(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
A型及びB型インフルエンザウイルスに対する交差保護応答を誘導する弱毒化A型インフルエンザウイルスであって、NS1タンパク質の短縮されたリーディングフレームとNep遺伝子異種配列とを含むキメラNS断片を含み、NS1タンパク質の前記短縮されたリーディングフレームが、H1N1亜型インフルエンザウイルスに由来し、Nep遺伝子異種配列が、H2N2亜型インフルエンザウイルスに由来し、前記前記短縮されたリーディングフレームが、配列番号4に対応する124アミノ酸残基からなるNS1タンパク質をコードする、弱毒化A型インフルエンザウイルス。
【請求項２】
細菌、ウイルス及び原虫からのタンパク質又はその断片からなる群から選択されるタンパク質又はその断片を発現する弱毒化インフルエンザウイルスベクターであって、前記ベクターが、請求項1に記載の弱毒化A型インフルエンザウイルスであり、NS1タンパク質遺伝子の短縮されたリーディングフレームが、細菌、ウイルス及び原虫からのタンパク質又はその断片をコードする少なくとも1つの導入遺伝子の配列のインサートにより伸長され、細菌、ウイルス又は原虫が病原性である、弱毒化インフルエンザウイルスベクター。
【請求項３】
タンパク質又はその断片が、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、結核菌、ヘルペスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、マラリア寄生虫、トリコモナス、トリパノソーマ、リーシュマニア、クラミジア、ブルセラ症原因物質又はこれらの組合せのタンパク質からなる群から選択される、請求項2に記載の弱毒化インフルエンザウイルスベクター。
【請求項４】
タンパク質又はその断片が、10〜400アミノ酸からなる、請求項2に記載の弱毒化インフルエンザウイルスベクター。
【請求項５】
インサートが、インフルエンザウイルスからのHAタンパク質領域をコードする、請求項2に記載の弱毒化インフルエンザウイルスベクター。
【請求項６】
HAタンパク質領域が、A型インフルエンザウイルスの1〜185アミノ酸、B型インフルエンザウイルスの1〜186アミノ酸、A型インフルエンザウイルスの23〜185アミノ酸、又はA型インフルエンザウイルスの65〜222アミノ酸からなる群から選択されるHA2サブユニット領域である、請求項5に記載の弱毒化インフルエンザウイルスベクター。
【請求項７】
インサートが、1〜21アミノ酸のA型又はB型インフルエンザウイルスHA2サブユニット領域の配列、及び243〜251アミノ酸のA型インフルエンザウイルスNPタンパク質領域の配列をコードする、請求項2に記載の弱毒化インフルエンザウイルスベクター。
【請求項８】
インサートが、結核菌のタンパク質ESAT-6、Ag85A、Ag85B、Mpt64、HspX、Mtb8.4若しくは10.4、又はその断片をコードする、請求項2に記載の弱毒化インフルエンザウイルスベクター。
【請求項９】
ウイルスゲノム配列が、NS1タンパク質遺伝子の前記短縮されたリーディングフレームとタンパク質ESAT6をコードするインサートの間に、自己切断性2Aペプチドをコードする配列を更に含む、請求項8に記載の弱毒化インフルエンザウイルスベクター。
【請求項１０】
インフルエンザウイルスタンパク質又はその断片を発現する弱毒化インフルエンザウイルスベクターであって、前記ベクターが、請求項1に記載の弱毒化インフルエンザウイルスであり、NS1タンパク質遺伝子の短縮されたリーディングフレームが、B型インフルエンザHA2タンパク質の1〜21aa及びA型インフルエンザNPタンパク質の243〜251aaをコードする配列のインサートにより伸長される、弱毒化インフルエンザウイルスベクター。
【請求項１１】
腫瘍溶解活性を有する弱毒化インフルエンザウイルスベクターであって、前記ベクターが、請求項1に記載の弱毒化A型インフルエンザウイルスであり、NS1タンパク質遺伝子の短縮されたリーディングフレームが、結核菌のタンパク質ESAT-6をコードする配列のインサートにより伸長される、弱毒化インフルエンザウイルスベクター。
【請求項１２】
タンパク質又はその断片が、10〜400アミノ酸からなる、請求項11に記載の弱毒化インフルエンザウイルスベクター。
【請求項１３】
NS1タンパク質遺伝子の短縮されたリーディングフレームが、自己切断性2Aペプチドをコードする配列のインサートにより更に伸長される、請求項11に記載の弱毒化インフルエンザウイルスベクター。
【請求項１４】
A型及びB型インフルエンザウイルスに対する交差保護応答を誘導する弱毒化インフルエンザウイルスベクターであって、
配列番号14のPB2タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又は配列番号14と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
配列番号15のPB1タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又は配列番号15と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
配列番号16のPAタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又は配列番号16と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
配列番号17のNPタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又は配列番号17と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
配列番号18のMタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又は配列番号18と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
配列番号19のHAタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又は配列番号19と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
配列番号20のNAタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又は配列番号20と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;及び
配列番号21のNSタンパク質キメラ遺伝子のヌクレオチド配列であって、
短縮されており、124アミノ酸残基からなるNS1タンパク質をコードする、インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)に由来するNS1タンパク質リーディングフレームと、
インフルエンザА/シンガポール/1/57様(H2N2)ウイルスに由来するNep遺伝子配列と
を含む、ヌクレオチド配列、又は
配列番号21と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含み、
前記NS1タンパク質の短縮されたリーディングフレームが、B型インフルエンザサブユニットHA2領域とA型インフルエンザウイルス核タンパク質(NP)の保存B細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列との融合ペプチドをコードするヌクレオチド配列のインサートによって伸長される、弱毒化インフルエンザウイルスベクター。
【請求項１５】
NSタンパク質キメラ遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号21に記載のものである、請求項14に記載の弱毒化インフルエンザウイルスベクター。
【請求項１６】
請求項2に記載の弱毒化インフルエンザウイルスベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む、対象における感染性病原体に対する免疫応答の誘導のための免疫原性組成物。
【請求項１７】
請求項14に記載の弱毒化インフルエンザウイルスベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む、インフルエンザの予防のための医薬組成物。
【請求項１８】
6.5〜10.5 log EID50/mlの弱毒化A型インフルエンザウイルスと、0〜1.5重量%の一価の塩、0〜5重量%のイミダゾール含有化合物、0〜5重量%の炭水化物成分、0〜2重量%のタンパク質成分、0〜2重量%のアミノ酸成分及び0〜10重量%のヒドロキシエチル化デンプンを含む緩衝溶液とを含む、請求項16又は17に記載の免疫原性又は医薬組成物。
【請求項１９】
緩衝溶液が、0.5〜1.5重量%の一価の塩、0.01〜5重量%のイミダゾール含有化合物、1〜5重量%の炭水化物成分、0.1〜2重量%のタンパク質成分、0.01〜2重量%のアミノ酸成分、及び1〜10重量%のヒドロキシエチル化デンプンを含む、請求項16に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
一価の塩が、塩化ナトリウムであり、炭化水素成分が、スクロース、トレハロース又はラクトースであり、タンパク質成分が、ヒトアルブミン、カジトン、ラクトアルブミン水解物又はゼラチンであり、アミノ酸成分が、アルギニン、グリシン又はグルタミン酸ナトリウムであり、イミダゾール含有化合物が、L-カルノシン又はN,N'-ビス[2-(1H-イミダゾール-5イル)エチル]プロパンジアミドである、請求項19に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
感染性疾患が、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、結核菌、単純ヘルペスウイルスI及びII型、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、マラリア寄生虫、トリコモナス、クラミジア、トリパノソーマ、リーシュマニア又はブルセラ症原因物質からなる群から選択される病原体によって引き起こされる、請求項16に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
対象が、哺乳動物又はトリである、請求項16に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
対象が、ヒト対象である、請求項22に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
請求項1に記載の弱毒化インフルエンザウイルスベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む、インフルエンザに対するワクチン。
【請求項２５】
請求項14に記載の弱毒化インフルエンザウイルスベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む、インフルエンザに対するワクチン。
【請求項２６】
6.5〜10.5 log EID50/mlの弱毒化インフルエンザウイルスと、0〜1.5重量%の一価の塩、0〜5重量%のイミダゾール含有化合物、0〜5重量%の炭水化物成分、0〜2重量%のタンパク質成分、0〜2重量%のアミノ酸成分及び0〜10重量%のヒドロキシエチル化デンプンを含む緩衝溶液とを含む、請求項24又は25に記載のワクチン。
【請求項２７】
緩衝溶液が、0.5〜1.5重量%の一価の塩、0.01〜5重量%のイミダゾール含有化合物、1〜5重量%の炭水化物成分、0.1〜2重量%のタンパク質成分、0.01〜2重量%のアミノ酸成分、及び1〜10重量%のヒドロキシエチル化デンプンを含む、請求項24に記載のワクチン。
【請求項２８】
一価の塩が、塩化ナトリウムであり、炭化水素成分が、スクロース、トレハロース又はラクトースであり、タンパク質成分が、ヒトアルブミン、カジトン、ラクトアルブミン水解物又はゼラチンであり、アミノ酸成分が、アルギニン、グリシン又はグルタミン酸ナトリウムであり、イミダゾール含有化合物が、L-カルノシン又はN,N'-ビス[2-(1H-イミダゾール-5イル)エチル]プロパンジアミドである、請求項27に記載のワクチン。
【請求項２９】
対象におけるインフルエンザを処置及び/又は予防するための医薬の製造における、請求項2に記載の弱毒化インフルエンザウイルスベクターの使用。
【請求項３０】
インフルエンザが、A型インフルエンザウイルス及びB型インフルエンザウイルスからなる群から選択される病原体によって引き起こされる、請求項29に記載の使用。
【請求項３１】
対象が、哺乳動物又はトリである、請求項30に記載の使用。
【請求項３２】
対象が、ヒト対象である、請求項31に記載の使用。
【請求項３３】
請求項11に記載の弱毒化インフルエンザウイルスベクターの有効量、及び薬学的に許容される担体を含む、対象における腫瘍性疾患の処置のための医薬組成物。
【請求項３４】
8.5〜10.5 log EID50/mlの弱毒化インフルエンザウイルスベクターと、0〜1.5重量%の一価の塩、0〜5重量%のイミダゾール含有化合物、0〜5重量%の炭水化物成分、0〜2重量%のタンパク質成分、0〜2重量%のアミノ酸成分及び0〜10重量%のヒドロキシエチル化デンプンを含む緩衝溶液とを含む、請求項33に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
緩衝溶液が、0.5〜1.5重量%の一価の塩、0.01〜5重量%のイミダゾール含有化合物、1〜5重量%の炭水化物成分、0.1〜2重量%のタンパク質成分、0.01〜2重量%のアミノ酸成分、及び1〜10重量%のヒドロキシエチル化デンプンを含む、請求項34に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
一価の塩が、塩化ナトリウムであり、炭水化物成分が、デンプンであり、タンパク質成分が、ヒトアルブミンであり、アミノ酸成分が、アルギニンであり、イミダゾール含有化合物が、L-カルノシン又はN,N'-ビス[2-(1H-イミダゾール-5イル)エチル]プロパンジアミドである、請求項35に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
対象におけるがん疾患を処置するための医薬の製造における、請求項11に記載の弱毒化インフルエンザウイルスベクターの使用。
【請求項３８】
腫瘍性疾患が、結腸直腸がん、食道胃接合部がん、膵がん、胆管細胞がん、神経膠腫、神経膠芽腫及び黒色腫からなる群から選択される、請求項37に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学及びウイルス学の分野に関し、特に、弱毒化キメラAウイルス、それに基づく弱毒化インフルエンザベクター、並びに感染性疾患の予防及び/又は処置のための並びに腫瘍性疾患の処置のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、ウイルス感染症に対する及びその伝播を制限するための最も重要な保護対策は、予防接種である。現代のワクチンは、通例に、表面ウイルス抗原に対する抗体の形成を誘導する。ワクチンの有効性は、ワクチンに含有されているウイルス株の抗原構造と集団内で循環している株との一致度に直接依存する。大部分のウイルスの表面タンパク質は、絶え間ない抗原変異(抗原連続変異)を起こすので、必然的にワクチン株組成の絶え間ない更新が必要となる。作用範囲の広い免疫応答を誘導する高免疫原性の安全なワクチンの開発は、効率的インフルエンザ予防で直面する目下の主な課題の1つである。
【０００３】
全てのウイルス性呼吸器疾患のうち、インフルエンザは、最も重篤な症状を引き起こし、公衆衛生及び経済に最も大きい損害をもたらす。定期的に出現する新たなパンデミックインフルエンザ株に対する集団免疫の欠如は、インフルエンザ感染症を特に危険なものにする。1918年にスペイン風邪が原因で3〜5千万人が死亡したことは公知である。現在、世界保健機関(WHO)データによれば、成人の5〜10%及び小児の20〜30%を含む、世界人口のおよそ20%が、毎年、季節性流行期にインフルエンザで体調が悪くなる(世界保健機関  URL: http://www.who.int/biologicals/vaccines/influenza/en/ (アクセス日: 2016年03月28日))。3〜5千万ケースに関して重症型が記録されており、250,000〜500,000ケースは致死性である。インフルエンザ及び他の急性呼吸器ウイルス感染症(ARVI)に起因する経済的損失は、全感染性疾患からの総合的損害のおよそ77%を占める。有意な損失が、患者の処置及びリハビリテーションの直接的なコストと、生産性の減少及び企業利益の低下に起因する間接的な損失の両方に関連している。インフルエンザ及び急性呼吸器ウイルス感染症は、一時労働不能ケースの総数の12〜14%を占める。
【０００４】
既存のワクチンは、弱毒化(低い病原性を示す全粒子型の活性ウイルスを含有する、生)タイプ及び不活化(ウイルス粒子の断片又は全粒子型の不活性ウイルスを含有する)タイプという、2つのタイプに細分することができる。感染した宿主において複製することができる生ウイルスは、発現されるこれらのウイルスの抗原に対して強い且つ持続性の免疫応答を惹起する。それらは、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を効果的に誘導し、サイトカイン媒介免疫応答及びケモカイン媒介免疫応答を刺激する。したがって、弱毒化生ウイルスは、免疫系の体液性部分のみを一般に刺激する、不活化された免疫原又は別個の免疫原サブユニットのいずれかに基づくワクチン組成物より、確実に有利である。
【０００５】
様々な感染性疾患に対する動物及びヒトの予防接種のために、外来ゲノム配列を発現するベクターとして異なる科のウイルスが使用されうる。ベクターは、旧来の死菌ワクチン若しくは生ワクチンを生産することができないか、又はそれらの有効性によって疾患を制御することができない場合に使用されうる。既存の抗原送達系の中で、ウイルスベクターは、次の特性のため、特別な位置を占めている。ウイルスベクターは、細胞と相互作用してその細胞に侵入し、細胞質又は細胞核に外来の遺伝物質を輸送する自然のメカニズムを有し、抗原の長期間続く発現をもたらすことができ、ウイルスエンベロープは、導入された導入遺伝子をコードする核酸を保護する。
【０００６】
全てのウイルスが、有効な弱毒化組換えワクチンの生産のためのベクターを構築するのに必要な特性を有するとは限らない。現在、ウイルスベクターに基づくワクチンの開発に最も広く使用されているウイルスは、ポックスウイルス(ポックスウイルス科(Poxviridae))[J. Gen.Virol.、2005年、86巻、11号、2925〜2936頁]、ニューカッスル病ウイルス(NDV)[Virol.、2001年、75巻、23号、11868〜11873頁]及びアデノウイルス(アデノウイルス科(Adenoviridae))[Biotechnology、2007年、5巻、38〜44頁]である。ウイルスベクターとして使用されるポックスウイルスの中で最も評判のよいウイルスは、高いパッケージ能(25kbpまで)に加えて生産の単純性、低い生産コストといった利点があるワクシニアウイルスである[J. Gen.Virol.、2005年、86巻、11号、2925〜2936頁]。ワクシニアウイルスに基づくベクターの深刻な欠点は、天然痘に対する免疫化の結果としてヒト集団の一部に存在するこのウイルスの既存の免疫である。したがって、カナリアポックス(カナリアポックス(Canarypox))及び家禽ポックスウイルス(フローポックス(Flowpox))等の、ポックスウイルスに基づくベクターを使用するのが賢明である。しかし、カナリアポックス及びフローポックスは、標的抗原に対して誘導する免疫応答がワクシニアウイルスより弱く、反復投与又はアジュバントの使用を必要とする[Vaccine、1991年、9巻、5号、303〜308頁]。NDVワクチンベクターの有意な欠点は、組換えNDVの投与の効果が十分に研究されておらず、NDVに基づくワクチンがヒトにとって安全であるかどうか明らかでない点である。加えて、NDVの特徴は、低いパッケージ能、及び数個の標的抗原を担持するベクターの生産の難しさである[Chem.Biodivers、2010年、7巻、3号、677〜689頁]。アデノウイルスにも、遺伝子移入用のベクターとしてのそれらの使用を制限するいくつかの欠点がある。アデノウイルスベクターの主な欠点は、次の点である: (1)多くの細胞をアデノウイルス感染に対して非感受性にする、体内の細胞の表面のウイルス受容体の不均一な分布; (2)公知アデノウイルスベクターに対する集団の強力な保護免疫の存在;及び(3)ヒト染色体へのアデノウイルスDNAゲノムの組み込みの論理的可能性(Stephen SL、Montini E、Sivanandam VG、Al-Dhalimy M、Kestler HA、Finegold M、Grompe M、Kochanek S、Chromosomal integration of adenoviral vector DNA in vivo、J Virol、2010年10月; 84(19):9987〜94頁、doi: 10.1128/JVI.00751-10、Epub 2010年8月4日)。
【０００７】
インフルエンザウイルスに基づいて構築されたベクターは、以下の理由のため、他のウイルスベクターより数々の利点を有する:
-  インフルエンザウイルスは、それらの複製サイクルにDNA相を有さないのでヒト又は動物ゲノムに挿入されることがありえない;
-  インフルエンザウイルスは、ヒト気道細胞感染時にその抗原に対する全身及び粘膜B及びT細胞応答を惹起する;
-  利用可能な複数の異なるインフルエンザウイルス亜型がある。前述の様々な亜型に対する抗体は交差反応性であるので、他の生ベクターでは問題になることが多い、宿主におけるウイルスベクターに対する既存の免疫性を回避することが可能である。同じ抗原を発現する様々なインフルエンザウイルス亜型での有効な追加免疫も可能である;
-  鼻腔内投与用のいくつかのタイプの生インフルエンザワクチンがあり(LIVE allantoic INFLUENZA VACCINE ULTRAVAC(登録商標)(RF)及びFlumist(登録商標)(USA))、10日齢のニワトリ胚を使用することによりそれらを生産する産業技術がある(Guideline on Influenza Vaccines - Quality Module、European Medicines Acency、2014年4月25日[電子情報資源] URL: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2014/06/WC500167817.pdf (アクセス日: 2015年11月01日))。
【０００８】
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)に属し、この科は次の属を含む: A型、B型及びC型インフルエンザウイルス。A型インフルエンザウイルスのゲノムとB型インフルエンザウイルスのゲノムは構造的に類似しており、負極性の8つのRNAゲノムセグメント:PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M及びNSからなる(Chou YY、Vafabakhsh R、Doganay S、Gao Q、Ha T、Palese P、One influenza virus particle packages eight unique viral RNAs as shown by FISH analysis.Proc Natl Acad Sci U S A. 2012年6月5日; 109(23):9101〜6頁、doi: 10.1073/pnas.1206069109、Epub 2012年4月30日)。ポリメラーゼ複合体PB2、PB1及びPAは、各々のゲノム断片から1つのmRNAを転写し、それが同じ名のタンパク質に翻訳される。ゲノムセグメントM及びNSのメッセンジャーRNAは、選択的スプライシングを受けて、それぞれ、M2及びNEPタンパク質をコードするmRNAを形成することができる。NS1及びPB1-F2(これらは全ての株において入手できるとは限らない)を除く全ての他タンパク質が、ウイルス粒子の構造成分である。非構造タンパク質NS1は、感染細胞の細胞質内に蓄積し、インターフェロン阻害剤として作用する(Krug RM、Functions of the influenza A virus NS1 protein in antiviral defense、Curr Opin Virol、2015年6月; 12:1〜6頁、doi: 10.1016/j.coviro.2015.01.007、Epub 2015年1月29日、Review)。
【０００９】
インフルエンザウイルスゲノムのセグメント化構造は、新たな異なる株の源であり、これらの株は再集合過程の結果である。これは、インフルエンザウイルスの天然の抗原多様性及びインフルエンザパンデミック発生のメカニズムの1つである。
【００１０】
インフルエンザウイルスの抗原特性は、ウイルス表面でスパイクを形成する表面糖タンパク質-ヘマグルチニン(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)によって決まる。HA分子は、細胞上のシアル酸受容体にウイルスを結合させるメカニズム並びに細胞質及び細胞核へのゲノムの侵入のためにウイルス膜と細胞膜を融合させるメカニズムに関与する。ウイルス複製の過程で、HAは、細胞プロテアーゼによって切断(HA活性化)されて、ジスルフィド結合により連結されたままである2つのサブユニット-HA1及びHA2-になる(Bullough PA、Hughson FM、Skehel JJ、Wiley DC、Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion、Nature 1994; 371、37〜43頁)。HA分子は、次の2つの部分からなる: HA1サブユニットを含む球状部と、主としてHA2により及び部分的にHA1サブユニットにより形成される幹領域。球状部は、受容体結合部位及び5つの抗原部位を含み、抗体形成の主標的としての役割を果す。細胞受容体へのウイルスの結合を遮断する抗体は、中和抗体である。HA1サブユニットの特徴は、高変異性である。ウイルス膜に近接した位置にあるHA幹は高保存性であり、その特徴は低い免疫原性である。HA2サブユニットの主な機能は、ウイルス膜とエンドソーム膜を確実に融合させることであり、このサブユニットは、高度に保存される。抗原特異性に従って、今までにA型インフルエンザウイルスについてHAの18の亜型及びNAの11の亜型が分かっている。亜型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17及びH18は、第1のグループに属し、亜型H3、H4、H7、H10、H14及びH15は、第2のグループに属する。とはいえ、パンデミック及び季節性インフルエンザ流行の原因となっているのは、ヒト集団内で循環している、A型インフルエンザウイルスの亜型H1、H2及びH3、並びにB型インフルエンザウイルスの異なる抗原変異体のみである。
【００１１】
疾患後又は1種のA型インフルエンザウイルス亜型による予防接種後に生ずる特異的免疫は、他のウイルス亜型による感染からはあまり保護しない。いずれのA型インフルエンザウイルス亜型に対する免疫も、B型インフルエンザウイルスによる感染からは保護せず、逆もまた同じである-B型インフルエンザウイルスに対する免疫化は、A型インフルエンザウイルスに関して有効でない。この関連で、A型及びB型インフルエンザウイルスの公知抗原全種類に対して有効な万能インフルエンザワクチンを緊急に開発する必要がある。
【００１２】
次の2つのメカニズムが、インフルエンザウイルスの極めて高い変異性、したがって、中和抗体からのその回避能力を可能にする:1)表面糖タンパク質の抗原構造の変化(抗原連続変異)をもたらす点突然変異の蓄積、及び2)ゲノムセグメントの再集合。それらは、パンデミックの原因となりうるウイルスの新たな亜型の出現(抗原不連続変異)をもたらす。
【００１３】
既存のインフルエンザワクチンの全てが、高齢者及び乳幼児での効率が低い(Jefferson T、Rivetti A、Di Pietrantonj C、Demicheli V、Ferroni E. Vaccines for preventing influenza in healthy children、Cochrane Database Syst Rev 2012; 8、CD004879; Osterholm MT、Kelley NS、Sommer A、Belongia EA、Efficacy and effectiveness of influenza vaccines: a systematic review and meta-analysis、Lancet Infect Dis 2011; 12、36〜44頁; Pfleiderer M、Trouvin JH、Brasseur D、Granstrom M、Shivji R、Mura M、Cavaleri M、Summary of knowledge gaps related to quality and efficacy of current influenza vaccines、Vaccine 2014; 32、4586〜91頁)。更に、これらのワクチンは、そのワクチンウイルスが流行株と同じ抗原特性を有する場合にしか循環ウイルスから保護することができない。その抗原特性とは、年1回の予防接種及びワクチン組成の更新を余儀なくされるインフルエンザウイルスの表面抗原-HA及びNA-の高変異性である。特筆すべきは、WHO勧告に従って開発される季節性ワクチンが、パンデミックウイルスA/カリフォルニア/7/2009 (H1N1pdm09)が出現した2009年に起こったように、循環株全てと根本的に異なる新型インフルエンザパンデミックウイルス株の発生ケースでは有効でないことである。もう1つの例は、季節性ワクチン2014のH3N2成分の、抗原連続変異の結果としてのこのウイルス亜型の新たな抗原変異体の出現に起因する、低い効率でありうる(Skowronski DM、Chambers C、Sabaiduc S、De Serres G、Dickinson JA、Winter AL、Drews SJ、Fonseca K、Charest H、Gubbay JB、Petric M、Krajden M、Kwindt TL、Martineau C、Eshaghi A、Bastien N、Li Y、Interim estimates of 2014/15 vaccine effectiveness against influenza A(H3N2) from Canada's Sentinel Physician Surveillance Network、2015年1月、Euro Surveill 2015; 20)。過去60年間に、ある特定の利点及び弱点を有する多数のワクチンが開発されたが、いずれの既存のワクチンも、常に進化し続けるインフルエンザウイルスに対する交差保護免疫を誘導する能力がそれらにはないため、インフルエンザ罹患率制御の問題を解決することができない。この関連で、持続性の幅広い交差保護免疫を与え、且つ、全ての公知亜型のA型及びB型インフルエンザウイルスから保護することができる、有効な万能インフルエンザワクチンを緊急に開発する必要がある。
【００１４】
全ての公知インフルエンザワクチン-不活化(全ウイルス粒子、スプリット若しくはサブユニット)ワクチン又は生(弱毒化低温馴化)ワクチン-の機能は、HAの球状部に対する免疫を発生させることである。可変性球状部とは対照的に、A型(グループI及びII)及びB型インフルエンザウイルスのHA幹部は、よりいっそう保存性である。HAのこの部分に誘導される抗体に関するいくつかの直接及び間接中和メカニズムが公知である。直接中和メカニズムの1つは、融合ペプチド放出とウイルスゲノムを細胞内に送達するためのその後のエンドソーム膜とウイルス膜の融合とに必要であるHA立体構造変化の防止に寄与する。第2の直接中和メカニズムは、切断部位付近に位置するHA部分と相互作用する抗体によるHA1及びHA2サブユニットへのHAの切断の防止に寄与する。間接的中和メカニズムには、抗体依存性及び補体依存性細胞傷害が関与する(Terajima M、Cruz J、Co MD、Lee JH、Kaur K、Wrammert J、Wilson PC、Ennis FA、Complement-dependent lysis of influenza a virus-infected cells by broadly cross-reactive human monoclonal antibodies、J Virol 2011; 85、13463〜7頁; Jegaskanda S、Weinfurter JT、Friedrich TC、Kent SJ、Antibody-dependent cellular cytotoxicity is associated with control of pandemic H1N1 influenza virus infection of macaques、J Virol 2013; 87、5512〜22頁)。
【００１５】
予防接種は、実際には抗体をHA幹領域に誘導しないが、自然感染後に少量のこれらの抗体が検出されることもあった(Moody MA、Zhang R、Walter EB、Woods CW、Ginsburg GS、McClain MT、Denny TN、Chen X、Munshaw S、Marshall DJ、Whitesides JF、Drinker MS、Amos JD、Gurley TC、Eudailey JA、Foulger A、DeRosa KR、Parks R、Meyerhoff RR、Yu JS、Kozink DM、Barefoot BE、Ramsburg EA、Khurana S、Golding H、Vandergrift NA、Alam SM、Tomaras GD、Kepler TB、Kelsoe G、Liao HX、Haynes BF、H3N2 influenza infection elicits more cross-reactive and less clonally expanded anti-hemagglutinin antibodies than influenza vaccination、PLoS ONE 2011; 6、e25797)。
【００１６】
万能ワクチンを生成するための現在開発中の手法の大多数は、インフルエンザウイルスタンパク質の保存領域を標的にしている。保存タンパク質PB2、PB1、PA、NP及びM1に対する抗体は、中和活性を有さないが、抗体依存性細胞傷害(ADCC)によるウイルス除去に重要な役割を果すことができるだろう。
【００１７】
万能ワクチンの生成についてのいくつかの例は、HA2サブユニットに基づく。外部ドメインHA2 (23〜185アミノ酸残基)に相当するペプチド又は(キーホール・リンペット・ヘモシアニン)(KLH)と結合している融合ペプチド(1〜38アミノ酸残基)及びフロイントアジュバントでのマウスへの三重免疫付与は、交差反応性免疫を誘導し、その結果、致死用量の異種ウイルス株に曝露されたときの前記動物の死亡率が低下した(Stanekova Z、Kiraly J、Stropkovska A、Mikuskova T、Mucha V、Kostolansky F、Vareckova E、Heterosubtypic protective immunity against influenza A virus induced by fusion peptide of the hemagglutinin in comparison to ectodomain of M2 protein、Acta Virol 2011; 55、61〜7頁)。キメラHA構築物での予防接種の場合には、より有効な保護が起こった。Krammerらは、異なる亜型のウイルスからのHA球状部を同じウイルスのHA幹領域と併せて含有するキメラタンパク質での免疫付与を受けたマウスにおいて異種亜型体液性免疫が誘導されることを明らかにした(Krammer F、Palese P、Steel J、Advances in universal influenza virus vaccine design and antibody mediated therapies based on conserved regions of the hemagglutinin、Curr Top Microbiol Immunol 2014; 386、301〜21頁; Krammer F、Hai R、Yondola M、Tan GS、Leyva-Grado VH、Ryder AB、Miller MS、Rose JK、Palese P、Garcia-Sastre A、Albrecht RA、Assessment of influenza virus hemagglutinin stalk-based immunity in ferrets、J Virol 2014; 
88、3432〜42頁)。DNAを使用する動物エレクトロポレーションを含む複雑な免疫付与スキーム、並びにアジュバントポリ(I:C)を補充したタンパク質構築物での筋肉内・鼻腔内二重免疫付与が、この手法の弱点である。
【００１８】
H1N1ウイルスのHA幹領域のアミノ酸配列に基づいて遺伝子工学によって生成された安定化構造(ミニHA)の使用は、万能インフルエンザワクチンを生成するための異なる手法の一例である。広範な中和活性を有する抗体に対して最も高い親和性を有する構造のみが、大型ライブラリーから選択された。これらの構造でのマウスへの免疫付与もまた、これらの動物をH5N1亜型の高病原性トリインフルエンザウイルスへの曝露時に死亡から保護した(Impagliazzo A、Milder F、Kuipers H、Wagner MV、Zhu X、Hoffman RM、van Meersbergen R、Huizingh J、Wanningen P、Verspuij J、de Man M、Ding Z、Apetri A、Kukrer B、Sneekes-Vriese E、Tomkiewicz D、Laursen NS、Lee PS、Zakrzewska A、Dekking L、Tolboom J、Tettero L、van Meerten S、Yu W、Koudstaal W、Goudsmit J、Ward AB、Meijberg W、Wilson IA、Radosevic K. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen、Science 2015; 349、1301〜6頁)。死亡からのマウスの完全保護は、Novavax社により製造されたMatrix-Mアジュバントを補充した30μgの精製ミニHAタンパク質での二重筋肉内免疫付与によって達成された。
【００１９】
万能インフルエンザワクチンの開発における他の予想される方向は、HAの免疫原特性を有意に向上させる自己集合性ナノ粒子の設計に基づく(Kanekiyo M、Wei CJ、Yassine HM、McTamney PM、Boyington JC、Whittle JR、Rao SS、Kong WP、Wang L、Nabel GJ、Self-assembling influenza nanoparticle vaccines elicit broadly neutralizing H1N1 antibodies、Nature 2013; 499、102〜6頁)。新たなアジュバントSAS(Sigma Adjuvant System社)を補充したナノ粒子で、2又は3回、動物の筋肉内に免疫を付与した。ナノ粒子での免疫付与後、中和抗体の欠如にもかかわらず、マウスはもちろんフェレットも、高病原性H5N1トリウイルスに感染させたとき死亡から完全に保護されることが判明した。
【００２０】
現代の生ワクチン生成技術の1つは、あるウイルスの抗原を他のウイルスによって発現させることが可能であるワクチンベクターの構築に基づく。異なるDNA含有ウイルス、すなわち、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス又はポックスウイルスが、インフルエンザ抗原の発現用ベクターとして使用される(Dudek T、Knipe DM、Replication-defective viruses as vaccines and vaccine vectors、Virology 2006; 344、230〜9頁; He F、Madhan S、Kwang J、Baculovirus vector as a delivery vehicle for influenza vaccines、Expert Rev Vaccines 2009; 8、455〜67頁; Draper SJ、Cottingham MG、Gilbert SC、Utilizing poxviral vectored vaccines for antibody induction-progress and prospects、Vaccine 2013; 31、4223〜30頁、Price GE、Soboleski MR、Lo CY、Misplon JA、Pappas C、Houser KV、Tumpey TM、Epstein SL、Vaccination focusing immunity on conserved antigens protects mice and ferrets against virulent H1N1 and H5N1 influenza A viruses、Vaccine 2009; 27、6512〜21頁)。かくて、アデノウイルスベクターでの実験により、A型インフルエンザウイルス保存タンパク質NP及びM2の配列を含有するプラスミド(50μg)での三重免疫付与、続いての、同タンパク質を発現する2つのアデノウイルスベクターによる鼻腔内感染は、ウイルスA/FM/1/47(H1N1)に又は高病原性トリインフルエンザウイルスH5N1亜型に感染したマウス及びフェレットの死亡及び体重減少からの完全保護をもたらすことが明らかになった。
【００２１】
このように、インフルエンザウイルス抗原の保存領域に対する免疫応答を標的にする論じた手法の全てが、A型インフルエンザウイルスの異なる変異体による感染から保護するワクチン生成の可能性を裏づけている。しかし、異なる性質の免疫アジュバントを使用することにより動物に対して多種類のワクチンを接種する複雑なスキームが、この目標を達成するために使用された。その上、万能インフルエンザワクチンの公知の実験的製剤のいずれも、B型インフルエンザウイルスからの保護をもたらさなかった。これに言い足すべきは、上記実験的製剤は、受け入れがたいほど高い最終製品コストを伴う複雑な技術プロセスを多成分ワクチンの生産のために必要とすることである。
【００２２】
鼻腔の細胞における抗原の発現が全身性及び局所性粘膜B及びT細胞免疫応答を誘導することは公知である。動物の気道の細胞内への外来ゲノム配列の送達及び該細胞におけるそれらの発現のためのベクターとしてインフルエンザウイルスを使用する非常に多くの試みがなされてきた。結果として得られるウイルス粒子の構造を破壊することなく、NS1非構造タンパク質のリーディングフレーム内に800ヌクレオチド超のゲノムインサートを安定的に保持することができるのは、A型又はB型インフルエンザウイルスの8つのゲノム断片の中でNSゲノム断片だけであった(Kittel C、Sereinig S、Ferko B、Stasakova J、Romanova J、Wolkerstorfer A、Katinger H、Egorov A、Rescue of influenza virus expressing GFP from the NS1 reading frame、Virology、2004年6月20日; 324(1):67〜73頁、PubMed PMID: 15183054)。更に、全てのインフルエンザウイルスタンパク質の中で、細胞培養物、ニワトリ胚又は動物の気道におけるウイルスの増殖能に有意な影響を与えることなくカルボキシル末端で50%に短縮することができるのは、230〜237アミノ酸残基を通常は含有するNS1タンパク質のみである(Egorov A、Brandt S、Sereinig S、Romanova J、Ferko B、Katinger D、Grassauer A、Alexandrova G、Katinger H、Muster T、Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells、J Virol、1998年8月; 72(8):6437〜41頁、PubMed PMID: 9658085; PubMed Central PMCID: PMC109801)。NS1タンパク質のこの短縮化により、ウイルスの形態及び基本機能を破壊することなく、外来ゲノム配列の長いインサートを導入するための空間が得られ、したがって、遺伝子的に安定しているベクターを構築することが可能になる。この関連で、A型インフルエンザウイルスに基づくインフルエンザウイルスベクターであって、NS1タンパク質の80〜126アミノ酸残基の短縮されたリーディングフレームをコードし、該短縮されたリーディングフレームを、様々な細菌及びウイルス病原体の抗原配列のインサートによって、例えば、結核菌(mycobacterium tuberculosis)、ウシ流産菌(brucella abortus)又はヒト免疫不全ウイルスのタンパク質配列によって伸長することができる、インフルエンザウイルスベクターが生産された(Tabynov K、Sansyzbay A、Kydyrbayev Z、Yespembetov B、Ryskeldinova S、Zinina N、Assanzhanova N、Sultankulova K、Sandybayev N、Khairullin B、Kuznetsova I、Ferko B、Egorov A、Influenza viral vectors expressing the Brucella OMP16 or L7/L12 proteins as vaccines against B. abortus infection、Virol J. 2014年4月10日; 11:69. doi: 10.1186/1743-422X-11-69、PubMed PMID: 24716528; PubMed Central PMCID: PMC3997475; Sereinig S、Stukova M、Zabolotnyh N、Ferko B、Kittel C、Romanova J、Vinogradova T、Katinger H、Kiselev O、Egorov A、Influenza virus NS vectors expressing the mycobacterium tuberculosis ESAT-6 protein induce CD4+ Th1 immune response and protect animals against tuberculosis challenge、Clin Vaccine Immunol、2006年8月; 13(8):898〜904頁、PubMed PMID: 16893990; PubMed Central PMCID: PMC1539114; Ferko B、Stasakova J、Sereinig S、Romanova J、Katinger D、Niebler B、Katinger H、Egorov A、Hyperattenuated recombinant influenza A virus nonstructural-protein-encoding vectors induce human immunodeficiency virus type 1 Nef-specific systemic and mucosal immune responses in mice、J Virol、2001年10月; 75(19):8899〜908頁、PubMed PMID: 11533153; PubMed Central PMCID: PMC114458)。124アミノ酸残基に短縮されたNS1タンパク質を保有する構築物(本明細書では以降、NS1-124ベクター)は、ニワトリ胚における増殖パラメーター及び動物における免疫原性���ラメーターにより、最適であるように思われた(Ferko B、Stasakova J、Romanova J、Kittel C、Sereinig S、Katinger H、Egorov A、Immunogenicity and protection efficacy of replication-deficient influenza A viruses with altered NS1 genes、J Virol、2004年12月; 78(23):13037〜45頁、PubMed PMID: 15542655; PubMed Central PMCID: PMC524997)。
【００２３】
より短縮されたNS1タンパク質を有する構築物は、10日齢ニワトリ胚をはじめとするインターフェロンコンピテント細胞(MDCK細胞、A549)では増殖能力が低減され、インターフェロン欠損ベロ細胞での生産にしか適さなかった。その一方で、124〜126アミノ酸残基からなるNS1タンパク質を有するベクターは、弱毒化にばらつきがあり、動物において十分安全なものではなかった。例えば、指定位置にESAT-6マイコバクテリアタンパク質を保有するウイルスベクターの増殖レベルは、マウス肺において病原性インフルエンザウイルスの値(肺組織1グラム当りウイルス粒子104以上)に近い値に達することがあった。更に、>5.0 log/マウスの感染用量でのNS1-124ベクターは、感染したマウスの肺組織においてウイルスの有意な増殖を引き起こし、目に見える肺症状の形成に至らしめることがあった(Egorov A、Brandt S、Sereinig S、Romanova J、Ferko B、Katinger D、Grassauer A、Alexandrova G、Katinger H、Muster T、Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells、J Virol、1998年8月; 72(8):6437〜41頁、PubMed PMID: 9658085; PubMed Central PMCID: PMC109801; Stukova MA、Sereinig S、Zabolotnyh NV、Ferko B、Kittel C、Romanova J、Vinogradova TI、Katinger H、Kiselev OI、Egorov A、Vaccine potential of influenza vectors expressing Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 protein、Tuberculosis (Edinb)、2006年5月〜7月; 86(3-4):236〜46頁、PubMed PMID: 16677861)。したがって、124アミノ酸残基に短縮されたNS1リーディングフレームを有するインフルエンザベクターは、ヒトの予防接種に使用することができない。なぜなら、必須条件がウイルスの温度感受性(39℃で増殖能力低減)及び動物の下気道におけるウイルスの能動的複製の欠如である、生インフルエンザワクチンについて開発された安全性パラメーターに対応しないからである(Maassab HF、Bryant ML、The development of live attenuated cold-adapted influenza virus vaccine for humans、Rev Med Virol、1999年10月〜12月; 9(4):237〜44頁、Review、PubMed PMID: 10578119; Gendon IuZ、「Live cold-adapted influenza vaccine: state-of-the-art」、Vopr Virusol、2011年1月〜2月; 56(1):4〜17頁、Review、Russian、PubMed PMID: 21427948; Aleksandrova GI、Gushchina MI、Klimov AI、Iotov VV、「Genetic basis for construction of the life influenza type A vaccine using temperature-sensitive mutants」、Mol Gen Mikrobiol Virusol、1990年3月; (3):3〜8頁、Review、Russian、PubMed PMID: 2194119; Kendal AP、Cold-adapted live attenuated influenza vaccines developed in Russia: can they contribute to meeting the needs for influenza control in other countries?、Eur J Epidemiol、1997年7月; 13(5):591〜609頁、Review、PubMed PMID: 9258574)。
【００２４】
認可されている生インフルエンザワクチン(LIVE allantoic INFLUENZA VACCINE ULTRAVAС(登録商標)(RF)又はFlumist(登録商標)(USA))とは異なり、公知インフルエンザベクターNS1-124及びそれらに近い構築物は、表現型温度感受性マーカー(ts表現型)を有さず、マウス肺において、完全長NS1タンパク質を有する野生型ウイルスのレベルに近い増殖レベルを有した。
【００２５】
20世紀の50〜60年代に、インフルエンザ感染症から回復後のがん寛解の個々のケースについての医師の所見に基づく腫瘍溶解剤としてのインフルエンザウイルスの使用が試みられた。(Lindenmann J、Klein PA、Viral oncolysis: increased immunogenicity of host cellantigen associated with influenza virus、J Exp Med、1967年7月1日; 126(1):93〜108頁)。
【００２６】
90年代後半にインフルエンザウイルスの遺伝子工学技術が開発されて以来、この技術により、修飾NS1タンパク質を有する腫瘍溶解性インフルエンザベクターを生産する可能性が生み出された。NS1タンパク質の短縮化は、組換えウイルスを腫瘍内に導入したとき、NS1タンパク質がアンタゴニストである自然免疫系の刺激に起因して腫瘍溶解効果の強化をもたらすことができることが明らかになった(Sturlan S、Stremitzer S、Bauman S、Sachet M、Wolschek M、Ruthsatz T、Egorov A、Bergmann M、Endogenous expression of proteases in colon cancer cells facilitate influenza A viruses mediated oncolysis、Cancer Biol Ther、2010年9月15日; 10(6):592〜9頁; Ogbomo H、Michaelis M、Geiler J、van Rikxoort M、Muster T、Egorov A、Doerr HW、Cinatl J Jr、Tumor cells infected with oncolytic influenza A virus prime natural killer cells for lysis of resistant tumor cells、Med Microbiol Immunol、2010年5月; 199(2):93〜101頁、doi: 10.1007/s00430-009-0139-0、Epub 2009年12月15日、PubMed PMID: 20012989; Efferson CL、Tsuda N、Kawano K、Nistal-Villan E、Sellappan S、Yu D、Murray JL、Garcia-Sastre A、Ioannides CG、Prostate tumor cells infected with a recombinant influenza virus expressing a truncated NS1 protein activate cytolytic CD8+ cells to recognize noninfected tumor cells、J Virol、2006年1月; 80(1):383〜94頁)。
【００２７】
更に、インフルエンザウイルスNS1タンパク質の長さに関する遺伝子工学操作の可能性は、免疫賦活剤、例えばインターロイキン-15、の発現の存在により有効性が強化されるベクターの開発を可能にした(van Rikxoort M、Michaelis M、Wolschek M、Muster T、Egorov A、Seipelt J、Doerr HW、Cinatl J Jr、Oncolytic effects of a novel influenza A virus expressing interleukin-15 from the NS reading frame、PLoS One、2012; 7(5):e36506)。
【００２８】
残念なことに、これらの研究は、インフルエンザワクチン製剤の生産に最適な基質であるニワトリ胚での大規模生産ために導入遺伝子に必要な遺伝子安定性を有さない、一部の細胞培養物に限定された増殖が可能なインフルエンザウイルスを使用した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】世界保健機関  URL: http://www.who.int/biologicals/vaccines/influenza/en/ (アクセス日: 2016年03月28日)
【非特許文献２】J. Gen.Virol.、2005年、86巻、11号、2925〜2936頁
【非特許文献３】Virol.、2001年、75巻、23号、11868〜11873頁
【非特許文献４】Biotechnology、2007年、5巻、38〜44頁
【非特許文献５】Vaccine、1991年、9巻、5号、303〜308頁
【非特許文献６】Chem.Biodivers、2010年、7巻、3号、677〜689頁
【非特許文献７】Stephen SL、Montini E、Sivanandam VG、Al-Dhalimy M、Kestler HA、Finegold M、Grompe M、Kochanek S、Chromosomal integration of adenoviral vector DNA in vivo、J Virol、2010年10月; 84(19):9987〜94頁、doi: 10.1128/JVI.00751-10、Epub 2010年8月4日
【非特許文献８】Guideline on Influenza Vaccines - Quality Module、European Medicines Acency、2014年4月25日[電子情報資源] URL: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2014/06/WC500167817.pdf (アクセス日: 2015年11月01日)
【非特許文献９】Chou YY、Vafabakhsh R、Doganay S、Gao Q、Ha T、Palese P、One influenza virus particle packages eight unique viral RNAs as shown by FISH analysis.Proc Natl Acad Sci U S A. 2012年6月5日; 109(23):9101〜6頁、doi: 10.1073/pnas.1206069109、Epub 2012年4月30日
【非特許文献１０】Krug RM、Functions of the influenza A virus NS1 protein in antiviral defense、Curr Opin Virol、2015年6月; 12:1〜6頁、doi: 10.1016/j.coviro.2015.01.007、Epub 2015年1月29日、Review
【非特許文献１１】Bullough PA、Hughson FM、Skehel JJ、Wiley DC、Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion、Nature 1994; 371、37〜43頁
【非特許文献１２】Jefferson T、Rivetti A、Di Pietrantonj C、Demicheli V、Ferroni E. Vaccines for preventing influenza in healthy children、Cochrane Database Syst Rev 2012; 8、CD004879
【非特許文献１３】Osterholm MT、Kelley NS、Sommer A、Belongia EA、Efficacy and effectiveness of influenza vaccines: a systematic review and meta-analysis、Lancet Infect Dis 2011; 12、36〜44頁
【非特許文献１４】Pfleiderer M、Trouvin JH、Brasseur D、Granstrom M、Shivji R、Mura M、Cavaleri M、Summary of knowledge gaps related to quality and efficacy of current influenza vaccines、Vaccine 2014; 32、4586〜91頁
【非特許文献１５】Skowronski DM、Chambers C、Sabaiduc S、De Serres G、Dickinson JA、Winter AL、Drews SJ、Fonseca K、Charest H、Gubbay JB、Petric M、Krajden M、Kwindt TL、Martineau C、Eshaghi A、Bastien N、Li Y、Interim estimates of 2014/15 vaccine effectiveness against influenza A(H3N2) from Canada's Sentinel Physician Surveillance Network、2015年1月、Euro Surveill 2015; 20
【非特許文献１６】Terajima M、Cruz J、Co MD、Lee JH、Kaur K、Wrammert J、Wilson PC、Ennis FA、Complement-dependent lysis of influenza a virus-infected cells by broadly cross-reactive human monoclonal antibodies、J Virol 2011; 85、13463〜7頁
【非特許文献１７】Jegaskanda S、Weinfurter JT、Friedrich TC、Kent SJ、Antibody-dependent cellular cytotoxicity is associated with control of pandemic H1N1 influenza virus infection of macaques、J Virol 2013; 87、5512〜22頁
【非特許文献１８】Moody MA、Zhang R、Walter EB、Woods CW、Ginsburg GS、McClain MT、Denny TN、Chen X、Munshaw S、Marshall DJ、Whitesides JF、Drinker MS、Amos JD、Gurley TC、Eudailey JA、Foulger A、DeRosa KR、Parks R、Meyerhoff RR、Yu JS、Kozink DM、Barefoot BE、Ramsburg EA、Khurana S、Golding H、Vandergrift NA、Alam SM、Tomaras GD、Kepler TB、Kelsoe G、Liao HX、Haynes BF、H3N2 influenza infection elicits more cross-reactive and less clonally expanded anti-hemagglutinin antibodies than influenza vaccination、PLoS ONE 2011; 6、e25797
【非特許文献１９】Stanekova Z、Kiraly J、Stropkovska A、Mikuskova T、Mucha V、Kostolansky F、Vareckova E、Heterosubtypic protective immunity against influenza A virus induced by fusion peptide of the hemagglutinin in comparison to ectodomain of M2 protein、Acta Virol 2011; 55、61〜7頁
【非特許文献２０】Krammer F、Palese P、Steel J、Advances in universal influenza virus vaccine design and antibody mediated therapies based on conserved regions of the hemagglutinin、Curr Top Microbiol Immunol 2014; 386、301〜21頁
【非特許文献２１】Krammer F、Hai R、Yondola M、Tan GS、Leyva-Grado VH、Ryder AB、Miller MS、Rose JK、Palese P、Garcia-Sastre A、Albrecht RA、Assessment of influenza virus hemagglutinin stalk-based immunity in ferrets、J Virol 2014; 88、3432〜42頁
【非特許文献２２】Impagliazzo A、Milder F、Kuipers H、Wagner MV、Zhu X、Hoffman RM、van Meersbergen R、Huizingh J、Wanningen P、Verspuij J、de Man M、Ding Z、Apetri A、Kukrer B、Sneekes-Vriese E、Tomkiewicz D、Laursen NS、Lee PS、Zakrzewska A、Dekking L、Tolboom J、Tettero L、van Meerten S、Yu W、Koudstaal W、Goudsmit J、Ward AB、Meijberg W、Wilson IA、Radosevic K. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen、Science 2015; 349、1301〜6頁
【非特許文献２３】Kanekiyo M、Wei CJ、Yassine HM、McTamney PM、Boyington JC、Whittle JR、Rao SS、Kong WP、Wang L、Nabel GJ、Self-assembling influenza nanoparticle vaccines elicit broadly neutralizing H1N1 antibodies、Nature 2013; 499、102〜6頁
【非特許文献２４】Dudek T、Knipe DM、Replication-defective viruses as vaccines and vaccine vectors、Virology 2006; 344、230〜9頁
【非特許文献２５】He F、Madhan S、Kwang J、Baculovirus vector as a delivery vehicle for influenza vaccines、Expert Rev Vaccines 2009; 8、455〜67頁
【非特許文献２６】Draper SJ、Cottingham MG、Gilbert SC、Utilizing poxviral vectored vaccines for antibody induction-progress and prospects、Vaccine 2013; 31、4223〜30頁
【非特許文献２７】Price GE、Soboleski MR、Lo CY、Misplon JA、Pappas C、Houser KV、Tumpey TM、Epstein SL、Vaccination focusing immunity on conserved antigens protects mice and ferrets against virulent H1N1 and H5N1 influenza A viruses、Vaccine 2009; 27、6512〜21頁
【非特許文献２８】Kittel C、Sereinig S、Ferko B、Stasakova J、Romanova J、Wolkerstorfer A、Katinger H、Egorov A、Rescue of influenza virus expressing GFP from the NS1 reading frame、Virology、2004年6月20日; 324(1):67〜73頁、PubMed PMID: 15183054
【非特許文献２９】Egorov A、Brandt S、Sereinig S、Romanova J、Ferko B、Katinger D、Grassauer A、Alexandrova G、Katinger H、Muster T、Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells、J Virol、1998年8月; 72(8):6437〜41頁、PubMed PMID: 9658085; PubMed Central PMCID: PMC109801
【非特許文献３０】Tabynov K、Sansyzbay A、Kydyrbayev Z、Yespembetov B、Ryskeldinova S、Zinina N、Assanzhanova N、Sultankulova K、Sandybayev N、Khairullin B、Kuznetsova I、Ferko B、Egorov A、Influenza viral vectors expressing the Brucella OMP16 or L7/L12 proteins as vaccines against B. abortus infection、Virol J. 2014年4月10日; 11:69. doi: 10.1186/1743-422X-11-69、PubMed PMID: 24716528; PubMed Central PMCID: PMC3997475
【非特許文献３１】Sereinig S、Stukova M、Zabolotnyh N、Ferko B、Kittel C、Romanova J、Vinogradova T、Katinger H、Kiselev O、Egorov A、Influenza virus NS vectors expressing the mycobacterium tuberculosis ESAT-6 protein induce CD4+ Th1 immune response and protect animals against tuberculosis challenge、Clin Vaccine Immunol、2006年8月; 13(8):898〜904頁、PubMed PMID: 16893990; PubMed Central PMCID: PMC1539114
【非特許文献３２】Ferko B、Stasakova J、Sereinig S、Romanova J、Katinger D、Niebler B、Katinger H、Egorov A、Hyperattenuated recombinant influenza A virus nonstructural-protein-encoding vectors induce human immunodeficiency virus type 1 Nef-specific systemic and mucosal immune responses in mice、J Virol、2001年10月; 75(19):8899〜908頁、PubMed PMID: 11533153; PubMed Central PMCID: PMC114458
【非特許文献３３】Ferko B、Stasakova J、Romanova J、Kittel C、Sereinig S、Katinger H、Egorov A、Immunogenicity and protection efficacy of replication-deficient influenza A viruses with altered NS1 genes、J Virol、2004年12月; 78(23):13037〜45頁、PubMed PMID: 15542655; PubMed Central PMCID: PMC524997
【非特許文献３４】Stukova MA、Sereinig S、Zabolotnyh NV、Ferko B、Kittel C、Romanova J、Vinogradova TI、Katinger H、Kiselev OI、Egorov A、Vaccine potential of influenza vectors expressing Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 protein、Tuberculosis (Edinb)、2006年5月〜7月; 86(3-4):236〜46頁、PubMed PMID: 16677861
【非特許文献３５】Maassab HF、Bryant ML、The development of live attenuated cold-adapted influenza virus vaccine for humans、Rev Med Virol、1999年10月〜12月; 9(4):237〜44頁、Review、PubMed PMID: 10578119
【非特許文献３６】Gendon IuZ、「Live cold-adapted influenza vaccine: state-of-the-art」、Vopr Virusol、2011年1月〜2月; 56(1):4〜17頁、Review、Russian、PubMed PMID: 21427948
【非特許文献３７】Aleksandrova GI、Gushchina MI、Klimov AI、Iotov VV、「Genetic basis for construction of the life influenza type A vaccine using temperature-sensitive mutants」、Mol Gen Mikrobiol Virusol、1990年3月; (3):3〜8頁、Review、Russian、PubMed PMID: 2194119
【非特許文献３８】Kendal AP、Cold-adapted live attenuated influenza vaccines developed in Russia: can they contribute to meeting the needs for influenza control in other countries、Eur J Epidemiol、1997年7月; 13(5):591〜609頁、Review、PubMed PMID: 9258574
【非特許文献３９】Lindenmann J、Klein PA、Viral oncolysis: increased immunogenicity of host cellantigen associated with influenza virus、J Exp Med、1967年7月1日; 126(1):93〜108頁
【非特許文献４０】Sturlan S、Stremitzer S、Bauman S、Sachet M、Wolschek M、Ruthsatz T、Egorov A、Bergmann M、Endogenous expression of proteases in colon cancer cells facilitate influenza A viruses mediated oncolysis、Cancer Biol Ther、2010年9月15日; 10(6):592〜9頁
【非特許文献４１】Ogbomo H、Michaelis M、Geiler J、van Rikxoort M、Muster T、Egorov A、Doerr HW、Cinatl J Jr、Tumor cells infected with oncolytic influenza A virus prime natural killer cells for lysis of resistant tumor cells、Med Microbiol Immunol、2010年5月; 199(2):93〜101頁、doi: 10.1007/s00430-009-0139-0、Epub 2009年12月15日、PubMed PMID: 20012989
【非特許文献４２】Efferson CL、Tsuda N、Kawano K、Nistal-Villan E、Sellappan S、Yu D、Murray JL、Garcia-Sastre A、Ioannides CG、Prostate tumor cells infected with a recombinant influenza virus expressing a truncated NS1 protein activate cytolytic CD8+ cells to recognize noninfected tumor cells、J Virol、2006年1月; 80(1):383〜94頁
【非特許文献４３】van Rikxoort M、Michaelis M、Wolschek M、Muster T、Egorov A、Seipelt J、Doerr HW、Cinatl J Jr、Oncolytic effects of a novel influenza A virus expressing interleukin-15 from the NS reading frame、PLoS One、2012; 7(5):e36506
【非特許文献４４】Hoffmann E、Neumann G、Kawaoka Y、Hobom G、Webster RG、A DNA from eight plasmids、Proc Natl Acad Sci USA、2000; 97 (11): 6108〜13頁
【非特許文献４５】Reed, LJ、Muench, H、(1938)、「The A simple method of estimating fifty percent endpoints」、The American Journal of Hygiene 27: 493〜497頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
それ故、動物生物体におけるウイルスの能動的増殖の欠如を特徴とし、温度感受性表現型を有し、感染性疾患の予防及び/又は処置並びに腫瘍性疾患の処置に使用することができる、新たな有効なウイルスベクター、特に、弱毒化インフルエンザベクターが、依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明は、A型及びB型インフルエンザウイルスに対する交差保護応答を誘導する弱毒化A型インフルエンザウイルスであって、NS1タンパク質の短縮されたリーディングフレームと、前記弱毒化A型インフルエンザウイルスの亜型とは異なるA型インフルエンザ亜型に由来するNep遺伝子異種配列とを含むキメラNS断片を含む、弱毒化A型インフルエンザウイルスに関する。
【００３２】
特に、本発明は、前記短縮されたリーディングフレームが、80〜130アミノ酸残基からなるNS1タンパク質をコードする、より好ましくは、前記短縮されたリーディングフレームが、124アミノ酸残基からなるNS1タンパク質をコードする、弱毒化A型インフルエンザウイルスに関する。
【００３３】
本発明の一実施形態は、NS1タンパク質の前記短縮されたリーディングフレームがH1N1亜型インフルエンザウイルスに由来し、Nep遺伝子異種配列がH2N2亜型インフルエンザウイルスに由来する、弱毒化A型インフルエンザウイルスに関する。
【００３４】
本発明の更に別の実施形態によれば、NS1タンパク質の短縮されたリーディングフレームとNep遺伝子異種配列とを含むキメラNS断片を含有し、NS1タンパク質の前記短縮されたリーディングフレームが、H1N1亜型インフルエンザウイルスに由来し、Nep遺伝子異種配列が、H2N2亜型インフルエンザウイルスに由来し、前記前記短縮されたリーディングフレームが、124アミノ酸残基からなるNS1タンパク質をコードする、弱毒化A型インフルエンザウイルス。
【００３５】
本発明は、細菌、ウイルス及び原虫からのタンパク質又はその断片からなる群から選択されるタンパク質又はその断片を発現する弱毒化インフルエンザウイルスベクターであって、前記ベクターが、本発明による弱毒化A型インフルエンザウイルスであり、NS1タンパク質遺伝子の短縮されたリーディングフレームが、細菌、ウイルス及び原虫からのタンパク質又はその断片をコードする少なくとも1つの導入遺伝子の配列のインサートにより伸長される、弱毒化インフルエンザウイルスベクターにも関する。
【００３６】
本発明の一実施形態は、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、結核菌、ヘルペスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、マラリア寄生虫、トリコモナス(Trichomonas)、トリパノソーマ(Trypanosoma)、リーシュマニア(Leishmania)、クラミジア(Chlamydia)、ブルセラ症原因物質又はこれらの組合せのタンパク質からなる群から選択されるタンパク質又はその断片を発現する弱毒化インフルエンザウイルスベクターに関する。
【００３７】
本発明の別の実施形態は、病原菌、病原性ウイルス又は病原性原虫からのタンパク質又はその断片を発現する弱毒化インフルエンザウイルスベクターであって、前記タンパク質又はその断片が10〜400アミノ酸からなる、弱毒化インフルエンザウイルスベクターに関する。
【００３８】
本発明の更に別の実施形態によれば、インサートがインフルエンザウイルスからのHAタンパク質領域をコードし、好ましくは、HAタンパク質領域が、A型インフルエンザウイルスの1〜185アミノ酸(aa)、B型インフルエンザウイルスの1〜186aa、A型インフルエンザウイルスの23〜185aa、又はA型インフルエンザウイルスの65〜222aaからなる群から選択されるHA2サブユニット領域である、弱毒化インフルエンザウイルスベクター。
【００３９】
本発明の次の実施形態は、インサートが、1〜21aaのA型又はB型インフルエンザウイルスHA2サブユニット領域の配列、及び243〜251aaのA型インフルエンザウイルスNPタンパク質領域の配列をコードする、弱毒化インフルエンザウイルスベクターである。
【００４０】
本発明の別の実施形態は、インサートが、結核菌のタンパク質ESAT-6、Ag85A、Ag85B、Mpt64、HspX、Mtb8.4若しくは10.4、又はその断片をコードし、特に、ウイルスゲノム配列が、NS1-124をコードする配列とESAT6をコードする配列の間に、自己切断性2Aペプチドをコードする配列を更に含む、弱毒化インフルエンザウイルスベクターに関する。
【００４１】
本発明は、タンパク質又はその断片を発現する弱毒化インフルエンザウイルスベクターであって、前記ベクターが、NS1タンパク質の短縮されたリーディングフレームとNep遺伝子異種配列とを含むキメラNS断片を含む弱毒化A型インフルエンザウイルスであり、NS1タンパク質の前記短縮されたリーディングフレームが、H1N1亜型インフルエンザウイルスに由来し、Nep遺伝子異種配列が、H2N2亜型インフルエンザウイルスに由来し、前記短縮されたリーディングフレームが、124アミノ酸残基からなるNS1タンパク質をコードし、NS1タンパク質遺伝子の短縮されたリーディングフレームが、B型インフルエンザHA2タンパク質の1〜21aa及びA型インフルエンザNPタンパク質の243〜251aaをコードする配列のインサートによって伸長される、弱毒化インフルエンザウイルスベクターにも関する。
【００４２】
本発明は、腫瘍溶解活性を有する弱毒化インフルエンザウイルスベクターであって、前記ベクターが、本発明による弱毒化A型インフルエンザウイルスであり、NS1タンパク質遺伝子の短縮されたリーディングフレームが、細菌、ウイルス又は原虫からのタンパク質又はその断片をコードする少なくとも1つの導入遺伝子の配列のインサートにより伸長される、弱毒化インフルエンザウイルスベクターに更に関する。
【００４３】
本発明の一実施形態は、腫瘍溶解活性を有する弱毒化インフルエンザウイルスベクターであって、インサートが、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、結核菌、ヘルペスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、マラリア寄生虫、トリコモナス、トリパノソーマ、リーシュマニア、クラミジア又はこれらの組合せからのタンパク質又はその断片からなる群から選択されるタンパク質又はその断片をコードする、弱毒化インフルエンザウイルスベクターである。
【００４４】
本発明の次の実施形態は、前記タンパク質又はその断片が10〜400アミノ酸からなる、腫瘍溶解活性を有する弱毒化インフルエンザウイルスである。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態は、腫瘍溶解活性を有する弱毒化インフルエンザウイルスベクターであって、インサートが、結核菌のタンパク質ESAT-6、Ag85A、Ag85B、Mpt64、HspX、Mtb8.4若しくは10.4、又はその断片をコードし、特に、NS1タンパク質遺伝子の短縮されたリーディングフレームが、結核菌タンパク質ESAT-6をコードする配列のインサートによって伸長され、より好ましくは、NS1タンパク質遺伝子の短縮されたリーディングフレームが、自己切断性2Aペプチドをコードする配列及び結核菌タンパク質ESAT-6をコードする配列のインサートによって伸長される、弱毒化インフルエンザウイルスベクターである。
【００４６】
本発明は、A型及びB型インフルエンザウイルスに対する交差保護応答を誘導する弱毒化インフルエンザウイルスベクターであって、
インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスに由来するPB2タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又はPB2タンパク質遺伝子の前記ヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスに由来するPB1タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又はPB1タンパク質遺伝子の前記ヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスに由来するPAタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又はPAタンパク質遺伝子の前記ヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスに由来するNPタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又はNPタンパク質遺伝子の前記ヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスに由来するMタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又はMタンパク質遺伝子の前記ヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
インフルエンザA/カリフォルニア/7/09様(H1N1pdm)ウイルスに由来するHAタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又はHAタンパク質遺伝子の前記ヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
インフルエンザA/カリフォルニア/7/09様(H1N1pdm)ウイルスに由来するNAタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又はNAタンパク質遺伝子の前記ヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;及び
NSタンパク質キメラ遺伝子のヌクレオチド配列であって、
短縮されており、124アミノ酸残基からなるNS1タンパク質をコードする、インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)に由来するNS1タンパク質リーディングフレームと、
インフルエンザА/シンガポール/1/57様(H2N2)ウイルスに由来するNep遺伝子配列と
を含む、ヌクレオチド配列、又は
NSキメラ遺伝子の前記配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含み、
前記NS1タンパク質の短縮されたリーディングフレームが、B型インフルエンザウイルスHA2サブユニット領域とA型インフルエンザウイルス核タンパク質(NP)の保存B細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列との融合ペプチドをコードするヌクレオチド配列のインサートによって伸長される、弱毒化インフルエンザウイルスベクターにも関する。特異的実施形態では、NSタンパク質キメラ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号21に記載のものである。
【００４７】
本発明は、本発明による弱毒化A型インフルエンザウイルス又は本発明による弱毒化インフルエンザウイルスベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む、対象における感染性疾患の処置及び/又は予防のための医薬組成物にも関する。
【００４８】
本発明は、本発明による弱毒化インフルエンザウイルスベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む、インフルエンザの予防のための医薬組成物も提供する。
【００４９】
特に、本発明による医薬組成物は、6.5〜10.5 log EID50/mlの弱毒化A型インフルエンザウイルスと、0〜1.5重量%の一価の塩、0〜5重量%のイミダゾール含有化合物、0〜5重量%の炭水化物成分、0〜2重量%のタンパク質成分、0〜2重量%のアミノ酸成分及び0〜10重量%のヒドロキシエチル化デンプンを含む緩衝溶液とを含む。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態は、緩衝溶液が、0.5〜1.5重量%の一価の塩、0.01〜5重量%のイミダゾール含有化合物、1〜5重量%の炭水化物成分、0.1〜2重量%のタンパク質成分、0.01〜2重量%のアミノ酸成分、及び1〜10重量%のヒドロキシエチル化デンプンを含む医薬組成物であって、好ましくは、一価の塩が、塩化ナトリウムであり、炭水化物成分が、スクロース、トレハロース又はラクトースであり、タンパク質成分が、ヒト組換えアルブミン、カジトン、ラクトアルブミン水解物又はゼラチンであり、アミノ酸成分が、アルギニン、グリシン又はグルタミン酸ナトリウムであり、イミダゾール含有化合物が、L-カルノシン又はN,N'-ビス[2-(1H-イミダゾール-5イル)エチル]プロパンジアミドである、医薬組成物である。
【００５１】
本発明の別の実施形態は、感染性疾患の処置及び/又は予防のための医薬組成物であって、感染性疾患が、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、結核菌、単純ヘルペスウイルスI及びII型、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、マラリア寄生虫、トリコモナス、クラミジア、トリパノソーマ、リーシュマニア又はブルセラ症原因物質からなる群から選択される病原体によって引き起こされる、医薬組成物である。本発明の好ましい実施形態では、対象は、哺乳動物又はトリであり、特に、対象は、ヒト対象である。
【００５２】
本発明は、本発明による弱毒化A型インフルエンザウイルス又は本発明の弱毒化インフルエンザウイルスベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む、感染性疾患に対するワクチンにも関する。
【００５３】
本発明は、本発明による弱毒化インフルエンザウイルスベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む、インフルエンザに対するワクチンも提供する。
【００５４】
特に、本発明によるワクチンは、6.5〜10.5 log EID50/mlの弱毒化インフルエンザウイルスベクターと、0〜1.5重量%の一価の塩、0〜5重量%のイミダゾール含有化合物、0〜5重量%の炭水化物成分、0〜2重量%のタンパク質成分、0〜2重量%のアミノ酸成分及び0〜10重量%のヒドロキシエチル化デンプンを含む緩衝溶液とを含む。
【００５５】
本発明の別の実施形態は、緩衝溶液が、0.5〜1.5重量%の一価の塩、0.01〜5重量%のイミダゾール含有化合物、1〜5重量%の炭水化物成分、0.1〜2重量%のタンパク質成分、0.01〜2重量%のアミノ酸成分、及び1〜10重量%のヒドロキシエチル化デンプンを含む、ワクチンである。好ましい実施形態では、前記緩衝溶液中の一価の塩は、塩化ナトリウムであり、炭化水素成分は、スクロース、トレハロース又はラクトースであり、タンパク質成分は、ヒト組換えアルブミン、カジトン、ラクトアルブミン水解物又はゼラチンであり、アミノ酸成分は、アルギニン、グリシン又はグルタミン酸ナトリウムであり、イミダゾール含有化合物は、L-カルノシン又はN,N'-ビス[2-(1H-イミダゾール-5イル)エチル]プロパンジアミドである。
【００５６】
本発明の一実施形態は、感染性疾患に対するワクチンであって、感染性疾患が、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、結核菌、単純ヘルペスウイルスI及びII型、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、マラリア寄生虫、トリコモナス、クラミジア、トリパノソーマ、リーシュマニア又はブルセラ症原因物質からなる群から選択される病原体によって引き起こされる、ワクチンである。
【００５７】
本発明は、対象における感染性疾患の処置及び/又は予防のための、特に、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、結核菌、単純ヘルペスウイルスI及びII型、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、マラリア寄生虫、トリコモナス、クラミジア、トリパノソーマ、リーシュマニア又はブルセラ症原因物質からなる群から選択される病原体によって引き起こされる疾患の処置及び/又は予防のための、本発明による弱毒化A型インフルエンザウイルス、本発明による弱毒化インフルエンザウイルスベクター、又は本発明による医薬組成物の使用にも関する。本発明の好ましい実施形態では、対象は、哺乳動物又はトリであり、特に、対象は、ヒト対象である。
【００５８】
本発明は、対象におけるインフルエンザの予防のための、本発明による弱毒化インフルエンザウイルスベクター又は医薬組成物の使用にも関する。
【００５９】
本発明は、それを必要とする対象における感染性疾患を処置及び/又は予防する方法であって、本発明による弱毒化A型インフルエンザウイルス、本発明による弱毒化インフルエンザウイルスベクター又は本発明による医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法、好ましくは、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、結核菌、単純ヘルペスウイルスI及びII型、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、マラリア寄生虫、トリコモナス、クラミジア、トリパノソーマ、リーシュマニア又はブルセラ症原因物質からなる群から選択される病原体によって引き起こされる疾患を処置する方法にも関する。本発明の好ましい実施形態では、対象は、哺乳動物又はトリであり、特に、対象は、ヒト対象である。
【００６０】
本発明は、本発明による弱毒化A型インフルエンザウイルス、又は本発明による弱毒化インフルエンザウイルスベクターの有効量、及び薬学的に許容される担体を含む、対象における腫瘍性疾患の処置のための医薬組成物も提供する。
【００６１】
本発明の一実施形態は、8.5〜10.5 log EID50/mlの本発明による弱毒化A型インフルエンザウイルス又は本発明による弱毒化A型インフルエンザウイルスベクターと、0〜1.5重量%の一価の塩、0〜5重量%のイミダゾール含有化合物、0〜5重量%の炭水化物成分、0〜2重量%のタンパク質成分、0〜2重量%のアミノ酸成分、及び0〜10重量%のヒドロキシエチル化デンプンを含む緩衝溶液とを含む医薬組成物であって、本発明の好ましい実施形態では、緩衝溶液が、0.5〜1.5重量%の一価の塩、0.01〜5重量%のイミダゾール含有化合物、1〜5重量%の炭水化物成分、0.1〜2重量%のタンパク質成分、0.01〜2重量%のアミノ酸成分、及び1〜10重量%のヒドロキシエチル化デンプンを含む、医薬組成物である。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、緩衝溶液中の、一価の塩が塩化ナトリウムであり、炭水化物成分がデンプンであり、タンパク質成分がヒトアルブミンであり、アミノ酸成分がアルギニンであり、イミダゾール含有化合物がL-カルノシン又はN,N'-ビス[2-(1H-イミダゾール-5イル)エチル]プロパンジアミドである、医薬組成物である。
【００６３】
本発明は、対象における腫瘍性疾患、特に、結腸直腸がん、食道胃接合部がん、膵がん、胆管細胞がん、神経膠腫、神経膠芽腫及び黒色腫からなる群から選択される疾患の処置のための、本発明による弱毒化ウイルスベクター、本発明による弱毒化インフルエンザウイルスベクター、又は本発明による医薬組成物の使用にも関する。本発明の好ましい実施形態では、対象は、ヒト対象である。
【００６４】
本発明は、それを必要とする対象における腫瘍性疾患の処置のための方法であって、本発明による弱毒化A型インフルエンザウイルス、本発明による弱毒化インフルエンザウイルスベクター又は本発明による医薬組成物の有効量を投与することを含む方法、好ましくは、結腸直腸がん、食道胃接合部がん、膵がん、胆管細胞がん、神経膠腫、神経膠芽腫及び黒色腫からなる群から選択される腫瘍性疾患を処置する方法にも関する。
【００６５】
本発明の一実施形態では、前記投与は、腫瘍内投与、腫瘍の外科的除去後に形成される空洞への投与、又は静脈内投与である。
【発明の効果】
【００６６】
本発明の技術的成果は、ヒト及び動物において安全度が高い、キメラNSゲノム断片を含むインフルエンザウイルス及び対応するインフルエンザベクターであって、特に、動物生物体における能動的ウイルス増殖の欠如を特徴とし、温度感受性表現型を有し、感染性疾患の予防及び/又は処置に使用されうる、ベクターの生産である。本発明の別の技術的成果は、アジュバントの非存在下での粘膜投与で万能インフルエンザワクチンの特性を有する、キメラNSゲノム断片を含むインフルエンザウイルスの生産である。加えて、技術的成果は、生産されたインフルエンザウイルス及びインフルエンザベクターの10日齢ニワトリ胚における高い潜在的増殖能力である。別の技術的成果は、万能インフルエンザワクチンの特性を有するインフルエンザベクターの生産である。技術的成果は、腫瘍溶解活性を有するインフルエンザウイルス及びインフルエンザベクターの生産でもある。別の技術的成果は、アジュバント不使用に起因する、インフルエンザワクチンの生産に要するコストの低下である。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】弱毒化インフルエンザベクターの設計の原理を示す図である。図1Aは、インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスのNSゲノム断片のスキームを示す。図1Bは、NS1リーディングフレームが短縮され、そして外来配列のインサートにより伸長されうる、遺伝子修飾キメラNSゲノム断片のスキームを示す。Nepタンパク質をコードする配列は、別のA型インフルエンザウイルス亜型に由来する異種配列で置換される。
【図２】野生型ウイルスのNSゲノム断片のヌクレオチド配列及び2つのキメラ遺伝子構築物の例のヌクレオチド配列を示す図である。図2Aは、インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスのNS断片を示す。図2Bは、NS1タンパク質のリーディングフレームが短縮され、Nep配列(太字で記されている)がA/シンガポール/1/57 (H2N2)ウイルスに由来する、A型インフルエンザウイルスのキメラNS断片を示す。図2Cは、NS1タンパク質のリーディングフレームが短縮され、Nep配列(太字で記されている配列)がA/レニングラード/134/47/57 (H2N2)ウイルスに由来する、A型インフルエンザウイルスのキメラNS断片を示す。
【図３】ウイルスA/レニングラード/134/47/57 (H2N2)ウイルスからの異種Nepを含有するNS1キメラインフルエンザベクターのリーディングフレーム内の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】異種Nep遺伝子を有するウイルスの病原性及びts-表現型を実証するデータを示す図である。図4Aは、34℃の至適温度での及び温度39℃の上昇温度でのベロ細胞におけるウイルス増殖のデータを示す。図4Bは、感染後2日目のマウス肺におけるウイルス増殖のデータを示す。
【図５】異種病原性インフルエンザ株による対照感染における、NS1リーディングフレームからのHA2サブユニット領域を発現するベクターでのマウスへの単回免疫付与の保護効果を実証するグラフを示す図である。図5Aは、A/ミシシッピー/85/1 (H3N2)ウイルスによる対照感染における致死性を示し、図5Bは、B/Lee/40ウイルスによる対照感染に関する致死性を示す。
【図６】後足の足関節より下の部分への1×106個のB16細胞の導入によりマウスに誘導した黒色腫に対する組換えインフルエンザウイルスの腫瘍溶解効果に関するデータを表す図である。腫瘍植え込み後5日目にウイルスの腫瘍内投与により治療を行った。図6Aは、腫瘍植え込み及び腫瘍溶解性ベクターでの4回処置後20日目の足の平均サイズを示し、図6Bは、腫瘍溶解性ベクターでの4回の処置後のマウスの生存率を示す。
【図７】弱毒化インフルエンザベクターの構造を示す図である。ウイルスゲノムの8つの断片及びそれらの特性が示されている。ゲノム断片PB2、PB1、PA、Np及びMが、A/PR/8/34 (H1N1)ウイルスに由来し、表面HA及びNA糖タンパク質遺伝子が、A/カリフォルニア/7/09様(H1N1pdm)ウイルスに由来し、並びにNSゲノム断片が、2つのタンパク質: 1) 124アミノ酸残基に短縮され、B型インフルエンザHA2タンパク質のN末端領域の配列のインサートによって、及びA型インフルエンザNPタンパク質の保存B細胞エピトープのインサートによって伸長される、NS1タンパク質と、2)異種A型インフルエンザ株、H2N2 A/シンガポール/1/57様血清学的亜型に由来する配列を有するNepタンパク質と、をコードするキメラ構造を有することが、示されている。
【図８Ａ】ワクチンベクターのゲノム断片: A/PR/8/34 (H1N1)ウイルスからのPB2、PB1、PA、NP及びM; A/カリフォルニア/7/09様(H1N1pdm)ウイルスからのHA及びNA;並びにキメラNS (NS1リーディングフレーム内のインサートが太字で記されている)のヌクレオチド配列を示す図である。
【図８Ｂ】ワクチンベクターのゲノム断片: A/PR/8/34 (H1N1)ウイルスからのPB2、PB1、PA、NP及びM; A/カリフォルニア/7/09様(H1N1pdm)ウイルスからのHA及びNA;並びにキメラNS (NS1リーディングフレーム内のインサートが太字で記されている)のヌクレオチド配列を示す図である。
【図８Ｃ】ワクチンベクターのゲノム断片: A/PR/8/34 (H1N1)ウイルスからのPB2、PB1、PA、NP及びM; A/カリフォルニア/7/09様(H1N1pdm)ウイルスからのHA及びNA;並びにキメラNS (NS1リーディングフレーム内のインサートが太字で記されている)のヌクレオチド配列を示す図である。
【図８Ｄ】ワクチンベクターのゲノム断片: A/PR/8/34 (H1N1)ウイルスからのPB2、PB1、PA、NP及びM; A/カリフォルニア/7/09様(H1N1pdm)ウイルスからのHA及びNA;並びにキメラNS (NS1リーディングフレーム内のインサートが太字で記されている)のヌクレオチド配列を示す図である。
【図９Ａ】マウスへの鼻腔内免疫付与後のA型インフルエンザウイルス及びB型インフルエンザウイルスの様々な変異体に対するワクチンベクターの保護特性を表す結果を示す図である。これらの図は、ワクチン接種を受けたマウスにおける、A型インフルエンザウイルス又はB型インフルエンザウイルスの示されている血清型による対照感染後の対照動物と比べた死亡率(%で)を示す。ワクチンを1回、すなわち1×、又は2回、すなわち2×投与した。
【図９Ｂ】マウスへの鼻腔内免疫付与後のA型インフルエンザウイルス及びB型インフルエンザウイルスの様々な変異体に対するワクチンベクターの保護特性を表す結果を示す図である。これらの図は、ワクチン接種を受けたマウスにおける、A型インフルエンザウイルス又はB型インフルエンザウイルスの示されている血清型による対照感染後の対照動物と比べた死亡率(%で)を示す。ワクチンを1回、すなわち1×、又は2回、すなわち2×投与した。
【図１０】フェレットへの鼻腔内免疫付与後のワクチンベクターの保護特性を実証するデータを示す図である。図Aは、ワクチン接種を受けた動物及び対照動物における、A/サンクトペテルブルク/224/2015 (H3N2)ウイルスによる対照感染後の温度変動の平均値の動態を示す。図Bは、感染後2、4及び6日目のフェレット鼻洗浄液からの対照ウイルスの接種結果を示す。力価は、MDCK細胞での力価測定後の50%細胞変性用量/mlとして表された、鼻洗浄液中のウイルス平均濃度として表されている。ワクチンを1回、すなわち1×、又は2回、すなわち2×投与した。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本発明は、遺伝子改変方法によって生産され、感染性疾患の処置及び/又は予防、並びに腫瘍性疾患の処置に使用することができる、弱毒化A型インフルエンザウイルスに関する。
【００６９】
特に、本発明は、A型及びB型インフルエンザウイルスに対する交差保護応答を誘導する弱毒化A型インフルエンザウイルスであって、NS1の短縮されたリーディングフレームと、前記弱毒化A型インフルエンザウイルスの亜型とは異なるA型インフルエンザ亜型に由来するNep遺伝子の異種配列とを含むキメラNS断片を含む、弱毒化A型インフルエンザウイルスに関する。したがって、短縮されたNS1タンパク質をコードする配列のA型インフルエンザウイルス亜型は、Nepタンパク質配列が由来したウイルス亜型とは異なる。特に、本発明の一実施形態は、前記NS1の短縮されたリーディングフレームが、インフルエンザH1N1亜型に由来し、Nep遺伝子の前記異種配列が、H2〜H18亜型のヒト又は動物インフルエンザ亜型に由来する、弱毒化A型インフルエンザウイルスに関する。
【００７０】
前記短縮されたリーディングフレームは、80〜130アミノ酸残基を含むNS1タンパク質をコードし、より好ましくは、前記短縮されたリーディングフレームは、124アミノ酸残基を含むNS1タンパク質をコードする。
【００７１】
本発明は、インフルエンザベクター、特にベクターNS1-124の不十分な弱毒化(温度感受性の非存在及びマウス肺における高い増殖レベル)の問題を、インフルエンザウイルスのNSゲノム断片の第2のスプライスされるタンパク質産物-Nepタンパク質(NS2)-の修飾によって解決することができるという、本発明者らが見出した事実に特に基づく。異種インフルエンザ株に由来する、例えばА/シンガポール/1/57 (H2N2)又はA/レニングラード/134/47/57 (H2N2)ウイルスに由来する、Nep配列での、A型インフルエンザウイルス、特に、A/PR/8/34 (H1N1)インフルエンザウイルス、のNepゲノム配列の置換は、A型インフルエンザウイルス、特に、A/PR/8/34 (H1N1)ウイルスの温度感受性表現型及び弱毒化の出現につながった。この現象に基づいて、H2N2血清学的亜型に由来するNepタンパク質リーディングフレームとの組合せで、A/PR/8/34 (H1N1)ウイルスの短縮されたリーディングフレーム、NS1-124、をコードする、インフルエンザウイルスのキメラNS断片を構築した。表面抗原H1N1、H5N1又はH1N1pdmの起源にかかわらず、キメラNSゲノム断片を保有する、A/PR/8/34ウイルスに基づくリアソータントインフルエンザウイルスは、39℃でマウスの肺において能動的に増殖することができなかった(弱毒化表現型)が、それでもなお10日齢ニワトリ胚において高力価に増殖した。
【００７２】
本発明は、細菌、ウイルス及び原虫からの抗原又はそれらの断片からなる群から選択される抗原又はその断片を発現する弱毒化インフルエンザウイルスベクターであって、前記ベクターが、本発明による弱毒化A型インフルエンザウイルスであり、NS1タンパク質遺伝子の短縮されたリーディングフレームが、細菌、ウイルス及び原虫からの抗原又はその断片をコードする少なくとも1つの導入遺伝子の配列のインサートにより伸長される、弱毒化インフルエンザウイルスベクターにも関する。一般に、弱毒化ウイルスは、動物及びヒトに対して病原性又は非病原性の任意の細菌、ウイルス又は原虫からのタンパク質又はその断片をコードする導入遺伝子に挿入することができ、特に、タンパク質は、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、結核菌、ウシ流産菌、ヘルペスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、マラリア寄生虫、トリコモナス、トリパノソーマ、リーシュマニア、クラミジア、ブルセラ症原因物質又はこれらの組合せからのタンパク質又はその断片からなる群から選択することができる。特に、インサートの配列は、インフルエンザウイルスのHAタンパク質断片、結核菌タンパク質ESAT-6、Ag85A、Ag85B、Mpt64、HspX、Mtb8.4若しくは10.4、又はこれらの断片をコードすることができる。本発明による弱毒化ベクターのゲノム配列は、NS1-124をコードする配列とESAT6をコードする配列の間に、自己切断性2Aペプチドをコードする配列を更に含むことができる。
【００７３】
インサートの配列によってコードされる抗原又はその断片は、該抗原又はその断片をコードするヌクレオチド配列を「受け入れる」ゲノム断片の能力によってのみ制限される任意のサイズを有することができる。好ましくは、抗原のサイズは、10〜400アミノ酸である。例えば、インサートは、A型インフルエンザウイルスの1〜185アミノ酸、B型インフルエンザウイルスの1〜186アミノ酸、A型インフルエンザウイルスの23〜185アミノ酸、又はA型インフルエンザウイルスの65〜222アミノ酸からなる群から選択されるHA2サブユニット領域に相当する、HAタンパク質断片をコードすることができる。アミノ酸の番号付けは、導入遺伝子の起源であるインフルエンザウイルスのHA2サブユニット領域内のアミノ酸の位置に従って与えたものである。
【００７４】
本発明による弱毒化インフルエンザウイルスベクターの別の特異的実施形態は、インサートが、1〜21アミノ酸のA型又はB型インフルエンザウイルスHA2サブユニット領域の配列、及び243〜251アミノ酸のA型インフルエンザウイルスNPタンパク質領域の配列をコードする、ベクターである。これらのベクター変異体は、それらの中の短いインサートにもかかわらず、マウスへの単回免疫付与後にB型インフルエンザウイルスとA型インフルエンザウイルスの異種抗原亜型とに対して最高の保護有効性を示すことが、驚くべきことに判明した。すなわち、それらのベクター変異体は、万能インフルエンザワクチンの特性を示す。
【００７５】
本発明者らは、NS1リーディングフレーム内への、例えば、アミノ酸124位の後への外来抗原配列のインサートが、本発明に従って生産されるキメラウイルスの弱毒化表現型に有意な影響を与えないことを見出した。かくて、生インフルエンザワクチンに対する要件と一致する、要求生産特性を有し、弱毒化表現型及び遺伝子型マーカーを明示する、様々なインフルエンザベクターを得た。インサートの性質にかかわらず、ウイルスは、実験動物に対するそれらの無害性、及び明示される弱毒化表現型マーカーの類似性-ts表現型の存在-を示した。それらの弱毒化遺伝子型マーカーの類似性は、NS1タンパク質の短縮されたリーディングフレームの存在によって、及び別のA型インフルエンザ亜型に由来するNep遺伝子の異種配列の存在によって判定した。インサートに依存して、結果として得られるベクターは、万能インフルエンザワクチン、結核に対するワクチン等の特性を示した。
【００７６】
特に、本発明は、遺伝子工学方法によって得られるA型インフルエンザウイルスワクチンベクターであって、A型及びB型インフルエンザウイルスを含む公知のあらゆる株によって引き起こされるインフルエンザを予防するために使用することができるA型インフルエンザウイルスワクチンベクターに関する。特に、本発明は、A型及びB型インフルエンザウイルスに対する交差保護応答を誘導する弱毒化A型インフルエンザウイルスであって、NS1タンパク質の短縮されたリーディングフレームと、A型H2N2亜型インフルエンザウイルスに由来するNep遺伝子異種配列とを含むキメラNS断片を含む、弱毒化A型インフルエンザウイルスに関する。したがって、短縮されたNS1タンパク質をコードする配列のA型インフルエンザウイルス亜型は、Nepタンパク質をコードする配列が由来したウイルス亜型とは異なる。特に、ワクチンベクターにおいて、NS1の短縮されたリーディングフレームは、H1N1亜型インフルエンザからのものであり、Nep異種配列は、H2N2亜型インフルエンザからのものである。
【００７７】
一実施形態では、本発明は、A型及びB型インフルエンザウイルスに対する交差保護応答を誘導する弱毒化インフルエンザベクターであって、
インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスに由来するPB2タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又はPB2タンパク質遺伝子の前記ヌクレオチド配列と少なくとも95%以上(例えば、96、97、98若しくは99%)の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスに由来するPB1タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又はPB1タンパク質遺伝子の前記ヌクレオチド配列と少なくとも95%以上(例えば、96、97、98若しくは99%)の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスに由来するPAタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又はPAタンパク質遺伝子の前記ヌクレオチド配列と少なくとも95%以上(例えば、96、97、98若しくは99%)の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスに由来するNPタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又はNPタンパク質遺伝子の前記ヌクレオチド配列と少なくとも95%以上(例えば、96、97、98若しくは99%)の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスに由来するMタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又はMタンパク質遺伝子の前記ヌクレオチド配列と少なくとも95%以上(例えば、96、97、98若しくは99%)の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
インフルエンザA/カリフォルニア/7/09様(H1N1pdm)ウイルスに由来するHAタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又はHAタンパク質遺伝子の前記ヌクレオチド配列と少なくとも95%以上(例えば、96、97、98若しくは99%)の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
インフルエンザA/カリフォルニア/7/09様(H1N1pdm)ウイルスに由来するNAタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列、又はNAタンパク質遺伝子の前記ヌクレオチド配列と少なくとも95%以上(例えば、96、97、98若しくは99%)の配列同一性を有するヌクレオチド配列;及び
NSタンパク質キメラ遺伝子のヌクレオチド配列であって、
短縮されており、124アミノ酸残基からなるNS1タンパク質をコードする、インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスに由来するNS1タンパク質リーディングフレームと、
インフルエンザА/シンガポール/1/57様(H2N2)ウイルスに由来するNep遺伝子配列と
を含む、ヌクレオチド配列、又は
前記NSキメラ遺伝子の前記ヌクレオチド配列と少なくとも95%以上(例えば、96、97、98若しくは99%)の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含み、
前記NS1タンパク質の短縮されたリーディングフレームが、B型インフルエンザウイルスHA2サブユニット領域とA型インフルエンザウイルス核タンパク質(NP)の保存B細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列との融合ペプチドをコードするヌクレオチド配列のインサートによって伸長される、弱毒化インフルエンザベクターにも関する。
【００７８】
この短縮されたリーディングフレームは、124アミノ酸残基を有するNS1タンパク質をコードし、これが、2つのグリシン、B型インフルエンザウイルスの第2のヘマグルチニンサブユニットHA2のN末端領域のインサート(23アミノ酸残基)、及びA型インフルエンザウイルスの保存B細胞エピトープの配列のインサート(7アミノ酸残基)によって伸長される。
【００７９】
このベクターの表面糖タンパク質遺伝子は、インフルエンザA/カリフォルニア/7/09 (H1N1pdm)ウイルスに由来する。内部タンパク質の遺伝子PB2、PB1、RA、NP及びMは、インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスに由来する。したがって、本発明によるインフルエンザベクターは、様々なインフルエンザ株のゲノム配列からなる複合遺伝子構築物であり、すなわち、1) PB2、PB1、PA、NP及びMをコードする遺伝子は、A/PR/8/34 (H1N1)ウイルスからのもの(PB2 (Genbank受託番号AB671295)、PB1 (Genbank受託番号CY033583)、PA (Genbank受託番号AF389117)、NP (Genbank受託番号AF389119)、M (Genbank受託番号AF389121))であり、2) HA及びNAをコードする遺伝子は、A/カリフォルニア/7/09様H1N1pdmウイルスからのもの(HA (GenBank: KM408964.1)及び(NA GenBank: KM408965.1))であり、3) NS遺伝子はキメラであり、この場合、A/PR/8/34 (H1N1)ウイルスのNSタンパク質リーディングフレームは、124アミノ酸残基に短縮され、B型インフルエンザウイルスHA2サブユニット領域とA型インフルエンザウイルス核タンパク質(NP)の保存B細胞エピトープをコードする配列との融合ペプチドをコードする配列のインサートによって伸長され、並びにNEPタンパク質リーディングフレームは、H2N2亜型インフルエンザウイルスからのものである。
【００８０】
本発明は、アジュバントなしでの、前記構造を有するベクターによるマウス及びフェレットへの鼻腔内免疫付与が、それらの動物をA型(H1N1)インフルエンザウイルスのみならずA型(H3N2)インフルエンザウイルス及びB型インフルエンザウイルスにもよる対照感染から保護するという、本発明者らが予想外に見出した事実に特に基づく。したがって、ワクチンベクターは、万能インフルエンザワクチンの特性を有する。
【００８１】
本発明に関して、用語「万能ワクチン」は、インフルエンザウイルスの既知及び未知の全ての変異体から保護することができるワクチンを意味する。通常の「季節性ワクチン」は、そのワクチン組成物に含まれているものに類似したウイルスからしか保護しない。
【００８２】
用語「粘膜ワクチン」は、ワクチンを気道腔及び消化管腔に投与することができ、口及び鼻の粘膜に適用することができる、すなわち、鼻腔内、経口又は舌下適用することができることを意味する。
【００８３】
キメラNSゲノム断片を保有するA/PR/8/34ウイルスに基づくインフルエンザベクターは、39℃でマウス肺において能動的に増殖することができなかった(弱毒化表現型)が、それでもなお10日齢ニワトリ胚において高力価に増殖した。
【００８４】
本発明は、腫瘍溶解活性を有する弱毒化インフルエンザウイルスベクターであって、NS1タンパク質遺伝子の短縮されたリーディングフレームが、病原菌、病原性ウイルス及び病原性原虫からの抗原又はその断片をコードする少なくとも1つの導入遺伝子の配列のインサートにより伸長される、本発明による弱毒化A型インフルエンザウイルスを含む、弱毒化インフルエンザウイルスベクターにも関する。前記抗原は、動物に対して病原性であるいずれの細菌、ウイルス又は原虫に由来してもよく、特に、抗原は、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、結核菌、ヘルペスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、マラリア寄生虫、トリコモナス、トリパノソーマ、リーシュマニア、クラミジア又はこれらの組合せのからなる群から選択することができる。特に、挿入される導入遺伝子は、結核菌タンパク質ESAT-6、Ag85A、Ag85B、Mpt64、HspX、Mtb8.4若しくは10.4又はその断片をコードすることができ、加えて、NS1タンパク質遺伝子の短縮されたリーディングフレームを、結核菌タンパク質ESAT-6をコードする配列のインサートによって伸長することができる。
【００８５】
インサートの配列によってコードされる抗原又はその断片は、該抗原又はその断片をコードするヌクレオチド配列を「受け入れる」NSゲノム断片の能力によってのみ制限される任意のサイズを有することができる。好ましくは、抗原のサイズは、10〜400アミノ酸である。
【００８６】
本発明者らは、弱毒化インフルエンザウイルスが、NS1タンパク質リーディングフレームから病原性抗原、特に細菌抗原が発現されることを条件に、異種Nep遺伝子の組み込みに起因して向上した腫瘍溶解性活性を有するキメラNSゲノム断片を保有することを、意外にも見出した。例えば、結核菌タンパク質Esat6をコードするウイルスベクターは、短縮されたNS1タンパク質を有するがインサートのない公知の組換えウイルスより高い活性を有した。いずれの理論にも拘束されることを望まないが、哺乳動物における強い抗結核免疫は、結核タンパク質を発現するウイルスに感染した腫瘍の免疫攻撃に寄与すると想定することができる。
【００８７】
本発明は、本発明による弱毒化A型インフルエンザウイルス又は本発明の弱毒化インフルエンザウイルスベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物にも関する。本発明による医薬組成物は、対象における感染性疾患、特に、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、結核菌、単純ヘルペスウイルスI及びII型、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、マラリア寄生虫、トリコモナス、クラミジア、トリパノソーマ又はリーシュマニアからなる群から選択される病原体によって引き起こされる感染性疾患の処置及び/又は予防に使用することができる。
【００８８】
加えて、本発明による医薬組成物は、様々な病因の腫瘍性疾患、特に、結腸直腸がん、食道胃接合部がん、膵がん、胆管細胞がん、神経膠腫、神経膠芽腫及び黒色腫からなる群から選択することができる腫瘍性疾患の処置に使用することができる。
【００８９】
本発明による医薬組成物は、本発明による弱毒化A型インフルエンザウイルス又は本発明の弱毒化インフルエンザウイルスベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含有するワクチンとして製剤化することができる。
【００９０】
本明細書で使用される用語「対象」又は「動物」は、トリ(水鳥、ニワトリ等)並びに様々な哺乳動物種の代表、例えばイヌ、ネコ、オオカミ、フェレット、齧歯類(ラット、マウス等)、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ及び霊長類を含む、病原菌、病原性ウイルス又は病原性原虫によって引き起こされる感染症にかかりやすい脊椎動物を意味する。本発明の一実施形態では、対象は、ヒト対象である。
【００９１】
用語「有効量」は、単回投与で又は処置サイクルの一部として投与されるときのウイルス又はベクターの量が、治療成果を伴う処置及び/予防に有効であることを意味する。この量は、患者の健康状態及び身体的状態、その年齢、処置を受ける対象の分類群、製剤、処置をする医師による医学的状況の推定、及び他の重要な因子に依存して変動しうる。この量は、比較的広い範囲内で変動しうるが、当業者は標準的な方法でそれを決定することができると考えられる。医薬組成物は、6〜10.5 log EID50/ml、更に特に6.5〜10.5 log EID50/ml、特に、6〜9.5 log EID50/ml、更に特に6.5〜8.5 log EID50/mlの、本発明によるキメラA型インフルエンザウイルス又は本発明によるインフルエンザベクターを含有しうる。
【００９２】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される担体」は、当分野において使用される任意の担体、特に、水、生理食塩水、緩衝溶液等を意味する。一実施形態では、薬学的に許容される担体は、0〜1.5重量%の一価の塩、0〜5重量%のイミダゾール含有化合物、0〜5重量%の炭水化物成分、0〜2重量%のタンパク質成分、0〜2重量%のアミノ酸成分及び0〜10重量%のヒドロキシエチルデンプンを含有する緩衝溶液であり、好ましくは、前記緩衝溶液は、0.5〜1.5重量%の一価の塩、0.01〜5重量%のイミダゾール含有化合物、1〜5重量%の炭水化物成分、0.1〜2重量%のタンパク質成分、0.01〜2重量%のアミノ酸成分及び1〜10重量%のヒドロキシエチルデンプンを含有し、最も好ましくは、一価の塩は、塩化ナトリウムであり、炭水化物成分は、スクロース、トレハロース又はラクトースであり、タンパク質成分は、ヒトアルブミン、カジトン、ラクトアルブミン水解物又はゼラチンであり、アミノ酸成分は、アルギニン、グリシン又はグルタミン酸ナトリウムである。
【００９３】
イミダゾール含有化合物は、L-カルノシン、又は下記式を有するN,N'-ビス[2-(1H-イミダゾール-5イル)エチル]-プロパンジアミドである:
【００９４】
【化１】
0006692835.tif 000002
【００９５】
ヒトアルブミンは、組換えアルブミンであってもよく、又はドナーアルブミンであってもよい。
【００９６】
本発明は、対象における感染性疾患、特に、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、結核菌、単純ヘルペスウイルスI及びII型、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、マラリア寄生虫、トリコモナス、クラミジア、トリパノソーマ又はリーシュマニアからなる群から選択される病原体によって引き起こされる感染性疾患の処置及び/又は予防のための、本発明による弱毒化A型インフルエンザウイルス、弱毒化インフルエンザウイルスベクター又は医薬組成物の使用にも関する。
【００９７】
本発明は、インフルエンザの予防のための、本発明による弱毒化インフルエンザベクター又は医薬組成物の使用にも関する。
【００９８】
加えて、本発明は、本発明による弱毒化A型インフルエンザウイルス、弱毒化インフルエンザベクター又は医薬組成物を対象に投与することを含む処置方法にも関する。前記方法は、病原性ウイルス、病原菌又は病原性原虫によって引き起こされる感染性疾患、特に、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、結核菌、単純ヘルペスウイルスI及びII型、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、マラリア寄生虫、トリコモナス、クラミジア、トリパノソーマ又はリーシュマニアからなる群から選択される病原体によって引き起こされる感染性疾患の処置及び/又は予防を目的としたものである。加えて、方法は、対象における腫瘍性疾患、特に、結腸直腸がん、食道胃接合部がん、膵がん、胆管細胞がん、神経膠腫、神経膠芽腫及び黒色腫からなる群から選択することができる腫瘍性疾患の処置を目的としたものである。
【００９９】
対象への投与は、任意の標準的な方法によって、特に、筋肉内に、静脈内に、経口的に、舌下に、吸入により又は鼻腔内に行うことができる。インフルエンザベクター又は医薬組成物を対象に1回投与してもよく、2回以上投与してもよいが、単回投与が好ましい。
【０１００】
加えて、がんを処置する場合、投与は、腫瘍内投与、腫瘍の外科的除去後に形成される空洞への投与、又は静脈内投与であってもよい。
【０１０１】
本発明を下でその実施形態によって例証するが、これらの実施形態は本発明の範囲を限定することを目的としたものではない。
【実施例】
【０１０２】
(実施例1)
修飾NSゲノム断片を有するインフルエンザベクターの生成
組換えウイルスを数工程で構築した。第1の工程で、インフルエンザウイルスA/PR/8/34 (H1N1)の8つ全てのゲノム断片の相補DNA (cDNA)コピーを、遺伝子バンクからのデータ: pHbank-PR8-HA (Genbank受託番号EF467821.1)、pHW-PR8-NA (Genbank受託番号AF389120.1)、pHW-PR8-PB2 (Genbank受託番号AB671295)、pHW-PR8-PB1 (Genbank受託番号CY033583)、pHW-PR8-PA (Genbank受託番号AF389117)、pHW-PR8-NP (Genbank受託番号AF389119)、pHW-PR8-M (Genbank受託番号AF389121)、pHW-PR8-NS (Genbank受託番号J02150.1))を使用することにより合成により生成した。第2の工程では、それらの合成された配列を二方向プラスミドpHW2000に基づくベクター(Hoffmann E、Neumann G、Kawaoka Y、Hobom G、Webster RG、A DNA from eight plasmids、Proc Natl Acad Sci USA、2000; 97 (11): 6108〜13頁)にクローニングした。このプラスミドベクターは、pol I及びpol IIプロモーターの存在のため、哺乳動物細胞にトランスフェクトし次第、ウイルスRNAと対応するメッセンジャーRNAの同時細胞内転写をもたらした。
【０１０３】
修飾されていないPB1、PB2、PA、HA、NA、NP及びMをコードする7つのプラスミドクローン、並びに修飾されたNSゲノム断片の一連の変異体を生成した。その原理を図1に提示する。
【０１０４】
図1Aは、インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスのNSゲノム断片のスキームを示す。負極性ウイルスRNA (vRNA)の完全長ゲノム断片は、230ヌクレオチド(nt)の長さを有する。インフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体によるNS断片の転写は、次の2つのタイプのメッセンジャーRNAの形成をもたらす: 1. 230アミノ酸残基(aa)を有するNS1タンパク質をコードするNS1タンパク質のmRNAである直接転写産物、及び121aaを有するタンパク質をコードするNepタンパク質のスプライスされたmRNA。図1Bは、NS1タンパク質のリーディングフレームが398以下のntを含み、それをトリプル終止コドンで終わる外来配列のインサートによって伸長することができる、遺伝子修飾キメラNSゲノム断片のスキームを示す。Nepタンパク質をコードする配列を別のA型インフルエンザウイルス亜型に由来する異種配列で置換する。修飾の結果として、キメラNSゲノム断片は、NS1リーディングフレームへの外来配列のインサートの長さに依存する長さを有する。
【０１０５】
コード領域と5'及び3'末端非コード領域とを含む、インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスのヌクレオチド配列(GenBankデータベースでの配列番号J02150)を、NSゲノム断片のキメラ構築物の開発の基礎として使用した。次の一般的特徴を有する、NSゲノム断片のキメラ構築物の様々な変異体を、目的に応じて構築した: 1) H2N2亜型インフルエンザウイルス(株: A/シンガポール/1/57及びA/レニングラード/134/47/57)に由来する配列での、A/PR/8/34 (H1N1)ウイルスのNepタンパク質をコードする配列の置換(図2B及び2C); 2) Nepスプライス部位までの、NS1をコードする領域からの30ヌクレオチド(499〜428位nt)からなる配列の欠失; 3)連続する3個の終止コドンのカセット(TGATAATAA)をヌクレオチド399位の後に挿入することによる、NS1タンパク質のリーディングフレームの124アミノ酸残基への制限(図2A及び図2B); 4) NS1リーディングフレームのヌクレオチド398位の後、終止コドンカセットの直前に挿入された外来遺伝子配列の存在又は不在。
【０１０６】
図2Aは、インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスのNS断片の配列番号1の配列を示すものであり、B及びCの構築物を生成するために欠失される30ntからなる配列が強調表示され、該配列に下線が引かれている。別のA型インフルエンザウイルス亜型からの異種類似体によって置換されるNep遺伝子の配列が太字で記されている。図2Bは、A型インフルエンザウイルスの組換えNS断片の配列番号2の配列であって、NS1タンパク質のリーディングフレームが、連続する3個の終止コドンからなるインサート(下線が引かれている)によって398ntに短縮されており、Nep配列(太字で記されている)が、A/シンガポール/1/57 (H2N2)ウイルスから借用したものである、配列を示す。図2Cは、A型インフルエンザウイルスの組換えNS断片の配列番号3の配列であって、NS1タンパク質のリーディングフレームが、連続する3個の終止コドンからなるインサート(下線が引かれている)によって398ntに短縮されており、Nep配列(太字で記されている)が、А/レニングラード/134/47/57 (H2N2)ウイルスから借用されたものである、配列を示す。
【０１０７】
【化２Ａ】
0006692835.tif 000003
【０１０８】
【化２Ｂ】
0006692835.tif 000004
【０１０９】
したがって、構築されたキメラNSゲノム断片は、ポリメラーゼインフルエンザウイルス複合体によって短縮されたとき、次の2つのタイプのメッセンジャーRNAを形成した: 1) 124アミノ酸残基に短縮され、終止コドンによって制限された、又はその翻訳が終止コドンカセットによって制限される異なる起源の導入遺伝子の配列のインサートによって伸長された、NS1タンパク質の形態で翻訳されたNS1 mRNA、2)別の抗原亜型のA型インフルエンザウイルスに由来する異種Nep mRNA。インサートを有する組換えNS1タンパク質の翻訳変異体を図3及び下のTable 1(表1)に示す。
【０１１０】
【表１Ａ】
0006692835.tif 000005
【０１１１】
【表１Ｂ】
0006692835.tif 000006
【０１１２】
【表１Ｃ】
0006692835.tif 000007
【０１１３】
【表１Ｄ】
0006692835.tif 000008
【０１１４】
プラスミドDNAエレクトロポレーション方法(Cell Line Nucleofector(登録商標) Kit V (Lonza社))により、その使用説明書に従って、インフルエンザウイルスのゲノム非修飾断片をコードする7つのプラスミドとキメラNSゲノム断片の変異体の1つとをベロ細胞にトランスフェクトすることによって、組換えウイルスを構築した。トランスフェクション後、ヘマグルチニン前駆体のHA1及びHA2サブユニットへの翻訳後切断を確実にするために、1μg/mlのトリプシンを添加したOptipro培地(Invitrogen社)において96時間、34℃で細胞をインキュベートした。ベロ細胞からのウイルス採取物を使用して、10日齢ニワトリ胚(SPF)を感染させた。胚を48時間、34℃で保温し、その後、赤血球凝集反応で陽性力価を有する尿膜腔液をニワトリ胚での第2継代に使用した。第2継代の尿膜腔液を小分けし、-80℃で保存した。その第2継代の材料を使用して、RT-PCR産物の生成及びそのシーケンシングにより、キメラNS断片の遺伝子構造、及び導入遺伝子の存在を制御した。加えて、第2継代の材料を使用して、組換えウイルス株及びベクターの表現型マーカーを決定し、ニワトリ胚において5継代にわたって導入遺伝子の遺伝的安定性を判定した。
【０１１５】
(実施例2)
異種Nep保有組換えウイルスの温度感受性表現型及び弱毒化の判定
96ウェルプレートにおける34℃の至適温度及び39℃の上昇温度でのウイルスの感染性の比較力価測定によって、ウイルスの温度感受性を判定した。ウイルス力価は、プレートウェルにおける細胞変性作用の発生を考慮に入れて、96時間のインキュベーション後にReed-Muench方法によって計数した(Reed, LJ、Muench, H、(1938)、「The A simple method of estimating fifty percent endpoints」、The American Journal of Hygiene 27: 493〜497頁)。図4Aは、50%組織細胞変性用量(Log TCD50/ml)で表した、これらの温度でのウイルス力価を示す。A/シンガポール/1/57 (H2N2)又はA/レニングラード/134/47/57 (H2N2)株からの異種Nepを保有する両方のウイルスが、驚くべきことに、34℃の至適温度と比較して、39℃で感染力価の4 logより大きい有意な減少を示した。対照株-野生型A/PR/8/34 (H1N1)ウイルス、及び短縮されたNS1タンパク質と異種Nepタンパク質とを有する組換えNS124/Nep PR8ウイルスは、温度感受性を示さず、高温で有効に複製した。このように、Nepの置換は、ウイルスにおいてts表現型を出現させる結果となった。
【０１１６】
更に、軽度麻酔下のマウスを6 log/マウスの用量の前記ウイルスにより鼻腔内感染させたとき、ウイルス-異種Nep遺伝子の担体-は、肺組織において野生型ウイルス、又は同種Nepを有するNS124/Nep PR8ウイルスと比較して、低減された増殖能力を有した(p <0.002)(図4B)。肺におけるウイルス力価を、前記動物の感染2日後に清澄化肺ホモジネートのベロ細胞に関する力価測定により評価した。肺の力価をlog TCD50/g  肺組織で表した。このように、キメラNSゲノム断片のインフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)株への導入は、このウイルスの弱毒化をもたらし、それが動物の下気道におけるその増殖能力の減少で明示された。
【０１１７】
(実施例3)
キメラNSゲノム断片を保有し且つNS1タンパク質のリーディングフレーム内への様々なインサートを保有するベクターのts表現型及び弱毒化の判定
異なる性質のインサートをコードするベクターの広範なセットを生成して、キメラNep遺伝子を含むウイルスのts表現型に対する、NS1タンパク質のリーディングフレーム内への外来配列の挿入の効果を判定した。図3に示されているインサートを有するウイルスを研究した。保温の48時間後に収集した尿膜腔液の赤血球凝集活性を測定することによる、10日齢ニワトリ胚(ChE)における34及び39℃の温度でのウイルス感染性の力価測定によって、ts表現型を研究した。力価をReed-Muenchによって算出し、50%胚感染用量の対数(log EID50/ml)で表した。Table 2(表2)に提示するデータから分かるように、全てのベクターは、野生型A/PR/8/34 (H1N1)ウイルスとは対照的に、高温で有意に低減された増殖能力を有し、ts表現型マーカーの点では、異種Nepを保有するがインサートを有さない原型キメラ株に対応した。
【０１１８】
【表２】
0006692835.tif 000009
【０１１９】
動物に対するベクター株の弱毒化(att)に対してのインサートの効果を判定するために、軽度麻酔下のマウスを、図3に表示されているウイルス又はベクターに感染したニワトリ胚のウイルス含有尿膜腔液に鼻腔内曝露した。尿膜腔液は、含有するウイルス関連力価レベルにより事前に特性解析した。その力価をlog EID50/mlで表した。マウスに0.05mlの各ウイルス試料を注射した。各マウス群は、動物8匹を含んだ。ウイルスの致死活性を12日間評価した。3.2 log EID50/mlの力価を有する材料を使用したときに50%致死効果をもたらした野生型A/PR/8/34 (H1N1)ウイルスとは異なり、いずれのベクターも、7.5 logを超える感染用量でマウスにおいて50%致死活性を示さないことが判明した。このように、キメラNSゲノム断片を保有する全てのベクターは、インサートにかかわらず、マウスに対して高度に弱毒化された(Table 3(表3))。
【０１２０】
【表３】
0006692835.tif 000010
【０１２１】
(実施例4)
マウスの対照感染におけるA型及びB型インフルエンザウイルスの異種株に対する保護応答
インフルエンザウイルスの異種抗原変異体に対する保護活性を、A/レニングラード/134/47/57 (H2N2)ウイルスからのNep配列を有するキメラNSゲノム断片を保有するA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスからの表面抗原を有するウイルスを使用することによって判定した。NS1リーディングフレーム内にヘマグルチニンHA2サブユニット領域をコードする、次の組換えウイルスを使用した: 1) 185アミノ酸残基の完全長A型インフルエンザウイルスHA2外部ドメインを発現するベクターNS124-HA2(A)-185(図3、配列番号5)、2) 186アミノ酸残基の完全長B型インフルエンザウイルスHA2外部ドメインを発現するベクターNS124-HA2(A)-185(図3、配列番号8)、3) A型インフルエンザウイルスNPタンパク質からの保存B細胞エピトープの配列との組合せでHA2のN末端21アミノ酸残基からなる配列(融合ドメイン)を発現するベクターNS124-Fus(A)-NP(図3、配列番号9)、及び4) NSゲノム断片のヌクレオチド配列の399位に、NS1タンパク質の翻訳を124アミノ酸残基に制限する終止コドンカセットを有するNS124/Nep-Lenウイルス(図3、配列番号4)。対照群は、遺伝子修飾を有さない野生型A/PR/8/34 (H1N1)ウイルスに感染させたマウス、又は活性成分を含有しないリン酸緩衝溶液を投与したマウスを含んだ。軽度麻酔下のマウスの鼻腔内に6.5 log/マウスの単回ウイルス用量で免疫を付与した。28日後、マウスに対して病原性の異種インフルエンザ株: A/ミシシッピー/85/1(H3N2)又はВ/Lee/40を3〜5 LD50に相当する用量でそれぞれ用いる対照感染に、それらの動物を供した。
【０１２２】
図5Aから分かるように、非免疫マウスのウイルス(H3N2)による対照感染は、80%のケースでそれらを死亡させる結果となった。その一方で、ウイルス製剤で免疫を付与したマウスは、異種A型(H3N2亜型)インフルエンザウイルス株による感染によって引き起こされる死亡から完全に保護された。野生型ウイルスでの免疫付与もまた、異種株による感染からの統計的に有意な保護レベルをもたらした。インフルエンザB/Lee/40ウイルスを使用することにより対照感染を行ったとき、野生型A/PR/8/34 (H1N1)ウイルスでのマウスへの免疫付与は、動物を死亡から保護せず、免疫付与の際にリン酸緩衝溶液を受けたマウスも死亡から保護されなかった(図5B)。NS1タンパク質のリーディングフレーム内にインサートを保有する組換えウイルスはB型インフルエンザウイルスから保護することが、驚くべきことに判明した。ベクターNS124-Fus(A)-NPは、最高保護レベルを示した。このように、マウスに対する単回鼻腔内免疫において、キメラNSゲノム断片を保有するベクター株は、A型インフルエンザウイルスとB型インフルエンザウイルスの両方の異種抗原亜型に対して有効な万能インフルエンザワクチンの特性を示した。
【０１２３】
(実施例5)
B型インフルエンザウイルスHA2領域の配列をコードする修飾NSゲノム断片とH1N1pdmウイルス表面糖タンパク質とを有するインフルエンザベクターの生成
組換えウイルスを数工程で構築した。第1工程で、インフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスの5つのゲノム断片(PB2、PB1、PA、NP、M)(PB2 (Genbank受託番号AB671295)、PB1 (Genbank受託番号CY033583)、PA (Genbank受託番号AF389117)、NP (Genbank受託番号AF389119)、M (Genbank受託番号AF389121))及びA/カリフォルニア/7/09様ウイルスの2つのゲノム断片(HA、NA)(HA (GenBank: KM408964.1)及び(NA GenBank: KM408965.1))の相補DNA (cDNA)コピーを生成し、H1N1ウイルス(NS1遺伝子)に関連する配列と、H2N2ウイルス(Nep遺伝子)に関連する配列と、B型インフルエンザウイルスHA2領域及びA型インフルエンザウイルスNP領域からの2つのペプチドの配列とで構成されているキメラNSゲノム断片を合成した。
【０１２４】
第2の工程では、それらの合成した配列を二方向プラスミドpHW2000に基づくベクター(Hoffmann E、Neumann G、Kawaoka Y、Hobom G、Webster RG、A DNA from eight plasmids、Proc Natl Acad Sci USA、2000; 97 (11):6108〜13頁)にクローニングした。このプラスミドベクターは、pol I及びpol IIプロモーターの存在のため、哺乳動物細胞にトランスフェクトし次第、ウイルスRNAと対応するメッセンジャーRNAの同時細胞内転写をもたらす。図7は、インフルエンザウイルスの遺伝子図を示す。図8は、ワクチンベクターの8つ全てのゲノム断片のヌクレオチド配列を示す。
【０１２５】
ゲノムPB2のヌクレオチド配列
【０１２６】
【化３Ａ】
0006692835.tif 000011
【０１２７】
【化３Ｂ】
0006692835.tif 000012
【０１２８】
【化３Ｃ】
0006692835.tif 000013
【０１２９】
ゲノムPB1のヌクレオチド配列
【０１３０】
【化４Ａ】
0006692835.tif 000014
【０１３１】
【化４Ｂ】
0006692835.tif 000015
【０１３２】
【化４Ｃ】
0006692835.tif 000016
【０１３３】
ゲノムPAのヌクレオチド配列
【０１３４】
【化５Ａ】
0006692835.tif 000017
【０１３５】
【化５Ｂ】
0006692835.tif 000018
【０１３６】
【化５Ｃ】
0006692835.tif 000019
【０１３７】
ゲノムNPのヌクレオチド配列
【０１３８】
【化６Ａ】
0006692835.tif 000020
【０１３９】
【化６Ｂ】
0006692835.tif 000021
【０１４０】
ゲノムMのヌクレオチド配列
【０１４１】
【化７Ａ】
0006692835.tif 000022
【０１４２】
【化７Ｂ】
0006692835.tif 000023
【０１４３】
ゲノムHAのヌクレオチド配列
【０１４４】
【化８Ａ】
0006692835.tif 000024
【０１４５】
【化８Ｂ】
0006692835.tif 000025
【０１４６】
ゲノムNAのヌクレオチド配列
【０１４７】
【化９Ａ】
0006692835.tif 000026
【０１４８】
【化９Ｂ】
0006692835.tif 000027
【０１４９】
キメラNS断片遺伝子のヌクレオチド配列(インサートを太字で示す)
【０１５０】
【化１０】
0006692835.tif 000028
【０１５１】
プラスミドDNAエレクトロポレーション方法(Cell Line Nucleofector(登録商標) Kit V (Lonza社))により、その使用説明書に従って、インフルエンザウイルスのゲノム非修飾断片をコードする8つのプラスミドと、キメラNSゲノム断片とを、ベロ細胞にトランスフェクトすることによって、組換えウイルスを構築した。トランスフェクション後、ヘマグルチニン前駆体のHA1及びHA2サブユニットへの翻訳後切断を確実にするために、1μg/mlのトリプシンを添加したOptipro培地(Invitrogen社)において96時間、34℃で細胞をインキュベートした。ベロ細胞からのウイルス採取物を使用して、10日齢ニワトリ胚(SPF)を感染させた。胚を48時間、34℃で保温し、その後、赤血球凝集反応で陽性力価を有する尿膜腔液をニワトリ胚で次の継代に使用した。第7継代の尿膜腔液をタンジェンシャルフロー濾過で精製し、保存のために凍結乾燥した。同体積の蒸留水での凍結乾燥物の溶解後、動物に免疫を付与した。
【０１５２】
(実施例6)
マウスの対照感染におけるA型及びB型インフルエンザウイルスの異種株に対する保護応答
50μlの体積の6.8 log EID50/マウスの用量のインフルエンザベクターで、3週間に1回又は2回、軽度麻酔下のマウスの鼻腔内に免疫を付与することによって、インフルエンザウイルスの異種抗原変異体に対する保護活性を判定した。最終免疫付与の21日後、マウスに対して病原性の異種インフルエンザ株:同種А/カリフォルニア/7/09 (H1N1pdm)又は異種A/アイチ/2/68 (H3N2)、A/ミシシッピー/85/1(H3N2)又はインフルエンザB/Lee/40ウイルスを3〜5 LD50に相当する用量でそれぞれ用いる対照感染に動物を供した。
【０１５３】
図9Aから分かるように、非免疫マウスのH1N1pdmウイルスによる対照感染は、90%のケースでそれらを死亡させる結果となった。しかし、ウイルス製剤で1回又は2回、免疫を付与したマウスは、死亡から確実に保護された。
【０１５４】
図9Bから分かるように、非免疫マウスのA/アイチ/2/68 (H3N2)ウイルスによる対照感染は、100%のケースでそれらを死亡させる結果となった。しかし、ウイルス製剤で1回又は2回、免疫を付与したマウスは、死亡から確実に保護された。
【０１５５】
図9Cから分かるように、非免疫マウスのA/ミシシッピー/85/1(H3N2)ウイルスによる対照感染は、100%のケースでそれらを死亡させる結果となった。しかし、ウイルス製剤で2回免役を付与したマウスは、100%保護された。
【０１５６】
図9Dから分かるように、非免疫マウスのB/Lee/40インフルエンザウイルスによる対照感染は、100%のケースでそれらを死亡させる結果となった。しかし、ウイルス製剤で2回免役を付与したマウスは、対照とは有意に異なり60%保護された。
【０１５７】
このように、キメラNSゲノム断片を保有するインフルエンザベクターは、A型インフルエンザウイルスとB型インフルエンザウイルスの両方の異種抗原亜型に対して有効な万能インフルエンザワクチンの特性を示した。
【０１５８】
(実施例7)
フェレットの対照感染における異種A型(H3N2亜型)インフルエンザ株に対する保護応答
フェレットは、WHOによりインフルエンザワクチン及び薬の有効性の研究に推奨されている最適なモデルである。7.5 log EID50/フェレットの用量の実施例5で生成したインフルエンザベクターを用いて軽度麻酔下で3週間に1回又は2回、500μlの体積で鼻腔内投与することによりフェレット(1群当り動物9匹)に免疫を付与することによって、インフルエンザウイルスの異種抗原変異体に対する保護活性を判定した。最終免疫付与の21日後、フェレットに対して病原性のA/サンクトペテルブルク/224/2015 (H3N2)ウイルスによる対照感染に動物を供した。図10Aに示されているように、非免疫動物の対照感染は、感染後2日目に体温を上昇させる結果となったが、ワクチン接種を受けた動物には温度応答がなかった。
【０１５９】
2、4及び6日目に動物から採取した鼻洗浄液を使用して、MDCK細胞培養での50%細胞変性用量の力価測定により感染性ウイルスの濃度を決定することによって、フェレットの気道における対照ウイルスの増殖に対するワクチン接種の効果を研究した。図10Bから分かるように、非免疫フェレットの対照感染は、6日目まで力価の有意な低下がなく、ウイルスの能動的増殖をもたらした。フェレットへの単回免疫付与の場合、曝露後4及び6日目にウイルス力価の有意な低減が観察された。二重免疫付与後には、100分の1より低くなるウイルス力価の有意な減少が、既に動物の感染後2日目に記録された。
【０１６０】
このように、インフルエンザベクターによるフェレットへの単回ワクチン接種でさえ、温度反応の形での臨床症状発現から動物を保護する結果となり、気道からの対照異種株の除去加速を助長した。反復免疫付与は、ウイルス除去過程を加速した。
【０１６１】
(実施例8)
マイコバクテリアタンパク質Esat6をコードするインフルエンザベクターの腫瘍溶解効果
異種Nep遺伝子を有するキメラNSゲノム断片を保有する弱毒化インフルエンザベクターの腫瘍溶解能を、右後足の皮下腔への30μlの体積の106個のB16細胞の投与により誘導したマウス黒色腫をウイルスで処置することによって判定した。各群は、動物10匹を含んだ。治療は、腫瘍細胞投与後5日目に、腫瘍増殖ゾーンに直接30μlのウイルス製剤又はリン酸緩衝溶液を注射することによって行った。注射を3日ごとに4回行い、その後、罹患した足の体積の増加率及び動物の生存率を85日間評価した。2000mm3に達する腫瘍を有する動物は、倫理的理由から安楽死させ、死亡と見なした。
【０１６２】
インフルエンザNS124-2A-Esat6ウイルス(図3、配列番号12)の短縮されたNS1タンパク質のC末端領域からのタンパク質Esat-6の2A媒介翻訳後切断をもたらす設計の、マイコバクテリア抗原Esat6を発現するベクターを用いて、黒色腫を処置した。対照治療剤は、マイコバクテリアタンパク質のインサートを含有しないNS124/Nep-Lenウイルスであった。
【０１６３】
図6Aは、腫瘍細胞の投与後19日目の足体積の測定結果を示す。驚くべきことに、タンパク質Esat6を発現するベクターでの治療を受けたマウスにおけるほうが平均足体積が小さいことが判明した。この結果は、85日からなる長い観察期間にわたってマウスの生存率と相関することが判明した(図6B)。NS124-2A-Esat6群の動物10匹からの3匹は、腫瘍増殖の寛解期にあることが判明したが、他の群の動物は、60日目までに死亡した。このように、得られたデータは、細菌抗原をコードする腫瘍溶解性ベクターの利点を実証する。
【０１６４】
(実施例10)
鼻腔内免疫付与用のインフルエンザウイルスに基づくワクチンの製剤化
6.5〜8.5 log 50%胚感染用量(EID50)/mlの量の実施例1又は5で生成したインフルエンザベクターと、0.9重量%  塩化物溶液、0.5重量% L-カルノシン、2.5重量%  スクロース、1重量%  組換えアルブミン、1重量% L-アルギニン及び3重量%  ヒドロキシエチルデンプン130/0.4 (分子量は130kDaであり、モル置換度は0.4である)を含有する緩衝安定化溶液とを含有するワクチン。
【０１６５】
(実施例11)
鼻腔内免疫付与用のインフルエンザウイルスに基づくワクチンの製剤
6.5〜8.5 log 50%胚感染用量(EID50)/mlの量の実施例1又は5で生成したインフルエンザベクターと、0.9重量%  塩化物溶液、0.1重量% L-カルノシン、2.5重量%  スクロース、1重量%  組換えアルブミン、1重量% L-アルギニン及び3重量%  ヒドロキシエチルデンプン130/0.4 (分子量は130kDaであり、モル置換度は0.4である)を含有する緩衝安定化溶液とを含有するワクチン。
【０１６６】
(実施例12)
腫瘍溶解を目的としたインフルエンザウイルスに基づくワクチンの製剤
6.5〜10.5 log 50%胚感染用量(EID50)/mlの量の実施例1又は5で生成したインフルエンザベクターと、1.35重量%  塩化物溶液、0.5重量% L-カルノシン、1重量%  組換えアルブミン、1重量% L-アルギニン及び3重量%  ヒドロキシエチルデンプン130/0.4 (分子量は130kDaであり、モル置換度は0.4である)を含有する緩衝安定化溶液とを含有するワクチン。
【図１】
0006692835.tif 000029
【図２】
0006692835.tif 000030
【図３】
0006692835.tif 000031
【図４】
0006692835.tif 000032
【図５】
0006692835.tif 000033
【図６】
0006692835.tif 000034
【図７】
0006692835.tif 000035
【図８Ａ】
0006692835.tif 000036
【図８Ｂ】
0006692835.tif 000037
【図８Ｃ】
0006692835.tif 000038
【図８Ｄ】
0006692835.tif 000039
【図９Ａ】
0006692835.tif 000040
【図９Ｂ】
0006692835.tif 000041
【図１０】
0006692835.tif 000042
【配列表】
0006692835000001.app