(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
c)前記質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に含まれる微生物が、Salmonella属菌のいずれの血清型の菌を含むかを識別する識別ステップと
を有し、
前記マーカータンパク質として２種類のリボソームタンパク質Ｓ８、Peptidylpropyl isomeraseの少なくとも一方を用いることを特徴とする微生物の識別方法。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物の識別方法において、
前記マーカータンパク質として、少なくとも１２種類のリボソームタンパク質Ｓ８、Ｌ１５、Ｌ１７、Ｌ２１、Ｌ２５、Ｓ７、SODa、Peptidylpropyl isomerase、gns、YibT、YaiA、YciFに由来する質量電荷比m/zを指標とするクラスター解析を用いて、Salmonella属菌の血清型を分類することを特徴とする識別方法。
【請求項３】
請求項２に記載の微生物の識別方法において、
前記クラスター解析による識別結果を表すデンドログラムを作成するステップを、さらに有することを特徴とする微生物の識別方法。
【請求項４】
請求項１に記載の微生物の識別方法において、
Salmonella属菌の血清型が Orionであって、
前記マーカータンパク質として少なくとも、Peptidylpropyl isomeraseを含むことを特徴とする微生物の識別方法。
【請求項５】
請求項１に記載の微生物の識別方法において、
Salmonella属菌の血清型が Rissenであって、
前記マーカータンパク質として少なくとも、Ｓ８を含むことを特徴とする微生物の識別方法。
【請求項６】
コンピュータに請求項１〜５のいずれかに記載の各ステップを実行させるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析を利用した微生物の識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラはグラム陰性通性嫌気桿菌の腸内細菌科に属し、Salmonella属にはSalmonella enterica、Salmonella bongoriとSalmonella subterraneaの３つの菌種が属し、さらにSalmonella entericaには６つの亜種（Salmonella（以下「S.」と略すこともある）enterica subsp. enterica 、S. enterica subsp. salamae 、S. enterica subsp. arizonae 、S. enterica subsp. diarizonae 、S. enterica subsp. houtenae 、S. enterica subsp. indica）に分類される。【０００３】
Salmonella属には約2500の血清型が存在し、これは細胞壁リポ多糖体であるＯ抗原と、鞭毛タンパク質であるＨ抗原の組み合わせの違いに基づいたKaffmann-Whiteの分類によって決定される。食中毒性サルモネラなどの病原性サルモネラは、ほとんどS. enterica subsp. entericaに属する。この亜種も約1500種の血清型(serovar)に分類されている（非特許文献１）。現在、血清型を決定するためには抗血清による凝集試験が用いられている。それはスライド凝集によるＯ群別試験と試験管凝集によるＨ型別試験であり、Ｈ型別試験は運動性を高めるため、かつ１相、２相決定のための相誘導を行うため、血清型決定には時間と熟達した技術を要する。【０００４】
一部の血清型は病原性を示す宿主が決まっている。たとえばTyphi,、Choleraesuis、 Dublin、 Gallinarumは、人間、ブタ、牛、鶏に特異的に全身感染症を引き起こす。しかし、これら以外の多くの血清型は人、家畜、ペット、野生動物と複数の宿主に感染し、非チフス性急性胃腸炎(食中毒)の原因菌となっている。非チフス性サルモネラ菌の感染経路としては河川等の環境、野生動物、ペット、食品（1次汚染のみならず鼠族、昆虫などの2次汚染も含む）等多岐にわたっており、血清型の決定は感染防止及び疫学的分析のため重要であり、80年以上使用されている（非特許文献２）。【０００５】
非チフス性サルモネラ菌感染症の近年における高検出血清型は、Enteritidis、Thompson、Infantis、Typhimurium、Saintpaul、Braenderup、Schwarzengrund、Litchfield、Montevideoであり（IASR HP(参考資料１)）、我が国の家畜伝染病予防法ではDublin、Enteritidis、Typhimurium、 Choleraesuisに家畜が感染した場合、農林水産省への届出が義務付けられている。【０００６】
これまでにサルモネラ菌の検出および血清型を決定する方法として、マルチプレックスＰＣＲ（非特許文献３，４）、パルスフィールドゲル電気泳動法（非特許文献５）、マルチローカスシーケンスタイピング法（非特許文献６）等が報告されている。しかしながら、マルチプレックスＰＣＲでは、数個の血清型を決定するか、あるいは一部のＯ抗原、Ｈ抗原を決定するにとどまり、またこれ以外の手法は煩雑な操作が必要で時間がかかるという課題がある。【０００７】
一方、近年ではマトリックス支援レーザ脱離イオン化法飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）による微生物同定技術が臨床ならび食品分野で急速に広がっている。本法は、ごく微量の微生物試料を用いて得られたマススペクトルパターンに基づいて微生物同定を行う手法であり、短時間で分析結果を得ることができ、且つ多検体の連続分析も容易であるため、簡便且つ迅速な微生物同定が可能である。これまでに、複数の研究グループによりＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いたサルモネラ菌の識別が試みられてきた（非特許文献７，８，９，１０）【０００８】
非特許文献１０ではバイオマーカーを選出し決定木（Decision Tree）を作製することでSalmonella enterica subsp. entericaの亜種及び主要な５種類の血清型を区別している。Dieckmanらの研究は非常に細かくタンパク質のピークを精査しているが、バイオマーカーピークが出る株と出ない株があり、またピークの確認に時間がかかる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開2006-191922号公報
【特許文献２】特開2013-085517号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ANTIGENIC FORMULAE OF THE SALMONELLA SEROVARS 2007 9th edition WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella Patrick A.D. Grimont, Fran?ois-Xavier Weill Institut Pasteur, 28 rue du Dr. Roux, 75724 Paris Cedex 15, France
【非特許文献２】Winfield&Groisman, 2003,  福岡県環境研究所
【非特許文献３】M Akiba Et.al., Microbiological Methods, 2011, 85, 9-15
【非特許文献４】Y Hong et al.,BMC microbiology 2008, 8:178
【非特許文献５】F Tenover, et al.  Journal of clinical microbiology 33.9 (1995): 2233.
【非特許文献６】M Achtman, et al. PLoS Pathog 8.6 (2012): e1002776.
【非特許文献７】Seng, Piseth, et al. Future microbiology 5.11 (2010): 1733-1754.
【非特許文献８】M Kuhns et al. PLoS One 7.6 (2012): e40004.
【非特許文献９】R Dieckmann et al. AEM, 74.24 (2008): 7767-7778.
【非特許文献１０】R Dieckmann, et al. (2011): AEM-02418.
【非特許文献１１】T, Ojima-Kato, et al. PLOS one 2014: e113458.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
一方、特許文献１には、微生物菌体を質量分析して得られるピークの約半分がリボソームタンパク質由来であることを利用し、質量分析で得られるピークの質量電荷比を、リボソームタンパク質遺伝子の塩基配列情報を翻訳したアミノ酸配列から推測される計算質量と関連づけることで該ピークの由来となるタンパク質の種類を帰属する手法（Ｓ１０−ＧＥＲＭＳ法）が有用であることが示されている（特許文献１）。この手法によれば、質量分析およびそれに付属するソフトウェアを用いて理論的根拠に基づいた信頼性の高い微生物同定を行うことが可能となる（特許文献２）。【００１２】
本発明が解決しようとする課題は、Salmonella enterica subsp. entericaの血清型を迅速かつ簡単に識別することができる、遺伝的情報に基づいた信頼性の高いバイオマーカーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、質量分析によって試料に含まれる菌種がSalmonella属菌のいずれの血清型であるかを識別するために用いられるマーカータンパク質として２種類のリボソームタンパク質Ｓ８、Peptidylpropyl isomeraseが有用であること、これらリボソームタンパク質の少なくとも一つを用いることにより再現性よく、且つ迅速にSalmonella属菌の血清型の識別が可能であることを発見し、本発明に至った。【００１４】
すなわち、上記課題を解決するために成された本発明に係る微生物の識別方法は、
a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取るステップと、
c)前記質量電荷比m/zに基づいて、前記試料に含まれる微生物が、Salmonella属菌のいずれの血清型の菌を含むかを識別する識別ステップと
を有し、
前記マーカータンパク質として２種類のリボソームタンパク質Ｓ８、Peptidylpropyl isomeraseの少なくとも一方を用いることを特徴とする。【００１５】
上記の微生物の識別方法においては、
前記マーカータンパク質として、少なくとも１２種類のリボソームタンパク質Ｓ８、Ｌ１５、Ｌ１７、Ｌ２１、Ｌ２５、Ｓ７、SODa、Peptidylpropyl isomerase、gns、YibT、YaiA、YciFに由来する質量電荷比m/zを指標とするクラスター解析を用いて、Salmonella属菌の血清型を分類することが好ましい。【００１６】
この場合、前記クラスター解析による識別結果を表すデンドログラムを作成するステップを、さらに有することが好ましい。【００１７】
また、上記の微生物の識別方法において、Salmonella属菌の血清型が Orionであるときは、前記マーカータンパク質として少なくとも、Peptidylpropyl isomeraseを含むことが好ましい。【００１８】
さらに、Salmonella属菌の血清型が Rissenであるときは、前記マーカータンパク質として少なくとも、Ｓ８を含むことが好ましい。【００１９】
また、Salmonella属菌の血清型が Saintpaulであるときは、前記マーカータンパク質として少なくとも、Ｌ２１、Ｓ７、YaiA、YciFを含むことが好ましい。【００２０】
さらに、Salmonella属菌の血清型が Braenderupであるときは、前記マーカタンパク質として少なくとも、ＳＯＤ、又はgns及びＬ２５から成る群を含むことが好ましい。【００２１】
さらにまた、Salmonella属菌の血清型が Montevideo、又はSchwarzengrundであるときは、前記マーカータンパク質として少なくとも、ＳＯＤ及びＬ２１のいずれか一方と、Ｓ７を含むことが好ましい。【００２２】
また、Salmonella属菌の血清型が Enteritidisであるときは、前記マーカータンパク質として少なくとも、ＳＯＤ、Ｌ１７、及びＳ７を含むことが好ましい。【００２３】
さらに、Salmonella属菌の血清型が Infantisであるときは、前記マーカータンパク質として少なくとも、ＳＯＤ、Ｌ２１、Ｓ７、YibT、及びYciFを含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、Salmonella属菌の血清型に特有な変異を示すリボソームタンパク質をマーカータンパク質として用いたため、Salmonella属菌の血清型を再現性よく、且つ迅速に識別することができる。
また、Salmonella属菌の血清型に特有な変異を示すリボソームタンパク質をマーカータンパク質として用い、マススペクトル上におけるマーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを指標としてクラスター解析を行うことにより、複数の試料に含まれるSalmonella属菌の血清型の識別を一括で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明に係る微生物の識別方法に用いられる微生物識別システムの要部を示す構成図。
【図２】本発明に係る微生物の識別方法の手順の一例を示すフローチャート。
【図３】実施例で使用したSalmonella属菌の菌種名、亜種名および血清型の一覧を示す図。
【図４】凝集した免疫血清の組み合わせと血清型の関係を示す図。
【図５】実施例で使用したプライマーの一覧を示す図。
【図６】各アミノ酸の質量を示す図。
【図７Ａ】実施例で使用したSalmonella属菌の各リボソームタンパク質の理論質量値とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる実測値の一覧を示す図（その１）。
【図７Ｂ】実施例で使用したSalmonella属菌の各リボソームタンパク質の理論質量値とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる実測値の一覧を示す図（その２）。
【図７Ｃ】実施例で使用したSalmonella属菌の各リボソームタンパク質の理論質量値とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる実測値の一覧を示す図（その３）。
【図７Ｄ】実施例で使用したSalmonella属菌の各リボソームタンパク質の理論質量値とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる実測値の一覧を示す図（その４）。
【図７Ｅ】実施例で使用したSalmonella属菌の各リボソームタンパク質の理論質量値とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる実測値の一覧を示す図（その５）。
【図７Ｆ】実施例で使用したSalmonella属菌の各リボソームタンパク質の理論質量値とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる実測値の一覧を示す図（その６）。
【図７Ｇ】実施例で使用したSalmonella属菌の各リボソームタンパク質の理論質量値とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる実測値の一覧を示す図（その７）。
【図８Ａ】１２種類のリボソームタンパク質の実測値による帰属結果（その１）。
【図８Ｂ】１２種類のリボソームタンパク質の実測値による帰属結果（その２）。
【図８Ｃ】１２種類のリボソームタンパク質の実測値による帰属結果（その３）。
【図８Ｄ】１２種類のリボソームタンパク質の実測値による帰属結果（その４）。
【図９】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定により得られたチャート。
【図１０Ａ】ＳＡＲＡＭＩＳによる識別結果（その１）。
【図１０Ｂ】ＳＡＲＡＭＩＳによる識別結果（その２）。
【図１１】リボソームタンパク質SODのピークチャート。
【図１２】リボソームタンパク質Ｌ１７のピークチャート。
【図１３】リボソームタンパク質Ｌ２１のピークチャート。
【図１４】リボソームタンパク質Ｓ８のピークチャート。
【図１５】リボソームタンパク質Ｌ１５のピークチャート。
【図１６】リボソームタンパク質Ｓ７のピークチャート。
【図１７】リボソームタンパク質gnsのピークチャート。
【図１８】リボソームタンパク質YibTのピークチャート。
【図１９】リボソームタンパク質ppicのピークチャート。
【図２０】リボソームタンパク質Ｌ２５のピークチャート。
【図２１】リボソームタンパク質YaiAのピークチャート。
【図２２】リボソームタンパク質YciFのピークチャート。
【図２３】１２種類のリボソームタンパク質を使って作成したデンドログラム。
【図２４Ａ】リボソームタンパク質Ｓ８のＤＮＡ配列（その１）。
【図２４Ｂ】リボソームタンパク質Ｓ８のＤＮＡ配列（その２）。
【図２４Ｃ】リボソームタンパク質Ｓ８のＤＮＡ配列（その３）。
【図２４Ｄ】リボソームタンパク質Ｓ８のＤＮＡ配列（その４）。
【図２５Ａ】リボソームタンパク質Ｌ１５のＤＮＡ配列（その１）。
【図２５Ｂ】リボソームタンパク質Ｌ１５のＤＮＡ配列（その２）。
【図２５Ｃ】リボソームタンパク質Ｌ１５のＤＮＡ配列（その３）。
【図２５Ｄ】リボソームタンパク質Ｌ１５のＤＮＡ配列（その４）。
【図２５Ｅ】リボソームタンパク質Ｌ１５のＤＮＡ配列（その５）。
【図２６Ａ】リボソームタンパク質Ｌ１７のＤＮＡ配列（その１）。
【図２６Ｂ】リボソームタンパク質Ｌ１７のＤＮＡ配列（その２）。
【図２６Ｃ】リボソームタンパク質Ｌ１７のＤＮＡ配列（その３）。
【図２６Ｄ】リボソームタンパク質Ｌ１７のＤＮＡ配列（その４）。
【図２６Ｅ】リボソームタンパク質Ｌ１７のＤＮＡ配列（その５）。
【図２７Ａ】リボソームタンパク質sodAのＤＮＡ配列（その１）。
【図２７Ｂ】リボソームタンパク質sodAのＤＮＡ配列（その２）。
【図２７Ｃ】リボソームタンパク質sodAのＤＮＡ配列（その３）。
【図２７Ｄ】リボソームタンパク質sodAのＤＮＡ配列（その４）。
【図２７Ｅ】リボソームタンパク質sodAのＤＮＡ配列（その５）。
【図２７Ｆ】リボソームタンパク質sodAのＤＮＡ配列（その６）。
【図２７Ｇ】リボソームタンパク質sodAのＤＮＡ配列（その７）。
【図２８Ａ】リボソームタンパク質Ｌ２１のＤＮＡ配列（その１）。
【図２８Ｂ】リボソームタンパク質Ｌ２１のＤＮＡ配列（その２）。
【図２８Ｃ】リボソームタンパク質Ｌ２１のＤＮＡ配列（その３）。
【図２８Ｄ】リボソームタンパク質Ｌ２１のＤＮＡ配列（その４）。
【図２９Ａ】リボソームタンパク質Ｌ２５のＤＮＡ配列（その１）。
【図２９Ｂ】リボソームタンパク質Ｌ２５のＤＮＡ配列（その２）。
【図２９Ｃ】リボソームタンパク質Ｌ２５のＤＮＡ配列（その３）。
【図３０Ａ】リボソームタンパク質Ｓ７のＤＮＡ配列（その１）。
【図３０Ｂ】リボソームタンパク質Ｓ７のＤＮＡ配列（その２）。
【図３０Ｃ】リボソームタンパク質Ｓ７のＤＮＡ配列（その３）。
【図３０Ｄ】リボソームタンパク質Ｓ７のＤＮＡ配列（その４）。
【図３０Ｅ】リボソームタンパク質Ｓ７のＤＮＡ配列（その５）。
【図３１Ａ】リボソームタンパク質gnsのＤＮＡ配列（その１）。
【図３１Ｂ】リボソームタンパク質gnsのＤＮＡ配列（その２）。
【図３２Ａ】リボソームタンパク質yibTのＤＮＡ配列（その１）。
【図３２Ｂ】リボソームタンパク質yibTのＤＮＡ配列（その２）。
【図３３Ａ】リボソームタンパク質ppiCのＤＮＡ配列（その１）。
【図３３Ｂ】リボソームタンパク質ppiCのＤＮＡ配列（その２）。
【図３４】リボソームタンパク質yaiAのＤＮＡ配列。
【図３５Ａ】リボソームタンパク質yciFのＤＮＡ配列（その１）。
【図３５Ｂ】リボソームタンパク質yciFのＤＮＡ配列（その２）。
【図３６Ａ】リボソームタンパク質ＳＯＤのアミノ酸配列（その１）。
【図３６Ｂ】リボソームタンパク質ＳＯＤのアミノ酸配列（その２）。
【図３６Ｃ】リボソームタンパク質ＳＯＤのアミノ酸配列（その３）。
【図３７Ａ】リボソームタンパク質Ｌ１７のアミノ酸配列（その１）。
【図３７Ｂ】リボソームタンパク質Ｌ１７のアミノ酸配列（その２）。
【図３８Ａ】リボソームタンパク質Ｌ２１のアミノ酸配列（その１）。
【図３８Ｂ】リボソームタンパク質Ｌ２１のアミノ酸配列（その２）。
【図３９Ａ】リボソームタンパク質Ｓ８のアミノ酸配列（その１）。
【図３９Ｂ】リボソームタンパク質Ｓ８のアミノ酸配列（その２）。
【図４０Ａ】リボソームタンパク質Ｌ１５のアミノ酸配列（その１）。
【図４０Ｂ】リボソームタンパク質Ｌ１５のアミノ酸配列（その２）。
【図４１Ａ】リボソームタンパク質Ｓ７のアミノ酸配列（その１）。
【図４１Ｂ】リボソームタンパク質Ｓ７のアミノ酸配列（その２）。
【図４２】リボソームタンパク質gnsのアミノ酸配列。
【図４３】リボソームタンパク質YibTのアミノ酸配列。
【図４４】リボソームタンパク質ppicのアミノ酸配列。
【図４５】リボソームタンパク質Ｌ２５のアミノ酸配列。
【図４６】リボソームタンパク質YaiAのアミノ酸配列。
【図４７】リボソームタンパク質YciFのアミノ酸配列。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明に係る微生物の識別方法の具体的な実施形態について説明する。
図１は本発明に係る微生物の識別方法に用いられる微生物識別システムの全体図である。この微生物識別システムは、大別して質量分析部１０と微生物判別部２０とから成る。質量分析部１０は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）によって試料中の分子や原子をイオン化するイオン化部１１と、イオン化部１１から出射された各種イオンを質量電荷比に応じて分離する飛行時間型質量分離器（ＴＯＦ）１２を備える。
【００２７】
ＴＯＦ１２は、イオン化部１１からイオンを引き出してＴＯＦ１２内のイオン飛行空間に導くための引き出し電極１３と、イオン飛行空間で質量分離されたイオンを検出する検出器１４とを備える。
【００２８】
微生物判別部２０の実体は、ワークステーションやパーソナルコンピュータ等のコンピュータであり、中央演算処理装置であるＣＰＵ（Central Processing Unit）２１にメモリ２２、ＬＣＤ（Liquid Crystal Display）等から成る表示部２３、キーボードやマウス等から成る入力部２４、ハードディスクやＳＳＤ（Solid State Drive）等の大容量記憶装置から成る記憶部３０が互いに接続されている。記憶部３０には、ＯＳ（Operating System）３１、スペクトル作成プログラム３２、属・種決定プログラム３３、および下位分類決定プログラム３５（本発明に係るプログラム）が記憶されると共に、第１データベース３４および第２データベース３６が格納されている。微生物判別部２０は、更に、外部装置との直接的な接続や、外部装置等とのＬＡＮ（Local Area Network）などのネットワークを介した接続を司るためのインターフェース（Ｉ／Ｆ）２５を備えており、該インターフェース２５よりネットワークケーブルＮＷ（又は無線ＬＡＮ）を介して質量分析部１０に接続されている。
【００２９】
図１においては、下位分類決定プログラム３５に係るように、スペクトル取得部３７、m/z読み取り部３８、下位分類判定部３９、クラスター解析部４０、およびデンドログラム（系統図）作成部４１が示されている。これらはいずれも基本的にはＣＰＵ２１が下位分類決定プログラム３５を実行することによりソフトウェア的に実現される機能手段である。なお、下位分類決定プログラム３５は必ずしも単体のプログラムである必要はなく、例えば属・種決定プログラム３３や、質量分析部１０を制御するためのプログラムの一部に組み込まれた機能であってもよく、その形態は特に問わない。なお、属・種決定プログラム３３としては、例えば、従来のフィンガープリント法による微生物同定を行うプログラム等を利用することができる。
【００３０】
また、図１では、ユーザが操作する端末にスペクトル作成プログラム３２、属・種決定プログラム３３、および下位分類決定プログラム３５、第１データベース３４、および第２データベース３６を搭載する構成としたが、これらの少なくとも一部又は全部を前記端末とコンピュータネットワークで接続された別の装置内に設け、前記端末からの指示に従って前記別の装置内に設けられたプログラムによる処理および／又はデータベースへのアクセスが実行される構成としてもよい。
【００３１】
記憶部３０の第１データベース３４には、既知微生物に関する質量リストが多数登録されている。この質量リストは、ある微生物細胞を質量分析した際に検出されるイオンの質量電荷比を列挙したものであり、該質量電荷比の情報に加えて、少なくとも、前記微生物細胞が属する分類群（科、属、種など）の情報（分類情報）を含んでいる。こうした質量リストは、予め各種の微生物細胞を前記質量分析部１０によるものと同様のイオン化法および質量分離法によって実際に質量分析して得られたデータ（実測データ）に基づいて作成することが望ましい。
【００３２】
前記実測データから質量リストを作成する際には、まず、前記実測データとして取得されたマススペクトルから所定の質量電荷比範囲に現れるピークを抽出する。このとき、前記質量電荷比範囲を2,000〜35,000程度とすることにより、主にタンパク質由来のピークを抽出することができる。また、ピークの高さ（相対強度）が所定の閾値以上のものだけを抽出することにより、不所望のピーク（ノイズ）を除外することができる。なお、リボソームタンパク質群は細胞内で大量に発現しているため、前記閾値を適切に設定することにより、質量リストに記載される質量電荷比の大部分をリボソームタンパク質由来のものとすることができる。そして、以上により抽出されたピークの質量電荷比（m/z）を細胞毎にリスト化し、前記分類情報等を付加した上で第１データベース３４に登録する。なお、培養条件による遺伝子発現のばらつきを抑えるため、実測データの採取に用いる各微生物細胞は、予め培養条件を規格化しておくことが望ましい。
【００３３】
記憶部３０の第２データベース３６には、既知微生物を種よりも下位の分類（亜種、病原型、血清型、株など）で識別するためのマーカータンパク質に関する情報が登録されている。該マーカータンパク質に関する情報としては、少なくとも既知微生物における該マーカータンパク質の質量電荷比（m/z）の情報が含まれる。本実施形態における第２データベース３６には、被検微生物がSalmonella属菌のいずれの血清型であるかを判定するためのマーカータンパク質に関する情報として、少なくとも１２種類のリボソームタンパク質Ｓ８、Ｌ１５、Ｌ１７、Ｌ２１、Ｌ２５、Ｓ７、SODa、Peptidylpropyl isomerase、gns、YibT、YaiA、YciFに由来する質量電荷比m/zの値が記憶されている。これらリボソームタンパク質の質量電荷比の値については後述する。
【００３４】
第２データベース３６に記憶するマーカータンパク質の質量電荷比の値としては、各マーカータンパク質の塩基配列をアミノ酸配列に翻訳することにより求められた計算質量と、実測により検出される質量電荷比を比較して選別することが望ましい。なお、マーカータンパク質の塩基配列は、シークエンスによって決定するほか、公共のデータベース、例えばＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター：National Center for Biotechnology Information）のデータベース等から取得したものを用いることもできる。前記アミノ酸配列から計算質量を求める際には、翻訳後修飾としてＮ−末端メチオニン残基の切断を考慮することが望ましい。具体的には、最後から２番目のアミノ酸残基がGly, Ala, Ser, Pro, Val, Thr, 又はCysである場合に、Ｎ−末端メチオニンが切断されるものとして前記理論値を算出する。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで実際に観測されるのはプロトンが付加した分子であるため、そのプロトンの分も加味して前記計算質量（すなわち各タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで分析した場合に得られるイオンの質量電荷比の理論値）を求めることが望ましい。
【００３５】
本実施形態に係る微生物識別システムを用いたSalmonella属菌の血清型の識別手順についてフローチャートを参照しつつ説明を行う。
【００３６】
まず、ユーザは被検微生物の構成成分を含む試料を調製し、質量分析部１０にセットして質量分析を実行させる。このとき、前記試料としては、細胞抽出物、又は細胞抽出物からリボソームタンパク質等の細胞構成成分を精製したものの他、菌体や細胞懸濁液をそのまま使用することもできる。
【００３７】
スペクトル作成プログラム３２は、質量分析部１０の検出器１４から得られる検出信号をインターフェース２５を介して取得し、該検出信号に基づいて被検微生物のマススペクトルを作成する（ステップＳ１０１）。
【００３８】
次に、種決定プログラム３３が、前記被検微生物のマススペクトルを第１データベース３４に収録されている既知微生物の質量リストと照合し、被検微生物のマススペクトルに類似した質量電荷比パターンを有する既知微生物の質量リスト、例えば被検微生物のマススペクトル中の各ピークと所定の誤差範囲で一致するピークが多く含まれている質量リストを抽出する（ステップＳ１０２）。種決定プログラム３３は、続いてステップＳ１０２で抽出した質量リストと対応付けて第１データベース３４に記憶された分類情報を参照することで、該質量リストに対応した既知微生物が属する生物種を特定する（ステップＳ１０３）。そして、この生物種がSalmonella属菌でなかった場合（ステップＳ１０４でNoの場合）は、該生物種を被検微生物の生物種として表示部２３に出力し（ステップＳ１１６）、識別処理を終了する。一方、前記生物種がSalmonella属菌であった場合（ステップＳ１０４でYesの場合）は、続いて下位分類決定プログラム３５による識別処理に進む。なお、あらかじめ他の方法で、試料中にSalmonella属菌を含むことが判定されている場合は、マススペクトルを用いた種決定プログラムを利用せずに、下位分類決定プログラム３５に進めばよい。
【００３９】
下位分類決定プログラム３５では、まず下位分類判定部３９がマーカータンパク質である１２種類のリボソームタンパク質Ｓ８、Ｌ１５、Ｌ１７、Ｌ２１、Ｌ２５、Ｓ７、SODa、Peptidylpropyl isomerase、gns、YibT、YaiA、YciFの質量電荷比の値をそれぞれ第２データベース３６から読み出す（ステップＳ１０５）。続いてスペクトル取得部３７が、ステップＳ１０１で作成された被検微生物のマススペクトルを取得する。そして、m/z読み取り部３８が、該マススペクトル上において、前記の各マーカータンパク質に関連付けて第２データベース３６に記憶された質量電荷比範囲に現れるピークを各マーカータンパク質に対応するピークとして選出し、その質量電荷比を読み取る（ステップＳ１０６）。そして、読み取った質量電荷比を指標とするクラスター解析を実行する。具体的には、下位分類判定部３９が、この質量電荷比と前記第２データベース３６から読み出した各マーカータンパク質の質量電荷比の値を比較し、該読み取った質量電荷比についてタンパク質の帰属を決定する（ステップＳ１０７）。そして、決定した帰属に基づきクラスター解析を実行して被検微生物の血清型を判定し（ステップＳ１０８）、その旨を被検微生物の識別結果として表示部２３に出力する（ステップＳ１０９）。
【００４０】
以上、本発明を実施するための形態について図面を参照しつつ説明を行ったが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲で適宜変更が許容される。
【実施例】
【００４１】
（１）使用菌株
図３に記載の通り、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター(NBRC)、菌株保存機関である理化学研究所 バイオリソースセンター微生物材料開発室 (JCM)（つくば）、ナショナルバイオリソースプロジェクトGTCコレクション（岐阜）およびアメリカンタイプカルチャーコレクション（Manassas, VA, USA）から入手可能なサルモネラ菌、及び、一般財団法人日本食品分析センターの単離菌、並びに兵庫県健康生活科学研究所の単離菌、合計６４株を解析に使用した。Salmonella enterica subsp. entericaの血清型は、サルモネラ免疫血清「生研」（デンカ生研株式会社）および非特許文献３、４により報告されたマルチプレックスPCR法により決定した。この方法では２２の血清型に分類された。図４に、Ｏ抗原免疫血清と血清型の関係を示す。【００４２】
（２）ＤＮＡの解析
Escherichia coliのデータベース作成（非特許文献１１）で使用したプライマーの中でSalmonella属菌と共用できないものをコンセンサス配列に基づいて設計した。設計したプライマーを図５に示す。これらのプライマーを用いてＳ１０-spc-alphaオペロンおよびバイオマーカーとなりうるタンパク質遺伝子のＤＮＡ配列を解析した。詳述すると、各菌株より常法にてゲノム抽出し、それを鋳型としてKOD plusによりＰＣＲを行い、目的遺伝子領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を精製し、それをシーケンス解析の鋳型とした。シーケンス解析にはBig Dye ver. 3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライド・バイオシステムズ, Foster City、カリフォルニア州、米国）を用いて行った。遺伝子のＤＮＡ配列からそれぞれの遺伝子のアミノ酸配列に変換し、図６のアミノ酸質量に基づき質量電荷比を算出して、理論質量値とした。【００４３】
（３）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分析
Luria Agar培地（Sigma-Aldrich Japan合同会社、東京、日本）に生育した菌体を回収し、およそ２コロニー分の菌体を１０μＬのシナピン酸マトリックス剤（５０v/v％アセトニトリル、0.6 v/v％トリフルオロ酢酸溶液中に２５mg/mLのシナピン酸（和光純薬工業株式会社、大阪、日本））に加えて良く撹拌し、そのうち1.2 μLをサンプルプレートに搭載し自然乾燥した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定にはAXIMA微生物同定システム（島津製作所、京都市、日本）を使用し、ポジティブリニアモード、スペクトルレンジ2000m/z〜35000m/zにて試料の測定を行った。上述の計算質量を測定された質量電荷比と許容誤差500ppmでマッチングし、適宜修正を施した。なお、質量分析装置のキャリブレーションには大腸菌ＤＨ５α株を用い、説明書に従い実施した。【００４４】
（４）Salmonella enterica subsp. enterica データベースの構築
上記（２）で得られたリボソームタンパク質等の理論質量値と、（３）で得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによるピークチャートを照合し、実測で検出できたタンパク質に関しては、遺伝子配列から求めた理論値と実測値に相違がないことを確認した。そして、Ｓ１０−ｓｐｃ−αオペロン内のリボソームタンパク質、および菌株により異なる質量を示したその他バイオマーカーとなりうるタンパク質の理論値および実測値を、データベースとして図７Ａ〜図７Ｇのようにまとめた。【００４５】
図７Ａ〜図７Ｇに示す数字は、遺伝子から求めた質量電荷比（m/z）の理論質量である。また、符号「〇」、「△」、「×」は実測での質量ピーク検出結果を表している。具体的には、符号「〇」はＡＸＩＭＡ微生物同定システムのデフォルトのピーク処理設定（Threshold offset ; 0.015mV, Threshold response ; 1.200）で理論値の500 ppm範囲内のピークとして検出されたものを、符号「×」は検出できない場合があったことを示している。また、符号「△」は、各菌株における理論値質量差または他のタンパク質ピークとの差がそれぞれ500 ppm以内であり、ピークが検出されてもその質量差を識別できなかったことを意味する。【００４６】
図７Ａ〜図７Ｇからわかるように、s10-spc-alphaオペロン内にコードされているリボソームタンパク質Ｌ２３、Ｌ１６、Ｌ２４、Ｓ８、Ｌ６、Ｓ５、Ｌ１５、Ｌ１７、およびオペロン外のＬ２１、Ｌ２５、Ｓ７、SODa、gns、YibT、Peptidylpropyl isomerase、YaiAおよびYciF（計１７種類）は、その理論質量値がSalmonella enterica subsp. entericaの菌株によって異なるため、Salmonella enterica subsp. entericaの血清型識別に使用できる有用なタンパク質マーカーである可能性が示された。【００４７】
しかしながら、Ｌ２３、Ｌ１６、Ｌ２４、Ｌ６およびＳ５は理論質量差が500 ppm以上離れている菌株が存在し、これら菌株の識別のための有力なバイオマーカーとなりうることが分かるが、実測において検出することができない株があった。【００４８】
一方、Ｓ８、Ｌ１５、Ｌ１７、Ｌ２１、Ｌ２５、Ｓ７およびPeptidylpropyl isomeraseの、計７種類のタンパク質は、菌株によらず安定的に検出され、さらに菌株による質量差も500 ppm以上であることから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおけるSalmonella enterica subsp. entericaの血清型識別のためのバイオマーカーとして有用であることがわかった。【００４９】
また、SODaはSalmonella enterica subsp. entericaの血清型識別に重要なバイオマーカーであるが、遺伝子型が多様であり７種の異なる質量電荷比が確認された。これらの質量電荷比はいずれもm/zが23000付近と大きく、この領域では他の質量電荷比との差が800ppm以上でないと現在提供されているＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳでの分析精度が低く、識別できないため、現時点で識別可能な４種類をバイオマーカーとして用いた。また、gns、YibT、YaiAおよびYciFに関しては、理論質量値の一方に夾雑ピークが存在するものの、血清型Infantis、Thompson、Typhimuriunmが特異的に変異をしているタンパク質のため、夾雑ピークのない理論質量値のみをバイオマーカーとして用いた。そこで、１２種類のタンパク質をSalmonella enterica subsp. enterica血清型識別用バイオマーカーとして用いた。【００５０】
（５）ソフトウェアによる、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ実測値の帰属
以上より、菌株によらず安定して検出される８種類のタンパク質Ｓ８、Ｌ１５、Ｌ１７、Ｌ２１、Ｌ２５、Ｓ７、SODa、Peptidylpropyl isomerase と、１つの質量の有無を確認する４種のタンパク質gns、YibT、YaiAおよびYciFの計１２種のタンパク質をバイオマーカーとして、その理論質量値を特許文献２に示されるようなソフトウェアに登録した。【００５１】
SODaの質量差800ppm以内であった5：22962.8は最も近い1：22948.82に、6：2296.82と7：23004.88は2：23010.84、として登録した。また、夾雑ピークが存在するgns、YibT、YaiAおよびYciFはそれぞれ6483.51、8023.08、7110.89及び18643.13/18653.16を登録した。【００５２】
次に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおける実測データを本ソフトウェアで解析し、それぞれのバイオマーカーが、登録された質量ピークとして正しく帰属されるかを調べた。その結果、図８Ａ〜図８Ｇに示すように、すべての菌株のすべてのバイオマーカー質量ピークが登録した質量数として帰属された。各帰属質量パターンをグループ１〜３１に分類し、各菌株の血清型を照らし合わせたところ、１，２および３にはTyphimurium、４と５には血清型不明O４グループ、６にはSaintpaul、７には血清型不明O18グループ、８にはOrion、 ９にはBraenderup、１０にはMontevideoとSchwarzengrund、１１にはSchwarzengrund、１２にはAbonyとPakistan、１３および１４にはEnteritidis、１５にはRissen、１６にはGallinarum Pullorum、１７にはAltona、１８にはAmsterdam、１９と２０にはInfantis、２１にはIstanbul、２２には血清型不明O４グループ、２３にはManhattan、２４にはMbandaka、２５にはSenftenbergと血清型不明O 1,3,19グループ、２６にはThompson、２７には血清型不明O4グループ、２８には血清型不明O７グループ、２９にはBrandenburg、Minnesota、Saintpaulおよび３０にはBrandenburgとSaintpaul、３１にはCholeraesuis菌株が属することが分かった。【００５３】
以上から、Ｓ８（m/z 13996.36または14008.41）、Ｌ１５（m/z14967.38、14981.41または14948.33）、Ｌ１７（m/z 14395.61または14381.59）、Ｌ２１（m/z11579.36または11565.33）、Ｌ２５（m/z10542.19または10528.17）、Ｓ７（m/z17460.15、17474.18または17432.1）、SODa（m/z22948.82、23010.84、22976.83または22918.79）、Peptidylpropyl isomerase (m/z10198.07または 10216.11）、gns (m/z6483.51）、YibT（m/z8023.08）、YaiA（m/z7110.89）およびYciF（m/z 18643.13）の質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析のバイオマーカーとすることは、Salmonella enterica subsp. entericaの血清型識別に有用であることがわかった。【００５４】
今回見出したバイオマーカーのうちＳ８とPeptidylpropyl isomeraseを除く１０種類は非特許文献１０で報告されている。しかし、非特許文献１０では、ピーク一つずつの確認を必要とし、血清型を識別するためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳのスペクトル解析に時間を要する。また、非特許文献１０でEnteriridisの識別に重要なピークであると報告されている質量電荷比m/z6036は、非特許文献１０では３２株中５株でピークが確認されず、本実施例では３５株中８株でピークが確認できなかった。このため、Salmonella enterica subsp. entericaの血清型識別用バイオマーカーには用いなかった。【００５５】
今回、バイオマーカーにＳ８、Peptidylpropyl isomeraseを加え、厳選した１２種類のタンパク質をバイオマーカーとすることにより、はじめて自動でSalmonella enteriva subsp. entericaを３１グループに識別するデータベースを提供することが可能になった。【００５６】
（６）フィンガープリント方式（ＳＡＲＡＭＩＳ）との比較
実際に、既存のフィンガープリント方式（ＳＡＲＡＭＩＳ）による識別結果と、表6の示すバイオマーカー理論質量値を指標とした識別結果を比較した。まず、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおける実測では図９に示すようなチャートが得られた。本結果をＡＸＩＭＡ微生物同定システムの説明書に従いＳＡＲＡＭＩＳにて解析した。これにより得られた結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。これらの図から分かるように、試料に用いた全てのSalmonella属菌が91％〜99.9％でSalmonella enterica subsp. entericaと同定され、種の識別、血清型の識別は行われなかった。【００５７】
そこで、異なる亜種の株の実測結果を図８Ａに示した理論質量データベースをもとに識別可能かを試みた。図１１〜図２２は図８のチャートのうち１２種類のバイオマーカーピーク部分を拡大したものである。図１１〜図２２からわかるように、それぞれのバイオマーカー質量がシフトしていることにより、ピークを区別することができる。１２種類のバイオマーカーの実測値と比較し帰属したところ、図８Ａ〜図８Ｄに示す結果と一致した。【００５８】
次に、１２種類のリボソームタンパク質の帰属結果を用いてクラスター解析を行い、系統分類図（デンドログラム）を作成した。その結果を図２３に示す。この方法では、Infantis、Brandenburg、Minnesota、Saintpaulの血清型の識別はできなかったものの、その他の血清型はほぼ識別することができた。【００５９】
以上より次のことが分かる。
SODa、Ｓ７、gnsが複数の血清型の識別に関与しており、Salmonella enterica subsp. entericaの血清型識別のためのバイオマーカーとして特に重要である。
また、SODaとＳ７の変異の組み合わせでEnteritidis、Mbandaka、Choleraesuisを他の血清型から識別することができる。
さらに、gnsによって、Infantisを識別し、EnteritidisとMbandakaを識別する。
非チフス性サルモネラ菌感染症原因血清型の上位であるTyphimuriumはYaiAによって、ThompsonはYibTによって分けられる。また、Pullorm(Gallinarum)はＬ１７によって、RissenはＳ８によって、OrionはPeptidylpropyl isomeraseによって、AltonaはＬ１５によって識別される。Ｌ２５はInfantisとAmsterdamを分け、Ｌ２１はMontevideoおよびShwarzengrund、Minnesotaを識別するのに重要である。YciFはInfantisの識別に重要である。【００６０】
（７）バイオマーカーの遺伝子配列およびアミノ酸配列
Salmonella enterica subsp. entericaの菌株によって異なる理論質量値を示した、Ｓ１０-spc-alphaオペロン内にコードされているリボソームタンパク質Ｓ８、Ｌ１５、Ｌ１７と、オペロン外のSODa、Ｌ２１、Ｌ２５、Ｓ７、gns、YibT、Peptidylpropyl isomeraseおよびYciFの、計１２種類のリボソームタンパク質の各菌株におけるＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を図２４〜図４７にまとめた。
【符号の説明】
【００６１】
１０…質量分析部
１１…イオン化部
１２…ＴＯＦ
１３…引き出し電極
１４…検出器
２０…微生物判別部
２１…ＣＰＵ
２２…メモリ
２３…表示部
２４…入力部
２５…Ｉ／Ｆ
３０…記憶部
３１…ＯＳ
３２…スペクトル作成プログラム
３３…属・種決定プログラム
３４…第１データベース
３５…下位分類決定プログラム
３６…第２データベース
３７…スペクトル取得部
３８…m/z読み取り部
３９…下位分類判定部
４０…クラスター解析部
４１…デンドログラム作成部
【図１】
0006692016.tif 000002
【図２】
0006692016.tif 000003
【図３】
0006692016.tif 000004
【図４】
0006692016.tif 000005
【図５】
0006692016.tif 000006
【図６】
0006692016.tif 000007
【図７Ａ】
0006692016.tif 000008
【図７Ｂ】
0006692016.tif 000009
【図７Ｃ】
0006692016.tif 000010
【図７Ｄ】
0006692016.tif 000011
【図７Ｅ】
0006692016.tif 000012
【図７Ｆ】
0006692016.tif 000013
【図７Ｇ】
0006692016.tif 000014
【図８Ａ】
0006692016.tif 000015
【図８Ｂ】
0006692016.tif 000016
【図８Ｃ】
0006692016.tif 000017
【図８Ｄ】
0006692016.tif 000018
【図９】
0006692016.tif 000019
【図１０Ａ】
0006692016.tif 000020
【図１０Ｂ】
0006692016.tif 000021
【図１１】
0006692016.tif 000022
【図１２】
0006692016.tif 000023
【図１３】
0006692016.tif 000024
【図１４】
0006692016.tif 000025
【図１５】
0006692016.tif 000026
【図１６】
0006692016.tif 000027
【図１７】
0006692016.tif 000028
【図１８】
0006692016.tif 000029
【図１９】
0006692016.tif 000030
【図２０】
0006692016.tif 000031
【図２１】
0006692016.tif 000032
【図２２】
0006692016.tif 000033
【図２３】
0006692016.tif 000034
【図２４Ａ】
0006692016.tif 000035
【図２４Ｂ】
0006692016.tif 000036
【図２４Ｃ】
0006692016.tif 000037
【図２４Ｄ】
0006692016.tif 000038
【図２５Ａ】
0006692016.tif 000039
【図２５Ｂ】
0006692016.tif 000040
【図２５Ｃ】
0006692016.tif 000041
【図２５Ｄ】
0006692016.tif 000042
【図２５Ｅ】
0006692016.tif 000043
【図２６Ａ】
0006692016.tif 000044
【図２６Ｂ】
0006692016.tif 000045
【図２６Ｃ】
0006692016.tif 000046
【図２６Ｄ】
0006692016.tif 000047
【図２６Ｅ】
0006692016.tif 000048
【図２７Ａ】
0006692016.tif 000049
【図２７Ｂ】
0006692016.tif 000050
【図２７Ｃ】
0006692016.tif 000051
【図２７Ｄ】
0006692016.tif 000052
【図２７Ｅ】
0006692016.tif 000053
【図２７Ｆ】
0006692016.tif 000054
【図２７Ｇ】
0006692016.tif 000055
【図２８Ａ】
0006692016.tif 000056
【図２８Ｂ】
0006692016.tif 000057
【図２８Ｃ】
0006692016.tif 000058
【図２８Ｄ】
0006692016.tif 000059
【図２９Ａ】
0006692016.tif 000060
【図２９Ｂ】
0006692016.tif 000061
【図２９Ｃ】
0006692016.tif 000062
【図３０Ａ】
0006692016.tif 000063
【図３０Ｂ】
0006692016.tif 000064
【図３０Ｃ】
0006692016.tif 000065
【図３０Ｄ】
0006692016.tif 000066
【図３０Ｅ】
0006692016.tif 000067
【図３１Ａ】
0006692016.tif 000068
【図３１Ｂ】
0006692016.tif 000069
【図３２Ａ】
0006692016.tif 000070
【図３２Ｂ】
0006692016.tif 000071
【図３３Ａ】
0006692016.tif 000072
【図３３Ｂ】
0006692016.tif 000073
【図３４】
0006692016.tif 000074
【図３５Ａ】
0006692016.tif 000075
【図３５Ｂ】
0006692016.tif 000076
【図３６Ａ】
0006692016.tif 000077
【図３６Ｂ】
0006692016.tif 000078
【図３６Ｃ】
0006692016.tif 000079
【図３７Ａ】
0006692016.tif 000080
【図３７Ｂ】
0006692016.tif 000081
【図３８Ａ】
0006692016.tif 000082
【図３８Ｂ】
0006692016.tif 000083
【図３９Ａ】
0006692016.tif 000084
【図３９Ｂ】
0006692016.tif 000085
【図４０Ａ】
0006692016.tif 000086
【図４０Ｂ】
0006692016.tif 000087
【図４１Ａ】
0006692016.tif 000088
【図４１Ｂ】
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【図４２】
0006692016.tif 000090
【図４３】
0006692016.tif 000091
【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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