(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩衝液を第１の水溶液として準備する水溶液準備工程と、
大気圧プラズマを前記第１の水溶液に照射して処理液とするプラズマ照射工程と、
ｉＰＳ細胞を分化させて分化細胞とする分化工程と、
前記ｉＰＳ細胞または前記分化細胞を前記処理液に浸漬する処理工程と、
を有し、
前記水溶液準備工程では、
前記第１の水溶液としてリン酸緩衝生理食塩水を用い、
前記プラズマ照射工程では、
単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、２．５×１０15ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以上１．２５×１０17ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以下であり、
前記単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、
Ｘ  ＝  Ｐ１  ×  Ｔ１  ／  Ｖ１
Ｘ  ：単位体積当たりのプラズマ密度時間積
Ｐ１：プラズマ発生領域でのプラズマ密度
Ｔ１：照射時間
Ｖ１：第１の水溶液の体積
を満たし、
前記処理工程は、
前記分化工程における前記ｉＰＳ細胞の分化の開始前から前記分化細胞への分化後までの間の期間に実施されること
を特徴とする分化細胞の生産方法。
【請求項２】
緩衝液を第１の水溶液として準備する水溶液準備工程と、
大気圧プラズマを前記第１の水溶液に照射して処理液とするプラズマ照射工程と、
ｉＰＳ細胞を分化させて分化細胞とする分化工程と、
前記ｉＰＳ細胞または前記分化細胞を前記処理液に浸漬する処理工程と、
を有し、
前記水溶液準備工程では、
前記第１の水溶液としてリン酸緩衝液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液のいずれかを用い、
前記プラズマ照射工程では、
単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、２．５×１０15ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以上１．２５×１０17ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以下であり、
前記単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、
Ｘ  ＝  Ｐ１  ×  Ｔ１  ／  Ｖ１
Ｘ  ：単位体積当たりのプラズマ密度時間積
Ｐ１：プラズマ発生領域でのプラズマ密度
Ｔ１：照射時間
Ｖ１：第１の水溶液の体積
を満たし、
前記処理工程は、
前記分化工程における前記ｉＰＳ細胞の分化の開始前から前記分化細胞への分化後までの間の期間に実施されること
を特徴とする分化細胞の生産方法。
【請求項３】
緩衝液を第１の水溶液として準備する水溶液準備工程と、
大気圧プラズマを前記第１の水溶液に照射して処理液とするプラズマ照射工程と、
ｉＰＳ細胞を分化させて分化細胞とする分化工程と、
前記ｉＰＳ細胞または前記分化細胞を前記処理液に浸漬する処理工程と、
を有し、
前記水溶液準備工程では、
前記第１の水溶液として、塩化ナトリウムと、塩化カリウムと、リン酸二水素カリウムと、リン酸水素二ナトリウムと、を含有するものを用い、
前記プラズマ照射工程では、
単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、２．５×１０15ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以上１．２５×１０17ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以下であり、
前記単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、
Ｘ  ＝  Ｐ１  ×  Ｔ１  ／  Ｖ１
Ｘ  ：単位体積当たりのプラズマ密度時間積
Ｐ１：プラズマ発生領域でのプラズマ密度
Ｔ１：照射時間
Ｖ１：第１の水溶液の体積
を満たし、
前記処理工程は、
前記分化工程における前記ｉＰＳ細胞の分化の開始前から前記分化細胞への分化後までの間の期間に実施されること
を特徴とする分化細胞の生産方法。
【請求項４】
請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載の分化細胞の生産方法において、
前記処理工程では、
前記ｉＰＳ細胞と分化後の細胞とが混合している状態で前記処理液に浸漬すること
を特徴とする分化細胞の生産方法。
【請求項５】
培養液を第１の水溶液として準備する水溶液準備工程と、
大気圧プラズマを前記第１の水溶液に照射して処理液とするプラズマ照射工程と、
ｉＰＳ細胞を分化させて分化細胞とする分化工程と、
前記ｉＰＳ細胞または前記分化細胞を前記処理液に浸漬する処理工程と、
を有し、
前記プラズマ照射工程では、
単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、２．５×１０15ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以上１．２５×１０17ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以下であり、
前記単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、
Ｘ  ＝  Ｐ１  ×  Ｔ１  ／  Ｖ１
Ｘ  ：単位体積当たりのプラズマ密度時間積
Ｐ１：プラズマ発生領域でのプラズマ密度
Ｔ１：照射時間
Ｖ１：第１の水溶液の体積
を満たし、
前記処理工程は、
前記分化工程における前記ｉＰＳ細胞の分化の開始前から前記分化細胞への分化後までの間の期間に実施され、
前記処理工程では、
前記処理液を希釈し、
前記ｉＰＳ細胞と分化後の細胞とが混合している状態で前記処理液に浸漬すること
を特徴とする分化細胞の生産方法。
【請求項６】
請求項５に記載の分化細胞の生産方法において、
前記培養液は、
ＤＭＥＭであり、
前記処理液の希釈倍率は、
１００００細胞あたり１倍以上４倍以下であること
を特徴とする分化細胞の生産方法。
【請求項７】
請求項５に記載の分化細胞の生産方法において、
前記培養液は、
ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）であり、
前記処理液の希釈倍率は、
１００００細胞あたり６倍以上３０倍以下であること
を特徴とする分化細胞の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書の技術分野は、分化細胞の生産方法およびｉＰＳ細胞の未分化細胞の除去方法に関する。さらに詳細には、ｉＰＳ細胞から未分化細胞を好適に除去することを図った分化細胞の生産方法およびｉＰＳ細胞の未分化細胞の除去方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）は、人工多能性幹細胞または誘導多能性幹細胞と呼ばれる。ｉＰＳ細胞は、線維芽細胞などの体細胞へ数種類の転写因子遺伝子を導入することにより、分化多能性を獲得した細胞である。ｉＰＳ細胞の分化多能性は、ＥＳ細胞の分化多能性と同等である。つまり、ｉＰＳ細胞は、生体を構成する全ての臓器や組織へ分化する能力を有している。よって、臓器等を再生する再生医療において極めて有効な技術として期待されている。
【０００３】
従来から、臓器や組織へ分化する分化多能性細胞としてＥＳ細胞が存在する。ＥＳ細胞は、生命の起源となる胚から得られる。そのため、その取扱いには倫理上の問題がある。また、ＥＳ細胞から分化させた組織は、患者に移植する段階で拒絶反応を引き起こすおそれがある。つまり、免疫学上の問題がある。ｉＰＳ細胞は、これらの倫理上の問題および免疫学上の問題を解決することが期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１２６１４６号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，１２（１）ｐｐ１２７−１３７，２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
例えば、ｉＰＳ細胞から臓器を生産しようとする場合には、多数のｉＰＳ細胞を含む未分化ｉＰＳ細胞群を特定の臓器や組織の機能を発揮する細胞群に分化させる。未分化ｉＰＳ細胞群を分化させると、一般に、分化細胞群と、残留未分化ｉＰＳ細胞群と、が生じる。つまり、未分化ｉＰＳ細胞群のそれぞれの未分化ｉＰＳ細胞を分化させようとすると、分化しない残留未分化ｉＰＳ細胞群が残留してしまうのである。そして、この残留未分化ｉＰＳ細胞群は、腫瘍化するおそれがある。
【０００７】
そのため、未分化ｉＰＳ細胞群を分化させる際に、残留する未分化ｉＰＳ細胞を除去する技術が研究開発されてきている。例えば、抗体やレクチンなどの標的認識分子を利用して標的分子を蛍光ラベルし、蛍光強度差を指標にしてセルソーターを用いて残留未分化ｉＰＳ細胞を分離する方法がある。または、磁気ビーズで標的分子をラベルし、磁力によって残留未分化ｉＰＳ細胞を分離する方法がある。または、標的認識分子に薬剤などを結合して、細胞選択的に細胞死を誘導する方法がある（特許文献１参照）。しかし、これらの方法では、特異的分子を予め調製する必要がある。そのため、これらの方法は、高価で煩雑である。また、セルソーターを用いるため、処理時間がかかりすぎる。また、３次元細胞塊の状態で分化させた細胞への適用が困難である。磁気分離についても同様の問題がある。
【０００８】
また、未分化ｉＰＳ細胞と分化ｉＰＳ細胞との栄養要求性の違いを利用して分離する方法がある（非特許文献１参照）。しかし、栄養要求性を利用する方法では、特定の細胞に限定される。また、分化誘導培地として選択培地を用いる。したがって、分化効率を最大限に高めることが出来ず、十分な数の分化細胞が得られない可能性がある。
【０００９】
本明細書の技術は、前述した従来の技術が有する問題点を解決するためになされたものである。すなわちその課題とするところは、簡易かつ低コストに未分化ｉＰＳ細胞を除去することを図った分化細胞の生産方法およびｉＰＳ細胞の未分化細胞の除去方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の態様における分化細胞の生産方法は、緩衝液を第１の水溶液として準備する水溶液準備工程と、大気圧プラズマを第１の水溶液に照射して処理液とするプラズマ照射工程と、ｉＰＳ細胞を分化させて分化細胞とする分化工程と、ｉＰＳ細胞または分化細胞を処理液に浸漬する処理工程と、を有する。水溶液準備工程では、第１の水溶液としてリン酸緩衝生理食塩水を用いる。プラズマ照射工程では、単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、２．５×１０15ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以上１．２５×１０17ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以下である。単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、
Ｘ  ＝  Ｐ１  ×  Ｔ１  ／  Ｖ１
Ｘ  ：単位体積当たりのプラズマ密度時間積
Ｐ１：プラズマ発生領域でのプラズマ密度
Ｔ１：照射時間
Ｖ１：第１の水溶液の体積
を満たす。処理工程は、分化工程におけるｉＰＳ細胞の分化の開始前から分化細胞への分化後までの間の期間に実施される。
【００１１】
この分化細胞の生産方法は、未分化ｉＰＳ細胞群を死滅させるとともに分化細胞を死滅させない。つまり、未分化ｉＰＳ細胞を選択的に死滅させることができる。また、この分化細胞の生産方法は、第１の水溶液にプラズマを照射した処理液に未分化ｉＰＳ細胞を浸漬するという簡単な手順により、分化細胞を死滅させることなく未分化ｉＰＳ細胞を死滅させることができる。また、大量の細胞に対して一度に処理することができる。したがって、この分化細胞の生産方法では、簡易に腫瘍化を防止しつつｉＰＳ細胞を分化させることができる。
【００１２】
第２の態様における分化細胞の生産方法は、緩衝液を第１の水溶液として準備する水溶液準備工程と、大気圧プラズマを第１の水溶液に照射して処理液とするプラズマ照射工程と、ｉＰＳ細胞を分化させて分化細胞とする分化工程と、ｉＰＳ細胞または分化細胞を処理液に浸漬する処理工程と、を有する。水溶液準備工程では、第１の水溶液としてリン酸緩衝液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液のいずれかを用いる。プラズマ照射工程では、単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、２．５×１０15ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以上１．２５×１０17ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以下である。単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、
Ｘ  ＝  Ｐ１  ×  Ｔ１  ／  Ｖ１
Ｘ  ：単位体積当たりのプラズマ密度時間積
Ｐ１：プラズマ発生領域でのプラズマ密度
Ｔ１：照射時間
Ｖ１：第１の水溶液の体積
を満たす。処理工程は、分化工程におけるｉＰＳ細胞の分化の開始前から分化細胞への分化後までの間の期間に実施される。
【００１３】
第３の態様における分化細胞の生産方法は、緩衝液を第１の水溶液として準備する水溶液準備工程と、大気圧プラズマを第１の水溶液に照射して処理液とするプラズマ照射工程と、ｉＰＳ細胞を分化させて分化細胞とする分化工程と、ｉＰＳ細胞または分化細胞を処理液に浸漬する処理工程と、を有する。水溶液準備工程では、第１の水溶液として、塩化ナトリウムと、塩化カリウムと、リン酸二水素カリウムと、リン酸水素二ナトリウムと、を含有するものを用いる。プラズマ照射工程では、単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、２．５×１０15ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以上１．２５×１０17ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以下である。単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、
Ｘ  ＝  Ｐ１  ×  Ｔ１  ／  Ｖ１
Ｘ  ：単位体積当たりのプラズマ密度時間積
Ｐ１：プラズマ発生領域でのプラズマ密度
Ｔ１：照射時間
Ｖ１：第１の水溶液の体積
を満たす。処理工程は、分化工程におけるｉＰＳ細胞の分化の開始前から分化細胞への分化後までの間の期間に実施される。
【００１４】
第４の態様における分化細胞の生産方法においては、処理工程では、ｉＰＳ細胞と分化後の細胞とが混合している状態で処理液に浸漬する。
【００１５】
第５の態様における分化細胞の生産方法は、培養液を第１の水溶液として準備する水溶液準備工程と、大気圧プラズマを第１の水溶液に照射して処理液とするプラズマ照射工程と、ｉＰＳ細胞を分化させて分化細胞とする分化工程と、ｉＰＳ細胞または分化細胞を処理液に浸漬する処理工程と、を有する。プラズマ照射工程では、単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、２．５×１０15ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以上１．２５×１０17ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以下である。単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、
Ｘ  ＝  Ｐ１  ×  Ｔ１  ／  Ｖ１
Ｘ  ：単位体積当たりのプラズマ密度時間積
Ｐ１：プラズマ発生領域でのプラズマ密度
Ｔ１：照射時間
Ｖ１：第１の水溶液の体積
を満たす。処理工程は、分化工程におけるｉＰＳ細胞の分化の開始前から分化細胞への分化後までの間の期間に実施される。処理工程では、処理液を希釈し、ｉＰＳ細胞と分化後の細胞とが混合している状態で処理液に浸漬する。
【００１６】
第６の態様における分化細胞の生産方法において、培養液は、ＤＭＥＭである。処理液の希釈倍率は、１００００細胞あたり１倍以上４倍以下である。
【００１７】
第７の態様における分化細胞の生産方法において、培養液は、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）である。処理液の希釈倍率は、１００００細胞あたり６倍以上３０倍以下である。
【発明の効果】
【００１８】
本明細書では、簡易かつ低コストに未分化ｉＰＳ細胞を除去することを図った分化細胞の生産方法およびｉＰＳ細胞の未分化細胞の除去方法が提供されている。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】プラズマ照射装置のガス噴出口を走査するロボットアームの構成を説明するための概念図である。
【図２】図２．Ａは第１のプラズマ照射装置の構成を示す断面図であり、図２．Ｂは電極の形状を示す図である。
【図３】図３．Ａは第２のプラズマ照射装置の構成を示す断面図であり、図３．Ｂはプラズマ領域の長手方向に垂直な断面における部分断面図である。
【図４】実験Ａにおける処理液（ＡＫ０３）の希釈倍率とｉＰＳ細胞の生存率との関係を示すグラフである。
【図５】実験Ａにおける処理液（ＡＫ０３）の希釈倍率とヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の生存率との関係を示すグラフである。
【図６】実験Ａにおける処理液（ＡＫ０３）の処理時間を変えた場合における処理液（ＡＫ０３）の希釈倍率とｉＰＳ細胞の生存率との関係を示すグラフである。
【図７】実験Ｂにおける実験方法を示す概念図である。
【図８】実験Ｂにおける処理液（ＡＫ０３）で６時間処理した後の細胞を示す顕微鏡写真である。
【図９】実験Ｂにおける処理液（ＡＫ０３）で６時間処理した後の染色した細胞を示す顕微鏡写真である。
【図１０】実験Ｂにおける処理液（ＡＫ０３）で６時間処理した後のＰＩ染色した細胞を示す顕微鏡写真である。
【図１１】実験Ｃにおける実験方法を示す概念図である。
【図１２】実験Ｃにおける実験結果を示す顕微鏡写真である。
【図１３】実験Ｃにおける処理液による処理から２４時間経過後の細胞を示す顕微鏡写真である。
【図１４】実験Ｄにおける処理液（ＤＭＥＭ）の希釈倍率とｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の生存率との関係を示すグラフである。
【図１５】実験Ｅにおける処理液（ＰＢＳ）の希釈倍率とｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の生存率との関係を示すグラフである。
【図１６】実験Ｆにおける５０００細胞に対する処理液（ＡＫ０３）の希釈倍率とｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の生存率との関係を示すグラフである。
【図１７】実験Ｆにおける２００００細胞に対する処理液（ＡＫ０３）の希釈倍率とｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の生存率との関係を示すグラフである。
【図１８】実験Ｆにおける５００００細胞に対する処理液（ＡＫ０３）の希釈倍率とｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の生存率との関係を示すグラフである。
【図１９】実験Ｇにおいて細胞を処理液に浸漬する処理時間を１分とした場合の細胞の生存率を示すグラフである。
【図２０】実験Ｇにおいて細胞を処理液に浸漬する処理時間を３分とした場合の細胞の生存率を示すグラフである。
【図２１】実験Ｇにおいて細胞を処理液に浸漬する処理時間を５分とした場合の細胞の生存率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、具体的な実施形態について、分化細胞の生産方法およびｉＰＳ細胞の未分化細胞の除去方法を例に挙げて図を参照しつつ説明する。
【００２１】
（第１の実施形態）
本実施形態では、プラズマ処理された水溶液中に未分化ｉＰＳ細胞群を浸漬する。これにより、未分化ｉＰＳ細胞群における残留未分化ｉＰＳ細胞を選択的に死滅させる。そのため、まずは、プラズマ装置について説明する。
【００２２】
１．処理液製造装置
１−１．処理液製造装置の構成
本実施形態の処理液製造装置ＰＭは、図１に示すように、プラズマ照射部Ｐ１と、アームロボットＭ１とを有している。プラズマ照射装置Ｐ１は、プラズマを発生させるとともに、そのプラズマを水溶液に向けて照射するためのものである。プラズマ照射装置Ｐ１には、後述するように、２種類の方式（第１のプラズマ照射装置１００および第２のプラズマ照射装置１１０）がある。そして、いずれの方式を用いてもよい。
【００２３】
アームロボットＭ１は、図１に示すように、プラズマ照射装置Ｐ１の位置をｘ軸、ｙ軸、ｚ軸方向のそれぞれの方向に移動させることができるようになっている。なお、説明の便宜上、プラズマを照射する向きを−ｚ軸方向としている。これにより、溶液の液面と、プラズマ照射部Ｐ１との間の距離を調整することができる。また、この処理液製造装置ＰＭは、予めプラズマ照射時間を設定することにより、その時間だけプラズマを照射することができる。
【００２４】
１−２．第１のプラズマ照射装置
図２．Ａはプラズマ照射装置１００の概略構成を示す断面図である。ここで、プラズマ照射装置１００は、プラズマを点状に噴出する第１のプラズマ照射装置である。図２．Ｂは、図２．Ａのプラズマ照射装置１００の電極２ａ、２ｂの形状の詳細を示す図である。
【００２５】
プラズマ照射装置１００は、筐体部１０と、電極２ａ、２ｂと、電圧印加部３と、を有している。筐体部１０は、アルミナ（Ａｌ2 Ｏ3 ）を原料とする焼結体から成るものである。そして、筐体部１０の形状は、筒形状である。筐体部１０の内径は２〜３ｍｍである。筐体部１０の厚みは０．２〜０．３ｍｍである。筐体部１０の長さは、例えば２５ｃｍである。筐体部１０の両端には、ガス導入口１０ｉと、ガス噴出口１０ｏとが形成されている。ガス導入口１０ｉは、プラズマを発生させるためのガスを導入するためのものである。ガス噴出口１０ｏは、プラズマを筐体部１０の外部に照射するための照射部である。なお、ガスの移動する向きは、図中の矢印の向きである。
【００２６】
電極２ａ、２ｂは、対向して配置されている対向電極対である。電極２ａ、２ｂの対向面方向の長さは、筐体部１０の内径より小さい。例えば１ｍｍ程度である。電極２ａ、２ｂには、図２．Ｂに示すように、対向面のそれぞれに凹部（ホロー）Ｈが多数形成されている。そのため、電極２ａ、２ｂの対向面は、微細な凹凸形状となっている。なお、この凹部Ｈの深さは、０．５ｍｍ程度である。
【００２７】
電極２ａは、筐体部１０の内部であってガス導入口１０ｉの近傍に配置されている。電極２ｂは、筐体部１０の内部であってガス噴出口１０ｏの近傍に配置されている。そのため、プラズマ照射装置１００では、電極２ａの対向面の反対側からガスを導入するとともに、電極２ｂの対向面の反対側にガスを噴出するようになっている。そして、電極２ａ、２ｂ間の距離は、２４ｃｍである。電極２ａ、２ｂ間の距離は、これより小さい距離であってもよい。
【００２８】
電圧印加部３は、電極２ａ、２ｂ間に交流電圧を印加するためのものである。電圧印加部３は、商用交流電圧である、６０Ｈｚ、１００Ｖを用いて９ｋＶに昇圧するとともに、電極２ａ、２ｂ間に電圧を印加する。
【００２９】
ガス導入口１０ｉからアルゴンを導入するとともに、電圧印加部３により、電極２ａ、２ｂ間に電圧を印加すると、筐体部１０の内部にプラズマが発生する。図２．Ａの斜線で示すように、プラズマが発生する領域をプラズマ発生領域Ｐとする。プラズマ発生領域Ｐは、筐体部１０に覆われている。
【００３０】
１−３．第２のプラズマ照射装置
図３．Ａはプラズマ照射装置１１０の概略構成を示す断面図である。ここで、プラズマ照射装置１１０は、プラズマを線状に噴出する第２のプラズマ照射装置である。図３．Ｂは、図３．Ａのプラズマ照射装置１１０のプラズマ領域Ｐの長手方向に垂直な断面における部分断面図である。
【００３１】
プラズマ照射装置１１０は、筐体部１１と、電極２ａ、２ｂと、電圧印加部３と、を有している。筐体部１１は、アルミナ（Ａｌ2 Ｏ3 ）を原料とする焼結体から成るものである。筐体部１１の両端には、ガス導入口１１ｉと、多数のガス噴出口１１ｏとが形成されている。ガス導入口１１ｉは、図３．Ａの左右方向を長手方向とするスリット形状をしている。ガス導入口１１ｉからプラズマ領域Ｐの直上までのスリット幅（図３．Ｂの左右方向の幅）は１ｍｍである。
【００３２】
ガス噴出口１１ｏは、プラズマを筐体部１１の外部に照射するための照射部である。ガス噴出口１１ｏは、円筒形状もしくはスリット形状である。円筒形状の場合のガス噴出口１１ｏは、プラズマ領域の長手方向に沿って一直線状に形成されている。ガス噴出口１１ｏの内径は１〜２ｍｍの範囲内である。また、スリット形状の場合には、ガス噴出口１１ｏのスリット幅を１ｍｍ以下とすることが好ましい。これにより、安定したプラズマが形成される。ガス導入口１１ｉは、電極２ａと電極２ｂとを結ぶ線と交差する向きにガスを導入するようになっている。
【００３３】
電極２ａ、２ｂおよび電圧印加部３については、図１に示したプラズマ照射装置１００と同じものである。そして、同様に、商用交流電圧を用いて、電極２ａ、２ｂ間に電圧を印加する。これにより、プラズマを一直線状に噴出することができる。
【００３４】
また、この一直線状にプラズマを噴出するプラズマ照射装置１１０を図３．Ｂの左右方向に列状に並べて配置すれば、プラズマをある長方形の領域にわたって平面的に噴出することができる。
【００３５】
２．プラズマ照射装置により発生されるプラズマ
プラズマ照射装置１００、１１０により発生されるプラズマは、非平衡大気圧プラズマである。ここで、大気圧プラズマとは、０．５気圧以上２．０気圧以下の範囲内の圧力であるプラズマをいう。
【００３６】
本実施形態では、プラズマ発生ガスとして、主にＡｒガスを用いる。プラズマ照射装置１００、１１０により発生されるプラズマの内部では、もちろん、電子と、Ａｒイオンとが生成されている。そして、Ａｒイオンは、紫外線を発生する。また、このプラズマは大気中に放出されているため、酸素ラジカルや窒素ラジカル等を発生させる。
【００３７】
このプラズマのプラズマ密度は、１×１０14ｃｍ-3以上１×１０17ｃｍ-3以下の範囲内である。なお、誘電体バリア放電により発生されるプラズマにおけるプラズマ密度は、１×１０11ｃｍ-3〜１×１０13ｃｍ-3程度である。したがって、プラズマ照射装置１００、１１０により発生されるプラズマのプラズマ密度は、誘電体バリア放電により発生されるプラズマのプラズマ密度に比べて、３桁程度大きい。したがって、このプラズマの内部では、より多くのＡｒイオンが生成する。そのため、ラジカルや、紫外線の発生量も多い。なお、このプラズマ密度は、プラズマ内部の電子密度にほぼ等しい。
【００３８】
そして、このプラズマ発生時におけるプラズマ温度は、およそ１０００Ｋ〜２５００Ｋの範囲内である。また、このプラズマにおける電子温度は、ガスの温度に比べて大きい。しかも、電子の密度が１×１０14ｃｍ-3以上１×１０17ｃｍ-3以下の範囲内の程度であるにもかかわらず、ガスの温度はおよそ１０００Ｋ〜２５００Ｋである。このプラズマの温度は、プラズマの発生しているプラズマ領域Ｐでの温度である。したがって、プラズマの条件や、ガス噴出口から水面までの距離を異なる条件とすることにより、水溶液の位置でのプラズマ温度を室温程度とすることができる。
【００３９】
３．処理液
本実施形態の処理液は、原材料である第１の水溶液に非平衡大気圧プラズマを照射した第２の水溶液である。第１の水溶液の溶媒は、水系溶媒である。第１の水溶液として、培養液を用いることができる。培養液として、例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標：味の素社製）、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩが挙げられる。もちろん、それ以外の培養液を用いてもよい。そして、表１に示すように、ＤＭＥＭには、グルコース等の糖が含まれている。ここで、培養成分とは、細胞等を培養するための培養液に含まれる成分である。例えば、表１（ＤＭＥＭ成分）に記載されているものである。
【００４０】
［表１］
塩化カルシウム
硝酸第二鉄・９Ｈ2 Ｏ
硫酸マグネシウム（無水）
塩化カリウム
炭酸水素ナトリウム
塩化ナトリウム
リン酸一ナトリウム（無水）（リン酸二水素ナトリウム）
Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ
Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ
Ｌ−グルタミン
グリシン
Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ2 Ｏ
Ｌ−イソロイシン
Ｌ−ロイシン
Ｌ−リジン・ＨＣｌ
Ｌ−メチオニン
Ｌ−フェニルアラニン
Ｌ−セリン
Ｌ−スレオニン
Ｌ−トリプトファン
Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ
Ｌ−バリン
塩化コリン
葉酸
ｍｙｏ−イノシトール
ナイアシンアミド
Ｄ−パントテン酸
ピリドキシン・ＨＣｌ
リボフラビン
チアミン・ＨＣｌ
Ｄ−グルコース
フェノールレッド・Ｎａ
ピルビン酸ナトリウム
【００４１】
４．処理液の製造方法
４−１．水溶液準備工程
まず、第１の水溶液を準備する。第１の水溶液とは、プラズマを照射する前の水溶液のことをいう。第１の水溶液は、培養液である。つまり、水に培養成分を添加した培養液を準備する。この段階における培養液のｐＨは、ほぼ７である。例えば、５．５以上８．５以下の範囲内である。
【００４２】
４−２．プラズマ照射工程
次に、処理液製造装置ＰＭによりプラズマ発生領域に発生させた大気圧プラズマを第１の水溶液（培養液）に照射する。プラズマを照射する際における液面とプラズマ噴出口との間の距離は、例えば、１ｃｍである。また、この距離は、０．１ｃｍ以上３ｃｍ以下の範囲内で変えてもよい。このプラズマのプラズマ密度は、１×１０14ｃｍ-3以上１×１０17ｃｍ-3以下の範囲内である。そして、このプラズマにおけるプラズマ温度は、およそ１０００Ｋ〜２５００Ｋの範囲内である。ただし、このプラズマ温度は、液面では、室温程度（３００Ｋ程度）まで下げることもできる。これらのプラズマ条件を表２に示す。これらの条件は、あくまで一例である。
【００４３】
［表２］
条件                          数値範囲
液面−噴出口距離            ０．１ｃｍ以上                ３ｃｍ以下
プラズマ密度          １×１０14ｃｍ-3以上      １×１０17ｃｍ-3以下
プラズマ温度                １０００Ｋ以上            ２５００Ｋ以下
【００４４】
単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、２．５×１０15ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以上１．２５×１０17ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以下であるとよい。単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、次式で表される。
Ｘ  ＝  Ｐ１  ×  Ｔ１  ／  Ｖ１
Ｘ  ：単位体積当たりのプラズマ密度時間積
Ｐ１：プラズマ発生領域でのプラズマ密度
Ｔ１：照射時間
Ｖ１：第１の水溶液（培養液）の体積
ここで、単位体積当たりのプラズマ密度時間積とは、水溶液の単位体積当たりに、プラズマ生成物を照射した量である。プラズマ密度時間積は、プラズマ発生領域におけるプラズマ密度とプラズマを照射する時間（照射時間）との積である。
【００４５】
このように、第１の水溶液（培養液）にプラズマを照射することにより、第１の水溶液（培養液）を第２の水溶液（処理液）にする。プラズマ照射前の第１の水溶液（培養液）のｐＨは、７に近い。例えば、５．５以上８．５以下の範囲内である。一般に、培養液は、ｐＨを７付近に保持しようとする物質を含んでいる。例えば、炭酸水素イオンである。そのため、プラズマを照射する前後で、この水溶液のｐＨはほとんど変化しない。プラズマ照射後の第２の水溶液（処理液）のｐＨは、７に近い。例えば、５．５以上８．５以下の範囲内である。
【００４６】
５．未分化ｉＰＳ細胞の除去方法
本実施形態の未分化ｉＰＳ細胞の除去方法は、培養液を第１の水溶液として準備する水溶液準備工程と、大気圧プラズマを第１の水溶液に照射して処理液とするプラズマ照射工程と、ｉＰＳ細胞を分化させて分化細胞とする分化工程と、ｉＰＳ細胞または分化細胞を処理液に浸漬する処理工程と、を有する。
【００４７】
５−１．水溶液準備工程
まず、第１の水溶液（培養液）を準備する。
【００４８】
５−２．プラズマ照射工程
次に、第１の水溶液（培養液）に非平衡大気圧プラズマを照射する。そのプラズマの条件は、表２に示したとおりである。これにより、第１の水溶液（培養液）は、第２の水溶液（処理液）となる。
【００４９】
５−３．第１の処理工程
次に、第２の水溶液（処理液）に未分化ｉＰＳ細胞を浸漬する。第２の水溶液（処理液）は、分化しない未分化ｉＰＳ細胞のみを死滅させ、分化した分化細胞についてはほとんど死滅させない。つまり、分化しない未分化ｉＰＳ細胞のみが選択的に死滅する。
【００５０】
この方法により、既に分化した分化細胞については死滅させずに、未だ分化していない未分化ｉＰＳ細胞を選択的に死滅させることができる。このように、残留する未分化ｉＰＳ細胞群を死滅させることにより、残留する未分化ｉＰＳ細胞群の腫瘍化を防止することができる。
【００５１】
このように、処理工程は、ｉＰＳ細胞を分化細胞に分化させる分化工程におけるｉＰＳ細胞の分化の開始前に実施される。
【００５２】
６．変形例
６−１．第２の処理工程（分化させる途中で処理）
本実施形態の第１の処理工程に加えて、第２の処理工程を実施してもよい。つまり、この分化細胞の生産方法は、処理工程の後に、ｉＰＳ細胞の未分化細胞を培養して分化細胞に分化させる分化工程を有する。分化工程は、プラズマ照射後の培養液に分化させる途中のｉＰＳ細胞を浸漬する第２の処理工程を有する。これにより、分化の途中で残留しているｉＰＳ細胞の未分化細胞を好適に死滅させることができる。
【００５３】
６−２．冷凍工程
処理液については、冷蔵庫で冷凍してもよい。その場合には、本実施形態の未分化ｉＰＳ細胞の処理方法は、処理液を冷凍する冷凍工程を有する。具体的には、冷凍庫に保存する。冷凍庫として、生物実験用冷蔵庫（例えば、日本フリーザー株式会社製のバイオフリーザーＧＳ−５２０３ＫＨＣ）を用いることができる。冷凍温度は、−１９６℃以上０℃以下である。冷凍温度は、好ましくは、−１９６℃以上−１０°以下である。より好ましくは、−１５０℃以上−２０℃以下である。さらに好ましくは、−８０℃以上―３０℃以下である。
【００５４】
６−３．培養成分添加工程
プラズマ照射工程の後に、第２の水溶液に培養成分を添加して第３の水溶液としてもよい。この第３の水溶液も処理液である。例えば、プラズマ照射工程では、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）のＡ液にプラズマを照射する。次に、培養成分添加工程において、プラズマ照射後のＡ液にプラズマを照射していないＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）のＢ液およびＣ液を混合してもよい。
【００５５】
７．本実施形態のまとめ
以上詳細に説明したように、本実施形態に係る処理液は、培養液にプラズマを照射したものである。もしくは、特定の培養成分を溶質とする水溶液にプラズマを照射し、その後に培養成分を添加したものである。この処理液は、ｉＰＳ細胞群のうち未分化ｉＰＳ細胞のみを選択的に死滅させることができる。ただし、処理液の濃度については、好適に調整することが好ましい。
【００５６】
（第２の実施形態）
１．処理工程
第２の実施形態について説明する。第２の実施形態では、処理液による処理工程を未分化ｉＰＳ細胞群を分化させている途中または後に実施する。つまり、この分化細胞の生産方法は、培養液を準備する水溶液準備工程と、大気圧プラズマを培養液に照射して処理液とするプラズマ照射工程と、ｉＰＳ細胞を分化させて分化細胞とする分化工程と、分化工程の途中または後に、ｉＰＳ細胞または分化細胞を処理液に浸漬する処理工程と、を有する。これにより、未分化ｉＰＳ細胞群のうち、既に分化している細胞を死滅させることなく、残留している未分化ｉＰＳ細胞を死滅させることができる。
【００５７】
つまり、本実施形態の分化細胞の生産方法は、第１の水溶液を準備する水溶液準備工程と、大気圧プラズマを第１の水溶液に照射して処理液とするプラズマ照射工程と、ｉＰＳ細胞を分化させて分化細胞とする分化工程と、ｉＰＳ細胞または分化細胞を処理液に浸漬する処理工程と、を有する。
【００５８】
第１の実施形態から第２の実施形態までに説明したように、処理工程は、分化工程におけるｉＰＳ細胞の分化の途中に実施されてもよい。処理工程は、分化工程における分化細胞への分化後に実施されてもよい。つまり、処理工程は、分化工程におけるｉＰＳ細胞の分化の開始前から分化細胞への分化後までの間の期間に実施されればよい。
【００５９】
（第３の実施形態）
第３の実施形態について説明する。第１の実施形態および第２の実施形態では水溶液として培養液を用いた。しかし、第３の実施形態では、緩衝液を用いる。
【００６０】
１．緩衝液
第３の実施形態では、プラズマを照射させる水溶液として緩衝液を用いる。緩衝液とは、水素イオン濃度に対する緩衝作用のある水溶液のことをいう。例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【００６１】
２．処理液の製造方法
２−１．水溶液準備工程
まず、第１の水溶液を準備する。本実施形態の第１の水溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。この段階における培養液のｐＨは、ほぼ７である。
【００６２】
２−２．プラズマ照射工程
次に、処理液製造装置ＰＭによりプラズマ発生領域に発生させた大気圧プラズマを第１の水溶液（リン酸緩衝生理食塩水）に照射する。プラズマ条件は、例えば、表２に示したとおりである。
【００６３】
これまで説明した第１の実施形態から第３の実施形態までに説明したように、第１の水溶液は、緩衝液または培養液である。また、第１の水溶液として、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）と、塩化カリウム（ＫＣｌ）と、リン酸二水素カリウム（ＫＨ2 ＰＯ4 ）と、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）と、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2 ＰＯ4 ）と、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3 ）と、のうちの少なくとも１種類を含む溶質を水に添加したものを用いればよい。また、ＰＢＳ以外の緩衝液について用いてもよい。例えば、リン酸緩衝液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液等が挙げられる。
【実施例】
【００６４】
１．実験Ａ
１−１．実験方法
１−１−１．処理液の作製
まず、処理液を作製した。本実験では、直径６０ｍｍのディッシュを用いた。この穴は、非貫通孔である。そのため、穴の内部に溶液を入れることができるようになっている。まず、プレートの穴に８ｍＬの培養液を入れる。ここで用いた培養液は、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）のＡＫ０３である。ここでは、ＡＫ０３のＡ液をプレートに入れる。
【００６５】
次に、処理液製造装置ＰＭを用いて、大気圧プラズマを培養液（ＡＫ０３のＡ液）に照射する。その際、プラズマ発生領域を培養液に接触させない位置に培養液の液面を配置した。そして、処理液製造装置ＰＭの対向電極を培養液の外部であって培養液の液面を挟まない位置に対向して配置した。その状態で、大気圧プラズマを培養液に照射した。このように、プラズマ発生領域は、培養液に接触していないが、プラズマ中で生成される種々のラジカルが培養液に照射される。プラズマがプレートにおける培養液の上方の大気を押し出すようにする。そのため、プラズマ照射時間中には、培養液は大気に触れることがほとんどない。これにより、第２の水溶液（処理液）が作製された。
【００６６】
そのプラズマの条件を、表３に示す。プラズマを発生させるためのガスとしてアルゴンガスのみを用いた。ガスの流量は、２．０ｓｌｍであった。また、プラズマ噴出口と液面との間の距離は、３ｍｍであった。そして、プラズマ照射時間は、５分であった。また、プラズマ発生領域におけるプラズマ密度は、２×１０16ｃｍ-3であった。第１の水溶液の量は８ｍＬであった。単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、７．５×１０17ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1であった。
【００６７】
［表３］
ガスの流量                            ２．０ｓｌｍ
プラズマ噴出口と液面との間の距離      ３ｍｍ
プラズマ照射時間                      ５分
プラズマ密度（発生時）                ２×１０16ｃｍ-3
水溶液の量                            ８ｍＬ
【００６８】
次に、プラズマ照射後のＡＫ０３のＡ液に、プラズマを照射していないＡＫ０３のＢ液およびＣ液を混合する。これにより、第３の水溶液（処理液）が作製された。
【００６９】
１−１−２．未分化ｉＰＳ細胞の培養
ここで、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルにｉＰＳ細胞とヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）とのいずれか一方を播種する。ｉＰＳ細胞については２４時間培養した。ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）については２４時間培養した。これにより、それぞれの細胞の数を１．０×１０4 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとした。
【００７０】
１−１−３．未分化ｉＰＳ細胞への処理
次に、処理液を未分化ｉＰＳ細胞の培地またはヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培地に供給する。供給量は、１ウェル当たり１５０μＬである。ここで、処理液については、１倍、２倍、４倍等に薄めたものを用いる。そして、処理液による処理時間は、２４時間であった。
【００７１】
１−２．実験結果
図４は、処理液の希釈倍率とｉＰＳ細胞の生存率との関係を示すグラフである。図４の横軸は、処理液の希釈倍率である。図４の縦軸は、ｉＰＳ細胞の生存率である。処理液の処理時間は２４時間である。図４に示すように、希釈倍率が１６倍以下では、ｉＰＳ細胞は死滅する。希釈倍率が３２倍以上では、ｉＰＳ細胞は死滅しない。
【００７２】
図５は、処理液の希釈倍率とヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の生存率との関係を示すグラフである。図５の横軸は、処理液の希釈倍率である。図５の縦軸は、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の生存率である。処理液の処理時間は２４時間である。図５に示すように、希釈倍率が４倍以下では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は死滅する。希釈倍率が８倍以上では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は死滅しない。
【００７３】
図４および図５に示すように、処理液の希釈倍率を６倍以上３０倍以下とすれば、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は死滅せず、ｉＰＳ細胞は死滅する。つまり、分化細胞は死滅せず、ｉＰＳ細胞のうちの未分化細胞のみを死滅させることができる。
【００７４】
なお、図６に示すように、処理液の処理時間を１時間から６時間の間で変化させても、ｉＰＳ細胞の生存率はそれほど変わらない。
【００７５】
１倍希釈の処理液における単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、７．５×１０17ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1である。そのため、ｉＰＳ細胞の未分化細胞を選択的に死滅させるには、６倍希釈から３０倍希釈のものを用いればよい。このときの処理液における単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、２．５×１０15ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以上１．２５×１０17ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以下である。
【００７６】
２．実験Ｂ（２領域への２種類の細胞の播種）
２−１．実験方法
２−１−１．処理液の作製
処理液の作製方法は、実験Ａと同様である。
【００７７】
２−１−２．未分化ｉＰＳ細胞の培養
ここで、図７に示すように、未分化ｉＰＳ細胞とヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）とを仕切る仕切りを用意する。この仕切りは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）に２つの貫通孔を形成したものである。貫通孔の直径は６ｍｍ程度である。これらの仕切りをラミニン５１１−Ｅ８コートした１２ウェルプレートの非貫通孔の底面の上に配置する。
【００７８】
そして、２つの貫通孔にそれぞれｉＰＳ細胞とヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）とを播種する。ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、分化していないｉＰＳ細胞に対して、分化した正常な細胞である。ｉＰＳ細胞は、５．４５×１０4 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種する。ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、１０．９×１０4 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種する。なお、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）については、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで染めた。そして、ｉＰＳ細胞については７２時間培養した。ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）については２４時間培養した。次に、ＰＤＭＳの仕切りを取り外す。この段階で、ｉＰＳ細胞と、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）とが、１２ウェルプレートの底部に接着している。
【００７９】
２−１−３．未分化ｉＰＳ細胞への処理
次に、処理液を未分化ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培地に供給する。供給量は、１ウェル当たり１６３０μＬである。ここで、処理液については、１倍、１６倍、１２８倍等に薄めたものを用いる。そして、処理液による処理時間は、特に記載がない限り６時間である。そして、その後、ＰＩ染色等を実施し、各細胞について観察した。
【００８０】
２−２．実験結果
図８は、処理液で６時間処理した後の細胞を示す顕微鏡写真である。図８（ａ）は、１倍希釈の処理液で処理したｉＰＳ細胞の顕微鏡写真である。図８（ｂ）は、１倍希釈の処理液で処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の顕微鏡写真である。図８（ｃ）は、１６倍希釈の処理液で処理したｉＰＳ細胞の顕微鏡写真である。図８（ｄ）は、１６倍希釈の処理液で処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の顕微鏡写真である。図８（ｅ）は、処理液で処理しなかったｉＰＳ細胞の顕微鏡写真である。図８（ｆ）は、処理液で処理しなかったヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の顕微鏡写真である。
【００８１】
図９は、処理液で６時間処理した後の蛍光染色した細胞を示す顕微鏡写真である。図９（ａ）は、１倍希釈の処理液で処理したｉＰＳ細胞（染色無し）の顕微鏡写真である。図９（ｂ）は、１倍希釈の処理液で処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）（染色有り）の顕微鏡写真である。図９（ｃ）は、１６倍希釈の処理液で処理したｉＰＳ細胞（染色無し）の顕微鏡写真である。図９（ｄ）は、１６倍希釈の処理液で処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）（染色有り）の顕微鏡写真である。図９（ｅ）は、処理液で処理しなかったｉＰＳ細胞（染色無し）の顕微鏡写真である。図９（ｆ）は、処理液で処理しなかったヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）（染色有り）の顕微鏡写真である。
【００８２】
図１０は、処理液で６時間処理した後にＰＩ染色した細胞を示す顕微鏡写真である。図１０（ａ）は、１倍希釈の処理液で処理したｉＰＳ細胞をＰＩ染色した顕微鏡写真である。図１０（ｂ）は、１倍希釈の処理液で処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）をＰＩ染色した顕微鏡写真である。図１０（ｃ）は、１６倍希釈の処理液で処理したｉＰＳ細胞をＰＩ染色した顕微鏡写真である。図１０（ｄ）は、１６倍希釈の処理液で処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）をＰＩ染色した顕微鏡写真である。図１０（ｅ）は、処理液で処理しなかったｉＰＳ細胞をＰＩ染色した顕微鏡写真である。図１０（ｆ）は、処理液で処理しなかったヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）をＰＩ染色した顕微鏡写真である。
【００８３】
図１０（ａ）および図１０（ｂ）に示すように、１倍希釈、すなわち原液の処理液を用いて処理した場合には、ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）のいずれも、細胞死を迎えている。また、図１０（ｃ）では、ｉＰＳ細胞は細胞死しているが、図１０（ｄ）では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は細胞死していない。
【００８４】
このことから、適切な濃度の処理液を用いることにより、未分化ｉＰＳ細胞を死滅させるとともに分化後の細胞を死滅させないことができる。
【００８５】
３．実験Ｃ（同一領域への２種類の細胞の播種）
３−１．実験方法
３−１−１．処理液の作製
処理液の作製方法は、実験Ａと同様である。
【００８６】
３−１−２．未分化ｉＰＳ細胞の培養
図１１に示すように、ラミニン５１１−Ｅ８コートした１２ウェルプレートの非貫通孔の中にｉＰＳ細胞を播種する。ｉＰＳ細胞の数は、５．４５×１０4 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。そして、そのまま４８時間培養する。その後、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで染めたヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を１２ウェルプレートに播種する。ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の数は、１０．９×１０4 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。そして、その後２４時間培養した。そのため、ｉＰＳ細胞は、合計７２時間培養したことになる。この段階で、ｉＰＳ細胞とヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）とが、混合した状態で１２ウェルプレートの底部に接着している。
【００８７】
３−１−３．未分化ｉＰＳ細胞への処理
次に、処理液を未分化ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に供給する。供給量は、１ウェル当たり１６３０μＬである。ここで、処理液については、１倍、４倍、８倍等に薄めたものを用いる。そして、処理液による処理時間は、特に記載がない限り６時間である。そして、その後、ＰＩ染色等を実施し、各細胞について観察した。
【００８８】
３−２．実験結果
図１２は、実験結果を示す顕微鏡写真である。図１２（ａ）は、１倍希釈の処理液で処理したｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の顕微鏡写真である。図１２（ｂ）は、４倍希釈の処理液で処理したｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の顕微鏡写真である。図１２（ｃ）は、処理液で処理しなかったｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の顕微鏡写真である。図１２（ｄ）は、１倍希釈の処理液で処理したｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の顕微鏡写真（染色有り）である。図１２（ｅ）は、４倍希釈の処理液で処理したｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の顕微鏡写真（染色有り）である。図１２（ｆ）は、処理液で処理しなかったｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の顕微鏡写真（染色有り）である。図１２（ｇ）は、１倍希釈の処理液で処理した後にＰＩ染色したｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の顕微鏡写真である。図１２（ｈ）は、４倍希釈の処理液で処理した後にＰＩ染色したｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の顕微鏡写真である。図１２（ｉ）は、処理液で処理せずにＰＩ染色したｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の顕微鏡写真である。図１２（ｊ）は、図１２（ｄ）と図１２（ｇ）とを重ね合わせたものである。図１２（ｋ）は、図１２（ｅ）と図１２（ｈ）とを重ね合わせたものである。図１２（ｌ）は、図１２（ｆ）と図１２（ｉ）とを重ね合わせたものである。
【００８９】
図１２（ａ）から図１２（ｃ）までに示すように、ｉＰＳ細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に囲まれて島状に配置されている。つまり、ｉＰＳ細胞の領域とヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の領域とがある程度分離している。図１２（ｄ）から図１２（ｆ）まででは、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで染色されたヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）が示されている。図１２（ｇ）から図１２（ｉ）まででは、死滅した細胞が染色されている。図１２（ｇ）に示すように、１倍希釈の処理液を用いることにより、比較的多くの細胞が死滅している。図１２（ｈ）に示すように、４倍希釈の処理液を用いることにより、ある程度の細胞が死滅している。図１２（ｉ）に示すように、処理液を用いない場合にはほとんどの細胞が死滅しない。
【００９０】
図１２（ｊ）に示すように、１倍希釈の処理液を用いることにより、ｉＰＳ細胞もヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）も死滅している。図１２（ｋ）に示すように、図１２（ｅ）で示されるヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の領域以外の領域で細胞が死滅している。つまり、ｉＰＳ細胞の未分化細胞が選択的に死滅している。
【００９１】
図１３（ａ）および図１３（ｂ）に示すように、４倍希釈の処理液によりｉＰＳ細胞が死滅した後には、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）がｉＰＳコロニーを埋めるように増殖する。
【００９２】
３−３．処理する細胞数との関係
上記の実験結果においては、４倍希釈から３０倍希釈の処理液を用いると、ｉＰＳ細胞の未分化細胞を選択的に死滅させることができる。この場合の処理液における単位体積当たりのプラズマ密度時間積は、２．５×１０15ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以上１．２５×１０17ｓｅｃ・ｃｍ-3・ｍｌ-1以下である。
【００９３】
しかし、これらの数値範囲に関しては、処理する細胞数によって変わる可能性がある。そうであっても、処理する細胞数に対して好適な濃度の処理液を用いれば、ｉＰＳ細胞の未分化細胞を選択的に死滅させることができると考えられる。
【００９４】
４．実験Ｄ（ＤＭＥＭ）
４−１．実験方法
４−１−１．処理液の作製
まず、処理液を作製した。第１の水溶液として、培養液を用いた。ここで用いた培養液はＤＭＥＭと血清（ＦＢＳ）と抗生物質（ペニシリン・ストレプトマイシン）とを混合した溶液である。ＤＭＥＭとして、ｎａｃａｌａｉ社製０８４５８−１６を用いた。ＤＭＥＭの成分は、表１のとおりである。
【００９５】
次に、処理液製造装置ＰＭを用いて、大気圧プラズマを培養液に照射した。プラズマの条件を表３に示す。このプラズマの照射により、第２の水溶液（処理液）が作製された。
【００９６】
４−１−２．未分化ｉＰＳ細胞の培養
未分化ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培養方法については、実験Ａと同様である。
【００９７】
４−１−３．未分化ｉＰＳ細胞への処理
次に、処理液を未分化ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培地に供給する。供給量は、１ウェル当たり１５０μＬである。ここで、処理液については、１倍、２倍、４倍等に薄めたものを用いる。そして、処理液による処理時間は、１時間である。
【００９８】
４−２．実験結果
図１４に結果を示す。図１４に示すように、１倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対して６０％程度の細胞が生存しているとともに、ｉＰＳ細胞に対してほぼ全ての細胞が死滅している。２倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対して１００％程度の細胞が生存しているとともに、ｉＰＳ細胞に対して９５％程度の細胞が死滅している。４倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対して１００％程度の細胞が生存しているとともに、ｉＰＳ細胞に対して３５％程度の細胞が生存している。８倍以上に薄めた処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）およびｉＰＳ細胞に対してほぼ全ての細胞が生存している。
【００９９】
このように、ＤＭＥＭを材料とする処理液は、濃度を選択すれば、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）にはほとんどダメージを与えずにｉＰＳ細胞のみを死滅させることができる。この傾向は、ＡＫ０３を用いた場合と同じである。この実験系においては、１倍以上４倍以下（図１４のＫ１参照）に希釈した処理液を用いるとよい。
【０１００】
５．実験Ｅ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））
５−１．実験方法
５−１−１．処理液の作製
まず、処理液を作製した。第１の水溶液として、緩衝液を用いた。ここで用いた緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））である。このリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）と、塩化カリウム（ＫＣｌ）と、リン酸二水素カリウム（ＫＨ2 ＰＯ4 ）と、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）と、を含有する。
【０１０１】
次に、処理液製造装置ＰＭを用いて、大気圧プラズマをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））に照射した。プラズマの条件を表３に示す。このプラズマの照射により、第２の水溶液（処理液）が作製された。
【０１０２】
５−１−２．未分化ｉＰＳ細胞の培養
未分化ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培養方法については、実験Ａと同様である。
【０１０３】
５−１−３．未分化ｉＰＳ細胞への処理
次に、処理液を未分化ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培地に供給する。供給量は、１ウェル当たり１５０μＬである。ここで、処理液については、１倍、２倍、４倍等に希釈したものを用いる。そして、処理液による処理時間は、１５分である。
【０１０４】
５−２．実験結果
図１５に結果を示す。図１５に示すように、１倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対して１００％程度の細胞が生存しているとともに、ｉＰＳ細胞に対してほぼ全ての細胞が死滅している。２倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対して１００％程度の細胞が生存しているとともに、ｉＰＳ細胞に対して９５％程度の細胞が死滅している。４倍以上１６倍以下に希釈した処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対して１００％程度の細胞が生存しているとともに、ｉＰＳ細胞に対して９５％程度の細胞が死滅している。３２倍に希釈した処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は１００％程度の細胞が生存しているとともに、ｉＰＳ細胞に対して７０％程度の細胞が死滅している。６４倍に希釈した処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は１００％程度の細胞が生存しているとともに、ｉＰＳ細胞に対して３０％程度の細胞が死滅している。
【０１０５】
このように、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））を材料とする処理液は、濃度を選択すれば、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）にはほとんどダメージを与えずにｉＰＳ細胞のみを死滅させることができる。この傾向は、ＡＫ０３を用いた場合と同じである。この実験系においては、１倍以上３０倍以下（図１５のＫ２参照）に希釈した処理液を用いるとよい。
【０１０６】
このように、第１の水溶液としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））を用いた場合に、非常に強い選択性が出た。つまり、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））を材料とする処理液は、通常の細胞にはダメージをほとんど与えずに、未分化のｉＰＳ細胞のみを死滅させた。
【０１０７】
６．実験Ｆ（細胞数依存性）
６−１．実験方法
６−１−１．処理液の作製
処理液の作製方法は、実験Ａと同様である。つまり、第１の水溶液としてＡＫ０３を用いた。
【０１０８】
６−１−２．未分化ｉＰＳ細胞の培養
未分化ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培養方法については、実験Ａと同様である。ただし、ここでは９６ウェルプレートを用いて、それぞれのウェルに異なる細胞数のｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を培養した。
【０１０９】
６−１−３．未分化ｉＰＳ細胞への処理
次に、処理液を未分化ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培地に供給する。ここで、処理液については、１倍、２倍、４倍等に希釈したものを用いる。そして、処理液による処理時間は、２４時間である。
【０１１０】
６−２．実験結果
図１６は、細胞数５０００に対する処理液の効果を示すグラフである。図１６に示すように、１倍から４倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）およびｉＰＳ細胞はいずれもほとんど死滅している。８倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は６０％程度生存しているのに対し、ｉＰＳ細胞はほぼ完全に死滅している。１６倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は１００％程度生存しているのに対し、ｉＰＳ細胞は８０％程度が死滅している。３２倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は１００％程度生存しているのに対し、ｉＰＳ細胞は４０％程度が死滅している。６４倍以上に希釈した処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）およびｉＰＳ細胞のいずれもが１００％程度生存している。
【０１１１】
細胞数が５０００個の場合には、８倍希釈から１６倍希釈程度の処理液（図１６のＫ３参照）を用いることが好ましい。
【０１１２】
図１７は、細胞数２００００に対する処理液の効果を示すグラフである。図１７に示すように、１倍および２倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）およびｉＰＳ細胞はいずれもほとんど死滅している。４倍および８倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は１００％程度生存しているのに対し、ｉＰＳ細胞はほぼ完全に死滅している。１６倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は１００％程度生存しているのに対し、ｉＰＳ細胞は７０％程度が死滅している。３２倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は１００％程度生存しているのに対し、ｉＰＳ細胞は２０％程度が死滅している。６４倍以上に希釈した処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）およびｉＰＳ細胞のいずれもが１００％程度生存している。
【０１１３】
細胞数が２００００個の場合には、４倍希釈から８倍希釈程度の処理液（図１７のＫ４参照）を用いることが好ましい。
【０１１４】
図１８は、細胞数５００００に対する処理液の効果を示すグラフである。１倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）およびｉＰＳ細胞はいずれもほとんど死滅している。２倍および４倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は１００％程度生存しているのに対し、ｉＰＳ細胞はほぼ完全に死滅している。８倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は１００％程度生存しているのに対し、ｉＰＳ細胞は９０％程度が死滅している。１６倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は１００％程度生存しているのに対し、ｉＰＳ細胞は４０％程度が死滅している。３２倍以上に希釈した処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）およびｉＰＳ細胞のいずれもが１００％程度生存している。
【０１１５】
細胞数が５００００個の場合には、２倍希釈から４倍希釈程度の処理液（図１８のＫ５参照）を用いることが好ましい。
【０１１６】
このように、処理する細胞数が多いほど、最適な希釈倍率は低い。つまり、処理する細胞数が多いほど、処理液の濃度を濃くすることが必要である。
【０１１７】
７．実験Ｇ（処理液への細胞の浸漬時間）
７−１．実験方法
７−１−１．処理液の作製
処理液の作製方法は、実験Ａと同様である。
【０１１８】
７−１−２．未分化ｉＰＳ細胞の培養
未分化ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培養方法については、実験Ａと同様である。
【０１１９】
７−１−３．未分化ｉＰＳ細胞への処理
次に、処理液を未分化ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培地に供給する。ここで、処理液については、８倍、１６倍、３２倍等に希釈したものを用いる。そして、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）およびｉＰＳ細胞を処理液に浸漬する処理時間を変えて、それぞれの細胞の生存数を数えた。
【０１２０】
７−２．実験結果
図１９は、細胞を処理液に浸漬する処理時間を１分とした場合の細胞の生存率を示すグラフである。図１９に示すように、８倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は１００％程度生存しているのに対し、ｉＰＳ細胞は４０％程度死滅している。１６倍以上に希釈した処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）およびｉＰＳ細胞のいずれも１００％程度生存している。
【０１２１】
図２０は、細胞を処理液に浸漬する処理時間を３分とした場合の細胞の生存率を示すグラフである。図２０に示すように、８倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は３０％程度死滅しているのに対し、ｉＰＳ細胞は７０％程度死滅している。１６倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は２０％程度死滅しているのに対し、ｉＰＳ細胞は６０％程度死滅している。３２倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）およびｉＰＳ細胞のいずれもそれほど死滅していない。
【０１２２】
図２１は、細胞を処理液に浸漬する処理時間を５分とした場合の細胞の生存率を示すグラフである。図２１に示すように、８倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は８０％程度生存しているのに対し、ｉＰＳ細胞は９０％程度死滅している。１６倍の処理液では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は９０％程度生存しているのに対し、ｉＰＳ細胞は８０％程度死滅している。
【０１２３】
このように、細胞を処理液に浸漬する処理時間を５分以上とすれば、ｉＰＳ細胞を選択的に死滅させることができる。また、本技術は、非常に短い処理時間で未分化ｉＰＳ細胞を選択的に死滅させる処理を実行することができる。また、一度に大量の細胞を処理することができる。
【符号の説明】
【０１２４】
１００、１１０…プラズマ照射装置
１０、１１…筐体部
１０ｉ、１１ｉ…ガス導入口
１０ｏ、１１ｏ…ガス噴出口
２ａ、２ｂ…電極
Ｐ…プラズマ領域
Ｈ…凹部（ホロー）
Ｐ１…プラズマ照射装置
Ｍ１…ロボットアーム
ＰＭ…処理液製造装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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