(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのＮ末端にアミノ酸配列ＲＲＰＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）を含む輸送コンストラクトを含む、炎症疾患または炎症状態を治療するための組成物であって、前記輸送コンストラクトがカーゴ部分を含む、組成物。
【請求項２】
前記炎症疾患または炎症状態は、ぶどう膜炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎、外傷性脳損傷または炎症性腸疾患である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記カーゴ部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３〜６からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
そのＮ末端にアミノ酸配列ＲＲＰＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）を含む輸送コンストラクトをコードする核酸を含む単離宿主細胞を含む、炎症疾患または炎症状態を治療するための組成物であって、前記輸送コンストラクトがカーゴ部分を含む、組成物。
【請求項５】
前記核酸は、（ａ）アミノ酸配列ＲＲＰＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）をコードする核酸と、（ｂ）アミノ酸配列ＲＲＰＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）をコードする核酸とインフレームでカーゴ部分をコードする核酸と、を含むベクターである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
カーゴ部分を標的細胞へまたは標的細胞中に送達することにより治療の必要な被験体を治療する方法において使用するための組成物であって、
前記組成物は、そのＮ末端にアミノ酸配列ＲＲＰＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）を含む輸送コンストラクトを含み、
前記方法は、前記標的細胞を前記組成物と接触させることを含み、
前記輸送コンストラクトは、前記カーゴ部分を含む、
組成物。
【請求項７】
前記カーゴ部分は、核酸；ペプチド；タンパク質；オリゴ糖；脂質；糖脂質；リポタンパク質；小分子化合物；治療薬；ＵＶ−ｖｉｓ、蛍光標識または放射性標識；造影剤；診断薬；予防薬；リポソームおよびウイルスからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記標的細胞は内皮細胞、心臓細胞、骨格筋細胞または脳細胞から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
カーゴ部分を治療の必要な被験体の標的細胞へまたは標的細胞中に送達する方法において使用するための組成物であって、
前記組成物は、そのＮ末端にアミノ酸配列ＲＲＰＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）を含む輸送コンストラクトを含み、
前記方法は、前記組成物の治療的有効量を前記被験体に投与することを含み、
前記輸送コンストラクトは、前記カーゴ部分を含む、
組成物。
【請求項１０】
前記カーゴ部分は、核酸；ペプチド；タンパク質；オリゴ糖；脂質；糖脂質；リポタンパク質；小分子化合物；治療薬；ＵＶ−ｖｉｓ、蛍光標識または放射性標識；造影剤；診断薬；予防薬；リポソームおよびウイルスからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
静脈内、経口、吸入、直腸、腟内、経皮、鼻腔内、頬側、舌下、非経口、くも膜下腔内、胃内、眼部、肺および局所からなる群より選択される少なくとも１つの経路により投与される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年１１月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／９０９，００５号の優先権の恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本開示は新規組成物およびそのような組成物を使用して、自己免疫および／または炎症疾患／病状を治療および／または防止するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの疾患の原因となるメカニズムは、生物学的経路の過活性である。生物学的経路の活性を低減できるペプチドは、生物学的経路の過活性により引き起こされる疾患の予防および／または治療において有効であり得る。同様に、多くの疾患の原因となるメカニズムは、生体分子の過剰産生である。生体分子の産生を低減または過剰産生された生体分子の活性をブロックできるペプチドは、生体分子の過剰産生により引き起こされる疾患の予防および／または治療において有効であり得る。
【０００４】
反対に、多くの疾患の原因となるメカニズムは、生物学的経路の活性低下である。生物学的経路の活性を増大できるペプチドは、生物学的経路の活性低下により引き起こされる疾患の予防および／または治療において有効であり得る。同様に、多くの疾患の原因となるメカニズムは、生体分子の産生不足である。生体分子の産生を増大できる、または産生不足の生体分子の生物活性を模倣できるペプチドは、生体分子の産生不足により引き起こされる疾患の予防および／または治療において有効であり得る。
【０００５】
カベオリンは、潜在的に様々なシグナル伝達経路を制御できるコレステロール結合タンパク質である（Ｓｍａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９，  ７２８９−７３０４；  Ｋｕｒｚｃｈａｌｉａ  ＆  Ｐａｒｔｏｎ，  （１９９９）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １１，  ４２４−４３１）。例えば、多くの研究者が、カベオラ中のタンパク質の局在、これらのタンパク質のカベオリンとの相互作用、および過剰発現されたカベオリンまたはカベオリン由来ペプチドがインビトロまたは培養細胞でシグナル伝達機能を抑制または刺激する能力を証明している（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１，  ２９１８２−２９１９０；  Ｒａｚａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４，  ２６３５３−２６３６０；  Ｎａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ４，  １０６２−１０６４；  Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｒｄｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  ２５４３７−２５４４０）。しかしながら、インビボでのシグナル伝達のモジュレーターとしてのカベオリンの重要性は議論の余地がある。なぜなら、カベオリン−１および−３は、それ自体、コレステロール結合タンパク質であり、コレステロールを小胞体から原形質膜に送達し、これによって、脂質ラフトドメインおよびカベオラのコレステロール量を調節することによりシグナル伝達を間接的に制御しているからである（Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １，  ９８−１０５；  Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １，  Ｅ３５−３７）。
【０００６】
研究は内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の細胞内輸送および制御に焦点が当てられてきた。ｅＮＯＳに誘導されるＮＯは、全身血圧の維持、血管リモデリング、血管新生および創傷治癒に必要である（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７７，  ２３９−２４２；  Ｍｕｒｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０１，  ２５６７−０．２５７８；  Ｒｕｄｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０１，  ７３１−７３６；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２７７，  Ｈ１６００−１６０８）。ｅＮＯＳは、脂質ラフトドメインおよびカベオラを標的にする、二重アシル化された表在性膜タンパク質である（Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｒｄｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３，  ６４４８−６４５３；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １３７，  １５２５−１５３５）。カベオラでは、ｅＮＯＳは、アミノ酸８２−１０１間に位置するそれらの推定足場ドメインに結合することにより、カベオリン−１および−３と物理的に相互作用でき（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１，  ２９１８２−２９１９０）、この相互作用は、ｅＮＯＳをその「より活性の低い」状態にする（Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｒｄｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  ２５４３７−２５４４０；  Ｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  １８５２２−１８５２５；  Ｍｉｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  ２５９０７−２５９１２）。このモデルのためのデータは、過剰発現系、融合タンパク質または相互作用ドメインをマッピングする酵母ツーハイブリッドスクリーニングを使用してインビトロでかなり解明された。
【０００７】
ｅＮＯＳの負調節因子としてカベオリンを用いて、複数の研究が、カベオリン−１の足場ドメイン由来のペプチドがｅＮＯＳのカベオリンへの結合を妨害し、レダクターゼからＮＯＳのオキシゲナーゼドメインへの電子束を減速させることによりインビトロでＮＯＳ活性を用量依存的に阻害することを示している（ＩＣ５０＝１−３μΜ）（Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｒｄｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  ２５４３７−２５４４０；  Ｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  １８５２２−１８５２５；  Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３，  ２２２６７−２２２７１）。
【０００８】
１つ以上の細胞を、少なくとも１つのカベオリン足場ドメインを含むペプチドで処置すると、処置された組織、器官または生物の１つ以上の病状または苦痛の低減および／または排除がもたらされた。例えば、少なくとも１つのカベオリン足場ドメインを含むペプチドによる処置は、炎症および腫瘍細胞血管新生および増殖を低減または排除することが示されている（米国特許第８，３４９，７９８号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【０００９】
多発性硬化症（ＭＳ）および視神経脊髄炎（ＮＭＯ）は、神経細胞を取り囲むミエリン鞘を損傷する中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患であり、数ある症状の中で特に、視覚障害、筋力低下、協調運動障害、しびれ、および精神機能低下を引き起こす。これらの疾患の原因は不確かであるが、それらは自己免疫障害であると考える人もいる。ぶどう膜炎は、目の中層であるぶどう膜の炎症であり、これは、関節リウマチおよび強直性脊椎炎などのいくつかの自己免疫疾患において起こることが知られている。症状としては、眼痛、視界のぼやけ、光感受性および視力減退が挙げられる。これらの衰弱性疾患および他の自己免疫障害に対する既知の治療はなく−治療は主として対症的であり、多くの場合、疾患を患う者が妥当な生活の質を維持するには有効性が最小限に限られる。
【００１０】
したがって、自己免疫疾患および炎症疾患の予防および／または治療のための新しいアプローチが必要とされている。本発明はそのような要求に向けられる。
【発明の概要】
【００１１】
発明の１つの態様では、アミノ酸配列ＲＲＰＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）を含む単離輸送ペプチドを含む組成物を投与することを含む、被験体において炎症疾患または病状を治療するための方法が提供される。特定の実施形態では、炎症疾患または病状はぶどう膜炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎、外傷性脳損傷または炎症性腸疾患である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、輸送ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で構成される。いくつかの実施形態では、輸送ペプチドは標的細胞に選択的に結合する、または細胞膜を横断する。特定の実施形態では、標的細胞は、内皮細胞、心臓細胞、骨格筋細胞または脳細胞を含む。様々な実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、組成物は輸送コンストラクトを含み、ここで、輸送コンストラクトはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１を含む輸送ペプチドに連結されるカーゴ部分を含む。特定の実施形態では、カーゴ部分は、下記からなる群より選択される：核酸；ペプチド；タンパク質；オリゴ糖；脂質；糖脂質；リポタンパク質；小分子化合物；治療薬；ＵＶ−ｖｉｓ、蛍光または放射性標識；造影剤；診断薬；予防薬；リポソームおよびウイルス。
【００１４】
様々な実施形態では、カーゴ部分は、輸送ペプチドにリンカーまたは化学結合を介して共有結合的に連結される。いくつかの実施形態では、輸送コンストラクトは標的細胞に選択的に結合し、または細胞膜を横断する。特定の実施形態では、標的細胞は内皮細胞、心臓細胞、骨格筋細胞または脳細胞を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、カーゴ部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３−６からなる群より選択される少なくとも１つである。特定の実施形態では、輸送コンストラクトは、下記からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１；およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１。
【００１６】
様々な実施形態では、組成物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１を含む輸送ペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、核酸は、５’−ＣＧＧＣＧＣＣＣＧＣＣＴＣＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つのカーゴ部分をコードする単離核酸をさらに含む。特定の実施形態では、カーゴ部分は、下記からなる群より選択される：ペプチド；タンパク質；生物活性化合物；標識；造影剤；診断薬；治療薬；および予防薬。いくつかの実施形態では、カーゴ部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３−６からなる群より選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、単離核酸は輸送ペプチドをコードする。特定の実施形態では、組成物は、輸送ペプチドをコードする核酸の発現を可能にする転写活性化エレメントをさらに含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、組成物は、輸送ペプチドをコードする核酸とインフレームでカーゴ部分をコードする核酸を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、組成物は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１を含む輸送ペプチドをコードする外因性核酸を含む単離宿主細胞を含む。特定の実施形態では、核酸は、（ａ）輸送ペプチドをコードする核酸、および（ｂ）輸送ペプチドをコードする核酸とインフレームでカーゴ部分をコードする核酸を含むベクターである。様々な実施形態では、組成物は、転写活性化エレメントをさらに含む。
【００２１】
本明細書では、カーゴ部分を標的細胞に、または標的細胞中に送達することにより、治療の必要な被験体を治療するための方法もまた提供され、方法は、標的細胞を輸送コンストラクトと接触させることを含み、ここで、輸送コンストラクトは、カーゴ部分およびアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１を含む輸送ペプチドを含み、これによりカーゴ部分は標的細胞に、または標的細胞中に送達される。特定の実施形態では、カーゴ部分は、輸送ペプチドにリンカーまたは化学結合を介して共有結合的に連結される。いくつかの実施形態では、カーゴ部分は、下記からなる群より選択される少なくとも１つである：核酸；ペプチド；タンパク質；オリゴ糖；脂質；糖脂質；リポタンパク質；小分子化合物；治療薬；ＵＶ−ｖｉｓ、蛍光または放射性標識；造影剤；診断薬；予防薬；リポソームおよびウイルス。様々な実施形態では、標的細胞は内皮細胞、心臓細胞、骨格筋細胞または脳細胞を含む。
【００２２】
本明細書では、カーゴ部分を治療の必要な被験体の標的細胞に、または標的細胞中に送達するための方法が提供され、方法は、被験体に、治療的有効量の、輸送コンストラクトを含む薬学的に許容される組成物を投与することを含み、ここで、輸送コンストラクトは、カーゴ部分およびアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１を含む輸送ペプチドを含み、これによりカーゴ部分は被験体の標的細胞に、または標的細胞中に送達される。特定の実施形態では、カーゴ部分は、輸送ペプチドにリンカーまたは化学結合を介して共有結合的に連結される。様々な実施形態では、カーゴ部分は、下記からなる群より選択される少なくとも１つである：核酸；ペプチド；タンパク質；オリゴ糖；脂質；糖脂質；リポタンパク質；小分子化合物；治療薬；ＵＶ−ｖｉｓ、蛍光または放射性標識；造影剤；診断薬；予防薬；リポソームおよびウイルス。いくつかの実施形態では、標的細胞は内皮細胞、心臓細胞、骨格筋細胞または脳細胞を含む。
【００２３】
本明細書で記載されるように、様々な実施形態では、組成物は、下記からなる群より選択される少なくとも１つの経路により投与される：静脈内、経口、吸入、直腸、腟内、経皮、鼻腔内、頬側、舌下、非経口、くも膜下腔内、胃内、眼部、肺および局所。いくつかの実施形態では、被験体は哺乳類である。特定の実施形態では、哺乳類はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】バイオパニング中の細胞透過性ファージの指数関数的濃縮を示す。回収されたファージのパーセンテージを、内皮細胞における６ラウンドのバイオパニングに対してプロットする。指数相関を０．９７５のＲ２値で確立する。
【図２Ａ】図２は、Ｅｎｄｏ５−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）がＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出ブロッキングにおいてＡＰ−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）よりも強力であるという知見を示す、一連の棒グラフである。図２Ａは、培養したウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を示されるペプチド（１０−５Ｍ）で６時間前処理し、示されるようにＶＥＧＦ（１０−９Ｍ）で３０分間刺激した場合、Ｅｎｄｏ５−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）がＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出を完全にブロックしたことを証明する、棒グラフである。ビヒクルと比較して＊Ｐ＜０．０５、ＡＰ−Ｃａｖ＋ＶＥＧＦと比較して†Ｐ＜０．０５、三つ組でｎ＝４。
【図２Ｂ】図２は、Ｅｎｄｏ５−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）がＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出ブロッキングにおいてＡＰ−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）よりも強力であるという知見を示す、一連の棒グラフである。図２Ｂは、培養したＢＡＥＣをペプチド（１−５０×１０−６Ｍ）で６時間前処理し、上で記載されるようにＶＥＧＦで刺激した場合、ＡＰ−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）およびＥｎｄｏ５−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）が用量依存性効果を示したことを証明する、棒グラフである。ビヒクルと比較して＊Ｐ＜０．０５、ＡＰ−Ｃａｖ＋ＶＥＧＦと比較して†Ｐ＜０．０５、二つ組でｎ＝４。
【図２Ｃ】図２は、Ｅｎｄｏ５−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）がＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出ブロッキングにおいてＡＰ−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）よりも強力であるという知見を示す、一連の棒グラフである。図２Ｃは、ＢＡＥＣをペプチド（１０−５Ｍ）で１、２、４または６時間処理し、上で記載されるようにＶＥＧＦで刺激した場合、ＡＰ−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）およびＥｎｄｏ５−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）が時間依存性効果を示したことを証明する、棒グラフである。ビヒクルと比較して＊Ｐ＜０．０５、ＡＰ−Ｃａｖ＋ＶＥＧＦと比較して†Ｐ＜０．０５、二つ組でｎ＝４。
【図２Ｄ】図２は、Ｅｎｄｏ５−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）がＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出ブロッキングにおいてＡＰ−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）よりも強力であるという知見を示す、一連の棒グラフである。図２Ｄは、ＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）のＥｎｄｏ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）への置換およびＣａｖ（８２−１０１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）のＣａｖＡＢ（８２−９５）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）への短縮（Ｅｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ；１０−５Ｍ）はＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出を完全にブロックし、ずっと短いペプチドＥｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）（２×１０−６Ｍ）はより少ない用量で、ＡＰ−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）（１０−５Ｍ）と同様の効果を有したことを証明する、棒グラフである。この図は、Ｅｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）の増強された効力を示す。この例では、ウシ大動脈内皮細胞をペプチドに６時間曝露し続いてＶＥＧＦで３０分間刺激した。細胞上清中の亜硝酸レベルを、Ｓｉｅｖｅｒｓ  ＮＯ化学ルミネセンス分析計を用いて決定した。
【図３Ａ】マウスをＡＰ−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）（１ｍｇ／ｋｇ）または同じモル用量のＥｎｄｏ５−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）で１時間前処置すると、カラシ油誘導性の血管透過性（右耳；３０分）の増加が防止され、一方、対照ペプチドは有意の効果を有さなかったことを示す。この例では、左耳に鉱物油のみを塗布し（ビヒクル、ベースライン対照）、マウスにエバンスブルーを前注射した。対照ペプチドと比較して＊Ｐ＜０．０５、ＡＰ−Ｃａｖ＋カラシ油と比較して†Ｐ＜０．０５。二つ組でｎ＝６または８／群。
【図３Ｂ】図３Ａにおけるデータに対する代表値を提供する。
【図４Ａ】溶液中のペプチド濃度と蛍光値との間の線形性を示すグラフである。この例では、図４Ｂで使用される同じ細胞溶解溶液に溶解された、同様の濃度のローダミン−ＡＰ（ｒｈｏｄ−ＡＰ）およびカルボキシフルオセイン−Ｅｎｄｏ５（ｃＦｌｕｏ−Ｅｎｄｏ５）に対する蛍光読み取りを実施した。ペプチドを別々に使用して干渉を防止した。
【図４Ｂ】カルボキシフルオセイン−Ｅｎｄｏ５インターナリゼーション速度は、ローダミン−ＡＰのそれより大きいことを示すグラフである。この例では、培養したウシ大動脈内皮細胞を１、２、４または６時間、個々のペプチドと共にインキュベートし、酸洗浄し、すすぎ、トリプシン処理し、溶解させ、総内部蛍光を決定して、検量線を使用することによりペプチドのモル／１０６に変換した。ペプチドと５分間インキュベートして記載されるように処理した細胞を、非インターナライズ染色に対するバックグラウンドとして使用した。
【図５Ａ】カルボキシフルオセイン−Ｅｎｄｏ５（左）またはローダミン−ＡＰ（中央；１０−５Ｍ）で１時間（パルス）処理しすすいだ、非固定培養したヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の、落射蛍光顕微鏡を使用したライブイメージングを示す。両方のペプチドによる点状染色、および核染色の欠如（卵形ダークゾーン）に注意すること。統合画像は両方のペプチド間の局在を示した（右）。
【図５Ｂ】生存ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において２時間ペプチド局在を追跡した後に、ライブイメージングにおいて両方のペプチド間の共局在（右）が依然として可視化されたことを示す。
【図５Ｃ】培養したウシ大動脈内皮細胞をＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）またはＥｎｄｏ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）（どちらも５×１０−５Ｍ）のいずれかで前処理し、ＡＰ−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）またはＥｎｄｏ５−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）（どちらも１０−５Ｍ）のいずれかと６時間インキュベートし、図２Ａ−２Ｄにより示されるようにＶＥＧＦ（１０−９Ｍ）で刺激した場合、Ｅｎｄｏ５およびＡＰは、ＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出のＡＰ−ＣａｖおよびＥｎｄｏ５−Ｃａｖ阻害を防止したことを示す。ビヒクルと比較して＊Ｐ＜０．０５、三つ組でｎ＝６／群。
【図６】硝子体内注射を介するカブトラチン（ｃａｖｔｒａｔｉｎ）の効力を示す。この実施形態では、ラットをレーザ誘起新血管新生に供した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
定義
本明細書で使用される略語は、化学および生物学分野内のそれらの従来の意味を有する。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され、記載されるが、そのような実施形態はほんの一例として提供されるにすぎないことは、当業者には明らかであろう。多くのバリエーション、変更、および置換は、発明から逸脱せずに、今当業者が思いつくものであろう。本明細書で記載される発明の実施形態に対する様々な代替物が、発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。添付の特許請求の範囲は発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内にある方法および構造は、それらにより含まれることが意図される。
【００２７】
別に規定されない限り、本明細書で使用される技術および科学用語はすべて、この発明が属する分野の当業者により普通に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２８】
本明細書で言及される全ての特許および刊行物は参照により組み込まれる。
【００２９】
単数形「１つの（ａ、ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈で明確に別記されない限り、複数の言及物を含む。
【００３０】
「有効量」または「治療的有効量」という用語は、以下で規定されるように、対象とする用途、例えば、限定はされないが、疾患治療を実行するのに十分な、本明細書で記載される化合物のその量を指す。治療的有効量は、対象とする用途（インビトロまたはインビボ）、または治療される被験体および疾患状態、例えば、被験体の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与様式などによって変動する可能性があり、これは容易に当業者により決定され得る。この用語はまた、標的細胞において特定の応答、例えば血小板接着および／または細胞移動の低減を誘導する用量に適用される。特定の用量は、選択された特定の化合物、従うべき投与レジメン、他の化合物と組み合わされて投与されたかどうか、投与のタイミング、これが投与される組織、これが運搬される物理的送達系によって変動するであろう。
【００３１】
本明細書では、「治療」または「治療する」または「緩和する」または「寛解する」は、本明細書では同じ意味で使用される。これらの用語は、有益なまたは所望の結果、例えば、限定はされないが、治療効果および／または予防効果を得るためのアプローチを指す。治療効果により、治療される根底にある障害の根絶または寛解が意味される。また、治療効果は、根底にある障害と関連する１つ以上の生理的症状の根絶または寛解により達成され、そのため、患者が根底にある障害にまだ苦しむ可能性があるにもかかわらず、患者において改善が観察される。予防効果のためには、組成物は、特定の疾患を発症するリスクがある患者に、または疾患の１つ以上の生理的症状を報告している患者に、この疾患の診断がなされていなくても、投与できる。症状の治療または寛解は、客観的または主観的パラメータに基づいてよく；パラメータには身体検査、機能（自己）評価、および／または任意の形態の視覚評価の結果が含まれる。
【００３２】
「治療効果」は、本明細書では、上で記載される治療効果および／または予防効果を包含する。予防効果としては、疾患または病状の出現を遅延または排除すること、疾患または病状の症状の発症を遅延または排除すること、疾患または病状の進行を減速、停止、または逆転させること、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００３３】
「同時投与」「と組み合わせて投与される」という用語、およびそれらの文法的等価物は、本明細書では、２つ以上の作用物質の被験体への投与を含み、そのため、両方の作用物質および／またはそれらの代謝産物が被験体内に同時に存在する。同時投与は、別々の組成物中での同時の投与、別々の組成物中での異なる時間での投与、または両方作用物質が存在する組成物中での投与を含む。
【００３４】
「インビボ」という用語は、被験体の体内で起こるイベントを指す。
【００３５】
「インビトロ」という用語は、被験体内の外側で起こるイベントを指す。例えば、インビトロアッセイは被験体アッセイの外側で実施される任意のアッセイを包含する。インビトロアッセイは、生きているまたは死んだ細胞が使用される細胞アッセイを含む。インビトロアッセイはまた、無傷の細胞が使用されない、無細胞アッセイを含む。
【００３６】
本明細書では、「約」という用語は、測定可能な値、例えば量、一時的な持続期間、などを指す場合、変動が開示される方法を実施するのに適切であるように、特定の値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、いっそうより好ましくは±０．１％の変動を含むことを意味する。
【００３７】
本明細書では、「輸送ペプチド」または「ＣＰＰ」という用語は、細胞透過性ペプチドを指し、これは、細胞膜を透過するおよび／また横断することができるペプチドとして規定される。
【００３８】
本明細書では、「輸送コンストラクト」という用語は、細胞膜を横断するコンストラクトを指し、コンストラクトは輸送ペプチドおよび少なくとも１つのカーゴ部分を含み、カーゴ部分は輸送コンストラクトより低い速度で、または低い程度まで細胞膜を横断する。１つの実施形態では、カーゴ部分は、下記からなる群より選択される：核酸；ペプチド；タンパク質；オリゴ糖；脂質；糖脂質；リポタンパク質；小分子化合物；治療薬；ＵＶ−ｖｉｓ、蛍光または放射性標識；造影剤；診断薬；予防薬；リポソームおよびウイルス。別の実施形態では、カーゴ部分は、共有または非共有結合を介して輸送ペプチドに連結される。
【００３９】
本明細書では、「Ｅｎｄｏ５」という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のペプチドまたはその塩を指す。
【００４０】
本明細書では、「ＡＰ」という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２のペプチドまたはその塩を指す。
【００４１】
本明細書では、「ＥＣ」という用語は、内皮細胞（複数可）を指す。
【００４２】
本明細書では、「ＲＨＭＶＥＣ」という用語は、ラット心臓毛細血管内皮細胞（複数可）を指す。
【００４３】
本明細書では、「ＢＡＥＣ」という用語は、ウシ大動脈内皮細胞（複数可）を指す。
【００４４】
本明細書では、「エバンスブルー」という用語は、（６Ｅ，６’Ｅ）−６，６−［（３，３’−ジメチルビフェニル−４，４’−ジイル）ジ（１Ｅ）ヒドラジン−２−イル−１−イリデン］ビス（４−アミノ−５−オキソ−５，６−ジヒドロナフタレン−１，３−ジスルホネート）の塩を指す。
【００４５】
本明細書では、「結合」という用語は、分子の互いの接着を指し、例えば、限定はされないが、酵素の基質への、抗体の抗原への、ＤＮＡ鎖のそれらの相補鎖への接着などである。結合は、分子表面の部分の形状および化学的性質が相補的であるため起こる。一般的なモデルは、どのようにして酵素がそれらの基質にぴったり合うかを説明するために使用される「鍵と鍵穴」である。非限定的例では、カベオリンタンパク質の結合は、ｅＮＯＳの１つ以上のドメイン、例えば、限定はされないが、ｅＮＯＳのオキシゲナーゼドメインおよび／またはｅＮＯＳのレダクターゼドメインなどで起こり得る。
【００４６】
「疾患」は、その動物がホメオスタシスを維持できない、動物の健康状態であり、疾患が寛解されないと動物の健康が悪化し続ける健康状態である。
【００４７】
動物における「障害」は、その動物がホメオスタシスを維持できるが、その動物の健康状態が障害の場合よりも有利ではない、健康状態である。治療せずにいても、障害は、動物の健康状態のさらなる低下を必ずしも引き起こさない。
【００４８】
疾患または障害は、疾患または障害の症状の重症度、そのような症状が患者により経験される頻度、または両方が低減される場合、「軽減される」。
【００４９】
本明細書では、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合により連結される、アミノ酸残基、関連する天然の構造バリアント、およびその合成の非天然の類似体から成るポリマを指す。合成ポリペプチドは、例えば、自動化ポリペプチドシンセサイザーを使用して合成されてもよい。
【００５０】
本明細書では、「タンパク質」という用語は、典型的には、大きなポリペプチドを指す。
【００５１】
本明細書では、「ペプチド」という用語は典型的には、短いポリペプチドを指す。従来の表示法がポリペプチド配列を表すために本明細書で使用される：ポリペプチド配列の左端はアミノ末端であり、ポリペプチド配列の右端はカルボキシル末端である。
【００５２】
本明細書では、「ＰＮＡ」という用語は、ペプチド核酸を指す。
【００５３】
「アミノ酸配列バリアント」という用語は、天然配列ポリペプチドとはある程度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。通常、アミノ酸配列バリアントは、天然ポリペプチドに対し、少なくとも約７０％相同性、少なくとも約８０％相同性、少なくとも約９０％相同性、または少なくとも約９５％相同性を有するであろう。アミノ酸配列バリアントは、天然アミノ酸配列のアミノ酸配列内のある一定の位置に、置換、欠失、および／または挿入を有する。
【００５４】
本明細書では、「保存的変異」または「保存的置換」という用語は、本明細書では、あるアミノ酸残基の、別の、生物学的に同様の残基による置き換えを指す。保存的変異または置換は、ペプチド鎖の形状を変化させにくい。保存的変異、または置換の例としては、１つの疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンの別のものとの置き換え、または１つの極性残基の別のものとの置換、例えばアルギニンのリジンとの、グルタミン酸のアスパラギン酸との、またはグルタミンのアスパラギンとの置換が挙げられる。
【００５５】
本明細書では、「ドメイン」という用語は、共通の物理化学的特徴、例えば、限定はされないが、疎水性の、極性の、球状のおよびらせん状のドメインまたは特性、を共有する分子または構造の一部を指す。結合ドメインの具体例としては、ＤＮＡ結合ドメインおよびＡＴＰ結合ドメインが挙げられるが、それらに限定されない。
【００５６】
本明細書では、「異種ペプチド」という用語は、その配列が、この配列の膜転移ドメインとの融合産物が任意の膜転移ドメインに隣接する野生型配列とは異なる配列を有するように選択される、任意のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。
【００５７】
本明細書では、「膜転移ドメイン」という用語は、細胞の膜を透過でき、付着されるペプチドをインビボで細胞内に輸送するために使用されるペプチドを指す。
【００５８】
本明細書では、「カベオリン足場ドメイン」という用語は、任意のカベオリンタンパク質の推定足場ドメインを含むドメインを指す。よって、この用語は、本明細書では推定足場ドメインに限定されない。ヒトＣａｖ−１の全ｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＡＧ７０２３０．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）で見出され得る。ヒトＣａｖ−３についての全タンパク質コードは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ３９７５８．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）で見出され得る。本明細書で記載されるこれらのおよび他の配列に関する追加の情報は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）からワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで公的に入手可能であり、その情報は参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
カベオリン足場ドメインの例としては下記が挙げられるが、それらに限定されない：ヒトカベオリン−１のアミノ酸８２−１０１（８２ＤＧＩＷＫＡＳＦＴＴＦＴＶＴＫＹＷＦＹＲ１０１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）またはその等価物；ヒトカベオリン−１のアミノ酸８２−９５（８２ＤＧＩＷＫＡＳＦＴＴＦＴＶＴ９５）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）またはその等価物。
【００６０】
本明細書では、「治療」または「治療すること」という用語は、疾患または障害、疾患または障害の症状、または疾患または障害を発症する可能性を治癒する、直す、軽減する、緩和する、変化させる、修復する、寛解する、改善するまたはそれらに効果を及ぼす目的で、治療薬の、すなわち、発明内の有用な化合物（単独で、または別の医薬品と組み合わせて）の、患者への適用または投与として、または治療薬の、患者（疾患または障害、疾患または障害の症状あるいは疾患または障害を発症する可能性を有する）から単離された組織または細胞株への適用または投与（例えば、診断またはエクスビボ適用のため）として規定される。そのような治療は、薬理ゲノミクスの分野から得られる知識に基づき、特定的に調整されまたは改変され得る。
【００６１】
本明細書では、「防止する」または「防止」という用語は、障害または疾患発症がなかった場合にはそれらがないこと、または障害または疾患がすでに発症していた場合にはさらなる障害または疾患の発症がないことを意味する。また、障害または疾患と関連する症状のいくつかまたは全てを防止する能力も考慮される。
【００６２】
本明細書では、「患者」「個体」または「被験体」という用語は、ヒトまたは非ヒト哺乳類を指す。非ヒト哺乳類としては、例えば、家畜およびペット、例えばヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコおよび海洋哺乳類が挙げられる。好ましくは、患者、個体または被験体はヒトである。
【００６３】
本明細書では、「薬学的に許容される」という用語は、化合物の生物活性または特性を抑制せず、比較的無毒性である、担体または希釈剤などの材料を指し、すなわち、この材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含まれる組成物の成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、個体に投与され得る。
【００６４】
本明細書では、「組成物」または「医薬組成物」という用語は、発明内の有用な少なくとも１つの化合物と薬学的に許容される担体との混合物を指す。医薬組成物は、化合物の患者への投与を容易にする。化合物を投与する複数の技術が、当技術分野において存在し、限定はされないが、静脈内、経口、エアロゾル、吸入、直腸、腟内、経皮、鼻腔内、頬側、舌下、非経口、くも膜下腔内、胃内、眼部（硝子体内、前房内、眼球後、結膜下、脈絡膜上などが挙げられるが、それらに限定されない）、肺および局所投与が挙げられる。
【００６５】
本明細書では、「薬学的に許容される担体」という用語は、発明内の有用な化合物を患者の体内にまたは患者に、その意図される機能を実行できるように、運搬または輸送するのに関与する、薬学的に許容される材料、組成物または担体、例えば液体または固体フィラー、安定剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒または封入材料を意味する。典型的には、そのようなコンストラクトは、１つの器官、または身体の一部から別の器官、または身体の一部に運搬または輸送される。各担体は、発明内の有用な化合物を含む、製剤の他の材料成分と適合し、かつ患者に有害ではないという意味で、「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例としては下記が挙げられる：糖類、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；デンプン、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン；セルロース、およびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばカカオバターおよび坐薬ワックス；油、例えばピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；グリコール、例えばプロピレングリコール；ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；表面活性剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；および医薬製剤で使用される他の無毒性適合性物質。本明細書では、「薬学的に許容される担体」はまた、発明内の有用な化合物の活性と適合可能であり、患者に生理的に許容される、任意のおよび全てのコーティング、抗菌および抗真菌薬、ならびに吸収遅延剤などを含む。補足活性化合物もまた、組成物に組み込まれ得る。「薬学的に許容される担体」は、発明内の有用な化合物の薬学的に許容される塩をさらに含む。発明の実施において使用される医薬組成物に含まれ得る他の追加の材料成分は、当技術分野で知られており、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｇｅｎａｒｏ，  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  １９８５，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ）（参照により本明細書に組み込まれる）において記載される。
【００６６】
この開示を通して、発明の様々な態様は範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に、便宜および簡潔さのためにすぎず、発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、特定的に開示される全ての可能なサブレンジならびにその範囲内の個々の数値を有すると考えるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、特定的に開示されるサブレンジ、例えば１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６を有すると考えられるべきである。これは、範囲の幅に関係なく当てはまる。
【００６７】
例示的な組成物
本明細書で記載するように、短い５−アミノ酸ペプチド（ＲＲＰＰＲ−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）であるＥｎｄｏ５は非常に強力な細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である。Ｅｎｄｏ５は、血管内皮細胞により迅速にインターナライズされるその能力に対する競合的選択プロセスにより単離され、細胞によるカーゴ取込を増大し、かつそれがコンジュゲートされるカーゴの治療活性を増大することが示された。
【００６８】
本明細書で記載するように、Ｅｎｄｏ５は、内皮細胞により迅速にインターナライズされる能力に対して選択されたファージの表面で発現されると、最も高く濃縮されたランダムに生成されるペプチドであった。ＶＥＧＦ誘導性のＮＯ放出の阻害でのＥｎｄｏ５−Ｃａｖの最大効力は、同様のモルベースではＡＰ−Ｃａｖのそれよりも大きかった。さらに、そのより小さいサイズにも関わらず（Ｅｎｄｏ５は５−ｍｅｒペプチドであり、対して、ＡＰは１６−ｍｅｒ酸ペプチドである）、Ｅｎｄｏ５の取込速度はＡＰのそれよりも３倍大きかった。Ｅｎｄｏ５−Ｃａｖは、インビボでの血管透過性の阻害でＡＰ−Ｃａｖよりも強力であることが見出された。
【００６９】
機構的には、Ｅｎｄｏ５取込に関与する細胞経路は、ＡＰのそれと同様であると考えられる。これは、初期エンドサイトーシスおよび細胞内分布中のＥｎｄｏ５とＡＰの間の著しい共局在；ＡＰによるＥｎｄｏ５−Ｃａｖ効果の競合阻害；およびＥｎｄｏ５によるＡＰ−Ｃａｖ活性の競合阻害により支持される。本明細書で報告される所見は、よく確立されたＡＰに比べて、Ｅｎｄｏ５のより高い「インターナリゼーション効率／アミノ酸」能力に対する証拠を提供する。
【００７０】
内皮細胞に対する有効な細胞透過性ペプチドを設計するための理論的根拠は、異常な内皮細胞活性により特徴付けられる様々な疾患にあるだけでなく、血液と下にある組織の間の内皮細胞の戦略的局在化からも得られる。吸収後に、血管コンパートメントを介する薬物分布は、排除および分解によりすぐに損なわれ得る。これらの正常な薬物不活性化メカニズムは、作用部位での迅速なインターナリゼーションによりオフセットされ得る。現システムにより試験が可能な、ランダムに生成された細胞透過性ペプチドのプールと比較した、内皮細胞におけるＥｎｄｏ５インターナリゼーションの大きさの証拠は、Ｔ７選択システムにおけるファージ取込を促進するその能力により説明される。このシステムは内皮細胞への高親和性結合のみを介する迅速な取込に有利であり、なぜならばそれは１未満のペプチドコピー／ファージの表面発現を可能にするからである。
【００７１】
いずれの理論にも制限されることを望まないが、それらの標的に向かうカーゴの細胞内分布は、２つの完全に異なる細胞透過性ペプチド（Ｅｎｄｏ５またはＡＰ）へ融合されたＣａｖが、２時間の「追跡」後に、ｅＮＯＳ活性を減弱させ、血管透過性を阻害し、共局在したという事実に基づき、少なくとも部分的に、細胞透過性ペプチド配列に依存しない可能性がある。
【００７２】
さらに、Ｅｎｄｏ５、ならびに他の細胞透過性ペプチドは、インターナリゼーション小器官からの様々な出口経路を可能にし、および／またはカーゴ分子の細胞内局在化を異なって指揮し得る。しかしながら、Ｅｎｄｏ５とＡＰの間の取込速度の違いは、Ｅｎｄｏ５−ＣａｖとＡＰ−Ｃａｖの間の効力の違いを正当化する可能なメカニズムである。これは、生細胞中でのＥｎｄｏ５およびＡＰの同様の局在を実証するデータにより支持される。
【００７３】
他方、Ｅｎｄｏ５に融合された場合のＣａｖ効力の増加および高い用量でのｅＮＯＳ活性に対するＡＰ−Ｃａｖ効果の近飽和は、ＡＰ−Ｃａｖ効果が、ファルマコフォア（Ｃａｖ）の制限によってというよりは、インターナリゼーションおよび排除／分解の重複する速度により制限され得ることを示唆する。いずれの理論にも制限されることを望まないが、これにより、著しく強力なＣＰＰ配列、例えばＥｎｄｏ５を含む配列を同定することへの関心が強調される。
【００７４】
様々な実施形態では、本明細書で記載される発明は、細胞膜を通過する単離輸送ペプチドを含む。１つの実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＲＲＰＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）を含む。別の実施形態では、輸送ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で本質的に構成される。さらに別の実施形態では、輸送ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で構成される。さらに別の実施形態では、輸送ペプチドは標的細胞に選択的に結合し、または細胞膜を横断する。さらに別の実施形態では、細胞は、内皮細胞、心臓細胞、骨格筋細胞または脳細胞を含む。
【００７５】
１つの態様では、発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１を含む輸送ペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。さらに別の実施形態では、細胞は内皮細胞、心臓細胞、骨格筋細胞または脳細胞を含む。さらに別の実施形態では、細胞は、内皮細胞、心臓細胞、骨格筋細胞または脳細胞で構成される。
【００７６】
発明は、発明のペプチドおよびカーゴ部分を含む輸送コンストラクトをさらに含む。
【００７７】
１つの実施形態では、輸送コンストラクトは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１を含む輸送ペプチドに連結されるカーゴ部分を含む。別の実施形態では、輸送ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で構成される。さらに別の実施形態では、カーゴ部分は、下記からなる群より選択される少なくとも１つである：核酸（およびその類似体、例えばペプチド核酸または「ＰＮＡ」）；ペプチド；タンパク質；オリゴ糖；脂質；糖脂質；リポタンパク質；治療薬；ＵＶ−ｖｉｓ、蛍光または放射性標識；造影剤；診断薬；予防薬；リポソームおよびウイルス（例えばＴ−７バクテリオファージ）。
【００７８】
１つの実施形態では、カーゴ部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３−６および１１−１９からなる群より選択される少なくとも１つである。別の実施形態では、輸送コンストラクトは、下記からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む：
【表１】
0006692751.tif 000002
【００７９】
さらに別の実施形態では、輸送コンストラクトは、下記からなる群より選択される：
【表２】
0006692751.tif 000003
【００８０】
別の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００８１】
カーゴ部分は輸送ペプチドと組み合わされ、またはこれに連結され、本発明の輸送コンストラクトを形成し得る。輸送ペプチドおよびカーゴ部分は、輸送コンストラクトが使用される条件下（例えば、輸送コンストラクトが個体に投与される条件下）でそれらが組み合わされたままであるか連結されたままであるような様式で、組み合わされ、または連結される。１つの実施形態では、カーゴ部分は、輸送ペプチドにリンカーまたは化学結合を介して共有結合により連結される。あるいは、輸送ペプチドおよびカーゴ部分は、非共有結合、例えば静電および／または疎水性相互作用により組み合わされる。
【００８２】
発明は、本明細書の他のどこかで記載されるペプチドの機能的に等価なバリアントを含む。そのようなバリアントは、元のペプチドの機能的統合性を維持するアミノ酸置換を有するペプチドを含む。アミノ酸置換の例としては、元のアミノ酸の同様の電荷、極性、疎水性または構造が維持されるペプチドに変更されるものが挙げられる。ペプチドバリアントはまた、ペプチド模倣物を含む。ペプチド模倣物は、化学的に修飾されたペプチドおよび非天然アミノ酸を含むペプチド様分子を含む。
【００８３】
１つの実施形態では、本発明のペプチドはそれらが自然に起こる起源から得られ、または公知の技術、例えば化学合成または遺伝子操作方法（例えば、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術）を使用して生成され得る。別の実施形態では、本発明のペプチドは、当技術分野で知られているように、標準固相（または溶液相）ペプチド合成法を使用して調製され得る。加えて、これらのペプチドをコードするＤＮＡは、市販のオリゴヌクレオチド合成器具類を使用して合成され、および標準組換え産生系を使用して組換えにより生成され得る。遺伝子にコードされないアミノ酸が含まれることになっている場合は、固相ペプチド合成を使用する生成が必要とされる。
【００８４】
１つの実施形態では、本発明の単離ペプチドは、非関連のペプチド、ならびに混入ポリペプチド、脂質、核酸および細胞内のペプチドと通常関連するまたはライブラリ内のペプチドと関連する他の細胞材料をあまり含まない。
【００８５】
発明の輸送コンストラクトは、細胞膜を横切るカーゴ部分の送達に有用である。発明の輸送コンストラクトはまた、標的細胞（例えば、特定の細胞型、例えば心臓細胞）へのカーゴ部分の送達および標的細胞へのおよび／または標的細胞の膜を横切るカーゴ部分の送達に有用である。
【００８６】
本発明の輸送ペプチドは、細胞の細胞膜を横断する（例えば、細胞内にインターナライズする）能力を有する。例えば、発明の１つの実施形態では、輸送ペプチドは、細胞の細胞外環境から移行し、細胞膜の脂質二重層に侵入し、細胞の細胞内環境へと細胞膜を横断する。別の実施形態では、本発明の輸送ペプチドは標的細胞に選択的に結合する。さらに別の実施形態では、輸送ペプチドは標的細胞の細胞膜に選択的に結合して、これを横断する。標的細胞は特定の細胞型、例えば、心臓細胞、皮膚細胞（例えば、内皮細胞）、骨格筋細胞または脳細胞（例えば、ニューロン）などであるが、ヒトおよび非ヒト細胞を含む任意の細胞であってもよい。
【００８７】
非限定的例では、発明の輸送ペプチドはカーゴ部分に連結され、カーゴ部分を細胞の細胞膜を横切って輸送する。例えば、１つの実施形態では、輸送ペプチドに連結された、カベオリンまたは転写因子などのタンパク質は、細胞の細胞外環境から運搬され、細胞膜を横切って細胞の細胞内環境内へと輸送される。別の実施形態では、カーゴ部分に連結された発明の輸送ペプチドは、カーゴ部分を標的細胞（例えば、心臓細胞）に選択的に結合させる。さらに別の実施形態では、カーゴ部分に連結された輸送ペプチドは、カーゴ部分を標的細胞（例えば、心臓細胞）に選択的に結合させ、カーゴ部分を標的細胞の細胞外環境から細胞膜を横切って標的細胞の細胞内環境内へと輸送する。
【００８８】
１つの実施形態では、カーゴ部分は有機または無機化合物を含む。有機化合物は自然から（例えば、これが生じる細胞から）単離されてもよく、または公知の方法、例えば遺伝子操作方法（例えば、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術）または化学合成法を使用して生成されてもよい。例えば、有機分子はＲＮＡ分子、ポリペプチドまたはそのフラグメントであってよく、これは細胞から単離され、組換え核酸分子から発現されまたは化学的に合成され得る。有機分子はまた、非天然分子であってもよい。非天然分子の非限定的な例は、非天然のヌクレオシド類似体または、ヌクレオチドを連結させてヌクレアーゼによる分解から保護するホスホロチオエート結合を含む核酸配列である。リボース残基の２’−炭素原子に結合された、正常なヒドロキシル基の代わりに２−メチル基を含むリボヌクレオチドは、酵素および化学分解に対して抵抗性のある非天然ＲＮＡ分子の一例である。非天然の有機分子の他の例としては、２’−アミノピリミジンを含むＲＮＡが挙げられる（そのようなＲＮＡはヒト血清および尿中で、天然のＲＮＡと比べて１，０００倍安定である；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：５２２９−５２３４，およびＪｅｌｌｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３４：  １１３６３−１１３７２）。
【００８９】
１つの実施形態では、カーゴ部分はＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡは任意の長さのオリゴ（デオキシ）ヌクレオチドであってよい。そのような核酸分子は直線、円形またはスーパーコイルであってもよく；一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく；あるいはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってもよい。核酸類似体は、荷電および無電荷骨格類似体、例えばホスホネート（例えば、メチルホスホネート）、ホスホラミデート（Ｎ３’またはＮ５’）、チオホスフェート、無電荷モルホリノ系ポリマ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。そのような分子は、例えば、酵素補充療法、遺伝子治療およびアンチセンス療法を含む様々な治療レジメンで使用され得る。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ＤＮＡの類似体である。ＰＮＡの骨格はリン酸エステルよりもペプチド結合により形成され、アンチセンス適用に適切となる。骨格は非荷電であるので、ＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡ二本鎖は通常よりも大きい熱安定性を示す。ＰＮＡは、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼにより認識されないという追加の利点を有する。ＰＮＡは、標準ｔ−Ｂｏｃ化学を使用して自動化ペプチドシンセサイザーで合成され得る。ＰＮＡは、当技術分野で公知の方法を使用して、発明の輸送ペプチドに連結され得る。
【００９０】
１つの実施形態では、カーゴ部分はポリペプチドである。別の実施形態では、カーゴ部分はカベオリンまたはそのフラグメントを含む。さらに別の実施形態では、カーゴ部分は転写因子または核局在化ペプチドである。さらに別の実施形態では、１つは転写因子を含み他方は核局在化ペプチドを含む、２つのカーゴ部分が、発明の輸送コンストラクト中に存在する。
【００９１】
１つの実施形態では、カーゴ部分は標識、例えば、染料または放射性標識化合物を含む。別の実施形態では、カーゴ部分はローダミンを含む。さらに別の実施形態では、カーゴ部分はマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、ビオチンまたはそれらの混合物を含む。
【００９２】
非限定的例では、組換え技術を使用して共有結合により輸送ペプチドをカーゴ部分に付着させてもよく、例えば、輸送ペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを、カーゴ部分をコードするＤＮＡまたはＲＮＡとつないで、コード生成物を適切な宿主細胞（輸送コンストラクトを発現できる細胞）において発現させる。あるいは、２つの別々のヌクレオチド配列を細胞で発現させることができ、または、公知の技術を使用して、化学的に合成しその後に組み合わせることができる。あるいは、輸送ペプチド−カーゴ部を単一アミノ酸配列として化学的に合成してもよく、よって、それらを組み合わせる必要はない。
【００９３】
１つの実施形態では、輸送ペプチドに連結される１を超えるカーゴ部分が存在する場合、１を超える部分は同じであるか、または異なっていてよい。別の実施形態では、１つのまたは複数のカーゴ部分は、輸送ペプチドのＮまたはＣ末端のいずれかで輸送ペプチドに連結される。輸送ペプチドに連結される少なくとも２つのカーゴ部分が存在する場合、１つのカーゴ部分が輸送ペプチドのＮ末端で連結され１つのカーゴ部分が輸送ペプチドのＣ末端で連結されてよい。あるいは、１を超えるカーゴ部分が、輸送ペプチドのＮまたはＣ末端のいずれかに連結され得る。
【００９４】
１つの実施形態では、カーゴ部分は、リンカーにより直接的に（すなわち、化学結合を介して）または間接的に本発明の輸送ペプチドに連結され得る。リンカーは、例えば、１つ以上のアミノ酸残基を含む。リンカーは、例えば、１０アミノ酸残基（例えば、１〜１０、１〜５または１〜４アミノ酸残基）の短い配列であってよく、任意でシステイン残基を含んでもよく、システイン残基を介してリンカーは輸送コンストラクトの輸送ペプチドまたはカーゴ部分に結合する。リンカーはまた、スルフヒドリル（ｓｕｌｆｙｄｒｙｌ）基またはカルボキシル基などの基であってもよい。
【００９５】
好適なリンカーは、二および多官能性アルキル、アリール、アラルキルまたはペプチド部分、アルキル、アリールまたはアラルキルアルデヒド、酸、エステルおよび無水物、スルフヒドリル（ｓｕｌｆｙｄｒｙｌ）またはカルボキシル基、例えばマレイミド安息香酸誘導体、マレイミドプロピオン酸誘導体およびスクシンイミド誘導体を含み、あるいは、シアヌル酸ブロミドまたはクロリド、カルボニルジイミダゾール、スクシンイミジルエステルまたはスルホン酸ハロゲン化物から誘導され得る。一方でリンカーとカーゴ部分の間の共有結合を形成するために使用されるリンカー上の官能基、ならびに他方でリンカーおよび輸送ペプチド上の官能基は、例えば、アミノ、ヒドラジン、ヒドロキシル、チオール、マレイミド、カルボニル、およびカルボキシル基の２つ以上であってもよい。
【００９６】
１つの実施形態では、輸送コンストラクトは、化学または酵素切断により、カーゴ部分および輸送ペプチドへとインビトロまたはインビトロで解離し得る。別の実施形態では、リンカーはアミノ酸残基を含み、インビトロまたはインビボ切断がリンカー内で起こる。
【００９７】
１つの実施形態では、カーゴ部分はポリペプチドであり、カーゴ部分は組換え技術により融合タンパク質として輸送ペプチドに連結される。融合タンパク質は、それらのタンパク質をコードする核酸分子の遺伝子発現による、それらのポリペプチド骨格を介する２つ以上のタンパク質の共直線、共有結合である。融合タンパク質のカーゴ部分をコードする核酸は、輸送ペプチドをコードする核酸とインフレームである。「インフレーム」は、カーゴ部分をコードする核酸配列が輸送ペプチドをコードする核酸配列として正しい読み枠内にあることを示す。よって、融合タンパク質の輸送ペプチドおよびカーゴ部分の両方について正しいアミノ酸配列が翻訳される。
【００９８】
１つの実施形態では、カーゴ部分は輸送ペプチドに化学架橋によりコンジュゲートされる。多くの化学架橋方法が知られており、この発明の輸送ペプチドをカーゴ部分に連結するのに有用である。カーゴ部分および輸送ペプチドのカップリングは、カップリングまたは連結剤により達成され得る。使用され得る分子間架橋試薬は、Ｍｅａｎｓ  ＆  Ｆｅｅｎｅｙ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ，  １９７４，  ｐｐ．  ３９−４３、およびＷｏｎｇ，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９１）において例示される。これらの試薬の中には、例えば、下記がある：３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（「ＳＰＤＰ」）またはΝ，Ν’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（どちらもスルフヒドリル（ｓｕｌｆｙｄｒｙｌ）基に対して非常に特異的であり、不可逆的結合を形成する）；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）または６〜１１の炭素メチレン橋を有する他のそのような試薬（スルフヒドリル基に対し比較的特異的である）；および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（アミノおよびチロシン基と不可逆的結合を形成する）。
【００９９】
このために有用な他の架橋試薬としては下記が挙げられる：ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（アミノおよびフェノール基と不可逆的架橋を形成する）；アジプイミド酸ジメチル（アミノ基に対して特異的である）；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド（主に、アミノ基と反応する）；ヘキサメチレンジイソシアネートまたはジイソチオシアネート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート（主に、アミノ基と反応する）；グルタルアルデヒド（異なる側鎖と反応する）およびジアゾベンジジン（主として、チロシンおよびヒスチジンと反応する）。
【０１００】
１つの実施形態では、架橋試薬により、細胞条件下で本質的に切断できない輸送コンストラクトが得られる。別の実施形態では、架橋試薬は共有結合、例えばジスルフィドを含み、これは細胞条件下で切断可能である。例えば、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（「ＤＳＰ」）、Ｔｒａｕｔ試薬および３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（「ＳＰＤＰ」）はよく知られた切断可能な架橋剤である。切断可能な架橋試薬の使用により、輸送ペプチドを標的細胞内への送達後にカーゴ部分から分離できる。直接ジスルフィド結合を含むコンストラクトもまた、発明の方法内で有用であり得る。１つの実施形態では、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシ−スクシンイミドエステル（「ＧＭＢＳ」）およびスルホ−ＧＭＢＳなどの架橋試薬は、低減した免疫原性を有する。
【０１０１】
本発明は、融合ペプチドを有するポリペプチドをコードする単離核酸分子およびその保存的ヌクレオチド置換を含み、本発明の組成物を生成するために好ましくは単離形態である組成物をさらに含む。保存的ヌクレオチド置換は、ほとんどのアミノ酸は１を超えるコドンを有するので、特定のアミノ酸に対するコーディングに影響しないヌクレオチド置換を含む。よって、保存的ヌクレオチド置換はまた、サイレント突然変異および差次的コドン使用を含む。
【０１０２】
１つの実施形態では、核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１を含む輸送ペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で構成される輸送ペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸は、５’−ＣＧＧＣＧＣＣＣＧＣＣＴＣＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）を含む。
【０１０３】
１つの実施形態では、組成物は、少なくとも１つのカーゴ部分をコードする核酸をさらに含む。別の実施形態では、カーゴ部分は、下記からなる群より選択される：ペプチド；タンパク質；生物活性化合物；標識；造影剤；診断薬；治療薬；および予防薬。さらに別の実施形態では、カーゴ部分は、下記からなる群より選択される少なくとも１つを含む：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３−６。さらに別の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【０１０４】
発明は、発現ベクター、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１を含むペプチドをコードする核酸を含む単離宿主細胞をさらに含む。１つの実施形態では、ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で構成される。
【０１０５】
発明はまた、発現ベクター、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１を含むペプチドに結合されたカーゴ部分をコードする核酸を含む単離宿主細胞を含む。１つの実施形態では、ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で構成される。
【０１０６】
１つの実施形態では、輸送コンストラクトは融合タンパク質を含む。別の実施形態では、ベクターまたは宿主細胞は、輸送ペプチドをコードする核酸の発現を可能にする転写活性化エレメントをさらに含む。タンパク質発現のために必要とされる調節エレメント、ならびに所望の配列のベクターへのクローニングを促進する制限エンドヌクレアーゼ部位を組み入れた発現系ベクターが当業者に知られている。１つの実施形態では、カーゴ部分は輸送ペプチドをコードする核酸とインフレームである。
【０１０７】
非限定的例では、前に記載されるエレメントを含む、組換えＤＮＡ発現ベクターが適切な宿主細胞（すなわち、輸送コンストラクトを発現することができる細胞）中に導入され、そこで宿主細胞の細胞メカニズムが組換えＤＮＡ発現ベクターによりコードされる融合タンパク質の発現を指揮する。あるいは、当業者に知られている無細胞系が、融合タンパク質の発現のために使用され得る。
【０１０８】
発現ベクター宿主細胞系により生成された精製融合タンパク質はその後、標的細胞に投与でき、ここで輸送ペプチドが、標的細胞の細胞膜を介して細胞の内部へと融合タンパク質の移入を媒介する。標的細胞は、下記のような特定の細胞型：例えば、心臓細胞、皮膚細胞、例えば上皮細胞；骨格筋細胞または脳細胞（例えば、ニューロン）であるが、ヒトおよび非ヒト細胞を含む任意の細胞であってもよい。
【０１０９】
発現ベクター宿主細胞系は、当業者に知られている多くのそのような系の中から選択され得る。１つの実施形態では、融合タンパク質は、大腸菌などの単離宿主細胞において発現され得る。別の実施形態では、融合タンパク質は、他の細菌発現系、ウイルス発現系、真核生物発現系、または無細胞発現系において発現され得る。当業者により使用される細胞宿主としては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：単離宿主細胞、例えば、例として、枯草菌、酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス、サッカロマイセス・ポンベ、およびピキア・パストリス、ならびに哺乳類細胞、例えばＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＵＶＥＣ、ラット大動脈平滑筋細胞および成人ヒト平滑筋細胞。当業者により選択される発現ベクターは、プロモーターエレメントなどの転写活性化エレメントおよび、融合タンパク質が発現される宿主細胞または無細胞系に適切な他の調節エレメントを含む。例えば、哺乳類発現系では、好適な発現ベクターは、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡウイルス、およびＲＮＡウイルスを含み得る。細菌発現系では、好適なベクターはプラスミドＤＮＡおよびバクテリオファージベクターを含み得る。
【０１１０】
特定の発現ベクター系の非限定的な例としては、転写制御因子ＡｒａＣにより制御される、大腸菌におけるタンパク質発現のためのｐＢＡＤ／ｇＩＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）系が挙げられる。哺乳類発現のためのベクターの一例は、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ真核生物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。このベクターでは、輸送コンストラクトは、強力なサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にて高レベルで発現され得る。Ｃ末端ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグは、ニッケルキレート樹脂を使用する輸送コンストラクト精製を可能にする。このベクターにより生成される分泌タンパク質は、抗Ｈｉｓ（Ｃ−ｔｅｒｍ）抗体を用いて検出できる。
【０１１１】
バキュロウイルス発現系もまた、輸送ペプチドおよびカーゴ部分を含む輸送コンストラクトの生成のために使用され得、ここでカーゴ部分はポリペプチドである。一般的に使用されるバキュロウイルスはＡｃＭＮＰＶである。輸送コンストラクトＤＮＡのクローニングは、相同組換えを使用することにより達成され得る。非限定的例では、輸送コンストラクトＤＮＡ配列は、バキュロウイルスＤＮＡ、特にポリヘドリン遺伝子由来のＤＮＡに隣接するバキュロウイルスプロモーターを含む、導入ベクター中にクローニングされる。このＤＮＡは昆虫細胞中にトランスフェクトされ、そこで相同組換えが起こり、輸送コンストラクトＤＮＡが親ウイルスのゲノム中に挿入される。組換え体は変化したプラーク形態により同定される。
【０１１２】
カーゴ部分がペプチドまたはタンパク質であり細菌発現系で適切に翻訳後に修飾され得ない多くの輸送コンストラクトは、代わりにバキュロウイルスベクターを用いて発現され得る。酵素、シグナル伝達分子、細胞周期調節のメディエータ、転写因子、抗原ペプチド、ワクチン療法において使用するためのウイルス、細菌、または他の起源の全長タンパク質産物、癌ワクチン療法において使用するためのヒト細胞のタンパク質産物、毒素、および細胞内シグナル伝達系に関与するタンパク質（細菌発現系で適切に翻訳後に修飾され得ない）は、バキュロウイルスベクターを用いて発現され得る。
【０１１３】
上で記載されるタンパク質はまた、本発明の方法により、哺乳類ウイルス発現系により生成され得る。エクジソン誘導性哺乳類発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）もまた、輸送コンストラクトを発現させるために使用され得、この場合、輸送コンストラクトは融合タンパク質である。
【０１１４】
１つの実施形態では、酵母宿主細胞、例えばピキア・パストリスが、本発明の方法による輸送コンストラクトの生成のために使用され得る。ピキア中にトランスフォームされたプラスミドからの異種タンパク質の発現は、Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａらの米国特許第５，００２，８７６号により記載されている。本発明の輸送ペプチドおよびカーゴ部分を含む融合タンパク質（カーゴ部分はペプチドまたはタンパク質である）の、ピキアでの発現のためのベクターは、ピキア発現キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）の一部として市販されている。
【０１１５】
ピキアで生成された異種タンパク質の精製は、Ｃｒａｉｇらの米国特許第５，００４，６８８号に記載されており、酵母発現系からのタンパク質精製のための技術は、当業者によく知られている。ピキア系では、ポリペプチドであるカーゴ部分のために適切なタンパク質発現が最適化されるよう、市販のベクターが、細胞質非グリコシル化タンパク質の生成により適しているもの、および分泌されるグリコシル化タンパク質の生成により適しているもの、または細胞内小器官へと誘導するものの中から選択され得る。
【０１１６】
例示的な使用方法
本明細書で記載される発明は、カーゴ部分を標的細胞に、または標的細胞中に送達する方法を含む。１つの実施形態では、方法は、標的細胞を輸送コンストラクトと接触させることを含み、輸送コンストラクトはカーゴ部分およびアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１を含む輸送ペプチドを含み、これによりカーゴ部分は標的細胞に、または標的細胞中に送達される。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、カーゴ部分は、輸送ペプチドにリンカーまたは化学結合を介して共有結合的に連結される。他の実施形態では、輸送ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で構成される。さらに他の実施形態では、カーゴ部分は、下記からなる群より選択される少なくとも１つである：核酸；ペプチド；タンパク質；オリゴ糖；脂質；糖脂質；リポタンパク質；小分子化合物；治療薬；ＵＶ−ｖｉｓ、蛍光または放射性標識；造影剤；診断薬；予防薬；リポソームおよびウイルス。さらに他の実施形態では、標的細胞は内皮細胞、心臓細胞、骨格筋細胞または脳細胞を含む。さらに別の実施形態では、細胞は哺乳類である。さらに別の実施形態では、哺乳類はヒトである。
【０１１８】
発明は、カーゴ部分を治療の必要な被験体の標的細胞に、または標的細胞中に送達する方法をさらに含む。１つの実施形態では、方法は、治療的有効量の、輸送コンストラクトを含む薬学的に許容される組成物を被験体に投与することを含み、輸送コンストラクトはカーゴ部分およびアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１を含む輸送ペプチドを含み、これによりカーゴ部分は被験体の標的細胞に、または標的細胞中に送達される。
【０１１９】
１つの実施形態では、カーゴ部分は、輸送ペプチドにリンカーまたは化学結合を介して共有結合的に連結される。別の実施形態では、輸送ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で構成される。さらに別の実施形態では、カーゴ部分は、下記からなる群より選択される少なくとも１つである：核酸；ペプチド；タンパク質；オリゴ糖；脂質；糖脂質；リポタンパク質；小分子化合物；治療薬；ＵＶ−ｖｉｓ、蛍光または放射性標識；造影剤；診断薬；予防薬；リポソームおよびウイルス。さらに別の実施形態では、標的細胞は内皮細胞、心臓細胞、骨格筋細胞または脳細胞を含む。さらに別の実施形態では、組成物は、下記からなる群より選択される少なくとも１つの経路により投与される：静脈内、経口、吸入、直腸、腟内、経皮、鼻腔内、頬側、舌下、非経口、くも膜下腔内、胃内、眼部、肺および局所。さらに別の実施形態では、被験体は哺乳類である。さらに別の実施形態では、哺乳類はヒトである。
【０１２０】
記載される本発明による方法は、下記を含むが、それらに限定されない１つ以上の疾患の治療／防止を含む：関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、Ｉ型糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、過敏性腸症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、自己免疫性心筋炎、川崎病、冠動脈疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、間質性肺疾患、自己免疫性甲状腺炎、強皮症、全身性硬化症、変形性関節症、アトピー性皮膚炎、白斑、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、自己免疫性腎炎、グッドパスチャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、ＡＮＣＡ関連血管炎、ぶどう膜炎、強皮症、水疱性類天疱瘡、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、嚢胞性線維症、痛風、加齢性黄斑変性、アレルギー、喘息および急性または慢性炎症のいずれかの結果である他の自己免疫疾患。
【０１２１】
さらなる実施形態では、疾患または障害は急性または慢性炎症であり、障害は自己免疫疾患であり得る。一実施形態では、障害は関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えばクローン病（ＣＤ）または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）または過敏性腸症候群（ＩＢＳ）である。さらなる実施形態では、障害はＲＡまたはＳＬＥである。慢性疾患だけでなく、本明細書で記載される組成物は、急性徴候、例えば移植、虚血／再灌流傷害（例えば急性心筋梗塞、脳卒中）、敗血症（例えばＳＩＲＳ、ＭＯＤＳ、ＡＬＩ）、アテローム性動脈硬化および脳内出血（ＩＣＨ）と関連し得る。
【０１２２】
例示的な自己免疫疾患
様々な実施形態では、本明細書で記載される組成物は、１つ以上の自己免疫疾患を治療するのに有用である。
【０１２３】
「自己免疫疾患」は、免疫系が異質分子を自己分子から識別できないことにより、および自己抗原に対する免疫寛容の損失（自己分子の破壊という結果になる）により引き起こされる疾患を指す。自己免疫疾患の非限定的な例としては下記が挙げられるが、それらに限定されない：全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、潰瘍性大腸炎、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、多発性硬化症（ＭＳ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、および関節リウマチ。
【０１２４】
特定の実施形態では、自己免疫疾患は多発性硬化症、甲状腺炎、１型糖尿病、サルコイドーシス、乾癬、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、重症筋無力症、炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節炎、変形性関節症、関節リウマチ、骨粗鬆症、喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。
【０１２５】
他の自己免疫疾患としては、例えば、下記が挙げられる：多発性硬化症、視神経脊髄炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、過敏性腸症候群、膵炎、潰瘍性大腸炎、憩室症、重症筋無力症、血管炎、乾癬、強皮症、喘息、アレルギー、全身性硬化症、白斑、関節炎、例えば変形性関節症、若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、川崎病、側頭動脈炎、ギラン・バレー症候群、および炎症性視神経症。
【０１２６】
例示的な炎症疾患
様々な実施形態では、本明細書で記載される組成物は、１つ以上の炎症疾患または障害を治療または防止するのに有用である。
【０１２７】
炎症応答は必ずしも外部刺激と関連せず、または有害でない環境物質により引き起こされる場合がある（アレルギーの場合）。どちらの場合でも、適正な制御のない炎症性サイトカインの過剰発現により、一般に局所性および全身性炎症の顕著な特徴であり、ならびに様々な炎症性の疾患および障害の顕著な特徴である、炎症が起こる。
【０１２８】
炎症は、例えば下記を含む、湿疹および皮膚炎などの様々な障害と関連する：アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、異汗性湿疹、貨幣状湿疹、うっ滞性皮膚炎炎、アレルギー性皮膚炎、乾癬、そう痒症、多発性硬化症、視神経脊髄炎、皮膚炎症、瘢痕性類天疱瘡、強皮症、化膿性汗腺炎、中毒性表皮壊死症、ざ瘡、骨炎、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、壊疽性膿皮症（ｐｙｒｏｄｅｒｍａ  ｇａｎｇｒｅｎｏｓｕｍ）、およびベーチェット症候群。
【０１２９】
結膜炎、ぶどう膜炎、虹彩炎、強膜炎を含む目の炎症疾患。
【０１３０】
鼻炎および副鼻腔炎などの上気道を含む気道の炎症疾患および気管支炎を含む下気道の炎症疾患。
【０１３１】
心筋炎などの炎症性ミオパチー。
【０１３２】
脳卒中または心停止などの炎症性虚血性イベントと関連する虚血再灌流障害などの他の炎症疾患。
【０１３３】
全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）および敗血症などの他の炎症状態。
【０１３４】
特定の実施形態では、炎症疾患または障害は、下記からなる群より選択される：乾癬、多発性硬化症、関節リウマチ、変形性関節症、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、糖尿病ＩまたはＩＩ型、喘息、炎症性肺損傷、炎症性肝損傷、炎症性糸球体損傷、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、シェーグレン症候群、角結膜炎、ぶどう膜炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節、皮膚、または筋肉の炎症疾患、急性または慢性特発性炎症性関節炎、筋炎、脱髄疾患、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、間質性腎炎および慢性活動性肝炎。
【０１３５】
ぶどう膜炎
ぶどう膜炎は米国の５０万を超える人々に影響を与え、その慢性形態は５−２０％の失明をもたらす。急性炎症過程および進行性視力喪失の両方を低減させるために、ぶどう膜炎のためのより良好な療法が必要とされる。特に、現在の療法と関連する重大な認容性の問題なしに、炎症および視力喪失を低減させる療法は、ぶどう膜炎患者に対し短期および長期の両方で視力を改善させるであろう。
【０１３６】
免疫抑制療法の目標は、目における急性炎症性イベントを軽減させることである。慢性ぶどう膜炎における炎症の抑制はしばしば、高い用量の全身ステロイド治療を含み、これは長期化し得る。静止状態の目においても、硝子体内ステロイドは、視力を改善する。しかしながら、これらの用量でのステロイドは著しい有害事象（ＡＥ）プロファイルを有する。全身ＡＥの多くは、硝子体内徐放ステロイド調製物を使用することにより回避され得る（Ｏｚｕｒｄｅｘ、Ｒｅｔｉｓｅｒｔ、など）。これらのアプローチは、視力を脅かすＡＥの白内障および緑内障を含む、ステロイドの眼のＡＥを回避しない。ステロイドはしばしば炎症の短期制御を達成するが、疾患の制御は達成せず、炎症の再発が起こり、この集団では一般的な追加の免疫抑制療法が必要とされる。
【０１３７】
ぶどう膜炎は、全てが、共通してぶどう膜（虹彩、毛様体および脈絡膜）の（しかし網膜をしばしば含む）炎症を有する病状の集合体である。現在の治療目標は、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｎｙｌａｔｅ  ｍｏｆｅｔｉｌ）などの免疫調節物質、および抗ＴＮＦを含む生物修飾物質と組み合わせてステロイドを使用する、炎症の抑制である。米国における６０，０００人の慢性後部および汎ぶどう膜炎患者では、高い用量の全身ステロイドを用いる治療が一般的であり、ステロイドの平均１日用量＞４０ｍｇ／日で、実質的にＳＵＮガイドラインを超えており重大な有害事象を引き起こすのに十分であり、そのいくつかはそれ自体が視力を脅かしている。
【０１３８】
免疫調節物質の使用により利用可能な治療選択肢が著しく広がり、ほとんどの慢性ぶどう膜炎患者は併用で治療される。しかしながら、これらの治療は有益な効果を有する一方、かなりの割合のぶどう膜炎患者が治療にもかかわらず視力を失っている。ある研究では、５８％の汎ぶどう膜炎患者が視力喪失を経験し、１０％近くが両側で盲目となった。
【０１３９】
ぶどう膜炎における炎症過程の主要な要素は、Ｔ−細胞およびマクロファージによる目の侵襲、血液網膜関門（ＢＲＢ）の破壊、浮腫、サイトカインの放出、およびタンパク質の房水および硝子体中への漏れを含む。多くの炎症経路がぶどう膜炎において活性化され、ぶどう膜炎の根底の原因が、若年性特発性関節炎〜ベーチェット病〜サルコイドまで広く多くの炎症状態にわたるため、単一の経路に対して特異性の高い治療アプローチが大多数のぶどう膜炎患者全体で有効であることはないであろう。より有望なアプローチは、複数の経路に共通の細胞過程を調節することである。
【０１４０】
主要炎症細胞シグナル経路の多くは、カベオラとして知られている細胞構造を介して制御される。カベオラおよび主要コートタンパク質カベオリン−１は、ＮＯシンターゼおよびＶＥＧＦ受容体の活性化を含むがこれらに限定されない、血管バリア機能および血管新生を制御するサイトカインおよび成長因子シグナルの伝達に関与する。分子レベルでは、これらのシグナル伝達イベントは、カベオリンとその結合パートナーとの間のタンパク質−タンパク質相互作用に依存する。
【０１４１】
カベオリン−タンパク質相互作用は細胞内作用であるため、このプロセスを標的にする分子は細胞透過性でなければならない。細胞透過性ペプチドのカブトラチンの足場ドメインへの融合ペプチドであるカベオリン模倣カブトラチンは、カベオラを介して媒介されるＮＯおよび他のシグナルの活性化を阻害する。カブトラチンは血管の透過性を低減させ、サイトカインＣＣＬ２が血液脳関門（ＢＢＢ）の単球の移行を促進する能力に拮抗し、ＭＭＰ発現を低減させ、ＮＧＦ（ＴｒｋＡを介する）およびＶＥＧＦの両方の作用を抑制しかつ血管新生を阻害する。
【０１４２】
ある一定の実施形態では、本明細書では、血管透過性をブロックする、ハイブリッド細胞透過性−カベオリンドメイン（カブトラチン）ペプチドの使用による、カベオラの機能の調節に基づくぶどう膜炎のための新規療法が提供される。第一世代カブトラチンは、浮腫および炎症細胞侵襲をブロックし、ならびに自己免疫性脳炎の実験モデルにおいて臨床スコアを改善することが示されている。
【０１４３】
ぶどう膜炎を治療するためのこの新規治療アプローチは、シグナル伝達におけるカベオリンの役割を調節し、血管内皮細胞により重要な血液−組織バリヤが維持および制御されている目および脳における特に重要な役割である、血管内皮細胞が免疫応答の制御において果たす役割を活用する。
【０１４４】
本明細書で提供される方法は細胞レベルで革新的であり、分子レベルで炎症過程を調節する血管内皮細胞機能を標的にし−分子メカニズムは本質的に抗炎症性ではないが、血液網膜関門（ＢＲＢ）のゲートキーパー機能において主要な役割を果たす内皮細胞内でのカベオリン機能の操作にある。カベオリン依存性シグナル伝達を阻害することにより、様々な成長因子およびサイトカインからのシグナルの伝達が阻害され、かつ血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊および免疫細胞の網膜中への移動が抑制される。
【０１４５】
本明細書で提供される組成物はまた、記載される発明に新規性を与える。特定の実施形態では、Ｅｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）が使用される。この分子は、ファージディスプレイにより発見された新規短配列を使用してインターナリゼーションを促進する、細胞透過性ペプチドである。この短ペプチドはカベオリン足場のフラグメントに結合されており、効率が最適化されて、より低い濃度でカベオリンより強固な効果を生成させることができる（図１）。よって、Ｅｎｄｏ５−ＣａｖＡＢは、最適化された、カブトラチンよりも強力な第二世代カブトラチンの一例である。
【０１４６】
本明細書で提供される組成物は、任意の好適な経路を介して投与できる。特定の実施形態では、組成物は、全身（ｉ．ｐ．）投与または硝子体内（ＩＶＴ）投与により被験体に提供される。
【０１４７】
多発性硬化症（ＭＳ）
炎症疾患の別の例は多発性硬化症（ＭＳ）である。ＭＳはＣＮＳの慢性で予測不可能な炎症疾患であり、脳および脊髄に影響を与える可能性があり、一般に若年成人に影響する。Ｈａｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２０４：２０８−３１。現在のところ、若年成人の最も一般的な神経疾患であるといわれており、通常２０歳〜４０歳の間で始まり、男性と比べてほぼ２倍の確率で女性に起こる傾向がある。
【０１４８】
ＭＳでは、神経細胞を取り囲み保護するおよび／または神経細胞の生成能力を保護する物質である、ミエリン鞘が損傷される。これは、「脱髄（ｄｅｍｙｅｌｉｚａｔｉｏｎ）」と呼ばれる。この損傷は、脳と身体との間のメッセージを減速させまたはブロックする効果を有し、ＭＳで観察される症状を引き起こす。脳内および／または脊髄内の播種性領域での脱髄（ｄｅｍｙｅｌｉｚａｔｉｏｎ）および瘢痕または他の病変は、この疾患の特徴であると考えられる。Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ５９４−６０４。
【０１４９】
これらの病変は、神経伝導を変化させ、身体に障害をもたらす神経障害（ＣＮＳ中の脱髄プラークの位置により異なる）を誘導すると考えられる。Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ５９４−６０４。その臨床徴候および症状は様々であり、それが影響するＣＮＳの部分に依存し、運動、感覚性、自律神経性および認知障害を含む。Ｎｏｓｅｗｏｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４３：９３８−５２。それでも、ＭＳのいくつかの一般的な症状として下記が挙げられる：（１）重度の疲労感；（２）バランス−歩行および協調の困難；（３）視覚の問題‐複視および失明；（４）手足のしびれおよびピリピリ感；（５）疼痛‐軽度および重度の両方；筋力の喪失；（６）筋肉におけるこわばりおよび攣縮；（７）気分変動‐うつ病および不安；（８）記憶および集中の問題；ならびに（９）言語の問題（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＭＳ  Ｓｏｃｉｅｔｙウェブサイト）。
【０１５０】
進行性能力障害は、特に２５年の展望が含まれる場合、ほとんどのＭＳ患者の運命である。ＭＳ患者の半分は、疾患発症の１５年以内に、歩行に杖を必要とする。ＭＳは若年および中年成人における神経障害の主原因であり、過去１０年までは有益な治療が知られていなかった。ＭＳは、非特異的な臨床所見のために診断が難しく、このことにより高度に構造化された診断判断基準が開発され、それはいくつかの技術的な進歩を含み、ＭＲＩスキャン、誘発電位、および脳脊髄液（ＣＳＦ）試験で構成される。診断判断基準は一般に、異なる時間に起こり感染、血管障害、または自己免疫障害などの他の原因により説明されない、中枢白質中の散在性の病変の一般原理に依存する。
【０１５１】
ＭＳは、未知の１つのまたは複数の作用物質がＴ−細胞媒介性炎症性発作を誘発し、ＣＮＳ（中枢神経系）組織の脱髄（ｄｅｍｙｅｌｉｚａｔｉｏｎ）を引き起こす、自己免疫疾患と広く考えられている。Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６１：  １６１３−１６１５。ミエリンを標的にする自己免疫反応の証拠は説得力があるが、決定的ではない。例えば、リンパ球またはミエリン食作用の非存在下での初期多発性硬化症病変における、ミクログリア活性化を伴う原発オリゴデンドロサイトアポトーシスの記載がある。Ｍａｎｕｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｂｒａｉｎ。
【０１５２】
ＭＳは、特徴的に４つの疾患パターンを有するとして報告されている：再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、一次性進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）、進行性再発性ＭＳ（ＰＲＭＳ）；および二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）。推定５０％のＲＲＭＳ患者が１０年でＳＰＭＳを発症し、９０％までのＲＲＭＳ患者が最終的にはＳＰＭＳを発症する。各疾患パターンは軽度、中度または重度を表し得る。ＲＲＭＳを有する個人は、神経機能を悪化させる明らかな発作を示す。これらの発作に続いて、部分的なまたは完全な回復期（緩解）があり、その間、疾患進行は起こらない（約８５％の人々が、最初にＲＲＭＳと診断される）。
【０１５３】
ＰＰＭＳは、最初から神経機能が徐々に悪化することにより特徴付けられ、明確な再発または緩解がない（約１０％の人々が、ＰＰＭＳと診断される）。ＳＰＭＳでは、初期のＲＲＭＳに続いて、多くの人々が二次性進行型疾患経過を発症し、この場合、疾患はより着実に悪化する（約５０％のＲＲＭＳの人々がこの形態の疾患を１０年以内に発症する）。ＰＲＭＳでは、人々は最初から着実に悪化する疾患症状を経験するが、途中で神経機能を悪化させる明確な発作があり、疾患は緩解なしで進行するように思われる（５％）（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＭＳ  Ｓｏｃｉｅｔｙウェブサイト）。疾患活動性および疾患進行を低減ようとするいくつかの治療が利用可能であるが、現在のところＭＳに対する治癒は存在しない。
【０１５４】
４つのクラスの６つの薬物がＭＳの治療のために米国で認可されている。ＦＤＡに認可された疾患治療としては下記が挙げられる：インターフェロンクラス、ＩＦＮ−β−１ａ（レビフ（商標）およびアボネックス（商標））およびＩＦＮ−β−１ｂ（ベータセロン（商標））；グラチラマー酢酸塩（コパキソン（商標））、ポリペプチド；ナタリズマブ（タイサブリ（商標））；およびミトキサントロン（ノバントロン（商標））、細胞傷害性薬物。他の薬物が様々な成功度で使用されており、コルチコステロイド、メトトレキサート、シクロホスファミド、アザチオプリン、および静脈内（ＩＶ）免疫グロブリンが挙げられる。現在認可される治療の利益は、ＭＳにおける再発率および能力障害の防止に関して比較的低い。
【０１５５】
レビフ（商標）（インターフェロンベータ１ａ）は、人体で見出されるのと同じインターフェロンベータを生成させる生物工学プロセスにより製造される医薬である。レビフ（商標）は、報告によれば週に３回皮下で投与される。（レビフ（商標）に対するＦＤＡに認可された処方情報から。
【０１５６】
アボネックス（商標）（インターフェロンベータ１ａ）は、人体で見出されるのと同じインターフェロンベータを生成させる生物工学プロセスにより製造される医薬である。アボネックス（商標）は、報告によれば週に一回の筋肉内注射として投与される。（アボネックス（商標）に対するＦＤＡに認可された処方情報から）。
【０１５７】
ベータセロン（商標）（インターフェロンベータ１ｂ）は、人体で見出されるのと同じインターフェロンベータを作り出した生物工学プロセスにより製造される医薬である。ベータセロン（商標）は、報告によれば、皮下に一日おきに注射される。（ベータセロン（商標）に対するＦＤＡに認可された処方情報から）。
【０１５８】
コパキソン（商標）（グラチラマー酢酸塩）は、ミエリン塩基性タンパク質を刺激する合成タンパク質である。完全には理解されていないメカニズムを介して、この薬物は、ミエリンデコイとして作用することにより、ミエリン損傷Ｔ細胞をブロックするように思われる。コパキソン（商標）は、報告によれば皮下に１日１回注射される。（コパキソン（商標）に対するＦＤＡに認可された処方情報から）。
【０１５９】
タイサブリ（商標）（ナタリズマブ）は、実験室で生成されたモノクローナル抗体である。これは、「血液脳関門」を横切って脳および脊髄に入る、潜在的に損傷する免疫細胞の血流からの動きを妨害するように設計される。タイサブリ（商標）は、報告によれば、４週間に一回、静脈内注入により投与される。（タイサブリ（商標）に対するＦＤＡに認可された処方情報から）。
【０１６０】
ノバントロン（商標）（ミトキサントロン）は、抗悪性腫瘍薬と呼ばれる医薬の一般群に属する。これは、ある一定の形態の癌を治療するために使用されてきた。これは、報告によれば、ミエリン鞘に対する攻撃を引き起こすと推定される、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージの活性を抑制することにより、ＭＳ治療において作用する。（ノバントロン（商標）に対するＦＤＡに認可された処方情報から）。
【０１６１】
炎症疾患と闘うための現在の療法は一般に、原因の複数の成分を標的にする多成分アプローチを提供できない。例えば、自己免疫疾患のための多くの治療は、細胞増殖をブロックすることにより、または炎症をブロックするために免疫応答を抑制することにより、疾患の単一成分を標的にすることを含む。結果として、ＰＣＫアイソフォーム活性を標的にし調節することにより炎症疾患原因の複数の成分を標的にする、有効な治療を提供することが強く求められている。特異的ＰＫＣアイソフォームの選択的阻害または活性化が可能な特異的に標的化された治療が必要であり、例えば、局所的に投与された場合に、低レベルの副作用を維持しつつ、炎症疾患原因の複数の成分を標的にする治療アプローチが提供されるであろう。よって、炎症性サイトカインの分泌を低減させる、および／またはＰＫＣアイソフォーム調節を介して免疫調節物質を制御する治療の開発が、局所および全身性炎症を一般に軽減することにおいて、ならびに本明細書で記載されるように炎症性および／または自己免疫疾患の宿主において有益であろう。
【０１６２】
自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）の実験モデルでは、カブトラチンは血液脳関門破壊、ＣＤ４５＋細胞の脳実質中への侵襲を阻害し、かつ機能欠損を寛解させる。このデータにより、カベオラの機能の調節は多発性硬化症において有用な治療アプローチとなりえることが示唆される。
【０１６３】
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）または神経外傷は、米国および世界中での多くの死亡および永久的な能力障害の症例の一因である。米国で毎年、ＴＢＩにかかっている１４０万の人々のうち、５０，０００人が死亡し、２３５，０００人が入院し、別の１１０万人が治療され、救急部から退出する。米国では０〜１４歳の子供のうち、ＴＢＩにより、毎年４３５，０００人が救急部を訪れ、２，６８５人が死亡し、３７，０００人が入院している。Ｌａｎｇｌｏｉｓ  ｓｅ  ａｌ，  Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ：  ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｖｉｓｉｔｓ，  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎｓ，  ａｎｄ  ｄｅａｔｈｓ，  Ａｔｌａｎｔａ  （Ｇａ．）：  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ；  ２００４。
【０１６４】
本明細書では、「神経変性イベント」は、脳卒中、発作、毒素曝露、虚血／再灌流傷害、低酸素症、外傷性脳損傷、多発性硬化症、視神経脊髄炎、脊髄損傷、レット症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、認知症（ＨＩＶに関連または関連せず）、または他の神経変性障害、ならびにうつ病、統合失調症、強迫性障害、神経性食欲不振症および神経性過食症などを意味する。「神経変性イベント」という用語はまた、ＰＮＳにおける神経への損傷と関連する、または関連する可能性のある著しい組織損傷をもたらす状態を含むことを意味する。説明的な例としては局所傷害、例えば挫傷、創傷または熱傷、あるいは切断または外科手術と関連する神経損傷が挙げられる。
【０１６５】
プロテアーゼに対するそれらの阻害特性のために、発明の作用物質は、例えば、様々な精神衰弱性の、精神病性の、神経のまたは血管の状態、例えば血管系または神経系の病状、疾患または障害の治療または防止において有用であり、ここではβ−アミロイド生成または凝集が役割を果たすか、または、ＢＡＣＥ−２（アミロイド前駆体タンパク質βサイト切断酵素２）またはカテプシンＤ（それらは、ペプシン型アスパルチルプロテアーゼおよびβ−セクレターゼの近縁ホモログである）の阻害に基づいており、および腫瘍細胞のより大きなの腫瘍化能または転移能とＢＡＣＥ−２またはカテプシンＤ発現の相関に基づいており、抗癌薬剤として、例えば、腫瘍細胞と関連する転移プロセスの抑制において、有用である。
【０１６６】
血管系または神経系の上記病状、疾患または障害は、下記により例示され、下記を含むが、限定されない：広場恐怖を有するまたは有さないパニック障害、パニック障害歴のない広場恐怖などの不安症、社会恐怖症、社交不安症、不安、強迫性障害を含む動物または他の特定恐怖症、外傷後または急性ストレス障害を含むストレス障害、または全般的なもしくは物質誘発性の不安症；神経症；てんかん発作；てんかん、とりわけ部分発作、二次性全般発作または全般発作［欠神（定型または非定型）、ミオクローヌス、間代性、強直性、強直性−間代性または強直性発作］へと発達する単純な、複雑なまたは部分的な発作；痙攣；片頭痛；うつ病性または双極性障害を含む感情障害、例えば単一エピソードまたは反復性大うつ病性障害、大うつ病、気分変調性障害、気分変調症、うつ病性障害ＮＯＳ、Ｉ型双極性またはＩＩ型双極性躁病または気分循環性障害；統合失調症またはうつ病を含む精神病性障害；神経変性、例えば脳虚血から生じる神経変性；パーキンソン病、ダウン症候群、認知症などの神経系の急性、外傷性または慢性変性過程、例えば老年認知症、レビー小体型認知症または前頭側頭型認知症、認知障害、認知障害、例えば軽度認知障害、記憶障害、アミロイドニューロパチー、末梢性ニューロパチー、アルツハイマー病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群、ニーマン・ピック病、例えばニーマン・ピック病Ｃ型、脳炎、脳、脊髄または神経損傷、例えば外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、神経外傷または脳外傷、血管アミロイドーシス、アミロイドーシスを伴う脳出血、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、視神経脊髄炎、または脆弱Ｘ症候群；スクレイピー；脳アミロイド血管症；脳症、例えば伝達性海綿状脳症；脳卒中；注意障害、例えば注意欠陥多動性障害；トゥレット症候群；吃音を含む発話障害；例えば時差ぼけまたは交代勤務の影響に苦しむ被験体における、概日リズムの障害；疼痛；侵害受容；かゆみ；急性、遅延性または予期性の嘔吐を含む嘔吐、例えば化学療法または放射線、乗物酔いにより誘発される嘔吐、または手術後の悪心または嘔吐症状；神経性食欲不振症または神経性過食症を含む摂食障害；月経前症候群；例えば対麻痺患者における、筋肉攣縮または痙縮；聴覚障害、例えば耳鳴または加齢性難聴；尿失禁；緑内障；封入体筋炎；あるいは物質乱用または依存を含む物質関連障害、例えばアルコールなどの物質退薬障害。発明の作用物質はまた、例えば、アルツハイマー病などの認知症性状態に苦しむ被験体における認知の増強において；胃内視鏡検査を含む内視鏡検査などの、麻酔またはマイナーな医療介入の前の前投薬として；またはリガンド、例えば放射性リガンドまたは陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）リガンドとして、有用であり得る。
【０１６７】
炎症性腸疾患（ＩＢＰ）
様々な実施形態では、本明細書で提供される組成物は、炎症性腸疾患の治療のために有用である。特定の実施形態では、炎症性腸疾患は潰瘍性大腸炎またはクローン病である。
【０１６８】
腸管装置は、一般に炎症性腸疾患に代表される多くの炎症疾患により影響される。特に、クローン病は、口から肛門までの様々なレベルの消化管に影響する重篤な慢性炎症疾患であり、特にこれは、小腸の最終部、回腸、結腸のいずれかまたは両方で観察され、時として結腸の粘膜および肛門部においても観察される可能性がある。
【０１６９】
対象となる腸管部分では、狭窄、出血性潰瘍および疼痛を引き起こす炎症、膨張および潰瘍形成が腸管壁全体で起こり、一方、影響されない組織部分は正常に見える。クローン病は、下記のような症状を伴う様々な程度の炎症性症状の交互の期間を示す：下痢、腹部疼痛、および体重減少。クローン病を有する３分の２〜４分の３の患者は、一生のある時点で外科手術を必要とする。外科手術は、医学療法に応答しない症状を緩和するために、または腸での封鎖、穿孔、膿瘍、または出血などの合併症をなくすために使用される。
【０１７０】
併用療法
本発明内の有用な組成物は、発明内で企図される疾患または障害を治療するために有用な１つ以上の追加の化合物と組み合わせて、本発明の方法内で有用であることが意図される。これらの追加の化合物は、本発明の化合物または発明内で企図される疾患または障害の症状を治療、防止、または低減させることが知られている化合物、例えば、市販の化合物を含み得る。
【０１７１】
相乗効果は、例えば、下記のような好適な方法を使用して計算できる：Ｓｉｇｍｏｉｄ−Ｅｍａｘ式（Ｈｏｌｆｏｒｄ  ＆  Ｓｃｈｅｉｎｅｒ，  １９９８１，  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．  ６：  ４２９−４５３）、Ｌｏｅｗｅ加算式（Ｌｏｅｗｅ  ＆  Ｍｕｉｓｃｈｎｅｋ，  １９２６，  Ａｒｃｈ．  Ｅｘｐ．  Ｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １１４：  ３１３−３２６）および半有効式（Ｃｈｏｕ  ＆  Ｔａｌａｌａｙ，  １９８４，  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．  ２２：  ２７−５５）。上で言及される各式を実験データに適用して対応するグラフを作成し、合剤の効果の評価を助ける。上で言及される式と関連する対応グラフは、それぞれ、濃度−効果曲線、アイソボログラム曲線および併用係数曲線である。
【０１７２】
投与／投与量／製剤
投与レジメンは、何が有効量を構成するかに影響し得る。治療製剤は、疾患または障害の発症の前または後のいずれかで患者に投与され得る。さらに、複数に分割された投与量、ならびに時差投与量が毎日または順次投与され得、または用量は連続して注入され得、またはボーラス注射であってもよい。さらに、治療製剤の投与量は、治療的または予防的状況の要件により示されるように、比例的に増加または減少させてもよい。
【０１７３】
患者、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトへの本発明内の有用な組成物の投与は、公知の手順を使用して、患者において疾患または障害を治療するのに有効な投与量で有効な期間の間実施され得る。治療効果を達成するのに必要とされる治療化合物の有効量は、下記のような因子によって変動し得る：患者における疾患または障害の状態；患者の年齢、性別、および体重；ならびに治療化合物の患者における疾患または障害を治療する能力。
【０１７４】
投与レジメンは、最適治療応答を提供するように調整され得る。例えば、複数に分割された用量が毎日投与されてもよく、または用量は、治療状況の要件により示されるように比例的に低減されてもよい。発明の治療化合物のための有効な用量範囲の非限定的な例は約１〜５，０００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。当業者であれば、関連因子を調べることができ、必要以上の実験をせずに、治療化合物の有効量を決定できるであろう。
【０１７５】
この発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与レベルは、特定の患者、組成物、および投与方法について、患者に有害となることなく、所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得られるように変化し得る。
【０１７６】
特に、選択される投与レベルは下記を含む様々な因子に依存する：使用される特定の化合物の活性、投与時間、化合物の排泄速度、治療期間、化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康および前病歴、および医学分野でよく知られている同様の因子。
【０１７７】
当技術分野で通常の技術を有する医師、例えば、内科医または獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方できる。例えば、医師または獣医師は、医薬組成物中で使用される発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるものより低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加できる。
【０１７８】
特定の実施形態では、投与の容易さかつ投与量の均一性のために、化合物を用量単位形態で製剤化することがとりわけ有利である。用量単位形態は、本明細書では、治療される患者のための単位投与量として適する物理的に別々のユニットを指し；各ユニットは、必要とされる医薬ビヒクルと共に所望の治療効果を生成させるように計算された、あらかじめ決められた量の治療化合物を含む。発明の用量単位形態は、下記により指示され、およびこれに直接的に依存する：（ａ）治療化合物の特有の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）患者における疾患または障害の治療のためのそのような治療化合物を配合する／製剤化する分野で固有の限界。
【０１７９】
１つの実施形態では、発明内の有用な組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を用いて製剤化される。１つの実施形態では、本発明の医薬組成物は、発明内の有用な化合物の治療的有効量および薬学的に許容される担体を含む。
【０１８０】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒質であってよい。適正な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散物の場合に必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールにより達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、塩化ナトリウム、またはマンニトールおよびソルビトールなどのポリアルコールを、組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物中に含むことによりもたらされ得る。
【０１８１】
１つの実施形態では、発明内の有用な組成物は、１〜５回／日またはそれ以上の範囲の投与量で患者に投与される。別の実施形態では、発明内の有用な組成物は、毎日１回、２日ごと、３日ごと〜週に一回、および２週間ごとに１回を含むが、それらに限定されない投与量の範囲で患者に投与される。発明内の有用な様々な併用組成物の投与頻度は、多くの因子、例えば、限定はされないが、年齢、治療される疾患または障害、性別、健康全般、および他の因子によって、個体間で変動することは当業者には容易に明らかであろう。よって、発明は、任意の特定の投与レジームに制限されると解釈されるべきではなく、任意の患者に投与される正確な投与量および組成物は、担当医が患者についての全ての他の因子を考慮することにより決定されるであろう。
【０１８２】
投与のための化合物は、約１μｇ〜約１０，０００ｍｇ、約２０μｇ〜約９，５００ｍｇ、約４０μｇ〜約９，０００ｍｇ、約７５μｇ〜約８，５００ｍｇ、約１５０μｇ〜約７，５００ｍｇ、約２００μｇ〜約７，０００ｍｇ、約３０５０μｇ〜約６，０００ｍｇ、約５００μｇ〜約５，０００ｍｇ、約７５０μｇ〜約４，０００ｍｇ、約１ｍｇ〜約３，０００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約２，５００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約２，０００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約１，５００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約７５ｍｇ〜約９００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約８００ｍｇ、約２５０ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約３００ｍｇ〜約６００ｍｇ、約４００ｍｇ〜約５００ｍｇ、ならびにそれらの間のありとあらゆる全体のまたは部分的な増分の範囲であってよい。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、化合物の用量は約１ｍｇ〜約２，５００ｍｇである。いくつかの実施形態では、本明細書で記載される組成物中で使用される発明の化合物の用量は、約１０，０００ｍｇ未満、または約８，０００ｍｇ未満、または約６，０００ｍｇ未満、または約５，０００ｍｇ未満、または約３，０００ｍｇ未満、または約２，０００ｍｇ未満、または約１，０００ｍｇ未満、または約５００ｍｇ未満、または約２００ｍｇ未満、または約５０ｍｇ未満である。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書で記載される第２の化合物（すなわち、疾患または障害を治療するために使用される薬物）の用量は約１，０００ｍｇ未満、または約８００ｍｇ未満、または約６００ｍｇ未満、または約５００ｍｇ未満、または約４００ｍｇ未満、または約３００ｍｇ未満、または約２００ｍｇ未満、または約１００ｍｇ未満、または約５０ｍｇ未満、または約４０ｍｇ未満、または約３０ｍｇ未満、または約２５ｍｇ未満、または約２０ｍｇ未満、または約１５ｍｇ未満、または約１０ｍｇ未満、または約５ｍｇ未満、または約２ｍｇ未満、または約１ｍｇ未満、または約０．５ｍｇ未満、ならびにありとあらゆる全体のまたは部分的な増分である。
【０１８４】
１つの実施形態では、本発明は、治療的有効量の発明の化合物を単独でまたは第２の医薬品と組み合わせて保持する容器；および患者における疾患または障害の１つ以上の症状を治療、防止、または低減させるため化合物を使用するための説明書を含むパッケージングされた医薬組成物に関する。
【０１８５】
製剤は経口、非経口、経鼻、静脈内、皮下、経腸、または当技術分野で知られている任意の他の好適な投与方法に好適な、従来の賦形剤、すなわち、薬学的に許容される有機または無機担体物質と混合して使用され得る。医薬調製物は滅菌されてもよく、望ましい場合は、助剤、例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧緩衝剤に影響を与えるための塩、着色剤、香味料および／または芳香物質などと混合され得る。それらはまた、望ましい場合、他の活性剤、例えば、他の認知改善剤と組み合わせることができる。
【０１８６】
「容器」という用語は、医薬組成物を保持するための任意の入れ物を含む。例えば、１つの実施形態では、容器は医薬組成物を含むパッケージングである。他の実施形態では、容器は医薬組成物を含むパッケージングではなく、すなわち、容器は、パッケージングされた医薬組成物またはパッケージングされていない医薬組成物および医薬組成物の使用のための説明書を含む入れ物、例えば箱またはバイアルである。その上、パッケージング技術は当技術分野でよく知られている。医薬組成物の使用のための説明書は医薬組成物を含むパッケージング上で含まれてもよく、および、そのようなものとして、説明書はパッケージングされた製品に対して機能的関係を増加させることが理解されるべきである。しかしながら、説明書は、化合物がその意図される機能、例えば、患者における疾患または障害を治療、防止、または低減させること、を実施する能力に関する情報を含み得ることが理解されるべきである。
【０１８７】
本発明の組成物のいずれかの投与経路としては、経口、経鼻、直腸、腟内、非経口、頬側、舌下または局所が挙げられる。本発明において使用するための化合物は、任意の好適な経路による投与、例えば経口または非経口、例えば、経皮、経粘膜的（例えば、舌下、舌、（経）頬側、（経）尿道、腟内（例えば、経および周囲膣）、鼻（内）および（経）直腸）、膀胱内、肺内、十二指腸内、胃内、くも膜下腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入、および局所投与のために製剤化され得る。
【０１８８】
好適な組成物および剤形としては、例えば、錠剤、カプセル、カプレット、丸薬、ジェル・キャップ、トローチ、分散物、懸濁液、溶液、シロップ、顆粒、ビーズ、経皮パッチ、ゲル、粉末、ペレット、マグマ、ロゼンジ、クリーム、ペースト、硬膏剤、ローション、ディスク、坐薬、経鼻または経口投与のための液体スプレー、吸入のための乾燥粉末またはエアロゾル化製剤、膀胱内投与のための組成物および製剤などが挙げられる。本発明で有用な製剤および組成物は、本明細書で記載される特定の製剤および組成物に制限されないことが理解されるべきである。
【０１８９】
経口投与
経口適用のためには、錠剤、糖衣錠、液体、ドロップ、坐薬、またはカプセル、カプレットおよびジェルキャップが特に好適である。経口使用のために意図される組成物は、当技術分野で知られている任意の方法により調製でき、そのような組成物は、錠剤の製造に好適な、不活性で無毒性の医薬賦形剤からなる群より選択される１つ以上の作用物質を含み得る。そのような賦形剤としては、例えば、ラクトースなどの不活性希釈剤；コーンスターチなどの造粒および崩壊剤；デンプンなどの結合剤；およびステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤が挙げられる。錠剤は無コートでもよく、または、正確さのためにまたは活性成分の放出を遅延させるための公知の技術によりコートしてもよい。経口使用のための製剤はまた、ハードゼラチンカプセルとして提供でき、この場合、活性成分は不活性希釈剤と混合される。
【０１９０】
経口投与のために、化合物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；フィラー（例えば、コーンスターチ、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）と共に従来の手段により調製される、錠剤またはカプセルの形態であってもよい。所望される場合、錠剤は、好適な方法およびコーティング材料、例えば、Ｃｏｌｏｒｃｏｎ，  Ｗｅｓｔ  Ｐｏｉｎｔ，  Ｐａ．から入手可能なＯＰＡＤＲＹ（商標）フィルムコーティング系（例えば、ＯＰＡＤＲＹ（商標）ＯＹ  Ｔｙｐｅ、ＯＹＣ  Ｔｙｐｅ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｅｎｔｅｒｉｃ  ＯＹ−Ｐ  Ｔｙｐｅ、Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｅｎｔｅｒｉｃ  ＯＹ−Ａ  Ｔｙｐｅ、ＯＹ−ＰＭ  ＴｙｐｅおよびＯＰＡＤＲＹ（商標）Ｗｈｉｔｅ，３２Ｋ１８４００）を用いてコートしてもよい。経口投与のための液体調製物は溶液、シロップまたは懸濁液の形態であってもよい。液体調製物は、薬学的に許容される添加物、例えば懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロースまたは水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステルまたはエチルアルコール）；および保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピルまたはソルビン酸）と共に従来の手段により調製され得る。
【０１９１】
造粒技術は、活性成分の開始粉末または他の微粒子材料を修飾するための医薬技術分野でよく知られている。粉末は典型的にはバインダ材料と共により大きな永久的な流動性凝集体または顆粒へと混合され、「造粒」と呼ばれる。例えば、溶媒を使用する「湿式」造粒プロセスは一般に、粉末がバインダ材料と組み合わされて、湿式造粒塊の形成が得られる条件下にて水または有機溶媒で湿らされ、この塊から次いで溶媒が除去されなければならないことを特徴とする。
【０１９２】
溶融造粒は一般に、室温で固体または半固体である（すなわち、比較的低い軟化または融点範囲を有する）材料の使用にあり、粉末または他の材料の造粒が、本質的に水または他の液体溶媒の添加なしで促進される。低溶融固体は、融点範囲の温度まで加熱されると、液化してバインダまたは造粒媒質として作用する。液化した固体はそれ自体、それと接触する粉末材料の表面上に広がり、冷却時に、固体造粒塊を形成し、その中で初期材料が共に結合される。得られた溶融造粒物はその後経口剤形を調製するために打錠機に提供されるかカプセル化され得る。溶融造粒は、固体分散物または固体溶液を形成することにより、活性物（すなわち、薬物）の溶解速度およびバイオアベイラビリティを改善する。
【０１９３】
米国特許第．５，１６９，６４５号は、改善された流動性を有する圧縮性のワックス含有顆粒を直接的に開示する。ワックスが溶融物中で、特定の流動性改善添加物と混合され、続いてこの混合物が冷却され造粒されることにより、顆粒が得られる。ある特定の実施形態では、ワックス（複数可）および添加物（複数可）の溶融混合物中でワックス自体のみが溶融し、他の場合には、ワックス（複数可）および添加物（複数可）の両方が溶融する。
【０１９４】
本発明はまた、発明の１つ以上の化合物の遅延放出を提供する層、および疾患または障害の治療のための薬剤の即時放出を提供するさらなる層を含む、多層錠剤を含む。ワックス／ｐＨ感受性ポリマ混合物を使用して、活性成分が封入された胃不溶性組成物を得ることができ、その遅延放出が確実になる。
【０１９５】
非経口投与
非経口投与のために、化合物は、注射または注入、例えば、静脈内、筋肉内または皮下注射または注入のために、あるいは急速投与量および／または持続注入での投与のために製剤化されてもよい。懸濁、安定および／または分散剤などの他の調合剤を任意に含む、油性または水性ビヒクル中の溶液、懸濁液またはエマルジョンが使用され得る。
【０１９６】
追加の投与形態
この発明の追加の剤形は、下で記載される剤形を含む：米国特許第６，３４０，４７５号、６，４８８，９６２号、６，４５１，８０８号、５，９７２，３８９号、５，５８２，８３７号、および５，００７，７９０号。この発明の追加の剤形はまた、下で記載される剤形を含む：米国特許出願第２００３／０１４７９５２号、２００３／０１０４０６２号、２００３／０１０４０５３号、２００３／００４４４６６号、２００３／００３９６８８号、および２００２／００５１８２０号。この発明の追加の剤形はまた、下で記載される剤形を含む：ＰＣＴ出願第ＷＯ０３／３５０４１号、ＷＯ０３／３５０４０号、ＷＯ０３／３５０２９号、ＷＯ０３／３５１７７号、ＷＯ０３／３５０３９号、ＷＯ０２／９６４０４号、ＷＯ０２／３２４１６号、ＷＯ０１／９７７８３号、ＷＯ０１／５６５４４号、ＷＯ０１／３２２１７号、ＷＯ９８／５５１０７号、ＷＯ９８／１１８７９号、ＷＯ９７／４７２８５号、ＷＯ９３／１８７５５号、およびＷＯ９０／１１７５７号。
【０１９７】
放出制御製剤および薬物送達系
ある実施形態では、本発明の製剤は、短期の、迅速消失性の、ならびに制御された、例えば、徐放の、遅延放出のおよびパルス放出の製剤であってよいが、それらに限定されない。
【０１９８】
徐放という用語は、その従来の意味で使用され、長期間にわたって薬物を徐々に放出し、必ずではないが、長期間にわたって薬物の実質的に一定の血液レベルをもたらし得る薬物製剤を指す。期間は、１ヶ月またはそれを超える長さであってよく、急速投与形態で投与される同じ量の作用物質よりも長い放出となるべきである。
【０１９９】
徐放のためには、化合物は、徐放特性を化合物に提供する好適なポリマまたは疎水性材料と共に製剤化されてよい。そのようなものとして、発明の方法で使用するための化合物は、微小粒子の形態で、例えば、注射により、あるいはウエハまたはディスクの形態で埋め込みにより投与され得る。
【０２００】
発明の好ましい実施形態では、発明の化合物は、単独で、または別の医薬品と組み合わせて、徐放製剤を使用して患者に投与される。
【０２０１】
遅延放出という用語は、その従来の意味で本明細書にて使用され、薬物投与後いくらか遅れて薬物の初期放出を提供し、必ずではないが、約１０分〜最大約１２時間までの遅延を含む薬物製剤を指す。
【０２０２】
パルス放出という用語は、その従来の意味で本明細書にて使用され、薬物投与後に薬物のパルス血漿プロファイルを生成させるような方法で薬物の放出を提供する薬物製剤を指す。
【０２０３】
即時放出という用語は、その従来の意味で使用され、薬物投与の直後に薬物の放出を提供する薬物製剤を指す。
【０２０４】
本明細書では、短期とは、薬物投与後、最大約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、約４０分、約２０分、または約１０分までのおよびそれらを含む任意の期間、ならびにありとあらゆる全体のまたは部分的な増分を指す。
【０２０５】
本明細書では、迅速消失とは、薬物投与後、最大約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、約４０分、約２０分、または約１０分までのおよびそれらを含む任意の期間、ならびにありとあらゆる全体のまたは部分的な増分を指す。
【０２０６】
投与
化合物の治療的有効量または用量は、患者の年齢、性別および体重、患者の現在の医学的状態および治療されている患者における疾患／障害の進行に依存するであろう。当業者は、これらのおよび他の因子によって適切な投与量を決定できるであろう。
【０２０７】
本発明の化合物の好適な用量は、約０．０１ｍｇ〜約５，０００ｍｇ／日の範囲であってよく、例えば約０．１ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、例えば約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、例えば約５ｍｇ〜約２５０ｍｇ／日である。用量は、単回投与で、または複数回投与で、例えば１〜４回またはそれを超える回／日で投与され得る。複数回投与が使用される場合、各投与量は同じであるか異なっていてもよい。例えば、１ｍｇ／日の用量は、２回の０．５ｍｇ用量として、約１２時間の投与間隔で投与され得る。
【０２０８】
投与される化合物の量／日は、非限定的な例では、毎日、一日おきに、２日ごとに、３日ごとに、４日ごとに、または５日ごとに投与され得ることが理解される。例えば、一日おきの投与を用いる場合、５ｍｇ／日の用量が、月曜日に開始され、続く第１の５ｍｇ／日用量が水曜日に、続く第２の５ｍｇ／日用量が金曜日に投与される、など。
【０２０９】
発明の方法で使用するための化合物は、単位剤形で製剤化され得る。「単位剤形」という用語は、治療を受けている患者のための単位投与量として好適な、物理的に別々のユニットを指し、各ユニットは、所望の治療効果を生成させるように計算されたあらかじめ決められた量の活性材料を、任意で好適な医薬担体と共に含む。単位剤形は、単一の１日用量または複数回の１日用量（例えば、約１〜４またはそれ以上回／日）の１つであってよい。複数回の１日用量が使用される場合、単位剤形は、各用量について同じであるか異なっていてもよい。
【０２１０】
当業者であれば、本明細書で記載される特定の手順、実施形態、特許請求の範囲、および実施例に対する多くの等価物を認識し、または、ただのルーチン実験を使用して確認できる。そのような等価物は、この発明の範囲内にあり、これに添付された特許請求の範囲に含まれると考えられた。例えば、限定はされないが、反応時間、反応サイズ／体積、および実験試薬、例えば溶媒、触媒、圧力、大気条件、例えば、窒素雰囲気、および還元／酸化剤を含む反応条件における、当該技術分野において承認されている代替物を用いる、およびただのルーチン実験を用いる改変は、本出願の範囲内にあることが理解されるべきである。
【０２１１】
値および範囲が本明細書で提供される場合、これらの値および範囲に包含される値および範囲はすべて、本発明の範囲内に包含されると意味されることが理解されるべきである。その上、これらの範囲に含まれる値は全て、ならびに値の範囲の上限または下限もまた、本出願により企図される。
【０２１２】
下記実施例はさらに本発明の態様を説明する。しかしながら、それらは決して、本明細書で明記される本発明の教示または開示を制限するものではない。
【０２１３】
実施例
発明を以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は、説明の目的のためだけに提供され、発明はこれらの実施例に制限されず、むしろ、本明細書で提供される教示の結果明らかになる全てのバリエーションを包含する。
【０２１４】
実施例１：細胞単離および培養
培養したラット心臓毛細血管内皮細胞（ＲＨＭＶＥＣ）を、ＶＥＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ、ＮＹ）から購入し、フィブロネクチンコートプレート上で、ＭＣＤＢ−１３１完全培地（ＶＥＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて増殖させた。ＢＡＥＣを地方の屠殺場から得られたウシ大動脈から単離し、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）およびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐが補充されたＤＭＥＭ（高グルコース；Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で増殖させた。ヒト臍血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ヒト臍帯から局所的に単離し、内皮細胞増殖サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐが補充されたＭ１９９培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させた。
【０２１５】
実施例２：Ｔ７ファージライブラリ構築
Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｔ７  ｓｅｌｅｃｔファージディスプレイシステムを、内皮細胞取込を促進するペプチドのランダムスクリーニングのために、７−ｍｅｒペプチドをランダムにコードするオリゴヌクレオチドのプールと併せて、使用した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ部位を含む７−ｍｅｒランダムペプチドプライマーを下記の通りに設計した：
センスプライマー：
５’−ＧＣＴＡＧＡＡＴＴＣＮＮＮＢＮＮＢＮＮＢＮＮＢＮＮＢＮＮＢＮＮＢＡＡＧＣＴＴＡＣＴＧＣＡＧＴＡＧＣＡＴＧ−３’、ここで、Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ；およびＢ＝Ｇ、Ｃ、Ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９）；
アンチセンスプライマー：
５’−ＣＡＴＧＣＴＡＣＴＧＣＡＧＴＡＡＧＣＴＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０）。
【０２１６】
同様の量の各プライマーを混合し、９５℃で５分間アニールし、その後、室温まで冷却した。Ｆｉｌｌ−ｉｎ反応をその後、クレノウ酵素を使用することにより実施して平滑末端ＤＮＡ断片を生成させた。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ消化後、０．０６ｐｍｏｌのインサートをＴ７ｓｅｌｅｃｔ４１５−１ｂベクター中に連結させた。ライゲーション反応物をインビトロパッケージングのためのＴ７パッケージング抽出物に直接的に付加し、３×１０７ｐｆｕのファージライブラリを生成させた。
【０２１７】
増幅のために、ライブラリにＢＬ２１培養物を接種し（０．５−１．０のＯＤ６００）１ｍＭのＩＰＴＧで、３７℃で２時間、細胞溶解が観察されるまで誘導した。ファージを含むライセートを遠心分離により８０００×ｇで１０分清澄化し、上清を滴定し、アリコートを４℃で貯蔵した。
【０２１８】
実施例３：ＥＣにおけるエンドサイトーシスによるファージ選択および増幅
ラット心臓毛細血管内皮細胞（ＲＨＭＶＥＣ）（８０％コンフルエント；およそ２×１０７細胞／１００ｍｍディッシュ）をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、無血清培地中、３７℃で３０分間プレインキュベートし、Ｔ７ファージライブラリ抽出物（５×ｌ０９ｐｆｕ）を接種し、２５０の感染多重度（ＭＯＩ）に到達させた。１時間の３７℃でのインキュベーション後、細胞を、氷冷ＰＢＳで洗浄し、０．１Ｎ  ＨＣｌ、ｐＨ２．２で１５秒間酸洗浄して未結合の、および弱く結合したファージを細胞表面から除去した。
【０２１９】
細胞をその後、トリプシン処理し、遠心分離し、氷上の無菌脱イオン水で溶解させた。細胞デブリを遠心分離により除去し、前にインターナライズさせたファージを含む上清を、上で記載される通り増幅させ、各ラウンド間で滴定し、５×１０９ｐｆｕのインプットファージが各連続ラウンドの開始時に使用されたことを確認した。６ラウンドの選択／増幅の完了後、大腸菌ＢＬ２１を得られたファージで感染してプレートに蒔き、個々のプラークを採取し、増幅させ、および配列決定した。
【０２２０】
実施例４：ペプチド合成
それらのＣ末端に融合されるカーゴ（ＤＧＩＷＫＡＳＦＴＴＦＴＶＴＫＹＷＦＹＲ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）を有する、または有さないＥｎｄｏ５（ＲＲＰＰＲ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）またはアンテナペディア（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）に対応するペプチドを、イェール大学医学大学院のＷ．Ｍ．Ｋｅｃｋバイオテクノロジー資源センターにより、標準Ｆｍｏｃ化学により合成し、質量分析により分析し純度を確認した。フルオロフォア（Ｅｎｄｏ５に対してはカルボキシフルオセインおよびＡＰに対してはローダミン）を、合成後にＮ末端に付加した。
【０２２１】
各実験前に、乾燥させたペプチドを秤量し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）に溶解して５×１０−２〜１０−２Ｍとし、蒸留水で希釈して１０−３Ｍにした。
【０２２２】
実施例５：ＮＯ放出
ＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出実験を、前に記載されるように実施した。簡単に言うと、コンフルエントＢＡＥＣを無血清ＤＭＥＭ中で６時間ペプチドと共にインキュベートした。培地を除去し、新鮮な無血清ＤＭＥＭを、ＶＥＧＦ（１０−９Ｍ）と共に、またはなしで３０分間添加した。培地を収集し、細胞をトリプシン処理し、計数し、上清中の亜硝酸レベルをＳｉｅｖｅｒｓ  ＮＯ化学ルミネセンス分析計を用いることにより決定した。
【０２２３】
実施例６：修正マイルスアッセイ
マウス皮膚における血漿漏出を、マイルスアッセイを用いて前に記載されるように検討した。簡単に言うと、雄Ｓｗｉｓｓマウス（３０−３５ｇ）に麻酔をかけ、エバンスブルー（ＰＢＳ溶液中３０ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ）を注射した。フェニルイソチオシアネート（鉱物油中５％）、カラシ油の類似体（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を、右耳に、綿棒で適用した。
【０２２４】
左耳を対照として使用し、鉱物油単独で処置した。３０分後、麻酔下の動物を屠殺し、灌流させ、耳を除去し、乾燥させ、秤量した。エバンスブルーを、耳からホルムアミドで抽出し、分光光度学的に５９５ｎｍで定量した。
【０２２５】
実施例７：インターナリゼーションの定量化
培養したＢＡＥＣを６−ウェルプレートでコンフルエンスに到達するまで増殖させた。細胞を洗浄し、標識ペプチド（１０−６Ｍ）を含む１ｍＬのＤＭＥＭ中で１、２、４または６時間、３７℃でインキュベートし、０．１Ｍグリシンを含む冷ＰＢＳ（ｐＨ４）で３回洗浄して非特異的表面染色を除去した。
【０２２６】
培地を完全に除去した後、細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、１５０μＬのＳＤＳ系溶解緩衝液またはトリトンＸ−１００溶解緩衝液を添加することにより、タンパク質を抽出した。膜を遠心分離により除去し、インターナライズされたペプチドを、蛍光プレートリーダー（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用することにより定量した。
【０２２７】
ペプチドと共に５分間インキュベートし、記載されるように洗浄した細胞を、基本の表面染色として使用した。使用した両方のフルオロフォアの線形性を、溶解溶液を使用して濃度−蛍光曲線を実施することにより決定した。各フルオロフォアを用いた実験を個々に実施し、交差干渉を防止した。
【０２２８】
実施例８：生存ヒト臍血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＣＰＰイメージング
新しく単離したＨＵＶＥＣを、ガラス底を有するペトリ皿上の、グルタミン、１０％ＦＢＳおよび内皮細胞増殖サプリメントが補充されたＭ１９９培地中で増殖させた。ＣＰＰは非特異的にガラスへ結合するので、ガラス底ペトリ皿を未標識ＡＰおよびＥｎｄｏ５を含むブロッキング溶液で３０分間（５×１０−５Ｍ）、１％ＦＢＳを有する無色Ｍ１９９培地中にて前処理することにより、バックグラウンド蛍光を低減した。
【０２２９】
細胞播種後、培地を除去し、カルボキシフルオレスセイン標識Ｅｎｄｏ５およびローダミン標識ＡＰを細胞に添加し（１０−５Ｍ）、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした（パルス）。培地を除去し、細胞を温かい培地で１回すすぎ、ペプチド取込を、Ｚｅｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ倒立蛍光顕微鏡上で、取得画像のＺ−スタックを実施し続いて体積デコンボリューションを実施することにより（Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェア）、迅速に可視化させた。新しい培地を細胞上に、さらに２時間（合計３時間）残し、ＣＰＰ局在を追跡し、細胞を再び可視化させた（追跡）。
【０２３０】
実施例９：ファージインターナリゼーションを媒介するペプチドのためのファージライブラリのスクリーニング
カプシド上に平均０．１〜１コピーのランダムに生成された７−ｍｅｒペプチドを発現する、Ｔ７ファージディスプレイライブラリを作成した。一定量のインプットファージ（５×１０９）を、培養したラット心臓毛細血管内皮細胞（ＲＨＭＶＥＣ）に添加し、これらのファージを、細胞単層により迅速にインターナライズされる（細胞取込）それらの能力について選択した。
【０２３１】
ＲＨＭＶＥＣを１時間、５．０×１０９ファージ（インプット）と共にインキュベートし、溶解させ、回収されたファージを定量し（細胞取込）、バイオパニングの次のラウンドのために増幅させた。回収パーセンテージは、インプットファージに対する回収されたファージの比として表される。表１に示されるように、６ラウンドの感染／精製後に、同一の開始条件下で０．０１８（ラウンド１）から１．８％（ラウンド６）へと、回収されたファージのパーセンテージにおける１００倍の増加が観察され、得られたファージライブラリが増強された内皮細胞インターナリゼーション特性を示す証拠が提供された。２４の個々のファージを単離した。
【表３】
0006692751.tif 000004
【０２３２】
図１に示されるように、選択の各ラウンド後の、内皮細胞におけるファージライブラリのインターナリゼーションの能力の分析は、取込パーセンテージにおける指数関数的増加を示唆する（指数関数との相関に対しＲ２＝０．９７５）。
【０２３３】
バイオパニングおよび濃縮の完了後に、得られたファージをプレートに蒔き、個々のプラークを増幅させ配列決定した。単離した２４の個々のファージのうち、５つのファージが予想外に短い５−ｍｅｒペプチドＲＲＰＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）（Ｅｎｄｏ５と呼ばれる）をコードし、それは最も頻繁に同定されたペプチドであった（２１％）。
【０２３４】
Ｅｎｄｏ５コーディングファージのＤＮＡ配列のコドン分析により、コード配列（ＣＧＧＣＧＣＣＣＧＣＣＴＣＧＴＴＧＡＧＧＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８）における終止コドンのランダムで予想外の挿入が明らかになり、これにより、このアプローチで生成できる理論的な７アミノ酸ＣＰＰサイズに比べてより小さなサイズのＥｎｄｏ５が正当化された。
【０２３５】
実施例１０：ｅＮＯＳ阻害活性
ＡＰ−Ｃａｖは、培養内皮細胞においてアゴニスト誘導性ｅＮＯＳ活性をブロックし（Ｂｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６：  １３６２−７）、この生物活性は、ＡＰ−Ｃａｖのインターナリゼーション、投与量および前処理時間に依存する。本明細書で記載される研究では、Ｅｎｄｏ５の取込可能性を、培養したＢＡＥＣによるＮＯ放出に関するＣａｖに融合したＥｎｄｏ５（ｅｎｄｏ５−Ｃａｖ）の効果を試験することにより、ＡＰのそれと比較した。
【０２３６】
図２Ａ−２Ｄは、Ｅｎｄｏ５−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）がＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出のブロッキングにおいて、ＡＰ−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）よりも強力であることを証明する棒グラフを提供する。図２Ａを参照すると、カーゴのないＡＰまたはＥｎｄｏ５による、またはＡＰ−ＣａｖもしくはＥｎｄｏ５−Ｃａｖ（１０−５Ｍ）によるＢＡＥＣの６時間前処理は、ＮＯ特異的化学ルミネセンスによりアッセイされる基本の（無刺激の）ＮＯ放出に有意の効果を有さなかった。ＡＰまたはＥｎｄｏ５による同様の前処理は、ＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出に対し有意の効果を示さず、一方、ＡＰ−Ｃａｖ（１０−５Ｍ）による前処理は、ＶＥＧＦ活性を４８％だけブロックした（Ｂｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６：１３６２−７）。興味深いことに、Ｅｎｄｏ５−Ｃａｖ（１０−５Ｍ）による同様の前処理はＢＡＥＣ  ＮＯ放出に対するＶＥＧＦ活性を完全に障害し、Ｅｎｄｏ５媒介取込はＡＰのそれよりもより効率的である証拠が提供された。
【０２３７】
Ｅｎｄｏ５−ＣａｖのＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出に対する薬理学的効果を、用量依存性阻害実験を実施することによりさらに検討した。図２Ｂにより示されるように、Ｅｎｄｏ５−Ｃａｖ（１０−６−１０−５Ｍ）での前処理により、ＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出の用量依存性阻害が引き起こされ、１０−５Ｍで最大に近い効果が得られた。ＡＰ−Ｃａｖ活性は、より高い用量でのペプチド不溶性のために、２．５×１０−５Ｍで最大阻害に到達したが、ずっと弱い阻害活性を示した（６１％阻害）。用量反応曲線の分析、続いて非線形回帰（曲線適合）により、ＡＰ−ＣａｖおよびＥｎｄｏ５−ＣａｖのＥＣ５０は、それぞれ、１．８×１０−６および７．５×１０−６Ｍであることが明らかになった。
【０２３８】
ＶＥＧＦ誘導性ｅＮＯＳ活性に対するＥｎｄｏ５−Ｃａｖの阻害が同様の濃度のＡＰ−Ｃａｖのそれよりも頑強であったので、ｅＮＯＳ活性に対するＡＰ−ＣａｖとＥｎｄｏ５−Ｃａｖ効果の間の時間依存性比較を実施した。図２Ｃにより示されるように、ＡＰ−Ｃａｖ（１０−５Ｍ）は、４時間および６時間のインキュベーション時間点の間ではわずかな違いしか観察されなかった（それぞれ、５７％対４９％）がＢＡＥＣにおけるＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出に対し時間依存性効果を有し、ＡＰ−Ｃａｖ取込と細胞内分解／排除の間でほぼ完全な平衡が到達され得ることが示唆される。
【０２３９】
Ｅｎｄｏ５−Ｃａｖ阻害効果もまた時間依存性であったが、より頑強であり、４時間で完全ｅＮＯＳ阻害を有し、Ｅｎｄｏ５のより速いインターナリゼーションが示唆された。その上、データは、ＡＰ−Ｃａｖ（１０−５Ｍ）による６時間前処理が、ＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出に対して、同様の濃度でのＥｎｄｏ５−Ｃａｖによる２時間前処理と比べて、同様の効果を有したことを示し、図２Ｃにより示されるように、Ｅｎｄｏ５−Ｃａｖ取込速度はＡＰ−Ｃａｖのそれのおよそ３倍であるという証拠が提供された。
【０２４０】
ＣａｖＡＢドメイン（ヒトカベオリン−１のアミノ酸８２−９５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）はｅＮＯＳ阻害を媒介する。Ｂｅｒｎａｔｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ，  ２００５，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０２：７６１−６６。Ｅｎｄｏ５は、カーゴインターナリゼーションの促進においてＡＰよりも強力であると考えられるので、ＡＰ−Ｃａｖリーダーおよびカーゴ配列の両方を、ＡＰ−Ｃａｖと比べて、治療効果／サイズ比を最大にするように改変した。よって、Ｅｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（１９−ｍｅｒペプチド）を合成し、その活性をＡＰ−Ｃａｖ（３６−ｍｅｒ酸ペプチド）のそれと比べた。
【０２４１】
図２Ｄは、Ｅｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（１０−５Ｍ）によるＢＡＥＣの６時間の前処理がＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出を完全にブロックし、一方、ＡＰ−Ｃａｖは同様の用量でＶＥＧＦ効果を５２％だけ阻害したことを示す。興味深いことに、Ｅｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（２×１０−６Ｍ）による前処理は、ＡＰ−Ｃａｖ（１０−５Ｍ）と同様の効果を有し、ＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出を４９％だけ阻害した。
【０２４２】
総合すれば、このデータは、ＡＰ−Ｃａｖ細胞取込配列およびカーゴの両方を最適化して１分子あたりまたは１アミノ酸あたりの治療可能性を最大化させる可能性を示唆する。
【０２４３】
実施例１１：抗炎症特性
ＥＣ誘導性ＮＯ生成は、炎症において、一つには、毛細管内圧力の増加およびその後の血管透過性を促進することにより積極的役割を果たす。マウスのＡＰ−Ｃａｖによる前処置は、マイルスアッセイにおいて血管漏出をブロックする（Ｂｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６：  １３６２−７；  Ｂｅｒｎａｔｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ，  ２００５，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０２：７６１−６）。この確立されたモデルはしたがって、Ｅｎｄｏ５−融合ペプチドのインビボ効力を評価するための有用なツールとなり得る。図３Ａおよび３Ｂは、Ｅｎｄｏ５−Ｃａｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）がインビボでエバンスブルー血管外漏出をブロックすることを証明する。
【０２４４】
図３Ａを参照すると、ＡＰ−Ｃａｖ（１ｍｇ／ｋｇ）によるマウスの１時間の前処置は、ＡＰ単独で処置した（分子量に基づく同様の用量）マウスに比べ、３７％だけ減弱させた（ｎ＝６／群）。Ｅｎｄｏ５−Ｃａｖは、Ｅｎｄｏ５前処置単独と比較すると、カラシ油誘導性血管漏出を５８％だけ阻害し（ｎ＝６または８／群）、ＡＰ−Ｃａｖよりも、統計的に有意なより大きな阻害活性を示した（†Ｐ＜０．０５）。
【０２４５】
図３Ｂで示されるプロットは、ＡＰ−ＣａｖおよびＥｎｄｏ５−Ｃａｖはどちらも、対照ペプチドと比べて、耳皮膚および組織におけるエバンスブルー血管外漏出を減弱させるが、Ｅｎｄｏ５−Ｃａｖはより強力であったことを示す。いずれの理論にも制限されることは意図しないが、Ｅｎｄｏ５−Ｃａｖにより示されるカラシ油誘導性炎症についての不完全阻害は、ＮＯがこのモデルにおいて血管透過性を媒介するのに部分的な役割しか果たさないという観察により説明され得る（Ｂｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６：  １３６２−７）。
【０２４６】
実施例１２：内皮細胞によるインターナリゼーション
ＡＰは、ニューロンの膜を横断するＣＰＰである。Ｊｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８８：  １８６４−８。本明細書の他のどこかで記載されるように、Ｅｎｄｏ５は内皮細胞におけるファージの高いインターナリゼーションを促進することが予想外に見出され、Ｅｎｄｏ５−Ｃａｖは、ｅＮＯＳ活性化および血管透過性の防止について、ＡＰ−Ｃａｖよりも強力であることが予想外に見出された。
【０２４７】
本明細書で記載される研究では、Ｅｎｄｏ５のインターナリゼーション速度をＡＰのそれと、それぞれ、各ペプチドのカルボキシフルオセインおよびローダミン−標識形態を使用することにより、直接的に比較した。各フルオロフォア結合ペプチドの線形性を、標準濃度／蛍光曲線を実施することにより確認した。
【０２４８】
図４Ａ−４Ｂは、Ｅｎｄｏ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）が、ＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）よりも速く、培養内皮細胞中でインターナライズされるという所見を示すグラフである。図４Ａを参照すると、両方のフルオロフォアに対して同様の吸光度値を得るために較正を実施した（各フルオロフォアに対して取得設定を調整することにより）。ＢＡＥＣを別々に、フルオロフォア標識ペプチド（１０−６Ｍ）と共に１、２、４または６時間インキュベートし、酸洗浄し、溶解させ、総ペプチド取込を、蛍光を定量することにより決定した。
【０２４９】
ＡＰインターナリゼーションでの時間に伴う直線増加が観察され、図４Ｂにより示されるように、６時間で、１．０７×１０−９モルのＡＰ／１０６細胞の値でピークとなった。これは、ゼロ時に添加されたローダミン−ＡＰの総量のおよそ１１％が、設定においてコンフルエントＢＡＥＣ単層によりインターナライズされることを示し、能動的濃縮メカニズムの証拠を提供する。カルボキシフルオセイン−Ｅｎｄｏ５のインターナリゼーション速度はＡＰのそれよりも大きく、これもまた６時間でピークとなり、２．８５×１０−９モルのＥｎｄｏ５／１０６細胞の値を有し、図４Ｂにより示されるように、添加されたペプチドの３０．５％が６時間後にインターナライズされたことを示唆する。
【０２５０】
実施例１３：生きた内皮細胞におけるインターナリゼーション
細胞内へのＣＰＰ移行に関与する取込メカニズムを明らかにすることを試みた以前の研究では、イメージングが固定した細胞中で実施された。これらの研究の結果は、細胞固定がＣＰＰの予想外の核移行を引き起こすという山のような証拠を考慮すると、信頼できない可能性がある。Ｒｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：５８５−９０。
【０２５１】
本研究では、落射蛍光顕微鏡法実験を生きたＨＵＶＥＣで実施してＥｎｄｏ５の取込メカニズムをＡＰと比較した。ガラス底ペトリ皿を非標識ＡＰおよびＥｎｄｏ５でブロックして標識ペプチドの非特異的結合を最小に抑えた後、新しく単離したＨＵＶＥＣを５０％コンフルエントまで増殖させ、カルボキシフルオセイン−Ｅｎｄｏ５およびローダミン−ＡＰ（１０−６Ｍ）の「パルス」で１時間標識し、すすぎ、その後、２時間の「追跡」を合計３時間実施した。
【０２５２】
デコンボリューションした画像を、「パルス」および「追跡」期間後に取得した。図５Ａ−５Ｃは、Ｅｎｄｏ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）およびＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）のインターナリゼーションが内皮細胞において重複する細胞経路を使用することを示す。Ｅｎｄｏ５（緑色チャネル、左）およびＡＰ（赤色チャネル、中央）はどちらも、３７℃での１時間のインキュベーション後の生きたＨＵＶＥＣ中で散在性の点状細胞質染色を示す（図５Ａ）。核染色はほぼ完全に消失した（暗い中央領域）。興味深いことに、統合画像により、Ｅｎｄｏ５とＡＰの間の高い共局在度が明らかになった（図５Ａ、右）。この観察により、Ｅｎｄｏ５とＡＰの初期インターナリゼーション経路の間の類似性が示唆される。ＨＵＶＥＣのローダミン−ＡＰとの個々のインキュベーションは、カルボキシフルオセイン−Ｅｎｄｏ５チャネルにおいてほとんど、または全くシグナルを引き起こさず、逆もまた同じであり、有意の漏れが存在しないことが示唆された。
【０２５３】
ＣＰＰなしでの２時間の「追跡」期間後に、Ｅｎｄｏ５およびＡＰの両方について点状染色は依然として顕著であったが、拡散パターンではなくより濃縮されたものが示され、能動的な細胞内濃縮／局在化メカニズムが強調された（図５Ｂ、左）。統合画像（右パネル）は再び、細胞表面からの初期インターナリゼーション後の、この長期相の細胞内ペプチド濃縮（追跡）中の、Ｅｎｄｏ５とＡＰの間の共局在を明らかにした。代表的な細胞を示した。総合すれば、これらのデータは、Ｅｎｄｏ５とＡＰの間のインターナリゼーションおよび細胞内分布の類似性を示した。
【０２５４】
Ｅｎｄｏ５とＡＰの間のインターナリゼーション経路の類似性を、競合研究を実施し、細胞中へのカーゴ移行を促進するＥｎｄｏ５およびＡＰの能力を定量することにより確認した。図５Ｃを参照すると、ＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出に対するＡＰ−Ｃａｖ（１０−５Ｍ）の部分的効果は、ＡＰまたはＥｎｄｏ５（５×１０−５Ｍ）のいずれかによる前処理によりブロックされた。Ｅｎｄｏ５−Ｃａｖにより媒介されるＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出のほぼ完全な阻害は、ＡＰまたはＥｎｄｏ５（５×１０−５Ｍ）のいずれかによる前処理により部分的に防止された。
【０２５５】
図５Ｃにより示されるように、Ｅｎｄｏ５−ＣａｖによるＶＥＧＦ誘導性ＮＯ放出の９１％阻害は、ＡＰ（３０％阻害）またはＥｎｄｏ５（１３％阻害）により防止された。総合すれば、これらの結果は、ＡＰおよびＥｎｄｏ５は、ＥＣにおいて同様の経路を介してインターナライズされることを示唆する。
【０２５６】
実施例１４：ぶどう膜炎の治療
レーザー誘起した新血管新生のラットモデルにおける、硝子体内注射に関するカブトラチンの分析。このモデルでは、カブトラチンを４日間隔で２回投与し、第８日に評価した。この研究からの結果を、図６で提供する。
【０２５７】
Ｂ１０．ＲＩＩＩ動物（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、ヒトＩＲΒΡ１６１−１８０ペプチドで第０日に免疫し、第７〜１９日まで毎日、生理食塩水中で製剤化したペプチドの腹腔内（ｉｐ）注射により、実験薬物で処置する。病理組織学的スコアリングによる炎症のピークである第１９日に、動物を屠殺し、目を固定しヘマトキシリン−および−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のために処理する。ＥＡＵの程度を網膜の病理組織学的スコアリングにより評価し、網膜切片を、熟達した評価者によるマスク様式で評価する。
【０２５８】
動物を６匹の群で処置し、両目を病理組織診断のために処理し、群ごとの１２の目のうちのｎでスコア化する。動物／目のこの数は、実験群の病理組織学的スコアが対照群の値の半分（未処置対照と未免疫動物の間での中間）である場合、実験群と未処置対照の間の差を検出するための検出力を与える。動物の初期群を段階分けして分散を確認し、試料サイズを実証する。
【０２５９】
動物のコホートをその後、治療／評価して下記の比較を可能にする：
（１）カブトラチン（２．５ｍｇ／ｋｇ）による治療対未処置対照。これにより、カベオリン機能の阻害が炎症を寛解させることを確認する。治療は、２つの群の病理組織学的スコア間に差がある場合に、成功と判断される。群間で、統計的に有意でない大きな差がある場合、有意性を達成するために数を増加させることが考えられる。平均値間に少なくとも２５％の差があるが統計学的有意性がない場合、より高い用量のカブトラチンを使用して実験が繰り返される。
（２）Ｅｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）よる治療（用量反応曲線、０．３、１．０、および３．０ｍｇ／ｋｇ用量を使用）対未処置対照。０．３ｍｇ／ｋｇ用量が、未免疫対照と統計的に差のない効果を生成する場合、より低い用量が、０．１、０．０３、０．０１ｍｇ／ｋｇの順で、効果レベルが未免疫対照動物スコアと異なるまで使用される。最大効果を生成するＥｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）の用量が同定された時に、研究が完了する。
（３）最適用量のＥｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）対ペプチドの細胞透過性フラグメントのみを含む対照ペプチドによる治療。この群を用いて用量応答実験を確認する。Ｅｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）の最適用量がいったん同定されると、最適用量Ｅｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）対カブトラチン対未処置対照の比較がなされる。この最後の比較が免疫組織化学のための固定により繰り返され、目が抗マウスＣＤ４５で染色され、およびＣＤ４５＋細胞により網膜の侵襲が定量化される。
【０２６０】
硝子体内に投与される場合カベオラの機能の調節がＥＡＵを寛解することを確立するために、ウサギＥＩＵモデルを使用する。このＥＩＵモデルは前房炎および網膜損傷の両方を引き起こし、マウスＥＡＵモデルと同様の網膜病理組織診断についてスコア化できる。
【０２６１】
Ｅｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）をウサギモデルにおいて試験する前に、ＩＶＴ投与による眼内および網膜毒性の可能性の評価を実施する。マウス体内での自由分布およびウサギ眼内での自由分布を仮定して、マウス内で同定された最適濃度と等価なものとして最低用量を選択する。
【０２６２】
この用量および１０および３０倍多い用量が硝子体内でウサギに投与され、網膜が除去され、固定され、Ｈ＆Ｅに対して処理される。急性研究（単一ＩＶＴ投与後２４時間に採取される網膜）および慢性研究（毎日、７日間注射される動物）が実施される。動物を保存するために、２匹の動物（４つの目）／群が評価され（合計１２匹の動物）。網膜切片が、熟達した網膜組織病理学者により評価される。
【０２６３】
Ｅｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）は、最適用量で観察可能な効果がない場合に、ならびに可能であれば、観察可能な有害作用のないレベル（ＮＯＡＥＬ）の同定および高い用量での観察される有害作用の定義がない場合に、非毒性であると決定される。試験した最高用量がＮＯＡＥＬである場合、より高い用量は試験されない。
【０２６４】
Ｅｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）の網膜炎症を阻害する能力は、下記の実験手順を使用して証明される。ＥＩＵ実験では、Ｅｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）注射用量は、毒性および薬物動態実験と組み合わせたマウスＥＡＵ用量−応答曲線に基づいて選択される。硝子体中の薬物の標的濃度は、マウスＥＡＵ実験（マウスにおける自由分布を仮定）において、最低の十分有効な用量のＥｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）を用いる投与で達成される濃度である。硝子体用量は、毒性濃度ではなく標的濃度を達成するための薬物動態データを用いて調整され、用量間の間隔が調整される。
【０２６５】
選択される硝子体用量および間隔は、標的濃度を超えるが毒性濃度に到達しない連続的な硝子体濃度を提供するものである。
【０２６６】
Ｅｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）は、ぶどう膜炎誘導の日に開始して、上により示されるように、誘導後第６日まで投与される。第６日に動物を屠殺し、目を病理組織学的分析のために処理する。切片は、熟達した評価者によりマスク様式で評価される。この実験は、抗原の硝子体内注射により一側性に誘導されたぶどう膜炎を有する各６匹の動物のコホートを用いて実施される。
【０２６７】
ぶどう膜炎および薬物の偽硝子体内投与を有する動物／目は、Ｅｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）を受けた動物と比較される。この実験は２回繰り返される。
【０２６８】
ウサギモデル実験：
ウサギ毒性学。このシリーズの目的は、薬物自体が、ぶどう膜炎モデルを妨害するいずれの毒性効果も動物において生成させないことを保証することである。第２の目的は、我々が使用するものより高い用量が毒性効果を有さず、治療濃度域が存在することを確立することである。
【０２６９】
使用が意図される濃度ならびに３倍高いおよび１０倍高い濃度での薬物の３つの用量が試験される。各動物に１つの目のみにおいて薬物が注射される。効力研究において意図される投与を反映する２回の薬物注射が実施される；第１の注射は第０日であり第２は第３日である。各用量に対し、２つの時間点が評価される、第４日（第２の注射後１日）および第６日（第２の注射後３日）。動物は全て、第１日、３日（第２の注射前）、４日（４日で屠殺される動物に対して）および６日に臨床的に検査される。臨床検査に続いて、血液が後のＰＫ分析のために採取され、貯蔵され、動物は屠殺され、目が固定され病理組織診断のために処理される。処置された目は全て薄片にされ染色され（Ｈ＆Ｅ）、組織（前側セグメントおよび網膜を含む）が熟達した眼組織病理学者により検査される。
【０２７０】
効力試験
ぶどう膜炎モデルは、Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ／Ｌｉｎ研究所において既存のプロトコルによって実施される。１つの目のみに免疫原が注射されてぶどう膜炎を誘導し、その目だけに薬物が注射される。薬物の少なくとも２つの用量が硝子体内で試験される。各用量で、薬物が第０日および第３日に投与され、第６日に屠殺される。終点（一次）は細胞であり、臨床スコアリングを有する房水中のタンパク質が二次である。細胞は細胞計数器（コールターカウンター）または血球計数器のいずれかを使用して計数される。
【０２７１】
最終臨床検査が第６日に実施され、血液の試料が後のＰＫのために採取されて貯蔵され、動物が屠殺される。実験の目が分析のために取られる。処置された目は全て薄片にされ染色され（Ｈ＆Ｅ）、組織（前側セグメントおよび網膜を含む）が熟達した眼組織病理学者により検査される。
【０２７２】
動物が６匹／用量の群で試験され、単一時間点で分析のために屠殺される。対照群、カブトラチン群およびＥｎｄｏ５−ＣａｖＡＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）の２つの用量および少なくとも１つの確証群を考えると、最低３０匹の動物がこの相のために必要とされ、３０の目が薄片にされ、染色され評価される。
【０２７３】
実施例１５：外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の治療
穿通性および閉鎖性頭部外傷の両方を含む外傷性脳損傷、ならびに脊髄への損傷は、炎症性要素を有することが長く認識されている。例えば、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｏｎｔｉｖｅｒｏｓ  ＤＧ，  Ｔａｊｉｒｉ  Ｎ，  Ａｃｏｓｔａ  Ｓ，  Ｇｉｕｎｔａ  Ｂ，  Ｔａｎ  Ｊ，  Ｂｏｒｌｏｎｇａｎ  ＣＶ．  Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．  ２０１３；  ４：３０  ｄｏｉ：  １０．３３８９／ｆｎｅｕｒ．２０１３．０００３０．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２３５３１６８１；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３６０７８０１を参照されたい。
【０２７４】
カベオリンおよび類似体は、浮腫および炎症細胞の浸潤を減少させる能力を有し、ミクログリア／マクロファージ活性化を抑制することもできる。カベオリン類似体の効果は、閉鎖性頭部損傷のモデルにおいて証明できる。制御式皮質衝撃モデルは、短期および長期の両方において炎症性効果を与えることが示されている。Ａｃｏｓｔａ  ＳＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔｓ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｉｍｐａｃｔ  ｍｏｄｅｌ．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．  ２０１３；  ８（１）：ｅ５３３７６．  ｄｏｉ：  １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５３３７６．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２３３０１０６５；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３５３６７６６を参照されたい。
【０２７５】
スプラーグドーリーラット（１０週齢）が１−２％イソフルランを用いて麻酔にかけられ、定位フレームで固定される。頭蓋骨が外科的に露出され、前頭頭頂葉皮質で正中線に対し−０．２ｍｍ前側および＋０．２ｍｍ外側の座標で中心とされる半径２．５ｍｍの骨切除開頭術がなされる。制御式皮質衝撃体（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，  ＰＡ）が、６．０ｍ／ｓの速度および硬膜下の１．０ｍｍの深さ、および１５０ｍｓの衝撃の持続期間を使用して用いられ衝撃を送達する。衝撃体は、衝撃点で脳に対して垂直に頭蓋骨に衝撃を与えるように角度がつけられる。動物は手順を通して正常体温で維持される。衝撃後、切開部を縫合し、動物を回復させる。
【０２７６】
神経障害は、損傷後２４および４８時間に評価されるＣｌａｒｋの系を用いてスコア化される。Ｃｌａｒｋ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｉｔｉｃｏｌｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｓｔｒｏｋｅ；  ａ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  １９９８；  ２９（１０）：２１３６−４０．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ９７５６５９５を参照されたい。
【０２７７】
ＴＢＩの直後に、およびＴＢＩ後２４時間にラットを２．５ｍｇ／ｋｇカブトラチンでｉ．ｐ．により治療すると、観察される神経障害が低減する。ＴＢＩ後４８時間に、ラットは屠殺され、脳は薄片にされ、組織が免疫組織化学のために処理される。未処置動物では、病変境界域でのＧＦＡＰの発現が劇的に増加し、カブトラチンによる治療によりＧＦＡＰ発現が低減する。Ｇｌｕｓｈａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｆ２ａｌｐｈａ  ＦＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  ２０１３；  １０（１）：  １３２．  ｄｏｉ：  １０．１１８６／１７４２−２０９４−１０−１３２．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４１７２５７６を参照されたい。
【０２７８】
実施例１６：炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療
クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、腸管の炎症疾患である。ＩＢＤの多くのモデルが存在し、最も一般的なのは、デキストラン硫酸ナトリウムモデルである。例えば、Ｋｏｂｏｚｉｅｖ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：  ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄａｔａ  ｉｎｔｏ  ｎｅｗ  ｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  ２０１１；  １７（５）：  １２２９−４５．  ｄｏｉ：  １０．１００２／ｉｂｄ．２１５５７．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２１３１２３１８；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３０７５３７を参照されたい。このモデルは、カベオリン類似体の効力を証明するために使用される。
【０２７９】
Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、デキストラン硫酸ナトリウム２％を含む飲料水が９日間与えられる。体重が毎日測定される。９日の終わりに、マウスは屠殺され、結腸の第１の遠位センチメートルが病理組織学的分析に供せられる。切片は、Ｊｉｒｋｏｆ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｕｒｒｏｗｉｎｇ  ｉｓ  ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｗｅｌｌｂｅｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍｉｃｅ．  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｉｍａｌｓ．  ２０１３，  ４７（４）：２７４−８３．  ｄｏｉ：  １０．１１７７／００２３６７７２１３４９３４０９．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２３８２８８５３で記載されるスコアリングシステムに従いスコア化される。
【０２８０】
これらのマウスを２．５ｍｇ／ｋｇのカブトラチンまたはＥｎｄｏ−５ＣａｖＡＢ（または他のカベオリン類似体）でｉ．ｐ．により、第１日に開始して毎日治療すると、９日で体重減少が低減し、病理組織学的スコアが改善する。
【０２８１】
実施例１７：多発性硬化症（ＭＳ）の治療
多発性硬化症は長く、炎症状態として認識されており、現在の治療としては、免疫抑制剤、例えばステロイド、メトトレキサート、およびインターフェロン（ベータセロン（登録商標）、アボネックス（登録商標）、など）、および最近になってジレニア（登録商標）（フィンゴリモド）が挙げられる。
【０２８２】
再発寛解型および一次性進行型を含む、ＭＳと診断された患者はＥｎｄｏ−５ＣａｖＡＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）（または他のカベオリン類似体）で、８０ｍｇ／日にて皮下注射により治療される。この治療によりＭＳの症状が改善し、運動機能、歩調などが改善される。治療を受ける患者における変化は、多発性硬化症機能評価を用いて測定される。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＭＳ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｙ  Ｍｅａｓｕｒｅｓのウェブサイトを参照されたい。
【０２８３】
本明細書で引用される各および全ての特許、特許出願、および刊行物の開示は、これにより、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８４】
発明について、特定の実施形態を参照して開示してきたが、この発明の他の実施形態およびバリエーションは、発明の真の精神および範囲から逸脱せずに、他の当業者により考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような実施形態および等価なバリエーションを全て含むと解釈されることが意図される。
【図１】
0006692751.tif 000005
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0006692751.tif 000007
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【配列表】
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