(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＦ１ヘリカーゼが有するＮＴＰ分解酵素活性を阻害する化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物を有効成分として含むプラス鎖ＲＮＡウイルス複製阻害剤であって、
前記化合物が、
２−｛４−［（１Ｚ）−２−クロロ−２−（５−クロロベンズイミダゾール−２−イル）ビニル］−２−メトキシフェノキシ｝酢酸、
２−｛４−［（５−イミノ−７−オキソ−３−フェニル（４−ヒドロ−１，３−チアゾリノ［３，２−ａ］ピリミジン−６−イリデン））メチル］−２−メトキシフェノキシ｝酢酸、
２−｛４−［（１Ｚ）−２−（３−シクロヘキシル（７Ｈ−１，２，４−トリアゾロ［３，４−ｂ］１，３，４−チアジアジン−６−イル））−２−（エトキシカルボニル）ビニル］フェノキシ｝酢酸、
２−［４−（｛１−［（４−クロロフェニル）メチル］−２，５−ジオキソ（１，３−ジアゾリジン−４−イリデン）｝メチル）−２−メトキシフェノキシ］酢酸、又は
４−｛［６−メチル−５−（４−メチルフェニル）−４−オキソ−３−ヒドロチオフェノ［２，３−ｄ］ピリミジン−３−イル］メチル｝安息香酸、
のいずれかであり、
前記プラス鎖ＲＮＡウイルスが、トマトモザイクウイルスであることを特徴とする
プラス鎖ＲＮＡウイルス複製阻害剤。
【請求項２】
ＳＦ１ヘリカーゼが有するＮＴＰ分解酵素活性を阻害する化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物を有効成分として含むプラス鎖ＲＮＡウイルス複製阻害剤であって、
前記化合物が、
４−｛［６−メチル−５−（４−メチルフェニル）−４−オキソ−３−ヒドロチオフェノ［２，３−ｄ］ピリミジン−３−イル］メチル｝安息香酸
であり、
前記プラス鎖ＲＮＡウイルスが、ブタコロナウイルスであることを特徴とするプラス鎖ＲＮＡウイルス複製阻害剤。
【請求項３】
ＳＦ１ヘリカーゼが有するＮＴＰ分解酵素活性を阻害する化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物を有効成分として含むプラス鎖ＲＮＡウイルス複製阻害剤であって、
前記化合物が、
２−｛４−［（１Ｚ）−２−クロロ−２−（５−クロロベンズイミダゾール−２−イル）ビニル］−２−メトキシフェノキシ｝酢酸
であり、
前記プラス鎖ＲＮＡウイルスが、風疹ウイルスであることを特徴とするプラス鎖ＲＮＡウイルス複製阻害剤。
【請求項４】
ＳＦ１ヘリカーゼが有するＮＴＰ分解酵素活性を阻害する化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物を有効成分として含むプラス鎖ＲＮＡウイルス複製阻害剤であって、
前記化合物が、
２−｛４−［（５−イミノ−７−オキソ−３−フェニル（４−ヒドロ−１，３−チアゾリノ［３，２−ａ］ピリミジン−６−イリデン））メチル］−２−メトキシフェノキシ｝酢酸、又は
２−｛４−［（１Ｚ）−２−（３−シクロヘキシル（７Ｈ−１，２，４−トリアゾロ［３，４−ｂ］１，３，４−チアジアジン−６−イル））−２−（エトキシカルボニル）ビニル］フェノキシ｝酢酸
のいずれかであり、
前記プラス鎖ＲＮＡウイルスが、ヒトＥ型肝炎ウイルスであることを特徴とするプラス鎖ＲＮＡウイルス複製阻害剤。
【請求項５】
請求項１に記載のプラス鎖ＲＮＡウイルス複製阻害剤を有効成分として含む、ＳＦ１ヘリカーゼを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスによる感染症の治療及び／又は予防に有用な農薬又は農薬組成物。
【請求項６】
請求項２乃至請求項４のいずれかに記載のプラス鎖ＲＮＡウイルス複製阻害剤を有効成分として含む、ＳＦ１ヘリカーゼを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスによる、動物に対する感染症の治療及び／又は予防に有用な医薬又は医薬組成物。
【請求項７】
請求項３又は請求項４に記載のプラス鎖ＲＮＡウイルス複製阻害剤を有効成分として含み、前記プラス鎖ＲＮＡウイルスによる感染症がヒトに対する感染症であることを特徴とする、請求項６に記載の医薬又は医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トマトモザイクウイルス、風疹ウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス及びヒトＥ型肝炎ウイルスを含むプラス鎖ＲＮＡウイルスに対する複製阻害剤に関する。特に、トマトモザイクウイルスなどが有するＳＦ１ヘリカーゼの有するＮＴＰ（ヌクレオチド３リン酸）分解酵素活性に対する阻害活性をもつ化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物を有効成分として含有するプラス鎖ＲＮＡウイルス複製阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに、ヒト単純ヘルペスウイルス、ヒト後天性免疫不全症候群ウイルス（ＨＩＶ）やインフルエンザウイルスの複製を阻害する薬剤が開発され、該ウイルスによる感染を防除するための薬剤として実用化されている。しかし、上記以外のウイルスによる感染を防除するための薬剤の開発は十分に進んでいない。例えば、植物ウイルスの感染に対しては、宿主に影響を与えず、ウイルス複製のみを抑える有効な薬剤が無いことから、ウイルス感染を根本的に抑制する手段がなく、現時点では、ウイルスを媒介する生物等の駆除や土壌の消毒、ウイルス抵抗性遺伝子を植物に導入するなどの対策がとられている。しかしながら、媒介生物の駆除や土壌の消毒には、多額の費用が必要となり経済的損失が大きく、環境への負荷が甚大である。また、遺伝子を組み換える手法においては、遺伝子組換作物の安全性への懸念があり、実用的な方法であるとまでは言いがたい。ブタ流行性下痢ウイルスなどを始めとする動物ウイルスに関しても有効な薬剤はほとんどなく、現時点では感染の早期診断、隔離、殺処分などの摘発淘汰や徹底的な消毒、ワクチンによる予防などの対策が取られている。しかしながら、摘発淘汰では多大な労力が必要とされること、また動物保護の観点からも好ましいとは言いがたい。また、過剰な消毒は植物ウイルスの場合と同様に環境への負荷が懸念される。ワクチン接種による予防では、ウイルスの変異のため従来のワクチンが無効であったり、そもそも有効なワクチンが無いウイルスも多く、ワクチンによる防疫が行えない場合も多い。
【０００３】
トバモウイルス（Ｔｏｂａｍｐｖｉｒｕｓ）の一種であるトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）は、トマトモザイク病を引き起こす病原プラス鎖ＲＮＡウイルスであり、分類上はプラス鎖ＲＮＡウイルスに属する。一般に、プラス鎖ＲＮＡウイルスは真核生物等の宿主細胞に進入し、脱外被を経てゲノムＲＮＡが翻訳され、複製を司る複製タンパク質が合成された後、該複製タンパク質は複製鋳型となる自身のゲノムＲＮＡを生体膜上にリクルートし、宿主因子と共に複製複合体を形成、マイナス鎖ＲＮＡを経てプラス鎖ＲＮＡを複製することが知られている。
【０００４】
更に、ＴｏＭＶゲノムにはヘリカーゼドメインがコードされている。ヘリカーゼとは核酸のリン酸エステル骨格に沿って動きながら絡み合う核酸をほどく酵素の総称であり、該ヘリカーゼドメインがＮＴＰ加水分解酵素活性を有し、該ＮＴＰ分解酵素活性がヘリカーゼ活性（塩基間の水素結合を解消し、ＤＮＡの二重らせんや二次構造を取ったＲＮＡなどをほどく働き）にとって必須であること、そして、該ヘリカーゼドメインは、ウイルス複製に必要な宿主因子（低分子量ＧＴＰａｓｅ タンパク質ＡＲＬ８(非特許文献１) や膜タンパク質ＴＯＭ１ (非特許文献２)等）との相互作用に重要な役割を果たすことで該ウイルスの複製に必須であることが既に明らかとなっている。この為、該ヘリカーゼドメインをターゲットとし、該ヘリカーゼ活性又はＮＴＰａｓｅ活性を阻害する化合物を見出すことが出来れば、該化合物はプラス鎖ＲＮＡウイルス複製阻害剤になりうることが期待される。
【０００５】
一般に、ヘリカーゼは立体構造の類似性と保存されているアミノ酸モチーフの相同性からスーパーファミリー（ＳＦ）１からＳＦ６の６種類に分類される（非特許文献３）が、この内、ウイルスのコードしているヘリカーゼドメインはＳＦ１からＳＦ３の３種類である（例えば非特許文献４）。
ＳＦ２をコードするウイルスにはデングウイルスやＣ型肝炎ウイルスなどが知られており、その構造を基盤とした薬剤開発が進められつつある（非特許文献５）。ＳＦ３をコードするウイルスとしてはパピローマウイルスなどがある。これらの立体構造もすでに解明されている（非特許文献６）。これらに対し、ＳＦ１については、ＴｏＭＶをはじめとする多くの植物ウイルスや動物ウイルスとしてコロナウイルス、風疹ウイルス等がコードしていると予想されているものの、その立体構造は解明されていなかった（非特許文献７）。
【０００６】
発明者らは、２０１２年に世界で初めてトマトモザイクウイルスがコードするＳＦ１ヘリカーゼ (ＴｏＭＶ−Ｈｅｌ)の立体構造決定に成功している（非特許文献７）。それにより明らかにされたＴｏＭＶ−Ｈｅｌの立体構造、および、ＴｏＭＶ−Ｈｅｌのアミノ酸配列とコロナウイルスをはじめとする各種プラス鎖ＲＮＡウイルスが有するヘリカーゼのアミノ酸配列との比較から、これらプラス鎖ＲＮＡウイルスが有するＳＦ１ヘリカーゼのＮＴＰ結合部位の立体構造がＴｏＭＶ−Ｈｅｌのそれと類似していることが推測されていた。
【０００７】
しかし、これまでにＴｏＭＶやコロナウイルスをはじめとする各種プラス鎖ＲＮＡウイルスに対する複製阻害剤の開発は報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｎｉｓｈｉｋｉｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．７：ｅ１００２４０９
【非特許文献２】Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）ＰＮＡＳ  ９７：１０１０７
【非特許文献３】Ｓｈｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｍｅ  ７６：２３
【非特許文献４】Ｋｏｏｎｉｎ  ａｎｄ  Ｄｏｌｊａ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌｅ  Ｂｉｏｌ  ２８：３７５
【非特許文献５】Ｋｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４２：１７１
【非特許文献６】Ｎｏｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ  ８９：２０４
【非特許文献７】Ｎｉｓｈｉｋｉｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６：７５６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記事情に鑑み、本発明は、トマトモザイクウイルスなどが有するＳＦ１ヘリカーゼドメインのＮＴＰ分解酵素活性を阻害する阻害剤の提供を目的とする。
さらに、本発明は、「ＳＦ１ヘリカーゼ」の阻害剤を有効成分として含む、該ＳＦ１ヘリカーゼを有するウイルスによる感染症の治療及び／又は予防に有用な医薬、あるいは農薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ＴｏＭＶ−ＨｅｌのＮＴＰ分解酵素活性を特異的に阻害することができれば、該タンパク質のヘリカーゼ活性を阻害することができ、従って、該ヘリカーゼをコードするウイルスの複製を阻害することができる。上述の立体構造解析の結果、ＴｏＭＶ−ＨｅｌにおけるＮＴＰの結合部位の立体構造が明らかとなっている。
発明者らは、ＴｏＭＶが有するＳＦ１ヘリカーゼの立体構造情報に基づき、コンピューターシミュレーションによって、該ＮＴＰ結合部位に特異的に結合する活性を有する可能性がある低分子有機化合物約３００種類を選抜した。該選抜された化合物の、ＴｏＭＶの複製を阻害する活性及びＴｏＭＶ−Ｈｅｌが有するＮＴＰ加水分解酵素活性を阻害する活性を調べた結果、５種類の有機化合物がＴｏＭＶの複製を阻害する活性を有することを見出した。さらに、発明者らは、これら化合物が、ＳＦ１ヘリカーゼをコードする風疹ウイルス等のプラス鎖ＲＮＡウイルスに対して複製阻害活性を有することを見出した。これらの結果に基づき、発明者らは、各種プラス鎖ＲＮＡウイルスに対する新規の複製阻害剤の発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、ＳＦ１ヘリカーゼが有するＮＴＰ分解酵素活性を阻害する化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物を有効成分として含むプラス鎖ＲＮＡウイルス複製阻害剤である。
より具体的には、本発明は、下記一般式（１）
【化１】
0006630887.tif 000002
[式（１）中、Ｘはメトキシ基又は直接結合を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、メトキシ基、エトキシ基、フッ素原子、塩素原子又は臭素原子を示し、Ｒ３はメチル基、エチル基、エテニル基、式（２）で表される置換基
【化２】
0006630887.tif 000003
（式（２）中、Ａ１は水素原子、メチル基、フッ素原子、塩素原子又は臭素原子を示し、Ａ２は水素原子、メチル基、３−オキソエチル基、３−オキソプロピル基、フッ素原子、塩素原子又は臭素原子を示し、Ａ３は任意の置換基を示し、好ましくはＡ２及びＡ３は、それぞれ独立して、塩素原子、式（３）〜（５）で表される置換基
【化３】
0006630887.tif 000004
【化４】
0006630887.tif 000005
【化５】
0006630887.tif 000006
のいずれかであり、更に好ましくは、Ａ２が塩素原子の場合は、Ａ３は式（３）で表される置換基であり、Ａ２が式（４）で表される置換基の場合は、Ａ３は式（５）で表される置換基であり、さらにＡ２とＡ３は共同して縮合環を形成していてもよく、該縮合環は、好ましくは、式（６）又は（７）で表される置換基
【化６】
0006630887.tif 000007
【化７】
0006630887.tif 000008
である。なお、式（６）及び（７）中において波線を重ねて記載した二重線部分は式（２）においてＡ２及びＡ３が結合している二重結合を示す。）、
又は下記一般式（８）で表される置換基
【化８】
0006630887.tif 000009
（式（８）中、Ｙは炭素原子又は窒素原子を示し、Ｂ１及びＢ２はそれぞれ任意の置換基を示し、さらにＢ１とＢ２は共同して縮合環を形成していてもよく、好ましくは、式（９）で表される置換基
【化９】
0006630887.tif 000010
である）、
を示す] で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物を有効成分として含むプラス鎖ＲＮＡウイルス複製阻害剤である。
【００１２】
また、本発明は、上記一般式（１）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物を有効成分として含むＳＦ１ヘリカーゼを有するウイルスによる、動物に対する感染症の治療及び／又は予防に有用な医薬若しくは医薬組成物であり、動物として、好ましくはヒト、ブタ、ウマなどが挙げられる。
【００１３】
さらに、本発明は、上記一般式（１）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物を有効成分として含む、ＳＦ１ヘリカーゼを有するウイルスによる感染症の治療及び／又は予防に有用な農薬若しくは農薬組成物である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の化合物は、ＳＦ１ヘリカーゼを有するウイルスの複製を阻害することができる。その結果、本発明の化合物を用いれば、ＳＦ１ヘリカーゼを有するウイルスの感染症の予防及び／又は治療を行うことが可能となる。
【００１５】
また、本発明の化合物及びこれを薬学的有効成分として含有する、動物に対する医薬、又は農薬は、ＳＦ１ヘリカーゼを有するウイルスの、動物又は植物の感染症の予防及び／又は治療のために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】インシリコスクリーニングの流れ。
【図２】試験管内ＴｏＭＶ  ＲＮＡ複製系を用いたＴｏＭＶ複製阻害活性評価。
【図３】等温滴定型カロリメトリーを用いたＡＴＰ加水分解酵素阻害活性評価。
【図４】ブタ豚流行性下痢ブタコロナウイルス（ＰＥＤＶ）複製阻害活性の評価。
【図５】風疹ウイルス複製阻害活性の評価。
【図６】ヒトＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）複製阻害活性の評価。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一般式（１）において、Ｘはメトキシ基又は直接結合を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立して水素原子、メトキシ基、エトキシ基、フッ素原子、塩素原子又は臭素原子を示し、Ｒ３はメチル基、エチル基、エテニル基、式（２）で表される置換基（式（２）中、Ａ１は水素原子、メチル基、フッ素原子、塩素原子又は臭素原子を示し、Ａ２は水素原子、メチル基、３−オキソエチル基、３−オキソプロピル基、フッ素原子、塩素原子又は臭素原子を示し、Ａ３は任意の置換基を示し、好ましくはＡ２及びＡ３はそれぞれ独立して塩素原子、式（３）〜（５）で表される置換基のいずれかであり、更に好ましくは、Ａ２が塩素原子の場合は、Ａ３は式（３）で表される置換基であり、Ａ２が式（４）で表される置換基の場合は、Ａ３は式（５）で表される置換基であり、さらにＡ２とＡ３共同して縮合環を形成していてもよく、該縮合環は、好ましくは、式（６）又は（７）で表される置換基である。なお、式（６）及び（７）中において波線を重ねて記載した二重線部分は式（２）においてＡ２及びＡ３が結合している二重結合を示す。）、又は下記一般式（８）で表される置換基（式（８）中、Ｙは炭素原子又は窒素原子を示し、Ｂ１及びＢ２はそれぞれ独立して任意の置換基を示し、さらにＢ１とＢ２は共同して縮合環を形成していてもよく、好ましくは、式（９）で表される置換基である）を示す。
また、本発明に係るＳＦ１ヘリカーゼを有するウイルスの複製阻害剤及び医薬の有効成分として含まれる一般式（１）で表される化合物には、特に断らない限り、その互変異性体、幾何異性体（例えば、Ｅ体、Ｚ体など）、鏡像異性体等の立体異性体も含まれる。
【００１８】
一般式（１）で示される化合物及びその塩としては、限定はしないが、例えば次のものが挙げられる。
２−｛４−［（１Ｚ）−２−クロロ−２−（５−クロロベンズイミダゾール−２−イル）ビニル］−２−メトキシフェノキシ｝酢酸（化合物Ａ）およびその許容される塩、
２−｛４−［（５−イミノ−７−オキソ−３−フェニル（４−ヒドロ−１，３−チアゾリノ［３，２−ａ］ピリミジン−６−イリデン））メチル］−２−メトキシフェノキシ｝酢酸（化合物Ｂ）およびその許容される塩、
２−｛４−［（１Ｚ）−２−（３−シクロヘキシル（７Ｈ−１，２，４−トリアゾロ［３，４−ｂ］１，３，４−チアジアジン−６−イル））−２−（エトキシカルボニル）ビニル］フェノキシ｝酢酸（化合物Ｃ）およびその許容される塩、
２−［４−（｛１−［（４−クロロフェニル）メチル］−２，５−ジオキソ（１，３−ジアゾリジン−４−イリデン）｝メチル）−２−メトキシフェノキシ］酢酸（化合物Ｄ）およびその許容される塩、
４−｛［６−メチル−５−（４−メチルフェニル）−４−オキソ−３−ヒドロチオフェノ［２，３−ｄ］ピリミジン−３−イル］メチル｝安息香酸（化合物Ｅ）およびその許容される塩。
【００１９】
本発明の一般式（１）で表わされる化合物は、市販されているものを購入することができ、例えば、Ｅｎａｍｉｎ社、ＭｏｌＰｏｒｔ社、ナミキ商事等からの市販品を使用することができる。
【００２０】
本発明の好ましい態様によれば、一般式（１）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物を有効成分として含有するプラス鎖ＲＮＡウイルス複製阻害剤が提供される。さらに、本発明の他の好ましい態様によれば、一般式（１）で表される化合物を薬理学的に有効な成分として含有する、ＳＦ１ヘリカーゼを有するウイルスによる感染症の予防及び／又は治療のための、動物に対する医薬若しくは医薬組成物、又は、農薬若しくは農薬組成物が提供される。
【００２１】
本発明におけるＳＦ１ヘリカーゼとは、モチーフIIIとしてＧＤｘｘＱ、モチーフVとしてＴ／ＳｘｘｘｘＱ／ＫＧ（ｘはどのアミノ酸でも可）の特徴と有するもので、ＳＦ１ヘリカーゼをその複製に必須の因子として持つウイルスとしては、例えば、植物ウイルスとしてタバコラットルウイルス、タバコモザイクウイルス、タバコマイルドグリーンウイルス、カブ黄斑モザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、ビート黄化ウイルス、ジャガイモＸウイルス、ムギ類萎縮ウイルス、動物ウイルスとしてブタ流行性下痢ウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、ネコ腹膜炎ウイルス、マウス肝炎ウイルスなどを含むコロナウイルス、風疹ウイルスを含むトガウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、を例示することができる。詳細については非特許文献４を参照のこと。
【００２２】
本発明の医薬の治療対象は、ＳＦ１ヘリカーゼをその複製の必須の因子として有するウイルスが感染するものであれば、いかなる動物であってもよい。あえて例示するならば、ブタ流行性下痢ウイルス、ネコ腹膜炎ウイルス、マウス肝炎ウイルスなどが感染する非ヒト動物、風疹ウイルスなどが感染するヒト、そして人畜共通感染症と言われるＥ型肝炎、ウマ脳炎ウイルスなどが感染するヒトおよび非ヒト動物が、本発明の医薬の治療対象となり、好ましくは、ブタ流行性下痢ウイルスなどにおけるブタ、又は風疹ウイルスなどにおけるヒトである。
また、本発明の農薬による病害防除の対象は、いかなる植物であってもよいが、例えば、トマトモザイクウイルスが感染するトマト、タバコラットルウイルス、タバコモザイクウイルス、タバコマイルドグリーンウイルスなどが感染するタバコ、ムギ類萎縮ウイルスが感染するムギなどを挙げることができる。
【００２３】
本発明の医薬の有効成分としては、上記一般式（１）で表される化合物のほか、生理学的に許容されるその塩を用いてもよい。塩としては、例えば、酸性基が存在する場合には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ金属及びアルカリ土類金属塩；アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｌ−グルカミン等のアミンの塩；又はリジン、δ− ヒドロキシリジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸との塩を形成することができる。塩基性基が存在する場合には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸の塩；メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸塩、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、乳酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、サリチル酸等の有機酸との塩；又はアスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸との塩などを挙げることができる。
さらに、本発明の医薬の有効成分として、一般式（１）で表される化合物又はその塩の溶媒和物若しくは水和物を用いることもできる。
【００２４】
本発明の医薬は、有効成分である一般式（１）で表される化合物及び薬理学的に許容されるその塩、又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物自体を投与してもよいが、一般的には、有効成分である一般式（１）で表される化合物の他、１又は２以上の製剤用添加物を含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。動物を治療対象とする本発明の医薬の有効成分としては、上記の物質の２種以上を組み合わせて用いることができ、上記医薬組成物には、他のウイルス感染症の治療薬の有効成分を配合することも可能である。
【００２５】
医薬組成物の種類は特に限定されず、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の化合物を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水或いはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。経口投与用又は非経口投与用の任意の製剤形態で提供される。例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤又は液剤等の形態の経口投与用医薬組成物、静脈内投与用、筋肉内投与用、若しくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤などの形態の非経口投与用医薬組成物として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。また、高分子などで被覆した徐放製剤を脳内に直接投与することも可能である。
【００２６】
医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、又は医薬組成物の製造方法は、組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機又は有機物質、或いは固体又は液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して１重量％から９０重量％の間で配合することができる。具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
【００２７】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸− メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、或いはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま或いはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
【００２８】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０ 、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００２９】
直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。
【００３０】
皮膚用外用剤を製造するには、有効成分を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加えて必要ならば加湿して練合し軟膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合した後ポリアルキルなどの不織布に展延してテープ剤とする。
【００３１】
本発明の医薬の投与量及び投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止及び／又は治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。一般的には、経口投与における成人一日あたりの投与量は０．０１〜１０００ｍｇ（有効成分重量）程度であり、一日１回又は数回に分けて、あるいは数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して一日量０．００１〜１００ｍｇ（有効成分重量）を連続投与又は間欠投与することが望ましい。
【００３２】
本発明の医薬は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。例えば、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な担体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。
【００３３】
さらに、本発明は、本発明の医薬を用いたウイルス感染症の予防又は治療方法を提供する。
本発明のウイルス感染症の予防方法には、ＳＦ１ヘリカーゼを有するウイルスに感染するおそれのある動物に本発明の医薬又は医薬組成物を投与し、該ウイルス感染に起因する症状の発症を抑制することが含まれる。また、本発明のウイルス感染症の治療方法には、ＳＦ１ヘリカーゼを有するウイルスに感染した動物に本発明の医薬又は医薬組成物を投与し、該ウイルス感染に起因する症状の進行および悪化を阻止または緩和することが含まれる。
【００３４】
予防又は治療の対象となる「動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。
【００３５】
本出願において、農薬とは、特別な意味に用いるものではなく、農作物（樹木及び農林産物を含む）に感染するウイルス等の防除に用いられる薬剤のことである。
本発明の農薬は、有効成分である一般式（１）で表される化合物及び薬理学的に許容されるその塩、又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物自体を投与してもよいが、一般的には、有効成分である一般式（１）で表される化合物の他、１又は２以上の農薬製剤用添加物を含む農薬組成物の形態で散布等してもよく、または、肥料成分と混合して用いてもよい。農薬製剤または肥料等として用いる場合、他の成分、例えば、界面活性剤、乳化剤、増量剤、保湿剤等と共に混合してもよい。農薬または肥料混合物として用いる場合、剤型は特に限定されないが、液剤、水溶剤、粉剤、粒剤、水和剤、乳剤、フロアブル剤、マイクロカプセル剤等にすることができる。使用方法としては、これらをそのまま、又は水で希釈し散布する方法が挙げられる。
【００３６】
本発明の農薬又は農薬組成物は、チッソ、リン酸、カリウムの３要素を含む複合肥料と混合して製剤化し、治療対象の植物に対し散布することにより、ウイルス感染症の治療を行うことができる。また、葉面散布肥料（液状又は粉末状の複合肥料）等を用いて混合製剤に加工し、これらを水に溶解して作物の葉面に直接散布することにより病害防除と施肥を同時に行うことができる。さらに、マンガン、ホウ素、鉄、銅、亜鉛、モリブデン、塩素、ニッケル等の必要とされる微量要素を含む微量要素肥料と混合して製剤化し、それを散布することにより、ウイルス感染の防除を行うことができる。
【００３７】
本発明の医薬又は農薬は、医薬組成物または農薬組成物としてキットの形態で、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明に係る薬剤組成物がキットとして供給される場合、該薬剤組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にするためである。
【００３８】
キット中に含まれる試薬は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などから構成される。他の適切な容器の例には、アンプルなどの類似物質から作られる簡単なボトル、及び内部がアルミニウム又は合金などのホイルで裏打ちされた包装材が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその類似物が含まれる。容器は、医薬用のキットの場合、皮下用注射針で貫通可能なストッパーを有するボトルなどの無菌のアクセスポートを有していてもよい。
【００３９】
また、キットには使用説明書も添付される。当該医薬組成物又は農薬組成物からなるキットの使用説明は、紙又は他の材質上に印刷され、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。
【００４０】
次に本発明を具体例によって説明するが、これらの例によって本発明が限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
１．コンピューターシミュレーションによるトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）ＳＦ１ヘリカーゼＮＴＰ結合部位への特異的結合化合物の選択
ＴｏＭＶが有するＳＦ１ヘリカーゼの立体構造情報に基づき、コンピューターシミュレーションによって、ＮＴＰの１種であるＡＴＰ結合部位に特異的に結合する活性を有する可能性がある低分子有機化合物約３００種類を選択した。具体的には、まずＴｏＭＶが有するＳＦ１ヘリカーゼの立体構造情報に基づき、ＮＴＰが結合するサイトを化合物の結合ポケットとして決定した。そのポケットに対し、公知のシミュレーション手法（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ＤＯＣＫ；Ｏｋａｍｏｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５８；１６５５）を用いたバーチャルスクリーニングにより、市販化合物（約５００万化合物、例えばＥｎａｍｉｎ社、ＭｏｌＰｏｒｔ社、ナミキ商事等から購入可能な化合物）中入手可能で且つ独立した骨格を持つ化合物群を選抜した約５０万化合物からなるデータベースを対象とした大規模バーチャルスクリーニングを実施した。各化合物についてドッキングを行い、スコアランキング上位５０００の化合物を第一次選択化合物群とした。その後、（ｉ）タンパク質と水素結合を中心とした相互作用が多く見られるか、（ｉｉ）結合ポーズに分子内の歪みが生じていないか、さらに（ｉｉｉ）ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ以外でも相互作用が見られるか、などを目視により評価し、３００化合物を第二次選択化合物群として絞り込んだ。その後、該第二次選択化合物群の中から入手可能な１７７の低分子有機化合物を最終候補化合物とし、以下の評価に供した。
【００４２】
２．試験管内ＴｏＭＶ  ＲＮＡ複製系を用いたＴｏＭＶ複製阻害活性評価
１．において選択された化合物の、ＴｏＭＶの複製を阻害する活性を以下の手順に基づき評価した。
生体膜を除去したタバコＢＹ−２培養細胞脱液胞化プロトプラスト抽出液（ｍｄＢＹＬ）由来の試験管内翻訳液１４．５μＬを用いて１７５ｎｇのＴｏＭＶ  ＲＮＡを翻訳した。この反応液に０．５μＬの候補化合物（５０μｌ  ＤＭＳＯ溶液）、５μＬの生体膜画分、および５μＬの５×Ｒバッファーを混合しＴｏＭＶ  ＲＮＡを複製させた。この際、５×Ｒバッファー中のＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰの濃度はそれぞれ０．５ｍＭとした。複製産物であるＴｏＭＶの相補鎖ＲＮＡをノーザンブロットハイブリダイゼーションにより検出した(図２)。
この実験の結果、５つの化合物（化合物Ａ−Ｅ）がＴｏＭＶに対する複製阻害活性を有することが示された。
【００４３】
３．ＡＴＰ加水分解酵素阻害活性評価
更に、２．において選択された５つの化合物（化合物Ａ−Ｅ）のＴｏＭＶヘリカーゼドメインが有するＮＴＰ分解酵素活性を阻害する活性を、ＮＴＰの１つであるＡＴＰに対する加水分解酵素阻害を指標に以下の方法により調べた。
Ｘｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ６７：１６４９−１６５２に記載された方法によりトマトモザイクウイルス複製タンパク質のヘリカーゼドメイン（Ｓ６６６−Ｑ１１１６）をコードする領域を発現および精製して、全ての実験に使用した。測定は高感度等温滴定型カロリメトリー装置（ＶＰ−ＩＴＣ：ＧＥヘルスケア）を用いて行った。精製したヘリカーゼの濃度をＵＶ２８０（ε＝４１３４０Ｌ・μＭ−１・ｃｍ−１）  により決定し、希釈することで１．５μＭの濃度に調整した。その後２０４００ｇ、４℃、１５ｍｉｎで遠心した後、シリンジに充填した。サンプルセル（セル容量１．４４ｍＬ）には透析外液を用いて調製した０．２ｍＭ  ＡＴＰ溶液を２０４００ｇ、４℃、３０ｍｉｎで遠心した後に充填した。正確なＡＴＰ溶液の濃度決定はＵＶ２５９（ＡＴＰ：ε＝１５．４Ｌ・μＭ−１・ｃｍ−１）  により決定した。測定はタンパク質の変性を防ぐため全て１５℃の温度で行い、一度に１００μＬのヘリカーゼ溶液を２５０ｓｅｃで滴下する単滴定法で行った。測定中のセル中では撹拌羽の回転数が３１０ｒｐｍとなるようにし、ＤＰは３４．５μｃａｌ／ｓｅｃとした。化合物によるＡＴＰ加水分解酵素阻害実験は、ヘリカーゼ及びＡＴＰ溶液それぞれに等量の化合物を加え同様に測定を行った。図３に化合物Ａ及び化合物Ｂの測定結果を示す。測定後、解析プログラムＩＴＣＥＮＺＷＣ（Ｋａｒｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｔｈｅｒｍｏｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４１２：９１）を使用し酵素活性（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を決定した。表１に化合物Ａ−Ｅそれぞれのｋｃａｔ、Ｋｍ及びｋｃａｔ／Ｋｍの値及び２．で測定した複製阻害活性を示す。
【表１】
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なお、ＡＴＰ加水分解酵素阻害活性の値は、コントロール実験との比較値で示し、試験管内翻訳系による複製阻害活性は、化合物を反応系において終濃度１０μＭ投与した時に強い阻害活性が見られたものを◎、弱い阻害活性が見られたものを○で示す。
この実験の結果、化合物Ａ乃至Ｅが、ＡＴＰ分解酵素活性を阻害する活性を有することが示された。
【００４４】
４．ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）複製阻害活性の評価
Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）およびＶｅｒｏ／ＴＭＰＲＳＳ２（Ｓｈｉｒｏｇａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８２：８９４２）をすべての実験に使用した。これらＶｅｒｏ細胞は膜型セリンプロテアーゼＴＭＲＰＳＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＦ１２３４５）を発現している。細胞は３７℃、５％ＣＯ２で、ＤＭＥＭ（Ｄ５７９６，Ｓｉｇｍａ）中、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｐ４３３３，Ｓｉｇｍａ）、および１μｇ／ｍＬのＧ４１８  ｓｕｌｆａｔｅ  （３８０−０１３，Ｅｎｚｏ）で維持した。ＰＥＤＶはＶｅｒｏ細胞を用いて複製、力価測定を行った。具体的には、１０ｃｍシャーレに用意したＶｅｒｏ細胞にＰＥＤＶウイルスを感染させ、６０分吸着したのち、リン酸バッファー（ＰＢＳ）で細胞を洗い、ＤＭＥＭ中１０％トリプトースリン酸ブイヨン溶液（２６０３００，Ｄｉｆｃｏ）を含む溶液で培養した。感染後３日目に培養上清を捨て、２ｍＬのＤＭＥＭを加えたのち細胞を回収し、５分間の超音波破砕を行った。その後８０００ｒｐｍ、４℃で遠心を行い、上清をウイルスストックとした。１０倍段階希釈したウイルス液をコラーゲンＩコート済み６ウェルプレート（Ｉｗａｋｉ）に用意したＶｅｒｏ細胞の各ウェルに接種し、６０分間の吸着後にＰＢＳによって２回細胞を洗浄した。その後、ＤＭＥＭ中、１０％トリプトースリン酸ブイヨン溶液、１．２５μｇ／ｍＬのトリプシン（Ｔ８８０２，ｓｉｇｍａ）を含む溶液で１８時間培養した。培養後、ＰＢＳ中、２０％ホルマリン液（０６４−００４０６，Ｗａｋｏ）、０．１％クリスタルバイオレットを含む溶液により、染色固定を２時間行い、ウイルスによって形成された巨細胞を顕微鏡下でカウントし、ウイルス力価をプラーク形成ユニット（ＰＦＵ）として表した。
薬剤阻害実験は、２．において選択された５つの各化合物（化合物Ａ−Ｅ）をＤＭＳＯに溶解した後、ＤＭＥＭ中、５％ＦＣＳ、１％ペニシリンストレプトマイシン、１００μＭの各薬剤を含む溶液を調製し、９６ウェルプレートに用意したＶｅｒｏ細胞の培養上清を一旦捨て、各ウェルに５０μＬずつ接種した。陰性対象として、ＤＭＳＯのみを同濃度で含む培養液を用いた。３０分後に培地を捨て、ＤＭＥＭ中、５％ＦＣＳ、１％ペニシリンストレプトマイシン、１５０ＰＦＵのＰＥＤＶを含む溶液を５０μＬずつ接種した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で培養し、ウイルス感染後３日目に、感染細胞を、ＰＢＳ中４％ホルムアルデヒド溶液にて１時間固定し、０．１％ホウ酸、１０％メタノール、１％クリスタルバイオレットを含む溶液で５分染色した後、ウイルスによる巨細胞形成を顕微鏡下で観察し、陰性対象との比較を行った。
結果として、化合物Ｅを処置した細胞でのＰＥＤＶの増殖が有意に阻害されることが示され、化合物ＥがＰＥＤＶの複製を阻害する活性を有することが明らかとなった（図４）。
【００４５】
５．風疹ウイルス複製阻害活性の評価
風疹ウイルスの構造蛋白質遺伝子をピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、口蹄疫ウイルス２Ａ蛋白質自己切断活性領域およびウミシイタケルシフェラーゼの融合蛋白質遺伝子に組換えた風疹ウイルスレプリコンＲＮＡをＢＨＫ細胞に導入し、Ｗｅｎ−Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４２９；２９の方法に準じて風疹ウイルスレプリコン細胞を樹立した。本細胞は３５℃、５％ＣＯ２で、細胞培養液［ＤＭＥＭ（Ｄ５７９６，Ｓｉｇｍａ）中、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリンストレプトマイシン（ＰＳ，１５１４０−１２２，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した溶液］にＰｕｒｏｍｙｃｉｎ  Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  （１１１３８０２，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を０．５μｇ／ｍＬで添加した溶液で維持した。２．において選択された５つの各化合物（化合物Ａ−Ｅ）の抗風疹ウイルス複製への効果を風疹ウイルスレプリコン細胞におけるウミシイタケルシフェラーゼ活性の変化で評価した。すなわち、細胞培養液中２０，０００個／１００μＬ調整した風疹ウイルスレプリコン細胞を１ウェル当たり１００μＬで播種し、３５℃、５％ＣＯ２で一夜培養した。ＤＭＳＯに溶解した各化合物を細胞培養液で１００，２０および４μＭに調製し、培養上清を破棄した風疹ウイルスレプリコン細胞へ１ウェル当たり１００μＬずつ添加した。陰性対照としてＤＭＳＯのみを同濃度で含む培養液を用いた。３５℃、５％ＣＯ２で３日間培養した後、風疹ウイルスレプリコン細胞内ウミシイタケルシフェラーゼ活性および細胞生存性をそれぞれＶｉｖｉＲｅｎ  Ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｅ６４９１，Ｐｒｏｍｅｇａ）および細胞生存性をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ（Ｇ７５７０，Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定し、化合物の抗風疹ウイルス複製への効果を細胞内ウミシイタケルシフェラーゼ活性／細胞生存性で評価し、陰性対照との比較を行った。
その結果、化合物Ａの処理により有意に風疹ウイルスレプリコン複製が阻害されることが示された（図５）
【００４６】
６．ヒトＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）複製阻害活性の評価
ＨＥＶは、ＥＭＢＬ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＡＢ７４０２３２に明示される核酸配列を有しており、ＨＥＶレプリコンは、ＨＥＶ配列の構造蛋白領域（核酸番号で５１７３から７１５５）を分泌型のＧａｕｓｓｉａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｐＮＬ１．３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＪＱ４３７３７２、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にコードされ、核酸番号で１００から６９９）に置換した遺伝子からなる。上記ＨＥＶレプリコン配列を修飾プラスミドｐＵＣ１９（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に標準分子生物学技術を使用して導入した。本レプリコン配列は、その上流にＴ７プロモーター配列（ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ）を付加してあるため、Ａｍｂｉｏｎ  ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥR  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いることによりレプリコンＲＮＡを合成することが可能である。
上記の方法で合成したＨＥＶレプリコンＲＮＡを、ＢＩＯ−ＲＡＤ社のＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌを用いてエレクトロポレーション法（ｖｏｌｔａｇｅ  ２７０Ｖ，  ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ  ９５０μＦ）によりヒト肝癌由来細胞ＰＬＣ／ＰＲＦ／５に導入した。９６ｗｅｌｌプレートに、１ｗｅｌｌあたりの細胞数は２．５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、レプリコンＲＮＡ量は３０ｎｇが導入されるように調製してエレクトロポレーションを行い、２．において選択された５つの各化合物（化合物Ａ−Ｅ）を３時間後に添加した。その後３７℃、５％ＣＯ２、１００％相対湿度で５日間培養後に培養上清を回収し、分泌されたルシフェラーゼ活性を、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＮａｎｏ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。
この実験の結果、評価した５化合物中、化合物Ｂ及びＣが、ＨＥＶの複製を阻害する活性を有することが示された（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明に係る化合物は、ＴｏＭＶや風疹ウイルスをはじめとする、ＳＦ１ヘリカーゼを有する各種プラス鎖ＲＮＡウイルスによる感染防御・治療剤として使用することができる。特に、植物へのウイルス感染に対する対策が遅々として進まない現状において、本発明の化合物は、農作物への被害を有効に抑止する新たな手段として大いに期待がもたれる。また、新たなウイルスが次々に問題になっているが有効な対策が取れていない家畜ウイルスに対しても、新たな抗家畜ウイルス戦略として期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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