(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス様粒子を含む免疫賦活化剤であって、
前記ウイルス様粒子が、
・配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む外殻タンパク質を含み、
・前記外殻タンパク質が前記ウイルス様粒子の外殻を構成し、
前記ウイルス様粒子は、SV40のゲノムDNAを実質的に含まず、且つ抗原を含まない、
全身性炎症を誘導するサイトカインの分泌を誘導せず、局所炎症を誘導するケモカインの分泌を誘導する、前記免疫賦活化剤。
【請求項２】
全身性炎症を誘導するサイトカインが、IFN-γ、TNF-α、IL-6及びIL-1βからなる群より選択される少なくとも１種であり、局所炎症を誘導するケモカインがCCL3及びCCL4からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１に記載の免疫賦活化剤。
【請求項３】
前記ウイルス様粒子は、VP2、VP3またはその両方を実質的に含まない、請求項１又は２に記載の免疫賦活化剤。
【請求項４】
抗原に対する生体の免疫作用を賦活化する免疫賦活化剤の製造方法であって、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む外殻タンパク質を用いてウイルス様粒子を調製する工程を含み、
前記外殻タンパク質が前記ウイルス様粒子の外殻を構成し、前記外殻内にゲノムDNAを実質的に含まず、前記ウイルス様粒子が抗原を含まず、
前記免疫賦活化剤が、全身性炎症を誘導するサイトカインの分泌を誘導せず、局所炎症を誘導するケモカインの分泌を誘導する、
ウイルス様粒子を含む免疫賦活化剤の製造方法。
【請求項５】
全身性炎症を誘導するサイトカインが、IFN-γ、TNF-α、IL-6及びIL-1βからなる群より選択される少なくとも１種であり、局所炎症を誘導するケモカインがCCL3及びCCL4からなる群より選択される少なくとも１種である請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記調製工程の前に
前記外殻タンパク質をコードするDNAを宿主細胞に導入し、前記宿主細胞に前記外殻タンパク質を発現させることにより、前記外殻タンパク質を取得する工程
を含む、請求項４又は５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記宿主細胞が、昆虫細胞、大腸菌、酵母、植物細胞からなる群より選択される、請求項６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス様粒子を含む免疫賦活化剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
病原体への感染防御（感染予防）や、感染症、がんなどの疾患の治療のために、生体にワクチンを投与することがある。ワクチンは通常免疫賦活化剤と共に投与される。免疫賦活化剤はアジュバントとも呼ばれ、ワクチン抗原に対する免疫反応の増強などワクチンの効果を高める作用がある。たとえば、特許文献１には、ペプチドワクチンを含む薬学的組成物にアジュバントを含み得ることが記載されている。具体的には、アジュバントの例として、リン酸アルミニウムや水酸化アルミニウムなどが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１５−１７４２２３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、新規の免疫賦活化剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、SV40の外殻を有するウイルス様粒子がアジュバントとしての性質を有することを意外にも見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明によれば、ウイルス様粒子を含む免疫賦活化剤であって、前記ウイルス様粒子が、配列番号１、配列番号２６、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３および配列番号４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む外殻タンパク質を含み、前記外殻タンパク質が前記ウイルス様粒子の外殻を構成し、前記ウイルス様粒子は、SV40のゲノムDNAを実質的に含まない、前記免疫賦活化剤が提供される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、抗原に対する生体の免疫作用を賦活化する新規物質を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ウイルス様粒子の一例を示す模式図である。
【図２】ウイルス様粒子の一例を示す模式図である。
【図３Ａ】wt SV40 VP1 VLPとFMP:58-66ペプチドとの架橋反応が起きていることを示すCBB染色およびウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図３Ｂ】FMP:58-66ペプチドが固定されたwt SV40 VP1 VLPで腹腔内免疫されたマウスの脾臓から調製したリンパ球について行ったICS解析の結果を示す図である。
【図３Ｃ】FMP:58-66ペプチドが固定されたBSAで腹腔内免疫されたマウスの脾臓から調製したリンパ球について行ったICS解析の結果を示す図である。
【図３Ｄ】腹腔投与によりFMP:58-66ペプチドが固定されたwt SV40 VP1 VLPで免疫されたマウスの脾臓から調製したリンパ球について行った51Chrome release解析の結果を示す図である。
【図４Ａ】wt SV40 VP1 VLPで刺激した非免疫マウス由来リンパ球の増殖を示す写真である。
【図４Ｂ】wt SV40 VP1 VLPで刺激した非免疫マウス由来リンパ球におけるCD86発現を示すFACScan解析結果を示す図である。
【図５】FMP-DE-VLPまたはFMP-HI-VLPで刺激した非免疫マウス由来リンパ球におけるCD86発現を示すFACScan解析結果を示す図である。
【図６Ａ】wt SV40 VP1 VLPで刺激した非免疫マウス由来リンパ球におけるCD86発現誘導に対するGM1またはGD1a処理の影響を示すFACScan解析結果を示す図である。
【図６Ｂ】FMP-DE-VLPまたはFMP-HI-VLPで刺激した非免疫マウス由来リンパ球におけるCD86発現誘導に対するGM1またはGD1a処理の影響を示すFACScan解析結果を示す図である。
【図６Ｃ】VP2-M1を内包するwt SV40 VP1 VLP、VP2-M1を内包するDE-FLAG VLPまたはVP2-M1を内包するDE-3xRGD VLPで刺激した非免疫マウス由来リンパ球におけるCD86発現誘導に対するGM1またはGD1a処理の影響を示すFACScan解析結果を示す図である。
【図７Ａ】wt SV40 VP1 VLPで刺激した非免疫マウス由来リンパ球における各種CD分子の発現を示すFACScan解析結果を示す図である。
【図７Ｂ】wt SV40 VP1 VLPで刺激した非免疫マウス由来リンパ球における各種CD分子の発現を示すFACScan解析結果を示す図である。
【図８】wt SV40 VP1 VLPで刺激した非免疫マウス由来のCD4+T細胞、CD8+T細胞またはB細胞における各種CD分子の発現を示すFACScan解析結果を示す図である。
【図９】wt SV40 VP1 VLPで刺激した非免疫マウス由来リンパ球による各種サイトカインまたはケモカインの産生を示すグラフである。
【図１０Ａ】SV40で刺激した非免疫マウス由来のCD86の発現を示すFACScan解析結果を示す図である。
【図１０Ｂ】SV40で刺激した非免疫マウス由来リンパ球による各種サイトカインまたはケモカインの産生を示すグラフである。
【図１１Ａ】wt SV40 VP1 VLPで刺激した非免疫マウス由来リンパ球によるErk1/2のリン酸化を示すFACScan解析結果を示す図である。
【図１１Ｂ】wt SV40 VP1 VLPで刺激した非免疫マウス由来リンパ球によるJNKのリン酸化を示すFACScan解析結果を示す図である。
【図１１Ｃ】wt SV40 VP1 VLPで刺激した非免疫マウス由来リンパ球によるp38MAPKのリン酸化を示すFACScan解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本実施形態の免疫賦活化剤は、SV40 (Simian Virus 40)に由来する外殻タンパク質から構成される外殻を有するウイルス様粒子を含む。ここで、「外殻が外殻タンパク質から構成される」とは、外殻が実質的に外殻タンパク質からなることを意味する。すなわち、外殻は、外殻タンパク質のみで構成されていてもよいし、または外殻の構造が維持される範囲において外殻タンパク質および該外殻タンパク質に結合可能なタンパク質で構成されていてもよい。より具体的には、野生型SV40ウイルスの外殻はVP1五量体ユニットが72個集合することによって構成され、構成された外殻の内側にはVP2およびVP3が裏打ちとして結合しているが、SV40のVP1は、VP2やVP3がなくてもそれだけで外殻を構成することが可能である。つまり、本実施形態において、外殻タンパク質は、SV40 VP1のように、実質的にそれらだけで外殻を構成し得るタンパク質を意味する。
【００１０】
ウイルス様粒子の外殻は、好ましくは、VP2、VP3またはその両方を実質的に含まない。ここで、「ウイルス様粒子の外殻がVP2、VP3またはその両方を実質的に含まない」とは、ウイルス様粒子の外殻にVP2またはVP3が含まれる可能性を排除するものではなく、野生型SV40におけるVP2およびVP3の本来の機能を発揮し得ない形であれば、外殻形成に非必須のメンバーとしてそれらが存在する可能性を残す表現として用いられる。より好ましくは、ウイルス様粒子の外殻は、VP2およびVP3の両方を含まない。
【００１１】
SV40とは、国際ウイルス分類委員会(International Committee on Taxonomy of Viruses: ICTV)により2014年に公表されたウイルス分類において、ポリオーマウイルス属(Genus: Polyomavirus)に属するウイルスの一種である。ウイルス分類においては、分類の再編や属名や種名等の改変が頻繁に行われる。よって、将来ICTVまたはそれに準ずる学術的権威機関による分類において分類が再編されたり、属名や種名等が改変されたりする可能性があるが、2014年のICTV分類におけるSV40に相当するウイルスは、当然に本明細書でいうところのSV40に包含されるものとする。
【００１２】
外殻タンパク質は、野生型ウイルスのものと完全に同一のアミノ酸配列を有している必要はなく、外殻形成に支障がない限り、アミノ酸配列が変異していてもよい。ここで、アミノ酸配列の変異とは、野生型の配列に比べてアミノ酸残基の１つ又は複数が置換、欠失、または付加されていることを意味する。変異アミノ酸配列は、好ましくは、野生型SV40 VP1のアミノ酸配列(配列番号１)と少なくとも８５％、より好ましくは９０％、更に好ましくは９５％の配列同一性を有する。外殻タンパク質は、その自己集合化能により外殻を形成するものであってもよいし、宿主に内在する因子の作用によって外殻を形成するものであってもよい。外殻タンパク質は、単量体のまま外殻を形成するものであってもよいし、多量体から構成される外殻形成ユニット(カプソメア)を形成し、それが集合することによって外殻を形成するものであってもよい。外殻タンパク質は、好ましくは２〜10量体、より好ましくは３〜５量体のカプソメアが50〜500個程度集合して外殻を形成するものである。外殻タンパク質は、天然のタンパク質を抽出・精製したものであってもよいし、遺伝子工学的手法などにより人工的に合成されたものであってもよい。
【００１３】
外殻タンパク質は、配列番号１、配列番号２６、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３および配列番号４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。配列番号１は、野生型SV40のVP1 (wt SV40 VP1)のアミノ酸配列であり、配列番号２または配列番号２５の核酸配列にコードされる。配列番号２６は、変異型SV40 VP1のアミノ酸配列の１つであり、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１または配列番号３２の核酸配列にコードされる。また、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３および配列番号４５は、各々が変異型SV40 VP1のアミノ酸配列の１つであり、それぞれ配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４および配列番号４６の核酸配列によりコードされる。
【００１４】
ウイルス様粒子は、SV40のゲノムDNAを実質的に含まない。ここで、「SV40のゲノムDNAを実質的に含まない」とは、SV40の自己複製のために機能するDNAを含まないことを意味する。ウイルス様粒子は、SV40のゲノムDNAを実質的に含まないため、天然のウイルスのように宿主細胞に寄生して自己複製を行うことができない。自己複製のために機能しないのであれば、ウイルス様粒子はSV40のゲノムDNAの少なくとも一部を含んでいてもよい。
【００１５】
外殻の形状は特に限定されない。球状であってもよいし、管状であってもよい。外殻は、たとえば、正八面体〜正二十面体の略球状である。野生型SV40のVP1は、略球状の正二十面体の外殻を形成するが、特に外殻タンパク質のアミノ酸配列に変異がある場合には、野生型の外殻とは異なる形状であってもよい。
【００１６】
外殻が外殻タンパク質の単量体から構成される場合、１つの外殻を構成する単量体の数は特に限定されないが、好ましくは100〜1000個、より好ましくは150〜500個である。外殻がカプソメアから構成される場合、１つの外殻を構成するカプソメアの数は、好ましくは50〜390個、より好ましくは72〜260個である。野生型SV40のVP1は、5量体のVP1から構成されるカプソメアが72個(単量体数360個)集合して外殻を形成するが、特に外殻タンパク質のアミノ酸配列に変異がある場合には、野生型とは異なる形態で外殻を構成していてもよい。
【００１７】
外殻の直径は、特に限定されないが、好ましくは30〜300 nm、より好ましくは45〜200 nmである。野生型SV40の外殻の直径は約45 nmであるが、特に外殻タンパク質のアミノ酸配列に変異がある場合には、野生型とは異なる直径を有していてもよい。
【００１８】
外殻は、上述した野生型VP1および変異型VP1のうち、いずれか1種により構成されていてもよいし、複数種類を含んでいてもよい。
【００１９】
ウイルス様粒子は、ウイルス性疾患の予防又は治療用ワクチンや各種癌の予防又は治療において、ワクチン用抗原と共に投与するためのアジュバントとして使用できる。具体的には、ウイルス様粒子は、疾患、例えば感染症(インフルエンザ、免疫不全症候群、C型肝炎等)、がん(子宮頸がん、咽頭乳頭腫等)、疣贅(尋常性疣贅、封入体疣贅、扁平疣贅等)、HPV関連表皮様嚢腫、疣贅状表皮発育異常症、尖圭コンジローマ、ボーエン様丘疹症等の予防又は治療において、ワクチン用抗原と共に投与するためのアジュバントとして用いることができる。
【００２０】
ウイルス様粒子は、抗原と共に生体に投与される場合、当該抗原に対する生体の免疫作用を賦活化することができる。つまり、本実施形態のウイルス様粒子は、疾患、例えばウイルス感染症、細菌感染症、がん等の予防および/または治療において、ワクチン用抗原と共に投与するためのアジュバントとして用いることができる。アジュバントの作用機序は多様であり解明されていないことも多い。１つの通説としては、アジュバントそれ自体が抗原性を有することに起因して免疫細胞の誘導能を高めるために、共に投与された抗原に対する免疫作用を賦活化している可能性があることが知られている。これまでに、SV40は、抗原提示細胞の代表格である樹状細胞において、免疫活性化マーカーであるCD86 (Cluster of Differentiation)分子の発現上昇を誘導しないために、免疫原性が弱いかまたは全くないと考えられてきた。また、ポリオーマウイルス全般に関しても、同様に樹状細胞に対するアジュバント効果はないと考えられていた。しかしながら、今回、本発明者らは、本実施形態のウイルス様粒子がそれ自体で抗原性を有し、抗原と共に投与される場合には、当該抗原に対する免疫作用を賦活化することを意外にも見出した。本実施形態のウイルス様粒子も、それ自体の抗原性に起因して、共に投与される抗原に対する免疫作用を賦活化する可能性がある。本実施形態のウイルス様粒子が、共に投与される抗原に対する生体の免疫作用を賦活化するという知見は、これまでの技術常識に反して、本発明者らが意外にも見出した観点である。
【００２１】
上記の抗原は、ウイルス様粒子の外殻タンパク質に付加されていてもよい。外殻タンパク質において、抗原が付加される部位は特に限定されず、いずれのアミノ酸に付加していてもよい。抗原は、外殻の外側に露出する形で付加していてもよいし、外殻に内包される形で付加していてもよい。
抗原の種類は特に限定されず、ポリペプチド、糖鎖、核酸、脂質などが例示される。ただし、本明細書において、外殻タンパク質は「抗原」に含まれない。抗原は、好ましくはポリペプチド、より好ましくは病原体に由来するポリペプチドである。病原体に由来するポリペプチド抗原としては、例えば、インフルエンザウイルスのHA、NA、M1、M2、NP、NS1、NS2、PA、PB1、PB2、PB1-F2など、HIVのGag、Pol、Env、Tat、Nef、Revなど、C型肝炎ウイルス(HCV)のE1、E2、Core、NS2、NS3、NS4、NS5など、パピローマウイルス科に属するウイルスのE6、E7など、癌細胞に特異的なタンパク質であるMelan-A/MART-1、gp100、MAGEA3、MAGE-A10、CEA、HER2/new、NY-E50-1、WT-1、hTERTなどが挙げられる。これらの中では、インフルエンザウイルスのM1、NP、NS1、PA、PB1、PB2、癌細胞に特異的なタンパク質であるHER2/new、WT-１、MAGE-A3などが好ましい。ポリペプチド抗原のサイズは、特に限定されない。ポリペプチド抗原は、全長タンパク質であってもよいし、少なくともエピトープを含むタンパク質の一部であってもよい。
【００２２】
抗原を外殻ペプチドに付加する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法、例えば化学的手法や遺伝子組換え技術を用いる方法等を用いることができる。化学的手法としては、たとえば当業者に公知の１以上のクロスリンカーによる架橋などが挙げられる。遺伝子組換え技術を用いる方法としては、たとえば米国特許出願番号2014-0286978号のようにSV40ウイルスのVP1をコードする遺伝子に抗原および/または抗原エピトープ(T-helperエピトープ, CTLエピトープ, 抗体エピトープ, ADCC (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)エピトープ等, 免疫反応を誘導するエピトープ)をコードする遺伝子を融合すること等が挙げられる。本実施形態では、抗原および/または抗原エピトープは、具体的にはEDCクロスリンカー(例えばThermo Fisher Scientific社製等)を介する架橋によって付加することができる。
【００２３】
ウイルス様粒子の一例の模式図を図１に示す。この模式図で表されるウイルス様粒子は、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型SV40外殻タンパク質VP1により構成される外殻からなる。図１に例示されるウイルス様粒子は、SV40のゲノムDNAを含まず、5量体のVP1から構成されるカプソメアが72個(単量体数360個)集合して構成された略球状の正二十面体の外殻からなり、その直径は約45 nmである。ウイルス様粒子の別の例の模式図を図２に示す。このウイルス様粒子は、図１に例示したウイルス様粒子と同じ外殻を有し、当該外殻の表面に抗原が付加されている。
【００２４】
ウイルス様粒子は、生体の免疫作用を賦活化する。ここで、「免疫作用を賦活化」とは、抗原に対する免疫反応を増強することをいう。免疫反応の増強は、例えば抗原の投与によって誘導された当該抗原に特異的な細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の産生を増強すること(細胞性免疫の増強)、抗原の投与によって誘導された当該抗原に特異的な抗体の産生を増強すること(液性免疫の増強)などをいう。
【００２５】
１つの実施形態では、ウイルス様粒子は、リンパ球、特にCD4+T細胞、CD8+T細胞およびB細胞においてCD86の発現誘導を伴い、免疫作用を賦活化することができる。例えば、CD86は、抗原提示細胞(B細胞、マクロファージ、樹状細胞)の表面に存在するタンパク質であり、T細胞の活性化に関与する。また、CD86は、B細胞を活性化する抗原でもある。よって、本実施形態のウイルス様粒子は、CD86の発現誘導を伴いつつT細胞やB細胞を活性化し、生体の免疫作用を賦活化すると考えられる。
【００２６】
好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、ガングリオシドの一種であるGM1に依存的に、マウスのリンパ球においてCD86の発現を伴いつつ、免疫作用を賦活化することができる。ガングリオシドは、脂質二重層に存在し、細胞の情報伝達の調節に関与する。よって、本実施形態のウイルス様粒子は、細胞の情報伝達の過程において何らかの形でGM1が関与してCD86の発現を誘導しつつ、T細胞やB細胞を活性化し、生体の免疫作用を賦活化すると考えられる。
【００２７】
別の実施形態では、ウイルス様粒子は、リンパ球において各種CD分子、具体的にはCD69、CD81、CD83、CD196、CD197、CD63、CD68の発現を誘導する。このことによって、本実施形態のウイルス様粒子は、生体の免疫作用を賦活化する。
別の実施形態では、ウイルス様粒子は、リンパ球において、全身性炎症の病態形成に関与する炎症性サイトカイン、例えばインターフェロンγ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、インターロイキン6 (IL-6)及びインターロイキン1β(IL-1β)の分泌をあまり誘導しない一方で、局所炎症の病態形成に関与するケモカイン、例えばCCL3及びCCL4の分泌を誘導する。ワクチンを投与すると、投与局所に炎症を起こし、マクロファージが集まり抗原が貪食されやすくなる。これにより、抗原提示が効果的に行われる。しかし、炎症が全身に及ぶと生体には好ましくない副作用となる。本実施形態のウイルス様粒子は、全身性の炎症に関与する炎症性サイトカインの誘導を低減し、局所炎症に関与するケモカインを誘導するため、生体の免疫作用を効果的に賦活化し、且つ副反応が低減されると考えられる。
別の実施形態では、ウイルス様粒子は、リンパ球において、各種キナーゼ、具体的にはErk1/2、JNKおよびp38MAPKのリン酸化を増大する。このことによって、本実施形態のウイルス様粒子は、生体の免疫作用を賦活化すると考えられる。
【００２８】
免疫賦活化剤は、薬理学的に有効である限り、配列番号１のVP1により構成されるウイルス様粒子、配列番号２６のVP1により構成されるウイルス様粒子、配列番号３３のVP1により構成されるウイルス様粒子、配列番号３５のVP1により構成されるウイルス様粒子、配列番号３７のVP1により構成されるウイルス様粒子、配列番号３９のVP1により構成されるウイルス様粒子、配列番号４１のVP1により構成されるウイルス様粒子、配列番号４３のVP1により構成されるウイルス様粒子および配列番号４５のVP1により構成されるウイルス様粒子のうち、いずれか1種を含んでもよいし、複数種を含んでいてもよい。
【００２９】
免疫賦活化剤において、ウイルス様粒子は、抗原および/または当業者に公知の医薬品添加物と共に製剤化されていてもよい。このような医薬品添加物としては、限定されないが、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤、カプセル基剤、可塑剤、着色剤、溶剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、無痛化剤、基剤、乳化剤および懸濁化剤、その他矯味剤、甘味剤、吸着剤、溶解補助剤、pH調節剤、増粘剤、等張化剤、分散剤、防腐剤、湿潤剤、着香剤、抗酸化剤等が挙げられる。
【００３０】
賦形剤としては、限定されないが、例えばマンニトール、白糖、ブドウ糖、トウモロコシデンプン、結晶セルロース、リン酸水素カルシウムなどが挙げられる。
滑沢剤としては、限定されないが、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
【００３１】
結合剤としては、限定されないが、例えばアラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、メチルセルロース(MC)、ポビドン(PVP)、ポリビニルアルコール(PVA)などが挙げられる。
崩壊剤としては、限定されないが、例えば架橋カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、架橋ポビドン、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。
【００３２】
コーティング剤としては、限定されないが、白糖、タルクなどの糖衣用コーティング剤、カルボキシメチルエチルセルロースなどの腸溶性コーティング剤、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテートなどの胃溶性コーティング剤などが挙げられる。
【００３３】
カプセル基剤としては、限定されないが、ゼラチンなどが挙げられる。
可塑剤としては、限定されないが、トリアセチン、中鎖脂肪酸トリグリセリドなどが挙げられる。
着色剤としては、限定されないが、食用タール色素、レーキ色素、三酸化二鉄などが挙げられる。
【００３４】
溶剤としては、限定されないが、注射用水、滅菌精製水などの水性溶剤、植物油(オリーブ油、ダイズ油、ゴマ油等を含む)などの非水性溶剤などが挙げられる。
安定剤としては、限定されないが、窒素、二酸化炭素などの不活性ガス、EDTAなどのキレート剤、L-アスコルビン酸などの還元物質などが挙げられる。
保存剤としては、限定されないが、パラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノールなどが挙げられる。
緩衝剤としては、限定されないが、クエン酸、酢酸、リン酸などのナトリウム塩などが挙げられる。
無痛化剤としては、限定されないが、ベンジルアルコール、プロカイン塩酸塩、ブドウ糖などが挙げられる。
【００３５】
基剤としては、限定されないが、カカオ脂、ゼラチンなどの坐剤用基剤および流動パラフィン、カルナウバロウなどの軟膏用基剤などが挙げられる。
乳化剤としては、限定されないが、アラビアゴム、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤としては、限定されないが、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント、モノステアリン酸アルミニウムなどが挙げられる。
【００３６】
免疫賦活化剤は、固形製剤、半固形製剤、液状製剤、注射剤、坐剤、その他当業者に公知の製剤形態のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、限定されないが、例えば錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、トローチ剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、シロップ剤、リモナーデ剤、坐剤、軟膏剤、懸濁剤、乳剤、リニメント剤、ローション剤、経皮吸収型製剤、貼付剤、パップ剤、エアゾール剤などが挙げられる。
【００３７】
液状製剤は、たとえば、ウイルス様粒子を発現した宿主細胞からウイルス様粒子を抽出し、必要に応じて抗原を添加したり、適切な溶媒で希釈したりすることにより調製される。
懸濁剤は、たとえば、ウイルス様粒子を発現した宿主細胞をホモジナイズして得られたホモジネートを精製し、必要に応じて抗原を添加したり、抽出、精製、溶媒によって希釈したりすることなどにより調製される。具体的には、カイコなどの鱗翅目昆虫固体を宿主とした場合、ウイルス様粒子を発現した個体を摩砕し、粗精製して調製され得る。
【００３８】
ウイルス様粒子が抗原と共に製剤化されない場合には、ウイルス様粒子を含む免疫賦活化剤は、抗原と同時に投与してもよいし、別々に投与してもよいが、同時に投与されることが好ましい。例えば、免疫賦活化剤は、抗原またはそれを含む組成物と混合して、生体に投与される。ここで、ウイルス様粒子に関して、「抗原と共に投与する」とは、上記のとおり、必ずしも同一の時点で投与されなければならないことを意味するものではなく、１回の投与計画の中で抗原とウイルス様粒子との両方をそれぞれ別々の時点で投与することを包含する表現として用いられる。
【００３９】
免疫賦活化剤の投与経路は、特に限定されないが、例えば経粘膜投与(例えば経口投与、経鼻投与、鼻内投与、口腔投与、注腸投与等)、非経口的投与(例えば腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、組織の間隙の空間への注射等)、経皮的投与等が挙げられる。即ち、本実施形態の免疫賦活化剤は、負担の大きい注射等による投与だけでなく、経口での摂取、点鼻薬での投与、浣腸など負担の少ない投与も可能である。例えば、免疫賦活化剤を抗原と共に動物の餌に混入させることによって、動物用ワクチンのためのアジュバントとして用いることができる。
【００４０】
免疫賦活化剤の投与量および投与回数は、抗原の種類、投与対象の動物種、投与対象の症状、年齢、体重、投与形態等に応じて当業者が適宜設定できるが、通常0.01μg〜100 mg、好ましくは0.1μg〜50 mg、より好ましくは1.0μg〜10 mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００４１】
免疫賦活化剤は、生体、より具体的にはヒトやヒト以外の動物(ヒト以外のほ乳類、鳥類、は虫類など)を投与対象とすることができる。ヒト以外の動物としては、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ニワトリ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、サルなどを挙げることができる。
【００４２】
本実施形態の免疫賦活化剤は、免疫作用増強の観点から薬理学的に有効な量のウイルス様粒子を含有する。ウイルス様粒子は、投与した際に医学的に許容できる副作用が生じてもよいが、投与対象の動物にとって病原性がなく、副作用が生じないことが好ましい。
【００４３】
本実施形態の免疫賦活化剤は、当業者に公知の方法に従ってウイルス様粒子を調製し、必要に応じて抗原および/または医薬的に許容される賦形剤等と混合して製剤化することによって製造することができる。
【００４４】
ウイルス様粒子は、配列番号１、配列番号２６、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３および配列番号４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む外殻タンパク質を用いて調製することができる。例えば、外殻タンパク質を適切な媒体に分散することによって行うことができる。媒体および分散条件は、当業者が適宜設定できる。
【００４５】
ウイルス様粒子を調製する前に、外殻タンパク質をコードするDNAを宿主細胞に組み込み、前記宿主細胞に前記外殻タンパク質を発現させることにより、前記外殻タンパク質を取得してもよい。これらのタンパク質の取得は、当業者に公知の方法、例えば遺伝子組換え等によって行うことができる。
【００４６】
宿主細胞は、ウイルス様粒子の形成に支障がない限り特に限定されない。宿主細胞は、例えば昆虫細胞（カイコのような昆虫個体を含む）、大腸菌、酵母、植物からなる群より選択される。宿主細胞は、好ましくは昆虫細胞、より好ましくは鱗翅目昆虫個体、さらに好ましくはカイコである。
【００４７】
宿主細胞において外殻タンパク質を発現させる場合、ウイルス様粒子は、宿主細胞内で発現された外殻タンパク質同士が接触することにより調製されてもよい。あるいは、宿主細胞に対するホモジナイズ、精製、抽出などの製造過程においてウイルス様粒子が形成されてもよい。
【００４８】
宿主細胞内で形成されたウイルス様粒子は、必要に応じて回収してもよい。回収方法は特に限定されないが、主に宿主細胞の種類によって当業者が適宜選択できる。例えば、宿主細胞が昆虫細胞や大腸菌細胞等である場合には超音波処理等による細胞溶解等、宿主細胞が鱗翅目昆虫の蛹である場合には磨砕等によってウイルス様粒子を溶出させ、遠心分離後に上清を回収する方法を用いることができる。
【００４９】
好ましい実施形態では、まず外殻タンパク質をコードするDNAが組み込まれたバキュロウイルスを昆虫細胞又は昆虫個体に感染させる。次に、昆虫細胞又は昆虫個体を超音波処理または磨砕し、その後遠心分離又は濾過して上清を回収することによってウイルス様粒子を取得することができる。
【００５０】
ウイルス様粒子は、必要に応じて精製してもよい。精製方法としては特に限定されず、例えば密度勾配遠心分離、クロマトグラフィ等の当業者に公知の方法等が挙げられる。
ウイルス様粒子には、抗原を付加してもよい。抗原を外殻ペプチドに付加する方法は上述のとおりである。
【００５１】
製剤化は、当業者に公知の方法によって、例えば抗原が付加されたウイルス様粒子と適切な医薬品組成物とを混合するか、またはウイルス様粒子と抗原および/または適切な医薬品添加物とを混合し、所望の剤形に成型し、必要に応じてコーティングすることによって行うことができる。
具体的には、剤形を固形製剤、例えば錠剤とする場合には、例えば抗原が付加されたウイルス様粒子と適切な賦形剤、結合剤および/または崩壊剤とを混合するか、またはウイルス様粒子と抗原および/または適切な賦形剤、結合剤および/または崩壊剤とを混合し、適切な滑沢剤を添加して更に混合し、混合物を打錠し、必要に応じてコーティングすることなどによって製剤化することができる。
剤形を注射剤や液状製剤とする場合には、例えば抗原が付加されたウイルス様粒子またはウイルス様粒子を適切な溶剤に分散させ、必要により抗原の添加および/または濾過もしくは滅菌処理を行い、所定の容器に充填することなどにより製剤化することができる。
【００５２】
剤形を軟膏剤とする場合には、例えば、適切な軟膏用基剤を加温装置付き混合機中で溶融させ、加温をやめ、軟膏状に固まるまで低速で混合し、固まる直前に抗原が付加されたウイルス様粒子またはウイルス様粒子および必要に応じて抗原を加え、所定の容器に充填することなどにより製剤化することができる。
剤形を坐剤とする場合には、例えば抗原が付加されたウイルス様粒子と予め低温で融解した適切な坐剤用基剤とを混合するか、またはウイルス様粒子と、予め低温で融解した適切な坐剤用基剤と、必要に応じて抗原とを混合し、鋳型に注いで冷却し固めることなどにより製剤化することができる。
【００５３】
別の実施形態は、生体の免疫作用を賦活化するためのウイルス様粒子に関する。より具体的には、生体の免疫作用を賦活化するためのウイルス様粒子であって、前記ウイルス様粒子が、配列番号１、配列番号２６、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３および配列番号４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む外殻タンパク質を含み、前記外殻タンパク質が前記ウイルス様粒子の外殻を構成し、前記ウイルス様粒子は、SV40のゲノムDNAを実質的に含まない、前記ウイルス様粒子に関する。
ウイルス様粒子、外殻タンパク質、外殻等については上記したとおりである。
【００５４】
本実施形態のウイルス様粒子は、疾患の予防又は治療において、抗原と共に生体に投与することにより当該抗原に対する生体の免疫作用を賦活化する免疫賦活化剤として使用できる。より具体的には、上記のウイルス様粒子は、疾患、例えば感染症(インフルエンザ、HIV、C型肝炎等)、がん(子宮頸がん、咽頭乳頭腫等)、疣贅(尋常性疣贅、封入体疣贅、扁平疣贅等)、HPV関連表皮様嚢腫、疣贅状表皮発育異常症、尖圭コンジローマ、ボーエン様丘疹症等の予防又は治療において、抗原と共に生体に投与することにより当該抗原に対する生体の免疫作用を賦活化する免疫賦活化剤として用いることができる。
【００５５】
よって、別の実施形態は、抗原と共に生体に投与することによって疾患を治療するためのウイルス様粒子に関するということもできる。より具体的には、本実施形態は、抗原と共に生体に投与することによって疾患を治療するための、配列番号１、配列番号２６、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３および配列番号４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む外殻タンパク質を含むウイルス様粒子であって、前記外殻タンパク質が前記ウイルス様粒子の外殻を構成し、SV40のゲノムDNAを実質的に含まない、前記ウイルス様粒子に関する。
ウイルス様粒子、外殻タンパク質、外殻、抗原、疾患等については上記したとおりである。
【００５６】
また、別の実施形態は、ウイルス様粒子を生体に投与することを含む、生体の免疫作用を賦活化する方法に関する。ウイルス様粒子は、配列番号１、配列番号２６、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３および配列番号４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む外殻タンパク質を含み、前記外殻タンパク質が前記ウイルス様粒子の外殻を構成し、SV40のゲノムDNAを実質的に含まない。
ウイルス様粒子、外殻タンパク質、外殻およびその投与方法、生体等については上記したとおりである。
【００５７】
また、別の実施形態は、ウイルス様粒子を生体に投与することを含む、疾患を予防又は治療する方法に関するということもできる。より具体的には、本実施形態は、ウイルス様粒子を抗原と共に生体に投与することを含む、疾患を予防又は治療する方法であって、前記ウイルス様粒子が、配列番号１、配列番号２６、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３および配列番号４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む外殻タンパク質を含み、前記外殻タンパク質が前記ウイルス様粒子の外殻を構成し、SV40のゲノムDNAを実質的に含まない、疾患を予防又は治療する方法に関する。
ウイルス様粒子、外殻タンパク質、外殻、抗原およびその投与方法、生体、疾患等については上記したとおりである。
【００５８】
また、別の実施形態では、免疫賦活化剤の製造におけるウイルス様粒子の用途に関する。
ウイルス様粒子、外殻タンパク質、外殻、免疫賦活化剤およびその投与方法、生体、疾患等については上記したとおりである。
【００５９】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００６０】
実施例１：wt SV40 VP1 VLPを用いたCTLペプチドの活性化
野生型 (wt: wild type) simian virus 40 (SV40) VP1を発現するバキュロウイルスの作製
wt SV40 VP1遺伝子(配列番号２；アミノ酸配列は配列番号１に示す)をpFastBac1プラスミド(invitrogen)のSal Iサイト及びKpn Iサイトに挿入したプラスミドで、バキュロウイルスゲノムを保持する大腸菌DH10bac (invitrogen)を形質転換し、VP1を組込んだ組換えバキュロウイルスゲノムを調製した。組換えバキュロウイルスゲノムをSf-9細胞にトランスフェクションした。三日後にその上清を回収して、組換えバキュロウイルスを含む溶液とした。この溶液の一部を再び、Sf-9細胞(invitrogen)に感染させることで、組換えバキュロウイルスタイターを上昇させて、組換えバキュロウイルスのストック溶液とした。
【００６１】
wt SV40 VP1ウイルス様粒子 (VLP: virus-like particle) の調製
wt SV40 VP1を組込んだ組換えバキュロウイルスを、0.05〜0.2の感染比率(M.O.I.ベース)で3x107個のSf-9細胞を撒いた15 cm 培養ディッシュ中で感染させた。これを計10枚ずつ作成した。感染3日後に、これら10枚のディッシュに撒いた計3x108個のSf-9細胞を回収し、PBS(-)で洗浄した。その後、細胞を10 mlのVP1超音波処理用バッファー(20 mM Tris-HCl (pH7.9), 1% (w/vol)デオキシコール酸(Sigma))で再懸濁した。内在性のプロテアーゼ活性を抑制するため、2 mMフッ化フェニルメタンスルホニル(最終濃度2μM, Sigma)、キモスタチン(最終濃度1μg/ml, Sigma)、アプロチニン(最終濃度1μg/ml, Sigma)、ロイペプチン(最終濃度1μg/ml, Sigma)、アンチパイン(最終濃度1μg/ml, Sigma)、及び、ペプスタチン(最終濃度1μg/ml, Sigma)を加えて、超音波破砕した。その後、15,000 rpm、4℃で5分間遠心分離して上清とペレットに分け、上清をライセート溶液とした。
【００６２】
塩化セシウム密度勾配遠心分離用に20% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 20% (w/vol) 塩化セシウム), 30% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 30% (w/vol) 塩化セシウム), 40% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 40% (w/vol) 塩化セシウム), 50% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 50% (w/vol) 塩化セシウム) をUltra-Clear 遠心分離用チューブ (14 x 89 mm, Beckman coulter)に密度の高い方から順に1.5 mlずつ重層した。次いで、wt SV40 VP1を含むライセート溶液5 mlを更に重層した。35,000 rpm, 3時間, 4℃で超遠心分離した(SW41Ti rotor, Beckman)。
【００６３】
超遠心分離後、中央に現れる白いバンドを23G, 1 mlのテルモシリンジ (0.60 x 32 mm、TERUMO)で回収した。この画分を37% CsCl溶液(20 mM Tris-HCl (pH7.9), 37% (w/vol) 塩化セシウム)と混合し、Ultra-Clear遠心分離用チューブ(11 x 60 mm, Beckman coulter)に移した。その後、50,000 rpm, 20 時間, 4℃で超遠心分離した (SW60Ti rotor, Beckman)。超遠心分離後、中央に現れる白いバンドを23G, 1 mlのテルモシリンジ (0.60 x 32 mm、TERUMO)で回収した。この画分をPBS(-) の溶媒で透析(Slide-A-Lyzer(商標) MINI Dialysis Units, 3,500MWCO, ThermoSCIENTIFIC)した。この画分を15,000 rpm, 5分, 4℃で遠心分離して上清を回収して精製VP1 VLP画分とした。
【００６４】
SV40 wild type VP1 VLPへのFMP:58-66ペプチドの固定化
以下に記載するようにして、FMP:58-66エピトープペプチド(GILGFVFTL, 配列番号３；本明細書中、「M1のCTLエピトープ」とも呼ばれる)が固定されたwt SV40 VP1 VLPの試料を調製した。
(1)  MES緩衝液(0.1 M MES (2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸), 0.9% 塩化ナトリウム, pH4.7, BupH MES緩衝化生理食塩水パック, 28390, ThermoSCIENTIFIC)で透析した39.96 μlのwt SV40 VP1 VLP (3752.7 ng/μl)に、同じ組成のMES緩衝液を35.04 μl加え、合計を75 μlとした。また、DMSOに溶解した155.1μlの10 mM FMP: 58-66 ペプチド (GILGFVFTL) (分子量966.9)にMES緩衝液32.4μlを加え、合計187.5μlとした。そして、これらを混合し、そこに7.5μlのEDCクロスリンカー(EDC, 22980, ThermoSCIENTIFIC) (再蒸留水中10 mg/ml)を加えた。さらに30μlの再蒸留水を加えて、総量を300μlとした。この混合液を室温で、2時間インキュベーションして、クロスリンカーを反応させた。これを、VP1：FMP:58-66エピトープペプチドの重量比で1:10 (with EDC)試料とした。
【００６５】
(2)  上記と同じ組成のMES緩衝液で透析した39.96 μlのSV40 wild type VP1 VLP (3752.7 ng/μl)に、同じ組成のMES緩衝液を35.04μl加え、合計を75μlとした。また、DMSOに溶解した77.55μlの10 mM FMP: 58-66ペプチド(GILGFVFTL) (分子量966.9)にMES緩衝液109.95μlを加え、合計187.5μlとした。そして、これらを混合し、そこに7.5μlのEDC クロスリンカー(EDC, 22980, ThermoSCIENTIFIC) (再蒸留水中10 mg/ml)を加えた。さらに30μlの再蒸留水を加えて、総量を300μlとした。この混合液を室温で、2時間インキュベーションして、クロスリンカーを反応させた。これを、VP1：FMP:58-66エピトープペプチドの重量比で1:5 (with EDC) 試料とした。
【００６６】
(3)  上記と同じ組成のMES緩衝液で透析した39.96 μlのSV40 wild type VP1 VLP (3752.7 ng/μl)に、同じ組成のMES緩衝液を35.04μl加え、合計を75μlとした。また、DMSOに溶解した38.78μlの10 mM FMP: 58-66ペプチド(GILGFVFTL) (分子量, 966.9)にMES緩衝液148.72μlを加え、合計187.5μlとした。そして、これらを混合し、そこに7.5 μlのEDCクロスリンカー(EDC, 22980, ThermoSCIENTIFIC) (再蒸留水中10 mg/ml)を加えた。さらに30μlの再蒸留水を加えて、総量を300μlとした。この混合液を室温で、2時間インキュベーションして、クロスリンカーを反応させた。これを、VP1：FMP:58-66エピトープペプチドの重量比で1:2.5 (with EDC)試料とした。
【００６７】
(4)  75μlのMES 緩衝液に、DMSOに溶解した155.1μlの10 mM FMP: 58-66ペプチド(GILGFVFTL) (分子量, 966.9)にMES緩衝液32.4μlを加え、合計262.5μlとした。そして、これらを混合し、そこに7.5 μlのEDCクロスリンカー(EDC, 22980, ThermoSCIENTIFIC) (再蒸留水中10 mg/ml)を加えた。さらに30μlの再蒸留水を加えて、総量を300μlとした。この混合液を室温で、2時間インキュベーションして、クロスリンカーを反応させた。これをpeptide alone (with EDC)試料とした。
【００６８】
(5)  上記と同じ組成のMES緩衝液で透析した39.96μlのSV40 wild type VP1 VLP (3752.7 ng/μl)に、同じ組成のMES緩衝液を35.04μl加え、合計を75μlとした。また、DMSOに溶解した155.1 μlの10 mM FMP: 58-66ペプチド(GILGFVFTL) (分子量, 966.9)にMES緩衝液32.4μlを加え、合計187.5μlとした。そして、これらを混合し、そこに37.5μlの再蒸留水を加えて、総量を300μlとした。この混合液を室温で、2時間インキュベーションした。これを、VP1：FMP:58-66エピトープペプチドの重量比で1:10 (no EDC)試料とした。
【００６９】
(6)  ネガティブコントロールとして、上記と同じ組成のMES緩衝液に溶解した15μlのウシ血清アルブミン (BSA) (10 μg/μl)に、同じ組成のMES緩衝液を60μl加え、合計を75μlとした。また、DMSOに溶解した155.1μlの10 mM FMP: 58-66ペプチド(GILGFVFTL) (分子量, 966.9)にMES緩衝液32.4μlを加え、合計187.5μlとした。そして、これらを混合し、そこに7.5μlのEDCクロスリンカー(EDC, 22980, ThermoSCIENTIFIC) (再蒸留水中10 mg/ml)を加えた。さらに30μlの再蒸留水を加えて、総量を300μlとした。この混合液を室温で、2時間インキュベーションして、クロスリンカーを反応させた。これを重量比でBSA: FMP:58-66ペプチド 1:10 (with EDC)試料とした。
【００７０】
上記(1)〜(5)の試料1μlを10%SDS-PAGEで展開し、CBBで染色した。また、上記(1)〜(5)の試料1μlを10%SDS-PAGEで展開した後、PVDF膜に転写して抗SV40 VP1抗体でウェスタンブロッティングを行った。結果を図3Aに示す。図3Aにおいて、上記(1)〜(3)の試料(図3A中、それぞれ1:10 (with EDC)、1:5 (with EDC)および1:2.5 (with EDC))では、ウェスタンブロッティングのゲル画像において、VP1 (約48 kDa)よりも高分子側に86〜114 kDaのバンドを確認した。これは、wt SV40 VP1 VLPとFMP:58-66ペプチドとの架橋反応が起きた結果、VP1のバンドが高分子量側にシフトしたことを示している。一方、上記(4)および(5)の試料(図3A中、それぞれpeptide alnoe (with EDC)および1:10 (no EDC))を用いた場合には、CBB染色においてもウェスタンブロッティングにおいても、VP1より高分子量側のバンドは観られなかった。上記の結果から、EDCクロスリンカーを用いて、wt SV40 VP1 VLPにM1 CTLエピトープを付加できることが示された。
【００７１】
wt SV40 VP1 VLPの免疫
以下の実験はC57BL/6をバックグラウンドとし、HLA-A*0201とH-2Dbのキメラでさらにヒトのβ2mを融合したものを発現しているトランスジェニックマウス（以下、HHDマウス）を使用した。このマウスは、マウスのβ2mおよびH-2Dbをノックアウトしているため、マウス由来のMHC class Iは細胞表面に露出していないと考えられる。
上記(1)〜(6)の試料それぞれ100 μlを8週齢のHHDマウスに腹腔内の経路で免疫した。免疫には、27ゲージのニードルを挿入した1 mlのシリンジ (マイジェクター、注射針付きシリンジ、インスリン用、TERUMO, SS-10M2713)を用いた。投入から1週間後に、免疫したマウスの脾臓を回収した。下記の方法でリンパ球を調製し、下に記すIntra-cellular cytokine staining (ICS) 解析を行った。
【００７２】
マウスの脾臓からのリンパ球の調製
免疫したマウスから脾臓を摘出し、5 mlのRPMI-1640 培地の入ったφ6 cm ディッシュに置いた。ピンセットを用いて脾臓を培地内で、良く揉みほぐし、培地に溶出されたリンパ球を含む溶液を15 ml チューブに移した。もう一度、φ6 cm ディッシュを5 mlのRPMI-1640 培地で洗浄した。上清をその15 ml チューブに加え、総量 10 mlとした。すぐに15 ml チューブの底にたまる組織断片を残して、上清を再び新しい15 ml チューブに移し、室温、1,200 rpmで5分間遠心分離し、リンパ球を含むペレットを得た。上清を除いて、ペレットをほぐした。その後、赤血球を除くために、250 μlのNH4Cl-トリス溶液を加えかき混ぜた。その後、すばやく10 mlのRPMI-1640 培地を加え、室温、1,2000 rpmで5分間遠心分離し、リンパ球を含むペレットを得た。上清を除いて、ペレットをほぐした後、再び10 mlのRPMI-1640培地を加えた。変性した赤血球を極力吸わないようにしてピペットでリンパ球を含む培地を新しい15 ml チューブに移して、再び室温、1,200 rpmで5分間遠心分離した。上清を除いた後、ペレットをほぐした。もう一度10 mlのRPMI-1640 培地で懸濁し、室温、1,200 rpmで5分間遠心分離した。上清を除いて、最後に2 mlの10% FCS混入RPMI-1640 培地で懸濁した。リンパ球を数えるために、490 μlの2%酢酸溶液に10 μlの上記懸濁溶液を加えた。ビュルケルチュルク血球計算版で、細胞数を算出した。1x107 細胞/mlとなるように10%FCS混入RPMI-1640 培地で希釈した。
【００７３】
Intra-cellular cytokine staining (ICS) 解析
マウスへ免疫後に、脾臓から回収したリンパ球中に、FMP:58-66 エピトープに反応して誘導されるCD8陽性IFN-γ陽性CTLの割合を同定するために、ICS解析を行った。96 ウェル丸底プレートに10% FCS混入RPMI-1640 培地で25倍希釈したBD GolgiPlug (商標)(BD Biosciences) を1 ウェル当り5 μl加えた。さらに10% FCS混入RPMI-1640 培地で希釈した20 μMのFMP:58-66エピトープ(GILGFVFTL, Operon)を100μl加えた。このウェルに上記で調製したリンパ球を100 μl加えた。その後、5時間、37℃、5% CO2でインキュベートした。
【００７４】
インキュベート後4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、ボルテックスミキサーで細胞をほぐした。その後、FACS バッファー(2% FCS, 0.1%アジ化ナトリウム, 1xPBS(-))を1 ウェル当り200μl加えた。再び4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、細胞をほぐした。その後、FACSバッファーで5μg/mlに希釈したMouse BD Fc Block(商標)(BD Pharmingen)を100μl加えて、４℃で10分間インキュベートした。
【００７５】
インキュベート後、4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、細胞をほぐした。その後、FACSバッファーを200μl/ウェル加えた。再び4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除いた。もう一度200 μl/ウェルのFACSバッファーを用いる洗浄操作を行った。ほぐした細胞に、FACS バッファーで10 μg/mlに希釈したFITC Rat Anti-Mouse CD8a Clone: 53-6.7 (BD Pharmingen) を1 ウェル当り50 μl加えた。4℃暗所で30分間インキュベートした。
【００７６】
インキュベート後、200μl/ウェルのFACS バッファーを用いる洗浄操作を2回行った。その後、ほぐした細胞に、1 ウェル当り100 μlのBD Cytofix/Cytoperm(商標)(BD Biosciences)を加えて、4℃暗所で20分間インキュベートした。インキュベート後、FACS バッファーに代えて200 μlの1xBD Perm/Wash(商標)(BD biosciences)を用いて、上記と同様の洗浄操作を2回行った。その後、ほぐした細胞に、1xBD Perm/Wash(商標)で10 μg/mlに希釈したPE anti-mouse IFN-γClone: XMG1.2 (BioLegend)を50 μl加えた。4℃暗所で30分間インキュベートした。
【００７７】
インキュベート後、200 μlの1xBD Perm/Wash(商標)を用いて上記と同様の洗浄操作を2回行った。その後、ほぐした細胞に、1 ウェル当り100 μlのFACS固定バッファー (1% ホルムアルデヒド, 1xFACS バッファー)を加えて、4℃ 暗所で一晩インキュベートした。
【００７８】
インキュベート後、400 μlのFACS バッファーを5 mlのポリスチレンチューブ(BD Falcon, 5 ml polystyrene round-bottom tube 12 x 75 mm style)に加えた。100 μlのFACS固定バッファーで固定したサンプルを加えた。その後、FACScan（Becton Dickinson）でドットプロット解析を行った。解析にはCell Quest（Becton Dickinson）のソフトウェアを使用した。
【００７９】
ICS解析の結果を図3Bおよび図3Cに示す。それぞれのドットプロットによるスキャッタグラムにおいて、横軸はCD8の発現量を表し、CD8発現量が高くなればなるほど、その細胞のプロットは右側にシフトする。また、縦軸はIFN-γの発現量を表し、IFN-γ発現量が高くなればなるほど、その細胞のプロットは上側にシフトする。本解析においては、スキャッタグラム中のそれぞれ縦軸および横軸に平行な２本の直線によって区切られた右上の象限にCD8+IFN-γ+T細胞がプロットされる。同象限中の数値(％)は、ICS解析のCD8陽性細胞全体のうちのCD8+IFN-γ+T細胞の百分率を示している。CD8陽性細胞は細胞傷害性T細胞(CTL: cytotoxic T lymphocyte)とも呼ばれ、ウイルス感染細胞や腫瘍細胞などにパフォーリンおよびグランザイムBなどを放出してアポトーシスを誘導する。IFN-γは活性化CD8細胞により産生されるサイトカインの一種である。図３B中、上記(1)の試料(1:10 (with EDC))を用いた場合(２組示される)には、免疫なし(-)のマウスリンパ球ではCD8+IFN-γ+T細胞が0.16％及び0.13％だったのに対して、免疫あり(+)のマウスリンパ球ではそれぞれ1.01％及び3.15％と、CD8+IFN-γ+T細胞の百分率が大幅に増大した。また、上記(2)及び(3)を用いた場合(それぞれ1:5 (with EDC)および1:2.5 (with EDC))にも、同様のことが観察された。これらの結果は、FMP:58-66エピトープを固定したwt SV40 VP1 VLPの腹腔内免疫後のFMP:58-66エピトープ添加によって、FMP:58-66エピトープ特異的な細胞傷害性T細胞が誘導されたことを示す。また、エピトープ添加量が多いほど、誘導されるエピトープ特異的CTLの数も多くなる傾向があることが明らかになった。更に、上記(5)の試料を用いた場合(1:10 (no EDC))にも、CD8+IFN-γ+T細胞の百分率が大幅に増大した。この試料(5)に関する結果から、wt SV40 VP1 VLPにエピトープペプチドが付加されていない場合であっても、両者で免疫することによって、エピトープペプチド付加wt SV40 VP1 VLPによる免疫と同様にマウスリンパ球のCTLを誘導できると考えられる。一方、ペプチドのみの上記(4)の試料(peptide alone (with EDC))では、CD8+IFN-γ+T細胞の百分率の大幅な増大は観られなかった。FMP:58-66ペプチドをクロスリンクしたBSAで免疫したマウスのリンパ球を含む試料(ネガティブコントロール、図3Cに２組示す)では、百分率の大幅な増大は観察されず、FMP:58-66 エピトープ特異的なCTLが効率的に誘導されることは無かった(図3C)。
これらの結果から、FMP:58-66エピトープを固定したVLPで免疫したマウスのリンパ球を含む試料では、エピトープ特異的CTLの誘導能が高く、CTLにVLPが関与している可能性が示唆された。また、BSAにエピトープを固定してもエピトープ特異的CTLの誘導能が低かったことから、エピトープ特異的CTLを効果的に誘導するためにはwt SV40 VP1 VLPが必要であることが示唆された。
【００８０】
51Chrome release解析
また、CD8陽性・細胞内IFN-γ陽性細胞が細胞傷害することを示すために、51Chrome release解析を行った。免疫をしていないHHDマウスから脾臓のリンパ球を上記と同様の方法で調製した。15 mlチューブ中の10% FCS混入RPMI-1640 培地2 ml中の非免疫マウスの脾臓リンパ球2.4x108細胞に、10 mMのM1のCTLエピトープのペプチド(FMP:58-66ペプチド；GILGFVFTL；Operon)を4μl加えた。これを2時間、37℃、5% CO2インキュベータでインキュベートした。インキュベート後、20 Gy (グレイ)のX線を照射した。照射後、室温、1,200 rpmで5分間遠心分離し、リンパ球を含むペレットを得た。上清を除いて、ペレットをほぐした。その後、2 mlの10% FCS混入RPMI-1640培地を加えた。リンパ球を数えるために、490μlの2%酢酸溶液に10 μlのリンパ球溶液を加えた。ビュルケルチュルク血球計算版で、細胞数を算出した。5x106細胞/mlとなるように10%FCS混入RPMI-1640 培地で希釈した。
【００８１】
一方で、FMP: 58-66 ペプチドを固定化したVLP溶液(1:10 (with EDC)) 50μlを腹腔免疫によって免疫した。免疫1週間後、マウスから脾臓を摘出し、それぞれ5 mlのRPMI-1640 培地の入ったφ6 cm ディッシュに置いた。ピンセットを用いて脾臓を培地内で、良く揉みほぐし、培地に溶出されたリンパ球を含む溶液を15 ml チューブに移した。もう一度、φ6 cm ディッシュを5 mlのRPMI-1640 培地で洗浄した。上清をその15 ml チューブに加え、総量 10 mlとした。免疫をしたリンパ球については血液を除かないので、その後すぐに15 ml チューブの底にたまる組織断片を残して、上清を再び新しい15 ml チューブに移した。室温、1,200 rpmで5分間遠心分離し、リンパ球を含むペレットを得た。上清を除いて、ペレットをほぐした。その後、2 mlの10% FCS混入RPMI-1640培地を加えた。リンパ球を数えるために、490μlの2%酢酸溶液に10μlのリンパ球溶液を加えた。ビュルケルチュルク血球計算版で、細胞数を算出した。5x106細胞/mlとなるように10%FCS混入RPMI-1640 培地で希釈した。
【００８２】
48 ウェルのプレート中で、M1のCTLエピトープのペプチドと共にインキュベート後X線照射した上記の非免疫リンパ球(5x106細胞/ml) 500μl/ウェルと、上記の免疫したリンパ球(5x106細胞/ml) 500μl/ウェルとを混合した。このウェルは1サンプル当り、24ウェル作製した。混合後、7日間、37℃、5% CO2インキュベータでインキュベートした。
【００８３】
その後、24 ウェル中のリンパ球を1本の50 mlチューブに集めた。室温、1,200 rpmで5分間遠心分離し、リンパ球を含むペレットを得た。上清を除いて、ペレットをほぐした。その後、2 mlの10% FCS混入RPMI-1640 培地を加えた。リンパ球を数えるために、20μlの0.4%トリパンブルー溶液(Gibco)に20μlのリンパ球溶液を加えた。ビュルケルチュルク血球計算版で、細胞数を算出した。7.5x106細胞/mlとなるように10%FCS混入RPMI-1640 培地で希釈または濃縮した。このようにして調製したリンパ球をエフェクター細胞とした。
【００８４】
一方で、1x106細胞/mlのRMA-HHD培養細胞を1 mlずつ、2本の15 mlチューブに分注した。片方のチューブには10 mMのM1のCTLエピトープのペプチド(GILGFVFTL, Operon)を5μl加えた。もう片方のチューブにはペプチドを加えなかった。これらのチューブを2時間、37℃、5% CO2インキュベータでそれぞれインキュベートした。その後、室温、1,200 rpmで5分間遠心分離し、細胞を含むペレットを得た。上清を除いて、ペレットをほぐした。その後、100μCi (マイクロシーベルト)のNa251CrO4溶液を加えた。30分間、37℃、5% CO2インキュベータでインキュベートした。その後、室温、1,200 rpmで5分間遠心分離し、細胞を含むペレットを得た。上清を除いて、ペレットをほぐした。その後、洗浄操作のために、1 mlの10% FCS混入RPMI-1640培地を加えた。室温、1,200 rpmで5分間遠心分離し、リンパ球を含むペレットを形成させ、上清を除いた。この洗浄操作を5回繰り返した。最後に、上清を除いた後、1 mlの10% FCS混入RPMI-1640培地を加えた。新しい15 mlチューブに、この細胞溶液500μlと9.5 mlの10% FCS混入RPMI-1640培地を混合して20倍希釈した。この細胞希釈溶液をターゲット細胞液とした。
【００８５】
96ウェルプレートに、100μlのターゲット細胞液(5x103細胞)を分注した。これにエフェクター細胞液100μl (7.5x105細胞)、エフェクター細胞液20μl (1.5x105細胞)と10% FCS混入RPMI-1640培地80μlとの混合液、及びエフェクター細胞液10μl (7.5x104細胞)と10% FCS混入RPMI-1640培地90μlとの混合液を添加し、エフェクター細胞：ターゲット細胞の比率をそれぞれ150：1、30：1、及び15：1とした。ポジティブコントロールとして5% Triton-X 100溶液100μl、ネガティブコントロールとして10% FCS混入RPMI-1640培地100μlをそれぞれ100μlのターゲット細胞液(5x103細胞)に加えた。混合後、4時間、37℃、5% CO2インキュベータでインキュベートした。
その後、Supernatant collection system (Molecular Devices)を用いて、上清を回収した。AUTO WELL GAMMA SYSTEM (ARC-380CL, Aloka)、及び、ALOKA RIA Program (ARCAS ver. 3.11, Aloka)で、リリースされた51Crのガンマ線をカウントし、解析した。% Specific lysisは、100 x (カウント（サンプル）- カウント（ネガティブコントロール）) /(カウント（ポジティブコントロール）- カウント（ネガティブコントロール）)で計算を行った。
【００８６】
結果を図3Dに示す。免疫なし(-)の場合51Crの溶出が殆ど観られなかったのに対して、免疫あり(+)の場合には、いずれのエフェクター細胞：ターゲット細胞比率においても、CTLにより攻撃されたターゲット細胞(RMA-HHD細胞)の細胞膜が破壊されたため細胞質中の51Crが溶出することが確認された。また、エフェクター細胞の添加量が多くなるほど、溶出する51Cr量も多くなることが示された。このことから、確かに、FMP:58-66 ペプチドを固定化したwt SV40 VP1 VLPの免疫により、固定化したペプチドに対する免疫活性を誘導できることが示された。
【００８７】
実施例２：マウスリンパ球におけるwt SV40 VP1 VLP刺激によるCD86分子の上昇の検出
wt SV40 VP1 VLPによるCD86分子の発現上昇
実施例１で調製した精製VP1 VLP画分をwt SV40 VP1 VLP溶液として用いた。96ウェル平底プレートに、wt SV40 VP1 VLP溶液(PBS(-)中500μg/ml)を5μl加え、一方で、丸底プレートに、wt SV40 VP1 VLP溶液を加えないウェルを用意した。また、平底プレートの別のウェルにPBS(-)バッファーを5μl加え、一方で、丸底プレートに、PBS(-)バッファーを加えない別のウェルを用意した。腹腔内免疫したマウスに代えて非免疫HHDマウスの脾臓を用いたこと以外は実施例１に記載したとおりにして調製したリンパ球を5x105細胞加えた。全量200μlとなるようにR10培地（RPMI-1640 medium (Sigma)に、最終濃度が10% FCS, 100 U/mlペニシリン, 100 μg/mlストレプトマイシン, 2 mM L-グルタミン, 50 μM 2-メルカプトエタノールとなるように加えた培地；10%FCS混入RPMI-1640培地と同じ組成である）を加えた。その後、5%CO2, 37℃のインキュベータで24時間インキュベートした。
【００８８】
平底プレートにwt SV40 VP1 VLP溶液を加えたウェルおよびPBS(-)バッファーを加えたウェルにつき、SV40 VP1 VLP刺激によるリンパ球の細胞増殖を観察するために、倒立位相差顕微鏡による細胞観察を行った。観察はx 200で行った。結果を図4Aに示す。図4Aにおいて、PBS(-)のみの刺激なし(図4A中、buffer)の場合には、リンパ球は増殖することなく均一に分布していた。一方、SV40 VP1 VLP刺激あり(図4A中、wt SV40 VP1 VLP)の場合には、リンパ球が増殖し、クラスタ形成していることが観察された。したがって、wt SV40 VP1 VLP刺激によって、リンパ球を活性化できることが明らかになった。
【００８９】
上記の24時間インキュベート後の丸底プレートにwt SV40 VP1 VLP溶液を加えたウェルおよびPBS(-)バッファーを加えたウェル、R10培地とリンパ球のみのウェルを4℃、1,400 rpmでスピンダウンした。上清を除き、ボルテックスミキサーで細胞をほぐした。その後、FACSバッファー(2% FCS, 0.1%アジ化ナトリウム, 1xPBS(-))を200μl/ウェル加えた。再び4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、細胞をほぐした。その後、FACSバッファーで20μg/mlに希釈したLEAF Purified Rat Anti-Mouse CD16/32 Clone: 93 (BioLegend)を100μl加えて、４℃で10分間インキュベートした。その後、200μlのFACSバッファーでの洗浄操作を1回行った。ほぐした細胞に、FACSバッファーで10μg/mlに希釈したPE Rat Anti-Mouse CD86 Clone: GL-1 (BioLegend)を50μlずつ加えた。４℃、暗所で30分間インキュベートした。その後、200μlのFACSバッファーでの洗浄操作を2回行った。その後、ほぐした細胞に、1ウェル当り100μlのFACS固定バッファー(1%ホルムアルデヒド, 1xFACSバッファー)を加えた。4℃暗所で一晩インキュベートした。その後、400μlのFACSバッファーを5 mlのポリスチレンチューブ(BD Falcon, 5 ml polystyrene round-bottom tube 12 x 75 mm style)に加えた。100μlのFACS固定バッファーで固定したサンプルを加えた。FACScan（Becton Dickinson）でヒストグラム解析を行った。解析にはCell Quest（Becton Dickinson）のソフトウェアを使用した。
【００９０】
結果を図4Bに示す。図4Bは、抗CD86抗体の蛍光強度と、蛍光強度に対応する細胞の数とを示すヒストグラムである。図4Bにおいて、灰色のヒストグラムは、wt SV40 VP1 VLP溶液もPBS(-)バッファーも加えずにR10培地のみでインキュベートした場合の各蛍光強度における細胞数を示す。白抜きのヒストグラムは、wt SV40 VP1 VLP溶液を加えたR10培地(図4B中、右図)又はPBS(-)バッファーを加えたR10培地(図4B中、左図)とインキュベートした場合の各蛍光強度における細胞数を示す。解析の結果、PBS(-)バッファーのみで刺激したマウスリンパ球についての白抜きのピークは、灰色のピークとほぼ重なっていた(図4B中、左図)。一方、wt SV40 VP1 VLPで刺激したマウスリンパ球についての白抜きのピークは、灰色のピークから右側にシフトしていた(図4B中、右図)。これは、wt SV40 VP1 VLPで刺激した場合CD86分子を高度に発現する細胞が増加したことを示す。以上より、マウスリンパ球において、wt SV40 VP1 VLPはCD86分子の発現上昇を誘導することが明らかとなった。
【００９１】
比較例１：マウスリンパ球におけるM1 CTLエピトープ挿入SV40 VP1 VLP刺激によるCD86分子の上昇の検出
M1 CTLエピトープ挿入SV40 VP1を発現するバキュロウイルスの作製
インフルエンザウイルス粒子内部タンパク質matrix protein 1 (M1) のCTLエピトープ配列 (FMP:58-66 epitope (influenza Matrix Protein 58-66 epitope): GILGFVFTL)（このエピトープ配列は、ヒトのMHC class IのHLA-A*0201に対するエピトープ配列である）を、SV40 VP1に挿入した。具体的には、VP1のDEループ領域 (137-138アミノ酸領域、慣例としてVP1遺伝子の4番目のAlaをアミノ酸番号1として) またはHIループ領域 (273-274アミノ酸領域) を、アミノ末端とカルボキシル末端を3つのグリシンを付加したGILGFVFTLで置き換え、M1 CTL エピトープ挿入SV40 VP1挿入変異体を作製した (FMP-DE-VP1、FMP-HI-VP1)。作製方法は、SV40 VP1をコードするpFastBac 1-SV40 wild type VP1をテンプレートして、Overhang PCR法にて作製した。プライマーは以下のものを用いた。
【００９２】
FMP-DE-VP1作製用プライマー
1st round
5'-SalI-Kozac-SV40 VP1
AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG（配列番号４）
3'-DE2 loop (M1)
CGTGAACACAAAGCCCAAAATGCCGCCACCGCCATGAGTTTTTTGTGTCCCTGAATG（配列番号５）
5'-DE2 loop (M1)
CATTTTGGGCTTTGTGTTCACGTTGGGCGGCGGTGGTGCTGGAAAACCCATTCAAG（配列番号６）
3'-KpnI-SV40 VP1
AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG（配列番号７）
【００９３】
2nd round
5'-SalI-Kozac-SV40 VP1
AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG（配列番号４）
3'-KpnI-SV40 VP1
AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG（配列番号７）
【００９４】
FMP-HI-VP1作製用プライマー
1st round
5'-SalI-Kozac-SV40 VP1
AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG（配列番号４）
3'-HI1 loop (M1)
CGTGAACACAAAGCCCAAAATGCCGCCACCGCCGTTGGTAAACAGCCCACAAATG（配列番号８）
5'-HI1 loop (M1)
CATTTTGGGCTTTGTGTTCACGTTGGGCGGCGGTGGAACACAGCAGTGGAAGGG（配列番号９）
3'-KpnI-SV40 VP1
AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG（配列番号７）
【００９５】
2nd round
5'-SalI-Kozac-SV40 VP1
AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG（配列番号４）
3'-KpnI-SV40 VP1
AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG（配列番号７）
【００９６】
テンプレートは10 ng使用した。プライマーは50 pmolずつ加えた。これらと、KOD polymerase (TOYOBO) 2.5 units, 0.2 mM dNTPs, 1 mM MgCl2, 6 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 120 mM Tris-HCl(pH8.0), 0.1% TritonX-100, 0.001% BSAとを含む混合溶液30 μlを調製した。
【００９７】
PCRは1st round、2 nd round共に、98℃で60秒インキュベートした後、次のサイクルを25回繰り返し (98℃15秒、59℃15秒、74℃30秒) 、最後に74℃で1分30秒インキュベートして、4℃に移行した。
【００９８】
Overhang PCRで作製した、PCR断片を制限酵素のKpnIとSalIで切断した。これをpFastBac 1プラスミドベクターのKpnI、SalIサイトの間に挿入し、FMP-DE-VP1及びFMP-HI-VP1プラスミドとした。バキュロウイルスゲノムを保持する大腸菌DH10bac (invitrogen)に各プラスミドを形質転換し、これらのループ領域エピトープ挿入VP1のコード配列を組込んだ組換えバキュロウイルスゲノムを調製した。組換えバキュロウイルスゲノムをSf-9細胞にトランスフェクションした。三日後にその上清を回収して、組換えバキュロウイルスを含む溶液とした。この溶液の一部を再び、Sf-9細胞に感染させることで、組換えバキュロウイルスタイターを上昇させて、組換えバキュロウイルスのストック溶液とした。
【００９９】
FMP-DE-VLP及びFMP-HI-VLPの調製
FMP-DE-VP1またはFMP-HI-VP1を組込んだ組換えバキュロウイルスを、0.05〜0.2の感染比率(M.O.I.ベース)でSf-9細胞(3x107個)に感染させた。感染3日後にSf-9細胞を回収し、PBS(-)で洗浄した。その後、細胞を1 mlのVP1超音波処理用バッファー(20 mM Tris-HCl (pH7.9), 1%デオキシコール酸ナトリウム(Sigma), 2 μM フッ化フェニルメタンスルホニル(Sigma), 1 μg/ml キモスタチン(Sigma), 1 μg/ml アプロチニン(Sigma), 1 μg/ml ロイペプチン(Sigma), 1 μg/ml アンチパイン(Sigma), 1 μg/ml ペプスタチン(Sigma)) で再懸濁し、超音波破砕した。その後、15,000 rpm、4℃で5分間遠心分離して上清とペレットに分け、上清を除いた。残ったペレットに200 μlの50% Opti-prep(商標)溶液 (20 mM Tris-HCl(pH7.9), 50%Opti-prep(商標)) を加えて超音波処理することで再懸濁した。これをペレット溶液(それぞれFMP-DE-VLP溶液およびFMP-HI-VLP溶液)とした。
【０１００】
マウスの脾臓からのリンパ球の調製
腹腔内免疫したマウスに代えて非免疫HHDマウスの脾臓を用いたこと以外は実施例１に記載したとおりにして、マウスの脾臓からリンパ球を調製した。
【０１０１】
FMP-DE-VLP及びFMP-HI-VLP刺激によるCD86分子の発現上昇
96ウェル丸底プレートに1ウェル当たり、Opti-prepバッファー、FMP-DE-VLP溶液(20 mM Tris-HCl (pH7.9)及び50% Opti-prep中500μg/ml)、および、FMP-HI-VLP溶液(20 mM Tris-HCl (pH7.9)及び50% Opti-prep中500μg/ml)をそれぞれ5μl/ウェル加えた。そこにマウスリンパ球を5x105細胞加えた。全量 200μlとなるようにR10培地を加えた。その後、5%CO2, 37℃のインキュベーターで24時間インキュベートした。
【０１０２】
インキュベート後、実施例２に記載したとおりにFACScanの前処理を行い、FACScan（Becton Dickinson）でヒストグラム解析を行った。解析にはCell Quest（Becton Dickinson）のソフトウェアを使用した。
【０１０３】
結果を図5に示す。FMP-DE-VLPを含む試料またはFMP-HI-VLPを含む試料で刺激した場合は、蛍光強度の増強が僅かに認められた (図5右上図および右下図)。しかし、実施例２の結果と比較すると、蛍光強度の増加量は顕著に低かった (図4B右図および図5右図)。以上より、実施例２の方法によると、比較例１に比べてリンパ球を顕著に活性化できることがわかった。
【０１０４】
実施例３：SV40 wild type VP1 VLP刺激におけるガングリオシドGM1依存的なCD86分子の上昇の検出
野生型 (wt: wild type) simian virus 40 (SV40) VP1を発現するバキュロウイルスの作製
実施例１に記載したものと同じ方法によって、wt SV40 VP1を発現するバキュロウイルスを作製した。
【０１０５】
wt SV40 VP1ウイルス様粒子 (VLP: virus-like particle) の調製
実施例１に記載したものと同じ方法によって、wt SV40 VP1 VLPを調製した。
【０１０６】
M1 CTLエピトープ挿入SV40 VP1を発現するバキュロウイルスの作製
比較例１に記載したものと同じ方法によって、M1 CTLエピトープ挿入SV40 VP1を発現するバキュロウイルスを作製した。
【０１０７】
FMP-DE-VLP及びFMP-HI-VLPの調製
比較例１に記載したものと同じ方法によって、FMP-DE-VLPおよびFMP-HI-VLPを調製した。
【０１０８】
マウスの脾臓からのリンパ球の調製
腹腔内免疫したマウスに代えて非免疫HHDマウスの脾臓を用いたこと以外は実施例１に記載したとおりにして、マウスの脾臓からリンパ球を調製した。
【０１０９】
wt SV40 VP1 VLP刺激によるCD分子の発現上昇に対するガングリオシドの影響
以下のようにして、wt SV40 VP1 VLP試料を調製した。96 ウェル丸底プレートに、wt SV40 VP1 VLP溶液 (PBS(-)中500 μg/ml)を5 μl/ウェル加えた。そこに非免疫HHDマウスの脾臓から調製したリンパ球を5x105細胞加えた。全量200 μlとなるようにR10 培地を加えた。その後、5%CO2, 37℃のインキュベータで24 時間インキュベートした。
【０１１０】
また、以下のようにして、GM1処理wt SV40 VP1 VLP試料およびGD1a処理wt SV40 VP1VLP試料を調製した。96 ウェル丸底プレートに、wt SV40 VP1 VLP溶液 (PBS(-)中500 μg/ml)を5 μl/ウェル加えた。そこに、SV40のレセプターである糖脂質の一種であるガングリオシドGM1溶液(R10培地中20 μg/ml)を100μl、または、SV40のレセプターではない糖脂質の一種であるガングリオシドGD1a溶液(R10培地中20 μg/ml)を100 μl加えた。37℃、1時間、5%CO2インキュベータでインキュベートした。インキュベート後、非免疫HHDマウスの脾臓から調製したリンパ球を5x105細胞加えた。全量200μlとなるようにR10 培地を加えた。その後、5%CO2, 37℃のインキュベータで24 時間インキュベートした。
コントロールとして、96ウェル丸底プレートにPBS(-)を5μl/ウェル加えた。そこに非免疫HHDマウスの脾臓から調製したリンパ球を5x105細胞加えた。全量200μlとなるようにR10培地を加えた。その後、5%CO2, 37℃のインキュベータで24 時間インキュベートした。
【０１１１】
インキュベート後、実施例２に記載したとおりにFACScan（Becton Dickinson）の前処理を行い、FACScan（Becton Dickinson）でヒストグラム解析を行った。解析にはCell Quest（Becton Dickinson） のソフトウェアを使用した。
【０１１２】
結果を図6Aに示す。図6Aに示すように、wt SV40 VLP試料およびGD1a処理wt SV40 VP1 VLP試料と共にインキュベートしたリンパ球では白抜きピークの右側へのシフトが観られ(図6A左下図および右下図)、CD86発現誘導が示唆された。一方、GM1処理wt SV40 VP1 VLP試料と共にインキュベートしたリンパ球では白抜きピークが灰色ピークとほぼ重なり(図6A右上図)、CD86の発現誘導が観られなかった。したがって、CD86分子の発現誘導は、GD1aでのインキュベーションでは阻害されないが、GM1とのインキュベーションで阻害されることが明らかとなった。このことから、wt SV40 VP1 VLPによるCD86分子の発現誘導は、wt SV40 VP1 VLPとGM1との結合を介して行われ、したがって、wt SV40 VP1 VLPによるCD86の発現増加にはwt SV40 VP1 VLP がリンパ球表面のガングリオシドGM1と結合することが必要であることが示唆された。
【０１１３】
FMP-DE-VLP及びFMP-HI-VLP刺激によるCD86分子の発現上昇に対するガングリオシドの影響
以下のようにしてFMP-DE-VLP試料およびFMP-HI-VLP試料を調製した。96 ウェル丸底プレートに、比較例１で調製したFMP-DE-VLP溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9)および50% Opti-prep中500 μg/ml)および比較例１で調製したFMP-HI-VLP溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9)および50% Opti-prep中500 μg/ml)をそれぞれ5 μl/ウェル加えた。そこに非免疫HHDマウスの脾臓から調製したリンパ球を5x105細胞加えた。全量200μlとなるようにR10培地を加えた。その後、5%CO2, 37℃のインキュベータで24時間インキュベートした。
【０１１４】
また、以下のようにしてGM1処理FMP-DE-VLP試料およびGM1処理FMP-HI-VLP試料を調製した。96ウェル丸底プレートに、FMP-DE-VLP溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9)および50% Opti-prep中500 μg/ml)およびFMP-HI-VLP溶液(20 mM Tris-HCl (pH7.9)および50% Opti-prep中500 μg/ml)をそれぞれ5 μl/ウェル加えた。そこに、SV40のレセプターである糖脂質の一種であるガングリオシドGM1溶液(R10培地中20 μg/ml)を100μl加えた。37℃、1時間、5%CO2インキュベータでインキュベートした。インキュベート後、非免疫HHDマウスの脾臓から調製したリンパ球を5x105細胞加えた。全量200 μlとなるようにR10培地を加えた。その後、5%CO2, 37℃のインキュベータで24 時間インキュベートした。
コントロールとして、96 ウェル丸底プレートに、20 mM Tris-HCl (pH7.9)および50% Opti-prepを含むバッファーを5 μl/ウェル加えた。そこに非免疫HHDマウスの脾臓から調製したリンパ球を5x105細胞加えた。全量200 μlとなるようにR10培地を加えた。その後、5%CO2, 37℃のインキュベータで24時間インキュベートした。
【０１１５】
インキュベート後、実施例２に記載したとおりにしてFACScanの前処理を行い、FACScan （Becton Dickinson）でヒストグラム解析を行った。解析にはCell Quest （Becton Dickinson）のソフトウェアを使用した。
【０１１６】
結果を図6Bに示す。図6Bに示すように、FMP-DE-VLP、FMP-HI-VLP、GM1処理FMP-DE-VLPおよびGM1処理FMP-HI-VLPと共にインキュベートしたマウスリンパ球の全てにおいて、白抜きピークが灰色ピークよりも右側にシフトし、CD86の発現が誘導されることが示唆された。すなわち、CD86分子の発現誘導は、GM1とのインキュベーションで阻害されなかった。
このことから、FMP-DE-VLPおよびFMP-HI-VLPによるCD86分子の発現誘導機構は、GM1との結合を介するものではないと考えられた。したがってwt SV40 VP1 VLPによるCD86発現誘導機構とは異なる可能性が示唆された。
【０１１７】
FLAG配列および3xRGD配列挿入SV40 VP1を発現する発現するバキュロウイルスの作製
FLAG配列(DYKDDDDK)または3xRGD配列(RGDRGDRGD)を、SV40 VP1に挿入した。具体的には、VP1のDEループ領域(137-138アミノ酸領域、古典的にVP1遺伝子の4番目のAlaをアミノ酸番号1として)を、アミノ末端とカルボキシル末端を3つのグリシンを付加したDYKDDDDKまたはRGDRGDRGDで置き換え、FLAG配列挿入SV40 VP1挿入変異体(DE-FLAG VP1)または3xRGD配列挿入SV40 VP1挿入変異体(DE-3xRGD VP1)を作製した。作製方法は、SV40 VP1をコードするpFastBac 1-SV40 wild type VP1をテンプレートして、Overhang PCR法にて作製した。
【０１１８】
DE-FLAG-VP1作製用プライマー
1st round
5'側断片作製用Fプライマー
5'-AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG（配列番号１０）
5'側断片作製用Rプライマー
5'-CTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTCCTCCTCCATGAGTTTTTTGTGTCCCTGAATG（配列番号１１）
3'側断片作製用Fプライマー
5'-CTACAAGGACGACGATGACAAGGGAGGAGGAGGTGCTGGAAAACCCATTCAAG（配列番号１２）
3'側断片作製用Rプライマー
5'-AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG（配列番号１３）
【０１１９】
2nd round
Fプライマー
5'-AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG（配列番号１０）
Rプライマー
5'-AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG（配列番号１３）
【０１２０】
DE-3xRGD-VP1作製用プライマー
1st round
5'側断片作製用Fプライマー
5'-AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG（配列番号１０）
5'側断片作製用Rプライマー
5'-GCCTCTATCGCCCCTGTCTCCTCTGCCTCCTCCATGAGTTTTTTGTGTCCCTGAATG（配列番号１４）
3'側断片作製用Fプライマー
5'-GAGACAGGGGCGATAGAGGCGACGGGGGAGGAGGTGCTGGAAAACCCATTCAAG（配列番号１５）
3'側断片作製用Rプライマー
5'-AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG（配列番号１３）
【０１２１】
2nd round
Fプライマー
5'-AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG（配列番号１０）
Rプライマー
5'-AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG（配列番号１３）
【０１２２】
テンプレートは10 ng使用した。プライマーは50 pmolずつ加えた。これらと、KOD polymerase (TOYOBO) 2.5 units, 0.2 mM dNTPs, 1 mM MgCl2, 6 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 120 mM Tris-HCl(pH8.0), 0.1% TritonX-100, 0.001% BSAとを含む混合溶液30 μlを調製した。
【０１２３】
PCRは1st round、2 nd round共に、98℃で60秒インキュベートした後、次のサイクルを25回繰り返し (98℃15秒、59℃15秒、74℃30秒) 、最後に74℃で1分30秒インキュベートして、4℃に移行した。
【０１２４】
Overhang PCRで作製した、PCR断片を制限酵素のKpnIとSalIで切断した。これをpFastBac 1プラスミドベクターのKpnI、SalIサイトの間に挿入し、DE-FLAG VP1またはDE-3xRGD VP1プラスミドとした。各プラスミドでバキュロウイルスゲノムを保持する大腸菌DH10bac (invitrogen)を形質転換し、これらの組換えVP1のコード配列を組込んだ組換えバキュロウイルスゲノムを調製した。組換えバキュロウイルスゲノムをSf-9細胞にトランスフェクションした。三日後にその上清を回収して、組換えバキュロウイルスを含む溶液とした。この溶液の一部を再び、Sf-9細胞に感染させることで、組換えバキュロウイルスタイターを上昇させて、組換えバキュロウイルスのストック溶液とした。
【０１２５】
VP2融合M1タンパク質を発現するバキュロウイルスの作製
wt SV40 VP2 (配列番号１６；核酸配列は配列番号１７に示す)のアミノ末端 (N末端: amino terminus)をコードするコドンの上流にFLAGタグのコード配列(配列番号１８)を付加して更にその上流にBamHIサイトを導入した。また、wt SV40 VP2コード配列のストップコドンを除いてEcoRIサイトを導入した。得られたポリヌクレオチドをpFastBac1プラスミドのBamHIサイト、および、EcoRIサイトを介して挿入し、wt SV40 VP2遺伝子を含むプラスミドを作製した。M1タンパク質のN末端をコードするコドンの上流にGGGGSGGGGSGGGGSリンカー(配列番号１９；核酸配列は配列番号２０に示す)のコード配列を導入し、更にその上流にEcoRIサイトを導入した。また、M1タンパク質コード配列の下流にストップコドンを付加して更にその下流にSal Iサイトを導入した。得られたポリヌクレオチドを、上記のwt SV40 VP2遺伝子を含むプラスミドのEcoRIサイト、および、Sal Iサイトを介して導入し、VP2コード配列の下流にM1コード配列を融合した遺伝子を保持したプラスミドを作製した。
【０１２６】
このプラスミドで、バキュロウイルスゲノムを保持する大腸菌DH10bac (invitrogen)を形質転換し、wt SV40 VP2にM1を融合したタンパク質VP2-M1（配列番号２１；核酸配列は配列番号２２に示す）を発現する組換えバキュロウイルスゲノムを調製した。これらの組換えバキュロウイルスゲノムをSf-9細胞にトランスフェクションした。三日後にその上清を回収して、組換えバキュロウイルスを含む溶液とした。上記で得られた溶液の一部を再び、Sf-9細胞に感染させることで、組換えバキュロウイルスタイターを上昇させて、組換えバキュロウイルスのストック溶液とした。
【０１２７】
VP2-M1を含むwtSV40 VP1 VLPの調製
wt SV40 VP1を組込んだ組換えバキュロウイルス（M.O.I. (multiplicity of infection) = 0.05〜0.2）と、VP2-M1を組込んだバキュロウイルス（M.O.I. = 0.015〜0.06）とを、3x107個のSf-9細胞を撒いた15 cm 培養ディッシュ中で共感染させた(wt SV40 VP1 : VP2-M1 = 1 : 0.3の感染比率 (M.O.I.ベース))。これを計10枚作成した。感染3日後に、これら10枚のディッシュに撒いた計3x108個のSf-9細胞を回収し、PBS(-)で洗浄した。その後、細胞を10 mlのVP1超音波処理用バッファー (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 1% (w/vol)デオキシコール酸(Sigma))で再懸濁した。内在性のプロテアーゼ活性を抑制するため、2 mM フッ化フェニルメタンスルホニル (最終濃度2 μM, Sigma) 、及び、キモスタチン (最終濃度1 μg/ml, Sigma)、アプロチニン (最終濃度1 μg/ml, Sigma)、ロイペプチン (最終濃度1 μg/ml, Sigma)、アンチパイン (最終濃度1 μg/ml, Sigma)、ペプスタチン (最終濃度1 μg/ml, Sigma) を加えて、超音波破砕した。その後、15,000 rpm、4℃で5分間遠心分離して上清とペレットに分け、上清をライセート溶液とした。
【０１２８】
塩化セシウム密度勾配遠心用に20% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 20% (w/vol) 塩化セシウム), 30% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 30% (w/vol) 塩化セシウム), 40% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 40% (w/vol) 塩化セシウム), 50% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 50% (w/vol) 塩化セシウム) をUltra-Clear 遠心分離用チューブ (14 x 89 mm, Beckman coulter)に密度の高い方から順に1.5 mlずつ重層した。更にVP2-M1を含むwt SV40 VP1を含むライセート溶液5 mlを重層した。35,000 rpm, 3時間, 4℃で超遠心分離した (SW41Ti rotor, Beckman)。
【０１２９】
超遠心分離後、中央に現れる白いバンドを23G, 1 mlのテルモシリンジ (0.60 x 32 mm、TERUMO)で回収した。この画分を37% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 37% (w/vol) 塩化セシウム) と混合し、Ultra-Clear 遠心分離用チューブ(11 x 60 mm, Beckman coulter)に移した。その後、50,000 rpm, 20時間, 4℃で超遠心分離した (SW60Ti rotor, Beckman)。超遠心分離後、中央に現れる白いバンドを23G, 1 mlのテルモシリンジ (0.60 x 32 mm、TERUMO)で回収した。この画分をPBS(-) の溶媒で透析(Slide-A-Lyzer(商標) MINI Dialysis Units, 3,500MWCO, ThermoSCIENTIFIC)した。この画分を15,000 rpm, 5分, 4℃で遠心して上清を回収して精製VP2-M1を含むwt SV40 VP1 VLP画分とした。
【０１３０】
VP2-M1を含むDE-FLAG VLP、およびVP2-M1を含むDE-3xRGD VLPの調製
DE-FLAG VP1またはDE-3xRGD VP1を組込んだ組換えバキュロウイルス(M.O.I. (multiplicity of infection) = 0.05〜0.2)と、VP2-M1を組込んだバキュロウイルス(M.O.I. = 0.015〜0.06)とを、3x107個のSf-9細胞を撒いた15 cm 培養ディッシュ中で共感染させた(DE-FLAG VP1またはDE-3xRGD VP1 : VP2-M1 = 1 : 0.3の感染比率(M.O.I.ベース))。これを計10枚作成した。感染3日後に、これら10枚のディッシュに撒いた計3x108個のSf-9細胞を回収し、PBS(-)で洗浄した。その後、細胞を10 mlのVP1 超音波処理用バッファー (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 1% (w/vol) デオキシコール酸(Sigma))で再懸濁した。その後、内在性のプロテアーゼ活性を抑制するため、2 mM フッ化フェニルメタンスルホニル (最終濃度2 μM, Sigma) 、及び、キモスタチン (最終濃度1 μg/ml, Sigma)、アプロチニン (最終濃度1 μg/ml, Sigma)、ロイペプチン (最終濃度1 μg/ml, Sigma)、アンチパイン (最終濃度1 μg/ml, Sigma)、ペプスタチン (最終濃度1 μg/ml, Sigma) を加えて、超音波破砕した。その後、15,000 rpm、4℃で5分間遠心して上清とペレットに分け、上清をライセート溶液とした。
【０１３１】
塩化セシウム密度勾配遠心用に20% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 20% (w/vol) 塩化セシウム), 30% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 30% (w/vol) 塩化セシウム), 40% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 40% (w/vol) 塩化セシウム), 50% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 50% (w/vol) 塩化セシウム) をUltra-Clear 遠心分離用チューブ (14 x 89 mm, Beckman coulter)に密度の高い方から順に1.5 mlずつ重層した。更にVP2-M1を含むwt SV40 VP1を含むライセート溶液5 mlを重層した。35,000 rpm, 3時間, 4℃で超遠心分離した (SW41Ti rotor, Beckman)。
【０１３２】
超遠心分離後、中央に現れる白いバンドを23G, 1 mlのテルモシリンジ (0.60 x 32 mm、TERUMO)で回収した。その画分を37% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 37% (w/vol) 塩化セシウム) と混合し、Ultra-Clear 遠心分離用チューブ(11 x 60 mm, Beckman coulter)に移した。その後、50,000 rpm, 20時間, 4℃で超遠心分離した (SW60Ti rotor, Beckman)。超遠心分離後、中央に現れる白いバンドを23G, 1 mlのテルモシリンジ (0.60 x 32 mm、TERUMO)で回収した。この画分をPBS(-) の溶媒で透析(Slide-A-Lyzer(商標) MINI Dialysis Units, 3,500MWCO, ThermoSCIENTIFIC)した。この画分を15,000 rpm, 5分, 4℃で遠心して上清を回収して精製VP2-M1を含むDE-FLAG VP1 VLP、および、精製VP2-M1を含むDE-3xRGD VP1 VLP画分とした。
【０１３３】
VP2-M1を含むwt SV40 VP1 VLP、VP2-M1を含むDE-FLAG VLP、およびVP2-M1を含むDE-3xRGD VLP刺激によるCD86分子の発現上昇
96ウェル丸底プレートに、VP2-M1を含むwt SV40 VP1 VLP溶液(PBS(-)中500μg/ml)、VP2-M1を含むDE-3xRGD VLP溶液(PBS(-)中500μg/ml)、およびVP2-M1を含むDE-FLAG VLP溶液(PBS(-)中500μg/ml)をそれぞれ5μl/ウェル加えた。そこに非免疫HHDマウスの脾臓から調製したリンパ球を5x105細胞加えた。全量200μlとなるようにR10培地を加えた。その後、5%CO2, 37℃のインキュベーターで24時間インキュベートした。
【０１３４】
インキュベート後、実施例２に記載したとおりにしてFACScanの前処理を行い、FACScan （Becton Dickinson）でヒストグラム解析を行った。解析にはCell Quest（Becton Dickinson）のソフトウェアを使用した。
【０１３５】
結果を図6Cに示す。図6Cに示すように、VP2-M1を含むwt SV40 VP1 VLPにおいて白抜きピークの右側へのシフトが観られ(図6C左下図)、wt SV40 VP1 VLPと同程度のCD86誘導活性を示した(図6Aおよび図6C)。この結果から、wt SV40 VP1からなるVLPはVP2-M1を内包してもwt SV40 VP1のみからなるVLPと同様にCD86分子の発現誘導能が高いことが明らかとなった。一方、VP2-M1を含むDE-FLAG VLPおよびVP2-M1を含むDE-3xRGD VLPではCD86分子の発現誘導がほとんど見られなかった(図6C右上図および右下図)。
以上の結果から、VP1のloop領域に異種ペプチドを挿入するとCD86分子の誘導が見られなくなるケースが生じることが明らかとなった。よって確実にCD86分子の発現誘導（リンパ球の活性化）を誘導するためにはwt SV40 VP1 VLPが効果的であることが示唆された。
【０１３６】
実施例４：マウスリンパ球におけるwt SV40 VP1 VLP刺激による細胞表面CD69, CD81, CD83, CD86, CD196, CD197分子、および、細胞内部CD63, CD68分子の発現上昇
野生型 (wt: wild type) simian virus 40 (SV40) VP1を発現するバキュロウイルスの作製
実施例１に記載した方法と同様にして、wt SV40 VP1を発現するバキュロウイルスを作製した。
【０１３７】
wt SV40 VP1ウイルス様粒子 (VLP: virus-like particle) の調製
実施例１に記載した方法と同様にして、wt SV40 VP1 VLPを調製した。
【０１３８】
マウスの脾臓からのリンパ球の調製
腹腔内免疫したマウスに代えて非免疫HHDマウスの脾臓を用いたこと以外は実施例１に記載したとおりにして、マウスの脾臓からリンパ球を調製した。
【０１３９】
wt SV40 VP1 VLP刺激によるCD69, CD81, CD83, CD86, CD196, CD197 分子の発現上昇
96 ウェル丸底プレートに、wt SV40 VP1 VLP溶液 (PBS(-)中500 μg/ml)またはPBS(-)のみを5 μl/ウェル加えた。そこに非免疫HHDマウスの脾臓から調製したリンパ球を5x105細胞加えた。全量200 μlとなるようにR10培地を加えた。その後、5%CO2, 37℃のインキュベーターで24時間インキュベートした。
【０１４０】
インキュベート後、4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、ボルテックスミキサーで細胞をほぐした。その後、FACS バッファー (2% FCS, 0.1% アジ化ナトリウム, 1xPBS(-))を200 μl/ウェル加えた。再び4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、細胞をほぐした。その後、FACS バッファーで20 μg/mlに希釈したLEAF Purified Rat Anti-Mouse CD16/32 Clone: 93 (BioLegend) を100 μl加えて、４℃で10分間インキュベートした。インキュベート後、200 μlのFACS バッファーでの洗浄操作を1回行った。その後、細胞をほぐし、以下のとおりに処理した。
【０１４１】
(1)  FACS バッファーで10 μg/mlに希釈したFITC American Hamster Anti-Mouse CD69 Clone: H1.2F3 (BD Pharmingen)を50 μl加えて、４℃、暗所で30分間インキュベートした。
(2)  FACS バッファーで10 μg/mlに希釈したPE Armenian Hamster Anti-Mouse/Rat CD81 Clone: Eat-2 (BioLegend)を50 μl加えて、４℃、暗所で30分間インキュベートした。
(3)  FACS バッファーで10 μg/mlに希釈したPE Rat Anti-Mouse CD83 Clone: Michel-19 (BioLegend)を50 μl加えて、４℃、暗所で30分間インキュベートした。
(4)  FACS バッファーで10 μg/mlに希釈したPE Rat Anti-Mouse CD86 Clone: GL-1 (BioLegend)を50 μl加えて、４℃、暗所で30分間インキュベートした。
(5)  FACS バッファーで10 μg/mlに希釈したPE Armenian Hamster Anti-Mouse CD196 (CCR6) Clone: 29-2L17 (BioLegend)を50 μl加えて、４℃、暗所で30分間インキュベートした。
(6)  FACS バッファーで10 μg/mlに希釈したPE Rat Anti-Mouse CD197 (CCR7) Clone: 4B12 (BioLegend)を50 μl加えて、４℃、暗所で30分間インキュベートした。
【０１４２】
インキュベート後、200 μlのFACS バッファーでの洗浄操作を2回行った。その後、ほぐした細胞に、100 μl/ウェルのFACS固定バッファー(1% ホルムアルデヒド, 1xFACS バッファー)を加えた。4℃ 暗所で一晩インキュベートした。その後、400 μlのFACS バッファーを5 mlのポリスチレンチューブ(BD Falcon, 5 ml polystyrene round-bottom tube 12 x 75 mm style)に加えた。そこに100 μlのFACS固定バッファーで固定したサンプルを加えた。その後、FACScan（Becton Dickinson）でヒストグラム解析を行った。解析にはCell Quest（Becton Dickinson）のソフトウェアを使用した。結果を図7Aに示す。
【０１４３】
図7A上段の各図に示されるように、PBS(-)バッファーのみで刺激したマウスリンパ球についての白抜きのピークは、VLPやバッファーなどを何も加えていないリンパ球とR10培地のみでインキュベーションしたサンプルと各種蛍光抗体で染色した灰色のピークとほぼ重なっていた。一方、wt SV40 VP1 VLPで刺激したマウスリンパ球についての白抜きのピークは、その灰色のピークから右側にシフトしていた(図7A下段各図)。これは、wt SV40 VP1 VLPで刺激した場合、各CD分子を高度に発現する細胞が増加したことを示す。以上より、マウスリンパ球において、wt SV40 VP1 VLPはCD69、CD81、CD83、CD86、CD196およびCD197分子の発現上昇を誘導することが明らかとなった。
【０１４４】
wt SV40 VP1 VLP刺激によるCD63, CD68 分子の発現上昇
96 ウェル丸底プレートに、wt SV40 VP1 VLP溶液 (PBS(-)中500 μg/ml) を5 μl/ウェル加えた。そこに非免疫HHDマウスの脾臓から調製したリンパ球を5x105細胞加えた。全量200μlとなるようにR10培地を加えた。その後、5%CO2, 37℃のインキュベーターで24時間インキュベートした。
【０１４５】
インキュベート後、4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、ボルテックスミキサーで細胞をほぐした。その後、FACS バッファー (2% FCS, 0.1% アジ化ナトリウム, 1xPBS(-))を200 μl/ウェル加えた。再び4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、細胞をほぐした。その後、FACS バッファーで20μg/mlに希釈したLEAF Purified Rat Anti-Mouse CD16/32 Clone: 93 (BioLegend)を100μl加えて、４℃で10分間インキュベートした。インキュベート後、200 μlのFACS バッファーでの洗浄操作を2回行った。その後、ほぐした細胞に、100 μl/ウェルのBD Cytofix/Cytoperm(商標) (BD Biosciences)を加えて、4℃暗所で20分間インキュベートした。インキュベート後、200 μlの1xBD Perm/Wash(商標) (BD biosciences)でFACS バッファーで行った洗浄操作と同様の操作を2回行った。その後、ほぐした細胞に、50 μlの1xBD Perm/Wash(商標) に2.5 μLのPE Rat anti-mouse CD63 antibody Clone: NVG-2 (BioLegend) 、またはPE Rat anti-mouse CD68 antibody Clone: FA-11 (BioLegend)を加えて、この混合液を各ウェルに加えた。4℃暗所で30分間インキュベートした。
【０１４６】
インキュベート後、200 μlの1xBD Perm/Wash(商標)での洗浄操作を2回行った。その後、ほぐした細胞に、1ウェル当り100μlのFACS固定バッファー (1% ホルムアルデヒド, 1xFACS バッファー)を加えて、4℃ 暗所で一晩インキュベートした。インキュベート後、400 μlのFACS バッファーを5 mlのポリスチレンチューブ(BD Falcon, 5 ml polystyrene round-bottom tube 12 x 75 mm style)に加えた。そこに100 μlのFACS固定バッファーで固定したサンプルを加えた。その後、FACScan（Becton Dickinson）でヒストグラム解析を行った。解析にはCell Quest（Becton Dickinson）のソフトウェアを使用した。結果を図7Bに示す。
【０１４７】
図7B上段各図に示されるように、PBS(-)バッファーのみで刺激したマウスリンパ球についての白抜きのピークは、VLPやバッファーなどを何も加えていないリンパ球とR10培地のみでインキュベーションしたサンプルを各種蛍光抗体で染色した灰色のピークとほぼ重なっていた。一方、wt SV40 VP1 VLPで刺激したマウスリンパ球についての白抜きのピークは、その灰色のピークから右側にシフトしていた(図7B下段各図)。これは、wt SV40 VP1 VLPで刺激した場合CD63およびCD68分子を高度に発現する細胞が増加したことを示す。以上より、マウスリンパ球において、wt SV40 VP1 VLPはCD63およびCD68分子の発現上昇を誘導することが明らかとなった。
【０１４８】
実施例５：マウスCD4+T細胞、マウスCD8+T細胞およびマウスB細胞におけるwt SV40 VP1 VLP刺激によるCD86分子の誘導
野生型 (wt: wild type) simian virus 40 (SV40) VP1を発現するバキュロウイルスの作製
実施例１に記載したものと同じ方法によって、wt SV40 VP1を発現するバキュロウイルスを作製した。
【０１４９】
wt SV40 VP1ウイルス様粒子 (VLP: virus-like particle) の調製
実施例１に記載したものと同じ方法によって、wt SV40 VP1 VLPを調製した。
【０１５０】
マウスの脾臓からのリンパ球の調製
腹腔内免疫したマウスに代えて非免疫HHDマウスの脾臓を用いたこと以外は実施例１に記載したとおりにして、マウスの脾臓からリンパ球を調製した。
【０１５１】
wt SV40 VP1 VLP刺激によるCD4+T, CD8+T, B細胞上のCD86分子の発現解析
マウス脾臓リンパ球から、磁気ビーズを用いてポジティブセレクションを行って、CD4+ T細胞 (mouse CD4 (L3T4) MicroBeads (Miltenyi Biotec Inc., 130-049-201))、CD8+T 細胞 (mouse CD8a (Ly-2) MicroBeads (Miltenyi Biotec Inc., 130-049-401))、B細胞(mouse CD19 MicroBeads (Miltenyi Biotec Inc., 130-052-201)) を添付のマニュアル通りの方法に従って調製した。調製した細胞の細胞数をカウントした後、以下の実験に用いた。
【０１５２】
96 ウェル丸底プレートに、wt SV40 VP1 VLP溶液 (PBS(-)中500 μg/ml) を5 μl/ウェル加えた。そこにCD4+T, CD8+T, B細胞を5x105細胞加えた。全量200μlとなるように、R10 培地を加えた。その後、5%CO2, 37℃のインキュベーターで24 時間インキュベートした。インキュベート後、実施例２に記載したとおりにしてFACScanの前処理を行い、FACScan（Becton Dickinson）でヒストグラム解析を行った。解析にはCell Quest（Becton Dickinson）のソフトウェアを使用した。結果を図8に示す。
【０１５３】
図8上段各図に示されるように、PBS(-)バッファーのみで刺激したマウスリンパ球についての白抜きのピークは、VLPやバッファーなどを何も加えていないリンパ球とR10培地のみでインキュベーションしたサンプルを各種蛍光抗体で染色した灰色のピークとほぼ重なっていた。一方、wt SV40 VP1 VLPで刺激したマウスリンパ球についての白抜きのピークは、その灰色のピークから右側にシフトしていた(図8下段各図)。これは、wt SV40 VP1 VLPで刺激した場合、CD86分子を高度に発現するマウスCD4+T細胞、マウスCD8+T細胞およびマウスB細胞が増加したことを示す。以上より、マウスCD4+T細胞、マウスCD8+T細胞およびマウスB細胞において、wt SV40 VP1 VLPはCD86分子の発現上昇を誘導することが明らかとなった。
【０１５４】
実施例６：マウスリンパ球におけるwt SV40 VP1 VLP刺激によるCCL3, CCL4の分泌誘導
野生型 (wt: wild type) simian virus 40 (SV40) VP1を発現するバキュロウイルスの作製
実施例１に記載した方法と同様にして、wt SV40 VP1を発現するバキュロウイルスを作製した。
【０１５５】
wt SV40 VP1ウイルス様粒子 (VLP: virus-like particle) の調製
実施例１に記載した方法と同様にして、wt SV40 VP1 VLPを調製した。
【０１５６】
マウスの脾臓からのリンパ球の調製
腹腔内免疫したマウスに代えて非免疫HHDマウスの脾臓を用いたこと以外は実施例１に記載したとおりにして、マウスの脾臓からリンパ球を調製した。
【０１５７】
M1 CTLエピトープ挿入SV40 VP1を発現するバキュロウイルスの作製
比較例１に記載した方法と同様にして、M1 CTLエピトープ挿入SV40 VP1を発現するバキュロウイルスを作製した。
【０１５８】
FMP-DE-VLP及びFMP-HI-VLPの調製
比較例１に記載した方法と同様にして、FMP-DE-VLP及びFMP-HI-VLPを調製した。
【０１５９】
wt SV40 VP1 VLP刺激によるサイトカイン、およびケモカインの分泌誘導
96 ウェル丸底プレートに、wt SV40 VP1 VLP溶液(最終濃度 12.5μg/ml)、FMP-DE-VLP溶液 (最終濃度 12.5μg/ml) 、FMP-HI-VLP溶液(最終濃度 12.5μg/ml)、LPS(リポ多糖、Sigma；最終濃度 1μg/ml)、およびCT(コレラトキシン、Sigma；最終濃度 12.5μg/ml)をそれぞれ添加した。そこに非免疫マウスの脾臓から調製したリンパ球を5x105細胞加えた。全量200μlとなるようにR10培地を加えた。その後、5%CO2, 37℃のインキュベーターで24 時間インキュベートした。
【０１６０】
インキュベート後、その細胞上清を回収した。その細胞上清に含まれるIFN-γ (DY485 Mouse IFN-gamma DuoSet, R&D SYSTEMS)、TNF-α (DY410 Mouse TNF-alpha DuoSet, R&D SYSTEMS)、IL-6 (DY406 Mouse IL-6 DuoSet, R&D SYSTEMS)、IL-1β (DY401 Mouse IL-1 beta/IL-1F2 DuoSet, R&D SYSTEMS)、CCL3 (DY450 Mouse CCL3/MPI-1α DuoSet, R&D SYSTEMS)、CCL4 (DY451 Mouse CCL4/MIP-1β DuoSet, R&D SYSTEMS)の量をELISA法で検出した。検出は、キットのマニュアルに従って行った。結果を図9に示す。
【０１６１】
その結果、wt SV40 VP1 VLPは、IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-1β (全身性の炎症を誘導するサイトカイン)の分泌を誘導せず、CCL3, CCL4 (局所炎症を誘導するケモカイン)の分泌を誘導した。一方、CTは、CCL3, CCL4に加えて、IL-6, IL-1βの分泌を誘導し、LPSは検討したすべてのサイトカインおよびケモカインの分泌を誘導した。以上より、本実施例のwt SV40 VP1 VLPは公知のアジュバントであるCTやLPSに比べて全身性の炎症が低減されることが示唆された。
また、FMP-DE-VLPおよびFMP-HI-VLPは、若干のIFN-γ, TNF-α, IL-6の分泌を誘導すると共に、CCL3, CCL4の分泌も誘導した。しかし、CCL3およびCCL4の発現量は本実施例のwt SV40 VP1 VLPよりも低かった。以上より、本実施例のwt SV40 VP1 VLPは、FMP-DE-VLPおよびFMP-HI-VLPよりも全身性の炎症が低減され、局所性の炎症をより誘導できることが示唆された。
【０１６２】
比較例２：マウスリンパ球におけるSV40 virus刺激によるCD86分子の発現上昇、および各種サイトカインの分泌誘導
simian virus 40 (SV40) ウイルスの作製
SV40ゲノム(配列番号２３)をコードした遺伝子を挿入したプラスミドpUC-SV40 (配列番号２４)をBamHIで処理した。T4 DNA Ligase (TaKaRa) を加えて、SV40ゲノムを環状化した。環状化したSV40ゲノムをトランスフェクション試薬 (Effectene, Qiagen) を用いてCV-1細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション3日後に培地を細胞ごと回収した。回収した培地を、凍結融解を3回繰り返した。その後、その培地を再びCV-1細胞と混合し、感染させた。感染3日後に、培地を細胞ごと回収した。培地に含まれるSV40ウイルスのウイルスタイターをプラークアッセイ法で算出した。
【０１６３】
マウスの脾臓からのリンパ球の調製
腹腔内免疫したマウスに代えて非免疫HHDマウスの脾臓を用いたこと以外は実施例１に記載したとおりにして、マウスの脾臓からリンパ球を調製した。
【０１６４】
SV40ウイルス刺激によるCD86分子の発現上昇
96 ウェル丸底プレートに、非免疫マウスの脾臓から調製したリンパ球を5x105細胞/ウェル加えた。そこに、 SV40 virus溶液を1x106〜1 plaque forming unit (pfu)加えた。全量200μlとなるようにR10 培地を加えた。その後、5%CO2, 37℃のインキュベーターで24 時間インキュベートした。
インキュベート後、実施例２に記載したとおりにしてFACScanの前処理を行い、FACScan（Becton Dickinson）でヒストグラム解析を行った。解析にはCell Quest（Becton Dickinson）のソフトウェアを使用した。
【０１６５】
結果を図10Aに示す。図10Aにおいて、灰色のヒストグラムは、SV40 virus溶液を加えずにR10培地のみでインキュベートした場合の各蛍光強度における細胞数を示す。白抜きのヒストグラムは、SV40 virus溶液を加えたR10培地とインキュベートした場合の各蛍光強度における細胞数を示す。解析の結果、1〜1x102 pfuのSV40 virusで刺激したマウスリンパ球についての白抜きのピークは、灰色のピークとほぼ重なっていた(図10A下段各図)。一方、1x103〜1x106 pfu のSV40 virusで刺激したマウスリンパ球についての白抜きのピークは、灰色のピークから右側にシフトしていた(図10A上段各図)。以上より、マウスリンパ球において、SV40 virusはCD86分子の発現上昇を誘導することが明らかとなった。
【０１６６】
SV40ウイルス刺激サイトカイン、ケモカインの発現上昇
96 ウェル丸底プレートに、SV40 virus 溶液 (1x107 plaque forming unit (pfu)/ml, 1x106pfu/ml, 1x105 pfu/ml, 1x104 pfu/ml, 1x103pfu/ml, 1x102 pfu/ml) を100 μl/ウェル加えた。そこにナイーブマウスの脾臓から調製したリンパ球を5x105細胞加えた。全量200μlとなるようにR10培地を加えた。その後、5%CO2, 37℃のインキュベーターで24 時間インキュベートした。
【０１６７】
インキュベート後、その細胞上清を回収した。その細胞上清に含まれるIFN-γ (DY485 Mouse IFN-gamma DuoSet, R&D SYSTEMS)、TNF-α (DY410 Mouse TNF-alpha DuoSet, R&D SYSTEMS)、IL-6 (DY406 Mouse IL-6 DuoSet, R&D SYSTEMS)、IL-1β (DY401 Mouse IL-1 beta/IL-1F2 DuoSet, R&D SYSTEMS)、CCL3 (DY450 Mouse CCL3/MPI-1α DuoSet, R&D SYSTEMS)、CCL4 (DY451 Mouse CCL4/MIP-1β DuoSet, R&D SYSTEMS)の量を、ELISA法で検出した。検出は、キットのマニュアルに従って行った。結果を図10Bに示す。
【０１６８】
その結果、SV40 virusは、解析した全てのサイトカイン(IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-1β)および、ケモカイン(CCL3, CCL4)の分泌を誘導した(図10B)。これは、wt SV40 VP1 VLPが、IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-1βの産生を誘導せず、ケモカイン、CCL3, CCL4の分泌を誘導するという実施例６でみられたパターンと異なる。このことから、SV40 virusによるマウスリンパ球の活性化は、SV40 virusの外殻(カプシド)以外の因子も関与している可能性が示唆された。
【０１６９】
実施例７：マウスリンパ球におけるwt SV40 VP1 VLP刺激によるErk1/2、JNK、p38MAPKのリン酸化
野生型 (wt: wild type) simian virus 40 (SV40) VP1を発現するバキュロウイルスの作製
実施例１に記載したとおりにして、wt SV40 VP1を発現するバキュロウイルスを作製した。
【０１７０】
wt SV40 VP1ウイルス様粒子 (VLP: virus-like particle) の調製
実施例１に記載したとおりにして、wt SV40 VP1 VLPを調製した。
【０１７１】
マウスの脾臓からのリンパ球の調製
腹腔内免疫したマウスに代えて非免疫HHDマウスの脾臓を用いたこと以外は実施例１に記載したとおりにして、マウスの脾臓からリンパ球を調製した。
【０１７２】
wt SV40 VP1 VLP刺激によるERK1/2, JNK, p38-MAPK分子のリン酸化解析
96ウェル丸底プレートに、wt SV40 VP1 VLP溶液 (PBS(-)中500 μg/ml)またはPBS(-)のみを5μl加えた。そこに非免疫マウスの脾臓から調製したリンパ球を5x105細胞加えた。全量200μlとなるようにR10培地を加えた。その後、5%CO2, 37℃のインキュベーターで10分、30分、1時間インキュベートした。
【０１７３】
インキュベート後、4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、ボルテックスミキサーで細胞をほぐした。その後、FACS バッファー (2% FCS, 0.1% アジ化ナトリウム, 1xPBS(-))を200 μl/ウェル加えた。再び4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、細胞をほぐした。その後、FACS バッファーで20 μg/mlに希釈したLEAF Purified Rat Anti-Mouse CD16/32 Clone: 93 (BioLegend) を100 μl加えて、４℃で10分間インキュベートした。インキュベート後、200 μlのFACS バッファーでの洗浄操作を2回行った。その後、ほぐした細胞に、100 μl/ウェルのBD Cytofix/Cytoperm(商標) (BD Biosciences)を加えて、4℃暗所で20分間インキュベートした。インキュベート後、200 μlの1xBD Perm/Wash(商標) (BD biosciences)でFACS バッファーで行った洗浄操作と同様の操作を2回行った。その後、細胞をほぐし、以下のとおり処理した。
【０１７４】
(1)  50 μlの1xBD Perm/Wash(商標) に1 μLのPhospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP(商標) Rabbit mAb (PE conjugate) (Cell Signaling TECHNOLOGY, #5682)を加えた。この混合液を各ウェルに加え、4℃暗所で30分間インキュベートした。
(2)  50 μlの1xBD Perm/Wash(商標) に1 μLのPhospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (G9) Mouse mAb (PE Conjugate) (Cell Signaling TECHNOLOGY, #5755)を加えた。この混合液を各ウェルに加え、4℃暗所で30分間インキュベートした。
(3)  50 μlの1xBD Perm/Wash(商標)に1 μLのPhospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (3D7) Rabbit mAb (PE Conjugate) (Cell Signaling TECHNOLOGY, #6908)を加えた。この混合液を各ウェルに加え、4℃暗所で30分間インキュベートした。
【０１７５】
インキュベート後、200 μlの1xBD Perm/Wash(商標)での洗浄操作を2回行った。その後、ほぐした細胞に、100μl/ウェルのFACS固定バッファー (1% ホルムアルデヒド, 1xFACS バッファー)を加えた。4℃暗所で一晩インキュベートした。
インキュベート後、400μlのFACS バッファーを5 mlのポリスチレンチューブ(BD Falcon, 5 ml polystyrene round-bottom tube 12 x 75 mm style)に加えた。そこに100 μlのFACS固定バッファーで固定したサンプルを加えた。その後、FACScan（Becton Dickinson）でヒストグラム解析を行った。解析にはCell Quest（Becton Dickinson）のソフトウェアを使用した。結果を図11A〜Cに示す。
【０１７６】
図11A〜Cにおいて、白抜きがwt SV40 VP1 VLP (図11A〜C中、wt SV40 VP1 VLP)又はPBS(-)バッファーのみ(図11A〜C中、buffer)とインキュベートし、各種抗リン酸化抗体で染色したマウスリンパ球サンプルのErk1/2、JNK、p38MAPKに対する各種抗リン酸化抗体の蛍光強度を表している。また、灰色がwt SV40 VP1 VLP又はPBS(-)バッファーを含まないR10培地のみでインキュベートし、各種抗リン酸化抗体で染色したマウスリンパ球サンプルの各種抗リン酸化抗体に対する抗体の蛍光強度を表している。
図11A〜C上段各図に示されるように、PBS(-)バッファーのみで刺激したマウスリンパ球についての白抜きのピークは、灰色のピークとほぼ重なっていた。一方、wt SV40 VP1 VLPで刺激したマウスリンパ球についての白抜きのピークは、灰色のピークから右側にシフトしていた(図11A〜C下段各図)。これらの結果から、wt SV40 VP1 VLPは、マウスリンパ球において、マウスErk1/2、JNKおよびp38MAPKのリン酸化を誘導させることが分かった。これらの分子は、細胞がアジュバントなどの刺激に応答して活性化し、リン酸化される。リンパ球におけるこれらの分子のリン酸化は、本実施例のwt SV40 VP1 VLPによってリンパ球が活性化されたことを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
0006715004.tif 000004
【図３Ｂ】
0006715004.tif 000005
【図３Ｃ】
0006715004.tif 000006
【図３Ｄ】
0006715004.tif 000007
【図４Ａ】
0006715004.tif 000008
【図４Ｂ】
0006715004.tif 000009
【図５】
0006715004.tif 000010
【図６Ａ】
0006715004.tif 000011
【図６Ｂ】
0006715004.tif 000012
【図６Ｃ】
0006715004.tif 000013
【図７Ａ】
0006715004.tif 000014
【図７Ｂ】
0006715004.tif 000015
【図８】
0006715004.tif 000016
【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
0006715004.tif 000019
【図１１Ａ】
0006715004.tif 000020
【図１１Ｂ】
0006715004.tif 000021
【図１１Ｃ】
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【配列表】
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