(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
立体的表面構造を有するセルロース要素（１０）の自己組織化製造のための方法であって、
第一工程において、
一つの面上に、製造される該立体的表面構造を有するセルロース要素（１０）に関して相補的な方法で立体的に表面構造化されており、酸素透過性を持つ第１表面（４）を持つモールド（２）が提供され、ここにおいて
セルロース生成細菌を含む液体増殖培地が提供され、ここで
該モールド（２）は該第１表面（４）を持つ面が液体増殖培地と直接接触するように液体増殖培地の液体／空気界面を形成するように配置され、反対の面（３）は空気又は特別に供給された酸素を含む周囲の気体に面し、該要素（１０）の厚さが少なくとも０．３ｍｍである連続セルロース層が形成されるまで、該細菌に該第１表面（４）上にセルロースを生産させ、堆積させ、該表面との界面上に、該第１表面と相補的な立体的に表面構造化させた表面を発達させ；
そして第二工程において、その立体的表面構造化された第１表面（４）上に該要素（１０）を有する該モールド（２）はＮａＯＨ溶液に浸漬され、該要素（１０）が該ＮａＯＨ溶液中の該第１表面（４）から剥がされ、該要素（１０）が該モールドから取り外され、
０．５〜５ｍｍの範囲の厚みを伴う連続層の形状であって、０．５〜２μｍの範囲の高さを持つ該立体的表面構造を有するセルロース要素（１０）を得る、前記製造方法。
【請求項２】
該モールド（２）が、少なくとも１０−６ｃｍ２／ｓのＯ２に対する拡散率を有する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
該モールド（２）が、酸素透過性物質で製造される、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
該モールド（２）が、酸素透過性ポリマー材料で製造され、立体的相補性構造化マスク要素（１）を、適用した液体又は注入した基板材料用のテンプレートとして使用して製造され、ソフトリソグラフィープロセスにおいて、該立体的表面（４）に対して架橋結合及び／又は重合工程、及び、プラズマ処理工程を含む表面処理工程を伴う、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
該モールド（２）が、酸素透過性ＰＤＭＳポリマー材料で製造される、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
該モールド（２）が、酸素透過性ＰＤＭＳポリマー材料で製造され、立体的相補性構造化マスク要素（１）を、適用した液体又は注入した基板材料用のテンプレートとして使用して製造され、ソフトリソグラフィープロセスにおいて、該立体的表面（４）に対して架橋結合及び／又は重合工程、及び、プラズマ処理工程を含む表面処理工程を伴う、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
該第１表面（４）は、柱の２次元配列形状、窪みの２次元配列形状、隆起及び溝の配列の形状であって、前記隆起は、隣接する前記溝の間の部分であって、隣接する前記溝の間で線状に突出している形状、又は２次元交差構造もしくはハニカムパターン構造の形状の立体的構造を有し、ポジティブ構造の幅は、０．５〜１００μｍの範囲である、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
該第１表面（４）は、隆起及び溝の配列の形状であって、前記隆起は、隣接する前記溝の間の部分であって、隣接する前記溝の間で線状に突出している形状、又は２次元交差構造もしくはハニカムパターン構造の形状の立体的構造を有し、ポジティブ構造の幅は、０．５〜１００μｍの範囲である、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
該第１表面（４）は、隆起及び溝の配列の形状であって、前記隆起は、隣接する前記溝の間の部分であって、隣接する前記溝の間で線状に突出している形状、又は２次元交差構造もしくはハニカムパターン構造の形状の立体的構造を有し、該隆起（５）を含むポジティブ構造の幅、及び／又は該溝（６）を含むネガ構造の幅は、０．５〜１００μｍの範囲である、請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
該第１表面（４）は、隆起及び溝の配列の形状であって、前記隆起は、隣接する前記溝の間の部分であって、隣接する前記溝の間で線状に突出している形状、又は２次元交差構造もしくはハニカムパターン構造の形状の立体的構造を有し、該隆起（５）の幅は、０．５〜５μｍの範囲であり、該溝（６）の幅は、０．５〜５μｍの範囲であり、両幅ともに同じである、請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
該第１表面（４）は、柱の２次元配列形状又は窪みの２次元配列形状の立体的構造を有し、該柱は、全てが規則的に丸、又は多角形の断面を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
該第１表面（４）は、柱の２次元配列形状又は窪みの２次元配列形状の立体的構造を有し、該柱は、全てが規則的に円形、楕円形、三角形、四角形、五角形、又は六角形の断面を有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１３】
柱の該２次元配列形状又は窪みの該２次元配列形状は、少なくとも１次元の、又は３つの異なる方向で、５〜５０μｍの範囲の周期性を有する、請求項１１又は１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
柱の該２次元配列形状又は窪みの該２次元配列は、少なくとも１次元の、３つの異なる方向で、７〜１５μｍの範囲の周期性を有する、請求項１１〜１３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１５】
該柱は、２〜２０μｍの範囲の幅を有し、及び／又は、該柱は、０．５〜２μｍの範囲の高さを有する、請求項１１〜１４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１６】
該柱は、４〜１０μｍの範囲の幅を有し、及び／又は、該柱は、０．５〜２μｍの範囲の高さを有する、請求項１１〜１５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１７】
該隆起（５）は、０．５〜２μｍの範囲の高さ（ｈ）を有する、請求項７〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１８】
該隆起（５）は、１〜２μｍの範囲の高さ（ｈ）を有する、請求項７〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１９】
該第２工程において、その立体的表面構造化された第１表面（４）上に該要素（１０）を有する該モールド（２）は液体に浸漬され、該要素（１０）が該液体中の該第１表面（４）から剥がされ、該液体は、０．５〜２Ｍの範囲の濃度のＮａＯＨ溶液であり、３次元要素（１０）の場合、ポーチ又はポケットの形状であり、該要素（１０）は、該モールド（２）から取り外され、内外がひっくり返され、製造中内側に面している該要素（１０）の表面は、使用時に外側に面している、請求項１〜１８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２０】
該第２工程の後、該要素（１０）は１０分以上熱処理される、請求項１〜１９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２１】
該第２工程の後、該要素（１０）は、ＮａＯＨ溶液中で、６０℃を越える温度に保つことによって６０分以上熱処理される、請求項１〜２０のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、立体的な表面構造化セルロースパッチ又は要素の製造及び、概して、そのような方法を用いて、又はそのような方法で製造された要素を用いて製造された、３Ｄデバイスを含む、パッチ又は要素のデバイスの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
創傷被覆材は、創傷領域をサポートするように設計してあり、創傷領域を感染から保護し、ある場合には、細胞増殖に対する好ましい環境を作り出すことによって創傷治癒を積極的に促進する。
【０００３】
創傷に対する応答は、体の組織の損傷として定義され、炎症段階、移動段階、及び再構築段階を含む。炎症段階は、創傷に対する急性期反応であり、その目的は、創傷を素早くシールし、細胞を創傷へと移動させて創傷治癒のプロセスを開始する化学的ファクターを生産することである。移動段階の間、細胞は創傷内へと迅速に移動し、治癒組織のベースとなる一時的な細胞外マトリックスを築き始める。再構築段階の間、新規に生成された組織は、永続型へとゆっくり成長する。
【０００４】
標準的な創傷被覆材は、以下の工程によって創傷治癒を促進する：１．創傷の端部を一緒にして機械的に保持し、細胞の移動をより簡単にし、２．創傷を機械的にシールして病原体による汚染を防ぎ、３．最新式の被覆材では、通常は創傷組織を水和ゲルに曝露させることによって、早期の創傷治癒を積極的に促進する環境を提供する。これらの応用に対し、材料の改良が望ましい。
【０００５】
形成外科分野において、市販のシリコーンの注入（例えば、胸、ふくらはぎ、尻、胸回り、二頭筋）はしばしば、異物反応及び瘢痕組織の被包化によって失敗する。また、そのような応用に対し、改良された材料／コーティングが望まれる。
【０００６】
美容品分野において、使い捨ての平坦な非構造化セルロースマスクが、皮膚水和を向上させ、代謝老廃物を吸収し、栄養剤又は他の化合物を皮膚へ放出するマスクとして近年販売されている（例えば、顔、手、足用）。
【発明の開示】
【０００７】
そのため、本発明の目的は、これらの応用ための材料を製造する新たな方法を提案することであり、特に、立体的な表面構造を持つパッチ又は被覆、より特に、セルロースパッチ又は要素の製造方法、及び概して、そのような方法を用いて、あるいはそのような方法で製造された要素を用いて製造されたデバイス及び３Ｄデバイスを含むパッチ又は要素などのデバイスを提案することである。
【０００８】
提案された発明における１つの重要な要素は、マイクロ又はナノ構造化された立体的特徴を細菌セルロースの表面に転写させるための単純でコスト効果のある手順についての記載である。本プロセスは、最小コスト及び最小の実験室器材で実行可能であり、訓練された人員を必要としない。本プロセスは、十分に自動化可能であり、アセトバクター・キシリナム又はグルコノバクター・キシリナム等（限定するものではない）の細菌株によるセルロースの自己組織化を活用する。本プロトコルは、図１に図式化してある。
【０００９】
自己組織化バイオリソグラフィー（ＳＡＢ）のプロセスは、ソフトリソグラフィー（ＳＬ）から着想を得た単純な技術に基づく。しかしながら、ＳＬにおいては標的エラストマーの成形には訓練された人員と様々な手順とが必要であり、時間がかかり細かな手順が必要となるが、ＳＡＢは完全に、細菌によるセルロース製造の自然なプロセスに基づくものである。ＳＡＢは、局所的にこのプロセスに介入してセルロース繊維の組織化及びポリマー化を方向付け、その結果、モールドによって現される表面幾何構造の高精細度ネガティブレプリカを生じる。
【００１０】
細菌セルロースの持つ多孔性は、細菌の増殖条件（酸素（部分）圧力、グルコース濃度、細菌株）を調整することによって制御可能であり、又は、既に組織化されたセルロースメッシュについての製造後の化学的処理を用いて修正し得る。しかしながら、我々の知る限り、入手可能で商業的に使用できる製品を導き得る十分な厚みを有した連続セルロースマトリックスの表面にある規則的な立体的配列の転写は未だに達成されていない。
【００１１】
細菌セルロースの応用は数えきれなく、細菌セルロースでできたいくつかの品目が現在、美容又は医療応用の市場で利用可能となっている。更に、細菌セルロースは、優れた機械的特性を有すること、及び動物へのインプラントにおいて本質的に不活性であることが証明された。インプラント可能な生物医療機器に対するこの材料のＦＤＡ認証は、更に、細菌セルロースの貢献する医療応用数を増加させるであろう。提案の発明は、ヒト組織と細菌セルロースとの間の相互作用を制御するための完全に独立した、重要な、物理的なパラメータを追加する。セルロース表面の立体的形状を制御することによって、細胞の接着、増殖、分化、移動、及びアポトーシスの調節又は直接的な誘導が可能となる。したがって、コスト効果のある材料表面エンジニアリングは、細菌セルロースを特徴とするバイオメディカルデバイスの生体親和性及び有効性を改良する全範囲の新規な特性を提供し得る。
【００１２】
そのため、自己組織化バイオリソグラフィー（ＳＡＢ）が、予め定義された幾何学的形状を細菌セルロース表面にミクロンスケール及びサブミクロンスケールで導入するための新たなプロトコルとして提案される。本プロトコルは、エラストマーベースのソフトリソグラフィーの原理を適用し、セルロースネットワークの生成に対してコスト効果のあるレプリカ成形をもたらす。特に、酸素透過材料のモールドが、好ましくは酸素透過ポリマー材料のモールドが、そして最も好ましくはシロキサンのモールドが、例えば、（ポリジメチルシロキサン）ＰＤＭＳモールドが、標準ソフトリソグラフィーを介して成形マスク上に生成される。標的の幾何学的形状を特徴とする成形マスクは、熱可塑性ポリマーで製造され、概して（しかしながら限定するものではないが）、標準熱エンボス加工を介して得られる。ＰＤＭＳモールドは次に、細菌増殖培地を有する界面に配置され、細菌セルロースのポリマー化を促進するガス透過枠組みと成る。ＳＡＢは、ＰＤＭＳモールド上表面幾何構造のネガティブレプリカの特徴を有し、したがって、初期の成形マスクと等しいセルロースパッチを生成する。表面構造化細菌セルロースパッチは、更なる工程を経ることなく、最終的にＰＤＭＳモールドから剥がされる。ＰＤＭＳモールド及び元の成形マスクは両方とも、劣化すること無く数サイクルの間使用できる。ＳＡＢの手順は、ミクロン及びサブミクロン範囲の表面構造をＰＤＭＳモールドから細菌セルロースへと高精細度で移行させ、操作者による更なるアクションを必要としない。まとめると、我々は、細菌セルロースの生化学的特性と界面の表面構造と細胞・材料の相互作用の制御とを結びつける新たな方法を発明した。我々は、改良された生物学的被覆、創傷被覆材、及び／又はヒト組織との強化された相互作用を持つ美容品を生産するために、この新たな技術の活用を予見する。
【００１３】
本発明は、より具体的には、次の工程を含む自己組織化バイオリソグラフィー（ＳＡＢ）プロトコルを提案する：好ましくは、ＰＤＭＳをプラスチックマスク（上段）に成型する標準ソフトリソグラフィーを介してモールド、好ましくはＰＤＭＳモールドが生成される。表面の立体的形状の特徴を有するマスクは、熱可塑性ポリマーで製造可能であり、概して（しかしながら限定するものではないが）、標準熱エンボス加工を介して得られる。立体的構造の表面上における増殖培地において、ストランドを生成するセルロースを用いる構造テンプレートをモールドとして用い、モールドを通して酸素を通過させるＳＡＢによって、（ＰＤＭＳ）モールドによってもたらされる表面幾何構造のネガティブレプリカを伴う平坦なセルロースパッチが生産される。モールドは、単純に増殖培地との界面に配置され、細菌セルロースのポリマー化を誘発するガス透過枠組みと成る。セルロースパッチは、更なる工程を経ることなく最終的にＰＤＭＳモールドから剥がされる。
【００１４】
そのようなものとして、表面構造セルロース構造に対するいくつかの試みが存在した。例えば、既存のセルロース材料を使用して機械的にエンボス加工を施し表面構造を作る提案がなされた。しかしながら、この技術を使用した場合、生成セルロース材料に顕著な密度変化が導かれ、分子レベルでセルロース構造の破壊が導かれ、十分な均質性が得られない。それに加え、この場合には表面構造のみが存在することになる。一方、提案のアプローチでは表面構造だけでなく、自己組織化増殖によって、表面構造と関連するセルロース繊維の特定方向の配向がこの表面構造中に存在することになる。これは、エンボス加工技術によっては成し遂げられない更なる効果である。
【００１５】
構造上においてセルロースを自己組織化させる他のアプローチが試された。しかしながら、全てのケースにおいて、連続的な層が生成されずに格子状構造のみが生成された。更に、これらの構造がテンプレートとセルロースが生成される場所との間の界面上に酸素を存在させずにテンプレート上に成長させられたという事実のため、生成されたセルロース構造は、本質的に極めて薄く、扱うことができない。そのため、これらのアプローチはすべて、実際に商業的に使用され得る製品を導くことがなかった。
【００１６】
更に一般的に述べると、本発明は、立体的表面構造化セルロース要素の自己組織化された製造に対する方法に関する。本方法は、以下の要素を伴う第１工程を含む：
・１つの面上には、相補的な方法で立体的に表面構造化され、酸素を透過する第１表面を伴うモールドが提供される。
・セルロース生成細菌を含む液体増殖培地が提供される。
・液体増殖培地の液体／空気界面を形成するようにモールドが配置され、第１表面を伴うモールドの面は、液体増殖培地に直接接触しており、反対側の面は空気又は特別に供給された酸素を含む周囲の気体に面している。
・該第１表面（４）上に該細菌にセルロースを生産させ、セルロースを堆積させ、要素（１０）の厚みが少なくとも０．３ｍｍ、好ましくは少なくとも０．４ｍｍ、より好ましくは少なくとも０．５ｍｍ又は少なくとも０．７５ｍｍである連続セルロース層が形成されるまで、該表面との界面上に立体的に該表面と相補的な表面構造化された表面を生成させる。
【００１７】
次の第２工程では、前述のモールドから要素が取り外される。
【００１８】
本発明に係る用語“立体的表面構造化”は、特に以下のように理解すべきである：
その表面にはひとつの立体的形状が供給される。すなわち、表面の少なくとも１つの方向における幾何学的特徴の規則的配列である３Ｄ表面形状が供給される。幾何学的特徴を持つこの規則的配列は、好ましくは、以下のパラメータによって定義される：
・個々の特徴のサイズ（縦及び横）は、数十ｎｍ（１０ｎｍ又は２０ｎｍ）から数十ミクロン（１０〜２０μｍ）の範囲にわたる。
・特徴の周期性（特徴間距離）：立体的特徴は、等方的に（特徴間距離は平面内の全方向に対して等しい）、又は異方的に（特徴間距離は、少なくとも１つの方向において平面内の他の方向よりも短いか又は長い）配置されている。
・特徴の方向性−異方的特徴（例えば、棒（形状））は、優先的に１つの方向に向けられる。例えば、主表面にすべて垂直、又は平面に対しては垂直ではないが依然として平面に対して傾いている１つの共通方向性ベクトルに沿って、すなわち平面内ではなく、任意の方向に向けられている。
・秩序／無秩序：立体的特徴の配列を製造する場合（例えば、上述され、以下で更に詳細に述べられるような柱（形状））、結晶配列内の特徴の位置は、理想的なｘｙ位置（完全な結晶構造に対応する）からある許容範囲を伴って定義され得る。許容範囲が増加した場合（例えば、理想的な結晶構造から数％のずれとして）、制御された大きさの無秩序を導入することができる。この秩序／無秩序比率は、細胞の応答に大きなインパクトを与える。
【００１９】
“立体的表面構造化”というこの考えは、したがって、通常の表面粗さ（単純にセルロースを成長させることによって取得される粗さ）とは異なる。通常の表面はランダムであり、規則的な構造ではなく、その粗さは、完全な平坦な形状からの表面のずれとして特徴付けられる。“立体的表面構造化”についてのこの定義において、２つの表面が類似の粗さを有し得るが、異なる立体的特徴又は特徴の配置を示す。
【００２０】
立体的に設計されたセルロース表面と素の粗さを有するセルロースとの間の主要な実用的相違は、第１のケースの場合、表面と相互作用する本質的に全細胞が同じ合理的に設計された立体形状のシグナルを受信し、第２のケースの場合、各細胞（相互作用の特定領域に依存している）が異なる一組のシグナルを受信することである。この理由のため、協調的な細胞応答（創傷治癒又は炎症反応の抑制のために必要とされるもの等）は、立体的に設計された表面を使用することでのみ取得され得る。
【００２１】
得られた構造において重要で予想されなかった特性の１つは、それらの構造が脱水／再水和に対して安定であり、したがって形状記憶が存在し、要素が乾燥し（立体的構造化表面が崩壊し）、続いて再度湿った場合（それにより膨張し、立体的構造化表面が再度生成される）、形状が保存されることになるという発見である。このことは、保存を簡単にし、保存期間を延ばし、その構造が崩壊することを抑制する。
【００２２】
医療デバイスとして、表面構造化セルロースは、次の効果を単独で又は組み合わせて得るために使用することができる：
・創傷における閉鎖効率の改善及び時間のスピードアップ。
・細胞の誘導、配列、方向付け。
・移動の促進。
・細胞接着力の減衰又は促進。
・細胞活性化の抑制又は推進。
・炎症反応の最小化。
・線維化組織堆積の最小化。
・異物反応の最小化。
・瘢痕形成の低減。
・再生組織の機械的特性の改善。
【００２３】
第１の好ましい実施の形態において、要素は、０．５〜１０ｍｍ又は１５ｍｍまでの範囲の厚みを有する。
【００２４】
好ましくは、モールドは、少なくとも１０−６ｃｍ２／ｓという酸素に対する拡散率を有する。
【００２５】
モールドは、２次元又は３次元モールドであり、優先的にはシロキサンで製造されており、好ましくはＰＤＭＳであり、好ましくは、立体的に相補的な構造化マスク要素が液体適用又は注入基板材料用のテンプレートとして使用されるように製造され、好ましくは、ソフトリソグラフィープロセスにおいて、場合によっては立体的表面に対して架橋結合及び／又はポリマー化工程、更に場合によっては表面処理工程、好ましくは、プラズマ処理工程を伴う。
【００２６】
他の好ましい実施の形態に係る第１表面は、柱（形状）、窪みの２次元配列形状、隆起／溝の配列の形状、又は２次元交差構造又はハニカムパターン構造の形状の立体的構造を有する。そのようにしてまた、規則的柱状構造、窪みの２次元配列のネガ（陰画）が可能となる。
【００２７】
一般的に、ポジ構造、特に隆起、及び／又はネガ構造、特に溝、の幅は、０．５〜１００μｍの範囲である。好ましくは、隆起の幅は、０．５〜５μｍの範囲であり、溝の幅は、０．５〜５μｍの範囲であり、好ましくは両幅ともに本質的に同じである。
【００２８】
更に好ましくは、隆起が少なくとも０．４μｍの高さ（ｈ）を有し、好ましくは０．５〜５μｍの範囲又は０．５〜２μｍの範囲であり、更に好ましくは１〜２μｍの範囲である。
【００２９】
一般的に、好ましくは、（本質的に全て同一の）柱形状は、好ましくは、全てが規則的に丸、楕円、又は多角形の断面を有し、好ましくは規則的な多角形、最も好ましくは三角形、四角形、五角形、又は六角形の断面を有する。
【００３０】
柱形状の２次元配列は、表面内に１次元の周期性を有し、好ましくは、表面平面内の２つ又は３つの異なる方向に５〜５０μｍの範囲、好ましくは７〜１５μｍの範囲の周期性を有する。例えば、六角形柱の場合、好ましい配置では、０°、６０°、及び１２０°に食い違った３つの周期性方向が存在する。好ましくは、周期性は、表面内で異なる方向に沿って同一である。
【００３１】
個々の柱形状は、２〜２０μｍの範囲の、好ましくは４〜１０μｍの範囲の横方向の拡張を有する。
【００３２】
更に好ましくは、個々の柱形状は０．２〜５μｍの範囲の、好ましくは０．５〜２μｍの範囲の高さを有する。
【００３３】
好ましくは、六角柱の規則的な２次元配列であり、好ましくは、個々の柱の横方向の拡張の２倍の周期性を有する。
【００３４】
上で詳述した柱の寸法について述べると、好ましくはまた、対応するネガ構造を含み、その構造では、規則的な柱が存在しないが、これらの柱の形状を有する規則的な窪みが存在する。
【００３５】
第２工程において、立体的表面構造化された第１表面上に要素を有するモールドは液体に浸漬され、要素が該液体中の該第１表面から取り外され、好ましくは剥がされる。この場合、該液体は、好ましくはＮａＯＨ溶液であり、好ましくは０．５〜２Ｍの範囲の濃度であり、好ましくは０．５Ｍ近傍である。
【００３６】
他の好ましい実施の形態において、第２工程の後、好ましくは、液体中で室温以上の温度を維持することによって、好ましくはＮａＯＨ溶液中において、１０分以上、好ましくは６０分以上、より好ましくは６０°Ｃ以上で要素は加熱処理される。
【００３７】
本発明は更に、０．５〜５ｍｍの範囲の厚みを有する連続層の形状を有する立体的表面構造化セルロース要素に関し、好ましくは、上で概説したような方法を用いて生産されるものであり、又は生産され得るものであり、０．５〜２μｍ（マイクロメータ）の範囲の高さを有し、溝／隆起の立体的構造の場合には、０．５〜１００μｍ（マイクロメータ）の範囲で構造の周期性を持つ立体的表面構造を有する。
【００３８】
この立体的表面構造化セルロース要素は、特に治療パッチ応用の場合、パッチであり、このパッチは一般に２次元であり、２次元において平坦な層として広がっており、各寸法は、１ｍｍより大きく、好ましくは２ｍｍより大きく、５〜２０ｃｍの大きさとすることができる。そのようなパッチの２Ｄ形状は、必要に応じ、例えば四角形、円形、三角形等（図９参照）とすることができる。形状及び立体は、応用のタイプによって最適化され得る。例えば、縦長の創傷に対する治療パッチ応用の場合、パラレルグレーチングが使用可能であり、やけど又は円形の創傷に対する場合、コンフォーカルグレーチングが使用可能である。そのため、言い換えると、立体的表面構造は、平行配置された隆起／溝（通常、パッチの一端部に平行）の配列、同心円上に収束する隆起／溝（例えば、円形のパッチの場合、又は楕円形のパッチの場合）の配列、及び／又は適応的に曲げられ局所的に平行配置された隆起／溝（例えば、図９ｃ参照）の配列となり得る。
【００３９】
更に本発明は、そのような要素を創傷治癒及び／又は美容品応用のパッチとして使用する内容に関し、インプラント物又は形成外科構造に対する被覆として使用する内容に関する。
【００４０】
また、インプラント物をカバーするため又はそのようなインプラント物を形成するために、例えばポーチ形状の３Ｄ要素として製造されたパッチを使用することができる。
【００４１】
この意味では、本発明はまた、請求項１２に係る立体的表面構造化要素に関し、支持要素の有無を伴う３次元構造の形状を有し、好ましくはカバー、バッグ、被覆、ポーチ、又はポケットの形状を有し、その中にインプラント可能な対象物を入れ、又はインプラント可能な対象物をカバーする。好ましくは、そのインプラント可能な対象物は、次のグループから選択される：循環器系デバイス、特にペースメーカ；好ましくは、胸部インプラント形状、腱板部インプラント形状、胸筋部インプラント形状、二頭筋部インプラント形状、尻部インプラント形状、臀部インプラント形状の美容用インプラント物；整形外科的人工装具；センサ及び／又は電気刺激デバイス；排液システム、好ましくはカテーテル；ポンプ又はチューブシステム；眼科的デバイス；聴力デバイス；生物工学的デバイス。
【００４２】
したがって、そのような３Ｄコーティング／ポーチ／カバー／ポケット／バッグに対し、以下のような使用が一般的に可能である：
・ペースメーカ
・胸部インプラント
・他の美容用インプラント（例えば、腱板、胸筋、二頭筋、尻部／臀部等）
・例えば、その他のインプラント可能な医療デバイス
・整形外科的人工装具
・循環器系デバイス
・センサ及び電気刺激デバイス
・尿失禁、脳室腹腔短絡術等用のカテーテルのような排液システムなど
・慢性疼痛治療用の持続的薬液点滴システム等のポンプ及びチューブシステムなど
・眼科的デバイス
・聴力デバイス
・ロボット工学等の生物工学的デバイス
【００４３】
一般的に、応用の可能な分野に関しては、次の分野が考えられる：
【００４４】
１）形成外科：
商業用シリコーンインプラント（例えば、胸、ふくらはぎ、尻、胸回り、二頭筋）は、異物反応及び瘢痕組織の被包化によって失敗する。セルロースは、これらの反応の両方を抑制する。これらの埋込物をマイクロパターンセルロース中に包んだ場合、人体によるネガティブな反応が抑制されるだけでなく、周辺組織中でポジティブな細胞反応が改良される。マイクロパターンセルロースは、既存の埋込物に対し、それらの失敗率を劇的に低減させることによって市場価値を増加させる。
【００４５】
２）美容品：
最近、美容品において、皮膚の水和の向上、代謝老廃物の吸収の向上、及び皮膚に対する栄養剤又は他の化合物の放出の向上をもたらすマスクなどの使い捨てセルロースマスクが市販されている（例えば、顔、手、及び足）。商業用セルロースマスクは、表面立体形状を特徴とするものではない。マイクロパターンを持つ立体形状は、ｉ）水又は他の液体と接触する表面を増加させることによって、皮膚に対する物質輸送を向上させ、ｉｉ）上皮組織上での頂側誘導によって細胞応答を向上させる。ＳＡＢは、マイクロパターンセルロース美容品マスクを開発するために採用され得る：ＳＡＢは、美容品マスクの性能を増加させ、最終的に、それらに市場価値を付加する。
【００４６】
３）パッチ及び創傷治癒：
セルロースは、完全に生体適合性な材料であり、損傷組織に接触する材料として理想的である（やけど治療用の人工皮膚、糖尿病性潰瘍、一般的な摩擦創傷等の慢性的創傷用の密封包帯など）。マイクロパターンを持つ立体形状は、伸展、増殖、分化、及び方向性移動において、細胞応答を刺激し、特にヒト線維芽細胞（ＨＤＦ）の細胞応答を刺激し、最終的に、創傷治癒の効率を向上させる。ＳＡＢは、創傷治療用のマイクロパターンセルロースパッチを製造するために使用され得る。
【００４７】
本発明の更に好ましい実施の形態については、添付の特許請求の範囲中に概説してある。
【００４８】
図面を参照しつつ、本発明の好ましい実施の形態が以下に記載してあるが、図面は、本発明の好ましい実施の形態を例示する目的で描かれたものであり、それを限定する目的をもって描かれたものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、自己組織化バイオリソグラフィー（ＳＡＢ）プロトコルの模式図を示す；ＰＤＭＳをプラスチックマスク上へ成形する標準ソフトリソグラフィーを介してＰＤＭＳモールドが生成される（上段）；表面立体形状を特徴とするマスクは、一般に（しかしながら限定するものではないが）、熱可塑性ポリマーで製造され、標準熱エンボス加工を介して取得される；ＳＡＢは、ＰＤＭＳモールドによってもたらされる表面幾何構造のネガティブレプリカを有する平坦なパッチを生産する（下段）；モールドは、単純に増殖培地との界面に配置され、細菌セルロースのポリマー化を誘発するガス透過枠組みと成る；セルロースパッチは、更なる工程を経ることなく最終的にＰＤＭＳモールドから剥がされ得る。
【図２】図２は、細菌が生産したセルロース上の表面立体形状を示す；ＳＡＢ方法によってセルロースパッチ上に生成された格子；溝の深さ０．４μｍ、それぞれ横方向周期２０（Ａ）又は１００μｍ（Ｂ）の格子の透過画像；（Ｃ）及び（Ｄ）パネルＡ及びＢで報告された画像の強度分布。
【図３】図３は、ＳＡＢ方法によって細菌のセルロース上に生成された高アスペクト比を有する格子を示す。
【図４】図４は、ＳＡＢにおける垂直特徴サイズの制御を示す；横方向周期１０μｍ及びそれぞれ、溝の深さ０．４（Ａ）又は１μｍ（Ｂ）の格子の透過画像。
【図５】図５は、ゼラチンコート細菌セルロース上でのヒト線維芽細胞（ＨＤＦ）の増殖を示す；細胞核及びアクチン細胞骨格を表すＨＤＦの免疫染色；高密度細胞層がＳＡＢ組織化セルロース上で取得され得るとき、平坦なパッチ（Ａ）上に付着して増殖する非分極細胞はほとんど無い；ここでＨＤＦは、立体形状の方向に沿って伸長し、特に１０（Ｂ）又は２０μｍ（Ｃ）の横方向周期を有する格子上に伸長する；１００μｍ（Ｄ）の横方向周期を伴う格子上に、減少した配向が得られる；格子の方向は、白色矢印によって示されている。
【図６】図６は、セルロースパッチ上のヒト線維芽細胞（ＨＤＦ）配向の分布を示す：格子の方向を基準とした配向角度；表面立体形状が無い平坦なサンプル（Ａ）、及びＳＡＢ方法によってセルロースパッチ上に生成された格子：溝の深さ０．４μｍ、それぞれ、横方向周期２０μｍ（Ｂ）、又は１０μｍ（Ｃ）；細胞は、平坦なパッチ（Ａ）上でランダムな分布を示す；セルロースパッチがマイクロ格子（Ｂ及びＣ）を伴う表面立体形状の特徴を有するとき、細胞の配向は、より均一となる。
【図７】図７は、可能な寸法を有する溝／隆起の進行方向に本質的に垂直な切片を示しており（ａ）、及びＰＤＭＳモールドの溝／隆起の可能な代替形状（ｂ）〜（ｄ）を模式的に示す。
【図８】図８は、異なるプラズマ処理に応じてアクティブなＰＤＭＳモールド表面上で測定された水の静的接触角を示しており、低電力（１０Ｗ）プラズマで３０、６０、９０、１２０、及び１５０秒処理されたパッチの接触角及びゼラチンコートＰＤＭＳの接触角と未処理ＰＤＭＳモールドの接触角とが比較される。
【図９】図９は、治癒／被覆パッチ上の立体的配列の幾何学的形状を示しており、Ａ）では、縦長創傷に対する形状が示されており、Ｂ）では、円形創傷に対する形状、Ｃ）では、より複雑な創傷に対する形状が提供されている。
【図１０】図１０は、脱水和前（左）及び再水和後（右）の構造化バイオセルロースパッチの垂直方向の特性を示す；上段（Ａ）：格子形状のパッチの原子間力顕微鏡写真；下段（Ｂ）：対応する高さ方向分布。
【図１１】図１１は、立体的表面構造化セルロース要素の図式パターンの上面図（上図）を示す。柱は、六角形の断面（六角形充填）を有する。また、上図のラインＫに沿った表面に垂直な切片（下図）を示す。
【図１２】図１２は、立体的表面構造化セルロース要素の図式パターンの上面図（上図）を示す。柱は円形断面を有する。及び上図のラインＫに沿った表面に垂直な切片（下図）を示す。
【図１３】図１３は、シリコンウエハ上の六角形充填柱構造のＳＥＭ画像を示す：上面図（左）及び４５°斜視図（右）。
【図１４】図１４は、立体構造を有する３ＤのＰＤＭＳモールドの画像を示す。
【図１５】図１５は、３Ｄモールド生成用バイオリアクタ構成の模式図を示す。
【図１６】図１６は、ペースメーカ上の３Ｄセルロースポーチ／カバー／ポケットを示す、左：ペースメーカのみ、中央：ポーチのみ、右：ポーチ内のペースメーカ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
ＰＤＭＳモールド製造：
ＰＤＭＳモールドは、混合比１：１０のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ、ダウコーニング、ＵＳＡ）で製造された。混合されたＰＤＭＳは、減圧室内で１０分間脱ガスし捕捉空気を除去し、２μｍの周期、１μｍの溝幅、及び０．６μｍの溝の深さを伴う平行溝から成るマイクロパターン化された環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）マスク上に５００μｍの厚みで注がれた。次に、ＰＤＭＳに、短時間第２回目の脱ガスを施し、６０°Ｃで４時間硬化させた。硬化されたＰＤＭＳモールドを、ピンセットを用いてモールドから分離し、メスを用いて１ｃｍ２の正方形形状に切断した。ブランクモールドは、比較目的のため、ＰＤＭＳを平坦なＣＯＣ基板上に注ぐことによって同様に生成した。次に、全パッチを一晩エタノール中に浸漬し、非架橋材料をすべて溶解させた。次に、モールドを酸素プラズマで処理し、表面の親水性を増加させた。最低接触角（２０．２±０．５°）を生じるものとして３０〜１５０秒の時間間隔の範囲を試験した後、１０Ｗで１２０秒のプロセス時間を選択した。図８は、試験について示しており、異なるプラズマ処理に応じて水の静的接触角をアクティブＰＤＭＳパッチ表面上で測定し、未処理ＰＤＭＳパッチの接触角を、３０、６０、９０、１２０、及び１５０秒間、低電力（１０Ｗ）プラズマで処理されたパッチの接触角、及びゼラチンコートＰＤＭＳの接触角と比較した。生成されたパッチの剛性を、一軸試験によって測定し、ヤング率が１．５３±０．０５７ＭＰａと計算された。
【００５１】
モールド２は、幅ｆの溝６と幅ｅの隆起５とを有する。これは、図７の、特に図７ａの中にやや詳細に例示してあり、モールド２上のパターンの進行方向に本質的に垂直な切片が示されている。この場合パターンは、規則的な矩形パターンとなり、幅ｅ及びｆが等しくなり、パターン角度α（アルファ）が９０°となる。実際のパターンの長さｌは、最小の長さを有するべきであり、つまり、パターン期間ｐは、１０μｍ［マイクロメータ］よりも小さくあるべきであり、パターン長さｌは、１ｍｍより大きくあるべきである。通常、この長さｌは、図１に例示してあるように、モールド２の全幅と同じ大きさである。隆起は、高さｈを有し（又は、溝が深さを有する）、上で概説したように境界の範囲内とすることができる。
【００５２】
パターンの形状は、図７ａに例示したように、規則的な矩形形状とする必要はない。隆起はまた、図７ｂに例示したように、少なくとも部分的に台形形状であってもよく、図７ｃに例示したように三角形状であってもよく（三角形が隆起の下側で合って、ジグザグ形状になってもよく）、図７ｄに例示したように丸型端部を伴う矩形でもよい（丸型端部は、図７ｄに例示したように、隆起の上端の角部分としてもよい。しかしながら、また、又は代わりに、溝の底の部分としてもよい）。
【００５３】
図１及び７内に、パターンが本質的に１つの線形方向に沿って伸長するという状況のみが示される。しかしながらまた、もし、セルロース生成細胞が方向９に沿った曲げ構造に沿って誘導されるような場合には、そのような曲げ構造を有することも可能である。上で概説したように、限界を持った長さｌは、この状況においては曲げ形状のようなものに沿った長さとして理解され得る。
【００５４】
治癒／被覆パッチ上の立体的配列の可能な幾何学的形状は、図９に例示される。隆起及び溝が交互する縦長配列のように、基本的な幾何学的形状が格子である場合、好ましくは、パッチが適用される場合に異方性の立体形状が創傷に垂直に配列される場合には、基本的な幾何学形状は、縦長の創傷又はやけどに対してのみ有効であろう。
【００５５】
しかしながら、円形の又は複雑な形状の創傷又はやけどと相互作用するために、より複雑な幾何学的形状が実現され得る。これらの幾何学的形状は、巨視的なパターンに対応する一方で、ミクロンスケール又はサブミクロンスケールにおいて立体的特徴は同一又は同様な特徴のサイズ及び周期性を保持するであろう。図９におけるＡ）縦長創傷、Ｂ）円形の創傷、又はＣ）複雑形状の創傷のケースに対し、視覚的な例が以下に提供される。
【００５６】
モールド上のセルロースパッチの成長：
【００５７】
【表１】
0006744008.tif 000002
【００５８】
手順：
【００５９】
【表２】
0006744008.tif 000003
【００６０】
得られた溶液を、１２１°Ｃで３０分間オートクレーブに処する。室温まで冷却した後、５０ｍｌのろ過したグルコース溶液（蒸留水中５０％）を添加する。
【００６１】
バイオリアクタのセットアップ：
【００６２】
１０ｃｍペトリディッシュの場合。
・均質化セルロース（細菌を含む）１ｍｌをとり、殺菌したファルコンチューブ（５０ｍｌ）内で培地２０ｍｌと混合する。
・混合したセルロース及び培地を最終ディッシュへ注ぐ。
・液体培地とＰＤＭＳモールドとの間に気泡がトラップされないように気をつけながら、上にＰＤＭＳモールドを置く。気泡は、最終セルロースパッチ中に不均質性を生じ得る。そのため、避けるべきである。
・ＰＤＭＳパッチは、培地上に浮かぶため、モールドよりも少し大きな容器を使用するほうが便利である。
・バイオリアクタを、注意深くインキュベータ内に配置し、加湿環境（湿度７０％）中で２９℃に維持する。
・細菌を十分な時間増殖させる。インキュベーション時間は、生成セルロースパッチの所望の全厚みに比例する。以下のテーブルは、この相関についての実験的指標を提供する：
【００６３】
【表３】
0006744008.tif 000004
【００６４】
これらの値は、全モールドにわたる酸素（部分）圧力の増加による影響を受け得る。
【００６５】
セルロースパッチの収穫：
・発酵期間の終了時、ＰＤＭＳモールド及びセルロースパッチをバイオリアクタから取り外す。これらは互いに付着する。
・ＰＤＭＳモールド及びセルロースパッチは、室温でＮａＯＨ（蒸留水中で１Ｍ）溶液中に浸漬される。
・セルロースパッチを、溶液中で注意深くＰＤＭＳモールドから剥がす。
・ＰＤＭＳモールドを、溶液から取り出す。
・セルロースパッチを、ＮａＯＨ溶液中に放置する。
・セルロースパッチが入ったＮａＯＨ溶液を、次に８０℃のオーブン内で８０分保持する（すなわちパッチ全体をＮａＯＨ溶液に浸漬する；その前に、細菌及び培地を、セルロースの中及び周辺に捕捉される；この工程が細菌を除去する／洗浄する（又は”アニーリングする”）；次の工程でＮａＯＨを水に置換する）。
・ＮａＯＨ溶液をその後に除去し、蒸留水を加える。
・セルロースパッチを、蒸留純水を用いて１時間に４回洗浄し、残存培地を除去する。
・セルロースパッチ（ハイドロゲルの特徴を有する）をその後、９５％エタノール溶液で洗浄し、使用するまでエタノール中で保存する。
【００６６】
この手順は、（可視スペクトル内で）半透明セルロースパッチを生成する。透明性を（入射光の９０％まで）改善するために、エタノール中での長期インキュベーション（１週間まで）が使用され得る。
【００６７】
図１０は、結果として得られた構造が脱水／再水和に対して安定であることを示す。初期に生産された水和パッチの表面立体構造を測定し、右側に例示した特徴が示された。次に、パッチは乾燥され、続いて、パッチは再び再水和され、パッチの同じ領域の表面構造が測定された。その結果は右側に示されている。乾燥前と同様に、再水和後に同じの深さ及び周期性が確立される。初期に確立された構造における周期性、及び／又は深さ、及び／又は形状に関する劣化又は変化は見られなかった。
【００６８】
図１１及び１２は、対応するモールド内で実現可能な立体構造を模式的に例示する。セルロース要素中に生成される柱は、モールド表面内の窪みに対応する。図１１において、六角形の構造が示されており、規則的な（均一な辺長、完全な対称性）六角形の断面の窪みの規則的な配列は、対応する六角形の柱を最終的にセルロースパッチ内に生じさせることになり、相互に対して６０°／１２０°に食い違う３つの斜行軸に沿ったラインに並んで、２Ｄ配列内に配置される。垂直表面の最大傾斜角は、好ましくは、モールド内において、１°より小さい。図１２は、窪みの断面が円形であるそれぞれの配置を例示しており、円形の断面柱を持つセルロースパッチをもたらす。
【００６９】
上で指摘したように、柱構造は好ましいが、対応するネガ構造も可能であり、すなわち、窪みの規則的な２次元配列が存在し、全窪みが本質的に同一となる構造も可能である。図１３において、表面立体構造として六角形の窪みの規則的配列を有するセルロースパッチを製造するためのモールド構造が示されている。
【００７０】
マウスのパッチに対するインビトロ・ビボ研究：
【００７１】
動物試験は、以下の内容を評価するために、体重２５〜３５ｇのマウスのオスＣ５７ＢＬ／６Ｊを用いて実行された（ｎ＝１８）：
１．立体的に設計された表面を有するセルロースパッチの創傷治癒性能。
２．セルロース存在下での炎症プロセス及び血管再生プロセス。
【００７２】
血管再生プロセスを研究するために、改変背方皮脂層チャンバ（ＭＤＳＣ）を使用した。簡単に説明すると、チャンバのインプラントとして、２つの対称的なチタンフレームを動物の背方皮脂層上に搭載した。次に、直径１５ｍｍの円形領域において、１つの皮膚層を完全に除去し、チタンフレームのうちの１つに組み入れられたガラスカバーのスリップを用いて残りの層（横紋皮膚筋、皮下組織、及び皮膚から構成される）を被覆した。皮膚移植の前に、回復期間として３日が与えられた。その後、人工的な全層創傷を生成するために、皮膚及び皮下脂肪層の大部分を、チャンバの後方から、直径７ｍｍの円形領域において注意深く除去した。次に、チャンバ後方にある欠損を、細菌セルロース基板で被覆し、他のチタンフレーム中に組み入れられたガラスカバーのスリップで被覆した。表面構造を持つ細菌セルロース基板を、創傷床に対して格子の向きを合わせて配置した。更に、細菌セルロース基板の生体親和性を調査するために、全ての動物に、鼠蹊部の皮膚ポケット内に同一細菌セルロース基板のレプリカを施術した。
【００７３】
総合的結果から、細菌のセルロースパッチ存在下で創傷床における炎症が最小であることが示された。この結果は、同じ動物に全皮膚移植をした場合（対照群として使用）と同程度の低い値であった。
【００７４】
したがって、細菌セルロースは、創傷治療及びインプラント処置に対する理想的な材料であることが確認される。更に、定量的組織学的コラーゲン生成分析及び分布の洞察から、立体的に設計されたセルロースを用いて処理された群では（２１日後）、すでに高密度の、均質に分布したコラーゲン繊維の層が再確立されたことが明らかになった。したがって、立体的に設計されたセルロースパッチの性能は、同一の非構造化パッチの性能と比べて優れていた。
【００７５】
３Ｄ‐立体的に構造化された要素の製造：
【００７６】
３Ｄセルロース構造は、細菌培養に３Ｄシリコーンモールドを導入することによって取得される。シリコーンモールドは、表面立体構造に特徴があり、一例が図１４に示されている。表面立体構造は、モールドプロセス自体の間に（例えば、ＰＤＭＳと共に）インプリントされ、又は、（例えば、前述したように、既に構造化された層をＰＤＭＳ自体を用いて接着することによって）追加層として適用される。シリコーンモールドは、０．５〜２ｍｍの間の厚みを有し、セルロースで被覆される対象物の形状、サイズ、及び寸法を持った内部空洞を有する。シリコーンモールドは、細菌培養物内への配置を容易にするため、その上部に追加の層を備えることができる。
【００７７】
表面立体を持ったシリコーンモールドを、細菌培養内に配置し、以下の操作を行う：
−シリコーンモールドの外部表面を完全に濡らす。
−内部空洞に空気を満たす。
【００７８】
シリコーンモールドの設置は、空気及び培地中の細菌のそれぞれに対し、２つのチャンバからなるバイオリアクタによってサポートされる。空気チャンバ内の酸素循環は、チャンバを開放することによって、又は、例えば、ポンプ又はバルブシステムを備えたガスボトルを用いてその中の酸素フローを制御することによって促進される。
【００７９】
バイオリアクタ構成の模式的な絵が図１５に例示してある。
【００８０】
培養時間の後、モールド界面にセルロース層が形成される。セルロースポーチ／カバー／ポケットは、その内部表面上に表面立体構造の特徴を持ち、平坦なセルロースパッチに対して前述したように、容易に取り外し、洗浄し、処理し、滅菌し得る。セルロースポケットは、最終的には、その外部表面上に表面立体構造の特徴を付けるために、内外をひっくり返される。標的対象物は、最終的に、セルロースポケット内に挿入される。対象物の封入は、セルロースポケットのオープンサイドを縫合することによって最適化され得る。
【００８１】
図１６は、ペースメーカ上の３Ｄセルロースポーチ／カバー／ポケットの一例を示す。
【符号の説明】
【００８２】
１  ＣＯＣマスク
２  パターンを持つアクティブ表面要素、ＰＤＭＳモールド
３  ２の背面
４  ２の前面、立体的表面
５  隆起              
６  溝
７  隆起の中央鏡面           
８  溝の中央鏡面              
９  パターンの進行方向    
１０  セルロース要素
１１  酸素チャンバ
１２  発酵チャンバ
１２．１  モールド
１２．２  チューブ
１２．３  蓋
１２．４  フランジ
１３  酸素透過用の内腔
ｅ  隆起幅
ｆ  溝幅
α  パターン角度
ｐ  パターン周期
ｈ  パターンの高さ
ｌ  溝／隆起の進行方向に沿ったパターンの長さ
【図１】
0006744008.tif 000005
【図２】
0006744008.tif 000006
【図３】
0006744008.tif 000007
【図４】
0006744008.tif 000008
【図５】
0006744008.tif 000009
【図６】
0006744008.tif 000010
【図７ａ）】
0006744008.tif 000011
【図７ｂ）】
0006744008.tif 000012
【図７ｃ）】
0006744008.tif 000013
【図７ｄ）】
0006744008.tif 000014
【図８】
0006744008.tif 000015
【図９Ａ】
0006744008.tif 000016
【図９Ｂ】
0006744008.tif 000017
【図９Ｃ】
0006744008.tif 000018
【図１０】
0006744008.tif 000019
【図１１】
0006744008.tif 000020
【図１２】
0006744008.tif 000021
【図１３】
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【図１４】
0006744008.tif 000023
【図１５】
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【図１６】
0006744008.tif 000025