(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖類の存在下で、かご状タンパク質に金属元素を導入して、前記金属元素を内包する金属内包かご状タンパク質を生成させる工程を備える、金属内包かご状タンパク質の製造方法であって、
前記かご状タンパク質がフェリチンであり、
前記金属元素が鉄であり、
前記金属内包かご状タンパク質が鉄内包フェリチンである、方法。
【請求項２】
前記金属内包かご状タンパク質を生成させる工程の後に、前記金属内包かご状タンパク質を含む混合物をゲル濾過クロマトグラフィーで精製し、得られた溶出液をそのまま濃縮する工程を備える、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記多糖類がオリゴ糖である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記オリゴ糖が二糖類である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記二糖類がスクロース、トレハロース及びマルトースからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記オリゴ糖が三糖類、四糖類又は五糖類である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項７】
前記多糖類がデキストリンである、請求項１又は２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属内包かご状タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フェリチンに代表されるかご状タンパク質は、その内部に空洞を有しており、空洞内に鉄等の金属元素を貯蔵することができる。金属元素を内包するかご状タンパク質は、量子ドットの作製に用いられることが提案されており、レーザー、太陽電池、熱電変換素子等への応用が期待されている。【０００３】
かご状タンパク質に金属元素を導入するための方法として、例えば特許文献１には、緩衝液中でフェリチンに鉄を導入する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−１９４８１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、特許文献１に記載の方法ではフェリチン内部への鉄の導入効率が十分に高いものではなく、鉄が導入されなかったフェリチンを除去する工程を要するため、工業的な生産の観点からは改善の余地が残っている。【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、かご状タンパク質に金属元素を高効率で導入することのできる、金属含有かご状タンパク質の製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、多糖類の存在下で、かご状タンパク質に金属元素を導入して、上記金属元素を内包する金属内包かご状タンパク質を生成させる工程を備える、金属内包かご状タンパク質の製造方法に関する。本発明に係る製造方法によれば、高効率でかご状タンパク質に金属元素を導入することができるため、金属内包かご状タンパク質を効率よく製造することができる。【０００８】
本発明に係る製造方法は、かご状タンパク質に金属元素を高効率で導入することを可能とするので、上記金属内包かご状タンパク質を生成させる工程の後に、上記金属内包かご状タンパク質を含む混合物をゲル濾過クロマトグラフィーで精製し、得られた溶出液をそのまま濃縮する工程を備えてもよい。【０００９】
上記多糖類は、オリゴ糖であってもよい。この構成を備えることにより、より高効率でかご状タンパク質に金属元素を導入することができる。【００１０】
上記オリゴ糖は、二糖類であってもよい。また、上記二糖類は、スクロース、トレハロース及びマルトースからなる群から選択される少なくとも一種であってもよい。この構成を備えることにより、より一層高効率でかご状タンパク質に金属元素を導入することができる。【００１１】
上記オリゴ糖は、三糖類、四糖類又は五糖類であってもよい。この構成を備えることにより、より一層高効率でかご状タンパク質に金属元素を導入することができる。【００１２】
上記多糖類は、デキストリンであってもよい。この構成を備えることにより、より高効率でかご状タンパク質に金属元素を導入することができる。【００１３】
本発明に係る製造方法は、上記かご状タンパク質がフェリチンである金属内包かご状タンパク質を製造するために特に有用である。また、本発明に係る製造方法は、上記金属元素が鉄である金属内包かご状タンパク質を製造するために特に有用である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、かご状タンパク質に金属元素を高効率で導入することのできる、金属内包かご状タンパク質の製造方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１６】
本実施形態に係る金属内包かご状タンパク質の製造方法は、多糖類の存在下で、かご状タンパク質に金属元素を導入して、上記金属元素を内包する金属内包かご状タンパク質を生成させる工程を備える。
【００１７】
本明細書において、金属内包かご状タンパク質とは、金属元素を内包するかご状タンパク質を意味する。
【００１８】
かご状タンパク質は、金属元素を内包できるタンパク質であればよい。かご状タンパク質としては、例えば、フェリチン、Ｄｐｓ（ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｓｔａｒｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ）、又はウイルスのコートタンパク質が挙げられる。また、かご状タンパク質本来の構造及び機能を有するかご状タンパク質の変異体も、本明細書におけるかご状タンパク質に含まれる。
【００１９】
フェリチンは、２０〜２５ｋＤａのサブユニットから構成される直径８．５〜１２ｎｍのタンパク質である。フェリチンは、微生物由来、動物由来若しくは植物由来のフェリチンを含む。微生物由来のフェリチンとしては、ヘリコバクター菌由来のフェリチン等が挙げられる。動物由来のフェリチンとしては、ヒト由来のフェリチン、マウス由来のフェリチン、及びウマ由来のフェリチン等が挙げられる。植物由来のフェリチンとしては、大豆フェリチン等が挙げられる。本明細書において「フェリチン」とは、特に明記しない限り、金属を内包しないフェリチン（すなわち、アポフェリチン）を意味する。
【００２０】
Ｄｐｓはフェリチン様タンパク質であり、例えば、リステリア菌由来のＤｐｓ、及びスルホロバス菌由来のＤｐｓが挙げられる。ウイルスのコートタンパク質としては、ＣＣＭＶ（ｃｏｗｐｅａ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）のコートタンパク質等が挙げられる。これらの中でも、熱、ｐＨなどに高い安定性を示すフェリチンが好ましい。
【００２１】
かご状タンパク質は、当業者に周知の方法で製造することができる。一例として、特開２０１２−２００２４２号公報に記載の方法に従い、かご状タンパク質をコードする遺伝子等を含むプラスミドを構築し、当該プラスミドを大腸菌に導入して得られた形質転換体としての大腸菌を培養してかご状タンパク質を産生させ、産生したかご状タンパク質を精製することにより、かご状タンパク質を製造することができる。また、かご状タンパク質の変異体は、通常の遺伝子工学的手法、例えば部位特異的変異導入法によってかご状タンパク質をコードする遺伝子に人為的に変異を導入する方法により作製することができる。
【００２２】
かご状タンパク質に導入される金属元素は、かご状タンパク質内部の空洞に貯蔵され得る金属元素であればよい。本明細書において、金属元素は、金属イオン等の金属元素そのものであってもよいし、金属元素を構成元素とする金属化合物（酸化物、硫化物等）としてかご状タンパク質に内包されていてもよい。金属元素は、２価の金属イオンを形成できる金属元素であってもよく、例えば、鉄、ニッケル、コバルト、インジウム、亜鉛、銅、カドミウム、金が挙げられる。これらの中でも、かご状タンパク質内部への導入効率が高い鉄が好ましい。
【００２３】
本明細書において多糖類は、２以上の単糖分子同士、あるいは１以上の単糖分子と１以上の糖アルコールが脱水縮合し、グリコシド結合を形成して１分子となった糖を意味し、以下に詳述するオリゴ糖は本明細書における多糖類に含まれる。オリゴ糖以外の多糖類としては、例えば、デキストリン、デンプン、フルクタンが挙げられる。これらの中でも、より高効率でかご状タンパク質に金属元素を導入することができる観点から、デキストリンが好ましい。多糖類は、１種を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２４】
本明細書においてオリゴ糖は、２以上の単糖分子同士、あるいは１以上の単糖分子と１以上の糖アルコールが脱水縮合し、グリコシド結合を形成して１分子となった糖のうち、構成する単糖分子数が１０以下であるものを意味する。オリゴ糖の中でも、より高効率でかご状タンパク質に金属元素を導入することができる観点から、二糖類が好ましい。二糖類としては、例えば、スクロース、トレハロース、マルトース、セロビオースが挙げられる。これら二糖類の中でも、より一層高効率でかご状タンパク質に金属元素を導入することができる観点から、スクロース、トレハロース、マルトースが好ましい。また、オリゴ糖の中でも、より高効率でかご状タンパク質に金属元素を導入することができる観点から、三糖類、四糖類又は五糖類が好ましい。三糖類としては、例えば、マルトトリオース、ラフィノース、マルトトリイトールが挙げられる。四糖類としては、例えば、マルトテトラオース、スタキオース、マルトテトライトールが挙げられる。五糖類としては、例えば、マルトペンタオースが挙げられる。これら三糖類、四糖類及び五糖類の中でも、より一層高効率でかご状タンパク質に金属元素を導入することができる観点から、三糖類としてはマルトトリオースが好ましく、四糖類としてはマルトテトラオースが好ましく、五糖類としてはマルトペンタオースが好ましい。オリゴ糖は、１種を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。なお、本実施形態に係る製造方法においては、オリゴ糖に代えて、又はオリゴ糖とともに糖アルコールを使用してもよい。本明細書において糖アルコールは、糖類のカルボニル基を還元することで得られる炭素数３〜８の多価アルコールを意味する。糖アルコールとしては、例えば、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトールが挙げられる。
【００２５】
金属元素の導入方法の一例として、溶媒、かご状タンパク質、金属源、及び多糖類を含む溶液中で、かご状タンパク質に金属元素を導入することができる。溶媒としては、例えば、水を用いることができる。金属源は、溶媒中で２価の金属イオンを形成できる金属化合物などを用いることができ、例えば、硫酸アンモニウム鉄（（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２）、硫酸アンモニウムコバルト（（ＮＨ４）２Ｃｏ（ＳＯ４）２）、硫酸インジウムが挙げられる。
【００２６】
本工程においては、緩衝液を用いて溶液のｐＨを７〜８に調整することが好ましい。このような緩衝液としては、例えば、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液を用いることができる。
【００２７】
かご状タンパク質に金属元素を導入して、金属内包かご状タンパク質を生成させる工程において、混合溶液の温度は、好ましくは０〜２０℃、より好ましくは５〜１５℃であり、混合溶液の撹拌時間は、好ましくは２〜４時間である。温度及び時間をこのように設定することで、より高効率でかご状タンパク質に金属元素を導入することができる。
【００２８】
また、かご状タンパク質に金属元素を導入して、金属内包かご状タンパク質を生成させる工程において、特に金属元素の酸化反応を伴う場合は、より高効率でかご状タンパク質に金属元素を導入することができる観点から、混合溶液に通気しながら撹拌するのが好ましい。通気量は、好ましくは０．２〜５ｖｖｍであり、より好ましくは１〜２ｖｖｍである。
【００２９】
本実施形態に係る製造方法は、金属内包かご状タンパク質を生成させる工程の後に、塩類、金属源、及びかご状タンパク質のオリゴマーを除去するための精製工程を備えてもよい。精製工程の一例として、金属内包かご状タンパク質を生成させる工程で得られた金属内包かご状タンパク質を含む混合物を、ゲル濾過クロマトグラフィーで精製する方法が挙げられる。金属内包かご状タンパク質の純度をより高くするため、金属内包かご状タンパク質を含む混合物をゲル濾過クロマトグラフィーで精製する前に、塩析、限外濾過濃縮等を行ってもよい。
【００３０】
本実施形態に係る製造方法は、金属内包かご状タンパク質を生成させる工程の後に、金属元素を含まないかご状タンパク質を除去する工程を備えていてもよい。通常、高純度の金属内包かご状タンパク質を得るためには、かご状タンパク質に金属元素を導入して、金属内包かご状タンパク質を生成させる工程において、金属元素を取り込まなかったかご状タンパク質を除去する工程が別途必要となる。金属元素を含まないかご状タンパク質を除去する方法としては、例えば、密度勾配遠心法が挙げられる。他方、本実施形態に係る製造方法は、高効率でかご状タンパク質に金属元素を導入することを可能とする。したがって、本実施形態に係る製造方法は、金属内包かご状タンパク質を生成させる工程の後に、金属内包かご状タンパク質を含む混合物をゲル濾過クロマトグラフィーで精製し、得られた溶出液をそのまま濃縮する工程を備えてもよい。
【００３１】
金属内包かご状タンパク質が鉄内包フェリチンであるとき、フェリチンへの鉄の導入率は３８０ｎｍにおける吸光度と密接に相関することが知られている（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９９２，２９８（１），２５９−２６４）。したがって、３８０ｎｍにおける一定濃度の鉄内包フェリチン溶液の吸光度を測定することで、フェリチンへの鉄の導入率を評価することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を挙げて本発明についてより具体的に説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。以下の実施例において、内部に鉄を内包していないフェリチンを「アポフェリチン」と称する。【００３３】
〔１．アポフェリチンの調製〕
特開２０１２−２００２４２号公報の実施例１に記載の方法に準じて、プラスミドｐＫＬ２２３を作製した。特開２００８−１９４８１５号公報に記載のウマ由来フェリチン「ＣＮＨＢ−Ｆｅｒ０」のアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成し（配列番号１）、開始コドンのすぐ上流にＥｃｏＲＩ及びＷＳＤ配列（ＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＴ、配列番号２）、終始コドンの下流にＰｓｔＩ配列（ＣＴＧＣＡＧ）を付加した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化し、プラスミドｐＫＬ２２３のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩギャップに挿入して、プラスミドｐＫＬＣＮＨ−Ｆｅｒ０を構築した。作製されたプラスミドｐＫＬＣＮＨ−Ｆｅｒ０を大腸菌ＢＬ２１に導入して、形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ｐＫＬＣＮＨ−Ｆｅｒ０）を得た。【００３４】
形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ｐＫＬＣＮＨ−Ｆｅｒ０）を、終濃度５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加した１０ｍＬのＬＢ培地中で、３７℃に加温しながら、２００ｒｐｍで１６〜２０時間振とうすることにより培養して、シード培養液を調製した。続いて、ラクトース（２％）を含むＴＢ培地５Ｌにシード培養液５ｍＬを添加し、３７℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌数２９０ｒｐｍで培養を開始した。２４〜４８時間後、遠心分離（８０００×ｇ、１５分間、２０℃）により培養液から菌体を集めた。菌体を５０ｍＭ  トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝液（ｐＨ８．０）５００ｍＬに懸濁してから、再度遠心分離により菌体を集めて、洗浄菌体を調製した。【００３５】
洗浄菌体を湿重量の５倍量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁し、超音波破砕器によって菌体を破砕した。破砕された菌体を含む懸濁液を遠心分離（１００００×ｇ、１５分間、４℃）し、上清を集めた。次に、集めた上清を７０℃で２０分間加熱した。これを室温で１時間静置した後、遠心分離（１００００×ｇ、１５分間、４℃）し、上清を集めて、アポフェリチン溶液を得た。得られたアポフェリチン溶液におけるタンパク質濃度の定量は、ブラッドフォード法（Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔプロテインアッセイ）を用いて行った。【００３６】
〔２．アポフェリチンへの鉄の導入〕
本実施例では、すべての成分を混合した時点での最終組成が、
８０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）
０．５ｍｇ／ｍＬ  アポフェリチン
５ｍＭ  硫酸アンモニウム鉄
２０％（ｗ／ｖ）  二糖類（実施例１：スクロース、実施例２：トレハロース、実施例３：マルトース）
となるように、以下の手順にしたがって合計８０ｍＬの溶液を調製し、鉄をアポフェリチンに導入した。
以下では、便宜上スクロースを添加した実施例１の方法について述べるが、実施例２及び３では、スクロースに代えてトレハロース、マルトースをそれぞれ用いたこと以外は実施例１と同様の方法で行い、比較例１では、二糖類を添加しなかったこと以外は実施例１と同様の方法で行った。【００３７】
５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）（１２．８ｍＬ）、蒸留水（２４．７ｍＬ）、及び５０％（ｗ／ｖ）スクロース水溶液（３２ｍＬ）を混合した溶液を調製した。得られた溶液を窒素で置換し、１０〜１５℃で２０分間撹拌した（撹拌速度：１００〜２００ｒｐｍ）。この溶液に、上記の方法に準じて調製した１５．９ｍｇ／ｍＬ  アポフェリチン溶液（２．５ｍＬ）を添加し、次いで、溶液を通気しながら（１〜２ｖｖｍ）、５０ｍＭ  硫酸アンモニウム鉄水溶液８ｍＬを２５分間かけて徐々に添加して、１０〜１５℃で２〜４時間撹拌した。【００３８】
得られた溶液を、遠心分離（１５０００×ｇ、１５分間、２０℃）して上清を回収した。回収した上清に、その１／１０容量の５Ｍ  塩化ナトリウム水溶液を添加し、遠心分離（１００００×ｇ、１０分間、４℃）して沈殿を回収した。回収した沈殿に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤（ｐＨ８．０）（８ｍＬ）を添加し、振とう機上で、室温で１〜２時間緩やかに撹拌して沈殿を溶解させた。得られた溶液を、遠心分離（１００００×ｇ、１０分間、２０℃）して上清を回収した。【００３９】
回収した上清を、ビバスピン２０（分画分子量５０Ｋ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）を用いて限外濾過（８０００×ｇ、１０分間、２０℃）を行い、約８００μＬになるまで濃縮した。【００４０】
濃縮液を、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、溶出液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））にて精製し、単量体を内包する画分を回収した。なお、得られた各画分の分析は、ＨＰＬＣを用いて以下の条件で行った。
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏ  ＳＥＣ−５  ５００Ａ
カラム温度：２５℃
移動相：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
流速：１．０ｍＬ／分
注入量：５０μＬ
検出：２８０ｎｍ
モノマー保持時間：８．９分付近【００４１】
回収した単量体を含有する画分を、ビバスピン２０（分画分子量５０Ｋ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）を用いて限外濾過濃縮（８０００×ｇ、５分間、２０℃）を行った。濃縮液を２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、上記と同様の条件で限外濾過濃縮を行い、鉄内包フェリチンを得た。【００４２】
タンパク質濃度の定量は、ブラッドフォード法（Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔプロテインアッセイ）を用いて行った。
鉄の導入率は、上記鉄内包フェリチンを２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で５．０ｍｇ／ｍＬとなるように調整し、更に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で０．１ｍｇ／ｍＬに希釈し、３８０ｎｍにおける希釈液の吸光度を、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））を用いて測定することで評価した。
また、ポジティブコントロールとして、特開２００８−１９４８１５号公報の実施例（準備４−２、５及び６）に記載の方法に準じて鉄内包フェリチンを製造し、上記と同様の方法で鉄の導入率評価を行った。
結果を表１に示す。【００４３】
【表１】
0006757408.tif 000002
【００４４】
二糖類を添加してフェリチンに鉄を導入した実施例１、２及び３の鉄内包フェリチンの吸光度は、ポジティブコントロールとほぼ同等であり、高効率でフェリチンに鉄が導入されたことが確認された。これに対し、二糖類の非存在下でフェリチンに鉄を導入した比較例１の鉄内包フェリチンの吸光度は、ポジティブコントロールの８割程度であり、実施例１、２及び３と比較して明らかに鉄の導入率に劣ることが確認された。【００４５】
〔３．アポフェリチンへの鉄の導入（２）〕
上記実施例１において、スクロースに代えて以下の表２に記載の各多糖類を用いたこと以外は、上記実施例１と同様の方法でアポフェリチンへの鉄への導入を行い、鉄の導入率を評価した（実施例４〜１０）。また、上記実施例１において、糖類を添加しなかったこと以外は、上記実施例１と同様の方法でアポフェリチンへの鉄への導入を行い、鉄の導入率を評価した（比較例２）。結果を表２に示す。【００４６】
【表２】
0006757408.tif 000003
【００４７】
多糖類を添加してフェリチンに鉄を導入した実施例４〜１０では、糖類非存在下でフェリチンに鉄を導入した比較例２と比較して３８０ｎｍにおける吸光度が１３〜３８％増加しており、より高い効率でフェリチンに鉄が導入されたことが確認された。【００４８】
以上より、本発明の製造方法によれば、高効率でかご状タンパク質に金属元素を導入できることが示された。
【配列表】
0006757408000001.app