(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳ベースのタンパク性材料を、微生物由来アルカリセリンプロテアーゼ、ブロメライン、アスペルギルス・オリゼ由来のロイシンアミノペプチダーゼ、アスペルギルス・オリゼ由来のアスペルギロペプシン１、及びバシラス・サブチリス由来の中性プロテアーゼにより加水分解することを含み、
前記微生物由来アルカリセリンプロテアーゼが、サブチリシンカールスバーグである、乳タンパク質加水分解物の製造方法。
【請求項２】
（ｉｉｉ）前記乳ベースのタンパク性材料を前記サブチリシンカールスバーグにより加水分解することを含む、第１の加水分解ステップと、
（ｉｖ）前記乳タンパク質を、前記ブロメライン、前記ロイシンアミノペプチダーゼ、前記アスペルギロペプシン１、及び前記バシラス・サブチリス由来の中性プロテアーゼにより加水分解することを含む、第２の加水分解ステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記乳ベースのタンパク性材料が、乳清タンパク質、カゼイン、又はこれらの両方の混合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記乳ベースのタンパク性材料が乳清タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記加水分解物が、酵素不活性化、精密濾過及び／又は限外濾過に更に供される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質加水分解物が、高度に加水分解された生成物であり、加水分解度（ＮＰＮ／ＴＮ％）が９５％超のものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質加水分解物が、高度に加水分解された生成物であり、加水分解度（ＮＰＮ／ＴＮ％）が９９％超のものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって乳ベースタンパク質加水分解物を得ることを含む、乳ベースタンパク質加水分解物を含む組成物の製造方法。
【請求項９】
前記組成物が小児用フォーミュラ、フォローオンフォーミュラ、ベビーフードフォーミュラ、児童用栄養補助食品、又は成人用栄養組成物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、低アレルゲン性組成物である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
小児用フォーミュラの製造における、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により得られた乳タンパク質加水分解物の使用。
【請求項１２】
前記組成物が、食物不耐性、牛乳タンパク質アレルギー（ＣＭＡ）、慢性下痢及び吸収不良の、軽減又は予防における使用のためのものである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物由来及び植物由来の酵素を使用した乳ベースタンパク質加水分解物を含む組成物に関する。組成物は、小児用フォーミュラ及び栄養補助食品に組み込まれ得る。
【０００２】
本発明は、ブタ由来酵素の使用を回避することから、ハラール認証を有する組成物が提供される。
【背景技術】
【０００３】
人間の母乳及び授乳は、小児栄養の観点で比類のない存在である。人間の母乳の代替物又は補完物として提供される小児用フォーミュラは、小児の栄養所要量を満足し、許容され得る味である必要があり、更にはアレルギー及び／又は食物不耐性のリスクがある小児を対象とする場合には低アレルゲン性である必要がある。
【０００４】
牛乳に対するアレルギー、及び牛乳タンパク質を含有する小児用フォーミュラに対するアレルギーは、牛乳タンパク質が母乳タンパク質とは異なっており、ヒトにとってのアレルゲンを構成し得ることに起因することが知られている。主要な牛乳アレルゲンとしては、α−ラクトアルブミン（ａＬＡ）、β−ラクトグロブリン（ｂＬＧ）、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が認識されている。
【０００５】
ウシ乳清タンパク質及び／又はカゼインは、しばしば小児用フォーミュラにおける乳タンパク質源として使用される。
【０００６】
アレルゲン性を低減するために、牛乳タンパク質は酵素により加水分解され、これによりペプチドへと分解される。これらの加水分解産物の産生に使用される加水分解方法は、最終産物がその栄養価及び所望の物性を保持しつつ低アレルゲン性になるよう、注意深くモニターされなければならない。
【０００７】
加水分解産物は、加水分解反応が実施される程度により、「軽度」又は「高度」として評価され得る。現在、ＷＡＯ（国際アレルギー学会）による、牛乳タンパク質アレルギー（ＣＭＡ）についてのガイドラインに準拠する、高度加水分解物（ＥＨＰ）は、法律上／臨床上の定義としての合意には至っていないものの、かかる加水分解フォーミュラは、牛乳アレルギー（ＣＭＡ）に罹患している小児のためのタンパク質源として有用であることが証明されており、広く使用されていることは認識されている。高度加水分解物は、タンパク質／ペプチド群のうち少なくとも９５％の分子量が１０００ダルトン未満であるものとして定義され得るのに対し、軽度加水分解物は、タンパク質／ペプチド群のうち６０％の分子量が１０００ダルトン未満であるものとして定義され得る。現在、工業界ではこれらの定義が使用されている。
【０００８】
欧州小児アレルギー学会（ＥＳＰＡＣＩ）及び欧州小児栄養消化器肝臓学会（ＥＳＰＧＨＡＮ）の両方から、ＩｇＥにより介在されるＣＭＡには、安全性及び低アレルゲン性が証明されている高度加水分解フォーミュラを使用すべきだとの圧力がかけられている（Ｂｕｓｉｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９３，４：１０１〜１１１；Ｈoｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ  １９９９，８１：８０〜８４；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １９８９，８３：１０６８〜１０６９）。
【０００９】
多くの団体が加水分解方法を最適化するための研究を行っている。加水分解の反応条件、例えば、温度及び反応体積、加水分解のサイクル数、タンパク質基質の選択、酵素（複数可）の種類及び濃度などが、加水分解反応、ひいては最終産物の物理的、化学的、及び最終的には生物学的特性に影響を与える数多くの因子のうちのいくつかとして挙げられる。
【００１０】
加水分解方法には、ブタ酵素、特にブタ膵臓酵素が一般的に使用される。例えば、欧州特許第０３５３１２２号では、低アレルゲン性の乳清タンパク質加水分解物の製造にあたり特定比のトリプシン及びキモトリプシン混合物が使用される。国際公開第９３０４５９３（Ａ１）号及び米国特許第５０３９５３２（Ａ）号もトリプシン及びキモトリプシンを使用した加水分解方法を開示している。これらの方法には２ステップの加水分解反応が含まれており、各ステップの間には、最終的な加水分解物を、インタクトなアレルゲン性タンパク質を実質的に含まないものにすることを担保すべく、熱変性ステップが含まれている。これらの方法に使用されるトリプシン及びキモトリプシンは、ブタ膵臓抽出物より製造される調製物である。
【００１１】
動物由来の酵素を使用して製造されたタンパク質加水分解物を含有する数多くの製品が市場に流通している。例えば、Ｎｅｓｔｌｅ  ＨＡ（登録商標）小児用フォーミュラは、動物の膵臓から抽出したトリプシン及びキモトリプシンを使用して製造された加水分解物を使用して製造され得る。更に、高度加水分解物製品であるＡｌｆａｒｅ（登録商標）及びＡｌｔｈｅｒａ（登録商標）も、ブタパンクレアチンを使用して製造され得る。
【００１２】
当該技術分野では、非ブタ由来の酵素を使用して製造されたタンパク質加水分解物を含有する製品が必要とされている。有利に、このような製品はハラール認証を有し得る。しかしながら、非ブタ由来の酵素ベースの加水分解物は、ブタ由来酵素により得られる加水分解物に実質的に相当するペプチドプロファイルを有する必要があり、かつ低アレルゲン性を維持する必要がある。これは大変な難関ではあるが、新しい小児用フォーミュラを流通させるには、例えば、欧州指令２００６／１４１／ＥＣにおける厳格な規制ガイドラインに準拠しなくてはならないことから特に重要である。
【００１３】
本発明は、非ブタ酵素を使用して製造したタンパク質加水分解物を含有する製品に対する要求に対処する。
【発明の概要】
【００１４】
本発明者らは、加水分解反応を実施するにあたり候補となり得る非ブタ酵素を同定するために、大規模な研究プログラムを実施した。特に、本発明者らは、市販されている加水分解物製品、特にＡｌｆａｒｅ（登録商標）及びＡｌｔｈｅｒａ（登録商標）の製造に使用されるブタ酵素の代替となり得る酵素の組み合わせを同定した。
【００１５】
本発明者らは、加水分解反応性能及びペプチド分子量プロファイルなどといったパラメーターをモニターし、所望の物理的、化学的及び生物学的特性を備えた加水分解物を提供する酵素混合物を決定した。
【００１６】
本明細書に開示される乳タンパク質加水分解物は、効率的かつ再現性よく製造することができ、必要とされる栄養価を備えており、低アレルゲン性である。
【００１７】
本発明の第１の態様によると、乳ベースのタンパク性材料を微生物由来アルカリセリンプロテアーゼ、ブロメライン、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のプロテアーゼ、及びバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のプロテアーゼにより加水分解することを含む、乳タンパク質加水分解物の製造方法が提供される。
【００１８】
好ましくは、方法は、乳ベースのタンパク性材料を、微生物由来アルカリセリンプロテアーゼ、ブロメライン、アスペルギルス属由来の２種類のプロテアーゼ、及びバシラス属由来のプロテアーゼにより加水分解することを含む。
【００１９】
好ましくは、微生物由来アルカリセリンプロテアーゼはサブチリシンであり、好ましくは、サブチリシンカールスバーグ（subtilisin Carlsberg）である。
【００２０】
一実施形態では、アルカリセリンプロテアーゼは、バシラス属、好ましくは、バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来する。本発明に使用するためのアルカリセリンプロテアーゼの例は、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）（登録商標）である。
【００２１】
好ましくは、アスペルギルス属由来の２種類のプロテアーゼは、ロイシンアミノペプチダーゼ及びアスペルギロペプシン（aspergillopepsin）１である。
【００２２】
好ましくは、アスペルギルス属由来のプロテアーゼは、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のものである。
【００２３】
好ましくは、バシラス属由来のプロテアーゼは、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のものである。
【００２４】
好ましくは、バシラス属由来のプロテアーゼは、バシラス・サブチリスの中性プロテアーゼである。
【００２５】
好ましくは、方法は：
（ｉ）乳ベースのタンパク性材料を微生物由来アルカリセリンプロテアーゼにより加水分解することを含む、第１の加水分解ステップと、
（ｉｉ）乳タンパク質を、アスペルギルス属のプロテアーゼ及びバシラス属のプロテアーゼと組み合わせたブロメラインにより加水分解することを含む、第２の加水分解ステップとを含む。
【００２６】
乳ベースのタンパク性材料は、例えば、乳清タンパク質、カゼイン、又はこれらの両方の組み合わせであり得る。好ましくは、乳ベースのタンパク性材料は乳清タンパク質である。
【００２７】
好ましくは、加水分解物は、酵素不活性化、精密濾過、及び限外濾過に更に供される。
【００２８】
特に好ましい実施形態では、タンパク質加水分解物は、高度に加水分解された生成物であり、加水分解度（非タンパク質窒素／全窒素比、ＮＰＮ／ＴＮ  ％）は９５％超であり、好ましくは９９％超である。
【００２９】
本発明は、牛乳アレルギーの小児及び児童に提供することが意図されたものなどのフォーミュラ中に存在する「高度」タンパク質加水分解物を提供するのに特に有用である。このような加水分解物は、好ましくは、病気（アレルギー）の小児、及び既に牛乳タンパク質に感作された児童を対象とするものである。
【００３０】
したがって、本発明の別の態様によると、本発明の方法により得られた乳ベースタンパク質加水分解物を含む組成物が提供される。組成物は、例えば、小児用フォーミュラ、フォローオン（follow−on）フォーミュラ、ベビーフードフォーミュラ（baby food formula）、児童用栄養補助食品、又は成人用栄養組成物であり得る。
【００３１】
好ましい実施形態では、組成物は小児用フォーミュラであり、好ましくは、低アレルゲン性小児用フォーミュラである。
【００３２】
本発明は、アレルギーに関係するもの以外の効果、例えば：消化促進；アミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の吸収及び代謝増強；病気からの回復促進；並びに窒素源の利用最適化などを対象とした、小児、児童、又は成人用製品に有用である、タンパク質加水分解物、組成物、及びその製造方法も提供する。
【００３３】
本発明の別の態様によると、乳ベースのタンパク性材料の加水分解物を含む組成物の製造におけるブロメラインの使用が提供される。
【００３４】
好ましくは、ブロメラインの使用は、本明細書で参照される微生物由来アルカリセリンプロテアーゼ、並びにアスペルギルス属種及びバシラス属種由来のプロテアーゼの使用と組み合わせられる。
【００３５】
本発明の別の態様によると、小児用フォーミュラの製造における、本発明の方法により得られた乳タンパク質加水分解物の使用が提供される。
【００３６】
本発明の別の態様によると、食物不耐性、牛乳タンパク質アレルギー（ＣＭＡ）、慢性下痢、及び吸収不良の軽減又は予防における使用のための、本明細書に定義される組成物が提供される。
【００３７】
本発明の別の態様によると、食物不耐性、牛乳タンパク質アレルギー（ＣＭＡ）、慢性下痢、及び吸収不良の低減又は予防のための、本明細書に定義されるとおりの組成物の使用が提供される。
【００３８】
本発明の別の態様によると、本発明の組成物を対象に投与する方法が提供され、対象は、食物不耐性、牛乳タンパク質アレルギー（ＣＭＡ）、慢性下痢、及び吸収不良を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明による酵素の組み合わせを使用したＵＦ透過物のアミノ酸プロファイルを示す。別個の２回の試行により決定した（左側の棒は第１回目の試行であり、右側の棒は第２回目の試行である）。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明の乳ベースタンパク質加水分解物は、乳ベースのタンパク性材料の溶液を、本明細書で参照されるプロテアーゼにより処理することで得られる。
【００４１】
乳ベースタンパク性材料
乳ベースタンパク質加水分解物は、好ましくは、乳ベースのタンパク性材料である。乳ベースのタンパク質性材料は、乳清ベースのタンパク性材料、カゼイン、又は乳清ベースのタンパク性材料及びカゼインの混合物であり得る。
【００４２】
カゼイン源は、酸カゼイン又は無脂肪乳固形分であり得る。
好ましくは、乳ベースのタンパク性材料は乳清ベースであり得る。
【００４３】
乳清ベースのタンパク性材料は、チーズの製造に由来する乳清であってよく、特に、レンネットによるカゼインの凝固により得られるスイートホエイ、酸によるカゼインの凝固又は発酵物の酸性化により得られる酸性ホエイ、あるいは更には酸による及びレンネットによる凝固により得られる混合乳清であってよい。この出発材料は、イオン交換により、及び／又は電気透析により脱塩された、脱塩乳清タンパク質（ＤＷＰ）として知られる乳清であり得る。
【００４４】
このような乳清ベースのタンパク性材料源は、カゼイノ−グリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）が完全に又は部分的に除去されたスイートホエイであり得る。このようなホエイは、変性スイートホエイ（ＭＳＷ）と呼ばれる。スイートホエイからＣＧＭＰを除去すると、スレオニン及びトリプトファン含量がヒト母乳に近いタンパク質材料が得られる。スイートホエイからのＣＧＭＰの除去方法は、欧州特許第８８０９０２号に記載されている。出発材料はＤＷＰ及びＭＳＷの混合物であってよい。出発材料は、乳清タンパク質がタンパク質の３５〜８０％である濃縮物（ＷＰＣ）であってよく、又は乳清タンパク質濃度がタンパク質の９５％超である場合には単離物（ＷＰＩ）であり得る。ＷＰＣの例は、Ａｒｉａ  Ｆｏｏｄｓ（Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手可能なＷＰＣ  ８７  Ｌａｃｐｒｏｄａｎ（登録商標）であり、ＷＰＩの例は、Ｄａｖｉｓｃｏ  Ｆｏｏｄｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  ＵＳＡ）から入手可能なＢｉｐｒｏ（登録商標）である。
【００４５】
好ましくは、乳ベースのタンパク性材料は、乳清タンパク質単離物（ＷＰＩ）である。
【００４６】
乳ベースのタンパク性材料は、溶液又は懸濁物であってよく、例えば、タンパク性材料の２〜３０重量％、より好ましくは５〜２０重量％、より好ましくは６〜１０重量％の濃度で存在し得る。一実施形態では、乳ベースのタンパク性材料は、約６％の濃度で存在する。
【００４７】
加水分解のための出発材料に乳糖を加えることには、乳糖に含まれるなんらかの残留タンパク質が加水分解されるという利点がある。乳糖は、０．０５〜３０％  ｗ／ｗ、好ましくは０．１０〜２０％  ｗ／ｗの濃度で存在させてよく、低乳糖含量が好ましい場合には、０．１０〜１％、好ましくは０．１０〜０．２０％（ｗ／ｗ）の濃度で存在させてよい。後者の場合には、最終的な生成物は、乳糖耐性の低い対象に届けられることになり得る。乳糖は、例えば、限外濾過（ＵＦ乳清を生成）により、任意選択的にはこれに続いて透析を行うことにより除去することもできる。一実施形態では、乳糖は、約２％の濃度で存在する。
【００４８】
出発材料は、純品（true）又はコロイド水溶液の形態であってよく、あるいは粉末の形態であり得る。後者の場合、粉末は、好ましくは脱塩水に溶解されて水溶液を形成する。
【００４９】
加水分解に使用する酵素
微生物由来アルカリセリンプロテアーゼ
微生物由来アルカリセリンプロテアーゼは、好ましくは、バシラス種、より好ましくはバシラス・リケニフォルミスに由来するものである。
【００５０】
好ましい実施形態では、アルカリセリンプロテアーゼはサブチリシンである。
【００５１】
サブチリシンの例は、バシラス属に由来するものであり、例えば、サブチリシンノボ（subtilisin Novo）、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７、及びサブチリシン１６８（国際公開第８９／０６２７９号）、及びプロテアーゼＰＤ１３８（国際公開第９３／１８１４０号）に由来するものである。例は、国際公開第９８／０２０１１５号、同第０１／４４４５２号、同第０１／５８２７５号、同第０１／５８２７６号、同第０３／００６６０２及び同第０４／０９９４０１号に記載されている。
【００５２】
アルカリセリンプロテアーゼの例は、サブチリシンカールスバーグ酵素Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ００７８０又はそれらの変異体である。
【００５３】
特に好ましい実施形態では、本発明において使用するアルカリセリンプロテアーゼはアルカラーゼ（登録商標）である。
【００５４】
ブロメライン
用語「ブロメライン」は、当該技術分野で周知である。ブロメラインは、パイナップル科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）のメンバーに由来する抽出物とされ、かかる抽出物は、様々なチオールプロテアーゼを含むとともに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいてタンパク質分解活性を有することが知られている。
【００５５】
好ましくは、抽出物は、アナナス・コモサス（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）（パイナップル）の茎に由来する。抽出物は、システインプロテアーゼ、アミラーゼ、酸ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、及びセルラーゼなどの成分を含み得る。
【００５６】
酵素は次のＥＣ番号：ＥＣ  ３．４．２２．３２を有し得る。
【００５７】
ブロメラインは：「茎ブロメライン（stem bromelain）」（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１４５１８）又はそれらの変異体を含み得る。
【００５８】
アスペルギルス属プロテアーゼ
ロイシンアミノペプチダーゼ
好ましくは、アスペルギルスロイシンアミノペプチダーゼが本発明に使用される。より好ましくは、アスペルギルス・オリゼロイシンアミノペプチダーゼが本発明に使用される。
【００５９】
酵素は、次のＥＣ番号：ＥＣ  ３．４．１１．１を有し得る。
【００６０】
ロイシンアミノペプチダーゼは、好ましくは、ペプチドのＮ末端の残基の加水分解を触媒し、好ましくはロイシン残基の加水分解を触媒する。
【００６１】
アスペルギルス・オリゼにより発現されるロイシンアミノペプチダーゼ酵素の例としては、ＬＡＰＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ２Ｕ１Ｆ３）、ＬＡＰ１（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ２ＰＩＴ３）、及びＬＡＰ２（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ２ＵＬＭ２））が挙げられる。
【００６２】
アスペルギロペプシン１
好ましくは、アスペルギルス属種に由来するアスペルギロペプシン１が本発明に使用される。より好ましくは、アスペルギルス・オリゼアスペルギロペプシン１が本発明に使用される。当該技術分野で一般的に使用されている、アスペルギロペプシン１の別名としては、特に、アスペルギロペプシンＡ、アスペルギロペプシンＦ、及びアスペルギロペプチダーゼ（Aspergillopeptidase）Ａが挙げられる。
【００６３】
酵素は次のＥＣ番号：ＥＣ  ３．４．２３．１８を有し得る。
【００６４】
アスペルギロペプシン１酵素は、好ましくは、広範な特異性によりポリペプチドの加水分解を触媒し、好ましくは、疎水性残基間のペプチド結合の加水分解を触媒する。
【００６５】
バシラス属プロテアーゼ
好ましくは、バシラス属由来のプロテアーゼが、本発明の方法に使用される。好ましくは、バシラス・サブチリス中性プロテアーゼが、本発明の方法に使用される。当該技術分野で一般的に使用されるバシラス・サブチリス中性プロテアーゼの別名としては、特に、バシロリシン、バシラスメタロエンドペプチダーゼ、メガテリオペプチダーゼ（ｍｅｇａｔｅｒｉｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、バシラス中性プロテアーゼ、及びバシラス細胞外中性メタロプロテアーゼが挙げられる。
【００６６】
好ましくは、バシラス・サブチリス中性プロテアーゼは、バシラス・サブチリスに由来するものである。
【００６７】
バシラス属プロテアーゼは、次のＥＣ番号：３．４．２４．２８を有し得る。
【００６８】
バシラス属プロテアーゼの例は、ＮＰＲＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ６８７６３）又はそれらの変異体である。
【００６９】
加水分解方法
加水分解方法を実施するにあたっての典型的な条件は、先行技術文献に記載されている。温度は、約４０℃〜６０℃の範囲であってよく、例えば、約５５℃であってよい。反応時間は、例えば、１〜１０時間であり、加水分解開始前のｐＨ値は、例えば、６．５〜８．５、好ましくは、７．０〜８．０の範囲内に該当し得る。
【００７０】
ｐＨは、既知の剤、例えば、Ｃａ（ＯＨ）２により調整され得る。
【００７１】
一実施形態では、方法は：
（ｉ）乳ベースのタンパク性材料を微生物由来アルカリセリンプロテアーゼにより加水分解することを含む、第１の加水分解ステップと、
（ｉｉ）乳タンパク質を、アスペルギルス属由来のプロテアーゼ及びバシラス属由来のプロテアーゼと組み合わせたブロメラインにより加水分解することを含む、第２の加水分解ステップとを含む。
【００７２】
ステップ（ｉ）は、例えば約４時間にわたって実施でき、ステップ（ｉｉ）は、例えば約６時間にわたって実施できる。
【００７３】
加水分解の実施される様式とは関係なく、加水分解産物は、加水分解を実施する酵素を不活性化する熱処理にかけられる。この熱処理は、好ましくは、加水分解物を７５℃以上（例えば、７５℃〜９０℃）の温度に予熱するステップと、加水分解物をこの温度で約０．１〜３０分保持して酵素の自動消化を促進するステップと、を含む。この処理の後には、好ましくは超高温での滅菌、例えば蒸気の注入により、あるいは熱交換器において、１２５℃〜１３５℃で３０秒間〜３分間の滅菌が行われ得る。
【００７４】
このようにして得られた加水分解物は、精製、精密濾過処理、及び／又は限外濾過されて、残存している大型のタンパク質断片が除去され得る。得られた加水分解物は、例えば、逆浸透により濃縮されてもよい。これは次に乾燥されてよく、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥により乾燥されてよく、あるいは異なる用途の際にはフリーズドライにより乾燥されてよく、あるいは更には続いて処理されてもよい。後者の場合、酵素は、後続の処理中に不活性化してもよい。
【００７５】
本発明の加水分解物は、ＮＰＮ／ＴＮ  ％含量により評価される加水分解度を有し得る。ＮＰＮ／ＴＮ％比は、非タンパク質窒素を全窒素で除したものに１００を乗じたものを意味する。非タンパク質窒素は、タンパク質の酸沈殿後に得られる窒素画分である。ＮＰＮ／ＴＮ％は、Ａｄｌｅｒ−Ｎｉｓｓｅｎ  Ｊ−，１９７９，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２７（６），１２５６〜１２６２に記載のとおりに測定され得る。
【００７６】
あるいは、加水分解度は、加水分解により放出されたアミノ窒素量により評価され得る；遊離アミノ窒素は、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）などの剤と反応し得る。
【００７７】
概して、高度加水分解物は、９５％超のＮＰＮ／ＴＮ％を有するものとして評価される一方、軽度に加水分解された加水分解物は、７５％〜８５％の範囲のＮＰＮ／ＴＮ％を有するものとして評価される。好ましい実施形態では、本発明の加水分解物は、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超の範囲のＮＰＮ／ＴＮ  ％を有する高度加水分解物である。
【００７８】
これらの加水分解物はまた、それらのタンパク質／ペプチド群のうちの少なくとも９５％が１０００ダルトン未満の分子量を有するものとして評価され得る。
【００７９】
得られたタンパク質加水分解物中のペプチドの分子量分布は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定され得る。好ましい実施形態では、本発明の加水分解物は、Ａｌｆａｒｅ（登録商標）と同様の又は実質的に同一のペプチド分子量分布を有する。好ましくは、本発明の加水分解物は、本明細書で参照される、ブロメライン並びにアスペルギルス属及びバシラス属プロテアーゼの代わりに（特に、ブロメライン、アスペルギルス・オリゼ由来のロイシンアミノペプチダーゼ、アスペルギルス・オリゼ由来のアスペルギロペプシン１、バシラス・サブチリス中性プロテアーゼの代わりに）、ブタパンクレアチンにより作製された加水分解物と同様である、又は実質的に同一であるペプチド分子量分布を有する。言い換えれば、ブロメライン並びにアスペルギルス属及びバシラス属プロテアーゼブレンドは、本発明の文脈において、ブタパンクレアチンと実質的に同じ加水分解活性を発揮する。
【００８０】
好ましい実施形態では、本発明の加水分解物は、高度加水分解物であり、３００Ｄａ〜３７０Ｄａ、好ましくは、３２０Ｄａ〜３６０Ｄａの平均分子量を有するペプチドから構成される。
【００８１】
加水分解物に残存している抗原性は、ＥＬＩＳＡ試験などの標準的な免疫アッセイを用い評価することができる。好ましくは、本発明の加水分解物の示す残存β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）は、タンパク質１ｇ当量あたり０．１ｍｇ当量未満のＢＬＧであり、最も好ましくは、タンパク質１ｇあたり０．０１ｍｇ当量未満のＢＬＧである。
【００８２】
本発明の加水分解物は、小児用フォーミュラ、フォローオンフォーミュラ、ベビーフード、小児用シリアル、グローアップミルク、小児用若しくは児童用栄養補助食品、又は成人用栄養組成物、すなわち、アレルギーの治療に関する全ての調製物に組み込むことができ、並びにタンパク質加水分解物が人体に提供し得る何らかのその他の効果を提供し得る。好ましくは、加水分解物は、小児用フォーミュラのスターターに使用される。
【００８３】
アレルギー予防を目的として牛乳タンパク質加水分解物から構成された、現在の低アレルゲン性フォーミュラは、その他の栄養素、例えば、動物油、植物油、スターチ、マルトデキストリン、乳糖、及びスクロースも含む。
【００８４】
本発明の一実施形態では、本発明の加水分解物は、選択されたプロバイオティクスと組み合わせて、例えば、小児用フォーミュラに使用される。選択されたプロバイオティクスは、小児用フォーミュラに一般に使用されるプロバイオティクスのいずれかであってよい。好ましくは、プロバイオティクスは、アレルギーに対し相加効果又は相乗効果を提供することができるものである。
【００８５】
本発明に使用され得る、好適なプロバイオティクス微生物の例としては、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバロマイセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、及びトルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）などの酵母、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、及びペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）及びトルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）などのカビ、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｕｍ）、メリソコッカス属（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｕｍ）、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｏｃｏｃｃｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ワイセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、オエノコッカス属（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、及びラクトバシラス属（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ）などのバクテリアが挙げられる。好適なプロバイオティクス微生物の具体例は：サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ）、バシラス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ラクトバシラス・アシドフィルス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシラス・アリメタリウス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ亜種カゼイ（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・カゼイ・シロタ（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  Ｓｈｉｒｏｔａ）、ラクトバシラス・カルバタス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバシラス・デルブリッキ亜種ラクチス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバシラス・ファルシミナス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒ���ｉｍｉｎｕｓ）、ラクトバシラス・ガセリ（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバシラス・ヘルベティカス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・ジョンソニ（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバシラス・ロイテリ（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバシラス・ラムノーサス（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）［ラクトバシラスＧＧ（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ＧＧ）］、ラクトバシラス・サケイ（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ミクロコッカス・バリアンス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ペディオコッカス・ハロフィルス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スタフィロコッカス・カルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）、及びスタフィロコッカス・キシローサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｕｓ）である。
【００８６】
好ましいプロバイオティクスバクテリア株としては、フィンランドのＶａｌｉｏ  Ｏｙから商品名ＬＧＧで入手可能なラクトバシラス・ラムノーサスＡＴＣＣ  ５３１０３、ラクトバシラス・ラムノーサスＣＧＭＣＣ  １．３７２４、ラクトバシラス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＮＣＭ  １−２１１６、特にデンマークのＣｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｈａｎｓｅｎ社から商品名Ｂｂ  １２で市販のビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＣＮＣＭ  １−３４４６、並びに日本の森永乳業から商品名ＢＢ５３６で市販のビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９が挙げられる。
【００８７】
プロバイオティクスは、例えば、組成物１ｇ当たり、又は組成物ｍＬ当たり、１０３〜１０１２ｃｆｕ、より好ましくは、１０６〜１０１１ｃｆｕ、更により好ましくは、１０４〜１０９ｃｆｕ、最も好ましくは、１０７〜１０９ｃｆｕの量で存在し得る。
【００８８】
当業者であれば理解されるように、当業者は、開示される本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書で説明する本発明の全ての特徴を自由に組み合わせることができる。
【００８９】
ここで、本発明の種々の好ましい特徴及び実施形態を非限定的な例として記載する。
【００９０】
本発明を実施するときには、特に断りのない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来技術を用いており、これは当業者の能力の範囲内である。このような技術は文献に説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ  １〜３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ  １６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ  Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ，１９９０，Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；及びＥ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，１９９２  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．を参照のこと。これらの一般的なテキストのそれぞれは、参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【００９１】
Ａｌｆａｒｅ（登録商標）及びＡｌｔｈｅｒａ（登録商標）は、食物アレルギー及び食物不耐性を有する乳児を対象とした、高度に加水分解された小児用フォーミュラである。
【００９２】
Ａｌｆａｒｅ及びＡｌｔｈｅｒａは、製造方法中にブタパンクレアチン調製物を用いる。
【００９３】
植物及び微生物由来プロテアーゼのプレブレンドは、予想外にも、高度加水分解産物（ＥＨＰ）の産生においてパンクレアチンの代替となり、かつ加水分解産物、特に高度加水分解産物（ＥＨＰ）の生物学的及び物理学的特性は維持する、好適な代替物として同定されている。特に、ブロメライン、微生物由来アルカリセリンプロテアーゼ、アスペルギルス属由来のプロテアーゼ、及びバシラス属由来のプロテアーゼの組み合わせの使用が、パンクレアチンの好適な代替として同定されている。
【００９４】
本発明者らは、乳ベースのタンパク性材料を前述の剤により加水分解することを含む、乳タンパク質加水分解物の製造方法を確立した。
【００９５】
実施例１−方法
５００ｋｇのＢｉｐｒｏ（乳清単離物）を、アルカラーゼ（登録商標）、ブロメライン、アスペルギルス・オリゼ由来のロイシンアミノペプチダーゼ、アスペルギルス・オリゼ由来のアスペルギロペプシン１、及びバシラス・サブチリス由来のバシラス・サブチリス中性プロテアーゼにより加水分解した。
【００９６】
酵素の不活性化は、熱処理（９０℃で５分間）により行い、残存している全てのインタクトなタンパク質と大型のペプチドとを精密濾過及び限外濾過により除去した。
【００９７】
実施例２−加水分解度
ＮＰＮ／ＴＮ  ％
加水分解度は、非タンパク質窒素と、全窒素との比（ＮＰＮ／ＴＮ  ％）を使用して決定した。非タンパク質窒素画分は、タンパク質の酸沈殿により得られる。タンパク質加水分解時に得られたペプチドは、「非タンパク質窒素」部分に該当する。したがって、ＮＰＮ／ＴＮ含有量は、加水分解度が増加するに伴い増加する。対象は、加水分解物中、ＮＰＮ／ＴＮが９５％以上であり、濾過後のＮＰＮ／ＴＮが９９％以上である。
【００９８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
加水分解度は、加水分解物中及び濾過後に残存するなんらかのインタクトなタンパク質及び大型ペプチド（１０ｋＤａ超）を同定するために、Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及び銀染色によっても決定した。サンプル中に存在する全タンパク質及びペプチドは、サンプルの変性（ＳＤＳ及び熱による処理）、還元（ジスルフィド架橋を還元するための、ＤＴＴによる処理）、及びアシル化（チオール基をブロックするためのヨードアセトアミド（iodoactamide）の付加）の後でポリアクリルアミドゲルを用い分離される。インタクトなタンパク質及び大型のペプチドのうちの一部のものは加水分解後にも存在し得るものの、溶液１μＬあたり２μｇの窒素を含有するサンプル溶液をゲルにロードし、濾過した後には、残存タンパク質及び大型ペプチドに関係するバンドは検出されなかった。
【００９９】
ＢＬＧ−ＥＬＩＳＡ
抗原性が残存していないことは、ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍから市販の、β−ラクトグロブリンに特異的な酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）キットを使用してβ−ラクトグロブリン抗原性を決定することにより評価した。対象は、乳清ベースの加水分解物においてキットの検出限界未満、すなわち、０．０１ｍｇ  β−ラクトグロブリン当量／ｇタンパク質未満である。
【０１００】
ペプチドプロファイル
加水分解により生成され、濾過後の最終産物中に存在するペプチドを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を使用してその分子量に基づき評価した。サンプルを０．１％  ＴＦＡ水溶液に溶解させた後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １０／３００  ＧＬサイズ排除カラムを使用し、移動相として、０．１％  ｖ／ｖ  ＴＦＡ、３０％  ｖ／ｖ  ＡＣＮ水溶液を用い、可溶性ペプチドの分子量分布（及び中央値）を得た。次の範囲：ペプチド２４００Ｄａ超、１２００〜２４００Ｄａ、６００〜１２００Ｄａ、２４０〜６００Ｄａ、及び２４０Ｄａ未満でペプチドの分子量分布を決定した。中央値は、ペプチドのうち５０％がこの値よりも大きな分子量を有する分子量である。
【０１０１】
遊離ＡＡ／全ＡＡ％
加水分解による遊離アミノ酸の放出は、遊離アミノ酸と、全アミノ酸との比（遊離ＡＡ／全ＡＡ％）を使用して決定した。イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）による、水性サンプル抽出物中に存在する遊離アミノ基の分離、及びニンヒドリン試薬によるカラム誘導体化後の光度検出により、遊離アミノ酸含量を得る。全アミノ酸含量は、上記のとおり、窒素下、６ｍｏｌ／Ｌ塩酸（ＨＣｌ）中での試験画分の加水分解（システインのシステイン酸への過酸化、及びメチオニンのメチオニン−スルホンへの過酸化は、酸安定なアミノ酸を定量するため加水分解前に行う）、及びイオン交換クロマトグラフィーによる各アミノ酸の分離により得られる。
【０１０２】
本発明の酵素ブレンドを使用した３通りの実験の結果を表１に示す。
【０１０３】
【表１】
0006748099.tif 000002
【０１０４】
全ての結果は目標値以内であった。
【図１】
0006748099.tif 000003