(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分別の方法であって、
第１の集団および第２の集団を含むエンティティをナノピラー・アレイに導入することであって、前記ナノピラー・アレイが、前記第１の集団および第２の集団の一方を他方から分離するギャップを有するように配置されたナノピラーを含み、前記ナノピラーが、あるアレイ角を流体流方向に対して有するように整列されている、導入することと、
前記エンティティの前記第１の集団が第１の方向に出力され、前記エンティティの前記第２の集団が前記第１の方向とは異なる第２の方向に出力されるように、前記エンティティを、分別されることに基づいて受けることと、を含み、
前記ギャップのギャップ・サイズが、前記第１の集団を前記第１の方向に、また前記第２の集団を前記第２の方向に分別するように調整され、前記ギャップ・サイズが、前記ナノピラー・アレイの前記ナノピラーに配置された酸化物層の厚さにより調整され、
前記ナノピラーの上部および底部よりも細い中心部が、前記ナノピラーに配置された前記酸化物層で埋められていて、前記ギャップの前記ギャップ・サイズが、前記上部から前記底部まで均一である、
方法。
【請求項２】
前記ナノピラーが化学修飾を有し、前記ギャップ・サイズが、前記化学修飾によって調整される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ギャップ・サイズが前記酸化物層によって調整される場合、前記酸化物層が前記ギャップ・サイズを第１の寸法にまで低減する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ギャップ・サイズが前記化学修飾によって調整される場合、前記化学修飾により前記ギャップ・サイズを第２の寸法にまでさらに低減し、
前記第２の寸法が前記第１の寸法よりも小さい、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の寸法が、前記ギャップ・サイズを２０ナノメートルにまで低減する前記酸化物層に対応するとともに、前記ギャップは均一のままである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の寸法が、前記ギャップ・サイズを２０ナノメートル未満にまで低減する前記化学修飾に対応する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ギャップ・サイズが前記化学修飾によって調整される場合、前記化学修飾により前記ギャップ・サイズを第１の寸法にまで低減する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記化学修飾により単分子層を前記ナノピラー上に、前記第１の集団が前記単分子層に対する親和性を持ち、前記第２の集団が前記単分子層に対する親和性を持たないように形成し、
前記単分子層に対する前記親和性を持つことにより、前記エンティティの前記第１の集団を前記第１の方向に出力されるように導く、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記エンティティに、生物マーカ、生物分子、細胞以下構成要素、エキソソーム、ウイルス、イムノアッセイ、およびタンパク質凝集物のうちの少なくとも１つが含まれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
分別の方法であって、
第１の集団および第２の集団を含むエンティティをナノピラー・アレイに導入することであって、前記ナノピラー・アレイが、あるアレイ角を流体流方向に対して有するように整列配置されたナノピラーを含み、前記ナノピラーが化学修飾を有する、導入することと、
分別後に前記エンティティを受けることであって、前記エンティティの前記第１の集団が、前記第１の集団が前記化学修飾に対する親和性を持つことに基づいて第１の方向に出力され、前記エンティティの前記第２の集団が前記第１の方向とは異なる第２の方向に出力される、受けることと、
を含み、
前記ナノピラーの上部および底部よりも細い中心部が、前記ナノピラーに配置された酸化物層で埋められていて、前記ナノピラー間のギャップのギャップ・サイズが、前記上部から前記底部まで均一である、
方法。
【請求項１１】
前記化学修飾が、前記ナノピラーに付着したリガンドであり、前記リガンドが、前記ナノピラーに付着する結合基、いくつかのスペーサ分子からなる骨格、前記エンティティと相互作用する末端基を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の集団が前記化学修飾に対する前記親和性を持たない、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化学修飾に対する前記親和性を前記第２の集団が持たないことによって、前記第２の集団が前記第２の方向に出力される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記エンティティに、生物マーカ、生物分子、細胞以下構成要素、エキソソーム、ウイルス、イムノアッセイ、およびタンパク質凝集物のうちの少なくとも１つが含まれる、請求項１０または１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンティティ（entities）のサイズによる連続流分離に関し、より詳細には、ナノピラー・アレイ構造を使用してエンティティを分離することに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞、タンパク質、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）などの生物学的エンティティを分離および分別することは、診断学、治療学、細胞生物学、およびプロテオミクスを含む数多くの生物医学的な適用分野にとって重要である。
【０００３】
分析的な目的のためのタンパク質およびＤＮＡ／ＲＮＡ分離は従来、ゲル電気泳動法によって行われており、その場合にはタンパク質混合物に強い電界（通常、３０ボルト／センチメートル（Ｖ／ｃｍ））がかけられる。タンパク質またはＤＮＡ／ＲＮＡは、そのサイズおよび表面電荷によって決まる速度で、ゲルの中を移動する。ゲルは、有毒であることが知られているアガロースまたはアクリルアミド・ポリマーから調製される。電気泳動法実験の結果は、色素でタンパク質を染色することにより、または極度に発がん性のある臭化エチジウムでＤＮＡ／ＲＮＡを染色することにより、光学的に明らかにされる。ゲルは、電気泳動法の結果が検出可能になるように十分な量の材料を必要とするが、ゲル・マトリックス中のよくない架橋結合により不確定な結果になること、および試料が完全に失われることになることが多い。ゲル・マトリックス・サイズが試料分子サイズに適合していない場合、または電気泳動があまりに長く実施されたままであった場合、試料はやはり失われる。
【０００４】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、およびその断片などの巨大分子の分離には、ゲル電気泳動法が広く使用されている。ゲル電気泳動法には、現在、世界中の販売高が毎年１０億ドルを超える市場がある。医療診断に適用されるゲル電気泳動法は、数十億ドル市場になる。
【０００５】
従来の技法と比較して、シリコン（Ｓｉ）ナノ加工技術は、ナノ構造体の寸法およびその位置決めに関して、よりいっそう精密かつ正確な制御を実現し、したがって、粒子のサイズに基づいて高い信頼性で粒子を分別することにつながり得る。今日まで、Ｓｉピラー・アレイを使用するＳｉベースのラブ・オン・チップ手法には将来性がありそうであった。しかし、ミクロン（１０−６ｍ、すなわちマイクロメートル（μm））範囲で分別することしか、これらの技法を使用して実証されておらず、この範囲では、ＤＮＡ、タンパク質などを分別するのに必要なナノメートル寸法に到達しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】“Hydrodynamic Metamaterials:Microfabricated Arrays To Steer, Refract, And Focus Streams Of Biomaterials” by Keith J. Morton, et al., in PNAS 2008 105 (21) 7434-7438
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、エンティティを分別する技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１つの実施形態により、エンティティを分別する方法が提供される。エンティティがナノピラー・アレイに導入され、エンティティは第１の集団および第２の集団を含む。ナノピラー・アレイは、ギャップが一方を他方から分離するように配置されたナノピラーを含み、ナノピラーは、あるアレイ角を流体流方向に対して有するように整列される。エンティティは、既定のサイズ未満のエンティティの第１の集団を第１の方向に移送することによって、また少なくとも既定のサイズのエンティティの第２の集団を第１の方向とは異なる第２の方向に移送することによって、ナノピラー・アレイに通して分別される。ナノピラー・アレイは、１００ナノメートル未満のサイズを有するエンティティを分別するために、３００ナノメートル未満のギャップ・サイズを有するギャップを使用するように構成される。
【０００９】
本発明の１つの実施形態により、分別する方法が提供される。エンティティがナノピラー・アレイに導入され、エンティティは第１の集団および第２の集団を含む。ナノピラー・アレイは、ギャップが一方を他方から分離するように配置されたナノピラーを含み、ナノピラーは、あるアレイ角を流体流方向に対して有するように整列される。エンティティは、エンティティの第１の集団が第１の方向に出力され、エンティティの第２の集団が第１の方向とは異なる第２の方向に出力されるように、分別されることに基づいて受けられる。ギャップのギャップ・サイズが、第１の集団を第１の方向に、また第２の集団を第２の方向に分別するように調整される。ギャップ・サイズは、ナノピラー・アレイ上に配置された酸化物層の厚さおよびギャップへの化学修飾（chemical modification）の少なくとも一方により調整される。
【００１０】
本発明の１つの実施形態により、分別する方法が提供される。エンティティがナノピラー・アレイに導入され、エンティティは第１の集団および第２の集団を含む。ナノピラー・アレイは、整列配置のナノピラーを含み、ナノピラーは化学修飾を有する。エンティティは、エンティティの第１の集団が第１の方向に、化学修飾に対する親和性を持つ第１の集団に基づいて出力され、エンティティの第２の集団が第１の方向とは異なる第２の方向に出力されるように、分別後に受けられる。
【００１１】
さらなる特徴および利点が本発明の技法によって実現される。本発明の他の実施形態および態様は、本明細書で詳細に説明されるとともに、特許請求される本発明の一部と考えられる。これらの利点および特徴とともに本発明をよりよく理解することについては、本明細書および図面を参照されたい。
【００１２】
本発明としてみなされる主題は、本明細書に添付の特許請求の範囲に具体的に指し示され、明確に特許請求される。上記および他の特徴、および本発明の利点は、以下の詳細な説明を添付の図面と併せ参照すれば明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】アレイ・パラメータの定義を示す決定論的横変位（ＤＬＤ）アレイの図である。
【図２】図２Ａは、ニュートラル領域とマイクロ流体メタマテリアル要素の間の境界面における粒子軌道を表す概略図である。  図２Ｂは、最も単純なメタマテリアルが、チャネル壁およびバルク流体流に対して角度＋αで傾斜したポストの非対称アレイであることを表す図である。  図２Ｃは、マイクロ加工されたポスト・アレイを示す断面ＳＥＭ画像を表す図である。  図２Ｄは、境界面を通過し、法線から偏向している２．７μｍ赤蛍光剤の時間追跡を示す、粒径に基づく等価マイクロ流体複屈折を表す図である。
【図３】図３Ａは、一実施形態によるナノピラー・アレイ製作のプロセス・フローの概略図であり、基板上に配置されたハード・マスク層を表す図である。  図３Ｂは、一実施形態によるナノピラー・アレイ製作のプロセス・フローの概略図であり、ハード・マスク層の上にレジスト層を配置することを表す図である。  図３Ｃは、一実施形態によるナノピラー・アレイ製作のプロセス・フローの概略図であり、レジスト層をパターニングすることを表す図である。  図３Ｄは、一実施形態によるナノピラー・アレイ製作のプロセス・フローの概略図であり、ハード・マスク層をパターニングすることを表す図である。  図３Ｅは、一実施形態によるナノピラー・アレイ製作のプロセス・フローの概略図であり、基板をピラー・アレイにエッチングすることを表す図である。  図３Ｆは、一実施形態によるナノピラー・アレイ製作のプロセス・フローの概略図であり、ハード・マスク・パターンが除去されているピラー・アレイを表す図である。  図３Ｇは、一実施形態によるナノピラー・アレイ製作のプロセス・フローの概略図であり、ピラー・アレイ上に酸化物層を配置することを表す図である。
【図４】図４Ａは、本発明の一実施形態による、ハード・マスクが除去される前の反応性イオン・エッチングの結果を表す、同一ウェハの走査電子顕微鏡画像である。  図４Ｂは、本発明の一実施形態による、ハード・マスクが除去される前の反応性イオン・エッチングの結果を表す、同一ウェハの走査電子顕微鏡画像である。  図４Ｃは、本発明の一実施形態による、ハード・マスクが除去された後の反応性イオン・エッチングの結果を表す、並行処理ウェハの走査電子顕微鏡画像である。  図４Ｄは、本発明の一実施形態による、ハード・マスクが除去された後の反応性イオン・エッチングの結果を表す、並行処理ウェハの走査電子顕微鏡画像である。
【図５】図５Ａは、本発明の一実施形態による、熱酸化物がない製作されたナノピラー・アレイを表す、別のウェハの走査電子顕微鏡画像である。  図５Ｂは、本発明の一実施形態による、熱酸化物がない製作されたナノピラー・アレイを表す、別のウェハの走査電子顕微鏡画像である。  図５Ｃは、一実施形態による、ナノピラー・アレイ上に熱酸化物を成長させる影響を表す、並行処理ウェハの走査電子顕微鏡画像である。  図５Ｄは、一実施形態による、ナノピラー・アレイ上に熱酸化物を成長させる影響を表す、並行処理ウェハの走査電子顕微鏡画像である。  図５Ｅは、一実施形態による、ナノピラー・アレイ上に熱酸化物を成長させる影響を表す、並行処理ウェハの走査電子顕微鏡画像である。
【図６】図６Ａは、本発明の一実施形態による、より小さいギャップ・サイズから開始することを表す、別のウェハの走査電子顕微鏡画像である。  図６Ｂは、本発明の一実施形態による、より小さいギャップ・サイズから開始することを表す、別のウェハの走査電子顕微鏡画像である。  図６Ｃは、本発明の一実施形態による、初期ギャップ・サイズが小さい場合の酸化処理を表す、並行処理ウェハの走査電子顕微鏡画像である。  図６Ｄは、本発明の一実施形態による、初期ギャップ・サイズが小さい場合の酸化処理を表す、並行処理ウェハの走査電子顕微鏡画像である。
【図７】図７Ａは、本発明の一実施形態による、分別アレイ面を形成するためのピラー・アレイへの化学修飾の一般的な概略化学構造式である。  図７Ｂは、本発明の一実施形態による、分別アレイ面を形成するための、ピラー・アレイに金属を付けることによる化学修飾の概略化学構造式である。
【図８】図８Ａは、一実施形態による、ピラー間のギャップ・サイズを修正する手段としての分別アレイの化学修飾を表す断面図であり、化学修飾前のピラー間のギャップ・サイズを表す図である。  図８Ｂは、一実施形態による、ピラー間のギャップ・サイズを修正する手段としての分別アレイの化学修飾を表す断面図であり、化学修飾後のピラー間の低減されたギャップ・サイズを表す図である。  図８Ｃは、一実施形態による、ピラー間のギャップ・サイズを修正する手段としての分別アレイの化学修飾を表す断面図であり、図８Ａの反応部位の拡大図である。  図８Ｄは、一実施形態による、ピラー間のギャップ・サイズを修正する手段としての分別アレイの化学修飾を表す断面図であり、図８Ｂの単分子層の拡大図である。
【図９】図９Ａは、本発明の一実施形態による、化学的に修飾された分別アレイ中の粒子流を、表面単分子層に対する親和性を持つ粒子と比較して表面単分子層に対する親和性がない粒子を用いて表す上面図である。  図９Ｂは、本発明の一実施形態による、ナノピラー、単分子層、および親和性のある粒子の断面拡大図である。
【図１０】図１０Ａは、本発明の一実施形態による、ギャップ変化があるピラーを表す断面図である。  図１０Ｂは、本発明の一実施形態による、ギャップ変化を取り除く酸化処理を表す断面図である。
【図１１】本発明の一実施形態による、ピラー・アレイを有するチップ（流体デバイス）を表す上面図である。
【図１２】本発明の一実施形態による、流体装置（たとえば、チップ）を提供する方法の流れ図である。
【図１３】本発明の一実施形態による、ナノピラー・アレイを形成する方法の流れ図である。
【図１４】本発明の一実施形態による、ナノピラー・アレイ中のピラーの配置を表す概略上面図である。
【図１５】本発明の一実施形態による、現在２つの入口があり、サイズの異なる粒子がナノピラー・アレイ中を横断するチップの概略図である。
【図１６】図１６Ａは、本発明の一実施形態による、直径７０ナノメートル・ビーズの粒子軌道の走査電子顕微鏡画像である。  図１６Ｂは、本発明の一実施形態による、７０ナノメートル・ビーズについての速度の関数としての軌道角度のグラフである。  図１６Ｃは、本発明の一実施形態による、直径５０ナノメートル・ビーズの粒子軌道の走査電子顕微鏡画像である。  図１６Ｄは、本発明の一実施形態による、５０ナノメートル・ビーズについての速度の関数としての軌道角度のグラフである。
【図１７】本発明の一実施形態による、例示的データの表である。
【図１８】本発明の一実施形態による、エンティティを分別する方法の流れ図である。
【図１９】本発明の一実施形態による、エンティティを分別する方法の流れ図である。
【図２０】本発明の一実施形態による、エンティティを分別する方法の流れ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ミクロン（１０−６ｍ、すなわちマイクロメートル（μm））範囲で分別することが、Ｓｉベースのラブ・オン・チップ手法を使用して実証されている。この点に関する付加情報が、論文“Hydrodynamic Metamaterials: Microfabricated Arrays To Steer,Refract, And Focus Streams Of Biomaterials” by Keith J.Morton, et al., in PNAS2008 105(21)7434-7438（印刷の前に２００８年５月２１日に発表）でさらに論じられている。
【００１５】
論文「Hydrodynamic Metamaterials:Microfabricated Arrays To Steer, Refract, And Focus Streams Of Biomaterials」では、光学についての著者の理解が、光を粒子として、直進し、光の速度が材料に依存する媒体に入ると屈折するものとして見ることに由来すると論じている。この論文は、ある構造化された層状の異方性流体力学媒体の、高ペクレ数の流れの中を動いている物体が、光学における光線に似ている軌道に沿って動くことを示している。１つの例は、決定論的横変位（ＤＬＤ）アレイとして知られている周期的マイクロ加工ポスト・アレイ、高分解能マイクロ流粒子分別機である。このポスト・アレイは非対称である。図１に示されるように、各連続する下流の列は、アレイ軸がチャネル壁および流体流の方向に対して角度αを形成するように、前の列に対してシフトされている。動作中、ある臨界サイズよりも大きい粒子は、各列でポストによって側面に沿って変位され、いわゆる「衝突」モードでアレイ中の決定論的経路をたどる。衝突粒子の軌道は、アレイ軸角度αに従う。臨界サイズよりも小さい粒子は流れの流線をたどり、周期的な「ジグザグ」モードでポスト・アレイを縫うように通って進む。
【００１６】
図１は、アレイ・パラメータの定義を示す決定論的横変位（ＤＬＤ）アレイの概略図である。ポストは間隔λで周期的に配置され、各下流の列は、前の列からδだけ、アレイの対称性を破って横方向にオフセットされている。このアレイ軸は、チャネル壁に対して、したがって流体流の方向に対して角度α＝ｔａｎ−１（δ／λ）＝ｔａｎ−１（ε）を形成する。アレイ非対称性により、ポストＧ間のギャップ内の流体流は（１／ε）スロットに分割される。これらのスロットのそれぞれが（１／ε）列ごとに繰り返すので、アレイを通る流れは概して直線になる。ポスト近くでギャップを通過する粒子は、その粒子半径がギャップ内のスロット幅よりも大きい場合、隣接する流線の方へ（スロット１からスロット２へ）変位し得る。したがって、大きい粒子は決定論的に各ポストで変位し、その流れに向かって角度αで移転する。より小さい粒子は、単にその流線形路をたどるだけで、流体流の方向にアレイを通って流れる。
【００１７】
図２Ａは、チャネルにまたがるマイクロ加工ポストからなる流体力学媒体を通って流れる粒子の、サイズによる複屈折を示す。サイズの異なる２つの粒子が、対称ポスト・アレイ（チャネルの左半分）と非対称ポスト・アレイ（右半分）の間の境界面に直角に入射する。アレイを通る圧力駆動流体流は左から右に向かっており、その全体的な方向は、大きい方のマイクロ流体チャネルによって決定される。図２Ａは、ニュートラル領域とマイクロ流体メタマテリアル要素の間の境界面における粒子軌道を表す概略図である。臨界サイズよりも大きい粒子がアレイを非対称に流れるのに対し、それより小さい粒子は流体流に従う。図２Ｂは、最も単純なメタマテリアルが、チャネル壁およびバルク流体流に対して角度＋αで傾斜したポストの非対称アレイであることを表す図である。示されているのは、ニュートラル・アレイ（α＝０°）とアレイ角α＝１１．３°であるアレイとの間の境界面の上面視走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である（ギャップＧ＝４μｍ、およびポスト・ピッチλ＝１１μｍは両側で同じである）。図２Ｃは、マイクロ加工されたポスト・アレイを示す断面ＳＥＭ画像を表す。図２Ｄは、境界面を通過し、法線から偏向している２．７μｍ赤蛍光剤の時間追跡を示す、粒径に基づく等価マイクロ流体複屈折を表す図である。小さい方の１．１μｍ緑ビーズは、境界面で偏向されない。
【００１８】
アレイ要素は、障害物サイズＤ、ポスト間の間隔Ｇ、およびポスト・ピッチλを含む、図１に示される設計パラメータを用いてアレイを構築することによって、特定の粒子サイズをある角度で流れに向けるように適合させることができる。非対称性は、列間シフトδの大きさによって決まり、勾配ε＝δ／λによって特徴づけられる。この場合、最終アレイ角はα＝ｔａｎ−１（ε）になる。所与のアレイ角に対し、衝突モードの臨界粒径は、粒子直径とポスト間隔すなわちギャップとの比によって決まる。この臨界粒径は、１．０°から１６°の間のアレイ角の範囲に対して前もって図で表された。所与のギャップ・サイズに対して、衝突の臨界サイズは、より鋭い角度において大きくなる。これらの設計基準を使用して、ビーズ、細胞、およびＤＮＡの流れがすべて、サイズによる分離適用例では決定論的に移動された。１１．３°のアレイ角があり、ギャップＧ＝４μｍであり、ポスト・ピッチλ＝１１μｍである、図１に示された例では、閾値粒径は約２．４μｍである。したがって、図示のように、２．７μｍ赤ビーズは、アレイ軸角度に沿って衝突モードで移動し、１．０μｍ緑ビーズは、流線に沿ってジグザグ・モードで移動する。アレイ要素ならびに任意の付随的なマイクロ流体チャネルおよび貯蔵器が、フォトリソグラフィおよびエッチングを含む標準的なマイクロ加工技術を使用して、シリコン・ウェハ内に製作される。アレイはまた、同様に作られたシリコン・マスタを使用してＰＤＭＳに成形することもできる。シリコン・エッチングでは、最適化ディープ反応性イオン・エッチング（ＤＲＩＥ）が平滑な垂直側壁を維持するために使用されて、図２Ｃに示される、上部から下部まで均一な間隔がポスト間に確保される。
【００１９】
最新技術とは異なり、本発明の実施形態は、ピラー（ポストとも呼ばれる）の間に寸法が１００ナノメートル（ｎｍ）未満の領域にある均一なギャップを有する、製造可能なシリコン・ピラー・アレイを作り出すように設計される。これらのピラー・アレイは、たとえば、これらの寸法の、ＤＮＡ、ＲＮＡ、エキソソーム、個々のタンパク質、およびタンパク質複合体などの生物学的エンティティを分別および分離するための上述のバンパー・アレイ構成において、使用することができる。具体的には、ピラー・アレイは、ピラーの軸全体に沿ったギャップ・サイズの変化を「治癒する」ために使用できる、ＳｉＯ２コーティングなどの酸化物コーティングを用いて設計される。均一なギャップ・サイズは、たとえば２０ｎｍ粒子を１０ｎｍ粒子から分別するための、効率的な分別を得るために利用される。これは、分別される粒子の寸法よりも大きいギャップ・サイズの固有変化がある１００ｎｍ未満領域のギャップでは特に困難であり、この固有変化は、反応性イオン・エッチング（ＲＩＥ）プロセスによってこの程度に限定される。最新技術において見出される、実証された分別ピラー・ギャップはミクロン範囲の寸法を有し、したがって、最新技術では、実施形態で開示された微細さの程度近くに分別することができない。角度ピッチ（アレイ角または臨界角とも呼ばれる）が非常に小さい、たとえば０．５７度であるピラー・アレイでも、分別効率が最高の場合で、ギャップの１２％よりも大きい粒子しか分別されない。したがって、ナノメートル領域において不変のギャップが、たとえばタンパク質凝集物を分別するには必要になる。個々のタンパク質（たとえば、１〜１０ｎｍのサイズ範囲）の分別は従来、イオン交換クロマトグラフィまたはゲル電気泳動法を使用して行われているが、これらは、シリコンによる連続流解決策ではなくロード・アンド・ソート技法である。しかし、最新技術には１０〜１００ｎｍ程度のエンティティを分別するための既存の解決策がないものの、実施形態では、これらの範囲の両方（たとえば、１〜１０ｎｍ範囲と１０〜１００ｎｍ範囲）における解決策を提供する。諸実施形態はまた、所与のギャップを適応サイズまでさらに低減するための、分子の付加または移植あるいはその両方によるピラーの化学修飾を含む。
【００２０】
理解しやすいように、副題が利用されることが場合によってあり得る。副題は、単に説明の目的のためであり限定ではないことに留意されたい。
【００２１】
ピラー・アレイ製作
【００２２】
図３Ａから図３Ｇは、本発明の一実施形態によるナノピラー・アレイ製作のプロセス・フローの概略図を表す。図３Ａで、プロセス・フロー３０１は基板３０２を表す。ハード・マスク３０４が基板３０２の最上部に配置される。基板３０２は、たとえばシリコン（Ｓｉ）ウェハなどのウェハとすることができる。酸化物ハード・マスク３０４は、エッチングに使用される二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）とすることができる。酸化物は１つの例であり、窒化物または他の硬質材料を利用することもできる。酸化物ハード・マスク３０４は、バルク・シリコン（基板３０２）上に堆積または成長あるいはその両方によって配置することができる。酸化物ハード・マスク３０４の厚さは、ピラーの高さを生じさせるのに必要なエッチング深さと、ハード・マスク材料３０４に対する基板３０２のＲＩＥ化学作用の選択性とに応じて、数十から数百ナノメートルの範囲になり得る。他の材料を基板３０２およびハード・マスク層３０４用に利用することもできる。
【００２３】
図３Ｂで、プロセス・フロー３０３は、酸化物ハード・マスク３０４の最上部にレジスト３０６を配置することを表す。レジスト３０６は、ポジティブ・レジストまたはネガティブ・レジストとすることができる。レジスト３０６の厚さは、レジスト３０６、ハード・マスク（３０４）エッチング選択性、ハード・マスク３０４の厚さ、および必要なナノピラー・ギャップ分解能に応じて、１００ｎｍ〜１μmの範囲になり得る。狭い１００ｎｍ未満のギャップおよび浅いピラー深さでは、１００〜５００ｎｍのレジスト厚さ範囲が利用されて、ギャップ・サイズの変化が少ないと高い分解能特性が得られる。レジスト３０６はまた、分解能を改善するために、エッチング選択性がそれぞれ異なる２つ以上の層からなる多層レジスト・スタックとすることもできる。
【００２４】
図３Ｃで、プロセス・フロー３０５は、レジスト３０６をレジスト・パターン３０８になるようにパターニングすることを表す。レジスト・パターン３０８は、それだけには限らないが、電子ビーム・リソグラフィ、ナノインプリント・リソグラフィ、干渉リソグラフィ、極端紫外線リソグラフィ、または遠紫外線リソグラフィあるいはこれらの組合せ、またはこれらの技法の組合せを使用して、画定することができる。レジスト・パターン３０８は、以後のナノピラー・アレイのパターンで、レジスト・ピラーの形に作られる。ある場合には、レジスト・パターン３０８は、異なるナノピラー・アレイのための複数のパターンを含み得る。
【００２５】
プロセス・フロー３０７は、図３Ｄのエッチングされたハード・マスク・パターン３１２を得るための、レジスト・パターン３０８から酸化物ハード・マスク３０４へのパターン転写を表す。ハード・マスク３０４へのパターン転写は、反応性イオン・エッチング（ＲＩＥ）を使用して行うことができる。プロセス・フロー３０７は、レジスト・パターン３０８をその対応するエッチングされたハード・マスク・パターン３１２の最上部に示す。
【００２６】
図３Ｅで、プロセス・フロー３０９は、ナノピラー３１４を、エッチングされたハード・マスク・パターン３１２の下の基板３０２に画定されるようにパターニングすることを表す。ナノピラー３１４は、反応性イオン・エッチングを使用してエッチングすることができる。レジスト・パターン３０８は、ナノピラー３１４を基板３０２にパターニングする前に、またはナノピラー３１４をパターニングした後に、エッチングされたハード・マスク・パターン３１２の最上部から除去することができる。ナノピラー３１４のエッチング後にレジスト・パターン３０８を除去することは、ナノピラー３１４のＲＩＥ処理中に起こり得るハード・マスク・パターン３１２の侵食を回避するのに役立ち得るので、実施されてよい。ハード・マスク侵食があると、不適正に変更された（望ましくない）側壁角度をピラーが持つことになり得る。
【００２７】
プロセス・フロー３１１は、図３Ｅのハード・マスク・パターン３１２の除去を表す。ハード・マスク・パターン３１２は、ハード・マスク材料がＳｉＯ２である場合、希フッ化水素（ＤＨＦ）酸で除去することができる。プロセス・フロー３１１は、ナノピラー３１４のナノピラー・アレイ３２０を示す。
【００２８】
ナノピラー３１４それぞれの間のギャップのサイズをさらに低減するために、またギャップ変化を低減するために、プロセス・フロー３１３は、酸化物３１６を、図３Ｇの基板３０２に形成されたナノピラー・アレイ３２０の表面を覆うように配置することを表す。ある場合には、熱酸化を利用して二酸化ケイ素３１６を成長させ、それによって、ギャップを狭くするようにナノピラー・アレイ３２０の表面を覆うことができる。別の事例では、酸化物３１６は、ナノピラー・アレイ３２０（シリコン製）上に、たとえば原子層堆積を使用して堆積させることができる。
【００２９】
一般に、ピラー・アレイは、ピラー・ポスト間のギャップを狭くしギャップ変化を最小にするのに役立つ酸化工程（たとえば、プロセス・フロー３１３）が後に続くＲＩＥによって画定された、シリコン・ピラーの高密度アレイを含む。ナノピラー・アレイ製作はまた、さらなるギャップ・スケーリング（すなわち、サイズの縮小）が必要になり得る、任意選択の化学修飾工程を含み得る。これらのピラーまたはギャップあるいはその両方は、傾斜ピラー設計になるように実施して、試料を濃縮すること、または生物学的エンティティの異種混合物を単一分子レベルで分離することが、細胞または大きい粒子の分別についての論文「Hydrodynamic Metamaterials: Microfabricated Arrays To Steer,Refract, And Focus Streams Of Biomaterials」で実証された作業と同様に、可能である。図３Ａおよび図３Ｂのナノピラー・アレイ製作のためのプロセス・フローを利用して、ナノピラー３１４間の任意の所望のギャップＧ間隔、所望のピラー・ピッチλ、所望の列間シフトδ、および所望のアレイ角α（臨界角αとも呼ばれる）（図１に示される）になるようにシフトされたナノピラー３１４のアレイを作り出すことができる。
【００３０】
複数のナノピラー・アレイ３２０（たとえば１〜Ｎ、ここでＮはナノピラー・アレイ３２０の最後の番号）は、図３Ａおよび図３Ｂで同じ基板３０２について論じたように製作することができる。第１のナノピラー・アレイ３２０は、第１の組のパラメータ（ナノピラー３１４間の任意の所望のギャップＧ間隔、所望のピラー・ピッチλ、所望の列間シフトδ、および所望のアレイ角α）を有することができる。第２のナノピラー・アレイ３２０は、第２の組のパラメータ（ナノピラー３１４間の任意の所望のギャップＧ間隔、所望のピラー・ピッチλ、所望の列間シフトδ、および所望のアレイ角α）を有することができ、第１の組のパラメータのうちの１つ以上が第２の組のパラメータと異なり得る。第３のナノピラー・アレイ３２０は、第３の組のパラメータ（ナノピラー３１４間の任意の所望のギャップＧ間隔、所望のピラー・ピッチλ、所望の列間シフトδ、および所望のアレイ角α）を有することができ、第１の組のパラメータのうちの１つ以上が、第２の組のパラメータのいくつかと異なるかまたは同じか、あるいはどちらもあり得、第３の組のパラメータのうちの１つ以上が、第１の組および第２の組のパラメータのいくつかと異なるかまたは同じか、あるいはどちらもあり得る。これと同じ類推を、最後の（Ｎ）の組のパラメータ（ナノピラー３１４間の任意の所望のギャップＧ間隔、所望のピラー・ピッチλ、所望の列間シフトδ、および所望のアレイ角α）を有することができる最後（Ｎ）のナノピラー・アレイ３２０まで適用することができ、最後の組のパラメータのうちの１つ以上が、第１、第２、第３、および第Ｎ−１の組のパラメータのいずれか１つと異なるかまたは同じか、あるいはどちらもあり得る。
【００３１】
ピラーおよびギャップを画定するには、ネガティブトーン・ナノスケール・リソグラフィ技法が、まず第一に１００ｎｍ未満（<）のパターン化ギャップ・サイズを確保するのにより望ましい可能性があり、たとえば、ピラーおよびギャップが、プロセス・フロー３０５に示されるレジスト・パターン３０８で画定される。電子ビーム・リソグラフィが、ピラー・アレイ・パターンが小さい場合の１つの選択肢である。しかし、より製造可能なナノインプリント・リソグラフィの手法もまた、十分に制御された露光量条件のもとでの極端紫外線（ＥＵＶ）および遠紫外線（ＤＵＶ）リソグラフィと同様に、適用することができる。高アスペクト比ピラーを得るには、書かれるパターン（すなわち、レジスト・パターン３０８）が、（Ｓｉ）基板３０２をエッチングする前にハード・マスク３０４（ハード・マスク・パターン３１２）に転写されなければならない。高アスペクト比ピラーは、より大きい流体スループットを可能にし、マイクロ／ナノ流体特性に付随する閉塞問題を低減することができる。したがって、高アスペクト比ピラーは、ギャップ・サイズを隣接ピラー間で維持できる限り有することが有用な特性である。ピラーをレジスト・パターン３０８で画定し、エッチングされたハード・マスク・パターン３１２にまず転写することによって、ピラー・アレイ（３２０）エッチングが行われるときにギャップ・サイズをより安定に保ちながら、エッチング選択性の利点によりアスペクト比が増大する。
【００３２】
いくつかの実験データが、例示的な実施形態として以下で論議される。実験データは説明のためのものであり、限定のためのものではない。この場合には、電子ビーム・リソグラフィが利用されてピラー寸法（たとえば、レジスト・パターン３０８）を水素シルセスキオキサン（ＨＳＱ）中で二層レジスト・スタックの一部（たとえば、レジスト３０６）として画定し、この二層レジストは次に、１５０ｎｍ非高密度化低温酸化物（ＬＴＯ）ハード・マスク（たとえば、エッチングされたハード・マスク・パターン３１２）に転写される。高密度化ＬＴＯ、熱酸化物またはＳｉＯ２／ＳｉＮ／ＳｉＯ２のハード・マスク、あるいはこれらの組合せのハード・マスクもまた考慮され得る。実験では次に、ＲＩＥによるＳｉエッチング処理を用いてピラー（たとえば、ピラー３１４）を基板内に画定した。ＲＩＥ処理のさらなる詳細について、次に説明する。
【００３３】
ＲＩＥ処理詳細。４００ｎｍ高Ｓｉピラーを電子ビーム・レジスト・パターンから製作するためのパターン転写では、乾式エッチングをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＤＰＳＩＩ  ＩＣＰエッチング・チャンバ内で実行した。最初に、現像されたネガティブ・トーン電子ビーム・レジスト（ＨＳＱ）を使用し、４００ワット（Ｗ）電源電力、１００Ｗバイアス電力、および６５℃において４ミリトル（ｍＴｏｒｒ）圧力で、Ｎ２／Ｏ２／Ａｒ／Ｃ２Ｈ４化学作用を用いて有機平坦化層（ＯＰＬ）マスクを貫通エッチングした。次に、５００Ｗ電源電力、１００Ｗバイアス電力、および６５℃において３０ｍＴｏｒｒで、ＣＦ４／ＣＨＦ３化学作用を用いてパターンをさらにＳｉＯ２ハード・マスクに転写する。次に、炭素ハード・マスクを、Ｏ２／Ｎ２化学作用を用いてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ａｘｉｏｍ下流アッシャ内で２５０℃において剥がす。ＳｉＯ２ハード・マスクを使用して、Ｓｉピラーを４００ｎｍの深さまでＤＰＳ  ＩＩを用いて、６５０Ｗ電源電力、８５Ｗバイアス電力、および６５℃において４ｍＴｏｒｒで、最初にＣＦ４／Ｃ２Ｈ４ブレークスルー・ステップによって、次に、Ｃｌ２／ＨＢｒ／ＣＦ４／Ｈｅ／Ｏ２／Ｃ２Ｈ４主エッチングによって、エッチングする。結局のところ３つのマスクを利用してピラーをエッチングしたが、３つのマスクとは、現像されたＨＳＱ電子ビーム・レジスト（マスク）、ＯＰＬマスク、およびＳｉＯ２ハード・マスクであったことに留意されたい。
【００３４】
ギャップ分析
【００３５】
図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、および図４Ｄは、別々の２つの事例に関する、このＲＩＥ処理の結果の走査電子顕微鏡画像である。図４Ａおよび図４Ｂは、ハード・マスク（たとえば、ハード・マスク・パターン３１２）が除去される前（プロセス・フロー３０９などにおいて）のピラー（たとえば、ピラー３１４）を表し、ピラー（ハード・マスク・パターン３１２が上部にあるピラー３１４）の上部は丸みのある形状である。１５０ｎｍＬＴＯ（非高密度化）ハード・マスクをＲＩＥエッチングと一緒に利用して、図４Ａおよび図４Ｂのピラー３１４を生成した。図４Ｃおよび図４Ｄは、別々のウェハに対して実行された、希フッ化水素酸によるハード・マスク（たとえば、ハード・マスク・パターン３１２）除去の後のピラー（たとえば、ピラー３１４）を表し、ピラー３１４の上部は、図４Ｃおよび図４Ｄでは平坦である。両方の場合で、アレイ内のピラーが高密度であることにより、Ｓｉピラーは中心において内向きに弓形になる。つまり、ピラーの直径が中心で減少するので、ピラー間のギャップはピラー３１４の中心において広がる。ピラーは、内向きの弓形、すなわち砂時計の形を有する。アレイの境界におけるピラーは全くの垂直（図示せず）であることに留意されたい。このことは、ナノメートル・スケールにおけるギャップ非均一性の問題に光を当て、およそ（約）１００ｎｍのギャップ・サイズでは、図４Ｃおよび図４Ｄで分かるように、およそ５０ｎｍのギャップ変化がピラーの上部から同じピラーの底部まで（すなわち、深さまたは高さ）にある。アレイ内の、ギャップによって画定されたピラーが近接していることにより、ピラーが中心において内向きに弓形になり、それによって、それ以上のスケーリングを妨げるギャップ変化が生じた。この影響は、上述のエッチング処理（すなわち、酸化物層３１６を配置する前）では、寸法が２５０ｎｍ以下であるギャップ・サイズについて観察された。
【００３６】
本発明の一実施形態により、図５Ａおよび図５Ｂは、５０ｎｍ厚の熱酸化物がないウェハ５の、製作されたナノピラー・アレイの走査電子顕微鏡画像である。図５Ｃ、図５Ｄ、および図５Ｅは、本発明の一実施形態による、Ｓｉに埋め込まれたナノピラー・アレイ上に５０ｎｍ厚の熱酸化物（たとえば、酸化物層３１６）を成長させることの影響を示す、ウェハ７の走査電子顕微鏡画像である。ピラーの側面には、右壁５０５（図５Ａおよび図５Ｃに示す）、基板の底部５１０、および左壁５１５（図５Ｂに示す）がある。
【００３７】
ウェハ５に対する図５Ａおよび図５Ｂのピラーの加工は、最終の酸化ステップ（図５Ｃ〜図５Ｅのウェハ７に対してのみ行われる）を除いて、図５Ｃ、図５Ｄ、および図５Ｅのウェハ７に対するピラーの加工と同一である。図５Ｂの場合（ウェハ５）、およそ１８６ｎｍのギャップ・サイズに対して２６ｎｍの変化があるのに対し、図５Ｄ（ウェハ７）は、酸化後に１３ｎｍのギャップ・サイズの変化しか示さず、この場合、ギャップ・サイズがおよそ１３８ｎｍにまで狭くなっている。この酸化の治癒効果は、図５Ｅに示されるように、これらの非平坦構造物（すなわち、ピラー）上の酸化物が非均一であることの結果として生じる。図５Ｅは、２つのピラーに関して（ｘ軸に並べて見て）、酸化物が内向きの弓形に埋められているので、これら２つのピラー間のギャップ・サイズが、上部から底部にかけて（すなわち、ｙ軸の垂直軸に沿って）１３ｎｍしか変化し得ないことを示す。図５Ａおよび図５Ｂ（ウェハ５）に施されるエッチング処理を用いると、ピラーの（上部および底部ではなく）中心において酸化がより速く進行するので、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ（ウェハ７）に示されるように、ピラー・フィーチャ上の不均一な酸化がギャップ変化を「治癒」することが見出され、このことは、図１０Ａおよび図１０Ｂにも示されている。
【００３８】
図６Ａおよび図６Ｂ（ウェハ５）は、砂時計の形に埋めるための酸化物が配置されない、８０〜８９ｎｍ（９ｎｍだけ変化する）などの小さいギャップ・サイズから開始する実例を示す。図６Ｃおよび図６Ｄ（ウェハ７）は、元のギャップ・サイズが８０〜８９ｎｍである（９ｎｍだけ変化する）場合に適用される５０ｎｍ酸化ステップを表す。酸化の影響は、図６Ｃおよび図６Ｄにおいて非常に明白であり、同じ５０ｎｍ酸化ステップにより（上記の図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅで論じた）、ギャップ・サイズが８０〜８９ｎｍからたったの２１〜２５ｎｍ（ギャップ変化４ｎｍ）まで、１２：１（深さ：ギャップ）の比で低減する。図６Ｃおよび図６Ｄで分かるように、より小さい開始ギャップ・サイズ（たとえば、ギャップを狭くし内向きの弓形を取り除くための酸化ステップの前で、８０〜８９ｎｍ（または、これより小さい））での酸化により、およそ２５ｎｍのギャップが、およそ３００ｎｍのエッチング深さにわたってわずか数ナノメートルの変化（４ｎｍ）のみで得られ、３００：２５の深さ対ギャップの比は１２：１の比になる。このギャップ変化がわずかなこと（たとえば、４ｎｍ）およびプロセスが、特にこれらのナノピラーが化学修飾プロセスと組み合わされた場合に、カスタムの調整可能なギャップ・サイズを作る機会がもたらされる。高アスペクト比という用語は、製造可能なプロセスにおいてこのスケールでは実現するのが困難であり得る、４：１よりも大きい深さ対ギャップの比を有する構造物に関連し得る。
【００３９】
本明細書で論議されているように酸化物をピラー・アレイ上に配置することによって、諸実施形態は、並んでいる２つのピラーの垂直軸（すなわち、深さ）に沿ってギャップ・サイズが均一（たとえば、並んでいる２つのピラー間のギャップ・サイズの変化が５ｎｍ未満（４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍなど））であるピラー・アレイが得られるように構成される。たとえば、図１０Ａおよび図１０Ｂは、本発明の一実施形態による、ピラー・アレイ３２０においてギャップ変化を取り除き（低減させ）、均一なギャップ・サイズを作り出す治癒プロセスを表す断面図である。説明の目的のためだけに、２つのピラー３１４が並べて示されているが、説明はピラー・アレイ３２０内のピラー３１４のすべてに当てはまる。ピラー３１４の高さはｙ軸上に示され、幅／直径はｘ軸上に示されている。ｚ軸はアレイ３２０の長さを表し、アレイ内のさらなるピラー３１４（図示せず）が、２つのピラー３１４の前および後ろに位置する。図１０Ａは、基板材料（基板３０２）から作られた２つの例示的なピラー３１４を示す。ピラー３１４は、内向きに弓形になって砂時計の形になる。図１０Ａには、２つのギャップ・サイズＧ１およびＧ２が示されているが、別のギャップ・サイズもギャップ・サイズＧ１とＧ２の間にあり得る。ギャップ・サイズＧ１は、ピラー３１４の上部および底部（の近く）にある。ギャップ・サイズＧ２は、ピラー３１４の中心（の近く）にある。アレイ３２０内でギャップ・サイズＧ１によって規定される、ピラー３１４が近接していることが、ＲＩＥ処理中に反応性イオンの衝突流に課されるギャップ・サイズＧ１の寸法上の制約の故に、砂時計の形を生じさせる。
【００４０】
図１０Ｂは、酸化物層３１６を配置した後の２つの例示的なピラー３１４を示す。ピラー・アレイ３２０における非平坦な構造、ナノサイズのピラー、およびピラー３１４間の緊密なナノ間隔の故に、酸化物層３１６はピラー３１４上に均一に分布しない。代わりに、より多くの酸化物３１６がピラー３１４の中心（空隙）に、ピラー３１４のｙ軸の上部および底部よりも速く形成される。言い換えると、弓形の中心は、ピラー３１４の上部および底部よりも速い速度で埋められる。ピラー３１４上に形成される酸化物３１６のこの不均一な分布は、個々のピラー３１４をまっすぐにする働きをして、ピラーが砂時計の形から円筒状の形に変わり、これにより、ギャップ・サイズＧ５が２つのピラー３１４の間（および、ｘ軸に並んでいる他の任意の２つのピラー３１４間）で均一になる。したがって、ギャップＧ（アレイの一般的なギャップ・サイズを表す）のすべてが、ピラー・アレイ３２０全体にわたって均一になる。
【００４１】
化学修飾
【００４２】
分別すべき粒子とアレイの表面との間の相互作用は、化学修飾を用いて調整することができる。一般にこれは、物理的吸着または化学結合の形成、あるいはその両方によってピラー・アレイの表面に分子を付着させること、または接合することあるいはその両方を含み得る。また、ピラー・アレイの化学修飾は、金属、ポリマー、またはセラミック・コーティングあるいはこれらの組合せなどの材料の層を付けること、ならびにアレイ表面の酸化状態の変更を含み得る。表面（化学修飾用）は、流体ピラー・アレイの分別ピラー、壁、天井、または床あるいはこれらの組合せの領域を含み得る。加えて、化学修飾は、入口、出口、駆動機構、またはナノ流体デバイス（たとえば、１つまたは複数のピラー・アレイ）に付加された他の流体チャネルあるいはこれらの組合せに存在する任意の面に行うことができる。
【００４３】
化学修飾は、上で論じたように適用することができるが、より適切な適用は分別ピラー自体の化学修飾である。その理由は、これにより粒子と分別アレイ表面の間の相互作用の設計が可能になるからである。
【００４４】
１つの例では、図７Ａに示されるように、リガンドと呼ばれる小さい有機分子またはポリマーをピラーの表面に、ピラーの自然シリコン酸化物上のクロロシランまたはアルコキシシランの縮合あるいはその両方の縮合などによって、化学的に接合することができる。また、図７Ｂに示されるように、リガンドはピラーの表面に、金または銀の薄い層（たとえば、１０ｎｍ）でコーティングされたピラー上のチオール、アミン、またはホスフィンあるいはこれらの組合せなどを介して、化学的に接合することもできる。得られるリガンド分子の層は単分子厚、すなわち単分子層である。流体および粒子と直接接触する単分子層の末端基は、アレイを通るときに粒子が感知する物理化学的（physochemical）相互作用を決定する。したがって、リガンドの末端基を変更することにより、アレイ内の表面相互作用を調整することが可能になる。
【００４５】
図７Ａおよび図７Ｂは、本発明の一実施形態による、分別アレイ面の化学修飾の方法の一般的な概略化学構造式を表す。図７Ａを参照すると、一般的な基板（アレイ・ピラー）では、基板上の反応部位（Ｘ）を使用して、小分子リガンドの化学結合または物理的吸着あるいはその両方を形成することができる。その表面にリガンドが付着することで新しい層が形成され、これは単分子厚（すなわち単分子層）になる。一般的なリガンドは、（ｉ）基板反応部位（Ｘ）と相互作用する結合基（Ｚ）、（ｉｉ）最終単分子層の厚さを大まかに決定するいくつかのスペーサ分子（ｎ）からなる骨格、および（ｉｉｉ）単分子層とアレイ内の流体／粒子との間の境界面と相互作用する末端基（Ａ）から構成される。末端基（Ａ）は、分別すべき粒子と相互作用する。図７Ａは、結合基Ｚおよび反応部位Ｘを示すが、これは単に１つの例であり、化学修飾は、この例にある反応機構の一種類に限定されるということではない。他に２つの一般的な機構的可能性がある。（１）直接結合形成、すなわちＺ基が反応部位ＸにＺ−Ｘ結合として結合する、または（２）脱離による結合形成、すなわち反応基Ｚ−ＷがＺ−Ｘ結合中の反応部位Ｘ−Ｖに結合し、副生成物Ｗ、Ｖが脱離する、あるいはこれらの両方である。たとえば、クロロシランＲ−Ｓｉ−Ｃｌがシリカ表面のシラノールＨ−Ｏ−Ｓｉと反応すると、Ｒ−Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合が形成され、ＨＣｌが脱離する。
【００４６】
図７Ｂを参照すると、単分子層が、ピラーのアレイの上に事前堆積した金属層（Ｍ）の上に形成され得る。たとえば、１つまたは複数の金属層（Ｍ）をピラーの上に堆積することができ（たとえば、均一なギャップ・サイズを作り出す酸化処理の後に）、それによりピラーはここで、金属面（Ｍ）を基板の上に（または内向きの弓形を埋める酸化物層の上に、あるいはその両方の上に）有するようになる。図７Ｂでは、結合基が、図７Ａの「Ｚ」とは対照的に「Ｙ」で識別されている。リガンド（たとえば、結合基（Ｙ）を有する）は、ピラー・アレイの金属面（Ｍ）と直接に配位化合物を形成して、緊密に詰まった単分子層を形成することができる。
【００４７】
図８Ａおよび図８Ｂに表されているようにギャップ・サイズを低減することによって、化学修飾を用いてより小さい粒子を分別するようにピラー・アレイを調整することができる。分別ピラー３１４の表面は、脂肪族または芳香族のオリゴマー／ポリマーを含む様々な長さの分子で修飾することができ、これによりピラーの厚さが効果的に増大し、それによってピラー間のギャップ間隔が低減する。より長いリガンドを選択することによって、ギャップ・サイズは小さくすることができ、したがって、実効分離粒径が小さくなる（すなわち、より小さい粒子を分別することができる）。リガンドの骨格は、剛性の緊密に詰まった分子層と柔軟で無秩序な層との間の機械的特性の範囲が得られるように選択することができる。リガンドには、小有機分子、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴ糖、または剛性ポリマーあるいはこれらの組合せが含まれ得る。１つの例では、ピラー表面が、シロキサン連鎖を介してポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）のオリゴマーによって修飾される。エチレン酸化物残基１つにつきおよそ０．３６ｎｍで、１２残基ＰＥＧオリゴマーでは、およそ９ｎｍのギャップ・サイズの減少が生じ、２０残基ＰＥＧオリゴマーでは、およそ１４ｎｍのギャップ・サイズの減少になる。
【００４８】
図８Ａから図８Ｄは、本発明の一実施形態による、ピラー間のギャップ・サイズを修正する手段としての分別アレイの化学修飾を表す概略図である。図８Ａを参照すると、自然酸化物、成長酸化物層、または代替材料（たとえば金属、セラミック、ポリマー）の堆積層あるいはこれらの組合せを有するピラー３１４では、ピラーの表面に反応部位（Ｘ）がある。ピラー３１４は、ｇで示される初期ギャップ幅を有する。アレイ床８０５（ピラーが立つ基板３０２の床）がある。図８Ｃは、図８Ａ中の空の反応部位（Ｘ）を描写する拡大図８２０を示す。図８２０では、反応部位（Ｘ）はリガンドに付着しておらず、リガンドは、図８Ｂに示されるようにピラー・アレイ３２０に付けられる。
【００４９】
図８Ｂを参照すると、ピラーの表面へのリガンド８１０の化学的付着により、リガンド詰め込みの特性によって決まる厚さを有する単分子８１５層が形成される。単分子層８１５の厚さの増加により、ギャップ幅が（初期ギャップ幅ｇから）新たな実効ギャップ幅（ｇｅ）まで低減する。リガンド構造（特に骨格）、ならびに単分子層８１５の詰め込みおよび欠陥密度の調整により、単分子層８１５の厚さを調整することができ、したがって実効ギャップ（ｇｅ）を調整することができる。実効ギャップ（ｇｅ）は、粒子がアレイ３２０を通って流れるときに遭遇する新たな物理的ギャップ・サイズであり、ピラーの物理的バリアに単分子層の付加立体バリアを加えた組合せから形成される。実効ギャップは一般に、粒子分別の実施条件のもとでの単分子層の構造、機構、および動的特性に依存する近似値である。図８Ｄは、反応部位（Ｘ）がリガンド８１０に付着し、それによってピラー３１４の直径が拡大している拡大図８３０を示す。
【００５０】
分別アレイのさらなる改善および改良は、図９の概略図に示されるように、流体または分別すべき粒子あるいはその両方と特定の相互作用をするように選択することが可能であるリガンドの末端基（Ａ）によって導入することができる。粒子がピラー・アレイ３２０を通って流れるとき、単分子層の９１５の末端基との相互作用により、付着力が増大し、ピラー３１４のピラー壁に一時的に保持されることになる。これらの相互作用により、粒子の流れが遅くなるとともに、粒子が概してピラーの壁により多く位置するようになり、したがって、それがサンプリングする流れ場が減少する。アレイのピッチが平均流体流に対して非対称であるので、とどまり、またピラー３１４間を移行する粒子（粒子９１０など）が、アレイの臨界角に沿って効果的に移動され分別される。１つの例では、ＰＥＧ型リガンドの端のチオール末端基を使用して、チオールで標識されたタンパク質または他の分子などの移行粒子間にジスルフィド結合を形成することができる。流体中で適切な触媒剤と組み合わせた状態で、タンパク質（粒子９１０など）がアレイ３２０を通って流れるときに、それがピラー３１４とジスルフィド結合を形成して、その流れを一時的に抑えることができる。別の例では、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの化学的に安定した核酸の小さなセグメントをピラー壁に付着させて、可逆的塩基対合によってＤＮＡまたはＲＮＡ分析物を選択的に遅らせ分別することができる。別の例では、親水性単分子層内に埋め込まれた疎水性リガンドのパッチをピラーの上に導入することができ、１つのこのような対は脂肪族炭化水素リガンドとＰＥＧである。疎水性パッチをタンパク質上の疎水性領域と相互作用するように使用して、タンパク質を溶液から選択的に分別することができる。
【００５１】
図９Ａは、本発明の一実施形態による、化学的に修飾された分別アレイ中の粒子流の実例を、表面単分子層９１５に対する親和性がない粒子９０５、および単分子層９１５と相互作用する粒子９１０を用いて提示する。親和性がない粒子９０５は、アレイ３２０中の流線をたどり（すなわち、ジグザグ・モードを示す）、ピラー３１４との強い相互作用を全く受けない。これらの粒子９０５の軌道は概して影響を受けず、粒子はアレイ３２０内で分別されずに流れる。たとえば、粒子９０５は出口９４０に流れ込む。しかし、表面の分子による物理化学的親和性を持つ粒子９１０は、ピラー３１４の表面の単分子層９１５の分子との相互作用を受ける。この相互作用により、これらの粒子９１０がピラー３１４の表面に一時的に結合し、また粒子９１０が概してピラー３１４のピラー壁により近接してとどまることになる。いくつかの連続した結合と分離の事象を経て、粒子９１０はピラー３１４の方向に沿って移送され（すなわち、臨界角αの方向に衝突モードを示し）、化学的親和性によりアレイ３２０によって分別される。粒子９１０は、出口９４５の中へ分別される。図９Ｂは、本発明の一実施形態による、ナノピラー３１４、単分子層９１５、および親和性を持つ粒子９１０の断面の拡大図である。
【００５２】
ピラー・アレイ３２０を化学的に修飾するために、リガンドを化学気相成長（ＣＶＤ）または湿式化学作用あるいはその両方に導入することができる。金属を付けるために、ＣＶＤ、スパッタリング、または湿式化学作用あるいはこれらの組合せを利用することができる。単分子層を付加することによってピラー３１４を化学的に修飾する２つの詳細な例が、限定ではなく説明を目的として論じられ、湿式化学作用を用いるこれら２つの例が以下に提示される。
【００５３】
説明を目的として、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＧ）リガンド調節剤を使用してマイクロ流体デバイスを修飾する例示的方法が以下に提示される。クロロシランにさらされるすべてのガラス器は、水酸化ナトリウムで飽和したイソプロパノール槽内で少なくとも２４時間まず洗浄し、次に、脱イオン水で完全にすすぎ、１４０℃で１２時間、オーブン内で乾燥させる。
【００５４】
１００ｍＬ丸底フラスコを１４０℃オーブンから取り出し、セプタムで素早く封止する。窒素ガス・パージを、針を使用してセプタムを通して開始し、フラスコを１０分間パージさせる。３０ｍＬの無水トルエンをフラスコの中にカニューレを介して移す。シリンジを介して、６００μＬのｎ−オクチルデシルトリクロロシランを注入して４９ｍＭ溶液を作る。フラスコを一瞬ボルテックスして、試薬を均一に混合する。これにより不動態化溶液が作られる。５００ｍＬ反応器および３ネック・ヘッドを１４０℃オーブンから取り出し、次に、各入口をセプタムで閉じて、素早く一緒に封止する。窒素ガス・パージを、針を使用してセプタムを通して開始し、フラスコを１０分間パージさせる。カニューレを介して、１００ｍＬフラスコ内の２０ｍＬの不動態化溶液を反応器に移す。反応器を静かに揺さぶって、不動態化溶液を反応器の壁のまわりに十分に動かす。同じことを１００ｍＬフラスコについて、残っている不動態化溶液を使用して行う。この静かに揺さぶることを１０〜１５分ごとに１時間繰り返す。揺さぶりと揺さぶりの間は、ガラス器を周囲温度で放置しておく。この手順は、さらなるシリル化（silizanizaiton）に対してガラス器の壁を不動態化するためのものである。次に、不動態化溶液を反応器からあけ、反応器をトルエン、アセトン、イソプロパノールおよび脱イオン水で、順にそれぞれ３回洗浄する。同じことを１００ｍＬフラスコについて行う。次に、ガラス器を１４０℃オーブンに戻し、１２〜１４時間乾燥させる。
【００５５】
１００ｍＬ丸底フラスコを１４０℃オーブンから取り出し、セプタムで素早く封止する。窒素ガス・パージを、針を使用してセプタムを通して開始し、フラスコを３０分間パージさせる。１００ｍＬの無水トルエンをフラスコの中にカニューレを介して移す。シリンジを介して１００μＬの２−（メトキシポリ（エチレンオキシ）６-９プロピル）ジメチルクロロシランを注入して、およそ２ｍＭの溶液を作る。フラスコを一瞬ボルテックスして、試薬を均一に混合する。この修飾溶液は、それを調製した日のうちに使用する。
【００５６】
シリカ／シリコン・ベースのマイクロ流体デバイス（チップ）は、酸素プラズマ中で３０分間洗浄して有機表面汚染物を除去する。次に、チップを０．１Ｍ硝酸水溶液に１０分間移して、シラノールとのいかなる表面シロキサン結合も加水分解する。次にチップを、スクイズ・ボトル流を使用して、脱イオン水、アセトン、エタノール、次にイソプロパノールで順に洗浄する。次に、チップを新しいテックスワイプの上に上向きに置き、溶剤をチップの中部から外側に押し出しながら、窒素ガス流を使用してすぐに乾燥させる。次に、チップをカスタムのガラス・ホルダの上に置く（以下で説明するように、ガラス・ホルダはチップを反応器の内部で水平／上向きに固定する）。
【００５７】
５００ｍＬ反応器および３ネック・ヘッドを１４０℃オーブンから取り出す。撹拌ビーズをガラス・ホルダおよびチップと一緒に反応器の中に入れ、各入口をセプタムで閉じて、素早く一緒に封止する。窒素ガス・パージを、針を使用してセプタムを通して開始し、反応器を３０分間パージさせる。
【００５８】
カニューレを介して修飾溶液（リガンドを有する）を反応フラスコの中へ、溶液レベルがチップを越えるまで移す。次に、バブラを使用して窒素陽圧を保つ。反応は周囲温度で、撹拌しながら２時間進行させる。次に、反応器を開放し、チップを（１つずつ）、スクイズ・ボトル流を使用してトルエン、アセトン、イソプロパノール、次に脱イオン水で順にすすぐことによって清浄にする。次に、チップを新しいテックスワイプの上に上向きに置き、溶剤をチップの中部から外側に押し出しながら、窒素ガス流を使用してすぐに乾燥させる。次に、チップをセプタム付きガラス保持ジャーの中に置く。窒素ガス・パージを、針を使用してセプタムを通して開始し、反応器を一晩（およそ１２〜１４時間）乾燥させる。
【００５９】
ここで小見出しの使用を終える。図１１は、一実施形態による、ピラー・アレイ３２０を有するチップ１１００（流体デバイス）を表す。チップ１１００は、異なるサイズの粒子（すなわち、生物学的エンティティ）を含む、分別すべき流体を受け入れる入口１１０５を有する。入口１１０５は、ナノピラー・アレイ３２０のまわりの壁の開口または孔でも、流体（たとえば、水、電解液、有機溶剤など）および粒子（たとえば、生物学的エンティティ）が通り抜けて流れることができる、ナノピラー・アレイ３２０の幅に及ぶものでもよい。臨界寸法よりも大きいサイズを有する粒子は、臨界角の方向にピラー・アレイ３２０を通って衝突し（すなわち、衝突モード）、臨界寸法よりも大きいこれらの粒子は出口９４０で集められる。臨界寸法は、ナノアレイ３２０中をジグザグに進むには大きすぎるＤＮＡなどの、丸形粒子のサイズ（たとえば、直径）または連鎖構造の持続長あるいはその両方である。臨界寸法よりもサイズが小さい粒子は、ピラー・アレイ３２０中を流体流の方向にジグザグに進み（すなわち、ジグザグ・モード）、これら小さい方の粒子は出口９４５に集められる。臨界寸法よりもサイズが小さい粒子は流体流の方向をたどり、分別されて出口９４５を通る。１つの例では、ピラー３１４は、ギャップ・サイズをさらに低減すること、または化学修飾に対する親和性を持つ粒子を分別すること、あるいはその両方ができる本明細書で論じた化学修飾を有することができる。出口９４０および９４５は、分別後に分別粒子が通り抜けて流れ、それをビンの中に集めることができる開口とすることができる。
【００６０】
図１２は、本発明の一実施形態による、流体装置１１００（たとえば、チップ１１００）を提供する方法１２００である。上で論じた図１〜図１１を参照することができる。ブロック１２０５で、入口１１０５が、流体を受け入れるように構成される。ブロック１２１０で、出口（たとえば、出口９４０、９４５）が、流体が出るように構成される。ブロック１２１５で、ナノピラー・アレイ３２０が入口および出口と結合され、ナノピラー・アレイ３２０が、流体が入口から出口まで流れることができるように構成される。
【００６１】
ブロック１２２０で、ナノピラー・アレイ３２０は、生物学的エンティティ（粒子）をサイズによって分離するように配置したナノピラー３１４を含む。ブロック１２２５で、ナノピラー３１４は、ギャップＧが一方のナノピラー３１４を他方のナノピラー３１４から分離するように配置され、ギャップは、ナノスケール範囲（たとえば、１００ｎｍ未満）になるように構築される。
【００６２】
一方のナノピラーは、他方のナノピラーのそばに、ギャップＧが中間にくるようにある。一方のナノピラーと他方のナノピラーの間のギャップは、一方のナノピラーと他方のナノピラーの垂直軸に沿って均一である（たとえば、図１０Ｂに示されるギャップＧ５など）。
【００６３】
ナノピラー・アレイは、ナノピラーに施した酸化物層３１６を含み、酸化物層３１６によりギャップは、一方のナノピラーと他方のナノピラーの垂直軸に沿って均一になる（たとえば、ギャップＧ５は、図１０Ｂの２つのナノピラー３１４の上下の間隔が均一である）。
【００６４】
酸化物層３１６により、ギャップ（たとえば、ギャップＧ５）のサイズが約２０ナノメートルにまで小さくなるが、このギャップは垂直軸（たとえば、図１０Ｂのｙ軸）に沿って均一のままである。酸化物層３１６により、ナノピラーの直径の不均一さが（たとえば、図１０Ａのピラー３１４の直径が均一ではない）図１０Ｂでは均一になって、ギャップは、一方のナノピラーと他方のナノピラーの垂直軸に沿って均一になる。酸化物層３１６の厚さが増大すると、ギャップのサイズが減少する。
【００６５】
ある場合には、ギャップのサイズは２０〜３００ｎｍの範囲にある。別の事例では、ギャップのサイズは、分離すべき粒子の所望のサイズに応じて、１００ｎｍ未満にすることができ、８０ｎｍ未満にすることができ、６０ｎｍ未満にすることができ、４０ｎｍ未満にすることができ、３０ｎｍ未満にすることができ、２５ｎｍ未満にすることなどができる。たとえば、１００ｎｍ粒子は、本発明の一実施形態によれば、２４０ｎｍサイズのギャップで分別／分離することができる。
【００６６】
単分子層（たとえば、図７Ａ、図７Ｂの単分子層、図８Ｂの単分子層８１５、または図９Ａの単分子層９１５あるいはこれらの組合せ）をナノピラー３１４に施して、ギャップのサイズを低減する。サイズが低減したギャップは、単分子層がナノピラーに施されない場合に比べて、より小さいエンティティを分離する構成になる。
【００６７】
図１３は、本発明の一実施形態による、ナノピラー・アレイ３２０を形成する方法１３００である。図１〜図１２を参照することができる。
【００６８】
ブロック１３０５で、ハード・マスク層３０４が基板３０２上に配置される。ブロック１３１０で、レジスト層３０６が、ハード・マスク層３０４上にレジスト層３０６が配置されたナノピラー・アレイ３２０のパターン（レジスト・パターン３０８）になるように、パターニングされる。
【００６９】
ブロック１３１５で、レジスト層（レジスト・パターン３０８）を利用してハード・マスク層３０４をナノピラー・アレイ３２０のパターン（ハード・マスク・パターン３１２）になるようにパターニングし、それによりレジスト層もハード・マスク層もナノピラー・アレイ３２０のパターンを有するようにする。
【００７０】
ブロック１３２０で、基板３０２がナノピラー・アレイ３２０のパターンになるようにパターニングされ、それによりここでナノピラー・アレイ３２０が形成され、ここでレジスト層（レジスト・パターン３０８）およびハード・マスク層（ハード・マスク・パターン３１２）が除去され、ナノピラー・アレイのナノピラー３１４が、互いに横方向に対して第１のギャップ・サイズ（たとえば、図１０Ａのギャップ・サイズＧ１またはＧ２あるいはその両方）を有する。ブロック１３２５で、酸化物層３１６をナノピラー・アレイ３２０上に配置することによって、第１のギャップ・サイズが第２のギャップ・サイズ（たとえば、ギャップ・サイズＧ５）にまで低減する。
【００７１】
電子ビーム・リソグラフィまたはナノインプリント・リソグラフィあるいはその両方、または他のリソグラフィの形のうちの少なくとも１つによって、レジスト層をナノピラー・アレイ３２０のパターン（レジスト・パターン３０８）になるようにパターニングする。
【００７２】
レジスト層を利用してハード・マスク層をナノピラー・アレイのパターンになるようにパターニングすることは、反応性イオン・エッチングを実行してハード・マスクをナノピラー・アレイ３２０のパターン（ハード・マスク・パターン３１２）になるようにエッチングすることを含む。
【００７３】
基板３０２をナノピラー・アレイのパターンになるようにパターニングしてナノピラー・アレイが形成されるようにすることが、基板をナノピラー・アレイ３２０になるようにエッチングするための反応性イオン・エッチングを実行することを含む。
【００７４】
酸化物層３１６をナノピラー・アレイ３２０上に配置することによって、ギャップ・サイズ（たとえば、ギャップ・サイズＧ１およびＧ２）を第２のギャップ・サイズにまで低減することが、第２のギャップ・サイズを低減すること（たとえば、３００ナノメートル未満にまで、１００ナノメートル未満にまでなど）を含む。
【００７５】
酸化物層をナノピラー・アレイ上に配置することによって、第１のギャップ・サイズを第２のギャップ・サイズにまで低減すると、ナノピラーのそれぞれが均一な形状を有することになり、また第２のギャップ・サイズが、ナノピラーの横方向に対して、ナノピラー・アレイ全体にわたって均一になる（図１０Ａおよび図１０Ｂに示すように）。酸化物層を配置することによって、第１のギャップ・サイズを第２のギャップ・サイズにまで低減する前に、ナノピラーは、ナノピラーの中央に内向きの弓形をナノスケール・レベルで有する。酸化物層を配置することによって、第１のギャップ・サイズを第２のギャップ・サイズにまで低減すると、中央の内向きの弓形を埋めることにも、ナノピラーを円筒状の形にまっすぐにすることにもなる。
【００７６】
本明細書で論じたように、諸実施形態は、ミクロン領域からナノメートル領域に至るまでのサイズによって分子および粒子を分離できる、ナノピラーおよびナノギャップを有するシリコン・チップを提供する。分離できる２つ以上のエンティティ（粒子）のサイズは、ナノピラー間のギャップ（すなわち、ナノギャップ）のサイズによって決まる。最新技術には、エンティティをサイズによって１０〜１００ｎｍスケールで分別する技術はない。しかし、本明細書で論じた本発明の実施形態は、この範囲（１０〜１００ｎｍ）の中、上、および下のエンティティを分別するための機構を提供する。たとえば、本発明の実施形態では、３０ｎｍ粒子を４０ｎｍ粒子から分別することができる。さらに、諸実施形態は連続流生物分離を提供し、このことは、粒子分別が流体のように連続的であり、かつ（分別すべき）エンティティがナノピラー・アレイ３２０の１つまたは複数の入口に導入されることを意味し、連続流生物分離ナノピラー・アレイ３２０は、いかなるタイプのリセットも必要とせずにエンティティを連続して分別する。
【００７７】
たとえば、本発明の実施形態の技術を用いてチップ１１００中に溶液混合物を流し、それによって、指定サイズ範囲内の粒子の連続分離を得ることができる。異種粒子溶液がチップ１１００の入口に導入され、溶液流により粒子がピラー網（すなわち、ピラー・アレイ３２０）を通して搬送される。大きい方のサイズの粒子が、ナノピラー３１４のオフセットδおよびピッチλによって規定された事前設定角度（すなわち、臨界角α）により、ナノピラー３１４に当たって跳ね返る。こうして、大きい方の粒子の軌道は、特定のマイクロチャネル出口（たとえば、出口９４０）に向けられ（衝突モード）、ここで分別試料を抽出できるのに対し、小さい方の粒子は、流体流の方向と平行にナノピラー３１４中をジグザグに進み、この場合、小さい方の粒子は、別のマイクロチャネル（たとえば、出口９４５）を通ってチップ１１００を出る。
【００７８】
本発明の実施形態の改善が、この種の連続流分離がナノメートル・スケールで機能することを可能にして、生物マーカ、生物分子、細胞以下構成要素、エキソソーム、ウイルス、イムノアッセイ、薬物スクリーニング、およびタンパク質凝集物の、Ｓｉチップ（たとえば、チップ１１００など）上での効率的な分離が可能になる。本発明の実施形態は、最新技術におけるミクロン・スケールからの大幅な縮小になる。最新技術に勝る改善は、粒子をナノスケールで分別できるナノピラーのナノ加工によって実現された。本発明の実施形態はまた、この新たなスケールで、異なる流れ領域が適合し、分別方法を改善することも実証した。このスケールでは、ナノピラー間の滞流（dead flow）領域がナノピラー・サイズに対応して重要になる。これらのデッド・フロー領域が存在することが、ナノピラー壁と壁間隔によって画定された物理的ギャップ（Ｇ）よりも狭いナノピラー間の流体ギャップをもたらす。これにより、当初理論的に予測したものよりも小さい粒子サイズを分別する機能が得られる。
【００７９】
図１４は、本発明の一実施形態による、ナノピラー・アレイ３２０中のピラー３１４の配置を表す概略上面図である。この例では、ピラー・アレイ３２０は複数のピラー・アレイと考えることができる。たとえば、ピラー・アレイ３２０は、ピラー３１４の対称部分／配列１４０５、およびピラー３１４の非対称部分／配列１４１０を含む。対称部分１４０５は、（実質的に）０°である臨界角を有するのに対し、非対称部分１４１０は、（図１４のｚ軸に対して規定された）臨界角αを有する。
【００８０】
図１４では、流れの向き（すなわち、流体流方向）は概して水平であり、ピラー列は、ナノピラー・アレイ３２０の非対称部分１４１０において、ある角度に傾斜している（すなわち、臨界角αを形成する）。十分に遅い流体の流速では、ピラー３１４間の距離（ギャップＧ）は、臨界角とともに、ピラー３１４を通り抜けてジグザグに進むことによって流れ方向に従うことができる粒子のサイズ（臨界寸法よりも小さい）と、ピラー列の角度によって変位する（衝突する）粒子のサイズ（臨界寸法以上）とを規定する。ある場合には、遅い流速は、５００μｍ／ｓよりも遅い流れに相当し得る。
【００８１】
ピラー３１４は、ある直径、ピラー・ピッチλ、ギャップ（Ｇ）、および列間シフト（δ）を有する。列間シフト（δ）は、対称部分１４０５には列間シフトがないので、非対称部分１４１０にある。図１４の例では、サイズが異なる２つの例示的な粒子が、ピラー・アレイ３２０を通り抜けて進んでいる。大きい方の粒子１４５０が、ピラー角（すなわち、臨界角α）に応じて、アレイ３２０全体にわたって変位する（破線で示す）のに対し、小さい方の粒子１４５５は、アレイ３２０を通る決定論的流れ（実線）に従って、ピラー３１４を通り抜けてジグザグに進む。
【００８２】
図１５は、一実施形態による、現在２つの入口があり、サイズの異なる粒子がナノピラー・アレイ３２０中を横断するチップ１１００の概略図である。大きい方の粒子１４５０が破線に沿って、ピラー角（臨界角）に応じてアレイ３２０全体にわたり変位するのに対し、小さい方の粒子１４５５は、ピラー３１４を通り抜けてジグザグに進むことによって、アレイを通る決定論的流れに従う。大きいナノ粒子１４５０および小さい方のナノ粒子１４５５は、別々のマイクロ流体チャネルを通ってアレイを出る。たとえば、大きいナノ粒子１４５０（たとえば、臨界寸法以上）は、出口９４０を通ってアレイを出るのに対し、小さいナノ粒子１４５５（たとえば、臨界寸法未満）は、出口９４５を通ってアレイを出る。この例では、緩衝溶液であり得る流体は、入口１１０５としてのバッファから導入することができる。緩衝溶液（ｐＨ緩衝液または水素イオン緩衝液とも呼ばれる）は、弱い酸とその共役塩基、またはその逆の混合物からなる水溶液である。分別すべきナノ粒子１４５０および１４５５を含む試料は、同一の入口１５１０から導入される。２つの粒子しか示されていないが、同じ分別プロセスが、試料入口１５１０に導入されるサイズの異なる多数の粒子に適用される。
【００８３】
図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃ、および図１６Ｄは、本発明の一実施形態による、ナノ・ビーズの２つの集団にナノピラー・アレイ３２０を通過させた実験結果を表す。図１６Ａおよび図１６Ｂは直径７０ｎｍビーズの集団に対応し、図１６Ｃおよび図１６Ｄは直径５０ｎｍビーズの集団に対応する。図１６Ａおよび図１６Ｃでは、それぞれのビーズの軌道が蛍光顕微鏡のビデオ・カメラで記録されている。この例では、ナノピラー３１４間のギャップ・サイズ（Ｇ）は２１０ｎｍである。
【００８４】
図１６Ａは、５．７°臨界角アレイ（３２０）内で変位している７０ｎｍビーズの粒子軌道の画像である。図１６Ａは、直径７０ｎｍビーズのビーズ軌道に、流れ方向に対する角度が付いていることを示す。７０ｎｍビーズについて観察された平均軌道角は、５．７°の角度である。３つの７０ｎｍ粒子の印付き軌道が示されている。流れ方向（すなわち、流体流方向）と粒子軌道の間の角度は、粒子がアレイ３２０内で衝突している度合いを示す。これら７０ｎｍ粒子については、速度の関数としての軌道角度のグラフが、図１６Ｂでは臨界角に近い正の値を示している。言い換えると、図１６Ｂでグラフ化された７０ｎｍビーズの平均軌道角はおよそ５．７°であり、これは、実験におけるアレイ３２０の５．７°臨界角で予測されるものである。
【００８５】
図１６Ｃは、同じアレイ３２０内で分別された直径５０ｎｍビーズの粒子軌道の画像である。同じ条件下で（５．７°臨界角を有する同じナノピラー・アレイ３２０を含めて）、５０ｎｍビーズがアレイ３２０内に導入され、その軌道が図１６Ｃに記録されている。これら５０ｎｍ粒子はアレイ３２０内で変位せず（すなわち、衝突モードではない）、このことは図１６Ｄの軌道角と速度のグラフで確認される。図１６Ｄのグラフは、対称に近い軌道角の分布を０°のまわりに示す（すなわち、アレイ３２０の流れ軸に一致して）。また、図１６Ｃは、５０ｎｍビーズがたどる平均軌道角が０°に近いことを示す。
【００８６】
図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃ、および図１６Ｄで分かるように、ナノピラー・アレイ３２０は、７０ｎｍビーズを第２の方向にピラー・アレイ３２０の臨界角に沿って出力しながら、５０ｎｍビーズを第１の方向に流れ軸に沿って出力することによって、５０ｎｍビーズを７０ｎｍビーズから分別するように構成される。
【００８７】
図１７は、本発明の一実施形態によるナノピラー・アレイ３２０を利用して、あるサイズの粒子を別のサイズの粒子から分離するためのおおよそのギャップ・サイズの例示的なデータを示す表である。図１７の表の例示的なデータは、限定ではなく説明を目的とするものであることに留意されたい。ナノピラー間のギャップ・サイズ（Ｇ）が横に列記され、粒子直径が縦に列記されている。各実験の結果が、変位なし、部分的変位、または変位１００％として示されている。変位１００％とは、アレイ上の粒子の軌道角が設定ピラー臨界角と同じである、またはこの角度の１５％以内であることを意味する。部分的変位は、ナノピラー臨界角の１５％から８５％の範囲にある粒子軌道に相当する。変位なしは、粒子の軌道角がナノピラー・アレイ臨界角の１５％未満であるすべての実験結果である。
【００８８】
１つの実施態様では、本発明の実施形態は、ピラー間の、１００ｎｍ未満の領域の寸法を有する、均一なギャップがある製造可能な（シリコン）ピラー・アレイ３２０に依拠する。これらのアレイ３２０は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、エキソソーム、個々のタンパク質、およびタンパク質複合体などの、これらの寸法の生物学的エンティティを分別および分離するためのものである。本発明の実施形態によれば、均一なギャップ・サイズを利用して、たとえば２０ｎｍ粒子を１０ｎｍ粒子から分別するための効率的な分別が得られる。これは特に、分別すべき粒子の寸法よりも大きい固有変化があり得る１００ｎｍ未満の領域のギャップでは、困難である。これは通常は、このスケールにおける不均一なナノパターニング、および反応性イオン・エッチング（ＲＩＥ）プロセスによるサイズおよび形状のフィーチャ変化が原因となる。最新技術において見出される実証済み分別ピラー・ギャップは、ミクロン範囲の寸法を有し、したがって、このスケールの細さの近くでさえも分別することができない。
【００８９】
したがって、ナノメートル領域において不変のギャップが、たとえばタンパク質凝集物を分別するには必要になる。個々のタンパク質（たとえば、１〜１０ｎｍのサイズ範囲）の分別は従来、イオン交換クロマトグラフィまたはゲル電気泳動法を使用して行われているが、これらは、連続流ではなくロード・アンド・ラン技法であり、したがって非常に遅い。しかし、本発明の実施形態は連続流分離プロセスおよび機構を提供し、これは、イオン交換クロマトグラフィまたはゲル電気泳動を必要とせずに、１〜１０ｎｍの範囲の個々のタンパク質（または他の粒子）を分別するように構成される。
【００９０】
図１８は、本発明の一実施形態による、エンティティを分別する方法１８００である。図１〜図１７を参照することができる。
【００９１】
ブロック１８０５で、エンティティがナノピラー・アレイ３２０に導入され、このエンティティは第１の集団および第２の集団を含む。ナノピラー・アレイ３２０は、ギャップが一方を他方から分離するように配置されたナノピラー３１４を含み、このナノピラーは、あるアレイ角を流体流方向に対して有するように整列される。
【００９２】
ブロック１８１０で、既定の臨界サイズ未満のエンティティの第１の集団を第１の方向に（たとえば、出口９４５に向けて）移送することによって、また少なくとも既定のサイズのエンティティの第２の集団を第１の方向とは異なる第２の方向に（たとえば、出口９４０に向けて）移送することによって、エンティティがナノピラー・アレイ３２０に通されて分別される。
【００９３】
ブロック１８１５で、１００ｎｍ未満のサイズを有するエンティティを分別するために、ナノピラー・アレイ３２０が、３００ナノメートル未満または１００ナノメートル未満のギャップ・サイズを有するギャップを使用するように構成される。
【００９４】
エンティティが７ナノメートル以上のナノメートル・サイズを有する場合、ナノピラー・アレイは、それに応じて７ナノメートル以上のナノメートル・サイズを有するエンティティを分別するように構成される。エンティティが７ナノメートル以上のナノメートル・サイズを有する場合、ギャップ・サイズは、それに応じて７ナノメートル以上のナノメートル・サイズを有するエンティティを分別するように構成される。
【００９５】
ギャップ・サイズの下限は約２０ナノメートルとすることができる。ナノピラー・アレイ３２０に施される酸化物層３１６の厚さにより、ギャップのギャップ・サイズは約２０ナノメートルになるとともに、ギャップは均一のままである。言い換えると、ギャップは、任意の２つのナノピラー３１４間の垂直軸（たとえば、ｙ軸）に沿って均一であり（すなわち、ギャップ変化なし）、またギャップのそれぞれが、ナノピラー・アレイ３２０全体にわたって同じギャップ・サイズを有する。
【００９６】
ギャップのギャップ・サイズは、少なくとも既定のサイズのエンティティの第２の集団を第２の方向に分別しながら、既定の臨界サイズ未満のエンティティの第１の集団を第１の方向に分別するように調整される。ギャップ・サイズを調整するのは、ナノピラー・アレイ３２０に施される酸化物層３１６の厚さに基づく。ギャップ・サイズをさらに調整するのは、化学修飾によってナノピラーに施される単分子層に基づき得る（たとえば、図７Ａで付けられた金属なしで、または図７Ｂで付けられた金属ありで、あるいはその両方で）。化学修飾により、単分子層（たとえば、単分子層８１５、９１５など）をナノピラー３１４上に、第１の集団が単分子層に対し親和性を持ち、第２の集団が単分子層に対し親和性を持たないように形成する。単分子層に対し親和性を持つことにより、エンティティの第１の集団（たとえば、エンティティ９１０など）が、第１の方向に（たとえば、出口９４５に）移送されるように導かれる。単分子層に対し親和性を持たないことにより、第２の集団（たとえば、エンティティ９０５など）が、出口９４０に至るまで第２の方向に衝突することが可能になる。ある場合には、両方のエンティティ９０５と９１０をほぼ同じサイズとすることができ、エンティティ９１０の親和性によりエンティティ９１０が出口９４５に向かって進むことになる。エンティティには、生物マーカ、生物分子、細胞以下構成要素、エキソソーム、ウイルス、イムノアッセイ、またはタンパク質凝集物あるいはこれらの組合せのうちの少なくとも１つが含まれる。
【００９７】
エキソソームはますます重要な科学になっているが、最新技術のアレイによって分別するには、たとえば３０〜１００ｎｍと、小さすぎる。現在エキソソームは、あらゆる体液中に存在すると考えられており、細胞シグナル伝達についての新しい考え方を提示する。これらの小さい細胞外小胞は、多数の生物学的機能において役割を果たすと考えられている。たとえば、エキソソームは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などを含み移送することができるメッセージ伝達系および制御系である。ナノピラー・アレイ３２０では、ギャップ・サイズは、１つのサイズのエキソソームをより大きいサイズのエキソソームから分別するために、またはより小さいエキソソームを異なる（より大きい）粒子から分別するために、あるいはその両方のために、酸化物層３１６によって狭くすることができる。加えて、エキソソームは、特定のリガンドに対して特別な親和性（すなわち、引力）を有する。たとえば、［６-（ピレン−２−イル）オクチル］シランまたは３−［（８−シリルオクチル）オキシ］コレステロールなどの、脂質膜統合リガンドからなる単分子層８１５、９１５をピラー３１４に施してエキソソームを第１の方向に向けることが、別の粒子を、別の粒子は特別な親和性を持たないので第２の方向に向けながら、可能である。したがって、ある場合に別の粒子がエキソソームと同じ（または類似の）サイズを有するとしても、エキソソームはやはり、特定のリガンドに対するその特別な親和性の故に、分別することができる。エキソソームに対する特別な親和性を有する特定のリガンドが説明を目的として論じられているが、エキソソームに対する特別な親和性を有する特定のリガンドはこれらの例に限定されないことを理解されたい。
【００９８】
図１９は、本発明の一実施形態による、エンティティを分別する方法１９００である。図１〜図１８を参照することができる。
【００９９】
ブロック１９０５で、分別すべきエンティティがナノピラー・アレイ３２０に導入され（たとえば、入口１１０５または入口１５１０あるいはその両方を介して）、このエンティティは第１の集団および第２の集団を含む。ナノピラー・アレイ３２０は、ギャップＧが一方を他方から分離するように配置されたナノピラー３１４を含み、このナノピラーは、あるアレイ角（たとえば、臨界角）を流体流方向に対して有するように整列される。
【０１００】
ブロック１９１０で、ナノピラー・アレイ３２０は、エンティティの第１の集団は第１の方向に出力され、エンティティの第２の集団は第１の方向とは異なる第２の方向に出力されるように、出口（収集トレイまたは収集ビンにそれぞれ装着／結合することができる出口９４０または９４５あるいはその両方など）で、分別されることに基づいてエンティティを受けるように構成される。
【０１０１】
ブロック１９１５で、ギャップＧのギャップ・サイズが、第１の集団を第１の方向に、第２の集団を第２の方向に分別するように調整され、ギャップ・サイズは、ナノピラー・アレイ３２０上に配置された酸化物層３１６の厚さ、またはギャップへの化学修飾（図７〜図９など）の少なくとも一方あるいは両方により調整される。
【０１０２】
ギャップ・サイズが酸化物層３１６によって調整される場合、酸化物層３１６はギャップ・サイズを第１の寸法にまで低減する。ギャップ・サイズが化学修飾によって調整される場合、化学修飾はギャップ・サイズを第２の寸法にまでさらに低減し、この第２の寸法は第１の寸法よりも小さい。
【０１０３】
第１の寸法は、ギャップ・サイズを約２０ナノメートルにまで低減する酸化物層３１６に対応するとともに、ギャップは均一のままである。第２の寸法は、ギャップ・サイズを２０ナノメートル未満にまでさらに低減する（たとえば、酸化物層３１６が堆積された後に）化学修飾（たとえば、リガンドの付着）に対応する。第２の寸法に対し、化学修飾はギャップ・サイズを１８、１６、１４、１２、または１０ナノメートルにまで低減することができる。ある場合には、化学修飾により、ギャップ・サイズを第２の寸法として１０ナノメートル未満にまで低減することができる。別の場合には、化学修飾（より長いリガンドを使用する）により、ギャップ・サイズを第２の寸法として８、６、４、または２ナノメートルにまで低減することができる。望まれる場合、化学修飾によりギャップ・サイズを第２の寸法として２ナノメートル未満にまで低減することによって、ギャップをほとんど閉鎖することができる。
【０１０４】
ギャップ・サイズが化学修飾によって調整される場合、化学修飾によりギャップ・サイズを第１の寸法にまで低減する。酸化物層３１６が施されない場合でも、化学修飾がナノピラー３１４に施され得ることが企図されている。
【０１０５】
化学修飾では単分子層をナノピラー上に、第１の集団が単分子層に対し親和性を持ち、第２の集団が単分子層に対し親和性を持たないように形成する。単分子層に対し親和性を持つことにより、エンティティの第１の集団を第１の方向に出力されるように導く。エンティティには、生物マーカ、生物分子、細胞以下構成要素、エキソソーム、ウイルス、イムノアッセイ、またはタンパク質凝集物あるいはこれらの組合せのうちの少なくとも１つが含まれる。
【０１０６】
図２０は、本発明の一実施形態による、エンティティを分別する方法２０００である。図１〜図１９を参照することができる。
【０１０７】
ブロック２００５で、エンティティがナノピラー・アレイ３２０に導入され、このエンティティは第１の集団および第２の集団を含む。ナノピラー・アレイ３２０は、整列配置のナノピラー３１４を含む。ナノピラーは化学修飾を有する。化学修飾についての様々な説明が、図７〜図９に論じられている。
【０１０８】
ブロック２０１０で、出力部（たとえば、出口９４０および９４５）は、エンティティの第１の集団が、化学修飾に対する親和性を持つ第１の集団に基づいて第１の方向（たとえば、図９Ａの出口９４５）に出力され、エンティティの第２の集団が第１の方向とは異なる第２の方向（たとえば、図９Ａの出力９４０）に出力されるように、分別後にエンティティを受ける。また、１つまたは複数の出口（出口９４０および９４５）に入る／を通る、今はもう分離された分別エンティティを受ける操作者がいることもある。操作者は、別個の収集装置を利用または装着して、収集エンティティを別々に受け保持することができる。
【０１０９】
第２の集団は、図９Ａのエンティティ９０５のように、化学修飾に対する親和性を持たない。化学修飾に対する親和性を持たない第２の集団によって、第２の集団が第２の方向（たとえば、出力出口９４０）に出力される。
【０１１０】
堆積は、材料をウェハの上に成長させる、コーティングする、または別の方法で移す任意のプロセスである。利用可能な技術には、それだけには限らないが、熱酸化、物理的気相成長法（ＰＶＤ）、化学的気相成長法（ＣＶＤ）、電気化学堆積（ＥＣＤ）、分子ビーム・エピキタシ（ＭＢＥ）、またより最近には、原子層堆積（ＡＬＤ）がとりわけ含まれる。
【０１１１】
除去は、ウェハから材料を除去する任意のプロセスであり、例としては、エッチング処理（湿式または乾式）、および化学的機械的平坦化（ＣＭＰ）などが含まれる。
【０１１２】
パターニングは、堆積した材料の整形または変更であり、一般にリソグラフィと呼ばれる。たとえば、従来のリソグラフィでは、ウェハがフォトレジストと呼ばれる化学物質でコーティングされ、次に、ステッパと呼ばれる機械がマスクの焦点を合わせ、マスクを位置合わせし、動かして、下のウェハの選択部を短波長光で露光し、露光された領域が現像液で洗い流される。エッチングまたは他の処理後、残っているフォトレジストが除去される。パターニングにはまた、電子ビーム・リソグラフィ、ナノインプリント・リソグラフィ、および反応性イオン・エッチングも含まれる。
【０１１３】
図中の流れ図およびブロック図は、本発明の様々な実施形態による方法の実現可能な実施態様の機能および動作を示す。いくつかの代替実施態様では、ブロック中に示された機能が、図に示された順序から外れて行われ得る。たとえば、連続して示された２つのブロックが、実際には実質的に同時に実行されることがあり、あるいは各ブロックが、含まれる機能に応じて、場合により逆の順序で実行されることがある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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