(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子治療のための細胞内送達のための、且つ少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないｍＲＮＡのためのビヒクルであって、以下の式（Ｉａ）または（Ｉｂ）
【化１】
0006774878.tif 000055
ここでＲＡ、ＲＢ、ＲＣ、ＲＤは、互いに独立して、
＊−［Ｂ］ｉ−［Ａ］ｊ−Ｒｅ又は
＊−［Ａ］ｉ−［Ｂ］ｊ−Ｒｅ
を表し、
ここで
Ａは、ポリエチレンオキシド単位を有する親水性ブロックであり、
Ｂは、ポリプロピレンオキシド単位、ポリカプロラクトン単位、およびポリ乳酸単位から選択される単位を有する疎水性ブロックであり、
Ｒｅは、水素原子、グリコシル残基、メチルまたはメトキシ基、Ｃ２−Ｃ６アルキルまたはアルコキシ基、酸、ジカルボン酸残基、アミン残基、アミノグリコシド残基、またはアミド残基を意味し、
ｉは約３〜約１２５の値を有し、
ｊは３〜約８５の値を有し、
Ｙは、以下の式であり：
【化２】
0006774878.tif 000056
ここでｎ'は１、２、３、４、５、または６に等しく、
Ｒ＊は、２〜６の炭素のアルキレン、５〜８の炭素のシクロアルキレン、またはフェニレンである、
で表される少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを含む上記ビヒクル。
【請求項２】
前記ｍＲＮＡがキャップされていないｍＲＮＡである、請求項１に記載のビヒクル。
【請求項３】
前記ｍＲＮＡがキャップされていずかつ修飾された、又はキャップされていずかつ修飾されていないｍＲＮＡである、請求項１又は２に記載のビヒクル。
【請求項４】
前記ｍＲＮＡがメッセンジャー5'pppRNA;5'ppRNA;5'pRNA;または 5'OHRNAである、請求項１〜３のいずれか一つに記載のビヒクル。
【請求項５】
前記四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーが、少なくとも一つの末端の親水性又は疎水性ブロックを有する、請求項１〜４のいずれか一つに記載のビヒクル。
【請求項６】
前記四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーが、約０．５〜約１．５の親水性ブロック／疎水性ブロックの比で親水性ブロックと疎水性ブロックを有する、請求項１〜５のいずれか一つに記載のビヒクル。
【請求項７】
前記四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーが、以下の式（ＩＩａ）または（ＩＩ´ａ）のコポリマーである、請求項１〜６のいずれか一つに記載のビヒクル：
【化３】
0006774878.tif 000057
0006774878.tif 000058
ここで
Ｒ＊は、２〜６の炭素のアルキレン、５〜８の炭素のシクロアルキレン、またはフェニレンであり、
ｉは約３〜約１２５の値を有し、及び
ｊは３〜約８５の値を有し、
ここで、各Ｒ１、Ｒ２対について、一方は水素であり、他方はメチル基であり、
ここで、各末端ブロックは任意的に更に、グリコシル残基、アルキル鎖、酸、ジカルボン酸、アミン、アミノグリコシド、若しくはアミドによって、グリコシル化および／または官能化されていても良い。
【請求項８】
前記四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーが、以下の物及びそれらの混合物から選択される、請求項１〜７のいずれか一つに記載のビヒクル。
【化４】
0006774878.tif 000059
0006774878.tif 000060
0006774878.tif 000061
0006774878.tif 000062
【化５】
0006774878.tif 000063
【化６】
0006774878.tif 000064
【請求項９】
前記四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーが、少なくとも一つのグリコシル部分と結合されている少なくとも一つの末端の親水性または疎水性ブロックを有する、請求項１〜８のいずれか一つに記載のビヒクル。
【請求項１０】
ビヒクルとしての、請求項１〜９のいずれか一つに記載の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーと少なくとも一つのキャップされていないｍＲＮＡとの組み合わせ物。
【請求項１１】
少なくとも一つのキャップされていないｍＲＮＡと組み合わせられた、ビヒクルとしての、請求項１〜９のいずれか一つに記載の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを含有する医薬組成物。
【請求項１２】
前記四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーおよびｍＲＮＡが、Ｔｙｒｏｄｅ媒体またはその等価媒体で製剤化された、請求項１１に記載された医薬組成物。
【請求項１３】
真核宿主中でのタンパク質の発現を増加、改善、及び／または維持する為の方法であって、少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないｍＲＮＡのためのビヒクルとして、請求項１〜９のいずれか一つに記載の少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを前記宿主にトランスフェクションする工程を有し、前記真核宿主がイン・ビトロ又はエクス・ビボの試料であり、又は前記真核宿主がヒト以外の哺乳類である、上記方法。
【請求項１４】
真核宿主中でのタンパク質の発現を増加、改善、及び／または維持する為の、且つ少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないｍＲＮＡのためのビヒクルであって、請求項１〜９のいずれか一つに記載の少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを含む上記ビヒクル。
【請求項１５】
細胞内送達のための又は遺伝子治療のためのキットであって、
(i)請求項１〜９のいずれか一つに記載の少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー、及び
(ii)少なくとも一つのキャップされていないｍＲＮＡ分子
を含む、上記キット。
【請求項１６】
以下の式の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー又はその薬学的に許容される塩の一つ：
【化７】
0006774878.tif 000065
ここで、各末端ブロックは任意的に更に、グリコシル残基、アルキル鎖、酸、ジカルボン酸、アミン、アミノグリコシド、若しくはアミドによって、グリコシル化および／または官能化されていても良い。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療の分野に、そしてより特別にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のようなＲＮＡ分子のベクター化に関する。特に、ｍＲＮＡのためのビヒクルとしての四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの使用に、本発明は関する。
【０００２】
より具体的には、四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーによる、キャップされた及びキャップされていないｍＲＮＡのベクター化に、本発明は関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、遺伝子治療の分野に、そしてより特別にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のようなＲＮＡ分子のベクター化に関する。特に、メッセンジャーＲＮＡのためのビヒクルとしての四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの使用に、本発明は関する。
【０００４】
化合物そしてより特別にはＲＮＡ分子の細胞内送達の技術分野において、種々の戦略が提案されてきた。
【０００５】
特に、多数の非ウイルスカチオンベクターまたはカチオントランスフェクション剤が合成されてきており、今日では培養細胞中へと核酸を送達するために利用されている。非ウイルス遺伝子送達の原理は、静電気力を通した、核酸とベクター上に存在するカチオン残基との相互作用に依存する。
【０００６】
ＷＯ２００３０１８６０３Ａ１は、トランスフェクションのためのアミノグリコシドの脂質誘導体に関する。この文献は、核酸送達のためのナノキャリアとして、リポアミノグリコシドの使用を教示している。アミノグリコシドである極性の先端部、１つのスペーサ、及びジオレイル鎖および／またはコレステロールから成ることができる疎水性末端部から、このようなリポアミノグリコシドは一般に構成される。このようなトランスフェクション試薬の例は、ＤＯＳＰ、ＤＯＳＴ、ＤＯＳＫ、ＤＯＳＮ、ＣＨＯＬＰ、ＣＨＯＬＴ、ＣＨＯＬＫ、およびＣＨＯＬＮを含む。それらのトランスフェクション試薬は、薄層状複合体を形成する傾向がある。それらはin  vitroではトランスフェクション試薬として有効であると証明されたが、in  vivoまたはin  situにおいては、比較的効率が小さい傾向がある。
【０００７】
ＷＯ２０１００２６５３７Ａ１は細胞内送達のための安定化されたマルチモジュラーの自己組織体に関し、それは少なくとも一つのカチオントランスフェクション剤、少なくとも一つの負に荷電する巨大分子、そして立体的コロイドスタビライザーとして作用する少なくとも一つの両親媒性ブロックコポリマーから構成されている。
【０００８】
より最近では、グリコシル化された四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーも、ＷＯ２０１３１２８４２３Ａ１中で免疫アジュバントとして報告された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、ＲＮＡ分子およびより特にはメッセンジャーＲＮＡのトランスフェクションは、生体内での満足なタンパク質生産に必ずしもつながらず、これは、劣ったトランスフェクション効率および／またはトランスフェクションされたＲＮＡ分子が一旦内在化されると、それらの安定性の不足に、一部起因し得る。
【００１０】
その上、それらのシステムは多くは、ＤＮＡタイプの核酸のために、今までは用いられていた。
【００１１】
このように、ＲＮＡ分子についての、そしてヒトの使用および治療に適している良好な安全性プロフィールを有する、新規トランスフェクション試薬の必要性が依然としてある。
【００１２】
細胞内送達、およびより具体的には遺伝子治療および／または遺伝子サイレンシングを改良する新規方法の必要性もある。
【００１３】
特に、メッセンジャーＲＮＡのような核酸の効率的な細胞内送達だけでなく、in  vivoでの効率的なタンパク質発現および／または制御された免疫応答を更に提供できる方法および試薬を提供する必要性が残っている。
【００１４】
宿主にＲＮＡ分子をトランスフェクションするための新規戦略の必要性もあり、そしてそれは遺伝子治療および／または遺伝子サイレンシングの場面において、長時間持続する効果を更に提供できる。
【００１５】
本発明の目的は、それらの必要性を満たすことである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
このように、本発明の第１の目的は、遺伝子治療のための細胞内送達のための、キャップされた又はキャップされていないｍＲＮＡのためのビヒクルとして、少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを使用する方法に関する。
【発明の効果】
【００１７】
特に、下記の実施例において、詳述されているように、（ｉ）キャップされていないＲＮＡ分子、より特別にはキャップされていないｍＲＮＡ分子と、（ｉｉ）本発明のブロックコポリマーの組み合わせが、in  vivoタンパク質発現を導くことを、発明者らは予想外に観測した。
【００１８】
ビヒクルとしての本発明のブロックコポリマーとともにトランスフェクションされたメッセンジャーＲＮＡ分子が、特定の免疫反応の誘導がほとんどなしにin  vivoトランスフェクション効率をもたらしたことを彼らは観察した。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１】Ｃ５７Ｂｌ６マウス骨格筋中のβ−ガラクトシダーゼ発現及びβ−ガラクトシダーゼに対する免疫反応への、ｍＲＮＡキャッピングおよび／またはヌクレオチド修飾の影響を示すグラフである。
【図１−２】Ｃ５７Ｂｌ６マウス骨格筋中のβ−ガラクトシダーゼ発現及びβ−ガラクトシダーゼに対する免疫反応への、ｍＲＮＡキャッピングおよび／またはヌクレオチド修飾の影響を示すグラフである。
【図２】培養中の細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現への、ｍＲＮＡキャッピングおよび／またはヌクレオチド修飾の影響を示すグラフである。
【図３】ブロックコポリマー製剤注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリットを示すグラフである。
【図４−１】ブロックコポリマー／ＲＮＡ製剤および７０４／ＤＮＡ製剤（Ｂ）を筋肉内注射されたマウス中のヘマトクリットの変化を示すグラフである。
【図４−２】ブロックコポリマー／ＲＮＡ製剤および７０４／ＤＮＡ製剤（Ｂ）を筋肉内注射されたマウス中のヘマトクリットの変化を示すグラフである。
【図５】20.10−４％の７０４によって製剤化されたｍＲＮＡの筋肉内注射後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現を示すグラフである。
【図６】種々の濃度の７０４によって製剤化されたｍＲＮＡの筋肉内注射後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現を示すグラフである。
【図７】裸の、又は１４４６３ｇ／ｍｏｌの四官能性ＰＥＯ−ＰＰＯ両親媒性ブロックコポリマーによって製剤化された、キャップされかつ修飾されたｍＲＮＡの筋肉内注射の後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現を示すグラフである。
【図８】裸の、又は７４２３ｇ／ｍｏｌの四官能性ＰＰＯ−ＰＯＥ両親媒性ブロックコポリマーによって製剤化された、キャップされかつ修飾されたｍＲＮＡの筋肉内注射の後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現を示すグラフである。
【図９】裸の、又は８９９６ｇ／ｍｏｌの四官能性ＰＬＡ−ＰＯＥ両親媒性ブロックコポリマーによって製剤化された、キャップされ修飾されたｍＲＮＡの筋肉内注射の後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現を示すグラフである。
【図１０】裸の、又は７３３２ｇ／ｍｏｌの四官能性ＰＯＥ−ＰＰＯ両親媒性ブロックコポリマーによって製剤化された、キャップされかつ修飾されたｍＲＮＡの筋肉内注射の後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現を示すグラフである。
【図１１−１】ブロックコポリマー製剤注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット及びＥＰＯのレベルを示すグラフである。
【図１１−２】ブロックコポリマー製剤注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット及びＥＰＯのレベルを示すグラフである。
【図１２】本発明のブロックコポリマーと組み合わされたキャップされていずかつ修飾されたｍＲＮＡの筋肉内注射の後のβ−ガラクトシダーゼ発現を示すグラフである。
【図１３】ブロックコポリマー９０４および１０２５７存在下で、第０および２１日目にキャップされかつ修飾されていないｍＲＮＡの２回の筋肉内注射後の第３５日目のマウスの体液応答を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
このように、  mＲＮＡのようなＲＮＡ分子と本発明のブロックコポリマーとの特定の組み合わせが、遺伝子治療のための細胞内送達の為に特別に効率的であることを、発明者らは本明細書において示す。
【００２１】
ＲＮＡ一次転写物が成熟ＲＮＡに成るためには、複数の同時転写修飾を経なければならないことが当分野で知られていたので、この結果は予想外であった。特に、未成熟ＲＮＡ転写物のいわゆる「キャッピング」工程が、効率的な遺伝子発現およびＲＮＡ安定性にとって重要であることが長年知られていた（ Hocine  et  al.;"RNA  Processing  and  Export"; Cold  Spring  Harb  Perspect  Biol.; 2010.参照。 Schoenberg  et  al.;"Re-capping  the  message";Trends  Biochem  Sci.; 2009参照。）。
【００２２】
より驚くべきことに、ビヒクルとしての本発明のブロックコポリマーでＲＮＡ分子をトランスフェクションさせることによって、前記トランスフェクションが、非自己認識および／または先天性免疫刺激および抗ウイルス性先天性免疫をトリガーしないか、又は少なくとも非常に限られた様式でトリガーすることがいま示された。
【００２３】
ＲＩＧ−Ｉ（配列番号SEQ  ID  No  4）は、最初１９９７年にレチノイン酸誘導性遺伝子として報告され（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ０３８９６３）、そしてパターン認識受容体（ＰＲＲ）ファミリーに属する。それは、ウイルスＲＮＡを検出すると、１型インターフェロン発現をトリガーすることでも公知である。
【００２４】
理論に束縛されることなく、本発明の組合せがいかなるＲＩＧ−Ｉ依存性応答をもトリガーしない、または少なくとも非常に限られた様式でトリガーし、これはトランスフェクションされたＲＮＡ分子のより高い安定性をもたらすと考えられる。
【００２５】
ウイルス由来のＲＮＡのような、外在性（非宿主）ＲＮＡ分子の先天性免疫認識に大きく関連する、ＲＩＧ−Ｉ（レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ）レセプターが、キャップされていないＲＮＡ分子と特異的に相互作用することが当技術分野で公知であるので（ Kolakofsky  et  al.;"A  structure-based  model  of  RIG-I  activation";RNA; 2012参照）、この別の結果も予想外であった。
【００２６】
より驚くべきことに、ｍＲＮＡのようなキャップされていない又はキャップされた、かつ修飾されたＲＮＡ分子は、細胞内送達のために、そして本発明のブロックポリマーと組み合わされてin  vivoでのタンパク質発現をトリガーするために効率的でもあることが本明細書中に示されている。
【００２７】
特に、（ｉ）キャップされていずかつ修飾された、またはキャップされていずかつ修飾されていないＲＮＡ分子と、（ｉｉ）ビヒクルとしての本発明のブロックコポリマーの組合せが特別に効率的な組合せであり、かつ遺伝子治療のための細胞内送達だけのためではない、有望なツールであることも本願明細書において、示されている。
【００２８】
理論に捕らわれることなく、この組合せはＲＮＡとＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８のようなＴｏｌｌ様レセプターとの相互作用（ Kormann  et  al.;"Expression  of  therapeutic  proteins  after  delivery  of  chemically  modified  mRNA  in  mice";Nature  Biotechnology; 2010参照）を排除することに関しても効率的であると考えられる。
【００２９】
換言すれば、（ｉ）ＲＮＡ分子および（ｉｉ）本発明のブロックコポリマーの特定の組み合わせが、効率的な細胞内伝達、並びに免疫系の活性化の減少を、おそらくパターン認識レセプターへのin  vivoでの結合の驚くほどの減少により、提供すると考えられる。
【００３０】
特に、ＲＩＧ−Ｉに依存する、及びＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）に依存する経路の活性化の驚くほどの減少が、両方とも（ｉ）キャップされていないｍＲＮＡと（ｉｉ）本発明のブロックコポリマーの、in  vivoタンパク質発現効率についての（Katze  et  al.;"Innate immune  modulation  by  RNA  viruses: emerging  insights  from  functional  genomics"; Nature  Reviews  Immunology; 2008）相乗効果の原因であり得ると提唱される。アミノ酸配列すなわちＲＩＧ−Ｉ（SEQ  ID  Ｎo  ３）は、単に参考のために本願明細書において示されている。
【００３１】
実施例から示さているように、この驚くほど高いin  vivoでのタンパク質発現効率は、ビヒクルとして本発明のブロックコポリマー（例えば四官能性ブロックコポリマー７０４）を含むナノキャリアに特有である。
【００３２】
所定の核酸の真核細胞へのトランスフェクションに対応する免疫系の活性化の減少は、ＥＰＯまたはβ−ガラクトシダーゼに関して材料と方法の個所に記載されているプロトコ−ルのいずれか一つを使用して、評価されることができる。
【００３３】
この活性化の減少は、以下の両方に伴うタイプＩまたは液性免疫応答の減少に対応し得る：
（ｉ） 全脾臓ＣＤ８＋細胞のうちのＣＤ８＋ＩＦＮγ＋セルのパーセンテージの低いか中程度の変化、および／または
（ｉｉ）
トランスフェクションされたＲＮＡ分子によってコードされた組換えタンパク質に向けられた抗体の低いか中程度の産生。
【００３４】
さらに、本発明のブロックコポリマーが低濃度であってさえ、発現の効率が観察されるということを、発明者らは予想外に発見した。このように、ＤＮＡの最適なin vivo送達のために使用されるより７５倍低い濃度である20.10−４％（ｗ／ｖ）のような低い濃度でブロックコポリマーを使用できる。
【００３５】
所定のタンパク質の発現に適しているメッセンジャーＲＮＡと組み合わされた本発明のブロックコポリマーの投与の後の、前記タンパク質の発現レベルに基づいて、発現の効率を評価できる。次に該発現レベルは、裸のｍＲＮＡ（前記ブロックコポリマーを有さない）の投与の後に決定された対照値と比較される。
【００３６】
ｍＲＮＡとともに投与されたブロックコポリマーの量がタンパク質の発現レベルに影響を及ぼすかも知れないので、前記タンパク質の発現レベルと投与量の間の比（すなわち所定の投与量の総体積に対する重量パーセンテージとして表される）として、発現の効率は評価されることもできる。
【００３７】
発現レベルを決定する方法は、特にβ−gal、ＥＰＯ、およびルシフェラーゼ発現に関して、材料と方法の個所において更に詳述される。
【００３８】
例えば、所定のブロックコポリマーに関する発現効率は、マウスにおいて、in  vivoで以下により評価されることができる：
（ｉ） 前記β−ｇａｌ、ＥＰＯおよび／またはルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡと組み合わせて所定のブロックコポリマーを、マウスに、好ましくは筋肉内注射で投与すること、
(ii) 前記マウスにおける前記β−ｇａｌ、ＥＰＯおよび／またはルシフェラーゼの発現レベルを測定すること、
(iii) 工程（ｉｉ）で測定された発現レベルを対照値と比較するか、あるいは前記発現レベルと投与量との比を対照値と比較すること。
【００３９】
例示的実施形態に従い、ブロックコポリマーは20.10−４％（ｗ／ｖ）という低濃度で投与される。
【００４０】
前記例示的実施形態に従い、ブロックコポリマーは約５０μＬの体積でマウスに投与されることができる。
【００４１】
また、そして一般的な方法において、所定のｍＲＮＡのための発現の増加が、その対応する「担体」の量の増加を、必ずしも直線的関係で厳密にたどるというわけではなく、換言すれば、それらの２つの値の間に厳密な相関が必ずしもあるというわけではなく、このことはつまり、飽和現象、あるいは真核宿主中の不十分な又は遅延された所定のタンパク質の発現を導き得る。
【００４２】
他方で、高濃度でさえ、発現の最大効率が著しく増加し得る（図７および８参照）ということも、本発明者らは予想外に発見した。
【００４３】
ＲＮＡ分子と組み合わされた場合、このようにビヒクルとしての本発明のブロックコポリマーは以下の理由により、細胞内送達および遺伝子治療に対して特に効率的である：
（i） 少量で使われる場合でさえの発現の高い効率、
（ii） 発現の最大効率、
（iii） 低い免疫原性。
【００４４】
その局面の１つに従い、少なくとも一つのＲＮＡ分子、および特に少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないｍＲＮＡの為のビヒクルとしての、少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー（それ自体または細胞内伝達の為の）に、本発明は関する。
【００４５】
その局面の他の１つに従い、少なくとも一つのＲＮＡ分子、および特に少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないｍＲＮＡの為のビヒクルとしての、少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを含有する医薬組成物および／またはトランスフェクション試薬に、本発明は関する。
【００４６】
その局面のもう一つに従い、真核宿主中でのタンパク質の発現を増加、改善、または維持する治療的なおよび／または非治療的な方法に本発明は関し、そしてそれは前記宿主内で前記タンパク質をコードするのに適している少なくとも一つのＲＮＡ分子、特に少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないｍＲＮＡのためのビヒクルとして、少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを前記宿主にトランスフェクションする工程を有する。
【００４７】
本発明に従い、「真核宿主」は、任意のヒトまたはヒト以外の哺乳類、ならびに細胞又は組織試料のような任意のイン・ビトロ（in  vitro）又はエクス・ビボ（ex  vivo）の試料を包含できる。
【００４８】
本発明の方法および試薬は、遺伝子治療にも適している。このように、細胞内送達のための使用のための、及び遺伝子治療の文脈において、（ｉ）少なくとも一つのブロックコポリマー、特に少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーと、（ｉｉ）ｍＲＮＡのような少なくとも一つのＲＮＡ分子との組合せに、本発明が更に関することは明白である。
【００４９】
遺伝子治療のために、本発明のブロックコポリマーは、少なくとも一つのＲＮＡ分子、特に１つのメッセンジャーＲＮＡ（例えばキャップされていないメッセンジャーＲＮＡ）のためのビヒクルとして役立つことができる。
【００５０】
その局面の他の１つに従い、遺伝子治療のための細胞内送達のために使われることを意図される薬物の製造のために、少なくとも一つのＲＮＡ分子、特に少なくとも一つのキャップされていないＲＮＡ分子の為のビヒクルとして、少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを使用することに、本発明は関する。
【００５１】
本発明に従い、「〜を有する（comprising）」は、「〜から成る（consisting of）」を包含する。
ＲＮＡ分子
【００５２】
これらは、天然由来又は人工の配列、そして特にｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（サイレンシングＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ミクロＲＮＡ）、ｍｔＲＮＡ（ミトコンドリアＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（短ヘアピンＲＮＡ）、ｔｍＲＮＡ（トランスファー−メッセンジャーＲＮＡ）、ｖＲＮＡ（ウイルスＲＮＡ）、一本鎖，二本鎖、および／または塩基対合したＲＮＡ（それぞれｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、およびｂｐＲＮＡ）、平滑端またはそうでないＲＮＡ、成熟したおよび未成熟のｍＲＮＡ、コーディングおよびノンコーディングＲＮＡ、オリゴヌクレオチドのハイブリッド配列または合成または半合成配列、及びそれらの修飾されたもの、混合物であっても良い。
【００５３】
したがって、これらはメッセンジャーＲＮＡ（mＲＮＡ）でもよく、それは成熟したおよび未成熟のｍＲＮＡ、例えば前駆体ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）又はヘテロ核ｍＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）および成熟ｍＲＮＡを包含する。このように、本発明のＲＮＡ分子は、モノシストロンおよびポリシストロン性メッセンジャーＲＮＡも包含する。
【００５４】
明確の為に言うと、ｍＲＮＡは任意のコーディングＲＮＡ分子を包含し、それは真核宿主によってタンパク質へと翻訳されることができる。
【００５５】
コーディングＲＮＡ分子は一般に、対象のタンパク質をコードする配列を含みかつ真核宿主により翻訳され得るＲＮＡ分子を指し、ここで前記配列は開始コドン（ＡＴＧ）で開始し、かつ好ましくは終止コドン（すなわちＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）により停止される。
【００５６】
一般的な実施形態に従い、本発明のｍＲＮＡは、以下の一般式を含むかまたはそれから成る：
［５´ＵＴＲ］ｘ−[対象の遺伝子］−［３´ＵＴＲ］ｙ−［ＰｏｌｙＡ］ｚ
ここで［５´ＵＴＲ］及び［３´ＵＴＲ］は翻訳されない領域（ＵＴＲ）であり、
ここで［５´ＵＴＲ］はコザック配列を有し、
ここで［対象の遺伝子］は対象のタンパク質をコ−ドする任意の遺伝子であり、
ここで［ＰｏｌｙＡ］はポリ（Ａ）末端部であり、そして
ここで、ｘ、ｙ、およびｚは同一であるか異なっており、０又は１に等しい。
【００５７】
好ましくは本発明のｍＲＮＡは、以下の一般式から成る：
［５´ＵＴＲ］−［対象の遺伝子］−［３´ＵＴＲ］−［ＰｏｌｙＡ］
ここで［５´ＵＴＲ］及び［３´ＵＴＲ］は翻訳されない領域であり、
ここで［５´ＵＴＲ］はコザック配列を有し、
ここで［対象の遺伝子］は対象のタンパク質をコ−ドする任意の核酸であり、及び
ここで［ＰｏｌｙＡ］はポリ（Ａ）末端部である。
【００５８】
コザック配列は、真核mＲＮＡ上に生じる一般にコンセンサス塩基配列であり、かつ翻訳プロセス開始において大きな役割を果たすところの配列を言うことに留意すべきである。コザック配列およびコザックコンセンサス塩基配列は、周知技術である。
【００５９】
ポリ（Ａ）末端部が周知技術である複数のアデノシン一ホスフェートから成ることも思い起こされる。成熟したｍＲＮＡの生成の間に一般的に生じる翻訳後修飾の一つであるポリアデニル化と呼ばれている工程の間に、ポリ（Ａ）末端部が一般に生成され、このようなポリ（Ａ）末端部は、前記ｍＲＮＡの安定性および半減期に貢献し、様々な長さであり得る。
【００６０】
特に、ポリ（Ａ）末端部は１０Ａ以上のヌクレオチドであることができ、それは２０Ａ以上のヌクレオチドを含み、そして１００Ａ以上のヌクレオチド、および例えば約１２０Ａのヌクレオチドを含む。
【００６１】
［３´ＵＴＲ］はいかなるタンパク質も発現しない。［３´ＵＴＲ］の目的は、ｍＲＮＡの安定性を増大させることである。特定の実施形態に従い、不安定性がないことが公知であるので、α−グロビンＵＴＲが選択される。
【００６２】
有利には、考慮される宿主内で満足なタンパク質生産を得るために、対象の遺伝子に対応する配列がコドン最適化されることができる。
【００６３】
本発明のＲＮＡ分子は、様々な長さでもよい。このように、それらは、例えば約１００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のような短いＲＮＡ分子、または約１００ヌクレオチド超又は約３００ヌクレオチドさえ超える長いＲＮＡ分子であってもよい。
【００６４】
例示的実施形態に従い、対象の遺伝子は、レポータータンパク質、例えばルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼをコ−ドしても良い。ルシフェラーゼの核酸配列（SEQ  ID  Ｎo  ５）は、本願明細書において、もっぱら参照の為に提供されている。β−ガラクトシダーゼの核酸配列（SEQ  ID  Ｎo  １）およびβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列（SEQ  ID  Ｎo  ２）は、本願明細書において、もっぱら参照の為に提供されている。
【００６５】
これらの核酸は、真核または原核由来でもよく、そしてより特別にはヒト、動物、植物、細菌、酵母、またはウイルス由来等であっても良い。当業者に公知の任意の技術によって、そして特にライブラリのスクリーニングによって、化学合成によって、あるいはライブラリのスクリーニングによって得られた配列の化学的又は酵素的修飾を含む混合された方法によって、それらは得られることが可能である。それらは、化学修飾されていてもよい。
【００６６】
このように、例えばｍＲＮＡのような本発明のＲＮＡ分子は、合成であるか人工のＲＮＡ分子ばかりでなく、天然に生じるＲＮＡ分子も含むことができる。
【００６７】
本発明に従い、例えばメッセンジャーＲＮＡ（またはｍＲＮＡ）のようなＲＮＡ分子は、以下の種類を含む：
(i) キャップされかつ修飾されていないＲＮＡ分子
(ii) キャップされかつ修飾されたＲＮＡ分子
(iii) キャップされていずかつ修飾されていないＲＮＡ分子
(iv) キャップされていずかつ修飾されたＲＮＡ分子
【００６８】
上記の語は、更に以下に詳述される。
【００６９】
キャップされた及びキャップされていないＲＮＡ分子
最も一般的な実施形態に従い、「キャップされたＲＮＡ分子」は、その５´末端がグアノシンまたは修飾されたグアノシン、好ましくは５´−５´三ホスフェート結合に結合された７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）に連結されたＲＮＡ分子または類似体を指す。この定義は５´キャップ、特に天然に生じるおよび／または生理学的なキャップの最も広く認められた定義に相応している。
【００７０】
本発明の意味において、「キャップ類似体」は、５’−５’三ホスフェート結合に結合された７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）に生物学的に等しく、かつこのように真核宿主中の対応するメッセンジャーＲＮＡのタンパク質発現を損なわずに置換されることもできるキャップを含む。
【００７１】
このように、「キャップされていないＲＮＡ分子」は、「キャップされたＲＮＡ分子」の定義に属さない、いかなるＲＮＡ分子をも指す。
【００７２】
このように、一般的で好ましい実施形態に従って、「キャップされていないｍＲＮＡ」は、その５’末端が５’−５’三ホスフェート結合を介して７−メチルグアノシンに連結されていないmＲＮＡ、又は前に定義された類似体を指すことができる。
【００７３】
メッセンジャーＲＮＡのようなキャップされていないＲＮＡ分子は、（５’）ｐｐｐ（５’）、（５’）ｐｐ（５’）、（５’）ｐ（５’）、または（５’）ＯＨ末端さえを有する、キャップされていないＲＮＡ分子でもよい。このようなＲＮＡ分子は、５´ｐｐｐＲＮＡ、５´ｐｐＲＮＡ、５´ｐＲＮＡ、５´ＯＨＲＮＡとそれぞれ略記されることができる。好ましくは、本発明のキャップされてないＲＮＡ分子は、メッセンジャー５´ｐｐｐＲＮＡである。
【００７４】
同様に、ＲＮＡ分子が一本鎖ＲＮＡ分子である場合は、それは５´ｐｐｐｓｓＲＮＡ、５´ｐｐｓｓＲＮＡ、５´ｐｓｓＲＮＡ、５´ＯＨｓｓＲＮＡとそれぞれ略記されることができる。
【００７５】
同様に、ＲＮＡ分子が二本鎖ＲＮＡ分子である場合は、それは５´ｐｐｐｄｓＲＮＡ、５´ｐｐｄｓＲＮＡ、５´ｐｄｓＲＮＡ、５´ＯＨｄｓＲＮＡとそれぞれ略記されることができる。
【００７６】
好ましくは、本発明のキャップされていないｍＲＮＡは、キャップされていない一本鎖ｍＲＮＡである。
【００７７】
さらに好ましい実施形態によれば、キャップされていない一本鎖ｍＲＮＡは、キャップされていないメッセンジャー５´ｐｐｐｓｓＲＮＡでもよい。
【００７８】
非制限的であるが、前記キャップされていないＲＮＡ分子の第一の塩基は、アデノシン、グアノシン、シトシンまたはウリジンであってもよい。
【００７９】
このように、キャップされていないＲＮＡ分子は、（５’）ｐｐｐ（５’）、（５’）ｐｐ（５’）、（５’）ｐ（５’）、または平滑端の５’グアノシン末端さえをするキャップされていないＲＮＡ分子でもよい。
【００８０】
合成キャップおよび／またはキャップ類似体の例は、以下からなるリストにおいて、選択されることができる：グリセリル、逆方向デオキシ無塩基残基（部分）、４’、５’メチレンヌクレオチド、１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４'−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１ ,5−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、α−ヌクレオチド、修飾された塩基ヌクレオチド、スレオ−ペントフラノース−１−ヌクレオチド、非環式３',４'−セコヌクレオチド、非環式3,4−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式3,5ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’逆方向ヌクレオチド部分、３’−３’逆方向無塩基部分、３'−２’−逆方向ヌクレオチド部分、３’−２’−逆方向無塩基部分、１ ,4−ブタンジオールホスフェート、３'−ホスホルアミダート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３'−ホスフェート、３´ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は架橋または非架橋メチルホスホナート部分。
【００８１】
合成キャップまたはキャップ類似体の他の例は、ＡＲＣＡキャップ類似体、Ｎ１−メチルグアノシン、２'−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、および２−アジドグアノシンを含む。
【００８２】
注目すべきは、合成キャップのうちで、上記キャップのいくつかは類似体として適切であり、しかし逆にタンパク質発現を妨げ得る他のものは適切ではない。このような区別は、当業者により理解される。
【００８３】
参考のために、そして非制限的であるが、抗逆方向キャップ類似体（Anti  Reverse  Cap  Analog:ＡＲＣＡ）３´−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  キャップ類似体の構造は、以下に示される：
【化１】
0006774878.tif 000002
【００８４】
ＡＲＣＡキャップ類似体は、例えば、in  vitro転写の間に使用されるキャップ類似体の例であり：それは、３´ＯＨ基（ｍ７Ｇに近接する）が−ＯＣＨ３で置き換えられた修飾されたキャップである。しかしながら、５’末端でＡＲＣＡにより合成される転写物の１００％は翻訳可能であり、翻訳に対する強い刺激効果を導く。
【００８５】
本発明に従い、「ＰＲＲの活性化」は、前記ＰＲＲに結合すると、先天性免疫の刺激、そしてより特別には１型インターフェロンの発現の刺激として理解される。
【００８６】
前記実施形態に従い、ＲＩＧ−Ｉ活性化の要件は、平滑端付近にミスマッチがなく、５´三ホスフェートを有する１０−２０ｂｐ長の、平滑端を持ち、塩基対合しているＲＮＡ（ｂｐＲＮＡ）であり得る。
【００８７】
他の実施形態に従い、ＲＩＧ−Ｉ活性化の要件は、短い、平滑端５´ＯＨｂｐＲＮＡであり得る（Kolakofsky  et al.; "A  structure-based  model  of  RIG-I  activation";RNA; 2012参照）。
【００８８】
修飾された及び修飾されていないＲＮＡ分子
本発明の範囲内で、少なくとも一つの修飾されたヌクレオチド、ヌクレオシド、または塩基、例えば修飾されたプリンまたは修飾されたピリミジンを含有するＲＮＡ分子を、「修飾されたＲＮＡ分子」は指す。修飾されたヌクレオシドまたは塩基は、Ａ、Ｕ、Ｃ、またはＧ（それぞれ、ヌクレオシドに関してはアデノシン、ウリジン、シチジン、またはグアノシン、及び糖部分を専ら指す場合にはアデニン、ウラシル、シトシン、またはグアニン）ではない、いかなるヌクレオシドまたは塩基であることもできる。
【００８９】
本発明に従い、例えば「少なくとも一つの修飾された塩基」中の表現「少なくとも１つ...」は、一つ以上の修飾された塩基を有するとして理解されるべきである。このように、この文脈において、このような語は、二つ以上の修飾された塩基を有するいかなるＲＮＡ分子、または修飾された塩基のみを包含することができる。
【００９０】
従って、「修飾されていないＲＮＡ分子」は、修飾されたＲＮＡ分子の定義に相応しないいかなるＲＮＡ分子も指す。
【００９１】
本発明の意味において、「キャップされたおよびキャップされていない」がＲＮＡ分子の５'末端の塩基に特に関係するので、本発明の意味において、語「修飾されたおよび修飾されていない」は語「キャップされたおよびキャップされていない」からはっきりと区別される。
【００９２】
最も好ましい実施例に従い、上記の少なくとも一つの塩基または糖の修飾、好ましくは上記の少なくとも１つの塩基の修飾を含むＲＮＡ例えばｍＲＮＡを、「修飾されたＲＮＡ分子」は指す。
【００９３】
非制限的であるが、修飾されたヌクレオチド、ヌクレオシド、および塩基の例は、ＷＯ２０１５０２４６６７Ａ１中に開示されている。
【００９４】
このように、修飾されたＲＮＡ分子は、骨格構造修飾、糖修飾、または塩基修飾を含む、修飾されたヌクレオチド、ヌクレオシド、または塩基を含むことができる。
【００９５】
本発明に関連して骨格構造修飾は、本明細書で定義されるようなＲＮＡ分子中に含まれるヌクレオチドの骨格構造のホスフェートが化学修飾さるところの修飾を包含する。
【００９６】
本発明に関連して糖修飾は、本明細書で定義されるようなＲＮＡ分子のヌクレオチドの糖の化学修飾を包含する。
【００９７】
本発明に関連して塩基修飾は、ＲＮＡのヌクレオチドの塩基部分の化学修飾を包含する。この文脈において、真核細胞中のＲＮＡ分子の転写および／または翻訳に適しているヌクレオチド類似体から、ヌクレオチド類似体または修飾体は好ましくは選択される。
【００９８】
糖修飾は、２’ヒドロキシ（ＯＨ）基の置換または修飾において存在することができ、それは多くの様々な「オキシ」又は「デオキシ」置換基により置換または修飾されることができる。
【００９９】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例は、下記に限定されないが、アルコキシまたはアリールオキシ（−ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ、２’ヒドロキシルが例えばメチレン架橋により同じリボース糖の４’炭素に結合された、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、及びアミノ基（−Ｏ−アミノ、ここでアミノ基、例えばＮＲＲは、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロサイクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノでありえる）又はアミノアルコキシを包含する。
【０１００】
「デオキシ」修飾は、水素、アミノ（例えばＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロサイクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）を包含し、またはアミノ基はリンカーを介して糖に結合されることができ、ここでリンカーは原子Ｃ、Ｎ、およびＯの一つ以上を有する。
【０１０１】
糖基は、リボース中の対応する炭素のそれとは逆の立体配置を有する一つ以上の炭素を含むこともできる。このように、修飾されたＲＮＡは、例えば、糖としてアラビノースを有しているヌクレオチドを含むことができる。
【０１０２】
本願明細書において記載されているように、ホスフェート骨格構造は更に修飾されることができ、修飾されたＲＮＡ分子に組み込まれることができる。一つ以上酸素原子を異なる置換基で置き換えることによって、骨格構造のホスフェート基は、修飾される。更に、修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは、修飾されていないホスフェート部分が、本願明細書に記載されている修飾されたホスフェートで完全に置換されることを含むことができる。
【０１０３】
修飾されたホスフェート基の例は、下記に限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレナート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホナート、ホスホロアミダート、アルキルまたはアリールホスホナート、およびホスホトリエステルを含む。ホスホロジチオエートは、硫黄で置き換えられた２つの非結合の酸素を有する。結合酸素を窒素で（架橋されたホスホロアミダート）、硫黄で（架橋されたホスホロチオエート）、および炭素で（架橋されたメチレンホスホネート）の置換によって、ホスフェートリンカーは修飾されることもできる。
【０１０４】
修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは本願明細書において、記載されているように、修飾されたＲＮＡ分子中へ組み込まれることができ、核酸塩基部分において、さらに修飾されることができる。例えば、本願明細書において記載されているヌクレオシドおよびヌクレオチドは、主溝表面上で化学修飾されることができる。いくつかの実施形態において、主溝の化学修飾は、アミノ基、チオール基、アルキル基、またはハロ基を含むことができる。
【０１０５】
例えば、以下からなるリストにおいて選択される塩基修飾から、ヌクレオチド類似体／修飾体は選択される：２−アミノ−６−クロロプリンリボシド−５´−三ホスフェート、２−アミノプリン−リボシド−５’−三ホスフェート、２−アミノアデノシン−５’−三ホスフェート、２´−アミノ−２´−デオキシシチジン−三ホスフェート、２−チオシチジン−５’−三ホスフェート、２−チオウリジン−５’−三ホスフェート、２´−フルオロチミジン−５´−三ホスフェート、２’−０−メチルイノシン−５’−三ホスフェート、４−チオウリジン−５’−三ホスフェート、５−アミノアリルシチジン−５’−三ホスフェート、５−アミノアリルウリジン−５’−三ホスフェート、５−ブロモシチジン−５’−三ホスフェート、５−ブロモウリジン−５’−三ホスフェート、５−ブロモ−２’−デオキシシチジン−５’−三ホスフェート、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン−５’−三ホスフェート、５−ヨードシチジン−５’−三ホスフェート、５−ヨード−２’−デオキシシチジン−５’−三ホスフェート、５−ヨードウリジン−５’−三ホスフェート、５−ヨード−２’−デオキシウリジン−５´−三ホスフェート、５−メチルシチジン−５’−三ホスフェート、５−メチルウリジン−５’−三ホスフェート、５−プロピニル−２’−デオキシシチジン−５’−三ホスフェート、５−プロピニル−２'−デオキシウリジン−５’−三ホスフェート、６−アザシチジン−５’−三ホスフェート、６−アザウリジン−５’−三ホスフェート、６−クロロプリンリボシド−５’−三ホスフェート、７−デアザアデノシン−５´−三ホスフェート、7−デアザグアノシン−５'−三ホスフェート、８−アザアデノシン−５’−三ホスフェート、８−アジドアデノシン−５’−三ホスフェート、ベンズイミダゾール−リボシド−５’−三ホスフェート、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−三ホスフェート、Ｎ１−メチルグアノシン−５'−三ホスフェート、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−三ホスフェート、０６−メチルグアノシン−５’−三ホスフェート、シュードウリジン−５’−三ホスフェート、またはピューロマイシン−５’−三ホスフェート、キサントシン‐５’‐三ホスフェート。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオシドは、以下からなるリストから選択されることができる：ピリジン−４−オン−リボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、および４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、５−アザシチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、及び４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジンを、修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは含む。
【０１０８】
他の実施態様において、２−アミノプリン、２、６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２、６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２、６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６,Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、および２−メトキシ−アデニンを、修飾されたヌクレオシドは含む。
【０１０９】
他の実施態様において、イノシン、１−メチルイノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザグアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、およびＮ２，Ｎ２−ジメチル−６チオ−グアノシンを、修飾されたヌクレオシドは含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、主溝表面で修飾されることができ、ウラシルのＣ−５上の水素をメチル基またはハロ基で置換することを含むことができる。
【０１１１】
更なる実施形態によれば、本明細書で定義されている修飾されたＲＮＡは、脂質修飾を包含できる。
【０１１２】
修飾された塩基および／または修飾されたＲＮＡ分子は、当技術分野において、公知であり、例えば、さらにＷａｒｒｅｎらにより教示されている（"Highly  Efficient  Reprogramming  to  Pluripotency  and  Directed  Differentiation  of  Human  Cells  with  Synthetic  Modified  mRNA"; Cell  Stem  Cell; 2010）
【０１１３】
上記からみて、修飾された塩基は、修飾されたプリン塩基または修飾されたピリミジン塩基でもよい。
【０１１４】
非制限的であるが、修飾されたプリン塩基の例は、修飾されたアデノシンおよび／または修飾されたグアノシン、例えばヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、イノシン、キサントシン、および７−メチルグアノシンを含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態に従い、ウリジン、シチジン、アデノシン及び/またはリボチミジンに対応するそれぞれのヌクレオシドが修飾されているところのＲＮＡに、修飾されたＲＮＡ分子またはｍＲＮＡは相当する。
【０１１６】
非制限的であるが、修飾されたピリミジン塩基の例は、修飾されたシチジンおよび／または修飾されたウリジン、例えば5,6−ジヒドロウラシル、シュードウリジン、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、ジヒドロウリジン、および５−メチルシチジンを含む。
【０１１７】
好ましくは、本発明の修飾された塩基は、修飾されたウリジンまたはシチジン、例えばシュードウリジンおよび５−メチルシチジンでもよい。
【０１１８】
いくつかの実施形態に従い、Ｕ（ウラシル）、Ｃ（シトシン）、Ａ（アデニン）、および／またはＴ（チミン）に対応するそれぞれの塩基が修飾されているところのＲＮＡに、修飾されたＲＮＡ分子またはｍＲＮＡは相当する。
【０１１９】
いくつかの例示的実施形態に従い、Ｕ（ウラシル）、Ｃ（シトシン）に対応するそれぞれの塩基が修飾されているところのＲＮＡに、修飾されたＲＮＡ分子またはｍＲＮＡは相当する。
【０１２０】
参考のために、シュードウリジン−５´−三ホスフェート、又はシュード−ＵＴＰ、又は５−リボシルウラシルの構造は、以下で表される：
【化２】
0006774878.tif 000003
【０１２１】
参考のために、５−メチルシチジン−５´−三ホスフェート、または５−メチル−ＣＴＰ、又は５−Ｍｅ−ＣＴＰの構造は、以下で表される：
【化３】
0006774878.tif 000004
【０１２２】
修飾された又は修飾されていない、キャップされた及びキャップされていないｍＲＮＡは、商業的に得られることもできる。
【０１２３】
非制限的であるが、本願明細書において記載されてきたｍＲＮＡは、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から注文することができ、以下からなるリストにおいて、選択されることができる：
- L-6309  β-gal  mRNA  unmodified  ARCA  cap (Batch#T1-APG01A)
- L-6109  β-gal  mRNA  fully  substituted  with  Pseudo-U  and  5-Methyl-C, ARCA cap (Batch#T1-AOL03A)
- L-6309  β-gal  mRNA  unmodified, NO  Cap(Batch#I9-B01A)
- L-6109  β-gal  mRNA  fully  substituted  with  Pseudo-U  and  5-Methyl-C, No  Cap (Batch#I9-B02A)
- L-6007  Fluc  mRNA  unmodified  ARCA  cap (I99-A01A), 及び
- L-6007  EPO  mRNA  unmodified  ARCA  cap (I9-A01A).
【０１２４】
核酸をコードするＥＰＯ（SEQ  ID  No  ４）は、単に参考のためだけに本願明細書において提供されている。
【０１２５】
キャップされていないＲＮＡ分子は修飾されたＲＮＡ分子でも修飾されていないＲＮＡ分子でもよいと理解される。
【０１２６】
従って、キャップされたＲＮＡ分子は、修飾されたＲＮＡ分子でも修飾されていないＲＮＡ分子でもよい。
【０１２７】
好ましくは、本発明のＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。
【０１２８】
本発明のＲＮＡ分子は、修飾された型であっても修飾されていない型であっても、好ましくはキャップされていないメッセンジャーＲＮＡである。
【０１２９】
最も好ましい実施例に従い、キャップされていないｍＲＮＡは、キャップされていずかつ修飾されていないｍＲＮＡまたはキャップされていずかつ修飾されたｍＲＮＡである。
【０１３０】
非制限的であるが、メッセンジャーＲＮＡのようなキャップされていないＲＮＡ分子は、天然にのみ生じる塩基を有するキャップされていないＲＮＡ分子でもよい。
【０１３１】
本発明に従い、宿主によって、in  vivoで、 メッセンジャーＲＮＡのようなＲＮＡ分子中に天然に組み込まれることができる塩基に、「天然に生じる塩基」は関する。このように、前記宿主内で天然の等価物がないところの合成塩基とは、「天然に生じる塩基」は異なっている。しかしながら、「天然に生じる塩基」は修飾された塩基であってもなくてもよい。なぜなら両方の語が本発明の意味において混乱を招くべきではないからである。
【０１３２】
キャップされていないメッセンジャーＲＮＡは、キャップされていずかつ修飾されたメッセンジャーＲＮＡでよく、即ち、少なくとも一つの修飾された塩基を有していてもよい。
【０１３３】
このように、キャップされていないメッセンジャーＲＮＡは、（５’）ｐｐｐ（５’）グアノシン末端を有しかつ少なくとも一つの修飾された塩基を有する、キャップされていずかつ修飾されたメッセンジャーＲＮＡでもよい。
【０１３４】
キャップされていないメッセンジャーＲＮＡは、（５’）ｐｐｐ（５’）グアノシン末端を有しかつ少なくとも一つのシュードウリジンと少なくとも一つの５−メチルシトシンを有する、キャップされていずかつ修飾されたメッセンジャーＲＮＡでもよい。
【０１３５】
キャップされたメッセンジャーＲＮＡは、その５´末端が５’−５’三ホスフェート結合に結合された７−メチルグアノシンに連結されかつ天然に生じる塩基、またはシュードウリジンまたは５−メチルシトシンのような修飾された塩基を有するところのメッセンジャーＲＮＡでもよい。
【０１３６】
修飾されたおよび修飾されていないＲＮＡ分子の両方が本発明の一つの実施形態の中で用いられる場合、それらは混合物として及び/または精製された形において使われることができるとも理解される。
【０１３７】
四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー
四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、当技術分野、例えばＷＯ２０１００２６５３７Ａ１および／またはＷＯ２０１３１２８４２３Ａ１において、前に報告されていた。
【０１３８】
本発明の範囲内で、特徴「ブロックコポリマー」は、重合した単量体単位の少なくとも２セットまたはブロックを有するポリマーを指すことを意図している。１「ブロック」は、モノマーの重合によって得られ、そしてポリマー中で繰り返されることができるモチーフを指す。ブロックコポリマーは必らず、重合したモノマーのブロックの少なくとも２つの異なった種類を有する。
【０１３９】
本発明の範囲内で、特徴「非イオン性両親媒性ブロックコポリマー」は、少なくとも一つの親水性ブロックおよび少なくとも一つの疎水性ブロックを有し、ここで該ブロックが非イオン性である、すなわちそれらがイオンを形成している部分を含まないところのブロックコポリマーを指すことを意図する。
【０１４０】
本発明の範囲内で、「ブロックコポリマー」との関係において、特徴「四官能性」は、四官能性結合部分によって運ばれる４つの反応性基に結合された４つのブロックコポリマーを有する化合物を指す。別の表現では、「四官能性ブロックコポリマー」は、中心の四官能性結合部分に結合されたブロックコポリマーの４本の枝を有する。
【０１４１】
４つのブロックコポリマーは、互いに独立して、同一でも異なってもよく、好ましくは同一である。
【０１４２】
本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、各々、少なくとも一つの親水性ブロックおよび少なくとも一つの疎水性ブロックを有しているブロックコポリマーの４つの枝を有する。
【０１４３】
本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーにおいて、親水性ブロックは、ポリオキシアルキレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、または糖からなる群において選択されることができ、そして疎水性ブロックは、ポリオキシアルキレン、脂肪族鎖、アルキリデンポリエステル、ベンジルポリエーテル先端を有するポリエチレングリコール、およびコレステロールからなる群において選択されることができる。
【０１４４】
特に、親水性ブロックは、ポリオキシアルキレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリテトラヒドロフランからなる群において選択されることができ、そして疎水性ブロックは、ポリオキシアルキレン、脂肪族鎖、アルキリデンポリエステル、ベンジルポリエーテル先端を有するポリエチレングリコール、およびコレステロールからなる群において選択されることができる。
【０１４５】
より特には、親水性ブロックはポリオキシエチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）からなる群において選択されることができ、そして疎水性ブロックは、ポリオキシプロピレン、脂肪族鎖、アルキリデンポリエステル、ベンジルポリエーテル先端を有するポリエチレングリコール、およびコレステロールからなる群において選択されることができる。
【０１４６】
一実施形態に従い、本発明のブロックコポリマーの親水性ブロックは、ポリエチレンオキシド単位を有し、好ましくはそれらから成る。
【０１４７】
一実施形態に従い、本発明のブロックコポリマーの疎水性ブロックは、ポリプロピレンオキシド単位を有し、好ましくはそれらから成る。
【０１４８】
一実施形態に従い、本発明のブロックコポリマーの疎水性ブロックは、ポリプロピレンオキシド単位、ポリカプロラクトン単位、およびポリ乳酸単位からなる群において選択されることができる。
【０１４９】
一実施形態に従い、本発明のブロックコポリマーの親水性ブロックは、ポリエチレンオキシド単位を有し、好ましくはそれらから成り、及び本発明のブロックコポリマーの疎水性ブロックは、ポリカプロラクトン単位を有し、好ましくはそれらから成る。
【０１５０】
一実施形態に従い、本発明のブロックコポリマーの親水性ブロックは、ポリエチレンオキシド単位を有し、好ましくはそれらから成り、及び本発明のブロックコポリマーの疎水性ブロックは、ポリプロピレンオキシド単位、ポリカプロラクトン単位、およびポリ乳酸単位から選択される単位を有し、好ましくはそれらから成る。
【０１５１】
好ましい実施形態に従い、本発明のブロックコポリマーは、ポリエチレンオキシド単位を有し、好ましくはそれらから成る親水性ブロック、及びポリプロピレンオキシド単位を有し、好ましくはそれらから成る疎水性ブロックを有する。
【０１５２】
本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、少なくとも一つの末端の親水性又は疎水性ブロックを有し、それは少なくとも二つ、三つ、または四つの末端の親水性または疎水性ブロックを含む。
【０１５３】
好ましい実施態様において、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、少なくとも一つの末端の親水性ブロックを有する。「末端の親水性ブロック」は、コポリマーの一端、特に本発明の四官能性ポリマーの枝の遠位端にあるブロックである。好ましくは、四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、少なくとも二つ、好ましくは三つ、および好ましくは四つの末端の親水性ブロックを有する。
【０１５４】
好ましい実施形態によれば、本発明のブロックコポリマーは、ポリマーの各枝の一端の各々に、少なくとも一つ、好ましくは二つ、さらに好ましくは三つ、および好ましくは四つの末端のオキシエチレン単位を有する。
【０１５５】
好ましくは、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、約０．５〜約１．５の親水性ブロック／疎水性ブロックの比で親水性ブロックと疎水性ブロックを有する。
【０１５６】
一実施形態に従い、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、４０％のポリエチレンオキシドを有する。
【０１５７】
一実施形態に従い、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）に対するポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）の比率５０／５６でこれらを有する。
【０１５８】
一実施形態に従い、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）に対するポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）の比率６１／６８でこれらを有する。
【０１５９】
本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性四官能性ブロックコポリマーは、（Ａ−Ｂ）ｎＬである枝分れされたブロックコポリマーでもよく、ここでＡは親水性ブロックを表し、Ｂは疎水性ブロックを表し、Ｌは結合部分を表し、及びｎは４でありかつＬに結合された（Ａ−Ｂ）基の数を表す。
【０１６０】
別の実施形態に従い、本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性四官能性ブロックコポリマーは、（Ｂ−Ａ）ｎＬである枝分れされたブロックコポリマーでもよく、ここでＡは親水性ブロックを表し、Ｂは疎水性ブロックを表し、Ｌは結合部分を表し、及びｎは４でありかつＬに結合された（Ｂ−Ａ）基の数を表す。
【０１６１】
一実施例に従い、親水性ブロックＡは、ポリオキシエチレンブロックであり、及び疎水性ブロックＢは、ポリオキシプロピレンブロックまたはポリカプロラクトンブロックまたはポリ乳酸ブロックである。
【０１６２】
好ましくは、親水性ブロックＡはポリオキシエチレンブロックであり、そして疎水性ブロックＢはポリオキシプロピレンブロックである。
【０１６３】
四価の結合部分Ｌは、以下から選択されることができる：
− アルキレンジアミノ部分、特にＣ１〜Ｃ６またはさらにＣ２〜Ｃ６アルキレンジアミノ部分であり、及び、好ましくはエチレンジアミノ部分であり、又は
−アルキレンまたは５〜８炭素のシクロアルキレンまたはフェニレンであり、特に５または６炭素のシクロアルキレン、又は
−式（Ｙ）の基であり：
【化４】
0006774878.tif 000005
ここで、ｎ’は、１、２、３、４、５、または６であり、最も好ましくは１である。
【０１６４】
特定の実施形態に従い、本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、以下の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）のコポリマーでもよく：
【化５】
0006774878.tif 000006
ここでＲＡ、ＲＢ、ＲＣ、ＲＤは、互いに独立して、
＊−［Ｂ］ｉ−［Ａ］ｊ−Ｒｅ又は
＊−［Ａ］ｉ−［Ｂ］ｊ−Ｒｅ、
を表し、
ここで
Ａは親水性ブロックであり、好ましくはポリエチレンオキシド単位を有し又それらから成り、
Ｂは上記に定義された疎水性ブロックであり、
Ｒｅは、水素原子、グリコシル残基、メチルまたはメトキシ基、Ｃ２−Ｃ６アルキルまたはアルコキシ基、酸、ジカルボン酸残基（例えばエタン二酸残基またはプロパン二酸残基またはブタン二酸残基）、アミン残基、アミノグリコシド残基、またはアミド残基を意味し、
ｉは約３〜約１２５の値を有し、それは６０以下を包含し、
ｊは３〜約８５の値を有し、それは５０以下を包含し、及び
Ｙは上記に定義された通りであり、
Ｒ＊は、１〜６の炭素のアルキレン、５〜８の炭素のシクロアルキレン、またはフェニレン、特にアルキレンジアミン部分、及び好ましくはエチレンジアミン部分である。
【０１６５】
特定の実施形態によれば、本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、このようにの式（1a）又は（1ｂ）のコポリマーでもよく：
【化６】
0006774878.tif 000007
0006774878.tif 000008
ここでＲＡ、ＲＢ、ＲＣ、ＲＤ、Ｒ＊、およびＹは上記に定義された通りである。
【０１６６】
好ましくはＲＡ、ＲＢ、ＲＣ、ＲＤは、互いに独立して以下を表し：
【化７】
0006774878.tif 000009
ここで
- Ｒｅは、水素原子、グリコシル残基、メチル、酸、アミン、アミノグリコシド、またはアミドを意味し、
- ｉは約３〜約１２５、特に約１０〜約１００、及び特に約１０〜約６０の値を有し、及び
- ｊは３〜約８５、特に約１０〜約５０、特に約１０〜約２０、およびより特には１３以上の値を有し、
- Ｒ１およびＲ２に関して、（ａ）両方とも水素であるか、または（ｂ）一方が水素であり他方はメチルであり、
- Ｒ３およびＲ４に関して、（ａ）両方とも水素であるか、または（ｂ）一方が水素であり他方はメチルであり、及び
- Ｒ３およびＲ４の両方とも水素である場合、Ｒ５およびＲ６の一方が水素であり他方はメチルであり、またはＲ３およびＲ４の１つがメチルである場合、Ｒ５およびＲ６の両方とも水素である。
【０１６７】
もっとも好ましくは、上記に定義されたＲＡ、ＲＢ、ＲＣ、ＲＤは同一である。
【０１６８】
好ましくは、四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、式（Ｉａ）のコポリマーであり、ここで：
- ｉは約３〜約１２５、特に約１０〜約１００、及び特に約１０〜約６０の値を有し、及び
- ｊは３〜約８５、特に約１０〜約５０、特に約１０〜約２０、およびより特には１３以上の値を有する。
【０１６９】
好ましくは、Ｒ＊は２、４、または６炭素のアルキレン、５〜８の炭素のシクロアルキレン、またはフェニレンであり、及び最も好ましくは、２、４、または６炭素のアルキレンである。
【０１７０】
それらのポリマーの合成のためのプロトコールは、当技術分野、例えばＷＯ２０１００２６５３７Ａ１および／またはＷＯ２０１３１２８４２３Ａ１にすでに記載されている（Schmola, I.R.; J.Am. Oil  Chem.; Soc. 54:110;1977 & Schmolka, I.R., Surf. Sci. Ser. 1967, 1, 300-371も参照)。他のブロックコポリマーは、商品として入手できる。このようなブロックコポリマーの例はＰ１０３２１、Ｐ１０２５７、Ｐ３８４８、Ｐ３１５２参照の下で商業的に入手可能であり、そしてＰｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ（商標）社（Ｄｏｒｖａｌ（モントリオ―ル）― カナダ）から販売されている。
【０１７１】
本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、少なくとも一つの末端のブロックをさらに有することができ、それ（ら）は任意的にグリコシル化及び/又は官能化されている。
【０１７２】
このように、そして非制限的であるが、少なくとも一つの末端のブロックは、グリコシル残基、アルキル鎖（例えばＣ１−Ｃ６アルキルまたはメチルでさえある）、酸、ジカルボン酸、アミン、アミノグリコシド、またはアミドによって、グリコシル化および／または官能化されていても良い。本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、上記および以下に定義されたように、少なくとも一つの末端ブロック、及び好ましくは一つの末端親水性ブロックを有し、それはアミノグリコシド、例えばトブラマイシン、パロモマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、マンノース、グルコース、グルコサミンから成る群により、任意的にグリコシル化および／または官能化される。
【０１７３】
特に、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、上記に定義されたように、少なくとも一つの末端ブロックを任意的に有することができ、それは、少なくとも一つのグリコシル部分により結合された、一つの末端親水性又は疎水性ブロック、好ましくは一つの末端親水性ブロックを包含できる。
【０１７４】
非制限的であるが、本発明のグリコシル化された四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー、および前記ブロックコポリマーを生成するための方法は、ＷＯ２０１３１２８４２３Ａ１において、開示されている。
【０１７５】
本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、このように式（ＩＩａ）または（ＩＩ'a）のコポリマーでもよく：
【化８】
0006774878.tif 000010
0006774878.tif 000011
ここで
−Ｒ＊は、２〜６の炭素のアルキレン、５〜８の炭素のシクロアルキレン、またはフェニレンであり、
−ｉは約３〜約１２５の値を有し、及び
−ｊは３〜約８５の値を有し、
−ここで、Ｒ１、Ｒ２一対ごとに、一方は水素であり、他方はメチル基であり、
−ここで、各末端ブロックは任意的に更にグリコシル化および／または官能化される。
【０１７６】
このように、本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、このように式（Ｉ1ａ）のコポリマーでもよく：
【化９】
0006774878.tif 000012
ここで
- Ｒ＊は、２〜６の炭素のアルキレン、５〜８の炭素のシクロアルキレン、またはフェニレンであり、及び好ましくは２、４、または６の炭素のアルキレンであり、
- ｉは約３〜約１２５、特に約１０〜約１００、及び特に約１０〜約６０の値を有し、及び
- ｊは約３〜約８５、特に約１０〜約５０、特に約１０〜約２０の値を有し、
- 及びここで、Ｒ１、Ｒ２一対ごとに、一方は水素であり、他方はメチル基である。
【０１７７】
あるいは、本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、式（Ｉ1’ａ）のコポリマーであり：
【化１０】
0006774878.tif 000013
ここで
- Ｒ＊は、２〜６の炭素のアルキレン、５〜８の炭素のシクロアルキレン、またはフェニレンであり、及び好ましくは２、４、または６の炭素のアルキレンであり、
- iは約３〜約１２５、特に約１０〜約１００、及びより特には約１０〜約６０、及び好ましくは約１０〜約３０の値を有し、
- ｊは約３〜約８５、特に約１０〜約５０、より特には約１０〜約３０、及び好ましくは約２０〜２５の値を有し、
- 及びここで、Ｒ１、Ｒ２一対ごとに、一方は水素であり、他方はメチル基である。
【０１７８】
特に、本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、式（Ｉ1ｂ）のコポリマーでもよく：
【化１１】
0006774878.tif 000014
ここで
- ｉは約３〜約１２５、特に約１０〜約１００、及び特に約１０〜約６０の値を有し、及び
- ｊは約３〜約８５、特に約１０〜約５０、特に約１０〜約２０、あるいは約３０〜約５０の値を有し、
- 及びここで、Ｒ１、Ｒ２一対ごとに、一方は水素であり、他方はメチル基である。
【０１７９】
本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、このように式（Ｉ1’ｂ）のコポリマーでもよい。
【化１２】
0006774878.tif 000015
【０１８０】
好ましくは、ｉは約３〜約１２５、特に約１０〜約１００、及びより特には約１０〜約６０でありえ、及びｊは約５〜約５０、特に約１０〜約２５、特に約１０〜約２０でありえる。
【０１８１】
ｉおよびｊ値が定義されている本発明のすべての四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、ｉおよびｊの可能な組み合わせごとに、明文で考慮されている。
【０１８２】
本発明のすべての四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーおよびそれらの薬学的に許容される塩は、単独でまたは混合物の形で、および／または少なくとも一つの末端ブロックまたは各末端ブロックでさえも、任意的に更にグリコシル化されおよび／または官能化されているものが更に考慮されている。
【０１８３】
本発明のブロックコポリマーは１０００〜３５０００の分子量を有することができ、そしてそれは１０００〜２００００、及び４０００〜３５０００、特に１０００〜１００００ｇ／molを包含する。
【０１８４】
本発明のブロックコポリマーは、約４０〜約８０％、特に約４０％〜７０％、及びより特には約４０％〜約６０％のエチレンオキシド単位含有量を有し、好ましくはそれから成る。
【０１８５】
本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー、特に非イオン性両親媒性四官能性ブロックコポリマーの多数が、「ポロキサミン（poloxamine)」という一般的な商品名の下で商業的に入手可能である。
【０１８６】
特に、本発明の非イオン性両親媒性四官能性ブロックコポリマーは、商品名Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（商標）の下でＢＡＳＦ（Wyandotte, Mich.）から入手できる。
【０１８７】
本発明のための適切なポロキサミンに関するさらなる詳細は、Surfactant  Systems, Eds. Attwood  and  Florence, Chapman  and  Hall, London 1983, p 356-361中;The  Condensed  Encyclopaedia  of  Surfactants, Ed.Ash  and  Ash, Edward  Arnold,London, 1989中,Non-ionic Surfactants, pp. 300-371, Ed.Nace, Dekker, New  York, 1996中,Santon,Am. Perfumer  Cosmet. 72(4):54-58 (1958); (Dekker, N.Y.,1967)中,又はUS 6,353,055中において、見い出されることができる。
【０１８８】
式（Ｉｂ）に属する四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーも、以下で開示される。
【０１８９】
本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、以下で開示される四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー（以下で開示される304, 414, 616, 618, 704, 904, 1014, 1107を包含する）から成る群およびそれらの混合物、好ましくは704又は904、最も好ましくは704から選ばれることができる。
【０１９０】
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー３０４（１６００g/mol）は、以下の配列を有し：
【化１３】
0006774878.tif 000016
ここで、ＰＥＯはポリエチレンオキシドを意味し、そしてＰＰＯはポリプロピレンオキシドを意味する。
【０１９１】
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー４１４（３８８０g/mol）は、以下の式を有する：
【化１４】
0006774878.tif 000017
【０１９２】
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー６１６は、以下の式を有する：
【化１５】
0006774878.tif 000018
【０１９３】
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー６１８は、以下の式を有する：
【化１６】
0006774878.tif 000019
【０１９４】
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー７０４（５５００g/mol）は、以下の式を有する：
【化１７】
0006774878.tif 000020
【０１９５】
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー９０４（６７００g/mol）は、以下の式を有する：
【化１８】
0006774878.tif 000021
【０１９６】
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー１０１４（８１００g/mol）は、以下の式を有する：
【化１９】
0006774878.tif 000022
【０１９７】
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー６０６（５８２９g/mol）は、以下の式を有する：
【化２０】
0006774878.tif 000023
【０１９８】
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー６０８（５５２８g/mol）は、以下の式を有する：
【化２１】
0006774878.tif 000024
【０１９９】
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー１６１４（１４４６３g/mol）は、以下の式を有する：
【化２２】
0006774878.tif 000025
【０２００】
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー７４２６（７４２３g/mol）は、以下の式を有する：
【化２３】
0006774878.tif 000026
【０２０１】
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー７０４−ＮＨ２（５５６８g/mol）は、以下の式を有する：
【化２４】
0006774878.tif 000027
【０２０２】
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー７０４−Ｍｅ（５６２４g/mol）は、以下の式を有し：
【化２５】
0006774878.tif 000028
ここで、Ｍｅは（−ＣＨ３）である。
【０２０３】
参考として述べると、本発明の官能化された四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー７０４−Ｏoｘ（５８０８グラム／モル）は、以下の式を有する：
【化２６】
0006774878.tif 000029
【０２０４】
参考として述べると、本発明の官能化された四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー７０４−Ｎｏｘ（５９００グラム／モル）は、以下の式を有する：
【化２７】
0006774878.tif 000030
【０２０５】
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー７０４−パロモマイシン（７７００g/mol）は、以下の式を有する：
【化２８】
0006774878.tif 000031
【０２０６】
式（Ｉｂ）に属する四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーも、以下で開示される。
【０２０７】
参考として述べると、本発明の四官能性ＰＬＡ−ＰＯＥ非イオン性両親媒性ブロックコポリマー「３６４８」（８９９６g/mol）は、以下の式を有し：
【化２９】
0006774878.tif 000032
ここで、ＰＯＥはポリエチレンオキシドを意味し、そしてＰＬＡはポリ乳酸を意味する。
【０２０８】
参考として述べると、本発明の四官能性ＰＯＥ−ＰＣＬ非イオン性両親媒性ブロックコポリマー「１０３２１」（４３３２のｇ／ｍｏｌ）は、以下の式を有し：
【化３０】
0006774878.tif 000033
ここで、ＰＯＥはポリエチレンオキシドを意味し、そしてＰＣＬはポリカプロラクトンを意味する。なお、値「６．５」は、その値が６または７であるブロックコポリマー、およびそれらの混合物を指す。
【０２０９】
参考として述べると、本発明の四官能性ＰＯＥ−ＰＰＯ非イオン性両親媒性ブロックコポリマー「１０２５７」（７３３２ｇ／ｍｏｌ）は、以下の式を有し：
【化３１】
0006774878.tif 000034
ここで、ＰＯＥはポリエチレンオキシドを意味し、そしてＰＰＯはポリプロピレンオキシドを意味する。
【０２１０】
例示的実施形態によれば、四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、以下から選択され又はその薬学的に許容される塩の一つであり、及びそれらの混合物であり：
【化３２】
0006774878.tif 000035
0006774878.tif 000036
0006774878.tif 000037
0006774878.tif 000038
【化３３】
0006774878.tif 000039
【化３４】
0006774878.tif 000040
ここで、各末端ブロックは任意的に更にグリコシル化および／または官能化される。
【０２１１】
前述のように、ＤＮＡをトランスフェクションさせるために検討される通常の濃度と比較して、ＲＮＡを効率的にトランスフェクションさせるために非常に低い濃度において、本発明のブロックコポリマーが予期されず用いられる。実際にここで、ブロックコポリマーの最適濃度が、ＤＮＡのin  vivoでの送達における最適のために使用される濃度より７５倍低いことが観察された。
【０２１２】
特に、そして実施例から示されるように、２０．１０−４％（ｗ／ｖ）、または１０．１０−４％（ｗ／ｖ）以下でさえ、および／または5. １０−４％（ｗ／ｖ）のような低い濃度で、ｍＲＮＡのようなＲＮＡ分子はトランスフェクションされることができる。
【０２１３】
本発明の意味において、ＲＮＡ分子の濃度に関連したパーセンテージは（ｗ／ｖ）で表現され、そして上記に記載された通りである。
【０２１４】
医薬組成物および処置の方法
上記に定義された四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー自体、およびそれらの薬学的に許容される塩、およびそれらの混合物に、本発明は関する。
【０２１５】
上記に定義されている少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの少なくとも有効量を含有する組成物、特に医薬組成物に、本発明は更に関する。
【０２１６】
このように、少なくとも一つのＲＮＡ分子、例えばキャップされたまたはキャップされていないｍＲＮＡのためのビヒクルとして少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの少なくとも有効量を含有する組成物、及びより特には医薬組成物にも、本発明は関する。
【０２１７】
このように、少なくとも一つのＲＮＡ分子、例えばキャップされたまたはキャップされていないｍＲＮＡ、及び好ましくは少なくとも一つのキャップされていないｍＲＮＡのためのビヒクルとして四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを含有する医薬組成物に、本発明は関する。
【０２１８】
このように、細胞内送達および遺伝子治療のための使用のための組成物を包含する薬物および／または医薬組成物の調製のための、上記の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーのいずれにも、本発明は関する。
【０２１９】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容され、任意の投与様式（腸内および腸管外投与を包含し、そして局所投与、針注入および針使わない注射を包含する）に適しているビヒクルを含有できる。
【０２２０】
本発明の意味において、針を使わない注射はジェットインジェクションを含むことができる。例えばＷＯ２０１５０２４６６７Ａ１に示されるように、ジェットインジェクションは当技術分野において公知である。
【０２２１】
ジェットインジェクションは上記の医薬組成物（任意的にさらなる補剤を含む）にオリフィスを通過させることを包含し、それにより、哺乳類の皮膚を、および、注入設定に依存して、皮下組織または筋肉組織を透過できる高圧の超微細液体流を生成する。原理において、液体流は皮膚中に穴を形成し、そこを通って液体流が標的組織に押し込まれる。好ましくは、ジェットインジェクションは、本発明に従う核酸の皮内、皮下、又は筋肉内投与のために用いられる。
【０２２２】
薬学的に許容され、注射可能な製剤の為の、特に全身注射、所望の組織へ直接注射の為の、又は局所投与、例えば皮膚および／または粘膜への投与の為のビヒクルを、本発明の医薬組成物は含有できる。それらは、無菌の等張液、乾燥、特に凍結乾燥された組成物でもよく、後者はまたは場合により滅菌水のまたは生理的食塩液の添加によって、注射可能な溶質を構成することを可能にする。
【０２２３】
種々のパラメータによって、そして特に検討中の投与方法、関連する症状、投与される予定の負に荷電する巨大分子の性質、達成されるべき処置のまたは予防の効果、処置される個体、および処置又は予防されるべき症状の関数として、注射の為の投与量、及び投与回数も調整されることができることは明白である。
【０２２４】
例えば遺伝子治療の分野において、発現され又は抑制されるべき遺伝子、又はメッセンジャーＲＮＡの性質に依存して、投与量は決まるであろう。
【０２２５】
本発明の意味の範囲内で、疾患に関して語「予防する」は、前記疾患の発生危険を低下させる意味として理解されるべきである。
【０２２６】
より特には投与方法については、組織または循環系への直接注射、又は培養中の細胞の処置とその後の注射又は移植によるin  vivo再移植を包含できる。
【０２２７】
本発明の目的のために、本発明の組成物が、生体組織、例えば筋肉（筋肉内）、皮内、または皮下への投与に適合することを、語「体内投与」は意味する。さらに、局所、口、肺、鼻、および粘膜、例えば口内、膣、または直腸への投与が、使用されることができる。
【０２２８】
本発明に従う組成物は、治療的な観点、特に遺伝子治療の観点から、及び薬物としての使用の為に特別に有利である。
【０２２９】
このように調製された組成物は、細胞、好ましくは筋細胞または樹状細胞にその後注射される。
【０２３０】
従って、トランスフェクションされた細胞により合成されるタンパク質の量を増加させるために、本発明の組成物は、特に有利である。
【０２３１】
局所的に直接に検討中の細胞に、又は上記で検討された投与経路の１つの手段によって、投与を実施できる。
【０２３２】
１つの好ましい実施形態に従い、本発明のブロックコポリマーは、Ｔｙｒｏｄｅ液（CaCl2  3 mM, MgCl2  2 mM, KCl  6 mM, NaCl  140 mM, グルコース10 mM, 及び Hepes 10 mM, pH 7.4; Tyrode  Pharmacology. Philadelphia, 1908, 2nd  Edition,1912）または等価の媒体中で製剤化される。
【０２３３】
しかしながら、他の等価な媒体（特にＨＥＰＥＳがＮＡＨＣＯ３により置換された媒体）が検討されることもできる。実際、トランスフェクションの効率がこのような緩衝液により増加されることを、結果は示した（図６参照）。
【０２３４】
このように、本発明は、少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないｍＲＮＡのためのビヒクルとして四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを含有する医薬組成物にも関し、ここで前記四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーとｍＲＮＡはＴｙｒｏｄｅ液または等価の媒体中で製剤化される。
【０２３５】
以下を有する、細胞内送達のためのおよび／または遺伝子治療のための使用に適しているキットに、本発明は更に関する：
(i) 上記に定義された少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー、およびそれらの混合物、および
(ii) 少なくとも一つのＲＮＡ分子、特に少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないｍＲＮＡ。
【０２３６】
真核宿主中のタンパク質の発現を増加、改善、または維持する為の方法に、本発明は関し、そしてそれは上記で定義されたように、少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないｍＲＮＡのためのビヒクルとして、少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを前記宿主にトランスフェクションする工程を有する。
【０２３７】
例示的実施形態に従い、少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないｍＲＮＡのためのビヒクルとしての上記の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、真核宿主中のエリスロポエチン（ＥＰＯ）の発現の増加、改善、および／または維持の為に特に効率的である。
【０２３８】
このように、赤血球形成障害、または赤血球産生障害、例えば貧血および腎不全から選択される疾患に関連された疾患の発生の可能性の処置または予防、および／または減少のための薬物としておよび／または医薬組成物において、少なくとも一つのＲＮＡ分子、特にキャップされた又はキャップされていないｍＲＮＡのためのビヒクルとして本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは特に効率的である。
【０２３９】
いくつかの実施形態に従い、ＲＮＡ分子は、個体中のエリスロポエチンの発現に適しているｍＲＮＡである。
【０２４０】
いくつかの実施形態に従い、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、個体中のＥＰＯの発現に適しているＲＮＡ分子のためのビヒクルとして、前記個体中のヘマトクリットのパーセンテージを改善、回復、又は安定化するために特に効率的である。
【０２４１】
４０％以上（４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５２、５４、および５５％を包含する）を包含する生理学的レベルで、個体中のヘマトクリットのパーセンテージを改善、回復、又は安定化させるために、上記の組合せは特に効率的である。
【０２４２】
例示的であり制限的でないと考えられるべき以下の実施例及び図の助けにより、本発明はより完全に記載されるであろう。
【０２４３】
図
[図１]Ｃ５７Ｂｌ６マウス骨格筋中のβ−ガラクトシダーゼ発現及びβ−ガラクトシダーゼに対する免疫反応へのｍＲＮＡキャッピングおよび／またはヌクレオチド修飾の影響。（Ａ）裸の又は２０．１０−４％の７０４により調製された20μｇのキャップされていずかつ完全に修飾された又は修飾されていないｍＲＮＡの筋肉内注射の１日後のβ−ガラクトシダーゼ活性。（Ｂ）裸の又は２０．１０−４％の７０４により調製された20μｇのキャップされた完全に修飾された又は修飾されていないｍＲＮＡの筋肉内注射の１日後のβ−ガラクトシダーゼ活性。（Ｃ）裸の又は20.10−４％の７０４により調製された、20μｇのキャップされた又はキャップされていずかつ修飾されたおよび／または修飾されていないｍＲＮＡの０及び２１日目の筋肉内１回注射から成るワクチン接種の４２日後の体液反応。各カラムは、少なくとも８匹の個々のマウスのＥＬＩＳＡにより測定された平均抗体価を表す。（Ｄ）特定のＣＤ８＋ＩＦＮγ＋β−ガラクトシダーゼ細胞のパーセンテージ。ＩＣＡＦｅｃｔｉｎ(商標）４４１およびβ−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドＤＮＡ又は対照としてα-フェトプロテインをコードするプラスミドＤＮＡによってトランスフェクションされたネズミ樹状細胞株（Jaws）で一晩刺激されて４２日目に、脾細胞は準備された。洗浄後、細胞は抗ＣＤ８抗体および抗ＩＦＮγで染色された。各カラムは、少なくとも６匹の個々のマウスの総脾臓ＣＤ８＋＋／−ＳＥＭにおけるＣＤ８＋ＩＦＮγ細胞のパーセンテージを表す。
【０２４４】
[図２]培養中の細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現へのｍＲＮＡキャッピングおよび／またはヌクレオチド修飾の影響。Ｈｅｌａ（図２の上部）、Ｃ２Ｃ１２（図２の中央）、及びＪＡＷＩＩ細胞（図２の一番下）は、βガラクトシダーゼをコードする調製されたｍＲＮＡ又は調製されたＤＮＡの０．５μｇと５（＋／−）の電荷比率のアミノグリコシド脂質誘導体ＤＯＳＴによって、トランスフェクションされた。ＲＮＡ分子は、シュード−Ｕ又は５−メチル−シトシンにより完全に修飾されたＵおよびＣ、または修飾されていないＵおよびＣによって、キャップされたか又はされなかった。２４時間後、細胞は集められ、そしてβガラクトシダーゼ発現が測定された。結果は、細胞タンパク質のｍｇ当たりのβガラクトシダーゼのｐｇ（ｐｇ／ｍｇ  ｐｒｏｔ）により表される。データは、トランスフェクションされた細胞のβガラクトシダーゼ（ｐｇ／ｍｇ  ｐｒｏｔ）の平均値±ＳＥＭとして示される。対照として、ＲＮＡ単独またはＤＮＡ単独によってトランスフェクションされた細胞は、βガラクトシダーゼの有意な発現を示さなかった。
【０２４５】
[図３]ブロックコポリマー製剤注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット。（Ａ）ネズミＥＰＯをコードする20μｇのｍＲＮＡと、10 x 10-4% (白抜き円), 20 x 10-4% (白抜き四角)、又は 100 x 10-4% (白抜き三角)の 704を含有している７０４／ＲＮＡ製剤の筋肉内注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット。対照として、ネズミＥＰＯをコードする20μｇの裸のＲＮＡを、マウスは注射された（黒塗り円）。対照として、一つのマウス群は注射をされなかった（黒塗り四角）。（Ｂ）ネズミＥＰＯをコードする10μｇのプラスミドＤＮＡおよび０．１５％の７０４を含有している７０４／ＤＮＡ製剤の筋肉内注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット（白抜き円）。対照として、ネズミＥＰＯをコードする10μｇの裸のＲＮＡを、マウスは注射された（黒塗り円）。対照として、一つのマウス群は注射をされなかった（黒塗り四角）。（Ｃ）ネズミＥＰＯをコードする20μｇのｍＲＮＡと、10 x 10-4%４ (白抜き円), 20 x 10-4% (白抜き四角)、又は 100 x 10-4% (白抜き三角)の 904を含有している９０４／ＲＮＡ製剤の筋肉内注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット。対照として、ネズミＥＰＯをコードする20μｇの裸のＲＮＡを、マウスは注射された（黒塗り円）。対照として、一つのマウス群は注射をされなかった（黒塗り四角）。
【０２４６】
[図４]ブロックコポリマー／ＲＮＡ製剤および７０４／ＤＮＡ製剤（Ｂ）を筋肉内注射されたマウス中のヘマトクリットの変化。（Ａ）６匹のマウスが１週間の間隔の２回連続注射により０および４２日目に２回処置された。裸の（白抜き三角）又は１００ｘ１０−４％の９０４（黒塗り四角）および２０×１０−４％の７０４（黒塗り円）で製剤化された、ネズミＥＰＯをコードする20μｇのメッセンジャーＲＮＡから、処置は構成された。処置の開始の後の１００日目に、裸の（白抜き三角）又は１００ｘ１０−４％の９０４（黒塗り四角）および２０×１０−４％(w/v)の７０４（黒塗り円）で製剤化された、ＥＰＯをコードする20μｇのメッセンジャーＲＮＡから構成される単回注射を、マウスは受けた。処置の開始の後の１３４日目に、１００ｘ１０−４％の９０４と共に、ネズミＥＰＯをコードする２０μｇのメッセンジャーＲＮＡの単回投与をマウスは受けた（黒塗り四角）。対照として、マウスは、注射をされなかった（白抜き四角）。点線は、健康な注射されなかったマウスのヘマトクリット変動を表す。（Ｂ）６匹のマウスは、０、５６、および１００日目に、１０μｇの裸のＤＮＡ（白抜き菱形）、又は0.15％の７０４（黒塗り菱形）によって製剤化された１０μｇのＤＮＡで処置された。対照として、マウスは、注射もされなかった（白抜き四角）。点線は、健康な注射されなかったマウスのヘマトクリット変動を表す。（Ｃ）１３５日目において、裸の又は１００ｘ１０−４％の９０４で製剤化されたネズミＥＰＯをコードする20μｇのＲＮＡ及び、裸の又は０．１５％の７０４によって製剤化されたＥＰＯをコードする10μｇのプラスミドＤＮＡの注射の２４時間後にマウスの血清中で第１３５日に測定されたネズミＥＰＯの発現。各バーは、６個体の平均値＋／−ＳＥＭを表す。（Ｄ）四官能性ブロックコポリマーによって製剤化された、ネズミＥＰＯをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡでの処置の開始から作られた１７０日における体液応答。種々の組成物を注射されたマウスの血清中で測定されたネズミＥＰＯに対する平均抗体量（商業的に入手可能なネズミＥＰＯに対する抗体の既知量から構成される標準曲線を用いたＥＬＩＳＡで測定された）を、各カラムは表す。
【０２４７】
[図５]20.10−４％の７０４によって製剤化されたｍＲＮＡの筋肉内注射後のマウス骨格筋のルシフェラーゼ発現。それぞれｐＨ７．４、７．４、および６．７に対応するＨｅｐｅｓ、ＮａＨＣＯ３、又は乳酸ナトリウムで緩衝された種々の媒体中において、７０４で製剤化された１０μｇのｍＲＮＡの筋肉内投与２４時間後のルシフェラーゼ活性。ルシフェラーゼ発現に対する１〜５ｍＭのＣａＣｌ２の濃度の影響も、ＨｅｐｅｓまたはＮａＨＣＯ３により緩衝される２つの異なる媒体において測定された。対照として、一つのマウス群は１５０ｍＭのＮａＣｌのみからなる媒体を注射された。各カラムは、少なくとも６個体の値の平均値＋／−ＳＥＭを表す。
【０２４８】
[図６]種々の濃度の７０４によって製剤化されたｍＲＮＡの筋肉内注射後のマウス骨格筋のルシフェラーゼ発現。１０．１０−４〜1000.10−４％（ｗ／ｖ）の種々の濃度の７０４によって製剤化された10μｇのｍＲＮＡの筋肉注射の２４時間後のルシフェラーゼ活性。各カラムは、少なくとも６個体の値の平均値＋／−ＳＥＭを表す。
【０２４９】
[図７]裸の又は１４４６３ｇ／ｍｏｌの四官能性ＰＥＯ−ＰＰＯ両親媒性ブロックコポリマーによって製剤化された、キャップされかつ修飾されたｍＲＮＡの筋肉内注射の後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現。５〜1000.10−４％（ｗ／ｖ）の種々の濃度のブロックコポリマーによって製剤化された５μｇのｍＲＮＡの筋肉注射の２４時間後のルシフェラーゼ活性。各カラムは、少なくとも６個体の値の平均値＋／−ＳＥＭを表す。カラム「裸の」は、ブロックコポリマーがない以外は他と同じｍＲＮＡの投与後のルシフェラーゼの発現に関する。カラム「参照」は、約20.10−４％（ｗ／ｖ）の濃度で投与された場合の四官能性ブロックコポリマー７０４と組み合わされた、同じｍＲＮＡの投与後の、ルシフェラーゼの発現に関する。
【０２５０】
[図８]裸の又は７４２３ｇ／ｍｏｌの四官能性ＰＰＯ−ＰＯＥ両親媒性ブロックコポリマーによって製剤化された、キャップされかつ修飾されたｍＲＮＡの筋肉内注射の後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現。５〜1000.10−４％（ｗ／ｖ）の種々の濃度のブロックコポリマーによって製剤化された５μｇのｍＲＮＡの筋肉注射の２４時間後のルシフェラーゼ活性。各カラムは、少なくとも６個体の値の平均値＋／−ＳＥＭを表す。カラム「裸の」は、ブロックコポリマーがない以外は他と同じｍＲＮＡの投与後のルシフェラーゼの発現に関する。カラム「参照」は、約20.10−４％（ｗ／ｖ）の濃度で投与された場合の四官能性ブロックコポリマー７０４と組み合わされた、同じｍＲＮＡの投与後のルシフェラーゼの発現に関する。
【０２５１】
[図９]裸の又は８９９６ｇ／ｍｏｌの四官能性ＰＬＡ−ＰＯＥ両親媒性ブロックコポリマーによって製剤化された、キャップされかつ修飾されたｍＲＮＡの筋肉内注射の後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現。10および100.10−４％（ｗ／ｖ）の濃度のブロックコポリマーによって、製剤化された５μｇのｍＲＮＡの筋肉注射の２４時間後のルシフェラーゼ活性。各カラムは、少なくとも６個体の値の平均値＋／−ＳＥＭを表す。カラム「裸の」は、ブロックコポリマーのない以外は他と同じｍＲＮＡの投与後のルシフェラーゼの発現に関する。
【０２５２】
[図１０]裸の又は７３３２ｇ／ｍｏｌの四官能性ＰＯＥ−ＰＰＯ両親媒性ブロックコポリマーによって製剤化された、キャップされかつ修飾されたｍＲＮＡの筋肉内注射の後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現。10および100.10−４％（ｗ／ｖ）の濃度のブロックコポリマーによって製剤化された５μｇのｍＲＮＡの筋肉注射の２４時間後のルシフェラーゼ活性。各カラムは、少なくとも６個体の値の平均値＋／−ＳＥＭを表す。カラム「裸の」は、ブロックコポリマーがない以外は他と同じｍＲＮＡの投与後のルシフェラーゼの発現に関する。
【０２５３】
[図１１]ブロックコポリマー製剤注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット及びＥＰＯのレベル。（Ａ）ネズミＥＰＯをコードする20μｇのｍＲＮＡと、10 x 10-4% (白抜き円), 20 x 10-4% (白抜き四角)、又は 100 x 10-4% (白抜き三角)の 704を含有している７０４／ＲＮＡ製剤の筋肉内注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット。対照として、ネズミＥＰＯをコードする20μｇの裸のＲＮＡを、マウスは注射された（黒塗り円）。対照として、一つのマウス群は注射もされなかった（黒塗り四角）。（Ｂ）ネズミＥＰＯをコードする20μｇのｍＲＮＡと、10 x 10-4%４ (白抜き円), 20 x 10-4% (白抜き四角)、又は 100 x 10-4% (白抜き三角)の 904を含有している９０４／ＲＮＡ製剤の筋肉内注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット。対照として、ネズミＥＰＯをコードする20μｇの裸のＲＮＡを、マウスは注射された（黒塗り円）。対照として、一つのマウス群は注射をされなかった（黒塗り四角）。（Ｃ）２０ｘ１０−４％の７０４および１（白抜き円）、５（白抜き菱形）、１０（白抜き三角）および５０μｇ（白抜き八角）を包含する種々の量の、ネズミをコードするｍＲＮＡを含有している７０４／ＲＮＡ製剤の筋肉内投与後の時間の関数としてのマウスＥＰＯ。対照として、１（黒塗り円）、５（黒塗り菱形）、１０（黒塗り三角）、および50μｇ（黒塗り八角）の、ネズミＥＰＯをコードする裸のＲＮＡを、マウスは注射された。（Ｄ）（Ｃ）に記載されているのと同一の時間の関数としてのヘマトクリットレベル。１０時間後に、７０４によって製剤化されたネズミＥＰＯをコードするプラスミドＤＮＡ（黒塗りの印）によって、または、７０４によって製剤化されたｍＲＮＡ（白抜きの印）によって、筋肉内に注射されたマウスの血清中（Ｅ）及び筋肉中（Ｆ）で、マウスＥＰＯレベルは測定された。各印は、少なくとも６個体のマウスの平均値＋／−ＳＥＭを表す。
【０２５４】
[図１２]本発明のブロックコポリマーと組み合わされた、キャップされていずかつ修飾されたｍＲＮＡの筋肉内注射の後のβ−ガラクトシダーゼ発現。ｙ軸は、ｃｐｓ（カウント/秒）単位のβ−ガラクトシダーゼ発現量を表す。ｘ軸は、左から右へ、ブロックコポリマー７０４、１０２５７、３６４８、１６１４、および７４２６に対応するデータセットを表す。
【０２５５】
[図１３]ブロックコポリマー９０４および１０２５７の存在下での、０および２１日目におけるキャップされかつ修飾されていないｍＲＮＡの２回の筋肉内注射後の３５日目のマウスの体液反応。ｙ軸は、ＥＬＩＳＡにより測定された少なくとも６個体のマウスの平均抗体価を表す。ｘ軸は、左から右へ、裸のｍＲＮＡ、ブロックコポリマー７０４、及び１０２５７に対応するデータセットを表す。データセットごとに、左のカラムはＤＮＡ、そして右のカラムはＲＮＡを表す。
【０２５６】
実施例
材料と方法
核酸分子
β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードしている、キャップされた又はされていない、それぞれのＵ又はＣがそれぞれシュード−Ｕおよび５−メチル−Ｃで完全に置換されているかされてないｍＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ（サン  ジエゴ、米国）から購入された。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥ１プロモータ／エンハンサの制御下のネズミＥＰＯｃＤＮＡを有しているプラスミドは、プラスミドｐＴｅｔＯ−ｍＥＰＯ（Richard et al., Human  Gene  Therapy  2005）からＰＣＲによりｍＥＰＯｃＤＮＡをリカバーすることにより構築され、ｐｃＤＮＡ−３ベクター（Invitrogen, Cergy  Pontoise, France）へ導入された。ヒトサイトメガロウイルス即初期遺伝子プロモータにより制御されるβ−ガラクトシダーゼをコードするｐＣＭＶ−ｂＧａｌプラスミド（Clontech, St  Germain  en  Laye, France）が、抗原として使われた。プラスミドは、ＥｎｄｏＦｒｅｅプラスミド精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、米国）によって、形質転換された組換え型大腸菌から精製された。
【０２５７】
動物実験および核酸の調製
すべての動物実験は、フランス国立保健医学研究所のガイドラインに従って実施された。８週齢の雌のスイスおよびＣ５７ｂｌ／６マウスは、Ｊａｎｖｉｅｒ（Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓａｉｎｔ  Ｉｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から得られた。少なくとも６〜８匹のマウスが、各実験群において、注射された。筋肉内投与のために、マウスは麻酔された。一個所の毛が剃られた前脛骨筋内に、極小シリンジ（Ｕ１００、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｒｕｎｇｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して５０マイクロリットルの合成製剤は注射された。ブロックコポリマーの原液は、水中の２％（ｗ／ｖ）濃度で調製され、4°Ｃで保管された。バッファ中の所望の濃度のプラスミドＤＮＡ溶液と、水中の所望の濃度のブロックコポリマーを等容量で混合することによって、ブロックコポリマーを有するＤＮＡおよびｍＲＮＡの製剤は調製された。
【０２５８】
細胞培養
ペニシリン、ストレプトマイシン、Lグルタミン及び１０％のウシ胎仔血清を補充されたダルベッコ改変イーグル培地中で、Ｈｅｌａ、Ｃ２Ｃ１２、ＪＡＷ  ＩＩは生育された。トランスフェクションの１日前に、細胞がトランスフェクション時にコンフルエントの７０−８０％（1ウェルあたり０．５  〜  ２×１０５細胞）に到達するように、細胞は１ｍＬの完全な細胞生育培地中に置かれた。トランスフェクションの１日後に、細胞は収集され、そしてプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を補充されたＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Promega）がそれぞれのウェルに加えられた。１０，０００rpm、４分間の遠心分離の後、ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を使用して、Ｖｉｃｔｏｒ２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で上澄の一部から、ルシフェラーゼ活性は決定された。上澄１０μｌにルシフェラーゼアッセイの基質100μｌの添加した後、発光を測定することによって、ルシフェラーゼ活性は決定された。
【０２５９】
ＥＰＯ発現分析
ヘマトクリット値は、ミクロキャピラリ遠心分離で測定された。筋肉内注射後の複数の時点で、眼窩後空洞からマウス血液は集められ、そして遠心分離（１０００ｇで３分）によって、血清が得られた。血漿試料のために、血液はヘパリナイズされたチューブ中に眼窩後洞から集められ、１０００ｇで３分間遠心分離された。製造業者（R&D Systems）により提供された説明書に従って、マウス血清のＥＰＯレベルは、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）で測定された。
【０２６０】
抗ネズミＥＰＯ特異的免疫応答
液性免疫応答は、ＥＬＩＳＡで測定された。簡潔に言うと、９６ウェルプレート（NuncMaxisorp）は、  ｐＨ  ９．５である５０ｍＭのＮａＨＣＯ３中の組換えネズミＥＰＯで、4°Ｃで一晩コートされ、その後、希釈された血清を三分配する前に、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で室温で1時間ブロックされた。プレートは37°Ｃで９０分間インキュベートされ、その後ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１％ＢＳＡ中で１／５０００に希釈されたペルオキシダーゼ結合ヤギマウス抗IgＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、英国）を用いて、ＥＰＯ特異的IgＧは検出された。プレートは工程の間にＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で３回洗われ、そしてペルオキシダーゼ活性はｐＨ５のクエン酸塩緩衝液中の１ｍｇ／ｍＬのＯＰＤによって、明らかにされた。反応は１ＭのＨ２ＳＯ４の添加によって止められ、そして吸収が４９２ナノメートルで測定された。血清は１／１００、１／１０００、および１／１００００でテストされ、そして各ＥＬＩＳＡプレートに存在する商業的に入手可能な抗ネズミＥＰＯの固定された複数の既知量から成る標準曲線に対して、抗ネズミＥＰＯ抗体量は算出された。
【０２６１】
ルシフェラーゼ発現
ＰｈｏｔｏｎＩＭＡＧＥＲ  Ｏｐｔｉｍａシステム（http://www.biospacelab.com）を使用する、動物のライブ画像化によって、ルシフェラーゼタンパク質発現は評価された。簡潔に言うと、２ｍｇのｉｎ  ｖｉｖｏルシフェラーゼ基質（ビートルルシフェリン基質、Promega）がマウスの腹膜内に注射され、そして１０分後に、マウスは麻酔され、そしてベースラインが安定するまで発光信号は測定されるであろう。発光信号の安定化後、発光の測定は、３０秒間実行された。
【０２６２】
β−ｇａｌ発現
製造業者のプロトコールに従ってＢｅｔａＧｌｏ  Ａｓｓａｙシステム（Promega、Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、筋肉抽出物中において、β−ｇａｌ発現は定量化された。
【０２６３】
抗−β−ｇａｌ特異的免疫応答
液性免疫応答は、ＥＬＩＳＡで測定された。簡潔に言うと、９６ウェルプレート（NuncMaxisorp）は、  ｐＨ  ９．５である５０ｍＭのＮａＨＣＯ３中の組換えｂＧａｌで、4°Ｃで一晩コートされ、その後、希釈された血清を三分配する前に、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、および１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で1時間ブロックされた。プレートは37°Ｃで９０分間インキュベートされ、その後ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１％ＢＳＡ中で１／５０００に希釈されたペルオキシダーゼ結合ヤギマウス抗IgＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、英国）を用いて、ｂＧａｌ特異的IgＧは検出された。プレートは工程の間にＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で３回洗われ、そしてペルオキシダーゼ活性はｐＨ５のクエン酸塩緩衝液中の１ｍｇ／ｍＬのＯＰＤによって、明らかにされた。反応は１ＭのＨ２ＳＯ４の添加によって止められ、そして吸収が４９２ナノメートルで測定された。血清は１／１００、１／１０００および１／１００００でテストされ、そして各ＥＬＩＳＡ中に存在するコントロール血清の二倍希釈液に対して、力価は算出された。
【０２６４】
脾臓ＣＤ８細胞の総数におけるＩＦＮｇ発現ＣＤ８細胞のパーセンテージを測定するために、脾細胞は完全培地中で５ｘ１０６  細胞／ｍＬで培養された。ｂ−ガラクトシダーゼまたはネズミアルファFetoproteinをコードするプラスミドＤＮＡを有するＩＣＡＦｅｃｔｉｎ（商標）４４１でネズミ樹状細胞株（ＪＡＷＳ）はトランスフェクションされ、そして細胞は５％ＣＯ２のもと37°Ｃでインキュベートされた。２４時間後に細胞は採取され、その後、抗ＣＤ８抗体および抗ＩＦＮγで染色され、FACSによって定量化された。
【０２６５】
末端ブロックでのブロックコポリマー７０４の官能基化のためのプロトコール
I -７０４−Ｍｅの調製
７０４（１．０７ｇ、０．１９ｍｍｏｌ、１当量）は真空下で３０分間乾燥され、そして乾燥ＴＨＦ（２５ｍＬ）中に溶解された。0°ＣでＮａＨ（９５％、５６ｍｇ、２．３３ｍｍｏｌ、１２当量）が加えられ、そして混合物は室温で３０分間撹拌された。ヨードメタン（０．１４ｍＬ、２．３３ｍｍｏｌ、１２当量）がその後加えられ、そして混合物は一晩室温で攪拌された。濃縮後、残渣はフラッシュクロマトグラフィ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製されて、７０４−Ｍｅが与えられた（０．９３ｇ、８８％）。
【０２６６】
ＩＩ−７０４−ＮＨ２の調製
ＤＣＭ（１２０ｍＬ）中の７０４（４．７ｇ、０．８５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ｐ−トルエンスルホニルクロライド（１．９５ｇ、１０．２５ｍｍｏｌ、１２当量）が加えられた。粉末状のＫＯＨ（０．７７ｇ、１３．６７ｍｍｏｌ、１６の式）はその後３０分にわたって少しづつ加えられ、そして混合物は２日間室温で撹拌された。ＤＣＭ（１００ｍＬ）が加えられ、そして混合物は水、塩水により洗浄され、ＭｇＳＯ４で乾燥され、濃縮された。残渣はフラッシュクロマトグラフィ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製されて、７０４−Ｔｏｓが与えられた（４．３７ｇ、８４％）。
【０２６７】
参考のために述べると、７０４Ｔｏｓは、以下の式を有し：
【化３５】
0006774878.tif 000041
ここで、ＴｓＯはトシル基を指す。
【０２６８】
ＥｔＯＨ（１００ｍＬ）中の７０４Ｔｏｓ（４．３７ｇ、０．７１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、アジ化ナトリウム（１．１６ｇ、１７．８５ｍｍｏｌ、２５当量）が加えられた。混合物は、２０時間間還流された。室温に冷却後、揮発物は蒸発された。残渣はＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解され、ＮａＨＣＯ３飽和溶液、水、塩水により洗浄され、ＭｇＳＯ４で乾燥され、そして濃縮された。残渣はフラッシュクロマトグラフィ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製されて、７０４−Ｎ３が与えられた（３．３０ｇ、８２％）。
【０２６９】
参考のために述べると、７０４Ｎ３は、以下の式を有する：
【化３６】
0006774878.tif 000042
【０２７０】
ＥｔＯＨ（６０ｍＬ）中の７０４−Ｎ３（３．３０ｇ、０．５８ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（１０％、０．７５ｇ、０．１１ｍｍｏｌ、０．２当量）が加えられた。
減圧／Ｎ２が３サイクル適用され、続いて減圧／Ｈ２が３サイクル適用された。混合物は室温で２日間撹拌され、その後セライトのパッドを通して濾過され、ＭｅＯＨで洗浄され、そして濃縮された。残渣はフラッシュクロマトグラフィ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製されて、７０４−ＮＨ２が与えられた（２．８１ｇ、８８％）。
【０２７１】
ＩＩＩ−７０４−ＮＯｘの調製
ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の７０４−ＮＨ２（０．２ｇ、０．０３６ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（０．０６ｍＬ、０．３６ｍｍｏｌ、１０当量）および無水コハク酸（０．０３６ｇ、０．３６ｍｍｏｌ、１０当量）が順次加えられた。混合物は、室温で一晩撹拌され、その後１ＭＨＣｌ、水で洗浄され、MｇＳＯ４で乾燥され、濃縮された。残渣はフラッシュクロマトグラフィ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製されて、７０４−ＮＯｘが与えられた（０．１８５ｇ、８７％）。
【０２７２】
15−７０４−Ｐａｒｏｍｏの調製
DMF（１５ｍｌ）中の７０４−ＮＯｘ（０．１８５ｇ、０．０３１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、Ｐａｒｏｍｏ（Ｔｅｏｃ）−ＮＨ２（０．２２４ｇ、０．１８８ｍｍｏｌ、６当量）、ＨＢＴＵ（０．０８３ｇ、０．２２０ｍｍｏｌ、７当量）、およびＤＭＡＰ（０．０５３ｇ、０．４４０ｍｍｏｌ、１４当量）が順次加えられた。混合物は50°Ｃで４８時間撹拌され、その後濃縮され、フラッシュクロマトグラフィ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製されて、７０４−Ｐａｒｏｍｏ（Ｔｅｏｃ）が与えられた（０．１４９ｇ、４８％）。
【０２７３】
参考のために述べると、７０４Ｐａｒｏｍｏ（Ｔｅｏｃ）は、以下の式を有する。
【化３７】
0006774878.tif 000043
ＤＣＭ（３ｍＬ）中の７０４−Ｐａｒｏｍｏ（Ｔｅｏｃ）（０．１４９ｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）の溶液に、0°Ｃでトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）が加えられた。0°Ｃで３０分間後に、混合物は室温で１時間撹拌され、そして濃縮された。残渣はフラッシュクロマトグラフィ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製されて、７０４−Ｐａｒｏｍｏが与えられた（０．０４２ｇ、３９％）。
【０２７４】
Ｖ−７０４ＯＯｘの調製
ピリジン（１５ｍＬ）中の７０４（２ｇ、０．３６ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、無水コハク酸（０．３６ｇ、３．６３ｍｍｏｌ、１０当量）が加えられた。混合物は、55°Ｃで一晩撹拌され、そして濃縮された。残渣はＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解され、１Ｍ  ＨＣｌ、  水、塩水により洗浄され、ＭｇＳＯ４で乾燥され、そして濃縮された。残渣はフラッシュクロマトグラフィ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製されて、７０４−ＯＯｘが与えられた（１．７８ｇ、８４％）。
【実施例１】
【０２７５】
種々のｍＲＮＡ構造および配列を用いた骨格筋のin  vivoでのトランスフェクションおよび免疫原性
目的：この実験は、Ｃ５７ＢＩ６骨格筋におけるタンパク質発現に対するｍＲＮＡキャッピング及びヌクレオチド修飾の影響の比較研究、及び更に注射後の免疫応答の重要性の評価を提示する。
【０２７６】
図１から示されるように、ビヒクルとして四官能性ブロックコポリマー７０４を使用している、β−ガラクトシダーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡのトランスフェクションは、（ｉ）効率的なタンパク質発現および（ｉｉ）最小の免疫応答を可能にする。
【実施例２】
【０２７７】
種々のｍＲＮＡ構造および配列を用いた培養細胞のin  vitroトランスフェクション。
目的：アミノグリコシド脂質誘導体が３つの異なる細胞株においてｍＲＮＡトランスフェクションにとってそれほど満足でないという証拠を、この実験は提示する（図２参照）。
【実施例３】
【０２７８】
ネズミエリスロポエチンの分泌。
目的：この実験は、ビヒクルとしてブロックコポリマー７０４を使用したネズミＥＰＯをコードするｍＲＮＡの注射の、２０日にわたる追跡を提示する（図３参照）。
【実施例４】
【０２７９】
ｍＲＮＡおよびＤＮＡの反復注射およびマウスネズミＥＰＯの発現。
目的：この実験は、ビヒクルとしてブロックコポリマー７０４又は９０４を使用して、ネズミＥＰＯをコードするｍＲＮＡの注射の、１８０日にわたる追跡を提示する（図３参照）。ＲＮＡトランスフェクションのためのビヒクルとしてのブロックコポリマー７０４および９０４の効率を示す比較研究が、更に提示される（図４参照）。
【実施例５】
【０２８０】
ルシフェラーゼ発現に対する混合媒体の影響。
目的：レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを使用して、本発明のブロックコポリマーを用いたＲＮＡトランスフェクションに関して、Ｔｙｒｏｄｅ媒体およびその等価媒体が優れた特性を与えられるという良い証拠を、この比較研究は提示する（図５参照）。
【実施例６】
【０２８１】
トランスフェクションの効率に対する７０４の濃度の影響。
目的：ブロックコポリマーが低濃度であっても、本発明のブロックコポリマーはＲＮＡ分子のトランスフェクションに対して非常に効率的であるという証拠を、この比較研究は提示する（図６参照）。
【実施例７】
【０２８２】
トランスフェクション効率における四官能性ＰＥＯ−ＰＰＯ非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの１４４６３ｇ／ｍｏｌ濃度の影響。
目的：この比較研究は、以下の一般式のブロックコポリマーの効率の証拠を提示する：
【化３８】
0006774878.tif 000044
【０２８３】
実際、マウス骨格筋への筋肉内投与後に、ブロックコポリマーが低濃度であっても、本発明のブロックコポリマーはＲＮＡ分子のトランスフェクションの為に非常に効率的であることが観察されている（図７参照）。その上、この特定のブロックコポリマーの投与後のルシフェラーゼの発現が、四官能性ブロックコポリマー７０４の投与後の発現よりも著しく高いことが見出された。
【実施例８】
【０２８４】
トランスフェクション効率における四官能性ＰＥＯ−ＰＰＯ非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの７４２３ｇ／ｍｏｌ濃度の影響。
目的：この比較研究は、以下の一般式のブロックコポリマーの効率の証拠を提示する：
【化３９】
0006774878.tif 000045
【０２８５】
実際、マウス骨格筋への筋肉内投与後に、ブロックコポリマーが低濃度であっても、本発明のブロックコポリマーはＲＮＡ分子のトランスフェクションの為に非常に効率的であることが観察されている（図８参照）。その上、この特定のブロックコポリマーの投与後のルシフェラーゼの発現が、四官能性ブロックコポリマー７０４の投与後の発現よりも著しく高いことが見出された。
【実施例９】
【０２８６】
マウス骨格筋への筋肉内投与後に、トランスフェクション効率における四官能性ＰＬＡ−ＰＯＥ非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの８９９６ｇ／ｍｏｌ濃度の影響。
目的：この比較研究は、以下の一般式のブロックコポリマーの効率の証拠を提示する：
【化４０】
0006774878.tif 000046
【０２８７】
実際、マウス骨格筋への筋肉内投与後に、ブロックコポリマーが低濃度であっても、本発明のブロックコポリマーはＲＮＡ分子のトランスフェクションの為に非常に効率的であることが観察されている（図９参照）。
【実施例１０】
【０２８８】
トランスフェクション効率における四官能性ＰＯＥ−ＰＰＯ非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの７３３２ｇ／ｍｏｌ濃度の影響。
目的：この比較研究は、以下の一般式のブロックコポリマーの効率の証拠を提示する：
【化４１】
0006774878.tif 000047
【０２８９】
実際、マウス骨格筋への筋肉内投与後に、ブロックコポリマーが低濃度であっても、本発明のブロックコポリマーはＲＮＡ分子のトランスフェクションの為に非常に効率的であることが観察されている（図１０参照）。
【実施例１１】
【０２９０】
マウス中のヘマトクリットのレベルにおける、ＥＰＯをコードするｍＲＮＡを伴うブロックコポリマー製剤の筋肉内注射のin  vivoでの効果。
目的：マウスの筋肉内注射後の、マウス中のＥＰＯおよびヘマトクリットの経時変化の証拠を、この研究は提示する（図１１参照）。
【実施例１２】
【０２９１】
キャップされていずかつ修飾されたメッセンジャーＲＮＡのためのビヒクルとしての本発明のブロックコポリマーの影響。
目的：真核宿主中でのキャップされていずかつ修飾されたメッセンジャーＲＮＡの発現を促進することに対して、本発明のブロックコポリマーが特別には効率的であるという証拠を、この研究は、提示する（図１２参照）。
【０２９２】
対照としての２０ｘ１０−４％の７０４、及び１００ｘ１０−４％の１０２５７、１０ｘ１０−４％の３６４８、２０ｘ１０−４％の１６１４、および１００ｘ１０−４％の７４２６によって製剤化されたβ−ガラクトシダーゼをコードするキャップされていずかつ修飾されたｍＲＮＡ15μｇの筋肉内投与１日後の、β−ガラクトシダーゼ活性。
【０２９３】
使用された修飾されたＲＮＡは、すべてのウラシルおよびシトシン塩基において、それぞれシュードウリジン−５'−三ホスフェートおよび５−メチルシチジン−５'−三ホスフェートヌクレオチドを使用して修飾された。注射の２４時間後に、筋肉は採取され、液体窒素中で凍結された。製造業者の説明書（Promega＃Ｅ４７２０）に従い、β−Ｇｌｏアッセイシステムの補助により、純粋な筋肉抽出物中で、βガラクトシダーゼ発現は評価された。７０４ブロックコポリマーと比較してさえ、ブロックコポリマー１０２５７、３６４８、１６１４、および７４２６はビヒクルとして特別に効率的であることを、結果は示している。
【実施例１３】
【０２９４】
目的：本発明のブロックコポリマーと組み合わされたＲＮＡ分子の投与後の免疫応答の欠如の証拠を、この研究は提示する（図１３参照）。
【０２９５】
プラスミドＤＮＡ、または裸の又は四官能性ブロックコポリマー９０４または１０２５７によって製剤化されたβ‐ガラクトシダーゼをコードするキャップされかつ修飾されていないｍＲＮＡ20μｇを、マウスは注射された。各カラムは、少なくとも６匹の個々のマウスのＥＬＩＳＡにより測定された平均抗体価を表す。ＲＮＡ分子の細胞内送達のために、および遺伝子治療のために、前記ブロックコポリマーが特に効率的である事が観察される。
【０２９６】
0006774878.tif 000048
0006774878.tif 000049
0006774878.tif 000050
0006774878.tif 000051
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0006774878.tif 000053
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【図１−１】
0006774878.tif 000066
【図１−２】
0006774878.tif 000067
【図２】
0006774878.tif 000068
【図３】
0006774878.tif 000069
【図４−１】
0006774878.tif 000070
【図４−２】
0006774878.tif 000071
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006774878.tif 000075
【図９】
0006774878.tif 000076
【図１０】
0006774878.tif 000077
【図１１−１】
0006774878.tif 000078
【図１１−２】
0006774878.tif 000079
【図１２】
0006774878.tif 000080
【図１３】
0006774878.tif 000081
【配列表】
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