(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の標的配列と第二の標的配列とを含む溶菌性の標的ファージのゲノムを改変する方法であって：
（ａ）標的ファージの宿主域決定因子とは異なる、マーカーファージの宿主域決定因子を含むファージ標的化領域を含有するベクターであって、ファージ標的化領域が、標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列と相同な第一および第二の隣接配列に隣接する、ベクターを提供するステップと；
（ｂ）標的ファージの宿主である第一の宿主細胞にベクターを導入するステップと；
（ｃ）第一の宿主細胞に標的ファージを感染させるステップと；
（ｄ）ファージを複製および組み換えさせて、それによって標的ファージのゲノムを改変するステップと；
（ｅ）得られたファージを、マーカーファージの宿主であるが標的ファージの宿主ではない第二の宿主細胞において増殖させるステップと；
（ｆ）得られたファージを回収するステップと
を含み、
ベクターのファージ標的化領域が、標的ファージのゲノムに組み込むための外因性のＤＮＡ配列をさらに含む方法。
【請求項２】
標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列が連続していない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列が、組み換え後の遺伝子の不活化のために、ファージ遺伝子、溶菌遺伝子、またはその一部に隣接する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
外因性のＤＮＡは遺伝子を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
外因性のＤＮＡが抗菌タンパク質をコードする、または、外因性のＤＮＡがα／β型低分子酸可溶性芽胞タンパク質（ＳＡＳＰ）をコードする遺伝子、もしくは、ＳＡＳＰ−Ｃをコードする遺伝子を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子が、構成的プロモーターまたはｐｄｈＡ、ｒｐｓＢ、ｐｇｉ、ｆｄａ、ｌａｓＢ、およびそれらと９０％超の配列同一性を有するプロモーターから選択される構成的プロモーターの制御下にある、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第一および第二の隣接配列の少なくとも１つが、標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列と比較して変異もしくは点突然変異を含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
マーカーファージの宿主域決定因子が、尾繊維タンパク質またはその領域または、第二の宿主細胞に結合するための受容体結合領域と、受容体結合領域をファージのボディに結合させる領域とを含む尾繊維タンパク質をコードする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
受容体結合領域が、Ｃ末端受容体結合領域であり、Ｃ末端受容体結合領域をファージのボディに結合させる領域がＮ末端領域である、または、
受容体結合領域が、バクテリオファージＰｈｉ３３のアミノ酸配列に基づいて、尾繊維タンパク質のアミノ酸６２９〜９６４位を含むＣ末端領域であり、さらに、ファージのボディへのＣ末端受容体結合領域に結合している領域が、尾繊維タンパク質のアミノ酸１〜６２８位を含むＮ末端領域である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｃ末端領域が、バクテリオファージＰｈｉ３３のＣ末端領域と９６％以下のアミノ酸配列同一性を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｃ末端領域が、バクテリオファージＰｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４−１、ＪＧ０２４、ＮＨ−４、ＰＴＰ４７、Ｃ３６、ＰＴＰ９３、およびＰＴＰ９２のいずれか１つに由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｃ末端領域アミノ酸配列同一性が８０％未満、もしくは７０％未満、もしくは、６０％未満である、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｎ末端領域がバクテリオファージＰｈｉ３３のＮ末端領域と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｎ末端領域が、バクテリオファージＰｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４−１、ＪＧ０２４、ＮＨ−４、ＰＴＰ４７、Ｃ３６、ＰＴＰ９２、およびＰＴＰ９３のいずれか１つに由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
尾繊維タンパク質がバクテリオファージＰｈｉ３３の尾繊維アミノ酸配列と８０％超のアミノ酸配列同一性を有する、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
各尾繊維タンパク質が、Ｐｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４−１、ＪＧ０２４、ＮＨ−４、ＰＴＰ４７、Ｃ３６、ＰＴＰ９２、およびＰＴＰ９３から選択されるバクテリオファージに由来する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
アミノ酸配列同一性が８５％超、もしくは９０％超、もしくは９５％超である、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第二の宿主細胞がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）宿主細胞、もしくは、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）宿主細胞である、請求項９〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
バクテリオファージが標的細菌に対して毒性であるＳＡＳＰを含み、非溶菌性である、複数の異なる標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージを産生するための、請求項５〜１８のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項２０】
バクテリオファージが複数の異なる宿主域決定因子を発現し、それぞれの宿主域決定因子が異なる細菌宿主特異性を有する、または、
バクテリオファージが複数の異なるバクテリオファージ由来のアミノ酸配列を含む、宿主域決定因子タンパク質、もしくは、尾繊維タンパク質を発現する、および／または、
宿主域決定因子の細菌宿主特異性が、同じ細菌種内である、請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶菌性標的ファージのゲノムを改変する方法、方法の使用、およびその産物に関する。
【背景技術】
【０００２】
バクテリオファージは、世界中で最も豊富な生物であり、常に１０３０個存在すると推定されている。バクテリオファージは、想像可能なあらゆる環境に住むことができると報告されており（Ｂｒａｂｂａｎら、２００５）、このため、生物工学において使用するために生物学的多様性の巨大な宝庫を提供することができる。ファージは、タンパク質−タンパク質相互作用を特徴付けするためのファージディスプレイ（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｅｎｋｏ、１９９７）、細菌病原体を迅速に同定するための診断試験（Ｄｏｂｏｚｉ−Ｋｉｎｇら、２００５）、および「ファージ療法」による細菌感染症の治療（Ｈａｒｐｅｒら、２０１１）などの多様な応用において使用されている。ファージの別の用途は、標的病原性細菌に毒性タンパク質をコードする遺伝子を送達するために使用することができる、ニーズに合わせた遺伝子送達ビヒクルを作製するための改変の基礎としての使用である。そのようなアプローチは、ＳＡＳＰｊｅｃｔシステム（国際公開第２００９／０１９２９３号パンフレット）に記述されており、このシステムでは、バクテリオファージを非溶菌性となるように、このため最終的に非生存となるように、およびＳＡＳＰ遺伝子発現カセットを有するように改変し、これを標的細菌に送達して、それによって迅速にＳＡＳＰを発現させる。ＳＡＳＰは、休眠時のグラム陽性菌芽胞のＤＮＡを保護する低分子酸可溶性芽胞タンパク質である。しかし、栄養細胞においてＳＡＳＰが発現されると、ＳＡＳＰが非配列特異的に細胞ＤＮＡに急速に結合することにより、急速な細胞死が起こる（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、１９９０）。
【０００３】
ファージは、テンペレートファージと非テンペレートファージに広く分類することができる（Ａｂｅｄｏｎ、２００８）。テンペレートファージは、２つの異なる生活環で存在することができる。１つの生活環において、テンペレートファージは、「溶菌的」に複製する−すなわち、ファージは宿主細胞に感染して、複製し、新しいファージ子孫を作製し、このプロセスは、細胞の溶解および成熟ファージ粒子の放出で終わる。他の生活環において、テンペレートファージは、細胞に感染して、通常、特異的結合部位で宿主細胞ゲノムに組み込まれ、「プロファージ」となる。その際に、ファージは、宿主細胞ゲノムの一過性の一部となり、宿主細胞ＤＮＡと共に複製される。組み込まれたプロファージは一般的に、その組み込まれた状態ではその宿主細胞に対して無害であり、細胞に追加の遺伝子を提供することによって、しばしば細胞に対して選択的利点を提供することができ、例えばＣＴＸ毒素遺伝子は、ＣＴＸプロファージによってビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａ）に提供され、非毒素遺伝子を有する株と比較してそのような株のビルレンスを増加させる（Ｗａｌｄｏｒ  ａｎｄ  Ｍｅｋａｌａｎｏｓ、１９９６）。これに対し、非テンペレートファージは、「溶菌性ファージ」としても知られ、上記の溶菌性の生活環に限って複製することができ、宿主ＤＮＡに組み込まれることはなく、したがって、決して宿主細胞ゲノムの一部となることはない。本明細書において以降、そのようなファージを、溶菌的複製とプロファージ複製の両方を行うことができるテンペレートファージと区別するために、「絶対溶菌性」として記述する。
【０００４】
遺伝子改変のためのファージを選択する場合、例として、そのようなファージがＳＡＳＰなどの抗菌タンパク質をコードする遺伝子の送達ベクターとして作用する場合には、遺伝子改変に対するファージの従順性は重要な要因である。概して、テンペレートバクテリオファージは、細菌宿主種を、組み換えおよび耐性マーカー選択、またはリコンビニアリングシステム（Ｔｈｏｍａｓｏｎら、２０１４）を伴う標準的な分子遺伝子学技術によって操作することができる限り、容易に遺伝子改変される。
【０００５】
組み込まれたファージＤＮＡをプロファージとして有する溶原菌の形態でのテンペレートファージを、抗生物質耐性または重金属耐性マーカーなどの任意の多様な選択可能マーカーに結合した外因性のＤＮＡを有するように改変することができる。そのようなマーカーを、外因性のＤＮＡに結合させて、プロファージＤＮＡの領域に隣接させ、細菌宿主（溶原菌）において複製できない適切なベクター（自殺ベクター）にクローニングすることができる。そのようなプラスミドを、接合または化学もしくは電気的形質転換などの一般的な方法により細菌溶原菌に導入した後、プラスミドに存在する相同な配列を介して組み込まれた組み換え体を、外因性のＤＮＡに結合した耐性マーカーを介して選択することができる。カウンターセレクタブルマーカーも同様にテンペレートファージを改変するために使用することができる。耐性マーカーを保持している組み換え型ファージを、ＰＣＲなどの一般的な方法によってスクリーニングすることができる。あるいは、ｓａｃＢなどのカウンターセレクタブルマーカーによって、そのようなファージを改変するために使用されるプラスミドの骨格を改変することができ、外因性のＤＮＡに結合した耐性マーカーを選択し、カウンターセレクタブルマーカーを選択しないことによって、外因性のＤＮＡのみを有する組み換え型プロファージを単離することができる。遺伝子型はＰＣＲによって確認することができる。そのようなベクターは市販されている。そのような改変ファージは、例えばマイトマイシンＣの添加によって溶原化した株から誘導することができ（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、２００２）、ファージが宿主染色体から切り離されてその溶菌相に入ると、保持されたマーカーをもはや選択することができないが、マーカーおよび外因性のＤＮＡはファージゲノムにとどまることができる。
【０００６】
しかし、遺伝子改変された溶菌性ファージの単離は、上記の同じ方法を使用して達成することはできない。例えば、細菌に耐性を付与する抗生物質耐性および重金属耐性マーカーは、ファージの絶対溶菌性の生活環により選択することができないことから、改変された絶対溶菌性ファージを単離するために通常の正の選択を使用することは不可能である。ファージのＤＮＡは、決して宿主細胞ゲノムの一部とならず、したがって宿主に耐性を伝達する選択可能耐性マーカーは、絶対溶菌性ファージに存在する場合は選択可能ではない。
【０００７】
溶菌性ファージを改変するためにいくつかの技術が開発されている。そのような１つの例は、ＢＲＥＤ技術（電気穿孔ＤＮＡのバクテリオファージリコンビニアリング）（Ｍａｒｉｎｅｌｌｉら、２００８）であり、これは「リコンビニアリング」アプローチを使用して、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ファージの改変に関して記述されている。細菌ゲノムを操作するためのリコンビニアリング法は、λＲｅｄシステムで最初に記述された（Ｙｕら、２０００）。この技術において、組み換えタンパク質ＥｘｏおよびＢｅｔａは、形質転換により宿主細胞に導入される直線状のＤＮＡ配列の効率的な組み換えを触媒する。ＢＲＥＤアプローチも同様に、ファージゲノムがＭ．スメグマティス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）細胞に直線状の「標的化」ＤＮＡ断片と同時形質転換される場合に、高レベルの組み換えを促進するために、組み換え促進タンパク質−マイコバクテリウムバクテリオファージ由来のＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ様タンパク質ｇｐ６０およびｇｐ６１を利用する。それによって、組み換え型ファージをスクリーニングすると、高い効率の組み換えにより比較的容易に同定される。しかし、そのようなアプローチは、選択された細菌種における効率的なリコンビニアリングシステムの開発に依存する。さらに、ファージゲノムは大きく（Ｈｅｎｄｒｉｘ、２００９）、大きいＤＮＡ分子の形質転換は、大腸菌などの容易に形質転換可能な細菌においても非効率的であり（Ｓｈｅｎｇら、１９９５）、効率的な形質転換技術は、多くの細菌種で開発されていない。
【０００８】
特定のバクテリオファージを改変するために特異的な技術が開発されている。例として、ＲＩＰｈ（ファージ複製のＲｈｏ＊媒介阻害）として知られる技術が、ファージＴ４に関して開発されている（Ｐｏｕｉｌｌｏｔら、２０１０）。ファージ複製に必須の初期遺伝子は、初期タンパク質を産生するために宿主転写ターミネーター因子Ｒｈｏを必要とするコンカテマー化ランスルーＲＮＡとして転写される。大腸菌を、Ｒｈｏ＊と呼ばれるＲｈｏの誘導物質制御過剰発現変異コピーを含有するように改変すると、初期Ｔ４タンパク質の産生を阻害し、このように、Ｔ４ファージ複製を可逆的に阻害するが、宿主細胞生存率に及ぼす効果は最小限であることが見出された。この状態では、Ｔ４ゲノムは複製せず、ファージの生活環を成熟ファージ合成および溶解まで継続させないが、細胞から失われることはなく、組み換えのための基質である。ＲＩＰｈ技術において、λＲｅｄシステムは、この安定な中断状態にある間にＴ４ゲノムへの組み換えを標的化するために使用される。誘導物質を除去すると、ファージはその生活環を継続して成熟することができ、改変されたファージが形成される。
【０００９】
特異的絶対溶菌性ファージ改変システムのもう１つの例は、Ｔ７ファージにおいて見出される。大腸菌遺伝子ｔｒｘＡおよびｃｍｋは、ファージＴ７の増殖にとって必要であるが、宿主細胞の増殖にとっては必要ではない（Ｑｉｍｒｏｎら、２００６；Ｍａｒｋ、１９７６）。したがって、Ｔ７は、マーカー遺伝子を欠如する改変宿主細胞上で組み換え型ファージを選択することによって、これらの「マーカー」遺伝子のいずれかを有するように改変することができる。しかし、Ｔ４およびＴ７の例のいずれにおいても、ファージの複製機構、またはファージ複製に特に必要な宿主細胞遺伝子に関する非常に具体的で詳細な知識が必要である。
【００１０】
ファージの複製経路に関係する遺伝子または細胞におけるファージ増殖に必要な宿主細胞の遺伝子に関する具体的で詳細な知識に依存しない、溶菌性ファージのゲノムを改変する技術があれば望ましい。そのような技術は、任意の細菌種由来のファージに広く応用可能であることがさらに望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００９／０１９２９３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／４０６７８号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｂｒａｂｂａｎ  ＡＤ，Ｈｉｔｅ  Ｅ，Ｃａｌｌａｗａｙ  ＴＲ．（２００５）．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｖｉａ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．２：２８７−３０３．
【非特許文献２】Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ，Ｐｅｔｒｅｎｋｏ  ＶＡ．（２００５）．Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．９７：３９１−４１０．
【非特許文献３】Ｄｏｂｏｚｉ−Ｋｉｎｇ  Ｍ，Ｓｅｏ  Ｓ，Ｋｉｍ  ＪＵ，Ｙｏｕｎｇ  Ｒ，Ｃｈｅｎｇ  Ｍ，Ｋｉｓｈ  ＬＢ．（２００５）．Ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ＳＥｎｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ−Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  Ｉｏｎ  Ｃａｓｃａｄｅ（ＳＥＰＴＩＣ）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．５：３−７．
【非特許文献４】Ｈａｒｐｅｒ  ＤＲ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｊ，Ｅｎｗｒｉｇｈｔ  ＭＣ．（２０１１）．Ｐｈａｇｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ．Ｔｈｅｒ  Ｄｅｌｉｖ．２：９３５−４７．
【非特許文献５】Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ＷＬ，Ｓｅｔｌｏｗ  Ｂ，Ｓｅｔｌｏｗ  Ｐ．（１９９０）．Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ａ  ｓｍａｌｌ，ａｃｉｄ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｓｐｏｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｉｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ．Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６９００−６９０６．
【非特許文献６】Ａｂｅｄｏｎ  ＳＴ．（２００８）．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｅｃｏｌｏｇｙ：Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，  ａｎ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｃｈａｐｔｅｒ  １．
【非特許文献７】Ｗａｌｄｏｒ  Ｍ，Ｍｅｋａｌａｎｏｓ  Ｊ．（１９９６）．Ｌｙｓｏｇｅｎｉｃ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７２：１９１０−１９１４．
【非特許文献８】Ｔｈｏｍａｓｏｎ  ＬＣ  Ｓａｗｉｔｚｋｅ  ＪＡ，Ｌｉ  Ｘ，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ  Ｎ，Ｃｏｕｒｔ  ＤＬ．（２０１４）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｕｓｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１０６：１−１６．
【非特許文献９】Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ＳＪ，Ｈｏｕｃｈｉｎ  ＬＡ，ＭｃＤａｎｉｅｌ  Ｌ，Ｐａｕｌ  ＪＨ．（２００２）．Ｓｅａｓｏｎａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｙｓｏｇｅｎｙ  ａｓ  ｄｅｐｉｃｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔａｍｐａ  Ｂａｙ，Ｆｌｏｒｉｄａ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：４３０７−１４．
【非特許文献１０】Ｍａｒｉｎｅｌｌｉ  ＬＪ，Ｐｉｕｒｉ  Ｍ，Ｓｗｉｇｏｎｏｖａ  Ｚ，Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ  Ａ，Ｏｌｄｆｉｅｌｄ  ＬＭ，ｖａｎ  Ｋｅｓｓｅｌ  ＪＣ，Ｈａｔｆｕｌｌ  ＧＦ．（２００８）．ＢＲＥＤ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．３：ｅ３９５７．
【非特許文献１１】Ｙｕ  Ｄ，Ｅｌｌｉｓ  ＨＭ，Ｌｅｅ  ＥＣ，Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＮＡ，Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ＮＧ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：５９７８−５９８３．
【非特許文献１２】Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＲＷ．（２００９）．Ｊｕｍｂｏ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２８：２２９−４０．
【非特許文献１３】Ｓｈｅｎｇ  Ｙ，Ｍａｎｃｉｎｏ  Ｖ，Ｂｉｒｒｅｎ  Ｂ．（１９９５）．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｌａｒｇｅ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：１９９０−６．
【非特許文献１４】Ｐｏｕｉｌｌｏｔ  Ｆ，Ｂｌｏｉｓ  Ｈ，ａｎｄ  Ｉｒｉｓ  Ｆ．（２０１０）．Ｂｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｒｒｏｒｉｓｍ：Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ，  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｂｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｒｒｏｒｉｓｍ．８：１５５−１６９．
【非特許文献１５】Ｑｉｍｒｏｎ  Ｕ，Ｍａｒｉｎｔｃｈｅｖａ  Ｂ，Ｔａｂｏｒ  Ｓ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＣＣ．（２００６）．Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ  ｓｃｒｅｅｎｓ  ｆｏｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｇｅｎｅｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｔ７  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０３：１９０３９−４４．
【非特許文献１６】Ｍａｒｋ  ＤＦ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＣＣ．（１９７６）．  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ：ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ７  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７３：７８０−４．
【非特許文献１７】Ｇｉｌｌ  ＪＪ，Ｈｙｍａｎ  Ｐ．（２０１０）．Ｐｈａｇｅ  Ｃｈｏｉｃｅ，  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｈａｇｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１１：２−１４．
【非特許文献１８】Ｒａｋｈｕｂａ  ＤＶ，Ｋｏｌｏｍｉｅｔｓ  ＥＩ，Ｓｚｗａｊｃｅｒ  Ｄｅｙ  Ｅ，Ｎｏｖｉｋ  ＥＩ．（２０１０）．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ．Ｐｏｌｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．５９：１４５−１５５．
【非特許文献１９】Ｃｅｙｓｓｅｎｓ  Ｐ，Ｍｉｒｏｓｈｎｉｋｏｖ  Ｋ，Ｍａｔｔｈｅｕｓ  Ｗ，Ｋｒｙｌｏｖ  Ｖ，Ｒｏｂｂｅｎ  Ｊ，Ｎｏｂｅｎ  Ｊ，Ｖａｎｄｅｒｓｃｈｒａｅｇｈｅ  Ｓ，Ｓｙｋｉｌｉｎｄａ  Ｎ，Ｋｒｏｐｉｎｓｋｉ  ＡＭ，Ｖｏｌｃｋａｅｒｔ  Ｇ，Ｍｅｓｙａｎｚｈｉｎｏｖ  Ｖ，Ｌａｖｉｇｎｅ  Ｒ．（２００９）．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＰＢ１−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｅｎｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：２８７４−２８８３．
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、第一の標的配列と第二の標的配列とを含む溶菌性標的ファージのゲノムを改変する方法であって：
（ａ）標的ファージの宿主域決定因子とは異なる、マーカーファージの宿主域決定因子を含むファージ標的化領域を含有するベクターであって、ファージ標的化領域が、標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列と相同な第一および第二の隣接配列に隣接する、ベクターを提供するステップと；
（ｂ）標的ファージの宿主である第一の宿主細胞にベクターを導入するステップと；
（ｃ）第一の宿主細胞に標的ファージを感染させるステップと；
（ｄ）ファージを複製および組み換えさせて、それによって標的ファージのゲノムを改変するステップと；
（ｅ）得られたファージを、マーカーファージの宿主であるが標的ファージの宿主ではない第二の宿主細胞において増殖させるステップと
（ｆ）得られたファージを回収するステップと
を含む方法を提供する。
【００１４】
意外にも、ファージの宿主域決定因子を、関連ファージのゲノムを改変するための選択可能マーカーとして使用できることが見出されている。本発明者らは、この技術をＨＯｓｔ宿主域決定因子選択（ＨＯＲＤＳ）と命名する。本発明は、宿主細胞の特徴を選択することに依存せず、その代わりにその溶菌状態でファージによって受け継がれる特徴に関して選択する遺伝子選択手段を提供することから、溶原菌を形成することができない絶対溶菌性ファージの遺伝子改変にとって特に有用である。
【００１５】
この技術は、ファージの複製経路に関係する遺伝子および／または細胞におけるファージの増殖にとって必要な宿主細胞遺伝子に関する具体的で詳細な知識に依存せず、したがって、操作の前にファージに対して過度の実験を必要としない。さらに、この技術は、任意の細菌種由来のファージに広く応用可能である。この技術は、関連ファージ由来の因子と共に、その宿主域を指示するファージ由来の因子の同定を必要とする。このことは、本出願によって示されるように、当業者が容易に実行することができる。
【００１６】
溶菌性標的ファージのゲノムは、外因性のＤＮＡ配列をその中に組み込むことによって、点突然変異などの変異を組み込むことによって、または欠失を作製することによって改変することができる。これらの改変の組み合わせも同様に行うことができる。
【００１７】
ファージ標的化領域の第一および第二の隣接配列は、標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列と相同であることから、第一の宿主細胞がベクターと標的ファージの両方を含有する場合、ファージは複製することができ、互いに相同な配列が対を形成する部位で組み換えが起こりうる。組み換え後、マーカーファージの宿主域決定因子を有する、それらの得られたファージのみが、第二の宿主細胞において増殖することができる。これによって、マーカーファージの宿主域決定因子を含有する、得られた所望のファージを選択することができる。
【００１８】
標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列は、連続であっても不連続であってもよい。１つの構成において、標的ファージの第一および第二の標的配列は、一般的に不連続である。この構成に従って、組み換え事象が第一および第二の隣接配列と第一および第二の標的配列の間で起こる場合、第一および第二の標的配列の間のＤＮＡの領域が標的ファージゲノムから切除されて、その結果、欠失が起こる。都合のよいことに、標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列が、ファージ遺伝子またはその一部に隣接する場合、そのような欠失によって、組み換え後に遺伝子の不活化が起こる。１つの構成において、ファージ遺伝子は、エンドライシンなどの溶菌遺伝子である。このようにして、溶菌性の標的ファージを非溶菌性にすることができる。
【００１９】
溶菌性の標的ファージのゲノムの改変が、外因性のＤＮＡ配列の組み込みを伴う場合、ベクターのファージ標的化領域は、標的ファージのゲノムに組み込むための外因性のＤＮＡ配列をさらに含む。外因性のＤＮＡ配列およびマーカーファージの宿主域決定因子はいずれも、ファージ標的化領域の第一および第二の隣接配列内に入ることから、宿主域決定因子に関して選択するためのファージの組み換えによって、得られたファージにおける外因性のＤＮＡ配列の取り込みが起こる。この構成に従って、標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列は、連続または不連続でありうる。それらが不連続である場合、外因性のＤＮＡ配列の取り込みによって、ゲノム領域の欠失が同時に起こる。第一および第二の標的配列がファージ遺伝子に存在する、またはそれらがファージ遺伝子もしくはその一部に隣接する場合には、外因性のＤＮＡ配列の取り込みによって同時に、組み換え後の遺伝子の不活化が起こる。
【００２０】
点突然変異などの変異を溶菌性の標的ファージに組み込む必要がある場合、ファージ標的化領域における第一および第二の隣接配列の少なくとも１つは標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列と比較して変異を含む。ファージの複製および組み換えによって、標的ファージのゲノムは変異を組み込むように改変される。このようにして、マーカーファージの宿主域決定因子を有するファージが単離され、これを変異の存在に関してスクリーニングすることができる。
【００２１】
上記のように、そのような変異の導入を、任意選択で標的ファージの欠失と共に、外因性のＤＮＡ配列の組み込みと組み合わせることができる。
【００２２】
典型的には、ファージ標的化領域を含有するベクターはプラスミドである。そのようなベクターは、第一の宿主細胞において複製することができる。
【００２３】
本発明に従って、マーカーファージの宿主域決定因子は典型的には、基盤タンパク質または尾繊維タンパク質、またはその領域をコードする。一般的に、尾繊維タンパク質の場合、それぞれは標的細菌に結合するためのＣ末端受容体結合領域と、Ｃ末端受容体結合領域をバクテリオファージのボディに結合させるＮ末端領域とを含む。１つの構成において、Ｐｈｉ３３および関連ファージを例とすると、Ｎ末端領域は尾繊維タンパク質のアミノ酸１〜６２８位を含み、Ｃ末端領域は尾繊維タンパク質のアミノ酸６２９〜９６４位を含む。
【００２４】
Ｃ末端領域は、バクテリオファージＰｈｉ３３のＣ末端領域と９６％以下のアミノ酸配列同一性を有してもよく、バクテリオファージＰｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４−１、ＪＧ０２４、ＮＨ−４、ＰＴＰ４７、Ｃ３６、ＰＴＰ９２、およびＰＴＰ９３のいずれか１つに由来しうる。Ｃ末端領域のアミノ酸配列同一性がより低いことが好ましい。配列同一性は、９０％未満であることが都合がよく、８０％未満であることがより都合がよく、好ましくは７０％未満、より好ましくは６０％未満、さらにより好ましくは５０％未満、特に好ましくは４０％未満、より特に好ましくは３０％未満である。Ｎ末端領域はバクテリオファージＰｈｉ３３のＮ末端領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することが都合がよく、バクテリオファージＰｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４−１、ＪＧ０２４、ＮＨ−４、ＰＴＰ４７、Ｃ３６、ＰＴＰ９２、およびＰＴＰ９３のいずれか１つに由来しうる。典型的には、それぞれの尾繊維タンパク質は、バクテリオファージＰｈｉ３３の尾繊維アミノ酸配列と８０％超のアミノ酸配列同一性を有し、８５％超であることが都合がよく、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超の配列同一性を有する。Ｎ末端領域とＣ末端領域が同じバクテリオファージに由来して、同種の尾繊維タンパク質を提供してもよい。あるいは、Ｎ末端領域とＣ末端領域が異なるバクテリオファージ尾繊維タンパク質に由来して、異種尾繊維タンパク質を提供してもよい。ファージ尾繊維タンパク質が同種である１つの構成において、それぞれの尾繊維タンパク質は、Ｐｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４−１、ＪＧ０２４、ＮＨ−４、ＰＴＰ４７、Ｃ３６、ＰＴＰ９２、およびＰＴＰ９３から選択されるバクテリオファージに由来する。
【００２５】
１つの構成において、本発明を使用して、絶対溶菌性バクテリオファージを改変することができる。もう１つの構成において、本発明を使用して、溶菌的増殖の際にテンペレートファージを改変することができる。
【００２６】
さらなる構成において、本発明は、遺伝子送達ビヒクルとして使用するための絶対溶菌性バクテリオファージの改変において特に有用である。好ましい構成において、本発明を使用して、抗菌タンパク質の遺伝子を有するように溶菌性ファージを改変することができる。
【００２７】
従来の抗生物質に対する代替として、細菌内部で広いスペクトルの抗菌活性を証明する１つのタンパク質ファミリーは、α／β型の低分子酸可溶性芽胞タンパク質（今後ＳＡＳＰとして知られる）を含む。細菌内部で、ＳＡＳＰは、細菌ＤＮＡに結合し、クライオ電子顕微鏡を使用するこのプロセスの可視化により、最も研究されているＳＡＳＰであるＳｓｐＣが、ＤＮＡを被覆して、突出ドメインを形成し、ＤＮＡ構造（Ｆｒａｎｃｅｓｃｏｎｉら、１９８８；Ｆｒｅｎｋｉｅｌ−Ｋｒｉｓｐｉｎら、２００４）をＢ様（ピッチ３．４ｎｍ）からＡ様（３．１８ｎｍ；Ａ様ＤＮＡは２．８ｎｍのピッチを有する）に改変することが示されている。突出するＳｓｐＣモチーフは、隣接するＤＮＡ−ＳｓｐＣフィラメントと相互作用して、フィラメントを核タンパク質ヘリックスの堅固なアセンブリに詰め込む。２００８年に、Ｌｅｅらは、１０ｂｐ  ＤＮＡ二本鎖に結合したα／β型ＳＡＳＰの結晶構造を２．１Åの解像度で報告した。複合体において、α／β型ＳＡＳＰは、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフを採用し、副溝の接触を通してＤＮＡと相互作用し、二量体としてＤＮＡのおよそ６ｂｐに結合し、ＤＮＡはＡ−Ｂ型コンフォメーションで存在する。このようにして、ＤＮＡの複製は停止し、ＳＡＳＰが結合している場合、ＳＡＳＰは、ＤＮＡの転写を防止する。ＳＡＳＰは、非配列特異的にＤＮＡに結合し（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、１９９０）、そのため細菌ＤＮＡに変異があっても、ＳＡＳＰの結合に影響を及ぼさない。α／β型ＳＡＳＰの配列は、好ましいα／β型ＳＡＳＰであるバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のＳＡＳＰ−Ｃを含む、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に見出されうる。国際公開第０２／４０６７８号パンフレットは、ＳＡＳＰ遺伝子を取り込むように改変されたバクテリオファージの抗菌剤としての使用を記述する。
【００２８】
ＳＡＳＰ遺伝子を含有するように改変されたバクテリオファージベクターは、一般的にＳＡＳＰｊｅｃｔベクターと呼ばれている。ＳＡＳＰ遺伝子が標的細菌に送達されると、ＳＡＳＰがそれらの細菌内で産生され、細菌ＤＮＡに結合して、ＤＮＡのコンフォメーションをＢ様からＡ様に変化させる。標的細菌細胞内で十分量のＳＡＳＰが産生されると、感染細胞の生存率の低下を引き起こす。
【００２９】
特に好ましい実施形態において、本発明の方法を使用して、ＳＡＳＰ発現カセットによりファージを改変してＳＡＳＰｊｅｃｔベクターを作製することができ、この技術を同様に使用して、ＳＡＳＰ発現カセットによりファージを改変すると同時に溶菌遺伝子を欠失させて、ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターを作製することもできる。
【００３０】
したがって、本発明に従う１つの構成において、外因性のＤＮＡは、α／β型低分子酸可溶性芽胞タンパク質（ＳＡＳＰ）をコードする遺伝子を含む。このようにして、本発明の方法を使用して、複数の異なる標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージを産生することができる。改変バクテリオファージは、標的細菌に対して毒性であるＳＡＳＰを含み、バクテリオファージは典型的には非溶菌性である。
【００３１】
１つの態様において、本明細書において使用される用語「ＳＡＳＰ」は、α／β型ＳＡＳＰ活性、すなわちＤＮＡに結合してその構造をそのＢ型からＡ型に改変する能力を有するタンパク質を指し、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に記載のタンパク質を含むのみならず、その任意の相同体、ならびに同様にα／β型ＳＡＳＰ活性を有する任意の他のタンパク質も含む。代わりの態様において、本明細書において使用される用語「ＳＡＳＰ」は、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に記載の任意のタンパク質、または国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に記載のタンパク質の任意の１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％、もしくは９９％配列同一性を有する任意の相同体を指す。別の代替の態様において、本明細書において使用される用語「ＳＡＳＰ」は、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に記載の任意のタンパク質を指す。
【００３２】
ＳＡＳＰ遺伝子は、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの別紙１に開示されるＳＡＳＰをコードする遺伝子のいずれか１つから選択することができる。好ましい構成において、ＳＡＳＰはＳＡＳＰ−Ｃである。ＳＡＳＰ−Ｃは、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）に由来しうる。
【００３３】
ＳＡＳＰ遺伝子は、改変バクテリオファージが標的細菌に複数のコピーで存在する場合に、毒性レベルのＳＡＳＰの産生を促進するために十分に強力であることが都合がよい構成的プロモーターの制御下に存在することが好ましい。有用な構成的プロモーターには、ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１成分αサブユニットのｐｄｈＡ、３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２のｒｐｓＢ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼのｐｇｉ、およびフルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子プロモーターｆｄａが挙げられる。感染の際に活性な好ましい調節型プロモーターは、エラスターゼのｌａｓＢである。これらのプロモーターは、典型的には緑膿菌に由来する。これらのプロモーター配列と少なくとも９０％の配列同一性を示す配列を有するプロモーターも同様に使用することができる。
【００３４】
本発明の方法を使用して改変バクテリオファージを提供する場合、改変バクテリオファージは、それぞれの宿主域決定因子が異なる細菌宿主特異性を有する、複数の異なる宿主域決定因子を発現することができる。あるいは、改変バクテリオファージは、複数の異なるバクテリオファージ由来のアミノ酸配列を含むハイブリッド宿主域決定因子タンパク質を発現することができる。それぞれの宿主域決定因子は、尾繊維タンパク質であってもよい。宿主域決定因子の細菌宿主特異性は、同じ細菌種内であることが都合がよい。
【００３５】
さらなる態様において、本明細書において定義される改変バクテリオファージまたはその混合物とその担体とを含む細菌細胞増殖を阻害または予防する組成物が提供される。そのような組成物は、広範囲の用途を有し、したがって意図される使用に従って調合される。組成物は、薬剤、特にヒト治療のための薬剤として調合されてもよく、細菌感染症を含む様々な状態を治療しうる。本発明に従って治療可能な感染症は、血流中の感染症、局所感染症、虫歯、呼吸器感染症、および眼の感染症を含む、局所組織および臓器の感染症、または多臓器感染症である。担体は、薬学的に許容されるレシピエントまたは希釈剤でありうる。そのような組成物の成分の正確な性質および量は、経験的に決定されてもよく、組成物の投与経路に一部依存する。
【００３６】
レシピエントに対する投与経路には、静脈内、動脈内、経口、口腔内、舌下、鼻腔内、吸入、局所（眼科を含む）、筋肉内、皮下、および関節内が挙げられる。使用の便宜上、本発明に従う投薬量は、治療または予防される感染症の部位およびタイプに依存する。呼吸器感染症は吸入投与によって治療され、眼の感染症は点眼液を使用して治療されうる。改変バクテリオファージを含有する口腔内衛生製品も同様に提供される。歯垢の形成に関連する細菌を消失させるように調合された、本発明に従う改変バクテリオファージを含有するマウスウォッシュまたは練り歯磨きを使用してもよい。
【００３７】
本発明に従って産生された改変バクテリオファージは、例えば表面細菌汚染の処理ならびに土壌の改良または水の処理における除菌剤として使用されうる。バクテリオファージは、医療従事者および／または患者の処置において、例えばハンドウォッシュ中の除菌剤として使用されうる。特に病院での手順または食品調製に使用する作業表面および機器の処置も同様に提供される。１つの特定の実施形態は、１人の個体から他の個体への細菌の伝達および汚染を予防、消失、または低減するために、局所使用のために調合された組成物を含む。これは、特に従来の抗生物質に対して耐性の細菌が流行している病院の環境において微生物感染症の伝播を制限するために重要である。そのような使用に関して、改変バクテリオファージを、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水もしくはリン酸緩衝生理食塩水に含めてもよく、またはゲルもしくはクリームに調合してもよい。何回も使用する場合、保存剤を添加してもよい。あるいは、製品を凍結乾燥して、賦形剤、例えばスクロースなどの糖を添加してもよい。
【００３８】
（技術の詳細な説明）
本発明において、同種の宿主域決定因子を有する複数のファージを同定することができることが見出されている。そのようなファージは単離することができる。例として、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株上でプラークを形成することができる環境起源由来のファージに関してスクリーニングすることによって、緑膿菌に感染するファージを単離することができる（Ｇｉｌｌ  ａｎｄ  Ｈｙｍａｎ、２０１０）。単離されたファージの全ゲノムをシークエンシングして、アノテーションを行ってもよい。あるいは、ＤＮＡ配列データベースを宿主域決定因子に関して検索することができる。２０１４年９月現在、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースに寄託されたファージゲノム配列は約１４００個であった。
【００３９】
ＨＲＤは、例としてファージＴ４、Ｔ５、およびＴ７において宿主細菌に対する最初の認識／結合を担うタンパク質であることが一般的に見出されている尾繊維タンパク質でありうる（Ｒａｋｈｕｂａら、２０１０）。あるいは、他のＨＲＤは基盤タンパク質でありうる。ＢＬＡＳＴ検索を使用して、公知の配列に対するファージゲノム中の全てのタンパク質の相同性を評価することによって、ファージゲノムを、可能性があるＨＲＤ配列に関して検索することができる。相同であるファージ尾繊維タンパク質を同定することが都合がよい。例えば、緑膿菌株に関して広い宿主域を有するいくつかのファージＰｈｉ３３、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、およびＣ３６が同定されて、そのゲノムがシークエンシングされている。Ｐｈｉ３３、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、およびＣ３６のゲノム配列の分析により、それらが、高レベルの配列同一性（カッコ内はアミノ酸同一性）を有する推定の尾繊維タンパク質をコードする遺伝子を含有することが判明している：Ｃ３６（９６％）、ＰＴＰ４７（８６％）、ＰＴＰ９２（８３％）。ＢＬＡＳＴ検索により、これらの４つのファージは、他の寄託された１０個のファージゲノム配列：ＰＢ１、ＳＰＭ１、Ｆ８、ＬＢＬ３、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、ＪＧ０２４、ＮＨ−４、１４−１に関連することが示されており、これらは共にＰＢ１様ファージのファミリーを形成する（Ｃｅｙｓｓｅｎｓら、２００９）。これらの推定の尾繊維タンパク質の相同性を評価した。２配列ＢＬＡＳＴアライメント後にＰｈｉ３３尾繊維タンパク質と比較した（カッコ内はアミノ酸同一性）：ＬＢＬ３（９６％）、ＳＰＭ−１（９５％）、Ｆ８（９５％）、ＰＢ１（９５％）、ＫＰＰ１２（９４％）、ＬＭＡ２（９４％）、ＳＮ（８７％）、１４−１（８６％）、ＪＧ０２４（８３％）、ＮＨ−４（８３％）。上記のファージの１４個全てのアライメントを図６に示す。
【００４０】
これら１４個のファージ由来のアノテーションを行った尾繊維タンパク質の分析により、Ｐｈｉ３３尾繊維アミノ酸１〜６２８位と同等のタンパク質のＮ末端領域が、１４個全てのタンパク質に関して９６〜１００％の範囲で、その全長に対するこれらのタンパク質の配列同一性よりアミノ酸レベルでさらにより高いレベルの配列同一性を示すことが判明している。２配列ＢＬＡＳＴアライメント後に、Ｐｈｉ３３尾繊維タンパク質のＮ末端アミノ酸１〜６２８位（カッコ内はアミノ酸同一性）と比較した：ＬＢＬ３（９６％）、ＳＰＭ−１（９６％）、Ｆ８（９６％）、ＰＢ１（９６％）、ＫＰＰ１２（９８％）、ＬＭＡ２（９９％）、ＳＮ（９９％）、１４−１（９７％）、ＪＧ０２４（９７％）、ＮＨ−４（９７％）、ＰＴＰ４７（９８％）、Ｃ３６（９６％）、ＰＴＰ９２（９７％）。しかし、Ｐｈｉ３３尾繊維アミノ酸６２９〜９６４位と同等のタンパク質のＣ末端領域は、いくつかのタンパク質ではＮ末端領域ほど保存されず、配列同一性の範囲は、典型的に５７〜９６％である。２配列ＢＬＡＳＴアライメント後、Ｐｈｉ３３尾繊維タンパク質のＣ末端アミノ酸６２９〜９６４位（カッコ内はアミノ酸同一性）と比較した：ＬＢＬ３（９４％）、ＳＰＭ−１（９３％）、Ｆ８（９３％）、ＰＢ１（９４％）、ＫＰＰ１２（８７％）、ＬＭＡ２（８５％）、ＳＮ（６５％）、１４−１（６５％）、ＪＧ０２４（５７％）、ＮＨ−４（５７％）、ＰＴＰ４７（６４％）、Ｃ３６（９６％）、ＰＴＰ９２（５７％）。他の十分に特徴づけされたファージのファージ尾繊維の分析により、それらがＮ末端尾部基盤結合領域とＣ末端受容体結合領域とを有することが示されている（Ｖｅｅｓｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｍｂｉｌｌａｕ，２０１１）。プラークアッセイまたは増殖阻害試験を使用するそれらの細菌株宿主域の実験的分析において、ファージＰｈｉ３３、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、およびＣ３６は、重なり合うが同一ではない宿主域を有する（表１）。ファージ尾繊維のＣ末端領域の役割が細菌宿主受容体結合に関係しているという確立された証拠と、これらの４つのファージのＣ末端領域の配列多様性およびその類似であるが同一でない宿主域と共に考慮すると、Ｃ末端の多様性は、評価されるファージの宿主域に関連すると推定される。
【００４１】
本発明に従って、同種の尾繊維タンパク質の遺伝子を、Ｎ末端領域におけるその高レベルの配列同一性に基づいて、１つのファージから採取して別のファージに付加できることがさらに提供される。Ｎ末端領域は、尾繊維のファージ尾部への結合に関係すると考えられており（Ｖｅｅｓｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｍｂｉｌｌａｕ，２０１１）、宿主域がドナーファージの尾繊維に関連する生存ファージを形成することができる。あるいは、本明細書に記述される遺伝子などの尾繊維遺伝子を使用して、異種ドナーファージ尾繊維タンパク質由来の多様なＣ末端受容体結合領域と共に、レシピエントファージ由来の尾繊維の保存されたＮ末端尾部結合領域を有するハイブリッド尾繊維遺伝子を作製してもよい。そのような尾繊維ハイブリッド遺伝子を使用して、ファージの尾繊維のいくつかを置換することができる。これは、（レシピエントファージ由来の）ハイブリッド尾繊維のＮ末端領域を提供して、宿主域がドナーファージ尾繊維のＣ末端受容体結合領域に関連する生存ファージを形成することができる。標準的な分子遺伝学技術を使用して、Ｐｈｉ３３は、以下のファージＰＴＰ９２、ＰＴＰ４７、ＬＢＬ３、ＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４−１、ＮＨ−４由来の異種尾繊維ハイブリッドを有するように改変されている。全ての改変ファージは、生存しており、緑膿菌上でプラークを形成できることが示されている（尾繊維ハイブリッドの命名は以下のとおりである：一例として、Ｐｈｉ３３のＮ末端尾部結合領域がＰＴＰ４７のＣ末端受容体結合領域とハイブリダイズしているハイブリッド遺伝子は、Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）である）。
【００４２】
ファージＰｈｉ３３およびＰＴＰ９２は、類似であるが同一ではない宿主域を有する。したがって、ＰＴＰ９２の宿主域は、Ｐｈｉ３３の尾繊維遺伝子（ＯＲＦ３２と命名）をハイブリッドＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維遺伝子に置換することによって、Ｐｈｉ３３に受け継ぐことができると仮定した。ハイブリッド遺伝子を、Ｐｈｉ３３のＮ末端領域（アミノ酸１〜６２８位と等しい）およびＰＴＰ９２のＣ末端領域（アミノ酸６２９〜９６２位と等しい）をコードするＤＮＡ配列を使用して作製し、このようにハイブリッド尾繊維遺伝子を作製した。このハイブリッド遺伝子を作製するためにこれらの領域を使用する根拠は、これらのタンパク質に関する過去の分析から明白である。ファージの結合に関係すると考えられている両方の尾繊維タンパク質のＮ末端領域は、９７％同一であり、宿主細胞受容体結合に関係すると考えられている両方の尾繊維タンパク質のＣ末端領域は５７％同一である。ハイブリッド尾繊維遺伝子を、Ｐｈｉ３３  ＯＲＦ３２（ネイティブＰｈｉ３３尾繊維遺伝子）のいずれかの側の約１０００ｂｐの配列を使用して、Ｐｈｉ３３  ＤＮＡに隣接させて、プラスミドにクローニングした。プラスミドを、Ｐｈｉ３３感染症に対して感受性がある緑膿菌株に導入して、得られた株にＰｈｉ３３を感染させて、ファージ溶解物を産生した。この溶解物内に、Ｐｈｉ３３ネイティブ尾繊維ではなくてハイブリッド尾繊維を有する組み換え型ファージが存在する。ファージ溶解物を使用して、ＰＴＰ９２においてプラーク形成することができるが、Ｐｈｉ３３においてプラーク形成することができない株に感染させた。したがって、非組み換え型Ｐｈｉ３３ファージは、この宿主において増殖せず、選択されない。一方、組み換え型Ｐｈｉ３３−ＰＴＰ９２ハイブリッド尾繊維遺伝子を有するＰｈｉ３３プラークは、増殖することができ、選択される。プラークを単離して、ＰＣＲによってスクリーニングして、その遺伝子型を評価した。試験したプラークは全てＰｈｉ３３由来のＮ末端領域とＰＴＰ９２由来のＣ末端領域とを有することが見出され、このようにＰＴＰ９２の宿主域がＰｈｉ３３に伝達された。
【００４３】
Ｐｈｉ３３は、以下のファージ：ＰＴＰ９２、ＰＴＰ４７、ＬＢＬ３、ＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４−１、ＮＨ−４由来の尾繊維ハイブリッド（Ｐｈｉ３３のＮ末端領域を有する）を有するように類似に改変されている。改変されたファージは全て、生存して、緑膿菌においてプラークを形成することができることが示されている。
【００４４】
本発明を、単なる例として、以下の添付の図面を参照してさらに詳細に記述する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】ｌａｃＺ△Ｍ１５およびエンドライシン遺伝子を含有するプラスミドの構築を示す概略図（その１）である。
【図１Ｂ】ｌａｃＺ△Ｍ１５およびエンドライシン遺伝子を含有するプラスミドの構築を示す概略図（その２）である。
【図２Ａ】ＳＡＳＰ−ＣまたはｌａｃＺαマーカーに加えてＳＡＳＰ−Ｃを付加するようにファージを遺伝子改変するための、置換された尾繊維部分を有するプラスミドの構築を示す概略図（その１）である。
【図２Ｂ】ＳＡＳＰ−ＣまたはｌａｃＺαマーカーに加えてＳＡＳＰ−Ｃを付加するようにファージを遺伝子改変するための、置換された尾繊維部分を有するプラスミドの構築を示す概略図（その２）である。
【図２Ｃ】ＳＡＳＰ−ＣまたはｌａｃＺαマーカーに加えてＳＡＳＰ−Ｃを付加するようにファージを遺伝子改変するための、置換された尾繊維部分を有するプラスミドの構築を示す概略図（その３）である。
【図２Ｄ】ＳＡＳＰ−ＣまたはｌａｃＺαマーカーに加えてＳＡＳＰ−Ｃを付加するようにファージを遺伝子改変するための、置換された尾繊維部分を有するプラスミドの構築を示す概略図（その４）である。
【図３Ａ】組み換え型ファージを選択する手段としてＨＯＲＤＳを使用して、組み換えによって、ＳＡＳＰ−ＣまたはｌａｃＺαマーカーに加えてＳＡＳＰ−Ｃがファージに付加されているファージの産生を示す概略図（その１）である。
【図３Ｂ】組み換え型ファージを選択する手段としてＨＯＲＤＳを使用して、組み換えによって、ＳＡＳＰ−ＣまたはｌａｃＺαマーカーに加えてＳＡＳＰ−Ｃがファージに付加されているファージの産生を示す概略図（その２）である。
【図４Ａ】エンドライシン遺伝子をＳＡＳＰ−ＣまたはＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺαマーカーに置換するようにファージを遺伝子改変するための、置換された尾繊維部分を有するプラスミドの構築を示す概略図（その１）である。
【図４Ｂ】エンドライシン遺伝子をＳＡＳＰ−ＣまたはＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺαマーカーに置換するようにファージを遺伝子改変するための、置換された尾繊維部分を有するプラスミドの構築を示す概略図（その２）である。
【図４Ｃ】エンドライシン遺伝子をＳＡＳＰ−ＣまたはＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺαマーカーに置換するようにファージを遺伝子改変するための、置換された尾繊維部分を有するプラスミドの構築を示す概略図（その３）である。
【図４Ｄ】エンドライシン遺伝子をＳＡＳＰ−ＣまたはＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺαマーカーに置換するようにファージを遺伝子改変するための、置換された尾繊維部分を有するプラスミドの構築を示す概略図（その４）である。
【図５Ａ】組み換え型ファージを選択する手段としてＨＯＲＤＳを使用して、組み換えによって、エンドライシン遺伝子が欠失されていて、ＳＡＳＰ−ＣまたはＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺαマーカーに置換されているファージの産生を示す概略図（その１）である。
【図５Ｂ】組み換え型ファージを選択する手段としてＨＯＲＤＳを使用して、組み換えによって、エンドライシン遺伝子が欠失されていて、ＳＡＳＰ−ＣまたはＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺαマーカーに置換されているファージの産生を示す概略図（その２）である。
【図６Ａ】関連するファージの尾繊維遺伝子のマルチプル配列アライメント（その１）を示す。
【図６Ｂ】関連するファージの尾繊維遺伝子のマルチプル配列アライメント（その２）を示す。
【図６Ｃ】関連するファージの尾繊維遺伝子のマルチプル配列アライメント（その３）を示す。
【図６Ｄ】関連するファージの尾繊維遺伝子のマルチプル配列アライメント（その４）を示す。
【図６Ｅ】関連するファージの尾繊維遺伝子のマルチプル配列アライメント（その５）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
図６は関連するファージの尾繊維遺伝子のマルチプル配列アライメントを示す。
【実施例】
【００４７】
以下の実施例は、外因性のＤＮＡの絶対溶菌性ファージへの付加におけるＨＯＲＤＳ技術の有用性を示すために示される。
【００４８】
一例として、代替ファージ由来の尾繊維遺伝子または尾繊維遺伝子の一部と、緑膿菌ｆｄａプロモーターによって制御されるバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子とを含むＤＮＡ領域を、広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターにおいて、ネイティブ尾繊維領域またはその一部に隣接するＰｈｉ３３  ＤＮＡの２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入して、得られた株にＰｈｉ３３を感染させることができる。子孫ファージの回収後、ネイティブＰｈｉ３３尾繊維または尾繊維部分が新しい尾繊維または尾繊維部分に置換されていて、ＤＮＡのｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃ領域が導入されている二重組み換え型バクテリオファージを、新しい組み換え型バクテリオファージの宿主であるが、Ｐｈｉ３３の宿主ではない適切な緑膿菌株におけるプラーク形成によって単離することができる。
【００４９】
もう１つの例として、外来ＤＮＡの２つの無関係な部分がゲノムに導入されているＰｈｉ３３誘導体の構築に関して、本明細書において、単なる例として、相同組み換えによって、大腸菌由来のｌａｃＺαマーカーと共に緑膿菌ｆｄａプロモーターの制御下でバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子を同時に付加しながら、既存の尾繊維またはその一部を、異なるバクテリオファージ由来の代替の尾繊維または尾繊維部分に置換する方法が示される。
【００５０】
代替ファージ由来の尾繊維遺伝子または尾繊維遺伝子の一部、緑膿菌ｆｄａプロモーターによって制御されたバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子、および大腸菌ｌａｃＺαレポーター遺伝子を含むＤＮＡ領域を、広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターにおいてネイティブ尾繊維領域またはその一部に隣接するＰｈｉ３３  ＤＮＡの２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入して、得られた株にＰｈｉ３３を感染させることができる。子孫ファージの回収後、ネイティブＰｈｉ３３尾繊維または尾繊維部分が新しい尾繊維または尾繊維部分に置換されていて、ｆｄａ−ＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺα領域が導入されている二重組み換え型バクテリオファージを、新しい組み換え型バクテリオファージの宿主であるが、Ｐｈｉ３３の宿主ではない適切な緑膿菌株におけるプラーク形成によって単離することができる。ｌａｃＺαマーカーの可視化が必要である場合、使用する緑膿菌宿主株は、宿主株ゲノムにおける適した位置で大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子を有しなければならない。
【００５１】
もう１つの例として、外来ＤＮＡの一部をゲノムに同時に導入しながら、バクテリオファージゲノムの領域が欠失しているＰｈｉ３３誘導体の構築に関して、本明細書において、単なる例として、相同組み換えによって、ネイティブエンドライシン遺伝子を同時に欠失させてファージを非溶菌性にして、および緑膿菌ｆｄａプロモーターの制御下でバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子を同時に導入しながら、既存の尾繊維またはその一部を、異なるバクテリオファージ由来の代替の尾繊維または尾繊維部分に置換しうる方法が示される。成功した組み換え体を、新しい宿主域決定因子を有する組み換え型ファージの宿主であるが、元のネイティブファージの宿主ではなく、Ｐｈｉ３３エンドライシン遺伝子が緑膿菌ゲノムに存在するように同様に改変されている緑膿菌株においてプラークを形成するバクテリオファージの選択によって同定することができる。
【００５２】
代替ファージ由来の尾繊維遺伝子または尾繊維遺伝子の一部、および緑膿菌ｆｄａプロモーターによって制御されたバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子を含むＤＮＡ領域を、広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターにおいてネイティブ尾繊維領域に隣接するＰｈｉ３３  ＤＮＡおよびエンドライシン遺伝子またはその一部の２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入して、得られた株にＰｈｉ３３を感染させることができる。子孫ファージの回収後、ネイティブＰｈｉ３３尾繊維または尾繊維部分が新しい尾繊維または尾繊維部分に置換されていて、ＤＮＡのｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃ領域が導入されていて、そこからネイティブエンドライシン遺伝子が欠失されている二重組み換え型バクテリオファージを、新しい組み換え型バクテリオファージの宿主であるが、Ｐｈｉ３３の宿主ではない適切な緑膿菌（エンドライシン＋）株におけるプラーク形成によって単離することができる。
【００５３】
この方法によって溶菌性バクテリオファージの非溶菌バージョンを作製するために、新しい宿主域決定因子を有する組み換え型バクテリオファージの宿主であるが、ネイティブバクテリオファージの宿主ではなく、さらに緑膿菌ゲノムにおける適した位置でバクテリオファージエンドライシン遺伝子を有する適切な緑膿菌宿主株が必要である。同様に、バクテリオファージが有するｌａｃＺαレポーターの可視化が必要である場合、新しい宿主域決定因子を有する組み換え型バクテリオファージの宿主であるが、ネイティブバクテリオファージの宿主ではなく、さらに適した位置で大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子を有する緑膿菌宿主株が必要である。これらのようなトランスジーンの挿入のためのゲノム位置は、必須の遺伝子が影響を受けないように、および隣接する遺伝子の発現に対する極性効果の結果として望ましくない表現型が生成されないように、選択すべきである。一例として、１つのそのような位置には、緑膿菌株のｐｈｏＡ遺伝子のすぐ下流が挙げられうる。
【００５４】
一例として、Ｐｈｉ３３エンドライシン遺伝子は、緑膿菌において複製できない大腸菌ベクターにおいて、ｐｈｏＡの３’末端に隣接する緑膿菌株ＰＡＯ１ゲノムＤＮＡの２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入して、ゲノムに全プラスミドを組み込むために１回の相同組み換えを受けている単離体を、テトラサイクリン（５０μｇ／ｍｌ）耐性の獲得に従って選択することができる。次に、２回目の相同組み換え事象を受けた単離体（エンドライシン＋、ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）を、１０％スクロースを含有する培地において単離することができる（プラスミド骨格に存在するｓａｃＢカウンターセレクタブルマーカーを利用する）。
【００５５】
一例として、大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子を、緑膿菌において複製できない大腸菌ベクターにおいて、ｐｈｏＡの３’末端に隣接する緑膿菌株ＰＡＯ１ゲノムＤＮＡの２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入して、ゲノムに全プラスミドを組み込むために１回の相同組み換えを受けている単離体を、テトラサイクリン（５０μｇ／ｍｌ）耐性の獲得に従って選択することができる。次に、２回目の相同組み換え事象を受けた単離体（エンドライシン＋、ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）を、１０％スクロースを含有する培地において単離することができる（プラスミド骨格に存在するｓａｃＢカウンターセレクタブルマーカーを利用する）。
【００５６】
（実験技法）
クローニング目的でＤＮＡを生成するためのＰＣＲ反応は、プライマーの融解温度（Ｔｍ）に応じて、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造元の説明書に従って実施することができる。スクリーニング目的のＰＣＲ反応は、プライマーの融解温度（Ｔｍ）に応じて、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、製造元の説明書に従って実施することができる。特に明記していない限り、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ依存的ライゲーション、コンピテント細胞の調製および形質転換などの一般的な分子生物学技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）に記述される方法に基づくことができる。酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓまたはＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入することができる。ＤＮＡは、酵素反応から精製して、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ精製キットを使用して細胞から調製することができる。プラスミドは、接合ヘルパー株である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＲＫ２０１３）によって媒介される接合によって大腸菌株から緑膿菌株に伝達することができる。β−ガラクトシダーゼの色素生成基質であるＳ−ｇａｌはＳｉｇｍａ（Ｓ９８１１）から購入することができ、これはβ−ガラクトシダーゼによる消化によって、鉄イオンとキレートを形成すると黒色の沈殿物を形成する。
【００５７】
プライマーは、Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅから得ることができる。プライマーが制限酵素の認識配列を含む場合、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの消化を確実にするために、さらなる２〜６ヌクレオチドを５’末端に付加することができる。
【００５８】
クローニングは全て、特に明記していない限り、他所で記述されるように（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによってＤＮＡを一晩ライゲートした後、ＤＨ５αまたはＴＯＰ１０などの大腸菌クローニング株にそれらを形質転換して、選択培地で単離することによって行うことができる。
【００５９】
ｐＳＭ１０８０などの広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターを使用して大腸菌と緑膿菌の間で遺伝子を伝達させることができる。ｐＳＭ１０８０は、ｐＲＫ２由来の、緑膿菌における複製を可能にする広い宿主域の複製開始点ｏｒｉＴ、プラスミドｐＲＫ４１５由来の、大腸菌および緑膿菌の両方で使用するためのｔｅｔＡＲ選択可能マーカー、ならびにプラスミドｐＵＣ１９由来の、高コピー数の大腸菌複製開始点ｏｒｉＶを結合させることによって既に産生された。
【００６０】
緑膿菌において複製することができない大腸菌ベクターｐＳＭ１１０４を使用して、対立遺伝子交換によって緑膿菌変異体を生成することができる。ｐＳＭ１１０４は、ｐＲＫ２由来のｏｒｉＴ、プラスミドｐＲＫ４１５由来の、大腸菌および緑膿菌の両方で使用するためのｔｅｔＡＲ選択可能マーカー、プラスミドｐＵＣ１９由来の高コピー数の大腸菌複製開始点ｏｒｉＶ、ならびに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８由来のｓａｃＢ遺伝子を、カウンターセレクタブルマーカーとして使用するために、強力なプロモーターの制御下で結合させることによって既に産生された。
【００６１】
（細菌ゲノムのｐｈｏＡ座のすぐ下流にＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子または大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子のいずれかを有する緑膿菌株を生成する、プラスミドの構築）
１．緑膿菌ＰＡＯ１  ｐｈｏＡ相同体の３’末端に隣接するＤＮＡを有するｐＳＭ１１０４を含むプラスミドｐＳＭＸ３０１（図１）は、以下のように構築することができる。
【００６２】
緑膿菌由来のｐｈｏＡ遺伝子の末端のおよそ１ｋｂを含む領域を、プライマーＢ４３００およびＢ４３０１を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図１）。次にＰＣＲ産物を精製して、ＳｐｅＩおよびＢｇｌＩＩによって消化することができる。緑膿菌由来のｐｈｏＡ遺伝子の下流のおよそ１ｋｂを含む第二の領域は、プライマーＢ４３０２およびＢ４３０３を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図１）。次に、この第二のＰＣＲ産物を精製して、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩによって消化することができる。２つの消化物を再度精製して、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩによって消化されているｐＳＭ１１０４に３方式のライゲーションでライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ３０１を得ることができる（図１）。
【００６３】
プライマーＢ４３００は、５’ＳｐｅＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌株ＰＡＯ１由来のｐｈｏＡの終止コドンのおよそ１ｋｂ上流に位置する配列とからなる（図１）。プライマーＢ４３０１は、５’ＢｇｌＩＩおよびＡｆｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌株ＰＡＯ１由来のｐｈｏＡ遺伝子の末端と相補的な配列とからなる（終止コドンを小文字で示す；図１）。プライマーＢ４３０２は、５’ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌株ＰＡＯ１由来のｐｈｏＡ遺伝子の終止コドンのすぐ下流の配列とからなる（図１）。プライマーＢ４３０３は、５’ＸｈｏＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌株ＰＡＯ１由来のｐｈｏＡ遺伝子のおよそ１ｋｂ下流の配列と相補的な配列とからなる（図１）。
【００６４】
【化１】
0006748074.tif 000002
【００６５】
２．エンドライシン遺伝子プロモーターの制御下で、Ｐｈｉ３３由来のエンドライシン遺伝子を有するｐＳＭＸ３０１を含むプラスミドｐＳＭＸ３０２（図１）は以下のように構築することができる。
【００６６】
エンドライシン遺伝子プロモーターを、プライマーＢ４３０４およびＢ４３０５を使用してＰｈｉ３３からＰＣＲによって増幅することができる（図１）。エンドライシン遺伝子そのものは、プライマーＢ４３０６およびＢ４３０７を使用してＰｈｉ３３からＰＣＲによって増幅することができる（図１）。次に、２つのＰＣＲ産物を、２つの外側のプライマーＢ４３０４およびＢ４３０７を使用してＳｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥｉｎｇ）ＰＣＲによって共に結合することができる。得られたＰＣＲ産物をＡｆｌＩＩおよびＢｇｌＩＩによって消化して、同様にＡｆｌＩＩおよびＢｇｌＩＩによって消化されているｐＳＭＸ３０１にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ３０２を得ることができる（図１）。
【００６７】
プライマーＢ４３０４は、５’ＡｆｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続く二方向転写ターミネーター（ｓｏｘＲターミネーター、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ０５８７１４の６０〜９６塩基）と、エンドライシンプロモーター領域の開始部の配列（下線、太字）とからなる（図１）。プライマーＢ４３０５は、Ｐｈｉ３３由来のエンドライシン遺伝子の開始コドンと重なり合う領域と相補的な配列の５’領域と、その後に続くエンドライシンプロモーター領域の末端と相補的な配列（下線、太字；図１）とからなる。プライマーＢ４３０６は、プライマーＢ４３０５の逆相補体である（同様に図１を参照されたい）。プライマーＢ４３０７は、５’ＢｇｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子の末端と相補的な配列とからなる（図１）。
【００６８】
【化２】
0006748074.tif 000003
【００６９】
３．ｌａｃプロモーターの制御下でｌａｃＺ△Ｍ１５を有するｐＳＭＸ３０１を含むプラスミドｐＳＭＸ３０３は、以下のように構築することができる。
【００７０】
ｌａｃプロモーターの制御下のｌａｃＺ△Ｍ１５遺伝子を、プライマーＢ４３０８およびＢ４３０９を使用して大腸菌株ＤＨ１０ＢからＰＣＲによって増幅することができる（図１）。次に、得られたＰＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩによって消化して、同様にＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩによって消化されているｐＳＭＸ３０１にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ３０３を得ることができる（図１）。
【００７１】
プライマーＢ４３０８は、５’ＢｇｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続くｌａｃプロモーターの配列とからなる（図１）。プライマーＢ４３０９は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続く二方向転写ターミネーターおよびｌａｃＺ△Ｍ１５の３’末端と相補的な配列とからなる（下線、太字；図１）。
【００７２】
【化３】
0006748074.tif 000004
【００７３】
（細菌ゲノムのｐｈｏＡ座のすぐ下流にＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子を導入する、緑膿菌の遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ３０２（図１）を、接合によって、新しい宿主域決定因子を有するバクテリオファージの宿主であるが、元のバクテリオファージの宿主ではない適切な緑膿菌株に伝達して、テトラサイクリン（５０μｇ／ｍｌ）に対する耐性の獲得によって一次組み換え体に関して選択することができる。
【００７４】
２．二重組み換え体を、１０％スクロースを含有する培地に播種することによって、ｓａｃＢ媒介カウンターセレクションによって選択することができる。
【００７５】
３．次に、１０％スクロースで増殖する単離体をＰＣＲによってスクリーニングして、Ｐｈｉ３３エンドライシン遺伝子が緑膿菌ｐｈｏＡ遺伝子の下流に導入されていることを確認することができる。
【００７６】
４．単離体（ＰＡＸ３１）の確認後、この株をエンドライシン変異の相補が必要であるバクテリオファージのさらなる改変のための宿主として使用することができる。
【００７７】
（細菌ゲノムのｐｈｏＡ座のすぐ下流に大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子を導入する、緑膿菌の遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ３０３（図１）を、接合によって、新しい宿主域決定因子を有するバクテリオファージの宿主であるが、元のバクテリオファージの宿主ではない適切な緑膿菌株に伝達して、テトラサイクリン（５０μｇ／ｍｌ）に対する耐性の獲得によって一次組み換え体に関して選択することができる。
【００７８】
２．次に、二重組み換え体を、１０％スクロースを含有する培地に播種することによってｓａｃＢ媒介カウンターセレクションによって選択することができる。
【００７９】
３．次に、１０％スクロースで増殖する単離体をＰＣＲによってスクリーニングして、大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子が緑膿菌ｐｈｏＡ遺伝子の下流に導入されていることを確認することができる。
【００８０】
４．単離体（ＰＡＸ３２）の確認後、ｌａｃＺαレポーターの相補が望ましい場合には、この株をバクテリオファージの宿主として使用することができる。
【００８１】
（選択可能マーカーとして代替の宿主域決定因子を利用してバクテリオファージＰｈｉ３３のゲノムにＤＮＡ（ｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃ）の新しい部分を導入する、プラスミドの構築）
１．関連するバクテリオファージＰＴＰ９２の尾繊維宿主域決定因子の配列に隣接するＰｈｉ３３配列を有するｐＳＭ１０８０を含むプラスミドｐＳＭＸ３０４（図２）は、以下のように構築することができる。
【００８２】
Ｐｈｉ３３尾繊維のすぐ下流の領域は、プライマーＢ４３３３およびＢ４３３４を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図２）。バクテリオファージＰＴＰ９２の尾繊維のＣ末端受容体結合領域をコードする領域は、プライマーＢ４３３５およびＢ４３３６を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図２）。次に、これらの２つのＰＣＲ産物を、外側のプライマーＢ４３３３およびＢ４３３６を使用してＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲによって共に結合することができる。Ｐｈｉ３３尾繊維のＮ末端領域をコードする領域、およびＰｈｉ３３尾繊維のすぐ上流の領域を、プライマーＢ４３３７およびＢ４３３８を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図２）。次に、このＰｈｉ３３尾繊維領域を、外側のプライマーＢ４３３３およびＢ４３３８を使用してＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲによって、Ｐｈｉ３３尾繊維の下流の領域とＰＴＰ９２宿主域決定因子とを含むＰＣＲ産物に結合することができる。得られたＰＣＲ産物を精製して、ＮｈｅＩによって消化して、再度精製し、ＮｈｅＩによって消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されて精製されたｐＳＭ１０８０にライゲートすることができる。この構築物により、プラスミドｐＳＭＸ３０４が得られる（図２）。
【００８３】
プライマーＢ４３３３は、５’ＮｈｅＩ−ＡｆｌＩＩ−ＰａｃＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３尾繊維のおよそ１ｋｂ下流の領域と相補的な配列とからなる（図２）。プライマーＢ４３３４は、ＰＴＰ９２尾繊維のＣ末端受容体結合領域をコードする領域の末端の５’配列と、その後に続くＰｈｉ３３尾繊維のすぐ下流の配列（下線、図２）とからなる。プライマーＢ４３３５は、プライマーＢ４３３４の逆相補体である。プライマーＢ４３３６は、ＰＴＰ９２尾繊維のＣ末端受容体結合領域の一部をコードする領域と相補的な５’配列と、その後に続くＰｈｉ３３尾繊維と相補的な配列（下線、図２）とからなる。プライマーＢ４３３７は、プライマーＢ４３３６の逆相補体である（図２）。プライマーＢ４３３８は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３尾繊維の上流の領域の配列とからなる（図２）。
【００８４】
【化４】
0006748074.tif 000005
【００８５】
２．ｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃ外来ＤＮＡの挿入のために選択された位置である、エンドライシン遺伝子のすぐ下流のＰｈｉ３３  ＤＮＡの領域を有するｐＳＭＸ３０４を含むプラスミドｐＳＭＸ３０５（図２）は、以下のように構築することができる。
【００８６】
ｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃ外来ＤＮＡの挿入のために選択された位置である、エンドライシン遺伝子のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３  ＤＮＡのおよそ１ｋｂの領域を、プライマーＢ４３３９およびＢ４３４０を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図２）。次に、得られたＰＣＲ産物を、ＡｆｌＩＩおよびＰａｃＩによって消化し、精製して、同様にＡｆｌＩＩおよびＰａｃＩによって消化されていて、ライゲーション前に精製されたｐＳＭＸ３０４にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ３０５を得ることができる（図２）。
【００８７】
プライマーＢ４３３９は、５’ＡｆｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続くｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃ  ＤＮＡの挿入のために本明細書において選択された位置のおよそ１ｋｂ下流のＰｈｉ３３配列とからなる（図２）。プライマーＢ４３４０は、５’ＰａｃＩ−ＫｐｎＩ−ＳａｃＩ制限部位（下線）と、その後に続くｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃ  ＤＮＡの挿入のために選択された位置のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３配列と相補的な配列とからなる（図２）。
【００８８】
【化５】
0006748074.tif 000006
【００８９】
３．ｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃを有するｐＳＭＸ３０５を含むプラスミドｐＳＭＸ３０６（図２）は以下のように構築することができる。
【００９０】
バチルス・メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ  １３６３２）由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子は、プライマーＢ４３４１およびＢ４３４２を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図２）。次に、得られたＰＣＲ産物を精製し、ＫｐｎＩおよびＮｃｏＩによって消化して、再度精製した。緑膿菌ｆｄａプロモーターは、プライマーＢ４３４３およびＢ４３４４を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図２）。得られたＰＣＲ産物を精製して、ＮｃｏＩおよびＰａｃＩによって消化して、再度精製することができる。次に、２つのＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩおよびＰａｃＩによって消化されていて、ライゲーション前に精製されたｐＳＭＸ３０５に３方式のライゲーションでライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ３０６を得ることができる（図２）。
【００９１】
プライマーＢ４３４１は、５’ＫｐｎＩ制限部位（下線）と、その後に続く二方向転写ターミネーター（ｔｏｎＢターミネーター）と、その後に続くバチルス・メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ  １３６３２）由来のＳＡＳＰ−Ｃの末端と相補的な配列（下線、太字；図２）とからなる。プライマーＢ４３４２（図２）は、５’ＮｃｏＩ制限部位（下線）と、その後に続くバチルス・メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ  １３６３２）由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子の開始部の配列とからなる。プライマーＢ４３４３は、５’ＮｃｏＩ制限部位（下線）と、その後に続くｆｄａプロモーターの配列とからなる（図２）。プライマーＢ４３４４は、５’ＰａｃＩ制限部位（下線）と、その後に続くｆｄａプロモーターと相補的な配列とからなる（図２）。
【００９２】
【化６】
0006748074.tif 000007
【００９３】
（選択の手段としてＰＴＰ９２宿主域決定因子を利用してバクテリオファージゲノムにｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃを付加する、Ｐｈｉ３３の遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ３０６（図２）を、接合によって、元のファージと宿主域決定因子ドナーファージの両方の宿主である緑膿菌株に導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ３１を得ることができる。
【００９４】
２．株ＰＴＡ３１に、ファージＰｈｉ３３を感染させて、子孫ファージを回収することができる。
【００９５】
３．ＰＴＰ９２宿主域決定因子がＰｈｉ３３に伝達されている組み換え型ファージは、ＰＴＰ９２宿主域決定因子を有する組み換え型ファージの宿主であるが、親バクテリオファージＰｈｉ３３の宿主ではない緑膿菌株２７２６においてステップ（２）の溶解物をプラーク形成させることによって同定することができる。
【００９６】
４．ＰＣＲスクリーニングをさらに行って、ＰＴＰ９２由来の宿主域決定因子に加えて、ｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃを同時に獲得した単離体を同定することができる。
【００９７】
５．確認された単離体（ＰＴＰＸ３１；図２；図３）の同定後、この単離体を、さらに使用する前にさらに２回プラーク精製することができる。
【００９８】
（選択可能マーカーとして代替の宿主域決定因子を利用して、バクテリオファージＰｈｉ３３のゲノムにＤＮＡの新しい２つの部分（ｆｄａ−ＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺα）を導入する、プラスミドの構築）
１．プラスミドｐＵＣ１９由来のｌａｃＺαレポーターを有するｐＳＭＸ３０６を含むプラスミドｐＳＭＸ３０７（図２）は、以下のように構築することができる。
【００９９】
ｌａｃＺαレポーターは、プライマーＢ４３４５およびＢ４３４６を使用してｐＵＣ１９からＰＣＲによって増幅することができる（図２）。次に、得られたＰＣＲ産物を精製して、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩによって消化し、再度精製して、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩによって消化されていて、ライゲーション前に精製されたｐＳＭＸ３０６にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ３０７を得ることができる（図２）。
【０１００】
プライマーＢ４３４５は、５’ＳａｃＩ制限部位（下線）と、後に続くｌａｃＺαの３’末端と相補的な配列とからなる（図２）。プライマーＢ４３４６は、５’ＫｐｎＩ制限部位（下線）と、その後に続くｌａｃプロモーターの配列とからなる（図２）。
【０１０１】
【化７】
0006748074.tif 000008
【０１０２】
（選択の手段としてＰＴＰ９２宿主域決定因子を利用して、バクテリオファージゲノムにｆｄａ−ＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺαを付加する、Ｐｈｉ３３の遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ３０７（図２；図３）を、接合によって、元のファージと宿主域決定因子ドナーファージの両方の宿主である緑膿菌株に導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ３２を得ることができる。
【０１０３】
２．株ＰＴＡ３２に、ファージＰｈｉ３３を感染させて、子孫ファージを回収することができる。
【０１０４】
３．ＰＴＰ９２宿主域決定因子がＰｈｉ３３に伝達されている組み換え型ファージは、ＰＴＰ９２宿主域決定因子を有する組み換え型ファージの宿主であるが、親バクテリオファージＰｈｉ３３の宿主ではない緑膿菌株２７２６においてステップ（２）の溶解物をプラーク形成させることによって同定することができる。
【０１０５】
４．ＰＣＲスクリーニングをさらに行って、ＰＴＰ９２由来の宿主域決定因子に加えてｆｄａ−ＳＡＳＰ−ＣおよびｌａｃＺαを同時に獲得した単離体を同定することができる。
【０１０６】
５．ｌａｃＺαを獲得した単離体を、β−ガラクトシダーゼの色素生成基質であるＳ−ｇａｌ（Ｓｉｇｍａ）を含有する培養培地を使用して、緑膿菌株ＰＡＸ３２（図１）におけるプラーク形成によってさらに確認することができる。この培養培地を使用して、ｌａｃＺαレポーターを有するバクテリオファージは、この宿主において黒色のプラークを生成するが、ｌａｃＺαレポーターを欠如するバクテリオファージのプラークは透明なままである。
【０１０７】
６．確認された単離体（ＰＴＰＸ３２；図３）の同定後、この単離体を、さらに使用する前にさらに２回プラーク精製することができる。
【０１０８】
（選択可能マーカーとして代替の宿主域決定因子を利用して、バクテリオファージＰｈｉ３３（エンドライシン遺伝子）の一部を欠失させて、同時にバクテリオファージＰｈｉ３３のゲノムにＤＮＡの新しい部分（ｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃ）を導入する、プラスミドの構築）
１．関連するバクテリオファージＰＴＰ９２の尾繊維宿主域決定因子の配列に隣接するＰｈｉ３３配列を有するが、エンドライシン遺伝子の欠失を含むｐＳＭ１０８０を含むプラスミドｐＳＭＸ３０８（図４）は、以下のように構築することができる。
【０１０９】
Ｐｈｉ３３尾繊維のすぐ下流の領域は、プライマーＢ４３４７およびＢ４３３４を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図４）。バクテリオファージＰＴＰ９２のＣ末端受容体結合領域をコードする領域は、プライマーＢ４３３５およびＢ４３３６を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図４）。次に、これらの２つのＰＣＲ産物を、外側のプライマーＢ４３４７およびＢ４３３６を使用してＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲによって共に結合することができる。Ｐｈｉ３３尾繊維のＮ末端領域をコードするＰｈｉ３３配列、および尾繊維の上流の領域を、プライマーＢ４３３７およびＢ４３３８を使用してＰＣＲによってＰｈｉ３３から増幅することができる。次に、このＰｈｉ３３尾繊維領域を、外側のプライマーＢ４３４７およびＢ４３３８を使用してＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲによって、Ｐｈｉ３３尾繊維の下流の領域とＰＴＰ９２宿主域決定因子とを含むＰＣＲ産物に結合することができる。得られたＰＣＲ産物を精製して、ＮｈｅＩによって消化して、再度精製した後、ＮｈｅＩによって消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理され、精製されたｐＳＭ１０８０にライゲートすることができる。この構築により、プラスミドｐＳＭＸ３０８が得られる（図４）。
【０１１０】
プライマーＢ４３４７は、５’ＮｈｅＩ−ＡｆｌＩＩ−ＰａｃＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３尾繊維のおよそ１ｋｂ下流の領域と相補的な配列とからなる（図４）。プライマーＢ４３３４は、ＰＴＰ９２尾繊維宿主域決定因子の５’配列と、その後に続くＰｈｉ３３尾繊維のすぐ下流の配列（下線、図４）とからなる。プライマーＢ４３３５は、プライマーＢ４３３４の逆相補体である（図４）。プライマーＢ４３３６は、ＰＴＰ９２の宿主域決定因子と相補的な５’配列と、その後に続くＰｈｉ３３尾繊維と相補的な配列（下線、図４）とからなる。プライマーＢ４３３７は、プライマーＢ４３３６の逆相補体である（図４）。プライマーＢ４３３８は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３尾繊維の上流の領域の配列とからなる（図４）。
【０１１１】
【化８】
0006748074.tif 000009
【０１１２】
２．ｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃ外来ＤＮＡの挿入のために本明細書において選択された位置である、エンドライシン遺伝子のすぐ下流のＰｈｉ３３  ＤＮＡの領域を有するｐＳＭＸ３０８を含むプラスミドｐＳＭＸ３０９（図４）は、以下のように構築することができる。
【０１１３】
ｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃ外来ＤＮＡの挿入のために本明細書において選択された位置である、エンドライシン遺伝子のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３  ＤＮＡのおよそ１ｋｂの領域を、プライマーＢ４３３９およびＢ４３４０を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図４）。次に、得られたＰＣＲ産物を、ＡｆｌＩＩおよびＰａｃＩによって消化し、精製して、同様にＡｆｌＩＩおよびＰａｃＩによって消化されていて、ライゲーション前に精製されたｐＳＭＸ３０８にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ３０９を得ることができる（図４）。
【０１１４】
プライマーＢ４３３９は、５’ＡｆｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続くｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃ  ＤＮＡの挿入のために本明細書において選択された位置である、エンドライシン遺伝子のおよそ１ｋｂ下流のＰｈｉ３３配列とからなる（図４）。プライマーＢ４３４０は、５’ＰａｃＩ−ＫｐｎＩ−ＳａｃＩ制限部位（下線）と、その後に続くｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃ  ＤＮＡの挿入のために本明細書において選択された位置である、エンドライシン遺伝子のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３配列と相補的な配列とからなる（図４）。
【０１１５】
【化９】
0006748074.tif 000010
【０１１６】
３．ｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃを有するｐＳＭＸ３０９を含むプラスミドｐＳＭＸ３１０（図４）は以下のように構築することができる。
【０１１７】
バチルス・メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ  １３６３２）由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子は、プライマーＢ４３４１およびＢ４３４２を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図４）。次に、得られたＰＣＲ産物を精製し、ＫｐｎＩおよびＮｃｏＩによって消化して、再度精製することができる。緑膿菌ｆｄａプロモーターは、プライマーＢ４３４３およびＢ４３４４を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図４）。得られたＰＣＲ産物を精製して、ＮｃｏＩおよびＰａｃＩによって消化して、再度精製することができる。次に、２つのＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩおよびＰａｃＩによって消化されていて、ライゲーション前に精製されたｐＳＭＸ３０９に３方式のライゲーションでライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ３１０（図４）を得ることができる。
【０１１８】
プライマーＢ４３４１は、５’ＫｐｎＩ制限部位（下線）と、その後に続く二方向転写ターミネーター（ｔｏｎＢターミネーター）と、その後に続くバチルス・メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ  １３６３２）由来のＳＡＳＰ−Ｃの末端と相補的な配列（下線、太字；図４）とからなる。プライマーＢ４３４２（図４）は、５’ＮｃｏＩ制限部位（下線）と、その後に続くバチルス・メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ  １３６３２）由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子の開始部の配列とからなる。プライマーＢ４３４３は、５’ＮｃｏＩ制限部位（下線）と、その後に続くｆｄａプロモーターの配列とからなる（図４）。プライマーＢ４３４４は、５’ＰａｃＩ制限部位（下線）と、その後に続くｆｄａプロモーターと相補的な配列とからなる（図４）。
【０１１９】
【化１０】
0006748074.tif 000011
【０１２０】
（選択の手段としてＰＴＰ９２宿主域決定因子を利用して、Ｐｈｉ３３エンドライシン遺伝子を欠失させて、同時にバクテリオファージゲノムにｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃを付加する、Ｐｈｉ３３の遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ３１０（図４）を、接合によって、元のファージと宿主域決定因子ドナーファージの両方の宿主である緑膿菌株に導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ３３を得ることができる。
【０１２１】
２．株ＰＴＡ３３に、ファージＰｈｉ３３を感染させて、子孫ファージを回収することができる。
【０１２２】
３．ＰＴＰ９２宿主域決定因子がＰｈｉ３３に伝達されている組み換え型ファージは、ＰＴＰ９２宿主域決定因子を有する組み換え型ファージの宿主であるが、親バクテリオファージＰｈｉ３３の宿主ではなく、Ｐｈｉ３３エンドライシン遺伝子をトランスに有する緑膿菌株ＰＡＸ３１（エンドライシン＋：図１）、すなわち株２７２６誘導体においてステップ（２）の溶解物をプラーク形成させることによって同定することができる。
【０１２３】
４．ＰＣＲスクリーニングをさらに行って、ＰＴＰ９２由来の宿主域決定因子に加えてｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃを同時に獲得した単離体を同定することができる。
【０１２４】
５．エンドライシンの除去に成功したファージ単離体は、非改変緑膿菌株２７２６（エンドライシン−）においてプラークを形成できないことから、単離体を、この株におけるプラーク形成によって、エンドライシン欠失に関してさらに試験することができる。
【０１２５】
５．確認された単離体（ＰＴＰＸ３３；図５）の同定後、この単離体を、さらに使用する前に、エンドライシン＋緑膿菌株においてさらに２回プラーク精製することができる。
【０１２６】
表１．緑膿菌の４４個のヨーロッパ臨床単離体に対するＰｈｉ３３、ＰＴＰ９２、Ｃ３６、およびＰＴＰ４７の宿主域
【０１２７】
粗ファージ溶解物１０μｌを、細菌を接種した軟寒天重層プレート上に滴下することによって、株を各ファージに対する感受性に関して試験した。プレートを３２℃で一晩増殖させて、接種点でのクリアランスゾーンを評価することによって、株を各ファージに対する感受性に関して採点した。ファージが、菌叢のクリアランスによって認められるように増殖を阻害した場合、株を感受性（＋）と記し、増殖の阻害が認められない場合、株を非感受性（−）と記した。
【０１２８】
【表１】
0006748074.tif 000012
【０１２９】
（参考文献）
Ａｂｅｄｏｎ  ＳＴ．（２００８）．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｅｃｏｌｏｇｙ：Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ａｎ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｃｈａｐｔｅｒ  １．
Ｂｒａｂｂａｎ  ＡＤ，Ｈｉｔｅ  Ｅ，Ｃａｌｌａｗａｙ  ＴＲ．（２００５）．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｖｉａ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ．  Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．２：２８７−３０３．
Ｃｅｙｓｓｅｎｓ  Ｐ，Ｍｉｒｏｓｈｎｉｋｏｖ  Ｋ，Ｍａｔｔｈｅｕｓ  Ｗ，Ｋｒｙｌｏｖ  Ｖ，Ｒｏｂｂｅｎ  Ｊ，Ｎｏｂｅｎ  Ｊ，Ｖａｎｄｅｒｓｃｈｒａｅｇｈｅ  Ｓ，Ｓｙｋｉｌｉｎｄａ  Ｎ，Ｋｒｏｐｉｎｓｋｉ  ＡＭ，Ｖｏｌｃｋａｅｒｔ  Ｇ，Ｍｅｓｙａｎｚｈｉｎｏｖ  Ｖ，Ｌａｖｉｇｎｅ  Ｒ．（２００９）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＰＢ１−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：２８７４−２８８３．
Ｄｏｂｏｚｉ−Ｋｉｎｇ  Ｍ，Ｓｅｏ  Ｓ，Ｋｉｍ  ＪＵ，Ｙｏｕｎｇ  Ｒ，Ｃｈｅｎｇ  Ｍ，Ｋｉｓｈ  ＬＢ．（２００５）．Ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ＳＥｎｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ−Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  Ｉｏｎ  Ｃａｓｃａｄｅ（ＳＥＰＴＩＣ）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．５：３−７．
Ｆｒａｎｃｅｓｃｏｎｉ，Ｓ．Ｃ．，ＭａｃＡｌｉｓｔｅｒ，Ｔ．Ｊ．，Ｓｅｔｌｏｗ，Ｂ．，＆  Ｓｅｔｌｏｗ，Ｐ．（１９８８）．Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ，  ａｃｉｄ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｓｐｏｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｓｐｏｒｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０：５９６３−５９６７．
Ｆｒｅｎｋｉｅｌ−Ｋｒｉｓｐｉｎ，Ｄ．，Ｓａｃｋ，Ｒ．，Ｅｎｇｌａｎｄｅｒ，Ｊ．，Ｓｈｉｍｏｎｉ，Ｅ．，Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．，Ｂｕｌｌｉｔｔ，Ｅ．＆  Ｗｏｌｆ，Ｓ．Ｇ．（２００４）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ−ＳｓｐＣ  ｃｏｍｐｌｅｘ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ，  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｐｏｒｅｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：３５２５−３５３０．
Ｇｉｌｌ  ＪＪ，Ｈｙｍａｎ  Ｐ．（２０１０）．Ｐｈａｇｅ  Ｃｈｏｉｃｅ，  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｈａｇｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１１：２−１４．
Ｈａｒｐｅｒ  ＤＲ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｊ，Ｅｎｗｒｉｇｈｔ  ＭＣ．（２０１１）．Ｐｈａｇｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ．Ｔｈｅｒ  Ｄｅｌｉｖ．２：９３５−４７．
Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＲＷ．（２００９）．Ｊｕｍｂｏ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２８：２２９−４０．
Ｌｅｅ，Ｋ．Ｓ．，Ｂｕｍｂａｃａ，Ｄ．，Ｋｏｓｍａｎ，Ｊ．，Ｓｅｔｌｏｗ，Ｐ．，＆  Ｊｅｄｒｚｅｊａｓ，Ｍ．Ｊ．（２００８）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ-ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｐｏｒｅｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５：２８０６−２８１１．
Ｍａｒｋ  ＤＦ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＣＣ．（１９７６）．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ：ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ７  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７３：７８０−４．
Ｍａｒｉｎｅｌｌｉ  ＬＪ，Ｐｉｕｒｉ  Ｍ，Ｓｗｉｇｏｎｏｖａ  Ｚ，Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ  Ａ，Ｏｌｄｆｉｅｌｄ  ＬＭ，ｖａｎ  Ｋｅｓｓｅｌ  ＪＣ，Ｈａｔｆｕｌｌ  ＧＦ．（２００８）．ＢＲＥＤ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．３：ｅ３９５７．
Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ＷＬ，Ｓｅｔｌｏｗ  Ｂ，Ｓｅｔｌｏｗ  Ｐ．（１９９０）．Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ａ  ｓｍａｌｌ，ａｃｉｄ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｓｐｏｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｉｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６９００−６９０６．
Ｐｏｕｉｌｌｏｔ  Ｆ，Ｂｌｏｉｓ  Ｈ，ａｎｄ  Ｉｒｉｓ  Ｆ．（２０１０）．Ｂｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｒｒｏｒｉｓｍ：  Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ，  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｂｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｒｒｏｒｉｓｍ．８：１５５−１６９．
Ｑｉｍｒｏｎ  Ｕ，Ｍａｒｉｎｔｃｈｅｖａ  Ｂ，Ｔａｂｏｒ  Ｓ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＣＣ．（２００６）．Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ  ｓｃｒｅｅｎｓ  ｆｏｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｇｅｎｅｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｔ７  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０３：１９０３９−４４．
Ｒａｋｈｕｂａ  ＤＶ，Ｋｏｌｏｍｉｅｔｓ  ＥＩ，Ｓｚｗａｊｃｅｒ  Ｄｅｙ  Ｅ，Ｎｏｖｉｋ  ＥＩ．（２０１０）．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ．Ｐｏｌｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．５９：１４５−１５５．
Ｓｈｅｎｇ  Ｙ，Ｍａｎｃｉｎｏ  Ｖ，Ｂｉｒｒｅｎ  Ｂ．（１９９５）．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｌａｒｇｅ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：１９９０−６．
Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ，Ｐｅｔｒｅｎｋｏ  ＶＡ．２００５）．Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ．Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．９７：３９１−４１０．
Ｔｈｏｍａｓｏｎ  ＬＣ  Ｓａｗｉｔｚｋｅ  ＪＡ，Ｌｉ  Ｘ，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ  Ｎ，Ｃｏｕｒｔ  ＤＬ．（２０１４）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｕｓｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０６：１−１６．
Ｖｅｅｓｌｅｒ  Ｄ，Ｃａｍｂｉｌｌａｕ  Ｃ．（２０１１）．Ａ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｒｉｇｉｎ  ｆｏｒ  Ｔａｉｌｅｄ−Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｉｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．７５：４２３−４３３．
Ｗａｌｄｏｒ  Ｍ，Ｍｅｋａｌａｎｏｓ  Ｊ．（１９９６）．Ｌｙｓｏｇｅｎｉｃ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７２：１９１０−１９１４．
Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ＳＪ，Ｈｏｕｃｈｉｎ  ＬＡ，ＭｃＤａｎｉｅｌ  Ｌ，Ｐａｕｌ  ＪＨ．（２００２）．Ｓｅａｓｏｎａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｙｓｏｇｅｎｙ  ａｓ  ｄｅｐｉｃｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔａｍｐａ  Ｂａｙ，Ｆｌｏｒｉｄａ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：４３０７−１４．
Ｙｕ  Ｄ，Ｅｌｌｉｓ  ＨＭ，Ｌｅｅ  ＥＣ，Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＮＡ，Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ＮＧ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：５９７８-５９８３．
【図１Ａ】
0006748074.tif 000013
【図１Ｂ】
0006748074.tif 000014
【図２Ａ】
0006748074.tif 000015
【図２Ｂ】
0006748074.tif 000016
【図２Ｃ】
0006748074.tif 000017
【図２Ｄ】
0006748074.tif 000018
【図３Ａ】
0006748074.tif 000019
【図３Ｂ】
0006748074.tif 000020
【図４Ａ】
0006748074.tif 000021
【図４Ｂ】
0006748074.tif 000022
【図４Ｃ】
0006748074.tif 000023
【図４Ｄ】
0006748074.tif 000024
【図５Ａ】
0006748074.tif 000025
【図５Ｂ】
0006748074.tif 000026
【図６Ａ】
0006748074.tif 000027
【図６Ｂ】
0006748074.tif 000028
【図６Ｃ】
0006748074.tif 000029
【図６Ｄ】
0006748074.tif 000030
【図６Ｅ】
0006748074.tif 000031
【配列表】
0006748074000001.app