(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロにおける細胞集団であって、該細胞集団が哺乳類の神経細胞を含み、該神経細胞のうちの少なくとも約８０％がリム（ＬＩＭ）ホメオボックス転写因子１（Ｌｍｘ１）とフォークヘッドボックスＡ２（ＦｏｘＡ２）両方の発現に関して陽性であり、該細胞がトランスジェニック細胞であり、該トランスジェニック細胞が、パンニューラルプロモーターの制御下にスクリーニング可能なまたは選択可能なマーカーを含み、該パンニューラルプロモーターが、ＴｕＪ−１、Ｍａｐ−２、Ｄｃｘ、シナプシン（Ｓｙｎａｐｓｉｎ）、エノラーゼ（ｅｎｏｌａｓｅ）２、グリア線維酸性タンパク質、またはチューブリンアルファ−１Ａ鎖プロモーターである、細胞集団。
【請求項２】
少なくとも５００，０００個の細胞を含んでいる、請求項１に記載の集団。
【請求項３】
少なくとも１００万個の細胞を含んでいる、請求項２に記載の集団。
【請求項４】
神経細胞のうちの少なくとも約１０％がチロシン水酸化酵素（ＴＨ）の発現に関して陽性な、請求項１に記載の集団。
【請求項５】
神経細胞のうちの少なくとも約５０％がＴＨの発現に関して陽性な、請求項４に記載の集団。
【請求項６】
該パンニューラルプロモーターがＭａｐ−２プロモーターである、請求項１に記載の集団。
【請求項７】
該細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の集団。
【請求項８】
限定培地に入っている請求項１に記載の細胞集団を含む、組織培養システム。
【請求項９】
薬学的に許容可能な培地に入っている請求項１に記載の細胞集団を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１から７の何れか一項に記載の細胞集団を含む、ヒト疾患を治療するための治療法としての使用が表示された容器であって、該容器は、ヒト疾患の治療におけるニューロンの使用用途を記載した表示とともに供給される、上記の容器。
【請求項１１】
候補薬物のスクリーニング方法であって、
ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞の集団を準備すること；
ｂ）該集団と該候補薬物を接触させること；および
ｃ）該候補薬物が該細胞集団に及ぼす影響を決定すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年３月２１日に出願の米国仮特許出願番号第６１／９６８，８３８号の優先権を主張し、その内容全体は参照することにより本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
１．発明の背景
本発明は一般に、分子および細胞生物学の分野に関する。本発明は、より具体的には、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの幹細胞から、中脳ドーパミン作動性神経細胞を生産するための方法に関する。
２．関連技術の説明
【０００３】
多数の特殊化した細胞型に分化する能力を維持している細胞集団は、細胞系列特異的に分化した様々な細胞集団を作るのに有用である。このような細胞系列特異的に分化した細胞集団は、ある特定の細胞集団の機能喪失によって生じた疾患を患っている患者の細胞補充療法に使えると考えられている。直接的な治療上の利用価値に加えて、細胞系列特異的に分化した細胞は、機能の詳細を同定、確認、そして試験するためのインビトロスクリーニング検定、または細胞系列特異的疾患を治療するための治療用分子の送達試験などを含む様々な目的の研究ツールとしても有用である。
【０００４】
例えば、パーキンソン病は、中脳ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンが喪失した結果、疾患の症状が現れる。そのため、多能性細胞からＤＡ神経細胞を生産する方法に対するニーズがある。これは、そのような細胞が、治療においても、また疾患モデルにおいても、例えばパーキンソン病の新規治療薬を同定するためのモデルにおいても利用できるためである。しかしながら、ＤＡニューロンを分化させるための従来型の方法（例えば、ペリエら、２００４を参照のこと）によって生じる細胞集団はインビボでの生着性が低く、本物の中脳ＤＡニューロンとは一致しないマーカーを発現した。近年になって、スチューダーとその共同研究者らはこれらの課題に取り組み、インビボで効率的に生着可能な本物の中脳ＤＡ神経細胞を分化させることができるプロトコールを開発した（参照することにより本明細書に組み入れられ、スチューダーらに付与されたＰＣＴ出願、国際公開第２０１３／０６７３６２号を参照のこと）。本明細書で提供する方法および組成物は、より分化効率が高く、高純度の中脳ＤＡ細胞集団を提供するためにスチューダーらの方法に基づいて詳述される。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の態様は、多能性幹細胞の集団から中脳ＤＡ神経細胞を分化させるための改良法に関する。
【０００６】
従って、本発明の第一の態様は、濃縮された中脳ＤＡニューロンの集団を準備するための方法に関し、この方法は：神経細胞系列の細胞集団を準備するために、多能性細胞の細胞集団を分化させること；中脳ニューロンを含んでいる細胞集団を生成するためにこの神経細胞系列の細胞集団の細胞をさらに分化させること；および濃縮された中脳ＤＡニューロンの集団を得るために、パンニューラル（ｐａｎ−ｎｅｕｒａｌ）プロモーターによって発現しているマーカーを利用して前記細胞集団から細胞を精製すること、を含む。いくつかの側面においてこの態様の方法は、中脳ＤＡ細胞を分化させる工程において、細胞集団の中脳特殊化を高めるＭＥＫ阻害剤を使用することをさらに含む。その上さらに別の側面では、この態様の方法は、ＤＡ特異的マーカーを利用して精製することを含まない。
【０００７】
特定の側面では、この態様によるマーカーを利用して細胞を精製することは、パンニューラルプロモーターの制御下でスクリーニング可能なまたは選択可能なマーカーを発現する細胞を選抜することを含んでいる。従っていくつかの側面では、細胞を精製することは、パンニューラルプロモーターの制御下で選択可能なマーカーを発現する細胞を選抜することを含み、ここで選択可能なマーカーとは薬剤耐性マーカーであり、かつ、選抜することは、薬剤耐性マーカーを発現している細胞の薬剤選抜である。特定の側面では、パンニューラルプロモーターは、ＴｕＪ−１、Ｍａｐ−２、Ｄｃｘ、シナプシン（Ｓｙｎａｐｓｉｎ）、エノラーゼ（ｅｎｏｌａｓｅ）２、グリア線維酸性タンパク質、またはチューブリンアルファ−１Ａ鎖プロモーターの場合がある。さらなる側面では、スクリーニング可能なまたは選択可能なマーカーは、細胞のゲノムに組み込まれている。例えばマーカーは、ゲノムのＡＡＶＳ１部位に組み込まれていてもよい。別の側面においてスクリーニング可能なまたは選択可能なマーカーは、例えばエピソームベクターに保有されていて、染色体外に存在する場合もある。
【０００８】
その上さらに別の側面では、この態様によるマーカーを利用して細胞を精製することには、パンニューラル細胞系列から発現される表面マーカーを含んでいる細胞のアフィニティ精製の実施が含まれる。例えば、細胞の精製には、表面マーカーに対するリガンドまたは抗体を使用することができる。この態様に従って使用され得る様々な精製方法には、これらには限定されないが、カラム精製、固相表面、例えばビーズ（例えば、磁気ビーズ）への細胞の吸着、または蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）の利用が挙げられる。
【０００９】
特定の側面においてこの態様の方法は、（ａ）多能性細胞の集団を得ること；（ｂ）細胞の集団を、ＢＭＰ阻害剤；ＴＧＦβ阻害剤；ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル活性化剤；およびＷｎｔシグナル活性化剤を含んでいる培地中で培養すること；（ｃ）細胞集団を、ＢＭＰ阻害剤；ＳＨＨシグナル活性化剤；およびＷｎｔシグナル活性化剤を含んでいる培地を使った浮遊培養に移し、それによって、細胞凝集体を形成させること；（ｄ）細胞凝集体を解離させ、その後解離細胞をマトリクス培養に播種すること；（ｅ）細胞集団を、神経成熟因子を含んでいる成熟培地中でさらに分化させて、中脳ニューロンを含む細胞集団を生成すること；ならびに（ｆ）パンニューラル細胞系列のマーカーを利用して細胞を精製し、濃縮した中脳ＤＡニューロンの細胞集団を準備すること、を含む。
【００１０】
さらなる態様では、濃縮された中脳ＤＡニューロンの集団を準備するための方法を提供し、この方法は、中脳ニューロンを含んでいる細胞集団を得ること、およびパンニューラルプロモーターから発現されるマーカーを利用して細胞集団から細胞を精製して濃縮された中脳ＤＡニューロンの集団を準備すること、を含む。いくつかの側面において細胞は、パンニューラルプロモーター（例えば、ＭＡＰ２）の制御下にあるマーカー遺伝子を含んでいる発現カセットを含んでおり；細胞を精製することは、パンニューラルプロモーターの制御下でマーカー遺伝子を発現している細胞を選抜し、それによって濃縮された中脳ＤＡニューロンの集団を準備することを含む。
【００１１】
さらなる態様では、濃縮された中脳ＤＡニューロンの集団を準備するための方法を提供し、この方法は：多能性細胞の集団を得ること；この細胞を、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ０３２５９０１）を含み、必要に応じて外因的に加えられたＦＧＦ８ｂを含まない培地中で神経細胞系列の細胞集団に分化させること；および神経細胞系列の細胞集団の細胞をさらに分化させて濃縮された中脳ＤＡニューロンの集団を準備すること、を含む。この態様で使用することができるＭＥＫ阻害剤の非限定的な例としては、ＰＤ０３２５９０１、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ピマセルチブ（ＡＳ−７０３０２６）、ＭＥＫ１６２、コビメチニブ、ＰＤ１８４３５２、ＢＩＸ０２１８９、ＡＺＤ８３３０およびＰＤ９８０５９が挙げられる。例えばこの方法に、細胞を、約０．１〜１０μＭの範囲（例えば、約０．１〜５；０．５〜３または０．５〜１．５μＭの範囲）のＭＥＫ阻害剤、例えばＰＤ０３２５９０１、の存在下で培養することを含めてもよい。従って特定の側面では、細胞を分化させることは、多能性細胞の集団を、ＢＭＰ阻害剤；ＴＧＦβ阻害剤；ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル活性化剤；Ｗｎｔシグナル活性化剤、ＭＥＫ阻害剤もしくはこれらの組み合わせを含むが、外因的に加えられたＦＧＦ８ｂを含まない培地中で培養することを含む。その上さらに別の側面では、この態様の方法は、ＤＡ特異的マーカーを利用して細胞を精製することを含まない。いくつかの側面において多能性細胞は、前述したように、パンニューラルプロモーターの制御下にある第一のマーカー遺伝子を含んでいる第一の発現カセットを含む。
【００１２】
そのため、いくつかの側面においてこの態様の方法は、（ａ）多能性細胞の集団を得ること；（ｂ）ＢＭＰ阻害剤；ＴＧＦβ阻害剤；ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル活性化剤；Ｗｎｔシグナル活性化剤を含んでいる（そして必要に応じて外因的に加えられたＦＧＦ８ｂを含んでいない）培地中で細胞の集団を培養すること；（ｃ）細胞集団を、ＢＭＰ阻害剤；ＳＨＨシグナル活性化剤；Ｗｎｔシグナル活性化剤；ＭＥＫ阻害剤を含み；必要に応じて、外因的に加えられたＦＧＦ８ｂを含まない培地を使った浮遊培養に移し、それによって、細胞凝集体を形成させること；（ｄ）細胞凝集体を解離させ、その後解離細胞をマトリクス培養に播種すこと；および（ｅ）細胞集団をさらに分化させて濃縮された中脳ＤＡニューロンの集団を生成すること、を含む。
【００１３】
好ましい側面では、この態様に使用する多能性細胞は、霊長類細胞またはヒト細胞のような哺乳類細胞である。例えば、多能性細胞は、パーキンソン病（ＰＤ）である、パーキンソン病のリスクのある、またはパーキンソン病の症状を呈している患者に由来するものであってよい。特に好ましい側面では、細胞は、ＤＡニューロンを使った治療を受ける患者から採取した細胞から作成したｉＰＳ細胞またはｉＰＳ細胞バンクの細胞などの人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。
【００１４】
特定の側面では、中脳ＤＡ神経細胞の集団を得ることは、多能性細胞の集団を得ること、ここで前記細胞は、パンニューラルプロモーターの制御下にある第一のマーカー遺伝子を含んでいる第一の発現カセットを含んでいる；およびこの細胞を、中脳ＤＡニューロンを含んでいる細胞の集団に分化させること、を含む。いくつかの側面において細胞は、第二の発現カセットをさらに含むんでいてもよい。例えば、第二の発現カセットは、マーカー遺伝子、リプログラミング因子または分化を促進する遺伝子を含んでいてもよい。いくつかの側面では、第二の発現カセットは第二のマーカー遺伝子、例えばＰＧＫプロモーターの制御下にあるマーカー遺伝子を含む。第二の発現カセットは、細胞のゲノム中に組み込まれていても、または染色体外にあっても（例えばエピソームであっても）よい。さらなる側面では、多能性細胞の集団を得ることは、第二のマーカー遺伝子、例えばＰＧＫプロモーターの制御下にある遺伝子を発現している多能性細胞の集団を選抜することを含んでいてもよい。さらなる側面では、第二のマーカー遺伝子は薬剤選抜マーカーであってよく、および多能性細胞の集団を選抜することは、細胞を、薬剤存在下で培養することを含んでいてもよい。
【００１５】
いくつかの側面では、この態様の方法を、約２０〜２００日間の期間にわたって（例えば、約３０〜１５０、３０〜１２０もしくは３０〜１００日間、または約９０日間未満）実施してもよい。さらなる側面では、濃縮された中脳ＤＡニューロンの集団に含まれている細胞のうちの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が、中脳ニューロンマーカーまたは中脳ＤＡニューロンマーカーに陽性である。さらなる側面では、この態様の方法によって生産された濃縮された中脳ＤＡニューロンの集団は、少なくとも１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、または１×１０６個の中脳ＤＡニューロン細胞を含む。いくつかの側面においてこの態様の方法によって生産されたニューロンは、少なくとも、ニューロン、中脳ニューロンまたは中脳ＤＡニューロンの第一のマーカーに分類される。
【００１６】
さらなる側面においてこの態様の方法は、（ａ）多能性細胞の集団を得ること（例えば、パンニューラルプロモーターの制御下にあるマーカー遺伝子を含んでいる発現カセットを含んでいる細胞）；（ｂ）接着細胞の集団を、ＢＭＰ阻害剤；ＴＧＦβ阻害剤；ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル活性化剤；Ｗｎｔシグナル活性化剤を含んでいて；必要に応じてＭＥＫ阻害剤を含んでいる培地中で培養すること；（ｃ）接着細胞集団を、ＢＭＰ阻害剤；ＳＨＨシグナル活性化剤；ミオシンＩＩ阻害剤（例えば、ブレビスタチン）；およびＷｎｔシグナル活性化剤を含んでいる培地（例えば、レチノールおよびレチノイン酸の入っていない培地）を使った浮遊培養に移し、それによって、細胞凝集体を形成させること；（ｄ）細胞凝集体を解離させ、その後、解離細胞をマトリックス培養に播種すること；（ｅ）細胞を、神経成熟因子を含む成熟培地を使ったマトリックス培養で成熟させること；および、必要に応じて、（ｆ）細胞を、パンニューラル細胞系列のマーカーを利用して細胞集団から精製し、それによって濃縮された中脳ＤＡニューロンの集団を準備すること、を含む。
【００１７】
この態様の側面は、多能性細胞を、中脳ＤＡニューロンを含んでいる神経細胞の集団に分化させることに関し、ここで分化させることは、少なくとも第一のＢＭＰシグナル阻害剤を含んでいる培地中で行われる。ＢＭＰシグナル阻害剤の非限定的な例としては、ドルソモルフィン、ドミナントネガティブ型ＢＭＰ、切断型ＢＭＰ受容体、可溶性ＢＭＰ受容体、ＢＭＰ受容体−Ｆｃキメラ、ノギン、ＬＤＮ−１９３１８９、フォリスタチン、コーディン、グレムリン、ケルベロス／ＤＡＮファミリータンパク質、ベントロピン（ｖｅｎｔｒｏｐｉｎ）、高用量アクチビン（ｈｉｇｈ  ｄｏｓｅ  ａｃｔｉｖｉｎ）、およびアムニオンレス（ａｍｎｉｏｎｌｅｓｓ）が挙げられる。例えば特定の側面では、工程（ｂ）または（ｃ）のＢＭＰ阻害剤はＬＤＮ−１９３１８９またはノギンであってよい。例えば、細胞を、約１〜１，０００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９（例えば、約１０〜５００、５０〜５００、５０〜３００の範囲、または約２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９）を含んでいる培地中で培養することができる。本明細書では、ＢＭＰシグナル阻害剤を単に「ＢＭＰ阻害剤」と呼ぶこともある。
【００１８】
この態様のさらなる側面は、多能性細胞を、少なくとも第一のＴＧＦβシグナル阻害剤を含んでいる培地中で、中脳ＤＡニューロンを含んでいる神経細胞の集団に分化させることに関する。ＴＧＦβシグナル阻害剤の非限定的な例としては、Ａ−８３〜０１、ＧＷ６６０４、ＩＮ−１１３０、Κｉ２６８９４、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ３６４９４７（ＨＴＳ−４６６２８４）、ＬＹ５５０４１０、ＬＹ５７３６３６、ＬＹ５８０２７６、ＮＰＣ−３０３４５、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＤ−０９３、Ｓｍｌ６、ＳＭ３０５、ＳＸ−００７、Ａｎｔｐ−Ｓｍ２Ａ、およびＬＹ２１０９７６１が挙げられる。例えば、工程（ｂ）のＴＧＦβ阻害剤はＳＢ４３１５４２であってもよい。いくつかの側面では、細胞を、約０．１〜１００μＭのＳＢ４３１５４２（例えば、約１〜１００、１〜５０、５〜２０μＭの、または約１０μＭのＳＢ４３１５４２）を含んでいる培地中で培養する。本明細書では、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含むＴＧＦβシグナル阻害剤を単に「ＴＧＦβ阻害剤」と呼ぶこともある。
【００１９】
この態様のその上さらなる側面は、多能性細胞を、少なくとも第一のＳＨＨシグナル活性化剤を含んでいる培地中で、中脳ＤＡニューロンを含んでいる神経細胞の集団に分化させることに関する。ＳＨＨシグナル活性化剤は例えば、組換えＳＨＨポリペプチド（もしくはその一部）または低分子活性化剤の場合がある。特定の側面では、工程（ｂ）または（ｃ）のＳＨＨシグナル活性化剤は、Ｓｈｈ  Ｃ２５ＩＩ、パルモルファミンまたはパルモルファミン類似体（例えば、スムーズンド・アゴニスト（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  ａｇｏｎｉｓｔ）、例えば３−クロロ−Ｎ−［（１ｒ，４ｒ）−４−（メチルアミノ）シクロヘキシル］−Ｎ−［３−（ピリジン−４−イル）ベンジル］ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボキサミド）であってもよい。従って特定の側面では、この態様に使用するための培地は、約０．１〜５０μＭのパルモルファミン（例えば、約０．１〜２０、０．５〜１０、０．５〜５μＭの、または約２μＭのパルモルファミン）を含む。さらなる側面において培地は、約１〜１，０００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ  Ｃ２５ＩＩ（例えば、約１０〜１，０００、１０〜５００、５０〜５００ｎｇ／ｍｌの、または約１００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ  Ｃ２５ＩＩ）を含む。さらなる側面では、工程（ｂ）または（ｃ）のＳＨＨシグナル活性化剤は、Ｓｈｈ  Ｃ２５ＩＩおよびパルモルファミンであってもよい。例えば、約０．１〜５０μＭのパルモルファミンおよび約１〜１，０００のｎｇ／ｍｌのＳｈｈ  Ｃ２５ＩＩを含んでいる培地中で細胞を培養することができる。
【００２０】
この態様のその上さらなる側面は、多能性細胞を、少なくとも第一のＷｎｔシグナル活性化剤を含んでいる培地中で、中脳ＤＡニューロンを含んでいる神経細胞の集団に分化させることに関する。ＷＮＴシグナル活性化剤は例えば、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤の場合がある。ＧＳＫ３阻害剤の非限定的な例としては、ＮＰ０３１１１２、ＴＷＳ１１９、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＳＢ４１５２８６、ＬＹ２０９０３１４およびＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。特定の側面では、工程（ｂ）または（ｃ）のＷｎｔシグナル活性化剤はＣＨＩＲ９９０２１であってよい。従っていくつかの側面では、この態様に使用するための培地は、約０．１〜１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１（例えば、約０．１〜５、０．５〜５、０．５〜３μＭの、または約１．２５μＭのＣＨＩＲ９９０２１）を含む。
【００２１】
そのため特定の側面において工程（ｂ）は、Ｂ２７サプリメント、１〜１，０００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、０．１〜１００μＭのＳＢ４３１５４２、０．１〜５０μＭのパルモルファミン、１〜１，０００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ  Ｃ２５ＩＩ、および０．１〜１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使った接着培養系で、細胞を１〜６日間培養することを含み得る。一側面において培地は、Ｂ２７サプリメント、２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、１０μＭのＳＢ４３１５４２、２μＭのパルモルファミン、１００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ  Ｃ２５ＩＩ、および１．２５μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含む場合もある。いくつかの側面において工程（ｂ）は、工程（ｂ）の培養の１〜２日後にＭＥＫ阻害剤を培地に加えることを含む場合がある。特定の側面では、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１（例えば、約１μＭのＰＤ０３２５９０１）であってよい。いくつかの側面において工程（ｂ）は、工程（ｂ）の培養の１〜２日後に、外因的に加えられたレチノールまたはレチノイン酸を含まない培地中で細胞を培養することを含み得る。いくつかの側面では、このような培地は外因的に加えられたＦＧＦ８を含まない。
【００２２】
さらなる側面において工程（ｃ）は、細胞を浮遊培養に移す前に、細胞塊を個々の細胞に（単細胞に）解離させることを含む場合がある。例えば工程（ｃ）は、Ｂ２７サプリメント、１〜１，０００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９および０．１〜１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加してあり、外因的に加えられたレチノールまたはレチノイン酸を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２を含んでいる培地を使った浮遊培養系で、細胞を５〜２０日間培養することを含む場合がある。一側面において培地は、Ｂ２７サプリメント、約５０〜５００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、および約０．５〜３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含んでいてもよい。さらなる側面において工程（ｃ）は、５〜２０日間の浮遊培養のうちの一部の期間、細胞を、１〜１００μＭのブレビスタチン（例えば、１〜５０μＭまたは約１０μＭのブレビスタチン）を含んでいる培地中で培養することを含み得る。その上さらなる側面において工程（ｃ）は、５〜２０日間の浮遊培養のうちの一部の期間、細胞を、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ８ｂ）を含んでいる培地中で培養することを含む場合がある。その上さらに別の側面において工程（ｃ）は、５〜２０日間の浮遊培養のうちの一部の期間、細胞を、０．１〜１０μＭのパルモルファミンおよび１０〜１，０００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ  Ｃ２５ＩＩを含んでいる培地中で培養することを含む場合がある。いくつかの側面では、パルモルファミンを約２μＭの濃度で使用してもよく、Ｓｈｈ  Ｃ２５ＩＩを約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用してもよい。さらなる側面においてこのような培地は、外因的に加えられたＦＧＦ８を含まない。
【００２３】
その上さらに別の側面では、工程（ｄ）の解離させることは、細胞凝集体を単細胞に解離することを含んでいてもよい。いくつかの側面において工程（ｄ）のマトリックス培養は、ラミニン、エンタクチン、コラーゲンまたはそれらの混合物（例えば、マトリゲル（登録商標））などの細胞外マトリックスタンパク質を含んでいてもよい。さらなる側面では、工程（ｄ）のマトリックス培養に、ラミニン、ポリリジンおよび／またはポリ−Ｌ−オルニチンをマトリックス成分として含めても良い。
【００２４】
一層さらに別の側面において工程（ｅ）は、Ｂ２７サプリメント、Ｌ−グルタミン、１〜５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ（例えば、５〜５０、１０〜３０または約２０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ）、１〜５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ（例えば、５〜５０、１０〜３０または約２０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ）、０．１〜１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ（例えば、０．１〜５、０．５〜３または約１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ）、１〜１，０００μＭのアスコルビン酸（例えば、１０〜１，０００、５０〜５００または約２００μＭのアスコルビン酸）、１０〜２，０００μＭのビブチリル（ｂｉｂｕｔｙｒｙｌ）ｃＡＭＰ（例えば、１０〜１，０００、１００〜１，０００または約５００μＭのビブチリル（ｂｉｂｕｔｙｒｙｌ）ｃＡＭＰ）、および０．１〜２０μＭのＤＡＰＴ（例えば、０．１〜１０、１〜１０または約５μＭのＤＡＰＴ）を加えたニューロベーサル培地を含んでいる成熟培地中で、細胞を２〜３０日間成熟させることを含んでいてもよい。いくつかの側面において培地は、外因的に加えられたレチノールまたはレチノイン酸を含まない。従って一側面においてニューロベーサル培地は、Ｂ２７サプリメント、Ｌ−グルタミン、２０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ、２００μＭのアスコルビン酸、５００μＭのビブチリル（ｂｉｂｕｔｙｒｙｌ）ｃＡＭＰ、および５μＭのＤＡＰＴを含み得る。いくつかの側面において工程（ｅ）は、２〜３０日間の培養のうちの一部の期間、１〜５０μＭのブレビスタチン、例えば、約２．５μＭのブレビスタチンを含んでいる成熟培地中で、細胞を成熟させることを含んでいる場合がある。
【００２５】
この態様の特定の側面は、多能性幹細胞またはその前駆細胞を培養している間に形成された細胞凝集体に関する。いくつかの側面では、細胞凝集体の直径は、およそ、少なくとも、または最大でも５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００μｍの場合がある。この直径は、平均値であっても中央値であってもまたは平均した直径であってもよい。別の側面では、凝集体の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、８０％、９０％、９５％、または９９％（もしくはこの中に導き出される任意の範囲）は、少なくともまたは約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００個の細胞を、またはこの中に導き出される任意の範囲の個数の細胞を含み得る。特定の側面では、凝集体の実質的な部分（例えば、少なくとも約５０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはこの中に導き出される任意の範囲）の直径は、約８０〜２００μｍである。分化は、凝集体の大きさを変化させることによって操作することができる空間的な手がかりと様々な細胞型間の相互作用によって誘導されるため、凝集体の大きさが至適範囲内にあり、おおよそ均一であることで分化が促進され得る。
【００２６】
この態様による分化させることは、多能性幹細胞および／または前駆細胞を、接着培養または浮遊培養で培養することを含む。特定の態様では、分化させている間に細胞を接着培養に移してもよい。例えば、接着培養には非細胞性マトリックス成分が含まれていてもよい。好ましい態様では、浮遊培養中で多能性幹細胞を分化させて神経細胞を生産するためにこの方法を用いてもよい。多能性幹細胞またはその前駆細胞を、浮遊培養中でインキュベートすることもできる。さらなる態様では、多能性幹細胞の凝集体を浮遊培養中で形成させてもよい。浮遊培養の容量は、およそ、少なくとも、または最大で２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、５００ｍＬ、１リットル、３リットル、５リットル、１０リットル、２０リットル、２５リットル、３０、リットル、４０リットル、５０リットル、またはこの中に導き出される任意の範囲であってよく、例えばバイオリアクターに入れられている。いくつかの態様は、細胞を、標準的なシャーレまたは９６穴プレートよりも大きい容量中で培養することを含むため、いくつかの態様では、そのような容器の使用は除外される。
【００２７】
細胞凝集体の大きさと成長を最適化するために、浮遊培養を、少なくともまたは約５、１０、１５、２０、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００ｒｐｍ、またはこの中に導き出される任意の速度の範囲で動かしてもよい。動きの非限定的な例としては、撹拌、振とう、揺動または回転が挙げられ得る。
【００２８】
この態様による分化させることは、多能性幹細胞を解離させることから開始される場合も、解離させることを含まない場合もある。いくつかの側面において分化させることは、細胞を、本質的な単細胞培養に解離させることを含んでいてもよい。解離させることには、本質的な単細胞培養を生産することが可能な、現在知られているまたは今後開発される全ての方法の使用が包含される。例示的な態様では、細胞を、プロテアーゼによる処理または機械的な処理で、例えばピペット操作によって解離させることができる。プロテアーゼは例えば、コラゲナーゼ、トリプシン−ＥＤＴＡ、ディスパーゼ、またはそれらの組み合わせであってよい。その他に、細胞を解離させるためには、クエン酸ナトリウム、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡまたはそれらの組み合わせなどのキレート剤を使用することもできる。本質的な単細胞培養とは、成長することが望まれる細胞が、１個ずつそれぞれ解離しており、大部分の細胞が単一の細胞として、または２個の細胞が結合したままで（２個組の）含まれる細胞培養であってよい。培養されることが望まれる細胞のうちの５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％より多く、またはそれよりも多くの細胞が単一または二個組みであることが好ましい。
【００２９】
いくつかの側面では、マーカー遺伝子は薬剤選抜マーカーであってよく、工程（ｆ）は、薬剤を含んでいる成熟培地中で細胞を選抜することを含み得る。また、第一のマーカー遺伝子はスクリーニング可能なマーカーであってよく、工程（ｆ）はスクリーニング可能なマーカーの発現に基づいて細胞を選抜すること（例えば、ＦＡＣＳを使って）を含み得る。
【００３０】
さらなる態様では、インビトロにおける神経細胞の集団を提供し、ここで細胞の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が、フォークヘッドボックスＡ２（ＦｏｘＡ２；ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０６８５５６．２、参照することにより本明細書に組み入れられる）および／またはＬＩＭホメオボックス転写因子１（Ｌｍｘ１）（例えば、Ｌｍｘ１−アルファ（Ｌｍｘ１ａ；ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１１６７５４０．１、参照することにより本明細書に組み入れられる）の発現に関して陽性である。いくつかの側面では、集団に含まれる細胞の少なくとも約７５％または８０％が、Ｌｍｘ１およびＦｏｘＡ２両方の発現に関して陽性である。例えば、インサイツハイブリダイゼーション、免疫蛍光法（ＩＦ）またはフローサイトメトリーで測定したときに、細胞がＦｏｘＡ２および／またはＬｍｘ１に関して陽性である可能性がある。さらなる側面では、集団に含まれている細胞の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％が、チロシン水酸化酵素（ＴＨ；ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿９５４９８６．２、参照することにより本明細書に組み入れられる）の発現に関して陽性である。いくつかの側面では、この態様の細胞集団は、少なくとも約５０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、５００，０００、１００万または１５０万個の細胞（例えば、約５００，０００〜２００万の間の個数の細胞）を含む。特定の側面では、この態様の細胞集団はいかなる遺伝的修飾をも含まない（例えば、導入遺伝子が組み込まれていない）。さらなる側面において細胞集団は、本明細書で詳述しているように、パンニューラルプロモーターの制御下にあるスクリーニング可能なまたは選択可能なマーカーなどの導入遺伝子を含んでいる。その上さらに別の側面では、この態様の細胞集団は、組織培養システムまたは薬学上許容可能な培地中に含まれている。
【００３１】
その上さらに別の態様では、中脳ＤＡニューロン細胞または多能性幹細胞を含んでいる精製した細胞のインビトロ集団を提供し、前記細胞は、パンニューラルプロモーターの制御下にある第一のマーカー遺伝子を含んでいる第一の発現カセットを含んでいる。いくつかの側面では、この態様の細胞は、ヒト細胞などの哺乳類細胞であってよい。特定の側面では、この細胞は、パーキンソン病を患っている、パーキンソン病の症状の発症のリスクをもつ、またはパーキンソン病の症状を呈している患者に由来するものであってもよい。いくつかの側面では、精製した細胞の集団は中脳ＤＡニューロン細胞を含んでいる場合があり、ここでその細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより多くの細胞が、中脳ＤＡ細胞マーカーに関して陽性である。
【００３２】
一層さらに別の態様では、中脳ニューロン、ＤＡニューロン、中脳ＤＡニューロンまたはそれらの混合物を含んでいる細胞の集団を提供する。例えば、この態様の集団は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％の中脳ニューロンと、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％のＤＡニューロン（例えば、少なくとも５０％の中脳ニューロンと少なくとも５０％のＤＡニューロン）から構成されている可能性がある。いくつかの側面において細胞の集団は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のパーセンテージの中脳ＤＡニューロン（例えば、約９０％〜９８％または９５％〜９９％の中脳ＤＡニューロン）から構成される。その上さらに別の側面では、中脳ＤＡニューロンを含んでいる細胞の集団を提供し、ここでこの集団は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のパーセンテージの中脳ＤＡニューロン（例えば、約９０％〜９８％または９５％〜９９％の中脳ＤＡニューロン）から構成されている。いくつかの側面においてこの集団は、パンニューラルプロモーター（例えば、ＭＡＰ２プロモーター）の制御下にある第一のマーカー遺伝子を含んでいる第一の発現カセットを含んでいる中脳ＤＡニューロン細胞を含む。
【００３３】
一層さらに別の態様では、生きている中脳ニューロン、生きているＤＡニューロン、生きている中脳ＤＡニューロンまたはそれらの混合物を含み、安定な凍結溶液中に入っている細胞の集団を提供する。いくつかの側面では、安定な凍結溶液に入っている細胞の集団を構成している細胞のうちの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が、ＦｏｘＡ２および／またはＬｍｘ１の発現に関して陽性である。さらなる側面においてこの態様の集団は、１回凍結融解した後に、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％の生きている中脳ニューロンと、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％の生きているＤＡニューロン（例えば、少なくとも５０％生きている中脳ニューロンと少なくとも５０％生きているＤＡニューロン）から構成される可能性がある。いくつかのさらなる側面では、中脳ＤＡニューロンを含み、安定な凍結溶液中に入っている細胞の集団を提供し、ここでこの集団は、１回凍結融解した後に、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の生きている中脳ＤＡニューロンから構成される。いくつかの側面においてこの集団は、２，３または４回凍結融解を繰り返した後に、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の生きている中脳ＤＡニューロンから構成される。その上さらに別の側面では、この集団は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のパーセンテージの中脳ＤＡニューロン（例えば、約９０％〜９８％または９５％〜９９％の中脳ＤＡニューロン）から構成される。いくつかの側面においてこの集団は、パンニューラルプロモーター（例えば、ＭＡＰ２プロモーター）の制御下にある第一のマーカー遺伝子を含んでいる第一の発現カセットを含んでいる中脳ＤＡニューロン細胞を含む。この態様の安定な凍結溶液はいくつかの側面において、細胞培養用培地、プロテアーゼまたはプロテアーゼ混液、安定剤（例えば、ＤＭＳＯまたはグリセロール）、成長因子、緩衝剤、または細胞外マトリックス成分のうちの１つ以上を含む。さらなる側面では、安定な凍結溶液に含まれている中脳ＤＡニューロンの集団（例えば、凍結させた細胞集団）の入った密閉したバイアルを提供し、ここでこの集団は、１回凍結融解した後にも、生きている中脳ＤＡニューロンを少なくとも９０％含む。いくつかの側面においてこの態様のバイアルは、少なくとも１ｘ１０２、１ｘ１０３、１ｘ１０４、１ｘ１０５、または１ｘ１０６個の生きている中脳ＤＡニューロン細胞を含む。
【００３４】
従って一層さらに別の態様では、ヒト疾患を治療するための治療法としての使用が表示された容器を提供し、前記容器には、一定の用量のヒトドーパミン作動性ニューロンが入っており、このヒトドーパミン作動性ニューロンを構成しているニューロンのうち、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％を上回るニューロンがＦｏｘＡ２およびＬｍｘ１（例えば、Ｌｍｘ１ａ）の発現に関して陽性であり、容器は、このニューロンのヒト疾患の治療における使用目的を説明した表示と共に供給される。いくつかの側面では、この態様の容器は、ＦｏｘＡ２およびＬｍｘ１（例えば、Ｌｍｘ１ａ）の発現に関して陽性の、生きているニューロンを少なくとも１ｘ１０２、１ｘ１０３、１ｘ１０４、１ｘ１０５、１ｘ１０６または１ｘ１０７個（例えば、約１ｘ１０４〜１ｘ１０７の範囲の個数）含んでいる。その上さらに別の側面では、これらの細胞は安定な凍結溶液に入っているため、１回凍結融解した後にも、ニューロンのうちの少なくとも８０％、８５％または９０％が生きている。
【００３５】
その上さらに別の態様では、凍結した中脳ＤＡニューロン細胞の集団の生産方法を提供し、この方法は、（ａ）中脳ＤＡニューロン細胞の培養を得ること；（ｂ）細胞を分離すること（例えば、本質的に単一の細胞に）；（ｃ）細胞を安定な凍結溶液に再懸濁すること；および（ｄ）ＤＡニューロン細胞の集団を凍結させること、を含む。いくつかの側面では、細胞を分離することには、機械的な分離および／または細胞をプロテイナーゼもしくはプロテイナーゼ混液（例えば、アキュターゼ（登録商標））で処理することが含まれる。例えばプロテイナーゼで１０、２０、３０、４０、５０分またはそれ以上の時間、処理する場合がある。さらなる側面では、細胞を安定な凍結溶液に再懸濁することには、細胞培養用培地、プロテアーゼまたはプロテアーゼ混液、安定剤（例えば、ＤＭＳＯまたはグリセロール）、成長因子、緩衝剤、または細胞外マトリックス成分のうちの１種以上を含んでいる溶液に細胞を再懸濁することが含まれる。その上さらに別の側面では、細胞を凍結することには、細胞を冷却速度制御型冷凍庫中（ｒａｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｆｒｅｅｚｅｒ）で凍結することが含まれる。
【００３６】
さらなる側面では、パンニューラルプロモーター（例えば、ＭＡＰ２プロモーター）の制御下にあるマーカー遺伝子を含んでいる多能性幹細胞を含んでいる、精製した細胞の集団を提供する。一側面では、多能性幹細胞はｉＰＳ細胞であってもよい。
【００３７】
さらなる側面では、この態様の細胞集団は、パンニューラルプロモーターの制御下にある第一のマーカー遺伝子を含んでいる発現カセットを含み、ここでマーカー遺伝子は選択可能なマーカーでもよい。いくつかの側面では、第一の発現カセットは細胞のゲノム中に組み込まれててもよい。一側面においてこの第一の発現カセットは、ゲノムのＡＡＶＳ１部位に組み込まれていてもよい。いくつかの側面では、この態様による細胞の集団は、少なくとも１ｘ１０２、１ｘ１０３、１ｘ１０４、１ｘ１０５または１ｘ１０６個の細胞を含み得る。
【００３８】
さらなる態様では、（ａ）この態様に従って、ニューロン（例えば、中脳ＤＡニューロン）の集団を準備すること；および（ｂ）前記集団由来の細胞をインビボで生着可能な条件で対象に移植すること（つまり、ＤＡニューロンを機能させるために）、を含む治療法を提供する。例えばいくつかの側面では、このニューロンの集団は、ＦｏｘＡ２および／またはＬｍｘ１（例えば、Ｌｍｘ１ａ）の発現（例えば、ＦｏｘＡ２とＬｍｘ１の発現）に関して陽性の細胞を少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％含んでいる。いくつかの側面において対象は、前記神経学的症状の少なくとも１つの軽減を示すだろう。例えば治療は、パーキンソン病を治療するためのまたはパーキンソン病の症状を軽減するための方法であってよい。
【００３９】
その上さらに別の態様では、（ａ）この態様に従って、ニューロンの集団（例えば、中脳ＤＡニューロン）を準備すること；（ｂ）このニューロンの集団と候補薬物とを接触させること；および（ｃ）候補薬物が細胞集団に及ぼす影響を決定すること、を含む候補薬物のスクリーニング方法を提供する。例えば、いくつかの側面においてこのニューロンの集団は、ＦｏｘＡ２および／またはＬｍｘ１、例えばＬｍｘ１ａの発現に関して陽性の細胞を少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％含む（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の細胞が、ＦｏｘＡ２およびＬｍｘ１の発現に関して陽性である）。特定の側面では、候補薬物の影響を決定することには、集団に含まれている細胞の生存性を評価することが含まれ得る。従っていくつかの側面では、方法には候補薬物のライブラリーをスクリーニングすることが含まれてもよい。
【００４０】
本明細書および請求項で使用される、「１つ」または「１種」とは、１つまたは１つ以上を意味する場合がある。「含んでいる」という単語と共に本明細書および請求項で使用される場合、「１つ」または「１種」は、１つまたは２つ以上を意味し得る。本明細書および請求項で使用される「別の」または「さらなる」とは、少なくとも２つめ、または３つめ以上を意味する場合がある。
【００４１】
本明細書および請求項で使用される、「約」という用語は、その値には、装置の誤差、その値を決定するのに用いられた方法に固有の変動、または試験対象ごとの差異が含まれていることを示すために使用される。
【００４２】
本明細書において、特定の成分に関して使用される「本質的に含まない」とは、本明細書では、この特定の成分はいずれも組成物として意図的に調整されているものではないこと、および／または単に汚染物質としてもしくは微量に存在していることを意味するために使用される。そのため、組成物中に含まれる、意図していない全ての汚染物質に由来する特定の成分の総量は０．０５％を大きく下回るか、好ましくは０．０１％未満である。特定の成分が、組成物中には標準的な分析方法では検出できない量しか含まれないことが最も好ましい。
【００４３】
本発明のその他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、当業者は詳細な説明から、本発明の精神および範囲に含まれる種々の変更および修正を簡単に思いつくことから、この詳細な説明および特定の実施例は本発明の特定の態様を説明してはいるが、例示するためだけに提供されるものであると理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
以下の図面は本明細書の一部を構成し、かつ、本発明の特定の側面をさらに証明するために提供されるものである。これらの図面のうちの１つ以上を、本明細書で示す特定の態様に関する詳細な説明と合わせて参照することで、本発明をより深く理解することができるだろう。
【００４５】
【図１】分化させる前の細胞（ヒトｉＰＳ細胞）、分化過程６日目（ドーパミン作動性ニューロン分化の６日目）の中脳ＤＡニューロン、および分化完了後（４２日目）の遺伝子発現プロファイルの定量。ＲＮＡを単離した後、タックマン（登録商標）遺伝子発現アッセイ（アプライド・バイオシステムズ）を用いてリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。結果は、対照としたＧＡＰＤＨの発現に対する相対量として表している。１０−４未満の値はバックグラウンドであると見なす（斜線部分）。ニューロンのサブタイプマーカーであるｖＧＡＴ、Ｎｋｘ６．１、ｖＧＬＵＴ１、ＮＧＮ２ならびに中脳マーカーであるＦｏｘＡ２、Ｌｍｘ１ａおよびＯＴＸ２の発現が上昇していることから分かるように、６日目までに神経が誘導されていることが分かった。４２日目までには、中脳ＤＡニューロンで発現するその他の遺伝子（ＥＮ１、ＮＵＲＲ１、ＴＨ、ＤＲＤ２、ＧＩＲＫ２、ＶＭＡＴ２、ＤＲＤ２、ＣＡＬＢ１、ＴＵＢＢ３、ＳＹＮ１、ＳＹＰ、ｖＧＬＵＴ２）の発現も増加した。
【図２】中脳におけるＤＡニューロン前駆細胞のパターン。ＦｏｘＡ２とＬｍｘ１ａが同時に発現していることが、中脳ＤＡニューロン前駆細胞由来底板の特異的マーカーとなっている。ハイコンテンツイメージングを使った定量的免疫細胞化学（ＩＣＣ）によって、分化過程の１５日目までには８０％を超える（８１．７％）細胞がＦｏｘＡ２とＬｍｘ１の両方を発現していることが示された。フローサイトメトリーによってこの結果を確認し、同時に、細胞のたった１６％がＦｏｘＡ２＋／Ｌｍｘ１−で、細胞のうちの３％がＦｏｘＡ２−／Ｌｍｘ１−であることも分かった。
【図３】中脳ＤＡニューロンを精製するためのパンニューロン遺伝子選抜。図は、ニューロン中で分化させたｉＰＳ細胞をフローサイトメトリーで分取した結果を示している。安全に格納できるＡＡＶＳ１部位におけるジンクフィンガーヌクレアーゼ介在性相同的組換えによって、ｉＰＳ細胞株ＭＡＰ２−Ｎｅｏ＃２（０１２７９．１０７．００４０２）を生成した。この構築物は、ネオマイシン耐性遺伝子の発現を誘導するＭａｐ２プロモーターを含むものである。薬剤選抜を行わないプロトコールで中脳ＤＡニューロンを分化させると、３８日目に、３９％がニューロンである細胞（Ｍａｐ２＋／ネスチン−）の集団が得られた。非神経細胞（Ｍａｐ２−／ネスチン＋）は増殖を続け、ＦｏｘＡ２またはチロシン水酸化酵素（ＴＨ）を発現することはなかった。対照的に、Ｇ４１８による遺伝的薬剤選抜を行うと、高度に精製されたニューロンの集団（９５％がＭａｐ２＋／ネスチン−）が得られた。マーカーの解析から、これら細胞の大部分が中脳ＤＡニューロンの表現型を有することが示された（図４〜６を参照のこと）。
【図４】融解した後の細胞の遺伝子発現プロファイルの定量。分化プロトコールの３８日目に細胞を凍結保存し、その後融解してＰＬＯ／ラミニンにプレーティングし、ＲＮＡを単離するまで示した日数おいた。タックマン（登録商標）遺伝子発現アッセイ（アプライド・バイオシステムズ）を使ったリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施し、結果はＧＡＰＤＨ対照の発現に対する相対量として示した。１０−４未満の値はバックグラウンドであると見なす（斜線部分）。細胞は、中脳領域の形成を示す遺伝子、ならびにニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、および底板由来中脳ＤＡニューロンに関するマーカーを発現した。前脳領域形成のマーカー（ＦｏｘＧ１）または他のニューロンサブタイプのマーカー（ＤＢＨ、ＣＨＡＴ、ＯＬＩＧ２）はほとんど発現していないかあるいは全く発現していなかった。融解後、４２日目の時点まで経過を追って試験したが、いずれにおいても多くの遺伝子が非常によく似た発現レベルを示した。発現プロファイルは、ヒト中脳黒質（ＳＮ）から抽出したＲＮＡのプロファイルと一致していた。
【図５】成熟した中脳ＤＡニューロンの純度。フローサイトメトリーを使ってＦｏｘＡ２の発現について調べ、９６％の細胞がＦｏｘＡ２＋であることを確認した。細胞は同時に、特有のＤＡニューロンマーカーであるチロシン水酸化酵素（ＴＨ）も発現していた（イソタイプを使った対照染色と比較して８８％）。加えて、９７％の細胞がパンニューロンマーカーのＭａｐ２でも染色された。
【図６】成熟した中脳ＤＡニューロンの純度。融解後、長期間培養した後でさえも中脳ＤＡニューロンの表現型が維持された。融解して１４日後、ＴＨの発現レベルは融解３日後よりも増加していた。ニューロンの純度は維持されており（９８％）、ネスチン＋細胞の増殖は見られなかった。
【図７】「ＦＧＦ８なし」に変更したプロトコールを用い、実施例２で生成した成熟中脳ＤＡニューロンの純度をフローサイトメトリーを使って評価した。この変更したプロトコールは、薬剤選抜の必要性をなくし（つまり、ｉＰＳ細胞株を遺伝的に修飾することなしに）、そして細胞分裂が終わった直後に凍結保存し、細胞を移植や臨床上の使用により適したものに変更して、高純度な中脳ＤＡニューロンが得られるように開発されたものである。薬剤選抜せずに２６日目に細胞を凍結保存すると、細胞の９９％がＦｏｘＡ２＋、４０％がＴＨ＋、そして７７％がＭａｐ２＋であった。しかしながら、この時点では、Ｍａｐ２とＴＨはまだ発現量増加の途中の段階であり、融解７日後には最終的なニューロン（Ｍａｐ２）の純度が９０％に達した。このとき、細胞の９３％がＦｏｘＡ２を、５５％がＴＨを発現していた。比較のために、同じプロトコールに薬剤選抜（＋Ｇ４１８）を加えて細胞を作成したところ、融解７日後の最終的な純度は、細胞の９６％はＦｏｘＡ２＋、６３％がＴＨ＋、および９８％がＭａｐ２＋であった。
【図８】複数のプロトコールで生産した中脳ＤＡニューロンの遺伝子発現の比較。実施例１で説明したように分化させた細胞（ｉＣｅｌｌドーパニューロン）、または実施例２で説明した「ＦＧＦ８なし」プロトコールにＧ４１８を使った薬剤選抜を加えた方法によって作成し、３３日目に凍結保存した細胞（ＦＧＦ８なしプロトコール）からＲＮＡを単離した。比較するために、幹細胞由来前脳ニューロン（ｉＣｅｌｌニューロン）およびヒト中脳黒質からもＲＮＡを単離した。タックマン（登録商標）遺伝子発現アッセイ（アプライド・バイオシステムズ）を使ったリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、結果はＧＡＰＤＨ対照の発現に対する相対量として示した。１０−４未満の値はバックグラウンドであると見なす（斜線部分）。多くの場合、ＦＧＦ８なしのプロトコールで作成した細胞の遺伝子発現パターンは、ＦＧＦ８を使った標準的なプロトコールで作成した細胞のパターンと非常によく似ていた（実施例１のプロトコールと実施例２のプロトコールの比較）。しかし１つだけ例外があり、ＦＧＦ８によって上方制御されることが知られているエングレイルド１（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ１、ＥＮ１）の発現には違いがあった。いずれの発現プロファイルも、ヒト中脳黒質（ＳＮ）から抽出したＲＮＡのプロファイルとよく似ていた。幹細胞由来前脳ニューロンの発現プロファイルは大きく異なり、ＦｏｘＡ２、Ｌｍｘ１、Ｎｕｒｒ１、ＴＨ、ｖＭＡＴ２、ｖＧＬＵＴ２およびＡＡＤＣなど中脳ＤＡニューロンマーカーの発現は低下し、前脳マーカーであるＦｏｘＧ１の発現が増加していた。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
Ｉ．本発明
細胞系列特異的に分化した細胞集団は、特定の細胞集団が失われている疾患を生じている患者に対する細胞補充療法に有望である。このような細胞は、疾患研究および新規治療法の同定のための研究ツールとしても価値がある。例えば、中脳ＤＡニューロンの生産は、パーキンソン病の治療と研究のために探求されてきた。スチューダーらは最近、インビボで効率的に生着させることのできる本物同等の中脳ＤＡ神経細胞を分化させることが可能なプロトコールを開発した（ＰＣＴ出願、国際公開第２０１３／０６７３６２号、参照することにより本明細書に組み入れられる）。本出願で詳述した方法および組成物は、有意に高い分化効率を有し、かつ、スプラーグドーリーラットおよび非ヒト霊長類に生着させられることが分かっている中脳ＤＡ細胞集団を高純度で準備することのできる方法を提供することによって、スチューダーらのプロトコールから発展させたものである。同様に、高純度の中脳ＤＡ細胞組成物を単離するための方法も提供する。例えば、中脳ＤＡ神経細胞を効率的に選抜（またはスクリーニング）可能にするためには、ＭＡＰ２プロモーターの制御下にあるスクリーニング可能なまたは選択可能なマーカーを含んでいる細胞を使用することが示されてきた。具体的には、多能性細胞を、マーカーを使って改変し、中脳ＤＡ細胞に分化させ、その後、マーカーに基づいた選抜を行って、精製された中脳ＤＡ細胞の集団を得ることができる。同様に、中脳ＤＡ細胞を分化させている間にＭＥＫ阻害剤を使用すると、中脳特異的な細胞集団が増えることが分かっている。従って、分化のプロトコールにＭＥＫ阻害剤組成物を用いることで、中脳ＤＡ細胞をより効率的に、より迅速に生産することができる。
ＩＩ．定義
【００４７】
「多能性」とは、１種以上の組織または器官を構成する全ての細胞、例えば三胚葉：内胚葉（胃内部の裏層、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、または外胚葉（表皮組織および神経系）のいずれか、に分化することが出来る能力を有している幹細胞を指す。
【００４８】
一般に、ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略されている「人工多能性幹細胞」とは、リプログラミング因子を導入するまたはこれを接触させることによって、多能性細胞ではない細胞、典型的には成人の体細胞または最終分化した細胞、例えば線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、上皮細胞などから、人工的に準備されたある種の多能性幹細胞を指す。
【００４９】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」とは、初期胚から誘導された多能性幹細胞である。
【００５０】
「接着培養」とは、細胞、または細胞の凝集体が、表面に付着している培養を指す。
【００５１】
「浮遊培養」とは、細胞、または細胞の凝集体が、液体培地中に懸濁された状態で増殖する培養を指す。
【００５２】
外から加えた成分を「本質的に含まない」とは、その培地が、培地中に含まれている細胞以外の原因に由来する特定の成分を、全く含まないまたは本質的に含んでいないことを指す。外から加えた成長因子またはシグナル阻害剤（例えば、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル阻害剤など）を「本質的に含まない」とは、外から加えた成分が最小量であることまたは検出不能な量であることを意味する場合もある。例えば、ＴＧＦβまたはｂＦＧＦを本質的に含まない培地または環境とは、５、４、３、２、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０１、０．００１ｎｇ／ｍＬ未満またはそこから誘導可能な任意の範囲の量のＴＧＦβまたはｂＦＧＦを含む場合がある。例えば、シグナル阻害剤を本質的に含まない培地または環境は、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１μＭ未満、またはそこから誘導可能な任意の範囲の量のシグナル阻害剤を含む場合がある。
【００５３】
「分化」とは、特殊化していない細胞が、より特殊化した新しい細胞型の少なくとも前駆細胞を形成する過程である。
【００５４】
「凝集促進培地」という用語は、作用機序にいかなる制限も加えることなく、細胞凝集体の形成を促すいずれの培地をも意味する。
【００５５】
「凝集体」すなわち胚様体という用語は、分化した細胞、部分的に分化した細胞、および／または懸濁液中で培養した多能性幹細胞を含んでいる、細胞の均一なまたは不均一なクラスターを指す。
【００５６】
「ニューロン」または「神経細胞」または「神経細胞型」または「神経細胞系列」には、任意のニューロン細胞系列の細胞が含まれる場合があり、またこれらの語は、特段の規定がない限り、いかなる制限もなく、ニューロン発生の任意の段階にある細胞を指すために利用される場合がある。例えば、ニューロンには、ニューロン前駆細胞、成熟したニューロンおよび神経細胞型、例えば星状細胞（アストロサイト）のいずれも含まれ得る。
【００５７】
特定のタンパク質を「コードしている」「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」または「断片」とは、適切な制御配列の制御下にある場合に、インビトロでまたはインビボで転写され、必要に応じて翻訳もされて遺伝子産物、例えばポリペプチドとなる核酸分子である。コード領域はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのいずれかの中に、またはＲＮＡの形態で存在し得る。ＤＮＡの形態で存在する場合、核酸分子は一本鎖（つまりセンス鎖）である場合も、または二本鎖である場合もある。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって規定される。遺伝子には、これらに限定されるものではないが、原核生物のｃＤＮＡもしくは真核生物のｍＲＮＡ、原核生物のゲノムＤＮＡ配列または真核生物のＤＮＡ、および合成ＤＮＡ配列が含まれ得る。転写終止配列は通常、その遺伝子配列の３’末端に位置する。
【００５８】
「導入遺伝子」という用語は、人工的なまたは天然の手段、例えば外生の核酸によって、細胞または生物中に導入された遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドを指す。外生の核酸は別の生物または細胞からのものでもよく、あるいは、その生物または細胞中で天然に生じる、核酸の１つ以上のさらなるコピーであってもよい。外生の核酸の非限定的な例としては、天然の細胞とは染色体の別の位置にある核酸、そうでなければ、天然に見られるものとは異なる核酸配列に隣接した核酸が挙げられる。
【００５９】
本明細書において「プロモーター」という用語は、通常、ＤＮＡの制御配列を含んでいるヌクレオチド領域を指す。ここで制御配列とは、ＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）にあるコード配列の転写を開始することができる遺伝子に由来する。
ＩＩＩ．多能性幹細胞の供給源
【００６０】
本方法では、多能性幹細胞からの神経誘導に、多能性幹細胞を用いてもよい。本発明では、培地の成分および／または、分化プロトコールの産物であり、所望される中脳ＤＡニューロンの選抜を最適化することによって、神経分化の効率を向上させるための方法および組成物を開示してきた。
【００６１】
「多能性幹細胞」という用語は、三胚葉、つまり内胚葉、中胚葉および外胚葉全て系列の細胞を生じることが可能な細胞を指す。理論的には、多能性幹細胞は体を構成する全ての細胞に分化することができるが、実験的には通常、多能性細胞が各胚葉の複数の細胞型に分化するということに基づいて多能性は決定される。本発明のいくつかの態様では、多能性幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊由来の胚性幹（ＥＳ）細胞である。他の態様において多能性幹細胞は、体細胞をリプログラミングすることにより誘導された人工多能性幹細胞である。特定の態様において多能性幹細胞は、体細胞核移植によって誘導された胚性幹細胞である。
Ａ．胚性幹細胞
【００６２】
胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚盤胞の内部細胞塊由来の多能性細胞である。ＥＳ細胞は、発生中の胚の栄養外胚葉の層を除去し、その後、内部細胞塊を、成長していない細胞から構成されるフィーダー細胞層上で培養することによって単離することができる。条件が適切であると、増殖している未分化のＥＳ細胞のコロニーが生産される。コロニーを取り、個々の細胞に解離させ、その後、新しいフィーダー細胞層の上に再度プレーティングすることができる。再度プレーティングした細胞をさらに増殖させ、未分化のＥＳ細胞の新しいコロニーを生産することができる。次いで新しいコロニーを取り、解離させ、再びプレーティングして成長させる。未分化のＥＳ細胞を「サブカルチャーする」または「継代する」過程を、未分化のＥＳ細胞を含んでいる細胞株が生産されるまで繰り返すことができる（米国特許第５，８４３，７８０号；同第６，２００，８０６号；同第７，０２９，９１３号）。「初代細胞培養」とは、胚盤胞の内部細胞塊などの組織から直接得られた細胞を培養したものである。「サブカルチャー（継代培養）」とは一次細胞培養由来の任意の培養である。
【００６３】
マウスＥＳ細胞の取得方法は良く知られている。一方法では、１２９系統マウスの着床前の胚盤胞をマウス抗血清で処理して栄養外胚葉を除去し、その後、内部細胞塊を、仔ウシ血清を含む培地を使い、化学的に不活化されたマウス胚性線維芽細胞から構成されるフィーダー細胞層上で培養する。未分化のＥＳ細胞のコロニーのうち、発生したものを、仔ウシ血清存在下、マウス胚性線維芽細胞のフィーダー細胞層上で継代培養し、ＥＳ細胞の集団を生産する。いくつかの方法では、マウスＥＳ細胞は、血清を含有している培地にサイトカイン白血病抑制因子（ＬＩＦ）を加えれば、フィーダー細胞層がなくても生育させることができる（スミス、２０００）。他の方法では、血清を含まない培地を使っても、骨形成タンパク質およびＬＩＦがあれば、マウスＥＳ細胞を生育することができる（インら、２００３）。
【００６４】
前述した方法によって、胚盤胞からヒトＥＳ細胞を得ることができる（トマソンら、１９９５；トマソンら、１９９８；トマソンおよびマーシャル、１９９８；レイビノフら、２０００）。一方法では、５日目のヒト胚盤胞を、ウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に暴露し、次いで５倍希釈したモルモットの補体に暴露して栄養外胚葉細胞を溶解する。溶解した栄養外胚葉細胞を無傷な内部細胞塊から除去した後、内部細胞塊ガンマ線で不活化した胚性線維芽細胞のフィーダー細胞層上、仔ウシ血清存在下で培養する。９〜１５日後、内部細胞塊由来の細胞凝集塊を化学的に（つまりトリプシンに暴露して）または機械的に解離させ、仔ウシ血清とマウス胚性線維芽細胞のフィーダー細胞層を含有する新しい培地に再度プレーティングすることができる。さらに増殖させてから、未分化な形態を有するコロニーをマイクロピペットを使って選抜し、細胞塊として解離させ、再度プレーティングする（米国特許第６，８３３，２６９号を参照のこと）。ＥＳ様の形態は、コロニーが小さく、細胞質に対する核の割合が高く、核小体が目立つことを特徴とする。生じたＥＳ細胞は、短時間のトリプシン処理によって、またはマイクロピペットで個々のコロニーを選抜することによって、常法により継代することができる。いくつかの方法では、ヒトＥＳ細胞は、ＥＳ細胞を塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下、線維芽細胞のフィーダー細胞層上で培養することによって、血清が無くても生育させることができる（アミットら、２０００）。他の方法では、ヒトＥＳ細胞は、細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有している「馴化」培地の存在下、タンパク質マトリックス（例えばマトリゲル（登録商標）またはラミニン）上で培養することにより、フィーダー細胞層なしでも生育させることができる（シュウら、２００１）。培地は線維芽細胞と共に培養しておくことで予め馴化させておく。
【００６５】
アカゲザルおよびコモンマーモセットのＥＳ細胞を単離する方法もよく知られている（トマソン、およびマーシャル、１９９８；トマソンら、１９９５；トマソンおよびオドリコ、２０００）。
【００６６】
ＥＳ細胞の供給源としてはこの他に、樹立されているＥＳ細胞株がある。種々のマウス細胞株およびヒトＥＳ細胞株が知られており、また、それらを成長・増殖させるための条件も確立されている。例えば、マウスＣＧＲ８細胞株は、１２９系統マウス胚の内部細胞塊から確立されたもので、ＣＧＲ８細胞の培養は、ＬＩＦ存在下、フィーダー細胞層なしで生育させることができる。別の例としては、ヒトＥＳ細胞株Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３およびＨ１４がトマソンらによって確立されている。加えて、Ｈ９株から、サブクローンであるＨ９．１とＨ９．２が開発されている。事実上、当該分野で知られているＥＳ細胞株または幹細胞株のいずれもが（例えば、参照することにより本明細書に組み入れられる、ユーおよびトマソン、２００８に記載されている細胞株が）本発明で使用できることが期待される。
【００６７】
本発明との関連において使用されるＥＳ細胞の供給源は、胚盤胞、胚盤胞の内部細胞塊を培養して得られた細胞、または樹立されている細胞株の培養から得られる細胞であってよい。従って、本発明で使用される「ＥＳ細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊細胞、内部細胞塊を培養して得られたＥＳ細胞、およびＥＳ細胞株の培養から得られたＥＳ細胞を指す。
Ｂ．人工多能性幹細胞
【００６８】
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞とは、ＥＳ細胞の特徴をもつが、分化した体細胞をリプログラミングすることによって得られる細胞である。人工多能性幹細胞は様々な方法によって得られてきた。一方法では、成人の皮膚線維芽細胞に、転写因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４を、レトロウイルスを使った形質導入によって導入する（タカハシら、２００７）。形質導入した細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加した培地に入れたＳＮＬフィーダー細胞（ＬＩＦを生産するマウス線維芽細胞株）にプレーティングする。およそ２５日経つと、培養中にヒトＥＳ細胞のコロニーに似たコロニーが現れる。このＥＳ細胞様コロニーを取り、ｂＦＧＦ存在下、フィーダー細胞上で増やす。
【００６９】
細胞特性によると、ＥＳ細胞様コロニーの細胞は人工多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞は、ヒトＥＳ細胞と形態学的に似ており、かつ、種々のヒトＥＳ細胞マーカーを発現している。また、ヒトＥＳ細胞の分化が起こることが知られている条件で生育させると、人工多能性幹細胞もこれに従って分化する。例えば、人工多能性幹細胞は、ニューロンの構造およびニューロンマーカーを有する細胞へと分化することが可能である。理論的には、例えばユーおよびトマソン、２００８に記載されている細胞などの、いかなるｉＰＳ細胞または細胞株も本発明に使用することができると考えられる。
【００７０】
別の方法では、ヒトの胎児または新生児の線維芽細胞に、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の４遺伝子を、レンチウイルスを使って導入する（ユーら、２００７）。感染した１２〜２０日後、ヒトＥＳ細胞と形態の似たコロニーが見えてくる。このコロニーを取って増殖させる。このコロニーを構成している人工多能性幹細胞はヒトＥＳ細胞と形態が似ており、ヒトＥＳ細胞の種々のマーカーを発現していて、かつ、マウスに注入すると神経組織を有する奇形腫、軟骨および消化管上皮を形成する。
【００７１】
マウスから人工多能性幹細胞を調製する方法も知られている（タカハシおよびヤマナカ、２００６）。ｉＰＳ細胞の誘導には通常、Ｓｏｘファミリーメンバーのうちの少なくとも１つ、およびＯｃｔファミリーメンバーのうちの少なくとも１つを発現させること、またはこれらに暴露することが必要となる。ＳｏｘとＯｃｔは、ＥＳ細胞の特徴を規定する階層的な転写制御の中心的な役割を担っていると考えられている。例えば、ＳｏｘはＳｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、Ｓｏｘ−１５であっても、またはＳｏｘ−１８であってもよく；ＯｃｔはＯｃｔ−４であってよい。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、またはｃ−Ｍｙｃなどの付加的な因子はリプログラミング効率を高める可能性があり；リプログラミング因子の特定の組とは、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇおよび必要に応じてＬｉｎ−２８を含む組、またはＳｏｘ−２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆおよび必要に応じてｃ−Ｍｙｃを含む組であってよい。
【００７２】
ＥＳ細胞などのｉＰＳ細胞は、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４（発達研究ハイブリドーマバンク、国立小児保健発育研究所、ベセスダ、メリーランド）、ならびにＴＲＡ−１〜６０およびＴＲＡ−１〜８１（アンドリューら、１９８７）に対する抗体を使って、免疫組織化学またはフローサイトメトリーによって同定または確認することが可能な特徴抗原を有している。胚性幹細胞の多能性は、８〜１２週齢のオスのＳＣＩＤマウスの後肢筋肉に、およそ０．５〜１０×１０６個の細胞を注入することで確認することができる。三胚葉それぞれのうちの少なくとも１つの細胞型を示す奇形腫が生じる。
【００７３】
本発明の特定の側面では、ＯｃｔファミリーメンバーとＳｏｘファミリーメンバー、例えば上述したように、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２と、さらにＫｌｆまたはＮａｎｏｇを含むリプログラミング因子を使って体細胞をリプログラミングすることによってｉＰＳ細胞を作成する。本発明の特定の側面において体細胞は、多能性へと誘導できるいかなる体細胞、例えば線維芽細胞、角化細胞、造血細胞、間葉細胞、肝臓細胞、胃細胞、またはβ細胞であってよい。特定の側面では、Ｔ細胞もまた、リプログラミングに使う体細胞の供給源として用いることができる（参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許出願第６１／１８４，５４６号を参照のこと）。
【００７４】
リプログラミング因子は、１つ以上のベクター、例えば組み込み型ベクター、染色体性非組み込み型ＲＮＡウイルスベクター（参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許出願第１３／０５４，０２２号を参照のこと）またはエピソーマルベクター、例えばＥＢＶエレメントを使った系（参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許出願第６１／０５８，８５８号；ユーら、２００９を参照のこと）に含まれている発現カセットから発現される場合もある。さらなる側面では、リプログラミングタンパク質またはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ）を、タンパク質またはＲＮＡトランスフェクションによって体細胞に直接導入することもできる（参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許出願第６１／１７２，０７９号、ヤクボフら、２０１０を参照のこと）。
Ｃ．体細胞核移植によって誘導した胚性幹細胞
【００７５】
多能性幹細胞は、提供者の核を紡錘体のない卵母細胞に移す、体細胞核移植の手段によっても調製することができる。核移植によって生産された幹細胞は、提供者の核と遺伝的に同一である。一方法では、アカゲザルの皮膚線維芽細胞由来のドナー線維芽細胞核を、アカゲザルの紡錘体のない第二減数分裂中期の卵母細胞の細胞質に電気融合によって導入する（ビルネら、２００７）。融合させた卵母細胞をイオノマイシンに暴露して活性化し、その後、胚盤胞期までインキュベートする。次いで選抜した胚盤胞の内部細胞塊を培養して胚性幹細胞株を生産する。この胚性幹細胞株は一般的なＥＳ細胞の形態を示し、種々のＥＳ細胞マーカーを発現し、そしてインビトロとインビボの両方で、複数の細胞型に分化する。本明細書で使用する場合「ＥＳ細胞」という用語は、受精した核を有する胚から誘導した胚性幹細胞を指す。ＥＳ細胞は、核移植によって生産された胚性幹細胞とは区別され、この胚性幹細胞は、「体細胞核移植によって誘導した胚性幹細胞」と呼ぶ。
ＩＶ．多能性幹細胞の分化条件
【００７６】
培養条件に応じて、多能性幹細胞は分化細胞または未分化細胞のコロニーを生産する場合がある。例えば、多能性幹細胞を分化させる前に、より具体的には、凝集体の形成を誘導する前に、ＴＧＦβおよびｂＦＧＦなどの成長因子を本質的に含まない培地中で培養する。別段の規定のない限り、分化は誘導（例えば、凝集体の形成）によって達成され、誘導には少なくとも培養条件の変更が含まれ得るが、自発的な変化は含まれない。
【００７７】
集団中の幹細胞およびそれらの誘導体の集団の実質的な割合（例えば、少なくとも約５０％、８０％、９０％、９５％、９９％もしくはこの中に導き出される任意の範囲）が未分化細胞の形態的特徴を示していて、胚または成体由来の分化細胞の形態的特徴とは明らかに異なる場合、その多能性幹細胞の培養は「未分化である」と言われる。当業者であれば、未分化のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を認識でき、また通常は、そのコロニーを構成している細胞の二次元の顕微鏡像から、核／細胞質比と核の多さから識別できる。未分化細胞のコロニーが、分化した細胞と隣接している場合があることにも留意されたい。
【００７８】
特定の側面では、本方法の出発細胞は、少なくともまたは約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３個もしくはこの中に導き出される任意の範囲の数の細胞を含み得る。出発細胞の集団の播種密度は、少なくともまたは約１０、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８またはもしくはこの中に導き出される任意の範囲の数の細胞／ｍＬであってよい。
Ａ．分化培地
【００７９】
本発明の特定の側面による分化培地は、動物細胞を培養するために使われる培地を基本培地として調製することができる。いくつかの側面において培地は、ＢＭＰ阻害剤；ＴＧＦβ阻害剤；ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル活性化剤；Ｗｎｔシグナル活性化剤および、必要に応じて、および／またはＭＥＫ阻害剤をふくむ。この培地は、ＴＧＦβとｂＦＧＦを本質的に含まない培地であってもよい。分化に使用される培地はいずれも、ＴＧＦβとｂＦＧＦを含んでいても、またはＴＧＦβとｂＦＧＦを本質的に含まない培地であってもよい。特定の側面では、分化培地は、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル阻害剤とｂＦＧＦ阻害剤を外因的に加える必要性を排除するものであってもよい。
【００８０】
特定の側面においてこの態様の分化させる方法は、細胞を一定の範囲の培地条件にわたって継代すること、例えば細胞を、
ＢＭＰ阻害剤；ＴＧＦβ阻害剤；ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル活性化剤；およびＷｎｔシグナル活性化剤を含んでいる培地を使った接着培養で培養すること；
ＢＭＰ阻害剤；ＳＨＨシグナル活性化剤；およびＷｎｔシグナル活性化剤を含んでいる培地を使った懸濁液中で培養して細胞凝集体を形成させること；
成熟させるためにＢ２７サプリメント、Ｌ−グルタミン、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦβ、アスコルビン酸、ビブチリル（ｂｉｂｕｔｙｒｙｌ）ｃＡＭＰ、ならびにＤＡＰＴ、（および必要に応じて、外因的に加えられたレチノールまたはレチノイン酸を含まない）を含んでいるニューロベーサル培地を使った接着培養で培養すること、
を含む。
【００８１】
基本培地としては、組成が化学的に明らかな限定培地のいずれか、例えばイーグル基本培地（ＢＭＥ）、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ  １０６６、グラスゴーＭＥＭ、ＭＥＭ改変亜鉛オプション、イスコーブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、培地１９９、イーグルＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ  １６４０、およびフィッシャー培地、それらの変異形またはその組み合わせを使用することができ、ＴＧＦβおよびｂＦＧＦは、含まれていても含まれていなくても良い。
【００８２】
さらなる態様では、細胞を分化させる環境に、Ｂ−２７サプリメント、インスリン、トランスフェリン、およびセレン（ＩＴＳ）サプリメント、Ｌ−グルタミン、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン）、Ｎ２サプリメント（５μｇ／ｍＬインスリン、１００μｇ／ｍＬトランスフェリン、２０ｎＭプロゲステロン、３０ｎＭセレン、１００μＭプトレシン（ボッテンシュタインおよびサトウ、１９７９  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ７６、５１４〜５１７）およびβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）などの添加剤を含めることもできる。フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、レチノイン酸などがあるがこれらには限定されない付加的な因子を加えてもまたは加えなくてもよいことが想定される。
【００８３】
分化培地には、成長因子を加えてもまたは加えなくてもよい。これに加えてまたは上述した因子の代わりに、上皮成長因子ファミリー（ＥＧＦ）のメンバー、線維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ）のメンバー、例えばＦＧＦ２および／またはＦＧＦ８など、血小板由来成長因子ファミリー（ＰＤＧＦ）のメンバー、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）／成長および分化因子（ＧＤＦ）因子ファミリー拮抗薬などの成長因子を、この過程の様々な工程で用いることもできる。加えても加えなくてもよいその他の因子としては、ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）受容体ファミリーを介したシグナル伝達を活性化するまたは不活性化することが可能な分子、例えば、これらには限定されないが、デルタ（Ｄｅｌｔａ）様ファミリーおよびジャッグド（Ｊａｇｇｅｄ）ファミリーのタンパク質、ならびにガンマセクレターゼ阻害剤や、ノッチのプロセシングもしくは開裂に関わる他の阻害剤、例えばＤＡＰＴ、が挙げられる。他の成長因子としては、インスリン様成長因子ファミリー（ＩＧＦ）、ウイングレス（ｗｉｎｇｌｅｓｓ）関連（ＷＮＴ）因子ファミリー、およびヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）因子ファミリーのメンバーを挙げることができる。
【００８４】
凝集形成および／または分化培地には、神経幹細胞／前駆細胞の増殖と生存、ならびにニューロンの生存と分化を促すために、その他の因子を加えてもよい。これらの神経栄養因子としては、これらには限定されないが、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、カルジオトロフィン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）／増殖分化因子（ＧＤＦ）ファミリーのメンバー、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリー、例えば、これらには限定されないが、ニュールツリン、ノイブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）／アルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）、およびパーセフィンとこれに関連する因子など、ならびに幹細胞成長因子等が挙げられる。最後まで分化させて有糸分裂以降のニューロン形成させる神経培養はまた、有糸分裂阻害剤または有糸分裂阻害剤の混合物を含んでいてもよく、そのような有糸分裂阻害剤としては、これらには限定されないが、５−フルオロ２′−デオキシウリジン、マイトマイシンＣおよび／またはシトシンβ−Ｄ−アラビノ−フラノシド（Ａｒａ−Ｃ）が挙げられる。
【００８５】
培地は血清を含むものであっても、または血清を含まないものであってもよい。血清を含まない培地は、処理されていないまたは未精製の血清を含まない培地を指す場合があり、そのため、精製した血液由来成分または動物組織に由来する成分（例えば成長因子）を含む培地の場合がある。不均一な動物由来成分による汚染を防ぐという観点から、血清は幹細胞の供給源となった動物と同じ動物に由来するものである場合がある。
【００８６】
培地は、血清代替品を含んでいてもまたは含んでいなくてもよい。血清代替品としては、アルブミン（例えば、脂質に富むアルブミンや、組換えアルブミン、植物のデンプン、デキストラン類およびタンパク質の加水分解産物などのアルブミン代用品、トランスフェリン（もしくは他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、またはこれらの等価物を適正に含んでいる物質を挙げることができる。血清代替品は、例えば、国際公開第９８／３０６７９号に開示されている方法によって調製することができる。あるいは、より簡便には、市販されている物質を使用することもできる。市販されている物質としては、ノックアウト血清置換品（ＫＳＲ）および化学的に規定された脂質濃縮物（ギブコ）が挙げられる。
【００８７】
培地はまた、脂肪酸または脂質、アミノ酸（例えば非必須アミノ酸）、ビタミン類、成長因子、サイトカイン、抗酸化物質、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、および無機塩を含む場合もある。２−メルカプトエタノールの濃度は、例えば、約０．０５〜１．０ｍＭであってよく、および特に約０．１〜０．５、または０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．１、０．２、０．５、０．８、１、１．５、２、２．５、５、７．５、１０ｍＭまたは任意の中間値であってよいが、この濃度は幹細胞の培養に適している限り、特にこれらに限定されるものではない。
【００８８】
分化させる多能性幹細胞の密度は、少なくともまたは約１０、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８個細胞／ｃｍ２であるか、または所望の効果、例えば高い神経誘導率、が達成され得る密度である限り、特に限定されない。密度は例えば、約１．０×１０４〜１．０×１０６個細胞／ｃｍ２、より具体的には約２．０×１０４〜６．５×１０５個細胞／ｃｍ２、および最も具体的には約３．０×１０４〜３．０×１０５個細胞／ｃｍ２である。
【００８９】
特定の態様では、神経誘導および底板パターンを改善するために、多能性幹細胞を凝集形成に先立って（例えば、凝集体の形成を誘導するために細胞を単細胞に解離させるまたは小さい凝集体に解離させる前に）培地中で培養する。本発明の特定の態様では、幹細胞を、フィーダー細胞、フィーダー細胞抽出物および／または血清を含まない条件で培養することもできる。
Ｂ．培養条件
【００９０】
細胞を培養するのに使用する培養容器としては、特にこれらに限定されるものではないが、その中で細胞を培養することが可能であれば、フラスコ、組織培養用フラスコ、スピナーフラスコ、ディッシュ、シャーレ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、管、トレー、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、培養用バッグ、およびローラーボトルを挙げることができる。培養の要求に応じて、細胞を、少なくともまたは約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、８００、１０００、１５００ｍＬの容量、またはもしくはこの中に導き出される任意の範囲の容量で培養することができる。特定の態様では、培養容器はバイオリアクターであってよく、バイオリアクターとは、生物学的に活性な環境を支援する任意の装置またはシステムを指し得る。バイオリアクターの容量は、少なくともまたは約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートル、またはもしくはこの中に導き出される任意の範囲の容量であってよい。
【００９１】
培養容器の表面は、その目的に応じて、細胞接着剤で処理してもしなくてもよい。細胞接着性の培養容器は、細胞の容器表面への接着性を高めるために、細胞を接着させるための任意の基質、例えば細胞外マトリックス（ＥＣＭ）でコーティングすることができる。細胞を接着させるために使用する基質は、幹細胞またはフィーダー細胞（使用している場合には）を接着することを目的とした任意の物質であってよい。細胞を接着させるための基質の非限定的な例としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ラミニン、ビトロネクチン、およびフィブロネクチンならびにこれらの混合物、例えば、エンゲル・ホルム・スワム（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ）マウス肉腫細胞由来のタンパク質混合物（例えばマトリゲル（商標）またはゲルトレックス（Ｇｅｌｔｒｅｘ））や溶解した細胞膜調整物（クリマンスカヤら、２００５）が挙げられる。
【００９２】
その他の培養条件も適宜決めることができる。例えば、培養温度は、約３０〜４０℃であってよく、例えば、特にこれらには限定されるものではないが、少なくともまたは約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃であってよい。ＣＯ２濃度は約１〜１０％であってよく、例えば、約２〜７％、またはもしくはこの中に導き出される任意の範囲であってよい。酸素圧は、少なくともまたは約１、５、８、１０、２０％、またはこの中に導き出される任意の範囲であってよい。
【００９３】
特定の側面では接着培養を用いてもよい。その場合、細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することができる。本発明の方法のうちでフィーダー細胞が使用される場合、フィーダー細胞としては胎児線維芽細胞などの間質細胞を使うことができる（例えば、マウス胚の操作、実習の手引き（１９９４）；遺伝子ターゲティング、実践的手法（１９９３）；マーティン（１９８１）；エバンスら（１９８１）；ジェインチルら、（１９６９）；ナカノら、（１９９６）；コダマら（１９８２）；ならびに国際公開第０１／０８８１００号および同第２００５／０８０５５４号を参照のこと）。
【００９４】
他の側面では浮遊培養を使用してもよい。浮遊培養には、担体を使った浮遊培養（フェルナンデスら、２００７）またはゲル／生体高分子を使った封入（米国特許出願第２００７／０１１６６８０号）が含まれ得る。幹細胞の浮遊培養とは、幹細胞を、培養容器または培地中のフィーダー細胞（使用している場合には）に接着させない条件で培養することを意味する。幹細胞の浮遊培養には、幹細胞の解離培養と幹細胞の凝集浮遊培養が含まれる。幹細胞の解離培養は、懸濁した幹細胞を培養することを意味し、幹細胞の解離培養には、単細胞に解離させた幹細胞を培養すること、または複数の幹細胞（例えば、約２〜４００個の細胞）から構成されている小さい細胞凝集体を培養することが含まれる。前述した解離培養を継続する場合、培養され、解離された細胞は、幹細胞のより大きな凝集体を形成し、その後、凝集浮遊培養を実施することができる。凝集浮遊培養には、胚様体の培養方法（ケラーら、１９９５を参照のこと）、およびＳＦＥＢ（血清を含まない胚様体）法（ワタナベら、２００５）；国際公開第２００５／１２３９０２号）が含まれる。
Ｃ．多能性幹細胞の培養
【００９５】
多能性幹細胞、例えばＥＳ細胞を調製および培養するための方法は、細胞生物学、組織培養、および奇形種や胚性幹細胞を含む発生学の標準的な教科書や総説に見ることができる：実践的な手法（１９８７）；マウスの発生に関する技術の手引き（１９９３）；インビトロにおける胚性幹細胞の分化（１９９３）；胚性幹細胞の特性および利用：ヒトの生物学および遺伝子医療への応用の見通し（１９９８）、これらは全て参照することにより本明細書に組み入れられる。組織培養に用いられる標準的な方法については通常、動物細胞培養（１９８７）；哺乳類細胞に関する遺伝子導入ベクター（１９８７）；および分子生物学における最新のプロトコールおよび分子生物学における手短なプロトコール（１９８７および１９９５）に記載されている。
【００９６】
体細胞にリプログラミング因子を導入するか体細胞とリプログラミング因子とを接触させた後、これらの細胞を、多能性と未分化な状態を維持するのに十分な培地中で培養することができる。人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の培養には、参照することによって本明細書に組み入れられる米国特許出願第２００７／０２３８１７０号および同第２００３／０２１１６０３号、および同第２００８／０１７１３８５号に記載されているように、霊長類の多能性幹細胞、特に胚性幹細胞を培養するために開発された様々な培地と技術を使うことができる。当然のことながら、当業者であれば知っている多能性幹細胞を培養および維持するためのその他の方法を本発明で用いてもよい。
【００９７】
特定の態様では、未定義の条件を使用することもできる。例えば、多能性細胞を、線維芽細胞のフィーダー細胞上で、または幹細胞が未分化の状態に維持されるように、線維芽細胞のフィーダー細胞に暴露させた培地中で培養することができる。あるいは、限定したフィーダー細胞層を使わない培養系、例えばＴｅＳＲ培地（ラドヴィグら、２００６ａ；ラドヴィグら、２００６ｂ）またはＥ８培地（チェンら、２０１１；ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４６７９６）を使用して、多能性細胞を本質的に未分化な状態において培養及び維持してもよい。これらの方法では、マウス線維芽細胞の「フィーダー細胞層」を使用する必要なしに、ヒト多能性幹細胞を本質的に未分化な状態に維持することができる。本明細書で記載するように、必要となる費用を削減するために、これらの方法に種々の変更を施してもよい。
【００９８】
ヒト多能性幹細胞を培養、維持または分化させるのに、様々なマトリックス成分を使用してもよい。例えば、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、およびビトロネクチンを組み合わせて、その全体が参照により組み込まれるラドヴィグら（２００６ａ；２００６ｂ）に記載されているように使用し、多能性細胞の成長を支える固体支持層になるように、培養表面をコーティングすることができる。
【００９９】
マトリゲル（登録商標）を、ヒト多能性幹細胞を培養し、維持するための基質となるように使用することもできる。マトリゲル（登録商標）はマウス腫瘍細胞から分泌されるゼラチン状のタンパク質混合物で、ＢＤバイオサイエンシズ（ニュージャージー、米国）から市販されている。この混合物は、多くの組織で見られる複雑な細胞外環境を模しており、細胞培養の基質として細胞生物学者に使用されているものである。
Ｄ．単細胞の継代
【０１００】
多能性幹細胞培養のいくつかの態様では、一旦培養容器がいっぱいになると、任意の適した解離方法によって、コロニーを凝集した細胞またはまだ単一のままの細胞とに分け、次いでこれらの細胞を継代するために新しい培養容器に移す。細胞の継代または分割は、細胞が培養条件下で長期間、生存および成長することを可能にする技術である。細胞は通常、コンフルエンスが約７０％〜１００％に達したときに継代される。
【０１０１】
本方法では、多能性幹細胞を個々の細胞に解離させ、その後個々の細胞を継代してもよく、これには、分化させるための細胞増殖、細胞の選別、および決められた播種を促進することおよび培養過程を機械化できることならびにクローンの増殖など、いくつかの利点がある。例えば、単一の細胞からクローン的に誘導可能な後代細胞は、均質な遺伝的構造をもつおよび／または細胞周期が一致している場合があり、それによって、狙い通りの分化を高めることができる。単細胞継代の例示的な方法は、参照することにより本明細書に組み入れられる米国特許出願第２００８／０１７１３８５号に記載されている。
【０１０２】
特定の態様では、多能性幹細胞を個々の細胞に、または個々の細胞と、２、３、４、５、６、７、８、９、１０細胞またはそれ以上の数の細胞から構成される小さい細胞クラスターとの組み合わせに解離させてもよい。解離は、機械的な力、または細胞を解離させる薬剤、例えばクエン酸ナトリウム、または酵素、例えば、トリプシン、トリプシン−ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥセレクトなどによって行うことができる。
【０１０３】
多能性幹細胞の供給源および増殖の必要性に基づいて、解離させた細胞を個々にまたは小さいクラスターごとに新しい培養容器に移してもよく、このときの分配比は、例えば、少なくともまたは約１：２、１：４、１：５、１：６、１：８、１：１０、１：２０、１：４０、１：５０、１：１００、１：１５０、１：２００、またはもしくはこの中に導き出される任意の範囲であってよい。浮遊培養の細胞株の分配比は、培養細胞懸濁液の量によって決めることができる。継代の間隔は、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日ごと、もしくはこの中に導き出される任意の範囲ごとであってよい。例えば、酵素を使用した異なる継代プロトコールにおいて達成可能な分配比は、１：２の比で３〜７日ごと、１：３の比で４〜７日ごと、および１：５〜１：１０の比でおよそ７日ごと、１：５０〜１：１００の比で７日ごとであってよい。分配比が高い場合には、継代間隔を少なくとも１２〜１４日、または過度の自発的な分化もしくは細胞死に起因する細胞消失が起きない任意の期間に延長してもよい。
【０１０４】
特定の側面では、単細胞継代は、クローニング効率や細胞の生存率を高めるのに有効な低分子、例えば上述のＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤の存在下で行ってもよい。このようなＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤としては、例えば、Ｙ−２７６３２、ＨＡ−１０７７、Ｈ−１１５２、またはブレビスタチンを、有効な濃度で、例えば、少なくともまたは約０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０〜約１００μＭ、もしくはこの中に導き出される任意の範囲の濃度で使用することができる。
Ｅ．幹細胞の分化
【０１０５】
方法は、多能性幹細胞からの神経分化効率（具体的には中脳ＤＡ分化効率）を改善するために提供される場合がある。多能性幹細胞の分化は、接着したコロニーまたは細胞凝集体の形成、例えば、その中に存在している凝集体が胚様体（ＥＢ）と呼ばれるような、接着性の低い環境などの様々な様式によって誘導することができる。ＥＢ内で生じる分子学的・細胞学的な形態形成シグナルおよびイベントは、発生中の胚の中にある細胞の天然の個体発生の様々な側面を模倣するものである。細胞をニューロン分化に方向付けるための方法は、例えば、参照することにより本明細書に組み入れられる米国特許出願第２０１２／０２７６０６３号に記載されている。ＤＡニューロン分化に関するより詳細で具体的なプロトコールは、国際公開第２０１３／０６７３６２号に記載されており、参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０１０６】
胚様体（ＥＢ）は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞に由来する細胞の凝集体で、マウス胚性幹細胞と共に長年研究されてきた。インビボにおける分化に固有の合図のいくつかを再現するために、本発明の特定の側面では、中間工程として三次元凝集体（つまり、胚様体）を用いる場合がある。細胞が凝集し始めると、分化が開始され、細胞はある程度まで胚発生を再現することができる。これらは栄養外胚葉組織（胎盤を含む組織である）を形作ることはできないが、実質上、器官に含まれる全ての他の型の細胞が発生することができる。本発明では、凝集体形成に続いて神経分化をさらに促進させ得る。
【０１０７】
細胞の凝集は、非組織培養処理されたプレートまたはスピナーフラスコを用いた懸滴（いずれの方法でも細胞が表面に接着して典型的なコロニーを形成することを防ぐ）によって実施されることもある。多能性幹細胞を培養するために、凝集形成の前、形成中、または形成後に、ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤を使用してもよい。
【０１０８】
多能性幹細胞を、当該分野で知られている細胞培養法のいずれかを使って凝集促進培地に播種してもよい。例えば、多能性幹細胞を、単一のコロニーとしてまたは一軍のコロニーとして凝集促進培地に播種してもよく、また、多能性幹細胞を本質的に個別の細胞として播種してもよい。いくつかの態様では、多能性幹細胞を、当該分野において知られている機械的な方法または酵素的な方法を使って、本質的に個別の細胞に解離させる。非限定的な例としては、多能性幹細胞を、細胞と培養表面との間および細胞同士の間の連結を壊すタンパク分解性酵素に曝してもよい。凝集体を形成させ分化させるために、多能性幹細胞を単細胞に解離させる酵素としては、これらに限定されるものではないが、トリプシン（ＴｒｙｐＬＥなど、様々な形で市販されている）または酵素混合物（例えばアキュターゼ（登録商標））が挙げられる。特定の態様では、培養表面に培養を形成させるために、多能性細胞を本質的に個別の細胞として（または分散させた細胞として）培地に添加または播種することができる。
【０１０９】
例えば、分散させた多能性細胞を、約１０４個細胞／ｍＬ〜約１０１０個細胞／ｍＬの密度で培地に播種する。より具体的には、多能性細胞を約１０５個細胞／ｍＬ〜約１０７個細胞／ｍＬ、または約０．５ｘ１０６個細胞／ｍＬ〜約３ｘ１０６個細胞／ｍＬの密度で播種する。これらの態様では、培養表面が当該分野において標準的な無菌的な細胞培養に適合する本質的に任意の材料、例えば非接着性表面によって構成されていてもよい。さらに培養表面は、本明細書に記載のマトリックス成分を含んでいてもよい。特定の態様では、細胞と培地を表面に接触させる前に、培養表面にマトリックス成分を処理してもよい。
【０１１０】
分化を誘導するために使用することのできる基質としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、マトリゲルなどが挙げられる。細胞を増殖誘導性の成長因子の存在下において懸濁液中に放置することで、増殖を再開させることなく（つまり神経球を解離させずに）、分化を誘導することができる。
【０１１１】
例示的な方法の１つには、培地に固定した基質上で細胞を培養することが含まれる。次に増殖誘導性の成長因子を細胞に投与することができる。増殖誘導性成長因子は細胞を基質（例えば、ポリオルニチン処理したプラスチックまたはガラス）に接着するように方向づけ、平らにして、様々な細胞型への分化を誘導することができる。
Ｖ．非静止培養
【０１１２】
特定の側面では、多能性幹細胞の培養および分化に非静止培養を用いることもができる。非静止培養は、例えば、振とう、回転、または攪拌機もしくは培養容器、特に大容量の回転型バイオリアクターを利用することで、細胞の運動速度を一定に制御するいかなる培養であってよい。撹拌することで、栄養素と細胞老廃物の循環が良くなる場合があり、また、より均一な環境を提供して細胞の凝集を制御するためにも撹拌が利用される。回転速度は例えば、少なくともまたは最大約２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００ｒｐｍ、またはもしくはこの中に導き出される任意の範囲の速度であってよい。多能性幹細胞、細胞凝集、分化した幹細胞、またはそれに由来する前駆細胞の非静止培養のインキュベーション期間は、少なくともまたは約４時間、８時間、１６時間、または１、２、３、４、５、６日間、または１、２、３、４、５、６、７週間、またはもしくはこの中に導き出される任意の範囲であってよい。
ＶＩ．細胞の遺伝子変異
【０１１３】
本発明の態様では、遺伝的に改変された本発明で想定する細胞（例えば、多能性細胞またはＤＡニューロン）を想定する。ポリヌクレオチドを人為的な操作のうち任意の好適な手段によって細胞に導入された細胞、または当初改変された細胞の後代であって、そのポリヌクレオチドを受け継いだ細胞は「遺伝子改変された」または「トランスジェニック」と呼ばれる。いくつかの側面では、この態様の細胞は、ＭＡＰ２プロモーターの制御下にある第一のマーカー遺伝子を含んでいる発現カセットを含む（例えば、プロモーターを含むＮＣＢＩの参照配列ＮＣ＿０００００２．１１を参照のこと（参照することにより本明細書に組み入れられる））。
【０１１４】
細胞の遺伝的改変には様々なメカニズムが利用され得る。例えば、組み込みがゲノム中の本質的に無作為な部位で生じる場合、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、アデノ関連ウイルスベクター（機能性Ｒｅｐ遺伝子をもたないもの）またはトランスポゾンシステムの一部、例えばピギーバックベクターによってポリヌクレオチドを導入することができる。他の側面では、ポリヌクレオチドを選択したゲノム中の部位に組み込む。例えば、核酸をＡＡＶＳ１組込み部位に組み込むことができる（例えば、機能性Ｒｅｐ遺伝子の存在下でアデノ関連ウイルスベクターを利用して）。同様に特定の側面では、相同性組換えによって、ゲノム中の選択した部位に組み込むことができる。哺乳類細胞における標準的なＨＲの効率は、処理した細胞のうちのわずか１０−６〜１０−９である（カペッチ、１９９０）。メガヌクレアーゼ、またはホーミングエンドヌクレアーゼ、例えばＩ−ＳｃｅＩがＨＲ効率の改善に使用されてきた。天然のメガヌクレアーゼならびに修正したターゲティング特性を有する改変型メガヌクレアーゼのいずれもがＨＲ効率の改善に利用されてきた（ピンゴウドおよびシルバ、２００７；シェバリエら、２００２）。ＨＲ効率を改善するための別の方法としては、キメラエンドヌクレアーゼをプログラム可能なＤＮＡ特異的ドメインで改変することがあった（シルバら、２０１１）。そのようなキメラ分子の一例としては、ＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメインがＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ、例えばＦｏｋＩなどの触媒ドメインと融合している、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（デュライらで総評されている、２００５；ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３０６０６）がある。別のクラスのそのような特異性分子としては、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ、例えばＦｏｋＩなどの触媒ドメインと融合させた、ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインが挙げられる（ミラーら、２０１１：ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０００１５４）。本明細書で使用する、ゲノム中の選択した部位での核酸の組み込みとは、ゲノム中の２つの連続したヌクレオチド部位の間に、または連続していない２つのヌクレオチド部位の間に、核酸分子（またはその一部）を挿入することを含み得る（例えば、介在性ゲノム配列の置換が生じる）。例えば、ゲノム中の選択した部位での組み込みとは、遺伝子のエキソン、イントロン、プロモーター、コード配列または遺伝子全体の置換を含む場合がある。
【０１１５】
本発明の特定の態様では、発現ベクター中にマーカー（例えば選択可能なマーカーもしくはスクリーニング可能なマーカー）を含めることで、所望の核酸構築物を含んでいる細胞をインビトロまたはインビボで同定することができる。そのようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を付与し、その発現ベクターを含んでいる細胞を容易に同定することができるようにする、あるいは濃縮を補助するまたは組織特異的なプロモーターを利用して、分化した神経細胞の同定を補助するものである。例えば、これらには限定されないが、ＴｕＪ−１、Ｍａｐ−２、Ｄｃｘ、シナプシン、エノラーゼ２、グリア線維酸性タンパク質、またはチューブリンアルファ−１Ａ鎖などのニューロン特異的プロモーターを使用してもよい。
【０１１６】
一般的に、選択可能なマーカーとは、選抜を可能にする特徴を付与するものである。選択可能な陽性マーカーとは、そのマーカーが存在することで選抜が可能になるものであり、一方、選択可能な陰性マーカーとは、マーカーの中でもそのマーカーが存在すると選抜が阻害されるマーカーである。選択可能な陽性マーカーの例としては薬剤耐性マーカーが挙げられる。一般に、薬剤選抜マーカーを含めることは、クローニングおよび形質転換体の同定に役立つ。例えば、ブラストサイジン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が有用な選択可能なマーカーである。
【０１１７】
実施条件に基づいて形質転換体の区別を可能にするような表現型を付与するマーカーに加えて、スクリーニング可能なマーカー（例えばＧＦＰ）（そのベースは発色分析である）などのその他の型のマーカーも想定される。また、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのスクリーニング可能な酵素を利用してもよい。当業者であれば、どのように免疫マーカーを使用するか（好ましくはＦＡＣＳ解析と併せて）を理解できる。マーカーは、それが遺伝子産物をコードしている核酸と同時に発現することが可能な限り使用することができる。選択可能なマーカーとスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は当業者にはよく知られている。
ＶＩＩ．ドーパミン作動性ニューロンの使用
【０１１８】
本発明の特定の側面の方法および組成物によって提供されるＤＡニューロンは、様々な応用に用いることができる。そのような例としては、これらには限定されないが、ＤＡニューロンを生体に移植または留置すること；細胞傷害性化合物、発がん物質、変異原成長／制御因子、医薬化合物などをインビトロでスクリーニングすること；神経変性のメカニズムを解明すること；薬剤および／または成長因子が作用するメカニズムについて研究すること；遺伝子治療；ならびに生物学的に活性な製品の生産が挙げられる。
Ａ．試験化合物のスクリーニング
【０１１９】
本発明の中脳ＤＡニューロンを使用して、本明細書で提供するＤＡニューロンの特徴に影響を及ぼす因子（溶媒、低分子薬、ペプチド、およびポリヌクレオチドなど）または環境条件（培養条件もしくは操作など）をスクリーニングすることができる。
【０１２０】
いくつかの応用例では、幹細胞（分化したものまたは未分化のもの）を使用して、細胞が神経細胞系列に沿って成熟するのを促進する因子、またや長期間培養においてそのような細胞を増殖させるまたは維持するのを促進する因子をスクリーニングする。例えば、候補となった神経成熟因子または成長因子を別々のウェルに入れて、幹細胞に加え、その後、結果として表れた表現型の変化の何れかを、さらに培養するためのおよび細胞の使用に関する望ましい基準に従って決定することによって、試験することができる。
【０１２１】
本発明の特定のスクリーニング例は、薬剤研究において医薬化合物を試験することに関する。読者は通常、一般的な教科書である、医薬研究におけるインビトロ法、アカデミックプレス、１９９７、および米国特許第５，０３０，０１５号を参照する。態様の特定の側面では、本明細書に詳述した方法によって生産した細胞を、これらが既に短期間培養において初代神経細胞について実施されているように、標準的な薬剤スクリーニングおよび毒性アッセイ（例えば、機能を明らかにするもしくは細胞系列特異的疾患を治療するために治療分子の送達について試験するために同定、確認および試験するための）に試験細胞として使用することができる。候補医薬化合物の活性評価には通常、本発明の特定の側面で提供されたニューロンを候補化合物と混合すること、その化合物に起因する全ての形態的な変化、マーカーの表現型の変化、または細胞の代謝活性の変化を決定すること（未処理の細胞または不活性化合物で処理した細胞と比較する）、次いで、化合物の影響と観察された変化とを関連づけること、が含まれる。スクリーニングは、その化合物がニューロン細胞に対して薬理学的効果をもつように設計されているため、あるいは化合物が他の場所に影響を及ぼし、神経細胞に意図しない副作用をもつように設計されているため、実施され得る。生じる得る薬剤間相互作用を検出するために、２種類以上の薬剤を組み合わせて試験する場合もある（細胞と同時に、または順次混合することによって）。
【０１２２】
いくつかの応用例では、化合物を最初、生じる可能性のある神経毒性の観点からスクリーニングする。まず、細胞の生存能、生存率、形態、および培地中への酵素の漏出に及ぼす影響から、細胞傷害性を決定することができる。より詳細な解析を実施して、その化合物が毒性を起こさずに細胞機能に影響を及ぼすか否かを決定する。
Ｂ．中枢神経系疾患の治療
１．中枢神経系の疾患
【０１２３】
神経前駆細胞または幹細胞を移植することで、中枢神経系疾患を有している患者の神経細胞を再生させることができる。そのような疾患としては、これらに限定されるものではないが、パーキンソニズム（parkinsonism）のような神経変性疾患が挙げられる。
【０１２４】
本明細書で使用する場合「パーキンソニズム」という用語は、いずれもが、脳の一部であり、運動を司っている大脳基底核におけるドーパミン不足と関連している一群の疾患を指す。その症状としては、振戦、動作緩慢（動きが非常に遅いこと）、屈曲姿勢、姿勢障害、および固縮が挙げられる。パーキンソニズムと診断するにはこれらの症状のうち、少なくとも２つが認められることが必要であり、そのうちの１つは振戦または動作緩慢でなくてはならない。最も一般的な形態のパーキンソニズムは特発性または古典的パーキンソン病（ＰＤ）であるが、診断された患者のうちのわずかではあるが一定数では、全患者のうちの約１５パーセントでは、パーキンソン病プラス（ＰＰＳ）のうちの１つが認められることがある。これらの症状は非定型パーキンソニズムとしても知られており、例えば、大脳皮質基底核変性症、レビー小体病、多系統萎縮症、および進行性核上性麻痺が挙げられる。パーキンソン病は通常、主に脳の黒質と呼ばれる部分において、生命維持に重要な神経細胞の機能不全と死を伴う。これら生命維持に重要な神経細胞の多くがドーパミンを生産している。これらのニューロンが死んでしまうと、ドーパミンの量が減少し、そのような症状を有している人は動きを正常に制御することができなくなる。腸にあるドーパミン細胞もパーキンソン病患者では変性しており、このことが、この疾患の一貫として生じる胃腸の症状の大きな原因となっている可能性がある。患者が経験する一連の症状は個々に異なる。パーキンソン病の初期に現れる運動障害には、手、腕、脚、顎および顔面の震え、動作緩慢または無動、脚および胴体の固縮またはこわばりならびに姿勢障害またはバランスおよび協調の障害がある。
２．細胞の投与方法
【０１２５】
幹細胞または分化細胞を、局所的または全身的のいずれかで対象に投与することができる。ＤＡニューロンの対象への投与方法が当該分野で知られている。患者が、自身の細胞に由来する細胞の投与を受ける場合、これを自己移植と言い、そのような移植では拒絶反応が生じる可能性が低い。
【０１２６】
幹細胞または分化細胞を対象、特にヒト対象に投与する方法の例としては、細胞を対象の標的部位（例えば、線条体および／または黒質）への注入または移植がある。幹細胞および／またはＤＡニューロンを、対象の細胞への導入を、注入または移植によって、促進する送達装置に挿入することもできる。そのような送達装置としては、例えば、細胞や液を受容する対象の体内に注入するための、チューブ（例えば、カテーテル）が挙げられる。好ましい態様では、それを介して本発明の細胞を対象の所望の一に導入することができる針を備えた管、例えばシリンジを使用する。幹細胞は種々の形態で、そのような送達装置、例えばシリンジに挿入することができる。例えば、細胞を溶液に懸濁することが、あるいは支持マトリックス中に（そのような送達装置に含まれる場合には）包埋することができる。
【０１２７】
幹細胞を取り込むまたは包埋することができる支持マトリックスとしては、受容者に適合し、かつ、受容者に害のない産物に分解するマトリックスが挙げられる。支持マトリックスは天然のものであっても（例えば、コラーゲンなど）および／または合成の生分解性マトリックスであってもよい。合成の生分解性マトリックスとしては、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの合成ポリマーが挙げられる。
【０１２８】
本明細書で使用する場合「溶液」という用語には、その中で本発明の細胞が生存可能な薬学上許容可能な担体または希釈剤が含まれる。薬学上許容可能な担体および希釈剤としては、生理食塩水、水性の緩衝溶液、溶媒および／または分散媒が挙げられる。そのような担体および希釈剤の使用は当該分野で知られている。溶液は、無菌的で、容易にシリンジに通る程度の流動性をもつことが好ましい。
【０１２９】
溶液は、製造および保管の条件で安定しており、かつ、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどを使用することで、細菌や真菌の汚染作用に対する保存性を有するものであることが好ましい。本発明の溶液は、本明細書に記載した幹細胞を、薬学上許容可能な担体または希釈剤、必要に応じて上に列挙したその他の成分、に組み入れ、その後、濾過滅菌することで調整することができる。
３．用量および投与
【０１３０】
一側面において、本明細書に記載の方法は、対象における前駆細胞またはＤＡニューロンの生着性を向上するための方法を提供する。一態様では、対象は哺乳類の場合がある。別の態様では、哺乳類はヒトの場合があるが、本発明は哺乳類全般に対して有効である。
【０１３１】
組成物は、剤形に適した様式で、かつ、治療上有効な量で投与される。投与される量およびタイミングは、治療される対象、活性成分に対する対象の系の許容量、および所望される治療効果の度合いによる。投与する必要のある各活性成分の正確な量は、医師の判断により、各患者に固有の量となる。しかしながら、好適な用量は投与経路による。好適な投与計画もまた多様である。
４．効力
【０１３２】
当業者は、ＤＡニューロンの生着性を高めるための所与の治療の効力を決定することができる。しかしながら、兆候または症状（例えばＤＡニューロンの生着性が低いこと）のうちのいずれか１つまたは全てが有益な様式で変化すれば、その他の臨床上許容可能な症状が改善すればまたは寛解すれば（例えば、本明細書で記載の細胞集団を使った治療後に少なくとも１０％改善すれば）、その治療は、本明細書で使用する用語の通り「効果的な治療」と見なされる。効力は、入院によって評価される患者の症状の悪化、医療介入の必要性（つまり、疾患の進行が停止される必要性）、または生着不全の頻度によっても測定することができる。これらの指標の測定方法は、当業者に知られており、および／または本明細書に記載されている。治療には、患者または動物（非限定的ないくつかの例としては、ヒトまたは哺乳類が挙げられる）における疾患に対するいかなる治療も含まれ、また、（１）疾患を阻害すること、例えば、生着不全を予防すること；または（２）疾患を緩和すること、例えば、症状を後退させることが含まれる。疾患の治療に関する有効量とは、それを必要とする哺乳動物に投与したときに、本明細書で定義するように、その疾患に対して有効な治療を生じるのに十分な量を意味する。薬剤の効力は、物理的な指標、例えば、ＤＡニューロンの生着性、例えば、振戦、動作緩慢、屈曲姿勢、バランスおよび協調などを評価することによって決定することができる。効力は、パーキンソン病の動物モデルを使って、例えば、階段テストや回転輪試験などの行動試験の実施によって評価することもできる。
Ｃ．商業的、治療用および研究目的での流通
【０１３３】
製造、流通および使用の目的では、本発明の神経細胞は通常、等張性の賦形剤または培地に入った細胞培養または懸濁液という形態で、必要に応じて、輸送または保管を容易にするために凍結されて、供給される。
【０１３４】
本発明はまた、製造、流通または使用のどんな時にも存在する一組または組み合わせの細胞を含んでいる種々の試薬系も含む。一組の細胞は、本開示で記載の２種以上の細胞集団の任意の組み合わせ、例えば、これらには限定されないが、プログラミング由来細胞（神経細胞系列の細胞、それらの前駆細胞およびサブタイプ）と未分化幹細胞または他の分化した細胞型の組み合わせが挙げられる。ある組に含まれている細胞集団は、同じゲノムまたはそれらの遺伝的改変型を共有していることがある。ある組に含まれているそれぞれの細胞型は、一緒に梱包してもまたは同じ設備に含まれる別々の容器に入れても、あるいは別々の場所にあっても、同時にもしくは時間的に別々にあっても、同じ実体の管理下にあってもまたは取引関係のあるい別の実体の管理下にあってもよい。
【実施例】
【０１３５】
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含まれるものである。当業者であれば理解できるように、以下の実施例で開示される技術は、本発明の実践において最もうまく機能することが発明者らによって発見された技術であり、そのため、その実践に関する好ましい形態であると見なすことができる。しかしながら、当業者は、本開示を踏まえて、開示されている特定の態様に多くの変更を施すことができ、それでもなお、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、似ているまたは同様の結果が得られることを理解する。
実施例１-多能性細胞からの中脳ＤＡの生産
細胞株の改変
【０１３６】
ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞株を、ヒトＭＡＰ２プロモーターで誘導されるネオマイシン耐性遺伝子とＰＧＫプロモーターで誘導されるピューロマイシン耐性遺伝子をコードしている構築物で改変した。この構築物をジンクフィンガーヌクレアーゼ介在性相同性組換えによってＡＡＶＳ１部位に挿入した。ピューロマイシンで選抜した後、クローンＭＡＰ２  Ｎｅｏ＃２を選抜し、ディスパーゼを使った剥離およびｍＴｅＳＲ１培地を使い、マトリゲル上で増殖させた。細胞株をＥＤＴＡを使った剥離とエッセンシャル８培地に変更し、その後、マスター細胞バンクを凍結させた。
ＤＡ前駆細胞の誘導と増殖
【０１３７】
２日前（−２日目）に、ＭＡＰ２  Ｎｅｏ＃２  ｉＰＳ細胞をＴｒｙｐＬＥ解離酵素（７分）で剥離し、２．５μＭのブレビスタチンを含有するエッセンシャル８培地に入れたマトリゲル上に３．３×１０４個細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした（３７℃、５％ＣＯ２）。前日（−１日目）および０日目に、細胞にエッセンシャル８培地を加えた。
【０１３８】
分化１日目に、神経誘導（ＢＭＰ−およびＴＧＦβ−シグナル阻害剤を使ったＳＭＡＤの二重阻害を介した）、底板への特異化（ソニックヘッジホッグシグナル伝達を介した）、および中脳ＤＡニューロンへの特異化（ＷＮＴシグナル伝達を介した）を同時に誘導した。１日目の培地は、Ｂ２７サプリメントを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を含むもので、かつ、低分子阻害剤と活性化剤の混液（「誘導用混液」、２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、１０μＭのＳＢ４３１５４２、２μＭのパルモルファミン、１００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ  Ｃ２５ＩＩおよび１．２５μＭのＣＨＩＲ  ９９０２１）を含有していた。２日目、細胞に同じ培地を加え、さらに、１μＭのＰＤ０３２５９０１、中脳の特異化をより迅速により効率的に誘導するＭＥＫ阻害剤も加えた（Ｂ２７添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋誘導用混液＋１μＭのＰＤ０３２５９０１）。３日目および４日目には、Ｂ２７（−ビタミンＡ）＋誘導用混液＋１μＭのＰＤ０３２５９０１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を細胞に加えた。
【０１３９】
５日目、ＴｒｙｐＬＥ（１５分）で細胞を解離させ、スピナーフラスコでの浮遊培養に移して凝集体を形成させた。細胞は、Ｂ２７（−ビタミンＡ）＋２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、２μＭパルモルファミン、１００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ  Ｃ２５ＩＩ、１．２５μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１および１０μＭのブレビスタチンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中、１×１０６個細胞／ｍＬの密度で培養した（３７℃、７％  ＣＯ２）。６日目、凝集体を沈降させ、培地の６６％を除去し、凝集体に、Ｂ２７（−ビタミンＡ）＋２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、２μＭパルモルファミン、１００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ  Ｃ２５ＩＩおよび１．２５μＭ  ＣＨＩＲ  ９９０２１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を加えた。７〜１０日目には、凝集体に、Ｂ２７（−ビタミンＡ）＋２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９および１．２５μＭ  ＣＨＩＲ  ９９０２１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を毎日加えた（培地の７５％を交換した）。１１〜１６日目、ＤＡ前駆細胞の培養に、ＦＧＦ８ｂと高濃度のＣＨＩＲ  ９９０２１を加えて増幅し：凝集体に、Ｂ２７（−ビタミンＡ）＋２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１および１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ８ｂを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を毎日加えた（培地の７５％を交換）。
ＤＡニューロンの成熟、薬剤選抜および凍結保存
【０１４０】
１７日目、ＴｒｙｐＬＥ（１５分）で凝集体を解離させ、単細胞の懸濁液とした。細胞を、１１〜１６日目に使ったとの同じ培地に２．５μＭのブレビスタチンを加えた培地に入れたマトリゲル上に５．２×１０５個細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした（３７℃、５％  ＣＯ２）。１８日目、培地を「成熟培地」（Ｂ２７（−ビタミンＡ）（ギブコ（登録商標））およびグルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）＋２０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３，２００μＭのアスコルビン酸、５００μＭのジブチリルｃＡＭＰおよび５μＭのＤＡＰＴを添加したニューロベーサル培地）と交換した。細胞には成熟培地を１日おきに加えた（１８、２０および２２日目）。
【０１４１】
２４日目に、アキュターゼ（４５分）で細胞を解離し、２．５μＭのブレビスタチンを含有いている成熟培地を入れたポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニン（ＰＬＯ／ラミニン）で予めコーティングしておいたフラスコに、３．１×１０５個細胞／ｃｍ２の密度で再度プレーティングした。２５日目には、細胞に成熟培地を加えた。２７日目と２９日目に、１００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有している成熟培地を細胞に加え、パンニューロナルＭＡＰ２プロモーターの制御下にあるネオマイシン耐性遺伝子を発現していない細胞に対する選抜を行った。
【０１４２】
３１日目に、アキュターゼ（４５分）を使って細胞を解離し、１００μｇ／ｍＬのＧ４１８と２．５μＭのブレビスタチンを含有した成熟培地を入れたＰＬＯ／ラミニンフラスコに３．１×１０５個細胞／ｃｍ２の密度で再度プレーティングした。３２、３４および３６日目に、細胞に成熟培地を加えた。３８日目に、細胞をアキュターゼ（４５分）で解離し、１．２５×１０７個細胞／ｍＬの密度でクライオストア（ＣｒｙｏＳｔｏｒ）ＣＳ１０培地に入れて冷却速度制御型冷凍庫で凍結保存した。
ＤＡニューロンの解析
【０１４３】
細胞の定量的な遺伝子発現プロファイルを、分化前（ヒトｉＰＳ細胞）、中脳ＤＡニューロン分化過程の６日目（ドーパミン作動性ニューロン分化の６日目）、および分化完了後（４２日目）に決定した。ＲＮＡを単離した後、リアルタイム定量的ＰＣＲを、タックマン（登録商標）遺伝子発現アッセイ（アプライド・バイオシステムズ）を使って実施し、結果を対照であるＧＡＰＤＨに対する相対的な発現量として表した。これらの研究結果を図１に示した。ニューロンサブタイプマーカーであるｖＧＡＴ、Ｎｋｘ６．１、ｖＧＬＵＴ１、ＮＧＮ２ならびに中脳マーカーのＦｏｘＡ２、Ｌｍｘ１ａおよびＯＴＸ２の発現量が上昇していることから分かるように、この図は、神経誘導が６日目までに検出されることを示している。４２日目には、中脳ＤＡニューロンで発現するその他の遺伝子（ＥＮ１、ＮＵＲＲ１、ＴＨ、ＤＲＤ２、ＧＩＲＫ２、ＶＭＡＴ２、ＤＲＤ２、ＣＡＬＢ１、ＴＵＢＢ３、ＳＹＮ１、ＳＹＰ、ｖＧＬＵＴ２）の発現量も上昇していた。
【０１４４】
細胞をさらに解析し、ＦｏｘＡ２とＬｍｘ１ａ（中脳ＤＡニューロン前駆細胞に由来する底板の特異的マーカー）が同時に発現していることを決定した。分化過程の１５日目には、ハイコンテンツイメージングを使った定量的ＩＣＣから、８０％を超える（８１．７％）細胞がＦｏｘＡ２とＬｍｘ１の両方を発現していることが分かった。フローサイトメトリー解析でこれらの結果を確認したところ、細胞のうちのわずか１６％がＦｏｘＡ２＋／Ｌｍｘ１−であり、細胞のうちの３％がＦｏｘＡ２−／Ｌｍｘ１−であった。
【０１４５】
細胞集団の遺伝子発現に及ぼす薬剤選抜の影響についても解析した。図３は、ニューロンに分化したｉＰＳ細胞のフローサイトメトリーの結果を示している。このｉＰＳ細胞株（ＭＡＰ２  Ｎｅｏ＃２（０１２７９．１０７．００４０２））は、上述したように、ゲノム内の安全な領域であるＡＡＶＳ１部位でのジンクフィンガーヌクレアーゼ介在性相同的組換えによって生成したものである。中脳ＤＡニューロンの分化プロトコールを薬剤選抜を行わずに実施すると、３９％がニューロンである（Ｍａｐ２＋／ネスチン−）細胞集団が３８日目に得られる。この非神経細胞（Ｍａｐ２−／ネスチン＋）は増殖を続け、ＦｏｘＡ２もチロシン水酸化酵素（ＴＨ）も発現しなかった。一方、Ｇ４１８を使った遺伝的薬剤選抜を実施すると、高度に精製されたニューロンの集団（９５％がＭａｐ２＋／ネスチン−）が得られた。さらにマーカー分析を行い（以下に詳細を記載する）、これら細胞のうちの大部分が中脳ＤＡニューロンの表現型を有することを明らかにした。
【０１４６】
細胞を解析して、融解後の様々な時点でのそれらの遺伝子発現プロファイルも決定した。具体的には、細胞を分化プロトコールの３８日目に凍結保存し、その後融解して、ＲＮＡを単離するまで、指示した期間、ＰＬＯ／ラミニンにプレーティングした。リアルタイム定量的ＰＣＲを、タックマン（登録商標）遺伝子発現アッセイ（アプライド・バイオシステムズ）を使って実施し、結果を対照であるＧＡＰＤＨに対する相対的な発現量として表した。図４に示した結果は、細胞が、中脳領域の形成を示す遺伝子、ならびに、ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、および底板由来中脳ＤＡニューロンのマーカーを発現していることを表している。前脳領域形成に関するマーカー（ＦｏｘＧ１）または他のニューロンのサブタイプのマーカー（ＤＢＨ、ＣＨＡＴ、ＯＬＩＧ２）はほとんど発現していないか、または陰性であった。融解後、４２日間の時間経過に沿って、大部分の遺伝子が似たような発現レベルを示した。発現プロファイルは、ヒト中脳黒質（ＳＮ）から抽出したＲＮＡのプロファイルとよく一致している。
【０１４７】
また、細胞を融解後に、ＦｏｘＡ２とＬｍｘ１ａの共発現についても試験した。具体的には、細胞を分化プロトコールの３８日目に凍結保存し、その後融解して、７日間、ＰＬＯ／ラミニンにプレーティングした。ハイコンテンツイメージングを使った定量的免疫細胞化学（ＩＣＣ）から、細胞のうちの９４％がＦｏｘＡ２を、９６％がＬｍｘ１を、および細胞のうちの９１％がＦｏｘＡ２とＬｍｘ１の両方を発現していることが分かった。従って、成熟した細胞の大部分で中脳の表現型が維持されている。ＦｏｘＡ２の発現についてもフローサイトメトリーで確認し、その結果、９６％の細胞がＦｏｘＡ２＋であった。細胞は、ＤＡニューロンに特徴的なマーカーであるチロシン水酸化酵素（ＴＨ）も共発現している（イソ型の対照染色に対して８８％）。加えて、９７％の細胞が、パン−ニューロンマーカーのＭａｐ２で染まった（図５を参照のこと）。融解後、長期間培養した後でさえも、中脳ＤＡニューロンの表現型は維持された。融解後１４日目には、ＴＨの発現レベルは融解後３日目に比べて増加し、ニューロンの純度は維持されていて（９８％）、ネスチン＋細胞の増殖は認められなかった（図６を参照のこと）。
【０１４８】
加えて、本実施例に従って、ＦＧＦ８含有培地で生産したＤＡニューロンが、スプラーグドーリーラットおよび非ヒト霊長類で効率的に生着することが分かった。
実施例２-多能性細胞からの中脳ＤＡの生産、ＦＧＦ８なし／早期凍結保存型プロトコール
ＤＡ前駆細胞の誘導と増殖
【０１４９】
２日前（−２日目）に、ＭＡＰ２  Ｎｅｏ＃２  ｉＰＳ細胞をＴｒｙｐＬＥ解離酵素（７分）で剥離し、２．５μＭのブレビスタチンを含有するエッセンシャル８培地に入れたマトリゲル上に３．３×１０４個細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした（３７℃、５％ＣＯ２）。前日（−１日目）および０日目に、細胞にエッセンシャル８培地を加えた。
【０１５０】
分化１日目に、神経誘導（ＢＭＰ−およびＴＧＦβ−シグナル阻害剤を使ったＳＭＡＤの二重阻害を介した）、底板への特異化（ソニックヘッジホッグシグナル伝達を介した）、および中脳ＤＡニューロンへの特異化（ＷＮＴシグナル伝達を介した）を同時に誘導した。１日目の培地は、Ｂ２７サプリメントを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を含むもので、かつ、低分子阻害剤と活性化剤の混液（「誘導用混液」、２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、１０μＭのＳＢ４３１５４２、２μＭのパルモルファミン、１００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ  Ｃ２５ＩＩおよび１．２５μＭのＣＨＩＲ  ９９０２１）を含有していた。２日目、細胞に同じ培地を加え、さらに、１μＭのＰＤ０３２５９０１、中脳の特異化をより迅速により効率的に誘導するＭＥＫ阻害剤も加えた（Ｂ２７添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋誘導用混液＋１μＭ  ＰＤ０３２５９０１）。３日目および４日目には、Ｂ２７（−ビタミンＡ）＋誘導用混液＋１μＭのＰＤ０３２５９０１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を細胞に加えた。
【０１５１】
５日目、ＴｒｙｐＬＥ（１５分）で細胞を解離させ、スピナーフラスコでの浮遊培養に移して凝集体を形成させた。細胞は、Ｂ２７（−ビタミンＡ）＋２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、２μＭパルモルファミン、１００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ  Ｃ２５ＩＩ、１．２５μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１および１０μＭのブレビスタチンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中、１×１０６個細胞／ｍＬの密度で培養した（３７℃、７％  ＣＯ２）。６日目、凝集体を沈降させ、培地の６６％を除去し、凝集体に、Ｂ２７（−ビタミンＡ）＋２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、２μＭパルモルファミン、１００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ  Ｃ２５ＩＩおよび１．２５μＭ  ＣＨＩＲ  ９９０２１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を加えた。７〜９日目には、凝集体に、Ｂ２７（−ビタミンＡ）＋２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９および１．２５μＭ  ＣＨＩＲ  ９９０２１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を毎日加えた（培地の７５％を交換した）。１０〜１２日目、ＤＡ前駆細胞の凝集体に、Ｂ２７（−ビタミンＡ）＋２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、および３μＭのＣＨＩＲ  ９９０２１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を毎日加えた（培地の７５％を交換）。
ＤＡニューロンの成熟、必要に応じた薬剤選抜と凍結保存
【０１５２】
１３日目、ＴｒｙｐＬＥ（１５分）で凝集体を解離させ、単細胞の懸濁液にした。細胞を、１０〜１２日目に使ったとの同じ培地に２．５μＭのブレビスタチンを加えた培地に入れたマトリゲル上に５．２×１０５個細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした（３７℃、５％  ＣＯ２）。１４日目、培地を「成熟培地」（Ｂ２７（−ビタミンＡ）（ギブコ（登録商標））およびグルタマックス＋２０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３、２００μＭのアスコルビン酸、５００μＭのジブチリルｃＡＭＰおよび５μＭのＤＡＰＴを添加したニューロベーサル培地）と交換した。細胞には成熟培地を１日おきに加えた（１６および１８日目）。
【０１５３】
１９日目に、アキュターゼ（４５分）で細胞を解離し、２．５μＭのブレビスタチンを含有いている成熟培地を入れたポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニン（ＰＬＯ／ラミニン）で予めコーティングしておいたフラスコに、３．１×１０５個細胞／ｃｍ２の密度で再度プレーティングした。２０、２２および２４日目に、細胞に成熟培地を加えた。薬剤選抜にかけた細胞と未選抜の細胞を比較するために、いくつかの実験では、２２および２４日目に、枝付き条件の細胞に、１００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有している成熟培地を加え、パンニューロナルＭＡＰ２プロモーターの制御下にあるネオマイシン耐性遺伝子を発現していない細胞に対する選抜を行った。
【０１５４】
２６日目に、細胞をアキュターゼ（４５分）で解離し、１．２５×１０７個細胞／ｍＬの密度でクライオストア（ＣｒｙｏＳｔｏｒ）ＣＳ１０培地に入れて冷却速度制御型冷凍庫で凍結保存した。
ＤＡニューロンの解析
【０１５５】
凍結保存した後、細胞を融解し、ＰＬＯ／ラミニンにプレーティングした。７日後、ハイコンテンツイメージングを使った定量的ＩＣＣにより、ＦｏｘＡ２とＬｍｘ１を発現している細胞を可視化した。これら研究の結果は、８３％（８３．２２％）の細胞がＦｏｘＡ２を、８４％（８４．０２％）の細胞がＬｍｘ１を、および７８％（７７．９７％）の細胞がＦｏｘＡ２とＬｍｘ１の両方を発現していることを意味している。従って、中脳の表現型は成熟細胞の大部分で維持されている。
【０１５６】
さらなる研究では、成熟中脳ＤＡニューロンの純度を、フローサイトメトリーによって「ＦＧＦ８なし」プロトコール単独で生成した細胞と薬剤選抜法を加えて得た細胞とを比較して評価した。これら研究の結果を図７に示している。薬剤選抜をせずに２６日目に細胞を凍結保存した場合、そのうちの９９％がＦｏｘＡ２＋、４０％がＴＨ＋、および７７％がＭａｐ２＋であった。しかしながらこの時点では、Ｍａｐ２とＴＨはまだ発現が上昇している最中であり、融解後に培養を始めて７日後には、最終的なニューロン（Ｍａｐ２）の純度は９０％に達し、９３％の細胞がＦｏｘＡ２を、そして５５％の細胞がＴＨを発現していた。比較するために、同じプロトコールに薬剤選抜（＋Ｇ４１８）を加えて細胞を生産したところ、融解後培養７日目の最終的な純度は、ＦｏｘＡ２＋が９６％、ＴＨ＋が６３％、およびＭａｐ２＋が９８％であった。
【０１５７】
さらなる研究において、薬剤選抜をして得られた中脳ＤＡニューロン（実施例１；ｉＣｅｌｌドーパニューロンを参照のこと）と薬剤選抜なしで得られた中脳ＤＡニューロン（実施例２のＦＧＦ８なしプロトコールを使用）の遺伝子発現を比較した。これらの実験のために、分化細胞からＲＮＡを単離し、タックマン（登録商標）遺伝子発現アッセイを使って解析した。比較するために、幹細胞由来前脳ニューロン（ｉＣｅｌｌニューロン）およびヒト中脳黒質からもＲＮＡを単離した。結果を図８に示す。ここから多くの場合で、ＦＧＦ８なしプロトコールで生産した細胞の遺伝子発現と、ＦＧＦ８を使った標準的なプロトコールで生産した細胞の遺伝子発現のパターンが非常に似ていることが分かった（実施例１のプロトコール対実施例２のプロトコール）。１つ顕著に異なっていたのは、ＦＧＦ８によって上方制御されることが知られているエングレイルド（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ）１（ＥＮ１）の発現である。いずれの発現プロファイルも、ヒト中脳黒質（ＳＮ）から抽出したＲＮＡのプロファイルとよく一致している。幹細胞由来前脳ニューロンの発現プロファイルだけが大きく異なっていて、中脳ＤＡニューロンのマーカーであるＦｏｘＡ２、Ｌｍｘ１、Ｎｕｒｒ１、ＴＨ、ｖＭＡＴ２、およびＡＡＤＣなどの発現が減少し、前脳マーカーのＦｏｘＧ１の発現が増加している。
【０１５８】
本明細書で開示し、特許請求した方法の全ては、本開示を踏まえれば過度の実験を行うことなく作成および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい態様の観点から説明してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法に、およびその工程に、またはその工程の順序に、変更を施すことができることは当業者には明らかである。より具体的には、同じまたは同様の結果が達成されるのであれば、本明細書に記載の薬剤を、化学的におよび生理学的に関連する特定の薬剤と置き換えてもよいと理解される。そのような当業者に明らかな類似した置き換えおよび修正は、添付の特許請求項によって定義されるように、本発明の精神、範囲および概念に含まれると見なされる。
【０１５９】
参考文献
以下に挙げる参考文献は、本明細書に示した方法またはその他の詳細を補足する例示的な方法またはその他の詳細を提供する程度において、特に参照することにより本明細書に組み入れられる。
米国特許第５，８４３，７８０号
米国特許第６，２００，８０６号
米国特許第６，８３３，２６９号
米国特許第７，０２９，９１３号
米国特許出願第６１／０５８，８５８号
米国特許出願第６１／１７２，０７９号
米国特許出願第６１／１８４，５４６号
米国特許出願第２００２／０１６８７６６号
米国特許出願第２００３／００２２３６７号
米国特許出願第２００３／０２１１６０３号
米国特許出願第２００３００８７９１９号
米国特許出願第２００３０１２５３４４号
米国特許出願第２００４０００２５０７号
米国特許出願第２００４０００２５０８号
米国特許出願第２００４００１４７５５号
米国特許出願第２００５０１９２３０４号
米国特許出願第２００５０２０９２６１号
米国特許出願第２００７／０１１６６８０号
米国特許出願第２００７／０２３８１７０号
米国特許出願第２００８／０１７１３８５号
米国特許出願第２０１１／０２２９４４１号
米国特許出願第２０１２／０２７６０６３号
ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２４４８７
ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４６７９６
実践的な手法（Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ）１９８７
アンドリューらによる「奇形種および胚性幹細胞（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）」より。ロバートソン編、ＩＲＬプレス、２０７〜２４６，１９８７
動物細胞の培養（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）、１９８７
ボッテンシュタインおよびサトウ、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）７６：５１４〜５１７、１９７９
ビルネら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４５０（７１６９）：４９７〜５０２、２００７
チェンら、セル（Ｃｅｌｌ）１３３：１１０６〜１１１７、２００８
チェンら、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）８：４２４〜４２９、２０１１
分子生物学の最新手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）および分子生物学の手短なプロトコール（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９８７および１９９５
ドエら、薬理学・実験的治療学雑誌（Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．）３２：８９〜９８、２００７
インビトロにおける胚性幹細胞の分化（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、１９９３
エヴァンズら、ネイチャー  ２９２：１５４、１９８１
フェルナンデスら、生物学雑誌（Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１３２（２）：２２７〜２３６、２００７
遺伝子ターゲティング；実践的な手法（Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、オックスフォード大学出版のＩＲＬプレス、１９９３
哺乳類細胞の遺伝子導入ベクター（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ）、１９８７
グレバーら、幹細胞（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）２５：４５５〜４６４、２００７
マウスの発生に関する技術の指針（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、１９９３
ハーブら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０；３（８）：ｅ３００１、２００８
国際特許出願第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号および同第２００４／０３９７９６号
国際公開第２００５／１２３９０２
国際公開第２００１／０８８１００
国際公開第２００５／０８０５５４
国際公開第２０１３／０６７３６２
イシザキら、分子薬理学雑誌（Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）５７：９７６〜９８３、２０００
ジェインチルら、ウイルス学雑誌（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．）４：５４９、１９６９
ケラーら、細胞生物学の最新の知見（Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）７：８６２〜８６９、１９９５
キムら、ネイチャー  ４１８：５０〜５６、２００２
クリマンスカヤら、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）３６５：Ｐ１６３６〜１６４１、２００５
コダマら、細胞生理学雑誌（Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．）１１２：８９、１９８２
クレンチックら、ネイチャー・バイオテクノロジー  ２９：５２８〜５３４、２０１１。
クレンチックおよびシャン、ネイチャー・プロトコールズ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）６（１１）：１７１０〜１７１７、２０１１。
ラドヴィグら、ネイチャー・バイオテクノロジー  ２４（２）：１８５〜１８７、２００６ｂ
ラドヴィグら、ネイチャー・メソッズ  ３（８）：６３７〜４６、２００６ａ
マウス胚の取り扱い；実験の手引き（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第二版、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、１９９４
マーティン、米国科学アカデミー紀要  ７８：７６３４、１９８１
ナカジマら、癌の化学療法と薬理（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）５２：３１９〜３２４、２００３
ナカノら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２７２、７２２、１９９６
オガワら、細胞科学雑誌（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．）１２０：５５〜６５、２００７
ペリエら、米国科学アカデミー紀要  １０１（３４）：１２５４３〜８、２００４
胚性幹細胞の特徴と使用：ヒト生物学および遺伝子治療への応用に向けて（Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９８。
レイビノフら、ネイチャー・バイオテクノロジー  １８：３９９〜４０４、２０００
ササキら、薬理学的治療（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．）９３：２２５〜２３２、２００２
シュワルツら、メソッズ（Ｍｅｔｈｏｄｓ）４５（２）：１４２〜１５８、２００８
スミス「マウス胚性幹細胞の由来と特性（Ｏｒｉｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）」より、細胞・発生生物学紀要（Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｃｅｌｌ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．）、２０００
ステルンエッカートら、幹細胞（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）２８：１７７２〜１７８１、２０１０
スズキら、米国科学アカデミー紀要  １０３：１０２９４〜１０２９９、２００６
タカハシおよびヤマナカ、セル  １２６：６６３〜６７６、２００６
タカハシら、セル  １２６（４）：６６３〜７６、２００７
タカハシら、セル  １３１：８６１〜８７２、２００７
トマソンおよびマーシャル、発生生物学の最新のトピック（Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．）３８：１３３〜１６５、１９９８
トマソンおよびオドリコ、生物工学のトレンド（Ｊ．  Ｔｒｅｎｄｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）１８：５３B５７、２０００
トマソンら、米国科学アカデミー紀要  ９２：７８４４〜７８４８、１９９５
トマソンら、サイエンス  ２８２：１１４５、１９９８
ワタベおよびミヤゾノ、細胞学研究（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．）１９：１０３〜１１５、２００９
ワタナベら、ネイチャー・ニューロサイエンス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．）８：２８８〜２９６、２００５
シュウら、細胞幹細胞（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）３：１９６〜２０６、２００８
シュウら、ネイチャー・バイオテクノロジー  １９：９７１〜９７４、２００１
ヤクボフら、生物化学・生物物理学研究通信（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）３９４：１８９〜１９３、２０１０
インら、セル  １１５：２８１〜２９２、２００３
ユーおよびトマソン、遺伝子と発生（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．）２２（１５）：１９８７〜９７、２００８
ユーら、サイエンス  ３１８：１９１７〜１９２０、２００７
ユーら、サイエンス  ３２４（５９２８）：７９７〜８０１、２００９
【図１】
0006718431.tif 000002
【図２】
0006718431.tif 000003
【図３】
0006718431.tif 000004
【図４】
0006718431.tif 000005
【図５】
0006718431.tif 000006
【図６】
0006718431.tif 000007
【図７】
0006718431.tif 000008
【図８】
0006718431.tif 000009