(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
位置の順で、５’−隣接領域、非ガイド領域、ループ領域、ガイド領域および３’−隣接領域からなる人工一次ｍｉＲＮＡ転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸であって、前記ガイド領域は、配列番号３７（ｍｉＨＤｓｓ３）または配列番号７（ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａ）からなり、前記非ガイド領域は、前記ガイド領域に対して少なくとも８０％相補的である、核酸。
【請求項２】
前記５’−隣接領域が、前記非ガイド領域と接して連結され、前記ループ領域が、前記非ガイド領域と前記ガイド領域との間に配置され、前記ガイド領域が、前記３’−隣接領域と接して連結される、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記５’−隣接領域が、前記非ガイド領域と接して連結された５’−連結配列を含む、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】
前記５’−連結配列が、５〜８ヌクレオチドからなる、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記５’−連結配列が、７ヌクレオチドからなる、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
前記５’−連結配列が、ＧＵＧＡＧＣＧＡ（配列番号１３）またはＧＵＧＡＧＣＧＣ（配列番号１４）をコードする、請求項３に記載の核酸。
【請求項７】
前記５’−隣接領域が、前記５’−連結配列の上流に配置された５’−バルジ配列をさらに含む、請求項３から６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８】
前記５’−バルジ配列が、クローニング部位を含む、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
前記５’−バルジ配列が、約１〜１０ヌクレオチドからなる、請求項７に記載の核酸。
【請求項１０】
前記５’−バルジ配列が、ＵＡＡＡＣＵＣＧＡ（配列番号１５）をコードする、請求項７に記載の核酸。
【請求項１１】
前記５’−隣接領域が、前記５’−バルジ配列の上流に配置された５’−スペーサー配列をさらに含む、請求項７から１０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１２】
前記５’−スペーサー配列が、１０〜１２ヌクレオチドからなる、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
前記５’−スペーサー配列が、ＵＧＧＵＡＣＣＧＵＵ（配列番号１６）をコードする、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１４】
前記５’−隣接領域が、前記５’−スペーサー配列の上流に配置された５’−上流配列をさらに含む、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１５】
前記５’−上流配列が、長さが約３０〜２０００ヌクレオチドである、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
前記３’−隣接領域が、前記ガイド領域と接して連結された３’−連結配列を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１７】
前記３’−連結配列が、５〜８ヌクレオチドからなる、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１８】
前記３’−連結配列が、前記５’−連結配列に対して少なくとも約８５％相補的である、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１９】
前記３’−連結配列が、ＣＧＣＣＵＡＣ（配列番号１８）をコードする、請求項１６に記載の核酸。
【請求項２０】
前記３’−隣接領域が、前記３’−連結配列の下流に配置された３’−バルジ配列をさらに含む、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２１】
前記３’−バルジ配列が、クローニング部位を含む、請求項２０に記載の核酸。
【請求項２２】
前記３’−バルジ配列が、約１〜１０ヌクレオチドからなる、請求項２０に記載の核酸。
【請求項２３】
３’−バルジ配列が、ＵＡＧ（配列番号３０）をコードする、請求項２０に記載の核酸。
【請求項２４】
前記５’−バルジ配列が、前記バルジ配列の各末端の１ヌクレオチドのみにおいて、前記３’−バルジ配列に対して相補的である、請求項２０に記載の核酸。
【請求項２５】
前記３’−隣接領域が、前記３’−バルジ配列の下流に配置された３’−スペーサー配列をさらに含む、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２６】
前記３’−スペーサー配列が、１０〜１２ヌクレオチドからなる、請求項２５に記載の核酸。
【請求項２７】
前記３’−スペーサー配列が、ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡ（配列番号１９）をコードする、請求項２５に記載の核酸。
【請求項２８】
前記３’−スペーサー配列が、前記５’−スペーサー配列に対して少なくとも約７０％相補的である、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２９】
前記３’−隣接領域が、前記３’−スペーサー配列の下流に配置された３’−下流配列をさらに含む、請求項２５から２８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項３０】
前記５’−上流配列が、前記３’−下流配列と顕著には対合しない、請求項２９に記載の核酸。
【請求項３１】
前記３’−下流配列は、長さが約３０〜２０００ヌクレオチドである、請求項２９または３０に記載の核酸。
【請求項３２】
前記ループ領域は、長さが１５〜２５ヌクレオチドである、請求項１から３１のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項３３】
請求項１から３２のいずれか一項に記載の核酸によってコードされるＲＮＡ。
【請求項３４】
請求項１から３２のいずれか一項に記載の単離された核酸をコードする発現カセット。
【請求項３５】
前記核酸と接して連結されたプロモーターをさらに含む、請求項３４に記載の発現カセット。
【請求項３６】
前記プロモーターが、ｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターである、請求項３５に記載の発現カセット。
【請求項３７】
前記ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、Ｕ６プロモーターである、請求項３６に記載の発現カセット。
【請求項３８】
前記ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、マウスＵ６プロモーターである、請求項３６に記載の発現カセット。
【請求項３９】
前記プロモーターが、ｐｏｌＩＩプロモーターである、請求項３６に記載の発現カセット。
【請求項４０】
前記プロモーターが、組織特異的プロモーターである、請求項３５に記載の発現カセット。
【請求項４１】
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項３５に記載の発現カセット。
【請求項４２】
マーカー遺伝子をさらに含む、請求項３５から４１のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項４３】
請求項３４から４２のいずれか一項に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項４４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４３に記載のベクター。
【請求項４５】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６および／またはＡＡＶ９である、請求項４４に記載のベクター。
【請求項４６】
前記ＡＡＶがＡＡＶ２である、請求項４５に記載のベクター。
【請求項４７】
前記ＡＡＶがＡＡＶ２／１である、請求項４５に記載のベクター。
【請求項４８】
位置の順で、５’−隣接領域、非ガイド領域、ループ領域、ガイド領域および３’−隣接領域からなる人工一次ｍｉＲＮＡ転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸を含む、長さが８０〜４０００ヌクレオチドの間の単離された核酸であって、前記ガイド領域は、配列番号３７（ｍｉＨＤｓｓ３）または配列番号７（ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａ）からなり、前記非ガイド領域は、前記ガイド領域に対して少なくとも８０％相補的である、単離された核酸。
【請求項４９】
Ｐｒｉ−ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕ（配列番号８）、Ｐｒｉ−ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａ（配列番号９）、Ｐｒｅ−ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕ（配列番号１０）またはＰｒｅ−ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａ（配列番号１１）からなる、単離された核酸。
【請求項５０】
核酸のガイド領域および核酸の非ガイド領域を含む、単離されたｍｉＲＮＡ二重鎖であって、前記ガイド領域は、配列番号３７（ｍｉＨＤｓｓ３）または配列番号７（ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａ）からなり、前記非ガイド領域は、前記ガイド領域に対して少なくとも８０％相補的である、単離されたｍｉＲＮＡ二重鎖。
【請求項５１】
前記二重鎖は、長さが１９〜３０塩基対の間にある、請求項５０に記載の単離されたｍｉＲＮＡ二重鎖。
【請求項５２】
請求項１から３３もしくは４８から４９のいずれか一項に記載の核酸、請求項３４から４２のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項４３から４７のいずれか一項に記載のベクター、または請求項５０から５１のいずれか一項に記載の二重鎖を含む非ヒト動物。
【請求項５３】
ＲＮＡ干渉を誘導するための組成物であって、請求項１から３３もしくは４８から４９のいずれか一項に記載の核酸、請求項３４から４２のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項４３から４７のいずれか一項に記載のベクター、または請求項５０から５１のいずれか一項に記載の二重鎖の有効量を含む、組成物。
【請求項５４】
治療における使用のための組成物であって、請求項１から３３もしくは４８から４９のいずれか一項に記載の核酸、請求項３４から４２のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項４３から４７のいずれか一項に記載のベクター、または請求項５０から５１のいずれか一項に記載の二重鎖を含む、組成物。
【請求項５５】
ハンチントン病を処置するための組成物であって、請求項１から３３もしくは４８から４９のいずれか一項に記載の核酸、請求項３４から４２のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項４３から４７のいずれか一項に記載のベクター、または請求項５０から５１のいずれか一項に記載の二重鎖を含む、組成物。
【請求項５６】
３’末端においてオーバーハングを有する請求項１に記載の核酸を含む、単離されたＲＮＡｉ分子。
【請求項５７】
前記オーバーハングが、２〜５ヌクレオチドのリピートである、請求項５６に記載の単離されたＲＮＡｉ分子。
【請求項５８】
前記核酸が、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列をコードする、請求項５６または５７に記載の単離されたＲＮＡｉ分子。
【請求項５９】
前記核酸が、人工ｍｉＲＮＡ配列をコードする、請求項５６または５７に記載の単離されたＲＮＡｉ分子。
【請求項６０】
前記ＲＮＡｉ分子が、減少したレベルのオフターゲット毒性を生じる、請求項５６から５９のいずれか一項に記載の単離されたＲＮＡｉ分子。
【請求項６１】
前記オーバーハングが、ＵＵ（配列番号２４）、ＵＵＵ（配列番号２５）またはＵＵＵＵ（配列番号２６）配列である、請求項５６に記載の単離されたＲＮＡｉ分子。
【請求項６２】
前記オーバーハングが、ＣＵＵ（配列番号２７）、ＣＵＵＵ（配列番号２８）またはＣＵＵＵＵ（配列番号２９）配列である、請求項５６に記載の単離されたＲＮＡｉ分子。
【請求項６３】
低毒性ＲＮＡ干渉を誘導するための組成物であって、請求項１から３３もしくは４８から４９のいずれか一項に記載の核酸、請求項３４から４２のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項４３から４７のいずれか一項に記載のベクター、または請求項５０から５１のいずれか一項に記載の二重鎖を含む、組成物。
【請求項６４】
前記発現カセットが、ｐｏｌＩＩプロモーターを含む、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
低毒性ＲＮＡ干渉を誘導するための組成物であって、ｍｉＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結したｐｏｌＩＩプロモーターをコードする請求項３５に記載の発現カセットを含む、組成物。
【請求項６６】
前記ｍｉＲＮＡが、２または３ヌクレオチドの５’または３’−オーバーハングを含む、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
前記ｍｉＲＮＡが、２ヌクレオチドの３’−オーバーハングを含む、請求項６５または６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ｍｉＲＮＡが人工ｍｉＲＮＡである、請求項６５から６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６９】
ハンチントン病を有する被験体を処置するための組成物であって、請求項１から３３もしくは４８から４９のいずれか一項に記載の核酸、請求項３４から４２のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項４３から４７のいずれか一項に記載のベクター、または請求項５０から５１のいずれか一項に記載の二重鎖を含む、組成物。
【請求項７０】
前記組成物が、直接または血流を介して前記被験体の脳に投与されることを特徴とする、請求項５３または６３から６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７１】
前記組成物が、頭蓋内投与されることを特徴とする、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記組成物が、前記被験体の大槽、線条体、皮質もしくは脳室、くも膜下腔および／または髄腔内に投与されることを特徴とする、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７３】
前記被験体がヒトである、請求項７０から７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７４】
前記組成物が、ＣＮＳ中の１〜５つの場所において注射されることを特徴とする、請求項７０から７３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７５】
前記組成物が、脳中の単一の場所において注射されることを特徴とする、請求項７０から７３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７６】
ハンチントン病を処置するための組成物であって、請求項１から３３もしくは４８から４９のいずれか一項に記載の核酸、請求項３４から４２のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項４３から４７のいずれか一項に記載のベクター、または請求項５０から５１のいずれか一項に記載の二重鎖を含み、前記核酸、発現カセット、ベクターまたは二重鎖が細胞と接触させられることを特徴とし、前記細胞が、上衣、軟膜、内皮、脳室および／または髄膜細胞である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１４年５月２０日に出願した米国仮特許出願第６２／０００，８９５号に対する優先権を主張する。この出願の全体は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府の支援
本発明は、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって授与された１１０３３、ＤＫ０５４７５９、ＮＳ０５０２１０およびＮＳ０６８０９９の下で、政府の支援によってなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ＲＮＡｉは、機能的低分子阻害性ＲＮＡ（約２１ｎｔ）へとプロセシングされる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）による、配列特異的遺伝子サイレンシングを指示する。事実上、遺伝子発現の調節のためのＲＮＡｉは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）として公知の低分子ＲＮＡを介して主に生じる。成熟マイクロＲＮＡ（約１９〜２５ヌクレオチド）は、ステム−ループ領域を含むより大きい一次ｍｉＲＮＡ転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）からプロセシングされる。リボヌクレアーゼ、ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒによって触媒される一連のプロセシング事象を介して、ｍｉＲＮＡの二重鎖領域が遊離され、次いで、単一の鎖（アンチセンス「ガイド」鎖）が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に取り込まれ、そうして、標的転写産物と塩基対合し、それをサイレンシングすることが可能な機能的複合体を生成する。標的抑圧の様式は、相補性の程度に主に依存する；転写産物切断は、典型的には、高い程度の塩基対合を必要とするが、翻訳抑圧およびｍＲＮＡ不安定化は、低分子ＲＮＡが標的転写産物に不完全に結合する（ほとんどの場合３’ＵＴＲにおいて）場合に生じる。後者については実際、相補性の短いストレッチ（わずかに６ｂｐ）が、遺伝子サイレンシングを引き起こすのに十分であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、限定されたオフターゲット毒性を有する治療的ｓｉＲＮＡを発現する、単離されたｍｉＲＮＡシャトルベクターを提供する。ある特定の実施形態では、本発明のｍｉＲＮＡシャトルベクターとの関連でオフターゲット毒性を示すｓｉＲＮＡを埋め込むことは、ｓｉＲＮＡのオフターゲット毒性を限定する。ある特定の実施形態では、このｍｉＲＮＡシャトルベクターは、脳において、限定されたオフターゲット毒性を有する治療的ｓｉＲＮＡを発現させる。ある特定の実施形態では、このｍｉＲＮＡシャトルベクターは、線条体において、限定されたオフターゲット毒性を有する治療的ｓｉＲＮＡを発現させる。ある特定の実施形態では、このｍｉＲＮＡシャトルベクターは、大脳において、限定されたオフターゲット毒性を有する治療的ｓｉＲＮＡを発現させる。
【０００５】
本発明は、位置の順で、５’−隣接領域、非ガイド（パッセンジャー）領域、ループ領域、ガイド領域および３’−隣接領域を含む一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）をコードする単離された核酸を提供し、このガイド領域は、配列番号３７（ｍｉＨＤｓｓ３）、配列番号６（ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕ）または配列番号７（ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａ）からなり、この非ガイド領域は、ガイド領域に対して少なくとも８０％相補的である。ある特定の実施形態では、この非ガイド領域は、ガイド領域に対して、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相補的である。ある特定の実施形態では、この５’−隣接領域は、非ガイド領域と接して連結され（contiguously  linked）、ループ領域は、非ガイド領域とガイド領域との間に配置され、ガイド領域は、３’−隣接領域と接して連結される。本明細書で使用する場合、用語「ｓｉＲＮＡガイド領域」は、標的配列に対して相補的なＲＮＡの一本鎖配列である。本明細書で使用する場合、用語「ｓｉＲＮＡ非ガイド領域」は、「ｓｉＲＮＡガイド領域」に対して相補的なＲＮＡの一本鎖配列である。したがって、適切な条件下で、ｓｉＲＮＡガイド領域およびｓｉＲＮＡ非ガイド領域は、会合して、ＲＮＡ二重鎖を形成する。本明細書で使用する場合、全ての核酸配列は、通例により、５’から３’の方向で列挙される。
【０００６】
ある特定の実施形態では、この５’−隣接領域は、非ガイド領域と接して連結された５’−連結配列を含む。本明細書で使用する場合、用語「連結部位」（joining  site）または「連結配列」（joining  sequence）は、２つの他の核酸配列を結びつける６０ヌクレオチド未満の短い核酸配列である。ある特定の実施形態では、この連結部位は、４と５０との間の、端数を含めた任意の整数の長さのものである。ある特定の実施形態では、この５’−連結配列は、５〜８ヌクレオチドからなる（例えば、６ヌクレオチドからなる）。ある特定の実施形態では、この５’−連結配列は、ＧＵＧＡＧＣＧＡ（配列番号１３）またはＧＵＧＡＧＣＧＣ（配列番号１４）をコードする。
【０００７】
ある特定の実施形態では、この５’−隣接領域は、５’−連結配列の上流に配置された５’−バルジ配列をさらに含む。本明細書で使用する場合、用語「バルジ配列」は、二重鎖中のそれと向かい合った核酸に対して非相補的である核酸の領域である。例えば、二重鎖は、相補的核酸の領域、次いで非相補的核酸の領域、その後相補的核酸の第２の領域を含む。相補的核酸の領域は、互いに結合するが、中心の非相補的領域は結合せず、それによって「バルジ」を形成する。ある特定の実施形態では、２つの相補的領域間に配置された核酸の２つの鎖は、異なる長さのものであり、それによって「バルジ」を形成する。ある特定の実施形態では、この５’−バルジ配列は、２〜１５ヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、この５’−バルジ配列は、約１〜１０ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態では、この５’−バルジ配列は、ＵＡＡＡＣＵＣＧＡ（配列番号１５）をコードする。ある特定の実施形態では、この５’−バルジ配列は、３’−バルジ配列に対して０〜５０％の相補性を有する。
【０００８】
ある特定の実施形態では、この５’−隣接領域は、５’−バルジ配列の上流に配置された５’−スペーサー配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、この５’−スペーサー配列は、９〜１２ヌクレオチド、例えば、１０〜１２ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態では、この５’−スペーサー配列は、３’−スペーサー配列に対して６０〜１００％の相補性を有する。ある特定の実施形態では、この５’−バルジ配列は、クローニング部位、例えば、ＸｈｏＩ部位を含む。ある特定の実施形態では、この５’−スペーサー配列は、ＵＧＧＵＡＣＣＧＵＵ（配列番号１６）である。
【０００９】
ある特定の実施形態では、この５’−隣接領域は、５’−スペーサー配列の上流に配置された５’−上流配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、この５’−上流配列は、長さが約５〜５０００ヌクレオチド、例えば、長さが３０〜２０００ヌクレオチドである。
【００１０】
ある特定の実施形態では、この３’−隣接領域は、ガイド領域と接して連結された３’−連結配列を含む。ある特定の実施形態では、この連結部位は、４と５０との間の、端数を含めた任意の整数の長さのものである。ある特定の実施形態では、この３’−連結配列は、５〜８ヌクレオチドからなる（例えば、６ヌクレオチドからなる）。ある特定の実施形態では、この３’−連結配列は、５’−連結配列に対して少なくとも約８５％相補的である。ある特定の実施形態では、この３’−連結配列は、ＣＧＣＹＵＡＣ（配列番号１７）をコードし、ここで、Ｙは、ＣまたはＵである。ある特定の実施形態では、この３’−連結配列は、ＣＧＣＣＵＡＣ（配列番号１８）をコードする。
【００１１】
ある特定の実施形態では、この３’−隣接領域は、３’−連結配列の下流に配置された３’−バルジ配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、この３’−バルジ配列は、クローニング部位、例えば、ＳｐｅＩ／ＸｂａＩ部位またはＳｐｅＩ部位を含む。ある特定の実施形態では、この３’−バルジ配列は、約１〜１５ヌクレオチド（例えば、２〜１５ヌクレオチドまたは１〜１０ヌクレオチド）からなる。ある特定の実施形態では、この３’−バルジ配列は、ＵＡＧ（配列番号３０）をコードする。ある特定の実施形態では、５’−バルジ配列は、配列の各末端の１ヌクレオチドのみにおいて、この３’−バルジ配列に対して相補的である。
【００１２】
ある特定の実施形態では、この３’−隣接領域は、３’−バルジ配列の下流に配置された３’−スペーサー配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、この３’−スペーサー配列は、９〜１２ヌクレオチド、例えば、１０〜１２ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態では、この３’−スペーサー配列は、ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡ（配列番号１９）である。ある特定の実施形態では、この３’−スペーサー配列は、５’−スペーサー配列に対して少なくとも約７０％相補的である。
【００１３】
ある特定の実施形態では、この３’−隣接領域は、３’−スペーサー配列の下流に配置された３’−下流配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、５’−上流配列は、３’−下流配列と顕著には対合しない。本明細書で使用する場合、用語「〜と顕著には対合しない」とは、２つの鎖が２０％未満相同であることを意味する。ある特定の実施形態では、この３’−下流配列は、長さが約５〜５０００ヌクレオチド、例えば、長さが３０〜２０００ヌクレオチドである。
【００１４】
ある特定の実施形態では、このループ領域は、長さが４〜２０ヌクレオチド、例えば、長さが１５〜１９ヌクレオチドである。ループ領域の０〜５０％は、そのループ領域の別の部分に対して相補的であり得る。本明細書で使用する場合、用語「ループ領域」は、核酸の２つの相補鎖を連結する配列である。ある特定の実施形態では、核酸の相補鎖と直接的に接しているループ領域の１〜３ヌクレオチドは、そのループ領域の最後の１〜３ヌクレオチドに対して相補的であり得る。例えば、ループ領域中の最初の２つの核酸は、ループ領域の最後の２つのヌクレオチドに対して相補的であり得る。ある特定の実施形態では、このループ領域は、長さが１７ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、このループ領域は、ＣＵＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＧ（配列番号２０）またはＣＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＧ（配列番号２１）をコードする。ある特定の実施形態では、このループ領域は、ＣＵＧＵＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＵＧＧＧ（配列番号２２）またはＣＣＧＵＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＵＧＧＧ（配列番号２３）をコードする。
【００１５】
本発明は、本明細書に記載される核酸によってコードされるＲＮＡをさらに提供する。
【００１６】
本発明は、本明細書に記載される核酸と接して連結されたプロモーターを含む発現カセットをさらに提供する。ある特定の実施形態では、このプロモーターは、ｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーター、例えば、Ｕ６プロモーター（例えば、マウスＵ６プロモーター）である。ある特定の実施形態では、この発現カセットは、マーカー遺伝子をさらに含む。ある特定の実施形態では、このプロモーターは、ｐｏｌＩＩプロモーターである。ある特定の実施形態では、このプロモーターは、組織特異的プロモーターである。ある特定の実施形態では、このプロモーターは、誘導性プロモーターである。ある特定の実施形態では、このプロモーターは、ｐｏｌＩＩＩプロモーターである。
【００１７】
ある特定の実施形態では、この発現カセットは、マーカー遺伝子をさらに含む。
【００１８】
本発明は、本明細書に記載される発現カセットを含むベクターを提供する。ある特定の実施形態では、このベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ある特定の実施形態では、このＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６および／またはＡＡＶ９である。ある特定の実施形態では、このＡＡＶはＡＡＶ２である。ある特定の実施形態では、このＡＡＶはＡＡＶ２／１である。かかるＡＡＶの例は、Davidsonら、PNAS（２０００年）９７巻：３４２８〜３４３２頁中に見出される。ある特定の実施形態では、このＡＡＶはＡＡＶ２／１である。ある特定の実施形態では、このＡＡＶはＡＡＶ２／５である。本明細書で使用する場合、用語ＡＡＶ２／１は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶ１カプシドを意味するために使用され、用語ＡＡＶ２／２は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶ２カプシドであり、用語ＡＡＶ２／４は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶ４カプシドである、など。ある特定の実施形態では、このＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６および／またはＡＡＶ９である。ある特定の実施形態では、このＡＡＶはＡＡＶ１である。ある特定の実施形態では、このＡＡＶはＡＡＶ２である。ある特定の実施形態では、このＡＡＶはＡＡＶ５である。ある特定の実施形態では、このＡＡＶはＡＡＶ６である。ある特定の実施形態では、このＡＡＶはＡＡＶ８である。ある特定の実施形態では、このＡＡＶはＡＡＶ９である。ある特定の実施形態では、このＡＡＶはＡＡＶｒｈ１０である。
【００１９】
ある特定の実施形態では、このＡＡＶカプシドは、任意の参照ＡＡＶ血清型カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、例えば、ＡＡＶ１カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶ２カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶ３カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶ４カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶ５カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶ６カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶ７カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶ８カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶ９カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３に対して、少なくとも８０％の相同性を有する。
【００２０】
ある特定の実施形態では、このＡＡＶカプシドは、任意の参照ＡＡＶ血清型カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、例えば、ＡＡＶ１カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶ２カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶ３カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶ４カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶ５カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶ６カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶ７カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶ８カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶ９カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３、または例えば、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３に対して、１００％の相同性を有する。
【００２１】
本発明は、本明細書に記載される核酸、発現カセット、ベクターまたは二重鎖を含む非ヒト動物を提供する。
【００２２】
本発明は、位置の順で、５’−隣接領域、非ガイド領域、ループ領域、ガイド領域および３’−隣接領域からなる人工一次ｍｉＲＮＡ転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸を含む、長さが８０〜４０００ヌクレオチドの間の単離された核酸を提供し、このガイド領域は、配列番号３７（ｍｉＨＤｓｓ３）、配列番号６（ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕ）または配列番号７（ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａ）からなり、この非ガイド領域は、ガイド領域に対して少なくとも８０％相補的である。
【００２３】
本発明は、Ｐｒｉ−ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕ（配列番号８）、Ｐｒｉ−ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａ（配列番号９）、Ｐｒｅ−ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕ（配列番号１０）またはＰｒｅ−ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａ（配列番号１１）からなる、単離された核酸を提供する。一実施形態では、全長ｍｉＨＤＳ１（配列番号１２）は、以下の配列を有する：
5'-GCGUUUAGUGAACCGUCAGAUGGUACCGUUUAAACUCGAGUGAGCGAUGCUGGCUCGCAUGGUCGAUACUGUAAAGCCACAGAUGGGUGUCGACCAUGCGAGCCAGCACCGCCUACUAGAGCGGCCGCCACAGCGGGGAGAUCCAGACAUGAUAAGAUACAUU-3'(配列番号１２)
【００２４】
本発明は、核酸のガイド領域および核酸の非ガイド領域を含む、単離されたＲＮＡ二重鎖を提供し、このガイド領域は、配列番号３７（ｍｉＨＤｓｓ３）、配列番号６（ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕ）または配列番号７（ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａ）であり、この非ガイド領域は、ガイド領域に対して少なくとも８０％相補的である。ある特定の実施形態では、この単離されたＲＮＡ二重鎖は、長さが１９〜３０塩基対の間である。ある特定の実施形態は、上記単離された核酸をコードする発現カセットを含む。ある特定の実施形態では、この発現カセットは、マーカー遺伝子をさらに含む。
【００２５】
本発明は、本明細書に記載される核酸、発現カセット、ベクターまたは組成物を被験体に投与することによって、ＲＮＡ干渉を誘導する方法を提供する。
【００２６】
本発明は、ｍｉＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結したＵ６プロモーターを含むベクターを提供する。本発明の構築物の予測された転写開始部位は、過去に研究者らに使用されたものとは異なっている。本発明のある特定の実施形態では、このＵ６ｍｉＲＮＡは、伸長された５’末端を有する。この５’末端が以前のＣＭＶベースの戦略と似るようにトランケートされると、サイレンシング効力は、激しく低減される。本発明は、天然のｍｉＲ−３０隣接配列を超える改善された効力を示す改善された隣接配列もまた提供する。本発明のｍｉＲＮＡ戦略の使用は、伝統的ｓｈＲＮＡアプローチと関連する毒性を軽減するようである。このｍｉＲＮＡ戦略は、Ｕ６ｓｈＲＮＡアプローチがするように過剰量のＲＮＡｉを生成することは一般にはない。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「ステム配列」は、同じ分子中の別の配列に対して相補的な配列であり、２つの相補鎖がアニーリングして、二重鎖（例えば、非ガイドおよびガイド領域）を形成する。形成される二重鎖は、互いに対して、完全に相補的であり得るか、または完全に満たずに相補的、例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７５％もしくは７０％相補的であり得る。さらに、ある特定の実施形態では、一方の鎖は、他方の鎖よりも多いヌクレオチドを含み得、サイドループの形成を可能にする。
【００２８】
本発明は、本明細書に記載される発現カセットを含むベクターもまた提供する。適切なベクターの例には、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）またはマウスモロニーベースのウイルスベクターが含まれる。一実施形態では、このベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。これらのカセットおよびベクターは、細胞、例えば、哺乳動物細胞中に含まれ得る。非ヒト哺乳動物は、このカセットまたはベクターを含み得る。
【００２９】
本発明は、本明細書に記載される核酸分子、発現カセットまたはベクターを含む、細胞（例えば、哺乳動物細胞）を提供する。本発明は、本明細書に記載される核酸分子、発現カセットまたはベクターを含む、非ヒト哺乳動物もまた提供する。
【００３０】
本発明は、神経変性疾患を処置するためのなどの、治療における使用のための、本明細書に記載される核酸、発現カセット、ベクターまたは組成物を提供する。
【００３１】
本発明は、３’末端においてオーバーハングを有するマイクロＲＮＡを有する単離されたＲＮＡｉ分子を提供する。ある特定の実施形態では、このオーバーハングは、２〜５ヌクレオチドのリピートである。ある特定の実施形態では、このオーバーハングは、ＵＵ（配列番号２４）、ＵＵＵ（配列番号２５）、ＵＵＵＵ（配列番号２６）、ＣＵＵ（配列番号２７）、ＣＵＵＵ（配列番号２８）またはＣＵＵＵＵ（配列番号２９）配列である。ある特定の実施形態では、このマイクロＲＮＡは、天然に存在するマイクロＲＮＡである。ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡは、人工マイクロＲＮＡである。ある特定の実施形態では、このＲＮＡｉ分子は、減少したレベルのオフターゲット毒性を生じる。
【００３２】
本発明は、本明細書に記載される核酸、発現カセット、ベクターまたは組成物を被験体に投与することによって、低毒性ＲＮＡ干渉を誘導する方法を提供する。ある特定の実施形態では、この発現カセットは、ｐｏｌＩＩプロモーターを含む。
【００３３】
本発明は、ｍｉＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結したｐｏｌＩＩプロモーターをコードする発現カセットを被験体に投与することによって、低毒性ＲＮＡ干渉を誘導する方法を提供する。ある特定の実施形態では、このｍｉＲＮＡは、２または３ヌクレオチドの５’または３’−オーバーハングを含む。ある特定の実施形態では、このｍｉＲＮＡは、２ヌクレオチドの３’−オーバーハングを含む。ある特定の実施形態では、このｍｉＲＮＡは、人工ｍｉＲＮＡである。
【００３４】
本発明は、ハンチントン病を処置するために、本明細書に記載される核酸、発現カセット、ベクターまたは組成物を被験体に投与することによって、ハンチントン病を有する被験体を処置する方法を提供する。
【００３５】
本発明は、細胞におけるハンチンチンの蓄積を抑制するのに十分な量で、本明細書に記載される核酸分子（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ））を細胞中に導入することによって、細胞におけるハンチンチンの蓄積を抑制する方法を提供する。ある特定の実施形態では、ハンチンチンの蓄積は、少なくとも１０％抑制される。ある特定の実施形態では、ハンチンチンの蓄積は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％抑制される。ある特定の実施形態では、このタンパク質の蓄積の抑制は、治療効果を引き起こすのに、例えば、もつれの形成を低減させるのに、十分な量においてである。
【００３６】
本発明は、ハンチンチンの蓄積を抑制するのに十分な量で、本明細書に記載される核酸分子（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ））を細胞中に導入することによって、細胞における変異体ハンチンチンの細胞傷害効果を予防する方法を提供する。ある特定の実施形態では、これらの核酸分子は、例えばニューロン細胞において、ハンチンチンの細胞傷害効果を予防する。
【００３７】
本発明は、ハンチンチンの発現を阻害するのに十分な量で、本明細書に記載される核酸分子（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ））を細胞中に導入することによって、細胞におけるハンチンチン遺伝子の発現を阻害する方法を提供し、ここで、このＲＮＡは、ハンチンチン遺伝子の発現を阻害する。ある特定の実施形態では、ハンチンチンは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％阻害される。
【００３８】
本発明は、（ａ）ニューロン細胞を含む哺乳動物を提供することであって、このニューロン細胞は、ハンチンチン遺伝子を含み、このニューロン細胞は、ＲＮＡ干渉に対して感受性であり、このハンチンチン遺伝子は、このニューロン細胞において発現される、こと；および（ｂ）この哺乳動物を、本明細書に記載されるリボ核酸（ＲＮＡ）またはベクターと接触させることであって、それによって、ハンチンチン遺伝子の発現を阻害する、こと、によって、哺乳動物（例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物）においてハンチンチン遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。ある特定の実施形態では、ハンチンチンの蓄積は、少なくとも１０％抑制される。ある特定の実施形態では、ハンチンチンは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％阻害される。ある特定の実施形態では、この細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで哺乳動物中に位置する。
【００３９】
本発明は、プロモーターおよび標的配列に対して特異的な埋め込まれたｓｉＲＮＡを含むマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）シャトルを含むウイルスベクターを提供する。ある特定の実施形態では、このプロモーターは、誘導性プロモーターである。ある特定の実施形態では、このベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポリオウイルス、ＨＳＶまたはマウスモロニーベースのウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、標的化される配列は、ハンチントン病と関連する配列である。この標的配列は、ある特定の実施形態では、ハンチンチンをコードする配列である。
【００４０】
本発明は、ハンチントン病と関連するタンパク質の蓄積を抑制するのに十分な量で、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡをコードするベクターを細胞中に導入することによって、それを必要とする哺乳動物において、神経変性疾患の細胞傷害効果を予防する方法を提供し、このＲＮＡは、ハンチントン病（ＨＤとも呼ばれ、関与するタンパク質は、ｈｔｔとも呼ばれるハンチンチンである）の細胞傷害効果を予防する。
【００４１】
本発明は、ハンチンチンタンパク質の発現を阻害するのに十分な量で、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡをコードするベクターを細胞中に導入することによって、それを必要とする哺乳動物において、ハンチントン病と関連するタンパク質の発現を阻害する方法もまた提供し、ここで、このＲＮＡは、ハンチンチンタンパク質の発現を阻害する。このハンチンチンタンパク質は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％阻害される。
【００４２】
本発明は、短鎖干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）分子を使用する、ハンチントン病遺伝子発現をモジュレートするために有用な、化合物、組成物および方法に関する。本発明は、低分子核酸分子を使用するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって、ＨＤ遺伝子の発現および／または活性の経路に関与する他の遺伝子の発現および活性をモジュレートするために有用な、化合物、組成物および方法にも関する。特に、本発明は、低分子核酸分子、例えば、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、ならびにＨＤ遺伝子の発現をモジュレートするために使用される方法を特徴とする。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、例えば、化学的に合成され得、ベクターから発現され得、または酵素的に合成され得る。
【００４３】
本明細書で使用する場合、特許請求の範囲が「〜に対応する」ＲＮＡを示す場合、これは、ウラシルがチミンに置換されることを除いて、ＤＮＡと同じ配列を有するＲＮＡを意味する。
【００４４】
本発明は、治療効果を提供するために、目的の標的遺伝子または目的の遺伝子についての標的化された対立遺伝子を実質的にサイレンシングする方法を、さらに提供する。本明細書で使用する場合、用語「実質的にサイレンシングする」または「実質的にサイレンシングされた」とは、この標的遺伝子または標的対立遺伝子の発現を、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％〜１００％減少、低減または阻害することを指す。本明細書で使用する場合、用語「治療効果」とは、病理学的および挙動的欠陥を含む、疾患状態の関連する異常における変化；疾患状態の腫瘍増殖停止時間における変化；疾患の症状の低減、弱まりもしくは変更；または疾患に罹患した人の生活の質における改善を指す。治療効果は、医師によって定量的に、またはｓｉＲＮＡによって標的化される疾患状態に罹患した患者によって定性的に、測定され得る。変異体および野生型の両方の対立遺伝子が実質的にサイレンシングされるある特定の実施形態では、用語治療効果は、患者が治療効果を有さないような、野生型対立遺伝子の発現のサイレンシングが正常な機能に対して有害な影響も害になる影響も有さない状態を規定する。
【００４５】
一実施形態では、本発明は、被験体または生物においてハンチントン病を処置または予防するための方法を特徴とし、この方法は、被験体または生物においてＨＤ遺伝子の発現をモジュレートするのに適切な条件下で、この被験体または生物を本発明のｓｉＲＮＡと接触させることを含み、それによって、ハンチントン病の処置または予防が達成され得る。一実施形態では、このＨＤ遺伝子標的は、両方のＨＤ対立遺伝子（例えば、トリヌクレオチド（ＣＡＧ）リピート伸長を含む対立遺伝子、および野生型対立遺伝子）を含む。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、被験体または生物中の適切な組織または細胞を標的化するために、本明細書に記載されるようにまたは当技術分野で公知の他の方法で、ベクターから発現され得る。
【００４６】
一実施形態では、本発明は、被験体または生物においてハンチントン病を処置または予防するための方法を特徴とし、この方法は、適切な組織または細胞、例えば、脳の細胞および組織（例えば、基底核、線条体または皮質）への局所投与を介して、例えば、適切な細胞（例えば、基底核、線条体または皮質）への、本発明のｓｉＲＮＡ分子を提供する本発明のベクターまたは発現カセットの投与によって、この被験体または生物を本発明のｓｉＲＮＡ分子と接触させることを含む。一実施形態では、このｓｉＲＮＡ、ベクターまたは発現カセットは、脳への定位的な送達または対流増強送達によって、被験体または生物に投与される。例えば、米国特許第５，７２０，７２０号は、脳への試薬の定位的な送達および対流増強送達に有用な方法およびデバイスを提供する。かかる方法およびデバイスは、本発明のｓｉＲＮＡ、ベクターまたは発現カセットの、被験体または生物への送達のために容易に使用され得、米国特許第５，７２０，７２０号は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。米国特許出願公開第２００２／０１４１９８０号；米国特許出願公開第２００２／０１１４７８０号；および米国特許出願公開第２００２／０１８７１２７号は全て、本発明のｓｉＲＮＡ、ベクターまたは発現カセットの、被験体または生物への送達のために容易に適合され得る、試薬の定位的な送達および対流増強送達に有用な方法およびデバイスを提供し、これらは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本発明のｓｉＲＮＡ、ベクターまたは発現カセットを被験体または生物に送達することにおいて有用であり得る特定のデバイスは、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４／０１６２２５５号中に記載されている。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、被験体または生物中の適切な組織または細胞を標的化するために、本明細書に記載されるようにまたは当技術分野で公知の他の方法で、ベクターから発現され得る。
【００４７】
ウイルスベクターの送達の方法には、動脈内、筋内、静脈内、鼻腔内および経口経路が含まれるがこれらに限定されない。一般に、ＡＡＶビリオンは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかの形質導入技術を使用して、ＣＮＳの細胞中に導入され得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入される場合、所望のレシピエント細胞が、被験体から取り出され、ＡＡＶビリオンで形質導入され、被験体中に再導入される。あるいは、同系間または異種間細胞が使用され得、ここで、これらの細胞は、被験体において不適切な免疫応答を生じない。
【００４８】
被験体中への形質導入された細胞の送達および導入のための適切な方法は、記載されている。例えば、細胞は、組換えＡＡＶビリオンを、例えば適切な培地中でＣＮＳ細胞と合わせることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入され得、目的のＤＮＡを保有する細胞についてのスクリーニングは、従来の技術、例えば、サザンブロットおよび／もしくはＰＣＲを使用して、または選択可能なマーカーを使用することによって、スクリーニングされ得る。次いで、形質導入された細胞は、以下により完全に記載される医薬組成物へと製剤化され得、この組成物は、種々の技術によって、例えば、移植、筋内、静脈内、皮下および腹腔内注射によって、被験体中に導入され得る。
【００４９】
一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために、ＡＡＶビリオンは、医薬組成物へと製剤化され、一般には、非経口で、例えば、骨格筋もしくは心筋中への直接的な筋内注射によって、またはＣＮＳ中への注射によって、投与される。
【００５０】
一実施形態では、本発明のウイルスベクターは、被験体の脳の大きい領域（例えば、線条体および／または皮質）にわたって、ウイルスベクター、例えばＡＡＶを効率的に送達できる対流増強送達（ＣＥＤ）系を介して、ＣＮＳに送達される。以下に詳細に記載され例示されるように、これらの方法は、種々のウイルスベクター、例えば、治療的遺伝子（例えば、ｓｉＲＮＡ）を保有するＡＡＶベクターに適切である。
【００５１】
任意の対流増強送達デバイスが、ウイルスベクターの送達のために適切であり得る。一実施形態では、このデバイスは、浸透圧ポンプまたは注入ポンプである。浸透圧ポンプおよび注入ポンプの両方は、種々の供給業者、例えば、Ａｌｚｅｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｉｚａ，Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。典型的には、ウイルスベクターは、以下のようにＣＥＤデバイスを介して送達される。カテーテル、カニューレまたは他の注射デバイスが、選択された被験体においてＣＮＳ組織中に挿入される。本明細書の教示を考慮すると、当業者は、ＣＮＳのどの一般的なエリアが適切な標的であるかを容易に決定できる。例えば、ＨＤを処置するために治療的遺伝子をコードするＡＡＶベクターを送達する場合、線条体が、標的化するのに適切な脳のエリアである。定位的なマップおよび配置決定（positioning）デバイスが、例えばＡＳＩ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗａｒｒｅｎ、Ｍｉｃｈ．から入手可能である。配置決定は、選択された標的へと注射デバイスをガイドするのを助けるために、被験体の脳のＣＴおよび／またはＭＲＩ画像化によって取得された解剖学的マップを使用することによっても実施され得る。さらに、本明細書に記載される方法は、脳の比較的大きいエリアがウイルスベクターを取り込むように実施され得るので、必要とされる注入カニューレは、より少ない。手術合併症は、貫通の数に関連するので、本明細書に記載される方法は、従来の送達技術で見られる副作用を低減させるようにも機能する。
【００５２】
一実施形態では、医薬組成物は、目的のｓｉＲＮＡの治療有効量、即ち、問題の疾患状態の症状を低減もしくは寛解させるのに十分な量、または所望の利益を付与するのに十分な量を産生するのに十分な遺伝子材料を含む。これらの医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤もまた含み得る。かかる賦形剤には、組成物を受けている個体にとって害になる抗体の産生をそれ自体は誘導せず、過度の毒性なしに投与され得る、任意の薬学的薬剤が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ８０、ならびに液体、例えば、水、食塩水、グリセロールおよびエタノールが含まれるがこれらに限定されない。その中で、薬学的に許容される塩には、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などが含まれ得る。さらに、補助的物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質などが、かかるビヒクル中に存在し得る。薬学的に許容される賦形剤の詳細な論述は、REMINGTON'S  PHARMACEUTICAL  SCIENCES（Mack  Pub.  Co.、N.J.  １９９１年）において入手可能である。
【００５３】
本明細書の教示を考慮して当業者に明らかなように、添加される必要があるウイルスベクターの有効量は、実験的に決定され得る。投与は、１つの用量で、処置の過程を通じて持続的にまたは間欠的に、もたらされ得る。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、当業者に周知であり、ウイルスベクター、治療の組成物、標的細胞、および処置されている被験体によって変動する。単一および複数回の投与が、処置を行う医師によって選択される用量レベルおよびパターンで実施され得る。
【００５４】
１よりも多い導入遺伝子が、送達されたウイルスベクターによって発現され得ることを理解すべきである。あるいは、各々１または複数の異なる導入遺伝子を発現する別々のベクターもまた、本明細書に記載されるようにＣＮＳに送達され得る。さらに、本発明の方法によって送達されるウイルスベクターは、他の適切な組成物および治療と組み合わされることもまた、意図される。
【００５５】
本発明は、医学的処置または診断における使用のための、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、発現カセットおよび／またはベクターをさらに提供する。
【００５６】
本発明は、動物において、ＲＮＡｉに従順な条件を処置するために有用な、例えば、ハンチントン病を処置するために有用な医薬を調製するための、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、発現カセットおよび／またはベクターの使用を提供する。
【００５７】
本発明は、治療における使用のための、本発明の核酸、発現カセット、ベクターまたは組成物もまた提供する。
【００５８】
本発明は、ハンチントン病を処置するための、例えば、ハンチントン病の予防的処置または治療的処置における使用のための、本発明の核酸、発現カセット、ベクターまたは組成物もまた提供する。
【００５９】
ある特定の実施形態では、薬剤が被験体の脳に投与される。ある特定の実施形態では、この薬剤は、直接または血流を介して脳に投与される。ある特定の実施形態では、この治療剤は、頭蓋内投与される。ある特定の実施形態では、この治療剤は、被験体の大槽、線条体、皮質もしくは室、くも膜下腔（subarachnoid  space）および／または髄腔内（intrathecal  space）に投与される。ある特定の実施形態では、この被験体はヒトである。ある特定の実施形態では、この被験体は、非ヒト哺乳動物である。ある特定の実施形態では、この薬剤は、脳中の１〜５つの場所において、例えば、脳中の１、２または３つの場所において、注射される。ある特定の実施形態では、この方法は、ｒＡＡＶを、非ヒト霊長類の脳室、くも膜下腔および／または髄腔内にさらに投与することをさらに含む。より具体的には、本発明は、核酸を、循環ＣＳＦと接触した細胞、例えば、上衣細胞、軟膜細胞、髄膜細胞、脳内皮細胞に送達する方法を提供し、この方法は、ＡＡＶ逆位末端リピートの対間に挿入された核酸を含むベクターを含むＡＡＶ粒子を細胞に投与することを含み、それによって、核酸を細胞に送達する。
【００６０】
本発明は、ハンチントン病を処置するために、細胞を、本明細書に記載される核酸、発現カセット、ベクターまたは二重鎖と接触させる方法もまた提供し、この細胞は、上衣、軟膜、内皮、脳室および／または髄膜細胞である。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
位置の順で、５’−隣接領域、非ガイド領域、ループ領域、ガイド領域および３’−隣接領域からなる人工一次ｍｉＲＮＡ転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸であって、前記ガイド領域は、配列番号３７（ｍｉＨＤｓｓ３）、配列番号６（ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕ）または配列番号７（ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａ）からなり、前記非ガイド領域は、前記ガイド領域に対して少なくとも８０％相補的である、核酸。
（項目２）
前記５’−隣接領域が、前記非ガイド領域と接して連結され、前記ループ領域が、前記非ガイド領域と前記ガイド領域との間に配置され、前記ガイド領域が、前記３’−隣接領域と接して連結される、項目１に記載の核酸。
（項目３）
前記５’−隣接領域が、前記非ガイド領域と接して連結された５’−連結配列を含む、項目１または２に記載の核酸。
（項目４）
前記５’−連結配列が、５〜８ヌクレオチドからなる、項目３に記載の核酸。
（項目５）
前記５’−連結配列が、７ヌクレオチドからなる、項目４に記載の核酸。
（項目６）
前記５’−連結配列が、ＧＵＧＡＧＣＧＡ（配列番号１３）またはＧＵＧＡＧＣＧＣ（配列番号１４）をコードする、項目３に記載の核酸。
（項目７）
前記５’−隣接領域が、前記５’−連結配列の上流に配置された５’−バルジ配列をさらに含む、項目３から６のいずれか一項に記載の核酸。
（項目８）
前記５’−バルジ配列が、クローニング部位を含む、項目７に記載の核酸。
（項目９）
前記５’−バルジ配列が、約１〜１０ヌクレオチドからなる、項目７に記載の核酸。
（項目１０）
前記５’−バルジ配列が、ＵＡＡＡＣＵＣＧＡ（配列番号１５）をコードする、項目７に記載の核酸。
（項目１１）
前記５’−隣接領域が、前記５’−バルジ配列の上流に配置された５’−スペーサー配列をさらに含む、項目７から１０のいずれか一項に記載の核酸。
（項目１２）
前記５’−スペーサー配列が、１０〜１２ヌクレオチドからなる、項目１１に記載の核酸。
（項目１３）
前記５’−スペーサー配列が、ＵＧＧＵＡＣＣＧＵＵ（配列番号１６）をコードする、項目１１に記載の核酸。
（項目１４）
前記５’−隣接領域が、前記５’−スペーサー配列の上流に配置された５’−上流配列をさらに含む、項目１１から１３のいずれか一項に記載の核酸。
（項目１５）
前記５’−上流配列が、長さが約３０〜２０００ヌクレオチドである、項目１４に記載の核酸。
（項目１６）
前記３’−隣接領域が、前記ガイド領域と接して連結された３’−連結配列を含む、項目１から１５のいずれか一項に記載の核酸。
（項目１７）
前記３’−連結配列が、５〜８ヌクレオチドからなる、項目１６に記載の核酸。
（項目１８）
前記３’−連結配列が、前記５’−連結配列に対して少なくとも約８５％相補的である、項目１６に記載の核酸。
（項目１９）
前記３’−連結配列が、ＣＧＣＣＵＡＣ（配列番号１８）をコードする、項目１６に記載の核酸。
（項目２０）
前記３’−隣接領域が、前記３’−連結配列の下流に配置された３’−バルジ配列をさらに含む、項目１６から１９のいずれか一項に記載の核酸。
（項目２１）
前記３’−バルジ配列が、クローニング部位を含む、項目２０に記載の核酸。
（項目２２）
前記３’−バルジ配列が、約１〜１０ヌクレオチドからなる、項目２０に記載の核酸。
（項目２３）
３’−バルジ配列が、ＵＡＧ（配列番号３０）をコードする、項目２０に記載の核酸。
（項目２４）
前記５’−バルジ配列が、前記バルジ配列の各末端の１ヌクレオチドのみにおいて、前記３’−バルジ配列に対して相補的である、項目２０に記載の核酸。
（項目２５）
前記３’−隣接領域が、前記３’−バルジ配列の下流に配置された３’−スペーサー配列をさらに含む、項目２０から２４のいずれか一項に記載の核酸。
（項目２６）
前記３’−スペーサー配列が、１０〜１２ヌクレオチドからなる、項目２５に記載の核酸。
（項目２７）
前記３’−スペーサー配列が、ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡ（配列番号１９）をコードする、項目２５に記載の核酸。
（項目２８）
前記３’−スペーサー配列が、前記５’−スペーサー配列に対して少なくとも約７０％相補的である、項目２５から２７のいずれか一項に記載の核酸。
（項目２９）
前記３’−隣接領域が、前記３’−スペーサー配列の下流に配置された３’−下流配列をさらに含む、項目２５から２８のいずれか一項に記載の核酸。
（項目３０）
前記５’−上流配列が、前記３’−下流配列と顕著には対合しない、項目２９に記載の核酸。
（項目３１）
前記３’−下流配列は、長さが約３０〜２０００ヌクレオチドである、項目２９または３０に記載の核酸。
（項目３２）
前記ループ領域は、長さが１５〜２５ヌクレオチドである、項目１から３１のいずれか一項に記載の核酸。
（項目３３）
項目１から３２のいずれか一項に記載の核酸によってコードされるＲＮＡ。
（項目３４）
項目１から３２のいずれか一項に記載の単離された核酸をコードする発現カセット。
（項目３５）
前記核酸と接して連結されたプロモーターをさらに含む、項目３４に記載の発現カセット。
（項目３６）
前記プロモーターが、ｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターである、項目３５に記載の発現カセット。
（項目３７）
前記ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、Ｕ６プロモーターである、項目３６に記載の発現カセット。
（項目３８）
前記ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、マウスＵ６プロモーターである、項目３６に記載の発現カセット。
（項目３９）
前記プロモーターが、ｐｏｌＩＩプロモーターである、項目３６に記載の発現カセット。
（項目４０）
前記プロモーターが、組織特異的プロモーターである、項目３５に記載の発現カセット。
（項目４１）
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、項目３５に記載の発現カセット。
（項目４２）
マーカー遺伝子をさらに含む、項目３５から４１のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目４３）
項目３４から４２のいずれか一項に記載の発現カセットを含むベクター。
（項目４４）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項目４３に記載のベクター。
（項目４５）
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６および／またはＡＡＶ９である、項目４４に記載のベクター。
（項目４６）
前記ＡＡＶがＡＡＶ２である、項目４５に記載のベクター。
（項目４７）
前記ＡＡＶがＡＡＶ２／１である、項目４５に記載のベクター。
（項目４８）
位置の順で、５’−隣接領域、非ガイド領域、ループ領域、ガイド領域および３’−隣接領域からなる人工一次ｍｉＲＮＡ転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸を含む、長さが８０〜４０００ヌクレオチドの間の単離された核酸であって、前記ガイド領域は、配列番号３７（ｍｉＨＤｓｓ３）、配列番号６（ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕ）または配列番号７（ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａ）からなり、前記非ガイド領域は、前記ガイド領域に対して少なくとも８０％相補的である、単離された核酸。
（項目４９）
Ｐｒｉ−ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕ（配列番号８）、Ｐｒｉ−ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａ（配列番号９）、Ｐｒｅ−ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕ（配列番号１０）またはＰｒｅ−ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａ（配列番号１１）からなる、単離された核酸。
（項目５０）
核酸のガイド領域および核酸の非ガイド領域を含む、単離されたＲＮＡ二重鎖であって、前記ガイド領域は、配列番号３７（ｍｉＨＤｓｓ３）、配列番号６（ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕ）または配列番号７（ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａ）からなり、前記非ガイド領域は、前記ガイド領域に対して少なくとも８０％相補的である、単離されたＲＮＡ二重鎖。
（項目５１）
前記二重鎖は、長さが１９〜３０塩基対の間にある、項目４４に記載の単離されたＲＮＡ二重鎖。
（項目５２）
項目１から３３もしくは４８から４９のいずれか一項に記載の核酸、項目３４から４２のいずれか一項に記載の発現カセット、項目４３から４７のいずれか一項に記載のベクター、または項目５０から５１のいずれか一項に記載の二重鎖を含む非ヒト動物。
（項目５３）
項目１から３３もしくは４８から４９のいずれか一項に記載の核酸、項目３４から４２のいずれか一項に記載の発現カセット、項目４３から４７のいずれか一項に記載のベクター、または項目５０から５１のいずれか一項に記載の二重鎖の有効量を被験体に投与することを含む、ＲＮＡ干渉を誘導する方法。
（項目５４）
治療における使用のための、項目１から３３もしくは４８から４９のいずれか一項に記載の核酸、項目３４から４２のいずれか一項に記載の発現カセット、項目４３から４７に記載のベクター、または項目５０から５１のいずれか一項に記載の二重鎖。
（項目５５）
ハンチントン病を処置するための、項目１から３３もしくは４８から４９のいずれか一項に記載の核酸、項目３４から４２のいずれか一項に記載の発現カセット、項目４３から４７に記載のベクター、または項目５０から５１のいずれか一項に記載の二重鎖の使用。
（項目５６）
３’末端においてオーバーハングを有する項目１に記載の核酸を含む、単離されたマイクロＲＮＡ分子。
（項目５７）
前記オーバーハングが、２〜５ヌクレオチドのリピートである、項目５６に記載の単離されたマイクロＲＮＡ分子。
（項目５８）
前記マイクロＲＮＡが、天然に存在するマイクロＲＮＡである、項目５６または５７に記載の単離されたマイクロＲＮＡ分子。
（項目５９）
前記マイクロＲＮＡが、人工マイクロＲＮＡである、項目５６または５７に記載の単離されたマイクロＲＮＡ分子。
（項目６０）
前記マイクロＲＮＡ分子が、減少したレベルのオフターゲット毒性を生じる、項目５６から５９のいずれか一項に記載の単離されたマイクロＲＮＡ。
（項目６１）
前記オーバーハングが、ＵＵ（配列番号２４）、ＵＵＵ（配列番号２５）またはＵＵＵＵ（配列番号２６）配列である、項目５６に記載の単離されたマイクロＲＮＡ。
（項目６２）
前記オーバーハングが、ＣＵＵ（配列番号２７）、ＣＵＵＵ（配列番号２８）またはＣＵＵＵＵ（配列番号２９）配列である、項目５６に記載の単離されたマイクロＲＮＡ。
（項目６３）
項目１から３３もしくは４８から４９のいずれか一項に記載の核酸、項目３４から４２のいずれか一項に記載の発現カセット、項目４３から４７のいずれか一項に記載のベクター、または項目５０から５１のいずれか一項に記載の二重鎖を被験体に投与することを含む、低毒性ＲＮＡ干渉を誘導する方法。
（項目６４）
前記発現カセットが、ｐｏｌＩＩプロモーターを含む、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
ｍｉＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結したｐｏｌＩＩプロモーターをコードする項目３５に記載の発現カセットを被験体に投与することを含む、低毒性ＲＮＡ干渉を誘導する方法。
（項目６６）
前記ｍｉＲＮＡが、２または３ヌクレオチドの５’または３’−オーバーハングを含む、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記ｍｉＲＮＡが、２ヌクレオチドの３’−オーバーハングを含む、項目６５または６６に記載の方法。
（項目６８）
前記ｍｉＲＮＡが人工ｍｉＲＮＡである、項目６５から６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
ハンチントン病を有する被験体を処置する方法であって、前記ハンチントン病を処置するために、項目１から３３もしくは４８から４９のいずれか一項に記載の核酸、項目３４から４２のいずれか一項に記載の発現カセット、項目４３から４７のいずれか一項に記載のベクター、または項目５０から５１のいずれか一項に記載の二重鎖を前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目７０）
前記治療剤が、直接または血流を介して前記被験体の脳に投与される、項目５３または６３から６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記治療剤が、頭蓋内投与される、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記治療剤が、前記被験体の大槽、線条体、皮質もしくは室、くも膜下腔および／または髄腔内に投与される、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記被験体がヒトである、項目７０から７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記薬剤が、ＣＮＳ中の１〜５つの場所において注射される、項目７０から７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記薬剤が、脳中の単一の場所において注射される、項目７０から７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
ハンチントン病を処置するために、細胞を、項目１から３３もしくは４８から４９のいずれか一項に記載の核酸、項目３４から４２のいずれか一項に記載の発現カセット、項目４３から４７のいずれか一項に記載のベクター、または項目５０から５１のいずれか一項に記載の二重鎖と接触させる方法であって、前記細胞が、上衣、軟膜、内皮、脳室および／または髄膜細胞である、方法。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１Ａ〜１Ｇ：ｍｉＨＤＳ１の過剰発現は、マウス脳において有害効果を引き起こす。ａ）マウスおよびヒトのハンチンチンｍＲＮＡと対合するｍｉＨＤＳ１（ｍｉＨＤＳ１は配列番号１であり；マウスＨｔｔは配列番号２であり；ヒトＨｔｔは配列番号３である）。ｂ）ｍｉＨＤＳ１およびｍｉＣｔｌ発現カセットを含むＡＡＶ／スタッファーシャトルベクターを示す漫画。ｃ）ｍｉＨＤＳ１のｉｎ  ｖｉｖｏ許容性を評価するための実験戦略。ｄ）ｍｉＨＤＳ１（ｎ＝１３）またはｍｉＣｔｌ（ｎ＝１１）を注射したマウスからのロータロッドデータ。データは、７週目（基底）、１６週目および２４週目において試験した、連続する４日間の１日当たりの各マウスの最良の２試行の平均として示される。落下までの潜時は、平均±平均値の標準誤差として示される（＊ｐ＞０．０５、示された時点における独立ｔ検定）。ｅ）ｍｉＨＤＳ１およびｍｉＣｔｌを注射したマウスの体重増加分析。データは、７週目の基底時点に対する増加体重として示される。ｆ）ｍｉＨＤｓ１およびｍｉＣｔｌを注射したマウスの握り分析。データは、示された時点における、握りを示すマウスの百分率および数として示される。ｇ）Ｕ６／ｍｉＨＤＳ１ベクターの鎖偏向。鎖偏向を、パッセンジャー（センス）またはガイド（アンチセンス）ｍｉＨＤＳ１鎖に対して相補的な標的配列を含むレポーター構築物からのルシフェラーゼ活性を測定して評価した。結果は、３つの異なる実験の代表的実験である（ｎ＝４／群）。データは、ｍｉＣｔｌをトランスフェクトした細胞に対する平均±平均値の標準誤差として示され、ｍｉＨＤＳ１がガイドｍｉＨＤＳ１鎖を優先的にロードすることを実証している。
【図２】図２Ａ〜２Ｄ：ｍｉＨＤＳ１のオフターゲット遺伝子の特徴付け。ａ）予測されたｍｉＨＤＳ１オフターゲット遺伝子の２５パーセンタイルの中の遺伝子のリスト。示される情報：遺伝子ＩＤ、参照配列、ｍｉＲＮＡ結合部位の型、ヌクレオチド３’ＵＴＲ位置、予測された標的スキャンコンテクストスコア（target  scan  context  score）、ＰＩＴＡアルゴリズムによって予測されたｄｄＧスコア。ｂ）予測されたオフターゲット化された遺伝子（Ｂｃｌ２は配列番号３１であり；Ｓｍａｄ９は配列番号３２であり；Ｓｄｆ４は配列番号３３であり；Ｍａｐ２ｋ６は配列番号３４である）上のｍｉＨＤＳ１：ｍＲＮＡ結合部位（ｍｉＨＤＳ１は配列番号１である）を示す漫画。ｃ）ｍｉＨＤＳ１注射の４ヶ月後の線条体試料におけるＨｔｔ、Ｂｃｌ２、Ｓｍａｄ９、Ｓｄｆ４およびＭａｐ２ｋ６  ｍＲＮＡレベルの定量的Ｑ−ＰＣＲ分析。全ての試料を、β−アクチンに対して標準化し、結果は、ｍｉＣｔｌを注射したマウスに対する平均±平均値の標準誤差である（１群当たりｎ＝６のマウス；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、マン・ホイットニー検定）ｄ）ｍｉＨＤＳ１エレクトロポレーション後のＳｔｈｄｈＱ７細胞におけるＨｔｔ、Ｂｃｌ２、Ｓｍａｄ９、Ｓｄｆ４およびＭａｐ２ｋ６  ｍＲＮＡレベルの定量的Ｑ−ＰＣＲ分析。全ての試料を、β−アクチンに対して標準化し、結果は、Ｕ６プロモーターまたはｍｉＣｔｌ発現カセットを含むプラスミドでエレクトロポレーションされた細胞に対する平均±平均値の標準誤差である（ｎ＝８のエレクトロポレーションしたウェル；＊＊ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡとその後のボンフェローニ事後検定）。
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａ〜３Ｃ：単一ヌクレオチドｍｉＨＤＳ１シードバリアントの生成。ａ）ｍｉＨＤＳ１配列（Ｐｒｉ−ｍｉＨＤＳ１は配列番号４であり；Ｐｒｅ−ｍｉＨＤＳ１は配列番号５であり；ＲＩＳＣロードされたｍｉＲＮＡ配列は配列番号１である）のシード領域における単一ヌクレオチド改変の場所を示す漫画。ｂ）ｍｉＨＤＳ１オフターゲット上のヌクレオチドミスマッチの位置に依存したＳＰＳスコアに対する影響。ｃ）表は、ｍｉＨＤＳ１およびｍｉＨＤＳ１−バリアントについての予測されたオフターゲット遺伝子（全体および線条体特異的）の数、ならびに共有されたオフターゲットの数を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃ：単一ヌクレオチドｍｉＨＤＳ１シードバリアントの生成。ａ）ｍｉＨＤＳ１配列（Ｐｒｉ−ｍｉＨＤＳ１は配列番号４であり；Ｐｒｅ−ｍｉＨＤＳ１は配列番号５であり；ＲＩＳＣロードされたｍｉＲＮＡ配列は配列番号１である）のシード領域における単一ヌクレオチド改変の場所を示す漫画。ｂ）ｍｉＨＤＳ１オフターゲット上のヌクレオチドミスマッチの位置に依存したＳＰＳスコアに対する影響。ｃ）表は、ｍｉＨＤＳ１およびｍｉＨＤＳ１−バリアントについての予測されたオフターゲット遺伝子（全体および線条体特異的）の数、ならびに共有されたオフターゲットの数を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｉ：単一ヌクレオチドｍｉＨＤＳ１シードバリアントのサイレンシング効力。ａ）Ｕ６／ｍｉＨＤＳ１発現カセットをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるｈＨｔｔ  ｍＲＮＡレベルの定量的分析。総ＲＮＡを、トランスフェクションの２４時間後に収集し、ｈＨｔｔレベルをＱ−ＰＣＲによって決定した。全ての試料を、β−アクチンに対して標準化し、結果は、ｍｉＨＤＳ１をトランスフェクトした細胞に対する平均±平均値の標準誤差である（ｎ＝１２のウェル；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡとその後のボンフェローニ事後検定）。ｂ）ｍｉＨＤＳ１、ｍｉＨＤＳ１ｖ５ｕ、ｍｉＨＤＳ１ｖ６ａおよびｍｉＨＤＳ１ｖ７ｕ発現カセットを、ヒトＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトし、内因性ハンチンチンタンパク質レベルを、トランスフェクションの４８時間後に決定した。ｍｉＣｔｌを、サイレンシングなし対照として使用し、β−カテニンは、ローディング対照として機能する。ｃ）ｍｉＨＤＳ１、ｍｉＨＤＳ１ｖ５ｕ、ｍｉＨＤＳ１ｖ６ａおよびｍｉＨＤＳ１ｖ７ｕのトランスフェクションの４８時間後のｈＨｔｔタンパク質レベルの定量化。データは、ｍｉＣｔｌをトランスフェクトした細胞に対する平均±平均値の標準誤差である（ｎ＝６、３つの異なるウエスタンブロット、＊ｐ＜０．０１、マン・ホイットニー検定）。ｄ）マウスハンチンチンｍＲＮＡと対合するｍｉＨＤＳ１ｖ５ｕおよびｍｉＨＤＳ１ｖ６ａ（ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕは配列番号６であり；マウスＨｔｔは配列番号２であり；ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａは配列番号７である）。ｅ）ｍｉＨＤＳ１、ｍｉＨＤＳ１ｖ５ｕおよびｍｉＨＤＳ１ｖ６ａ発現カセットを、マウスＳｔｈｄｈＱ７細胞中にエレクトロポレーションし、内因性ハンチンチンタンパク質レベルを、エレクトロポレーションの４８時間後に決定した。ｍｉＣｔｌを、サイレンシングなし対照として使用し、β−カテニンは、ローディング対照として機能する。ｆ）ｍｉＨＤＳ１、ｍｉＨＤＳ１ｖ５ｕおよびｍｉＨＤＳ１ｖ６ａのエレクトロポレーションの４８時間後のｍＨｔｔタンパク質レベルの定量化。データは、ｍｉＣｔｌをトランスフェクトした細胞に対する平均±平均値の標準誤差である（ｎ＝６、３つの異なるウエスタンブロット、＊ｐ＜０．０１、マン・ホイットニー検定）。ｇ−ｈ−ｉ）Ｕ６／ｍｉＨＤＳ１、Ｕ６／ｍｉＨＤＳ１ｖ５ｕおよびＵ６／ｍｉＨＤＳ１ｖ６ａ発現カセットをエレクトロポレーションしたＳｔｈｄｈＱ７細胞におけるｍＨｔｔ、Ｂｃｌ２およびＳｍａｄ９  ｍＲＮＡレベルの定量的分析。総ＲＮＡを、エレクトロポレーションの２４時間後に収集し、ｍＨｔｔ、Ｂｃｌ２およびＳｍａｄ９レベルを、Ｑ−ＰＣＲによって決定した。全ての試料を、β−アクチンに対して標準化し、結果は、プロモーターおよびＵ６／ｍｉＣｔｌ発現カセットを含むＵ６をトランスフェクトした細胞に対する平均±平均値の標準誤差である（ｎ＝１２のウェル；＃ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡとその後のボンフェローニ事後検定）。
【図５Ａ−Ｅ】図５Ａ〜５Ｆ：ヒトハンチンチン発現を標的化するｍｉＨＤｓｓ１〜４配列の生成。ａ）シード領域と標的化されたヒトＨｔｔ  ｍＲＮＡとの間での単一ヌクレオチドミスマッチを許容するｍｉＣｔｌシード配列を含む４つの人工ｍｉＲＮＡトリガーを生成した。ＭｉＨＤｓｓ１およびｍｉＨＤｓｓ４結合部位は、３’ＵＴＲに位置するが、ｍｉＨＤｓｓ２および３は、それぞれ、ｈＨｔｔ  ｍＲＮＡのエクソン７−８境界およびエクソン３３において結合する。ｂ）ｍｉＨＤｓｓ１〜４とヒトハンチンチンｍＲＮＡとの間でのｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ結合対。単一ヌクレオチドミスマッチは、ｍｉＨＤｓｓ１、２、３および４配列について、それぞれ、シード領域の７位、６位、５位および４位において見出された（ｍｉＨＤｓｓ１は配列番号３５であり；ｍｉＨＤｓｓ２は配列番号３６であり；ｍｉＨＤｓｓ３は配列番号３７であり；ｍｉＨＤｓｓ４は配列番号３８である）。図は、出現の順に、それぞれ、配列番号４０〜４３もまた開示している。ｃ）Ｕ６／ｍｉＨＤｓｓ１〜４発現カセットをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるｈＨｔｔ  ｍＲＮＡレベルの定量的分析。総ＲＮＡを、トランスフェクションの２４時間後に収集し、ｈＨｔｔレベルをＱ−ＰＣＲによって決定した。全ての試料を、β−アクチンに対して標準化し、結果は、ｍｉＣｔｌをトランスフェクトした細胞に対する平均±平均値の標準誤差である（ｎ＝８のウェル；＊ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡとその後のボンフェローニ事後検定）。ｄ）ｍｉＨＤｓｓ３発現カセットを、ヒトＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトし、内因性ハンチンチンタンパク質レベルを、トランスフェクションの４８時間後に決定した。ｍｉＣｔｌを、サイレンシングなし対照として使用し、β−カテニンは、ローディング対照として機能する。ｅ）ｍｉＨＤｓｓ３のトランスフェクションの４８時間後のｈＨｔｔタンパク質レベルの定量化。データは、ｍｉＣｔｌをトランスフェクトした細胞に対する平均±平均値の標準誤差である（ｎ＝６、２つの異なるウエスタンブロット、＊ｐ＜０．０１、マン・ホイットニー検定）。ｆ）ＰＩＴＡアルゴリズムを使用して、予測された意図しないｍＲＮＡ結合部位上でのｍｉＨＤｓｓ３（配列番号３７）およびｍｉＣｔｌ（配列番号３９）の結合安定性を決定した。ｍｉＣｔｌおよびｍｉＨＤｓｓ３のシード領域は、太字で強調されている。データは、ｍｉＣｔｌまたはｍｉＨＤｓｓ３に関する各オフターゲット遺伝子についてのｄｄＧ（Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）スコアとして示される。本発明者らの予測は、ｍｉＨＤｓｓ３の３’配列が、ｍｉＣｔｌよりも、オフターゲット遺伝子を通じてより高い結合安定性を提供することを示唆している。
【図５Ｆ】図５Ａ〜５Ｆ：ヒトハンチンチン発現を標的化するｍｉＨＤｓｓ１〜４配列の生成。ａ）シード領域と標的化されたヒトＨｔｔ  ｍＲＮＡとの間での単一ヌクレオチドミスマッチを許容するｍｉＣｔｌシード配列を含む４つの人工ｍｉＲＮＡトリガーを生成した。ＭｉＨＤｓｓ１およびｍｉＨＤｓｓ４結合部位は、３’ＵＴＲに位置するが、ｍｉＨＤｓｓ２および３は、それぞれ、ｈＨｔｔ  ｍＲＮＡのエクソン７−８境界およびエクソン３３において結合する。ｂ）ｍｉＨＤｓｓ１〜４とヒトハンチンチンｍＲＮＡとの間でのｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ結合対。単一ヌクレオチドミスマッチは、ｍｉＨＤｓｓ１、２、３および４配列について、それぞれ、シード領域の７位、６位、５位および４位において見出された（ｍｉＨＤｓｓ１は配列番号３５であり；ｍｉＨＤｓｓ２は配列番号３６であり；ｍｉＨＤｓｓ３は配列番号３７であり；ｍｉＨＤｓｓ４は配列番号３８である）。図は、出現の順に、それぞれ、配列番号４０〜４３もまた開示している。ｃ）Ｕ６／ｍｉＨＤｓｓ１〜４発現カセットをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるｈＨｔｔ  ｍＲＮＡレベルの定量的分析。総ＲＮＡを、トランスフェクションの２４時間後に収集し、ｈＨｔｔレベルをＱ−ＰＣＲによって決定した。全ての試料を、β−アクチンに対して標準化し、結果は、ｍｉＣｔｌをトランスフェクトした細胞に対する平均±平均値の標準誤差である（ｎ＝８のウェル；＊ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡとその後のボンフェローニ事後検定）。ｄ）ｍｉＨＤｓｓ３発現カセットを、ヒトＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトし、内因性ハンチンチンタンパク質レベルを、トランスフェクションの４８時間後に決定した。ｍｉＣｔｌを、サイレンシングなし対照として使用し、β−カテニンは、ローディング対照として機能する。ｅ）ｍｉＨＤｓｓ３のトランスフェクションの４８時間後のｈＨｔｔタンパク質レベルの定量化。データは、ｍｉＣｔｌをトランスフェクトした細胞に対する平均±平均値の標準誤差である（ｎ＝６、２つの異なるウエスタンブロット、＊ｐ＜０．０１、マン・ホイットニー検定）。ｆ）ＰＩＴＡアルゴリズムを使用して、予測された意図しないｍＲＮＡ結合部位上でのｍｉＨＤｓｓ３（配列番号３７）およびｍｉＣｔｌ（配列番号３９）の結合安定性を決定した。ｍｉＣｔｌおよびｍｉＨＤｓｓ３のシード領域は、太字で強調されている。データは、ｍｉＣｔｌまたはｍｉＨＤｓｓ３に関する各オフターゲット遺伝子についてのｄｄＧ（Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）スコアとして示される。本発明者らの予測は、ｍｉＨＤｓｓ３の３’配列が、ｍｉＣｔｌよりも、オフターゲット遺伝子を通じてより高い結合安定性を提供することを示唆している。
【図６】図６Ａ〜６Ｅ：ｍｉＨＤＳ１−バリアントおよびｍｉＨＤｓｓ３配列のｉｎ  ｖｉｖｏ許容性。ａ）新たなｍｉＲＮＡ配列設計のｉｎ  ｖｉｖｏ許容性を評価するための実験戦略。ｂ）ｍｉＨＤＳ１バリアントおよびｍｉＨＤｓｓ３発現カセットを含むＡＡＶ／スタッファーシャトルベクターを示す漫画。ｃ）製剤化緩衝液（ｎ＝７）、ｍｉＣｔｌ（ｎ＝８）、ｍｉＨＤＳ１（ｎ＝９）、ｍｉＨＤＳ１ｖ５ｕ（ｎ＝１０）、ｍｉＨＤＳ１ｖ６ａ（ｎ＝１１）またはｍｉＨＤｓｓ３（ｎ＝１０）を注射したマウスからのロータロッドデータ。データは、７週目（基底）、１６週目および２４週目において試験した、連続する４日間の１日当たりの各マウスの最良の２試行の平均として示される。落下までの潜時は、ｍｉＣｔｌを注射したマウスに対する平均±平均値の標準誤差として示される（＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡとその後のボンフェローニ事後検定）。ｄ）製剤化緩衝液、ｍｉＣｔｌ、ｍｉＨＤＳ１、ｍｉＨＤＳ１ｖ５ｕ、ｍｉＨＤＳ１ｖ６ａまたはｍｉＨＤｓｓ３を注射したマウスの体重増加分析。データは、７週目の基底時点に対する増加体重として示される。ｅ）ｍｉＨＤｓ１およびｍｉＣｔｌを注射したマウスの握り分析。データは、示された時点における、握りを示すマウスの百分率および数として示される。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
（発明の詳細な説明）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、低分子ｄｓＲＮＡによって媒介される遺伝子調節のプロセスである。ＲＮＡｉは、遺伝子機能を研究するための一般的な生物学的ツールとして使用され、種々の疾患を処置するための治療剤として調査されている。ＲＮＡｉの送達または発現は、外因性ｓｉＲＮＡの投与を介して（一過的遺伝子サイレンシング）またはステム−ループＲＮＡを発現するベクターの投与を介して（持続的遺伝子サイレンシング）であり得る。ＲＮＡｉの絶対的特異性は、疑問の余地がある。取り組むべき問題には、ｄｓＲＮＡ（ＩＦＮ−ｂ、ＰＫＲ、ＯＡＳ１）に対する細胞応答、およびＲＮＡｉマシナリーの飽和に起因する、または意図しないｍＲＮＡとの部分的相補性を介した、オフターゲット効果が含まれる。ＲＮＡｉベクターを最適化し、組織特異的かつ調節された発現戦略を潜在的に開発することが現在必要とされている。
【００６３】
治療剤としてのＲＮＡｉの使用は、以下を含むいくつかの因子の解明に依存する：ｉ）標的遺伝子配列の有効なサイレンシングのためのＲＮＡｉ構築物の送達および持続；ｉｉ）標的配列の有効なノックダウンまたは遺伝子抑制を達成するためのｓｉＲＮＡの設計、ならびにｉｉｉ）治療的ｓｉＲＮＡの送達のための最適なｓｉＲＮＡ発現系（ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）。多くの研究が、多くの臨床状態および疾患状態、例えばハンチントン病について、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド構造として送達されるＲＮＡｉの使用を評価してきたが、治療的利益を達成するために、発現されたｓｉＲＮＡの内因性産生によって達成されるような、治療的ｓｉＲＮＡの長期にわたるおよびまたは持続的な高レベル発現が必要とされると考えられる。今日まで、ｓｈＲＮＡベースのおよび人工ｍｉＲＮＡベースの戦略が、矛盾する結果を伴って比較されてきた。発現されたＲＮＡｉの治療的有用性は、ｄｓＲＮＡ（ＩＦＮ−ｂ、ＰＫＲ、ＯＡＳ１）に対する細胞応答、ＲＮＡｉマシナリーの飽和、または意図しないｍＲＮＡとの部分的相補性を介したオフターゲットのサイレンシングから生じる、オフターゲット毒性の結果としての安全性の懸念に起因して、未解決である。したがって、安全かつ有効な発現されたＲＮＡｉベクターを最適化することが現在必要とされている。
【００６４】
ｓｈＲＮＡは、５’隣接領域、ｓｉＲＮＡ領域セグメント、ループ領域、３’ｓｉＲＮＡ領域および３’隣接領域を含むように設計されたステム−ループ構造から構成される。ほとんどのＲＮＡｉ発現戦略は、強いｐｏｌＩＩＩベースのプロモーターによって駆動される短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を利用してきた。多くのｓｈＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏならびにｉｎ  ｖｉｖｏでの標的配列の有効なノックダウンを実証しているが、標的遺伝子の有効なノックダウンを実証した一部のｓｈＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで毒性を有することもまた見出された。最近発見された代替的アプローチは、ＲＮＡｉベクターとしての人工ｍｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ配列をシャトリングするｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ足場）の使用である。人工ｍｉＲＮＡは、より天然に、内因性ＲＮＡｉ基質と似ており、Ｐｏｌ−ＩＩ転写（例えば、ＲＮＡｉの組織特異的発現を可能にする）およびポリシストロニック戦略（例えば、複数のｓｉＲＮＡ配列の送達を可能にする）により従順である。今日まで、ｓｈＲＮＡと比較したｍｉＲＮＡベースのベクター系の効力は、矛盾する結果によって混乱されてきた。重要なことに、２つの系によって生じるオフターゲット毒性の問題は、評価されていない。
【００６５】
発現されたｓｉＲＮＡの開発のための重要な検討事項は、発現されたｓｉＲＮＡ構築物を宿主細胞に「投薬する」という概念である。本発明の文脈において、発現されたｓｉＲＮＡについて「投薬する」とは、送達ビヒクル（例えば、ウイルス性または非ウイルス性）、送達ビヒクルの相対的な量または濃度、ならびにｓｉＲＮＡ配列の発現を駆動するために利用されるプロモーターの強度および特異性を指し、それらに依存し得る。
【００６６】
本発明者らは、これらの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列をシャトリングするように機能する天然に存在するヒトマイクロＲＮＡ  ３０配列またはｍｉ３０配列の改変内に、ｓｈＲＮＡ中に含まれるステムループ配列を取り込む、人工ｍｉＲＮＡシャトルベクターを開発した。例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開公報ＷＯ２００８／１５０８９７を参照のこと。
【００６７】
本発明者らは、ハンチントン病を処置するための、人工ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、発現ベクター、二重鎖および方法を開発した。例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１２／１０９６６７を参照のこと。
【００６８】
ＲＮＡｉのためのマイクロＲＮＡシャトル
ｍｉＲＮＡは、前駆体ステムループ転写産物からプロセシングされた低分子細胞性ＲＮＡ（約２２ｎｔ）である。公知のｍｉＲＮＡステムループは、目的の遺伝子に対して特異的なＲＮＡｉ配列を含むように改変され得る。ｍｉＲＮＡは、内因的に発現されるので、ｍｉＲＮＡ分子は、ｓｈＲＮＡ分子よりも好まれ得る。したがって、ｍｉＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ応答性インターフェロン経路を誘導する可能性が低く、ｓｈＲＮＡよりも効率的にプロセシングされ、８０％より有効にサイレンシングすることが示されている。
【００６９】
また、プロモーターの役割は、ｓｈＲＮＡ分子と比較して、ｍｉＲＮＡ分子について異なっている。ｓｈＲＮＡの組織特異的な誘導性の発現は、転写開始部位までのｐｏｌＩＩプロモーターのトランケーションを含む。対照的に、ｍｉＲＮＡは、任意のｐｏｌＩＩプロモーターから発現され得るが、それは、転写開始および停止部位が、比較的任意であり得るからである。
【００７０】
ハンチントン病の処置
脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）およびハンチントン病（ＨＤ）を含む、優性なポリグルタミン伸長疾患は、進行性の処置不能な神経変性障害である。誘導性マウスモデルＨＤでは、変異体対立遺伝子発現の抑圧は、疾患表現型を改善する。したがって、疾患遺伝子発現を阻害するように設計された治療は、有益である。本発明は、ハンチントン病を処置するためにＲＮＡｉをｉｎ  ｖｉｖｏで使用する方法を提供する。「処置する」とは、本明細書で使用する場合、疾患もしくは状態の少なくとも１つの症状を寛解すること、疾患もしくは状態を治癒すること、および／または疾患もしくは状態の発生を予防することを指す。
【００７１】
本発明のある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子の発現を阻害するために使用される。「発現を阻害する」とは、標的遺伝子の発現を低減、減退または抑制することを意味する。標的遺伝子の発現は、「遺伝子サイレンシング」を介して阻害され得る。遺伝子サイレンシングとは、転写に影響を与えるプロセスおよび／または転写後機構に影響を与えるプロセスを介して媒介され得る、遺伝子発現、例えば、導入遺伝子、異種遺伝子および／または内因性遺伝子の発現の抑制を指す。一部の実施形態では、遺伝子サイレンシングは、ＲＮＡｉ分子が、ＲＮＡ干渉を介して配列特異的様式で目的の遺伝子から転写されるｍＲＮＡの阻害または分解を開始する場合に生じ、それによって、遺伝子の産物の翻訳を防止する。
【００７２】
本明細書で、ｓｉＲＮＡに対する言及は、例えばＲＮＡ干渉を介して、標的化された遺伝子、例えばＨＤ遺伝子の発現をモジュレートできる、またはモジュレートすることが可能な、ｓｈＲＮＡおよび他の低分子ＲＮＡを含むことを意味する。かかる低分子ＲＮＡには、ｓｈＲＮＡおよびｍｉｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００７３】
ＲＮＡｉを介して、標的化された遺伝子の実質的なサイレンシングを生じる戦略が、本明細書に開示される。この戦略の使用は、標的化された遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの発現を顕著に減退させる。この戦略は、生物学的プロセスをモデル化するため、またはヒト疾患に対する治療を提供するために、標的化された遺伝子の発現を低減させる際に有用である。例えば、この戦略は、ハンチントン病に適用され得る。本明細書で使用する場合、用語「実質的なサイレンシング」とは、標的化された遺伝子のｍＲＮＡが、導入されたｓｉＲＮＡの存在によって阻害および／または分解され、その結果、標的化された遺伝子の発現が、ｓｉＲＮＡが存在しない場合に見られる発現のレベルと比較して、約１０％〜１００％低減されることを意味する。一般に、遺伝子が実質的にサイレンシングされる場合、それは、ｓｉＲＮＡが存在しない場合と比較して、少なくとも４０％、５０％、６０％、〜７０％、例えば、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、〜７９％、一般には少なくとも８０％、例えば、８１％〜８４％、少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％の発現の低減を有する。本明細書で使用する場合、用語「実質的に正常な活性」とは、ｓｉＲＮＡが細胞に導入されていない場合の遺伝子の発現のレベルを意味する。
【００７４】
ハンチントン病（ＨＤ）は、ｓｉＲＮＡベースの治療のための強力な候補である。ＨＤは、疾患タンパク質中のポリＱをコードするＣＡＧリピート伸長によって引き起こされる。ポリＱ伸長は、変異体タンパク質に、ニューロンにおける疾患タンパク質の異常な蓄積と関連する優性な毒性特性を付与する。ＨＤは、典型的には成人期に始まる、進行性の、最終的には致死的な障害である。ＣＡＧリピート／ポリＱドメインの伸長は、コードされたタンパク質に、優性な毒性特性を付与する。したがって、治療戦略として、細胞死の前に変異体遺伝子産物の発現を低下させる試みが、患者にとって高度に有益であり得る。
【００７５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子
「ＲＮＡ干渉」、「ＲＮＡｉ」、「低分子干渉ＲＮＡ」または「短鎖干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」または「短鎖ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」分子または「ｍｉＲＮＡ」は、目的の核酸配列、例えば、ハンチンチン（ｈｔｔ）に対して標的化される、ヌクレオチドのＲＮＡ二重鎖である。本明細書で使用する場合、用語「ｓｉＲＮＡ」は、ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡのサブセットを包含する一般的用語である。「ＲＮＡ二重鎖」とは、１つのＲＮＡ分子の２つの領域間の相補的対合によって形成される構造を指す。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの二重鎖部分のヌクレオチド配列が、標的化された遺伝子のヌクレオチド配列に対して相補的であるという点で、遺伝子に「標的化」される。ある特定の実施形態では、このｓｉＲＮＡは、アタキシン−１またはハンチンチンをコードする配列に標的化される。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡの二重鎖の長さは、３０塩基対未満である。一部の実施形態では、この二重鎖は、長さが２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０塩基対であり得る。一部の実施形態では、二重鎖の長さは、長さが１９〜２５塩基対である。ある特定の一実施形態では、二重鎖の長さは、長さが１９または２１塩基対である。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二重鎖部分は、ヘアピン構造の一部であり得る。この二重鎖部分に加えて、このヘアピン構造は、二重鎖を形成する２つの配列間に配置されたループ部分を含み得る。このループは、長さが変動し得る。一部の実施形態では、このループは、長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、このループは、長さが１８ヌクレオチドである。このヘアピン構造は、３’および／または５’オーバーハング部分もまた含み得る。一部の実施形態では、このオーバーハングは、長さが０、１、２、３、４または５ヌクレオチドの３’および／または５’オーバーハングである。
【００７６】
「ｓｈＲＮＡ」の転写単位は、対合していないヌクレオチドのループによって結びつけられたセンス配列およびアンチセンス配列から構成される。ｓｈＲＮＡは、エキスポーチン−５によって核からエキスポートされ、一旦細胞質中に入ると、Ｄｉｃｅｒによってプロセシングされて機能的ｓｉＲＮＡを生成する。「ｍｉＲＮＡ」ステム−ループは、Ｄｒｏｓｈａ−ＤＧＣＲ８複合体によって切り出されてｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして公知の中間体を生成し、エキスポーチン−５によって引き続いて核からエキスポートされ、一旦細胞質中に入ると、Ｄｉｃｅｒによってプロセシングされて機能的ｓｉＲＮＡを生成する、より大きい一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）の一部として典型的には発現される対合していないヌクレオチドのループによって結びつけられたセンス配列およびアンチセンス配列から構成される。「人工ｍｉＲＮＡ」または「人工ｍｉＲＮＡシャトルベクター」とは、本明細書で相互交換可能に使用する場合、有効なＤｒｏｓｈａプロセシングに必要なステムループ内の構造的エレメントを保持しつつ、標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡ配列で置き換えられた、ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒプロセシングを介して切り出される二重鎖ステムループ（少なくとも約９〜２０ヌクレオチド）の領域を有している一次ｍｉＲＮＡ転写産物を指す。用語「人工」は、隣接配列（約３５ヌクレオチド上流および約４０ヌクレオチド下流）が、ｓｉＲＮＡのマルチクローニング部位内の制限酵素部位から生じるという事実から生じる。本明細書で使用する場合、用語「ｍｉＲＮＡ」は、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列ならびに人工的に生成されたｍｉＲＮＡシャトルベクターの両方を包含する。
【００７７】
このｓｉＲＮＡは、核酸配列によってコードされ得、この核酸配列は、プロモーターもまた含み得る。この核酸配列は、ポリアデニル化シグナルもまた含み得る。一部の実施形態では、このポリアデニル化シグナルは、合成の最小ポリアデニル化シグナルまたは６Ｔの配列である。
【００７８】
「オフターゲット毒性」とは、ｓｉＲＮＡを発現するまたは含む宿主細胞の、有害な、望ましくないまたは意図しない表現型変化を指す。オフターゲット毒性は、望ましい機能の喪失、望まれない機能の獲得、またはさらには細胞レベルもしくは生物レベルでの死を生じ得る。オフターゲット毒性は、ｓｉＲＮＡの発現の際に即座に生じ得るか、または経時的に徐々に生じ得る。オフターゲット毒性は、ｓｉＲＮＡの発現の直接的結果として生じ得るか、またはｓｉＲＮＡを発現する細胞に対する宿主免疫応答の誘導の結果として生じ得る。理論によって束縛されることは望まないが、オフターゲット毒性は、細胞内の高レベルのまたは過多のＲＮＡｉ基質から生じると推論される。これらの過多のまたは過剰発現された、ｐｒｅ−またはｐｒｉ  ＲＮＡｉ基質ならびに過多の成熟アンチセンス−ＲＮＡが含まれるがこれらに限定されないＲＮＡｉ基質は、内因性ＲＮＡｉマシナリーについて競合し得、こうして、天然のｍｉＲＮＡのバイオジェネシスおよび機能を破壊する。オフターゲット毒性は、配列の部分的相補性に起因した意図しないｍＲＮＡ（即ち、オフターゲット）のサイレンシングの増加した可能性からも生じ得る。オフターゲット毒性は、ＲＮＡｉの標的化された領域またはガイド領域を超える、非ガイド領域の優先的なローディングが存在するような、非ガイド領域の適切でない鎖偏向からも生じ得る。オフターゲット毒性は、ｄｓＲＮＡ（ＩＦＮ−ｂ、ＰＫＲ、ＯＡＳ１）を含むｄｓＲＮＡに対する細胞応答の刺激からも生じ得る。「減少されたオフターゲット毒性」とは、改善された寿命もしくは生活の質、またはｓｉＲＮＡによって標的化されている疾患もしくは状態の改善された徴候もしくは症状によって測定されるように、毒性が限定的または有害であるというよりも、治療効果が宿主にとってより有益であるような、オフターゲット毒性における減少、低減、抑止または減弱を指す。「限定されたオフターゲット毒性」または「低いオフターゲット毒性」は、検出可能であってもなくても、ｓｉＲＮＡで処置された宿主にとっての治療的利益を妨げることも、それに勝ることも、それを限定することもない、治療の「副作用」とみなされ得る、細胞または生物に対する意図しない望ましくない表現型変化を指すために使用される。減少されたまたは限定されたオフターゲット毒性は、等価なｓｈＲＮＡベクターを本発明のｍｉＲＮＡシャトルベクターと比較する、ｓｉＲＮＡ基質またはｉｎ  ｖｉｖｏ効果のレベルについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析、例えば、ノーザンブロットまたはＱＰＣＲを比較することによって、決定または推論され得る。
【００７９】
「ノックダウン」、「ノックダウンテクノロジー」とは、標的遺伝子産物の産生の阻害をもたらし得る、標的遺伝子の発現がｓｉＲＮＡの導入前の遺伝子発現と比較して低減される、遺伝子サイレンシングの技術を指す。用語「低減される」は、標的遺伝子発現が１〜１００％低下されることを示すために、本明細書で使用される。言い換えると、ポリペプチドまたはタンパク質への翻訳に利用可能なＲＮＡの量が、最小化される。例えば、タンパク質の量は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５または９９％低減され得る。一部の実施形態では、発現は、約９０％低減される（即ち、タンパク質の量の約１０％のみが、ｓｉＲＮＡ分子が投与されていない細胞と比較してある細胞において観察される）。遺伝子発現のノックダウンは、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの使用によって指示され得る。
【００８０】
「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」は、ｓｉＲＮＡによって開始される配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。ＲＮＡｉの間に、ｓｉＲＮＡは、遺伝子発現の、結果としての配列特異的阻害と共に、標的ｍＲＮＡの分解を誘導する。
【００８１】
本発明の方法によれば、ハンチンチンの発現は、ＲＮＡｉを介して改変され得る。例えば、ハンチンチンの蓄積は、細胞において抑制され得る。用語「抑制する」とは、特定の細胞中に存在する転写産物の数または量における減退、低減または排除を指す。例えば、ハンチンチンをコードするｍＲＮＡの蓄積は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって細胞において抑制され得、例えば、この遺伝子は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とも呼ばれる配列特異的二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によってサイレンシングされる。これらのｓｉＲＮＡは、一緒にハイブリダイズした２つの別々のＲＮＡ分子であり得るか、または単一のヘアピンであり得、ここで、１つのＲＮＡ分子の２つの部分は、一緒にハイブリダイズして二重鎖を形成している。
【００８２】
変異体タンパク質とは、ハンチンチン中に変異、例えば、ミスセンスまたはナンセンス変異を有する遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。変異体ハンチンチンは、疾患原因性であり得る、即ち、１つまたは２つのいずれかの変異体対立遺伝子（複数可）を有する動物において、ハンチンチンの存在と関連する疾患をもたらし得る。
【００８３】
用語「遺伝子」は、生物学的機能と関連する核酸の任意のセグメントを指すために広く使用される。したがって、遺伝子は、コード配列および／またはそれらの発現に必要とされる調節配列を含む。例えば、「遺伝子」とは、調節配列を含む、ｍＲＮＡ、機能的ＲＮＡまたは特定のタンパク質を発現する核酸断片を指す。「遺伝子」は、例えば、他のタンパク質に対する認識配列を形成する、発現されないＤＮＡセグメントもまた含む。「遺伝子」は、目的の供給源からクローニングすることまたは既知のもしくは予測された配列情報から合成することを含め、種々の供給源から取得され得、所望のパラメーターを有するように設計された配列を含み得る。「対立遺伝子」は、染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替的形態のうちの１つである。
【００８４】
用語「核酸」とは、糖、リン酸およびプリンまたはピリミジンのいずれかである塩基を含むモノマー（ヌクレオチド）から構成される、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーを指す。特に限定しない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。特記しない限り、特定の核酸配列は、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明確に示された配列もまた包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１もしくは複数の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／もしくはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって、達成され得る。「核酸断片」は、所与の核酸分子の一部分である。
【００８５】
「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマー中への取込みが可能な、合成の、非天然のまたは変更されたヌクレオチド塩基を任意選択で含む、一本鎖または二本鎖であり得るＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーである。
【００８６】
用語「核酸」、「核酸分子」、「核酸断片」、「核酸配列またはセグメント」または「ポリヌクレオチド」は、相互交換可能に使用され、遺伝子、遺伝子によってコードされるｃＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡとも、相互交換可能に使用され得る。
【００８７】
本発明は、単離されたまたは実質的に精製された核酸分子およびかかる分子を含む組成物を包含する。本発明の文脈では、「単離された」または「精製された」ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、そのネイティブ環境から離れて存在し、したがって天然の産物ではない、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。単離されたＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子は、精製された形態で存在し得、または例えば、トランスジェニック宿主細胞などの非ネイティブ環境中に存在し得る。例えば、「単離された」または「精製された」核酸分子または生物学的に活性なその部分は、他の細胞性材料、もしくは組換え技術によって産生される場合には培養培地を実質的に含まない、または化学的に合成される場合には、化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。一実施形態では、「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中のその核酸に天然に隣接する配列（即ち、その核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態では、この単離された核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中のその核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列の、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満を含み得る。開示されたヌクレオチド配列の断片およびバリアントもまた、本発明によって包含される。「断片」または「部分」とは、全長または全長未満のヌクレオチド配列を意味する。
【００８８】
「天然に存在する」、「ネイティブ」または「野生型」は、人工的に産生されるのではなく、天然に見出され得る物体を記載するために使用される。例えば、自然における供給源から単離され得る、および研究員によって故意に改変されていない、生物（ウイルスを含む）中に存在するタンパク質またはヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００８９】
分子の「バリアント」は、ネイティブ分子の配列と実質的に類似した配列である。ヌクレオチド配列について、バリアントには、遺伝子コードの縮重に起因して、ネイティブタンパク質の同一のアミノ酸配列をコードする、配列が含まれる。これらのような、天然に存在する対立遺伝子バリアントは、分子生物学技術の使用によって、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術によって、同定され得る。バリアントヌクレオチド配列には、例えば、部位特異的変異誘発を使用することによって生成されたものなどの、ネイティブタンパク質をコードする、合成由来のヌクレオチド配列、ならびにアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするものもまた含まれる。一般に、本発明のヌクレオチド配列バリアントは、ネイティブ（内因性）ヌクレオチド配列に対して、少なくとも４０％、５０％、６０％、〜７０％、例えば、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、〜７９％、一般には少なくとも８０％、例えば、８１％〜８４％、少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、〜９８％の配列同一性を有する。
【００９０】
「導入遺伝子」とは、形質転換によってゲノム中に導入された遺伝子を指す。導入遺伝子には、例えば、形質転換される特定の細胞のＤＮＡに対して異種または相同のいずれかであるＤＮＡが含まれる。さらに、導入遺伝子には、非ネイティブ生物中に挿入されたネイティブ遺伝子、またはキメラ遺伝子が含まれ得る。
【００９１】
用語「内因性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその天然の場所にあるネイティブ遺伝子を指す。
【００９２】
用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書で相互交換可能に使用される。
【００９３】
「野生型」とは、天然に見出される正常の遺伝子または生物を指す。
【００９４】
「ゲノム」とは、生物の完全遺伝子材料を指す。
【００９５】
「ベクター」は、とりわけ、自己伝播性もしくは可動性であってもなくてもよく、細胞ゲノム中への組込みによって原核生物宿主もしくは真核生物宿主のいずれかを形質転換でき、または染色体外に存在し得る（例えば、複製起点を有する自律複製性プラスミド）、二本鎖または一本鎖の線状または環状形態の、任意のウイルスベクター、ならびに任意のプラスミド、コスミド、ファージまたはバイナリーベクターを含むと定義される。
【００９６】
「発現カセット」とは、本明細書で使用する場合、終結シグナルに作動可能に連結し得る目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターを含み得る、適切な宿主細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指示することが可能な核酸配列を意味する。コード領域は、通常、目的の機能的ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡをコードする。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであり得る。この発現カセットは、天然に存在するが、異種発現のために有用な組換え形態で取得されているものでもあり得る。この発現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターの、または宿主細胞がある特定の刺激に曝露された場合にのみ転写を開始させる調節可能なプロモーターの制御下にあり得る。多細胞生物の場合、このプロモーターは、特定の組織もしくは臓器または発生段階に特異的でもあり得る。
【００９７】
かかる発現カセットは、目的のヌクレオチド配列に連結された転写イニシエーション領域を含み得る。かかる発現カセットには、調節領域の転写調節下になるような目的の遺伝子の挿入のための複数の制限部位が提供される。この発現カセットは、選択可能なマーカー遺伝子をさらに含み得る。
【００９８】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。これは、「中断されていないコード配列」、即ち、例えばｃＤＮＡ中の、イントロンを欠くコード配列を構成し得、または適切なスプライスジャンクションによって境界された１もしくは複数のイントロンを含み得る。「イントロン」は、一次転写産物中に含まれるが、細胞内でのＲＮＡの切断および再ライゲーションを介して除去されて、タンパク質へと翻訳され得る成熟ｍＲＮＡを創出する、ＲＮＡの配列である。
【００９９】
用語「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）とは、コード配列の翻訳イニシエーションコドンと終結コドンとの間の配列を指す。用語「イニシエーションコドン」および「終結コドン」とは、タンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）のイニシエーションおよび鎖終結をそれぞれ特定する、コード配列中の３つの隣接するヌクレオチドの単位（「コドン」）を指す。
【０１００】
「機能的ＲＮＡ」とは、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、または翻訳されない可能性があるが、少なくとも１つの細胞性プロセスに対する影響をなおも有する他のＲＮＡを指す。
【０１０１】
用語「ＲＮＡ転写産物」または「転写産物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼで触媒された転写から生じる産物を指す。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、これは一次転写産物と呼ばれるか、またはこれは、一次転写産物の転写後プロセシングに由来するＲＮＡ配列であり得、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）とは、イントロンなしの、細胞によってタンパク質へと翻訳され得るＲＮＡを指す。
【０１０２】
「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的でありそのｍＲＮＡに由来する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡを指す。
【０１０３】
「調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列の内部、またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を与える、ヌクレオチド配列である。調節配列には、エンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロンおよびポリアデニル化シグナル配列が含まれる。これらには、天然および合成の配列、ならびに合成および天然の配列の組合せであり得る配列が含まれる。本明細書で留意するように、用語「適切な調節配列」は、プロモーターに限定されない。しかし、本発明において有用ないくつかの適切な調節配列には、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、調節可能なプロモーターおよびウイルスプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。
【０１０４】
「５’非コード配列」とは、コード配列に対して５’側（上流）に位置するヌクレオチド配列を指す。これは、イニシエーションコドンの上流の完全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に存在し、ｍＲＮＡへの一次転写産物のプロセシング、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響を与え得る。
【０１０５】
「３’非コード配列」とは、コード配列に対して３’側（下流）に位置するヌクレオチド配列を指し、ポリアデニル化シグナル配列、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与えることが可能な調節シグナルをコードする他の配列が含まれ得る。このポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を与えることによって特徴付けられる。
【０１０６】
用語「翻訳リーダー配列」とは、プロモーターと、ＲＮＡへと転写されるコード配列との間の遺伝子のＤＮＡ配列部分を指し、翻訳開始コドンの上流（５’側）の完全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に存在する。この翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの一次転写産物のプロセシング、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響を与え得る。
【０１０７】
用語「成熟」タンパク質とは、そのシグナルペプチドなしの、翻訳後プロセシングされたポリペプチドを指す。「前駆体」タンパク質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物を指す。「シグナルペプチド」とは、前駆体ペプチドを形成するポリペプチドと併せて翻訳され、分泌経路へのその進入のために必要とされる、ポリペプチドのアミノ末端伸長を指す。用語「シグナル配列」とは、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を指す。
【０１０８】
「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼおよび適切な転写のために必要とされる他の因子に対する認識を提供することによって、コード配列の発現を指示および／または制御する、通常はそのコード配列の上流（５’側）の、ヌクレオチド配列を指す。「プロモーター」には、ＴＡＴＡ−ボックスから構成される短いＤＮＡ配列であるミニマルプロモーター、および調節エレメントが発現の制御のために付加される、転写イニシエーションの部位を特定するように機能する他の配列が含まれる。「プロモーター」とは、ミニマルプロモーター＋コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能な調節エレメントを含むヌクレオチド配列もまた指す。この型のプロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、エンハンサーと呼ばれる場合が多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激でき、プロモーターの生得的エレメント、またはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであり得る、ＤＮＡ配列である。これは、両方の配向（正常または反転した）で作動することが可能であり、プロモーターから上流または下流のいずれかに移動させた場合であっても機能することが可能である。エンハンサーおよび他の上流プロモーターエレメントの両方が、それらの効果を媒介する配列特異的ＤＮＡ結合性タンパク質を結合する。プロモーターは、その全体がネイティブ遺伝子に由来し得る、または天然に見出される異なるプロモーター由来の異なるエレメントから構成され得る、またはさらには合成ＤＮＡセグメントから構成され得る。プロモーターは、生理学的条件または発生条件に応答した転写イニシエーションの有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列もまた含み得る。本発明において使用され得るプロモーターの例には、マウスＵ６  ＲＮＡプロモーター、合成ヒトＨ１ＲＮＡプロモーター、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが含まれる。
【０１０９】
「イニシエーション部位」は、＋１位としても規定される、転写された配列の一部である最初のヌクレオチド周辺の位置である。この部位に対して、遺伝子およびその制御領域の全ての他の配列が番号付けされる。下流配列（即ち、３’方向にあるさらなるタンパク質コード配列）は、正で表示され、上流配列（大部分は、５’方向にある制御領域の）は、負で表示される。
【０１１０】
プロモーターエレメント、特に、上流活性化の非存在下で不活性であるかまたは大きく低減されたプロモーター活性を有するＴＡＴＡエレメントは、「ミニマルまたはコアプロモーター」と呼ばれる。適切な転写因子の存在下で、このミニマルプロモーターは、転写を可能にするように機能する。したがって、「ミニマルまたはコアプロモーター」は、転写イニシエーションに必要な全ての基本エレメント、例えば、ＴＡＴＡボックスおよび／またはイニシエーターのみからなる。
【０１１１】
「構成的発現」とは、構成的または調節されたプロモーターを使用した発現を指す。「条件的」および「調節された発現」とは、調節されたプロモーターによって制御される発現を指す。
【０１１２】
「作動可能に連結した」とは、配列のうちの１つの機能が別の配列によって影響を受けるような、単一の核酸断片上での核酸配列の関連を指す。例えば、コードするＤＮＡ配列の発現に調節ＤＮＡ配列が影響を与える（即ち、コード配列または機能的ＲＮＡが、プロモーターの転写制御下にある）ように２つの配列が配置される場合、調節ＤＮＡ配列は、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列「に作動可能に連結した」またはそれ「と関連した」と言われる。コード配列は、センス配向またはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結し得る。
【０１１３】
「発現」とは、細胞中での内因性遺伝子、異種遺伝子もしくは核酸セグメント、または導入遺伝子の転写および／または翻訳を指す。例えば、ｓｉＲＮＡ構築物の場合、発現とは、ｓｉＲＮＡのみの転写を指し得る。さらに、発現とは、センス（ｍＲＮＡ）または機能的ＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現は、タンパク質の産生もまた指し得る。
【０１１４】
「変更されたレベル」とは、正常なまたは形質転換されていない細胞または生物のものとは異なる、トランスジェニック細胞または生物における発現のレベルを指す。
【０１１５】
「過剰発現」とは、正常なまたは形質転換されていない細胞または生物における発現のレベルを超える、トランスジェニック細胞または生物における発現のレベルを指す。
【０１１６】
「アンチセンス阻害」とは、内因性遺伝子または導入遺伝子からのタンパク質の発現を抑制することが可能なアンチセンスＲＮＡ転写産物の産生を指す。
【０１１７】
「転写停止断片」とは、転写を終結させることが可能な、ポリアデニル化シグナル配列などの１または複数の調節シグナルを含むヌクレオチド配列を指す。例には、ノパリンシンターゼ、およびリブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットをコードする遺伝子の３’非調節領域が含まれる。
【０１１８】
「翻訳停止断片」とは、翻訳を終結させることが可能な、３つ全てのフレームでの１または複数の終結コドンなどの１または複数の調節シグナルを含むヌクレオチド配列を指す。コード配列の５’末端におけるイニシエーションコドンに隣接するまたはその近傍での翻訳停止断片の挿入は、翻訳を生じないまたは不適切な翻訳を生じる。部位特異的組換えによる翻訳停止断片の切り出しは、イニシエーションコドンを使用する適切な翻訳を妨害しないコード配列中の部位特異的配列を残す。
【０１１９】
用語「シス作用性配列」および「シス作用性エレメント」とは、それらの機能が、同じ分子上にそれらが存在することを必要とする、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。レプリコン上のシス作用性配列の一例は、ウイルス複製起点である。
【０１２０】
用語「トランス作用性配列」および「トランス作用性エレメント」とは、それらの機能が、同じ分子上にそれらが存在することを必要としない、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。
【０１２１】
「染色体に組み込まれた」とは、共有結合による宿主ＤＮＡ中への外来遺伝子または核酸構築物の組込みを指す。遺伝子が「染色体に組み込まれ」ていない場合、それらは、「一過的に発現され」得る。遺伝子の一過的発現とは、宿主染色体中に組み込まれていないが、自律複製性プラスミドもしくは発現カセットの一部としての、例えば、またはウイルスなどの別の生物学的系の一部としての、独立して機能する遺伝子の発現を指す。
【０１２２】
以下の用語は、２またはそれ超の核酸またはポリヌクレオチド間の配列の関連性を記載するために使用される：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウインドウ」、（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性の百分率」および（ｅ）「実質的同一性」。
【０１２３】
（ａ）本明細書で使用する場合、「参照配列」は、配列比較のための基礎として使用される規定された配列である。参照配列は、例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列など、特定された配列のサブセットまたは全体であり得る。
【０１２４】
（ｂ）本明細書で使用する場合、「比較ウインドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続している特定されたセグメントに言及し、ここで、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して、付加または欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。一般に、この比較ウインドウは、長さが少なくとも２０連続しているヌクレオチドであり、任意選択で、３０、４０、５０、１００またはそれ超であり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列中にギャップを含むことに起因した参照配列との高い類似性を回避するために、ギャップペナルティが典型的には導入され、マッチの数から差し引かれることを理解している。
【０１２５】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野で周知である。したがって、任意の２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを使用して達成され得る。
【０１２６】
これらの数学アルゴリズムのコンピューター実行は、配列同一性を決定するための配列の比較のために利用され得る。かかる実行には、以下が含まれるがこれらに限定されない：ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム中のＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡから入手可能）中のＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）ならびにＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ。これらのプログラムを使用するアラインメントは、デフォルトパラメーターを使用して実施され得る。
【０１２７】
ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインした場合にマッチするまたはいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たす、クエリー配列中の長さＷのショートワードを同定することによって、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる。これらの初期近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、これらのワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方の方向で伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（マッチする残基の対についての報酬スコア（reward  score）；通常＞０）およびＮ（ミスマッチする残基についてのペナルティスコア；通常＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列について、スコアリングマトリックスが、累積スコアを計算するために使用される。各方向でのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、その最大の達成された値から量Ｘ下落する場合、累積スコアが、１もしくは複数の負のスコアの残基アラインメントの蓄積に起因してゼロもしくはそれ未満になる場合、またはいずれかの配列の末端に到達した場合に、停止する。
【０１２８】
パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析もまた実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド配列間のマッチが偶然生じる確率の指標を提供する、最小和確率（smallest  sum  probability）（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸配列は、試験核酸配列と参照核酸配列との比較における最小和確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、参照配列と類似とみなされる。
【０１２９】
比較目的のためにギャップ付きアラインメントを取得するために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０中の）が利用され得る。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０中の）が、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施するために使用され得る。ＢＬＡＳＴを利用する場合、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、それぞれのプログラム（例えば、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメーターが使用され得る。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を、デフォルトとして使用する。アラインメントは、検査によって手動でも実施され得る。
【０１３０】
本発明の目的のために、本明細書に開示されるプロモーター配列に対するパーセント配列同一性の決定のためのヌクレオチド配列の比較は、好ましくは、そのデフォルトパラメーターを用いるＢｌａｓｔＮプログラム（バージョン１．４．７またはそれ以降）または任意の等価なプログラムを使用して行われる。「等価なプログラム」とは、問題の任意の２つの配列について、好ましいプログラムによって生成された対応するアラインメントと比較した場合に、同一のヌクレオチドマッチおよび同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する、任意の配列比較プログラムを意図する。
【０１３１】
（ｃ）本明細書で使用する場合、２つの核酸配列に関して「配列同一性」または「同一性」は、配列比較アルゴリズムまたは目視検査によって測定されるような、特定された比較ウインドウにわたる最大の対応のためにアラインされた場合に同じである２つの配列中のヌクレオチドの、特定された百分率に言及する。
【０１３２】
（ｄ）本明細書で使用する場合、「配列同一性の百分率」とは、比較ウインドウにわたって２つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定される値を意味し、ここで、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して、付加または欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。この百分率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較のウインドウ中の位置の総数によって除算し、結果に１００を乗算して配列同一性の百分率を得ることによって、計算される。
【０１３３】
（ｅ）ポリヌクレオチド配列の用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーターを使用して記載されるアラインメントプログラムの１つを使用して、参照配列と比較して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％または７９％、好ましくは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％または９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。
【０１３４】
ヌクレオチド配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするかどうかである。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特異的配列についての熱的融点（thermal  melting  point）（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように、選択される。しかし、ストリンジェントな条件は、本明細書で他の方法で適格とされる場合、ストリンジェンシーの所望の程度に依存して、約１℃〜約２０℃の範囲の温度を包含する。
【０１３５】
配列比較のために、典型的には１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列は、コンピューター中にインプットされ、必要に応じて下位配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次いで、この配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した、試験配列（複数可）についてのパーセント配列同一性を計算する。
【０１３６】
本明細書で留意するように、２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。語句「〜に特異的にハイブリダイズする」とは、その配列が複雑な混合物（例えば、総細胞性）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合、ストリンジェントな条件下での、特定のヌクレオチド配列のみへの分子の結合、二重鎖形成またはハイブリダイズを指す。「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的ハイブリダイゼーションを指し、標的核酸配列の所望の検出を達成するためにハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを低減させることによって達成され得る軽微なミスマッチを包含する。
【０１３７】
核酸ハイブリダイゼーション実験、例えば、サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションに関して、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、異なる環境パラメーターの下で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。Ｔｍは、完全にマッチしたプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨの下）である。特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのために、このＴｍは、以下の方程式から概算され得る：Ｔｍ  ８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルム）−５００／Ｌ；式中、Ｍは、一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの百分率であり、％ホルムは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、Ｌは、塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔｍは、各１％のミスマッチにつき約１℃低減される；したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするように調整され得る。例えば、＞９０％同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍは、１０℃減少され得る。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特異的配列およびその相補体についての熱的融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように、選択される。しかし、苛酷にストリンジェントな条件は、熱的融点（Ｔｍ）よりも１、２、３または４℃低い温度におけるハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る；中程度にストリンジェントな条件は、熱的融点（Ｔｍ）よりも６、７、８、９または１０℃低い温度におけるハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る；低いストリンジェンシーの条件は、熱的融点（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低い温度におけるハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。この方程式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望のＴを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーにおけるバリエーションが、固有に記載されることを理解する。所望の程度のミスマッチが、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴを生じる場合、より高い温度が使用できるように、ＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特異的配列についての熱的融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように、選択される。
【０１３８】
高度にストリンジェントな洗浄条件の一例は、７２℃で約１５分間の０．１５Ｍ  ＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、６５℃で１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の記述については、SambrookおよびRussell  ２００１年を参照のこと）。しばしば、高いストリンジェンシーの洗浄には、背景プローブシグナルを除去するための低いストリンジェンシーの洗浄が先行する。短い核酸配列（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）について、ストリンジェントな条件は、典型的には、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．５Ｍ未満、より好ましくは約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）の塩濃度を含み、この温度は、典型的には少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成され得る。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係のプローブについて観察されるものの２×（またはそれよりも高い）のシグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。非常にストリンジェントな条件は、特定の核酸分子についてのＴｍと等しくなるように、選択される。
【０１３９】
非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴｍと等しくなるように、選択される。サザンまたはノーザンブロットにおけるフィルター上での、１００よりも多い相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントな条件の一例は、５０％ホルムアミド、例えば、３７℃で５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃で０．１×ＳＳＣ中での洗浄である。例示的な低いストリンジェンシーの条件は、３７℃で３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いたハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃で１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中での洗浄を含む。例示的な中程度のストリンジェンシーの条件は、３７℃で４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃で０．５×〜１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。
【０１４０】
用語「形質転換」とは、遺伝的に安定な遺伝を生じる、宿主細胞のゲノム中への核酸断片の移入を指す。「宿主細胞」は、外因性核酸分子によって形質転換されたまたは形質転換が可能な細胞である。形質転換された核酸断片を含む宿主細胞は、「トランスジェニック」細胞と呼ばれる。
【０１４１】
「形質転換された」、「形質導入された」、「トランスジェニック」および「組換え」とは、異種核酸分子が導入された宿主細胞を指す。本明細書で使用する場合、用語「トランスフェクション」とは、真核生物（例えば、哺乳動物）細胞中へのＤＮＡの送達を指す。用語「形質転換」は、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中へのＤＮＡの送達を指すために、本明細書で使用される。用語「形質導入」は、ウイルス粒子を細胞に感染させることを指すために、本明細書で使用される。核酸分子は、当技術分野で一般に公知のゲノム中に安定に組み込まれ得る。ＰＣＲの公知の方法には、対プライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的にミスマッチしたプライマーなどを使用する方法が含まれるがこれらに限定されない。例えば、「形質転換された」、「形質転換体」および「トランスジェニック」細胞は、形質転換プロセスを経ており、それらの染色体中に組み込まれた外来遺伝子を含む。用語「形質転換されていない」とは、形質転換プロセスを経ていない正常細胞を指す。
【０１４２】
「遺伝的に変更された細胞」は、組換え核酸または異種核酸（例えば、１もしくは複数のＤＮＡ構築物またはそれらのＲＮＡ対応物）の導入によって改変された細胞を示し、かかる遺伝的改変の一部または全てを保持するかかる細胞の子孫をさらに含む。
【０１４３】
本明細書で使用する場合、ヌクレオチド分子に関して、用語「由来する（derived）」または「〜に対する（directed  to）」とは、その分子が、目的の特定の分子に対して相補的な配列同一性を有することを意味する。
【０１４４】
本発明のｓｉＲＮＡは、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写、組換えまたは合成手段によって、生成され得る。一例では、ｓｉＲＮＡは、組換え酵素、例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡオリゴヌクレオチド鋳型を使用することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成され得る。
【０１４５】
本発明の核酸分子
用語「単離および／または精製された」とは、核酸が配列決定、複製および／または発現され得るような、その天然の細胞環境からの、および核酸またはポリペプチドなどの細胞の他の構成成分との関連からの、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子などの核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ単離を指す。ＲＮＡまたはＤＮＡは、そのＲＮＡまたはＤＮＡの天然の供給源においてそれが通常関連する少なくとも１つの混入核酸を含まない、好ましくは、任意の他の哺乳動物のＲＮＡまたはＤＮＡを実質的に含まないという点で、「単離され」ている。語句「それが通常関連する少なくとも１つの混入供給源核酸を含まない」は、核酸が、供給源もしくは天然の細胞中に再導入されるが、異なる染色体場所にある場合、または供給源細胞中に通常は見出されない核酸配列が他の方法で、例えば、ベクターもしくはプラスミド中で隣接する場合を含む。
【０１４６】
ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に加えて、本発明の核酸分子は、標的遺伝子の発現を阻害するためにも有用な二本鎖干渉ＲＮＡ分子を含む。
【０１４７】
本明細書で使用する場合、用語「組換え核酸」、例えば、「組換えＤＮＡ配列またはセグメント」とは、その配列が、天然には存在していないか、または外因性ＤＮＡで形質転換されていないゲノム中に配置されるようには配置されていない天然に存在する配列に対応するように、任意の適切な細胞性供給源から誘導または単離され、引き続いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで化学的に変更され得る、ＤＮＡなどの核酸を指す。供給源に「由来する」予め選択されたＤＮＡの一例は、所与の生物内で有用な断片として同定され、次いで本質的に純粋な形態で化学的に合成される、ＤＮＡ配列である。供給源から「単離された」かかるＤＮＡの一例は、それが、本発明における使用のために、遺伝子操作の方法論によって、さらに操作、例えば増幅され得るように、化学的手段によって、例えば、制限エンドヌクレアーゼの使用によって、供給源から切り出されたまたは取り出された有用なＤＮＡ配列である。「組換えＤＮＡ」には、完全に合成のＤＮＡ配列、半合成ＤＮＡ配列、生物学的供給源から単離されたＤＮＡ配列、およびＲＮＡに由来するＤＮＡ配列、ならびにそれらの混合物が含まれる。
【０１４８】
本発明の発現カセット
発現カセットを調製するために、組換えＤＮＡ配列またはセグメントは、環状または線状、二本鎖または一本鎖であり得る。一般に、このＤＮＡ配列またはセグメントは、得られた形質転換された細胞中に存在する組換えＤＮＡの発現を促進する制御配列が隣接するコード領域もまた含み得る、キメラＤＮＡ、例えば、プラスミドＤＮＡまたはベクターの形態である。
【０１４９】
「キメラ」ベクターまたは発現カセットとは、本明細書で使用する場合、少なくとも２つの異なる種由来の核酸配列を含むベクターもしくはカセットを意味し、または「ネイティブ」もしくは野生型の種には存在しない様式で連結もしくは関連する同じ種由来の核酸配列を有する。
【０１５０】
ＲＮＡ転写産物のための転写単位として機能する組換えＤＮＡ配列またはその部分とは別に、調節機能または構造的機能を果たす組換えＤＮＡの一部分は、転写されない可能性がある。例えば、この組換えＤＮＡは、哺乳動物細胞において活性なプロモーターを有し得る。
【０１５１】
宿主細胞において機能的な他のエレメント、例えば、イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化配列などもまた、組換えＤＮＡの一部であり得る。かかるエレメントは、ＤＮＡの機能に必要であってもなくてもよいが、転写、ｓｉＲＮＡの安定性などに影響を与えることによって、ＤＮＡの改善された発現を提供し得る。かかるエレメントは、細胞中でのｓｉＲＮＡの最適な性能を得ることが望まれる場合に、ＤＮＡ中に含まれ得る。
【０１５２】
制御配列は、特定の宿主生物中での、作動可能に連結したコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列である。原核生物細胞に適切な制御配列には、例えば、プロモーター、および任意選択でオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが公知である。
【０１５３】
作動可能に連結した核酸は、別の核酸配列と機能的に関連して配置された核酸である。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は、連結された、接しているＤＮＡ配列である。しかし、エンハンサーは、接している必要はない。連結は、簡便な制限部位におけるライゲーションによって達成される。かかる部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の実務に従って使用される。
【０１５４】
細胞中に導入される組換えＤＮＡは、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させることが求められる細胞の集団からの発現細胞の同定および選択を促進するために、選択可能なマーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたはそれら両方を含み得る。他の実施形態では、選択可能なマーカーは、ＤＮＡの別々の小片上に保有され得、共トランスフェクション手順において使用され得る。選択可能なマーカーおよびレポーター遺伝子の両方が、宿主細胞における発現を可能にするために、適切な調節配列と隣接され得る。有用な選択可能なマーカーは、当技術分野で公知であり、これには、例えば、例えばｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
【０１５５】
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するため、および調節配列の機能性を評価するために、使用される。容易にアッセイ可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子は、当技術分野で周知である。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織中に存在することもレシピエント生物または組織によって発現されることもない、いくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によってその発現が顕在化されるタンパク質をコードする、遺伝子である。例えば、レポーター遺伝子には、Ｅ．ｃｏｌｉのＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ）およびホタルＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼ遺伝子が含まれる。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞中に導入された後の適切な時点においてアッセイされる。
【０１５６】
標的細胞をトランスフェクトできる組換えＤＮＡを構築するための一般的方法は、当業者に周知であり、構築の同じ組成物および方法が、本明細書で有用なＤＮＡを産生するために利用され得る。
【０１５７】
この組換えＤＮＡは、本発明のＤＮＡ分子または配列が宿主細胞によって発現されるように、そのゲノム中に安定に組み込まれたまたはエピソームエレメントとして存在する組換えＤＮＡを有する細胞を得るために、特定の細胞中への導入のために有用な任意の手順、例えば、物理的または生物学的方法による、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡから構成される発現ベクターによるトランスフェクションによって、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞中に容易に導入され得る。好ましくは、ＤＮＡは、ベクターを介して宿主細胞中に導入される。この宿主細胞は、好ましくは、真核生物起源、例えば、植物、哺乳動物、昆虫、酵母または真菌供給源のものであるが、非真核生物起源の宿主細胞もまた使用され得る。
【０１５８】
予め選択されたＤＮＡを宿主細胞中に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。目的のＤＮＡを宿主細胞中に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスベクターの使用が含まれる。哺乳動物遺伝子治療のために、本明細書の以下に記載されるように、１コピーの遺伝子を宿主ゲノム中に挿入する効率的な手段を使用することが望ましい。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物、例えば、ヒト細胞中に挿入するための、最も広く使用される方法になっている。他のウイルスベクターは、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および米国特許第５，５８５，３６２号を参照のこと。
【０１５９】
本明細書で論じる場合、「トランスフェクトされた」または「形質導入された」宿主細胞または細胞株は、ゲノムが、少なくとも１つの異種または組換え核酸配列の存在によって変更または増強されている、宿主細胞または細胞株である。本発明の宿主細胞は、典型的には、プラスミド発現ベクター、ウイルス発現ベクター中のＤＮＡ配列による、または単離された線状ＤＮＡ配列としてのトランスフェクションによって、産生される。トランスフェクトされたＤＮＡは、ｓｉＲＮＡをコードする配列から構成される、染色体に組み込まれた組換えＤＮＡ配列になり得る。
【０１６０】
宿主細胞中の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、種々のアッセイが実施され得る。かかるアッセイには、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）による、または本発明の範囲内に入る薬剤を同定するための本明細書に記載されるアッセイによる、特定のペプチドの存在または非存在を検出するなどの、「生化学的」アッセイが含まれる。
【０１６１】
導入された組換えＤＮＡセグメントから産生されたＲＮＡを検出および定量化するために、ＲＴ−ＰＣＲが使用され得る。ＰＣＲのこの適用では、最初に、逆転写酵素などの酵素を使用してＲＮＡをＤＮＡに逆転写し、次いで、従来のＰＣＲ技術の使用を介してＤＮＡを増幅することが、必要である。ほとんどの場合、ＰＣＲ技術は、有用ではあるが、ＲＮＡ産物の完全性を実証しない。ＲＮＡ産物の性質に関するさらなる情報は、ノーザンブロッティングによって取得され得る。この技術は、ＲＮＡ種の存在を実証し、そのＲＮＡの完全性に関する情報を提供する。ＲＮＡ種の存在または非存在は、ドットまたはスロットブロットノーザンハイブリダイゼーションを使用しても決定され得る。これらの技術は、ノーザンブロッティングの改変であり、ＲＮＡ種の存在または非存在を実証するだけである。
【０１６２】
サザンブロッティングおよびＰＣＲは、問題の組換えＤＮＡセグメントを検出するために使用され得るが、これらは、予め選択されたＤＮＡセグメントが発現されているかどうかに関する情報を提供しない。発現は、導入された組換えＤＮＡ配列のペプチド産物を具体的に同定すること、または宿主細胞における導入された組換えＤＮＡセグメントの発現によってもたらされる表現型変化を評価することによって、評価され得る。
【０１６３】
本発明は、哺乳動物レシピエントにおいて外因性核酸材料を発現するための細胞発現系を提供する。この発現系は、「遺伝的に改変された細胞」とも呼ばれ、細胞および外因性核酸材料を発現するための発現ベクターを含む。遺伝的に改変された細胞は、哺乳動物レシピエントへの投与に適切であり、そこで、これらは、レシピエントの内因性細胞を置き換える。したがって、好ましい遺伝的に改変された細胞は、不死化されておらず、非腫瘍原性である。
【０１６４】
一実施形態によれば、これらの細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクトされるまたは他の方法で遺伝的に改変される。これらの細胞は、哺乳動物（好ましくはヒト）から単離され、治療剤をコードする異種（例えば、組換え）遺伝子を発現させるためのベクターで核酸導入され（即ち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入またはトランスフェクトされ）、次いで、ｉｎ  ｓｉｔｕでの治療剤の送達のために哺乳動物レシピエントに投与される。この哺乳動物レシピエントは、ヒトであり得、改変される細胞は、自家細胞である、即ち、これらの細胞は、哺乳動物レシピエントから単離される。
【０１６５】
別の一実施形態によれば、これらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトもしくは形質導入されまたは他の方法で遺伝的に改変される。哺乳動物レシピエント由来の細胞は、治療剤をコードする異種（例えば、組換え）遺伝子を発現させるための外因性核酸材料を含むベクターでｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入またはトランスフェクトされ、この治療剤は、ｉｎ  ｓｉｔｕで送達される。
【０１６６】
本明細書で使用する場合、「外因性核酸材料」とは、細胞中に天然には見出されない、天然または合成のいずれかの核酸またはオリゴヌクレオチドを指し；またはそれが細胞中に天然に見出される場合には、その元のまたはネイティブ形態から改変されている。したがって、「外因性核酸材料」には、例えば、アンチセンスＲＮＡへと転写され得る天然に存在しない核酸、ｓｉＲＮＡ、ならびに「異種遺伝子」（即ち、同じ型の天然に存在する細胞において発現されないまたは生物学的に顕著でないレベルで発現されるタンパク質をコードする遺伝子）が含まれる。説明するために、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする合成または天然の遺伝子は、ヒト腹膜中皮細胞に関して「外因性核酸材料」とみなされるが、それは、後者の細胞が、ＥＰＯを天然には発現しないからである。「外因性核酸材料」のなお別の例は、相同組換えを介して調節可能なプロモーターを内因性コード配列と組み合わせるなどの、組換え遺伝子を創出するための遺伝子の一部のみの導入である。
【０１６７】
遺伝子阻害治療に従順な状態は、予防的プロセス、即ち、疾患または望ましくない医学的状態を予防するためのプロセスであり得る。したがって、本発明は、予防的機能を有するｓｉＲＮＡ（即ち、予防剤）を哺乳動物レシピエントに送達するための系を包含する。
【０１６８】
細胞中に本発明の発現カセットを導入するための方法
阻害性核酸材料（例えば、目的の遺伝子に対するｓｉＲＮＡをコードする発現カセット）は、遺伝的に改変された細胞を提供するために、遺伝子移入方法、例えば、トランスフェクションまたは形質導入によって、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞中に導入され得る。種々の発現ベクター（即ち、標的細胞中への外因性核酸の送達を促進するためのビヒクル）が、当業者に公知である。
【０１６９】
本明細書で使用する場合、「細胞のトランスフェクション」とは、添加されたＤＮＡの取込みによる、細胞による新たな核酸材料の獲得を指す。したがって、トランスフェクションとは、物理的または化学的方法を使用した、細胞中への核酸の挿入を指す。リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション、タングステン粒子促進性微粒子銃およびリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿を含む、いくつかのトランスフェクション技術が、当業者に公知である。
【０１７０】
対照的に、「細胞の形質導入」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスを使用して細胞中に核酸を移入させるプロセスを指す。細胞中に核酸を移入させるためのＲＮＡウイルス（即ち、レトロウイルス）は、本明細書で、形質導入性キメラレトロウイルスと呼ばれる。レトロウイルス内に含まれる外因性核酸材料は、形質導入された細胞のゲノム中に取り込まれる。キメラＤＮＡウイルス（例えば、治療剤をコードするｃＤＮＡを保有するアデノウイルス）が形質導入された細胞は、そのゲノム中に取り込まれた外因性核酸材料を有さないが、細胞内に染色体外で保持される外因性核酸材料を発現することが可能である。
【０１７１】
この外因性核酸材料は、転写を制御するためのプロモーターと一緒に、ｓｉＲＮＡをコードする核酸を含み得る。このプロモーターは、特徴的に、転写を開始するために必要な特異的ヌクレオチド配列を有する。この外因性核酸材料は、所望の遺伝子転写活性を得るために必要とされるさらなる配列（即ち、エンハンサー）をさらに含み得る。この論述の目的のために、「エンハンサー」は、単に、プロモーターによって命令される基底転写レベルを変化させるために、コード配列と（シスで）共に働く任意の非翻訳ＤＮＡ配列である。この外因性核酸材料は、プロモーターおよびコード配列が、コード配列の転写を可能にするように作動可能に連結されるように、プロモーターのすぐ下流で細胞ゲノム中に導入され得る。発現ベクターは、挿入された外因性遺伝子の転写を制御するための外因性プロモーターエレメントを含み得る。かかる外因性プロモーターには、構成的プロモーターおよび調節可能なプロモーターの両方が含まれる。
【０１７２】
天然に存在する構成的プロモーターは、重要な細胞機能の発現を制御する。結果として、構成的プロモーターの制御下にある核酸配列は、細胞成長の全ての条件下で発現される。構成的プロモーターには、特定の構成的または「ハウスキーピング」機能をコードする以下の遺伝子のためのプロモーターが含まれる：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼ、ベータ−アクチンプロモーター、および当業者に公知の他の構成的プロモーター。さらに、多くのウイルスプロモーターが、真核生物細胞において構成的に機能する。これらには、とりわけ、以下が含まれる：ＳＶ４０の初期および後期プロモーター；モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長鎖末端リピート（ＬＴＲ）；ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター。
【０１７３】
調節可能なプロモーターの制御下にある核酸配列は、それのみで、または誘導剤もしくは抑圧剤の存在下でより高いもしくはより低い程度まで、発現される（例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下での転写は、特定の金属イオンの存在下で、大きく増加される）。調節可能なプロモーターは、それらの誘導因子が結合した場合に転写を刺激する応答性エレメント（ＲＥ）を含む。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸、サイクリックＡＭＰ、ならびにテトラサイクリンおよびドキシサイクリンに対するＲＥが存在する。特定のＲＥを含むプロモーターが、調節可能な応答を得るために選択され得、一部の場合には、ＲＥ自体が、異なるプロモーターに結合され得、それによって、コードされた核酸配列に調節可能性を付与する。したがって、適切なプロモーター（構成的対調節可能な；強い対弱い）を選択することによって、遺伝的に改変された細胞における核酸配列の発現の存在およびレベルの両方を制御することが可能である。核酸配列が調節可能なプロモーターの制御下にある場合、ｉｎ  ｓｉｔｕでの治療剤の送達は、例えば、この薬剤の転写を制御する調節可能なプロモーターの特異的誘導因子の腹腔内注射によって、この核酸配列の転写を可能にするための条件に、遺伝的に改変された細胞をｉｎ  ｓｉｔｕで曝露することによって、誘発される。例えば、遺伝的に改変された細胞におけるメタロチオネインプロモーターの制御下にある核酸配列のｉｎ  ｓｉｔｕ発現は、この遺伝的に改変された細胞を適切な（即ち、誘導性の）金属イオンを含む溶液とｉｎ  ｓｉｔｕで接触させることによって、増強される。
【０１７４】
したがって、ｉｎ  ｓｉｔｕで生成されるｓｉＲＮＡの量は、核酸配列の転写を指示するために使用されるプロモーターの性質（即ち、プロモーターが構成的か調節可能か、強いか弱いか）、および細胞中にあるｓｉＲＮＡ配列をコードする外因性核酸配列のコピー数などの因子を制御することによって、調節される。
【０１７５】
少なくとも１つのプロモーター、およびｓｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの異種核酸配列に加えて、この発現ベクターは、この発現ベクターでトランスフェクトまたは形質導入された細胞の選択を促進するために、選択遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。
【０１７６】
細胞は、２つまたはそれ超の発現ベクター、ｓｉＲＮＡ（複数可）をコードする核酸配列（複数可）を含む少なくとも１つのベクター、選択遺伝子を含む他のベクターでも、トランスフェクトされ得る。適切なプロモーター、エンハンサー、選択遺伝子および／またはシグナル配列の選択は、過度の実験なしに当業者の技術範囲内であるとみなされる。
【０１７７】
以下の論述は、本発明の種々の有用性に関する。例えば、本発明は、目的の遺伝子（複数可）の発現をサイレンシングするのに適切な発現系としての有用性を有する。
【０１７８】
本発明は、哺乳動物レシピエントの細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝的に改変するための方法もまた提供する。一実施形態によれば、この方法は、例えば、ベクターをレシピエント中に注射することによって、哺乳動物レシピエントの細胞においてｓｉＲＮＡ配列をｉｎ  ｓｉｔｕで発現させるための、発現ベクターを導入することを含む。
【０１７９】
本発明の発現カセットのための送達ビヒクル
組織中へのおよび血液脳関門を横切る化合物の送達は、その化合物のサイズおよび生化学的特性によって限定され得る。現在、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞中への化合物の効率的な送達は、分子が小さい（通常は６００ダルトン未満）場合にのみ、達成され得る。中枢神経系（ＣＮＳ）の代謝の先天性異常および神経変性疾患の補正のための、ならびにがんの処置のための遺伝子移入は、組換えアデノウイルスベクターを用いて達成されている。
【０１８０】
細胞において特定のｓｉＲＮＡを発現するための特定の発現ベクターの選択および最適化は、おそらくは１または複数の適切な制御領域（例えば、プロモーター、挿入配列）と共に、ｓｉＲＮＡの核酸配列を取得すること；ｓｉＲＮＡをコードする核酸配列が挿入されるベクターを含むベクター構築物を調製すること；培養細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏでベクター構築物をトランスフェクトまたは形質導入すること；およびｓｉＲＮＡが培養細胞中に存在するかどうかを決定することによって、達成され得る。
【０１８１】
細胞遺伝子治療のためのベクターには、ウイルス、例えば、複製欠損ウイルス（以下に詳細に記載される）が含まれる。例示的なウイルスベクターは、ハーベイ肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、（ＭＰＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルスおよびＤＮＡウイルス（例えば、アデノウイルス）由来である。
【０１８２】
複製欠損レトロウイルスは、全てのビリオンタンパク質の合成を指示することが可能であるが、感染性粒子を作製することはできない。したがって、これらの遺伝的に変更されたレトロウイルス発現ベクターは、培養細胞における核酸配列の高効率の形質導入のための一般的有用性、および本発明の方法における使用のための具体的な有用性を有する。かかるレトロウイルスは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞中への核酸配列の効率的な形質導入のための有用性をさらに有する。レトロウイルスは、細胞中に核酸材料を移入させるために広範に使用されている。複製欠損レトロウイルスを産生するためのプロトコール（プラスミド中への外因性核酸材料の取込みのステップ、プラスミドによるパッケージング細胞株のトランスフェクションのステップ、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生のステップ、組織培養培地からのウイルス粒子の収集のステップ、およびウイルス粒子による標的細胞の感染のステップを含む）は、当技術分野で周知である。
【０１８３】
遺伝子治療にレトロウイルスを使用することの利点は、これらのウイルスが、ｓｉＲＮＡをコードする核酸配列を宿主細胞ゲノム中に挿入し、それによって、細胞が分裂するときに、ｓｉＲＮＡをコードする核酸配列がその細胞の子孫に受け継がれることを可能にすることである。ＬＴＲ領域中のプロモーター配列は、種々の細胞型において、挿入されたコード配列の発現を増強し得る。レトロウイルス発現ベクターを使用することのいくつかの欠点は、以下である：（１）挿入変異誘発、即ち、例えば、調節されない細胞成長をもたらす、標的細胞ゲノム中の望ましくない位置への、ｓｉＲＮＡをコードする核酸配列の挿入、および（２）ベクターが保有するｓｉＲＮＡをコードする核酸配列が標的ゲノム中に組み込まれるための、標的細胞増殖の必要。
【０１８４】
細胞の形質転換のための発現ベクターとして有用な別のウイルス候補は、アデノウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノウイルスは、例えば、筋肉および内皮細胞を含む、広範な細胞型において感染性である。
【０１８５】
アデノウイルス（Ａｄ）は、３６ｋｂのゲノムを有する二本鎖線状ＤＮＡウイルスである。アデノウイルスのいくつかの特色が、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子送達を促進するなどの治療的適用のための導入遺伝子送達ビヒクルとして、アデノウイルスを有用にしている。組換えアデノウイルスベクターは、肺、脳、膵臓、胆嚢および肝臓を含む種々の臓器の実質細胞への効率的なｉｎ  ｓｉｔｕ遺伝子移入が可能であることが示されている。これは、嚢胞性線維症などの遺伝性の遺伝子疾患を処置するための方法におけるこれらのベクターの使用を可能にしており、ここで、ベクターは、標的臓器に送達され得る。さらに、ｉｎ  ｓｉｔｕ腫瘍形質導入を達成するアデノウイルスベクターの能力は、非播種性疾患に対する種々の抗がん遺伝子治療方法の開発を可能にしている。これらの方法では、ベクターの封じ込めは、腫瘍細胞特異的形質導入に都合が良い。
【０１８６】
レトロウイルスと同様、アデノウイルスゲノムは、遺伝子治療のための発現ベクターとしての使用のために、即ち、ウイルス自体の産生を制御する遺伝情報を除去することによって、適合可能である。アデノウイルスは、染色体外様式で機能するので、この組換え体アデノウイルスは、挿入変異誘発の理論的問題を有さない。
【０１８７】
いくつかのアプローチが、伝統的に、組換えアデノウイルスを生成するために使用されてきた。１つのアプローチは、アデノウイルスゲノムの部分への、目的の核酸配列を含む制限エンドヌクレアーゼ断片の直接的ライゲーションを含む。あるいは、目的の核酸配列は、相同組換えの結果によって、欠陥アデノウイルス中に挿入され得る。所望の組換えは、相補細胞の叢において生成された個々のプラークをスクリーニングすることによって、同定される。
【０１８８】
ほとんどのアデノウイルスベクターは、初期領域１（Ｅ１）または初期領域３（Ｅ３）の代わりに目的の核酸配列を含む発現カセットが導入されている、アデノウイルス５型（Ａｄ５）骨格に基づく。Ｅ１が欠失されているウイルスは、複製について欠陥があり、欠けている遺伝子Ｅ１およびｐＩＸをトランスで供給するヒト相補細胞（例えば、２９３または９１１細胞）においてプロパゲートされる。
【０１８９】
本発明の一実施形態では、脳細胞または脳組織においてｓｉＲＮＡを生成することが所望される。この適用に適切なベクターは、ＦＩＶベクターまたはＡＡＶベクターである。例えば、ＡＡＶ５を使用してもよい。また、ポリオウイルスまたはＨＳＶベクターを適用してもよい。
【０１９０】
ｓｉＲＮＡの適用は、一般に、合成ｓｉＲＮＡ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡを発現するプラスミドのトランスフェクションによって、達成される。より最近、ウイルスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究のために、および標的化された遺伝子のトランスジェニックマウスノックダウンを生成するために、使用されている。組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子を送達するために使用され得る。各々が、それ自身の利点および欠点を有する。アデノウイルスは、大きいゲノム（３６ｋｂ）を有する二本鎖ＤＮＡウイルスであり、別個の領域中に発現カセットを収容するために、我が実験室などによって操作されている。
【０１９１】
アデノ随伴ウイルスは、Ａｄと類似のカプシドで包まれたゲノムを有するが、サイズおよびパッケージング能においてはより小さい（約３０ｎｍ対約１００ｎｍ；約４．５ｋｂのパッケージング限界）。ＡＡＶは、＋鎖または−鎖の一本鎖ＤＮＡゲノムを含む。８つの血清型のＡＡＶ（１〜８）が、広範に研究されており、そのうち３つは、脳において評価されている。本出願のための重要な検討事項は、ＡＡＶ５が線条体および皮質ニューロンを形質導入し、任意の公知の病理と関連しないことである。
【０１９２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科の小さい非病原性ウイルスである。ＡＡＶは、複製についてのヘルパーウイルスへのその依存によって、この科の他のメンバーとは別個である。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶは、第１９染色体のｑアーム中に、遺伝子座特異的な様式で組み込まれ得る。ＡＡＶのおよそ５ｋｂのゲノムは、プラスまたはマイナスのいずれかの極性の一本鎖ＤＮＡの１つのセグメントからなる。このゲノムの末端は、ヘアピン構造へと折り畳まれ得る短い逆位末端リピートであり、ウイルスＤＮＡ複製起点として機能する。物理的には、パルボウイルスビリオンは、非エンベロープ型であり、その正二十面体カプシドは、直径およそ２０ｎｍである。
【０１９３】
キメラウイルスが、本発明によってさらに提供され、ここで、ＡＡＶは、別のウイルスと関連する所望のトロピズムを達成するために、ヘルペスウイルス、ヘルペスウイルスアンプリコン、バキュロウイルスまたは他のウイルスと組み合わされ得る。例えば、ＡＡＶ４  ＩＴＲは、ヘルペスウイルス中に挿入され得、細胞が感染され得る。感染後、ＡＡＶ４のＩＴＲは、ゲノムからＡＡＶ４をレスキューするために、その系中または別々のビヒクル中に提供されたＡＡＶ４  ｒｅｐによって作用され得る。したがって、単純ヘルペスウイルスの細胞トロピズムが、ＡＡＶ４  ｒｅｐ媒介性の標的化された組込みと組み合わされ得る。キメラウイルスを構築するために利用され得る他のウイルスには、レンチウイルス、レトロウイルス、シュードタイプレトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターが含まれる。
【０１９４】
バリアントＡＡＶベクターもまた、本発明によって提供される。例えば、ＡＡＶ５などのネイティブＡＡＶの配列は、個々のヌクレオチドにおいて改変され得る。本発明は、ネイティブおよび変異体ＡＡＶベクターを含む。本発明は、全てのＡＡＶ血清型をさらに含む。
【０１９５】
ＦＩＶは、ヒトにおいて強い安全性プロファイルを有するエンベロープ型ウイルスである；ＦＩＶ感染したネコに咬まれたまたは引っかかれた個体は、セロコンバージョンせず、疾患のいずれの徴候も示さないことが報告されている。ＡＡＶと同様、ＦＩＶは、マウスおよび非ヒト霊長類のニューロンにおいて、持続する導入遺伝子発現を提供し、形質導入は、ウイルスのネイティブエンベロープを別のウイルス由来のエンベロープに交換するプロセス、シュードタイプ化によって、異なる細胞型へと指向され得る。
【０１９６】
したがって、当業者に明らかなように、種々の適切なウイルス発現ベクターが、細胞中に外因性核酸材料を移入させるために利用可能である。遺伝子サイレンシング治療に従順な特定の状態に対する治療剤を発現する適切な発現ベクターの選択、および細胞中への選択された発現ベクターの挿入のための条件の最適化は、過度の実験の必要なしに当業者の技術範囲内である。
【０１９７】
別の一実施形態では、この発現ベクターは、種々の方法：物理的（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、スクレイプローディング（scrape  loading）、微粒子銃）のうち１つによって、または化学的複合体（例えば、カルシウムまたはストロンチウム共沈殿、脂質との複合体化、リガンドとの複合体化）としての細胞取込みによって、標的細胞中に移入される、プラスミドの形態である。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）およびＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を含む、いくつかの市販の製品が、カチオン性リポソーム複合体化のために入手可能である。しかし、これらの方法によるトランスフェクションの効率は、標的細胞の性質に高度に依存し、したがって、本発明で言及した手順を使用した細胞中への核酸の最適なトランスフェクションのための条件は、最適化する必要がある。かかる最適化は、過度の実験の必要なしに当業者の技術範囲内である。
【０１９８】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科の小さい非病原性ウイルスである。ＡＡＶは、複製についてのヘルパーウイルスへのその依存によって、この科の他のメンバーとは別個である。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶは、第１９染色体のｑアーム中に、遺伝子座特異的な様式で組み込まれ得る。ＡＡＶのおよそ５ｋｂのゲノムは、プラスまたはマイナスのいずれかの極性の一本鎖ＤＮＡの１つのセグメントからなる。このゲノムの末端は、ヘアピン構造へと折り畳まれ得る短い逆位末端リピートであり、ウイルスＤＮＡ複製起点として機能する。物理的には、パルボウイルスビリオンは、非エンベロープ型であり、その正二十面体カプシドは、直径およそ２０ｎｍである。
【０１９９】
今日まで、多くの血清学的に別個のＡＡＶが同定されており、１２よりも多くが、ヒトまたは霊長類から単離されている。ＡＡＶ２のゲノムは、長さが４６８０ヌクレオチドであり、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。左のＯＲＦは、非構造Ｒｅｐタンパク質、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８をコードし、これらは、一本鎖子孫ゲノムの産生に加えて、複製および転写の調節に関与する。さらに、これらのＲｅｐタンパク質のうち２つは、ヒト第１９染色体のｑアームの領域中へのＡＡＶゲノムの優先的な組込みと関連付けられてきた。Ｒｅｐ６８／７８は、ＮＴＰ結合活性ならびにＤＮＡおよびＲＮＡヘリカーゼ活性を有することもまた示されている。これらのＲｅｐタンパク質は、核局在化シグナルならびにいくつかの潜在的リン酸化部位を有する。これらのキナーゼ部位のうち１つの変異は、複製活性の喪失を生じた。
【０２００】
このゲノムの末端は、ウイルスＤＮＡ複製起点として機能する、Ｔ型ヘアピン構造へと折り畳まれる潜在力を有する短い逆位末端リピート（ＩＴＲ）である。ＩＴＲ領域内の、ＩＴＲ、ＧＡＧＣリピートモチーフおよび末端分割部位（terminal  resolution  site）（ｔｒｓ）の機能の中核をなす２つのエレメントが、記載されている。ＩＴＲが線状またはヘアピンコンフォメーションのいずれかである場合、このリピートモチーフは、Ｒｅｐを結合することが示されている。この結合は、部位特異的様式および鎖特異的様式で生じるｔｒｓにおける切断のために、Ｒｅｐ６８／７８を配置するように機能する。複製におけるそれらの役割に加えて、これら２つのエレメントは、ウイルス組込みの中核をなすようである。第１９染色体の組込み遺伝子座内には、隣接するｔｒｓとのＲｅｐ結合部位が含まれる。これらのエレメントは、機能的であり、遺伝子座特異的組込みに必要であることが示されている。
【０２０１】
ＡＡＶビリオンは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と呼ばれる３つの関連するタンパク質からなる、直径およそ２５ｎｍの非エンベロープ型の正二十面体粒子である。右のＯＲＦは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。これらのタンパク質は、それぞれ１：１：１０の比で見出され、全て、右手のＯＲＦに由来する。これらのカプシドタンパク質は、選択的スプライシングおよび普通と違う開始コドンの使用によって、互いに異なる。欠失分析は、選択的スプライシングされたメッセージから翻訳されるＶＰ１の除去または変更が、低減された収量の感染性粒子を生じることを示している。ＶＰ３コード領域内の変異は、任意の一本鎖子孫ＤＮＡまたは感染性粒子を産生することを失敗させる。ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。ＡＡＶカプシドポリペプチドは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３ポリペプチド全体をコードし得る。この粒子は、ＡＡＶ２および他のＡＡＶカプシドタンパク質（即ち、キメラタンパク質、例えば、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２）を含む粒子であり得る。標準的な方法によって慣用的に決定され得るように、ＡＡＶ２カプシドを含む得られたウイルス粒子が、ＡＡＶ１とは抗原的にまたは免疫学的に別個のままである限り、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列におけるバリエーションが、本明細書で企図される。具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットが、ウイルス粒子がＡＡＶ１と抗原的にまたは免疫学的に別個であるかどうかを決定するために使用され得る。さらに、このＡＡＶ２ウイルス粒子は、好ましくは、ＡＡＶ１とは別個の組織トロピズムを保持する。
【０２０２】
ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３ポリペプチド全体をコードするＡＡＶ２カプシドポリペプチドは、全体として、ＮＣ＿００１４０１（ＡＡＶ２カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列）に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも約６３％の相同性（または同一性）を有し得る。このカプシドタンパク質は、ＮＣ＿００１４０１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に対して、約７０％の相同性、約７５％の相同性、８０％の相同性、８５％の相同性、９０％の相同性、９５％の相同性、９８％の相同性、９９％の相同性またはさらには１００％の相同性を有し得る。このカプシドタンパク質は、ＮＣ＿００１４０１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に対して、約７０％の同一性、約７５％の同一性、８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性またはさらには１００％の同一性を有し得る。この粒子は、別のＡＡＶおよびＡＡＶ２カプシドタンパク質を含む粒子、即ち、キメラタンパク質であり得る。標準的な方法によって慣用的に決定され得るように、ＡＡＶ２カプシドを含む得られたウイルス粒子が、ＡＡＶ４とは抗原的にまたは免疫学的に別個のままである限り、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列におけるバリエーションが、本明細書で企図される。具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットが、ウイルス粒子がＡＡＶ１と抗原的にまたは免疫学的に別個であるかどうかを決定するために使用され得る。さらに、このＡＡＶ２ウイルス粒子は、好ましくは、本明細書の実施例で例示されるものなど、ＡＡＶ１とは別個の組織トロピズムを保持するが、少なくとも１つのＡＡＶ２コートタンパク質を含むＡＡＶ２キメラ粒子は、ＡＡＶ２コートタンパク質のみからなるＡＡＶ２粒子のものとは異なる組織トロピズムを有し得る。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、本発明は、一対のＡＡＶ２逆位末端リピートを含むベクターを含む、即ちカプシドで包む、ＡＡＶ２粒子をさらに提供する。ＡＡＶ２  ＩＴＲのヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。さらに、この粒子は、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２カプシドタンパク質の両方を含む粒子、即ち、キメラタンパク質であり得る。さらに、この粒子は、他のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１〜ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０）由来の一対のＡＡＶ逆位末端リピートを含むベクターをカプシドで包んでいる粒子であり得る。この粒子中にカプシドで包まれたベクターは、逆位末端リピート間に挿入された外因性核酸をさらに含み得る。
【０２０４】
ＡＡＶの以下の特色が、ＡＡＶを、遺伝子移入のための魅力的なベクターにしている。ＡＡＶベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞ゲノム中に安定に組み込まれ；広い宿主範囲を有し；分裂細胞および非分裂細胞の両方をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入し、形質導入された遺伝子の高いレベルの発現を維持することが示されている。ウイルス粒子は、熱安定で、溶媒、界面活性剤、ｐＨにおける変化、温度に対して耐性であり、ＣｓＣｌ勾配でまたは他の手段によって、濃縮され得る。本発明は、ＡＡＶ粒子、組換えＡＡＶベクターおよび組換えＡＡＶビリオンを投与する方法を提供する。例えば、ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むウイルス粒子であり、またはＡＡＶ１粒子は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。組換えＡＡＶ２ベクターは、ＡＡＶ２の少なくとも１つの独自の核酸を含む核酸構築物である。組換えＡＡＶ２ビリオンは、組換えＡＡＶ２ベクターを含む粒子である。用語「ＡＡＶ２  ＩＴＲ」内で考えると、このヌクレオチド配列は、ＡＡＶ１  ＩＴＲからＡＡＶ２  ＩＴＲを識別する、本明細書に記載される一方または両方の特色を保持しなくてはならない：（１）３つ（ＡＡＶ１のように４つではなく）の「ＧＡＧＣ」リピート、および（２）ＡＡＶ２  ＩＴＲ  Ｒｅｐ結合部位では、最初の２つの「ＧＡＧＣ」リピートにおける４番目のヌクレオチドは、ＴではなくＣである。
【０２０５】
送達されるタンパク質、または別の薬剤をコードする配列の発現を駆動するためのプロモーターは、公知の検討事項、例えば、プロモーターに機能的に連結した核酸の発現のレベル、およびこのベクターが使用される細胞型によって選択される、任意の所望のプロモーターであり得る。プロモーターは、外因性または内因性プロモーターであり得る。プロモーターには、例えば、公知の強いプロモーター、例えば、ＳＶ４０もしくは誘導性メタロチオネインプロモーター、またはＡＡＶプロモーター、例えばＡＡＶ  ｐ５プロモーターが含まれ得る。プロモーターのさらなる例には、アクチン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスプロモーター、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター、誘導性ヒートショックプロモーター、呼吸器多核体ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来のプロモーターなどが含まれる。さらなる例には、調節されたプロモーターが含まれる。
【０２０６】
このＡＡＶベクターは、プロモーターに機能的に連結した外因性（異種）核酸をさらに含み得る。「異種核酸」とは、任意の異種または外因性の核酸が、細胞、組織または生物中への移入のために、ベクター中に挿入され得ることを意味する。この核酸は、例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質またはアンチセンスＲＮＡをコードし得る。「機能的に連結した」とは、プロモーターが異種核酸の発現を促進できるような、当技術分野で公知のような、異種核酸に対するプロモーターの適切な配向などを意味する。さらに、この異種核酸は、好ましくは、この核酸を機能的にコードする、即ち、その核酸の発現を可能にするような、当技術分野で公知のような、核酸の発現のための全ての適切な配列を有する。この核酸は、例えば、発現制御配列、例えばエンハンサー、ならびに必要な情報処理部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列を含み得る。この核酸は、パッケージングされ得る核酸のサイズのみによって限定される、１よりも多い遺伝子産物をコードし得る。
【０２０７】
本発明のある特定の実施形態では、この異種核酸は、ベクターが移入される被験体によって必要とされる、欠けているまたは欠陥タンパク質を置き換える有益なタンパク質、例えば、ＲｈｅｂまたはＲｈｅｓをコードし得る。
【０２０８】
ＡＡＶ１粒子は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。標準的な方法によって慣用的に決定され得るように、ＡＡＶ１カプシドを含む得られたウイルス粒子が、他のＡＡＶカプシドとは抗原的にまたは免疫学的に別個のままである限り、ＡＡＶ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列におけるバリエーションが、本明細書で企図される。具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットが、ウイルス粒子が他のＡＡＶ血清型と抗原的にまたは免疫学的に別個であるかどうかを決定するために使用され得る。
【０２０９】
用語「ポリペプチド」とは、本明細書で使用する場合、アミノ酸のポリマーを指し、これには、全長タンパク質およびその断片が含まれる。したがって、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書で相互交換可能に使用される場合が多い。置換は、公知のパラメーターによって中性であるように選択され得る。当業者に理解されるように、本発明は、アミノ酸配列または他の特性における僅かなバリエーションを有するポリペプチドもまた含む。かかるバリエーションは、対立遺伝子バリエーション（例えば、遺伝子多型に起因する）として天然に生じ得、または誘導された点変異体、欠失変異体、挿入変異体および置換変異体など、ヒト介入（例えば、クローニングされたＤＮＡ配列の変異誘発）によって生成され得る。アミノ酸配列における軽微な変化、例えば、保存的アミノ酸置き換え、小さい内部欠失または挿入、および分子の末端における付加または欠失が、一般には好ましい。これらの改変は、アミノ酸配列における変化を生じ得、サイレント変異を提供し得、制限部位を改変し得、または他の特異的変異を提供し得る。
【０２１０】
本発明の方法は、ＡＡＶ逆位末端リピートの対の間に挿入された核酸を含むベクターを含むＡＡＶ粒子を細胞に投与し、それによって核酸を細胞に送達することを含む、核酸を細胞に送達する方法を提供する。細胞への投与は、所望の液体、例えば、組織培養培地または緩衝食塩水溶液中に任意選択で含まれた粒子を、細胞と単に接触させることを含む、任意の手段によって達成され得る。この粒子は、任意の所望の長さの時間にわたって細胞と接触したままにされ得、典型的には、この粒子は、投与され、無制限に残存する。かかるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法のために、ウイルスは、当技術分野で公知であり、本明細書に例示されるように、標準的なウイルス形質導入方法によって、細胞に投与され得る。投与するウイルスの力価は、特に細胞型に依存して変動し得るが、一般には、ＡＡＶ形質導入に使用される細胞型に特有である。さらに、本発明の実施例において特定の細胞を形質導入するために使用される力価が、利用され得る。これらの細胞には、ヒトならびに他の大型（非げっ歯類）哺乳動物、例えば、霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタおよびイヌにおける、任意の所望の細胞が含まれ得る。
【０２１１】
より具体的には、本発明は、ＡＡＶ逆位末端リピートの対の間に挿入された核酸を含む核酸を、脳中の細胞、特に中型有棘ニューロンに送達し、それによって、核酸を細胞に送達する方法を提供する。
【０２１２】
本発明は、ＡＡＶ逆位末端リピートの対の間に挿入された核酸を含むＡＡＶ粒子を被験体に投与し、それによって、核酸を被験体中の細胞に送達することを含む、核酸を被験体中の細胞に送達する方法をさらに提供する。
【０２１３】
ＡＡＶ逆位末端リピートの対の間に挿入された核酸を含むＡＡＶ粒子を被験体に投与し、それによって、核酸を被験体中のニューロンまたは他の細胞に送達することを含む、核酸を被験体中の脳細胞、例えば、線条体または皮質中のニューロンに送達する方法もまた、提供される。
【０２１４】
本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載されるようなウイルスベクターを含む細胞を提供する。
【０２１５】
ＡＡＶベクター
一実施形態では、本開示のウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。「ＡＡＶ」ベクターとは、アデノ随伴ウイルスを指し、天然に存在する野生型ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用され得る。この用語は、別のことが要求される場合を除いて、全てのサブタイプ、血清型およびシュードタイプ、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方をカバーする。本明細書で使用する場合、用語「血清型」とは、規定された抗血清とのカプシドタンパク質反応性によって同定され、それに基づいて他のＡＡＶから識別される、ＡＡＶを指し、例えば、霊長類ＡＡＶの８つの公知の血清型、ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−９およびＡＡＶｒｈ１０が存在する。例えば、血清型ＡＡＶ２は、ＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子からコードされるカプシドタンパク質ならびに同じＡＡＶ２血清型由来の５’および３’ＩＴＲ配列を含むゲノムを含むＡＡＶを指すために使用される。本明細書で使用する場合、例えば、ｒＡＡＶ１は、同じ血清型由来のカプシドタンパク質および５’−３’ＩＴＲの両方を有するＡＡＶを指すために使用され得、またはｒＡＡＶ１は、１つの血清型由来のカプシドタンパク質および異なるＡＡＶ血清型由来の５’−３’ＩＴＲ、例えば、ＡＡＶ血清型２由来のカプシドおよびＡＡＶ血清型５由来のＩＴＲを有する、ＡＡＶを指し得る。本明細書に例示される各例について、ベクターの設計および産生の記載は、カプシドおよび５’−３’ＩＴＲ配列の血清型を記載する。略称「ｒＡＡＶ」とは、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも呼ばれる、組換えアデノ随伴ウイルスを指す。
【０２１６】
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（好ましくは、野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質の全てによって）およびカプシドで包まれたポリヌクレオチドから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（即ち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、これは、典型的には、「ｒＡＡＶ」と呼ばれる。
【０２１７】
一実施形態では、これらのＡＡＶ発現ベクターは、作動可能に連結した構成成分として、転写の方向で、転写イニシエーション領域を含む制御エレメント、目的のＤＮＡおよび転写終結領域を少なくとも提供するために、公知の技術を使用して構築される。これらの制御エレメントは、哺乳動物細胞において機能的であるように選択される。作動可能に連結した構成成分を含む得られた構築物は、機能的ＡＡＶ  ＩＴＲ配列と隣接している（５’および３’）。
【０２１８】
「アデノ随伴ウイルス逆位末端リピート」または「ＡＡＶ  ＩＴＲ」とは、ＤＮＡ複製起点として、およびウイルスのためのパッケージングシグナルとしてシスで一緒に機能する、ＡＡＶゲノムの各末端において見出される、当技術分野で認識された領域を意味する。ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域と一緒になって、２つの隣接ＩＴＲ間に介在するヌクレオチド配列の、そこからの効率的な切り出しおよびレスキュー、ならびに哺乳動物細胞ゲノム中へのその組込みを提供する。
【０２１９】
ＡＡＶ  ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は、公知である。本明細書で使用する場合、「ＡＡＶ  ＩＴＲ」は、示された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はないが、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更され得る。さらに、ＡＡＶ  ＩＴＲは、限定ではなくＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７などが含まれる、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。さらに、意図したように、即ち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的の配列の切り出しおよびレスキューを可能にするように、ならびにＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞中に存在する場合にレシピエント細胞ゲノム中への異種配列の組込みを可能にするようにそれらが機能する限り、ＡＡＶベクター中の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、同じＡＡＶ血清型または単離体と同一である必要もそれらに由来する必要も必ずしもない。
【０２２０】
一実施形態では、ＡＡＶ  ＩＴＲは、限定ではなくＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７などが含まれる、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。さらに、意図したように、即ち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的の配列の切り出しおよびレスキューを可能にするように、ならびにＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞中に存在する場合にレシピエント細胞ゲノム中へのＤＮＡ分子の組込みを可能にするようにそれらが機能する限り、ＡＡＶ発現ベクター中の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、同じＡＡＶ血清型または単離体と同一である必要もそれらに由来する必要も必ずしもない。
【０２２１】
一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２由来であり得る。ＡＡＶベクターにおける使用に適切なＤＮＡ分子は、約５キロベース（ｋｂ）未満、約４．５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３．５ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、約２．５ｋｂ未満のサイズであり、当技術分野で公知である。
【０２２２】
一実施形態では、この選択されたヌクレオチド配列は、被験体においてｉｎ  ｖｉｖｏでその転写または発現を指示する制御エレメントに作動可能に連結される。かかる制御エレメントは、選択された遺伝子と通常関連する制御配列を含み得る。あるいは、異種制御配列が使用され得る。有用な異種制御配列には、一般に、哺乳動物またはウイルスの遺伝子をコードする配列由来のものが含まれる。例には、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ｐｏｌ  ＩＩプロモーター、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが含まれるがこれらに限定されない。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子由来の配列もまた、本明細書で使用を見出す。かかるプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。
【０２２３】
一実施形態では、異種プロモーターならびに他の制御エレメント、例えば、ＣＮＳ特異的および誘導性プロモーター、エンハンサーなどの両方が、特に使用される。異種プロモーターの例には、ＣＭＶプロモーターが含まれる。ＣＮＳ特異的プロモーターの例には、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）由来の遺伝子から単離されたものが含まれる。誘導性プロモーターの例には、エクジソン、テトラサイクリン、低酸素およびオーフィン（aufin）に対するＤＮＡ応答性エレメントが含まれる。
【０２２４】
一実施形態では、ＡＡＶ  ＩＴＲによって境界された目的のＤＮＡ分子を保有するＡＡＶ発現ベクターは、主要ＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）がそこから切り出されたＡＡＶゲノム中に、選択された配列（複数可）を直接挿入することによって構築され得る。ＡＡＶゲノムの他の部分は、ＩＴＲの十分な部分が複製およびパッケージング機能を可能にする限り、欠失されることもできる。かかる構築物は、当技術分野で周知の技術を使用して設計され得る。
【０２２５】
あるいは、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ウイルスゲノムから、または標準的なライゲーション技術を使用して別のベクター中に存在する選択された核酸構築物の同じおよび融合された５’および３’を含むＡＡＶベクターから、切り出され得る。例えば、ライゲーションは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＮａＣｌ、ならびに０℃における４０ｕＭ  ＡＴＰ、０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「粘着末端」ライゲーションについて）または１４℃における１ｍＭ  ＡＴＰ、０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「平滑末端」ライゲーションについて）のいずれかにおいて、達成され得る。分子間「粘着末端」ライゲーションは、３０〜１００μｇ／ｍｌの総ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＭの総最終濃度）で、通常実施される。ＩＴＲを含むＡＡＶベクター。
【０２２６】
さらに、キメラ遺伝子は、１または複数の選択された核酸配列の５’側および３’側に整列されたＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含むように、合成によって産生され得る。哺乳動物ＣＮＳ細胞におけるキメラ遺伝子配列の発現に好ましいコドンが使用され得る。完全キメラ配列は、標準的な方法によって調製された重複するオリゴヌクレオチドからアセンブルされる。
【０２２７】
ｒＡＡＶビリオンを産生するために、ＡＡＶ発現ベクターは、公知の技術を使用して、例えばトランスフェクションによって、適切な宿主細胞中に導入される。いくつかのトランスフェクション技術が、当技術分野で一般に公知である。例えば、Sambrookら（１９８９年）Molecular  Cloning、a  laboratory  manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratories、New  Yorkを参照のこと。特に適切なトランスフェクション方法には、リン酸カルシウム共沈殿、培養細胞中への直接的マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性遺伝子移入、脂質媒介性形質導入、および高速度微粒子射出（high-velocity  microprojectile）を使用する核酸送達が含まれる。
【０２２８】
一実施形態では、ｒＡＡＶビリオンを産生するのに適切な宿主細胞には、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用され得る、または使用されてきた、微生物、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が含まれる。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、「宿主細胞」とは、本明細書で使用する場合、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を一般に指す。安定なヒト細胞株、２９３（例えば、受託番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３の下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから容易に入手可能）由来の細胞が、本開示の実施において使用され得る。特に、ヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型ＤＮＡ断片で形質転換されたヒト胎児由来腎臓細胞株であり、アデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子を発現する。２９３細胞株は、容易にトランスフェクトされ、ｒＡＡＶビリオンを産生するための特に簡便なプラットホームを提供する。
【０２２９】
「ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする、ＡＡＶゲノムの、当技術分野で認識された領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合およびニック形成、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写のモジュレーションを含む、多くの機能を有することが示されている。これらのＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムを複製するために集合的に必要とされる。ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域の適切なホモログには、ＡＡＶ−２  ＤＮＡ複製を媒介することも公知のヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子が含まれる。
【０２３０】
「ＡＡＶ  ｃａｐコード領域」とは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３、またはそれらの機能的ホモログをコードする、ＡＡＶゲノムの、当技術分野で認識された領域を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージングするために集合的に必要とされるパッケージング機能を供給する。
【０２３１】
一実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクションの前にまたはそれと同時に、ＡＡＶヘルパー構築物で宿主細胞をトランスフェクトすることによって、宿主細胞中に導入される。したがって、ＡＡＶヘルパー構築物は、生産的なＡＡＶ感染に必要な欠けているＡＡＶ機能を補完するために、ＡＡＶ  ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の少なくとも一過的な発現を提供するために使用される。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ  ＩＴＲを欠き、それ自体では複製もパッケージングもできない。これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態であり得る。ＲｅｐおよびＣａｐの両方の発現産物をコードする、一般に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５などの、いくつかのＡＡＶヘルパー構築物が記載されている。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ発現産物をコードするいくつかの他のベクターが記載されている。
【０２３２】
ウイルスベクターの送達の方法は、ＡＡＶを被験体中に注射することを含む。一般に、ｒＡＡＶビリオンは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかの形質導入技術を使用して、ＣＮＳの細胞中に導入され得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入される場合、所望のレシピエント細胞が、被験体から取り出され、ｒＡＡＶビリオンで形質導入され、被験体中に再導入される。あるいは、同系間または異種間細胞が使用され得、ここで、これらの細胞は、被験体において不適切な免疫応答を生じない。
【０２３３】
被験体中への形質導入された細胞の送達および導入のための適切な方法は、記載されている。例えば、細胞は、組換えＡＡＶビリオンを、例えば適切な培地中でＣＮＳ細胞と合わせることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入され得、目的のＤＮＡを保有する細胞についてのスクリーニングは、従来の技術、例えば、サザンブロットおよび／もしくはＰＣＲを使用して、または選択可能なマーカーを使用することによって、スクリーニングされ得る。次いで、形質導入された細胞は、以下により完全に記載される医薬組成物へと製剤化され得、この組成物は、種々の技術によって、例えば、移植、筋内、静脈内、皮下および腹腔内注射によって、被験体中に導入され得る。
【０２３４】
一実施形態では、医薬組成物は、目的の核酸の治療有効量、即ち、問題の疾患状態の症状を低減もしくは寛解させるのに十分な量、または所望の利益を付与するのに十分な量を産生するのに十分な遺伝子材料を含む。これらの医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤もまた含む。かかる賦形剤には、組成物を受けている個体にとって害になる抗体の産生をそれ自体は誘導せず、過度の毒性なしに投与され得る、任意の薬学的薬剤が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ８０、ならびに液体、例えば、水、食塩水、グリセロールおよびエタノールが含まれるがこれらに限定されない。その中で、薬学的に許容される塩には、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などが含まれ得る。さらに、補助的物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質などが、かかるビヒクル中に存在し得る。薬学的に許容される賦形剤の詳細な論述は、Remington's  Pharmaceutical  Sciences（Mack  Pub.  Co.、N.J.  １９９１年）において入手可能である。
【０２３５】
１よりも多い導入遺伝子が、送達されたウイルスベクターによって発現され得ることを理解すべきである。あるいは、各々１または複数の異なる導入遺伝子を発現する別々のベクターもまた、本明細書に記載されるように被験体に送達され得る。さらに、本開示の方法によって送達されるウイルスベクターは、他の適切な組成物および治療と組み合わされることもまた、意図される。
【０２３６】
本明細書の教示を考慮して当業者に明らかなように、添加される必要があるウイルスベクターの有効量は、実験的に決定され得る。投与は、１つの用量で、処置の過程を通じて持続的にまたは間欠的に、もたらされ得る。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、当業者に周知であり、ウイルスベクター、治療の組成物、標的細胞、および処置されている被験体によって変動する。単一および複数回の投与が、処置を行う医師によって選択される用量レベルおよびパターンで実施され得る。
【０２３７】
ある特定の実施形態では、このｒＡＡＶは、約０．３〜２ｍｌの１×１０５〜１×１０１６ｖｇ／ｍｌの用量で投与される。ある特定の実施形態では、このｒＡＡＶは、約１〜３ｍｌの１×１０７〜１×１０１４ｖｇ／ｍｌの用量で投与される。ある特定の実施形態では、このｒＡＡＶは、約１〜２ｍｌの１×１０８〜１×１０１３ｖｇ／ｍｌの用量で投与される。
【０２３８】
ｒＡＡＶ粒子を含む製剤は、ビヒクル中に有効量のｒＡＡＶ粒子を含み、この有効量は、当業者によって容易に決定される。これらのｒＡＡＶ粒子は、典型的には、組成物の約１％から約９５％（ｗ／ｗ）までの、または、必要に応じて、さらにより高いもしくはより低いところまでの範囲であり得る。投与すべき量は、処置が考慮される動物またはヒト被験体の齢、体重および肉体的状態などの因子に依存する。有効な投薬量は、用量反応曲線を確立する慣用的な試験によって、当業者によって確立され得る。被験体は、１または複数の用量でのｒＡＡＶ粒子の投与によって処置される。適切な酵素活性を維持することが必要とされる場合、複数の用量が投与され得る。
【０２３９】
水、水性食塩水、人工ＣＳＦまたは他の公知の物質を含むビヒクルが、本発明で使用され得る。製剤を調製するために、精製された組成物は、単離、凍結乾燥および安定化され得る。次いで、この組成物は、任意選択で抗炎症剤と組み合わせて、適切な濃度に調整され得、使用のためにパッケージングされ得る。
【０２４０】
本発明は、タンパク質、または上記タンパク質をコードする核酸分子を、細胞における標的タンパク質のレベルを増加させるのに十分な量で細胞中に導入することによって、細胞における標的タンパク質のレベルを増加させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、標的タンパク質の蓄積は、少なくとも１０％増加される。標的タンパク質の蓄積は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％増加される。
【０２４１】
さらに、このＡＡＶベクターは、投与の所望の経路に従って、例えば限定ではなく全身投与のために、選択／設計され得、血液脳関門を横断することが可能なＡＡＶベクターが使用され得る（例えば、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ９カプシドタンパク質を有するキメラＡＡＶベクター）。一部の血清型は、血液脳関門を横切ることが可能であるので、本発明は、ＡＡＶを血流に投与する方法もまた提供する。
【０２４２】
標的化ペプチド
ウイルスベクターなどの薬剤を中枢神経系の血管内皮細胞に標的化するように機能するペプチドが同定されている。本開示は、例えば、ウイルスカプシドを目的の細胞型に再指向させるためにこれらの新規ペプチドを利用する方法を記載している。この例では、脳血管を裏打ちする内皮細胞が、同定されたペプチドによって標的化される。かかるペプチドを含むように改変されたカプシドタンパク質を保有するベクターは、治療剤を中枢神経系（例えば、脳）に提供するために使用され得る。
【０２４３】
本明細書で使用する場合、用語「標的化する」とは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルスのカプシドタンパク質が、別の型の組織（例えば、肝臓組織）を超えて１つの型の組織（例えば、脳組織）に優先的に結合し、および／または特定の状態（例えば、野生型または罹患した）にある組織に結合することを意味する。ある特定の実施形態では、この遺伝的に改変されたカプシドタンパク質は、匹敵する未改変のカプシドタンパク質よりも１０％〜１０００％高いレベルで結合することによって、脳血管上皮組織を「標的化」し得る。例えば、遺伝的に改変されたカプシドタンパク質を有するＡＡＶは、未改変のＡＡＶウイルスよりも５０％〜１００％高いレベルで脳血管上皮組織に結合し得る。ある特定の実施形態では、ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸は、ウイルスカプシドが、リソソーム蓄積症に罹患している哺乳動物において脳血管内皮に優先的に結合し、または異なる配列を使用して、同じ種の脳における野生型脳血管内皮に優先的に結合するように、改変される。
【０２４４】
本発明は、標的化ペプチドを含む改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を提供し、この標的化ペプチドは、長さが３〜１０アミノ酸であり、この標的化ペプチドは、ＡＡＶを脳血管内皮に標的化する。ある特定の実施形態では、この標的化ペプチドは、長さが３、４、５、６または７アミノ酸である。ある特定の実施形態では、このＡＡＶはＡＡＶ２であるが、トロピズムは、かかる改変が任意のＡＡＶのトロピズムを変化させることになるように、改変される。
【０２４５】
本開示のある特定の実施形態は、改変されたカプシドを含むウイルスベクターを提供し、この改変されたカプシドは、ウイルスベクターを脳血管内皮に標的化する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
【０２４６】
ある特定の実施形態では、このウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。ある特定の実施形態では、このＡＡＶはＡＡＶ２である。
【０２４７】
ある特定の実施形態では、この標的化ペプチドは、野生型脳血管内皮を標的化する。ある特定の実施形態では、この標的化ペプチドは、アミノからカルボキシの配向でまたはカルボキシからアミノの配向で表される、ＰＸＸＰＳ（配列番号４４）、ＳＰＸＸＰ（配列番号４５）、ＴＬＨ（配列番号４６）またはＱＳＸＹ（配列番号４７）である。ある特定の実施形態では、この標的化ペプチドは、アミノからカルボキシの配向でまたはカルボキシからアミノの配向で表される、ＰＹＦＰＳＬＳ（配列番号４８）、ＹＡＰＬＴＰＳ（配列番号４９）、ＰＬＳＰＳＡＹ（配列番号５０）、ＤＳＰＡＨＰＳ（配列番号５１）、ＧＴＰＴＨＰＳ（配列番号５２）、ＰＤＡＰＳＮＨ（配列番号５３）、ＴＥＰＨＷＰＳ（配列番号５４）、ＳＰＰＬＰＰＫ（配列番号５５）、ＳＰＫＰＰＰＧ（配列番号５６）、ＮＷＳＰＷＤＰ（配列番号５７）、ＤＳＰＡＨＰＳ（配列番号５８）、ＧＷＴＬＨＮＫ（配列番号５９）、ＫＩＰＰＴＬＨ（配列番号６０）、ＩＳＱＴＬＨＧ（配列番号６１）、ＱＳＦＹＩＬＴ（配列番号６２）、またはＴＴＱＳＥＹＧ（配列番号６３）である。配列の配向が重要でないことに留意すべきである。例えば、このペプチドは、ＴＴＱＳＥＹＧ（配列番号６３）になるように、ペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端へと配向され得、またはＧＹＥＳＱＴＴ（配列番号６５）になるように、ペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端へであり得る。
【０２４８】
ある特定の実施形態では、この標的化ペプチドは、罹患した脳血管内皮を標的化する。ある特定の実施形態では、この標的化ペプチドは、リソソーム蓄積症を有する被験体において脳血管内皮を標的化する。ある特定の実施形態では、この標的化ペプチドは、ムコ多糖（mucopolysaccharide）（ＭＰＳ）ＶＩＩ脳血管内皮を標的化する。ある特定の実施形態では、この標的化ペプチドは、アミノからカルボキシの配向またはカルボキシからアミノの配向で表される、ＬＸＳＳ（配列番号６６）、ＰＦＸＧ（配列番号６７）またはＳＩＸＡ（配列番号６８）である。ある特定の実施形態では、この標的化ペプチドは、アミノからカルボキシの配向でまたはカルボキシからアミノの配向で表される、ＭＬＶＳＳＰＡ（配列番号６９）、ＬＰＳＳＬＱＫ（配列番号７０）、ＰＰＬＬＫＳＳ（配列番号７１）、ＰＸＫＬＤＳＳ（配列番号７２）、ＡＷＴＬＡＳＳ（配列番号７３）、ＷＰＦＹＧＴＰ（配列番号７４）、ＧＴＦＰＦＬＧ（配列番号７５）、ＧＱＶＰＦＭＧ（配列番号７６）、ＡＮＦＳＩＬＡ（配列番号７７）、ＧＳＩＷＡＰＡ（配列番号７８）、またはＳＩＡＡＳＦＳ（配列番号７９）である。
【０２４９】
ある特定の実施形態では、標的化ペプチドは、ＴＰＰ１脳血管内皮を標的化する。ある特定の実施形態では、この標的化ペプチドは、アミノからカルボキシの配向でまたはカルボキシからアミノの配向で表される、ＧＭＮＡＦＲＡ（配列番号６４）である。
【０２５０】
ある特定の実施形態では、脳血管内皮を標的化するアミノ酸配列は、配列番号４４〜４７のうち少なくとも１つを含む。
【０２５１】
ある特定の実施形態では、脳血管内皮を標的化するアミノ酸配列は、配列番号６６〜６８のうち少なくとも１つを含む。
【０２５２】
ある特定の実施形態では、脳血管内皮を標的化するアミノ酸配列は、配列番号４８〜６３のうち少なくとも１つを含む。
【０２５３】
ある特定の実施形態では、脳血管内皮を標的化するアミノ酸配列は、配列番号６９〜７９のうち少なくとも１つを含む。
【０２５４】
ある特定の実施形態では、脳組織を標的化するアミノ酸配列は、以下の表１に列挙されたものから選択される：
【０２５５】
【表１】
0006663859.tif 000002
【０２５６】
ある特定の実施形態では、脳血管内皮を標的化するアミノ酸配列は、リソソーム蓄積症などの疾患を有する被験体において、脳血管内皮を標的化する。
【０２５７】
ある特定の実施形態では、脳血管内皮を標的化するアミノ酸配列は、リソソーム蓄積症を有さない被験体において、脳血管内皮を標的化する。
【０２５８】
ある特定の実施形態では、このウイルスベクターは、治療剤をコードする核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、この治療剤は、β−グルクロニダーゼである。
【０２５９】
ある特定の実施形態では、脳血管内皮を標的化するアミノ酸配列は、長さが多くても１０アミノ酸である。
【０２６０】
ある特定の実施形態では、脳血管内皮を標的化するアミノ酸配列は、長さが３、４、５、６または７アミノ酸である。
【０２６１】
本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載されるウイルスベクターをコードする核酸配列を提供する。
【０２６２】
本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載される改変されたカプシドをコードする核酸配列を提供する。本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載される核酸配列によってコードされる改変されたカプシドを提供する。
【０２６３】
本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載されるウイルスベクターを含む細胞を提供する。
【０２６４】
本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載されるウイルスベクターによって形質導入された細胞を提供する。
【０２６５】
ある特定の実施形態では、この細胞は、哺乳動物細胞である。ある特定の実施形態では、この細胞は、ヒト細胞である。ある特定の実施形態では、この細胞は、非ヒト細胞である。ある特定の実施形態では、この細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。ある特定の実施形態では、この細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏである。ある特定の実施形態では、この細胞は、内皮細胞である。ある特定の実施形態では、この細胞は、血管内皮細胞である。
【０２６６】
本発明の薬剤の投薬量、製剤化および投与の経路
本発明の薬剤は、好ましくは、疾患と関連する少なくとも１つの症状における低減を生じるように、投与される。投与される量は、選択された組成物、特定の疾患、体重、肉体的状態、哺乳動物の齢、および予防または処置が達成されるかどうかが含まれるがこれらに限定されない、種々の因子に依存して変動する。かかる因子は、当技術分野に周知の動物モデルまたは他の試験系を使用して、医師によって容易に決定され得る。本明細書で使用する場合、用語「治療的ｓｉＲＮＡ」とは、レシピエントに対して有益な効果を有する任意のｓｉＲＮＡを指す。したがって、「治療的ｓｉＲＮＡ」は、治療的ｓｉＲＮＡおよび予防的ｓｉＲＮＡの両方を包含する。
【０２６７】
ｓｉＲＮＡの投与は、ｓｉＲＮＡをコードする核酸分子の投与を介して達成され得る。核酸のための医薬製剤、投薬量および投与の経路は、一般に公知である。
【０２６８】
本発明は、薬剤、例えば、本発明の核酸組成物、発現ベクターまたはウイルス粒子の投与によって、哺乳動物においてハンチントン病を処置することを想定する。本発明に従う治療剤の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的であるか予防的であるか、および当業者に公知の他の因子に依存して、持続的または間欠的であり得る。本発明の薬剤の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に持続的であり得、または一連の間隔をあけた用量であり得る。局所的投与および全身投与の両方が企図される。
【０２６９】
以下に論じるように、徐放のために（例えば、マイクロカプセル化を使用して、それらの開示が参照によって本明細書に組み込まれる、ＷＯ９４／０７５２９および米国特許第４，９６２，０９１号を参照のこと）任意選択で製剤化され得る本発明の治療剤（複数可）を有する１または複数の適切な単位剤形は、静脈内および筋内経路によるもの、ならびに罹患組織中への直接的注射によるものを含む、非経口を含む種々の経路によって投与され得る。例えば、この治療剤は、脳中に直接注射され得る。あるいは、この治療剤は、脳および脊髄の状態のために、くも膜下腔内に導入され得る。別の例では、この治療剤は、筋肉から罹患ニューロンに戻り移動するウイルス、例えば、ＡＡＶ、レンチウイルスおよびアデノウイルスについては、筋内で導入され得る。これらの製剤は、適切な場合、個別の単位剤形中に簡便に提示され得、薬学に周知の方法のいずれかによって調製され得る。かかる方法は、治療剤を液体担体、固体マトリックス、半固体担体、微細に分割された固体担体またはそれらの組合せと会合させるステップ、および次いで、必要に応じて、その産物を所望の送達系中に導入するまたは所望の送達系の形状にするステップを含み得る。
【０２７０】
本発明の治療剤が投与のために調製される場合、それらは、好ましくは、医薬製剤または単位剤形を形成するために、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わされる。かかる製剤中の総活性成分は、製剤の０．１〜９９．９重量％を含む。「薬学的に許容される」は、製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントにとって有害でない、担体、希釈剤、賦形剤および／または塩である。投与のための活性成分は、粉末としてまたは顆粒として、溶液、懸濁物またはエマルジョンとして、存在し得る。
【０２７１】
本発明の治療剤を含む医薬製剤は、周知かつ容易に入手可能な成分を使用して、当技術分野で公知の手順によって調製され得る。本発明の治療剤は、例えば、筋内、皮下または静脈内経路による非経口投与に適切な溶液としても、製剤化され得る。
【０２７２】
本発明の治療剤の医薬製剤は、水性もしくは無水の溶液もしくは分散物の形態、またはあるいは、エマルジョンもしくは懸濁物の形態もまたとり得る。
【０２７３】
したがって、この治療剤は、（例えば、注射、例えば、ボーラス注射または持続的注入による）非経口投与のために製剤化され得、アンプル、事前充填シリンジ、小容量注入コンテナ中に、または防腐剤が添加された多用量コンテナ中に、単位用量形態で提示され得る。活性成分は、油性または水性ビヒクル中の懸濁物、溶液またはエマルジョンなどの形態をとり得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤用薬剤を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前の、適切なビヒクル、例えば、無菌の、発熱物質を含まない水による構成のための、無菌固体の無菌性単離または溶液からの凍結乾燥によって取得された粉末形態であり得る。
【０２７４】
必要な有効量は、複数の投薬単位の投与によって達成され得るので、各剤形の個々のエアロゾル用量中に含まれる活性成分（単数または複数）の単位含量は、特定の適応症または疾患を処置するための有効量をそれ自体で構成する必要はないことが、理解される。さらに、この有効量は、個々に、または一連の投与で、剤形中の用量未満を使用して、達成され得る。
【０２７５】
本発明の医薬製剤は、任意選択の成分として、当技術分野で周知の型の、薬学的に許容される担体、希釈剤、可溶化剤または乳化剤および塩を含み得る。本発明の医薬製剤において有用な担体および／または希釈剤の具体的な非限定的な例には、水および生理学的に許容される緩衝食塩水溶液、例えば、リン酸緩衝食塩水溶液  ｐＨ７．０〜８．０食塩水溶液および水が含まれる。
【０２７６】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってここで例示される。
【実施例】
【０２７７】
（実施例１）
単一ヌクレオチドのシード改変は、マウス脳における毒性ｍｉＲＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｖｏ許容性を回復させる
【０２７８】
ハンチントン病（ＨＤ）は、ハンチンチン（ＨＴＴ）のポリグルタミン伸長形態の発現によって引き起こされる、致死的な神経変性疾患である。最近の研究により、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を含む遺伝子サイレンシングアプローチが、ＨＤマウスモデルにおいて疾患リードアウトを改善することが示されている。ＨＴＴ標的化ＲＮＡｉをクリニックまで前進させるために、本発明者らは、頑強なオンターゲットサイレンシング効力および意図しないヒト転写産物の最小化されたサイレンシングを有するＲＮＡｉ構築物、ＨＤＳ１を設計した（McBrideら、Mol  Ther.  ２０１１年１２月、１９巻（１２号）、２１５２〜２１６２頁）。Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓでは、被殻へのＡＡＶ．ｍｉＨＤＳ１の送達は、注射の６週間後まで、細かい運動スキルおよび大まかな運動スキルを含む神経学的状態に対する有害効果なし、免疫活性化なし、ならびに神経病理学なしで、ＨＴＴ発現を低減させた。他者は、注射後６ヶ月間にわたって、サルにおいて異なるＨＴＴ標的化ＲＮＡｉの安全性を示した。
【０２７９】
ＨＤ患者へのＨＤＳ１の適用は、それがヒトのために最適化されたという事実にもかかわらず、げっ歯類におけるさらなる安全性試験を必要とする。この規制上の要件を満たすために、本発明者らは、ＡＡＶ．ｍｉＨＤＳ１注射後にマウスを評価した。サルとは対照的に、神経学的欠陥がマウス脳において急性的に生じ、これは、ｍｉＨＤＳ１と他の転写産物の３’非翻訳領域との相互作用を介したオフターゲットサイレンシングに起因し得る。本発明者らは、マウス脳におけるｍｉＨＤＳ１毒性を解決し、ｍｉＨＤＳ１−サイレンシング効力を維持したが、これらの研究は、ヒト使用のために安全性のために核酸ベースの薬を最適化することが、げっ歯類または他の遠縁の種における安全性試験にとって、課題を提示することを強調している。
【０２８０】
ＨＤは、ハンチンチンの第１エクソン内でのＣＡＧリピート伸長（＞３６リピート）によって引き起こされる。変異体ハンチンチン（ｍＨＴＴ）は、遍在的に発現されるが、脳、特に線条体は、頑強かつより早期の変性を示す。ＨＤの発生率は、欧州および米国において１００，０００個体当たり約５〜１０人であり、発病は、一般には、２０歳代または３０歳代に生じる。今日まで、ＨＤの管理は、運動症状または精神症状を低減させ得る薬物を含んでいる。
【０２８１】
ＨＤの誘導可能なモデルを使用した以前の研究により、ｍＨＴＴ発現が一旦止まると、疾患発病および線条体萎縮症の数週間後であっても、疾患症状が改善することが示されている。これは、初期症状発病後にＨＤを処置する絶好のチャンスが存在することを暗示している。したがって、ＲＮＡｉを含む遺伝子サイレンシングテクノロジーを使用して遺伝子発現を低減させる方法を、治療的代替法として調査すべきである。
【０２８２】
ＲＮＡｉは、二本鎖低分子非コードＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）が、標的化されたｍＲＮＡ配列の配列特異的分解を引き起こす、転写後遺伝子サイレンシングの進化的に保存されたプロセスである。内因性ＲＮＡｉ経路は、マイクロプロセッサー複合体の構成成分Ｄｒｏｓｈａによって核において順次切断されて、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を生成する、より大きい一次ＲＮＡ転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）の発現によって始まる。Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、細胞質にエキスポートされ、引き続いてＤｉｃｅｒによって切断されて、成熟ｍｉＲＮＡを放出する。ｍｉＲＮＡ配列の２つの鎖のうち、一方（アンチセンス「ガイド」鎖）は、一般に、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に優先的に取り込まれ、ここで、標的ｍＲＮＡに直接結合し、発現を阻害する。ｍｉＲＮＡは、典型的には、部分的相補性を介してｍＲＮＡ発現を抑圧する。Ｄｉｃｅｒ切断から出現するｄｓＲＮＡの一方の鎖が、その標的に対して完全に相補的である場合、得られた低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、「ガイド」鎖のヌクレオチド１０および１１の向かいの塩基における標的のエンドヌクレアーゼ的切断を指示し、ｍＲＮＡ破壊を誘発する。科学者は、内因性ＲＮＡｉ経路を選出し、特異的遺伝子の発現を抑制するために、異なる発現ベースの系を開発した。例えば、ＲＮＡｉ発現系は、標的化されたｍＲＮＡに対して相補的なその鎖の一方を有する低分子ヘアピンＲＮＡ配列を発現させ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（短鎖ヘアピンＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ）またはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ（人工ｍｉＲＮＡ）ステップにおいてこの経路に進入するように、設計され得る。
【０２８３】
細胞中に急性的にトランスフェクトされる発現系またはｓｉＲＮＡについて、活性なガイド鎖を、最小のオフシークエンス（off-sequence）サイレンシングと可能な限り特異的であるように設計する。ガイドと、完全な相補性を有する他の転写産物との相互作用から生じるオフシークエンスサイレンシングは、標準的な検索アルゴリズムを使用して回避され得る。回避がより困難な型のオフターゲティングは、他のｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲ配列との、ロードされた鎖の５’末端における塩基２〜７の、ＲＮＡｉシード配列の部分的相補性に起因して生じるものである。この場合、発現の抑圧は、ｍｉＲＮＡ様機構を介して生じる。以前の研究において、本発明者らは、ＲＩＳＣローディングへの強い鎖偏向、および意図しないヒト転写産物に対する最小化されたオフターゲットサイレンシング潜在力を有する、強力なＲＮＡｉ配列を設計するために、アルゴリズムｓｉＳＰＯＴＲを開発した。ｓｉＳＰＯＴＲを使用して、ＨＴＴサイレンシングのためのトリガーを設計した場合、本発明者らは、ＡＡＶベクターから発現されたｍｉＨＤＳ１が、非ヒト霊長類被殻への送達後に複数のレベルで安全性を示したことを見出した。
【０２８４】
ヒト適用のための前提条件として、本発明者らは、正常なげっ歯類において安全性を評価するための追跡実験を実施した。特に、本発明者らは、ＨＤＳ１が、Ｂｃｌ２の意図しないサイレンシングに起因し得る、線条体注射後の頑強な運動欠陥を誘導したことを見出した。本発明者らは、オフターゲティング毒性が、ＨＴＴ−サイレンシング効力を維持したままで、いくつかの戦略によって解決され得ることを、さらに示している。全体として、これらの研究は、遠縁の種において使用した場合に、異なる、おそらくは疾患誘導性のオフターゲティングプロファイルを示す核酸ベースの薬を、ヒトにおける特異性および安全性のために最適化するという課題を強調している。
【０２８５】
結果
【０２８６】
ｍｉＨＤＳ１は、マウス脳において神経学的欠陥を誘導する。
【０２８７】
以前の研究において、本発明者らは、高いオンターゲットサイレンシング効力および最小化されたオフターゲット潜在力を有する、ハンチンチンに対する人工ｍｉＲＮＡ配列、ｍｉＨＤＳ１を設計した（図１Ａ）。ｍｉＨＤＳ１を発現するＡＡＶベクターを非ヒト霊長類の被殻中に注射した場合、ＨＴＴレベルは有意に低減され、ニューロン変性、免疫応答または運動欠陥の徴候は存在しなかった。全体として、これらの研究は、ＨＤ治療剤としてのｍｉＨＤＳ１の潜在力を強調した。しかし、ヒト適用のための前提条件として、げっ歯類などの別の種におけるさらなる試験が必要とされる。したがって、本発明者らは、それがヒト細胞における安全性のために設計されたという事実にもかかわらず、正常マウスにおけるＡＡＶ．ｍｉＨＳＤ１の安全性試験を実施することを目指した。
【０２８８】
前臨床構築物を構築することにおける最初のステップとして、本発明者らは、形質導入された領域の可視化のために本発明者らの以前の研究において使用したｅＧＦＰ発現カセットではなく、スタッファー配列を含むように、ＡＡＶ．ｍｉＨＳＤ１ベクターを再設計した。このスタッファー配列は、エンハンサーまたはリプレッサー配列、スプライスアクチベーターまたはリプレッサー、およびアンチセンスまたは他の非コードＲＮＡを欠き、小さいＲＮＡｉ発現カセットの最適なパッケージングのための十分なサイズであるように、設計した。最終ＡＡＶ２／１ベクターは、本発明者らのｉｎ  ｖｉｖｏ研究の多くにおいて以前に使用した対照、ｍｉＨＤＳ１またはｍｉＣｔｌを発現した（図１Ｂ）。
【０２８９】
野生型マウスを計量し、基底ロータロッド成績を、等しい能力の群への動物の分配の前に７週齢の時点で評価した（群間の処置前の差異を回避するため）。ＡＡＶ．ｍｉＨＤＳ１またはＡＡＶ．ｍｉＣｔｌを、ＡＡＶｍｉＨＤＳ１／スタッファー（ｎ＝１３）およびＡＡＶｍｉＣｔｌ／スタッファー（ｎ＝１１）ウイルスによって、８週齢の時点で線条体中に両側的に注射した（図１Ｃ、Ｄ）。ＡＡＶ送達の早くも２ヶ月後に、ｍｉＨＤＳ１を発現するマウスは、対照処置した同腹仔と比較して、有意なロータロッド欠陥を有し、減少した落下までの潜時を示した（図１Ｄ）。そして、全ての動物は、研究の過程にわたって体重増加したが、ＨＤＳ１処置したマウスは、ｍｉＣｔｌ処置したマウスよりも増加が有意に少なかった（図１Ｅ）。
【０２９０】
マウス脳におけるｍｉＨＤＳ１オフターゲット遺伝子の特徴付け。
【０２９１】
ｍｉＨＤＳ１を、ヒト転写産物の最小のオフターゲットサイレンシングを有するように設計したが、マウスにおける安全性のためには最適化せず、本発明者らは、マウス転写産物に対する潜在的毒性について、配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで事前に評価しなかった。サルにおいて以前に使用したＡＡＶ．ｍｉＨＤＳ１．ｅＧＦＰ構築物は、適切な鎖ローディングを示したが、本発明者らは、次に、いずれか一方の鎖が、ロードされた場合に、オフターゲットサイレンシングを惹起できるので、鎖偏向についてｍｉＨＤＳ１．スタッファー発現カセットの忠実度を試験した。このために、本発明者らは、ルシフェラーゼレポーターの下流にクローニングされたｍｉＨＤＳ１標的からなるレポーター構築物を設計した。本発明者らは、ガイド鎖からの抑圧を見出し、非ガイド鎖からの抑圧がないことを見出した（図１Ｇ）。これは、ＨＤＳ１．ｅＧＦＰ発現カセットの本発明者らの以前のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現分析と一致しており、本発明者らが、ＲＩＳＣ複合体中へのガイド「アンチセンス」鎖の適切なローディングを促進するために、低い５’末端熱力学的安定性を有するｍｉＨＤＳ１配列を設計したという事実によって支持される。したがって、ｍｉＨＤＳ１発現によって観察されたニューロン欠陥は、意図しないｍＲＮＡの３’ＵＴＲへのガイド「アンチセンス」鎖の結合、およびｍｉＲＮＡ様機構によるサイレンシング発現に起因する可能性が高い。
【０２９２】
以前の研究により、ほとんどのオフターゲット効果は、他のｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲへのシード媒介性の結合に起因していることが実証されているので、本発明者らは、一般的なｉｎ  ｓｉｌｉｃｏアプローチを使用して、可能性のあるｍｉＨＤＳ１オフターゲットを最初に同定した。ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ＴＳ）およびＰＩＴＡアルゴリズムなどの、多くの異なる標的予測プログラムが、推定ｍｉＲＮＡ結合部位を同定すると記載されている。ＴａｒｇｅｔＳｃａｎは、ｍｉＲＮＡシード配列に対して相補的な８マーおよび７マー部位の存在について３’ＵＴＲ配列を検索することによって、特異的ｍｉＲＮＡのための生物学的標的を予測する。このアルゴリズムは、ｍｉＲＮＡ媒介性調節に好都合であることが公知の、代償的３’塩基対合、局所的配列コンテクストおよび強い配列保存を有する標的部位を優先順位付けすることによって、標的予測精度を改善している。以前の研究により、シード媒介性のオフターゲット効果が種特異的であることが示されているので、本発明者らは、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎを使用して、マウス３’ＵＴＲトランスクリプトームにおいて、シード配列相補性に基づいて標的を予測した。ＰＩＴＡアルゴリズムは、ｍｉＲＮＡ結合部位を予測するために、標的−部位アクセス可能性を取り込む。所与の標的部位について、ＰＩＴＡは、標的へのｍｉＲＮＡの結合（ｄＧ二重鎖）と対合していない標的−部位ヌクレオチド（ｄＧオープン）との間での自由エネルギー差、ｄｄＧスコア値を決定する。ＰＩＴＡに基づいて、−１０を下回るｄｄＧスコアは、内因性ｍｉＲＮＡ標的に対して機能的である可能性がより高いが、過剰発現されたｍｉＲＮＡ配列についての閾値は、より高くなり得る（０と−１０との間）。したがって、本発明者らのアプローチにおいて、本発明者らは、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎを使用して、全ての潜在的シード結合部位を同定し、その後、ＰＩＴＡアルゴリズムによって、ｄｄＧスコアを決定し、全ての潜在的ｍｉＨＤＳ１部位をランク付けした。マウス３’ＵＴＲｏｍｅに対して本発明者らのアプローチを使用して、本発明者らは、ｍｉＨＤＳ１についての潜在的オフターゲットとして１９７の転写産物を予測し、１７０が線条体において発現された（図３ｃ）。予測されたように、オルソロガスなヒトおよびアカゲザルの３’ＵＴＲにおけるｍｉＨＤＳ１オフターゲットの予測により、マウスにおけるｍｉＨＤＳ１オフターゲティングが保存されないことが明らかになった。
【０２９３】
本発明者らは、オフターゲット遺伝子リストの上位２５パーセンタイルの中で、Ｂｃｌ２、Ｓｄｆ４、Ｓｍａｄ９、Ｂｍｉ１、Ｍｅｔｔｌ２、Ｌａｎｃｌ１およびＭａｐ２ｋ６を同定した（図２ａ、ｂ）。本発明者らは、これらの予測されたオフターゲットおよびマウスＨｔｔについてのＱ−ＰＣＲによって、ｍｉＣｔｌまたはｍｉＨＤＳ１で処置したマウスから取得した線条体試料を分析した。予測されたように、マウスＨｔｔ発現は、ｍｉＣｔｌ処置したマウスと比較して、ｍｉＨＤＳ１処置したマウスにおいて、有意に低減された（最大７０％）（図２ｃ）。評価したオフターゲット転写産物のセットの中で、Ｂｃｌ２、Ｓｄｆ４およびＭａｐ２ｋ６は、ＡＡＶ．ｍｉＨＤＳ１で処置したマウスから取得された組織試料上で、有意に低減された（図２ｃ）。これらの転写産物の中には、ｍｉＣｔｌによって影響されると予測されたものはなかった。本発明者らは、正常Ｈｔｔ対立遺伝子を有する不死化マウスニューロン線条体細胞株（ＳｔｈｄｈＱ７細胞）を使用して、これらの結果を確認した。ＳｔｈｄｈＱ７細胞を、ｍｉＨＤＳ１、ｍｉＣｔｌまたは転写産物なし（Ｕ６プロモーターのみを含んだ）を発現するプラスミドでエレクトロポレーションし、２４時間後、転写産物を、Ｑ−ＰＣＲによって分析した。マウス脳において観察されたように、Ｂｃｌ２発現は、ｍｉＨＤＳ１発現細胞において低減されたが、ｍｉＣｔｌを発現するものまたは対照Ｕ６プラスミド処理したものでは低減されなかった（図２ｄ）。対照的に、Ｓｄｆ４およびＭａｐ２ｋ６発現は、ｍｉＨＤＳ１の過剰発現によって低減されず（図２ｄ）、このことは、これらの遺伝子が、ｉｎ  ｖｉｖｏで直接的なオフターゲットではない可能性があり、経時的なＨｔｔ抑制または非ニューロン細胞におけるオフターゲット抑制の間接的効果を反映している可能性があることを示唆している；しかし、ＡＡＶ２／１は、ニューロンを主に形質導入する。興味深いことに、Ｓｍａｄ９発現は、ＳｔｈｄｈＱ７細胞において有意に増加し、ｍｉＨＤＳ１処置した線条体では、それほど有意ではないものの、上昇した（図２ｄ）。したがって、本発明者らのスクリーニングにより、マウス３’ＵＴＲｏｍｅにおいて、ＨＤＳ１の潜在的な有害なオフターゲットとして、Ｂｃｌ２が明らかになった。
【０２９４】
マウス脳における安全性のために、ｍｉＨＤＳ１をレスキューする。
【０２９５】
ｍｉＲＮＡ配列が、触媒的アルゴノートタンパク質（Ａｇｏ２）を含むＲＩＳＣ中にロードされる場合、ｍｉＲＮＡとその標的配列との間の完全な結合相補性が、エンドヌクレアーゼ的ｍＲＮＡ切断を媒介するために必要である。しかし、ｍｉＲＮＡ配列上の単一点変異によって生成されたミスマッチは、許容され得る。したがって、シード領域によって主に指向されるｍｉＨＤＳ１のオフターゲットプロファイルを改変するために、本発明者らは、サイレンシング効力に影響を与えることなしにシードを変更するように設計した単一点変異を導入した（図３Ａ）。
【０２９６】
どのシード変異が（ｉ）オフターゲットプロファイルを効率的に変化させ、（ｉｉ）低い全体的オフターゲティング潜在力を維持し、（ｉｉｉ）ヒトＨＴＴをサイレンシングするか、を同定するための最初のステップとして、本発明者らは、ｍｉＨＤＳ１の全ての単一ヌクレオチドシードバリアント（２〜７位）を使用して、オフターゲット予測分析を繰り返した（図３Ｃ）。オフターゲットプロファイルは、ｍｉＨＤＳ１のものと広範に重複したので、８位の変異体は放棄した。８位での対合は、ｍｉＲＮＡ媒介性のサイレンシングに必要でないので、これは予測されたことであった。３位および４位におけるシード変異体もまた放棄したが、それは、これらの変異が、予測されたオフターゲットの数を顕著に増加させたからである。残りのシードバリアントについて、全体的オフターゲティング潜在力は、ｍｉＨＤＳ１と匹敵し、ｍｉＨＤＳ１オフターゲットの１０％未満は、ｍｉＨＤＳ１バリアントと共有されていた（図３Ｃ）。
【０２９７】
したがって、本発明者らは、ｍｉＨＤＳ１シード領域の２、５、６および７位において単一点変異を導入して、ｍｉＨＤＳ１バリアントを生成した。本発明者らの目的は、ヒトＨＴＴのサイレンシングであるので、本発明者らは、ヒト由来ＨＥＫ２９３細胞株において全てのバリアントを最初にスクリーニングし、Ｑ−ＰＣＲによってサイレンシング効力を決定した（図４Ａ）。全てのｍｉＨＤＳ１バリアントが、元のｍｉＨＤＳ１と同等にＨＴＴ発現を低減させたわけではない。ｍｉＨＤＳ１と比較して、２位および７位においてミスマッチを有するｍＨＤＳ１バリアントは、ｍｉＨＤＳ１−サイレンシング効力を混乱させる。しかし、５位または６位においてミスマッチを含むｍｉＨＤＳ１バリアントについては、有意差は観察されなかった。注目すべきは、７位にミスマッチを有する異なるｍｉＨＤＳ１バリアントの中で、Ｃ＞Ｕ置換を有するバリアントだけが、Ｇ：Ｕゆらぎの熱力学的安定性におそらくは起因して、ｍｉＨＤＳ１と同等のサイレンシング効力を有した。本発明者らは、以下に基づいて、さらなる実験のためにｍｉＨＤＳ１ｖ６ＡおよびｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕを選択する：（１）同じシード位置においてミスマッチを含む他のｍｉＲＮＡバリアントと比較した、そのより高いサイレンシング効力、および（２）ＨＤＳ１と広く異なる中程度のオフターゲットプロファイルを有する、生成されたヌクレオチドミスマッチ型（Ｕ：Ｕ、ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕ；Ａ：Ｇ、ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａ、図４Ｄ）（図４Ｂ、４Ｃ、４Ｅ、４Ｆ）。
【０２９８】
ＲＩＳＣロードされたｍｉＲＮＡ配列は、以下である（注：３’→５’）：
【化１】
0006663859.tif 000003
【０２９９】
そのＰｒｉ−ｍｉＨＤＳ１は、以下である（５’→３’）：
【化２】
0006663859.tif 000004
【０３００】
そのＰｒｅ−ｍｉＨＤＳ１は、以下である（５’→３’）：
【化３】
0006663859.tif 000005
【０３０１】
予測されたように、ｍｉＨＤＳ１ｖ６ＡおよびｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕの発現は、マウス（ＳｔｈｄｈＱ７）およびヒト（ＨＥＫ２９３）細胞株の両方においてＨｔｔタンパク質レベルを低減させ、ｍｉＨＤＳ１に対して有意差はなかった（図４Ａ〜４Ｅ）。
【０３０２】
次に、本発明者らは、検証されたｍｉＨＤＳ１オフターゲットマウス転写産物に対する、ｍｉＨＤＳ１ｖ６ＡおよびｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕの効果を評価した。ｍｉＲＮＡシードとその標的ｍＲＮＡとの間での自由エネルギー結合、シード対合安定性（ＳＰＳ）は、ｍｉＲＮＡ配列がオフターゲットサイレンシング効果を生じるかどうかに影響する。ｍｉＨＤＳ１バリアントは、それ自身の標的に対して、元のｍｉＨＤＳ１と類似のＳＰＳ値を有したが、ｍｉＨＤＳ１オフターゲット上の、ｍｉＨＤＳ１バリアントのシード領域におけるミスマッチは、ＳＰＳ値を減少させた（図３ｂ）。ＰＩＴＡに基づくと、シード領域におけるミスマッチの導入は、全てのＨＤＳ１の予測されたオフターゲット遺伝子に対するｄｄＧスコア値を低減させ、ｍｉＨＤＳ１ｖ５ＵよりもｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａについて顕著であった。興味深いことに、ｍｉＨＤＳ１バリアントのシード配列は、同じｍｉＨＤＳ１オフターゲットのいくつかの上に、異なる標的部位を生じた。
【０３０３】
本発明者らは、ｍｉＨＤＳ１によって、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＢｃｌ２のサイレンシングを以前に実証している。ＴａｒｇｅｔＳｃａｎに基づくと、ｍｉＨＤＳ１ｖ６ＡおよびｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕは、Ｂｃｌ２  ３’ＵＴＲをもはや標的化せず、ＰＩＴＡは、ｍｉＨＤＳ１部位において低減されたｄｄＧスコアを予測しており、このことは、Ｂｃｌ２サイレンシングがｍｉＨＤＳ１ｖ６ＡまたはｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕによって弱められることを示唆している。これを試験するために、ＳｔｈｄｈＱ７細胞を、ｍｉＲＮＡ発現カセットを含むプラスミドまたはＵ６プロモーターのみの対照プラスミドでエレクトロポレーションし、２４時間後に、Ｂｃｌ２、ＨｔｔおよびＳｍａｄ９の発現を、Ｑ−ＰＣＲによって決定した。対照（ｍｉＣｔｌおよびＵ６）と比較して、Ｈｔｔ  ｍＲＮＡレベルは、ｍｉＨＤＳ１でエレクトロポレーションした細胞およびｍｉＨＤＳ１バリアントでエレクトロポレーションした細胞の両方において、有意に低減された（図４ｇ）。しかし、重要なことに、ｍｉＨＤＳ１は、Ｂｃｌ２発現を４０％有意に低減させたが、ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａのエレクトロポレーション後にはサイレンシングは観察されなかった。ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕ発現は、Ｂｃｌ２に対してなおも活性であり、サイレンシングレベルを２０％に保持した（図４ｈ）。興味深いことに、ｍｉＨＤＳ１発現と関連するＳｍａｄ９過剰発現は、ｍｉＨＤＳ１ｖ５ＵまたはｍｉＨＤＳ１ｖ６でエレクトロポレーションした細胞においては観察されなかった（図４ｉ）。
【０３０４】
ヒトハンチンチンｍＲＮＡに対してｍｉＣｔｌを再指向させる。
【０３０５】
本発明者らの以前の実験は、そのオフターゲット効果に起因するｍｉＨＤＳ１の毒性を露呈したが、マウス脳において発現される場合、ｍｉＣｔｌが許容可能であることもまた強調した。ｍｉＣｔｌは、低いオフターゲットサイレンシングプロファイルで設計したが、ハンチンチンｍＲＮＡを標的化することは意図しなかった。したがって、本発明者らは、本発明者らが、マウス線条体におけるｍｉＣｔｒｌシードの相対的安全性を利用できるかどうか、およびそのシード周辺でＨＴＴ標的化ＲＮＡｉトリガーを設計できるかどうかを試験した。
【０３０６】
最初のステップとして、本発明者らは、ｍｉＣｔｌシード領域に対して完全に相補的な配列について、ヒトＨＴＴ  ｍＲＮＡまたは臨床的標的をスクリーニングしたが、何も見出さなかった。ｍｉＨＤＳ１バリアントを設計するための同じ戦略に従って、本発明者らは、ｍｉＲＮＡ配列のヌクレオチド２〜７の間に単一のミスマッチを許容するこのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析を反復した。本発明者らは、４つの相補的配列（ｍｉＨＤｓｓ１〜４）を見出した：ＭｉＨＤｓｓ１（７位におけるミスマッチ）およびｍｉＨＤｓｓ４（４位におけるミスマッチ）は、３’ＵＴＲにおいてＨＴＴを標的化し、一方、ｍｉＨＤｓｓ２（６位におけるミスマッチ）およびｍｉＨＤｓｓ３（５位におけるミスマッチ）は、それぞれエクソン７−８接合部にまたがるまたはエクソン３３におけるコード領域において、ＨＴＴを標的化した（図５ａ、ｂ）。ＨＥＫ２９３細胞において試験した場合、ｍｉＨＤｓｓ３のみが、Ｑ−ＰＣＲ（図５ｃ）およびウエスタンブロット（図５ｄ、ｅ）によって決定したように、対照処理した細胞の４０〜５０％までＨＴＴ発現をサイレンシングした。
【０３０７】
ｍｉＣｔｌおよびｍｉＨＤＳＳ３は、同じシード配列を共有するので、本発明者らは、両方のｍｉＲＮＡが同じオフターゲットプロファイルを有すると予測する。しかし、特定のｍｉＲＮＡファミリー由来の内因性ｍｉＲＮＡで観察されるように、サイレンシング効力は、各ｍｉＲＮＡの３’領域上の配列差異に起因して変化し得る。本発明者らは、ＰＩＴＡアルゴリズムを使用して、ｍｉＣｔｌとｍｉＨＤｓｓ３オフターゲットとの間で、ｍｉＲＮＡ結合安定性およびサイレンシング潜在力を比較した。本発明者らのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏアプローチによって、本発明者らは、ｍｉＣｔｌおよびｍｉＨＤｓｓ３の両方について８９のオフターゲット部位を予測し、６７が線条体において発現された。興味深いことに、ｍｉＨＤｓｓ３の３’領域は、ｍｉＣｔｌと比較して、オフターゲット−ｍｉＲＮＡ結合安定性を増加させる（図５ｆ）。
【０３０８】
マウス脳におけるｍｉＨＤＳ１バリアントおよびｍｉＨＤｓｓ３の許容性の特徴付け。
【０３０９】
新たな配列のｉｎ  ｖｉｖｏ許容性を決定するために、ｍｉＲＮＡ発現カセットを、本発明者らのＡＡＶシャトルベクター中にクローニングした（図６ｂ）。７週齢の野生型マウスを、同等な体重および基底ロータロッド成績に基づいて群に分け、引き続いて、ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａ、ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕ、ｍｉＨＤｓｓ３またはｍｉＨＤＳ１、ｍｉＣｔｌを発現するウイルス、および実験対照としての製剤化緩衝液（ＦＢ）を、線条体中に両側的に注射した。注射の２ヶ月後および４ヶ月後に、マウス体重を記録し、神経性の有害効果を、加速ロータロッド、握りおよびオープンフィールド試験を使用することによって決定した（図６ａ）。
【０３１０】
本発明者らの以前の結果と一致して、ｍｉＨＤＳ１を発現するマウスは、加速ロータロッド装置上で運動欠陥を示した（図６ｃ）。また、ＦＢ緩衝液単独またはｍｉＣｔｌを注射したマウス間では、差異は観察されなかった。有害効果が、内因性経路を選出した結果ではなく、特異的ｍｉＨＤＳ１オフターゲット効果の結果であることを示唆しているので、この結果は重要である。興味深いことに、かつ本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究と一致して、ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕもまた、ロータロッド欠陥を示した。これは、ピリミジン：ピリミジンミスマッチ（Ｕ：Ｕ、ｍｉＲＮＡ：ｍＲＮＡ）が中程度の識別力を示し、このバリアントがＢｃｌ２をなおも部分的にサイレンシングしたことを反映している可能性がある（図４Ｈ）。本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究からも予測されるが、ｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａは、ｍｉＨＤＳ１媒介性の毒性を改善し、ＡＡＶ注射の２ヶ月後または４ヶ月後に、ｍｉＨＤＳ１ｖ６ＡとｍｉＣｔｌとの間で有意差は観察されなかった。ヒトハンチンチンをサイレンシングすることに加えて、ｍｉＨＤｓｓ３は、ｍｉＣｔｌと同じオフターゲットプロファイルを共有する。しかし、ＰＩＴＡアルゴリズムは、ｍｉＨＤｓｓ３が、ｍｉＲＮＡ：ｍＲＮＡ対の結合安定性を増加させることによって、ｍｉＣｔｌオフターゲットレパートリーをサイレンシングする傾向がより高いことを示唆している（図５ｆ）。しかし、２ヶ月または４ヶ月の時点では、加速ロータロッド上で、有意差は観察されなかった（図６ｃ）。
【０３１１】
経時的に体重減少する（４ヶ月の時点で、−１．７ｇ、８％低減）、ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕを注射したマウスを除いて、体重増加が、全ての他の群において記録された。また、体重増加は、前述のように、ｍｉＨＤＳ１処置で有意に低減された。４ヶ月の時点で、ｍｉＨＤＳ１注射したマウスは、１．３グラム（５％）の体重増加を有したが、他の群は、３．６および５．２グラムからの体重増加を有した（４ヶ月の時点で、１５〜２２％増加）（図６ｄ）。
【０３１２】
考察
【０３１３】
この研究において、本発明者らは、ヒトにおける安全性のために設計されたＲＮＡｉトリガーの、正常マウスにおける安全性を試験することを目指し、以前の研究において、非ヒト霊長類において安全であることを示した。２つの種、一般には、げっ歯類および大型哺乳動物において、ヒト使用について薬物を試験することは、規制当局の承認を初期相研究に向かって前進させるための標準的な手順である。本発明者らは、後の研究において他者によっても報告された、サルにおける著しい毒性は見出さなかったが、意図した構築物をげっ歯類において試験した場合、急性毒性が認められた。
【０３１４】
本発明者らは、本発明者らが、オフターゲットプロファイルを変更するために、シードにおいて点変異を作製することによって、試験した配列、ｍｉＨＤＳ１の毒性を低減できることを見出した。単一のシード配列改変は、サイレンシング効力を維持しつつ、元のｍｉＨＤＳ１のオフターゲットプロファイルを変化させた。ｍｉＨＤＳ１ｖ５ではなくｍｉＨＤＳ１ｖ６は、マウス脳においてｍｉＨＤＳ１許容性を回復させた。ｍｉＨＤＳ１ｖ５Ｕは、ピリミジン：ピリミジンミスマッチであるＵ：Ｕミスマッチを生じ、一方でｍｉＨＤＳ１ｖ６Ａは、プリン：ピリミジンミスマッチであるＡ：Ｇを生じ、識別するのに最も効果的であることが見出された。
【０３１５】
ＨＤＳ１のシードを変更することの代替法として、本発明者らは、低いオフターゲティング潜在力のためにも設計された本発明者らの制御配列が、ヒトＨＴＴを標的化するように再操作され得ることを、以前に認めていた。マウスにおいて試験した場合、両方の配列が、十分に許容され、親ＨＤＳ１について以前に認められたような、神経病理学も神経学的欠陥も誘導しなかった。
【０３１６】
これらの知見は、伝統的薬物開発と核酸ベースの薬の新たに出現した分野との間のコントラストを強調している。全てのヒト薬物開発の目的は、標的集団における安全性および効力であるが、核酸ベースの薬の場合、意図した薬物は、ゲノムおよび／または発現された転写産物と直接相互作用する。したがって、配列特異性に依存し、ヒトにおける安全性のために最適化された薬物は、他の種のゲノムと、特に、げっ歯類などの遠縁の種のゲノムと、示差的に相互作用する可能性が高い。他方、配列が、げっ歯類における安全性のために最適化される場合、ヒトゲノムに関連する問題のリスクはより高い。
【０３１７】
まとめ
【０３１８】
本発明の結果は、以下を強調する：（１）ｍｉＲＮＡの安全性および許容性プロファイルは、種特異的であり、疾患のマウスモデルを使用する初期の研究の注意深い解釈を強調している、および（２）単一のシード配列改変は、サイレンシング効力を維持しつつ、ｍｉＲＮＡ配列のオフターゲット毒性を解決するための有効な戦略である。
【０３１９】
材料および方法
【０３２０】
細胞株およびトランスフェクション。
【０３２１】
ＨＥＫ２９３を、ＡＴＣＣから取得し、製造業者によって提供される条件下で培養した。ＳｔｈｄｈＱ７は、Ｍａｒｃｙ  ＭａｃＤｏｎａｌｄの厚意により取得した。ＨＥＫ２９３に対する全てのプラスミドＤＮＡトランスフェクションを、製造業者によって提供されるガイドラインを使用して、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。ＳｔｈｄｈＱ７細胞のＤＮＡトランスフェクションを、エレクトロポレーション条件を使用し、製造業者によって提供されるガイドラインに従って、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｎｅｏｎトランスフェクションシステムを使用して行った。
【０３２２】
ベクター設計およびＡＡＶ産生。
【０３２３】
人工ｍｉＲＮＡ配列（ｍｉＣｔｌ、ｍｉＨＤｓｓバリアント、ｍｉＨＤＳ１およびｍｉＨＤＳ１バリアントを、重複するＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ）のポリメラーゼ伸長によって生成した。ポリメラーゼ伸長産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、ＸｈｏＩ−ＳｐｅＩで消化し、マウスＵ６プロモーター、ＭＣＳおよびＰｏｌ−ＩＩＩ−ターミネーター（６Ｔ）を含むＰｏｌ−ＩＩＩ発現カセット上のＸｈｏＩ−ＸｂａＩ部位中にクローニングした。
【０３２４】
ＲＮＡｉルシフェラーゼレポーターベクターを、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して構築した。ｍｉＨＤＳ１のセンス鎖またはアンチセンス鎖に対する単一の完全に相補的なＲＮＡｉ標的部位を含むテイル付きＤＮＡオリゴヌクレオチドを、アニーリングさせ、ウミシイタケルシフェラーゼｃＤＮＡ配列の停止コドンの下流のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ部位中にクローニングした。
【０３２５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究のために、ｍｉＲＮＡ発現カセットを、ＤＮＡスタッファー配列の上流のＡＡＶシャトルプラスミド中に移動させた。ｍｉＲＮＡ発現カセットおよびスタッファー配列を、ＡＡＶ血清型２の１４５−ｂｐの逆位末端リピート配列によって、各末端において隣接させた。
【０３２６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏルシフェラーゼアッセイ。
【０３２７】
２４ウェルプレート中で成長させた７０％コンフルエンスのＨＥＫ２９３細胞に、ｍｉＲＮＡ発現プラスミドおよびＲＮＡｉルシフェラーゼレポータープラスミドを共トランスフェクトした。２４時間後に、細胞を、氷冷ＰＢＳでリンスし、ウミシイタケおよびホタルのルシフェラーゼ活性を、２０μｌの細胞溶解物を使用して、製造業者の指示に従ってＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。発光リードアウトを、Ｍｏｎｏｌｉｇｈｔ  ３０１０ルミノメーター（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて得た。相対発光量を、ウミシイタケ／ホタル相対発光量の商として計算し、結果を対照ｍｉＲＮＡと比較して表した。
【０３２８】
ウエスタンブロット分析。
【０３２９】
ＨＥＫ２９３細胞を、示されたようにｍｉＲＮＡ発現カセットでトランスフェクトした。４８時間の時点で、細胞を、氷冷ＰＢＳで１回リンスし、Ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ緩衝液（ＰＢＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解させた。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ−Ｌｏｗｒｙ法（ＢｉｏＲａｄ）、およびＮｕＰＡＧＥ３〜８％  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅゲル（Ｎｏｖｅｘ  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上にロードした１０μｇのタンパク質によって決定した。タンパク質を、ＰＶＤＦメンブレン上に移し、マウス抗Ｈｔｔ（１：５０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＣＡ）またはウサギ抗ベータ−アクチン（１：４００００、Ｓｉｇｍａ）抗体と共に、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼカップリング抗体（１：１０，０００、マウス；または１：５０，０００、ウサギ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）と共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて発色させた。サイレンシング効力を、ＶｅｒｓａＤｏｃ（商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ）およびＱｕａｎｔｉｔｙ  ＯｎｅＲ分析ソフトウェアを用いて、ベータアクチンと比較したタンパク質レベルのデンシトメトリー（ｎ＝４の独立した実験）によって決定した。
【０３３０】
ＲＮＡ抽出およびＱＰＣＲ分析。
【０３３１】
総ＲＮＡ単離を、イソプロパノール沈殿ステップでの水相への１μｌ  Ｇｌｙｃｏｂｌｕｅ添加、および冷７０％エタノールによる単回洗浄を除いて、製造業者のプロトコールに従ってＴｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して抽出した。ＲＮＡ試料を、分光光度法によって定量化し、引き続いて、ｃＤＮＡを、ランダムヘキサマー（ＴａｑＭａｎ  ＲＴ試薬、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて５００ｎｇの総ＲＮＡから生成した。マウスオフターゲット遺伝子のためのＳｙＢｒＧｒｅｅｎ  Ｑ−ＰＣＲプライマー対を、ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎウェブサーバー（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ）を使用して設計した。最終融解曲線アッセイを用いた７点検量線を実施して、各プライマー対を検証した。１００±５％の増幅効率および単一増幅産物を有するプライマー対のみを使用して、ｄｄＣｔ法を使用して、相対的遺伝子発現を決定した。
【０３３２】
マウス研究
【０３３３】
全ての動物プロトコールは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。野生型ＦＢＶおよびＢＡＣＨＤマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から取得した。マウスを、ＣＡＧリピートに隣接する変異体ヒトハンチンチン導入遺伝子に対して特異的なプライマーを使用して遺伝子型決定し、トランスジェニック同腹仔および同齢野生型同腹仔を、示された実験に使用した。マウスを、１２時間の明／暗サイクルで、温度制御した環境に収容した。食物および水を、自由に提供した。示された時点において、マウスに、ＡＡＶ２／１−ｍＵ６−ｍｉＲＮＡ／スタッファーウイルスを注射した。ＡＡＶ注射のために、マウスを、ケタミンおよびキシラジンミックスで麻酔し、５μｌのＡＡＶを、０．２μｌ／分の速度で線条体中に両側的に注射した（座標：十字縫合に対して＋０．８６ｍｍ吻側、内側に対して＋／−１．８ｍｍ外側、脳表面から−２．５ｍｍ腹側）。遺伝子発現分析に使用するマウスを、ケタミンおよびキシラジンミックスで麻酔し、２ｍｌのＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）溶液と混合した１８ｍｌの０．９％冷食塩水で灌流した。示された時点において、マウスを屠殺し、脳を取り出し、ブロッキングし、１ｍｍ厚の冠状スライスへとカットした。線条体由来の組織パンチを、組織芯抜き機（直径１．４ｍｍ；Ｚｉｖｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）を使用することによって採取した。全ての組織パンチを、液体窒素で急速冷凍し、使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【０３３４】
挙動分析
【０３３５】
注射したマウスの運動協調性を、ロータロッド装置（モデル４７，６００；Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、Ｃｏｍｅｒｉｏ、Ｉｔａｌｙ）を使用して決定した。基底ロータロッド試験を、７週齢の時点で、ならびにＡＡＶ注射の２ヶ月後および４ヶ月後に再度、実施した。マウスを、１日当たり３回の試行で連続する４日間にわたって試験し、各日の、試行と５分間の馴化期間との間の３０分間の休息期間は、最初の試行の６０分前に開始した。マウス１匹当たりの落下までの潜時を、試験した連続する４日間の１日当たりの各マウスの最良の２試行を平均することによって計算した。握り試験のために、各マウスを、１分間尾で吊るし、マウスがその胴体近くでその前足を一緒に抱える場合に、握りとしてスコアリングした。
【０３３６】
全ての刊行物、特許および特許出願は、参照によって本明細書に組み込まれる。上述の明細書中で、本発明は、そのある特定の好ましい実施形態に関連して記載され、多くの詳細が例示目的のために示されてきたが、本発明が、さらなる実施形態に影響されやすいこと、および本明細書に記載される詳細の一部が、本発明の基本原理から逸脱することなしに相当に変動され得ることは、当業者に明らかである。
【０３３７】
本発明を説明する文脈において、用語「１つの（a）」および「１つの（an）」および「この（the）」ならびに類似の指示対象の使用は、本明細書で特記しない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」および「含む（containing）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むがそれらに限定されない」を意味する）として解釈すべきである。本明細書での値の範囲の列挙は、本明細書で特記しない限り、その範囲内に入る各別々の値に個々に言及する速記方法として機能することのみを意図しており、各別々の値は、それらが本明細書で個々に列挙されているかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で特記しない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書に提供される任意のおよび全ての例、または例示的な言語（例えば、「例えば／など（such  as）」）の使用は、本発明をより明らかにすることのみを意図しており、他の仕方で特許請求されない限り、本発明の範囲に対する限定にはならない。本明細書中の言語は、任意の特許請求されていない要素を、本発明の実施に必須として示していると解釈すべきではない。
【０３３８】
本発明を実施するための、本発明者らが知る最良の様式を含む、本発明の実施形態が、本明細書に記載されている。かかる実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば、当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者が、かかるバリエーションを必要に応じて使用することを予測しており、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されたものとは異なって実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許容される通り、本明細書に添付の特許請求の範囲において列挙された主題の全ての改変および等価物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組合せは、本明細書で特記しない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【配列表】
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