(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中の抗体濃度を決定するための方法であって、
反応チャンバー中で、前記液体試料を、蛍光色素とコンジュゲートされた汎用抗体結合性タンパク質を含む抗体結合性プローブとともにインキュベートして、反応混合物を提供する工程と、
前記反応チャンバー中の前記反応混合物を蛍光偏光に関してアッセイして、励起光と放射光との間の偏光の変化を検出する工程と、
前記偏光の変化を前記液体試料の抗体価と相関させる工程と
を含み、
前記蛍光色素は、４ｎｓから１００ｎｓの寿命を有する長寿命蛍光色素であり、前記汎用抗体結合性タンパク質は、トランケート型であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記長寿命蛍光色素は、５ｎｓから１００ｎｓの寿命を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記長寿命蛍光色素は、ＦＩＴＣであるか、または５ｎｓから１００ｎｓの寿命を有することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記汎用抗体結合性タンパク質は、プロテインＧまたはプロテインＡであることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記汎用抗体結合性タンパク質は、トランケート型プロテインＧまたはトランケート型プロテインＡであることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記トランケート型プロテインＧは、２０ｋＤａ未満の分子量を有することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記トランケート型プロテインＧは、１５ｋＤａ未満の分子量を有することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記トランケート型プロテインＧは、１０ｋＤａ未満の分子量を有することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記トランケート型プロテインＡは、５０ｋＤａ未満の分子量を有することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記トランケート型プロテインＡは、４０ｋＤａ未満の分子量を有することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記トランケート型プロテインＡは、３０ｋＤａ未満の分子量を有することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記トランケート型プロテインＡは、２０ｋＤａ未満の分子量を有することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記トランケート型プロテインＡは、１０ｋＤａ未満の分子量を有することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記蛍光色素は、ＦＩＴＣまたは５ｎｓから１００ｎｓの寿命を有する蛍光色素であり、前記汎用抗体結合性タンパク質は、トランケート型プロテインＧまたはトランケート型プロテインＡであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記反応チャンバーは、マルチウェルプレートのウェルであることを特徴とする請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記液体試料は、細胞培養液であることを特徴とする請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記液体試料は、生物製剤プロデューサー細胞培養物からの細胞培養液であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）４ｎｓから１００ｎｓの寿命を有する長寿命蛍光色素とコンジュゲートされたトランケート型プロテインＡまたはトランケート型プロテインＧを含む抗体結合性プローブ、および（ｂ）蛍光偏光分析機を含むことを特徴とするキット。
【請求項１９】
前記抗体結合性プローブは、２０ｋＤａ未満の分子量を有するトランケート型プロテインＧを含むことを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記抗体結合性プローブは、１０ｋＤａ未満の分子量を有するトランケート型プロテインＧを含むことを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記抗体結合性プローブは、ＦＩＴＣまたは５ｎｓから１００ｎｓの蛍光寿命を有する蛍光プローブであることを特徴とする請求項１８から２０のいずれかに記載のキット。
【請求項２２】
１または複数のマルチウェルプレートを含むことを特徴とする請求項１８から２１のいずれかに記載のキット。
【請求項２３】
４ｎｓから１００ｎｓの寿命を有する長寿命蛍光色素およびトランケート型汎用抗体結合性タンパク質のコンジュゲート体であって、前記トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、２０ｋＤａ未満の分子量を有するトランケート型プロテインＧ；および４５ｋＤａ未満の分子量を有するトランケート型プロテインＡから選択されることを特徴とするコンジュゲート体。
【請求項２４】
前記トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、１５ｋＤａ未満の分子量を有するトランケート型プロテインＧであることを特徴とする請求項２３に記載のコンジュゲート体。
【請求項２５】
前記トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、１０ｋＤａ未満の分子量を有するトランケート型プロテインＧであることを特徴とする請求項２３に記載のコンジュゲート体。
【請求項２６】
前記トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、４５ｋＤａ未満の分子量を有するトランケート型プロテインＡであることを特徴とする請求項２３に記載のコンジュゲート体。
【請求項２７】
前記トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、３０ｋＤａ未満の分子量を有するトランケート型プロテインＡであることを特徴とする請求項２３に記載のコンジュゲート体。
【請求項２８】
前記トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、２０ｋＤａ未満の分子量を有するトランケート型プロテインＡであることを特徴とする請求項２３に記載のコンジュゲート体。
【請求項２９】
前記トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、１０ｋＤａ未満の分子量を有するトランケート型プロテインＡであることを特徴とする請求項２３に記載のコンジュゲート体。
【請求項３０】
前記長寿命蛍光色素は、ＦＩＴＣであるか、または５ｎｓから１００ｎｓの寿命を有することを特徴とする請求項２３に記載のコンジュゲート体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
免疫蛍光法は、蛍光顕微鏡を用いる光学顕微鏡法に使用される技法であり、微生物学的試料において主に使用される。この技法は、それらの抗原への抗体の特異性を使用して、蛍光色素を細胞内の特定の生体分子標的へと標的化することによって、試料全体の標的分子の分布の可視化を可能にする。免疫蛍光法は、免疫染色の広範に使用される例であり、フルオロフォアを利用して、抗体の位置を可視化する免疫組織化学的検査の具体例である。蛍光プローブおよびそれらの使用の例は、中国特許出願公開第１０３６４２２６１号明細書、国際公開第２０１３／１５３６８７号、特開２０１２−２２４６４６号公報、米国特許出願公開第２０１２／０２９６０９８号明細書、国際公開第２０１２／１４９１８０号、欧州特許出願公開第２３１２３１７号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１４３３８７号明細書、特開２０１０−０３７５１１号公報、および米国特許第４９３７１９８号明細書に記載されている。（特許文献１〜９参照）。
【０００２】
蛍光偏光免疫測定法は、Nielsenら（Methods、22、71-76、2000）、国際公開第９６／１３７２２号、国際公開第２００９／０７８８７６号、欧州特許出願公開第０９５７３６５号明細書、国際公開第２０１０／１４１２４９号、米国特許出願公開第２００６／０１０５３９７号明細書に記載されており、抗体または抗原の迅速で正確な検出に用いることができる（非特許文献１、および特許文献１０〜１４参照）。このアッセイは、溶液中で小さい分子がより大きい分子よりも速く回転し、回転速度は蛍光偏光によって決定できるという原理に基づく。試料中の抗体を、光プローブで標識されている抗体特異的な抗原とともにインキュベートし場合、蛍光偏光によって試料中の抗体−抗原複合体の存在を検出できる。この技法の問題点は、所与の抗体の検出のために、その抗体に特異的な抗原が必要であることであり、それはアッセイを多くの企業にとって高価なものにする。この技法のさらなる問題点は、試料中の抗体の定量的検出に適していないことである。
【０００３】
特開２００５−３３７８０５号公報は、１つの実施形態において、ヒトＩｇＧの定量的測定のために組換え汎用抗体結合性タンパク質（プロテインＡ）および短寿命蛍光色素（Ａｌｅｘａ６４７）のコンジュゲート体を用いる蛍光偏光を使用する、抗体または抗原の測定法を記載している（特許文献１５参照）。この日本文献は、それぞれ、０．００００５または０．０００５ｍｇ／ｍｌに等しい、１または１０ｎＭの濃度での蛍光標識プロテインＡの使用を記載している。このプロテインＡは、１：１の比で抗体に結合することが予測されており、それらの分子量は、それぞれ５０，０００Ｄａおよび１５０，０００Ｄａであるから、これは、１：３の重量比での結合を意味する。したがって、１ｍｇのプロテインＡは、３ｍｇの抗体を結合して、「飽和」するであろう。「飽和」とは、これ以上の抗体濃度の増加は、さらなる結合が起きないため、偏光値の増加を生じさせないことを意味する。したがって、１および１０ｎＭのプロテインＡは、０．００００１５および０．０００１５ｍｇ／ｍｌの抗体濃度のＩｇＧ濃度で飽和する（すなわち、特異的結合からもはや増加しない）ＦＰシグナルを有するであろう。しかしながら、上記日本特許に示される図面において、明らかにこの「飽和」は生じていない。著しい増加は、この飽和限界のはるかに過ぎてからのみ生じ、ここでの偏光のいかなる変化も、抗体へのプロテインＡの特異的結合によるのではなく、抗体濃度が増加するので粘度の増加などの人為的な効果によるものである。したがって、この文献において示されたデータは、実際には、この発明が機能しないことを示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】中国特許出願公開第１０３６４２２６１号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１３／１５３６８７号
【特許文献３】特開２０１２−２２４６４６号公報
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１２／０２９６０９８号明細書
【特許文献５】国際公開第２０１２／１４９１８０号
【特許文献６】欧州特許出願公開第２３１２３１７号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１１／０１４３３８７号明細書
【特許文献８】特開２０１０−０３７５１１号公報
【特許文献９】米国特許第４９３７１９８号明細書
【特許文献１０】国際公開第９６／１３７２２号
【特許文献１１】国際公開第２００９／０７８８７６号
【特許文献１２】欧州特許出願公開第０９５７３６５号明細書
【特許文献１３】国際公開第２０１０／１４１２４９号
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００６／０１０５３９７号明細書
【特許文献１５】特開２００５−３３７８０５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nielsenら、Methods、22、71-76、2000
【非特許文献２】http://www.piercenet.com/method/antibody-igg-binding-proteins
【非特許文献３】Wiltonら、Proteins: Structure, Function and Bioinformatics、Vol. 71、Issue 3、P1432-1440
【非特許文献４】Dinonら、J.  Mol. Recognit.、2011、Nov-Dec; 24(6)
【非特許文献５】M. Bodanzsky and A. Bodanzsky、The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)
【非特許文献６】J. M. Stewart and J. D. Young、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition、Pierce Chemical Company (Rockford, Illinois) (1984)
【非特許文献７】Wurm. Florian M、「Production of recombinant protein therapeutics in cμｌtivated mammalian cells」、Nature Biotechnology (New York. NY.)、22(2004)、S.1393-1398
【非特許文献８】http://chem.isc.kharkov.com/dep9/research-achievements
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、上記の問題点の少なくとも１つを克服することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、試料中の正確および感度のよい抗体濃度または力価を、蛍光偏光およびプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬ（以下、「汎用抗体結合性タンパク質」）などの汎用免疫グロブリン結合性タンパク質とコンジュゲートされた長寿命蛍光色素を含むトレーサーを使用して決定できるという知見に基づく。これらのタンパク質は、全ての免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子の定常領域に結合し、したがって、任意のＩｇＧ分子の濃度を決定するためのアッセイにおいて使用できる。図６は、短寿命色素と比較した、長寿命色素を使用する効果を実証している。さらに、出願人は、驚くべきことに、タンパク質の一部が除去された（たとえば、１または複数の抗体結合性または非抗体結合性部位が除去された）トランケート型汎用抗体結合性タンパク質の使用が感度のさらなる増加を提供することを発見した。図７は、部分的にトランケートされたタンパク質（ｍｗ  ２９ｋＤａ）と比較した、大きくトランケートされたＩｇＧ結合性タンパク質（ｍｗ  ７ｋＤａ）を使用する効果を実証している。
【０００８】
第１の態様では、本発明は、液体試料中の抗体価を決定するための方法であって、
反応チャンバー中で、液体試料を、蛍光色素（典型的には、長寿命蛍光色素）とコンジュゲートされた汎用抗体結合性タンパク質を含む抗体結合性プローブとともにインキュベートして、反応混合物を提供する工程と、
反応チャンバー中の反応混合物を蛍光偏光に関してアッセイして、励起光と放射光との間の偏光の変化を検出する工程と、
偏光の変化を試料の抗体価と相関させる工程と
を含む方法を提供する。
【０００９】
長寿命蛍光色素を用いる実施形態では、長寿命蛍光色素は、好ましくは、少なくとも４ｎｓの蛍光寿命を有する。好ましくは、長寿命蛍光色素は、少なくとも５ｎｓの蛍光寿命を有する。好ましくは、長寿命蛍光色素は、少なくとも６ｎｓの蛍光寿命を有する。好ましくは、長寿命蛍光色素は、少なくとも７ｎｓの蛍光寿命を有する。好ましくは、長寿命蛍光色素は、少なくとも８ｎｓの蛍光寿命を有する。好ましくは、長寿命蛍光色素は、少なくとも９ｎｓの蛍光寿命を有する。好ましくは、長寿命蛍光色素は、少なくとも１０ｎｓの蛍光寿命を有する。好ましくは、長寿命蛍光色素は、少なくとも１５ｎｓの蛍光寿命を有する。好ましくは、長寿命蛍光色素は、少なくとも２０ｎｓの蛍光寿命を有する。
好ましくは、蛍光色素は、ＦＩＴＣである。好ましくは、蛍光色素は、ＦＩＴＣおよび少なくとも５ｎｓの寿命を有する長寿命蛍光プローブから選択される。
好ましくは、汎用抗体結合性タンパク質は、プロテインＡまたはプロテインＧである。
好ましくは、汎用抗体結合性タンパク質は、トランケート型汎用抗体結合性タンパク質である。
好ましくは、試料は、細胞培養液である。
好ましくは、細胞は、真核生物または原核生物プロデューサー細胞である。
好ましくは、反応チャンバーは、マルチウェルプレートのウェルである。
好ましくは、汎用抗体結合性タンパク質（すなわち、汎用ＩｇＧ結合性タンパク質）は、１５ｋＤａ以下の分子量を有し、蛍光色素は、少なくとも５ｎｓ（理想的には、少なくとも１０ｎｓまたは少なくとも１５ｎｓ）の寿命を有する。より好ましくは、汎用抗体結合性タンパク質（すなわち、汎用ＩｇＧ結合性タンパク質）は、１０ｋＤａ以下の分子量を有し、長寿命蛍光色素は、少なくとも５ｎｓ（理想的には、少なくとも１０ｎｓまたは少なくとも１５ｎｓ）の寿命を有する。理想的には、汎用抗体結合性タンパク質（すなわち、汎用ＩｇＧ結合性タンパク質）は、５ｋＤａ以下の分子量を有し、長寿命蛍光色素は、少なくとも５ｎｓ（理想的には、少なくとも１０ｎｓまたは少なくとも１５ｎｓ）の寿命を有する。
【００１０】
第２の態様では、本発明は、抗体産生細胞（典型的には、ＩｇＧ産生細胞、理想的には、モノクローナルＩｇＧ産生細胞）を含む複数の細胞培養物試料中の抗体価を決定する迅速でハイスループットな方法であって、
マイクロタイタープレートの個々のウェル中で、各細胞培養物試料を、長寿命蛍光色素とコンジュゲートされた汎用抗体結合性タンパク質（すなわち、汎用ＩｇＧ結合性タンパク質）を含む抗体結合性プローブとともにインキュベートして、複数の反応混合物を提供する工程と、
ウェル中の反応混合物を蛍光偏光に関してアッセイして、励起光と放射光との間の偏光の変化を検出する工程と、
偏光の変化を細胞培養物試料の抗体価と相関させる工程と
を含む方法に関する。
【００１１】
１つの実施形態では、複数の細胞培養物試料は、クローンプロデューサー細胞のパネルを含む。したがって、本発明は、クローンプロデューサー細胞のパネルにおける抗体価を決定する迅速でハイスループットな方法にも関する。
【００１２】
典型的には、本方法は、マイクロタイタープレートの複数のウェル上で同時に蛍光偏光アッセイを実施できる蛍光偏光分析機を用いる。
【００１３】
本発明は、本発明の方法を行うのに適しており、（ａ）蛍光色素（好ましくは、長寿命蛍光色素）とコンジュゲートされた汎用抗体結合性タンパク質を含む抗体結合性プローブと、（ｂ）蛍光偏光分析機とを含むキットも提供する。
好ましくは、汎用抗体結合性タンパク質は、トランケート型である。
好ましくは、汎用抗体結合性タンパク質は、ＩｇＧ結合性タンパク質である。
好ましくは、ＩｇＧ結合性タンパク質は、プロテインＧである。
好ましくは、汎用抗体結合性タンパク質は、１５ｋＤａまたは１０ｋＤａ未満の分子量を有するトランケート型プロテインＧを含む。
好ましくは、蛍光色素は、ＦＩＴＣであるまたは少なくとも５ｎｓの蛍光寿命を有する。
本発明は、蛍光色素および汎用抗体結合性タンパク質のコンジュゲート体にも関する。
１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、トランケート型である。
１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、３０ｋＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、２５ｋＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、２０ｋＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、１５ｋＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、１０ｋＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、８ｋＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、５ｋＤａ未満の分子量を有する。
１つの実施形態では、蛍光色素は、長寿命蛍光色素である。１つの実施形態では、蛍光色素は、少なくとも４ｎｓの寿命を有する。１つの実施形態では、蛍光色素は、少なくとも５ｎｓの寿命を有する。１つの実施形態では、蛍光色素は、ＦＩＴＣであるまたは少なくとも４ｎｓの寿命を有する。
【００１４】
典型的には、１〜３０ｍｇ／Ｌ、好ましくは、１〜４０ｍｇ／Ｌの範囲内の、理想的には、１〜５０ｍｇ／Ｌにわたる抗体濃度を正確に決定する能力がある方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＩｇＧの存在下での、ダンシル標識プロテインＡの蛍光偏光の効果を示す図である。
【図２】ＩｇＧの存在下での、ＦＩＴＣ標識プロテインＧの蛍光偏光の効果を示す図である。
【図３】ＣＤ−ＣＨＯ培地で希釈されたＩｇＧの存在下での、ＦＩＴＣ標識プロテインＧの蛍光偏光の効果を示す図である。
【図４】水で希釈されたＩｇＧの存在下での、ＦＩＴＣ標識プロテインＧの蛍光偏光の効果を示す図である。
【図５】水で希釈された非標識プロテインＡの存在下での、ＦＩＴＣ標識プロテインＧの蛍光偏光の効果を示す図である。
【図６】ＣＤ−ＣＨＯで希釈された種々の濃度のＩｇＧの存在下での、３つの異なるトレーサーによる蛍光偏光の効果を示す図である。トレーサーは、（１）ＢＩＯＤＯＰＹ（寿命５ｎｓ）、（２）ＦＩＴＣ（寿命４ｎｓ）および（３）Ａｌｅｘａ６４７（寿命１ｎｓ）に結合しているプロテインＧのコンジュゲート体である。短寿命色素（Ａｌｅｘａ６４７）は、無視できるシグナルを提供する一方、より長い寿命色素は、優れたシグナルを提供する。
【図７】ＣＤ−ＣＨＯで希釈された種々の濃度のＩｇＧの存在下での、２つの異なるトレーサーによる蛍光偏光の効果を示す図である。トレーサーは、（１）プロテインＧ（フルＧ）、および（２）２つのＩｇＧ結合性部位が除去されたトランケート型プロテインＧ（ｇｂｌ）に結合しているＦＩＴＣ（寿命４ｎｓ）のコンジュゲート体である。高度にトランケートされたプロテインＧを含むコンジュゲート体の使用が、最も大きいシグナルをもたらすことが明白である。
【図８】ＣＤ−ＣＨＯで希釈された種々の濃度のＩｇＧの存在下での、異なるトレーサーによる蛍光偏光の効果を示す図である。トレーサーは、スクアラインロタキサン色素に結合しているプロテインＧのコンジュゲート体であり、当該スクアラインロタキサン色素は、４０５ｎｍで吸収し、約９ｎｓの寿命を有する。より長い寿命色素の使用が、優れたシグナルをもたらすことが明白である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、液体試料（典型的には細胞培養物試料、理想的にはモノクローナル抗体産生細胞を含む細胞培養物試料）中の抗体（典型的にはＩｇＧ抗体）の存在を決定する（好ましくは定量的に決定する）方法に関する。本方法は、蛍光偏光分析を用いて、抗体（一般的にはＩｇＧ抗体）と汎用抗体結合性プローブとの間の結合を検出する。抗体結合性プローブは、蛍光プローブ（色素）とコンジュゲートされた汎用抗体結合性タンパク質を含む。ここで、蛍光プローブは典型的にはダンシルなどの長寿命蛍光プローブ（色素）であり、汎用抗体結合性タンパク質は、たとえば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬまたはプロテインＡ／Ｇなどの汎用ＩｇＧ結合性タンパク質を含む。プローブが汎用ＩｇＧ結合性トレーサーを含むため、プローブは、任意のＩｇＧ抗体に対するアッセイにおいて使用することができ、かつ、何らの特定のＩｇＧ抗体にも特異的ではない。使用時に、抗体結合性プローブとともに試料をインキュベートし、各試料中のプローブによって放射光を分析して、蛍光偏光を検出し、検出された蛍光偏光のレベルを、各試料中の抗体価と相関させる。
【００１７】
本明細書では、「抗体」という用語は、免疫グロブリンを意味すると理解されるべきである。免疫グロブリンは、たとえば、ヒト化されたまたはヒト化されていない、モノクローナルまたはポリクローナル形のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥもしくはＩｇＭ免疫グロブリン、またはその断片である。１つの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ分子、好ましくは、モノクローナルＩｇＧ分子である。１つの実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。
【００１８】
本明細書では、「反応チャンバー中の試料を蛍光偏光に関してアッセイすること」という用語は、蛍光色素の励起波長に相当する波長での平面偏光で試料を励起させ、２つの平面の両方において、適切な放射波長で蛍光色素からの放射光の強度を検出することを意味すると理解されるべきである。ここで、前述の２つの平面の一方は、励起平面の面に平行であり、他方は励起光の平面に直交している。１つの実施形態では、励起平面は、垂直または水平であり、放射光は、垂直および水平平面において検出される。放射強度が励起平面（すなわち垂直）から直角平面（すなわち水平）まで移行する程度（すなわち、励起光と放射光との間の偏光の変化）は、蛍光色素の回転の程度の関数である。プローブ標識抗体結合性タンパク質が抗体に結合している場合、複合体は、プローブ標識抗体結合性タンパク質よりもゆっくり回転することになり、放射光の偏光の増加をもたらす。
【００１９】
「偏光の変化を抗体濃度と相関させる」という用語は、蛍光プローブによって放射光の偏光の変化に基づいて、試料の抗体濃度を計算することを意味すると理解されるべきである。抗体濃度を計算するための方法は、抗体の既知の濃度の標準曲線から抗体濃度を推測すること、または解離定数および必要なパラメーターを計算し、第一原理から濃度を推測することを含む。競合的結合アッセイも抗体濃度を計算するために用いることができる。
【００２０】
本明細書では、「迅速でハイスループットな」という用語は、方法を１時間以下、好ましくは、３０分未満で行うことができることを意味すると理解されるべきである。
【００２１】
「抗体価」または「抗体濃度」という用語は、本明細書では、所与の時点で試料中に存在する、抗体、一般的に、組換え抗体、理想的には、組換えモノクローナル抗体の量を表す。典型的には、試料は、細胞培養物試料である。好ましくは、試料は、細胞培養物試料由来の上清である。力価または濃度は、絶対的または相対的用語で定量できる。一般的に、力価または濃度は、培養物の体積あたりの生成物の重量で表わされ、グラム毎リットル（ｇ／Ｌ）が一般的な測定基準である。
【００２２】
「試料」という用語は、本明細書では、液体試料、たとえば、細胞培養物試料または細胞培養物試料由来の上清を意味すると理解されるべきである。好ましくは、細胞は、プロデューサー細胞（すなわち、組換えタンパク質を産生するように遺伝的に改変された細胞）、たとえば、原核生物プロデューサー細胞（すなわち、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ））または真核生物プロデューサー細胞（すなわち、ＣＨＯ細胞）である。原核生物および真核生物プロデューサー細胞のいずれの例も、当業者に既知であろう。また、試料は、血液または血液派生物（たとえば、血漿または血清）であってもよい。好ましくは、細胞は、抗体濃度を決定する前に試料から除去されている。
【００２３】
「汎用抗体結合性タンパク質」という用語は、抗体（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体）の定常領域に結合するアプタマーのような、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、または非タンパク質リガンドを意味すると理解されるべきである。好ましい実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、典型的にはＩｇＧ抗体に特異的である汎用ＩｇＧ結合性タンパク質、またはＩｇＧ結合性変異体もしくはその断片である。汎用ＩｇＧ結合性タンパク質の例は、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、およびプロテインＬ、またはその抗体結合性変異体もしくはその断片を含む（http://www.piercenet.com/method/antibody-igg-binding-proteins）（非特許文献２参照）。１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、トランケート型汎用抗体結合性タンパク質、好ましくは、複数の相同な抗体結合性ドメインを通常含み、修飾されて１個または複数個の抗体結合性ドメインが除去されているタンパク質である。好ましくは、抗体結合性タンパク質は、プロテインＧである。好ましくは、抗体結合性タンパク質は、トランケート型プロテインＧである。１つの実施形態では、タンパク質は、Sigma Aldrich(Paisley,UK)から得られるトランケート型プロテインＧである。１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、３０ｋＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、２５ｋＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、２０ｋＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、１５ｋＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、１０ｋＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、８ｋＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、５ｋＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、アプタマー（すなわちＤＮＡアプタマー）である。１つの実施形態では、汎用抗体結合性タンパク質は、抗体の断片、たとえば、単鎖可変断片である。
【００２４】
本明細書では、「トランケート型汎用抗体結合性タンパク質」という用語は、修飾されてタンパク質の一部が除去されている汎用抗体結合性タンパク質を意味すると理解されるべきである。汎用抗体結合性タンパク質のＭＷを減少させることにより、蛍光偏光アッセイにおけるコンジュゲート体のシグナルが増加することが見出された。１つの実施形態では、抗体結合性領域の少なくとも１つが除去されている。１つの実施形態では、抗体結合に関与しないタンパク質の一部が除去されている。典型的には、この用語は、汎用抗体結合性タンパク質のトランケート型タンパク質および断片を含む。１つの実施形態では、断片は、少なくとも１つの抗体結合性ドメインを含む（たとえば、実施例７におけるｇｂｌ）。トランケート型プロテインＧの場合、３つの抗体結合性領域の１つまたは２つが除去されていてもよい。トランケート型プロテインＡの場合、４つの抗体結合性領域の１つ、２つまたは３つが除去されていてもよい。トランケート型タンパク質の例は、約２０ｋＤａの分子量を有し、修飾されて少なくとも１つのＩｇＧ結合性ドメインが除去されている、Sigma、AbeamおよびMolecular Probes製の組換えプロテインＧである。別の例は、プロテインＧの断片であるペプチドｇｂｌ（以下の実施例７を参照）、および分子量７ｋＤａを有するＨｉｓ−ｔａｇである。トランケート型プロテインＧの断片は、Wiltonら、Proteins: Structure, Function and Bioinformatics、Vol. 71、Issue 3、P1432-1440に報告されている（非特許文献３参照）。１つの実施形態では、トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、３０ｋＤａ未満のＭＷを有するトランケート型プロテインＧである。１つの実施形態では、トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、２５ｋＤａ未満のＭＷを有するトランケート型プロテインＧである。１つの実施形態では、トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、２０ｋＤａ未満のＭＷを有するトランケート型プロテインＧである。１つの実施形態では、トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、１５ｋＤａ未満のＭＷを有するトランケート型プロテインＧである。１つの実施形態では、トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、１０ｋＤａ未満のＭＷを有するトランケート型プロテインＧである。１つの実施形態では、トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、８ｋＤａ未満のＭＷを有するトランケート型プロテインＧである。１つの実施形態では、トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、５５ｋＤａ未満のＭＷを有するトランケート型プロテインＡである。１つの実施形態では、トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、５０ｋＤａ未満のＭＷを有するトランケート型プロテインＡである。１つの実施形態では、トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、４０ｋＤａ未満のＭＷを有するトランケート型プロテインＡである。１つの実施形態では、トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、３０ｋＤａ未満のＭＷを有するトランケート型プロテインＡである。１つの実施形態では、トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、２０ｋＤａ未満のＭＷを有するトランケート型プロテインＡである。１つの実施形態では、トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、１５ｋＤａ未満のＭＷを有するト���ンケート型プロテインＡである。１つの実施形態では、トランケート型汎用抗体結合性タンパク質は、１０ｋＤａ未満のＭＷを有するトランケート型プロテインＡである。
【００２５】
「変異体」という用語は、汎用抗体結合性タンパク質の模倣物（すなわち、ペプチド模倣物）および化学的誘導体（すなわち、汎用抗体結合性タンパク質の１個または複数個の残基が官能性側基の反応によって化学的に誘導体化されている）を含むことも意図する。天然のアミノ酸残基がアミノ酸類似体で置換されている汎用抗体結合性タンパク質も変異体という用語内に含まれる。汎用抗体結合性タンパク質変異体の例は、Dinonら、J.  Mol. Recognit.、2011、Nov-Dec; 24(6)に報告されている（非特許文献４参照）。
【００２６】
本発明のタンパク質およびポリペプチド（その変異体および断片を含む）、および本発明における使用のためのタンパク質およびポリペプチド（その変異体および断片を含む）は、化学合成によってまたは核酸からの発現によって全体的にまたは部分的に産出することができる。本発明のタンパク質およびペプチド、および本発明における使用のためのタンパク質およびペプチドは、当技術分野で既知の十分に確立された標準的な液相ペプチド合成方法、または、好ましくは固相ペプチド合成方法に従って容易に調製できる（たとえば、J. M. Stewart and J. D. Young、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition、Pierce Chemical Company (Rockford, Illinois) (1984)、M. Bodanzsky and A. Bodanzsky、The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)参照）（非特許文献６および５参照）。
【００２７】
本明細書では、「蛍光プローブ」または「蛍光色素」または「フルオロフォア」という用語は、光励起時に光を再放射することができる蛍光性化学物質を意味すると理解されるべきである。蛍光プローブの例は、当業者に既知であり、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＹＦＰおよびＲＦＰなど）および非タンパク質有機フルオロフォア（テトラピロール誘導体、ピレン誘導体、キサンテン誘導体、およびシアニン誘導体を含む）を含む。
【００２８】
本明細書では、「長寿命蛍光色素」という用語は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０ナノ秒の蛍光寿命を有する蛍光色素を意味すると理解されるべきである。好ましくは、蛍光色素は、少なくとも４ｎｓの蛍光寿命を有する。好ましくは、蛍光色素は、少なくとも５ｎｓの蛍光寿命を有する。好ましくは、蛍光色素は、５〜１００ｎｓ、５〜５０ｎｓ、５〜４０ｎｓ、５〜３０ｎｓまたは５〜２５ｎｓ、典型的には、１０〜１００ｎｓ、１０〜５０ｎｓ、１０〜４０ｎｓ、１０〜３０ｎｓまたは５〜２５ｎｓ、理想的には、１５〜１００ｎｓ、１５〜５０ｎｓ、１５〜４０ｎｓ、１５〜３０ｎｓまたは１５〜２５ｎｓの蛍光寿命を有する。好ましくは、蛍光色素は、４〜１００ｎｓ、４〜５０ｎｓ、４〜４０ｎｓ、４〜３０ｎｓまたは４〜２５ｎｓ、典型的には、１０〜１００ｎｓ、１０〜５０ｎｓ、１０〜４０ｎｓ、１０〜３０ｎｓまたは５〜２５ｎｓ、理想的には、１５〜１００ｎｓ、１５〜５０ｎｓ、１５〜４０ｎｓ、１５〜３０ｎｓまたは１５〜２５ｎｓの蛍光寿命を有する。長寿命蛍光色素を含む蛍光色素の例を、以下の表に提供する。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
【表２】
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【００３１】
「プロデューサー細胞」という用語は、特定の望ましいタンパク質を産出するために用いられる細胞を表す。一般的に、細胞は、一般的に特定のプロモーターの制御下にある望ましいタンパク質をコードする導入遺伝子の１つまたは複数のコピーを含むように遺伝的に改変されている。したがって、特定のタンパク質は、通常、組換えタンパク質である。プロデューサー細胞は、当技術分野で既知であり、たとえば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を含む。理想的には、プロデューサー細胞は、ＣＨＯ細胞である。典型的には、プロデューサー細胞は、モノクローナル抗体プロデューサー細胞である。
【００３２】
本明細書では、「ハイスループットな」という用語は、多数の試料、たとえば、少なくとも２０、５０、９０、１２０、すなわち２０〜５００の試料を同時にアッセイできる方法を意味すると理解されるべきである。
【００３３】
本明細書では、「マルチウェルプレート」という用語は、多数のウェル、たとえば、少なくとも１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または３８４ウェルを有するプレートを表す。１つの実施形態では、プレートは、固体の、非柔軟性のプレートとすることができる、あるいは、柔軟性材料のロールとして提供することができる。
【００３４】
本明細書では、「クローンプロデューサー細胞のパネル」という用語は、２から５００以上のクローンプロデューサー細胞集団を含む、単一の細胞株由来のクローンプロデューサー細胞集団のパネルを意味すると理解されるべきである。クローンプロデューサー細胞のパネルを産出するための方法は、当業者に既知であり、Wurm. Florian M、「Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells」、Nature Biotechnology (New York. NY.)、22(2004)、S.1393-1398に報告されている（非特許文献７参照）。典型的には、クローンプロデューサー細胞集団のパネルは、１０〜５００、２０〜５００、３０〜５００、４０〜５００、５０〜５００、６０〜５００、７０〜５００、８０〜５００、９０〜５００または１００〜５００のクローン細胞集団を含む。典型的には、クローンプロデューサー細胞集団のパネルは、１００〜５００、１００〜４００、１５０〜４００、１５０〜３５０のクローン細胞集団を含む。
【００３５】
本明細書では、「蛍光偏光分析機」という用語は、試料を受容し、蛍光色素の励起波長に相当する波長での平面偏光で試料を励起させ、放射平面に１つが平行および１つが直角である２つの平面において、適切な放射波長で蛍光色素によって放射される光強度を検出し、典型的には、励起光と放射光との間の偏光の変化を決定する能力がある機械を意味すると理解されるべきである。典型的には、機械は、典型的にはハイスループットに、マルチウェルプレートに含有された多数の試料を受容し、読む能力がある。蛍光偏光分析機の例は、ＢＭＧ  ＰｈｅｒａＳｔａｒ、ＢＭＧ  ＣｌａｒｉｏＳｔａｒ、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５００を含む。
【００３６】
実験
蛍光標識汎用ＩｇＧ結合性タンパク質を使用したＩｇＧの定量化を評価するための実験方法
ダンシルプロテインＡを黄色ブドウ球菌からの組換えプロテインＡ（Sigma, UK）への塩化ダンシル（５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−ｌ−スルホニルクロライド）（Sigma, UK）の共有結合によって作製した。
ＦＩＴＣ標識トランケート型プロテインＧをSigma, UKから得た。
免疫グロブリンＧ（ヒト、活性）をAbeam(Cambridge, UK)から得た。
蛍光偏光測定をＢＭＧ  ＣｌａｒｉｏＳｔａｒ（Bucks, UK）を使用して行った。読みを黒色底部表面積１／２「ノンバインディングサーフェイス」９６ウェルプレート（Corning, UK、製品番号３６８６）において行った。陰性対照の標的ｍＰ値は、７０ｍＰであった。ブランクを減算した蛍光に基づいて、ｍＰ値を計算した。
【００３７】
ダンシル標識トランケート型プロテインＡコンジュゲート体の評価
ここで、水で希釈された０．０３ｍｇ／ｍＬのダンシルプロテインＡ（２５μｌ）を、水で希釈された完全長のヒト活性ＩｇＧ１（２５μｌ）と混合した。試料を混合し、直ちに読んだ。図１は、ＩｇＧの存在下でのダンシル標識プロテインＡの蛍光偏光の効果を示す。この技法を使用して、この範囲にわたってＩｇＧを正確に定量化することが可能であることが明白である。ＩｇＧの濃度の変化とのｍＰの明らかな線量応答変化がある。
【００３８】
ＦＩＴＣトランケート型プロテインＧコンジュゲート体の評価
この技法を市販のＦＩＴＣコンジュゲートトランケート型プロテインＧ（Sigmaなど）を使用して繰り返した。ここで、水で希釈された０．０３ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣプロテインＧ（２５μｌ）を、様々な濃度に水で希釈された完全長のヒト活性ＩｇＧｌ（Abeamなど）（２５μｌ）と混合した。
【００３９】
図２および４は、ＩｇＧの存在下でのＦＩＴＣ標識プロテインＧの蛍光偏光の効果を示す。観察された範囲にわたってＩｇＧを正確に定量するために、この手法を使用できることが明白である。分解能は、明らかに高く、０．０１ｇ／Ｌの差違を容易に観察できる。これは、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）などのより短い寿命のフルオロフォアを使用して、この手法を使用できることを実証している。
【００４０】
短寿命フルオロフォアと長寿命フルオロフォアの比較
この技法を３つのプローブ、すなわち、（１）ＦＩＴＣ−トランケート型プロテインＧ、（２）ＢＩＯＤＯＰＹ−トランケート型プロテインＧおよび（３）Ａｌｅｘａ６４７−トランケート型プロテインＧを使用して繰り返した。ここで、プロテインＧ結合性緩衝液（Sigma, UK）で希釈された０．０２ｍｇ／ｍＬのコンジュゲート体（３０μｌ）を、様々な濃度にＣＤ−ＣＨＯで希釈された完全長のヒト活性ＩｇＧ１（Abeamなど）（３０μｌ）と混合した。図６は、ＩｇＧの存在下での３つのコンジュゲート体の蛍光偏光の効果を示す。観察された範囲にわたってＩｇＧを正確に定量するために、この手法を使用できることが明白である。より長い寿命のプローブ（ＦＩＴＣ＝４ｎｓ、ＢＩＯＤＯＰＹ＝５ｎｓ）を有するコンジュゲート体で達成されたシグナルが、短寿命プローブ（Ａｌｅｘａ６４７＝１ｎｓ）で達成されたものよりも著しく優れていたことが明白である。
トランケート型プロテインＧとプロテインＧ断片の比較
【００４１】
この技法を２つのプローブ、すなわち、（１）トランケート型プロテインＧとコンジュゲートされたＦＩＴＣおよび（２）単一のＩｇＧ結合性ドメイン（ｇｂｌ）を含有するプロテインＧの断片とコンジュゲートされたＦＩＴＣを使用して繰り返した。ここで、プロテインＧ結合性緩衝液（Sigma, UK）で希釈された０．０２ｍｇ／ｍＬの各コンジュゲート体（３０μｌ）を、２様々な濃度にＣＤ−ＣＨＯで希釈された完全長のヒト活性ＩｇＧ１（Abeamなど）（２５μｌ）と混合した。図７は、ＩｇＧの存在下での２つのコンジュゲート体の蛍光偏光の効果を示す。プロテインＧ断片（＜１０ｋＤａ）で達成されたシグナルが、トランケート型プロテインＧ（２０ｋＤａ）で達成されたものよりも著しく優れていることが明白である。
【００４２】
スクアラインロタキサン色素−トランケート型プロテインＧコンジュゲート体の評価
この技法をスクアラインロタキサンコンジュゲートトランケート型プロテインＧを使用して繰り返した。ここで、プロテインＧ結合性緩衝液（Sigma, UK）で希釈された０．０２ｍｇ／ｍＬのスクアラインロタキサンプロテインＧ（３０μｌ）を、様々な濃度にＣＤ−ＣＨＯ培地で希釈された完全長のヒト活性ＩｇＧ１（Abeamなど）（３０μｌ）と混合した。図７は、ＩｇＧの存在下でのコンジュゲート体の蛍光偏光の効果を示す。観察された範囲にわたるＩｇＧを正確に定量するために、この手法を使用できることが明白である。スクアラインロタキサン色素は、http://chem.isc.kharkov.com/dep9/research-achievementsに記載されている（非特許文献８参照）。
【００４３】
哺乳動物培地中のＩｇＧを定量化するための蛍光偏光手法の評価
培地で希釈されたＩｇＧ試料の効果を評価した。ここで、水で希釈された０．０３ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣプロテインＧ（２５μｌ）を、ＣＤ−ＣＨＯ（Life Technologies, Paisley, UK）で希釈された完全長のヒト活性ＩｇＧ１（Abeamなど）（２５μｌ）の様々な希釈物と混合した。図３は、ＣＤ−ＣＨＯ培地で希釈されたＩｇＧの存在下でのＦＩＴＣ標識プロテインＧの蛍光偏光の効果を示す。
【００４４】
非標的タンパク質の存在下でのｍＰの陰性対照の評価
陰性対照として、ＦＩＴＣプロテインＧをＩｇＧ濃度と比較可能な濃度の様々な濃度の非標識プロテインＡに加えた。図５は、水で希釈された非標識プロテインＡの存在下でのＦＩＴＣ標識プロテインＧの蛍光偏光の効果を示す。ここで、非標的タンパク質が使用された場合、偏光の体系的な変化がないことが明らかである。
【００４５】
上記の結果は、本発明の方法を、ＩｇＧ抗体の迅速、安価かつハイスループットな定量化のために使用できることを明白に実証している。
【００４６】
本発明は、本発明の精神から逸脱することなく構成および詳細において変動することができ、上記の実施形態に限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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