(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程と、
前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程と、
前記上清画分（Ｓ０）を、前記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けして前記篩（Ｃ）を通過しない画分を取得する工程と、
前記篩（Ｃ）を通過しない画分に前記コロイド溶液を添加する工程と、
を含む、生物粒子を含む試料の前処理方法。
【請求項２】
検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程と、
前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程と、
前記遠心分離後の沈殿（Ｐｎ−１）を、前記コロイド溶液に懸濁して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓｎ）を取得することを、ｎ回（ｎは１以上の整数であり、沈殿（Ｐｎ−１）はｎ−１回目の遠心分離後に得られる沈殿であり、上清画分（Ｓｎ）はｎ回目の遠心分離後に得られる上清画分である。）行う工程と、
前記上清画分（Ｓ０）及び前記上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を、前記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けして前記篩（Ｃ）を通過しない画分を取得する工程と、
前記篩（Ｃ）を通過しない画分に前記コロイド溶液を添加する工程と
を含む、生物粒子を含む試料の前処理方法。
【請求項３】
前記生物粒子がメイオファウナである、請求項１又は２に記載の生物粒子を含む試料の前処理方法。
【請求項４】
前記コロイド溶液がコロイド状シリカである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生物粒子を含む試料の前処理方法。
【請求項５】
前記生物粒子が、色素によって染色されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の生物粒子を含む試料の前処理方法。
【請求項６】
前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を、前記画分（１ｂ）：前記コロイド溶液＝１：１〜１：５の割合で添加する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の生物処理方法。
【請求項７】
検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程と、
前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程と、
前記上清画分（Ｓ０）を、前記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けして前記篩（Ｃ）を通過しない画分を取得する工程と、
前記篩（Ｃ）を通過しない画分に前記コロイド溶液を添加して、前記上清画分（Ｓ０）を調製する工程と、
前記調製された上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体をフローセルに流しながら、前記フローセルを流れる前記流体を撮像する工程と、
を含む、生物粒子の画像取得方法。
【請求項８】
検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程と、
前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程と、
前記遠心分離後の沈殿（Ｐｎ−１）を、前記コロイド溶液に懸濁して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓｎ）を取得することを、ｎ回（ｎは１以上の整数であり、沈殿（Ｐｎ−１）はｎ−１回目の遠心分離後に得られる沈殿であり、上清画分（Ｓｎ）はｎ回目の遠心分離後に得られる上清画分である。）行う工程と、
前記上清画分（Ｓ０）及び前記上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を、前記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けして前記篩（Ｃ）を通過しない画分を取得する工程と、
前記篩（Ｃ）を通過しない画分に前記コロイド溶液を添加して、前記上清画分（Ｓ０）及び前記上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を調製する工程と、
前記調製された上清画分（Ｓ０）及び前記上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の少なくとも一部を含む流体をフローセルに流しながら、前記フローセルを流れる前記流体を撮像する工程と、
を含む、生物粒子の画像取得方法。
【請求項９】
前記上清画分（Ｓ０）及び前記上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の一部又は全てを混合し、前記混合物を前記篩（Ｃ）で篩分けする、請求項８に記載の生物粒子の画像取得方法。
【請求項１０】
前記撮像を終了した前記流体を回収する工程をさらに含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の生物粒子の画像取得方法。
【請求項１１】
前記生物粒子がメイオファウナである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の生物粒子の画像取得方法。
【請求項１２】
前記コロイド溶液がコロイド状シリカである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の生物粒子の画像取得方法。
【請求項１３】
前記生物粒子が、色素によって染色されている、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の生物粒子の画像取得方法。
【請求項１４】
前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を、前記画分（１ｂ）：前記コロイド溶液＝１：１〜１：５の割合で添加する、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の生物処理方法。
【請求項１５】
目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とを備え、検出対象である生物粒子を含む試料の篩分けを行って、前記篩（Ａ）を通過し、かつ前記篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する篩分け部と、
前記篩分け部で取得された画分（１ｂ）に、コロイド溶液を添加するコロイド溶液添加部と、
前記コロイド溶液が添加された画分（１ｂ）を遠心分離する遠心分離部と、
前記遠心分離部における遠心分離後に、上清画分を取得する上清画分取得部と、
前記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）と篩（Ｃ）を通過しない画分にコロイド溶液を添加する構成とを備え、前記上清画分を篩分けして、前記篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、前記篩（Ｃ）を通過しない画分にコロイド溶液を添加する上清画分調製部と、
を備える、生物粒子を含む試料の前処理装置。
【請求項１６】
篩（Ａ）と、前記篩（Ａ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｂ）とを備え、検出対象である生物粒子を含む試料の篩分けを行って、前記篩（Ａ）を通過し、かつ前記篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する篩分け部と、
前記篩分け部で取得された画分（１ｂ）に、コロイド溶液を添加するコロイド溶液添加部と、
前記コロイド溶液が添加された画分（１ｂ）を遠心分離する遠心分離部と、
前記遠心分離部における遠心分離後に、上清画分を取得する上清画分取得部と、
前記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）と前記篩（Ｃ）を通過しない画分にコロイド溶液を添加する構成とを備え、上清画分を篩分けして、前記篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、前記篩（Ｃ）を通過しない画分にコロイド溶液を添加する上清画分調製部と、
フローセルとカメラとを備え、前記上清画分取得部で取得された上清画分の少なくとも一部を含む流体を前記フローセルに流しながら、前記フローセルを流れる前記流体を前記カメラで撮像する撮像部と、を備え、
前記篩（Ａ）は、前記フローセルの幅方向及び奥行方向の内径のいずれか大きい方よりも小さい目開きを有する、
生物粒子画像取得装置。
【請求項１７】
前記篩（Ｂ）は、前記フローセルの奥行方向の内径及び前記カメラの焦点深度により規定される前記カメラが焦点を合わせることが可能な粒子径の最小値以上の目開きを有する、
請求項１６に記載の生物粒子画像取得装置。
【請求項１８】
篩（Ａ）と、前記篩（Ａ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｂ）とを備え、検出対象である生物粒子を含む試料の篩分けを行って、前記篩（Ａ）を通過し、かつ前記篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する篩分け部と、
前記篩分け部で取得された画分（１ｂ）に、コロイド溶液を添加するコロイド溶液添加部と、
前記コロイド溶液が添加された画分（１ｂ）を遠心分離する遠心分離部と、
前記遠心分離部における遠心分離後に、上清画分を取得する上清画分取得部と、
前記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）と前記篩（Ｃ）を通過しない画分にコロイド溶液を添加する構成とを備え、上清画分を篩分けして、前記篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、前記篩（Ｃ）を通過しない画分にコロイド溶液を添加する上清画分調製部と、
フローセルとカメラとを備え、前記上清画分取得部で取得された上清画分の少なくとも一部を含む流体を前記フローセルに流しながら、前記フローセルを流れる前記流体を前記カメラで撮像する撮像部と、を備え、
前記篩（Ａ）は、前記フローセルの幅方向及び奥行方向の内径のいずれか大きい方よりも小さい目開きを有し、
前記篩（Ｂ）は、前記フローセルの奥行方向の内径及び前記カメラの焦点深度により規定される前記カメラが焦点を合わせることが可能な粒子径の最小値以上の目開きを有する、
生物粒子画像取得装置。
【請求項１９】
前記篩（Ａ）の目開きは２５０〜１０００μｍであり、前記篩（Ｂ）の目開きは３２〜６３μｍである、
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の生物粒子画像取得装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物粒子を含む試料の前処理方法、生物粒子の画像取得方法、生物粒子を含む試料の前処理装置、及び生物粒子の画像取得装置に関する。
本願は、２０１６年１１月３０日に、日本に出願された特願２０１６−２３２８６８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
メイオファウナとは、目開き１ｍｍの篩を通過し、目開き３２μｍの篩に捉えられる生物の総称である。メイオファウナは、物質循環や堆積物の安定に大きな影響を与えることが知られており、深海生態系の重要な構成要素である。また、世代時間が短く、環境の変化に素早く反応することから、環境の変化を検出しやすい。さらに、メイオファウナは、生物の生息密度が低い深海底でも生息密度が高く、定量採集も容易であることから、統計解析が容易である。これらのことから、メイオファウナは、深海底における環境影響評価の対象生物として重要視されている。【０００３】
従来、メイオファウナの種類の判別及び計数は、顕微鏡観察により行われており、細かな作業が必須である。そのため、１つのサンプルを処理するために膨大な時間を要している。環境影響評価を行う場合には、大量のサンプルを処理する必要があることから、全てのサンプルを処理するために数年以上かかることもある。また、顕微鏡観察による解析には、専門的知識と器用さが必要であり、そのような人材を安定的に確保することも難しい。さらに、顕微鏡観察による解析では、観察者により、解析結果にばらつきが出る可能性もある。【０００４】
一方、流体中の粒子を解析するための装置として、例えば、特許文献１に記載の装置が提案されている。特許文献１に記載の装置は、流体希釈システムと粒子イメージングシステムとを備え、サンプル流体が不透明又は粘性がある場合には、流体希釈システムによりサンプル流体の希釈を行うようになっている。流体希釈システムは、粒子イメージングシステムで取得された画像が不鮮明であった場合に、作動するように制御されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１４／０１４６１５７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に記載の装置は、粒子イメージングシステムで取得された画像が不鮮明であった場合に、流体希釈システムが作動するため、流体希釈システムが作動する前のサンプル流体は無駄となってしまう。また、メイオファウナのような堆積物中に生息する生物を対象とする場合、海底等から採取されたサンプルには、対象とする生物粒子に対して堆積物粒子が圧倒的に多く存在する。そのため、希釈したのみでは対象とする生物粒子を観察することが難しい。さらに、大量の堆積物粒子を含むサンプルを、粒子イメージングシステムが使用するフローセルに流し込むと、フローセル流路に堆積物粒子が詰まってしまうという問題もある。一方、堆積物粒子によるフローセルの目詰まりしなくなる程度までサンプルを希釈しようとすると、フローセルに投入するサンプル量が膨大となり現実的ではない。【０００７】
そこで、本発明は、堆積物粒子が存在する場合であっても、迅速に生物粒子の解析を行うことが可能な技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程と、前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程と、を含む、生物粒子を含む試料の前処理方法である。【０００９】
本発明の一態様は、検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程と、前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程と、前記遠心分離後の沈殿を、コロイド溶液に懸濁して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓｎ）を取得することを、ｎ回（ｎは１以上の整数であり、沈殿（Ｐｎ−１）はｎ−１回目の遠心分離後に得られる沈殿であり、上清画分（Ｓｎ）はｎ回目の遠心分離後に得られる上清画分である。）行う工程と、を含む、生物粒子を含む試料の前処理方法である。【００１０】
本発明の一態様は、上記生物粒子を含む試料の前処理方法であって、前記上清画分（Ｓ０）を、前記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けして前記篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、前記画分にコロイド溶液を添加する工程をさらに含む、方法である。【００１１】
本発明の一態様は、上記生物粒子を含む試料の前処理方法であって、前記上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を前記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けして前記篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、前記画分にコロイド溶液を添加する工程をさらに含む、方法である。【００１２】
本発明の一態様は、上記生物粒子を含む試料の前処理方法であって、前記生物粒子がメイオファウナである、方法である。【００１３】
本発明の一態様は、上記生物粒子を含む試料の前処理方法であって、前記コロイド溶液がコロイド状シリカである、方法である。【００１４】
本発明の一態様は、上記生物粒子を含む試料の前処理方法であって、前記生物粒子が、色素によって染色されている、方法である。【００１５】
本発明の一態様は、検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程と、前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程と、前記上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体をフローセルに流しながら、前記フローセルを流れる流体を撮像する工程と、を含む、生物粒子の画像取得方法である。【００１６】
本発明の一態様は、検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程と、前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程と、前記遠心分離後の沈殿（Ｐｎ−１）を、前記コロイド溶液に懸濁して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓｎ）を取得することを、ｎ回（ｎは１以上の整数であり、沈殿（Ｐｎ−１）はｎ−１回目の遠心分離後に得られる沈殿であり、上清画分（Ｓｎ）はｎ回目の遠心分離後に得られる上清画分である。）行う工程と、前記上清画分（Ｓ０）及び前記のｎ回分の上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の少なくとも一部を含む流体をフローセルに流しながら、前記フローセルを流れる流体を撮像する工程と、を含む、生物粒子の画像取得方法である。【００１７】
本発明の一態様は、上記生物粒子の画像取得方法であって、前記上清画分（Ｓ０）及び前記上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の一部又は全部を混合し、前記混合物の少なくとも一部を含む流体をフローセルに流す、方法である。【００１８】
本発明の一態様は、上記生物粒子の画像取得方法であって、前記のフローセルに流す流体が、前記コロイド溶液を含む、方法である。【００１９】
本発明の一態様は、上記生物粒子の画像取得方法であって、前記のフローセルに流す流体が、前記上清画分（Ｓ０）を、前記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けして前記篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、前記画分に前記コロイド溶液を添加したものを含む、方法である。【００２０】
本発明の一態様は、上記生物粒子の画像取得方法であって、前記のフローセルに流す流体が、前記上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を、前記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けして前記篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、前記画分に前記コロイド溶液を添加したものを含む、方法である。【００２１】
本発明の一態様は、上記生物粒子の画像取得方法であって、前記撮像を終了した前記流体を回収する工程をさらに含む、方法である。【００２２】
本発明の一態様は、上記生物粒子の画像取得方法であって、前記生物粒子がメイオファウナである、方法である。【００２３】
本発明の一態様は、上記生物粒子の画像取得方法であって、前記コロイド溶液がコロイド状シリカである、方法である。【００２４】
本発明の一態様は、上記生物粒子の画像取得方法であって、前記生物粒子が、色素によって染色されている、方法である。【００２５】
本発明の一態様は、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とを備え、検出対象である生物粒子を含む試料の篩分けを行って、前記篩（Ａ）を通過し、かつ前記篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する篩分け部と、前記篩分け部で取得された画分（１ｂ）に、コロイド溶液を添加するコロイド溶液添加部と、前記コロイド溶液が添加された画分（１ｂ）を遠心分離する遠心分離部と、前記遠心分離部における遠心分離後に、上清画分を取得する上清画分取得部と、を備える、生物粒子を含む試料の前処理装置である。【００２６】
本発明の一態様は、篩（Ａ）と、前記篩（Ａ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｂ）とを備え、検出対象である生物粒子を含む試料の篩分けを行って、前記篩（Ａ）を通過し、かつ前記篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する篩分け部と、前記篩分け部で取得された画分（１ｂ）に、コロイド溶液を添加するコロイド溶液添加部と、前記コロイド溶液が添加された画分（１ｂ）を遠心分離する遠心分離部と、前記遠心分離部における遠心分離後に、上清画分を取得する上清画分取得部と、フローセルとカメラとを備え、前記上清画分取得部で取得された上清画分の少なくとも一部を含む流体を前記フローセルに流しながら、前記フローセルを流れる前記流体を前記カメラで撮像する撮像部と、を備え、前記篩（Ａ）は、前記フローセルの幅方向及び奥行方向の内径のいずれか大きい方よりも小さい目開きを有する、生物粒子画像取得装置である。【００２７】
本発明の一態様は、上記物粒子画像取得装置であって、前記篩（Ｂ）は、前記フローセルの奥行方向の内径及び前記カメラの焦点深度により規定される前記カメラが焦点を合わせることが可能な大きさ以上の目開きを有する、生物粒子画像取得装置である。【００２８】
本発明の一態様は、上記物粒子画像取得装置であって、前記篩（Ｂ）は、前記フローセルの奥行方向の内径及び前記カメラの焦点深度により規定される前記カメラが焦点を合わせることが可能な粒子径の最小値以上の目開きを有する、生物粒子画像取得装置である。【００２９】
本発明の一態様は、上記物粒子画像取得装置であって、前記篩（Ａ）の目開きは２５０〜１０００μｍであり、前記篩（Ｂ）の目開きは３２〜６３μｍである、生物粒子画像取得装置である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、篩分けにより、検出対象の生物粒子を濃縮した後、さらにコロイド溶液を添加して遠心分離を行っているため、元の試料に堆積物粒子が大量に存在する場合であっても、効率よく検出対象である生物粒子を濃縮することができる。そのため、迅速に生物粒子の解析を行うことが可能な技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の一実施形態に係る生物粒子の画像取得方法の概略を示す。
【図２】本発明の一実施形態に係る生物粒子の画像取得方法における工程の一例を示す。
【図３】本発明の一実施形態に係る生物粒子を含む試料の前処理装置の構成例を示す。
【図４】本発明の一実施形態に係る生物粒子画像取得装置の構成例を示す。
【図５】本発明の一実施形態に係る方法で取得したメイオファウナの画像の一例を示す。（ａ）は線虫類、（ｂ）はカイアシ類、（ｃ）はノープリウス幼生、（ｄ）は動吻動物、（ｅ）は有孔虫である。
【図６】本発明の一実施形態に係る方法で取得した画像に基づき計数したメイオファウナの個体数と、顕微鏡下で計数された個体数との相関を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
＜生物粒子を含む試料の前処理方法＞
[第１実施形態]
１実施形態において、本発明は、検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程(以下、「工程（Ｉ）」という。)と、前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程(以下、「工程（ＩＩ）」という。)と、を含む、生物粒子を含む試料の前処理方法である。
【００３３】
本実施形態の方法の概略を、図１ａ〜１ｃを参照して説明する。
まず、検出対象である生物粒子を含む試料１を、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と、目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とを使用して篩分けし、篩（Ａ）を通過し、かつ篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する（図１ａ；工程（Ｉ））。
次に、画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液２を添加して、適宜撹拌する（図１ｂ）。その後、画分（１ｂ）とコロイド溶液２とを含む混合物３を、遠心分離して、上清画分（Ｓ０）を取得する（図１ｃ）。（以上、工程（ＩＩ））。
以下、本実施形態の方法の各工程について、説明する。
【００３４】
（工程（Ｉ））
工程（Ｉ）は、検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程である。
【００３５】
工程（Ｉ）では、検出対象である生物粒子を含む試料１の篩分けを行う。本実施形態の方法において、検出対象とする生物粒子は、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない生物粒子である。そのような生物粒子の例としては、メイオファウナを挙げることができる。検出対象とする生物粒子は、目開き２５０〜５００μｍの篩を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩を通過しない粒子であってもよく、目開き２５０μｍの篩を通過し、かつ目開き６３μｍの篩を通過しない粒子であってもよい。
【００３６】
本実施形態の方法では、堆積物を多く含む試料であっても、生物種を分類するのに十分な画質の画像を取得することができる。そのため、検出対象とする生物粒子は、堆積物中に生息する生物であってもよい。そのような生物の例としては、例えば、海底、湖底、又は川底等に生息する底生生物等を挙げることができる。底生生物であるメイオファウナは、この点からも、検出対象の生物粒子として適している。
【００３７】
本実施形態の方法で検出対象とする生物粒子は、生物体全体であってもよく、生物体の一部であってもよい。また、生物粒子は、胞子等の休眠中の粒子や、卵等であってもよい。また、生きているものに限定されず、死骸であってもよい。
【００３８】
本実施形態の方法で篩分けする試料１は、検出対象とする生物粒子を含むものであれば、特に限定されない。試料１としては、例えば、検出対象とする生物粒子が生息する環境から採取された試料等が挙げられる。本実施形態の方法では、試料が堆積物を含んでいても構わないため、海底、湖底、又は川底等から採取された堆積物試料を試料１として用いてもよい。例えば、検出対象とする生物粒子がメイオファウナである場合には、深海底から採取された堆積物試料を、試料１として用いることができる。
【００３９】
本実施形態の方法で篩分けする試料１は、環境中から採取されたそのままの試料であってもよいし、固定や染色等の処理が施されたものであってもよい。試料の固定処理を行った場合には、試料の腐敗を防ぐことができる。そのため、採取した試料をすぐに使用しない場合には、試料の固定処理を行うことが好ましい。固定処理の方法は、特に限定されず、一般的に用いられる方法で試料の固定処理を行えばよい。例えば、ホルマリン、エタノール、ルゴール液、グルタールアルデヒド、ＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等の試薬を用いたり、冷凍することによって固定処理を行うことができる。好適な固定処理の方法としては、ホルマリン固定を挙げることができる。
【００４０】
また、試料の染色処理を行った場合には、後に、前処理試料中の生物粒子の画像を取得した場合に、当該画像において、生物粒子の視認が容易になる。そのため、篩分けを行う前に、試料１中の生物粒子は、色素等により染色されていることが好ましい。染色処理の方法は、特に限定されず、一般的に用いられる色素等を使用して試料の染色処理を行えばよい。例えば、ローズベンガル、コンゴーレッド、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｇｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等を用いて、染色処理を行うことができる。好適な染色処理の方法としては、ローズベンガル染色を挙げることができる。
【００４１】
試料１の篩分けには、少なくとも２つの篩を使用する。一方は、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）であり、他方は、目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）である。目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）は、試料１から、前記篩を通過しない画分を除去するために使用する。また、目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）は、試料１から、前記篩を通過する画分を除去するために使用する。そして、工程（Ｉ）では、試料１において、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分を取得する。これにより、試料１に含まれる径の大きい堆積物を除去するとともに、検出対象とする生物粒子よりも小さい粒子を除去することができる。
【００４２】
上記篩（Ａ）及び（Ｂ）は、上記の範囲の目開きを有するものであれば、特に限定されず、一般的に使用されるものを用いればよい。また、検出対象とする生物粒子のサイズに合わせて、上記範囲内で、目開きのサイズを変動させてもよい。篩分けで取得する画分（１ｂ）の目開きの範囲を狭くすることにより、後の撮像工程において、検出対象とする生物粒子をより効率よく撮像することができる。
【００４３】
例えば、検出対象とする生物粒子がメイオファウナである場合、約９８％以上の個体が３８〜５００μｍの篩画分に存在し、約８３％以上の個体が３８〜２５０μｍの篩画分に存在し、約７５％の個体が６３〜２５０μｍの篩画分に存在する（表１参照）。そのため、工程（Ｉ）では、２５０〜５００μｍの篩を通過し、かつ３２〜６３μｍの篩を通過しない画分を取得するようにしてもよく、２５０〜５００μｍの篩を通過し、かつ３８〜６３μｍの篩を通過しない画分を取得するようにしてもよく、また、２５０μｍの篩を通過し、かつ６３μｍの篩を通過しない画分を取得するようにしてもよい。
【００４４】
本工程における篩分けの方法は、特に限定されず、一般的に用いられる方法で篩分けを行えばよい。例えば、図１ａに示されるように、容器１０に、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と、目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とを設置し、試料１を、篩（Ａ）の上から注入することにより、篩分けを行ってもよい。これにより、試料１は、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過しない画分（１ａ）と、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）と、目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過する画分（１ｃ）とに篩分けされる。
【００４５】
なお、図１ａの例では、容器１０を振とう機１３上に設置し、振とう機１３で振とうしながら篩分けを行っている。振とうしながら篩分けを行うことにより、篩分けに要する時間を短縮することができる。
【００４６】
篩分けの後は、例えば、篩（Ａ）を捕捉された粒子ごと除去し、篩（Ｂ）を捕捉された粒子ごと取得することにより、画分（１ｂ）を取得することができる。
【００４７】
なお、図１ａの例では、容器１０に、篩（Ａ）と篩（Ｂ）とを設置したが、篩（Ａ）と篩（Ｂ）の設置方法はこれに限定されない。例えば、篩（Ａ）を通過しない画分（１ａ）を捕集する容器と、篩（Ａ）を通過しかつ篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を捕集する容器と、篩（Ｂ）を通過する画分（１ｃ）を捕集する容器とを、別々の容器とし、篩（Ａ）を通過しない画分（１ａ）を捕集する容器に篩（Ａ）を設置し、篩（Ａ）を通過しかつ篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を捕集する容器に篩（Ｂ）を設置するようにしてもよい。この場合、試料１の篩分けを行った後、篩（Ｂ）を設置した容器を取得することにより、画分（１ｂ）を取得することができる。
【００４８】
（工程（ＩＩ））
工程（ＩＩ）は、画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程である。
【００４９】
工程（ＩＩ）では、まず、画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液２を添加する（図１ｂ）。図１ｂの例では、遠沈管２１に、画分（１ｂ）を入れ、コロイド溶液２を添加して、画分（１ｂ）とコロイド溶液２とを含む混合物３を取得している。コロイド溶液２は、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するものであれば、特に限定されない。画分１ｂに含まれる生物粒子の密度は約１．０〜１．２ｇ／ｃｍ３であり、堆積物粒子の密度は約２．５〜２．８ｇ／ｃｍ３である。そのため、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液２を、画分１ｂに添加することにより、遠心分離を行った際に、生物粒子と堆積物とを、上清画分と沈殿とに分離することができる。コロイド溶液２の密度は、１．１０〜２．００ｇ／ｃｍ３であることが好ましく、１．１０〜１．５０ｇ／ｃｍ３であることがより好ましい。
【００５０】
また、コロイド溶液２は、ｐＨが４．０〜１１．０であることが好ましい。ｐＨがこの範囲であれば、生物粒子への悪影響を避けることができる。
【００５１】
工程（ＩＩ）で使用可能なコロイド溶液２の例としては、コロイド状シリカを挙げることができる。また、コロイド溶液２は、市販のものを用いてもよい。例えば、ＬＵＤＯＸ（登録商標）  ＨＳ−４０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；密度１．３ｇ／ｃｍ３、ｐＨ９．５−１０．３）、Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）（ＧＥヘルスケア；密度１．１３ｇ／ｃｍ３、ｐＨ９．０）、ＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１．２５ｇ／ｃｍ３、ｐＨ５．０）等をコロイド溶液２として用いることができる。
【００５２】
コロイド溶液２の添加量は、特に限定されず、画分（１ｂ）を懸濁できる量であればよい。例えば、コロイド溶液２の添加量は、篩分け前の試料１との体積比として、試料１：コロイド溶液２＝１：１〜５となるようにすることができる。
【００５３】
画分（１ｂ）に、コロイド溶液２を添加した後、画分（１ｂ）とコロイド溶液２とを含む混合物３を、遠心分離機２０で遠心分離する（図１ｃ）。これにより、混合物３は、上清画分（Ｓ０）と、沈殿（Ｐ０）とに分離する。上清画分（Ｓ０）には、検出対象である生物粒子が多く含まれており、沈殿（Ｐ０）には、堆積物が多く含まれている。
【００５４】
本工程における遠心分離の条件は、検出対象とする生物粒子の種類に応じて、適宜選択することができる。例えば、検出対象がメイオファウナである場合には、遠心分離の条件として、６００〜１０００Ｇを挙げることができ、７００〜９００Ｇとすることが好ましく、７５０〜８５０Ｇとすることがより好ましく、８００Ｇとすることが特に好ましい。
また、遠心分離の時間としては、３〜３０分を例示することができ、５〜２０分が好ましく、８〜１５分がより好ましく、１０分が特に好ましい。
【００５５】
遠心分離後は、ピペット等を用いて、上清画分（Ｓ０）を取得すればよい。
【００５６】
本実施形態の試料前処理方法により調製された試料は、例えば、生物粒子の画像を取得するための試料として使用することができる。例えば、後述する図１ｄに示されるようなフローセルを備えた撮像装置において、フローセルに投入するための試料として好適に用いることができる。
【００５７】
本実施形態の試料前処理方法によれば、多くの堆積物を含む試料であっても、堆積物を効率的に除去して、生物粒子の画像を取得するために適した試料を調製することができる。また、本実施形態の試料前処理方法により調製された試料が、コロイド溶液を含む場合には、生物粒子の画像を取得するためにフローセルに投入した際に、フローセル中での生物粒子の沈降を防ぐことができ、フローセルが生物粒子で詰まることを防止することができる。
【００５８】
また、本実施形態の試料前処理方法により調製された試料は、ゲノム解析等の様々な解析に供することもできる。
【００５９】
（任意工程）
本実施形態の方法は、上記工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ）に加えて、さらに、上清画分（Ｓ０）を調製する工程を含んでいてもよい。
【００６０】
上清画分（Ｓ０）を調製する工程としては、例えば、上清画分（Ｓ０）にコロイド溶液２を添加する工程を挙げることができる。上清画分（Ｓ０）は、通常、コロイド溶液２を含むが、さらにコロイド溶液２を添加することにより、試料中での生物粒子の浮力を調整することができる。
【００６１】
また、上清画分（Ｓ０）を調製する工程としては、篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けして篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、前記画分にコロイド溶液２を添加する工程を挙げることもできる。篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けすることにより、余分なコロイド粒子を除去し、対象とする生物粒子を濃縮することができる。また、篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きの篩を用いることにより、検出対象とする生物粒子のロストを少なくすることができる。篩（Ｃ）の目開きは、工程（Ｉ）で使用した篩（Ｂ）の目開きよりも小さければ、特に限定されないが、例えば、３０〜６３μｍを挙げることができる。
【００６２】
なお、本工程で使用するコロイド溶液２は、工程（ＩＩ）で使用したものと同様のものを用いればよい。
【００６３】
[第２実施形態]
１実施形態において、本発明は、検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程（以下、「工程Ｉ」という。）と、前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程（以下、「工程ＩＩ」という。）と、前記遠心分離後の沈殿（Ｐｎ−１）を、コロイド溶液に懸濁して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓｎ）を取得することを、ｎ回（ｎは１以上の整数であり、沈殿（Ｐｎ−１）はｎ−１回目の遠心分離後に得られる沈殿であり、上清画分（Ｓｎ）はｎ回目の遠心分離後に得られる上清画分である。）行う工程（以下、「工程ＩＩ’」という。）と、を含む、生物粒子の画像を取得するための試料前処理方法である。
【００６４】
本実施形態の方法の概略を、図１ａ〜ｃ、図２ａ〜ｃ及び図２ａ−ｎ〜ｃ−ｎを参照して説明する。
まず、検出対象である生物粒子を含む試料１を、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と、目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とを使用して篩分けし、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する（図１ａ；工程（Ｉ））。
次に、画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液２を添加して、適宜撹拌する（図１ｂ）。その後、画分（１ｂ）とコロイド溶液２とを含む混合物３を、遠心分離して、上清画分（Ｓ０）を取得する（図１ｃ）。（以上、工程（ＩＩ））
次に、遠心分離後の沈殿（Ｐ０）に、コロイド溶液２を添加して（図２ａ）、沈殿（Ｐ０）をコロイド溶液２に懸濁し、懸濁物６を作成する（図２ｂ）。そして、懸濁物６を遠心分離し、上清画分（Ｓ１）を取得する（図２ｃ）。このようにして、ｎ回分遠心分離した後の上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を取得する（図２ａ−ｎ〜ｃ−ｎ））。（以上、工程（ＩＩ’））
以下、本実施形態の方法の各工程について、説明する。
【００６５】
（工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ））
工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ）は、上述の第１実施形態の方法における工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ）と同じである。そのため、説明は省略する。
【００６６】
（工程（ＩＩ’））
工程（ＩＩ’）は、遠心分離後の沈殿（Ｐｎ−１）を、コロイド溶液に懸濁して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓｎ）を取得することを、ｎ回（ｎは１以上の整数であり、沈殿（Ｐｎ−１）はｎ−１回目の遠心分離後に得られる沈殿であり、上清画分（Ｓｎ）はｎ回目の遠心分離後に得られる上清画分である。）行う工程である。
【００６７】
工程（ＩＩ’）においては、工程（ＩＩ）における遠心分離で得られた沈殿（Ｐ０）に、コロイド溶液２を添加する（図２ａ）。コロイド溶液２は、工程（ＩＩ）で用いたものと同じものを用いればよい。そして、コロイド溶液２に、沈殿（Ｐ０）を懸濁し、懸濁物６を得る（図２ｂ）。この懸濁物６を遠心分離すると、上清画分（Ｓ１）と沈殿（Ｐ１）とに分離する（図２ｃ）。上清画分（Ｓ１）には、沈殿（Ｐ０）に残存していた生物粒子が移行し、沈殿（Ｐ１）には堆積物が残存する。
【００６８】
上記の遠心分離の条件は、工程（ＩＩ）における遠心分離の条件と同じであってもよく、異なっていてもよいが、同じであることが好ましい。遠心分離後は、ピペット等を用いて、上清画分（Ｓ１）を取得すればよい。
【００６９】
上記遠心分離で得られた沈殿（Ｐ１）に、必要に応じて、再度、コロイド溶液２を添加し、懸濁して、遠心分離を行う。そして、遠心分離後に得られた上清画分（Ｓ２）を取得する。このようにしてｎ回目の遠心分離で得られる上清画分を上清画分（Ｓｎ）、ｎ回目の遠心分離で得られる沈殿を沈殿（Ｐｎ）とすると、沈殿（Ｐｎ−１）にコロイド溶液２を添加し、懸濁して、遠心分離を行うことをｎ回行うことにより、上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を取得することができる。
【００７０】
本工程において、ｎは１以上の整数であればよく、遠心分離の回数は特に限定されない。遠心分離の回数を多くするほど（ｎが大きくなるほど）、沈殿（Ｐｎ）に残存する生物粒子の回収率を上げることができる。通常、ｎは、１〜５の整数とすることができ、１〜３の整数であってもよく、例えば２又は３とすることができる。
【００７１】
なお、沈殿（Ｐｎ−１）に対するコロイド溶液２の添加量は、沈殿（Ｐｎ−１）を懸濁できる量であれば特に限定されない。沈殿（Ｐｎ−１）の量に応じて、適当な量のコロイド溶液２を添加し、沈殿（Ｐｎ−１）を懸濁すればよい。例えば、添加するコロイド溶液２の量は、沈殿（Ｐｎ−１）との体積比として、沈殿（Ｐｎ−１）：コロイド溶液２＝２：３等を挙げることができる。
【００７２】
本実施形態の方法によって前処理された試料は、通常、コロイド溶液２を含む。工程（ＩＩ）で得られた上清画分（Ｓ０）、及び工程（ＩＩ’）で得られた上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）は、その一部又は全部を混合し、後述する画像の取得や解析等に用いることができる。
【００７３】
本実施形態の試料前処理方法により調製された試料は、第１実施形態の方法で調製された試料と同様に、生物粒子の画像を取得するための試料として使用することができる。
【００７４】
本実施形態の方法によれば、多くの堆積物を含む試料であっても、堆積物を効率的に除去して、生物粒子の画像を取得するために適した試料を調製することができる。また、工程（ＩＩ’）において、遠心分離で得られた沈殿にコロイド溶液を添加してさらに遠心分離を行っているため、沈殿に生物粒子が残存していた場合であっても、当該生物粒子を回収することができる。
【００７５】
また、本実施形態の試料前処理方法により調製された試料は、第１実施形態の方法で調製された試料と同様に、ゲノム解析等の様々な解析に供することもできる。
【００７６】
（任意工程）
本実施形態の方法は、上記工程（Ｉ）、工程（ＩＩ）及び工程（ＩＩ’）に加えて、さらに、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を調製する工程を含んでいてもよい。
【００７７】
上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を調製する工程としては、例えば、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）にコロイド溶液２を添加する工程を挙げることができる。上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）は、通常、コロイド溶液２を含むが、さらにコロイド溶液２を添加することにより、試料中での生物粒子の浮力を調整することができる。
【００７８】
なお、コロイド溶液２の添加は、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）のそれぞれに対して、個別に行ってもよく、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の一部又は全部の混合物に対して、行ってもよい。コロイド溶液２の添加を、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）のそれぞれに対して、個別に行った場合には、コロイド溶液２の添加後に、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の一部又は全部を混合してもよい。
【００７９】
また、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を調製する工程としては、上記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けして篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、前記画分にコロイド溶液２を添加する工程を挙げることもできる。篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けすることにより、余分なコロイド粒子を除去して、対象とする生物粒子を濃縮することができる。また、篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きの篩を用いることにより、検出対象とする生物粒子のロストを少なくすることができる。篩（Ｃ）の目開きは、工程（Ｉ）で使用した篩（Ｂ）の目開きよりも小さければ、特に限定されないが、例えば、３０〜６３μｍを挙げることができる。
【００８０】
なお、本工程で使用するコロイド溶液２は、工程（ＩＩ）で使用したもの同様のものを用いればよい。
【００８１】
篩（Ｃ）を用いた篩分けは、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）のそれぞれに対して、個別に行ってもよく、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の一部又は全部の混合物に対して、行ってもよい。篩分け及びコロイド溶液２の添加を、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）のそれぞれに対して、個別に行った場合には、篩分け及びコロイド溶液２の添加後に、得られた試料の一部又は全部を混合してもよい。
【００８２】
＜生物粒子の画像取得方法＞
[第１実施形態]
１実施形態において、本発明は、検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程（以下、工程（Ｉ）という。）と、前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程（以下、工程（ＩＩ）という。）と、前記上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体をフローセルに流しながら、前記フローセルを流れる流体を撮像する工程（以下、工程（ＩＩＩ）という。）と、を含む、生物粒子の画像取得方法である。
【００８３】
本実施形態の方法の概略を、図１ａ〜１ｅを参照して説明する。
まず、検出対象である生物粒子を含む試料１を、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と、目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とを使用して篩分けし、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する（図１ａ；工程（Ｉ））。
次に、画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液２を添加して、適宜撹拌する（図１ｂ）。その後、画分（１ｂ）とコロイド溶液２とを含む混合物３を、遠心分離して、上清画分（Ｓ０）を取得する（図１ｃ）。（以上、工程（ＩＩ））。
次に、上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体４を、フローセル３１に流しながら、カメラ３２により、フレーム４０内のフローセル３１を撮像する（図１ｄ；工程（ＩＩＩ））。なお、図１ｄの例では、対物レンズ３３を介して撮像を行っている。
これにより、撮像時に、フレーム４０内に存在していた生物粒子５ｂの画像４１を取得することができる。
以下、本実施形態の方法の各工程について、説明する。
【００８４】
（工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ））
工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ）は、上述の「＜生物粒子を含む試料の前処理方法＞」における工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ）と同じである。そのため、説明は省略する。
【００８５】
（工程（ＩＩＩ））
工程（ＩＩＩ）は、前記上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体をフローセルに流しながら、前記フローセルを流れる流体を撮像する工程である。
【００８６】
工程（ＩＩＩ）では、まず、上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体４を、フローセル３１に流す。フローセル３１に流す流体４は、コロイド溶液２を含むことが好ましい。流体４が、コロイド溶液２を含むことにより、検出対象である生物粒子の沈降を防ぎ、生物粒子によりフローセル３１が詰まることを防止することができる。
【００８７】
上清画分（Ｓ０）は、通常コロイド溶液２を含むため、上清画分（Ｓ０）をそのまま流体４としてフローセル３１に流してもよい。また、上清画分（Ｓ０）に、さらにコロイド溶液２を添加したものを、流体４として、フローセル３１に流してもよい。
【００８８】
また、上清画分（Ｓ０）に対して、篩分け等の処理を行い、所定の画分を取得して流体４を調製し、フローセル３１に流すようにしてもよい。例えば、上記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）を用いて、上清画分（Ｓ０）から余分なコロイド粒子を除き、篩（Ｃ）を通過しない画分を取得して、当該画分にコロイド溶液２を添加し、流体４としてもよい。すなわち、流体４は、上清画分（Ｓ０）を、篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けして篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、前記画分にコロイド溶液２を添加したものを含んでいてもよい。篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けすることにより、余分なコロイド粒子を除去して、対象とする生物粒子が濃縮され、効率よく撮像を行うことができる。また、篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きの篩を用いることにより、検出対象とする生物粒子のロストを少なくすることができる。篩（Ｃ）の目開きは、工程（Ｉ）で使用した篩（Ｂ）の目開きよりも小さければ、特に限定されないが、例えば、３０〜６３μｍを挙げることができる。
【００８９】
本工程では、上記のように調製した上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体４を、フローセル３１に流しながら、フローセル３１を流れる流体４を撮像する。図１ｄの例では、撮像装置３０内に設置されたカメラ３２により、対物レンズ３３を介して、フローセル３１を流れる流体４が撮像される。図１ｄの例では、フローセル３１の撮像部分（フレーム４０）には、光源３４により、光が照射されるようになっている。
【００９０】
フローセル３１は、内部を流れる流体４を撮像可能なように、透明度の高いものであることが好ましい。フローセル３１の形状は、特に限定されないが、カメラ３２による撮像面が平面となる形状であることが好ましい。フローセル３１の形状の例としては、例えば、直方体が挙げられる。フローセル３１のサイズは、特に限定されず、検出対象の生物粒子に応じて、適宜選択することができる。例えば、検出対象がメイオファウナである場合には、カメラ３２による撮像面に対する奥行方向の内径が、１５０〜５００μｍのものを用いることができる。当該内径は、２００〜４００μｍであることが好ましく、２５０〜３５０μｍであることがより好ましい。
なお、本明細書において、フローセルの「奥行方向の内径」という場合、撮像面に対して垂直方向のフローセルの内径を意味するものとする。また、フローセルの「幅方向の内径」という場合、撮像面に対して平行な方向のフローセルの内径を意味するものとする。
【００９１】
フローセル３１への流体４の投入方法は、特に限定されない。例えば、ピペット等で投入を行ってもよく、フローセル３１の上流側にチューブを接続し、当該チューブの上流端を容器等に入った流体４に接触させて、流体４を吸い上げることにより行ってもよい。また、フローセル３１内の流体４の流れは、例えば、フローセル３１の下流側にチューブ等を介してポンプを接続し、ポンプを稼働させること等により、作り出すことができる。また、流体４をフローセル３１に投入する前に、フローセル３１内（フローセル３１の上流側にチューブを接続した場合は、そのチューブ内も）をコロイド溶液２で満たしておくことが好ましい。
【００９２】
図１ｄの例では、対物レンズ３３を介して、カメラ３２により撮像を行っている。
対物レンズ３３を用いることにより、生物粒子の拡大画像を取得することができる。対物レンズ３３の倍率は、特に限定されず、検出対象の生物粒子に応じて、適宜選択することができる。例えば、検出対象がメイオファウナである場合には、倍率１〜２０倍の対物レンズを用いることができ、倍率２〜１０倍であることが好ましく、倍率２〜５倍であることがより好ましい。なお、対物レンズ３３を用いずに撮像し、撮像後に、画像の拡大処理を行うようにしてもよい。
【００９３】
また、図１ｄの例では、光源３４により、撮像部分に光を照射して、撮像を行っている。撮像部分に光を照射して撮像を行うことにより、より鮮明な画像を取得することができる。光源３４は、撮像に合わせて間欠的に光を照射するものであってもよく、常時光を照射するものであってもよい。照射する光は、特に限定されないが、可視光であることが好ましい。なお、工程（Ｉ）において、試料１に、蛍光色素で染色処理をした試料を用いた場合には、当該蛍光色素を励起する波長の光を照射してもよい。
【００９４】
また、図１ｄの例では、カメラ３２は、フローセル３１上のフレーム４０内に存在する流体４の画像を取得するようになっている。カメラ３２が撮像する画像は、静止画であってもよく、動画であってもよい。静止画を撮像する場合、カメラ３２は、所定時間毎に撮像を行うものであることが好ましい。撮像間隔は、フローセル３１を流れる流体４の流速に応じて、適宜選択すればよい。撮像間隔は、例えば、５〜５０回／秒等とすることができる。
【００９５】
上記のような構成の撮像装置３０において、フローセル３１に、上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体４を流すと、流体４に含まれる生物粒子５ａ〜５ｃが、流体４の流れに応じてフローセル３１内を移動する。この間、カメラ３２は、フローセル３１上のフレーム４０の画像を連続的に取得している。そのため、生物粒子５ａ〜５ｃがフレーム４０内に移動すると、生物粒子５ａ〜５ｃの画像が撮像される。図１ｄの例では、生物粒子５ｂの画像が撮像されている。その結果、生物粒子５ｂの画像４１を取得することができる（図１ｅ）。
【００９６】
本実施形態の方法によって取得された生物粒子の画像は、生物種を分類するための解析に供することができる。例えば、本実施形態の方法によって取得された画像を、目視又は画像解析プログラム等で分類することにより、従来の検鏡による方法よりも、迅速に生物相の解析を行うことが可能となる。
【００９７】
本実施形態の方法によれば、篩分け処理及び遠心処理によって堆積物を除去できるため、堆積物を含む試料であっても効率よく生物粒子の画像を取得することができる。また、フローセルを流れる流体がコロイド溶液を含む場合には、フローセル中での生物粒子の沈降を防ぐことができ、生物粒子によりフローセルが詰まることを防止することができる。
【００９８】
（任意工程）
本実施形態の方法は、上記工程（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に加えて、撮像が終了した流体４を回収する工程をさらに含んでいてもよい。撮像が終了した流体４を回収することにより、流体４に含まれる生物粒子のさらなる解析が可能になる。
【００９９】
撮像を終了した流体４を回収する場合には、例えば、フローセル３１の下流側にチューブ等を接続し、チューブの下流端を密閉容器内等に設置するようにすればよい。前記密閉容器にポンプ等を接続し、密閉容器内の空気を排出するようにすれば、フローセル３１内に流体４の流れを作り出すことができ、さらに、前記密閉容器内に撮像を終了した流体４を回収することができる。
【０１００】
上記のようにして回収された流体４に含まれる生物粒子は、ポンプ等で潰されることなく、ほとんどダメージを受けていない。そのため、生物粒子のさらなる解析に供することができる。
【０１０１】
[第２実施形態]
１実施形態において、本発明は、検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程（以下、「工程（Ｉ）」という。）と、前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程（以下、「工程（ＩＩ）」という。）と、前記遠心分離後の沈殿（Ｐｎ−１）を、前記コロイド溶液に懸濁して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓｎ）を取得することを、ｎ回（ｎは１以上の整数であり、沈殿（Ｐｎ−１）はｎ−１回目の遠心分離後に得られる沈殿であり、上清画分（Ｓｎ）はｎ回目の遠心分離後に得られる上清画分である。）行う工程（以下、「工程（ＩＩ’）」という。）と、前記上清画分（Ｓ０）及び前記のｎ回分の上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の少なくとも一部を含む流体をフローセルに流しながら、前記フローセルを流れる流体を撮像する工程（以下、「工程（ＩＩＩ’）」という。）と、を含む、生物粒子の画像取得方法である。
【０１０２】
本実施形態の方法の概略を、図１ａ〜１ｅ、図２ａ〜ｃ、及び図２ａ−ｎ〜ｃ−ｎを参照して説明する。
まず、検出対象である生物粒子を含む試料１を、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と、目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とを使用して篩分けし、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する（図１ａ；工程（Ｉ））。
次に、画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液２を添加して、適宜撹拌する（図１ｂ）。その後、画分（１ｂ）とコロイド溶液２とを含む混合物３を、遠心分離して、上清画分（Ｓ０）を取得する（図１ｃ）。（以上、工程（ＩＩ））
次に、遠心分離後の沈殿（Ｐ０）に、コロイド溶液２を添加して（図２ａ）、沈殿（Ｐ０）をコロイド溶液２に懸濁し、懸濁物６を作成する（図２ｂ）。そして、懸濁物６を遠心分離し、上清画分（Ｓ１）を取得する（図２ｃ）。このようにして、ｎ回遠心分離した後の上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を取得する（図２ａ−ｎ〜ｃ−ｎ））。（以上、工程（ＩＩ’））
次に、上清画分（Ｓ０）及びｎ回分の上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の少なくとも一部を含む流体４を、フローセル３１に流しながら、カメラ３２により、フレーム４０内のフローセル３１を撮像する（図１ｄ；工程（ＩＩＩ’））。なお、図１ｄの例では、対物レンズ３３を介して撮像を行っている。これにより、撮像時に、フレーム４０内に存在していた生物粒子５ｂの画像４１を取得することができる。
以下、本実施形態の方法の各工程について、説明する。
【０１０３】
（工程（Ｉ）、工程（ＩＩ）及び工程（ＩＩ’））
工程（Ｉ）、工程（ＩＩ）及び工程（ＩＩ’）は、上述の「＜生物粒子を含む試料の前処理方法＞」における工程（Ｉ）、工程（ＩＩ）及び工程（ＩＩ’）と同じである。そのため、説明は省略する。
【０１０４】
（工程（ＩＩＩ’））
工程（ＩＩＩ’）は、前記上清画分（Ｓ０）及び前記のｎ回分の上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の少なくとも一部を含む流体をフローセルに流しながら、前記フローセルを流れる流体を撮像する工程である。
【０１０５】
工程（ＩＩＩ’）では、工程（ＩＩ）で得られた上清画分（Ｓ０）、及び工程（ＩＩ’）で得られた上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の少なくとも一部を含む流体４を、フローセル３１に流す。流体４は、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の一部又は全てを混合し、当該混合物の少なくとも一部を含むように、調製してもよい。好ましくは、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓ０）の全てを混合し、当該混合物の少なくとも一部を含むように流体４を調製する。
【０１０６】
フローセル３１に流す流体４は、第１実施形態の方法と同様に、コロイド溶液２を含むことが好ましい。上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）は、通常コロイド溶液２を含むため、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）をそのまま流体４としてフローセル３１に流してもよい。また、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）に、さらにコロイド溶液２を添加したものを、流体４として、フローセル３１に流してもよい。上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の混合物を使用する場合には、当該混合物に、コロイド溶液２を添加するようにしてもよい。
【０１０７】
また、第１実施形態の方法と同様に、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）に対して、さらに篩分け等の処理を行い、所定の画分を取得して流体４を調製し、フローセル３１に流すようにしてもよい。例えば、上記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）を用いて、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の篩分けを行い、前記篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、当該画分にコロイド溶液２を添加して、流体４としてもよい。篩（Ｃ）を用いた篩分け及びコロイド溶液２の添加は、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）のそれぞれに対して、個別に行ってもよく、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の一部又は全部の混合物に対して、行ってもよい。篩分け及びコロイド溶液２の添加を、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）のそれぞれに対して、個別に行った場合には、篩分け及びコロイド溶液２の添加後に、得られた試料の一部又は全部を混合してもよい。すなわち、流体４は、上清画分（Ｓ０）及び／又は上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を、前記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けして篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、前記画分にコロイド溶液２を添加したものを含んでいてもよい。また、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の混合物を使用する場合には、篩（Ｃ）を用いて、当該混合物の篩分けを行い、篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、当該画分にコロイド溶液２を添加して、流体４とすればよい。篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けすることにより、余分なコロイド粒子を除去して、対象とする生物粒子が濃縮され、効率よく撮像を行うことができる。また、篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きの篩を用いることにより、検出対象とする生物粒子のロストを少なくすることができる。篩（Ｃ）の目開きは、工程（Ｉ）で使用した篩（Ｂ）の目開きよりも小さければ、特に限定されないが、例えば、３０〜６３μｍを挙げることができる。
【０１０８】
本工程では、上記のように調製した上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の少なくとも一部を含む流体４を、フローセル３１に流しながら、フローセル３１を流れる流体４を撮像する。フローセル３１は、第１実施形態の方法と同様のものとすることができる。また、フローセル３１への流体４の投入方法、及びフローセル３１を流れる流体４の撮像方法等もまた、第１実施形態の方法と同様の方法で行うことができる。
【０１０９】
本実施形態の方法によって取得された生物粒子の画像は、第１実施形態の方法で取得された画像と同様に、生物種を分類するための解析に供することができる。
【０１１０】
本実施形態の方法によれば、篩分け処理及び遠心処理によって堆積物を除去できるため、堆積物を含む試料であっても効率よく生物粒子の画像を取得することができる。また、工程（ＩＩ’）において、遠心分離で得られた沈殿にコロイド溶液を添加してさらに遠心分離を行っているため、当該沈殿に生物粒子が残存していた場合であっても、当該生物粒子を回収することができる。
【０１１１】
（任意工程）
本実施形態の方法は、第１実施形態の方法と同様に、上記工程（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ’）及び（ＩＩＩ’）に加えて、撮像が終了した流体４を回収する工程をさらに含んでいてもよい。撮像が終了した流体４を回収することにより、流体４に含まれる生物粒子のさらなる解析が可能になる。撮像を終了した流体４を回収する方法もまた、第１実施形態の方法と同様に行えばよい。
【０１１２】
＜生物粒子を含む試料の前処理装置＞
１実施形態において、本発明は、上記生物粒子を含む試料の前処理方法を実現するための生物粒子を含む試料の前処理装置を提供する。本実施形態の生物粒子を含む試料の前処理装置は、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とを備え、検出対象である生物粒子を含む試料の篩分けを行って、前記篩（Ａ）を通過し、かつ前記篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する篩分け部と、前記篩分け部で取得された画分（１ｂ）に、コロイド溶液を添加するコロイド溶液添加部と、前記コロイド溶液が添加された画分（１ｂ）を遠心分離する遠心分離部と、前記遠心分離部における遠心分離後に、上清画分を取得する上清画分取得部と、を備える。
以下、本実施形態の生物粒子を含む試料の前処理装置の構成の一例について説明する。
【０１１３】
図３は、本実施形態の生物粒子を含む試料の前処理装置の構成の一例を示したものである。図３に示す前処理装置１００は、篩分け部１１０と、コロイド溶液添加部１２０と、遠心分離部１３０と、上清画分取得部１４０と、を備える。
【０１１４】
篩分け部１１０は、検出対象である生物粒子を含む試料１の篩分けを行って、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得するためのユニットである。篩分け部１１０は、少なくとも、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とを備えており、これらの篩により、試料１の篩分けを行う。篩分け部１１０は、例えば、図１ａに示すような構成としてもよい。図１ａの例では、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とが容器１０に設置されており、振とう機１３により振とうしながら、篩分けを行う構成となっている。篩分け終了後は、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する。
【０１１５】
なお、篩分け部１１０の構成は、図１ａの例に限定されず、例えば、篩（Ａ）と篩（Ｂ）とが別々の容器に設置されていてもよい。この場合、篩分け終了後に、各篩が設置された容器を分離し、篩（Ｂ）が設置された容器ごと画分（１ｂ）を取得することができる。
【０１１６】
コロイド溶液添加部１２０は、篩分け部１１０で取得された画分（１ｂ）に、コロイド溶液２を添加するためのユニットである。コロイド溶液２は、上述の「＜生物粒子の画像取得方法＞」における工程（ＩＩ）で使用するものと同じである。コロイド溶液添加部１２０は、例えば、ピペット、チューブ、ガラス管等により、コロイド溶液２を画分（１ｂ）に添加する構成とすることができる。
【０１１７】
遠心分離部１３０は、コロイド溶液添加部１２０においてコロイド溶液２が添加された画分（１ｂ）を、遠心分離するためのユニットである。なお、図３では、画分（１ｂ）とコロイド溶液２が混合されたものを混合物３として表している。遠心分離部１３０は、一般的な遠心分離機が備える構成とすることができる。遠心分離部１３０における遠心分離の条件は、操作パネル等により、設定できるようにしてもよい。
【０１１８】
上清画分取得部１４０は、遠心分離部１３０における遠心分離後に、上清画分（Ｓ０）を取得するためのユニットである。上清画分取得部１４０は、例えば、ピペット、チューブ、ガラス管等により、上清画分（Ｓ０）を取得するようにしてもよく、遠沈管から直接他の容器に上清画分（Ｓ０）を移す構成としてもよい。
【０１１９】
上記のような構成を備える前処理装置１００の動作の一例について説明する。
【０１２０】
まず、検出対象である生物粒子を含む試料１を、篩分け部１１０に投入する。篩分け部１１０では、試料１の篩分けを行い、目開き２５０〜１０００μｍの篩を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩を通過しない画分（１ｂ）を取得する。篩分け部１１０での篩分けにより、試料１に含まれる堆積物粒子の多くが除去される。
【０１２１】
篩分け部１１０で取得された画分（１ｂ）は、コロイド溶液添加部１２０により、コロイド溶液２が添加される。これにより、画分（１ｂ）とコロイド溶液２との混合物３が調製される。
【０１２２】
混合物３は、遠心分離部１３０に投入され、遠心分離が行われる。これにより、混合物３は、上清画分（Ｓ０）と沈殿（Ｐ０）とに分離される。上清画分（Ｓ０）には検出対象とする生物粒子が含まれており、沈殿（Ｐ０）には堆積物粒子が含まれている。遠心分離部１３０での遠心分離により、堆積物粒子をほとんど含まない上清画分（Ｓ０）を取得することができる。その後、上清画分（Ｓ０）は、上清画分取得部１４０により取得され、適宜調製が行われて、生物粒子を含む試料の前処理が完了する。
【０１２３】
本実施形態の生物粒子を含む試料の前処理装置は、上記のような構成を備えるため、堆積物粒子を多く含む試料であっても、その後の解析に十分な品質の試料を調製することができる。また、本実施形態の生物粒子を含む試料の前処理装置により調製された試料は、画像取得装置等で生物粒子の画像を取得した場合に、その後の解析に十分な画質の画像を取得することができる。
【０１２４】
なお、前処理装置１００は、上記の構成以外の他の構成を備えていてもよい。例えば、前処理装置１００は、沈殿懸濁部を備えていてもよい。沈殿懸濁部は、遠心分離部１３０における遠心分離の後、上清画分取得部１４０により上清画分（Ｓ０）が取得された後の沈殿（Ｐ０）に、コロイド溶液２を添加して沈殿を懸濁するためのユニットである。沈殿懸濁部においてコロイド溶液２に懸濁された沈殿（Ｐ０）は、遠心分離部１３０において、再度、遠心分離される。遠心分離後は、上清画分取得部１４０により、上清画分（Ｓ１）が取得される。これにより、沈殿（Ｐ０）に、検出対象とする生物粒子が残存していた場合であっても、当該生物粒子を回収することができる。なお、再度の遠心分離によって得られた沈殿（Ｐ１）を、沈殿懸濁部において、さらにコロイド溶液２に懸濁し、遠心分離部１３０において、再度、遠心分離を行ってもよい。このようにしてｎ回目の遠心分離で得られる上清画分を上清画分（Ｓｎ）、ｎ回目の遠心分離で得られる沈殿を沈殿（Ｐｎ）とすると、沈殿（Ｐｎ−１）にコロイド溶液２を添加し、懸濁して、遠心分離を行うことをｎ回行ってもよい。沈殿懸濁部において沈殿（Ｐ０）〜（Ｐｎ−１）の懸濁を行う回数は、操作パネル等により設定できるようにしてもよい。
【０１２５】
沈殿懸濁部は、上清画分取得後の遠沈管に、ピペット、チューブ、ガラス管等によりコロイド溶液２を添加して、遠沈管を振とうすることにより沈殿を懸濁する構成としてもよく、コロイド溶液２の添加後にピペッティング等を行うことにより、沈殿を懸濁する構成としてもよい。また、コロイド溶液２の添加は、コロイド溶液添加部１２０により行うようにすることもできる。
【０１２６】
また、前処理装置１００は、上清画分調製部を備えていてもよい。上清画分調製部は、上清画分取得部１４０により取得された上清画分（Ｓ０）〜（Ｓｎ）を、その後の解析用にさらに調製するためのユニットである。上清画分調製部は、例えば、上清画分取得部１４０によって取得された上清画分（Ｓ０）〜（Ｓｎ）を混合する構成を備えることができる。また、上清画分（Ｓ０）〜（Ｓｎ）に、コロイド溶液を添加する構成を備えていてもよい。あるいは、篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）を備え、上清画分（Ｓ０）〜（Ｓｎ）を篩分けして、篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、当該画分にコロイド溶液を添加する構成を備えていてもよい。
【０１２７】
前処理装置１００は、その他、装置全体の動作を制御する制御部等を備えることができる。
【０１２８】
＜生物粒子画像取得装置＞
１実施形態において、本発明は、上記生物粒子の画像取得方法を実現するための生物粒子画像取得装置を提供する。本実施形態の生物粒子画像取得装置は、篩（Ａ）と、前記篩（Ａ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｂ）とを備え、検出対象である生物粒子を含む試料の篩分けを行って、前記篩（Ａ）を通過し、かつ前記篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する篩分け部と、前記篩分け部で取得された画分（１ｂ）に、コロイド溶液を添加するコロイド溶液添加部と、前記コロイド溶液が添加された画分（１ｂ）を遠心分離する遠心分離部と、前記遠心分離部における遠心分離後に、上清画分を取得する上清画分取得部と、フローセルとカメラとを備え、前記上清画分取得部で取得された前記上清画分の少なくとも一部を含む流体を前記フローセルに流しながら、前記フローセルを流れる前記流体を撮像する撮像部と、を備える。前記篩（Ａ）は、前記フローセルの幅方向及び奥行方向の内径のいずれか大きい方よりも小さい目開きを有する。
以下に、本実施形態の生物粒子画像取得装置の構成の一例について説明する。
【０１２９】
図４は、本実施形態の生物粒子画像取得装置の構成の一例を示したものである。図４に示す生物粒子画像取得装置２００は、篩分け部１１０と、コロイド溶液添加部１２０と、遠心分離部１３０と、上清画分取得部１４０と、撮像部１５０と、流体回収部１６０と、を備える。
【０１３０】
篩分け部１１０は、検出対象である生物粒子を含む試料１の篩分けを行って、篩（Ａ）を通過し、かつ篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得するためのユニットである。篩（Ａ）は、篩（Ｂ）よりも大きい目開きを有する。篩（Ａ）は、検出対象である生物粒子よりも大きい粒子を除去するためのものである。篩（Ａ）の目開きは、検出対象である生物粒子の大きさに基づき、適宜選択することができる。ただし、篩（Ａ）の目開きは、撮像部１５０が備えるフローセルを通過可能なサイズの最大値以下に設定される。具体的には、篩（Ａ）は、フローセルの幅方向及び奥行方向の内径のいずれか大きい方よりも小さい目開きを有する。あるいは、篩（Ａ）の目開きは、フローセルの流路設計において、生物粒子が通過可能な最大サイズより小さい目開きとしてもよい。
【０１３１】
篩（Ｂ）は、篩（Ａ）よりも小さい目開きを有する。篩（Ｂ）は、検出対象である生物粒子よりも小さい粒子を除去するためのものである。篩（Ｂ）の目開きは、検出対象である生物粒子の大きさに基づき、適宜選択することができる。ただし、篩（Ｂ）は、撮像部１５０が備えるカメラが焦点を合わせることが可能な粒子径の最小値以上の目開きを有することが好ましい。カメラが焦点を合わせることが可能な粒子径の最小値は、撮像部１５０が備えるフローセルの奥行方向の内径と、カメラの焦点深度により規定される。したがって、篩（Ｂ）の目開きは、検出対象である生物粒子の大きさと、フローセルの奥行方向の内径と、カメラの焦点深度に基づいて、選択してもよい。
【０１３２】
例えば、カメラの焦点深度は、一般的には、下記式（１）のＢｅｒｅｋの式で表すことができる。
【０１３３】
【数１】
0006715527.tif 000002
D.O.F       ：焦点深度（Depth of Focus）
ω      ：目の分解能（0.014：目の視角を5分とした場合）
M       ：総合倍率
λ      ：光の波長（可視光の場合λ＝0.55mm）
NA ：カメラで規定される開口数
【０１３４】
ここで、例えば、Ｍ＝１０００、ＮＡ＝０．９０とすると、Ｄ．Ｏ．Ｆ＝０．７３μｍとなる。また、例えば、Ｍ＝４、ＮＡ＝０．９０とすると、Ｄ．Ｏ．Ｆ＝１８２．５μｍとなる。
また、例えば、１／２インチＨＤカメラの場合、ＣＣＤサイズは６．４ｍｍ（Ｗ）×４．８ｍｍ（Ｈ）であり、ＣＣＤ画素数は１９８０（Ｗ）×１０８０（Ｈ）であり、分解能は幅（Ｗ）３．２μｍ、高さ（Ｈ）４．４μｍである。したがって、Ｍ＝４とすると、カメラが焦点を合わせることが可能な粒子径の最小値は、幅（Ｗ）０．８μｍ、高さ（Ｈ）１．１μｍとなる。
このように、焦点深度、及びカメラの仕様が設定されると、総合倍率（Ｍ）が決まり、カメラが焦点を合わせることが可能な粒子径の最小値が決定される。
【０１３５】
なお、光学系での限界分解能は、０．２μｍとされているため、篩（Ｂ）の目開きは０．２μｍ以上としてもよい。例えば、篩（Ｂ）の目開きは、検出対象である生物粒子の細部に合わせて、１μｍ以上としてもよく、１０μｍ以上としてもよく、２０μｍ以上としてもよい。
【０１３６】
例えば、検出対象である生物粒子がメイオファウナである場合、篩（Ａ）の目開きとしては２５０〜１０００μｍが挙げられ、篩（Ｂ）の目開きとしては３２〜６２μｍが挙げられる。
篩（Ａ）及び篩（Ｂ）は、検出対象である生物粒子のサイズ、フローセルのサイズ、及びカメラの焦点深度に基づいて、操作者が、各々適切な目開きのものを選択して、篩分け部１１０に設置してもよい。あるいは、篩分け部１１０が、目開きの異なる複数種類の篩を備え、検出対象である生物粒子、フローセルのサイズ、及びカメラの焦点深度に応じて、篩（Ａ）及び篩（Ｂ）を選択するものであってもよい。この場合、操作者の選択により、篩分け部１１０に篩（Ａ）及び篩（Ｂ）が設置されるものであってよい。あるいは、検出対象である生物粒子、フローセルのサイズ、及びカメラの焦点深度に応じて、生物粒子画像取得装置２００が自動的に篩（Ａ）及び篩（Ｂ）を選択し、篩分け部１１０に設置するものであってもよい。生物粒子画像取得装置２００は、生物検出対象である生物粒子のサイズ、フローセルのサイズ、及びカメラの焦点深度等を入力するための入力部等を備えていてもよい。
篩分け部１１０の他の構成については、上記生物粒子を含む試料の前処理装置１００において説明したものと同様とすることができる。
【０１３７】
コロイド溶液添加部１２０、遠心分離部１３０、及び上清画分取得部１４０は、上記生物試料を含む試料の前処理装置１００において説明したものと同じである。
【０１３８】
撮像部１５０は、上清画分取得部１４０で取得された上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体４をフローセルに流しながら、前記フローセルを流れる前記流体をカメラで撮像するためのユニットである。撮像部１５０は、少なくとも、フローセルとカメラとを備える。
【０１３９】
撮像部１５０は、例えば、図１ｄのような構成としてもよい。図１ｄの例では、フローセル３１とカメラ３２とを備え、フローセル３１とカメラ３２との間に対物レンズ３３が設置されて、カメラ３２が対物レンズ３３を介して、フローセル３１のフレーム４０部分を撮像する構成となっている。また、光源３４により、フレーム４０部分に光が照射されるようになっている。
【０１４０】
フローセル３１は、検出対象の生物粒子に応じて、適宜選択すればよい。例えば、検出対象がメイオファウナである場合には、フローセル３１は、撮像面に対する奥行方向の内径を１５０〜５００μｍとすることができる。また、フローセル３１の下流側にポンプ等を接続し、フローセル３１に投入された流体を、当該ポンプ等で吸引することにより、フローセル３１内に流体の流れを作り出すようにしてもよい。
【０１４１】
カメラ３２は、静止画用のものであってもよく、動画用のものであってもよい。静止画用のものである場合には、連続撮像が可能なものであることが好ましく、所定時間毎に連続撮像を行うものであることがより好ましい。また、操作パネル等により、撮像間隔を設定できるようにしてもよい。
【０１４２】
対物レンズ３３は、フレーム４０の拡大画像を取得するために用いられる。対物レンズ３３の倍率は、検出対象の生物粒子に応じて、適宜選択すればよい。例えば、検出対象がメイオファウナである場合には、倍率１０〜１００倍の対物レンズを使用することができる。
【０１４３】
光源３４は、フレーム４０に光を照射して、より鮮明な画像を取得するために用いられる。光源３４は、カメラ３２による撮像間隔に合わせて間欠的に光を照射するものであってもよく、常時光を照射するものであってもよいが、所定間隔で光を照射するフラッシュ光源であることが好ましい。また、操作パネル等により、照射間隔を設定できるようにしてもよい。
【０１４４】
光源３４から照射される光は、特に限定されないが、可視光であることが好ましい。また、検出対象の生物粒子が蛍光色素で染色されたものである場合には、当該蛍光色素を励起する波長の光を照射するものであってもよい。
【０１４５】
上記のような構成を備える生物粒子画像取得装置２００の動作の一例について説明する。
【０１４６】
まず、検出対象である生物粒子を含む試料１を、篩分け部１１０に投入する。篩分け部１１０では、試料１の篩分けを行い、篩（Ａ）を通過し、かつ篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する。篩分け部１１０での篩分けにより、試料１に含まれる堆積物粒子の多くが除去される。
【０１４７】
篩分け部１１０で取得された画分（１ｂ）は、コロイド溶液添加部１２０により、コロイド溶液２が添加される。これにより、画分（１ｂ）とコロイド溶液２との混合物３が調製される。
【０１４８】
混合物３は、遠心分離部１３０に投入され、遠心分離が行われる。これにより、混合物３は、上清画分（Ｓ０）と沈殿（Ｐ０）とに分離される。上清画分（Ｓ０）には検出対象とする生物粒子が含まれており、沈殿（Ｐ０）には堆積物粒子が含まれている。遠心分離部１３０での遠心分離により、堆積物粒子をほとんど含まない上清画分（Ｓ０）を取得することができる。その後、上清画分（Ｓ０）は、上清画分取得部１４０により取得され、適宜調製が行われて、上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体４として調製される。
【０１４９】
流体４は、撮像部１５０に投入されて、撮像が行われる。流体４は、撮像部１５０内において、フローセルに流され、フローセル上の撮像フレーム内に存在する流体の画像が、カメラにより撮像される。生物粒子画像取得装置２００では、このようにして、検出対象とする生物粒子の画像を取得することができる。
【０１５０】
本実施形態の生物粒子画像取得装置は、上記のような構成を備えるため、堆積物粒子を多く含む試料であっても、その後の解析に十分な画質の画像を取得することができる。また、画像取得までの操作を自動で行うことができるため、従来、検鏡による解析に要していた時間と手間を省くことができる。
【０１５１】
なお、生物粒子画像取得装置２００は、上記の構成以外の他の構成を備えていてもよい。図４に示す例では、生物粒子画像取得装置２００は、流体回収部１６０を備えている。
流体回収部１６０は、撮像部１５０において撮像を終了した流体４を回収するためのユニットである。流体回収部１６０は、例えば、流体４を回収するための容器と、当該容器に流体４を導くためのチューブと、当該チューブ内での流体４の流れを作るポンプ等を備える構成とすることができる。例えば、撮像部１５０内のフローセル３１の下流端にチューブを接続し、当該チューブを流体回収部１６０内の容器と接続する構成とすることができる。また、当該容器にポンプを接続し、当該容器内の空気を排出して、フローセルを通過した流体４を、前記チューブを介して、前記容器に回収する構成としてもよい。
流体回収部１６０で回収された流体４は、さらなる解析に使用することができる。
【０１５２】
また、生物粒子画像取得装置２００は、上記生物粒子を含む試料の前処理装置１００と同様に、沈殿懸濁部、上清画分調製部等を備えていてもよい。沈殿懸濁部及び上清画分調製部は、前処理装置１００において説明したものと同じである。
【０１５３】
生物粒子画像取得装置２００は、その他、撮像部１５０で取得した画像を表示する画像表示部、取得した画像を解析する画像解析部、装置全体の動作を制御する制御部等を備えることができる。
【実施例】
【０１５４】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１５５】
＜試験例１＞
［解析用試料］
北海道釧路沖の３測点（水深５６０ｍ、３３００ｍ、７１００ｍ）で得られた堆積物試料を用いた。【０１５６】
［試料の篩分け］
前記堆積物試料を、目開き１ｍｍ、５００μｍ、２５０μｍ、１２５μｍ、６３μｍ、及び３８μｍの６つの篩を用いて、篩分けした。前記各篩に捉えられたメイオファウナの個体数を、検鏡により確認した。【０１５７】
［結果］
各篩に捉えられたメイオファウナの個体数を表１に示す。６３〜２５０μｍの篩区分に、約８０％の個体が入っていた。【０１５８】
【表１】
0006715527.tif 000003
【０１５９】
＜試験例２＞
［解析用試料］
岩手県大槌湾沖の４測点（水深７２ｍ、３０３ｍ、１０６４ｍ、１６７７ｍ）で得られた堆積物試料を用いた。【０１６０】
［解析用画像を取得するための試料前処理］
前記堆積物試料を５％中和ホルマリンで固定し、堆積物試料中の生物をローズベンガルで染色した（終濃度０．０５ｇ／Ｌ）。
前記染色操作後の堆積物試料約２６．４ｍＬを、振とうしながら篩分けした。篩分けには、目開き２５０μｍの篩と、目開き６３μｍの篩を使用し、目開き２５０μｍの篩を通過し、かつ目開き６３μｍの篩を通過しない試料を回収した。
回収した試料を５０ｍＬ遠沈管に入れ、コロイド状シリカ（ＬＵＤＯＸ  ＨＳ−４０、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を約３０ｍＬ加えて、試料をコロイド状シリカに懸濁した。その後、遠心分離機（ＬＣ２００、ＴＯＭＹ）を用いて、８００Ｇで１０分間遠心した。遠心後の遠沈管から上清を採取し、目開き３２μｍの篩上に捕集した。
上清を採取した後、遠沈管内の沈殿にコロイド状シリカを約３０ｍＬ加えて、沈殿をコロイド状シリカに懸濁した。その後、遠心分離機を用いて、８００Ｇで１０分間遠心した。遠心後の遠沈管から上清を採取し、目開き３２μｍの篩上に捕集した。この作業をさらに１回行った。
上記の遠心３回分の上清から目開き３２μｍの篩上に捕集された試料を、コロイド状シリカ約１０ｍＬに懸濁し、新たな５０ｍＬ遠沈管に回収した。【０１６１】
［解析用画像の取得］
解析用画像の取得は、カメラ付き流動微粒子計数装置ＦｌｏｗＣＡＭ（Ｆｌｕｉｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。対物レンズは倍率４倍のものを使用し、フローセルはカメラの撮像面に対する奥行方向の内径が３００μｍのものを使用した。
また、ＦｌｏｗＣＡＭを通過した試料を回収するために、新たな５０ｍＬ遠沈管を準備した。当該遠沈管の上部をパラフィルムで密閉し、チューブを２本刺し、一方のチューブの他端をフローセルの下流側に接続した。もう一方のチューブの他端は、ペリスタティックポンプ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続した。この構成により、ペリスタティックポンプを稼働すると、フローセルから前記チューブに試料が流れ、遠沈管内に試料が回収される。このようにして、ＦｌｏｗＣＡＭを通過した試料を遠沈管に捕集した。
なお、フローセル及びフローセルに接続するチューブは、試料投入前に、予めコロイド状シリカ溶液で満たしておいた。【０１６２】
上記のような構成において、遠沈管に回収した試料を軽く撹拌し、パスツールピペットを用いて、ＦｌｏｗＣＡＭのフローセルに投入し、撮像を行った。撮像は、Ａｕｔｏ  Ｉｍａｇｅ  Ｍｏｄｅで行い、Ａｕｔｏ  Ｉｍａｇｅ  Ｒａｔｅ（１秒間に撮像される画像の数）を２０に設定した。また、Ｆｌａｓｈ  Ｄｕｒａｔｉｏｎは、１０μｓに設定した。【０１６３】
［画像の解析］
撮像した画像は、ＦｌｏｗＣＡＭ付属のソフトＶｉｓｕａｌＳｐｒｅａｄＳｈｅｅｔのソート機能Ｒｅｄ／Ｂｌｕｅ  Ｒａｔｉｏでソートし、目視にて各画像を確認して生物を選別し、高次分類群ごとに計数した。なお、ここでは、目視により選別を行ったが、各画像から得られた生物の形態、ひげ等の形態的特徴から、プログラム等で自動的に、生物画像の選別・分類を行うようにしてもよい。生物画像の選別は、画像解析ソフトやＡＩ（人工知能）等により行ってもよい。【０１６４】
［結果］
ＦｌｏｗＣＡＭへの試料の投入に使用した遠沈管、及び計数を終えた後のチューブ内を検鏡したが、残っていた生物個体は数個体であった。
ＦｌｏｗＣＡＭで撮像された画像の一例を図５ａ〜５ｅに示す。ＦｌｏｗＣＡＭで撮像された画像は、目視により生物を選別するのに十分な画質であった。
ＦｌｏｗＣＡＭで観察された生物個体数と、ＦｌｏｗＣＡＭ通過後に遠沈管に捕集された個体数を比較して撮影効率を計算した。その結果、撮影効率は、メイオファウナ全体で５７．９±１４．８％、線虫類で５８．９±１９．６％、カイアシ類で３４．６±３．７％であった。また、ＦｌｏｗＣＡＭで計数した個体数と、遠沈管に捕集された試料を検鏡により計数した個体数とは、有意な相関を示した（メイオファウナ全体：ｒ＝０．９５、ｐ＜０．０５；線虫類：ｒ＝０．９５、ｐ＜０．０５；カイアシ類：ｒ＝１．００、ｐ＜０．０１；図６）。
以上より、本方法は、従来の検鏡による方法で得られる生物個体数の解析結果と、相関の高い解析結果を得られることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１６５】
本発明によれば、堆積物粒子が存在する場合であっても、迅速に生物粒子の解析を行うことができる技術が提供される。
【符号の説明】
【０１６６】
１    試料
１ａ    目開き２５０〜１０００μｍの篩を通過しない画分
１ｂ    目開き２５０〜１０００μｍの篩を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩を通過しない画分
１ｃ    目開き３２〜６３μｍの篩を通過する画分
２    コロイド溶液
３    画分（１ｂ）とコロイド溶液２とを含む混合物
４    流体
５ａ〜５ｃ    生物粒子
６    懸濁物
１０    容器
１３    振とう機
２０    遠心分離機
２１    遠沈管
３０    撮像装置
３１    フローセル
３２    カメラ
３３    対物レンズ
３４    光源
４０    フレーム
４１    画像
１００    生物粒子を含む試料の前処理装置
１１０    篩分け部
１２０    コロイド溶液添加部
１３０    遠心分離部
１４０    上清画分取得部
１５０    撮像部
１６０    流体回収部
２００    生物粒子画像取得装置
Ａ    目開き２５０〜１０００μｍの篩
Ｂ    目開き３２〜６３μｍの篩
Ｓ０〜Ｓｎ    上清画分
Ｐ０〜Ｐｎ    沈殿
【図１】
0006715527.tif 000004
【図２】
0006715527.tif 000005
【図３】
0006715527.tif 000006
【図４】
0006715527.tif 000007
【図５】
0006715527.tif 000008
【図６】
0006715527.tif 000009