(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のグリコサミノグリカンを含む、子癇前症を処置するための組成物であって、前記組成物は、
（１）被験体から得られた試験試料においてアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のレベルを測定すること、および
（２）前記試験試料における前記ＡＮＸＡ２のレベルをＡＮＸＡ２の対照レベルと比較すること
により、子癇前症を発症するリスクが高いと決定された前記被験体に投与されることを特徴とし、前記試料が、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、および子宮内膜液の試料からなる群より選択される、組成物。
【請求項２】
前記被験体が子癇前症の病歴をもたない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＡＮＸＡ２の対照レベルが、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から導かれる、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記グリコサミノグリカンが、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸、低分子量デルマタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＡＮＸＡ２のレベルが、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記被験体が妊娠していることがわかっている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記被験体が妊娠しようと試みている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
アネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のレベルを、被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかの指標とする方法であって、前記方法が、
被験体から得られた試験試料においてアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のレベルを測定するステップ、および
前記試験試料における前記ＡＮＸＡ２のレベルをＡＮＸＡ２の対照レベルと比較するステップ
を含み、前記試料が、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、および子宮内膜液の試料からなる群より選択される、方法。
【請求項９】
前記被験体が子癇前症の病歴をもたない、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
対照試料が、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から得られる試料であることを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＮＸＡ２のレベルが、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験体が妊娠していることがわかっている、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験体が妊娠しようと試みている、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
有効量のグリコサミノグリカンを含む、子癇前症を処置するための組成物であって、前記組成物は、
（１）現在、子癇前症を有していない被験体であって、妊娠しているか、または妊娠する計画を有する被験体から得られた子宮内膜液試料においてＡＮＸＡ２のレベルを決定するアッセイを実施すること、および
（２）前記子宮内膜液試料中の前記ＡＮＸＡ２のレベルをＡＮＸＡ２の対照レベルと比較すること
により、子癇前症を発症するリスクが高いと決定された前記被験体に投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項１５】
前記被験体が子癇前症の病歴をもたない、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＡＮＸＡ２の対照レベルが、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から導かれる、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記グリコサミノグリカンが、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸、低分子量デルマタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＡＮＸＡ２のレベルが、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
被験体においてＡＮＸＡ２のレベルを上昇させるのに十分な量でグリコサミノグリカンを含む、子癇前症を処置するための組成物であって、前記被験体が、ＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して低レベルのＡＮＸＡ２を有し、妊娠する計画を有し、かつ子癇前症の病歴をもたず、
前記被験体におけるＡＮＸＡ２のレベルが、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、および子宮内膜液の試料からなる群より選択される試料から決定される、組成物。
【請求項２０】
前記ＡＮＸＡ２の対照レベルが、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から導かれる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記グリコサミノグリカンが、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸、低分子量デルマタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＡＮＸＡ２のレベルが、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
子癇前症についてのグリコサミノグリカン治療の効力を評価するための方法であって、前記方法は、
有効量のグリコサミノグリカンでの処置前および処置後、子癇前症を有するか、または子癇前症を発症するリスクが高い被験体から得られた試験試料においてアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のレベルを測定するステップであって、処置前の前記レベルに対する処置後の前記ＡＮＸＡ２のレベルの増加が、前記グリコサミノグリカン治療が有効であることを示す、ステップ
を含み、
前記試料が、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、および子宮内膜液の試料からなる群より選択される、方法。
【請求項２４】
前記グリコサミノグリカンが、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸、低分子量デルマタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＡＮＸＡ２のレベルが、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される、請求項２３または２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１４年３月２１日に出願された米国仮出願第６１／９６８，７２８号および２０１４年３月２４日に出願された米国仮出願第６１／９６９，５２０号（これらの内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、一般的に、子癇前症についてのバイオマーカー、およびこの疾患を処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
子癇前症（ＰＥ）は、妊産婦および胎児の罹患および死亡の主な原因であり、妊娠の４％〜８％を冒し、１年あたり世界中で８百万人超の症例を引き起こしている。臨床的には、子癇前症は、高血圧、蛋白尿、浮腫、ならびに一部の患者においては、ＨＥＬＬＰ症候群および子癇の存在によって定義される。子癇前症を正確に予測することができるマーカーを開発するために多大な努力がなされてきた。母体の子宮動脈における生化学的マーカーおよび血流のドップラー超音波測定が広範囲に試験されているが、これまで、これらのどれも広汎な臨床的使用の達成に至っていない（Ｃｏｎｄｅ−Ａｇｕｄｅｌｏら、Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ２００４年、１０４巻、１３６７〜９１頁）。子癇前症を予測するための信頼でき、かつ臨床的に有用なマーカーを開発するための必要性が依然としてある。子癇前症を発症するリスクがある妊婦を同定し得ることにより、子癇前症発症を防ぐのに有効であることが公知である予防薬の使用が可能になり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｏｎｄｅ−Ａｇｕｄｅｌｏら、Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｌ（２００４年）１０４巻、１３６７〜９１頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＰＥを発症する素因がある女性を確実に同定するための非侵襲性アッセイを提供する。これにより、ＰＥを防ぎ、または軽減する適切な治療での早期介入が可能になる。本発明は、子宮内膜のアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）レベルが、正常に（健康に）妊娠した女性におけるレベルと比較して、以前の妊娠において子癇前症（ＰＥ）を有した女性において減少しているという発見に、少なくとも部分的に、基づいている。
【０００６】
本発明の一部の態様によれば、子癇前症を処置するための方法が提供される。本方法は、被験体から得られた試験試料においてアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のレベルを測定することにより、被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップ、試験試料におけるＡＮＸＡ２のレベルをＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して、被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップ、および子癇前症を発症するリスクが高いと決定された被験体に、有効量のグリコサミノグリカンを投与するステップを含む。
【０００７】
一部の実施形態では、被験体は子癇前症の病歴をもたない。一部の実施形態では、試料は、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、および子宮内膜液（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｆｌｕｉｄ）の試料からなる群より選択される。一部の実施形態では、ＡＮＸＡ２の対照レベルは、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から導かれる。一部の実施形態では、グリコサミノグリカンは、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸、低分子量デルマタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される。一部の実施形態では、ＡＮＸＡ２のレベルは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される。一部の実施形態では、被験体は、妊娠していることがわかっている。一部の実施形態では、被験体は、妊娠しようと試みている。
【０００８】
本発明の一部の態様は、子癇前症を診断するか、または子癇前症の診断を補助するための方法を提供する。本方法は、被験体から得られた試験試料においてアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のレベルを測定するステップ、および試験試料におけるＡＮＸＡ２のレベルをＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して、被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップを含む。
【０００９】
一部の実施形態では、被験体は子癇前症の病歴をもたない。一部の実施形態では、試料は、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、および子宮内膜液の試料からなる群より選択される。一部の実施形態では、対照試料は、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から得られる。一部の実施形態では、ＡＮＸＡ２のレベルは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される。一部の実施形態では、被験体は、妊娠していることがわかっている。一部の実施形態では、被験体は、妊娠しようと試みている。
【００１０】
本発明の一部の態様は、子癇前症を処置するための方法を提供する。本方法は、現在、子癇前症を有していない被験体の子宮内膜液試料を得るステップであって、被験体が妊娠しているか、または被験体が妊娠する計画を有する、ステップ、子宮内膜液試料においてＡＮＸＡ２のレベルを決定するアッセイを実施するステップ、子宮内膜液試料におけるＡＮＸＡ２のレベルをＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して、被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップ、および被験体が子癇前症を発症するリスクが高いと決定された場合には、有効量のグリコサミノグリカンを被験体に投与するステップを含む。
【００１１】
一部の実施形態では、被験体は子癇前症の病歴をもたない。一部の実施形態では、ＡＮＸＡ２の対照レベルは、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から導かれる。一部の実施形態では、グリコサミノグリカンは、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸、低分子量デルマタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される。一部の実施形態では、ＡＮＸＡ２のレベルは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される。
【００１２】
本発明の一部の態様は、子癇前症を処置するための方法を提供する。本方法は、ＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して低レベルのＡＮＸＡ２を有し、妊娠する計画を有し、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体を同定するステップ、およびグリコサミノグリカンを、被験体においてＡＮＸＡ２のレベルを上昇させるのに十分な量で被験体に投与するステップを含む。
【００１３】
一部の実施形態では、ＡＮＸＡ２の対照レベルは、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から導かれる。一部の実施形態では、グリコサミノグリカンは、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸、低分子量デルマタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される。一部の実施形態では、ＡＮＸＡ２のレベルは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される。
【００１４】
本発明の一部の態様は、子癇前症についてのグリコサミノグリカン治療の効力を評価するための方法を提供する。本方法は、子癇前症を有するか、または子癇前症を発症するリスクが高い被験体を有効量のグリコサミノグリカンで処置するステップ、グリコサミノグリカンでの処置前および処置後、被験体から得られた試験試料においてアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のレベルを測定するステップであって、処置前のレベルに対する処置後のＡＮＸＡ２のレベルの増加が、グリコサミノグリカン治療が有効であることを示すステップを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、グリコサミノグリカンは、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸、低分子量デルマタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される。一部の実施形態では、ＡＮＸＡ２のレベルは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
子癇前症を処置するための方法であって、
被験体から得られた試験試料においてアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のレベルを測定することにより、前記被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップ、
前記試験試料における前記ＡＮＸＡ２のレベルをＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して、前記被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップ、および
子癇前症を発症するリスクが高いと決定された前記被験体に、有効量のグリコサミノグリカンを投与するステップ
を含む、方法。
（項目２）
前記被験体が子癇前症の病歴をもたない、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記試料が、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、および子宮内膜液の試料からなる群より選択される、項目１〜２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
前記ＡＮＸＡ２の対照レベルが、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から導かれる、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記グリコサミノグリカンが、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸、低分子量デルマタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記ＡＮＸＡ２のレベルが、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記被験体が妊娠していることがわかっている、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記被験体が妊娠しようと試みている、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
子癇前症を診断するか、または子癇前症の診断を補助するための方法であって、
被験体から得られた試験試料においてアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のレベルを測定するステップ、および
前記試験試料における前記ＡＮＸＡ２のレベルをＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して、前記被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップ
を含む、方法。
（項目１０）
前記被験体が子癇前症の病歴をもたない、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記試料が、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、および子宮内膜液の試料からなる群より選択される、項目９〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
対照試料が、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から得られる、項目９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記ＡＮＸＡ２のレベルが、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される、項目９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記被験体が妊娠していることがわかっている、項目９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記被験体が妊娠しようと試みている、項目９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
子癇前症を処置するための方法であって、
現在、子癇前症を有していない被験体の子宮内膜液試料を得るステップであって、前記被験体が妊娠しているか、または前記被験体が妊娠する計画を有する、ステップ、
前記子宮内膜液試料においてＡＮＸＡ２のレベルを決定するアッセイを実施するステップ、
前記子宮内膜液試料中の前記ＡＮＸＡ２のレベルをＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して、前記被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップ、および
前記被験体が子癇前症を発症するリスクが高いと決定された場合には、有効量のグリコサミノグリカンを前記被験体に投与するステップ
を含む、方法。
（項目１７）
前記被験体が子癇前症の病歴をもたない、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ＡＮＸＡ２の対照レベルが、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から導かれる、項目１６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記グリコサミノグリカンが、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸、低分子量デルマタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、項目１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記ＡＮＸＡ２のレベルが、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される、項目１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
子癇前症を処置するための方法であって、
ＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して低レベルのＡＮＸＡ２を有し、妊娠する計画を有し、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体を同定するステップ、および
グリコサミノグリカンを、前記被験体において前記ＡＮＸＡ２のレベルを上昇させるのに十分な量で前記被験体に投与するステップ
を含む、方法。
（項目２２）
前記ＡＮＸＡ２の対照レベルが、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から導かれる、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記グリコサミノグリカンが、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸、低分子量デルマタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、項目２１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記ＡＮＸＡ２のレベルが、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される、項目２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
子癇前症についてのグリコサミノグリカン治療の効力を評価するための方法であって、
子癇前症を有するか、または子癇前症を発症するリスクが高い被験体を有効量のグリコサミノグリカンで処置するステップ、
グリコサミノグリカンでの前記処置前および前記処置後、前記被験体から得られた試験試料においてアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のレベルを測定するステップであって、処置前の前記レベルに対する処置後の前記ＡＮＸＡ２のレベルの増加が、前記グリコサミノグリカン治療が有効であることを示す、ステップ
を含む、方法。
（項目２６）
前記グリコサミノグリカンが、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸、低分子量デルマタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ＡＮＸＡ２のレベルが、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される、項目２５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【００１６】
本発明の限定のそれぞれは、本発明の様々な実施形態を包含し得る。したがって、任意の１つの要素または要素の組合せを含む本発明の限定のそれぞれが、本発明の各態様に含まれ得ることは予想される。この発明は、それの出願において、以下の説明に示され、または図面に図示された構築の詳細および構成要素の配置に限定されない。本発明は、他の実施形態を含むことができ、かつ様々な様式で実施、または実行することができる。また、本明細書で使用される語句および用語は、説明のためであり、限定としてみなされるべきではない。本明細書における「を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含むこと（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、およびその変形の使用は、その後に列挙された項目およびその等価物、加えて追加の項目を包含することを意図される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１は、以前の妊娠においてｓＰＥを患ったことがある患者におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｈＥＳＣ脱落膜化（ｄｅｃｉｄｕａｌｉｚａｔｉｏｎ）を示す。図１Ａおよび１Ｂは、以前の妊娠において重篤な子癇前症（ｓＰＥ）を患ったことがある女性（ｎ＝１３）および対照患者（非ＰＥ）（ｎ＝１３）由来の、脱落膜対非脱落膜ｈＥＳＣにおいてＥＬＩＳＡによって測定されたプロラクチンおよびＩＧＦＢＰ−１分泌を示す。プロラクチンおよびＩＧＦＢＰ−１分泌は、非脱落膜（黒色バー）および脱落膜化（灰色バー）におけるｎｇ／ｍｌ（平均値±ｓｄ）として提示され、中央値がグラフ上に図式化された。図１Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定されたＩＧＦＢＰ−１分泌を示す。図１Ｃは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱落膜化がｓＰＥおよび非ＰＥ由来のｈＥＳＣに誘導された場合の、非脱落膜ｈＥＳＣと比較した、Ｆ−アクチンリモデリングを示す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．００５  。
【図１Ｂ】図１は、以前の妊娠においてｓＰＥを患ったことがある患者におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｈＥＳＣ脱落膜化を示す。図１Ａおよび１Ｂは、以前の妊娠において重篤な子癇前症（ｓＰＥ）を患ったことがある女性（ｎ＝１３）および対照患者（非ＰＥ）（ｎ＝１３）由来の、脱落膜対非脱落膜ｈＥＳＣにおいてＥＬＩＳＡによって測定されたプロラクチンおよびＩＧＦＢＰ−１分泌を示す。プロラクチンおよびＩＧＦＢＰ−１分泌は、非脱落膜（黒色バー）および脱落膜化（灰色バー）におけるｎｇ／ｍｌ（平均値±ｓｄ）として提示され、中央値がグラフ上に図式化された。図１Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定されたＩＧＦＢＰ−１分泌を示す。図１Ｃは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱落膜化がｓＰＥおよび非ＰＥ由来のｈＥＳＣに誘導された場合の、非脱落膜ｈＥＳＣと比較した、Ｆ−アクチンリモデリングを示す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．００５  。
【図１Ｃ】図１は、以前の妊娠においてｓＰＥを患ったことがある患者におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｈＥＳＣ脱落膜化を示す。図１Ａおよび１Ｂは、以前の妊娠において重篤な子癇前症（ｓＰＥ）を患ったことがある女性（ｎ＝１３）および対照患者（非ＰＥ）（ｎ＝１３）由来の、脱落膜対非脱落膜ｈＥＳＣにおいてＥＬＩＳＡによって測定されたプロラクチンおよびＩＧＦＢＰ−１分泌を示す。プロラクチンおよびＩＧＦＢＰ−１分泌は、非脱落膜（黒色バー）および脱落膜化（灰色バー）におけるｎｇ／ｍｌ（平均値±ｓｄ）として提示され、中央値がグラフ上に図式化された。図１Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定されたＩＧＦＢＰ−１分泌を示す。図１Ｃは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱落膜化がｓＰＥおよび非ＰＥ由来のｈＥＳＣに誘導された場合の、非脱落膜ｈＥＳＣと比較した、Ｆ−アクチンリモデリングを示す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．００５  。
【図２−１】図２は、ｓＰＥにおけるＡＮＸＡ２の免疫組織化学およびウェスタンブロット分析を示す。図２Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、ＡＮＸＡ２抗体でイムノブロッティングされた、重篤な子癇前症（ｓＰＥ）の子宮内膜の生検材料から抽出された細胞内総タンパク質、およびハウスキーピングタンパク質、β−アクチンを示す。ＡＮＸＡ２の濃度測定分析を、３つの異なる実験から実施し、ＧＡＰＤＨで正規化した。図２Ｂは、非ＰＥおよびｓＰＥ子宮内膜組織において観察されたＡＮＸＡ２含有量の染色プロフィールを示す。図２Ｃは、ｓＰＥおよび非ＰＥ患者のｈＥＳＣ脱落膜化および非脱落膜化子宮内膜から得られた細胞内総タンパク質抽出物のＡＮＸＡ２ウェスタンブロットおよび濃度測定分析を示す。図２Ｄは、タンパク質抽出物および馴化培地ｈＥＳＣ、それぞれの細胞内ＡＮＸＡ２分析および細胞外ＡＮＸＡ２分析を示す。ＡＮＸＡ２タンパク質を、ＥＬＩＳＡにより測定し、３つの異なる実験からのｎｇ／ｍＬ（平均値±ｓｄ）として表した。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．００５  。
【図２−２】図２は、ｓＰＥにおけるＡＮＸＡ２の免疫組織化学およびウェスタンブロット分析を示す。図２Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、ＡＮＸＡ２抗体でイムノブロッティングされた、重篤な子癇前症（ｓＰＥ）の子宮内膜の生検材料から抽出された細胞内総タンパク質、およびハウスキーピングタンパク質、β−アクチンを示す。ＡＮＸＡ２の濃度測定分析を、３つの異なる実験から実施し、ＧＡＰＤＨで正規化した。図２Ｂは、非ＰＥおよびｓＰＥ子宮内膜組織において観察されたＡＮＸＡ２含有量の染色プロフィールを示す。図２Ｃは、ｓＰＥおよび非ＰＥ患者のｈＥＳＣ脱落膜化および非脱落膜化子宮内膜から得られた細胞内総タンパク質抽出物のＡＮＸＡ２ウェスタンブロットおよび濃度測定分析を示す。図２Ｄは、タンパク質抽出物および馴化培地ｈＥＳＣ、それぞれの細胞内ＡＮＸＡ２分析および細胞外ＡＮＸＡ２分析を示す。ＡＮＸＡ２タンパク質を、ＥＬＩＳＡにより測定し、３つの異なる実験からのｎｇ／ｍＬ（平均値±ｓｄ）として表した。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．００５  。
【図２−３】図２は、ｓＰＥにおけるＡＮＸＡ２の免疫組織化学およびウェスタンブロット分析を示す。図２Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、ＡＮＸＡ２抗体でイムノブロッティングされた、重篤な子癇前症（ｓＰＥ）の子宮内膜の生検材料から抽出された細胞内総タンパク質、およびハウスキーピングタンパク質、β−アクチンを示す。ＡＮＸＡ２の濃度測定分析を、３つの異なる実験から実施し、ＧＡＰＤＨで正規化した。図２Ｂは、非ＰＥおよびｓＰＥ子宮内膜組織において観察されたＡＮＸＡ２含有量の染色プロフィールを示す。図２Ｃは、ｓＰＥおよび非ＰＥ患者のｈＥＳＣ脱落膜化および非脱落膜化子宮内膜から得られた細胞内総タンパク質抽出物のＡＮＸＡ２ウェスタンブロットおよび濃度測定分析を示す。図２Ｄは、タンパク質抽出物および馴化培地ｈＥＳＣ、それぞれの細胞内ＡＮＸＡ２分析および細胞外ＡＮＸＡ２分析を示す。ＡＮＸＡ２タンパク質を、ＥＬＩＳＡにより測定し、３つの異なる実験からのｎｇ／ｍＬ（平均値±ｓｄ）として表した。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．００５  。
【図３−１】図３は、ＡＮＸＡ２阻害のｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱落膜化への効果を示す。図３Ａは、非処理ｈＥＳＣと比較した、２つの系：Ｐ４＋Ｅ２およびｃＡＭＰ＋ＭＰＡによる脱落膜ｈＥＳＣのＡＮＸＡ２ウェスタンブロットおよび濃度測定分析を示す。図３Ｂは、３つの異なる実験における、ＥＬＩＳＡにより測定された、脱落膜化し、かつ処理されていないｈＥＳＣの馴化培地における細胞外ＡＮＸＡ２レベルを示す。対照細胞（トランスフェクションされていない）、スクランブル配列（対照ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクションされた細胞、またはＡＮＸＡ２特異的ｓｉＲＮＡ（ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクションされた細胞のｍＲＮＡ（図３Ｃ）およびタンパク質のＡＮＸＡ２レベル（図３Ｄ）を、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析により評価した。図３Ｅおよび３Ｆは、対照およびＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ阻害ｈＥＳＣの馴化培地におけるＥＬＩＳＡにより測定されたＰＲＬおよびＩＧＦＢＰ−１レベルを示す。図３Ｇは、ローダミンファロイジン染色により可視化された、対照、対照ｓｉＲＮＡ、およびＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣにおけるＦ−アクチン構造を示す。図３Ｈは、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにより分析されたＧ−アクチン（可溶性）、Ｆ−アクチン（線維状）、および総アクチン画分を示し、その結果は、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよび対照ｈＥＳＣにおけるウェスタンブロット分析により観察された。濃度測定分析を、３つの異なる実験から実施し、Ｇ／Ｆアクチン比として表し、総アクチンで正規化した。
【図３−２】図３は、ＡＮＸＡ２阻害のｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱落膜化への効果を示す。図３Ａは、非処理ｈＥＳＣと比較した、２つの系：Ｐ４＋Ｅ２およびｃＡＭＰ＋ＭＰＡによる脱落膜ｈＥＳＣのＡＮＸＡ２ウェスタンブロットおよび濃度測定分析を示す。図３Ｂは、３つの異なる実験における、ＥＬＩＳＡにより測定された、脱落膜化し、かつ処理されていないｈＥＳＣの馴化培地における細胞外ＡＮＸＡ２レベルを示す。対照細胞（トランスフェクションされていない）、スクランブル配列（対照ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクションされた細胞、またはＡＮＸＡ２特異的ｓｉＲＮＡ（ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクションされた細胞のｍＲＮＡ（図３Ｃ）およびタンパク質のＡＮＸＡ２レベル（図３Ｄ）を、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析により評価した。図３Ｅおよび３Ｆは、対照およびＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ阻害ｈＥＳＣの馴化培地におけるＥＬＩＳＡにより測定されたＰＲＬおよびＩＧＦＢＰ−１レベルを示す。図３Ｇは、ローダミンファロイジン染色により可視化された、対照、対照ｓｉＲＮＡ、およびＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣにおけるＦ−アクチン構造を示す。図３Ｈは、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにより分析されたＧ−アクチン（可溶性）、Ｆ−アクチン（線維状）、および総アクチン画分を示し、その結果は、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよび対照ｈＥＳＣにおけるウェスタンブロット分析により観察された。濃度測定分析を、３つの異なる実験から実施し、Ｇ／Ｆアクチン比として表し、総アクチンで正規化した。
【図３−３】図３は、ＡＮＸＡ２阻害のｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱落膜化への効果を示す。図３Ａは、非処理ｈＥＳＣと比較した、２つの系：Ｐ４＋Ｅ２およびｃＡＭＰ＋ＭＰＡによる脱落膜ｈＥＳＣのＡＮＸＡ２ウェスタンブロットおよび濃度測定分析を示す。図３Ｂは、３つの異なる実験における、ＥＬＩＳＡにより測定された、脱落膜化し、かつ処理されていないｈＥＳＣの馴化培地における細胞外ＡＮＸＡ２レベルを示す。対照細胞（トランスフェクションされていない）、スクランブル配列（対照ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクションされた細胞、またはＡＮＸＡ２特異的ｓｉＲＮＡ（ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクションされた細胞のｍＲＮＡ（図３Ｃ）およびタンパク質のＡＮＸＡ２レベル（図３Ｄ）を、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析により評価した。図３Ｅおよび３Ｆは、対照およびＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ阻害ｈＥＳＣの馴化培地におけるＥＬＩＳＡにより測定されたＰＲＬおよびＩＧＦＢＰ−１レベルを示す。図３Ｇは、ローダミンファロイジン染色により可視化された、対照、対照ｓｉＲＮＡ、およびＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣにおけるＦ−アクチン構造を示す。図３Ｈは、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにより分析されたＧ−アクチン（可溶性）、Ｆ−アクチン（線維状）、および総アクチン画分を示し、その結果は、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよび対照ｈＥＳＣにおけるウェスタンブロット分析により観察された。濃度測定分析を、３つの異なる実験から実施し、Ｇ／Ｆアクチン比として表し、総アクチンで正規化した。
【図４Ａ】図４は、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣの運動性、トロホブラスト拡散（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）および浸潤の分析を示す。図４Ａは、対照ｈＥＳＣおよびＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣにおける創傷治癒アッセイを示す。創傷幅を、創傷後０時間目および２４時間目に測定した。創傷閉鎖のパーセンテージを、画像分析により決定した。値は、３つの異なる実験からの１０個の測定値の平均値である。図４Ｂは、ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションされ、その後、胚付着が起きるまでマウス胚盤胞と共培養されたｈＥＳＣを示す。４８時間後、ｈＥＳＣをビメンチンに関して免疫染色し、マウストロホブラスト細胞をＥ−カドヘリンに関して免疫染色した。ｈＥＳＣ上のマウス胚盤胞拡散を白線で取り囲み、面積を、ピクセルで測定した。図４Ｃは、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣにおけるヒトトロホブラストＪＥＧ−３細胞浸潤の効果を測定するために使用したコラーゲンｔｒａｎｓｗｅｌｌ浸潤アッセイの概略図を示す。ヒストグラムは、対照細胞の浸潤を１００％と指定した、ＪＥＧ−３浸潤細胞のパーセンテージを示す。データは、３つの独立した実験の平均値を表す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．００５。
【図４Ｂ】図４は、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣの運動性、トロホブラスト拡散（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）および浸潤の分析を示す。図４Ａは、対照ｈＥＳＣおよびＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣにおける創傷治癒アッセイを示す。創傷幅を、創傷後０時間目および２４時間目に測定した。創傷閉鎖のパーセンテージを、画像分析により決定した。値は、３つの異なる実験からの１０個の測定値の平均値である。図４Ｂは、ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションされ、その後、胚付着が起きるまでマウス胚盤胞と共培養されたｈＥＳＣを示す。４８時間後、ｈＥＳＣをビメンチンに関して免疫染色し、マウストロホブラスト細胞をＥ−カドヘリンに関して免疫染色した。ｈＥＳＣ上のマウス胚盤胞拡散を白線で取り囲み、面積を、ピクセルで測定した。図４Ｃは、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣにおけるヒトトロホブラストＪＥＧ−３細胞浸潤の効果を測定するために使用したコラーゲンｔｒａｎｓｗｅｌｌ浸潤アッセイの概略図を示す。ヒストグラムは、対照細胞の浸潤を１００％と指定した、ＪＥＧ−３浸潤細胞のパーセンテージを示す。データは、３つの独立した実験の平均値を表す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．００５。
【図４Ｃ】図４は、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣの運動性、トロホブラスト拡散（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）および浸潤の分析を示す。図４Ａは、対照ｈＥＳＣおよびＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣにおける創傷治癒アッセイを示す。創傷幅を、創傷後０時間目および２４時間目に測定した。創傷閉鎖のパーセンテージを、画像分析により決定した。値は、３つの異なる実験からの１０個の測定値の平均値である。図４Ｂは、ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションされ、その後、胚付着が起きるまでマウス胚盤胞と共培養されたｈＥＳＣを示す。４８時間後、ｈＥＳＣをビメンチンに関して免疫染色し、マウストロホブラスト細胞をＥ−カドヘリンに関して免疫染色した。ｈＥＳＣ上のマウス胚盤胞拡散を白線で取り囲み、面積を、ピクセルで測定した。図４Ｃは、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣにおけるヒトトロホブラストＪＥＧ−３細胞浸潤の効果を測定するために使用したコラーゲンｔｒａｎｓｗｅｌｌ浸潤アッセイの概略図を示す。ヒストグラムは、対照細胞の浸潤を１００％と指定した、ＪＥＧ−３浸潤細胞のパーセンテージを示す。データは、３つの独立した実験の平均値を表す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．００５。
【図５−１】図５は、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよびｓＰＥ  ｈＥＳＣにおける線維素溶解活性を示す。図５Ａは、３つの異なる実験においてＥＬＩＳＡにより評価され、かつ中央値ｐｇ／ｍＬとして表された、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよびｓＰＥ患者由来のｈＥＳＣの馴化培地におけるプラスミノーゲンレベルを示す。図５Ｂは、蛍光定量的機能アッセイにより評価され、かつ活性プラスミンのｍＭ濃度として表された、ｈＥＳＣ馴化培地と共に存在するプラスミン活性を示す。３つの異なる実験において、ＥＬＩＳＡにより、ＭＭＰ２（図５Ｃ）およびＭＭＰ９（図５Ｄ）のタンパク質レベルを、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよびｓＰＥ  ｈＥＳＣの馴化培地において評価した。図５Ｅは、５０μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬのヘパリンで処理され、かつ０分間、１５分間、３０分間、および６０分間の区間中でのプラスミノーゲンレベルについて分析した、対照、対照ｓｉＲＮＡ、ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ、およびｓＰＥのｈＥＳＣを示し、処理なしの場合も示す。図５Ｅは、１００μｇ／ｍＬのヘパリンで処理され、または処理されていないＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよびｓＰＥ  ｈＥＳＣの馴化培地において測定されたプラスミン活性を示す。図５Ｆは、ヘパリン用量で処理されたｈＥＳＣの馴化培地において分泌されたＡＮＸＡ２タンパク質を示す。ＭＭＰ２（図５Ｈ）およびＭＭＰ９（図５Ｇ）レベルを、ヘパリン処理ｈＥＳＣの馴化培地においてＥＬＩＳＡにより評価した。
【図５−２】図５は、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよびｓＰＥ  ｈＥＳＣにおける線維素溶解活性を示す。図５Ａは、３つの異なる実験においてＥＬＩＳＡにより評価され、かつ中央値ｐｇ／ｍＬとして表された、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよびｓＰＥ患者由来のｈＥＳＣの馴化培地におけるプラスミノーゲンレベルを示す。図５Ｂは、蛍光定量的機能アッセイにより評価され、かつ活性プラスミンのｍＭ濃度として表された、ｈＥＳＣ馴化培地と共に存在するプラスミン活性を示す。３つの異なる実験において、ＥＬＩＳＡにより、ＭＭＰ２（図５Ｃ）およびＭＭＰ９（図５Ｄ）のタンパク質レベルを、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよびｓＰＥ  ｈＥＳＣの馴化培地において評価した。図５Ｅは、５０μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬのヘパリンで処理され、かつ０分間、１５分間、３０分間、および６０分間の区間中でのプラスミノーゲンレベルについて分析した、対照、対照ｓｉＲＮＡ、ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ、およびｓＰＥのｈＥＳＣを示し、処理なしの場合も示す。図５Ｅは、１００μｇ／ｍＬのヘパリンで処理され、または処理されていないＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよびｓＰＥ  ｈＥＳＣの馴化培地において測定されたプラスミン活性を示す。図５Ｆは、ヘパリン用量で処理されたｈＥＳＣの馴化培地において分泌されたＡＮＸＡ２タンパク質を示す。ＭＭＰ２（図５Ｈ）およびＭＭＰ９（図５Ｇ）レベルを、ヘパリン処理ｈＥＳＣの馴化培地においてＥＬＩＳＡにより評価した。
【図５−３】図５は、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよびｓＰＥ  ｈＥＳＣにおける線維素溶解活性を示す。図５Ａは、３つの異なる実験においてＥＬＩＳＡにより評価され、かつ中央値ｐｇ／ｍＬとして表された、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよびｓＰＥ患者由来のｈＥＳＣの馴化培地におけるプラスミノーゲンレベルを示す。図５Ｂは、蛍光定量的機能アッセイにより評価され、かつ活性プラスミンのｍＭ濃度として表された、ｈＥＳＣ馴化培地と共に存在するプラスミン活性を示す。３つの異なる実験において、ＥＬＩＳＡにより、ＭＭＰ２（図５Ｃ）およびＭＭＰ９（図５Ｄ）のタンパク質レベルを、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよびｓＰＥ  ｈＥＳＣの馴化培地において評価した。図５Ｅは、５０μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬのヘパリンで処理され、かつ０分間、１５分間、３０分間、および６０分間の区間中でのプラスミノーゲンレベルについて分析した、対照、対照ｓｉＲＮＡ、ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ、およびｓＰＥのｈＥＳＣを示し、処理なしの場合も示す。図５Ｅは、１００μｇ／ｍＬのヘパリンで処理され、または処理されていないＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよびｓＰＥ  ｈＥＳＣの馴化培地において測定されたプラスミン活性を示す。図５Ｆは、ヘパリン用量で処理されたｈＥＳＣの馴化培地において分泌されたＡＮＸＡ２タンパク質を示す。ＭＭＰ２（図５Ｈ）およびＭＭＰ９（図５Ｇ）レベルを、ヘパリン処理ｈＥＳＣの馴化培地においてＥＬＩＳＡにより評価した。
【図５−４】図５は、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよびｓＰＥ  ｈＥＳＣにおける線維素溶解活性を示す。図５Ａは、３つの異なる実験においてＥＬＩＳＡにより評価され、かつ中央値ｐｇ／ｍＬとして表された、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよびｓＰＥ患者由来のｈＥＳＣの馴化培地におけるプラスミノーゲンレベルを示す。図５Ｂは、蛍光定量的機能アッセイにより評価され、かつ活性プラスミンのｍＭ濃度として表された、ｈＥＳＣ馴化培地と共に存在するプラスミン活性を示す。３つの異なる実験において、ＥＬＩＳＡにより、ＭＭＰ２（図５Ｃ）およびＭＭＰ９（図５Ｄ）のタンパク質レベルを、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよびｓＰＥ  ｈＥＳＣの馴化培地において評価した。図５Ｅは、５０μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬのヘパリンで処理され、かつ０分間、１５分間、３０分間、および６０分間の区間中でのプラスミノーゲンレベルについて分析した、対照、対照ｓｉＲＮＡ、ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ、およびｓＰＥのｈＥＳＣを示し、処理なしの場合も示す。図５Ｅは、１００μｇ／ｍＬのヘパリンで処理され、または処理されていないＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣおよびｓＰＥ  ｈＥＳＣの馴化培地において測定されたプラスミン活性を示す。図５Ｆは、ヘパリン用量で処理されたｈＥＳＣの馴化培地において分泌されたＡＮＸＡ２タンパク質を示す。ＭＭＰ２（図５Ｈ）およびＭＭＰ９（図５Ｇ）レベルを、ヘパリン処理ｈＥＳＣの馴化培地においてＥＬＩＳＡにより評価した。
【図６】図６は、少なくとも部分的にＡＮＸＡ２欠乏により媒介される、ｓＰＥに存在するｈＥＳＣ脱落膜化抵抗性を、ＰＥの母体における原因としての浅いトロホブラスト浸潤および線維素溶解の変化と共に組み込んだモデルを示す。
【図７】図７は、子宮内膜液におけるＡＮＸＡ２レベルの研究を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、子宮内膜のアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）レベルが、正常に妊娠した女性におけるレベルと比較して、以前の妊娠において子癇前症（ＰＥ）を有した女性において減少しているという発見に、少なくとも一部、基づいている。本発明の方法は、ＰＥを発症する素因がある女性を確実に同定するための非侵襲性アッセイを提供する。したがって、本発明は、症状が発生する前にＰＥを発症する素因の早期検出を可能にし、それにより、適切な治療を、時期を逃さずに開始することを可能にする。本発明のもう１つの利点は、子癇前症のリスクが高いと決定されている女性が、子癇前症を防ぎ、または軽減するためにＡＮＸＡ２レベルを増加させる薬剤で処置することができることである。
【００１９】
子癇前症（ＰＥ）は、以前には正常な血圧であった女性において妊娠２０週間後に起きる高血圧（収縮期血圧≧１４０ｍｍＨｇおよび／または拡張期血圧≧９０ｍｍＨｇ）により特徴付けられる状態である。加えて、正常と比較して、尿中のタンパク質のレベルの増加がある。蛋白尿の増加は、２４時間分の尿の収集において≧３００ｍｇと定義される（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｉｇｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｉｎ  Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ２０００年、１８３巻、Ｓ１〜Ｓ２２頁）。血圧の上昇に伴って、頭痛、腹痛、出血問題、痙攣、ならびに胎児成長不良、早産、およびさらに胎児または母親の死亡などの合併症などの関連した徴候および症状があり得る。頻度は、全妊娠の５〜８％であるが、ある特定の群、例えば、双生児を身ごもる女性において非常に高くあり得る。
【００２０】
本発明の一態様によれば、子癇前症を処置するための方法が提供される。本方法は、被験体から得られた試験試料においてアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のレベルを測定することにより、被験体が子癇前症を有するか、または子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップ、試験試料におけるＡＮＸＡ２のレベルをＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して、被験体が子癇前症を有するか、または子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップ、および子癇前症を発症するリスクが高いと決定された被験体に、ＡＮＸＡ２のレベルを上昇させることが公知の有効量の薬剤を投与するステップを含む。
【００２１】
一部の実施形態では、本方法は、被験体から得られた試験試料においてアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のレベルを測定することにより、被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップ、試験試料におけるＡＮＸＡ２のレベルをＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して、被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップ、および子癇前症を発症するリスクが高いと決定された被験体に、有効量のグリコサミノグリカンを投与するステップを含む。
【００２２】
本発明の一態様によれば、子癇前症を診断するか、または子癇前症の診断を補助するための方法が提供される。本方法は、被験体から得られた試験試料においてアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のレベルを測定するステップ、および試験試料におけるＡＮＸＡ２のレベルをＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して、被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップを含む。
【００２３】
本発明の一態様による、子癇前症を処置するための方法。本方法は、現在、子癇前症を有していない被験体の子宮内膜液試料を得るステップであって、被験体が妊娠しているか、または被験体が妊娠する計画を有する、ステップ、子宮内膜液試料においてＡＮＸＡ２のレベルを決定するアッセイを実施するステップ、子宮内膜液試料におけるＡＮＸＡ２のレベルをＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して、被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップ、および被験体が子癇前症を発症するリスクが高いと決定された場合には、有効量のグリコサミノグリカンを被験体に投与するステップを含む。
【００２４】
本発明の一態様によれば、子癇前症を処置するための方法が提供される。本方法は、ＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して低レベルのＡＮＸＡ２を有し、妊娠の計画があり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体を同定するステップ、およびグリコサミノグリカンを、被験体においてＡＮＸＡ２のレベルを上昇させるのに十分な量で被験体に投与するステップを含む。
【００２５】
本発明の一態様によれば、子癇前症についてのグリコサミノグリカン治療の効力を評価するための方法が提供される。本方法は、子癇前症を有するか、または子癇前症を発症するリスクが高い被験体を有効量のグリコサミノグリカンで処置するステップ、グリコサミノグリカンでの処置前および処置後、被験体から得られた試験試料においてアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のレベルを測定するステップであって、処置前のレベルに対する処置後のＡＮＸＡ２のレベルの増加が、グリコサミノグリカン治療が有効であることを示すステップを含む。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「被験体」は、全ての哺乳類を含み、それらとしては、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ヒト、および非ヒト霊長類が挙げられるが、それらに限定されない。一部の実施形態では、被験体は女性である。本明細書で使用される場合、「子癇前症を発症するリスクが高い」被験体は、その集団を代表する平均と比較した場合、子癇前症を発症する確率がより高い被験体を含む。一部の実施形態では、被験体は妊娠していることがわかっている。一部の実施形態では、被験体は妊娠しようと試みている。被験体は、以前に妊娠したことがなくてもよいし、以前、１回もしくは複数回、正常に妊娠したことがあってもよいし、または以前の妊娠においてＰＥを患っている。一部の実施形態では、被験体は、子癇前症についての１つまたは複数のリスク因子を有する。例えば、被験体は、以下の１つまたは任意の組合せを有する場合がある：被験体は１人より多くの赤ん坊を身ごもっている、慢性高血圧、糖尿病、腎臓疾患、もしくは臓器移植の病歴を有する、初めて妊娠している、肥満であり、特に３０もしくはそれ超のボディマス指数（ＢＭＩ）を有する、４０歳超である、もしくは１８歳未満である、子癇前症の家族歴（すなわち、母親、姉妹、祖母、または伯母・叔母がその障害を有した）をもつ、多嚢胞性卵巣症候群を有する、ループス、もしくは関節リウマチ、サルコイドーシス、および多発性硬化症を含む他の自己免疫疾患を有する、体外受精を受けたことがある、または鎌状赤血球症を有する。
【００２７】
一部の実施形態では、本明細書に記載された方法は、ＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して低レベルのＡＮＸＡ２を有し、妊娠の計画があり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体を同定するステップを含む。本明細書で使用される場合、「ＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して低レベルのＡＮＸＡ２を有し、妊娠の計画があり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体を同定すること」とは、ＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して低レベルのＡＮＸＡ２を有し、妊娠する計画を有し、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体を選択することを意味する。そのように同定または選択された被験体は、グリコサミノグリカンを、被験体においてＡＮＸＡ２のレベルを上昇させるのに十分な量で被験体に投与することによりＰＥについて処置される。
【００２８】
用語「試験試料」は、本発明の方法を使用して評価されることになっている被験体、例えば、妊娠しているか、または妊娠しようと試みている被験体に由来した試料を指す。試料の非限定的例としては、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、および子宮内膜液が挙げられる。被験体の試料を得ることとは、被験体の試料を入手することを意味する。被験体から試料を得ることとは、被験体から試料を取り出すことを意味する。したがって、被験体の試料を得て、試料においてＡＮＸＡ２のレベルを測定する人は、必ずしも、被験体から試料を得るとは限らない。一部の実施形態では、試料は、医療従事者（例えば、医者、看護師、または臨床検査実施者（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒ））によって被験体から取り出され、その後、ＡＮＸＡ２のレベルを測定する人に提供されてもよい。試料は、被験体により、または医療従事者（例えば、医者、看護師、または臨床検査実施者）により、ＡＮＸＡ２のレベルを測定する人に提供されてもよい。一部の実施形態では、ＡＮＸＡ２のレベルを測定する人は、試料を被験体から取り出すことにより被験体から試料を得る。
【００２９】
アネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）は、ヒト子宮内膜の分泌期中期および後期中に有意に上方制御されるカルシウム制御性リン脂質結合タンパク質である。このタンパク質は、Ｆ−アクチンネットワークの調節により子宮内膜上皮による受容能表現型の獲得に重要である。ＡＮＸＡ２は、ヒト子宮内膜間質細胞（ｈＥＳＣ）上に存在し、かつ機能する線維素溶解促進性受容体である。それは、プラスミノーゲンおよびそれのアクチベーターｔＰＡの細胞表面共受容体として働き、細胞表面プラスミン生成を有意に増強する。本明細書で使用される場合、用語「アネキシンＡ２」は、アネキシンＡ２の任意の既知のアイソフォームを指す。非限定的に、アネキシンＡ２としては、核酸配列ＮＭ＿００１００２８５８．２、ＮＭ＿００１１３６０１５．２、ＮＭ＿００４０３９．２、およびＮＭ＿００１００２８５７．１、ならびにタンパク質配列ＮＰ＿００１００２８５８．１、ＮＰ＿００１１２９４８７．１、ＮＰ＿００４０３０．１、およびＮＰ＿００１００２８５７．１が挙げられる。他の既知のアネキシンＡ２核酸およびコードされたポリペプチドは、（参照により本明細書に組み入れられた）ＷＯ２００９／１４３６３３に記載されている。
【００３０】
本明細書に開示された方法は、典型的には、試料においてＡＮＸＡ２のレベルを測定し、またはＡＮＸＡ２のレベルを決定するアッセイを実施するステップを含む。ＡＮＸＡ２のレベルは、一般的に、細胞からｍＲＮＡを検出し、ならびに／またはポリペプチドおよびタンパク質などの発現産物を検出することにより、検出され得る。核酸によってコードされた転写産物および／またはタンパク質の発現は、当技術分野における様々な公知の方法のいずれかにより測定され得る。例えば、ＡＮＸＡ２タンパク質のレベルを測定する方法には、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫組織化学的分析、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、質量分析、マイクロアレイ、および顕微鏡観察が挙げられるが、それらに限定されない。ＡＮＸＡ２核酸配列を検出するための方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、インサイチュＰＣＲ、定量的ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）、インサイチュハイブリダイゼーション、サザンブロット、ノーザンブロット、配列分析、マイクロアレイ分析、レポーター遺伝子の検出、または他のＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションプラットフォームが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３１】
本明細書に開示された方法は、典型的には、試験試料におけるＡＮＸＡ２のレベルをＡＮＸＡ２の対照レベルと比較して、被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップを含む。一部の実施形態では、「ＡＮＸＡ２の対照レベル」は、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から導かれる。そのような場合、ＡＮＸＡ２の対照レベルが、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から導かれている時、対照レベルより低い、試験試料におけるＡＮＸＡ２のレベルは、被験体が子癇前症を有するか、または子癇前症を発症するリスクが高いことを示している。一部の実施形態では、対照レベルが、ＰＥ発症の予測となることが公知であり、そのような場合、対照レベルに相当する、試験試料におけるＡＮＸＡ２のレベルは、被験体が、子癇前症を有するか、または子癇前症を発症するリスクが高いことを示している。したがって、試験レベルが対照レベルより統計的に低いかどうかを決定することよりむしろ、試験レベルが、ＰＥ発症の予測となることが公知の範囲内にあるかどうかを決定することができる。対照レベルは、例えば子宮内膜液の１ｍｌあたりのＡＮＸＡ２単位での、定数であり得る。対照レベルは範囲であり得る。対照レベルは、対照試料において測定された比較レベルであり得、そのレベルは、試験レベルのアッセイと同時に測定される。対照レベルは、標準偏差を有する平均として表され得る。本発明は、試験試料が、統計的に、対照より低く、または対照に相当すると決定する特定の方法によって限定されることを意図するものではない。
【００３２】
一部の実施形態では、ＡＮＸＡ２レベルは、月経周期を通して任意の期において測定される。一部の実施形態では、ＡＮＸＡ２のレベルは、月経周期の黄体期中に測定される。一部の実施形態では、ＡＮＸＡ２のレベルは、月経周期の黄体期中期（１８〜２４日目）中に測定される。一部の実施形態では、月経周期の黄体期中期（１８〜２４日目）中に正常な被験体（すなわち、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体）において測定されるＡＮＸＡ２の平均対照子宮内膜液内レベルは、３２μｇ／ｍｌ（平均値±４）であり、一方、ＰＥの素因がある被験体における黄体期中期中のＡＮＸＡ２のレベルは、この対照レベルと比較して、有意に低下している。一部の実施形態では、ＰＥの素因がある被験体におけるＡＮＸＡ２のレベルは、この平均対照ＡＮＸＡ２レベルより２、３、４、または５標準偏差分、低い。一部の実施形態では、ＰＥの素因がある被験体における黄体期中期中のＡＮＸＡ２のレベルは、５μｇ／ｍｌ未満、１０μｇ／ｍｌ未満、１５μｇ／ｍｌ未満、２０μｇ／ｍｌ未満、または２５μｇ／ｍｌ未満である。
【００３３】
一部の実施形態では、対照試料に対する、試験試料におけるＡＮＸＡ２のレベルの減少は、被験体が子癇前症を有するか、または子癇前症を発症するリスクが高いことを示している。「発現の減少」とは、試験試料におけるＡＮＸＡ２の発現が、対照試料におけるその発現から統計的に有意に減少していることを意味する。例えば、試験試料におけるＡＮＸＡ２の発現レベルが、対照試料におけるそれより、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２５０％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％、低い場合、有意な減少が検出され得る。同様に、試験試料におけるＡＮＸＡ２の発現レベルが、対照試料のそれの少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも６分の１、少なくとも７分の１、少なくとも８分の１、少なくとも９分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、少なくとも３０分の１、少なくとも４０分の１、少なくとも５０分の１、少なくとも１００分の１、またはそれ未満である場合、有意な減少が検出され得る。有意差は、適切な統計的検定を使用することにより、同定され得る。統計的有意性についての検定は、当技術分野において周知であり、Ｐｅｔｒｕｃｃｅｌｌｉ、ＣｈｅｎおよびＮａｎｄｒａｍによるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ  １９９９年  再版に例示されている。
【００３４】
一部の実施形態では、分析の結果、すなわち、被験体がＰＥを有し、またはＰＥを有する素因があるかどうか、および分析に関連する任意の他の情報を要約する報告書は、任意選択で、分析の一部として作成すること（本明細書において、報告書を「提供すること」、報告書を「製作すること」、または報告書を「作成すること」と交換可能に呼ばれ得る）ができる。例えば、血圧および／または尿中のタンパク質含量の測定値が決定され得、これらは報告書に含まれ得る。報告書の例には、紙（例えば、試験結果のコンピュータ作成のプリントアウト）または等価の形式での報告書、およびコンピュータ可読媒体（例えば、ＣＤ、コンピュータハードドライブ、またはコンピュータネットワークサーバーなど）上に保存された報告書が挙げられ得るが、それらに限定されない。報告書、特に、コンピュータ可読媒体上に保存された報告書は、データベース（例えば、患者および患者の医療従事者だけがその報告書を見ることを許可するように、報告書へのアクセスを制限するセキュリティ特徴を有する「セキュアデータベース」であり得る、患者の記録のデータベースなど）の一部であり得る。有形の報告書を作成することに加えて、またはその代替として、報告書はまた、コンピュータスクリーン（または別の電子デバイスもしくは電子装置のディスプレイ）上に表示することができる。
【００３５】
報告書はさらに、試験された個体、医療従事者（例えば、医者、看護師、または臨床検査実施者、遺伝子カウンセラー等）、ヘルスケア組織、臨床実験室、および／または報告書を見、もしくは保有することを意図された任意の他の団体などへ伝達、通信、または報告され得る（これらの用語は本明細書で交換可能に使用され得る）。報告書を「伝達すること」または「通信すること」は、報告書の型に基づいて、当技術分野において公知の任意の手段によることができ、その手段としては、口頭伝達と非口頭伝達の両方が挙げられる。さらに、報告書を「伝達する」または「通信する」行為は、報告書を配達すること（「プッシュ型（ｐｕｓｈｉｎｇ）」）、および／または報告書を引き出すこと（「プル型（ｐｕｌｌｉｎｇ）」）を含み得る。例えば、非口頭報告書は、（例えば、紙の形での報告書について）１つの団体から別の団体へ物理的に配達することによるなどの団体間を物理的に移動するような手段により、またはコンピュータネットワークサーバー等上に保存されたデータベースから引き出すことによりなどの電子的に、もしくは信号の形で（例えば、Ｅメールによって、もしくはインターネットを通じて、ファクシミリにより、および／または当技術分野において公知の任意の有線もしくは無線の通信方法により）伝達されることにより、伝達／通信することができる。
【００３６】
一部の実施形態では、本明細書に記載された方法は、子癇前症を有し、または子癇前症を発症する素因があると同定される被験体を、ＡＮＸＡ２レベルを増加させることによって子癇前症が防がれ、または軽減されるようにすることが公知である有効量の薬剤で処置するステップを含む。ＡＮＸＡ２レベルを増加させることが公知の薬剤としては、グリコサミノグリカンが挙げられるが、それに限定されない。グリコサミノグリカンの例としては、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸、低分子量デルマタン硫酸、およびそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。子癇前症についての処置のためのグリコサミノグリカンの追加の例は、参照により本明細書に組み入れられた、ＥＰ１０１６４１０に記載されている。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」は、被験体のＰＥを発症するリスクを低下させ、または改善することを意味する。被験体のＰＥを発症するリスクの低下は、処置前に得られたＡＮＸＡ２レベルと比較した、または対照の正常なＡＮＸＡ２レベル（すなわち、以前、正常に妊娠したことがあり、かつＰＥの病歴をもたない被験体のＡＮＸＡ２レベル）と比較した、ＡＮＸＡ２のレベルの増加として現れ得る。一部の実施形態では、用語「処置する」は、ＰＥを検出可能な量または程度で、低下させ、または改善することを意味する。本明細書で使用される場合、用語「処置する」は、完全な処置と部分的な処置の両方を指す。例えば、ＰＥの処置は、尿中のタンパク質レベルの低下、および／または処置前に得られた血圧レベルと比較した、もしくは対照の正常な血圧レベルと比較した、血圧レベルの減少として現れ得る。
【００３８】
グリコサミノグリカンの「有効量」は、所望の生物学的応答、すなわち、子癇前症を処置することを誘発するのに十分な量を指す。当業者により認識されているように、グリコサミノグリカンの有効量は、所望の生物学的エンドポイント、その化合物の薬物動態、処置されることになっている状態、投与様式、ならびに被験体の年齢および健康のような因子に依存して異なり得る。有効量としては、ＰＥに伴う１つまたは複数の症状を遅らせ、低下させ、阻害し、改善し、または逆転させるのに必要な量が挙げられるが、それらに限定されない。ＰＥの処置において、そのような量は、処置前に得られた血圧レベルと比較して、または対照の正常な血圧レベルと比較して、血圧レベルを減少させるのに十分な量を指し得る。一部の実施形態では、有効量は、尿中のタンパク質レベルの低下を引き起こすのに十分な量を指し得る。一部の実施形態では、有効量は、被験体のＰＥを発症するリスクを低下させるのに十分な量を指し得る。そのような量は、処置前に得られたＡＮＸＡ２レベルと比較して、または対照の正常なＡＮＸＡ２レベル（すなわち、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体のＡＮＸＡ２レベル）と比較して、ＡＮＸＡ２のレベルを増加／上昇させるのに十分な量を指し得る。一部の実施形態では、その量は、処置された被験体においてＡＮＸＡ２の対照の正常なレベルを再確立するのに十分である。
【００３９】
化合物の有効量は、（投与様式に依存して）１または数日間、１回または複数回の用量投与において、約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇまで様々であり得る。ある特定の実施形態では、有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇまで、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約７５０ｍｇ／ｋｇまで、約０．１ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇまで、約１．０ｍｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇまで、および約１０．０ｍｇ／ｋｇから約１５０ｍｇ／ｋｇまで様々である。一部の実施形態では、有効量は、１０００ＩＵ、２０００ＩＵ、３０００ＩＵ、４００００ＩＵ、５０００ＩＵ、６０００ＩＵ、または７０００ＩＵのグリコサミノグリカンである。一部の実施形態では、有効量は、５０００ＩＵのグリコサミノグリカン（例えば、低分子量ヘパリン）である。グリコサミノグリカンは、任意の適切な投与経路を介して投与することができる。例えば、グリコサミノグリカンは、皮下、静脈内、腹腔内、または筋肉内経路を介して投与することができる。
【００４０】
一部の実施形態では、本明細書に記載された方法は、グリコサミノグリカンでの処置前および処置後、被験体から得られた試験試料においてアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のレベルを測定するステップを含む。有効な治療は、処置前のレベルに対して処置後のＡＮＸＡ２のレベルを増加させることが予想される。したがって、有効な治療は、処置後のＡＮＸＡ２のレベルの増加によって示される。
【００４１】
本発明は、以下の実施例によってさらに例証され、その実施例は、決して、さらなる限定として解釈されるべきではない。この出願を通して引用された（文献参考、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属の特許出願を含む）参考文献の全部の全内容は、参照により本明細書に明確に組み入れられている。
【実施例】
【００４２】
（実施例１）
ＡＮＸＡ２欠乏を通して媒介される子宮内膜脱落膜化抵抗性が、子癇前症の母体における原因を示す
材料および方法
組織収集、ｈＥＳＣ単離、および培養
ＩＲＢ承認がＣＥＩＣ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｌａ  Ｆｅ、Ｖａｌｅｎｃｉａ  Ｓｐａｉｎ（コード  ２０１１／０３８３）によって２０１１年８月８日に得られ、書面でのインフォームドコンセントは、組織収集の前に各患者からサインされた。重篤な子癇前症（ｓＰＥ）子宮内膜生検材料（ｎ＝１３）を、１〜５年間の間に生じた最近の妊娠中にｓＰＥを患ったことがある女性から得た。非子癇前症（非ＰＥ）子宮内膜生検材料を、１８〜３２歳の正常な妊娠をもつ女性から収集した（ｎ＝１３）。全ての患者は、規則的な月経周期を有し、潜在する子宮内膜病理はなく、生検材料収集前の３ヶ月間の間、ホルモン処置を受けなかった。平均年齢および平均ＢＭＩは、２つの群において類似していた。
【００４３】
子宮内膜生検材料を、ｐｉｐｅｌｌｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して無菌条件下で得た。前に記載されているように（４１）、穏やかなコラゲナーゼ消化により試料を処理し、間質コンパートメントを単離した。ヒト子宮内膜間質細胞（ｈＥＳＣ）培養物を、１０％活性炭処理済みウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および０．１％抗生物質を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ）で構成される培地を使用して増殖させた。異なるアッセイのためのｈＥＳＣを、２日間または４日間、プレートにおいてコンフルエンスまで培養した。
【００４４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱落膜化プロトコール
コンフルエントなｈＥＳＣ単層を、２％ＦＢＳ、０．１％抗生物質、ならびに２つの異なる脱落膜化プロトコール：ｉ）３日ごとに培地を新しくしながら、９日間、プロゲステロン（Ｐ４）（１μＭ）およびβ−エストラジオール（Ｅ２）（３０ｎＭ）；ｉｉ）３日間、８−ブロモ−ｃＡＭＰ（ｃＡＭＰ、Ｓｉｇｍａ）（０．５ｍＭ）および酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ、Ｓｉｇｍａ）（１μＭ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２で脱落膜化させた。対照ｈＥＳＣを、脱落膜反応の誘導物質を含まずに、並行して培養した。
【００４５】
特徴的な脱落膜表現型を、生化学的に、馴化培養培地中のＰＲＬ（Ａｂｎｏｖａ）およびＩＧＦＢＰ−１（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ）タンパク質レベルのＥＬＩＳＡによる分析により、ならびに形態学的に、Ｆ−アクチン染色により確認した。ｈＥＳＣを、プラスチックプレートにおいて、３０〜４０％のコンフルエンスまで培養した。エピトープマスキングの効果を最小限にするために、細胞を、低濃度の固定液（２〜３％パラホルムアルデヒド）で固定し、５％ＢＳＡでブロッキングした。細胞を、Ｆ−アクチンへの０．１μｇ／ｍＬ  Ａｍａｎｉｔａ  Ｐｈａｌｌｏｉｄｅｓ由来のファロイジン−テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート結合体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）と、暗所中、室温で３０分間、インキュベートした。共焦点蛍光顕微鏡画像を、１００×１．４５開口数の対物レンズおよびＹｏｋｏｇａｗａ回転盤共焦点ユニット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を備えたＮｉｋｏｎ顕微鏡で得た。各免疫蛍光標識について、少なくとも３つの異なる組織調製物を使用した。
【００４６】
細胞内および細胞外ＡＮＸＡ２タンパク質アッセイ
ｈＥＳＣ細胞を、溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ  ３６０、０．５％  Ｎａ−ＤＯＣ、０．１％  ＳＤＳ、および０．５Ｍ  ＥＤＴＡ）中に溶解した。タンパク質抽出物（２５μｇ／レーン）を、電気泳動により１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ（疎水性ポリビニリデンジフルオリド膜）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に転写し、５％ミルクおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ緩衝食塩水中でブロッキングした。膜を、１／２５００ウサギポリクローナル抗ヒトアネキシンＩＩ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）および１／２０００マウスモノクローナル抗ヒトβ−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）と４℃で終夜、インキュベートし、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（ＣＡ、ＵＳＡ）製の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化二次ヤギ抗ウサギ抗体およびヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体で調べた。抗体−抗原複合体を、増強ケミルミネッセンスＥＣＬ  Ｐｌｕｓ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＴ、ＵＳＡ）を使用して検出した。
【００４７】
タンパク質抽出物（２μｇ／ウェル）および馴化培地を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）により分析した。固定化捕捉抗体は、アネキシンＡ２を特異的に結合する。結合していない材料を洗い流した後、アネキシンＡ２に特異的なビオチン化検出抗体を使用して、標準ストレプトアビジン−ＨＲＰ様式で、結合したアネキシンＡ２を検出した。条件ごとに３つの複製で実施し、吸光度値を、標準曲線に外挿して、ヒトアネキシンＡ２濃度（ｐｇ／ｍＬ）を確立した。
【００４８】
ＡＮＸＡ２免疫組織化学
ホルマリン固定されかつパラフィン包埋された子宮内膜生検材料を、切片にし、Ｖｅｃｔａｂｏｎｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）でコーティングされたスライドガラス上にマウントした。脱パラフィンおよび再湿潤化（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）後、切片を、ＰＢＳで５分間、３回、すすいだ。免疫組織化学を、ＬＳＡＢペルオキシダーゼキット（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、子宮内膜切片上で実施した。非特異的結合を、ＰＢＳ中５％ＢＳＡでブロッキングした。３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に希釈した１：１００ウサギポリクローナル抗ヒトアネキシンＩＩ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）と、室温で１時間、切片をインキュベートした。抗体の非存在下で、陰性対照を、３％ＢＳＡを含むＰＢＳとともにインキュベートした。ウサギ起源一次抗体に対して適用される二次抗体は、ＬＳＡＢペルオキシダーゼキット（Ｄａｋｏ）に含まれていた。３，３０−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）色素原で、３０秒間から１分間の間の時間、染色を達成させた。ヘマトキシリンでの１０秒間の対比染色および蒸留水での洗浄後、スライドをｅｎｔｅｌｌａｎ（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でマウントした。
【００４９】
ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ
ＡＮＸＡ２をサイレンスさせるために、ＡＮＸＡ２に対する特異性を有するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＣＧＧＣＣＵＧＡＧＣＧＵＣＣＡＧＡＡＡＴＴ、配列番号１）および陰性対照ＲＮＡ二重鎖を、どちらも３’−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｑｉａｇｅｎ  ＣＡ、ＵＳＡ）で修飾して、使用した。ｈＥＳＣにＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）またはｓｉＲＮＡ陰性対照（１００ｎＭ）をトランスフェクションした。全てのトランスフェクション実験を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用して実施した。その処理と共に、細胞を３７℃で６時間、インキュベートし、その後、培地は、新しく、ｓｉＲＮＡを含まない新鮮な培地に交換した。
【００５０】
Ｆ−アクチン／Ｇ−アクチンのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
ＡＮＸＡ２阻害、続いて脱落膜誘導物質（ＡＭＰｃおよびＭＰＡ）に供したＥＳＣ細胞中の遊離単量体アクチン（Ｇ−アクチン）  対  線維状アクチン（Ｆ−アクチン）の含有量を、Ｇ−アクチン／Ｆ−アクチンｉｎ  ｖｉｖｏアッセイキット（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ、ＣＯ、ＵＳＡ）を使用して決定した。非脱落膜対照、対照野生型、ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ、および脱落膜のＥＳＣ細胞を、Ｆ−アクチン安定化バッファー中、３７℃でホモジナイズした。その後、細胞溶解産物を、低速度遠心分離（２０００ｒｐｍ）で非破壊細胞を除去した。除去後の溶解産物を、その後、１０００００×ｇで遠心分離して、可溶性Ｇ−アクチンを不溶性Ｆ−アクチンから分離した。その後、諸画分を、ポリアクリルアミドゲル上に比例させてロードし、電気泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、１／５００抗アクチン抗体（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ、ＣＯ、ＵＳＡ）でプローブするためにニトロセルロース膜に転写した。ウェスタンブロットの濃度測定定量化により、総アクチンで正規化された、サイトゾル中に見出されるＧ−アクチン  対  細胞骨格に組み入れられたＦ−アクチンの比が決定された。
【００５１】
創傷閉鎖アッセイ
ｈＥＳＣ細胞をカバーガラス上に播種し、コンフルエンスまで増殖させ、脱落膜化させ、続いて、ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ処理（６時間）を行った。９６時間後、各カバーガラスを滅菌ピペットチップで引っ掻き、ＰＢＳで洗浄し、新鮮な培地に置いた。創傷幅を、位相差顕微鏡により、すぐに、および２４時間後に、測定した。創傷閉鎖を、最初の創傷幅のうちの閉鎖区域のパーセンテージとして計算した。示されたデータは、３つの独立した実験から取られた１０個の測定値の平均値±ＳＥＭを表している。
【００５２】
トロホブラスト拡散アッセイ
使用されるプロトコールは、Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖａｌｅｎｃｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅにより、実験動物の保護および使用についてのＵ．Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈガイドラインに従って、承認された。Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウス系統を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）から購入した。週齢６〜８週間の雌マウスを過排卵させ、繁殖用雄とペアで終夜、収容した。妊娠２日目に、卵管から胚を回収し、ＣＣＭ−３０培地（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ、Ｌｕｂｅｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で３日間、培養した。正常な形態を有する発達した胚盤胞だけを、研究に含めた（ｎ＝４２５マウス胚）。
【００５３】
孵化した胚を、対照、対照ｓｉＲＮＡ、またはＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡとして働くコンフルエントな脱落膜化ｈＥＳＣ単層上に共培養した。４８時間後、付着した胚盤胞のトロホブラスト拡散面積を評価した。共培養物を、低濃度の固定液（２〜３％パラホルムアルデヒド）で固定し、５％ＢＳＡでブロッキングし、３％ＢＳＡ中に希釈された、１／５０マウス抗ビメンチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）および１／１００ウサギ抗Ｅ−カドヘリン（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を含む一次抗体と、室温で２時間、インキュベートした。細胞を、二次抗体、ビメンチンに対する１／１０００  ＴＲＩＣＴ抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、ｓｐａｉｎ）、およびＥ−カドヘリンに対する１／１０００  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）と、暗所中、室温で１時間、インキュベートした。条件あたり１０〜１５個のマウス胚盤胞を、各実験において評価した。（ピクセルで表される）成長面積を、３つの独立した実験から取られた３連セットの測定値の平均値±ＳＥＭとして表した。
【００５４】
浸潤アッセイ
トロホブラスト由来細胞株ＪＥＧ−３を使用して、トロホブラストの脱落膜ｈＥＳＣを通って浸潤する能力を評価した（参考文献  Ｈａｎｎａｎ  ２０１０年）。浸潤アッセイを、コラーゲンＴｒａｎｓｗｅｌｌ浸潤キット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔ．  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して実施した。対照、対照ｓｉＲＮＡ、またはＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡとしての５×１０５個の脱落膜化ｈＥＳＣを、８ｍｍポアサイズのｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートに入れて、２４時間、コンフルエンスまで増殖させた。インサートの上面において、１０６個のＪＥＧ−３細胞をｈＥＳＣ培地中に再懸濁し、ＪＥＧ−３細胞を４８時間、浸潤させた。浸潤を、標準マイクロプレートリーダーを使用してＯＤにより測定した（図４Ｃ）。
【００５５】
線維素溶解研究
プラスミノーゲンレベルを、馴化培地において、ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）により、製造業者の使用説明書に従って評価した。２連のウェルにおける平均吸光度（Δ４５０ｎｍ）を、ｈＥＳＣを含まない培地を有するウェル由来のバックグラウンドを引き算することにより計算した。
【００５６】
プラスミン活性を、馴化培地において、蛍光定量アッセイキット（Ａｎａｓｐｅｃ、ＣＡ、ＵＳＡ）により測定した。それは、４９６ｎｍ／５２０ｎｍ（励起／発光）で検出される明るい緑色蛍光を有するローダミン１１０フルオロフォアを生成する、プラスミン基質のプロテアーゼ切断に基づいている。５０マイクロリットルの馴化培地を、室温で１０分間、プレインキュベートし、５０μＬのプラスミン基質溶液を各ウェルに加えた。蛍光シグナルを、動態読み取りのために得た。測定はすぐに開始し、６０分間にわたり５分ごとにデータを記録し、読み取り（ｌｅｃｔｕｒｅ）は合計１３個であった。各条件を２連で評価した。蛍光を、Ｒｈ１１０蛍光参照標準を使用して濃度値に内挿した（ｉｎｔｅｒｐｏｌ）。
【００５７】
ＭＭＰ２およびＭＭＰ９のレベル
ＭＭＰ２およびＭＭＰ９のプロタンパク質型および活性タンパク質型を、市販のＥＬＩＳＡ分析（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、ＧＡ、ＵＳＡ）により評価した。これらのアッセイは、９６ウェルプレート上にコーティングされたヒトＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９に特異的な抗体を利用している。標準および試料を、ピペットによりウェルへ２連にし、試料中に存在するＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を、固定化抗体によりウェルに結合させる。ビオチン化抗ヒトＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９ならびにＨＲＰ結合体化ストレプトアビジンを加えた。ＴＭＢ基質溶液を加え、４５０ｎｍでの吸光度を、標準曲線に外挿した。
【００５８】
定量的ＰＣＲ
全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ  ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）を使用して、製造業者の使用説明書に従い、ｈＥＳＣ培養物から抽出した。最初に、１μｇの全ＲＮＡを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、製造業者の使用説明書に従い、ｃＤＮＡへ逆転写した。定量的リアルタイムＰＣＲを、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０システム（Ｒｏｃｈｅ）においてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して実施した。転写産物を、内部対照としてＧＡＰＤＨを使用して、対応する標準曲線から定量化した。各実験を、３連で試料ごとに３回、実施した。以下のプライマーを使用した：ＡＮＸＡ２（Ｆｗ：ＴＧＴＧＣＡＡＧＣＴＣＡＧＣＴＴＧＧＡ、配列番号２、Ｒｖ：ＡＧＧＴＧＴＣＴＴＣＡＡＴＡＧＧＣＣＣＡＡ、配列番号３）およびＧＡＰＤＨ（Ｆｗ：ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ、配列番号４、Ｒｖ：ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ、配列番号５）。
【００５９】
ヘパリン用量反応
ｈＥＳＣを、用量反応実験を策定するために、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ、Ｍａｄｒｉｄ）の存在下、１５分間、３０分間、および６０分間、単層上で培養した。ｈＥＳＣ細胞からの馴化培地を収集して、プラスミノーゲンレベル、プラスミン活性、およびメタロプロテアーゼ産生を分析した。
【００６０】
統計解析
各実験あたり、少なくとも３つの異なる子宮内膜生検材料を使用し、３連で測定値を取った。平均値±ＳＥＭが提示され、ｎは実験の数を示す。データは、ＳＰＳＳソフトウェアを用い、ｔ検定を使用して、分析された群間の大域的差について分析した。Ｐ≦０．０５のｐ値は、有意とみなされた。（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【００６１】
結果
以前の妊娠においてｓＰＥを患った患者におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱落膜化抵抗性
正常な妊娠の過去をもつ対照患者（非ＰＥ）（ｎ＝１３）と比較した、以前の妊娠において重篤なＰＥ（ｓＰＥ）を患ったことがある女性（ｎ＝１３）由来のｈＥＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱落膜化を評価した。ｓＰＥ群において、混合型ＨＥＬＬＰ症候群、子癇、または子癇に終わったＨＥＬＬＰ症候群を発症した２つの連続した以前のｓＰＥを含む異なる型を患った女性からｈＥＳＣを単離した。ｓＰＥおよび非ＰＥの患者は、同等のＢＭＩおよび年齢をもつが、ｓＰＥの患者は、より高い収縮期／拡張期血圧、蛋白尿、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ならびにより低い血小板数およびフィブリノーゲンレベルを有した。脱落膜刺激物質としてのｃＡＭＰ（０．５μＭ）＋ＭＰＡ（１μＭ）で５日間か、またはホルモン誘導物質Ｐ４（１μＭ）＋Ｅ２（３０ｎＭ）で９日間のいずれかで脱落膜化したｈＥＳＣは、類似した結果を示した。したがって、ｃＡＭＰ＋ＭＰＡプロトコールをこの研究に使用した。興味深いことには、ＰＲＬおよびＩＧＦＢＰ−１分泌は、非ＰＥ対応物と比較して、ｓＰＥから得られたｈＥＳＣにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱落膜化が損なわれていたことを実証している（それぞれ、図１Ａおよび１Ｂ）。ｈＥＳＣにおけるＦ−アクチン再編成を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱落膜化中に調べ、非ＰＥにおいて線維芽細胞表現型から膨大した円形細胞形態への移行を示したが、脱落膜表現型への移行は、ｓＰＥ患者由来の脱落膜化ｈＥＳＣにおいて存在しなかった（図１Ｃ）。
【００６２】
ｓＰＥにおけるＡＮＸＡ２の下方制御され、かつ制御解除されたｈＥＳＣ発現
以前の妊娠においてｓＰＥを患った女性  対  非ＰＥ患者に由来した全子宮内膜試料におけるＡＮＸＡ２タンパク質存在量を分析した（図２Ａ）。濃度測定分析により、非ＰＥ患者（ｎ＝６）と比較して、ｓＰＥ（ｎ＝６）由来の子宮内膜におけるＡＮＸＡ２存在量の有意な低下が示された（図２Ａ）。子宮内膜ＡＮＸＡ２局在化を調べた。非ＰＥに対してｓＰＥにおける間質コンパートメントでのより低い染色が観察された（図２Ｂ）。次に、ｓＰＥ患者  対  非ＰＥ患者に由来したｈＥＳＣを単離し、脱落膜化させ、ＡＮＸＡ２タンパク質をウェスタンブロットによって評価した（図２Ｃ）。濃度測定分析により、ｓＰＥ女性において、非ＰＥ患者と比較して、ＡＮＸＡ２が、基礎条件下で有意に低下し、脱落膜化したｈＥＳＣにおいて制御解除されることが実証された（図２Ｃ）。この分子をさらに定量化するために、両方の条件において脱落膜化中の細胞内型および分泌型のＡＮＸＡ２を、ＥＬＩＳＡを使用して分析した。この分析により、脱落膜化刺激物質の存在下でｓＰＥ女性由来のｈＥＳＣが、対照と比較して、細胞内および細胞外の両方のＡＮＸＡ２において有意な低下および制御解除を受けることが裏付けられる（図２Ｄ）。さらに、分泌型は細胞内ＡＮＸＡ２を反映し、これにより、ＰＥ患者において脱落膜化抵抗性を予測するために使用することができるバイオマーカーとしてのＡＮＸＡ２の使用が確認される。
【００６３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱落膜化中のｈＥＳＣにおけるＡＮＸＡ２の制御および機能性
以前の研究は、ＡＮＸＡ２が、胚着床の受容能獲得および初期段階の間、ヒト子宮内膜において月経周期を通して制御されることを示している。次に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｈＥＳＣ脱落膜化中のＡＮＸＡ２の制御を調べた。ウェスタンブロット（図３Ａ）および濃度測定分析により評価された細胞内ＡＮＸＡ２は、どちらのプロトコールを使用しても、非脱落膜化ｈＥＳＣに対する脱落膜化ｈＥＳＣにおける細胞内ＡＮＸＡ２の上方制御が裏付けられる（図３Ａ）。その細胞内動力学と並行して、分泌型ＡＮＸＡ２を、ｈＥＳＣの上清においてＥＬＩＳＡにより測定した（図３Ｂ）。これらの結果は、細胞内および細胞外ＡＮＸＡ２が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱落膜化中にｈＥＳＣにおいて上方制御されることを実証している。
【００６４】
次に、ｈＥＳＣにおけるＡＮＸＡ２の機能性を、ｓｉＲＮＡアプローチを使用してＡＮＸＡ２分子を阻害することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱落膜化中に評価した。ｈＥＳＣトランスフェクションから２４時間後、非脱落膜条件および脱落膜条件の両方で、対照群および対照ｓｉＲＮＡ群と比較して、ｓｉＲＮＡ群において、ＡＮＸＡ２  ｍＲＮＡ（図３Ｃ）およびタンパク質（図４Ｄ）の有意な低下が観察された。それの機能的関連性を確証するために、ＡＮＸＡ２阻害の影響を、ＰＲＬおよびＩＧＦＢＰ−１などの脱落膜バイオマーカーの分泌、加えて、脱落膜刺激の開始後７２時間目における形態学的表現型変化において評価した。対照と違って、ｓｉＲＮＡ脱落膜化ｈＥＳＣにおいてＰＲＬおよびＩＧＦＢＰ−１は存在しなかった（図３Ｅおよび３Ｆ）。また、ローダミン−ファロイジン染色により、ＡＮＸＡ２干渉は、脱落膜化過程中のＦ−アクチン構造の特徴的な表現型改変を抑止し、Ｆ−アクチンフィラメントの長手方向の配向を変化しないままにした（図３Ｇ）。ＡＮＸＡ２阻害後の脱落膜化中のアクチン細胞骨格の再編成もまた、細胞骨格へ組み入れられたＦ−アクチンと比較した、サイトゾルに見出される遊離単量体Ｇ−アクチンの比を使用して、調べた（図３Ｈ）。平均Ｇ／Ｆ−アクチン比は、脱落膜表現型および非脱落膜表現型のどちらも、対照および対照ｓｉＲＮＡのｈＥＳＣ細胞においておよそ１：１であったが、ＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣ細胞は、Ｆ−アクチンと比較して単量体Ｇ−アクチンの含有量の有意な増加を示した（ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ処理された非脱落膜細胞において３：１の比、およびＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ処理された脱落膜細胞において４：１の比）（図３Ｈ）。これらのデータは、ＡＮＸＡ２阻害が、アクチンフィラメント脱重合およびＧ−アクチン単量体の割合の有意な増加を通して脱落膜化抵抗性を誘導することを実証し、脱落膜化過程中のＦ−アクチンファイバーの再編成におけるＡＮＸＡ２の機能的役割を示している。
【００６５】
ＡＮＸＡ２阻害は、ｈＥＳＣ運動性、トロホブラスト拡散および浸潤を低下させる
ＡＮＸＡ２阻害により誘導される脱落膜化抵抗性のトロホブラスト拡散および浸潤へのパラクリン作用をさらに理解するために、ＡＮＸＡ２のｈＥＳＣ運動性への関与を分析するために、創傷閉鎖アッセイを実施した。ｈＥＳＣの脱落膜化に続いて、ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡを、６時間、トランスフェクションし、その後、細胞の単層を引っ掻きによって破壊し、遊走に関してのＡＮＸＡ２阻害の効果を、ビデオ顕微鏡観察により２４時間中、追跡した（図４Ａ）。ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ阻害細胞における創傷閉鎖のパーセンテージは、対照細胞および対照ｓｉＲＮＡ細胞と比較して、有意に低下した（図４Ａ）。
【００６６】
マウス胚をコンフルエントな脱落膜化ｈＥＳＣ単層上に置き、続いてＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡによる阻害を行う異種性ｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養モデルを使用する、ＡＮＸＡ２阻害のトロホブラスト拡散への効果を、次に研究した。Ｅ−カドヘリンおよびビメンチンの免疫染色により、それぞれ、マウストロホブラストおよびｈＥＳＣが同定される。トロホブラスト拡散の総面積を、ピクセルの数として評価し、対照および対照ｓｉＲＮＡのｈＥＳＣ細胞と比較して、ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ細胞における有意な減少が観察された（図４Ｂ）。
【００６７】
ＪＥＧ−３ヒトトロホブラスト細胞株のＡＮＸＡ２阻害ｈＥＳＣ細胞への浸潤性もまた、コラーゲン浸潤チャンバーアッセイを使用して分析した。脱落膜化ｈＥＳＣを、ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡにより阻害し、コラーゲン層上のインサート内で培養した。その後、ＪＥＧ−３細胞懸濁物をインサートの上面に置いた。処理されたｈＥＳＣの単層およびコラーゲンバリアを通って浸潤する能力を調べた。ＡＮＸＡ２阻害細胞における浸潤したＪＥＧ−３細胞のパーセンテージは、対照ｈＥＳＣと比較して有意に低下した（図４Ｃ）。
【００６８】
ＡＮＸＡ２の阻害による線維素溶解活性の欠乏もまた、ｓＰＥ由来のｈＥＳＣに存在する
線維素溶解系は、フィブリン沈着を通してＰＥの病因および子宮内膜機能不全の素因に結びつけられている。ＰＥ女性由来のｈＥＳＣと比較した、ｈＥＳＣ  ＡＮＸＡ２阻害の線維素溶解活性への機能的効果を調べた。この目的のために、脱落膜化対照、ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ、およびＰＥ由来のｈＥＳＣからの、馴化培地におけるプラスミノーゲンレベルおよびプラスミン活性を分析した。プラスミノーゲンレベルおよびプラスミン活性は、対照ｓｉＲＮＡ  ｈＥＳＣおよび対照脱落膜化ｈＥＳＣと比較して、ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡおよびｓＰＥ由来のｈＥＳＣにおいて有意に低下した（プラスミノーゲンレベル：それぞれ、２２９．１±２３．１および１９１．５±３６．７ｐｇ／ｍＬ  対  ３０５．１±２３．２および３９７．１±４５．１ｐｇ／ｍＬ；プラスミン活性：それぞれ、１２．７±３．６ｍＭおよび４．２±０．７５ｍＭ  対  ２７．５±１０．２ｍＭおよび２３．１±４．１ｍＭ）（図５Ａおよび５Ｂ）。したがって、線維素溶解系は、脱落膜化ｈＥＳＣにおいてＡＮＸＡ２が阻害されている場合に欠乏し、ｓＰＥ患者由来のｈＥＳＣにおいてより高い程度で欠乏している。
【００６９】
興味深いことに、プラスミノーゲン／プラスミン系は、フィブリンおよびコラーゲンなどのＥＣＭ成分を分解するＭＭＰ２およびＭＭＰ９タンパク質の産生によりトロホブラスト浸潤を制御する。ＭＭＰ２およびＭＭＰ９タンパク質分泌を、ＡＮＸＡ２阻害およびｓＰＥの脱落膜化ｈＥＳＣの馴化培地においてＥＬＩＳＡにより分析した。ＭＭＰ２およびＭＭＰ９分泌のレベルは、ＡＮＸＡ２が阻害された場合、およびｓＰＥ患者において、有意に低下した（図５Ｃおよび５Ｄ）。
【００７０】
ヘパリン処理は、ＡＮＸＡ２低下ｈＥＳＣにおいて欠損線維素溶解系の活性化を支持する
ヘパリンは、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）を通して線維素溶解経路に作用し、ヘパリンのＡＮＸＡ２との結合の直接的効果としても記載されている。ヘパリンの線維素溶解への効果を、対照ｓｉＲＮＡ、ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ阻害、非ＰＥ、およびＰＥの脱落膜化ｈＥＳＣにおいてプラスミノーゲン存在量およびプラスミン活性を測定する用量反応および時間依存性実験で分析した。１００μｇ／ｍＬでのヘパリンは、ＡＮＸＡ２阻害およびｓＰＥの脱落膜化ｈＥＳＣを含む、調べられた全ての条件において馴化培地へのプラスミノーゲンおよびプラスミンの分泌を有意に増加させた（図５Ｅ）。また、ヘパリンのプラスミンへの効果もまた評価し、同じ用量において、ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡおよびｓＰＥ由来のｈＥＳＣにおけるプラスミン活性の有意な増加を生じた（図５Ｆ）。対照、ＡＮＸＡ２  ｓｉＲＮＡ、およびｓＰＥ患者由来のｈＥＳＣの馴化培地における分泌された細胞外ＡＮＸＡ２レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。結果により、ヘパリン処理が、培養培地へ分泌されたＡＮＸＡ２タンパク質の有意な増加を誘導することが裏付けられた（図５Ｇ）。
【００７１】
最後に、全ての条件における、ヘパリンのＭＭＰ２およびＭＭＰ９メタロプロテアーゼ産生への機能的効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した（図５Ｈ）。ヘパリンでの処理は、トロホブラストの子宮内膜間質細胞を通っての浸潤を促進する重要な要素である、メタロプロテアーゼの有意な増加を誘導した。したがって、ｓｉＲＮＡにより誘導されたか、またはｓＰＥを有する患者に自然発生したＡＮＸＡ２欠乏脱落膜化ｈＥＳＣへのヘパリンの直接的および／または間接的効果は、少なくとも一部、関連した線維素溶解性欠陥を矯正する。
【００７２】
これらのデータに基づいて、少なくとも部分的にＡＮＸＡ２欠乏によって媒介される、ｓＰＥに存在するｈＥＳＣ脱落膜化抵抗性を、ＰＥの母体における原因としての浅いトロホブラストの浸潤および線維素溶解の変化と共に組み込んだモデルが提案される（図７）。ｓＰＥにおける、またはｓｉＲＮＡを通して誘導されたＡＮＸＡ２欠乏ｈＥＳＣが、それらの典型的な形態学的変換を妨害する、アクチンフィラメントの脱重合およびＧ−アクチン単量体の割合の有意な増加により適切に脱落膜化しないことが見出された。下流における主な帰結は、前酵素プラスミノーゲンへの直接的効果を含み、そのことが、プラスミン生成の低下をもたらし、それが、線維素溶解系の欠乏による血栓形成促進性パラクリン効果を生じることを含んだ。同様に、ＡＮＸＡ２活性化の欠損は、フィブリンおよびコラーゲンなどのＥＣＭ成分を分解するＭＭＰ２およびＭＭＰ９の阻害を通して浅いトロホブラスト浸潤をもたらす。ＡＮＸＡ２を通して作用するヘパリンの添加は、示した下流における効果を克服することができる。
【００７３】
考察
ＰＥの考え得る原因として欠損ＣＴＢ分化は熱心に研究されているが、本研究は、この産科合併症の起源に関与する子宮内膜の母体のパラクリン因子に着目した。疫学研究によって、母系家族における過去のＰＥが、近親者の女性においてＰＥを患うリスクの２４％〜１６３％増加と関連することが明らかになっている。しかしながら、父系家族におけるＰＥエピソードは、所定の患者におけるＰＥリスクに影響しない。したがって、ＰＥについての遺伝子感受性は、母系と明らかに関連している。
【００７４】
子宮壁におけるＣＴＢの浸潤を制御する脱落膜からの脱落膜化変換を通してｈＥＳＣを標的にした。非ＰＥ対応物と比較した、ｓＰＥから得られるｈＥＳＣにおける脱落膜化抵抗性の同定は本研究を促進した。
【００７５】
アネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）は、ヒト子宮内膜の分泌期中期および後期中に有意に上方制御されるカルシウム制御性リン脂質結合タンパク質である。このタンパク質は、Ｆ−アクチンネットワークの調節によって、子宮内膜上皮が受容能表現型を獲得するうえで重要である。ＡＮＸＡ２は、ｈＥＳＣ上に存在し、かつ機能する線維素溶解促進性受容体である。それは、プラスミノーゲンおよびそれのアクチベーターｔＰＡの細胞表面共受容体として働き、細胞表面プラスミン生成が有意に増強される。ＰＥにおいて線維素溶解経路が変化しているので、機構分析をＡＮＸＡ２に注力した。なぜなら、この分子の高い力価が、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）（ＰＥの発症の素因となることが公知である状態）における血栓性事象と関連づけられているからである。さらに、ＰＥを有する胎盤におけるＡＮＸＡ２自己抗体が、胎盤トロンビン形成の考え得る原因として示唆されている。
【００７６】
最初に、子宮内膜間質コンパートメント内のＡＮＸＡ２は、非ＰＥに対して、以前の妊娠でｓＰＥを患った患者において低下した。次に、この分析から、脱落膜化刺激物質の存在下でのｓＰＥ女性由来のｈＥＳＣは、対照と比較して、細胞内ＡＮＸＡ２および細胞外ＡＮＸＡ２の両方において有意な低下および制御解除を受けることが裏付けられる。もう１つの驚くべき所見は、細胞内および細胞外ＡＮＸＡ２が、ｈＥＳＣにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱落膜化中、上方制御され、それの機能阻害が、アクチンフィラメントの脱重合およびＧ−アクチン単量体割合の増加を通して脱落膜化抵抗性を誘導することであった。ＡＮＸＡ２阻害により誘導される脱落膜化抵抗性のオートクリンおよびパラクリン作用のさらなる研究により、ｈＥＳＣ運動性の直接的効果、ならびに、この病理学的状態の顕著な特徴である、トロホブラスト拡散および浸潤の低下が明らかにされた。
【００７７】
線維素溶解は、フィブリン血栓をリモデリングおよび分解する組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）およびウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）の作用を通して、プラスミノーゲンがプラスミンへと変換される、非常に組織化された過程である。ＰＥ由来の胎盤における共通の病理組織学的所見は、フィブリン沈着と共に様々な程度の血栓症の出現である。線維素溶解機能の欠陥は、血栓症の増加の公知のリスク因子である。線維素溶解の変化がＰＥに存在しており、その疾患の発症における、原因かまたは結果のいずれかとしての線維素溶解異常を示唆している。ＡＮＸＡ２は、前酵素プラスミノーゲン、および同じ程度で、外因性線維素溶解経路へ直接的効果を生じ、したがって、線維素溶解系は、ＡＮＸＡ２が阻害された場合の脱落膜化ｈＥＳＣにおいて欠乏し、脱落膜化抵抗性をもつｓＰＥ患者由来のｈＥＳＣにおいてより高い程度で欠乏した。プラスミノーゲン／プラスミン系の変化は、フィブリンおよびコラーゲンなどのＥＣＭ成分を分解するＭＭＰ２およびＭＭＰ９の阻害を通して、トロホブラスト浸潤を妨げた。１００μｇ／ｍＬの用量でのヘパリンがｉｎ  ｖｉｔｒｏで、調べられた全ての条件において、分泌型ＡＮＸＡ２タンパク質、プラスミノーゲン、プラスミン、ＭＭＰ２、およびＭＭＰ９の産生を増加させることも実証された。したがって、この研究は、ＰＥにおけるヘパリン処置の報告された有益な効果を理解するための基礎を固めるものである。
【００７８】
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【００７９】
本明細書に示され、記載されたものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の説明から当業者にとって明らかになるであろうが、それらは、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。本発明の利点および目的は、必ずしも、本発明の各実施形態によって包含されるとは限らない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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