(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアミン高生産性酵母の製造方法であって、
サッカロマイセス属酵母に突然変異処理を施すこと、
該突然変異処理された酵母を、２ｍＭ以上のスペルミンを含有する培地で培養すること、及び
該培地上に形成されたコロニーの菌体中ポリアミン量を測定し、該突然変異処理前と比べてポリアミン量の向上している株を、ポリアミン高生産性酵母変異株として取得すること、
を含む、方法。
【請求項２】
２ｍＭ以上のスペルミンを含有する、ポリアミン高生産性サッカロマイセス属酵母選択用培地。
【請求項３】
２ｍＭ以上のスペルミン存在下で増殖能を有し、２００ｍｇ／１００ｇ菌体（乾物換算）以上のポリアミンを含有する、サッカロマイセス属酵母変異株。
【請求項４】
サッカロマイセス・セレビシエＳ６３１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２１９９）、サッカロマイセス・セレビシエＳ６３５株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２００）及びサッカロマイセス・セレビシエＳＳ２０８株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２０１）からなる群より選択される、請求項３記載の酵母変異株。
【請求項５】
請求項３又は４記載の酵母変異株を培養することを含む、ポリアミンの製造方法。
【請求項６】
培養した前記酵母変異株からポリアミンを分離することをさらに含む、請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリアミン高生産性酵母変異株、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリアミンは第１級アミノ基を複数有する直鎖状脂肪族炭化水素の総称であり、生物の細胞内に普遍的に存在する。現在までに、２０種類以上のポリアミンの存在が報告されている。ヒトの体内のポリアミンは、主にプトレスシン、スペルミジン及びスペルミンの３種類であり、２０歳台をピークにその量は減少する。ポリアミンは、細胞の分裂に必要な成分であり、細胞内ポリアミン量が減少すると、細胞のターンオーバーが低下し、老化が促進すると考えられている。
【０００３】
したがって、体外からポリアミンを補充することによって、様々な生理効果を享受できると期待される。ポリアミンを多く含む食品としては、大豆、キノコ類、鶏肉、チーズなどが知られている。しかし、通常の食品中に含まれるポリアミンの量はそれほど多くないことから、日常の食事から充分な量のポリアミンを摂取することは容易ではない。
【０００４】
特許文献１には、酵母に高濃度のポリアミンが含まれていること、及び酵母の菌体や培養液を酸溶液で抽出することによりポリアミン含有画分を分離、精製する方法が記載されている。従来報告されている酵母のポリアミン含量は、特許文献１によれば、乾燥菌体１００ｇ中、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで約１３ｍｇ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃａｓで約２３ｍｇ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｌｉｔｉｓで約１０３ｍｇである。非特許文献１の報告から算出される菌体１００ｇ（湿重量）中のプトレスシン、スペルミジン及びスペルミンの合計含量は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで約１７ｍｇ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔｅで約３０ｍｇ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉで約２１ｍｇである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−５２２９１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】群馬保健学紀要  ２５：１１７−１２３，２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ポリアミンを高生産することができる酵母変異株、及び当該酵母変異株の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、種々検討した結果、酵母を突然変異処理した後、高濃度のポリアミンを含有する培地で培養してポリアミン耐性の高い酵母変異株を選択することによって、ポリアミン生産性の高い酵母変異株を効率よく取得することができることを見出した。
【０００９】
したがって本発明は、ポリアミン高生産性酵母の製造方法であって、
酵母に突然変異処理を施すこと、及び
突然変異処理された酵母を、スペルミジン及びスペルミンからなる群より選択される１種以上のポリアミンを該突然変異処理前の酵母に対する生育抑制濃度以上の濃度で含有する培地で培養すること、
を含む方法を提供する。
また本発明は、スペルミジン及びスペルミンからなる群より選択される１種以上のポリアミンを高濃度で含有するポリアミン高生産性酵母選択用培地を提供する。
さらに本発明は、ポリアミン生産性及びポリアミン耐性が向上した酵母変異株を提供する。
さらに本発明は、上記酵母変異株を培養することを含む、ポリアミンの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ポリアミン生産性の高い酵母変異株を提供することができる。本発明により提供される酵母変異株は、ポリアミンの微生物学的生産に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において、「ポリアミン」とは、特に説明がない場合、第１級アミノ基を複数有する直鎖状脂肪族炭化水素をいい、その種類は特に限定されない。通常、酵母が主に産生するポリアミンはプトレスシン、スペルミジン及びスペルミンの３種類であるため、本明細書における「ポリアミン」とは、好ましくは、プトレスシン、スペルミジン及びスペルミンからなる群より選択される１種以上をいい、より好ましくは、スペルミジン及びスペルミンからなる群より選択される１種以上をいう。したがって、本明細書における酵母又はその菌体中の「ポリアミン量」とは、好ましくは、酵母菌体中におけるプトレスシン、スペルミジン及びスペルミンの合計量を指し、より好ましくは、酵母菌体中におけるスペルミジン及びスペルミンの合計量を指す。酵母菌体中のポリアミン量は、ＨＰＬＣ法（例えば、後述の参考例１参照）などによって測定することができる。
【００１２】
ポリアミンは、細胞の分裂に必要な成分であるが、細胞外に多量に存在すると細胞の増殖を妨げる。しかしながら、本発明者らは、高濃度のポリアミン存在下でも増殖可能なポリアミン耐性の高い酵母株を取得した。さらに本発明者らは、それらのポリアミン耐性の高い株は、ポリアミン生産性が高い傾向があることを見出した。これらの知見に基づいて、本発明者らは、酵母変異株のポリアミン耐性を基準に、ポリアミン高生産性酵母変異株を効率よく取得することができることを見出した。
【００１３】
したがって、本発明は、ポリアミン高生産性酵母の製造方法を提供する。当該方法は、酵母に突然変異処理を施すこと、及び突然変異処理された酵母を、該突然変異処理前の酵母に対する生育抑制濃度以上の濃度のポリアミンを含有する培地で培養することを含む。培養後に培地上に形成されたコロニーを回収すれば、ポリアミン耐性が高く、かつポリアミン生産性の高い酵母変異株を取得することができる。
【００１４】
本発明のポリアミン高生産性酵母の製造方法において、突然変異処理を施す酵母（親株）には、通常の食用又は発酵に用いられる酵母を使用することができる。当該酵母の例としては、子嚢菌門のサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ジゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ウィッケルハミア属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ）、フェロマイセス属（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母、及び担子菌門のスポロボロマイセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母、などが挙げられる。これらの中でも、サッカロマイセス属、カンジダ属及びジゴサッカロマイセス属に属する酵母が好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、及びＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉがより好ましい。
【００１５】
突然変異処理は、親株に対して人工的に突然変異を誘発する処理であれば特に限定されないが、好ましくは、親株を変異原に曝す処理である。変異原としては、物理的変異原及び化学的変異原が挙げられる。物理的変異原としては、紫外線（ＵＶ）やＸ線、ガンマ線、重イオンビームなどのエネルギー線が挙げられるが、これらに限定されない。化学的変異原としては、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、亜硝酸などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
上記突然変異処理を施された酵母は、ポリアミンを高濃度で含有する培地で培養される。培養に使用される培地の種類としては、酵母の培養に一般的に使用される種類の培地であればよく、また合成培地、天然培地及びこれらの組合せのいずれであってもよい。好ましい培地の例としては、ＹＭ培地、ＹＰＤ培地、ＳＤ培地（グルコース最小培地）、ＹＭＰＤ培地、糖蜜培地（糖濃度０．３〜１０質量／容量％、発酵試験用）などが挙げられる。これらの培地の代表的な組成は、限定ではないが、以下のとおりである：ＹＭ培地［３ｇ／Ｌイーストエキス、３ｇ／Ｌモルトエキス、３ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌグルコース］；ＹＰＤ培地［１０ｇ／Ｌイーストエキス、２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌグルコース］；ＳＤ培地［６．７ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、２０ｇ／Ｌグルコース］；ＹＭＰＤ培地［３ｇ／Ｌイーストエキス、３ｇ／Ｌモルトエキス、５ｇ／Ｌペプトン、３０ｇ／Ｌグルコース］；糖蜜培地［糖蜜を還元糖濃度０．３〜１０質量／容量％になるように水で希釈したもの］。好ましくは、上記培地は、調製後に１２１℃、１５分間等の条件でオートクレーブして滅菌される。培地上に形成されたコロニーを回収するためには、好ましくは、該突然変異処理を施された酵母は平板培養用培地で培養される。平板培養用培地としては、ＹＭＰＤ寒天培地、ＹＭ寒天培地、ＹＰＤ寒天培地、ＳＤ寒天培地などが挙げられる。培地の固形化は、２％の寒天を加えてプレートを作製するなど、常法に従って行えばよい。
【００１７】
上記培地に含まれるポリアミンの例としては、好ましくはスペルミジン及びスペルミンからなる群より選択される１種以上が挙げられる。上記培地におけるポリアミンの濃度は、突然変異処理前の酵母（親株）に対する生育抑制濃度以上に調整される。
【００１８】
突然変異処理前の酵母（親株）に対するポリアミンの生育抑制濃度は、該親株の増殖を阻害するポリアミンの最低濃度として規定される。親株に対するポリアミンの生育抑制濃度は、突然変異処理に供した酵母株と同じ酵母株をポリアミン濃度を段階的に変更した培地で培養し、細胞の増殖が観察されなくなる最低濃度を求めることによって決定することができる。当該培地には、好ましくは平板培養用培地が使用され、より好ましくは突然変異処理を施された酵母を培養する培地と同じ種類の培地が使用される。細胞の増殖の有無は、例えば目視により、液体培地の濁度変化の有無、平板培地上のコロニー形成の有無を評価することによって確認することができる。
【００１９】
好ましい実施形態において、突然変異処理を施された酵母を培養する培地は、ＹＭＰＤ寒天培地、ＹＭ寒天培地、ＹＰＤ寒天培地、ＳＤ寒天培地などの平板培養用培地である。該培地におけるポリアミンの濃度は、スペルミジンの場合７５ｍＭ以上、より好ましくは１００〜２００ｍＭであり、スペルミンの場合２ｍＭ以上、好ましくは３ｍＭ以上、より好ましくは３〜５０ｍＭ、さらに好ましくは３〜２０ｍＭである。
【００２０】
上記ポリアミン含有培地に上記突然変異処理した酵母を接種し、培養する。培養の条件は、通常の酵母の培養条件、例えば、２９〜３２℃で１〜６日間、好ましくは３〜５日間を採用することができる。あるいは、酵母の培養方法やその条件は、例えば、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｃｕｌｔ  Ｃｏｌｌ，２５（２）８９−９１，２００９などを参考に決定することができる。
【００２１】
次いで、本発明のポリアミン高生産性酵母の製造方法においては、上記培養後に培地上に形成されたコロニーを回収する。培地上に複数のコロニーが形成されていた場合、全コロニーを各々回収してもよいが、生育のよいコロニーを選択的に回収してもよい。培地上に形成されたコロニーは、親株が増殖できない高濃度のポリアミン存在下でも増殖可能な株、すなわち親株よりもポリアミン耐性が向上した酵母変異株のコロニーである。続いて、回収したコロニーの酵母株の菌体中ポリアミン量を測定する。親株と比べてポリアミン量の向上している株を、ポリアミン高生産性酵母変異株として取得する。
【００２２】
後述の実施例に示すとおり、親株と比べてポリアミン耐性が向上した酵母変異株は、親株と比べてポリアミン生産性が向上している傾向が高い。したがって、ポリアミン高含有培地で増殖するコロニーを回収することで、多様な酵母変異株の中から、ポリアミン生産性の高い酵母変異株を効率よく取得することが可能になる。
【００２３】
さらに、本発明のポリアミン高生産性酵母の製造方法においては、上記で取得したポリアミン生産性が向上した酵母変異株に、さらなる突然変異処理を施してもよい。さらなる突然変異処理を施された酵母株は、ポリアミンをより高濃度で含有する培地で培養され、培地上に形成したコロニーは回収される。次いで、回収したコロニーの酵母株の菌体中ポリアミン量を測定し、親株と比べてポリアミン量の向上している株を取得する。上記さらなる突然変異処理及び培養の手順は、２回以上繰り返してもよい。該さらなる突然変異処理及び培養は、上述したとおりの手順で行えばよい。好ましくは、該さらなる培養で培地に添加されるポリアミンは、最初の培養で使用したものと同じ種類のものであり、ただし後の培養における培地のポリアミン濃度は、その直前の培養に用いた培地に対して、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．５〜４倍である。突然変異処理と高濃度ポリアミン含有培地での培養を繰り返すことにより、よりポリアミン生産性の高い酵母変異株を効率よく取得することができる。
【００２４】
本発明では、ポリアミンを高濃度で含有する培地を、突然変異処理した酵母からポリアミン高生産性酵母株を選択するために使用している。したがって、本発明において、上記ポリアミン高生産性酵母の製造方法で使用する培地は、ポリアミン高生産性酵母選択用培地として提供される。好ましい実施形態において、該ポリアミン高生産性酵母選択用培地は、スペルミジンを７５ｍＭ以上、より好ましくは１００〜２００ｍＭ含有する培地であるか、又はスペルミンを２ｍＭ以上、好ましくは３ｍＭ以上、より好ましくは３〜５０ｍＭ、さらに好ましくは３〜２０ｍＭ含有する培地である。該選択用培地の種類としては、上述した酵母の培養に一般的に使用されるものであればよいが、好ましくは平板培養用培地であり、例えばＹＭＰＤ寒天培地、ＹＭ寒天培地、ＹＰＤ寒天培地、ＳＤ寒天培地などが挙げられる。
【００２５】
以上の本発明の方法に従って、ポリアミン高生産性酵母を製造することができる。本発明の方法で得られたポリアミン高生産性酵母は、親株と比べてポリアミン生産性が向上した酵母変異株であり、菌体中にポリアミンを高濃度で含有することができる。また本発明の方法で得られたポリアミン高生産性酵母は、親株と比べて、より高濃度のポリアミンを含有する培地中で増殖することができる酵母変異株である。
【００２６】
したがって、本発明はまた、ポリアミン生産性及びポリアミン耐性が向上した酵母変異株を提供する。本発明の酵母変異株は、親株と比べてポリアミン耐性が向上しており、好ましくは２ｍＭ以上のスペルミン存在下（スペルミンを２ｍＭ以上含有する培地中）、より好ましくは３ｍＭ以上のスペルミン存在下（スペルミンを３ｍＭ以上含有する培地中）で増殖能を有する。また本発明の酵母変異株は、親株と比べてポリアミン生産性が向上している。本発明の酵母変異株の菌体中のポリアミン量は、酵母野生株の菌体中のポリアミン量に対して、好ましくは１２０％以上、より好ましくは２００％以上である。さらに好ましくは、当該酵母変異株は、ＹＭＰＤ培地中での３０℃で１〜２日間の振とう培養の後、菌体中に、ポリアミン、好ましくはスペルミジンを２００ｍｇ／１００ｇ菌体（乾物換算）以上の量で含有する。本発明の酵母変異株の例としては、サッカロマイセス・セレビシエＳ６３１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２１９９）、サッカロマイセス・セレビシエＳ６３５株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２００）及びサッカロマイセス・セレビシエＳＳ２０８株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２０１）が挙げられる。これらの株は、出願人により、２０１６年２月２日に独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に寄託された。
【００２７】
本発明の酵母変異株は、ポリアミン生産性が高く、ポリアミンの微生物学的生産に有用である。したがって本発明はまた、本発明の酵母変異株を用いたポリアミンの製造方法を提供する。当該方法では、本発明の酵母変異株を培養し、ポリアミンを生産させる。
【００２８】
本発明のポリアミンの製造方法において、酵母変異株の培養は、通常の酵母の培養方法に従って行うことができる。酵母の培養方法やその条件は、例えば、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｃｕｌｔ  Ｃｏｌｌ，２５（２）８９−９１，２００９などを参考に決定することができる。
【００２９】
好ましくは、本発明のポリアミンの製造方法における酵母変異株の培養では、まず本発明の酵母変異株を前培養し、次いで、前培養液を用いて本培養を行う。該前培養では、本発明の酵母変異株を液体培地に接種し、２９〜３２℃で１〜２日間振とう培養する。必要に応じて、前培養した培地を遠心分離等にかけ、酵母画分を分離してもよい。本培養では、培地に前培養液又はその酵母画分を加え、２９〜３２℃で培養する。好ましくは１２０〜１５０ｒｐｍ程度で振とう培養する。本培養用培地に加える前培養液又は酵母画分の量は、培養スケールや装置、環境等に応じて適宜変更することができる。好ましくは、本培養用培地１００容量％に対して、０．１〜５０容量％程度の前培養液、又は０．１〜５０容量％程度の前培養液から分離した酵母画分が添加される。本培養の培養時間は、培養スケールによっても異なるが、６時間〜２日間程度である。培養液の濁度などを指標とする酵母の増殖量と、サンプリングして得られる酵母菌体中のポリアミン量を指標として、所望される培養スケールで効率よくポリアミンを生産できる培養時間を決定することができる。
【００３０】
上記前培養及び本培養に用いる培地としては、酵母の培養に使用することができる一般的な培地を使用することができる。培地は、合成培地、天然培地及びこれらの組合せのいずれであってもよく、液体培地が好ましい。好ましい例としては、上述したＹＭ培地、ＹＰＤ培地、ＳＤ培地（グルコース最小培地）、ＹＭＰＤ培地、糖蜜培地などを挙げることができる。あるいは、培地としては、グルコース水溶液を使用することもできる。該グルコース水溶液のグルコース濃度は０．５〜１０質量／容量％が好ましい。
【００３１】
本発明のポリアミンの製造方法に従って培養された本発明の酵母変異株は、菌体１００ｇ（乾物換算）あたり、好ましくは２００ｍｇ以上のポリアミン、より好ましくは２５０ｍｇ以上のポリアミン、さらに好ましくは２００ｍｇ以上のスペルミジン、なお好ましくは２５０ｍｇ以上のスペルミジンを含有する。
【００３２】
本発明のポリアミンの製造方法においては、ポリアミンを高濃度で含有する培養後の酵母変異株そのものをポリアミン源として提供することができる。提供された酵母変異株は、そのまま飲食品、栄養組成物などに添加することができる。あるいは、本発明のポリアミンの製造方法においては、培養後の酵母変異株の菌体中から公知の方法（例えば、特許文献１記載の方法）に従ってポリアミンを分離することができる。必要に応じて、分離したポリアミンをさらに精製してもよい。菌体から分離又は精製されたポリアミンは、飲食品、栄養組成物、医薬品などの有効成分として使用することができる。
【実施例】
【００３３】
以下に実施例を示し、本発明の効果を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３４】
（実施例１  酵母変異株の作製）
（１）親酵母株
市販のパン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、野生株）を、酵母変異株の親株として使用した。
【００３５】
（２）培地
酵母株の液体培養は、ＹＭＰＤ培地（３ｇ／Ｌイーストエキス、３ｇ／Ｌモルトエキス、５ｇ／Ｌペプトン、３０ｇ／Ｌグルコース）を使用し、５ｍＬのＹＭＰＤ培地に菌体を接種して、３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。また、平板培養には２％となるように寒天を加えて作製したＹＭＰＤ寒天培地を用いた。
【００３６】
（３）親酵母株のポリアミン耐性の評価
親株の生育が抑制されるポリアミン濃度を求めた。ポリアミンは、スペルミジン又はスペルミンを用いた。スペルミジン三塩酸塩又はスペルミン四塩酸塩をそれぞれ１００ｍＭから２倍希釈系列（１００ｍＭ〜０．６２５ｍＭ）で添加したＹＭＰＤ液体培地を９６ウェルプレートに２００μＬずつ分注した。各ウェルに一昼夜培養した酵母培養液を２μＬずつ接種し、３０℃で２４時間静置培養した。各ウェルの酵母の生育の有無を目視による濁度に基づいて評価し、スペルミジン及びスペルミンそれぞれについての親株の生育が抑制される濃度を調べた。各ポリアミンを添加した液体培地中での親株の生育性は以下の通りであった：スペルミジン  １２．５ｍＭでやや抑制、２５ｍＭで抑制；スペルミン  ０．６２５ｍＭで抑制。
【００３７】
スペルミジンとスペルミンについて、平板培養用培地における親株の生育抑制濃度を決定した。段階的に濃度を変更したスペルミジン三塩酸塩（１２．５〜７５ｍＭ）又はスペルミン四塩酸塩（０．３〜３ｍＭ）を添加したＹＭＰＤ寒天培地に、一昼夜培養した酵母培養液の１０倍希釈系列を１０μＬずつ滴下して、３０℃で６日間培養した。平板培地上でのコロニー形成の有無により酵母の生育性を評価することによって、親株の生育が抑制される濃度を調べた。寒天培地上での親株の生育性は以下の通りであった：スペルミジン：７５ｍＭで若干抑制；スペルミン：２ｍＭで若干抑制、３ｍＭで抑制。以上の結果から、以降の実施例における酵母変異株選択用培地として、スペルミンを３ｍＭ以上添加したＹＭＰＤ寒天培地を用いた。
【００３８】
（４）突然変異処理及びポリアミン耐性株の選択
一昼夜培養した酵母培養液１．５ｍＬを３，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、菌体を回収した。得られた菌体を１０ｍＬ超純水で洗浄した後、１５ｍＬ超純水に懸濁して、予め７０％エタノールに漬けて殺菌したマグネチックスターラーを入れたφ９ｃｍシャーレに流し入れた。紫外線の光源には、殺菌ランプ（ＧＬ１５、１５Ｗ、主波長２５３．７ｎｍ、東芝）を用いた。光源直下から３０ｃｍの距離に菌懸濁液を入れたシャーレを置き、蓋を開けてスターラーで撹拌しながら４５秒間紫外線を照射した。紫外線照射した菌懸濁液を、３、４又は５ｍＭスペルミン添加ＹＭＰＤ寒天培地に１枚あたり５００μＬ塗抹し、３０℃で３〜５日間培養した。培養後の培地１枚あたり数個〜数１００個程度のコロニーが生育した。生育の良い大きめのコロニーを釣菌し、ＹＭＰＤ寒天培地に塗抹してストックした。３ｍＭスペルミン添加培地から４８株、４ｍＭスペルミン添加培地から１１株、５ｍＭスペルミン添加培地から２株の合計６１株を得た。
【００３９】
得られた６１株について、後述する参考例１記載の手順に従ってポリアミン量を測定した。２０株（３２．８％）が、親株（野生株）と比べて１２０％以上ポリアミン生産性が向上していた。
【００４０】
（５）さらなる突然変異処理
上記（４）で取得したポリアミン高生産性酵母変異株のうち、３ｍＭスペルミン添加培地で生育した１０２７−３−１８株は、液体培地中での増殖性がよくポリアミン量が親株（野生株）の約２倍であった。この１０２７−３−１８株に対し、上記（４）と同様の手順で２回目の突然変異処理を行い、紫外線照射した菌懸濁液をスペルミン６ｍＭ添加ＹＭＰＤ寒天培地に１枚あたり１ｍＬ塗抹し、３０℃で３〜５日間培養した。培養後の培地１枚あたり数１０個程度のコロニーが生育した。生育の良い大きめのコロニーを釣菌して３６株（株番号Ｓ６１〜Ｓ６３６）の変異株を得た。これらの株について、後述する参考例１記載の手順に従ってポリアミン量を測定した。
【００４１】
表１〜表４に示すとおり、ポリアミン量を測定した３６株のうち、３３株（９１．６％）は野生株と比べて２００％以上、２０株（５５．６％）は野生株と比べて３００％以上、ポリアミン生産性が向上していた。
【００４２】
【表１】
0006663757.tif 000002
【００４３】
【表２】
0006663757.tif 000003
【００４４】
【表３】
0006663757.tif 000004
【００４５】
【表４】
0006663757.tif 000005
【００４６】
Ｓ６２８株に対し、上記（４）と同様の手順で３回目の突然変異処理を行い、紫外線照射した菌懸濁液をスペルミン１０、１５又は２０ｍＭ添加ＹＭＰＤ寒天培地に塗抹し、３０℃で３〜５日間培養した。１０、１５及び２０ｍＭスペルミン添加培地から、それぞれ６株（株番号ＳＳ１０１からＳＳ１０６）、６株（株番号ＳＳ１５１からＳＳ１５６）及び８株（株番号ＳＳ２０１からＳＳ２０８）の変異株を取得した。表５〜７に示すとおり、取得した２０株のポリアミン高生産性酵母変異株のポリアミン量は、いずれも野生株の約３００％又はそれ以上であった。
【００４７】
【表５】
0006663757.tif 000006
【００４８】
【表６】
0006663757.tif 000007
【００４９】
【表７】
0006663757.tif 000008
【００５０】
（６）ポリアミン高生産性酵母変異株の確立
取得した変異株のうち、スペルミジン及びスペルミン含量の高い株を選択して、シングルコロニーアイソレーションの後、ＹＭＰＤ寒天培地で５回継代してからグリセロールストックを調製して−８０℃で冷凍保存した。グリセロールストックは、２ｍＬ容凍結用チューブに滅菌した１５％グリセロールを入れ、ここに培養した菌苔をディスポーザブル白金耳でかき取って加え懸濁して調製した。各グリセロールストックを平板培養し、生育したコロニーを接種して液体培養した後、菌株のポリアミン量を測定し、ポリアミン高生産性が維持されていたものをポリアミン高生産性酵母変異株として取得した（表８）。
【００５１】
得られた変異株のうちＳ６３１株、Ｓ６３５株及びＳＳ２０８株は、２０１６年２月２日に独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に寄託され、それぞれ受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２１９９、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２００及びＮＩＴＥ  Ｐ−０２２０１を付与された。
【００５２】
【表８】
0006663757.tif 000009
【００５３】
（参考例１  酵母菌体中ポリアミン量の測定）
酵母培養物を遠心分離して菌体を回収し、超純水で２回洗浄した後、総量が０．５ｍＬとなるように超純水を加えて菌液を調製した。得られた菌液から０．２ｍＬを採取し、含まれる菌体の乾燥重量を測定した。次いで、該菌体を乾物換算で５〜１０質量％程度となるように水に懸濁して、ポリアミン量測定用の試験溶液を調製した。
試験溶液０．２ｍＬをスクリューキャップ付き褐色試験管に採り、０．２Ｍ  ＨＣｌＯ4  ４．８ｍＬを加えて混和した後、１００℃、１０分間加熱処理した。流水で冷却後、２，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離して得た上清を０．４５μｍフィルターで濾過した。共栓付褐色試験管に濾液０．２ｍＬと０．２Ｍ  ＨＣｌＯ4  ０．８ｍＬ（又は標準溶液１ｍＬ）を採り、飽和Ｎａ2ＣＯ3水溶液  ０．５ｍＬ、１％ダンシルクロライド・アセトン溶液１ｍＬを加えてよく混和した後、遮光して４５℃の水浴中に１時間静置した。次いで、１０％プロリン水容液０．５ｍＬを加えて十分に撹拌後、暗所で１０分間静置した。これにトルエン２ｍＬを加えて２５０ｒｐｍ、１０分間振とうした後、分離した上層１ｍＬを採り、褐色ナスフラスコを用いて４０℃の水浴中で減圧濃縮した。残渣にアセトニトリル１ｍＬを加えて溶解したものをＨＰＬＣ用試料とした。
得られたＨＰＬＣ用試料を下記条件にてＨＰＬＣ分析にかけ、標準試料のピーク面積から検量線を作成してプトレスシン、スペルミジン及びスペルミンをそれぞれ定量した。標準試料には、プトレスシン二塩酸塩、スペルミジン三塩酸塩、スペルミン四塩酸塩（いずれもＳＩＧＭＡ）を０．２Ｍ  ＨＣｌＯ4に各１ｐｐｍとなるように溶解したものを用いた。
＜ＨＰＬＣ条件＞
装置：日立ＨＰＬＣ  Ｌ−７０００シリーズ
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ３μｍ（４．６×１００ｍｍ）（資生堂）
検出：Ｅｘ．３６５  ｎｍ；Ｅｍ．５１０ｎｍ
カラム温度：３５℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
試料インジェクション量：１０μＬ
溶離液Ａ：１０ｍＭ  酢酸アンモニウム
溶離液Ｂ：アセトニトリル
グラジエント：Ａ ５０％（０ｍｉｎ）−１０％（１５ｍｉｎ）−１０％（２５ｍｉｎ）−５０％（２５．１ｍｉｎ）−５０％（３５ｍｉｎ）