への結合は抗原提示細胞を活性化し、様々な下流での影響を誘導する。
【００４８】
ＣＤ２７はＴＮＦスーパーファミリーに属するＴ細胞共刺激分子でありＴ細胞免疫の生成および長期維持において役割を担う。それは、様々な免疫過程においてリガンドＣＤ７０に結合する。
【００４９】
本発明において使用され得るさらなる共刺激分子としては、ＨＶＥＭ、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ（ＣＤ２５８）、Ｂ７−１、およびＢ７−２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
ｇｐ９６−Ｉｇ融合体に関し、Ｔ細胞共刺激融合タンパク質のＩｇ部分（「タグ」）は、免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ分子）の非可変部分を含み得る。先に記載された通り、典型的にはそのような部分は、免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞共刺激ペプチドは、ネズミＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合され得る（Ｂｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９６，  １５６：４４２−４４９）。Ｉｇタグは哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、またはラット）免疫グロブリン由来であり得るが、融合タンパク質がヒトへのインビボ使用を意図されれる場合にはヒト免疫グロブリンが特に有用であり得る。同じく、免疫グロブリン軽鎖または重鎖定常領域をコードするＤＮＡは公知であるか、またはｃＤＮＡライブラリーから容易に入手可能である。先に記載されたようにリーダー配列もまた、細菌および哺乳動物細胞からのＴ細胞共刺激融合タンパク質の分泌に用いられ得る。
【００５１】
Ｉｇに融合されたヒトＩＣＯＳＬの細胞外ドメインをコードする代表的なヌクレオチド最適化配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、およびコードされた融合体のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）が提供される：
【化２】
0006744318.tif 000004
0006744318.tif 000005
【００５２】
Ｉｇに融合されたヒト４−１ＢＢＬの細胞外ドメインをコードする代表的なヌクレオチド最適化配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、およびコードされたアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）が提供される：
【化３】
0006744318.tif 000006
0006744318.tif 000007
【００５３】
Ｉｇに融合されたヒトＴＬ１Ａの細胞外ドメインをコードする代表的なヌクレオチド最適化配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、およびコードされたアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）が提供される：
【化４】
0006744318.tif 000008
0006744318.tif 000009
【００５４】
ヒトＯＸ４０Ｌ−Ｉｇをコードする代表的なヌクレオチド最適化配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、およびコードされたアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）が提供される：
【化５】
0006744318.tif 000010
0006744318.tif 000011
【００５５】
ヒトＴＬ１Ａの代表的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示す：
【化６】
0006744318.tif 000012
0006744318.tif 000013
【００５６】
ヒトＨＶＥＭの代表的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８（アクセション番号ＣＲ４５６９０９）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９（アクセション番号ＣＲ４５６９０９）に示す：
【化７】
0006744318.tif 000014
【００５７】
ヒトＣＤ２８の代表的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０（アクセション番号ＮＭ＿００６１３９）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に示す：
【化８】
0006744318.tif 000015
0006744318.tif 000016
0006744318.tif 000017
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0006744318.tif 000019
【００５８】
ヒトＣＤ３０Ｌの代表的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２（アクセション番号Ｌ０９７５３）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に示す：
【化９】
0006744318.tif 000020
0006744318.tif 000021
0006744318.tif 000022
【００５９】
ヒトＣＤ４０の代表的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４（アクセション番号ＮＭ＿００１２５０）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に示す：
【化１０】
0006744318.tif 000023
0006744318.tif 000024
【００６０】
ヒトＣＤ７０の代表的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６（アクセション番号ＮＭ＿００１２５２）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に示す：
【化１１】
0006744318.tif 000025
【００６１】
ヒトＬＩＧＨＴの代表的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８（アクセション番号ＣＲ５４１８５４）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９に示す：
【化１２】
0006744318.tif 000026
【００６２】
様々な実施形態において、本発明は、本明細書に記載された配列のいずれか、例えば本明細書に開示された配列（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１３および３８〜４９）のいずれかと少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含むバリアントを提供する。
【００６３】
様々な実施形態において、本発明は、本明細書に記載されたタンパク質配列のいずれかに関係する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を有するアミノ酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸突然変異は独立して、本明細書に記載される保存的または非保存的置換、挿入、欠失、およびトランケーションから選択され得る。
【００６４】
チェックポイント遮断／腫瘍免疫抑制の遮断
いくつかのヒト腫瘍は、患者の免疫系によって排出され得る。例えば、免疫「チェックポイント」分子に標的されるモノクローナル抗体の投与は、完全な応答および腫瘍寛解を導き得る。そのような抗体の作用機序は、腫瘍が抗腫瘍免疫応答からの防御として共選択した免疫調節分子の阻害を介する。これらの「チェックポイント」分子を阻害することによって（例えば、アンタゴニスト抗体を用いて）、患者のＣＤ８＋  Ｔ細胞は増殖し腫瘍細胞を破壊することができる。
【００６５】
例えば、限定ではなく例としてＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１に標的されるモノクローナル抗体の投与は、完全な応答および腫瘍寛解を導き得る。そのような抗体の作用機序は、腫瘍が抗腫瘍免疫応答からの防御として共選択したＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１の阻害を介する。これらの「チェックポイント」分子を阻害することによって（例えば、アンタゴニスト抗体を用いて）、患者のＣＤ８＋  Ｔ細胞は増殖し腫瘍細胞を破壊することができる。
【００６６】
したがって本明細書で提供されるベクターは、免疫「チェックポイント」分子に標的される１つまたは複数の遮断抗体と併せて用いることができる。例えば幾つかの実施形態において、本明細書で提供されるベクターは、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１などの分子に標的される１つまたは複数の遮断抗体と併せて用いることができる。例えば本明細書で提供されるベクターは、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２ならびに／またはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２との結合を遮断、低減および／または阻害する薬剤（非限定的例として、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、Ｍｅｒｃｋ）、ピジリズマブ（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）（ＣＴ−０１１、ＣＵＲＥ  ＴＥＣＨ）、ＭＫ−３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ  ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）の１つまたは複数）と併せて用いることができる。一実施形態において、本明細書で提供されるベクターは、ＣＴＬＡ−４の活性および／またはＣＴＬＡ−４と１つもしくは複数の受容体との結合を遮断、低減および／または阻害する薬剤（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＡＰ２Ｍ１、ＳＨＰ−２、およびＰＰＰ２Ｒ５Ａ）と併せて用いることができる。例えば、幾つかの実施形態において、免疫調整剤は、非限定的にイピリムマブ（ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１、Ｙｅｒｖｏｙ、ＢＭＳ）および／またはトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）などの抗体である。これらの分子に対する遮断抗体は、例えばＢｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ（ニューヨーク州ニューヨーク所在）、Ｍｅｒｃｋ（ニュージャージー州、ケニルワース所在）、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（メリーランド州ゲイザースバーグ所在）、およびＰｆｉｚｅｒ（ニューヨーク州ニューヨーク所在）から得ることができる。
【００６７】
さらに、本明細書で提供されるベクターは、例えばＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも称される）、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１およびＣＨＫ２キナーゼ、Ａ２ａＲ、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ガレクチン−９、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰα、ＩＣＯＳ、ＣＤ１７２ａ、およびＴＭＩＧＤ２ならびに様々なＢ−７ファミリーリガンド（非限定的にＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ６およびＢ７−Ｈ７など）などの免疫「チェックポイント」分子に標的される１つまたは複数の遮断抗体と併せて用いることができる。
【００６８】
ベクターおよび宿主細胞
この文書は、原核細胞および真核細胞において発現され得る、ワクチンタンパク質融合タンパク質（例えば、ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質）およびＴ細胞共刺激融合タンパク質をコードする核酸構築物を提供する。例えば、この文書は、ワクチンタンパク質融合体（例えば、ｇｐ９６−Ｉｇ融合体）およびＴ細胞共刺激融合タンパク質（例えば、ＯＸ４０Ｌ−ＩｇもしくはＯＸ４０に特異的に結合するその一部、ＩＣＯＳＬ−ＩｇもしくはＩＣＯＳに特異的に結合するその一部、４−１ＢＢＬ−Ｉｇ、もしくは４−１ＢＢＲに特異的に結合するその一部、ＣＤ４０Ｌ−Ｉｇ、もしくはＣＤ４０に特異的に結合するその一部、ＣＤ７０Ｌ−Ｉｇ、もしくはＣＤ２７に特異的に結合するその一部、ＴＬ１Ａ−ＩｇもしくはＴＮＦＲＳＦ２５に特異的に結合するその一部、またはＧＩＴＲＬ−ＩｇもしくはＧＩＴＲに特異的に結合するその一部）をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを基剤とするベクター）を提供する。加えて、この文書は、本明細書に記載されたベクターを作製するための方法、およびコードされたポリペプチドの発現のために適当な宿主細胞中にベクターを導入するための方法を提供する。一般に、本明細書で提供される方法は、ワクチンタンパク質融合タンパク質（例えば、ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質）およびＴ細胞共刺激融合タンパク質をコードする核酸配列を構築すること、融合タンパク質をコードする配列を発現ベクター中にクローニングすること、を含む。発現ベクターは、宿主細胞中に導入されまたはウイルス粒子中に取り込まれてよく、そのいずれかが対象に投与されて、例えば癌または感染を処置できる。例えば、類人猿免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびマラリアによって発現される個々の抗原に対する抗原特異的免疫応答を刺激するために、ｇｐ９６−Ｉｇを基剤とするワクチンを作製することができる。これらのワクチンに対する免疫応答は、ｇｐ９６−ＩｇベクターによるＴ細胞共刺激融合タンパク質の共発現を通して増強され得る。
【００６９】
ワクチンタンパク質融合体（例えば、ｇｐ９６−Ｉｇ融合体）およびＴ細胞共刺激融合タンパク質をコードするｃＤＮＡまたはＤＮＡ配列は、従来のＤＮＡクローニングおよび突然変異誘発法、ＤＮＡ増幅法、ならびに／または合成法を利用して得ることができる（そして所望なら修飾することができる）。一般に、ワクチンタンパク質融合タンパク質（例えば、ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質）および／またはＴ細胞共刺激融合タンパク質をコードする配列は、発現前に、遺伝子修飾および複製を目的としてクローニングベクター中に挿入できる。各コード配列は、コードされたタンパク質をインビトロおよびインビボで適切な宿主細胞で発現する目的で、プロモーターなどの調節要素に動作可能に連結され得る。
【００７０】
発現ベクターは、分泌されるワクチンタンパク質（例えば、ｇｐ９６−Ｉｇ）およびＴ細胞共刺激融合タンパク質を生成するために宿主細胞中に導入され得る。核酸を生存可能な細胞中に導入するために利用可能な種々の技術が存在する。核酸をインビトロで哺乳動物細胞中に移入させるのに適した技術は、リポソームの使用、電気穿孔、マイクロインジェクション、細胞融合、ポリマーを基にした系、ＤＥＡＥ−デキストラン、ウイルス形質導入、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。インビボ遺伝子移入のために、リポソーム；キトサンおよびゼラチンなどの天然ポリマーを基にした送達ビヒクルを含む多数の技術および試薬を用いることができ、ウイルスベクターもインビボ形質導入に適する。幾つかの状況において、細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体またはリガンドなどの標的物質を提供することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、例えば特定の細胞型に親和性の（ｔｒｏｐｉｃ）カプシドタンパク質またはその断片、循環において内在化を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在を標的とし細胞内半減期を延長するタンパク質、を標的とするため、かつ／またはその取り込みを促進するために用いられ得る。受容体を介したエンドサイトーシスの技術は、例えばＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２，  ４４２９−４４３２  （１９８７）；およびＷａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７，  ３４１０−３４１４  （１９９０）に記載される。
【００７１】
適当ならば、遺伝子送達剤、例えば組み込み配列（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を用いることもできる。数多くの組み込み配列が、当該技術分野で公知である（例えば、Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６：３９１−４０６，  １９９８；  Ｓａｄｗｏｓｋｉ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １６５：３４１−３５７，  １９８６；  Ｂｅｓｔｏｒ，  Ｃｅｌｌ，  １２２（３）：３２２−３２５，  ２００５；  Ｐｌａｓｔｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＴＩＧ  １５：３２６−３３２，  １９９９；  Ｋｏｏｔｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．，  ４３：４１３−４３９，  ２００３参照）。これらは、リコンビナーゼおよびトランスポザーゼを含む。例として、Ｃｒｅ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １５０：４６７−４８６，  １９８１）、ラムダ（Ｎａｓｈ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２４７，  ５４３−５４５，  １９７４）、ＦＩｐ（Ｂｒｏａｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ２９：２２７−２３４，  １９８２）、Ｒ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １７２：６１０−６１８，  １９９０）、ｃｐＣ３１（例えば、Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３５：６６７−６７８，  ２００４参照）、マリナー（ｍａｒｉｎｅｒ）ファミリーのトランスポザーゼであるスリーピングビューティー（Ｐｌａｓｔｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，上掲）、ならびにＡＡＶ、レトロウイルス、およびレトロウイルスまたはレンチウイルスのＬＴＲ配列およびＡＡＶのＩＴＲ配列などのウイルス組み込みを提供する成分を有するアンチウイルスなどのウイルスを組み込むための成分（Ｋｏｏｔｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．，  ４３：４１３−４３９，  ２００３）が挙げられる。
【００７２】
細胞は、例えば、インビトロで培養されまたは遺伝的に改変されてよい。宿主細胞は、健常なヒト、癌患者、および感染疾患を有する患者、私的研究室の寄託物、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎなどの公的培養収集物を含む、正常なもしくは罹患した対象から、または商業的供給業者から得ることができる。
【００７３】
インビボでｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質およびＴ細胞共刺激融合タンパク質の生成および分泌に用いられ得る細胞としては、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、もしくは顆粒球などの血液細胞；造血幹細胞もしくは前駆細胞（例えば、骨髄から得られるような）などの様々な幹細胞もしくは前駆細胞、臍帯血、末梢血、胎児肝臓など、および腫瘍細胞（例えば、ヒト腫瘍細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。細胞型の選択は、処置または予防される腫瘍または感染性疾患の型に依存し、かつ当業者によって決定され得る。
【００７４】
異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングおよび修飾に特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。レシピエントがそのヒートショックプロテイン（ｈｓｐｓ）を処理する方法と類似の特異的な様式で、発現された遺伝子産物を修飾および処理する宿主細胞が選択され得る。多量のｇｐ９６−Ｉｇを生成する目的では、宿主細胞の型が異種遺伝子の発現に用いられていて、合理的に十分特徴づけられ、大規模生産工程用に開発されていることが好ましいかもしれない。幾つかの実施形態において、宿主細胞は、本発明の融合体、または本発明の融合タンパク質を分泌する組換え細胞が後に投与される患者に対して自家性である。
【００７５】
幾つかの実施形態において、本明細書で提供される発現構築物は、抗原性細胞中に導入され得る。本明細書で用いられるように、抗原性細胞は、例えば、ウイルスなどの癌原性感染物質に感染しているがまだ腫瘍性でない前新生物細胞、またはＤＮＡ損傷物質または放射線などの変異原または癌原性物質に暴露された抗原性細胞を包含し得る。用いられ得る他の細胞は、形態学または生理学的もしくは生化学的機能による特徴づけられるように正常形態から新生物形態への移行にある前新生物細胞である。
【００７６】
典型的には、本明細書で提供される方法で用いられる癌細胞および前新生物細胞は、哺乳動物起源のものである。企図される哺乳動物としては、ヒト、コンパニオンアニマル（例えば、イヌおよびネコ）、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタおよびウマ）、実験動物（例えば、マウス、ラットおよびウサギ）、および捕獲されたまたは自由な野生動物が挙げられる。
【００７７】
幾つかの実施形態において、癌細胞（例えば、ヒト腫瘍細胞）が、本明細書に記載された方法で用いられ得る。癌細胞は、発現されたｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質と非共有結合でつながるようになる抗原性ペプチドを提供する。前新生物病変、癌組織、または癌細胞に由来する細胞株もまた用いることができるが、但し、その細胞株の細胞が、標的癌細胞上の抗原と共通のなくとも１つまたは複数の抗原決定基を有することを条件とする。癌組織、癌細胞、癌原性物質に感染した細胞、他の前新生物細胞、およびヒト起源の細胞株を用いることができる。最終的に融合タンパク質が投与されることになる患者から切除された癌細胞が特に有用であり得るが、同種細胞を用いることもできる。幾つかの実施形態において、癌細胞は、樹立された腫瘍細胞株、例えば非限定的に、樹立された非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膀胱癌、メラノーマ、卵巣癌、腎細胞癌、前立腺癌、肉腫、乳癌、扁平上皮癌、頭頸部癌、肝細胞癌、膵臓癌、または結腸癌細胞株由来であり得る。
【００７８】
様々な実施形態において、本発明の融合タンパク質は、Ｔ細胞の共刺激および様々な腫瘍抗原の提示の両方を可能にする。例えば、幾つかの実施形態において、本発明のワクチンタンパク質融合体（例えば、ｇｐ９６融合体）は、これらの様々な腫瘍抗原を介添えする。様々な実施形態において、腫瘍細胞は、種々の抗原を分泌する。例示的で非限定的な、分泌され得る抗原は、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、大腸関連抗原（ＣＲＣ）−００１７−１Ａ／ＧＡ７３３、  癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ならびにその免疫原性エピトープＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）ならびにその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、およびＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ―Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ―Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ―Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリー（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、およびγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００  Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、腺腫様多発結腸ポリープタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質などのウイルス産物、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ−１、ＮＡ、ＥＢＶにコードされる核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１  ＣＴ−７、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ１３８、ＡＧＳ１６、ＭＵＣ１、ＧＰＮＭＢ、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＭＳＡ、膀胱癌抗原、例えばＡＣＴＬ８、ＡＤＡＭ２２、ＡＤＡＭ２３、ＡＴＡＤ２、ＡＴＡＤ２Ｂ、ＢＩＲＣ５、ＣＡＳＣ５、ＣＥＰ２９０、ＣＥＰ５５、ＣＴＡＧＥ５、ＤＣＡＦ１２、ＤＤＸ５、ＦＡＭ１３３Ａ、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＭＰ３、ＫＩＡＡ０１００、ＭＡＧＥＡ１１、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ６、ＭＰＨＯＳＰＨ１０、ＯＤＦ２、ＯＤＦ２Ｌ、ＯＩＰ５、ＰＢＫ、ＲＱＣＤ１、ＳＰＡＧ１、ＳＰＡＧ４���ＳＰＡＧ９、ＴＭＥＦＦ１、ＴＴＫ、および前立腺癌抗原、例えばＰＲＡＭＥ、ＢＩＲＣ５、ＣＥＰ５５、ＡＴＡＤ２、ＯＤＦ２、ＫＩＡＡ０１００、ＳＰＡＧ９、ＧＰＡＴＣＨ２、ＡＴＡＤ２Ｂ、ＣＥＰ２９０、ＳＰＡＧ１、ＯＤＦ２Ｌ、ＣＴＡＧＥ５、ＤＤＸ５、ＤＣＡＦ１２、ＩＭＰ３である。幾つかの実施形態において、抗原は、ヒト内在性レトロウイルス抗原である。例示的抗原として、非限定的に、Ｇａｇの少なくとも一部、Ｔａｔの少なくとも一部、Ｒｅｖの少なくとも一部、Ｎｅｆの少なくとも一部、およびｇｐ１６０の少なくとも一部に由来するエピトープを含むヒト内在性レトロウイルスからの抗原を挙げることもできる。
【００７９】
さらに、幾つかの実施形態において、本発明のワクチンタンパク質融合体（例えば、ｇｐ９６融合体）は、本明細書に記載された様々な方法で用いられる場合に、目的の疾患に対抗して患者の免疫系をさらに活性化させるアジュバント効果を提供する。
【００８０】
原核生物および真核生物ベクターの両者が、本明細書で提供された方法でのワクチンタンパク質（例えば、ｇｐ９６−Ｉｇ）およびＴ細胞共刺激融合タンパク質の発現に用いられ得る。原核生物ベクターとしては、大腸菌配列に基づく構築物が挙げられる（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  １９９６，  ６０：５１２−５３８参照）。大腸菌における発現に用いられ得る調節領域の非限定的例としては、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７およびλＰＬが挙げられる。原核生物発現ベクターの非限定的例としては、λｇｔ１１などのλｇｔベクターシリーズ（Ｈｕｙｎｈ  ｅｔ  ａｌ．，  “ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｖｏｌ．  Ｉ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，”  １９８４，  （Ｄ．  Ｇｌｏｖｅｒ，  ｅｄ．），  ｐｐ．  ４９−７８，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ）、およびｐＥＴベクターシリーズ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９９０，  １８５：６０−８９）を挙げることができる。しかし、原核生物宿主ベクター系は、哺乳動物細胞の翻訳後プロセシングの多くを実施することができない。したがって、真核生物宿主ベクター系が特に有用であり得る。
【００８１】
種々の超節領域を、哺乳動物宿主細胞におけるワクチンタンパク質（例えば、ｇｐ９６−Ｉｇ）およびＴ細胞共刺激融合体の発現に用いることができる。例えば、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ならびにラウス肉腫ウイルスロングターミナルリピート（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーターを用いることができる。哺乳動物細胞において用いられ得る誘導性プロモーターとしては、非限定的に、メタロチオネインＩＩ遺伝子、マウス乳腺腫瘍ウイルスグルココルチコイド応答性ロングターミナルリピート（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、β−インターフェロン遺伝子、およびｈｓｐ７０遺伝子に関連するプロモーターが挙げられる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８９，  ４９：２７３５−４２；およびＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９０，  １０：１６５−７５）。ヒートショックプロモーターまたはストレスプロモーターもまた、組換え宿主細胞での融合タンパク質の発現を駆動するのに有利であり得る。
【００８２】
一実施形態において、本発明は、合図に応答して一過的に高レベルの発現を実行できる誘導性プロモーターの使用を企図する。例示的な誘導性発現制御領域としては、低分子量化学物質などの合図で刺激される誘導性プロモーターを含むものが挙げられる。特定の例は、例えば米国特許第５，９８９，９１０号、同第５，９３５，９３４号、同第６，０１５，７０９号、および同第６，００４，９４１号に見出すことができ、それらのそれぞれは、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【００８３】
組織特異性を示しトランスジェニック動物において用いられてきた動物調節領域もまた、特定の組織タイプの腫瘍細胞で用いることができる：膵腺房細胞中で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １９８４，  ３８：６３９−６４６；  Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ  １９８６，  ５０：３９９−４０９；およびＭａｃＤｏｎａｌｄ，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９８７，  ７：４２５−５１５）；膵ベータ細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８５，  ３１５：１１５−１２２）、リンパ細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １９８４，  ３８：６４７−６５８；  Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８５，  ３１８：５３３−５３８；およびＡｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８７，  ７：１４３６−１４４４）、精巣細胞、乳房細胞、リンパ細胞および肥満細胞中で活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １９８６，  ４５：４８５−４９５）、肝臓中で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌ，  １９８７，  １：２６８−２７６）、肝臓中で活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８５，  ５：１６３９−１６４８；およびＨａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８７，  ２３５：５３−５８）、肝臓中で活性なα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌ  １９８７，  １：１６１−１７１）、骨髄細胞中で活性なβ−グロブリン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８５，  ３１５：３３８−３４０；およびＫｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １９８６，  ４６：８９−９４）；脳中の乏突起膠細胞中で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １９８７，  ４８：７０３−７１２）；骨格筋中で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８５，  ３１４：２８３−２８６）、ならびに視床下部中で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６，  ２３４：１３７２−１３７８）。
【００８４】
発現ベクターは、ＳＶ４０ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、免疫グロブリン遺伝子、メタロチオネイン、およびβ−アクチンで見出されるものなどの転写促進要素も含み得る（Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９８７，  １５３：５１６−５４４；およびＧｏｒｍａｎ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９０，  １：３６−４７参照）。加えて、発現ベクターは、１つよりも多くの型の宿主細胞におけるベクターの維持および複製、または宿主染色体へのベクターの組み込みを可能にする配列を含み得る。そのような配列としては、複製起点、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメアＤＮＡ、およびテロメアＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
加えて、発現ベクターは、本明細書に記載された融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む宿主細胞を最初に単離すること、同定すること、または追跡することのために、１つまたは複数の選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含み得る。ｇｐ９６−ＩｇおよびＴ細胞共刺激融合タンパク質の長期の高収率生産のために、哺乳動物細胞における安定発現が有用であり得る。多くの選択システムが、哺乳動物細胞に用いられ得る。例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １９７７，  １１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９６２，  ４８：２０２６）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １９８０，  ２２：８１７）の遺伝子を、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞において用いることができる。加えて、代謝拮抗薬耐性を、メトトレキサートへの耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８０，  ７７：３５６７；  Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８１，  ７８：１５２７）；ミコフェノール酸への耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８１，  ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９８１，  １５０：１）；およびハイグロマイシンへの耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １９８４，  ３０：１４７）の選択の原理として用いることができる。他の選択マーカー、例えばヒスチジノールおよびＺｅｏｃｉｎ（商標）を用いることもできる。
【００８６】
有用な哺乳動物宿主細胞としては、ヒト、サル、およびげっ歯類由来の細胞（例えば、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ  ｉｎ  “Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  １９９０，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．参照）が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓細胞株（例えば、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児腎臓株（例えば、懸濁培養での生育のためにサブクローニングされた２９３、２９３−ＥＢＮＡ、または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  １９７７，  ３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞−ＤＨＦＲ（例えば、ＣＨＯ、ウルラウブおよびチャシン（Ｃｈａｓｉｎ）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８０，  ７７：４２１６）；マウスセルトリ細胞（Ｍａｔｈｅｒ，  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９８０，  ２３：２４３−２５１）；マウス線維芽細胞（例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３）、サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファロー  ラット肝細胞（例えば、ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；およびマウス乳腺腫瘍細胞（例えば、ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）を含む。本明細書に記載された融合タンパク質を発現するための例示的な癌細胞型としては、マウス線維芽細胞株：ＮＩＨ３Ｔ３、マウスルイス肺癌細胞株：ＬＬＣ、マウス肥満細胞腫細胞株：Ｐ８１５、マウスリンパ腫細胞株：ＥＬ４およびそのオボアルブミントランスフェクタント：Ｅ．Ｇ７、マウスメラノーマ細胞株：Ｂ１６Ｆ１０、マウス線維肉腫細胞株：ＭＣ５７、ヒト小細胞肺癌細胞株：ＳＣＬＣ＃２およびＳＣＬＣ＃７、ヒト肺腺癌細胞株、例えばＡＤ１００、ならびにヒト前立腺癌細胞株、例えばＰＣ−３が挙げられる。
【００８７】
多数の、ウイルスに基づく発現系もまた、ｇｐ９６−ＩｇおよびＴ細胞共刺激融合タンパク質を生成するために哺乳動物細胞と共に用いられ得る。ＤＮＡウイルスバックボーンを用いるベクターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（Ｈａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １９７９，  １７：７２５）、アデノウイルス（Ｖａｎ  Ｄｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８４，  ４：１６５３）、アデノ随伴ウイルス（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９８８，  ６２：１９６３）、およびウシパピローマウイルス（Ｚｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８２，  ７９：４８９７）から得られた。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、ドナーＤＮＡ配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三分節リーダー配列（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）にライゲートされ得る。この融合遺伝子は、その後、インビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノム内に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、非感染宿主において生存可能で異種生成物を発現できる組換えウイルスをもたらし得る（例えば、Ｌｏｇａｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８４，  ８１：３６５５−３６５９参照）。
【００８８】
ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）はヒトを含む高等な脊椎動物の多くに感染することができ、そのＤＮＡはエピソームとして複製する。多数のシャトルベクターが組換え遺伝子発現用に開発され、それらは哺乳動物細胞において安定したマルチコピー（２０〜３００コピー／細胞）染色体外要素として存在する。典型的にはこれらのベクターは、ベクターを大腸菌内で増殖させるＢＰＶ  ＤＮＡのセグメント（ゲノム全体または６９％のトランスフォーミング断片）、広い宿主範囲を含むプロモーター、ポリアデニル化シグナル、スプライスシグナル、選択マーカー、および「無毒」プラスミド配列を含む。細菌での構築および増幅に続いて、発現遺伝子構築物は、例えばリン酸カルシウム共沈法によって、培養哺乳動物細胞中へトランスフェクトされる。形質転換された表現型を明示しない宿主細胞について、形質転換体の選択を、ヒスチジノールおよびＧ４１８耐性などの主要な選択マーカーの使用によって実現する。
【００８９】
あるいは、ワクチニア７．５Ｋプロモーターが用いられ得る（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８２，  ７９：７４１５−７４１９；  Ｍａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９８４，  ４９：８５７−８６４；およびＰａｎｉｃａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８２，  ７９：４９２７−４９３１．参照）。ヒト宿主細胞が用いられる場合、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）起点（ＯｒｉＰ）およびＥＢＶ核抗原１（ＥＢＮＡ−１；トランスに作用する複製因子）に基づくベクターが用いられ得る。そのようなベクターは、広範囲のヒト宿主細胞、例えばＥＢＯ−ｐＣＤ（Ｓｐｉｃｋｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  Ｔｅｃｈ  １９９０，  ２：１４−１８）；ｐＤＲ２およびλＤＲ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手）と共に用いることができる。
【００９０】
ｇｐ９６−ＩｇおよびＴ細胞共刺激融合タンパク質は、レトロウイルスを基にした発現系で作製することもできる。ウイルス遺伝子配列のほとんどは、取り出して外来のコード配列と交換することができ、一方で失ったウイルス機能をトランスに供給し得るため、モロニーネズミ白血病ウイルスなどのレトロウイルスを用いることができる。トランスフェクションとは異なり、レトロウイルスは効率的に感染し、例えば初代造血細胞を含む、広範囲の細胞型に遺伝子を移入できる。その上、レトロウイルスベクターによる感染のための宿主範囲は、ベクターパッケージングに用いられるエンベロープの選択によって操作され得る。
【００９１】
例えば、レトロウイルスベクターは、５’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）、３’ＬＴＲ、パッケージングシグナル、細菌複製起点、および選択マーカーを含み得る。例えば、ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質をコードする配列を５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間の位置に挿入でき、それにより５’ＬＴＲプロモーターからの転写がクローン化されたＤＮＡを転写する。５’ＬＴＲは、プロモーター（例えば、ＬＴＲプロモーター）、Ｒ領域、Ｕ５領域、およびプライマー結合部位をこの順序で含む。これらのＬＴＲ要素のヌクレオチド配列は、当該技術分野で周知である。異種プロモーターおよび多剤選択マーカーもまた、感染した細胞の選択を促進するために発現ベクターに含まれ得る。ＭｃＬａｕｃｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９０，  ３８：９１−１３５；  Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９９０，  １８：３５８７−３５９６；  Ｃｈｏｕｌｉｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９６，  ７０：１７９２−１７９８；  Ｂｏｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  １９９４，  ６：２９１−３０２；  Ｓａｌｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９９３，  ４：１２９−１４１；およびＧｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖｅｌ  １９９３，  ３：１１０−１１４を参照されたい。
【００９２】
本明細書に記載されるクローニングおよび発現ベクターのいずれも、当業者に知られる技術を利用して既知のＤＮＡ配列から合成し組立てることができる。調節領域およびエンハンサー要素は、天然のおよび合成の両方の、種々の起源のものであり得る。幾つかのベクターおよび宿主細胞は、商業的に得ることができる。有用なベクターの非限定的例は、参照により本明細書に組み入れられるＡｐｐｅｎｄｉｘ  ５  ｏｆ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９８８，  ｅｄ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ａｓｓｏｃ．  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ならびにＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃなどの商標的供給業者のカタログに記載される。
【００９３】
処置の方法
本明細書で提供される発現ベクターは、対象（例えば、研究用動物または哺乳動物、例えば癌またな感染などの臨床状態を有するヒト）への投与のために組成物中に組み込まれ得る。例えば、発現ベクターは、癌または感染の処置のために対象に投与され得る。したがって本文書は、癌または感染などの臨床状態を、本明細書で提供された発現ベクターで処置するための方法を提供する。感染は、例えば、急性感染または慢性感染であり得る。幾つかの実施形態において、感染は、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、またはマラリアによる感染であり得る。方法は、発現ベクター、発現ベクターを含む細胞、または発現ベクターを含むウイルスもしくはウイルス様粒子を、対象の臨床状態の進行または症状が治療的様式で低減される条件下で、対象に投与することを含み得る。
【００９４】
様々な実施形態において、本発明は、癌および／または腫瘍に、例えば癌および／または腫瘍の処置または予防に関係する。癌または腫瘍は、身体の臓器または系の正常な機能を妨害する細胞の非制御的生育および／または細胞生存率の異常な上昇および／またはアポトーシスの阻害を指す。良性および悪性の癌、ポリープ、過形成に加え、休止状態の腫瘍または微小転移が含まれる。また、免疫系によって妨げられない異常な増殖を有する細胞（例えば、ウイルス感染細胞）が含まれる。癌は、原発癌または転移癌であり得る。原発癌は、臨床的に検出可能になる発生部位での癌細胞のエリアであり、原発腫瘍であり得る。これに対して転移癌は、１つの臓器または部分から別の非隣接臓器または部分への疾患の広がりであり得る。転移癌は、局所領域において周辺の正常組織を透過および浸潤する能力を獲得した癌細胞によって誘発され得、新しい腫瘍を形成し、これは局所転移であり得る。癌はまた、リンパ管および／または血管の壁を透過する能力を獲得した癌細胞によっても誘発され、その後、癌細胞は血流を通して体内の他の部位および組織へ循環できる（それにより循環する腫瘍細胞である）。癌は、リンパ行性または血行性播種などの過程によるものであり得る。癌は、別の部位に定置し、血管または壁を再透過し、増殖し続け、かつ最終的に別の臨床的に検出可能な腫瘍を形成するようになる腫瘍細胞によっても誘発され得る。癌は、この新しい腫瘍でもあり得、これは転移（または続発性）腫瘍であり得る。
【００９５】
癌は、続発性のまたは転移性の腫瘍であり得る、転移された腫瘍細胞によって誘発され得る。腫瘍の細胞は、元の腫瘍におけるものと類似し得る。例として、乳癌または結腸癌が肝臓に転移すると、続発性腫瘍は、肝臓に存在しながら、異常な肝臓細胞ではなく、異常な乳腺細胞または結腸細胞で構成される。したがって肝臓での腫瘍は、肝臓癌ではなく、転移性乳癌または転移性結腸癌であり得る。
【００９６】
癌は、任意の組織からの起源を有し得る。癌は、メラノーマ、結腸、乳房、または前立腺を起源とし得、したがってそれぞれ、元は皮膚、結腸、乳房、または前立腺であった細胞から構成され得る。癌は、血液の悪性腫瘍でもあり得、リンパ腫であり得る。癌は、肝臓、肺、膀胱、または腸などの組織に浸潤し得る。
【００９７】
処置され得る例示的な癌としては、癌腫、例えば様々なサブタイプ、例として腺癌、基底細胞癌、扁平上皮癌および移行上皮細胞癌）、肉腫（例えば、骨および軟組織など）、白血病（例えば、急性骨髄性、急性リンパ芽球性、慢性骨髄性、慢性リンパ球性、および毛様細胞など）、リンパ腫および骨髄腫（例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、軽鎖、非分泌性、ＭＧＵＳ、ならびに形質細胞腫など）、および中枢神経系癌（例えば、脳（例えば、グリオーマ（例えば、星細胞腫、オリゴデンドログリオーマ、および上皮腫）、髄膜腫、下垂体腺腫、神経腫、および骨髄腫瘍（例えば、髄膜腫および神経線維腫）など）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
本発明の代表的な癌および／または腫瘍としては、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳および中枢神経系の癌、乳癌、腹膜癌、子宮頚癌、絨毛癌、結腸および直腸癌、結合組織癌、消化器系の癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌（胃腸癌を含む）、グリオブラストーマ、肝臓癌、肝臓腫、上皮内新生物、腎臓癌、咽頭癌、白血病、肝癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌）、メラノーマ、骨髄腫、神経芽腫、口腔癌（唇、舌、口、および咽頭）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽腫、横紋筋芽細胞腫、直腸癌、呼吸器系の癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌または子宮内膜癌、泌尿器系の癌、外陰部癌、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小非切れ込み細胞ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ、外套細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、およびワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、毛様細胞リンパ腫、慢性骨髄芽急性白血病、ならびに他の癌腫および肉腫、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、およびメイグス症候群と関連する異常な血管増殖が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
幾つかの態様において、本発明の融合体は、細胞内病原を排出するのに用いられる。幾つかの態様において、本発明の融合体は、１つまたは複数の感染を処置するのに用いられる。幾つかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶおよびＨＣＶなど）、寄生虫感染（例えば、マラリアなど）、および細菌感染を処置するための方法において用いられる。様々な実施形態において、感染は、免疫抑制を誘導する。例えば、ＨＩＶ感染は多くの場合、感染された対象において免疫抑制をもたらす。したがって、本明細書の他の箇所に記載された通り、そのような感染の処置は、様々な実施形態において、免疫系を本発明の融合タンパク質で調整して、免疫阻害よりも免疫刺激を優先させることを含み得る。あるいは、本発明は、免疫活性化を誘導する感染を処置するための方法を提供する。例えば、腸蠕虫感染は、慢性免疫活性化に関連づけられている。これらの実施形態において、そのような感染の処置は、免疫系を本発明の融合タンパク質で調整して、免疫刺激よりも免疫阻害を優先させることを含み得る。
【０１００】
様々な実施形態において、本発明は、非限定的に、例えば呼吸管の、パピローマウイルス感染の、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染の、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の、および肝炎ウイルス感染などの内部臓器のウイルス感染の、急性または慢性のウイルス感染を含むウイルス感染を処置するための方法を提供する。幾つかの実施形態において、ウイルス感染は、フラビウイルス科のウイルスによって誘発される。幾つかの実施形態において、フラビウイルス科のウイルスは、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルスから選択される。他の実施形態において、ウイルス感染は、ピコルナウイルス科のウイルス、例えばポリオウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルスによって誘発される。他の実施形態において、ウイルス感染は、オルトミクソウイルス科のメンバー、例えばインフルエンザウイルスによって誘発される。他の実施形態において、ウイルス感染は、レトロウイルス科のメンバー、例えばレンチウイルスによって誘発される。他の実施形態において、ウイルス感染は、パラミクソウイルス科、例えば呼吸系発疹ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、ルブラウイルス（例えば、ムンプスウイルス）、麻疹ウイルス、およびヒトメタニューモウイルスによって誘発される。他の実施形態において、ウイルス感染は、ブニヤウイルス科のメンバー、例えばハンタウイルスによって誘発される。他の実施形態において、ウイルス感染は、レオウイルス科のメンバー、例えばロタウイルスによって誘発される。
【０１０１】
様々な実施形態において、本発明は、原生動物または蠕虫感染などの寄生虫感染を処置する方法を提供する。幾つかの実施形態において、寄生虫感染は、寄生性原虫による。幾つかの実施形態において、ｏｒｉｔｉｚｉａｂ寄生虫は、消化管内原虫、組織内原虫、または血液原虫から選択される。例示的な寄生性原虫としては、赤痢アメーバ、ジアルディア・ランブリア、クリプトスポリジウム・ムリス、トリパノソーマ・ガンビエンス、トリパノソーマ・ローデシエンス、トリパノソーマ・クルージ、リーシュマニア・メキシカーナ、リーシュマニア・ブラジリエンシス、リーシュマニア・トロピカ、リーシュマニア・ドノバニ、トキソプラズマ・ゴンジイ、プラスモジウム・ビバクス、プラスモジウム・オバレ、プラスモジウム・マラリア、プラスモジウム・ファルシパルム、トリコモナス・バギナリス、およびヒストモナス・メレグリディスが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、寄生虫感染は、線虫（例えば、双器網）などの寄生性蠕虫による。幾つかの実施形態において、寄生虫は、双腺網（例えば、トリキュリス・コリキウラ、アスカリス・ルンブリコイデス、エンテロウイルス・ベルミキュラリス（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ  ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）、アンシロストマ・デュオデナレ、ネカトール・アメリカヌス、ストロンギロイデス・ステロコラリス、ウチェレリア・バンクロフチ、ドラクンクルス・メディネンシス）から選択される。幾つかの実施形態において、寄生虫は、トレマトーデス属（例えば、住血吸虫、肝吸虫、腸肝吸虫、および肺吸虫）から選択される。幾つかの実施形態において、寄生虫は、シストソーマ・マンソニ、シストソーマ・ヘマトビウム、シストソーマ・ジャポニクム、ファシオラ・ヘパチカ、ファシオラ・ギガンチカ、ヘテロフィエス・ヘテロフィエス、パラゴニウム・ウェステルマニから選択される。幾つかの実施形態において、寄生虫は、条虫（例えば、タエニア・ソリウム、タエニア・サギナタ、ヒメノレプシス・ナナ、エヒノコッカス・グラニュローサス）から選択される。
【０１０２】
様々な実施形態において、本発明は、細菌感染を処置する方法を提供する。様々な実施形態において、細菌感染は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、好気性および／または嫌気性細菌による。様々な実施形態において、細菌は、非限定的に、ブドウ球菌、乳酸菌、連鎖球菌、サルシナ属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、シュードモナス属、アシネトバクター属、マイコバクテリウム属、変形菌属、カンピロバクター属、シトロバクター属、ナイセリア属、バチルス属、バクテロイデス属、ペプトコッカス属、クロストリジウム属、サルモネラ属、赤痢菌属、セラチア属、ヘモフィルス属、ブルセラ属および他の生物体から選択される。幾つかの実施形態において、細菌は、非限定的に緑膿菌、蛍光菌、シュードモナス・アシドボランス、シュードモナス・アルカリゲネス、シュードモナス・プチダ、ステノトロホモナス・マルトフィリア、バークホルデリア・セパシア、エロモナス・ヒドロフィラ、大腸菌、シトロバクター・フロインディ、ネズミチフス菌、チフス菌、パラチフス菌、腸炎菌、志賀赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、ソンネ赤痢菌、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロバクター・アエロゲネス、肺炎桿菌、クレブシエラ・オキシトカ、霊菌、野兎病菌、モルガン菌、ミラビリス変形菌、尋常変形菌、プロビデンシア・アルカリファシエンス、プロビデンシア・レットゲリ、プロビデンシア・スチュアルティ、アシネトバクター・バウマニ、アシネトバクター・カルコアセチカス、アシネトバクター・ヘモリティカス、腸炎エルシニア菌、ペスト菌、偽結核エルシニア菌、エルシニア・インターメディア、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌、インフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティクス、ヘモフィルス・パラヘモリティクス、軟性下疳菌、パスツレラ・ムルトシダ、パスツレラ・ヘモリチカ、ブランハメラ・カタラーリス、ヘリコバクター・ピロリ、カンピロバクター・フェタス、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・コリ、ボレリア・ブルグドルフェリ、コレラ菌、腸炎ビブリオ菌、在郷軍人病菌、リステリア菌、淋菌、髄膜炎菌、キンゲラ属、モラクセラ属、ガードネラ・バジナリス、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・ディスタソニス、バクテロイデス３４５２Ａホモロジー群、バクテロイデス・ブルガータス、バクテロイデス・オバタス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・エガーシイ、バクテロイデス・スプランクニカス、クロストリジウム・ディフィシレ、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、ライ菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム・ウルセランス、肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、化膿連鎖球菌、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、スタフィロコッカス・インターメジウス、スタフィロコッカス・ヒカス亜種ヒカス、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、スタフィロコッカス・ホミニス、またはスタフィロコッカス・サッカロリティカスから選択される。投与される発現ベクター（複数可）、細胞、または粒子は、他の分子、分子構造、または化合物の混合物、例えば  取り込み、分配、および／または吸収を支援するためのリポソーム、受容体もしくは細胞標的分子、または経口、局所もしくは他の配合剤などと混和、封入、コンジュゲート、またはその他の方法で会合させることができる。幾つかの例において、発現ベクターは、対象に投与される細胞内に含まれ得るか、またはウイルスもしくはウイルス様粒子の中に含まれ得る。投与されるベクター、細胞、または粒子は、医薬的に許容し得る担体と組み合わせて投与され得る。
【０１０３】
それゆえ本文書は、生理学的および医薬的に許容し得る担体と組み合わせた、本明細書に記載された分泌されるｇｐ９６−Ｉｇ融合ポリペプチドとＴ細胞共刺激融合ポリペプチドとをコードするベクターを含有するベクターまたは腫瘍細胞もしくはウイルス粒子を含有する組成物を提供する。生理学的および医薬的に許容し得る担体は、免疫付与に有用な周知成分のいずれかを含み得る。担体は、ワクチン中で投与される抗原への免疫応答を促進または増強し得る。細胞配合剤は、抗原への免疫応答を刺激する組成物中で、好ましいｐＨ範囲、塩または個体に抗原を提示する他の構成要素を維持する緩衝液を含有し得る。生理学的に許容し得る担体はまた、抗原に対する免疫応答を増強する１種または複数のアジュバントを含有し得る。医薬的に許容し得る担体としては、例えば対象に化合物を送達するための、医薬的に許容し得る溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルが挙げられる。医薬的に許容し得る担体は、液体または固体であり得、所与の医薬的組成物の１種または複数の治療化合物および任意の他の成分と組み合わされる場合に、所望の嵩、粘稠度、ならびに他の適切な輸送特性および化学的特性を提供するように、計画された投与手法を念頭に選択され得る。典型的な医薬的に許容し得る担体としては、水、生理食塩溶液、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトースもしくはデキストロースおよび他の糖、ゼラチン、または硫酸カルシウム）、滑沢剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム）、崩壊剤（例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、皮下、筋肉内もしくは皮内投与のために、または免疫付与のために許容される任意の手法で配合され得る。
【０１０４】
アジュバントは、分泌されるワクチンタンパク質（例えば、ｇｐ９６−Ｉｇ）およびＴ細胞共刺激融合ポリペプチドを発現する腫瘍細胞などの免疫原性剤に添加された場合に、混合物への暴露によってレシピエントの宿主において薬剤への免疫応答を非特異的に増進または強化する物質を指す。アジュバントとしては、例えば水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、アルム（アルミニウム塩）、リポソームおよび微粒子、例えばポリスチレン、デンプン、ポリホスファゼンおよびポリラクチド／ポリグリコシドを挙げることができる。
【０１０５】
アジュバントとしては、例えばスクアレン混合物（ＳＡＦ−Ｉ）、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム細胞壁調製物、モノホスホリルリピッドＡ、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、Ｑｕｉｌ  Ａ、コレラ毒Ｂサブユニット、ポリホスファゼンおよび誘導体、ならびに免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、例えばＴａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９９０，  ３４４：８７３−８７５に記載されたものなども挙げることもできる。獣医学的使用および動物における抗体産生のために、フロイントアジュバント（完全および不完全の両方）の分裂促進性成分を用いることができる。ヒトでは、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が有用なアジュバントである。様々な適当なアジュバントが、当該技術分野で周知である（例えば、Ｗａｒｒｅｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｄｉｄ，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９８８，  ８：８３；およびＡｌｌｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｙａｒｓ，  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：  Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ，  １９９２，  Ｅｌｌｉｓ，  ｅｄ．，  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，  Ｂｏｓｔｏｎ参照）。さらなるアジュバントとしては、例えばカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、ＤＥＴＯＸ（マイコバクテリウム・フレイの細胞壁骨格（ＣＷＳ）およびサルモネラ・ミネソタ由来のモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ））などが挙げられる（例えば、Ｈｏｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９３，  １１：３９０；およびＷｏｏｄｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  １９９９，  ２２：２５１−２５９参照）。
【０１０６】
幾つかの実施形態において、ベクターは、対象へ１回または複数回（例えば、１回、２回、２〜４回、３〜５回、５〜８回、６〜１０回、８〜１２回、または１２回よりも多く）投与され得る。本明細書で提供されるベクターは、１日あたり１回もしくは複数回、１週あたり１回もしくは複数回、１週ごとに、１ヶ月あたり１回もしくは複数回、２〜３ヶ月ごとに１回、３〜６ヶ月ごとに１回、または６〜１２ヶ月ごとに１回、投与され得る。ベクターは、約１日〜約１２ヶ月の期間など、任意の適切な期間にわたって投与され得る。幾つかの実施形態において、例えば投与期間は、約１日〜９０日、約１日〜６０日、約１日〜３０日、約１日〜２０日、約１日〜１０日、約１日〜７日であり得る。幾つかの実施形態において、投与期間は、約１週間〜５０週間、約１週間〜５０週間、約１週間〜４０週間、約１週間〜３０週間、約１週間〜２４週間、約１週間〜２０週間、約１週間〜１６週間、約１週間〜１２週間、約１週間〜８週間、約１週間〜４週間、約１週間〜３週間、約１週間〜２週間、約２週間〜３週間、約２週間〜４週間、約２週間〜６週間、約２週間〜８週間、約３週間〜８週間、約３週間〜１２週間、または約４週間〜２０週間であり得る。
【０１０７】
幾つかの実施形態において、ベクターの初回用量（時には「プライミング」用量と称される）が投与されて、最大抗原特異的免疫応答が達成された後、本明細書で提供されるベクターの１つまたは複数のブースト用量が投与され得る。例えばブースト用量は、プライミング用量後約１０〜３０日、約１５〜３５日、約２０〜４０日、約２５〜４５日、または約３０〜５０日に投与され得る。
【０１０８】
幾つかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、腫瘍の成長（例えば、乳腺、前立腺、メラノーマ、腎臓、結腸、または子宮頸の腫瘍の成長）および／または転移を制御するために用いられ得る。方法は、本明細書に記載された発現ベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み得る。幾つかの実施形態において、対象は、哺乳動物（例えば、ヒト）である。
【０１０９】
本明細書で提供されるベクターおよび方法は、腫瘍に対する免疫応答を刺激するのに有用であり得る。そのような免疫応答は、腫瘍に関連する徴候または症状を処置または緩和するのに有用である。本明細書で用いられる「処置すること」は、本明細書に記載されたベクターが投与された個体における症状を、処置されていない個体の症状に比較して、低減する、予防する、および／または回復させることを意味する。実施担当者は、本明細書に記載された方法が熟練の実施担当者（医師または獣医師）による連続した臨床評価と付随して用いられて、後の治療が決定されるべきであることを認識するであろう。そのような評価は、特定の処置用量、投与方式などを増進、低減、または継続するか否かを評価する上で支援および情報を与えるであろう。
【０１１０】
したがって本明細書で提供される方法は、例えば癌などの腫瘍を処置するのに用いられ得る。方法を利用して、例えば、さらなる腫瘍成長を予防することにより、腫瘍成長を緩徐にすることにより、または腫瘍退縮を誘発することにより、腫瘍の成長を阻害することができる。したがって、方法を用いて、例えば肺癌などの癌を処置することができる。化合物が投与される対象が、特定の外傷状態に罹患している必要がないことは、理解されよう。実際に、本明細書に記載されるベクターは、症状の発症以前に防護的に投与され得る（例えば、癌が軽減している患者）。用語「治療的な」および「治療的に」、そしてこれらの用語の交換は、治療的、苦痛軽減的、および防護的使用を包含するために使用される。したがって本明細書で用いられる「症状を処置または緩和すること」は、組成物の治療有効量が投与された個体の症状を、そのような投与を受けていない個体の症状に比較して、低減する、予防する、および／または回復させることを意味する。
【０１１１】
本明細書で用いられる用語「有効量」および「治療有効量」は、対象（例えば、癌または感染を有すると診断されたヒト）において所望の治療的（例えば、抗癌、抗腫瘍または抗感染）効果を提供するのに十分な量を指す。抗腫瘍および抗癌効果としては、腫瘍成長（例えば、腫瘍成長の遅延）、腫瘍サイズ、または転移の調整、特定の抗癌剤に関連する毒性および副作用の低減、癌の臨床的損傷または症状の軽減または最小化、そのような処置を行わなかった場合に予測されるものを超える対象の生存期間延長、ならびに投与前に腫瘍形成を有さない動物における腫瘍成長の予防、即ち防護的投与が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、ベクター、またはベクターを含有する組成物、細胞もしくはウイルス粒子の有効量の投与は、対象における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の活性化または増殖を増加させ得る。例えば対象における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の活性化または増殖は、投与前の対象における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の活性化または増殖のレベルに比較して、少なくとも１０％（例えば、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも７５％）増加され得る。
【０１１２】
抗感染効果としては、例えば感染性物質（例えば、ウイルスまたは細菌）の数の減少が挙げられる。処置される対象における臨床状態が感染である場合、本明細書で提供されるベクターの投与は、対象における病原性抗原特異的Ｔ細胞の活性化または増殖を刺激できる。例えば、ベクターの投与は、ｇｐ９６−Ｉｇワクチン接種のみで実現される場合よりも大きなレベルに、対象における抗原特異的Ｔ細胞活性化を誘導し得る。
【０１１３】
当業者は、精密な調整によりおよび／または１用量を超える投与により（例えば、ベクターを含有する２種の異なる遺伝的に修飾された腫瘍細胞の同時投与により）、または治療効果を増強するために（例えば、相乗的に）別の薬剤（例えば、ＰＤ−１のアンタゴニスト）と共にベクターを投与することにより、ベクターの有効量を減少または増加させ得ることを認識するであろう。それゆえ本文書は、所与の哺乳動物に特異的な特定の要件に投与／処置を適合させるための方法を提供する。治療有効量は、例えば相対的に低い量で開始して、有益効果を同時に評価しながら段階的な増加を用いることにより、決定され得る。したがって本明細書で提供される方法は、腫瘍を有する患者を処置するために、単独でまたは他の周知の腫瘍治療と併せて用いられる。当業者は、例えば癌患者の寿命を延長させることおよび／または癌患者（例えば、肺癌患者）の生活の質を改善することにおける、本明細書で提供されるベクターおよび方法の有利な使用を、容易に理解するであろう。
【０１１４】
併用療法およびコンジュゲーション
幾つかの実施形態において、本発明は、追加的薬剤を対象に投与することをさらに含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、共投与および／または共配合に関係する。
【０１１５】
幾つかの実施形態において、ワクチンタンパク質（例えば、ｇｐ９６−Ｉｇ）および１種または複数の共刺激分子の投与は、別の薬剤と共投与されると相乗的に作用し、かつそのような薬剤が単剤療法として用いられる場合に一般に用いられる用量よりも低い用量で投与される。
【０１１６】
幾つかの実施形態において、本発明は、非限定的に癌適用を含む、追加的薬剤としての化学療法剤に関係する。化学療法剤の例としては、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン；アセトゲニン（例えば、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（例えば、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどのニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔｌ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．，  ３３：  １８３−１８６  （１９９４）参照）；ダイネマイシンＡを含むダイネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連の色素タンパク質エネジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えばメトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チ��グアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド（ｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド、例えばメイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、オレゴン州ユージーン所在）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テニュアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（例えばＴ−２毒素、ベラクリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ  Ａ）、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばＴＡＸＯＬパクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、ニュージャージー州プリンストン所在）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ  クレモホールフリー、パクリタキセルのアルブミン改変ナノ粒子配合剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，  Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，  １１１．）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、フランス  アントニー所在）；クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ＧＥＭＺＡＲゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；Ｘｅｌｏｄａ；イバンドロナート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓｔａｒ、ＣＰＴ−１１）（イリノテカンと５−ＦＵおよびロイコボリンの処置レジメンを含む）；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン処置レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ）；細胞増殖を��減するＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ））およびＶＥＧＦ−Ａの阻害剤、ならびに上述のいずれかの医薬的に許容し得る塩、酸または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。加えて処置方法は、放射線の使用をさらに含み得る。加えて処置方法は、光力学的療法の使用をさらに含み得る。
【０１１７】
幾つかの実施形態において、本発明は、非限定的に感染疾患適用を含む、追加的薬剤としての抗感染症剤に関する。幾つかの実施形態において、抗感染症剤は、非限定的に、アバカビル、アシクロビル、アデフォビル、アンプレナビル、アタザナビル、シドフォビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エファビレンツ、エルビテグラビル、エムトリシタビン、エンフビルチド、エトラビリン、ファムシクロビル、およびホスカルネットを含む抗ウイルス薬である。幾つかの実施形態において、抗感染症剤は、非限定的にセファロスポリン系抗生物質（セファレキシン、セフロキシム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、およびセフトビプロール）；フルオロキノロン系抗生物質（シプロ、Ｌｅｖａｑｕｉｎ、フロキシン、Ｔｅｑｕｉｎ、アベロックス、およびノルフロックス）；テトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、およびドキシサイクリン）；ペニシリン系抗生物質（アモキシシリン、アンピシリン、ペニシリンＶ、ジクロキサシリン、カルベニシリン、バンコマイシン、およびメチシリン）；モノバクタム系抗生物質（アズトレオナム）；およびカルバペネム系抗生物質（エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、およびメロペネム）を含む抗菌剤である。幾つかの実施形態において、抗感染症剤として、抗マラリア薬（例えば、クロロキン、キニン、メフロキン、プリマキン、ドキシサイクリン、アルテメーテル／ルメファントリン、アトバコン／プログアニルおよびスルファドキシン／ピリメタミン）、メトロニダゾール、チニダゾール、イベルメクチン、パモ酸ピランテル、およびアルベンダゾールが挙げられる。
【０１１８】
免疫「チェックポイント」分子を標的とする遮断抗体を含む他の追加的薬剤は、本明細書の他の箇所に記載される。
【０１１９】
対象および／または動物
本明細書に記載される方法は、これらの方法の利益を享受し得る任意の対象での使用が意図される。したがって「対象」、「患者」および「個体」（互換的に用いられる）は、ヒトおよび非ヒト対象、特に飼育動物を包含する。
【０１２０】
幾つかの実施形態において、対象および／または動物は、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、または非ヒト霊長類、例えばサル、チンパンジー、またはヒヒである。他の実施形態において、対象および／または動物は、非哺乳動物、例えばゼブラフィッシュなどである。幾つかの実施形態において、対象および／または動物は、蛍光標識された細胞（例えば、ＧＦＰを用いるなど）を含み得る。幾つかの実施形態において、対象および／または動物は、蛍光細胞を含むトランスジェニック動物である。
【０１２１】
幾つかの実施形態において、対象および／または動物は、ヒトである。幾つかの実施形態において、ヒトは、小児のヒトである。他の実施形態において、ヒトは、成人のヒトである。他の実施形態において、ヒトは、老人のヒトである。他の実施形態において、ヒトは、患者を指し得る。
【０１２２】
特定の実施形態において、ヒトは、約０ヶ月〜約６ヶ月齢、約６ヶ月〜約１２ヶ月齢、約６ヶ月〜約１８ヶ月齢、約１８ヶ月〜約３６ヶ月齢、約１〜約５歳、約５〜約１０歳、約１０〜約１５歳、約１５〜約２０歳、約２０〜約２５歳、約２５〜約３０歳、約３０〜約３５歳、約３５〜約４０歳、約４０〜約４５歳、約４５〜約５０歳、約５０〜約５５歳、約５５〜約６０歳、約６０〜約６５歳、約６５〜約７０歳、約７０〜約７５歳、約７５〜約８０歳、約８０〜約８５歳、約８５〜約９０歳、約９０〜約９５歳または約９５〜約１００歳の範囲の年齢を有する。
【０１２３】
別の実施形態において、対象は、非ヒト動物であり、それゆえ本発明は、獣医学的使用に関係する。具体的実施形態において、非ヒト動物は、家庭用ペットである。別の具体的実施形態において、非ヒト動物は、家畜動物である。特定の実施形態において、対象は、化学療法を受けることができないヒト癌患者であり、例えば患者は、化学療法に非応答性であるか、またはあまりに体調が悪く化学療法の適切な手段を有さない（例えば、用量またはレジメンを限定する副作用を過度に有する）。特定の実施形態において、対象は、進行疾患および／または転移性疾患を有するヒト癌患者である。
【０１２４】
本明細書で用いられる「同種細胞」は、その細胞が投与される個体に由来しない細胞、即ちその個体と異なる遺伝的構成を有する細胞を指す。同種細胞は、一般にはその細胞が投与される個体と同じ種から得られる。例えば、同種細胞は、癌患者などのヒト患者に投与するための、本明細書に開示されるような、ヒト細胞であり得る。本明細書で用いられる「同種腫瘍細胞」は、その同種細胞が投与される個体に由来しない腫瘍細胞を指す。一般に、同種腫瘍細胞は、その細胞が投与される個体において腫瘍に対する免疫応答を刺激し得る１種または複数の腫瘍抗原を発現する。本明細書で用いられる「同種癌細胞」、例えば肺癌細胞は、その同種細胞が投与される個体に由来しない癌細胞を指す。
【０１２５】
本明細書で用いられる「遺伝的に修飾された細胞」は、例えばトランスフェクションまたは形質導入によって、外来の核酸を発現するように遺伝的に修飾された細胞を指す。
【０１２６】
本明細書で用いられる技術的および科学的用語は、他に定義されない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。
【０１２７】
本明細書で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に明白な断りがなければ、それらが指す用語の複数形も包含する。本明細書で用いられる言語「または」は、他に具体的に示されなければ、「および／または」の「包括的」意味で使用され、「いずれか一方／または」の「排他的」意味ではない。本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形は、文脈に他に明白に示されなければ、複数の対象を包含する。
【０１２８】
用語「ａｂｏｕｔ」は、およそ、領域内で、大まかに、または前後で、を意味するために本明細書で用いられる。用語「約」は、数値範囲と連結して用いられる場合、境界を示された数値より上および下へ拡大することによりその範囲を修正する。一般に用語「約」は、２０％の変動によって述べられた値より上および下の数値を修正するために本明細書で用いられる。本明細書で用いられる用語「含む」および「含んでいる」は、特許請求の範囲の過渡的語句で用いられるか、または主要部で用いられるかにかかわらず、制限のない意味を有すると解釈されなければならない。即ちこれらの用語は、「少なくとも有している」または「少なくとも含んでいる」という語句と同義に解釈されなければならない。工程の文脈で用いられる場合の用語「含んでいる」は、その工程が少なくとも列挙されたステップを含むが、追加のステップを含み得ることを意味する。化合物または組成物の文脈で用いられる場合の用語「含んでいる」は、化合物または組成物が少なくとも列挙された特色または成分を含むが、追加的特色または成分も含み得ることを意味する。
【０１２９】
本発明を以下の実施例にさらに記載するが、それは特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
【０１３０】
実施例
実施例１  −  ｇｐ９６−ＩｇおよびＴ細胞共刺激融合タンパク質を組み込んだベクター改変免疫療法（ｖｅｃｔｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）は、優れた抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘発する
分泌可能なヒートショックプロテインｇｐ９６−Ｉｇに基づく同種細胞ワクチンは、インビボでの抗原交差プライミングを通して、フェムトモル濃度の腫瘍抗原への頻度ポリクローナルＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を実現できる。確立された腫瘍によって進化した多重免疫抑制メカニズムは、このワクチンアプローチの活性をくじく可能性がある。以下に記載される通り、長期確立Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマのマウスモデルにおけるＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、およびＬＡＧ−３遮断抗体の系統的比較により、他のチェックポイントと比べて優れた、ｇｐ９６−Ｉｇワクチン接種とＰＤ−１遮断との組み合わせが実証された。ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、または４−１ＢＢアゴニストを用いるｇｐ９６−Ｉｇワクチン接種とＰＤ−１遮断とＴ細胞共刺激との三重の組み合わせは、相乗的な抗腫瘍利益を提供した。
【０１３１】
ｇｐ９６−Ｉｇ発現ベクターを再改変して、ＩＣＯＳＬ−Ｉｇ、４−１ＢＢＬ−Ｉｇ、またはＯＸ４０Ｌ−Ｉｇを同時に共発現し、これにより追加の抗体療法を必要とせずに共刺激の利益を提供した。以下に記載される通り、同種細胞株におけるｇｐ９６−Ｉｇおよびこれらの共刺激融合タンパク質の共分泌は、抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化増進をもたらした。したがって併用免疫療法は、ベクター再改変によって実現され、ワクチン／抗体／融合タンパク質レジメンの必要性を排除し、重要なことに治療コストおよび全身毒性リスクの両方を抑制し得る。
【０１３２】
実施例２  −  ワクチン＋共刺激物質ベクター再改変
ベクター再改変戦略を利用して、単一ベクター内へワクチンおよびＴ細胞共刺激融合タンパク質を組み込んだ。具体的には、元のｇｐ９６−Ｉｇベクターを再改変して、ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質および様々なＴ細胞共刺激融合タンパク質の両方を分泌する、細胞に基づく併用ＩＯ生成物を作製した（図１および２）。ワクチンと共刺激融合タンパク質との組み合わされた局所分泌（図３）は腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を活性化でき、特に腫瘍細胞によって産生される免疫抑制分子を阻害する薬剤（例えば、ＰＤ−１に対する抗体）の投与と併せた場合、制限されたコストおよび全身毒性で抗原特異的免疫を増大すると予測される。
【０１３３】
実施例３  −  ＩｍＰＡＣＴ対ＣｏｍＰａＣＴのインビボ試験
材料および方法
細胞培養およびワクチン細胞株作製：３Ｔ３細胞は、グルタミンおよび１０％ウシ成長血清（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｅｒｕｍ）（ＢＧＳ）を含有するＩＭＤＭ中、３７℃で５％ＣＯ２に保持した。３Ｔ３−オボアルブミン−ハイグロ親細胞株を、製造業者の指導に従い４Ｄ−ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）およびＣｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）Ｋｉｔ  ＳＥ（Ｌｏｎｚａ）を用いるヌクレオフェクションにより、ニワトリオボアルブミン（Ｏｖａ）をコードするハイグロマイシン耐性プラスミドバックボーンｐｃＤＮＡ３．１を用いて樹立した。高レベルのＯｖａを分泌する単一細胞クローンを、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、ネズミ  Ｇｐ９６−ＩｇまたはＧｐ９６−ＩｇのいずれかとＯＸ４０Ｌ−Ｆｃの細胞外ドメインとをコードするＧ４１８耐性プラスミドｐＢ４５のヌクレオフェクションを通して３Ｔ３−Ｏｖａ−Ｇｐ９６−Ｉｇ（ＩｍＰＡＣＴ）および３Ｔ３−Ｏｖａ−Ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ（ＣｏｍＰＡＣＴ）をそれぞれ作製するのに使用した。同じく、ＩｍＰＡＣＴおよびＣｏｍＰＡＣＴの両方の単一細胞クローンを抗生物質選択により作製し、類似レベルのマウスＩｇＧを分泌するクローンをさらにスクリーニングして、次の分析に使用した。ＯＸ４０Ｌ  ｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって確認し、タンパク質レベルをウェスタンブロットによって評価した。
【０１３４】
ＣＴ２６細胞は、グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ中、３７℃で５％ＣＯ２に保持した。ＩｍＰＡＣＴ（ＣＴ２６−Ｇｐ９６−Ｉｇ）およびＣｏｍＰＡＣＴ  （ＣＴ２６−Ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ）のＣＴ２６バージョンを、上記と同じ発現プラスミドを用いて作製したが、製造業者の指導に従いＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＣＴ２６細胞株中にトランスフェクトした。単一細胞クローンを抗生物質選択により単離し、ＥＬＩＳＡによりマウスＩｇＧ分泌についてスクリーニングした。ＯＸ４０Ｌ  ｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって確認した。
【０１３５】
Ｂ１６．Ｆ１０細胞株を、ｏｖａ親クローン（Ｂ１６．Ｆ１０−ｏｖａ：３Ｔ３細胞に関して先に記載された通り）を作製することによって最初に樹立した。その後、ＩｍＰＡＣＴ（Ｂ１６．Ｆ１０−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ）およびＣｏｍＰＡＣＴ（Ｂ１６．Ｆ１０−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ／Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ）のＢ１６．Ｆ１０−ｏｖａバージョンを、上記と同一のプラスミドで再度トランスフェクトし、高レベルのｇｐ９６−Ｉｇ分泌について選択した。
【０１３６】
マウスモデルＯＴ−Ｉ／ＯＴ−ＩＩの移入および分析：抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を、Ｈ２Ｋｂ  ＭＨＣクラスＩ抗原交差提示の際にオボアルブミン残基２５７〜２６４を認識するＴ細胞受容体トランスジーンＴＣＲα−Ｖ２およびＴＣＲβ−Ｖ５を担持するＯＴ−Ｉ／ＥＧＦＰマウスの脾臓から、単離した。抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を、ＣＤ４強受容体と相補性がありＩ−Ａｂ  ＭＨＣクラスＩＩ抗原交差提示の際にニワトリオボアルブミン残基３２３〜３３９に特異的なマウスα−およびβ−鎖Ｔ細胞受容体を発現する、ＯＴ−ＩＩマウスの脾臓から単離した。
【０１３７】
手短に述べると、マウスをＣＯ２窒息とそれに続く頸椎脱臼により殺処分して、脾臓を滅菌ＰＢＳ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ中へ切り出した。脾臓細胞を組織から分離して、１００μＭストレイナーに通した。細胞を１，２００ＲＰＭで５分間ペレット化して、室温で１〜２分間１×ＡＣＫ溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）５ｍＬを添加することにより赤血球細胞を溶解した。溶解に続いて、同容量の１×ＰＢＳを添加して、細胞を再度１，２００ＲＰＭで５分間ペレット化した。ＯＴ−Ｉ（ＣＤ８）およびＯＴ−ＩＩ（ＣＤ４）を、製造業者の指導に従って、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣＤ４およびＣＤ８単離キットを利用して全脾臓細胞から単離した。ＯＴ−Ｉ（０．５×１０６細胞／マウス）およびＯＴ−ＩＩ（１×１０６細胞／マウス）を、尾静脈への静脈内（ＩＶ）注射によってＦＯＸＰ３−ＲＦＰ（調節Ｔ細胞Ｔｒｅｇを追跡するため）用にトランスジェニックのマウスへ移入した。ＩＶ注射日は、実験の−１日目に対応した。
【０１３８】
０日目および３５日目（ブーストされたマウスの場合）に、マウスは未処置か、対照として３Ｔ３−Ｏｖａ親クローンをワクチン接種、またはＩｍＰＡＣＴ（単独で、またはＩＣＯＳ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３１３５１２）、４−１ＢＢ（３Ｈ３抗体、Ｂｉｏ−Ｘ−Ｃｅｌｌ）またはＯＸ４０（ＯＸ８６抗体、Ｂｉｏ−Ｘ−Ｃｅｌｌ）に対するアゴニスト抗体  １００μｇと組み合わせて））をワクチン接種、またはＣｏｍＰＡＣＴをワクチン接種された。ワクチン接種物は１×１０６細胞からなり、腹腔内注射（ＩＰ）により投与された。末梢血から採取されたリンパ球を、経過時間全体にわたりフローサイトメトリーにより分析した。
【０１３９】
ＣＴ２６腫瘍モデルおよび分析：ＣＴ２６腫瘍試験では、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、２×１０５または５×１０５腫瘍細胞のいずれかで皮下注射により脇腹後部に接種し、０日目とした。Ｂ１６．Ｆ１０−ｏｖａ試験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、５×１０５腫瘍細胞で脇腹後部に接種し、０日目とした。ワクチン接種日には、腫瘍担持マウスは、未処置か、またはマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）処置ＩｍＰＡＣＴ、ＩｍＰＡＣＴ＋１００ｍｇ  抗ＯＸ８６（全体を通してＯＸ４０（ａｂ）と称する）またはＣｏｍＰＡＣＴ細胞をワクチン接種された。腫瘍面積（ｍｍ２）および全生存率を、タイムコースを通して評価した。３０日生存規準は、腫瘍潰瘍形成の兆候を有さない１７５ｍｍ２未満の総腫瘍面積を含んだ。腫瘍が確立し次に続く処置が拒絶された完全な応答者を、図１２のパネルＤおよび図１１のパネルＥに列挙する。２×１０５細胞を接種されたマウスのコホートを、腫瘍接種後１１日目に殺処分した。腫瘍をこれらのマウスから切り出し、３７℃で１０分間トリプシン処理し、分離し、１００μｇ細胞ストレイナーに通した。細胞をペレット化し、赤血球を溶解し（上記の通り）、ＲＮＡを単離して逆転写し、ｑＰＣＲによって分析した（以下参照）。ＣＴ２６実験マウスのコホートを、脾臓細胞中のＡＨ１四量体分析および腫瘍組織の遺伝子解析のために、１２日目に安楽死させた。腫瘍をこれらのマウスから切り出し、３７℃で１０〜１５分間トリプシン処理し、分離して１００ｍＭストレイナーでホモジナイズした。細胞をペレット化して、ＲＮＡ単離のために処理した（以下参照）。
【０１４０】
フローサイトメトリー：フローサイトメトリーおよびセルソーティングを、Ｓｏｎｙ  ＳＨ８００で実施した。細胞外染色のために、細胞ペレットを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０２％アジ化ナトリウム、および２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ならびに適当な抗体を含有する１×ＰＢＳ緩衝液中に再懸濁し、暗室で氷上にて３０分間インキュベートした。その後、細胞をフローサイトメトリー緩衝液中で洗浄し、再懸濁しその後分析した。細胞内染色では、細胞を、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＦＯＸＰ３  Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍキットを用いて固定し浸透処理し、上記の通り染色し、フローサイトメトリー緩衝液中で洗浄し、再懸濁しその後分析した。用いられた抗体は、ＰＥ／Ｃｙ７−ＣＤ４（Ｓｏｎｙ、１１０２６４０）、ＡＦ７００−ＣＤ８ａ（Ｓｏｎｙ、１１０３６５０）、ＡＰＣ−ＴＣＲ  Ｖβ５．１，５．２（Ｓｏｎｙ、１２９７５３０）、ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ−ＴＣＲ  Ｖα２（Ｓｏｎｙ、１２３９０８０）、ＡＰＣ−ＫＬＲＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、１３８４１２）、ＢＶ４２１−ＣＤ４４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、１０３０３９）、ＢＶ６０５−ＣＤ１２７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、１３５０２５）、ＡＰＣ−Ｋｉ６７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、６５２４０６）、ＰＥ／Ｃｙ７−ＩＦＮγ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、５０５８２６）、およびＢＶ４２１−ＩＬ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、５０３８２５）であった。
【０１４１】
ＥＬＩＳＡ：標準のＥＬＩＳＡ条件を、１×１０６細胞を培地１ｍＬ中に播種し上清を２４時間後に分析するように、設定した。高結合ＥＬＩＳＡプレートを、重炭酸ナトリウム緩衝液中の１０μｇ／ｍＬ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＃１１５−００５−０６２）でコーティングした。コーティングされたプレートを４℃で一晩インキュベートした。翌朝、プレートをＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、Ｃａｓｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ）で１時間ブロックし再度ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。  プレートに、細胞上清５０μＬを、１１点マウスＩｇＧ標準セット（１１−ｐｏｉｎｔ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｅｔ）の試料と共に、コーティングされたＥＬＩＳＡプレートに添加して、室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、検出抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＃１１５−０３５−０７１）５０μＬを添加し、暗室において室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄しＳＵＲＥＢＬＵＥ（商標）ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ）１００μＬを各ウェルに添加し、暗室において室温で２０分間インキュベートした。反応を停止するために、硫酸１００μＬを各ウェルに添加し、即座にプレートをＢｉｏＴｅｋプレートリーダーで読み取った。試料は、複数の希釈倍率で少なくとも三重測定で実施された。
【０１４２】
ＲＮＡ単離およびｑＲＴ−ＰＣＲ：全ＲＮＡを、オンカラムＤＮａｓｅ処理を含み、製造業者の推奨に従いＲＮｅａｓｙおよびＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製した。総量１μｇ（ＲＮｅａｓｙを使用）または１００ｎｇ（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏを使用）を用いて、ＯｒｉＧｅｎｅのＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キットでｃＤＮＡを合成した。ｑＰＣＲを、ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施し、その後Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒで分析した。値は１８Ｓ  ｍＲＮＡに正規化されており、最少で３つ生物学的複製物について平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表し、全てを三重測定で実施した。用いられたプライマー配列は、
【化１３】
0006744318.tif 000027
【０１４３】
ウェスタンブロット分析：ＩｍＰＡＣＴおよびＣｏｍＰＡＣＴ細胞を、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ−Ａで１６時間処置して、タンパク質輸送および分泌を阻害した。その後、細胞を、１×完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１％デオキシコール酸ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ）中で、氷上にて１０分間溶解した。タンパク質濃度を、ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて測定し、タンパク質２０μｇをプローブした。抗体は、ＣＤ２５２（ＯＸ４０Ｌ、Ａｂｃａｍ  ＃ａｂ１５６２８５、１：１０００希釈）、ヒスチジンＨ３（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ  ＃６１２７８、１：１０，０００）、ヒスチジンＨ４（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ  ＃６１３００、１：１０，０００）、およびβアクチン（Ａｂｃａｍ  ＃ａｂ８２２６、１：１０，０００）であった。
【０１４４】
ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘサイトカイン分析：実験用マウスを、ＣＯ２窒息および頸椎脱臼により安楽死させ、全血を心穿刺により採取した。赤血球細胞を室温で１時間、重力により沈降させ、残りの細胞を１，２００ＲＰＭで５分間ペレット化した。その後、血清を新しい１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。サイトカイン分析を、製造業者の推奨に従いＬＥＧＥＮＤＰＬＥＸ（商標）  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて実施し、Ｓｏｎｙ  ＳＨ８００で分析した。
【０１４５】
統計解析：実験の複製物（Ｎ）を、図に示している。他に記載がなければ、プロットされた値は、最少で３回の異なる実験から得られた平均を表し、誤差はＳＥＭである。統計学的有意性（ｐ値）を、ウェルチの集計による対応のないパラメトリックｔ検定を利用して決定した。有意なｐ値をアスタリスク（＊）で標識し、対応するｐ値を各図の中に標識した。
【０１４６】
結果
多くの新しい試験は、治療ワクチンまたはＴ細胞共刺激抗体の添加が、応答する患者の割合および臨床応答の期間を増加させるのに効果的な方策であるか否かを調査する。そのような方策の実行は、どの薬剤が相乗的利益を提供し得るか、そのような併用の毒性は許容し得るか、そして最終的にどのように医療システムでそのような併用を管理するか、が完全に理解されていないことを含む、複数の要因によって制限されている。
【０１４７】
ワクチンと個々のＴ細胞共刺激分子との潜在的相乗作用を調査するために、一連の直接比較試験を、前臨床マウスモデルで実施した。修飾された分泌可能なｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質を発現する細胞を基にしたワクチン（図４Ａ）を用いて、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、またはＩＣＯＳを標的とするアゴニスト抗体の共投与が抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のさらなる共刺激を提供するか否かを調査する試験を実施した（図５Ａ〜５Ｃ）。オボアルブミン特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＯＴ−Ｉ）を養子移入されたＣ５７ＢＬ／６マウスの３Ｔ３−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇワクチンでの免疫付与は、末梢血ＣＤ８＋  Ｔ細胞の１０％までのＯＴ−Ｉ細胞の増殖をもたらした。この応答は、ＯＸ４０アゴニスト抗体の追加投与によって倍増し得たが、４−１ＢＢまたはＩＣＯＳ共刺激抗体では倍増し得なかった（図５Ｄ）。
【０１４８】
ＯＸ４０ＬによるＴ細胞共刺激は、２〜５日の過程にわたる抗原提示細胞による空間的に制限された微小環境における局所炎症によって惹起される。ＯＸ４０受容体アゴニスト抗体の投与は、数週間持続し得る全身的共刺激を提供する。ワクチンは典型的には局所投与されるため、全身性共刺激を制限して単一化合物との併用免疫療法を可能にするための方策としてＯＸ４０Ｌ融合タンパク質（Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ）がｇｐ９６−Ｉｇ含有プラスミドの第二のカセット中で共発現され得るか否かを決定するための実験を実施した（図６Ａ）。概念実証として、可溶性オボアルブミンと、ｇｐ９６−Ｉｇ単独（「ＩｍＰＡＣＴ」）またはｇｐ９６−ＩｇとＦｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、または４−１ＢＢＬのいずれかとを共発現する３Ｔ３細胞を作製した。これらの細胞株は、ｏｖａおよびｇｐ９６−Ｉｇの両方を類似の量で分泌するようにしっかりと選択された（図７Ａおよび７Ｂ）。Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、または４−１ＢＢＬの発現を、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットにより評価し（図７Ｃおよび７Ｄ）、初代脾臓細胞からのＩＬ−２分泌アッセイにより細胞培養上清中で機能的に活性であることを示した。
【０１４９】
ＩｍＰＡＣＴのインビボ活性を単独で、またはＯＸ４０アゴニスト抗体との組み合わせで、図５に記載されたＯＴ−Ｉモデルを使用してＣｏｍＰａＣＴと比較した。上記のコトランスフェクションが図５のｏｖａを発現するネオマイシン耐性カセットでは可能でなかったため、この実験では異なる細胞株を用いた。ＣｏｍＰａＣＴは局所的に投与されたため、全身投与されたＩｍＰＡＣＴとＯＸ４０アゴニスト抗体の組み合わせに対比すると劇的なプライムおよびブースト効果を予測することができなかった。しかし図６Ｂおよび６Ｃに示された通り、ＣｏｍＰａＣＴ免疫付与は、ＩｍＰＡＣＴ単独またはＯＸ４０アゴニスト抗体との組み合わせのいずれかでのプライマリー免疫付与後にＯＴ−Ｉ細胞の驚くべき、そして有意に改善された増殖を提供した。末梢血におけるピーク増殖は、ＣｏｍＰａＣＴで５日目に増加したが、より重要なことに、６〜２０日の応答期間でそうであった。
【０１５０】
ワクチンと組み合わされたＯＸ４０アゴニスト抗体へのメモリー応答は、抗原特異的ＣＤ８コンパートメント内では相対的に弱い。ブースト応答を、プライマリー免疫付与後３５日目にマウスを再度免疫付与することによって評価した（図６Ｃ）。ＯＸ４０アゴニスト抗体の組み合わせは、ＯＴ−Ｉ応答の相対的に弱いブーストをもたらしたが、ＣｏｍＰａＣＴ処置マウスは、一次応答の規模とほぼ一致したブースト応答を示した（図６Ｃ）。ＣｏｍＰａＣＴを投与されたマウス由来の脾臓細胞および腹膜細胞のフローサイトメトリー分析から、他の群と比較してＣＤ１２７＋ＫＬＲＧ１−細胞での顕著な増加  が明らかとなり、メモリー前駆細胞の増加が示された（図８Ｂ）。この効果は、ＣｏｍＰａＣＴ（ＯＸ４０Ｌ）、ＣｏｍＰａＣＴ（ＩＣＯＳＬ）およびＣｏｍＰａＣＴ（４−１ＢＢＬ）を含む様々なＣｏｍＰａＣＴで観察されたが、ＯＸ４０アゴニスト抗体処置では観察されなかった。様々なＣｏｍＰａＣＴは、ＯＸ４０アゴニスト抗体処置と同様の短命エフェクター細胞（ＣＤ１２７−ＫＬＲＧ１＋、図８Ｂ）の増加を誘導しなかった。しかしＣｏｍＰａＣＴは、脾臓内のメモリーＴ細胞（ＣＤ１２７−ＫＬＲＧ１＋）を増加させた（図８Ｂ）。これらのデータは、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬまたは４−１ＢＢＬアゴニスト融合タンパク質の局所投与が抗原特異的ＣＤ８コンパートメントでのプライマリー応答およびブースト応答の両方を有意に増加させ、これはメモリー前駆細胞の増加およびプライミング後の収縮期の延長と相関することを示す。加えて、これらのデータは、ＩｍＰＡＣＴ＋／−ＯＸ４０アゴニスト抗体と比較した、ＣｏｍＰａＣＴ処置マウスでの新規で予想外の作用機序も明らかにした。
【０１５１】
局所的に提供されたＯＸ４０Ｌによる抗原特異的ＣＤ８コンパートメントにおける増加したプライマリー応答およびブースト応答の原因は、ＯＸ４０アゴニスト抗体の全身投与により提供されたオフターゲット活性化の減少によるという可能性があった。この仮説を検証するために、腹膜細胞、脾臓細胞および腫瘍流出リンパ節（ＴＤＬＮ）細胞を、ＩｍＰＡＣＴ＋／−ＯＸ４０アゴニスト抗体またはＣｏｍＰａＣＴで免疫付与されたマウスから８日目に単離し、フローサイトメトリーおよび定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって分析してオフターゲット免疫活性化と抗原特異的応答を識別した。プライマリー免疫付与後８日目に単離された腹膜細胞の分析から、ＣｏｍＰＡＣＴ処置マウスで全単球、ＯＴ−Ｉ、およびＯＴ−ＩＩ細胞の数の増加が示されたが、ＯＸ４０アゴニスト抗体で処置されたマウスでも全ＣＤ４０細胞数の増加が示された（図８Ａ）。全ＣＤ４＋細胞およびＦＯＸＰ３＋調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増加したレベルが、ＯＸ４０アゴニスト抗体で処置されたマウスの腹腔、脾臓およびＴＤＬＮにおいて検出された（図８Ａおよび８Ｅ）。これに対して、ＣｏｍＰａＣＴ処置マウスは、Ｔｒｅｇ細胞の明白な刺激なしに抗原特異的ＯＴ−Ｉ（ＣＤ８＋）およびＯＴ−ＩＩ（ＣＤ４＋）細胞を特異的に増幅した（図８Ａおよび８Ｅ）。類似の結果が、脾臓およびリンパ節においても観察され、全ＣＤ４細胞および抗原特異的ＣＤ４細胞の全身的増殖を示唆する（図９Ａおよび９Ｂ）。ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）もまた、ＯＸ４０アゴニストで増加したが、ＣｏｍＰＡＣＴ処置動物では増加しなかった。血清サイトカイン分析は、ＯＸ４０アゴニスト抗体で処置されたマウスにおけるＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５およびＩＬ−６の全身的増加をさらに実証した（図８Ｃ）。全身的なサイトカイン増加の細胞内供給源を調査するために、ＲＴ−ＰＣＲを、免疫付与後８日目に全ＣＤ８＋細胞またはＯＴ−Ｉ細胞のいずれかで実施した。ＣｏｍＰＡＣＴ処置マウスは、ＯＴ−Ｉ集団に単離されたＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびグランザイム−Ｂの増加を示したが、ＯＸ４０アゴニスト抗体で処置されたマウスは、ＯＴ−Ｉおよび全ＣＤ８集団の両方の増加を示した（図８Ｄ）。
【０１５２】
これらのデータは、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質が、ヒートショックプロテインｇｐ９６−Ｉｇに基づくワクチンを共発現するプラスミドの安定なトランスフェクションにより局所的に提供され得ることを示す。共刺激を提供するのに十分な濃度のＦｃ−ＯＸ４０Ｌが分泌されるか否かに関する初期実行可能性は、これが実現可能であり、かつ驚くべきことにＯＸ４０アゴニスト抗体の全身投与よりも効果的であることを実証した。共刺激されたＯＴ−Ｉ細胞は、ＯＸ４０抗体で共刺激されたＯＴ−Ｉ細胞と同レベルのエフェクターサイトカインを産生し、標的細胞に対して増加された細胞傷害活性を発揮すると予測される。
【０１５３】
ネズミ腫瘍モデルにおいてＩｍＰＡＣＴ＋／−ＯＸ４０抗体対ＣｏｍＰａＣＴの機能的活性を調査するために、ＣＴ２６細胞を、図７の３Ｔ３細胞に概説されたように、これらの構築物で安定にトランスフェクトした（図１０Ａ〜１０Ｃ）。一つの実験において、０日目にマウスにＣＴ２６細胞を接種し、その後、腫瘍接種後６および１１日目にマイトマイシンＣ処置ＣＴ２６細胞、ＣＴ２６−ｇｐ９６−Ｉｇ、ＯＸ４０アゴニスト抗体とまたはＣＴ２６  ＣｏｍＰａＣＴと組み合わせたＣＴ２６−ｇｐ９６−Ｉｇで処置した。二つ目の実験では、０日目にマウスにＣＴ２６細胞を接種し、その後、腫瘍接種後４、７および１０日目にマイトマイシンＣ処置ＣＴ２６細胞、ＣＴ２６−ＩｍＰＡＣＴ、ＯＸ４０アゴニスト抗体とまたはＣＴ２６  ＣｏｍＰａＣＴと組み合わせたＣＴ２６−ＩｍＰＡＣＴ  で免疫付与した（図１１Ａ）。腫瘍接種後１２日目に単離された腫瘍組織での定量ＲＴ−ＰＣＲにより、ＯＸ４０アゴニスト抗体、ＩｍＰＡＣＴ、ＣｏｍＰＡＣＴおよびＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０アゴニスト抗体の組み合わせで処置された群におけるＣＤ８ａ、ＩＬ−２およびＩＦＮγの発現増加が明らかとなり、免疫細胞活性化および腫瘍浸潤が示された。予測通り、ＯＸ４０アゴニスト抗体（単独で、またはＩｍＰＡＣＴと一緒に）を投与されたマウスのみが腫瘍内でのＣＤ４およびＦＯＸＰ３発現増加を示した（図１１Ｂ）。ＣＴ２６抗原特異的ＣＤ８＋増殖は、ＡＨ１四量体染色によって検出された通り、未処置群に比較して、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０抗体ではおよそ４倍、およびＣｏｍＰａＣＴ処置マウスではおよそ５倍、有意に上昇した（図１１Ｂ）。腫瘍進行は、ＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０アゴニストまたはＣｏｍＰＡＣＴ処置を受けたマウスでは、対照または単剤療法群に比較して強く遮断されることが示された（図１１Ｄ）。これは、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍モデルで本発明者らが観察したものと比較して、ＣｏｍＰＡＣＴ処置マウスにおける長期生存率の有意な上昇および高割合の完全腫瘍拒絶をもたらした（図１１Ｅ、それぞれ８０％およびおよそ４７％）。したがってＣｏｍＰａＣＴは、強力な抗原特異的Ｔ細胞増殖および腫瘍浸潤、腫瘍成長の遅延および著しい生存利益を生成する。
【０１５４】
Ｂ１６．Ｆ１０マウスメラノーマ腫瘍モデルは、アグレッシブな腫瘍であり、典型的にはＯＸ４０アゴニスト抗体で効果的に処置されない。Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍モデルにおけるｇｐ９６−Ｉｇを基にしたワクチンを評価するために、Ｂ１６．Ｆ１０−ｏｖａ細胞株を作製した。加えて、Ｂ１６．Ｆ１０−ｏｖａ−ＩｍＰＡＣＴおよび−ＣｏｍＰａＣＴワクチンを、それぞれｇｐ９６−Ｉｇおよびｇｐ９６−Ｉｇ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌベクターの安定なトランスフェクションによって次に作製した。Ｂ１６．Ｆ１０−ＩｍＰＡＣＴおよび−ＣＯｍＰＡＣＴ細胞株からの同等レベルのｇｐ９６−Ｉｇ分泌がＥＬＩＳＡによって確認され、Ｂ１６．Ｆ１０−ｏｖａ−ＣｏｍＰＡＣＴ細胞株におけるＦｃ−ＯＸ４０Ｌ発現もまたｑＲＴ−ＰＣＲによって確認された。Ｂ１６．Ｆ１０−ｏｖａ腫瘍接種前１日目に、マウスにＯＴ−Ｉ細胞を養子移入した（−１日と表示、図１２Ａ）。次に、ＯＴ−Ｉ細胞の抗原特異的応答を、４日目、７日目および１０日目にマイトマイシンＣ処置Ｂ１６．Ｆ１０−ｏｖａ細胞、Ｂ１６．Ｆ１０−ｏｖａ−ＩｍＰＡＣＴ、ＯＸ４０アゴニスト抗体とまたはＢ１６．Ｆ１０−ｏｖａ−ＣｏｍＰａＣＴと組み合わせたＢ１６．Ｆ１０−ｏｖａ−ＩｍＰＡＣＴでワクチン接種した後のマウスで調査した（図１２Ｂ）。３Ｔ３−Ｏｖａモデル系で得られたデータと一致して、Ｂ１６．Ｆ１０−ｏｖａ−ＣｏｍＰＡＣＴ処置マウスは１０日目〜１９日目（初回ワクチン接種後６日目〜１５日目に対応）にロバストなＯＴ−Ｉ細胞増殖を示し、それはＩｍＰＡＣＴ＋／−ＯＸ４０アゴニスト抗体で観察されたものよりも大きく、過去に観察されたものと類似の、収縮期における持続的動態を有した。したがって、Ｂ１６．Ｆ１０−ｏｖａ−ＣｏｍＰＡＣＴワクチン接種マウスは、ＩｍＰＡＣＴ＋／−ＯＸ４０アゴニスト抗体ワクチン接種の両方よりも強力な抗腫瘍効果を示した（図１２Ｃ）。ＣｏｍＰＡＣＴ処置マウスでの長期生存率はおよそ７８％であり、マウスの１１％がアグレッシブな腫瘍の完全な拒絶を示した。比較すると、ＩｍＰＡＣＴ単独ワクチン接種マウスおよびＩｍＰＡＣＴ＋ＯＸ４０アゴニストＡｂ処置マウスは、それぞれ５０％および６２．５％の全生存率を示した（図１２Ｄ）。
【０１５５】
追加的なＣｏｍＰａＣＴの機能的活性を、過去に記載された免疫アッセイおよびＯＴ−Ｉ移入アッセイを利用して調査した。具体的には、ＯＴ−Ｉ／ＧＦＰ細胞を、０日目に初回ワクチン接種および３５日目にブーストして、ワクチンなし、Ｏｖａのみの対照細胞、ＣｏｍＰＡＣＴ（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌまたはｇｐ９６−Ｉｇ／ＴＬ１Ａ）またはＣｏｍＰａＣＴ−ＯＸ４０細胞株とＣｏｍＰａＣＴ−ＴＬ１Ａ細胞株との混合物であるＣｏｍＰＡＣＴ２（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ＋ＴＬ１Ａ）で４６日間にわたり処置されたマウスにおいて、フローサイトメトリーにより分析した（図１３）。プライム応答およびメモリー応答の両方が、ＣｏｍＰＡＣＴ（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌまたはｇｐ９６−Ｉｇ／ＴＬ１Ａ）またはＣｏｍＰＡＣＴ２（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ＋ＴＬ１Ａ）で処置されたマウスで強力であった。ＣｏｍＰＡＣＴまたはＣｏｍＰＡＣＴ２マウスはまた、驚くべきことにタイムコース全体を通して（およそ７日目〜２０日目）高レベルのＯＴ−１を保持した。加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０日目にＩｍＰＡＣＴ単独またはＣｏｍＰＡＣＴ（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ、ｇｐ９６−Ｉｇ／４−１ＢＢＬまたはｇｐ９６−Ｉｇ／ＩＣＯＳ−Ｌ）で免疫付与した（図１４）。結果は、ＩｍＰＡＣＴに比較して様々なＣｏｍＰａＣＴがＯＴＩ細胞の増殖を増進したことを示す。
【０１５６】
追加のＣｏｍＰａＣＴのインビボ活性を、ＣＴ２６大腸癌モデルでさらに調査した。具体的には、マウスは未処置であるか、または４日目、７日目および１０日目にＣＴ２６親細胞、ＩｍＰＡＣＴ単独、ＩｍＰＡＣＴ＋ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト（４Ｃ１２ａｂ）、４Ｃ１２（ａｂ）単独、ＰＤ−１（ａｂ）単独、４Ｃ１２（ａｂ）とＰＤ−１（ａｂ）、ＣｏｍＰＡＣＴ（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌまたはｇｐ９６−Ｉｇ／ＴＬ１Ａ）、ＣｏｍＰＡＣＴ（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ）＋ＰＤ−１（ａｂ）、またはＣｏｍＰＡＣＴ２（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ＋ＴＬ１Ａ）をワクチン接種された（図１５）。結果は、ＣｏｍＰＡＣＴ  処置単独（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌまたはｇｐ９６−Ｉｇ／ＴＬ１Ａ）およびＰＤ−１との組み合わせが、腫瘍成長を有意に減少したことを示す。図１６に示される通り、ＣｏｍＰＡＣＴ  処置単独（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌまたはｇｐ９６−Ｉｇ／ＴＬ１Ａ）およびＰＤ−１との組み合わせはまた、マウス生存率を有意に増大させた。
【０１５７】
ヒト癌細胞株におけるＣｏｍＰａＣＴの発現をテストした。具体的には、ＣｏｍＰＡＣＴ（ｇｐ９６−Ｉｇ／ＯＸ４０Ｌ）を、ヒト前立腺癌細胞株（例えば、ＰＣ−３）またはヒト肺腺癌細胞株（例えば、ＡＤ１００）中へトランスフェクトした。それぞれ、図１７および１８を参照されたい。結果は、両方の細胞株がＯＸ４０Ｌを生成し排出したことを示す。
【０１５８】
総括すると、これらのデータは、１つの組成物中に複数の相補的なモダリティー、この場合はワクチンとＴ細胞共刺激融合タンパク質、を組み込むことにより、併用免疫療法に近づき得ることを実証した。ベクターにコードされかつ細胞から分泌されるＦｃ−ＯＸ４０ＬによるＴ細胞共刺激の提供は実行可能であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体に比較して、プライムおよびブーストの両方の時点で抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖の増進をもたらした。組み合わせたワクチンと共刺激物質により活性化されたＴ細胞は、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦα、およびグランザイム−Ｂを産生し、ＯＸ４０アゴニスト抗体で観察されたオフターゲットＴ細胞増殖および全身の炎症性サイトカイン増加を伴わなかった。重要なことに、このアプローチは、確立されたネズミ結腸癌モデルにおいて治療的腫瘍免疫も増大させた。まとめると、これらの結果は、二種または三種の抗体の組み合わせに依存しない併用免疫療法を実行するための方策を提供し、これは、低減されたオフターゲットＴ細胞活性化によりより大きな安全性および有効性を患者に提供し得る。
【０１５９】
他の実施形態
本発明を、詳細な説明と併せて記載したが、前述の説明が例示であり、本発明の範囲を限定する意図がなく、それが添付の特許請求の範囲によって定義されることが、理解されなければならない。他の態様、利点、および改良は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【０１６０】
任意の個々の節の内容は、全ての節に等しく適用可能である。
【０１６１】
参照による組み入れ
本明細書で参照される全ての特許および発行物は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６２】
本明細書で議論された発行物は、本出願の提出日以前に単にそれらの開示ために提供されている。本明細書内のいずれも、先行の発明のせいで本発明がそのような発行物よりも前の日付けにする権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。
【０１６３】
本明細書で用いられる全ての見出しは、単に組織化のためにあり、本開示を限定するものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｄ】
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【図４Ｅ−Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ−Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ−Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ−Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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