(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳｍａｒｔＡｍｐ法に用いるためのＡ型インフルエンザウイルス検出用試薬であって、以下の（１）から（２３）からなる群から選択されるいずれかのプライマーセットを含む試薬：
（１）配列番号５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５９のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２）配列番号４９のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（３）配列番号５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（４）配列番号５０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（５）配列番号５２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（６）配列番号５２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号４６のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（７）配列番号５３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（８）配列番号４７のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号１０、１２または２８のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（９）配列番号４９のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号３９、４０、４２または４３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１０）配列番号５０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号３９〜４２のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１１）配列番号５１のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４１または４２のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１２）配列番号５２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号３９〜４３のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１３）配列番号５３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号３９、４２または４３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１４）配列番号４８のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号９〜３７のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１５）配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号５６〜５８のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１６）配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号５６〜５８のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１７）配列番号１９のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４８のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（１７ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１７ｂ）配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（１７ｃ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１８）配列番号４０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４９のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（１８ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１８ｂ）配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（１８ｃ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１９）配列番号１４のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号３８のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４７のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（１９ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６４のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（１９ｂ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２０）配列番号４０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（２０ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２０ｂ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２０ｃ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２０ｄ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２０ｅ）配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（２０ｆ）配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２１）配列番号３８のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（２１ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２１ｂ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２１ｃ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２１ｄ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２１ｅ）配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（２１ｆ）配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２）配列番号４９または５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（２２ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２ｂ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２ｃ）配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２ｄ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２ｅ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２ｆ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（２２ｇ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；ならびに
（２３）配列番号５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号５９、６８、６９、または７０のヌクレオチド配列からなるプライマー。
【請求項２】
前記プライマーセットの少なくとも１つのプライマーが標識されている、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のいずれかのプライマーセットを使用することを含む、ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いるＡ型インフルエンザウイルスの検出方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のいずれかのプライマーセットを含む、Ａ型インフルエンザウイルスの検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスを検出するためのプライマー、プライマーセット、方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは流行性のウイルス性の呼吸器感染症であり、幅広い年齢層が罹患する疾患である。その症状は、３９度以上の高熱、関節痛および筋肉痛などの全身症状である。また、高齢者では肺炎、小児では脳症などを併発する場合があり、致命的になることがある。さらに、世界的な大流行（パンデミック）を引き起こすこともある。
【０００３】
インフルエンザの病原体であるインフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科に属する、一本鎖ＲＮＡウイルスである。インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン（ＨＡ：赤血球凝集素）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、Ｍ１タンパク質などのタンパク質を含むエンベロープを有する。エンベロープ内には一本鎖ＲＮＡゲノムが含まれており、このゲノムは８つの分節に分かれている。このゲノムはＮＰタンパク質と呼ばれる核タンパク質にらせん状に巻き付いている。インフルエンザウイルスは、Ｍ１タンパク質とＮＰタンパク質の抗原性の違いに基づき、Ａ型、Ｂ型およびＣ型に分類される。Ａ型はさらに、１６種類のＨＡと９種類のＮＡとの組み合わせの違いにより、複数の亜型に分類される。
【０００４】
インフルエンザウイルスは変異を起こしやすい。中でも、Ａ型インフルエンザウイルスは突然変異によって変異型ウイルスが出現しやすい。突然変異には「連続変異」と「不連続変異」が存在する。「連続変異」は、「抗原ドリフト」とも呼ばれ、ウイルス核酸が一塩基単位で変異を起こすものである。Ａ型インフルエンザウイルスにおいて、連続変異によって生じる変異は、同じ亜型の中における変異株の違いに相当する。しかしながら、変異が起きた部位がウイルスの感染性や毒性に関わる重要な部位である場合にはウイルスの性質が大きく変わる。また、小さな変異が積み重なった結果としてウイルスの抗原性が変化すると、ウイルスに対する従来の抗体との反応性が低下し、新型ウイルスの流行を起こすきっかけとなる。「不連続変異」は、「抗原シフト」とも呼ばれ、ＨＡおよび／またはＮＡが全く異なる型に置き換わるものである。これは、異なる亜型のウイルスが１つの細胞に同時に感染することにより、細胞内で合成されたウイルス遺伝子やタンパク質が集合する時に混ざり合い、結果として元のウイルスとは異なった組み合わせの遺伝子分節を獲得したウイルスが新たに生じることに起因する。特に、ヒト型のウイルスと他の動物のウイルスとの間で組換えが起きると、それまでヒトの間には存在しなかった新型のヒトインフルエンザウイルスが出現し、パンデミックにつながる可能性がある。
【０００５】
一般に、インフルエンザウイルスの検出には、免疫クロマトグラフィー法に基づく迅速診断キットが用いられている。これは、鼻拭い液などの検体中にインフルエンザウイルスが存在するかどうかを確認する方法である。迅速診断キットは、短時間で結果を得ることができるという利点を有する。しかしながら、発症直後の検査では、ウイルス量の少なさに起因して偽陰性となる可能性もある。また、キット間で感度にばらつきが見られるという問題点もある。より確実な診断方法としては、検体から採取したウイルスを培養細胞などで培養し、抗インフルエンザ血清を用いて同定する方法（ウイルス分離検査）や、ウイルス遺伝子をＰＣＲ法によって増幅させて同定する方法（ＰＣＲ検査）がある。
【０００６】
近年、様々な型／亜型のインフルエンザウイルスを検出するためのＰＣＲプライマーが開発されている（特許文献１〜４）。しかしながら、ＰＣＲ検査は、ウイルス分離法に比べて短時間で結果を得ることができるが、結果が出るまでに数〜十数時間を要する。最近になって、トリインフルエンザウイルスのより迅速な診断を目的として、等温で増幅可能なＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を用いるインフルエンザの検出方法が開発されている（特許文献５および６）。一方、等温で増幅可能な方法である、核酸増幅の特異性に優れたＳｍａｒｔＡｍｐ法が開発されている（特許文献７）。最近になって、ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いて２００９  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスを特異的に検出する方法が見出された（非特許文献１）。しかしながらこの方法は、２００９  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスの検出に特化している。これまで、ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いて、既に知られているＡ型インフルエンザウイルス全般を検出する方法は開発されていない。また、既に知られているＡ型インフルエンザウイルス全般を検出するだけでなく、将来的に出現し得る新型のＡ型インフルエンザウイルスも検出し得る方法の開発も求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−２５０５８９号公報
【特許文献２】特開２００７−２８２５９２号公報
【特許文献３】特開２０１２−５２５８３７号公報
【特許文献４】特開２０１２−５３２６２７号公報
【特許文献５】特許第４７８６５４８号明細書
【特許文献６】特許第５３３７９４４号明細書
【特許文献７】特許第３８９７８０５号明細書
【特許文献８】特許第４３７０３８５号
【特許文献９】特許第４７６１０８６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１２；７（１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の解決課題は、Ａ型インフルエンザウイルスの亜型の違いやウイルスの変異の影響を受けずにＡ型インフルエンザウイルスを検出するための、ＳｍａｒｔＡｍｐ法用のプライマーおよびプライマーセット、ならびにそれらを用いた方法およびキットを提供することである。前記ＳｍａｒｔＡｍｐ法用のプライマーセットの構築においては少なくとも２種類以上のプライマーを競合することなく適切に設定する必要がある。しかしながら、Ａ型インフルエンザウイルスの亜型の違いやウイルスの変異の影響を受けない領域は限られており、前記領域において２種類以上のプライマーを競合することなく適切に設定する必要がある。また、Ａ型インフルエンザウイルスの亜型の違いやウイルスの変異の影響を受けない領域において、ヒトゲノム配列との相同性が少ない領域にプライマーを設定する必要もあり、プライマーを設定できる領域がさらに限られてくる。つまり、Ａ型インフルエンザウイルスの亜型の違いやウイルスの変異の影響を受けず、さらにヒトゲノムとの交差反応を示さないように、Ａ型インフルエンザウイルスを検出するためのＳｍａｒｔＡｍｐ法用のプライマーセットとして、適切にプライマーを設定・構築する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Ａ型インフルエンザウイルスゲノムの塩基配列に特異的にハイブリダイズするＳｍａｒｔＡｍｐ法用のプライマーを作製した。そして、作製したプライマーが、Ａ型インフルエンザウイルスの亜型の違いやウイルスの変異の影響を受けないことを見出した。それによって、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下のものを提供するものである：
［１］ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いてＡ型インフルエンザウイルスを検出するための７〜３０塩基長のプライマーであって、
（ａ）配列番号１の連続した５以上の塩基からなる配列；または
（ｂ）配列番号２の連続した５以上の塩基からなる配列
を含む、プライマー；
［２］配列番号９〜４６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む、［１］に記載のプライマー；
［３］配列番号９〜４６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなる、［２］に記載のプライマー；
［４］ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いてＡ型インフルエンザウイルスを検出するための２０〜４５塩基長のプライマーであって、
（ｃ）配列番号３の連続した５以上の塩基からなる配列または配列番号４の連続した５以上の塩基からなる配列；および
（ｄ）配列番号５の連続した５以上の塩基からなる配列
を含み、
ここで、配列（ｄ）は配列（ｃ）の５’側に接続されている、
プライマー；
［５］配列番号４７〜５５のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む、［４］に記載のプライマー；
［６］配列番号４７〜５５のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなる、［５］に記載のプライマー；
［７］ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いてＡ型インフルエンザウイルスを検出するための２０〜４５塩基長のプライマーであって、
（ｅ）配列番号６の連続した５以上の塩基からなる配列
を含む、プライマー；
［８］配列番号５６〜５９および６８〜７０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む、［７］に記載のプライマー；
［９］配列番号５６〜５９および６８〜７０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなる、［８］に記載のプライマー；
［１０］ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いてＡ型インフルエンザウイルスを検出するための１０〜３５塩基長のプライマーであって、
（ｇ）配列番号７の連続した５以上の塩基からなる配列；または
（ｈ）配列番号８の連続した５以上の塩基からなる配列
を含む、プライマー；
［１１］配列番号６０〜６５のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む［１０］に記載のプライマー；
［１２］配列番号６０〜６５のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなる、［１１］に記載のプライマー；
［１３］少なくとも１個のヌクレオチドが、付加、欠失および／または置換されている、［１］〜［１２］のいずれか一つに記載のプライマー；
［１４］［１］〜［１２］のいずれか一つに記載のプライマーのヌクレオチド配列に対して、５０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、プライマー；
［１５］少なくとも１個のヌクレオチドが標識されている、［１］〜［１２］のいずれか一つに記載のプライマー；
［１６］［４］〜［６］のいずれか一つに記載のプライマー、および［７］〜［９］のいずれか一つに記載のプライマーを含む、ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いてＡ型インフルエンザウイルスを検出するためのプライマーセット；
［１７］さらに［１］〜［３］のいずれか一つに記載のプライマーを少なくとも１つ含む、［１６］に記載のプライマーセット；
［１８］［１］〜［３］のいずれか一つに記載のプライマーを２つ以上含む、［１７］に記載のプライマーセット；
［１９］さらに［１０］〜［１２］のいずれか一つに記載のプライマーを少なくとも１つ含む、［１６］〜［１８］のいずれか一つに記載のプライマーセット；
［２０］［１０］〜［１２］のいずれか一つに記載のプライマーを２つ以上含む、［１９］に記載のプライマーセット；
［２１］少なくとも１つのプライマーが標識されている、［１６］〜［２０］のいずれか一つに記載のプライマーセット；
［２２］少なくとも１つのプライマーが、その配列において少なくとも１個のヌクレオチドが、付加、欠失および／または置換されている、［１６］〜［２１］のいずれか一つに記載のプライマーセット；
［２３］以下からなる群から選択される、ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いてＡ型インフルエンザウイルスを検出するためのプライマーセット：
（１）配列番号５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５９のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２）配列番号４９のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（３）配列番号５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（４）配列番号５０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（５）配列番号５２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（６）配列番号５２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号４６のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（７）配列番号５３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（８）配列番号４７のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号１０、１２または２８のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（９）配列番号４９のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号３９、４０、４２または４３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１０）配列番号５０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号３９〜４２のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１１）配列番号５１のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４１または４２のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１２）配列番号５２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号３９〜４３のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１３）配列番号５３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号３９、４２または４３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１４）配列番号４８のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号９〜３７のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１５）配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号５６〜５８のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１６）配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号５６〜５８のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１７）配列番号１９のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４８のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（１７ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１７ｂ）配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（１７ｃ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１８）配列番号４０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４９のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（１８ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１８ｂ）配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（１８ｃ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１９）配列番号１４のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号３８のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４７のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（１９ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６４のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（１９ｂ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２０）配列番号４０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（２０ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２０ｂ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２０ｃ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２０ｄ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２０ｅ）配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（２０ｆ）配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２１）配列番号３８のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（２１ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２１ｂ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２１ｃ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２１ｄ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２１ｅ）配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（２１ｆ）配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２）配列番号４９または５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（２２ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２ｂ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２ｃ）配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２ｄ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２ｅ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２ｆ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（２２ｇ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；ならびに
（２３）配列番号５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号５９、６８、６９、または７０のヌクレオチド配列からなるプライマー；
［２４］［１］〜［１５］のいずれか一つに記載のプライマーまたは［１６］〜［２３］のいずれか一つに記載のプライマーセットを使用することを含む、ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いるＡ型インフルエンザウイルスの検出方法；および
［２５］［１］〜［１５］のいずれか一つに記載のプライマーまたは［１６］〜［２３］のいずれか一つに記載のプライマーセットを含む、Ａ型インフルエンザウイルスの検出用キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、Ａ型インフルエンザウイルスゲノムの塩基配列に特異的にハイブリダイズするプライマーを用いて、ＳｍａｒｔＡｍｐ法により、Ａ型インフルエンザウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、ウイルスの亜型の違いやウイルスの変異の有無に関わらず、Ａ型インフルエンザウイルスを検出することができる。また、従来法に比べてより正確にＡ型インフルエンザウイルスを検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】図１−１〜１−４はＳｍａｒｔＡｍｐ法による核酸増幅反応の模式図を示す。
【図１−２】図１−２は図１−１の続きである。
【図１−３】図１−３は図１−２の続きである。
【図１−４】図１−４は図１−３の続きである。
【図２】図２は、本発明のプライマーセットＡを用いたＳｍａｒｔＡｍｐ法の結果を示す。図Ａは、「合成ＲＮＡ」を鋳型として用いた場合の結果である。図Ｂは、Ａ＿Ｖｉｃｔｏｒｉａ＿２１０＿２００９（Ｈ３Ｎ２）ウイルスを鋳型として用いた場合の結果である。陰性対照は、蒸留水を鋳型として用いた場合の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明では、Ａ型インフルエンザウイルスを検出するために、ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いる。ＳｍａｒｔＡｍｐ法は核酸増幅法の一つである。この方法は、標的配列を挟み込む非対称な形の複数（通常3-6本）のプライマーを利用した遺伝子の等温増幅法である。従来のＰＣＲ法とは異なり、反応温度を変化させる必要がない。
【００１５】
ＳｍａｒｔＡｍｐ法では、一般に、２つのプライマーが用いられる。これらのプライマーはそれぞれ、ターンバックプライマー（ＴＰ）およびフォールディングプライマー（ＦＰ）と呼ばれる。ＴＰは、増幅される核酸配列（標的核酸配列）の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）（アニーリング領域）を３’末端部分に含み、かつ標的核酸配列において配列（Ａ）の５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）（ターンバック領域）を配列（Ａｃ’）の５’側に含む。ＦＰは、標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）（アニーリング領域）を３’末端部分に含み、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）（テール配列）を配列（Ｃｃ’）の５’側に含む。図１−１〜１−４に、ＳｍａｒｔＡｍｐ法による核酸増幅反応の模式図を示す。ＳｍａｒｔＡｍｐ法の詳細については、出典明示によりその全体が本明細書に組み込まれる、特許第３８９７８０５号を参照のこと。
【００１６】
また、ＳｍａｒｔＡｍｐ法では、ＴＰおよびＦＰに加えて、さらなるプライマーを用いてもよい。このさらなるプライマーは、ブーストプライマー（ＢＰ）と呼ばれる。ＢＰは、標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズし、かつ標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて、ＴＰやＦＰなどの他のプライマーと競合しないプライマーである。ＢＰは、ＴＰおよびＦＰの増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった場合に、その一本鎖部分に存在する標的核酸配列にハイブリダイズすることができる。これにより増幅産物中の標的核酸配列に新たな遊離型の３’末端が提供される。この遊離型の３’末端は、続く合成反応における「相補鎖合成起点」となる。
【００１７】
本発明において、「他のプライマーと競合しない」とは、あるプライマーが標的核酸配列にハイブリダイズすることによって、他のプライマーによる相補鎖合成起点の提供が妨げられないことを意味する。
【００１８】
本発明において、「ヒトゲノムとの交差反応が抑制され」とは、ヒトゲノムとの交差反応が認められない、あるいは無いことを言う。具体的には、あるプライマーが、ヒトゲノムを鋳型とした場合よりも、インフルエンザウイルスを鋳型とした場合の方が、核酸増幅シグナルを検出するまでの時間が短いことを指す。また、あるプライマーが、インフルエンザウイルスの存在を検出するが、ヒトゲノムの存在は検出しないことを指す。例えば、ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いてインフルエンザウイルスを検出する場合、インフルエンザウイルスに対しては所定の時間以下で核酸増幅シグナルが検出できるが、ヒトゲノムに対してはその所定の時間が過ぎた後でないと核酸増幅シグナルが検出できない場合、ヒトゲノムとの交差反応が抑制されている。
【００１９】
本発明において、「ウイルスの亜型の違いの影響を受けない」とは、核酸増幅シグナルの検出において、あるプライマーが、ウイルスの複数の亜型を検出し得ることを言う。また、「ウイルスの変異の影響を受ない」とは、あるプライマーが、野生型のウイルスだけでなく、変異型のウイルスも検出し得ることを言う。この場合、変異型のウイルスは、連続変異によって出現したものであってもよく、不連続変異によって出現したものであってもよい。
【００２０】
１つの態様において、本発明は、ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いてＡ型インフルエンザウイルスを検出するためのブーストプライマー（ＢＰ）に関する。本発明のＢＰは、（ａ）配列番号１（ACCCCAAAATCCCCTTAGTCAGAGGTGACA）の連続した５以上の塩基からなる配列、または（ｂ）配列番号２（TGAGCGTGAACACAAA）の連続した５以上の塩基からなる配列を含む。一実施形態では、本発明のＢＰは、配列番号１の連続した数塩基、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６塩基を含む。他の実施形態では、本発明のＢＰは、配列番号２の連続した数塩基、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６塩基を含む。本発明のＢＰの長さは、例えば、５〜４０塩基長、７〜３０塩基長、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基長である。
【００２１】
好ましい実施形態では、本発明のＢＰは、配列番号９〜４６のいずれかのヌクレオチド配列を含む。より好ましい実施形態では、本発明のＢＰは、配列番号９〜４６のいずれかのヌクレオチド配列からなる。
【００２２】
他の態様において、本発明は、ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いてＡ型インフルエンザウイルスを検出するためのターンバックプライマー（ＴＰ）に関する。本発明のＴＰは、（ｃ）配列番号３（TGGCTAAAGACAAGACC）の連続した５以上の塩基からなる配列または配列番号４（TGTCACCTCTGACTAAGGGGAT）の連続した５以上の塩基からなる配列、および（ｄ）配列番号５（CGCTCACTGGGCACGGTGAGCGTGAACACAAA）の連続した５以上の塩基からなる配列を含み、かつ配列（ｄ）は配列（ｃ）の５’側に接続されている。配列（ｃ）はＴＰの「アニーリング領域」であり、配列（ｄ）はＴＰの「ターンバック領域」である。一実施形態では、本発明のＴＰは、配列番号３の連続した数塩基、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７塩基を含み、かつ配列番号５の連続した数塩基、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基を含む。他の実施形態では、本発明のＴＰは、配列番号４の連続した数塩基、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２塩基、を含み、かつ配列番号５の連続した数塩基、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基を含む。本発明のＴＰの長さは、例えば、１０〜５０塩基長、２０〜４５塩基長、例えば、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０塩基長である。配列（ｃ）および配列（ｄ）の間には、介在配列が存在してもよく、あるいは存在しなくてもよい。介在配列については、特許第３８９７８０５号を参照のこと。
【００２３】
好ましい実施形態では、本発明のＴＰは、配列番号４７〜５５のいずれかのヌクレオチド配列を含む。より好ましい実施形態では、本発明のＴＰは、配列番号４７〜５５のいずれかのヌクレオチド配列からなる。
【００２４】
別の態様において、本発明は、ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いてＡ型インフルエンザウイルスを検出するためのフォールディングプライマー（ＦＰ）に関する。本発明のＦＰは、（ｅ）配列番号６（CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCCTCGC）の連続した５以上の塩基からなる配列を含む。配列（ｅ）はＦＰの「アニーリング領域」である。ＦＰは、アニーリング領域の５’側に「テール配列」を含む。「テール配列」には本技術分野で公知の任意の配列が用いられ得る。一実施形態では、本発明のＦＰは、配列番号６の連続した数塩基、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基を含む。本発明のＦＰの長さは、例えば、１５〜５０塩基長、２０〜４５塩基長、例えば、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４塩基長である。配列（ｅ）および「テール配列」の間には、介在配列が存在してもよく、あるいは存在しなくてもよい。介在配列については公知である。例えば特許第３８９７８０５号を参照のこと。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明のＦＰは、配列番号５６〜５９および６８〜７０のいずれかのヌクレオチド配列を含む。より好ましい実施形態では、本発明のＦＰは、配列番号５６〜５９および６８〜７０のいずれかのヌクレオチド配列からなる。
【００２６】
本発明では、上述のＴＰ、ＦＰおよびＢＰの他に、ＬＡＭＰ法またはＳＤＡ法において用いられる「アウタープライマー（ＯＰ）」を用いてもよい。ＯＰとは、他のプライマーの外側に位置し、先に合成された鎖を剥がしながらＤＮＡ合成を行うことにより増幅を加速する機能をもつプライマーである。ＯＰを用いることで、標的核酸配列の増幅効率を向上させることができる。ＯＰは、標的核酸配列内の配列にハイブリダイズしてもよく、または標的核酸配列を含む鋳型核酸配列上の、標的核酸配列の外側に位置する配列にハイブリダイズしてもよい。
【００２７】
ＯＰは、標的核酸配列を含む鋳型核酸配列において、ＴＰ、ＦＰおよび／またはＢＰがハイブリダイズする配列の５’側に位置する配列にハイブリダイズしてもよい。あるいは、ＴＰ、ＦＰおよび／またはＢＰがハイブリダイズする配列の３’側に位置する配列にハイブリダイズしてもよい。またあるいは、ＴＰ、ＦＰおよび／またはＢＰがハイブリダイズする配列の全体または一部分にハイブリダイズしてもよい。
【００２８】
したがって、他の態様において、本発明は、ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いてＡ型インフルエンザウイルスを検出するためアウタープライマー（ＯＰ）に関する。本発明のＯＰは、（ｇ）配列番号７（GATCTTGAGGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAAT）の連続した５以上の塩基からなる配列、または（ｈ）配列番号８（CCCCATTCCCATTAAGGGCATTTTGGACAAAG）の連続した５以上の塩基からなる配列を含む。一実施形態では、本発明のＯＰは、配列番号７の連続した数塩基、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８塩基を含む。他の実施形態では、本発明のＯＰは、配列番号８の連続した数塩基、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８塩基を含む。本発明のＯＰの長さは、例えば、５〜４０塩基長、１０〜３５塩基長、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０塩基長である。
【００２９】
好ましい実施形態では、本発明のＯＰは、配列番号６０〜６５のいずれかのヌクレオチド配列を含む。より好ましい実施形態では、本発明のＯＰは、配列番号６０〜６５のいずれかのヌクレオチド配列からなる。
【００３０】
本発明の上述したプライマーには、その変異体も含まれる。「変異体」は、上述した各プライマーのヌクレオチド配列において、数個のヌクレオチド、例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個のヌクレオチドが、付加、欠失および／または置換された配列を有するプライマーである。あるいは、変異体は、本発明のプライマーのヌクレオチド配列に対してローカルアラインメント（Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を実施した場合に、約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、より一層好ましくは約８５％以上、特に好ましくは約９０％以上（例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列を有するプライマーである。配列の同一性は、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）などを用いて測定することができる。あるいは、単純に配列を比較して、配列の同一性を計算することもできる。変異体の長さは、Ａ型インフルエンザウイルスを検出できる限り特に限定されないが、例えば５〜１００塩基長、５〜８０塩基長、５〜６０塩基長、５〜５０塩基長、５〜４０塩基長、５〜３０塩基長、８〜２７塩基長、１０〜２５塩基長、１２〜２３塩基長または１５〜２０塩基長である。
【００３１】
さらに、本発明の上述したプライマーには、その修飾体も含まれる。「修飾体」は、プライマーを構成するヌクレオチドのいずれかが修飾されているプライマーである。本発明において、プライマーの５’末端のヌクレオチドが修飾されていてもよく、または３’末端のヌクレオチドが修飾されていてもよい。あるいは、５’末端および３’末端のヌクレオチドの両方が修飾されていてもよい。あるいは、プライマーの末端以外の内部に位置するヌクレオチドが修飾されていてもよい。修飾には、例えば、放射性同位元素または蛍光色素、あるいはジゴキシゲニンおよびビオチンなどの有機化合物による標識が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、本発明のプライマーは蛍光物質により標識されている。蛍光物質には、例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）、フルオレセイン（ＦＡＭ）（商標）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）（商標）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）（商標）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＶＩＣ（登録商標）、ＮＥＤ（商標）、ＰＥＴ（登録商標）、Ａｌｅｘａ（登録商標）蛍光色素、テキサスレッド（登録商標）、ローダミンレッドＸ（ＲＯＸ）（商標）、およびＥｘｃｉｔｏｎ色素（特許文献８および９を参照のこと）などが挙げられるが、これらに限定されない。より好ましい実施形態では、本発明のプライマーはＥｘｃｉｔｏｎ色素により標識されている。
【００３２】
ＳｍａｒｔＡｍｐ法で無標識のプライマーが用いられる場合、ＤＮＡの増幅を検出するために、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する試薬（インターカレーター）が用いられる。そのようなインターカレーターは、当技術分野において公知である。例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いてもよい。
【００３３】
本発明に用いられるＳｍａｒｔＡｍｐ法には、その改良方法も含まれ得る。したがって、本発明のプライマーには、ＳｍａｒｔＡｍｐ法の改良方法に用いられるように適宜改変されたプライマーが含まれ得る。プライマーの改変の一つして、上述の修飾が挙げられる。また、ＳｍａｒｔＡｍｐ法において、ｄＮＴＰの代わりに、ビオチンあるいは蛍光物質で標識された塩基を基質として用いてもよい。
【００３４】
本発明のプライマーは、Ａ型インフルエンザウイルスゲノムにおけるマトリックスプロテイン（ＭＰ）をコードする配列の一部分にハイブリダイズする。ＭＰ領域は、季節性インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）と新型インフルエンザ（２００９ｐｄｍＨ１Ｎ１）に共通する分節である。したがって、本発明のプライマーは、季節性と新型の区別なく、かつ亜型の区別なく、Ａ型インフルエンザウイルスを広く検出できる。さらに、以下の実施例に記載されるように、ＭＰ領域の中でも変異の発生頻度が低い領域を、プライマーがハイブリダイズする標的核酸配列としていることから、将来発生し得る新型のＡ型インフルエンザウイルスを検出することも可能である。
【００３５】
他の態様において、本発明は、上述した本発明のプライマーを含む、ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いてＡ型インフルエンザウイルスを検出するためのプライマーセットに関する。本発明のプライマーセットは、上述した個々のプライマーの任意の組み合わせも含む。一実施形態では、本発明のプライマーセットは、上述したＴＰのいずれか１つ、および上述したＦＰのいずれか１つを含む。本発明のプライマーセットは、さらに、上述したＢＰを少なくとも１つ含み得る。例えば、本発明のプライマーセットは、上述したＢＰを２つ以上、例えば２、３、４または５つのＢＰをさらに含み得る。本発明のプライマーセットは標識された１以上のＢＰと標識されていない１以上のＢＰを含んでもよい。また、本発明のプライマーセットは、さらに、上述したＯＰを少なくとも１つ含み得る。例えば、本発明のプライマーのセットは、上述したＯＰを２つ以上含み得る。
【００３６】
他の実施形態では、本発明のプライマーセットは、配列番号４７〜５５のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＴＰ、および配列番号５６〜５９および６８〜７０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＦＰを含む。別の実施形態では、本発明のプライマーセットは、配列番号９〜４６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＢＰをさらに含む。さらに別の実施形態では、本発明のプライマーセットは、配列番号４７〜５５のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるＴＰ、および配列番号５６〜５９および６８〜７０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるＦＰを含む。さらに別の実施形態では、本発明のプライマーセットは、配列番号９〜４６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるＢＰをさらに含む。本発明のプライマーセットは、２以上の配列番号９〜４６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＢＰを含んでもよい。あるいは、２以上の配列番号９〜４６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるＢＰを含んでもよい。また、本発明のプライマーセットは、配列番号９〜４６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む標識された１以上のＢＰと配列番号９〜４６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む標識されていない１以上のＢＰを含んでもよい。あるいは配列番号９〜４６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなる標識された１以上のＢＰと配列番号９〜４６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなる標識されていない１以上のＢＰを含んでもよい。さらに別の実施形態では、本発明のプライマーセットは、配列番号６０〜６５のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＯＰをさらに含む。あるいは配列番号６０〜６５のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるＯＰをさらに含む。本発明のプライマーセットは、２以上の配列番号６０〜６５のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＯＰを含んでもよい。あるいは２以上の配列番号６０〜６５のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるＯＰを含んでもよい。
【００３７】
さらに好ましい実施形態では、本発明のプライマーセットは、以下からなる群から選択される：
（１）配列番号５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５９のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２）配列番号４９のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（３）配列番号５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（４）配列番号５０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（５）配列番号５２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（６）配列番号５２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号４６のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（７）配列番号５３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（８）配列番号４７のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号１０、１２または２８のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（９）配列番号４９のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号３９、４０、４２または４３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１０）配列番号５０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号３９〜４２のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１１）配列番号５１のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４１または４２のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１２）配列番号５２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号３９〜４３のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１３）配列番号５３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号３９、４２または４３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１４）配列番号４８のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号９〜３７のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１５）配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号５６〜５８のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１６）配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号５６〜５８のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１７）配列番号１９のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４８のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（１７ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１７ｂ）配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（１７ｃ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１８）配列番号４０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４９のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（１８ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１８ｂ）配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（１８ｃ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（１９）配列番号１４のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号３８のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４７のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（１９ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６４のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（１９ｂ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２０）配列番号４０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（２０ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２０ｂ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２０ｃ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２０ｄ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２０ｅ）配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（２０ｆ）配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２１）配列番号３８のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（２１ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２１ｂ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２１ｃ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２１ｄ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２１ｅ）配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（２１ｆ）配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６３のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２）配列番号４９または５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに以下からなる群から選択されるプライマー：
（２２ａ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２ｂ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２ｃ）配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２ｄ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２ｅ）配列番号６１のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー；
（２２ｆ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー；および
（２２ｇ）配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマーおよび配列番号６５のヌクレオチド配列からなるプライマー；ならびに
（２３）配列番号５５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４４のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６０のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号６２のヌクレオチド配列からなるプライマー、および配列番号５９、６８、６９、または７０のヌクレオチド配列からなるプライマー。
【００３８】
別の態様において、本発明は、本発明のプライマーまたはプライマーセットを使用することを含む、試料中のＡ型インフルエンザウイルスの検出方法に関する。
【００３９】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のプライマーまたはプライマーセットを使用することを含む、Ａ型インフルエンザウイルスの診断方法に関する。Ａ型インフルエンザウイルスの感染の有無は、試料中のＡ型インフルエンザウイルスを検出することにより判定できる。
【００４０】
試料は、インフルエンザウイルスの感染が疑われる、ヒトまたは他の動物などの生体由来の検体である。検体は、インフルエンザウイルスの存在が検出できるものであれば、何を用いてもよい。かかる検体には、例えば、鼻汁、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、唾液、喀痰、気管支肺胞洗浄液、血液、血清、血漿、髄液、尿、糞便、組織などが挙げられるが、これらに限定されない。試料は、感染実験などに用いられた細胞やその培養液であってもよい。あるいは、試料は、生体由来の検体や培養細胞などから分離したウイルスを含む溶液などであってもよい。本発明において、かかる試料は、採取した状態のまま用いてもよく、あるいは、分離、抽出、濃縮、精製などの前処理を適宜行ってもよい。
【００４１】
別の態様において、本発明は、本発明のプライマーまたはプライマーセットを含む、Ａ型インフルエンザウイルスの検出用キットに関する。かかるキットは、ＳｍａｒｔＡｍｐ法およびその改良方法に利用される、酵素試薬および／またはｄＮＴＰなどの核酸試薬などの任意の試薬を含んでもよい。さらに、検出を簡便にするための適当な試薬、例えば、試料希釈液、プライマー希釈液、反応希釈液、バッファー、および／または標識試薬などを含んでもよい。またさらに、ＳｍａｒｔＡｍｐ法およびその改良方法の実行に必要な説明書などの資材を含んでもよい。
【００４２】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００４３】
標的配列の選択
本発明者らは、Ａ型インフルエンザウイルスを広く検出できるプライマーを作成するため、増幅される標的配列の選択を行った。まず、Ａ型インフルエンザウイルスゲノムのうち、マトリックスプロテイン（ＭＰ）をコードする領域を選択した。これは、ＭＰ領域が、新型インフルエンザ（２００９ｐｄｍＨ１Ｎ１）と季節性インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）に共通する分節であるため、新型と季節性の区別なく、また亜型の区別なく、Ａ型インフルエンザウイルスを検出することが可能であると考えたためである。次に、新型インフルエンザ（２００９ｐｄｍＨ１Ｎ１）と季節性インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）のＭＰ領域の配列を比較し、それによって配列上の変異の位置および発生頻度を計算した。これは、ＮＣＢＩ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｏｕｅｃｅのデータベースに基づいて実施した。変異の発生頻度が１％以下の塩基が多く含まれる領域を標的配列として選択した。
【実施例２】
【００４４】
プライマーの合成
以下の表に示されるプライマーをシグマアルドリッチジャパンにて受託合成した。
【００４５】
【表１】
0006702683.tif 000002
【００４６】
【表２】
0006702683.tif 000003
【００４７】
【表３】
0006702683.tif 000004
【００４８】
【表４】
0006702683.tif 000005
【実施例３】
【００４９】
様々なＡ型インフルエンザウイルスの検出
実施例２で合成したプライマーを用いて、ＳｍａｒｔＡｍｐ法により、様々なＡ型インフルエンザウイルスの検出を行った。
【００５０】
用いたＳｍａｒｔＡｍｐバッファーの組成は、以下の表の通りである。
【表５】
0006702683.tif 000006
【００５１】
用いたプライマーセットは、以下の表の通りである。
【表６】
0006702683.tif 000007
各プライマーの濃度は１００μＭである。比率はモル比を表す。
【００５２】
用いた鋳型は、以下の表の通りである。
【表７】
0006702683.tif 000008
【００５３】
用いた反応組成は、以下の表の通りである。
【表８】
0006702683.tif 000009
【００５４】
用いたＳｍａｒｔＡｍｐ増幅反応条件は以下の通りである。
反応条件：６０℃、９０分
検出機器：Ｍｘ３０００Ｐ（アジレント・テクノロジー株式会社）
【００５５】
以下の通り、ｑＰＣＲ用のスタンダードを作成した。
１．１０９コピー／μｌのｓｔｄ  ＲＮＡをキャリアＲＮＡで希釈して５ｘ１０７コピー／４ｕｌの溶液を作製した。
２．得られた溶液を４等分ずつ段階希釈し、６段階の濃度のスタンダードを作成した。
３．サンプルＲＮＡをキャリアＲＮＡで１０−２０倍希釈した。
４．Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲのＰｒｅＭｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ（登録商標）  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＰＬＵＳ  ＲＴ−ＰＣＲ  ＫＩＴ（商標））に、以下の表に示すプライマーを最終濃度０．４ｕＭになるように加えた。
【表９】
0006702683.tif 000010
５．ＰｒｉｍｅｒとＰｒｅＭｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ（登録商標）  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＰＬＵＳ  ＲＴ−ＰＣＲ  ＫＩＴ（商標））の混合液をＰＣＲ  ｐｌａｔｅの各ウェルに入れた（各溶液の量は任意、反応液全体で１０−２０ｕｌになるように）。
６．ｓｔｄ  ＲＮＡ及びサンプルＲＮＡを各ウェルに加えた。ＷＡＴＳＯＮの圧着シールを圧着させた。
７．以下の表に示す温度パラメーターでＰＣＲ反応を行った。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ装置（Ｍｘ３０００Ｐ）の操作はアジレント・テクノロジー株式会社のマニュアルに従った。
【表１０】
0006702683.tif 000011
尚、ｑＰＣＲ反応はトリプリケートで実施した。
【００５６】
結果を以下の表に示す。
【表１１−１】
0006702683.tif 000012
ND：検出せず
単位：分
【表１１−２】
0006702683.tif 000013
ND：検出せず
単位：分
【００５７】
以上の結果から、これらのプライマーセットは、ウイルスの変異の影響を受けないことが示された。また、プライマーセット＃３−１、＃３−２、および＃３−３については、ヒトゲノムと交差反応しないことが示された。プライマーセット＃３−４、＃３−５、＃３−６および＃３−７については、ヒトゲノムを鋳型とした場合よりも、ＦｌｕＡ−ＭＰ、Ｈ１Ｎ１−ＭＰまたはＨ３Ｎ２−ＭＰを鋳型とした場合の方が、核酸増幅シグナルを検出するまでの時間が短いことが示された。すなわち、プライマーセット＃３−４、＃３−５、および＃３−７は、測定時間が９０分以内であれば、ヒトゲノムとの交差反応が認められない。また、プライマーセット＃３−６は、測定時間が６０分以内であれば、ヒトゲノムとの交差反応が認められない。
【実施例４】
【００５８】
反応組成の変更
次に、ＳｍａｒｔＡｍｐ反応における反応組成の変更による影響の有無について調べた。具体的には、Ｍａｘｉｍａ  ＲＴおよびＡａｃ  ＤＮＡポリメラーゼの使用量を変更した。
【００５９】
用いたプライマーセットは、以下の表の通りである。
【表１２】
0006702683.tif 000014
各プライマーの濃度は１００μＭである。比率はモル比を表す。
【００６０】
鋳型として、「ＦｌｕＡ−ＭＰ」（６×１０３コピー／μＬ、６×１０４コピー／μＬ）を用いた。
【００６１】
ＳｍａｒｔＡｍｐ増幅反応組成における酵素の使用量は、以下の表の通りである。
【表１３】
0006702683.tif 000015
酵素の使用量以外のＳｍａｒｔＡｍｐ増幅反応組成は、実施例３の通りである。
【００６２】
用いたＳｍａｒｔＡｍｐバッファー（２×反応バッファー）の組成、ＳｍａｒｔＡｍｐ増幅反応条件、使用機器、およびスタンダードの作成は、実施例３の通りである。
【００６３】
結果を以下の表に示す。
【表１４】
0006702683.tif 000016
単位：分
以上の結果から、反応組成を変更しても安定したシグナルが得られることが示された。
【実施例５】
【００６４】
異なるプライマーセットによる検出
実施例３で使用したプライマーとは異なるプライマーを用いて、ＳｍａｒｔＡｍｐ法により、様々なＡ型インフルエンザウイルスの検出を行った。
【００６５】
用いたプライマーセットは、以下の表の通りである。
【表１５】
0006702683.tif 000017
各プライマーの濃度は１００μＭである。比率はモル比を表す。
【００６６】
用いたＳｍａｒｔＡｍｐバッファー（２×反応バッファー）の組成、鋳型、ＳｍａｒｔＡｍｐ増幅反応組成および反応条件、使用機器、ならびにスタンダードの作成は、実施例３の通りである。
【００６７】
結果を以下の表に示す。
【表１６】
0006702683.tif 000018
ND：検出せず
単位：分
以上の結果から、これらのプライマーセットは、ウイルスの変異の影響を受けないことが示された。また、ヒトゲノムを鋳型とした場合よりも、ＦｌｕＡ−ＭＰ、Ｈ１Ｎ１−ＭＰまたはＨ３Ｎ２−ＭＰを鋳型とした場合の方が、核酸増幅シグナルを検出するまでの時間が短いことが示された、すなわち、測定時間が６０分以内であれば、ヒトゲノムとの交差反応が認められない。
【実施例６】
【００６８】
ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎの使用
本実施例では、Ｅｘｃｉｔｏｎ色素以外の色素を用いてもインフルエンザウイルスが検出可能かどうかを検討した。
【００６９】
用いたプライマーセットは、以下の表の通りである。
【表１７】
0006702683.tif 000019
各プライマーの濃度は１００μＭである。比率はモル比を表す。
【００７０】
用いた鋳型は、以下の表の通りである。
【表１８】
0006702683.tif 000020
【００７１】
用いた反応組成は、以下の表の通りである。
【表１９】
0006702683.tif 000021
【００７２】
用いたＳｍａｒｔＡｍｐバッファー（２×反応バッファー）の組成、ＳｍａｒｔＡｍｐ増幅反応条件、使用機器、およびスタンダードの作成は、実施例３の通りである。なお、ＳｍａｒｔＡｍｐバッファー（２×反応バッファー）中に、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを１：１０００００となるように加えた。
【００７３】
結果を以下の表に示す。
【表２０−１】
0006702683.tif 000022
ND：検出せず
単位：分
【表２０−２】
0006702683.tif 000023
ND：検出せず
単位：分
【表２０−３】
0006702683.tif 000024
ND：検出せず
単位：分
【表２０−４】
0006702683.tif 000025
ND：検出せず
単位：分
【表２０−５】
0006702683.tif 000026
ND：検出せず
単位：分
以上の結果から、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎを用いる系においても、インフルエンザウイルスを検出できることが示された。また、これらの結果から、ＯＰが無くてもウイルスの検出が可能であることも示された。
【実施例７】
【００７４】
２つのＯＰの存在下で様々なＢＰを用いた検出
【００７５】
２つのＯＰの存在下で様々なＢＰを用いてＡ型インフルエンザウイルスの検出を行った。ＢＰ以外の用いたプライマーは以下の表の通りである。
【表２１】
0006702683.tif 000027
用いたプライマーのモル比は、ＴＰ：ＦＰ：ＢＰ：第一のＯＰ：第二のＯＰ＝８：８：３：１：１であった。
【００７６】
用いた鋳型は、以下の表の通りである。
【表２２】
0006702683.tif 000028
【００７７】
用いたＳｍａｒｔＡｍｐバッファーの組成、ＳｍａｒｔＡｍｐ増幅反応組成および反応条件、使用機器、ならびにスタンダードの作成は、実施例３の通りである。なお、蛍光標識としてＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いた。
【００７８】
結果を以下の表に示す。
【表２３】
0006702683.tif 000029
【００７９】
これらの結果から、２つのＯＰの存在下、上記のＢＰを用いて、Ａ型インフルエンザウイルスを検出できることが示された。検出にかかる時間は約２５〜３０分であった。これは、ＯＰを添加しない場合に比べてより速くウイルスを検出できたことを示す。また、ヒトゲノムを鋳型とした場合よりも、Ｈ３Ｎ２を鋳型とした場合の方が、核酸増幅シグナルを検出するまでの時間が短いことが示された。すなわち、これらのプライマーを用いる場合、測定時間が６０分以内であれば、ヒトゲノムとの交差反応が認められない。
【実施例８】
【００８０】
様々なＦＰを用いた検出
様々なＦＰを用いてＡ型インフルエンザウイルスの検出を行った。ＦＰ以外のプライマーについては、以下に示す２つのプライマーセットを用いた。
【表２４】
0006702683.tif 000030
【表２５】
0006702683.tif 000031
用いたプライマーのモル比は、ＴＰ：ＦＰ：第一のＢＰ：第二のＢＰ：第一のＯＰ：（第二のＯＰ）＝８：８：３：１：１：（１）であった。
【００８１】
用いた鋳型は、以下の表の通りである。
【表２６】
0006702683.tif 000032
【００８２】
用いたＳｍａｒｔＡｍｐバッファーの組成、ＳｍａｒｔＡｍｐ増幅反応組成および反応条件、使用機器、ならびにスタンダードの作成は、実施例３の通りである。
【００８３】
結果を以下の表に示す。
【表２７】
0006702683.tif 000033
【００８４】
これらの結果から、上記のＦＰを用いて、Ａ型インフルエンザウイルスを検出できることが示された。検出にかかる時間は、１００倍希釈したウイルスでは約３０〜４０分であった。ＦＰ（ｏｒｉ）およびＦＰ（１）を用いれば、ウイルスを１０００倍希釈した場合であっても、約３５分〜５０分で検出できることが示された。また、ヒトゲノムを鋳型とした場合よりも、Ｈ３Ｎ２を鋳型とした場合の方が、核酸増幅シグナルを検出するまでの時間が短かった。すなわち、これらのプライマーを用いた場合、ヒトゲノムとの交差反応が抑制されることが示された。
【実施例９】
【００８５】
様々なＯＰを用いた検出
様々なＯＰを用いてＡ型インフルエンザウイルスの検出を行った。ＯＰ以外のプライマーについては、以下に示す２つのプライマーセットを用いた。
【表２８】
0006702683.tif 000034
【表２９】
0006702683.tif 000035
用いたプライマーのモル比は、ＴＰ：ＦＰ：ＢＰ：第一のＯＰ：（第二のＯＰ）＝８：８：３：１：（１）であった。
【００８６】
用いた鋳型は、以下の表の通りである。
【表３０】
0006702683.tif 000036
【００８７】
用いたＳｍａｒｔＡｍｐバッファーの組成、ＳｍａｒｔＡｍｐ増幅反応組成および反応条件、使用機器、ならびにスタンダードの作成は、実施例３の通りである。なお、蛍光標識としてＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いた。
【００８８】
結果を以下の表に示す。
【表３１】
0006702683.tif 000037
【００８９】
これらの結果から、上記のＯＰを用いて、Ａ型インフルエンザウイルスを検出できることが示された。また、ＯＰを１つだけ用いても、あるいはＯＰを２つ用いても、検出が可能であることが示された。さらに、ウイルスを１０００倍希釈した場合であっても、Ｏｆ  ２単独、あるいはＯｆ  ２とＯｒ  Ｎｅｗ（Ｖ２１０）の組み合わせを用いることで、約２５分〜５０分で検出できることが示された。また、ヒトゲノムを鋳型とした場合よりも、Ｈ３Ｎ２を鋳型とした場合の方が、核酸増幅シグナルを検出するまでの時間が短かった。すなわち、これらのプライマーを用いた場合、ヒトゲノムとの交差反応が抑制されることが示された。
【００９０】
次に、他のＯＰの組み合わせを用いて検出を行った。ＯＰ以外の用いたプライマーは以下の表の通りである。
【表３２】
0006702683.tif 000038
用いたプライマーのモル比は、ＴＰ：ＦＰ：第一のＢＰ：第二のＢＰ：第一のＯＰ：第二のＯＰ＝８：８：３：１：１：１であった。
【００９１】
用いた鋳型は、以下の表の通りである。
【表３３】
0006702683.tif 000039
「合成ＲＮＡ」は次のように作製した。データベース上の配列から、Ａ型インフルエンザウイルスの各亜型、あるいはＡ型インフルエンザウイルス全てに共通するＭＰ領域の配列を決定した。その後、決定したＭＰ領域の配列に基づき、ｃＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成した。得られたＲＮＡを「合成ＲＮＡ」と命名した。
【００９２】
用いたＳｍａｒｔＡｍｐバッファーの組成、ＳｍａｒｔＡｍｐ増幅反応組成および反応条件、使用機器、ならびにスタンダードの作成は、実施例３の通りである。
【００９３】
結果を以下の表に示す。
【表３４】
0006702683.tif 000040
【００９４】
さらに、別のＯＰの組み合わせを用いて検出を行った。ＯＰ以外のプライマーについては、以下に示す２つのプライマーセットを用いた。
【表３５】
0006702683.tif 000041
【表３６】
0006702683.tif 000042
【００９５】
用いた鋳型は、以下の表の通りである。
【表３７】
0006702683.tif 000043
【００９６】
用いたＳｍａｒｔＡｍｐバッファーの組成、ＳｍａｒｔＡｍｐ増幅反応組成および反応条件、使用機器、ならびにスタンダードの作成は、実施例３の通りである。なお、プライマーセット＃１０−３を用いる場合、蛍光標識としてＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いた。
【００９７】
結果を以下の表に示す。
【表３８】
0006702683.tif 000044
【００９８】
これらの結果から、様々なＯＰの組み合わせを用いて、Ａ型インフルエンザウイルスを検出できることが示された。検出にかかる時間は、約３０〜４０分であった。また、ヒトゲノムを鋳型とした場合よりも、合成ＲＮＡまたはＨ３Ｎ２を鋳型とした場合の方が、核酸増幅シグナルを検出するまでの時間が短かった。すなわち、これらのプライマーを用いた場合、ヒトゲノムとの交差反応が抑制されることが示された。
【実施例１０】
【００９９】
プライマーセットの選択
上述の結果から、ＴＰとして「ＴＰ１６」または「ＴＰ２４」、ＢＰとして「ＢＰ（３５）」および「ＢＰ（Ｅｘ３２）」を用いた場合に、ヒトゲノムとの交差反応がより抑制され、かつより迅速にＡ型インフルエンザウイルスを検出できることが示された。そこで、さらに良好な検出結果を得るプライマーセットの選択を行った。
【０１００】
１．ＯＰの選択
まず、好ましいＯＰの選択のため、様々なＯＰを用いて検出を行った。ＯＰ以外のプライマーについては、以下に示す２つのプライマーセットを用いた。
【表３９】
0006702683.tif 000045
【表４０】
0006702683.tif 000046
用いたプライマーのモル比は、ＴＰ：ＦＰ：第一のＢＰ：第二のＢＰ：（第一のＯＰ）：（第二のＯＰ）＝８：８：３：１：（１）：（１）であった。
【０１０１】
用いた鋳型は、以下の表の通りである。
【表４１】
0006702683.tif 000047
【０１０２】
用いたＳｍａｒｔＡｍｐバッファーの組成、ＳｍａｒｔＡｍｐ増幅反応組成および反応条件、使用機器、ならびにスタンダードの作成は、実施例３の通りである。
【０１０３】
結果を以下の表に示す。
【表４２】
0006702683.tif 000048
【表４３】
0006702683.tif 000049
【０１０４】
２．ＦＰの選択
次に、好ましいＦＰの選択のため、検出結果が良好であったＦＰを用いて検出を行った。用いたＦＰは以下の通りである。
【表４４】
0006702683.tif 000050
ＦＰ以外のプライマーについては、以下に示すプライマーセットを用いた。
【表４５】
0006702683.tif 000051
用いたプライマーのモル比は、ＴＰ：ＦＰ：第一のＢＰ：第二のＢＰ：第一のＯＰ：第二のＯＰ＝８：２４：３：１：１：１であった。
【０１０５】
用いた鋳型は、以下の表の通りである。
【表４６】
0006702683.tif 000052
【０１０６】
用いたＳｍａｒｔＡｍｐバッファーの組成、ＳｍａｒｔＡｍｐ増幅反応組成および反応条件、使用機器、ならびにスタンダードの作成は、実施例３の通りである。
【０１０７】
結果を以下の表に示す。
【表４７】
0006702683.tif 000053
【表４８】
0006702683.tif 000054
【０１０８】
以上の結果から、以下のプライマーセットを用いることで、最も良好な検出結果が得られることが示された。
【表４９】
0006702683.tif 000055
【０１０９】
再度、プライマーセットＡを用いてＡ型インフルエンザウイルスの検出を行った。用いた鋳型は、以下の表の通りである。
【表５０】
0006702683.tif 000056
【０１１０】
用いたＳｍａｒｔＡｍｐバッファーの組成、ＳｍａｒｔＡｍｐ増幅反応組成および反応条件、使用機器、ならびにスタンダードの作成は、実施例３の通りである。用いたプライマーのモル比は、ＴＰ：ＦＰ：第一のＢＰ：第二のＢＰ：第一のＯＰ：第二のＯＰ＝８：２４：３：１：１：１であった。
【０１１１】
結果を図２に示す。また、鋳型ごとの平均値を以下の表に示す。
【表５１】
0006702683.tif 000057
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明のプライマーは、Ａ型インフルエンザウイルスの亜型の違いやウイルスの変異の影響を受けない。また、本発明のプライマーを用いることで、ヒトゲノムとの交差反応が抑制される。そのため、これらのプライマーを用いることにより、ウイルスの亜型の違いやウイルスの変異の有無に関わらず、Ａ型インフルエンザウイルスを検出することができる。また、従来法に比べてより正確にＡ型インフルエンザウイルスを検出することができる。したがって、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスの診断、予防および治療において利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１３】
配列番号１：ＢＰ配列
配列番号２：ＢＰ配列
配列番号３：ＴＰアニーリング配列
配列番号４：ＴＰアニーリング配列
配列番号５：ＴＰターンバック配列
配列番号６：ＦＰアニーリング配列
配列番号７：ＯＰ配列
配列番号８：ＯＰ配列
配列番号９：ＢＰ（ｏｒｉ）
配列番号１０：ＢＰ（１）
配列番号１１：ＢＰ（２）
配列番号１２：ＢＰ（３）
配列番号１３：ＢＰ（４）
配列番号１４：ＢＰ（５）
配列番号１５：ＢＰ（６）
配列番号１６：ＢＰ（７）
配列番号１７：ＢＰ（８）
配列番号１８：ＢＰ（９）
配列番号１９：ＢＰ（１０）
配列番号２０：ＢＰ（１１）
配列番号２１：ＢＰ（１２）
配列番号２２：ＢＰ（１３）
配列番号２３：ＢＰ（１４）
配列番号２４：ＢＰ（１５）
配列番号２５：ＢＰ（１６）
配列番号２６：ＢＰ（１７）
配列番号２７：ＢＰ（１８）
配列番号２８：ＢＰ（１９）
配列番号２９：ＢＰ（２０）
配列番号３０：ＢＰ（２１）
配列番号３１：ＢＰ（２２）
配列番号３２：ＢＰ（２３）
配列番号３３：ＢＰ（２４）
配列番号３４：ＢＰ（２５）
配列番号３５：ＢＰ（２６）
配列番号３６：ＢＰ（２７）
配列番号３７：ＢＰ（５−Ｖ２１０）
配列番号３８：ＢＰ（Ｅｘ５）、５番目のｔがＥｘｃｉｔｏｎ色素で標識されている。
配列番号３９：ＢＰ（３１）
配列番号４０：ＢＰ（３２）
配列番号４１：ＢＰ（３３）
配列番号４２：ＢＰ（３４）
配列番号４３：ＢＰ（３５）
配列番号４４：ＢＰ（Ｅｘ３２）、７番目のｔがＥｘｃｉｔｏｎ色素で標識されている。
配列番号４５：ＢＰ（Ｅｘ３４）、４番目のｔがＥｘｃｉｔｏｎ色素で標識されている。
配列番号４６：ＢＰ（Ｅｘ３５）、７番目のｔがＥｘｃｉｔｏｎ色素で標識されている。
配列番号４７：ＴＰ（ｏｒｉ）
配列番号４８：ＴＰ（１３）
配列番号４９：ＴＰ（１６）
配列番号５０：ＴＰ（１８）
配列番号５１：ＴＰ（１９）
配列番号５２：ＴＰ（２１）
配列番号５３：ＴＰ（２２）
配列番号５４：ＴＰ（２３）
配列番号５５：ＴＰ（２４）
配列番号５６：ＦＰ（ｏｒｉ）
配列番号５７：ＦＰ（１）
配列番号５８：ＦＰ（２）
配列番号５９：ＦＰ（３−ｎ）
配列番号６０：Ｏｆ２
配列番号６１：Ｏｆ３
配列番号６２：Ｏｆ４
配列番号６３：Ｏｒ１
配列番号６４：ＯｒＮｅｗ
配列番号６５：ＯｒＮｅｗ（Ｖ２１０）
配列番号６６：フォワードプライマー
配列番号６７：リバースプライマー
配列番号６８：ＦＰ（Ｏ−ｎ）
配列番号６９：ＦＰ（３−ｌ）
配列番号７０：ＦＰ（３−ｍ）
【図１−１】
0006702683.tif 000058
【図１−２】
0006702683.tif 000059
【図１−３】
0006702683.tif 000060
【図１−４】
0006702683.tif 000061
【図２】
0006702683.tif 000062
【配列表】
0006702683000001.app