(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロマイセス・センス・ストリクト属、カザフスタニア属、ナウモボジマ属、ナカセオマイセス属およびバンデルワルトジマ属から選択される微生物を唯一の窒素源としてのグアニジノブチレートの存在下に培養する培養方法であって、
（ａ）グアニジノブチラーゼをコードするヌクレオチド配列を備える核酸分子を前記微生物に導入することであって、前記ヌクレオチド配列はプロモーター配列およびターミネーター配列に作動可能に連結されていることと、
（ｂ）前記グアニジノブチラーゼをコードする前記核酸分子が前記微生物において発現されるように前記微生物を培養することと、
（ｃ）唯一の窒素源としてのグアニジノブチレートの存在下に前記微生物を培養することを備え、
前記コードされたグアニジノブチラーゼは、ＥＣ番号３．５．３．７のグアニジノ酸ヒドロラーゼである培養方法。
【請求項２】
請求項１に記載の培養方法において、
前記グアニジノブチラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１４８のアミノ酸配列を有するクルイウェロマイセス・ラクティスのグアニジノブチラーゼをコードする培養方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の培養方法において、
前記プロモーター配列および／またはターミネーター配列は解糖系遺伝子から選択される培養方法。
【請求項４】
請求項３に記載の培養方法において、
前記解糖系遺伝子は、PGI1、PFK1、PFK2、FBA1、TPI1、TDH1、TDH3、PGK1、GPM1、PYK1、ENO1、および／またはENO2から選択される培養方法。
【請求項５】
グアニジノブチラーゼをコードするヌクレオチド配列を備える、サッカロマイセス・センス・ストリクト属、カザフスタニア属、ナウモボジマ属、ナカセオマイセス属およびバンデルワルトジマ属から選択される微生物であって、
前記コードされたグアニジノブチラーゼは、ＥＣ番号３．５．３．７のグアニジノ酸ヒドロラーゼである、微生物。
【請求項６】
請求項５に記載の微生物において、
前記グアニジノブチラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１４８のアミノ酸配列を有するクルイウェロマイセス・ラクティスのグアニジノブチラーゼをコードする、微生物。
【請求項７】
コンストラクトの組であって、
グアニジノブチラーゼをコードするヌクレオチド配列の第１の部分を備える第１のコンストラクトと、前記グアニジノブチラーゼをコードする前記ヌクレオチド配列の第２の部分を含む第２のコンストラクトとを備え、
前記ヌクレオチド配列の前記第１の部分の断片が前記ヌクレオチド配列の前記第２の部分に存在する断片と重なり合い、前記ヌクレオチド配列の前記第１および第２の部分の間で組換えを可能にしており、
前記コードされたグアニジノブチラーゼは、ＥＣ番号３．５．３．７のグアニジノ酸ヒドロラーゼである、コンストラクトの組。
【請求項８】
請求項７に記載のコンストラクトの組において、
前記第１のコンストラクトは、さらに、エンドヌクレアーゼ認識部位と微生物の標的ゲノムに相同性を有する第１の領域とを備え、
前記第２のコンストラクトは、さらに、前記微生物の前記標的ゲノムに相同性を有する第２の領域と、前記エンドヌクレアーゼ認識部位のコピーとを含み、
誘導可能なプロモーターに結合された前記エンドヌクレアーゼをコードするコーディング配列が前記第１または第２のコンストラクト上に存在し、かつ
前記第１のコンストラクト上の前記標的ゲノムに相同性を有する前記第１の領域の一部分が、前記第２のコンストラクト上の前記エンドヌクレアーゼ認識部位の前記コピーと前記標的ゲノムに相同性を有する前記第２の領域との間に複製されているか、または
前記第２のコンストラクト上の前記標的ゲノムに相同性を有する前記第２の領域の一部分が、前記第１のコンストラクト上の前記標的ゲノムに相同性を有する第１の領域と、前記第１のコンストラクト上の前記エンドヌクレアーゼ認識部位との間に複製されている、コンストラクトの組。
【請求項９】
請求項７または８に記載のコンストラクトの組において、
前記グアニジノブチラーゼをコードするヌクレオチド配列の前記重なり合う断片は約２００塩基対であるコンストラクトの組。
【請求項１０】
請求項７から９までのいずれか一項に記載のコンストラクトの組において、
前記第１および第２のコンストラクト上の標的ゲノムに相同性を有する複製された領域は、２０ｂｐ〜２００ｂｐであるコンストラクトの組。
【請求項１１】
サッカロマイセス・センス・ストリクト属、カザフスタニア属、ナウモボジマ属、ナカセオマイセス属およびバンデルワルトジマ属から選択される微生物のゲノムを改変する方法であって、
請求項７から１０までのいずれか一項に記載の前記コンストラクトの組を前記微生物に与えることと、
前記ゲノムが改変された微生物を選択することとを備える、ゲノムを改変する方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載のゲノムを改変する方法において、
前記改変は標的遺伝子になされ、
前記ゲノムが改変された微生物は、前記グアニジノブチラーゼを機能的に発現する微生物を選択することにより選択される、ゲノムを改変する方法。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のゲノムを改変する方法において、
微生物を、唯一の窒素源としてのグアニジノブチレートの存在下に培養する、ゲノムを改変する方法。
【請求項１４】
請求項７から１０までのいずれか一項に記載の前記コンストラクトの組を備えるキット。
【請求項１５】
サッカロマイセス・センス・ストリクト属、カザフスタニア属、ナウモボジマ属、ナカセオマイセス属およびバンデルワルトジマ属から選択される微生物のゲノムを改変する方法であって、
請求項７から１０までのいずれか一項に記載の前記コンストラクトの組を前記微生物に与えることと、
前記ゲノムが機能的な、組み換えられたグアニジノブチラーゼの挿入により改変された微生物を選択することとを備える、ゲノムを改変する方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載のゲノムを改変する方法において、
唯一の窒素源としてのグアニジノブチレートの存在下に前記微生物を培養することにより前記微生物が選択される、ゲノムを改変する方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養方法、微生物、コンストラクトの組、ゲノムを改変する方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルギニン代謝はこれまで集約的な生化学的研究の主題であった。アルギニンを窒素源として利用するための尿素サイクル (Krebs and Henseleit, (1932) Wochenschrift 11: 757-759; Krebs, (1973) Biochemical Education 1: 19-23) が発見された後、注目されたのはポリアミンならびにシグナル化合物であるγ−アミノブチレート（GABA）および酸化窒素の合成の前駆体としてのアルギニンの役割である(Knowles and Moncada (1994) Biochem J 298: 249-258; Pitkanen et al., (2001)  Biochem Biophys Res Commun 287: 1051-1057)。３つの分野すべてにわたって起きるアルギニン分解の経路で最も広く分布している経路(Abdelal, (1979) Annu Rev Microbiol 33: 139-168)は、アルギニンをオルニチンと尿素に転換するウレオヒドロラーゼであるアルギナーゼ(EC 3.5.3.1)、により開始される。アルギナーゼの活性部位はいくつかのMn２＋結合部位を含むが、該活性部位は他のウレオヒドロラーゼ、例えばアグマチナーゼ（agmatinase (EC 3.5.3.11)）、ホルムイミノグルタマーゼ（formiminoglutamase (EC 3.5.3.8)）、プロクラバミネートアミジノヒドロラーゼ（proclavaminate amidinohydrolase (EC 3.5.3.22)）、グアニジノブチラーゼ（guanidinobutyrase (EC 3.5.3.7)）およびグアニジノプロピオナーゼ（guanidinopropionase (EC 3. 5.3.17)）においても保存されている(Ouzounis and Kyrpides (1994) J Mol Evol 39: 101-104)。これらの酵素をコードする遺伝子は進化の初期に出現したものと考えられ(Hartman, (1975) Orig Life 6: 423-427)、系統発生的研究においてマーカーとして用いられてきた(Ouzounis and Kyrpides (1994) J Mol Evol 39: 101-104; Sekowska et al., (2000) Microbiology 146: 1815-1828)。
【０００３】
真核生物においては、２つのタイプのウレオヒドロラーゼだけが報告されている。アルギナーゼに加えて、高等な真核生物はアグマチナーゼを発現する(Coleman et al., (2004) Biochem J 379: 849-855)が、アグマチナーゼはアルギニン異化の別の経路に参加している（図１）。この経路では、アルギニンはまずカルボキシル基を除去されてアグマチン（agmatine）となり、さらにアグマチナーゼによりプトレシン（putrescine）と尿素に転換される。次いで、プトレシンはＧＡＢＡ、またはポリアミンであるスペルミン（spermine）とスペルミジン（spermidine）、のいずれかに転換され得る((Pegg, (2009) IUBMB Life 61: 880-894))。急激に数が増加している全ゲノム解析により、多くの真核生物におけるアルギナーゼおよびアグマチナーゼ遺伝子のおおよその同定が可能となっている。しかしながら、そのような遺伝子注釈は配列の相同性（ホモロジー）のみに基づいているので、コードされているタンパク質の触媒機能について決定的な結論を出すことができない。
【０００４】
菌類のアルギニン代謝についての知識の多くはモデル生物サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae）を用いた研究に基づいている。S. Cerevisiae（Ｓ．セレビシエ）において、アルギニンは細胞に輸送された後にアルギナーゼ(Car1)により加水分解されてオルニチンと尿素を生じる (Sumrada and Cooper, (1992) Yeast 8: 311-314; Cooper et al., (1992) J Bacteriol 700 174: 48-55; Shima 64 et al., (2003) Appl Environ Microbiol 69: 715-718)。次いで、ATP依存性アミドリアーゼ（amidolyase (Dur1,2)）が尿素をアンモニアと二酸化炭素に転換する。オルニチンはさらにオルニチン特異的トランスアミナーゼ(Car2)によりグルタメミン酸−γ−セミアルデヒド（GSA）に転換され、このものは自然発生的に１−ピロリン−５−カルボン酸(P5C)を形成する(Martin et al., (2003) Appl Environ Microbiol 69: 1623-1628)。細胞内が区画化されているので、S. cerevisiaeは細胞質P5Cをグルタメートに直接転換することができない(Davis, (1986) Microbiol Rev 50: 280-313)。その代わりに、P5Cは、ピロリン−５−カルボン酸・レダクターゼ(Pro3)を用いてプロリンに還元される。プロリンは、次いで、ミトコンドリア内に輸送され(Brandriss and Falvey, (1992) Bacteriol 174: 5176)、オキシダーゼ(Put1)により転換されてP5Cに戻り、ミトコンドリアP5Cデヒドロゲナーゼ(Put2)により最終的にグルタメートに転換される(Davis, (1986) Microbiol Rev 50: 280-313)。非サッカロミセス酵母におけるアルギニン代謝についての生理学的研究はごく少ないので、アルギナーゼ経路−これはアルギニンを唯一の窒素源として用いてＳ．セレビシエを成長させるのに必須である(Bossinger and Cooper, (1977) J Bacteriol 131: 163-173)−が菌類にとってアルギニン異化の唯一の経路であるか否かが不明である。
【０００５】
Ｓ．セレビシエと Kluyveromyces lactis（クルイウェロマイセス・ラクティス）はいずれもサッカロマイセス科（Saccharomycetaceae）に属する。これら２つの同族の酵母は、Ｓ．セレビシエのゲノムを再形成する全ゲノム重複(WGD)イベントの前に遺伝的に分離したものと考えられており、さらにK. lactis（Ｋ．ラクティス）はＳ．セレビシエのWGD前の祖先に似ていると考えられている(Dujon, (2010) Nat Rev Genet 11: 512-524)。これら２つの種の間の糖代謝の相違についてこれまで多くの研究が成されているが、アミノ酸代謝における相違について詳しい研究はなされてはいない。それにもかかわらず、Ｋ．ラクティスの完全ゲノム配列はアルギニン代謝に関与しているＳ．セレビシエの遺伝子の多くの推定オーソログを示している(Dujon et al., (2004) Nature 430: 35-44; Souciet et al., (2009) BMC Genomics 13: 517; Dias et al., (2012) BMC Genomics 13: 517)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
組換えDNAを用いて形質転換される微生物の選別は適切な選択マーカーを用いることでずっと容易になる。サッカロマイセス・セレビシエを用いて研究を行う分子生物学者は多数の選択マーカーを利用できる(Solis-Escalente et al., (2013) FEMS Yeast Research 13: 126-139)。しかしながら、栄養要求性マーカーおよび抗生物質抵抗性マーカーは場合によっては望ましくないため、適切なマーカーの数は激減する。結局、分子遺伝子学研究者が野生型、異質倍数性および／または異数性の原栄養性酵母株に遺伝的に介入しようとする場合は、限られた数しか残されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
アルギニン代謝の研究の結果、２つの新しい「機能獲得型」優性マーカーが同定され、これらのマーカーは、例えば微生物、好ましくは、Ｓ．セレビシエを始めとする実験室用、野生型および工業用酵母株にゲノム改変を導入するために用いることができる。
【０００８】
従って、本発明は、（a）グアニジノブチラーゼ選択マーカーをコードするヌクレオチド配列、および／または（b）グアニジノアミドヒドロラーゼ選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列が（非相同の）プロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された核酸分子を提供する。この核酸分子は、優性マーカーカセットとも呼ばれるが、微生物、好ましくは酵母において好適に使用される便利な優性選択可能マーカーシステムを提供する。
【０００９】
グアニジノブチラーゼ（グアニジノ酸ヒドロラーゼ）とグアニジノアミドヒドロラーゼはタンパク質の大きなファミリー、ウレオヒドロラーゼ、に属し、このウレオヒドロラーゼファミリーは、３層のα−β−α構造を共通に有し、アルギニン／アグマチン代謝、尿素サイクルおよびヒスチジン分解に重要な役割を果たしている酵素を含む。グアニジノブチラーゼは、４−グアニジノブタノエート（4-guanidinobutanoate）を４−アミノブタノエート（４−アミノ酪酸；4-aminobutanoate）と尿素に加水分解する反応を触媒する。グアニジノアミドヒドロラーゼは、アグマチンを尿素とプトレシンに加水分解し、プトレシンはスペルミジンとスペルミンというポリアミンの生合成の前駆体でもある。ウレオヒドロラーゼ・ファミリーはさらに３つのサブグループを含む。すなわち、ｉ）アルギニンの尿素およびオルニチンへの転換に触媒作用を及ぼすグアニジノアミノ酸ヒドロラーゼ(アルギナーゼ, EC3.5.3.1)、ｉｉ）アミジノプロクラバミネートの、尿素と、クラブラン酸の生合成の中間体であるプロクラバミネートへの転換に触媒作用を及ぼすプロクラバミネートアミジノヒドロラーゼ(EC 3.5.3.22)、およびｉｉｉ）Ｎ−ホルムイミドイル−Ｌ−グルタメートをＬ−グルタメートとホルムアミドに加水分解することにより、ヒスチジン分解の第４ステップに触媒作用を及ぼすホルムイミノグルタマーゼ(EC 3.5.3.8)を含む。
【００１０】
上記のグアニジノブチラーゼをコードするヌクレオチド配列は、グアニジノ酸ヒドロラーゼ(EC. 3.5.3.7)をコードする。このヌクレオチド配列がコードするのは、好ましくは、図２Ａに示され、図２Ｂに描かれているような一方または双方の保存されたドメインを有するグアニジノ酸ヒドロラーゼ、および／または図２Ａに描かれているようなコンセンサス配列である。このグアニジノ酸ヒドロラーゼは、好ましくは、３５０〜４５０個のアミノ酸、好ましくは約４００個のアミノ酸を包含する。このグアニジノブチラーゼをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、図３に示すような、GenBank XP_456325.1の配列を有するクルイウェロマイセス・ラクティスNRRL Y-1140推定（hypothetical ) タンパク質をコードする。
【００１１】
上記のグアニジノアミドヒドロラーゼをコードするヌクレオチド配列は、アグマチンウレオヒドロラーゼ（アグマチナーゼ）(EC.3.5.3.11)をコードする。このヌクレオチド配列がコードするのは、好ましくは、図４Ａに示され、図４Ｂに描かれているような保存されたドメインを有するアグマチンウレオヒドロラーゼおよび／または図４Ａに示されるようなコンセンサス配列である。このアグマチンウレオヒドロラーゼは、好ましくは、２９０〜３３０個のアミノ酸、好ましくは約３０６個のアミノ酸を包含する。このアグマチンウレオヒドロラーゼは、好ましくは、図５に描かれているように、GenBank AAC75974.1の配列をコードする。
【００１２】
グアニジノブチラーゼとアグマチナーゼはともに尿素の形成に触媒作用を及ぼす。尿素は、Ｓ．セレビシエのような微生物により共通して同化される窒素源である。従って、これら２つのウレオヒドロラーゼ遺伝子は、グアニジノブチレートおよび／またはアグマチンを唯一の窒素源として成長させた場合のＳ．セレビシエのような微生物において、優性「機能獲得型」選択可能マーカーとなりえるマーカーの本質的特徴を示す。
【００１３】
本発明は、このように、サッカロマイセス科の微生物を唯一の窒素源としてのグアニジノブチレートの存在下に培養する方法であって、（ａ）グアニジノブチラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記微生物に導入し、前記ヌクレオチド配列がプロモーター配列およびターミネーター配列に作動可能に連結されるようにし、（ｂ）前記グアニジノブチラーゼをコードする前記核酸分子が前記微生物において発現されるように前記微生物を培養し、（ｃ）唯一の窒素源としてのグアニジノブチレートの存在下に前記微生物を培養することを含む方法を提供する。
【００１４】
このグアニジノブチラーゼをコードするヌクレオチド配列は、好ましくはクルイウェロマイセス・ラクティスNRRL Y-1140推定タンパク質をコードする。
【００１５】
上記のプロモーターは前記微生物における選択マーカーの発現を誘導する。上記のプロモーターは効率的なRNA 3’末端形成を実現する。このプロモーターは、好ましくは酵母プロモーターであり、より好ましくは解糖系遺伝子から選択された酵母プロモーター、例えばPGI1 （ホスホグルコースイソメラーゼ−１（phosphoglucose isomerase 1））、PFK1（ホスホフルクトキナーゼ−１(phosphofructokinase-1)）、PFK2 （ホスホフルクトキナーゼ−２(phosphofructokinase-2)）、FBA1 （フラクトースビスホスフェートアルドラーゼ−１(fructose-bisphosphate aldolase-1)）、TPI1 （トリオースホフェートイソメラーゼ−１(triosephosphate isomerase-1)）、TDH1 （グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ−１(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1)）、TDH3 （グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ−３(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase3)）、PGK1 （ホスホグリセレートキナーゼ−１(phosphoglycerate kinase 1)）、GPM1 （グリセレートホスホムターゼ−１(glycerate phosphomutase 1)）、PYK1 （ピルベートキナーゼ-1(pyruvate kinase 1)）、ENO1 (alpha-enolase)、および／若しくは ENO2 (enolase 2) プロモーターから選択され他プロモーターであり、またはACT1 (actin 1), TEF1 （翻訳延長因子EF-1α(translational elongation factor EF-1 alpha)）、TEF2 （翻訳延長因子EF-1α２(translational elongation factor EF-1 alpha 2)）、AgTEF2 （アッシビヤ・ゴシッピー(Ashbya gossypii) TEF2 遺伝子）, PMA1 （原形質膜(plasma membrane） P2-型 H+-ATPase) プロモーターから選択されるプロモーターである。好ましいプロモーター配列は、PGI1, FBA1; TPI1; TDH3; PGK1; GPM1; ENO1; ENO2およびPYK1遺伝子のプロモーター配列から選ばれる。多数の遺伝子起源のターミネーターが当業者に知られ、例えば発現ベクター等に用いられている。これらのターミネーターにはCYC1, TRP1, ADH1, MFl, FLPおよびD遺伝子ターミネーターが含まれる(Romanos et al., 1992. Yeast 8: 423-488)。
【００１６】
好ましいプロモーター配列およびターミネーター配列はサッカロマイセス属（Saccharomyces）の配列を含まないものである。好ましいプロモーター配列およびターミネーター配列は、翻訳延長因子をコードする（アッシビヤ・ゴシッピー(Ashbya gossypii) ）TEF遺伝子を起源とし、および／またはそれぞれオロチジン−５‘−ホスフェート(OMP)デカルボキシラーゼおよびβ−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼをコードするＫ．ラクティスURA3 および LEU2遺伝子起源の調節配列である。
【００１７】
好ましくはグアニジノブチラーゼをコードする本発明の核酸分子は、増幅された生産物として、または増幅された生産物の一部分として提供される。この増幅された生産物は、さらに微生物のゲノムの第１の部分、好ましくは改変される遺伝子（標的遺伝子と呼ぶ）の上流部分、に相同な配列および微生物の第２の部分、好ましくは当該標的遺伝子の下流部分、に相同な配列を核酸分子に隣接して含む。「隣接」という用語はゲノムの第１の部分に相同な当該配列が核酸分子の一方の側に位置し、ゲノムの第２の部分に相同な配列が核酸分子の他方の側に位置することを示すのに用いられる。ゲノムの第１および第２の部分に相同な配列は、好ましくは２０〜１０００ｂｐ、より好ましくは３０〜５００ｂｐ、より好ましくは４０〜２５０ｂｐ、より好ましくは５０〜８０ｂｐの配列を含む。遺伝子の上流部分に相同な配列は、このましくは開始コドンを含む。遺伝子の下流部分に相同な配列は、好ましくは、終止コドンを含む。本発明の核酸分子を含む増幅された生産物を生産する方法は、当業者に知られており、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応および核酸配列に基づく増幅(NASBA)を含む。
【００１８】
本発明の核酸分子は、好ましくはベクターに含まれている。ベクターは、例えば、抗生物質の存在下でバクテリアの成長を許容するバクテリアの耐性遺伝子を含む。もっとも好ましいベクターはプラスミド、すなわち染色体DNAとは独立にバクテリア中で複製可能である二重鎖DNA分子である。
【００１９】
上記のベクター、好ましくはプラスミドは、好ましくは、微生物のゲノムの第１の部分、好ましくは改変される遺伝子（標的遺伝子と呼ぶ）の上流部分、に相同な配列および微生物のゲノムの第２の部分、好ましくは標的遺伝子の下流部分、に相同な配列を核酸分子に隣接して含む。「隣接」という用語はゲノムの第１の部分に相同な当該配列が核酸分子の一方の側に位置し、ゲノムの第２の部分に相同な配列が核酸分子の他方の側に位置することを示すのに用いられる。
【００２０】
ゲノムの第１の部分に相同な配列は、ゲノムの第１の部分、好ましくは改変また欠失される遺伝子の上流部分、に相同な配列の２０〜１０００ｂｐ、より好ましくは３０〜５００ｂｐ、より好ましくは４０〜２５０ｂｐ、より好ましくは５０〜８０ｂｐを含んでいることが好ましい。遺伝子の上流部分に相同な配列は、好ましくは開始コドンを含む。
【００２１】
ゲノムの第２の部分に相同な配列は、ゲノムの第２の部分、好ましくは改変また欠失される遺伝子の下流部分、に相同な配列の２０〜１０００ｂｐ、より好ましくは３０〜５００ｂｐ、より好ましくは４０〜２５０ｂｐ、より好ましくは５０〜８０ｂｐを含んでいることが好ましい。遺伝子の下流部分に相同な配列は、好ましくは、終止コドンを含む。
【００２２】
ゲノムの第１および／または第２の部分、好ましくは標的遺伝子、に相同なこれらの配列は、当該ゲノムの配列と比べて改変された配列を含んでいてもよい。「改変する」（altering）、「改変」（alteration）および「改変された」（altered）という用語は、相同配列内の任意の位置の１つ以上のヌクレオチドの置換、１つ以上のヌクレオチドの挿入、および／または１つ以上のヌクレオチドの欠失を指す。
【００２３】
１つ以上のヌクレオチドの置換は、第１の部分および／または第２の部分、好ましくは遺伝子の上流および／または下流部分に相同な配列において１つ以上のヌクレオチドを改変することにより達成することができる。相同性を有する第１の部分と相同性を有する第２の部分がゲノム上、好ましくは標的遺伝子上の隣接する領域を含む場合、ターゲティングベクターを組み込むとゲノムが改変される。
【００２４】
上記のベクター、好ましくはプラスミドは、好ましくは、さらに本発明の核酸分子の一端にエンドヌクレアーゼのための認識部位と、本発明の核酸分子の他端にこの認識部位のコピーを含む。上記認識部位は、好ましくは本発明の核酸分子に直接隣接して位置している。上記エンドヌクレアーゼは、好ましくは、レアカッターエンドヌクレアーゼ（rare-cutting endonuclease）であり、例えばPacI (標的認識配列5'-TTAATTAA); AscI (標的認識配列5’-GGCGCGCC)、および AsiSI (標的認識配列5'-GCGATCGC)である。PacI, AscIおよび AsiSIはニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）から入手できる。このエンドヌクレアーゼは、好ましくは、ホーミングエンドヌクレアーゼ（homing  endonuclease）である。ホーミングエンドヌクレアーゼという用語は、イントロン内の独立の遺伝子として、宿主タンパク質との融合体として、または自己スプライシングインテイン（self-splicing intein）としてコードされているエンドヌクレアーゼを指す。好適なホーミングエンドヌクレアーゼのリストが表１に示されている。ホーミングエンドヌクレアーゼの例としては、さらに、I-DirI、I-NjaI, I-NanI、I-NitI、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、I-CsmIがあるが、これらはすべて当業者に知られている。さらなるホーミングエンドヌクレアーゼの例がBenjamin K (米国特許出願公開第US2012/052582号明細書)に記載されており、本書に参照により組み込まれる。
【００２５】
上記ベクター、好ましくはプラスミドは、好ましくは、さらに核酸配列を含み、該核酸配列は２０〜２００ｂｐ、好ましくは３０〜１００ｂｐ、より好ましくは約４０〜５０ｂｐであり、本発明の核酸分子のいずれかの側、好ましくはエンドヌクレアーゼを認識する認識部位の外側に複製されている（重複している（duplicated））。好ましくは、上記２０〜２００ｂｐの核酸配列は、本発明の核酸分子の一端において、標的遺伝子の上流部分に相同な配列とエンドヌクレアーゼを認識する認識部位の間に位置し、本発明の核酸分子の他端において、標的遺伝子の下流部分に相同な配列とエンドヌクレアーゼを認識する認識部位の間に位置する。複製されている核酸配列は、標的ゲノム上、好ましくは標的遺伝子上の領域に相同であることが好ましい。この２０〜２００ｂｐの重複されている核酸配列を用いると、相同組換えにより、標的ゲノムから継ぎ目のないマーカーの除去が確実に実現される。
【００２６】
本発明は、さらに、本発明の核酸分子を含む微生物、好ましくは酵母を生産する方法を提供する。この方法は、前記微生物に本発明の核酸分子を与え、前記核酸分子を有する微生物を選択し、それにより本発明の核酸分子を含む微生物を生産するものである。
【００２７】
本発明の核酸分子を有する微生物、好ましくは酵母を選択する方法は当業者に知られており、サザンブロッティングおよび、増幅であって、前記核酸分子の少なくとも一部分を含む核酸生産物を、前記核酸分子に特異的な少なくとも１つのプライマーを用いて増幅することを含む。あるいはまた、本発明の核酸分子を備えるベクターは、好ましくは、さらに選択可能なマーカーを備え、該選択可能なマーカーは本発明の核酸分子を含む微生物の選択を可能にするものである。
【００２８】
ここに用いられている「特異的」という用語は、当業者に知られているように、ストリンジェントな条件を適用した際、典型的には核酸の複合混合物中の、その標的部分列（target subsequence）のみにハイブリダイズするが本質的には他の配列にはハイブリダイズしないプライマーまたはポリヌクレオチドをいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり状況毎に異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範囲の案内がTijssen (Tijssen, (1993) Hybridization with Nucleic Acid Probes, vol. 2, Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, Volume 24. Elsevier, Amsterdam)にある。通常、ストリンジェントな条件は規定イオン強度、ｐHにおける特異的配列の熱融点（Tm）よりも約５〜１０℃低く選ばれる。このTmは、平衡状態で、標的に相補的なプライマーの５０％が標的配列にハイブリダイズする（規定イオン強度、ｐHおよび核酸濃度における）温度である（標的配列は過剰に存在するので、Tmにおいて、プローブの５０％が平衡状態にある）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩類）であり、温度が短いプローブ（例えば１０〜５０個のヌクレオチド）に対して約３０℃以上および長いプローブ（例えば５０個のヌクレオチド超）に対して約６０℃以上である。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに対して、陽性シグナルはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２倍、好ましくは１０倍である。
【００２９】
本発明の好適な方法は、選択マーカーをコードする核酸分子を機能的に発現する微生物、好ましくは酵母の選択を含む。例えば、酵素活性アッセイで決定されるように、グアニジノブチラーゼおよび／またはアグマチナーゼを発現する酵母を選ぶことができる。グアニジノブチラーゼまたはアグマチナーゼ活性を決定する方法は当技術において知られている。生産された尿素の量は、例えばアーチボールド（Archibald）法(Archibald, (1945) J Biol Chem 157: 507-518)を用いて定量することができる。尿素０〜１ｍＭの範囲の検量線を作成して尿素の量を定量することができる。
【００３０】
本明細書において「機能的に発現する」という用語は、関心のある遺伝子が該遺伝子によりコードされるタンパク質を活性型で発現することを示す。
【００３１】
上記微生物、好ましくは酵母、好ましくはサッカロマイセス科（Saccharomycetaceae）の酵母が選ばれるのが好ましいのは、基質、好ましくはグアニジノブチレートおよび／またはアグマチンを唯一の窒素源として含む合成培地において成長できるからである。
【００３２】
本発明は、さらに、本発明の核酸分子を含む微生物、好ましくは酵母を提供する。上記本発明の核酸分子は、好ましくは、上記微生物のゲノム内に組み込まれる。
【００３３】
上記微生物は、好ましくはサッカロマイセス科（Saccharomycetacea）の微生物であり、グアニジノブチラーゼをコードするヌクレオチド、好ましくはクルイウェロマイセス・ラクティスNRRL Y-1140推定タンパク質をコードする、グアニジノブチラーゼ・コード化ヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
本発明の方法は全ての微生物に適用することができる。微生物が内因性のグアニジノブチラーゼおよび／またはアグマチナーゼ活性を有するならば、この微生物の変異体はこの活性を不活化されて提供される。微生物においてグアニジノブチラーゼまたはアグマチナーゼをコードする遺伝子を不活化する方法は当業者に知られている。好適な方法が、例えば、Akada et al., (2002). Yeast 19: 393-402; McNabb et al., (1997). Biotechniques, 22: 1134-1139; Storici et al., (1999). Yeast 15: 271-283; Gueldener et al., (2002) Nucleic Acids Res 30: e23; および Iwaki and Takegawa, (2004). Biosci Biotechnol Biochem 68: 545-550に記載されている。これらの方法のいずれをもグアニジノブチラーゼおよび／またはアグマチナーゼをコードする内因性の遺伝子が機能的に不活化された微生物を生成するのに利用することができる。
【００３５】
ここに用いられている「機能的に不活化される」という用語は、微生物の遺伝子のタンパク質生産物の機能的存在が低減されていることを示し、この低減は、発現レベルが低減されているか、またはタンパク質の活性のレベルが低減されているかのいずれかによる。上記低減された機能的存在は、関連する微生物であって前記機能的に不活化された遺伝子を含まない微生物における相当するタンパク質活性と比べて、好ましくはタンパク質の量および／または活性の９０％を超える低減、より好ましくはタンパク質の量および／または活性の９５％を超える低減、最も好ましくはタンパク質の量および／または活性の９９％を超える低減を招来する。最も好ましい実施の形態では、機能的に不活化された遺伝子は残留活性がなく、ノックアウト遺伝子と同等である。「ノックアウト」遺伝子という用語は、当該遺伝子をコードするゲノムDNAからコード領域を部分的にまたは完全に欠失させることにより機能的に不活化されている遺伝子を指す。
【００３６】
本発明の微生物、好ましくは酵母は、好ましくはサッカロマイセス科（Saccharomycetaceae）の酵母である。この属はサッカロマイセス・センス・ストリクト（Saccharomyces sensu stricto）、カザフスタニア（Kazachstania）、ナウモボジマ（Naumovozyma）、 ナカセオマイセス（Nakaseomyces） およびバンデルワルトジマ（Vanderwaltozyma）を含む。サッカロミセス科ファミリーに属するこれらの属が、この亜門（subphylum）の進化に重要な役割を果たした全ゲノム重複イベント後(post WGD)に現れることが提案されている。
【００３７】
窒素代謝をサッカロマイセス・セレビシエとクルイウェロマイセス・ラクティスの間で比べると、これら２つの酵母種の間にアルギニン同化に実質的な差があることが分かった。単一のＳ・セレビシエのアルギナーゼ遺伝子CAR1の欠失はアルギニンを唯一の窒素源とする成長を停止させるのに十分であったが、Ｋ．ラクティスにおける対応するKlcar1Δ変異体は依然としてアルギニンで成長可能であった。この表現型の相違は、Ｋ．ラクティスにおいて、菌類ではこれまでに実証されていない酵素であるグアニジノブチラーゼ(EC.3.5.3.7)をコードする遺伝子（KLLA0F27995g/KlGBU1）が存在することにより引き起こされた。この酵素が存在するため、グアニジノブチレートを唯一の窒素源として成長する能力が得られる。
【００３８】
グアニジノブチラーゼのオーソログは、WGDより後 のサッカロマイセス科には存在しないことが発見された。注目に値するのは、SGD データベース(www.yeastgenome.org/)から入手可能な、EC1118株に属する３４例の注釈されたＳ．セレビシエのゲノム配列の内１例において、予想されるタンパク質配列がクルイウェロマイセス・ラクティスのグアニジノブチラーゼ配列と６２％の配列同一性を有する遺伝子を含んでいることである。EC1118株のゲノム構造をさらに調べた結果、このオーソログは水平伝播により、ほぼ確実にトルラスポラ・デルブリュッキイ（Torulaspora delbrueckii）から獲得されたゲノム領域上に見出されることが分かった。この遺伝子の起源は、WGD以前のサッカロマイセス科の属(ジゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）、ラチャンセア（Lachancea）、トルラスポラ（Torulaspora）、クルイウェロマイセス（Kluyveromyces） およびエレモテシウム（Eremothecium）)において、並びにCTGグループおよびディポダスカス科（Dipodascacae）に属する属においてグアニジノブチラーゼのオーソログの系統発生的分布に適合している(Kurtzman, (2003) FEMS Yeast Res 4: 233-245; Dujon, (2010) Nat Rev Genet 11: 512-524)。
【００３９】
好適な酵母は、実験室用、野生型および産業用のラガー醸造酵母サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）、実験室用、野生型および産業用のＳ．セレビシエ株、好ましくはサッカロマイセス・センス・ストリクト（Saccharomyces sensu stricto） (サッカロマイセス・パラドクサス（Saccharomyces paradoxus）, Ｓ．ミカテ（S. mikatae）, Ｓ．バヤヌス（S. bayanus）, Ｓ．ユーバヤヌス（S. eubayanus）, Ｓ．クドリアブゼビイ（S. kudriavzevii）, Ｓ．パラドクサス（S. paradoxus）, Ｓ．アルボリコルス（S. arboricolus）)、またはカザフスタニア（Kazachstania）, ナウモボジマ（Naumovozyma）,ナカセオマイセス（Nakaseomyces） またはバンデルワルトジマ（Vanderwaltozyma）株であり、もっとも好ましい酵母は実験室用、野生型および産業用のラガー醸造酵母サッカロマイセス・パストリアヌスまたはＳ．セレビシエ株である。
【００４０】
本発明は、さらに、微生物のゲノム、好ましくは酵母のゲノム、好ましくはサッカロマイセス科の属の酵母のゲノムを改変する方法を提供する。この方法は、本発明の核酸分子、好ましくはグアニジノブチラーゼをコードするもの、より好ましくはクルイウェロマイセス・ラクティス NRRL Y-1140推定タンパク質をコードするものを前記微生物に与えること、ゲノムが前記本発明の核酸分子のゲノムへの挿入により変異させられている微生物を選択することを含む。好適な方法は、本発明の１組のコンストラクトを前記微生物に与えること、ゲノムが改変された微生物を、好ましくは前記グアニジノブチラーゼを機能的に発現する微生物の選択により、選択することを含む。好適な方法は、唯一の窒素源としてグアニジノブチラーゼの存在下に培養することにより微生物を選択することを含む。
【００４１】
本発明は、さらに、１組のコンストラクトを提供する。このコンストラクトは、請求項１に示される選択マーカーをコードするヌクレオチド配列の第１の部分を含む第１のコンストラクトと、請求項１に示される選択マーカーをコードするヌクレオチド配列の第２の部分を含む第２のコンストラクトとを備え、前記選択マーカーの前記第１の部分の断片（fragment）が前記ヌクレオチド配列の前記第２の部分中に存在する断片と重なり合い、前記ヌクレオチド配列の前記第１および第２の部分の間で組み替えが可能である。
【００４２】
この１組のコンストラクトは、選択マーカーの正しい発現がターゲッティングコンストラクト間の組換えイベントによって決まる１組のターゲティング構築物を提供することにより、低ターゲティング効率を克服している。ターゲティングコンストラクト間の組換えイベントの発生は、正しいターゲティング遺伝子座にターゲティングコンストラクトを組み込んだ後に顕著に増加した。従って、１組のターゲティングコンストラクトを含む本発明の標的システムは、選択マーカーを発現する微生物において単一ベクターターゲティングシステムと比べて正しく組み込まれたコンストラクトのパーセンテージ（割合）を大いに高める。２つの分離したコンストラクト上でマーカーを分割すると、単一交差イベントによる偽陽性の発生が制限される。この分割マーカー法は偽陽性に対する真陽性の比率を向上させる(Nielsen et al., 2006. Fungal Gen Biol 43: 54-64)。
【００４３】
ここに用いられている「コンストラクト」または「ターゲティングコンストラクト」という用語は人工的に構築された核酸のセグメントを指す。好ましいコンストラクトは、ベクター、好ましくはバクテリアにおいて増殖するためのバクテリアの耐性遺伝子を含むベクターである。もっとも好ましいコンストラクトは、プラスミド、つまり染色体DNAとは独立にバクテリア内で複製可能である線状または環状二重鎖DNAである。
【００４４】
ここに用いられているように、「重なり合い（overlap）」という用語は、両方の組のコンストラクト上に存在する１つの選択マーカーをコードするヌクレオチド配列の重複する領域を指す。重複する領域は実質的に同等であり、好ましくは４０〜４００ｂｐ、好ましくは約２００ｂｐである。ここに用いられているように、「実質的に」という用語は、ターゲティングコンストラクト間の効率的な組換えを確実に実現するために少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、より好ましくは少なくとも９９％同一、より好ましくは１００％同一であることを指す。
【００４５】
前記１組のターゲティングコンストラクト中の第１のコンストラクトは、好ましくは、さらに、エンドヌクレアーゼの認識部位と微生物の標的ゲノムと相同性を有する第１の領域を含み、前記第２のコンストラクトは、さらに、前記微生物の前記標的ゲノムと相同性を有する第２の領域と前記エンドヌクレアーゼ認識部位のコピーとを含み、ここで、前記エンドヌクレアーゼをコードし、誘導可能なプロモーターに結合されているコーディング配列が、前記第１または第２のコンストラクト上に存在し、かつ前記第１のコンストラクト上の前記標的ゲノムと相同性を有する第１の領域の一部分が、前記第２のコンストラクト上の前記エンドヌクレアーゼ認識部位のコピーと、前記標的ゲノムと相同性を有する第２の領域の間に複製されているか、または前記第２のコンストラクト上の前記標的ゲノムと相同性を有する第２の領域の一部分が、前記第１のコンストラクト上の前記標的ゲノムと相同性を有する第１の領域と前記エンドヌクレアーゼ認識部位との間で複製されている。
【００４６】
前記第１および第２のターゲティングコンストラクト上の標的ゲノムと相同性を有する複製されている（重複している）領域は、好ましくは２０〜２００ｂｐ、好ましくは４０〜１００ｂｐ、好ましくは約８０ｂｐである。前記第１および第２のターゲティングコンストラクト上の標的ゲノムと相同性を有する複製されている領域は、相同組換えにより標的ゲノムから前記マーカーを傷跡を残さず除去することを可能にする。
【００４７】
好ましくは、前記第１のコンストラクトは、微生物の標的ゲノムと相同性を有する第１の領域、エンドヌクレアーゼ認識部位、および選択マーカーの第１の部分をこの順に含む。好ましくは、前記第２のコンストラクトは、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列の第１の部分と重なり合う領域、それに続く、前記選択マーカーをコードするヌクレオチド配列の第２の部分、誘導プロモーターに結合された前記エンドヌクレアーゼをコードするコーディング配列、前記エンドヌクレアーゼ認識部位のコピー、前記第１のコンストラクト上に存在する標的ゲノムと相同性を有する第１の領域の一部分のコピー、および前記微生物の標的ゲノムと相同性を有する第２の領域をこの順に備える。この構成は図６に描かれている。
【００４８】
前記標的ゲノムは、微生物のゲノム上の任意の位置、好ましくは遺伝子であってもよい。この微生物は、好ましくは酵母であり、好ましくはゲノム配列が改変させられるべきSaccharomytacea属の酵母である。ここに用いられているように、「遺伝子」という用語は遺伝子のイントロンおよびエクソン部分、前記遺伝子のプロモーター領域、および例えばエンハンサー配列のような前記遺伝子の発現を媒介するゲノム配列を備える微生物のゲノムの一部分を指す。
【００４９】
当業者に了解されているように、ターゲティングコンストラクトは微生物の遺伝子を改変するのに好適に用いられる。従って、本発明がさらに提供するのは、１組のターゲティングコンストラクトであって、微生物の標的遺伝子と相同性を有する第１の領域と、エンドヌクレアーゼ認識部位と、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列の第１の部分とを含む第１のコンストラクトと、前記選択マーカーの第２の部分をコードするヌクレオチド配列が後に続く、前記選択マーカーをコードするヌクレオチド配列の前記第１の部分と重なり合う領域と、前記エンドヌクレアーゼ認識部位のコピーと、前記微生物の標的遺伝子に相同性を有する第２の領域とを含む第２のコンストラクトとを備え、ここで、前記重なり合う断片により前記選択マーカーをコードするヌクレオチド配列の前記第１および第２の部分の間の組換えが可能であり、ここで、誘導プロモーターに結合された前記エンドヌクレアーゼをコードするコーディング配列が前記第１または第２のコンストラクト上に存在し、かつ、ここで、前記第１のコンストラクト上の標的遺伝子に相同性を有する前記第１の領域の一部分が、前記第２のコンストラクト上の前記エンドヌクレアーゼ認識部位のコピーと前記標的遺伝子に相同性を有する前記第２の領域との間に複製されているか、または、前記第２のコンストラクト上の標的遺伝子に相同性を有する前記第２の領域の一部分が、前記第１のコンストラクト上の前記標的遺伝子に相同性を有する第１の領域と前記エンドヌクレアーゼ認識部位との間に複製されている１組のターゲティングコンストラクトである。
【００５０】
前記第１および第２のターゲティングコンストラクト上の標的遺伝子に相同性を有する前記複製されている領域は、好ましくは２０−２００ｂｐ、好ましくは４０−１００ｂｐ、好ましくは約８０ｂｐである。
【００５１】
ゲノム配列の改変という用語は、ゲノム内、好ましくは遺伝子内の任意の位置における１つ以上のヌクレオチドの置換、１つ以上のヌクレオチドの挿入、および／または１つ以上のヌクレオチドの欠失を指す。
【００５２】
例えば、標的遺伝子に相同性を有する第１および第２の領域がこの遺伝子の隣接ゲノム配列を含む場合、前記相同性を有する第１の領域内、および／または前記相同性を有する第２の領域内の１つ以上のヌクレオチドを置換すると、その結果、本発明の１組のターゲティングコンストラクトによる相同性ターゲティングに続いて、この遺伝子の改変が起きる。前記１つ以上のヌクレオチドの置換は、好ましくは、前記第１および第２のコンストラクト上に存在する標的遺伝子に相同性を有する領域において起きる。
【００５３】
前記ゲノム配列の改変は、好ましくは、１つ以上のヌクレオチドの欠失であり、好ましくは前記遺伝子内の任意の部位において起きる。例えば、標的遺伝子に相同性を有する前記第１および第２の領域が、その遺伝子のゲノム配列であって、前記生物のゲノム上に分離されているゲノム配列を含む場合、本発明の前記１組のターゲティングコンストラクトを用いた相同性ターゲティングに続いて前記遺伝子を改変させると、その結果、親染色体上の前記第１および第２の相同性を有する領域の間に位置する領域の欠失が起きる。
【００５４】
前記第１のコンストラクトは、好ましくは、前記選択マーカーをコードする領域の第１の部分、好ましくは最初の３分の２または最初の半分を含む。例えば、Ｋ．ラクティスのグアニジノブチラーゼタンパク質は４１０個のアミノ酸を有し、１２３０ｂｐの核酸配列によりコードされている。前記第１のコンストラクトは、好ましくは、このタンパク質のコーディング領域の４００−８００ｂｐ、さらに好ましくは、５００−７００ｂｐを含む。前記第２のコンストラクトは、好ましくは、このタンパク質のコーディング領域の４００−８００ｂｐ、さらに好ましくは５００−７００ｂｐを含む。
【００５５】
前記選択マーカーの第１および第２の部分の間の重なり合う領域は、好ましくは約５０ｂｐ−約６００ｂｐ、好ましくは約２００ｂｐである。
【００５６】
前記第１または第２のターゲティングコンストラクトは誘導可能なプロモーターに結合されているエンドヌクレアーゼをコードするコーディング配列を含む。。このエンドヌクレアーゼは、好ましくはレアカッター・エンドヌクレアーゼ、例えば、PacI (標的認識配列  5'-TTAATTAA)、AscI (標的認識配列  5’-GGCGCGCC)、AsiSI (標的認識配列  5'-GCGATCGC)である。PacI、AscI、およびAsiSIはニュー・イングランド・バイオラブズから入手可能である。このエンドヌクレアーゼは、より好ましくはホーミング・エンドヌクレアーゼである。ホーミング・エンドヌクレアーゼという用語は、イントロン内の自立遺伝子として、宿主タンパク質との融合物として、または自己スプライシングを行うインテインとしてコードされているエンドヌクレアーゼを指す。好適なホーミング・エンドヌクレアーゼのリストが表１に示されている。ホーミング・ヌクレアーゼの追加の例としてはI-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、I-CsmIがあり、これらはすべて当業者に知られている。ホーミング・ヌクレアーゼのさらなる例は米国特許出願公開第2012/052582号明細書に記載されている。同出願公開公報明細書は引用により本願明細書において参照される。
【００５７】
好適なホーミング・エンドヌクレアーゼは、PI-PspI (New England Biolabs; 認識配列5’-TGGCAAACAGCTATTATGGGTATTATGGGT))またはPI-SceI (New England Biolabs; 認識配列5’-ATCTATGTCGGGTGCGGAGAAAGAGGTAAT)である。ほとんどのホーミング・エンドヌクレアーゼのコーディング配列は知られている。例えば、PI-SceIのコーディング配列およびPI-PspIのコーディング配列は公共データベースから入手可能である(それぞれGenBank 登録番号 Z74233.1およびGenbank 登録番号 U00707.1)。当業者には了解されているように、公に入手できるヌクレアーゼ用配列と異なる配列もヌクレアーゼをコードしている。例えば、PI-PspIコーディング領域は、公に入手可能な配列から、例えばコドン最適化により、逸脱した配列を含んでいてもよいが、このものは依然として示された標的認識配列を認識して、これを消化する活性エンドヌクレアーゼを発現させる。
【００５８】
前記エンドヌクレアーゼは誘導可能なプロモーターの制御下にあるのが好ましい。誘導可能なプロモーターという用語は、ここで用いられているように、発現が制御可能なプロモーターを指す。誘導可能なプロモーターは当業者に知られている。酵母に用いられている誘導プロモーターの例は、GAL1プロモーターとGAL10プロモーター−これらはいずれもガラクトースにより誘導可能である−、SUC2プロモーター−これはスクロースにより誘導可能である−、MAL12プロモーター−これはマルトースにより誘導可能である−、CUP1プロモーター−これは銅により誘導可能である−、およびtetO7およびtetO2プロモーター−これらはいずれもテトラサイクリンにより誘導可能である−である[Gari et al., (1997) Yeast 13: 837-48; Yen et al., (2003) Yeast 20 1255-62]。好適な誘導可能なプロモーターはGAL1プロモーターである。
【００５９】
エンドヌクレアーゼ用の標的認識配列を含む１つの認識部位は、第１のコンストラクト上の微生物の標的遺伝子と相同性を有する第１の領域に隣接して（の背後に）位置している。この認識部位のコピーは第２のコンストラクト上の前記微生物の標的遺伝子に相同性を有する第２の領域に隣接して（の前に）位置している。当業者に了解されるように、前記第１のコンストラクト上の標的遺伝子に相同性を有する第１の領域の一部分が、前記第２のコンストラクト上の前記エンドヌクレアーゼ認識部位のコピーと標的遺伝子に相同性を有する第２の領域との間に複製されているときに、前記認識部位のコピーは前記第２のコンストラクト上で、標的遺伝子に相同性を有する第１の領域の複製物に隣接して（の前に）位置している。あるいはまた、前記認識部位は前記第１のコンストラクト上で、標的遺伝子に相同性を有する第２の領域の前記複製されている部分に隣接して（の背後に）位置しているが、これは前記第２のコンストラクト上の標的遺伝子に相同性を有する前記第２の領域の一部分が前記第１のコンストラクト上に複製されているときである。プロモーター配列およびターミネーター配列を含む選択マーカー並びに誘導可能なプロモーターをを含むエンドヌクレアーゼのコーディング領域は前記第１のコンストラクト上の認識部位と前記第２のコンストラクト上のこの認識部位のコピーとの間にある。
【００６０】
本発明がさらに提供するのは、微生物においてゲノム、好ましくは標的遺伝子を変異させる方法であって、本発明の前記１組のターゲティングコンストラクトを前記微生物に与えることと、ゲノムが改変された微生物を選択することとを備える方法である。前記ゲノムが改変された微生物の選択は、好ましくは、組み換えられた選択マーカーを機能的に発現する微生物を選択することにより達成される。
【００６１】
上述のように、ターゲティングコンストラクト同士の間の組換えイベントが発生する頻度は前記ターゲティングコンストラクトを正しいターゲティング位置に組み込んだ後に顕著に高まった。従って、機能的に組換えられた選択マーカーの存在は、標的ゲノムにおける正しく組み込まれたターゲティングコンストラクトの存在を強く示しており、従って前記微生物中における改変されたゲノムの存在を強く示している。
【００６２】
上に示したように、改変する（altering）、改変（alteration）、および改変された（altered）という用語は、ゲノムの任意の位置、好ましくは標的遺伝子内の、１つ以上のヌクレオチドの置換、１つ以上のヌクレオチドの挿入、および／または１つ以上のヌクレオチドの欠失を指す。
【００６３】
１つ以上のヌクレチドの置換は、前記相同性を有する第１の領域および／または相同性を有する第２の領域における１つ以上のヌクレオチドを改変することにより達成することができる。前記標的ゲノムに相同性を有する前記第１の領域および第２の領域は、前記ゲノム、好ましくは標的遺伝子の隣接領域をカバーしている場合、ターゲティングベクターが組み込まれると、その結果、ゲノムの改変が起きる。存在する場合、前記１つ以上のヌクレオチドの置換は、好ましくは、前記第１のコンストラクト上および第２のコンストラクト上に存在するゲノムに相同性を有し重なり合う領域における１つ以上のヌクレオチドを改変することにより達成される。
【００６４】
前記ゲノム配列の改変は、ゲノム内、好ましくは遺伝子内の任意の位置における１つ以上のヌクレオチドの欠失であることが好ましい。例えば、標的ゲノムに相同性を有する前記第１および第２の領域が生物のゲノム上で分離されたゲノム配列を含む場合、本発明の１組のターゲティングコンストラクトを用いて相同性ターゲティングに続くゲノムの改変を行うと、その結果、親染色体上の前記第１および第２の相同性を有する領域の間に位置する領域が欠失する。
【００６５】
本発明がさらに提供するのは、改変されたゲノム、好ましくは改変された遺伝子、を含む微生物を生産する方法である。この方法は、本発明の１組のターゲティングコンストラクトを前記微生物に与えること、およびゲノムが改変され、組み換えられた選択マーカーを機能的に発現する微生物を選択することを含む。
【００６６】
前記改変されたゲノムを含む微生物を生産する方法は、エンドヌクレアーゼの発現を誘導可能なプロモーターを誘導し、それにより選択マーカーと前記エンドヌクレアーゼのコーディング領域であって前記誘導可能なプロモーターを含むものを前記標的ゲノムから除去することを含む。
【００６７】
本発明がさらに提供するのは、本発明の方法により生成されたゲノム改変を含む微生物である。存在する場合、前記第１および第２のターゲティングコンストラクト上の標的ゲノムに相同性を有する複製されている領域により、相同組換えにより標的ゲノムからのマーカーの除去が継ぎ目なく行われることが確実になる。得られた微生物は、前記第１および／または第２のターゲティングコンストラクト上に存在していた、またはターゲティングゲノム内にターゲティングコンストラクトを組換えにより導入することにより、例えばターゲティングゲノム内へ挿入することもしくはターゲティングゲノムから除去することにより誘導された、１つまたは複数の改変のみを含む。
【００６８】
本発明がさらに提供するのは、ゲノム改変（genomic  alteration)、好ましくは標的遺伝子の改変を含む微生物であって、該改変は機能的に組換えられた選択マーカーと誘導可能なプロモーターに結合されたエンドヌクレアーゼ用コーディング配列の挿入を含み、ここで前記標的ゲノムが該挿入の両部位においてエンドヌクレアーゼ認識配列を１コピーずつ含む微生物である。
【００６９】
本発明がさらに提供するのは、本発明の核酸分子または本発明の１組のコンストラクトを含むキットである。前記キットは、さらに、微生物、好ましくは酵母、好ましくはサッカロマイセス科の酵母の、グアニジノブチレートおよび／またはアグマチンを含む合成培地中における成長方法および手段、および／またはグアニジノブチラーゼまたはアグマチナーゼ酵素の同定手段、例えばグアニジノ酪酸および／またはアグマチンを備えていてもよい。
【００７０】
また、本発明が提供するのは、微生物、好ましくは酵母、好ましくはサッカロマイセス科の酵母を、唯一の窒素源としてのグアニジノブチレートまたはアグマチンの存在下に培養する方法であって、該方法は、（ａ）本発明の核酸分子を前記微生物中に導入すること、および（ｂ）該微生物をヌクレオチド分子が該微生物中で発現されるように培養することを含む。
【００７１】
また、本発明が提供するのは、微生物、好ましくは酵母、好ましくはサッカロマイセス科の酵母を、唯一の窒素源としてのグアニジノブチレートまたはアグマチンの存在下に培養する方法であって、該方法は、（ａ）前記微生物に本発明の１組のコンストラクトを導入すること、および（ｂ）前記ターゲティングコンストラクトの組換えに続いて選択マーカーをコードするヌクレオチド分子が前記微生物中に発現されるように該微生物を培養することを含む。
【００７２】
さらに、本発明が提供するのは、改変されたゲノムを含む微生物を生産する方法である。該方法は、ゲノム、好ましくは標的遺伝子の改変を備える微生物を提供することであって、この改変は、選択マーカーをコードする機能的に組み換えられたヌクレオチド配列および誘導可能なプロモーターに結合されたエンドヌクレアーゼ用コーディング配列の挿入を含み、ここで前記標的ゲノムは、該挿入の両部位上にエンドヌクレアーゼ認識配列を１コピーずつ含むこと、および前記誘導可能なプロモーターを誘導して前記エンドヌクレアーゼ認識配列の間の前記核酸配列を除去することを含む。この場合も、存在する場合、前記第１および第２のターゲティングコンストラクト上の標的遺伝子に相同性を有する複製されている（重複している）領域は、ゲノムＤＮＡに、相同な小片を設けて破壊されたＤＮＡ鎖を効率的に再結合することにより、相同組換えによって標的ゲノムからのマーカーの除去が途切れることなく行われることを確実にする。得られた微生物は、前記第１および／または第２のターゲティングコンストラクト上に存在していた、またはターゲティングゲノム内にターゲティングコンストラクトを組換えにより導入すること、例えばターゲティングゲノム内へ挿入することもしくはゲノムから欠失すること、好ましくは標的遺伝子内へ挿入することもしくは標的遺伝子を欠失することもしくは標的遺伝子内で欠失することにより誘導された、１つまたは複数の改変のみを含む。
【００７３】
明確にかつ簡潔に説明するために、いくつかの特徴は同一または個別の実施の形態の一部分として記載されているが、本発明の範囲には記載された特徴の内のすべてまたはいくつかの特徴の組合せを有する実施の形態が含まれていているものと了解される。
【００７４】
【表１】
0006764788.tif 000002
0006764788.tif 000003
0006764788.tif 000004
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0006764788.tif 000009
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【００７５】
略語集：SF：構造ファミリー：HI: LAGLIDADGファミリー、HII: GIY-YIGファミリー、HIII: H-N-Hファミリー、HIV: His-Cysボックスファミリー
D：起源の生物学的ドメイン：Ａ：古細菌、Ｂ：細菌（バクテリア）、Ｅ：真核生物
ＳＣＬ：細胞内での位置：chloro:葉緑体、chrm:染色体、mito:ミトコンドリア、nuclear:染色体外の核、phage:バクテリオファージ
【００７６】
【表２】
0006764788.tif 000011
【００７７】
【表３】
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【００７８】
【表４】
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【００７９】
【表５】
0006764788.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】真核生物のアルギニン代謝における主要反応の概観を示す図である。太線はウレオヒドロラーゼ反応を示す。EC 3.5.3.1:アルギナーゼ、EC 4.1.1.17：オルニチンデカルボキシラーゼ、EC 2.6.1.13:オルニチンアミノトランスフェラーゼ、EC 1.5.1.2: 1-ピロリジン-5-カルボン酸レダクターゼ、EC 1.5.99.8:プロリンデヒドロゲナーゼ、EC 1.5.1.12: 1-ピロリン-5-カルボキシレートデヒドロゲナーゼ、EC  2.6.1：アミノトランスフェラーゼ、EC 4.1.1.75：2-オキソ酸デカルボキシラーゼ（2-oxo acid decarboxylase）、EC 1.2.1.54：γ−グアニジノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（gamma-guanidinobutyraldehyde dehydrogenase）、EC 3.5.3.7：グアニジノブチレート、EC 2.6.1.19：GABAトランスアミナーゼ、EC 1.2.1.16：スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（succinate-semialdehyde dehydrogenase）
【図２ＡＡ】サッカロマイセス亜門（Saccharomycotina）酵母のグアニジノ酸ヒドロラーゼ(EC.3.5.3.7)アミノ酸配列のアラインメント（整列）を示す図である。これらのアミノ酸配列はClustal W (V1.7)を用いてアラインメントした。すべての配列中に保存されているアミノ酸残基は符号＊が付されている。参照  XP_456325: クルイウェロマイセス・ラクティスNRRL Y-1140由来のGBU1、XP_002498240: Zygosaccharomyces rouxii CBS 732、XP_716668: カンジダ・アルビカンス（Candida albicans） SC5314、XP_461566: デバリオマイセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii） CBS767、EIF45280: デッケラ・ブルクセレンシス（Dekkera bruxellensis） AWRI1499、 BAO40383: クルイウェロマイセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus） DMKU3-1042、AADM01000201.1: Lachancea waltii NCYC 2644、XP_503530: ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica） CLIB122、EFW95653.1: オガタエア・パラポリモルファ（Ogataea parapolymorpha） DL-1 (Hansenula polymorpha)、XP_002552049: ラチャンセア・サーモとれランス（Lachancea thermotolerans） CBS 6340 (Kluyveromyces thermotolerans CBS6340)、XP_001523956: ロッデロマイセス・エロンジスポラス（Lodderomyces elongisporus） NRRL YB-4239、XP_001482640: メエロジーマ グイリエルモンディ（Meyerozyma guilliermondii） ATCC 6260 (Pichia guilliermondii ATCC6260)、XP_004196483: メヤロジーマ・ファリノサ（Millerozyma farinosa） CBS 7064 (Pichia sorbitophila)、XP_001385334: シェフェルソマイセス・スティピィティス（Scheffersomyces stipitis） CBS 6054 (Pichia stipitis CBS 6054)、XP_003679661: トルラスポラ・デルブリュッキイ（Torulaspora delbrueckii ）CBS 1146、AACE03000003.1: ラチャンセア・クルイウェリ（Lachancea kluyveri ）NRRL Y-12651。コンセンサス配列は、配列アラインメントの下に示され、アミノ酸は配列の少なくとも５０％において保存されている。太字および下線を引かれたアミノ酸はグアニジノ酸ヒドロラーゼ中に見出される保存された領域を示す。
【図２ＡＢ】サッカロマイセス亜門酵母のグアニジノ酸ヒドロラーゼ(EC.3.5.3.7)アミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図２ＡＣ】サッカロマイセス亜門酵母のグアニジノ酸ヒドロラーゼ(EC.3.5.3.7)アミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図２ＡＤ】サッカロマイセス亜門酵母のグアニジノ酸ヒドロラーゼ(EC.3.5.3.7)アミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図２ＡＥ】サッカロマイセス亜門酵母のグアニジノ酸ヒドロラーゼ(EC.3.5.3.7)アミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図２Ｂ】配列アラインメントに由来する保存されたグアニジノ酸ヒドロラーゼモチーフを表すWeblogo (Schneider and Stephens (1990). Nucleic Acids Research 18, 6097-6100)を示す図である。
【図３】Ｋ．ラクティスタンパク質XP_456325.1のGenBank寄託を示す図である。
【図４ＡＡ】細菌のグアニジノアミドヒドロラーゼ(EC.3.5.3.11)アミノ酸配列のアラインメントを示す図である。これらのアミノ酸配列はClustal W (V1.7)を用いてアラインメントした。すべての配列中に保存されているアミノ酸残基は符号＊が付されている。NP_289508: 大腸菌（Escherichia coli）、WP_000105576: シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）、YP_005016506: クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca） KCTC 1686、YP_001337000: クレブシエラ・ニューモニエ亜種（Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae） MGH 78578、YP_003614749: エンテロバクター・クロアカ亜種（Enterobacter cloacae subsp. Cloacae） ATCC 13047、YP_001455807: シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri ）ATCC BAA-895、XP_004532666: Ceratitis capitata、WP_006734551: サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、AHE29794: バークホルデリア・シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei ）NCTC 1317。配列アラインメントから生成されたコンセンサス配列。配列アラインメントから生成されたコンセンサス配列  コンセンサス配列は、配列アラインメントの下に示され、アミノ酸は配列の少なくとも５０％において保存されている。太字および下線を引かれたアミノ酸はグアニジノアミドヒドロラーゼ中に見出される保存された領域を示す。
【図４ＡＢ】細菌のグアニジノアミドヒドロラーゼ(EC.3.5.3.11)アミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図４Ｂ】配列アラインメントに由来する保存されたグアニジノアミドヒドロラーゼモチーフを表すWeblogoを示す図である。
【図５】E. coli タンパク質(アグマチナーゼ) AAC75974.1のGenBank寄託を示す図である。
【図６】標準欠失カセット用のすべての必須部分を持つベクター１およびベクター２を示す図である。選択マーカーKlGBU1中の４００塩基の重複（X印で示されている）は相同性により再結合するように設計されている。
【図７】KlGBU1YMマーカーモジュールを含むプラスミドpDS8の遺伝子地図を示す図である。
【図８】グアニジノブチレート上のＳ．セレビシエ株の典型的な成長プロフィール：Ｓ．セレビシエ株CEN.PK113-7D（閉環）およびIME215 (TDH3pr::KlGBU1::CYC1ter)（閉じた正方形）は、振とうフラスコ中、グアニジノブチレートを唯一の窒素源として含むグルコース合成培地で成長させた。
【図９】Ｓ．セレビシエとＳ．パストリアヌスのpUDE264を用いた形質転換を説明する図である。Ｓ．セレビシエCEN.PK113-7D株および Ｓ．パストリアス CBS1483株を、Ｋ．ラクティス由来のグアニジノブチラーゼ遺伝子を保持するpUDE264を用いて形質転換した。形質転換された細胞(50μl)を種々の窒素源（(NH4)2SO4、グアニジノブチレートおよびアグマチン）を含むSM上に植菌した。未形質転換株（-DNA）も同様の培地上に陰性対照として植菌した。
【図１０】欠失カセットの例を示す図である。欠失カセットはいくつかの領域を含む。Ａ−（１）欠失されるべき遺伝子の上流部分に相同で、開始コドンを含む５０−８０ｂｐ配列、および欠失されるべき遺伝子の下流部分に相同で、終止コドンを含む５０−８０ｂｐの配列、並びに（４）アッシビヤ・ゴシッピーTEF2プロモーター、Ｋ．ラクティス GBU1遺伝子、およびＡ．ゴシッピーTEF2ターミネーターを含む選択可能なカセットＢ−上記領域（１）および（４）に加えて、欠失カセットは（２）４０−ｂｐの配列と、その横にあり、マーカー分子の上流および下流のそれぞれに位置する（３）I-SceI制限部位とを含む。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
実施例１
材料および方法
株および維持管理
本研究に用いたサッカロマイセス．セレビシエ株は表２に示されている。このＳ．セレビシエ株はCEN.PKバックグラウンド(Nijkamp et al., (2012) Microb Cell Fact 11: 36; Entian & Kotter, (2007) Meth Microbiol 36: 629-666)において構築された。プラスミドを持たない酵母株はYPD培地（脱イオン水、酵母抽出物10 g/L、ペプトン20 g/L、グルコース20 g/L）上に維持した。プラスミドを保持する酵母株は、塩類、微量元素、およびビタミン類を含み、以前に記載されたように調製および滅菌された合成培地(Verduyn et al., (1992) Yeast 8: 501-517)であって、適用できる場合は硫酸アンモニウムの代わりに尿素を用いた培地上に維持した。培養のストックは、２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを加え、３０℃でインキュベートし２００ｒｐｍで撹拌された振とうフラスコ培養から調製され、８０℃で貯蔵された。
【００８２】
培地および培養条件
成長実験は、塩類、微量元素およびビタミン類を含む合成培地であって、以前に記載されたように調製および滅菌された培地(Verduyn et al., (1992) Yeast 8: 501-517)中で行われた。グルコースを終末濃度が20.0 g/Lとなるように添加した。硫酸アンモニウムが合成培地中の窒素源ではない場合、その代わりにグアニジノブチレートを用い、これをろ過滅菌し、滅菌培地に2.9 g/Lの濃度となるように添加した。さらに、硫酸カリウム3.3 g/Lを添加して硫酸アンモニウムを除去した分を補った。
必要ならば、ウラシル0.15 g/Lおよび／またはG418（ゲネティシン）200 mg/Lを完全培地に添加した。選択寒天プレートはこれらの合成培地に寒天を20.0 g/L添加することにより作製した。
振とうフラスコ培養は、液体培地をそれぞれ100 mlまたは20 ml含む500 mlまたは250 mlの振とうフラスコ中で行われ、オービタルシェーカー(New Brunswick Scientific, Edison,  NJ)中で200 rpm、30 °Cにてインキュベートされた。
【００８３】
Ｓ．セレビシエにおけるＫ．ラクティス KLLA0F27995gのクローニングと過剰発現
原栄養基準株Ｓ．セレビシエ CEN.PK113-7DのゲノムDNAを以前に記載されたように調製した(Burke et al., 2000. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual)。ORF KLLA0F27995g (KlGBU1)をゲノムDNAからクローニングしたが、これにはPhusion Hot-Startポリメラーゼ(Finnzymes)と標３のGBU1順方向プライマー／GBU1逆方向プライマーを用いた。PCR生産物の消化は、SpeIおよびXhoI を用いて行われ、同じ酵素を用いて予め消化されたpAG426GPDccdB  (Alberti et al., (2007) Yeast 24: 913-919; 表４) 中にT4リガーゼ(Life Technologies, Breda, The Netherlands)を用いたクローニングにより導入され、プラスミドpUDE264が得られた。このプラスミドpUDE264をＳ．セレビシエ CEN.PK113-5D (ura3-52)において以前(Gietz & Woods, (2002) Methods Enzymol 350: 87-96)に記載されたLiAc法を用いて形質転換し、IME215 (MATa ura3-52 pUDE264 (TDH3pr-KlGBU1-CYC1terURA3 2μ)株が得られた。バックボーンプラスミドpAG426GPD-ccdBは、Ｓ．セレビシエ CEN.PK113-5D (ura3-52)中で以前(Gietz & Woods, (2002) Methods Enzymol 350: 87-96)に記載されたLiAc法を用いて形質転換され、IMZ312 (MATa ura3-52 pAG426GPD-ccdB (TDH3pr-CYC1ter URA3 2μ)が得られた。
【００８４】
プラスミドpDS8の構築
KLLA0F27995g (KlGBU1) ORFは、pUDE264から、kanR遺伝子の代わりにpDS1に転移された。プラスミドpDS1を構築するために、ベクターpUG6 (Guldener et al. (1996) Nucleic Acids Res 24:2519-24)をPCRのテンプレートとして用いた。PCRは、製造元の指示に従うPhusionTM Hot Start II DNAポリメラーゼ(Thermo Scientific, Waltham, MA)と、プライマー対pUGfw/pUGrvを用いてベクターのバックボーンを増幅し、プライマー対pDSfw/pDSrvを用いて選択マーカーを増幅した。プライマーpUGfwは、XbaI制限酵素認識部位と、８０ｂｐのダイレクト・リピートを構築するのに用いられる４０ｂｐ合成配列（リピートB)を含んでいた。プライマーpUGrvは、BglII制限酵素認識部位と第２の８０ｂｐダイレクト・リピートを構築するのに用いられるもう１つの４０ｂｐ合成配列（リピートA)を含んでいた。プライマーpDSfwは、BglII制限酵素認識部位と、これに続く４０ｂｐのBリピートとを含んでいた。プライマーpDSrvは、XbaI制限酵素認識部位と４０ｂｐのAリピートとを含んでいた。これらのPCRはすべてゲル電気泳動を用いて視覚化された。これらの断片はアガロースゲルからZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit. (Zymo Research, Irvine,CA)を用いて単離された。PCR断片はXbalおよびBgLIIを用いて切断され、T4 DNAリガーゼ（Thermo Scientific）を用いてライゲーションされた。ケミカルコンピテント大腸菌（Escherichia coli）  DH5α株はライゲーションミックスを用いて形質転換され、正しいコロニーが下記のプライマーFK140 pUDI065 fw、SLT1_control_rv, KANMX4 fwおよびFK105‐MP1を用いたPCRにより選択された。kanRの位置にKlGBU1を転移することは、ギブソンアセンブリ（Gibson assembly）により実現された(Gibson et al., (2009) Nat Methods 6: 343-345)。KlGBU1遺伝子を持つ断片が、Phusion Hot-Startポリメラーゼ(Finnzymes)並びにプライマーGBU1-fwおよびGBU1-rv（表３）を用いてPCR増幅された。プラスミドpUDE264はテンプレートとして用いられた。バックボーンプラスミドは、Phusion Hot-Startポリメラーゼ(Finnzymes)並びにプライマーBackbone -fwおよびBackbone-rvを用いてPCR増幅された。プラスミドpDS1がテンプレートとして用いられた。これら２つの断片はそれらの側方（flanks）において少なくとも４３個のヌクレオチドが同一であり、イン・ビトロでNew England Biolabs (Ipswich, MA)社製のギブソンアセンブリ・クローニングキットを用いてアセンブルされた。アセンブルされた混合物はE. coli DH5αにおいて形質転換され、アンピシリン(100mg/L)を含むLBプレート上に植菌された。マーカーモジュールKlGBU1YMを含むアセンブルされたプラスミドは限定分析（restriction analysis)とシークエンシングにより検証され、正しいクローンがpDS8と命名された。
【００８５】
Ｓ．セレビシエにおけるADE2の欠失
Ｓ．セレビシエにおける遺伝子の欠失は、KlGBU1YM(SceI 部位::AgTEF2pr-KlGBU1-AgTEF2ter::SceI 部位)カセットをショート・フランキング・ホモロジー（short-flanking-homology）PCR法(Wach et al., (1994) Yeast 10: 1793-1808)により組み込むことにより行われた。オリゴヌクレオチドの配列が表３に示されている。ADE2用欠失カセットは、Phusion Hot-Startポリメラーゼ(Finnzymes, Landsmeer, オランダ国)と、プライマーGBU1-ADE2ko-CENPK-fw/ GBU1-ADE2ko-CENPK-rvを用いたテンプレートプラスミドpDS8とを用いて増幅された。ADE2欠失カセットを用いたＳ．セレビシエCEN.PK113-7Dの形質転換は、以前(Gietz & Woods, (2002) Methods Enzymol 350: 87-96)に記載されたLiAc法を用いて行われ、IMX598株が得られた。
【００８６】
KlGBU1SYカセットの正しい組み込みと関心のある遺伝子の置換は、ADE2の5’ UTR (非翻訳領域)に特異的な順方向プライマーと欠失カセット用の逆方向プライマー（表３）とを用いた診断（diagnostic）PCRにより検証された。
【００８７】
細胞抽出物の調製
細胞抽出物の調製のために、培養サンプルが遠心分離により採取され、2 mM EDTA を含む10 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.5)を用いて２回洗浄され、-20 °Cで貯蔵された。細胞破壊の前に、サンプルは室温で解凍され、洗浄され、2 mM MgCl2および2 mM ジチオスレイトールを含む100 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.5)中に再懸濁された。抽出物の調製は、0.7 mmのガラスビーズを用い、0．5分間隔で0℃2分間の超音波処理を、MSEソニケーター(Wolf Laboratories Limited, Pocklington, United Kingdom) (出力150 W; 頂点間振幅8 μm)を用いて行われた (Luttik et al., (2008) Metab Eng 10: 141-153)。未破砕細胞とデブリは、4 °C (20 分; 36000 x g)で遠心分離することにより除去された。得られた細胞抽出物は酵素アッセイに用いられた。
【００８８】
酵素活性アッセイ
アルギナーゼ酵素アッセイのために、50μLの細胞抽出物が950μLのマレイン酸マンガン緩衝液(50 mM 硫酸マンガン、50 mM マレイン酸、pH 7)中で１時間３７℃で活性化された(Messenguy et al., (1971) Eur J Biochem 22: 277-286)。アルギナーゼアッセイのための反応混合物は、暗エッペンドルフチューブ中で調製され、活性化された細胞抽出物60 μL、713 mMアルギニン溶液(pH 9.5) 400 μLと脱イオン水を１mLまで含んでいた。反応混合物は30分間37℃でインキュベートされた。反応を停止するために、硫酸−リン酸混合液（脱イオン水中20% v/v濃縮硫酸および60% v/vシロップ状リン酸）0.7 mLが反応混合物に添加された。生成された尿素の量がArchibald法(Archibald, (1945) J Biol Chem 157: 507-518)を用いて定量され、検量線は0〜0.6 mM尿素の範囲であった。α−イソニトロソプロピオフェノン（α-isonitroso-propiophenone）の4% v/vエタノール溶液0.06 mLが添加され、サンプルは完全に混合されてから１時間１００℃水浴中で煮沸されると、色を呈した。サンプルは室温で１５分間冷却され、５４０ｎｍにおける吸収がLibra S11分光光度計(Biochrom, Cambridge, 英国)で測定された。
【００８９】
グアニジノブチラーゼ（ＧＢＵ）酵素アッセイ用の反応混合物の調製は、終末体積1 mLにおいて50 mMグリシン緩衝液(pH 9)、5 mM   MnSO4および50 μL−100 μLの細胞抽出物を含み、暗エッペンドルフチューブ中で行われた。この反応は50 mMグアニジノ酪酸の添加により開始された。３７℃で３０分間インキュベートした後、反応は硫酸−リン酸混合液（脱イオン水中20% v/v濃縮硫酸および60% v/vシロップ状リン酸）700 μLの添加により停止された。生成された尿素の量がArchibald法(Archibald (1945))を用いて定量され、検量線は0〜0.6 mM尿素の範囲であった。α−イソニトロソプロピオフェノンの4% v/vエタノール溶液0.06 mLが添加され、サンプルは完全に混合されてから１時間１００℃水浴中で煮沸されると、色を呈した。サンプルは室温で１５分間冷却され５４０ｎｍにおける吸収がLibra S11分光光度計(Biochrom)を用いて測定された。
【００９０】
結果
Ｓ．セレビシエにおいてKlGBU1が発現すると、グアニジノブチレートを唯一の窒素源として成長する能力が与えられる。
この機能の特性を明らかにするため、Ｋ．ラクティス推定ウレオヒドロラーゼ遺伝子KLLA0F27995gが定常的に（constitutive）強いTDH3プロモーター(TDH3pr)の制御下で発現ベクター中でクローニングされ、Ｓ．セレビシエに形質転換された（図８）。
【００９１】
発現プラスミドpUDE264は、実験室株CEN.PK113.7D (原栄養)および野生型醸造用サッカロマイセス・パストリアヌス株CBS1483 (www.cbs.knaw.nl/Collections/)において形質転換された。形質転換された細胞は、グアニジノブチレートまたはアグマチンまたは硫酸アンモニウムを含む合成培地上に植菌された。予想されたように、両株について、すべての形質転換細胞が硫酸アンモニウムを含む非選択プレート上で成長することができた。酵素測定と一致して、アグマチンプレート上では形質転換細胞はレスキューされなかったが、一方１０００、および１００を超える形質転換細胞がCEN.PK113-7DおよびCBS1483用のグアニジノブチレートプレート上でそれぞれ検出された。これにより、KlGBU1がＳ．パストリアヌスの原栄養株における優性選択可能マーカーとして効率的に使用できることが実証された。
【００９２】
プラスミドおよび欠失カセットの構築
アッシビヤ・ゴシッピー  TEF2 プロモーターおよびターミネーターによりはさまれた（flanked）Ｋ．ラクティス GBU1遺伝子のコーディング配列のベクターpDS1へのクローニングを、KanMX遺伝子を置換することにより行い、プラスミドpDS8（図７）を得た。得られたKlGBU1YMモジュールは非相同配列のみを含み、それにより、誤った標的に組み込まれる蓋然性が低減した(Wach et al., (1994) Yeast 10: 1793-1808)。pDS8プラスミドは新しいマーカーモジュールKlGBU1YMを含む欠失カセット用のテンプレートとして手軽に使用することができ、本研究において用いられた全ての欠失カセットの構築に使用された。
【００９３】
欠失カセットは３つの主要領域を含む（図１０）：（１）欠失されるべき遺伝子の上流部分に相同で開始コドンを含む５０−５５ｂｐ配列、および欠失されるべき遺伝子の下流部分に相同で終止コドンを含む５０−５５ｂｐ配列。これらの領域はターゲティングされた相同組換え(Baudin et al., (1993) Nucleic Acids Res 21: 3329-3330)に用いられた。（２）４０−ｂｐ配列。この配列は、（３）マーカーモジュールの上流および下流に位置するI-SceI制限部位、および（４）KlGBU1YMマーカーの側方にある。エンドヌクレアーゼにより制限する際、マーカーモジュールを取り外し、リサイクルするには、ダイレクトリピートの相同組換えをすれば十分である。
【００９４】
KlGBU1YMを用いたＳ．セレビシエにおける遺伝子欠失
この新しいマーカーKlGBU1YMがＳ．セレビシエにおける遺伝子ノックアウトに適しているか評価するために、実験室株CEN.PK113-7Dにおいて遺伝子の欠失を試みた。ADE2がこの原理証明実験のために選択されたが、その理由はADE2欠失により生じる表現型を視覚的にスクリーニングすることが可能であり、ターゲティングされた組み込みの予備的評価が迅速に得られるからである。ADE2は、プリンヌクレオチドの生合成に関与する酵素ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ（phosphoribosylaminoimidazol carboxylase）をコードする。ade2変異体はアデニンの外部ソースを要求し、プリンヌクレオチドの前駆体を液胞中に蓄積し、これによりコロニーが赤色を呈する(Zonneveld & van der Zanden, (1995) Yeast 11: 823-827)。
【００９５】
KlGBU1YMの優性マーカーとしての可能性の試験が、欠失カセットを形質転換してCEN.PK113-7D中のADE2を破壊することにより行われた。形質転換後、細胞を、グアニジノブチレートを唯一の窒素源として含む合成培地(SM)寒天プレート上で成長させた。ターゲティングされた遺伝子の欠失は、単一コロニーがSM（アデニンは含まない）上で成長できないことおよびPCRにより確認された。平均形質転換率はμｇDNA当たり５形質転換体であり、コロニーの１００％が正しい組み込みを示し、グアニジノブチレートを唯一の窒素源として成長可能であった。
【図１】
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【図２ＡＡ】
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【図２ＡＢ】
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【図２ＡＣ】
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【図２ＡＤ】
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【図２ＡＥ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４ＡＡ】
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【図４ＡＢ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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