(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌートカトンを含むバレンセンの含酸素生成物の作製方法であって、バレンセンを、配列番号３７、３８、又は５５のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、バレンセン酸化活性を有する、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａカウレンオキシダーゼ（ＳｒＫＯ）またはその誘導体と接触させることと、前記ヌートカトンを含む含酸素生成物を回収することとを含む、方法。
【請求項２】
表２または表６から選択される、ＳｒＫＯ（配列番号３７、３８、または５５）と比較して１つ以上の変異を有するＳｒＫＯ誘導体とバレンセンを接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｎ末端膜貫通領域の少なくとも一部分の欠失、及びＥ．ｃｏｌｉ  ｙｈｃＢまたはその誘導体に由来する内膜貫通ドメインの付加を有するＳｒＫＯの誘導体とバレンセンを接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
配列番号３７と比較して４６、７６、９４、１３１、２３１、２８４、３８３、３９０、４００、４４４、４６８、４８８及び４９９から選択される位置に１つ以上の変異を有するＳｒＫＯの誘導体とバレンセンを接触させることを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
配列番号３７と比較してＲ７６Ｋ、Ｍ９４Ｖ、Ｔ１３１Ｑ、Ｆ２３１Ｌ、Ｈ２８４Ｑ、Ｒ３８３Ｋ、Ｉ３９０Ｌ、Ｔ４６８Ｉ、及びＴ４９９Ｎから選択される１つ以上の変異を有するＳｒＫＯの誘導体とバレンセンを接触させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
主要な含酸素生成物が、ヌートカトンである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記接触が非ヒト宿主細胞中で行われ、この細胞が必要に応じて細菌又は酵母である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記非ヒト宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、又はＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記バレンセンが、ＭＥＰ経路による代謝フラックスによって少なくとも部分的に産生され、必要に応じて前記非ヒト宿主細胞が、ｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及び／またはｉｄｉ遺伝子の少なくとも１つの追加コピーを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記非ヒト宿主細胞が、ファルネシルピロリン酸シンターゼをさらに発現する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記非ヒト宿主細胞が、異種バレンセンシンターゼをさらに発現する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記バレンセンシンターゼが、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓもしくはＶｉｔｉｓ  ｖｉｎｆｅｒａのバレンセンシンターゼまたはその誘導体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＳｒＫＯが、シトクロムＰ４５０レダクターゼを共発現する非ヒト宿主細胞中で発現される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｐ４５０レダクターゼが、ステビア種に由来する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記非ヒト宿主細胞が、ヌートカトンを産生するアルコールデヒドロゲナーゼをさらに発現する、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
回収が、水性反応媒体から前記含酸素生成物を含む酸化油を抽出すること、続く分留を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ヌートカトン画分が回収される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
バレンセンの含酸素生成物が風味製品、芳香製品、化粧品、洗浄製品、洗剤若しくは石鹸、又は有害生物防除製品に組み込まれる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記有害生物防除製品が昆虫忌避剤である、請求項１８に記載の方法。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１５年８月２１日出願の米国特許仮出願第６２／０４０，２８４号の利益、及びその優先権を主張し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、含酸素セスキテルペン（例えば、ヌートカトン）ならびにそれらの産生方法及び使用方法に関する。本発明は、含酸素セスキテルペン（例えば、ヌートカトン）の産生のための酵素ならびにこれらの酵素を同定する、選択する、作製する及び使用する方法もまた提供する。
【背景技術】
【０００３】
食品及び飲料産業、加えてその他の産業、例えば香料、化粧品及び健康管理産業などでは、風味及び芳香としてテルペン及び／またはテルペノイド生成物を日常的に使用する。例として、多くのセスキテルペン化合物が、香料製造（例えば、パチュロール）及び風味産業（例えば、ヌートカトン）で使用され、多くは植物から抽出される。しかしながら、要因、例えば（ｉ）植物原料の可用性及び高価格；（ｉｉ）植物中における比較的低いテルペン含有量；ならびに（ｉｉｉ）工業的規模で十分な量のテルペン生成物を産生するには時間の掛かる非効率的な抽出プロセスなどの全てにより、植物に依存しない系を使用するテルペンの生合成に関する研究が振興されてきた。結果として、グルコースなどの再生可能資源をテルペノイド生成物に変換するために微生物を操作するという技術の開発に労力が費やされてきた。従来の方法と比較すると、微生物は、発達を持続するための土壌の必要なく急速に成長するという利点を有する。
【０００４】
多くの微生物は、メチルエリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）経路またはメラボネート（ｍｅｌａｖｏｎａｔｅ）（ＭＶＡ）経路のいずれかを使用して、テルペノイド生成物を産生するのに必要な中間体を供給する。これらのＭＥＰまたはＭＶＡ経路としては、内因性または操作されたＭＥＰもしくはＭＶＡ経路またはその両方を挙げることができる。イソプレノイド経路工学及び最適化の詳細な理解は、ＷＯ２０１１／０６００５７、ＵＳ２０１１／０１８９７１７、ＵＳ２０１２／１０７８９３、ＵＳ８，５１２，９８８及びＡｊｉｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３０  ７０−７４に開示されていて、これはヌートカトンなどのセスキテルペン化合物を含む様々なテルペノイド化合物の産生について開示し、ヌートカトンはバレンセンセスキテルペン基質から産生される酸化セスキテルペンである。
【０００５】
ヌートカトン（４，４ａ，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−６−イソプロペニル−４，４ａ−ジメチル−２（３ＩＩ）−ナフタレノン）は、グレープフルーツの重要な風味構成要素であり、清涼飲料及びその他の飲料に風味付けするために商業的に使用され、加えて香料製造にも使用されている。従来のヌートカトン調製方法は、バレンセンの酸化によるものである（ＵＳ６，２００，７８６及びＵＳ８，０９７，４４２を参照のこと）。出発物質のバレンセンは高価であり、それゆえバレンセンを消費する方法は、商業的にあまり許容されない。これらの欠点ゆえに、ヌートカトン及び関連生成物を調製する商業的に実現可能かつ持続可能な方法が必要である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、含酸素セスキテルペン生成物の持続可能な産生を提供することである。具体的には、本発明は、ある種の含酸素セスキテルペンのエクスビボまたはインビボ産生のための酵素触媒を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、含酸素セスキテルペンの生合成のために操作された宿主細胞を提供する。本発明の別の目的は、含酸素セスキテルペン合成のための操作されたシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）酵素を提供することであり、いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、またはその他の宿主細胞におけるレダクターゼ対応物と並行した機能発現を含む。本発明は、それによってこの類の酵素特有の能力を利用し、酸化化学を実施する。
【０００７】
一態様では、本発明は、セスキテルペンの含酸素生成物を作製する方法を提供する。本方法は、セスキテルペンを、セスキテルペン酸化活性を有するＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａカウレンオキシダーゼ（ＳｒＫＯ）またはその誘導体と接触させることを含む。驚くべきことに、野生型ＳｒＫＯ酵素は、その天然活性がジテルペン基質に作用すると考えられているにもかかわらず、セスキテルペン基質に対して活性を有することが示された。さらに、ＳｒＫＯ酵素は、２回の酸素添加サイクルを必要とするケトン、すなわちヌートカトンへの酸素添加を含む特有の活性を示し、ヒドロキシゲルマクラ−１（１０）５−ジエン、及びムーロラン−３，９（１１）ジエン−１０−ペルオキシを含む異なる含酸素テルペン生成物を産生した。これらの活性は、試験したその他のＰ４５０酵素とは異なり、これらは主要生成物として、ヒドロキシル化生成物の立体異性体のうち１種のみ（例えば、β−ヌートカトール）を産生した、及び／または少量のヌートカトンを産生しただけであった。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本方法は、エクスビボ（例えば、無細胞）系で行われる。その他の実施形態では、セスキテルペン基質とＳｒＫＯまたはその誘導体は、ＳｒＫＯを発現する細胞、例えば細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）などにおいて接触される。セスキテルペンの含酸素生成物は回収されてよい、またはさらなる化学変換のための基質であってよい。Ｅ．ｃｏｌｉにおける野生型シトクロムＰ４５０の機能発現は、細菌プラットフォームに起因する固有の制限を有する（電子伝達機構及びシトクロムＰ４５０レダクターゼが存在しないこと、ならびに小胞体の欠如によるＰ４５０酵素の膜シグナルモジュールの翻訳不適合など）。したがって、いくつかの実施形態では、ＳｒＫＯ酵素は、例えばＳｒＫＯのＮ末端膜貫通領域の一部分を、Ｅ．ｃｏｌｉ内膜との相互作用を安定させる、及び／または細胞ストレスを減少させる短いペプチド配列と置き換えることにより、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞における機能発現のために改変される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ＳｒＫＯ誘導体は、野生型ＳｒＫＯに対してバレンセンオキシダーゼ活性を増加させる（例えば、ヌートカトンの産生を増加させる）少なくとも１つの変異を有する。例えば、ＳｒＫＯは、野生型ＳｒＫＯ（配列番号３７）またはＥ．ｃｏｌｉにおける発現及び活性のために改変されたＳｒＫＯ（例えば、配列番号３８もしくは５５）と比較して置換、欠失、または挿入から独立して選択される１〜５０の変異を有してよい。例えば、ＳｒＫＯ誘導体は、ＳｒＫＯ（配列番号３７、３８、または５５）と比較して１〜４０の変異、１〜３０の変異、１〜２０の変異、または１〜１０の変異を有してよい。これらの、またはその他の実施形態では、ＳｒＫＯ誘導体は、ＳｒＫＯ（配列番号３７、３８、または５５）と少なくとも５０％の配列同一性、または少なくとも６０％の配列同一性、または少なくとも７０％の配列同一性、または少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでよく、バレンセンオキシダーゼ活性を有する。様々な実施形態におけるＳｒＫＯは、バレンセンオキシダーゼ活性を維持する、またはエクスビボもしくは細菌系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における野生型酵素と比較した場合に、増加したバレンセンオキシダーゼ活性を有する。バレンセンオキシダーゼ活性を維持する、または増強する可能性のあるＳｒＫＯの様々な変異は、表２及び表６に列挙されている。したがって、様々な実施形態では、ＳｒＫＯは、表２及び／または表６から選択される少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０の変異を有してよい。本明細書において「バレンセンオキシダーゼ」または「ＶＯ」とも称されるＳｒＫＯの例示的な誘導体は、配列番号１０４及び１０５によって表され、これらは所望の活性を改善するためにさらに誘導体化されてよい。変異は、含酸素セスキテルペン力価の増加のために経験的に選択されてよい、もしくはインシリコ評価により選択されてよい、またはその両方であってよい。
【００１０】
本発明の態様においては、含酸素セスキテルペン生成物は、セスキテルペン基質を、バレンセン酸化活性を有するＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａカウレンオキシダーゼ（ＳｒＫＯ）またはその誘導体と接触させることにより得られる。その他のＣＹＰ４５０酵素とは異なり、ＳｒＫＯ酵素がバレンセンセスキテルペン基質と共に使用される場合、この酵素は、ヒドロキシゲルマクラ−１（１０）５−ジエン、ムーロラン−３，９（１１）ジエン−１０−ペルオキシ、ヌートカトール、及びヌートカトンを含み得る異なる含酸素テルペン生成物プロファイルを生成する。比較すると、バレンセンをヒドロキシル化する活性を有するその他のＣＹＰ４５０は、有意な量のケトン（ヌートカトン）を産生せず、このケトンは２回の酸素添加サイクルを必要とする。表４及び図７を参照のこと。
【００１１】
様々な実施形態では、セスキテルペン基質は（または主要なセスキテルペン基質は）、バレンセン、ゲルマクレン（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、もしくはＥ）、ファルネセン、ファルネソール、ヌートカトール、パチュロール、カジネン、セドロール、フムレン、ロンギホレン、及び／またはベルガモテン、β−イランゲン、β−サンタロール、β−サンタレン、α−サンタレン、α−サンタロール、β−ベチボン、ａ−ベチボン、クシモール、ビサボレン、β−アリオフィレン（ａｒｙｏｐｈｙｌｌｅｎｅ）、ロンギホレン；α−シネンサール；α−ビサボロール、（−）−β−コパエン、（−）−α−コパエン、４（Ｚ），７（Ｚ）−エカジエナール（ｅｃａｄｉｅｎａｌ）、セドロール、セドレン、セドロール、グアイオール、（−）−６，９−グアイアジエン、ブルネソール、グアイオール、レデン、レドール、リンデストレン、ならびにアルファ−ベルガモテンである。いくつかの実施形態では、主要なセスキテルペン基質はバレンセンであり、主要な含酸素生成物は、ヌートカトン及び／またはヌートカトールである。
【００１２】
本発明は、インビボで適用される場合、幅広い宿主細胞に適用可能である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、微生物宿主、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ、もしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａから選択される細菌；または酵母、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む、サッカロマイセス属、ピキア属、もしくはヤロウイア属の種などである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、イソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）を産生し、これはセスキテルペン合成の基質として作用する。いくつかの実施形態では、ＩＰＰは、内因性または異種メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）またはメバロン酸（ＭＶＡ）経路による代謝フラックスによって産生される。いくつかの実施形態では、セスキテルペンは、ＭＥＰ経路による代謝フラックスによって少なくとも部分的に産生され、この宿主細胞は、ｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及び／またはｉｄｉ遺伝子の少なくとも１つの追加コピーを有する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）を発現し、これはＩＰＰまたはＤＭＡＰＰからファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）を産生する。宿主細胞は、異種セスキテルペンシンターゼをさらに発現し、所望のセスキテルペン骨格を産生してよい。例えば、いくつかの実施形態では、細胞はバレンセンシンターゼを発現する。いくつかのバレンセンシンターゼ酵素が既知であり、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａバレンセンシンターゼ（ＶｖＶＳ）（配列番号１）またはＣｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｕｓバレンセンシンターゼ（ＣｓＶＳ）（配列番号１２）を含み、この酵素は本発明、またはあるいはＶｖＶＳもしくはＣｓＶＳの誘導体と共に用いられてよい。例示的な誘導体ＶｖＶＳ酵素は、本明細書に開示されている。ある種の実施形態では、セスキテルペンシンターゼは、本明細書に開示されているようなＶｖ１Ｍ１（配列番号３）、Ｖｖ２Ｍ１（配列番号５）、Ｖｖ１Ｍ５（配列番号７）、Ｖｖ２Ｍ５（配列番号９）、またはＶＳ２（配列番号１１）から選択されるバレンセンシンターゼである。
【００１５】
ＳｒＫＯまたはその誘導体は、セスキテルペン（例えば、バレンセン）に作用して含酸素テルペン生成物を産生する。いくつかの実施形態では、ＳｒＫＯは、補因子が効率的に再生されるのを可能にするシトクロムＰ４５０レダクターゼパートナー（例えば、ＳｒＣＰＲ）との融合タンパク質である。その他の実施形態では、Ｐ４５０レダクターゼは、（例えば、インビトロ系に）提供され、または宿主細胞において別々に発現され、いくつかの実施形態ではＳｒＫＯと同じオペロン中に発現されてよい。いくつかの実施形態では、ＣＰＲ酵素は別々に発現され、いくつかの実施形態では遺伝子が宿主細胞ゲノム中に組み込まれてよい。様々な例示的ＣＰＲ酵素が本明細書に開示され、これらは含酸素セスキテルペノイド力価を改善するために及び／またはＰ４５０効率を改善するために誘導体化されてよい。
【００１６】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、含酸素生成物をヌートカトンへとさらに誘導する１種以上の酵素を発現し、例えば、１種以上のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）酵素の発現などである。例示的なＡＤＨ酵素は、本明細書に開示されている。
【００１７】
その他の態様では、本発明は、含酸素セスキテルペンを含有する製品を作製する方法を提供し、この方法は消費者製品または工業製品に、本明細書に記載される方法によって調製及び回収された含酸素セスキテルペンを組み込むことを含む。例えば、製品は、風味製品、芳香製品、化粧品、洗浄製品、洗剤もしくは石鹸、または有害生物防除製品であってよい。いくつかの実施形態では、回収された含酸素生成物はヌートカトンを含み、製品は、飲料、チューインガム、キャンディ、または風味添加剤から選択される風味製品である。
【００１８】
その他の態様では、本発明は、野生型と比較した場合に増強したバレンセンオキシダーゼ活性を有する操作されたＳｒＫＯ酵素、加えて本明細書に記載されているような含酸素セスキテルペンを産生する宿主細胞を提供し、これはイソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）から所望の含酸素セスキテルペンを産生するための酵素成分の全てを発現する。例えば、様々な実施形態における宿主細胞は、ファルネシルピロリン酸シンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、及びＳｒＫＯまたはその誘導体を発現する。ＩＰＰは、ＭＥＰ及び／またはＭＶＡ経路により産生されてよく、経路は宿主細胞にとって内因性であってよく、経路における異種酵素の発現またはある種の酵素の重複により増強されてよい。宿主細胞としては、本明細書に記載されているような、様々な細菌及び酵母が挙げられる。含酸素セスキテルペン（例えば、ヌートカトン及び／またはヌートカトール）は、培養物から回収されてよい、及び／または場合により、細胞系もしくはエクスビボ系においてさらなる化学変換の基質として作用してよい。
【００１９】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される方法及び宿主細胞により産生されるセスキテルペン含有油を提供する。いくつかの実施形態では、油は、ヒドロキシゲルマクラ−１（１０）５−ジエン、ムーロラン−３，９（１１）ジエン−１０−ペルオキシ、ヌートカトール、及びヌートカトンを含む。いくつかの実施形態では、バレンセンの主要な含酸素生成物は、ヌートカトン及び／またはヌートカトールである。
【００２０】
別の態様では、Ｐ４５０１７Ａ１（これはアンドロゲンの生合成を触媒する）の構造座標に基づくＳｒＫＯ結晶モデル構造（ＣＭＳ）が提供される。ＣＭＳは、テルペン結合ポケット（ＴＢＰ）を含むテルペン結合ポケットドメイン（ＴＢＤ）及びＴＢＤに結合したテルペン（例えば、バレンセン）を含み、図８Ａ及び図８Ｂに示されている。このＳｒＫＯ結晶モデル構造（ＣＭＳ）は、ＳｒＫＯ誘導体のインシリコ試験を容易にする。この相同性モデルにより部分的に支援され、本開示は、セスキテルペン酸素添加活性の増加または改善を同定するためにいくつかの変異戦略の使用を示し、これらはコンセンサス復帰変異誘発、部位飽和変異誘発、及び組換えライブラリースクリーニングを含む。
【００２１】
本発明の追加の態様及び実施形態は、以下の詳細説明から明らかとなるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】バレンセンの生合成についてのスキームを示し、バレンセンは本開示においてＳｒＫＯの基質である。
【図２】ＶｖＶＳに対して作製された部位特異的変異体の産生力倍率を図示する。２２５の点変異のうち４６が、野生型ＷＴ  ＶｖＶＳと比較して少なくとも２０％のバレンセン産生力における平均的改善を示す。図２は、野生型に対して一定のレベルの産生力（ｘ軸）を示すＶｖＶＳ変異体の数（ｙ軸）を示す。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、バレンセンシンターゼのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を提供する。図３Ａは、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ野生型（ＷＴ）（ＶｖＶＳ）（配列番号１及び２）ならびに誘導体Ｖｖ１Ｍ１（配列番号３及び４）、Ｖｖ２Ｍ１（配列番号５及び６）、Ｖｖ１Ｍ５（配列番号７及び８）、Ｖｖ２Ｍ５（配列番号９及び１０）のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列、ならびに誘導体ＶＳ２のアミノ酸配列（配列番号１１）；加えてＣｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｕｓ野生型（ＣｓＶＳ）のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。図３Ｂは、野生型ＶｖＶＳ及びＣｓＶＳ配列、ならびに操作されたＶｖ２Ｍ５及びＶＳ２配列のアラインメントを示す。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、セスキテルペン骨格に対して活性を有する様々なＣＹＰ４５０（シトクロムＰ４５０）酵素のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を提供する。図４Ａは、野生型アミノ酸配列ならびに細菌発現のために操作されたアミノ酸配列及びヌクレオチド配列：ＺｚＨＯ（それぞれ配列番号１３、１４、及び１５）、ＢｓＧＡＯ（それぞれ配列番号１６、１７、及び１８）、ＨｍＰＯ（それぞれ配列番号１９、２０、及び２１）、ＬｓＧＡＯ（それぞれ配列番号２２、２３、及び２４）、ＮｔＥＡＯ（それぞれ配列番号２５、２６、及び２７）、ＣｐＶＯ（それぞれ配列番号２８、２９、及び３０）、ＡａＡＯ（それぞれ配列番号３１、３２、及び３３）、ＡｔＫＯ（それぞれ配列番号３４、３５、及び３６）、ＳｒＫＯ（それぞれ配列番号３７、３８、及び３９）、ＰｐＫＯ（それぞれ配列番号４０、４１、及び４２）、ＢｍＶＯ（それぞれ配列番号４３及び配列番号４４）、ＰｓＶＯ（それぞれ配列番号４５及び配列番号４６）、ＰｏＬＯ（それぞれ配列番号４７及び配列番号４８）、ＣｉＶＯ（それぞれ配列番号４９、５０、及び５１）、ＨａＧＡＯ（それぞれ配列番号５２、５３、及び５４）の配列を示す。図４Ｂは、ＳｒＫＯ骨格に基づいて操作されたバレンセンオキシダーゼ酵素のアミノ酸配列（配列番号５５〜６１）を示す。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＭＥＰ、テルペン及びテルペノイドシンターゼ、ならびにＰ４５０酵素の発現についての構築設計を図示する。図５Ａは、上流ＭＥＰ経路遺伝子及び下流経路遺伝子を持つ２つのプラスミドの株構成を示す。図５Ｂは、Ｐ４５０融合物の構築を示し、その手段とはＰ４５０とＣＰＲ（シトクロムＰ４５０レダクターゼ）の両方のＮ末端領域を切断し、例示的なリーダー配列（ＭＡＬＬＬＡＶＦ−−配列番号１１２）（８ＲＰ）を付加して、さらにＰ４５０とＣＰＲの２つを短いリンカーペプチドで融合する。
【図６】図６Ａ〜図６Ｄは、様々なＣＰＲ（シトクロムＰ４５０レダクターゼ）酵素のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を配列アラインメントと共に提供する。図６Ａでは：Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（Ｓｒ）ＣＰＲ（配列番号６２及び６３）、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（Ｓｒ）ＣＰＲ１（配列番号７６及び７７）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＰＲ（配列番号６４及び６５）、Ｔａｘｕｓ  ｃｕｓｐｉｄａｔａ（Ｔｃ）ＣＰＲ（配列番号６６及び６７）、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ（Ａａ）ＣＰＲ（配列番号６８及び６９）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＰＲ１（配列番号７０及び７１）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＰＲ２（配列番号７２及び７３）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）Ｒ２（配列番号７４及び７５）；Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（Ｓｒ）ＣＰＲ２（配列番号７８及び７９）；Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（Ｓｒ）ＣＰＲ３（配列番号８０及び８１）；Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ（Ｐｇ）ＣＰＲ（配列番号８２及び８３）。図６Ｂは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ及びＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ  ＣＰＲ配列（配列番号７２、７４、６８、６４、及び７０）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図６Ｃは、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＣＰＲ配列（配列番号７８、８０、６２、及び７６）のアラインメントを示す。図６Ｄは、８つのＣＰＲアミノ酸配列（配列番号７４、７２、８２、６８、８０、６２、７８、及び７６）のアラインメントを示す。
【図７】実施例２に記載されているようなＣＰＲパートナーと共にバレンセン産生Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されるような、様々なＣＹＰ４５０酵素の異なる活性を示すＧＣクロマトグラフを提供する。株を４日間培養し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で抽出した。１μｌのＭＴＢＥをＧＣ−ＭＳに注入し、生成物プロファイルをＭＳライブラリーと比較することによりモニターした。上から下に：Ｔａｘｕｓ５−アルファヒドロキシラーゼ、Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ  ｉｎｔｙｂｕｓ（ＣｉＶＯ）Ｐ４５０（配列番号５０）、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ  ｍｕｔｉｃｕｓ（ＨｍＰＯ）Ｐ４５０（配列番号２０）、及びＳｒＫＯ（配列番号３８）。
【図８】図８Ａ及び図８Ｂは、ＳｒＫＯの相同性モデル及びその活性部位を示す。ＳｒＫＯ相同性モデルは、既知の変異体Ｐ４５０１７Ａ１（ＤｅＶｏｒｅ  ＮＭ及びＳｃｏｔｔ  ＥＥ（Ｎａｔｕｒｅ，４８２，１１６−１１９，２０１２）に開示されているような膜結合シトクロムＰ４５０  １７  Ａ１の結晶構造）に基づき、これはヒトにおいてアンドロゲンの生合成を触媒する。ヘムの位置をスティックとして示す。図８Ｂは、ＳｒＫＯ活性部位の構造モデルを、そのα結合様式においてドッキングしたバレンセンと共に図示する。二次構造モチーフ（Ｂ−Ｃループ及びＩ−へリックス）ならびに変異誘発のために標的とされるアミノ酸を示す。
【図９】バレンセンオキシダーゼ（ＶＯ）Ｎ末端膜アンカーの最適化を示す。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｈｃＢのＮ末端を膜アンカー配列として選択し、これは１回膜貫通へリックスを提供する。アンカーの長さ（２０〜２４のアミノ酸）及びＶＯのＮ末端切断長（２８〜３２のアミノ酸）を、酸素添加力価の改善のためにスクリーニングした。
【図１０】２９の切断長、及びＥ．ｃｏｌｉ  ｙｈｃＢに基づく２０のアミノ酸Ｎ末端アンカーが、対照の平均値と比較して総含酸素力価の１．２倍の増加をもたらしたことを示す。
【図１１】ファルネシル二リン酸からヌートカトンへの変換について、宿主細胞における発現の例示的な下流経路を示す。ファルネシル二リン酸（発現されるファルネシルピロリン酸シンターゼによりＩＰＰ／ＤＭＡＰＰから産生される）は、バレンセンシンターゼ（ＶＳ）の作用によりバレンセンに変換され、バレンセンはバレンセンオキシダーゼ（ＶＯ）、例えば、本明細書に記載されるＳｒＫＯまたは操作された誘導体などにより酸化される。ＶＯ補因子は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）により再生される。ＶＯによる酸化の生成物は、ヌートカトール及びヌートカトンを含み得、ヌートカトールはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の作用によりヌートカトンへとさらに誘導され得る。
【図１２】ＶＯ１−Ｌ−ＳｒＣＰＲを発現する株の酸素添加プロファイルを示す。酸素添加プロファイルは、２段階酸素添加生成物、すなわちヌートカトンと共にβ−ヌートカトール及びα−ヌートカトールの単一酸素添加生成物を含む。
【図１３】図１３Ａ及び図１３Ｂは、コンセンサス復帰戦略を使用して野生型ＳｒＫＯを操作したバレンセンオキシダーゼバックグラウンド（ｎ２２ｙｈｃＢ＿ｔ３０ＶＯ１）に変換したものにおいて同定された変異の評価を示す。変異の５０％超が、総含酸素力価の１．２〜１．４５倍の改善をもたらした。パネル（Ａ）は、力価をｍｇ／Ｌで示す。パネル（Ｂ）は、含酸素力価の変化倍率を示す。
【図１４】コンセンサス復帰変異、Ｎ末端アンカー最適化、及び部位飽和変異誘発（ＳＳＭ）の二次スクリーニング結果を示す。いくつかの変異が、含酸素力価の１．１〜１．４倍の改善を示すと同定された。
【図１５】選択したＶＯ１バリアントの３３℃での性能を示す。６つの変異が、３３℃で改善された産生力を維持したと同定された。
【図１６】図１６Ａ及び図１６Ｂは、組換えライブラリーの一次スクリーニングからの結果を示す。いくつかのバリアント（示される）は、含酸素生成物力価の最大１．３５倍の改善を示した。選択したバリアントでは、（＋）−ヌートカトンがより多くなり、酸素添加能がより高くなるというプロファイルのシフトが存在した。パネル（Ａ）は、含酸素生成物をｍｇ／Ｌで示す。パネル（Ｂ）は、酸素添加能における変化倍率をプロットする（ヌートカトールに必要なバレンセンからの酸素添加サイクルは１回のみであるが、ヌートカトンは２回の酸素添加サイクルを必要とする）。
【図１７】選択したＶＯ組換えライブラリーバリアントについて３４℃及び３７℃での酸素添加能を示す。
【図１８】リードＶＯバリアントの再スクリーニング後における３４℃及び３７℃での酸素添加力価を示す。Ｃ６（１）（Ｒ７６Ｋ、Ｍ９４Ｖ、Ｔ１３１Ｑ、Ｉ３９０Ｌ、Ｔ４６８Ｉ）が、３７℃で最も高い酸素添加能を有し、これをＶＯ２と称した。
【図１９】バレンセンオキシダーゼ活性の増強についてシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）オルソログのスクリーニングを示す（３０℃）。ＳｒＣＰＲ３は、酸素添加力価の増加及びより高いヌートカトンの産生を示す。
【図２０】３４℃でのＣＰＲオルソログのスクリーニングを示す。ＳｒＣＰＲ３及びＡａＣＰＲは、より高い高温であっても含酸素力価の約１．３倍の改善を示す。
【図２１】アルコールデヒドロゲナーゼを用いたヌートカトールからヌートカトンへの変換を示す。４つのＡＤＨオルソログ（ｖｖＤＨ、ｃｓＡＢＡ２、ｂｄＤＨ、及びｚｚＳＤＲ）は、ヌートカトールを（＋）−ヌートカトンに変換すると同定され、（＋）−ヌートカトン力価の３倍の増加をもたらした。
【図２２】図２２Ａ及び図２２Ｂは、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素を図示する。図２２Ａは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（Ｒｅ）ＣＤＨ（配列番号８４及び８５）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｕｓ（Ｃｓ）ＤＨ（配列番号８６及び８７）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｕｓ（Ｃｓ）ＤＨ１（配列番号８８及び８９）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｕｓ（Ｃｓ）ＤＨ２（配列番号９０及び９１）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｕｓ（Ｃｓ）ＤＨ３（配列番号９２及び９３）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（Ｖｖ）ＤＨ（配列番号９４及び９５）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（Ｖｖ）ＤＨ１（配列番号９６及び９７、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｕｓ（Ｃｓ）ＡＢＡ２（配列番号９８及び９９）、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ（Ｂｄ）ＤＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１００及び１０１）、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ  ｚｅｒｕｍｂｅｔ（Ｚｚ）ＳＤＲ（配列番号１０２及び１０３）についての配列を含むアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。図２２Ｂは、アミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図２３】図２３Ａ及び図２３Ｂは、いくつかの操作されたバレンセンオキシダーゼ（ＶＯ）バリアントのアラインメントを示す。図２３Ａでは：８ｒｐ−ｔ２０ＳｒＫＯ（配列番号１０６）は、Ｎ末端での２０のアミノ酸切断、及び８つのアミノ酸膜アンカーの付加を有するＳｒＫＯ配列である。８ｒｐ−ｔ２０ＶＯ０（配列番号１０７）は、ＳｒＫＯ  Ｎ末端の２０のアミノ酸切断、８つのアミノ酸Ｎ末端アンカーの付加、及び４９９位（野生型ＳｒＫＯにより番号付けされる）に単一変異を有する。ｎ２２ｙｈｃＢ−ｔ３０ＶＯ１（配列番号１０４）は、ＳｒＫＯ  Ｎ末端の３０のアミノ酸切断、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｈｃＢに由来する２２のアミノ酸に基づく膜アンカー、ならびに４６位、２３１位、２８４位、３８３位、４００位、４４４位、４８８位、及び４９９位（ＳｒＫＯ野生型に対して）に８つの点変異を有する。ｎ２２ｙｈｃＢ−ｔ３０ＶＯ２（配列番号１０５）は、ＳｒＫＯ  Ｎ末端の３０のアミノ酸切断、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｈｃＢに由来する２２のアミノ酸に基づく膜アンカー、ならびに７６位、９４位、１３１位、２３１位、２８４位、３８３位、３９０位、４６８位、及び４９９位（ＳｒＫＯ野生型に対して）に９つの点変異を有する。図２３Ｂ、すなわちＶＯ０（配列番号１０９）、ＶＯ１（配列番号１１０）、及びＶＯ２（配列番号１１１）の点変異を、野生型ＳｒＫＯ（配列番号１０８）に対して示す（便宜上、全て野生型ＳｒＫＯ  Ｎ末端と共に示す）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
様々な態様における本発明は、エクスビボまたは細胞系において含酸素テルペンまたはテルペノイドを作製する方法を提供する。本発明は、このような方法に使用するための操作された、または改変された酵素、ポリヌクレオチド、及び宿主細胞をさらに提供する。様々な実施形態における本発明は、ＳｒＫＯ酵素を使用してヌートカトンを産生する方法を対象とする。驚くべきことに、ＳｒＫＯ酵素がセスキテルペン酸化（例えば、ヌートカトール及びヌートカトンへのバレンセン酸化）を触媒するために使用され得ることが見出された。
【００２４】
本明細書で使用される場合、ＳｒＫＯは、アクセッション番号ＡＡＱ６３４６４．１のｅｎｔ−カウレンオキシダーゼＣＹＰ７０１Ａ５［Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］（配列番号３７）を指す。ＳｒＫＯならびにジテルペン（及び特にカウレン）に対するその活性は既知であり、例えば、ＵＳ２０１２／０１６４６７８に記載されていて、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ＳｒＫＯは、シトクロムｐ４５０酵素（ＣＹＰ４５０）のＣＹＰ７０ファミリーのメンバーである。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために改変されたＳｒＫＯ配列は、配列番号３８として示される。本明細書で示されるように、ＳｒＫＯは、セスキテルペン基質（例えば、バレンセン）に対して活性であり、この基質はヌートカトール及びヌートカトンを産生し、これらは貴重なテルペノイド化合物である。これらの酸素添加活性及び生成物プロファイル（例えば、ヌートカトンの産生増加）は、本明細書で詳細に記載されるプロセスを使用したＳｒＫＯの変異誘発によりさらに改良され得る（及びインシリコモデルにより支援され得る）。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「ＳｒＫＯ誘導体」または「操作されたＳｒＫＯ」という用語は、ＳｒＫＯと実質的な構造的同一性及び／または配列同一性を有するアミノ酸配列を指し、バレンセンなどのセスキテルペン骨格の酸素添加を触媒する。バレンセンの酸素添加のために操作されたＳｒＫＯ酵素は、本明細書において「バレンセンオキシダーゼ」または「ＶＯ」酵素とも称される。一般に、誘導体は、バレンセン基質に対する、またはヌートカトン及び／またはその他の生成物の産生に対する酵素の活性を増加させる少なくとも１つの変異を有するＳｒＫＯの変異型を含む。いくつかのＳｒＫＯ変異が表２に提供される。いくつかのこのような追加のＳｒＫＯ変異が表６に提供される。
【００２６】
「接触させること」という用語は、成分が、宿主細胞における関連タンパク質生成物の共発現（例えば、セスキテルペンシンターゼ及びＣＹＰ４５０）により、もしくはＳｒＫＯもしくはその誘導体を発現する宿主細胞に関心対象の基質を添加もしくは供給することによりインビボであっても、または精製Ｐ４５０酵素もしくは細胞抽出物もしくは同じものを含有する部分的な精製抽出物にセスキテルペン基質を添加することによりインビトロ（もしくは「エクスビボ」）であっても物理的に結集されることを意味する。インビトロ及びエクスビボという用語は無細胞系を指し、反応チューブまたはウェルで実行されてよい。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「テルペン」は、それらの構造的多様性にもかかわらず、単純で統一的な特徴を有する炭化水素の多数かつ多様な類である。「イソプレン則」によれば、全てのテルペンは、イソプレン（Ｃ５）単位からなる。この事実は、このような単位の数に依存する合理的分類のために使用される。モノテルペンは２つのイソプレン単位を含み、（Ｃ１０）テルペンに分類され、セスキテルペンは３つのイソプレン単位を含み、（Ｃ１５）テルペンに分類され、ジテルペンは４つのイソプレン単位を含み、（Ｃ２０）テルペンに分類されて、セスタテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）及びゴム（Ｃ５）ｎがある。それらは、アルコール基、エーテル基、エステル基、アルデヒド基、またはケトン基を有する非環式または単環式〜五環式誘導体（いわゆる「テルペノイド」）として生物において、特に高等植物において至る所で生じ、植物の各種類の特徴を示している。テルペン、例えばモノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）及びジテルペン（Ｃ２０）などは、それぞれプレニル二リン酸基質、すなわちゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）及びゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）から、テルペン（テルペノイド）シンターゼと称される非常に大きな群の酵素の作用により誘導される。これらの酵素は、反応生成物が様々なモノテルペン、セスキテルペン及びジテルペン炭素骨格生成物へと環化されるので、多くの場合にテルペンシクラーゼと称される。得られた炭素骨格の多くは、続いてシトクロムｐ４５０ヒドロリサーゼ（ｈｙｄｒｏｌｙｓａｓｅ）酵素により酸素添加を受けて誘導体の大きなファミリーを発生させる。一番売れている風味及び芳香の技術的合成は、染料及びワニスに対する優れた溶媒または希釈剤としても機能し得るテルペンから出発し得る。テルペンの天然樹脂または合成樹脂が使用され、ビタミン及び殺虫剤の多くの医薬品合成もまた、テルペンから出発する。本明細書で使用される場合、「テルペン」または「セスキテルペン」（例えば）という用語は、対応するテルペノイドまたはセスキテルペノイド化合物を含む。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「含酸素セスキテルペン」という用語は、１回以上の酸素添加事象を有するセスキテルペン骨格を指し、これは対応するアルコール、アルデヒド、カルボン酸及び／またはケトンを産生する。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「ＭＥＰ経路」という用語は、（２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸）経路を指し、ＭＥＰ／ＤＯＸＰ（２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸／ｌ−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸）経路または非メバロン酸経路またはメバロン酸非依存性経路とも呼ばれる。ＭＥＰ経路では、ピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸が、一連の反応によりＩＰＰ及びＤＭＡＰＰに変換される。経路は、典型的には以下の酵素の作用を伴う：１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（Ｄｘｓ）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＩｓｐＣ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＩｓｐＤ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＩｓｐＥ）、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＦ）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＧ）、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩｓｐＨ）。ＭＥＰ経路、ならびにＭＥＰ経路を構成する遺伝子及び酵素は、ＵＳ８，５１２，９８８に記載されていて、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、ＭＥＰ経路を構成する遺伝子としては、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、及びｉｓｐＡが挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用される場合、ＭＶＡ経路は、アセチルＣｏＡをＩＰＰに変換する生合成経路を指す。メバロン酸経路は、典型的には以下のステップを触媒する酵素を含む：（ａ）アセチルＣｏＡの２つの分子をアセトアセチルＣｏＡに縮合するステップ（例えば、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼの作用により）；（ｂ）アセトアセチルＣｏＡをアセチルＣｏＡと縮合して、ヒドロキシメチルグルタリル−補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成するステップ（例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）の作用により）；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換するステップ（例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）の作用により）；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸へとリン酸化するステップ（例えば、メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）の作用により）；（ｅ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換するステップ（例えば、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）の作用により）；及び（ｆ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換するステップ（例えば、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ（ＭＰＤ）の作用により）。ＭＶＡ経路、ならびにＭＥＰ経路を構成する遺伝子及び酵素は、ＵＳ７，６６７，０１７に記載されていて、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「シトクロムＰ４５０レダクターゼパートナー」または「ＣＰＲパートナー」という用語は、酸化化学について関心対象のシトクロムＰ４５０オキシダーゼ（例えば、ＳｒＫＯ）の補因子成分を再生することができるシトクロムＰ４５０レダクターゼを指す。例えば、ＳｒＣＰＲは、ＳｒＫＯに対する天然のＣＰＲパートナーである。いくつかの実施形態では、ＣＰＲパートナーは、ＳｒＫＯに対する天然のＣＰＲパートナーではない。含酸素セスキテルペンのインビボ産生を用いるいくつかの実施形態では、ＳｒＫＯ及びＳｒＣＰＲは、別個のタンパク質として共発現される、またはいくつかの実施形態では融合タンパク質として発現される。
【００３２】
ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の類似性、すなわち配列同一性のパーセンテージは、配列アラインメントにより決定され得る。このようなアラインメントは、いくつかの公知技術アルゴリズムを用いて、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌの数学的アルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７）により、ｈｍｍａｌｉｇｎ（ＨＭＭＥＲパッケージ、ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）により、またはＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．＆Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，４６７３−８０）などにより行われ得る。配列同一性（配列マッチング）のグレードは、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴまたはＢｌａｓｔＺ（もしくはＢｌａｓｔＸ）を使用して計算されてよい。類似のアルゴリズムが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴポリヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実行され得る。
【００３３】
ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行されてよい。比較を目的としたギャップアラインメントを得るために、ギャップ付きＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されているように利用される。ＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトパラメータが使用される。配列マッチング分析は、Ｓｈｕｆｆｌｅ−ＬＡＧＡＮ（Ｂｒｕｄｎｏ  Ｍ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００３ｂ，１９  Ｓｕｐｐｌ  １：１５４−１６２）またはマルコフ確率場のような確立された相同性マッピング技術により補完されてよい。
【００３４】
「保存的置換」は、例えば、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性の類似性に基づいて行われてよい。２０の天然に存在するアミノ酸は、以下の６つの標準的なアミノ酸群に分類され得る：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ、Ｇｉｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、アミノ酸の、上に示される６つの標準的なアミノ酸群の同じ群内に列挙されている別のアミノ酸による交換と定義される。例えば、ＡｓｐのＧｌｕによる交換は、そのような改変ポリペプチドにおいて１つの負電荷を保持する。加えて、グリシン及びプロリンは、ａ−ヘリックスを破壊するそれらの能力に基づいて互いに置換されてよい。上記の６つの群内におけるいくつかの好ましい保存的置換は、以下の亜群内における交換である：（ｉ）Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＨｅ；（ｉｉ）Ｓｅｒ及びＴｈｒ；（ｉｉ）Ａｓｎ及びＧｉｎ；（ｉｖ）Ｌｙｓ及びＡｒｇ；ならびに（ｖ）Ｔｙｒ及びＰｈｅ。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」または「非保存的アミノ酸交換」は、アミノ酸の、上に示される６つの標準的なアミノ酸群（１）〜（６）の異なる群に列挙されている別のアミノ酸による交換と定義される。
【００３７】
一態様では、本発明は、セスキテルペンの含酸素生成物を作製する方法を提供する。様々な実施形態では、セスキテルペン基質は（または主要なセスキテルペン基質は）、バレンセン、ゲルマクレン（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、もしくはＥ）、ファルネセン、ファルネソール、ヌートカトール、パチュロール、カジネン、セドロール、フムレン、ロンギホレン、及び／またはベルガモテン、β−イランゲン、β−サンタロール、β−サンタレン、α−サンタレン、α−サンタロール、β−ベチボン、ａ−ベチボン、クシモール、ビサボレン、β−アリオフィレン（ａｒｙｏｐｈｙｌｌｅｎｅ）、ロンギホレン；α−シネンサール；α−ビサボロール、（−）−β−コパエン、（−）−α−コパエン、４（Ｚ），７（Ｚ）−エカジエナール（ｅｃａｄｉｅｎａｌ）、セドロール、セドレン、セドロール、グアイオール、（−）−６，９−グアイアジエン、ブルネソール、グアイオール、レデン、レドール、リンデストレン、ならびにアルファ−ベルガモテンである。いくつかの実施形態では、主要なセスキテルペン基質はバレンセンであり、主要な含酸素生成物は、ヌートカトン及び／またはヌートカトールである。これに関連して、「主要な」という用語は、特定のセスキテルペンが、全てのその他のテルペンまたはテルペノイド種のそれぞれよりも高いレベルで存在することを意味する。いくつかの実施形態では、主要なセスキテルペン（基質または反応後の含酸素生成物のいずれか）は、組成物の少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも７５％のテルペンまたはテルペノイド成分を構成する。含酸素セスキテルペンのインビボ産生を伴う様々な実施形態では、酸素添加生成物は培養培地から回収され、分画されて生成物の様々な成分、例えばヌートカトンなどを単離し得る、またはそれらについて濃縮し得る。いくつかの実施形態では、ヌートカトンは単離及び／または濃縮され、結果としてヌートカトンは、セスキテルペン成分（重量）の少なくとも約２５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％を構成する、またはヌートカトール及びヌートカトンの総量（重量）の少なくとも約２５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは約１００％を構成する。
【００３８】
様々な実施形態では、本発明は、セスキテルペンをテルペン酸化Ｐ４５０酵素、またはその誘導体と接触させることを含む。接触は、宿主細胞中で、または無細胞系で行われてよい。酸化のための基質（例えば、セスキテルペン）は、細胞により（例えば、ＭＥＰもしくはＭＶＡ経路による代謝フラックスにより）産生されてよい、またはあるいはＰ４５０酵素を発現する宿主細胞に供給されてよい。含酸素生成物は回収されてよい、または細胞系もしくは無細胞系のいずれかにおける、さらなる化学変換のための基質であってよい。以下の表１は、例示的なＰ４５０酵素の一覧を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、以下のＰ４５０酵素（場合により、バレンセンからヌートカトン及び／またはヌートカトールへの酸素添加を増加させるように操作される）の使用を含むが、本開示において好ましい酵素はＳｒＫＯである。本開示において、これらの反応物により得られる例示的な含酸素セスキテルペン生成物を表４に示す。
【００３９】
【表１】
0006735750.tif 000002
【００４０】
様々な実施形態では、本方法は、セスキテルペンをＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａカウレンオキシダーゼ（ＳｒＫＯ）またはその誘導体を含むタンパク質と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ＳｒＫＯは、以下に記載されているような宿主細胞中で発現される、または無細胞系で提供される。例えば、Ｐ４５０酵素を用いてテルペンを酸化させるためのある種のインビトロ及びインビボ系は、ＵＳ７，２１１，４２０に開示されていて、これは参照によって本明細書に組み込まれる。ＭｃＤｏｕｇｌｅ  ＤＲ，Ｐａｌａｒｉａ  Ａ，Ｍａｇｎｅｔｔａ  Ｅ，Ｍｅｌｉｎｇ  ＤＤ，Ｄａｓ  Ａ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＣＹＰ２Ｊ２  ｅｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｉｎ  Ｍｏｄｅｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２０１３  ２２：９６４−７９；Ｌｕｔｈｒａ，Ａ．，Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｍ．，Ｇｒｉｎｋｏｖａ，Ｙ．Ｖ．，Ｄｅｎｉｓｏｖ，Ｉ．Ｇ．，Ｓｌｉｇａｒ，Ｓ．Ｇ．（２０１３）“Ｎａｎｏｄｉｓｃｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｅｎｚｙｍｅｓ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８７，１１５−１２７）。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＳｒＫＯ誘導体は、ＳｒＫＯ（配列番号３７）と比較して、またはＥ．ｃｏｌｉにおける機能発現のためにそのＮ末端で改変されたＳｒＫＯ酵素（配列番号３８もしくは５５）と比較して置換、欠失、または挿入から独立して選択される約１〜約５０の変異を有するアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では、変異または変異の組み合わせは、バレンセンの酸素添加に対する酵素活性、例えばヌートカトンの産生などを増強する。本明細書に記載されているようなタンパク質モデリングは、ＳｒＫＯ配列にこのような置換、欠失、または挿入を導くために使用されてよい。例えば、ＳｒＫＯアミノ酸配列の構造モデルは、Ｐ４５０１７Ａ１の座標を使用して作製されてよい。本明細書で実証されるように、このような相同性モデルは、バレンセン酸素添加についてＳｒＫＯの改善を誘導するために有用である。したがって、様々な実施形態では、ＳｒＫＯ誘導体は、ＳｒＫＯ（配列番号３７、３８、または５５）と比較して約１〜約４５の変異、約１〜約４０の変異、約１〜約３５の変異、約１〜約３０の変異、約１〜約２５の変異、約１〜約２０の変異、約１〜約１５の変異、約１〜約１０の変異、または約１〜約５つの変異を有してよい。様々な実施形態では、ＳｒＫＯは、配列番号３７、３８、または５５に対して少なくとも５つまたは少なくとも１０の変異を有するが、約２０または３０以下の変異である配列を含む。様々な実施形態では、ＳｒＫＯ誘導体は、ＳｒＫＯ（配列番号３７、３８、または５５）と比較して約１つの変異、約２つの変異、約３つの変異、約４つの変異、約５つの変異、約６つの変異、約７つの変異、約８つの変異、約９つの変異、約１０の変異、約１１の変異、約１２の変異、約１３の変異、約１４の変異、約１５の変異、約１６の変異、約１７の変異、約１８の変異、約１９の変異、約２０の変異、約２１の変異、約２２の変異、約２３の変異、約２４の変異、約２５の変異、約２６の変異、約２７の変異、約２８の変異、約２９の変異、約３０の変異、約３１の変異、約３２の変異、約３３の変異、約３４の変異、約３５の変異、約３６の変異、約３７の変異、約３８の変異、約３９の変異、約４０の変異、約４１の変異、約４２の変異、約４３の変異、約４４の変異、約４５の変異、約４６の変異、約４７の変異、約４８の変異、約４９の変異、または約５０の変異を有してよい。配列番号３７、及び本明細書に開示されるその他のＷＴ酵素は、場合により野生型には存在しないＡｌａを２位に含有し得る。
【００４２】
これらの、またはその他の実施形態では、ＳｒＫＯ誘導体は、ＳｒＫＯ（配列番号３７、３８、または５５）と少なくとも約５０％の配列同一性、少なくとも約５５％の配列同一性、少なくとも約６０％の配列同一性、少なくとも約６５％の配列同一性、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９１％の配列同一性、または少なくとも９２％の配列同一性、または少なくとも９３％の配列同一性、または少なくとも９４％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９６％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。様々な実施形態では、ＳｒＫＯ誘導体は、野生型酵素よりもバレンセンの酸素添加について高い活性、例えば、野生型酵素（配列番号３７）またはＥ．ｃｏｌｉにおける機能発現のために改変されるような野生型酵素よりもバレンセン基質との接触時における含酸素油の高い産生などを有する。例えば、ＳｒＫＯ誘導体は、ＳｒＫＯ（配列番号３７、３８、または５５）と少なくとも約５０％の同一性、約５１％の同一性、約５２％の同一性、約５３％の同一性、約５４％の同一性、約５５％の同一性、約５６％の同一性、約５７％の同一性、約５８％の同一性、約５９％の同一性、約６０％の同一性、約６１％の同一性、約６２％の同一性、約６３％の同一性、約６４％の同一性、約６５％の同一性、約６６％の同一性、約６７％の同一性、約６８％の同一性、約６９％の同一性、約７０％の同一性、約７１％の同一性、約７２％の同一性、約７３％の同一性、約７４％の同一性、約７５％の同一性、約７６％の同一性、約７７％の同一性、約７８％の同一性、約７９％の同一性、約８０％の同一性、約８１％の同一性、約８２％の同一性、約８３％の同一性、約８４％の同一性、約８５％の同一性、約８６％の同一性、約８７％の同一性、約８８％の同一性、約８９％の同一性、約９０％の同一性、約９１％の配列同一性、約９２％の配列同一性、約９３％の配列同一性、約９４％の配列同一性、約９５％の配列同一性、約９６％の配列同一性、約９７％の配列同一性、約９８％の配列同一性、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、変異体は、ヌートカトンなどの含酸素バレンセンの産生増加のために選択される。例えば、ＳｒＫＯ誘導体は、配列番号３７と比較して４６、７６、９４、１３１、２３１、２８４、３８３、３９０、４００、４４４、４６８、４８８及び４９９から選択される位置に１つ、２つ、３つ、４つまたはそれを超える変異を有してよい。例えば、いくつかの実施形態では、ＳｒＫＯは、配列番号３７と比較してＲ７６Ｋ、Ｍ９４Ｖ、Ｔ１３１Ｑ、Ｆ２３１Ｌ、Ｈ２８４Ｑ、Ｒ３８３Ｋ、Ｉ３９０Ｌ、Ｔ４６８Ｉ、及びＴ４９９Ｎから選択される変異のうち１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、または全て）を有するアミノ酸配列を含む誘導体である。いくつかの実施形態では、ＳｒＫＯ誘導体は、配列番号５５〜６１、１０４、または１０５から選択されるアミノ酸配列を含み、これらはバレンセンの酸素添加に対する活性（例えば、ヌートカトンの産生）を改善するために本開示により操作された。いくつかの実施形態では、誘導体は、配列番号５５〜６１、１０４、及び１０５から選択される配列と比較して１〜２０、または１〜１０、または１〜５つの変異を有するアミノ酸配列を含み、ただし、アミノ酸配列が、配列番号３７と比較して４６、７６、９４、１３１、２３１、２８４、３８３、３９０、４００、４４４、４６８、４８８及び４９９から選択される位置に１つ以上の変異を有することを条件とする、またはただし、ＳｒＫＯ誘導体が、配列番号３７と比較してＲ７６Ｋ、Ｍ９４Ｖ、Ｔ１３１Ｑ、Ｆ２３１Ｌ、Ｈ２８４Ｑ、Ｒ３８３Ｋ、Ｉ３９０Ｌ、Ｔ４６８Ｉ、及びＴ４９９Ｎから選択される変異のうち１つ、２つ、３つもしくはそれを超えて（もしくは全て）有するアミノ酸配列を含むことを条件とする。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本発明は、上に記載されるＳｒＫＯ誘導体をコードする組換えポリヌクレオチドを提供し、これは発現及び任意の精製のために発現ベクター中に挿入されてよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、バレンセン産生細胞、例えばバレンセン産生Ｅ．ｃｏｌｉ細胞などのゲノム中に組み込まれる。
【００４５】
様々な実施形態におけるＳｒＫＯまたは誘導体は、バレンセンオキシダーゼ活性を有する。バレンセンオキシダーゼ活性を決定し、定量化するためのアッセイが本明細書に記載され、これらは当該技術分野において既知である。アッセイは、バレンセン産生細胞（例えば、ＦＰＰＳ及びバレンセンシンターゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ）においてＳｒＫＯ（または誘導体）を発現すること、ならびに水性反応媒体から酸化油を抽出することを含む。テルペノイド生成物のプロファイルは、ＧＣ／ＭＳにより定量的に決定され得る。バレンセンオキシダーゼ活性に対する効果について試験したＳｒＫＯの様々な変異は、表２または表６に列挙されている。したがって、様々な実施形態では、ＳｒＫＯは、表２または表６から選択される少なくとも約１つ、少なくとも約２つ、少なくとも約３つ、少なくとも約４つ、少なくとも約５つ、少なくとも約６つ、少なくとも約７つ、少なくとも約８つ、少なくとも約９つ、または少なくとも約１０の変異を有してよい。いくつかの実施形態では、ＳｒＫＯ誘導体は、配列番号３７による野生型タンパク質（またはＥ．ｃｏｌｉにおける発現のために改変されるその対応物と比較して最大２５の変異を有するアミノ酸配列を含む改変ＳｒＫＯポリペプチドであり、少なくとも置換Ｉ３１０Ｖ、Ｖ３７５ＩまたはＴ４８７Ｎを、Ｖ３７５Ｆ、Ｖ３７５Ａ、Ｖ３７５Ｍ、Ｍ１２０Ｌ、Ｍ１２０Ｉ、Ｍ１２０Ｖ、Ｆ１２９Ｌ、Ｆ１２９Ｉ、Ｌ１１４Ｖ、Ｌ１１４Ｆ及びＶ１２１Ａ（配列番号３８により番号付けされる）のうち少なくとも任意の１つ以上と組み合わせて含み、場合によりＥ．ｃｏｌｉにおける機能発現を支持する（配列番号３８に示されるような）リーダー配列を含む。
【００４６】
【表２．１】
0006735750.tif 000003
0006735750.tif 000004
【００４７】
【表２．２】
0006735750.tif 000005
【００４８】
ＳｒＫＯは、組換えタンパク質産生のために、またはセスキテルペン（例えば、バレンセン）酸化のいずれかのために様々な宿主細胞中で発現されてよい。例えば、宿主細胞としては、ＵＳ８，５１２，９８８に記載されるものが挙げられ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。いくつかの実施形態では、細胞は細菌細胞、例えばエシェリキア種、ストレプトマイセス種、ザイモナス種、アセトバクター種、シトロバクター種、シネコシスティス種、リゾビウム種、クロストリジウム種、コリネバクテリウム種、ストレプトコッカス種、キサントモナス種、ラクトバチルス種、ラクトコッカス種、バチルス種、アルカリゲネス種、シュードモナス種、エロモナス種、アゾトバクター種、コマモナス種、マイコバクテリウム種、ロドコッカス種、グルコノバクター種、ラルストニア種、アシディチオバチルス種、ミクロルナタス種、ジオバクター種、ジオバチルス種、アルスロバクター種、フラボバクテリウム種、セラチア種、サッカロポリスポラ種、テルムス種、ステノトロホモナス種、クロモバクテリウム種、シノリゾビウム種、サッカロポリスポラ種、アグロバクテリウム種、及びパントエア種などである。細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などのグラム陰性細胞、またはバチルス属の種などのグラム陽性細胞であり得る。その他の実施形態では、細胞は、酵母細胞などの真菌細胞、例えばサッカロマイセス種、シゾサッカロマイセス種、ピキア種、パフィア（Ｐａｆｆｉａ）種、クルイベロマイセス種、カンジダ種、タラロマイセス種、ブレタノマイセス種、パチソレン種、デバリオマイセス種、ヤロウイア種、及び工業的倍数体酵母株などである。一実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａから選択される細菌である。一実施形態では、宿主細胞は酵母であり、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む、サッカロマイセス属、ピキア属、またはヤロウイア属の種であってよい。
【００４９】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、イソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）を産生し、これはセスキテルペン合成の基質として作用する。いくつかの実施形態では、ＩＰＰは、内因性または異種メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）またはメバロン酸（ＭＶＡ）経路による代謝フラックス（例えば、細胞に供給される炭素源から始まる）によって産生される。ある種の実施形態では、ＭＥＰまたはＭＶＡ経路は、経路における異種酵素の発現またはある種の酵素の重複により増強されてよい。
【００５０】
ＭＥＰ（２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸）経路は、ＭＥＰ／ＤＯＸＰ（２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸／ｌ−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸）経路または非メバロン酸経路またはメバロン酸非依存性経路とも呼ばれ、グリセルアルデヒド−３−リン酸及びピルビン酸をＩＰＰ及びＤＭＡＰＰに変換する経路を指す。経路は、典型的には以下の酵素の作用を伴う：１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（Ｄｘｓ）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＩｓｐＣ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＩｓｐＤ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＩｓｐＥ）、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＦ）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＧ）、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩｓｐＨ）。ＭＥＰ経路、ならびにＭＥＰ経路を構成する遺伝子及び酵素は、ＵＳ８，５１２，９８８に記載されていて、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、ＭＥＰ経路を構成する遺伝子としては、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、及びｉｓｐＡが挙げられる。いくつかの実施形態では、セスキテルペンは、ＭＥＰ経路による代謝フラックスによって少なくとも部分的に産生され、この宿主細胞は、ｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及び／またはｉｄｉ遺伝子（例えば、ｄｘｓ及びｉｄｉ；またはｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及び／またはｉｄｉ）の少なくとも１つの追加コピーを有する。
【００５１】
ＭＶＡ経路は、アセチルＣｏＡをＩＰＰに変換する生合成経路を指す。メバロン酸経路は、典型的には以下のステップを触媒する酵素を含む：（ａ）アセチルＣｏＡの２つの分子をアセトアセチルＣｏＡに縮合するステップ（例えば、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼの作用により）；（ｂ）アセトアセチルＣｏＡをアセチルＣｏＡと縮合して、ヒドロキシメチルグルタリル−補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成するステップ（例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）の作用により）；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換するステップ（例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）の作用により）；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸へとリン酸化するステップ（例えば、メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）の作用により）；（ｅ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換するステップ（例えば、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）の作用により）；及び（ｆ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換するステップ（例えば、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ（ＭＰＤ）の作用により）。ＭＶＡ経路、ならびにＭＥＰ経路を構成する遺伝子及び酵素は、ＵＳ７，６６７，０１７に記載されていて、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）を発現し、これはＩＰＰまたはＤＭＡＰＰからファルネシルピロリン酸を産生する。図１に示されるように、ファルネシルピロリン酸は、バレンセン産生のための中間体である。例示的なファルネシルピロリン酸シンターゼは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ２０（ＮＣＢＩアクセッションＰ０８５２４）及びＥ．ｃｏｌｉ  ｉｓｐＡである。様々なその他の原核生物、酵母、植物、及び哺乳動物のＦＰＰＳ酵素が既知であり、本態様に従って使用されてよい。
【００５３】
宿主細胞は、所望のセスキテルペンを産生する異種セスキテルペンシンターゼ、例えばバレンセンシンターゼなどをさらに発現してよい。いくつかのバレンセンシンターゼ酵素が既知であり、Ｃｉｔｒｕｓ  ｘ  ｐａｒａｄｉｓｉに由来する、またはＣｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓに由来するバレンセンシンターゼを含む。Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ＶＳ（例えば、ＡＡＱ０４６０８．１）に加えて様々なその誘導体が、ＵＳ２０１２／０２４６７６７に記載されていて、これは参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、本発明は、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓバレンセンシンターゼのアミノ酸配列（配列番号１２）、または野生型アミノ酸配列（配列番号１２）に対して１〜３０の変異もしくは１〜２０の変異もしくは１〜１０の変異を有する誘導体を用いてよい。このような配列は、野生型配列（配列番号１２）と少なくとも６０％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の配列同一性を有してよい。さらに、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａに由来するバレンセンシンターゼ（ＶｖＶＳ）（配列番号１）が、Ｌｉｃｋｅｒら（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４）６５：２６４９−２６５９）により記載されている。一実施形態では、ＶｖＶＳのアミノ酸配列を含むバレンセンシンターゼまたは操作されたその誘導体が、本発明と共に用いられてよい。バレンセンシンターゼなどの様々なセスキテルペンシンターゼ酵素が既知であり、例えば、ＵＳ２０１２／０１０７８９３、ＵＳ２０１２／０２４６７６７、及びＵＳ７，２７３，７３５に記載されていて、それら全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５４】
例えば、いくつかの実施形態では、バレンセンシンターゼは、ＶｖＶＳ（配列番号１）に対して置換、欠失、または挿入から独立して選択される約１〜約４０の変異、約１〜約３５の変異、約１〜約３０の変異、約１〜約２５の変異、約１〜約２０の変異、約１〜約１５の変異、または約１〜約１０の変異を有するアミノ酸配列を含むＶｖＶＳ誘導体である。例えば、ＶｖＶＳ誘導体は、配列番号１に対して少なくとも約５つまたは少なくとも約１０の変異を有するが、約３０未満または約２０未満の変異であるアミノ酸配列を含んでよい。様々な実施形態では、ＶｖＶＳ誘導体は、ＶｖＶＳ（配列番号１）と比較して約１つの変異、約２つの変異、約３つの変異、約４つの変異、約５つの変異、約６つの変異、約７つの変異、約８つの変異、約９つの変異、約１０の変異、約１１の変異、約１２の変異、約１３の変異、約１４の変異、約１５の変異、約１６の変異、約１７の変異、約１８の変異、約１９の変異、約２０の変異、約２１の変異、約２２の変異、約２３の変異、約２４の変異、約２５の変異、約２６の変異、約２７の変異、約２８の変異、約２９の変異、約３０の変異、約３１の変異、約３２の変異、約３３の変異、約３４の変異、約３５の変異、約３６の変異、約３７の変異、約３８の変異、約３９の変異、または約４０の変異を有するアミノ酸配列を含む。このような配列は、配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の配列同一性を有してよい。ＶｖＶＳの例示的な変異を表３に示す。変異は、鋳型として５−エピ−アリストロケンシンターゼの結晶構造（ＰＤＢ：５ＥＡＴ）に基づくＶｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａバレンセンシンターゼ（ＶｖＶＳ）の相同性モデルにより導かれ得る。
【００５５】
【表３．１】
0006735750.tif 000006
0006735750.tif 000007
0006735750.tif 000008
0006735750.tif 000009
0006735750.tif 000010
0006735750.tif 000011
【００５６】
【表３．２】
0006735750.tif 000012
0006735750.tif 000013
【００５７】
【表３．３】
0006735750.tif 000014
0006735750.tif 000015
0006735750.tif 000016
【００５８】
したがって、様々な実施形態では、操作されたＶｖＶＳは、表３から選択される少なくとも約１つの変異、約２つの変異、約３つの変異、約４つの変異、約５つの変異、約６つの変異、約７つの変異、約８つの変異、約９つの変異、約１０の変異、約１１の変異、約１２の変異、約１３の変異、約１４の変異、約１５の変異、約１６の変異、約１７の変異、約１８の変異、約１９の変異、約２０の変異、約２１の変異、約２２の変異、約２３の変異、約２４の変異、約２５の変異、約２６の変異、約２７の変異、約２８の変異、約２９の変異、約３０の変異、約３１の変異、約３２の変異、約３３の変異、約３４の変異、約３５の変異、約３６の変異、約３７の変異、約３８の変異、約３９の変異、または約４０の変異を有してよい。例示的な組換えバレンセンシンターゼのＶｖ１Ｍ１（配列番号３）、Ｖｖ２Ｍ１（配列番号５）、Ｖｖ１Ｍ５（配列番号７）、Ｖｖ２Ｍ５（配列番号９）、及びＶＳ２（配列番号１１）が、図３Ｂのアラインメントを含む図３にさらに図示される。
【００５９】
ある種の態様では、本発明は、上に記載されているようなバレンセンの発現増加のために改変されたバレンセンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチドは宿主細胞中で発現されてよく、これはプラスミドなどの染色体外要素上か、または染色体に組み込まれるかのいずれかであってよい。
【００６０】
様々な実施形態では、ＳｒＫＯは、酵素を再生するＰ４５０レダクターゼと共に発現される、またはあるいは、ＳｒＫＯもしくは誘導体は、キメラＰ４５０酵素としてＰ４５０レダクターゼと共に発現される。シトクロムＰ４５０の機能発現は、細菌プラットフォームの固有の制限、例えば、電子伝達機構及びシトクロムＰ４５０レダクターゼが存在しないこと、ならびに小胞体の欠如によるＰ４５０酵素の膜シグナルモジュールの翻訳不適合などにより困難であると考えられてきた。
【００６１】
したがって、いくつかの実施形態では、ＳｒＫＯは、シトクロムＰ４５０レダクターゼパートナーとの融合タンパク質として発現される。シトクロムＰ４５０レダクターゼは、小胞体で見られる膜タンパク質である。このレダクターゼは、ピリジンヌクレオチド脱水及び膜結合シトクロムＰ４５０への電子伝達を触媒する。類似した構造のアイソザイムは、ヒト、植物、その他の哺乳動物、及び昆虫で見られる。例示的なＰ４５０レダクターゼパートナーとしては、例えば、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（Ｓｒ）ＣＰＲ（配列番号６２及び６３）、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（Ｓｒ）ＣＰＲ１（配列番号７６及び７７）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＰＲ（配列番号６４及び６５）、Ｔａｘｕｓ  ｃｕｓｐｉｄａｔａ（Ｔｃ）ＣＰＲ（配列番号６６及び６７）、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ（Ａａ）ＣＰＲ（配列番号６８及び６９）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＰＲ１（配列番号７０及び７１）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＰＲ２（配列番号７２及び７３）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）Ｒ２（配列番号７４及び７５）；Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（Ｓｒ）ＣＰＲ２（配列番号７８及び７９）；Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（Ｓｒ）ＣＰＲ３（配列番号８０及び８１）；Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ（Ｐｇ）ＣＰＲ（配列番号８２及び８３）が挙げられる。これらのＰ４５０のいずれも、いくつかの実施形態では、例えば１〜約２０の変異、または約１〜約１０の変異を導入して誘導体化され得る。図６Ｂは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ及びＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ  ＣＰＲ配列（配列番号７２、７４、６８、６４、及び７０）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図６Ｃは、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＣＰＲ配列（配列番号７８、８０、６２、及び７６）のアラインメントを示す。図６Ｄは、８つのＣＰＲアミノ酸配列（配列番号７４、７２、８２、６８、８０、６２、７８、及び７６）のアラインメントを示す。
【００６２】
Ｐ４５０融合タンパク質の工学は、例えば、ＵＳ２０１２／０１０７８９３及びＵＳ２０１２／０１６４６７８に開示されていて、その両方の全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ある種の実施形態では、ＳｒＫＯは、リンカーによりシトクロムＰ４５０レダクターゼパートナーに融合される。例示的なリンカー配列は、主にセリン、グリシン、及び／またはアラニン、ならびに場合により１〜５つの荷電アミノ酸、例えばリジンまたはアルギニンなどであり、この配列としては、例えばＧＳＧ、ＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１３）、ＧＳＧＥＡＡＡＫ（配列番号１１４）、ＧＳＧＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号１１５）、ＧＳＧＭＧＳＳＳＮ（配列番号１１６）、及びＧＳＴＧＳ（配列番号１１７）が挙げられる。リンカーは一般に柔軟であり、１つ、２つ、または３つ以下の疎水性残基を含有し、一般に３〜５０のアミノ酸長、例えば３〜２０のアミノ酸長などである。その他の実施形態では、Ｐ４５０レダクターゼは、宿主細胞中で別々に発現され、いくつかの実施形態ではＳｒＫＯと同じオペロン中に発現されてよい。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０レダクターゼ酵素は宿主細胞中で別々に発現され、遺伝子は場合によりゲノムに組み込まれる、またはプラスミドから発現される。
【００６３】
ある種の実施形態では、Ｐ４５０酵素のＮ末端は、それらの機能発現を増加させるために操作されてよい。膜結合Ｐ４５０のＮ末端は、酵素発現、膜会合及び基質接近において重要な役割を果たす。Ｐ４５０のＮ末端におけるレアコドンの使用が、Ｐ４５０の発現レベルを有意に改善したと報告されている。さらに、大多数の植物Ｐ４５０酵素が膜結合し、疎水性基質がＰ４５０と膜との間に動的に確立されたチャネルを介して酵素に入り込むと考えられるため、Ｎ末端工学は膜とＰ４５０との会合に影響を及ぼす可能性があり、したがって、基質の酵素への接近にも影響を及ぼし得る。したがって、一実施形態では、ＳｒＫＯのＮ末端工学は、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母などの宿主系におけるバレンセンオキシダーゼ活性の増強を維持する、または増強を示すいずれかのＳｒＫＯ誘導体を生成する。例示的なＮ末端配列は、ＭＡＬＬＬＡＶＦ（配列番号１１２）であり、その他の例示的な配列としては、主に疎水性であって、例えばロイシン、バリン、アラニン、イソロイシン、及びフェニルアラニンから選択される（少なくとも５０％、または少なくとも７５％の）アミノ酸から主に構成される４〜２０のアミノ酸（４〜１５のアミノ酸、または４〜１０のアミノ酸、または約８つのアミノ酸など）の配列が挙げられる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ＳｒＫＯは、そのＮ末端膜貫通領域の少なくとも一部分の欠失、及びＥ．ｃｏｌｉ  ｙｈｃＢまたはその誘導体に由来する内膜貫通ドメインの付加を有する誘導体である。これらの実施形態では、Ｐ４５０酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ内膜とのより安定した及び／または産生的な会合を有し、さもなければ膜会合Ｐ４５０酵素の発現により誘導されてしまう細胞ストレスを減少させる。いくつかの実施形態では、ＳｒＫＯは、そのＮ末端膜貫通ドメインの１５〜３５のアミノ酸欠失、及びＥ．ｃｏｌｉ  ｙｈｃＢまたはその誘導体に由来する膜貫通ドメインの１５〜２５のアミノ酸付加を有する誘導体である。いくつかの実施形態では、誘導体のＮ末端膜貫通ドメインは、アミノ酸配列のＭＡＷＥＹＡＬＩＧＬＶＶＧＩＩＩＧＡＶＡ（配列番号１１８）、または配列番号１１８に対して１〜１０もしくは１〜５つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、生成物をヌートカトンに転換する１種以上の酵素をさらに発現する。例えば、宿主細胞は、ヌートカトールからヌートカトンを産生するアルコールデヒドロゲナーゼ酵素を発現してよく、その例としては、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＣＤＨ（配列番号８４）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｕｓ  ＤＨ（配列番号８６）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｕｓ  ＤＨ１（配列番号８８）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｕｓ  ＤＨ２（配列番号９０）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｕｓ  ＤＨ３（配列番号９２）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  ＤＨ（配列番号９４）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  ＤＨ１（配列番号９６）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｕｓ  ＡＢＡ２（配列番号９８）、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ  ＤＨ（配列番号１００）、及びＺｉｎｇｉｂｅｒ  ｚｅｒｕｍｂｅｔ  ＳＤＲ（配列番号１０２）が挙げられる。アルコールデヒドロゲナーゼは、この段落に記載される酵素のうち１種以上と少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでよく、ヌートカトールをヌートカトンに変換する活性を有する。
【００６６】
セスキテルペン（例えば、バレンセン及びその含酸素生成物）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける非メバロン酸経路の生合成生成物として産生され得、この経路は２つのモジュール：イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を形成する天然の上流経路及び異種の下流テルペノイド形成経路を含む。代謝経路工学のための多変量モジュラー手法は、操作されたＥ．ｃｏｌｉにおけるセスキテルペンの産生を最適化するために用いられ得る。多変量モジュラー経路工学手法は、系統的多変量検索に基づいて、阻害中間体の蓄積及び副生成物へのフラックス分流を最小限に抑えるために２つの経路モジュールのバランスを最適に保つ条件を同定する。
【００６７】
ＷＯ２０１１／０６００５７、ＵＳ２０１１／０１８９７１７、ＵＳ２０１２／１０７８９３、及びＵＳ８５１２９８８（その各々が参照によって本明細書に組み込まれる）は、上流経路及び下流経路に関与する遺伝子またはタンパク質の発現を制御することにより細胞におけるテルペノイドの産生を最適化する方法及び組成物について記載する。これは、酵素経路を２つのモジュール：上流（ＭＥＰ）経路モジュール（例えば、ＭＥＰ経路の１種以上の遺伝子を含有する）及びセスキテルペン産生への下流の異種経路に分類することにより達成され得る。この基本構成を使用して、パラメータ、例えば細胞生理学上のプラスミドコピー数の効果、発現カセットにおける遺伝子順序及びプロモーター強度、ならびに染色体組み込みなどが、テルペン及びテルペノイド（例えば、セスキテルペン）産生に対するそれらの効果について評価される。ＭＥＰ経路内での遺伝子の発現は、このようにしてモジュラー法で制御され得る。本明細書で使用される場合、モジュラー法による制御は、複数の遺伝子を共に制御することを指す。例として、ＭＥＰ経路内における複数の遺伝子は、オペロンなどのＤＮＡの隣接領域上で組換えて発現され得る。ＭＥＰ経路内における遺伝子のモジュールは、本発明の態様に合致して、ＭＥＰ経路内における遺伝子のいずれも任意の順序で含有し得ることが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、ＭＥＰ経路内における遺伝子は、以下のうちの１つである：ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、ｉｓｐＡまたはｉｓｐＢ。ＭＥＰ経路内における遺伝子のモジュールの非限定的例は、遺伝子ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｉｓｐＤ及びｉｓｐＦを含有するモジュールであり、ｄｘｓ−ｉｄｉ−ｉｓｐＤＦと称される。
【００６８】
ｄｘｓ−ｉｄｉ−ｉｓｐＤＦオペロン、及びＦＰＰＳ−ＶＳオペロンなどのモジュールを含む遺伝子及び／またはタンパク質の発現の操作は、当業者に既知の方法により達成され得る。例えば、遺伝子またはオペロンの発現は、異なる強度を有するプロモーター、例えば誘導性プロモーターなどの選択により制御され得る。プロモーターのいくつかの非限定的例としては、Ｔｒｃ、Ｔ５及びＴ７が挙げられる。さらに、遺伝子またはオペロンの発現は、細胞における遺伝子またはオペロンのコピー数の操作により制御され得る。
【００６９】
ＭＥＰ経路内における１種以上の遺伝子及び／またはタンパク質の発現は、上方制御及び／または下方制御され得る。ある種の実施形態では、ＭＥＰ経路内における１種以上の遺伝子及び／またはタンパク質の上方制御は、ＭＥＰ経路内における１種以上の遺伝子及び／またはタンパク質の下方制御と組み合わされ得る。例として、いくつかの実施形態では、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路の１種以上の成分を過剰発現する細胞を少なくとも部分的に使用して、ＧＧＰＰＳの基質であるイソペンチル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を増幅する。いくつかの実施形態では、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路における１種以上の成分の過剰発現は、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路における１種以上の成分のコピー数を増加させることにより達成される。この点に関して、ＭＥＰ経路における律速段階での成分、例えば（ｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、ｉｄｉ）などのコピー数が、追加のエピソーム発現などにより増幅され得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、インドールの産生は、セスキテルペン産生の代理マーカーとして使用される、及び／または培養物中におけるインドールの蓄積は、セスキテルペン産生を増加させるために制御される。例えば、様々な実施形態では、培養物中におけるインドールの蓄積は、約１００ｍｇ／Ｌ未満、または約７５ｍｇ／Ｌ未満、または約５０ｍｇ／Ｌ未満、または約２５ｍｇ／Ｌ未満、または約１０ｍｇ／Ｌ未満に制御される。インドールの蓄積は、上に記載される多変量モジュラー手法を使用してタンパク質発現と活性とのバランスを取ることにより制御され得る、及び／または化学的手段により制御される。
【００７１】
その他の態様では、本発明は、（記載されているような）含酸素セスキテルペンを含有する製品を作製する方法を提供し、この方法は消費者製品または工業製品に、上に記載される方法によって調製及び回収された含酸素セスキテルペンを組み込むことを含む。例えば、製品は、風味製品、芳香製品、化粧品、洗浄製品、洗剤もしくは石鹸、または有害生物防除製品（例えば、昆虫忌避剤）であってよい。いくつかの実施形態では、回収された及び場合により分画（例えば、分留）により濃縮された含酸素生成物はヌートカトンであり、製品は飲料、チューインガム、キャンディ、もしくは風味添加剤から選択される風味製品である、または昆虫忌避剤である。
【００７２】
酸化生成物は、所望の生成物を有機相に分離することを含む、任意の好適なプロセスにより回収され得る。所望の生成物の産生は、例えば、ガスクロマトグラフィー（例えば、ＧＣ−ＭＳ）により決定及び／または定量化され得る。所望の生成物は、バッチ系または連続バイオリアクター系において産生され得る。生成物の産生、回収、及び／または生成物の分析は、ＵＳ２０１２／０２４６７６７に記載されているように行われ得、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、いくつかの実施形態では、酸化油は水性反応媒体から抽出され、これは例えば有機溶媒、例えばヘプタンなどのアルカンなどを使用して有機相に分離し、続いて分留することにより行われてよい。画分のセスキテルペン及びセスキテルペノイド成分は、ＧＣ／ＭＳにより定量的に測定されてよく、続いて画分をブレンドし、風味（またはその他の）用途のための、所望のヌートカトン含有構成成分を生成する。
【００７３】
その他の態様では、本発明は、本明細書に記載されるＰ４５０誘導体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態においてＥ．ｃｏｌｉまたは酵母中での発現のためにコドン最適化されてよい。別の例では、ポリヌクレオチドは、場合により本明細書に記載されているようなＰ４５０レダクターゼパートナーとのＳｒＫＯ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでよい。その他の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるセスキテルペンシンターゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供し、これは同様に、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母中での発現のためにコドン最適化されてよい。このようなポリヌクレオチドは、Ｐ４５０またはセスキテルペンシンターゼをコードする配列に加えて、１種以上の発現制御要素をさらに含んでよい。例えば、ポリヌクレオチドは、発現制御要素として１つ以上のプロモーターまたは転写エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナル、及びポリアデニル化シグナルを含んでよい。ポリヌクレオチドは、発現ベクターを含む任意の好適なベクター内に挿入されてよく、ベクターは発現のために任意の好適な宿主細胞内に含有されてよい。ポリヌクレオチドは、細菌細胞及び酵母細胞を含む任意の好適な宿主細胞における導入及び／またはタンパク質発現のために設計されてよく、プラスミドから発現されてよい、または染色体に組み込まれてよい。いくつかの実施形態では、組換え核酸分子は、野生型酵素（配列番号３７）よりもバレンセンの酸化について高い活性を有し、かつ記載されているようなリーダー配列、例えばリーダー配列のＭＡＬＬＬＡＶＦ（配列番号１１７）またはＥ．ｃｏｌｉ  ｙｈｃＢに由来するリーダー配列などを有するＳｒＫＯ誘導体をコードする。ある種の実施形態では、組換え核酸分子は、オペロンとして、またはＳｒＫＯ誘導体とのインフレーム融合物としてのいずれかでＳｒＫＯ酵素を再生することができるＳｒＣＰＲまたはその誘導体をさらにコードする。融合タンパク質として存在する場合、ＳｒＫＯ誘導体及びＳｒＣＰＲは、３〜１０のアミノ酸（例えば、５つのアミノ酸）の連結配列により結合されてよい。いくつかの実施形態では、連結配列は、主にグリシン、セリン、及び／またはアラニンであり、配列ＧＳＴＧＳを含んでよい。
【００７４】
その他の態様では、本発明は、本明細書に記載されているような含酸素セスキテルペンを産生する宿主細胞を提供し、これはイソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）から所望の含酸素セスキテルペンを産生するための酵素成分の全てを発現する。例えば、様々な実施形態における宿主細胞は、ファルネシルピロリン酸シンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、及びＳｒＫＯまたはその誘導体を発現する。ＩＰＰは、ＭＥＰ及び／またはＭＶＡ経路により産生されてよく、経路は宿主細胞にとって内因性であってよい、または経路における異種酵素の発現もしくはある種の酵素の重複により改変されてよい。宿主細胞としては、本明細書に記載されているような、様々な細菌及び酵母が挙げられる。
【００７５】
さらにその他の態様では、本発明は、本明細書に記載される方法及び宿主細胞により産生されるセスキテルペン生成物を提供する。本明細書に開示されているように、ＳｒＫＯ酵素は、ヌートカトールを作製し、ケトン、すなわちヌートカトンへとさらに酸化することにより特有の活性を示して、ヒドロキシゲルマクラ−１（１０）５−ジエン、及びムーロラン−３，９（１１）ジエン−１０−ペルオキシを含む異なる含酸素テルペン生成物を産生した。
【００７６】
さらに、試験したその他のＰ４５０酵素は、バレンセン基質に対してヒドロキシル化活性を有する従来より知られているセスキテルペンＣＹＰ４５０またはＰ４５０を含み、これらは立体異性体の１種（ベータヌートカトール）及びごく少量のケトン（ヌートカトン）を産生した。具体的には、その他のセスキテルペンＣＹＰ４５０酵素は、ベータ−ヌートカトール及びヒドロキシルバレンセンを主要生成物として産生したが、Ｔａｘｏｌ  ＣＹＰ４５０酵素は、含酸素バレンセンを一切産生しなかった（表４及び図７）。
【００７７】
ある種の態様では、本発明は、ＳｒＫＯ誘導体酵素に関する。例えば、ＳｒＫＯ誘導体は、配列番号３７と比較して４６、７６、９４、１３１、２３１、２８４、３８３、３９０、４００、４４４、４６８、４８８及び４９９から選択される位置に１つ以上の変異を有するアミノ酸配列を含んでよい。例えば、いくつかの実施形態では、ＳｒＫＯは、配列番号３７と比較してＲ７６Ｋ、Ｍ９４Ｖ、Ｔ１３１Ｑ、Ｆ２３１Ｌ、Ｈ２８４Ｑ、Ｒ３８３Ｋ、Ｉ３９０Ｌ、Ｔ４６８Ｉ、及びＴ４９９Ｎから選択される変異のうち１つ以上（２つ、３つ、４つ、または全て）を有するアミノ酸配列を含む誘導体である。いくつかの実施形態では、ＳｒＫＯ誘導体は、配列番号５５〜６１、１０４、または１０５から選択されるアミノ酸配列を含み、これらはバレンセンの酸素添加に対する活性（例えば、ヌートカトンの産生）を改善するために本開示により操作された。いくつかの実施形態では、誘導体は、配列番号５５〜６１、１０４、または１０５から選択される配列と比較して１〜２０の変異、または１〜１０の変異、または１〜５つの変異を有するアミノ酸配列を含み、ただし、アミノ酸配列が、配列番号３７と比較して４６、７６、９４、１３１、２３１、２８４、３８３、３９０、４００、４４４、４６８、４８８及び４９９から選択される位置に１つ、２つ、３つもしくはそれを超える変異を有することを条件とする、またはただし、ＳｒＫＯ誘導体が、配列番号３７と比較してＲ７６Ｋ、Ｍ９４Ｖ、Ｔ１３１Ｑ、Ｆ２３１Ｌ、Ｈ２８４Ｑ、Ｒ３８３Ｋ、Ｉ３９０Ｌ、Ｔ４６８Ｉ、及びＴ４９９Ｎから選択される変異のうち１つ、２つ、３つもしくはそれを超えて（もしくは全て）有するアミノ酸配列を含むことを条件とする。本明細書で示されるように、これらの変異は、ＳｒＫＯのバレンセン酸化活性のレベルを増加させる。
【００７８】
これらの、またはその他の実施形態では、ＳｒＫＯは、そのＮ末端膜貫通領域の少なくとも一部分の欠失、及びＥ．ｃｏｌｉ  ｙｈｃＢまたはその誘導体に由来する内膜貫通ドメインの付加を有する誘導体である。いくつかの実施形態では、ＳｒＫＯは、（配列番号３７と比較して）そのＮ末端膜貫通ドメインの１５〜３５のアミノ酸欠失、及びＥ．ｃｏｌｉ  ｙｈｃＢまたはその誘導体に由来する膜貫通ドメインの１５〜２５のアミノ酸付加を有する誘導体である。いくつかの実施形態では、誘導体のＮ末端膜貫通ドメインは、アミノ酸配列のＭＡＷＥＹＡＬＩＧＬＶＶＧＩＩＩＧＡＶＡ（配列番号１１８）、または配列番号１１８に対して１〜１０もしくは１〜５つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含む。
【００７９】
さらにその他の態様では、本発明は、改変ＳｒＫＯポリペプチドを調製する方法を提供し、この方法は（ｉ）ポリペプチドの発現を可能にする条件下で改変ポリペプチドを発現する宿主細胞を培養するステップ；及び（ｉｉ）場合によりポリペプチドを回収するステップを含む。
【００８０】
さらにその他の態様では、本発明は、含酸素セスキテルペンを産生する方法を提供し、これは（ｉ）改変ＳｒＫＯポリペプチドを提供するステップ、（ｉｉ）セスキテルペンを改変ＳｒＫＯポリペプチドと接触させるステップ、及び（ｉｉｉ）産生された含酸素セスキテルペンを回収するステップを含む。本方法は、ＳｒＫＯ補因子を再生するためのＣＰＲ酵素（例えば、ＳｒＣＰＲ）を提供することをさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、含酸素セスキテルペンは、油として回収される。いくつかの実施形態では、セスキテルペンはバレンセンである。いくつかの実施形態では、含酸素セスキテルペンは、ヒドロキシゲルマクラ−１（１０）５−ジエン、ムーロラン−３，９（１１）ジエン−１０−ペルオキシ、ヌートカトール、及びヌートカトンを含む。いくつかの実施形態では、主要な含酸素生成物は、ヌートカトン及び／またはヌートカトールである。
【００８１】
別の態様では、本明細書に記載されるＳｒＫＯまたは誘導体のアミノ酸配列を有する、Ｐ４５０１７Ａ１の構造座標に基づくＳｒＫＯ結晶モデル構造（ＣＭＳ）が提供される。ＣＭＳは、テルペン結合ポケット（ＴＢＰ）を含むテルペン結合ポケットドメイン（ＴＢＤ）及びＴＢＤに結合したテルペン（例えば、バレンセン）を含む。図８Ａ及び図８Ｂ。このＳｒＫＯ結晶モデル構造（ＣＭＳ）は、ＳｒＫＯ誘導体のインシリコ試験を容易にする。
【００８２】
したがって、さらにその他の実施形態では、本発明は、ＴＢＤに結合することができるテルペンについてスクリーニングする方法を提供し、本方法はＳｒＫＯ  ＣＭＳの使用を含む。別の態様では、本発明は、ＴＢＰに結合することができるテルペンについてスクリーニングする方法を提供し、本方法は、ＴＢＰを試験化合物と接触させること、及びその試験化合物がＴＢＰに結合するかどうかを決定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＳｒＫＯ酵素活性の調節に有用な試験化合物（例えば、テルペン）についてスクリーニングすることである。
【００８３】
別の態様では、本発明は、テルペン結合ドメイン（ＴＢＤ）の分子特性及び／または分子相互作用を予測する、刺激する、またはモデル化する方法を提供し、これはコンピュータモデルの使用を含み、このコンピュータモデルは、上に定義されるようなテルペン結合ドメインの構造座標を使用して、または図示してそのリガンド結合ドメインの画像を提供し、場合によりその画像を表示することを含む。
【実施例】
【００８４】
実施例１：セスキテルペン前駆体（バレンセン）産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の構築
上流ＭＥＰ経路遺伝子のｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉを過剰発現するＥ．ｃｏｌｉを作製し、これはイソプレノイド前駆体のイソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）へのフラックスを促進し、異種ジテルペノイド生成物の１ｇ／Ｌ超の力価を支持する（３）。ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ＧＧＰＳ）及びジテルペンシンターゼを、ファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）及びセスキテルペンシンターゼまたはゲラニルピロリン酸シンターゼ（ＧＰＰＳ）及びモノテルペンシンターゼと置き換えることによりモノテルペン及びセスキテルペンを含む様々なテルペノイドを産生する株を構築した。新規含酸素テルペン用のＣＹＰ４５０を試験するためにセスキテルペン産生株を開発するには、バレンセンシンターゼ酵素をクローニングしてＭＥＰ経路過剰発現Ｅ．ｃｏｌｉ株中で発現させた。高基質フラックスは、ＣＹＰ４５０の活性を同定するのに役立つ。これまで、含酸素タキサジエン産生株に関する研究は、ＣＹＰ４５０経路をタキサジエン産生株に導入すると産生力の有意な減少を示した（３００ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌ）。
【００８５】
さらに、多変量モジュラー代謝工学（ＭＭＭＥ）をバレンセンの高レベル産生のために経路のバランスを取ることに利用した。Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａに由来するものなどの天然に存在するバレンセンシンターゼは、１００ｍｇ／Ｌ台のジテルペノイドを得る以前の結果と比較して、ＭＭＭＥ最適化後であっても多くの場合に最適以下（約５ｍｇ／Ｌ）で実行する。セスキテルペン生合成に関与する酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現が困難な場合があり、一次代謝に関与するこれらと比較して反応速度が不十分でもある（１７）。
【００８６】
Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａバレンセンシンターゼ（ＶｖＶＳ）の相同性モデルを、ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ（登録商標）ソフトウェアパッケージ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，Ｉｎｃ．）を使用し、鋳型として５−エピ−アリストロケンシンターゼの結晶構造（ＰＤＢ：５ＥＡＴ）を用いて構築した。さらに、テルペンシンターゼの天然変異の全体像を同定するために、何百もの関連テルペンシンターゼ配列を組み込んだ幅広い多重配列アラインメントを作製した。この情報を使用して、変異をコンセンサス復帰、インシリコエネルギー論、及び構造分析の組み合わせを使用して設計した。コンセンサス復帰変異は、安定性（１９、２０）及び発現（２１）を改善するための重要なツールであることが示されている。ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅにおける原子間力場モデルに基づくエネルギー論計算を使用して、少ない溶媒露出表面積を有する位置について予測した個々の変異について折り畳みのΔΔＧを評価し、この変異は折り畳み及び安定性に影響を及ぼすと予想した。
【００８７】
ＭＭＭＥ手法を利用することにより、ｐ１５Ａ複製起点及びＴ７プロモーターを有するプラスミド上にＶｖＶＳのコドン最適化型を組み込み、バランスの取れた上流及び下流バレンセン産生株を同定した。次いで、この株バックグラウンドを使用して、設計したシンターゼ酵素変異をスクリーニングした。上述のタンパク質工学ツールを使用して、本発明者らは、２００を超える独自の点変異（表３）を設計し、これらを次いで部位特異的変異誘発を使用してｐ１５Ａ−Ｔ７スクリーニングプラスミド中に構築した。変異した酵素バリアントをスクリーニング株に形質転換し、３連のコロニーを選択ＬＢ細胞培養培地中で一晩培養し、次いで最小Ｒ培地中に播種して２２℃で４日間培養した。培養物を、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を使用して抽出し、バレンセンの産生力について複合ガスクロマトグラフィー／質量分析により分析した。
【００８８】
設計した点変異のおよそ５分の１で、本発明のスクリーニング株におけるバレンセン産生力が少なくとも２０％増加した（図２）。次いで、有益な点変異を戦略的に組み合わせて、より一層有利な表現型を付与した。組換えたバレンセンシンターゼ配列を、Ｖｖ１Ｍ１（変異−Ｒ３３１Ｋ、Ｉ３３４Ｅ、Ｎ３３５Ｓ、Ｖ３７１Ｉ、Ａ３７４Ｌ、Ｔ４１８Ｖ、Ｓ４８２Ｔ、Ｓ５１２Ｐ、Ｋ３５６Ｎ、Ｑ４９１Ｋ、Ｅ３９４Ｄ、Ａ４２８Ｖ、Ｙ３４８Ｆ、Ｔ３１８Ｓ、Ｌ３５２Ｉ、Ｉ４４２Ｌ、Ａ５５４Ｐ）、Ｖｖ２Ｍ１（変異−Ｒ３３１Ｋ、Ｉ３３４Ｅ、Ｎ３３５Ｓ、Ｖ３７１Ｉ、Ａ３７４Ｌ、Ｔ４１８Ｖ、Ｓ４８２Ｔ、Ｓ５１２Ｐ、Ｋ３５６Ｎ、Ｑ４９１Ｋ、Ｅ３９４Ｄ、Ａ４２８Ｖ、Ｖ５４２Ｔ、Ｇ４８０Ａ、Ｍ３０５Ｌ、Ｋ４４１Ｒ、Ａ５５４Ｐ）、Ｖｖ１Ｍ５（変異−Ｒ３３１Ｋ、Ｉ３３４Ｅ、Ｎ３３５Ｓ、Ｖ３７１Ｉ、Ａ３７４Ｌ、Ｔ４１８Ｖ、Ｓ４８２Ｔ、Ｓ５１２Ｐ、Ｋ３５６Ｎ、Ｑ４９１Ｋ、Ｅ３９４Ｄ、Ａ４２８Ｖ、Ｙ３４８Ｆ、Ｔ３１８Ｓ、Ｌ３５２Ｉ、Ｉ４４２Ｌ、Ａ５５４Ｐ、Ｈ２８４Ｍ、Ｃ４６Ｋ、Ｆ４４８Ｔ、Ｑ５３３Ｅ）、及びＶｖ２Ｍ５（変異−Ｒ３３１Ｋ、Ｉ３３４Ｅ、Ｎ３３５Ｓ、Ｖ３７１Ｉ、Ａ３７４Ｌ、Ｔ４１８Ｖ、Ｓ４８２Ｔ、Ｓ５１２Ｐ、Ｋ３５６Ｎ、Ｑ４９１Ｋ、Ｅ３９４Ｄ、Ａ４２８Ｖ、Ｖ５４２Ｔ、Ｇ４８０Ａ、Ｍ３０５Ｌ、Ｋ４４１Ｒ、Ａ５５４Ｐ、Ｈ２８４Ｍ、Ｃ４６Ｋ、Ｆ４４８Ｔ、Ｑ５３３Ｅ）（図３）として提供する。これらの酵素のいずれかを、ｄｘｓ−ｉｄｉ−ｉｓｐＤＦが過剰発現している本明細書のＭＥＰ経路株において過剰発現させ、ＭＭＭＥを使用してバランスを取った場合、得られたバレンセンの力価は、含酸素バレンセンの形成を触媒するＰ４５０酵素の能力を試験するための、その酵素の組み込みの動機付けに十分であった。Ｐ４５０組み込み前のバレンセンの力価は、約３０ｍｇ／Ｌであった。
【００８９】
実施例２：バレンセン骨格に対するＣＹＰ４５０ライブラリーの機能活性
バレンセンをモデル系として使用し、産生テルペン化学物質についてのＣＹＰ４５０に基づく酸素添加化学の能力を検証した。
【００９０】
ＣＹＰＰ４５０候補スクリーニングを、バレンセン産生Ｅ．ｃｏｌｉ株を宿主バックグラウンドとして使用して実施した。機能発現のためにＣＹＰ４５０を構築するには、独自のプラスミド系であるｐ５Ｔｒｃ（ｐＳＣ１０１に由来するプラスミド）を使用して、Ｎ末端切断型Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＳｒＣＰＲ）に柔軟な５つのアミノ酸リンカー（ＧＳＴＧＳ、配列番号１１７）によって融合した候補Ｐ４５０を含有するプラスミドを構築した。様々な候補Ｐ４５０の配列を図４に示す。候補ＣＹＰ４５０を、切断して８つのアミノ酸リーダー配列（ＭＡＬＬＬＡＶＦ、配列番号１１２）を融合物に付加したＮ末端膜会合領域（図５Ａ及び図５Ｂ）について分析した。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ及びＴａｘｕｓ  ｃｕｓｐｉｄａｔａに由来するＣＰＲレドックスパートナーもまた、類似した遺伝子構築物中で調製した。天然のＳｒＣＰＲが効果的であったので、これらの構築物の活性レベルは決定しなかった。様々なＣＰＲレドックスパートナーの配列を図６に示す。バレンセン産生株に対するｐ５Ｔｒｃ−ＣＹＰ４５０−Ｌ−ＳｒＣＰＲの形質転換後、株を抗生物質選択ＬＢ培地中において３０℃で一晩培養した。次いで、これらの培養物を使用して、２ｍＬの抗生物質選択Ｒ培地培養物を１５ｇ／Ｌのグリセロール及び０．１ｍＭのＩＰＴＧと共にハンゲートチューブ中に播種し、その後にこれらを２２℃で４日間培養してからメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で抽出した。
【００９１】
表４に列挙されたものからＣＹＰ４５０酵素のセットを選択し、このＥ．ｃｏｌｉ系におけるセスキテルペン及びジテルペン酸素添加の両方に分類した。バレンセンに対する酸素添加について試験した様々なＣＹＰ４５０酵素の中でも、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａに由来するカウレンオキシダーゼ（ＳｒＫＯ）（１６）が、バレンセン骨格に対して特有の酸素添加化学を有することを発見した。ＳｒＫＯは、ジテルペン（−）−カウレンをＣ１９位で自然に酸化して（−）−カウレン酸にする。ＳｒＫＯ酵素は、ヒドロキシル化生成物の異なる立体異性体を作製する（アルファ及びベータヌートカトールならびにさらにケトン、すなわちヌートカトンへと酸化する）ことにより本研究において特有の活性を示し、アルファ−ヌートカトール、ベータ−ヌートカトール、及びヌートカトンに加えて、ヒドロキシゲルマクラ−１（１０）５−ジエン、ムーロラン−３，９（１１）ジエン−１０−ペルオキシを含む異なる含酸素テルペン生成物を産生した。その他のＰ４５０は、バレンセンをヒドロキシル化するための従来より知られているセスキテルペンＣＹＰ４５０を含み、これらは異性体の１種のみ（ベータヌートカトール）及びわずかに検出可能な量のケトン（ヌートカトン）を産生した。具体的には、その他のセスキテルペンＣＹＰ４５０酵素は、ベータ−ヌートカトール及びヒドロキシルバレンセンを主要生成物として産生したが、別のジテルペンＣＹＰ４５０酵素（例えば、Ｔａｘｕｓ５−アルファヒドロキシラーゼ）は、ヌートカトールをごく微量の（検出可能な）生成物として産生した（表４及び図７）。
【００９２】
【表４】
0006735750.tif 000017
【００９３】
実施例３：ＳｒＫＯの構造及び変異研究
一旦ＳｒＫＯの特有の活性を同定したら、実験を実施してその多様なバレンセンの酸化を実施するその能力を改善した。ＳｒＫＯの結晶構造は記載されてこなかった。ＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに対するＳｒＫＯのＢｌａｓｔ検索は、結晶構造によるＳｒＫＯとＰ４５０酵素との配列同一性が低いこと（約２０％）を示す。その低い配列同一性にかかわらず、Ｐ４５０の保存的折り畳み構造を考慮し、最新のタンパク質モデリングツールを使用してＳｒＫＯ上に構築した。ヒトにおいてアンドロゲンの生合成を触媒する膜結合シトクロムＰ４５０  １７  Ａ１の結晶構造（ＤｅＶｏｒｅ  Ｎ．Ｍ．，Ｓｃｏｔｔ  Ｅ．Ｅ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８２，１１６−１１９，２０１２を参照のこと）をモデル開発のための鋳型として選択した。ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅタンパク質モデリングソフトウェアを使用して、主要な残基及び特徴的なモチーフの位置決め（Ｇｏｔｏｈ  Ｏ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６７，８３−９０，１９９２を参照のこと）が鋳型と十分に整列するようにして相同性モデルを開発した（図８Ａ）。さらに、補欠分子ヘム鉄錯体を含んだＳｒＫＯの相同性モデルもまた構築した。次いで、ＡｕｔｏＤｏｃｋ  ＶＩＮＡを使用して、ＳｒＫＯ活性部位におけるバレンセンの可能な結合様式の全体を作製した（図８Ｂ）（２９）。
【００９４】
加えて、ＮＣＢＩ非冗長タンパク質配列ライブラリーに対するＳｒＫＯのＢｌａｓｔ検索は、（ＳｒＫＯそれ自体を除いて）８０％超の配列同一性を有するオルソログは存在しないと返した。上位ヒットを表５に列挙する。
【００９５】
【表５】
0006735750.tif 000018
【００９６】
一旦ＳｒＫＯの特有の活性を同定したら、実験を実施してその多様なバレンセンの酸化を実施するその能力を改善した。コンセンサス復帰変異誘発戦略を使用して、Ｐ４５０酵素の多重配列アラインメントを構築し、これは４種のカウレンオキシダーゼ遺伝子を使用するＵｎｉｒｅｆ１００データベースのＢＬＡＳＴ検索からの、Ｐ４５０ＢＭ３、Ｐ４５０ＣＡＭ、及びＰ４５０ｅｒｙＦを種遺伝子として使用する細菌プロテオソームのＢＬＡＳＴ検索からの、ならびに最も近縁なＳｒＫＯホモログからの（９０％超の同一性を有する配列のクラスタリング及び排除後の）配列を含んだ。相同性モデルに基づいて、多重配列アラインメント、ならびに文献の様々な点変異及び二重変異を設計して試験した。これらのシトクロムＰ４５０誘導体を、上に記載されるインビボ試験系において総含酸素テルペン産生力（例えば、ＧＣ／ＭＳにより観察した主要なピークの合計）の改善について評価した。モデルによって導かれた活性部位の位置上の変異誘発により、有意に改善した含酸素生成物を伴ういくつかのバリアントが明らかになった（以下の表６及び表７）。
【００９７】
【表６】
0006735750.tif 000019
【００９８】
【表７】
0006735750.tif 000020
【００９９】
実施例４：ヌートカトンの単離及び評価
シトクロムＰ４５０酵素ＳｒＫＯ（配列番号３８）によるバレンセンの酸化から誘導した生成物をＧＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ６８００；カラム：Ｒｔｘ−５、０．３２ｍｍ×６０ｍ×１．０μｍ膜厚；ＧＣ温度プログラム：４０℃で５分間、４℃／分ずつ３００℃まで増加させて３０分間保持した。）により分析し、表８Ａ及び表８Ｂに提供したデータを得た。
【０１００】
【表８Ａ】
0006735750.tif 000021
【０１０１】
【表８Ｂ】
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【０１０２】
同様の分析をＳｒＫＯ誘導体により産生された生成物で実施した。生成物プロファイルが同等であること、及び主要生成物のヌートカトン、ヌートカトールをＳｒＫＯの変異誘発に基づいて高レベルで産生できることを確認した。
【０１０３】
次いで、酸化油生成物を適切な溶媒（例えば、ヘプタン）を使用して水性反応媒体から抽出し、続いて分留を行うことができる。各画分の化学組成をＧＣ／ＭＳにより定量的に測定することができる。画分をブレンドし、風味またはその他の用途に使用するための、所望のヌートカトール及び／またはヌートカトン構成成分を生成することができる。
【０１０４】
受容性の検証を、参照ヌートカトン風味料生成物（例えば、Ｆｒｕｔａｒｏｍから入手した既存の天然風味料市販製品）との直接比較により行うことができ、表９に提供した分析を含む。
【０１０５】
【表９】
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【０１０６】
実施例５：Ｎ末端アンカー工学
最初のＳｒＫＯバリアント（これらの実施例においてバレンセンオキシダーゼ１、またはＶＯ１と称される）の膜相互作用を最適化するために、細胞質Ｃ末端で内膜に固定されたＥ．ｃｏｌｉタンパク質を同定した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｈｃＢのＮ末端配列を選択し、これは１回膜貫通ドメインを提供する。ｙｈｃＢのＮ末端の２０〜２４アミノ酸を元の膜アンカー配列であるＭＡＬＬＬＡＶＦ（配列番号１１２）と交換し、ＳｒＫＯのＮ末端切断サイズを２８〜３２で変えた。図９を参照のこと。ＶＯ１をｐ５プラスミド上のＴ７プロモーターの制御下で発現させた。ＳｒＣＰＲを染色体から独立して発現させた。株を９６ディープウェルプレートにおいて、既に記載したようにグリセロール及びドデカン重層を添加したＲ培地中で３０℃で４８時間培養した。
【０１０７】
図１０に示すように、ｎ２０ｙｈｃＢ＿ｔ２９ＶＯ１は、対照の平均値と比較して総含酸素力価の１．２倍の産生力を示した。Ｎ２０ｙｈｃＢ＿ｔ２９ＶＯ１は、元の８ＲＰアンカーのおよそ１．８倍の総含酸素力価を示した（示さず）。
【０１０８】
実施例６：ＶＯ１の変異分析
ＶＯ１の変異分析を、含酸素力価を増加させるために実施した。株ＭＢ２５０９（ＭＰ６−ＭＥＰ  ＭＰ１−ＳｃＦＰＰＳ  Ｆａｂ４６−ＶＳ２  ＭＰ６−ＳｃＣＰＲ）をバックグラウンドとして使用し、これはｐ５−Ｔ７−ｙｈｃＢ−ＶＯ１プラスミドで形質転換した場合に約１８％のヌートカトンを産生する。株をヌートカトンのより高い産生について評価した。
【０１０９】
Ｐ４５０  １７Ａ１に基づく相同性モデル（実施例３）により導いたら、ＶＯ活性部位の部位飽和変異誘発を１８の位置で実施し、５つの対位置ライブラリーを構築した。第１シェル残基を基質ドッキングにより同定し、非保存第１シェル残基を、結合ポケット形状を変化させるために相対近接及び相対位置に基づいて選択した。対位置ライブラリーを、オーバーラップエクステンションＰＣＲ及びギブソンアセンブリにより構築した。
【０１１０】
【表１０】
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【０１１１】
株を実施例４におけるようにバレンセンの総酸素添加について評価した。株を３０℃及び２２℃で評価した。
【０１１２】
対位置ライブラリーの一次スクリーニングにより、バリアントの多くが活性を失ったことが明らかとなった。ライブラリー３は、２２℃では改善した活性を有していたが、３０℃では有しなかったバリアントを含有していた。したがって、第１シェル残基中に２つ以上の変異を同時に導入することが、活性の決定要因であり得る。
【０１１３】
【表１１】
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【０１１４】
いくつかのバリアントは、含酸素力価を最大１．７倍に改善した。Ｅ３２３位、Ｉ３９０位、及びＱ５００位の変異は、改善した酸素添加力価を有するいくつかのヒットを示し、これらの位置を二次スクリーニングのために選択した。
【０１１５】
次に、コンセンサス復帰変異（１９の変異体）をＶＯ１バックグラウンドにおいてスクリーニングした。実施例３に記載されるスクリーニングプロセスを使用して、以下の変異をスクリーニングした：Ａ２Ｔ、Ｉ３８９Ｌ、Ｉ３８９Ｖ、Ｉ３８９Ａ、Ｍ９４Ｖ、Ｔ４８８Ｄ、Ｅ４９１Ｋ、Ｅ５２Ａ、Ｈ４６Ｒ、Ｄ１９１Ｎ、Ｌ１５０Ｍ、Ｉ４９５Ｖ、Ｔ４６８Ｉ、Ｋ３４４Ｄ、Ｑ２６８Ｔ、Ｒ３５１Ｑ、Ｒ７６Ｋ、Ｖ４００Ｑ、及びＩ４４４Ａ（配列番号３７により番号付けした）。図１３Ａに示すように、生成物プロファイルの劇的なシフトなしに、変異の５０％超が１．２〜１．４５倍の含酸素力価（ｍｇ／Ｌとして示す）をもたらした。Ａ２Ｔ、Ｍ９４Ｖ、Ｔ４８８Ｄ、Ｅ５２Ａ、Ｈ４６Ｒ、Ｌ１５０Ｍ、Ｔ４６８Ｉ、Ｋ３４４Ｄ、Ｑ２６８Ｔ、Ｒ３５１Ｑ、Ｒ７６Ｋ、Ｖ４００Ｑ、及びＩ４４４Ａで改善が見られ、これらを二次スクリーニングのために選択した。図１３Ｂは、総含酸素生成物変化倍率に対してプロットした同じスクリーニングを示す。
【０１１６】
活性部位ＳＳＭ（Ｌ２３１Ｍ、Ｉ３９０Ｌ、Ｉ３９０Ｍ、Ｔ１３１Ｋ、及びＴ１３１Ｑ）からのリードバリアント、Ｎ末端アンカーバリアントのｎ２０ｙｈｃＢ＿ｔ２９ＶＯＲ１、ならびにコンセンサス復帰変異誘発を選択して再スクリーニングした。この二次スクリーニングの結果を図１４に示す。いくつかの変異が、含酸素力価の１．１〜１．４倍の改善を示した。組換えのための変異の一覧を絞り込むために、同じ変異を３３℃でスクリーニングし、より高い温度へのプロセスシフトを可能にできた安定化変異を区別した。図１５に示すように、６つの変異（Ｍ９４Ｖ、Ｌ１５０Ｍ、Ｔ４６８Ｉ、Ｒ７６Ｋ、Ｉ３９０Ｌ、及びＴ１３１Ｑ）が、３３℃で改善した産生力を維持した。リードＮ末端アンカーに加えて、これらの６つの変異を組換えのために選択した。
【０１１７】
実施例７：ＳｒＫＯ組換えライブラリースクリーニング
二次スクリーニング（実施例６）後に選択した７つの変異を、バリアントまたは野生型のいずれかを各部位に割り当てることにより、ＶＯ組換えライブラリー中にランダムに組み込んだ。バックグラウンド株は、ＭＢ２５０９（ＥＧＶ  Ｇ２  ＭＰ６−ＣＰＲ）＋ｐＢＡＣ−Ｔ７−ＢＣＤ７−ｙｈｃＢ−ＶＯであった。
【０１１８】
３０℃での一次スクリーニング（実施例５に記載される同じプロセスを使用する）により、ＶＯ１と比較して含酸素生成物力価の最大１．３５倍の改善を有するいくつかのバリアントを同定した。さらに、選択したバリアントは、ヌートカトンへの産生のシフトを示し、これは（ヌートカトンの産生が２回の酸素添加サイクルを必要とするため）より高いＰ４５０活性を示唆していた。一次スクリーニングの結果を図１６Ａに示す（株対ｍｇ／Ｌでの力価）。図１６Ｂは、酸素添加能（ヌートカトン及びヌートカトールの合計）に基づいて示した同じスクリーニングを提示する。
【０１１９】
次いで、組換えバリアントを３４℃及び３７℃でスクリーニングし、より高い温度でも改善した活性及び安定性を有するリードを選択した。二次スクリーニングの結果を図１７に示す。対照は３７℃でほぼ完全に不活性であったが、倍率が高い６つのバリアントは、より高い温度で有望な活性を示したため、さらなるスクリーニングのために選択した（ｃ１１（８）、ｂ４（７）、ｃ６（１）、ｃ１２（３）、ｂ６（２）、及びｃ９（６））。このさらなるスクリーニング（図１８）に基づいて、ｃ６（１）を酸素添加能に基づいた最適なバリアントとして選択した。倍率が高い６つのバリアントは、以下の変異セットを含有する。
【０１２０】
【表１２】
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【０１２１】
図２３（Ａ及びＢ）は、本明細書に記載されているようないくつかの操作されたバレンセンオキシダーゼ（ＶＯ）バリアントのアラインメントを示し、スクリーニングプロセスで評価した、選択した変異を強調表示する。図２３Ａでは：８ｒｐ−ｔ２０ＳｒＫＯ（配列番号１０６）は、Ｎ末端での２０のアミノ酸切断、及び８つのアミノ酸膜アンカーの付加を有するＳｒＫＯ配列である。８ｒｐ−ｔ２０ＶＯ０（配列番号１０７）は、ＳｒＫＯ  Ｎ末端の２０のアミノ酸切断、８つのアミノ酸Ｎ末端アンカーの付加、及び４９９位（野生型ＳｒＫＯにより番号付した）に単一変異を有する。ｎ２２ｙｈｃＢ−ｔ３０ＶＯ１（配列番号１０４）は、ＳｒＫＯ  Ｎ末端の３０のアミノ酸切断、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｈｃＢに由来する２２のアミノ酸に基づく膜アンカー、ならびに４６位、２３１位、２８４位、３８３位、４００位、４８８位、及び４９９位（ＳｒＫＯ野生型に対して）に８つの点変異を有する。ｎ２２ｙｈｃＢ−ｔ３０ＶＯ２（配列番号１０５）は、ＳｒＫＯ  Ｎ末端の３０のアミノ酸切断、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｈｃＢに由来する２２のアミノ酸に基づく膜アンカー、ならびに７６位、９４位、１３１位、２３１位、２８４位、３８３位、３９０位、４６８位、及び４９９位（ＳｒＫＯ野生型に対して）に９つの点変異を有する。図２４Ｂでは、ＶＯ０（配列番号１０９）、ＶＯ１（配列番号１１０）、及びＶＯ２（配列番号１１１）の点変異を、野生型ＳｒＫＯ（配列番号１０８）に対して示す（便宜上、全て野生型ＳｒＫＯ  Ｎ末端と共に示す）。
【０１２２】
実施例８：シトクロムＰ４５０レダクターゼスクリーニング
シトクロムＰ４５０レダクターゼのセットをＶＯ１との活性の改善についてスクリーニングした。本実施例は、株ＭＢ２４５９をバックグラウンドとしてｐＢＡＣ−Ｔ７−ＢＣＤ７−ＶＯ１（Ｉ３８２Ｌ）−Ｔ７ＢＣＤｘ−ＣＰＲｘと共に使用して行った。ＢＣＤは２シストロン設計を表し、これはＭｕｔａｌｉｋ  ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３（１０）４：３５４に記載されている。より低いＢＣＤ数は、より高い翻訳速度を指す。ＣＰＲは、ＳｒＣＰＲ（配列番号６２）、ＳｒＣＰＲ３（配列番号８０）、ＡａＣＰＲ（配列番号６８）、ＰｇＣＰＲ（配列番号８２）、ＡｔＣＰＲ２（配列番号７２）、ＡｔＣＰＲ１（配列番号７０）、ｅＳｒＣＰＲ１（配列番号７６）、及びｅＡＴＲ２（配列番号７４）を含んだ。株を実施例５におけるように３０℃で試験した。
【０１２３】
図２０に示すように、ＳｒＣＰＲ３をＲＮＡ配列決定研究により入手し、これは含酸素力価の１．３倍の改善を示した。
【０１２４】
ＣＰＲオルソログを３４℃で再試験した。結果を図２０に示す。ＳｒＣＰＲ３（配列番号８０）及びＡａＣＰＲ（配列番号６８）の両方が、より高い温度であっても含酸素力価の１．３倍の改善を示した。含酸素力価は、３０℃で得られた力価と同等であった。
【０１２５】
実施例９：生成物プロファイルを変化させるアルコールデヒドロゲナーゼ酵素
ヌートカトールをヌートカトンに変換するアルコールデヒドロゲナーゼの能力を評価した。以下のＡＤＨ酵素を評価した：
【０１２６】
【表１３】
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【０１２７】
ＭＢ２４９０をバックグラウンド株として使用し、実施例５におけるように株を評価した（ＭＰ６−ＭＥＰ  ＦＡＢ４６−ＳｃＦＰＰＳ−Ｌ−ＶＳ１  ＭＰ６−ＶＯ１−ｏ−ＳｒＣＰＲ＋ｐ５−Ｔ７−ＢＣＤ１４−ＡＤＨ）。簡潔に述べると、ＭＰ６、Ｆａｂ４６及びＴ７は、結合した遺伝子またはオペロンのプロモーターを指す。本明細書のＭＥＰは、Ｅ．ｃｏｌｉのｄｘｓ、ｉｄｉ、及びｉｓｐＤＦ遺伝子を過剰発現するオペロンである。ＳｃＦＰＰＳとＶＳ１との間のＬが、（ＧＳＴＧＳ）をコードする短いポリペプチドリンカーを指すのに対して、ＶＯ１とＳｒＣＰＲとの間の−ｏ−は、ＲＢＳ配列が２つの遺伝子間に挿入されているオペロン構築物を指す。プラスは、以下のプラスミドを表し、これはプロモーター、ＢＣＤ（上に記載される）及び問題となっているＡＤＨを有するｐ５（５コピー）プラスミドとして記載される。
【０１２８】
４つのオルソログが、ヌートカトールをヌートカトンに変換する（ｖｖＤＨ、ｃｓＡＢＡ２、ｂｄＤＨ、及びｚｚＳＤＲ）と同定し、ヌートカトン力価の３倍超の増加をもたらした。図２１。
【０１２９】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ａ−３】
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【図３Ａ−４】
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【図３Ａ−５】
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【図３Ａ−６】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ａ−３】
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【図４Ａ−４】
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【図４Ａ−５】
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【図４Ａ−６】
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【図４Ａ−７】
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【図４Ａ−８】
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【図４Ａ−９】
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【図４Ａ−１０】
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【図４Ａ−１１】
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【図４Ａ−１２】
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【図４Ａ−１３】
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【図４Ａ−１４】
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【図４Ｂ−１】
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【図４Ｂ−２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ａ−３】
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【図６Ａ−４】
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【図６Ａ−５】
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【図６Ａ−６】
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【図６Ａ−７】
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【図６Ａ−８】
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【図６Ａ−９】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図６Ｃ−１】
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【図６Ｃ−２】
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【図６Ｄ−１】
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【図６Ｄ−２】
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【図６Ｄ−３】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ−１】
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【図２２Ａ−２】
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【図２２Ａ−３】
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【図２２Ａ−４】
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【図２２Ａ−５】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【配列表】
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