(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソロイシン、ロイシンおよびバリンを有効成分として含有する、緑内障、網膜色素変性または加齢黄斑変性の処置および／または予防剤であって、イソロイシン、ロイシンおよびバリンの重量比が、１：１.５〜２.５：０.８〜１.７である、緑内障、網膜色素変性または加齢黄斑変性の処置および／または予防剤。
【請求項２】
イソロイシン、ロイシンおよびバリンの重量比が、１：１.９〜２.２：１.１〜１.３である、請求項１に記載の緑内障、網膜色素変性または加齢黄斑変性の処置および／または予防剤。
【請求項３】
イソロイシン、ロイシンおよびバリンの重量比が、１：２：１.２である、請求項１または請求項２に記載の緑内障、網膜色素変性または加齢黄斑変性の処置および／または予防剤。
【請求項４】
イソロイシン、ロイシンおよびバリンを有効成分として含有する、緑内障、網膜色素変性または加齢黄斑変性のリスクの低減、または、視機能の維持もしくは改善用の食品であって、イソロイシン、ロイシンおよびバリンの重量比が、１：１.５〜２.５：０.８〜１.７である、食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、日本国特許出願第２０１５−０２４４３９号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
【０００２】
本発明は、有効成分としての分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）を含む眼疾患の処置および／または予防剤を提供する。本発明は、また、ＢＣＡＡを有効成分として含む網膜の細胞の変性および／または細胞死の抑制剤を提供する。本発明は、さらに、ＢＣＡＡを有効成分として含む視機能低下の抑制剤を提供する。本発明は、さらに、ＢＣＡＡを有効成分として含む、眼疾患のリスクの低減、または、視機能の維持もしくは改善用の食品を提供する。
【背景技術】
【０００３】
緑内障は、網膜神経節細胞の変性または脱落による視野欠損を特徴とし、積極的な治療が行われなければ失明すら引き起こし得る疾患である。日本国における有病率は４０歳以上の５％であり、２００５年には中途失明の最多原因であった（２４.６％）。緑内障の病因として高眼圧が挙げられるが、高眼圧を伴わない緑内障、すなわち正常眼圧緑内障の患者数は、例えば日本国において、全緑内障患者の６割に上る。現在の緑内障の処置方法は、薬物投与であれ外科手術であれ、眼圧を低下させることによる。正常眼圧緑内障患者の眼圧を低下させることによって緑内障の進行が停止または遅延することがあるが、眼圧を降下させても緑内障の進行が十分遅延しないか、あるいは全く遅延しない患者も存在する。またそもそも正常眼圧緑内障患者の眼圧は正常であるから、眼圧降下ができないか、あるいは十分ではないこともある。また、高眼圧を伴う緑内障であっても、眼圧降下療法によって緑内障の進行が十分に遅延しない場合や眼圧降下が困難な場合もある。
【０００４】
網膜色素変性は、視細胞の変性または脱落による視野欠損および夜盲を特徴とする進行性の疾患である。約半分の症例において網膜色素変性は遺伝性であるが、残り半分は孤発性である。現在、遺伝子治療、神経保護治療および再生医療による治療が試みられているが、網膜色素変性の治療方法は十分に確立されておらず、予防方法は存在しない。従って、患者の視野欠損および視力低下の進行を防止する方法はなく、多くの場合失明に至る。患者数は日本国で推定５万人であり、２００５年に中途失明の第３番目の原因であった。
【０００５】
加齢黄斑変性は、中心が見えにくい、ゆがむなどの症状を伴う眼疾患であり、先進国では高齢者の失明原因の上位を占める。米国では、２０００年に８０歳以上の高齢者の約１５％が加齢黄斑変性に罹患している。日本国においても、高齢化、食文化の欧米化に伴い、加齢黄斑変性患者は近年増加しており、中途失明の第４番目の原因となっている（２００５年）。
【０００６】
加齢黄斑変性では、主として脂質で構成される老廃物であるドルーゼンが網膜色素上皮下に蓄積される。その後、滲出型加齢黄斑変性では、脈絡膜下新生血管が形成され、網膜下出血・網膜浮腫などによる視力低下が起こる。現状では、有効な治療方法として、形成された新生血管に対する血管退縮治療（抗ＶＥＧＦ剤の硝子体内投与、光線力学療法）や、新生血管からの漏出などを抑制するステロイド治療が用いられているが、一度新生血管が形成されると、このような治療を行っても視力予後は不良である。良好な視力を保つためには、ドルーゼン形成期に進行抑制治療を行うことが重要であるが、現在のところ、そのような治療方法はない。また、萎縮型加齢黄斑変性では、ドルーゼン蓄積の後、新生血管形成を伴わずに、徐々に網脈絡膜が萎縮し、視力低下が起こる。萎縮型加齢黄斑変性に対しては、現在のところ有効な治療方法はない。滲出型加齢黄斑変性から萎縮性加齢黄斑変性に移行することもある。
【０００７】
分岐鎖アミノ酸は必須アミノ酸として人体に不可欠な栄養素であるため、合成化合物と比較して極めて安全性が高い。これまでに、分岐鎖アミノ酸を、肝癌発生・進展抑制剤、非代償性肝硬変患者の低アルブミン血症の改善薬などとして用いることは知られていた。しかしながら、緑内障、網膜色素変性および加齢黄斑変性を含む眼疾患の処置または予防に使用することは報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０４３８９１号
【特許文献２】国際公開第２０１２／１４７９０１号
【特許文献３】国際公開第２０１４／１２９４９５号
【特許文献４】特許第４４１９３９０号公報
【特許文献５】特許第５０６７１６０号公報
【特許文献６】特許第５０７４６６１号公報
【特許文献７】特許第５５１６６５４号公報
【特許文献８】特許第５５５５４０１号公報
【特許文献９】特表２０１３−５２７２２２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、眼疾患の処置および／または予防剤を提供することである。本発明の目的は、また、網膜の細胞の変性および／または細胞死の抑制剤を提供することである。本発明の目的は、さらに、視機能低下の抑制剤を提供することである。本発明の目的は、さらに、眼疾患のリスクの低減、または、視機能の維持もしくは改善用の食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究した結果、分岐鎖アミノ酸が、緑内障、網膜色素変性および加齢黄斑変性のモデルにおいて治療および予防効果を示すことを見出した。また、分岐鎖アミノ酸が、視細胞、網膜色素上皮細胞および網膜神経節細胞を含む網膜の細胞を保護し、その変性および／または細胞死を抑制し、視機能の低下を抑制することを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、眼疾患の処置および／または予防剤を提供する。
【００１２】
本発明は、また、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、網膜の細胞の変性および／または細胞死の抑制剤を提供する。
【００１３】
本発明は、また、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、視機能低下の抑制剤を提供する。
【００１４】
本発明は、また、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、眼疾患のリスクの低減、または、視機能の維持もしくは改善用の食品を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の薬剤は、網膜の細胞の変性および／または細胞死を抑制し、視機能の低下を抑制する。そのため、本発明は、網膜の細胞の変性および／または細胞死に起因する疾患に、新たな処置および／または予防方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、１３か月齢および１９か月齢の網膜色素変性モデルマウスｒｄ１２の全層網膜厚測定の結果を示す。
【図２】図２は、１３か月齢および１９か月齢の網膜色素変性モデルマウスｒｄ１２の視細胞層厚測定の結果を示す。
【図３】図３は、１９か月齢の網膜色素変性モデルマウスｒｄ１２の明順応網膜電図検査の結果を示す。
【図４】図４は、１９か月齢の網膜色素変性モデルマウスｒｄ１２の網膜組織染色および細胞数計測の結果を示す。
【図５】図５は、１９か月齢の網膜色素変性モデルマウスｒｄ１２の網膜外組織および網膜の、抗ＣＨＯＰ抗体および抗切断型カスパーゼ−３抗体によるウェスタンブロットの結果を示す。
【図６】図６は、１２か月齢の正常眼圧緑内障モデルマウスの網膜フラットマウントにより計測した、網膜神経節細胞の数を示す。
【図７】図７は、１８か月齢の正常眼圧緑内障モデルマウスの視神経乳頭径を示す。
【図８】図８は、９か月齢および１５か月齢の加齢黄斑変性モデルマウスの代表的な眼底写真である。
【図９】図９は、加齢黄斑変性モデルマウスにおけるドルーゼン数の増減経過を示す。
【図１０】図１０は、１５か月齢の加齢黄斑変性モデルマウスの暗順応網膜電図検査の結果を示す。
【図１１】図１１は、１５か月齢の加齢黄斑変性モデルマウスの網膜組織ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色写真である。
【図１２】図１２は、１５か月齢の加齢黄斑変性モデルマウスの網膜電子顕微鏡写真である。
【図１３】図１３は、９か月齢の加齢黄斑変性モデルマウスの暗順応網膜電図検査の結果を示す。
【図１４】図１４は、３７日齢の網膜色素変性モデルマウスｒｄ１０の全層網膜厚測定の結果を示す。
【図１５】図１５は、３７日齢の網膜色素変性モデルマウスｒｄ１０の視細胞層厚測定の結果を示す。
【図１６】図１６は、３７日齢の網膜色素変性モデルマウスｒｄ１０の代表的な光干渉断層計像を示す。
【図１７】図１７は、２４日齢の網膜色素変性モデルマウスｒｄ１０の暗順応網膜電図検査の結果を示す。
【図１８】図１８は、３０日齢の網膜色素変性モデルマウスｒｄ１０の明順応網膜電図検査の結果を示す。
【図１９】図１９は、３０日齢の網膜色素変性モデルマウスｒｄ１０の代表的な明順応網膜電図検査の波形を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする眼疾患の処置および／または予防剤（本明細書中、「本発明の薬剤」と称することもある）を提供する。
【００１８】
本発明の薬剤の有効成分であるイソロイシン、ロイシンおよび／またはバリンは、それぞれＬ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体のいずれも使用することができるが、好ましくは、Ｌ−体、ＤＬ−体であり、さらに好ましくは、Ｌ−体である。
【００１９】
また、本発明におけるイソロイシン、ロイシンおよび／またはバリンは、それぞれ遊離体だけでなく塩の形態でも使用することができる。本発明におけるイソロイシン、ロイシンおよび／またはバリンは、かかる塩の形態をも包含する。塩の形態としては、酸との塩（酸付加塩）、塩基との塩（塩基付加塩）等を挙げることができるが、医薬として許容される塩を選択することが好ましい。
【００２０】
イソロイシン、ロイシンおよび／またはバリンに付加し、かつ医薬として許容される酸付加塩を形成する酸としては、例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸等の無機酸；酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、モノメチル硫酸等の有機酸が挙げられる。
【００２１】
イソロイシン、ロイシンおよび／またはバリンに付加し、かつ医薬として許容される塩基付加塩を形成する塩基としては、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム等の金属の水酸化物または炭酸化物、あるいはアンモニア等の無機塩基；エチレンジアミン、プロピレンジアミン、プロピレンジアミン、エタノールアミン、モノアルキルエタノールアミン、ジアルキルエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機塩基が挙げられる。
【００２２】
本発明の薬剤は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンの３種の分岐鎖アミノ酸からなる群から選択される少なくとも１種（即ち、１種（イソロイシン、ロイシンまたはバリン）、２種（イソロイシンおよびロイシン、イソロイシンおよびバリン、またはロイシンおよびバリン）または３種（イソロイシン、ロイシンおよびバリン））を有効成分として含有する。本発明の薬剤は、少なくともイソロイシンを有効成分として含有することが好ましい（即ち、イソロイシン、ロイシンおよびバリンの３種、イソロイシンおよびロイシンの２種、イソロイシンおよびバリンの２種、またはイソロイシンのみを有効成分として含有する）。本発明の薬剤は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンの３種を有効成分として含有するか、或いはイソロイシンのみを有効成分として含有する（即ちイソロイシンを有効成分として含有し、且つロイシンおよびバリンを有効成分として含有しない）ことがより好ましい。本発明の薬剤は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンの３種を有効成分として含有するのが最も好ましい。本発明の薬剤は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンの３種の分岐鎖アミノ酸からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する医薬組成物であり得る。
【００２３】
本発明の薬剤がイソロイシン、ロイシンおよびバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分として含有する場合、かかる３種のアミノ酸の配合比は、それぞれ重量比で、通常、１：１.５〜２.５：０.８〜１.７の範囲であり、特に好ましくは１：１.９〜２.２：１.１〜１.３の範囲であり、最も好ましくは１：２：１.２である。
【００２４】
本発明の薬剤がイソロイシンおよびロイシン、イソロイシンおよびバリン、またはロイシンおよびバリンの２種の分岐鎖アミノ酸を有効成分として含有する場合、かかる２種のアミノ酸の配合比は、上記３種のアミノ酸の配合比における当該２種のアミノ酸の配合比とすればよい。
【００２５】
また本発明の薬剤がイソロイシンのみ、ロイシンのみ、またはバリンのみを有効成分として含有する場合、その配合量を後述する投与量に基づいて決定して製剤化することができる。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、「予防する」または「予防」は、対象において、特に、眼疾患に罹る可能性が高いが、未だ罹患していない対象において、眼疾患への罹患を防止すること、または、眼疾患に罹る可能性を低減することを意味する。眼疾患に罹る可能性があるが、未だ罹患していない対象には、例えば、自覚症状はないが網膜に異常が認められる対象、および、網膜に損傷を受けた可能性がある対象が含まれる。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、「処置する」または「処置」は、眼疾患に罹患している対象において、眼疾患の原因を軽減または除去すること、眼疾患の進行を遅延または停止させること、および／または、眼疾患の症状を軽減、緩和、改善または除去することを意味する。
【００２８】
本発明の薬剤により処置および／または予防される眼疾患には、網膜の細胞の変性および／または細胞死に起因または関連するすべての眼疾患が含まれ、例えば、緑内障、網膜色素変性、加齢黄斑変性が含まれる。緑内障には、正常眼圧緑内障および眼圧降下療法に不応性の緑内障が含まれる。加齢黄斑変性には、滲出型加齢黄斑変性および萎縮型加齢黄斑変性が含まれる。
【００２９】
正常人の眼圧は１０〜２１ｍｍＨｇであるが、眼圧が何らかの原因によりこの範囲以上、典型的には２５ｍｍＨｇ以上に上昇することによって網膜神経節細胞が変性または脱落して、緑内障を発症すると考えられてきた。しかし近年、眼圧が正常値（１０〜２１ｍｍＨｇ）であるにも拘わらず緑内障を発症する症例が非常に多くみられ、そのような患者には眼圧降下療法が適用できないか、有効ではないか、あるいは不十分である場合がある。また高眼圧を伴う緑内障患者であっても、眼圧降下療法が有効ではないか、あるいは不十分である場合もある。本発明の薬剤は、眼圧に非依存的に網膜神経節細胞の変性または脱落を抑制することができるので、正常眼圧緑内障および眼圧降下療法に不応性の緑内障の処置にも有用である。緑内障の予防における対象には、視野検査で異常が認められる対象、および、視神経乳頭陥凹拡大、神経線維層および／または神経節細胞層の菲薄化が認められる対象が含まれる。
【００３０】
本発明の薬剤は眼圧に非依存的に緑内障を処置し得るが、このことは本発明の薬剤と眼圧降下療法の併用を除外することを意図するわけではない。本発明の薬剤と併用することができる眼圧降下療法には、緑内障または高眼圧症の処置用薬物または眼圧降下剤の投与、レーザー手術または外科手術等が含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
網膜色素変性は、神経細胞の一種である視細胞、特に杆体細胞の細胞死によって引き起こされる疾患である。視細胞で働く遺伝子の異常により、視細胞が変性脱落することにより引き起こされる。網膜色素変性は遺伝性であり、常染色体優性遺伝、常染色体劣性遺伝、Ｘ染色体劣性遺伝により遺伝する。約５０種の原因となる遺伝子の変異が知られている。本発明の薬剤は、原因遺伝子の種類に拘わらず、また、その原因遺伝子が明らかであるかどうかに拘わらず、網膜色素変性を処置および／または予防し得る。網膜色素変性の予防における対象には、網膜色素変性の原因となる遺伝子変異を有する対象、および、原因遺伝子が明らかであるかどうかに拘わらず、遺伝学的に網膜色素変性の発症が予想される対象が含まれる。
【００３２】
加齢黄斑変性は滲出型と萎縮型に分けられる。滲出型は黄斑部の網膜色素上皮細胞−ブルッフ膜−脈絡膜の変化により発生する脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization：ＣＮＶ）とその増殖変化を本態とする疾患である。ＣＮＶは網膜色素上皮下、ついで網膜下に発育する。出血、滲出による網膜色素上皮剥離、網膜剥離を呈し、それらが吸収された後には萎縮・瘢痕が形成され、高度の永続する視力低下を生じ、その進行は速い。萎縮型では黄斑部に網膜色素上皮−脈絡毛細血管板の地図状萎縮病巣が形成されるが、進行は緩慢である。
【００３３】
網膜色素上皮細胞は視細胞の外節の貪食機能を始め神経網膜の環境を保持する上で重要な役割を果たしているが、加齢性の変化として、消化残渣物としてのリポフスチンの蓄積が起こり、ドルーゼンと呼ばれる異常な構造が形成される。また、加齢とともに色素上皮下のブルッフ膜の肥厚が起こり、視細胞−網膜色素上皮−ブルッフ膜間の生理的環境に変化が生じる。こうした変化によって起こった慢性炎症や虚血が脈絡膜からの新生血管の原因になると考えられており、新生血管の発生・発育に最も大きな作用を及ぼす生理活性物質として、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が挙げられる。ＣＮＶはブルッフ膜の破損部から網膜色素上皮下、網膜下、場合により網膜内へと進展してくる。
【００３４】
現在のところ、萎縮型加齢黄斑変性に対しては、有効な治療方法はない。滲出型加齢黄斑変性に対しては、有効な治療方法は、形成された新生血管に対する血管退縮治療（抗ＶＥＧＦ治療、光線力学療法）のみである。本発明の薬剤は、ドルーゼンを除去するか、あるいはドルーゼンの形成または増加を抑制することにより、血管退縮治療とは異なる作用機序で、萎縮型および滲出型の加齢性黄斑変性を処置および／または予防できる。加齢黄斑変性の予防における対象には、眼底検査でドルーゼン形成などの異常が認められる対象、片眼のみにＣＮＶまたはドルーゼン形成などの異常が認められる対象、遺伝子多型などの検査により加齢黄斑変性発症のリスクが高いと認められる対象、および、加齢黄斑変性の家族歴を有する対象が含まれる。
【００３５】
本発明の薬剤は血管退縮治療とは異なる作用機序で、萎縮型および滲出型の加齢黄斑変性を処置および／または予防し得るが、このことは本発明の薬剤と血管退縮治療、ステロイド剤、外科手術などとの併用を除外することを意図するわけではない。本発明の薬剤と併用することができる血管退縮治療には、抗ＶＥＧＦ剤の硝子体内投与、並びに、光線力学療法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬剤と併用することができる外科手術には、ＣＮＶの除去、硝子体内出血の除去、網膜下出血の移動を目的とするものが含まれる。
【００３６】
本発明の薬剤の適用対象としては、動物、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）が挙げられる。なお、ヒト以外の動物に適用する場合、本発明の薬剤の投与量は、動物の体重もしくは大きさに応じて適宜加減すればよい。
【００３７】
本発明の薬剤の投与方法は特に限定されないが、経口投与、直腸投与、注射、輸液、点眼、硝子体内注射による投与等の一般的な投与経路を経ることができる。
【００３８】
経口投与の剤形としては、顆粒剤、細粒剤、粉剤、被覆錠剤、錠剤、坐剤、散剤、（マイクロ）カプセル剤、チュアブル剤、シロップ、ジュース、液剤、懸濁剤、乳濁液などが挙げられる。また注射による投与の剤形としては、静脈直接注入用、点滴投与用、硝子体注射用、活性物質の放出を延長する製剤等などの医薬製剤一般の剤形を採用することができる。
【００３９】
これらの剤形は、常法により製剤化することによって製造される。さらに製剤上の必要に応じて、医薬的に許容し得る各種の製剤用物質を配合することができる。製剤用物質は製剤の剤形により適宜選択することができるが、例えば、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等が挙げられる。更に、製剤用物質を具体的に例示すると、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよびその他の糖類、タルク、牛乳蛋白、ゼラチン、澱粉、セルロースおよびその誘導体、動物および植物油、ポリエチレングリコール、および溶剤、例えば滅菌水および一価または多価アルコール、例えばグリセロール等を挙げることができる。
【００４０】
本発明の薬剤はまた、点眼剤の形態で投与することができる。点眼剤は、塩化ナトリウム、濃グリセリンなどの等張化剤；リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどの緩衝化剤；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤；クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム等の安定化剤；塩化ベンザルコニウム、パラベン等の防腐剤等を必要に応じて用い、製造することができる。ｐＨは眼科製剤に許容される範囲内にあればよいが、通常４〜８の範囲内である。また、眼軟膏は、白色ワセリン、流動パラフィン等の汎用される基剤を用い、製造することができる。
【００４１】
硝子体内投与用の注射剤は、塩化ナトリウム等の等張化剤；リン酸ナトリウム等の緩衝化剤；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート等の界面活性剤；メチルセルロース等の増粘剤等を必要に応じて用い、製造することができる。
【００４２】
本発明の薬剤の投与量は、対象患者の年齢、体重もしくは病態、または医薬の剤形もしくは投与方法などによっても異なるが、成人１日あたり、イソロイシン０.００５ｇ／ｋｇ体重〜５ｇ／ｋｇ体重、ロイシン０.０１ｇ／ｋｇ体重〜１０ｇ／ｋｇ体重、バリン０.００５ｇ／ｋｇ体重〜５ｇ／ｋｇ体重を目安とする。
【００４３】
一般の成人の場合、好ましくは、成人１日あたり、イソロイシン０.０１ｇ／ｋｇ体重〜１ｇ／ｋｇ体重、ロイシン０.０２ｇ／ｋｇ体重〜２ｇ／ｋｇ体重、バリン０.０１ｇ／ｋｇ体重〜１ｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは、イソロイシン０.０２ｇ／ｋｇ体重〜０.２ｇ／ｋｇ体重、ロイシン０.０４ｇ／ｋｇ体重〜０.４ｇ／ｋｇ体重、バリン０.０２ｇ／ｋｇ体重〜０.２ｇ／ｋｇ体重である。アミノ酸の全体量としては１日あたり０.０１ｇ／ｋｇ体重〜２ｇ／ｋｇ体重程度が好ましい。上記１日あたりの量は一度に、もしくは数回に分けて投与することができる。投与の時期としては特に限定されず、例えば食前、食後、食間のいずれでもよい。また、投与期間も特に限定されない。
【００４４】
なお、本発明の薬剤の有効成分である分岐鎖アミノ酸の投与量について算出する際、その値は、本発明が目的とする作用とは別目的で（例えば通常の食生活の必要から、または別の疾患の治療を目的として）摂取もしくは投与される分岐鎖アミノ酸については、前記算出に含める必要はない。例えば、通常の食生活から摂取される１日あたりの分岐鎖アミノ酸の量を、前記本発明における有効成分の１日あたりの投与量から控除する必要はない。
【００４５】
本発明の薬剤の有効成分であるイソロイシン、ロイシンおよび／またはバリンは、それぞれが単独もしくは任意の組み合わせで製剤に含有されていてもよく、または全てが１種の製剤中に含有されていてもよい。別途製剤化して投与する場合、それらの投与経路、投与剤形は同一であっても、異なっていてもよく、また各々を投与するタイミングも、同時であっても別々であってもよい。従って、投与剤形、投与時期、投与経路などは、適宜決定することができる。即ち、本発明の薬剤は、複数の分岐鎖アミノ酸を含有する製剤であってもよく、またそれぞれを別途製剤化して併用するような併用剤であってもよい。本発明の薬剤は、これら全ての形態の製剤を包含するものである。特に、同一製剤中に全ての分岐鎖アミノ酸を含有する形態が、簡便に投与できるため好ましい。
【００４６】
本発明において、「重量比」とは、製剤中のそれぞれの成分の重量の比を示す。例えば、イソロイシン、ロイシンおよびバリンの各有効成分を１つの製剤中に含めた場合には、個々の重量の比であり、各有効成分のそれぞれを単独でまたは任意の組み合わせで複数製剤中に含めた場合には、各製剤に含められる各有効成分の合計重量の比である。
【００４７】
また本発明において、実際の投与量の比は、投与対象（即ち患者）あたりの各有効成分１回投与量あるいは１日投与量の比である。例えば、イソロイシン、ロイシンおよびバリンの各有効成分を１つの製剤中に含め、それを投与対象に投与する場合には、重量比が投与量比に相当する。各有効成分を単独または任意の組み合わせで複数の製剤中に含めて投与する場合には、１回あるいは１日投与する各製剤中の各有効成分の合計重量の比が投与量比に相当する。
【００４８】
イソロイシン、ロイシン、およびバリンは既に、医薬・食品分野において広く用いられていて、安全性は確立している。例えば、これらのアミノ酸を１：２：１.２の重量比で含有する製剤の急性毒性（ＬＤ５０）は、マウスに経口投与する場合でも、１０ｇ／ｋｇ以上である。
【００４９】
本発明の薬剤は、単独で、または、１種またはそれ以上のさらなる有効成分、特に、眼疾患の処置および／または予防のための有効成分と併用できる。
【００５０】
本発明に関して、成分を「併用する」ことは、全成分を含有する投与剤形の使用および各成分を別個に含有する投与剤形の組合せの使用のみならず、それらが同じ疾患の予防および／または処置に使用される限り、各成分を同時に、または、いずれかの成分を遅延して投与することも意味する。２種またはそれ以上のさらなる有効成分を併用することも可能である。
【００５１】
眼疾患が緑内障である場合、併用に適する有効成分には、例えば、交感神経刺激薬（エピネフリン、ジピベフリン等の非選択性刺激薬、アプラクロニジン、ブリモニジン等のα２刺激薬）、交感神経遮断薬（チモロール、ベフノロール、カルテオロール、ベタキソロール、ニプラジロール、レボブノロール等のβ遮断薬、ブナゾシン等のα１遮断薬）、副交感神経作動薬（ピロカルピン、ジスチグミン等）、炭酸脱水酵素阻害薬（アセタゾラミド、ブリンゾラミド、ドルゾラミド等）、プロスタグランジン類（イソプロピルウノプロストン、ラタノプロスト、トラボプロスト、ビマトプロスト、タフルプロスト等）、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（リパスジル塩酸塩等）などの眼圧降下剤が含まれ、特に、ラタノプロスト、トラボプロストおよびタフルプロストなどのプロスタグランジン類、β遮断薬、炭酸脱水酵素阻害薬並びにブリモニジンが含まれる。
【００５２】
眼疾患が加齢黄斑変性である場合、併用に適する有効成分には、例えば、抗ＶＥＧＦ剤（ラニビズマブ、ペガプタニブ、アフリベルセプト、ベバシズマブなど）の抗血管新生薬およびステロイド剤（トリアムシノロンアセトニドなど）が含まれ、特に、ペガプタニブおよびラニビズマブが含まれる。
【００５３】
併用に適する他の有効成分には、例えば、ビタミン１２などのビタミン類、ルテインなどのカロテノイド類が含まれる。
【００５４】
本発明の薬剤の投与に加えて、薬物療法以外の眼疾患の治療法を実施することもできる。適する治療法には、例えば、外科手術、光線力学療法、遺伝子治療、再生医療、人工網膜移植、レーザー治療が含まれる。
【００５５】
別の態様では、本発明は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、網膜の細胞の変性および／または細胞死の抑制剤を提供する。好ましい態様では、網膜の細胞は、視細胞、網膜色素上皮細胞および網膜神経節細胞を含む。
【００５６】
本発明の網膜の細胞の変性および／または細胞死の抑制剤は、上述の眼疾患の処置および／または予防剤と同様に製造および使用することができる。本発明において、網膜の細胞の変性および／または細胞死、並びにその抑制は、当分野で知られている方法により、例えば、光干渉断層検査や補償光学走査型レーザー検眼鏡により、確認することができる。
【００５７】
本発明の網膜の細胞の変性および／または細胞死の抑制剤は、網膜の細胞の変性および／または細胞死に起因する眼疾患を処置および／または予防することができる。また、本発明の網膜の細胞の変性および／または細胞死の抑制剤は、網膜の細胞の変性および／または細胞死を抑制することにより、網膜の細胞を保護することができる。また、本発明の網膜の細胞の変性および／または細胞死の抑制剤は、網膜の細胞の変性および／または細胞死に起因する視機能の低下を抑制することができる。
【００５８】
さらなる態様では、本発明は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、視機能低下の抑制剤を提供する。
【００５９】
本発明の視機能低下の抑制剤は、上述の眼疾患の処置および／または予防剤と同様に製造および使用することができる。本発明において、視機能の低下は、矯正視力の低下および／または視野の異常、色覚の異常、を意味し、夜盲、視野欠損、視野狭窄、変視、失明などを含む。視機能の低下およびその抑制は、当分野で知られている方法により、例えば、視力検査、視野検査、網膜電図検査、網膜感度検査、中心フリッカー検査、色覚検査、視覚誘発電位などにより、確認することができる。ある態様では、視機能の低下は、網膜の細胞の変性および／または細胞死に起因する。他の態様では、視機能の低下は眼疾患に起因する。
【００６０】
また、ある態様では、本発明は、眼疾患の処置および／または予防用の医薬を製造するための、有効成分としてのイソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種の使用を提供する。
【００６１】
他の態様では、本発明は、網膜の細胞の変性および／または細胞死を抑制するための医薬を製造するための、有効成分としてのイソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種の使用を提供する。
【００６２】
他の態様では、本発明は、視機能低下を抑制するための医薬を製造するための、有効成分としてのイソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種の使用を提供する。
【００６３】
これらの態様では、上述の眼疾患の処置および／または予防剤の製造方法に準じて、有効成分としてのイソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を、医薬の製造のために使用できる。
【００６４】
また、ある態様では、本発明は、眼疾患の処置および／または予防において使用するための、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を提供する。
【００６５】
他の態様では、本発明は、網膜の細胞の変性および／または細胞死の抑制において使用するための、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を提供する。
【００６６】
他の態様では、本発明は、視機能低下の抑制において使用するための、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を提供する。
【００６７】
これらの態様では、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種は、上述の眼疾患の処置および／または予防剤に準じて使用される。
【００６８】
また、ある態様では、本発明は、有効成分としてのイソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を対象に投与することを含む、眼疾患の処置および／または予防方法を提供する。
【００６９】
他の態様では、本発明は、有効成分としてのイソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を対象に投与することを含む、網膜の細胞の変性および／または細胞死の抑制方法を提供する。
【００７０】
他の態様では、本発明は、有効成分としてのイソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を対象に投与することを含む、視機能低下の抑制方法を提供する。
【００７１】
これらの態様では、上述の眼疾患の処置および／または予防剤の使用方法に準じて、有効成分としてのイソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を対象に投与することができる。
【００７２】
さらに、本発明の有効成分である分岐鎖アミノ酸は、眼疾患のリスクの低減、または、視機能の維持もしくは改善の効果を有する機能性食品の形態でも簡便に使用することができる。従って、本発明は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、眼疾患のリスクの低減、または、視機能の維持もしくは改善用の食品を提供する。本発明の食品は、本発明の食品の有効成分、すなわち分岐鎖アミノ酸を含む一般的な食事形態であればいかなるものでも良い。例えば、適当な風味を加えてドリンク剤、例えば清涼飲料、粉末飲料とすることもできる。具体的には、例えば、ジュース、牛乳、菓子、ゼリー、ヨーグルト、飴等として飲食することができる。また、例えば、製造業者または消費者により他の食品に添加して摂取される食品添加剤の形態であっても良く、経口投与用の医薬と同様の形態であっても良い。
【００７３】
また、このような食品を、保健機能食品またはダイエタリーサプリメントとして提供することも可能である。この保健機能食品には、特定保健用食品および栄養機能食品なども含まれる。特定保健用食品は、例えば、眼疾患のリスクの低減、または、視機能の維持もしくは改善など、特定の保健の目的が期待できることを表示できる食品である。また、栄養機能食品は、１日あたりの摂取目安量に含まれる栄養成分量が、国が定めた上・下限値の規格基準に適合している場合その栄養成分の機能の表示ができる食品である。ダイエタリーサプリメントには、いわゆる栄養補助食品または健康補助食品などが含まれる。本発明において、特定保健用食品には、眼疾患のリスクの低減、または、視機能の維持もしくは改善などの用途に用いるものであるという表示を付した食品、さらには、かかる用途に用いるものである旨を記載した書類（いわゆる能書き）などをパッケージとして包含する食品なども含まれるものとする。
【００７４】
本発明の食品の摂取量、摂取期間は、本発明の薬剤の投与量、投与期間の記載に基づき、本発明の食品が所望の効果を示すように適宜設定することができる。
【００７５】
他の態様では、本発明は、眼疾患のリスクの低減、または、視機能の維持もしくは改善用の食品を製造するための、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種の使用を提供する。別の態様では、本発明は、眼疾患のリスクの低減、または、視機能の維持もしくは改善のための、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種の使用を提供する。別の態様では、本発明は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を含む食品を摂取または投与することによる、眼疾患のリスクの低減、または、視機能の維持もしくは改善方法を提供する。別の態様では、本発明は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される少なくとも１種を含む食品を投与することを含む、眼疾患のリスクを低減する、または、視機能を維持もしくは改善する非治療的方法を提供する。
【実施例】
【００７６】
下記実施例は本発明を説明するが、その範囲を限定するものではない。
以下の実施例において、ロイシン、イソロイシン及びバリンを２：１：１.２の割合で含む分岐鎖アミノ酸の混合物をＢＣＡＡとして使用した。ＢＣＡＡはγ-シクロデキストリン水溶液（CAVAMAX W8, Wacker fine chemicals）への溶解後に投与した。
【実施例１】
【００７７】
実施例１：比較的高齢の網膜色素変性モデルにおける薬理試験
網膜色素変性モデルとして、ｒｄ１２マウス（The Jackson Laboratory）（Pang, J.J., Chang, B., Hawes, N.L., et al. 2005. Retinal degeneration 12 (rd12): a new, spontaneously arising mouse model for human Leber congenital amaurosis (LCA). Molecular vision 11, 152-162）を用いた。このマウスモデルでは、ゆっくりと視細胞の細胞死が進行する。１３か月齢のｒｄ１２マウス３４匹を、ＢＣＡＡ投与群（１７匹）および対照群（１７匹）の２群に分けた。１３か月齢からＢＣＡＡ群ではＢＣＡＡ７.５ｇ／ｌを含む水の自由飲水により、ＢＣＡＡを経口投与した（約１.６ｋｇ／ｋｇ／日）。対照群には、同じ方法で水のみを与えた。
【００７８】
１３か月齢および１９か月齢にて、光干渉断層検査（optical coherence tomography；ＯＣＴ）を行った。ケタミン７０ｍｇ／ｋｇ＋キシラジン１４ｍｇ／ｋｇの筋肉注射によりマウスを麻酔した。トロピカミド・フェニレフリン点眼により、マウスを散瞳させた。光干渉断層検査には、２５Ｄアダプターレンズを装着した Spectralis HRT+OCT（Heidelberg Engineering, Inc.）を使用した。マウス角膜にポリメタクリル酸メチル製のコンタクトレンズを設置し、視神経乳頭を中心に縦に３０度×１５度の範囲を連続撮影した。視神経乳頭中心の３６６μｍの範囲（中心の１２２μｍの範囲は除外）の全層網膜厚を測定した。
【００７９】
全層網膜厚測定の結果を図１に示す。１３か月齢では、平均全層網膜厚は対照群で２０２.４±９.０μｍ、ＢＣＡＡ群で２０３.０±９.０μｍであり、有意差は認められなかった（Ｐ＝０.４０）。１９か月齢では、平均全層網膜厚は対照群で１８４.９±１０.２μｍ、ＢＣＡＡ群で１９４.４±１２.６μｍであり、ＢＣＡＡ群の方が厚かった（Ｐ＝０.００４９）。
【００８０】
同様の方法で、視細胞層厚を測定した。視神経乳頭を中心に垂直に３０度のラインスキャンを撮影した。視神経乳頭より２４４μｍ上下の部位で視細胞層厚（外顆粒層厚と視細胞内節・外節厚の和）を測定した。視細胞層厚測定の結果を図２に示す。１３か月齢では、平均視細胞層厚は対照群で５８.５±６.３μｍ、ＢＣＡＡ群で５９.７±４.６μｍであり、有意差は認められなかった（Ｐ＝０.２０）。１９か月齢では、視細胞層厚は対照群で３９.４±７.４μｍ、ＢＣＡＡ群で４５.３±６.８μｍであり、ＢＣＡＡ群の方が厚かった（Ｐ＝０.００７）。
【００８１】
１９か月齢にて、明順応網膜電図検査（electroretinogram；ＥＲＧ）を行った。全身麻酔（ケタミン７０ｍｇ／ｋｇ＋キシラジン１４ｍｇ／ｋｇ筋注）下で検査を行った。トロピカミド・フェニレフリン点眼により、マウスを散瞳させた。コンタクトレンズ型ＬＥＤ電極（メイヨー）を用い、LS-W（メイヨー）にて１０ｃｄｓ／ｍ２の刺激光で刺激し、PowerLab 2/25（AD Instruments, New South Wales, Australia）にて、波形を記録し、明順応網膜電図のｂ波振幅を測定した。結果を図３に示す。ｂ波の振幅は、対照群で１２.２±５.０μＶ、ＢＣＡＡ群で１４.９±６.０μＶであり、ＢＣＡＡ群の方が大きかった（Ｐ＝０.０４６）。
【００８２】
１９か月齢にて、眼球を摘出し、４％パラホルムアルデヒドにより終夜固定し、網膜をヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色した。視神経を通る垂直断切片を用いて、視神経乳頭縁から４００−５００μｍの範囲の外顆粒層の細胞数を計測した（各ｎ＝４眼）。図４に示す通り、オスでは、細胞数は対照群で７８.８±５.０個、ＢＣＡＡ群で１００±１１.２個であり、ＢＣＡＡ群の方が多かった（Ｐ＝０.００７）。全体では、細胞数は対照群で９５.３±２０.０個、ＢＣＡＡ群で１０１.１±１６.４個であり、ＢＣＡＡ群の方が多かった（Ｐ＝０.２６）。
【００８３】
１９か月齢で摘出した眼球から、網膜外組織（網膜色素上皮、脈絡膜および強膜を含む）および神経網膜を取り出し、ＣＨＯＰ：ＧＡＤＤ１５３（Ｒ−２０）抗体（Santa Cruz Biotechnology）、１：１０００希釈、カスパーゼ−３：切断型カスパーゼ−３（cleaved caspase-3）(D175) 抗体（cell signaling）、１：１０００希釈を使用して、ウェスタンブロットを行った。対照として、アクチン：抗アクチン抗体（Millipore）、１：１００００希釈を使用した。結果を図５に示す。小胞体ストレスマーカーとして知られているＣＨＯＰは、網膜外組織で、ＢＣＡＡ群で抑制されていた。アポトーシスのマーカーである切断型カスパーゼ−３は、網膜で、ＢＣＡＡ群で抑制されていた。
【００８４】
これらの結果は、進行期の網膜色素変性のモデルである比較的高齢のｒｄ１２マウスにおいて、ＢＣＡＡが視細胞の変性および細胞死を抑制し、視機能の低下を抑制したことを示す。
【実施例２】
【００８５】
実施例２：正常眼圧緑内障モデルにおける薬理試験
進行が遅い正常眼圧緑内障のマウスモデルであるＧＬＡＳＴ欠損（ヘテロ+/-）マウス（The Journal of Clinical Investigation, Volume 117, Number 7, July 2007）をマウスB6.Cg-Tg (Thy 1-CFP) 23Jrs/Jと交配し、ＧＬＡＳＴ欠損（+/-）・Thy 1-CFPマウスを得、正常眼圧緑内障のモデルマウスとして使用した。４週齢のモデルマウス３０匹を、対照群（１５匹）およびＢＣＡＡ投与群（１５匹）の２群に分けた。ＢＣＡＡ群では、４週齢から８週齢にわたり、０.３７５ｇ／ｋｇ／日のＢＣＡＡを週５日、腹腔内投与し、８週齢以降はＢＣＡＡ７.５ｇ／ｌを含む水の自由飲水により、ＢＣＡＡを経口投与した（約１.７ｇ／ｋｇ／日）。対照群には、４週齢から８週齢にわたり、生理食塩水を週５日、腹腔内投与し、８週齢以降は自由飲水によりＢＣＡＡを含まない水を与えた。
【００８６】
１２か月齢でマウスから眼球を摘出し、４％パラホルムアルデヒドにて１時間固定後、網膜をフラットマウントにし、視神経乳頭中心から１２００μｍの位置で、２５０μｍ×２５０μｍの範囲で、ＣＦＰ蛍光をもつ細胞の数を計測した（図６）。これらの細胞は、網膜神経節細胞と考えられる。細胞数は、対照群で１１０±９.６個、ＢＣＡＡ群で１２４.８±７.５個であり、ＢＣＡＡ群の方が多かった（Ｐ＝０.０１６）。
【００８７】
１８か月齢で、マウスから眼球を摘出し、４％パラホルムアルデヒドにて終夜固定後、パラフィンに包埋し、眼球後方の視神経部を垂直断した切片にて、視神経断面を写真撮影し、視神経乳頭径を測定した（図７）。視神経乳頭径は、神経節細胞の数を反映する。視神経乳頭径の中央値は、対照群で４５３５２μｍ２、ＢＣＡＡ群で７０６３７μｍ２であり、ＢＣＡＡ投与群の方が高かった。
【００８８】
これらの結果は、正常眼圧緑内障モデルにおいて、ＢＣＡＡが網膜神経節細胞の変性および細胞死を抑制したことを示す。
【実施例３】
【００８９】
実施例３：比較的老齢の加齢黄斑変性モデルにおける薬理試験
加齢黄斑変性のモデルとして、ＣＣＲ２（単球走化活性化因子（ＭＣＰ−１）受容体）欠損マウス（The Jackson Laboratory）（Nat Med. 2003 Nov;9(11):1390-7. Epub 2003 Oct 19. An animal model of age-related macular degeneration in senescent Ccl-2- or Ccr-2-deficient mice. Ambati J1, Anand A, Fernandez S, Sakurai E, Lynn BC, Kuziel WA, Rollins BJ, Ambati BK）を用いた。９か月齢のＣＣＲ２欠損マウス３４匹を、対照群（２４匹）およびＢＣＡＡ投与群（１０匹）の２群に分けた。ＣＣＲ２欠損マウスに対して、９か月齢から、γ−シクロデキストリン水溶液に溶解したＢＣＡＡ（７.５ｇ／ｌ）を含む水の自由飲水により、ＢＣＡＡを経口投与した。対照マウスには、同じ方法で水のみを与えた。
【００９０】
９か月齢から１５か月齢まで１か月毎に、視神経乳頭を中心とした眼底カラー写真を撮影し（Micron III, Phoenix Research Laboratories）、ドルーゼン数を評価した。代表的な写真を図８に示す。白色の粒状の構造がドルーゼンである。図中、白点線は、ドルーゼンが多い場所を示す。ＢＣＡＡ投与群で、ドルーゼン数の増加が抑制されるものが多く存在した。投与開始９か月齢でのドルーゼン数からの各月のドルーゼン数の増減を図９に示す。ＢＣＡＡ投与群（ｎ＝１４眼）では、対照群（ｎ＝１６眼）と比較して、１０か月齢以降、ドルーゼンの増加が有意に抑制された（Ｐ＝０.０４３（１０か月齢）、０.０１５（１１か月齢）、０.０４６（１２か月齢）、０.０１５（１３か月齢）、０.０１８（１４か月齢）、０.０１６（１５か月齢））。
【００９１】
１５か月齢にて、暗順応網膜電図検査（ＥＲＧ）を行った。ＥＲＧの２４時間前からマウスを暗順応させ、全身麻酔（７０ｍｇ／ｋｇケタミン＋１４ｍｇ／ｋｇキシラジン筋注）、散瞳下（０.５％フェニレフリン、５％ネオシネジン）で検査を行った。暗順応下にて、コンタクトレンズ型ＬＥＤ電極を用い、LS−Wにて０.０１ｃｄｓ／ｍ２の刺激光で刺激してPowerLab 2/25にて波形を記録し、ｂ波の振幅を測定し、同様に３ｃｄｓ／ｍ２の刺激光で刺激して波形を記録し、ａ波の振幅を測定した。結果を図１０に示す。ａ波の振幅は、対照群で１６３.６±６５.２μＶ、ＢＣＡＡ群で２０７.０±４７.４μＶであり、ＢＣＡＡ群の方が大きかった（Ｐ＝０.００２６）。ｂ波の振幅は、対照群で２２３.１±８２.０μＶ、ＢＣＡＡ群で３０８.４±５６.８μＶであり、ＢＣＡＡ群の方が大きかった（Ｐ＝０.００１６）。
【００９２】
１５か月齢にて、眼球を摘出し、４％パラホルムアルデヒドにより終夜固定し、網膜をＨＥ染色し、網膜切片を観察した。図１１は、１５か月齢におけるＣＣＲ２欠損マウスの網膜切片を示す（上段：４０倍、下段：１００倍）。水のみを投与した対照群では、網膜色素上皮に空胞変性を生じているのに対し（矢頭）、ＢＣＡＡ投与群では、空胞変性は認められなかった（上段）。また、対照群のブルッフ膜（網膜色素上皮の基底膜）は、ＢＣＡＡ投与群に比べ、著明に肥厚していた（下段、矢印）。
【００９３】
１５か月齢にて、網膜の電子顕微鏡検査を行った。眼球を摘出し、ＨＥ染色と同様の方法で固定後、１％四酸化オスミウムで固定した。エタノール脱水、エポキシ樹脂包埋の後、超薄切片を作成、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、染色切片を透過型電子顕微鏡（H-7650、日立株式会社）で観察した。結果を図１２に示す。図１２中、ＲＰＥは網膜色素上皮を示す。網膜下蓄積物は、対照に比べて、ＢＣＡＡ投与群にて少なかった。
【００９４】
これらの結果は、比較的老齢の加齢黄斑変性モデルマウスにおいて、ＢＣＡＡがドルーゼンの増加を抑制し、視機能の低下を抑制したことを示す。
【実施例４】
【００９５】
実施例４：比較的若年の加齢黄斑変性モデルにおける薬理試験
２か月齢のＣＣＲ２欠損マウス３７匹を、ＢＣＡＡ投与群（１１匹）および対照群（２６匹）の２群に分けた。ＣＣＲ２欠損マウスに対して、２か月齢から、γ−シクロデキストリン水溶液に溶解したＢＣＡＡ（７.５ｇ／ｌ）を含む水の自由飲水により、ＢＣＡＡを投与した。対照マウスには、同じ方法で水のみを与えた。
【００９６】
９か月齢にて、暗順応網膜電図検査（ＥＲＧ）を行った。ＥＲＧの２４時間前からマウスを暗順応させ、全身麻酔（７０ｍｇ／ｋｇケタミン＋１４ｍｇ／ｋｇキシラジン筋注）、散瞳下（０.５％フェニレフリン、５％ネオシネジン）で検査を行った。暗順応下にて、コンタクトレンズ型ＬＥＤ電極を用い、LS-Wにて０.０１ｃｄｓ／ｍ２の刺激光で刺激し、PowerLab 2/25にて波形を記録し、ｂ波の振幅を測定し、同様に３ｃｄｓ／ｍ２の刺激光で刺激して波形を記録し、ａ波の振幅を測定した（対照 ｎ＝４３眼、ＢＣＡＡ ｎ＝１７眼）。結果を図１３に示す。ａ波の振幅は、対照群で１７４.６±６９.６μＶ、ＢＣＡＡ群で２５１.１±７２.３μＶであり、ＢＣＡＡ群の方が大きかった（Ｐ＝０.００１１）。ｂ波の振幅は、対照群で２５３.１±１１３.２μＶ、ＢＣＡＡ群で３８６.７±１３３.６μＶであり、ＢＣＡＡ群の方が大きかった（Ｐ＝０.００１０）。
【００９７】
これらの結果は、比較的若年の加齢黄斑変性モデルマウスにおいて、ＢＣＡＡが視機能の低下を抑制したことを示す。
【実施例５】
【００９８】
実施例５：網膜色素変性モデルにおける薬理試験
網膜色素変性モデルとして、ｒｄ１０マウス（B6.CXB1-Pde6brd10/J（Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)より購入、Chang B. et al; Vision Res (2007)）を用いた。このマウスモデルでは、２か月齢までに急速に視細胞が変性する。７日齢のｒｄ１０マウス３５匹を、ＢＣＡＡ投与群（１７匹）および対照群（１８匹）の２群に分けた。ＢＣＡＡ群では、７日齢から２３日齢まで、１.５ｇ／ｋｇ／日のＢＣＡＡを腹腔内投与し、２４日齢以降はＢＣＡＡ７.５ｇ／ｌを含む水の自由飲水により、ＢＣＡＡを経口投与した（約１．７ｇ／ｋｇ／日）。対照群には、７日齢から２３日齢まで生理食塩水を腹腔内投与し、２４日齢以降は自由飲水によりＢＣＡＡを含まない水を与えた。
【００９９】
２４日齢、３０日齢および３７日齢にて、光干渉断層検査（ＯＣＴ）を行った。ケタミン７０ｍｇ／ｋｇ＋キシラジン１４ｍｇ／ｋｇの筋肉注射によりマウスを麻酔した。トロピカミド・フェニレフリン点眼により、マウスを散瞳させた。光干渉断層検査には、２５Ｄアダプターレンズを装着した Spectralis HRT+OCT（Heidelberg Engineering, Inc.）を使用した。マウス角膜にポリメタクリル酸メチル製のコンタクトレンズを設置し、視神経乳頭を中心に縦に３０度×１５度の範囲を連続撮影した。視神経乳頭中心の３６６μｍの範囲（中心の１２２μｍの範囲は除外）の全層網膜厚を測定した。
【０１００】
２４日齢では、平均全層網膜厚は対照群で１８８．９±２１．８μｍ、ＢＣＡＡ群で１８７．２±１３．８μｍであり、有意差は認められなかった（Ｐ＝０．３６）。３０日齢では、平均全層網膜厚は対照群で１５３．７±７．４μｍ、ＢＣＡＡ群で１５５．０±６．３μｍであり、有意差は認められなかった（Ｐ＝０．２７）。３７日齢では、平均全層網膜厚は対照群で１４４．２±５．７μｍ、ＢＣＡＡ群で１４９．８±３．３μｍであり、ＢＣＡＡ群の方が厚かった（Ｐ＜０．０１）。３７日齢の全層網膜厚測定の結果を図１４に示す。
【０１０１】
同様の方法で、視細胞層厚を測定した。視神経乳頭を中心に縦に３０度のラインスキャンを撮影した。視神経乳頭より２４４μｍ上下の部位で視細胞層厚（外顆粒層厚と視細胞内節・外節厚の和）を測定した。２４日齢では、平均視細胞層厚は対照群で５０．４±２３．８μｍ、ＢＣＡＡ群で４２．６±１９．１μｍであり、有意差は認められなかった（Ｐ＝０．０９）。３０日齢では、平均視細胞層厚は対照群で１６．８±３．６μｍ、ＢＣＡＡ群で１８．９±６．０μｍであり、有意差は認められなかった（Ｐ＝０．０９）。３７日齢では、視細胞層厚は対照群で１０．１±４．８μｍ、ＢＣＡＡ群で１５．１±３．３μｍであり、ＢＣＡＡ群の方が厚かった（Ｐ＜０．０１）。３７日齢の視細胞層厚測定の結果を図１５に示す。視細胞層厚の中央値をとる３７日齢マウスの光干渉断層計像を、図１６に示す。視機能と相関することが知られているエリプソイド帯（Ellipsoid zone）の連続性はＢＣＡＡ群のほうが対照群よりも保たれているのが見られる。
【０１０２】
２４日齢にて、暗順応網膜電図検査（ＥＲＧ）を行った。ＥＲＧの前に終夜、マウスを暗順応させ、全身麻酔（７０ｍｇ／ｋｇケタミン＋１４ｍｇ／ｋｇキシラジン筋注）下で検査を行った。トロピカミド・フェニレフリン点眼により、マウスを散瞳させた。暗順応下にて、コンタクトレンズ型ＬＥＤ電極を用い、LS-Wにて０.０１ｃｄｓ／ｍ２および３．０ｃｄｓ／ｍ２の刺激光で刺激してPowerLab 2/25にて波形を記録し、ｂ波の振幅を測定した。結果を図１７に示す。ｂ波の振幅は、刺激光強度０．０１ｃｄｓ／ｍ２にて、対照群で１８．８±１６．８μＶ、ＢＣＡＡ群で４０．１±５０．２μＶ（Ｐ＜０．０１）であり、刺激光強度３．０ｃｄｓ／ｍ２にて、対照群で７６．４±６１．３μＶ、ＢＣＡＡ群で１２１．３±１１５．９μＶ（Ｐ＝０．０２）であり、いずれもＢＣＡＡ群の方が大きかった。
【０１０３】
３０日齢および３７日齢にて、明順応網膜電図検査を行った。全身麻酔（ケタミン７０ｍｇ／ｋｇ＋キシラジン１４ｍｇ／ｋｇ筋注）下で検査を行った。トロピカミド・フェニレフリン点眼により、マウスを散瞳させた。マウスにコンタクトレンズ型ＬＥＤ電極を装着させ、LS−Wにて３ｃｄｓ／ｍ２、１０ｃｄｓ／ｍ２および３０ｃｄｓ／ｍ２の刺激光で刺激し、PowerLab 2/25にて波形を記録し、明順応網膜電図のｂ波振幅を測定した。３０日齢において、ｂ波の振幅は、刺激光強度３ｃｄｓ／ｍ２にて、対照群で１０．０±９．７μＶ、ＢＣＡＡ群で１４．８±１１．０μＶ（Ｐ＝０．０３）であり、刺激光強度１０ｃｄｓ／ｍ２にて、対照群で１５．７±１２．０μＶ、ＢＣＡＡ群で２４．９±２１．２μＶ（Ｐ＝０．０１）、刺激光強度３０ｃｄｓ／ｍ２にて、対照群で２０．６±１６．３μＶ、ＢＣＡＡ群で３６．３±２２．４μＶ（Ｐ＜０．００１）であり、いずれもＢＣＡＡ群の方が大きかった（図１８）。３７日齢では、刺激光強度３ｃｄｓ／ｍ２でのｂ波の振幅は、対照群で８．７±４．０μＶ、ＢＣＡＡ群で９．３±４．４μＶであり、有意差は認められなかった（Ｐ＝０．２９）。刺激光強度１０ｃｄｓ／ｍ２では、対照群で６．７±３．１μＶ、ＢＣＡＡ群で１５．６±１１．０μＶ（Ｐ＜０．０００１）、刺激光強度３０ｃｄｓ／ｍ２では、対照群で９．７±５．５μＶ、ＢＣＡＡ群で２０．５±１４．０μＶ（Ｐ＜０．０００１）であり、いずれもＢＣＡＡ群の方が大きかった。ｂ波振幅の中央値をとる３０日齢マウスの明順応網膜電図検査の結果を、図１９に示す。ＢＣＡＡ群のほうが対照群よりも波形が保たれているのが見られる。
【０１０４】
これらの結果は、網膜色素変性モデルにおいて、ＢＣＡＡが視細胞の変性および細胞死を抑制し、視機能の低下を抑制したことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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