(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
疼痛を減らす効果を有するヤマブシタケの活性物質の調製方法であって、
（ａ）ヤマブシタケ菌糸体を寒天プレートに接種し、８〜１６日間、１５〜３２℃の温度で培養する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で培養した前記ヤマブシタケ菌糸体をフラスコ内の培地に接種し、３〜５日間、２０〜３０℃の温度及びｐＨ４．５〜６．５で培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で培養した前記ヤマブシタケ菌糸体を発酵タンク中の培地に接種し、８〜１６日間、２４〜３２℃の温度及びｐＨ４．５〜５．５で培養して、前記ヤマブシタケ菌糸体の発酵培地を得る工程と、
（ｄ）工程（ｃ）での前記ヤマブシタケ菌糸体の発酵培地を乾燥し、ヤマブシタケ菌糸体の粉末を得る工程と、
（ｅ）工程（ｄ）でのヤマブシタケ菌糸体の粉末を更にアルコール溶媒で抽出し、ヤマブシタケ菌糸体のアルコール抽出物を得る工程と、
（ｆ）水と酢酸エチルでヤマブシタケ菌糸体のアルコール抽出物を抽出した後、カラムクロマトグラフィーにより下記構造式（Ｉ）を有するヘリペンを得る工程であって、前記ヘリペンの構造式（Ｉ）に含まれるＲが水素であり、前記ヘリペンは、下記の構造式（II）を有するエリナシンＳである前記工程と、を含む、
【化１】
0006757405.tif 000007
ことを特徴とする調製方法。
【化２】
0006757405.tif 000008
【請求項２】
工程（ｂ）での培養が、１００〜２５０ｒｐｍの振盪速度での振盪培養であることを特徴とする請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
工程（ｃ）での発酵タンクが、０．８〜１．２ｋｇ／ｃｍ２のタンク圧力及び１０〜１５０ｒｐｍの攪拌速度を有し、前記発酵タンクには、ガスを０．５〜１容積／分（ｖｖｍ）の通気速度で導入し前記ガスが、空気、酸素、二酸化炭素、窒素ガス、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項４】
工程（ｂ）で使用された培地と、工程（ｃ）で使用された前記培地が同じであり、
培地が、複合炭素窒素源、動物若しくは植物由来のタンパク質またはその加水分解物、無機塩、糖類、酵母、麦芽エキス、消泡剤あるいはそれらの組み合わせを含み、
前記複合炭素窒素源が、穀類または豆であり、前記無機塩が、硫酸塩またはリン酸塩であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の調製方法。
【請求項５】
前記アルコール溶媒が、３０−１００ｖ／ｖ％のエタノール又は３０−１００ｖ／ｖ％のメタノールであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の調製方法。
【請求項６】
水と酢酸エチルが１：４（ｖ／ｖ）の比を有することを特徴とする請求項１に記載の調製方法。
【請求項７】
疼痛が、神経障害性疼痛又は癌性疼痛であり、
前記疼痛が、Ｐ２−プリン受容体（Ｐ２Ｒ）に関するシグナル伝達経路を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の調製方法。
【請求項８】
疼痛を減らす効果を有し、構造式（Ｉ）を有するヘリペン化合物であって、
前記ヘリペン化合物の構造式（Ｉ）に含まれるＲが水素であり、
前記ヘリペン化合物が、構造式（II）を有するエリナシンＳである、
【化３】
0006757405.tif 000009
【化４】
0006757405.tif 000010
ことを特徴とするヘリペン化合物。
【請求項９】
請求項８に記載のヘリペン化合物と、生物学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤又は補助剤とを含むことを特徴とする疼痛を減らす効果を有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疼痛を減らす効果を有する活性物質に関し、特に、ヤマブシタケに由来する活性物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
痛覚の神経伝達経路とP2プリン受容体（P2R）
痛覚の発生は、一連の神経経路上に疼痛シグナルが伝達され、最終的に大脳に到達し、ヒトが痛みを感じる。痛覚の神経伝達経路は、刺激の発生から始まり、痛覚受容器によってその刺激を神経シグナルに変換する。この神経シグナルは、後根神経節（DRG）に伝達され、続いて、脊髄を通過し、最終的に大脳の視床の痛覚領域に到達する。従来の研究では、前記一連の神経伝達経路、例えば感覚神経、交感神経、副交感神経および中枢神経において、P2プリン受容体（P2R）が分布していることが示されており、その中、感覚神経におけるP2Rは、主にP2X3RとP2X2/3Rである。
【０００３】
痛覚の神経伝達経路とP2プリン受容体に関する文献を以下に列挙する。
１、遺伝子欠損モデルマウスを用いてP2X3R、P2X4RとP2X7Rが痛覚受容器、疼痛伝達、炎症性疼痛及び神経因性疼痛に関連することを証明する（Collier et al., 1966; Cockayne et al., 2000; Souslova et al., 2000; Jarvis et al., 2002; Tsuda et al., 2003; Khakh and North, 2006; Burnstock, 2008; Beggs et al., 2012）。
２、P2X3R遺伝子欠損マウスにいて、ATPはDRGにおける神経電気シグナルの伝達を誘導せず、末梢から中枢神経系への痛覚伝達を遮断する（Cockayne et al., 2000）。
３、ホルマリン誘発炎症性疼痛の程度は、P2X3Rを欠損することより減弱している（Souslova et al., 2000）。
４、P2X3Rアンタゴニストは、即時疼痛、炎症性疼痛、及び神経因性疼痛に関連する内臓痛を遮断することができる（Jarvis et al., 2002）。
５、神経損傷マウスにおいて、P2X4Rの発現量は顕著に増加し、長期の痛覚過敏症をもたらす（Tsuda et al., 2003）。
６、P2X4R遺伝子欠損マウスにおいて、マウスが物理的損傷によって誘発される痛覚過敏を示さず、末梢神経損傷による脊髄への神経シグナル伝達経路を欠いていることが見出されている（Ulmann et al., 2008）。
７、P2X7R遺伝子欠損マウスにおいて、炎症性と神経因性の痛覚過敏がほとんどないことが見出されている（Chessell et al., 2005）。
８、P2X7Rアンタゴニストは、神経因性疼痛と炎症性疼痛を軽減する効果を有する（Honore et al., 2006）。
【０００４】
P2R
P2Rは、その受容体の構造とシグナル伝達経路に基づいて、P2X1-P2X7（P2X1-7）受容体及びP2Y1-P2Y14（P2Y1-14）受容体の二つの群に分類することができる（Yang and Liang, 2012）。P2X1-P2X7受容体は、二つの膜貫通ドメインを有し、そのタンパク質のC-末端とN-末端領域は、細胞内に位置する。更に、細胞の外側にループ状のタンパク質構造が存在する。P2X1-P2X7受容体の中で、最小のものであるP2X4Rは、388個のアミノ酸を有し、最大のP2X7Rは、595個のアミノ酸を有する。P2X受容体（P2XR）は、陽イオンチャネル受容体であり、Na+とCa2+を通過させる。受容体が刺激された後、Ca2+はP2XRを介して細胞内に流入し、細胞内の遊離カルシウムイオン濃度を増加させ（[Ca2+] c↑）、細胞内遊離カルシウムイオン濃度の増加を二次シグナルとしてその後の生理反応を誘発し、脊髄を介して神経シグナルを大脳の視床に送り、痛覚を生成する。同時に、増加した細胞内遊離カルシウムイオン濃度（[Ca2+] c↑）は、細胞分泌にも影響を及ぼす。具体的には、神経免疫細胞におけるサイトカインの分泌を制御することができる。一方、P2Y1-14受容体は、Gタンパク質共役受容体（G-protein coupled receptor，GPCR）であり、P2Y11-14受容体を除き、他のP2YサブタイプはGタンパク質（G-protein, Gq）と相関する。Gqの作動の後、ホスホリパーゼC-β（PLC-β）を活性化して、ホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート（PIP2）を分離し、イノシトール1,4,5-トリホスフェート（IP3）を生成する。次に、IP3は、細胞の小胞体（ER）上のIP3受容体と結合し、ERに保存されたカルシウムイオンが放出され、細胞内の遊離カルシウムイオンの濃度が上昇（[Ca2+] c↑）する。したがって、P2XRとP2YR（P2Y11-14受容体を除く）は、受容体の機能を評価する指標として、細胞内の遊離カルシウムイオン濃度の変化を使用することができる。
【０００５】
アデノシン三リン酸（ATP）
ATPは、よく知られているエネルギー運搬及び転送の生体分子である。1929年において、Szent-Gyorgyiは、ATPが細胞外生物学的機能も有することを発見した（Drury and Szent-Gyorgyi, J. Physiol., 1929, 68(3):213-237)。1996年において、ATPは、正式に神経科学分野の神経伝達物質と見做された。ATPは、P2Rに関連する神経シグナル伝達経路上のP2Rの神経伝達物質として作用する。神経が刺激されると、ATPはシナプス小胞からシナプス間隙に放出され、シナプス後ニューロン上のP2Rを刺激する。その後、ATPはシナプス間隙の酵素によって速やかに分解される。上記の神経伝達モデルは、以下のように公開された文献によっても支持される。
【０００６】
１、ATPは、シナプス前ニューロンとシナプス後ニューロンの間のシグナル伝達を媒介し、神経伝達物質としての役割を果たす（Burnstock, 2006a; Burnstock, 2008）。
２、ATPは、組織損傷の後に放出され、痛覚受容体上のP2Rを刺激することにより痛覚を媒介する。
３、ATPは、ヒト皮膚のP2Rを刺激し、痛覚を媒介することが見出されている（Collier et al., 1966）。
４、ATPは痛覚の伝達において重要な役割を果たす（Burnstock, 2006b; Burnstock, 2013）。
【０００７】
鎮痛薬の必要性
鎮痛薬市場は、社会人口の高齢化や生活の質の漸進的な向上に伴い、大きくなる傾向がある。様々なタイプの疼痛において治療することがより困難なものは、神経障害による神経障害性疼痛及び癌性疼痛である。一つの理由は、痛みを完全に抑制する有効な薬物はほとんどない。さらに、この長期間の痛みを軽減するには、鎮痛剤を長期間使用する必要がある。臨床鎮痛薬には二つの主な種類があり、一つはモルヒネのようなオピオイドが含まれる鎮痛薬であり、もう一つは非麻薬性鎮痛薬である。患者にモルヒネ鎮痛剤を長期間投与すると、耐性及び依存症の問題を引き起こす可能性がある。耐性とは、投与回数の増加に伴って薬物の効率が徐々に低下することを意味し、鎮痛効果を達成するためには所定の投与量を増加させる必要がある。非麻薬性鎮痛薬は、麻薬に類似した有害反応（例えば、呼吸抑制、依存性など）を有さないが、鎮痛及び抗炎症機能を有し、上昇する体温（解熱機能）を低下させて炎症症状を軽減する。これらの薬物は、通常、リウマチ、関節炎、坐骨神経痛、変性関節炎などの疾患によって引き起こされる軽度から中等度の痛みを和らげるために使用される。又、これらの薬物は、シクロオキシゲナーゼ-1（COX-1）及びCOX-2の同時抑制の副作用を有する非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）でもある。COX-2が抑制されると、プロスタグランジンI2（PGI2）が減少して抗炎症及び鎮痛作用をもたらしながら、血小板の凝集を促進する。COX-1が抑制されると、胃腸管粘膜の完全性が破壊され、腎臓血流に影響を及ぼすことで、胃損傷、腎障害などの副作用をもたらし、血小板凝集を抑制して頻繁な出血をもたらす。従って、より優れた鎮痛薬を開発するために、鎮痛薬の安全性、副作用、依存性及び耐性は解決すべく問題になる。
【０００８】
ヤマブシタケ
麻酔科医Allen W. Burtonは、「新しい鎮痛薬は依然として臨床腫瘍学の要求を満たすことができず、多くの難治性疼痛患者に無力感を感じています」と述べている（Burton et al., 2007）。従って、現在の臨床医学が新しい生物学的経路に対して安全かつ効率的な鎮痛薬を開発することは非常に重要かつ緊急に必要なことである。従って、安全性を考慮して、天然の食材からそれぞれの活性物質を捜し、長期使用の薬物として調製することが産業の現在の傾向である。
【０００９】
「中国の薬用真菌」の記述によると、ヤマブシタケは、甘い、中性の強壮薬であり、五臓、消化に対する利点を有しており、消化不良、神経変性、十二指腸潰瘍と胃潰瘍に優れた効果を有している (D2 Mao, X.-L. Chinese edible and pharmaceutical large fungi. Microbiology China, 1989. 16(5):290-297)。したがって、ヤマブシタケの病気予防効果は昔から知られていて、薬用・食用菌として長く使われている。ヤマブシタケは、菌界（Fungi）、真菌門（Eumycota）、担子菌亜門（Basidiomycotina）、真正担子菌綱（Basidiomycetes）、ヒダナシタケ目（Aphyllophorales）、ハリタケ科（Hydnaceae）、サンゴハリタケ亜科（Hericioideae）及びサンゴハリタケ属（Hericium）に分類されている。ヤマブシタケの子実体は長い針状突起からなる軟らかい球塊状である。新鮮な時は白色で、古くなったり乾燥すると黄褐色になる。ヤマブシタケの子実体または菌糸体からの抽出物は、糖類（Wang et al., 2001; Yang et al., 2003）、エリナシン（Saito et al., 1998; Kenmoku et al., 2002; Kenmoku et al., 2004; Watanabe et al., 2007; Watanabe and Nakada, 2008; Lee et al., 2014; Li et al., 2014）、ジリノレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（DLPE）（Nagai et al., 2006）、アミノ酸、タンパク質、及び微量元素（Jia et al., 2004）が含まれる。従来の文献から見れば、ヤマブシタケの多糖類が免疫調節、血中脂質低下、血糖値の減少、胃の炎症の抑制、または胃癌の予防に効果があることは周知の事実である。これまでに、日本の科学者は、液体発酵製品から１４種のエリナシン（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、P、Q、R）を単離精製していた。エリナシンは、マウスのアストロサイトを刺激してニューロン成長因子（NGF）を分泌することにより、知的劣化、神経変性などの疾患を改善することができる。本発明者らは、ヤマブシタケの菌糸体のアルコール抽出物から新規化合物、すなわちヘリペン（heripene）を単離、精製及び同定する。ヘリペンは、鎮痛効果を有することを実験結果で証明した。詳細は次のように記述される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Collier et al., Nature, 1966, 212(5060):411-412
【非特許文献２】Cockayne et al., Nature, 2000, 407(6807):1011-1015
【非特許文献３】Souslova et al., Nature, 2000, 407(6807):1015-1017
【非特許文献４】Jarvis and Burgard, Br. J. Pharmacol., 2002, 135(6):1343-1344
【非特許文献５】Tsuda et al., Nature, 2003, 424(6950):778-783
【非特許文献６】Khakh and North, Nature, 2006, 442(7102):527-532
【非特許文献７】Burnstock, Nat. Rev. Drug Discov., 2008, 7(7):575-590
【非特許文献８】Beggs et al., Nat. Neurosci., 2012, 15(8):1068-1073
【非特許文献９】Ulmann et al., J. Neurosci. 2008. 28(44):11263-11268
【非特許文献１０】Chessell et al., Pain, 2005, 114(3):386-396
【非特許文献１１】Honore, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2006, 319(3): 1376-1385
【非特許文献１２】Yang and Liang, Circ. Res., 2012, 111(4):397-401
【非特許文献１３】Drury and Szent-Gyorgyi, J. Physiol., 1929, 68(3):213-237
【非特許文献１４】Burnstock, Trends Pharmacol. Sci., 2006, 27(3):166-176
【非特許文献１５】Burnstock, Pharmacol. Ther., 2006, 110(3):433-454
【非特許文献１６】Burnstock, 2013
【非特許文献１７】Burton et al., Pain Med., 2007, 8(2):189-198
【非特許文献１８】Mao, X.-L. Chinese edible and pharmaceutical large fungi. Microbiology China, 1989. 16(5):290-297
【非特許文献１９】Wang et al., Kaohsiung J. Med. Sci., 2001, 17(9):461-467
【非特許文献２０】Yang et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 2003, 67(6):1292-1298)
【非特許文献２１】Saito et al., J. Antibiot., 1998, 51(11):983-990
【非特許文献２２】Kenmoku et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 2002, 66(3):571-575
【非特許文献２３】Kenmoku et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 2004, 68(8):1786-1789
【非特許文献２４】Watanabe et al., Org. Lett., 2007, 9(2):359-362
【非特許文献２５】Watanabe and Nakada, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(4):1150-1151
【非特許文献２６】Lee et al., Int. J. Mol. Sci., 2014, 15(9):15073-15089
【非特許文献２７】Li et al., Food Chem. Toxicol., 2014, 70:61-67
【非特許文献２８】Nagai et al., J. Nutr. Biochem., 2006, 17(8):525-530
【非特許文献２９】Jia et al., Carbohydr. Res., 2004, 339(16):2667-2671
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ヘリペン及びヤマブシタケの活性物質の調製方法を提供することを目的とし、これにより、疼痛を減らす効果を有するヘリペン、活性物質及び前記ヘリペン又は前記活性物質を含む医薬組成物を調製するために使用される。
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、疼痛を減らす効果を有するヤマブシタケの活性物質の調製方法であって、
（ａ）ヤマブシタケ菌糸体を寒天プレートに接種し、８〜１６日間、１５〜３２℃の温度で培養する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で培養した前記ヤマブシタケ菌糸体をフラスコ内の培地に接種し、３〜５日間、２０〜３０℃の温度及びｐＨ４．５〜６．５で培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で培養した前記ヤマブシタケ菌糸体を発酵タンク中の培地に接種し、８〜１６日間、２４〜３２℃の温度及びｐＨ４．５〜５．５で培養して、前記ヤマブシタケ菌糸体の発酵培地を得る工程と、
（ｄ）工程（ｃ）での前記ヤマブシタケ菌糸体の発酵培地を乾燥し、ヤマブシタケ菌糸体の粉末を得る工程と、を含む。
【００１３】
好ましくは、前記調製方法における工程（ｂ）での培養は、１００〜２５０ｒｐｍの振盪速度での振盪培養である。
【００１４】
好ましくは、前記調製方法における工程（ｃ）での前記発酵タンクは、０．８〜１．２ｋｇ／ｃｍ２のタンク圧力及び１０〜１２０ｒｐｍの攪拌速度を有し、前記発酵タンクには、ガスを０．５〜１容積/分（ｖｖｍ）の通気速度で導入する。
【００１５】
好ましくは、前記調製方法における前記ガスは、空気、酸素、二酸化炭素、窒素ガス、又はそれらの組み合わせである。
【００１６】
好ましくは、前記調製方法における工程（ｂ）で使用された前記培地及び工程（ｃ）で使用された前記培地は同じである。
【００１７】
好ましくは、前記調製方法における前記培地は、複合炭素窒素源、動物若しくは植物由来のタンパク質またはその加水分解物、無機塩、糖類、酵母、麦芽エキス、消泡剤あるいはそれらの組み合わせを含む。
【００１８】
好ましくは、前記調製方法における前記複合炭素窒素源は、穀類または豆であり、前記無機塩は、硫酸塩またはリン酸塩である。
【００１９】
好ましくは、工程（ｄ）でのヤマブシタケ菌糸体の粉末を更にアルコール溶媒で抽出し、ヤマブシタケ菌糸体のアルコール抽出物を得る。
【００２０】
好ましくは、前記アルコール溶媒は、30-100v/v％のエタノール又は30-100v/v％のメタノールである。
【００２１】
好ましくは、水と酢酸エチルで前記ヤマブシタケ菌糸体のアルコール抽出物を抽出した後、カラムクロマトグラフィーにより下記構造式（I）を有するヘリペンを得る。
【化１】
0006757405.tif 000002
Rは、水素、ヒドロキシル、C1-C10アルキル、C1-C10アルケニル及びC1-C10アルキニルからなる群から選択される一つであり、これらの官能基は、ハロゲン、酸素 、窒素、リン又は硫黄を含む置換基で置換されていてもよく、
C-5、C-6、C-9、C-13、C-14、C-21、C-22及びC-23の立体配置は、R配置又はS配置である。
【００２２】
「官能基が置換基で置換されていてもよく」は、前記二つの官能基Rがハロゲン、酸素、窒素、リン又は硫黄を含む置換基で個々に又は両方置換されてもよいことを意味する。
【００２３】
好ましくは、前記ヘリペンの構造式（I）に含まれるＲが水素である場合、前記ヘリペンは下記の構造式（II）を有するエリナシンＳである。
【化２】
0006757405.tif 000003
【００２４】
好ましくは、前記水と酢酸エチルは1：4（v/v）の比を有する。
【００２５】
好ましくは、前記調製方法における前記疼痛は、神経障害性疼痛又は癌性疼痛である。
【００２６】
好ましくは、前記調製方法における前記疼痛は、P2-プリン受容体（P2R）に関するシグナル伝達経路を含む。
【００２７】
本発明は、疼痛を減らす効果を有し、前記調製方法を用いて調製される、ヤマブシタケの活性物質を更に開示する。
【００２８】
好ましくは、ヤマブシタケの活性物質は、前記調製方法のいずれかを用いて調製される粉末である。
【００２９】
好ましくは、ヤマブシタケの活性物質は、前記調製方法のいずれかを用いて調製されるアルコール抽出物である。
【００３０】
好ましくは、前記活性物質は、前記調製方法のいずれかを用いて調製される、構造式（I）を有するヘリペンである。
【００３１】
好ましくは、前記ヘリペンの構造式（I）に含まれるＲが水素である場合、前記ヘリペンは構造式（II）を有するエリナシンＳである。
【００３２】
本発明は、構造式（I）を有するヘリペン化合物を更に開示する。
【００３３】
好ましくは、前記ヘリペン化合物の構造式（I）に含まれるＲが水素である場合、前記ヘリペン化合物は構造式（II）を有するエリナシンＳである。
【００３４】
好ましくは、前記ヘリペン化合物は、疼痛を減らす効果を有する。
【００３５】
本発明は、疼痛を減らす効果を有する医薬組成物を更に開示し、前記医薬組成物は前記ヤマブシタケの活性物質と、生物学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤又は補助剤とを含む。
【００３６】
本発明は、疼痛を減らす効果を有する医薬組成物をさらに開示し、前記医薬組成物は前記ヘリペン化合物と、生物学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤又は補助剤とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施例４に係るエリナシンSのHPLC分析スペクトルを示す図である。
【図２】実施例５の項目２において、RT-PCRを用いて検出する細胞のP2R受容体の遺伝子発現量を示す図である。
【図３】実施例６の項目１において、蛍光剤を用いて解析する細胞の受容体におけるカルシウムシグナルを示す図であり、（A）HOSヒト骨肉腫細胞、（B）PC12ラット神経様細胞、（C）SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞をATPで刺激して解析する結果、及び（D）SH-SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞をカルバコールで刺激する結果。
【図４】実施例６の項目２において、HOSヒト骨肉腫細胞におけるP2XRサブタイプと相関するカルシウムシグナルを示す図である。
【図５】実施例６の項目２において、HOSヒト骨肉腫細胞におけるP2XRサブタイプと相関するカルシウムシグナルを示す図であり、（A）カルシウムフリー緩衝液中でのATP刺激によって誘導されるカルシウムシグナル、（B）ウリジン三リン酸（UTP）刺激によって誘導されるカルシウムシグナル。
【図６】実施例６の項目３において、ヤマブシタケ菌糸体のアルコール抽出物がHOSヒト骨肉腫細胞のATP刺激によるP2Rのカルシウムシグナルに対する影響を示す図である。
【図７】実施例６の項目４において、（A）アルコール抽出物及び（B）エリナシンSの投与がHOSヒト骨肉腫細胞のATP刺激によるカルシウムシグナルに対する抑制効果を示す図である。
【図８】実施例７の項目１において、テイルフリック試験を用いてヤマブシタケのアルコール抽出混合物及びヤマブシタケのアルコール抽出物の投与が短期痛みの緩和に対する効果を示す図である。
【図９】実施例７の項目２において、テイルフリック試験におけるヤマブシタケアルコール抽出混合物及びヤマブシタケアルコール抽出物の投与前後の差の群間の比較によって、短期痛みの緩和に対する効果を示す図である。
【図１０】実施例７の項目３において、テイルフリック試験におけるヤマブシタケアルコール抽出混合物及びヤマブシタケアルコール抽出物の投与前後の差から計算した最大可能効果の群間の比較によって、短期痛みの緩和に対する効果を示す図である。
【図１１】実施例７の項目４において、ホットプレート試験におけるヤマブシタケアルコール抽出混合物及びヤマブシタケアルコール抽出物投与の群間の比較によって、長期痛みの緩和に対する効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、ヤマブシタケからの種々のタイプの活性物質を調製するための調製方法を提供することを目的とする。更に、新規なヘリペン化合物を単離精製し、前記ヘリペン及び前記活性物質を更に疼痛を減らす効果を有する医薬組成物として調製することができる。
【００３９】
実験の原理
P2Rの機能を解析するために、P2R細胞モデルが確立される。まず、細胞株におけるP2R発現は、逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によって検出され、刺激剤の刺激によって受容体の機能を評価する。P2XRとP2YRは両方ともカルシウムイオンシグナルと関与しているので、細胞内の遊離カルシウムイオン濃度は、受容体機能の検出標的として使用される。痛覚は、P2R伝達によって中枢神経系に発生できるが、実際、疼痛の有無は動物の行動によって判断する必要がある。従って、本発明における活性物質の疼痛を減らす効果を確認するために、テイルフリック試験及びホットプレート試験という二つの行動実験を用いて、動物生体における痛覚の強度を評価する。本発明では、痛覚メカニズム及び動物の行動に関する生体実験の解析によって、天然の食用キノコから潜在的な鎮痛活性成分を探し、更に前記エリナシンS又は前記活性物質を含む医薬組成物として開発する。
【００４０】
実験方法
菌種の源：
本発明の実施形態で使用されるヤマブシタケの菌種（Hericium erinaceus）は、中国北京の中国普通微生物菌種保蔵管理センター（CGMCC）に寄託されており、寄託番号は、CGMCC No. 10905である。この菌種は、台湾の食品工業発展研究所（BCRC 35669）から購入したが、この種から得られたものに限定されるものではない。
【００４１】
液体培養：
ヤマブシタケ菌糸体の液体培養は以下のように記載される。 ヤマブシタケ菌糸体を寒天プレートに接種し、約１４日間、１５〜３２℃の適切な温度で培養した。その後、前記菌糸体をフラスコ内の培地に接種し、３〜５日間、２０〜３０℃の温度、ｐＨ４．５〜６．５、及び１００〜２５０ｒｐｍの振盪速度という条件で対数増殖期初期まで振盪培養した。最後に、フラスコ内の培養物を発酵タンク中の培地（フラスコと同じ成分）に接種し、２４〜３２℃の温度、０．８〜１．２ｋｇ／ｃｍ２のタンク圧力及びｐＨ４．５〜５．５という条件の下で、ガスを０．５〜１容積/分（ｖｖｍ）の通気速度で導入し、８〜１６日間、１０〜１５０ｒｐｍの攪拌速度で培養し、菌糸体及び上清を含むヤマブシタケ菌糸体の発酵液を得た。前記ガスは、空気、空気と酸素、二酸化炭素又は窒素の混合物であり、好ましくは、空気である。
【００４２】
培地の配合処方は、以下のように記載されている。
【００４３】
【表１】
0006757405.tif 000004
【００４４】
前記複合炭素窒素源は、穀類（例えば、小麦粉、小麦ふすま）または豆（例えば、大豆粉、緑豆粉など）が挙げられ、前記無機塩としては、硫酸マグネシウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸鉄、硫酸亜鉛等が挙げられ、糖類は、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース等が挙げられ、また、上記の成分に加えて、残りは水である。
【００４５】
発酵タンク内の培地には、過度の発泡を防止する目的で、消泡剤を追加してもよく、消泡剤は市販のものでもよく、例えば、シリコン油やシリコーンを含む0.01％の水系消泡剤が挙げられる。以下、本実施形態における培養方法について以下に詳細に説明する。
【００４６】
蛍光を用いたカルシウムシグナルの検出
細胞をカルシウムイオン蛍光「Fura-2/AM」 (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, U.S.A.)で満たし、蛍光スペクトロメーター（SPEX（登録商標）1681、Spec Industries、Inc.、New Jersey、U.S.A.）を用いて、340nmと380nmの励起波長における発光波長505nmでの蛍光強度の変化を測定した。実験は、細胞にATPを添加してP2Rを刺激し、蛍光強度の変化を観察した。最後に、１重量％のジギトニン（digitonin）の添加による細胞の透過処理を行い、2mM Ca2+濃度で最大蛍光比（Rmax）を得た。次いで、エチレングリコールビス（2-アミノエチルエーテル）四酢酸（ethyleneglycol bis(2-aminoethylether)tetraacetic acid、EGTA）を添加してカルシウムイオンと結合し、最小蛍光比（Rmin）を得た。 fura-2対Ca2+の解離係数（Kd）は225nMである。細胞内のカルシウムイオン濃度は、計算式（Grynkiewicz et al., 1985）を用いて算出した。
【００４７】
テイルフリック試験：
テイルフリック試験（Fukui et al., 2001; Okada et al., 2002）は、マウスの尾を赤外線放射で刺激するときの痛覚閾値を測定するために主に使用されている。実験の間、マウスを麻酔しておらず、マウスの尾（尾端からの1〜2cm）を加熱パネルの特定の溝に配置した。次に、赤外線光源校正器の赤外線ヒーターを点灯させ、放物面反射鏡を介して赤外線をマウスの尾に集中させた。実験動物が痛みを感じると、その尾部がパネルを軽くひっくり返し、この反応をテイルフリック反応と呼ぶ。テイルフリック反応が起こると、内蔵センサーがこの反応を検出し、テイルフリック反応時間を記録した。痛覚閾値は、テイルフリックの秒数として表すことができ、投与前/後の秒数の変動として表すこともできる。テイルフリック秒数の変化も最大可能効果（MPE：maximum possible effect）として更に計算することができる。計算式は次のとおりである。
（％MPE）=（薬物投与後の待機時間（latency） - 薬物投与前の待機時間）/（cutoff時間（cutoff time） - 薬物投与前の待機時間）×100％。
【００４８】
マウスホットプレート試験：
マウスホットプレート試験（Yaksh and Tyce, 1979）において、まず、ヒーターのプレートを特定の温度に予熱し、次いで実験動物を金属のヒーターのプレートに配置し、熱を与えて実験動物を刺激した。実験動物が熱によって痛みを感じ、熱によってジャンプしたという反応は、足引っ込め反応と呼ばれる。各実験動物がヒーターのプレート上に配置されてからジャンプするまでの所要時間は、足引っ込め反応時間と呼ばれる。最後に、足引っ込め反応時間は、実験動物の痛覚閾値として表す。
【００４９】
実施例１：ヤマブシタケ菌糸体の培養及びその活性物質の調製
寒天プレート上での培養：
ヤマブシタケ菌糸体をポテトデキストロース寒天（Potato Dextrose Agar、PDA）プレートに接種し、約７日間、２５℃で培養した。
【００５０】
フラスコ内での培養：
ヤマブシタケ菌糸体を寒天プレート上から無菌的にこすり取り、フラスコ内の培地（下記参照）に接種し、続いて振盪培養器で、５日間、２６℃の温度及びｐＨ５．０で１２０ｒｐｍの振盪速度での振盪培養を行った。
【００５１】
培地の配合処方は以下の通りである。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
発酵タンク内での培養：
発酵タンクで使用する培地は、フラスコ内の培養工程と同じである。フラスコ内で培養した菌糸体を発酵タンク内の培地に接種し、２６℃、０．５〜１．０ｋｇ／ｃｍ２のタンク圧力及びｐＨ５．０で、１０〜１５０ｒｐｍの攪拌速度の（エアリフトによる）撹拌を伴って又は伴わずに、ガスを０．５〜１ｖｖｍの通気速度で導入し、接種した菌糸体を１２日間培養した。菌糸体、上清、及び疼痛を減らす効果を有する活性物質を含む発酵液が１２日後に得られた。発酵液を凍結乾燥して、ヤマブシタケ菌糸体の凍結乾燥粉末（「凍結乾燥粉末」と略記する）を得た。２０メートルトンの発酵液を凍結乾燥して約８０ｋｇの凍結乾燥粉末が得られた。
【００５４】
実施例２：ヤマブシタケ菌糸体の活性物質のアルコール抽出
ヤマブシタケ菌糸体の凍結乾燥粉末を９５v/v％のエタノール溶液（１：２５w/w）に添加して第一回抽出を行い、次いで、１時間の超音波処理（１２０rpm）を行った。懸濁液を遠心分離して上清を得た。この上清を８５v/v％のエタノール溶液で第二回抽出を行い、前記超音波処理及び遠心分離処理工程を繰り返して上清を得た。最後に、上清を減圧濃縮し、クリーム状の、ヤマブシタケ菌糸体のアルコール抽出物（以下、「アルコール抽出物」と略記する）を得た。
【００５５】
実施例３：アルコール抽出混合物の調製
等量の前記凍結乾燥粉末とアルコール抽出物を混合し、遠心分離して上清を得た。上清を凍結乾燥することにより、ヤマブシタケ菌糸体とアルコール抽出物との混合物（以下、「アルコール抽出混合物」と略記する）を得た。
【００５６】
実施例４：エリナシンＳ標準品の調製と分析
エリナシンＳ標準品の調製方法は以下の通りである。ヤマブシタケ菌糸体のアルコール抽出物を液-液分配抽出し（H2O：酢酸エチル（EA）= １：４（v/v））、得られた酢酸エチル抽出液をシリカゲルとLH-20シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて、n-ヘキサン：EA（10：1、3：1、3：2、1：1、1：2、0：1 v/v）の勾配溶出を行い、七つのサブ層を得た。第三のサブ層（n-ヘキサン：EA＝3：2）は、LH-20シリカゲルカラムクロマトグラフィーを更に用いて、新規化合物を得た。この新規化合物は、化学分析によって構造（前記の式（I））が確認され、エリナシンＳと呼ばれ、更に高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により特性分析を行った。逆相クロマトグラフィーカラムCosmosil 5C18-AR-II（Nacalai USA、California、USA）を用いて、４０℃で分析開始から20分間で移動相アセトニトリルの比率を60％（ｖ/ｖ）から65％（ｖ/ｖ）に変化させ、流速１ｍｌ/分、ＵＶ検出波長２９０ｎｍの分析条件におけるエリナシンＳの滞留時間は１４分である。HPLC分析結果は図１に示す（ラベルはエリナシンＳ標準品である）。図１において、上の曲線は、ヤマブシタケ菌糸体の凍結乾燥粉末のアルコール抽出物を示し、下の曲線は、エリナシンＳ標準品を示す。エリナシンＳ標準品は、本出願人により上記の方法を用いて調製された標準品であり、抽出物の成分中のエリナシンＳの定量化基準とする。
【００５７】
実施例２で調製したアルコール抽出物のクロマトグラフィー曲線は、滞留時間２、７及び１４分にピークが現れることを示している。エリナシンＳ標準品の滞留時間14分で唯一のピークと比較し、そのピークがエリナシンＳを示すと判定された。アルコール抽出物中のエリナシンＳは５９ppmとして定量した。
【００５８】
核磁気共鳴（NMR）によってエリナシンＳの水素と炭素のスペクトルを得い、以下の表に記載されている。
【００５９】
【表３】
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【００６０】
実施例５：P2Rの細胞モデルの確立と分析
１、細胞の培養：
三つの細胞株、すなわちPC12ラット神経様細胞株、SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞株及びHOSヒト骨肉腫細胞株を使用した。PC12細胞株は、１０％（v/v）のウマ血清（HS）及び５％（v/v）のウシ胎児血清（FBS）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium、DMEM）という高グルコース培地で培養した（Kao et al., 2012）。SH-SY5Y細胞株（Liu et al., 2009）は、１０％（v/v）のFBSを含むDMEM/F-12培地で培養した。HOS細胞株は、アール塩（Earle′s salts）、２mMのL-グルタミン（L-glutamine）、０．１mMの非必須アミノ酸（non-essential amino acids）、１．５g/Lの重炭酸ナトリウム、１mMのピルビン酸ナトリウム及び５％（v/v）のFBSを含む最小必須培地（Minimum Essential Medium、MEM）で培養した。細胞を３７℃、５％（v/v）CO2の環境で培養した。2〜3日ごとに培地交換を行い、細胞をトリプシン-エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を用いて継代培養した（Liu et al., 2011）。
【００６１】
２、P2RのmRNAの検出：
メッセンジャーRNA（messenger RNA、mRNA）を細胞から抽出し、相補DNA（complementary DNA、cDNA）を製造し、P2Rサブタイプそれぞれの受容体の特定プライマーを設計し、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase chain reaction、PCR）を用いて、P2Rサブタイプ受容体のmRNA発現を増幅して検出した。まず、細胞をリン酸緩衝食塩水（Phosphate buffered saline、PBS）で洗浄し、NucleoSpin（登録商標）RNA IIキット（MACHEREY-NAGEL GmbH＆Co. KG、Duren、Germany）を用いてカラム内でmRNAを得て、ACTGene ASP-2680分光光度計（CellTAGen、Seoul、Republic of Korea）を用いてRNAの濃度を測定した。逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）は、SuperScript（登録商標）III逆転写酵素（Invitrogen（登録商標）、ThermoFisher Scientific、Waltham、Massachusetts、U.S.A.）を用いて行った。生成したcDNAを更に、Q-Amp（登録商標）2x HotStart PCRマスターミックス（Taq DNAポリメラーゼを含む）（Bio-Genesis Technologies  Inc.、台湾）及びP2Rプライマーを用いてPCRを行った。得られたPCR産物は、（0.5Xのトリス・ホウ酸・EDTA緩衝液を含む）電気泳動槽中に１．５％（w/v）アガロースゲルで電気泳動させた（電気泳動開始の10分間は電圧を５０Vに設定し、次の15分間は電圧を１００Vに設定した）。電気泳動の後、アガロースゲルを臭化エチジウム（EtBr）で染色して、ゲル画像システムに移して紫外線（ＵＶ）で励起し、ゲル画像を記録し、細胞株P2Rの発現を観察した。
【００６２】
PC12ラット神経様細胞株、SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞株及びHOSヒト骨肉腫細胞株におけるP2Rの遺伝子発現をRT-PCRで検出した結果を図２に示す。図２の左列は、P2Xサブタイプ受容体のmRNA発現を示す。図２の右列は、P2Yサブタイプ受容体のmRNA発現を示し、下にそれぞれの細胞株の名前を示す。P2XRサブタイプ（P2X1R、P2X4R、P2X5R、P2X6R及びP2X7R）及びP2YRサブタイプ（P2Y1R、P2Y2R、P2Y4R、P2Y6R及びP2Y11R）は、HOSヒト骨肉腫細胞株において検出された。P2XRサブタイプ（P2X3R、P2X4R、P2X5R、P2X6R及びP2X7R）及びP2YRサブタイプ（P2Y1R、P2Y2R、P2Y4R及びP2Y11R）は、SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞株において検出された。P2XRサブタイプ（P2X2R、P2X3R及びP2X4R）及びP2YXRサブタイプ（P2Y12R）は、PC12ラット神経様細胞株において検出された。
【００６３】
実施例６：カルシウムシグナルに対する活性物質の抑制効果の分析
１、細胞株において検出されたP2Rと相関するカルシウムシグナル
Fura-2カルシウムイオン感受性蛍光色素で満たすことで、PC12ラット神経様細胞株、SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞株及びHOSヒト骨肉腫細胞株における遊離カルシウムイオン濃度を検出し、更に細胞膜上のP2RをATPを用いて刺激し、細胞内の遊離カルシウムイオン濃度の変動を観察した。図３は、０．１mMのATP刺激による（A）HOSヒト骨肉腫細胞、（B）PC12ラット神経様細胞及び（C）SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞における受容体のカルシウムシグナルの変化を示す。SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞内の遊離カルシウムイオン濃度が変化していなかったので、細胞がカルシウムイオンシグナルに相関する生体分子を生成しないという可能性を排除するために、SH-SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞上のアセチルコリン受容体を０．１mMのカルバコール（carbachol）で刺激し、細胞が確かにカルシウムイオンシグナルに相関する生体分子を有することを確認した。その結果を図３（D）に示す。
【００６４】
２、個々のP2Rサブタイプに相関するカルシウムシグナル
三つの細胞株におけるATP刺激によるP2R関連カルシウムシグナルを比較すると、HOSヒト骨肉腫細胞の遊離カルシウムイオン濃度の変化が最も有意であるため、追加された薬剤のP2Rに及ぼす影響を明確に区別することができる。従って、HOSヒト骨肉腫細胞モデルを用いて、カルシウムシグナルに相関するP2Rサブタイプを更に検討した。HOSヒト骨肉腫細胞におけるP2Rサブタイプを検出するために、2-MeATP（P2X1R及びP2X5Rサブタイプの選択的刺激剤）、α,β-MeATP（P2X7サブタイプの選択刺激剤）、2-MeSATP（P2X1サブタイプの選択的刺激剤）及びCTP（P2X4サブタイプの選択刺激剤）を使用した。図４の左から右への曲線は、CTP、2-MeATP、α,β-MeATP及び2-MeSATPのサブタイプ受容体特異的刺激剤によって誘発されたカルシウムイオンシグナルを示す。その結果、HOSヒト骨肉腫細胞において、少なくともP2X1、P2X4、P2X5及びP2X7に相関するカルシウムシグナルを検出でき、その中のP2X4に対する反応が最も顕著である。
【００６５】
P2Y受容体は、Gqタンパク質（Gq）と共役している。P2Y受容体が刺激を受けた後、Gq/ホスホリパーゼC（phospholipase C）を更に活性化して、イノシトール1,4,5-トリホスフェート（IP3）を生成し、IP3感受性細胞内カルシウムプールからカルシウムイオンを放出させる。従って、カルシウムイオンを含まない緩衝液に適切な量のEGTAを加えると、緩衝液中の残りのカルシウムイオンをキレート化し、細胞外からカルシウムイオンの流入を防ぐことができる。この状態で細胞内の遊離カルシウムイオン濃度を測定することで、細胞内カルシウムプールから放出されたカルシウムイオンを解析することができる。図５は、P2Y受容体に相関するカルシウムシグナルを示し、図５（A）は、カルシウムイオンを含まない緩衝液を用い、ATP刺激によるP2Rに相関するカルシウムシグナルを示し、EGTAの添加により細胞外のカルシウムイオンが細胞内に流入しないので、P2Y受容体に相関するカルシウムシグナルである。図５（B）は、UTP（P2Y2及びP2Y4の刺激剤）刺激によるカルシウムシグナルを示す。図５に示すように、HOSヒト骨肉腫細胞において、少なくともP2Y2R及びP2Y4Rに相関するカルシウムシグナルを検出することができる。
【００６６】
３、ヤマブシタケの活性物質によって抑制されるP2R関連カルシウムシグナル
ATPは体内のP2R刺激剤であるため、０．１mMのATPを使用してP2R受容体を刺激した。ATP刺激でP2R関連カルシウムシグナルを誘導する前に、ヤマブシタケのアルコール抽出物を添加した。カルシウムイオンという二次シグナルは、受容体が刺激された後の生理学的反応に相当している。したがって、図６に示すように、ATP刺激によるP2Rのカルシウムシグナルが完全に抑制されたことにより、ヤマブシタケのアルコール抽出物はP2Rの機能を抑制する効果があることが示唆された。前記の実験から、HOS細胞には種々のP2XR及びP2YRが存在していることが確認された。ヤマブシタケのアルコール抽出物はHOS細胞におけるP2R受容体の機能を完全に抑制できるので、ヤマブシタケのアルコール抽出物は、P2X1、P2X4、P2X5、P2X7、P2Y2及びP2Y4などの受容体に対する抑制作用を有することが示された。
【００６７】
４、ヤマブシタケの活性物質とエリナシンＳの抑制効果とその濃度関連性
図７は、HOS細胞におけるヤマブシタケのアルコール抽出物及びエリナシンSの投与がATP刺激によるカルシウムイオンの濃度変化に及ぼす影響を示す。図７（A）は、２．５、５及び５０μg/ mlのヤマブシタケのアルコール抽出物の投与結果を示し、図７（B）は、５、１０及び１５μg/ mlのエリナシンＳの投与結果を示す。ヤマブシタケのアルコール抽出物及びエリナシンS両者ともに抑制効果を有し、また、投与濃度の上昇と伴って、抑制効果が増加しているので、その抑制効果は濃度依存性があることが認められた。
【００６８】
実施例７：ヤマブシタケの活性物質が動物の疼痛を減らす効果の測定
本実施例は、テイルフリック試験とホットプレート試験を用いて、実施例２で得られたアルコール抽出物及び実施例３で得られたアルコール抽出混合物を短期間または長期間マウスに投与し、その投与前/投与後における外因性刺激に対するマウスの疼痛反応を観察した。
【００６９】
１、ヤマブシタケの活性物質の短期間投与後のテイルフリック試験
本試験におけるマウスは、対照群、ヤマブシタケの菌糸体/アルコール抽出物（アルコール抽出混合物群）、及びヤマブシタケのアルコール抽出物（アルコール抽出物群）の三つの群に分けられ、各群は８週齢以上の５匹の雄C57BL/6Nar1マウスを使用した。マウスには、ソフトフィーディングチューブを介して２５００mg/kgの薬物を経口投与し、対照群のマウスには同量の水を与えた。マウスの痛覚は、投与前、投与後３０分と投与後６０分にテイルフリック試験によって測定した。試験結果は、平均値±標準偏差として表し、スチューデントt検定を用いてアルコール抽出混合物群、アルコール抽出物群及び対照群の統計学的有意性を分析した。その結果は図８に示すように、活性物質の短期間投与による疼痛緩和効果が認められた。
【００７０】
まず、投与前のテイルフリック基本値を調べ、三つの群のテイルフリック反応時間は、対照群で4.1±1.5秒、アルコール抽出混合群で4.3±1.9秒、 アルコール抽出物群で4.5±1.2秒であった。アルコール抽出混合物群と対照群との間のスチューデントt検定のp値は０．８であり、アルコール抽出物群と対照群との間のスチューデントt検定のp値は０．６であり、アルコール抽出混合物群とアルコール抽出物群との間のスチューデントt検定のp値は０．８であることから、投与前、群の間に有意差がないことを示した。
【００７１】
投与後３０分に、マウスの痛覚反応を、テイルフリック試験によって測定した。その結果、対照群のテイルフリック反応時間は2.0±0.5秒であり、アルコール抽出混合群は6.2±1.6秒であり、アルコール抽出群は8.4±1.1秒であった。アルコール抽出混合物群と対照群との間のスチューデントt検定のp値は、０．０００８で有意差があり、アルコール抽出物群と対照群とのスチューデントt検定のp値は、０．０００００９で有意差があり 、アルコール抽出混合物群とアルコール抽出物群との間のスチューデントt検定のp値は、０．０７で有意差がないことを示した。
【００７２】
投与後６０分に、マウスの痛覚反応を、テイルフリック試験によって測定した。その結果、対照群のテイルフリック反応時間は2.1±0.57秒であり、アルコール抽出混合群は5.7±2.46秒であり、アルコール抽出群は7.2±1.9秒であった。アルコール抽出混合物群と対照群との間のスチューデントt検定のp値は、０．０２５６で有意差があり、アルコール抽出物群と対照群とのスチューデントt検定のp値は、０．００１６で有意差があり、アルコール抽出混合物群とアルコール抽出物群との間のスチューデントt検定のp値は、０．３３で有意差がないことを示した。
【００７３】
２、ヤマブシタケの活性物質の短期間投与前と投与後のテイルフリック試験の差異
本実験条件は、前記「ヤマブシタケの活性物質の短期間投与後のテイルフリック試験」の条件と同様であり、アルコール抽出物群、アルコール抽出混合物群及び対照群の間のテイルフリック反応時間の差を比較し、活性物質の短期間投与が疼痛緩和に与える効果を評価した。その結果を図９に示す。
【００７４】
投与後３０分に、マウスの痛覚反応を、テイルフリック試験によって測定した。実験結果は、対照群におけるテイルフリック反応時間は投与前のテイルフリック基本値よりも短く、その差は-2.1±1.7秒であり、アルコール抽出混合物群におけるテイルフリック反応時間は投与前よりも長く、その差は2.6±2.18秒であり、アルコール抽出物群のテイルフリック反応時間は投与前よりも長く、その差は3.9±1.61秒であった。アルコール抽出混合物群と対照群との間のスチューデントt検定のp値は、０．００８で有意差があり、アルコール抽出物群と対照群とのスチューデントt検定のp値は、０．００１０８で有意差があり、アルコール抽出混合物群とアルコール抽出物群との間のスチューデントt検定のp値は、０．３５で有意差がないことを示した。
【００７５】
投与後６０分に、マウスの痛覚反応を、テイルフリック試験によって測定した。実験結果は、対照群におけるテイルフリック反応時間は投与前のテイルフリック基本値よりも短く、その差は-1.0±0.71であり、アルコール抽出混合物群におけるテイルフリック反応時間は投与前よりも長く、その差は2.0±2.53秒であり、アルコール抽出物群のテイルフリック反応時間は投与前よりも長く、その差は2.6±1.77秒であった。アルコール抽出混合物群と対照群との間のスチューデントt検定のp値は、０．０３３で有意差があり、アルコール抽出物群と対照群とのスチューデントt検定のp値は、０．００２８で有意差があり、アルコール抽出混合物群とアルコール抽出物群との間のスチューデントt検定のp値は、０．６６で有意差がないことを示した。
【００７６】
３、ヤマブシタケの活性物質の短期間投与のテイルフリック試験における最大可能効果
本実験条件は、前記「ヤマブシタケの活性物質の短期間投与後のテイルフリック試験」の条件と同様である。最大可能効果（maximal possible effects、MPE）は、以下のように計算された。投与後のテイルフリック反応時間から投与前のテイルフリック反応時間（単一マウスのテイルフリック基本値）を引き、この差を単一マウスのテイルフリック基本値で割った値がMPEである。したがって、ヤマブシタケの活性物質の短期間投与の疼痛緩和効果を観察することができ、その結果を図１０に示した。
【００７７】
投与後３０分に、マウスの痛覚反応を、テイルフリック試験によって測定した。その結果、対照群におけるテイルフリック反応時間は投与前のテイルフリック基本値より短く（約半分）、アルコール抽出混合群におけるテイルフリック反応時間は投与前より長く、アルコール抽出物群におけるテイルフリック反応時間は、投与前よりも約１倍長かった。アルコール抽出混合物群と対照群との間のスチューデントt検定のp値は、０．０３で有意差があり、アルコール抽出物群と対照群との間のスチューデントt検定のp値は、０．０１３４で有意差があり、アルコール抽出混合物群とアルコール抽出物群との間のスチューデントt検定のp値は、０．３１で有意差がないことを示した。
【００７８】
投与後６０分に、マウスの痛覚反応を、テイルフリック試験によって測定した。その結果、対照群におけるテイルフリック反応時間は投与前のテイルフリック基本値より短く、アルコール抽出混合群におけるテイルフリック反応時間は投与前よりも約１倍長く、アルコール抽出物群におけるテイルフリック反応時間は、投与前よりも長かった。アルコール抽出混合物群と対照群との間のスチューデントt検定のp値は、０．０５で有意差があり、アルコール抽出物群と対照群との間のスチューデントt検定のp値は、０．００４で有意差があり、アルコール抽出混合物群とアルコール抽出物群との間のスチューデントt検定のp値は、０．６１で有意差がないことを示した。これらの結果から、ヤマブシタケの活性物質は、疼痛の即時緩和効果を有し、その効果は少なくとも６０分間継続できることが示唆された。
【００７９】
４、ヤマブシタケの活性物質の長期間投与後のホットプレート試験
ヤマブシタケ活性物質の長期間にわたる投与がホットプレートによる痛覚反応を遅延させることができるかを評価するために、各マウスには２５００mg/kgの活性物質を３日間与え、各給餌間隔は、２４時間であった。次に、活性物質を３日間摂取させた後、ホットプレート試験を行い、足引っ込め、舐め又はジャンプの回数を測定し、その結果を図１１に示した。
【００８０】
３日間投与後の実験結果は、足引っ込め反応時間は対照群で6.4±1.8秒であり、アルコール抽出混合群で11.7±2.5秒であり、アルコール抽出群で11.5±1.8秒であった。アルコール抽出混合物群と対照群との間のスチューデントt検定のp値は、０．００５で有意差があり、アルコール抽出物群と対照群との間のスチューデントt検定のp値は、０．００２５で有意差があり、アルコール抽出混合物群とアルコール抽出物群との間のスチューデントt検定のp値は、０．０９で有意差がないことを示した。
【００８１】
投与３日目の初回のホットプレート試験を行ってから３０分後に、同じ実験方法で再び足引っ込め反応時間を測定した。その結果、足引っ込め反応時間は対照群で6.3±0.8秒であり、アルコール抽出混合群で11.8±2.5秒であり、アルコール抽出群で8.9±1.2秒であることを示した。アルコール抽出混合物群と対照群との間のスチューデントt検定のp値は、０．００７で有意差があり、アルコール抽出物群と対照群との間のスチューデントt検定のp値は、０．０１０で有意差があり、アルコール抽出混合物群とアルコール抽出物群との間のスチューデントt検定のp値は、０．０９で有意差がないことを示した。
【００８２】
給餌３日後の初回測定データ及び３０分後の測定データを合併して計算した結果、足引っ込め反応時間は対照群で5.7±2.4秒であり、アルコール抽出混合群で11.7±2.3秒であり、アルコール抽出群で10.3±2.0秒であることを示した。アルコール抽出混合物群と対照群との間のスチューデントt検定のp値は、０．００００６で有意差があり、アルコール抽出物群と対照群との間のスチューデントt検定のp値は、０．０００３で有意差があり、アルコール抽出混合物群とアルコール抽出物群との間のスチューデントt検定のp値は、０．８１で有意差がないことを示した。
【００８３】
この動物実験によれば、短期的な効果について、アルコール抽出混合物及びアルコール抽出物は、投与３０分後に有意な疼痛緩和効果を有し、投与６０分後に疼痛緩和効果が低下している傾向が見られる。アルコール抽出混合物及びアルコール抽出物を長期間にわたって投与する実験では、脱アレルギーが起こり、疼痛緩和効果が安定している傾向がある。
【００８４】
以上によると、本発明で開示されるヤマブシタケの菌糸体、ヤマブシタケのアルコール抽出物、ヤマブシタケのアルコール抽出混合物、及びエリナシンＳを含むヤマブシタケの活性物質は、疼痛を減らす効果を有することが実証されており、疼痛緩和の治療のためのさまざまな用途に広く使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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