(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊芝（赤芝）熱水抽出物及び／又は黒霊芝熱水抽出物を含有することを特徴とする７−ケトコレステロール処理された血管内皮細胞のＶＣＡＭ−１又はセレクチン発現抑制剤（動脈硬化症の予防剤を除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、霊芝を含有することを特徴とする、細胞接着分子発現抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞接着分子は、細胞同士、あるいは細胞とウイルス及び細胞外マトリクスとの接着を担う分子であり、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ：Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ：Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、セレクチン、カドヘリン、インテグリン等多くの種類が存在する。その機能は細胞形態や組織構造の維持、シグナル伝達、ウイルスや細菌のレセプター等多岐に及び、動脈硬化症、急性上気道炎、リウマチ、膠原病、一型糖尿病、多発性硬化症、ウイルス性肝炎等の疾患との関連性も報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
血管内皮は、動脈及び静脈を含む血管の内壁を構成する細胞層であり、血管内皮を構成する細胞を血管内皮細胞という。血管内皮細胞は、血管拡張、血管形成、止血反応、炎症反応等を調節することで、血管機能や血管のホメオスタシスを維持する重要な細胞である。主要な機能の一つとして、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ：ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ）の働きにより一酸化窒素を産生することで、収縮、拡張、弾性、透過性等の血管の性状を調節する働きがある。他にも、血管内皮細胞はプロスタサイクリン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、トロンボモジュリン、ブラジニキンを産生することで血液凝固や血圧を調節する働きがある。また、血管内皮細胞が発現するＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、セレクチン等の細胞接着分子、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ：Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）やプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ：Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は、血管新生や創傷治癒において重要な働きをする。ＭＣＰは単球の血管内皮細胞への遊走に働き、ＰＡＩは組織プラスミノーゲンアクチベーターの活性消失により血液凝固を促進する分子である。
【０００４】
しかし、血液中の炎症性サイトカイン（インターロイキン、腫瘍壊死因子等）、酸化ＬＤＬ（Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、酸化ストレスが増加すると、血管内皮細胞の細胞接着分子、ＭＣＰ、ＰＡＩの発現増加やｅＮＯＳの発現減少が起こる。その結果、血管機能が維持できなくなった状態が血管内皮細胞機能障害であり、動脈硬化症の発症原因となる（非特許文献２、３）。
【０００５】
動脈硬化症は、高コレステロール血症や糖尿病から進行し、心筋梗塞、脳卒中、脳血栓、脳出血、クモ膜下出血等の原因となる。動脈硬化症の一種であるアテローム性（粥状）動脈硬化症は、比較的大きな動脈の血管の内側にアテローム性のプラーク（隆起）が発生して肥大化することで進行する。これまで、血中コレステロール濃度の増加と血管内皮への沈着が動脈硬化症の主な原因として考えられていたが、近年の研究から血管内皮細胞機能障害の重要性が明らかとなっている。血管内皮細胞機能障害が起こると、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、セレクチン、ＭＣＰ、ＰＡＩ等の発現増加、ｅＮＯＳの発現減少により、血液中の単球が血管内皮細胞表面に接着し、続いて血管内皮細胞下への浸潤が起きる。浸潤した単球はマクロファージへと形質転換し、酸化ＬＤＬを貪食してマクロファージ内に取り込む。そして、酸化ＬＤＬの過剰な取り込みにより泡沫化したマクロファージが血管内膜に沈着すると、血管内膜の肥厚により血流の阻害や血管の閉塞が起き、動脈硬化症に至る。そのため、血管内皮細胞機能障害を抑制することによる動脈硬化症の予防も提案されている（特許文献１、２、３）。
【０００６】
ＩＣＡＭは免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞接着分子の一つで、血管内皮細胞や気道上皮細胞で発現しており、炎症性サイトカインの作用により発現が増加する。血管内皮細胞で発現するＩＣＡＭは、動脈硬化症の進行に寄与している。また、気道上皮細胞で発現するＩＣＡＭは、鼻、喉等の上気道での炎症を引き起こすライノウイルスと結合する。ライノウイルスは、急性上気道炎（風邪、普通感冒）の病因ウイルスであり、急性上気道炎の原因の５０％を占め、児童の喘息の増悪にも関与することがわかっている（非特許文献４）。そのため、急性上気道炎の予防において、ライノウイルス感染防止は重要な役割を持ち、ＩＣＡＭの抑制により急性上気道炎を予防できると言われている（非特許文献５）。
【０００７】
霊芝の薬理作用として、霊芝抽出物を含有することを特徴とするコレステロール吸収抑制剤（特許文献４）、黒霊芝の抽出物を含有することを特徴とするＬＤＬレセプター合成促進剤（特許文献５）が報告されている。特許文献４は、コレステロールの脂質ミセルへの取込抑制作用を作用機序とした、腸管内での食事由来コレステロール吸収抑制作用を示している。しかし、特許文献４には、血管内皮細胞や気道上皮細胞における細胞接着分子発現抑制作用、血管内皮細胞機能障害抑制作用に関する記載はなく、それらの作用を示唆する表現もない。更に、特許文献４の作用する器官は腸管であり、本発明の血管又は上気道とは全く異なる器官であるため、特許文献４から本発明を想到することはできない。特許文献５には肝臓でのＬＤＬレセプター合成促進作用が示されている。しかし、特許文献５には、血管内皮細胞や気道上皮細胞における細胞接着分子発現抑制作用、血管内皮細胞機能障害抑制作用に関する記載はなく、それらの作用を示唆する表現もない。更に、特許文献５の作用する器官は肝臓であり、本発明の血管又は上気道とは全く異なる器官であるため、特許文献５から本発明を想到することはできない。  
【特許文献１】特許第５０６０１３６号
【特許文献２】特開２０１１−２１９４３４号公報
【特許文献３】特許第５７７４８３９号
【特許文献４】特開２０１５−１７０４３号公報
【特許文献５】特開２０１０−２０８９６５号報
【非特許文献１】産業医科大学雑誌．２００１  ２３（４）：４２１−４２９
【非特許文献２】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００４  Ｊｕｎ  １５；１０９（２３  Ｓｕｐｐｌ  ＩＩＩ）：ＩＩＩ２７−３２．
【非特許文献３】Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．２００２  Ｍａｙ；１３（３）：１８５−１８９
【非特許文献４】Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００２  Ａｐｒ  ２２；１１２  Ｓｕｐｐｌ  ６Ａ：４Ｓ−１２Ｓ．
【非特許文献５】Ｃｅｌｌ．１９８９  Ｍａｒ  １０；５６（５）：８３９−４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、霊芝を含有することを特徴とする細胞接着分子発現抑制剤に関する。更に詳しくは、霊芝を含有することを特徴とする血管内皮細胞機能障害抑制剤、動脈硬化症又は急性上気道炎の予防剤に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究した結果、霊芝が細胞接着分子発現抑制作用、血管内皮細胞機能障害抑制作用、動脈硬化症又は急性上気道炎の予防作用を有することを見出した。
【００１０】
本発明に用いる霊芝は、担子菌類のマンネンタケ科（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｔａｃｅａｅ）マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）に属するキノコで、中国の薬学古書である「本草綱目」や「神農本草経」によると、霊芝（赤芝）、黒霊芝（黒芝）、紫霊芝（紫芝）、青霊芝（青芝）、黄霊芝（黄芝）及び白霊芝（白芝）が知られている。本発明では、マンネンタケ科に属する全てのキノコを用いることができるが、好ましくは霊芝、黒霊芝、紫霊芝、青霊芝、黄霊芝、白霊芝であり、更に好ましくは霊芝（赤芝、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）又は黒霊芝（黒芝、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｕｍ）を用いることが望ましい。
【００１１】
本発明に用いる霊芝は、子実体、胞子、菌糸体、天産物、栽培物、培養物等を問わず使用することができ、広く中国や日本市場等で流通しているものを用いることができる。また、必要に応じてそのままの状態、破砕物、乾燥物等を適宜選択して抽出操作に付することができる。又、破壁胞子を得る方法として、微粒化処理、ロールプレス処理、摩砕処理、超高圧マイクロスチーム処理、通常工業的に用いられるその他機械的方法等が挙げられる。
【００１２】
本発明に用いる霊芝には、抽出溶媒として、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール類（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）等を用いることができる。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。
【００１３】
本発明に用いる霊芝の摂取量は、投与形態、使用目的、年齢、体重等によって異なるが、乾燥物に換算して１〜２００００ｍｇ／日、好ましくは１０〜１００００ｍｇ／日、より好ましくは５０〜５０００ｍｇ／日の範囲で１日１回から数回経口投与できる。上記投与範囲より少ない量で十分な場合もあるし、また、範囲を超えて投与する必要がある場合もある。また、製剤化における薬効成分の添加法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。
【００１４】
本発明に関わる細胞接着分子は、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、セレクチン、カドヘリン、ネクチン、血小板内皮細胞接着分子、神経細胞接着分子、インテグリン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、フィブリノーゲン、デスモグレイン、コネキシン、ニューロリギン、ニューレキシン、コンタクチン、クローディン、オクルーディン、ヘマグルチニン、レクチン等を対象とすることができる。中でも、ＩＣＡＭは動脈硬化症又は急性上気道炎の発症及び予防において最も重要な細胞接着分子である。
【００１５】
本発明の細胞接着分子発現抑制剤は、食品、医薬部外品又は医薬品のいずれにも用いることができる。その剤形は、経口用として散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤等がある。また、非経口用として注射剤、座剤等にすることもできる。
【００１６】
本発明の細胞接着分子発現抑制剤は、霊芝をそのまま使用しても良く、効果を損なわない範囲内で、必要に応じて通常の医薬品、医薬部外品又は食品に用いられる賦形剤、安定剤、保存剤、結合剤、崩壊剤、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料等の成分を含有することもできる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の霊芝を含有することを特徴とする細胞接着分子発現抑制剤は、血管内皮細胞機能障害抑制作用、動脈硬化症又は急性上気道炎の予防作用を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
製造例１  霊芝熱水抽出物
霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）の乾燥物２０ｇに４００ｍＬの精製水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して霊芝熱水抽出物を１．４ｇ得た。
【００１９】
製造例２  霊芝エタノール抽出物
霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）の乾燥物１００ｇに９００ｍＬのエタノールを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、霊芝エタノール抽出物を１．６ｇ得た。
【００２０】
製造例３  黒霊芝熱水抽出物  
黒霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の乾燥物２０ｇに４００ｍＬの精製水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して黒霊芝熱水抽出物を１．１ｇ得た。
【００２１】
製造例４  黒霊芝エタノール抽出物  
黒霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の乾燥物１００ｇに９００ｍＬのエタノールを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、黒霊芝エタノール抽出物を１．４ｇ得た。
【００２２】
製造例５  霊芝胞子熱水抽出物
霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）の胞子乾燥物２０ｇを微粒化処理し、４００ｍＬの精製水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して霊芝胞子熱水抽出物を１．２ｇ得た。
【００２３】
製造例６  霊芝胞子エタノール抽出物
霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）の胞子乾燥物１００ｇを微粒化処理し、９００ｍＬのエタノールを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、霊芝胞子エタノール抽出物を１．５ｇ得た。
【００２４】
本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されない。実施例に示す％は重量％を示す。
【実施例１】
【００２５】
軟カプセル剤
＜処方＞
成分                                                      含有量（％）
１．霊芝熱水抽出物（製造例１）                                ３０．０
２．米胚芽油                                                  ６０．０
３．ミツロウ                                                    ７．０
４．ビタミンＥ                                                  ３．０
＜製造方法＞
成分１〜４を混合し、ゼラチン、グリセリン、カラメル色素で構成される被膜に、２５０ｍｇ充填し、乾燥後、軟カプセル剤を得る。
＜用法＞
１日当り４粒摂取する。
【実施例２】
【００２６】
硬カプセル剤
＜処方＞
成分                                                      含有量（％）
１．黒霊芝熱水抽出物（製造例３）                              ２０．０
２．コーンスターチ                                            ７２．０
３．ショ糖脂肪酸エステル                                        ８．０
＜製造方法＞
成分１〜３を混合し、２号硬カプセルに２５０ｍｇ充填してカプセル剤を得る。
＜用法＞
１日当り４粒摂取する。
【実施例３】
【００２７】
飲料
＜処方＞
成分                                                      含有量（％）
１．霊芝熱水抽出物（製造例１）                                  ０．５
２．クエン酸                                                    ６．０
３．ショ糖                                                    １０．０
４．香料                                                        １．０
５．水                                                        ８２．５
＜製造方法＞
成分１〜４を成分５の一部の水に撹拌溶解する。次いで、成分５の残りの水を加えて混合し、殺菌したものを飲料とする。
＜用法＞
１日当り５０ｍＬ摂取する。
【実施例４】
【００２８】
顆粒剤
＜処方＞
成分                                                      含有量（％）
１．霊芝エタノール抽出物（製造例２）                            ８．０
２．乳糖                                                      ８０．０
３．セルロース                                                １２．０
＜製造方法＞
成分１〜３を乾式法により造粒し、顆粒剤を得る。
＜用法＞
１日当り１ｇ摂取する。
【実施例５】
【００２９】
錠剤
＜処方＞
成分                                                      含有量（％）
１．霊芝胞子熱水抽出物（製造例５）                            １１．０
２．乳糖                                                      ６０．０
３．還元麦芽糖水飴                                            ２５．０
４．ショ糖脂肪酸エステル                                        ４．０
＜製造方法＞
成分１〜４を混合して打錠成型し、０．５ｇの錠剤を得る。
＜用法＞
１日当り２粒摂取する。
【実施例６】
【００３０】
ゼリー
＜処方＞
成分                                                      含有量（％）
１．黒霊芝エタノール抽出物（製造例４）                          ０．１
２．カラギーナン                                                ２．０
３．ゼラチン                                                    １．０
４．砂糖                                                      ２８．５
５．精製水                                                    ６８．４
＜製造方法＞
成分１〜５を混合し、加熱しながら煮詰め、ゼリーの型に流し込み、冷却する。
＜用法＞
１日当り１個（１００ｇ）を摂取する。
比較例１
【００３１】
従来の軟カプセル剤
実施例１の軟カプセル剤において、霊芝熱水抽出物を米胚芽油に置き換えたものを従来の軟カプセル剤とした。
【００３２】
試験例１  細胞接着分子発現抑制試験
細胞は血管内皮細胞ＨＵＶＥＣ（クラボウ）、培地はＨｕｍｅｄｉａ−ＥＧ２（クラボウ）を用いて細胞培養を行った。コンフルエントにしたＨＵＶＥＣに、血管内皮細胞機能障害を誘発する物質として、酸化ＬＤＬに含まれる７−ケトコレステロールを７．５μｇ/ｍＬ、霊芝熱水抽出物（製造例１）を１ｍｇ/ｍＬとなるように添加して培養した。次いで、回収した細胞を超音波粉砕して、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。分離後、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（ミリポア）に転写してブロッキングし、抗ＩＣＡＭ−１抗体（ウサギポリクローナル抗体、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）、抗ウサギＩｇＧ抗体（ヤギポリクローナル抗体、Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を反応させた。次いで、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により発した蛍光シグナルをライトキャプチャーＡＥ６９７２（ＡＴＴＯ）にて検出し、ＣＳ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＴＴＯ）にて定量した。また、抗β−Ａｃｔｉｎ抗体（マウスモノクローナル抗体、Ａｂｃａｍ）、抗マウスＩｇＧ抗体（ウマポリクローナル抗体、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた同様の方法により、β−Ａｃｔｉｎの定量を行い、ＩＣＡＭ−１とβ−Ａｃｔｉｎの比率からＩＣＡＭ−１タンパク質発現量を算出した。そして、７−ケトコレステロール未添加のタンパク質発現量を１として、７−ケトコレステロール及び霊芝熱水抽出物を添加した際のタンパク質発現量比を算出した。
【００３３】
試験例１の結果を表１に示す。霊芝熱水抽出物は、ＩＣＡＭ−１タンパク質発現量を抑制した。よって、霊芝熱水抽出物には、細胞接着分子発現抑制作用があることが示された。
【００３４】
【表１】
0006764651.tif 000002
【００３５】
尚、試験例１の細胞接着分子発現抑制試験で、霊芝熱水抽出物を製造例２〜６の霊芝抽出物に置き換えた場合のいずれにおいても同様の効果が得られた。また、ＨＵＶＥＣを気道上皮細胞ＨＳＡＥｐＣ（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ）に置き換えた場合においても、同様の効果が得られた。以上の結果から、霊芝による動脈硬化症又は急性上気道炎の予防作用が期待できる。
【００３６】
試験例２  血管内皮細胞機能障害抑制試験
細胞は血管内皮細胞ＨＵＶＥＣ（クラボウ）、培地はＨｕｍｅｄｉａ−ＥＧ２（クラボウ）を用いて細胞培養を行った。コンフルエントにしたＨＵＶＥＣに、７−ケトコレステロールを１０μｇ/ｍＬ、霊芝熱水抽出物（製造例１）、黒霊芝熱水抽出物（製造例３）、又は霊芝胞子熱水抽出物（製造例５）を１ｍｇ/ｍＬとなるように添加して２４時間培養した。ＲＮＡｉｓｏ  Ｐｌｕｓ（タカラバイオ株式会社）を用いてＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）によりｃＤＮＡ溶液を調製した。調製したｃＤＮＡを用いて、Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるリアルタイムＰＣＲ法で遺伝子発現解析を行った。遺伝子発現解析は、血管内皮細胞機能障害に関連する遺伝子であるＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、セレクチン、ＰＡＩ−１、ＭＣＰ−１、ｅＮＯＳで行った。その際、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を内部標準として、目的遺伝子とＧＡＰＤＨの比率から発現量を算出した。そして、７−ケトコレステロールにより変動した遺伝子発現量を１として、霊芝熱水抽出物、黒霊芝熱水抽出物、霊芝胞子熱水抽出物を添加した際の遺伝子発現量比を算出した。尚、遺伝子発現解析に使用したプライマーは次の通りである。
【００３７】
ＩＣＡＭ−１用のプライマーセット
ＣＣＧＧＴＡＴＧＡＧＡＴＴＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１）
ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＴＧＡ（配列番号２）
ＶＣＡＭ−１用のプライマーセット
ＣＡＡＡＴＣＣＴＴＧＡＴＡＣＴＧＣＴＣＡＴＣ（配列番号３）
ＴＴＧＡＣＴＴＣＴＴＧＣＴＣＡＣＡＧＣ（配列番号４）
セレクチン用のプライマーセット
ＣＴＧＣＣＴＧＴＡＣＣＡＡＴＡＣＡＴＣＣ（配列番号５）
ＣＡＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＴＧＣＴＣＡＣＡＣ（配列番号６）
ＰＡＩ−１用のプライマーセット
ＣＧＴＧＧＴＴＴＴＣＴＣＡＣＣＣＴＡＴＧＧ（配列番号７）
ＣＴＧＧＧＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＧＴＣ（配列番号８）
ＭＣＰ−１用のプライマーセット
ＴＣＡＧＣＣＡＧＡＴＧＣＡＡＴＣＡＡＴＧＣ（配列番号９）
ＧＧＡＣＡＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＴＣ（配列番号１０）
ｅＮＯＳ用のプライマーセット
ＣＣＴＧＴＧＴＡＴＧＧＡＴＧＡＧＴＡＴＧＡＣ（配列番号１１）
ＣＧＧＡＴＣＴＴＡＴＡＡＣＴＣＴＴＧＴＧＣＴ（配列番号１２）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号１３）
ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ（配列番号１４）
【００３８】
試験例２の結果を表２に示す。霊芝熱水抽出物、黒霊芝熱水抽出物、霊芝胞子熱水抽出物により、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、セレクチン、ＰＡＩ−１、ＭＣＰ−１の遺伝子発現量は減少し、ｅＮＯＳの遺伝子発現量は増加した。また、霊芝熱水抽出物と黒霊芝熱水抽出物を同時に添加した場合の結果を表３に示す。霊芝熱水抽出物と黒霊芝熱水抽出物を個別に添加するよりも同時に添加した場合の方が、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、セレクチンの遺伝子発現量はより顕著に減少した。よって、霊芝熱水抽出物、黒霊芝熱水抽出物、霊芝胞子熱水抽出物には、血管内皮細胞機能障害抑制作用があることが示された。また、霊芝熱水抽出物と黒霊芝熱水抽出物を併用することで、より高い血管内皮細胞機能障害抑制作用があることが示された。
【００３９】
【表２】
0006764651.tif 000003
【００４０】
【表３】
0006764651.tif 000004
【００４１】
尚、試験例２の血管内皮細胞機能障害抑制試験で、霊芝熱水抽出物、黒霊芝熱水抽出物、霊芝胞子熱水抽出物を、製造例２、４、６の霊芝抽出物に置き換えた場合のいずれにおいても同様の効果が得られた。以上の結果から、霊芝による動脈硬化症の予防作用が期待できる。
【００４２】
試験例３  血管内皮細胞への単球接着抑制試験
細胞は血管内皮細胞ＨＵＶＥＣ（クラボウ）、培地はＨｕｍｅｄｉａ−ＥＧ２（クラボウ）を用いて細胞培養を行った。コンフルエントにしたＨＵＶＥＣに、７−ケトコレステロールを７．５μｇ/ｍＬ、霊芝熱水抽出物（製造例１）を１ｍｇ/ｍＬとなるように添加して２４時間培養した。次いで、ＢＣＥＣＦ（２'，７’−Ｂｉｓ（ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）−４  ｏｒ  ５−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、株式会社同仁化学研究所）で標識した単球ＴＨＰ−１（理化学研究所バイオリソースセンター）を加えて４時間培養した。培養後に未接着のＴＨＰ−１を取り除き、ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ  ＧＥＭＩＮ  ＥＭ（モレキュラーデバイスジャパン株式会社）により蛍光強度を測定することで、接着した単球数を比較した。
【００４３】
試験例３の結果、霊芝熱水抽出物により蛍光強度が低下したことから、霊芝熱水抽出物には血管内皮細胞への単球接着を抑制する作用があることが示された。
【００４４】
尚、試験例３の血管内皮細胞への単球接着抑制試験で、霊芝熱水抽出物を製造例２〜６の霊芝抽出物に置き換えた場合のいずれにおいても同様の効果が得られた。以上の結果から、霊芝による動脈硬化症の予防作用が期待できる。
【００４５】
試験例４  急性上気道炎の予防作用の検討
健康な男女２０人（２７〜６２歳）を１０人ずつ対照群及び試験群に分け、対照群には従来の軟カプセル剤（比較例１）、試験群には霊芝を含有する軟カプセル剤（実施例１）を用いて、１回４粒を１日１回、１２月〜２月の３ヶ月間摂取させ、試験期間中の急性上気道炎の罹患回数と罹患時の自覚症状に関するアンケートを行った。アンケートでは、罹患時の自覚症状の程度について、「少しある」「ある」「ひどい」の３段階の回答を設け、「少しある」を１点、「ある」を２点、「ひどい」を３点として、期間中における罹患一回あたりの自覚症状の程度の平均点を算出した。
【００４６】
試験例４の急性上気道炎の罹患回数に関するアンケートの結果を表４に示す。その結果、急性上気道炎の罹患回数を、霊芝を含有する軟カプセル剤を摂取した群と従来の軟カプセル剤を摂取した群で比較すると、霊芝を含有する軟カプセル剤を摂取した群で急性上気道炎への罹患回数が減少した。試験例４の自覚症状に関するアンケートの結果を表５に示す。その結果、罹患一回あたりの自覚症状の程度を、霊芝を含有する軟カプセル剤を摂取した群と従来の軟カプセル剤を摂取した群で比較すると、霊芝を含有する軟カプセル剤を摂取した群で罹患一回あたりの自覚症状の程度の平均点が減少した。すなわち、霊芝に急性上気道炎の予防作用があることが示された。なお、試験期間中、喉の痛みや咳等急性上気道炎以外の体調悪化を訴えた被験者は一人もいなかった。
【００４７】
【表４】
0006764651.tif 000005
【００４８】
【表５】
0006764651.tif 000006
【００４９】
以上の結果より、霊芝は、細胞接着分子発現抑制作用、血管内皮細胞機能障害抑制作用、動脈硬化症又は急性上気道炎の予防作用を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の細胞接着分子発現抑制剤は、優れた細胞接着分子発現抑制作用を示した。従って、安全で優れた細胞接着分子発現抑制作用を有する医薬品、医薬部外品又は食品としての利用に有用である。
【配列表】
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