(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ショウジョウバエ科に属しており、
点変異を含み、非致死成体表現型として顕在化するのに十分な組織特異的様式で翅組織内にて発現するヒトｋＲＡＳ導入遺伝子を含み、
前記非致死成体表現型は縮れた翅を含んでおり、
前記点変異はＧ１２変異を含む
ことを特徴とする変異体ハエ。
【請求項２】
前記点変異はＧ１２Ｖであることを特徴とする請求項１に記載の変異体ハエ。
【請求項３】
キイロショウジョウバエであることを特徴とする請求項２に記載の変異体ハエ。
【請求項４】
前記ヒトｋＲＡＳ導入遺伝子はＵＡＳ：ＧＡＬ４トランス活性化系に作動可能に連結していることを特徴とする請求項３に記載の変異体ハエ。
【請求項５】
変異型ＭＳ１０９６ハエであることを特徴とする請求項４に記載の変異体ハエ。
【請求項６】
細胞増殖性疾患に関する活性について化合物をスクリーニングする方法であって、
請求項１から５のいずれかに記載の変異体ハエに前記化合物を与えること、及び、前記化合物が前記変異体ハエに及ぼす効果を観察することを含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
前記化合物が与えられるときに、前記変異体ハエは幼若発達段階にあることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記変異体ハエが前記化合物の効果について観察されるときに、前記変異体ハエは成体発達段階にあることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
複数の化合物を複数の変異体ハエに、前記複数の化合物から単一タイプの化合物のみが各ハエに与えられることを確保するのに十分な様式で摂食させること、及び、前記化合物が前記複数の変異体ハエに及ぼす効果を観察することを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
後続の活性アッセイにて活性を有すると観察された化合物をさらに評価することをさらに含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＲＡＳ（ラット肉腫）タンパク質は、低分子量のＧＴＰ結合／ＧＴＰａｓｅのファミリーであり、細胞分化、増殖、及び生存の調節に関与する（Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇら、“Ｔｈｅ  ＲＡＳ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ａｔ  ａ  ｇｌａｎｃｅ”，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．（２００５）１１８：８４３−８４６、Ａｄｊｅｉ，“Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ＲＡＳ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｊ  Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．（２００１）９３：１０６２−１０７４）。ＲＡＳファミリーには、ｈＲＡＳ、ｎＲＡＳ、及びｋＲＡＳの３つの主なメンバーがある。全メンバーが癌の形成及び進行を促進する（Ｋａｒｎｏｕｂら、“ＲＡＳ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ：ｓｐｌｉｔ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｔｉｅｓ”，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００８）９：５１７−５３１）。
【０００２】
提唱される、ＲＡＳ系のシグナル伝達経路を図１に提示する。チロシンキナーゼの活性化によるシグナル伝達の開始は、種々の膜結合型増殖因子に関連することに留意されたい。実質的には、全てのこれらの増殖因子、例えば、ＥＧＦが腫瘍の増殖に重要である。
【０００３】
ＲＡＳにおける変異がヒト癌のおおよそ３０％で見出される。主な変異点を記したヒトｋＲＡＳの配列を図２に提示する。ＲＡＳ変異が存在しない場合、ヒト腫瘍において増加したＲＡＳ活性が遺伝子増幅または上流の活性化の増加をもたらすと示されている（Ｆｒｉｄａｙら、“Ｋ−ＲＡＳ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２００５）１７５６：１２７−１４４）。残基Ｇ１２（Ｇ１２Ｖ）及びＧ１３（Ｇ１３Ｄ）に影響するＲＡＳ遺伝子の単一点変異は、立体障害を通してＧＡＰ誘導性ＧＴＰ加水分解を無効にし、一方でＱ６１Ｌ変異はＧＴＰ加水分解に必要な水分子の配座を妨害する（Ｐｙｌａｙｅｖａ−Ｇｕｐｔａら、“ＲＡＳ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ：Ｗｅａｖｉｎｇ  ａ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｗｅｂ”，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．，Ｃａｎｃｅｒ（２０１１）１１：７６１−７７４）。これらの変異は、タンパク質を構成的に活性にし、活性ＧＴＰ結合ＲＡＳの持続がその下流エフェクター経路の恒常的活性化をもたらす。
【０００４】
ｋＲＡＳは最も頻度高く変異するＲＡＳアイソフォームであり、癌で変異が非常によく見られるタンパク質の１つである。例えば、ｋＲＡＳは、膵腺癌の９０％、大腸癌の４５％及び肺腺癌の３５％において変異する（Ｄｏｗｎｗａｒｄ，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＲＡＳ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ（２００３）３：１１−２２）。ｋＲＡＳ変異は、腫瘍形成能の増大及び予後不良に関連する。加えて、活性化したＲＡＳの阻害は、インビトロ及びインビボの両方において、悪性細胞を非悪性表現型に戻し、腫瘍退縮を伴う（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｍｙｃ  ａｎｄ  ｍｕｔａｎｔ  ｋＲＡＳ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００８）１０５：５２４２−５２４７、Ｃｈｉｎら、“Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ＲＡＳ  ｉｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ”，Ｎａｔｕｒｅ  １９９９；４００：４６８−４７２）。
【０００５】
癌の発生及び進行にｋＲＡＳを含むＲＡＳタンパクがしばしば関与するために、ｋＲＡＳは種々の癌のための魅力的な治療標的である。発癌性ＲＡＳシグナル伝達の有効な阻害は、いまだに癌研究の「はるか遠い目標（Ｈｏｌｙ  Ｇｒａｉｌ）」と考えられている（Ｓｐｉｅｇｅｌら、“Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．（２０１４）１０：６１３−２２）。構成的に活性なｋＲＡＳタンパク質の低分子阻害剤の開発が癌療法として理想であるだろうが、変異型ｋＲＡＳのＧＴＰ結合ポケットを標的する薬物の研究に２５年の歳月が費やされているが有効な分子はまだ得られていない（Ｖａｓａｎら、“Ａ  ＲＡＳ  Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ：Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｋＲＡＳ−Ｍｕｔａｔｅｄ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ”，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２０１４）２０：３９２１−３９３０）。今日まで、変異型ｋＲＡＳを特異的に標的する有効な治療法はない。ＧＤＰまたはＧＴＰの役割がＲＡＳタンパク質の不活性または活性状態を安定化させるものであるために、ｋＲＡＳの構成的に活性な分子スイッチを標的することは非常に困難である（Ｇｙｓｉｎら、“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＲＡＳ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｇｅｎｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ（２０１１）２：３５９−３７２）。この状況は、ＡＴＰから基質へのホスホリル転位が迅速な触媒プロセスであるタンパク質キナーゼと異なる。加えて、ｋＲＡＳとＧＴＰ間のｐＭ親和性、並びに細胞内のＧＴＰのマイクロモル濃度のために、競合阻害剤は見出されそうにない。さらには、ｋＲＡＳの活性化及びシグナル伝達は、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、及び種々のｋＲＡＳエフェクタータンパク質とのタンパク質間相互作用（ＰＰＩ）を通して達成される（Ｓｕｎら、“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  Ｋ−ＲＡＳ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ＳＯＳ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２０１２）５１：６１４０−６１４３）。ＰＰＩは、伴われる表面の特徴がないトポロジーのために標的することが難解である（Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ：ｍｉｍｉｃｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｒｆａｃｅｓ”，Ｊ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（２００６）３：２１５−２３３）。ｋＲＡＳ系の複雑さを考慮すると、種々の直接的な（実質的に全て間接的であっても）アプローチを使用した、異常なｋＲＡＳシグナル伝達を標的する試みが失敗に終わっていることも納得できる。
【０００６】
ＲＡＳタンパク質の翻訳後、これらは図３に示す一連の翻訳後修飾を必ず受ける（Ｇｈｏｂｒｉａｌら、“Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＡＳ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ”，Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．（２００２）１６：１０６５−１０８８、Ａｄｊｅｉ，“ＦａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅＲＡＳｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄｉｆ．（２００１）１９：１４９−１６４、Ｃｈｏら、“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＡＳ  ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅＲＡＳｅ”，Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（２００２）２５：７５９−７６９）。最初に、ｋＲＡＳ内の末端システインのチオール基がファルネシルトランスフェラーゼ（ＦＴａｓｅ）によりファルネシル化される（Ｃａｓｅｙら、“ｐ２１ＲＡＳ  ｉｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ａ  ｆａｒｎｅｓｙｌ  ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８９）８６：８３２３−８３２７、Ｃｏｘら、“ＦａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅＲＡＳｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉｍｐｌｙ  ＲＡＳ？”，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９７）１３３３：Ｆ５１−Ｆ７１、Ｈａｎｃｏｃｋら、“Ａｌｌ  ＲＡＳ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｒｅ  ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｙｌａｔｅｄ  ｂｕｔ  ｏｎｌｙ  ｓｏｍｅ  ａｒｅ  ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｅｄ”  Ｃｅｌｌ（１９８９）５７，１１６７−１１７７、Ｈａｎｃｏｃｋら、“Ａ  ｐｏｌｙｂａｓｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｒ  ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｉｎ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＣＡＡＸ  ｍｏｔｉｆ  ｔｏ  ｌｏｃａｌｉｚｅ  ｐ２１ＲＡＳ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ”，Ｃｅｌｌ（１９９０）６３：１３３−１３９）。次に、ＣＡＡＸ（Ｃ＝システイン；Ａ＝イソロイシン；Ｘ＝セリンまたはメチオニン）（Ｂｏｙａｒｔｃｈｕｋら、“Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＡＳ  ａｎｄ  ａ−ｆａｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７５：１７９６−１８００、Ｏｔｔｏら、“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｅｎｙｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４：８３７９−８３８２．）プロテアーゼＲＡＳ変換酵素１（ＲＣＥ１）が末端ＡＡＸアミノ酸を切断し、システインのカルボキシ基がイソプレニルシステインカルボキシルメチルトランスフェラーゼＩ（ＩＣＭＴ  Ｉ）によりメチル化される（Ｃｌａｒｋｅら、“Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈａ−ＲＡＳ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｔｈｉｒｄ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅＲＡＳｅｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．���．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５：４６４３−４６４７、Ｈｒｙｃｙｎａら、“Ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＴＥ１４  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅＲＡＳｅ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ−ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ＲＡＳ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９１）１０：１６９９−１７０９、Ｄａｉら、“Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｅｎｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅＲＡＳｅ  ｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３：１５０３０−１５０３４）。最後に、パルミトイル転移酵素（ＰＴａｓｅ）が、パルミトイル部分をｈＲＡＳ、ｎＲＡＳ及びｋＲＡＳのＣ末端の直ぐ上流に位置するシステイン残基に転移する。次いでＲＡＳタンパク質が、そのファルネシル基及びパルミトイル基ならびに正電荷Ｃ末端リジン残基を介して細胞膜と安定した相互作用を形成する。
【０００７】
ｋＲＡＳの翻訳後、下流修飾は、いくつかの可能性のある薬物標的を提供する：ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴａｓｅ）（Ａｐｐｅｌｓら、“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆａｒｎｅｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅＲＡＳｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ”，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ（２００５）１０：５６５−５７８）、ＣＡＡＸエンドペプチダーゼ（Ｗｒｉｇｈｔら、“Ｔｈｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ｓｅｒｉｅｓ：ｌｉｐｉｄ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．ＣＡＡＸ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＲＡＳ”，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．（２００６）４７：８８３−８９１、Ｍａｎａｎｄｈａｒら、“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣａａＸ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ｙｅａｓｔ  ＲＡＳ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ”，Ｙｅａｓｔ（２０１０）２７：３２７−３４３）、Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｗｉｎｔｅｒ−Ｖａｎｎら、“Ａ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｉｓｏｐｒｅｎｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅＲＡＳｅ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００５）１０２：４３３６−４３４１）、またはパルミトイル転移酵素。ＦＴａｓｅ阻害剤は、ｋＲＡＳ活性のモジュレータとして最も広範に研究されている。ＦＴａｓｅ阻害剤（Ｓｅｂｔｉら、“Ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｉ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｂｅｎｃｈ−ｔｏ−ｂｅｄｓｉｄｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ”，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０００）９：６５８４−６５９３、Ｃｏｘら、“Ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｐｒｏｍｉｓｅｓ  ａｎｄ  ｒｅａｌｉｔｉｅｓ”，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００２）２：３８８−３９３）は、２つに分類される：ＦＴＩ−２７６（Ｓｕｎら、“Ｂｏｔｈ  ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｉ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  Ｋ−Ｒａｓ  ｐｒｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｅａｃｈ  ａｌｏｎｅ  ｉｓ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｏｕｓｅ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ”，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９８）１６：１４６７−１４７３）、ＦＴＩ−２７７（Ｌｅｒｎｅｒら、“Ｒａｓ  ＣＡＡＸ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ＦＴＩ−２７７  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｂｌｏｃｋｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  Ｒａｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｒａｓ−Ｒａｆ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：２６８０２−２６８０６）、Ｌ−７４４８３２（Ｓｏｎｇら、“Ｋ−Ｒａｓ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｒｎｅｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｌ−７４４，８３２  ｏｎ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１／Ｃｄｃ２  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｇ２／Ｍ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ”，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ（２０００）２：２６１−２７２）、Ｂ９５６（Ｎａｇａｓｕら、“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｆａｒｎｅｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｂ９５６”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９５）５５，５３１０−５３１４）、及びＦＴＩ−２１５３（Ｃｒｅｓｐｏら、“Ｔｈｅ  ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＦＴＩ−２１５３，ｂｌｏｃｋｓ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃａｕｓｅｓ  ｐｒｏｍｅｔａｐｈａｓｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｉｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６：１６１６１−１６１６７）を含むＣＡＡＸペプチド模倣薬、及びチピファルニブ（ｔｉｐｉｆａｒｎｉｂ）（Ｂｅａｕｐｒｅら、“Ｒ１１５７７７  ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｒａｓ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ．”，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．（２００４）３：１７９−１８６）、ロナファルニブ（Ｗａｎｇら、“Ｔｈｅ  ｆａｒｎｅｓｙｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｌｏｎａｆａｒｎｉｂ（ＳＣＨ６６３３６）ｉｓ  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １  ａｎｄ  ２”，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２００３）４９：３０３−３０８）、及びＢＭＳ−２１４６６２（Ｒｏｓｅら、“Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ  ＢＭＳ−２１４６６２．；ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００１）６１，７５０７−７５１７）を含む非ペプチド模倣薬。多数の最近の刊行物がそれらの前臨床有効性を説明している（Ｈａｌｕｓｋａら、“Ｆａｒｎｅｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｓ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２００２）３８，１６８５−１７００、Ｓｅｂｔｉ，“Ｂｌｏｃｋｅｄ  ｐａｔｈｗａｙｓ：ＦＴＩｓ  ｓｈｕｔ  ｄｏｗｎ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｓｉｇｎａｌｓ”，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ（２００３）８（Ｓｕｐｐｌ．３）：３０−３８）。しかしながら、これらの薬剤はどれも市場への承認��向けて前進しているようには見えない。
【０００８】
ｋＲＡＳ阻害のための上流標的としては、チロシンキナーゼ（Ｓａｗｙｅｒｓ．，“Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｋｉｎａｓｅｓ  ａｓ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ”，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．（２００２）１２：１１１−１１５）、ＧＲＢ２／ＧＥＦ相互作用（Ｑｕｉｌｌｉａｍら、“Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＣＤＣ２５  ａｎｄ  ＳＯＳ１  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＡＳ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９４）；９１：８５１２−８５１６．）、及びＧＥＦ（Ｓｈｉｅｌｄｓら、“Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ＲＡＳ：“ｉｔ  ａｉｎ’ｔ  ｏｖｅｒ  ’ｔｉｌ  ｉｔ’ｓ  ｏｖｅｒ”．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２０００）１０；１４７−１５４）が挙げられる。
【０００９】
不活性なＧＤＰ結合型及び活性なＧＴＰ結合型間のＲＡＳタンパク質サイクルにあって、この活性化状態はＧＥＦ及びＧＡＰによって調節される（図３）（Ｒｅｕｔｈｅｒら、“Ｔｈｅ  ＲＡＳ  ｂｒａｎｃｈ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ＧＴＰａｓｅｓ：ＲＡＳ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｄｏｎ’ｔ  ｆａｌｌ  ｆａｒ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｒｅｅ”，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２０００）１２：１５７−１６５、Ｔａｋａｉら、“Ｓｍａｌｌ  ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００１）８１：１５３−２０８、Ｃｕｌｌｅｎら、“Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｄ  ＲＡＳ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ”，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００２）；３：３３９−３４８、Ｈｅｌｄｉｎ，“Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｃｅｌｌ（１９９５）８０：２１３−２２３、Ｌｅｍｍｏｎら、“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｂｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（１９９４）１９：４５９−４６３、Ｗｅｉｓｓら、“Ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ＲＴＫ  ｓｉｇｎａｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．（１９９７）７：８０−８６）。増殖因子がチロシンキナーゼ受容体に結合すると、それは自己リン酸化を受ける活性ホモ二量体を形成する。これはアダプタータンパク質ＳＨＣと増殖因子受容体結合２（ＧＲＢ２）との結合をもたらす。次いで、ＧＲＢ２はそのＳＨ３ドメインを通してＧＥＦと会合する。ＧＥＦは、結合ＧＤＰをＧＴＰに交換し、それによりＲＡＳタンパク質を活性化してシグナル伝達カスケードを開始する。シグナル伝達を終了するために、ＧＡＰはＲＡＳタンパク質の内在性ＧＴＰａｓｅ活性を刺激し、ＧＤＰへのＧＴＰの加水分解を引き起こし、ＲＡＳタンパク質の不活性化をもたらす。
【００１０】
ＲＡＳ／ＧＥＦなどのタンパク質間相互作用は調節が難しい点で有名であるが、いくつかのＲＡＳ−ＧＥＦが同定されている。研究努力の大半がｋＲＡＳと特定のＧＥＦ、つまりセブンレスの息子（ＳＯＳ）との相互作用に焦点を当てている。ｋＲＡＳ／ＳＯＳ接面に近接するポケットは、低分子結合を受けることができ（Ｍａｕｒｅｒら、“Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅｌｉｇａｎｄｓ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐｏｃｋｅｔ  ｉｎ  ＲＡＳ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ＳＯＳ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２０１２）１０９：５２９９−５３０４）、ＮＭＲベースの断片スクリーニングによりｋＲＡＳ／ＳＯＳ相互作用面に近接するポケットに結合する低分子が最近同定され、その後ｋＲＡＳ／ＳＯＳ相互作用は妨害された。しかしながら、この手法からの薬物候補はまだ報告されていない。
【００１１】
ｋＲＡＳは、多くの下流エフェクタータンパク質と相互作用して細胞生存及び増殖を変えることができる（図４）（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，“Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ”，Ｃｅｌｌ（２０００）１０３：２１１−２２５、Ｒｅｐａｓｋｙら、“Ｒｅｎｅｗｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｐｉｒａｃｙ  ｔｈｅｏｒｙ  ｄｅｂａｔｅ：ｄｏｅｓ  Ｒａｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｌｏｎｅ  ｔｏ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＡＳ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ？”，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００４）１４：６３９−６４７）。主なものには、ＲＡＦタンパク質キナーゼ、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＲＡＳ関連タンパク質Ｒａｌのグアニンヌクレオチド交換因子（ＲａｌＧＤＳ）、及びホスホリパーゼＣε（ＰＬＣε）を含む。ＲＡＦは、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼカスケードを開始し、これは細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）を活性化する。この活性キナーゼは多くの標的を有し、それには細胞周期進行遺伝子の発現を調節する転写因子ＥＬＫ１が含まれる（Ｌｅｅｖｅｒｓら、“Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ＲＡＳ  ｉｎ  Ｒａｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｒａｆ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ”，Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３６９：４１１−４１４、Ｍａｒａｉｓら、“ＲＡＳ  ｒｅｃｒｕｉｔｓ  Ｒａｆ−１  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ”，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９５）１４：３１３６−３１４５、Ｆｉｎｎｅｙら、“ＲＡＳ−Ｒａｆ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｏｒｍｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９５）２５５，３１０−３２３、Ｊｏｈｎｓｏｎら、“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｅｙ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａ−Ｒａｆ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００５）４４：３４３２−３４４０、Ｇｈｏｓｈら、“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｒａｆ−１  ｋｉｎａｓｅ：ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ｔａｉｌ  ａｎｄ  ｔｒｕｎｋ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｅｍｂｒｙｏｓ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００３）２７８：４５６９０−４５６９６）。ＰＩ３Ｋ経路は、ＡＫＴを活性化し、生存促進性遺伝子の転写、細胞骨格の再構成、及び多くの転写因子（中でも注目すべきはＮＦ−κＢ）の経路活性化をもたらす（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｖｉｃｉａｎａら、“Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−３−ＯＨ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓ  ａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ＲＡＳ”，Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７０：５２７−５３２、���ａｃｏｌｄら、“Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＡＳ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３−ｋｉｎａｓｅ  γ”，Ｃｅｌｌ（２０００）１０３：９３１−９４３）。ＲＡＬ１結合タンパク質の活性化は、ＦＯＸ転写因子の阻害をもたらし（Ｄｅ  Ｒｕｉｔｅｒら、“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＡＦＸ  ｂｙ  Ｒａｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｓ  ４４７  ａｎｄ  ４５１”，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２００１）２１：８２２５−８２３５）、それは細胞成長、増殖、及び分化に関与する。ＲａｌＧＤＳも、ＪＮＫ経路を通してシグナル伝達して生存促進性遺伝子及び細胞周期進行遺伝子の転写を刺激することができる（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇａｒｃiａら、“ＲａｌＧＤＳ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ（２００５）７，２１９−２２６、Ｈｏｆｅｒら、“Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＲＡＳ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｒａｌ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９４）９１：１１０８９−１１０９３）。ＰＬＣεの活性化は、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化及び細胞内ストアからのカルシウムの動員を生じる。
【００１２】
ｋＲＡＳのこれらの下流エフェクターは、製薬業界で現在研究中のいくつかの非常に重要な癌標的を代表する。ｋＲＡＳのこれらの下流標的の重要性は、癌の発生及び散布におけるｋＲＡＳの重要性のさらなる証拠を提供する。
【００１３】
進行癌におけるｋＲＡＳの重要な役割に加えて、このＧＴＰａｓｅも、ＥＧＦ経路を阻害するものである抗がん剤の主要なクラスの有効性への影響において重大な役割を有する。前に述べたように、ｋＲＡＳは細胞の増殖、分化、及び生存を制御するＥＧＦＲ下流シグナル伝達カスケードにおける主要なエフェクター分子である。ｋＲＡＳは、ＥＧＦＲ受容体からＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ系などの主要なシグナル伝達系へと増殖シグナルを送る。変異型ｋＲＡＳは、ＥＧＦＲ系が、ＥＧＦ系に存在する自然制御を回避して増殖促進モードに連続的に保たれて作用することを可能にする（野生型ｋＲＡＳは自己不活性化するが、発癌性ｋＲＡＳは自己不活性化しない）。この機構と矛盾することなく、変異型ｋＲＡＳの存在により、大腸癌及び多くの他の癌を処置するために使用されるパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））またはセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））などの抗ＥＧＦモノクローナル抗体薬への応答の欠如が予測される。実際、大腸癌患者がこれらの一般的なＥＧＦＲ阻害剤の１つに応答し得るか否かを現在予測するための最も信頼できる方法は、ｋＲＡＳをコード化する遺伝子内の「活性化」変異について検査することである。この点について、Ｇ１２Ｖ変異は、Ｇ１３Ｄ変異よりも抗ＥＧＦ療法に対する応答の欠如の予測因子としてより顕著に現れる（Ｃｈｅｎら、“Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｋＲＡＳ  ｃｏｄｏｎ  １３  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２０１３）７１：２６５−７２、Ｍａｏ  Ｃら、“ｋＲＡＳ  ｐ．Ｇ１３Ｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｄｏｎ  １２  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｒｅ  ｎｏｔ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｅｑｕａｌ  ｉｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ｃａｎｃｅｒ．（２０１３）１１９：７１４−７２１）。
【００１４】
２００９年に、ＦＤＡは転移性大腸癌を処置するパニツムマブ及びセツキシマブについての薬剤添付文書を、ｋＲＡＳ変異を伴うこれらの薬剤の不活性についての情報を含むように更新した。それゆえ、これらの薬剤の不活性の原因であるｋＲＡＳの変異型を正常型に影響することなく標的する薬剤が、抗ＥＧＦ薬の活性を回復するはずである。
【発明の概要】
【００１５】
ＲＡＳ導入遺伝子を含む、非哺乳類トランスジェニック動物、例えば、ハエを提供する。新生物疾患などの細胞増殖性疾患に関して活性を有する化合物を同定するために主題のトランスジェニック非哺乳類動物を使用する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＲＡＳのシグナル伝達経路を示す。活性化した増殖因子受容体と会合したチロシンキナーゼは自己リン酸化を受け、アダプタータンパク質ＳＨＣ及びＧＲＢ２と相互作用する。これらのタンパク質は、ＧＤＰをＧＴＰに交換する種々のＧＥＦと会合し、それによりＲＡＳタンパク質を活性化する。ＧＡＰは、ＲＡＳタンパク質の内在性ＧＴＰａｓｅ活性を刺激し、ＧＤＰへのＧＴＰの加水分解を引き起こし、タンパク質の不活性化をもたらす。
【図２】変異の主な部位が記されたヒトｋＲＡＳの配列を示す。
【図３】ＲＡＳタンパク質の翻訳後処理を示す。ファルネシルトランスフェラーゼ（ＦＴａｓｅ）は、新しく合成されたＲＡＳタンパク質の末端システインへのファルネシル基の転移を触媒する。次に、３つのＣ末端アミノ酸がエンドペプチダーゼＲＡＳ変換酵素１（ＲＣＥ１）により切断される。末端システイン残基のカルボキシメチル化がイソプレニルシステインカルボキシルメチルトランスフェラーゼＩ（ＩＣＭＴ  Ｉ）によりなされる。最後に、パルミトイル転移酵素（ＰＴａｓｅ）が、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、及びｋＲＡＳ−４ＡアイソフォームのＣ末端システイン残基にパルミトイル基を転移させる。
【図４】ＲＡＳの下流シグナル伝達を示す。ＲＡＳは多数の下流エフェクターと相互作用する。主なものには、ＲＡＦタンパク質キナーゼ、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＲＡＳ関連タンパク質Ｒａｌのグアニンヌクレオチド交換因子（ＲａｌＧＤＳ）、及びホスホリパーゼＣε（ＰＬＣε）を含む。
【図５】本発明の実施形態に係る遺伝子改変されたハエを使用した薬物スクリーニングプロトコルを示す。
【図６】１２ＶヒトｋＲＡＳ遺伝子を示す。
【図７】Ｂｇｌ  ＩＩ及びＸｈｏ  Ｉ部位の位置を示すｐＵＡＳＴマップを示す。
【図８】対照（ＧＡＬ４のみ）ハエ、ｋＲＡＳ変異型（Ｇ１２Ｖ）ハエ及びＤＭＳＯ中に溶解したデルタラシン（ｄｅｌｔａｒａｓｉｎ）類似体を用いてｋＲＡＳ／ｋＲＡＳ×ＭＳ１０９６  ＧＡＬ４変異Ｆ１表現型から救われたハエを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ＲＡＳ導入遺伝子を含む、非哺乳類トランスジェニック動物、例えば、ハエを提供する。新生物疾患などの細胞増殖性疾患に関して活性を有する化合物を同定するために主題のトランスジェニック非哺乳類動物を使用する方法も提供する。
【００１８】
本発明をより詳細に記載する前に、本発明が、本明細書に記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、そのような実施形態は当然に変化し得ることを理解されたい。本明細書に使用される用語は、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定され得るために、単に特定の実施形態を説明することを目的とし、限定することを意図しないことも理解されたい。
【００１９】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値及び下限値の間の各介在値（別途文脈が明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１まで）、及びその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が本発明に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、表示範囲内の任意の具体的に除外された境界値に従って本発明内にも包含される。表示範囲がそれらの境界値のうちの一方または両方を含む場合、それらの包含される境界値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００２０】
ある範囲は、本明細書では「約」という用語によって先行される数値で提示される。「約」という用語は、本明細書においてそれが先行する正確な数、ならびにその用語が先行する数の付近にあるか、または近似する数の文字通りの支持を提供するために使用される。数が具体的に列挙される数の付近にあるかまたは近似するかを決定する際に、その付近にあるか、または近似する列挙されていない数は、それが提示される文脈において、具体的に列挙される数の実質的な等価を提供する数であり得る。
【００２１】
別段の規定がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法及び物質と同様もしくは同等の任意の方法及び物質を本発明の実践または試験において使用することもできるが、代表的な例示の方法及び物質は、これから説明される。
【００２２】
本明細書に引用される全ての刊行物及び特許は、各個別の刊行物または特許が、具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているかの如く、参照により本明細書に組み込まれ、それらの刊行物が引用される関連の方法及び／または物質を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前にそれを開示するためであり、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、個別に確認する必要があり得る。
【００２３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いるとき、単数形（“ａ”、“ａｎ”、及び“ｔｈｅ”）は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲が任意の要素を除外するように作成され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単に」、「のみ」（“ｓｏｌｅｌｙ”、“ｏｎｌｙ”）等の排他的な用語の使用のため、または「否定的な」（“ｎｅｇａｔｉｖｅ”）限定の使用のための先行記述となるよう意図される。
【００２４】
この開示を読めば当業者には明らかとなるように、本明細書に記載及び例示される個別の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態の特徴から容易に分離され得るか、またはそれらと組み合わされ得る別個の構成要素及び特徴を有する。任意の列挙される方法は、列挙される事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で実行されてもよい。
【００２５】
トランスジェニック動物モデル
上記に概説するように、本発明の態様は非哺乳類ＲＡＳトランスジェニック動物を含む。多数の異なるタイプの非哺乳類多細胞生物が主題の方法において採用されてよく、これらのタイプの生物には昆虫、両生類、魚類等が含まれる。対象となる具体的な生物には、ゼノパス属、ゼブラフィッシュ、カエノルハブディティス属（Ｃａｅｎｅｒｈａｂｄｉｔｉｓ）、ショウジョウバエ属等が含まれるがこれに限定されない。ある特定の実施形態における対象は、節足動物門に属するものなどの無脊椎動物であり、昆虫綱に属するものを含む。ある特定の実施形態における対象は、ハエである。いくつかの例では、ハエはショウジョウバエ科に属し、例えばキイロショウジョウバエである。本発明において採用される多細胞生物は、例えば幼生期、成体期等の、その生命の任意の段階にあってよい。
【００２６】
対象となるトランスジェニック動物の態様は、動物が安定的に組み込まれたＲＡＳ導入遺伝子を宿すものである。用語「導入遺伝子」は、細胞のゲノム内へ人工的に挿入されている、または挿入されようとしている遺伝物質を記載するために本明細書において使用される。対象の動物に組み込まれた導入遺伝子はＲＡＳ導入遺伝子であり、導入遺伝子は、ＲＡＳタンパク質をコード化するｒａｓ核酸コード配列を含む。いくつかの例では、ＲＡＳタンパク質は、ｈＲＡＳ、ｎＲＡＳまたはｋＲＡＳである。コード化されたＲＡＳタンパク質は、いくつかの例では、哺乳類ＲＡＳタンパク質、例えば、マウスＲＡＳタンパク質またはヒトＲＡＳタンパク質である。
【００２７】
いくつかの例では、導入遺伝子は野生型ＲＡＳタンパク質の多様体をコード化し、ここで対象となる多様体はホモログ、変異体等を含む。いくつかの例では、コード化されたＲＡＳタンパク質は、ＲＡＳホモログである。ホモログとは、野生型ＲＡＳタンパク質に対して１０％以上、例えば２０％以上、及び３０％以上を含む、例えば、３５％以上、４０％以上及び６０％以上を含むアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を意味し、例えば、図２に提供する配列を有するヒトｋＲＡＳであり、その配列同一性は、Ｄ．Ｇ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐ．Ｍ．Ｓｈａｒｐ，”Ｆａｓｔ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ａ  Ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ，”（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１−１５３に記載されているようにＭｅｇＡｌｉｇｎ，ＤＮＡｓｔａｒ（１９９８）ｃｌｕｓｔａｌアルゴリズムを使用して決定される（使用パラメータは、ｋｔｕｐｌｅ＝１、ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｗｉｎｄｏｗ＝５、及びｄｉａｇｏｎａｌｓ  ｓａｖｅｄ＝５である）。いくつかの実施形態では、対象のホモログはより一層高い配列同一性、例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはより高い配列同一性を有する。さらに対象となるのは、野生型タンパク質に実質的に同一であるタンパク質であり、ここで実質的に同一とは野生型タンパク質のアミノ酸配列に対して６０％以上、例えば６５％以上、及び７０％以上を含むアミノ酸配列同一性をタンパク質が有することを意味し、いくつかの例では、同一性はより一層高く、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはより高い。
【００２８】
ＲＡＳ導入遺伝子は、変異ＲＡＳタンパク質もコード化し得る。変異体は、野生型（例えば、天然に生じる）タンパク質の生物学的特性を保持し得るか、または野生型タンパク質とは異なる生物学的特性を有し得る。変異体は、変動し得、単一のアミノ酸変化、１つまたは複数のアミノ酸の挿入または欠損（隣接していても隣接していなくても良い）、Ｎ末端トランケーション、Ｃ末端トランケーション等を含み得る。
【００２９】
いくつかの例では、導入遺伝子は、１つまたは複数のアミノ酸置換変異を含む変異ヒトｋＲＡＳタンパク質をコード化する。対象の置換変異は、Ｇ１２変異、Ｇ１３変異、及びＱ６１変異を含む。例えば、変異タンパク質は、Ｇ１２Ｘ変異を含み得、ここでＸはＧ以外の任意のアミノ酸である。具体的な置換変異には、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ及びＱ６１Ｌが含まれるがこれらに限定されない。
【００３０】
いくつかの例では、ＲＡＳ導入遺伝子は、トランスジェニック動物において観察可能な非致死表現型として動物の成体段階において顕在化する。非致死とは、成体が生存しており、表現型を少なくともその表現型が観察されるのに十分な期間、例えば１日またはより長く、５日間またはより長く、１０日間またはより長く等にわたって呈することを意味する。観察可能な表現型とは、動物の成体段階において視覚的に見ることができる表現型を意味し、任意の解剖学的特徴部にて観察され得る。例えば、ハエでは、解剖学的特徴部には眼、翅、脚等が含まれる。解剖学的特徴部が眼である場合、対象となる観察可能な表現型には、荒い外縁部、存在／非存在、色、形状、荒い外縁部等が含まれるがこれに限定されない。解剖学的特徴部が翅である場合、対象の観察可能な表現型には、皺の寄った翅、不完全な翅（１つまたは複数の部分が欠けている翅）等が含まれるが、これに限定されない。
【００３１】
ＲＡＳ導入遺伝子は、偏在的に発現し得るかまたは組織特異的様式で発現し得る、すなわち導入遺伝子は動物の１つまたは複数の組織にて発現するが動物の全ての組織で発現するわけではない。例えば、導入遺伝子は、翅組織においてのみ、眼組織においてのみ等で発現し得る。さらには、導入遺伝子は動物の全ての生命段階において発現し得るか、または動物の全ての生命段階ではないが１つまたは複数の段階において発現し得る。
【００３２】
所望の場合、導入遺伝子は、その発現が所望の細胞型に空間的に制御される様式で、動物のゲノムに安定的に組み込まれ得る。具体的には、主題の導入遺伝子は、対象の組織、例えば、翅組織における発現を提供するプロモーターの制御下にある動物のゲノムへと安定的に組み込まれ得る。導入遺伝子は、この必須の空間的発現パターンを提供する任意の好都合なプロモーターの制御下にあってよく、プロモーターは動物に対し内因性であっても外因性であってもよい。
【００３３】
導入遺伝子は、プロモーターによる直接的または間接的な発現活性化を提供する様式で、すなわちプロモーターによる遺伝子発現のシスまたはトランスいずれかの活性化を提供するような様式で、ハエゲノムへと組み込まれ得る。換言すると、導入遺伝子の発現は、プロモーターにより直接媒介され得、または１つまたは複数のトランス活性化剤によって媒介され得る。導入遺伝子がプロモーターの直接制御下にある場合、すなわちプロモーターがシス様式で導入遺伝子の発現を制御する場合、その導入遺伝子は、プロモーターによるシス制御が起こるように、プロモーターに十分に近接した部位で、及びプロモーターとインフレームで、ハエのゲノムに安定的に組み込まれる。
【００３４】
導入遺伝子の発現が内因性プロモーターにより間接的に媒介されるさらなる他の実施形態では、プロモーターは、１つまたは複数のトランス活性化剤（すなわちその発現がプロモーターにより直接制御され、導入遺伝子の発現を開始させるのに十分な様式で導入遺伝子の領域と結合する薬剤）、通常は１つのトランス活性化剤により導入遺伝子の発現を制御する。任意の好都合なトランスアクチベーターが採用されてよいが、ＧＡＬ４トランスアクチベーター系がある特定の実施形態において採用される。
【００３５】
トランスジェニックハエがＧＡＬ４標的化発現系を含むこれらの実施形態では、ＧＡＬ４コード配列は、適切な空間的及び時間的様式での発現を提供する内因性プロモーターと作動可能に連結されるように、動物のゲノムへ安定的に組み込まれる。そのようなハエの一例は、ブルーミントンストックセンター（インディアナ州ブルーミントン、（ストック番号８８６０）より入手されるハエ系統ＭＳ１０９６である。ＭＳ１０９６はショウジョウバエの翅においてＧＡＬ４を発現し、それゆえショウジョウバエの翅におけるＵＡＳ応答性ｋＲＡＳ導入遺伝子の発現のみを駆動する。導入遺伝子は、ゲノムの異なる位置、一般的にはゲノム内のランダムな位置へ安定的に組み込まれ、この導入遺伝子は、ＧＡＬ４が結合して導入遺伝子の発現を開始させる上流アクチベーター配列、すなわちＵＡＳ配列に作動可能に連結する。ＵＡＳ：ＧＡＬ４トランス活性化系を有するトランスジェニックハエは、当業者に既知であり、Ｂｒａｎｄ＆Ｐｅｒｒｉｍｏｎ、Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９３）１１８：４０１−４１５；及びＰｈｅｌｐｓ＆Ｂｒａｎｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９８年４月）１４：３６７−３７９に記載される。
【００３６】
主題のトランスジェニックハエは、導入遺伝子の所望の発現、例えば偏在的または組織特異的、例えば翅特異的様式で発現を提供するのに十分な様式での、ハエゲノムへの導入遺伝子の安定的組込みを提供する任意の好都合なプロトコルを使用して調製されることができる。必須の発現パターンを有する導入遺伝子の組込みを得るために、多数の異なる方略を採用することができる。一般的には、主題のトランスジェニックハエを作製する方法は、ハエゲノムへの導入遺伝子の安定的組込みを必然的に含む。安定的組込みは、まず導入遺伝子を、ハエの１つまたは複数の細胞、例えばハエ胚に導入することにより達成される。導入遺伝子は、一般的には、プラスミドなどの好適なベクター上に存在する。導入遺伝子の導入は、任意の好都合なプロトコルを使用して達成されてよく、好適なプロトコルには、電気穿孔法、マイクロインジェクション、小胞送達、例えばリポソーム送達ビヒクル等が含まれる。細胞（複数可）への導入遺伝子の導入の後、導入遺伝子は、細胞のゲノムへと安定的に組み込まれる。安定的組込みは、部位特異的、またはランダムのいずれであってもよいが、一般的にはランダムである。
【００３７】
組込みがランダムである場合、導入遺伝子はトランスポザーゼの使用により組み込まれ得る。かかる実施形態では、導入遺伝子は、必須の末端３１塩基対逆方向反復を含むベクター内の細胞（複数可）へ導入される。導入遺伝子を組み込む細胞が内因性トランスポザーゼを含まない場合には、トランスポザーゼをコード化するベクター、例えばｐＴＵＲＢＯ（Ｓ  Ｓｔｅｌｌｅｒ  ＆  Ｐｉｒｒｏｔｔａ，“Ｐ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ，”  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）６：１６４０−１６４９に開示される）などの、トランスポザーゼ遺伝子を含むヘルパープラスミドも細胞内へ導入される。標的キイロショウジョウバエの細胞（複数可）のゲノムへの導入遺伝子のランダムな組込み法は、米国特許第４，６７０，３８８号及び６，４７５，７９８号に開示されており、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００３８】
導入遺伝子がハエゲノムにランダムな様式で安定的に組み込まれるこれらの実施形態では、ハエの発達中の適切な時期に導入遺伝子を選択的に発現させるための手段も提供する。換言すれば、導入遺伝子の標的化発現を得るための手段を提供する。ランダムに組み込んだ導入遺伝子の所望の標的化発現を得るために、Ｐ因子ベクターの単一単位として、導入遺伝子の上流の特定のプロモーター組込みが採用され得る。あるいは、導入遺伝子の発現を媒介するトランスアクチベーターが採用され得る。特に対象となるのは、既述のＢｒａｎｄ＆Ｐｅｒｒｉｍｏｎに記載されるＧＡＬ４系である。
【００３９】
特定の実施形態では、トランスジェニックハエは、（１）２つの別々のトランスジェニックハエ系統：（ａ）上記のように、例えば、翅組織において組織特異的様式でＧＡＬ４を発現する第１の系統と、（ｂ）導入遺伝子が細胞ゲノムに安定的に組み込まれ、ＵＡＳドメインと融合した第２の系統とを作製し；（２）この２つの系統を交雑させ；及び（３）所望の表現型、すなわち新生物腫瘍の自然発生について子孫をスクリーニングすることにより作製される。前記の各段階は、当業者に周知である。例えば、Ｂｒａｎｄ＆Ｐｅｒｒｉｍｏｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９３）１１８：４０１−４１５；及びＰｈｅｌｐｓ＆Ｂｒａｎｄ、Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９８年４月）１４：３６７−３７９を参照されたい。下記実験の項も参照されたい。別の実施形態では、Ｇ１２Ｖ遺伝子型について記載された方法は、他のよく見出されるｋＲＡＳ変異であるＧ１３Ｄ及びＱ６１Ｌを発現する、ｋＲＡＳに変異を有するハエを作製するために使用される。単一の変異を含有するハエの他に、いくつかの実施形態では、複数の変異、例えばＧ１２Ｖ及びＧ１３ＤＶ、Ｇ１２Ｖ及びＱ６１Ｌ、Ｇ１３ＤＶ及びＱ６１Ｌを有するハエ、さらには全３つの変異を含有するハエを採用する。
【００４０】
上記の方略は、卵が所望の表現型、例えば皺の寄った翅表現型を呈する成体ハエを生じさせるように、正しい空間的及び時間的様式で発現するような様式でゲノム中へ安定的に組み込まれた導入遺伝子を含む受精卵を得るために採用される。受精卵は、新生物表現型を生じさせるような条件下で成熟され得る。
【００４１】
動物の表現型は、動物を成熟させる条件を変更することにより調節することが可能である。例えば、主題の動物の表現型の性質を調節するために、温度を採用することができる。
【００４２】
有用性
主題の動物は、細胞増殖性状態の処置において使用するための治療化合物を同定するスクリーニングツールとして（例えば、ヒト新生物疾患状態の動物モデルとして）の用途を含む、様々な用途において有用である。主題のトランスジェニック動物、例えばハエ（または特定のスクリーニングアッセイによっては、それらに由来する細胞）の使用を通して、新生物疾患に関する活性を有する化合物を同定することが可能である。化合物が、異常な細胞分裂またはそれに伴う合併症の喪失などの、疾患の少なくとも１つのパラメータまたは症状を調節するかまたはそれに対する効果を有する場合に、化合物は新生物疾患に関する活性を有し、ここでの調節活性は、疾患及び症状の性質に応じて、症状の程度を減少または増強し得る。従って、本発明のスクリーニング法は、例えば新生物疾患の進行に関与するタンパク質またはペプチドに結合、その活性を調節、増強、または抑制することにより、新生物疾患の進行を調節する化合物、及び／または疾患の表現型症状を寛解、軽減、またさらには除去する化合物を同定するために使用されることができる。ここで、かかる活性は、疾患の根底の機序に関する活性の結果であってもなくてもよい。新生物状態に対する効果が欠如している薬物を決定するためのスクリーニングも対象となる。本発明のアッセイにより、最終的に、（１）新生物疾患状態に関する正の効果を有し、従って、治療薬、例えば新生物状態を抑止または逆転させるか、またはかかる状態の症状を寛解または軽減させる薬剤である化合物、または（２）新生物疾患に関する有害効果を有し、従って治療剤として回避されるべき化合物を同定することが可能となる。
【００４３】
本発明のスクリーニング法では、ある量の候補薬剤が、一般的には、動物、例えばハエに経口投与される。経口投与後、候補薬剤が観察可能な表現型（例えば、縮れた翅）に与える効果を、典型的には対照（すなわち、候補薬剤が投与されていないトランスジェニックハエ）との比較により決定する。候補薬剤の効果は、新生物状態に特徴的な表現型のうちの１つまたは複数が、対照ハエと比較して、被検ハエにおいて悪化または寛解されているか否かを決定することにより決定される。ここで、モニターされる特徴には、縮れた翅等が含まれる。候補薬剤は、ハエ栄養培地、例えば水、付加的な栄養剤を含む水性溶液等に薬剤を混合すること、及びハエが培地を摂取するようにハエ（幼虫であっても成体ハエであってもよい）の存在下に培地を置くことにより、ハエに経口投与され得る。所望の場合、様々な濃度の候補薬剤に対する異なる応答を得るため、異なる薬剤濃度を用いた複数のアッセイ混合物を並行して進めてよい。好都合には、これらの濃度のうちの１つは、陰性対照、すなわち化合物でないものとして機能する。ある特定の実施形態では、大量のハエを使用して大量の候補薬剤が並行して試験される、ハイスループットスクリーニングプロトコルが採用される。「大量」とは、複数を意味し、複数とは１０から５０またはそれ以上、例えば１００以上を意味し、さらに１０００以上を含み、その数は１０，０００または５０，０００またはそれ以上であってもよいが、いくつかの例では、５０００を越えない。
【００４４】
ある特定の実施形態で対象となるのは、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６，８５５，５０４号及び６，３６５，１２９号に記載されているようなハイスループット毒性スクリーニングアッセイにおける主題のハエの使用である。かかるハイスループットスクリーニングアッセイにおいては、複数の異なる化合物組成物、通常１０個以上の異なる化合物組成物が、その活性（あれば）について同時にアッセイされる。複数のうちの各化合物組成物は、それを表現型を有する主題のトランスジェニック動物の集団と接触させること、及び化合物組成物が動物に与える効果を決定することにより、活性についてアッセイされる。疾患を処置し、かつ動物の生存を可能にするよう十分に非毒性である化合物のみが、さらなる研究のための陽性化合物として同定されるため、かかるＨＴＳ法は、細胞増殖性疾患、例えば新生物疾患の処置において使用するための薬剤の検索において有用である。
【００４５】
主題の方法は、種々の異なる潜在的な候補治療剤のスクリーニングにおいて有用である。候補薬剤には、多くの化学的クラスが包含されるが、典型的には、それらは５０ダルトン以上約２，５００〜２，０００ダルトン以下の分子量を有する小有機化合物を含む有機分子である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を含み、好ましくは少なくとも２個の官能化学基を含む。候補薬剤は、しばしば、上記の官能基のうちの１つまたは複数で置換された環状炭素または複素環式構造、及び／または芳香族またはポリ芳香族構造を含む。候補薬剤はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体、またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限られない生体分子の中にも見出される。
【００４６】
候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む、多様な起源から得られる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む、多様な有機化合物及び生体分子のランダム合成及び特異的合成のための多くの手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、利用可能であるか、または容易に作製される。加えて、天然の、または合成的に作製されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的、及び生化学的な手段により容易に修飾され、それらはコンビナトリアルライブラリーを作製するために使用され得る。構造類似体を作製するため、既知の薬剤に、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等の特異的またはランダムな化学修飾を施してもよい。新規の潜在的な治療剤も、合理的薬物設計またはコンピューターモデリングなどの方法を使用して製造され得る。
【００４７】
スクリーニングは、既知の薬理活性化合物及びそれらの化学的類似体に対して、または合理的薬物設計により製造されたものなどの不明な特性を有する新規薬剤に対して実施される。新生物状態に関する治療的活性を有する候補薬剤は、上述のような腫瘍増殖、腫瘍転移等のような本発明の成体トランスジェニックハエの１つまたは複数の新生物表現型を、完全には軽減または除去しないまでも、少なくとも寛解させる能力に基づき同定されることができる。
【００４８】
ある特定の実施形態における対象は、低い宿主毒性を呈し、かつ抗新生物薬として有効である癌治療剤を同定するための、主題のスクリーニング法の使用である。慣例の化学療法及び放射線処置は、正常細胞にも腫瘍細胞にも同様に影響を与える。これらの処置の主要メカニズムは分裂細胞にのみ影響を与えるため、そして正常細胞の大半は分裂中でないため、正常細胞の耐性は高く、副作用は容認されるが、それでも相当に重度である。主題のスクリーニング法は、幼虫が生存可能なハエに発達するには相当量の細胞分裂が必要であるため、副作用に対して高いストリンジェンシーを置く。従って、主題のスクリーニング法により選択された抗転移性腫瘍化合物は、そのままでは発達中のハエが死亡するだろう腫瘍の形成／増殖／転移を、高度に特異的に排除または阻害しなければいけないだろう。換言すると、主題の方法は、正常な発達中及び分裂中の細胞に対する低い毒性も有する抗腫瘍薬物候補を選択するための高感度の系を代表する。
【００４９】
上記スクリーニング法は、哺乳類宿主、例えばヒトにおける新生物疾患の処置におけるその効力（及び安全性）に関して候補治療剤を評価する多段階スクリーニングプロセスの一部であり得る。本発明の多段階スクリーニングプロセスでは、候補化合物または化合物のライブラリーは、主題のトランスジェニック動物モデルにおけるスクリーニングに続き、第２のインビボモデル、例えばマウスモデルにおけるスクリーニングを受ける。本発明の非哺乳類トランスジェニック動物における最初のスクリーニング後、次いで、陽性化合物を、トランスジェニック非ヒト哺乳動物モデルを含む非ヒト哺乳動物モデルにおいてスクリーニングする。新生物疾患のトランスジェニックマウスモデル及びスクリーニングアッセイにおけるそれらの使用法は、米国特許第５，９１７，１２４号、第５，９０７，０７８号、第５，８４９，９９６号、第５，７０９，８４４号、第５，５５０，３１６号、及び第４，７３６，８６６号に記載され、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。加えて、まず化合物に、新生物状態の治療における治療剤としてのその可能性についてインビトロ・スクリーニングアッセイを施す、インビボ・スクリーニングの前段階も採用され得る。任意の好都合なインビトロ・スクリーニングアッセイが採用されてよく、種々の好適なインビトロ・スクリーニングアッセイ法が当業者に既知である。
【００５０】
本発明の実施形態に係るトランスジェニックハエを採用するスクリーニングプロトコルの例を図５に示す。スクリーニングは疾患または遺伝子に関する有害な状態の導入後のハエにおいて表現型を作製することに依拠することに留意されたい。次いで、遺伝子操作したハエを表現型の逆転を求めて化学物質または他の因子のライブラリーに曝露する。次いで、表現型を遮断する化学物質または他の因子（「ヒット」）をより慣例的な細胞培養物をベースとするアッセイにおいて試験し、細胞培養物において活性である場合は、ヒットは研究下にある特定の疾患の齧歯モデルにおいてさらに検査され得る。これらのモデルにおけるヒットの性能を改善するために、しばしば追加的な構造修正も、細胞培養物及び齧歯モデルにおいても活性なヒットに実施される。ハエにおけるスクリーニングは、有望な治療標的に対してより良好な薬剤候補をもたらすのに有望である。
【００５１】
新生物状態の治療において使用するための治療剤、ならびにそれらの薬学的製剤も、本発明によって提供される。本発明の治療剤は、新生物状態に関する有益な活性を示す、前記のスクリーニング法を使用して同定された薬剤（または、新生物状態の表現型を調節するものとして同定された遺伝子の発現に効果を有することが既知の薬剤（同定は、主題の非トランスジェニック動物の使用を採用する））である。直接的に新生物状態を処置する他にも、本明細書に記載のように同定された治療剤は、かかる薬剤をより効果的にするのに有効な抗ＥＧＦ療法などの他の薬剤と組み合わせても使用することができる（Ｗｅｂｓｔｅｒら、“ｋＲＡＳ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｓｅｔｔｉｎｇｓ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ（２０１３）２２：９１−１０１）。本発明から得られる治療剤の使用は、分析測定により導かれて、処置を投与された患者に関連する変異型ｋＲＡＳの遺伝子型を決定することもできる（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，“Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ＫＲＡＳ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ．（２０１１）１１：６３５−６４２）。
【００５２】
主題の治療剤の医薬組成物も提供される。本発明の医薬組成物または製剤においては、上記の薬剤が、適切な薬学的に許容され得る担体または希釈剤との組み合わせにより医薬組成物へと製剤化され、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、及びエアロゾル剤などの固体、半固体、液体、または気体の形態の調製物へと製剤化され得る。薬学的剤形において、薬剤は、その薬学的に許容され得る塩の形態で投与され得るか、または単独で、または他の薬学的に活性な化合物と適切に会合させて、ならびに組み合わせて使用され得る。以下の方法及び賦形剤は単に例示的なものであり、本発明を限定するものではない。
【００５３】
経口用調製物については、薬剤は、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、またはジャガイモデンプンなどの従来の添加剤；結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、トウモロコシデンプン、またはゼラチンなどの結合剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤；タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；そして望ましい場合には、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、及び香料と共に、錠剤、散剤、顆粒剤、またはカプセル剤を作成するため、単独で、または適切な添加剤と組み合わされて使用することができる。
【００５４】
薬剤は、所望であれば、可溶化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、及び保存剤などの従来の添加剤を伴って、植物油またはその他の同様の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸エステル、またはポリプロピレングリコールなどの、水性または非水性の溶媒へと、それらを溶解、懸濁、または乳化させることにより、注射用調製物へと製剤化することができる。
【００５５】
薬剤は、吸入を介して投与するエアロゾル製剤において利用することができる。本発明の化合物は、加圧された許容され得る噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などに製剤化できる。
【００５６】
さらに、薬剤は、乳化基剤または水溶性基剤などの、種々の基剤との混合により坐剤へと作成されることができる。本発明の化合物は、坐剤を介して直腸投与できる。坐剤は、体温で融解するが、室温では固体化するココアバター、カーボワックス、及びポリエチレングリコールなどのビヒクルを含むことができる。
【００５７】
シロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁剤などの経口投与または直腸内投与用の単位剤形が提供され得る。ここで、各投薬単位、例えば、大さじ１杯、錠剤または坐剤は、１つまたは複数の阻害剤を含有する所与の量の組成物を含有する。同様に、注射または静脈内投与用の単位剤形は、滅菌水、生理食塩水、または別の薬学的に許容され得る担体の溶液としての組成物中に阻害剤（複数可）を含み得る。
【００５８】
本明細書で用いるとき、用語「単位剤形」は、ヒト及び動物対象のための単位投与量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、またはビヒクルに伴って所望の効果を生じさせるために十分な量に計算された、所定量の本発明の化合物を含有する。本発明の新規な単位剤形の詳細は、使用される特定の化合物及び達成されるべき効果、及び宿主における各化合物に関連した薬力学によって異なる。
【００５９】
ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの薬学的に許容され得る賦形剤は、容易に公的に入手可能である。さらに、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤、安定剤、湿潤剤等などの薬学的に許容され得る補助物質は、容易に公的に入手可能である。
【００６０】
薬剤が、（上記の変異体スクリーン分析プロトコルを使用して同定される）ポリペプチド、ポリヌクレオチド、その類似体または模倣物である場合、それは、ウイルス感染、マイクロインジェクション、または小胞の融合を含む、任意の数の経路により、組織または宿主細胞へと導入され得る。Ｆｕｒｔｈら（１９９２）、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０５：３６５−３６８に記載のように、ジェット注射も筋肉内投与に使用され得る。ＤＮＡを金微粒子上にコーティングし、粒子衝撃装置または文献（例えば、Ｔａｎｇら（１９９２）、Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：１５２〜１５４を参照）に記載の「遺伝子銃」により皮内に送達され得、ここで金マイクロプロジェクタイルはＤＮＡでコーティングされ、次いで皮膚細胞内に衝撃される。
【００６１】
当業者であれば、用量レベルが、具体的な化合物、症状の重度、及び対象の副作用に対する感受性の関数として変動し得ることを容易に理解するだろう。所与の化合物の好ましい投与量は、種々の手段により、当業者により容易に決定される。
【００６２】
活性薬剤の単位用量（通常は経口または注射可能な用量）を含むキットが提供される。かかるキットには、単位用量を含有する容器に加え、対象となる病態の処置における薬物の使用及びそれに付随する利益を説明する情報添付書類が含まれる。好ましい化合物及び単位用量は本明細書内で前述されている。
【００６３】
主題の活性薬剤を使用して、細胞増殖性疾患状態、特に新生物疾患状態を処置する方法も提供される。主題の方法では、有効量の本発明の活性薬剤が、処置を受ける宿主に投与される。「有効量」とは、所望の結果を生じるために十分な投与量を意味し、所望の結果とは、一般的に、処置を受ける細胞増殖性疾患の１つまたは複数の症状が、完全に中止するわけではないにしても、寛解または軽減することである。薬剤の投与は、経口、頬側、直腸内、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内投与等を含む種々の方式で達成されることができる。種々の宿主が主題の方法に従い処置可能である。一般的には、かかる宿主は、「哺乳動物」または「哺乳類」である。ここで、これらの用語は、肉食目（例えば、イヌ及びネコ）、齧歯類（例えば、マウス、モルモット、及びラット）、及び霊長類（例えばヒト、チンパンジー、及びサル）を含む、哺乳綱に含まれる生物を記載するために広義に使用される。多くの実施形態では、宿主はヒトであるだろう。
【００６４】
以下の実施例は、例示のために提供され、本発明を限定するものではない。
【００６５】
実験
実施例１−ｐＵＡＳＴベクターに挿入された変異体ヒトｋＲＡＳの合成。
このベクターを作成するために、Ｇｅｎｅｃｏｐｉａ（メリーランド州、ロックビル）から入手したヒトｋＲＡＳ−１２Ｖ遺伝子をＢｇｌ  ＩＩ及びＸｈｏ  Ｉで消化し、ｋＲＡＳ−１２Ｖシャトルベクターから得たＢｇｌ  ＩＩ−Ｘｈｏ  Ｉ断片をｐＵＡＳＴベクターに挿入した。
【００６６】
Ｂｇｌ  ＩＩ酵素及びＸｈｏ  Ｉ酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ／マサチューセッツ州イプスウィッチ）から、それぞれカタログ番号Ｒ０１４３及びＲ０１４６で購入した。ｐＵＡＳＴベクターは、Ｄｒ．Ｍｉｃｈｅｌｅ  Ｃａｌｏｓ、スタンフォード大学（カリフォルニア州パロアルト）から頂戴した。Ｇｅｎｅｃｏｐｉａから入手したプラスミド及びｐＵＡＳＴベクターをＮＥＢから入手した酵素を用いて４時間にわたり３７℃にてＮＥＢ緩衝液番号３．１中で個別に消化した。消化産物を水平型１％アガロースゲル上で分離し、Ｐｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州フィッツバーグ）ゲル精製キット、カタログ番号Ａ２８１を使用して精製した。単離したＤＮＡの大きさは、それぞれｐＵＡＳＴについて８８９３塩基対及びｋＲＡＳ断片については５８２塩基対であった。
【００６７】
ＮＥＢから入手したＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、これまたＮＥＢから入手したＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液中でＤＮＡ断片を接続した。ライゲートした混合物を大腸菌に形質転換し、ＬＢ−ＡＭＰプレートに蒔いた。アンピシリン耐性コロニーを採取して２ｍＬ  ＬＢに入れ、Ｐｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州フィッツバーグ）Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ（キット番号Ａ１３３０）を実施した。Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓから得た単離物はＳｅｑｕｅｔｅｃｈ（カリフォルニア州マウンテンビュー）にて分析され、正しいｋＲＡＳ−１２Ｖ配列のｐＵＡＳＴベクターへの挿入を確認した。
【００６８】
ｐＵＡＳＴ内のｋＲＡＳ−１２Ｖに関するＤＮＡを胚注入及びｋＲＡＳハエの選択のためにＢｅｓｔＧｅｎｅ（カリフォルニア州チノ）に送った。
【００６９】
実施例２．変異型（Ｍｕｔｅｄ）ｋＲＡＳ／Ｃｙｏハエの作製。
実施例１に記載のｐＵＡＳＴ−１２Ｖ  ｋＲＡＳプラスミドを、ハエゲノムへの形質転換のためにＢｅｓｔＧｅｎｅ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州チノ）に送った。ショウジョウバエの背景は、ｗ１１１８であった。ＢｅｓｔＧｅｎｅ社の職員は、変異型ｋＲＡＳをそれぞれ第１、第２、及び第３染色体に挿入されたトランスジェニック成体ハエを回収した。それぞれの個別のトランスジェニック系統は、Ｔｏｓｋに平衡系統として送達された。
【００７０】
約２００個の胚を注入し、成体期まで飼育した（世代０、すなわち、Ｇ０、ハエと命名）。約１４０匹のＧ０幼虫を孵化させ約１２０匹の成体が蛹化した。おおよそ１００匹のこれらのＧ０成体を５×ｗ１１１８ハエと交雑させた、すなわち、１×Ｇ０雄を５×ｗ１１１８未交尾の雌と交雑させ、１×Ｇ０雌を５×ｗ１１１８雄と交雑させた（おおよそ１００バイアルの交雑種）。約８０の上記交雑種は繁殖性であり、Ｇ１ハエを作製した。それぞれの８０交雑種は、その単一バイアル内でおおよそ３００匹のそれぞれのＧ１ハエを作製した。
【００７１】
各バイアルをＧ１形質転換体始祖（ｆｏｕｎｄｅｒｓ）について検査した。見つけ出した場合、Ｇ１形質転換体始祖（Ｇ２）を再交雑した（これが形質転換体系統である）。第二形質転換体（「Ｇ１同胞」）が同一バイアル中にいた場合は、それを最初のＧ１形質転換体が死亡した場合に備えてバックアップとして保存した。この過程を全ての交雑が完了するまで、または第１０代Ｇ１形質転換体が見出されるまで反復した。
【００７２】
それぞれの始祖について３つの個別の交雑が以下のバランサー系統を用いて行われた：（１）Ｘが付着しているＦＭ７ｉ／ＸＸ、（２）ＣｙＯ／Ｓｃｏ及び（３）ＴＭ３  ｔｂ／ＴＭ６Ｂ  ｓｂ。結果生じるＧ３成体を自家交雑させた（赤目及び適切なバランサー表現型を伴う）。各原始祖（ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｆｏｕｎｄｅｒ）について上手く平衡できた１交雑種のみを保存した。さらには、ｋＲＡＳ／ｋＲＡＳハエを、元となるｋＲＡＳ／ＣｙＯ系統から単離し、飼育し、変異表現型を発現する後代を作製するための後続のｋＲＡＳ／ｋＲＡＳ×ＭＳ１０９６において活用した。
【００７３】
実施例３−変異型ｋＲＡＳ／ｋＲＡＳ×ＭＳ１０９６ハエの作製。
ＵＡＳ  ｋＲＡＳハエにおけるｐＵＡＳＴ構築物は、ＵＡＳエンハンサーエレメントを有した。ＧＡＬ４転写因子のＵＡＳエレメントへの結合は、ＵＡＳの下流にある遺伝子の発現を誘導した。特定の組織においてＧＡＬ４を発現するショウジョウバエ成体のｐＵＡＳＴ−ｋＲＡＳ形質転換体への交雑は、ＧＡＬ４を発現する同一組織における強いｋＲＡＳ発現を誘導した。
【００７４】
ＭＳ１０９６は、インディアナ州ブルーミントンにあるショウジョウバエストックセンターから購入した（ストック番号８８６０）。ＭＳ１０９６は、ショウジョウバエの翅においてＧＡＬ４を発現し、それゆえショウジョウバエの翅における発癌性ｋＲＡＳの発現のみを駆動する。
【００７５】
おおよそ２５匹の雄変異型ｋＲＡＳハエ及びおおよそ２５匹のＭＳ１０９６雌をストッパー（ＶＷＲ、ペンシルベニア州ラドナー、カタログ番号８９１４０−９６０）を備えた２５０ｍＬのポリスチレンフラスコ（ＶＷＲ、カタログ番号１６００４−０８４）に配置した。フラスコの底には、公表されたプロトコル（Sullivan W，Ashburner M，Hawley，SR，Drosophila Protocols 2000，Cold Spring Harbor Laboratory Press，p 544）を使用して調製したおおよそ１０ｇのブドウ寒天を充填した。５０個の胚を、鉗子を使用してストッパー（ＶＷＲ、カタログ番号８９１６８−８８６）を備えたガラスバイアル（ＶＷＲ、カタログ番号８９０９２−７２０）に移した。バイアルの底には、Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｐｐｌｙ（ノースカロライナ州バーリントン）から入手したおおよそ小さじ２分の１の青色ハエ飼料（カタログ番号１７３２１６）を充填した。
【００７６】
１４日間経過した後、欠損した翅についてハエを検査した。変異型ｋＲＡＳの表現型を有する典型的な翅の例を図８に示す。翅は、皺くちゃで／ねじれており、機能的でない。
【００７７】
実施例４．変異型ｋＲＡＳ／ｋＲＡＳ×ＭＳ１０９６ハエの翅表現型を逆転させる薬剤についてのスクリーニング。
雄変異型ｋＲＡＳ／ｋＲＡＳハエを雌ＭＳ１０９６／ＧＡＬ４ハエと共にブドウ寒天プレート床を有するハエコロニー（Sullivan W，Ashburner M，Hawley，SR，Drosophila Protocols 2000，Cold Spring Harbor Laboratory Press，pp 541-551.）にて一晩飼育した。結果得られた胚を、蒸留水中に０．７％のＮａＣｌ、０．０３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する噴霧ボトルを使用してブドウ寒天プレートから丁寧に除去した。胚を計数し、次いで１４．４％のショ糖、０．７％のＮａＣｌ及び０．０５％のＴｒｉｔｏｎを含有する溶液に溶解して１５胚／１０μＬの濃度の溶液を得た。
【００７８】
ＲＡＳシグナル伝達に対する（ａｇａｉｎｓｙ）活性を有するデルタラシン類似体である（Sullivan W，Ashburner M，Hawley，SR，Drosophila Protocols 2000，Cold Spring Harbor Laboratory Press，p 544）、被験物質、１−ベンジル−２−フェニル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾールを、ＤＭＳＯ中に溶解して１０ｍＭの濃度を得た。デルタラシン類似体阻害剤はＴｏｓｋ施設にて合成された。４μＬのこの溶液、１００μＬの胚溶液（１５０個の胚）、小さじ２分の１の青色ハエ飼料（ノースカロライナ州、カタログ番号１７３２１６）及び４ｍｌの水をバイアル（ＶＷＲ、カタログ番号８９０９２−７２０）中で合わせ、蓋（ＶＷＲ、カタログ番号８９１６８−８８６）をした。上に提供した作成法を用いて、混合物中の被験物質の最終濃度は１０μＭであった。
【００７９】
バイアルを２５℃のインキュベーターに１４日間配置し、その後、それらを皺くちゃな／ねじれた翅を有するハエの割合（％）について検査した。被験物質を用いた処置により救出されたハエについての典型的な結果を下記図８に提示する。ハエの翅は、顕著に皺くちゃ／ねじれが少なかったがまだ非機能的であった。抗ｋＲＡＳ活性について化学物質をスクリーニングすることの目的は、デルタラシン類似体を用いて達成される皺くちゃな／ねじれた翅表現型からの救出を、ｋＲＡＳに変異があるハエにおいて達成することである。
【００８０】
上記結果から理解することができるように、抗新生物活性を有する既知の化合物は、主題の変異体動物における抗新生物活性も実証する。上記の結果は、本発明が特許請求する変異体動物を、抗新生物活性を有する薬剤のためのスクリーニングモデルとして有効であることを証明する。
【００８１】
下記の表１は、対照ハエ、ｋＲＡＳに変異があるハエ及び被験物質を用いた処置により救出されたハエの翅の典型的な外観を比較する。
【００８２】
【表１】
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【００８３】
本発明が、細胞増殖性障害の治療において使用するための潜在的な治療剤の評価に使用する、価値あるスクリーニングツールを提供することは、上記の結果及び考察から明らかである。潜在的な治療剤候補のスクリーニングに主題のトランスジェニックハエを使用する利点としては、ハイスループットスクリーニングプロトコルへの主題のハエの適応性、主題のハエを維持する単純性及び低費用、潜在的に経口的に活性な治療剤を同定する主題のハエの能力、主題のハエの迅速な繁殖、及び大量の子孫を産生する主題のハエの能力が挙げられる。従って、本発明は、本発明がインビボでのハイスループットスクリーニングアッセイを実施する手段を提供する点において、スクリーニングツールの今ある武器が欠く部分を埋める。さらに重要な利点は、正常分裂細胞に対して低毒性または非毒性を呈するが異常な分裂細胞には十分な毒性を呈する化合物を同定するために主題のハエを使用することができることである。従って、主題のスクリーニング法は、正常細胞に低毒性または非毒性を呈する有効な抗新生物薬を同定するための手段を提供する。それゆえ、本発明は、当該分野に重大な貢献を示す。
【００８４】
添付の請求項にもかかわらず、本明細書に記載される本開示は、以下の付記によっても定義される。
１．ＲＡＳ導入遺伝子を含む非哺乳類変異体動物。
２．前記ＲＡＳ導入遺伝子はｋＲＡＳ導入遺伝子である付記１に記載の非哺乳類変異体動物。
３．前記ｋＲＡＳ導入遺伝子はヒトｋＲＡＳ導入遺伝子である付記２に記載の非哺乳類変異体動物。
４．前記ヒトｋＲＡＳ導入遺伝子は置換変異を含む付記３に記載の非哺乳類変異体動物。
５．前記動物は無脊椎動物である付記１に記載の非哺乳類変異体動物。
６．前記無脊椎動物は昆虫である付記５に記載の非哺乳類変異体動物。
７．前記昆虫はハエである付記６に記載の非哺乳類変異体動物。
８．前記ハエはショウジョウバエ科に属する付記７に記載の非哺乳類変異体動物。
９．前記ハエはキイロショウジョウバエである付記８に記載の非哺乳類変異体動物。
１０．前記導入遺伝子は偏在的に発現する付記１に記載の非哺乳類変異体動物。
１１．前記導入遺伝子は組織特異的様式で発現する付記１に記載の非哺乳類変異体動物。
１２．前記導入遺伝子は翅組織内で発現する付記１１に記載の非哺乳類変異体動物。
１３．前記導入遺伝子は発生特異的様式で発現する付記１に記載の非哺乳類変異体動物。
１４．非致死成体表現型として顕在化するのに十分な組織特異的または発生特異的様式で発現するｋＲＡＳ導入遺伝子を含むトランスジェニックキイロショウジョウバエ。
１５．前記非致死成体表現型は縮れた翅を含む付記１４に記載のトランスジェニックキイロショウジョウバエ。
１６．前記ｋＲＡＳ導入遺伝子は変異ｋＲＡＳタンパク質をコード化する付記１４に記載のトランスジェニックキイロショウジョウバエ。
１７．前記変異ｋＲＡＳタンパク質は点変異を含む付記１６に記載のトランスジェニックキイロショウジョウバエ。
１８．前記点変異はＧ１２変異を含む付記１７に記載のトランスジェニックキイロショウジョウバエ。
１９．前記点変異は、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ及びＱ６１Ｌからなる群より選択される付記１７に記載のトランスジェニックキイロショウジョウバエ。
２０．細胞増殖性疾患に関する活性について化合物をスクリーニングする方法であって、付記１から１９のいずれかに記載の非哺乳類トランスジェニック動物に前記化合物を与えること、及び、、前記化合物が前記非哺乳類トランスジェニック動物に及ぼす効果を観察することを含む方法。
２１．前記化合物が前記非哺乳類トランスジェニック動物に経口的に与えられる付記２０に記載の方法。
２２．前記化合物が栄養培地内に与えられる付記２１に記載の方法。
２３．前記化合物が経口的に与えられるときに、前記非哺乳類トランスジェニック動物は幼若発達段階にある付記２１に記載の方法。
２４．前記動物が前記化合物の効果について観察されるときに、前記非哺乳類トランスジェニック動物は成体発達段階にある付記２３に記載の方法。
２５．前記細胞増殖性疾患は新生物疾患である付記２０に記載の方法。
２６．前記新生物疾患がｋＲＡＳ変異により媒介される付記２５に記載の方法。
２７．複数の化合物を複数の非哺乳類トランスジェニック動物に、前記複数の化合物から単一タイプの化合物のみが各動物に与えられることを確保するのに十分な様式で摂食させること、及び、前記化合物が前記複数の動物に及ぼす効果を観察することを含む付記２０から２６のいずれかに記載の方法。
２８．後続の活性アッセイにて活性を有すると観察された化合物をさらに評価することをさらに含む付記２０から２７のいずれかに記載の方法。
２９．前記後続の活性アッセイはインビトロアッセイである付記２８に記載の方法。
３０．前記後続の活性アッセイはインビボアッセイである付記２８に記載の方法。
【００８５】
前述の発明は、理解を明確にする目的で例示及び実施例により幾分詳細に記載してきたが、本発明の教示に鑑みて、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、それらにある特定の変更及び修正がなされ得ることは当業者には明白であろう。
【００８６】
従って、先行の記載は本発明の原理を例示するに過ぎない。本明細書に明示的に説明または示されていなくとも、本発明の原理を実施し本発明の趣旨及び範囲内に含まれる、様々な構成を当業者が考案できるだろうことが理解されよう。さらに、本明細書に記載したすべての例及び条件つきの表現は、主に、本発明の原理と、当該技術分野を発展に対して本発明者が貢献する概念とを読者が理解する助けとなるための教育的な目的となることを意図しており、具体的に記載した例及び条件に限定されることなく解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、及び実施形態、並びに本発明の具体例に関して述べている本明細書のすべての記載は、本発明の構造的等価物及び機能的等価物のいずれをも含むことが意図される。それに加え、そのような等価物は、現在知られている等価物と、将来開発される等価物、すなわち構造に関係なく同じ機能を実行する、開発されるあらゆる要素のいずれをも含むことが意図される。よって、本発明の範囲は本明細書に示され記載された例示的な実施形態に限定されることを意図されない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲により実施される。
【００８７】
関連出願の相互参照
合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）に基づき、本出願は２０１３年８月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／８６７，９７９号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）の出願日に対する優先権を主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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