(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
減少した非特異的な増幅副生成物を伴う、複数の増幅された核酸生成物を調製するための方法であって、以下を含む方法：
ａ）複数の増幅生成物を形成するための増幅条件下において、一以上の核酸と少なくとも一組の増幅プライマー対とを接触させる、ここで各増幅プライマーはその３’領域に少なくとも３つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む；
ｂ）複数の増幅生成物と、５’−３’エキソヌクレアーゼおよび、３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼのいずれかを接触させて、複数の消化された増幅生成物を形成する、ここで複数の消化された増幅生成物は、ヌクレアーゼ耐性の修飾基を持っていないプライマーを用いて行う標準的な核酸増幅反応と比較して、非特異的な増幅副生成物のレベルが減少している。
【請求項２】
複数の消化された増幅生成物がそれぞれ、その５’末端にリン酸基を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
複数の消化された増幅生成物がそれぞれ、平滑末端である、または複数の消化された増幅生成物がそれぞれ、３’オーバーハングを持つ、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
ヌクレアーゼ耐性の修飾基が、ホスホロチオエート結合、２’Ｏ−メチル基、２’フルオロ基、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１から３までのいずれかに記載の方法。
【請求項５】
５’−３’エキソヌクレアーゼが、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１から４までのいずれかに記載の方法。
【請求項６】
３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＴ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１から５までのいずれかに記載の方法。
【請求項７】
校正ポリメラーゼが、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１から５までのいずれかに記載の方法。
【請求項８】
非特異的な増幅副生成物がプライマーダイマー生成物である、請求項１から７までのいずれかに記載の方法。
【請求項９】
非特異的な増幅副生成物が、標準的な核酸増幅反応と比較して、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％減少する、請求項１から８までのいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
アダプターが連結した複数の増幅生成物を形成するために、一以上のアダプターと複数の消化された増幅生成物との連結をさらに含む、請求項１から９までのいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
複数の消化された増幅生成物の精製なしに連結が進行する、または複数の消化された増幅生成物の精製後に連結が進行する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）の工程で用いられる一以上の核酸がゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である、請求項１から１１までのいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
各増幅プライマーの３’領域に少なくとも５つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む、請求項１から１２までのいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ヌクレアーゼ耐性の修飾基がホスホロチオエート結合である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
シーケンシングライブラリーを調製するための方法であって、以下を含む方法：
ａ）複数の増幅生成物を形成するための増幅条件下において、複数の核酸と複数の増幅プライマー対とを接触させる、ここで各増幅プライマーはその３’領域に少なくとも３つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む；
ｂ）複数の増幅生成物と、５’−３’エキソヌクレアーゼおよび、３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼのいずれかを接触させて、複数の消化された増幅生成物を形成する；
ｃ）一以上のアダプターと複数の消化された増幅生成物とを連結して、シーケンシングライブラリーを形成する。
【請求項１６】
複数の消化された増幅生成物がそれぞれ、その５’末端にリン酸基を有する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
複数の消化された増幅生成物がそれぞれ、平滑末端である、または複数の消化された増幅生成物がそれぞれ、３’オーバーハングを持つ、請求項１５または１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ヌクレアーゼ耐性の修飾基が、ホスホロチオエート結合、２’Ｏ−メチル基、２’フルオロ基、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１５から１７までのいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
５’−３’エキソヌクレアーゼが、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１５から１８までのいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＴ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１５から１９までのいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
校正ポリメラーゼが、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１５から１９までのいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
複数の消化された増幅生成物の精製なしに（ｃ）の工程が進行する、または複数の消化された増幅生成物の精製後に（ｃ）の工程が進行する、請求項１５から２１までのいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）の工程で用いられる複数の核酸が、ゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である、請求項１５から２２までのいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
各増幅プライマーの３’領域に少なくとも５つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む、請求項１５から２３までのいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ヌクレアーゼ耐性の修飾基がホスホロチオエート結合である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
非特異的な増幅副生成物を有さない複数の増幅生成物を調製するためのキットであって、以下を含むキット：
ａ）一以上の増幅プライマー対、ここで各増幅プライマーはその３’領域に少なくとも３つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む；
ｂ）５’−３’エキソヌクレアーゼ；
ｃ）３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼのいずれか。
【請求項２７】
ヌクレアーゼ耐性の修飾基が、ホスホロチオエート結合、２’Ｏ−メチル基、２’フルオロ基、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２６記載のキット。
【請求項２８】
５’−３’エキソヌクレアーゼが、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２６または２７のいずれかに記載のキット。
【請求項２９】
３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＴ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２６から２８までのいずれかに記載のキット。
【請求項３０】
校正ポリメラーゼが、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２６から２９までのいずれかに記載のキット。
【請求項３１】
一以上のアダプターおよびＤＮＡリガーゼをさらに含む、請求項２６から３０までのいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は核酸増幅および、特に、非特異的な増幅副生成物の減少を伴う、複数の増幅生成物を調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
次世代ゲノムシーケンシング（ＮＧＳ）技術によるターゲットゲノムシーケンシングは、ヒト同一性および祖先特定、病気診断、植物生殖質の分子的特性(plant germplasm molecular characterization)、ならびに分子育種などの、生物医学および農学におけるゲノム解析のための強力なプラットフォームとなってきた。ＮＧＳプラットフォームの能力が急速に進歩する一方で、ＮＧＳ用ＤＮＡライブラリーの調製が律速要因となってきた。マルチプレックスＰＣＲは、ＤＮＡライブラリーのハイスループットな生成のための、理想的なプラットフォームである。しかしながら単一の反応によって、プライマー対の数が数組の対から数百または数千組の対にさえ劇的に増加するため、マルチプレックスＰＣＲ中におけるプライマーダイマーの形成および形成されたプライマーダイマーの次のライブラリー調製の工程における干渉が、ＮＧＳへの適用を成功させるための妨げとなっている。従って、生物医学および農業に用いるための、合理化され、ハイスループットで、低価格式の、ＤＮＡシーケンスライブラリーを調製するための手法、構成、およびキットが必要とされている。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１Ａ】図１Ａは、本明細書で開示された方法を用いる、ＤＮＡライブラリー調製の模式図を表す。興味の対象であるＤＮＡ標的を、３’末端（プライマーの黒色部分）をホスホロチオエート結合で修飾したプライマーで、ＰＣＲ増幅する。その後、ＰＣＲ生成物を、Ｔ７エキソヌクレアーゼとクレノウ断片の併用によって消化し、次にＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いてＮＧＳアダプターと連結する。連結生成物を精製し、ＮＧＳプラットフォームで配列決定する。
【０００４】
【図１Ｂ】図１Ｂは、本明細書で開示された方法を用いる、増幅反応からのプライマーダイマーの除去を示す。ＰＣＲ中に生成する潜在的なプライマーダイマーは、Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片によって小さなオリゴマーへと消化され、その結果ＮＧＳアダプターとの連結において、標的ＤＮＡのＰＣＲ断片との競合から除外される。
【０００５】
【図２】図２は、３’末端を４〜６個のホスホロチオエート結合で修飾したプライマーで増幅したＰＣＲ断片が、Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片による消化から保護されることを説明する。サイズ分画した、消化されたＰＣＲ生成物および未消化の対照の、バイオアナライザ(BioAnalyzer)の画像を示す。（Ｌ）バイオアナライザＤＮＡ１０００ラダー。（１）４個のホスホロチオエート結合を持つプライマーで増幅した未消化生成物。（２）５個のホスホロチオエート結合を持つプライマーで増幅した未消化生成物。（３）６個のホスホロチオエート結合を持つプライマーで増幅した未消化生成物。（４）非修飾の対照プライマーで増幅した未消化生成物。（５）４個のホスホロチオエート結合を持つプライマーで増幅した、消化された生成物。（６）５個のホスホロチオエート結合を持つプライマーで増幅した、消化された生成物。（７）６個のホスホロチオエート結合を持つプライマーで増幅した、消化された生成物。（８）非修飾の対照プライマーで増幅した、消化された生成物。３’末端をホスホロチオエート結合で修飾したプライマーは、Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片による分解から、結果として得られるＰＣＲ断片を保護できることを、この結果は示す。
【０００６】
【図３】図３はＴ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片の併用による消化における、プライマーダイマーの除去を示す。各プライマーの３’末端を６個のホスホロチオエート結合で修飾した。人為的なプライマーダイマーは人為的なプライマーの対によって生成し、これらの各プライマーもまた、３’末端に６個のホスホロチオエート結合を含んだ。ＰＣＲ生成物およびプライマーダイマーは、種々の量のＴ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片と結合させ、消化させた。サイズ分画したＰＣＲ断片およびプライマーダイマーの１０％ポリアクリルアミドゲルの画像を示す。（Ａ）ＰＣＲ生成物およびプライマーダイマー。（Ｂ）各５ユニットのＴ７エキソヌクレアーゼとクレノウ。（Ｃ）各２．５ユニットのＴ７エキソヌクレアーゼとクレノウ消化。（Ｄ）各１ユニットのＴ７エキソヌクレアーゼとクレノウ。（Ｅ）酵素による消化なしの対照。（Ｆ）ＤＮＡラダー(Sigma-Aldrich)。ホスホロチオエート結合で修飾したプライマーでＰＣＲ増幅を行うと、Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片の併用によって、プライマーダイマーを標的ＤＮＡのＰＣＲ断片から選択的に分解できることを、この結果は示す。
【０００７】
【図４】図４は、Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片による消化後の、トウモロコシ標的ＤＮＡのＰＣＲ断片とＮＧＳアダプターとの連結を説明する。先の図２および図３で示すように、修飾したプライマーを用いて、トウモロコシＤＮＡを増幅した。リガーゼなしの試料およびリガーゼを用いて３０または６０分インキュベートした試料における、連結した標的ＤＮＡのコピー数（TaqManリアルタイムＰＣＲによって定量化した）をプロットする。３’末端にホスホロチオエート結合を含むプライマーで増幅したＰＣＲ断片は、Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片を用いて消化され、次にＮＧＳアダプターと連結できることを、この結果は示す。
【０００８】
【図５】図５は、Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片による消化後の、ヒトの３８４プレックス(plex)でのＰＣＲ断片とＮＧＳアダプターとの連結を示す。３’末端を５個のホスホロチオエート結合で修飾した３８４対のプライマーのプールを用いて、ヒトＤＮＡを増幅し、Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片を用いて、ＰＣＲ生成物を消化した。下記の反応で連結した標的ＤＮＡのコピー数（TaqManリアルタイムＰＣＲによって定量化した）をプロットする。（Ａ）アダプターの、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなしの対照。（Ｂ）アダプターの、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼありの対照。（Ｃ）消化されたＰＣＲ生成物とアダプターの、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなしの対照。（Ｄ）未消化のＰＣＲ生成物とアダプターの、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼありの対照。（Ｅ）消化されたＰＣＲ生成物とアダプターの、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼありの連結テスト。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの酵素調製における不純物、おそらくポリヌクレオチドＤＮＡキナーゼ、によって、対照におけるバックグラウンドでの連結反応が起こった。テストＥにおける、アダプターと連結したＰＣＲ断片の濃度は約０．４５ｎＭであった。３’末端にホスホロチオエート結合を含むプライマーを用いて増幅した、高度に多重化されたヒトＤＮＡのＰＣＲ断片は、Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片を用いて消化され、次にＮＧＳアダプターと連結できることを、この結果は示す。
【０００９】
【図６】図６は、エチジウムブロマイド染色した１０％ポリアクリルアミドゲルの画像を表す。レーンＡ：未消化の、３，０７２プレックスのＰＣＲ生成物。レーンＢ：Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片で消化した、３，０７２プレックスのＰＣＲ生成物。レーンＣ：シーケンシングアダプタープライマー(sequencing adapter primer)で増幅した、３，０７２プレックスのライブラリーにおける未消化のライブラリー。レーンＤ：シーケンシングアダプタープライマーで増幅した、３，０７２プレックスのライブラリーにおける消化されたライブラリー。レーンＥ：ＤＮＡラダー(Sigma-Aldrich)。ＤＮＡラダーの下部から上部：５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐなど。レーンＦ：Ａの対照としての鋳型なしの試料。レーンＧ：Ｂの対照としての鋳型なしの試料。レーンＨ：Ｃの対照としての鋳型なしの試料。レーンＩ：Ｄの対照としての鋳型なしの試料。レーンＣおよびＨ（未消化）はおよそ１５０ｂｐのダブレットを持ち、これはアダプターとプライマーとの(adapter-to-primer)ダイマー連結増幅生成物と一致する。レーンＤおよびＩ（消化）はこのダブレットを欠く。Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片による消化は、ライブラリー内のプライマーダイマー連結生成物を減少させることにより、シーケンシングライブラリーの質を改善することを、これらの結果は示す。
【発明の概要】
【００１０】
本開示の一つの態様は、非特異的な増幅副生成物の減少を伴う、複数の増幅された核酸生成物の調製のための方法を包含する。この方法の最初の工程は、複数の増幅生成物を形成するための増幅条件下での、一以上の核酸と、少なくとも一つの増幅プライマー対との接触を含む。ここで、各増幅プライマーはその３’領域に少なくとも３つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む。この方法はさらに、複数の消化された増幅生成物を形成するために、複数の増幅生成物と、５’−３’エキソヌクレアーゼおよび、３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼ(proofreading polymerase)のいずれかとの接触を含む。ここで複数の消化された増幅生成物は、ヌクレアーゼ耐性の修飾基を持たないプライマーを用いて行う標準的な核酸増幅反応と比較して、非特異的な増幅副生成物のレベルが減少している。いくつかの実施態様において、非特異的増幅副生成物はプライマーダイマー生成物である。ある反復において、非特異的な増幅副生成物は、標準的な核酸増幅反応と比較して、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％または少なくとも約９０％減少する。一般的に、複数の消化された増幅生成物はそれぞれ、その５’末端にリン酸基を持つ。消化の工程で使用する酵素に依存して、複数の消化された増幅生成物はそれぞれ、平滑末端であるか、または複数の消化された増幅生成物はそれぞれ、３’オーバーハングを持つ。
【００１１】
いくつかの実施態様において、増幅される核酸はゲノムＤＮＡ、オルガネラＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡである。ある実施態様において、ヌクレアーゼ耐性の修飾基は、ホスホロチオエート結合、２’Ｏ−メチル基、２’フルオロ基、またはそれらの組み合わせから選択される。特徴的な実施態様において、ヌクレアーゼ耐性の修飾基はホスホロチオエート結合である。さらなる実施態様において、５’−３’エキソヌクレアーゼは、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆ、またはそれらの組み合わせから選択される。特徴的な実施態様において、５’−３’エキソヌクレアーゼはＴ７エキソヌクレアーゼである。ある実施態様において、３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＴ、またはそれらの組み合わせから選択される。他の実施態様において、校正ポリメラーゼは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせから選択される。特徴的な実施態様において、校正ポリメラーゼはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼまたはクレノウＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施態様において、この方法はさらに、アダプターが連結した複数の増幅生成物を形成するために、一以上のアダプターを複数の消化された増幅生成物へ連結することを含む。
【００１２】
本開示の別の態様は、シーケンシングライブラリーを調製するための方法を提供する。この方法は、複数の増幅生成物を形成するための増幅条件下での、複数の核酸と複数の増幅プライマー対との接触を含む。ここで、各増幅プライマーはその３’領域に少なくとも３つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む。この方法の次の工程は、複数の消化された増幅生成物を形成するための、複数の増幅生成物と、５’−３’エキソヌクレアーゼおよび、３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼのいずれかとの接触を含む。この方法の最後の工程は、シーケンシングライブラリーを形成するための、一以上のアダプターと複数の消化された増幅生成物との連結を含む。
【００１３】
本開示のさらなる態様は、非特異的な増幅副生成物を持たない複数の増幅生成物を調製するためのキットを包含する。このキットは、（ａ）一以上の増幅プライマー対、ここで各増幅プライマーはその３’領域に少なくとも３つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む、（ｂ）５’−３’エキソヌクレアーゼ、および（ｃ）３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼのいずれか、を含む。
【００１４】
本開示の他の態様および反復は、下記により詳細に記述する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示は、非特異的な増幅副生成物の減少を伴う、複数の増幅した核酸生成物の調製のための方法およびキットを提供する。この方法は、増幅プライマーを用いた、所望の標的核酸の増幅を含む。ここで各増幅プライマーは３’領域に少なくとも３つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む。この方法はさらに、ヌクレアーゼ感応性ヌクレオチドが増幅生成物の末端から除去され、増幅反応中に形成したプライマーダイマーがヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む短いオリゴヌクレオチドに分解される（図１および図２参照）ような、５’−３’エキソヌクレアーゼおよび、３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼのいずれかによる、結果として得られる増幅生成物の消化を含む。従って、本明細書で開示される方法およびキットは、次世代シーケンスのプラットフォームまたは他の下流での処理に適したライブラリーの調製のための、効率的、合理的、ハイスループットおよび低価格な方法を提供する。
Ｉ．複数の増幅生成物を調製するための方法
【００１６】
本開示の一つの態様は、非特異的な増幅副生成物の減少を伴う、複数の増幅された核酸生成物を調製するための方法を提供する。一般的に、この方法は、複数の増幅生成物を形成するための増幅条件下での、一以上の核酸と少なくとも一組の増幅プライマー対との接触を含む。ここで、各増幅プライマーはその３’領域に少なくとも３つのヌクレアーゼ耐性修飾基を含む。この方法はさらに、複数の消化された増幅生成物を形成するための、複数の増幅生成物と、５’−３’エキソヌクレアーゼおよび、３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼのいずれかとの接触を含む。ここで複数の消化された増幅生成物は、ヌクレアーゼ耐性の修飾基を持たないプライマーを用いて行う標準的な核酸増幅反応と比較して、非特異的な増幅副生成物のレベルが減少している。
【００１７】
（ａ）増幅工程
この方法の最初の工程は、核酸を増幅するための増幅条件下での、興味の対象である一以上の核酸と少なくとも一組の増幅プライマー対との接触を含む。各増幅プライマーは３’領域に少なくとも３つのヌクレアーゼ耐性の修飾基含むオリゴヌクレオチドである。
【００１８】
（ｉ）ヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む増幅プライマー
各増幅プライマーはその３’領域に少なくとも３つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む。多様なヌクレアーゼ耐性の修飾基が、本明細書で開示された増幅プライマーに含まれ得る。適切なヌクレアーゼ耐性の修飾基は、ホスホロチオエート結合、ジチオリン酸結合、ホスホロアミダイト結合、ホスホロジアミデート結合、アミド結合、２’Ｏ−メチル基、２’フルオロ基、プロピン塩基(propyne bases)、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施態様において、ヌクレアーゼ耐性の修飾基はホスホロチオエート結合であり得る。別の実施態様において、ヌクレアーゼ耐性の修飾基はホスホロチオエート結合と２’Ｏ−メチル基または２’フルオロ基の組み合わせであり得る。当業者には他の併用が可能であることがわかる。
【００１９】
いくつかの実施態様において、各増幅プライマーはその３’領域に、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、または１０個以上のヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む。特徴的な実施態様において、各増幅プライマーはその３’領域に、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む。ある実施態様において、各増幅プライマーはその３’領域に、５、６、７、または８個のホスホロチオエート結合を含む。各増幅プライマーはさらにその３’領域に、１、２、３、または４個の２’Ｏ−メチル基および／または２’フルオロ基を含み得る。
【００２０】
本明細書において、３’領域とは、オリゴヌクレオチドのプライマーにおける、分子の３’末端に最も近い部分を指す。いくつかの実施態様において、ヌクレアーゼ耐性の修飾基は、分子の３’末端の最後、最後から二番目、および最後から三番目のヌクレオチド（すなわち、３’末端から１〜３番目のヌクレオチド）内、３’末端から１〜６番目のヌクレオチド内、３’末端から１〜９番目のヌクレオチド内、３’末端から１〜１２番目のヌクレオチド内、または３’末端から１〜１５番目のヌクレオチド内に位置し得る。
【００２１】
増幅プライマーの長さは、約１０ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドまで変動し得る。いくつかの実施態様において、増幅プライマーは、約１０から約１５ヌクレオチドの長さ、約１５から約２０ヌクレオチドの長さ、約２０から約２５ヌクレオチドの長さ、約２５から約３０ヌクレオチドの長さ、約３０から約３５ヌクレオチドの長さ、または約３５から約４０ヌクレオチドの長さの範囲となり得る。特徴的な実施態様において、増幅プライマーは、約１８から約２７ヌクレオチドの長さの範囲となり得る。
【００２２】
一般的に、増幅プライマーは一本鎖であり、興味の対象である核酸と相補的であり、各増幅プライマーは、ＤＮＡ合成を開始するために、３’末端にヒドロキシ基を持つ。増幅プライマーは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。ヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、および／またはＵ）またはヌクレオチド類似体であり得る。ヌクレオチド類似体は、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基および／または修飾されたリボース部分を持つヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、天然に生じるヌクレオチド（例えばイノシン）または非天然に生じるヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドの糖または塩基部分の修飾における限定されない例は、アセチル基、アミノ基、カルボキシ基、カルボキシメチル基、ヒドロキシ基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の増加（または減少）、ならびに塩基における炭素および窒素原子の他原子への置換（例えば、７−デアザプリン）、を含む。ヌクレオチド類似体はまた、ロックド核酸(locked nucleic acids)（ＬＮＡ）およびモルフォリノを含む。増幅プライマーはまた、２重の縮重（すなわち、Ｒ、Ｙ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、および／またはＷ）、３重の縮重（すなわち、Ｂ、Ｄ、Ｈ、および／またはＶ）、または４重の縮重（すなわち、Ｎ）を持つヌクレオチドの混合を含み得る。
【００２３】
増幅プライマーは、容易に利用できるプライマー設計ソフトウェア（例えば、Primer3、PrimerQuest Tool、NPprimer、Multiplex primer design、など）を用いて設計してもよい。一般的に、増幅プライマーは約４０〜６０％の平均ＧＣ含量、および約５８℃から約６５℃の平均融解温度（Ｔｍ）を持ち得る。増幅プライマーは標準的なオリゴヌクレオチド化学合成法によって合成でき、ヌクレアーゼ耐性の修飾基はよく知られた方法で組み入れることができる。増幅プライマーは、一以上のプライマー対、例えば、数十組のプライマー対、数百組のプライマー対、または数千組のプライマー対を含んでもよい。
【００２４】
増幅反応における各増幅プライマーの濃度は、例えば、プライマー対の数および標的核酸の複雑性に依存して、約１ｎＭから約５００ｎＭの範囲となり得る。いくつかの実施態様において、各増幅プライマーの濃度は、約１〜１０ｎＭ、約１０〜３０ｎＭ、約３０〜１００ｎＭ、約１００〜３００ｎＭ、または約３００〜５００ｎＭの範囲となり得る。ある実施態様において、各増幅プライマーの濃度は約１０ｎＭから約２００ｎＭの範囲となり得る。他の実施態様において、各増幅プライマーの濃度は約５ｎＭから約５０ｎＭの範囲となり得る。
【００２５】
特徴的な実施態様において、一以上の増幅プライマー対は、約２０から２５ヌクレオチドの長さの範囲であり、標準的なデオキシリボヌクレオチドを含み、および各プライマーの３’末端に５から８個のホスホロチオエート結合を含み得る。
【００２６】
（ｉｉ）標的核酸
本明細書に開示された方法によって増幅される一以上の核酸は、様々な種類であってよい。いくつかの実施態様において、標的核酸はゲノムＤＮＡであり得る。ゲノムＤＮＡは、細胞核、ミトコンドリア、または色素体のゲノムＤＮＡであり得る。他の実施態様において、標的核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはノンコーディングＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、遺伝子間長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ(Piwi-interacting RNA)（ｐｉＲＮＡ）、トランス作用性ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ミトコンドリアｔＲＮＡ（ＭＴ−ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ＳｍＹ ＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、スプライスリーダーＲＮＡ（ＳＬ ＲＮＡ）、および／またはテロメラーゼＲＮＡコンポーネント）から転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であり得る。特徴的な実施態様において、核酸はゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。当業者はゲノムＤＮＡの単離およびｃＤＮＡの調製の方法（例えば、標準プロトコル、市販のキット、など）に精通している。
【００２７】
標的核酸は、野生型であってもよく、一塩基多型（ＳＮＰ）を含んでもよく、複数の塩基置換を含んでもよく、挿入および／または欠失（ｉｎｄｅｌ）を含んでもよく、および／またはエピジェネティック修飾（例えば、メチル化シトシン、その他の修飾されたヌクレオチド、など）を含んでもよい。
【００２８】
核酸は、真核生物、古細菌、または細菌の細胞由来でもよい。適切な真核細胞には、哺乳類細胞（例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、家畜、動物園の動物、齧歯類、研究動物、など）、非哺乳類脊椎動物細胞（例えば、家禽、魚、カエル、など）、植物細胞（例えば、トウモロコシ、マメ科植物、イネ科植物、アブラナ科植物、など）、無脊椎動物細胞（昆虫、寄生虫、など）、真菌細胞、単細胞生物、などを含む。
【００２９】
（ｉｉｉ）増幅条件
本方法の最初の工程は、複数の増幅生成物の形成のための増幅条件下での、一以上の核酸と少なくとも一組以上の増幅プライマー対との接触を含む。一般的に増幅条件は、適切な緩衝液の存在下での、ＤＮＡポリメラーゼとデオキシリボヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）との接触を含む。一般的に、増幅に用いられるＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性および３’−５’校正エキソヌクレアーゼ(proofreading exonuclease)活性を持っており、さらに５’−３’エキソヌクレアーゼ活性および／またはターミナルトランスフェラーゼ活性を含んでもよい。ＤＮＡポリメラーゼは好熱性（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、それらの変異体、またはそれらの組み合わせ）であってもよい。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼは中温性（例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、それらの変異体、またはそれらの組み合わせ）であってもよい。
【００３０】
増幅反応は、ＰＣＲに基づく増幅方法（例えば、マルチプレックスＰＣＲ、ロングレンジＰＣＲ、ルーチンＰＣＲ、高速ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、など）、多重置換増幅（ＦＤＡ）、転写増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＡＤ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、またはライゲーション介在増幅であってもよい。
【００３１】
一つの実施態様において、核酸はＰＣＲに基づく方法；例えばマルチプレックスＰＣＲ、によって増幅される。増幅条件は、好熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、およびＰＣＲに適した緩衝液（現技術でよく知られているもの）の接触を含む。各ＰＣＲサイクルは一般的に３つの工程を含む（すなわち、変性、アニーリング、および伸長）；全サイクル数は約２５から約５０サイクルの範囲でよく、変性の工程における温度は約９０℃から約１００℃の範囲でよく、変性の工程における持続時間は約１０秒から約１０分の範囲でよい。アニーリングの工程における温度は、増幅プライマーの融解温度に依存して変動し得る。例えば、アニーリングの工程における温度は、約５０℃から約６５℃の範囲でよく、アニーリングの工程における持続時間は約２０秒から約４分の範囲でよい。伸長の工程における温度は約６８℃から約７５℃の範囲でよく、伸長の工程における持続時間は約２０秒から約４分の範囲でよい。最後の伸長の工程の次に、約５分、１０分、またはそれ以上の間持続する、末端伸長の工程があってもよい。
【００３２】
（ｂ）消化工程
本方法はさらに、複数の消化された増幅生成物の形成のための、最初の工程で形成する複数の増幅生成物と、５’−３’エキソヌクレアーゼおよび、３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼのいずれかとの接触を含む。増幅生成物と５’−３’エキソヌクレアーゼとの接触は、一以上のヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドに出くわすまで、増幅生成物の５’末端からヌクレアーゼ感応性ヌクレオチドを除去する；ここで各５’末端はリン酸基を持つ（図１Ａ参照）。３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼとの接触は、結果として得られる３’オーバーハングを除去し、また校正ポリメラーゼとの接触は、結果として得られる３’オーバーハングを除去し、および／または３’末端にアデニンオーバーハングを付加する。最終的には、複数の消化された増幅生成物は平滑末端または３’オーバーハングとなる。しかしながら、増幅反応中に生じたプライマーダイマーまたはプライマーダイマー生成物が、５’−３’エキソヌクレアーゼおよび、３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼと接触すると、短いオリゴヌクレオチドが生じる（図１Ｂ参照）。結果として得られる短いオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む増幅プライマーの３’領域を含む。従って消化の工程では、下流の反応の準備のための消化された増幅生成物を生じるが、より重要なことは、続く反応からプライマーダイマー生成物が減少または除去されることである。
【００３３】
（ｉ）５’−３’エキソヌクレアーゼ
エキソヌクレアーゼは、ホスホジエステル結合を加水分解し、核酸鎖のいずれかの末端からヌクレオチドを一つずつ除去する酵素である。５’−３’活性を持つエキソヌクレアーゼは５’末端からヌクレオチドを除去する。５’−３’エキソヌクレアーゼは一本鎖および／または二本鎖鋳型ＤＮＡを認識し、切断できる。適切な５’−３’エキソヌクレアーゼの限定されない例は、Ｔ７（ｇｅｎｅ ６）エキソヌクレアーゼ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆ、またはそれらの併用を含む。特徴的な実施態様において、５’−３’エキソヌクレアーゼはＴ７エキソヌクレアーゼである。
【００３４】
一般的に、増幅生成物と接触する５’−３’エキソヌクレアーゼの量は、約０．０１から約２０ユニットの範囲となり得る。いくつかの実施態様において、５’−３’エキソヌクレアーゼの量は、約０．０１ユニットから約１ユニット、約１ユニットから約３ユニット、約３ユニットから約１０ユニット、または約１０ユニットから約２０ユニット、の範囲となり得る。
【００３５】
（ｉｉ）３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼおよび校正ポリメラーゼ
３’−５’活性を持つ、一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ（ｓｓＥｘｏ）は、一本鎖核酸の３’末端からヌクレオチドを除去する。適切な３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼの例は、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＴ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施態様において、エキソヌクレアーゼＩは、大腸菌、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)（Ｐｆｕ）、またはサーモコッカス・サーモフィルス(Thermococcus thermophilus)（Ｔｔｈ）由来であってもよい。
【００３６】
校正ポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つが、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たない。校正ポリメラーゼは、中温性ＤＮＡポリメラーゼ、好熱性ＤＮＡポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせであってもよい。適切な中温性の校正ＤＮＡポリメラーゼ(proofreading DNA polymerase)の限定されない例は、クレノウＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片）、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせを含む。適切な好熱性の校正ＤＮＡポリメラーゼの限定されない例は、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせを含む。
【００３７】
増幅生成物と接触する３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼの量は、約０．０１から約２０ユニットの範囲となり得る。いくつかの実施態様において、反応に用いるＤＮＡポリメラーゼの量は、約０．０１ユニットから約１ユニット、約１ユニットから約３ユニット、約３ユニットから約１０ユニット、または約１０ユニットから約２０ユニット、の範囲となり得る。
【００３８】
（ｉｉｉ）反応条件
反応の温度は、一般的に、消化の工程で用いる酵素の性質に依存して、変える。いくつかの実施態様において、消化は単一の温度で進行し得る。例えば、消化は、約１０℃から約４０℃、約２０℃から約３０℃、またはおおよその室温で進行してもよい。他の実施態様において、消化は二つの異なる温度で進行し得る、すなわち、１番目の温度の後に２番目の温度。例えば、１番目の温度は約１０℃から約４０℃、約２０℃から約３０℃、またはおおよその室温の範囲でよく、２番目の温度の工程では約４０℃から約８５℃、または約５０℃から７５℃の範囲でよい。消化の工程の持続時間は約５分から約１８０分の範囲となり得る。様々な実施態様において、反応は、約５分から約２０分、約２０分から約４０分、約４０分から約９０分、または約９０分から約１８０分、の時間で進行し得る。
【００３９】
いくつかの実施態様において、消化酵素は反応終了時に熱によって失活し得る。このため、特定の酵素の失活の温度に依存して、約６０℃から約７０℃、約７０℃から約８０℃、または約８０℃から約９０℃の範囲の温度まで、約１分から約１２０分の範囲の時間、反応混合物を加熱してもよい。
【００４０】
一般的に、複数の消化された増幅生成物は、ヌクレアーゼ耐性の修飾基を持っていないプライマーを用いて行う標準的な核酸増幅反応と比較して、非特異的な増幅副生成物のレベルが減少している。いくつかの実施態様において、非特異的な増幅副生成物のレベルは、標準的な核酸増幅反応と比べて、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少し得る。ある実施態様において、複数の消化された増幅生成物は非特異的な増幅副生成物をほぼ有さない。
【００４１】
何らかの精製の工程を介さずに、複数の消化された増幅生成物を直接、次の反応または下流の処理に用いてもよい。あるいは、消化された増幅生成物を、よく知られた核酸精製法（例えば、ＰＣＲ精製キット、など）を用いて、ヌクレオチド、増幅プライマー、酵素、および塩から精製してもよい。
【００４２】
（ｃ）任意の連結反応
いくつかの実施態様において、アダプターが連結した複数の増幅生成物を形成するために、複数の消化された増幅生成物を一以上のアダプターと連結してもよい。アダプターはシーケンシングアダプター(sequencing adaptor)でもよい。いくつかの実施態様において、アダプターはＮＧＳの適用に適していてもよい。例えば、アダプターは、リニアアダプター(linear adaptor)（例えば、Illumina/Solexaアダプター、TruSeqアダプター、SOLiDアダプター、TAアダプター、NEBNextアダプター、４５４アダプター、バーコードアダプターなど)、 サーキュラーアダプター(circular adaptor)、またはバブルアダプター(bubble adaptor)などでもよい。いくつかの実施態様において、アダプターは一般的に平滑末端であり非リン酸化であり得る。他の実施態様において、アダプターは３’のＴオーバーハングおよび５’のリン酸基を含み得る。
【００４３】
連結は連結酵素（すなわち、ホスホジエステル結合の形成を触媒するリガーゼ）の存在下で行う。一般的に、リガーゼは二本鎖ＤＮＡに特異的であり、平滑末端の連結またはＴ／Ａの連結を触媒する。限定されることのない、適切なＤＮＡリガーゼの例は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、またはそれらの組み合わせである。特徴的な実施態様において、ＤＮＡリガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼである。反応物に含まれるリガーゼおよびアダプターの量は、当業者の技能によって決定するため、反応条件と同じく、変更してもよい。
【００４４】
先に述べた方法はまた、シーケンシングライブラリーの調製に用いることができる。このためには、複数の増幅生成物を、増幅条件下において、複数の核酸と複数の増幅プライマー対との接触によって生じる。ここで、各増幅プライマーは上述のように少なくとも３つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む。そして、複数の消化された増幅生成物を形成するため、複数の増幅生成物を、５’−３’エキソヌクレアーゼおよび、３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼのいずれかと接触する。最後に、上述のようにアダプターを消化された増幅生成物と連結し、それによってシーケンスライブラリーが形成する。
【００４５】
（ｄ）下流の処理
いくつかの実施態様において、アダプターが連結した複数の増幅生成物を、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）プラットフォームを用いて、配列決定できる。ＮＧＳプラットフォームの限定されない例には、イオントレントシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、イルミナシーケンシング、ゲノムアナライザーシーケンシング(genome analyzer sequencing)、４５４シーケンシング、方向性ディープシーケンシング(directional deep sequencing)、ナノボールシーケンシング、一分子リアルタイムシーケンシング、などを含む。ＮＧＳ技術は、臨床診断、がん診断、分子診断検査、がん治療、薬剤開発、マイクロバイオームテクノロジー、食品および農業技術、ならびに基礎研究を含む。
【００４６】
他の実施態様において、アダプターが連結した複数の増幅生成物または複数の消化された増幅生成物は、ＳＮＰ遺伝子型判定、ｑＰＣＲおよびＰＣＲに基づく変異検出法、ＳＴＲ／マイクロサテライト分析、マイクロアレイに基づく技術、ならびにＲＦＬＰおよびサザンブロット解析、などの他の処理に用いてもよい。
【００４７】
ＩＩ．キット
本開示の別の態様は、非特異的な増幅副生成物の減少を伴う、複数の増幅生成物を調製するためのキットを包含する。一般的に、各キットは（ａ）一以上の増幅プライマー対、ここで各増幅プライマーはその３’領域に少なくとも３つのヌクレアーゼ耐性の修飾基を含む、（ｂ）５’−３’エキソヌクレアーゼ、および（ｃ）３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたは校正ポリメラーゼ、を含む。適切な増幅プライマーは先の（Ｉ）（ａ）（ｉ）節に詳述され、適切な５’−３’エキソヌクレアーゼは先の（Ｉ）（ｂ）（ｉ）節に説明され、適切な３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼおよび校正ポリメラーゼは先の（Ｉ）（ｂ）（ｉｉ）節に説明されている。
【００４８】
キットはさらに、先の（Ｉ）（ｃ）に詳述したように、一以上のアダプターおよび／またはリガーゼを含んでもよい。キットはさらに、各酵素またはそれらの組み合わせに適切な、一以上の緩衝液を含んでもよい。
【００４９】
本明細書で提供されるキットは一般的に、先に詳述した方法を実行するための説明書を含む。キット内に含まれる説明書は、包装材に添付されてもよく、また添付文書として含まれてもよい。説明書は通常、書面または印刷物であるが、そのようなものに限定されない。そのような説明書を保存でき、エンドユーザーに伝えることができる、あらゆる媒体が、本開示によって意図されている。そのような媒体は、限定されないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、磁気テープ、カセット、素子）、光学式媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）、などを含む。本明細書において、用語「説明書」は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。
【００５０】
本発明の範囲から逸脱することなく、上記の方法およびキットに様々な変化を施すことができるため、上記の説明および下記で与えられる実施例内に含まれる全ての事柄は、説明として解釈すべきであり、限定の意味で解釈されるべきでないことを意図している。
【００５１】
定義
他の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明の当業者が通常理解する意味を持つ。下記の参考文献は、本発明で用いる多くの用語の一般的な定義を当業者に示す：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において、下記の用語は、他に指示がない限り、下記に帰属した意味を持つ。
【００５２】
本開示またはそれについての好ましい態様における要素を紹介する際、冠詞（a, an, theおよびsaid）は一以上の要素を意味することを意図する。用語「含む(comprising)」、「含む(including)」、「持つ(having)」は、包括的であり、記載された要素の他にさらなる要素があってもよいことを意図する。
【００５３】
縮重したヌクレオチドは、２重の縮重（すなわち、二種のヌクレオチドの内の一種であり得る）、３重の縮重（すなわち、三種のヌクレオチドの内の一種であり得る）、または４重の縮重（すなわち、四種のヌクレオチドの内の一種であり得る。ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）を持ち得る。３重の縮重を持つヌクレオチドは、「Ｂ」（ＣまたはＧまたはＴになり得る）、「Ｄ」（ＡまたはＧまたはＴになり得る）、「Ｈ」（ＡまたはＣまたはＴになり得る）、および「Ｖ」（ＡまたはＣまたはＧになり得る）を含む。２重の縮重を持つヌクレオチドは、「Ｋ」（ＧまたはＴになり得る）、「Ｍ」（ＡまたはＣになり得る）、「Ｒ」（ＡまたはＧになり得る）、「Ｙ」（ＣまたはＴになり得る）、「Ｓ」（ＣまたはＧになり得る）、および「Ｗ」（ＡまたはＴになり得る）を含む。
【００５４】
本明細書において、用語「相補的」または「相補性」は、特異的な水素結合を介した塩基対形成による二本鎖核酸の会合を指す。塩基対形成は標準的なワトソン−クリック塩基対（例えば、５’−ＡＧＴＣ−３’は、相補的な配列である３’−ＴＣＡＧ−５’と対になる）であってもよい。塩基対形成はまた、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であってもよい。相補性は通常、二本鎖領域に対して評価されるため、例えばオーバーハングは除外される。いくつかの塩基対のみが相補的だった場合、二本鎖領域における二本鎖間の相補性は部分的で、百分率（例えば、７０％）で表され得る。相補的でない塩基は「ミスマッチ」である。二本鎖領域における全ての塩基対が相補的である場合、相補性はまた完全（すなわち１００％）になり得る。
【００５５】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、直鎖状または環状の立体構造で、一本鎖または二本鎖いずれかの形状の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの重合体を指す。本開示の目的のため、これらの用語は、重合体の長さについて限定するようには解釈されない。これらの用語は、天然のヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）を修飾したヌクレオチドを包含し得る。一般的に、特定のヌクレオチドの類似体は同様の塩基対形成の特異性を持つ；すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対形成する。
【００５６】
用語「ヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは標準的なヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン）またはヌクレオチド類似体であってもよい。ヌクレオチド類似体は、修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基または修飾されたリボース部分を持つヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、天然に生じるヌクレオチド（例えば、イノシン）または非天然に生じるヌクレオチドでもよい。ヌクレオチドの糖または塩基部分の修飾における限定されない例は、アセチル基、アミノ基、カルボキシ基、カルボキシメチル基、ヒドロキシ基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の増加（または減少）、ならびに塩基における炭素および窒素原子の他原子への置換（例えば、７−デアザプリン）、を含む。ヌクレオチド類似体はまた、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルフォリノを含む。
【００５７】
核酸およびアミノ酸の配列同一性の決定における技術は、現技術で知られている。通常、そのような技術は、遺伝子としてのｍＲＮＡのヌクレオチド配列の決定および／またはそれにコードされたアミノ酸配列の決定、ならびにこれらの配列と第２のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列との比較、を含む。ゲノム配列はまた、この方法で決定され、比較され得る。一般的に同一性は、二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列における、それぞれ、ヌクレオチドとヌクレオチドとの、またはアミノ酸とアミノ酸との、正確な一致を示す。二つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、同一性割合(percent identity)を決定することによって、比較され得る。二つの配列の同一性割合は、核酸配列またはアミノ酸配列のどちらでも、より短い配列の長さに分割され、１００倍された、二つの整列した配列間の正確な合致の数である。核酸配列のおおよそのアラインメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)によるローカルホモロジーアルゴリズムによって与えられる。このアルゴリズムは、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAによって開発されたアミノ酸置換表を用いて、アミノ酸配列に適用でき、Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)によって規格化し得る。配列の同一性割合を決定するための、このアルゴリズムの模範的な実行は、「ベストフィット」な実用的用途におけるジェネティクスコンピュータグループ(Madison, Wis.)(Genetics Computer Group (Madison, Wis.) in the "BestFit" utility application)によって与えられる。配列間の同一性割合または類似性を計算するための、その他の適切なプログラムは現技術で一般的に知られている、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターで用いるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは下記のデフォルトパラメーターで用いられ得る：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述(Descriptions)＝５０配列；分類(sort by)＝ハイスコア(HIGH SCORE)；データベース＝非冗長、GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。これらのプログラムの詳細はGenBankのウェブサイトで見つけることができる。
【実施例】
【００５８】
下記の例は本発明のある態様を説明する。
【００５９】
実施例１：修飾したプライマーで増幅したＰＣＲ断片の、増幅および消化
トウモロコシのゲノムＤＮＡは、JumpStart Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich)を用いて、非修飾の、または修飾したプライマーで、ＰＣＲ増幅した。修飾したプライマーはそれぞれ、３’末端に４〜６個のホスホロチオエート結合を含んでいた。順方向プライマーは５‘−ＣＣＡＣＧＧＴＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＴＴＴＧＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）であり、逆方向プライマーは５‘−ＡＧＧＣＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＧＴＣＡＧＴＣＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）であった。各反応混合物は２００ｎＭの各プライマーを含んでいた。ＰＣＲ増幅は、最初の変性を９５℃／２分；９４℃／３０秒、６０℃／３０秒、および７２℃／３０秒を３４サイクル；および７２℃／５分、で行った。その後ＰＣＲ生成物を、各５ユニットのＴ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片で、２２℃、３０分間消化した。消化されたＰＣＲ生成物をサイズ分画し、バイオアナライザ(Agilent)で定量化した。３’末端におけるホスホロチオエート結合でのプライマーの修飾は、結果として得られるＰＣＲ断片をＴ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片の分解から保護したことを、この結果は示す（図２参照）。
【００６０】
実施例２：修飾したプライマーで増幅したＰＣＲ断片内におけるプライマーダイマーの除去
トウモロコシのゲノムＤＮＡを、JumpStart Taq ReadyMixを用いて、順方向プライマー５‘−ＣＣＡＣＧＧＴＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＴＴＴＧＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および逆方向プライマー５‘−ＡＧＧＣＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＧＴＣＡＧＴＣＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）で、ＰＣＲ増幅した。プライマーはそれぞれ３’末端を６個のホスホロチオエート結合で修飾した。人為的なプライマーダイマーは人為的なプライマーの対によって生じ、それぞれはまた３’末端に６個のホスホロチオエート結合を含んでいた。各反応混合物は２００ｎＭの各プライマーを含んでいた。ＰＣＲ増幅は、最初の変性を９５℃／２分；９４℃／３０秒、６０℃／３０秒、および７２℃／３０秒を３４サイクル；および７２℃／５分、で行った。ＰＣＲ生成物およびプライマーダイマーは、各５ユニット、各２．５ユニット、または各１ユニットのＴ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片と、２２℃、３０分間結合しおよび消化され、１０％ポリアクリルアミドゲル上に分散された。ホスホロチオエート結合で修飾したプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うと、プライマーダイマー（しかし標的ＤＮＡのＰＣＲ断片でない）がＴ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片の併用によって、選択的に分解されたことを、この結果は示す（図３参照）。
【００６１】
実施例３：修飾したプライマーで増幅した、消化されたＰＣＲ断片とＮＧＳアダプターとの連結
トウモロコシのゲノムＤＮＡを、JumpStart Taq ReadyMixを用いて、順方向プライマー５‘−ＣＣＡＣＧＧＴＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＴＴＴＧＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および逆方向プライマー５‘−ＡＧＧＣＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＧＴＣＡＧＴＣＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）で、ＰＣＲ増幅した。プライマーはそれぞれ３’末端を６個のホスホロチオエート結合で修飾した。各反応混合物は２００ｎＭの各プライマーを含んでいた。ＰＣＲ増幅は、最初の変性を９５℃／２分；９４℃／３０秒、６０℃／３０秒、および７２℃／３０秒を３４サイクル；および７２℃／５分、で行った。その後、ＰＣＲ生成物を、各３ユニットのＴ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片で、２２℃、３０分間消化し、次に酵素を不活化するため、８０℃で１５分間とした。消化されたＰＣＲ生成物を、２２℃で３０または６０分間、続いて７２℃で１０分間で、イオントレントＰ１およびＡアダプターと連結した。３０μＬの反応物において、各反応混合物は、１μＭのアダプター、５％ＰＥＧ６０００、および８０ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼを含んでいた。連結生成物をＰＣＲ精製キットで精製し、３０μＬの水に溶出した。連結した標的ＤＮＡのＰＣＲ断片を、遺伝子特異的TaqManプローブならびにＰ１およびＡアダプターに特異的なプライマーを用いて、TaqManリアルタイムＰＣＲで定量化した。連結した標的ＤＮＡのＰＣＲ断片の濃度は、３０分および６０分の連結反応において、それぞれ約０．６ｎＭおよび１．２ｎＭであった。３’末端にホスホロチオエート結合を含むＰＣＲ生成物を、Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片で消化し、続いてＮＧＳアダプターと連結できることを、この結果は示す（図４参照）。
【００６２】
実施例４：ヒトＰＣＲ断片とＮＧＳアダプターとの連結
ヒトゲノムＤＮＡを、KAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPA Biosciences)を用いて、３８４組のプライマー対のプールで、ＰＣＲ増幅した。プライマーはＮＩＨヒト膵臓がんシーケンシングプロジェクト(NIH human pancreatic cancer sequencing project)によって設計され、発表された多量なプライマーセットのサブセットであった。各プライマーは、プライマーの３’末端を５個のホスホロチオエート結合で修飾した。各３８４プレックスのＰＣＲ増幅反応物は１０ｎＭの各プライマーを含んでいた。ＰＣＲ増幅は、最初の変性を９５℃／２分；９８℃／２０秒、５９℃／２分、および７２℃／３０秒を３０サイクル；および７２℃／５分、で行った。ＰＣＲ生成物を、３ユニットのＴ７エキソヌクレアーゼおよび５ユニットのクレノウ断片で、２２℃、３０分間で消化し、次に７５℃、２０分間で熱失活した。消化されたＰＣＲ生成物を、２２℃で３０分間、続いて７２℃で１０分間で、イオントレントＰ１およびＡアダプターと連結した。３０μＬの反応物において、各連結反応物は、１μＭのアダプター、６％ＰＥＧ６０００、および８０ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼを含んでいた。連結生成物をAgencourt AMPure XP system (Beckman Coulter, Inc.)で精製し、３０μＬの水に溶出した。精製した生成物を、Ｐ１アダプター特異的TaqManプローブならびにＰ１およびＡアダプターに特異的なプライマーを用いて、TaqManリアルタイムＰＣＲで定量化した。図５に示すように、３’末端にホスホロチオエート結合を含むプライマーで増幅した、高度に多重化されたヒトＤＮＡのＰＣＲ断片を、Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片で消化し、続いてＮＧＳアダプターと連結できた。
【００６３】
実施例５：消化された、および未消化の３，０７２プレックスのＰＣＲ生成物を含む、アダプターが連結したライブラリーの比較
３，０７２組のプライマー対のセットは、１２０から３００ヌクレオチドの長さの範囲となるトウモロコシのゲノム領域を増幅するために設計された。各プライマーの３’末端を６個のホスホロチオエート結合で修飾した。トウモロコシのゲノムＤＮＡを、この３，０７２組のプライマー対のプールで、ＰＣＲ増幅した。標的領域のＰＣＲ増幅は、０．７５ユニットのJumpStart（商標） AccuTaq（商標） LA Polymerase (Sigma-Aldrich)、３００μＭの各ｄＮＴＰ、５ｎｇのトウモロコシのゲノムＤＮＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５％／ｖ ＤＭＳＯ、５０ｍＭトリス塩酸、１５ｍＭ硫酸アンモニウム（ｐＨ９．３）、０．１％ツイーン２０(Tween-20)、および各プライマーが７．５ｎＭである、３，０７２プレックスのプライマープールを含む１０μＬ中で行った。ＰＣＲ増幅は、最初の変性を９６℃／２分；９４℃／２０秒、５９℃／２分３０秒、および６８℃／３０秒を３４サイクル；および最後の伸長を６８℃／５分、で行った。鋳型なしの対照（すなわちゲノムＤＮＡなし）の反応を、同一条件下で実行した。
【００６４】
ＰＣＲ後、試料を（ｉ）ヌクレアーゼの併用で消化し、末端へｄＡを付加した(dA-tailed) 、または（ｉｉ）リン酸化し、末端へｄＡを付加した。ヌクレアーゼ消化は、１０μＬのＰＣＲ生成物、１．５ユニットのＴ７エキソヌクレアーゼ(New England BioLabs Inc.)、１．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＩ巨大クレノウ断片(DNA Polymerase I Large Klenow Fragment) (New England BioLabs Inc.)、１．４４ｍＭ ＤＴＴ、および１６ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１２．５μＬの反応物中で行った。消化反応では、２５℃で３０分間インキュベートした。消化反応後すぐに、１．２５Ｕ／μＬ JumpStart（商標） Taq DNA Polymerase (Sigma-Aldrich)と５ｍＭ ｄＡＴＰとの混合物０．５μＬを加え、混合した。その後、７２℃で２０分間、反応物をインキュベートした。この工程では、アンプリコンに３’ｄＡオーバーハングが加わり、同時に、Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウポリメラーゼが熱失活する。比較のために、１０μＬのＰＣＲ生成物、０．６２５ユニットのJumpStart（商標） Taq DNA Polymerase (Sigma-Aldrich)、５ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(New England BioLabs Inc.)、１９２μＭの追加のｄＡＴＰ、５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２からなる１３μＬの反応物中で、未消化の試料をリン酸化し、末端へｄＡを付加した。リン酸化および末端へのｄＡ付加の反応物は、３７℃で３０分間インキュベートし、その後酵素を熱失活させるため７２℃で２０分間インキュベートした。
【００６５】
消化された、および未消化の試料はそれぞれ、シーケンシングライブラリーを作製するため、５０μＬの反応物中で、イルミナシーケンシングアダプター(Illumina sequencing adapters)と連結した。各連結反応物は、８００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ(New England BioLabs Inc.)、７００ｎＭイルミナ社用(Illumina compatible)Ｐ５およびＰ７アダプター二本鎖、１２％／ｖ ＰＥＧ６０００、５０ｍＭトリスｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、および１ｍＭ ＡＴＰを含んでいた。５０μＬの連結反応物は、２０℃で３０分間インキュベートした。１μＬの１：１００に希釈した各ライブラリー、５μＬの2x JumpStart（商標） Taq ReadyMix（商標） (Sigma-Aldrich)、ならびに２００ｎＭ Ｐ５およびＰ７アダプター特異的ＰＣＲプライマーを用いた、１０μＬの反応物によるＰＣＲ増幅後、シーケンシングライブラリーは１０％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分析された。鋳型なしの対照試料もまた実行した。温度サイクルの条件は、最初の変性を９５℃／２分；９５℃／１５秒、５９℃／２０秒、および７２℃／２０秒を１８サイクル；および最後の伸長を７２℃／５分、であった。
【００６６】
結果を図６に示す。レーンＣおよびＤはそれぞれ、シーケンシングアダプタープライマーで増幅した、未消化のライブラリーおよび消化されたライブラリーの試料を含んでいた。レーンＨおよびＩはそれぞれ、シーケンシングアダプタープライマーで増幅した、未消化のライブラリーおよび消化されたライブラリーの試料における、鋳型なしの対照試料を含んでいた。これらの各レーンにおいて、１００ｂｐにおけるマーカーのバンドの真上にバンドがあり、これはシーケンシングのアダプターとアダプターとの(adapter-to-adapter)連結増幅生成物と一致する。このバンドの上にある、未消化のレーンＣおよびＨにおける約１５０ｂｐのバンドは、アダプターとプライマーとの二量体連結増幅生成物と一致する。消化されたレーンＤおよびＩには、これらのバンドは存在しない。Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびクレノウ断片による３，０７２プレックスのＰＣＲ生成物の消化は、ライブラリー内のプライマーダイマー連結生成物の減少によって、シーケンシングライブラリーの質を改善することを、この結果は示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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