(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)が存在せず、スペーサー又はスタッファーヌクレオチド配列(SNS)を含んでなり、SNSが当該ベクターに対して異種であり、開始コドンを含まず、約３〜約50ヌクレオチド長であり、SNSが配列番号１〜７のいずれか１つの配列を含んでなる、工学的に操作されたか又は天然に存在しないレトロウイルスベクター。
【請求項２】
興味対象のヌクレオチド配列(NOI)とNOIの発現を刺激するためのスペーサー又はスタッファーヌクレオチド配列(SNS)とを含有してNOIを発現する、工学的に操作されたか又は天然に存在しないレトロウイルスベクターであって、SNSが当該ベクターに対して異種であり、開始コドンを含まず、約３〜約50ヌクレオチド長であり、SNSが配列番号１〜７のいずれか１つの配列を含んでなるベクター。
【請求項３】
ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)を含まない請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
WPREがＸ領域を含有する、請求項１又は３に記載のベクター。
【請求項５】
SNSが約３〜約10ヌクレオチド長である請求項１〜４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項６】
SNSが配列番号１の配列を含んでなる請求項１〜４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７】
少なくとも１つの興味対象のヌクレオチド配列(NOI)を含んでなる請求項１及び４〜６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項８】
レンチウイルスベクターである請求項１〜７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項９】
レンチウイルスベクターが最小レンチウイルスベクターである請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
レンチウイルスベクターがヒト免疫不全ウイルス(HIV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ビスナ/マエディウイルス(VMV)、ヤギ関節炎-脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)及びウシ免疫不全ウイルス(BIV)からなる群より選択されるウイルス種に由来する請求項８又は９に記載のベクター。
【請求項１１】
Revをコードする核酸配列が非機能的Revをコードするよう破壊されている請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１２】
Tatをコードする核酸配列が、非機能的Tatをコードするよう破壊されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１３】
セントラルポリプリントラクト(cPPT)配列を含んでなる請求項１〜１２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１４】
ATGモチーフを含むgagパッケージングシグナルを含んでなる請求項１〜１３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１５】
ATGモチーフがATTGモチーフである請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
マルチシストロン性である請求項１〜１５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１７】
少なくとも１つの内部調節エレメントを含んでなる請求項１〜１６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１８】
内部調節エレメントがプロモーターである請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
内部調節エレメントが内部リボソーム進入部位(IRES)である請求項１７又は１８に記載のベクター。
【請求項２０】
(i)請求項１〜１９のいずれか１項に記載のベクター、(ii)レトロウイルスgag及びpolタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び(iii)(ii)のヌクレオチド配列がコードしない他の必須ウイルスパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、レトロウイルス由来のベクター粒子を作製するためのレトロウイルスベクターシステム。
【請求項２１】
Vpr、Vif、Tat、Nef又は類似の補助タンパク質の少なくとも１つをコードする核酸配列が、非機能的Vpr、Vif、Tat、Nef又は類似の補助タンパク質をコードするよう破壊されている請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
異種envタンパク質の少なくとも一部で偽型化されている請求項２０又は２１に記載のシステム。
【請求項２３】
異種envタンパク質が狂犬病ウイルス-G又はVSV-Gに由来する請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のシステムから作製されたウイルス粒子。
【請求項２５】
請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のシステムを形質導入した細胞。
【請求項２６】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のベクター、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のシステム、請求項２４に記載の粒子又は請求項２５に記載の細胞と、キャリア又は希釈剤とを含んでなる組成物。
【請求項２７】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のベクターを標的細胞に導入することにより、NOIを標的細胞に送達することを含んでなる、少なくとも１つのNOIを標的細胞に送達するインビトロ方法。
【請求項２８】
SNSを、NOIの下流に挿入することを含んでなり、SNSを有するレトロウイルスベクター中のNOIの発現がSNSを有しないレトロウイルスベクター中より高く、SNSが約３〜約50ヌクレオチド長であり、SNSが配列番号１〜７のいずれか１つの配列を含んでなる、WPREが存在しないレトロウイルス発現ベクターにおけるNOIの転写を増強する方法。
【請求項２９】
WPREがＸ領域を含有する請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
SNSが約３〜約10ヌクレオチド長である請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
ベクターがレンチウイルスベクターである請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
レンチウイルスベクターが最小レンチウイルスベクターである請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
レンチウイルスベクターがヒト免疫不全ウイルス(HIV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ビスナ/マエディウイルス(VMV)、ヤギ関節炎-脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)及びウシ免疫不全ウイルス(BIV)からなる群より選択されるウイルス種に由来する請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
参照による組込み
本明細書中で引用又は参照する全ての書類(「引用書類」)及び引用書類中で引用又は参照される全ての書類、並びに本明細書中又は参照により本明細書に組み込まれた任意の書類中で言及される製品に関する製造業者による指示書、説明、製品仕様書及び製品シートは、本宣言の結果、参照により本明細書中に組み込まれ、また、本発明の実施に用い得る。より具体的には、全ての参照書類は、各個の書類が個別具体的に参照により組み込まれると示されている場合と同様に、参照により組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、転写後調節エレメントの代わりにスペーサー又はスタッファーヌクレオチド配列(SNS)を含んでなり得るベクターシステムに関する。具体的には、本発明は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)配列の、レトロウイルスベクターシステムにおける興味対象のヌクレオチドの効率的発現を容易にする無関係の短いスペーサー配列での置換に関する。本発明はまた、興味対象のヌクレオチドを標的細胞に送達して発現させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
レトロウイルスベクターシステム(例えば、レンチウイルスベクターシステム)が送達システムとして提案されている。WO98/17815はアクセサリー遺伝子の多くの除去に関する。WO99/45126は、輸出についてのRev/RRE要件を克服し、RNA安定性を増強する手段としてのgag-pol配列のコドン最適化に関する。
Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)転写後調節エレメント(PRE)及びイントロンは機能的に等価であり得る[Huang, Z. M.及びYen, T. S.(1995) Mol. Cell. Biol. 15:3864-386])。ウッドチャック肝炎ウイルス(WHV)(HBVに近縁である)もまたPRE(以下、WPREと呼ぶ)を有する(米国特許第6,136,597号及び同第6,287,814号を参照)。レンチウイルスベクターへのWPREの挿入により、異なる種に跨る種々の細胞において、ルシフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質(GFP)のようなレポーター遺伝子の顕著な発現増強が生じた[Zufferey, R.ら(1999) J. Virol 73:2886-2892]。刺激は形質導入細胞のサイクル状態とは無関係であった。
【０００４】
WPREは、発現レベル増強におけるその機能に重要な３つのシス作用性配列を含有する。しかし、WPREは、加えて、約180塩基対(bp)のフラグメントを含有し、該フラグメントはWHV Ｘタンパク質オープンリーディングフレームの5'末端部をその関連プロモーターと共に含み得る。完全長Ｘタンパク質は腫瘍形成に関連付けられている[Flajolet, M.ら(1998) J. Virol. 72:6175-6180]。このことは、子宮内の胎仔マウスへのEIAVベクターの投与により直接証明されている[米国特許第7,419,829号]：野生型EIAVを含有するベクターを形質導入したマウスは肝臓腫瘍を発症した一方、WPREを欠くベクターを形質導入したマウスは肝臓腫瘍を発症しなかった。宿主ゲノムへのウイルスDNAの挿入に起因するmycファミリーオンコジーンのシス活性化による腫瘍形成活性は、WHV媒介性発ガンの鍵となる機序であることが知られている(Buendia, M. A.(1994), C. Brechot編「Primary liver cancer: etiological and progression factors」 CRC Press, Boca Raton, Fla., 211-224頁；Fourel, G.(1994), F. Tronche及びM. Yaniv編「Liver gene expression」 R. G. Landes Company, Austin, Tex., 297-343頁)。更に、ヒト肝細胞ガン腫において、Ｃ末端で短縮化されたＢ型肝炎ウイルスＸタンパク質は、完全長Ｘタンパク質より腫瘍形成性が強くあり得る(Tu Hら，2001 Biological impact of natural COOH-terminal deletions of hepatitis B virus X protein in hepatocellular carcinoma tissues. Cancer Res 61:7803-7810)。
【０００５】
米国特許第7,419,829号は、Ｘタンパク質を発現させることなく導入遺伝子の発現増強を維持するように設計された変異体WPRE配列で野生型WPRE配列を置換することに関する。WPREに対して、導入遺伝子発現を増強する能力に影響することなく行い得る変更が、数には制限があるものの存在すると考えられている。しかし、レトロウイルス逆転写酵素は忠実度が低いことが知られている(平均で、逆転写された10,000ヌクレオチドあたり１つのエラーが組み込まれる)。したがって、変異WPREが腫瘍形成能を有する機能的な野生型配列に復帰する可能性が残る。
Realら(Appl Microbiol Biotechnol[2011]91:1581)は、Ramezaniら(Molecular Therapy [2000] 2(5):458)が示したように、レンチウイルスベクターにおけるWPREの除去が導入遺伝子発現を顕著に低減させることを示している。Johnsonら(Gene Therapy[2013]20:607)は、導入遺伝子が高発現に関して既に最適化されているレンチウイルスシステムにおいて、WPREの除去が導入遺伝子発現に対して有意な効果を有しないことを示した：しかし、この著者らは、WPREのスタッファー配列での置換には何ら言及していない。EP1757702は、WPREの非存在下で導入遺伝子の高発現を支持することができるγ-レトロウイルスベクターシステムを記載している：しかし、この著者らもまた、WPREのスタッファー配列での置換には何ら言及していない。
本願における如何なる書類の引用又は特定も、当該書類が本発明に対する先行技術として利用し得ることを認めるものではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明者らは、驚くべきことに、WPREの短い無関係のヌクレオチド配列での置換により、レトロウイルス及びレンチウイルス発現ベクターからの、興味対象の異種遺伝子又はヌクレオチドの発現レベルの増強が促進されることを示した。よって、Ｘタンパク質のORFの完全除去により、この配列の腫瘍形成能が取り除かれ、これらベクターの治療的使用に関する安全性プロフィールが増大する。
本発明の第１の観点によれば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)を欠き、WPREの代わりにスペーサーヌクレオチド配列が挿入されている工学的に操作された核酸分子が提供される。１つの好適な実施形態において、単離された核酸分子は配列番号１の配列[TCTAGA]を含んでなってもよい。WPREはＸ領域を含有していてもよい。
【０００７】
本発明の第２の観点において、少なくとも１つの興味対象のヌクレオチド配列(NOI)及び本発明の第１の観点に従う単離された核酸分子を含んでいてもよいレトロウイルスベクターゲノムが提供される。
好ましくは、レトロウイルスベクターゲノムは、レンチウイルスベクターゲノムであってもよい。具体的には、レンチウイルスベクターゲノムは、最小レンチウイルスベクターゲノムであってもよい。レンチウイルスベクターゲノムは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ビスナ/マエディウイルス(VMV)、ヤギ関節炎-脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)及びウシ免疫不全ウイルス(BIV)からなる群より選択されるウイルス種に由来してもよい。
別の１つの好適な実施形態において、Revをコードする核酸配列又はその機能的等価物は、機能的Revをコードすることができないか又はベクターゲノムから除去されるよう破壊されていてもよい。
【０００８】
更に別の１つの好適な実施形態において、Tatをコードする核酸配列は、機能的Tatをコードすることができないか又はベクターゲノムから除去されるよう破壊されていてもよい。
本発明の１つの好適な実施形態は、セントラルポリプリントラクト(cPPT)配列を含んでなってもよいレトロウイルスベクターゲノムを提供する。別の１つの好適な実施形態において、レトロウイルスベクターゲノムは、ATGモチーフを有するgagパッケージングシグナルを含んでなってもよく、ここで、ATGモチーフはATTGモチーフであってもよい。
別の１つの好適な実施形態において、レトロウイルスベクターゲノムはマルチシストロン性であってもよく、少なくとも１つの内部調節エレメントを含んでなってもよい。好ましくは、内部調節エレメントはプロモーターであってもよいし、内部リボソーム進入部位(IRES)であってもよい。
【０００９】
本発明の第３の観点によれば、レトロウイルス由来ベクター粒子を作製するためのレトロウイルスベクターシステムが提供され、このベクターシステムは、(i)本発明の第２の観点に従うレトロウイルスベクターゲノム、(ii)レトロウイルスgag及びpolタンパク質をコードするヌクレオチド配列、(iii)(ii)のヌクレオチド配列がコードしない他の必須ウイルスパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列を含んでなってもよい。好ましくは、当該粒子が由来するレトロウイルスのVpr、Vif、Tat、Nef又は類似の補助遺伝子の少なくとも１つをコードする核酸配列は、機能的Vpr、Vif、Tat、Nef又は類似の補助タンパク質をコードすることができないか又はそのベクターシステムから除去されるよう破壊されていてもよい。
好ましくは、ベクターシステムは、異種envタンパク質の少なくとも一部で偽型化されていてもよい。具体的には、異種envタンパク質は、狂犬病ウイルス-G又はVSV-Gに由来してもよい。
【００１０】
本発明の第５の観点において、本発明のレトロウイルスベクターシステムから作製されたウイルス粒子が提供される。
本発明の第６の観点は、本発明のレトロウイルスベクターシステムを形質導入されている細胞を提供する。
本発明の第７の観点において、本発明のレトロウイルスベクターゲノムをキャリア又は希釈剤と共に含んでなっていてもよい組成物が提供される。
本発明の第８の観点は、本発明のウイルス粒子をキャリア又は希釈剤と共に含んでなっていてもよい組成物を提供する。
本発明の第９の観点は、本発明のレトロウイルスベクターゲノムを標的細胞に導入することによりNOIが標的細胞に送達されることを含んでなっていてもよい、少なくとも１つのNOIを標的細胞に送達する方法を提供する。
本発明の１つの更なる観点は、本明細書に示されるようなスペーサー又はスタッファー配列を提供する。
【００１１】
したがって、如何なる既知の物、その物を製造する方法及びその物を使用する方法も本発明に包含しないことが本発明の１つの目的であり、その結果、本出願人は、如何なる既知の物、その物を製造する方法及びその物を使用する方法も放棄する権利を留保し、ここに表明する。更に、本発明は、USPTO(35 U.S.C. §112第一パラグラフ)の記載要件及び実施可能要件もEPO(EPC Article 83)の記載要件及び実施可能要件を満たさない如何なる物、その物を製造する方法及びその物を使用する方法も本発明の範囲に含めることを意図しておらず、その結果、本出願人は、如何なる以前に記載された物、その物を製造する方法及びその物を使用する方法も放棄する権利を留保し、ここに表明する。
【００１２】
本開示、特に特許請求の範囲及び/又は段落において、「含んでなる」などの用語は、米国特許法においてその用語に帰せられる意味を有することがある；例えば、前記用語は「含む」などを意味することがある；「〜から本質的になる」のような用語は米国特許法においてその用語に帰せられる意味を有することがある；例えば、前記用語は明示的に言及されていないエレメントを許容するが、先行技術に見出されるか又は本発明の基本的若しくは新規な特徴に影響するエレメントを排除することに留意すべきである
これら及び他の実施形態は、以下の詳細な説明に開示されているか又は該説明から自明であり、そして該説明により包含されている。
【００１３】
図面の簡単な説明
以下の詳細な説明(例証として示されるのであって、記載された具体的実施形態のみに本発明を限定することを意図されたものではない)は、添付図面との組合せで最も十分に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、pELNS-NY-ESO ADB152と名付けられた元のトランスファープラスミドの概略地図である。
【図２】図２は、pELNS-NY-ESO NoX ADB693と名付けられたプラスミドの概略地図である。pELNS-NY-ESO ADB152プラスミドのWPRE領域に改変がなされており、3'末端でＸプロモーター及び短縮化Ｘタンパク質が除去されている。
【図３】図３は、pELNS-NY-ESO NoW ADB694と名付けられたプラスミドの概略地図である。pELNS-NY-ESO ADB152プラスミドのWPRE領域に改変がなされており、WPRE領域が６ヌクレオチド(TCTAGA)、すなわちXbaI制限酵素部位で置換されている。
【図４】図４は、pELNS Tomato-Luc ADB73と名付けられたプラスミドの概略地図である。
【図５】図５は、pELNS Luc ADB678と名付けられたプラスミドの概略地図である。
【図６】図６は、pELNS LucNoX ADB679と名付けられたプラスミドの概略地図である。
【図７】図７は、pELNS LucNoW ADB680と名付けられたプラスミドの概略地図である。
【図８】図８は、Luc、LucNoX及びLucNoWレンチウイルスベクター調製物に存在するレンチウイルスベクター関連p24 gagキャプシドタンパク質のレベルを示すグラフである。
【図９】図９は、Luc、LucNoX及びLucNoWベクターの系列希釈物を形質導入したSupT1細胞におけるルシフェラーゼ活性の発現を示すグラフである。
【図１０】図10は、SupT1並びにBuff504、Buff505、Buff506及びBuff507と名付けられた４人の異なるドナーからの初代Ｔ細胞におけるルシフェラーゼ活性の発現を示すグラフである。
【図１１】図11は、完全長WPREを含有するか又はWPREがスタッファー配列で置換されたルシフェラーゼ発現導入遺伝子プラスミドに由来するLVを形質導入したSupT1細胞により発現されるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図１２】図12は、NY-ESO1、NY-ESO1 WPRE NoX又はNY-ESO1 NoW 6merの系列希釈物を形質導入したSupT1細胞の表面でのNYESO-1 TCRの発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の種々の好適な特徴及び実施形態を、ここで、非限定的例証として説明する。一般的には、本明細書で言及する技法は当該分野で周知であるが、具体的には、Sambrookら，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)及びAusubelら，Short Protocols in Molecular Biology (1999)第４版, John Wiley & Sons, Inc.(並びにCurrent Protocols in Molecular Biologyの完全版)を挙げることができる。
本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結された」は、記載された成分が、意図された様式で機能することを可能にする関係にあることを意味する。
ウッドチャック肝炎ウイルス(WHV)転写後調節エレメント(WPRE)は、レンチウイルスベクターを含む幾つかの異なるベクタータイプからの発現を増強し得る[米国特許第6,136,597号；同第6,287,814号；Zufferey, R.ら(1999) J. Virol. 73:2886-92]。理論に拘束されることは望まないが、この増強は、転写後レベルでのRNAプロセシングの改善(これは、核転写物レベルの増大をもたらす)に起因すると考えられる。mRNA安定性の２倍増大もまたこの増強に寄与する[Zufferey, R.ら，前出]。WPREを含有しない場合に対する、WPREを含有する転写物からのタンパク質発現の増強レベルは約２〜５倍と報告されており、転写物レベルの増加と良好に相関している。このことは幾つかの異なる導入遺伝子で証明されている(Zufferey, R.ら，前出)。
【００１６】
WPREは、発現レベル増強におけるその機能に重要な３つのシス作用性配列を含有する。加えて、WPREは、WHVのＸタンパク質ORF(完全長ORFは425bp)の5'末端部をその関連プロモーターと共に含み得る約180bpフラグメントを含有する。Ｘプロモーターから開始される転写物の翻訳により、Ｘタンパク質のNH2末端60アミノ酸であるタンパク質が生成される。この短縮型Ｘタンパク質は、短縮型Ｘタンパク質配列が宿主細胞ゲノムに特定の遺伝子座で組み込まれた場合には特に、腫瘍形成を促進し得る[Balsano, C.ら(1991) Biochem. Biophys Res. Commun. 176:985-92；Flajolet, M.ら(1998) J. Virol. 72:6175-80；Zheng, Y. W.ら(1994) J. Biol. Chem. 269: 22593-8；Runkel, L.ら(1993) Virology 197:529-36]。更に、Ｃ末端で短縮されたＸタンパク質は、完全長Ｘタンパク質より腫瘍形成性が強くあり得る(Tu Hら，2001 Cancer Res 61:7803-7810)。したがって、短縮型Ｘタンパク質の発現は、興味対象の細胞へ送達される場合には、腫瘍形成を促進することがあり、そのために野生型WPRE配列の安全な使用が妨げられる。
本明細書で使用する場合、WPREの「Ｘ領域」は、Ｘタンパク質ORFの少なくとも最初の60アミノ酸(翻訳開始コドンを含む)及びその関連プロモーターを有するものとして定義される。「機能的な」Ｘタンパク質は、本明細書中では、興味対象の細胞で発現したときに腫瘍形成又は形質転換表現型を促進することができる短縮型Ｘタンパク質として定義される。「非機能的な」Ｘタンパク質は、本願に関しては、興味対象の細胞において腫瘍形成を促進することができないＸタンパク質として定義される。
【００１７】
本発明者は、WPRE配列をスペーサー又はスタッファーヌクレオチド配列(SNS)で置換し、そして、効率的な転写が依然として生じること：このことから、Ｘタンパク質ORFにより媒介される腫瘍形成の可能性が否定されることを見出した。スペーサー又はスタッファーヌクレオチド配列(SNS)は、任意の配列であり得、有利にはWPRE配列以外のランダム及び/又は非コーディング配列である(有利には、かつ、開始コドンを含まない)任意の配列であり得る。好ましくは、スタッファーはまた、多重スタッファー配列の除去を可能にするために、稀に切断する制限酵素の制限酵素部位(すなわち、分析する核酸に存在しない可能性が高い制限酵素部位)であって、ライブラリベクターの多重クローニング領域に存在しない制限酵素部位を含有する。
よって、本発明は、興味対象のヌクレオチド配列(NOI)の下流に挿入されたスペーサー又はスタッファーヌクレオチド配列(SNS)を含むが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)を含まない、工学的に操作されたか又は天然に存在しないレトロウイルスベクターであって、SNSがベクターに対して異種であり、停止コドンを含まない、ベクターを提供する。SNSはNOI配列の直ぐ下流にあってもよい。換言すれば、本発明は、WPREがSNSで置換された、工学的に操作されたか又は天然に存在しないレトロウイルスベクターを提供する。
【００１８】
有利には、スペーサー又はスタッファーヌクレオチド配列(SNS)は、約３ヌクレオチド、約４ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約６ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約８ヌクレオチド、約９ヌクレオチド、約10ヌクレオチド、約11ヌクレオチド、約12ヌクレオチド、約13ヌクレオチド、約14ヌクレオチド、約15ヌクレオチド、約16ヌクレオチド、約17ヌクレオチド、約18ヌクレオチド、約19ヌクレオチド、約20ヌクレオチド、約21ヌクレオチド、約22ヌクレオチド、約23ヌクレオチド、約24ヌクレオチド、約25ヌクレオチド、約26ヌクレオチド、約27ヌクレオチド、約28ヌクレオチド、約29ヌクレオチド、約30ヌクレオチド、約31ヌクレオチド、約32ヌクレオチド、約33ヌクレオチド、約34ヌクレオチド、約35ヌクレオチド、約36ヌクレオチド、約37ヌクレオチド、約38ヌクレオチド、約39ヌクレオチド、約40ヌクレオチド、約41ヌクレオチド、約42ヌクレオチド、約43ヌクレオチド、約44ヌクレオチド、約45ヌクレオチド、約46ヌクレオチド、約47ヌクレオチド、約48ヌクレオチド、約49ヌクレオチド又は約50ヌクレオチドである。
【００１９】
別の１つの実施形態において、スペーサー又はスタッファーヌクレオチド配列(SNS)は、約３〜50ヌクレオチド、約５〜45ヌクレオチド、約７〜40ヌクレオチド、約10〜30ヌクレオチド又は約15〜25ヌクレオチドであってもよい。１つの特に有利な実施形態において、スペーサー又はスタッファーヌクレオチド配列(SNS)は、約３〜20ヌクレオチド、約３〜18ヌクレオチド、約３〜16ヌクレオチド、約３〜14ヌクレオチド、約３〜12ヌクレオチド、約３〜10ヌクレオチド、約３〜９ヌクレオチド、約３〜８ヌクレオチド、約３〜７ヌクレオチド又は約３〜５ヌクレオチドであってもよい。SNSは、50〜200ヌクレオチド長、75〜175ヌクレオチド長又は100〜150ヌクレオチド長であってもよい。
好ましくは、このスペーサー又はスタッファーヌクレオチド配列(SNS)は、10ヌクレオチド未満である。スペーサー又はスタッファー配列は本発明の更なる１つの観点を構成する。
【００２０】
遺伝子療法にウイルスベクターを使用する着想は知られている(Verma及びSomia (1997) Nature 389:239-242)。
多くのレトロウイルスが存在する。本願について、用語「レトロウイルス」には次のものが含まれる：マウス白血病ウイルス(MLV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、フジナミ肉腫ウイルス(FuSV)、モロニーマウス白血病ウイルス(Mo-MLV)、FBRマウス骨肉腫ウイルス(FBR MSV)、モロニーマウス肉腫ウイルス(Mo-MSV)、エーベルソンマウス白血病ウイルス(A-MLV)、トリ骨髄球症ウイルス-29(MC29)及びトリ赤芽球症ウイルス(AEV)並びに全ての他のレトロウイルス科ウイルス(レンチウイルスを含む)。
レトロウイルスの詳細なリストは、Coffinら(「Retroviruses」 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press, J M Coffin, S M Hughes, H E Varmus編 758-763頁)に見出し得る。
レンチウイルスもまたレトロウイルス科に属するが、レンチウイルスは分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染し得る[Lewisら(1992) EMBO J. 3053-3058]。
【００２１】
レンチウイルス群は、「霊長類」レンチウイルス及び「非霊長類」レンチウイルスに分け得る。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒト後天性免疫不全症候群(AIDS)の原因因子、及びサル免疫不全ウイルス(SIV)が挙げられる。非霊長類レンチウイルス群としては、プロトタイプ「スローウイルス」ビスナ/マエディウイルス(VMV)、並びに関連するヤギ関節炎-脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、より最近に報告されたネコ免疫不全ウイルス(FIV)及びウシ免疫不全ウイルス(BIV)が挙げられる。
幾つかのレンチウイルスのゲノム構造についての詳細は、当該分野に見出し得る。例証として、HIV及びEIAVについての詳細は、NCBI Genbankデータベースに見出し得る(すなわち、それぞれゲノムアクセッション番号AF033819及びAF033820)。また、HIVバリアントの詳細は、米国ロスアラモス国立研究所(Los Alamos National Laboratory)が維持管理するHIVデータベースに見出し得る。EIAVクローンの詳細は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)が維持管理するNCBIデータベースに見出し得る。米国特許第7,790,419号；同第7,585,676号；同第7,419,829号；同第7,351,585号；同第7,303,910号；同第7,198,784号；同第7,070,994号；同第6,924,123号；同第6,818,209号；同第6,808,922号；同第6,800,281号；同第6,783,981号；同第6,541,248号；同第6,312,683号；及び同第6,312,682号もまた参照。
【００２２】
感染プロセスの間に、レトロウイルスは、当初、特定の細胞表面レセプターに付着する。その後、罹患性宿主細胞への進入に際して、レトロウイルスRNAゲノムは、ウイルスがコードする逆転写酵素(親ウイルス内部に保持される)によりDNAにコピーされる。このDNAは宿主細胞の核に輸送され、そこで、その後宿主ゲノムに組み込まれる。この段階で、これは、代表的には、プロウイルスと呼ばれる。プロウイルスは、細胞分裂の間、宿主染色体中で安定であり、他の細胞性遺伝子と同様に転写される。プロウイルスは、より多くのウイルスを産生するために必要なタンパク質及びその他の因子をコードする。産生されたウイルスは、時に「出芽」と呼ばれるプロセスにより細胞から離れ得る。
各レトロウイルスゲノムは、ビリオンタンパク質及び酵素をコードするgag、pol及びenvと呼ばれる遺伝子を含んでなり得る。これら遺伝子には、両端部で、長末端反復(LTR)と呼ばれる領域が隣接している。LTRは、プロウイルスの組込み及び転写を担っている。これらはまた、エンハンサー-プロモーター配列として働く。換言すれば、LTRはウイルス遺伝子の発現を制御し得る。レトロウイルスRNAのキャプシド形成は、ウイルスゲノムの5'末端部に位置するpsi配列によって起きる。
LTR自体は、U3、Ｒ及びU5と呼ばれる３つのエレメントに分割し得る同一配列である。U3はRNAの3'末端部に特有な配列に由来する。ＲはRNAの両端部で繰り返される配列に由来し、U5はRNAの5'末端部に特有な配列に由来する。この３つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルス間で相当変化し得る。
【００２３】
ウイルスゲノムについては、転写開始部位は、左側LTR中のU3とＲとの境界部にあり、ポリ(Ａ)付加(終止)部位は、右側LTR中のＲとU5との境界部にある。U3はプロウイルスの転写制御エレメント(プロモーターと、細胞性転写活性化因子タンパク質及び幾つかの場合にはウイルス性転写活性化因子タンパク質に応答性である多重エンハンサー配列とを含む)のほとんどを含有する。幾つかのレトロウイルスは、遺伝子発現の調節に関与するタンパク質をコードする以下の遺伝子tat、rev、tax及びrexの任意の１以上を有する。
構造遺伝子gag、pol及びenv自体に関しては、gagはウイルスの内部構造タンパク質をコードする。gagタンパク質は、成熟タンパク質MA(マトリクス)、CA(キャプシド)及びNC(ヌクレオキャプシド)にタンパク質分解的にプロセシングされる。pol遺伝子は逆転写酵素(RT)(DNAポリメラーゼを含む)、関連RNase H及びインテグラーゼ(IN)(ゲノム複製を媒介する)をコードする。env遺伝子は、ビリオンの表面(SU)糖タンパク質及び膜貫通(TM)タンパク質をコードする。これらタンパク質は、細胞レセプタータンパク質と特異的に相互作用する複合体を形成する。この相互作用は、最終的には、ウイルス膜と細胞膜との融合により感染に至る。
レトロウイルスはまた、gag、pol及びenv以外のタンパク質をコードする「更なる」遺伝子を含み得る。更なる遺伝子の例としては、HIVでは、vif、vpr、vpx、vpu、Tat、rev及びnefの１以上が挙げられる。EIAVは、例えば、更なる遺伝子S2及びdUTPaseを有する。
【００２４】
更なる遺伝子がコードするタンパク質は、種々の機能を発揮し、そのうちの幾つかは、細胞性タンパク質が提供する機能の複製であり得る。EIAVでは、例えば、tatはウイルス性LTRの転写活性化因子として作用する。tatは、TARと呼ばれる安定なステムループRNA二次構造に結合する。Revは、rev応答エレメント(RRE)を通じてウイルス性遺伝子の発現を調節し、協調させる。これら２つのタンパク質の作用機序は、霊長類ウイルスにおける同様な機序に広範に類似すると考えられる。S2の機能は未知である。加えて、EIAVタンパク質Ttmは、膜貫通タンパク質の開始時にenvコーディング配列にスプライスされるtatの第１エキソンがコードするものとして同定されている。
レトロウイルスベクターシステムは、送達システム、とりわけ、１以上の興味対象の部位にNOIを移入するための送達システムとして提案されている。移入は、インビトロ、エクスビボ、インビボ又はそれらの組合せで起こり得る。
組換えレトロウイルスベクター粒子は、NOIをレシピエント細胞に形質導入することができる。細胞内で、ベクター粒子のRNAゲノムがDNAに逆転写され、レシピエント細胞のDNAに組み込まれる。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語「ベクターゲノム」とは、レトロウイルスベクター粒子に存在するRNA構築物及び/又は組み込まれたDNA構築物をいう。この用語はまた、そのようなRNAゲノムをコードすることができる別の又は単離されたDNA構築物を包含する。レトロウイルス又はレンチウイルスゲノムは、レトロウイルス又はレンチウイルスに由来し得る少なくとも１つの構成部分を含んでなり得る。用語「由来し得る」は、通常の意味で使用され、ウイルス(例えば、レンチウイルス)から必ずしも取得されることを要しないが、代わりに当該ウイルスから誘導し得るヌクレオチド配列又はその一部を意味するものとして使用される。例証として、配列は、合成的に作製されてもよいし、組換えDNA技法を用いて作製されてもよい。好ましくは、ゲノムは、psi領域(又はキャプシド形成を引き起こすことができる類似の成分)を含んでなり得る。
ウイルスベクターゲノムは、好ましくは「複製欠損」であり、このゲノムは、単独では、独立に複製してレシピエント細胞内で感染性ウイルス粒子を産生することを可能にするに十分な遺伝情報を含まない。１つの好適な実施形態において、ゲノムは、機能的なenv、gag又はpol遺伝子を欠く。
ウイルスベクターゲノムは長末端反復(LTR)の幾らかを含んでなってもよいし、全てを含んでなってもよい。好ましくは、ゲノムは、プロウイルスの組込み及び転写を媒介することができるLTRの少なくとも一部又は類似配列を含んでなってもよい。配列はまた、エンハンサー-プロモーター配列を含んでなってもよいし、エンハンサー-プロモーター配列として作用してもよい。
【００２６】
本発明の第２の観点のウイルスベクターゲノムは、キットとして提供されてもよい。例えば、キットは、(i)NOI及び内部調節配列(例えば、プロモーター又はIRES配列)を含有するプラスミド；及び(ii)NOI及び内部調節配列をウイルスゲノムにクローニングするに適切な制限酵素認識部位を有するレトロウイルスゲノム構築物を含んでなってもよい。
レトロウイルスベクター粒子の作製に必要な成分であって、同じ細胞に共導入された別個のDNA配列上の成分の別々の発現により、治療用遺伝子を保有する欠損レトロウイルスゲノムを有するレトロウイルス粒子が生じることは公知である(例えば、Miller 1992による概説)。この細胞はプロデューサー細胞と呼ばれる(下記参照)。
プロデューサー細胞を作製する一般的な手順が２つ存在する。１つ手順では、レトロウイルスGag、Pol及びEnvタンパク質をコードする配列を、細胞に導入して細胞ゲノムに安定的に組み込む；パッケージング細胞株と呼ばれる安定な細胞株が作製される。パッケージング細胞株は、レトロウイルスRNAのパッケージングに必要なタンパク質を産生するが、psi領域を欠いているためキャプシド形成を引き起こすことができない。しかし、psi領域を有するベクターゲノムを、パッケージング細胞株に導入すると、ヘルパータンパク質が、psi陽性組換えベクターRNAをパッケージングして組換えウイルスストックを産生し得る。これを使用して、NOIをレシピエント細胞に形質導入し得る。ゲノムがウイルスタンパク質の産生に必要な全ての遺伝子を欠く組換えウイルスは、一度だけ感染する可能性があるが、増殖し得ない。よって、潜在的に有害なレトロウイルスを生じさせることなく、NOIが宿主細胞ゲノムに導入される。入手可能なパッケージング株のまとめは、「Retroviruses」(1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press  M Coffin, S M Hughes, H E Varmus編 449頁)に提供されている。
【００２７】
本発明はまた、本発明のウイルスベクターゲノムを含んでなってもよいパッケージング細胞株を提供する。例えば、パッケージング細胞株には、ゲノムを含んでなってもよいウイルスベクターシステムが形質導入されていてもよいし、RNAゲノムをコードすることができるDNA構築物を保有するプラスミドがトランスフェクトされていてもよい。本発明はまた、このような細胞が産生するレトロウイルス(又はレンチウイルス)ベクター粒子を提供する。
第２のアプローチは、レトロウイルスベクター粒子を作製するに必要な３つの異なるDNA配列、すなわち、envコーディング配列と、gag-polコーディング配列と、１以上のNOIを含有する欠損レトロウイルスゲノムを、一過性トランスフェクションにより、細胞に同時に導入することであり、この手順は一過性三重トランスフェクションと呼ばれる[Landau & Littman (1992) J Virol 66:8 5110-5113；Pearら(1993) Proc natl Acad Sci USA 90:18 8392-6]。三重トランスフェクション手順は最適化されている(Soneokaら，Nucleic Acids Res (1995) 23:4 628-633；Finerら(1994) Blood 83:43-50]。WO 94/29438は、この多重DNA一過性トランスフェクション法を用いて、インビトロでのプロデューサー細胞の産生を記載する。
ベクターゲノムの補充に必要なウイルスシステム成分は、細胞へのトランスフェクションのための１以上の「プロデューサープラスミド」に存在していてもよい。
【００２８】
本発明はまた、Ｘ領域を含有するWPREを、スペーサー又はスタッファーヌクレオチド配列(SNS)で置換することを含んでなる、Ｘ領域を含有するWPREを含むレトロウイルスベクターに関連する腫瘍形成性を低減させる方法を提供する。
SNSは本明細書で定義したとおりであり得る。
Ｘ領域を含有するWPREのSNSでの置換は、驚くべきことに、細胞にトランスフェクトしたときのベクターの腫瘍形成効果を低減させるが、複製の高い忠実性及び導入遺伝子複製の効率的増強を保持する。したがって、このレトロウイルスベクターの安全性プロフィールは、WPRE/Ｘ領域配列を含有するベクターのものより増大している。
本発明はまた、(i)本発明の第２の観点に従うレトロウイルスゲノム；(ii)レトロウイルスgag及びpolタンパク質をコードするヌクレオチド配列；(iii)(ii)のヌクレオチド配列がコードしない他の必須ウイルスパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列を含んでなっていてもよい、レトロウイルス由来粒子を作製するためのベクターシステムを提供する。
好ましくは、粒子が由来するレトロウイルスからのVpr、Vif、Tat、Nef又は類似の補助遺伝子の少なくとも１つをコードする核酸配列は、機能的なVpr、Vif、Tat、Nef又は類似の補助タンパク質をコードできないか又はシステムから除去されるよう破壊されている。
【００２９】
本発明はまた、このベクターシステムをトランスフェクトされた細胞及びこの細胞が産生するレトロウイルスベクター粒子を提供する。好ましくは、gag-pol配列は、特定のプロデューサー細胞での使用についてコドン最適化されている(下記参照)。
iii)のヌクレオチド配列によりコードされるenvタンパク質は、同種のレトロウイルス又はレンチウイルスenvタンパク質であってもよい。或いは、異種envであってもよいし、非レトロ又はレンチウイルスのenvであってもよい(下記の「偽型化」の項を参照)。
用語「ウイルスベクターシステム」は、一般に、ウイルス粒子産生に必要な他の成分と組み合わせて宿主細胞でウイルス粒子を産生するときに使用され得るキットを意味するように使用される。例えば、レトロウイルスベクターゲノムは、ウイルスの複製に必要とされる遺伝子の１以上を欠いていてもよい。これを、キットにおいて、(例えば１以上のプロデューサープラスミド上の)更なる補完的なヌクレオチド配列と組み合わせてもよい。感染性ウイルス粒子の産生に必要な成分は、ゲノムとプロデューサープラスミドとのコトランスフェクションにより提供されるべきである。
或いは、補完的なヌクレオチド配列は、キットに含まれるパッケージング細胞株内に安定的に存在していてもよい。
【００３０】
本発明はまた、RNAゲノムをレシピエント細胞に送達することができるレトロウイルスベクターシステムであって、ゲノムがレンチウイルスの野生型ゲノムより長いベクターシステムに関する。ベクターシステムは、例えば、EIAVベクターシステムであってもよい。
好ましくは、ベクターシステムのRNAゲノムは、野生型ゲノムより５％まで、より好ましくは10％まで、更には30％まで多い塩基を有する。好ましくは、RNAゲノムは野生型ゲノムより約10％長い。例えば、野生型EIAVは約８kbのRNAゲノムを含んでなってもよい。本発明のEIAVベクターシステムは、8.8kbまで(好ましくは約8.8kb)のRNAゲノムを有していてもよい。
好ましくは、本発明のレトロウイルスベクターシステムは、自己不活化性(SIN)ベクターシステムである。
例証として、自己不活化性レトロウイルスベクターシステムは、3' LTRのU3領域中の転写エンハンサー又は該エンハンサー及びプロモーターを欠失させることにより構築されている。１回のベクター逆転写及び組込みの後、これら変更は5' LTR及び3' LTRの両方にコピーされ、転写不活性なプロウイルスが産生される。しかし、このベクター中のLTRに対して内側のプロモーターは依然として転写活性である。このストラテジは、内側に配置された遺伝子からの転写に対する、ウイルス性LTR中のエンハンサー及びプロモーターの影響を排除するために用いられている。このような影響としては、転写増大又は転写抑制が挙げられる。このストラテジは、3' LTRからゲノムDNAへの下流転写を排除するためにも使用され得る。これは、内因性オンコジーンの外来性活性化を防止することが重要であり得るヒト遺伝子療法では、特に懸念される(Yuら(1986) PNAS 83:3194-98；Naviauxら(1996) J. Virol. 70:5701-5；Iwakumaら(1999) Virol. 261:120-32)。
好ましくは、本発明のプロデューサー細胞からの高力価調節レンチウイルスベクターの産生を容易にするリコンビナーゼ支援機序を用いる。
【００３１】
本明細書で使用する場合、用語「リコンビナーゼ支援システム」としては、バクテリオファージP1のCreリコンビナーゼ/loxP認識部位又はS. cerevisiaeの部位特異的FLPリコンビナーゼ(34bp FLP認識標的(FRT)間の組換え事象を触媒する)を用いるシステムが挙げられるが、これらに限定されない。
S. cerevisiaeの部位特異的FLPリコンビナーゼ(34bp FLP認識標的(FRT)間の組換え事象を触媒する)は、リコンビナーゼ支援組換え事象を利用して、高レベルのプロデューサー細胞株を作製するために、DNA構築物に構築される(Karremanら(1996) NAR 24:1616-1624)。バクテリオファージP1のCreリコンビナーゼ/loxP認識部位を用いる類似システムが開発されている(Vaninら(1997) J. Virol 71:7820-7826)。これは、高力価レンチウイルスプロデューサー細胞株が作製されるように、レンチウイルスゲノム中に構築された。
プロデューサー/パッケージング細胞株を用いることにより、その後の形質導入、例えば、対象部位(例えば、成体脳組織)での形質導入のために、レトロウイルスベクター粒子を多量に増殖させて単離すること(例えば、適切な力価のレトロウイルスベクター粒子を作製すること)が可能となる。プロデューサー細胞株が、通常、ベクター粒子の大規模産生に関して、より良好である。
【００３２】
一過性トランスフェクションは、パッケージング細胞法より多くの利点を有する。この点に関して、一過性トランスフェクションは、安定なベクター産生細胞株の作製に長時間要することを回避し、ベクターゲノム又はレトロウイルスパッケージング成分が細胞に対して毒性である場合に使用される。ベクターゲノムが毒性遺伝子又は宿主細胞の複製と干渉する遺伝子(例えば、細胞サイクルの阻害因子又はアポトーシスを誘導する遺伝子)をコードする場合、安定なベクター産生細胞株を作製することは困難であり得るが、一過性トランスフェクションは、細胞が死ぬ前にベクターを産生するように使用し得る。また、安定なベクター産生細胞株から得られるレベルより良好なベクター力価レベルを生じる細胞株が、一過性感染を利用して開発されている(Pearら1993, PNAS 90:8392-8396)。
プロデューサー細胞/パッケージング細胞は任意の適切な細胞タイプであってよい。プロデューサー細胞は、一般に、哺乳動物細胞であるが、例えば昆虫細胞であってもよい。
本明細書で使用する場合、用語「プロデューサー細胞」又は「ベクター産生細胞」とは、レトロウイルスベクター粒子の産生に必要な全てのエレメントを含有する細胞をいう。
好ましくは、プロデューサー細胞は、安定なプロデューサー細胞株から取得し得る
好ましくは、プロデューサー細胞は、誘導した安定なプロデューサー細胞株から取得し得る。
好ましくは、プロデューサー細胞は、誘導したプロデューサー細胞株から取得し得る。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「誘導したプロデューサー細胞株」は、マーカー遺伝子の高発現に関してスクリーニング、選択された形質導入プロデューサー細胞株である。この細胞株はレトロウイルスゲノムからの高レベル発現を支持する。用語「誘導したプロデューサー細胞株」は、用語「誘導した安定なプロデューサー細胞株」及び用語「安定なプロデューサー細胞株」と互換可能に使用される。
好ましくは、誘導したプロデューサー細胞株としては、レトロウイルス及び/又はレンチウイルスプロデューサー細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、誘導したプロデューサー細胞株は、HIV又はEIAVプロデューサー細胞株であり、より好ましくはEIAVプロデューサー細胞株である。
好ましくは、エンベロープタンパク質配列及びヌクレオキャプシド配列は全て、プロデューサー及び/又はパッケージング細胞に安定に組み込まれている。しかし、これら配列の１以上は、エピソーム形態でも存在し得、遺伝子発現はエピソームから起こり得る。
本明細書で使用する場合、用語「パッケージング細胞」とは、RNAゲノムを欠く感染性組換えウイルスの作製に必要なエレメントを含有する細胞をいう。代表的には、このパッケージング細胞は、１以上のプロデューサープラスミドを含有し、プロデューサープラスミドは、ウイルスの構造タンパク質(例えば、コドン最適化gag-Pol及びenv)を発現することができるが、パッケージングシグナルを含有しない。
【００３４】
用語「パッケージングシグナル」は、「パッケージング配列」又は「psi」とも互換可能に呼ばれ、ウイルス粒子形成の間のレトロウイルスRNA鎖のキャプシド形成に必要とされる非コーディングのシス作用性配列に関して使用される。HIV-1では、この配列は、主要なスプライスドナー部位(SD)の上流から少なくともgag開始コドンに拡がる遺伝子座にマッピングされている。
上記ベクター構築物との使用に適切なパッケージング細胞株は、容易に作製し得(WO 92/05266も参照)、レトロウイルスベクター粒子の産生用のプロデューサー細胞株の作製に利用し得る。前述のとおり、入手可能なパッケージング株のまとめは「Retroviruses」(前出)に示されている。
また、上記のとおり、単純なパッケージング細胞株(パッケージングシグナルを欠失させたプロウイルスを含んでなってもよい)は、組換えにより、望まない複製コンピテントウイルスの迅速な産生に至ることが見出されている。安全性を向上させるため、プロウイルスの3' LTRを欠失させた第二世代の細胞株が作製されている。この細胞では、野生型ウイルスを生じるには２つの組換えが必要となる。更なる改良点としては、gag-pol遺伝子及びenv遺伝子の別々の構築物への導入が挙げられる(いわゆる、第三世代のパッケージング細胞株)。これら構築物は、トランスフェクションの間の組換を防止するために逐次的に導入される。
好ましくは、パッケージング細胞株は第二世代のパッケージング細胞株である。
好ましくは、パッケージング細胞株は第三世代のパッケージング細胞株である。
【００３５】
これら分割構築物たる第三世代の細胞株では、コドンの変更により組換えの更なる低減が達成され得る。遺伝子コードの冗長性に基づくこの技法は、別々の構築物間、例えば、gag-pol及びenvオープンリーディングフレーム中のオーバーラップ領域間の相同性を低減させることを目的とする。
パッケージング細胞株は、高力価ベクター粒子産生のためのキャプシド形成及び膜タンパク質提供に必要な遺伝子産物を提供するために有用である。パッケージング細胞は、インビトロで培養された細胞、例えば組織培養細胞株であってもよい。適切な細胞株としては、哺乳動物細胞、例えばマウス線維芽細胞由来細胞株又はヒト細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、パッケージング細胞株は、霊長類又はヒト細胞株、例えばHEK293、293-T、TE671、HT1080である。
実験適用及び実践適用の両方で、高力価ウイルス調製物の使用が高度に望ましい。ウイルス力価を増大させる技法としては、psi＋上記のパッケージングシグナルの使用及びウイルスストックの濃縮が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「高力価」は、標的部位、例えば細胞に形質導入することができるレトロウイルスベクター又は粒子の有効量を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、標的部位でNOIの発現を誘導するに十分なレトロウイルス又はレンチウイルスベクター又はベクター粒子の量を意味する。
【００３６】
プロデューサー/パッケージング細胞のための高力価ウイルス調製物は、通常、105〜107レトロウイルス粒子/mLのオーダーである。組織(例えば、脳)における形質導入には、非常に少量を使用することが必要であり、そのため、ウイルス調製物を超遠心分離により濃縮する。得られる調製物は、少なくとも108t.u./mL、好ましくは108〜109t.u./mL、より好ましくは少なくとも109t.u./mLを有するべきである。(力価は、標準D17細胞株について力価決定したときの１mLあたりの形質導入単位(t.u./mL)で表す)。他の濃縮方法、例えば限外濾過又は、マトリクスへの結合及びマトリクスからの溶出を使用してもよい。
NOIがコードする発現産物は、細胞から分泌されるタンパク質であってもよい。或いは、NOI発現産物は分泌されず、細胞内で活性である。幾つかの適用には、NOI発現産物について、バイスタンダー効果又は遠位バイスタンダー効果(すなわち、或る細胞での発現産物の産生が、共通の表現型を有する更なる関連細胞(近隣のもの又は遠位(例えば、転移性)のもの)の改変を導くこと)を証明することが好ましい。
セントラルポリプリントラクト(cPPT)と名付けられた配列の存在により、非分裂細胞への遺伝子送達の効率性が向上し得る[Charneau及びClavel(1991) J Virol 65:2415-2421；Barryら(2001) Human Gene Therapy 12:1103-1108]。このシス作用性エレメントは、例えば、EIAVポリメラーゼコーディング領域エレメントに位置する。好ましくは、本発明のゲノムはcPPT配列を含んでなってもよい。
加えて、ウイルスゲノムは翻訳エンハンサーを含んでなってもよい。
【００３７】
NOIは、１以上のプロモーター/エンハンサーエレメントに作動可能に連結されてもよい。１以上のNOIの転写は、ウイルス性LTRの制御下で行なわれてもよく、或いはプロモーター-エンハンサーエレメントの制御下で行なわれてもよい。好ましくは、プロモーターは、強力なウイルス性プロモーター、例えばCMVであるか、又は細胞の構成性プロモーター、例えばPGK、βアクチン又はEF1αである。プロモーターは、調節性であってもよいし、組織特異的であってもよい。発現の制御はまた、外部因子(この場合、テトラサイクリン又はそのアナログ)に応答して遺伝子発現のオン/オフを切替えるテトラサイクリンシステムのようなシステムを用いることにより達成されてもよい。
レトロウイルスベクターシステムの設計において、天然型ウイルスとは異なる標的細胞特異性を有する粒子を工学的に操作して、拡大又は変更された範囲の細胞タイプへの遺伝物質の送達を可能にすることが望ましい。このことを達成する１つの方法は、ウイルスエンベロープタンパク質を工学的に操作してその特異性を変更することによる。別の１つのアプローチは、異種エンベロープタンパク質をベクター粒子に導入して、ウイルスの天然型エンベロープタンパク質を置換するか又はこれに追加することである。
用語 偽型化は、ウイルスゲノムのenv遺伝子の少なくとも一部に、異種env遺伝子(例えば別のウイルスのenv遺伝子)を組み込むか、又はウイルスゲノムのenv遺伝子の一部を異種env遺伝子で置換するか、又はウイルスゲノムのenv遺伝子の全部を異種env遺伝子で置き換えることを意味する。偽型化は新たな現象ではなく、その例は、WO 99/61639、WO 98/05759、WO 98/05754、WO 97/17457、WO 96/09400、WO 91/00047及びMebatsionら(1997) Cell 90, 841-847に見出し得る。
【００３８】
本発明の１つの好適な実施形態において、ベクターシステムは、狂犬病ウイルスＧタンパク質の少なくとも一部をコードする遺伝子で偽型化されている。狂犬病ウイルスＧタンパク質で偽型化されたレトロウイルスベクターの例は、WO 99/61639に見出し得る。本発明の１つの更に好適な実施形態において、ベクターシステムは、VSV-Gタンパク質の少なくとも一部をコードする遺伝子で偽型化されている。VSV-G偽型化レトロウイルスベクターの例は、米国特許第5,817,491号に見出し得る。
レトロウイルス又はレンチウイルス最小システムは、HIV、SIV、FIV及びEIAVウイルスから構築し得ることが証明されている。このシステムは、ベクター産生のため又は分裂細胞及び非分裂細胞の形質導入のために、更なる遺伝子vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev及びnefのいずれも必要としない。ベクター産生のため又は分裂細胞及び非分裂細胞の形質導入のためにS2を必要としないEIAV最小ベクターシステムが構築され得ることも証明されている。更なる遺伝子の欠失は高度に有利である。第一に、レンチウイルス(例えば、HIV)感染による疾患に関連する遺伝子を有さないベクターを作製することが可能になる。具体的には、tatは疾患に関連する。第二に、更なる遺伝子の欠失により、ベクターは、より異種のRNAをパッケージングすることができるようになる。第三に、機能が不明の遺伝子(例えばS2)を省略し得、よって望まない効果を引き起こすリスクを低減させ得る。最小レンチウイルスベクターの例は、WO 99/32646及びWO 98/17815に開示されている。
【００３９】
レトロウイルスベクター産生システムにおける機能的補助遺伝子の不存在は、それら機能的遺伝子が当該システムにより産生されるレトロウイルスベクター粒子にも存在しないことを意味する。また、そうでなければ当該遺伝子によりコードされ、ベクター粒子に組み込まれるはずの如何なる補助タンパク質も、ベクター粒子に存在しない。既知のレトロウイルスベクター産生システムでは、補助遺伝子は、ベクターゲノムがコードするDNAの一部として存在し得るか、又はパッケージング成分と共に存在し得る。ベクター産生システム中の補助遺伝子の位置は、他のレトロウイルス成分との関係に一部依存する。例えば、vifは、パッケージング細胞において、gag-polパッケージングカセットの一部であることが多い。よって、本発明の目的のために機能的補助遺伝子を取り除くことには、パッケージング成分若しくはベクターゲノムからの除去又は(おそらく)その両方からの除去が含まれ得る。
機能的補助遺伝子を除去は、遺伝子全体の除去を要しなくてもよい。通常、遺伝子の部分的除去又は何か別の方法での遺伝子の破壊で十分である。機能的補助遺伝子の不存在は、本明細書では、該遺伝子が、機能的補助タンパク質をコードすることができる形態で存在しないことを意味すると理解される。
【００４０】
本発明に従う１つの好適なシステムにおいて、ベクター粒子が基礎とするレンチウイルスに通常存在する機能的vpr及びtat遺伝子又は類似遺伝子は、共に存在しない。これら２つの補助遺伝子は、遺伝子療法ベクターには特に望ましくないレンチウイルスの特性に関連付けられる。しかし、上記の条件による他は、本発明は、HIV-1ベースのベクター粒子を作製するための本発明に従うシステムに存在しない補助遺伝子の組合せに関して制限されず、任意の組合せの３つ(より好ましくは４つ)の遺伝子が機能的形態で存在しなくてもよい。最も好ましくは、補助遺伝子Vpr、vif、tat、nef及びvpuの５つ全てが機能的形態で存在しない。同様に、他のレンチウイルスに関するシステムについても、補助遺伝子の全てが機能的形態で存在しないことが最も好ましい(revを除く。revは、rev/RREシステムに類似するシステムで置換されていない限り、存在することが好ましい)。
よって、好ましくは、本発明において使用される送達システムは、少なくともtat及びS2を欠いており(EIAVベクターシステムの場合)、おそらくはvif、vpr、vpx、vpu及びnefも欠いている。より好ましくは、本発明のシステムはrevも欠いている。revは、以前には、効率的なウイルス産生のために幾つかのレトロウイルスゲノムで必須であると考えられていた。例えば、HIVの場合、rev及びRRE配列は含ませるべきと考えられていた。しかし、コドン最適化(下記参照)又は他の機能的に等価なシステム(例えば、MPMVシステム)での置換により、rev及びRREの必要性は低減し又は排除され得ることが見出されている。コドン最適化gag-polの発現はrev非依存性であるので、RREはgag-pol発現カセットから除去されてもよく、よって、ベクターゲノムに含まれるRREの組換えの可能性も除かれる。
【００４１】
１つの好適な実施形態において、本発明のウイルスゲノムはRev応答エレメント(RRE)を欠く。別の１つの好適な実施形態において、Revをコードする核酸又はその機能的等価物は、機能的Revをコードできないか又はベクターゲノムから除去されるよう破壊されている。
１つの好適な実施形態において、本発明において使用するシステムは、更なる遺伝子の幾つか又は全てが除去されている、いわゆる「最小」システムに基づく。好ましくは、本発明のウイルスベクターは最小ウイルスゲノムを有する。
本明細書で使用する場合、用語「最小ウイルスゲノム」は、ウイルスベクターが、非必須エレメントを除去し、必須エレメントを保持してNOIの標的宿主細胞への感染、形質導入及び送達に必要な機能性を提供するように操作されていることを意味する。
好ましくは、最小ウイルスゲノムを有するウイルスベクターは、最小レンチウイルスベクターである。
コドン最適化は、以前にWO99/41397に記載されている。異なる細胞は特定コドンの使用頻度が異なる。このコドンバイアスは、細胞タイプにおける特定のtRNAの相対的豊富さのバイアスに対応する。配列中のコドンを対応するtRNAの相対的豊富さと適合するように変更することにより、発現増大が可能となる。同様な理由で、対応するtRNAが特定の細胞タイプにおいて稀であることが知られているコドンを意図的に選択することにより、発現を減少させることができる。よって、更なる程度の翻訳制御が利用可能である。
【００４２】
多くのウイルス(HIV及び他のレンチウイルスを含む)は、数多くの稀なコドンを利用している。これらコドンを一般に使用される哺乳動物コドンに対応するように変化させることにより、哺乳動物プロデューサー細胞においてパッケージング成分の発現増大を達成し得る。コドン使用頻度表は、哺乳動物細胞についても、他の種々の生物についても当該分野において公知である。
コドン最適化は他の利点も有する。配列の変更により、プロデューサー細胞/パッケージング細胞におけるウイルス粒子の組立てに必要なウイルス粒子のパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列は、RNA不安定性配列(INS)が排除される。同時に、パッケージング成分のアミノ酸配列コーディング配列は保持される結果、当該配列によりコードされるウイルス成分がパッケージング成分の機能を損なわないように同じまま又は少なくとも十分に類似して維持される。コドン最適化はまた、輸出のためのRev/RRE要件を克服して最適化配列をRev非依存性とする。コドン最適化はまた、ベクターシステム内の異なる構築物間(例えば、gag-pol及びenvオープンリーディングフレーム中のオーバーラップ領域間)での相同組換えを低減する。したがって、コドン最適化の全体効果は、ウイルス力価の顕著な増大及び向上した安全性である。
１つの実施形態において、INSに関するコドンのみがコドン最適化される。しかし、更により好適で実践的な実施形態において、配列は、フレームシフト部位を含む配列を除き、その全体がコドン最適化される。
【００４３】
gag-pol遺伝子は、gag及びpolタンパク質をそれぞれコードする２つのオーバーラップするリーディングフレームを有する。両タンパク質の発現は翻訳の間のフレームシフトに依存する。このフレームシフトは、翻訳の間のリボソームの「ずれ」の結果として生じる。このずれは、少なくとも部分的に、RNA二次構造のリボソーム-ストーリングによって引き起こされると考えられている。この二次構造は、gag-pol遺伝子においてはフレームシフト部位の下流に存在する。HIVに関しては、オーバーラップ領域は、gagの始点の下流のヌクレオチド1222からgagの終点(nt1503)まで拡がる(ここで、ヌクレオチド１はgag ATGのＡである)。結果的に、２つのリーディングフレームのフレームシフト部位及びオーバーラッピング領域に跨る281bpフラグメントは、好ましくは、コドン最適化されない。このフラグメントの保持により、gag-polタンパク質のより効率的発現が可能になる。
EIAVに関しては、オーバーラップの始点はnt1262であると考えられている(ここで、ヌクレオチド１はgag ATGのＡである)。オーバーラップの終点は1461bpである。フレームシフト部位及びgag-polオーバーラップが確実に保存されるように、nt1156から1465までの野生型配列を保持する。
例えば、好都合な制限部位を提供するために、最適コドン使用頻度から逸脱してもよいし、保存的アミノ酸変化をgag-polタンパク質に導入してもよい。
１つの高度に好適な実施形態において、コドン最適化は、高度に発現される哺乳動物遺伝子に基づく。３番目の塩基、時には２番目及び３番目の塩基を変化させてもよい。
【００４４】
遺伝子コードの縮重性のため、当業者は、多くのgag-pol配列を達成し得ることが理解される。また、コドン最適化gag-pol配列を作製するための出発点として使用し得る多くのレトロウイルスバリアントが記載されている。レンチウイルスゲノムは相当変化可能であり得る。例えば、依然として機能的である多くのHIV-1偽種が存在する。EIAVについても同様である。これらバリアントは、形質導入プロセスの特定の部分を増強するために使用し得る。HIVバリアントの詳細は、米国ロスアラモス国立研究所が維持管理するHIVデータベースにも見出し得る。EIAVクローンの詳細は、米国国立衛生研究所が維持管理するNCBIデータベースに見出し得る。
コドン最適化gag-pol配列のためのストラテジは、任意のレトロウイルスに関して使用し得る。これは、EIAV、FIV、BIV、CAEV、VMR、SIV、HIV-1及びHIV-2を含む全てのレンチウイルスに当てはまる。加えて、この方法は、HTLV-1、HTLV-2、HFV、HSRV及びヒト内因性レトロウイルス(HERV)、MLV並びに他のレトロウイルスに由来する遺伝子の発現増大に使用し得る。
コドン最適化はgag-pol発現をRev非依存性にし得る。しかし、レトロウイルスベクターにおける抗rev又はRRE因子の使用を可能にするためには、ウイルスベクター作製システムを完全にRev/RRE非依存性にする必要がある。よって、ゲノムも改変する必要がある。このことは、ベクターゲノム成分を最適化することにより達成される。有利なことには、これら改変により、プロデューサー細胞及び形質導入細胞の両方に全ての更なるタンパク質が存在しない、より安全なシステムが作製され得る。
【００４５】
上記のとおり、レトロウイルスベクター用のパッケージング成分として、gag、pol及びenv遺伝子の発現産物が挙げられる。加えて、効率的なパッケージングは、４つのステムループからなる短い配列及びこれに続くgag及びenvの部分配列(「パッケージングシグナル」)に依存する。よって、(パッケージング構築物の完全gag配列に加えて)レトロウイルスベクターゲノムに欠失gag配列を含ませることにより、ベクター力価が最適化する。今日まで、効率的なパッケージングは、env配列を依然として保持するベクターにおいて、gagの255〜360ヌクレオチドを、又はスプライスドナー変異、gag及びenv欠失の特定の組合せにおいてはgagの約40ヌクレオチドを必要とすると報告されている。驚くべきことに、gagにおける、Ｎ末端の360ヌクレオチド程度を除く全ての欠失により、ベクター力価の増大が導かれることが見出されている。よって、好ましくは、レトロウイルスベクターゲノムは、１以上の欠失を含んでいてもよいgag配列、より好ましくはＮ末端に由来する約360ヌクレオチドを含んでないてもよいgag配列を含む。
本発明において、用語NOI(興味対象のヌクレオチド配列)は、任意の適切なヌクレオチド配列(これは、必ずしも、天然に存在する完全なDNA又はRNA配列ではない)を含む。よって、NOIは、例えば、合成のRNA/DNA配列、コドン最適化RNA/DNA配列、組換えRNA/DNA配列(すなわち、組換えDNA技法を用いて作製されたもの)、cDNA配列若しくは部分的なゲノムDNA配列又はそれらの組合せであってもよい。配列はコーディング領域である必要はない。コーディング領域である場合、配列は、コーディング領域全体である必要はない。加えて、RNA/DNA配列は、センス配向であっても、アンチセンス配向であってもよい。好ましくは、配列はセンス配向である。好ましくは、配列は、cDNAであり、cDNAを含んでなってもよく、又はcDNAから転写されてもよい。
【００４６】
NOI(「異種配列」、「異種遺伝子」又は「導入遺伝子」とも呼ばれる)は、例えば、選択遺伝子、マーカー遺伝子及び治療用遺伝子のいずれか１以上であってもよい。
NOIは、疾患プロセスにおいて潜在的に重要である候補遺伝子であってもよい。よって、本発明のベクターシステムは、例えば、標的検証目的に使用してもよい。
NOIは、治療的に適用されてもよいし、診断的に適用されてもよい。適切なNOIとして、酵素、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化剤分子、工学的に操作されたイムノグロブリン様分子、単鎖抗体、融合タンパク質、免疫同時刺激性分子、免疫調節性分子、アンチセンスRNA、小干渉性RNA(siRNA)、標的タンパク質のトランスドミナントネガティブ変異体、毒素、条件的毒素、抗原、腫瘍抑制タンパク質及び成長因子、膜タンパク質、血管新生促進及び抗血管新生タンパク質及びペプチド、血管作用性タンパク質及びペプチド、抗ウイルスタンパク質及びリボザイム、並びにこれらの誘導体(例えば、レポーター基が付着されたもの)をコードする配列が挙げられるが、これらに限定されない。NOIはまたプロドラッグ活性化酵素をコードしてもよい。研究に使用する場合、NOIは、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼのような(ただし、これらに限定されない)レポーター遺伝子、又は、とりわけ、アンピシリン、ネオマイシン、ブレオマイシン、ゼオシン、クロラムフェニコール、ハイグロマイシン、カナマイシンのような抗生物質に対する耐性遺伝子をコードしてもよい。
NOIは、興味対象のタンパク質(「POI」)又はその変異体、ホモログ若しくはバリアントの全体又は一部をコードしてもよい。例えば、NOIは、インビボで、野生型タンパク質と類似する様式で機能することができるPOIのフラグメントをコードしてもよい。
【００４７】
用語「変異体」は、野生型配列からの１以上のアミノ酸変化を有するPOIを含む。例えば、変異体は、１以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換を含んでなってもよい。
好ましくは、NOIは、単一のPOI又はその変異体、ホモログ若しくはバリアントをコードする。１つの高度に好適な実施形態において、NOIは融合タンパク質をコードしない。本明細書で使用する場合、用語「融合タンパク質」は、従来の意味で使用され、単一のキメラタンパク質を形成するようにペプチド結合により連結された２以上のタンパク質活性を含んでなってもよい実体を意味する。融合タンパク質は、単一プロモーターにより駆動される単一ポリヌクレオチドによりコードされる。
本発明のウイルスゲノムは、少なくとも１つのNIOを含んでなってもよいが、場合により、２以上のNOIを含んでなってもよい。２以上のNOIを発現させるために、ベクターゲノム内に２以上の転写ユニット(各NOIに１つ)が存在してもよい。しかし、レトロウイルスベクターは、遺伝子的に単純に維持されている場合に、最高力価及び最も強力な遺伝子発現特性を達成することが文献から明らかである[WO96/037623；Bowtellら(1988) J. Virol. 62, 2464；Correllら(1994) Blood 84, 1812；Emerman and Temin (1984) Cell 39, 459；Ghattasら(1991) Mol. Cell. Biol. 11, 5848]。よって、内部リボソーム進入部位(IRES)を用いて、ポリシストロン性(又は本明細書で使用する場合、「マルチシストロン性」)メッセージで２番目(及びそれ以降)のコーディング配列の翻訳を開始することが好ましい[Adamら(1991) J. Virol. 65, 4985]。
【００４８】
レトロウイルスベクターへのIRESエレメントの挿入は、レトロウイルス複製サイクルと適合性であり、単一プロモーターからの複数のコーディング領域の発現を可能にする(Adamら(前出)；Ngoiら(2004) Curr Gene Ther 4(1):15-31；Chenら(1993) J. Virol 67:2142-2148)。RNAにおいてオープンリーディングフレーム間に位置する場合、IRESエレメントは、該IRESエレメントでのリボソームの進入を促進し、続いて下流の翻訳を開始することにより、下流のオープンリーディングフレームの効率的な翻訳を可能にする。
本明細書で使用する場合、用語「シストロン」とは、ポリペプチド鎖に対応する核酸セグメント(該当する翻訳開始(始動)及び停止(終止)コドンを含んでもよい)をいう。マルチシストロン性mRNAは、１より多いシストロンを有し、よって１より多いポリペプチドをコードするmRNA転写物である。
WO 97/14809によれば、IRES配列は、代表的には、遺伝子の5'非コーディング領域に見出される。文献に記載のものに加え、発現に影響する遺伝子配列を探索した後に、その配列がDNAに影響する(すなわち、プロモーター又はエンハンサーとして作用する)か又はRNAのみに影響する(IRES配列として作用する)かを決定することにより、IRES配列を実験的に見出してもよい。
PV、EMCV及びブタ水泡性疾患ウイルスのIRESエレメントは、以前に、レトロウイルスベクターで使用されている Coffinら，前出)。
【００４９】
用語「IRES」は、IRESとして働くか又はその機能を改善する任意の配列又は配列の組合せを含む。
IRESは、ウイルス起源のもの(例えば、EMCV IRES、PV IRES又はFMDV 2A様配列)であってもよいし、細胞起源のもの(例えば、FGF2 IRES、NRF IRES、Notch 2 IRES又はEIF4 IRES)であってもよい。
IRESは、各NOIの翻訳を開始することができるためには、ベクターゲノム中でNOI間又はNOIの前に位置すべきである。例えば、ｎ個のNOIを含むマルチシストロン性配列については、ゲノムは下記のとおりであり得る：[NOI1-IRES1] ... [IRES(n-1)-NOIn]。
バイシストロン性配列及びトリシストロン性配列については、順序は下記のとおりである：NOI1-IRES1-NOI2  NOI1-IRES1-NOI2-IRES2-NOI3。
IRES及びNOIの代替の立体配置を利用してもよい。例えば、IRES及びNOIを含む転写物は、同じプロモーターに駆動される必要はない。
このアレンジの例はIRES1-NOI1-プロモーター-NOI2-IRES2-NOI3であってもよい。
好ましくは、１より多いIRES及びNOIを有する内部カセットを利用する任意の構築物において、IRESは、異なる起源のもの、すなわち互いに異種であってもよい。例えば、一方のIRESはEMCV由来であってもよく、他方はIRESポリオウイルス由来であってもよい。
IRESは、１つのベクターから複数の遺伝子を共発現させる効率的な方法であるが、他の方法もまた有用であり、該他の方法を単独で用いてもよいし、IRESとの組合せで用いてもよい。これら方法には、ベクターにおける複数の内部プロモーターの使用[Overellら(1988)、Mol Cell Biol. 8:1803-8]、又は異なる遺伝子を発現する単一ウイルスゲノムに由来する複数RNA種を導くオルタネートスプライシングパターンの使用が含まれる。
【００５０】
本発明はまた、本発明の第１の観点に従うウイルスゲノムを含んでなり得るベクターシステムを形質導入した細胞に関する。
細胞は、インビボ、インビトロ又はエクスビボで形質導入されてもよい。例えば、細胞は、哺乳動物被験体の細胞である場合、被験体から取り出され、該被験体への再移入に備えて形質導入されてもよい(エクスビボ形質導入)。或いは、細胞は、本発明のベクターシステムを標準的技法に従って用いて(例えば、NOIを発現するベクターストックの注射を介して)、インビボで直接遺伝子移入により形質導入されてもよい。細胞は、培養において安定である細胞株の一部である(すなわち、何世代も継代して生存し得、インビトロで増殖し得る)場合、標準的技法により、例えばNOIを発現するベクターを含んでいてもよいウイルス上清への細胞の曝露により、インビトロで形質導入してもよい。
細胞は、形質導入に感受性である任意の細胞であってもよい。ベクターシステムが非分裂細胞の形質導入が可能である場合(例えば、レンチウイルスシステムである場合)、細胞は非分裂細胞(例えば、ニューロン)であってもよい。
本発明は、１以上のNOIを含み得るカセット(これは、２以上のNOIの場合には、IRESにより作動可能に連結されていてもよい)を用いてもよい。これらカセットは、プロデューサー細胞でベクターゲノムを作製する方法において使用してもよい。
【００５１】
本発明はまた、このカセットを含んでいてもよい発現ベクターを提供する。この発現ベクターでの適切な細胞のトランスフェクションは、カセットにおいてNOIによりコードされる各POIを発現する細胞を生じるはずである。本発明はまた、このようなトランスフェクト細胞を提供する。
発現ベクターへのカセットのクローニング及び(カセットの発現を得るための)ベクターでの細胞のトランスフェクションは、当該分野において周知の技法により行なってもよい(例えば、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989))及び他の実験教科書に記載のもの)。
好ましくは、カセットはプロモーターを含んでなってもよい。２以上のNOIを含み得るカセットは、バイシストロン性であっても、トリシストロン性であってもよく、次のエレメントを含んでなってもよい：プロモーター-(NOI1)-(IRES1)-(NOI2)  プロモーター-(NOI1)-(IRES1)-(NOI2)-(IRES2)-(NOI3)。
本発明は、本発明の第２の観点に従うベクターゲノム及び医薬的に許容され得るキャリア、希釈剤又は賦形剤(それらの組合せを含む)を含んでなり得る医薬組成物を提供する。
【００５２】
医薬組成物は、ヒト及び獣医学に関する医学又は研究におけるヒト又は動物への使用のためであってもよく、代表的には、医薬的に許容され得る希釈剤、キャリア又は賦形剤のうちの任意の１以上を含んでなってもよい。治療的使用に関して許容され得るキャリア又は希釈剤は、医薬分野において周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro編 1985)に記載されている。医薬用キャリア、賦形剤又は希釈剤は、意図する投与経路及び標準的な製薬実務に関して選択されてもよい。医薬組成物は、キャリア、賦形剤又は希釈剤として、又はこれらに加えて、任意の適切な結着剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含んでなってもよい。
医薬組成物においては、保存剤、安定化剤、染料、及び香料さえも提供されてもよい。保存剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びp-ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。抗酸化剤及び懸濁剤もまた使用してよい。
異なる送達システムに依存して異なる組成/製剤要件が存在し得る。例証として、本発明の医薬組成物は、ミニポンプを用いて又は粘膜経路により、例えば、吸入用の鼻スプレー若しくはエアロゾルとして、又は摂取可能溶液として、又は非経口的に送達されるように製剤化されてもよい。非経口的送達の場合、組成物は、例えば、静脈内、筋内又は皮下経路による送達のために、注射可能形態で製剤化される。或いは、製剤化は、両経路により送達されるように設計されてもよい。
【００５３】
医薬組成物は、胃腸粘膜を介して経粘膜送達される場合、胃腸管を通過する間は安定なままであることが可能でなければならない；例えば、医薬組成物は、タンパク質分解性分解に対して抵抗性であり、酸性pHで安定であり、胆汁の界面活性効果に対して抵抗性でなければならない。
適切な場合、医薬組成物は吸入により、坐剤若しくは腟坐薬の形態で、ローション、溶液、クリーム、軟膏若しくは散布剤の形態で局所的に、皮膚パッチを使用して、スターチ若しくはラクトース若しくはチョークのような賦形剤を含有する錠剤の形態で又はカプセル若しくは小卵(ovule)(単独若しくは賦形剤との混合物で)で又は香料若しくは着色剤を含有するエリキシル剤、溶液若しくは懸濁物の形態で経口的に投与されてもよい。或いは、医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、筋内又は皮下に注射されてもよい。非経口投与には、最良には、組成物は、他の物質(例えば、血液と等張である溶液を作製するに十分な塩又は単糖)を含有し得る滅菌水溶液の形態で使用されてもよい。頬粘膜又は舌下投与には、組成物は、従来の様式で製剤化され得る錠剤又はトローチ剤の形態で投与されてもよい。
代表的には、医師が、個々の被験体に最も適切な実際の投薬量を決定するが、投薬量は、患者の年齢、体重及び応答並びに病状の重篤度により変化する。下記の投薬量は、平均的な場合の例示である。当然のことながら、より高いか又はより低い投薬範囲が有効であることもあり得る。
【００５４】
本発明の組成物(又はその成分部分)は経口で投与されてもよい。加えて又は択一的に、本発明の組成物(又はその成分部分)は直接注射により投与されてもよい。加えて又は択一的に、本発明の組成物(又はその成分部分)は局所的に投与されてもよい。加えて又は択一的に、本発明の組成物(又はその成分部分)は吸入により投されてもよい。加えて又は択一的に、本発明の組成物(又はその成分部分)は、非経口、粘膜、筋内、静脈内、皮下、眼内又は経皮投与手段のうちの１以上により投与されてもよく、当該投与用に製剤化される。
更なる例証として、本発明の医薬組成物は、１日当たり１〜10回、例えば１又は２回/日のレジメンに従って投与されてもよい。特定の患者に関する具体的な投薬量レベル及び投薬頻度は、用いる具体的化合物の活性、該化合物の代謝安定性及び作用の長さ、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食餌、投与の態様及び回数、排出速度、薬物の組合せ、病状の重篤度、及び治療を受ける対象を含む種々の因子に依存して変化し得る。
用語「投与」は、粘膜経路による送達、例えば、吸入用鼻スプレー若しくはエアロゾルとして又は摂取可能な溶液として；非経口経路による送達(この場合、送達は、例えば、静脈内、筋内又は皮下経路のような注入可能形態による)もまた含むが、これらに限定されない。
よって、本発明の医薬組成物は、以下の経路のうちの１以上により投与され得る：経口投与、注射(例えば、直接注射)、局所、吸入、非経口投与、粘膜投与、筋内投与、静脈内投与、皮下投与、眼内投与又は経皮投与。
【００５５】
NOIに作動可能に連結された同定済み調節化成分を含み得るベクターを有効量で含み得る医薬組成物は、疾患、例えばWO 98/09985に列挙されているものの治療に使用してもよい。参照を容易とするために、当該リストの一部をここに提供する：マクロファージ阻害活性及び/又はＴ細胞阻害活性、よって抗炎症性活性；抗免疫活性、すなわち炎症に関連しない応答を含む細胞性及び/又は体液性免疫応答に対する阻害効果；ウイルス及び/又は他の細胞内病原体に関連する疾患；マクロファージ及びＴ細胞が細胞外マトリクス成分及びフィブロネクチンに接着する能力の阻害並びにＴ細胞においてアップレギュレートされたFasレセプター発現；望ましくない免疫反応及び炎症(関節炎(慢性関節リウマチを含む)、過敏症に関連する炎症、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、膠原病及び他の自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、アテローム硬化症性心疾患、再灌流傷害、心停止；心筋梗塞、血管炎症性疾患、呼吸困難症候群又は他の心肺性疾患、消化性潰瘍に関連する炎症、潰瘍性大腸炎及び他の胃腸管疾患、肝線維症、肝硬変又は他の肝疾患、甲状腺炎又は他の腺疾患、糸球体腎炎又は他の腎臓及び泌尿器疾患、耳炎、ならびに免疫および／または炎症抑制が有益となるであろう他の耳鼻咽喉科の疾患、病状又は他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎又は他の皮膚疾患、歯周疾患又は他の歯科疾患、睾丸炎又は精巣上体睾丸炎、不妊症、睾丸外傷又は他の免疫関連性精巣疾患、胎盤機能障害、胎盤不全、習慣性流産、子癇、子癇前症及び他の免疫及び/又は炎症関連性婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜炎網膜炎、視神経炎、眼内炎症(例えば、網膜炎又は類嚢胞黄斑浮腫)、交感性眼炎、強膜炎、色素性網膜炎、変性性眼底疾患の免疫及び炎症成分、眼の外傷の炎症成分、感染により引き起こされる眼の炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、過剰な瘢痕化(例えば、緑内障濾過手術後のもの)、眼移植物に対する免疫及び/又は炎症反応及び他の免疫及び炎症関連眼科疾患、中枢神経系(CNS)又は任意の他の器官の両方における自己免疫疾患又は病的状態又は障害に関連する炎症、免疫及び/又は炎症抑制が有益となる、パーキンソン病、パーキンソン病の治療による合併症及び/又は副作用、AIDS関連痴呆複合症  HIV関連脳症、デビック病、シドナム舞踏病、アルツハイマー病及び他の変性性疾患、CNSの病的状態又は障害、卒中の炎症成分、ポリオ後症候群、精神疾患の免疫及び炎症成分、骨髄炎、脳炎、亜急性硬化性汎脳炎、脳脊髄炎、急性ニューロパシー、亜急性ニューロパシー、慢性ニューロパシー、ギヤン‐バレー症候群、シドナム舞踏病、重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、CNS圧迫又はCNS外傷又はCNSの感染の炎症成分、筋萎縮症及び筋ジストロフィーの炎症成分及び中枢神経系及び末梢神経系の免疫及び炎症関連疾患、病的状態又は障害、外傷後炎症、敗血症性ショック、感染性疾患、外科手術、骨髄移植又は他の移植の炎症性合併症及び/又は副作用、(例えば、ウイルスキャリアの感染に起因する)遺伝子療法の炎症性及び/又は免疫合併症並びに副作用、又はAIDSに関連する炎症を含む)の阻害、体液性及び/又は細胞性免疫応答の抑制又は阻害、単球又は白血球の量の低減による単球又は白血球増殖性疾患(例えば、白血病)の治療又は寛解、天然又は人工の細胞、組織及び器官(例えば、角膜、骨髄、臓器、レンズ、ペースメーカー、天然又は人工の皮膚組織)を移植する場合に、移植片拒絶の予防及び/又は治療のため。具体的なガン関連疾患としては、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：充実性腫瘍；血液腫瘍、例えば、白血病；腫瘍転移；良性腫瘍、例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫；慢性関節リウマチ；乾癬；眼血管新生疾患、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植物拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス；オスラー-ウェーバー症候群；心筋血管新生；斑状新生血管形成(plaque neovascularization)；毛細管拡張症；血友病関節(hemophiliac joints)；血管線維腫；創傷肉芽化；冠血管側枝；脳側枝；動静脈奇形症；虚血性四肢血管新生；血管新生緑内障；水晶体後線維増殖症；糖尿病性新生血管形成；ヘリコバクター関連疾患、骨折、脈管形成、造血、排卵、月経及び胎盤形成。
【００５６】
本発明及びその利点を詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲に規定したとおりの本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、種々の変更、置換及び代替をなし得ることを理解すべきである。
以下の実施例で本発明を更に説明する。実施例は、説明のために提供するのであって、如何なる様式でも本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００５７】
実施例
実施例１
ウイルスベクターの安全プロフィールを増大させるためのウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)の除去
レトロウイルスベクターからのタンパク質発現レベルに対するWPRE除去の効果を評価する研究を行なった。
方法
トランスファープラスミド「pELNS Luc ADB678」、「pELNS LucNoX ADB679」及び「pELNS LucNoW ADB680」の構築
pELNS-NY-ESO ADB152プラスミド(図１)に基いて、pELNS-NY-ESO NoX ADB693及びpELNS-NY-ESO NoW ADB694と名付けた２つのバリアントを構築した。pELNS-NY-ESO NoX ADB693の構築のために、pELNS-NY-ESO ADB152プラスミドのWPRE領域を、Platinum Taq DNAポリメラーゼPCRキット(Life Technologies Catalog # 11304011)を用い、フォワードプライマー[ヌクレオチド配列：cgGTCGACaatcaacctctggattac]及びリバースプライマー[ヌクレオチド配列：cgGAATTCgacaacaccacggaattgtc]を用いるPCR増幅により改変させた。PCR産物をSalI及びEcoRI制限酵素で消化し、続いてZymo Clean & Concentratorキット(Zymo Research cat. No. D4005)を用いて精製した。次いで、精製フラグメントをSalI_EcoRI消化pELNS-NY-ESO ADB152プラスミド骨格フラグメントにライゲートしてpELNS-NY-ESO NoX ADB693プラスミドを生成した(図２)。
pELNS-NY-ESO NoW ADB694プラスミドの作製のために、２つの5'-リン酸化オリゴヌクレオチド[上方鎖オリゴヌクレオチド配列：tcgacTCTAGAg；下方鎖オリゴヌクレオチド配列：aattcTCTAGAg]をアニールし、「粘着性」SalI及びEcoRI制限酵素末端を有するSalI_XbaI_EcoRI部位を含有するリンカーを生成した：
【００５８】
【化１】
0006702863.tif 000002
【００５９】
次いで、アニールしたリンカーをSalI_EcoRI消化pELNS-NY-ESO ADB152プラスミド骨格フラグメントにライゲートし、pELNS-NY-ESO NoW ADB694プラスミドを生成した(図３)。
次いで、pELNS-NY-ESO ADB152、pELNS-NY-ESO NoX ADB693及びpELNS-NY-ESO NoW ADB694プラスミドを用いて、それぞれpELNS Luc ADB678、pELNS LucNoX ADB679及びpELNS LucNoW ADB680プラスミドを生成した。
pELNS Luc ADB678プラスミドの作製のために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子[5'-末端にNheI制限酵素部位が3'-末端にSalI部位が位置する]をpELNS Tomato-Luc ADB73プラスミド(図４)から、フォワードプライマー[ヌクレオチド配列：ACTGGCTAGCCACCatggaagatgccaaaaaca]及びリバースプライマー[ヌクレオチド配列：gaggttgattgtcgacttac]を用いるPCRにより増幅させた。PCR産物をNheI及びSalI制限酵素で消化し、続いてZymo Clean & Concentratorキットを用いて精製した。次いで、精製フラグメントをNheI_SalI消化pELNS-NY-ESO ADB152、pELNS-NY-ESO NoX ADB693及びpELNS-NY-ESO NoW ADB694プラスミド骨格フラグメントにライゲートし、それぞれpELNS Luc ADB678、pELNS LucNoX ADB679及びpELNS LucNoW ADB680プラスミドを作製した(図５〜７)。
【００６０】
ルシフェラーゼを発現する組換えレンチウイルスベクターの作製
ヒトHEK293T細胞株を宿主として使用し、４つのプラスミド − ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現カセットを含有する１つのトランスファープラスミドとHIV-1 gag-pol構造遺伝子、アクセサリー遺伝子rev又はウイルスエンベロープである水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-G)を発現する３つのパッケージングプラスミド − の一過性トランスフェクションにより、組換えレンチウイルスベクターを作製した。トランスフェクションの48時間後に上清を回収し、0.45μmフィルターでの濾過により細胞残渣を除去した。次いで、レンチウイルスベクター粒子を、明澄な上清から10,000×ｇにて16〜18時間の超遠心分離により濃縮した。最後に、ウイルス粒子のペレットを適量の培養培地に懸濁した。
pELNS Luc ADB678[完全長WPREエレメント]、pELNS LucNoX ADB679[WPREエレメントは、Ｘ-プロモーター及び3'末端の短縮型Ｘタンパク質の除去により短縮化されている]又はpELNS LucNoW ADB680[WPREエレメントは６ヌクレオチドTCTAGAに置換されている]トランスファープラスミドを有して作製されたレンチウイルスベクターを、それぞれ「Luc」、「LucNoX」又は「LucNoW」ベクターと呼ぶ。
レンチウイルスベクター調製物におけるインタクトなベクター粒子レベルの測定
インタクトなレンチウイルスベクター粒子のレベルを、QuickTiter +emtovoris Titerキット(Cell Biolabs Inc, cat. No. VPK-107)を用いて測定した。このアッセイキットは、ウイルスベクター調製物に存在する、レンチウイルスベクター粒子に結合したp24 gagキャプシドタンパク質のみを測定し、遊離のp24タンパク質を測定しない。したがって、このアッセイの結果は、レンチウイルスベクターの生物学的力価の代用物として使用し得る。
【００６１】
標的細胞−SupT1細胞株及びドナー由来の初代Ｔ細胞−のレンチウイルスベクター形質導入及び細胞ペレット収集
標的細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を、ヒトSupT1細胞株又は種々のドナー由来の初代Ｔ細胞の形質導入により評価した。SupT1細胞の形質導入のために、SupT1細胞をペレット化し、新鮮な培養培地に再懸濁した。これら細胞を、24ウェルプレートに１×106細胞/ウェルの密度にて0.5mL/ウェルで播種した。次いで、0.5mLのレンチウイルスベクター[Luc、LucNoX又はLucNoW]をウェルに添加した。ルシフェラーゼ発現の測定のために、48時間後、形質導入SupT1細胞を細胞ペレットとして採集した[300×ｇにて５分間]。
ドナー由来の初代Ｔ細胞の形質導入のために、Ｔ細胞を含む白血球をドナーの全血から、Lymphoprepキット(Axis-Shield, cat# NYC-1114547)を製造業者の指示に従って用いて単離した。この集団からCD14及びCD25陽性白血球を、適量のヒトCD14及びCD25マイクロビーズ(Miltenyi Biotech cat # 130-050-201, 130-092-983)とインキュベートし、続いてMiltenyi LSカラム(Miltenyi Biotec cat #130-042-401)で分離することにより除去した。適量の残存細胞を適量の組換えインターロイキン-２及び適量の抗CD3/抗CD28ビーズとインキュベートした。一晩のインキュベーション後、これら細胞を24ウェルプレートに１mL容量中106細胞/ウェルで移した。次いで、１mLのレンチウイルスベクター[Luc、LucNoX又はLucNoW]をウェルに添加した。ルシフェラーゼ発現の測定のために、48時間後、形質導入初代Ｔ細胞を細胞ペレットとして採集した[300×ｇにて５分間]。
【００６２】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するLuc、LucNoX及びLucNoWベクターの系列希釈物を形質導入したSupT1細胞における活性ルシフェラーゼの発現
SupT1細胞ペレットを、１分間の強力なボルテックス後、＞５分間、氷上で適量の冷Glo Lysis緩衝液(Promega E2661)とインキュベートした。その後、使用まで、細胞溶解物を氷上で維持した。Glo Lysis緩衝液に希釈した適量のQuantiLum組換えルシフェラーゼ(Promega E1701)を用いてルシフェラーゼ標準曲線を作成した。次いで、適量の標準物及びサンプルを固相壁白色96ウェルプレート(Greiner Bio Cat # 655083)のウェルに添加した。各ウェルに、室温に平衡化した100μLの再構成Bright-Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイ基質(Promega E2620)を加えた。ルシフェラーゼ発現レベルに対応する各ウェルの発光(相対光量単位RLU)をWallac Victor2 1420プレートリーダー(Perkin Elmer)により測定した。各サンプルウェルの発光を、標準曲線を用いて、活性ルシフェラーゼの濃度(ng/mL)に変換した。
【００６３】
結果
レンチウイルスベクター調製物におけるインタクトなベクター粒子のレベルの測定
図８に示すように、レンチウイルスベクター結合p24 gagキャプシドタンパク質のレベルは、Luc、LucNoX及びLucNoWレンチウイルスベクター調製物で同様であった。このことは、これらレンチウイルスベクター調製物が類似レベルのベクター粒子を含有していたことを示唆する。これらウイルスベクターのペレットの再懸濁に使用した完全培養培地[10％ v/v胎仔ウシ血清(FBS)及び２mM GlutaMaXを補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)]は、いかなるバックグランドシグナルにも寄与しなかった。
標的細胞−SupT1細胞株及びドナー由来の初代Ｔ細胞−のレンチウイルスベクター形質導入及び細胞ペレット収集
図９に示す結果は、トランスファープラスミドpELNS LucNoX ADB679を有して作製されたLucNoXレンチウイルスベクターを形質導入したSupT1細胞が、ベクター希釈率にわたって、pELNS Luc ADB678プラスミドを有して作製されたLucコントロールベクターを形質導入したものより僅かに良好なルシフェラーゼ活性を発現したことを示している。このことは予測されていた。なぜならば、Ｘタンパク質を発現しないWPRE変異体を含有するトランスファープラスミドを有して作製されたレンチウイルスベクターは、導入遺伝子発現の増強に関して、完全長WPREと機能的に類似していることが以前に示されているからである[Gonzalez-Murillo A.ら(2010). Hum Gene Ther 21(5):623-30；Schambach A.ら(2006) Gene Ther 13(7):641-5]。
更に、トランスファープラスミドpELNS LucNoW ADB680を有して作製されたLucNoWレンチウイルスベクターを形質導入した細胞も、ベクター希釈率にわたって、Lucコントロールベクターを形質導入したものより僅かに良好なルシフェラーゼ活性を発現した(図９)。このことは、６ヌクレオチドTCTAGA(XbaI制限酵素部位)を機能的WPREエレメントの代わりに使用してもよいことを示している。
【００６４】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するLuc、LucNoX及びLucNoWベクターを形質導入したSupT1細胞又は初代Ｔ細胞における活性ルシフェラーゼの発現
この結果が初代Ｔ細胞において再現されるかどうかを更に評価するために、Luc、LucNoX及びLucNoWベクターの同一バッチを最高用量で用いて上記実験を繰り返した。また、同一バッチのSupT1細胞をコントロールとして用いた。
図10に示すように、LucNoXレンチウイルスベクターを形質導入した、４人の異なるドナーからの単離初代Ｔ細胞及びSupT1は、Lucコントロールベクターを形質導入したものより高いルシフェラーゼ活性を発現した。
更に、LucNoWレンチウイルスベクターを形質導入した細胞は、Lucコントロール又はLucNoXベクターを形質導入したものより高いルシフェラーゼ活性を発現した(図10)。このことは、ベクター力価に対して影響を及ぼすことなく、WPREエレメント全体を短いスペーサーエレメントで置換し得るという前の実験結果と一致する。
【００６５】
実施例２
プラスミドNoWPRE ０マー、NoWPRE ３マー、NoWPRE 10マー、NoWPRE 20マー、NoWPRE 30マー、NoWPRE 40マー及びNoWPRE 50マーの構築
「Luc NoW ０マー」プラスミドを、ADB680プラスミド(図７)をSalI及びEcoRIで消化することにより作製した。次いで、このベクター骨格フラグメントにT4ポリメラーゼを充填した後ライゲーションを行なった。新たなプラスミドはもはやSalI及びEcoRI部位を含有していなかった(図２)。
標記プラスミドは、ライゲーション用のSalI及びEcoRI制限部位適合末端を有する(ランダムに選択した)スタッファー配列を生成するための２つの相補的オリゴをアニールすることにより作製した(表１を参照)。その後、アニールしたスタッファー配列をSalI及びEcoRI消化ADB 680プラスミド骨格にライゲートして対応するプラスミドを生成した。これらプラスミドはSalI及びEcoRI制限部位を含有していた。
【００６６】
表１：ライゲーション用のSalI及びEcoRI制限部位適合末端(太字)を有するスタッファー配列を含有するアニールしたリンカー：
【表１】
0006702863.tif 000003
したがって、挿入されたスタッファー配列は次のとおりである：
配列番号２  TCT
配列番号３  GCAACTAGAA
配列番号４  ACCAAGCTGGACATCTACCC
配列番号５  CCGAAGGAGTACTATAAACCGCCATACGGA
配列番号６  GGCGAGTTTAAAACCTCTTGCTACATCGCCTCATCTGTGA
配列番号７  GTGACGAACATGGGGCAGATTGCTTCCAGTGCTTGCTGGGCATTGCTGAT
【００６７】
ルシフェラーゼ又はNYESO-1 TCRを発現する組換えレンチウイルスベクターの作製
ヒトHEK293T細胞株を宿主として使用し、４つのプラスミド − ルシフェラーゼレポーター遺伝子又はNYESO-1 Ｔ細胞レセプター(TCR)遺伝子の発現カセットを含有する１つのトランスファープラスミドとHIV-1 gag-pol構造遺伝子、アクセサリー遺伝子rev又はウイルスエンベロープである水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-G)を発現する３つのパッケージングプラスミド − の一過性トランスフェクションにより、組換えレンチウイルスベクターを作製した。トランスフェクションの48時間後に上清を回収し、0.45μmフィルターでの濾過により細胞残渣を除去した。次いで、明澄なウイルス上清を10,000×ｇにて16〜18時間の超遠心分離により濃縮した。次に、ウイルス粒子ペレットを適量の培養培地に再懸濁した。
ルシフェラーゼ(Luc)又はNY-ESO1 Ｔ細胞レセプター(NY-ESO1)を含み、そしてWPREを含むか、Ｘフラグメントを欠くWPREを含むか、又はWPREを欠くレンチウイルスベクターを、表２のとおりに名付けた：
【００６８】
表２：種々の導入遺伝子プラスミドを用いて作製したレンチウイルスベクターのまとめ
【表２】
0006702863.tif 000004
【００６９】
標的細胞−SupT1細胞株−のレンチウイルスベクター形質導入
標的細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子又はNYESO- 1 TCRの発現を、ヒトSupT1細胞株の形質導入により評価した。形質導入のために、SupT1細胞をペレット化し、新鮮な培養培地に再懸濁した。これら細胞を、24ウェルプレートに１×106細胞/ウェルの密度にて0.5mL/ウェルで播種した。次いで、0.5mLのレンチウイルスベクターをウェルに添加した。
ルシフェラーゼ発現の測定のために、48時間後、形質導入SupT1細胞を細胞ペレットとして採集した[300×ｇにて５分間]。NYESO-1 TCRの測定のために、これら細胞を、TCRののβ鎖に対する特異抗体で染色し、陽性標識細胞の％をフローサイトメトリで決定した。
【００７０】
完全長WPREを含むか又はWPREをスタッファー配列で置換した、ルシフェラーゼを発現する導入遺伝子プラスミドに由来するレンチウイルスベクターを形質導入したSupT1細胞における活性ルシフェラーゼの発現
SupT1細胞ペレットを、１分間の強力なボルテックス後、＞５分間、氷上で適量の冷Glo Lysis緩衝液(Promega E2661)とインキュベートした。その後、使用まで、細胞溶解物を氷上で維持した。Glo Lysis緩衝液に希釈した適量のQuantiLum組換えルシフェラーゼ(Promega E1701)を用いてルシフェラーゼ標準曲線を作成した。次いで、適量の標準物及びサンプルを固相壁白色96ウェルプレート(Greiner Bio Cat # 655083)のウェルに添加した。各ウェルに、室温に平衡化した100μLの再構成Bright-Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイ基質(Promega E2620)を加えた。ルシフェラーゼ発現レベルに対応する各ウェルの発光(相対光量単位RLU)をFLUOStar Omegaプレートリーダー(BMG LabTech)により測定した。各サンプルウェルの発光を、標準曲線を用いて、活性ルシフェラーゼの濃度(ng/mL)に変換した。
４つの個別レンチウイルスベクター調製物を、各導入遺伝子プラスミドについて作製した。図11の結果は、代表的調製物のものであり、３つ組の測定値(Lucベクターの発光を100％として規格化)の平均値を表す。導入遺伝子の発現は、WPREの不在下で顕著に低減するが、この発現は、３〜50ヌクレオチドの「スタッファー配列」の付加により回復させることができる。
【００７１】
NY-ESO1 WPRE NoX又はNY-ESO1 NoW ６マーを形質導入したSupT1細胞の細胞表面でのNYESO-1 TCRの発現
NYESO-1 Ｔ細胞レセプター遺伝子(Robbinsら[2008] J Immunol 180:9, 611)を発現するレンチウイルスベクターを用いて同様な得られるかどうかを評価するため、SupT1細胞に、短縮型WPREを含有する(NYESO1 WPRE NoX)か又はWPREを６ヌクレオチド[TCTAGA]配列で置換した(NY-ESO1 NoW ６マー)NYESO-1発現導入遺伝子プラスミドから誘導したレンチウイルスベクターを形質導入した。
形質導入後、SupT1細胞の培養培地を、NYESO-1 TCRのVβサブユニットに対する13.1β PE接合抗体(Beckman Coulter IM2292)を含有する(96ウェルプレート用に１μl/ウェルに希釈した)FACS緩衝液[カルシウム及びマグネシウムを含まず、２％ FBS及び２mM EDTAを補充したPBS(pH7.4)]で置換した。次いで、この集団中の陽性標識細胞の％を、Accuri C6フローサイトメータ(BD BioSciences)を用いるフローサイトメトリにより決定した。
図12に示す結果は、スタッファー配列を含有するベクター(NYESO1 NoW ６マー)を形質導入した細胞がWPREを含有するベクター(NYESO1 WPRE NoX)を形質導入した細胞と類似するパーセンテージのNYESO1 TCR発現細胞を産生することができたことを示す。
本発明の好適な実施形態を詳細に記載したが、本明細書に規定される本発明は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多くの明白な変形が可能であり、上記の説明に記載した特定の具体的記載に限定されるものでないことを理解すべきである。
【図１】
0006702863.tif 000005
【図２】
0006702863.tif 000006
【図３】
0006702863.tif 000007
【図４】
0006702863.tif 000008
【図５】
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【図６】
0006702863.tif 000010
【図７】
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【図８】
0006702863.tif 000012
【図９】
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【図１０】
0006702863.tif 000014
【図１１】
0006702863.tif 000015
【図１２】
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【配列表】
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