(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの第Ｘａ因子変異体と少なくとも一つの直接ＦＸａ阻害剤とを有する止血関連疾患の治療のための組成物であって、
前記第Ｘａ因子変異体は、
キモトリプシン番号システムで１６位におけるイソロイシンが、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グリシン、メチオニン、またはトレオニンで置換されるものであること、
キモトリプシン番号システムで１７位におけるバリンが、ロイシン、アラニン、グリシン、メチオニン、トレオニン、またはセリンで置換されるものであること、および、
キモトリプシン番号システムで１９４位におけるアスパラギン酸が、アスパラギンまたはグルタミン酸で置換されるものであること
からなる群から選択される置換変異を有するものであり、
前記止血関連疾患は、血友病Ａ、血友病Ｂ、抑制抗体に関連する血友病Ａおよび血友病Ｂ、凝固因子欠乏症、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠乏症、ガンマ−カルボキシラーゼ欠損症、外傷または損傷に関連する出血、血小板減少症、凝血障害、過剰抗凝固治療障害、ベルナール・スーリエ症候群、グランツマンの血小板無力症、および貯蔵プール欠乏症から成る群から選択される、
組成物。
【請求項２】
請求項１記載の組成物であって、さらに、少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体を有する、組成物。
【請求項３】
請求項１記載の組成物において、前記第Ｘａ因子変異体は、
キモトリプシン番号システムで１６位におけるイソロイシンが、ロイシン、メチオニン、またはトレオニンで置換されるものであること、および、
キモトリプシン番号システムで１７位におけるバリンが、メチオニン、トレオニン、またはセリンで置換されるものであること
からなる群から選択される置換変異を有するものである、組成物。
【請求項４】
請求項１記載の組成物において、前記凝固因子欠乏症は、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩ因子、第ＩＩ因子、およびフォン・ウィルブランド因子から成る群から選択される少なくとも一つの凝固因子の欠乏症である、組成物。
【請求項５】
請求項１記載の組成物において、前記過剰抗凝固治療による疾患は、ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、ワルファリン、低分子抗血栓剤、およびＦＸａ阻害剤から成る群から選択される少なくとも一つの抗凝固剤の事前投与によって引き起こされる、組成物。
【請求項６】
請求項１記載の組成物において、前記直接ＦＸａ阻害剤は、アピキサバン、ベトリキサバン、ダレキサバン、エドキサバン、オタミキサバン、およびリバーロキサバンから成る群から選択される、組成物。
【請求項７】
請求項１記載の組成物において、前記第Ｘａ因子変異体は軽鎖および重鎖を有し、前記軽鎖は配列ＩＤ番号３と少なくとも９０％の相同性を有し、前記重鎖は配列ＩＤ番号５と少なくとも９０％の相同性を有する、組成物。
【請求項８】
請求項１記載の組成物において、前記第Ｘａ因子変異体はキモトリプシン番号システムで１６位にＬｅｕを有する、組成物。
【請求項９】
少なくとも一つの第Ｘａ因子変異体、少なくとも一つの直接ＦＸａ阻害剤、および少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体からなる、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１、３または８記載の組成物において、前記止血関連疾患は、凝血障害である、組成物。
【請求項１１】
請求項１、３または８記載の組成物において、前記止血関連疾患は、外傷または損傷に関連する出血である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２０１３年１１月１日に提出され
た米国仮出願第６１／８９８，８８４号、および２０１３年１２月１９日に提出された米国仮出願第６１／９１８，３４１号の優先権を主張するものである。前述の出願は、その引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｐ０１  ＨＬ−７４１２４の下、政府からの支援によって成されたものである。政府は本発明の一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は医学および血液学に関するものである。より具体的には、本発明は第Ｘａ因子およびその変異体の半減期を延ばす組成物および方法を提供する。同じ物を用いて対象において凝固カスケードを調節しそして止血関連疾患を治療する方法もまた提供される。
【背景技術】
【０００４】
本発明に係る技術水準を説明するために複数の出版物および特許文献が本明細書にわたり引用されている。これらの各引用物は引用されることにより本明細書に組み込まれる。
【０００５】
止血は心臓血管系恒常性に不可欠な要素であり血管開存性を保ちながら血管損傷部位の出血を止める。この工程は血栓症（病理学的な、過剰な凝固）または出血を防ぐため、綿密に制御されている。止血は二つの要素からなり、初期血小板血栓を形成するよう活性化血小板の凝集を引き起こす一次止血、そしてその損傷部位に主に架橋されたフィブリンポリマーから成る安定した凝塊が蓄積される二次止血がある。二次止血は、凝血促進セリンプロテアーゼであるトロンビンを生成する相同的なセリンプロテアーゼおよびそれらの補因子のカスケードにより起こる。この凝固カスケードによって生成されるトロンビンは水溶性フィブリノーゲンを重合し凝血塊を形成する非水溶性フィブリンに変換する。この止血系はまた、血管の開存性を落とす無差別凝固を防ぐ循環凝固抑制因子から成る。さらに、凝固セリンプロテアーゼおよび補因子は肝臓でそれぞれ不活性なチモーゲンおよび補因子前駆体として合成される。チモーゲンおよび補因子前駆体は、部位特異的タンパク質分解を経て活性型プロテアーゼまたは補因子に成る。
【０００６】
薬理的な抗凝固が心房細動、肺塞栓症または深部静脈血栓症の病歴を有する人、および人工の心臓弁を持つ患者を含む血栓誘発性の患者の治療の主力である。５０年以上にわたり、唯一存在する経口抗凝固剤は、酸化型ビタミンＫを還元するビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ｅｐｏｘｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＶＫＯＲ）の阻害剤であるワルファリンであった。ビタミンＫは、多くの翻訳後γカルボキシル化の重要な補因子であり、よってワルファリンは強力な抗凝固剤となる。残念なことに、ワルファリンの使用は、凝固パラメーターの頻繁なモニタリングおよび用量調整を必要とする予測不可能な薬物動態を含む多くの欠点を有する。しかしながら、緊急出血または緊急や救急手術が必要な場合は、素早くかつ完全な回復を可能にする解毒剤が存在する。
【０００７】
近年では、ワルファリンと比較してより予測可能な薬物動態、より単純な投与計画、および速い発現および消失を有する、直接トロンビンおよびＦＸａを阻害する経口抗凝固剤が開発されている。リバーロキサバンおよびアピキサバンを含む経口直接ＦＸａ阻害剤は、プロトロンビンに関するＦＸａの非競合阻害剤である重要な新規薬剤である。これらは基質結合溝に結合し、同様に基質結合溝に結合する小型ペプチヂル基質に関して競合的にＦＸａを阻害する。アピキサバンおよびリバーロキサバンはどちらも高ピコモル濃度／低ナノモル濃度のＫｉ値の酵素を阻害し、血漿中でほとんどタンパク結合している。経口第Ｘａ因子阻害剤はワルファリンに対して優位性を有しているが、現在のところ経口直接第Ｘａ因子阻害剤に完全に有効な回復薬は存在しない。直接第Ｘａ因子阻害剤の使用による異常出血を元に戻す回復薬が求められているが、未だこの臨床的な必要性を満たすものは存在しない。
【０００８】
凝血促進に関しては、損傷に対する反応は集中的かつ傷害の大きさに相応でなければならない。ここで述べるように凝固は、タンパク質分解反応の連鎖による酵素の活性化によって進み、最終酵素であるトロンビンが血小板を活性化し構造タンパク質（フィブリノーゲン）を切断してフィブリンを産生し、血液が物理的に血管から漏れるのを防ぐ網目構造を提供することにより、完了する。トロンビンの形成に繋がるタンパク質の異常は出血性の合併症を引き起こす可能性がある。最も一般的な出血性疾患は血友病ＡおよびＢである。血友病Ａは凝固因子ＶＩＩＩの欠陥によって特徴付けられ、友血病Ｂは第ＩＸ因子の欠陥が特徴である。血友病に対する現在の治療は、欠陥または欠損している凝固因子を補充することによって行われる。残念ながら、一定数の患者（約３〜２０％）は高い抗体価を生じてしまい、注入された第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対する抑制抗体を産生してしまう。投与したタンパク質に対する阻害因子の形成は血友病の管理における重大な問題を表している。これらのいわゆる阻害因子患者の代替治療法として、活性型プロトロンビン複合体製剤（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ：ａＰＣＣ）や組み換え型ＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））などの内因性経路を迂回する方法が開発されて来た。これらの製品はＦＸａ形成、そして最終的にトロンビンの形成を加速化し、それにより十分な止血を提供する。短い半減期、有効用量の範囲、コストおよび血栓性合併症の可能性を含む多くの問題のため、別の方法が模索される必要がある。一つの代替的な方法はＦＸａを直接注入することである。しかし、これは血漿中において顕著に短い半減期を有する。よって、未だいち早く臨床的な必要性を満たすことが求められている。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１）  米国特許第８，４５５，４３９号明細書
（特許文献２）  米国特許出願公開第２００８／０３１８２７６号明細書
（特許文献３）  米国特許出願公開第２００９／００４２７８７号明細書
（特許文献４）  米国特許出願公開第２０１０／０２９７２５７号明細書
（特許文献５）  米国特許出願公開第２０１１／００１５１２８号明細書
（特許文献６）  国際公開第２０１４／１１８６７７号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、対象における止血の調節方法が提供される。ある実施形態では、対象において止血関連疾患を阻害、治療、および／または予防する方法が提供される。ある実施形態では、前記方法は治療的に有効な量の第Ｘａ因子またはその変異体および直接第Ｘａ因子阻害剤を投与する工程を有する方法を提供する。前記第Ｘａ因子またはその変異体および前記直接第Ｘａ因子阻害剤は同時および／または経時的に投与されることが可能である。ある実施形態では、前記直接ＦＸａ阻害剤はアピキサバン、ベトリキサバン、ダレキサバン、エドキサバン、オタミキサバン、およびリバーロキサバンから成る群から選択される。ある実施形態では、前記第Ｘａ因子変異体は、キモトリプシン番号システムで１６位または１７位における置換を有し、特に１６位にＬｅｕを有する変異体である。
【００１０】
本発明の別の観点によれば、血液中で直接ＦＸａ阻害剤の抗凝固効果を低減する方法が提供される。ある実施形態では、前記方法は血液を有効量の第Ｘａ因子またはその変異体と接触させる工程を有する。前記方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行われてもよい。ある実施形態では、前記直接ＦＸａ阻害剤はアピキサバン、ベトリキサバン、ダレキサバン、エドキサバン、オタミキサバン、およびリバーロキサバンから成る群から選択される。ある実施形態では、前記第Ｘａ因子変異体はキモトリプシン番号システムで１６位または１７位における置換を有し、特に１６位にＬｅｕを有する変異体である。
【００１１】
本発明の別の観点によれば、血液凝固の調節のための組成物が提供される。ある実施形態では、前記組成物は少なくとも一つの第Ｘａ因子またはその変異体および少なくとも一つの直接第Ｘａ因子阻害剤を有する。前記組成物は、さらに少なくとも一つの薬学的に許容される担体を有してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、リバーロキサバンおよびＦＸａＩ［１６］Ｌを使用して行ったトロンビン生成試験（ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ：ＴＧＡ）のグラフを提供する。図１Ａは乏血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｐｏｏｒ  ｐｌａｓｍａ：ＰＰＰ）へのリバーロキサバンの滴定を表し、阻害剤レベルに対するこの試験の感度を表す。図１Ｂは５００ｎＭリバーロキサバンを添加されたＰＰＰへのＦＸａＩ［１６］Ｌの滴定を表す。データは最大トロンビン生成を正常の最大トロンビン生成のパーセンテージとして数値化した。この試験において、１ｎＭの前記変異体がトロンビン生成を回復するのに十分だった。
【図２】図２は、全血凝固線溶分析を、２５μｇ／ｍＬのトウモロコシトリプシン阻害剤（試料間の変動を最小化するため）で処理した、採血したばかりのクエン酸血液を使用して行った。２５０ｎＭアピキサバンが血液に添加され、異なる濃度のＦＸａＩ［１６］Ｌ（０．３ｎＭおよび３ｎＭ）をその効果を元に戻すために添加した。リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）をアピキサバンの代わりに、ポジティブコントロールとして一つの試料に添加した。アピキサバンは凝血時間を大幅に延ばし、０．３ｎＭの変異体が正常の止血に回復させるのに十分であった。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、リバーロキサバンを含む血漿中におけるＦＸａの事前放置の効果を提供している。ＷＴのＦＸａ（右側の棒）または前記Ｉ［１６］Ｌｅｕ変異体（左側の棒）を、５００ｎＭリバーロキサバンを含む（図３Ａ）または含まない（図３Ｂ）ＰＰＰに加えた。表記されている放置時間後、ＴＧＡ反応を組織因子／リン脂質を添加することによって開始した。図３Ｂにおいては、反応開始前に５００ｎＭのリバーロキサバンを他のＴＧＡ薬剤と共に加えた。放置時間はＰＢＳを添加されたＰＰＰの最大トロンビン生成のそれに対するパーセンテージとしてプロットした。「５００ｎＭ  ｒｉｖ」と表した試料は、５００ｎＭのリバーロキサバンのみかつＦＸａの代わりにＰＢＳで処理したものを示す。
【図４】図４Ａはヒトプロ第Ｘ因子前駆体（配列ＩＤ番号２）のアミノ酸配列を提供する。下線および太文字で示される残基は、キモトリプシン番号で１６、１７、１８、１９、および１９４位のものである。図４Ｂは第Ｘ因子の軽鎖（配列ＩＤ番号３）および重鎖（配列ＩＤ番号４）のアミノ酸配列を提供する。図４Ｃは活性型第Ｘ因子（ＦＸａ）の軽鎖（配列ＩＤ番号３）および重鎖（配列ＩＤ番号５）を提供する。図４ＤはヒトＦＸプロタンパク質前駆体をコードする核酸配列（配列番号６）を提供する。
【図５】図５は、ＦＸａ−アンチトロンビンＩＩＩ複合体（ＦＸａ−ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＩＩＩ：ＦＸａ−ＡＴＩＩＩ）形成を放置時間の関数で示したグラフを提供する。２５ｎＭのＷＴのＦＸａをリバーロキサバンを含まない、１００ｎＭリバーロキサバン、または１μＭリバーロキサバンを含む、ＦＸ欠損血漿に添加した。試料は表記された時間放置され、その後全ての残留ＦＸａを、ＦＸａの活性部位を不可逆的に修飾してアンチトロンビンとの更なる反応を防ぐ５０μＭのビオチン化グルタミル−グリシニル−アルギニル−クロロメチルケトン（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｙｌ−ａｒｇｉｎｙｌ−ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ：ＢＥＧＲＣＫ）を添加することによって失活させた。その後ＦＸａ−ＡＴＩＩＩレベルを抗ＦＸａ捕捉抗体およびＨＲＰ標識−抗ＡＴＩＩＩ検出抗体を用いてエライザ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）により測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
凝固セリンプロテアーゼは血管傷害時に安定した凝血塊の形成を起こす止血工程の、重要な要素である。この工程は過剰な凝血（血栓症）または不十分な凝血（出血）を防ぐため綿密に制御されていなければならない。この制御の主要要素は、血管損傷後に局所でタンパク質切断により活性化されることが出来る不活性なチモーゲンとして、プロテアーゼを合成すること、そして迅速に遊離している活性型プロテアーゼを不活化する血漿プロテアーゼ阻害剤の存在を、含む。凝血の不十分な制御は心房細動、肺塞栓症、および深部静脈血栓症を含む血栓誘発状態に繋がる。薬理的な抗凝固がこれらの患者の治療の主力となっている。近年では、前記凝固カスケードで下から二番目にある、凝固第Ｘａ因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ：ＦＸａ）を直接阻害して、治療計画を簡易にし得る新規抗凝固剤が出現した。これらの直接第Ｘａ因子阻害剤は、最も幅広く使用されている経口抗凝固剤であるワルファリンと少なくとも同等の安全プロフィールを持ち、非常に有効であると示されている一方で、大量出血や緊急手術時のこれらの効果に対する特異的な対応薬の欠如が医師にとって大きな関心事である。
【００１４】
ＦＸａはその補因子であるＦＶａと共に、トロンビン生成の重要なセリンンプロテアーゼであり、トロンビン生成のためプロトロンビンをタンパク質分解的に活性化する。第Ｘ因子のチモーゲンは活性化ペプチドの特異的な切断または除去によって凝固の内因性または外因性経路によって活性化される。活性化ペプチドの除去は、チモーゲン−プロテアーゼ変換と呼ばれる、構造変化を引き起こし、活性化したプロテアーゼを生じる。この重要な構造変化を行う能力を欠くＦＸａ変異体が開発されてきた。これらの変異体はこれらの特別な生化学的特徴に基づき、血友病または頭蓋内出血の場合における凝血促進剤としての治療上の可能性を持つことが示されている。これらのチモーゲン様ＦＸａ変異体はまた直接ＦＸａ阻害剤に対する効果的な拮抗薬としての効果がある可能性もある。ここに、直接ＦＸａ阻害剤の存在下でＦＸａやその変異体が触媒機能および半減期に関してどのような挙動を示すのかを証明する。
【００１５】
第Ｘａ因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ：ＦＸａ）は前記凝固カスケード中で重要なプロテアーゼであり、膜表面に存在するその捕因子Ｖａ（ｃｏｆａｃｔｏｒ  Ｖａ：ＦＶａ）に結合した時、チモーゲンプロトロンビンを切断して活性化プロテアーゼであるトロンビンにする。ＦＸａはそれに対してチモーゲン第Ｘ因子（ｆａｃｔｏｒ  Ｘ：ＦＸ）として合成され、それが内因性または外因性「テナーゼ」複合体によって活性化される。ヒトＦＸは一つのポリペプチド鎖として翻訳されてそれが二つのジスフィルド結合したサブユニット：１３９残基の「軽鎖」および３０６残基の「重鎖」（例えば、図４参照）にタンパク質分解によって、切断される。この軽鎖は二つのＥＧＦ−２相同ドメインおよびビタミンＫ依存性凝固因子の特徴でありＦＸ／ＦＸａの膜結合特性の原因となる一つのγ−カルボキシグルタミン酸（γ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ：Ｇｌａ）ドメインを有する。この重鎖はアミノ末端にセリンプロテアーゼドメインおよび５２アミノ酸の「活性化ペプチド」を有する。
【００１６】
キモトリプシン様セリンプロテアーゼ同士の顕著な相同性のため、異なるタンパク質間の残基同士の有意義な比較を可能にする、キモトリプシンの残基番号に基づいた標準命名法が開発された。ＦＸについては、前記アミノ末端軽鎖はキモトリプシンとは非相同である（キモトリプシン中に存在しないＧｌａドメインおよび二つのＥＧＦ−２ドメインを含むため）ので１〜１３９まで連続で番号付けされている。軽鎖残基はＬの後に残基番号を付けて表わされてもよい（例えば、ＡｒｇＬ１３９）。キモトリプシンとの相同性はプロテアーゼドメインを含む前記重鎖内に存在し、よってこの重鎖はキモトリプシン番号システムに基づいて括弧内に番号付けされることが出来る（例えば、Ｓｅｒ［１９５］）。
【００１７】
内因性または外因性Ｘアーゼ複合体の限定的なタンパク質分解は、このタンパク質の活性化ペプチドの除去およびその後の構造再編成である前記「チモーゲン−プロテアーゼ変換」を引き起こし、成熟プロテアーゼを生成する。実質全ての構造変化が活性化ドメインとして知られるＦＸａの特定の部位で起こる。重要なことに、前記チモーゲン−プロテアーゼ変換は前記チモーゲンには存在しないＦＸａの三つの特徴的な機能特性：１）ＦＶａ結合能、２）プロトロンビン結合能、そして３）機能的活性部位、の獲得を引き起こす（例、Ｆｕｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７６）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２５１：６８０７−６８１４；  Ｒｏｂｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５５：２０１４−２０２１；  Ｋｅｙｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５７：８６８７−８６９５；  Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６６：２４５８；  Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６８：２２５３１−２２５３９；  Ｄａｈｌｂａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １７：４９３８−４９４５参照）。ＦＸの活性化ペプチドの除去に際して、前記重鎖の新たに露出されたアミノ末端が疎水ポケット内に挿入されＩｌｅ［１６］（Ｎ末端残基）とＡｓｐ［１９４］間で塩橋を形成する。これは構造変化の連鎖を引き起こし、成熟プロテアーゼを生じる。この新しいＮ末端内の残基（Ｈ２Ｎ−ＩＶＧＧ−；配列ＩＤ番号１）はＡｓｐ［１９４］と共に、ＦＸ／Ｘａ中で進化の過程において高度に保存されている。野生型ＦＸａでは、このプロテアーゼの構造はチモーゲンの構造と平衡にあり、この平衡はプロテアーゼ寄りに大きく傾いている。ＦＸａ中のＡｓｐ［１９４］への変異導入は触媒不活性型のタンパク質となる。さらに、Ｉｌｅ［１６］およびＶａｌ［１７］残基への変異導入を通した、Ｎ末端挿入の破壊はこのチモーゲンとプロテアーゼの平衡をチモーゲン様構造に傾かせることが確かめられている。これらの「チモーゲン様」ＦＸａ変異体は未成熟な活性部位およびプロトロンビン結合部位を有する。しがしながら、これらのチモーゲン様変異体への前記捕因子ＦＶａの結合は熱力学的に活性型プロテアーゼ構造および機能を救け、捕因子結合がチモーゲン−プロテアーゼ変換と熱力学的に関連があることを示している。前記チモーゲンの活性化ドメインに結合する強いリガンドは、この部位を安定化させ、そして少なくとも部分的にチモーゲン−プロテアーゼ変換で見られる変化を模倣することもまた示されている。また、ＩＶＧＧ（配列ＩＤ番号１）ペプチドは１６位での切断なしで、少なくとも部分的にトリプシノーゲン（チモーゲン）を活性化することが示されている。
【００１８】
野生型（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ：ＷＴ）ＦＸａは循環血漿阻害因子による迅速な阻害のため血漿中において約１分の半減期を有する。不可逆的セリンプロテアーゼ阻害因子であり、アンチトロンビンＩＩＩ（ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＩＩＩ：ＡＴＩＩＩ）を含むセルピンは、この分子の主要な種類を占めている。組織因子経路阻害因子（Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＴＦＰＩ）は別のＦＸａの主要な血漿阻害因子である。ＴＦＰＩは可逆的にＦＸａに結合して阻害し、さらに組織因子／ＦＶＩＩａに結合して、不活性の四量体である複合体を形成する。この四量体である複合体は不可逆である。ＡＴＩＩＩおよびＴＦＰＩ両方が基質結合溝においてＦＸａに作用し、完全に形成された活性部位を必要とする。さらに、小型発色基質とこれらの阻害因子が同時にＦＸａに結合することは出来ない。ここで記載される前記Ｎ末端ＦＸａチモーゲン様変異体はＡＴＩＩＩおよびＴＦＰＩによる阻害による感受性がより低いことが示されており、その結果、より長い半減期を有する。
【００１９】
前記Ｎ末端チモーゲン様ＦＸａ変異体は血友病および頭蓋内出血などにおける治療用凝血促進剤である。これらの変異体の二つの重要な特性が凝血促進剤として魅力的にさせている。第一に、これらのより長い半減期がこれらをＷＴのＦＸａよりも医薬物質としてより適切なものにしている。第二に、これらは主にチモーゲン様構造で循環するが血管損傷部位でＦＶａに結合することによって回収される。よって、これらは血漿中を自由に循環している間は、比較的不活性であるが、ＦＶａ存在下では機能的プロテアーゼとなる。さらには、以下で証明されるように、ＦＸａおよびＦＸａチモーゲン様変異体はまた直接ＦＸａ阻害剤に対する回復薬として機能する可能性がある。事実、ここでＦＸａ変異体は、血漿および全血を直接ＦＸａ阻害剤によって抗凝固したｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝固実験において正常な止血を回復させることを表した。さらに、直接ＦＸａ阻害剤およびＴＦＰＩ／ＡＴＩＩＩはどちらもＦＸａの基質結合溝に結合するため、直接ＦＸａ阻害剤はＦＸａおよびその変異体の半減期を長くすることが示されている。ＦＸａおよびＦＸａチモーゲン様変異体はまたｉｎ  ｖｉｖｏにおいてマウス止血解析によって安全かつ効果的に直接ＦＸａ阻害剤の効果を取り消すことが出来ることが示されている。
【００２０】
本発明はＦＸ分子および、ＦＸａ変異体、ＦＸ変異体、ＦＸプロペプチド前駆体を含む変異体ＦＸ分子、およびＦＸプロペプチド変異体を含む。単純化のため、前記変異体は明細書にわたってＦＸａに関して説明される。しかしながら、本発明は、選択的に変異体ＦＸａと同じアミノ酸置換を有する、ＦＸ、ＦＸプロペプチド前駆体およびＦＸプロペプチド分子、を考慮しており、含むものである。
【００２１】
本発明のＦＸａおよびその変異体はいかなる哺乳類の種からのものでもよい。ある実施形態では、前記ＦＸａまたはその変異体はヒトのものである。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００４９５は野生型ヒトＦＸプロタンパク質前駆体の例を提供する。図４Ａは、前記ヒトＦＸプロタンパク質前駆体のアミノ酸配列の例である、配列ＩＤ番号２を提供する。前記ＦＸプロペプチド前駆体はアミノ酸１〜２３のシグナルペプチドおよびアミノ酸２４〜４０のプロペプチド配列を有する。前記プロペプチドの切断は新しいＮ末端配列Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｓｅｒを生じる。前記ＦＸプロペプチド前駆体はまた第Ｘ因子チモーゲンを生成するためトリペプチドＲＫＲにおいて切断することによって成熟した二鎖の形態（軽および重）にも切断される。この二鎖はジスフィルド結合によって繋がっている。図４Ｂは、ヒトＦＸのそれぞれ軽および重鎖のアミノ酸配列の例である、配列ＩＤ番号３および４を提供する。第Ｘ因子は５２アミノ酸の活性化ペプチドの切断によって活性化され、新しいアミノ末端配列ＩＶＧＧ（配列ＩＤ番号１）を野生型ＦＸａ重鎖に生じる。図４Ｃは、ヒトＦＸａのそれぞれ軽および重鎖のアミノ酸配列の例である、配列ＩＤ番号３および５を提供する。特に、この上述のタンパク質切断の事象が不正確であることもあり、それによって前記切断部位においてアミノ酸の追加または欠損に繋がる。例えば、前記成熟したＦＸａまたはその変異体は不正確なタンパク質切断およびこのタンパク質の成熟により予想されるアミノ酸配列よりも短いかもしれない。図４Ｄは、ヒトＦＸプロタンパク質前駆体をコードする核酸配列（配列ＩＤ番号６）を提供する。ＦＸおよびＦＸａをコードする核酸分子は提供されるアミノ酸およびヌクレオチド配列によって容易に決定されることが出来る。
【００２２】
ある実施形態では、本発明のＦＸは配列ＩＤ番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性（同一性）、特に少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の相同性を有する。ある実施形態では、本発明のＦＸは、配列ＩＤ番号２のアミノ酸２４〜４８８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性、特に少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の相同性を有する。ある実施形態では、本発明のＦＸは配列ＩＤ番号２のアミノ酸４１〜４８８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性、特に少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の相同性を有する。ある実施形態では、本発明のＦＸは軽鎖および重鎖を有し、前記軽鎖は配列ＩＤ番号３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性、特に少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の相同性を有し、前記重鎖は配列ＩＤ番号４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性、特に少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の相同性を有する。ある実施形態では、前記ＦＸａは軽鎖および重鎖を有し、前記軽鎖は配列ＩＤ番号３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性、特に少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の相同性を有し、そして前記重鎖は配列ＩＤ番号５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性、特に少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の相同性を有する。前記変異体は一つまたはそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって異なってもよい。
【００２３】
本発明の変異体はまた翻訳後に修飾（γ−カルボキシル化）されることも可能である。前記変異体は細胞内でまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳後修飾されることが出来る。
【００２４】
ある実施形態では、本発明の変異体は血漿内（例えば、血友病血漿）で延長された半減期を有する。さらに、ＦＶａ非存在下における本発明の変異体は、全ての活性部位機能が無効であり不十分な活性化因子である可能性がある。しかし、前記変異体はＦＶａ存在下において活性を示すと考えられる。
【００２５】
本発明のＦＸａ変異体は、少なくとも一つの置換を１６、１７、１８、１９、および／または１９４位において（キモトリプシン番号で；例えば、図４Ａの２３５〜２３９および４１８  位において（配列ＩＤ番号２））、特に１６または１７位において有する。ＦＸａ変異体の例はまたＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６０９２７およびＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８２７９にも記載されており、このどちらもが引用されることによって本明細書に含まれるものとする。ある実施形態では、１６位におけるイソロイシンはロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グリシン、メチオニン、トレオニン、またはセリンと置換される。ある実施形態では、１６位におけるイソロイシンはロイシンと置換される。ある実施形態では、１６位におけるイソロイシンはトレオニンと置換される。ある実施形態では、１７位におけるバリンはロイシン、アラニン、グリシン、メチオニン、トレオニン、またはセリンと置換される。ある実施形態では、１７位におけるバリンはアラニンと置換される。ある実施形態では、１７位におけるバリンはヒドロキシルアミノ酸であるトレオニンまたはセリンと置換される。ある実施形態では、１７位におけるバリンはトレオニンと置換される。ある実施形態では、１９４位にあるＡｓｐはアスパラギンまたはグルタミン酸と置換されることが可能である。本発明の変異体は一つまたはそれ以上の上記の置換を有することが出来る。
【００２６】
第Ｘ／Ｘａ因子配列の変異体（例えば、自然アレル変異体）が、例えば、ヒト集団中で存在することは当業者によって認識されている。したがって、第Ｘ／Ｘａ因子アミノ酸およびヌクレオチド配列に関してこのような変異体は本発明の範囲内である。したがって、ヒト集団中で起こる「自然アレル変異体」という用語はここで本発明の様々な特定のヌクレオチド配列およびその変異体を意味する。コードされたタンパク質内で同類または中立的なアミノ酸置換になる異なるコドンのゆらぎおよび遺伝的多型はこのような変異体の例である。このような変異体は大きく変化した第Ｘ／Ｘａ因子活性またはタンパク質レベルを示さない。
【００２７】
ある実施形態では、前記ＦＸａ変異体は「チモーゲン様」でありかつ未熟な活性部位機能を有し、生理的な阻害因子であるアンチトロンビンＩＩＩ（ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＩＩＩ：ＡＴＩＩＩ）および組織因子経路阻害因子（ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＴＦＰＩ）に対して低い感受性を有する。前記変異体の生体活性は捕因子ＦＶａと結合することによってプロトロンビナーゼを形成するとき、少なくとも大部分が、または完全に回復する。例えば、ＦＸａＩ１６Ｌは血友病血漿内におけるトロンビン生成を回復させ、延長した半減期を有する（ｗｔ−ＦＸａが１分に対し１２０分；  Ｔｏｓｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  ＪＢＣ  ２８３：１８６２７−３５；  Ｂｕｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｂｌｏｏｄ，  １１７：２９０−２９８）。さらに、血友病Ｂ（ＨＢ）マウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ実験は複数の傷害モデルにおいてチモーゲン様ＦＸａＩ１６Ｌが安全でありかつ十分な止血を提供することを示した（Ｉｖａｎｃｉｕ  ａｎｄ  Ｃａｍｉｒｅ，  ＡＳＨ  Ａｂｓｔｒａｃｔ，  ２００８；  ＩＳＴＨ  Ａｂｓｔｒａｃｔ，  ２００９）。
【００２８】
上記タンパク質をコードする核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ）もまた本発明に含まれる。前記タンパク質をコードする核酸分子は当該技術分野で既知の方法で作製されてもよい。前記核酸分子は、発現ベクターまたはクローニングベクターなどの、適切なベクター内に保持されていてもよい。例えば、クローンは好適な宿主細胞（例えば、大腸菌または哺乳類細胞）内で増殖される、プラスミドクローニング／発現ベクター内で維持されてもよい。翻訳後修飾が機能に影響する場合は、哺乳類細胞内で発現させるのが好ましい。
【００２９】
一つの実施形態では、本発明の前記ＦＸａまたはその変異体をコードする核酸は、細胞内タンパク質切断部位の挿入によってさらに修飾されることも出来る（本発明はまたその結果として得られる切断前後のポリペプチドを含む）。哺乳類細胞内でＦＸａ変異体を発現させるため、タンパク質切断部位（例えば、細胞内タンパク質切断部位）が前記ＦＸ中のＡｒｇ１５とＩｌｅ１６の間で切断が起こるよう挿入されてもよい（例えば、前記切断部位がＡｒｇ１５とＩｌｅ１６の間に挿入される、または５２アミノ酸の活性ペプチド全長が切断部位と置換される）。ある実施形態では、前記細胞内タンパク質節切断部位はＰＡＣＥ／フーリン様酵素切断部位である（例えば、Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ（配列ＩＤ番号７）；Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ；またはＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列ＩＤ番号８）。この位置における前記切断部位の組み込みは、前記重鎖が１６位で始まる分解されたＦＸａを生じる。言い換えると、この位置へのこの切断部位の導入はＦＸからＦＸａへの細胞内変換を引き起こす。これらの修飾は、この修飾ＦＸを発現する哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯまたはＨｅｌａ細胞）から「活性型」形態のＦＸの分泌を可能にする。前記切断されている因子の分泌は血液凝固中または前記タンパク質の抽出後のタンパク質切断を不要にさせる。
【００３０】
本発明のタンパク質は、適切な抽出源（例えば、変異体を発現する細菌または動物の形質転換された培養細胞、または変異体を発現する組織）からの抽出および精製を含む当該技術分野で知られているどの方法でも調製されてよい。前記タンパク質（例えば、組み換え原核または真核システム内での遺伝子発現によって生成されたもの）は当該技術分で知られる方法によって精製されることが出来る。ある実施形態では、前記組み換えタンパク質を発現させその後、簡便に周囲の培地から精製出来るよう宿主細胞から分泌させることによる、発現／分泌システムが用いられることが可能である。前記タンパク質はまた存在すれば、前記組み換えタンパク質に特異的に結合する抗体を前記タンパク質に用いる免疫反応またはタグの使用などによるアフィニティ分離（例、６〜８ヒスチジン残基、ＦＬＡＧエピトープ、ＧＳＴまたはヘマグルチニンエピトープ）によって精製されることも出来る。前述した方法によって調製した、タンパク質は、標準の手順によって解析されることが出来る。例えば、そのようなタンパク質は、既知の方法に従ってアミノ酸配列解析にかけられることが出来る。前記タンパク質はまた従来の品質管理にかけられ治療用形態に形状を変えられることも出来る。特に、組み換え生成時に、この精製された調製物は細胞由来の核酸および前記発現ベクター由来の核酸を含まないことを確かめることも出来る。
【００３１】
ある実施形態では、本発明のＦＸは、このＦＸ変異体をＦＸａに活性化出来る、第ＸＩａ因子またはその誘導体と混合することも出来る。前記ＦＸａ変異体は、マトリックス上に固定された第ＸＩａ因子の溶液を保持する容器、例えばプロテアーゼを補充された小型カラムまたはシリンジの形態、かつ医薬調製物を含む容器を有する組み合わせ調製物の形態で、存在してもよい。前記ＦＸを活性化するため、前記Ｘ因子を含む溶液は、例えば、固定化された前記プロテアーゼ上に圧縮されることが出来る。調製物の貯蔵時には、前記ＦＸ含有溶液は前記プロテアーゼと物理的に分離されていてもよい。本発明に従う調製物は前記プロテアーゼと同じ容器に保存されることが出来るが、各成分はこの調製物の投与前に容易に取外し可能な不透過性隔壁によって分離される。前記溶液はまた別の容器に保存され投与直前にのみ互いを接触させることが出来る。前記ＦＸは使用直前に、例えば、当該患者への投与前に、第Ｘａ因子に活性化されることが可能である。この活性化は第Ｘ因子変異体を固定化プロテアーゼと接触させるまたはプロテアーゼを含む溶液と前記ＦＸを混合することによって行われる。従って、この２つの成分を溶液中で別に維持すること、および前記成分が装置を通過しながら互いに接触してそれにより第Ｘａ因子または第Ｘａ因子変異体への活性化に繋がる好適な注入装置によってこれらを混合することは可能である。前記患者はよって、第Ｘａ因子および、追加的に、前記活性化の原因となるセリンプロテアーゼの混合物を投与される。これに関して、この追加的セリンプロテアーゼ投与はまた、内在性ＦＸも活性化し、これにより凝固時間が短縮され得るため、用量に留意することが重要である。
【００３２】
ある実施形態では、本発明の組成物は約１０〜５０００μｇ／ｋｇ、約１０〜１０００μｇ／ｋｇ、約１０〜５００μｇ／ｋｇ、約１０〜２５０μｇ／ｋｇ、約１０〜７５μｇ／ｋｇ、または約４０μｇ／ｋｇの間の前記ＦＸａまたはその変異体を有する。この量は「必要に応じて」静脈経由で投与されるか、または計画（例えば、少なくとも一日一回）に準じて送達されてもよい。患者は当該診療所において出血の提示後すぐまたは出血に繋がる切り傷／傷害の受傷前に治療されてもよい。または、患者は１〜３時間毎にボーラス投与を受ける、または十分な改善が見られた場合、ここに記述される前記変異体を一日一回投与されてもよい。
【００３３】
ここで使用されるように、「直接第Ｘａ因子阻害剤」とは選択的に第Ｘａ因子に直接結合し阻害する成分を意味する。ある実施形態では、この直接第Ｘａ因子阻害剤はトロンビンに対する阻害活性を持たない。直接第Ｘａ因子阻害剤の例には、これらに限らないが、抗スタチン（ａｎｔｉｓｔａｓｉｎ）、ダニ抗凝固ペプチド、アピキサバン、ベトリキサバン、ダレキサバン、エドキサバン、オタミキサバン、リバーロキサバン、ＤＸ−９０６５ａ、ＹＭ−６０８２８、ＲＰＲ−１２０８４４、ＢＸ−８０７８３４、ＹＭ−１５０、ＰＤ−３４８２９２、ラザキサバン、ＢＡＹ  ５９−７９３９、ＴＡＫ−４４２、エリバキサバン、ＬＹ５１７７１７、ＧＳＫ９１３８９３、およびその塩、アナログ、または誘導体を含む。第Ｘａ因子阻害剤はまた、米国特許第６，３６９，０８０号、第６，２６２，０４７号、および第６，１３３，２５６号明細書でも提供されており、引用されることで本明細書に含まれるものとする。ある実施形態では、前記直接第Ｘａ因子阻害剤は、アピキサバン、ベトリキサバン、ダレキサバン、エドキサバン、オタミキサバン、およびリバーロキサバンから成る群から、選択される。
【００３４】
本発明によれば、止血関連疾患または障害を阻害、治療、および／または予防する方法が提供される。ある実施形態では、本発明の方法は凝固形成を促進する（凝血促進）。ある実施形態では、本発明の方法は抗凝固剤、特に直接ＦＸａ阻害剤の活性を、中和および／または失活させる。ある実施形態では、前記ＦＸａまたはその変異体と阻害剤の比は約１：１または１：２〜約１：１０，０００、特に約１：１０〜約１：１０００、約１：１０〜約１：５００、または約１：１０〜約１：１００である。
【００３５】
本発明は止血関連疾患または障害を、阻害、治療、および／または予防する方法を含む。止血関連疾患または障害の例には、これらに限定しないが：これらに限らないが血友病、血友病Ａ、血友病Ｂ、抑制抗体を有する血友病ＡおよびＢ患者、少なくとも一つの凝固因子（例えば、第ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、Ｖ、ＸＩＩ、ＩＩ、および／またはフォン・ウィルブランド因子）の欠乏症、ＦＶ／ＦＶＩＩＩ重複欠乏症、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠乏症、ガンマ−カルボキシラーゼ欠乏症などの出血性疾患；例えば、外傷、損傷、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝血障害（凝固能低下）、および／または播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）に伴う出血などの出血；ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、ワルファリン、および／または低分子抗凝固剤（例えば、ＦＸａ阻害剤）による過剰な抗凝固などの過剰抗凝固；および、これらに限らないが、ベルナール・スーリエ症候群、グランツマンの血小板無力症、および貯蔵プール欠乏症などの血小板障害を含む。ある実施形態では、前記方法はそれを必要とする対象に治療的に有効な量の：１）少なくとも一つのＦＸａまたはその変異体および２）少なくとも一つの直接ＦＸａ阻害剤を投与する工程を、有する。前記化合物は同時におよび／または経時的に投与されることが、出来る。前記ＦＸａまたはその変異体および直接ＦＸａ阻害剤は同じ組成物中（例えば、少なくとも一つの薬学的に許容される担体と共に）または別の組成物中（例えば、同じまたは異なる薬学的に許容される担体と共に）に含まれることが出来る。前記組成物は少なくとも一つの担体、特に薬学的に許容される担体を有することが出来る。前記組成物が別々に投与されるとき、前記組成物は同時におよび／または経時的に投与されてもよい。例えば、前記ＦＸａまたはその変異体が最初に、そしてその後前記直接ＦＸａ阻害剤が投与される；前記直接ＦＸａ阻害剤が最初に、そしてその後前記ＦＸａまたはその変異体が投与される；または各組成物の複数回の投与があらゆる順番で用いられることが出来る。本発明の方法はさらに、特定の止血関連疾患または障害に有益な他の治療薬を投与する工程を有しても、よい。例えば、前記ＦＸａまたはその変異体は少なくとも一つの別の止血を調節することが知られている薬剤（例えば、第Ｖ因子、第Ｖａ因子、またはその誘導体）と共に投与されてもよい。ある実施形態では、前記ＦＸａまたはその変異体と阻害剤の比は約１：１または１：２〜約１：１０，０００、特に約１：１０〜約１：１０００、約１：１０〜約１：５００、または約１：１０〜約１：１００である。
【００３６】
ある実施形態では、前記止血関連疾患または障害は直接第Ｘａ因子阻害剤による過剰抗凝固治療である。前記疾患または障害が第Ｘａ因子阻害剤の使用／存在によって抗凝固治療の過剰になったとき（例えば、出血に繋がる第Ｘａ因子阻害剤の過使用／存在）、この第Ｘａ因子阻害剤（例えば、直接ＦＸａ阻害剤）によって引き起こされたこの抗凝固は、血液に少なくとも一つのＦＸａまたはその変異体を送達することによって阻害、治療、および／または予防することが出来る（例えば、少なくとも一つのＦＸａまたはその変異体を対象に投与することによって）。ある実施形態では、少なくとも一つのＦＸａ変異体が前記対象に投与される。
【００３７】
本発明はまた血液の凝固を促進する方法も含む。ある実施形態では、前記方法は前期血液を１）少なくとも一つのＦＸａまたはその変異体および２）少なくとも一つの直接ＦＸａ阻害剤と接触させる工程を、有する。前記方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行われることが出来る。前記化合物は血液に同時におよび／または経時的に送達されることが出来る。前記ＦＸａまたはその変異体および直接ＦＸａ阻害剤は、同じ組成物中に含まれる（例えば、少なくとも一つの担体と共に）または別々の組成物中（例えば、同じまたは異なる担体と共に）に存在することが出来る。前記組成物は少なくとも一つの担体（例えば、少なくとも一つの薬学的に許容される担体）を有することが、出来る。前記組成物が別々に送達されるとき、この組成物は同時および／または経時的に投与されることが出来る。例えば、前記ＦＸａまたはその変異体が最初に、そしてその後前記直接ＦＸａ阻害剤が送達されてもよい；前記直接ＦＸａ阻害剤が最初に、そしてその後前記ＦＸａまたはその変異体が送達されてもよい；または各組成物の複数回の送達があらゆる順番で使用されてもよい。本発明の方法は、さらに少なくとも一つの他の止血を調節することが知られている薬剤（例えば、第Ｖ因子、第Ｖａ因子、またはそれらの誘導体）を送達する工程を含むことが、出来る。
【００３８】
本発明の別の観点によれば、少なくとも一つのＦＸａまたはその変異体および少なくとも一つの直接ＦＸａ阻害剤を有する組成物が提供される。前記組成物は止血関連疾患または障害を治療／阻害／予防するために使用される、または血液凝固を促進するために使用される。一つの実施形態では、前記組成物はさらに少なくとも一つの薬学的に許容される担体を有する。ある実施形態では、本発明は少なくとも二つの組成物を有するキットを含み：一つ目の組成物は少なくとも一つのＦＸａまたはその変異体および、選択的に少なくとも一つの薬学的に許容される担体を有し；そして二つ目の組成物は少なくとも一つの直接ＦＸａ阻害剤および、選択的に少なくとも一つの薬学的に許容される担体を含む。前記キットはさらに少なくとも一つの他の止血を調節することが知られている薬剤（例えば、第Ｖ因子、第Ｖａ因子、またはそれらの誘導体）を有し、選択的に薬学的に許容される担体を有する組成物中に存在する。
【００３９】
本発明の組成物は生理的に許容されるマトリックスを有してもよい。本発明の医薬組成物は、例えば、点滴、注射または放出制御装置などの他の投与形態などのどのような好適な経路でも血液に投与されることが可能である。ある実施形態では、前記組成物は静脈注射によって送達される。本発明の組成物は出血部位に直接投与または塗布されてもよい（例えば、注射によって）。本発明の医薬組成物および担体は、他のものと共に、薬学的に許容されるバッファー、希釈剤、液体（水、生理食塩水、グリセロール、糖およびアルコールなど）、保存料、安定剤、可溶化剤、乳化剤、湿潤剤、ｐＨ緩衝物質、アジュバントおよび／または担体を有する。このような組成物は、様々なバッファー内容物（例えば、生理食塩水、トリス塩酸、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度；および界面活性剤や可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、二亜硫酸ナトリウム）、保存料（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）および増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加物を含むことが出来る。例えば、この超生物はＮａＣｌ、ＣａＣｌ２などの塩およびグリシンおよび／またはリジンなどのアミノ酸を含み、ｐＨの範囲が６〜８であるバッファーと調整されることが出来る。前記医薬組成物は水溶液中（例えば、生理学的に適合するバッファー）に調整されてもよい。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどのこの懸濁液の粘度を高める物質を含んでもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は適切な油性注射懸濁液として調製されることが出来る。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、ゴマ油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームなどの油脂を含む。選択的に、前記懸濁液はまた好適な安定剤または高濃度溶液の調製物になるよう前記化合物の溶解度を上げる薬剤を含んでもよい。本発明の組成物はまた、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの高分子化合物の微粒子製剤中、またはリポソームまたはミセル中に組み込む、または安定性を高めるためリポソームまたはミセルと混合することも出来る。このような組成物は、本発明の医薬組成物成分の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ  における放出速度およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける排出速度に影響を及ぼす。例となる医薬組成物および担体は、例えば、"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"  ｂｙ  Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．）および"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ"  ｂｙ  Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ  （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  &  Ｗｉｌｋｉｎｓ）に提供されており、これらは引用することにより、本明細書に含まれる。本発明の医薬組成物は、例えば、液体状、凍結状、または粉末乾燥状（例えば、凍結乾燥）として調製されることが出来る。ある実施形態では、この調製物が凍結乾燥形態で保存されるとき、投与前に適当な再懸濁液によって視覚的に透明な溶液で溶解されることが、可能である。
【００４０】
ここで記載される組成物は医薬製剤として患者に投与される。ここで使用される、「患者」または「対象」という用語はヒトまたは動物である対象を意味する。本発明の組成物は、医師の指示の下、治療のために使用されることが出来る。
【００４１】
本発明の組成物は利便性のため、あらゆる担体、特に薬学的に許容される担体と共に投与されるよう調製されてもよい。ただし標準的に用いられる担体が、投与される薬剤と不適合である場合、前記医薬組成物中での使用は再考される。例えば、この活性剤は無菌の液体、水、水溶液、緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールおよび同様のもの）、ジメチル・スルホキシド（ＤＭＳＯ）、油、界面活性剤、懸濁化剤、またはこれらの好適な混合物などの許容される溶媒と共に調製されてもよい。選択された溶媒中で活性剤の濃度は様々であり、この溶媒はこの医薬製剤の望まれる投与経路によって選択されることが可能である。ただし標準的に用いられる溶媒または薬剤が、投与される活性剤と不適合であるとき、この医薬製剤におけるその使用は再考される。
【００４２】
本発明に従う組成物を特定の患者に投与するときの適切な用量および用法は、前記患者の年齢、性別、体重、全身の健康状態、および前記活性剤が投与される特定の症状および重症度（例えば、出血の重症度）に応じて、医師によって決定されることが可能である。当該医師はまた投与経路、薬学的担体、および特定の薬剤の生体活性を鑑みることも可能である。
【００４３】
適切な医薬製剤の選択もまた選ばれる投与形態にもよって変わる。例えば、本発明の組成物は、直接求められる部位に投与されてもよい。この場合、医薬製剤は注射部位に適切な溶媒中に分散された本発明の活性剤を有する。本発明の組成物はどのような方法で投与されてもよい。例えば、前記組成物は、限定されないが、静脈内投与されることが出来る。注射用の医薬製剤は当該技術分野で知られている。注射が前記組成物の投与方法として選択された場合、生物学的影響を与えるよう、十分な量のこの分子が標的細胞に達することを確実にする工程を踏まなければならない。
【００４４】
本発明の医薬製剤は投与の利便性および用量の均一性のため用量単位形態で調製されることが可能である。ここで使用されるように、用量単位形態とは、治療中の患者に適切な、物理的に個別の医薬製剤の単位を、意味する。各用量は求められる効果を生じるように計算された量の活性剤と共に、選択された医薬担体を含まなければならない。適当な用量単位を決定する手順は当業者に周知である。用量単位は、当該患者の体重に比例して増減させてもよい。特定の病状の緩和のために適当な濃度は、当該分野で周知である用量濃度曲線の計算によって決定されてもよい。
【００４５】
本発明によれば、前記組成物を投与するための適切な用量単位は、この分子の毒性を動物モデル細胞によって評価することにより決定してもよい。医薬製剤中で様々な濃度の活性剤をマウスまたは他の動物モデルに投与し、そして治療の結果として観察された有益な結果および副作用に基づき最小および最大用量を決定してもよい。好適な用量単位は、他の標準薬との組み合わせによる治療の効果を分析することにより決定してもよい。本発明の組成物の用量単位は検出した効果に従って、個別に、または、各治療と組み合わせによって決定されることが出来る。
【００４６】
ＦＸａタンパク質またはその変異体の投与がここで説明されるが、ＦＸａ（またはＦＸ）またはその変異体をコードする核酸が用いられてもよい。本発明のある実施形態では、血液凝固を調節するため核酸送達ビヒクル（例えば、発現ベクタ−）が提供され、この核酸送達ビヒクルはＦＸａまたはその変異体をコードする核酸配列を、有する。ＦＸａをコードする発現ベクターを患者に投与することは、前記凝固カスケードを変化させるＦＸａポリペプチド、またはその変異体の発現に繋がる。本発明に従って、ＦＸａまたはその変異体をコードする核酸配列は、その発現が凝固形成を増加させる、ここで説明されるような変異体ポリペプチドをコードしてもよい。前記タンパク質の投与と同様に、ＦＸａまたはその変異体の核酸配列を有する発現ベクターは、それのみで、または止血を調節するために有用な他の分子と共に投与されてもよい。本発明によれば、前記発現ベクターまたは治療薬剤を組み合わせたものはそれのみで、または薬学的に許容されるまたは生物学的に適合する組成物中において投与されることが可能である。
【００４７】
ある実施形態では、ＦＸａまたはその変異体をコードする核酸配列を有する発現ベクターは、ウイルスベクターである。本発明で使われることが出来るウイルスベクターは、これらに限らないが、アデノウイルスベクター（組織特異的プロモーター／エンハンサーを有するまたは有しないもの）、種々の血清型（例えば、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−７、およびＡＡＶ−８）を有するアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）ベクター、およびハイブリッドＡＡＶベクター、レンチウイルスベクターおよび偽型レンチウイルスベクター［例えば、エボラウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）、およびネコ免疫不全ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ：ＦＩＶ）］、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターを含む。
【００４８】
ある実施形態では、変異体またはその機能的断片をコードする核酸配列を有するウイルスベクターを投与する方法が、提供される。本発明の方法において使用されるアデノウイルスベクターは、好ましくは少なくともアデノウイルスベクターＤＮＡに不可欠な部分を有する。ここに記載されるように、このような変異体アデノウイルスベクター投与後の変異体ポリペプチドの発現は止血を調節し、特に前記プロテアーゼの凝血促進活性を加速させる。組み換えアデノウイルスベクターは遺伝子治療の応用への幅広い有用性が認められている。このような使用に対するその有用性は、様々な臓器に関して高効率のｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入が起こることに大きく依存している。
【００４９】
本発明のベクターは医薬組成物中に組み込まれて対象に送達され、生体活性型タンパク質（例えば、変異体ポリペプチドまたはそれらの機能的断片または誘導体）の産生を可能にする。本発明のある実施形態では、治療を受ける者が治療的に有効な量の変異体ポリペプチドを産生することを可能にするのに十分な遺伝物質を有する医薬組成物は、当該対象において止血に影響を与えることが出来る。または、上述のように、有効量の変異体ポリペプチドがそれを必要とする患者に直接注入されてもよい。前記組成物はそれのみで、または、安定性の組成物など、少なくとも一つの他の薬剤と共に、これらに限らないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、および水を含む無菌の生体適合性の薬学的担体中で投与されることも出来る。前記組成物は患者にそれのみで、または止血に影響を与える別の薬剤（例えば、捕因子）と共に投与されることも出来る。
【００５０】
定義
本発明の生物学的分子に関する様々な用語がここおよび、また本明細書および特許請求の範囲にわたり用いられる。
【００５１】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそうでない限り、複数形の指示対象も含むものである。
【００５２】
「止血関連疾患」という用語は、これらに限らないが、血友病Ａ、血友病Ｂ、抑制抗体を有する血友病ＡおよびＢ患者、少なくとも一つの凝固因子（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩ因子、第ＩＩ因子、および／またはフォン・ウィルブランド因子）の欠乏症、ＦＶ／ＦＶＩＩＩ重複欠乏症、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠乏症、ガンマ−カルボキシラーゼ欠乏症などの出血疾患；外傷、損傷、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝血障害（凝固能低下）、播種性血管内凝固症候群（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ：ＤＩＣ）などの出血性疾患；ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、ワルファリン、低分子抗血栓剤（例えば、直接ＦＸａ阻害剤）に関連する過剰な抗凝固；およびベルナール・スーリエ症候群、グランツマンの血小板無力症、および貯蔵プール欠乏症などの血小板障害、を意味する。
【００５３】
本発明の核酸に関連して、ここで「単離された核酸」という用語が時折用いられる。この用語は、ＤＮＡに用いられるとき、それが由来する生物において自然に起こるゲノム中ではそれが直接隣接（５’および３’方向で）している配列から分離されたＤＮＡ分子を意味する。例えば、この「単離された核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクター中に挿入された、または原核生物または真核生物ＤＮＡ中に導入された、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子を有する。
【００５４】
本発明のＲＮＡ分子に関して、「単離された核酸」という用語は主に上で定義された単離されたＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を指す。または、この用語は自然にある状態（つまり、細胞または組織内）のＲＮＡ分子から十分に分離され、よって「実質的に純粋な」形態で存在する、ＲＮＡ分子を意味する。
【００５５】
タンパク質に関しては、ここで「分離されたタンパク質」という用語が時折用いられる。この用語は本発明の単離された核酸分子の発現によって産生されたタンパク質を意味する。または、この用語は自然にある状態（例えば、「実質上純粋な」形態で存在するように）の他のタンパク質から十分に分離されたタンパク質を意味する。
【００５６】
「ベクター」という用語はそれが複製される宿主細胞への導入のために核酸配列を挿入されることが出来るキャリア核酸分子（例、ＤＮＡ）を意味する。「発現ベクター」とは宿主細胞内での発言に必要な制御領域に、作動可能に結合された遺伝子または核酸配列を含む、特殊化されたベクターである。
【００５７】
「作動可能に結合された」という用語はＤＮＡ分子中のコード配列の発現に影響を与えるよう、コード配列から適当な位置にコード配列の発現に必要な制御配列が置かれることを意味する。この同じ定義は時折、発現ベクター内のコード配列および転写制御因子（例、プロモーター、エンハンサー、および終結因子）の配置にも使用される。この定義はまた時折、ハイブリッド核酸分子作製時の一つ目の核酸配列および二つ目の核酸配列の配置にも使用される。
【００５８】
「実質的に純粋な」という用語は対象化合物（例、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）の重量が少なくとも５０〜６０％、特に対象化合物の重量が少なくとも９０〜９９％またはそれ以上を有する調製物を意味する。純度は対象化合物に適当な方法（例、クロマトグラフィー法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析、および同様のもの）によって、計測されることが出来る。
【００５９】
「薬学的に許容される」は動物、より具体的にはヒトにおける使用について、連邦の規制機関若しくは州政府による承認を指すか、または米国薬局方または他の一般に認識される薬局方に掲載されることを指す。
【００６０】
「担体」は、本発明の活性剤と共に投与される、例えば希釈剤、アジュバント、保存料（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、二亜硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、乳化剤、バッファー（例えば、トリス塩酸、酢酸塩、リン酸塩）、抗菌剤、増量物質（例えば，ラクトース、マンニトール）、賦形剤、助剤（ａｕｘｉｌｉａｒｙ  ａｇｅｎｔ）、ビヒクルを意味する。薬学的に許容される担体は水、または石油、動物、植物または合成由来を含む油であってもよい。水または生理食塩水溶液およびブドウ糖およびグリセロール溶液は、とりわけ注射用溶液の担体として用いられることが好ましいとされる。好適な医薬担体は"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"  ｂｙ  Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ）；  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ａ．  Ｒ．，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ）；  Ｌｉｂｅｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．；  ａｎｄ  Ｋｉｂｂｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎに記載されている。
【００６１】
ここで用いられる「治療」という用語は、疾患に苦しむ患者に、その患者の症状の改善（例えば、一またはそれ以上の症状）、その症状の進行を遅らせることなどを含む、利益を与えるあらゆる種類の治療を指す。
【００６２】
ここで用いられるように、「予防」という用語は、発症の危険がある（例えば、出血、特に異常出血（例、過剰に抗凝固剤を与えられる））対象において、前記対象が発症する確率の低下に繋がる、予防的治療を意味する。
【００６３】
化合物または医薬組成物の「治療的に有効な量」は特定の疾患や障害および／またはそれらの症状の、予防、阻害、または治療に有効な量を意味する。例えば、「治療的に有効な量」は対象において出血を止めるために十分な量を指す。
【００６４】
ここで用いられるように、「対象」という用語は動物、特に哺乳類、特にヒトを意味する。
【００６５】
以下の実施例は本発明の様々な実施形態を説明するため提供されるものである。これらは例示であってどのような形でも本発明を限定する意図のものではない。
【実施例１】
【００６６】
正常ヒト乏血小板血漿（ｐｌａｐｌａｔｅｌｅｔ  ｐｏｏｒ  ｐｌａｓｍａ：ＰＰＰ）  中における治療用血漿濃度であるリバーロキサバンおよびアピキサバンは、トロンビン生成試験（ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ：ＴＧＡ）においてトロンビン生成を顕著に減少させる（図１Ａ）。ＴＧＡは９６ウェル形式の試験であり、組織因子／リン脂質の開始剤を使用し、蛍光発生トロンビン基質によってトロンビンの生成を測定する。これらの阻害剤濃度の１％以下の濃度でＦＸａＩ［１６］Ｌを添加すると、トロンビン生成はほぼ完全に回復した（図１Ｂ）。
【００６７】
これらの結果が全血でも再現されるかを確かめるため、全血凝固線溶分析装置（ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ：ＲＯＴＥＭ）実験をアピキサバンおよびＦＸａＩ［１６］Ｌを使用して行った。ＲＯＴＥＭでは、回転するピンを全血を含むカップ中に沈める。凝固開始剤を添加してこの血液が凝固するにつれて前記ピンの回転が制限され、それが装置によって光学的に測定される。これらの実験では、クエン酸全血中に２５０ｎＭのアピキサバンを、ＰＢＳまたは増加していく濃度のＦＸａＩ［１６］Ｌと共に添加した。図２に示されるように、アピキサバンは未処理のコントロール血液と比較して凝血時間を延ばしたが、ＦＸａＩ［１６］Ｌの添加によって凝血時間は完全に元に戻された。
【００６８】
ＦＸａ半減期が直接ＦＸａ阻害剤の存在によって延びるかを確かめるため、半減期実験を、ＦＸａＩ［１６］ＬまたはＷＴのＦＸａを５００ｎＭリバーロキサバンを含む血漿中で事前放置し、ＴＧＡ反応を開始することによって、行った。限られた1時間のみの経時変化であるため、この実験から正確な半減期は決定出来ないが、図３は明らかに、ＦＸａＩ［１６］ＬとＷＴのＦＸａの両方の半減期が１時間以上であり、これまでに測定された半減期と比べて大幅に長く（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＦＸａＩ［１６］Ｌが>３０分、ＷＴであるＦＸａで１〜２分）なっていることを表している。
【００６９】
さらに、リバーロキサバンがＦＸａの阻害を止めることを示すために、血漿中における  ＦＸａ−アンチトロンビンＩＩＩ（ＦＸａ−ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＩＩＩ：ＦＸａ−ＡＴＩＩＩ）レベルを測定した。図５に示すように、５分以内に、ＦＸ欠損血漿に添加されたほぼ全ての２５ｎＭＷＴのＦＸａが不可逆的なＦＸａ−ＡＴＩＩＩ抑制複合体に組み込まれていた。リバーロキサバンは用量依存的にこの工程を阻害し、１μＭのリバーロキサバン存在下では、９０分後においてＡＴＩＩＩにより添加された約半分のＦＸａのみが不活性化された。よって、図５はリバーロキサバンがＦＸａ−ＡＴＩＩＩ複合体の形成を阻害することを明らかに表している。
【００７０】
ここで述べられるように、ＦＶａへの結合がチモーゲン様ＦＸａ変異体の活性を正常にし、その結果、これらは血友病におけるｉｎ  ｖｉｖｏの非常に効果的な凝血促進剤となる。よって、これらの変異体はまた直接ＦＸａ阻害剤の効果を無効にすることが出来る、効率的な凝血促進剤でもある。さらに、直接ＦＸａ阻害剤はＦＸａ活性部位に結合するため、前記変異体はＦＸａとＡＴＩＩＩおよびＴＦＰＩとの結合に競合し、そしてこれらの半減期を延長する。リバーロキサバンは正常ヒト血漿に添加されたとき、ＴＧＡにおいて用量依存的にトロンビン生成を阻害した。特に、期待される治療用定常状態の血漿濃度である５００ｎＭのリバーロキサバンは、最大トロンビン生成を正常の〜１０％まで減少させ、そして３ｎＭの前記ＦＸａチモーゲン様変異体であるＦＸａＩ１６Ｌは最大トロンビン生成を正常の１０５％まで回復させた。より高い濃度のリバーロキサバン（２．５μＭ）はこの試験においてトロンビン生成を完全になくしたが、１０ｎＭのＦＸａＩ１６Ｌはトロンビン生成を、これらの条件下で正常の７２％まで回復させた。これらのデータを、他の提案されている回復方法と比較した。前記阻害剤を捕捉することにより、リバーロキサバンの効果を無効にすることが示されている、Ｇｌａドメインを持たない、触媒能のないＦＸａ（ＧＤ−ＦＸａＳ１９５Ａ）は、５００ｎＭリバーロキサバン存在下においてトロンビン生成を回復させたが、効果を示すのに高い濃度（１μＭ；>３００倍もＦＸａＩ１６Ｌより大きい）が必要であった。さらに、一定のｅｘ  ｖｉｖｏでの効果があることが示されている、活性型プロトロンビン複合体製剤（ＦＥＩＢＡ）は、この試験条件下でトロンビン生成を回復させなかった。
【００７１】
マウスにおける尾を留める止血の実験では、リバーロキサバンは用量依存的に失血を増加させ、５０ｍｇ／ｋｇのリバーロキサバンは正常の失血の２１７％を起こした。ＦＸａＩ１６Ｌ（２００ｍｇ／ｋｇ）の添加は、リバーロキサバンによって促進された失血を正常の１４１％まで減少させた。ＦＸａ半減期へのリバーロキサバンの影響を確かめるため、ＦＸａＩ１６Ｌまたはｗｔ−ＦＸａを、正常ヒト血漿中で事前にリバーロキサバンとまたはそれのみで放置し、様々な放置時間を経てその後ＴＧＡ実験を行った。ｗｔ−ＦＸａまたはＦＸａＩ１６Ｌがリバーロキサバンを含まない血漿中で事前放置されたとき、これらの半減期は、それぞれ４．６分および１．３７時間であった。驚くべきことに、ｗｔ−ＦＸａまたはＦＸａＩ１６Ｌを５００ｎＭリバーロキサバンを含む血漿中で事前放置したとき、これらの半減期はそれぞれ９．４時間（１２３倍増加）と１８．１時間（１３．２倍増加）に延長された。これらの結果はチモーゲン様ＦＸａ変異体である、ＦＸａＩ１６Ｌがｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでリバーロキサバンの効果を無効させることを示している。さらに、効果を得るのに化学量論濃度が必要な捕捉剤またはＧＤ−ＦＸａＳ１９５Ａのような「真の」とは異なり、ＦＸａＩ１６Ｌは触媒量のタンパク質のみを必要とする迂回剤である。これは、より少量のＦＸａＩ１６Ｌがｉｎ  ｖｉｖｏで有効であるかもしれないことを示している。リバーロキサバンは、おそらくはＦＸａ結合でＡＴＩＩＩおよびＴＦＰＩと競合することにより、劇的に血漿中ＦＸａの半減期を延ばしていることも表された。これは半減期を延ばす直接ＦＸａ阻害剤から回復させる手法を表している。
【００７２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態を説明し具体的に上記に例示したが、本発明がこれらの実施形態に限定されることを意図したものではない。以下の特許請求の範囲に含まれるような、本発明の範囲および意図から外れることなく様々な修正がそれらに加えられることが出来るものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
0006629744.tif 000007
【図４Ｄ】
0006629744.tif 000008
【図５】
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【配列表】
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