(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鮭由来のプロテオグリカンを、プロトン型強酸性陽イオン交換樹脂に接触させ、次に、該接触プロテオグリカンをピリジンで中和させ、次に、中和したプロテオグリカンに三酸化硫黄ピリジン錯体を加え、ジメチルスルホキシド中で２０〜４０℃で１〜５時間反応させて得られた硫酸基が２２重量％以上３６重量％以下の範囲で付加されたことを特徴とするプロテオグリカン。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料や日用品、医薬品などで使用される、保水性が改善されたプロテオグリカンに関するものである。
【０００２】
肌や髪を健康的に美しく保つために、潤いを与えるなどの手入れが必要である。そのため、スキンケア製品や化粧料、整髪料には保水性を有する物質を含んでいるものが多い。関節機能改善剤や点眼剤などの医薬品にも保水性を有する物質が使用されており、保水性そのものや、保水力に裏打ちされた弾力性を活かした製品が数多く生み出されている。保水性を有する物質として、グリセリンやセラミドなどの低分子化合物からヒアルロン酸やコラーゲンなどの高分子化合物などが挙げられる。近年、新たな保水性物質としてプロテオグリカンが注目されてきている。
【０００３】
プロテオグリカンは、プロテオグリカン単独もしくは、キトサンやコラーゲン、ヒアルロン酸などと併用し、わた体に付着させて使用すること（特許文献１）、美容液や化粧品において、プロテオグリカンの保水能力を補う目的で１０重量％以上のコラーゲンと併用すること（特許文献２）が行われている。しかし、特許文献１の方法では、わた体に付着させてもプロテオグリカン自体の保水能力は変わらない。特許文献２の方法では、保水能力を補うにはコラーゲンと併用しなければならないという煩わしさが生じる。また、特許文献１や特許文献２の方法においてコラーゲンを利用する場合、コラーゲンは元々水に不溶であるため、透明または清澄な製品とするには困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２５５７２６号  公報
【特許文献２】特開平６−１６６６１６号  公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記課題を鑑み、本発明は、コラーゲンなどの他物質との併用をすることなく、保水性が改善されたプロテオグリカンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を達成するために、本発明の一つの態様は、カルバゾール硫酸法によるウロン酸含量が２２〜３３重量％であり、かつローリー法によるタンパク質含量が１〜４重量％であり、かつ硫酸基含量が２２〜３９重量％である多硫酸化プロテオグリカンであることを要旨とする。
【０００７】
本発明の他の態様は、ＫＢｒディスク透過法により測定した赤外吸収スペクトルにおいて、波数１６４０±１０ｃｍ−１、１５６０±１０ｃｍ−１、１２４０±１０ｃｍ−１、１０３０±１０ｃｍ−１、１０００±１０ｃｍ−１すべてに吸収ピークを有し、かつ１６４０±１０ｃｍ−１の吸収ピークに対する１２４０±１０ｃｍ−１の吸収ピークの吸収ピーク強度比が、１．００〜１．２５である多硫酸化プロテオグリカンであることを要旨とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、コラーゲンなどの他物質との併用をすることなく、保水性が改善されたプロテオグリカンが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の、実施例１の多硫酸化プロテオグリカンの保水性の測定１に係り、比較例のプロテオグリカンの保水能を表す図である。
【図２】実施例１の多硫酸化プロテオグリカンの保水性の測定１に係り、実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水能と、比較例のプロテオグリカンの保水能とを比較する図である。
【図３】実施例１の多硫酸化プロテオグリカンの分析１に係り、実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンのＫＢｒディスク透過法により測定した赤外吸収スペクトルを表す図である。
【図４】実施例１の多硫酸化プロテオグリカンの分析１に係り、比較例のプロテオグリカンのＫＢｒディスク透過法により測定した赤外吸収スペクトルを表す図である。
【図５】実施例２の多硫酸化プロテオグリカンの保水性の測定２に係り、実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水能と、比較例のプロテオグリカンの保水能とを比較する図である。
【図６】実施例２の多硫酸化プロテオグリカンの分析２に係り、実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンのＫＢｒディスク透過法により測定した赤外吸収スペクトルを表す図である。
【図７】実施例３の多硫酸化プロテオグリカンの保水性の測定３に係り、実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水能と、比較例のプロテオグリカンの保水能とを比較する図である。
【図８】実施例３の多硫酸化プロテオグリカンの分析３に係り、実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンのＫＢｒディスク透過法により測定した赤外吸収スペクトルを表す図である。
【図９】実施例４の多硫酸化プロテオグリカンの保水性の測定４に係り、実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水能と、比較例のプロテオグリカンの保水能とを比較する図である。
【図１０】実施例４の多硫酸化プロテオグリカンの分析４に係り、実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンのＫＢｒディスク透過法により測定した赤外吸収スペクトルを表す図である。
【図１１】実施例５の多硫酸化プロテオグリカンの保水性の測定５に係り、実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水能と、比較例のプロテオグリカンの保水能とを比較する図である。
【図１２】実施例５の多硫酸化プロテオグリカンの分析５に係り、実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンのＫＢｒディスク透過法により測定した赤外吸収スペクトルを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、実施の形態をより具体的に説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１１】
（定義：硫酸化）
本明細書において、「硫酸化」とは、ヒドロキシ基に対して、硫酸イオンをエステル結合させ、硫酸基を導入させることである。
【００１２】
（定義：多硫酸化）
本明細書において、「多硫酸化」とは、原料となる有機物質に硫酸化を行い、原料となる有機物質に含まれている硫酸基の量より多くの硫酸基を導入することである。
【００１３】
（定義：吸収ピーク強度比）
本明細書において、赤外吸収スペクトルにおける「吸収ピーク強度比」を以下のように定義する。はじめに「吸収ピーク強度」とは、特に断りがない限り、赤外吸収スペクトルの縦軸を透過率（％）、横軸を波数（ｃｍ−１）とした場合に谷で表されるピークにおいて、「１００−透過率（％）」で表される値（単位：％）のことである。「吸収ピーク強度比」とは、任意の２つの吸収ピークの「吸収ピーク強度」の相対比を表す。例えば、本明細書において、「吸収ピークＡに対する吸収ピークＢの吸収ピーク強度比」とは、吸収ピークＢの吸収ピーク強度を吸収ピークＡの吸収ピーク強度で割ることで得られる値である。
【００１４】
本発明の実施の形態に係る多硫酸化プロテオグリカンの原料となるプロテオグリカンは、動物や魚類に存在するグリコサミノグリカンとタンパク質の共有結合物からなる分子量数十万から数百万の天然高分子化合物である。起源となる生物や抽出・製造条件により、分子量や含まれるアミノ酸や糖（中性糖、ウロン酸、アミノ糖など）の種類や量、比率も異なっているが、本発明の実施の形態に係る多硫酸化プロテオグリカンの原料となるプロテオグリカンは、起源となる生物や抽出・製造条件を問わない。
【００１５】
本発明の実施の形態に係る多硫酸化プロテオグリカンは、原料となるプロテオグリカンを有機溶媒に可溶な状態にした後、硫酸化反応をさせて製造することができる。原料となるプロテオグリカンは、その種類や有機溶媒の種類によるが、有機溶媒に不溶あるいは難溶である場合が多い。その場合は、硫酸化反応は有機溶媒中で行う必要があるため、原料となるプロテオグリカンを、硫酸化反応に使用する有機溶媒に可溶な状態にする必要がある。
【００１６】
原料となるプロテオグリカンを有機溶媒に可溶な状態にする方法の一例として、原料となるプロテオグリカンを溶解した水溶液を、プロトン型に活性化させた陽イオン交換樹脂にて処理した後に、有機塩基を接触させる方法がある。陽イオン交換樹脂をプロトン型に活性化させるには、無機酸や有機酸などの酸を用いる。原料となるプロテオグリカンを溶解した水溶液をプロトン型の陽イオン交換樹脂に接触させた後は、樹脂を水で洗浄し、樹脂に付着したプロテオグリカンを回収する。得られた水溶液に接触させる有機塩基には、ピリジン、トリエチルアミン、トリブチルアミンなど、構造中に窒素原子を含むものが主に挙げられるが、有機溶媒に可溶な状態にできるならばこの限りではない。有機塩基を接触させた後の水溶液から水分を除去する。水分除去方法は、噴霧乾燥や凍結乾燥、アルコールやアセトンなどの有機溶剤により沈殿、風乾するなど、水分を除去できるのであればいずれでもよい。
【００１７】
原料となるプロテオグリカンを有機溶媒に可溶な状態にする別の方法として、有機塩基が水溶性の場合、任意の割合で有機塩基を混合した水溶液を、原料となるプロテオグリカンに接触させる方法がある。接触の後は、透析や限外ろ過膜などの通常の化学的手法により過剰の有機塩基を除去し、上記と同様に水分除去を行うと、有機溶媒に可溶なプロテオグリカンが得られる。
【００１８】
有機溶媒に可溶なプロテオグリカンを用いて、各種硫酸化試薬により硫酸化反応を行うことで、本発明の実施の形態に係る多硫酸化プロテオグリカンが得られる。硫酸化試薬には、硫酸化試薬や濃硫酸などを使用することができる。硫酸化試薬の一例として、三酸化硫黄−ピリジン錯体、三酸化硫黄−トリエチルアミン錯体、三酸化硫黄−ジメチルホルムアミド錯体などが挙げられる。反応に用いる有機溶媒の一例として、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。硫酸化試薬や有機溶媒はそれぞれ、複数種類を混合して用いることも可能である。有機溶媒は可能な限り予備乾燥され、水分や不純物が少ないものが、反応効率の点で好ましい。反応温度は概ね２０〜６０℃程度、反応時間は概ね１時間以上必要である。硫酸化試薬は、そのまま反応液に添加する方法でもよいし、はじめに有機溶媒に溶解させ、その溶解液を反応液に滴下する方法でもよい。
【００１９】
任意の反応時間後、少量の水を添加することで硫酸化反応を止め、塩基による中和工程や、エタノール沈殿や透析などによる精製工程を経て、本発明の実施の形態に係る多硫酸化プロテオグリカンが得られる。
【００２０】
本発明の実施の形態に係る多硫酸化プロテオグリカンは、カルバゾール硫酸法によるウロン酸含量が２２〜３３重量％であり、かつローリー法によるタンパク質含量が１〜４重量％であり、かつ硫酸基含量が２２〜３９重量％である多硫酸化プロテオグリカンである。プロテオグリカンに硫酸基が導入されると、単位重量当たりの硫酸基含量は増大するが、一方でウロン酸含量やタンパク質含量は相対的に減少する。
【００２１】
本発明のカルバゾール硫酸法は、ウロン酸の呈色反応を利用した定量法である。プロテオグリカンは、タンパク質と糖鎖が共有結合していることを特徴とする化合物であり、プロテオグリカン糖鎖の主成分のひとつがウロン酸である。サンプル水溶液にカルバゾール溶液と濃硫酸を添加すると、サンプル水溶液にウロン酸が含まれていれば赤紫色に呈色する。呈色度合はウロン酸含量に比例する。呈色液の吸光度を分光光度計で測定し、標準物質の検量線からウロン酸含量を算出する。
【００２２】
本発明のローリー法は、タンパク質の呈色反応を利用した定量法である。サンプル水溶液をアルカリ性銅溶液とフェノール試薬で処理すると、サンプル水溶液にタンパク質が含まれていれば青色に呈色する。呈色度合はタンパク質含量に比例する。呈色液の吸光度を分光光度計で測定し、標準物質の検量線からタンパク質含量を算出する。
【００２３】
硫酸基含量の測定法は、元素分析あるいはロジゾン酸法などの比色法など、硫酸基が定量できる方法であればいずれでもよい。元素分析の場合は、分析の結果得られた硫黄含量を基に硫酸基含量を算出する。プロテオグリカンにおいて、硫黄原子は糖鎖中の硫酸基とタンパク質中のアミノ酸に含まれる。プロテオグリカンのタンパク質中のアミノ酸の硫黄量は、プロテオグリカンの糖鎖中の硫酸基の硫黄量に比べて極めて少ない。よって、本明細書においては、元素分析で測定された硫黄含量を、糖鎖の硫酸基由来の硫黄含量として表す。硫黄含量を測定する元素分析については、硫黄含量を測定できる手法であればいずれでもよい。
【００２４】
本発明の他の態様に係る多硫酸化プロテオグリカンは、ＫＢｒディスク透過法により測定した赤外吸収スペクトルにおいて、波数１６４０±１０ｃｍ−１、１５６０±１０ｃｍ−１、１２４０±１０ｃｍ−１、１０３０±１０ｃｍ−１、１０００±１０ｃｍ−１すべてに吸収ピークを有し、かつ１６４０±１０ｃｍ−１の吸収ピークに対する１２４０±１０ｃｍ−１の吸収ピークの吸収ピーク強度比が、１．００〜１．２５である多硫酸化プロテオグリカンである。
【００２５】
プロテオグリカンの赤外吸収スペクトルのうち、波数２０００〜１０００ｃｍ−１に表れる複数の吸収ピークは、主に糖鎖中の官能基である、硫酸基やカルボキシ基、アミドなどに由来する吸収ピークで構成されていると考えられる。各官能基に由来するピークは複数あり、さらに互いに重なり合っているため、各ピークを各官能基へ帰属させることは困難だが、硫酸基の吸収ピークは概ね１４４０〜１３５０ｃｍ−１付近と１２３０〜１１５０ｃｍ−１付近の２か所に表れることが知られている。本発明の硫酸化反応においては、理論的には原料となるプロテオグリカンのカルボキシ基やアミドには影響を及ぼさず、ヒドロキシ基に硫酸基が新たに導入され、硫酸基由来の赤外吸収スペクトルの吸収ピークの吸収ピーク強度が変化する。硫酸基由来と考えられる吸収ピークのうち、１２４０±１０ｃｍ−１の吸収ピークについて、主にカルボキシ基由来と考えられる１６４０±１０ｃｍ−１の吸収ピークとの吸収ピーク強度比を、本明細書における硫酸基量の指標として用いる。
【００２６】
本発明の実施の形態に係る多硫酸化プロテオグリカンは、原料となるプロテオグリカンより高い保水性を有する。原料となるプロテオグリカンと比較し、本発明の実施の形態に係る多硫酸化プロテオグリカンは約２倍以上の保水性を有し、コラーゲンなどの他物質との併用をすることなく、単独で保水性向上を達成できる。
【００２７】
本発明の実施の形態に係る多硫酸化プロテオグリカンは、単独で使用してもよいし、他の物質と併用してもよい。また、使用する形態も問わず、固体の状態で使用してもよいが、溶液の状態で使用してもよい。
【００２８】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これは単に例示の目的で述べるものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
（多硫酸化プロテオグリカンの製造１−１：プロテオグリカンピリジニウム塩の調製）
原料となるプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を購入し、比較例として用いた（以降、「比較例のプロテオグリカン」と略記する）。強酸性陽イオン交換樹脂（商品名：ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（三菱化学（株）））をガラス製カラムに充填し（内径４．５ｃｍ、高さ５ｃｍ）、１Ｍ塩酸６０ｍＬと脱イオン水２００ｍＬを順次流下して樹脂をプロトン型に活性化した後、比較例のプロテオグリカン０．５００ｇを脱イオン水１０ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を約５０ｍＬ流下し、溶出液約６０ｍＬを得た。溶出液のｐＨを卓上ｐＨメータ（Ｆ−５５、（株）堀場製作所製）で測定したところ、２．１であった。ｐＨを測定しながら、ピリジン（試薬特級、関東化学（株））を滴下し、溶出液のｐＨを６．６とした。中和後の溶液を回収し、凍結乾燥し、０．５３６ｇの白色綿状固体であるプロテオグリカンピリジニウム塩を得た。以降の実施例で用いるプロテオグリカンピリジニウム塩は、すべて本実施例と同じ方法で得たものである。
【００３０】
（多硫酸化プロテオグリカンの製造１−２：硫酸化反応）
本実施例に係るプロテオグリカンピリジニウム塩０．３００ｇとジメチルスルホキシド（特級、関東化学（株））１８ｍＬをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体（純度９８％、シグマアルドリッチ社）１．４４５ｇを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を４０℃の恒温水層に入れた。５時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、溶液全量をプラスチック製遠沈管に移した。遠沈管にエタノール３００ｍＬを加え、高速冷却遠心機（ｈｉｍａｃ  ＣＲ  ２２Ｇ３、日立工機（株）製）を用い、５，０００ｒｐｍで２０分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約１２０ｍＬを加え、溶解させた。溶解液のｐＨを卓上ｐＨメータ（Ｆ−５５、（株）堀場製作所製）により測定したところ、２．８であった。溶解液を水酸化ナトリウム水溶液で中和した。中和後の溶液全量を透析用セルロースチューブ（エーディア（株））に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は１日に３回交換した。３日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約１０ｍＬになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、０．４２６ｇの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
【００３１】
（多硫酸化プロテオグリカンの保水性の測定１）
実施例１で用いた比較例のプロテオグリカン０．３０ｇ、０．２０ｇ、０．１０ｇをそれぞれ脱イオン水１００ｍＬに溶解し、比較例のプロテオグリカンの０．３０ｗ／ｖ％、０．２０ｗ／ｖ％、０．１０ｗ／ｖ％水溶液を得た。この比較例のプロテオグリカン水溶液１００ｍＬずつをそれぞれ、透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ３５ｃｍ、エーディア（株））に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして浮遊させ、４℃の低温室で透析した。外液の交換は１週間に一度行った。吸水した透析用セルロースチューブの重量を不定期に３０日間測定し、あらかじめ測定した透析用セルロースチューブ風袋重量を控除し、吸水・保水した重量を求めた。
【００３２】
図１は、比較例のプロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量（ｇ）を示す。図１中の×印は比較例のプロテオグリカンの０．３０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、黒塗りの四角は比較例のプロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、黒塗りの三角は比較例のプロテオグリカンの０．１０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を示す。いずれの濃度でも吸水・保水量は経過日数にほぼ比例して増えること、また、濃度が０．１０ｗ／ｖ％、０．２０ｗ／ｖ％、０．３０ｗ／ｖ％と高くなるほど吸水・保水量が多くなることが明らかとなった。
【００３３】
比較例のプロテオグリカンと、実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンそれぞれ０．２０ｇを、脱イオン水１００ｍＬに溶解し、比較例のプロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液、実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液を得た。これらの水溶液１００ｍＬずつをそれぞれ、透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ３５ｃｍ、エーディア（株））に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして浮遊させ、４℃の低温室で透析した。外液の交換は１週間に一度行った。吸水した透析用セルロースチューブの重量を不定期に３０日間測定し、あらかじめ測定した透析用セルロースチューブ風袋重量を控除し、吸水・保水した重量を求めた。
【００３４】
図２は、比較例のプロテオグリカンと、実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量（ｇ）を示す。図２中の白抜きのひし形は実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、黒塗りの四角は比較例のプロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を示す。３０日間の測定結果を平均すると、１日当たりの重量の増加量は、比較例のプロテオグリカン２．７ｇ／日に対して、実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンは１０．７ｇ／日であった。比較例のプロテオグリカンと比較して、実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンは約４．０倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
【００３５】
（多硫酸化プロテオグリカンの分析１）
実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量をカルバゾール硫酸法で求めた。実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの２００μｇ／ｍＬ水溶液０．２５ｍＬに、カルバゾール溶液５０μＬと濃硫酸１．５ｍＬを添加してよく撹拌し、２０分間１００℃で加熱した。放冷後、分光光度計（Ｕ−３４１０、（株）日立製作所製）で５３５ｎｍの吸光度を測定した。グルクロン酸（シグマ社）を標準物質として作成した検量線より、実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量は２２．４重量％と算出された。
【００３６】
実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンのタンパク質含量をローリー法で求めた。実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの１．０ｍｇ／ｍＬ水溶液０．２ｍＬに、アルカリ性銅溶液（２％炭酸ナトリウム（０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）：０．５％硫酸銅（１％酒石酸ナトリウム水溶液）＝５０：１（ｖ：ｖ））１．０ｍＬを添加して１０分間静置し、２倍希釈のフォーリン＆チオカルト−フェノール試薬（ＭＰバイオメディカルズ社）０．１ｍＬを添加して３０分静置し、分光光度計（Ｕ−３４１０、（株）日立製作所製）で７５０ｎｍの吸光度を測定した。牛血清アルブミン（アクロス社）を標準物質として作成した検量線より、実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンのタンパク質含量は２．３重量％と算出された。
【００３７】
比較例のプロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量を、同様の方法で測定したところ、ウロン酸含量は３４．６重量％、タンパク質含量は６．５重量％であった。
【００３８】
実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの水分含量を、熱天秤装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｌｕｓ ＴＧ８２１０、（株）リガク製）にて、１２５℃で試料重量が恒量となるまで加熱し、重量減少分を試料に含まれていた水分とした。その結果、実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの水分含量は１４重量％であった。同様に、比較例のプロテオグリカンの水分含量について分析したところ、１７重量％であった。
【００３９】
実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの相対粘度を、オストワルド相対粘度計（粘度計Ｎｏ．１、毛細管内径０．５ｍｍ、柴田科学（株）製）で、脱イオン水の粘度を基準として測定した。実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカン２５．０ｍｇを５ｍＬの脱イオン水に溶解し、この水溶液５ｍＬをオストワルド相対粘度計に移し、粘度を測定した。実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの水分含量は１４重量％なので、乾燥重量当たりで換算すると、２１．５ｍｇ／５ｍＬ水溶液となり、濃度は０．４３ｗ／ｖ％となる。水温２６．５℃の水槽中で脱イオン水の粘度を１．０としたとき、実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの相対粘度は１．１であった。比較例のプロテオグリカンについて同一の相対粘度計を用いて分析した。比較例のプロテオグリカン２５．９ｍｇを５ｍＬの脱イオン水に溶解し、この水溶液５ｍＬをオストワルド相対粘度計に移し、粘度を測定した。比較例のプロテオグリカンの水分含量は１７重量％なので、乾燥重量当たりで換算すると、２１．５ｍｇ／５ｍＬ水溶液となり、濃度は０．４３ｗ／ｖ％となる。水温２６．５℃の水槽中で脱イオン水の粘度を１．０としたとき、比較例のプロテオグリカンの相対粘度は４．２であった。
【００４０】
実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの硫酸基含量を、燃焼型元素分析装置ｖａｒｉｏ  ＥＬ  ｃｕｂｅ（エレメンタール社製）を用い、炭素・水素・窒素・硫黄の４元素測定モードで測定した結果より算出した。実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの硫黄含量は１２．６８重量％であり、硫酸基含量は３８．０４重量％と算出された。同様の測定法で比較例のプロテオグリカンを測定したところ、硫黄含量は４．５１重量％であり、硫酸基含量は１３．５３重量％と算出された。
【００４１】
実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの炭素含量を、燃焼型元素分析装置ｖａｒｉｏ  ＥＬ  ｃｕｂｅ（エレメンタール社製）を用い、炭素・水素・窒素・硫黄の４元素測定モードで測定した結果より算出した。実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの炭素含量は２０．８３重量％であり、炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．６０８７であった。同様の測定法で比較例のプロテオグリカンの炭素含量を測定したところ、炭素含量は３０．８５重量％であり、炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．１４６２であった。硫酸化反応の前後で、プロテオグリカンの基本骨格を成す炭素原子の量は不変であるため、炭素含量に対する硫黄含量の重量比を比較することで、硫酸基の導入度合を算出することができる。炭素含量に対する硫黄含量の重量比の相対比より、実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンは、比較例のプロテオグリカンの約４．２倍に硫酸基が増えたことが分かった。
【００４２】
実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの赤外吸収スペクトルを、ＫＢｒディスク透過法で測定した。赤外吸収スペクトルは、フーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴ／ＩＲ−４２０、日本分光（株）製）を用いて、測定範囲４０００〜４００ｃｍ−１、分解能４ｃｍ−１、積算回数５４、スキャンスピード２ｍｍ／秒の条件で測定した。図３は実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの赤外吸収スペクトルである。図３のグラフの横軸は波数（ｃｍ−１）を表し、縦軸は透過率（％）を表す。図３のグラフにおいて、谷となっている部分が吸収ピークである。図３のグラフより、実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンは、１６３８ｃｍ−１（ピーク番号１）、１５６１ｃｍ−１（ピーク番号２）、１２４０ｃｍ−１（ピーク番号５）、１０２６ｃｍ−１（ピーク番号８）、９９９ｃｍ−１（ピーク番号９）に吸収ピークを有することが分かった。また、１６３８ｃｍ−１の吸収ピークの透過率は６１．６５３８（％）であり、１２４０ｃｍ−１の吸収ピークの透過率は５７．７９２９（％）であることから、吸収ピーク強度は、１６３８ｃｍ−１の吸収ピークは３８．３４６２（％）、１２４０ｃｍ−１の吸収ピークは４２．２０７１（％）と算出された。１６３８ｃｍ−１の吸収ピークに対する１２４０ｃｍ−１の吸収ピークの吸収ピーク強度比は、１．１０と算出された。図３中の吸収ピーク１〜１１の波数については、１は１６３８ｃｍ−１、２は１５６１ｃｍ−１、３は１４２０ｃｍ−１、４は１３７８ｃｍ−１、５は１２４０ｃｍ−１、６は１１２７ｃｍ−１、７は１０５６ｃｍ−１、８は１０２６ｃｍ−１、９は９９９ｃｍ−１、１０は８２０ｃｍ−１、１１は５９２ｃｍ−１であった。
【００４３】
同様に、比較例のプロテオグリカンについても赤外吸収スペクトルを、積算回数６４で測定した。図４は比較例のプロテオグリカンの赤外吸収スペクトルである。図４のグラフの横軸は波数（ｃｍ−１）を表し、縦軸は透過率（％）を表す。図４のグラフにおいて、谷となっている部分が吸収ピークである。図４のグラフより、比較例に係るプロテオグリカンは、１６４２ｃｍ−１（ピーク番号１）および１２３３ｃｍ−１（ピーク番号５）に吸収ピークを有するが、１５６０±１０ｃｍ−１、１０３０±１０ｃｍ−１、１０００±１０ｃｍ−１に吸収ピークを有しないことが分かった。また、１６４２ｃｍ−１の吸収ピークの透過率は５３．７７６０（％）であり、１２３３ｃｍ−１の吸収ピークの透過率は６８．７４２６（％）であることから、吸収ピーク強度は、１６４２ｃｍ−１の吸収ピークは４６．２２４０（％）、１２３３ｃｍ−１の吸収ピークは３１．２５７４（％）と算出された。１６４２ｃｍ−１の吸収ピークに対する１２３３ｃｍ−１の吸収ピークの吸収ピーク強度比は、０．６８と算出された。図４中の吸収ピーク１および３〜７、１０、１１の波数については、１は１６４２ｃｍ−１、３は１４２２ｃｍ−１、４は１３７８ｃｍ−１、５は１２３３ｃｍ−１、６は１１３０ｃｍ−１、７は１０６７ｃｍ−１、１０は８２３ｃｍ−１、１１は５８９ｃｍ−１であった。
【実施例２】
【００４４】
（多硫酸化プロテオグリカンの製造２）
実施例１に係るプロテオグリカンピリジニウム塩０．３００ｇとジメチルスルホキシド（特級、関東化学（株））１８ｍＬをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体（純度９８％、シグマアルドリッチ社）１．４４５ｇを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を４０℃の恒温水層に入れた。１時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、溶液全量をプラスチック製遠沈管に移した。遠沈管にエタノール３００ｍＬを加え、高速冷却遠心機（ｈｉｍａｃ  ＣＲ  ２２Ｇ３、日立工機（株）製）を用い、５，０００ｒｐｍで２０分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約１５０ｍＬを加え、溶解させた。溶解液のｐＨを卓上ｐＨメータ（Ｆ−５５、（株）堀場製作所製）により測定したところ、３．０であった。溶解液を水酸化ナトリウム水溶液で中和した。中和後の溶液全量を透析用セルロースチューブ（エーディア（株））に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は１日に３回交換した。３日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約１０ｍＬになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、０．４１１ｇの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
【００４５】
（多硫酸化プロテオグリカンの保水性の測定２）
比較例のプロテオグリカンと実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水性を、実施例１と同様に測定した。図５は、比較例のプロテオグリカンと、実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量（ｇ）を示す。図５中の白抜きのひし形は実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、黒塗りの四角は比較例のプロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を示す。３０日間の測定結果を平均すると、１日当たりの重量の増加量は、比較例のプロテオグリカン２．７ｇ／日に対して、実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンは８．９ｇ／日であった。比較例のプロテオグリカンと比較して、実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンは約３．３倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
【００４６】
（多硫酸化プロテオグリカンの分析２）
実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量を、実施例１と同様の方法で測定したところ、ウロン酸含量は２４．９％、タンパク質含量は２．２重量％であった。
【００４７】
実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンの水分含量を、実施例１と同様の方法で測定したところ、１４重量％であった。
【００４８】
実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンの相対粘度を、オストワルド相対粘度計（粘度計Ｎｏ．１、毛細管内径０．５ｍｍ、柴田科学（株）製）で、脱イオン水の粘度を基準として測定した。実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカン２５．０ｍｇを５ｍＬの脱イオン水に溶解し、この水溶液５ｍＬをオストワルド相対粘度計に移し、粘度を測定した。実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンの水分含量は１４重量％なので、乾燥重量当たりで換算すると、２１．５ｍｇ／５ｍＬ水溶液となり、濃度は０．４３ｗ／ｖ％となる。水温２６．５℃の水槽中で脱イオン水の粘度を１．０としたとき、実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンの相対粘度は１．４であった。
【００４９】
実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンの硫酸基含量を、実施例１と同様の方法で算出したところ、硫黄含量は１２．０９重量％であり、硫酸基含量は３６．２７重量％であった。
【００５０】
実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンの炭素含量を、実施例１と同様の方法で測定した。その結果、炭素含量は２１．２８重量％であり、炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．５６８１であった。実施例１より、比較例のプロテオグリカンの炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．１４６２であった。炭素含量に対する硫黄含量の重量比の相対比より、実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンは、比較例のプロテオグリカンの約３．９倍に硫酸基が増えたことが分かった。
【００５１】
実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンの赤外吸収スペクトルを、積算回数５７で実施例１と同様の方法で測定した。図６は実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンの赤外吸収スペクトルである。図６のグラフの横軸は波数（ｃｍ−１）を表し、縦軸は透過率（％）を表す。図６のグラフにおいて、谷となっている部分が吸収ピークである。図６のグラフより、実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンは、１６３８ｃｍ−１（ピーク番号１）、１５６１ｃｍ−１（ピーク番号２）、１２３８ｃｍ−１（ピーク番号５）、１０２６ｃｍ−１（ピーク番号８）、９９７ｃｍ−１（ピーク番号９）に吸収ピークを有することが分かった。また、１６３８ｃｍ−１の吸収ピークの透過率は５３．５７９６（％）であり、１２３８ｃｍ−１の吸収ピークの透過率は４７．４４６６（％）であることから、吸収ピーク強度は、１６３８ｃｍ−１の吸収ピークは４６．４２０４（％）、１２３８ｃｍ−１の吸収ピークは５２．５５３４（％）と算出された。１６３８ｃｍ−１の吸収ピークに対する１２３８ｃｍ−１の吸収ピークの吸収ピーク強度比は、１．１３と算出された。図６中の吸収ピーク１〜１１の波数については、１は１６３８ｃｍ−１、２は１５６１ｃｍ−１、３は１４１１ｃｍ−１、４は１３７７ｃｍ−１、５は１２３８ｃｍ−１、６は１１２９ｃｍ−１、７は１０５７ｃｍ−１、８は１０２６ｃｍ−１、９は９９７ｃｍ−１、１０は８２０ｃｍ−１、１１は５９１ｃｍ−１であった。
【実施例３】
【００５２】
（多硫酸化プロテオグリカンの製造３）
実施例１に係るプロテオグリカンピリジニウム塩０．３００ｇとジメチルスルホキシド（特級、関東化学（株））１８ｍＬをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体（純度９８％、シグマアルドリッチ社）０．８６７ｇを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を４０℃の恒温水層に入れた。１時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、溶液全量をプラスチック製遠沈管に移した。遠沈管にエタノール３００ｍＬを加え、高速冷却遠心機（ｈｉｍａｃ  ＣＲ  ２２Ｇ３、日立工機（株）製）を用い、５，０００ｒｐｍで２０分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約１２０ｍＬを加え、溶解させた。溶解液のｐＨを卓上ｐＨメータ（Ｆ−５５、（株）堀場製作所製）により測定したところ、３．０であった。溶解液を水酸化ナトリウム水溶液で中和した。中和後の溶液全量を透析用セルロースチューブ（エーディア（株））に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は１日に３回交換した。３日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約１０ｍＬになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、０．４１０ｇの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
【００５３】
（多硫酸化プロテオグリカンの保水性の測定３）
比較例のプロテオグリカンと実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水性を、実施例１と同様に測定した。図７は、比較例のプロテオグリカンと、実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量（ｇ）を示す。図７中の白抜きのひし形は実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、黒塗りの四角は比較例のプロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を示す。３０日間の測定結果を平均すると、１日当たりの重量の増加量は、比較例のプロテオグリカン２．７ｇ／日に対して、実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンは８．１ｇ／日であった。比較例のプロテオグリカンと比較して、実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンは約３．０倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
【００５４】
（多硫酸化プロテオグリカンの分析３）
実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量を、実施例１と同様の方法で測定したところ、ウロン酸含量は２４．１重量％、タンパク質含量は２．０重量％であった。
【００５５】
実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンの水分含量を、実施例１と同様の方法で測定したところ、１８重量％であった。
【００５６】
実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンの相対粘度を、オストワルド相対粘度計（粘度計Ｎｏ．１、毛細管内径０．５ｍｍ、柴田科学（株）製）で、脱イオン水の粘度を基準として測定した。実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカン２６．２ｍｇを５ｍＬの脱イオン水に溶解し、この水溶液５ｍＬをオストワルド相対粘度計に移し、粘度を測定した。実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンの水分含量は１８重量％なので、乾燥重量当たりで換算すると、２１．５ｍｇ／５ｍＬ水溶液となり、濃度は０．４３ｗ／ｖ％となる。水温２６．５℃の水槽中で脱イオン水の粘度を１．０としたとき、実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンの相対粘度は１．９であった。
【００５７】
実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンの硫酸基含量を、実施例１と同様の方法で算出したところ、硫黄含量は１１．３３重量％であり、硫酸基含量は３３．９９重量％であった。
【００５８】
実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンの炭素含量を、実施例１と同様の方法で測定した。その結果、炭素含量は２１．９９重量％であり、炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．５１５２であった。実施例１より、比較例のプロテオグリカンの炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．１４６２であった。炭素含量に対する硫黄含量の重量比の相対比より、実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンは、比較例のプロテオグリカンの約３．５倍に硫酸基が増えたことが分かった。
【００５９】
実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンの赤外吸収スペクトルを、積算回数６４で実施例１と同様の方法で測定した。図８は実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンの赤外吸収スペクトルである。図８のグラフの横軸は波数（ｃｍ−１）を表し、縦軸は透過率（％）を表す。図８のグラフにおいて、谷となっている部分が吸収ピークである。図８のグラフより、実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンは、１６３８ｃｍ−１（ピーク番号１）、１５６１ｃｍ−１（ピーク番号２）、１２４２ｃｍ−１（ピーク番号５）、１０３０ｃｍ−１（ピーク番号８）、９９７ｃｍ−１（ピーク番号９）に吸収ピークを有することが分かった。また、１６３８ｃｍ−１の吸収ピークの透過率は４３．４５３４（％）であり、１２４２ｃｍ−１の吸収ピークの透過率は３２．５４５６（％）であることから、吸収ピーク強度は、１６３８ｃｍ−１の吸収ピークは５６．５４６６（％）であり、１２４２ｃｍ−１の吸収ピークは６７．４５４４（％）と算出された。１６３８ｃｍ−１の吸収ピークに対する１２４２ｃｍ−１の吸収ピークの吸収ピーク強度比は、１．１９と算出された。図８中の吸収ピーク１〜１１の波数については、１は１６３８ｃｍ−１、２は１５６１ｃｍ−１、３は１４１２ｃｍ−１、４は１３７７ｃｍ−１、５は１２４２ｃｍ−１、６は１１３０ｃｍ−１、７は１０６４ｃｍ−１、８は１０３０ｃｍ−１、９は９９７ｃｍ−１、１０は８２０ｃｍ−１、１１は５９２ｃｍ−１であった。
【実施例４】
【００６０】
（多硫酸化プロテオグリカンの製造４）
実施例１に係るプロテオグリカンピリジニウム塩０．２７３ｇとジメチルスルホキシド（特級、関東化学（株））１６．４ｍＬをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体（純度９８％、シグマアルドリッチ社）０．５２３ｇを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を４０℃の恒温水層に入れた。１時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、溶液全量をプラスチック製遠沈管に移した。遠沈管にエタノール３００ｍＬを加え、高速冷却遠心機（ｈｉｍａｃ  ＣＲ  ２２Ｇ３、日立工機（株）製）を用い、７，０００ｒｐｍで２０分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約４０ｍＬを加え、溶解させた。溶解液のｐＨを卓上ｐＨメータ（Ｆ−５５、（株）堀場製作所製）により測定したところ、２．６であった。溶解液を水酸化ナトリウム水溶液で中和した。中和後の溶液全量を透析用セルロースチューブ（エーディア（株））に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は１日に３回交換した。３日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約１０ｍＬになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、０．３９３ｇの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
【００６１】
（多硫酸化プロテオグリカンの保水性の測定４）
比較例のプロテオグリカンと実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水性を、実施例１と同様に測定した。図９は、比較例のプロテオグリカンと、実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量（ｇ）を示す。図９中の白抜きのひし形は実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、黒塗りの四角は比較例のプロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を示す。３０日間の測定結果を平均すると、１日当たりの重量の増加量は、比較例のプロテオグリカン２．７ｇ／日に対して、実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンは７．２ｇ／日であった。比較例のプロテオグリカンと比較して、実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンは約２．７倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
【００６２】
（多硫酸化プロテオグリカンの分析４）
実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量を、実施例１と同様の方法で測定したところ、ウロン酸含量は２４．８重量％、タンパク質含量は１．２重量％であった。
【００６３】
実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンの水分含量を、実施例１と同様の方法で測定したところ、１４重量％であった。
【００６４】
実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンの相対粘度を、オストワルド相対粘度計（粘度計Ｎｏ．１、毛細管内径０．５ｍｍ、柴田科学（株）製）で、脱イオン水の粘度を基準として測定した。実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカン２５．０ｍｇを５ｍＬの脱イオン水に溶解し、この水溶液５ｍＬをオストワルド相対粘度計に移し、粘度を測定した。実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンの水分含量は１４重量％なので、乾燥重量当たりで換算すると、２１．５ｍｇ／５ｍＬ水溶液となり、濃度は０．４３ｗ／ｖ％となる。水温２６．５℃の水槽中で脱イオン水の粘度を１．０としたとき、実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンの相対粘度は２．１であった。
【００６５】
実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンの硫酸基含量を、実施例１と同様の方法で算出したところ、硫黄含量は１１．３８重量％であり、硫酸基含量は３４．１４重量％であった。
【００６６】
実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンの炭素含量を、実施例１と同様の方法で測定した。その結果、炭素含量は２２．１２重量％であり、炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．５１４５であった。実施例１より、比較例のプロテオグリカンの炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．１４６２であった。炭素含量に対する硫黄含量の重量比の相対比より、実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンは、比較例のプロテオグリカンの約３．５倍に硫酸基が増えたことが分かった。
【００６７】
実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンの赤外吸収スペクトルを、積算回数７７で実施例１と同様の方法で測定した。図１０は実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンの赤外吸収スペクトルである。図１０のグラフの横軸は波数（ｃｍ−１）を表し、縦軸は透過率（％）を表す。図１０のグラフにおいて、谷となっている部分が吸収ピークである。図１０のグラフより、実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンは、１６３８ｃｍ−１（ピーク番号１）、１５６２ｃｍ−１（ピーク番号２）、１２３９ｃｍ−１（ピーク番号５）、１０３１ｃｍ−１（ピーク番号８）、９９７ｃｍ−１（ピーク番号９）に吸収ピークを有することが分かった。また、１６３８ｃｍ−１の吸収ピークの透過率は４６．９８８０（％）であり、１２３９ｃｍ−１の吸収ピークの透過率は３５．６５５１（％）であることから、吸収ピーク強度は、１６３８ｃｍ−１の吸収ピークは５３．０１２０（％）であり、１２３９ｃｍ−１の吸収ピークは６４．３４４９（％）と算出された。１６３８ｃｍ−１の吸収ピークに対する１２３９ｃｍ−１の吸収ピークの吸収ピーク強度比は、１．２１と算出された。図１０中の吸収ピーク１〜１１の波数については、１は１６３８ｃｍ−１、２は１５６２ｃｍ−１、３は１４１９ｃｍ−１、４は１３７８ｃｍ−１、５は１２３９ｃｍ−１、６は１１３０ｃｍ−１、７は１０６５ｃｍ−１、８は１０３１ｃｍ−１、９は９９７ｃｍ−１、１０は８２０ｃｍ−１、１１は５８５ｃｍ−１であった。
【実施例５】
【００６８】
（多硫酸化プロテオグリカンの製造５）
実施例１に係るプロテオグリカンピリジニウム塩０．２８３ｇとジメチルスルホキシド（特級、関東化学（株））１７．０ｍＬをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体（純度９８％、シグマアルドリッチ社）０．２７１ｇを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を４０℃の恒温水層に入れた。１時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、溶液全量をプラスチック製遠沈管に移した。遠沈管にエタノール３００ｍＬを加え、高速冷却遠心機（ｈｉｍａｃ  ＣＲ  ２２Ｇ３、日立工機（株）製）を用い、７，０００ｒｐｍで２０分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約４０ｍＬを加え、溶解させた。溶解液のｐＨを卓上ｐＨメータ（Ｆ−５５、（株）堀場製作所製）により測定したところ、２．８であった。溶解液を水酸化ナトリウム水溶液で中和した。中和後の溶液全量を透析用セルロースチューブ（エーディア（株））に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は１日に３回交換した。３日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約１０ｍＬになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、０．３６９ｇの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
【００６９】
（多硫酸化プロテオグリカンの保水性の測定５）
比較例のプロテオグリカンと実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水性を、実施例１と同様に測定した。図１１は、比較例のプロテオグリカンと、実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量（ｇ）を示す。図１１中の白抜きのひし形は実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、黒塗りの四角は比較例のプロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を示す。３０日間の測定結果を平均すると、１日当たりの重量の増加量は、比較例のプロテオグリカン２．７ｇ／日に対して、実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンは７．１ｇ／日であった。比較例のプロテオグリカンと比較して、実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンは約２．６倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
【００７０】
（多硫酸化プロテオグリカンの分析５）
実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量を、実施例１と同様の方法で測定したところ、ウロン酸含量は２５．１重量％、タンパク質含量は２．０重量％であった。
【００７１】
実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンの水分含量を、実施例１と同様の方法で測定したところ、１６重量％であった。
【００７２】
実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンの相対粘度を、オストワルド相対粘度計（粘度計Ｎｏ．１、毛細管内径０．５ｍｍ、柴田科学（株）製）で、脱イオン水の粘度を基準として測定した。実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカン２５．６ｍｇを５ｍＬの脱イオン水に溶解し、この水溶液５ｍＬをオストワルド相対粘度計に移し、粘度を測定した。実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンの水分含量は１６重量％なので、乾燥重量当たりで換算すると、２１．５ｍｇ／５ｍＬ水溶液となり、濃度は０．４３ｗ／ｖ％となる。水温２６．５℃の水槽中で脱イオン水の粘度を１．０としたとき、実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンの相対粘度は３．５であった。
【００７３】
実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンの硫酸基含量を、実施例１と同様の方法で算出したところ、硫黄含量は９．０７重量％であり、硫酸基含量は２７．２１重量％であった。
【００７４】
実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンの炭素含量を、実施例１と同様の方法で測定した。その結果、炭素含量は２４．３１重量％であり、炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．３７３１であった。実施例１より、比較例のプロテオグリカンの炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．１４６２であった。炭素含量に対する硫黄含量の重量比の相対比より、実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンは、比較例のプロテオグリカンの約２．６倍に硫酸基が増えたことが分かった。
【００７５】
実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンの赤外吸収スペクトルを、積算回数８１で実施例１と同様の方法で測定した。図１２は実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンの赤外吸収スペクトルである。図１２のグラフの横軸は波数（ｃｍ−１）を表し、縦軸は透過率（％）を表す。図１２のグラフにおいて、谷となっている部分が吸収ピークである。図１２のグラフより、実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンは、１６３８ｃｍ−１（ピーク番号１）、１５６２ｃｍ−１（ピーク番号２）、１２３７ｃｍ−１（ピーク番号５）、１０３４ｃｍ−１（ピーク番号８）、９９６ｃｍ−１（ピーク番号９）に吸収ピークを有することが分かった。また、１６３８ｃｍ−１の吸収ピークの透過率は５３．８３３１（％）であり、１２３７ｃｍ−１の吸収ピークの透過率は５１．８５１１（％）であることから、吸収ピーク強度は、１６３８ｃｍ−１の吸収ピークは４６．１６６９（％）であり、１２３７ｃｍ−１の吸収ピークは４８．１４８９（％）と算出された。１６３８ｃｍ−１の吸収ピークに対する１２３７ｃｍ−１の吸収ピークの吸収ピーク強度比は、１．０４と算出された。図１２中の吸収ピーク１〜１１の波数については、１は１６３８ｃｍ−１、２は１５６２ｃｍ−１、３は１４２０ｃｍ−１、４は１３７８ｃｍ−１、５は１２３７ｃｍ−１、６は１１３２ｃｍ−１、７は１０６７ｃｍ−１、８は１０３４ｃｍ−１、９は９９６ｃｍ−１、１０は８２３ｃｍ−１、１１は５８６ｃｍ−１であった。
【実施例６】
【００７６】
（多硫酸化プロテオグリカンの製造６）
実施例１に係るプロテオグリカンピリジニウム塩１５．０ｍｇとジメチルスルホキシド（特級、関東化学（株））０．９ｍＬをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体（純度９０％以上、和光純薬工業（株））４７．１ｍｇを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を２０℃の恒温水層に入れた。１時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、溶液のｐＨを卓上ｐＨメータ（Ｆ−５５、（株）堀場製作所製）により測定したところ、弱酸性を呈した。溶液を水酸化ナトリウム水溶液で中和し、全量をプラスチック製遠沈管に移し、エタノール３０ｍＬを加え、卓上遠心機（ｈｉｍａｃ  ＣＴ  ６Ｄ、日立工機（株）製）を用い、２，０００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約１０ｍＬを加え、溶解させた。溶解液にエタノール３０ｍＬを加え、再度遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約１５ｍＬを加え、溶解させた。溶解液全量を透析用セルロースチューブ（エーディア（株））に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は１日に３回交換した。３日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約５ｍＬになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、１５．０ｍｇの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
【００７７】
（多硫酸化プロテオグリカンの分析６）
実施例６に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量を、実施例１と同様の方法で測定したところ、ウロン酸含量は３２．７重量％、タンパク質含量は３．４重量％であった。
【００７８】
実施例６に係る多硫酸化プロテオグリカンの硫酸基含量を、実施例１と同様の方法で算出したところ、硫黄含量は７．５４重量％であり、硫酸基含量は２２．６２重量％であった。
【００７９】
実施例６に係る多硫酸化プロテオグリカンの炭素含量を、実施例１と同様の方法で測定した。その結果、炭素含量は２９．９５重量％であり、炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．２５１８であった。実施例１より、比較例のプロテオグリカンの炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．１４６２であった。炭素含量に対する硫黄含量の重量比の相対比より、実施例６に係る多硫酸化プロテオグリカンは、比較例のプロテオグリカンの約１．７倍に硫酸基が増えたことが分かった。
【実施例７】
【００８０】
（多硫酸化プロテオグリカンの製造７）
実施例１に係るプロテオグリカンピリジニウム塩３０．０ｍｇとジメチルスルホキシド（特級、関東化学（株））１．８ｍＬをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体（純度９０％以上、和光純薬工業（株））１５７ｍｇを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を６０℃の恒温水層に入れた。５時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、バイアル瓶のふたを開け、溶液全量をプラスチック製遠沈管に移した。溶液の入った遠沈管にエタノール６ｍＬを加え、卓上遠心機（ｈｉｍａｃ  ＣＴ  ６Ｄ、日立工機（株）製）を用い、２，０００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約４ｍＬを加え、溶解させた。溶解液にエタノール６ｍＬを加え、再度遠心分離を行った後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約１０ｍＬを加え、溶解させた。溶解液のｐＨを卓上ｐＨメータ（Ｆ−５５、（株）堀場製作所製）により測定したところ、弱酸性を呈した。溶解液を水酸化ナトリウム水溶液で中和し、溶液全量を透析用セルロースチューブ（エーディア（株））に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は１日に３回交換した。３日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約５ｍＬになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、３１．７ｍｇの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
【００８１】
（多硫酸化プロテオグリカンの分析７）
実施例７に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量を、実施例１と同様の方法で測定したところ、ウロン酸含量は２２．８重量％、タンパク質含量は３．３重量％であった。
【００８２】
実施例７に係る多硫酸化プロテオグリカンの硫酸基含量を、実施例１と同様の方法で算出したところ、硫黄含量は１１．３９重量％であり、硫酸基含量は３４．１７重量％であった。
【００８３】
実施例７に係る多硫酸化プロテオグリカンの炭素含量を、実施例１と同様の方法で測定した。その結果、炭素含量は２６．３４重量％であり、炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．４３２４であった。実施例１より、比較例のプロテオグリカンの炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．１４６２であった。炭素含量に対する硫黄含量の重量比の相対比より、実施例７に係る多硫酸化プロテオグリカンは、比較例のプロテオグリカンの約３．０倍に硫酸基が増えたことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明により、コラーゲンなどの他物質との併用をすることなく、単独で高保水性を有する多硫酸化プロテオグリカンが提供されることにより、化粧料や日用品、医薬品などに広く利用されることが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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