(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合し、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の特徴を有する抗体
（ａ）配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列を、軽鎖ＣＤＲ１〜３として各々含む、軽鎖可変領域と、
配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列を、重鎖ＣＤＲ１〜３として各々含む、重鎖可変領域を保持する
（ｂ）配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列を、軽鎖ＣＤＲ１〜３として各々含む、軽鎖可変領域と、
配列番号：２２〜２４に記載のアミノ酸配列を、重鎖ＣＤＲ１〜３として各々含む、重鎖可変領域を保持する
（ｃ）配列番号：２７〜２９に記載のアミノ酸配列を、軽鎖ＣＤＲ１〜３として各々含む、軽鎖可変領域と、
配列番号：３２〜３４に記載のアミノ酸配列を、重鎖ＣＤＲ１〜３として各々含む、重鎖可変領域を保持する。
【請求項２】
ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合し、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の特徴を有する抗体
（ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列を軽鎖ＣＤＲ１〜３として含み、かつ配列番号：３に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列を重鎖ＣＤＲ１〜３として含み、かつ配列番号：９に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と
を保持する
（ｂ）配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列を軽鎖ＣＤＲ１〜３として含み、かつ配列番号：１５に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：２１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、配列番号：２２〜２４に記載のアミノ酸配列を重鎖ＣＤＲ１〜３として含み、かつ配列番号：２１に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と
を保持する
（ｃ）配列番号：２６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、配列番号：２７〜２９に記載のアミノ酸配列を軽鎖ＣＤＲ１〜３として含み、かつ配列番号：２６に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：３１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、配列番号：３２〜３４に記載のアミノ酸配列を重鎖ＣＤＲ１〜３として含み、かつ配列番号：３１に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と
を保持する。
【請求項３】
ヒト由来の定常領域を有する、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性から選択される少なくとも１の細胞障害活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項６】
抗がん剤である、請求項５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Ｅｖａ１タンパク質抗体に関し、より詳しくは、特定のアミノ酸配列からなる相補性決定領域（ＣＤＲ）を保持し、ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合する抗体、及び該抗体を有効成分とする抗がん剤等の医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、冠状動脈疾患と共に、先進国における主たる死因であり、その割合も年々増加の一途を辿っている。そのため、がんの根絶療法の早急な開発が希求されている。
【０００３】
がんの根治療法の開発において、がん幹細胞の存在が近年重要視されている。がん幹細胞は、がんの組織のごく一部にしか存在していないものの、自己複製を繰り返し、さらに分化することによって大多数のがん細胞を創出する元になっていると考えられている。また、このような強い腫瘍形成能を有する一方で、がん幹細胞は、化学療法、放射線療法に対して強い耐性能を有していることが示唆されている。そのため、化学療法、放射線療法によって、がん組織における大部分のがん細胞が死滅し得たとしても、がん幹細胞が残存することにより、がんの再発、転移等が生じることとなる。然るに、がん幹細胞を標的として、それも死滅させることができれば、がんの転移や再発等の防止にも有用な治療法の開発につながることが期待されている。
【０００４】
かかる状況を鑑み、本発明者らは、グリオーマ及びそのがん幹細胞において高発現しているタンパク質としてＥｖａ１タンパク質を同定することに成功している。さらに、このＥｖａ１タンパク質の発現は、グリオーマの悪性度と相関しており、グリオーマ患者の生存率とその患者由来のグリオーマにおけるＥｖａ１遺伝子の発現との間には強い相関があることを明らかにしている。また、Ｅｖａ１遺伝子の機能の抑制が、グリオーマ細胞の増殖能、腫瘍形成能及び組織浸潤能、並びにグリオーマ幹細胞の腫瘍塊形成能の抑制において有効であることも見出している（特許文献１）。
【０００５】
また、がんにおいて、このグリオーマは、この数十年間、手術を基本として放射線治療及び化学療法を補助療法とする治療がほとんど変わっておらず、特に中枢神経系組織における悪性グリオーマのうち最も悪性度の高い多形神経膠芽腫（ＧＢＭ、ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）に対して、有効な治療法は未だ見出されていない。さらに、悪性グリオーマに対する標準治療薬としてテモゾロミドが用いられているが、有効血中濃度の数倍のテモゾロミドに対しても、グリオーマ幹細胞は非感受性であることを発明者らは確認している。また。このような化学療法剤に曝露されたがん細胞は、グリオーマに限らず、それに対する耐性が生じ、他の複数の化学療法剤に対しても同様に交差耐性が生じることも多い。さらに、化学療法剤は正常細胞に対しても細胞傷害をもたらすことが多々あり、そのような副作用を低減するため、化学療法剤の用量又は用法は多くの場合制約される。
【０００６】
かかる現状から、近年、抗がん剤としての抗体の利用が注目され、その重要性が認められつつある。例えば、がん特異的な抗原を標的とした抗体であれば、投与した抗体はがん組織に集積することが推定されるため、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性や補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性による、免疫システムを介したがん細胞への攻撃が期待できる。また、抗体に細胞毒性物質や放射性核種等の薬剤を結合しておくことにより、結合した薬剤を効率よく腫瘍部位に送達することが可能となる。これにより、他組織への薬剤到達量を減少させ、ひいては副作用の軽減を見込むことができる。がん特異的抗原に細胞死を誘導する活性がある場合は、アゴニスティックな活性を持つ抗体を投与することで、また、がん特異的抗原が細胞の増殖及び生存に関与する場合は、中和活性を持つ抗体を投与することで、腫瘍特異的な抗体の集積と抗体の活性によって、がんの増殖停止または退縮が期待できる。このような特性から、抗体は抗がん剤としての適用に好適であると考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０４３７４７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、グリオーマ等のがん、特にがん幹細胞において高発現している、Ｅｖａ１タンパク質を標的とする抗体、ひいては該抗体を有効成分とする抗がん剤等の医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に対して高い親和性を示す、３種のマウスモノクローナル抗体（Ｂ２Ｅ５−４８抗体、Ｃ３抗体、Ａ５Ｄ１１−１０抗体）を得ることに成功した。また、Ｂ２Ｅ５−４８抗体及びＣ３抗体に関しては、これらの定常領域をヒト由来のものに置換したキメラ抗体も作製した。そして、これらマウス抗体及びキメラ抗体が、高いＡＤＣＣ活性及び／又はＣＤＣ活性を有することも見出した。さらに、メラノーマ細胞を投与したマウスに、これら抗体を投与することによって、当該細胞の肺への転移等が抑制されることも明らかにし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
＜１＞  ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合し、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の特徴を有する抗体
（ａ）配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列、配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸配列を、ＣＤＲとして含む可変領域を保持する
（ｂ）配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列、配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列、配列番号：２２〜２４に記載のアミノ酸配列、配列番号：２２〜２４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに配列番号：２２〜２４に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸配列を、ＣＤＲとして含む可変領域を保持する
（ｃ）配列番号：２７〜２９に記載のアミノ酸配列、配列番号：２７〜２９に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号：２７〜２９に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列、配列番号：３２〜３４に記載のアミノ酸配列、配列番号：３２〜３４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、並びに配列番号：３２〜３４に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸配列を、ＣＤＲとして含む可変領域を保持する。
＜２＞  ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合し、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の特徴を有する抗体
（ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列、配列番号：３に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号：３に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：９に記載のアミノ酸配列、配列番号：９に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号：９に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）配列番号：１５に記載のアミノ酸配列、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号：１５に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：２１に記載のアミノ酸配列、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号：２１に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｃ）配列番号：２６に記載のアミノ酸配列、配列番号：２６に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号：２６に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：３１に記載のアミノ酸配列、配列番号：３１に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号：３１に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
＜３＞  ヒト由来の定常領域を有する、＜１＞又は＜２＞に記載の抗体。
＜４＞  ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性から選択される少なくとも１の細胞障害活性を有する、＜１＞〜＜３＞のいずれか一に記載の抗体。
＜５＞  ＜１＞〜＜４＞のいずれか一に記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
＜６＞  抗がん剤である、＜５＞に記載の医薬組成物。
【００１１】
なお、Ｂ２Ｅ５−４８抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号：３に記載のアミノ酸配列であり、Ｂ２Ｅ５−４８抗体の軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列であり、Ｂ２Ｅ５−４８抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号：９に記載のアミノ酸配列であり、Ｂ２Ｅ５−４８抗体の重鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列である。また、Ｃ３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列であり、Ｃ３抗体の軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列であり、Ｃ３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列であり、Ｃ３抗体の重鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、配列番号：２２〜２４に記載のアミノ酸配列である。また、Ａ５Ｄ１１−１０抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号：２６に記載のアミノ酸配列であり、Ａ５Ｄ１１−１０抗体の軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、配列番号：２７〜２９に記載のアミノ酸配列であり、Ａ５Ｄ１１−１０抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号：３１に記載のアミノ酸配列であり、Ａ５Ｄ１１−１０抗体の重鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、配列番号：３２〜３４に記載のアミノ酸配列である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に対して高い親和性を示し、また高いＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を有する抗体を提供することが可能となる。さらに、本発明の抗体は、インビボにおいても高い抗腫瘍活性を示すため、がんの転移抑制及び再発抑制等も含め、がんを治療又は予防することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の抗Ｅｖａ１タンパク質抗体  Ｂ２Ｅ５−４８抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を示す図である。図中、下線を付したアミノ酸配列は、各可変領域におけるＣＤＲ１〜３を示す。また、Ｂ２Ｅ５−４８抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列は、各々配列番号：３及び９に記載のアミノ酸配列である。
【図２】本発明の抗Ｅｖａ１タンパク質抗体  Ｃ３抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を示す図である。図中、下線を付したアミノ酸配列は、各可変領域におけるＣＤＲ１〜３を示す。また、Ｃ３抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列は、各々配列番号：１５及び２１に記載のアミノ酸配列である。
【図３】本発明の抗Ｅｖａ１タンパク質抗体  Ａ５Ｄ１１−１０抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を示す図である。図中、下線を付したアミノ酸配列は、各可変領域におけるＣＤＲ１〜３を示す。また、Ａ５Ｄ１１−１０抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列は、各々配列番号：２６及び３１に記載のアミノ酸配列である。
【図４】ヒトＥｖａ１タンパク質を発現させたＤａｕｄｉ細胞に対する、本発明の抗Ｅｖａ１タンパク質マウス抗体のＡＤＣＣ活性を解析した結果を示すグラフである。図中、縦軸は前記細胞の溶解率を示し、横軸は前記細胞に添加した抗体の濃度を示す（以下、図中の表記については、図５〜１４においても同様である）。
【図５】ヒトＥｖａ１タンパク質を発現させたＤａｕｄｉ細胞に対する、本発明の抗Ｅｖａ１タンパク質キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を解析した結果を示すグラフである。
【図６】ＭＫＮ２８細胞に対する、本発明の抗Ｅｖａ１タンパク質マウス抗体のＡＤＣＣ活性を解析した結果を示すグラフである。
【図７】ＭＫＮ２８細胞に対する、本発明の抗Ｅｖａ１タンパク質キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を解析した結果を示すグラフである。
【図８】ヒトＥｖａ１タンパク質を発現させたＤａｕｄｉ細胞に対する、本発明の抗Ｅｖａ１タンパク質マウス抗体のＡＤＣＣ活性を解析した結果を示すグラフである。
【図９】ヒトＥｖａ１タンパク質を発現させたＤａｕｄｉ細胞に対する、本発明の抗Ｅｖａ１タンパク質マウス抗体のＣＤＣ活性を解析した結果を示すグラフである。
【図１０】ヒトＥｖａ１タンパク質を発現させたＤａｕｄｉ細胞に対する、本発明の抗Ｅｖａ１タンパク質キメラ抗体のＣＤＣ活性を解析した結果を示すグラフである。
【図１１】ＭＫＮ２８細胞に対する、本発明の抗Ｅｖａ１タンパク質マウス抗体（Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体）のＣＤＣ活性を解析した結果を示すグラフである。
【図１２】ＭＫＮ２８細胞に対する、本発明の抗Ｅｖａ１タンパク質キメラ抗体（Ｂ２Ｅ５−４８キメラ抗体）のＣＤＣ活性を解析した結果を示すグラフである。
【図１３】ＭＫＮ２８細胞に対する、本発明の抗Ｅｖａ１タンパク質マウス抗体（Ｃ３マウス抗体）のＣＤＣ活性を解析した結果を示すグラフである。
【図１４】ＭＫＮ２８細胞に対する、本発明の抗Ｅｖａ１タンパク質キメラ抗体（Ｃ３キメラ抗体）のＣＤＣ活性を解析した結果を示すグラフである。
【図１５】ヒトＥｖａ１タンパク質を発現させたＢ１６メラノーマ細胞を投与し、その１日後からＢ２Ｅ５−４８マウス抗体を投与したマウスの肺において、形成されたメラノーマのコロニーを観察した結果を示す写真である。図中、下部にＢ２Ｅ５−４８マウス抗体を投与した結果を示し、上部に当該抗体の代わりにそのアイソタイプコントロール抗体を投与した結果を示す。
【図１６】ヒトＥｖａ１タンパク質を発現させたＢ１６メラノーマ細胞を投与し、その１日後からＢ２Ｅ５−４８マウス抗体を投与したマウスの肺において、形成されたメラノーマのコロニー数を計測した結果を示すグラフである。図中、縦軸は各抗体投与群１匹あたりの肺に形成されたコロニーの平均数を示す（図中の表記については、図１８、２０及び２４においても同様である）。
【図１７】Ｂ１６メラノーマ細胞を投与し、その１日後からＢ２Ｅ５−４８マウス抗体を投与したマウスの肺において、形成されたメラノーマのコロニーを観察した結果を示す写真である。図中、右側にＢ２Ｅ５−４８マウス抗体を投与した結果を示し、左側に当該抗体の代わりにそのアイソタイプコントロール抗体を投与した結果を示す。
【図１８】Ｂ１６メラノーマ細胞を投与し、その１日後からＢ２Ｅ５−４８マウス抗体を投与したマウスの肺において、形成されたメラノーマのコロニー数を計測した結果を示すグラフである。
【図１９】Ｂ１６メラノーマ細胞を投与し、その１日後からＢ２Ｅ５−４８キメラ抗体を投与したマウスの肺において、形成されたメラノーマのコロニーを観察した結果を示す写真である。図中、右側にＢ２Ｅ５−４８キメラ抗体を投与した結果を示し、左側に当該抗体の代わりにそのアイソタイプコントロール抗体を投与した結果を示す。
【図２０】Ｂ１６メラノーマ細胞を投与し、その１日後からＢ２Ｅ５−４８キメラ抗体を投与したマウスの肺において、形成されたメラノーマのコロニー数を計測した結果を示すグラフである。
【図２１】Ｂ１６メラノーマ細胞を投与し、その１４日後からＢ２Ｅ５−４８マウス抗体を投与したマウスの肺において、形成されたメラノーマのコロニーを観察した結果を示す写真である。図中、右側にＢ２Ｅ５−４８マウス抗体を投与した結果を示し、左側に当該抗体の代わりにそのアイソタイプコントロール抗体を投与した結果を示す。
【図２２】Ｂ１６メラノーマ細胞を投与し、その１４日後からＢ２Ｅ５−４８マウス抗体を投与したマウスの肺において、形成されたメラノーマのコロニー数を計測した結果を示すグラフである。図中、横軸は、肺に形成されたコロニーの数（左から順に、５０個未満、５０個以上１００個未満、１００個以上）を示し、縦軸は形成されたコロニー数に応じて分類された各抗体マウスの匹数を示す。
【図２３】ヒトＥｖａ１タンパク質を発現させたＢ１６メラノーマ細胞を投与し、その１日後からＣ３マウス抗体を投与したマウスの肺において、形成されたメラノーマのコロニーを観察した結果を示す写真である。図中、右側にＣ３マウス抗体を投与した結果（２例）を示し、左側に当該抗体の代わりにそのアイソタイプコントロール抗体を投与した結果（２例）を示す。
【図２４】ヒトＥｖａ１タンパク質を発現させたＢ１６メラノーマ細胞を投与し、その１日後からＣ３マウス抗体を投与したマウスの肺において、形成されたメラノーマのコロニー数を計測した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に対する抗体＞
後述の実施例において示す通り、本発明者らは、ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に対して高い親和性を示す、３種のマウスモノクローナル抗体（Ｂ２Ｅ５−４８抗体、Ｃ３抗体、Ａ５Ｄ１１−１０抗体）を得ることに成功した。さらに、かかる抗体が高いＡＤＣＣ活性及び／又はＣＤＣ活性を有することも見出した。また、メラノーマ細胞を投与したマウスに、前記抗体を投与することによって、当該細胞の肺への転移等が抑制されることも明らかにした。さらに、これら抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の各々の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３の配列も決定した。
【００１５】
本発明は、かかる事項に基づき、ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合し、下記のいずれかのアミノ酸配列、下記のいずれかのアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列、又は下記のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列をＣＤＲとして含む可変領域を保持する特徴を有する抗体を提供する
Ｂ２Ｅ５−４８抗体の軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列（配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列）、Ｂ２Ｅ５−４８抗体の重鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列（配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列）、Ｃ３抗体の軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列（配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列）、Ｃ３抗体の重鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列（配列番号：２２〜２４に記載のアミノ酸配列）、Ａ５Ｄ１１−１０抗体の軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列（配列番号：２７〜２９に記載のアミノ酸配列）、Ａ５Ｄ１１−１０抗体の重鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列（配列番号：３２〜３４に記載のアミノ酸配列）。。なお、本明細書において「相同性」は「同一性」を含む。
【００１６】
また、本発明のより好ましい態様としては、以下の抗体が挙げられる。
ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合し、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の特徴を有する抗体
（ａ）配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列を軽鎖ＣＤＲ１〜３として含む軽鎖可変領域と、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列を重鎖ＣＤＲ１〜３として含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列を軽鎖ＣＤＲ１〜３として含む軽鎖可変領域と、配列番号：２２〜２４に記載のアミノ酸配列を重鎖ＣＤＲ１〜３として含む重鎖可変領域とを保持する
（ｃ）配列番号：２７〜２９に記載のアミノ酸配列を軽鎖ＣＤＲ１〜３として含む軽鎖可変領域と、配列番号：３２〜３４に記載のアミノ酸配列を重鎖ＣＤＲ１〜３として含む重鎖可変領域とを保持する。
【００１７】
ここで、上記ＣＤＲはいずれもそれぞれの配列番号にて特定されるアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性（又は同一性）を有するアミノ酸配列、又は、それぞれの配列番号にて特定されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列であってもよい。
【００１８】
また、本発明のさらに好ましい態様としては、以下の抗体が挙げられる。ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に結合し、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の特徴を有する抗体
（ａ）Ｂ２Ｅ５−４８抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：３に記載のアミノ酸配列）と、Ｂ２Ｅ５−４８抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：９に記載のアミノ酸配列）とを保持する
（ｂ）Ｃ３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：１５に記載のアミノ酸配列）と、Ｃ３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：２１に記載のアミノ酸配列）とを保持する
（ｃ）Ａ５Ｄ１１−１０抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：２６に記載のアミノ酸配列）と、Ａ５Ｄ１１−１０抗体の重鎖可変領域（配列番号：３１に記載のアミノ酸配列）とを保持する。
【００１９】
ここで、上記可変領域はいずれもそれぞれの配列番号にて特定されるアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性（又は同一性）を有するアミノ酸配列、又はそれぞれの配列番号にて特定されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列であってもよい。
【００２０】
なお、アミノ酸の改変（置換、欠失、付加及び／又は挿入）については後述を参照のこと。また、これら抗体のうち、後述のＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性がより高いという観点から、前記（ａ）の特徴を有する抗体が好ましい。
【００２１】
本発明において、「Ｅｖａ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）１タンパク質」は、一回膜貫通型の細胞膜タンパク質であり、ＭＰＺＬ２（Ｍｙｅｌｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｚｅｒｏ−ｌｉｋｅ  ２）とも称される細胞骨格系に関わる分子である。ヒト由来のものであれば典型的には配列番号：３６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号：３５に記載のヌクレオチド配列がコードするタンパク質）である。しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し、それにコードされるタンパク質のアミノ酸配列もそれに伴い改変される。したがって、本発明に係る「Ｅｖａ１タンパク質」は、前記典型的なアミノ酸配列からなるタンパク質に特定されることなく、このような天然の変異体も含まれる。
【００２２】
本発明における「抗体」は、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスを含む。「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれ、また、抗体の機能的断片の形態も含む意である。「ポリクローナル抗体」は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物である。また、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味する。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、自然環境の成分から分離され、及び／又は回収された（即ち、単離された）抗体である。
【００２３】
本発明の抗体のヒトＥｖａ１タンパク質に対する親和性は、ＫＤ（解離定数）値として１０−８以下であることが好ましく、１０−９以下であることがより好ましく、さらにまたｋｄ（解離速度定数）値は１０−３以下であることが好ましい。なお、ＫＤ値及びｋｄ値は、後述の実施例において示すように、表面プラズモン共鳴法による解析によって求めることができる。また、本発明の抗体は、ヒトＥｖａ１タンパク質以外に、他の動物由来のＥｖａ１タンパク質（例えば、マウスＥｖａ１タンパク質（典型的には配列番号：３８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：３７に記載のヌクレオチド配列がコードするタンパク質））に結合する抗体であってもよい。
【００２４】
本発明のヒトＥｖａ１タンパク質に結合する抗体は、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性から選択される少なくとも１の細胞障害活性を有していることが望ましく、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を有していることがより望ましい。
【００２５】
本発明において「ＡＤＣＣ活性（抗体依存性細胞障害活性）」とは、標的細胞の細胞表面抗原に抗体が結合した際、その抗体のＦｃ領域にエフェクター細胞（ＮＫ細胞、単球等の免疫細胞）がさらに結合することにより、当該細胞が活性化され、それに伴い、因子を放出して標的細胞を殺傷する活性を意味する。他方、「ＣＤＣ活性（補体依存性細胞障害活性）」とは、抗体が標的細胞に結合すると補体系が活性化し、その結果、標的細胞を溶解する活性を意味する。
【００２６】
また、本発明の抗体は、好ましくは、０．０１μｇ／ｍＬにてヒトＥｖａ１タンパク質を発現する標的細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する抗体である。本発明の抗体がこのようなＡＤＣＣ活性を有しているか否かは、例えば、後述の実施例に記載の方法にて測定することができ、より具体的には、ヒトＥｖａ１タンパク質を発現させたＤａｕｄｉ細胞を標的細胞とし、その細胞溶解率にてＡＤＣＣ活性を評価した場合において、０．０１μｇ／ｍＬの本発明の抗Ｅｖａ１抗体を用いた場合のＡＤＣＣ活性は、好ましくは、細胞溶解率が３０％以上であり、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上である。
【００２７】
また、本発明の抗体は、好ましくは０．３０μｇ／ｍＬにて、より好ましくは０．０１μｇ／ｍＬにて、ヒトＥｖａ１タンパク質を発現する標的細胞に対してＣＤＣ活性を有する抗体である。本発明の抗体がこのようなＣＤＣ活性を有しているか否かは、例えば、後述の実施例に記載の方法にて測定することができ、より具体的には、ヒトＥｖａ１タンパク質を発現させたＤａｕｄｉ細胞を標的細胞とし、その細胞溶解率にてＣＤＣ活性を評価した場合において、０．３０μｇ／ｍＬの本発明の抗Ｅｖａ１抗体を用いた場合のＣＤＣ活性は、好ましくは、細胞溶解率が２０％以上であり、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは６０以上、より好ましくは８０％以上である。
【００２８】
本発明の抗体は、更に抗がん活性を有していることが望ましい。本発明において「抗がん活性」とは、がん細胞の増殖を抑制する活性、がん細胞の死を誘導する活性及びがん細胞の転移を抑制する活性のうちの少なくともいずれか一つの活性を意味する。抗がん活性は、例えば、後述の実施例に記載のような担がんモデル（Ｂ１６メラノーマ細胞を接種したマウス等）を用いた分析により評価することができる。より具体的には、Ｂ１６メラノーマ細胞をマウスに静脈内投与等した後、その翌日又は数週間後から、毎日又は数日おきに、抗Ｅｖａ１抗体を静脈内投与等する。そして、肺に形成されたＢ１６メラノーマ細胞のコロニー数を計測することにより、インビボでの抗がん活性を評価することができる。陰性対照として、同一のアイソタイプを有するコントロール抗体を投与してもよく、またＰＢＳ等を投与してもよい。そして、抗Ｅｖａ１抗体投与群におけるコロニー形成数が陰性対照投与群におけるそれよりも少ない場合（陰性対照投与群におけるコロニー形成数を１００％とした際に、好ましくは６０＆以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下に、当該抗Ｅｖａ１抗体は抗がん活性を有すると判定し得る。
【００２９】
本発明の抗体は、上述のヒトＥｖａ１タンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状等は特に限定されない。具体的には、非ヒト動物由来の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びこれら抗体の機能的断片が含まれる。本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体又はヒト化抗体が望ましい。
【００３０】
本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平８−２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。
【００３１】
キメラ抗体の定常領域には、通常、ヒト由来の抗体のものが使用される。例えば重鎖においては、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃμ、Ｃδ、Ｃα１、Ｃα２、及びＣεを定常領域として利用することができる。また軽鎖においてはＣκやＣλを定常領域として使用できる。これらの定常領域のアミノ酸配列、並びにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体自体の安定性、又は抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト由来の抗体定常領域中の１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、付加及び／又は挿入をすることができる。
【００３２】
本発明において「ヒト化抗体」とは、非ヒト（マウス等）由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト由来の抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、オーバーラップエクステンションＰＣＲ等、公知である（例えば、欧州特許出願公開第２３９４００号明細書、欧州特許出願公開第１２５０２３号明細書、国際公開第９０／０７８６１号、国際公開第９６／０２５７６号）。抗体の可変領域は、通常、４つのＦＲにはさまれた３つのＣＤＲで構成されている。ＣＤＲは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。ＣＤＲのアミノ酸配列は多様性に富む一方、ＦＲを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い相同性を示すことが多い。そのため、一般に、ＣＤＲの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるといわれている。また、ＣＤＲの機能の維持の観点から、非ヒト由来ＣＤＲのヒトＦＲへの移植においては、その非ヒト動物由来のＦＲと相同性の高いヒトＦＲが選択される。すなわち、ＣＤＲ内のアミノ酸は、抗原を認識するばかりでなく、ＣＤＲの近傍にあるＦＲのアミノ酸と配位し、ＣＤＲのループ構造の維持にも関与しているため、移植すべきＣＤＲに隣接しているＦＲのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトＦＲを利用することが好ましい。
【００３３】
非ヒト動物由来のＦＲと相同性の高い公知のヒトＦＲの検索を、例えば、インターネットで利用可能な抗体に特化した検索システム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／）を利用して行うことができる。このようにして得られたヒトＦＲの配列と一致するように、非ヒト由来の抗体のＣＤＲ以外の配列に変異を導入することができる。あるいは、検索によって得られたヒトＦＲのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）が入手可能な場合は、その配列中に非ヒト由来ＣＤＲを導入してもよい。変異の導入等は核酸合成、部位特異的変異誘発などの当該分野で公知の技術を用いて行うことができる。
【００３４】
このようにして作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、ＣＤＲを介して連結されたときに該ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト由来の抗体のＦＲが好適に選択できる。また必要に応じ、Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１−８５６等に記載の方法に沿って、ヒト化抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するようにＦＲのアミノ酸残基を置換することもでき、さらに当該アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を測定して評価することによって、所望の性質を有する変異ＦＲ配列を選択することができる。
【００３５】
本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、ヒト由来のＥｖａ１タンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体等が挙げられる。
【００３６】
ここで「Ｆａｂ」とは、１つの軽鎖及び重鎖の一部からなる免疫グロブリンの一価の抗原結合断片を意味する。抗体のパパイン消化によって、また、組換え方法によって得ることができる。「Ｆａｂ’」は、抗体のヒンジ領域の１つ又はそれより多いシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのわずかの残基の付加によって、Ｆａｂとは異なる。「Ｆ（ａｂ’）２」とは、両方の軽鎖と両方の重鎖の部分からなる免疫グロブリンの二価の抗原結合断片を意味する。
【００３７】
「可変領域断片（Ｆｖ）」は、完全な抗原認識及び結合部位を有する最少の抗体断片である。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである。「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」は、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在する。「ｓｃ（Ｆｖ）２」は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合して一本鎖にしたものである。「ダイアボディー」とは、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であり、この断片は、同一ポリペプチド鎖の中に軽鎖可変領域に結合した重鎖可変領域を含み、各領域は別の鎖の相補的領域とペアを形成している。「多特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。例えば、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現により調製することができる。
【００３８】
本発明の抗体には、望ましい活性（抗原に対する親和性、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、抗がん活性、及び／又は他の生物学的特性）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。このようなアミノ酸配列変異体は、例えば、後述のＢ２Ｅ５−４８抗体、Ｃ３抗体又はＡ５Ｄ１１−１０抗体の抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖又は軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（ＦＲ及びＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８）、ＭＡｂｓ．Ｍａｒ−Ａｐｒ；６（２）：４３７−４５（２０１４））。また、現在では、統合計算化学システム等（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔ、カナダＣＣＧ社製）を利用することにより、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をモデリングすることもできる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｓｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｋａｇａｋｕ／ｃｓ／ｃｃｇ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ／ｐｒｏｔｅｉｎ．ｈｔｍｌ  参照）。さらに、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２０１０  Ａｕｇ；２３（８）：６４３−５１に記載の通り、抗原へのアフィニティーにおいて、重鎖可変領域のＣＤＲ１及び軽鎖可変領域のＣＤＲ３は関与していない例が知られている、また同様に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４４：１０７５−１０８４（２００７））には、大抵の抗体においては、軽鎖可変領域のＣＤＲ２は抗原へのアフィニティーに関与していないということが報告されている。このように、抗体の抗原へのアフィニティーにおいては、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域各々のＣＤＲ１〜３の全てを要せずとも、同等の活性を発揮し得る。実際に、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００３  Ｊｕｌ  １８；３０７（１）：１９８−２０５、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００４  Ｊｕｌ  ９；３４０（３）：５２５−４２、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００３  Ａｕｇ  ２９；３３１（５）：１１０９−２０においては、元の抗体の少なくとも１のＣＤＲを保持することによって、抗原へのアフィニティーが維持された例が報告されている。したがって、本発明の抗体には、後述のＢ２Ｅ５−４８抗体、Ｃ３抗体又はＡ５Ｄ１１−１０抗体の少なくとも１のＣＤＲを含む抗体も含まれる。
【００３９】
また、本発明の抗体に関し、改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。
【００４０】
また、改変後のアミノ酸配列が、後述のＢ２Ｅ５−４８抗体、Ｃ３抗体又はＡ５Ｄ１１−１０抗体の抗体鎖に対して、アミノ酸配列レベルで８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗体鎖を有する抗体も、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、本発明の抗体に含まれる。かかる相同性としては、少なくとも８０％であればよいが、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。また、配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＰによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００４１】
また、「同等の活性を有する」とは、抗原への親和性、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性又は抗がん活性が、対象抗体（代表的には、Ｂ２Ｅ５−４８抗体、Ｃ３抗体、Ａ５Ｄ１１−１０抗体）と同等（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）であることを意味する。
【００４２】
また、本発明の抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数又は位置を変化させる等の抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。これにより、例えば、抗体のＡＤＣＣ活性を向上させることができる。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ−結合又はＯ−結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入又は欠失等の公知の方法で行うことができる（特開２００８−１１３６６３号公報、米国特許第５０４７３３５号、米国特許第５５１０２６１号、米国特許第５２７８２９９号、国際公開第９９／５４３４２号）。さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。
【００４３】
本発明の抗体は、後述の実施例の通り、ハイブリドーマ法によって作製することができ、また組換えＤＮＡ法によって作製することができる。ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原（ヒト由来のＥｖａ１タンパク質、その部分ペプチド、それらにＦｃタンパク質等が融合してあるタンパク質、またはこれらを発現する細胞等）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等である。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
【００４４】
組換えＤＮＡ法は、上記本発明の抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば、ＨＥＫ細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７−７７５（１９９０））。本発明の抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（国際公開第９４／１１５２３号公報  参照）。本発明の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
【００４５】
本発明は、上記本発明の抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ＤＮＡを保持する宿主細胞、及び該宿主細胞を培養し、抗体を回収することを含む抗体の生産方法をも提供することができる。
【００４６】
＜抗Ｅｖａ１抗体を含む組成物等＞
本発明の抗体は、後述の実施例において示す通り、ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に対して高い親和性を示し、またＡＤＣＣ活性及び／又はＣＤＣ活性等を発揮することから、Ｅｖａ１タンパク質に関連する疾患の治療又は予防に利用することができる。したがって、本発明は、本発明の抗体を有効成分とする医薬組成物（例えば、本発明の抗体を有効成分とする抗がん剤）、並びに本発明の抗体の治療上又は予防上の有効量を、ヒトを含む哺乳類に投与する工程を含んでなる、Ｅｖａ１タンパク質に関連する疾患（例えば、がん）の治療又は予防の方法をも提供するものである。
【００４７】
本発明の抗体の標的とするＥｖａ１タンパク質に関連する疾患は、Ｅｖａ１タンパク質の発現が、その発症、症状の進行、悪化等に関与する疾患であればよく、例えば、がんが挙げられる。
【００４８】
また、本発明の抗体の標的とするがんとしては、Ｅｖａ１タンパク質を発現しており、また本発明の抗体が、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、又は抗がん活性を発揮しうるものである限り特に制限はなく、例えば、グリオーマ（神経幹細胞、神経系前駆細胞及び神経膠細胞から発生した腫瘍、例えば、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、星細胞腫（アストロサイトーマ）、随芽腫、脳室上位腫、オリゴデンドログリオーマ、脈絡叢乳頭腫、特に退形成アストロサイトーマ、退形成オリゴデンドロアストロサイトーマ、退形成オリゴデンドログリオーマ）、胃がん、メラノーマ（黒色腫）、リンパ腫、乳がんが挙げられる。また、このようながんは原発性のものであってもよく、転移性のものであってもよい、さらに、本発明に係るがんには、がん幹細胞も含まれる。
【００４９】
本発明の抗体を有効成分とする医薬組成物は、本発明の抗体と任意の成分、例えば生理食塩水、葡萄糖水溶液又はリン酸塩緩衝液等を含有する組成物の形態で使用することができる。本発明の医薬組成物は、必要に応じて液体又は凍結乾燥した形態で製形化しても良く、任意に薬学的に許容される担体若しくは媒体、例えば、安定化剤、防腐剤、等張化剤等を含有させることもできる。
【００５０】
薬学的に許容される担体としては、凍結乾燥した製剤の場合、マンニトール、ラクトース、サッカロース、ヒトアルブミン等を例として挙げることができ、液状製剤の場合には、生理食塩水、注射用水、リン酸塩緩衝液、水酸化アルミニウム等を例として挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
医薬組成物の投与方法は、投与対象の年齢、体重、性別、健康状態等により異なるが、非経口投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）、経口投与のいずれかの投与経路で投与することができる。好ましい投与方法は、非経口投与であり、より好ましくは静脈投与である。医薬組成物の投与量は、患者の年齢、体重、性別、健康状態、症状の進行の程度及び投与する医薬組成物の成分により変動しうるが、一般的に静脈内投与の場合、成人には体重１ｋｇ当たり１日０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇである。
【００５２】
なお、治療対象が脳である場合には、血液脳関門（ＢＢＢ）の存在がしばし問題となる。しかしながら、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）等を罹患している患者は、血管新生が生じた脳腫瘍内血管に正常な脳にあるＢＢＢが形成されていないことから、前記抗体を静脈注射等によってＧＢＭに送達することができる。
【００５３】
また、ＢＢＢが機能している場合においても、それを回避して本発明の抗体を投与し得る。例えば、定位脳手術方法によってカニューレ等を挿入し、当該カニューレを通じてグリオーマ等に直接投与する方法が挙げられる。また、本発明の抗体を含むドラッグデリバリーシステムを脳内に埋め込む方法が挙げられ（Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：５８９−５９５（２００３）等）。さらには、本発明の抗体をコードする遺伝子を含むベクターによるＢＢＢにまたがるニューロンのトランスフェクションが含まれる（米国特許出願公開第２００３／００８３２９９号等）。
【００５４】
また、上記ＢＢＢを回避する方法の他、本発明の抗体を脳関門透過物質に含有又は結合させて投与する方法を利用することもできる。脳関門透過物質としては、例えば、ＢＢＢの血管内皮上の受容体に結合する抗体結合断片と結合しているリポソーム（米国特許出願公開第２００２００２５３１３号な等）、低密度リポタンパク質粒子（米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号等）、アポリポタンパク質Ｅ（米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号等）、トランスフェリン（米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号等）、狂犬病ウィルス由来の２９アミノ酸からなる糖タンパク質（Ｋｕｍａｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年７月５日、４４８巻、３９〜４３ページ  参照）が挙げられる。
【００５５】
さらに、受容体又はチャンネルの活性を制御して本発明の抗体を投与することにより、当該抗体がＢＢＢを通過してグリオーマ等に送達させることもできる。かかる方法としては、例えば、グルココルチコイド遮断薬を用いて血液脳関門の透過性を増加させること（米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、米国特許出願公開第２００３／０１６２６９５号、米国特許出願公開第２００５／０１２４５３３号等）、カリウムチャネルを活性化すること（米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号等）、ＡＢＣ薬物トランスポーターを阻害すること（米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号等）、本発明の抗体を陽イオン化すること（米国特許第５，００４，６９７号等）が挙げられる。
【００５６】
以上、グリオーマ等の脳における疾患を対象として説明したが、当該疾患における本発明の抗体の投与方法はこれらに限定されるものではない、また、他の疾患に関しても、上記脳における疾患同様に、当業者であればその疾患に適した公知の方法を適宜選択し、本発明の抗体を患部に作用させることができる。
【００５７】
＜ミサイル療法に用いられるための薬剤＞
以上、本発明の抗体の好適な実施形態について説明したが、本発明の抗体は上記実施形態に限定されるものではない。本発明の抗体の標的であるＥｖａ１タンパク質は、がん、特にがん幹細胞において高発現しているため、例えば、光感受性物質、毒性ペプチド、化学療法剤又は放射性化学物質等の細胞傷害性物質を結合した本発明の抗体は、いわゆるミサイル療法において有用である。
【００５８】
本発明の抗体に結合させて細胞傷害活性を機能させる光感受性物質としては、光照射により活性化されることにより、それ自体が細胞傷害性（細胞毒性）を示す形態に変化する物質であってもよく、また細胞傷害性物質（細胞毒性物質）を生じさせる物質であってもよく、例えば、クロリン（ｃｈｌｏｒｉｎｓ）、クロリンｅ６、ポルフィマーナトリウム、タラポルフィンナトリウム、ベルテポルフィン、及びこれらの前駆体及び誘導体が挙げられる。毒性ペプチドとしては、例えば、サポリン、リシン、志賀毒等のリボソーム不活化タンパク質（ＲＩＰ）が挙げられる。化学療法剤としても、特に制限はなく、例えば、テモゾロミド、ブレオマイシン、シスプラチン、イリノテカン、デキサメタゾン、タキソール）が挙げられる。また、放射性化学物質とは、放射性同位体を含む化学物質のことをいい、含まれる放射性同位体としては特に限定されず、例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅが挙げられる。
【００５９】
また、このような細胞傷害性物質は１又は２以上抗体に結合してもよい、細胞傷害性物質の抗体への結合は、公知の手法を適宜選択して行うことができる。例えば、光感受性物質や化学療法剤等の低分子化合物は、共有結合または非共有結合を利用して、抗体に結合させることができる。また、毒素ペプチド等は、遺伝子工学的な手法によって抗体と結合することができる。なお、このような抗体の修飾方法は既に確立されている。
【００６０】
＜診断方法、診断薬＞
また、本発明の抗体は、上述の治療方法、予防方法、及びこれらの方法に用いられる薬剤の態様に制限されることなく、診断方法、及び該方法に用いられる薬剤としても利用し得る。
【００６１】
本発明の診断方法の具体例の一つとして、被験者から単離された試料におけるＥｖａ１タンパク質の発現を、本発明の抗体を用いて検出する工程を含む、Ｅｖａ１タンパク質に関連する疾患の診断方法を挙げることができる。
【００６２】
本発明に係る試料としては、Ｅｖａ１タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されず、例えば、組織、細胞、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿が挙げられる。また、このようなヒトの体から採取された組織又は細胞のみならず、それらが固定化された標本又は細胞の培養液等も、本発明に係る試料に含まれる。
【００６３】
本発明においては、試料中にＥｖａ１タンパク質が検出された場合に、そのレベルを指標として前記疾患が診断される。具体的には、健常者等の陰性対照と比較して試料中に検出されるＥｖａ１タンパク質の量が多い場合に、被検者が当該疾患に罹患している、または将来罹患する可能性が高いことが示される。
【００６４】
本発明において、Ｅｖａ１タンパク質は、本発明の抗体を用いた免疫学的方法により検出することができる。このような免疫学的方法としては、例えば、免疫組織化学法、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、ウエスタンブロット、免疫沈降法が挙げられる。
【００６５】
また、本発明の診断方法においては、生体内においてＥｖａ１タンパク質を発現している細胞を、本発明の抗体によって検出することもできる。生体内に投与した抗体を追跡するために、検出可能に標識された抗体を用いることができる。この方法は、例えば、標識物質が結合された本発明の抗体を被検者に投与する工程と、該標識物質の集積を検出する工程を含む。例えば、標識物質として、放射性同位元素、蛍光物質又は発光物質を用い、これらで標識された抗体の生体における挙動を追跡することで、生体内において前記細胞を検出することができる。標識物質として放射性同位元素を用いた場合、その放射活性を追跡することによって、抗体の局在を画像化することができる。また、蛍光物質や発光物質で標識された抗体は、内視鏡や腹腔鏡を利用して観察することができる。
【００６６】
生体内において細胞を検出するために、抗体を標識する放射性同位元素として、陽電子放出核種を利用することができる。例えば、６４Ｃｕ、１８Ｆ、５５Ｃｏ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、７６Ｂｒ、８９Ｚｒ及び１２４Ｉのような陽電子放出核種で抗体を標識することができる。これらの陽電子放出核種による抗体の標識には、公知の方法（Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．１９９９；２６（８）：９４３−５０．、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．２０１３；５４（１１）：１８６９−７５．等）を利用することができる。また、陽電子放出核種で標識された抗体がヒトに投与された後に、ＰＥＴ（ポジトロン断層撮影装置）により、その放射性核種から放射される放射線を体外から計測し、コンピュータートモグラフィーの手法で画像に変換される。
【００６７】
このように、前記標識物質が結合した本発明の抗体は、上述の診断方法において有用であるため、本発明は、放射性同位元素、蛍光物質又は発光物質が結合した本発明の抗体も提供する。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６９】
（実施例１）
以下に記載の方法にて、ヒトＥｖａ１タンパク質に対して高い親和性を示すマウス由来のモノクローナル抗体（後述の、Ｂ２Ｅ５−４８抗体、Ｃ３抗体、Ａ５Ｄ１１−１０抗体）を作製した。さらにそれら抗体の可変領域のアミノ酸配列を決定すると共に、相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）を同定した。また、Ｂ２Ｅ５−４８抗体及びＣ３抗体に関しては、これら抗体を基にし、ヒト由来の定常領域を保持するキメラ抗体を作製した。
【００７０】
＜抗Ｅｖａ１抗体を産生するハイブリドーマの調製＞
親和性の高い抗Ｅｖａ１抗体を得るため、その抗原を調製すべく、先ず、ヒトＥｖａ１タンパク質の細胞外ドメイン  ２７〜１５０位のアミノ酸からなる領域に、免疫グロブリンのＦｃ部位を融合させたタンパク質（以下、「Ｆｃ融合Ｅｖａ１」とも称する）を、ＨＥＫ２９３細胞において発現させた。
【００７１】
すなわち先ず、前記領域をコードするＤＮＡをｐＩＮＦＵＳ−ＥｍＩｇＧ２ｂＦｃベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）に挿入し、Ｆｃ融合Ｅｖａ１をコードするｐＩＮＦＵＳＥ−ｈＥｖａ１−ｍＩｇＧ２ｂＦｃベクターを作製した。次に、このプラスミドベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、Ｆｃ融合Ｅｖａ１を一過的に発現させた。次いで、このようにして得られたＨＥＫ２９３細胞の培養上清１Ｌを、アフィニティーカラム  ｒプロテインＡセファロース（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ社製）にて処理し、Ｆｃ融合Ｅｖａ１を吸着させた後、非特異的なタンパクを除去するためにカラムを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），３００ｍＭ  ＮａＣｌの溶液で洗浄した。次いで、１００ｍＭ  アルギニン溶液（ｐＨ４．０〜２．０）を使用し、前記カラム中のｐＨを、中性（ｐＨ４．０）から、段階的に酸性側（ｐＨ２．０）に変えていくことで、Ｆｃ融合Ｅｖａ１を溶出させた。溶出後は直ちに、溶出容量の１／１０の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を加え、中性に近いｐＨになるよう調整した。次いで、溶出画分をタンパク電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して、Ｆｃ融合Ｅｖａ１が溶出された画分を同定し、当該画分のタンパク質を濃縮した。そして、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＤＴＴの溶液下で  ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ社製）を用いて限界濾過を行い、最終的に、抗原タンパク質として２．９２ｍｇの精製物を得た。
【００７２】
次に、このようにして調製して得られた抗原タンパク質をアジュバントと共にマウス足蹠に免疫した。そして、免疫したマウスから所属リンパ節を採取し、リンパ球を単離した。次いで、当該リンパ球をマウスミエローマ細胞  Ｐ３Ｕ１と融合させ、ハイブリドーマを調製した。このようにして調製して得られたた１０００個のハイブリドーマの培養上清中の抗体を、ヒトＥｖａ１タンパク質を強制発現させた２Ｂ４細胞と反応させることにより、陽性反応を示した抗体を産生する６１個のハイブリドーマを先ず選抜した。そして、更に強い親和性を示した抗体を産生する２０個のハイブリドーマを選別した。さらに限界希釈法により。最終的に２８クローン（同一の親株を由来とする４クローンを含む）を確立した。
【００７３】
＜表面プラズモン共鳴解析による抗Ｅｖａ１抗体の選抜＞
前記２８のハイブリドーマから、より抗原親和性の高い抗体を産生するハイブリドーマを選別するために、表面プラズモン共鳴解析（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ａｓｓａｙ）装置  Ｂｉａｃｏｒｅを行い、各抗体（以下「候補抗体」とも称する）について、ＫＤ値等を算出した。具体的には、先ず、デキストランコートされたセンサーチップ（ＣＭ５，ＧＥ  ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ社製）にマウスＩｇＧをキャプチャーする抗体を固定化した。次いで、当該抗体を介して各候補抗体をセンサーチップ上にキャプチャーさせた後に、抗原であるＥｖａ１タンパク質を流した。なお、抗原を流す際には、１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ−ＮａＣｌ，３ｍＭ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液を用い、また抗原を候補抗体から解離させるための溶液（キャプチャーさせた候補抗体蘇生溶液）として、１０ｍＭ  グリシン溶液（ｐＨ１．７）を用いた。そして、このような溶液を用い、各候補抗体と抗原との結合反応、解離反応をＢｉａｃｏｒｅにて検出し、付属のソフトウェアを用いて解析することにより、解離定数（ＫＤ）、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）を算出した。その結果、前記２８ハイブリドーマから産生される抗体において、高親和性を示し（ＫＤの値が小さく）、かつ解離の遅い（ｋｄの値が小さい）抗体上位４種（Ｃ３抗体、Ｂ１Ｅ４−３２抗体、Ｂ２Ｅ５−４８抗体、Ａ５Ｄ１１−１０抗体）を選抜した。なお、これら抗体において、解析の結果、Ｃ３抗体とＢ１Ｅ４−３２抗体とは、起源を同一とする抗体であることが明らかになったため、以後の解析においては、Ｃ３抗体、Ｂ２Ｅ５−４８抗体及びＡ５Ｄ１１−１０抗体を対象とした。
【００７４】
これら３種の抗体に関する、ヒトＥｖａ１タンパク質に対する、ＫＤ、ｋａ及びｋｄを表１に示す。
【００７５】
【表１】
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【００７６】
また、これら抗体に関し、表面プラズモン共鳴法を用いた競合実験を行った。具体的には、デキストランコーティングされたＣＭ５センサーチップ上に、マウス抗体をキャプチャーする抗体を固定化し、先ず抗Ｅｖａ１マウスモノクローナル抗体を流して、これら抗Ｅｖａ１抗体をセンサーチップ上に各々捕捉させた。次いで、ヒトＥｖａ１タンパク質を流して、前記抗Ｅｖａ１抗体に捕捉させた。さらに、そのチップ上に構成された各抗Ｅｖａ１抗体とヒトＥｖａ１タンパク質とからなる複合体に対し、当該抗Ｅｖａ１抗体とは異なるクローンの抗Ｅｖａ１抗体を流すことにより、ヒトＥｖａ１タンパク質上における各抗体間の認識部位における競合の有無を解析した。
【００７７】
その結果、Ｃ３抗体とＡ５Ｄ１１−１０抗体とは互いに競合することが明らかになった。そのため、両者は、完全又は部分的にヒトＥｖａ１タンパク質上における認識部位が一致していることが示唆された。また、Ｂ２Ｅ５−４８抗体は、Ｃ３抗体及びＡ５Ｄ１１−１０抗体のいずれにも競合しなかったことから、これら抗体とはＢ２Ｅ５−４８抗体は完全に異なるエピトープを認識していることが明らかになった。
【００７８】
また、Ｅｖａ１タンパク質は、マウスとヒトとの種間で高度に保存されているタンパク質であり、互いの配列上で異なるアミノ酸は１２アミノ酸だけであり、高い相同性（８６．９９％）を有する。そこで、各抗体の種特異性を解析するために、表面プラズモン共鳴法を用いて、ヒト由来のＥｖａ１タンパク質及びマウス由来のＥｖａ１タンパク質各々に対する親和性を評価した。その結果、Ｃ３抗体及びＡ５Ｄ１１−１０抗体は、ヒトＥｖａ１タンパク質及びマウスＥｖａ１タンパク質の双方に対して親和性を示すことが明らかになった。なお、Ｃ３抗体に関しては、ヒトＥｖａ１タンパク質に対する親和性のほうが、マウスＥｖａ１タンパク質に対するそれよりも、ＫＤ値として１０−１程度強かった。また、Ｂ２Ｅ５−４８抗体に関しては、ヒトＥｖａ１タンパク質のみに特異的に結合し、マウスＥｖａ１タンパク質には全く結合しないことが明らかになった。
【００７９】
さらに、クラスチェックの結果、Ｂ２Ｅ５−４８抗体はマウスＩｇＧ２ｂであり、Ｃ３抗体はマウスＩｇＧ１であった。
【００８０】
＜Ｂ２Ｅ５−４８抗体のエピトープ解析＞
ヒトＥｖａ１とマウスＥｖａ１との相同性は極めて高いにも関わらず、上述の通り、Ｂ２Ｅ５−４８抗体は、ヒトＥｖａ１タンパク質のみを特異的に認識し、マウスＥｖａ１タンパク質に対しては結合性が認められなかった。したがって、この結果から、Ｂ２Ｅ５−４８抗体はヒトＥｖａ１タンパク質とマウスＥｖａ１タンパク質との間で保存されていない１２アミノ酸のいずれかを認識している可能性が示唆される。
【００８１】
そこで、Ｅｖａ１タンパク質において、ヒトとマウスとの間で保存されておらず、かつ表面に側鎖が向いているアミノ酸に関し、ヒトＥｖａ１のそれをマウスのものに置換した変異体を作製した。すなわち、（Ａ４３Ｖ，Ｓ９６Ｖ，Ｑ８５Ｒ）、（Ｒ３３Ｇ，Ｖ３４Ａ，Ｖ１３４Ｌ，Ｉ１３５Ｖ，Ｅ１３７Ｔ）、（Ｌ６８Ｒ，Ｐ７２Ｒ）、（Ｉ８１Ｍ）の計４種のヒトＥｖａ１変異体を作製し、表面プラズモン共鳴法を利用した結合実験を行った。
【００８２】
その結果、これら変異体のうち、（Ｌ６８Ｒ及びＰ７２Ｒ）の二重点変異体のみに対し、Ｂ２Ｅ５−４８抗体の結合性が認められなかった。したがって、これら６８位及び７２位のアミノ酸を含む領域が、Ｂ２Ｅ５−４８抗体のエピトープであることが示唆された。さらに寄与するアミノ酸を絞り込むために、それぞれの部位に関する単一変異体（Ｌ６８Ｒ又はＰ７２Ｒ）を作製し、表面プラズモン共鳴法を利用した結合実験を行った。その結果、Ｐ７２Ｒ変異体に対しては、Ｂ２Ｅ５−４８抗体の結合性が完全に喪失していた。一方、Ｌ６８Ｒ変異体に対しては、野生型と同様のＫＤ値を維持していた。したがって、少なくとも７２番目のプロリンがＢ２Ｅ５−４８抗体のエピトープに含まれる認識アミノ酸であることが明らかになった。
【００８３】
＜Ａ５Ｄ１１−１０抗体のエピトープ解析＞
Ａ５Ｄ１１−１０抗体のＦａｂとヒトＥｖａ１タンパク質との複合体に関し、その結晶構造を２．０Åの分解能で決定した。その構造から、Ａ５Ｄ１１−１０抗体はヒトＥｖａ１タンパク質の３０番目のチロシン、３１番目のスレオニン、３３番目のアルギニン、４６番目のリシン、４８番目のスレオニン、４９番目のフェニルアラニン、５１番目のセリン、１０２番目のグルタミン酸、１０３番目のアルギニン、１０４番目のチロシンを認識していることが明らかになった。次に、前記構造解析の結果から結合に重要と考えられたヒトＥｖａ１タンパク質上の３０番目のチロシン、４６番目のリシン、１０２番目のグルタミン酸、１０３番目のアルギニン、１０４番目のチロシンに関し、各アミノ酸をアラニンに置換した変異体を作製し、それらを用いた表面プラズモン共鳴法を利用した結合実験を行い、Ａ５Ｄ１１−１０抗体のエピトープの確認と、該抗体が認識する各アミノ酸の結合における重要性とを解析した。その結果、Ｙ３０Ａ変異体に対し、Ａ５Ｄ１１−１０抗体の結合性は喪失した。前記構造解析の結果、当該３０番目のチロシンは、Ａ５Ｄ１１−１０抗体の重鎖ＣＤＲ３の１０３番目のグリシンと１０４番目のグリシンの主鎖と疎水結合を形成していることが明らかになっている。また側鎖部分は、自身の５０番目のセリンと水素結合を形成し、構造維持に寄与していると考えられる。そのため、アラニンに置換することにより、チロシン側鎖の環構造部分で形成されていた疎水結合が完全に断ち切られたことと、安定化に寄与していた水素結合を失ったことにより、Ａ５Ｄ１１−１０抗体のヒトＥｖａ１タンパク質に対する結合性も完全に失われたと考えられる。また、Ｋ４６Ａ変異体及びＹ１０４Ａ変異体においては、ＫＤ値に関し、ヒトＥｖａ１タンパク質（野生型）と比較してが１０−２ほど向上し、親和性の低下が確認された。前記構造解析の結果、当該４６番目のリシンの側鎖は、軽鎖ＣＤＲ３のアスパラギン酸の側鎖及び主鎖の両方と、水素結合を結合し、軽鎖ＣＤＲ１の３２番目のチロシンと分子間相互作用を形成している。また前記１０４番目のチロシンに関しては、側鎖部分で重鎖ＣＤＲ１の３２番目のアルギニンの側鎖と主鎖の両方と水素結合を形成、重鎖ＣＤＲ３の１０２番目アスパラギン酸、１０３番目グリシンと分子間相互作用を形成している。そのため、かかるアラニン置換により、いくつかの結合が断ち切られ、その結果としてＫＤ値が１０−２大きくなったと考えられる。さらに、結晶構造では、多くの結合を抗体側と結んでいる１０２番目のグルタミン酸と１０３番目のアルギニンであるが、それぞれのアラニン置換体に対し、ＫＤ値は２５倍程度の上昇が認められた。前記構造解析の結果、１０２番目のグルタミン酸は、Ａ５Ｄ１１−１０抗体の重鎖ＣＤＲ２の５７番目のセリンの側鎖及び主鎖のそれぞれと水素結合を、さらには５５番目のグリシン、５６番目のグリシンの主鎖とも水素結合を結んでいる。一方、１０３番目のアルギニンは、Ａ５Ｄ１１−１０抗体の重鎖ＣＤＲ以外の側鎖、５９番目のアスパラギン酸により水素結合を形成することで固定され、さらに５３番目のトリプトファンとの間に分子間相互作用による結合が生じ、総合的に強い結合が生じていることが、構造解析から明らかになっている。そのため、前記ＫＤ値の上昇が２５倍程度であり、完全に結合を失わなかったのは、１０３番目のアルギニンをアラニンに置換した変異体では弱いながらも重鎖ＣＤＲ２の５３番目のトリプトファンとの間に分子間力が保持されていた事に基づくと予想される。また、多数の水素結合を形成しているヒトＥｖａ１タンパク質上の１０２番目のグルタミン酸をアラニンに置換した変異体においては、全ての水素結合が失われると予想されたにもかかわらず、２５倍のＫＤ値の上昇であったのは、この側鎖の抗原・抗体における結合への寄与度が低いことを意味する。
【００８４】
＜Ｃ３抗体のエピトープ解析＞
上述の通り、Ｃ３抗体は、ヒトＥｖａ１タンパク質上の認識部位において、完全又は一部、Ａ５Ｄ１１−１０抗体と競合していることが考えられた。そこで、上記Ａ５Ｄ１１−１０抗体のエピトープ解析同様に、アラニン変異体を用いた表面プラズモン共鳴法を利用した結合実験を行った。その結果、Ｃ３抗体は、ヒトＥｖａ１タンパク質において、４６番目のリシン、９６番目のセリン及び１０３番目のアルギニンを認識していることが明らかになった。Ｃ３抗体が認識するヒトＥｖａ１タンパク質上の４６番目のリシン、９６番目のセリン及び１０３番目は、Ａ５Ｄ１１−１０抗体の認識アミノ酸でもあり、これら２つの抗体がヒトＥｖａ１タンパク質との結合において競合したことと一致する。しかしながら、ヒトＥｖａ１タンパク質におけるＹ１０４Ａ変異は、Ａ５Ｄ１１−１０抗体の結合性を著しく低下させたが、Ｃ３抗体の結合性には影響を与えなかった。一方、Ｓ９６Ａ変異は、Ａ５Ｄ１１−１０抗体の結合性に影響を与えなかったが、Ｃ３抗体との結合に影響を与えたことから、これら抗体において、認識部位は部分的に重なるが、認識機構は異なるとことが考えられる。
＜抗Ｅｖａ１抗体をコードする遺伝子のクローニングと配列決定＞
Ｂ２Ｅ５−４８及びＣ３に関し、各ハイブリドーマから常法に従ってＲＮＡを抽出した。そして、それらを鋳型とし、ＳＭＡＲＴ又はＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行い、ＶＨＤＨＪＨ領域の抗体重鎖可変領域（ＶＨ鎖）及びＶＬＪＬ領域の軽鎖可変領域（ＶＬ鎖）のｃＤＮＡを増幅した。
【００８５】
また、Ａ５Ｄ１１−１０に関しては、そのハイブリドーマから常法に従ってＲＮＡを抽出し、ＡｃｃｕＳｃｒｉｐｔ  ｐｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ａｇｉｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行い、当該抗体をコードするＤＮＡを増幅した。ＲＴ−ＰＣＲにおいては、可変領域の開始部分に特徴的に見られるＡＡ配列をもとに設計した１０種類を混ぜたＰｒｉｍｅｒ  ｍｉｘをＦｗ側のプライマーとして用い、Ｒｅｖ側のプライマーは、上記ＲＡＣＥでも使用しているのと同じものを用いた。
【００８６】
そして、このようにして調製した各抗体をコードするｃＤＮＡについてシークエンシング解析を行った。また、このようにして得られた配列に基づき、Ｋａｂａｔナンバリング法に従ってＣＤＲ及びＦＲを決定した。さらに、得られた配列を、ＮＣＢＩのＩｇＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）にかけた結果、Ｂ２Ｅ５−４８抗体をコードする遺伝子は、重鎖遺伝子ＩＧＨＶ１Ｓ８１＊０２／ＩＧＨＤ１−２＊０１／ＩＧＨＪ２＊０１及び軽鎖遺伝子ＩＧＫＶ４−６８＊０１／ＩＧＫＪ５＊０１と最も相同性が高いことが明らかになった。また、Ｃ３抗体をコードする遺伝子は、重鎖遺伝子ＩＧＨＶ５−１２−２＊０１／ＩＧＨＤ３−１＊０１、ＩＧＨＤ３−２＊０１／ＩＧＨＪ４＊０１及び軽鎖遺伝子ＩＧＫＶ６−３２＊０１／ＩＧＫＪ１＊０１と最も相同性が高いことが明らかになった。Ａ５Ｄ１１−１０抗体をコードする遺伝子は、重鎖遺伝子ＩＧＨＶ２−２＊０２／ＩＧＨＤ２−９＊０１／ＩＧＨＪ４＊０１及び軽鎖遺伝子ＩＧＫＶ１０−９６＊０１／ＩＧＫＪ１＊０１と最も相同性が高いことが明らかになった。
【００８７】
Ｂ２Ｅ５−４８抗体の重鎖可変領域に関しては、前記最も相同性が高い生殖細胞系列遺伝子と比較し、１３塩基に置換があり、その結果アミノ酸配列においては、３１番目セリンがアスパラギン、３９番目グルタミンがロイシン、４５番目ロイシンがフェニルアラニン、５４番目セリンがスレオニン、５７番アルギニンがグリシン、５９番目アスパラギンがアスパラギン酸、６６番目セリンがアルギニン、８６番目プロリンがロイシン、９７番目アラニンがスレオニンに変換されていた。また、軽鎖可変領域に関しては、前記最も相同性が高い生殖細胞系列遺伝子と比較し、５塩基に置換があり、その結果アミノ酸配列においては、１８番目リシンがアルギニン、２１番目メチオニンがロイシン、３０番目セリンがグリシン、４０番アルギニンがグリシン、４９番目ロイシンがバリンに変換されていた。
【００８８】
Ｃ３抗体の重鎖可変領域に関しては、前記最も相同性が高い生殖細胞系列遺伝子と比較し、６塩基に置換があり、その結果アミノ酸配列においては、５２番目セリンがスレオニン、５３番目アスパラギンがスレオニン、５５番目グリシンがアラニン、５７番目セリンがアルギニンに変換されていた。
【００８９】
Ａ５Ｄ１１−１０抗体の重鎖可変領域に関しては、前記最も相同性が高い生殖系列遺伝子と比較し、２塩基に置換があり、その結果アミノ酸配列においては、５番目のグルタミン酸がグルタミン、３０番目のアルギニンがセリンに置換されていた。また、軽鎖可変領域に関しては、前記最も相同性が高い生殖系列遺伝子と比較し、４塩基に置換があり、その結果アミノ酸配列においては、６８番目のアルギニンがグリシン、６９番目のイソロイシンがスレオニンに置換されていた。
【００９０】
このようにして得られた同定されたＢ２Ｅ５−４８抗体、Ｃ３抗体及びＡ５Ｄ１１−１０抗体の可変領域及びＣＤＲのアミノ酸配列等を、以下に示す配列番号にて配列表において示す。また、図１〜３においても、これら抗体の可変領域及びＣＤＲのアミノ酸配列を示す。なお、上述の通り、Ａ５Ｄ１１−１０に関しては、他の２クローンとは異なり、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ解析によって配列を決定していないため、シグナル配列については未同定である。
Ｂ２Ｅ５−４８抗体のシグナルペプチド及びＬ鎖（軽鎖）可変領域をコードする塩基配列：配列番号：１
Ｂ２Ｅ５−４８抗体のシグナルペプチド及びＬ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：２
Ｂ２Ｅ５−４８抗体のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：３
Ｂ２Ｅ５−４８抗体のＬ鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列：配列番号：４〜６
Ｂ２Ｅ５−４８抗体のシグナルペプチド及びＨ鎖（重鎖）可変領域をコードする塩基配列：配列番号：７
Ｂ２Ｅ５−４８抗体のシグナルペプチド及びＨ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：８
Ｂ２Ｅ５−４８抗体のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：９
Ｂ２Ｅ５−４８抗体のＨ鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列：配列番号：１０〜１２
Ｃ３抗体のシグナルペプチド及びＬ鎖（軽鎖）可変領域をコードする塩基配列：配列番号：１３
Ｃ３抗体のシグナルペプチド及びＬ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：１４
Ｃ３抗体のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：１５
Ｃ３抗体のＬ鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列：配列番号：１６〜１８
Ｃ３抗体のシグナルペプチド及びＨ鎖（重鎖）可変領域をコードする塩基配列：配列番号：１９
Ｃ３抗体のシグナルペプチド及びＨ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：２０
Ｃ３抗体のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：２１
Ｃ３抗体のＨ鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列：配列番号：２２〜２４
Ａ５Ｄ１１−１０抗体のＬ鎖可変領域をコードする塩基配列：配列番号：２５
Ａ５Ｄ１１−１０抗体のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：２６
Ａ５Ｄ１１−１０抗体のＬ鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列：配列番号：２７〜２９
Ａ５Ｄ１１−１０抗体のＨ鎖可変領域をコードする塩基配列：配列番号：３０
Ａ５Ｄ１１−１０抗体のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：３１
Ａ５Ｄ１１−１０抗体のＨ鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列：配列番号：３２〜３４。
【００９１】
＜抗体の精製＞
Ｃ３抗体、Ｂ２Ｅ５−４８抗体及びＡ５Ｄ１１−１０抗体を各々産生するハイブリドーマを、ヌードマウスに移植し、当該マウスから腹水を採取した。次いで、腹水を４Ｍ  硫安で処理し、得られた沈殿を透析、可溶化した後、プロテインＧカラムにてこれら抗体（以下、下記キメラ抗体と区別するため、Ｃ３マウス抗体、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体、Ａ５Ｄ１１−１０マウス抗体とも称する）を精製した。
【００９２】
＜キメラ抗体の作製＞
上記マウス由来のＣ３抗体及びＢ２Ｅ５−４８抗体の定常領域を、ヒト由来の抗体のそれに置き換えたキメラ抗体を以下の通りに作製した。
【００９３】
ヒトＩｇＧ１抗体の重鎖定常領域のｃＤＮＡと、ヒトＩｇＣκ抗体の軽鎖定常領域のｃＤＮＡとを、各々ｐｃＤＮＡ３．４ベクタ−（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に組み込んだ。次いで、前者のベクターにＰＣＲで増幅したＢ２Ｅ５−４８抗体又はＣ３抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを、後者のベクターにＰＣＲで増幅したＢ２Ｅ５−４８抗体又はＣ３抗体の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを挿入した。そして、このようにして作製した２種のベクターをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に共導入し、Ｅｘｐｉ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて３７℃、８％  ＣＯ２の条件で７日間撹拌培養に供した。そして、それら培養上清から、キメラ抗体（以下、Ｃ３キメラ抗体、Ｂ２Ｅ５−４８キメラ抗体とも称する）を回収、精製した。精製は、プロテイン  Ｇカラムを使用し、酸性条件（１００ｍＭ  アルギニン溶液、ｐＨ  ４．０−２．０）で段階的に溶出し、直ちに１／１０容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和を行った。その後２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌの溶液１Ｌに対し、透析を行い、濃縮を行った。
【００９４】
また、Ｂ２Ｅ５−４８キメラ抗体に関しては、上述のマウス抗体同様に、抗原との結合反応、解離反応をＢｉａｃｏｒｅにて検出し、解離定数（ＫＤ）、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）を算出した。得られた結果を上記表１に示す。
【００９５】
（実施例２）
上記の通りに調製した、ヒトＥｖａ１タンパク質に対して高い親和性を示すマウス抗体、及びキメラ抗体について、以下に記載の方法にて、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、インビボにおける抗腫瘍活性を解析した。
【００９６】
＜ＡＤＣＣ活性解析＞
上記の通りに調製した、Ｃ３マウス抗体、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体、Ｃ３キメラ抗体及びＢ２Ｅ５−４８キメラ抗体に関し、ＡＤＣＣ活性（抗体依存性細胞障害活性）を解析した。すなわち、これら抗体のＦｃ部位にＦｃ−γ受容体を介してエフェクター細胞が結合することによって、当該細胞が活性化し、それに伴って当該抗体が認識する標的細胞を溶解し得るを、以下の方法にて解析した。
【００９７】
先ず、標的細胞として、ＭＫＮ２８細胞（ヒト胃がん細胞）と、ヒトＥｖａ１タンパク質を強制的に発現させたＤａｕｄｉ細胞（ヒトパーキットリンパ腫細胞）とを用意した。なお、ＭＫＮ２８細胞においてはＥｖａ１タンパク質が発現しているが、Ｄａｕｄｉ細胞においては元来発現していない。また、図には示さないが、ヒトＥｖａ１タンパク質を強制的に発現させたＤａｕｄｉ細胞（以下「Ｄａｕｄｉ−ｈＥｖａ１細胞」とも称する）及びＭＫＮ２８細胞の各々に対して、Ｃ３マウス抗体、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体、Ｃ３キメラ抗体、Ｂ２Ｅ５−４８キメラ抗体及びＡ５Ｄ１１−１０マウス抗体のいずれも結合し得ることは、フローサイトメトリーにより確認している。さらに、Ｄａｕｄｉ細胞は、後述のリツキシマブの標的となるＣＤ２０を発現しているが、ＭＫＮ２８細胞においては発現していない。
【００９８】
また、これら標的細胞を、後述の通り抗Ｅｖａ１抗体に接触させる前に、各細胞１×１０６細胞／ｍＬあたり、カルセイン−ＡＭ  １０μＬ（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。なお、カルセイン−ＡＭは、蛍光をほとんど示さないが、細胞膜透過性を有し、細胞内のエステラーゼによる加水分解でカルセインとなる。カルセインは膜不透過性の化合物で、強い黄緑色の蛍光を示す。ＡＤＣＣ活性により細胞が殺傷されると細胞内からカルセインが放出され蛍光を発する。  また、エフェクター細胞として、マウス由来のＦｃ−γ受容体ＩＩＩ遺伝子が導入されたＫＨＹＧ−１細胞（ＮＫ細胞腫細胞）と、ヒト由来のＦｃ−γ受容体ＩＩＩａ遺伝子が導入されたＫＨＹＧ−１細胞とを用意した。
【００９９】
そして、９６ウェルプレートの各ウェルに、前記抗体（添加濃度：０．０１、０．１、１又は１０μｇ／ｍｌ）と前記カルセイン−ＡＭを取り込んだ標的細胞（１×１０４個）とを、計１００μＬになるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３０分間静置した。また、前記抗体の代わりに、アイソタイプコントロール抗体（マウスＩｇＧ２ｂ抗体、ヒトＩｇＧ１抗体及びマウスＩｇＧ１抗体）を各々添加したウェル、並びに抗体を添加しないウェルを、陰性対照群として用意した。さらに、抗ヒトＣＤ２０ヒト・マウスキメラ抗体であるリツキシマブは、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を有することが明らかになっているため、当該抗体を添加したウェルを、陽性対照群として用意した。次いで、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にてインキュベーションした後、各ウェルにエフェクター細胞を５０μＬ（前記標的細胞の添加数の十倍：１×１０５個）添加し、最終的に２００μＬの培養液とし、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３時間培養した。そして、ＡＤＣＣ活性による殺傷で細胞内から放出されたカルセインの蛍光値、細胞内から自律的に放出されるカルセインの蛍光値、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（最終濃度１％）による殺傷で細胞内から放出されたカルセインの蛍光値をマルチラベルリーダーＡＬＶＯ  Ｘ３により検出した。
【０１００】
次いで、得られた蛍光値に基づき、溶解率を以下のように計算して求めた。
溶解率（％）＝（ＡＤＣＣ活性による殺傷で細胞内から放出されたカルセインの蛍光値−細胞内から自律的に放出されるカルセインの蛍光値／ＴｒｉｔｏｎＸ（最終濃度１％）による殺傷で細胞内から放出されたカルセインの蛍光値−細胞内から自律的に放出されるカルセインの蛍光値）ｘ１００。得られた結果を図４〜７に示す。
【０１０１】
図４に示した結果から明らかな通り、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体及びＣ３マウス抗体は共に、Ｄａｕｄｉ−ｈＥｖａ１細胞に対して強いＡＤＣＣ活性を示した。また、Ｃ３マウス抗体のＡＤＣＣ活性はリツキシマブのそれと同程度であったが、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体はそれらよりも強いＡＤＣＣ活性を示した。さらに、図５に示した結果から明らかな通り、キメラ抗体にしても、Ｄａｕｄｉ−ｈＥｖａ１細胞に対する強いＡＤＣＣ活性は維持されていた。
【０１０２】
また、図６及び７に示した結果から明らかな通り、ＭＫＮ２８細胞に対しても、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体、Ｂ２Ｅ５−４８キメラ抗体、Ｃ３マウス抗体及びＣ３キメラ抗体のいずれもＡＤＣＣ活性を示した。特に、ＭＫＮ２８細胞に対しても、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体及びＢ２Ｅ５−４８キメラ抗体は強いＡＤＣＣ活性を示した。
【０１０３】
また標的細胞として前記Ｄａｕｄｉ−ｈＥｖａ１細胞を用い、エフェクター細胞として、マウス由来のＦｃ−γ受容体ＩＩＩ遺伝子が導入されたＫＨＹＧ−１細胞を用い、前記同様に、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体、Ｃ３マウス抗体及びＡ５Ｄ１１−１０マウス抗体に関し、ＡＤＣＣ活性を解析した。得られた結果を図８に示す。
【０１０４】
図８に示した通り、Ａ５Ｄ１１−１０マウス抗体も、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体及びＣ３マウス抗体と同様に、Ｄａｕｄｉ−ｈＥｖａ１細胞に対して強いＡＤＣＣ活性を示すことが明らかになった。
【０１０５】
＜ＣＤＣ活性解析＞
上記の通りに調製した、Ｃ３マウス抗体、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体、Ｃ３キメラ抗体及びＢ２Ｅ５−４８キメラ抗体について、補体の存在下、当該抗体が認識する標的細胞を溶解する活性（ＣＤＣ活性：補体依存性細胞障害活性）を、以下の方法にて解析した。
【０１０６】
標的細胞は、ＡＤＣＣ活性解析と同じく、前記２種の細胞を用い、各細胞１×１０６細胞／ｍＬあたり、カルセイン−ＡＭ  １０μＬ（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。また、補体として、Ｌｏｗ−Ｔｏｘ（登録商標）−Ｍ  ウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、製品コード：ＣＬ３０５１）を用意した。
【０１０７】
そして、９６Ｕウェルプレートの各ウェルに、前記抗体（添加濃度：０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３又は１０μｇ／ｍｌ）と前記標的細胞（１ｘ１０４個）とを、計１００μＬになるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３０分培養した。また、前記抗体の代わりに、アイソタイプコントロール抗体（マウスＩｇＧ２ｂ抗体及びヒトＩｇＧ１抗体）を各々添加したウェル、並びに抗体を添加しないウェルを、陰性対照群として用意した。さらに、リツキシマブを添加したウェルを陽性対照群として用意した。次いで、氷上の各ウェルに前記補体を５０μＬ（希釈率：１／６４）添加して、直ちに３７℃、５％ＣＯ２の条件下、２時間インキュベートした。そして、プレートを２０００ｒｐｍ、５分間の条件で遠沈し、各ウェルから１００μＬの上清を採取し、９６フラットウェルプレートの各ウェルに添加して静置した。次いで、補体活性による殺傷で細胞内から放出されたカルセインの蛍光値、細胞内から自律的に放出されるカルセインの蛍光値、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（最終濃度１％）による殺傷で細胞内から放出されたカルセインの蛍光値をマルチラベルリーダーＡＬＶＯ  Ｘ３（Ｅｌｍｅｒ社）によりｅｘ．４８５ｎｍ  ａｎｄ  ｅｍ．５３５ｎｍの条件で蛍光発色を検出した。次いで、得られた蛍光値に基づき、溶解率を以下のように計算して求めた。
溶解率（％）＝（補体活性による殺傷で細胞内から放出されたカルセインの蛍光値−細胞内から自律的に放出されるカルセインの蛍光値／ＴｒｉｔｏｎＸ（最終濃度１％）による殺傷で細胞内から放出されたカルセインの蛍光値−細胞内から自律的に放出されるカルセインの蛍光値）ｘ１００。得られた結果を図９〜１４に示す。
【０１０８】
図９に示した結果から明らかな通り、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体はＤａｕｄｉ−ｈＥｖａ１細胞に対して強いＣＤＣ活性を示し、特に低濃度側における活性強度はリツキシマブよりも顕著に高いものであった。一方、Ｃ３マウス抗体に関しては、Ｄａｕｄｉ−ｈＥｖａ１細胞に対するＣＤＣ活性が認められなかった。
【０１０９】
しかしながら、図１０に示す通り、Ｃ３抗体はキメラ化することによって、ＣＤＣ活性を奏するようになった。また、Ｂ２Ｅ５−４８抗体に関し、キメラ抗体にしても、Ｄａｕｄｉ−ｈＥｖａ１細胞に対するＣＤＣ活性は維持されていた。
【０１１０】
一方、図１１〜１４に示した結果から明らかなように、Ｃ３マウス抗体、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体、Ｃ３キメラ抗体及びＢ２Ｅ５−４８キメラ抗体のいずれにおいても、ＭＫＮ２８細胞に対するＣＤＣ活性は認められなかった。
【０１１１】
なお、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体のＣＤＣ活性における、Ｄａｕｄｉ−ｈＥｖａ１細胞とＭＫＮ２８細胞との差異は、ＣＤＣ活性の耐性に依ることが考えられる。ＣＤＣ活性の耐性については、標的分子の抗体結合領域からの細胞膜への距離が離れている場合（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．．１７４，５７０６−５７１２，２００５）、あるいはＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９等の補体活性抑制細胞受容体の発現により補体活性の障害が誘導することが報告されている（ＦＥＢＳ  ５８７，６４５−６５１，２０１３；ＦＥＢＳ  ５８６，  ７７６−７７１，２０１２；Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２５，４９６−５０３，２００４）。これらの報告から、ＭＫＮ２８細胞では認められず、Ｄａｕｄｉ−ｈＥｖａ１細胞に対して認められるＣＤＣ活性障害は、ＭＫＮ２８細胞上の補体活性抑制細胞受容体の発現を原因とする可能性が推察される。
【０１１２】
＜がん転移モデルマウスを用いた解析＞
上記の通りに調製した抗Ｅｖａ１抗体のインビボでの抗腫瘍活性を評価すべく、以下の通り、当該抗体をがん転移モデルマウスに投与して解析を行った。
【０１１３】
先ず、マウスに接種して転移させる細胞を調製した。すなわち、Ｂ１６メラノーマ細胞（マウスＢ１６／ＢＬ６メラノーマ、ＲＩＫＥＮ  ＲＢＣより受領）は、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタマックス、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（全てナカライテスク社製）にて、３７℃、５％ＣＯ２条件下、維持した。
【０１１４】
なお、Ｂ１６メラノーマ細胞は、培養条件下では、Ｅｖａ１タンパク質を発現していない。この性状を考慮し、Ｂ１６メラノーマ細胞にＥｖａ１タンパク質を強制的に発現させるべく、ｐＣＭＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に、ヒトＥｖａ１タンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、ｐＣＭＳ−ＥＧＦＰ−ｈｕｍａｎ  Ｅｖａ１ベクターを調製した。そして、ｐＣＭＳ−ＥＧＦＰ−ｈｕｍａｎ  Ｅｖａ１又はｐＣＭＳ−ＥＧＦＰを、ＡＭＡＸＡヌクレオフェクター装置（Ｌｏｎｚａ社製）を用いて、Ｂ１６メラノーマ細胞に導入した。次いで、これら形質転換細胞を対象としてフローサイトメトリー（使用したフローサイトメーター：ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を繰り返し、ＧＦＰ陽性細胞を精製した。以下、ｐＣＭＳ−ＥＧＦＰ−ｈｕｍａｎ  Ｅｖａ１を導入し、精製して得られた細胞を「Ｂ１６−Ｅｖａ１」とも称し、またｐＣＭＳ−ＥＧＦＰを導入し、精製して得られた細胞を「Ｂ１６−ＧＦＰ」とも称する。
【０１１５】
次に、下記（１）〜（４）に記載の各条件にて、前記ＧＦＰ陽性Ｂ１６メラノーマ細胞をマウスに接種し、さらに上記の通りに調製した抗Ｅｖａ１抗体を投与することで、これら抗体のインビボでの抗腫瘍活性を評価した。
（１）Ｂ１６−Ｅｖａ１を、５〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに１×１０５個  尾静脈内投与した。当該メラノーマ接種１日後から、３日間おきに、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体を１００μｇずつ尾静脈内に計４回投与した。そして、メラノーマを接種してから１３日後に肺を採取し、形成されたメラノーマのコロニー数を計測した（ｎ＝５）。得られた結果を、図１５及び１６に示す。
（２）Ｂ１６−ＧＦＰを、５〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに各々１×１０５個  尾静脈内投与した。当該メラノーマ接種１日後から、３日間おきに、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体又はＢ２Ｅ５−４８キメラ抗体を１００μｇずつ尾静脈内に計４回投与した。そして、メラノーマを接種してから１３日後に肺を採取し、形成されたメラノーマのコロニー数を計測した（ｎ＝５）。得られた結果を、図１７〜２０に示す。
（３）Ｂ１６−ＧＦＰを、５〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに各々１×１０５個  尾静脈内投与した。当該メラノーマ接種１３日後から、３日間おきに、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体を１００μｇずつ尾静脈内に計３回投与した。そして、メラノーマ接種してから２２日後に肺を採取し、形成されたメラノーマのコロニー数を計測した（ｎ＝５）。また、形成されたコロニー数に応じてマウスを群に分け、それらの匹数をも計測した。得られた結果を、図２１〜２２に示す。
（４）Ｂ１６−Ｅｖａ１を、５〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに１×１０５個  尾静脈内投与した。当該メラノーマ接種１日後から、４日間おきに、Ｃ３マウス抗体を１００μｇずつ尾静脈内に計４回投与した。そして、メラノーマを接種してから１４日後に肺を採取し、形成されたメラノーマのコロニー数を計測した（ｎ＝５）。
得られた結果を、図２３及び２４に示す。
（５）Ｂ１６−ＧＦＰを、５〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに１×１０５個  尾静脈内投与した。当該メラノーマ接種１日後から、４日間おきに、Ｃ３マウス抗体を１００μｇずつ尾静脈内に計４回投与した。そして、メラノーマを接種してから１４日後に肺を採取し、形成されたメラノーマのコロニー数を計測した（ｎ＝５）。
得られた結果を、図２３及び２４に示す。
【０１１６】
なお、コロニー数の計測は、Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ．ら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００２年、７０巻、７９１〜７９８ページに記載の方法に沿って行った。また、いずれの解析においても、アイソタイプコントロール抗体投与群を対照群として用意した。そして、得られた結果を、マイクロ社製ソフト  エクセルを用いスチューデントｔ検定法によって解析してＰ値を算出し、前記対照群との差の有意性について評価した。
【０１１７】
図１５及び１６に示す通り、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体を投与したマウスにおいては、Ｅｖａ１タンパク質を強制的に発現させたＢ１６メラノーマ細胞の肺におけるコロニー形成を顕著に抑制できることが明らかになった、また、この結果がメラノーマ接種１日後に抗体を投与して得られた結果であることを鑑みるに、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体はがんの転移に対して予防的な効果を奏したことが示唆される。
【０１１８】
上述の通り、Ｂ１６メラノーマ細胞は培養条件下においてＥｖａ１タンパク質を発現していない。しかしながら、図１７〜２０に示した結果から明らかなように、このようなＥｖａ１タンパク質を強制的に発現させていないＢ１６メラノーマ細胞に関しても、肺におけるコロニー形成を、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体及びＢ２Ｅ５−４８キメラ抗体は顕著に抑制した。
【０１１９】
そこで、抗Ｅｖａ１ポリクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによって、Ｂ１６メラノーマ細胞を接種させたマウスにおける肺を解析し、当該細胞におけるＥｖａ１タンパク質の有無を確認した。その結果、図には示さないが、肺に転移したＢ１６メラノーマ細胞においてＥｖａ１タンパク質が発現していることが明らかになった。したがって、前記Ｂ１６メラノーマ細胞に対して認められたＢ２Ｅ５−４８抗体の抗腫瘍効果は、マウス体内に投与された後に獲得されたＥｖａ１タンパク質の発現を介して奏されていることが示唆される。
【０１２０】
また、図１８及び２０に示す通り、かかるＢ１６メラノーマ細胞に対する抗腫瘍効果は、Ｂ２Ｅ５−４８抗体をキメラ化することにより向上することも明らかになった。
【０１２１】
さらに、Ｂ１６メラノーマ細胞を接種してから抗体の投与を開始する時期を、上述の接種１日後から１４日後に遅らせても、図２１及び２２に示す通り、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体を投与したマウスにおいて、Ｂ１６メラノーマ細胞の肺におけるコロニー形成を顕著に抑制できることが明らかになった、また、この結果がメラノーマを接種してから１４日も経った後に抗体を投与して得られた結果であることを鑑みるに、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体は転移したがんに対して治療的な効果を奏したことが示唆される。
【０１２２】
また、図２３及び２４に示した結果から明らかなように、Ｂ２Ｅ５−４８マウス抗体同様に、Ｃ３マウス抗体においても、インビボにおける抗腫瘍活性が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
以上説明したように、本発明の抗体は、ヒト由来のＥｖａ１タンパク質に対して高い親和性を示し、また高いＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を有する。さらに、本発明の抗体は、インビボにおいても高い抗腫瘍活性を示すため、がんを治療又は予防するための薬剤、がんの転移を抑制するための薬剤等として有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２４】
配列番号：１
＜２２３＞  シグナルペプチド及び軽鎖可変領域（Ｂ２Ｅ５−４８）
配列番号：３
＜２２３＞  軽鎖可変領域（Ｂ２Ｅ５−４８）
配列番号：４
＜２２３＞  軽鎖可変領域のＣＤＲ１（Ｂ２Ｅ５−４８）
配列番号：５
＜２２３＞  軽鎖可変領域のＣＤＲ２（Ｂ２Ｅ５−４８）
配列番号：６
＜２２３＞  軽鎖可変領域のＣＤＲ３（Ｂ２Ｅ５−４８）
配列番号：７
＜２２３＞  シグナルペプチド及び重鎖可変領域（Ｂ２Ｅ５−４８）
配列番号：９
＜２２３＞  重鎖可変領域（Ｂ２Ｅ５−４８）
配列番号：１０
＜２２３＞  重鎖可変領域のＣＤＲ１（Ｂ２Ｅ５−４８）
配列番号：１１
＜２２３＞  重鎖可変領域のＣＤＲ２（Ｂ２Ｅ５−４８）
配列番号：１２
＜２２３＞  重鎖可変領域のＣＤＲ３（Ｂ２Ｅ５−４８）
配列番号：１３
＜２２３＞  シグナルペプチド及び軽鎖可変領域（Ｃ３）
配列番号：１５
＜２２３＞  軽鎖可変領域（Ｃ３）
配列番号：１６
＜２２３＞  軽鎖可変領域のＣＤＲ１（Ｃ３）
配列番号：１７
＜２２３＞  軽鎖可変領域のＣＤＲ２（Ｃ３）
配列番号：１８
＜２２３＞  軽鎖可変領域のＣＤＲ３（Ｃ３）
配列番号：１９
＜２２３＞  シグナルペプチド及び重鎖可変領域（Ｃ３）
配列番号：２１
＜２２３＞  重鎖可変領域（Ｃ３）
配列番号：２２
＜２２３＞  重鎖可変領域のＣＤＲ１（Ｃ３）
配列番号：２３
＜２２３＞  重鎖可変領域のＣＤＲ２（Ｃ３）
配列番号：２４
＜２２３＞  重鎖可変領域のＣＤＲ３（Ｃ３）
配列番号：２５
＜２２３＞  軽鎖可変領域（Ａ５Ｄ１１−１０）
配列番号：２７
＜２２３＞  軽鎖可変領域のＣＤＲ１（Ａ５Ｄ１１−１０）
配列番号：２８
＜２２３＞  軽鎖可変領域のＣＤＲ２（Ａ５Ｄ１１−１０）
配列番号：２９
＜２２３＞  軽鎖可変領域のＣＤＲ３（Ａ５Ｄ１１−１０）
配列番号：３０
＜２２３＞  重鎖可変領域（Ａ５Ｄ１１−１０）
配列番号：３２
＜２２３＞  重鎖可変領域のＣＤＲ１（Ａ５Ｄ１１−１０）
配列番号：３３
＜２２３＞  重鎖可変領域のＣＤＲ２（Ａ５Ｄ１１−１０）
配列番号：３４
＜２２３＞  重鎖可変領域のＣＤＲ３（Ａ５Ｄ１１−１０）
配列番号：３５
＜２２３＞  ヒトＥｖａ１
配列番号：３７
＜２２３＞  マウスＥｖａ１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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