(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰＤ−１に結合し、下記（ａ）または（ｂ）で示される重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の組み合わせを含む抗体：
（ａ）それぞれ、配列番号１７、４０および６３で規定される相補性決定領域 （ＣＤＲ）１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号８６、１０９および１３２で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｂ）それぞれ、配列番号２、２５および４８で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号７１、９４および１１７で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ。
【請求項２】
キメラ抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体および医薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項４】
細胞上のＰＤ−１に結合するためのものである、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項５】
細胞上のＰＤ−１に結合するためのものである、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
ヒトにおける疾患を治療するためのものであって、該疾患が癌、自己免疫疾患および感染性疾患からなる群より選ばれる、請求項４に記載の抗体。
【請求項７】
前記癌が、乳癌、血液癌、大腸癌、胃癌、結腸癌、骨格組織癌、皮膚癌、脳腫瘍、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および肝臓癌からなる群より選ばれる、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記感染性疾患がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による、請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
ヒトにおける疾患を治療するためのものであって、該疾患が癌、自己免疫疾患および感染性疾患からなる群より選ばれる、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記癌が、乳癌、血液癌、大腸癌、胃癌、結腸癌、骨格組織癌、皮膚癌、脳腫瘍、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および肝臓癌からなる群より選ばれる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記感染性疾患がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗体をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
前記抗体が、未精製、部分精製または精製形態にある、請求項１、２、４および６−８のいずれかに記載の抗体。
【請求項１６】
ヒト抗体、イヌ抗体、ニワトリ抗体、ヤギ抗体、マウス抗体、ブタ抗体およびラット抗体からなる群から選ばれる抗体の定常領域を含む、請求項１、２、４、６−８および１５のいずれかに記載の抗体。
【請求項１７】
前記ヒト抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、Ｉｇ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群より選ばれ、前記イヌ抗体が、ＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣおよびＩｇＧＤからなる群より選ばれ、前記ニワトリ抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＹからなる群より選ばれ、前記ヤギ抗体がＩｇＧであり、前記マウス抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭからなる群より選ばれ、前記ブタ抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭからなる群より選ばれ、前記ラット抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭからなる群より選ばれる、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ２抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆｖ抗体、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三量体抗体、多価抗体、キメラ抗体、イヌ−マウスキメラ抗体、イヌＦｃを含む抗体、ヒト化抗体、イヌ化抗体、ＣＤＲグラフト化抗体およびイントラボディからなる群より選択される、請求項１、２、４、６−８および１５−１７のいずれかに記載の抗体の誘導体。
【請求項１９】
少なくとも第１および第２の特異性を有し、前記第１の特異性はＰＤ−１に対するものであり、および前記第２の特異性は異なる抗原に対するものである、請求項１、２、４、６−８および１５−１８のいずれかに記載の抗体もしくは誘導体。
【請求項２０】
前記第２の特異性は、感染性因子の抗原または腫瘍抗原に対するものである、請求項１９に記載の抗体もしくは誘導体。
【請求項２１】
請求項１、２、４、６−８および１５−２０のいずれかに記載の抗体もしくは誘導体、および医薬上許容される賦形剤を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、それぞれがこれにより全体として本開示に組み込まれる、２０１４年８月５日に出願された米国特許出願第６２／０３３，１７７号；２０１４年９月２２日に出願された米国特許出願第６２／０５３，３６６号；および２０１４年１２月１７日に出願された米国特許出願第６２／０９３，３６８号に対する優先権を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）（例えば、ヒトＰＤ−１）に対する特異性を有する結合剤、ならびに感染症（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））、癌および／または自己免疫を治療および／または予防するためにそれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＩＶが流行し始めてから４０年目に入り、ＨＩＶの病因に関する理解が進み、強力で安全な抗ウイルス薬の開発が大きな進歩を遂げてきた。３０種を超える抗ウイルス薬が登録され、組合せ抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）が罹患率および死亡率に及ぼす大きな影響は注目すべきものであった。しかし、ＡＲＴを最適に順守した患者においてはＨＩＶ複製の長期間にわたる抑制が達成されてきたにもかかわらず、ＨＩＶは常に療法の中断後には逆戻りする。さらに、上首尾が得られる療法は、ＡＲＴの非存在下ではＨＩＶ複製を制御できるウイルス特異的免疫応答を誘導せず、あるいはそれらの回復(restoration)／発生を可能にしない。そこで、大多数のＨＩＶ感染対象においてＨＩＶ複製および関連疾患を制御するためには生涯にわたりＡＲＴが必要とされる。
【０００４】
ＨＩＶに潜伏感染した長寿命のセントラルメモリーＣＤ４  Ｔ細胞の集団は、ＨＩＶ細胞リザバーの重要な構成要素として、およびＨＩＶの永続性の主要原因として、血液中において同定されている。この潜伏細胞リザバー(latent cell reservoir)の寿命は、ＡＲＴを用いた完全ＨＩＶ抑制の存在下ではおよそ７０年であると推定されている。しかし、近年の研究は、リンパ節内に存在するＣＤ４  Ｔ細胞の２つの集団が、ＨＩＶの感染、複製および生成のための主要なＣＤ４  Ｔ細胞コンパートメントとして機能することを証明している。これらの２つのＣＤ４  Ｔ細胞集団は、ＰＤ−１およびＣＸＣＲ５の発現によって規定され、ＰＤ−１＋ＣＸＣＲ５＋、つまり濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）およびＰＤ−１＋ＣＸＣＲ５−ＣＤ４  Ｔ細胞集団を含んでいる。
【０００５】
ＨＩＶ潜伏細胞リザバーの確立および維持を担う多数の機序が提案されている。これらの機序の１つは、ＨＩＶ細胞リザバーに補充し得る、ＡＲＴ下での最小ウイルス複製の持続である。従って、ＡＲＴは、ＨＩＶ複製の完全抑制を誘導することができず、ＡＲＴ下での「天然」ＨＩＶ−１特異的免疫応答も、進行中の残留ウイルス複製を完全に抑制および排除することができない。ＡＲＴおよびＨＩＶ特異的免疫応答の失敗は、永続的なＨＩＶ細胞リザバーをも標的とする代替インターベンションを検討する理論的根拠を提供する。
【０００６】
これまでに多数の免疫学的インターベンションが検討されてきたが、現在でも、持続的な抗ウイルス療法なしにウイルス複製が抑制されるＨＩＶの機能的治癒を達成することを目標に、さらに開発が続けられている（９）。治療的ワクチン戦略はこれまでに検討された主要インターベンション戦略であったが、その結果は、実験動物モデルおよび患者において、ＣＭＶをベースとするベクターＨＩＶワクチン（ＮＨＰモデルにおける５０％有効性；１０）を除いてささやかな有効性しか示していない。近年の研究は、ＨＩＶ感染症における治療薬として抗エンベロープ広域中和抗体（ｂＮａｂｓ）を使用する可能性に関して興味深い結果をもたらした（１１、１２）。さらに、アンタゴニストＰＤ−１抗体は、ＨＩＶ感染患者においてＴ細胞機能を回復させることが示されており、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答の効力を増強する治療戦略としてこれらの抗体を使用する可能性が提案されている（１３、１４）。
【０００７】
浸潤性腫瘍特異的ＣＤ８  Ｔ細胞が、増殖しおよび細胞傷害活性を媒介する能力に関して機能不全であることはよく確立されている。大多数の浸潤性腫瘍特異的ＣＤ８  Ｔ細胞は、いわゆる機能的疲弊(exhaustion)状態にある。浸潤性腫瘍特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の疲弊を担う主要な機序は、多数の調節受容体および特にＰＤ−１調節受容体の発現の増加である。ＰＤ−１／ＰＤＬ−１／２（ＰＤ−１リガンド）の遮断がＣＤ８  Ｔ細胞の疲弊からの回復に関連していることの所見は、疲弊ＣＤ８  Ｔ細胞により発現されたＰＤ−１分子を標的とするインターベンション戦略を開発するための理論的根拠を提供した。近年の研究は、進行性癌関連疾患を有する患者における、アンタゴニスト活性を備えるＰＤ−１抗体の使用による極めて前途有望な結果を示している。研究は、進行性黒色腫、非小細胞性肺癌および腎癌を有する患者において、１８〜４０％の範囲の実質的な応答率を示している。これらの研究において、抗ＰＤ−１抗体は、単独でまたは抗ＣＴＬ−Ａ４抗体との組合せのいずれかで使用された。これらの初期の研究の後、血液腫瘍も含む様々な腫瘍を有する患者において、現在の研究が行なわれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本技術分野において、ＰＤ−１を標的とするための追加の試薬およびそれを使用する方法に対する要求がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、ＰＤ−１およびそれを発現する細胞および／または組織を標的とするのに使用できる試薬および方法を提供することによって、それらの要求に対処する。
【００１０】
本開示は、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）（例えば、ヒトＰＤ−１）に対して特異性を有する結合剤、ならびに、例えば、感染症（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））、癌および／または自己免疫状態を治療、予防および／または改善するためにそれを使用する方法に関する。ＰＤ−１と相互作用する結合剤を同定するための機能的アッセイも提供される。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する第１結合剤、およびＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断しない第２結合剤のような、結合剤の組合せも提供され、それらはＴ細胞を疲弊から救済するために相乗的に作用する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ａ．マウスＰＤ−１；Ｂ．ヒトＰＤ−１。
【図２】ＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖に抗ＰＤ１抗体が及ぼす機能的効果を評価するためのＣＦＳＥアッセイ。
【図３】活性化ＣＤ４ Ｔ細胞上の細胞表面ＰＤ−１への抗ＰＤ−１抗体の濃度反応結合。
【図４】抗体のクラス。
【図５】コントロール（ＮＥＧおよびペプチド８）と比較した増殖。
【図６ａ】機能的疲弊回復アッセイにおける、様々なエピトープに結合する抗ＰＤ−１抗体により媒介されたＨＩＶペプチド特異的ＣＤ８ Ｔ細胞増殖の回復。
【図６ｂ】機能的疲弊回復アッセイにおける、様々なエピトープに結合する抗ＰＤ−１抗体により媒介されたＨＩＶペプチド特異的ＣＤ８ Ｔ細胞増殖の回復。
【図７】機能的疲弊回復アッセイにおける、様々なＰＤ−１エピトープに結合する抗ＰＤ−１抗体の組合せにより媒介されるＨＩＶペプチド特異的ＣＤ８ Ｔ細胞増殖の回復の増強。
【図８】ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する第１結合剤と、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断しない第２結合剤との相乗作用。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで、細胞表面上のプログラム細胞死１（ＰＤ−１）タンパク質（例えば、これにより全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６９８，５２０号明細書（Ｈｏｎｊｏ，ｅｔ  ａｌ．）の配列番号１、図１Ａ、図１Ｂ）（例えば、ヒトＰＤ−１）に結合する結合剤に関する。その結合剤は、単離ＰＤ−１ポリペプチド（例えば、ヒトＰＤ−１）および／またはその断片および／または誘導体にも、典型的にはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、結合することができる。さらに、ＰＤ−１を発現する細胞の存在に関連する１種以上の疾患を診断、治療、予防および／または改善するために、そのような結合剤を使用する方法も提供される。例えば、結合剤は、ＰＤ−１のエピトープと反応できるおよび／またはＰＤ−１のエピトープに結合できる抗体（例えば、モノクローナル抗体）であってよい。本明細書に記載した「結合剤」は、例えば、ＰＤ−１のアゴニストまたはアンタゴニストを含むことができる。アゴニスト結合剤は、典型的には、Ｔ細胞機能および／またはＰＤ−１の発現を回復させることのできない結合剤である。アゴニストＰＤ−１結合剤は、ＰＤ−１発現細胞が疾患の進行に関与する、自己免疫疾患等を治療するのに有用となり得る。これとは対照的に、アンタゴニスト結合剤は、Ｔ細胞機能および／またはＰＤ−１の発現を回復させることができる結合剤である。例えば、ＰＤ−１アンタゴニスト結合剤は、ＨＩＶ感染症および様々な腫瘍において生じることが知られている機能的疲弊から、ＰＤ−１発現Ｔ細胞の機能を回復させることができるであろう。Ｔ細胞機能の回復は、例えば、そのような細胞の増殖、サイトカイン産生、細胞傷害活性またはその他の特徴を測定することによって決定することができる。本明細書に記載した結合剤の別の用途は、複製可能なＨＩＶ（例えば、潜伏および／または複製状態にある）を含むＨＩＶ感染ＣＤ４  Ｔ細胞集団の選択的標的化および排除である。そのようなＰＤ−１を発現するＰＤ−１発現細胞は、複製可能なＨＩＶのための主要細胞リザバーとして機能することが知られている。これらのＣＤ４  Ｔ細胞集団を排除するための潜在的機序は、本明細書に記載した結合剤（例えば、単一および／または二重特異性ＰＤ−１抗体）を使用する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。一部の実施形態では、例えば、異なる特異性（例えば、異なるエピトープを認識する）を有する１つ以上のＰＤ−１アンタゴニスト結合剤を、ＰＤ−１発現によって誘発される機能的疲弊からの抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の救済（例えば、増殖、サイトカイン産生および／または細胞傷害活性の回復または改善）をそれらの細胞において誘導するために組み合わせてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載した結合剤を、ＰＤ−１発現細胞の選択的排除および／または抑制のために提供してもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載したＰＤ−１アゴニスト結合剤は、例えば、感染性疾患（例えば、ＨＩＶ）、癌、および／または特に自己免疫状態を治療するためにＰＤ−１発現細胞を抑制および／または排除するために使用できる。その他の実施形態、使用などについては下記に記載する。
【００１３】
結合剤は、例えば、表１に示したアミノ酸配列（および／またはそれらの１つ以上の断片および／または誘導体）のいずれか１つ以上を含んでいてよい、例えば、モノクローナル抗体などの抗体であってよい。本開示はさらに、ＰＤ−１を発現する細胞を単離する、同定するおよび／または標的とするためのそのようなモノクローナル抗体の使用を提供する。所定の実施形態では、これらのモノクローナル抗体は、細胞表面に発現したＰＤ−１に対して反応性であってよい。用語「抗体」もしくは「複数の抗体」は、未精製形態もしくは部分精製形態（例えば、ハイブリドーマ上清、腹水、ポリクローナル抗血清）または精製形態にある、全抗体もしくは断片化抗体を意味し得る。抗体は、例えば、マウス（例えば、マウスハイブリドーマ細胞によって生成される）を含む任意の好適な起源もしくは形態にあってよい、またはヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体などとして発現させることができる。例えば、抗体は、例えば完全に、または部分的にヒト（例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、Ｉｇ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ＩｇＤおよびＩｇＥ）、イヌ（例えば、ＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣ、ＩｇＧＤ）、ニワトリ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ）、ヤギ（例えば、ＩｇＧ）、マウス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）および／またはブタ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）、ラット（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）抗体に由来してよい。様々なタイプの抗体を調製、利用および保存する方法は当業者には周知であり、本発明を実施する際には好適であろう（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．１，１９９８；Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６���８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５）；ならびに米国特許第４，８１６，５６７号明細書；同第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書および同第５，６６１，０１６号明細書を参照されたい）。所定の用途では、抗体は、ハイブリドーマ上清もしくは腹水内に含有されている場合があり、そのままで直接的に、または標準技術を使用した濃縮後のいずれかで利用してもよい。他の用途では、抗体は、例えば、塩析による分画およびイオン交換クロマトグラフィー、あるいはアガロースビーズなどの固体支持体に共有結合したプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇおよび／またはプロテインＬリガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィーを使用して、さらに精製することができる。抗体は、冷凍製剤（例えば、−２０ｏＣもしくは−７０ｏＣ）、凍結乾燥形態を含む任意の好適な形態で、または通常の冷蔵条件（例えば、４℃）下で保存することができる。例えば、液体形態で保存される場合は、例えばトリス緩衝食塩液（ＴＢＳ）もしくはリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）などの好適なバッファーを利用するのが好ましい。一部の実施形態では、結合剤は、非毒性の非経口的に摂取可能な希釈剤もしくは溶剤中の懸濁液のような、注射用製剤として調製することができる。利用できる好適なビヒクルおよび溶剤として、特に水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液、ＴＢＳおよび／またはＰＢＳが挙げられる。そのような製剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで使用するのに好適となり得、当技術分野において公知であるように調製することができ、正確な製剤は特定の用途に依存するであろう。
【００１４】
しかしながら、本明細書に記載した結合剤は、決して抗体には限定されない。例えば、結合剤は、別のものと類似の結合特性を示す任意の化合物（例えば、模倣物(mimetic)）であってよい。例えば、代表的な結合剤は、ＰＤ−１に結合する、および／またはそれらに対する特異性を有する結合剤（モノクローナル抗体）と競合できる結合剤であってよい。一部の実施形態では、模倣物は、比較される結合剤（例えば、モノクローナル抗体）と、結合アッセイにおいて実質的に同一の親和性を示し得る。特定の結合剤の親和性は、限定はされないが、実施例において記載するような活性化ＣＤ４  Ｔ細胞での内因性細胞表面ＰＤ−１のＦＡＣＳ染色を含む、任意の好適なアッセイによって測定することができる。１つの結合剤が、別の結合剤と測定値（例えば、ｎｍ）が相互に約１〜２０、１〜５、５〜１０、１０〜１５または１５〜２０％のいずれかの範囲内にある場合は、別の結合剤と「実質的に同一親和性」を有すると言うことができる。典型的な模倣物には、例えば、ＰＤ−１に特異的に結合する有機化合物、またはアフィボディ（Ｎｙｇｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｊ．２７５（１１）：２６６８−７６（２００８））、アフィリン（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２（１）：１７２−８５（２００７））、アフィチン（Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８３（５）：１０５８−６８（２００８））、アンチカリン（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ＦＥＢＳ  Ｊ．２７５（１１）：２６７７−８３（２００８））、アビマー（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１２）：１５５６−６１（２００５））、ＤＡＲＰｉｎ（Ｓｔｕｍｐｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  １３（１５−１６）：６９５−７０１（２００８））、フィノマー（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（５）：３１９６−３２０４（２００７））、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド（Ｎｉｘｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．９（２）：２６１−８（２００６））および／またはモノボディ（Ｋｏｉｄｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５２：９５−１０９（２００７））を含むことができる。その他の模倣物は、例えば、抗体（例えば、モノクローナル抗体１Ｅ４、１Ｇ１０および／または１Ｇ１）の誘導体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’一本鎖抗体、Ｆｖ，単一ドメイン抗体、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多価抗体、キメラ抗体、イヌ−ヒトキメラ抗体、イヌ−マウスキメラ抗体、イヌＦｃを含む抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、イヌ化、ＣＤＲグラフト化抗体、サメ抗体、ナノボディ、ラクダ抗体、マイクロボディおよび／またはイントラボディまたはそれらの誘導体を含むことができる。当業者には理解されるように、本明細書ではその他の結合剤も提供される。
【００１５】
ＰＤ−１に対する（例えば、結合する）特異性を有する結合剤を作成するために、当業者には公知である任意の方法を使用できる。例えば、モノクローナル抗体を作成および単離するために、マウスなどの動物に１つ以上のＰＤ−１タンパク質（例えば、ＰＤ−１  Ｆｃ融合タンパク質および／またはＰＤ−１  Ｈｉｓタグタンパク質）を投与することができる。次に、抗ＰＤ−１ハイブリドーマ細胞株を作成するために、活性化ヒトＴリンパ球上に発現されたＰＤ−１に対して（例えば、フローサイトメトリーおよび／または顕微鏡によって決定される）血清反応性を示す動物を選択することができる。これを、複数回ラウンドにわたり繰り返すことができる。例えば、第１ラウンドの結合剤選択のための一次基準は：ｉ）フローサイトメトリーによる活性化ヒトＴリンパ球上のＰＤ−１の染色レベル；（ｉｉ）既存の抗ＰＤ−１抗体と比較したＣＤＲ  ＶＨおよびＶＬ配列の多様性；および（ｉｉｉ）ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１上の様々なエピトープに結合する数種の市販で入手できる抗ＰＤ−１抗体結合の１つと予備結合したＰＤ−１共役Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ(PD-1 conjugated Luminex beads)を用いた競合結合試験によって実施されるエピトープマッピングを含むことができるがそれらに限定されない。典型的な第１もしくは第２ラウンドの選択はさらに、例えば、親和性結合（抗ＰＤ−１抗体の刺激能力と相関していない可能性があるので一次基準ではない）および／または結合剤をアゴニストまたはアンタゴニストであると同定するための機能的特性解析も含むことができる。
【００１６】
本明細書の実施例１に記載するように、例えば、疲弊機能回復アッセイ（Exhaustion Functional Recovery Assay)（ＥＦＲＡ）を使用できる。このアッセイでは、試験結合剤は、Ｔ細胞などの免疫細胞を疲弊から救済する能力についてアッセイすることができる。これは、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなウイルスに由来する試験ペプチドなどの抗原の存在下において、そのような細胞に増殖を回復させる結合剤の能力を測定することによって決定できる。増殖は、例えば試験ペプチド単独のようなコントロール、または例えばＭＫ−３４７５（ペンブロリズマブ）のような陽性コントロールである抗ＰＤ−１抗体と比較して、ＣＦＳＥアッセイにおいて測定される。一部の実施形態では、ペプチド単独コントロール、またはアイソタイプのコントロールマウスＩｇＧ１抗体と共にペプチドを使用した場合の、いずれかと比較して、有意差（例えば、＜０．００１のＰ値）を示す場合に、結合剤は増殖を回復させると決定される。このアッセイは、ＰＤ−１（例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２）への結合について他の結合剤と競合する、および／または免疫細胞の機能的回復をもたらす結合剤（例えば抗体）を同定するために使用できる。実施例１は、Ｌｕｍｉｎｅｘに基づくアッセイを使用して表２に列挙した抗体をエピトープマッピングする２つの方法も記載する。１つの生化学的アッセイでは、ＰＤ−１  Ｆｃ融合タンパク質をビーズに結合させ、表２に記載されている抗ＰＤ−１抗体と２つの異なる市販の抗ＰＤ−１抗体のうちの１つとの間で、競合的結合試験を実施する。実施例１は、ＰＤ−１上の別個のエピトープに結合するモノクローナル抗体の４つのクラス：クラス１（ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する第１モノクローナル抗体と競合的）、クラス２（ＰＤ−１に結合するがＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断しない第２モノクローナル抗体と競合的）、クラス３（第１および第２モノクローナル抗体の両方と競合的）およびクラス４（第１および第２抗体のいずれとも非競合的）を記載する。別個のアッセイでは、組換えＰＤ−１タンパク質に対する結合についての競合を、表２に列挙する抗ＰＤ−１抗体およびビオチン化ＰＤ−Ｌ１組換えタンパク質について評価した。ＥＦＲＡにおいて増殖を誘導した抗体は、ＰＤ−１上の異なるエピトープに結合するとして提案された４つの結合クラスの全てから同定された。さらに、ＥＦＲＡは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用と競合的、部分競合的または非競合的のいずれかでありかつＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞に対して増殖機能を明確に回復した抗ＰＤ−１抗体の同定を可能にした。
【００１７】
例えば実施例２に記載するような、結合剤の組合せも同定することができる。一部の実施形態では、１つ以上の結合剤だけを使用して他の物質を使用せずに得られた結果から統計的有意差を提供する組合せを同定することができる。一部の実施形態では、免疫細胞機能を回復させる相乗的能力を示す組合せを同定できる。一部の実施形態では、組合せは、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する第１結合剤を、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断しない第２結合剤とともに含むことができる。第１および第２結合剤は、例えば２種以上の異なるモノクローナル抗体もしくはそれらの誘導体などの異なる構成要素であっても、あるいは、例えば二重機能性抗体(bi-functional antibody)（複数の結合特異性を含む単一抗体もしくはその誘導体）のような同一構成要素上に見いだされてもよい。例えば、典型的な二重機能性抗体は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する第１結合領域、およびＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断しない第２結合領域を含むことができる。さらに、複数のタイプの各結合剤を提供する組合せが企図されている。例えば、組合せは、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断しない１つ以上の結合剤とともに、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する複数のタイプの結合剤を含むことができる。一部の実施形態では、組合せは、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断しない複数の結合剤とともに、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する１つ以上の結合剤を含むことができる。一部の実施形態では、組合せは、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する複数の結合剤を、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断しない複数の結合剤とともに含むことができる。本明細書に記載されているそのような組合せは、ＣＴＬＡ−４などに対する抗体のような、免疫細胞機能に影響し得る１種以上の他の作用物質と組み合わせてもよい。当業者は、多数のそのような組合せが本明細書に記載した使用のために好適となり得ることを認識できるであろう。
【００１８】
結合剤が抗体である場合、その可変領域および／または相補性決定領域（「ＣＤＲ」）に対応するヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列に関して、それを同定することができる。可変領域／ＣＤＲ配列は、１つ以上の他の可変領域／ＣＤＲアミノ酸配列と組み合わせて使用できる。可変領域／ＣＤＲアミノ酸配列は、その代りにおよび／またはさらに、抗体分子の１つ以上のタイプの定常領域ポリペプチドに隣接させることができる。例えば、表１Ａおよび１Ｂに示したＣＤＲアミノ酸配列は、同一もしくは異なる種（例えば、ヒト、ヤギ、ラット、ヒツジ、ニワトリ）の任意の抗体分子および／またはＣＤＲアミノ酸配列が由来する抗体サブタイプの定常領域に隣接または結合していてもよい。例えば、例示的な結合剤は、表２に列挙されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体、またはそれに由来する、またはそれに関連するものでよく、および／または表２に示されているのとほぼ同一の親和性および／または増殖効果を有する、および／または同一結合クラスを有するものでよく、および／または配列番号１〜１３８のアミノ酸配列および／または表１Ａおよび１Ｂに示した配列番号のいずれか１つ以上を有していてもよい。結合剤は、それぞれが１つ以上の定常領域および／または可変領域を含む抗体重鎖および／または軽鎖を含んでいてよい。可変領域は、典型的には、抗体の結合特異性を決定できる１つ以上のＣＤＲを含んでいる。モノクローナル抗体は、そのような可変領域の（例えば、そのようなヌクレオチド配列によってコードされ得る）アミノ酸配列の解析によって同定することができる。例えば、ＰＤ−１に結合する結合剤の重鎖ＣＤＲの典型的なアミノ酸配列は、配列番号１〜１３８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列および／または表１Ａおよび／または１Ｂに示した任意の他の配列を含む１つ以上を含むことができる。本明細書に記載したアミノ酸配列のいずれかおよび／またはそれらの任意の断片および／または誘導体も、標準技術を使用してハイブリッドおよび／または融合結合剤を形成するために任意の順序および／または組合せで任意の他の可変領域および／またはＣＤＲと結合する、および／または他の重鎖および／または軽鎖可変領域内に導入することができる。本開示のＰＤ−１（例えば、ヒトＰＤ−１）結合剤内で見いだすことのできるＣＤＲの典型的な組合せ（例えば、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せ）は、例えば、表１Ａおよび／または１Ｂに示した実施形態を含むことができる。
【００１９】
【表１Ａ】
0006629321.tif 000002
【００２０】
【表１Ｂ】
0006629321.tif 000003
【００２１】
さらに、結合剤において、配列番号１〜６９の任意のものを、配列番号７０〜１３８の任意の１つ以上と組み合わせることができる。好ましい実施形態では、結合剤において、各クローンの重鎖ＣＤＲを、それら各自の軽鎖ＣＤＲと組み合わせることができる。一部の実施形態では、結合剤は、下記に示す重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含むことができる：
１２２Ｆ１０（配列番号１、２４、４７、７０、９３および１１６）；
１３９Ｄ６（配列番号２、２５、４８、７１、９４および１１７）；
１３５Ｄ１（配列番号３、２６、４９、７２、９５および１１８）；
１３４Ｄ２（配列番号４、２７、５０、７３、９６および１１９）；
１２１Ｇ１（配列番号５、２８、５１、７４、９７および１２０）；
１３６Ｂ５（配列番号６、２９、５２、７５、９８および１２１）；
１２７Ｃ２（配列番号７、３０、５３、７６、９９および１２２）；
１３７Ｆ２（配列番号８、３１、５４、７７、１００および１２３）；
１３８Ｈ５（配列番号９、３２、５５、７８、１０１および１２４）；
１４０Ａ１（配列番号１０、３３、５６、７９、１０２および１２５）；
１３５Ｈ１２（配列番号１１、３４、５７、８０、１０３および１２６）；
１３１Ｄ１１（配列番号１２、３５、５８、８１、１０４および１２７）；
１３２Ｆ７（配列番号１３、３６、５９、８２、１０５および１２８）；
１２６Ｅ４（配列番号１４、３７、６０、８３、１０６および１２９）；
１３５Ｇ１（配列番号１５、３８、６１、８４、１０７および１３０）；
１３６Ｅ１０（配列番号１６、３９、６２、８５、１０８および１３１）；
１３５Ｃ１２（配列番号１７、４０、６３、８６、１０９および１３２）；
１３６Ｆ４（配列番号１８、４１、６４、８７、１１０および１３３）；
１３６Ｂ４（配列番号１９、４２、６５、８８、１１１および１３４）；
１３５Ｅ１０（配列番号２０、４３、６６、８９、１１２および１３５）；
１４０Ｇ５（配列番号２１、４４、６７、９０、１１３および１３６）；
１２２Ｈ２（配列番号２２、４５、６８、９１、１１４および１３７）；または
１３９Ｆ１１（配列番号２３、４６、６９、９２、１１５および１３８）
当業者が確認できるように、その他の組合せも有用となり得る。
【００２２】
表１Ａおよび／または１ＢのＣＤＲまたは直前の段落のＣＤＲを含む結合剤も、下記の特徴を示し得る。
【００２３】
【表２】
0006629321.tif 000004
【００２４】
結合親和性は、当業者が利用できる任意の技術によって決定できる。表２に提示した結合親和性データは、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を用いて３〜６日間にわたり刺激したＣＤ４  Ｔ細胞上の内因性細胞表面ＰＤ−１のフローサイトメトリー染色によって評価した。結合クラスも、当業者が利用できる任意の技術によって決定できる。表２に提示した結合クラスデータは、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ競合結合試験によって決定した。表２では、結合クラス１のモノクローナル抗体は、ＥＨ１２．２Ｈ７クローン市販抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能（例えば、製品番号３２９９０５））と競合的であると決定された抗体である；クラス２の抗体は、Ｊ１１６クローン市販抗体（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能（例えば、製品番号１６−９９８９−８０））と競合的であると決定された抗体である；クラス３の抗体は、ＥＨ１２．２Ｈ７抗体およびＪ１１６抗体の両方と競合的であると決定された抗体である；およびクラス４のモノクローナル抗体クローン抗体は、ＥＨ１２．２Ｈ７抗体およびＪ１１６抗体の両方の存在下でＰＤ−１に結合すると決定された抗体である。
【００２５】
増殖効果は、当業者が利用できる任意の技術によって決定できる。例えば、上述した、および実施例１で使用したＥＦＲＡシステムを使用できる。そのようなアッセイを使用して、表２に提示した増殖効果データを決定した。簡単に説明すると、慢性ＨＩＶ感染した対象から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、その細胞を抗ＰＤ−１抗体の存在下および非存在下においてＨＩＶ特異的ペプチドで刺激する、カルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）アッセイである。コントロール抗ＰＤ１抗体（Ｍｅｒｃｋ社の抗体ＭＫ−３４７５）についても陽性コントロールとして試験した。６日間のインキュベーション後、ＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖を、ペプチド単独コントロールと比較して抗ＰＤ−１処置サンプルにおいて評価し、コントロールを超えるパーセンテージとして結果を表わした（増殖効果）。
【００２６】
一部の実施形態では、例えば抗体のようなＰＤ−１結合剤を同定および特性付けるために使用される技術を、そのような結合剤を同定および特徴付けるためのシステムを提供するために組み合わせることができる。例えば、１種以上のモノクローナル抗体のような１つ以上の候補結合剤を、免疫原性ペプチドの存在下での増殖等によって測定されるような、免疫細胞に対する機能を回復させる候補結合剤の能力を決定するために、ＥＦＲＡまたは類似のアッセイによってアッセイすることができる。一部の実施形態では、このタイプのアッセイは、さらに検討すべき候補結合剤が免疫細胞機能を回復させることができることを裏付けるための初期スクリーンとして使用できる。一部の実施形態では、これらのタイプのアッセイの後に、例えば活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などの免疫細胞に対する結合親和性を決定するアッセイを実施することができる。一部の実施形態では、このアッセイは、例えばＦＡＣＳ(fluorescence activated cell sorting)などの技術を使用することができる。一部の実施形態では、このアッセイは例えば抗ＰＤ１抗体（例えば、ペンブロリズマブとしても公知であるＭｅｒｃｋ社の抗体ＭＫ−３４７５）などの公知の結合剤を使用する非特異的結合および／または競合的結合試験の存在または非存在を含むことができる。これらのアッセイの後には、次に例えば上記の表１Ａおよび／または１Ｂに提供したＣＤＲなどの候補結合剤のＣＤＲをシーケンシングする工程を実施することができる。総合して、本明細書に記載したＥＦＲＡ、親和性決定、エピトープマッピング試験およびＣＤＲ同定法は、候補結合剤を同定できるシステムを提供する。
【００２７】
表１Ａおよび／または１Ｂのアミノ酸配列のいずれか（および／または任意のそれらの１つ以上の断片および／または誘導体）はさらに、当業者が所望する任意の他のアミノ酸によって置換されてもよい。例えば、当業者は、特定のアミノ酸を下記の表３に示す他のアミノ酸と交換することによって保存的置換を行うことができる。選択される特定のアミノ酸置換は、選択される部位の位置に依存し得る。そのような保存的アミノ酸置換は、その位置でのアミノ酸残基のサイズ、極性、荷電、疎水性または親水性への効果がほとんどまたは全くないように、および特に、ＰＤ−１結合の低減を生じさせないように、天然アミノ酸残基の非天然残基による置換を含んでいてよい。
【００２８】
【表３】
0006629321.tif 000005
【００２９】
一部の実施形態では、本開示は、ＰＤ−１および少なくとも１つの他の第２の抗原（例えば、細胞表面タンパク質）に単一結合剤が結合できるように、複数の特異性を有する結合剤を提供する。一部の実施形態では、第２の抗原は、感染性因子に感染した細胞によって発現される抗原であってよい。例えば、典型的な第２の抗原は、ＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原であってよい。そのような結合剤は、第２の抗原に結合できる、および／または感染性因子を中和するように機能することができる。所定の実施形態では、例えばＰＤ−１と例えばｅｎｖおよび／または他の抗原などのＨＩＶ抗原とに対する二重特異性を有する二重特異性結合剤である。ＨＩＶ免疫原は、本明細書、または任意の他の場所に記載された任意のサブタイプに由来し得る。一部の実施形態では、そのような結合剤は：ＰＤ−１アゴニスト／Ｅｎｖ結合；ＰＤ−１アゴニストＰＤ−１／Ｅｎｖ結合および中和；ＰＤ−１アンタゴニスト／Ｅｎｖ結合；および／またはＰＤ−１アンタゴニスト／ＰＤ−１／Ｅｎｖ結合および中和を含み得る。様々なサブタイプの有病率を前提にすると、ＨＩＶ−１サブタイプＢおよび／またはＣ由来の抗原を選択するのが好ましいであろう。さらに、単一組成物中に、複数のＨＩＶサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−１サブタイプＢおよびＣ、ＨＩＶ−２サブタイプＡおよびＢ、またはＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２サブタイプの組合せ）由来の抗原に特異性を有する結合剤を含めるのが望ましいであろう。癌などの疾患を治療するために、複数のＰＤ−１特異性（例えば、２つの異なるエピトープに特異的な二重特異性ＰＤ−１ａ／ＰＤ１ｂアンタゴニストＰＤ−１抗体）および／またはＰＤ−１および１種以上の腫瘍抗原（例えば、癌精巣（ＣＴ）抗原（すなわち、ＭＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１）；メラノサイト分化抗原（すなわち、Ｍｅｌａｎ  Ａ／ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、ｇｐ１００）；突然変異抗原（すなわち、ＭＵＭ−１、ｐ５３、ＣＤＫ−４）；過剰発現「自己」抗原（すなわち、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｐ５３）；および／またはウイルス抗原（すなわち、ＨＰＶ、ＥＢＶ））の両方に対する特異性を有する結合剤を得ることが有益となり得る。結合剤（例えば、モノクローナル抗体）は、概して上述したように作成することができる。そのような結合剤の特異性を、当業者に広く利用可能な技術を使用して、単一結合剤に再合成(recombined)することができる。一部の実施形態では、効果的な複数の特異性を有する試薬を提供するために、複数の単一特異性結合剤を組み合わせて使用する（例えば、投与する）こともできる。
【００３０】
一部の実施形態では、本明細書に記載された結合剤は、ＰＤ−１（および／または複数の特異性を有する結合剤の場合には別の抗原）を発現する細胞集団の機能を標的化および阻害する、および／またはその細胞集団を排除するために、活性薬剤に共役させてもよい。例えば、複製可能なＨＩＶを含むＣＤ４＋  Ｔ細胞集団を、結合剤／薬物複合体（例えば、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ））を用いて、標的化および排除することができる。単一および／または二重特異性候補結合剤は、１つ以上のタイプの薬物（例えば、微小管を標的とする、ＤＮＡを損傷させる薬物）と共役させることができる。また、本明細書に記載した結合剤および／またはそれらの誘導体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ使用のために、機能的薬剤に隣接および／または共役させてもよい。例えば、結合剤は、細胞傷害剤もしくは毒素のような機能的成分、および／または例えばジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンのようなそれらの活性断片に、隣接および／または共役させることができる。好適な機能的成分は、放射化学薬品を含み得る。抗体のような結合剤は、当技術分野における標準技術を使用して、１種以上の機能的薬剤に隣接および／または共役させることができる。
【００３１】
一部の実施形態では、結合剤は、例えば抗感染剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス薬）などの他の薬剤と共に投与することができる。例えば、本明細書に記載した結合剤は、モノクローナル抗体および／または他の試薬、例えばニボルマブ（ＭＤＸ−１１０６、ＢＭＳ−９３６５５８としても公知である（Ｔｏｐａｌｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１２；３６６（２６）：２４４３−２４５４）、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社から入手できる完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体）、ランブロリズマブ（ＭＫ−３４７５としても公知である、およびＭｅｒｃｋ社から入手できるヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体であるＳＣＨ  ９００４７５）、ピジリズマブ（ＣｕｒｅＴｅｃｈ社から入手できるヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体）、ＡＭＰ−２２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ／Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ社から入手できるＢ７−ＤＣ／ＩｇＧ１融合タンパク質）、および／または米国特許第８，３５４，５０９Ｂ２号明細書（Ｃａｒｖｅｎ，ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第８，００８，４４９Ｂ２号明細書（Ｋｏｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．）、国際公開第２０１２／１３５４０８Ａ１号（Ｍａｎｏｊ，ｅｔ  ａｌ．）、米国特許出願公開第２０１０／０２６６１７号明細書（Ｃａｒｖｅｎ，ｅｔ  ａｌ．）、国際公開第２０１１／１１０６２１Ａ１号（Ｔｙｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第７，４８８，８０２Ｂ２号明細書（Ｃｏｌｌｉｎｓ，ｅｔ  ａｌ．）、国際公開第２０１０／０２９４３５Ａ１号（Ｓｉｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．）、国際公開第２０１０／０８９４１１Ａ２号（Ｏｌｉｖｅ，Ｄ．）、国際公開第２０１２／１４５４９３Ａ１号（Ｌａｎｇｅｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．）、国際公開第２０１３／０４３５５６９Ａ１号（Ｒｏｌｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．）、国際公開第２０１１／１５９８７７Ａ２号（Ｋｕｃｈｒｏｏ，ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第７，５６３，８６９Ｂ２号明細書（Ｏｎｏ  Ｐｈａｒｍ．）、米国特許第７，８５８，７４６Ｂ２号明細書（Ｈｏｎｊｏ，ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第８，７２８，４７４Ｂ２号明細書（Ｏｎｏ  Ｐｈａｒｍ．）、米国特許第９，０６７，９９９号明細書（Ｏｎｏ  Ｐｈａｒｍ．）および／または米国特許第９，０６７，９９９号明細書のいずれかに記載された抗体または他の試薬または方法と組み合わせることができ、上記のそれぞれは参照により本開示に全体として組み込まれる。
【００３２】
上述のように、本明細書に記載したＰＤ−１結合剤（例えば、ＰＤ−１アンタゴニスト）は、ＨＩＶによる感染症の症状を治療および／または予防および／または改善するために使用できる。当技術分野において周知であるように、ＨＩＶ単離体は、現在では別個の遺伝子サブタイプに分類される。ＨＩＶ−１は、少なくとも１０種のサブタイプ（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ、Ｈ、ＪおよびＫ）を含むことは公知である（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ，ＮＥＪＭ，３５９（１８）：１９６５−１９６６（２００８））。ＨＩＶ−２は、少なくとも５種のサブタイプ（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）を含むことが公知である。サブタイプＢは、世界中の男性同性愛者および静注薬物使用者におけるＨＩＶ流行と関連付けられてきた。大多数のＨＩＶ−１免疫原、検査室適応単離体、試薬およびマッピングされたエピトープはサブタイプＢに属する。新規ＨＩＶ感染症の発生率が高いサハラ以南のアフリカ、インドおよび中国領域では、ＨＩＶ−１サブタイプＢはほんの少数の感染症しか占めておらず、サブタイプＨＩＶ−１Ｃが最も一般的な感染サブタイプであると思われる。これらのタイプの単離体はいずれも、本明細書に記載した結合剤を使用して対応できるであろう。１つ以上の結合剤は、例えば、プロテアーゼ阻害剤、ＨＩＶ侵入阻害剤、逆転写酵素阻害剤および／または抗レトロウイルスヌクレオシドアナログのような、ＨＩＶを予防、治療および／または改善するのに使用できる１種以上の薬剤と一緒にまたは共に投与することもできる。好適な化合物には、例えば、Ａｇｅｎｅｒａｓｅ（アンプレナビル）、Ｃｏｍｂｉｖｉｒ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒ／Ｅｐｉｖｉｒ）、Ｃｒｉｘｉｖａｎ（インジナビル）、Ｅｍｔｒｉｖａ（エムトリシタビン）、Ｅｐｉｖｉｒ（３ｔｃ／ラミブジン）、Ｅｐｚｉｃｏｍ、Ｆｏｒｔｏｖａｓｅ／Ｉｎｖｉｒａｓｅ（サキナビル）、Ｆｕｚｅｏｎ（エンフビルチド）、Ｈｉｖｉｄ（ｄｄｃ／ザルシタビン）、Ｋａｌｅｔｒａ（ロピナビル）、Ｌｅｘｉｖａ（ホスアンプレナビル）、Ｎｏｒｖｉｒ（リトナビル）、Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ（デラビルジン）、Ｒｅｔｒｏｖｉｒ／ＡＺＴ（ジドブジン）、Ｒｅｙａｔａｘ（アタザナビル、ＢＭＳ−２３２６３２）、Ｓｕｓｔｉｖａ（エファビレンツ）、Ｔｒｉｚｉｖｉｒ（アバカビル／ジドブジン／ラミブジン）、Ｔｒｕｖａｄａ（エムトリシタビン／テノホビルＤＦ）、Ｖｉｄｅｘ（ｄｄＩ／ジダノシン）、Ｖｉｄｅｘ  ＥＣ（ｄｄＩ、ジダノシン）、Ｖｉｒａｃｅｐｔ（ネビラビン）、Ｖｉｒｅａｄ（テノホビルジソプロキシルフマレート）、Ｚｅｒｉｔ（ｄ４Ｔ／スタブジン）およびＺｉａｇｅｎ（アバカビル）が含まれる。その他の好適な薬剤は当業者では公知であり、本明細書に記載するように使用するのに好適となり得る。そのような薬剤は、本明細書に記載した結合剤の投与および／または方法の使用の前、間または後のいずれでも使用できる。
【００３３】
上述のように、本明細書に記載したＰＤ−１結合剤（例えば、ＰＤ−１アンタゴニスト）は、癌の症状を治療および／または予防および／または改善するために使用できる。典型的な癌は、例えば、特に乳癌、血液癌、大腸癌、胃癌、結腸癌、骨格組織癌、皮膚癌（例えば、黒色腫）、脳腫瘍、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および／または肝臓癌のいずれかを含み得る。１つ以上の結合剤は、例えば、アルキル化剤（例えば、任意のナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、テトラジン、アジリジン、シスプラチンおよび／またはそれらの誘導体）、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート類、ペメトレキセド類、フルオロピリミジン類および／またはそれらの誘導体）、抗微小管薬（例えば、ビンカアルキロイド類、タキサン類、ポドフィロトキシンおよび／またはそれらの誘導体）、トポイソメラーゼＩおよび／またはＩＩ阻害剤（例えば、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン、アクラルビシンおよび／またはそれらの誘導体）および／または細胞傷害性抗生物質（例えば、任意のアントラサイクリン類、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシンおよびマイトマイシンおよび／またはそれらの誘導体）などの癌を予防、治療および／または改善するのに使用される１種以上の薬剤と組み合わせてもよく、および／またはそれらと一緒にまたは共に投与してもよい。その１つ以上の結合剤は、さらにまたは代りに、例えばニボルマブ、ランブロリズマブ、ピジリズマブおよび／またはその他の類似の薬剤および／またはそれらの誘導体などの癌を治療する、予防するおよび／または改善するのに当業者が入手できる１つ以上の他の結合剤と組み合わせることができる。その他の好適な薬剤は当業者では公知であり、本明細書に記載するように使用するのに好適となり得る。そのような薬剤は、本明細書に記載した結合剤の投与および／または方法の使用の前、間または後のいずれでも使用できる。
【００３４】
上述のように、本明細書に記載したＰＤ−１結合剤（例えば、ＰＤ−１アゴニスト）は、自己免疫の症状を治療および／または予防および／または改善するために使用できる。典型的な自己免疫状態は、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、糸球体腎炎および多発性硬化症のような、ＰＤ−１が自己寛容を維持することに関係しおよび／または炎症性Ｔ細胞（例えば、自己反応性または自己抗原特異的Ｔ細胞）を伴う任意の状態を含み得る。そのようなＰＤ−１結合剤は、例えば抗ＣＴＬＡ−４薬剤（例えば、イピリムマブ）などの他の薬剤と組み合わせてもよい。１つ以上の結合剤は、例えば、グルココルチコイド剤、細胞増殖抑制剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗物質、メトトレキセート、アザチオプリン、メルカプトプリン、細胞傷害性抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、アントラサイクリン類、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン）、抗体類（例えば、Ａｔｇａｍ、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅ、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ、Ｚｅｎａｐａｘ）、イムノフィリン類（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス）に作用する薬剤、インターフェロン類、オピオイド剤、ＴＮＦ結合剤（例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｅｎｂｒｅｌ、Ｈｕｍｉｒａ）、ミコフェノレート、フィンゴリモド、ミリオシンおよび／またはそれらの誘導体のような、例えば自己免疫を予防、治療および／または改善するために使用できる１種以上の薬剤と組み合わせる、および／または一緒にまたは共に投与することもできる。その他の好適な薬剤は当業者に公知であり、本明細書に記載するように使用するのに好適となり得る。そのような薬剤は、本明細書に記載した結合剤の投与および／または方法の使用の前、間または後のいずれでも使用できる。
【００３５】
一部の実施形態では、結合剤は、１つ以上の検出可能な標識に隣接および／または共役させることができる。例えば、好適な検出可能な標識は、例えば、フルオロセイン類（例えば、ＤｙＬｉｇｈｔ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン；５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）；５−ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）；５−ヒドロキシトリプタミン（ＨＡＴ）；６−ＪＯＥ；６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）；ＦＩＴＣ；６−カルボキシ−１，４−ジクロロ−２’，７’−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）；６−カルボキシ−１，４−ジクロロ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）；６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）；Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ類（例えば、３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０）；ＢＯＤＩＰＹ蛍光体（例えば、４９２／５１５、４９３／５０３、５００／５１０、５０５／５１５、５３０／５５０、５４２／５６３、５５８／５６８、５６４／５７０、５７６／５８９、５８１／５９１、６３０／６５０−Ｘ、６５０／６６５−Ｘ、６６５／６７６、ＦＬ、ＦＬ  ＡＴＰ、ＦＩ−セラミド、Ｒ６Ｇ  ＳＥ、ＴＭＲ、ＴＭＲ−Ｘ複合体、ＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ、ＴＲ、ＴＲ  ＡＴＰ、ＴＲ−Ｘ  ＳＥ））、ローダミン類（例えば、１１０、１２３、Ｂ、Ｂ  ２００、ＢＢ、ＢＧ、Ｂ  ｅｘｔｒａ、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、５  ＧＬＤ、６−カルボキシローダミン６Ｇ、リサミン、リサミンローダミンＢ、ファリシジン、ファロイジン、レッド、Ｒｈｏｄ−２、ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、スルホローダミンＢ  ｃａｎ  Ｃ、スルホローダミンＧ  Ｅｘｔｒａ、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、ＷＴ）、テキサスレッドおよび／またはテキサスレッド−Ｘを含み得る。当技術分野において公知の他の検出可能な標識も使用に好適となり得る。例えば抗体などの結合剤は、当技術分野における標準技術を使用して１種以上の検出可能な標識に隣接および／または共役させることができる。
【００３６】
所定の実施形態では、本明細書に記載した１つ以上の結合剤をコードする核酸分子は、下記でより詳細に考察するように、１種以上の発現ベクター内に挿入することができる。そのような実施形態では、結合剤は、アミノ酸配列に対応するヌクレオチドによってコードされ得る。様々なアミノ酸（ＡＡ）をコードするヌクレオチド（コドン）の特定の組合せは、当業者によって使用される様々な参考文献に記載されているように当技術分野において周知である（例えば、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４）。前記結合剤のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、例えば、表４を参照して確認することができる。核酸変異体は、結合剤をコードするヌクレオチドの任意の組合せを使用できる。
【００３７】
【表４】
0006629321.tif 000006
【００３８】
当業者は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、表４に提示したアミノ酸配列および情報から容易に導き出せることを理解できる。例えば、アミノ酸配列ＤＤＦＬＨ（配列番号１）および表４に提示した情報から、このアミノ酸配列がヌクレオチド配列ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＣＡＴ（配列番号１３９）によってコードされ得ることを推定することができる。当業者は、配列番号２〜１３８をコードするヌクレオチド配列を同じやり方で推定することができ、そのようなヌクレオチド配列が本明細書で企図されていることを理解できるであろう。結合剤が抗体である場合、所定の調製物（例えば、ヒト化抗体）を作成するために、その可変領域をコードするヌクレオチド配列を、発現ベクター中にクローン化されたそれを発現するファージおよび／またはハイブリドーマ細胞から単離することもできる。そのような調製物を作成する方法は、当技術分野において周知である。
【００３９】
重要な可変領域（例えば、ＣＤＲ）のアミノ酸配列を決定するために、ＰＤ−１抗原／免疫原を用いて免疫したマウス由来のハイブリドーマ細胞を、本明細書に記載した機能的アッセイおよび当業者が容易に利用可能なクローニング技術を使用して選択することができる。例えば、選択されたハイブリドーマの重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸を単離およびシーケンシングするために、製造業者のプロトコルにしたがってＴＲＩｚｏｌ試薬を使用して新鮮ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出することができる。ｃＤＮＡは、標準技術を使用してＲＮＡからアイソタイプ特異的アンチセンスプライマーもしくはユニバーサルプライマーを用いて（例えば、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キットの技術的マニュアルにしたがって）合成することができる。次にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施して、選択されたハイブリドーマによって産生される抗体の（重鎖および軽鎖）可変領域をコードする核酸を増幅することができ、次いでそれを標準クローニングベクター内に別個にクローン化してシーケンシングすることができる。次にコロニーＰＣＲスクリーニングを実施すると、正しいサイズのインサートを有するクローンを同定することができる。好ましくは、正確なサイズのインサートを有する５個以下の単一コロニーを各抗体可変領域に対してシーケンシングする。次に抗ＰＤ−１抗体の発現および精製のために標準プロトコルを使用することができる。例えば、ハイブリドーマクローンは、無血清培地中で増殖させることができ、細胞培養ブロスを遠心し、次に濾過した。次に、抗体を含有する濾過上清を親和性カラム（例えば、プロテインＡカラム）に装填し、洗浄し、適切なバッファー（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  ＩｇＧ溶出バッファー）を用いて溶出させることができる。溶出分画をプールし、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中にバッファー交換してもよい。次に、分子量、収率および純度についての標準プロトコルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって精製抗体を分析することができる。次に、タンパク質凝集体の存在が少ない高抗体純度（概して＞９０％）を確実にするために、生物物理学的特性解析に適切なカラム（例えば、ＴＳＫ  ＧＥＬ−Ｇ３０００  ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ））においてサイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣを実施することができる。これらの手法は、選択されたハイブリドーマ細胞由来の配列番号１〜１３８をコードする核酸を単離およびシーケンシングする際に使用した。これらの技術、それらの変形および／またはその他は、さらにまた当業者に理解できるようにこれらの目的に使用することもできる。
【００４０】
１つ以上のＰＤ−１結合剤をコードする核酸分子は、ウイルスおよび／または非ウイルスベクター内に含まれていてよい。１つの実施形態では、ＤＮＡベクターが、１つ以上のＰＤ−１結合剤をコードする核酸を患者に送達するために利用される。そのように実施する場合に、そのような機序の効率を改善するために、例えば、自己複製ウイルスレプリコン（Ｃａｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｖａｃｃｉｎｅ，１７：３１２４−２１３５；Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：７２３−７３２；Ｌｅｉｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：５１−５５）、コドン最適化（Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１：４９７−５００；Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，ｓｕｐｒａ；Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：４９４７−４９５１）、ｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーション（Ｗｉｄｅｒａ，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４６３５−３６４０）、共刺激性分子であるサイトカイン類および／またはケモカイン類をコードする核酸分子の組込み（Ｘｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２：１２９−１３５；Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：１０８９−１１０３；Ｉｗａｓａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：４５９１−３６０１；Ｓｈｅｅｒｌｉｎｃｋ，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９：２６４７−２６５６）、例えばＣｐＧなどの刺激性モチーフの組込み（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，ｓｕｐｒａ；Ｌｅｉｔｎｅｒ，ｓｕｐｒａ）、エンドサイトーシスもしくはユビキチンプロセッシング経路をターゲティングするための配列（Ｔｈｏｍｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２４６−２２５２；Ｖｅｌｄｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５３６６−５３７３）、プライム−ブーストレジメン（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，ｓｕｐｒａ；Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｎａｔｕｒｅ，４０８：６０５−６０９；Ｈａｎｋｅ，ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ，１６：４３９−４４５；Ａｍａｒａ，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９−７４）、プロテアソーム感受性開裂部位の使用ならびに例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）などの粘膜送達ベクターの使用（Ｄａｒｊｉ，ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｃｅｌｌ，９１：７６５−７７５；Ｗｏｏ，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９：２９４５−２９５４）を含む様々な戦略を利用できる。その他の方法は当技術分野において公知であり、それらの一部について下記に記載する。宿主に核酸を導入するのにうまく利用されてきた様々なウイルスベクターは、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスを含む。、当業者に広く利用可能な標準的な組換え技術を使用してベクターを構築することができる。そのような技術は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌ��ｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｃａ）などの一般的な分子生物学参考文献の中に見いだすことができる。「非ウイルス」プラスミドベクターは、所定の実施形態においても好適となり得る。好ましいプラスミドベクターは、細菌、昆虫および／または哺乳動物宿主細胞と適合し得る。そのようなベクターには、例えば、ＰＣＲ−ｉｉ、ＰＣＲ３およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｐＢＳｉｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐｅｔ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ｐＥＧＦｐ−ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＥＴｌ（Ｂｌｕｅｂａｃｉｉ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（国際公開第９０／１４３６３号）およびｐＦＡＳＴＢＡＣｄｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）ならびにＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数ＣＯＬｅ１ベースのファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ＴＡＱ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯ（商標）ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれる。細菌ベクターも使用できる。これらのベクターには、例えば、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ：ＢＣＧ）およびストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、国際公開第８８／６６２６号；国際公開第９０／０５９４号；国際公開第９１／１３１５７号；国際公開第９２／１７９６号および国際公開第９２／２１３７６号を参照されたい）が含まれる。多数の他の非ウイルスプラスミド発現ベクターおよび発現系が当技術分野において公知であり、使用できる。例えば、ＤＮＡ−リガンド複合体、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡの直接注入、ＣａＰＯ４沈降、遺伝子銃技術、エレクトロポレーションおよびコロイド分散系を含む、他の送達技術も差し支えない。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズおよび水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベース系が含まれる。好ましいコロイド系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとして有用な人工膜小胞で��るリポソームである。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷ビリオンを水性内部にカプセル封入し、生物活性形態にある細胞に送達することができる（Ｆｒａｌｅｙ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，６：７７）。リポソームの組成は、通常はステロイド、特にコレステロールと組み合わせた、リン脂質、特に高相転移温度リン脂質の組合せである。その他のリン脂質または他の脂質も使用できる。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。リポソーム生成において有用な脂質の例には、ホスファチジル化合物、例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドが含まれる。特に有用であるのは、脂質部分が、１４〜１８個の炭素原子、特に１６〜１８個の炭素原子を有し、および飽和している、ジアシルホスファチジルグリセロールである。例示的なリン脂質には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。
【００４１】
ベクターを含む培養細胞も提供される。培養細胞は、ベクターでトランスフェクトされた培養細胞またはその細胞の子孫であり、その細胞は免疫原性ポリペプチドを発現する。好適な細胞株は当業者には公知であり、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）を通して市販で入手可能である。トランスフェクトされた細胞を、免疫原性ポリペプチドを生成する方法において使用できる。その方法は、任意選択的に発現配列の制御下において、免疫原性ポリペプチドの発現を可能にする条件下でベクターを含む細胞を培養する工程を含む。免疫原性ポリペプチドは、標準のタンパク質精製法を使用して細胞または培養培地から単離することができる。
【００４２】
当業者は、それに結合するタンパク質を含有する生物学的サンプルを同定するために本明細書に記載した結合剤（例えば、抗体）を使用するための多数の好適な技術を有する。例えば、免疫沈降法または他の捕捉タイプのアッセイを使用し、抗体を利用してＰＤ−１を単離することができる。この周知の技術は、固体支持体またはクロマトグラフィー材料（例えば、プロテインＡ、プロテインＧおよび／またはプロテインＬ）に抗体を付着させることによって実施される。次に、結合した抗体を、ＰＤ−１を含有するまたは含有すると考えられる溶液（例えば、ＨＩＶ感染Ｔ細胞溶解物）中に導入する。それにより、ＰＤ−１は抗体に結合し、ＰＤ−１が抗体に結合したままである条件下で非結合物質を洗い流す。次に、結合タンパク質を抗体から分離し、所望の分析を行う。抗体を使用してタンパク質を単離する類似の方法は、当技術分野において周知である。結合剤（例えば、抗体）は、生物学的サンプル中のＰＤ−１を検出するためにも利用できる。例えば、フローサイトメトリー分析、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロッティング（例えば、ウェスタンブロット）、ｉｎ  ｓｉｔｕ検出、免疫細胞化学および／または免疫組織化学などのアッセイにおいて、抗体を使用できる。そのようなアッセイを実施する方法は、当技術分野において周知である。
【００４３】
本明細書に記載した結合剤は、患者における疾患状態の存在を決定する、予後を予測する、または化学療法薬もしくは他の治療計画の有効性を決定するためにも使用できる。本明細書に記載するように実施したまたは当技術分野において公知である発現プロファイルアッセイは、ＰＤ−１の発現の相対レベルを決定するために使用できる。次に、特定疾患が患者の体内に存在するか否か、患者の予後、または特定の治療計画が有効であるか否かを決定するために、その発現のレベルを基準（例えば、コントロール）レベルと相関させることができる。例えば、患者が特定の抗感染症治療計画により治療される場合、患者の組織（例えば、末梢血、乳腺組織生検）におけるＰＤ−１の発現レベルの増加または減少は、その治療計画が宿主内の感染性因子の量を悪化させるまたは改善することを指示し得る。発現の増加または減少は、治療計画が所望の効果を有するまたは有さないこと、従って、別の治療様式を選択され得ることを指示することができる。
【００４４】
さらに、例えば、新規薬物の候補を試験するための薬物スクリーニングアッセイにおける試薬として、本明細書に記載した結合剤を使用することも可能である。その試薬を使用して、細胞株あるいは患者の細胞または組織における免疫原性標的の発現に対する、候補薬剤の効果を確認することができる。有用な化合物の迅速な同定を可能にしおよび候補薬剤を用いた治療の有効性をモニターするために、発現プロファイリング技術を高スループットスクリーニング技術と組み合わせてもよい（例えば、Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９，８４−８（１９９８））。候補薬剤は、化学的化合物、核酸、タンパク質、抗体、またはそれらの誘導体であってよく、天然のものまたは合成由来のもののいずれであってもよい。このように同定された候補薬剤は、例えば、患者に投与するための医薬組成物として、または他のスクリーニングアッセイにおいて使用するために利用することができる。
【００４５】
一部の実施形態では、結合剤は精製形態にある。「精製」結合剤（例えば、抗体）は、（例えば、モノクローナル抗体の場合にはハイブリドーマ上清または腹水調製物の一部として）最初に一緒に含まれるタンパク質および／または他の成分の少なくとも約５０％から分離されたものであってよい。精製結合剤（例えば、抗体）は、最初に一緒に含まれるタンパク質および／または他の成分の少なくとも約５０％、６０％、７５％、９０％または９５％から分離されたものであってよい。
【００４６】
本明細書に記載したポリペプチドおよび核酸は、宿主に投与する前に１つ以上の医薬上許容される担体と組み合わせることができる。医薬上許容される担体は、生物学的もしくは他の点で望ましくない物質ではなく、例えば、その物質は、いずれの望ましくない生物学的影響も生じることなく、またはそれが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれとも有害に相互作用することなく、対象に投与することができる。担体は必然的に、当業者に周知であるように、有効成分の分解を最小限に抑え、および対象における有害副作用を最小限に抑えるように選択されるであろう。好適な医薬担体およびそれらの調製物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ  Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されている。典型的には、調製物を等張性にさせるために調製物中で適切な量の医薬上許容される塩が使用される。医薬上許容される担体の例には、無菌水、食塩液、リンゲル液およびデキストロース溶液のような緩衝液が含まれるがそれらに限定されない。溶液のｐＨは、一般に約５〜８または約７〜約７．５である。その他の担体には、例えばポリペプチドもしくはそれらの断片を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスのような、徐放性製剤が含まれる。マトリックスは、成形品、例えば、フィルム、リポソームもしくは微粒子の形態にあってよい。所定の担体が、例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に依存して、より好ましいものとなり得ることは当業者に明白であろう。担体は、ヒトまたは他の対象にポリペプチドおよび／またはその断片を投与するのに好適なものである。医薬組成物は、免疫原性ポリペプチドに加えて、担体、増粘剤、希釈剤、保存料、界面活性剤、アジュバント、免疫刺激剤も含んでいてよい。医薬組成物は、抗菌剤、抗炎症剤および麻酔剤などの１種以上の有効成分も含んでいてよい。医薬組成物は、従来の医薬上許容される担体、アジュバントおよびビヒクルを含有する単位用量調製物(dosage unit formulations)において、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、経直腸により、結節内にまたは局所的に投与することができる。本明細書で使用する用語「医薬上許容される担体」もしくは「生理学上許容される担体」は、医薬組成物として核酸、ポリペプチドまたはペプチドの送達を達成または増強するのに好適な１種以上の調製物材料(formulation material)を意味する。「医薬組成物」は、治療有効量の核酸またはポリペプチドを含む組成物である。用語「有効量」および「治療有効量」は、それぞれ所望の治療効果（例えば、Ｔ細胞機能を回復させる）を観察するために使用される結合剤、核酸などの量を意味する。
【００４７】
少なくとも１つ以上の有効量の本明細書に記載した１つ以上の結合剤（および／またはそれらの誘導体）を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物宿主における１つ以上の疾患状態（例えば、ＨＩＶまたは癌）を治療する方法も提供される。一部の実施形態では、結合剤は、配列番号１〜１３８および／または表１Ａおよび１Ｂに示した１つ以上を含むモノクローナル抗体またはそれらの断片もしくは誘導体である。その１つ以上の結合剤は、約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、または約５〜約３０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５または４０ｍｇ／ｋｇのいずれか）の用量で投与することができる。所定の実施形態では、１つ以上の結合剤は、約１０ｍｇ／ｋｇで１回以上、哺乳動物に（例えば、皮内、静脈内、経口、経直腸）投与することができる。複数回の用量が投与される場合、投与は各用量でほぼ同一の量または異なる量の結合剤を含むことができる。投与は、同一または異なる間隔を空けて時間的に分離してもよい。例えば、投与は、約６、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４もしくは９６時間、１週間、２週間、３週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、１．５年間、２年間、３年間、４年間、５年間、あるいはこれらの期間のいずれかの前、後および／またはそれらの間の期間により、分離することができる。一部の実施形態では、結合剤は、例えば他の薬剤（例えば、抗感染剤および／または化学療法薬）と共に投与することができる。そのような他の薬剤は、結合剤とほぼ同時に、または異なる時点および／または頻度で投与することができる。当業者が容易に特定できるように、そのような方法の他の実施形態も適切となり得る。
【００４８】
本明細書に記載した抗体を使用する際に当業者を助けるために、同一物をキットフォーマットで提供してもよい。そのような抗体、および任意選択的に、その抗体を使用してＰＤ−１を発現する細胞を検出するのに必要な他の成分を含むキットが提供される。キットの抗体は、冷凍、凍結乾燥を含む任意の好適な形態で、あるいはＴＢＳまたはＰＢＳのような医薬上許容されるバッファー中において、提供することができる。キットは、例えば、バッファー（例えば、ＴＢＳ、ＰＢＳ）、ブロック化剤（脱脂粉乳、正常血清、Ｔｗｅｅｎ−２０界面活性剤、ＢＳＡもしくはカゼインを含む溶液）および／または検出試薬（例えば、ヤギ抗マウスＩｇＧビオチン、ストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体、アロフィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ペルオキシダーゼ、検出可能な標識およびその他の標識および／または染色キット（例えば、ＡＢＣ染色キット、Ｐｉｅｒｃｅ））などの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで抗体を利用するのに必要とされる他の試薬も含んでいてよい。キットは、例えばフローサイトメトリー分析、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロッティング（例えば、ウェスタンブロット）、ｉｎ  ｓｉｔｕ検出、免疫細胞化学、免疫組織化学などの、上述した一般的に利用されるアッセイにおいて抗体を使用するための他の試薬および／または取扱説明書も含んでいてよい。１つの実施形態では、キットは、精製形態にある結合剤を提供する。また別の実施形態では、結合剤は、ビオチン化形態で、それを単独でまたはアビジン共役検出試薬（例えば、抗体）と共に、提供することができる。また別の実施形態では、キットは、ＰＤ−１を直接的に検出するのに使用できる１種以上の検出可能な標識を含む結合剤を含む。これらの系のいずれかを使用するのに必要とされるバッファーなどは、当技術分野において周知であり、および／または最終使用者によって準備するか、またはキットの構成成分として提供してもよい。キットは、陽性コントロールおよび陰性コントロールタンパク質および／または組織サンプルを含む、固体支持体も含んでいてよい。例えば、スポッティングもしくはウェスタンブロットタイプのアッセイを実施するためのキットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで使用するためのコントロール細胞または組織溶解物、あるいは、実験サンプルのための追加のスペースと共に事前に固定されたコントロールサンプルを含有するナイロン膜もしくは他の膜を含むことができる。スライド上の細胞におけるＰＤ−１を可視化するためのキットは、実験サンプルのための追加のスペースと共にコントロール細胞もしくは組織サンプルを含有するフォーマット済みスライドを含むことができる。当業者には理解されるように、キットの他の実施形態も本明細書において企図されている。
【００４９】
そこで、本開示は、ＰＤ−１に作動的または拮抗的に結合する結合剤を提供する。一部の実施形態では、結合剤は、配列番号１〜１３８からなる群より選択されるおよび／または表１Ａおよび１Ｂに示した少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。一部の実施形態では、結合剤は、配列番号１〜１３８（例えば、表１Ａおよび／または１Ｂに示した）の１つ以上の組合せを含むポリペプチドである。一部の実施形態では、結合剤は抗体である。一部の実施形態では、結合剤は、配列番号１〜２３からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む抗体のような、ポリペプチドである。一部の実施形態では、結合剤は、配列番号２４〜４６からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む抗体のような、ポリペプチドである。一部の実施形態では、結合剤は、配列番号４７〜６９からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む抗体のような、ポリペプチドである。一部の実施形態では、結合剤は、配列番号７０〜９２からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む抗体のような、ポリペプチドである。一部の実施形態では、結合剤は、配列番号９３〜１１５からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む抗体のような、ポリペプチドである。一部の実施形態では、結合剤は、配列番号１１６〜１３８からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む抗体のような、ポリペプチドである。一部の実施形態では、結合剤は、表１Ａおよび／または１Ｂに示したＣＤＲの組合せを含む、および／または表２に記載した特性を有する。一部の実施形態では、結合剤は、ヒト抗体、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ２ａ、ヒトＩｇＧ２ｂ、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＡ１、ヒトＩｇＡ２、ヒトＩｇＤ、ヒトＩｇＥ、イヌ抗体、イヌＩｇＧＡ、イヌＩｇＧＢ、イヌＩｇＧＣ、イヌＩｇＧＤ、ニワトリ抗体、ニワトリＩｇＡ、ニワトリＩｇＤ、ニワトリＩｇＥ、ニワトリＩｇＧ、ニワトリＩｇＭ、ニワトリＩｇＹ、ヤギ抗体、ヤギＩｇＧ、マウス抗体、マウスＩｇＧ、ブタ抗体および／またはラット抗体および／またはそれらの誘導体に由来する、または（例えば、配列または起源によって）それらに関連する。一部の実施形態では、誘導体は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’一本鎖抗体、Ｆｖ，一本鎖、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多重特異性抗体、多価抗体、キメラ抗体、イヌ−ヒトキメラ抗体、イヌ−マウスキメラ抗体、イヌＦｃを含む抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、イヌ化抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、サメ抗体、ナノボディおよび／またはラクダ抗体からなる群より選択することができる。一部の実施形態では、結合剤は少なくとも第１および第２の特異性を有し、第１の特異性はＰＤ−１に対するものであり、および第２の特異性は異なる抗原（例えば、ＨＩＶ（例えばｅｎｖ）などの感染性因子および／または腫瘍抗原などの抗原）に対するものである。一部の実施形態では、結合剤および／またはその誘導体は、それに固定可能に付着させた検出可能な標識を含むことができる。一部の実施形態では、任意の１つおよび／またはその誘導体の結合剤は、それに固定可能に付着させたエフェクター部分（例えば、細胞傷害性薬物、毒素、ジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンおよび放射化学薬品）を含む。一部の実施形態では、１つ以上の結合剤をコードするポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）も提供される。そのようなポリヌクレオチドのポリペプチド産物を含むおよび／または発現する宿主細胞も提供される。一部の実施形態では、少なくとも１つの結合剤もしくは誘導体；少なくとも１つの単離ポリヌクレオチド；少なくとも１つの発現ベクター；および／または少なくとも１つの宿主細胞；またはそれらの組合せ；ならびに医薬上許容される担体を含む組成物も提供される。
【００５０】
本開示はさらに、細胞上のＰＤ−１を検出するための方法において、試験生物学的サンプルを本明細書に記載した結合剤もしくは誘導体と接触させる工程、およびその生物学的サンプルもしくはその成分に結合した結合剤を検出する工程を含む方法も提供する。そのような方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ法またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であってよい。一部の実施形態では、本方法は、試験生物学的サンプルもしくはその成分に結合する量をコントロール生物学的サンプルもしくはその成分に結合する量と比較する工程を含み、コントロール生物学的サンプルもしくはその成分に結合する量と比較して増加した試験生物学的サンプルもしくはその成分に結合する量は、試験生物学的サンプル（例えば、哺乳動物血液）におけるＰＤ−１を発現する細胞の存在を示す。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体結合剤を同定するためのシステムにおいて、疲弊機能回復アッセイ（ＥＦＲＡ）により候補結合剤をアッセイする工程；ＰＤ−１に対する候補結合剤の親和性を決定する工程；および候補結合剤のＣＤＲのヌクレオチド配列を決定する工程によるシステムが提供される。
【００５１】
一部の実施形態では、細胞内または細胞上でのＰＤ−１の発現を検出するためのキットにおいて、結合剤もしくはその誘導体および使用説明書を含むキットを提供する。一部の実施形態では、結合剤および／またはその誘導体は、凍結乾燥形態にある。
【００５２】
一部の実施形態では、本開示は、哺乳動物における感染性疾患、癌および／または自己免疫を治療、予防および／または改善する方法において、結合剤もしくはその誘導体を含む少なくとも１つの有効量の医薬組成物を、その哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態では、感染性疾患は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。一部の実施形態では、感染性疾患および／または癌を治療するために使用される結合剤および／またはその誘導体は、ＰＤ−１アンタゴニストである。一部の実施形態では、自己免疫状態を治療するために使用される結合剤および／またはその誘導体は、ＰＤ−１アゴニストである。一部の実施形態では、複数回用量が動物に投与される。一部の実施形態では、結合剤および／またはその誘導体は、それに約１〜５０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与することができる。
【００５３】
本開示は、さらにＰＤ−１結合剤の組合せも提供する。一部の実施形態では、組合せは、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する第１結合剤、およびＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断しない第２結合剤を含む。そのような組合せは、本明細書に記載したまたは当業者が確認できる任意の用途のために使用できる。例えば、そのような組合せは、本明細書に記載した哺乳動物における感染性疾患、癌および／または自己免疫を治療、予防および／または改善する方法において使用できる。
【００５４】
本開示は、細胞において結合剤を発現させる工程、およびその細胞またはその細胞の培養上清から結合剤を単離する工程により、本明細書に記載した結合剤を製造する方法も提供する。一部の実施形態では、そのような方法は、そのような結合剤をコードする核酸を発現させる工程をさらに含むことができる。一部の実施形態では、そのような方法は、単離後に結合剤を１種以上の医薬上許容される賦形剤と組み合わせる工程をさらに含むことができる。
【００５５】
本開示によって、例えばＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する第１結合剤、およびＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断しない第２結合剤などの、結合剤の組合せを製造する方法も提供される。一部の実施形態では、第２結合剤はＰＤ−１に結合する。一部の実施形態では、第１および／または第２結合剤は、例えばモノクローナル抗体またはそれらの断片もしくは誘導体のような抗体である。一部の実施形態では、第２結合剤は、配列番号２、２５、４８、７１、９４および１１７のアミノ酸配列、または配列番号１７、４０、６３、８６、１０９および１３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、これらの方法は、医薬上許容される賦形剤の添加をさらに含むことができる。
【００５６】
用語「約」、「およそ」などは、数値もしくは範囲のリストに先行する場合は、リストもしくは範囲内の各個別値が、その用語の直前に置かれているかのように、そのリストもしくは範囲内の各個別の値に独立して言及する。これらの用語は、それが言及する数値がその数値と正確に同一、それに近い、またはそれに類似することを意味する。
【００５７】
本明細書で使用する「対象(subject)」もしくは「宿主」は、個体であることが意図されている。対象は、例えばネコおよびイヌ、家畜類（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジおよびヤギ）などの家畜化された動物、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット）およびトリ類を含むことができる。１つの態様では、対象は、例えば霊長類もしくはヒトなどの哺乳動物である。
【００５８】
「任意選択的(optional)」もしくは「任意選択的に(optionally)」は、続いて記載した事象もしくは状況が発生する場合がある、または発生しない場合があること、およびその記述が事象もしくは状況が発生する場合およびそれが発生しない場合を含むことを意味する。例えば、語句の「任意選択的に組成物が組合せを含み得る」は、その記述が組合せおよび組合せの非存在（すなわち、組合せの個別メンバー）の両方を含むように、その組成物が、異なる分子の組合せを含んでいてもまたは組合せを含まなくてもよいことを意味する。
【００５９】
本明細書では、「範囲」は、約１つの特定値から、および／またはまた別の特定値までで表示することができる。そのような範囲が表示される場合、また別の態様は、１つの特定値から、および／または他の特定値までを含む。同様に、数値が近似値として表示される場合は、先行詞「約」もしくは「およそ」の使用によって、特定値がまた別の態様を形成すると理解されるであろう。さらに、範囲のそれぞれの終点は、他の終点に関連して、および他の終点からは独立しての両方で重要であることは理解されるであろう。範囲（例えば、９０〜１００％）は、各数値が個別に列挙されているかのように範囲自体ならびにその範囲内の各独立値を含むことが意図されている。
【００６０】
用語「組み合わせた(combined)」、「組み合わせて(in combination)」または「共に(in conjunction)」は、一緒に投与される薬剤の物理的組合せ、あるいは、特定疾患を治療、予防および／または改善するための治療計画における２種以上の薬剤の使用（例えば、物理的および／または時間において別個に投与される）を意味することができる。
【００６１】
「治療する」、「予防する」および／または「改善する」の用語が、所定の状態のための所定の治療（例えば、ＨＩＶによる感染、癌を予防する）と関連して使用される場合、治療された患者がその状態の臨床的に観察可能なレベルを全く発生しない、または彼／彼女が治療を受けなかった場合より、よりゆっくりおよび／または少ない程度までしか発生しないことを伝えることを意図している。これらの用語は、患者が何であれその状態の態様を全く経験しない状況のみに限定されるものではない。例えば、「治療」は、状態の所定の発現を生じると予測される刺激物への患者の曝露中に与えられ、それが与えられなかった場合に予測されるよりも少ないおよび／またはより軽度の症状をその患者が経験する場合に、その状態を予防したと言われるであろう。例えば、治療は、患者が感染の軽度の明らかな症状しか示さない状態をもたらすことによって、感染を「予防する」ことができる；これは、微生物の感染による細胞の侵入があってはならないことを意味するものではない。
【００６２】
同様に、特定の治療による所定の状態の予防、治療および／または改善と関連して本明細書に使用される「低減させる」、「低減させる工程」および／または「低減」は、典型的には、治療（例えば、１つ以上のＰＤ−１結合剤の投与）の非存在下において感染症を発生するコントロールもしくは基礎レベルと比較して、よりゆっくり、またはより少ない程度に感染症を対象が発生することを称する。感染症のリスクの低減は、患者が、感染の軽度の明らかな症状または感染の遅延された症状のみを示すことを生じさせ得る；これは、微生物の感染による細胞の侵入があってはならないことを意味するものではない。
【００６３】
本開示の中で言及したすべての参考文献は、その全体が参照によりここに組み込まれる。下記の実施例では、所定の実施形態についてさらに記載する。これらの実施形態は、例示としてのみ提供され、決して特許請求項の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【００６４】
実施例１
ＰＤ−１結合剤の生成および特性解析
４種のマウス系統（マウス計１６匹）を、２種のＰＤ−１タンパク質、すなわちヒトＰＤ−１  Ｆｃ融合タンパク質およびヒトＰＤ−１モノマータンパク質で免疫した。活性化ヒトＴリンパ球上に発現されたＰＤ−１に対して血清反応性を示すマウスを、抗ＰＤ−１ハイブリドーマ細胞株を作成するために選択した。組換えＰＤ−１タンパク質に結合する抗体を作成するために、計２４０のＰＤ−１ハイブリドーマ細胞株を選択した。第１ラウンドの抗体選択のための一次基準は：ｉ）フローサイトメトリーによる活性化ヒトＴリンパ球上のＰＤ−１の染色；ｉｉ）既存の抗ＰＤ−１抗体と比較したＣＤＲ  ＶＨおよびＶＬ配列の多様性；および（ｉｉｉ）ＰＤ−１共役ＬｕｍｉｎｅｘビーズとＰＤ−１上の様々なエピトープに結合する２種の市販の抗ＰＤ−１抗体との競合結合試験によって実施されるエピトープマッピングであった。第２ラウンドの選択は、次に：ｉｖ）親和性結合アッセイ（抗ＰＤ−１抗体の刺激能力とは相関しないので一次基準ではない）；ｖ）ＰＤ−１に結合し、かつＬｕｍｉｎｅｘ生化学的アッセイにおいてＰＤ−Ｌ１の結合と競合的、部分競合的または非競合的のいずれかである抗ＰＤ−１抗体の評価；およびｖｉ）アゴニスト（Ｔ細胞を機能的疲弊から回復させられない）またはアンタゴニスト（Ｔ細胞を機能的疲弊から回復させられる）としての抗体の機能的特性解析；によって実施した。これらの試験では、抗体がＨＩＶ特異的疲弊ＣＤ８  Ｔ細胞における増殖を救済する能力に基づき、抗体を試験および識別した。
【００６５】
個々の細胞培養ハイブリドーマ細胞クローンからの抗体上清の一次スクリーニングにおいて、ＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖に対する抗ＰＤ−１抗体の機能的効果を評価するためにＥＦＲＡアッセイを実施した（図２）。上方のボックス内の抗体クローン（Ｅ８−３、Ｃ２−３、Ｅ１−３、Ｆ３−３、Ｈ８−３、Ｃ１０−２、Ｇ２−１、Ｇ３−２、Ｈ２−１およびＨ４−２）は、ＰＤ−１アンタゴニストとして作用して増殖を刺激するが、下方のボックス内の抗体クローン（Ｃ８−１およびＧ１０−２）は作動性で、ＰＤ−１の負の調節作用(negative regulatory effect)を促進する。ペプチドコントロール（Ｐｅｐ  ８）によって誘導される増殖のレベルは、下方水平線（１％の直ぐ下）によって表示され、Ｍｅｒｃｋ  ＭＫ−３４７５抗ＰＤ１抗体により誘導された増殖は上方水平線（２％の直ぐ上）によって示される。これらのプロセスによって同定された関心抗体は、第２ラウンドのサブクローニングを受け、その結果得られたハイブリドーマクローンは、表２における抗体の製造および精製のために使用された。サブクローンがＰＤ−１に対する親和性を維持していることを確認するために、精製抗ＰＤ−１を用いて結合アッセイを実施した。抗ＰＤ−１抗体の細胞表面ＰＤ−１への濃度反応結合は、活性化ＣＤ４  Ｔ細胞上で評価した（図３）。
【００６６】
ＥＦＲＡは、機能的疲弊からＴ細胞を回復させるが必ずしも拮抗性ではない結合剤（これはＰＤ−１とその生物学的リガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２）との相互作用を必ずしも妨害しない結合剤であることを意味する）の選択を提供する。ＥＦＲＡの実施形態は、ＰＤ−１に結合するそのような結合剤（抗体）を同定するためであった。ＰＤ−１に結合する抗体のエピトープマッピングは、２つの別個の生物化学的アッセイを用いて実施した。１つのアッセイでは、ＰＤ−１  Ｆｃ融合タンパク質標識ビーズへの競合的結合は、２種の市販の抗ＰＤ−１抗体（ＢＭＳ−５Ｃ４およびＭＫ３４７５）のうちの１つと、列挙した（表２にも記載した）抗ＰＤ−１抗体との間で評価した。別個のエピトープに結合する４つのクラスのモノクローナル抗体を、このアッセイに基づいて同定した。これらは：クラス１（ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する市販モノクローナル抗体クローンＥＨ１２．２Ｈ７と競合的）、クラス２（ＰＤ−１に結合するがＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断しない市販モノクローナル抗体クローンＪ１１６と競合的）、クラス３（市販モノクローナル抗体ＥＨ１２．２Ｈ７およびＪ１１６の両方と競合的）およびクラス４（市販抗体ＥＨ１２．２Ｈ７およびＪ１１６のどちらとも非競合的）である。図４において、細胞表面ＰＤ−１に対するこれら抗体の相対結合を、コントロール抗ＰＤ−１抗体に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって表わした。これらの結果は、緊密な結合抗体が４つ全ての結合クラスから同定されたことを示している。第２のＬｕｍｉｎｅｘ結合アッセイを使用して、抗ＰＤ−１抗体が、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を遮断するか否かを直接的に評価した。このアッセイは、表２に列挙した抗ＰＤ−１抗体の様々な濃度の非存在下または存在下においてインキュベートしたＰＤ−１  Ｆｃ融合タンパク質被覆ビーズを用いて実施した。次に、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用のＩＣ５０とほぼ等価である固定濃度のビオチン化ＰＤ−Ｌ１を、ＰＤ−１／抗体複合体とインキュベートし、蛍光標識ストレプトアビジンを使用してＰＤ−Ｌ１結合を検出した（図５ａ〜ｃに示した代表的な結合曲線）。この生化学的アッセイを使用して、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用と競合的、部分競合的または非競合的であるとして抗体を規定した。ＰＤ−１上の別個の部位に結合し、および高い結合親和性を示す競合的、部分競合的または非競合的抗体が同定された（表２）。ＰＤ−１  Ｆｃ融合タンパク質被覆Ｌｕｍｉｎｅｘビーズを、２０ｎＭの表２からの抗ＰＤ−１抗体とインキュベーションし、その後にＰＤ−１／抗体複合体を様々な濃度のビオチン化ＰＤ−Ｌ１とインキュベーションすることにより、ＰＤ−１に結合しかつＰＤ−Ｌ１と非競合的または部分競合的である抗体のさらなる評価を実施した。図５ｄ〜ｆは、競合的抗ＰＤ−１抗体がＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を完全に遮断することを示している。表２に列挙した部分競合的および非競合的抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１に対するＰＤ−Ｌ１の結合親和性のシフトを生じさせるが、ＰＤ−Ｌ１の濃度が上昇した場合には相互作用を遮断しない。これら抗体の一部は、コントロール（図６ａおよび６ｂにおける、ペプチド８単独コントロール、またはそのペプチドおよびＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体）と比較して増殖の統計的に有意な増加を示すことも証明された。クラス１の抗体（ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する市販モノクローナル抗体ＥＨ１２．２Ｈ７と競合的、またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用アッセイにおいて競合的）は、概して、改善された増殖回復をもたらすことが特定された。複数回のＥＦＲＡ実験からのデータを組み合わせ、および共通コンパレーターとしてのＭＫ−３４７５を使用して、図７は、表２に記載した選択抗体が、ベンチマークＭＫ−３４７５抗体と比較して、同等または統計的に改善された活性（ｐ＜０．００７）を示したことを証明している。
【００６７】
実施例２
抗体の組合せ
様々なＰＤ−１エピトープに結合する抗体の組合せが、機能的疲弊回復アッセイにおいて、ＨＩＶペプチド特異的ＣＤ８  Ｔ細胞増殖の回復を増強することが見いだされた（図８）。抗体タイプ間の相乗作用も観察された。例えば、クラス１（図８におけるＭＫ−３４７５）およびクラス２（図８における１３９Ｄ６）の抗体が同時にＰＤ−１に結合できることが特定された。ＭＫ−３４７５について観察された最高の刺激は、ＨＩＶペプチドに対して一貫して約２００％であるが、５μｇ／ｍｌでのＭＫ−３４７５および１３９Ｄ６モノクローナル抗体の組合せは、ＨＩＶペプチドコントロール単独に対してＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞増殖の２８８％の増加、またはＭＫ−３４７５もしくは１３９Ｄ６添加単独に対して１４４％の増殖増加をもたらし、相乗作用を示した（図８）。増殖におけるこの相乗的増加は、数回の実験による試験において０．００７の統計的有意なｐ値をもって観察された。比較として、ＭＫ−３４７５または１３９Ｄ６いずれか単独の１０μｇ／ｍｌの添加は、ＥＦＲＡにおける増殖増加を生じさせなかった。そこで、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する第１結合剤およびＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断しない第２結合剤のような、結合剤の組合せは、Ｔ細胞を疲弊から救済するために相乗的に作用すると決定された。
【００６８】
所定の実施形態について好ましい実施形態に関して記載してきたが、当業者は、変形および修飾を思い付くであろうと理解されている。このため、添付の特許請求項が以下の特許請求項の範囲内に含まれるそのような同等の変形全てに及ぶと意図されている。
本発明のさらなる態様例：
（１）配列番号１〜１３８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、および／または表１Ａおよび／または１Ｂに示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、プログラム細胞死１（ＰＤ１）に結合する結合剤。
（２）単離モノクローナル抗体である、上記（１）の結合剤。
（３）配列番号１〜２３からなる群より選択される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む、上記（１）または（２）の結合剤。
（４）配列番号２４〜４６からなる群より選択される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む、上記（１）〜（３）いずれかの結合剤。
（５）配列番号４７〜６９からなる群より選択される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、上記（１）〜（４）いずれかの結合剤。
（６）配列番号７０〜９２からなる群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む、上記（１）〜（５）いずれかの結合剤。
（７）配列番号９３〜１１５からなる群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む、上記（１）〜（６）いずれかの結合剤。
（８）配列番号１１６〜１３８からなる群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、上記（１）〜（７）いずれかの結合剤。
（９）
【表５】
0006629321.tif 000007
からなる群より選択されるアミノ酸配列および／または
【表６】
0006629321.tif 000008
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、上記（１）〜（８）いずれかの結合剤。
（１０）配列番号１、２４、４７、７０、９３および１１６；
配列番号２、２５、４８、７１、９４および１１７；
配列番号３、２６、４９、７２、９５および１１８；
配列番号４、２７、５０、７３、９６および１１９；
配列番号５、２８、５１、７４、９７および１２０；
配列番号６、２９、５２、７５、９８および１２１；
配列番号７、３０、５３、７６、９９および１２２；
配列番号８、３１、５４、７７、１００および１２３；
配列番号９、３２、５５、７８、１０１および１２４；
配列番号１０、３３、５６、７９、１０２および１２５；
配列番号１１、３４、５７、８０、１０３および１２６；
配列番号１２、３５、５８、８１、１０４および１２７；
配列番号１３、３６、５９、８２、１０５および１２８；
配列番号１４、３７、６０、８３、１０６および１２９；
配列番号１５、３８、６１、８４、１０７および１３０；
配列番号１６、３９、６２、８５、１０８および１３１；
配列番号１７、４０、６３、８６、１０９および１３２；
配列番号１８、４１、６４、８７、１１０および１３３；
配列番号１９、４２、６５、８８、１１１および１３４；
配列番号２０、４３、６６、８９、１１２および１３５；
配列番号２１、４４、６７、９０、１１３および１３６；
配列番号２２、４５、６８、９１、１１４および１３７；および
配列番号２３、４６、６９、９２、１１５および１３８
からなる群より選択されるアミノ酸配列の組合せを含む、上記（９）の結合剤。
（１１）ヒト抗体、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ２ａ、ヒトＩｇＧ２ｂ、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＡ１、ヒトＩｇＡ２、ヒトＩｇＤ、ヒトＩｇＥ、イヌ抗体、イヌＩｇＧＡ、イヌＩｇＧＢ、イヌＩｇＧＣ、イヌＩｇＧＤ、ニワトリ抗体、ニワトリＩｇＡ、ニワトリＩｇＤ、ニワトリＩｇＥ、ニワトリＩｇＧ、ニワトリＩｇＭ、ニワトリＩｇＹ、ヤギ抗体、ヤギＩｇＧ、マウス抗体、マウスＩｇＧ、ブタ抗体またはラット抗体に由来する、上記（１）〜（１０）いずれかの結合剤。
（１２）上記（１）〜（１１）いずれかの結合剤の誘導体。
（１３）Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’一本鎖抗体、Ｆｖ，一本鎖、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三量体抗体、多重特異性抗体、多価抗体、キメラ抗体、イヌ−ヒトキメラ抗体、イヌ−マウスキメラ抗体、イヌＦｃを含む抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、イヌ化抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、サメ抗体、ナノボディおよびラクダ抗体からなる群より選択される、上記（１２）記載の誘導体。
（１４）少なくとも第１および第２の特異性を有し、前記第１の特異性はＰＤ−１に対するものであり、および前記第２の特異性は異なる抗原に対するものである、上記（１）〜（１３）いずれかの結合剤もしくは誘導体または（３８）〜（４０）いずれかの組合せ。
（１５）前記第２の特異性は、感染性因子の抗原または腫瘍抗原に対するものである、上記（１４）の結合剤または誘導体。
（１６）前記感染性因子はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、上記（１５）の結合剤または誘導体。
（１７）前記抗原はＨＩＶ  ｅｎｖである、上記（１６）の結合剤または誘導体。
（１８）固定的に付着した検出可能な標識を含む、上記（１）〜（１７）いずれかの結合剤またはその誘導体。
（１９）前記検出可能な標識は、フルオロセイン、ＤｙＬｉｇｈｔ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−ＦＡＭ、ヒドロキシトリプタミン、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＡＴ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、ＦＩＴＣ、６−カルボキシ−１，４−ジクロロ−２’，７’−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシ−１，４−ジクロロ−２’，４’、５’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（６−ＪＯＥ）、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＢＯＤＩＰＹ蛍光体、ＢＯＤＩＰＹ  ４９２／５１５、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５００／５１０、ＢＯＤＩＰＹ  ５０５／５１５、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５４２／５６３、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ  ６６５／６７６、ＦＬ、ＦＬ  ＡＴＰ、ＦＩ−セラミド、Ｒ６Ｇ  ＳＥ、ＴＭＲ、ＴＭＲ−Ｘ複合体、ＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ、ＴＲ、ＴＲ  ＡＴＰ、ＴＲ−Ｘ  ＳＥ、ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン１２３、ローダミンＢ、ローダミンＢ  ２００、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＢ  ｅｘｔｒａ、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、５  ＧＬＤ、６−カルボキシローダミン６Ｇ、リサミン、リサミンローダミンＢ、ファリシジン、ファロイジン、ローダミンレッド、Ｒｈｏｄ−２、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、スルホローダミンＢ  ｃａｎ  Ｃ、スルホローダミンＧ  Ｅｘｔｒａ、６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、ローダミンＷＴ、テキサスレッドおよびテキサスレッド−Ｘからなる群より選択される、上記（１８）の結合剤。
（２０）固定的に付着したエフェクター部分を含む、上記（１）〜（１９）いずれかの結合剤またはその誘導体。
（２１）前記エフェクター部分は、細胞傷害性薬、毒素、ジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンおよび放射化学薬品からなる群より選択される、上記（２０）の結合剤または誘導体。
（２２）上記（１）〜（１７）いずれかの結合剤をコードする単離ポリヌクレオチド。
（２３）上記（２２）の１つ以上のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（２４）上記（２２）の単離ポリヌクレオチドおよび／または）上記（２３）の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（２５）上記（１）〜（２１）いずれかの少なくとも１つの結合剤もしくは誘導体；上記（２２）の少なくとも１つの単離ポリヌクレオチド；上記（２３）の少なくとも１つの発現ベクター；および／または上記（２４）の少なくとも１つの宿主細胞；またはそれらの組合せ；および／または（３９）〜（４３）いずれかの組合せ；ならびに医薬上許容される担体を含む、組成物。
（２６）細胞上のＰＤ−１を検出する方法において、
試験生物学的サンプルを、上記（１）〜（２１）いずれかの結合剤もしくは誘導体および／または（３９）〜（４３）いずれかの組合せと接触させる工程、および
前記生物学的サンプルもしくはその成分に結合した前記結合剤を検出する工程、を含む、方法。
（２７）前記試験生物学的サンプルもしくはその成分に結合する量を、コントロール生物学的サンプルもしくはその成分に結合する量と比較する工程をさらに含み、前記コントロール生物学的サンプルもしくはその成分に結合する量と比較して、増加した試験生物学的サンプルもしくはその成分に結合する量は、試験生物学的サンプルにおけるＰＤ−１を発現する細胞の存在を示す、上記（２６）の方法。
（２８）前記試験生物学的サンプルは哺乳動物血液である、上記（２６）または（２７）の方法。
（２９）前記方法はｉｎ  ｖｉｖｏ法である、上記（２６）〜（２８）いずれかの方法。
（３０）前記方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ法である、上記（２６）〜２８）いずれかの方法。
（３１）哺乳動物における感染性疾患、癌および／または自己免疫状態を治療、予防および／または改善する方法において、前記哺乳動物に、上記（１）〜２１）いずれかの結合剤もしくはその誘導体、および／または（３９）〜（４３）いずれかの組合せを含む、少なくとも１つの有効量の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
（３２）前記感染性疾患はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、上記（３１）の方法。
（３３）感染性疾患、ＨＩＶおよび／または癌を治療するために使用される前記結合剤および／またはその誘導体は、ＰＤ−１アンタゴニストである、上記（３１）または（３２）の方法。
（３４）自己免疫状態を治療するために使用される前記結合剤および／またはその誘導体は、ＰＤ−１アゴニストである、上記（３１）の方法。
（３５）前記動物に複数回投与される、上記（３１）〜（３４）いずれかの方法。
（３６）前記結合剤は、約１〜５０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される、上記（３１）〜（３５）いずれかの方法。
（３７）細胞内または細胞上でのＰＤ−１の発現を検出するためのキットにおいて、上記（１）〜２１）いずれかの結合剤もしくはその誘導体または組合せ、ならびに使用説明書を含む、キット。
（３８）前記結合剤、抗体または誘導体は、凍結乾燥形態にある、上記（３７）のキット。
（３９）ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する第１結合剤、およびＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断しない第２結合剤を含む、結合剤の組合せ。
（４０）前記第２結合剤はＰＤ−１に結合する、上記（３９）の組合せ。
（４１）前記第１および／または第２結合剤は抗体である、上記（３９）の組合せ。
（４２）前記結合剤はモノクローナル抗体である、上記（４０）の組合せ。
（４３）前記第２結合剤は、配列番号２、２５、４８、７１、９４および１１７のアミノ酸配列、または配列番号１７、４０、６３、８６、１０９および１３２のアミノ酸配列を含む、上記（３９）の組合せ。
（４４）ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する第１結合剤、およびＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断しない第２結合剤を組み合わせる工程を含む、上記（３９）〜（４３）いずれかの組合せを製造する方法。
（４５）前記第２結合剤はＰＤ−１に結合する、上記（４４）の方法。
（４６）前記第１および／または第２結合剤は抗体である、上記（４４）の方法。
（４７）前記結合剤はモノクローナル抗体である、上記（４４）の方法。
（４８）前記第２結合剤は、配列番号２、２５、４８、７１、９４および１１７のアミノ酸配列、または配列番号１７、４０、６３、８６、１０９および１３２のアミノ酸配列を含む、上記（４４）の方法。
（４９）医薬上許容される賦形剤の添加をさらに含む、上記（４４）〜（４８）いずれかの方法。
（５０）免疫細胞を上記（３９）〜（４３）いずれかの組合せと接触させることにより、抗原の存在下で免疫細胞の増殖を誘導する方法。
（５１）ＰＤ−１抗体結合剤を同定する方法において、
ａ）疲弊機能回復アッセイ（ＥＦＲＡ）により候補ＰＤ−１結合剤をアッセイする工程；
ｂ）ＰＤ−１に対する前記候補結合剤の親和性を決定する工程；および
ｃ）前記候補結合剤の相補性決定領域（ＣＤＲ）のヌクレオチド配列を決定する工程；を含む、方法。
（５２）上記（１）〜（１１）いずれかの結合剤を製造する方法において、
細胞において前記結合剤を発現させる工程；および
前記細胞または前記細胞の培養上清から前記結合剤を単離する工程；を含む、方法。
（５３）上記（１）〜（１１）いずれかの結合剤をコードする核酸を宿主細胞において発現させる工程をさらに含む、上記（５２）の方法。
（５４）単離後、前記結合剤を医薬上許容される賦形剤と組み合わせる工程をさらに含む、上記（５２）または（５３）の方法。
（５５）ヒトＰＤ−１に結合し、下記（ａ）〜（ｗ）からなる群より選択される重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の組み合わせを含む結合剤：
（ａ）それぞれ、配列番号１７、４０および６３で規定される相補性決定領域 （ＣＤＲ）１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号８６、１０９および１３２で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｂ）それぞれ、配列番号８、３１および５４で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号７７、１００および１２３で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｃ）それぞれ、配列番号１、２４および４７で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号７０、９３および１１６で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｄ）それぞれ、配列番号２、２５および４８で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号７１、９４および１１７で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｅ）それぞれ、配列番号３、２６および４９で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号７２、９５および１１８で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｆ）それぞれ、配列番号４、２７および５０で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号７３、９６および１１９で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｇ）それぞれ、配列番号５、２８および５１で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号７４、９７および１２０で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｈ）それぞれ、配列番号６、２９および５２で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号７５、９８および１２１で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｉ）それぞれ、配列番号７、３０および５３で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号７６、９９および１２２で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｊ）それぞれ、配列番号９、３２および５５で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号７８、１０１および１２４で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｋ）それぞれ、配列番号１０、３３および５６で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号７９、１０２および１２５で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｌ）それぞれ、配列番号１１、３４および５７で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号８０、１０３および１２６で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｍ）それぞれ、配列番号１２、３５および５８で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号８１、１０４および１２７で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｎ）それぞれ、配列番号１３、３６および５９で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号８２、１０５および１２８で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｏ）それぞれ、配列番号１４，３７および６０で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号８３、１０６、１２９で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｐ）それぞれ、配列番号１５、３８および６１で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号８４、１０７および１３０で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｑ）それぞれ、配列番号１６、３９および６２で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号８５、１０８および１３１で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｒ）それぞれ、配列番号１８、４１および６４で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号８７、１１０および１３３で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｓ）それぞれ、配列番号１９、４２および６５で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号８８、１１１および１３４で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｔ）それぞれ、配列番号２０、４３および６６で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号８９、１１２および１３５で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｕ）それぞれ、配列番号２１、４４および６７で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号９０、１１３および１３６で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、
（ｖ）それぞれ、配列番号２２、４５および６８で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号９１、１１４および１３７で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、および
（ｗ）それぞれ、配列番号２３、４６および６９で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号９２、１１５および１３８で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ。
（５６）それぞれ、配列番号１７、４０および６３で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号８６、１０９および１３２で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬを含む、前記（５５）の結合剤。
（５７）それぞれ、配列番号８、３１および５４で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号７７、１００および１２３で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬを含む、前記（５５）の結合剤。
（５８）前記（５６）の結合剤と、
それぞれ、配列番号８、３１および５４で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、およびそれぞれ、配列番号７７、１００および１２３で規定されるＣＤＲ１、２および３を含むＶＬを含む結合剤と、を含む組成物。
【００６９】
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【図１】
0006629321.tif 000009
【図２】
0006629321.tif 000010
【図３】
0006629321.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
0006629321.tif 000014
【図６ｂ】
0006629321.tif 000015
【図７】
0006629321.tif 000016
【図８】
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