(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン２２（ＩＬ２２）、並びに、
フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤ−Ａ）に結合し、そして、抗体Ｆ８の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗原結合部位を含む、ダイアボディ、
を含むコンジュゲートであって、ここにおいて
Ｆ８  ＶＨ  ＣＤＲ１が、ＬＦＴ（配列番号１）の配列を有し；
Ｆ８  ＶＨ  ＣＤＲ２が、ＳＧＳＧＧＳ（配列番号２）の配列を有し； Ｆ８  ＶＨ  ＣＤＲ３が、ＳＴＨＬＹＬ（配列番号３）の配列を有し；
Ｆ８  ＶＬ  ＣＤＲ１が、ＭＰＦ（配列番号４）の配列を有し；
Ｆ８  ＶＬ  ＣＤＲ２が、ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号５）の配列を有し；そして、
Ｆ８  ＶＬ  ＣＤＲ３が、ＭＲＧＲＰＰ（配列番号６）の配列を有し；そして、
ここにおいて、前記ＩＬ２２が、アミノ酸リンカーによって前記ダイアボディのＶＨドメインのＮ末端に連結されている、
前記コンジュゲート。
【請求項２】
前記ダイアボディが、配列番号７及び８に示されている抗体Ｆ８のＶＨ及びＶＬドメインを含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記ダイアボディの前記ＶＨドメイン及び前記ＶＬドメインが、５〜１２個のアミノ酸リンカーによって連結されている、請求項１又は２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記ダイアボディが、配列番号１０に示されているＦ８のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記ＩＬ２２がヒトＩＬ２２である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記ＩＬ２２が、配列番号１１に示されている配列を含む、又は前記配列からなる、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記ＩＬ２２を前記ＶＨドメインのＮ末端に連結しているアミノ酸リンカーが、１０〜２０個のアミノ酸長である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
配列番号１６に示されているアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲートをコードする核酸分子。
【請求項１０】
配列番号１４に示されているヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の宿主細胞を、前記コンジュゲートの発現の条件下で培養するステップを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲートを作製する方法。
【請求項１４】
前記コンジュゲートを発現後に単離及び／又は精製するステップを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
患者の自己免疫疾患を処置するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
患者の自己免疫疾患の部位にＩＬ２２を送達するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物。
【請求項１８】
前記自己免疫疾患が、腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、子宮内膜症、自己免疫性糖尿病（例えば、１型糖尿病）、乾癬、乾癬性関節炎、歯周炎、及びアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される、請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記自己免疫疾患が腸疾患である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記腸疾患が、潰瘍性大腸炎又はクローン病である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
患者の炎症を処置するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物。
【請求項２２】
患者の炎症の部位にＩＬ２２を送達するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物。
【請求項２３】
前記炎症が、炎症性疾患及び／又は障害の結果である、請求項２１又は２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記炎症性疾患及び／又は障害が、移植片対宿主病；創傷治癒；及び潰瘍、特に糖尿病による足の壊疽からなる群から選択される、請求項２３に記載の医薬組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン２２（ＩＬ２２）及び抗体分子を含むコンジュゲートに関する。この抗体分子は、好ましくは、血管形成に関連した抗原、例えば、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する。詳細には、本発明は、疾患／障害、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む自己免疫疾患の処置におけるこのようなコンジュゲートの治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、先天性免疫及び適応免疫の重要なメディエーターである。多くのサイトカインが、患者、例えば、進行癌患者に治療目的で使用されているが、これらの投与は、典型的には、重度の毒性、治療効果のある投与計画への用量増加の阻害、及び、例えば、抗癌剤としてのこれらの開発に関連する。これらの問題を解消するために、正常な組織に害を与えることなく、病変部位に免疫系刺激活性を集中させることを目的として、「免疫サイトカイン」（即ち、抗体又は抗体断片に融合したサイトカイン）の使用が提案された（Ｓａｖａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｓｃｈｒａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００５；Ｄｅｌａ  Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０００３】
例えば、いくつかの炎症性免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＴＮＦをベースとするサイトカイン）は、癌のマウスモデルで強力な抗腫瘍効果を提示することが示された（Ｂｏｒｓｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３；Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｋａｓｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｐａｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。対照的に、抗炎症性免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ１０をベースとするサイトカイン）は、慢性炎症性疾患（関節リウマチ、子宮内膜症［Ｓｃｈｗａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１１；Ｓｃｈｗａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９］）のマウスモデルにおいて治療効果を与えることができるが、腫瘍の増殖には影響を与えないことが示されている。
【０００４】
フィブロネクチンのスプライスアイソフォーム及びテネイシンＣのスプライスアイソフォームに特定的な抗体は、大部分の充実性腫瘍及びリンパ腫並びに他の疾患で強く発現されるが、通常の健康な成人では（胎盤、子宮内膜、及び卵巣の一部の脈管を除いて）事実上検出不可能であるため、これらの抗体は、薬物送達（ｐｈａｒｍａｃｏｄｅｌｉｖｅｒｙ）の用途に用いられるビヒクルとして説明されている（Ｂｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｐｅｄｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｓｃｈｌｉｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。例えば、フィブロネクチンの選択的にスプライシングされたＥＤＡ及びＥＤＢドメインのそれぞれに特異的な抗体Ｆ８及びＬ１９、並びに抗テネイシンＣ抗体Ｆ１６（Ｂｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．２００６、Ｖｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）は、武装抗体の開発に利用され、武装抗体の一部は、腫瘍学及びリウマチ学において臨床試験が始まっている（Ｅｉｇｅｎｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｐａｐａｄｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。これらの抗体の腫瘍標的特性が、癌のマウスモデル及び患者で立証されている。
【０００５】
インターロイキン２２（ＩＬ２２）は、ＩＬ−１０ファミリーに属する１７ｋＤａの球形サイトカインであり、ＮＫ細胞、樹状細胞、及びＴ細胞によって主に分泌される（Ｍｕｒｐｈｙ  ２０１２）。ＩＬ２２は、２つの分子内ジスルフィド結合及び３つのＮ結合型グリコシル化部位を含む。ＩＬ２２の生物学的機能には、組織防御、自己免疫、及び炎症における関与が含まれる。腸における固有層エフェクターＴ細胞によって分泌され、ＩＬ２２は、ムチンの産生、抗菌性、増殖、及び抗アポトーシス経路を誘導し、これにより、組織の損傷が防止されて上皮修復が促進される（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。本発明者らは、ＩＬ２２が血管標的抗体にうまく融合できるか否かを調べた。
【０００６】
サイトカインは、上述されたように抗体分子にコンジュゲートして免疫サイトカインを産生することができる。しかしながら、全ての免疫サイトカインが、例えば、親抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ標的特性（Ｐａｓｃｈｅ  ＆  Ｎｅｒｉ  ２０１２）又は期待される活性を維持するわけではない。従って、治療効果、例えば、抗炎症活性を有する免疫サイトカインの調製は、決して容易ではない。
【０００７】
マウスＩＬ２２のＮ末端又はＣ末端に融合されたマウスＩｇＧ１  Ｆｃを含むコンジュゲートの調製は、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）に記載されている。これらのコンジュゲートは、ｒＩＬ−２２と比較してより強力でより長く持続するＩＬ−２２Ｒアゴニストを提供することを目的として調製した。従って、この場合のＦｃ領域の目的は、前の段落で説明された免疫サイトカインの場合と同様にＩＬ２２が疾患の領域を標的にしないことであった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＩＬ２２が、非コンジュゲート抗体の標的特性を維持するだけではなくＩＬ２２の生物活性も維持したまま、ＥＤ−Ａに結合する抗体にコンジュゲートできることを示した。
【０００９】
従って、一態様では、本発明は、インターロイキン２２（ＩＬ２２）、及び血管形成に関連した抗原に結合する抗体分子又はその抗原結合断片を含むコンジュゲートに関する。本発明はまた、このようなコンジュゲートをコードする核酸分子、及びこのような核酸を含む発現ベクターにも関する。このようなベクターを含む宿主細胞も企図される。
【００１０】
本発明は、療法によるヒトの体の処置のための方法に使用される本発明のコンジュゲートにも関する。例えば、本発明は、患者の自己免疫疾患を処置する方法に使用される本発明のコンジュゲート、及び患者の自己免疫疾患の部位へのＩＬ２２の送達に使用される本発明のコンジュゲートに関する。治療有効量の本発明のコンジュゲートを患者に投与するステップを含む、患者の自己免疫疾患を処置する方法も、本発明のコンジュゲートを患者に投与するステップを含む、患者の自己免疫疾患の部位にＩＬ２２を送達する方法と同様に本発明の一部を構成する。
【００１１】
本発明は、患者の炎症を処置する方法に使用される本発明のコンジュゲート、及び患者の炎症部位へのＩＬ２２の送達に使用される本発明のコンジュゲートに更に関する。治療有効量の本発明のコンジュゲートを患者に投与するステップを含む、患者の炎症を処置する方法も、本発明のコンジュゲートを患者に投与するステップを含む、患者の炎症部位にＩＬ２２を送達する方法と同様に本発明の一部を構成する。炎症は、好ましくは、炎症性疾患及び／又は障害の結果である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ｍｕＩＬ２２−Ｆ８（図１Ａ）及びＦ８−ｍｕＩＬ２２コンジュゲート（図１Ｂ）を発現させるために使用される哺乳動物細胞発現ベクターの概略図を示している。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂはそれぞれ、還元条件及び非還元条件下（それぞれレーン１及び２）、及びＰＮＧａｓｅ  Ｆの存在化下（それぞれレーン３及び４）、ｍｕＩＬ２２−Ｆ８及びＦ８−ｍｕＩＬ２２コンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示している。図２Ｃ及び図２Ｄはそれぞれ、ｍｕＩＬ２２−Ｆ８及びＦ８−ｍｕＩＬ２２コンジュゲートのサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示している。１つのピークのみが確認されたという事実は、コンジュゲート調製物の均質性を裏付けている。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂはそれぞれ、ＥＤ−Ａ被覆チップ並びにｍｕＩＬ２２−Ｆ８及びＦ８−ｍｕＩＬ２２融合タンパク質をそれぞれ用いた表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）の結果を示し、ｍｕＩＬ２２−Ｆ８及びＦ８−ｍｕＩＬ２２融合タンパク質がＥＤ−Ａに結合できることを実証している。図３Ｃ及び図３Ｄはそれぞれ、ＥＤ−Ａ被覆ウェル並びにｍｕＩＬ２２−Ｆ８及びＦ８−ｍｕＩＬ２２融合タンパク質をそれぞれ用いたＥＬＩＳＡの結果を示し、ｍｕＩＬ２２−Ｆ８及びＦ８−ｍｕＩＬ２２融合タンパク質がＥＤ−Ａに結合できることを更に裏付けている。
【図４】図４は、Ｆ８−ｍｕＩＬ２２及びｍｕＩＬ２２−Ｆ８融合タンパク質を用いた生物活性アッセイの結果を示し、Ｆ８−ｍｕＩＬ２２及びｍｕＩＬ２２−Ｆ８融合タンパク質中のｍｕＩＬ２２が、結腸癌細胞の受容体に結合したときにＳＴＡＴ３のリン酸化を誘導する能力を維持することを実証している。実験に利用される融合タンパク質の濃度（５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、及び０．０５μｇ／ｍｌ）は、図面の上部に示されている。「Ｏ」は、陰性対照を含むレーンを示している。リン酸化ＳＴＡＴ３に一致するバンドの位置が示されている。
【図５】図５は、Ｆ９担癌マウスにおけるｍｕＩＬ２２−Ｆ８及びＦ８−ｍｕＩＬ２２融合タンパク質を用いた腫瘍標的試験の結果を示している。融合タンパク質は、腫瘍新生血管でＥＤ−Ａを発現することが分かっている腫瘍組織に主に局在化し、ＥＤ−Ａの発現が期待されていないマウスの他の（健常な）組織では最少量の融合タンパク質しか見られない。ｙ軸は、組織１グラム当たりの融合タンパク質の注射用量のパーセンテージを示している（％ＩＤ／ｇ）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
抗体分子
これは、天然であるか又は部分的に若しくは完全に合成により生産されるかにかかわらない免疫グロブリンを説明する。この用語は、抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチド又はタンパク質にも関する。本明細書では、抗体分子が、天然の供給源から単離する又はその精製によって得てもよいし、又は遺伝子組み換え若しくは化学合成によって得てもよいこと、及び抗体分子が非天然のアミノ酸を含み得ることを理解されたい。
【００１４】
抗体は、多数の方法で改変できるため、「抗体分子」という用語は、抗原に対する要求される特異性及び／又は結合性を有する抗体抗原結合部位を有するあらゆる特異的な結合メンバー又は基質を包含すると解釈されるべきである。従って、この用語は、天然であるか又は完全に若しくは部分的に合成であるかにかかわらない抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを含む、抗体断片、特に抗原結合断片、及び誘導体を包含する。従って、別のポリペプチド（例えば、別の抗体クラス又はサブクラスに属する）に融合した、抗体抗原結合部位を含むキメラ分子又はその等価物も含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は、欧州特許公開第Ａ−０１２０６９４号明細書及び同第Ａ−０１２５０２３号明細書、並びに多数の以下の文献に記載されている。
【００１５】
上述のように、全長抗体の断片は、抗原に結合する機能を果たすことができる。結合する断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨ又はＶＬドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２−５５４；Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１，４８４−４９０）；（ｖ）単離ＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価の断片、（ｖｉｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、この２つのドメインを会合させて抗原結合部位を形成することができるアミノ酸リンカーによって連結されている、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３）；（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５号明細書）、及び（ｉｘ）「ダイアボディ」、遺伝子融合によって構築される多価又は多重特異性断片（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３ａ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８）が挙げられる。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又はダイアボディ分子は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを連結するジスルフィドブリッジの組み込みによって安定させることができる（Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９−１２４５）。ＣＨ３ドメインに結合されたｓｃＦｖを含むミニボディも作製することができる（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６（１３）：３０５５−６１）。結合断片の他の例としては、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における２、３の残基の付加によりＦａｂ断片とは異なるＦａｂ’、及び定常領域のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片であるＦａｂ’−ＳＨが挙げられる。
【００１６】
本発明に使用される抗体分子又は本発明のコンジュゲートの半減期は、化学修飾によって、特にＰＥＧ化によって、又はリポソームに含めることによって長くすることができる。
【００１７】
本発明に使用される抗体分子は、好ましくは、ｓｃＦｖであるか又はｓｃＦｖを含む。例えば、ダイアボディは、２つのｓｃＦｖ分子を含む。最も好ましくは、本発明に使用される抗体分子はダイアボディである。ダイアボディ及びｓｃＦｖは、抗体Ｆｃ領域を含まないため、抗体−イディオタイプ反応の効果を低下させる可能性がある。
【００１８】
抗体分子がダイアボディである場合は、ＶＨ及びＶＬドメインは、好ましくは、５〜１２個のアミノ酸リンカーによって連結される。ダイアボディは、会合して二量体を形成する２つのＶＨ−ＶＬ分子を含む。各ＶＨ−ＶＬ分子のＶＨ及びＶＬドメインは、好ましくは、５〜１２個のアミノ酸リンカーによって連結される。例えば、ＶＨ及びＶＬドメインは、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個のアミノ酸長であるアミノ酸リンカーによって連結することができる。好ましくは、アミノ酸リンカーは、５個のアミノ酸長である。適切なリンカー配列は、当技術分野で公知であり、配列番号９に示されているリンカー配列を含む。
【００１９】
抗体分子がｓｃＦｖである場合は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインは、好ましくは、１４〜２０個のアミノ酸リンカーによって連結される。例えば、ＶＨ及びＶＬドメインは、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、又は２０個のアミノ酸長であるアミノ酸リンカーによって連結することができる。適切なリンカー配列は、当技術分野で公知であり、配列番号４３に示されているリンカー配列を含む。
【００２０】
本発明者らは、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤ−Ａ）に結合する抗体分子及びＩＬ２２を含むコンジュゲートが、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍組織をうまく特異的に標的とすることができることを示した。フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームは、新生血管、例えば、腫瘍では見られるが健康な組織では見られない新生血管で発現されることが分かっている。従って、このデータは、フィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合する抗体分子及びＩＬ２２を含むコンジュゲートを使用して血管形成の部位を標的とすることができるというエビデンスを提供する。従って、ＩＬ２２コンジュゲートは、個人の炎症及び自己免疫疾患を処置するのに適している。多くの自己免疫疾患、及び炎症に関連した疾患は、血管形成に関与すること、及び／又は血管形成によって特徴付けられることが分かっている。
【００２１】
血管形成に関連した抗原に結合する抗体分子及びＩＬ２２を含む他のコンジュゲートも同様に、ＩＬ２２が血管形成の部位を標的にするのに適しており、従って、自己免疫疾患及び／又は炎症の処置に応用されることが期待される。多くのこのような抗原は、当技術分野で公知であり、このような抗原に結合できる抗体と同様である。加えて、所与の抗原に対する抗体は、周知の方法、例えば、本明細書に記載される方法を用いて作製することができる。一例では、抗原は、血管形成に関連した細胞外マトリックス成分、例えば、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤ−Ａ）アイソフォーム（Ａ−ＦＮ）、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）アイソフォーム（Ｂ−ＦＮ）、テネイシンＣ、フィブロネクチンのＥＤ−Ａ、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、又はテネイシンＣのＡ１ドメインを含むフィブロネクチンであり得る。フィブロネクチンのＥＤ−Ａ、従ってＡ−ＦＮにも結合する抗体は、当技術分野で公知であり、抗体Ｆ８を含む。フィブロネクチンのＥＤ−Ｂに結合する抗体、又はテネイシンＣのＡ１ドメイン（従ってＢ−ＦＮ及びテネイシンＣも）も、当技術分野で公知であり、それぞれ抗体Ｌ１９及びＦ１６を含む。抗体Ｌ１９及びＦ１６を含む、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ又はテネイシンＣのＡ１ドメインに結合する抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで新生血管を特異的に標的とすることができることが示されている。従って、Ｂ−ＦＮ、テネイシンＣ、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、又はテネイシンＣのＡ１ドメインに結合する抗体分子及びＩＬ２２を含むコンジュゲートは、本明細書で抗体Ｆ８を用いて実証されたように、Ａ−ＦＮに結合する抗体分子及びＩＬ２２を含むコンジュゲートと同じ方法でＩＬ２２が新生血管を標的とすることができ、従って自己免疫疾患及び／又は炎症の処置に応用されることが期待される。
【００２２】
従って、本発明に使用される抗体分子は、血管新生に関連した抗原に結合する。好ましくは、本発明に使用される抗体分子は、血管新生に関連した細胞外マトリックス成分、例えば、Ａ−ＦＮ、Ｂ−ＦＮ、テネイシンＣ、フィブロネクチンのＥＤ−Ａ、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、又はテネイシンＣのＡ１ドメインに結合する。より好ましくは、本発明に使用される抗体分子は、Ａ−ＦＮ又はフィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合する。最も好ましくは、本発明に使用される抗体分子は、フィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合する。
【００２３】
好ましい一実施形態では、本発明に使用される抗体分子は、本明細書に記載される抗体Ｆ８、Ｌ１９、又はＦ１６のＣＤＲ及び／又はＶＨ及び／又はＶＬドメインを有し得る。本発明に使用される抗体分子は、好ましくは、配列番号１〜６に示されている抗体Ｆ８のＣＤＲを有する。より好ましくは、本発明に使用される抗体は、配列番号７及び８に示されている抗体Ｆ８のＶＨ及び／又はＶＬドメインを含む。なお更に好ましくは、本発明に使用される抗体は、配列番号７及び８に示されている抗体Ｆ８のＶＨ及びＶＬドメインを含む。Ｆ８抗体は、好ましくは、ダイアボディ又はｓｃＦｖの形態であり、最も好ましくは、ダイアボディの形態である。Ｆ８抗体がダイアボディの形態である場合は、本発明に使用される抗体分子は、好ましくは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２４】
本発明に使用される抗体分子は、例えばダイアボディの形態の抗ＥＤ−Ａ抗体Ｆ８と同じ親和性で、又はより良い親和性でＡ−ＦＮ及び／又はフィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合し得る。本発明に使用される抗体分子は、例えばダイアボディの形態の抗ＥＤ−Ｂ抗体Ｌ１９と同じ親和性で、又はより良い親和性でＢ−ＦＮ及び／又はフィブロネクチンのＥＤ−Ｂに結合し得る。本発明に使用される抗体分子は、例えばダイアボディの形態の抗ＥＤ−Ａ抗体Ｆ１６と同じ親和性で、又はより良い親和性でテネイシンＣ及び／又はテネイシンＣのＡ１ドメインに結合し得る。
【００２５】
本発明に使用される抗体分子は、抗ＥＤ−Ａ抗体Ｆ８と同じ、Ａ−ＦＮ及び／又はフィブロネクチンのＥＤ−Ａのエピトープに結合し得る。本発明に使用される抗体分子は、抗ＥＤ−Ａ抗体Ｌ１９と同じ、Ｂ−ＦＮ及び／又はフィブロネクチンのＥＤ−Ｂのエピトープに結合し得る。本発明に使用される抗体分子は、抗体Ｆ１６と同じ、テネイシンＣ及び／又はテネイシンＣのＡ１ドメインのエピトープに結合し得る。
【００２６】
本明細書に開示される抗体分子の変異体を作製して、これを本発明に使用することができる。ＣＤＲ、抗体ＶＨ又はＶＬドメイン、特にＶＨ及びＶＬドメインのフレームワーク領域、及び抗体分子のアミノ酸配列内で置換を行うために必要な技術は、一般に当技術分野で利用可能である。変異体配列は、活性に対して最小限の又は有利な効果を有することが予測されてもされなくてもよい置換で作製することができ、かつＡ−ＦＮ及び／若しくはフィブロネクチンのＥＤ−Ａ、Ｂ−ＦＮ及び／若しくはフィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、テネイシンＣ及び／若しくはテネイシンＣのＡ１ドメインに結合する能力について、並びに／又はその他の所望の特性について試験することができる。
【００２７】
１〜５個、例えば、１〜３個、又は１個若しくは２個、又は３個若しくは４個を含む１〜４個のアミノ酸の変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換、及び／又は挿入）を、本明細書に記載されるように抗体分子のＣＤＲ及び／又はＶＨ及び／又はＶＬドメインの１つ以上で行うことができることが企図される。従って、ＦＮ−Ａ、ＦＮ−Ｂ、又はテネイシンＣに結合する抗体分子は、本明細書に記載される抗体Ｆ８、Ｌ１９、又はＦ１６のＣＤＲ及び／又はＶＨ及び／又はＶＬドメインを含み得、これらのＣＤＲ及び／又はＶＨ及び／又はＶＬドメイン内に５個以下、例えば、５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸の変更を有する。例えば、ＦＮ−Ａ、ＦＮ−Ｂ、又はテネイシンＣに結合する抗体分子は、本明細書に記載される抗体Ｆ８、Ｌ１９、又はＦ１６のＶＨ及び／又はＶＬドメインを含み得、これらのＶＨ及び／又はＶＬドメインのフレームワーク領域内に５個以下、例えば、５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸の変更を有する。従って、本明細書で言及されるＦＮ−Ａ又はフィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合する抗体分子は、配列番号７に示されているＶＨドメイン及び／又は配列番号８に示されているＶＬドメインを含み得、これらのＶＨ及び／又はＶＬドメインのフレームワーク領域内に５個以下、例えば、５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸の変更を有する。このような抗体分子は、配列番号７に示されているＶＨドメイン及び配列番号８に示されているＶＬドメインを含む抗体分子と同じ又は実質的に同じ親和性でフィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォーム又はＥＤ−Ａに結合し得る、又は配列番号７に示されているＶＨドメイン及び配列番号８に示されているＶＬドメインを含む抗体分子よりも高い親和性でフィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォーム又はＥＤ−Ａに結合し得る。
【００２８】
本発明に使用される抗体分子は、適切な場合には、配列番号７、８、３１、３２、４０、及び４１に示されている抗体Ｆ８、Ｌ１９、又はＦ１６のＶＨ及び／又はＶＬドメインに対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のうちの１つの配列同一性を有するＶＨ及び／又はＶＬドメインを含み得る。本発明に使用される抗体分子は、配列番号１０、３３、及び４２のそれぞれに示されるＦ８、Ｌ１９、又はＦ１６抗体のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のうちの１つの配列同一性を有し得る。
【００２９】
配列同一性は、一般的には、アルゴリズムＧＡＰ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧ  ｐａｃｋａｇｅ，Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ  Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＵＳＡ）に基づいて決定される。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して、一致の数を最大にし、かつギャップの数を最小にするように２つの完全な配列を整列させる。一般に、ギャップ形成ペナルティー＝１２及びギャップ伸長ペネルティー＝４のデフォルトパラメーターが使用される。ＧＡＰの使用が好ましい場合もあるが、他のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５−４１０の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８の方法を使用する）、又はＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）、又は一般的にはデフォルトパラメーターを利用する上記のＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）のＴＢＬＡＳＴＮプログラムも使用することができる。特に、ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔアルゴリズム（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９７）２５  ３３８９−３４０２）を使用することができる。
【００３０】
抗原結合部位
これは、標的抗原に結合し、かつその全て又は一部に相補的である分子の一部を説明する。ある抗体分子では、抗原結合部位は、抗体抗原結合部位と呼ばれ、そして標的抗原に結合し、かつその全て又は一部に相補的である抗体の一部を含む。抗原が大きい場合は、抗体は、抗原の特定の部分のみに結合することができ、この部分はエピトープと呼ばれる。抗体抗原結合部位は、１つ以上の抗体可変ドメインによって提供することができる。抗体抗原結合部位は、好ましくは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００３１】
抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列によって提供することができる。ＣＤＲ又はＣＤＲのセットを有するための構造は、一般に、抗体の重鎖又は軽鎖の配列又はそれらのかなりの部分であり、このＣＤＲ又はＣＤＲのセットは、再配列された免疫グロブリン遺伝子によってコードされる自然に存在するＶＨ及びＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲ又はＣＤＲのセットに一致する位置に存在する。免疫グロブリン可変ドメインの構造及び位置は、現在インターネット（ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ、又は任意の検索エンジンを用いて「Ｋａｂａｔ」で見つかる）上で利用可能なＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．）及びその最新情報を参照して決定することができる。
【００３２】
ＣＤＲ領域又はＣＤＲとは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１ａ），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，および後版）によって定義される免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の超可変領域を示すものとする。抗体は、典型的には、３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む。ＣＤＲ又は複数のＣＤＲという用語は、場合により、抗体が認識する抗原又はエピトープに対する抗体の親和性による結合に関与するアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域の１つ、又はこれらの領域のいくつか若しくは全てを示すために本明細書で使用される。
【００３３】
６つの短いＣＤＲ配列のうち、重鎖の第３のＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）は、より大きいサイズ変動性（本質的に、多様性を生み出す遺伝子の配列の機構によるより大きな多様性）を有する。ＨＣＤＲ３は、２個のアミノ酸長の短さであり得るが、知られている最長のサイズは２６個である。機能的に、ＨＣＤＲ３は、抗体の特異性の決定にある程度関与する（Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７４），ＰＮＡＳ，７１：４２９８−４３０２；Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７−７５３；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３；Ｃａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：１９６５−１９６８；Ｓｈａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０ａ），ＰＮＡＳ，８７：４８１４−４８１７；Ｓｈａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０ｂ），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：４８６３−４８６９；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１ｂ），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：１７０９−１７１９）。
【００３４】
本発明に使用される抗体分子の一部を形成する抗原結合部位は、好ましくは、配列番号１〜６に示されている抗体Ｆ８のＣＤＲ、配列番号２５〜３０に示されている抗体Ｌ１９のＣＤＲ、又は配列番号３４〜３９に示されている抗体Ｆ１６のＣＤＲを有する。最も好ましくは、本発明に使用される抗体分子の一部を形成する抗原結合部位は、配列番号１〜６に示されている抗体Ｆ８のＣＤＲを有する。
【００３５】
抗体分子の調製及び選択
標的抗原に対する抗体分子を得るための様々な方法が当技術分野で利用可能である。本発明に使用される抗体分子は、好ましくは、当業者に周知の標準的な方法に従って得ることができる特にヒト、マウス、キメラ、又はヒト由来のモノクローナル抗体である。本発明に使用される抗体分子は、最も好ましくは、ヒト抗体分子である。
【００３６】
モノクローナル抗体及び他の抗体を使用し、組換えＤＮＡ技術を用いて標的抗原に結合する他の抗体又はキメラ分子を作製することが可能である。このような技術は、抗体分子の免疫グロブリン可変領域又はＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域又は定常領域及びフレームワーク領域に導入するステップを含み得る。例えば、欧州特許出願公開第Ａ−１８４１８７号明細書、英国特許出願公開第２１８８６３８Ａ号明細書、又は欧州特許出願公開第Ａ−２３９４００号明細書、及び多数の以下の文献を参照されたい。ハイブリドーマ又は抗体を産生する他の細胞も、産生される抗体の結合特異性を変更してもしなくてもよい遺伝子変異又は他の変化を受け得る。
【００３７】
抗体エンジニアリングの分野で利用可能な技術は、ヒト抗体及びヒト化抗体を単離することを可能にした。例えば、ヒトハイブリドーマは、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＆  Ｄｕｂｅｌ（２００１），Ｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＬＬＣ；ＩＳＢＮ：３５４０４１３５４５に記載されているように作製することができる。ファージディスプレイ、特異的結合メンバーを作製するための別の確立された技術は、多数の公開文献、例えば、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット（以下に詳述）、及び米国特許第５９６９１０８号明細書、同第５５６５３３２号明細書、同第５７３３７４３号明細書、同第５８５８６５７号明細書、同第５８７１９０７号明細書、同第５８７２２１５号明細書、同第５８８５７９３号明細書、同第５９６２２５５号明細書、同第６１４０４７１号明細書、同第６１７２１９７号明細書、同第６２２５４４７号明細書、同第６２９１６５０号明細書、同第６４９２１６０号明細書、同第６５２１４０４号明細書、及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＆  Ｄｕｂｅｌ（２００１），Ｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＬＬＣ；ＩＳＢＮ：３５４０４１３５４５に詳細に記載されている。マウス抗体遺伝子が不活化されて、ヒト抗体遺伝子で機能的に置換されたが、マウス免疫系の他の成分がそのまま残されたトランスジェニックマウスを、ヒト抗体を単離するために使用することができる（Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ，１５（２）：１４６−１５６）。
【００３８】
一般に、特にマウス由来のモノクローナル抗体又はその機能的な断片の調製では、特にマニュアル「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．７２６，１９８８）に記載されている技術、又はＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７に記載されているハイブリドーマからの調製技術を参照することが可能である。
【００３９】
モノクローナル抗体は、通常の作業方法に従って、例えば、血管形成に関連した抗原、例えば、Ａ−ＦＮ、Ｂ−ＦＮ、テネイシンＣ、フィブロネクチンのＥＤ−Ａ、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、若しくはテネイシンＣのＡ１ドメインに対して免疫化された動物細胞から、Ａ−ＦＮ、Ｂ−ＦＮ、若しくはテネイシンＣ、若しくはそれらの断片をコードするｃＤＮＡ配列に含められた核酸配列で始まる遺伝子組み換えによって、又は、Ａ−ＦＮ、Ｂ−ＦＮ、若しくはテネイシンＣ、及び／若しくはそれらの断片のペプチド配列に含められたアミノ酸配列から始まるペプチド合成によって得ることができる。
【００４０】
合成抗体分子は、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６，５７−８６、又はＫｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５４  ６７−８４に記載されているように、適切な発現ベクター内で合成され構築されるオリゴヌクレオチドによって作製される遺伝子からの発現によって産生することができる。
【００４１】
別法では、血管形成に関連した抗原、例えば、Ａ−ＦＮ、ＥＤ−Ａ、Ｂ−ＦＮ、ＥＤ−Ｂ、テネイシンＣ、又はテネイシンＣのＡ１ドメインに対する１つ以上の抗体分子を、抗体分子のライブラリー及び抗原又はその断片、例えば、ＥＤ−Ａ、ＥＤ−Ｂ、又はテネイシンＣのＡ１ドメインを含む若しくはこれらからなる断片、又はそのペプチド断片に接触させて、そして抗原に結合できるライブラリーの１つ以上の抗体分子を選択することによって得ることができる。
【００４２】
抗体ライブラリーは、反復コロニーフィルタースクリーニング（ＩＣＦＳ：Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を用いてスクリーニングすることができる。ＩＣＦＳでは、いくつかの結合特異性をコードするＤＮＡを含む細菌を液体培地で増殖させ、指数増殖の段階に達したら、数十億個の細菌を、適切に前処置された膜フィルターからなる増殖支持体に載せ、完全にコンフルエントな細菌コロニーが出現するまでインキュベートする。第２の捕捉支持体は、予備湿潤されて、所望の抗原で覆われた別の膜フィルターからなる。
【００４３】
次いで、捕捉膜フィルターを、適切な培養培地を含むプレートに載せ、細菌コロニーで覆われた表面を上に向けて増殖フィルターで覆う。このように得られたサンドイッチを、室温で約１６時間インキュベートする。従って、拡散作用を有する抗体断片ｓｃＦｖをコードする遺伝子の発現を達成し、これにより、捕捉膜上に存在する抗原に特異的に結合するこれらの断片を捕捉することが可能である。次いで、捕捉膜を処置して、このために一般的に使用される比色技術を用いて結合した抗体断片ｓｃＦｖを示すことができる。
【００４４】
捕捉フィルター上の着色されたスポットの位置により、増殖膜上に存在し、捕捉された抗体断片を産生した一致する細菌コロニーに戻ることができる。このようなコロニーを収集して増殖させ、コロニーの数百万個の細菌を新しい培養膜に載せ、上記の手順を繰り返す。次いで、捕捉膜上の陽性シグナルが単一陽性コロニーに一致するまで類似のサイクルを実行し、これらのコロニーのそれぞれが、選択に使用される抗原に対するモノクローナル抗体断片の潜在的な供給源を意味する。ＩＣＦＳは、国際公開第０２４６４５５号パンフレットに記載されている。
【００４５】
ライブラリーはまた、粒子又は分子複合体、例えば、バクテリオファージ（例えば、Ｔ７）粒子のような複製可能な遺伝子パッケージ、又は他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ提示系に提示することもでき、それぞれの粒子又は分子複合体は、その表面に提示される抗体ＶＨ可変ドメインをコードし、かつ任意選択により、存在する場合は提示されるＶＬドメインもコードする核酸を含む。ファージディスプレイは、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、並びに、例えば、米国特許第５９６９１０８号明細書、同第５５６５３３２号明細書、同第５７３３７４３号明細書、同第５８５８６５７号明細書、同第５８７１９０７号明細書、同第５８７２２１５号明細書、同第５８８５７９３号明細書、同第５９６２２５５号明細書、同第６１４０４７１号明細書、同第６１７２１９７号明細書、同第６２２５４４７号明細書、同第６２９１６５０号明細書、同第６４９２１６０号明細書、及び同第６５２１４０４号明細書に記載されている。
【００４６】
抗原に結合して、バクテリオファージ又は他のライブラリー粒子又は分子複合体上に提示され得る抗体分子の選択後に、核酸を、前記選択された抗体分子を提示するバクテリオファージ又は他の粒子又は分子複合体から得ることができる。このような核酸を、前記選択された抗体分子を提示するバクテリオファージ又は他の粒子又は分子複合体から得られた核酸の配列を有する核酸からの発現による抗体分子又は抗体ＶＨ若しくはＶＬ可変ドメインの次の作製に使用することができる。
【００４７】
血管形成に関連した抗原、例えば、Ａ−ＦＮ、Ｂ−ＦＮ、フィブロネクチンのＥＤ−Ａ若しくはＥＤ−Ｂ、テネイシンＣ、若しくはテネイシンＣのＡ１ドメイン、又は他の標的抗原又はアイソフォームに結合する能力、例えば、Ａ−ＦＮ、Ｂ−ＦＮ、フィブロネクチンのＥＤ−Ａ又はＥＤ−Ｂ、テネイシンＣ、又はテネイシンＣのＡ１ドメインに特異的な抗体、例えば、抗体Ｆ８、Ｌ１９、又はＦ１６と競合する能力を更に試験することができる。
【００４８】
本発明に使用されるＣＤＲ由来配列を有する新規なＶＨ又はＶＬ領域も、１つ以上の選択されたＶＨ及び／又はＶＬ遺伝子のランダム変異を用いて全可変ドメイン内に変異を生じさせて作製することができる。一部の実施形態では、１つ又は２つのアミノ酸置換が、全可変ドメイン又はＣＤＲのセット内で行われる。使用できる別の方法では、ＶＨ又はＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に変異を誘導する。
【００４９】
本発明に利用される可変ドメインは、任意の生殖細胞系又は再配列ヒト可変ドメインから得る若しくは由来してもよいし、又は既知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列若しくは実際の配列に基づいた合成可変ドメインでもよい。可変ドメインは、非ヒト抗体に由来し得る。本発明に使用されるＣＤＲ配列（例えば、ＣＤＲ３）は、組換えＤＮＡ技術を用いて、ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）が欠損している可変ドメインのレパートリーに導入することができる。例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）は、抗体可変ドメインのレパートリーを作製する方法を記載し、この方法では、可変ドメイン領域の５’末端に又はその近傍に向けられるコンセンサスプライマーを、ヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと共に使用して、ＣＤＲ３が欠損したＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供する。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．は、このレパートリーを特定の抗体のＣＤＲ３とどのように組み合わせることができるかを更に記載している。類似の技術を用いて、本発明のＣＤＲ３由来配列を、ＣＤＲ３が欠損したＶＨ又はＶＬドメインのレパートリーと混合し、そして混合された完全なＶＨ又はＶＬドメインを同種のＶＬ又はＶＨドメインと組み合わせて、本発明に使用される抗体分子を提供することができる。次いで、レパートリーを適切な宿主系、例えば、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、又はＫａｙ，Ｗｉｎｔｅｒ  ＆  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ（１９９６）を含む以下の多数の文献のいずれかのファージディスプレイ系に提示することができ、これにより、適切な抗体分子を選択することができる。レパートリーは、１０４個の個々のメンバー以上のいずれか、例えば、少なくとも１０５個、少なくとも１０６個、少なくとも１０７個、少なくとも１０８個、少なくとも１０９個、又は少なくとも１０１０個のメンバーからなり得る。
【００５０】
血管形成に関連した抗原、例えば、Ａ−ＦＮ、Ｂ−ＦＮ、フィブロネクチンのＥＤ−Ａ又はＥＤ−Ｂ、テネイシンＣ、又はテネイシンＣのＡ１ドメインは、抗体分子、例えば、本発明に使用される抗体分子のスクリーニングに使用することができる。スクリーニングは、本明細書の他の部分で開示されるレパートリーのスクリーニングであり得る。
【００５１】
同様に、１つ以上又は３つ全てのＣＤＲをＶＨ又はＶＬドメインのレパートリーにグラフトして、次いで、これらを、血管形成に関連した抗原、例えば、Ａ−ＦＮ、Ｂ−ＦＮ、フィブロネクチンのＥＤ−Ａ又はＥＤ−Ｂ、テネイシンＣ、又はテネイシンＣのＡ１ドメインに対する１つ又は複数の抗体分子についてスクリーニングすることができる。抗体Ｆ８、Ｌ１９、若しくはＦ１６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の１つ以上、又は抗体Ｆ８、Ｌ１９、若しくはＦ１６のＨＣＤＲのセットを利用してもよいし、かつ／又は抗体Ｆ８、Ｌ１９、若しくはＦ１６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の１つ以上、又は抗体Ｆ８、Ｌ１９、若しくはＦ１６のＬＣＤＲのセットを利用してもよい。
【００５２】
かなりの割合の免疫グロブリンン可変ドメインが、少なくとも３つのＣＤＲ領域を、それらの介在フレームワーク領域と共に含み得る。この割合は、第１及び第４のフレームワーク領域のいずれか又は両方の少なくとも約５０％も含み得、この５０％は、第１のフレームワーク領域のＣ末端の５０％及び第４のフレームワーク領域のＮ末端の５０％である。かなりの割合の可変ドメインのＮ末端又はＣ末端における追加の残基は、自然に存在する可変ドメイン領域に通常は関連していない残基であり得る。例えば、組換えＤＮＡ技術によって行われる本発明の抗体分子の構築は、クローニング又は他の操作ステップを容易にするために導入されるリンカーによってコードされるＮ末端残基又はＣ末端残基の導入をもたらし得る。他の操作ステップは、抗体定常領域、他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディの作製における）、又は本明細書の他の部分でより詳細に述べられる検出可能な／機能的な標識を含む更なるタンパク質配列に本明細書の他の部分に開示される可変ドメインを結合するためのリンカーの導入を含む。
【００５３】
抗体分子は、一対のＶＨ及びＶＬドメインを含み得るが、ＶＨ又はＶＬドメイン配列のいずれかに基づいた単一結合ドメインを本発明に使用してもよい。単一免疫グロブリンドメイン、特にＶＨドメインは、特定の方式で標的抗原に結合できることが分かっている。例えば、上記のｄＡｂの記述を参照されたい。
【００５４】
単一結合ドメインのいずれかの場合には、これらのドメインを使用して、血管形成に関連した抗原、例えば、Ａ−ＦＮ、Ｂ−ＦＮ、フィブロネクチンのＥＤ−Ａ又はＥＤ−Ｂ、テネイシンＣ、又はテネイシンＣのＡ１ドメインに結合し得る２ドメイン抗体分子を形成することができる相補的なドメインについてスクリーニングすることができる。これは、国際公開第９２／０１０４７号パンフレットに開示されている、いわゆる階層的な二重組み合わせアプローチを用いるファージディスプレイスクリーニング法によって達成することができ、このアプローチでは、Ｈ鎖クローン又はＬ鎖クローンのいずれかを含む個々のコロニーを使用して、他方の鎖（Ｌ又はＨ）をコードするクローンの完全なライブラリーを感染させ、得られる二本鎖抗体分子を、ファージディスプレイ技術、例えば、本参照文献に記載される技術に従って選択する。この技術は、Ｍａｒｋｓ  １９９２にも開示されている。
【００５５】
本発明に使用される全長抗体の断片は、酵素、例えば、ペプシン又はパパインによる消化のような方法によって、及び／又は化学的還元によるジスルフィドブリッジの切断によって、本明細書に開示される任意の抗体分子、例えば、本明細書に記載される任意の抗体のＶＨ及び／又はＶＬドメイン又はＣＤＲを含む抗体分子から開始して得ることができる。別の方式では、抗体断片は、当業者に周知の技術と同様の遺伝子組み換え技術によって、又は、例えば、自動ペプチドシンセサイザー、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社などによって供給されるペプチドシンセサイザーによるペプチド合成によって、又は核酸の合成及び発現によって得ることができる。
【００５６】
コンジュゲート
本明細書に記載されるように、本発明によるコンジュゲートは、ＩＬ２２、及び本血管形成に関連した抗原に結合する抗体分子を含む。抗体分子は、本明細書に記載されるように、好ましくはダイアボディ又はｓｃＦｖであり、最も好ましくはダイアボディである。
【００５７】
ＩＬ２２は、好ましくはヒトＩＬ２２である。典型的には、ＩＬ２２は、配列番号１１に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のうちの１つの配列同一性を有する。本発明のコンジュゲート中のＩＬ２２は、ヒトＩＬ２２の生物活性、例えば、炎症を抑制する能力を維持する。最も好ましくは、ＩＬ２２は、配列番号１１に示されている配列を含む、又はこの配列からなる。
【００５８】
本発明者らは、ＩＬ２２が、配列番号１１の２１位、３５位、及び６４位のアスパラギン酸残基でグリコシル化されると考えている。２つのグリコシル化部位は、昆虫細胞ベースの産生で説明されている（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００５  Ｊｕｌ；６１（Ｐｔ  ７）：９４２−５０．Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｊｕｎ  ２４）。第３のグリコシル化部位は、配列分析を用いて得られた。本発明者らはまた、２１位、３５位、及び６４位のアスパラギン残基のグルタミンでの置換が、これらの残基でのＩＬ２２のグリコシル化を防止すると予測している。グリコシル化は、バッチの一貫性を含むコンジュゲートの形成を阻害して、患者の体からのコンジュゲートのクリアランスがより迅速になり得るため、一般にグリコシル化を回避することが好ましい。好ましくは、本発明のコンジュゲート、特に本発明のコンジュゲート中に存在するＩＬ２２はグリコシル化されない。従って、ＩＬ２２は、配列番号１１に示されている配列を含む、又はこの配列からなり得るが、配列番号１１の２１位、及び／又は３５位、及び／又は６４位の残基は、アスパラギン残基ではなくグルタミン残基である。
【００５９】
好ましくは、抗体分子は、リンカー、好ましくはアミノ酸リンカーによってＩＬ２２に連結される。別法では、抗体分子及びＩＬ２２は、例えば、化学結合によって直接連結することができる。
【００６０】
抗体分子が二本鎖又は複数鎖の分子である場合は、ＩＬ２２は、アミノ酸リンカーによって抗体分子中の１つ以上のポリペプチド鎖に連結してもよいし、又は抗体分子中の１つ以上のポリペプチド鎖に直接連結してもよい。
【００６１】
化学結合は、例えば、共有結合又はイオン結合であり得る。共有結合の例としては、ペプチド結合（アミド結合）及びジスルフィド結合が挙げられる。抗体分子及びＩＬ２２は、例えば、ペプチド結合（アミド結合）によって共有結合し得る。
【００６２】
抗体分子が、アミノ酸リンカーによってＩＬ２２に連結される場合は、このコンジュゲートは、融合タンパク質であってもよいし、又は融合タンパク質を含んでもよい。「融合タンパク質」とは、２つ以上の遺伝子又は核酸コード配列の１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）への融合から生じる翻訳産物であるポリペプチドのことである。コンジュゲートがダイアボディを含む場合は、ダイアボディを構成する２つのｓｃＦｖ分子（それぞれのｓｃＦｖ分子は、アミノ酸リンカーによってＩＬ２２に連結されるのが好ましい）はそれぞれ、融合タンパク質として発現され、次いで会合して二量体を形成することができる。
【００６３】
抗体分子及びＩＬ２２を連結するアミノ酸リンカーは、柔軟なアミノ酸リンカーであり得る。アミノ酸リンカー配列の適切な例は、当技術分野で公知である。このリンカーは、１０〜２０個のアミノ酸長、好ましくは、１０〜１５個のアミノ酸長であり得る。最も好ましくは、このリンカーは、１１〜１５個のアミノ酸長である。このリンカーは、配列番号１２に示されている配列を有し得る。
【００６４】
本実施例で利用されるコンジュゲートでは、ハツカネズミ（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来のＩＬ２２（ｍｕＩＬ２２）を、配列番号２３及び２４に示されているように、ダイアボディを構成する２つのｓｃＦｖ分子のＶＨドメイン又はＶＬドメインのいずれかにアミノ酸リンカーによってコンジュゲートした。両方のコンジュゲートは、新生血管を特異的に標的にすることができることが示された。従って、抗体分子が、ｓｃＦｖである、又はｓｃＦｖを含む場合は、ＩＬ２２は、アミノ酸リンカーによってｓｃＦｖのＶＨドメインのＮ末端に、又はアミノ酸リンカーによってｓｃＦｖのＶＬドメインのＣ末端に連結することができる。
【００６５】
本発明のコンジュゲートは、配列番号１６又は１７に示されている配列を含む、又はこれらの配列からかなり得る。このコンジュゲートは、配列番号１６又は１７に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のうちの１つの配列同一性を有し得る。
【００６６】
本発明のコンジュゲートは、脱グリコシル化することができる。ポリペプチドの脱グリコシル化の方法は、当技術分野で公知であり、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）での処置を含む。
【００６７】
核酸
本発明によるコンジュゲートをコードする単離核酸分子も提供される。核酸分子は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含み得、かつ部分的に又は完全に合成であり得る。本明細書に示されるヌクレオチド配列への言及は、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、かつ文脈上別段の解釈が必要でない限り、ＴがＵで置換された特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
【００６８】
このような核酸を含むプラスミド、ベクター（例えば、発現ベクター）、転写又は発現カセットの形態の構築物が更に提供される。必要に応じてプロモーター配列、終了配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び他の配列を含め、適切な調節配列を含む適切なベクターを選択又は構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、例えば、ファージミド、又はウイルス、例えば、ファージであり得る。さらなる詳細については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析における核酸の操作のための多数の既知の技術及びプロコトルは、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）４ｔｈ  ｅｄｓ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓに詳細に記載されている。
【００６９】
宿主細胞
上記のように１つ以上の構築物を含む組換え宿主細胞も提供される。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、糸状菌、酵母、及びバキュロウイルス系、並びにトランスジェニック植物及び動物が挙げられる。
【００７０】
本発明によるコンジュゲートは、このような組換え宿主細胞を用いて作製することができる。この作製方法は、上記のように核酸又は構築物を発現させるステップを含み得る。発現は、コンジュゲートの産生に適した条件下で組換え宿主細胞を培養することによって好都合に達成することができる。産生後、コンジュゲートを、任意の適切な技術を用いて単離及び／又は精製し、そして必要に応じて使用することができる。コンジュゲートは、少なくとも１つの追加の成分、例えば、薬学的に許容され得る賦形剤を含む組成物に調合することができる。
【００７１】
様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現のための系は周知である。原核細胞におけるそのコンジュゲートを含む抗体の発現は、当技術分野で十分に確立されている。再考察のために、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（１９９１），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５−５５１を参照されたい。一般的な細菌宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００７２】
培地中の真核細胞での発現も、コンジュゲートの作製のための選択肢として当業者が利用可能である。例えば、Ｃｈａｄｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：１８８−１９４）；Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：１１７；Ｌａｒｒｉｃｋ  ＆  Ｔｈｏｍａｓ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：４１１−４１８を参照されたい。異種ポリペプチドの発現用の当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス黒色腫細胞、ＹＢ２／０ラット黒色腫細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト胎児網膜細胞、及び他多数が挙げられる。
【００７３】
本明細書に開示される核酸又は構築物を宿主細胞に導入するステップを含む方法も説明される。この導入は、任意の利用可能な技術を利用することができる。真核細胞の場合は、適切な技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、及びレトロウイルス又は他のウイルス、例えば、ワクシニア、又は昆虫細胞用のバキュロウイルスを用いる形質導入を挙げることができる。宿主細胞、特に真核細胞への核酸を導入するステップは、ウイルス又はプラスミドベースの系を使用することができる。プラスミド系は、エピソームに保持してもよいし、又は宿主細胞若しくは人工染色体に取り込んでもよい。取り込みは、単一又は複数の遺伝子座での１つ以上のコピーのランダム又は標的組み込みのどちらでもよい。細菌細胞の場合は、適切な技術としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、及びバクテリオファージを使用するトランスフェクションを挙げることができる。
【００７４】
核酸又は構築物は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に組み込むことができる。組み込みは、標準的な技術に従って、ゲノムでの再組換えを促進する配列の組み入れによって促進することができる。
【００７５】
単離された
これは、本発明のコンジュゲート、本発明に使用される抗体、又はこのようなコンジュゲートをコードする核酸が、概ね本発明に従っている状態を指す。従って、本発明のコンジュゲート、本発明に使用される抗体、又はこのようなコンジュゲートをコードする核酸は、実質的に純粋又は均質な形態で、又は、核酸の場合には、要求される機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸を含まない又は実質的に含まずに、例えば、これらが調製された環境（例えば、細胞培養）から単離及び／又は精製されて提供することができる。単離されたメンバー及び単離された核酸は、調製がｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで行われる組換えＤＮＡ技術による場合は、これらが調製される環境（例えば、細胞培養）で、これらと共に見られる物質を含まない又は実質的に含まない。特定のコンジュゲート及び核酸は、希釈剤又はアジュバントで調合することができ、そして更に実用目的で単離され、例えば、メンバーは、治療で使用されるときに薬学的に許容され得る担体又は希釈剤と混合することができる。特定のコンジュゲートは、自然に、又は異種真核細胞（例えば、ＣＨＯ又はＮＳ０（ＥＣＡＣＣ  ８５１１０５０３）細胞の系によってグリコシル化してもよいし、又は（例えば、原核細胞での発現によって作製される場合は）グリコシル化しなくてもよい。
【００７６】
コンジュゲートの異種調製物も本発明で使用することができる。例えば、このような調製物は、完全長重鎖及びＣ末端のリジンが欠損した重鎖を有する抗体分子を含むコンジュゲートの混合物であり得、様々な程度のグリコシル化及び／又は誘導体化アミノ酸、例えば、ピログルタミン酸残基を形成するＮ末端のグルタミン酸の環化を含む。
【００７７】
フィブロネクチン
フィブロネクチンは、選択的にスプライシングされた抗原であり、多数のフィブロネクチンの選択的アイソフォームが既知であり、これらの選択的アイソフォームは、血管形成の既知のマーカーである、それぞれドメインＥＤ−Ａ又はＥＤ−Ｂを含む選択的にスプライシングされたアイソフォームＡ−ＦＮ及びＢ−ＦＮを含む。本明細書で言及される抗体分子は、新生血管で選択的に発現されるフィブロネクチンのアイソフォームに選択的に結合し得る。抗体分子は、フィブロネクチンのアイソフォームＡ−ＦＮに結合することができ、例えば、抗体分子は、ドメインＥＤ−Ａ（エクストラドメインＡ）に結合し得る。抗体分子は、ドメインＥＤ−Ｂ（エクストラドメインＢ）に結合し得る。
【００７８】
フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤ−Ａ又はＥＤ−Ａ）は、ＥＤ、エクストラＩＩＩ型リピートＡ（ＥＩＩＩＡ）、又はＥＤＩとしても知られる。ヒトＥＤ−Ａの配列は、Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，５８５３−５８６８及びＰａｏｌｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ  ．（１９８８），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６，３５４５−３５５７によって公開されている。ヒトＥＤ−Ａの配列は、アクセッション番号Ｐ０２７５１で預託されたアミノ酸配列のアミノ酸１６３１〜１７２０（フィブロネクチンＩＩＩ型１２；エクストラドメイン２）としてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースでも入手可能である。マウスＥＤ−Ａの配列は、アクセッション番号Ｐ１１２７６で預託されたアミノ酸配列のアミノ酸１７２１〜１８１０（フィブロネクチンＩＩＩ型１３；エクストラドメイン２）としてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースで入手可能である。
【００７９】
フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォーム（Ａ−ＦＮ）は、エクストラドメインＡ（ＥＤ−Ａ）を含む。ヒトＡ−ＦＮの配列は、アクセッション番号Ｐ０２７５１でＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースで入手可能な一致するヒトフィブロネクチン前駆体配列から推定することができる。マウスＡ−ＦＮの配列は、アクセッション番号Ｐ１１２７６でＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースで入手可能な一致するマウスフィブロネクチン前駆体配列から推定することができる。Ａ−ＦＮは、フィブロネクチンのヒトＥＤ−Ａアイソフォームであり得る。ＥＤ−Ａは、ヒトフィブロネクチンのエクストラドメインＡであり得る。
【００８０】
ＥＤ−Ａは、選択的スプライシングによってフィブロネクチン（ＦＮ）に挿入される９０個のアミノ酸配列であり、かつＦＮのドメイン１１と１２との間に位置する（Ｂｏｒｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０４，５９５−６００）。ＥＤ−Ａは、血漿型のＦＮには大抵は存在しないが、血管形成、胚形成、組織再構築、線維症、心臓移植、及び充実性腫瘍の成長の最中には豊富である。
【００８１】
フィブロネクチンのアイソフォームＢ−ＦＮは、血管形成の最もよく知られているマーカーの１つである（米国特許出願第１０／３８２，１０７号明細書、国際公開第０１／６２２９８号パンフレット）。９１個のアミノ酸のエクストラドメイン「ＥＤ−Ｂ」は、Ｂ−ＦＮアイソフォームで見られ、かつマウス、ラット、ウサギ、イヌ、及びヒトで同一である。Ｂ−ＦＮは、浸潤性腫瘍及び血管形成が起きている他の組織、例えば、増殖期の子宮内膜における新血管構造並びに病的状態の一部の眼球構造の周りに蓄積するが、そうでない場合は正常な成体組織中では検出不可能である。
【００８２】
テネイシンＣ
テネイシンＣは、細胞接着を調節する細胞外マトリックスの大きい六量体糖タンパク質である。テネイシンＣは、プロセス、例えば、細胞増殖及び細胞移動に関与し、かつ形態形成及び胚形成中並びに癌形成又は血管形成下で起きる組織構造の変化に関連している。テネイシンＣのいくつかのアイソフォームは、ドメインＡｌからドメインＤまでの範囲の（複数の）ドメインのこのタンパク質の中心部分への組み入れをもたらし得る選択的スプライシングの結果として作製することができる（Ｂｏｒｓｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９２；５２：６８８−６９２、Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９２；２０５：５６１−５６７、国際公開第２００６／０５０８３４号パンフレット）。本明細書で言及される抗体分子は、テネイシンＣに結合し得る。抗体分子は、テネイシンＣのドメインＡ１に結合し得る。
【００８３】
自己免疫疾患
自己免疫疾患は、好ましくは、血管形成に関連し、かつ／又は血管形成によって特徴付けられる。自己免疫疾患は、血管形成によって特徴付けられる自己免疫疾患であり得、新生血管が、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォーム、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂアイソフォーム、及び／又はテネイシンＣを発現する。自己免疫疾患は、炎症性自己免疫疾患、即ち、炎症に関連し、かつ／又は炎症によって特徴付けられる自己免疫疾患であり得る。
【００８４】
自己免疫疾患の処置、又は患者の自己免疫疾患部位へのＩＬ２２の送達に使用されるコンジュゲートは、前記自己免疫疾患におけるフィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォーム、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂアイソフォーム、及び／又はテネイシンＣの発現に基づいて選択することができる。自己免疫疾患は：炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、子宮内膜症、自己免疫性糖尿病（例えば、１型糖尿病）、乾癬、乾癬性関節炎、及び歯周炎からなる群から選択することができる。好ましくは、自己免疫疾患はＩＢＤである。
【００８５】
ＩＢＤは、結腸及び小腸に影響を及ぼす一群の炎症状態である。ＩＢＤの主なタイプは、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）であるが、ＩＢＤの他のタイプとして、コラーゲン蓄積大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、及び不確定大腸炎が挙げられる。ＣＤは、胃腸管のあらゆる部分に影響を与え得るが、ＵＣは、典型的には結腸及び直腸に限定される。
【００８６】
本明細書で言及されるＩＢＤは、ＣＤ、ＵＣ、コラーゲン蓄積大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、又は不確定大腸炎であり得る。具体的には、本明細書で使用されるＣＤ、ＵＣ、コラーゲン蓄積大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、及び不確定大腸炎という用語はそれぞれ、活動性ＣＤ、活動性ＵＣ、活動性コラーゲン蓄積大腸炎、活動性リンパ球性大腸炎、活動性虚血性大腸炎、活動性空置大腸炎、及び活動性不確定大腸炎を指し得る。一実施形態では、ＩＢＤは、ＣＤ又はＵＣであり得る。
【００８７】
炎症性疾患及び／又は障害
「炎症性疾患及び／又は障害」は、炎症を伴い、かつ／又は炎症によって特徴付けられる疾患及び／又は障害を指す。炎症性疾患及び／又は障害は、好ましくは、血管形成に関連し、かつ／又は血管形成によって特徴付けられる。炎症性疾患及び／又は障害は、血管形成によって特徴付けられる炎症性疾患及び／又は障害であり得、新生血管が、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォーム、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂアイソフォーム、及び／又はテネイシンＣを発現する。
【００８８】
炎症性疾患及び／又は障害の処置、或いは患者の炎症性疾患及び／又は障害の部位へのＩＬ２２の送達に使用されるコンジュゲートは、前記炎症性疾患及び／又は障害におけるフィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォーム、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂアイソフォーム、及び／又はテネイシンＣの発現に基づいて選択することができる。炎症性疾患及び／又は障害は、移植片対宿主病；創傷治癒；及び潰瘍、特に糖尿病による足の壊疽からなる群から選択することができる。
【００８９】
処置
本発明のコンジュゲートは、抗炎症活性を有し、従って、炎症及び／又は自己免疫疾患の処置に応用されることが期待される。いかなる理論的な説明によっても限定されるものではないが、本発明のコンジュゲートは、実施例で実証されるように、新生血管の優れた標的化の結果として強力な抗炎症活性を示すことが期待される。従って、本発明のコンジュゲートは、患者、好ましくはヒト患者の処置の方法に使用されるように設計される。
【００９０】
従って、本発明は、本発明によるコンジュゲートを投与するステップを含む処置の方法、このようなコンジュゲートを含む医薬組成物、並びに投与される薬剤の製造での、例えば、このコンジュゲートと薬学的に許容され得る賦形剤を調合するステップを含む薬剤又は医薬組成物を製造する方法でのこのようなコンジュゲートの使用を提供する。薬学的に許容され得るビヒクルは、周知であり、選択される活性化合物の性質及び投与方式に応じて当業者によって適合される。
【００９１】
本発明によるコンジュゲートは、通常は医薬組成物の形態で投与され、この医薬組成物は、抗体分子に加えて少なくとも１つの成分を含み得る。従って、本明細書で説明され、本発明に従って使用される医薬組成物は、活性成分に加えて、薬学的に許容され得る賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、又は当業者に周知の他の物質を含み得る。このような物質は、非毒性であるべきであり、かつ活性成分の有効性を阻害するべきではない。担体又は他の物質の正確な性質は、注射、例えば、静脈注射又は皮下注射であり得る投与経路によって決まる。好ましくは、本発明のコンジュゲートは静脈内投与される。
【００９２】
液体医薬組成物は、一般に、液体担体、例えば、水、石油、動物油又は植物油、鉱油、又は合成油を含む。生理食塩水、デキストロース、又は他の糖溶液若しくはグリコール、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、若しくはポリエチレングリコールが含まれ得る。
【００９３】
静脈注射、又は患部への注射の場合は、活性成分は、発熱物質を含まず、かつ適切なｐＨ、等張性、及び安定性を有する非経口的に許容され得る水溶液の形態である。当業者であれば、例えば、等張性ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー液、乳酸化リンガー液を用いて適切な溶液を十分に調製することができる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝液、抗酸化物質、及び／又は他の添加物を利用してもよい。医薬製剤の調製の多数の方法が当業者に公知である。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｄ．，Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【００９４】
本発明によるコンジュゲートを含む組成物は、炎症及び／又は自己免疫疾患の処置のために、単独で又は他の処置と組み合わせて、同時に又は連続的に、又は１つ若しくは複数の別の治療薬と組み合わせられた製剤として投与することができる。例えば、本発明のコンジュゲートは、炎症及び／又は自己免疫疾患のために既存の治療薬と組み合わせて使用してもよい。
【００９５】
本発明によるコンジュゲートは、薬剤の製造に使用することができる。薬剤は、個人への別個の投与又は併用投与用とすることができ、従って、コンジュゲート、及び併用製剤又は別個の製剤としての追加の成分を含み得る。別個の製剤は、別個の投与及び連続的又は同時の投与を容易にするために使用することができ、異なる経路による成分の投与が可能となる。
【００９６】
本発明によると、提供される組成物は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与することができる。投与は、「治療有効量」であり得、これは、患者への恩恵を示すのに十分な量である。このような恩恵は、少なくとも１つの症状の少なくとも緩和であり得る。従って、特定の疾患の「処置」は、少なくとも１つの症状の緩和を指す。投与される実際の量、並びに投与の割合及び経時変化は、処置されるものの性質及び重症度、処置される特定の患者、個々の患者の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、コンジュゲートのタイプ、投与方法、投与のスケジュール、及び医師に既知の他の因子によって決まる。処置の処方箋、例えば、薬用量の決定などは、一般的な開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、症状の重症度及び／又は処置される疾患の進行度によって決まり得る。抗体の適切な容量は、当技術分野で周知である（Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：６５９−６６４；及びＢａｇｓｈａｗｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ４：９１５−９２２）。本明細書又は投与される薬剤のタイプに適切なＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２００３）に示される特定の用量を使用することができる。本発明に使用されるコンジュゲートの治療有効量又は適切な用量を、動物モデルにおいてそのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性とｉｎ  ｖｉｖｏ活性とを比較することによって決定することができる。マウス及び他の試験動物における有効量のヒトへの外挿法は公知である。正確な用量は、抗体が診断、予防用、又は処置用であるか否か、処置するべき領域のサイズ及び位置、コンジュゲートの正確な性質を含む多数の因子によって決まる。典型的なコンジュゲートの用量は、全身適用では１００μｇ〜１ｇの範囲である。最初の高い負荷用量、続いて１回以上の低い用量を投与することができる。これは、成人患者の単回処置の用量であり、この用量は、小児及び乳児に対して比例的に調整し、そして分子量に比例してコンジュゲートの形態に従って調整することもできる。処置は、医師の裁量で毎日、１週間に２回、毎週、又は毎月の間隔で繰り返すことができる。処置は、皮下投与では２週間に１回から４週間に１回、静脈内投与では４週間に１回から８週間に１回とすることができる。本発明の一部の実施形態では、処置は定期的であり、投与の間隔は、約２週間以上、例えば、約３週間以上、約４週間以上、又は約１カ月に１回である。本発明の他の実施形態では、処置は、外科手術の前及び／又は後で行うことができ、かつ外科処置の解剖学的部位に直接施す又は適用することができる。
【００９７】
本発明の更なる態様及び実施形態は、以下の実験的な例証を含む本開示から当業者には明らかであろう。
【００９８】
本明細書で言及される全ての文献は、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み込まれる。
【００９９】
本明細書で使用される「及び／又は」は、２つの特定の特徴又は構成要素のそれぞれと他方又はそれぞれのみの特定の開示と解釈される。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれが本明細書で個々に示されるかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの特定の開示と解釈される。
【０１００】
文脈上別段の記載がない限り、上に示される特徴の記載及び定義は、本発明の任意の特定の態様又は実施形態に限定されず、記載される全ての態様及び実施形態に等しく適用される。
非限定的に、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
インターロイキン２２（ＩＬ２２）、及び血管形成に関連した抗原に結合する抗体分子又はその抗原結合断片を含むコンジュゲート。
［態様２］
前記抗体分子又はその抗原結合断片が、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であるか、又は前記ｓｃＦｖを含む、態様１に記載のコンジュゲート。
［態様３］
前記抗体分子又はその抗原結合断片がダイアボディである、態様１又は２に記載のコンジュゲート。
［態様４］
前記抗体分子又はその抗原結合断片がフィブロネクチンに結合する、態様１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［態様５］
前記抗体分子又はその抗原結合断片が、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤ−Ａ）に結合する、態様４に記載のコンジュゲート。
［態様６］
前記抗体分子又はその抗原結合断片が、配列番号１〜６に示されている抗体Ｆ８の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗原結合部位を含む、態様５に記載のコンジュゲート。
［態様７］
前記抗体分子又はその抗原結合断片が、配列番号７及び８に示されている抗体Ｆ８のＶＨ及びＶＬドメインを含む、態様６に記載のコンジュゲート。
［態様８］
前記抗体分子又はその抗原結合断片の前記ＶＨドメイン及び前記ＶＬドメインが、５〜１２個のアミノ酸リンカーによって連結されている、態様１〜７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［態様９］
前記抗体分子又はその抗原結合断片が、配列番号１０に示されているＦ８のアミノ酸配列を有する又は含む、態様６〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［態様１０］
前記ＩＬ２２がヒトＩＬ２２である、態様１〜９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［態様１１］
前記ＩＬ２２が、配列番号１１に示されている配列を含む、又は前記配列からなる、態様１０に記載のコンジュゲート。
［態様１２］
前記ＩＬ２２が、アミノ酸リンカーによって前記抗体分子又はその抗原結合断片に連結されている、態様１〜１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［態様１３］
前記抗体分子又はその抗原結合断片が、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であるか、又は前記ｓｃＦｖを含み、前記ＩＬ２２が、アミノ酸リンカーによって前記ｓｃＦｖのＶＨドメインのＮ末端に連結されている、態様１〜１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［態様１４］
前記抗体分子又はその抗原結合断片が、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であるか、又は前記ｓｃＦｖを含み、前記ＩＬ２２が、アミノ酸リンカーによって前記ｓｃＦｖのＶＬドメインのＣ末端に連結されている、態様１〜１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［態様１５］
前記アミノ酸リンカーが、１０〜２０個のアミノ酸長である、態様１２〜１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［態様１６］
配列番号１６に示されているアミノ酸配列を有する又は含む、態様１〜１３及び１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［態様１７］
配列番号１７に示されているアミノ酸配列を有する又は含む、態様１〜１２、１４、及び１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［態様１８］
態様１〜１７のいずれか一項に記載のコンジュゲートをコードする核酸分子。
［態様１９］
配列番号１４又は１５に示されているヌクレオチド配列を有する又は含む、態様１８に記載の核酸分子。
［態様２０］
態様１８又は１９に記載の核酸を含む発現ベクター。
［態様２１］
態様２０に記載のベクターを含む宿主細胞。
［態様２２］
態様２１に記載の宿主細胞を、前記コンジュゲートの発現の条件下で培養するステップを含む、態様１〜１７のいずれか一項に記載のコンジュゲートを作製する方法。
［態様２３］
前記コンジュゲートを発現後に単離及び／又は精製するステップを更に含む、態様２２に記載の方法。
［態様２４］
治療によるヒトの体の処置のための方法に使用される態様１〜１７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［態様２５］
患者の自己免疫疾患を処置する方法に使用される態様１〜１７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［態様２６］
患者の自己免疫疾患の部位にＩＬ２２を送達する方法に使用される態様１〜１７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［態様２７］
患者の自己免疫疾患を処置する方法であって、態様１〜１７のいずれか一項に記載のコンジュゲートを前記患者に治療有効量投与するステップを含む、方法。
［態様２８］
態様１〜１７のいずれか一項に記載のコンジュゲートを患者に投与するステップを含む、前記患者の自己免疫疾患の部位にＩＬ２２を送達する方法。
［態様２９］
前記自己免疫疾患が、腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、子宮内膜症、自己免疫性糖尿病（例えば、１型糖尿病）、乾癬、乾癬性関節炎、歯周炎、及びアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される、態様２５又は２６に従って使用されるコンジュゲート、或いは態様２７又は２８に記載の方法。
［態様３０］
前記自己免疫疾患が腸疾患である、態様２９に従って使用されるコンジュゲート又は態様２９に記載の方法。
［態様３１］
前記腸疾患が、潰瘍性大腸炎又はクローン病である、態様３０に従って使用されるコンジュゲート又は態様３０に記載の方法。
［態様３２］
患者の炎症を処置する方法に使用される態様１〜１７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［態様３３］
患者の炎症の部位にＩＬ２２を送達する方法に使用される態様１〜１７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［態様３４］
患者の炎症を処置する方法であって、態様１〜１７のいずれか一項に記載のコンジュゲートを前記患者に治療有効量投与するステップを含む、方法。
［態様３５］
態様１〜１７のいずれか一項に記載のコンジュゲートを患者に投与するステップを含む、前記患者の炎症の部位にＩＬ２２を送達する方法。
［態様３６］
前記炎症が、炎症性疾患及び／又は障害の結果である、態様３２又は３３に従って使用されるコンジュゲート、或いは態様３４又は３５に記載の方法。
［態様３７］
前記炎症性疾患及び／又は障害が、移植片対宿主病；創傷治癒；及び潰瘍、特に糖尿病による足の壊疽からなる群から選択される、態様３６に従って使用されるコンジュゲート、又は態様３６に記載の方法。 
【０１０１】
本発明の特定の態様及び実施形態はこれから、上記の図面を参照して例として例示される。
【実施例】
【０１０２】
材料及び方法
ＩＬ２２及び抗ＥＤ−Ａ抗体Ｆ８を含む融合タンパク質のクローニング
ｍｕＩＬ２２（ハツカネズミ由来）及び抗ＥＤ−Ａ抗体Ｆ８を含む抗体融合タンパク質をコードする遺伝子を、ＰＣＲアセンブリを用いて作製した。ＩＬ２２をコードする配列（シグナルペプチド配列が欠損した）を、１５個のアミノ酸グリシン−セリン−リンカー［（Ｇ４Ｓ）３］をコードする配列によって、ダイアボディの形態（ＧＧＳＧＧ−リンカーによって連結された重鎖及び軽鎖）のＦ８抗体をコードする遺伝子のＣ末端（Ｆ８−ＩＬ２２）又はＮ末端（ＩＬ２２−Ｆ８）に連結した。ＩｇＧ由来シグナルペプチドをコードする配列を、コードされた融合タンパク質の高収率生産を可能にするためにＮ末端に付加した。エンジニアリングされたＮｈｅｌ及びＮｏｔｌ制限部位を用いて、遺伝子を、ｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物細胞発現ベクターにクローニングした。遺伝子アセンブリの概略図が図１に示されている。ｍｕＩＬ２２−Ｆ８及びＦ８−ｍｕＩＬ２２融合タンパク質をコードするために使用される遺伝子の配列がそれぞれ、配列番号２１及び２２に示され、以下に報告される実験に利用される成熟ｍｕＩＬ２２−Ｆ８及びＦ８−ｍｕＩＬ２２融合タンパク質のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２３及び２４に示されている。シグナルペプチドは、融合タンパク質の発現後に切断され、従って、成熟融合タンパク質の一部ではない。
【０１０３】
上記のアプローチを使用して、ヒトＩＬ２２（ｈｕＩＬ２２）及び抗ＥＤ−Ａ抗体Ｆ８を含む抗体融合タンパク質をコードする遺伝子を作製することもできる。ｈｕＩＬ２２−Ｆ８及びＦ８−ｈｕＩＬ２２融合タンパク質をコードするために使用することができる例示的な配列はそれぞれ、配列番号１４及び１５に示され、成熟ｈｕＩＬ２２−Ｆ８及びＦ８−ｈｕＩＬ２２融合タンパク質のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１６及び１７に示されている。上で説明されたように、配列番号１４及び１５に示されている核酸配列によってコードされるシグナルペプチドは、融合タンパク質の発現後に切断され、従って、成熟融合タンパク質の一部ではない。
【０１０４】
融合タンパク質の発現
ｍｕＩＬ２２を含む融合タンパク質を、ＰＥＩ媒介トランスフェクションによりＣＨＯ−Ｓ細胞で一過性に発現させた。５００×１０６個の細胞を、２５０ｍＬの予備加温ＰｒｏＣＨＯ−２培地（１０％  ＦＢＳ、２％  ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、４％  Ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１％  抗生物質−抗真菌溶液が添加された）で再懸濁した。融合タンパク質をコードする遺伝子を含む６２５μｇのプラスミドを、１５０ｍＭ  滅菌ＮａＣｌ溶液で希釈して１２．５ｍＬの総量にした。濾過水中、２．５ｍＬの滅菌ＰＥＩ溶液（ポリエチレンイミン、１ｇ／Ｌ  線形、ＭＷ  ２５，０００）を１０ｍｌの１５０ｍＭ  滅菌ＮａＣｌと混合した。ＰＥＩ混合物をプラスミド混合物に添加して、室温で１０分間インキュベートした。必要なインキュベーション時間後に、混合物を調製した細胞に添加し、この細胞を、３７℃の振盪機に載せて１６０ｒｐｍで４時間振盪した。４時間後に、２５０ｍＬの予備加温ＰｏｗｅｒＣＨＯ−２培地（１０％  ＦＢＳ、２％  ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、４％  Ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１％  抗生物質−抗真菌溶液が添加された）を添加し、細胞を３１℃の振盪機に載せて１４０ｒｐｍで６日間振盪した。次いで、融合タンパク質を精製した。同じ方法を利用して、ｈｕＩＬ２２を含む融合タンパク質も発現させることができる。
【０１０５】
プロテインＡ樹脂を用いた融合タンパク質の精製
５００ｍＬのトランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞懸濁液を、４℃で２０分間、７０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清をフラスコにデカントして４０℃で保存し、ペレットを廃棄した。上清を、ＰＢＳを用いて流量が最大２ｍＬ／分に調整されたポンプを用いて、プロテインＡ樹脂を含むカラム（プロテインＡアガロースビーズ／樹脂、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）の上のゲル濾過培地を含むカラム（ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ  Ｇ−２５  Ｍｅｄｉｕｍ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，＃１７−００３３−０２）に流した。続いて、ゲル濾過樹脂を廃棄した。プロテインＡカラムを、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ，ｗｉｔｅｃ  ａｇ，ＯＤ２８０ｎｍ）を用いて決定される洗浄液の光学濃度が０．１未満になるまで４００ｍＬの「洗浄液Ａ」（ＰＢＳ中、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（分析用の塩化ナトリウム、Ｅｍｓｕｒｅ（商標）、７５４７−１４−５）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０（Ｆｒａｎｚｉｓｋａ  Ｂｏｏｔｚによって親切に提供された）、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（商標），＃ＳＺＢＡ３１９０Ｖ））で洗浄し、次いで、分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐで決定される洗浄液の２８０ｎｍでの光学濃度が０．０５未満になるまで４００ｍＬの「洗浄液Ｂ」（ＰＢＳ中、１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）で洗浄した。ｍｕＩＬ２２を含む融合タンパク質を、１０ｍＬの０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ３、Ｆｌｕｋａ（商標）、＃ＢＣＢＢ２８１９）を用いて重力流で溶出した。画分を、１．５ｍＬのエッペンドルフ管に１ｍＬのアリコートとして収集し、即座に凍結させた。紫外分光測定によって確認される融合タンパク質を含む画分をプールし、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，ＭＷＣＯ  １２’０００−１４’０００，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に移し、そして３〜４ＬのＰＢＳで一晩透析した。翌日、融合タンパク質溶液をエッペンドルフ管に移し、更なる分析のために４℃で１〜２日間保存するか、又は液体窒素で急速凍結し、−８０℃の冷凍器に移した。同じ方法を使用して、ｈｕＩＬ２２を含む融合タンパク質も精製することができる。
【０１０６】
融合タンパク質の脱グリコシル化
ｍｕＩＬ２２を含む融合タンパク質の脱グリコシル化を、Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｆ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ，ＮＥＢ  Ｐ０７０４Ｓ）を用いて行って、Ｎ結合型糖タンパク質から複合オリゴ糖を除去した。変性条件下、１５μｇの融合タンパク質を、総量３０μｌの１０×糖タンパク質変性緩衝液（ＮＥＢ）と共に９９℃で１０分間インキュベートした。変性した融合タンパク質を６μｌの１０×Ｇｌｙｃｏｂｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢ）、６μｌの１０％  ＮＰ−４０、及び脱イオン水と総量６０μｌで混合した。３μｌのＰＮＧａｓｅ  Ｆの添加後、反応混合物を３７℃で４時間インキュベートした。その後、全ての試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。脱グリコシル化の効果は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中での移動度シフト及びバンドの鋭さとして確認できる。ｈｕＩＬ２２を含む融合タンパク質の脱グリコシル化も、同じ方法で行うことができる。
【０１０７】
融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー
融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを、ＡＥＫＴＡ−ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において電気泳動用緩衝液としてリン酸緩衝生理食塩水を含むｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ５／１５０カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。１００μｌのタンパク質溶液をループに注入して、自動的にカラムに注入した。２８０ｎｍでの紫外吸光度を長時間評価した。
【０１０８】
融合タンパク質のＢｉａｃｏｒｅ分析
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００  ｓｙｓｔｅｍ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ｍｕＩＬ２２を含む融合タンパク質のＥＤ−Ａに対する結合親和性を分析した。マイクロセンサーチップ（ＣＭ５，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、１５００共鳴単位被覆密度で、１１Ａ１２、組換え的に発現されたＥＤ−Ａで被覆した。表面プラズモン共鳴での分析では、シリンジフィルタユニット（Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＧＶ，低タンパク質結合デュラポアメンブレン（Ｌｏｗ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｕｒａｐｏｒｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ），０．２２μｍ，＃Ｎ３ＨＡ７０６９５）でタンパク質を濾過し、そしてその濃度を、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ，ｗｉｔｅｃ  ａｇ，ＯＤ２８０ｎｍ）で決定した。ｈｕＩＬ２２を含む融合タンパク質のＢｉａｃｏｒｅ分析も、同じ方法で行うことができる。
【０１０９】
融合タンパク質のＥＬＩＳＡ
抗体部分の結合能力を、ＥＬＩＳＡによって更に確認した。組換えＥＤＡドメインを、マキシソープウェル（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ）に室温で一晩固定した。結合の評価の日に、ウェルを、リン酸緩衝生理食塩水中、２００μｌの４％ミルク（ミルク−ＰＢＳ）を用いて室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング液の除去後、２％ミルク−ＰＢＳ中、２００μｌの異なる抗体濃度をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、ウェルを、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含む２００μｌのＰＢＳで３回、そしてＰＢＳで３回洗浄した。続いて、プロテインＡ  ＨＲＰ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含む２００μｌの２％ミルク−ＰＢＳで洗浄した。室温で４０分間のインキュベーション後、ＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ）を添加した。Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させ、紫外分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐａｒａｄｉｇｍ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４５０ｎｍ及び６５０ｎｍでの吸光度の測定により測定値を得た。
【０１１０】
融合タンパク質の生物活性アッセイ：ＩＬ２２誘導性のＳＴＡＴ３のリン酸化
ｍｕＩＬ２２を含む融合タンパク質中のｍｕＩＬ２２の活性を、ＨＴ２９細胞中のＳＴＡＴ３のリン酸化によって検証した。細胞を融合タンパク質と共にインキュベートし、そしてＳＴＡＴ３のリン酸化を、ウェスタンブロット分析によって定量した。
【０１１１】
ＨＴ２９細胞を、滅菌９６ウェルプレートの３００μｌのマッコイ培地（ＧＩＢＣＯ、１０％  ＦＢＳ及び１％  抗生物質−抗真菌溶液が添加された）中に０．１×１０６個の細胞／ウェルの密度で播種した。細胞がフラスコに付着したら、培地を、無血清培地で交換し、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ｍｕＩＬ２２融合タンパク質を、１０倍段階希釈に添加し、図４に示されているように５μｇ／ｍｌの濃度で開始した。３７℃で２０分間のインキュベーション期間後、細胞を、洗浄緩衝液（１錠のプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼ阻害剤カクテル）を含む１０ｍｌのＰＢＳ）及び２０μｌのＲＩＰＡ緩衝液（２５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ４０、０．１％  ＳＤＳ）で洗浄し、１錠のプロテアーゼ阻害剤を、細胞溶解のために１５分間細胞に添加した。遠心分離（２０００ｒｐｍ、１５分間、２５℃）後、細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用した。その後、分離したタンパク質を、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース膜に３０Ｖ及び２２０ｍＡで１時間ブロットした。この後、膜を、４％ミルクＰＢＳで、２５℃で１時間ブロッキングした。２％ミルクＰＢＳ中、１：１０００の希釈の一次抗体、マウス−α−ヒト−ホスホーＳＴＡＴ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、０．１ｍｇ／ｍｌ）を膜に添加し、振盪機で、２５℃で１時間インキュベートした。二次抗体とのインキュベーションの前に、洗浄ステップを行った。膜を、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ中、５分間のインキュベートを３回行った。二次抗体、α−マウス−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、２％ミルクＰＢＳ中、１：１０００の希釈で膜に添加し、振盪機で、２５℃で１時間インキュベートした。二次抗体とのインキュベーション後に、洗浄処置を、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎで５分間を２回行い、その後、ＰＢＳで５分間を２回行った。シグナルの検出のために、膜をＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｒｉｍｅ，ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で覆い、薄膜に曝露して展開した。ｈｕＩＬ２２を含む融合タンパク質中のｈｕＩＬ２２の活性も、同じ方法で決定することができる。
【０１１２】
腫瘍標的の評価
ｍｕＩＬ２２を含む融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ標的性能を、Ｆ９担癌マウスでの定量的生体分布試験によって評価した。タンパク質を、Ｉｏｄｏｇｅｎ法を用いて１２５Ｉで標識した。１５μｇの放射性ヨウ化融合タンパク質を、側尾静脈に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。注射の２４時間後にマウスを屠殺し、臓器を摘出して秤量し、そして放射活性を、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏｂｒａ  γカウンターを用いて測定した。臓器の放射活性を、組織１グラム当たりの注射用量のパーセンテージとして表した（％ＩＤ／ｇ±ＳＥＭ）。同じアプローチを使用して、ｈｕＩＬ２２を含む融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ標的性能を決定することができる。
【０１１３】
結果
ｍｕＩＬ２２−Ｆ８及びＦ８−ｍｕＩＬ２２融合タンパク質の特徴付け
精製融合タンパク質は、（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び（２）サイズ排除クロマトグラフィーを用いて確認されたように好ましい生化学特性を示した。クマーシー染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、推定４４ｋＤａよりも僅かに高い広いタンパク質バンドを明らかにした（図２Ａ及び図２Ｂ）。このシフトは、Ｎ結合型グリカンの存在によって引き起こされ、これは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて除去することができ、バンドシフトが融合タンパク質の予想サイズになる（図２Ａ及び図２Ｂ）。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  ５／１５０カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィー分析により、コンジュゲート調製物の均質性を更に確認した（図２Ｃ及び図２Ｄ）。
【０１１４】
ｍｕＩＬ２２との融合後、フィブロネクチンのＥＤ−ＡへのＦ８部分の結合能力が、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）（図３Ａ及び図３Ｂ）及びＥＬＩＳＡ分析（図３Ｃ及び図３Ｄ）を用いて確認されたように維持された。
【０１１５】
ｍｕＩＬ２２はまた、ｍｕＩｌ２２融合タンパク質を用いた誘導後のＨＴ２９細胞のリン酸化ＳＴＡＴ３に対するウェスタンブロット分析を用いて決定されたように、ｍｕＩｌ２２−Ｆ８及びＦ８−ｍｕＩＬ２２融合タンパク質中のＦ８抗体との融合後にその生物活性を維持した（図４）。
【０１１６】
ｍｕＩＬ２２−Ｆ８及びＦ８−ｍｕＩＬ２２融合タンパク質の組織標的特異性
Ｆ９担癌マウスでｍｕＩＬ２２−Ｆ８及びＦ８−ｍｕＩＬ２２融合タンパク質の定量的生体分布試験により、融合タンパク質による優れた腫瘍標的が示された。融合タンパク質は、腫瘍の処置又は検出での使用を意図していないが、これは、融合タンパク質が、ＥＤ−Ａを発現する組織（例えば、ＥＤ−Ａを発現することが分かっている新生血管）を特異的に標的とすることを実証し、他の（健常な）組織では融合タンパク質の存在が非常に限定されている。これらの優れた標的特性は、治療への応用のためにＩＬ２２を含む融合タンパク質を利用する場合に有用であることが期待される。
【０１１７】
配列表
Ｆ８  ＣＤＲのアミノ酸配列
Ｆ８  ＣＤＲ１  ＶＨ−ＬＦＴ（配列番号１）
Ｆ８  ＣＤＲ２  ＶＨ−ＳＧＳＧＧＳ（配列番号２）
Ｆ８  ＣＤＲ３  ＶＨ−ＳＴＨＬＹＬ（配列番号３）
Ｆ８  ＣＤＲ１  ＶＬ−ＭＰＦ（配列番号４）
Ｆ８  ＣＤＲ２  ＶＬ−ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号５）
Ｆ８  ＣＤＲ３  ＶＬ−ＭＲＧＲＰＰ（配列番号６）
【０１１８】
Ｆ８  ＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７）
【化１】
0006735822.tif 000002
【０１１９】
Ｆ８  ＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号８）
【化２】
0006735822.tif 000003
【０１２０】
Ｆ８ダイアボディのＦ８  ＶＨドメインをＦ８  ＶＬドメインに連結するリンカーのアミノ酸配列（配列番号９）
ＧＧＳＧＧ
【０１２１】
Ｆ８ダイアボディのアミノ酸配列（配列番号１０）
【化３】
0006735822.tif 000004
【０１２２】
ヒトＩＬ２２（ｈｕＩＬ２２）のアミノ酸配列（配列番号１１）
【化４】
0006735822.tif 000005
【０１２３】
ｈｕＩＬ２２−Ｆ８コンジュゲートのｈｕＩＬ２２をＦ８  ＶＨドメインに、そしてＦ８−ｈｕＩＬ２２コンジュゲートのｈｕＩＬ２２をＦ８  ＶＬドメインにそれぞれ連結するリンカーのアミノ酸配列（配列番号１２）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
【０１２４】
ｈｕＩＬ２２をコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）
【化５】
0006735822.tif 000006
【０１２５】
ｈｕＩＬ２２−Ｆ８コンジュゲートをコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）
以下の配列は：（ｉ）ｈｕＩＬ２２［下線付き］、（ｉｉ）１５個のアミノ酸リンカー［太字］；（ｉｉｉ）Ｆ８  ＶＨドメイン［斜字体］；（ｉｖ）５個のアミノ酸リンカー［太字で下線付き］；（ｖ）Ｆ８  ＶＬドメイン；及び（ｖｉ）停止コドン［太字］をコードする配列を（順に）示している。
ｈｕＩＬ２２−１５ＡＡリンカー−Ｆ８ＶＨ−５ＡＡリンカー−Ｆ８ＶＬ
【化６】
0006735822.tif 000007
【０１２６】
Ｆ８−ｈｕＩＬ２２コンジュゲートをコードするヌクレオチド配列（配列番号１５）
以下の配列は：（ｉ）Ｆ８  ＶＨドメイン［斜字体］；（ｉｉ）５個のアミノ酸リンカー［太字で下線付き］；（ｉｉｉ）Ｆ８  ＶＬドメイン；（ｉｖ）１５個のアミノ酸リンカー［太字］；ｈｕＩＬ２２［下線付き］；及び（ｖｉ）停止コドン［太字］をコードする配列を（順に）示している。
Ｆ８ＶＨ−５ＡＡリンカー−Ｆ８ＶＬ−１５ＡＡリンカー−ｈｕＩＬ２２
【化７】
0006735822.tif 000008
【０１２７】
ｈｕＩＬ２２−Ｆ８コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号１６）
以下の配列は：（ｉ）ｈｕＩＬ２２［下線付き］、（ｉｉ）１５個のアミノ酸リンカー［太字］；（ｉｉｉ）Ｆ８  ＶＨドメイン［斜字体］；（ｉｖ）５個のアミノ酸リンカー［太字で下線付き］；及び（ｖ）Ｆ８  ＶＬドメインのアミノ酸配列を（順に）示している。
【化８】
0006735822.tif 000009
【０１２８】
Ｆ８−ｈｕＩＬ２２コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号１７）
以下の配列は：（ｉ）Ｆ８  ＶＨドメイン［斜字体］；（ｉｉ）５個のアミノ酸リンカー［太字で下線付き］；（ｉｉｉ）Ｆ８  ＶＬドメイン；（ｉｖ）１５個のアミノ酸リンカー［太字］；及びｈｕＩＬ２２［下線付き］のアミノ酸配列を（順に）示している。
【化９】
0006735822.tif 000010
【０１２９】
ハツカネズミＩＬ２２（ｍｕＩＬ２２）のアミノ酸配列（配列番号１８）
【化１０】
0006735822.tif 000011
【０１３０】
ｍｕＩＬ２２−Ｆ８コンジュゲートのｍｕＩＬ２２をＦ８  ＶＨドメインに連結するリンカーのアミノ酸配列（配列番号１９）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
【０１３１】
Ｆ８−ｍｕＩＬ２２コンジュゲートのｍｕＩＬ２２をＦ８  ＶＬドメインに連結するリンカーのアミノ酸配列（配列番号２０）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
【０１３２】
ｍｕＩＬ２２−Ｆ８コンジュゲートをコードするヌクレオチド配列（配列番号２１）
ｍｕＩＬ２２−１５ＡＡリンカー−Ｆ８ＶＨ−５ＡＡリンカー−Ｆ８ＶＬ
以下の配列は：（ｉ）ｍｕＩＬ２２［下線付き］、（ｉｉ）１５個のアミノ酸リンカー［太字］；（ｉｉｉ）Ｆ８  ＶＨドメイン［斜字体］；（ｉｖ）５個のアミノ酸リンカー［太字で下線付き］；（ｖ）Ｆ８  ＶＬドメイン；及び（ｖｉ）停止コドン［太字］をコードする配列を（順に）示している。
【化１１】
0006735822.tif 000012
【０１３３】
Ｆ８−ｍｕＩＬ２２コンジュゲートをコードするヌクレオチド配列（配列番号２２）
Ｆ８ＶＨ−５ＡＡリンカー−Ｆ８ＶＬ−１５ＡＡリンカー−ｍｕＩＬ２２
以下の配列は：（ｉ）Ｆ８  ＶＨドメイン［斜字体］；（ｉｉ）５個のアミノ酸リンカー［太字で下線付き］；（ｉｉｉ）Ｆ８  ＶＬドメイン；（ｉｖ）１５個のアミノ酸リンカー［太字］；ｍｕＩＬ２２［下線付き］；及び（ｖｉ）停止コドン［太字］をコードする配列を（順に）示している。
【化１２】
0006735822.tif 000013
【０１３４】
ｍｕＩＬ２２−Ｆ８コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号２３）
以下の配列は：（ｉ）ｍｕＩＬ２２［下線付き］、（ｉｉ）１５個のアミノ酸リンカー［太字］；（ｉｉｉ）Ｆ８  ＶＨドメイン［斜字体］；（ｉｖ）５個のアミノ酸リンカー［太字で下線付き］；及び（ｖ）Ｆ８  ＶＬドメインのアミノ酸配列を（順に）示している。
【化１３】
0006735822.tif 000014
【０１３５】
Ｆ８−ｍｕＩＬ２２コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号２４）
以下の配列は：（ｉ）Ｆ８  ＶＨドメイン［斜字体］；（ｉｉ）５個のアミノ酸リンカー［太字で下線付き］；（ｉｉｉ）Ｆ８  ＶＬドメイン；（ｉｖ）１５個のアミノ酸リンカー［太字］；及びｍｕＩＬ２２［下線付き］のアミノ酸配列を（順に）示している。
【化１４】
0006735822.tif 000015
【０１３６】
Ｌ１９  ＣＤＲのアミノ酸配列
Ｌ１９  ＣＤＲ１  ＶＨ−Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ（配列番号２５）
Ｌ１９  ＣＤＲ２  ＶＨ−Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ（配列番号２６）
Ｌ１９  ＣＤＲ３  ＶＨ−Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ（配列番号２７）
Ｌ１９  ＣＤＲ１  ＶＬ−Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｌａ（配列番号２８）
Ｌ１９  ＣＤＲ２  ＶＬ−Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｔｈｒ（配列番号２９）
Ｌ１９  ＣＤＲ３  ＶＬ−Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ（配列番号３０）
【０１３７】
Ｌ１９  ＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３１）
【化１５】
0006735822.tif 000016
【０１３８】
Ｌ１９  ＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３２）
【化１６】
0006735822.tif 000017
【０１３９】
Ｌ１９ダイアボディのアミノ酸配列（配列番号３３）
ＶＨ及びＶＬドメインリンカー配列は下線付きで示されている。
【化１７】
0006735822.tif 000018
【０１４０】
Ｆ１６  ＣＤＲのアミノ酸配列
Ｆ１６  ＣＤＲ１  ＶＨ−ＲＹＧＭＳ（配列番号３４）
Ｆ１６  ＣＤＲ２  ＶＨ−ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３５）
Ｆ１６  ＣＤＲ３  ＶＨ−ＡＨＮＡＦＤＹ（配列番号３６）
Ｆ１６  ＣＤＲ１  ＶＬ−ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号３７）
Ｆ１６  ＣＤＲ２  ＶＬ−ＧＫＮＮＲＰＳ（配列番号３８）
Ｆ１６  ＣＤＲ３  ＶＬ−ＮＳＳＶＹＴＭＰＰＶＶ（配列番号３９）
【０１４１】
Ｆ１６  ＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号４０）
【化１８】
0006735822.tif 000019
【０１４２】
Ｆ１６  ＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号４１）
【化１９】
0006735822.tif 000020
【０１４３】
Ｆ１６ダイアボディのアミノ酸配列（配列番号４２）
ＶＨ及びＶＬドメインリンカー配列は下線付きで示されている。
【化２０】
0006735822.tif 000021
【０１４４】
ｓｃＦｖ分子のＶＨ及びＶＬドメインリンカー配列（配列番号４３）
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ
【０１４５】
参照文献
本明細書で言及される全ての文献は、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられる。
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Ｍｕｌｌｅｒ，Ｎ．，Ｍ．Ｄｅｒｏｕａｚｉ，Ｆ．Ｖａｎ  Ｔｉｌｂｏｒｇｈ，Ｓ．Ｗｕｌｈｆａｒｄ，Ｄ．Ｌ．Ｈａｃｋｅｒ，Ｍ．Ｊｏｒｄａｎ  ａｎｄ  Ｆ．Ｍ．Ｗｕｒｍ（２００７）．“Ｓｃａｌａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅｄ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅｄ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２９（５）：７０３−７１１．
Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋ．（２０１２）．Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．
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Ｓｃｈｒａｍａ，Ｄ．，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，Ｒ．Ａ．＆  Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇｓ  ａｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ５，１４７−１５９（２００６）．
Ｎｅｒｉ，Ｄ．＆  Ｂｉｃｋｎｅｌｌ，Ｒ．Ｔｕｍｏｕｒ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ５，４３６−４４６（２００５）．
Ｄｅｌａ  Ｃｒｕｚ，Ｊ．Ｓ．，Ｈｕａｎｇ，Ｔ．Ｈ．，Ｐｅｎｉｃｈｅｔ，Ｍ．Ｌ．＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ｗｅａｐｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｗａｒ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ４，５７−６４（２００４）．
Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，Ｒ．Ａ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．＆  Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ  ７  Ｓｕｐｐｌ  ２，Ｓ９９−１０６（１９９７）．
Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２０１２；５２６：１９４−２０５．
Ｂｏｒｓｉ  Ｌ，Ｂａｌｚａ  Ｅ，Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ  Ｂ，Ｓａｓｓｉ  Ｆ，Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ  Ｐ，Ｂｅｒｎｄｔ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＴＮＦａｌｐｈａ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０２：４３８４−９２．
Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ  Ｂ，Ｂｏｒｓｉ  Ｌ，Ｂａｌｚａ  Ｅ，Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ  Ｐ，Ｍｅａｚｚａ  Ｒ，Ｂｅｒｎｄｔ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｂｙ  ｉｔｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ．Ｂｌｏｏｄ．２００２；９９：１６５９−６５．
Ｆｒｅｙ  Ｋ，Ｓｃｈｌｉｅｍａｎｎ  Ｃ，Ｓｃｈｗａｇｅｒ  Ｋ，Ｇｉａｖａｚｚｉ  Ｒ，Ｊｏｈａｎｎｓｅｎ  Ｍ，Ｎｅｒｉ  Ｄ．Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｆ８−ＩＬ２  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ  Ｕｒｏｌ．２０１０；１８４：２５４０−８．
Ｋａｓｐａｒ  Ｍ，Ｔｒａｃｈｓｅｌ  Ｅ，Ｎｅｒｉ  Ｄ．Ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５  ａｎｄ  ＧＭ−ＣＳＦ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７：４９４０−８
Ｐａｓｃｈｅ  Ｎ，Ｆｒｅｙ  Ｋ，Ｎｅｒｉ  Ｄ．Ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＩＬ１７  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｏ−ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｕｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｒｅｄｕｃｅ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．２０１２；１５：１６５−９．
Ｐａｓｃｈｅ  Ｎ，Ｎｅｒｉ  Ｄ．Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｒｍｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．２０１２；１７：５８３−９０．
Ｓｃｈｗａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＥＫＡＶＩＬ（Ｆ８−ＩＬ１０），ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｓｔａｇｅ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｗｈｉｃｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００９，１１（５）：Ｒ１４２．
Ｓｃｈｗａｇｅｒ  Ｋ，Ｂｏｏｔｚ  Ｆ，Ｉｍｅｓｃｈ  Ｐ，Ｋａｓｐａｒ  Ｍ，Ｔｒａｃｈｓｅｌ  Ｅ，Ｎｅｒｉ  Ｄ．Ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ．２０１１；２６：２３４４−５２．
Ｓｃｈｗａｇｅｒ  Ｋ，Ｋａｓｐａｒ  Ｍ，Ｂｏｏｔｚ  Ｆ，Ｍａｒｃｏｌｏｎｇｏ  Ｒ，Ｐａｒｅｓｃｅ  Ｅ，Ｎｅｒｉ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＥＫＡＶＩＬ（Ｆ８−ＩＬ１０），ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｓｔａｇｅ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｗｈｉｃｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．２００９；１１：Ｒ１４２．
Ｓｃｈｗａｇｅｒ  Ｋ，Ｖｉｌｌａ  Ａ，Ｒｏｓｌｉ  Ｃ，Ｎｅｒｉ  Ｄ，Ｒｏｓｌｉ−Ｋｈａｂａｓ  Ｍ，Ｍｏｓｅｒ  Ｇ．Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｓｔａｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ．Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｏｎｃｏｌ．２０１１；３：２５．
Ｂｒａｃｋ  ＳＳ，Ｓｉｌａｃｃｉ  Ｍ，Ｂｉｒｃｈｌｅｒ  Ｍ，Ｎｅｒｉ  Ｄ．Ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｌａｒｇｅ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６；１２：３２００−８．
Ｐｅｄｒｅｔｔｉ  Ｍ，Ｓｏｌｔｅｒｍａｎｎ  Ａ，Ａｒｎｉ  Ｓ，Ｗｅｄｅｒ  Ｗ，Ｎｅｒｉ  Ｄ，Ｈｉｌｌｉｎｇｅｒ  Ｓ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｌ１９  ａｎｄ  Ｆ１６  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ：ｔｗｏ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｎｃｅｒ．Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ．２００９；６４：２８−３３．
Ｓｃｈｌｉｅｍａｎｎ  Ｃ，Ｐａｌｕｍｂｏ  Ａ，Ｚｕｂｅｒｂｕｈｌｅｒ  Ｋ，Ｖｉｌｌａ  Ａ，Ｋａｓｐａｒ  Ｍ，Ｔｒａｃｈｓｅｌ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｌ１９−ＩＬ２．Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３：２２７５−８３．
Ｓｃｈｌｉｅｍａｎｎ  Ｃ，Ｗｉｅｄｍｅｒ  Ａ，Ｐｅｄｒｅｔｔｉ  Ｍ，Ｓｚｃｚｅｐａｎｏｗｓｋｉ  Ｍ，Ｋｌａｐｐｅｒ  Ｗ，Ｎｅｒｉ  Ｄ．Ｔｈｒｅｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｓｔａｇｅ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ａｎｄ  ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ．２００９；３３：１７１８−２２．
Ｓｃｈｌｉｅｍａｎｎ  Ｃ，Ｐａｌｕｍｂｏ  Ａ，Ｚｕｂｅｒｂｕｈｌｅｒ  Ｋ，Ｖｉｌｌａ  Ａ，Ｋａｓｐａｒ  Ｍ，Ｔｒａｃｈｓｅｌ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｌ１９−ＩＬ２．Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３：２２７５−８３．
Ｖｉｌｌａ  Ａ，Ｔｒａｃｈｓｅｌ  Ｅ，Ｋａｓｐａｒ  Ｍ，Ｓｃｈｌｉｅｍａｎｎ  Ｃ，Ｓｏｍｍａｖｉｌｌａ  Ｒ，Ｒｙｂａｋ  ＪＮ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ＥＤＡ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｏ−ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００８；１２２：２４０５−１３．
Ｖｉｔｉ  Ｆ，Ｔａｒｌｉ  Ｌ，Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ  Ｌ，Ｚａｒｄｉ  Ｌ，Ｎｅｒｉ  Ｄ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒａｌ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９；５９：３４７−５２．
Ｅｉｇｅｎｔｌｅｒ  ＴＫ，Ｗｅｉｄｅ  Ｂ，ｄｅ  Ｂｒａｕｄ  Ｆ，Ｓｐｉｔａｌｅｒｉ  Ｇ，Ｒｏｍａｎｉｎｉ  Ａ，Ｐｆｌｕｇｆｅｌｄｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｌ１９−ＩＬ２  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１１；１７：７７３２−４２．
Ｐａｐａｄｉａ  Ｆ，Ｂａｓｓｏ  Ｖ，Ｐａｔｕｚｚｏ  Ｒ，Ｍａｕｒｉｃｈｉ  Ａ，Ｄｉ  Ｆｌｏｒｉｏ  Ａ，Ｚａｒｄｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｌｉｍｂ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ１９−ＴＮＦ  ｐｌｕｓ  ｍｅｌｐｈａｌａｎ  ａｎｄ  ｍｉｌｄ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｃａｌｌｙ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．２０１２．
Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．ＩＬ−２２  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｉｒｏｎ  Ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｐｃｉｄｉｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１３；１９１：１８４５−１８５５
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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