(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物の細胞における標的ＲＮＡ配列中のヌクレオチドの部位特異的編集のためのオリゴヌクレオチドコンストラクトであって、
（ａ）前記標的ＲＮＡの一部に相補的なアンチセンス配列を含むターゲティング部分；および
（ｂ）分子内ステムループ構造を形成する能力があり、前記細胞において天然に存在するＲＮＡ編集実体（entity）に結合し、それをリクルートする能力があり、前記ヌクレオチドの編集を行う能力があるリクルート部分
を含むオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項２】
リクルート部分が以下の部分のいずれか一つ；
（ｉ）ヒトＧｌｕＲタンパク質のＢ−ドメインをコードするＲＮＡ配列；
（ｉｉ）ＧｌｕＲ−Ｃ、ＧｌｕＲ−Ｄまたは５−ＨＴ２ｃセロトニン受容体のＲＮＡ編集実体結合ドメインをコードするＲＮＡ配列；
（ｉｉｉ）配列（ＲＹまたはＹＲ）ｎＮｍ（ＲＹまたはＹＲ）ｎ（式中、Ｒはアデノシンまたはグアノシンであり、Ｙはウリジンまたはシチジンであり、Ｎはアデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、またはイノシンであり、ｎは３以上であり、ｍは４以上であり、Ｎはループを形成し、前記２つの（ＲＹ）ｎまたは（ＹＲ）ｎ配列は、相補的塩基対形成を通じて２本鎖ステム構造を形成する）を含むＲＮＡまたはＤＮＡステム−ループ構造；
（ｉｖ）配列（ＣＧ）３Ｎ１−Ｎｎ（ＣＧ）３を含むＤＮＡステム−ループ構造、ここでＮ１〜Ｎｎのそれぞれは、同じであっても、または異なっていてもよく、グアノシン、アデノシン、チミジン、シチジン、およびイノシンから選択され、「ｎ」は、２〜２０である；
（ｖ）配列：ＧＣＵＭＡを有するペンタヌクレオチド、ここで、Ｇはグアノシンであり、Ｃはシチジンであり、Ｍはアデノシンまたはシチジンであり、Ｕはウリジンである；および
（ｖｉ）ＲＮＡ編集実体に結合するため選択されたアプタマー
に由来する配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項３】
前記リクルート部分が、前記標的配列ＲＮＡに相補的でない、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項４】
前記ターゲティング部分が、前記標的ＲＮＡ配列との塩基対形成の際にｄｓＲＮＡ構造を形成するオリゴリボヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項５】
前記ターゲティング部分が、前記標的ＲＮＡ配列中の編集されるべき前記ヌクレオチドに向かい合った位置で非相補的ヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項６】
編集の標的である前記ヌクレオチドが、アデノシンまたはシチジンであり、前記ＲＮＡ編集実体が、デアミナーゼ活性を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項７】
編集の標的である前記ヌクレオチドがアデノシンであり、前記編集実体がアデノシンデアミナーゼである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項８】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項９】
前記編集実体が、ｈＡＤＡＲ１、またはｈＡＤＡＲ２を含む、請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項１０】
前記非相補的ヌクレオチドが、シチジン、またはウリジンであり、好ましくは、シチジンである、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項１１】
分子内ステム−ループ構造を形成する能力がある前記核酸配列が、オリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）配列である、請求項３に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項１２】
前記リクルート部分が、ヌクレオチド配列：
５’−（ＡＵＡＮａ）ｎＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＵｇｃｕａａＡＵＧＵＵＧＵＵＡＵＡ（ＮｂＵＡＵ）ｎ−３’
（式中、ＮａおよびＮｂは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵであってもよいそれぞれ単一のヌクレオチドであり、但し、ＮａおよびＮｂは、ステム−ループ構造の形成の際にミスマッチ塩基対を形成し、ｎは、１または０である）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項１３】
前記リクルート部分が、配列番号６、７、２０、２１、２２、２３、および２４から選択される配列を含む、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項１４】
前記リクルート部分が、配列（ＣＧ）３Ｔ４（ＣＧ）３（配列番号５）（式中、Ｃはシチジンであり、Ｇはグアノシンであり、Ｔはチミジンである）を含むデオキシオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項１５】
前記ヌクレオチドの１つまたは複数が化学修飾を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドコンストラクトの前記ターゲティング部分が、１つまたは複数の２’−Ｏリボシル置換ウリジン、好ましくは、２’−ＯＭｅ置換ウリジンを含む、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項１７】
編集の標的ではない、前記標的ＲＮＡ配列中のアデノシンに向かい合った全てのウリジンが、２’−メトキシ−（２’−ＯＭｅ）ウリジンである、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項１８】
前記ターゲティング部分と前記リクルート部分とが、オリゴヌクレオチド配列、オリゴペプチド配列、またはＰＥＧなどの別の共有化学結合を含むリンカー配列により隔てられている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項１９】
前記ターゲティング部分が、本質的には中断されず、前記オリゴヌクレオチドコンストラクトの５’部分を形成し、前記リクルート部分が、前記オリゴヌクレオチドコンストラクトの３’部分を形成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項２０】
前記ターゲティング部分が、本質的には中断されず、前記オリゴヌクレオチドコンストラクトの３’部分を形成し、前記リクルート部分が、前記オリゴヌクレオチドコンストラクトの５’部分を形成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項２１】
前記ターゲティング部分が、前記オリゴヌクレオチドコンストラクトの５’部分、および３’部分を形成し、前記リクルート部分が、前記オリゴヌクレオチドコンストラクトの中央部分を形成するように、前記ターゲティング部分が、前記リクルート部分により中断される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項２２】
前記ターゲティング部分が、相補的な塩基対形成を通じて前記標的ＲＮＡ配列にアニーリングするとき、前記リクルート部分がループアウトされる、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドの長さが、２０〜１００個のヌクレオチド、好ましくは、２４〜６０個のヌクレオチド、より好ましくは、３０〜５０個のヌクレオチドである、請求項１−２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項２４】
前記標的ＲＮＡ配列が、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１−２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【請求項２５】
請求項１−２４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクトを含む医薬組成物であって、真核生物、好ましくは、哺乳類の細胞、より好ましくは、ヒト細胞における標的ＲＮＡ中のヌクレオチドを、前記細胞において天然に存在し前記ヌクレオチドの編集を行う能力があるＲＮＡ編集実体の作用を通じて部位特異的に編集する方法であって、（ｉ）前記細胞に、請求項１−２４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドコンストラクトを供給する工程；（ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドコンストラクトを細胞が取り込み、前記オリゴヌクレオチドコンストラクトが前記標的ＲＮＡ配列にアニーリングし、前記ＲＮＡ編集実体に、前記標的ＲＮＡ配列中の前記ヌクレオチド上で編集反応を行わせるのに十分な時間を割り当てる工程；および（ｉｉｉ）前記ＲＮＡ配列中の編集されたヌクレオチドの存在を同定する工程を含む方法、における使用のための、医薬組成物。
【請求項２６】
前記標的ＲＮＡが、ＣＦＴＲ（例えば、１７８４Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、ＣＥＰ２９０（例えば、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ変異を編集するため）、Ａ１ＡＴ（例えば、９９８９Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、またはＬＲＲＫ２（例えば、Ｇ６０５５変異を編集するため）をコードする、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記標的ＲＮＡが、ＣＦＴＲ（例えば、１７８４Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、ＣＥＰ２９０（例えば、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ変異を編集するため）、Ａ１ＡＴ（例えば、９９８９Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、またはＬＲＲＫ２（例えば、Ｇ６０５５変異を編集するため）をコードする、請求項１−２４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドコンストラクト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、英国特許出願第１４２２５１１．４号、第１５１２４６７．０号、第１５１２５９５．８号、および第１５２１９８７．６号（それぞれ、２０１４年１２月１７日、２０１５年７月１６日、２０１５年７月１７日、および２０１５年１２月１４日付けで出願された）に基づく優先権を主張し、そのそれぞれの完全な内容が、あらゆる目的について参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ＲＮＡ編集の分野にあり、それにより、例えば、変異を修正するために、標的ＲＮＡ（target RNA）配列のヌクレオチド配列を修飾する。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ編集は、真核生物の細胞が、ＲＮＡ分子の配列を、しばしば部位特異的かつ正確な方法で変化させ、それにより、ゲノムによりコードされるＲＮＡのレパートリーを数桁分増大させる天然のプロセスである。ＲＮＡ編集酵素は、動植物界を通じて真核生物種について記載されており、これらのプロセスは、線虫（Caenorhabditis elegans）のような、最も単純な生命体からヒトまでの後生動物における細胞のホメオスタシスの維持において重要な役割を果たす。ＲＮＡ編集の例は、それぞれ、アデノシンデアミナーゼ、およびシチジンデアミナーゼと呼ばれる酵素を介したアデノシンからイノシンへの、ならびにシチジンからウリジンへの変換である。最も広く研究されたＲＮＡ編集システムは、アデノシンデアミナーゼ酵素である。アデノシンデアミナーゼは、認識ドメインおよび触媒ドメインを含む複数ドメインタンパク質である。認識ドメインは、特異的なｄｓＲＮＡ配列および／または立体構造を認識するのに対して、触媒ドメインは、核酸塩基の脱アミノ化により、標的ＲＮＡにおいてすぐ近くの、多かれ少なかれ事前に規定された位置にあるアデノシンをイノシンに変換する。イノシンは、細胞の翻訳機構によりグアニンとして読みとられ、これは、編集されたアデノシンが、ｍＲＮＡまたはプレ−ｍＲＮＡのコード領域にあるなら、タンパク質配列を再コード化することができることを意味する。ＡからＩへの変換はまた、標的ｍＲＮＡの５’非コード配列において起き、本来の開始部位の上流の新規翻訳開始部位を生ずることもあり、これにより、Ｎ末端で伸長されたタンパク質が生じる。加えて、ＡからＩへの変換は、プレ−ｍＲＮＡ中のイントロンまたはエクソンにおけるスプライスエレメントにおいて生じ、それにより、スプライシングのパターンを変化させることもある。エクソンは、かかるＲＮＡ編集の結果として、含まれるか、またはスキップされ得る。アデノシンデアミナーゼは、ヒトデアミナーゼｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、およびｈＡＤＡＲ３を含む、ＲＮＡ（ＡＤＡＲ）上で作用するアデノシンデアミナーゼと呼ばれる酵素の広範なファミリーの一部である。
【０００４】
標的ＲＮＡを編集するためのオリゴヌクレオチドの使用は、当該技術分野において公知であり、例えば、Montiel-Gonzalez et al.（Proceedings of the National Academy of Sciences 2013 November 5, 2013, vol. 110, no. 45, pp. 18285-18290）を参照されたい。本発明者らは、バクテリオファージラムダタンパク質ＮのいわゆるＢ−ボックス結合ドメインに融合された、ｈＡＤＡＲ１タンパク質のアデノシンデアミナーゼドメインを含む遺伝子的に操作された融合タンパク質を使用した、標的ＲＮＡの標的化された編集を記載した。ｈＡＤＡＲ１の天然の認識ドメインを取り除いて、天然のＡＤＡＲの基質認識特性を除去し、ラムダＮ−タンパク質のＢ−ボックス認識ドメインによりこれを置き換えた。Ｂ−ボックスは、Ｎ−タンパク質Ｂ−ボックス結合ドメインにより認識される１７個のヌクレオチドのＲＮＡの短い区間である。本発明者らは、Ｎ−ドメイン−デアミナーゼ融合タンパク質による配列特異的認識のためＢ−ボックス部分に融合された、編集の標的配列に相補的であるガイドＲＮＡ部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを創造した。本発明者らは、ガイドＲＮＡオリゴヌクレオチドが、アデノシンデアミナーゼ融合タンパク質を標的部位に対して忠実に指向化され、これにより、標的ＲＮＡの、ｇＲＮＡにより指定された部位特異的なＡからＩへの編集がもたらされたことを見事に示した。
【０００５】
提案された方法の欠点は、トランケートされた天然のＡＤＡＲタンパク質のアデノシンデアミナーゼドメインに遺伝子的に融合された、バクテリオファージラムダＮ−タンパク質のＢ−ボックス結合ドメインからなる融合タンパク質の必要性である。これは、標的細胞に、融合タンパク質を用いて形質導入を行うか（これはかなりハードルが高い）、または標的細胞における発現のため操作されたアデノシンデアミナーゼ融合タンパク質をコードする核酸コンストラクトを標的細胞にトランスフェクトするかのいずれかを要求する。後者は、編集が、例えば、ヒト疾患に対する治療法で、多細胞生物において達成されるべき場合、些細な障害ではない。
【０００６】
Vogel et al.（Angewandte Chemie. Int. Ed. 2014, 53, 6267-71）は、ベンジルグアニン置換ガイドＲＮＡ、およびＳＮＡＰ−タグドメインに遺伝子的に融合されたＡＤＡＲ１または２のアデノシンデアミナーゼドメイン（操作されたＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡ−アルキルトランスフェラーゼ）を含む、遺伝子操作された融合タンパク質を使用した、ｅＣＦＰならびに第Ｖ因子ライデンをコードするＲＮＡの編集を開示する。この遺伝子操作された人工デアミナーゼ融合タンパク質は、共有結合されたガイドＲＮＡ（ベンジルグアニンを通じて）を使用して、培養中のＨｅｌａ細胞における標的ＲＮＡの所望の編集部位を標的とすることができたが、このシステムは、遺伝子操作したタンパク質を有する細胞を提供するために、まずＡＤＡＲを遺伝子的に修飾し、続いて、標的ＲＮＡを有する細胞にトランスフェクションまたは形質導入することを必要とすることなくシステムを適用する方法が明確ではないという点で、上記の遺伝子操作されたＡＤＡＲと同様の欠点を抱えている。明らかなことに、このシステムは、ヒトにおける、例えば、治療設定での使用に容易には適合できない。
【０００７】
オリゴヌクレオチドを使用する別の編集技術は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムとして知られているが、この編集複合体はＤＮＡ上で作用する。後者の方法は、上で記載された操作されたＡＤＡＲシステムと同じ欠点に悩まされる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素、またはそれをコードする発現コンストラクトを、ガイドオリゴヌクレオチドと共に、標的細胞に同時にデリバリーすることを必要とするからである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
故に、先行技術の方法に伴う問題を有することなく、哺乳類細胞において、さらには生物体全体において、内在性の核酸を編集するために内在性の細胞経路を利用することができる新規技術の必要が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、編集されるべき標的核酸配列に特異的なターゲティング部分、および細胞において天然に存在する核酸編集実体（entity）に結合し、それをリクルートする能力があるリクルート部分を含むオリゴヌクレオチドコンストラクトを使用した、ＲＮＡ編集に標的化されたアプローチを提供することにより、先行技術による方法の欠点を排除する。オリゴヌクレオチドコンストラクトのリクルート部分の機能は、細胞に内在性かつ常在性のＲＮＡ編集実体と十分な親和性で選択的に結合し、本発明のオリゴヌクレオチドコンストラクトのターゲティング部分により、かかる実体を予め選択された標的部位に再指向化し、それにより、オリゴヌクレオチドコンストラクトのターゲティング部分に対応する標的ＲＮＡの領域中の予め選択されたヌクレオチド残基の編集を促進することである。
【００１０】
オリゴヌクレオチドコンストラクトのターゲティング部分は、編集されるべきＲＮＡ配列中の標的部位に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を通常含む。標的ＲＮＡを編集するかかる標的化されたアプローチの１つの好ましい実施態様は、２つの部分、標的ＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス配列を含むターゲティング部分、およびＲＮＡ編集酵素のための認識配列を含むリクルート部分を含むオリゴヌクレオチドコンストラクトである。
【００１１】
リクルート部分は、ステムおよびループを有するヘアピン構造の形態のｄｓＲＮＡを含んでもよい。ヘアピンは、ターゲティング部分の上流（５’）または下流（３’）（好ましくは、上流）に存在し得る。あるいは、オリゴヌクレオチドコンストラクトのリクルート部分は、ターゲティング部分の一部がリクルート部分の上流にあり、ターゲティング部分の一部がリクルート部分の下流にあるような形でターゲティング部分を中断し、オリゴヌクレオチドコンストラクトが標的ＲＮＡにアニールした後、オリゴヌクレオチドコンストラクトのリクルート部分をループアウトさせてもよい。
【００１２】
別の実施態様によると、リクルート部分は、天然に存在するＲＮＡ編集実体により編集されることが知られているＲＮＡ配列を模倣する、すなわち、構造において同一または類似するｄｓＲＮＡセグメントを含む。ＲＮＡ編集のための天然の基質であることが知られているこのＲＮＡ配列は、相補的な核酸塩基対形成を介してそれ自体に対して折り畳まれ、それにより、ヘアピンまたはステム−ループ構造を形成する単一ＲＮＡセグメントを好ましくは含む、ｄｓＲＮＡセグメントを含む。非常に詳細に特徴付けられた公知の編集されたＲＮＡ配列の２つの例は、３−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）サブタイプグルタミン酸受容体のＢ−サブユニット（ＧｌｕＲ−Ｂ）にある。このモデルシステムは、２つの頻繁に編集された部位を含み、ここで、ＤＮＡによりコードされたＡＧＡがＩＧＡに編集され、アルギニンからグリシンへの置換（Ｒ／Ｇ部位）、および別個のグルタミンからアルギニンへの置換（Ｑ／Ｒ部位）をもたらす。ＧｌｕＲ−Ｂ（Ｒ／Ｇ）部位は、３つのミスマッチ、２つのＡ・Ｃおよび１つのＧ・Ｕゆらぎ塩基対を含む、７１個のヌクレオチドからなるステム−ループ構造を含むことが知られている。興味深いことに、ループは、系統的に保存されたＧＣＵＭＡ配列（式中、ＭはＡまたはＣである）に適合する、十分に保存されたペンタループ構造ＧＣＵＡＡ構造からなる（Aruscavage P.J. & Bass B.L. RNA. 2000; 6: 257-269）。編集されるアデノシンに向かい合った塩基が、シチジンまたはウリジンから選択される（シチジンが好ましい）とき、より高い効率で、２つのゆらぎアデノシンの編集が幾分優先されるように思われる。
【００１３】
この構造は、そのまま好都合に使用されるか、または本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトにおいて使用されるとき、ステム中のゆらぎ核酸塩基対の数を減らすか、もしくは増大させて、編集の特異性を修飾し、および／または編集を標的ＲＮＡ配列中の好ましい部位に再指向化することにより、リクルート部分として適合されてもよい。加えて、またはあるいは、ｈＡＤＡＲ１についてのＧｌｕＲ−Ｂの認識部位は、認識を完全に無効にすることなくステムを短縮することにより、修飾されてもよい。かかる短縮は、製造可能性またはコストなどの見込みが良好になることから、好都合であり得る。
【００１４】
ＧｌｕＲ−Ｂドメインに由来するリクルート部分の例は、配列：５’−（ＡＵＡＮａ）ｎＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＵｇｃｕａａＡＵＧＵＵＧＵＵＡＵＡ（ＮｂＵＡＵ）ｎ−３’（式中、ＮａおよびＮｂは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵであってもよいそれぞれ単一のヌクレオチドであり、但し、ＮａおよびＮｂは、ステム−ループ構造の形成の際にミスマッチ塩基対を形成し、ｎは、１または０である）（すなわち、配列番号６および７）を含む。かかるリクルート部分の有用な例は、例えば、それぞれが１〜１０個のヌクレオチド長（またはより長い、例えば、１〜２０個のヌクレオチドもしくはそれ以上）である５’および３’の向きのさらなる伸長を有する、ｎ＝１である、この配列を含む。例えば、３個のさらなるヌクレオチドをそれぞれの向きでの伸長は、配列番号２０〜２２内で見られる、（配列番号２３）５’−ＧＧＡＡＵＡＮａＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＵｇｃｕａａＡＵＧＵＵＧＵＵＡＵＡＮｂＵＡＵＣＣＣ−３’（式中、Ｎａ＝Ｎｂ＝Ｇ）を生じる。このさらなる伸長は、修正効率を改善し得る。
【００１５】
全長の天然のＧｌｕＲ−Ｂ受容体基質に基づくリクルート部分の別の例は、実施例において以下で使用される、
【表１】
0006718872.tif 000002
（配列番号２４；先行する段落の下線に関連する伸長された配列）である。Ａ１ＡＴ−欠損と関連する位置９９８９においてＧからＡへの変異を有するＡ１ＡＴ−転写物についてのターゲティング部分と組み合わせた全長ＧｌｕＲ−Ｂ受容体リクルート部分が、実施例４において記載される。パーキンソン病と関連する、Ｇ２０１９Ｓ変異を有するＬＲＲＫ２転写物についてのターゲティング部分と組み合わせた全長ＧｌｕＲ−Ｂ受容体リクルート部分が、実施例５において記載される。
【００１６】
リクルート部分は、適宜、１個もしくは複数のヌクレオチド含むリンカー「Ｌ」、オリゴペプチド、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような、別の化学リンカーを介して、５’または３’末端においてターゲティング部分に結合されてもよい。
【００１７】
ターゲティング部分は、一般式：
N1N2N3N4N5N6N7N8N9N10N11N12N13N14N15N16N17CN18N19N20（配列番号８）、
（式中、Ｎ１〜Ｎ２０は、標的ＲＮＡ配列における相補的配列に依存して、それぞれ独立して、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵであり、Ｎ４は、ターゲティング部分がその標的ＲＮＡ配列にアニーリングされるとき、標的ＲＮＡ配列中のその向かい合ったヌクレオチドとミスマッチ塩基対を好ましくは形成し、Ｎ１０およびＮ１６は、ターゲティング部分がその標的ＲＮＡ配列にアニーリングされるとき、標的ＲＮＡ配列中のそれらの向かい合ったヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成し、Ｃは、脱アミノ化についての標的である標的ＲＮＡ配列中のアデノシンに向かい合ったシチジンである）により表される標的ＲＮＡ配列に相補的である配列を含んでもよい。
【００１８】
ミスマッチ塩基対は、Ｇ−Ａ、Ｃ−Ａ、Ｕ−Ｃ、Ａ−Ａ、Ｇ−Ｇ、Ｃ−Ｃ、Ｕ−Ｕ塩基対である。ゆらぎ塩基対は、Ｇ−Ｕ、Ｉ−Ｕ、Ｉ−Ａ、およびＩ−Ｃ塩基対である。５０より長いことは必須ではなく、４０より短いことが好ましいと考えられているが、ターゲティング部分は、２００個のヌクレオチドまたはそれ以上と同等の、２０個より長いヌクレオチドであってもよい。３０個のヌクレオチドより短い、好ましくは、２５個のヌクレオチドより短いリクルート部分が、なおより好ましい。
【００１９】
好ましくは、ターゲティング部分は、ターゲティング部分が標的ＲＮＡ配列にアニーリングされるとき、標的ＲＮＡ配列中のそのアデノシンが編集の標的でないなら、アデノシンに向かい合うそれぞれの位置において２’−Ｏメチル基を含む。より一般的には、ヌクレアーゼによる分解からターゲティング部分を保護するために、ヌクレオチドが、標的アデノシンに向かい合ったヌクレオチド、および前記向かい合ったヌクレオチドに隣接するヌクレオチド（１つは５’、および１つは３’）が２’−ＯＨ基を含むべきことを除き、全てのヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル基を含むことが好ましい。
【００２０】
好ましい実施態様によると、リクルート部分は、ＤＮＡ配列：（ＣＧ）３Ｎ１−Ｎｎ（ＣＧ）３（式中、Ｎ１〜Ｎｎのそれぞれは、同じであっても、または異なっていてもよく、グアノシン、アデノシン、チミジン、シチジン、およびイノシンから選択され、「ｎ」は、２〜２０であり、好ましくは、２〜１０であり、より好ましくは、２〜５であり、なおより好ましくは、３〜５であり、最も好ましくは、４または５である）を含む。したがって、最大２０個の中間ヌクレオチドに隣接する３個のＣＧリピートが存在する。このＤＮＡ配列は、ステム−ループ構造を形成する能力がある。さらに好ましい実施態様によると、オリゴヌクレオチドコンストラクトのリクルート部分は、配列：（ＣＧ）３Ｔｎ（ＣＧ）３［式中、ｎは、３〜５の整数であり、好ましくは、４である（ＣＧＣＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＧＣＧ；配列番号５）］を含むＤＮＡ構造である。このＤＮＡ配列は、ステム−ループ構造を形成する能力がある。さらに、（ＣＧ）３Ｔ４（ＣＧ）３配列が、生理学的条件下でＺ−ＤＮＡ立体構造を形成すること、およびこのＺ−ＤＮＡ構造が、ｈＡＤＡＲ１により認識され、結合されることが、当該技術分野において記載されている（FEBS letters 458:1 1999 Sep 10 pg 27-31）。ｄｓＲＮＡリクルート部分についての上記の通り、このＺ−ＤＮＡリクルート部分は、ターゲティング部分の上流もしくは下流にあっても、またはターゲティング部分を中断し、ターゲティング部分を上流セグメントと下流セグメントとに隔て、それにより、ターゲティング部分が標的ＲＮＡにアニーリングしたとき、ＤＮＡリクルート部分がループアウトされてもよい。この実施態様によると、シチジン塩基は、ＣｐＧ配列と関連する可能性のある免疫原性を低減するために、好ましくは、５−メチルシチジンである。
【００２１】
本発明によるオリゴヌクレオチドは、ターゲティング部分（すなわち、オリゴヌクレオチドを標的ＲＮＡ配列中の正しい位置に標的化する部分）、およびリクルート部分（すなわち、例えば、ＡＤＡＲのような、編集実体をリクルートするための一次機能として有し、編集の標的であるアデノシンの領域中の標的ＲＮＡと必ずしも相補的でなく、好ましくは、相補的でない部分）を含む。この二分された構造は、それらの全体の長さに渡り標的に本質的に相補的であり、リクルートメント部分を含まない（標的ＲＮＡに相補的ないが、代わりに本発明と同様に、編集実体に対して親和性を有するものはもちろん確実でない）、先行技術（例えば、国際特許出願公開第２０１４／０１１０５３号、国際特許出願公開第２００５／０９４３７０号、およびWoolf et al, 1995. PNAS USA 92, 8298-8302）において開示されたもののような公知のオリゴヌクレオチドから本発明のオリゴヌクレオチドを明確に区別する。それ故、真核生物の細胞における標的ＲＮＡ配列中のヌクレオチドの部位特異的編集のためのオリゴヌクレオチドコンストラクトを提供することが、本発明により好ましく、前記オリゴヌクレオチドコンストラクトは、
（ａ）標的ＲＮＡの一部に相補的なアンチセンス配列を含むターゲティング部分；および
（ｂ）標的ＲＮＡ配列に相補的でなく、前記細胞において天然に存在するＲＮＡ編集実体に結合し、それをリクルートする能力があり、前記ヌクレオチドの編集を行う能力があるリクルート部分
を含む。
【００２２】
さらなる実施態様に従い、本発明は、
（ａ）標的ＲＮＡの一部に相補的なアンチセンス配列を含むターゲティング部分；および
（ｂ）分子内ステムループ構造を形成し、前記細胞において天然に存在するＲＮＡ編集実体に結合し、それをリクルートし、前記ヌクレオチドの編集を行う能力があるリクルート部分
を含むオリゴヌクレオチドコンストラクトを提供する。
【００２３】
なお別の実施態様によると、リクルート部分は、細胞において常在性の編集実体に結合するため選択されたアプタマーであってもよい。アプタマーを選択する手法は、当該技術分野において周知である。デアミナーゼ活性を無効にすることなく、編集実体に結合するアプタマーを、リクルート部分として選択し、通常の（ホスホジエステル）、もしくは修飾された（例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオアート）ヌクレオシド間結合、ペプチジル結合、またはポリエチレングリコールのような、任意の他の化学結合を含む任意のタイプのリンカーを使用して、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトのターゲティング部分に容易に融合することができる。
【００２４】
本発明のなお別の実施態様によると、編集活性を無効にすることなく、細胞において常在性の編集実体に結合する、抗体、抗体フラグメント、その結合ドメイン、またはラクダ抗体を、リクルート部分として選択し、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトのターゲティング部分に融合してもよい。
【００２５】
用語「オリゴヌクレオチドコンストラクト」は、直接、またはＰＥＧもしくは他のリンカーを介して結合されてもよい、単一オリゴヌクレオチド、互いに親和性（アンチセンス相補性、もしくは他）を有する２つ以上のオリゴヌクレオチド（アプタマーを含む）の複合体、またはオリゴヌクレオチドとタンパク質性結合部分の複合体（例えば、抗体、抗体フラグメント、もしくは結合ドメイン）を指す。
【００２６】
したがって、本発明は、遺伝子操作された編集酵素を細胞に形質導入するか、またはトランスフェクションする必要のない、細胞における標的ＲＮＡ配列の部位特異的編集のためのオリゴヌクレオチドコンストラクトおよび方法を提供する。オリゴヌクレオチドコンストラクトの設計に起因し、ＡＤＡＲのような、編集実体は、実験者により選ばれた編集部位へとリクルートされ指向化される。本発明のこれらのオリゴヌクレオチドコンストラクトおよび方法を好都合に使用して、標的ＲＮＡ配列を変化させる、例えば、疾患に関与するか、または疾患を引き起こす変異を元に戻すことにより、疾患の症状を軽減することができる。ＲＮＡ編集実体は、オリゴヌクレオチドにより仲介されるＤＮＡまたはＲＮＡ修復を遥かに超える頻度で、それらの基質を非常に効率的に編集することが知られている。これは、疾患を処置する際に使用されるとき、大いなる利点である。
【００２７】
本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトにおけるターゲティング部分およびリクルート部分は、直接隣接していてもよい。あるいは、ターゲティング部分、およびリクルート部分は、リンカーを介して共有結合されてもよい。リンカーは、非特異的ヌクレオチド残基（標的ＲＮＡ配列に必ずしも相補的ではないが、細胞において常在性の編集実体への親和性を有しないという意味で非特異的）、（オリゴ）ペプチドリンカー、または他の化学リンカーを含んでもよい。なお別の実施態様によると、ターゲティング部分、およびリクルート部分は、ｄｓＲＮＡ、またはハイブリッドＤＮＡ：ＲＮＡ構造を形成する能力があるアンチセンス相補性を含む、２つの別々の、すなわち、非共有結合した、オリゴヌクレオチド配列として提供されてもよい。かかるｄｓＲＮＡあるいはハイブリッドオリゴヌクレオチドコンストラクトの形成は、処置されるべき細胞もしくは対象への投与に先立ち、または２つの別々のオリゴヌクレオチドの投与の後、インビトロ（in vitro）、またはインビボ（in vivo）、例えば、処置されるべき対象において生じてもよい。
【００２８】
本発明は、真核生物、好ましくは、哺乳類細胞において標的ＲＮＡ配列中の変化をもたらす方法であって、（ｉ）前記標的ＲＮＡと核酸塩基対形成することにより結合するのに十分なほど標的ＲＮＡ配列に相補的な配列を含むターゲティング部分と、前記真核生物、好ましくは、哺乳類細胞において天然に存在するＲＮＡ編集実体により認識される配列を含むリクルート部分とを含むオリゴヌクレオチドコンストラクトを前記細胞に導入する工程；（ｉｉ）ＲＮＡ編集実体が標的ＲＮＡ配列上で編集反応を行うのに十分な時間を割り当てる工程；および（ｉｉｉ）ＲＮＡ配列中の変化の存在を同定する工程を含む方法を提供する。好ましい実施態様によると、編集反応は、オリゴヌクレオチドコンストラクトの標的ＲＮＡ配列とターゲティング部分の間の重なりの領域内の１個または複数の核酸塩基に対して前記編集実体により行われる。好ましい実施態様によると、オリゴヌクレオチドコンストラクトのターゲティング部分は、編集されるべき核酸塩基に向かい合ったミスマッチを含む。さらに好ましい実施態様によると、編集反応は、標的ＲＮＡ配列におけるアデノシン核酸塩基の脱アミノ化によるＡからＩへの変換を含む。後者の方法に従い、オリゴヌクレオチドコンストラクトが、編集されるべきアデノシンと向かい合ったＣを含むものが好ましい。別の好ましい方法によると、編集反応は、シチジン核酸塩基の脱アミノ化を介したＣからＵへの変換であり、後者の方法に従い、オリゴヌクレオチドコンストラクトのターゲティング部分が、編集されるべき標的ＲＮＡ配列中のＣと向かい合った位置にＡを含むことが好ましい。
【００２９】
本発明はまた、ヒト細胞において変異ＣＦＴＲ標的ＲＮＡ配列を編集する方法であって、（ｉ）ＣＦＴＲ標的ＲＮＡ配列に相補的であるターゲティング部分と、ｈＡＤＡＲ編集実体をリクルートする能力があるリクルート部分とを含むオリゴヌクレオチドコンストラクトを前記細胞に導入する工程；ならびに（ｉｉ）ｈＡＤＡＲ編集実体が、オリゴヌクレオチドコンストラクトの標的ＲＮＡ配列とターゲティング部分の間の重なりの領域における、または近くの核酸塩基を編集するのに十分な時間を割り当てる工程を含む方法も提供する。本発明による好ましい実施態様において、変異ＣＦＴＲ標的ＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）は、Ｇ５５１Ｄ変異を含み、編集反応により、アデノシンをイノシンに変換させ、それにより、前記標的ＲＮＡ配列中においてＧ５５１Ｄ変異からの復帰をもたらす。アスパラギン酸（Ｄ）について２つのコドン；ＧＡＵ、およびＧＡＣが存在する。故に、Ｇ５５１Ｄ変異を有する嚢胞性線維症患者は、ＣＦＴＲタンパク質のコドン５５１に対応する位置のいずれかの変異ＧＡＵまたはＧＡＣを有し得る。コドンの第２の位置のＡの脱アミノ化は、Ｉの形成を導き、翻訳機構によりＧとして読み取られる。故に、変異したコドンの第２の位置のＡの脱アミノ化は、事実上、ＧＧＵおよびＧＧＣとして読み取られるＧＩＵまたはＧＩＣをそれぞれ創造する。ＧＧＵおよびＧＧＣはいずれもグリシンをコードし、したがって、アデノシンデアミナーゼによる変異したＧ５５１Ｄコドンのいずれに対するＲＮＡ編集も、変異を正常なＣＦＴＲタンパク質に有効に復帰させる適切なグリシンコードトリプレットを生ずる。
【００３０】
Ｇ５５１Ｄ変異は例示のみとして使用され、本発明の範囲を全く制限しないことは、当業者に明らかだろう。本明細書において詳述されるアデノシンデアミナーゼのような、デアミナーゼ、またはシチジンデアミナーゼのいずれかをリクルートする、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトおよび方法を使用した復帰を適用できる一塩基対置換により引き起こされた、文字通り何千もの遺伝性疾患が存在する。
【００３１】
シチジンデアミナーゼの標的部位へのリクルートメントは、アデノシンデアミナーゼｈＡＤＡＲ１およびｈＡＤＡＲ２についてと同じ方法で機能する。しかしながら、シチジンデアミナーゼは、異なる結合要件を有し、シチジンの編集を決定するそれらの標的ＲＮＡ配列において異なる構造を認識する。１つの特に十分に研究されたシチジンは、ヒトＡｐｏｂｅｃ１である。編集部位を標的化し、常在性、天然に存在する、編集実体をリクルートするためのオリゴヌクレオチドコンストラクトを使用したＲＮＡ編集の一般的な原理は、シチジンデアミナーゼについてと同じままであり、本明細書において開示され、特許請求される発明の一部である。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、それらが、以下の２つの本質的な機能を組み合わせる点で特有である；それらが、ある親和性で天然に存在するＲＮＡ編集実体に結合し、また編集が生じるべき、標的ＲＮＡ配列中の部位に、アンチセンス相補的（ワトソン−クリック）塩基対形成を通じて結合し、それにより、ＲＮＡ編集実体を編集部位にリクルートする。「天然に存在する」実体は、先行のヒト介入を必要とすることなく、細胞に存在する。故に、トランケートされた、または組み換え酵素（例えば、Montiel-Gonzalez et al.、およびVogel et al.において記載される）は、細胞において天然に存在しない；それらは細胞に存在し得るが、それは、ヒト介入（形質導入またはトランスフェクション）後においてのみである。したがって、本発明は、細胞に内在性である、野生型ＲＮＡ編集実体を使用して、操作する。
【００３３】
かかるリクルートは、細胞において常在性の全てのＲＮＡ編集実体が、選ばれた標的ＲＮＡ配列の編集のためリクルートされるという意味で定量的である必要はないことは理解されるだろう。常在性の編集実体のある割合が、それらの天然の基質上での作用に利用可能なままであるなら、それは予想されたことであり、望ましいとすら考えられる。加えて、例えば、オリゴヌクレオチドコンストラクトのリクルート部分が、アデノシンを含むｄｓＲＮＡ配列であるある種の実施態様において、オリゴヌクレオチドコンストラクトにより一度リクルートされた、ＲＮＡ編集実体の触媒ドメインは、ターゲティング部分の標的ＲＮＡ配列中の相補的配列へのアニーリングにより創造されるｄｓＲＮＡ部分における編集基質だけでなく、オリゴヌクレオチドコンストラクトのリクルート部分上でも作用し得る。過剰な編集が望まれる適用が存在し得るので、これは、全ての状況下で問題になるというわけではない。過剰な編集が回避されるべき場合においては、ターゲティング部分は、例えば、標的アデノシンに向かい合ったヌクレオチド、ならびに標的アデノシンに向かい合っているそれぞれのヌクレオチドに隣接する２つのヌクレオチド（１つの５’、および１つの３’）を除いた全てのヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル化糖部分を加えることにより、その全体として化学的に修飾されてもよい。標的ＲＮＡ中のアデノシンは、向かい合っているヌクレオチドに２’−ＯＭｅ基を加えることにより、またはグアニンもしくはアデニンを、向かい合っている塩基とすることにより、編集から保護することができる。これらの２つの核酸塩基は、一般に、向かい合っているアデノシンの編集を妨げることができるからである。
【００３４】
オリゴヌクレオチドコンストラクト
本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトのリクルート部分は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤＮＡ構造により特徴付けられる。単一分子において２本鎖オリゴヌクレオチド構造を確立する１つの方法は、その長さの少なくとも一部に渡りそれ自体に対して折り畳まれる能力があるパリンドローム配列を確立することによる。かかるステム−ループ構造は、（１）ステム−ループ構造を形成する能力がある人工ＲＮＡ配列、（２）ステム−ループ構造を形成する能力がある人工ＤＮＡ配列、（３）細胞において常在性の編集実体のための公知の基質ＲＮＡから採取されるＲＮＡ配列から生じてもよい。例えば、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、編集活性のための天然の認識部位に配列が類似したリクルート部分を含んでも、またはその認識部位をアプタマー様様式で模倣してもよい。これらの実施態様のそれぞれが、以下でより詳細に記載されるだろう。加えて、当業者は、より詳細に記載される実施形態のそれぞれに基づき、設計およびリクルート部分を作製する能力があるだろう。タンパク質についての親和性を有する核酸構造を設計し、試験する方法は、それ自体、当該技術分野において周知である。
【００３５】
本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトのターゲティング部分は、オリゴヌクレオチドコンストラクトの標的ＲＮＡ配列との配列特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な、標的部位に対する重なりおよび相補性を有するべきである。重なりの長さおよび量は、標的ごとに変動してもよいが、当業者により日常的に決定することができる。一般に、配列が長いほど、より特異性をもたらし、結果、例えば、非特異的結合を通じて、より少ないオフターゲット効果をもたらし、より強い標的部位への結合をもたらす。本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトのターゲティング部分は、通常、１０個より多いヌクレオチドであり、好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６個より多いヌクレオチドであり、なおより好ましくは、１７個より多いヌクレオチドであるべきである。ターゲティング部分は、好ましくは、２００個より少ないヌクレオチドであり、より好ましくは、１００個より少ないヌクレオチドであり、なおより好ましくは、５０個より少ないヌクレオチドであり、なおより好ましくは、２５個以下のヌクレオチドである。
【００３６】
１つの実施態様によると、本発明は、配列５’−Ｘ−（Ｙ−Ｘ’）ｎ−Ｌ−Ｚ−３’［式中、Ｘは、特定の位置の下流の標的ＲＮＡ配列に相補的であり、Ｘ’は、特定の位置の上流の標的ＲＮＡ配列に相補的であり、Ｙは、標的ＲＮＡ配列に相補的でない、１個または複数のヌクレオチド（例えば、最大１０個、好ましくは、１〜５個、より好ましくは、１〜３個、例えば、１個または２個）を含み、ｎは、１〜１０（好ましくは、１〜５、より好ましくは、１〜３、または１）の整数であり、Ｌは、適宜であり、ゼロを含む任意の数のヌクレオチドを含んでもよいリンカー配列であり、Ｚは、前記ＲＮＡ編集実体により認識され、それに結合する配列である］を有する、前記細胞において天然に存在するＲＮＡ編集実体をリクルートすることにより、細胞において標的ＲＮＡ配列中の１カ所または複数カ所において所望の変化をもたらすためのオリゴヌクレオチドコンストラクトを提供する。Ｌはまた、（オリゴ）ペプチド結合のような、異なる化学結合、またはＰＥＧ結合からなってもよい。
【００３７】
ｎが１より大きいか、または１と等しいとき、オリゴヌクレオチドコンストラクトのターゲティング部分は、標的ＲＮＡ配列に完璧には相補的ではないが、代わりに、標的ＲＮＡ配列中の向かい合っているヌクレオチドの編集の頻度を増大させることにより特異性を増強するのに働く１つもしくは複数のミスマッチ、またはゆらぎ塩基を含む。ｎが２以上であるとき、Ｘ’は１回より多く生じ、２個以上のＸ’は、標的ＲＮＡ配列中の相補的塩基の配列に依存して同一であってもよいが、全ての可能性において、２個以上のＸ’は、同一ではない。ｎが０であるとき、ターゲティング部分は、ターゲティング部分の全体的長さに渡り標的ＲＮＡ配列に完璧に相補的であり、すなわち、標的ＲＮＡ配列への、ミスマッチを含まない。この実施態様は、アデノシンデアミナーゼにより非特異的な方法でＲＮＡ編集を引き起こす可能性が高く、これは、オリゴヌクレオチドコンストラクトの標的部分と標的ＲＮＡ配列との間の重なり領域中の全てのアデノシンが、同等の可能性で、イノシンに変換されることを意味する。アデノシンの任意の非特異的編集は、標的とされるべきでない、または少なくともより少ない頻度で標的とされるべきアデノシンが、２’−ＯＭｅのような、２’−Ｏ修飾リボース部分を有する向かい合ったヌクレオチドに出会うことを確実にすることにより制限することができる。これは、後者が、向かい合ったアデノシンの編集の効率を低減することが知られているからである。あるいは、または加えて、向かい合っている塩基をグアニンもしくはアデニンとしてもよい。これらの核酸塩基は向かい合っている塩基の脱アミノ化を一般に妨げるからである。
【００３８】
別の実施態様によると、本発明は、配列５’−Ｚ−Ｌ−（Ｘ’−Ｙ）ｎ−Ｘ−３’［式中、Ｘは、特定の位置の上流の標的ＲＮＡ配列に相補的であり、Ｘ’は、特定の位置の下流の標的ＲＮＡ配列に相補的であり、Ｙは、標的ＲＮＡ配列に相補的でない、１個または複数のヌクレオチドを含む（例えば、最大１０個、好ましくは、１〜５個、より好ましくは、１〜３個、例えば、１個または２個）、ｎは１〜１０（好ましくは、１〜５、より好ましくは、１〜３、または１）の整数であり、Ｌは、Ｌは、適宜であり、ゼロを含む任意の数のヌクレオチドを含んでもよいリンカー配列であり、Ｚは、前記ＲＮＡ編集実体により認識され、それに結合する配列である］を有する、前記細胞において天然に存在するＲＮＡ編集実体をリクルートすることにより、細胞において標的ＲＮＡ配列中の特定の位置において所望の変化をもたらすためのオリゴヌクレオチドコンストラクトを提供する。Ｌはまた、（オリゴ）ペプチド結合のような、異なる化学結合からなっていてもよい。
【００３９】
ｎが１より大きいか、または１と等しいとき、オリゴヌクレオチドコンストラクトのターゲティング部分は、標的ＲＮＡ配列に完璧には相補的ではないが、代わりに、標的ＲＮＡ配列中の向かい合っているヌクレオチドの編集の頻度を増大させることにより特異性を増強するのに働く１つもしくは複数のミスマッチ、またはゆらぎ塩基を含む。ｎが２以上であるとき、Ｘ’は１回より多く生じ、２個以上のＸ’は、標的ＲＮＡ配列中の相補的塩基の配列に依存して同一であってもよいが、全ての可能性において、２個以上のＸ’は、同一ではない。ｎが０であるとき、ターゲティング部分は、ターゲティング部分の全体的長さに渡り標的ＲＮＡ配列に完璧に相補的であり、すなわち、標的ＲＮＡ配列への、ミスマッチを含まない。この実施態様は、アデノシンデアミナーゼにより非特異的な方法でＲＮＡ編集を引き起こす可能性が高く、これは、オリゴヌクレオチドコンストラクトの標的部分と標的ＲＮＡ配列との間の重なり領域中の全てのアデノシンが、同等の可能性で、イノシンに変換されることを意味する。アデノシンの任意の非特異的編集は、標的とされるべきでない、または少なくともより少ない頻度で標的とされるべきアデノシンが、２’−ＯＭｅのような、２’−Ｏ修飾リボース部分を有する向かい合ったヌクレオチドに出会うことを確実にすることにより制限することがでる。これは、後者が、向かい合ったアデノシンの編集の効率を低減することが知られているからである。
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子であることができ、すなわち、同じオリゴヌクレオチド（oligocnucleotide）内にデオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドの両方を含む。
【００４１】
リクルート部分：好ましい実施態様
リクルート部分は、本発明による編集実体により認識される、ステム−ループＲＮＡまたは好ましくはＺ−ＲＮＡもしくはＺ−ＤＮＡ立体構造のＤＮＡ構造などの構造をもたらすのに十分な長さであるべきである。編集実体がｈＡＤＡＲ１であるなら、ｈＡＤＡＲ１の１５０ｋＤａ変異体のＺ−アルファドメインによる認識および結合を提供する核酸配列が公知である。
【００４２】
人工ＲＮＡまたはＤＮＡステム−ループ構造由来のリクルート部分
本発明による好ましいリクルート部分である、人工ＲＮＡまたはＤＮＡステム−ループ構造の例は、配列（ＲＹまたはＹＲ）ｎＮｍ（ＲＹまたはＹＲ）ｎ［式中、Ｒ、Ｙ、およびＮは、リボヌクレオチドまたはデゾキシリボヌクレオチドのいずれかを表し、ＲはＡまたはＧであり、Ｙは、Ｔ、Ｕ、またはＣであり、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵであり、ｎは３以上であり、ｍは１以上であり（好ましくは、ｍは２以上であり、より好ましくは、ｍは３以上であり、なおより好ましくは、ｍは４以上である）、Ｎはループを形成し、２個の（ＲＹ）ｎまたは（ＹＲ）ｎ配列のいずれかは、相補的ワトソン−クリック核酸塩基対形成を介して、ｄｓＲＮＡステム構造（全てのヌクレオチドがリボヌクレオチドであるとき）、もしくはｄｓＤＮＡ構造（全てのヌクレオチドがデゾキシリボヌクレオチドであるとき）を形成する］を含む。リボ−およびデゾキシリボヌクレオチドの両方を含むリクルート部分は除外されないが、リクルート部分は、好ましくは、全てリボヌクレオチドから、または全てデゾキシリボヌクレオチドからなる。
【００４３】
ｈＡＤＡＲ１に結合することが知られているリクルート部分の特に好ましい例は、（ｉ）いわゆるＺ−ＤＮＡ構造を形成する傾向を有する、（ＣＧ）ｎＴｍ（ＣＧ）ｎ（式中、ｎは３であり、ｍは４以上であり、好ましくは、４または５である）により表されるＤＮＡ構造、（ｉｉ）Ｚ−ＲＮＡ構造を形成する傾向を有する、式（ＲＹ）ｎＮｍ（ＲＹ）ｎ（式中、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＵであり、Ｎは、任意のＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵであり、Ｎは、全て同じであるか、または異なってもよく、ｎは３以上であり、ｍは４以上であり、好ましくは、４または５である）により表されるＲＮＡ構造である。Ｚ−ＤＮＡおよびＺ−ＲＮＡ構造は、二重らせんが、いずれも右巻きであるＡおよびＢ形態とは反対に左巻きであり、Ｚ−ＤＮＡおよびＺ−ＲＮＡの骨格における核酸塩基が、ジグザグ配列で空間的に配置される（故に、プレフィックス「Ｚ」）という事実により、それらのより一般的な対応物と異なる（ｄｓＤＮＡについて、Ｂ立体構造が最も一般的な形態であり、一方ｄｓＲＮＡについて、Ａ形態が最も一般的である）。
【００４４】
天然の基質ＲＮＡ由来のリクルート部分
ステム−ループ構造およびふくらみを形成するｄｓＲＮＡ配列を形成する非Ｚ−ＲＮＡも、リクルート部分として作用する。上でいくらか詳細に記載されたＧｌｕＲ−Ｂ以外の、ＧｌｕＲ−ＣおよびＧｌｕＲ−Ｄのような、編集実体、５−ＨＴ２ｃセロトニン受容体、ならびにいくつかのプリ−およびプレ−ｍｉＲＮＡならびにｍｉＲＮＡの結合ドメインと相互作用する、ステム−ループ、およびミスマッチ、またはゆらぎ塩基対を有する様々なｄｓＲＮＡ構造が、当該技術分野において記載されている。本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトのリクルート部分中の好ましいループは、テトラ−あるいはペンタループ保存配列ＵＮＣＧ（式中、Ｎは、任意のＡ、Ｇ、Ｃ、もしくはＵであってもよい）、またはＧＣＵＭＡ（式中、Ｍは、それぞれ、Ａ、もしくはＣである）に従う。リクルート部分が、当該技術分野において公知のＲＮＡ編集部位由来のステムループセグメントを含むとき、リクルートする機能が完全に損なわれない限り、ステムは、「そのまま」取られてもよいか、または製造可能性もしくは取り扱いの理由、コスト、または任意の他の理由のため、配列もしくは長さが変更され、短縮され、またはいくつかの他の方法で修飾されて、ＲＮＡ編集実体に対する親和性のような、その特徴が変更されてもよい。これらの構造は、インビトロで容易に作製され、編集実体に結合し、それをリクルートし、再指向化するそれらの能力について試験することができる。ｈＡＤＡＲを含む、市販で得ることができ本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトにおけるｄｓＲＮＡまたはｄｓＤＮＡ構造への結合についてアッセイにおいて試験することができるいくつかの編集実体は、当該技術分野において公知である。かかるアッセイは、タンパク質と核酸の相互作用の当業者に容易に入手可能であり、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を含む。
【００４５】
多いに詳細に特徴付けられた公知の編集されたＲＮＡ配列の２つの例は、３−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）サブタイプグルタミン酸受容体（ＧｌｕＲ−Ｂ）のＢ−サブユニット内にある。このモデルシステムは、ＤＮＡによりコードされるＡＧＡがＩＧＡに編集され、アルギニンからグリシンへの置換（Ｒ／Ｇ部位）、および別個のグルタミンからアルギニンへの置換（Ｑ／Ｒ部位）をもたらす、２個の頻繁に編集される部位を含む。３個のミスマッチ、２個のＡ・Ｃ、および１個のＧ・Ｕゆらぎ塩基対を含む７１個のヌクレオチドからなるステム−ループ構造を含むＧｌｕＲ−Ｂ（Ｒ／Ｇ）部位が公知である。興味深いことに、ループは、系統的に保存されたＧＣＵＭＡ配列（式中、ＭはＡまたはＣである）に従う、十分に保存されたペンタループ構造ＧＣＵＡＡ構造からなる（Aruscavage P.J. & Bass B.L. RNA. 2000; 6: 257-269）。編集されたアデノシンに向かい合った塩基が、シチジンまたはウリジン（シチジンが好ましい）から選択されるとき、より高い効率で、２個のゆらぎアデノシンの編集が幾分優先されるように思われる。
【００４６】
この構造は、そのまま好都合に使用されるか、または本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトにおいて使用されるとき、ステム中のゆらぎ核酸塩基対の数を低減もしくは増大して、編集の特異性を修飾し、および／または編集を標的ＲＮＡ配列中の好ましい部位に再指向化することにより、リクルート部分として適合されてもよい。加えて、またはあるいは、ｈＡＤＡＲ１についてのＧｌｕＲ−Ｂの認識部位は、認識を完全に無効にすることなく、ステムを短縮することにより、修飾されてもよい。かかる短縮は、製造可能性またはコストなどの見込みが良好になることから、好都合であり得る。
【００４７】
本発明による好ましい実施態様である、ＧｌｕＲ−Ｂドメインに由来するリクルート部分の例は、配列：５’（ＡＵＡＮａ）ｎＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＵｇｃｕａａＡＵＧＵＵＧＵＵＡＵＡ（ＮｂＵＡＵ）ｎ−３’［式中、ＮａおよびＮｂは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵであってもよい、それぞれ単一のヌクレオチドであり、但し、ＮａおよびＮｂは、ステム−ループ構造の形成の際にミスマッチ塩基対を形成し、ｎは１または０である（すなわち、配列番号６および７）］を含む。
【００４８】
別の好ましいリクルート部分は、配列５’−ＧＵＧＧＮｃＡＵＡＮａＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＵｇｃｕａａＡＵＧＵＵＧＵＵＡＵＡＮｂＵＡＵＮｄＣＣＡＣ−３’（配列番号２５）（式中、Ｎａ、Ｎｂ、Ｎｃ、およびＮｄそれぞれは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵであってもよく、但し、ＮａおよびＮｂは、ミスマッチ塩基対を形成し、ＮｃおよびＮｄは、ステムループ形成の際にミスマッチ塩基対を形成し、それにより、ｇｃｕａａペンタヌクレオチドは、ループを形成し、ｇｃｕａａに隣接する上流および下流配列は、塩基対形成によりステムを形成する）を含むか、またはからなる。
【００４９】
リクルート部分は、１個もしくは複数のヌクレオチド、オリゴペプチド、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような、別の化学リンカーを含むリンカー「Ｌ」を適宜介して、５’または３’末端においてターゲティング部分に結合してもよい。
【００５０】
オリゴヌクレオチドコンストラクトの化学的修飾
本発明により従い容易に使用することができる様々な化学および修飾は、オリゴヌクレオチドの分野において公知である。ヌクレオチド間の通常のヌクレオシド間結合を、ホスホジエステル結合のモノ−またはジ−チオエート化（thioation）により変更して、それぞれ、ホスホロチオエートエステルまたはホスホロジチオアートエステルを生じてもよい。アミド化、およびペプチドリンカーを含む、ヌクレオシド間の結合の他の修飾が可能である。リボース糖は、低級アルキル（Ｃ１−４、例えば、２’−Ｏ−Ｍｅ）、アルケニル（Ｃ２−４）、アルキニル（Ｃ２−４）、メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、または他の置換基での２’−Ｏ部分の置換により、修飾されてもよい。２’ＯＨ基の好ましい置換基は、メチル、メトキシエチル、または３，３’−ジメチルアリル基である。後者は、そのかさばりに起因して、ヌクレアーゼ感受性を阻害し、一方、ハイブリダイゼーションの効率を改善するその特性について知られている（Angus & Sproat FEBS 1993 Vol. 325、no. 1, 2, 123-7）。あるいは、リボース環内部の２’−４’分子内架橋（通常、２’酸素と４’炭素の間のメチレン架橋）結合を含む、固定された核酸配列（ＬＮＡ）が適用されてもよい。例えば、複素環式環のアミノ化もしくは脱アミノ化により、プリン核酸塩基、および／またはピリミジン核酸塩基を修飾して、それらの特性が変更されてもよい。正確な化学およびフォーマットは、オリゴヌクレオチドコンストラクト間、および適用間で依存してもよく、当業者の希望および優先に従い成し遂げられてもよい。
【００５１】
長さ
本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、２０〜数百個のヌクレオチドを含んでもよい。製造可能性およびコストのような実質的な理由のため、オリゴヌクレオチドコンストラクトは、好ましくは、２００個より少ないヌクレオチドであるべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドコンストラクトは、２０〜１００個のヌクレオチド長であり、より好ましくは、２４〜６０個のヌクレオチド長であり、なおより好ましくは、３０〜５０個のヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドコンストラクトのターゲティング部分は、１０個より多くのヌクレオチドを含み、好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６個より多くのヌクレオチドを含み、なおより好ましくは、１７個より多くのヌクレオチドを好ましくは含む。ターゲティング部分が長いほど、編集されるべきＲＮＡ配列の標的部位についてのより高い特異性、より少ない、意図したものでない（オフターゲット）結合に起因するオフターゲット効果、ならびにターゲティング部分自体内のステム−ループ構造のような、二次構造、ミスマッチ、あるいはゆらぎ−塩基（編集されるべき部位において、もしくは近くの標的化ＲＮＡ配列中の相補的塩基の１個または複数を有するミスマッチに起因する）を創造するより多くの機会などをもたらす。好ましいターゲティング部分は、編集されるべきミスマッチに向かい合うヌクレオチド、および適宜、１個または２個のゆらぎ塩基を除き、ターゲティング部分の全体の長さに渡り、標的ＲＮＡ配列に相補的である。
【００５２】
立体構造
ｈＡＤＡＲのような、ＲＮＡ編集実体は、多数の要因に依存して変動する特異性をもってｄｓＲＮＡ構造を編集することは、当該技術分野において公知である。１つの重要な要因は、ｄｓＲＮＡ配列を形成する２つの鎖の相補性の程度である。２つの鎖の完璧な相補性は、通常、ｈＡＤＡＲの触媒ドメインに、それが出会う任意のアデノシンと多かれ少なかれ反応させ無差別にアデノシンからアミノ基を取り除かせる。編集されるべきミスマッチに向かい合ったアデノシンを含むターゲティング部分を用意することでｄｓＲＮＡにおいてミスマッチが生じることを確かにすることにより、特定のアデノシンのみを変換するようにｈＡＤＡＲ１の特異性を増大させることができる。ミスマッチは、編集されるべきアデノシンに向かい合ったシチジンまたはウリジン、最も好ましくは、シチジンを有するターゲティング部分を用意することにより、好ましくは創造される。標的鎖中のアデノシンの脱アミノ化の際、標的鎖に、ほとんどの生化学的プロセスで細胞の生化学的機構によりＧとして「読み取られる」イノシンが生じるだろう。故に、ＡからＩへの変換後、Ｉは、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトのターゲティング部分中の向かい合ったＣと塩基対形成する完璧な能力があるので、ミスマッチは解消された。編集に起因して、ミスマッチが解消された後、基質が放出され、オリゴヌクレオチドコンストラクト−編集実体複合体が、標的ＲＮＡ配列から放出され、それは、次に、スプライシングおよび翻訳のような、下流の生化学的プロセスに利用可能となる。
【００５３】
標的ＲＮＡ配列を編集する特異性の所望のレベルは、適用間で依存し得る。本特許出願における指示に従い、当業者は、彼らのニーズに従い、オリゴヌクレオチドコンストラクトのターゲティング部分を設計する能力があり、いくらかの試行錯誤で、所望の結果を得るだろう。
【００５４】
本発明のオリゴヌクレオチドコンストラクトのターゲティング部分は、通常、通常のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、およびＣを含むだろうが、例えば、１個または複数のＧヌクレオチドの代わりに、イノシン（Ｉ）も含んでよい。ステムまたはループ中のＩが、これが所望可能であるそれらの実施態様において、Ｚ−ＤＮＡまたはＺ−ＲＮＡ立体構造の形成と干渉しないというケアが取られなければならないが、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトのリクルート部分において、Ｇはまた、Ｉにより置き換えられてもよい。
【００５５】
編集特異性
オリゴヌクレオチドコンストラクトとの重なりの領域における標的ＲＮＡ配列中のアデノシンの望ましくない編集を防ぐために、オリゴヌクレオチドコンストラクトのターゲティング部分を、化学的に修飾してもよい。標的ＲＮＡ配列中のアデノシンに向かい合ったヌクレオシドのリボシル−部分の２’−Ｏ−メチル化が、ＡＤＡＲによるそのアデノシンの脱アミノ化を劇的に低減することが、当該技術分野において示されている（Vogel et al. 2014 Angewandte Chemie Int. Ed. 53, 6267-71）。故に、オリゴヌクレオチドコンストラクトの所望の位置に２’−メトキシ（２’−ＯＭｅ）ヌクレオチドを含むことにより、編集の特異性が、劇的に改善されてもよい。２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）および２’−Ｏ−ジメチルアリル基のような、リボシル部分の他の２’−Ｏ置換が、標的ＲＮＡ配列中の対応する（向かい合った）アデノシンの望まない編集も低減し得ることが予想される。他の化学修飾は、オリゴヌクレオチド合成および設計の当業者にとって容易に入手可能である。かかる化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドコンストラクトの合成、およびそれを本発明による方法において試験することは、不当な負担をもたらさず、他の修飾は、本発明により包含される。
【００５６】
編集実体
編集実体は、通常、哺乳類を含む、後生動物において見出されるＡＤＡＲ酵素など、本質的にタンパク質性であろう。編集実体はまた、リボヌクレオタンパク質のような、核酸とタンパク質またはペプチドの複合体も含んでよい。編集酵素は、リボザイムのような、核酸のみを含むか、またはからなってもよい。全てのかかる編集実体は、それらが、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトによりリクルートされる限り、本発明により包含される。好ましくは、編集実体は、酵素であり、より好ましくは、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼであり、なおより好ましくは、アデノシンデアミナーゼである。編集実体がアデノシンデアミナーゼであるとき、Ｙは、好ましくは、シチジンまたはウリジンであり、最も好ましくは、シチジンである。最も目的のものは、ｈＡＤＡＲ１  ｐ１１０およびｐ１５０のような、その任意のアイソフォームを含む、ヒトＡＤＡＲ、ｈＡＤＡＲ１、ならびにｈＡＤＡＲ２である。
【００５７】
本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトが好都合に設計されてもよい、当該技術分野において公知のＲＮＡ編集酵素は、ヒトまたはヒト細胞において、ｈＡＤＡＲ１およびｈＡＤＡＲ２のような、ＲＮＡ上で作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、ならびにシチジンデアミナーゼを含む。ヒトＡＤＡＲ３（ｈＡＤＡＲ３）は、先行技術において記載されているが、デアミナーゼ活性はないと報告されている。
【００５８】
ｈＡＤＡＲ１が、２つのアイソフォーム；共通のプレ−ｍＲＮＡから選択的スプライシングを通じて産生される、長さ１５０ｋＤａのインターフェロンにより誘導可能なバージョン、およびより短い、１００ｋＤａのバージョンに存在することが知られている。興味深いことに、より長いアイソフォームのみが、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトのリクルート部分に含まれ得るＺ−ＤＮＡ構造に結合する能力がある。結果として、細胞に存在する１５０ｋＤａのアイソフォームのレベルは、インターフェロン、特に、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）により、影響され得る。ｈＡＤＡＲ１はまた、ＴＮＦ−アルファにより誘導可能である。これは、併用療法を開発する機会を提供し、それにより、インターフェロン−ガンマまたはＴＮＦ−アルファ、およびＺ−ＤＮＡを本発明によるリクルート部分として含むオリゴヌクレオチドコンストラクトが、組み合わせた製品または別々の製品のいずれかとして、同時または連続のいずれかで、任意の順で患者に投与される。ある種の疾患状態は、患者のある種の組織においてＩＦＮ−ガンマまたはＴＮＦ−アルファレベルの上昇と既に一致することがあり、これにより、編集を疾患組織により特異的にする機会が創出される。
【００５９】
両方のターゲティング部分およびリクルート部分は、ヌクレアーゼ抵抗性を変更し、結合の親和性（融点として表される）または他の特性を変更する化学修飾を有するヌクレオチドを含むか、またはからなってもよい。化学修飾の例は、上で特定された長さを有する、糖（リボース）部分内の架橋結合している置換基（例えば、ＬＮＡ、または固定した核酸などで）によるもの、２’−Ｏ原子のアルキル基での置換（例えば、２’−Ｏ−メチル）、アルキニル基での置換（２’−Ｏ−アルキニル）、アルケニル基での置換（２’−Ｏ−アルケニル）、アルコキシアルキル基での置換（例えば、メトキシエチル、２’−ＭＯＥ）によるものを含む、糖部分の修飾である。加えて、骨格のホスホジエステル基を、チオエート化、ジチオエート化、アミド化などにより修飾して、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミダートなどのヌクレオシド間結合を生じてもよい。ヌクレオチド間結合を、ペプチド性結合により、完全または一部置き換えて、ペプチド核酸配列などとしてもよい。あるいは、または加えて、核酸塩基を、（脱）アミノ化により修飾して、イノシン、または２’６’−ジアミノプリンなどを生じてもよい。
【００６０】
さらなる修飾は、ＣｐＧ配列と関連することが知られている可能性のある免疫原性を低減するために、ヌクレオチドのシチジン部分におけるＣ５のメチル化であってもよい。
【００６１】
本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトの構成は、「片足」ヘアピン（図１および２）から「両足」ヘアピン（図３）まで変動してもよく、それにより、足は、ターゲティング部分または複数の部分を含み、ヘアピンの主要部または中心は、リクルート部分となる（図１〜３）。オリゴヌクレオチドコンストラクトの足または複数の足は、標的ＲＮＡにおける、編集部位の向かい合う部位、例えば、編集されるべきアデノシンまたはシチジンを表すミスマッチまたはゆらぎ核酸塩基をもたらすだろう。例えば、オリゴヌクレオチドコンストラクトがＡＤＡＲ活性をリクルートして、標的ＲＮＡにおけるＡからＩへの変換を編集する場合において、ミスマッチまたはゆらぎは、アデノシン、グアニン、ウリジン、またはシチジン残基、好ましくは、シチジン残基を含んでもよい。ゆらぎまたはミスマッチ塩基のような限定された数の不完全なマッチは、オリゴヌクレオチドコンストラクトと標的ＲＮＡ配列の間の結合の特異性および／もしくは強度を受け入れがたい程度に損なうことがなければ許されてもよいが、ターゲティング部分は、編集部位に向かい合ったミスマッチまたはゆらぎ以外は、通常、標的ＲＮＡに完璧に相補的だろう。ヘアピンのステムは、その長さの全体に渡り２本鎖ＲＮＡ構造を形成する、ヌクレオチドの完璧に相補的な区間からなってもよい。あるいは、編集活性によるオリゴヌクレオチドコンストラクトの認識が、受け入れがたい程度に損なわれない限り、ヘアピンのステムは、１個もしくは複数のゆらぎまたはミスマッチに向かい合うヌクレオチドを含んでもよい。その天然の編集部位での細胞における編集活性の機能は、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトによる編集活性に関与する実体のリクルートメントの結果として低減し得ることは理解されるべきである。細胞内部の編集実体が、他の標的部位に再指向化される程度は、編集実体の認識ドメインについての本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトのリクルート部分の親和性を変動させることにより制御され得ることは、当業者により理解されるだろう。これは、ステムの配列、ループのサイズもしくは構造（配列、骨格の化学、リボシル、または核酸塩基）、または両方の組合せを変えることによるものを含む方法のいずれか１つまたは組合せを通じて、編集実体に対する、オリゴヌクレオチドコンストラクトのリクルート部分の親和性を低減することにより、行われてもよい。正確な修飾は、ある程度の試行錯誤を通じて、および／またはオリゴヌクレオチドコンストラクトのリクルート部分と編集実体の認識ドメインとの間の構造的相互作用に基づくコンピューターによる方法を通じて、決定されてもよい。
【００６２】
加えて、または代わりに、細胞において常在性の編集実体をリクルートし、再指向化する程度は、オリゴヌクレオチドコンストラクトの投薬および投与計画により制御されてもよい。これは、実験者（インビトロ）、または通常、第Ｉ相および／または第ＩＩ相の臨床試験において臨床医により決定されるものである。
【００６３】
好ましくは、本発明は、核酸配列を編集するためターゲティング部分およびリクルート部分の両方を含む、単一のオリゴヌクレオチド（図１、図２Ａ、図３）からなるオリゴヌクレオチドコンストラクトの使用を提供する。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチド（図２Ｂ）、例えば、ターゲティング部分を含む１つのオリゴヌクレオチド、およびリクルート部分を含む１つのオリゴヌクレオチドの使用を含むオリゴヌクレオチドコンストラクトは、確実に、本発明の範囲内である。故に、別の実施態様によると、本発明は、２つの別々のオリゴヌクレオチド、ターゲティング部分を含む１つのオリゴヌクレオチド、およびリクルート部分を含むもう１つのオリゴヌクレオチドを提供し、２つのオリゴヌクレオチドは、例えば、これら２つの機能的部分の間の、または特異的なターゲティングまたはリクルート機能を有しない配列、例えば、リンカー配列のアンチセンスワトソン−クリック塩基対形成により互いに対する親和性を有するような方法で設計される。かかる２つの成分のシステムは、柔軟性、適合性（例えば、個人用医薬の枠の中で）、製造可能性、良好なコストなどの点で利点を有し得る。複数成分のシステムに従った２個（またはそれ以上）のオリゴヌクレオチドは、必ずしも、異なる機能（ターゲティングおよびリクルート）を厳密に分け持たなければならないわけではない。例えば、オリゴヌクレオチドは、複合体に集合した後のみ、ターゲティングおよびリクルート機能を生じてもよい。２個のオリゴヌクレオチドがアニールし、ｄｓＲＮＡ部分を形成する場合、それらは実際、アニーリングの際にリクルート機能を生じ得る。アニーリングは、複合体を形成する１つの方法であるが、２つ（またはそれ以上）のオリゴヌクレオチド成分が一緒に登場し、それにより、ターゲティング機能とリクルート機能を併合する、他の方法が存在することは明らかだろう。１個のコンストラクト当たりのオリゴヌクレオチドの数が多いほど、製造、分析、製剤、投与、または物流およびコストを含む、取り扱いの他の態様の点でシステムをより複雑にするが、２個より多くのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドコンストラクトは、本発明の範囲から除外されない。
【００６４】
哺乳類細胞
本発明は、真核生物、好ましくは、後生動物、より好ましくは、哺乳類細胞における標的ＲＮＡ配列の修飾に関する。原理上、本発明は、任意の哺乳類種由来の細胞と共に使用することができるが、ヒト細胞と共に好ましくは使用される。
【００６５】
本発明は、任意の器官、例えば、皮膚、肺、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、腸、筋肉、腺、眼、脳、血液など由来の細胞と共に使用することができる。本発明は、（ヒト）対象の疾患状態に関係する細胞、組織、または器官において配列を修飾するのに特に適当である。かかる細胞は、肺または胃腸管の上皮細胞、生殖器官の細胞、筋肉細胞、眼の細胞、皮膚の細胞、肝臓、腎臓、膵臓、免疫細胞、癌性細胞、腺細胞、脳細胞などのような組織および器官由来の細胞を含むが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明はまた、生物において天然に存在しない哺乳類細胞と共に、例えば、細胞株と共に、または胚性幹（ＥＳ）細胞と共に使用することもできる。
【００６７】
本発明は、多能性幹細胞、全能性幹細胞、胚性幹細胞、誘導された多能性幹細胞などを含む、種々のタイプの幹細胞と共に使用することができる。
【００６８】
細胞は、インビトロまたはインビボで存在することができる。本発明の１つの利点は、それを、生きている生物においてインサイチュの細胞と共に使用することができるが、それを、培養中の細胞と共に使用することもできることである。いくつかの実施態様において、細胞は、エクスビボで処置され、次に、生きている生物に導入される（例えば、それらが本来もたらされた生物に再導入される）。
【００６９】
本発明を使用して、いわゆるオルガノイド内の細胞において標的ＲＮＡ配列を編集することもできる。オルガノイドは、３次元のインビトロでもたらされた組織と考えることができるが、個々の、単離された組織を創造するための特異的な条件を使用してもたらされる（例えば、Lancaster & Knoblich, Science 2014, vol. 345 no. 6194 1247125を参照）。治療上の設定において、それらを、患者の細胞からインビトロでもたらすことができ、次に、オルガノイドを、通常の移植片ほどには拒絶される可能性が高くない自家材料として患者に再導入することができるので、それらは有用である。したがって、別の好ましい実施態様によると、本発明は、患者から採取した組織試料から増殖させたオルガノイド上で実施され（例えば、彼らの胃腸管から；Sala et al. J Surg Res. 2009; 156(2):205-12、およびまたSato et al. Gastroenterology 2011;141:1762-72を参照）、本発明に従ったＲＮＡ編集の際、オルガノイド、またはオルガノイド内に存在する幹細胞を使用して、患者に移植し戻して、器官機能を改善してもよい。
【００７０】
処理されるべき細胞は、一般に、遺伝子変異を有するだろう。変異は、ヘテロ接合性またはホモ接合性であってよい。本発明を典型的に使用して、ＮからＡへの変異（ここで、Ｎは、Ｇ、Ｃ、Ｕ（ＤＮＡレベルにおいてＴ）であってもよい）、好ましくは、ＧからＡへの変異、またはＮからＣへの変異（ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｕ（ＤＮＡレベルにおいてＴ）であってもよい）、好ましくは、ＵからＣへの変異のような、点変異が修飾されるだろう。特定の目的の変異を含有する遺伝子が、以下で考察される。しかしながら、いくつかの実施態様において、本発明は、問題の疾患についての有用な研究ツールを提供するために、疾患に関連する変異を細胞株または動物に導入することによる、逆の方法で使用される。疾患モデルを創造する例として、本発明者らは、先天性小児盲目の最も一般的な形態である、レーバー先天黒内障の形態の基礎を形成する潜在性のスプライス部位を創出する、ＣＥＰ２９０遺伝子における変異を創出するために、ヒト細胞において編集活性のリクルートメントをもたらすオリゴヌクレオチド配列を提供した。
【００７１】
ＲＮＡ編集を通じて復帰されるべき変異は、染色体、もしくはミトコンドリアＤＮＡのようないくつかの他の形態のＤＮＡ、またはプレ−ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、もしくはミトコンドリアＲＮＡを含むＲＮＡのレベルで生じてもよい。もたらされるべき変化は、細胞または対象に感染させた、真菌、酵母、寄生虫、キネトプラスト類、細菌、ファージ、ウイルスなどを含む、病原体の標的ＲＮＡ内のものであってもよい。続いて、編集は、かかる細胞、対象、または病原体内部の標的配列上でＲＮＡレベルにて生じてもよい。ウイルスのような、ある種の病原体は、それらの核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡを感染した宿主の細胞（細胞）に放出する。他の病原体は、感染した宿主において常在するか、または循環する。編集が生じるべき細胞が、それに投与されるオリゴヌクレオチドコンストラクトと適合可能な編集実体を含有する限り、本発明のオリゴヌクレオチドコンストラクトを使用して、感染した真核生物宿主の細胞において常在する標的ＲＮＡ配列を編集することも、または真核生物宿主において常在もしくは循環する病原体の細胞内部のＲＮＡ配列を編集することもできる。
【００７２】
理論に縛られることを望むものではないが、ｈＡＤＡＲ１およびｈＡＤＡＲ２を通じたＲＮＡ編集は、転写またはスプライシング中に、核内のプレ−ｍＲＮＡ上で生じると考えられる。シチジンデアミナーゼによるＲＮＡ編集は、ｍＲＮＡレベルで生じると考えられる。ミトコンドリアＲＮＡコドン、または成熟ｍＲＮＡ中の非コード配列の編集は、除外されない。
【００７３】
標的配列およびその変化
本発明を使用して、編集反応をもたらすために、細胞において常在性のＲＮＡ編集実体を編集し、リクルートすべき部位をターゲティングする能力があるオリゴヌクレオチドコンストラクトの使用を通じて、真核生物細胞における標的ＲＮＡ配列を変化させる。好ましい編集反応は、それぞれ、アデノシンをイノシンに、およびシチジンをウリジンに変換する、アデノシン脱アミノ化、およびシチジン脱アミノ化である。変化は、標的ＲＮＡの５’または３’非翻訳領域内、（潜在性）スプライス部位内、エクソン内（標的ＲＮＡから翻訳されたタンパク質中のアミノ酸を変化させる、またはエクソンのスプライシングサイレンサーあるいはエンハンサーを変化させることでコドン利用、もしくはスプライシング挙動を変化させる、開始もしくは終止コドンを導入するか、もしくは取り除くことによる）、イントロン内（イントロンのスプライシングサイレンサーもしくはイントロンのスプライシングエンハンサー、分岐点を変更することにより、スプライシングを変化させる）、および一般に、ＲＮＡ安定性、構造、または機能に作用する任意の領域内であってもよい。標的ＲＮＡ配列は、（トランジションもしくはトランスバージョン）のような、修正または変更することを望む可能性がある変異を含んでいてもよい。あるいは、以前は変異が存在しなかった場合には標的ＲＮＡ配列に計画的に変異導入して、変更された表現型（またはＲＮＡウイルスのような、ＲＮＡベースの生物の場合において、遺伝子型）を創出する。例えば、疾患を研究するため、疾患に対して実験化合物を試験するためなどのアッセイにおいて、または（動物、オルガノイドなど）モデルシステムとして使用され得る、標的ＲＮＡ配列中に変化（変異）を有する細胞株または動物を作製してもよい。本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトおよび方法は、例えば、化合物スクリーニング、タンパク質操作などを含むさらなる実験のために非常に様々なタンパク質アイソフォームをコードする非常に様々な標的ＲＮＡを含む細胞バンクを作るため、高処理スクリーニングシステム（アレイフォーマットにおける）において使用されてもよい。
【００７４】
標的ＲＮＡは、任意の細胞またはウイルスＲＮＡ配列であってもよいが、より通常には、タンパク質コード機能を有するプレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡである。
【００７５】
純粋に参照しやすくするため、かつ本発明を制限する意図なく、以下の表は、本発明のオリゴヌクレオチドにより指定されるアデノシンデアミナーゼ編集によりもたらすことができる可能性のあるコドン変化を説明するために、提供される。表は、特に、任意のＲＮＡ中のコード配列に対する本発明の適用性の制限として解釈されるべきではなく、既に指摘された通り、本発明は、いずれかの、コード領域、イントロン、非コードエクソン（例えば、５’−または３’非翻訳領域）内、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ内などの、アデノシンを含む任意のＲＮＡ標的に対して実施することができる。適用性の幅広さについての誤解を回避するために、コード化の点で重要でない（「サイレント」）変化は、ある種のタンパク質の遺伝子発現を依然変更させ得る。同じアミノ酸に対するいくつかのコドンが、他のコドンより好まれることがあり、例えば、転写安定性または翻訳効率がもたらされ、コードされるタンパク質が、変化がなかった場合よりも存在量が多く、または少なくなることがあるからである。
【００７６】
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【００７７】
本発明によるオリゴヌクレオチドを使用した編集のための特に興味深い標的アデノシンは、触媒部位、他のタンパク質のための結合部位、基質による結合、局在化ドメイン、グリコシル化、ヒドロキシル化、ミリストイル化、タンパク質分解酵素によるタンパク質切断（タンパク質を成熟させるため、および／もしくは細胞内経路の一部として）などのような、翻訳時修飾または翻訳後修飾のような、鍵となる機能または特徴を規定するアミノ酸残基についてのコドンの一部であるものである。
【００７８】
遺伝性疾患の宿主は、ＧからＡへの変異により引き起こされ、変異導入された標的アデノシンでのアデノシン脱アミノ化は変異を野生型へと復帰させるので、これらは好ましい標的疾患である。しかしながら、野生型への復帰は、有益な効果を得るのに常に必須ではないこともある。標的におけるＡからＧへの修飾はまた、野生型ヌクレオチドがＧ以外である場合にも有益であり得る。ある種の状況においてはその通りであると予想されてもよく、他の状況においては、これは、いくらかの試験を必要とし得る。ある種の状況において、野生型がＧではない場合の標的ＲＮＡ中のＡからＧへの修飾は、サイレントであるか（異なるアミノ酸に翻訳されない）、もしくはそうでなければ重大な帰結をもたらさない（例えば、アミノ酸は置換されるが、それは、タンパク質構造および機能を破壊しない保存的置換を構成する）か、またはアミノ酸は、変化についてある種の頑強性を有する機能ドメインの一部である可能性がある。本発明に従った編集によりもたらされたＡからＧへのトランジションが、非コードＲＮＡ、またはＲＮＡの非コードの一部にあるなら、結果はまた、重要でないか、または本来の変異ほど重度でない。当業者は、本発明の適用性が非常に幅広く、疾患の予防または処置に限定されないことさえ理解するだろう。たとえ、または特に修飾が、例えば細胞もしくは非ヒト動物モデルにおいて疾患状態を誘導する場合、その効果を研究するために本発明を使用して転写物にそのような修飾を施してもよい。
【００７９】
本発明によるオリゴヌクレオチドで予防し、および／または処置することができる遺伝性疾患の好ましい例は、標的ＲＮＡ中の１個もしくは複数のアデノシンの修飾が、（可能性のある）有益な変化をもたらす、任意の疾患である。
【００８０】
特定の目的の変異を含有する、本発明による可能性のある標的ＲＮＡ配列である、転写されたＲＮＡ配列は、ＣＦＴＲ遺伝子から転写されたもの（嚢胞性線維症膜貫通型透過性調節因子）、ジストロフィン、ハンチンチン、ニューロフィブロミン１、ニューロフィブロミン２、ヘモグロビンのβ−グロビン鎖、ＣＥＰ２９０（中心体タンパク質２９０ｋＤａ）、β−ヘキソサミニダーゼＡのヘキサ遺伝子、およびアッシャー症候群と呼ばれる遺伝的盲目の形態に関与するアッシャー遺伝子のいずれか１つ（例えば、アッシャリン（Usherin）をコードするＵＳＨ２Ｂ）を含むが、これらに限定されない。より広範なリストが、以下でさらに提示される。標的配列が適切に選択され、オリゴヌクレオチドコンストラクトは、変異を修正するために所望の修飾を含むだろう。
【００８１】
ＣＦ変異の当業者は、Ｒ１１７Ｈ、Ｇ５４２Ｘ、Ｇ５５１Ｄ、Ｒ５５３Ｘ、Ｗ１２８２Ｘ、およびＮ１３０３Ｋを含む、１０００〜２０００種の変異が、ＣＦＴＲ遺伝子において公知であることを認識している。
【００８２】
一般的に、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトを使用して、どのような標的ＲＮＡ中にあっても復帰させることができる変異は、アデノシンデアミナーゼリクルートメントの場合において、ＧからＡへの変異であり、シチジンデアミナーゼリクルートメントの場合において、ＵからＣへの変異であり、そのようにオリゴヌクレオチドコンストラクトを設計することができる。本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトを使用して、標的化され得る変異はまた、アデノシンデアミナーゼをリクルートする場合において、ＣからＡ、ＵからＡ（ＤＮＡレベルにおいて、ＴからＡ）、ならびにシチジンデアミナーゼをリクルートする場合において、ＡからＣ、およびＧからＣへの変異も含む。後者の状況でのＲＮＡ編集は、必ずしも変異から野生型への復帰をもたらさないが、編集されたヌクレオチドが、本来の変異に対する改善を生ずることもある。例えば、翻訳の際、トランケートされたタンパク質を生じる、インフレームの終止コドンを引き起こす変異は、その位置で本来のアミノ酸でなくてもよいが、少なくともいくらかの機能性、トランケートされたタンパク質を少なくとも上回る機能性を有する（全長）タンパク質を生じるアミノ酸をコードするコドンに変えられてもよい。
【００８３】
標的配列は、真核生物、好ましくは、哺乳類、より好ましくは、ヒト細胞に内在性である。したがって、標的配列は、例えば、細胞の経歴においてあるポイントで人工的に導入された導入遺伝子またはマーカー遺伝子ではないが、むしろ、細胞において天然に存在する遺伝子である（変異または非変異形態のいずれか）。
【００８４】
本発明は、それが、代わりに、本発明によるオリゴヌクレオチドを適用することにより、野生型配列を変異導入された配列に変化させるのに有用であり得るので、変異の修正に制限されない。野生型アデノシンを修飾するのに有利であり得る一例は、例えば、たまたま、前記エクソンのスプライシングに要求される分岐部位にあるアデノシンの修飾によってエクソンのスキッピングをもたらすことである。別の例は、アデノシンが、タンパク質結合のための認識配列を規定するか、もしくはその一部である場合、またはｍＲＮＡの安定性を定義する二次構造において含まれる場合である。それ故、上で述べられた通り、本発明は、既存の変異より有害でない新規変異を導入するなどのための疾患についての研究ツールを提供するために使用することができる。
【００８５】
オリゴヌクレオチドコンストラクトの適用
投与されるべきオリゴヌクレオチドコンストラクトの量、投薬量、および投薬計画は、細胞タイプの間、処置されるべき疾患、標的集団、投与の経路（例えば、全身対局所）、疾患の重症度、副作用の許容可能なレベルで変動することができるが、これらは、試行錯誤により、インビトロ研究中、前臨床および臨床試験において評価することができ、かつそうすべきである。修飾された配列が、容易に検出される表現型変化を導くとき、試験は特に簡単である。より高い用量のオリゴヌクレオチドは、細胞内で核酸編集実体（例えば、ＡＤＡＲ）への結合について競合することにより、ＲＮＡ編集において自由に生じる実体の量を激減させる可能性があるが、日常的な投薬試験が、所定のオリゴヌクレオチド、および所定の標的に対する任意のかかる効果を明らかにするだろう。
【００８６】
１つの適当な試験技術は、オリゴヌクレオチドコンストラクトを細胞株、または試験生物にデリバリーし、次に、その後様々な時間ポイントにて生検試料を採取することを含む。標的ＲＮＡの配列は、生検試料において評価することができ、修飾を有する細胞の集団を容易にフォローすることができる。この試験を一旦行ったら、この知見を維持しておき、生検試料を採取することを必要とせずに、さらなるデリバリーを行うことができる。
【００８７】
したがって、本発明の方法は、細胞の標的ＲＮＡ配列における所望の変化の存在を同定し、それにより、標的ＲＮＡ配列が修飾されたことを検証する工程を含むことができる。この工程は、典型的には、上で考察された通り、標的ＲＮＡ、またはそのｃＤＮＡコピー（もしくは標的ＲＮＡがプレ−ｍＲＮＡである場合において、そのスプライシング産物のｃＤＮＡコピー）の相当する一部の配列決定を含み、これにより、配列変化を容易に検証することができる。あるいは、変化は、タンパク質のレベルで（長さ、グリコシル化、機能など）、または標的ＲＮＡ配列によりコードされるタンパク質が、例えば、イオンチャンネルであるとき、（誘導可能な）流れのような、いくつかの機能的読み取りにより、評価されてもよい。ＣＦＴＲ機能の場合において、機能の回復または取得を評価するための、ヒトを含む、哺乳類におけるウッシングチャンバーアッセイまたはＮＰＤ試験が、当業者に周知である。
【００８８】
ＲＮＡ編集が細胞において生じた後、修飾されたＲＮＡは、例えば、細胞分裂、編集されたＲＮＡの半減期の制限などに起因して、経時的に希釈され得る。したがって、実際の治療期間では、本発明の方法は、患者に物的な恩恵をもたらし、および／または経時的に恩恵を維持するのに十分な標的ＲＮＡが修飾されるまで、オリゴヌクレオチドコンストラクトのデリバリーの繰り返しを含んでもよい。
【００８９】
オリゴヌクレオチドコンストラクトのデリバリー
本発明のオリゴヌクレオチドコンストラクトは、治療上の使用に特に適当であり、故に、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドコンストラクト、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。本発明のいくつかの実施態様において、薬学的に許容し得る担体は、単に食塩水溶液であることもできる。これは、特に、肺デリバリーのため、役立つには、等張または低張であることができる。
【００９０】
本発明はまた、本発明の医薬組成物を含む、デリバリー装置（例えば、シリンジ、吸入器、噴霧器）も提供する。
【００９１】
本発明はまた、本明細書において記載される、哺乳類、好ましくは、ヒト細胞において標的ＲＮＡ配列中の変化をもたらす方法における使用のための本発明のオリゴヌクレオチドコンストラクトも提供する。同様に、本発明は、本明細書において記載される、哺乳類、好ましくは、ヒト細胞において標的ＲＮＡ配列中の変化をもたらすための医薬の製造における本発明のオリゴヌクレオチドコンストラクトの使用を提供する。
【００９２】
治療法における使用のための製剤、投薬、および投与の経路
本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、１ｎｇ／ｍｌ〜１ｇ／ｍｌ、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲にある濃度にて、医薬的使用に適合可能な、添加剤、賦形剤、および他の成分を含んでもよい、水溶液、例えば、食塩水において、または懸濁液において適当に投与される。投薬量は、適当には、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、約１００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲にあってもよい。投与は、吸入による（例えば、噴霧器を通じて）、鼻腔内、経口、注射もしくは注入により、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内、気管内、腹膜内、直腸内、腫瘍への直接注射によるなどであってもよい。投与は、固体形態、粉末、ピルの形態、またはヒトにおける医薬的使用と適合可能な任意の他の形態であってもよい。
【００９３】
本発明は、嚢胞性線維症、白皮症、アルファ−１−アンチトリプシン欠損、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β−サラセミア、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、ジストロフィー型表皮水疱症、表皮水疱症（Epidermylosis bullosa）、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性大腸腺腫症、ポリープ症、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース−６−リン酸塩脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス（Hereditary Hematochromatosis）、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集反応症候群（Inherited polyagglutination syndrome）、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、ＩおよびＩＩ型筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、Ａ、ＢおよびＣ型ニーマン・ピック病、ＮＹ−ｅｓｏ１関連がん、パーキンソン病、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛機能不全（Primary Ciliary Disease）、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異のような、プロトロンビン変異関連障害、肺高血圧、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合型免疫不全症候群（Severe Combined Immune Deficiency Syndrome）（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、シュタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、様々な形態のがん（例えば、ＢＲＣＡ１および２関連乳がんならびに卵巣がん）などのような、遺伝性疾患の処置に特に適している。
【００９４】
いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドコンストラクトは、全身性にデリバリーすることができるが、標的配列の表現型が見られる細胞にオリゴヌクレオチドコンストラクトをデリバリーすることがより典型的である。例えば、ＣＦＴＲにおける変異は、肺上皮組織において主に見られる嚢胞性線維症を引き起こし、故に、ＣＦＴＲ標的配列で、オリゴヌクレオチドコンストラクトを肺に特異的かつ直接デリバリーすることが好ましい。これは、典型的には、噴霧器の使用を介した、例えば、粉末またはエアロゾルの吸入により、都合良く達成することができる。ＰＡＲＩ  ｅＦｌｏｗ（Ｒａｐｉｄ）またはＲｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓのｉ−ｎｅｂを含む、いわゆる、振動メッシュを使用する噴霧器が特に好ましい。本発明者らは、オリゴヌクレオチドコンストラクトの吸入使用が、オリゴヌクレオチドコンストラクトの全身性の分布、ならびにとりわけ、腸、肝臓、膵臓、腎臓、および唾液腺組織における細胞による取り込みを導くことができることを見出した。それ故に、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトの吸入デリバリーはまた、これらの細胞を効率的に標的とすることができ、ＣＦＴＲの場合において、遺伝子ターゲティングが、嚢胞性線維症とも関連する胃腸の症状の改善を導くことができることが予想されるべきである。他の標的配列について、疾患および／または標的器官に依存して、投与は、局所（例えば、皮膚上）、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、経口、眼性注射などであってもよい。
【００９５】
いくつかの疾患において、粘液層は、肺を介した医薬の吸入の低減を導く、厚さの増大を示す。１つのかかる疾患は、慢性気管支炎であり、別の例は、嚢胞性線維症である。Ｂｒｏｎｃｈｉｔｏｌの名称下で市販されている、ＤＮＡｓｅｓ、高張食塩水、またはマンニトールのような、様々な形態の粘液正常化剤が入手可能である。粘液正常化剤が、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトのような、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドコンストラクトと併用して使用されるとき、それらは、それらの医薬の有効性を増大させてもよい。したがって、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトの対象、好ましくは、ヒト対象への投与は、好ましくは、粘液正常化剤、好ましくは、本明細書において記載されるその粘液正常化剤と併用される。加えて、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトの投与は、増強剤化合物、例えば、Ｋａｌｙｄｅｃｏ（アイバカフトール；ＶＸ−７７０）、または修正剤化合物、例えば、ＶＸ−８０９（ルマカフトール）、および／もしくはＶＸ−６６１のような、ＣＦの処置のための小分子の投与と併用することができる。ＣＦにおける他の併用療法は、ＩＦＮ−ガンマまたはＴＮＦ−アルファを使用した、アデノシンデアミナーゼのインデューサーと併用した本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトの使用も含んでよい。
【００９６】
あるいは、または粘液正常化剤との併用において、粘液浸透性粒子またはナノ粒子におけるデリバリーを、ＲＮＡ編集分子の、例えば、肺および腸の上皮細胞への有効なデリバリーのため提供することができる。したがって、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトの対象、好ましくは、ヒト対象への投与は、好ましくは、粘液浸透性粒子またはナノ粒子におけるデリバリーを好ましくは使用する。
【００９７】
慢性および急性肺感染は、嚢胞性線維症のような疾患を有する患者においてしばしば存在する。抗生物質処置は、細菌感染、ならびに粘液肥厚化および／またはバイオフィルム形成のようなそれらの症状を低減する。本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトと併用した抗生物質の使用は、オリゴヌクレオチドコンストラクトのための標的細胞の容易なアクセスに起因して、ＲＮＡ編集の有効性を増大させることができた。したがって、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトの対象、好ましくは、ヒト対象への投与を、好ましくは、抗生物質処置と併用して、細菌感染、ならびに粘液肥厚化および／またはバイオフィルム形成のようなそれらの症状が低減される。抗生物質は、全身性もしくは局所性、または両方で投与することができる。
【００９８】
例えば、嚢胞性線維症患者における適用のため、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクト、または本発明によるパッケージ化され、もしくは複合化されたオリゴヌクレオチドコンストラクトは、ＤＮａｓｅ、マンニトール、高張食塩水のような、任意の粘液正常化剤、および／あるいは抗生物質、および／あるいは増強剤化合物、例えば、アイバカフトール、または修正剤化合物、例えば、ルマカフトールおよび／もしくはＶＸ−６６１のような、ＣＦの処置のための小分子と併用されてもよい。
【００９９】
標的細胞へのアクセスを増大させるために、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトの投与前に、Ｂｒｏｎｃｈｅｏ−Ａｌｖｅｏｌａｒ  Ｌａｖａｇｅ（ＢＡＬ）を適用して、肺を綺麗にすることができる。
【０１００】
本発明はまた、配列番号１〜３のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドコンストラクトも提供する。
【表５】
0006718872.tif 000006
【０１０１】
小文字＝Ｚ−ＤＮＡ構造を形成する傾向を有するＤＮＡ
下線を付した太字＝２’−Ｏ−メチル
イタリック体＝ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、および２’−Ｏ−メチル
Ｃ＊＝編集されるべき標的アデノシンに向かい合う塩基
【０１０２】
同様に、本発明はまた、配列番号１６〜２２（および、適宜、かかるヌクレオチド配列にいついて実施例１において記載される核修飾）のいずれか１つ、または配列番号２、３、２８、３８、３９、４０、および４１（および、適宜、かかるヌクレオチド配列について実施例２〜５において記載される核修飾）のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドコンストラクトも提供する。
【０１０３】
一般
用語「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウラシル」、およびヒポキサンチン（イノシンにおける核酸塩基）は、核酸塩基自体を指す。
【０１０４】
用語アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジン、およびイノシンは、（デスオキシ）リボシル糖に結合した核酸塩基を指す。
【０１０５】
用語「ヌクレオシド」は、（デオキシ）リボシル糖に結合した核酸塩基を指す。
【０１０６】
用語ヌクレオチドは、それぞれの核酸塩基−（デオキシ）リボシル−ホスホリンカー、ならびにリボース部分またはホスホ基の任意の化学修飾を指す。したがって、用語は、固定されたリボシル部分（２’−４’架橋を含み、メチレン基、または当該技術分野において周知の任意の他の基を含む）を含むヌクレオチド、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロ（ジ）チオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミダートリンカーなどを含むリンカーを含むヌクレオチドを含むだろう。
【０１０７】
ときに、用語アデノシンおよびアデニン、グアノシンおよびグアニン、シトシンおよびシチジン、ウラシルおよびウリジン、チミンおよびチミジン、イノシンおよびハイポ−キサンチンを、互換的に使用して、対応する核酸塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドを指す。
【０１０８】
ときに、用語核酸塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチドは、文脈が明確に、異なって要求しなければ、互換的に使用される。
【０１０９】
「オリゴヌクレオチド」に言及されるときはいつも、文脈がそうでないと示さなければ、オリゴリボヌクレオチドおよびデゾキシオリゴリボヌクレオチドの両方を意味する。オリゴリボヌクレオチドに言及されるときはいつも、それは、塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、またはＩを含み得る。デゾキシオリゴリボヌクレオチドに言及されるときはいつも、それは、塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＩを含み得る。
【０１１０】
オリゴヌクレオチドコンストラクトにおけるヌクレオチドに言及されるときはいつも、例えば、シトシン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、およびβ−Ｄ−グルコシル−５−ヒドロキシ−メチルシトシンが含まれ、アデニンに言及されるとき、Ｎ６−メチルアデニン、および７−メチルアデニンが含まれ、ウラシルに言及されるとき、ジヒドロウラシル、４−チオウラシル、および５−ヒドロキシメチルウラシルが含まれ、グアニンに言及されるとき、１−メチルグアニンが含まれる。
【０１１１】
ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、リボフラノース誘導体、例えば、２’−デゾキ、２’−ヒドロキシ、および２’−Ｏ−置換変異体、例えば、２’−Ｏ−メチル、ならびに２’−４’架橋結合変異体を含む他の修飾が含まれる。
【０１１２】
オリゴヌクレオチドに言及されるときはいつも、２個のモノ−ヌクレオチド間の結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロ（ジ）チオエート、メチルホスホネート、ホスホル−アミデートリンカーなどを含む、ホスホジエステル結合、ならびにその修飾であり得る。
【０１１３】
用語「含む」は、「含んでいる」、ならびに「からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、独占的にＸからなり得るか、または追加の何かを含み得る、例えば、Ｘ＋Ｙ。
【０１１４】
数値ｘと関連した用語「約」は、適宜であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１１５】
語句「実質的に」は、「完全に」を除外せず、例えば、「実質的に」Ｙを含まない組成物は、完全にＹを含まなくてもよい。関連する場合、語句「実質的に」は、本発明の定義から除かれてもよい。
【０１１６】
核酸配列と関連した用語「下流」は、３’方向にさらに配列に沿うことを意味し、用語「上流」は、逆を意味する。したがって、ポリペプチドをコードする任意の配列において、開始コドンは、センス鎖において終止コドンの上流であるが、アンチセンス鎖において終止コドンの下流である。
【０１１７】
「ハイブリダイゼーション」への言及は、典型的には、特異的ハイブリダイゼーションを指し、非特異的ハイブリダイゼーションを除外する。特異的ハイブリダイゼーションは、プローブと標的の間での安定な相互作用の大部分が、プローブと標的が少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％の配列同一性を有する場合に起きることが確実になるように、当該技術分野において周知の技術を使用して、選択された実験条件下で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】標的ＲＮＡ配列、および本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトの模式図；Ａ：オリゴヌクレオチドコンストラクトは、その３’末端においてターゲティング部分、およびその５’末端においてリクルート部分を有する、単一オリゴヌクレオチド「片足」コンストラクトとして設計される。Ｂ：オリゴヌクレオチドコンストラクトは、その５’末端においてターゲティング部分、およびその３’末端においてリクルート部分を有する、単一オリゴヌクレオチド「片足」コンストラクトとして設計され；編集実体は、認識ドメインを左側に、触媒ドメインを右側に描き、標的部位における脱アミノ化反応（閃光）を示す、灰色の構造として描かれる。
【図２】オリゴヌクレオチドコンストラクトを伴った標的ＲＮＡ構造の模式図：Ａは、ターゲティング部分とリクルート部分の間にリンカーを有するオリゴヌクレオチドコンストラクトを示す；Ｂは、オリゴヌクレオチドコンストラクトが、共有結合せずにそれぞれの３’セグメントによるワトソン−クリックのアンチセンス塩基対形成を通じて相互作用する２つのオリゴヌクレオチド配列を含む、実施態様を示す。
【図３】ターゲティング部分が、リクルート部分により隔てられた（または「スプリットされた」）、その「両足」フォーマットにおけるオリゴヌクレオチドコンストラクトを伴った、標的ＲＮＡ構造の模式図；Ａは、オリゴヌクレオチドコンストラクトのリクルート部分に対して、標的ＲＮＡ配列において上流の編集部位を示す；Ｂは、オリゴヌクレオチドコンストラクトのリクルート部分に対して、ターゲティングＲＮＡ配列において下流の編集部位を示す。
【図４】ｐＧＦＰｓｔｏｐ５７、および示されたオリゴヌクレオチドでのリポフェクタミントランスフェクション後のＨｅＬａ細胞において緑色蛍光を示すウェルの蛍光顕微鏡検査、但し、上部左パネルは無処理の細胞であり；下部の４つのパネルは、示された成分の少なくとも１つも与えられていない対照である。図４ａおよび４ｂは、コントラストのみが異なる。
【図５】２つのプラスミドの様々な割合において、ｐＧＦＰｓｔｏｐ５７、ｐＡＤＡＲ２、およびオリゴヌクレオチド１１番でのリポフェクタミントランスフェクション後のＨｅＬａ細胞において緑色蛍光を示すウェルの蛍光顕微鏡検査。上部左パネルは、無処理の細胞であり；下部のパネルは、ｐＧＦＰｓｔｏｐ５７よりむしろ無変異ＧＦＰをコードするプラスミドを有する細胞を示す。
【図６】無処理、またはｐＧＦＰｓｔｏｐ５７と共に５０ｎＭもしくは２００ｎＭオリゴヌクレオチド１１番を（または５００ｎＭ対照オリゴヌクレオチドでの）トランスフェクトした２４あるいは４８時間後のＨｅＬａ細胞において緑色蛍光を示すウェルの蛍光顕微鏡検査。
【図７】無処理（左ピーク）、またはトランスフェクションされた（右ピーク）ＨｅＬａ細胞のＦＡＣＳスペクトル。７Ａ〜７Ｆにおいて、細胞に、ｐＧＦＰｓｔｏｐ５７、およびオリゴヌクレオチド１１番をトランスフェクションした。７Ｂ〜７Ｆ（７Ａではない）において、細胞に、ｐＡＤＡＲ２もトランスフェクションした。７Ｇおよび７Ｈにおいて、無変異ＧＦＰを発現させた。
【発明を実施するための形態】
【０１１９】
図面において説明される全ての実施態様は、本明細書における発明の詳細な説明において説明される通り、組み合わされてもよい。
【実施例１】
【０１２０】
部位特異的なＡからＩへの編集によるＧＦＰ標的ＲＮＡ中のナンセンス変異の復帰
使用されるオリゴヌクレオチドコンストラクト：
【表６】
0006718872.tif 000007
（配列番号１）。ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２）を、１０％熱失活ウシ胎児血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において培養する。細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿空気の雰囲気にて維持する。細胞を、トランスフェクションの１日前に、それらが７０〜８０％の培養密度に達するとき、２４ウェルプレートに播種する。終止コドンＴＧＡのため無効にされたＧＦＰ活性を有するＧＦＰレポーターコンストラクトを使用した。プラスミドＤＮＡ１００〜２００ｎｇ、ならびにオリゴヌクレオチド（１０〜１００ｐｍｏｌ）コンストラクト５００ｎｇを、適量のＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびリポフェクタミン２０００試薬において混合し、細胞を、製造元の手法に従いトランスフェクションする。細胞を、３７℃でＣＯ２インキュベーターにおいてインキュベーションし、培地を４〜６時間後に置き換える。４８時間後、細胞を、蛍光顕微鏡下で分析し、ＧＦＰ発現を回復させるオリゴの効率を評価する。
【０１２１】
さらなる実験は、プラスミド（「ｐＧＦＰｓｔｏｐ５７」）から発現させた、ＧからＡへの点変異に起因した内部ＴＡＧ終止コドンを有する変異体ＧＦＰをやはり使用した。細胞がＲＮＡ編集を行うことができることを確かにするために、ＡＤＡＲ２をコードするプラスミドを細胞にさらにトランスフェクションした。ＧＦＰ変異に特異的なターゲティング部分、およびＧｌｕＲ−Ｂベースのリクルート部分の原理に基づき、変異体Ａ残基の脱アミノ化を介してＧＦＰ発現を回復させるため、様々なオリゴヌクレオチドを調製した。
【０１２２】
７種のＲＮＡオリゴヌクレオチドを試験し、これらは、ＧｌｕＲ−Ｂの短い、中程度の、長い形態（Ｓ／Ｍ／Ｌ；異なる長さのリクルート部分）を標的とした。加えて、これらは、ターゲティングおよびリクルート部分をいずれかの順で（上流／下流）有し、いくつかの場合において、オリゴは、化学的に修飾された領域を含んでいた（リクルート部分を、２’−ＯＭｅ糖およびホスホロチオエート結合を含むよう化学的に修飾し、変異体Ａ位置（２本の下線）およびその２個の隣接するヌクレオチドを除き、ターゲティング部分を同じ方法で修飾した）。全てのオリゴは、配列番号７（下線）を含み、ＧＦＰターゲティング部分は太字である。
【０１２３】
【表７】
0006718872.tif 000008
【０１２４】
ＨｅＬａ細胞を、１０％熱失活ウシ胎児血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地において培養する。細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿空気の雰囲気にて維持する。細胞８×１０４個を、トランスフェクションの１日前に、それらが７０〜８０％の培養密度に達するとき、２４ウェルプレートの１つのウェルに播種し、製造元の手法に従い、リポフェクタミン２０００を使用することにより、（ｉ）オリゴヌクレオチド＋ＧＦＰｓｔｏｐ５７プラスミド、または（ｉｉ）オリゴヌクレオチド＋ＧＦＰｓｔｏｐ５７＋ＡＤＡＲ２プラスミドを一過性にトランスフェクションする。トランスフェクションの２４時間後に、培地を新しくし、２４時間後に、ＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡下でチェックする。
【０１２５】
ＦＡＣＳ分析も行う。細胞をトリプシン処理し、エッペンドルフチューブに集め、次に、フローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁する。前方散乱および側方散乱を使用して、形態学的特性に基づき、デブリを排除しつつインタクトな細胞を選択する。インタクトな細胞のうち、ＧＦＰ平均蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値および平均値を計算する。レイアウトエディターを使用して、オーバーレイヒストグラムを作製する。
【０１２６】
ＡＤＡＲプラスミドなしでトランスフェクションした細胞についての結果を図４において示す。対照（細胞および／または培地成分の自己蛍光に起因する）において見られるレベルより上の緑色蛍光を、全ての７種のオリゴについて明確に視認できる。オリゴ１０番および１１番が、最良な結果（両方が長いＧｌｕＲ−Ｂリクルート部分を有する）を生じ、上流のリクルート部分（１１番）を有するオリゴの方がわずかにより良好であった。
【０１２７】
それ故、ＡＤＡＲ２をコードするプラスミドと組み合わせたさらなる研究のため、オリゴ１１番を選択した。図５は、オリゴ１１番で処理した細胞が、やはり陰性対照において見られるレベルを上回る蛍光を発することを示す。比較のため、無変異体ＧＦＰをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクションし、予想した蛍光を観察した（図５、下部のパネル）。
【０１２８】
５０〜１５００ｎＭの範囲にある、異なる濃度のオリゴ１１番を試験した。図６は、５０および２００ｎＭを使用した、２４または４８時間後の結果の例を、無処理の細胞（左）、および５００ｎＭの同じ長さを有する対照オリゴで試験した対照細胞と共に示す。オリゴ１１番は、蛍光の時間依存性の増大を示し、それは、対照オリゴでは観察されなかった。
【０１２９】
ＧＦＰ発現に対するオリゴヌクレオチドの効果もまた、ＦＡＣＳにより視認できた
（図７）。オリゴ１１番で、ＡＤＡＲ２プラスミドで（７Ｂ〜７Ｆ）またはＡＤＡＲ２プラスミドなしで（７Ａ）処理した細胞は、無処理の細胞（左側のピーク）と比較して、ＧＦＰ蛍光の増大を示した。無変異体ＧＦＰを陽性対照（７Ｇ〜７Ｈ）として使用した。
【実施例２】
【０１３０】
部位特異的なＡからＩへの編集によるＣＥＰ２９０標的ＲＮＡ中の潜在性スプライス部位の導入
使用されるオリゴヌクレオチドコンストラクト：
【表８】
0006718872.tif 000009
（配列番号２）。
【０１３１】
全ての細胞株は、皮膚生検から作製したヒト線維芽細胞である。ＦＢＬ１（ＣＬ１０−００００８）、およびＦＢＬ２（ＣＬ１２−０００２７）は、野生型であり、対照細胞株を表し、ＦＢＬ３（ＣＬ１２−０００３５）、およびＦＢＬ４（ＣＬ１２−０００３６）は、共に、ＣＥＰ２９０（ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ）における変異についてホモ接合性変異体である。全ての細胞株を、２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１％ピルビン酸ナトリウムを添加したＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて増殖させる。
【０１３２】
トランスフェクションの１日前、２．５ｍｌの総容量の培地において６ウェルプレート上２×１０５／ウェルの密度で細胞を播種する。トランスフェクションの日、試験すべきＡＯＮを、１００ｎＭの終濃度で、１：４のオリゴ：ＰＥＩの質量比で、ｍａｘＰＥＩ（Ｐｏｌｉｓｃｉｅｎｃｅ）をトランスフェクション剤として使用して、それぞれのウェルに加える。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞溶解液を集め、−８０℃において凍結する。
【０１３３】
Ｐｒｏｍｅｇａ  ｋｉｔ  ＲｅｌｉａＰｒｅｐ  ＲＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、−８０℃で維持していた細胞溶解液から、ＲＮＡを単離する。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００分光光度計を使用して、総ＲＮＡを定量する。
【０１３４】
製造元の指示に従い、Ｖｅｒｓｏ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した、ｃＤＮＡ合成のための鋳型として、ＲＮＡ４００ｎｇを使用する。
【０１３５】
この反応のため、ｃＤＮＡを２．５倍希釈し、これらの希釈したｃＤＮＡ２μｌを鋳型として使用する。標的配列の増幅は、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０  ＤＮＡポリメラーゼを使用する。使用するプライマーは、ｅｘ２６＿Ｆｗ（配列番号１０）、およびｅｘ２７＿Ｒｖ（配列番号１１）であり、ＰＣＲ条件は以下の通りである：９５℃において５分維持、９５℃において３０秒の変性、５８℃において３０秒のアニール、および７２℃において３５秒の伸長を３５サイクル、最後の伸長は７２℃において７分である。
【０１３６】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  １０００キットを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにおいて、ＰＣＲフラグメントを分析する。このキットは、フラグメントが電気泳動により通り抜けさせられるにしたがって、それらがそのサイズに基づき分離される、相互接続したマイクロチャンネルから構成されるチップを含有する。ＣＥＰ２９０ｍＲＮＡの発現のレベルを測定するために、野生型および変異体転写物を、それぞれ、９３ｂｐおよび１１７ｂｐのフラグメントとして増幅する。ヒトＰ０巨大リボソームタンパク質ｍＲＮＡ（ＲＰＬＰ０）を標準として使用する。使用するプライマーは、ｗｔ＿Ｆｗ（配列番号１２）、ｗｔ−Ｒｖ（配列番号１３）、ｍｔ＿Ｆｗ（配列番号１４）、およびｍｔ＿Ｒｖ（配列番号１５）である。この反応のため、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＳＹＢＲ  ｓｅｌｅｃｔ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘを、１０倍希釈したｃＤＮＡと共に、鋳型として使用した。ＰＣＲプログラムは、５０℃２分間、９５℃２分間、５０サイクルの９５℃１５秒間、６２．５℃１分間である。
【実施例３】
【０１３７】
部位特異的なＡからＩへの編集による変異体ＣＦＴＲ  Ｇ５５１Ｄ標的ＲＮＡ中のアミノ酸置換の復帰
使用されるオリゴヌクレオチドコンストラクト：
【表９】
0006718872.tif 000010
（配列番号３）。
【０１３８】
細胞株は、皮膚生検、および心臓心膜生検から作製した、ヒト線維芽細胞であり、それぞれ、ＧＭ００１４２、およびＧＭ０３４６５である（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）。それらは共に、ヘテロ接合性である：１つの対立遺伝子が、デルタＦ５０８欠損変異（Ｐｈｅ５０８Ｄｅｌ）を有し、第２の対立遺伝子が、ＣＦＴＲ遺伝子［Ｇｌｙ５５１Ａｓｐ（Ｇ５５１Ｄ）］におけるエクソン１１中のミスセンス変異をもたらす、ｇｌｙ−５５１コドン（ＧＧＴ）をａｓｐ（ＧＡＴ）に変換する、ヌクレオチド１７８４（１７８４Ｇ＞Ａ）におけるＧからＡへのトランジションを有する。全ての細胞株を、１５％非活性化ＦＢＳ、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した、アール塩、および非必須アミノ酸を含むイーグル最小必須培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において増殖させる。
【０１３９】
トランスフェクションの１日前に、２．５ｍｌの総容量の培地において６ウェルプレート上２×１０５／ウェルの密度で、細胞を播種する。トランスフェクションの日、試験すべきオリゴを、１００ｎＭの最終濃度で、１：４のオリゴ：ＰＥＩの質量比で、ｍａｘＰＥＩ（Ｐｏｌｉｓｃｉｅｎｃｅ）をトランスフェクション剤として使用して、それぞれのウェルに加える。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞溶解液を集め、−８０℃において凍結する。
【０１４０】
Ｐｒｏｍｅｇａ  ｋｉｔ  ＲｅｌｉａＰｒｅｐ  ＲＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、−８０℃で維持していた細胞溶解液から、ＲＮＡを単離する。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００分光光度計を使用して、総ＲＮＡを定量する。製造元の指示に従い、Ｖｅｒｓｏ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したｃＤＮＡ合成のための鋳型として、ＲＮＡ４００ｎｇを使用する。ｃＤＮＡ１μｌを、０．４μＭフォワードおよびリバースプライマー、２５μＭ各ｄＮＴＰ、１×ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０バッファー、３．１２５  ３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、およびＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０ポリメラーゼ１．０単位（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＰＣＲのまず対象にし、アセンブルした。使用するプライマーは、配列番号２６（フォワード）、および２７（リバース）である。ＰＣＲサイクルを、次のサイクル条件を使用して行った。９５℃において７分間の最初の変性工程、続いて、３０サイクルの９５℃において３０秒、５５℃において３０、および７２℃において４５秒。７２℃において７分の最後の伸長期間により、ＰＣＲ増幅を終えた。先のＰＣＲ１μｌを、３５  ０．４μＭフォワードプライマー、および試料ごとに固有のＭｉＳｅｑインデックスプライマー、２５μＭ各ｄＮＴＰ、１×ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０バッファー、３．１２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ならびにＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０ポリメラーゼ１．０単位を含有する、ネステッド−ＰＣＲプログラムにおいて使用した。ＰＣＲサイクルを、以下のサイクル条件を使用して行った：９５℃において７分間の最初の変性工程、続いて、２５サイクルの９５℃において３０秒、６０℃において３０秒、および７２℃において４５秒。７２℃において７分の最後の伸長期間により、反応を終えた。ＭｉＳｅｑ配列プライマー配列を含有するＰＣＲ産物をシークエンサーにロードする前に、精製したＰＣＲ産物の濃度を、製造元のプロトコールに従い、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０蛍光光度計（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して測定した。要約すれば、希釈標準溶液中の２種のストック標準の２０倍希釈を作製することにより、標準についての２つのアッセイチューブを作製した。それぞれの試料のため、希釈標準溶液２００μｌを１０本の別々のチューブにおいて調製し、ＰＣＲ産物１μｌをこの溶液に入れ、数秒間ボルテックスすることにより混合した。試料を２種の標準に対して測定し、ｎｇ／μｌでの濃度を、適切に計算した。合成による配列決定を使用して、迅速な高品質配列データを提供する、ＩｌｌｕｍｉｎａのＭｉＳｅｑ（商標）システムにおいて、ＰＣＲ産物の配列決定を行った。
【実施例４】
【０１４１】
Ａ１ＡＴ欠損の処置のための標的化ＡからＩへの編集によるα−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）転写物におけるアミノ酸置換変異の復帰
オリゴヌクレオチド（配列番号２８）：
ADAR45: rGrGrArArUrArGrUrArUrArArCrArArUrArUrgrcrurararArUrGrUrUrGrUrUrArUrArGrUrArUrCrCrCmC*mA*mG*mU*mCmCmCmUmUmUmCrUrCrGmUmCmGmAmUmGmG*mU*mC*mA*mG
ADAR47: mG*mG*mA*mA*mU*mA*mG*mU*mA*mU*mA*mA*mC*mA*mA*mU*mA*mU*mG*mC*mU*mA*mA*mA*mU*mG*mU*mU*mG*mU*mU*mA*mU*mA*mG*mU*mA*mU*mC*mC*mCmC*mA*mG*mU*mCmCmCmUmUmUmCrUrCrGmUmCmGmAmUmGmG*mU*mC*mA*mG
【０１４２】
ｒ＝修飾なし
ｍ＝２’Ｏ−Ｍｅ
＊＝ホスホロチオエート結合
【０１４３】
肝臓線維芽細胞のトランスフェクション
肝線維芽細胞はＣｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＧＭ１１４２３）から入手し、これは、コドン３４２［Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ（Ｅ３４２Ｋ）］におけるグルタミン酸をリジンに置換する、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子［９９８９Ｇ＞Ａ］のエクソン５中のヌクレオチド９９８９におけるＧ＞Ａトランジションから生じる、Ｚ対立遺伝子（ＺＺ）についてホモ接合性のドナー対象から単離されたものである。細胞を、ＥＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において維持し、１５％ＦＢＳを添加した。トランスフェクションの１日前に、２ｍｌの総容量の培地において６ウェルプレートに細胞を播種する。トランスフェクションの日に、オリゴヌクレオチドを、１．５ｍｌのマイクロチューブ中の１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に加え、ＭａｘＰｅｉ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合し、一緒にインキュベーションし、２０分間インキュベーションする。合間に、細胞培養液を細胞から取り除き、適当な量の、１５％ＦＢＳを含む新鮮ＥＭＥＭを加える。次に、ＤＮＡ／Ｏｌｉｇｏ−ＭａｘＰｅｉ希釈混合液を、静かに１滴ずつピペッティングしながら、細胞に加える。細胞を３７℃においてインキュベーションし、６〜２４時間後に、培地を新しくする。
【０１４４】
ＲＮＡ単離
製造元の手法に従い、Ｒｅｌｉａｐｒｅｐ  ＲＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＲＮＡ単離を行う。簡単に言うと、培養液を取り除き、細胞を冷ＰＢＳで洗浄する。６ウェルプレートの各ウェルに、溶解バッファー２５０μｌを加える。プレートを優しく振動させ、ウェル表面上を繰り返しピペッティングすることにより、細胞を完全に溶解する。推奨される通り、イソプロパノール８５μｌを溶解液に加え、溶解液をミニカラムに移し、１２，０００〜１４，０００ｇ（ＲＴ）において３０秒間遠心分離し、液体を廃棄する。ＲＮＡ洗浄溶液５００μｌを加え、１２，０００〜１４，０００ｇにおいて３０秒間再度遠心分離する。無菌のチューブにおいて、Ｙｅｌｌｏｗ  Ｃｏｒｅバッファーの試料２４μｌを合わせることにより、ＤＮａｓｅ  Ｉインキュベーションマスターミックスを調製し、０．０９Ｍ  ＭｎＣｌ２３μｌ、ＤＮＡｓｅ  Ｉ３μｌ、および新たに調製したＤＮａｓｅ  Ｉミックス３０μｌを、それぞれの試料のカラム中のメンブレンに加え、１５分間ＲＴにおいてインキュベーションする。次に、カラム洗浄溶液２００μｌを加え、１２，０００〜１４，０００ｇにおいて１５秒間遠心分離する。その後、ＲＮＡ洗浄溶液５００μｌを加え、１２，０００〜１４，０００ｇにおいて３０秒間遠心分離し、液体を廃棄する。ミニカラムを新たなコレクションチューブ内に置き、ＲＮＡ洗浄溶液３００μｌを加え、１４，０００ｇにおいて２分間遠心分離する。各ミニカラムを溶出チューブに置き、ヌクレアーゼを含まない水をメンブレンに加え、１分間遠心分離する。最後に、Ｎａｎｏｄｒｏｐ上で、ＲＮＡ濃度を測定する。
【０１４５】
ｃＤＮＡ合成
ＲＮＡインプット５００ｎｇまたは１０００ｎｇを用い、Ｖｅｒｓｏ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ｃＤＮＡ合成を行う。所望の量のＲＮＡを取り、水を加えることにより、それを１１μｌの総容量にすることにより、ＲＮＡミックスを調製する。ミックスを５分間、７０℃において過熱し、次に、冷却する。供給者により提供されるピペッティングスキームに従い、ｃＤＮＡミックスを調製する。ｃＤＮＡミックス９μｌを反応チューブに入れ、ＲＮＡミックス１１μｌを加え、サーマルサイクラーにおいて、４２℃において３０分間、および９５℃において２分間維持する。
【０１４６】
ＰＣＲ
ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ３６０  ＤＮＡポリメラーゼ１０００Ｕキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＰＣＲを行う。ｃＤＮＡ１μｌ、１０×バッファー２．５μｌ、ＭｇＣｌ２３μｌ、ｄＮＴＰｓ０．５μｌ、各プライマー１μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ０．５μｌを加えることにより、および水を２５μｌになるまで加えることにより、ＰＣＲマスターミックスを調製する。ＰＣＲプログラムは次の通りである；９５℃、５分間、９５℃、３０秒間、５５℃、３０秒間、７２℃、１分間、３５サイクル、および７２℃、７分間。ＰＣＲ後、ＤＮＡ  １０００キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）およびプログラムを使用して、試料をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒに掛ける。
【０１４７】
ＰＣＲ試料精製
ＰＣＲ産物の夾雑物の除去を確実にするために、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して、試料を精製する。ＰＣＲ試料１容量を、ＮＴ１  ２容量と混合し、試料を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ゲルにロードし、ＰＣＲクリーンアップカラムをコレクションチューブに入れ、３０秒間、１１０００×ｇにおいて遠心分離する。液体を廃棄し、カラムをコレクションチューブに戻す。バッファーＮＴ３  ７００μｌを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ゲルに加え、３０秒間、１１０００×ｇにおいて遠心分離する。洗浄工程を繰り返し、チューブを、１分間、１１０００×ｇにおいて遠心分離して、バッファーＮＴ３を取り除く。
【０１４８】
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ゲル、およびＰＣＲクリーンアップカラムを、新しい１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、バッファーＮＥ１５〜３０μｌを加え、１分間、室温においてインキュベーションし、次に、１分間、１１０００×ｇにおいて遠心分離する。Ｎａｎｏｄｒｏｐ法を使用することにより、ＤＮＡ濃度を測定する。
【０１４９】
制限酵素消化
ＰＣＲ精製後、ＳＥＲＰＩＮＡ１増幅産物を、Ｈｙｐ９９Ｉ制限消化の対象にする。酵素は、ＷＴにおけるＣＧＡＣＧ配列中の最後のＧを認識し、増幅産物を２つの小片に切断するが、２番目のＧが存在しないため、変異バージョンにおいてＣＧＡＣＡ配列を切断することができない。したがって、編集が十分であるなら、Ｈｙｐ９９Ｉ制限消化のための基質としていくらかのＷＴ  ＤＮＡが存在するだろう。Ｈｙｐ９９Ｉ（ＮＥＢ）１単位を使用して、ＤＮＡ０．１μｇを消化する。０．５μｇのＤＮＡインプットを用いる。ヌクレアーゼを含まない水において、試料を希釈し、１〜１．５時間、３７℃においてインキュベーションし、続いて、試料を６５℃において２０分間インキュベーションすることにより、酵素を不活化する。インキュベーション後、ＤＮＡ１０００キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）およびプログラムを使用して、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上に、試料をロードして、結果を視覚化する。
【０１５０】
Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ
カスタムＳＥＲＰＩＮＡ１  ＳＮＰジェノタイピングアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＳＮＰジェノタイピングアッセイを行う。アッセイが、編集の検出についてより高感度であることを調査するために、制限酵素消化アッセイと並行して、このアッセイを行う。ＷＴおよび変異体ＳＥＲＰＩＮＡ１に特異的なプローブは、結合した異なる蛍光基、それぞれ、ＶＩＣおよびＦＡＭを有する。故に、本発明者らは、ＷＴ／変異体転写物の量の増大または低減を定量することができる。マスターミックス５μｌ、およびプローブ−プライマー混合物０．５μｌを加えることにより、反応ミックスを調製する。使用されるオリゴの配列は、：ＷＴプローブ（配列番号２９）、変異プローブ（配列番号３０）、フォワードプライマー（配列番号３１）、およびリバースプライマー（配列番号３２）である。反応ミックス５．５μｌを、９６ウェルプレートの指定のウェルに加える。ｃＤＮＡ４．５μｌをそれぞれのウェルに加える。ＰＣＲプログラムを次の通り走らせる：９５℃、１０分間、９２℃、１５秒間、および６０℃、９０秒間、５０サイクル。ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒを使用して、結果を分析した。
【実施例５】
【０１５１】
パーキンソン病の処置のための標的化されたＡからＩへの編集によるＬＲＲＫ２転写物中のアミノ酸置換変異Ｇ２０１９Ｓの復帰
触媒Ｒｏｃ−ＣＯＲ、およびロイシンリッチリピートキナーゼ２遺伝子（ＬＲＲＫ２遺伝子番号：１２０８９２）のキナーゼドメインにおける変異は、家族性パーキンソン病（ＰＤ）の共通の原因である。本発明者らは、リクルート部分としての全長または短縮されたＧｌｕＲＢ部分に基づきＡＤＡＲ１および２をリクルートする能力があるＡＯＮを、位置Ｇ６０５５における（下線の変異導入されたＧを有する以下の配列を参照）エクソン４１中のＧからＡへの変異の周囲の配列に対する相補性を有するターゲティング部分に結合させ使用して、ＬＲＲＫ２プレ−ｍＲＮＡ転写物（転写物参照配列ＮＭ＿１９８５７８．３）におけるＧ２０１９Ｓ変異を標的化することに着手する。この変異はまた、一般的にＧ２０１９Ｓとして言及されるＧｅｎｂａｎｋ  ｄｂＳＮＰバリエーションｒｓ３４６３７５８４としても同定される。
【０１５２】
位置６０５５において強調したｗｔ  Ｇ残基を有するＬＲＲＫ２エクソン４１配列：
【表１０】
0006718872.tif 000011
（配列番号３３）
【０１５３】
変異体対立遺伝子および翻訳：
【表１１】
0006718872.tif 000012
配列番号３４
【表１２】
0006718872.tif 000013
配列番号３５
【０１５４】
正常な対立遺伝子および翻訳（ＡからＩへの編集後）：
【表１３】
0006718872.tif 000014
配列番号３６
【表１４】
0006718872.tif 000015
配列番号３７
【０１５５】
以下の配列は、ＬＲＲＫ２  Ｇ２０１９Ｓ変異を標的とするよう設計された。太字のヌクレオチドはターゲティング部分を形成する；下線を付したものを除き、全てのヌクレオチドは２’−ＯＭｅである；＊は、ＰＳ−結合を指定する。ＡＯＮは、ターゲティング部分の長さが変動し、２５（ＬＲＲＫ２−ＡＤＡＲ１およびＬＲＲＫ２−ＡＤＡＲ３）、または３０個のヌクレオチド（ＬＲＲＫ−ＡＤＡＲ２および４）のいずれかである。ＡＯＮは、リクルート部分の長さが変動する。つまり短縮されたＧｌｕＲＢリクルート部分（ＬＲＲＫ２−ＡＤＡＲ３および４）、ならびに全長ＧｌｕＲＢリクルート部分（ＬＲＲＫ２−ＡＤＡＲ１および２）である。
【０１５６】
【表１５】
0006718872.tif 000016
【０１５７】
ＲＮＡ配列決定、ＬＲＲＫ２（自己）リン酸化状態のウエスタンブロット分析、および確立したＬＲＲＫ２と関連するミトコンドリアの表現型（酸素消費速度およびミトコンドリアの膜電位）の機能的読み取りの手段を通じて、ＬＲＲＫ２Ｇ６０５５Ａ変異体線維芽細胞において、ＬＲＲＫ２の修正を評価する。Tatiana et al. (2012) Hum. Mol. Genet. 21 (19): 4201-4213; Smith et al. (2015) Molecular Neurobiology, 1-17;およびGruenewald et al. (2014) Antioxidants & Redox Signaling, 20(13), 1955-1960を参照のこと。
【０１５８】
ＬＲＲＫ２Ｇ６０５５Ａホモ接合性線維芽細胞株ｆｆｆ−０２８（Ｔｅｌｅｔｈｏｎ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｏｂａｎｋｓ）、ヘテロ接合性Ｇ６０５５Ａ株ＮＤ２９４９２、ＮＤ２９５４２、ＮＤ２９８０２、および健常対照株ＧＭ０２３０７４、ＧＭ０８４０２（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に、リポフェクタミン２０００を使用して、ＬＲＲＫ２−ＡＤＡＲ  ＡＯＮをトランスフェクションする。４８〜９６時間インキュベーション後、以下の分析を行う。
【０１５９】
１）ＡからＩに編集したＬＲＲＫ２転写物を検出するために、細胞を溶解し、標準的方法によりＲＮＡを単離し、配列番号４２および４３の以下の配列決定プライマーを使用して、半定量的ＲＮＡ配列決定分析の対象にする。ＡからＩに編集したｍＲＮＡ配列は、ＬＲＲＫ２−ＡＤＡＲ−ＡＯＮのトランスフェクション後に出現する。
【０１６０】
２）ＬＲＲＫ２Ｇ６０５５Ａタンパク質は、ＬＲＲＫ２ｗｔと比較して、キナーゼドメインの触媒活性が増大していることに起因して、ミトコンドリア膜脱分極剤バリノマイシン（１０μＭ、２４時間）によるストレス処理後、セリン９５５において増大した自己リン酸化を示すことが既に示されている（Smith et al., 2015）。ＬＲＲＫ２−ＡＤＡＲ−ＡＯＮでの処理は、バリノマイシンで処理したＬＲＲＫ２Ｇ６０５５Ａ細胞のセリン−９５５リン酸化を少なくとも部分的に、潜在的には、野生型レベルまで完全に低減する。これは、ＬＲＲＫ２ホスホ−Ｓ９５５（ＡｂｃａｍクローンＭＪＦ−Ｒ１１−（７５−１））、およびトータルＬＲＲＫ２（ＡｂｃａｍクローンＭＪＦＦ２（ｃ４１−２））抗体を使用した、ウエスタンブロット分析（Smith et al.）により、評価することができる。
【０１６１】
３）ＬＲＲＫ２Ｇ６０５５Ａ線維芽細胞は、ＬＲＲＫ２−ＡＤＡＲ−ＡＯＮトランスフェクション後に元に戻り得る増大したプロトンリーク（Smith et al., 2015; Gruenewald et al., 2014）を含む、ミトコンドリアの呼吸（ＯＸＰＨＯＳ）における変化を示す。Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４細胞外流動分析装置（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、固形状態のセンサープローブにより２秒の時間間隔で培養液中の溶解した酸素の濃度を測定する装置を使用して、基本および強制的呼吸条件下での酸素消費速度を評価する。この分析を、オリゴマイシン、カルボニルシアニジン−４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、ロテノン、およびアンチマイシン−Ａでの連続的処理により、基本呼吸、ＡＴＰ産生、プロトンリーク、および最大呼吸のような、代謝性パラメーターを決定することができる、ＸＦ  Ｘｅｌｌ  Ｍｉｔｏストレス試験キット（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と一緒に行うことができる。製造元の指示に従い、アッセイを行い、プロトンリークを、オリゴマイシン処理後の残存酸素消費として定義する。
【０１６２】
４）ＬＲＲＫ２Ｇ６０５５Ａ線維芽細胞は、対照細胞と比較して、ミトコンドリア膜電位の低減を示す（Smith et al., 2015; Gruenewald et al., 2014）。ミトコンドリア膜電位を、フェノールレッドを含まない培養液において２０分間ロードした、非クエンチングモード（０．５〜３０ｎＭ、実験的に決定する）で使用した、親油性カチオン性色素テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）で評価する。色素ロード後、定常状態のミトコンドリアのＴＭＲＭ蛍光を、生きた細胞の共焦点顕微鏡、および画像解析により測定する。ＬＲＲＫ２−ＡＤＡＲ−ＡＯＮトランスフェクションは、ミトコンドリア膜電位を、少なくとも部分的に、潜在的には、完全に対照レベルまで増大することができる。
【０１６３】
結論
上記した実施例は、本発明によるオリゴヌクレオチドコンストラクトを使用した、標的ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドの部位特異的編集により、標的ＲＮＡ配列において所望の変化をもたらす方法を示す。実施例は、ＧＦＰ発現コンストラクトのリーディングフレームを再度オープンにする（ｒｅｏｐｅｎ）ために終止コドンを取り除き、ＣＥＰ２９０をコードする標的ＲＮＡのスプライシングパターンを変化させるためのスプライス部位を創出する方法、および変異体Ｇ５５１Ｄ  ＣＦＴＲタンパク質をコードする標的ＲＮＡ配列中のコドンにおいて変化をもたらすことにより、所望のアミノ酸置換を確立する方法を教示する。成功したＲＮＡ編集を、例えば、ＧＦＰナンセンス変異からの復帰の場合は、蛍光細胞を観察することにより、ＣＥＰ２９０をコードするＲＮＡにおいて潜在性スプライス部位を導入する場合は野生型から変異体へのゲルにおけるＲＴ−ＰＲバンドのシフトを観察することにより、およびＣＦＴＲをコードするＲＮＡ中のＧ５５１Ｄ変異からの復帰の場合は配列決定により、または機能的アッセイ（例えば、ウッシングチャンバーアッセイ）を使用することによるなどでして、好都合なことには、確かめることができる。α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）およびＬＲＲＫ２における同様の研究も行うことができる。
【０１６４】
本発明は、例示のみの目的で上記され、本発明の範囲および精神内にとどまりながら、改変が成され得ることは、理解されるであろう。
【０１６５】
配列表
配列番号： 1 eGFPにおけるナンセンス変異を編集するDNA-RNAオリゴヌクレオチド構築物:
cgcgcgttttcgcgcgGCUGAACCACUGCAC
配列番号： 2 hCEP290におけるクリプトスプライス部位（cryptic splice site）を作製するDNA-RNAオリゴヌクレオチド構築物:
cgcgcgttttcgcgcgGAGAUACUCACAAUU
配列番号: 3 hCFTR１におけるG551D変異を編集するDNA-RNAオリゴヌクレオチド構築物:
cgcgcgttttcgcgcgCGUUGACCUCCACUC
配列番号: 4 G551D hCFTR変異（小文字）を示すhCFTR DNA (nはTまたはC):
【表１６】
0006718872.tif 000017
配列番号: 5 - 例示的なリクルート部分
CGCGCGTTTTCGCGCG
配列番号: 6 - 例示的なリクルート部分
AUANUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUANUAU
配列番号: 7 - 例示的なリクルート部分
UAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUA
配列番号: 8 - 一般的な標的化部分
NNNNNNNNNNNNNNNNNCNNN
配列番号: 9
GCAACUAGAGGUGAG
配列番号: 10
TGCTAAGTACAGGGACATCTTGC
配列番号: 11
AGACTCCACTTGTTCTTTTAAGGAG
配列番号: 12
TGACTGCTAAGTACAGGGACATCTTG
配列番号: 13
AGGAGATGTTTTCACACTCCAGGT
配列番号: 14
CTGGCCCCAGTTGTAATTTGTGA
配列番号: 15
CTGTTCCCAGGCTTGTTCAATAGT
配列番号: 16
GUGUUGGCCAUGGAACAUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUA
配列番号: 17
UAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUGUUGGCCAUGGAACA
配列番号: 18
GUGUUGGCCAUGGAACAUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUA
配列番号: 19
GUGUUGGCCAUGGAACAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAU
配列番号: 20
GGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCGUGUUGGCCAUGGAACA
配列番号: 21
GUGUUGGCCAUGGAACAGGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCC
配列番号: 22
GGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCGUGUUGGCCAUGGAACA
配列番号: 23
GGAAUANUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUANUAUCCC
配列番号: 24
GUGGAAUANUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUANUAUCCCAC
配列番号: 25
GUGGNAUANUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUANUAUNCCAC
配列番号: 26
GCCTGGCACCATTAAAGAAA
配列番号: 27
GCATCTTTGTATACTGCTCTTGCT
配列番号: 28
GGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCCAGUCCCUUUCUCGUCGAUGGUCAG
配列番号: 29
CCATCGACGAGAAAG
配列番号: 30
CATCGACAAGAAAG
配列番号: 31
TCCAGGCCGTGCATAAGG
配列番号: 32
GCCCCAGCAGCTTCAG
配列番号: 33
ATACCTCCACTCAGCCATGATTATATACCGAGACCTGAAACCCCACAATGTGCTGCTTTTCACACTGTATCCCAATGCTGCCATCATTGCAAAGATTGCTGACTACGGCATTGCTCAGTACTGCTGTAGAATGGGGATAAAAACATCAGAGGGCACACCAG
配列番号: 34
GCTGACTACAGCATTGCTCAG
配列番号: 35
ADYSIAQ
配列番号: 36
GCTGACTACGGCATTGCTCAG
配列番号: 37
ADYGIAQ
配列番号: 38
GUGGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCACACUGAGCAAUGCcGUAGUCAGCAAU
配列番号: 39
GUGGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCACGUACUGAGCAAUGCcGUAGUCAGCAAUCUU
配列番号: 40
GGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCACUGAGCAAUGCcGUAGUCAGCAAU
配列番号: 41
GGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCGUACUGAGCAAUGCcGUAGUCAGCAAUCUU
配列番号: 42
GTTTGAGATACCTCCACTCAGC
配列番号: 43
AGGTGCACGAAACCCTGGTG
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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