(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンＡ１の重鎖遺伝子によってコードされるポリペプチドのヒンジ領域におけるガラクトースが結合していないセリン／スレオニン結合型糖鎖（以下、糖鎖異常ＩｇＡ１）を特異的に認識し、当該糖鎖異常ＩｇＡ１と結合するモノクローナル抗体を用いて、抗体組織染色により、腎炎患者由来の腎組織に沈着する糖鎖異常ＩｇＡ１を検出することを特徴とする、ＩｇＡ腎症及び紫斑病性腎炎と他の腎炎との鑑別のための検出方法。
【請求項２】
前記他の腎炎が、ループス腎炎、関節リウマチ、セリアック病、肝硬変に伴う腎炎、ＨＣＶ関連腎炎及びＨＩＶ腎症から選ばれる腎炎である請求項１記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の腎炎のうち、ＩｇＡ腎症と紫斑病性腎炎と他の腎炎とを区別して鑑別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＡ腎症は、世界で最も頻度の高い原発性糸球体腎炎で、約３０〜４０％は末期腎不全に至る予後不良の疾患である。ＩｇＡ腎症は、このように予後不良であることから、確定診断及び定義は極めて重要である。最近、ＩｇＡ腎症は、血尿、蛋白尿等の尿所見を呈し、優位なＩｇＡ沈着を糸球体に認め、その原因となり得る基礎疾患が認められないものである、と定義されるようになった（非特許文献１）。
【０００３】
このように定義されていることからもわかるように、ＩｇＡ腎症の診断には腎組織所見が必須である。糸球体のＩｇＡ沈着部位は主にメサンギウム領域で、多くはＣ３の沈着を同時に認める。一方で、ＩｇＡ腎症では、腎糸球体にＩｇＡが優位に沈着することが定義とされているものの、ＩｇＧやＩｇＭ、あるいは両者が沈着するケースなど、多様性に富む疾患であることも知られている。
【０００４】
近年、腎生検をすることなくＩｇＡ腎症を診断する試みが検討され、免疫グロブリンＡ１の重鎖遺伝子によってコードされるポリペプチドのヒンジ領域におけるガラクトースが結合していないセリン／スレオニン結合型糖鎖（以下、糖鎖異常ＩｇＡ１）を特異的に認識し、当該糖鎖異常ＩｇＡ１と結合するモノクローナル抗体を用いて、血中の糖鎖異常ＩｇＡ１を測定することが可能となった。血中糖鎖異常ＩｇＡ１、また血中糖鎖異常ＩｇＡ１に対する自己抗体、免疫複合体などを組み合わせてＩｇＡ腎症を診断する方法が報告された（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０８１１８９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】エビデンスに基づくＩｇＡ腎症診療ガイドライン２０１４
【非特許文献２】Pediatr Nephrol 25:19-26, 2010
【非特許文献３】Nephrol Dial Transplant, 30:1315-21, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
血中の糖鎖異常ＩｇＡ１は、ＩｇＡ腎症だけでなく紫斑病性腎炎（ＨＳＰＮ）でも有意に高値を示すが、その他の腎炎患者や健常者と同等の値を示す症例もある（非特許文献２、３）。紫斑病性腎炎は、ＩｇＡ腎症と同様に腎糸球体メサンギウム領域にＩｇＡ優位の沈着が認められ、組織学的にはＩｇＡ腎症と鑑別が困難であるだけではなく、感染を契機に尿所見異常が悪化すること、糖鎖異常ＩｇＡ１の産生亢進など、病態もＩｇＡ腎症と極めて類似している。しかし、ＨＳＰＮは紫斑を先行所見とすることから、臨床上ＨＳＰＮとＩｇＡ腎症の鑑別は可能である。腎生検組織上、ＩｇＡ腎症と鑑別が困難な疾患として、ループス腎炎、関節リウマチ、セリアック病、肝硬変に伴うもの、HCV関連腎炎、HIV腎症などが挙げられる。
【０００８】
従って、本発明の課題は、ＩｇＡ腎症及び紫斑病性腎炎と他の腎炎との新たな鑑別方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで本発明者は、ＩｇＡ腎症及び紫斑病性腎炎と他の類似する腎炎とを明確に鑑別する手法を見出すべく検討した結果、糖鎖異常ＩｇＡ１に特異的なモノクローナル抗体を用いて、血中でなく、腎炎患者の腎組織に沈着する糖鎖異常ＩｇＡ１を検出すれば、ＩｇＡ腎症及び紫斑病性腎炎と他の腎炎とが明確に区別できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、次の〔１〕及び〔２〕を提供するものである。
【００１１】
〔１〕糖鎖異常ＩｇＡ１を特異的に認識し、当該糖鎖異常ＩｇＡ１と結合するモノクローナル抗体又はその断片を用いて、腎炎患者由来の腎組織に沈着する糖鎖異常ＩｇＡ１を検出することを特徴とする、ＩｇＡ腎症及び紫斑病性腎炎と他の腎炎との鑑別方法。
〔２〕腎炎患者由来の腎組織に沈着する糖鎖異常ＩｇＡ１の検出が、抗体組織染色である〔１〕記載の鑑別方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明方法によれば、腎生検組織にてＩｇＡ腎症と鑑別が困難であった、ループス腎炎、関節リウマチ、セリアック病、肝硬変に伴うもの、HCV関連腎炎、HIV腎症等が、ＩｇＡ腎症及び紫斑病性腎炎と明確に鑑別できる。従って、早期に正確な治療計画を立てることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】血中の糖鎖異常ＩｇＡ１の検出結果を示す図である。
【図２】腎組織への糖鎖異常ＩｇＡ１の沈着を検出した結果を示す。
【図３】腎組織への糖鎖異常ＩｇＡ１の沈着を検出した結果を示す。
【図４】腎組織への糖鎖異常ＩｇＡ１の沈着を検出した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明方法に用いられるモノクローナル抗体は、免疫グロブリンＡ１の重鎖遺伝子によってコードされるポリペプチド（ＩｇＡ１重鎖）のヒンジ領域におけるガラクトースが結合していないセリン／スレオニン結合型糖鎖（糖鎖異常ＩｇＡ１）を特異的に認識し、当該糖鎖異常ＩｇＡ１と結合するモノクローナル抗体である。このようなモノクローナル抗体の例としては、ＷＯ２０１１／０８１１８９に記載のモノクローナル抗体が挙げられる。
【００１５】
前記糖鎖異常ＩｇＡ１が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン−セリン／スレオニン（以下、Ｔｎ抗原）又はシアリルＴｎ抗原から選ばれる糖鎖異常ＩｇＡ１であるのが好ましい。
【００１６】
ＩｇＡ１重鎖のアミノ酸配列を配列番号１に示す。ヒンジ領域は、配列番号１のVPSTPPTPSPSTPPTPSPSである（Mol Cell Proteomics 9: 2545-2557, 2010）。
【００１７】
さらに具体的には、ハイブリドーマＫＭ４１３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２１４）、ＫＭ４１４０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２１５）、ＫＭ４１４４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２１６）及びＫＭ５５から選ばれるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が好ましい。
【００１８】
これらのモノクローナル抗体は、ＷＯ２０１１／０８１１８９に記載の方法により製造することができる。
【００１９】
前記モノクローナル抗体は、遺伝子組み換え抗体であってもよく、さらにヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる抗体であってもよい。
【００２０】
前記モノクローナル抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片が挙げられる。
【００２１】
本発明においては、前記のモノクローナル抗体を用いて、腎炎患者由来の腎組織に沈着する糖鎖異常ＩｇＡ１を検出する。腎炎患者としては、ＩｇＡ腎症や紫斑病性腎炎を含む急性又は慢性の糸球体腎炎、すなわち溶連菌感染後糸球体腎炎、膜性腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、ANCA関連腎炎、ループス腎炎、関節リウマチ、セリアック病、肝硬変に伴うもの、HCV関連腎炎、HIV腎症等が挙げられる。腎炎患者由来の腎組織としては、腎炎患者の腎臓から採取した組織が用いられる。
【００２２】
腎炎患者由来の腎組織に沈着する糖鎖異常ＩｇＡ１を検出する手段としては、前記モノクローナル抗体を用いる抗体組織染色法が好ましい。より具体的には、腎組織と前記モノクローナル抗体を反応させた後、ＦＩＴＣなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、ビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体又は結合断片を反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡する方法が挙げられる。
【００２３】
腎組織に糖鎖異常ＩｇＡ１の沈着が認められる場合には、ＩｇＡ腎症又は紫斑病性腎炎と鑑別できる。一方、腎組織に糖鎖異常ＩｇＡ１の沈着が認められない場合には、ＩｇＡ腎症及び紫斑病性腎炎以外の腎炎と鑑別できる。
従来の腎組織へのＩｇＡの沈着では、ＩｇＡ腎症及び紫斑病性腎炎以外の腎炎、例えば、ループス腎炎、関節リウマチ、セリアック病、肝硬変に伴うもの、ＨＣＶ関連腎炎、ＨＩＶ腎症等も陽性になるが、本発明によればＩｇＡ腎症及び紫斑病性腎炎と他の腎炎とが正確に鑑別できる。
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００２５】
参考例１
（血中の糖鎖異常ＩｇＡ１測定）
血中糖鎖異常ＩｇＡ１値は、ＫＭ５５を用いたＥＬＩＳＡ法により測定する。まず９６ｗｅｌｌのＥＬＩＳＡプレートにＫＭ５５を固相化する。１％のBovine serum albumin（ＢＳＡ）ＰＢＳ溶液にてブロッキング後に、血清サンプルを反応させる。ペルオキシダーゼ標識の抗ヒトＩｇＡ１抗体で同定する（Nephrol Dial Transplant. 30: 1315-1321, 2015）。
【００２６】
その結果を図１に示す。図１の結果から、ＩｇＡ腎症であっても血中の糖鎖異常ＩｇＡ１陰性の患者もあり、一方血中の糖鎖異常ＩｇＡ１陽性であっても他の腎炎患者である例も存在する。
【００２７】
実施例１
（腎組織の糖鎖ＩｇＡ１沈着の測定）
パラフィンブロックの腎生検組織を３μｍに薄切し、プレパラートにサンプルをのせ、脱パラフィンを行う。５分間、流水洗浄後、プロテアーゼ溶液：Protease from Bacillus licheniformis（ＳＩＧＭＡ  Ｐ５３８０）を用いて室温２時間で抗原賦活処理を行う。５分間、流水洗浄後、Protein Block Serum Free(Dako X090930)を用いて室温３０分でブロッキングする。ＫＭ５５抗体を抗体希釈液：REAL Antibody Diluent（Dako S2022）を用いて１００μｇ／ｍｌに希釈して反応させる（３７℃、３０分）。０．０５％Ｔｗｅｅｎ＋ＰＢＳ溶液（ＰＢＳ−Ｔ）にて３回洗浄後、Alexa Fluor 555 Goat anti-Rat IgG (Invitrogen A21434)を１０００倍希釈で反応させる（３７℃、３０分）。ＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄後、プレパラートに封入剤を用いてカバーガラスをかける。
【００２８】
その結果を図２〜図４に示す。図２〜図４から明らかなように、本発明のモノクローナル抗体を用いて腎組織への糖鎖異常ＩｇＡ１の沈着を検出すれば、ＩｇＡ腎症と紫斑病性腎炎と他の腎炎が正確に鑑別できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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