(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮脂腺を観察する方法であって、
皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を、皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないように支持体に固定する固定ステップ、および
前記固定ステップで得られた皮脂腺構造体を観察する観察ステップ、
を含む、皮脂腺の観察方法。
【請求項２】
前記固定ステップにおいて、コラーゲン、アガロース、基底膜マトリックス、およびポリ−Ｄ−リジンからなる群より選択される少なくとも１つによって、皮脂腺構造体を、支持体に固定する、請求項１に記載の皮脂腺の観察方法。
【請求項３】
前記固定ステップにおいて、皮脂腺構造体に含まれている、表皮、毛包、真皮、皮下組織、および観察対象以外の皮脂腺からなる群より選択される少なくとも１つと、支持体とを固定する、請求項１または２に記載の皮脂腺の観察方法。
【請求項４】
皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体と、支持体と、固定部材と、を備え、
前記皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないように、前記皮脂腺構造体が固定部材を介して支持体に固定された、皮脂腺観察用の試料。
【請求項５】
被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価する方法であって、
請求項４に記載の皮脂腺観察用の試料を、被験物質と接触させる接触ステップ、および
前記接触ステップにおける皮脂腺構造体を観察し、被験物質の皮脂産生調節作用を評価する評価ステップ、を含む、被験物質の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮脂腺の観察方法に関する。本発明はまた、皮脂腺観察用の試料、およびそれを用いた、被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮脂は、皮脂腺から皮膚の表面に分泌され、体外の刺激から皮膚を保護する機能を有する。皮膚の健康を保つためには、過不足のない適度な皮脂の分泌が重要であることから、皮脂の産生を適度に調節する化粧料等の外用剤が望まれている。【０００３】
物質が皮脂の産生に与える影響を分析する方法としては、例えば、皮脂腺細胞を、被験物質を含む培地中で培養し、当該細胞中の脂質量を測定する方法が知られている（特許文献１参照）。【０００４】
また、皮脂腺と同じ外分泌腺である汗腺については、生体に近い動態での観察方法が報告されている。例えば、特許文献２には、皮膚組織中から単離した汗腺を、（ａ）生体基質ゲルで覆う、（ｂ）生体基質により、支持体と接着する、（ｃ）上記汗腺の上にメンブレンを載せて固定する、等の方法が開示されている。これらの方法により、汗腺が容器内で位置ずれを起こすことを回避することができ、その結果、汗腺の動態を的確に観察することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−３２３３１号公報
【特許文献２】国際公開第２０１８／０１６５０１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、特許文献１に記載の方法では、生体における皮脂腺からの皮脂の産生を十分に再現していないため、生体に近い皮脂腺の動態を的確に観察することができない。【０００７】
また、特許文献２に記載の汗腺の動態を観察する方法を、皮脂腺に適用することについても、全く検討されていない。【０００８】
本発明の一態様は、生体に近い皮脂腺の動態を観察することができる、皮脂腺の観察方法およびその利用技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、皮脂腺構造体中の観察対象となる皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないような条件下で、皮脂腺構造体を支持体に固定することにより、固定した状態で皮脂腺の動態を観察することに初めて成功した。また、本発明者らは、そのようにして観察された皮脂腺の動態が、生体における皮脂腺の動態と近いものであることを見出した。この知見に基づき、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明の一態様は、皮脂腺を観察する方法であって、皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を、皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないように支持体に固定する固定ステップ、および前記固定ステップで得られた皮脂腺構造体を観察する観察ステップ、
を含む、皮脂腺の観察方法に関する。【００１１】
また、本発明の別の一態様は、皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体と、支持体と、固定部材と、を備え、前記皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないように、前記皮脂腺構造体が固定部材を介して支持体に固定された、皮脂腺観察用の試料に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の一態様によれば、生体に近い皮脂腺の動態を観察し得る、皮脂腺の観察方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】皮脂腺構造体の皮脂腺を含む要部の構造を示す概略図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る観察方法において、皮脂腺構造体を支持体に固定する態様の一例を示す概略図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る観察方法により、皮脂腺観察用の試料を観察した結果を示す図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る観察方法により、皮脂腺観察用の試料を２つの時点で観察した結果を示す図である。図中、点線で囲まれた部分は、皮脂の位置を示す。
【図５】本発明の一実施形態に係る観察方法により、皮脂腺観察用の試料を２つの時点で観察した結果を示す図である。図中、点線で囲まれた部分は、核の位置を示す。
【図６】本発明の一実施形態に係る観察方法により、皮脂腺観察用の試料を２つの時点で観察した結果を示す図である。図中、点線で囲まれた部分は、核の位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の一実施形態に関して以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態に関しても本発明の技術的範囲に含まれる。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【００１５】
〔１．概要〕
本発明の一実施形態に係る皮脂腺を観察する方法（以下、「本観察方法」と称する。）は、皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を、皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないように支持体に固定する固定ステップ（以下、説明の便宜上、「ステップ（Ｉ）」とも称する。）、および前記固定ステップで得られた皮脂腺構造体を観察する観察ステップ（以下、説明の便宜上、「ステップ（ＩＩ）」とも称する。）、を含む、方法である。
【００１６】
本発明者らは、皮脂腺の動態を観察する方法を検討するにあたり、まず、特許文献２に記載の方法（すなわち、汗腺の動態を観察する方法）を皮脂腺に適用できないかにつき、検討を行った。
【００１７】
しかし、特許文献２に記載の方法を皮脂腺に適用する場合には、以下の問題が生じることを、本発明者らは独自に見出した。
【００１８】
（ｉ）皮脂腺は、エクリン汗腺（以下、「汗腺」と称する。）とは異なり毛包付属器官である。それ故に、皮脂腺についてより生体に近い動態を観察するためには、皮脂腺単独ではなく、皮脂腺が表皮および毛包との接続を維持した状態（換言すれば、皮脂腺構造体の状態）で観察する必要がある。しかし、皮脂腺は、汗腺と比べて、外部からの刺激物質等に対する応答に時間を要する。そうすると、生体基質ゲルまたは生体基質を用いる場合には、時間の経過とともに、固定に用いる生体基質等へ細胞が遊走してしまい、その結果、皮脂腺構造体が本来の機能を損なう恐れがあること。
【００１９】
（ｉｉ）皮脂腺構造体においては、皮脂腺は内部に油脂（皮脂）を多く含んでおり、また表皮は疎水性であることから、皮脂腺構造体の浮力は全体として高い状態にある。それ故、皮脂腺構造体の上にメンブレンを載せて固定することを試みても、十分には固定できず、皮脂腺構造体が浮遊してしまうこと。
【００２０】
そこで、本発明者らは、さらに検討を進めた結果、皮脂腺構造体中の観察対象となる皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないような条件下で、皮脂腺構造体を支持体に固定することにより、固定した状態で皮脂腺の動態を観察できることを初めて見出した。また、本発明者らは、そのようにして観察された皮脂腺の動態が、生体における皮脂腺からの皮脂の産生を十分に再現していることを見出した。
【００２１】
本観察方法によれば、固定した状態で皮脂腺の動態を観察でき、かつ、観察された皮脂腺の動態が生体における皮脂腺の動態と近いものであることから、生体に近い皮脂腺の動態を観察する方法を提供することができる。また、本観察方法によれば、生体に近い皮脂腺の動態を経時的に観察することもできる。
【００２２】
〔２．観察方法〕
本観察方法は、皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を、皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないように支持体に固定する固定ステップ、および前記固定ステップで得られた皮脂腺構造体を観察する観察ステップ、を含む、方法である。
【００２３】
本観察方法によれば、前記皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないように支持体に固定するという操作が採られている。そのため、前記皮脂腺構造体において、真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去されていても、生体における皮脂腺からの皮脂の産生等に代表される生体における皮脂腺の動態が、観察しやすい状態で的確に再現される。したがって、本観察方法によれば、生体内により近い環境下で皮脂腺の動態を観察することができる。
【００２４】
本明細書において「皮脂腺構造体」は、皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された構造体であり、皮脂腺に加えて、少なくとも毛包および表皮を含む。
【００２５】
皮脂腺構造体は、皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去されている点を除き、生体内の皮膚組織と同様の構造を有するため、生体に近い状態での皮脂腺の動態の観察に適している。皮脂腺構造体において、皮脂腺は、毛包と表皮との接続を維持する機能を有する。
【００２６】
皮脂腺構造体は、前記皮脂腺、表皮および毛包に加えて、真皮および皮下組織をさらに含んでいてもよい。
【００２７】
皮脂腺構造体に含まれる皮脂腺の数は、特に限定されることなく、１個以上であればよい。より観察に好ましい皮脂腺が選択できるという観点から、皮脂腺構造体に含まれる観察可能な皮脂腺の数は、５個以上であることが好ましい。
【００２８】
前記皮脂腺構造体について、図１に基づき、具体的に説明する。すなわち、図１に示されるように、皮脂腺構造体１は、毛２と、毛２を取り囲む毛包３と、表皮４と、皮脂腺５とを含有する。皮脂腺５は、皮脂腺５の最外層に局在する未分化の皮脂腺基底細胞６と、皮脂腺基底細胞６の局在位置よりも内側に局在し、脂肪滴（皮脂）を生成する細胞（以下、「分化皮脂腺細胞」とも称する。）７と、皮脂腺５の中心部に局在し、分化皮脂腺細胞７が皮脂をため込み膨張した成熟皮脂腺細胞８と、成熟皮脂腺細胞８が死滅して崩壊することで細胞内部より流出した皮脂９と、を含有している。皮脂腺５で生成された皮脂９は、毛包３を介して皮膚の外に放出される。前記皮脂腺構造体１における皮脂腺５と毛２と毛包３と表皮４とから構成される部分は、皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去されている点を除き、生体中の皮膚組織における皮脂腺と毛と毛包と表皮とから構成される部分と同じ構造を有する。
【００２９】
なお、本明細書において、「皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの一部が除去された」とは、皮膚組織から真皮および皮下組織が除去され、皮脂腺を観察することができる程度に皮脂腺が露出していることを意味する。
【００３０】
前記ステップ（Ｉ）では、皮脂腺構造体を、皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないように支持体に固定する。前記皮脂腺構造体は、例えば、単離した皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部を除去すること等によって製造することができる。したがって、本観察方法は、前記ステップ（Ｉ）を行なう前に、単離された皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部を除去して前記皮脂腺構造体を得るステップをさらに含むことができる。
【００３１】
前記皮脂腺構造体の製造方法としては、例えば、
（ａ１）単離された皮膚組織から皮下組織の全部または一部を切除するステップ、および
（ａ２）前記ステップ（ａ１）で得られた組織から膠原繊維等の繊維を除去して皮脂腺を露出させて前記皮脂腺構造体を得るステップを含む方法（以下、「製法Ａ」とも称する。）；
（ｂ１）単離された皮膚組織から皮下組織の全部または一部を切除するステップ、
（ｂ２）前記ステップ（ｂ１）で得られた組織をディスパーゼ、コラゲナーゼ、プロナーゼ等の表皮付属器官を真皮から解離させるための酵素と接触させるステップ、および
（ｂ３）前記ステップ（ｂ２）で得られた組織から真皮を分離するステップを含む方法（以下、「製法Ｂ」とも称する。）等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの皮脂腺構造体の製法のなかでは、皮脂腺構造体を容易に製造することができ、しかも生体における皮脂腺の動態を的確に観察することができることから、製法Ａおよび製法Ｂが好ましく、製法Ａがより好ましい。
【００３２】
前記単離された皮膚組織としては、例えば、外科手術の際に生じた余剰皮膚等から取得され、生きている状態の皮膚組織等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、本明細書において、「生きている状態の皮膚組織」とは、生体内における本来の生物学的活性および本来の動きと同様の生物学的活性および動きを示す状態の皮膚組織をいう。
【００３３】
前記皮膚組織の供給源としては、例えば、ヒト等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。本観察方法をヒトにおける皮脂の産生時の皮脂腺の観察等に用いる場合、前記皮膚組織の供給源は、ヒトであることが好ましい。従来、ヒトの皮脂腺の動態を的確に観察することが困難であったことから、本観察方法は、ヒトの皮脂腺の観察に好適である。
【００３４】
皮脂腺の動態としては、例えば、（ｉ）皮脂の産生の際の少なくとも２つの時点における皮脂腺を構成する細胞の形状を対比したときの細胞の形状の変化；（ｉｉ）皮脂の産生の際の少なくとも２つの時点における皮脂腺を構成する細胞の分化状態を対比したときの細胞の分化状態の変化；（ｉｉｉ）皮脂の産生の際の少なくとも２つの時点における分化した細胞の形状を対比したときの分化した細胞の形状の変化；（ｉｖ）皮脂の産生の際の少なくとも２つの時点における分化した細胞の局在部位の位置を対比したときの分化した細胞の局在部位の位置の変化等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３５】
本観察方法のステップ（Ｉ）において、皮脂腺構造体は、該皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないように、支持体に固定される。
【００３６】
本明細書において「皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しない」とは、皮脂腺が、生体基質を介した支持体との接触によって、生物学的な影響を受けていないことを意味する。生物学的な影響とは、例えば、皮脂腺中の細胞が生体基質や培地中へ遊走すること、皮脂腺構造体の一体性が破壊されること、他に皮脂腺細胞が分化すること等が挙げられる。したがって、皮脂腺と支持体とが物理的に接触していたとしても、皮脂腺が前記の生物学的な影響を受けていなければ、「皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しない」の定義の範囲に含まれる。
【００３７】
前記支持体と生物学的に接触しない皮脂腺は、皮脂腺構造体中の観察対象となる皮脂腺であり、観察対象以外の皮脂腺であれば支持体と生物学的に接触していてもよい。一般的に、所定の大きさ（例えば、１ｃｍ角）の皮脂腺構造体中には、複数の皮脂腺が含まれている。当該皮脂腺構造体において、例えば、中央部の皮脂腺を観察対象とする場合、端部の皮脂腺は非観察対象となるため、観察対象の皮脂腺に影響を与えない範囲であれば支持体と生物学的に接触していてもかまわないことを意図する。
【００３８】
皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺は、支持体に接触していないことが好ましいが、生物学的な接触以外の接触方法で接触していることが好ましい場合もある。例えば、観察機器（顕微鏡等）や支持体として使用される容器（皮脂腺構造体を培養するための培養器等）によっては、皮脂腺が支持体に接触している方が、観察がし易い、観察精度が良好である等の利点を有する場合がある。このような場合には、観察対象の皮脂腺は、生物学的な接触以外の接触方法で、支持体と接触していてもよい。
【００３９】
前記支持体は、皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないように、皮脂腺構造体を固定できる物体であり、かつ観察機器に適するものであれば、特に限定されない。支持体としては、例えば、シャーレ、ディッシュ、プレート、フラスコ、チャンバーおよびチューブ等の容器等が挙げられる。また、材質についても、一般的なプラスチック、ガラス等、種々のものを好適に利用可能である。皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないようにするという観点から、表面に生体基質がコーティングされていないものが好ましい。
【００４０】
本発明の一実施形態において、前記ステップ（Ｉ）における皮脂腺構造体と支持体との固定は、生体基質を介して行われる。本明細書において「生体基質」は、皮脂腺構造体と支持体との固定を仲介する材料であるとの観点から、「固定部材」とも称する。前記生体基質は、皮脂腺構造体および支持体のいずれにも結合し、皮脂腺構造体と支持体とを固定できるものであれば特に限定されない。前記生体基質としては、例えば、コラーゲン、アガロース、基底膜マトリックス、ポリ−Ｄ−リジン等が挙げられる。したがって、本発明の一実施形態において、皮脂腺構造体は、コラーゲン、アガロース、基底膜マトリックス、およびポリ−Ｄ−リジンからなる群より選択される少なくとも１つによって、支持体に固定される。
【００４１】
前記コラーゲンとしては、例えば、コラーゲン  タイプＩ−Ａ、コラーゲン  タイプＩ−Ｂ等のＩ型コラーゲン；ＩＩＩ型コラーゲン；ＩＶ型コラーゲン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
前記アガロースは、皮脂腺を構成する細胞が生存することができる温度を融点として有するアガロースであればよい。
【００４３】
前記基底膜マトリックスは、構成必須成分として、ラミニン、コラーゲン  タイプＩＶ、ニドゲンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカンを含んでいればよい。前記基底膜マトリックスとしては、例えば、マトリゲル基底膜マトリックス（コーニング社製）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
前記ポリ−Ｄ−リジンは、皮脂腺を構成する細胞を支持体に接着する程度の分子量を有するものであればよい。
【００４５】
本発明の一実施形態において、前記ステップ（Ｉ）における皮脂腺構造体と支持体との固定は、皮脂腺構造体に含まれている、表皮、毛包、真皮、皮下組織、および観察対象以外の皮脂腺からなる群より選択される少なくとも１つが、前記生体基質を介して支持体と結合することにより行われる。
【００４６】
本明細書において「皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないように支持体に固定する」とは、観察対象の皮脂腺が、生体基質を介した支持体との接触によって、生物学的な影響を受けない状態で、皮脂腺構造体が支持体に固定されることを意味する。固定された皮脂腺構造体は、観察中に支持体上を移動することがないため、観察に適している。
【００４７】
本発明の一実施形態において、固定される皮脂腺構造体の形状およびサイズは特に限定されない。例えば、操作上の容易さの観点から、３〜５ｍｍ角の四角形に調製された皮脂腺構造体が好ましい。
【００４８】
支持体上での固定態様も特に限定されないが、皮脂腺構造体中の皮脂腺に培地が接触できるという観点から、皮脂腺構造体の全ての端部が支持体に固定されていることは望ましくない。すなわち、皮脂腺構造体の少なくとも１つの端部は、支持体に固定されていないことが好ましい。例えば、皮脂腺構造体が四角形の場合、４つの端部のうち、対向する１つの両端部（すなわち、２つの端部）が固定され得る。
【００４９】
本明細書において「皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺」とは、皮脂腺構造体中に含まれる皮脂腺のうち、皮脂腺の動態を観察するために任意で選択された皮脂腺を意味する。
【００５０】
観察対象の皮脂腺は、皮脂腺構造体の中から、支持体と生物学的に接触していない皮脂腺を適宜選択すればよい。例えば、皮脂腺構造体の端部に近い位置に存在する皮脂腺は生体基質と生物学的に接触している可能性が高いことから、皮脂腺構造体の中央部付近の皮脂腺を観察対象とすることが好ましい。
【００５１】
本発明の別の実施形態において、皮脂腺構造体の上にメンブレン等の重石材を載せ、当該メンブレンと、支持体とを固定することにより、皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないように皮脂腺構造を支持体に固定することもできる。このとき、メンブレンは、例えば、前記生体基質を介して、支持体に固定できる。
【００５２】
前記メンブレンは、皮脂腺構造体を通過させず、緩衝液、後述の被験物質等を通過させることができる孔径の孔を有するメンブレンであればよい。前記孔径は、皮脂腺の通過を抑制するという観点から、好ましくは５ｍｍ以下、より好ましくは１ｍｍ以下であり、後述の被験物質を通過させるという観点から、好ましくは０．１μｍ以上である。
【００５３】
前記ステップ（Ｉ）において、支持体に固定された皮脂腺構造体は、培地を添加することにより、培地中で培養される。皮脂腺構造体は、培地中で培養されることにより、生存状態を維持することができる。その結果、より生体に近い状態で皮脂腺の動態を観察することが可能となる。
【００５４】
前記培地は、皮脂腺構造体に含まれる未分化の皮脂腺基底細胞を成熟皮脂腺細胞に分化させるのに適した分化促進成分および細胞を増殖させる増殖成分を含む培地であればよく、特に限定されるものではない。前記培地は、慣用の基本培地に、前記分化促進成分および増殖成分を補った培地であってもよく、市販されている培地であってもよい。前記分化促進成分としては、例えば、ウシ胎児血清、脂肪酸、ペプチド、ホルモン等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの分化促進成分は、単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。前記培地における前記分化促進成分の含有率は、前記培地の種類、前記分化促進成分の種類等によって異なるので一概に決定されるものではない。従い、前記培地の種類、前記分化促進成分の種類等に応じて適宜設定することが好ましい。前記増殖成分としては、例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、糖類、細胞増殖促進因子等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記培地における前記増殖成分の含有率は、前記培地の種類、前記増殖成分の種類等によって異なるので一概に決定されるものではない。従い、前記培地の種類、前記増殖成分の種類等に応じて適宜設定することが好ましい。これらの増殖成分は、単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。前記基本培地としては、例えば、ダルベッコ改変培地とＦ−１２培地との混合培地等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００５５】
前記皮脂腺構造体の培養を行なう際の培養条件は、前記皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類、観察対象の皮脂腺の動態の種類等によって異なるので一概には決定することができない。従い、前記皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類、観察対象の皮脂腺の動態の種類等に応じて決定することが望ましい。前記培養条件は、例えば、培養温度、培養時間、培地のｐＨ、培養雰囲気における二酸化炭素濃度等を含む。
【００５６】
前記皮膚組織の供給源がヒトである場合、培養温度は、生体における皮脂腺の状態を的確に再現する観点から、通常、好ましくは３５℃〜３８℃、より好ましくは３６．５℃〜３７．５℃である。また、前記皮膚組織の供給源がヒトである場合、培養時間は、培地中において、前記皮脂腺構造体における生理機能を良好な状態で維持する観点から、通常、好ましくは６〜１６８時間、より好ましくは２４〜４８時間である。さらに、前記皮膚組織の供給源がヒトである場合、培地のｐＨは、生体における皮脂腺の状態を的確に再現する観点から、通常、好ましくは６．８〜７．６、より好ましくは７．０〜７．４である。培養雰囲気における二酸化炭素濃度は、生体における皮脂腺の状態を的確に再現する観点から、通常、好ましくは４〜１０体積％、より好ましくは５〜７体積％である。
【００５７】
続いて、前記ステップ（ＩＩ）では、前記ステップ（Ｉ）で得られた皮脂腺構造体を観察する。皮脂腺構造体の観察は、例えば、前記ステップ（Ｉ）の前に染色試薬によって染色された皮脂腺構造体を観察試料として用いたり、前記ステップ（Ｉ）の後に染色試薬によって染色された皮脂腺構造体を観察試料として用いたりして行うことができる。
【００５８】
前記皮脂腺構造体の染色は、例えば、前記皮脂腺構造体と前記染色試薬とを接触させること等によって行なうことができる。前記染色試薬としては、例えば、マーカーに結合する結合物質と検出可能な物質との複合体を含む試薬、前記結合物質を含有し、前記検出可能な物質を含まない試薬等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、本明細書において「マーカー」とは、皮脂腺構造体に含まれる組織、細胞等の存在の指標、細胞の分化度等の指標となる物質を意味する。
【００５９】
前記結合物質は、本観察方法の用途等によって異なる。したがって、一概には決定することができないことから、皮脂腺の観察方法の用途等に応じて適宜決定することが好ましい。前記結合物質としては、例えば、前記マーカーに結合する抗体（以下、単に、「抗体」と称する。）またはその断片（以下、単に「抗体断片」と称する。）、前記マーカーに結合する化合物等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。前記抗体のなかでは、前記マーカーに対する特異性が高いことから、モノクローナル抗体が好ましい。前記抗体断片としては、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記ポリクローナル抗体、前記モノクローナル抗体および前記抗体断片は、前記マーカーを抗原として用い、慣用の手法によって製造することができる。また、前記ポリクローナル抗体、前記モノクローナル抗体および前記抗体断片として、商業的に容易に入手可能なポリクローナル抗体、商業的に容易に入手可能なモノクローナル抗体および商業的に容易に入手可能な抗体断片を用いることができる。前記結合物質は、検出可能なシグナルを生じる物質であってもよく、当該シグナルを生じない物質であってもよい。
【００６０】
前記検出可能な物質としては、例えば、蛍光物質、酵素等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒシリーズの蛍光物質（例えば、インビトロジェン製、商品名：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７等）等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、前記酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスフォターゼ等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの検出可能な物質のなかでは、検出操作が容易であり、高い精度で検出対象物を検出することができることから、蛍光物質が好ましく、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒシリーズの蛍光物質（例えば、インビトロジェン製、商品名：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７等）がより好ましい。
【００６１】
なお、前記結合物質が抗体またはその抗体断片である場合、前記染色試薬は、必要に応じ、前記抗体またはその抗体断片に結合する標識結合物質をさらに含んでいてもよい。前記標識結合物質としては、例えば、前記結合物質に結合する第２の結合物質と標識物質との複合体等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記第２の結合物質としては、例えば、前記抗体を製造する際に免疫した動物が有する免疫グロブリンに対する抗体、当該免疫グロブリンの断片に対する抗体等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記標識物質としては、例えば、前記検出可能な物質等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００６２】
前記染色試薬の種類は、発明の皮脂腺の観察方法の用途等によって異なるので一概には決定することができない。従い、皮脂腺の観察方法の用途等に応じて適宜決定することが好ましい。前記染色試薬としては、例えば、前記未分化の皮脂腺基底細胞に対する染色試薬（以下、「未分化細胞染色試薬」とも称する。）、皮脂に対する染色試薬（以下、「皮脂染色試薬」とも称する。）、細胞核に対する染色試薬（以下、「核染色試薬」とも称する。）、分化細胞染色試薬等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００６３】
前記未分化細胞染色試薬は、未分化の皮脂腺基底細胞に特異的なマーカー（以下、「未分化マーカー」とも称する。）に結合する物質（以下、「未分化細胞結合物質」とも称する。）を含む。前記未分化細胞染色試薬は、未分化細胞結合物質と検出可能な物質との複合体を含む試薬であってもよく、前記未分化細胞結合物質自体が検出可能なシグナルを生じる物質である場合には、前記未分化細胞結合物質を含有し、前記検出可能な物質を含まない試薬であってもよい。前記未分化細胞マーカーとしては、例えば、ケラチン−５、ケラチン―７、ケラチン―１４、Ｂリンパ球誘導成熟タンパク質１（Ｂｌｉｍｐ１）、ロイシン−リッチリピート・イムノグロブリン様ドメインタンパク質１（Ｌｒｉｇ１）等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００６４】
前記核染色試薬は、核を構成する物質に結合する結合物質（以下、「核結合物質」とも称する。）を含む。前記核染色試薬は、核結合物質と検出可能な物質との複合体を含む試薬であってもよく、前記核結合物質自体が検出可能なシグナルを生じる物質である場合には、前記核結合物質を含有し、前記検出可能な物質を含まない試薬であってもよい。前記核を構成する物質としては、例えば、ＤＮＡ等の核酸等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記核結合物質は、細胞膜を透過する物質であればよい。前記核結合物質としては、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２は、検出可能な蛍光を生じる物質であることから、前記核染色試薬は、前記検出可能な物質を含有しない試薬であってもよい。
【００６５】
前記皮脂染色試薬としては、例えば、皮脂に溶解する脂溶性色素等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記脂溶性色素としては、例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、オイルレッドＯ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、ズダンブラックＢ等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、前記脂溶性色素は、皮脂に溶解して皮脂を染色することから、前記脂溶性色素を含む皮脂染色試薬は、前記検出可能な物質を含有しない試薬であってもよい。
【００６６】
前記分化細胞染色試薬としては、例えば、未分化の皮脂腺基底細胞から分化した皮脂腺細胞に特異的なマーカー（以下、「分化マーカー」とも称する。）に結合する物質（以下、「分化細胞結合物質」とも称する。）を含む。前記分化細胞染色試薬は、分化細胞結合物質と検出可能な物質との複合体を含む試薬であってもよく、前記分化細胞結合物質自体が検出可能なシグナルを生じる物質である場合には、前記分化細胞結合物質を含有し、前記検出可能な物質を含まない試薬であってもよい。前記分化細胞マーカーとしては、例えば、ステアロイル−ＣｏＡ不飽和化酵素１（Ｓｃｄ−１）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００６７】
前記染色試薬中における前記結合物質の含有率は、前記結合物質の種類、発明の皮脂腺の観察方法の用途等によって異なるので一概に決定されるものではない。従い、前記結合物質の種類、発明の皮脂腺の観察方法の用途等に応じて適宜決定することが好ましい。
【００６８】
前記未分化細胞染色試薬に含まれる検出可能な物質、前記皮脂染色試薬に含まれる検出可能な物質および前記核染色試薬に含まれる検出可能な物質は、互いに識別可能な物質であることが好ましい。
【００６９】
前記皮脂腺構造体と前記染色試薬との混合比および接触時間は、前記染色試薬の種類等によって異なるので一概に決定されるものではない。従い、前記染色試薬の種類等に応じて適宜設定することが好ましい。
【００７０】
前記皮脂腺構造体と前記染色試薬との接触後、皮脂腺の動態をより的確に観察する観点から、染色された皮脂腺構造体を適切な洗浄液で洗浄することが好ましい。前記洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝生理的食塩水、リン酸緩衝液等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００７１】
なお、前記染色試薬が抗体またはその抗体断片を含む場合、皮脂腺の動態をより的確に観察する観点から、前記染色された皮脂腺構造体に対し、ブロッキング剤を用いてブロッキング処理を施すことが好ましい。前記ブロッキング剤としては、例えば、アルブミンを含有するリン酸緩衝生理的食塩水溶液等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００７２】
前記染色された皮脂腺構造体を用いて皮脂腺の動態を観察する。皮脂腺の観察は、例えば、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡等の光学顕微鏡等を用いて行なうことができる。具体的には、皮脂腺の観察は、例えば、染色された皮脂腺構造体をそのまま観察すること、染色された皮脂腺構造体における染色試薬に由来するシグナルを検出することによって行なうことができる。
【００７３】
本発明の一実施形態において、皮脂腺構造体の観察は、皮脂腺構造体の毛穴／表皮側および皮脂腺側のいずれから行ってもよい。皮脂腺構造体の観察は、皮脂腺側から行うことが好ましく、例えば、図２で説明すると、支持体１２の位置する側（皮脂腺側）から皮脂腺構造体を観察することができる（すなわち、支持体１２の下側から観察できる。）。
【００７４】
以上で説明したように、本観察方法によれば、皮脂腺からの皮脂の産生を的確に観察することができることから、皮脂産生調節物質のスクリーニング、皮脂産生調節物質の有効性の評価等に用いられることが期待される。
【００７５】
〔３．皮脂腺観察用の試料〕
本発明の一実施形態に係る皮脂腺観察用の試料（以下、「本試料」と称する。）は、皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体と、支持体と、固定部材と、を備え、前記皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないように、前記皮脂腺構造体が固定部材を介して支持体に固定されている。
【００７６】
本試料について、模式的に示した図２を用いて説明する。本試料２０は、皮脂腺構造体１と支持体１２と生体基質（固定部材）１０とを備える。皮脂腺構造体１は、容器１３において培地１１中にて培養される。本図では、容器１３の底部が支持体１２として機能するが、これに限定されず、支持体１２は容器１３とは別部材であってもよい。皮脂腺構造体１は、毛２、表皮４、観察対象の皮脂腺５を備える。皮脂腺構造体１は、その端部の表皮４と支持体１２とを生体基質（固定部材）１０を介して、支持体１２に固定化されている。ここで、観察対象の皮脂腺５は、支持体１２と生物学的に接触しないように固定化されている。つまり、観察対象の皮脂腺５は、生体基質（固定部材）１０と接触していない。
【００７７】
一般的に、皮脂腺構造体は、例えば、容器の培地の中に存在するため、生体基質で固定化しない場合、培地中に浮遊し、観察できない。これに対して、本試料２０は、皮脂腺構造体１中の皮脂腺５が生物学的に接触しないように、支持体１２に固定されている。特に、皮脂線５が生体基質（固定部材）１０とも接触していないため、皮脂腺５の細胞が遊走し、皮脂腺構造体が壊れることもない。したがって、本試料２０を用いると、生体に近い皮脂腺の動態を正確に観察することができる。
【００７８】
本試料における皮脂腺構造体および支持体は、前記〔２．観察方法〕に記載したものと同じであるため詳細な説明は〔２．観察方法〕を援用する。また、本試料において、前記皮脂腺構造体と支持体とは、前記〔２．観察方法〕に記載したとおりの態様および方法により、固定されている。
【００７９】
〔４．被験物質の評価方法〕
本発明の一実施形態に係る被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価する方法（以下、「本評価方法」と称する。）は、皮脂腺観察用の試料を、被験物質と接触させる接触ステップ（以下、説明の便宜上、「ステップ（Ａ）」とも称する。）、および前記接触ステップにおける皮脂腺構造体を観察し、被験物質の皮脂産生調節作用を評価する評価ステップ（以下、説明の便宜上、「ステップ（Ｂ）」とも称する。）、を含む、方法である。なお、「被験物質と接触」とは、被験物質と皮脂腺構造体とが接触する態様であればよく、例えば、被験物質の存在下で皮脂腺構造体を培養する態様、被験物質を皮脂腺構造体に直接振りかける態様等、種々の方法を適用できる。以下では、被験物質を含む培養液中で皮脂腺構造体を培養する場合を例に挙げて説明する。
【００８０】
本評価方法は、被験物質と接触させた状態で皮脂腺観察用の試料を観察するので、前記被験物質が有する皮脂産生調節作用を経時的に評価することができる。したがって、本評価方法によれば、被験物質が皮脂の産生を調節する物質であるかどうかを的確に評価することができる。前記皮脂産生調節作用には、皮脂産生を増加させる皮脂産生促進作用および皮脂産生を減少させる皮脂産生抑制作用が含まれる。
【００８１】
前記ステップ（Ａ）では、皮脂腺観察用の試料を、被験物質の存在下で培養する。前記ステップ（Ａ）で用いられる皮脂腺観察用の試料および培地は、前記〔３．皮脂腺観察用の試料〕に記載の本試料および前記〔２．観察方法〕に記載の培地と同様である。前記ステップ（Ａ）における前記皮脂腺観察用の試料の培養は、前記〔２．観察方法〕に記載の皮脂腺構造体の培養の手法と同様の手法で行なうことができる。前記皮脂腺観察用の試料の培養条件は、評価内容、評価対象の被験物質の種類、前記皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類等によって異なるので一概には決定することができない。従い、評価内容、評価対象の被験物質の種類、前記皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類等に応じて決定することが望ましい。
【００８２】
前記ステップ（Ｂ）では、前記ステップ（Ａ）における皮脂腺構造体を観察し、被験物質の皮脂産生調節作用を評価する。
【００８３】
また、比較のため、皮脂腺観察用の試料を被験物質の非存在下で培養するステップ（Ｃ）を行ってもよい。前記ステップ（Ｃ）で用いられる培地は、前記ステップ（Ａ）で用いられる培地と同じ種類の培地である。前記ステップ（Ｃ）において、被験物質の非存在下での前記皮脂腺観察用の試料の培養は、例えば、前記ステップ（Ａ）で用いられる培地と同じ種類の培地に被験物質を添加して得られた被験物質含有培地を用いることを除き、前記〔２．観察方法〕に記載の皮脂腺構造体の培養の手法と同様の手法で行なうことができる。前記ステップ（Ｃ）における皮脂腺観察用の試料の培養条件は、被験物質を用いないことを除き、前記ステップ（Ａ）における皮脂腺観察用の試料の培養条件と同じである。
【００８４】
本発明の一実施形態において、前記ステップ（Ａ）で得られた培養後の皮脂腺観察用の試料（Ａ）を観察し、前記皮脂腺観察用の試料（Ａ）における皮脂腺の動態と通常の皮脂腺構造体における皮脂腺の動態との違いに基づき、前記被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価することができる。この場合、コントロールは用いず、通常の動態と比較して評価することになる。
【００８５】
また、本発明の他の一実施形態において、前記ステップ（Ａ）で得られた培養後の皮脂腺観察用の試料（Ａ）と前記ステップ（Ｃ）で得られた培養後の皮脂腺観察用の試料（Ｃ）とを観察し、前記皮脂腺観察用の試料（Ａ）における皮脂腺の動態と前記皮脂腺観察用の試料（Ｃ）における皮脂腺の動態との違いに基づき、前記被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価することができる。
【００８６】
さらに、本発明の他の一実施形態において、前記ステップ（Ｃ）で得られた培養後の皮脂腺観察用の試料（Ｃ）を観察した後、前記試料（Ｃ）と同じ試料を用いて前記ステップ（Ａ）を行い、得られた試料（Ａ）を観察し、その後、前記ステップ（Ｃ）で得られた培養後の皮脂腺観察用の試料（Ｃ）における皮脂腺の動態と前記試料（Ａ）における皮脂腺の動態との違いに基づき、前記被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価することができる。
【００８７】
なお、前記ステップ（Ｃ）を行う場合、前記ステップ（Ａ）およびステップ（Ｃ）を行なう順は、ステップ（Ａ）を行なった後にステップ（Ｃ）を行なう順であってもよく、ステップ（Ｃ）を行なった後にステップ（Ａ）を行なう順であってもよい。また、ステップ（Ａ）およびステップ（Ｃ）を同時に行なってもよい。
【００８８】
前記皮脂腺観察用の試料（Ａ）における皮脂腺の動態と、通常の皮脂腺構造体における皮脂腺の動態または前記皮脂腺観察用の試料（Ｃ）における皮脂腺の動態との違いとしては、（ｉ）被験物質の有無による皮脂腺の最外層における皮脂を内包する細胞の動態の違い；（ｉｉ）被験物質の有無による皮脂腺における未分化の皮脂腺基底細胞から成熟皮脂腺細胞への分化の速度の違い；（ｉｉｉ）被験物質の有無による皮脂腺の中心部付近に存在する崩壊した成熟皮脂腺細胞の動態の違い；（ｉｖ）被験物質の有無による皮脂腺の中心部付近に存在する皮脂量の変化の違い；（ｖ）被験物質の有無による分化マーカーの発現位置の変化の違い；（ｖｉ）被験物質の有無による分化マーカーの発現量の変化の違い等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００８９】
前記被験物質が皮脂産生促進作用を有することの指標は、被験物質や皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類等によって異なるため、一概に決定することはできないが、例えば、以下の（１ａ）〜（３ａ）の指標等が挙げられる。これらの指標は、単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。
【００９０】
（１ａ）前記皮脂腺観察用の試料（Ｃ）の皮脂腺の最外層における皮脂を内包する細胞の数に比べて、前記皮脂腺観察用の試料（Ａ）の皮脂腺の最外層における皮脂を内包する細胞の数が多いこと、
（２ａ）前記皮脂腺観察用の試料（Ｃ）の皮脂腺における未分化の皮脂腺基底細胞から成熟皮脂腺細胞への分化の速度に比べて、前記皮脂腺観察用の試料（Ａ）の皮脂腺における未分化の皮脂腺基底細胞から成熟皮脂腺細胞への分化の速度が大きいこと、および
（３ａ）前記皮脂腺観察用の試料（Ｃ）の皮脂腺の中心部付近に存在する崩壊した成熟皮脂腺細胞の数に比べて、前記皮脂腺観察用の試料（Ａ）の皮脂腺の中心部付近に存在する崩壊した成熟皮脂腺細胞の数が多いこと。
【００９１】
また、前記被験物質が皮脂産生抑制作用を有することの指標は、被験物質や皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類等によって異なるため、一概に決定することはできないが、例えば、以下の（１ｂ）〜（３ｂ）の指標等が挙げられる。これらの指標は、単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。
【００９２】
（１ｂ）前記皮脂腺観察用の試料（Ｃ）の皮脂腺の最外層における皮脂を内包する細胞の数に比べて、前記皮脂腺観察用の試料（Ａ）の皮脂腺の最外層における皮脂を内包する細胞の数が少ないこと、
（２ｂ）前記皮脂腺観察用の試料（Ｃ）の皮脂腺における未分化の皮脂腺基底細胞から成熟皮脂腺細胞への分化の速度に比べて、前記皮脂腺観察用の試料（Ａ）の皮脂腺における未分化の皮脂腺基底細胞から成熟皮脂腺細胞への分化の速度が小さいこと、および
（３ｂ）前記皮脂腺観察用の試料（Ｃ）の皮脂腺の中心部付近に存在する崩壊した成熟皮脂腺細胞の数に比べて、前記皮脂腺観察用の試料（Ａ）の皮脂腺の中心部付近に存在する崩壊した成熟皮脂腺細胞の数が少ないこと。
【００９３】
なお、皮脂腺観察用の試料（Ａ）および皮脂腺観察用の試料（Ｃ）は一例であり、上述した皮脂腺の動態の違い、被験物質が皮脂産生促進作用を有することの指標、被験物質が皮脂産生抑制作用を有することの指標は、本評価方法の他の実施形態にも援用される。
【００９４】
以上説明したように、本評価方法によれば、前記被験物質が有する皮脂産生調節作用を的確に評価することができることから、皮脂産生調節物質のスクリーニング、皮脂産生調節物質の有効性の評価等に用いられることが期待される。前記皮脂産生調節物質は、例えば、顔、腋、頭皮等の皮膚用の化粧料に配合される皮脂産生抑制剤、皮脂産生促進剤等に用いられることが期待されるものである。
【００９５】
すなわち、本発明の一態様は、以下の発明を包含する。
＜１＞皮脂腺を観察する方法であって、
皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を、皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないように支持体に固定する固定ステップ、および
前記固定ステップで得られた皮脂腺構造体を観察する観察ステップ、
を含む、皮脂腺の観察方法。
＜２＞前記固定ステップにおいて、コラーゲン、アガロース、基底膜マトリックス、およびポリ−Ｄ−リジンからなる群より選択される少なくとも１つによって、皮脂腺構造体を、支持体に固定する、＜１＞に記載の皮脂腺の観察方法。
＜３＞前記固定ステップにおいて、皮脂腺構造体に含まれている、表皮、毛包、真皮、皮下組織、および観察対象以外の皮脂腺からなる群より選択される少なくとも１つと、支持体とを固定する、＜１＞または＜２＞に記載の皮脂腺の観察方法。
＜４＞皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体と、支持体と、固定部材と、を備え、
前記皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないように、前記皮脂腺構造体が固定部材を介して支持体に固定された、皮脂腺観察用の試料。
＜５＞被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価する方法であって、
＜４＞に記載の皮脂腺観察用の試料を、被験物質と接触させる接触ステップ、および
前記接触ステップにおける皮脂腺構造体を観察し、被験物質の皮脂産生調節作用を評価する評価ステップ、を含む、被験物質の評価方法。
【００９６】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００９７】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。以下において、各略語の意味は、以下のとおりである。【００９８】
〔略語の説明〕
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変培地
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
〔調製方法〕
（１．混合培地）
ＤＭＥＭとＦ−１２培地との混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地、体積比１：１）に、ＦＢＳを、ＦＢＳの濃度が１０体積％となるように添加して、混合培地を得た。【００９９】
（２．染色試薬Ａ）
核染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（株）製、商品名：ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を、核染色剤の濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ溶液に添加して、染色試薬Ａを得た。【０１００】
（３．染色試薬Ｂ）
脂肪染色試薬（和光純薬（株）製、商品名：ナイルレッド（Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ））を、その濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ溶液に添加して、染色試薬Ｂを得た。【０１０１】
（４．皮脂腺構造体の調製）
実体顕微鏡下で、ハサミを用い、皮膚組織から皮下組織を除去した。つぎに、ハサミおよびピンセットを用いて、皮下組織除去後の皮膚組織中の真皮から膠原繊維を除去することにより、皮脂腺が露出した３〜５ｍｍ角程度の四角形の皮脂腺構造体を得た。なお、皮脂腺構造体は、皮膚組織における皮脂腺と毛と毛包と表皮とを含有しているが、真皮および皮下組織を実質的に含有しておらず、皮脂腺が露出していた。【０１０２】
（５．生体基質の調製）
コラーゲン  タイプＩ−Ａ液（コラーゲン  タイプＩ−Ａの含有率：３質量％、新田ゼラチン（株）製）８００μＬと、１０×ＰＢＳ（組成：１３７０ｍＭ塩化ナトリウム、２７ｍＭ塩化カリウム、１００ｍＭリン酸水素二ナトリウム十二水和物および１８ｍＭリン酸二水素カリウム、ｐＨ７．４）１００μＬと、前記コラーゲン再構成緩衝液１００μＬ（組成：５０ｍＭ水酸化ナトリウム、２６０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび２００ｍＭ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ１０．０）とを混合することにより、コラーゲン含有液Ａを得た。【０１０３】
〔実施例１〕
（１）皮脂腺構造体中の核および皮脂の染色
前記（４．皮脂腺構造体の調製）で得られた皮脂腺構造体を、染色試薬Ａ中、室温（２５℃）で３０分間インキュベートすることにより、皮脂腺の最外層に存在する皮脂腺基底細胞の核を染色した。染色後の皮脂腺構造体を、ＰＢＳですすぐことにより洗浄を行った。【０１０４】
洗浄後の皮脂腺構造体を、染色試薬Ｂ中、室温（２５℃）で３０分間インキュベートすることにより、皮脂腺構造体に含まれる皮脂を染色した。染色後の皮脂腺構造体を、ＰＢＳですすぐことにより洗浄を行った。【０１０５】
（２）観察用試料の調製
核および皮脂を染色した皮脂腺構造体を空のチャンバー（ｉｂｉｄｉ製、商品名：μ−ｓｌｉｄｅ  ８  ｗｅｌｌ）のウェルに入れた。次いで、前記ウェルにコラーゲン含有液Ａを滴下し、前記チャンバーを３７℃で５分間インキュベートすることにより、皮脂腺構造体の４つの端部のうち対向する両端部を固定した。その後、皮脂腺構造体が固定されたチャンバーのウェルに、混合培地０．５ｍＬを添加した。このとき、皮脂腺構造体のうち１対の対向する端部は未固定であるため、ここから混合培地が入り込み、皮脂腺と接触することができる。完成した観察用試料の概略図を図２に示す。【０１０６】
（３）皮脂腺構造体の観察
前記（２）で得られた観察用試料を、生物用共焦点レーザー走査型顕微鏡（オリンパス（株）製の商品名：ＦＶ１２００を搭載した倒立顕微鏡（オリンパス（株）製、商品名：ＩＸ−８３））を用いて観察した。観察は、チャンバーの底面側から行われた。【０１０７】
１つの観察用試料（３〜５ｍｍ角程度の皮脂腺構造体）中には、数十個程度の皮脂腺が存在する。端部に近い皮脂腺は、生体基質と接触していると推測されるため、真ん中あたりに存在する１つの皮脂腺を観察対象とした。観察は、皮脂腺構造体を、５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間培養しながら経時的に行った。観察結果を図３〜図６に示す。【０１０８】
＜結果＞
図３は、観察開始時点での皮脂腺の観察結果を示す。図４は、図３の拡大図であり、（ａ）は、観察開始時点の皮脂の状態、および（ｂ）は、２４時間経過後の皮脂の状態を示す。また、図５および図６は、それぞれ図３の拡大図であり、（ａ）は、開始時点の核の状態、および（ｂ）は、２４時間経過後の核の状態を示す。【０１０９】
図３に示された結果から、観察された皮脂腺構造体は、皮脂の漏出が確認できないことから、皮脂腺基底細胞で覆われた皮脂腺であり、生体における皮脂腺本来の構造を維持していることが分かる。【０１１０】
図４に示された結果から、時間の経過に伴い、小さかった皮脂が合一して大きくなっていることが分かる。また、図５および６に示された結果から、時間の経過に伴い、核が消失していることが分かる。したがって、本観察方法によると、皮脂腺中の皮脂および核の動態が継時的に観察できることが分かった。図４〜６の結果より、時間の経過に伴い、合一して大きくなった皮脂が細胞を破裂させて（核の消滅）、細胞の外に放出されたことが推察される。【０１１１】
以上の結果より、本観察方法によると、生体に近い皮脂腺の動態を経時的に観察できることが示された。
【符号の説明】
【０１１２】
１  皮脂腺構造体
２  毛
３  毛包
４  表皮
５  皮脂腺
６  皮脂腺基底細胞
７  分化皮脂腺細胞
８  成熟皮脂腺細胞
９  皮脂
１０  生体基質（固定部材）
１１  培地
１２  支持体
１３  容器
１４  核
２０  試料
【要約】
生体に近い皮脂腺の動態を観察することができる、皮脂腺の観察方法を提供する。皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を、皮脂腺構造体中の観察対象の皮脂腺と支持体とが生物学的に接触しないように支持体に固定する固定ステップ、および前記固定ステップで得られた皮脂腺構造体を観察する観察ステップ、を含む、皮脂腺の観察方法である。【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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