(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘキソンタンパク質とアルブミン結合部分を含んでなる融合タンパク質の発現を生じさせる、ヘキソンタンパク質の超可変領域１（ＨＶＲ１）のコード領域に挿入されたアルブミン結合部分をコードする配列を含んでなり、前記アルブミン結合部分はヘキソンタンパク質がアデノウイルスキャプシドに組み立てられる際にヘキソンタンパク質の外側表面に位置することを特徴とする、アデノウイルスゲノム。
【請求項２】
アルブミン結合部分が、連鎖球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメイン、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Peptostreptococcus magnus）タンパク質ＰＡＢ由来のアルブミン結合ドメインおよびコア配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号９）を有するアルブミン結合ペプチドから選択される、請求項１に記載のアデノウイルスゲノム。
【請求項３】
アルブミン結合部分が連鎖球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメイン３である、請求項２に記載のアデノウイルスゲノム。
【請求項４】
生成する融合タンパク質がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ４８７８２．１を有するヘキソンタンパク質（配列番号２７）のナンバリングに従ってヘキソンタンパク質のＤ１５０アミノ酸の後にアルブミン結合部分を含むように、アルブミン結合部分をコードする配列が挿入されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアデノウイルスゲノム。
【請求項５】
アデノウイルスが腫瘍溶解性アデノウイルスである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアデノウイルスゲノム。
【請求項６】
前記アデノウイルスゲノムが腫瘍における選択的複製を達成するために、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ４およびＶＡ−ＲＮＡｓからなる群から選択される１以上の遺伝子における突然変異をさらに含んでなる、請求項５に記載のアデノウイルスゲノム。
【請求項７】
アデノウイルスゲノムが、アデノウイルスの感染力を高めるための、または腫瘍細胞に存在する受容体を標的化するためのキャプシド改変をさらに含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアデノウイルスゲノム。
【請求項８】
キャプシドの改変が、アデノウイスルファイバータンパク質のＨ１ループへのＲＧＤモチーフの挿入である、請求項７に記載のアデノウイルスゲノム。
【請求項９】
アデノウイルスゲノムがゲノムに挿入された１以上の非アデノウイルス遺伝子を含んでなり、該遺伝子が遺伝子治療またはワクチン接種において使用される遺伝子である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアデノウイルスゲノム。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のアデノウイルスゲノムを有する組換えアデノウイルス。
【請求項１１】
治療上有効な量の請求項１０に記載の組換えアデノウイルスを薬学上許容可能な担体とともに含んでなる、医薬組成物。
【請求項１２】
医薬において使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
アデノウイルスが、ａ）腫瘍溶解性アデノウイルスおよびｂ）アデノウイルスのゲノムに挿入された癌遺伝子治療において使用される１以上の非アデノウイルス遺伝子を含んでなるアデノウイルスゲノムを有するアデノウイルスからなる群から選択される、哺乳動物の癌の予防および／または治療において使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
哺乳動物における感染性疾患の予防において使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
アデノウイルスが全身投与される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾病治療の分野、より詳しくは、アデノウイルスヘキソンタンパク質の外側表面にアルブミン結合部分を含んでなる遺伝子治療またはウイルス療法のための組換えアデノウイルス、特に、アルブミン結合部分を含んでなる腫瘍溶解性アデノウイルス、ならびに癌の予防および／または治療のためのその使用に関する。前記アデノウイルスは、血流中に存在する中和抗体からシールドされ、従って、全身投与に特に好適である。
【背景技術】
【０００２】
アデノウイルスは、遺伝子治療用の遺伝子送達ベクターならびに癌治療用の腫瘍溶解性薬剤として広範囲に使用されている。アデノウイルスは、これらの適用に好適であるいくつかの特徴を示す。すなわち、アデノウイルスのゲノムの容易な改変を可能とするアデノウイルスの構造および生物学が広く研究されており、アデノウイルスは複製細胞と非複製細胞の両方に感染するこができ、また、アデノウイルスは臨床での使用のために高力価で容易に生産可能である。安全性の点で、アデノウイルスはヒトにおいて命を脅かす疾患を引き起こさず、それらのゲノムは非組み込み型であり、これにより挿入突然変異誘発が妨げられる。アデノウイルスに基づくベクターを用いた臨床試験では良好な毒性および安全性特性が報告されているが、この有効性は、特にウイルスが全身投与される場合には改良の必要がなおある。
【０００３】
遺伝子治療の分野では、全身投与、すなわち、静脈内または動脈内での血流への注射は、複数の臓器または播種性細胞に到達することが必要であり得る。例えば、アデノウイルスベクターおよび腫瘍溶解性アデノウイルスを用いた癌治療では、全身投与は進行または転移ステージでは播種性腫瘍を治療する必要がある。しかしながら、アデノウイルスは、血流中に注射した場合、治療の有効性を損なう重大な制限を示す。アデノウイルス５型（Ａｄ５）は、ウイルスのバイオアベイラビリティを劇的に低下させる血流中の複数の中和相互作用を受ける。肝臓捕捉は、注射用量の９０％超がこの器官、主としてクップファー細胞と呼ばれる肝臓マクロファージにより保持されるだけでなく、肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）および肝細胞によっても保持されるので、治療の主要な障害となる。血液細胞およびタンパク質との直接的相互作用もまた重大な障壁となる。Ａｄ５はＣＡＲ受容体を介して赤血球などの血液細胞と、また、インテグリンを介して血小板と直接結合することができる。抗体はウイルスを直接中和することができるだけでなく、補体の活性化により、また、ウイルス粒子を単球および好中球のＦｃ受容体と合体させることにより、自然免疫応答を誘発することもできる。さらに、ベクターの再投与は抗Ａｄ中和抗体（ＮＡｂ）のレベルを上昇させ、従って、ウイルスの中和を上昇させる。抗体および補体によるアデノウイルスのオプソニン化も、クップファー細胞によるクリアランスを促進する。これらの相互作用を併せると、血中でのアデノウイルスの半減期はマウスおよびヒトで約数分という極めて短いものとなる。
【０００４】
アデノウイルスが全身投与される場合の抗体および免疫細胞による中和を逃れるために、鋭意努力がなされてきた。
【０００５】
ポリマー（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ））によるアデノウイルスキャプシドの化学修飾が試験されている。ウイルス表面へのポリマーのコンジュゲーションは、ウイルスに抗体および免疫細胞による中和を逃れさせることを可能とするとともに、ＣＡＲ、インテグリン、およびＦＸ−結合を除去する。しかしながら、キャプシドにコンジュゲートされたポリマーはウイルス後代には受け渡されず、臨床適用のための大規模ＧＭＰ生産の複雑性を増す。
【０００６】
国際公開２０１１／１２９４６８  Ａ９は、中和抗体の免疫認識を逃れ得るキメラアデノウイルスを開示している。前記アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型５のキャプシドの遺伝子改変により得られ、ヘキソンタンパク質をコードする遺伝子がサルアデノウイルス血清型１９由来のヘキソン遺伝子により置換されている。得られたキメラアデノウイルスは、遺伝子改変のない同じアデノウイルスよりも高い抗腫瘍活性も示した。
【０００７】
アルブミンタンパク質によりシールドされたアデノウイルスを得るためにいくつかの試みがなされてきた（国際公開２００７／０５０１２８  Ａ２参照）。しかしながら、アルブミン結合ドメインで改変されたキャプシドを有するアデノウイルスは中和抗体から保護されないことが実験的証拠から証明されている(Hedley S.J. et al. 2009. The Open Gene Therapy Journal, 2:1-11)。
【０００８】
従って、全身投与に好適でありかつ中和抗体から逃れ得るさらなる遺伝子改変アデノウイルスの必要性がなお存在している。
【発明の概要】
【０００９】
第１の態様において、本発明は、ヘキソンタンパク質とアルブミン結合部分を含んでなる融合タンパク質の発現を生じさせる、ヘキソンタンパク質の超可変領域１（ＨＶＲ１）のコード領域に挿入されたアルブミン結合部分をコードする配列を含んでなり、前記アルブミン結合部分は前記ヘキソンタンパク質がアデノウイルスキャプシドに組み立てられる際にヘキソンタンパク質の外側表面に位置することを特徴とするアデノウイルスゲノムに関する。
第２の態様において、本発明は、本発明によるアデノウイルスゲノムを有する組換えアデノウイルスに関する。
第３の態様において、本発明は、治療上有効な量の本発明による組換えアデノウイルスを薬学上許容可能な担体とともに含んでなる医薬組成物に関する。
第４の態様において、本発明は、医薬において使用するための本発明による組換えアデノウイルスまたは医薬組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、哺乳動物における癌の予防および／または治療において使用するための本発明による組換えアデノウイルスまたは医薬組成物に関し、前記アデノウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルス、またはゲノムに挿入された癌治療において使用される遺伝子を含んでなるアデノウイルスである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤに挿入されたアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の概略図。連鎖球菌Ｇタンパク質（配列番号１）由来のＡＢＤ  ３に、２つのＧＳＧＳ（配列番号２）リンカーを隣接させ、腫瘍溶解性アデノウイルスＩＣＯＶＩＲ１５のヘキソンの超可変領域１（ＨＶＲ１）の中央に挿入し、ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤとする。左および右逆方向末端反復配列であるＬＩＴＲ／ＲＩＴＲ；主要後期プロモーターであるＭＬＰ；改変型Ｅ１ＡプロモーターであるＥ１Ａｐ；ポリペプチド鎖のアミノ酸１２１〜１２９が欠失されている変異型のＥ１Ａタンパク質であるＥ１Ａ−Δ２４；後期遺伝子であるＬ１〜Ｌ５；ファイバーのＨ１−ループにおけるＲＧＤペプチドの挿入によるＲＧＤ改変ファイバーであるファイバーＲＧＤ。
【図２】ヘキソンに挿入されたアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含有するアデノウイルスの図。非改変アデノウイルスＩＣＯＶＩＲ１５（左）に比べ、ＡＢＤ改変ウイルスＩＣＯＶＩＲ−１５−ＡＢＤ（右）は血中に存在するアルブミンで被覆され、中和抗体からウイルスをシールドしている。
【図３】ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤおよびＩＣＯＶＩＲ１５のウイルス生産速度。コンフルエントのＡ５４９細胞に細胞当たり８００ウイルス粒子（ｖｐ）を感染させた。感染４時間（ｈ）後、ウイルスを除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ウイルス不含培地でインキュベートした。感染４、２４、４８、および７２時間後に細胞抽出液を回収し、抗ヘキソン染色に基づく方法により力価を測定した。サンプルは３反復で評価した。平均±ＳＤエラーバーをプロットする（しかしながら、これらは低い値であるため識別が困難である）。ＴＵ／ｍＬは、１ｍＬ当たりの形質導入単位。＊は、ＩＣＯＶＩＲ１５群と比較した場合の統計的有意性（ｐ≦０．０５）。
【図４】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下または非存在下でのＩＣＯＶＩＲ１５およびＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤのインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）にける相対的細胞傷害性。Ａ５４９、Ｓｋ−ｍｅｌ２８、ＨＥＫ２９３およびＭＣＦ−７細胞に細胞当たり１００００〜０．０００１ウイルス粒子（ｖｐ）の示されたウイルスを感染させた。感染７日後のＩＣ５０値（細胞培養生存率に５０％の低下を引き起こすために必要とされる細胞当たりのｖｐ）を示す。各細胞株について異なる３反復を定量した。平均±ＳＤエラーバーをプロットする。ＭＯＩは、感染多重度。
【図５】ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤは、ＥＬＩＳＡにより検出されるように、ヒトおよびマウスアルブミンと結合する。Ａ）ウェルを、ヒトまたはウシ血清アルブミン（ＨＳＡまたはＢＳＡ、それぞれＡＢＤと結合するまたは結合しない）のいずれかでコーティングした。結合を検出するために３種類の異なる量のウイルスタンパク質を試験した（０．２５、２．５、および２５ｎｇ）。抗ヘキソン抗体およびペルオキシダーゼ標識二次抗体とのインキュベーション後に、比色定量分析によりアルブミンコーティングウェルへのＩＣＯＶＩＲ１５およびＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤアデノウイルスの結合を検出した。サンプルを３反復で評価した。平均±ＳＤエラーバーをプロットする。ＯＤは、光学密度。＊は、他の群と比較した場合の統計的有意性（ｐ≦０．０５）。Ｂ）ウェルをウシ、ヒト、またはマウス血清アルブミン（ＢＳＡ、ＨＳＡ、またはＭＳＡ）のいずれかでコーティングした。供試ウイルスタンパク質量は２５ｎｇであった。抗ヘキソン抗体およびペルオキシダーゼ標識二次抗体とのインキュベーション後に、比色定量分析によりアルブミンコーティングウェルへのアデノウイルスの結合を検出した。アデノウイルスを含まない対照ｍｏｃｋ群を含めた。サンプルを３反復で評価した。平均±ＳＤエラーバーをプロットする。  ＯＤは、光学密度。＊は、他の群と比較した場合の統計的有意性（ｐ≦０．０５）。
【図６】インビトロにおいてアルブミン結合はアデノウイルスを中和抗体から保護する。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）でコーティングしたまたはしないＡｄＧＬおよびＡｄＧＬ−ＡＢＤアデノウイルスを、中和抗体Ａｂ６９８２の連続希釈系とともに３７℃で１時間インキュベートした。次に、ＨＥＫ２９３細胞を細胞当たり０．５形質導入単位（ＴＵ）の感染多重度が得られるように加えた。感染２４時間後、細胞の形質導入をルシフェラーゼ発現により分析した。１００％感染値を得るために、抗体（Ａｂ）不含対照（「Ａｂ無しの」対照）を含めた。サンプルを３反復で評価した。平均±ＳＤエラーバーをプロットする。
【図７】ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）で保護された場合、中和抗体の存在下でインビトロ細胞傷害性の増強を示す。ＩＣＯＶＩＲ１５およびＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤをヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下または非存在下で中和抗体Ａｂ６９８２（Ｎａｂ、市販のポリクローナル抗ＨＡｄ５）の連続希釈系とともに１時間インキュベートした。Ａ５４９細胞を細胞当たり６００ウイルス粒子（ｖｐ）の感染多重度が得られるように加えた。感染後４日目に生存細胞のパーセンテージ（ウェル中のタンパク質含量）を測定した。サンプルを３反復で評価した。平均±ＳＤエラーバーをプロットする。
【図８】ＡＢＤの挿入はアデノウイルス血漿半減期を延長する。ヌードマウスにＩＣＯＶＩＲ１５とＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤの１：１比の混合物をマウス（ｎ＝５）当たり５×１０１０ウイルス粒子（ｖｐ）の総用量で注射した。投与後５分（５ｍｉｎ）、１５分（１５ｍｉｎ）、１時間（１ｈ）、４時間（４ｈ）、および２４時間（２４ｈ）に血液サンプルを採取し、遠心分離を行い、血清を回収した。アデノウイルスヘキソンの超可変領域１（ＨＶＲ１）のＰＣＲ増幅を行い、サンプルを電気泳動により分析した。ＡＢＤの挿入は、ＨＶＲ１のサイズを２９９ｂｐから３６１ｂｐに増大させる。ゲルは、数種類の比のＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤ：ＩＣＯＶＩＲ１５ゲノムを含む標準品（０．２、１、５、１０および５０）、注射前対照（ｔ０）、ＰＣＲの水陰性対照（ネガティブコントロール）（Ｈ２Ｏ）および血清サンプルのＰＣＲ（＃１〜＃５）を示す。
【図９】インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）全身投与後のＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤの抗腫瘍活性。黒色腫の皮下異種移植片を有するヌードマウス（Ｓｋ−ｍｅｌ２８）に単回静脈用量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＩＣＯＶＩＲ１５またはＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤ（マウス当たり５×１０１０ウイルス粒子（ｖｐ））を注射した。腫瘍体積±ＳＥＭをプロットする（ｎ＝１０〜１２）。＊ＰＢＳ群と比較した場合の統計的有意性（ｐ≦０．０５）。
【図１０】ヘキソンＨＶＲ１にアルブミン結合ドメインを有するように改変されたアデノウイルスベクターによるインビボにおける肝臓および腫瘍への形質導入はアデノウイルス前免疫マウスで保存される。黒色腫の皮下異種移植片を有するＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ１６−ＣＡＲ）をｈＡｄ５ｗｔ（マウス当たり２×１０１０ウイルス粒子（ｖｐ））またはビヒクルの腹腔内注射により免疫し、７日後に、ＡｄＧＬ（ＧＦＰ−ルシフェラーゼベクター）またはＡｄＧＬ−ＡＢＤ（マウス当たり３×１０１０ｖｐ）を静注した。３日後、肝臓および腫瘍のルシフェラーゼ活性を生物発光イメージング（ＩＶＩＳ）により分析した。平均±ＳＥＭをプロットする。（肝臓ｎ＝４〜６、腫瘍ｎ＝８〜１２）。ｓｅｃ：秒；ｓｒ：ステラジアン。
【図１１】超可変領域５へのＡＢＤの挿入はウイルス生存率に影響を及ぼさない。ＨＥＫ２９３細胞をｐＡｄＺＧＬ−Ｈ５−ＡＢＤプラスミドでトランスフェクトして、ＡｄＧＬ−Ｈ５−ＡＢＤウイルスを作出した。１週間後、細胞および上清を採取し、３回の凍結融解サイクルにより溶解させた。ウイルスを含有する細胞抽出液の力価をＨＥＫ２９３細胞で、プラークアッセイにより測定した。１Ｅ６、１Ｅ７および１Ｅ８の希釈率に相当するウェルを示すが、ウイルスの増殖を示すプラークが明らかである。
【図１２】ＨＶＲ５に挿入されたアルブミン結合ドメインは、ＨＶＲ１に挿入された同じドメインとは対照的にアデノウイルスを中和抗体から保護しない。インビトロ中和試験を、ＨＥＫ２９３細胞およびＳｋ−ｍｅｌ２８細胞で、ＡｄＧＬ、ＡｄＧＬ−Ｈ１−ＡＢＤおよびＡｄＧＬ−Ｈ５−ＡＢＤを比較して行った。アデノウイルスをヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下または非存在下で、中和抗体Ａｂ６９８２の希釈系とともに１時間インキュベートした。次に、細胞を細胞（ＨＥＫ２９３）当たり１０ウイルス粒子（ｖｐ）および細胞（Ｓｋ−ｍｅｌ２８）当たり４０ｖｐの感染多重度が得られるように加えた。感染２４時間時間後に、細胞の形質導入をルシフェラーゼ発現により分析した。抗体（Ａｂ）を含まない対照（「Ａｂ不含」対照）を、１００％感染値を得るために含めた。サンプルを３反復で評価した。平均±ＳＤエラーバーをプロットする。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の発明者らは、キャプシドの外側表面、特に、アデノウイルスヘキソンタンパク質の外側表面にアルブミン結合部分を有するように遺伝的に改変されたアデノウイルスは、全身投与後に、アルブミンシールドを獲得することができ、ウイルスを中和抗体から逃れさせ、かつ、その血液残存率を高めることを見出した。アルブミン結合ドメインによるアデノウイルスの改変の従来の試みは中和抗体からのアデノウイルスの保護を高めることができなかった(Hedley S.J. et al. 2009. The Open Gene Therapy Journal, 2:1-11)ことから、この結果は予期されないものである。
【００１２】
加えて、組換えアデノウイルスが腫瘍溶解性アデノウイルスである場合、アルブミン結合部分の挿入はその抗腫瘍活性を高める。この意味で、前記の遺伝子改変アデノウイルスは、特に癌の治療に関して、全身投与の制限を克服するための潜在的価値を持つ。
【００１３】
本発明の例に示された結果は、ヘキソンタンパク質コード配列の超可変領域１（ＨＶＲ１）に挿入された連鎖球菌Ｇタンパク質由来のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）をコードする配列を含んでなる複製選択的腫瘍溶解性アデノウイルス（ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤ）は、このドメインをそのキャプシドに露出し、アルブミン結合を促進し、アデノウイルスを中和抗体からシールドし、その血漿半減期を延長し、かつ、その抗腫瘍有効性を高めることを明らかに示す。本発明により示される試験例もまた、複製欠陥アデノウイルス（ＡｄＧＬ−ＡＢＤ）のヘキソンタンパク質のＨＶＲ１内への連鎖球菌Ｇタンパク質由来のＡＢＤの挿入がアデノウイルスを中和抗体から保護することを示す（図６）。従って、これらの結果は、アデノウイルスのアルブミン被覆がウイルスタンパク質を隠し、血中での複数の望ましくない相互作用（中和抗体、血液細胞吸着および肝臓取り込み）を回避し、」その薬物動態を改良するシールドとして働くことを示す。このことは遺伝子治療用のアデノウイルスベクター、ワクチンまたは腫瘍溶解性アデノウイルスが再投与される場合に特に重要である。従って、本発明の遺伝子改変アデノウイルスは全身投与に好適である。
【００１４】
本発明のアデノウイルス
本発明で得られた結果によると、アデノウイルスヘキソンタンパク質の外側表面にアルブミン結合部分を含んでなるアデノウイルスは、アルブミンで被覆されて、血中に存在する中和抗体からそれ自体を保護することができることを示す。この保護効果は複製型（ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤ）および非複製型（ＡｄＧＬ−ＡＢＤ）アデノウイルスの両方で見られる。
【００１５】
一態様において、本発明は、ヘキソンタンパク質とアルブミン結合部分を含んでなる融合タンパク質の発現を生じさせる、ヘキソンタンパク質の超可変領域１（ＨＶＲ１）のコード領域に挿入されたアルブミン結合部分をコードする配列を含んでなり、前記アルブミン結合部分は、前記ヘキソンタンパク質がアデノウイルスキャプシドに組み立てられる際にヘキソンタンパク質の外側表面に位置することを特徴とする、アデノウイルスゲノムを有する組換えアデノウイルスに関する。
【００１６】
用語「アデノウイルス」は、本明細書で使用する場合、アデノウイルスとして分類することができるいずれのウイルス、すなわち、二本鎖ＤＮＡゲノムを含有する二十面体ヌクレオキャプシドを有する非エンベロープウイルスであることを特徴とするアデノウイルス科に属する全てのウイルスを意味する。この用語は、標的細胞への感染のための受容体としてＣＡＲを用いる総ての群、亜群および血清型を含む、ヒトまたは動物に感染可能ないずれのアデノウイルスも含む。本発明のアデノウイルスとしては、限定されるものではないが、鳥類、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヒトまたはカエルアデノウイルスが挙げられる。好ましい実施形態では、本発明のアデノウイルスはヒトアデノウイルス、すなわち、ヒトに感染可能なアデノウイルスである。本発明によれば、「血清型」は、免疫学的に異なるタイプの各アデノウイルスである。ヒトアデノウイルスには少なくとも５７の血清型が存在し、いくつかの亜群（Ａ〜Ｇ）に分類されている。本発明は、限定されるものではないが、表１に定義される血清型のいずれをも含む、技術の現状において既知のいずれのアデノウイルス血清型も意図する。
【００１７】
【表１】
0006639412.tif 000002
【００１８】
好ましい実施形態では、ヒトアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型１〜５７からなる群から選択される。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、アデノウイルスは亜群Ｃに属し、より好ましくは、血清型５である。
【００２０】
ヒトアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）は、軽度呼吸器系感染に関連する。ヒトアデノウイルス血清型５の遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ３３９８６５．１（２００７年８月１２日版）に見出すことができる。
【００２１】
本発明のアデノウイルスは、組換えアデノウイルスである。用語「組換え」は、本明細書で使用する場合、天然には見られないアデノウイルスを意味する。この組換えアデノウイルスは、野生型に対して１以上の改変を含み得る。このような改変としては、限定されるものではないが、感染性ウイルスを作り出すための、粒子にパッケージングされるアデノウイルスゲノムに対する改変が挙げられる。他の改変は、ウイルスゲノムから複製に重要な遺伝子を除去することにより複製欠陥ウイルス（すなわち、複製することができないウイルス）の取得を可能とする。例示的改変としては、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３、またはＥ４コード領域のうち１以上における欠失など、当技術分野で公知の欠失が挙げられる。他の例示的改変としては、アデノウイルスゲノムのコード領域の総ての欠失が挙げられる。このようなアデノウイルスは、「ガットレス」アデノウイルスとして知られる。異なる血清型に由来する要素の組合せにより形成されるキメラアデノウイルスも含まれる。
【００２２】
用語「組換え」はまた、特定のタイプの細胞または組織種では優先的に複製するが、他のタイプでは低い程度でしかまたは全く複製しないウイルスである条件付き複製アデノウイルスも含む。例えば、本明細書に示されるアデノウイルスの中には、固形腫瘍および他の新生物などの異常に増殖する組織で複製するアデノウイルスがある。これらには米国特許第５，９９８，２０５号および米国特許第５，８０１，０２９号に開示されるウイルスが含まれる。このようなウイルスは、「細胞溶解性」または「細胞変性」ウイルス（またはベクター）と呼ばれる場合があり、それらが新生細胞に対してこのような効果を有する場合には、「腫瘍溶解性」ウイルス（またはベクター）と呼ばれる。
【００２３】
１つの実施形態では、アデノウイルスは、複製アデノウイルス、特に、腫瘍溶解性アデノウイルスである。
【００２４】
別の実施形態では、アデノウイルスは、非複製アデノウイルスまたは複製欠陥アデノウイルスである。複製欠陥アデノウイルスまたは非複製アデノウイルスは、その目的が細胞の溶解ではなくその細胞内で治療遺伝子を発現させることであるので、標的細胞への遺伝子の担体として遺伝子治療において使用される、標的細胞で複製不能のアデノウイルスである。
【００２５】
本発明の組換えアデノウイルスは、アデノウイルスヘキソンタンパク質の外側表面への異種配列の挿入により改変される。特に、異種配列はアルブミン結合部分をコードする。
【００２６】
アデノウイルス粒子は、ウイルスＤＮＡをパッケージングするキャプシドからなる。用語「キャプシド」は、本明細書で使用する場合、五角形または六角形であり得るカプソマーと呼ばれるサブユニットにより形成されるウイルスのタンパク質外被を意味する。アデノウイルスキャプシドは、２０の二等辺三角形面を有する二十面体形をしている。キャプシドのほとんどはヘキソンタンパク質により形成され、各頂点はペントン塩基とファイバータンパク質により形成された複合体を有している。
【００２７】
用語「アデノウイルスヘキソンタンパク質」または「ヘキソンタンパク質」（旧称「タンパク質ＩＩ」）は、本明細書で使用する場合、自己会合してそれぞれ六辺形の形態で三量体を形成するアデノウイルスに見られる主要な構造キャプシドタンパク質を意味する。２４０のヘキソン三量体が組み立てられてアデノウイルスキャプシドとなる。ヘキソンタンパク質は、ウイルスキャプシドの組み立て、キャプシドの二十面体の対称性およびキャプシドの整合性に不可欠である。ヘキソンタンパク質の主要な構造的特徴は、血清型全域にわたってアデノウイルスに共有されているが、ヘキソンタンパク質は血清型間で大きさと免疫特性が異なる。本発明では、用語「ヘキソンタンパク質」は、限定されるものではないが、ヒトアデノウイルスＣ血清型５のヘキソンタンパク質に相当する、２０１４年２月１９日付けの受託番号Ｐ０４１３３を有するＵｎｉＰｒｏｔデータベースの配列により定義されるタンパク質；ヒトアデノウイルスＣ血清型２のヘキソンタンパク質に相当する、２０１４年２月１９日付けの受託番号Ｐ０３２７７を有するＵｎｉＰｒｏｔデータベースの配列により定義されるタンパク質；トリアデノウイルスｇａｌ１（Ｐｈｅｌｐｓ株）のヘキソンタンパク質に相当する２０１４年２月１９日付けの受託番号Ｐ４２６７１を有するＵｎｉＰｒｏｔデータベースの配列により定義されるタンパク質；およびヒトアデノウイルスＦ血清型４０のヘキソンタンパク質に相当する、２０１４年２月１９日付けの受託番号Ｐ１１８１９を有するＵｎｉＰｒｏｔデータベースにより定義されるタンパク質を含む任意のアデノウイルスのヘキソンタンパク質を包含する。この表現は、他の亜群または血清型において天然に見られるヘキソンタンパク質の天然変異体の総てを含む。
【００２８】
本発明において、「ヘキソンタンパク質の外側表面」という表現は、キャプシドの表面に露出しているヘキソンタンパク質の領域を意味する。本発明のアルブミン結合部分がアデノウイルスヘキソンタンパク質の内部の部分に導入されたか外側表面に導入されたかを知るためには、本特許出願の実験の節に開示されているように、ヒト血清アルブミンとの結合を検出するためのアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）またはインビトロ中和アッセイを行えばよい。ヒト血清アルブミンがアデノウイルスに結合することができれば、そのアルブミン結合部分はアデノウイルスヘキソンタンパク質の外側表面に導入されている。
【００２９】
ヘキソンタンパク質のループ１（Ｌ１）およびループ２（Ｌ２）はウイルスカプソマー構造の外側に露出していることが報告されている。Ｌ１は、６つの超可変領域（ＨＶＲ）、すなわち、ＨＶＲ１〜ＨＶＲ６を含み、Ｌ２は、７つの超可変領域（ＨＶＲ７）を含む。
【００３０】
用語「超可変領域」または「ＨＶＲ」は、本明細書で使用する場合、表面に露出したループの部分を形成している、アデノウイルス血清型間で長さおよび配列が異なる領域を意味する。三量体の各サブユニットにつき、アデノウイルスヘキソンの７つの超可変領域が存在する(Biere B and Schweiger B. J Clin Virol 2010; 47(4):366-371)。本発明の文脈では、ＨＶＲに使用する命名法はCrawford-Miksza and Schnurr (Crawford-Miksza and Schnurr. 1996. Virology, 224(2):357-367)に開示されている。本発明の好ましい実施形態では、ＨＶＲはＨＶＲ１である。ＨＶＲ領域内への特定の残基の挿入は、アデノウイルスベクター当たり２４０×３、すなわち全部で７２０通りの挿入をもたらす。好ましい実施形態では、アルブミン結合部分をコードする配列は、結果として得られる融合タンパク質が、ヒトアデノウイルス血清型５由来のヘキソンタンパク質に相当する２００８年６月１４日付けのＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ４８７８２．１を有するヘキソンタンパク質（配列番号２７）のナンバリングに従って、ヘキソンタンパク質のＤ１５０アミノ酸の後にアルブミン結合部分を含むように挿入される。より好ましい実施形態では、ＨＶＲ１（ＡＢＤ−ＨＶＲ１）に挿入されたＡＢＤを有する完全改変型のアデノウイルスヘキソンのヌクレオチド配列は配列番号３である。本発明者らは、別のＨＶＲ（具体的には、ＨＶＲ５）内へのアルブミン結合ドメインの挿入は、生存能のあるウイルスを生産するが、アデノウイルスを中和抗体から保護しないことを示した。本特許出願の実施例は、アルブミン結合部分をコードする配列が、ヒトアデノウイルス血清型５由来のヘキソンタンパク質に相当する２００８年６月１４日付けのＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ４８７８２．１を有するヘキソンタンパク質のナンバリングに従って、ヘキソンタンパク質のＡ２７４アミノ酸の後にアルブミン結合部分を含むように、ＨＶＲ５に挿入されていることを示す。ＨＶＲ５に挿入されたＡＢＤ（ＡＢＤ−ＨＶＲ５）を有する完全改変型のアデノウイルスヘキソンのヌクレオチド配列は、配列番号４である。図１２は、アルブミン結合ドメインは、ＨＶＲ５ではなくＨＶＲ１に挿入された場合に機能的であることを示す。
【００３１】
アルブミン結合部分はヘキソンタンパク質に直接結合されてもよく、すなわち、アルブミン結合部分のＮ末端およびＣ末端はヘキソンタンパク質に直接連結される。しかしながら、アルブミン結合部分は、リンカー配列の手段によってヘキソンタンパク質に接続されることも可能である。よって、別の実施形態では、アルブミン結合部分のＮ末端および／または(an/or)Ｃ末端は、リンカー配列によりヘキソンタンパク質に接続される。
【００３２】
用語「リンカー配列」は、本明細書で使用する場合、両要素間に空間を設け、ヘキソンタンパク質とアルブミン結合部分の間でヒンジ領域として働き、ヘキソンタンパク質の二次構造がＡＢＤ部分の存在により影響を受けないようにする、またその逆である、アミノ酸配列を意味する。リンカー配列は、個々の要素の三次元形態を維持しつつ、両要素が互いに独立に可動であるいずれの長さであってもよい。好ましい実施形態では、リンカー配列は、３１アミノ酸長以下のフレキシブルリンカーペプチドである。より好ましくは、リンカー配列は、１０アミノ酸未満、５アミノ酸未満、４アミノ酸未満または２アミノ酸未満を含んでなる。１つの実施形態では、リンカー配列は、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択される２以上のアミノ酸を含んでなる。別の実施形態では、前記リンカーはポリグリシンリンカーである。リンカー配列の例示的非限定例としては、ＳＧＧＴＳＧＳＴＳＧＴＧＳＴ（配列番号 ５）、ＡＧＳＳＴＧＳＳＴＧＰＧＳＴＴ（配列番号６）、ＧＧＳＧＧＡＰ（配列番号７）およびＧＧＧＶＥＧＧＧ（配列番号８）が挙げられる。これらの配列は、設計されたコイルドコイルを他のタンパク質ドメインに結合するために使用されている(Muller, K.M. et al. Meth. Enzymology, 2000, 328:261-281)。好ましくは、リンカー配列は、配列ＧＳＧＳ（配列番号２）を含んでなる。あるいは、当技術分野で公知の他のリンカーも使用可能である(Reddy Chichili, VP., Kumar, V., and Sivaraman, J. (2013). Linkers in the structural biology of protein-protein interactions. Protein Science 22(2):153-67)。
【００３３】
よって、本発明のアデノウイルスは、ヘキソンタンパク質の外側表面にアルブミン結合部分を有し、従って、アデノウイルスのキャプシドをアルブミンで被覆する。
【００３４】
用語「アルブミン」、本明細書で使用する場合、濃塩溶液中で溶解度があまり大きくない、熱変性を受ける水溶性球状タンパク質である、アルブミンファミリータンパク質のメンバーに関する。アルブミンは、血漿中に一般に見られる。血清アルブミンは肝臓によって産生され、血漿中に溶け、哺乳動物で最も豊富な血液タンパク質である。特に、用語「血清  アルブミン」は、ヒトにおいてはＡＬＢ遺伝子（ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．  ４１８１６７）によりコードされている球状タンパク質に関する。ヒト血清アルブミンタンパク質は、２０１４年３月１９日付けの受託番号Ｐ０２７６８を有するＵｎｉｐｒｏｔデータベースの配列により定義されるタンパク質である。
【００３５】
用語「アルブミン結合部分」は、本明細書で使用する場合、アルブミンと結合し得る、すなわち、アルブミン結合親和性を有するいずれのアミノ酸配列も意味する。好ましくは、それは血清アルブミン、より好ましくは、ヒト血清アルブミンと結合し得る。用語「アルブミン結合部分」としては、限定されるものではないが、天然アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）（細菌タンパク質中に存在するＡＢＤなど）、および合成ペプチド由来のアルブミン結合配列が挙げられる。好ましい実施形態では、アルブミン結合部分は、連鎖球菌Ｇタンパク質由来のアルブミン結合ドメイン、ペプトストレプトコッカス・マグナス(Peptostreptococcus magnus)タンパク質ＰＡＢ由来のアルブミン結合ドメイン、コア配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号９）を有するアルブミン結合ペプチドおよびそれらの機能的に等価な変異体から選択される。より好ましい実施形態では、アルブミン結合ドメインは連鎖球菌Ｇタンパク質由来である。
【００３６】
用語「アルブミン結合ドメイン」とは、中和抗体からの保護を確保するために十分な特異性を有するアルブミンと結合し得る天然タンパク質に由来するいずれの領域をも意味する。
【００３７】
用語「連鎖球菌Ｇタンパク質に由来のアルブミン結合ドメイン」、または「連鎖球菌Ｇタンパク質由来のＡＢＤ」は、本明細書で使用する場合、３ヘリックスバンドルを形成する４６アミノ酸残基からなり(Kraulis P.J. et al. FEBS Lett, 1996; 378:190-4)、かつ、ヒトおよびマウスアルブミンと高親和性で結合するが、ウシアルブミンとは結合しない(Konig T. and Skerra A. J Immunol Methods, 1998; 218:73-83)ドメインを意味する。連鎖球菌Ｇタンパク質中には複数のアルブミン結合ドメインが存在する。好ましいドメインでは、アルブミン結合部分は、連鎖球菌Ｇタンパク質由来のアルブミン結合ドメイン３である。好ましくは、連鎖球菌Ｇタンパク質由来のアルブミン結合ドメイン３の配列は配列番号１である。
【００３８】
用語「ペプトストレプトコッカス・マグナスタンパク質ＰＡＢ由来のアルブミン結合ドメイン」は、本明細書で使用する場合、アルブミンと結合し得る「ＧＡモジュール」として知られるフィネゴルディア・マグナ(Finegoldia magna)（以前はペプトストレプトコッカス・マグナスとして知られていた）のタンパク質ＰＡＢ由来のアルブミン結合ドメインを意味する(Lejon S et al. 2004. J Biol Chem 279:42924-42928)。フィネゴルディア・マグナのタンパク質ＰＡＢは、２００４年９月９日付けの受託番号ＣＡＡ５４８５７．１を有するＧｅｎＢａｎｋデータベースの配列により定義されるタンパク質である。
【００３９】
用語「コア配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号９）を有するアルブミン結合ペプチド」は、本明細書で使用する場合、Dennis MS et al. (J Biol Chem. 2002. 277:35035-35043)に開示されているようなファージクローンＲＡおよびＳＡに由来するアルブミンと結合するペプチドを意味する。
【００４０】
本発明はまた、このようなアルブミン結合部分の機能的に等価な変異体も包含する。用語「機能的に等価な変異体」は、本明細書で使用する場合、１以上の残基の挿入、欠失または置換によるアルブミン結合部分に由来し、かつ、上記で決定されたようにアルブミンとの相互作用能を実質的に維持するいずれのポリペプチドも意味する。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のアルブミン結合ドメインのアルブミン結合能の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％であるアルブミン結合能を示す場合に、アルブミン結合部分の機能的に等価な変異体と見なされる。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１のアルブミン結合ドメインと少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％同じ効率の中和抗体能である場合に、アルブミン結合部分の機能的に等価な変異体とみなされる。
【００４１】
好適な機能的変異体は、本発明に開示されるアルブミン結合ドメインまたはアルブミン結合配列に関して、少なくとも２５％、例えば少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％などのアミノ酸配列同一性の同一性程度を示すものである。２つのポリペプチド間の同一性の程度は当業者に広く知られているコンピューターアルゴリズムおよび方法を用いて決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム[BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]により決定されるが、他の類似のアルゴリズムも使用可能である。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、配列同一性パーセントを決定するために、本明細書に記載のパラメーターとともに使用される。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウエアは、the National Center for Biotechnology Informationから公的に入手できる。
【００４２】
アルブミン結合部分の機能的に等価な変異体は、アルブミン結合ドメインおよびアルブミン結合配列の誘導体であり得る。用語「誘導体」としては、限定されるものではないが、Johansson MU. et al. (J Biol Chem. 2002. 277:8114-8120), Jonsson A. et al. (Protein Eng Des Sel. 2008. 21: 515-527)およびLinhult M. et al. (Protein Sci. 2002. 11:206-213)に開示されているような、アルブミンに対する親和性を増強するために改変された細菌に由来のアルブミン結合ドメインが挙げられる。例えば、誘導体は、Jonsson A. et al. (Protein Eng Des Sel. 2008. 21: 515-527)に開示されている改変型連鎖球菌Ｇ  ＡＢＤ  ＡＢＤ０３５であり得る。
【００４３】
組換えアデノウイルスは、技術の現状において既知の標準的な分子生物学的技術(Chillon and Bosch. Adenovirus. Methods and Protocols. 3rd edition. Methods in Molecular Biology, vol. 1089. Springer Protocols. Humana Press. (2014))に得られる。
【００４４】
本発明のアルブミン結合部分を含むアデノウイルスは、Chillon and Bosch. Adenovirus. Methods and Protocols. 3rd edition. Methods in Molecular Biology, vol. 1089. Springer Protocols. Humana Press. (2014);およびAlemany R, Zhang W. Oncolytic adenoviral vectors. Totowa, NJ.: Humana Press, 1999に開示されているようなアデノウイルスベクターの分野で標準的な方法に従って増殖および増幅させる。遺伝子治療およびウイルス療法の分野において通常使用される細胞株は、ＨＥＫ−２９３およびＡ５４９細胞株である。増殖のための好ましい方法は、アデノウイルスの複製を可能とする細胞株の感染による。肺腺癌Ａ５４９細胞株は、このような細胞株の例である。増殖は例えば次のように行う：Ａ５４９細胞をプラスチック細胞培養プレートに播種し、細胞当たり１００ウイルス粒子を感染させる。２日後に、細胞を解離させた際に細胞変性作用がウイルス生産を証明し、「ブドウ様」クラスターを形成する。これらの細胞を試験管に採取する。１０００ｇで５分間の遠心分離後に、細胞ペレットを３回凍結および解凍させて細胞を破壊する。得られた細胞抽出液を１０００ｇで５分間遠心分離し、ウイルスを含有する上清を塩化セシウム勾配で層状とし、３５０００ｇで１時間遠心分離した。この勾配から得られたウイルスのバンドを回収し、別の塩化セシウム勾配で再び層状とし、１６時間３５０００ｇで遠心分離した。ウイルスバンドを回収し、ＰＢＳ−１０％グリセロールに対して透析した。透析したウイルスをアリコートに分け、−８０℃で維持した。ウイルス粒子およびプラーク形成単位の数の定量は、標準的なプロトコールに従って行う。５％グリセロールを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、アデノウイルスの保存に使用される標準的な配合物である。しかしながら、ウイルスの安定性を改善する他の配合物も記載されている。
【００４５】
癌の予防または治療におけるその使用のためのアルブミン結合部分を含むアデノウイルスの精製方法は、癌のウイルス療法および遺伝子治療において使用される他のアデノウイルスおよびアデノウイルスベクターに関して記載されているものと同じである。
【００４６】
アデノウイルスは、異常な細胞、例えば、有害なまたはそうでなければインビボにおいて望ましくない任意の細胞を標的とするために使用することができる。広い例としては、自己免疫疾患、再狭窄、および瘢痕組織形成を引き起こす細胞が含まれる。
【００４７】
本発明のアデノウイルスは、インビボにおいて、非標的または非腫瘍組織での発現を回避または有意に低減しつつ、所与の組織に選択的に分布させることができる。
【００４８】
本発明の複製アデノウイルスは、そのゲノム配列に、ある細胞における選択的複製を付与する改変を持ち得る。アデノウイルスの発現を、そのような発現が必要とされる組織または治療する腫瘍組織に向けるために、本発明のアデノウイルスは、組織特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターを含んでなり得る。よって、１つの実施形態では、アデノウイルスは、組織特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターをさらに含んでなる。
【００４９】
好ましい実施形態では、組織特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターは、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、およびＥ４からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を制御するためのプロモーター配列である。好ましくは、プロモーターはＥ１ａの発現を制御する。
【００５０】
用語「プロモーター」は、本明細書で使用する場合、その技術分野で認識される意味に従って使用される。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと結合して酵素を適正な転写開始部位に導く、通常、遺伝子のコード配列の上流にあるＤＮＡ領域を意味するものとする。前記プロモーターは、複製を開始するウイルス遺伝子を制御する。
【００５１】
用語「組織特異的」は、複製に必須の遺伝子が、その組織で複製を進行するように、その組織で機能特異的に、作動可能なように連結されているプロモーターを意味するものとする。これは、そのプロモーターを活性化する正の転写因子がその組織に存在し、非標的組織には存在しないことによって起こり得る。それはまた、通常、非標的組織に存在し、そのプロモーターの結果として転写を妨げる転写阻害因子の不存在によっても起こり得る。よって、転写が起こる場合、それは複製に必須の遺伝子への進行し、その結果、標的組織において、ベクターの複製およびその付帯機能が生じる。
【００５２】
組織特異性は、異常な組織を処置しつつ、組織の正常な対応物を避け、または異常な組織とは異なるタイプの周囲組織の正常な対応物を避けるとともに、特定の組織タイプの異常な対応物を標的化することに関して特に関連がある。特定の実施形態では、プロモーターは「腫瘍特異的」であり、それはそのプロモーターが特異的に腫瘍組織で機能することを意味する。例えば、本発明の組換えアデノウイルスは、肝臓への転移を処置するのに有用である。１つの具体例は結腸癌であり、これは肝臓に転移することが多い。結腸癌が肝臓に転移する場合でさえ、ＣＥＡプロモーターは転移の細胞で活性であるが、正常な肝臓細胞では活性でないことを分かっている。よって、正常なヒト成人肝臓は、結腸癌ＣＥＡ特異的プロモーターに連結された複製に必須のウイルス遺伝子を有するウイルスの複製を支持しないはずである。複製は原発性癌細胞で起こるはずである。別の例として、肝細胞癌でのみ活性なαフェトタンパク質プロモーターがある。さらなる例として、黒色腫でのみ活性で、正常皮膚では活性でないチロシナーゼプロモーターがある。各場合において、複製は異常な細胞で予想されるが、正常な細胞では予想されない。
【００５３】
組織特異的プロモーターの例は、限定されるものではないが、αフェトタンパク質プロモーター、ＤＥ３プロモーター、チロシナーゼプロモーター、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーター、界面活性タンパク質プロモーター、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼｈＴＥＲＴプロモーター、前立腺特異的抗原プロモーター、ＣＯＸ−２プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、肝炎ウイルスのコアプロモーター、チロキシンと結合するグロブリン結合タンパク質のプロモーターおよびＥｒｂＢ２プロモーターがある。
【００５４】
好ましい実施形態では、プロモーターは、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼｈＴＥＲＴプロモーター、チロシナーゼプロモーター、前立腺特異的抗原プロモーター、αフェトタンパク質プロモーター、およびＣＯＸ−２プロモーターからなる群から選択される。
【００５５】
本発明のアデノウイルスは、癌の治療に特に有用である。総ての腫瘍が本発明のアデノウイルスによる治療に潜在的に従う。腫瘍タイプとしては、限定されるものではないが、  造血系、膵臓、神経系、肝臓、消化管、内分泌、胆道、洞肺、頭頸部、軟組織肉腫および癌腫、皮膚、および生殖管などが挙げられる。治療に好ましい腫瘍は、正常組織よりも高い有糸分裂指数を有するもの、好ましくは、固形腫瘍である。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明のアデノウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルスである。
【００５７】
用語「腫瘍溶解性アデノウイルス」は、本明細書で使用する場合、選択性 がなくとも、腫瘍細胞で複製し得るまたは複製能を有するいずれのアデノウイルスも意味する。腫瘍溶解性アデノウイルスの治療作用は、複製して、除去する腫瘍細胞を溶解させる能力に基づく。腫瘍細胞の死滅は、生細胞数、細胞変性効果、腫瘍細胞のアポトーシス、腫瘍細胞におけるウイルスタンパク質の合成（例えば、代謝標識、ウイルスタンパク質のウエスタンブロットまたは複製に必要とされるウイルス遺伝子の逆転写を用いたＰＣＲによる）または腫瘍サイズの縮小の測定など、技術の現状のいずれかの方法によって検出することができる。
【００５８】
腫瘍における選択的複製を達成するための別の戦略は、正常細胞での複製に必要であるが、腫瘍細胞では必要とされないウイルス機能の欠失である。これには、例えば、レチノブラストーマ（ｐＲＢ）経路を遮断する初期Ｅ１Ａ機能の欠失が含まれる。このような突然変異体の選択的複製は、いくつかの従来技術の文献に示されている。Ｅ４およびＥ４ｏｒｆ６／７などのｐＲＢと直接相互作用する他のウイルス遺伝子も、腫瘍細胞での選択的複製を達成するために欠失される候補である。
【００５９】
腫瘍での選択的複製を達成するために記載されているもう１つの改変は、ウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡ−ＲＮＡ）をコードするアデノウイルス遺伝子の欠失である。これらのＲＮＡは、インターフェロンの抗ウイルス活性を遮断し、それらの欠失は、インターフェロン阻害に感受性のあるアデノウイルスをもたらす。腫瘍細胞におけるインターフェロン経路の特徴的な末端切断により、このようなアデノウイルス腫瘍において正常に複製する。
【００６０】
よって、別の実施形態では、本発明のアデノウイルスは、腫瘍における選択的複製を達成するためのＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ４、およびＶＡ−ＲＮＡからなる群から選択される１以上の遺伝子に突然変異をさらに含んでなる。好ましくは、これらの突然変異は、Ｅ１ａにおけるものである。好ましい実施形態では、Ｅ１ａにおける突然変異は、Ｅ１ＡとｐＲＢの相互作用に影響を及ぼすＥ１Ａタンパク質の数いくつかのアミノ酸の欠失、好ましくは、ポリペプチド鎖のアミノ酸１２１〜１２９の欠失（Δ２４欠失）である。
【００６１】
「選択的複製」という表現は、本明細書で使用する場合、アデノウイルスが腫瘍細胞において正常細胞よりも高い（例えば、正常細胞よりも１０００倍高い）複製効率を有することを意味する。
【００６２】
用語「複製」は、本明細書で使用する場合、核酸のレベルまたは感染性ウイルス粒子のレベルで起こるアデノウイルスベクターの複製を意味する。ＤＮＡウイルスの場合、核酸レベルでの複製はＤＮＡの複製である。しかしながら、複製はまた感染性ＤＮＡウイルス粒子の形成も含む。
【００６３】
アデノウイルスの複製は、周知の技術によってアッセイすることができ細胞におけるアデノウイルスベクターの複製に関するアッセイは一般に、ポリヌクレオチド、ビリオンまたは感染性ウイルスの検出を含む。この目的で使用可能な多様な周知の方法は、細胞においてある期間中にポリヌクレオチドに組み込まれた標識基質の量の測定を含む。
【００６４】
複製がＤＮＡポリヌクレオチドを含む場合、３Ｈ−チミジンが標識基質として使用される場合が多い。この場合、複製の量は、細胞ＤＮＡのバルクからベクターのＤＮＡを分離すること、およびベクターＤＮＡに特異的に組み込まれたトリチウムの量を測定することによって決定される。
【００６５】
ポリヌクレオチドベクターの複製はまた、細胞を溶解させるかまたは透過処理を施してポリヌクレオチドを放出させること、次いで、ポリヌクレオチドを単離し、回収されたＤＮＡまたはＲＮＡを直接定量することにより検出してもよい。ポリヌクレオチドの複製はまた、アッセイされるポリヌクレオチドに特異的なプライマーを用いた定量的ＰＣＲにより検出してもよい。
【００６６】
ビリオンは、当技術分野で周知の電子顕微鏡計数技術により、ビリオンを単離しタンパク質および核酸含量を決定することにより、ならびにウイルスゲノムポリヌクレオチドまたはビリオンタンパク質を標識しポリヌクレオチドまたはタンパク質の量からビリオンの量を求めることによりアッセイされ得る。
【００６７】
腫瘍細胞に対するアデノウイルスの選択性を達成するためのもう１つの戦略は、アデノウイルスを腫瘍細胞に存在する受容体に標的化するために宿主細胞の感染に含まれるウイルスキャプシドタンパク質の改変である。ウイルスが細胞に感染するために用いるキャプシドタンパク質の改変はまた、アデノウイルスの感染力を高める（すなわち、細胞内へのウイルスの侵入を高める）ためにも使用され得る。アデノウイルスの腫瘍への標的化はまた一方の末端でウイルスと他方で腫瘍受容体と結合する二機能性リガンドで達成することもできる。
【００６８】
よって、別の実施形態では、本発明のアデノウイルスは、その感染力を高めるため、またはそれを腫瘍細胞に存在する受容体に標的化するためのキャプシド改変をさらに含んでなる。より好ましい実施形態では、キャプシドの改変は、ＲＧＤモチーフ（アルギニン−グリシン−アスパラギンモチーフ）の、アデノウイルスファイバータンパク質のＨ１ループへの挿入である。この挿入は、アデノウイルスが、野生型アデノウイルスの場合と同様に内部移行するだけでなく、細胞内でインテグリンを用いて合体することを可能とする。ウイルスの細胞受容体としてのインテグリンの使用は、感染力および腫瘍溶解効力を高める。別の実施形態では、腫瘍溶解性アデノウイルスは、アデノウイルスファイバー中のヘパラン硫酸結合ドメインＫＫＴＫ（配列番号１０）をドメインＲＧＤＫ（配列番号１１）で置換する手段によって改変されたキャプシドを有する(N. Bayo et al. Human Gene Therapy 2009, 20:1214-21)。アデノウイルスを用いて標的細胞の感染力を高めるためのもう１つの戦略は、ファイバーの一部を異なる血清型に由来の相同部分で置換することである。一般に、血清型５に由来するヒトアデノウイルスのファイバーシャフトとノブが、ヒト血清型３または３５アデノウイルスのファイバーシャフトとノブに置換されている。得られる、異なる血清型に由来するゲノムを有する組換えアデノウイルスは、当技術分野でキメラアデノウイルスとして知られている。別の実施形態では、本発明のアデノウイルスは、異なるアデノウイルス血清型に由来するキメラキャプシドをさらに含んでなる。別の好ましい実施形態では、キャプシドの改変は、ファイバー遺伝子の一部を異なるアデノウイルス血清型由来の相同部分で置換することによるキメラアデノウイルスの形成である。
【００６９】
好ましい実施形態では、腫瘍溶解性アデノウイルスは、ポリペプチド鎖の、Ｅ１ａとｐＲＢの相互作用に影響を及ぼすアミノ酸１２１〜１２９が欠失されている（Δ２４欠失）変異型のＥ１Ａタンパク質、Ｅ１ａの発現を制御するためのＥ１ａの内因性プロモーターにおける４つのＥ２Ｆ結合部位と１つのＳｐ１結合部位の挿入、および最後に、ウイルスの感染力を高めるためのアデノウイルスファイバー中へのＲＧＤペプチドの挿入を含むことを特徴とする腫瘍選択的複製アデノウイルスである。ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤは、本発明の好ましい実施形態である。前記改変は、同じアデノウイルス内に組合せとして存在してもよいし、または単独で存在してもよい。
【００７０】
好ましい実施形態では、腫瘍溶解性アデノウイルスは、Ｅ１Ａタンパク質の、Ｅ１ＡとｐＲＢの相互作用に影響を及ぼすいくつかのアミノ酸の欠失、好ましくは、ポリペプチド鎖のアミノ酸１２１〜１２９の欠失（Δ２４欠失）を含むことを特徴とする腫瘍選択的複製アデノウイルスである。
【００７１】
別の好ましい実施形態では、腫瘍溶解性アデノウイルスは、Ｅ１ａの発現を制御するためのＥ１ａの内因性プロモーターにおける４つのＥ２Ｆ結合部位と１つのＳｐ１結合部位の挿入を含むことを特徴とする腫瘍選択的複製アデノウイルスである。
【００７２】
別の好ましい実施形態では、腫瘍溶解性アデノウイルスは、ウイルスの感染力を高めるためのアデノウイルスファイバー内へのＲＧＤペプチドの挿入を含むことを特徴とする腫瘍選択的複製アデノウイルスである。
【００７３】
アデノウイルスのゲノムはまた、治療タンパク質をコードする異種遺伝子も含むことができ、これにより、感染細胞内で異種遺伝子が発現される。治療タンパク質は、本明細書で使用する場合、所与の細胞で発現された際に何らかの治療利益をもたらすことが予想されるタンパク質を意味する。前記異種遺伝子産物は、複製または非複製アデノウイルスに含有され得る。挿入される治療遺伝子は、遺伝子治療またはワクチン接種において使用されるいずれの遺伝子であってもよい。好ましくは、異種遺伝子は、癌遺伝子治療において使用される。腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムにおける治療遺伝子の挿入は、腫瘍細胞に対する腫瘍溶解性アデノウイルスの細胞傷害性を高める「腫瘍溶解性強化アデノウイルス」を生成する。例えば、前記異種遺伝子は、とりわけ、腫瘍細胞の死滅をもたらし、腫瘍に対する免疫系を活性化し、血管新生を阻害し、細胞外マトリックスを排除し、アポトーシスを誘導することができる。これらの場合、治療遺伝子の発現の方法および時間がこの治療アプローチの最終結果に重要となる。
【００７４】
よって、１つの実施形態では、アデノウイルスは、前記アデノウイルスのゲノムに挿入された１以上の非アデノウイルス遺伝子を含んでなる。好ましい実施形態では、これらの遺伝子は、遺伝子治療またはワクチン接種において使用される遺伝子である。より好ましい実施形態では、これらの遺伝子は、癌遺伝子治療において使用される遺伝子である。好ましくは、癌遺伝子治療において使用されるこれらの遺伝子は、プロドラッグ活性化遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、抗腫瘍干渉ＲＮＡをコードする遺伝子および免疫刺激性遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子である。
【００７５】
用語「非アデノウイルス遺伝子」は、本明細書で使用する場合、野生型アデノウイルスのゲノムには存在しない異種遺伝子を意味する。
【００７６】
用語「遺伝子治療において使用される遺伝子」は、本明細書で使用する場合、患者の細胞に前記治療ＤＮＡを送達することにより、遺伝的または後天的疾患または病態を予防または治療するための薬物として使用することができる遺伝子を意味する。当業者が理解しているように、用語遺伝子治療は、突然変異した遺伝子を置換するための機能的治療遺伝子をコードするＤＮＡの使用、または治療タンパク質をコードするＤＮＡの使用を含む。例えば、このＤＮＡは、治療価値のある酵素、ホルモン、受容体またはポリペプチドをコードし得る。遺伝子治療により適切に処置される疾患を治療するために使用できるいずれの遺伝子を、本発明のアデノウイルスのアデノウイルスゲノムに挿入してもよい。遺伝子治療において使用される遺伝子は、限定されるものではないが、酵素、血液誘導体、ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ、増殖因子、神経伝達物質またはそれらの前駆体または合成酵素、栄養因子、すなわち、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、およびＮＴ５など；アポリポタンパク質、すなわち、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、およびＡｐｏＥなど；ジストロフィンまたはミニジストロフィン；腫瘍抑制遺伝子、すなわち、ｐ５３、Ｒｂ、ＲａｐｌＡ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ；凝固に関与する因子をコードする遺伝子、すなわち、因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ；プロドラッグ活性化遺伝子、すなわち、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ；天然または人工免疫グロブリン（Ｆａｂ、およびＳｃＦｖなど）の全部または一部をコードする遺伝子であり得る。治療遺伝子はまた、標的細胞での発現が遺伝子発現または細胞ｍＲＮＡの転写の制御を可能とするアンチセンス遺伝子または配列でもあり得る。
【００７７】
用語「ワクチン接種において使用される遺伝子」は、本明細書で使用する場合、予防または治療ワクチン生産の目的でヒトまたは動物において免疫応答を生成し得る抗原ペプチドをコードする遺伝子を意味する。このような抗原ペプチドは、限定されるものではないが、エプスタイン−バーウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、偽狂犬病ウイルスに特異的なものおよび腫瘍特異的ペプチドであり得る。
【００７８】
用語「プロドラッグ活性化遺伝子」は、本明細書で使用する場合、非毒性プロドラッグに働いて非毒性プロドラッグを標的組織に毒性のある形態に変換する産物をコードする遺伝子を意味する。好ましくは、毒素は抗腫瘍活性を有するか、または細胞増殖を排除する。
【００７９】
プロドラッグ活性化遺伝子の例としては、限定されるものではないが、チミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼは、ガンシクロビルをリン酸化してヌクレオチド毒素であるリン酸ガンシクロビルを生成する。この化合物はチェーンターミネーターおよびＤＮＡポリメラーゼ阻害剤として機能し、ＤＮＡ合成を妨げ、従って、細胞傷害性である。１つの実施形態では、プロドラッグ活性化遺伝子は、チミジンキナーゼ遺伝子、好ましくは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼおよび水痘−帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼからなる群から選択されるウイルスチミジンキナーゼである。ウイルスチミジンキナーゼが使用される場合、相互作用剤または化学療法薬は、好ましくは、ヌクレオシド類似体、例えば、ガンシクロビル、アシクロビル、および１−２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）からなる群から選択されるものである。このような相互作用剤は、ウイルスチミジンキナーゼにより基質として効率的に用いられ、よって、このような相互作用剤はウイルスチミジンキナーゼを発現する腫瘍細胞のＤＮＡに致死的に組み込まれ、それにより、標的細胞の死滅をもたらす。別の実施形態では、プロドラッグ活性化遺伝子は、シトシンデアミナーゼである。シトシンデアミナーゼは、５’−フルオロシトシンを抗癌薬５’−フルオロウラシルに変換し、これは細胞傷害性が高い。よって、シトシンデアミナーゼ遺伝子を発現する標的細胞は、５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに変換し、死滅される。このような「自殺」遺伝子の考察については、Blaese, R. M. et al., Eur. J. Cancer 30A:1190-1193 (1994)を参照。
【００８０】
用語「腫瘍抑制遺伝子」は、本明細書で使用する場合、抗癌遺伝子または癌への経路の一ステップから細胞を保護する遺伝子を意味する。これらの遺伝子の１つがその機能の欠損または低下を引き起こすように変異すると、その細胞は、通常は他の遺伝子の変異との組合せで癌へと進行し得る。
【００８１】
腫瘍抑制遺伝子は、限定されるものではないが、ＴＰ５３遺伝子によりコードされているｐ５３腫瘍抑制タンパク質、ＰＴＥＮ、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、およびＳＴ１４である。
【００８２】
用語「抗腫瘍干渉ＲＮＡをコードする遺伝子」は、本明細書で使用する場合、腫瘍の処置に治療上有用なＲＮＡ分子、すなわち、ｓｉＲＮＡ(Dorsett and Tuschl (2004) Nature Rev Drug Disc 3:318-329)をコードする遺伝子を意味する。いくつかの場合、単球／マクロファージ系譜の細胞を根絶するアデノウイルスの能力をさらに増強するために本発明の組換えアデノウイルスに遺伝子を組み込むことができるが、細胞自体に直接的な影響を持たない。これらには、ＭＨＣクラスＩ提示を障害する、補体を遮断する、ＩＦＮおよびＩＦＮにより誘導される機構、ケモカインおよびサイトカインを阻害する、ＮＫ細胞に基づく死滅、免疫応答（例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β）および細胞外マトリックスを崩壊させ腫瘍内へのウイルスの核酸を促進し得るメタロプロテアーゼをダウンレギュレートする因子の活性を阻害することができるｓｉＲＮＡをコードする遺伝子が含まれる。
【００８３】
用語「免疫刺激性遺伝子」は、本明細書で使用する場合、腫瘍に対して免疫系を活性化する遺伝子を意味する。異種遺伝子、またはそれらのフラグメントのさらなる例としては、免疫調節タンパク質、例えば、サイトカインまたはケモカインをコードするものが挙げられる。例としては、インターロイキン２、米国特許第４，７３８，９２７または同第５，６４１，６６５号；インターロイキン７、米国特許第４，９６５，１９５号または同第５，３２８，９８８号；およびインターロイキン１２、米国特許第５，４５７，０３８号；腫瘍壊死因子α、米国特許第４，６７７，０６３号または同第５，７７３，５８２号；インターフェロンγ、米国特許第４，７２７，１３８号または同第４，７６２，７９１号；またはＧＭ  ＣＳＦ、米国特許第５，３９３，８７０号または同第５，３９１，４８５号、Mackensen et al. (1997) Cytokine Growth Factor Rev. 8:119-128)が挙げられる。
【００８４】
アデノウイルスゲノムにおけるこれらの改変は互いを排除しない。
【００８５】
本発明のアデノウイルスゲノム
本発明はまた、アデノウイルスのゲノムを対象とする。一態様において、本発明は、ヘキソンタンパク質の超可変領域１（ＨＶＲ１）のコード領域に挿入されたアルブミン結合部分をコードする配列を含んでなり、これによりヘキソンタンパク質とアルブミン結合部分を含んでなる融合タンパク質の発現がもたらされること、および前記アルブミン結合部分は、前記ヘキソンタンパク質がアデノウイルスキャプシドに組み立てられる際にヘキソンタンパク質の外側表面に位置することを特徴とするアデノウイルスゲノムに関する。
【００８６】
「アデノウイルスゲノム」という表現は、本明細書で使用する場合、適当なタンパク質の存在下でパッケージングされて完全なアデノウイルス粒子を生じ得る二本鎖ＤＮＡ配列を意味する。このパッケージングを生じるためには、配列はいくつかの条件に従わなければならず、次のようにまとめることができる：
・その終了点の各個で独立のアデノウイルスＩＴＲを示す；
・パッケージングシグナルＰｓｉの５’末端とそれに最も近いＩＴＲの３’末端の間の距離が、天然アデノウイルスのパッケージングを妨げる距離、すなわち、ヒト血清型５アデノウイルスの場合には２００塩基対の距離（配列内のＩＴＲとパッケージングシグナルの間に自然状態でそれらを分離している配列を導入すると、アデノウイルスゲノムのパッケージング能が低下し、それらのパッケージングに必要な時間に有意な変化が見られないとしても、得られるアデノウイルス粒子の総数に減少を生じることから、この距離は、他の血清型の場合にもほぼ等しいと類推される）を超えないように配置された両ＩＴＲの間にパッケージングシグナルＰｓｉを含んでなる；
・両ＩＴＲの末端間の距離が、キャプシドを形成するタンパク質が属する、天然に存在するアデノウイルスゲノムのサイズの１０５％を越えてはならない。
【００８７】
アデノウイルスゲノムは、好ましくは、ウイルス複製に必要とされる少なくとも１つの遺伝子機能に欠陥があり、それにより、「複製欠陥」アデノウイルスベクターとなる。「複製欠陥」とは、アデノウイルスベクターが少なくとも１つの複製に必須の遺伝子機能を欠いているアデノウイルスゲノムを含んでなる（すなわち、その結果、アデノウイルスベクターは、典型的な宿主細胞、特に、本発明に従う処置コースでアデノウイルスベクターにより感染され得るヒト患者の宿主細胞では複製しない）ことを意味する。
【００８８】
より好ましくは、複製欠陥アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの１以上の領域の少なくとも１つの複製に必須の遺伝子機能に欠陥のあるアデノウイルスゲノムを含んでなる。この点で、アデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要とされるアデノウイルスゲノムのＥ４領域またはＥ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能に欠陥がある。Ｅ１領域における欠陥に加え、組換えアデノウイルスは、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）にも突然変異を持ち得る。より好ましくは、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能およびＥ３領域の少なくとも一部（例えば、Ｅ３領域のＸｂａＩ欠失）に欠陥がある。Ｅｌ領域に関して、アデノウイルスベクターは、Ｅ１ａ領域の少なくとも一部およびＥ１ｂ領域の少なくとも一部に欠陥（例えば、欠失）を持ち得る。例えば、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥｌ領域全体およびＥ３領域の一部（すなわち、ヌクレオチド３５５〜３，５１１および２８，５９３〜３０，４７０）の欠失を含んでなり得る。単一欠陥アデノウイルスベクターは、およそヌクレオチド３５６〜３，３２９および２８，５９４〜３０，４６９（アデノウイルス血清型５ゲノムに基づく）を欠失させることができる。あるいは、アデノウイルスベクターゲノムは、およそヌクレオチド３５６〜３，５１０および２８，５９３〜３０，４７０（アデノウイルス血清型５ゲノムに基づく）を欠失させることができ、それにより、アデノウイルスゲノムのＥｌ、Ｅ３、およびＥ４領域に欠失を有するアデノウイルスベクターが得られる。
【００８９】
遺伝子、遺伝子機能、または遺伝子もしくはゲノム領域の欠陥は、本明細書で使用する場合、核酸配列の全部または一部が欠失された遺伝子の機能を障害または末梢するのに十分なウイルスゲノムの遺伝物質の欠失として定義される。複製必須遺伝子機能の破壊には遺伝子領域全体の欠失は必要とされない場合が多い。しかしながら、アデノウイルスゲノム内に１以上の導入遺伝子のために十分なスペースを設けるためには、大部分の遺伝子領域を除去することが望ましい場合がある。遺伝物質の欠失が好ましいが、付加または置換による遺伝物質の突然変異も遺伝子機能を破壊するために適当である。複製必須遺伝子機能は、複製（例えば、増殖）に必要とされ、例えば、アデノウイルス初期領域（例えば、Ｅｌ、Ｅ２、およびＥ４領域）、後期領域（例えば、Ｌ１〜Ｌ５領域）、ウイルスパッケージングに関与する遺伝子（例えば、ＩＶａ２遺伝子）、およびウイルス関連ＲＮＡ（例えば、ＮＡ−ＲＮＡ−１および／またはＮＡ−ＲＮＡ−２）によりコードされている遺伝子機能である。
【００９０】
アデノウイルスベクターはまた、ＩＴＲおよびパッケージング配列以外の全アデノウイルスゲノムが本質的に除去されていてもよい。このようなベクターは当技術分野でガットレスまたはヘルパー依存性アデノウイルスベクターとして知られる。この場合、アルブミン結合部分を含むように改変されたヘキソン配列は、ヘルパーアデノウイルスにより提供される。ＩＴＲとパッケージング配列を含んでなるアデノウイルスゲノムの５’または３’領域は、ウイルスゲノムの残部とアデノウイルス血清型に由来する必要はない。例えば、アデノウイルス血清型５ゲノムの５’領域（すなわち、アデノウイルスＥｌ領域の５’側のゲノム領域）をアデノウイルス血清型２ゲノムの対応する領域で置換することができる（例えば、アデノウイルスゲノムのＥｌ領域の５’側のＡｄ５ゲノム領域がＡｄ２ゲノムのヌクレオチド１〜４５６で置換される）。しかしながら、本発明の方法のアデノウイルスベクターのアデノウイルスゲノムの欠損は、好ましくは、アデノウイルスゲノムの初期領域によりコードされている複製必須遺伝子機能に限定される。
【００９１】
本発明によれば、逆方向末端反復配列またはＩＴＲは、アデノウイルスの線状ゲノムの両側にあってアデノウイルスゲノムの複製に必須の、およそ１００塩基対の配列として理解される(Stow, N.D., 1982, Nucl. Acid. Res, 10:5105-5109)。
【００９２】
本発明によれば、アデノウイルスパッケージングシグナルψは、血清型２および５のアデノウイルスの場合には、ゲノムの１９０番〜３５０番の間にわたるおよそ１６０塩基対長の配列として理解される。アデノウイルスのゲノムのこれらの配列を排除すると、ウイルスの複製中に生成されるＤＮＡ分子が、形成されたばかりのキャプシドに効率的に組み込まれないようになるが(Hearing, P. et al., 1987, J. Virol., 61:2555-2558)、それらは、ＩＴＲの排除とは異なり、パッケージング細胞における前記ゲノムの複製は妨げない。
【００９３】
本発明のアデノウイルスに関して開示された実施形態は総て、本発明のアデノウイルスゲノムにも当てはまり得る。
【００９４】
特に、１つの実施形態では、アデノウイルスゲノムは、ヒトアデノウイルス、好ましくは、ヒトアデノウイルス血清型１〜５７、より好ましくは、血清型５からなる群から選択される。
【００９５】
別の実施形態では、アルブミン結合部分は、連鎖球菌Ｇタンパク質由来のアルブミン結合ドメイン、ペプトストレプトコッカス・マグナスタンパク質ＰＡＢ由来のアルブミン結合ドメイン、コア配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号９）を有するアルブミン結合ペプチドおよびそれらの機能的に等価な変異体から選択される。より好ましい実施形態では、アルブミン結合部分は、好ましくは、配列番号１の配列を有する、連鎖球菌Ｇタンパク質由来のアルブミン結合ドメイン３である。
【００９６】
別の実施形態では、アルブミン結合部分をコードする配列は、結果として得られる融合タンパク質が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ４８７８２．１を有するヘキソンタンパク質（配列番号２７）のナンバリングに従ってヘキソンタンパク質のＤ１５０アミノ酸の後にアルブミン結合部分を含むように挿入される。好ましい実施形態では、ＨＶＲ１（ＡＢＤ−ＨＶＲ１）に挿入されたＡＢＤを有する完全改変型のアデノウイルスヘキソンのヌクレオチド配列は配列番号３である。
【００９７】
別の実施形態では、アルブミン結合部分のＮ末端および／またはＣ末端が、リンカー配列、好ましくは、配列ＧＳＧＳ（配列番号２）を含んでなるリンカー配列によりヘキソンタンパク質に接続される。
【００９８】
別の実施形態では、アデノウイルスゲノムは、組織特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターをさらに含んでなる。好ましい実施形態では、組織特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターは、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、およびＥ４からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を制御するためのプロモーター配列；より好ましくは、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼｈＴＥＲＴプロモーター、チロシナーゼプロモーター、前立腺特異的抗原プロモーター、αフェトタンパク質プロモーター、およびＣＯＸ−２プロモーターからなる群から選択されるプロモーターである。
【００９９】
別の実施形態では、アデノウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルス、好ましくは、そのアデノウイルスゲノムが腫瘍において選択的複製を達成するためのＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ４、およびＶＡ−ＲＮＡからなる群から選択される１以上の遺伝子に突然変異をさらに含んでなるアデノウイルスである。
【０１００】
別の実施形態では、アデノウイルスゲノムは、アデノウイルスの感染力を高めるため、またはそれを腫瘍細胞に存在する受容体に標的化するためのキャプシド改変をさらに含んでなる。好ましくは、キャプシドの改変は、アデノウイルスファイバータンパク質のＨ１ループへのＲＧＤモチーフの挿入である。別の実施形態では、アデノウイルスゲノムは、ある所与の血清型に由来し、そのゲノムのフラグメントまたは一部が別の血清型に由来のゲノムの相同部分により置換されたものを含むキメラアデノウイルスゲノムである。好ましくは、前記キメラアデノウイルスは、血清型５に由来し、ファイバー遺伝子の一部が別の血清型、好ましくは、ヒトアデノウイルス３またはヒトアデノウイルス３５に由来の相同部分で置換されたものを含むヒトアデノウイルスである。好ましい実施形態では、キャプシドの改変は、ファイバー遺伝子の一部を異なるアデノウイルス血清型由来の相同部分で置換することによるキメラアデノウイルスの形成である。
【０１０１】
別の実施形態では、アデノウイルスゲノムは、前記ゲノムに挿入されたさらなる遺伝子を含んでなる。１つの実施形態では、前記遺伝子は、遺伝子治療またはワクチン接種において使用される。好ましくは、前記遺伝子は、癌遺伝子治療において使用される遺伝子であり、より好ましくは、プロドラッグ活性化遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、抗腫瘍干渉ＲＮＡをコードする遺伝子、および免疫刺激性遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子である。
【０１０２】
本発明の組成物
本発明の組換えアデノウイルスは、医薬組成物を作製するために使用することができる。よって、本発明の別の態様は、治療上有効な量の本発明による組換えアデノウイルスを薬学上許容可能な担体とともに含んでなる医薬組成物である。
【０１０３】
本発明において使用される場合、「医薬組成物」という表現は、細胞、細胞群、器官、組織または生物に所定用量の１または複数の治療上有用な薬剤を投与するために適合された処方物に関する。
【０１０４】
組換えアデノウイルスは、有効量で投与される。「治療上有効な量」は、治療効果をもたらし得る、当業者が常法により決定できる量として理解される。有効量は処置する特定の病態、処置する対象の年齢および健康状態、病態の重篤度、処置の期間、同時療法または併用療法（ある場合）の性質、特定の投与経路などの医師の知識および専門技術の範囲内の因子によって異なる。使用最大用量、すなわち、健全な医学的判断に従う最高安全用量が一般に好ましい。例えば、対象が腫瘍を有する場合、有効量は腫瘍体積または負荷量（例えば、腫瘍のイメージングにより決定される）を低減する量であり得る。有効量はまた、血中または他の体液または組織（例えば、生検）中の癌細胞の存在および／または頻度によって評価してもよい。腫瘍が組織または器官の正常機能に影響を及ぼす場合、有効量は組織または器官の正常機能を測定することにより評価してもよい。当業者は、用量がまたGoodman and Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition (1996), Appendix II, pp. 1707-1711 and from Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Tenth Edition (2001), Appendix II, pp. 475-493からの指針を用いて決定可能であることを認識するであろう。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、用語「薬学上許容可能な担体」は、薬理学的／毒理学的観点から患者に許容され、かつ、組成物、処方物、安定性、患者忍容性およびバイオアベイラビリティに関して物理的／化学的観点から製造している製薬化学者に許容されるいずれのタイプの非毒性の不活性固体、半固体または液体増量剤、希釈剤、封入剤または調剤補助剤も意味する。Remington's Pharmaceutical Sciences. Ed. by Gennaro, Mack Publishing, Easton, Pa., 1995は、処方医薬組成物において使用される種々の担体およびその製造のための公知技術を開示している。薬学上許容可能な担体として働き得る材料のいくつかの例としては、限定されるものではないが、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖類；コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン類；セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのその誘導体；粉末トラガカントガム；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオ脂および坐薬ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油などの油類；プロピレングリコールなどのグリコール類；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；ＴＷＥＥＮ（商標）８０などの洗剤；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱性物質除去水；等張性生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；およびリン酸緩衝溶液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性適合滑沢剤、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味および芳香剤、保存剤および酸化防止剤もまた、処方者の判断に従って組成物中に存在してもよい。濾過または他の最終滅菌法が実現可能でなければ、それらの処方物は無菌条件下で製造することができる。
【０１０６】
本発明の医薬組成物は、経口経路および非経口経路を含む当技術分野で公知の手段により患者に投与することができる。このような実施形態によれば、本発明の組成物は、注射（例えば、静脈内、皮下または筋肉内、腹腔内注射）によって投与され得る。特定の実施形態では、本発明の組換えアデノウイルスは、それを必要とする対象に、例えば、ＩＶ注入または注射により全身投与される。注射用製剤、例えば、無菌注射用水性または油性懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤および沈殿防止剤を用いて既知の技術に従って処方され得る。無菌注射用製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液としてなど、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌注射溶液、懸濁液、またはエマルションであってもよい。使用できる許容可能なビヒクルおよび溶媒としては、水、リンゲル溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌硬化油も溶媒または懸濁媒として従来使用されている。この目的で、合成モノまたはジグリセリドを含む、いずれの銘柄の硬化油も使用可能である。加えて、オレイン酸などの脂肪酸も注射剤の調製に使用される。一実施形態では、組換えアデノウイルスは、１％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（商標）８０を含んでなる担体流体中に懸濁される。注射処方物は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過により、または使用前に無菌水またはその他の無菌注射媒体に溶解または分散させることができる無菌固体組成物の形態で殺菌剤を配合することにより滅菌することができる。
【０１０７】
本組成物は、組換えアデノウイルスを薬剤単独としてまたは別の治療薬と組み合わせて含んでなり得る。
【０１０８】
好ましい実施形態では、組成物は、腫瘍溶解性アデノウイルスまたはアデノウイルスのゲノムに挿入された癌遺伝子治療において使用される１以上の遺伝子を含んでなるアデノウイルスを含んでなる。この特定の場合では、本組成物は、このアデノウイルスを、腫瘍に対する薬剤単独として、または化学療法薬などの別の治療薬または治療遺伝子が挿入されたベクターと組み合わせて含んでなり得る。
【０１０９】
本発明のアデノウイルスの治療的使用
遺伝子治療の分野およびワクチン接種の分野における複製欠陥アデノウイルスおよび複製可能アデノウイルスの使用には幅広い経験が存在する。
【０１１０】
さらなる態様において、本発明は、医薬において使用するための本発明の組換えアデノウイルスまたは本発明による医薬組成物に関する。本発明のアデノウイルスは、血流中へのこのようなアデノウイルスの投与を必要とするいずれの種類の疾患を治療するようにも設計することができる。
【０１１１】
本発明者らはまた、本発明のアデノウイルスは癌の治療に特に有用であることも示した。
【０１１２】
別の態様では、本発明は、哺乳動物における癌の予防および／または治療において使用するための本発明の組換えアデノウイルスまたは本発明による医薬組成物に関し、前記アデノウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルスまたはアデノウイルスのゲノムに挿入された癌遺伝子治療において使用される１以上の遺伝子を含んでなるアデノウイルスである。
【０１１３】
あるいは、本発明は、哺乳動物における癌の予防および／または治療のための薬剤の製造のための本発明の組換えアデノウイルスまたは本発明による医薬組成物の使用に関し、前記アデノウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルスまたはアデノウイルスのゲノムに挿入された癌遺伝子治療において使用される１以上の遺伝子を含んでなるアデノウイルスである。
【０１１４】
あるいは、本発明は、哺乳動物における癌の予防および／または治療のための方法であって、前記哺乳動物に本発明の組換えアデノウイルスまたは本発明による医薬組成物を投与することを含んでなる方法に関し、前記アデノウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルスまたはアデノウイルスのゲノムに挿入された癌遺伝子治療において使用される１以上の遺伝子を含んでなるアデノウイルスである。
【０１１５】
用語「予防」とは、本明細書で使用する場合、アデノウイルスが疾病の初期または早期段階（すなわち、腫瘍の前悪性段階）において、またはその発症を予防するためにも投与される予防または予防方法を意味する。
【０１１６】
アデノウイルスベクターは、病原体のタンパク質に対して免疫を惹起するワクチンを作製するために慣用されている。例えば、組換えアデノウイルスワクチンは、とりわけ、ＨＩＶ、狂犬病ウイルス、デング熱ウイルス、エボラウイルス、サーズコロナウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス２ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルス、クルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)および熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)に対して公的に記載されている。
【０１１７】
別の態様では、本発明は、哺乳動物における感染性疾患の予防において使用するための本発明の組換えアデノウイルスまたは本発明による医薬組成物に関する。
【０１１８】
あるいは、本発明は、哺乳動物における感染性疾患の予防のための薬剤、好ましくは、ワクチンの製造のための本発明の組換えアデノウイルスまたは本発明による医薬組成物の使用に関する。
【０１１９】
あるいは、本発明は、前記哺乳動物に本発明の組換えアデノウイルスまたは本発明による医薬組成物を投与することを含んでなる哺乳動物における感染性疾患の予防のための方法に関する。
【０１２０】
「感染性疾患」または「感染」という表現は、本明細書で使用する場合、ウイルス、ウイロイドおよびプリオンなどの感染因子または病原因子；細菌などの微生物；線虫などの寄生虫（線虫および蟯虫を含む）、マダニ、ダニ、ノミおよびシラミなどの節足動物；真菌および原虫による宿主生物も侵害により引き起こされる疾患を意味する。
【０１２１】
本発明の組換えアデノウイルスは、いずれの種類の感染性疾患の予防用ワクチンの製造にも好適である。
【０１２２】
好ましい実施形態では、感染性疾患は、ＨＩＶ、狂犬病ウイルス、デング熱ウイルス、エボラウイルス、サーズコロナウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス２ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、インフルエンザウイルス、クルーズトリパノソーマおよび熱帯熱マラリア原虫からなる群から選択される病原因子により引き起こされる。
【０１２３】
用語「処置する」または「処置」は、その目的が、臨床徴候が現れる前または現れた後に疾病の進行を制御することである治療処置を意味する。疾病の進行の制御は、限定されるものではないが、症状の軽減、疾病の持続期間の短縮、病状の安定化（具体的には、さらなる障害の回避）、疾病の進行の遅延、病状の改善および寛解（部分的および完全の両方）を含む有益なまたは望まれる臨床結果として理解される。疾病の進行の制御はまた、その処置が適用されなかった場合に予想される生存に比べた場合の生存の延長も含む。
【０１２４】
例えば、癌を治療する場合、応答は、以下の効果：（１）（ｉ）血管新生の緩徐化（ｉｉ）、阻害および（ｉｉ）完全な成長停止を含む、腫瘍成長のある程度の阻害；（２）腫瘍細胞の数の低減；（３）腫瘍サイズの維持；（４）腫瘍サイズの低減；（５）末梢器官への腫瘍細胞浸潤の（ｉ）低減、（ｉｉ）緩徐化または（ｉｉｉ）完全な防止を含む阻害；（６）転移の（ｉ）低減、（ｉｉ）緩徐化または（ｉｉｉ）完全な防止を含む阻害；（７）（ｉ）腫瘍サイズの維持、（ｉｉ）腫瘍サイズの低減、（ｉｉｉ）腫瘍成長の緩徐化、（ｉｖ）浸潤の低減、緩徐化または防止をもたらし得る抗腫瘍免疫応答の増強；および／または（８）障害に関連する１以上の症状の重篤度または数の、ある程度の軽減、のうちの１以上を観察することによりモニタリングすることができる。
【０１２５】
用語「癌」は、制御されない細胞分裂（または生存またはアポトーシス耐性の増大）、前記細胞の他の隣接組織への侵入能（浸潤）またはリンパ管および血管を介した、細胞が本来存在しない身体の他の領域への拡散（転移）を特徴とする疾患を指す。本明細書で使用する場合、癌という用語は、限定されるものではないが、以下のタイプの癌：乳癌；胆道  癌；膀胱癌；膠芽腫および髄芽細胞腫を含む脳癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；急性リンパ性および骨髄性白血病を含む造血系新生物；Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫；有毛細胞白血病；慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫；ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫；ボーエン病およびパジェット病を含む上皮内新生物；肝臓癌；肺癌；ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽腫；扁平上皮癌を含む口腔癌；上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉細胞から生じるものを含む卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および骨肉腫を含む肉腫；黒色腫、メルケル細胞癌、カポジ肉腫、基底細胞癌、および扁平上皮細胞癌を含む皮膚癌；精上皮腫、非精上皮腫（奇形腫、絨毛癌）、間質腫瘍、および生殖細胞腫瘍などの胚性腫瘍を含む精巣癌；甲状腺腺癌および髄質癌を含む甲状腺癌；および腺癌およびビルムス腫瘍を含む腎臓癌を含む。１つの実施形態では、癌は乳癌である。別の実施形態では、癌は黒色腫である。他の癌も当業者に知られている。
【０１２６】
本発明のアデノウイルスは、哺乳動物に投与することができる。用語「哺乳動物」は、本明細書で使用する場合、限定されるものではないが、家庭内および農用動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたは齧歯類）、霊長類、およびヒトを含むいずれの哺乳動物種も意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。本発明に関して、哺乳動物は癌に罹患しているか、または癌に罹患するリスクがある。
【０１２７】
動物モデルまたは患者において腫瘍を治療するために、アデノウイルスは腫瘍内もしくは腔内注射を介して局所または領域投与により、または血流中への注射により全身に送達することができる。ウイルスはまた、腫瘍の血管に投与することもできる。本発明の組換えアデノウイルスは血中に存在する中和抗体から保護されるので、全身投与に特に好適である。よって、好ましい実施形態では、本発明のアデノウイルスは全身投与される。「全身投与する」という表現は、本明細書で使用する場合、体全体が影響を受けるような循環系への投与経路を意味する。好ましくは、投与は、非経口（一般に、動脈内または静脈内注射、注入または移植）である。
【０１２８】
本発明のアデノウイルスは、理想的には、血清アルブミンと結合してしまう前に投与し、それは処置する対象の血中のアルブミンと結合する。しかしながら、播種性腫瘍結節に達する可能性を引き上げるために、アデノウイルスの血中残存率を高めるには、アデノウイルスが投与される前にキャプシドをアルブミンでコーティングすることができる。
【０１２９】
本発明のアデノウイルスによる腫瘍の処置は、腫瘍溶解性アデノウイルスの分野で従前に記載したように、化学療法または放射線療法などの他の治療モダリティーと組み合わせて使用することができる。
【０１３０】
癌の処置のために本発明に記載のアデノウイルスを使用するためのプロトコールは、アデノウイルスを用いるウイルス療法および遺伝子治療の分野において使用されるものと同じ手順である。
【０１３１】
本発明また以下を対象とする。
［１］．ヘキソンタンパク質とアルブミン結合部分を含んでなる融合タンパク質の発現を生じさせる、ヘキソンタンパク質の超可変領域（ＨＶＲ）のコード領域に挿入されたアルブミン結合部分をコードする配列を含んでなり、前記アルブミン結合部分は、前記ヘキソンタンパク質がアデノウイルスキャプシドに組み立てられる際にヘキソンタンパク質の外側表面に位置することを特徴とする、アデノウイルスゲノム。
［２］．ゲノムがヒトアデノウイルス由来である、［１］に記載のアデノウイルスゲノム。
［３］．ヒトアデノウイルスがヒトアデノウイルス血清型１〜５７からなる群から選択される、［２］に記載のアデノウイルスゲノム。
［４］．ヒトアデノウイルスがヒトアデノウイルス血清型５である、［３］に記載のアデノウイルスゲノム。
［５］．前記アルブミン結合部分が、連鎖球菌Ｇタンパク質由来のアルブミン結合ドメイン、ペプトストレプトコッカス・マグヌスタンパク質ＰＡＢ由来のアルブミン結合ドメイン、コア配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号９）を有するアルブミン結合ペプチドおよびそれらの機能的に等価な変異体から選択される、［１］、［２］、［３］または［４］のいずれか一項に記載のアデノウイルスゲノム。
［６］．前記アルブミン結合部分が連鎖球菌Ｇタンパク質由来のアルブミン結合ドメイン３である、［５］に記載のアデノウイルスゲノム。
［７］．連鎖球菌Ｇタンパク質由来のアルブミン結合ドメイン３の配列が配列番号１である、［６］に記載のアデノウイルスゲノム。
［８］．ヘキソンタンパク質のＨＶＲがＨＶＲ１、ＨＶＲ２、ＨＶＲ３、ＨＶＲ４、ＨＶＲ５、ＨＶＲ６およびＨＶＲ７からなる群から選択される、［１］、［２］、［３］、［４］、［５］、［６］または［７］に記載のアデノウイルスゲノム。
［９］．ヘキソンタンパク質のＨＶＲがＨＶＲ１である、［８］に記載のアデノウイルスゲノム。
［１０］．生成する融合タンパク質がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ４８７８２．１を有するヘキソンタンパク質のナンバリングに従ってヘキソンタンパク質のＤ１５０アミノ酸の後にアルブミン結合部分を含むように、アルブミン結合部分をコードする配列が挿入されている、［９］に記載のアデノウイルスゲノム。
［１１］．ヘキソンタンパク質のＨＶＲがＨＶＲ５である、［８］に記載のアデノウイルスゲノム。
［１２］．生成する融合タンパク質がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ４８７８２．１を有するヘキソンタンパク質のナンバリングに従ってヘキソンタンパク質のＡ２７４アミノ酸の後にアルブミン結合部分を含むように、アルブミン結合部分をコードする配列が挿入されている、［１１］に記載のアデノウイルスゲノム。
［１３］．アルブミン結合部分のＮ末端および／またはＣ末端がリンカー配列によりヘキソンタンパク質に接続されている、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載のアデノウイルスゲノム。
［１４］．前記リンカー配列が配列ＧＳＧＳ（配列番号２）を含んでなる、［１３］に記載のアデノウイルスゲノム。
［１５］．アデノウイルスゲノムが組織特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターをさらに含んでなる、［１］〜［１４］のいずれか一項に記載のアデノウイルスゲノム。
［１６］．前記組織特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターが、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、およびＥ４からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を制御するためのプロモーター配列である、［１５］に記載のアデノウイルスゲノム。
［１７］．前記プロモーターがＥ２Ｆプロモーター、テロメラーゼｈＴＥＲＴプロモーター、チロシナーゼプロモーター、前立腺特異的抗原プロモーター、αフェトタンパク質プロモーター、およびＣＯＸ−２プロモーターからなる群から選択される、［１６］に記載のアデノウイルスゲノム。
［１８］．アデノウイルスが腫瘍溶解性アデノウイルスである、［１］〜［１７］のいずれか一項に記載のアデノウイルスゲノム。
［１９］．アデノウイルスゲノムが腫瘍における選択的複製を達成するためにＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ４、およびＶＡ−ＲＮＡからなる群から選択される１以上の遺伝子に突然変異をさらに含んでなる、［１８］に記載のアデノウイルスゲノム。
［２０］．アデノウイルスゲノムがアデノウイルスの感染力を高めるため、またはそれを腫瘍細胞に存在する受容体に標的化するためのキャプシド改変をさらに含んでなる、［１］〜［１９］のいずれか一項に記載のアデノウイルスゲノム。
［２１］．キャプシドの改変がアデノウイルスファイバータンパク質のＨ１ループへのＲＧＤモチーフの挿入である、［２０］に記載のアデノウイルスゲノム。
［２２］．アデノウイルスゲノムが前記ゲノムに挿入された１以上のさらなる遺伝子を含んでなる、［１］〜［２１］のいずれか一項に記載のアデノウイルスゲノム。
［２３］．前記さらなる遺伝子が遺伝子治療またはワクチン接種において使用される１以上の非アデノウイルス遺伝子である、［２２］に記載のアデノウイルスゲノム。
［２４］．前記遺伝子が癌遺伝子治療において使用される遺伝子である、［２３］に記載のアデノウイルスゲノム。
［２５］．前記癌遺伝子治療において使用される遺伝子が、プロドラッグ活性化遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、抗腫瘍干渉ＲＮＡをコードする遺伝子および免疫刺激性遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子である、［２４］に記載のアデノウイルスゲノム。
［２６］．［１］〜［２５］のいずれか一項に記載のアデノウイルスゲノムを有する組換えアデノウイルス。
［２７］．治療上有効な量の［２６］に記載の組換えアデノウイルスを薬学上許容可能な担体とともに含んでなる医薬組成物。
［２８］．医薬で使用するための［２６］に記載の組換えアデノウイルスまたは［２７］に記載の医薬組成物。
［２９］．アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスまたは［２４］もしくは［２５］に記載のアデノウイルスゲノムを有するアデノウイルスである、哺乳動物において癌の予防および／または治療で使用するための、［２６］に記載の組換えアデノウイルスまたは［２７］に記載の医薬組成物。
［３０］．哺乳動物がヒトである、［２８］または［２９］に記載の使用のための組換えアデノウイルス。
［３１］．アデノウイルスが全身投与される、［２８］、［２９］または［３０］に記載の使用のための組換えアデノウイルス。
【０１３２】
以下の実施例は単に例として示され、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１３３】
材料および方法
細胞株
ＨＥＫ２９３（ヒト胚腎臓）、Ａ５４９（ヒト肺腺癌）、Ｓｋ−ｍｅｌ２８（黒色腫）、およびＭＣＦ７（ヒト乳腺癌）細胞をｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ）から入手した。ＭＣＦ７を除く総ての腫瘍細胞株を、３７℃、５％ＣＯ２にて、５％ウシ胎児血清を添加したダルベッコの改変イーグル培地で維持した。ＭＣＦ７細胞は、１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地で維持した。総ての細胞株をマイコプラズマの存在に関して定期的に検査した。
【０１３４】
ウイルス構築
ＩＣＯＶＩＲ１５腫瘍溶解性アデノウイルスは従前に記載されている(Rojas JJ, et al. Minimal RB-responsive E1A promoter modification to attain potency, selectivity, and transgene-arming capacity in oncolytic adenoviruses. Mol Ther 2010; 18 (11):1960-71)。ＡｄＧＬは、ｐＥＧＦＰＬｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＥＧＦＰ−ルシフェラーゼ融合タンパク質カセットを発現するＥ１欠失第一世代ベクターである。Ｅ１領域を置換するＣＭＶプロモーター−ＥＧＦＰＬｕｃ−ポリＡカセットの挿入を、陽性−陰性選択を用いる細菌での相同組換えに基づくStanton et al. (Stanton RJ, et al. Re-engineering adenovirus vector systems to enable high-throughput analyses of gene function. Biotechniques 2008; 45(6):659-62, 664-8)から適合させたリコンビニアリングプロトコールに従って行った。Ｅ１相同領域により挟み込まれたＣＭＶ−ＧＦＰＬｕｃカセットを用いて、Ｅ１欠失アデノウイルスベクターを構築するために慣用されるｐＡｄ５−ＣＶ５−Ｅ３＋の陽性−陰性選択マーカーを置換した。ＩＣＯＶＩＲ１５をＡ５４９細胞で増殖させ、複製欠陥ＡｄＧＬをＨＥＫ２９３細胞で増殖させた。
【０１３５】
ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤおよびＡｄＧＬ−ＡＢＤは、アデノウイルスヘキソンの超可変領域１（ＨＶＲ１）内のＤ１５０アミノ酸の後に２つのリンカー（ＧＳＧＳ）（配列番号２）で挟み込まれたアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を挿入することにより構築した。ＨＶＲ１（ＡＢＤ−ＨＶＲ１）に挿入されたＡＢＤを有する完全改変型のヘキソンのヌクレオチド配列は配列番号３である。総ての改変を、ＲｐｓＬ−Ｎｅｏカセットによる陽性−陰性選択を用いる細菌での相同組換えに基づくStanton et al. (Stanton RJ, et al. Re-engineering adenovirus vector systems to enable high-throughput analyses of gene function. Biotechniques 2008; 45(6):659-62, 664-8) から適合させたリコンビニアリングプロトコールに従って行った。
【０１３６】
まず、ｒｐｓＬＮｅｏカセットを、ｐＪｅｔ１．２／平滑(Genscript, Wheelock House, Hong Kong)にクローニングされたｒｐｓＬｎｅｏ陽性−陰性選択マーカーを含有するプラスミドｐＪｅｔＲｐｓＬＮｅｏから、オリゴヌクレオチドＨＶＲ１ｒｐｓＬＦ  ５’−ＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＡＧＧＧＴＧＣＣＣＣＡＡＡＴＣＣＴＴＧＣＧＡＡＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣ−３’（配列番号１２）およびＨＶＲ１ｒｐｓＬＲ  ５’−ＧＴＡＡＴＡＴＴＴＡＴＡＣＣＡＧＡＡＴＡＡＧＧＣＧＣＣＴＧＣＣＣＡＡＡＴＡＣＧＴＧＡＧＴＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧ−３’（配列番号１３）を用いてＰＣＲにより増幅した。このカセットをｐＡｄＺＩＣＯＶＩＲ１５およびｐＡｄＺＧＬプラスミドのＨＶＲ１に挿入してｐＡｄＺＩＣＯＶＩＲ１５−Ｈ１−ｒｐｓＬＮｅｏおよびｐＡｄＺＧＬ−Ｈ１−ｒｐｓＬＮｅｏを作出した。次に、リンカー−ＡＢＤ−リンカーフラグメントを、オーバーラッピングオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲにより作出した。
【０１３７】
【表２】
0006639412.tif 000003
【０１３８】
このフラグメントを用いて両プラスミドのｒｐｓＬＮｅｏカセットを置換し、ｐＡｄＺＩＣＯＶＩＲ１５−Ｈ１−ＡＢＤおよびｐＡｄＺＧＬ−Ｈ１−ＡＢＤを作出した。
【０１３９】
また、ＡＢＤをＡｄＧＬの超可変領域５のＡ２７４アミノ酸の後に挿入した。ＨＶＲ５に挿入されたＡＢＤ（ＡＢＤ−ＨＶＲ５）を有する完全改変型のヘキソンのヌクレオチド配列は配列番号４である。この目的で、ｒｐｓＬＮｅｏカセットを、ｐＪｅｔＲｐｓＬＮｅｏから、次のようなオリゴヌクレオチドＨ５ｒｐｓＬＦおよびＨ５ｒｐｓＬＲを用いてＰＣＲにより増幅し、ｐＡｄＺＧＬプラスミドに挿入し、ｐＡｄＺＧＬ−Ｈ５−ｒｐｓＬＮｅｏを作出した。
【０１４０】
【表３】
0006639412.tif 000004
【０１４１】
第２の組換え工程で、リンカー−ＡＢＤ−リンカーフラグメントを、ｐＡｄＺＩＣＯＶＩＲ１５−Ｈ１−ＡＢＤから、次のようなオリゴヌクレオチドＡＢＤＨ５ＦおよびＡＢＤＨ５Ｒを用いてＰＣＲにより増幅した。
【表４】
0006639412.tif 000005
【０１４２】
このフラグメントを用いてｐＡｄＺＧＬ−Ｈ５−ｒｐｓＬＮｅｏのｒｐｓＬＮｅｏを置換し、ｐＡｄＺＧＬ−Ｈ５−ＡＢＤを作出した。
【０１４３】
加えて、このドメインは、ヘキソンタンパク質のいずれの超可変領域にも挿入することができた。そうするためには、ｒｐｓＬＮｅｏを所望の領域に挿入した後、相同性アームを有する、ＰＣＲにより作出されたＡＢＤフラグメントで置換して特定の超可変ループ内で組み換えを行わなければならない。
【０１４４】
ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤ（ＨＶＲ１内のＡＢＤ）、ＡｄＧＬ−ＡＢＤ（ＨＶＲ１内のＡＢＤ）、およびＡｄＧＬ−Ｈ５−ＡＢＤ（ＨＶＲ５内のＡＢＤ）は、作出されたプラスミドの、ＨＥＫ２９３細胞におけるリン酸カルシウム標準プロトコールを用いたトランスフェクションにより作出された。腫瘍溶解性アデノウイルスＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤをプラーク精製し、Ａ５４９細胞でさらに増幅させた。アデノウイルスベクターＡｄＧＬ−ＡＢＤをプラーク精製し、ＨＥＫ２９３細胞でさらに増幅させた。両ウイルスを、標準技術に従う塩化セシウム二重勾配を用いて精製した。
【０１４５】
ウイルスとヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とのインキュベーションを、室温で１時間、１ｍｇ／ｍｌのＨＳＡを含有する培地を用いて行った。
【０１４６】
ウイルス生産アッセイ
Ａ５４９細胞に、８０〜１００％の感染が得られるように細胞当たり８００ウイルス粒子（ｖｐ）の各ウイルスを感染させた。感染４時間後に細胞をＰＢＳで３回洗浄し、新鮮培地でインキュベートした。示された時点で細胞を採取し、３回凍結−解凍して細胞抽出液を得た。ウイルス力価は、ＨＥＫ２９３細胞で、抗ヘキソン染色に基づく方法(Cascallo M, et al. Systemic toxicity-efficacy profile of ICOVIR-5, a potent and selective oncolytic adenovirus based on the pRB pathway. Mol Ther 2007; 15:1607-15)により得た。
【０１４７】
インビトロ細胞傷害性アッセイ
細胞傷害性アッセイは、９６ウェルプレートに１ウェル当たり１０，０００のＨＥＫ２９３細胞、３０，０００のＡ５４９細胞、１０，０００のＳｋ−ｍｅｌ２８細胞および２０，０００のＭＣＦ−７細胞を播種することによって行った。感染前に、ウイルスを室温で１時間、培地または１ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する培地のいずれかでインキュベートした。細胞に、通常培地またはアルブミン含有培地中、１０，０００ｖｐ／細胞で始まる連続希釈系（ＨＥＫ２９３、Ｓｋ−ｍｅｌ２８およびＭＣＦ−７細胞では１／３、Ａ５４９細胞では１／５）を感染させた。感染後７日目に、プレートをＰＢＳで洗浄し、全タンパク質内容物に関して染色し（ビシンコニン酸アッセイ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ロックフォード、ＩＬ）、吸光度を定量した。５０％の増殖阻害をもたらすために必要とされる細胞当たりのｖｐ（ＩＣ５０）を用量反応曲線から、適合したヒル式を用いた標準非線形回帰（ＧｒａＦｉｔ；Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ホーリー、ＵＫ）により決定した。
【０１４８】
ヒトおよびマウス血清アルブミンとの結合の検出
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）との結合の検出は、Konig and Skerra (Konig T, Skerra A. Use of an albumin-binding domain for the selective immobilisation of recombinant capture antibody fragments on ELISA plates. J Immunol Methods 1998; 218:73-83)から適合させたＥＬＩＳＡプロトコールに従って行った。室温で１時間インキュベーションを行った後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ２００μｌで３回の洗浄工程を行い、これはまたウイルスおよび抗体を希釈するために使用したバッファーでもあった。
【０１４９】
９６ウェルプレートを、ＰＢＳで希釈した２ｍｇ／にて、ＨＳＡまたはＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）のいずれか２００μｌでコーティングした。プラスチック表面に残った結合部位を、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで希釈した２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで遮断した。次の工程で、精製したウイルスを５０μｌの容量で加えた。結合を検出するために３種類の異なる量のウイルスタンパク質（２５、２．５、および０．２５ｎｇのウイルスタンパク質）を試験した（図５Ａ）。精製ウイルスサンプルのウイルスタンパク質濃度は、Ｂｉｏ  Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて定量した。ウイルスの検出は、２Ｈｘ−２ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ−８１１７（商標））上清からの抗ヘキソン抗体（１／５希釈でウェル当たり５０μｌ）およびセイヨウワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたポリクローナルヤギ抗マウス（１／２０００希釈でウェル当たり５０μｌ）を用いて行った。ウェル当たり１００μｌの新しく混合した３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ基質溶液を加えてウェルを染色し、振盪しながら２５分インキュベートした。１００μｌの２Ｎ硫酸を加えて反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１５０】
同じ試験を行い、９６ウェルプレートを、ＰＢＳで希釈した２ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、ＨＳＡまたはＭＳＡ（Ｓｉｇｍａ）のいずれか２００μｌでコーティングし、結合を検出するために２５ｎｇのウイルスタンパク質を試験した。ウイルスを含まない対照ｍｏｃｋ群  を含めた（図５Ｂ）。
【０１５１】
インビトロ抗体により媒介される中和アッセイ
抗体により媒介される中和を感染（ルシフェラーゼ−ＧＦＰリポーターアデノウイルスの形質導入）および複製（複製可能アデノウイルスにより媒介される細胞傷害性）のレベルで分析した。市販の抗体Ａｂ６９８２（抗Ａｄ５ウサギポリクローナル、Ａｂｃａｍ）を中和抗体として使用した。感染力分析では、９６ウェルプレートにて異なるアデノウイルス（ＡｄＧＬまたはＡｄＧＬ−ＡＢＤ）を含有する培地で、１／１００希釈の抗体原液から開始し、抗体の１／６連続希釈を行った。
【０１５２】
室温で１時間のインキュベーション後、ウェル当たり１Ｅ５  ＨＥＫ２９３細胞または３Ｅ４  Ｓｋ−ｍｅｌ２８細胞を、所望の感染多重度（ＨＥＫ２９３細胞では、０．５ＴＵ／細胞または１０ｖｐ／細胞、Ｓｋ−ｍｅｌ２８細胞では、４０ｖｐ／細胞）が得られるように加えた。感染２４時間後、培地を除去し、細胞を、５０μｌのＣｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、Ｗｉ）を加えて溶解し、１回、凍結−解凍した。溶解液を４℃、１３，０００ｇで５分間遠心分離し、上清のルシフェラーゼ酵素活性を、ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｊｕｎｉｏｒ、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ、ＫＧ、ドイツ）にて測定した。
【０１５３】
複製の分析については、抗体原液の１／１００希釈から開始し、抗体の１／２連続希釈を行った。この連続希釈はＩＣＯＶＩＲ１５またはＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤを含有する培地を用いて行った。室温で抗体とともにインキュベーション１時間後、ウェル当たり３Ｅ５  Ａ５４９細胞を６００ｖｐ／細胞の感染多重度が得られるように加えた。感染後４日目に、細胞生存率を、上記の「インビトロ細胞傷害性アッセイ」の材料および方法の節に記載したように全タンパク質内容物を染色することにより分析した。
【０１５４】
インビボ血液クリアランス
インビボ試験はＩＣＯ−ＩＤＩＢＥＬＬ施設（バルセロナ、スペイン）ＡＡＡＬＡＣユニット１１５５で行い、ＩＤＩＢＥＬＬの動物実験倫倫理委員会により承認された。Ｂａｌｂ／Ｃ  ｎｕ／ｎｕ雌マウスにＩＣＯＶＩＲ１５とＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤ（１：１比）の混合物を、ＰＢＳ中１０ｍｌ／ｋｇの容量で総用量５×１０１０ｖｐとして静注した（ｎ＝５）。投与後５分、１５分、１時間、４時間、および２４時間に尾静脈から血液サンプルを採取した。血液サンプルを４℃、５０００ｇで５分間遠心分離して細胞画分を分離し、血清を回収した。血清サンプルを５４℃で４５分間、その後９０℃で１０分間、プロテイナーゼＫおよびＳＤＳで消化し、キャプシドのタンパク質分解を行い、ウイルスＤＮＡを放出させた。消化したサンプルをＰＣＲによりヘキソンＨＶＲ１フランキングオリゴヌクレオチドＡｄ１９１２１Ｆ  ５’−ＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＴＴＣＣＡＣＧＴＡ−３’（配列番号２５）およびＡｄ１９３００Ｒ  ５’−ＧＣＴＣＧＴＣＴＡＣＴＴＣＧＴＣＴＴＣＧ−３’（配列番号２６）を用いて増幅し、１％アガロースゲルでの電気泳動により分析した。ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤはＨＶＲ１の中央にＡＢＤの挿入を有するので、ＰＣＲ産物のサイズはより長くなり、ＩＣＯＶＩＲ１５からの１９９ｂｐに対して、ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤから予想されるＰＣＲ産物は３６１ｂｐである。
【０１５５】
インビボ抗腫瘍有効性
６週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの側腹部への１×１０７Ｓｋ−ｍｅｌ２８細胞の注射により、皮下黒色腫異種移植腫瘍を確立した。腫瘍が１５０ｍｍ３に達した際（実験０日）に、マウスを無作為化し（１群当たりｎ＝１０〜１２個体）、尾静脈からＰＢＳ中１０ｍｌ／ｋｇの容量で、ＰＢＳまたは５×１０１０ｖｐのＩＣＯＶＩＲ１５またはＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤの単回静脈内投与を行った。腫瘍サイズおよびマウスの状態を週に３回モニタリングした。腫瘍体積はデジタルカリパスで測定し、式Ｖ（ｍｍ３）＝π／６×Ｗ２×Ｌ（式中、ＷおよびＬはそれぞれ腫瘍の幅および長さである）により定義した。処置群間の腫瘍サイズの違いの統計的有意性は、対応のない両側スチューデントのｔ検定により評価した。
【０１５６】
インビボ形質導入
黒色腫腫瘍は、６週齢雌Ｃ５７ＢＬ６マウス（１群当たりｎ＝４〜６個体）の両側腹部に１×１０６  Ｂ１６−ＣＡＲ細胞を皮下移植して確立した。腫瘍が１００ｍｍ３に達した際に、マウスの腹膜内にＰＢＳ（ナイーブ群）または２×１０１０ｖｐのｈＡｄ５ｗｔ（前免疫群）のいずれかを注射した。免疫誘導７日後、動物にマウス当たり３×１０１０ウイルス粒子の用量でＰＢＳ、ＡｄＧＬ、またはＡｄＧＬ−ＡＢＤの単回静脈内投与を行った。ベクター注射３日後、マウスに２５０μＬのＤ−ルシフェリン（１５ｍｇ／ｍＬ；Ｂｉｏｓｙｎｔｈ、シュタート、スイス）の腹腔内注射を行い、マウスを生物発光イメージング（ＩＶＩＳ）用の肝臓および腫瘍採取のために犠牲にした。臓器をＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＸＲ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ホプキントン、ＭＡ）で画像化し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ｖ４．０ソフトウエアを,用いて発光を定量した。
【０１５７】
結果
ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤの作出および同定
アルブミン結合アデノウイルスを作出するために、連鎖球菌属細菌のＧタンパク質由来のアルブミン結合ドメイン３（配列番号１）をＩＣＯＶＩＲ１５ヘキソンのＨＶＲ１に挿入し、腫瘍溶解性アデノウイルスＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤを作出した（図１および２）。このドメインは、ヘキソン配列に欠失なく、ＨＶＲ１の中央のＤ１５０アミノ酸の後に２つのリンカー（ＧＳＧＳ）（配列番号２）に挟み込まれて挿入された（図１）。
【０１５８】
ウイルス複製に対するＡＢＤ挿入の影響を分析するために、Ａ５４９細胞においてＩＣＯＶＩＲ１５およびＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤの複製速度を比較した。図３に示されるように、両ウイルスの複製の速度が同等であったとしても、ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤの全生産量に減少が見られた。また、インビトロにおけるウイルスの癌細胞死滅能も分析した。細胞傷害性試験は、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９、Ｓｋ−ｍｅｌ２８およびＭＣＦ−７細胞にて、ＨＳＡの存在下または非存在下で行った。ＩＣ５０値は、４つの供試細胞株のうち３つではウイルス間で有意差を示さず、ＭＣＦ−７細胞においてＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤではＩＣＯＶＩＲ１５の３倍のＩＣ５０増が見られ、この細胞株における特定の細胞傷害性欠如が示された（図４）。ＨＳＡの添加は、いずれの場合にも細胞傷害性に影響を及ぼさなかった。
【０１５９】
ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤのＨＳＡおよびＭＳＡへの結合を示すためにＥＬＩＳＡ試験を行った。ウェルをＭＳＡ、ＨＳＡまたはＢＳＡのいずれかでコーティングし（ＡＢＤはＭＳＡおよびＨＳＡに結合するが、ＢＳＡｍには結合しないことに注意）、両ウイルスＩＣＯＶＩＲ１５またはＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤの結合を分析した。ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤをＨＳＡコーティングウェル（図５Ａ）およびＭＳＡコーティングウェル（図５Ｂ）の両方に加えた際に陽性シグナルが得られ、そのシグナルの強度はウイルスの使用量とともに増強した（図５Ａ）。ＨＳＡまたはＭＳＡの代わりにＢＳＡを用いた場合には、ウイルスの添加量にかかわらずシグナルは見られず、このウイルスはヒトおよびマウスアルブミンには結合できるがウシアルブミンには結合できないことが示される。予想されたように、いずれの場合でもＩＣＯＶＩＲ１５ウイルスでは結合は検出されなかった。
【０１６０】
アルブミン結合はインビトロにおいてアデノウイルスを中和抗体から保護する
ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤとヒトアルブミンとの結合が証明されたので、この結合がウイルスを中和抗体（ＮＡｂ）から保護できるかどうかを試験した。このために、ヘキソンにおいてＡＢＤで修飾されたＧＦＰ−ルシフェラーゼ融合タンパク質を発現するアデノウイルスベクター（ＡｄＧＬ−ＡＢＤと呼称）を構築した。ＨＳＡの存在下および非存在下で、市販の中和抗体Ａｂ６９８２（Ａｄ５に対するウサギポリクローナル抗体）の連続希釈系とともにインキュベートした後に、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡｄＧＬ−ＡＢＤの形質導入効率を調べた。図６に示されるように、アルブミンインキュベーションにかかわらず、非改変ＡｄＧＬベクターで同等レベルの形質導入が達成された。対照的に、ＨＳＡはＡｄＧＬ−ＡＢＤを中和から保護した。興味深いことに、ＡｄＧＬ−ＡＢＤは、アルブミンとともにインキュベートしなかった場合でも、非改変ベクターＡｄＧＬよりも中和程度が低く、ＡＢＤによるＨＶＲ１の改変が一部のＮＡｂの結合をすでに除外していたに過ぎないことを示す。
【０１６１】
加えて、中和抗体の存在下でのウイルスの癌細胞死滅能も分析した。この目的で、Ａ５４９細胞に、ＨＳＡの存在下および非存在下で中和抗体Ａｂ６９８２の連続希釈系とともに予めインキュベートしたＩＣＯＶＩＲ１５またはＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤを感染させ、感染４日後に細胞生存率を分析した。ヒトアルブミンの存在下で、両ウイルスは同等の腫瘍細胞死滅能を示し（図７）、ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤでは、おそらく形質導入で見られる中和抗体のある程度の逸脱のために、細胞傷害性の小さな増加が見られたに過ぎなかった（図６）。重要なこととして、ヒトアルブミンを培地に加えた場合、不変のままであったＩＣＯＶＩＲ１５のそれとは対照的に、ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤの細胞傷害性は有意に増強された。
【０１６２】
ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤは血漿半減期の延長を示す
アルブミン結合がアデノウイルスの急速な血液クリアランスを軽減できるかどうかを検討するために、インビボ全身投与後のＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤの薬物動態学を調べた。マウスにＩＣＯＶＩＲ１５とＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤの１：１比の混合物を、マウス当たり５×１０１０ウイルス粒子の総用量で注射し、種々の時点で血液サンプルを採取した。血清サンプル中のヘキソンＨＶＲ１の増幅をＰＣＲにより行った。ＡＢＤの挿入のためＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤでは３６１ｂｐバンドが見られ、一方、ＩＣＯＶＩＲ１５では、バンドのサイズはわずか１９９ｂｐである。ゆえに、各時点でこれらのバンドの相対強度を比較すれば、どのウイルスが血流で長く存続するかを決定することが可能であった。図８は、数種類の比率のＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤ：ＩＣＯＶＩＲ１５（０．２、１、５、１０および５０）、注射前対照、および水陰性対照とともに標準品を含む全サンプルのＰＣＲ反応の電気泳動を示す。注射前対照と注射５分後では等しい強度のバンドが得られた。その時から、ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤに相当するバンドがＩＣＯＶＩＲ１５に相当するバンドより強くなるにつれ、バンド強度のシフトが見て取れる。注射後１時間で、両ウイルスの示差的残存率はＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤに有利であることが明確である。これらのデータは、注射５分後にＩＣＯＶＩＲ１５はＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤよりもはるかに速く血流から排除されることを示し、ＡＢＤ修飾ウイルスの薬物動態の改善を証明する。
【０１６３】
インビボ全身投与後のＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤの抗腫瘍活性
ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤの血漿半減期の延長が示されたところで、これが全身投与後の抗腫瘍有効性の増強に表れたかどうかを試験した。Ｓｋ−ｍｅｌ２８（黒色腫）異種移植腫瘍を担持するマウスに、単回静脈内用量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、マウス当たり５×１０１０ウイルス粒子のＩＣＯＶＩＲ１５またはＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤを注射した。処置後３８日目に、ＰＢＳ処置腫瘍のサイズが大きくなったために動物を犠牲にした。両ウイルスともＰＢＳに比べて腫瘍成長を有意に低減することができた（図９）。しかしながら、ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤ処置は２１日目から処置の終了まで腫瘍成長に統計的低減を示したが、ＩＣＯＶＩＲ１５は３５日目まで、統計的に腫瘍成長の制御ができなかった。３８日目に動物を犠牲にした際、ＩＣＯＶＩＲ１５−ＡＢＤでの２倍の低減に比べ、ＩＣＯＶＩＲ１５が誘導したのは１．４倍の低減であった。
【０１６４】
アルブミン結合はインビボにおいてアデノウイルスを抗ＨＡｄ５前免疫から保護する
免疫応答性のＢ１６−ＣＡＲ黒色腫腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ６マウスに、２×１０１０ウイルス粒子のｈＡｄ５ｗｔまたはＰＢＳ（前免疫群またはナイーブ群）の腹腔内注射で免疫誘導を行った。数日後、マウスにＰＢＳ、マウス当たり３×１０１０ウイルス粒子のＡｄＧＬまたはＡｄＧＬ−ＡＢＤの単回静脈内用量を施した。ベクター注射３日後に、マウスを犠牲にし、インビボ生物発光イメージング（ＩＶＩＳ）のために肝臓および腫瘍を採取した。ナイーブ動物における肝臓および腫瘍形質導入においてベクター間で有意な違いは見られなかった（図１０）。注目すべきは、動物を前免疫した場合、肝臓および腫瘍の形質導入は完全に無効となったことから、非改変ＡｄＧＬベクターは完全な中和を受けた。対照的に、ＡｄＧＬ−ＡＢＤは、肝臓および腫瘍で同等レベルの形質導入を維持することができ、抗ＨＡｄ５前免疫からの保護を示す。
【０１６５】
超可変領域５内へのＡＢＤの挿入
この挿入がヘキソンの他の超可変領域で成し得る化合物どうかを調べるため、ＡｄＧＬ−Ｈ５−ＡＢＤベクターを構築した。ＨＥＫ２９３細胞をｐＡｄＺＧＬ−Ｈ５−ＡＢＤプラスミドでトランスフェクトしてＡｄＧＬ−Ｈ５−ＡＢＤウイルスを作出した。トランスフェクション１週間後に、細胞および上清を採取し、３回の凍結−解凍サイクルにより溶解した。ウイルスを含有する細胞抽出液の力価をＨＥＫ２９３細胞でプラークアッセイにより測定した。希釈率１Ｅ６、１Ｅ７および１Ｅ８に相当するウェルを図１１に示し、そこではウイルス増殖を示すプラークが明らかである。ＨＶＲ５内へのＡＢＤの挿入は、ウイルスゲノムのシーケンシグによって確認した。これはウイルスの生存率に影響を及ぼさずに他の超可変領域内にＡＢＤを挿入できることを示す。
【０１６６】
超可変領域５内へのＡＢＤの挿入はアデノウイルスを中和抗体から保護しない
超可変領域５に挿入されたＡＢＤもアデノウイルスを中和抗体から保護できるかどうかを確認するために、ＨＥＫ２９３細胞およびＳｋ−ｍｅｌ２８細胞において、ＨＳＡを含むまたは含まないＡｂ６９８２  ＮＡｂの連続希釈系とともにインキュベートした後の、ベクターＡｄＧＬ、ＡｄＧＬ−Ｈ１−ＡＢＤおよびＡｄＧＬ−Ｈ５−ＡＢＤの形質導入効率を比較した。図６に見られるように、ＨＳＡを含むインキュベーションでは、両細胞株でＡｄＧＬ−Ｈ１−ＡＢＤへの形質導入に明らかな優位性が示されたが、非改変ベクターＡｄＧＬに対してそれは重要な効果を持たなかった（図１２）。驚くことに、ヒトアルブミンの添加はＡｄＧＬ−Ｈ５−ＡＢＤの形質導入レベルを高めなかった。このことは、ＡＢＤがＨＶＲ１に挿入された場合には機能的であるがＨＶＲ５に挿入された場合には機能的でないことを示す。
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110>  FUNDACIO INSTITUT D'INVESTIGACIO BIOMEDICA DE BELLVITGE (IDIBELL)
INSTITUT CATALA D'ONCOLOGIA (ICO)
<120>  ADENOVIRUS COMPRISING AN ALBUMIN-BINDING MOIETY
<130>  16107101
<150>  EP 14382162
<151>  2014-04-30
<160>  27    
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  36
<212>  PRT
<213>  Streptococcus
<400>  1
Cys Glu Trp Asp Glu Ala Ala Thr Ala Leu Glu Ile Asn Leu Glu Glu 
1               5                   10                  15      
Glu Asp Asp Asp Asn Glu Asp Glu Val Asp Glu Gln Ala Glu Gln Gln 
20                  25                  30          
Lys Thr His Val 
35      
<210>  2
<211>  4
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  linker
<400>  2
Gly Ser Gly Ser 
1               
<210>  3
<211>  3021
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Complete modified adenoviral hexon having ABD inserted in HVR1
<400>  3
atggctaccc cttcgatgat gccgcagtgg tcttacatgc acatctcggg ccaggacgcc       60
tcggagtacc tgagccccgg gctggtgcag tttgcccgcg ccaccgagac gtacttcagc      120
ctgaataaca agtttagaaa ccccacggtg gcgcctacgc acgacgtgac cacagaccgg      180
tcccagcgtt tgacgctgcg gttcatccct gtggaccgtg aggatactgc gtactcgtac      240
aaggcgcggt tcaccctagc tgtgggtgat aaccgtgtgc tggacatggc ttccacgtac      300
tttgacatcc gcggcgtgct ggacaggggc cctactttta agccctactc tggcactgcc      360
tacaacgccc tggctcccaa gggtgcccca aatccttgcg aatgggatga agctgctact      420
gctcttgaaa taaacctaga agaagaggac ggcagcggat ccctggccga ggctaaggtg      480
cttgcgaacc gggaactaga caaatacggt gtttctgatt attacaagaa tttgattaac      540
aatgccaaaa ccgtcgaggg cgtaaaggct ctgatcgacg aaatacttgc ggccctaccc      600
gggtctggta gcgatgacaa cgaagacgaa gtagacgagc aagctgagca gcaaaaaact      660
cacgtatttg ggcaggcgcc ttattctggt ataaatatta caaaggaggg tattcaaata      720
ggtgtcgaag gtcaaacacc taaatatgcc gataaaacat ttcaacctga acctcaaata      780
ggagaatctc agtggtacga aacagaaatt aatcatgcag ctgggagagt cctaaaaaag      840
actaccccaa tgaaaccatg ttacggttca tatgcaaaac ccacaaatga aaatggaggg      900
caaggcattc ttgtaaagca acaaaatgga aagctagaaa gtcaagtgga aatgcaattt      960
ttctcaacta ctgaggcagc cgcaggcaat ggtgataact tgactcctaa agtggtattg     1020
tacagtgaag atgtagatat agaaacccca gacactcata tttcttacat gcccactatt     1080
aaggaaggta actcacgaga actaatgggc caacaatcta tgcccaacag gcctaattac     1140
attgctttta gggacaattt tattggtcta atgtattaca acagcacggg taatatgggt     1200
gttctggcgg gccaagcatc gcagttgaat gctgttgtag atttgcaaga cagaaacaca     1260
gagctttcat accagctttt gcttgattcc attggtgata gaaccaggta cttttctatg     1320
tggaatcagg ctgttgacag ctatgatcca gatgttagaa ttattgaaaa tcatggaact     1380
gaagatgaac ttccaaatta ctgctttcca ctgggaggtg tgattaatac agagactctt     1440
accaaggtaa aacctaaaac aggtcaggaa aatggatggg aaaaagatgc tacagaattt     1500
tcagataaaa atgaaataag agttggaaat aattttgcca tggaaatcaa tctaaatgcc     1560
aacctgtgga gaaatttcct gtactccaac atagcgctgt atttgcccga caagctaaag     1620
tacagtcctt ccaacgtaaa aatttctgat aacccaaaca cctacgacta catgaacaag     1680
cgagtggtgg ctcccgggct agtggactgc tacattaacc ttggagcacg ctggtccctt     1740
gactatatgg acaacgtcaa cccatttaac caccaccgca atgctggcct gcgctaccgc     1800
tcaatgttgc tgggcaatgg tcgctatgtg cccttccaca tccaggtgcc tcagaagttc     1860
tttgccatta aaaacctcct tctcctgccg ggctcataca cctacgagtg gaacttcagg     1920
aaggatgtta acatggttct gcagagctcc ctaggaaatg acctaagggt tgacggagcc     1980
agcattaagt ttgatagcat ttgcctttac gccaccttct tccccatggc ccacaacacc     2040
gcctccacgc ttgaggccat gcttagaaac gacaccaacg accagtcctt taacgactat     2100
ctctccgccg ccaacatgct ctaccctata cccgccaacg ctaccaacgt gcccatatcc     2160
atcccctccc gcaactgggc ggctttccgc ggctgggcct tcacgcgcct taagactaag     2220
gaaaccccat cactgggctc gggctacgac ccttattaca cctactctgg ctctataccc     2280
tacctagatg gaacctttta cctcaaccac acctttaaga aggtggccat tacctttgac     2340
tcttctgtca gctggcctgg caatgaccgc ctgcttaccc ccaacgagtt tgaaattaag     2400
cgctcagttg acggggaggg ttacaacgtt gcccagtgta acatgaccaa agactggttc     2460
ctggtacaaa tgctagctaa ctataacatt ggctaccagg gcttctatat cccagagagc     2520
tacaaggacc gcatgtactc cttctttaga aacttccagc ccatgagccg tcaggtggtg     2580
gatgatacta aatacaagga ctaccaacag gtgggcatcc tacaccaaca caacaactct     2640
ggatttgttg gctaccttgc ccccaccatg cgcgaaggac aggcctaccc tgctaacttc     2700
ccctatccgc ttataggcaa gaccgcagtt gacagcatta cccagaaaaa gtttctttgc     2760
gatcgcaccc tttggcgcat cccattctcc agtaacttta tgtccatggg cgcactcaca     2820
gacctgggcc aaaaccttct ctacgccaac tccgcccacg cgctagacat gacttttgag     2880
gtggatccca tggacgagcc cacccttctt tatgttttgt ttgaagtctt tgacgtggtc     2940
cgtgtgcacc agccgcaccg cggcgtcatc gaaaccgtgt acctgcgcac gcccttctcg     3000
gccggcaacg ccacaacata a                                               3021
<210>  4
<211>  3021
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Complete modified adenoviral hexon having ABD inserted in HVR5
<400>  4
atggctaccc cttcgatgat gccgcagtgg tcttacatgc acatctcggg ccaggacgcc       60
tcggagtacc tgagccccgg gctggtgcag tttgcccgcg ccaccgagac gtacttcagc      120
ctgaataaca agtttagaaa ccccacggtg gcgcctacgc acgacgtgac cacagaccgg      180
tcccagcgtt tgacgctgcg gttcatccct gtggaccgtg aggatactgc gtactcgtac      240
aaggcgcggt tcaccctagc tgtgggtgat aaccgtgtgc tggacatggc ttccacgtac      300
tttgacatcc gcggcgtgct ggacaggggc cctactttta agccctactc tggcactgcc      360
tacaacgccc tggctcccaa gggtgcccca aatccttgcg aatgggatga agctgctact      420
gctcttgaaa taaacctaga agaagaggac gatgacaacg aagacgaagt agacgagcaa      480
gctgagcagc aaaaaactca cgtatttggg caggcgcctt attctggtat aaatattaca      540
aaggagggta ttcaaatagg tgtcgaaggt caaacaccta aatatgccga taaaacattt      600
caacctgaac ctcaaatagg agaatctcag tggtacgaaa cagaaattaa tcatgcagct      660
gggagagtcc taaaaaagac taccccaatg aaaccatgtt acggttcata tgcaaaaccc      720
acaaatgaaa atggagggca aggcattctt gtaaagcaac aaaatggaaa gctagaaagt      780
caagtggaaa tgcaattttt ctcaactact gaggcagccg caggcagcgg atccctggcc      840
gaggctaagg tgcttgcgaa ccgggaacta gacaaatacg gtgtttctga ttattacaag      900
aatttgatta acaatgccaa aaccgtcgag ggcgtaaagg ctctgatcga cgaaatactt      960
gcggccctac ccgggtctgg tagcggcaat ggtgataact tgactcctaa agtggtattg     1020
tacagtgaag atgtagatat agaaacccca gacactcata tttcttacat gcccactatt     1080
aaggaaggta actcacgaga actaatgggc caacaatcta tgcccaacag gcctaattac     1140
attgctttta gggacaattt tattggtcta atgtattaca acagcacggg taatatgggt     1200
gttctggcgg gccaagcatc gcagttgaat gctgttgtag atttgcaaga cagaaacaca     1260
gagctttcat accagctttt gcttgattcc attggtgata gaaccaggta cttttctatg     1320
tggaatcagg ctgttgacag ctatgatcca gatgttagaa ttattgaaaa tcatggaact     1380
gaagatgaac ttccaaatta ctgctttcca ctgggaggtg tgattaatac agagactctt     1440
accaaggtaa aacctaaaac aggtcaggaa aatggatggg aaaaagatgc tacagaattt     1500
tcagataaaa atgaaataag agttggaaat aattttgcca tggaaatcaa tctaaatgcc     1560
aacctgtgga gaaatttcct gtactccaac atagcgctgt atttgcccga caagctaaag     1620
tacagtcctt ccaacgtaaa aatttctgat aacccaaaca cctacgacta catgaacaag     1680
cgagtggtgg ctcccgggct agtggactgc tacattaacc ttggagcacg ctggtccctt     1740
gactatatgg acaacgtcaa cccatttaac caccaccgca atgctggcct gcgctaccgc     1800
tcaatgttgc tgggcaatgg tcgctatgtg cccttccaca tccaggtgcc tcagaagttc     1860
tttgccatta aaaacctcct tctcctgccg ggctcataca cctacgagtg gaacttcagg     1920
aaggatgtta acatggttct gcagagctcc ctaggaaatg acctaagggt tgacggagcc     1980
agcattaagt ttgatagcat ttgcctttac gccaccttct tccccatggc ccacaacacc     2040
gcctccacgc ttgaggccat gcttagaaac gacaccaacg accagtcctt taacgactat     2100
ctctccgccg ccaacatgct ctaccctata cccgccaacg ctaccaacgt gcccatatcc     2160
atcccctccc gcaactgggc ggctttccgc ggctgggcct tcacgcgcct taagactaag     2220
gaaaccccat cactgggctc gggctacgac ccttattaca cctactctgg ctctataccc     2280
tacctagatg gaacctttta cctcaaccac acctttaaga aggtggccat tacctttgac     2340
tcttctgtca gctggcctgg caatgaccgc ctgcttaccc ccaacgagtt tgaaattaag     2400
cgctcagttg acggggaggg ttacaacgtt gcccagtgta acatgaccaa agactggttc     2460
ctggtacaaa tgctagctaa ctataacatt ggctaccagg gcttctatat cccagagagc     2520
tacaaggacc gcatgtactc cttctttaga aacttccagc ccatgagccg tcaggtggtg     2580
gatgatacta aatacaagga ctaccaacag gtgggcatcc tacaccaaca caacaactct     2640
ggatttgttg gctaccttgc ccccaccatg cgcgaaggac aggcctaccc tgctaacttc     2700
ccctatccgc ttataggcaa gaccgcagtt gacagcatta cccagaaaaa gtttctttgc     2760
gatcgcaccc tttggcgcat cccattctcc agtaacttta tgtccatggg cgcactcaca     2820
gacctgggcc aaaaccttct ctacgccaac tccgcccacg cgctagacat gacttttgag     2880
gtggatccca tggacgagcc cacccttctt tatgttttgt ttgaagtctt tgacgtggtc     2940
cgtgtgcacc agccgcaccg cggcgtcatc gaaaccgtgt acctgcgcac gcccttctcg     3000
gccggcaacg ccacaacata a                                               3021
<210>  5
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  linker
<400>  5
Ser Gly Gly Thr Ser Gly Ser Thr Ser Gly Thr Gly Ser Thr 
1               5                   10                  
<210>  6
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  linker
<400>  6
Ala Gly Ser Ser Thr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Gly Ser Thr Thr 
1               5                   10                  15  
<210>  7
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  linker
<400>  7
Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro 
1               5           
<210>  8
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  linker
<400>  8
Gly Gly Gly Val Glu Gly Gly Gly 
1               5               
<210>  9
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Core sequence of an albumin-binding peptide
<400>  9
Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 
1               5                   10      
<210>  10
<211>  4
<212>  PRT
<213>  Human adenovirus type 5
<400>  10
Lys Lys Thr Lys 
1               
<210>  11
<211>  4
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  modified capsid domain
<400>  11
Arg Gly Asp Lys 
1               
<210>  12
<211>  56
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  oligonucleotide HVR1rpsLF
<400>  12
gccctggctc ccaagggtgc cccaaatcct tgcgaatggg gcctggtgat gatggc           56
<210>  13
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  oligonucleotide HVR1rpsLR
<400>  13
gtaatattta taccagaata aggcgcctgc ccaaatacgt gagttcagaa gaactcgtca       60
agaag                                                                   65
<210>  14
<211>  90
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  oligonucleotide ABDH1F
<400>  14
cccaagggtg ccccaaatcc ttgcgaatgg gatgaagctg ctactgctct tgaaataaac       60
ctagaagaag aggacggcag cggatccctg                                        90
<210>  15
<211>  49
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  oligonucleotide ABDR1
<400>  15
cccggttcgc aagcacctta gcctcggcca gggatccgct gccccattc                   49
<210>  16
<211>  49
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  oligonucleotide ABDF2
<400>  16
gcttgcgaac cgggaactag acaaatacgg tgtttctgat tattacaag                   49
<210>  17
<211>  50
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  oligonucleotide ABDR2
<400>  17
cgacggtttt ggcattgtta atcaaattct tgtaataatc agaaacaccg                  50
<210>  18
<211>  50
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  oligonucleotide ABDF3
<400>  18
atgccaaaac cgtcgagggc gtaaaggctc tgatcgacga aatacttgcg                  50
<210>  19
<211>  50
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  oligonucleotide ABDR3
<400>  19
atacgtgagt gctaccagac ccgggtaggg ccgcaagtat ttcgtcgatc                  50
<210>  20
<211>  91
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  oligonucleotide ABDH1R
<400>  20
cagaataagg cgcctgccca aatacgtgag ttttttgctg ctcagcttgc tcgtctactt       60
cgtcttcgtt gtcatcgcta ccagacccgg g                                      91
<210>  21
<211>  58
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  oligonucleotide H5rpsLF
<400>  21
gaaagctaga aagtcaagtg gaaatgcaat ttttctcaac tggcctggtg atgatggc         58
<210>  22
<211>  62
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  oligonucleotide H5rpsLR
<400>  22
gtttctatat ctacatcttc actgtacaat accactttag gtcagaagaa ctcgtcaaga       60
ag                                                                      62
<210>  23
<211>  138
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  oligonucleotide ABDH5F
<400>  23
ctggccgagg ctaaggtgct tgcgaaccgg gaactagaca aatacggtgt ttctgattat       60
tacaagaatt tgattaacaa tgccaaaacc gtcgagggcg taaaggctct gatcgacgaa      120
atacttgcgg ccctaccc                                                    138
<210>  24
<211>  138
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  oligonucleotide ABDH5R
<400>  24
ctggccgagg ctaaggtgct tgcgaaccgg gaactagaca aatacggtgt ttctgattat       60
tacaagaatt tgattaacaa tgccaaaacc gtcgagggcg taaaggctct gatcgacgaa      120
atacttgcgg ccctaccc                                                    138
<210>  25
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  oligonucleotide Ad19121F
<400>  25
ctggacatgg cttccacgta                                                   20
<210>  26
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  oligonucleotide Ad19300R
<400>  26
gctcgtctac ttcgtcttcg                                                   20
<210>  27
<211>  952
<212>  PRT
<213>  Human adenovirus type 5
<400>  27
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ser Tyr Met His Ile Ser 
1               5                   10                  15      
Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala 
20                  25                  30          
Arg Ala Thr Glu Thr Tyr Phe Ser Leu Asn Asn Lys Phe Arg Asn Pro 
35                  40                  45              
Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu 
50                  55                  60                  
Thr Leu Arg Phe Ile Pro Val Asp Arg Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Tyr 
65                  70                  75                  80  
Lys Ala Arg Phe Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met 
85                  90                  95      
Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Thr 
100                 105                 110         
Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Leu Ala Pro Lys Gly 
115                 120                 125             
Ala Pro Asn Pro Cys Glu Trp Asp Glu Ala Ala Thr Ala Leu Glu Ile 
130                 135                 140                 
Asn Leu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asn Glu Asp Glu Val Asp Glu Gln 
145                 150                 155                 160 
Ala Glu Gln Gln Lys Thr His Val Phe Gly Gln Ala Pro Tyr Ser Gly 
165                 170                 175     
Ile Asn Ile Thr Lys Glu Gly Ile Gln Ile Gly Val Glu Gly Gln Thr 
180                 185                 190         
Pro Lys Tyr Ala Asp Lys Thr Phe Gln Pro Glu Pro Gln Ile Gly Glu 
195                 200                 205             
Ser Gln Trp Tyr Glu Thr Glu Ile Asn His Ala Ala Gly Arg Val Leu 
210                 215                 220                 
Lys Lys Thr Thr Pro Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Tyr Ala Lys Pro 
225                 230                 235                 240 
Thr Asn Glu Asn Gly Gly Gln Gly Ile Leu Val Lys Gln Gln Asn Gly 
245                 250                 255     
Lys Leu Glu Ser Gln Val Glu Met Gln Phe Phe Ser Thr Thr Glu Ala 
260                 265                 270         
Ala Ala Gly Asn Gly Asp Asn Leu Thr Pro Lys Val Val Leu Tyr Ser 
275                 280                 285             
Glu Asp Val Asp Ile Glu Thr Pro Asp Thr His Ile Ser Tyr Met Pro 
290                 295                 300                 
Thr Ile Lys Glu Gly Asn Ser Arg Glu Leu Met Gly Gln Gln Ser Met 
305                 310                 315                 320 
Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Ala Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu 
325                 330                 335     
Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala 
340                 345                 350         
Ser Gln Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu 
355                 360                 365             
Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Asp Ser Ile Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe 
370                 375                 380                 
Ser Met Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile 
385                 390                 395                 400 
Ile Glu Asn His Gly Thr Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro 
405                 410                 415     
Leu Gly Gly Val Ile Asn Thr Glu Thr Leu Thr Lys Val Lys Pro Lys 
420                 425                 430         
Thr Gly Gln Glu Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Thr Glu Phe Ser Asp 
435                 440                 445             
Lys Asn Glu Ile Arg Val Gly Asn Asn Phe Ala Met Glu Ile Asn Leu 
450                 455                 460                 
Asn Ala Asn Leu Trp Arg Asn Phe Leu Tyr Ser Asn Ile Ala Leu Tyr 
465                 470                 475                 480 
Leu Pro Asp Lys Leu Lys Tyr Ser Pro Ser Asn Val Lys Ile Ser Asp 
485                 490                 495     
Asn Pro Asn Thr Tyr Asp Tyr Met Asn Lys Arg Val Val Ala Pro Gly 
500                 505                 510         
Leu Val Asp Cys Tyr Ile Asn Leu Gly Ala Arg Trp Ser Leu Asp Tyr 
515                 520                 525             
Met Asp Asn Val Asn Pro Phe Asn His His Arg Asn Ala Gly Leu Arg 
530                 535                 540                 
Tyr Arg Ser Met Leu Leu Gly Asn Gly Arg Tyr Val Pro Phe His Ile 
545                 550                 555                 560 
Gln Val Pro Gln Lys Phe Phe Ala Ile Lys Asn Leu Leu Leu Leu Pro 
565                 570                 575     
Gly Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Asn Phe Arg Lys Asp Val Asn Met Val 
580                 585                 590         
Leu Gln Ser Ser Leu Gly Asn Asp Leu Arg Val Asp Gly Ala Ser Ile 
595                 600                 605             
Lys Phe Asp Ser Ile Cys Leu Tyr Ala Thr Phe Phe Pro Met Ala His 
610                 615                 620                 
Asn Thr Ala Ser Thr Leu Glu Ala Met Leu Arg Asn Asp Thr Asn Asp 
625                 630                 635                 640 
Gln Ser Phe Asn Asp Tyr Leu Ser Ala Ala Asn Met Leu Tyr Pro Ile 
645                 650                 655     
Pro Ala Asn Ala Thr Asn Val Pro Ile Ser Ile Pro Ser Arg Asn Trp 
660                 665                 670         
Ala Ala Phe Arg Gly Trp Ala Phe Thr Arg Leu Lys Thr Lys Glu Thr 
675                 680                 685             
Pro Ser Leu Gly Ser Gly Tyr Asp Pro Tyr Tyr Thr Tyr Ser Gly Ser 
690                 695                 700                 
Ile Pro Tyr Leu Asp Gly Thr Phe Tyr Leu Asn His Thr Phe Lys Lys 
705                 710                 715                 720 
Val Ala Ile Thr Phe Asp Ser Ser Val Ser Trp Pro Gly Asn Asp Arg 
725                 730                 735     
Leu Leu Thr Pro Asn Glu Phe Glu Ile Lys Arg Ser Val Asp Gly Glu 
740                 745                 750         
Gly Tyr Asn Val Ala Gln Cys Asn Met Thr Lys Asp Trp Phe Leu Val 
755                 760                 765             
Gln Met Leu Ala Asn Tyr Asn Ile Gly Tyr Gln Gly Phe Tyr Ile Pro 
770                 775                 780                 
Glu Ser Tyr Lys Asp Arg Met Tyr Ser Phe Phe Arg Asn Phe Gln Pro 
785                 790                 795                 800 
Met Ser Arg Gln Val Val Asp Asp Thr Lys Tyr Lys Asp Tyr Gln Gln 
805                 810                 815     
Val Gly Ile Leu His Gln His Asn Asn Ser Gly Phe Val Gly Tyr Leu 
820                 825                 830         
Ala Pro Thr Met Arg Glu Gly Gln Ala Tyr Pro Ala Asn Phe Pro Tyr 
835                 840                 845             
Pro Leu Ile Gly Lys Thr Ala Val Asp Ser Ile Thr Gln Lys Lys Phe 
850                 855                 860                 
Leu Cys Asp Arg Thr Leu Trp Arg Ile Pro Phe Ser Ser Asn Phe Met 
865                 870                 875                 880 
Ser Met Gly Ala Leu Thr Asp Leu Gly Gln Asn Leu Leu Tyr Ala Asn 
885                 890                 895     
Ser Ala His Ala Leu Asp Met Thr Phe Glu Val Asp Pro Met Asp Glu 
900                 905                 910         
Pro Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Glu Val Phe Asp Val Val Arg Val 
915                 920                 925             
His Gln Pro His Arg Gly Val Ile Glu Thr Val Tyr Leu Arg Thr Pro 
930                 935                 940                 
Phe Ser Ala Gly Asn Ala Thr Thr 
945                 950         
【図１】
0006639412.tif 000006
【図２】
0006639412.tif 000007
【図３】
0006639412.tif 000008
【図４】
0006639412.tif 000009
【図５】
0006639412.tif 000010
【図６】
0006639412.tif 000011
【図７】
0006639412.tif 000012
【図８】
0006639412.tif 000013
【図９】
0006639412.tif 000014
【図１０】
0006639412.tif 000015
【図１１】
0006639412.tif 000016
【図１２】
0006639412.tif 000017
【配列表】
0006639412000001.app