(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式１で示されるジアシルホスファチジルコリンと、
【化１】
0006692089.tif 000015
（式中、Ｒ１及びＲ２は、二重結合を２〜６有する炭素数１６〜２４の直鎖状又は分岐状の不飽和脂肪酸残基を表し、Ｒ１及びＲ２は、同一であっても、異なっていてもよい）
一般式２で示されるジアシルホスファチジルエタノールアミンと、
【化２】
0006692089.tif 000016
（式中、Ｒ３及びＲ４は、炭素数１０〜１８の直鎖状又は分岐状の飽和脂肪酸残基を表し、Ｒ３及びＲ４は、同一であっても、異なっていてもよい）
を構成成分として含み、前記ジアシルホスファチジルコリンと前記ジアシルホスファチジルエタノールアミンとが重量比７５〜９５：２５〜５で含まれる、
ことを特徴とする抗酸化能測定用リポソーム。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２は、二重結合を２〜４有する炭素数１８〜２０の直鎖状の不飽和脂肪酸残基である、
ことを特徴とする請求項１に記載の抗酸化能測定用リポソーム。
【請求項３】
Ｒ３及びＲ４は、炭素数１４〜１６の直鎖状の飽和脂肪酸残基である、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の抗酸化能測定用リポソーム。
【請求項４】
一般式１で示されるジアシルホスファチジルコリンと、
【化３】
0006692089.tif 000017
（式中、Ｒ１及びＲ２は、二重結合を２〜６有する炭素数１６〜２４の直鎖状又は分岐状の不飽和脂肪酸残基を表し、Ｒ１及びＲ２は、同一であっても、異なっていてもよい）
一般式２で示されるジアシルホスファチジルエタノールアミンと、
【化４】
0006692089.tif 000018
（式中、Ｒ３及びＲ４は、炭素数１０〜１８の直鎖状又は分岐状の飽和脂肪酸残基を表し、Ｒ３及びＲ４は、同一であっても、異なっていてもよい）
を構成成分として含み、前記ジアシルホスファチジルコリンと前記ジアシルホスファチジルエタノールアミンとが重量比７５〜９５：２５〜５で含まれるリポソームに、対象物質を接触させ、および前記リポソームを酸化させる工程と、
前記リポソームの酸化の度合を測定する工程と、
を含む抗酸化能測定方法。
【請求項５】
Ｒ１、Ｒ２は、二重結合を２〜４有する炭素数１８〜２０の直鎖状の不飽和脂肪酸残基である、
ことを特徴とする請求項４に記載の抗酸化能測定方法。
【請求項６】
Ｒ３及びＲ４は、炭素数１４〜１６の直鎖状の飽和脂肪酸残基である、
ことを特徴とする請求項４又は５に記載の抗酸化能測定方法。
【請求項７】
一般式１で示されるジアシルホスファチジルコリンと、
【化５】
0006692089.tif 000019
（式中、Ｒ１及びＲ２は、二重結合を２〜６有する炭素数１６〜２４の直鎖状又は分岐状の不飽和脂肪酸残基を表し、Ｒ１及びＲ２は、同一であっても、異なっていてもよい）
一般式２で示されるジアシルホスファチジルエタノールアミンと、
【化６】
0006692089.tif 000020
（式中、Ｒ３及びＲ４は、炭素数１０〜１８の直鎖状又は分岐状の飽和脂肪酸残基を表し、Ｒ３及びＲ４は、同一であっても、異なっていてもよい）
を構成成分として含み、前記ジアシルホスファチジルコリンと前記ジアシルホスファチジルエタノールアミンとが重量比７５〜９５：２５〜５で含まれる、
ことを特徴とするリポソーム。
【請求項８】
Ｒ１、Ｒ２は、二重結合を２〜４有する炭素数１８〜２０の直鎖状の不飽和脂肪酸残基である、
ことを特徴とする請求項７に記載のリポソーム。
【請求項９】
Ｒ３及びＲ４は、炭素数１４〜１６の直鎖状の飽和脂肪酸残基である、
ことを特徴とする請求項７又は８に記載のリポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化能測定用リポソーム、抗酸化能測定方法及びリポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液に含まれる低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）が酸化を受けて酸化ＬＤＬに変化すると、冠動脈疾患の進展につながることが知られている。このため、ＬＤＬなどの脂質の酸化を抑制することが健康維持のために重要であると考えられ、昨今、抗酸化能を有する素材、機能性食品などの利用に関心が高まってきている。
【０００３】
ＬＤＬなど脂質に対して抗酸化能を有する物質の探索方法として、いくつか提案がされてきた。
【０００４】
非特許文献１には、抗酸化物質の抗酸化能を評価する方法であるＯＲＡＣ法及びＤＰＰＰ法が記載されている。また、非特許文献２、３では、レシチンなどから抽出した脂質を用いてリポソームを作製することにより、脂質に対する抗酸化能を評価する方法が報告されている。また、非特許文献４では、ＬＤＬの酸化状態をＣＮＴ電極により評価する方法が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】木村英生ら、山梨県工業技術センター研究報告Ｎｏ．２５（２０１１）ｐ６４−６７
【非特許文献２】Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．６０，Ｎｏ．２，ｐｐ．  １６５−１７５，１９９７
【非特許文献３】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２０１４，６２，６７２６−６７３５
【非特許文献４】Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ  １６６−１６７（２０１２）８３３−８３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１に記載のＯＲＡＣ法及びＤＰＰＰ法による抗酸化能の測定値は、同じ抗酸化物質を用いて実際のＬＤＬなどの脂質に対する抗酸化能を測定した場合の値と相関しないことが示されている（ＩＥＥＥ  ＳＥＮＳＯＲＳ  ＪＯＵＲＮＡＬ，ＶＯＬ．１４，ＮＯ．２，ＦＥＢＲＵＡＲＹ  ２０１４，５３２−５３７）。また、非特許文献２、３に記載の方法では、原料ロットにより脂質の酸化状態が異なり、また、ＬＤＬに対する抗酸化能との相関も得られていない。また、非特許文献４に記載の方法では、ヒト由来の試料であるＬＤＬを用いるため、保存性、廃棄など汎用性の点で課題を残していた。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便かつ高精度に抗酸化能を測定することのできる抗酸化能測定用リポソーム、抗酸化能測定方法及びリポソームを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る抗酸化能測定用リポソームは、
一般式１で示されるジアシルホスファチジルコリンと、
【化１】
0006692089.tif 000002
（式中、Ｒ１及びＲ２は、二重結合を２〜６有する炭素数１６〜２４の直鎖状又は分岐状の不飽和脂肪酸残基を表し、Ｒ１及びＲ２は、同一であっても、異なっていてもよい）
一般式２で示されるジアシルホスファチジルエタノールアミンと、
【化２】
0006692089.tif 000003
（式中、Ｒ３及びＲ４は、炭素数１０〜１８の直鎖状又は分岐状の飽和脂肪酸残基を表し、Ｒ３及びＲ４は、同一であっても、異なっていてもよい）
を構成成分として含み、前記ジアシルホスファチジルコリンと前記ジアシルホスファチジルエタノールアミンとが重量比７５〜９５：２５〜５で含まれる、
ことを特徴とする。
【０００９】
例えば、Ｒ１、Ｒ２は、二重結合を２〜４有する炭素数１８〜２０の直鎖状の不飽和脂肪酸残基である。
【００１０】
例えば、Ｒ３及びＲ４は、炭素数１４〜１６の直鎖状の飽和脂肪酸残基である。
【００１１】
本発明の第２の観点に係る抗酸化能測定方法は、
一般式１で示されるジアシルホスファチジルコリンと、
【化３】
0006692089.tif 000004
（式中、Ｒ１及びＲ２は、二重結合を２〜６有する炭素数１６〜２４の直鎖状又は分岐状の不飽和脂肪酸残基を表し、Ｒ１及びＲ２は、同一であっても、異なっていてもよい）
一般式２で示されるジアシルホスファチジルエタノールアミンと、
【化４】
0006692089.tif 000005
（式中、Ｒ３及びＲ４は、炭素数１０〜１８の直鎖状又は分岐状の飽和脂肪酸残基を表し、Ｒ３及びＲ４は、同一であっても、異なっていてもよい）
を構成成分として含み、前記ジアシルホスファチジルコリンと前記ジアシルホスファチジルエタノールアミンとが重量比７５〜９５：２５〜５で含まれるリポソームに、対象物質を接触させ、および前記リポソームを酸化させる工程と、
前記リポソームの酸化の度合を測定する工程と、
を含む。
【００１２】
例えば、Ｒ１、Ｒ２は、二重結合を２〜４有する炭素数１８〜２０の直鎖状の不飽和脂肪酸残基である。
【００１３】
例えば、Ｒ３及びＲ４は、炭素数１４〜１６の直鎖状の飽和脂肪酸残基である。
【００１４】
本発明の第３の観点に係るリポソームは、
一般式１で示されるジアシルホスファチジルコリンと、
【化５】
0006692089.tif 000006
（式中、Ｒ１及びＲ２は、二重結合を２〜６有する炭素数１６〜２４の直鎖状又は分岐状の不飽和脂肪酸残基を表し、Ｒ１及びＲ２は、同一であっても、異なっていてもよい）
一般式２で示されるジアシルホスファチジルエタノールアミンと、
【化６】
0006692089.tif 000007
（式中、Ｒ３及びＲ４は、炭素数１０〜１８の直鎖状又は分岐状の飽和脂肪酸残基を表し、Ｒ３及びＲ４は、同一であっても、異なっていてもよい）
を構成成分として含み、前記ジアシルホスファチジルコリンと前記ジアシルホスファチジルエタノールアミンとが重量比７５〜９５：２５〜５で含まれる、
ことを特徴とする。
【００１５】
例えば、Ｒ１、Ｒ２は、二重結合を２〜４有する炭素数１８〜２０の直鎖状の不飽和脂肪酸残基である。
【００１６】
例えば、Ｒ３及びＲ４は、炭素数１４〜１６の直鎖状の飽和脂肪酸残基である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、簡便かつ高精度に抗酸化能を測定することのできる抗酸化能測定用リポソーム、抗酸化能測定方法及びリポソームを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】飽和脂肪酸の含有濃度がリポソームの酸化に与える影響を示したグラフ図である。
【図２】不飽和脂肪酸の長さ及び二重結合の数がリポソームの酸化に与える影響を示したグラフ図である。
【図３】飽和脂肪酸の長さがリポソームの酸化に与える影響を示したグラフ図である。
【図４】飽和脂肪酸の極性基部分がリポソームの酸化に与える影響を示したグラフ図である。
【図５】様々な抗酸化剤のＬＤＬ又はリポソームに対する抗酸化能を示したグラフ図である。
【図６】リポソームの保存性について示したグラフ図である。
【図７】異なる作製方法によって作製されたリポソームについて酸化の度合を示したグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
まず、本実施形態に係るリポソームについて詳細に説明する。
【００２０】
本実施形態に係るリポソームは、ジアシルホスファチジルコリン（以下「α成分」という）と、ジアシルホスファチジルエタノールアミン（以下「β成分」という）と、を構成成分として含む。
【００２１】
本実施形態に係るリポソームに含まれるα成分は、下記一般式１で示される。下記の通り、α成分は、極性基としてフォスファチジルコリン基を有する。なお、本願明細書において、α成分（ジアシルホスファチジルコリン）を単に「不飽和脂肪酸」と称する場合がある。
【００２２】
【化７】
0006692089.tif 000008
【００２３】
上記式中、Ｒ１及びＲ２は、二重結合を２〜６有する炭素数１６〜２４の直鎖状又は分岐状の不飽和脂肪酸残基を表す。Ｒ１、Ｒ２は、好ましくは、二重結合を２〜４有する炭素数１８〜２０の直鎖状の不飽和脂肪酸残基である。Ｒ１、Ｒ２として、例えば、９−ヘキサデセノイル、９−オクタデセノイル、１１−エイコセノイル、１３−ドコセノイル、１５−テトラコセノイル、９，１２−オクタデカジエノイル（リノール酸）、１１，１４−エイコサジエノイル、９，１２，１５−オクタデカトリエノイル（α―リノレン酸）、６，９，１２−オクタデカトリエノイル（γ―リノレン酸）、エイコサトリエノイル、４，８，１２，１６−エイコサテトラエノイル、５，８，１１，１−エイコサテトラエノイル（アラキドン酸）等の直鎖状又は分枝状の不飽和脂肪酸由来のものが挙げられる。特に、リノール酸、α−リノレン酸、アラキドン酸が好ましく、さらにアラキドン酸が好ましい。なお、Ｒ１及びＲ２は、同一であっても、異なっていてもよい。
【００２４】
本実施形態に係るリポソームに含まれるβ成分は、下記一般式２で示される。下記の通り、β成分は、極性基としてエタノールアミン基を有する。なお、本願明細書において、β成分（ジアシルホスファチジルエタノールアミン）を単に「飽和脂肪酸」と称する場合がある。
【００２５】
【化８】
0006692089.tif 000009
【００２６】
上記式中、Ｒ３及びＲ４は、炭素数１０〜１８の直鎖状又は分岐状の飽和脂肪酸残基を表す。Ｒ３及びＲ４は、好ましくは、炭素数１４〜１６の直鎖状の飽和脂肪酸残基である。Ｒ３及びＲ４として、例えば、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル（ミリスチン酸）、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル（パルミチン酸）、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル（ステアリン酸）等の直鎖もしくは分枝状の飽和脂肪酸由来ものが挙げられる。特に、ミリスチン酸、パルミチン酸が好ましい。なお、Ｒ３及びＲ４は、同一であっても、異なっていてもよい。
【００２７】
本実施形態に係るリポソームに含まれるα成分とβ成分との組み合わせの好適例は、以下の通りである。
・α成分のＲ１及びＲ２：アラキドン酸、β成分のＲ３及びＲ４：ミリスチン酸
・α成分のＲ１及びＲ２：アラキドン酸、β成分のＲ３及びＲ４：パルミチン酸
・α成分のＲ１及びＲ２：アラキドン酸、β成分のＲ３及びＲ４：ステアリン酸
・α成分のＲ１及びＲ２：α−リノレン酸、β成分のＲ３及びＲ４：ミリスチン酸
・α成分のＲ１及びＲ２：α−リノレン酸、β成分のＲ３及びＲ４：パルミチン酸
・α成分のＲ１及びＲ２：α−リノレン酸、β成分のＲ３及びＲ４：ステアリン酸
・α成分のＲ１及びＲ２：リノール酸、β成分のＲ３及びＲ４：ミリスチン酸
・α成分のＲ１及びＲ２：リノール酸、β成分のＲ３及びＲ４：パルミチン酸
・α成分のＲ１及びＲ２：リノール酸、β成分のＲ３及びＲ４：ステアリン酸
【００２８】
なお、Ｒ１及びＲ２がアラキドン酸の場合、α成分は、ＤＡＰＣ（２０−４）（ジアラキドニルホスファチジルコリン）であり、下記式で表される。
【００２９】
また、Ｒ１及びＲ２がα−リノレン酸の場合、α成分は、ＤＬＮＰＣ（１８−３）（ジリノレノイルホスファチジルコリン）であり、下記式で表される。
【００３０】
また、Ｒ１及びＲ２がリノール酸の場合、α成分は、ＤＬＰＣ（１８−２）（ジラウロイルホスファチジルコリン）であり、下記式で表される。
【００３１】
【化９】
0006692089.tif 000010
【００３２】
また、Ｒ３及びＲ４がミリスチン酸の場合、β成分は、ＤＭＰＥ（１４−０）（ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン）であり、下記式で表される。
【００３３】
また、Ｒ３及びＲ４がパルミチン酸の場合、β成分は、ＤＰＰＥ（１６−０）（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）であり、下記式で表される。
【００３４】
また、Ｒ３及びＲ４がステアリン酸の場合、β成分は、ＤＳＰＥ（１８−０）（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）であり、下記式で表される。
【００３５】
【化１０】
0006692089.tif 000011
【００３６】
本実施形態に係るリポソームには、α成分とβ成分とが重量比７５〜９５：２５〜５で含まれる。α成分：β成分の重量比は、例えば、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０、９５：５等である。
【００３７】
本実施形態に係るリポソームは、前述のα成分及びβ成分が上記の重量比で含まれ、かつ所望の効果を発揮する限り、前述のα成分及びβ成分に加えて、他のジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン等を含んでもよい。また、本実施形態に係るリポソームは、他の成分として、例えば、膜安定化剤としてコレステロール、コレスタノール等のステロール類を、荷電物質としてジアルキルホスフェート、ジアシルホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ステアリルアミン等を含んでいてもよい。また、本実施形態に係るリポソームは、他の成分として、ビオチンを結合させたリン脂質、蛍光物質を結合させたリン脂質、ローダミン（脂溶性色素、酸化されることで退色するため抗酸化能の評価が可能である）等を含んでいてもよい。また、本実施形態に係るリポソームは、対象物質（被検物質）の抗酸化能を測定するために用いられるので、酸化防止剤を含まないことが好ましい。
【００３８】
本実施形態に係るリポソームは、エクストルーダー（市販品）を用いて作製してもよく、公知の超音波照射による方法や、高速攪拌法等を用いて作製してもよい。本発明の効果を奏する限り、任意の方法で作製され得る。また、本実施形態に係るリポソームの粒径は、例えば、３０〜２００ｎｍ程度である。
【００３９】
本実施形態に係るリポソームの作製方法について例示する。以下、α成分としてＤＡＰＣ、β成分としてＤＭＰＥを、重量比ＤＡＰＣ：ＤＭＰＥ＝７５：２５で含むリポソームの作製方法について例示する。ＤＡＰＣ（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）３２０μＬ、ＤＭＰＥ（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１１０μＬ、１０μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で１８時間以上乾燥させる。脱ガスした５μＭグリシンを含むＰＢＳ緩衝溶液を１ｍＬ添加して、約２０秒間ボルテックスした後、エクストルーダー（３０ｎｍフィルター）を一定温度（４２〜４７℃）になるように加温して、本実施形態に係るリポソームを作製する。リポソーム溶液のフィルター膜の通過回数は１２回とする。
【００４０】
本実施形態に係るリポソームの他の作製方法について例示する。α成分及びβ成分からなるリポソームと、β成分からなるリポソームと、を混合することでリポソームを作製してもよい。以下、α成分としてＤＡＰＣ、β成分としてＤＭＰＥを含むリポソームの作製方法について例示する。まず、ＤＡＰＣ（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１６０μＬ、ＤＭＰＥ（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）３．６μＬ、３．６μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で１８時間以上乾燥させる。脱ガスした５μＭグリシンを含むＰＢＳ緩衝溶液を０．３９０ｍＬ添加して、約２０秒間ボルテックスした後、エクストルーダー（３０ｎｍフィルター）を一定温度（４２〜４７℃）になるように加温して、リポソーム溶液を作製する。次に、ＤＭＰＥ（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１６０μＬ、３．６μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で１８時間以上乾燥させる。脱ガスした５μＭグリシンを含むＰＢＳ緩衝溶液を０．３９０ｍＬ添加して、６０℃で超音波処理によりＤＭＰＥリポソーム溶液（脂質懸濁液）を作製する。最後に、前述の通り作製したリポソーム溶液８０μＬに緩衝溶液５５μＬ、ＤＭＰＥリポソーム溶液２５μＬを混合して、本実施形態に係るリポソームを作製する。
【００４１】
また、本実施形態に係るリポソームは、α成分のみからなるリポソームと、β成分のみからなるリポソームと、を混合することによっても作製され得る。
【００４２】
本実施形態に係るリポソームは、公知のリポソームの保存方法で保存され得、例えば、脱気及びアルゴン置換後４℃で保存することができる。なお、光酸化を抑制するために、遮光保存することが望ましい。
【００４３】
次に、本実施形態に係る抗酸化能測定用リポソームについて説明する。
【００４４】
本実施形態に係る抗酸化能測定用リポソームは、対象物質（脂質酸化抑制剤又は脂質酸化抑制剤の候補物質）の抗酸化能を測定するために用いられるものである。前述の“脂質酸化抑制剤の抗酸化能を測定する”とは、脂質酸化抑制剤がどの程度の抗酸化能を有するのかについて評価することを表し、前述の“脂質酸化抑制剤の候補物質の抗酸化能を測定する”とは、脂質酸化抑制効果を有することが予想される「脂質酸化抑制剤の候補物質」が抗酸化能を有するか否かを評価すること及び「脂質酸化抑制剤の候補物質」がどの程度の抗酸化能を有するのかについて評価することを表す。この場合、脂質酸化抑制剤は、好ましくは、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化抑制剤である。本明細書において「抗酸化能」は、（リポソームの酸化とともに過酸化脂質が生成するが）リポソームの酸化に伴う過酸化脂質の生成が、対象物質（脂質酸化抑制剤又は脂質酸化抑制剤の候補物質）によってどの程度抑制されるかを表す。過酸化脂質の生成を抑制する程度が高いほど、対象物質の抗酸化能は高くなる。なお、本実施形態に係る抗酸化能測定用リポソームとして、前述のリポソームが使用される。
【００４５】
前述のリポソームを用いた抗酸化能測定の具体的方法については、後述する。
【００４６】
次に、本実施形態に係る抗酸化能測定方法について説明する。
【００４７】
次に、本実施形態に係る対象物質の抗酸化能測定方法について説明する。
【００４８】
本実施形態に係る対象物質の抗酸化能測定方法は、
（ａ）前述のリポソームに、対象物質を接触させ、およびリポソームを酸化させる工程と、
（ｂ）リポソームの酸化の度合を測定する工程と、
を含む。
【００４９】
上記工程（ａ）において、対象物質は、前述の通り、脂質酸化抑制剤又は脂質酸化抑制剤の候補物質であり、例えば、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）に対して酸化抑制効果を有する物質又はＬＤＬに対して酸化抑制効果を有することが予想される物質であってもよい。対象物質は、例えば、化合物、タンパク質、ペプチド、これらの混合物等である。
【００５０】
上記工程（ａ）における「接触」とは、前述のリポソームに、対象物質が抗酸化能を有しているならば該対象物質が抗酸化能を発揮できるように、該対象物質を近接させることを意味し、例えば、リポソームを含む溶液に該対象物質を添加すること等によってなされ得る。
【００５１】
上記工程（ｂ）において、リポソームの酸化の度合を測定する方法としては、電極（ＣＮＴ電極等）を用いて電位応答を測定する方法、蛍光物質を用いた方法（ＤＰＰＰ法等）などが例示されるが、リポソームの酸化の度合を測定することができる限り、測定方法は限定されない。
【００５２】
上記工程（ｂ）において、酸化を開始させた状態でリポソームの酸化の度合を測定してもよい。酸化を開始させる手段としては、酸化剤（硫酸銅等）を添加する方法、光（紫外線等）を照射する方法、熱を加える方法、既知のラジカル発生剤を添加する方法等が挙げられる。酸化を開始させるタイミングは、工程（ａ）及び（ｂ）のいずれでもよい。すなわち、工程（ａ）では、リポソームに対象物質を接触させる前に酸化を開始してもよく、リポソームに対象物質を接触させた後に酸化を開始してもよく、工程（ｂ）では、リポソームの酸化の度合を測定する前に酸化を開始させてもよい。
【００５３】
本実施形態に係る抗酸化能測定方法は、脂質酸化抑制剤のスクリーニング方法を含む。脂質酸化抑制剤のスクリーニング方法を具体的に説明する。前述のリポソームに、脂質酸化抑制剤の候補物質（例えば、化合物、タンパク質、ペプチド、これらの混合物等）を接触させおよびリポソームを酸化させて、リポソームの酸化の度合を測定し、例えば、リポソームの酸化の度合が標準的な脂質酸化抑制剤のそれと同等以上であれば、該候補物質が脂質酸化抑制剤として使用可能であることが判明する。
【００５４】
以上説明したように、本実施形態に係るリポソームを用いることで、簡便に抗酸化能を測定することが可能である。より具体的には、対象物質の抗酸化能（脂質酸化抑制効果）を評価する場合、従来のヒト由来のＬＤＬを用いると廃棄等の点で不利であったが、汎用性が高いリポソームを用いることで簡便に、また、効率良く抗酸化能の評価が可能であり、本実施形態に係るリポソームを、いわばＬＤＬの代替品として用いることができる。また、ヒトＬＤＬは１０日程度しか保存できないが、本実施形態に係るリポソームは作製後２ヵ月間にわたって安定的に保存可能であることが示されており、保存性に優れている。
【００５５】
また、本実施形態に係るリポソームによる抗酸化能の測定値と、ヒトＬＤＬによるそれと、の間で良好な相関が示されているため、対象物質の抗酸化能を精度高く評価することができる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５７】
（実施例１）
種々のリポソームを作製し、酸化の度合について評価した。
【００５８】
（リポソームの材料）
α成分（極性基：ホファチジルコリン基）として、以下に示される化合物を使用した。
・ＤＡＰＣ（２０−４）：ジアラキドニルホスファチジルコリン
・ＤＬＮＰＣ（１８−３）：ジリノレノイルホスファチジルコリン
・ＤＬＰＣ（１８−２）：ジラウロイルホスファチジルコリン
【００５９】
【化１１】
0006692089.tif 000012
【００６０】
また、β成分（極性基：エタノールアミン基）として、以下に示される化合物を使用した。
・ＤＭＰＥ（１４−０）：ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン
・ＤＰＰＥ（１６−０）：ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
・ＤＳＰＥ（１８−０）：ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン
【００６１】
【化１２】
0006692089.tif 000013
【００６２】
また、β成分の比較例として、以下に示される化合物を使用した。
・ＤＭＰＣ（１４−０）（コリン型）：ジミリストイルホスファチジルコリン
・ＤＭＰ（１４−０）（リン酸型）：ジミリストイルホスファチジル酸
・ＤＭＰＳ（１４−０）（セリン型）：ジミリストイルホスファチジルセリン
・ＤＭＰＯＨ（１４−０）（グリセロール型）：ジミリストイルホスファチジルグリセロール
【００６３】
【化１３】
0006692089.tif 000014
【００６４】
なお、上記のかっこ内の最初の数字は炭素数、その後の数字は二重結合の数を表し、例えば、（１４−０）は炭素数１４で二重結合を有しない脂肪酸を表す。
【００６５】
（β成分の含有濃度がα成分含有リポソームの酸化に与える影響）
β成分としてＤＭＰＥ（１４−０）（以下、ＤＭＰＥとする）を用いて、種々のＤＭＰＥ含有濃度のリポソームを作製し、β成分の含有濃度がリポソームの酸化に与える影響について検討した。
【００６６】
α成分としてＤＡＰＣ（２０−４）（以下、ＤＡＰＣとする）、β成分としてＤＭＰＥを、以下の重量比で含む各リポソーム（ＤＭＰＥ２５、ＤＭＰＥ１５、ＤＭＰＥ５、ＤＭＰＥ２、ＤＭＰＥ０）を作製した。
・ＤＭＰＥ２５；  ＤＭＰＥ（β成分）：ＤＡＰＣ（α成分）＝２５：７５
・ＤＭＰＥ１５；  ＤＭＰＥ（β成分）：ＤＡＰＣ（α成分）＝１５：８５
・ＤＭＰＥ５  ；  ＤＭＰＥ（β成分）：ＤＡＰＣ（α成分）＝５：９５
・ＤＭＰＥ２  ；  ＤＭＰＥ（β成分）：ＤＡＰＣ（α成分）＝２：９８
・ＤＭＰＥ０  ；  ＤＭＰＥ（β成分）：ＤＡＰＣ（α成分）＝０：１００
【００６７】
各リポソームの作製方法について以下説明する。
・ＤＭＰＥ２５：ＤＭＰＥ（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１１０μＬ、ＤＡＰＣ（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）３２０μＬ、１０μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で１８時間以上乾燥させた。脱ガスした５μＭグリシンを含むＰＢＳ緩衝溶液を１ｍＬ添加して、約２０秒間ボルテックスした後、エクストルーダー（Ａｖａｎｔｉ  Ｍｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社）（３０ｎｍフィルター）を一定温度（４２〜４７℃）になるように加温して、リポソームを作製した。リポソーム溶液のフィルター膜の通過回数は１２回とした。電極による電位測定時に、５μＭグリシンを含むＰＢＳ緩衝溶液で２倍に希釈した。
・ＤＭＰＥ１５：ＤＭＰＥ（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）２７μＬ、ＤＡＰＣ（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１６０μＬ、５μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で１８時間以上乾燥させた。脱ガスした５μＭグリシンを含むＰＢＳ緩衝溶液を０．４４ｍＬ添加して、上記同様にリポソームを作製した。電極による電位測定時に、５μＭグリシンを含むＰＢＳ緩衝溶液で２倍に希釈した。
・ＤＭＰＥ５：ＤＭＰＥ（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１１μＬ、ＤＡＰＣ（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１６０μＬ、５μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で１８時間以上乾燥させた。脱ガスした５μＭグリシンを含むＰＢＳ緩衝溶液を０．４０ｍＬ添加して、上記同様にリポソームを作製した。電極による電位測定時に、５μＭグリシンを含むＰＢＳ緩衝溶液で２倍に希釈した。
・ＤＭＰＥ２：ＤＭＰＥ（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）２．７μＬ、ＤＡＰＣ（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１２０μＬ、２．８μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で１８時間以上乾燥させた。脱ガスした５μＭグリシンを含むＰＢＳ緩衝溶液を０．５８ｍＬ添加して、上記同様にリポソームを作製した。電極による電位測定時に希釈せずにそのまま使用した。
・ＤＭＰＥ０：ＤＡＰＣ（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１６０μＬ、３．７μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で１８時間以上乾燥させた。脱ガスした５μＭグリシンを含むＰＢＳ緩衝溶液を０．７５ｍＬ添加して、上記同様にリポソームを作製した。電極による電位測定時に希釈せずにそのまま使用した。
【００６８】
リポソーム酸化の度合の測定方法について説明する。３７℃のリポソーム溶液１００μＬに、ＣＮＴ電極（後述）及び銀塩化銀電極（参照電極）を浸し、ＣＮＴ電極の電位測定を開始した。電位測定開始５００秒後から１０００秒後の間に、硫酸銅（酸化剤）を２．５μＭになるように添加し、撹拌して酸化を開始させた。参照電極に対する電位変化量から、酸化の程度を評価した。つまり、リポソームに硫酸銅を添加すると、脂質の酸化とともに過酸化脂質が生成されて、電極の電位が正方向にシフトする。グラフ図において、プラス方向の電位が大きくなるほど酸化が進行していることを示している。
【００６９】
ＣＮＴ電極の作製方法について説明する。まず、ＰＥＴ素材の基板上にカーボンペースト（ＣＰ）を施し、Ａｇ／ＡｇＣｌペーストで印刷、加熱してＣＰ電極を作製した。使用前に、ＣＮＴ分散溶液をＣＰ電極上に滴下乾燥し、ＣＮＴ電極として用いた。
【００７０】
結果を図１に示す。図１において、“０”はＤＭＰＥ０、“２”はＤＭＰＥ２、“５”はＤＭＰＥ５、“１５”はＤＭＰＥ１５、“２５”はＤＭＰＥ２５を表す。酸化開始後、ＤＭＰＥ（β成分）を含むＤＭＰＥ２５、ＤＭＰＥ１５、ＤＭＰＥ５では、時間の経過とともに電位応答の顕著な増加が見られた。ＤＭＰＥ（β成分）含有濃度が増加するにつれて、電位応答が大きくなったが、ＤＭＰＥ１５とＤＭＰＥ２５とではその差は小さかった。一方、ＤＭＰＥ（β成分）を少量含むＤＭＰＥ２では、電位応答はわずかしか見られず、また、ＤＭＰＥ（β成分）を含まないＤＭＰＥ０では、電位応答は見られなかった。
【００７１】
以上より、ＤＭＰＥ（β成分）とＤＡＰＣ（α成分）とが重量比で２５〜５：７５〜９５含まれるリポソームが酸化を受けやすいことが示された。
【００７２】
（α成分の不飽和脂肪酸の鎖長及び二重結合の数がリポソームの酸化に与える影響）
次に、α成分の鎖長及び二重結合の数がリポソームの酸化に与える影響について検証した。
【００７３】
β成分としてＤＭＰＥ（１４−０）（以下、ＤＭＰＥとする）、α成分としてＤＡＰＣ（２０−４）、ＤＬＮＰＣ（１８−３）又はＤＬＰＣ（１８−２）を用いて、以下の通り、各リポソーム（ＤＡＰＣ（２０−４）、ＤＬＮＰＣ（１８−３）、ＤＬＰＣ（１８−２））を作製した。
【００７４】
・ＤＡＰＣ（２０−４）：ＤＭＰＥ（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１１０μＬ、ＤＡＰＣ（２０−４）（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）３２０μＬ、１０μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で１８時間以上乾燥させた。脱ガスした５μＭグリシンを含むＰＢＳ緩衝溶液を１ｍＬ添加して、上記同様にリポソームを作製した。
・ＤＬＮＰＣ（１８−３）：ＤＭＰＥ（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１１０μＬ、ＤＬＮＰＣ（１８−３）（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）３２０μＬ、１０μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で１８時間以上乾燥させた。脱ガスした５μＭグリシンを含むＰＢＳ緩衝溶液を１ｍＬ添加して、上記同様にリポソームを作製した。
・ＤＬＰＣ（１８−２）：ＤＭＰＥ（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１１０μＬ、ＤＬＰＣ（１８−２）（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）３２０μＬ、１０μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で１８時間以上乾燥させた。脱ガスした５μＭグリシンを含むＰＢＳ緩衝溶液を１ｍＬ添加して、上記同様にリポソームを作製した。
【００７５】
リポソーム酸化の度合の測定については、硫酸銅（酸化剤）を５μＭになるように添加したことを除き、上記同様に行った。
【００７６】
結果を図２に示す。図２において、“ＤＡＰＣ”はＤＡＰＣ（２０−４）、“ＤＬＰＣ”はＤＬＰＣ（１８−２）、“ＤＬＮＰＣ”はＤＬＮＰＣ（１８−３）を表す。酸化のピークが観察されるまでの時間は、ＤＡＰＣ（２０−４）では酸化開始後約９０００秒、ＤＬＮＰＣ（１８−３）では約２００００秒、ＤＬＰＣ（１８−２）では２００００秒以上であった。
【００７７】
以上より、α成分の不飽和脂肪酸の鎖長が長く二重結合の数が多いほうが、リポソームの酸化の進行が速いことが示された。
【００７８】
（β成分の飽和脂肪酸の鎖長がリポソームの酸化に与える影響）
次に、β成分の鎖長がリポソームの酸化に与える影響について検証した。
【００７９】
β成分としてＤＭＰＥ（１４−０）、ＤＰＰＥ（１６−０）、ＤＳＰＥ（１８−０）、α成分としてＤＡＰＣ（２０−４）を用いて、以下の通り、各リポソーム（ＤＭＰＥ（１４−０）、ＤＰＰＥ（１６−０）、ＤＳＰＥ（１８−０））を作製した。
【００８０】
・ＤＭＰＥ（１４−０）：ＤＭＰＥ（１４−０）（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１１０μＬ、ＤＡＰＣ（２０−４）（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）３２０μＬ、１０μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れて、上記同様にリポソームを作製した。
・ＤＰＰＥ（１６−０）：ＤＰＰＥ（１６−０）（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１１０μＬ、ＤＡＰＣ（２０−４）（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）３２０μＬ、１０μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れて、上記同様にリポソームを作製した。
・ＤＳＰＥ（１８−０）：ＤＳＰＥ（１８−０）（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１１０μＬ、ＤＡＰＣ（２０−４）（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）３２０μＬ、１０μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れて、上記同様にリポソームを作製した。
【００８１】
リポソーム酸化の度合の測定については、硫酸銅（酸化剤）を５μＭになるように添加したことを除き、上記同様に行った。
【００８２】
結果を図３に示す。図３において、“ＤＰＰＥ”はＤＰＰＥ（１６−０）、“ＤＭＰＥ”はＤＭＰＥ（１４−０）、“ＤＳＰＥ”はＤＳＰＥ（１８−０）を表す。ＤＳＰＥ（１８−０）＞ＤＰＰＥ（１６−０）＞ＤＭＰＥ（１４−０）の順に酸化のピーク時間が長くなっていた。
【００８３】
以上より、β成分の飽和脂肪酸の鎖長が長いほうが、酸化時間が長くなる傾向にあることが示された。
【００８４】
（β成分の極性基部分がリポソームの酸化に与える影響）
次に、β成分の極性基部分がリポソームの酸化に与える影響について検討した。
【００８５】
β成分として鎖長が同じで極性基部分が異なるＤＭＰＥ（１４−０）（エタノールアミン型）、ＤＭＰ（１４−０）（リン酸型）、ＤＭＰＣ（１４−０）（コリン型）、ＤＭＰＯＨ（１４−０）（グリセロール型）、ＤＭＰＳ（１４−０）（セリン型）、α成分としてＤＡＰＣ（２０−４）を用いて、以下の通り、各リポソーム（実施例：ＤＭＰＥ、比較例：ＤＭＰ、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＯＨ、ＤＭＰＳ）を作製した。
・ＤＭＰＥ：ＤＭＰＥ（１４−０）（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１１０μＬ、ＤＡＰＣ（２０−４）（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）３２０μＬ、１０μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れて、上記同様にリポソームを作製した。
・ＤＭＰ：ＤＭＰ（１４−０）（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１１０μＬ、ＤＡＰＣ（２０−４）（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）３２０μＬ、１０μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れて、上記同様にリポソームを作製した。
・ＤＭＰＣ：ＤＭＰＣ（１４−０）（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１１０μＬ、ＤＡＰＣ（２０−４）（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）３２０μＬ、１０μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れて、上記同様にリポソームを作製した。
・ＤＭＰＯＨ：ＤＭＰＯＨ（１４−０）（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１１０μＬ、ＤＡＰＣ（２０−４）（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）３２０μＬ、１０μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れて、上記同様にリポソームを作製した。
・ＤＭＰＳ：ＤＭＰＳ（１４−０）（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１１０μＬ、ＤＡＰＣ（２０−４）（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）３２０μＬ、１０μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れて、上記同様にリポソームを作製した。
【００８６】
リポソーム酸化の度合の測定については、硫酸銅（酸化剤）を２．５μＭになるように添加して、上記同様に行った。
【００８７】
結果を図４に示す。極性基としてエタノールアミン基を有するＤＭＰＥでは、酸化による電位変化が観察された。一方、エタノールアミン型ではない極性基を有するＤＭＰ、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＯＨ、ＤＭＰＳ（比較例）では、電位変化は観察されなかった。
【００８８】
以上より、酸化を評価可能なリポソームの作製には、エタノールアミン基を有するβ成分の添加が必須であることが示された。
【００８９】
（実施例２）
市販の抗酸化剤８種類について、実施例１にて作製したリポソームとヒトＬＤＬとで抗酸化能を比較した。
【００９０】
抗酸化剤として、グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｔｒｏｌｏｘ、カテキン、ルテオリン、アピゲニン、クエン酸、ダイゼイン及びナリンギンを用いた。
【００９１】
リポソームとして、実施例１で作製したＤＡＰＣ（２０−４）：ＤＭＰＥ（１４−０）＝７５：２５（重量比）のリポソームを用いた。ＬＤＬとして、２０歳代の健康な男女から採血により得られたＬＤＬを用いた（Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ２０１５；  ａｏｐ，Ｒｏｊｅｅｔ  Ｓｈｒｅｓｔｈａ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＤＯＩ  １０．１５１５／ｃｃｌｍ−２０１４−１０８８  Ｒｅｃｅｉｖｅｄ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ６，２０１４；ａｃｃｅｐｔｅｄ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １１，２０１５，ｐ１−ｐ１１に記載の条件下で超遠心法によりＬＤＬの分画を得た）。
【００９２】
リポソーム酸化及びＬＤＬ酸化の度合の測定については、硫酸銅（酸化剤）を５μＭになるように添加したことを除き、実施例１と同様に行った。
【００９３】
抗酸化能を以下の通り評価した。ＤＭＳＯに溶解した抗酸化剤を１００μＭになるようにリポソーム又はＬＤＬに添加した場合（Ａ）と、抗酸化剤の代わりにＤＭＳＯのみを添加した場合（Ｃ）と、の電位変化を測定し、酸化開始後１００００秒後の電位変化の比（Ａの電位変化／Ｃの電位変化×１００）を抗酸化能の測定値とした。
【００９４】
結果を図５に示す。図５において、横軸はＬＤＬに対する抗酸化能の測定値、縦軸はリポソームに対する抗酸化能の測定値を表している。ＬＤＬに対する抗酸化能と、作製したリポソームに対する抗酸化能と、では、Ｒ＝０．９５と良い相関が得られた。
【００９５】
以上より、抗酸化能についてリポソームとＬＤＬで良い相関が得られたことが示され、本実施例によるリポソームを、ＬＤＬの酸化抑制物質をスクリーニングするための、ＬＤＬの代替品として利用できることが示された。
【００９６】
（実施例３）
作製したリポソームの保存性について検討した。
【００９７】
リポソームとして、実施例２と同様のものを用いた。リポソーム作製後、１、８、３５、７２日後のリポソームに酸化剤（硫酸銅）を５μＭとなるように添加して、３７℃で０、４、８時間後の過酸化脂質量をＤＰＰＰ法（Ｋ．Ａｋａｓａｋａ，Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．  Ｏｈｒｕｉ  ａｎｄ  Ｈ．Ｍｅｇｕｒｏ，Ａｎａｌ  Ｌｅｔｔ．，２０，７３１−７４５，７９７−８０７（１９８７））により測定した。
【００９８】
結果を図６に示す。図６において、縦軸はＤＰＰＰによる過酸化脂質量、横軸はリポソーム作製後の経過日数を表している。また、横軸の“０”、“４”、“８”は酸化時間を表しており、酸化０時間ではＤＰＰＰの反応がなく（リポソーム酸化が進行していない状態）、酸化時間が４時間、８時間と長くなるに従いＤＰＰＰによる過酸化脂質量が増加する（リポソーム酸化が進行している状態）。リポソーム作製８日後では作製１日後に比して酸化の進行が若干速まる傾向が見られたものの、作製７２日後まで酸化の進行の程度に大きな差は見られなかった。
【００９９】
以上より、本実施例のリポソームでは、作製２か月後まで酸化の特性が維持されており、保存性に優れていることが示された。ヒト由来のＬＤＬの保管可能期間は１０日前後であるので、本実施例のリポソームでは、大幅に保存性が高まったことがわかる。
【０１００】
（実施例４）
異なる方法によって作製されたリポソームの酸化の度合について評価した。
【０１０１】
（ＤＡＰＣ（α成分）とＤＭＰＥ（β成分）とが重量比９８：２のリポソーム（Ａ液）の調製）
ＤＭＰＥ（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）３．６μＬ、ＤＡＰＣ（α成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１６０μＬ、３．６μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で１８時間以上乾燥させた。脱ガスした５μＭグリシンを含むＰＢＳ緩衝溶液を０．３９０ｍＬ添加して、上記同様にリポソームを作製し、Ａ液とした。電極による電位測定時、緩衝溶液で１．８８倍に希釈して使用した。
【０１０２】
（“ＤＭＰＥ液”の調製）
ＤＭＰＥ（β成分）（１０ｍｇ／ｍＬ）１６０μＬ、３．６μＬコレステロール（１ｍｇ／ｍＬ）をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で１８時間以上乾燥させた。脱ガスした５μＭグリシンを含むＰＢＳ緩衝溶液を０．３９０ｍＬ添加して、６０℃で超音波処理によりリポソーム（脂質懸濁液）を作製し、ＤＭＰＥ液とした。
【０１０３】
（“Ａ液＋ＤＭＰＥ溶液”の調製）
Ａ液８０μＬに緩衝溶液５５μＬ、ＤＭＰＥ液１５μＬを混合して、Ａ液＋ＤＭＰＥ溶液とした。
【０１０４】
リポソーム酸化の度合の測定については、硫酸銅（酸化剤）を５μＭになるように添加したことを除き、上記同様に行った。
【０１０５】
結果を図７に示す。図７中、「２＋ＤＭＰＥ」は“Ａ液＋ＤＭＰＥ溶液”を、「２」は“ＤＡＰＣ（α成分）とＤＭＰＥ（β成分）とが重量比９８：２のリポソーム（Ａ液）”を表す。「２＋ＤＭＰＥ」では、「２」に比して酸化を受けやすいことが示され、ＤＭＰＥを添加することにより、ＤＡＰＣ（α成分）とＤＭＰＥ（β成分）とが重量比９８：２のリポソームが、ＤＡＰＣ（α成分）とＤＭＰＥ（β成分）とが重量比８０：２０のリポソームとなり、酸化が促進されたことが明らかとなった。
【０１０６】
以上より、２種類の組成の異なるリポソーム溶液を混合する作製方法で作製されたリポソームについても、酸化を受けやすいことが示された。
【図１】
0006692089.tif 000021
【図２】
0006692089.tif 000022
【図３】
0006692089.tif 000023
【図４】
0006692089.tif 000024
【図５】
0006692089.tif 000025
【図６】
0006692089.tif 000026
【図７】
0006692089.tif 000027