(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
・Ｒａｓ／ＥＲＫ経路における突然変異により引き起こされるかまたは該突然変異が関与している、および／または
・ｃ−Ｆｏｓの産生の増加に関連している
癌の予防および／または治療における使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターであって、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターが、
・少なくとも１つの細胞透過性配列と、
・配列番号２９（ＦＶＦＴＹＰＥＡ）を含むアミノ酸配列
とを含むペプチドである、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビター。
【請求項２】
Ｒａｓ／ＥＲＫ経路における突然変異により引き起こされるかまたは該突然変異が関与している癌が、ＲａｆまたはＲａｓの突然変異により引き起こされるかまたは該突然変異が関与している、請求項１記載の使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビター。
【請求項３】
癌が、結腸癌、膵臓癌、黒色腫、甲状腺癌、肺癌および白血病、および卵巣癌からなる群から選択される、請求項２記載の使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビター。
【請求項４】
Ｒａｓ／ＥＲＫ経路における突然変異により引き起こされるかまたは該突然変異が関与している癌が、ＮＦ１の突然変異により引き起こされるかまたは該突然変異が関与している、請求項１記載の使用のためのｃ−Ｆｏｓのインヒビターペプチド。
【請求項５】
癌が、神経膠腫、若年性骨髄単球性白血病および神経線維腫からなる群から選択される、請求項４記載の使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビター。
【請求項６】
ｃ−Ｆｏｓの産生の増加に関連している癌が、頸部肝細胞癌、膵臓癌、乳癌、骨肉腫および子宮内膜癌からなる群から選択される、請求項１記載の使用のためのｃ−Ｆｏｓのインヒビターペプチド。
【請求項７】
転移の予防方法における使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターであって、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターが、
・少なくとも１つの細胞透過性配列と、
・配列番号２９（ＦＶＦＴＹＰＥＡ）を含むアミノ酸配列
とを含むペプチドである、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビター。
【請求項８】
血管形成術およびステント移植の後の血管平滑筋細胞の増殖を抑制および／または予防するための使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターであって、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターが、
・少なくとも１つの細胞透過性配列と、
・配列番号２９（ＦＶＦＴＹＰＥＡ）を含むアミノ酸配列
とを含むペプチドであり、ペプチドが、血管形成術およびステント移植の後の再狭窄に罹患した患者を治療するために使用される、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビター。
【請求項９】
ステントが、薬物溶出性ステントである、請求項８記載の使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビター。
【請求項１０】
神経線維腫症の予防および／または治療における、使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターであって、少なくとも１つの細胞透過性配列と、配列番号２９（ＦＶＦＴＹＰＥＡ）を含むアミノ酸配列とを含む、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビター。
【請求項１１】
配列番号２９（ＦＶＦＴＹＰＥＡ）を含むアミノ酸配列が、
【化１】
0006735676.tif 000007
からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項記載の使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビター。
【請求項１２】
アミノ酸配列が、配列番号３９（ＣＴＴＹＴＳＳＦＶＦＴＹＰＥＡＤＳＦＰＳ）である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビター。
【請求項１３】
細胞透過性配列が、
・ＨＩＶ−ＴＡＴ配列（配列番号２）、
・ペネトラチン（配列番号３）、
・７〜１１個のアルギニンのアミノ酸配列（配列番号４〜８）、
・配列番号９〜１２のような配列内にランダムに位置する７〜１１個のアルギニンを含む７〜２５アミノ酸のＸ７／１１Ｒ配列、および
・ＤＰＶに由来する配列（配列番号１３〜１７）
からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項記載の使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビター。
【請求項１４】
ペプチドが配列番号２６（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＣＴＴＹＴＳＳＦＶＦＴＹＰＥＡＤＳＦＰ）または配列番号３６（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＣＴＴＹＴＳＳＦＶＦＴＹＰＥＡＤＳＦＰＳ）の配列を有する、請求項１〜１３のいずれか１項記載の使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビター。
【請求項１５】
・結腸癌、膵臓癌、黒色腫、卵巣癌、肺癌、甲状腺癌、白血病、若年性骨髄単球性白血病、神経膠腫、神経線維腫、頸部肝細胞癌、乳癌、骨肉腫および子宮内膜癌からなる群から選択される癌、および／または
・神経線維腫症
を予防および／または治療するための使用のための医薬組成物であって、
ａ）請求項１〜１４のいずれか１項記載のｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターの少なくとも１つ、
ｂ）前記ペプチドをコードする核酸、または
ｃ）前記核酸を含む発現ベクター
を含む医薬組成物。
【請求項１６】
神経線維腫症が、神経線維腫症Ｉである、請求項１５に記載の予防および／または治療するための使用のための医薬組成物。
【請求項１７】
神経線維腫症が、神経鞘腫瘍を示す、請求項１０に記載の使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌および再狭窄における異常増殖を治療するための、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は種々の疾患の広範な一群であり、全ては、制御不能な細胞増殖を伴う。ＧＬＯＢＯＣＡＮによると、２０１２年の癌の新たな症例の数は１４１０万と推定されており、癌により引き起こされる死亡数は８２０万と推定されている。これに対して、２００８年には、それらの数字はそれぞれ１２７０万および７６０万と推定された。２００８年には、癌は世界中の全死亡人数の約１０％に相当した。新規治療法に対する集中的な調査および研究が行われているが、比率は増加しつつある。
【０００３】
癌を克服するための幾つかの種々の治療法が提示されている。それらの１つはＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫ（細胞外シグナル制御）経路およびその抑制を含み、これは新規抗癌薬の開発を目的として研究されている。
【０００４】
癌はＥＲＫ経路の異常活性化にしばしば関連していることが示されている。これは、ＥＲＫの上流のＲａｓまたはＲａｆタンパク質の過剰活性化を招く、種々の悪性疾患で見られる突然変異によるものである。したがって、この経路の抑制が治療法として精力的に追求されている。
【０００５】
しかし、この経路の標的化は難題である。なぜなら、ＥＲＫは恒常性機能において必須の役割を果たしているからである。おそらくこれは、ＥＲＫにより制御される多数の異なる、そして更には反対の細胞応答によるものであろう。したがって、ＥＲＫ経路を標的とする抗癌薬は非常に少数しか臨床レベルで検証されていない。実際、現在入手可能なＥＲＫインヒビターは、ＲａｆまたはＭＥＫを含むＥＲＫの上流のキナーゼに作用し、したがって、無差別に全てのその基質に対するＥＲＫ活性の全インヒビターとして作用する。これは細胞恒常性に対して非特異的かつ重要な毒性副作用をもたらし、これは、癌に罹患している患者の治療において許容できない。
【０００６】
したがって、有効であり、より低い望ましくない副作用を有する一方で、ＥＲＫ経路を効率的に標的化しうる新規抗癌剤の需要は満たされていない。
【０００７】
本発明者らは、ＥＲＫの上流ではなくＥＲＫの下流の関心のある標的をより特異的に標的化することによりこの難題を克服する新規方法を既に開発している。ＷＯ  ２００６／０８７２４２に開示されているとおり、本発明者らは、キナーゼＥＲＫ（細胞外シグナル制御キナーゼ）に対する与えられた基質のドッキングドメインに対応するアミノ酸配列を含む細胞透過性ペプチドを開発した。したがって、該ペプチドはＥＲＫに関するその基質のそれぞれに対してＤＥＪＬまたはＤＥＦドッキング部位を選択的に妨げる。そのような特異性はＥＲＫのドッキング部位によりもたらされることが可能であり、これらは、その基質の選択的な認識、相互作用およびリン酸化をもたらすのに必要である。
【０００８】
ＤＥＦ−ドメインドッキング部位（ＥＲＫに対するドッキング部位，ＦＸＦＰ）は、細胞周期進行に必要な核基質に対する活性ＥＲＫの結合をもたらす。もう１つの特徴的なドメインはＤドメイン（またはＤＥＪＬ：ＥＲＫおよびＪＮＫに対するドッキング部位，ＬＸＬ）であり、これはＥＲＫエフェクターまたはキナーゼ、例えばＲｓｋまたはＭＳＫの認識および活性化に必要であり、そしてまた、そのホスファターゼ（ＭＫＰ）によるＥＲＫ抑制、またはＭＥＫによる認識および活性化に必要である。
【０００９】
本発明者らにより既に開発されているペプチドは１つのおよびただ１つのＥＲＫ基質の選択的インヒビターとしてＥＲＫの下流で作用する。したがって、それらの生物学的効果は標的指向性がより高く、毒性でない。
【００１０】
これらのペプチドは、ＥＲＫの下流の１つの標的に選択的な影響を及ぼすがＥＲＫの全体的活性を損なわない新規タイプのインヒビターに相当する。この概念は、活性化ＥＲＫによる認識、相互作用およびリン酸化に決定的に重要な特異的ドッキングドメイン（ＥＲＫに対するＤＥＪＬおよびＤＥＦドッキング部位）を介してＥＲＫがその下流標的に結合しうることに基づいている。
【００１１】
本発明者らは、ＥＲＫと癌原遺伝子ｃ−Ｆｏｓとの相互作用を妨げるために非常に特異的なペプチド、すなわち、ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃを設計した。この相互作用はＤＥＦドメインに特異的であり、ｃ−Ｆｏｓリン酸化（これはその安定化および発癌特性のための重要な事象である）を招く。ｃ−Ｆｏｓは最初期遺伝子であり、細胞トランスフォーメーションに決定的に関与し、種々の癌において高度に発現され、癌の進行の予後マーカーである。
【００１２】
重要なことに、腫瘍化細胞においてはｃ−Ｆｏｓ発現量の上昇が認められるが、ｃ−Ｆｏｓ自体は癌において稀にしか突然変異しておらず、異常な活性のためにはＲａｓ／ＥＲＫシグナリング経路の機能不全を要する。ｃ−Ｆｏｓは、浸潤性および転移細胞への腫瘍化細胞の移行にも関与している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２００６／０８７２４２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
驚くべきことに、本発明者らは、このように、ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓが特異的ヒト細胞系に対する抗増殖および抗浸潤特性を有することを示した。
【００１５】
したがって、本発明者らは、癌および転移を含む異常な細胞増殖および浸潤に関連した病理に関する非常に有望な治療方法を開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の概括
第１の態様において、本発明は、
・Ｒａｓ／ＥＲＫ経路における突然変異により引き起こされるかまたは該突然変異が関与している、および／または
・ｃ−Ｆｏｓの産生の増加に関連している
癌の予防および／または治療における使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターであって、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターが、
・少なくとも１つの細胞透過性配列と、
・配列番号２９（ＦＶＦＴＹＰＥＡ）を含むｃ−Ｆｏｓのドッキングドメイン配列に対応するアミノ酸配列
とを含むペプチドである、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターに関する。
【００１７】
好ましくは、該癌は、結腸癌、膵臓癌、黒色腫、卵巣癌、肺癌、甲状腺癌、白血病、若年性骨髄単球性白血病、神経膠腫、神経線維腫、頸部肝細胞癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌、骨肉腫および子宮内膜癌からなる群から選択される。
【００１８】
第２の態様において、本発明は、転移の予防方法における使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターであって、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターが、
・少なくとも１つの細胞透過性配列と、
・配列番号２９（ＦＶＦＴＹＰＥＡ）を含むｃ−Ｆｏｓのドッキングドメイン配列に対応するアミノ酸配列
とを含むペプチドである、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターに関する。
【００１９】
第３の態様において、本発明は、ステント上の細胞、好ましくは血管平滑筋細胞の増殖を抑制および／または予防するための使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターであって、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターが、
・少なくとも１つの細胞透過性配列と、
・配列番号２９（ＦＶＦＴＹＰＥＡ）を含むｃ−Ｆｏｓのドッキングドメイン配列に対応するアミノ酸配列
とを含むペプチドであり、ステントが、心血管疾患に罹患した患者を治療するために使用される、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターに関する。
【００２０】
第４の態様において、本発明は、神経線維腫症を治療および／または予防するための使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターであって、少なくとも１つの細胞透過性配列と、配列番号２９（ＦＶＦＴＹＰＥＡ）を含むｃ−Ｆｏｓのドッキングドメイン配列に対応するアミノ酸配列とを含む、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターに関する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
定義
本明細書中で用いる「ペプチド」なる語は、１００個未満のアミノ酸を有するアミノ酸配列を意味する。本明細書中で用いる「ペプチド」なる語は、９０個未満のアミノ酸、８０個未満のアミノ酸、７０個未満のアミノ酸、６０個未満のアミノ酸または５０個未満のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、該アミノ酸配列は２０、２１、２２、２３、２４、２５、５０、７５または１００個のアミノ酸を含む。
【００２２】
本明細書中で用いる、障害または状態を「治療する」なる語は、そのような障害または状態の、１以上の症状の過程を逆転させ、改善し、または抑制することを意味する。障害または状態を「予防する」なる語は、そのような障害または状態の、１以上の症状を予防することを意味する。
【００２３】
本明細書中で用いる「治療的有効量」は、対象に治療利益をもたらすのに必要な、活性物質の最小量を意図している。例えば、対象にとっての「活性物質の治療的有効量」は、病的症状、疾患進行、または対象を冒している疾患に関連した身体状態の改善を誘導し、それらを改善し、またはそれらの改善を引き起こす活性物質の量である。
【００２４】
本明細書中で用いる「本発明のペプチド」または「ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビター」なる表現はｃ−Ｆｏｓリン酸化のインヒビターを意味する。より厳密には、該表現はＥＲＫおよびｃ−Ｆｏｓ相互作用に対する阻害性ペプチドを意味する。該ペプチドは、
・少なくとも１つの細胞透過性配列と、
・ｃ−Ｆｏｓのドッキングドメイン配列に対応するアミノ酸配列
とを含む。
【００２５】
該ドッキングドメイン配列はｃ−ＦｏｓのＤＥＦドッキングドメイン配列である。好ましくは、ｃ−Ｆｏｓのドッキングドメイン配列に対応するアミノ酸配列は、
【００２６】
【化１】
0006735676.tif 000002
からなる群から選択される。
【００２７】
好ましくは、ｃ−Ｆｏｓのドッキングドメイン配列に対応するアミノ酸配列は配列番号１（ＣＴＴＹＴＳＳＦＶＦＴＹＰＥＡＤＳＦＰ）である。より好ましくは、ｃ−Ｆｏｓのドッキングドメイン配列に対応するアミノ酸配列は配列番号３９（ＣＴＴＹＴＳＳＦＶＦＴＹＰＥＡＤＳＦＰＳ）である。
【００２８】
本発明のペプチドは下流標的ｃ−Ｆｏｓに選択的な影響を及ぼすが、全体的なＥＲＫ活性を損なわない。好ましくは、該ペプチドは、配列番号２６に記載されている特異的ペプチドである。より好ましくは、該ペプチドは、配列番号３６に記載されている特異的ペプチドである。
【００２９】
本発明の文脈においては、該ペプチドは「ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビター」または「ＥＲＫおよびｃ−Ｆｏｓ相互作用に対する選択的阻害性ペプチド」と称される。
【００３０】
本明細書中で用いる「ｃ−Ｆｏｓ」または「Ｆｏｓ」は、レトロウイルス癌遺伝子ｖ−Ｆｏｓのヒトホモログである癌原遺伝子を意味する。ｃ−Ｆｏｓは３８０アミノ酸のタンパク質である。ｃ−Ｆｏｓの配列はアクセッション番号ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ２４７５６．１としてオンラインで入手可能である。この最初期遺伝子は細胞周期進行に関連づけられている。ｃ−Ｆｏｓおよび癌におけるその関与は刊行物Ｈｅａｌｙら，Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １３７，Ｉｓｓｕｅ  １，２０１３年１月，ｐ．６４−７７に開示されている。
【００３１】
本明細書中で用いる「ＭＡＰキナーゼ」または「マイトジェン活性化プロテインキナーゼ」なる表現は、減数分裂、有糸分裂、分化およびアポトーシスを含む複数の機能を制御するように細胞内で作用する広範に発現されるタンパク質キナーゼのファミリーを意味する。ＭＡＰＫ「細胞外シグナル制御キナーゼ」、「ＥＲＫ」経路は幾つかの上流細胞内パートナーを含み、これらは小ＧＴＰ交換因子Ｒａｓを含み、これはｃ−Ｒａｆファミリーのメンバーを活性化し、ついでマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＫＫ、ＭＥＫまたはＭＡＰ２Ｋと略称される）を活性化し、ついでＥＲＫ  １／２を活性化する。
【００３２】
ホルモン、増殖因子および更には機械的／物理的刺激は通常、膜受容体を活性化し、これらは更に、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路を含む細胞内シグナリング経路を活性化する。この経路の活性化における最初の細胞内事象は小さなＧＴＰ結合性タンパク質、例えばＲａｓであり、そしてこれは細胞の細胞質内のリン酸化事象のカスケードを活性化する。このカスケードはＭＡＰ３キナーゼ（ＭＡＰ３Ｋ、通常はＲａｆキナーゼ：Ｒａｆ−１、Ａ−ＲａｆおよびＢ−Ｒａｆ）を含み、これはＭＡＰＫＫ成分（ＭＥＫ１およびＭＥＫ２：ＭＥＫ）を活性化し、ついでＭＡＰＫ（ＥＲＫ１、ＥＲＫ２）を活性化しうる。そして活性化ＥＲＫは、分化、増殖、形態決定などを含む多数の基本的細胞応答に関与する数百種の異なる基質をリン酸化しうる。これらの細胞応答、そしてそれによる生物学的機能に対するＥＲＫの特異性は、膜、細胞質または核のものでありうる選択的基質に本質的に左右される。このようにして、ＥＲＫは、一旦活性化されると、刺激の強度および持続時間に応じて、核へ移行しうる。ここにおいて、ＥＲＫは、細胞周期進行に関連づけられている転写因子（転写因子Ｅｌｋ−１およびｃ−Ｆｏｓ）をリン酸化（すなわち、活性化）しうる。ヒトの癌における特異的シグナリング経路および突然変異を図１に要約する。
【００３３】
本明細書中で用いる「ペプシグナル（ｐｅｐｓｉｇｎａｌ）」は、本発明者らにより開発された、ＷＯ  ２００６／０８７２４２に開示されているペプチドを意味する。これらのペプチドの基礎をなす概念を図２に示す。
【００３４】
該ペプチドはＥＲＫの下流に作用する。これは、活性化ＥＲＫによる基質の認識、相互作用およびリン酸化に決定的に重要なＥＲＫに対する特異的ドッキングドメインであるＤＥＪＬ（ＥＲＫおよびＪＮＫに対するドッキング部位，ＬＸＬ）およびＤＥＦ（ＥＲＫに対するドッキング部位，ＦＸＦＰ）ドッキング部位を介して、ＥＲＫがその下流標的に結合しうることに基づく。
【００３５】
したがって、「ペプシグナル」は、ＥＲＫに対する与えられた基質のＤＥＦドッキングドメインを模倣しており、したがって、ＥＲＫの全体的な活性に影響を及ぼすことなく、与えられた関心のある基質に対する非常に特異的な抑制作用を有する。
【００３６】
本発明のペプチドＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓは「ペプシグナル」である。
【００３７】
本明細書中で意図される「癌」なる表現は、無制御な細胞増殖および隣接組織の浸潤により特徴づけられる疾患を意味する。異常細胞は、しばしば、固形腫瘍を形成しうるトランスフォーム細胞である腫瘍細胞と称される。本明細書中で用いる癌なる語は該疾患の任意の発生段階を意味する。
【００３８】
「腫瘍」なる語は、悪性または良性のものを含む過剰または異常な細胞分裂から生じる細胞（すなわち、２以上の細胞）ならびに前癌および癌細胞の異常な塊または集団を意味する。悪性腫瘍は、無制御な細胞増殖に加えて、それが周辺組織に浸潤可能であり転移可能である点で、良性増殖または腫瘍からは区別される。
【００３９】
本明細書中で用いる「再狭窄」は経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）後の管腔直径の減少を意味する。再狭窄は動脈損傷およびその後の新生内膜組織増殖の結果である。基本的には、それは、心血管疾患の治療における血管形成術およびステント移植の後に生じる炎症によるものである。再狭窄は血管平滑筋細胞の増殖および炎症による該細胞の遊走により特徴づけられる。
【００４０】
本発明
第１の態様において、本発明は、
・Ｒａｓ／ＥＲＫ経路における突然変異により引き起こされるかまたは該突然変異が関与している、および／または
・ｃ−Ｆｏｓの産生の増加に関連している
癌の予防および／または治療における使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターであって、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターが、
・少なくとも１つの細胞透過性配列と、
・ＥＲＫに対するｃ−ＦｏｓのＤＥＦドッキングドメインに対応するアミノ酸配列、好ましくは、配列番号２９（ＦＶＦＴＹＰＥＡ）を含むｃ−Ｆｏｓのドッキングドメイン配列に対応するアミノ酸配列
とを含むペプチドである、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターに関する。
【００４１】
本発明者らは、本発明のペプチドが種々の細胞型の細胞増殖、遊走および悪性性において有望な抑制特性を示すことを示している。また、本発明のペプチドは抗増殖効果を有するが、配列番号２７に記載されているペプチドＴＡＴ−ＤＥＦ−Ｅｌｋ−１または配列番号３７に記載されているＴＡＴ−ＤＥＦ−ＪｕｎＢを含む他の基質を標的化するペプチドはそれほど重要な効果を示さなかったことを、本発明者らは示している。特に、ペプチドＴＡＴ−ＤＥＦ−Ｅｌｋ−１はｖＳＭＣ、ＮＩＨ３Ｔ３またはＨＣＡＥＣのいずれにも効果を示さず、ＭＰＮＳＴには若干の抑制効果（ＩＣ５０に到達せず）を示した。
【００４２】
このように、本発明者らは、ｃ−ＦｏｓのＤＥＦドメインを特異的に標的化するペプチドを開発し、これは種々の増殖細胞の結果に有益な効果をもたらすことが判明している。また、このペプチドは毒性を有さず、創傷治癒試験での試験において重要な抗浸潤特性を有することが判明しており、したがって、それは転移を予防しうることが示されている。
【００４３】
より詳細には、驚くべきことに、該ペプチドはヒト由来の血管平滑筋細胞（ｖＳＭＣ）、ＮＦ１患者からの悪性末梢神経鞘腫瘍および線維芽細胞に対する抗腫瘍特性を有することを、本発明者らは示している。該効果はヒト由来の内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）においては見出されなかった。したがって、本発明のペプチドは、血管平滑筋細胞、線維芽細胞および神経鞘細胞からなる群から選択される細胞の増殖の抑制および／または予防に有用である。
【００４４】
１つの実施形態においては、標的化癌はＲａｓ／ＥＲＫ経路における突然変異により引き起こされるかまたは該突然変異が関与している。好ましくは、Ｒａｓ／ＥＲＫ経路における突然変異はこの経路のいずれかの成分、より好ましくはＲａｓ、ＲａｆおよびＮＦ１の突然変異である。これらの突然変異に関連した癌の頻度およびタイプを図１に要約する。典型的には、ＲａｓまたはＲａｆにおける突然変異はＥＲＫに対するそれらの構成的活性、したがってＥＲＫの異常活性化を招く。典型的には、ＮＦ１の突然変異はＲａｓの過剰活性化を招く。したがって、Ｒａｓ／ＥＲＫ経路における関連突然変異はＲａｓ、ＲａｆおよびＮＦ１の突然変異である。
【００４５】
「Ｒａｓ」は、ＧＴＰに結合しＧＴＰを加水分解するタンパク質であるＧＴＰアーゼの大ファミリーの注目に値するメンバーである。最初はマウス肉腫ウイルスのトランスフォーミング癌遺伝子として発見された３つの非常に関連した２１ｋＤａの哺乳類タンパク質であるハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）−Ｒａｓ（Ｈ−Ｒａｓ）、キルステン（Ｋｉｒｓｔｅｎ）−Ｒａｓ（Ｋ−Ｒａｓ）および神経芽細胞腫（Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）−Ｒａｓ（Ｎ−Ｒａｓ）が特定されている。ＧＴＰアーゼ活性を損ない、ＧＴＰ結合状態を安定化するこれらのＲａｓアイソフォームの、またはそれらの下流エフェクターの、１４個の活性化突然変異が全てのヒト癌の約３分の１で見出され、それにより、これらの腫瘍性タンパク質は最も強力な公知トランスフォーミングポリペプチドの１つとなっている。
【００４６】
ＲａｓファミリーメンバーはＣ末端ファルネシル化により細胞膜の細胞質面に固定される。内部小葉へのこの局在化はＲａｓをＳＯＳに接近させて、Ｒａｓに結合したＧＤＰがサイトゾルからのＧＴＰと交換されることを刺激する。この交換はＲａｓをコンホメーション的に活性化して、それが幾つかの下流エフェクターと相互作用することを可能にする。
【００４７】
ＥＲＫシグナリングカスケード内で、活性Ｒａｓは、エフェクターＲａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（Ｒａｆ）キナーゼに高いアフィニティで結合するアダプターとして機能して、細胞膜へのそれらのトランスロケーション（移行）を引き起こし、その部位においてプロヒビチン（ＰＨＢ）によりＲａｆ活性化が生じる。
【００４８】
Ｒａｓにおける突然変異により引き起こされるかまたは該突然変異が関与する癌の非限定的な一覧には結腸癌、膵臓癌、黒色腫、甲状腺癌、肺癌および白血病が含まれる。
【００４９】
「Ｒａｆ」は、特定のセリンおよびトレオニン残基上のヒドロキシル基のリン酸化を触媒するセリン／トレオニンプロテインキナーゼである。哺乳動物は７０〜１００ｋＤａのサイズ範囲の以下の３種のＲａｆタンパク質を有する：
・Ｒａｆ−１（これは遍在的に発現される）、
・Ａ−Ｒａｆ（軟骨、腸、心臓、脾臓、胸腺、小脳、および尿生殖器組織において見出される）、
・Ｂ−Ｒａｆ（複数のアイソフォームで存在し、ほとんどの組織において発現され、神経組織において高い発現が見られる）。
【００５０】
ＧＴＰ結合Ｒａｓによる細胞膜へのリクルートメントはＲａｆ活性化における開始事象である。ＲａｓのエフェクタードメインはＭＡＰ３ＫのＮ末端における２つの位置（すなわち、Ｒａｓ結合ドメイン（ＲＢＤ）およびシステインリッチドメイン（ＣＲＤ））でＲａｆに結合し、活性化のためには両方の部位における結合が必要である。
【００５１】
異なるＲａｓアイソフォームは、インビトロでは同等のアフィニティで結合するものの、様々な度合でＲａｆを活性化するようである。例えば、Ｋ−ＲａｓはＨ−Ｒａｓより効率的にＲａｆ−１を細胞膜にリクルートし、かつ、リクルートされたＲａｆ−１をＨ−Ｒａｓより強力に活性化する。Ｂ−Ｒａｆは発癌性Ｒａｓアイソフォームの主要標的であることも示唆されている。Ｂ−ｒａｆの活性化突然変異が悪性黒色腫の約５０％で報告されている。
【００５２】
Ｒａｆにおける突然変異により引き起こされるかまたは該突然変異が関与する癌の非限定的な一覧には結腸癌、卵巣癌、黒色腫および甲状腺癌が含まれる。
【００５３】
したがって、ＲａｓまたはＲａｆにおける突然変異により引き起こされるかまたは該突然変異が関与する癌には、結腸癌、膵臓癌、黒色腫、甲状腺癌、肺癌および白血病、および卵巣癌が含まれる。
【００５４】
「ＮＦ１」はタンパク質ニューロフィブロミンをコードしており、これはｒａｓシグナル伝達経路の負の調節因子である。
【００５５】
ＮＦ１における突然変異は全ヒトゲノムにおける自然突然変異の最大頻度の１つを示す。それは腫瘍抑制因子であり、発現は種々の細胞、主にメラニン細胞、神経細胞、シュワン細胞およびグリア細胞において検出される。その抗腫瘍機能ゆえに、ＮＦ１タンパク質の不活性化は、皮膚および中枢神経系（ＣＮＳ）に関する幾つかの腫瘍の成長を招く。皮膚腫瘍は実際には末梢神経系（ＰＮＳ）の悪性疾患であり、皮膚、皮下および叢状神経線維腫を含む。神経線維腫は末梢神経系における神経鞘腫瘍である。
【００５６】
中枢神経系においては、最も頻繁に生じる腫瘍は神経膠腫である。
【００５７】
ＮＦ１における突然変異により引き起こされるかまたは該突然変異が関与する癌の非限定的な一覧には神経膠腫、若年性骨髄単球性白血病および神経線維腫が含まれる。
【００５８】
したがって、Ｒａｓ／ＥＲＫ経路、特にＲａｓ、ＲａｆおよびＮＦ１における突然変異により引き起こされるかまたは該突然変異が関与する癌には、結腸癌、膵臓癌、黒色腫、卵巣癌、肺癌、甲状腺癌、白血病、若年性骨髄単球性白血病、神経膠腫および神経線維腫が含まれる。
【００５９】
もう１つの実施形態においては、標的化される癌はｃ−Ｆｏｓの産生の増加に関連している。該増加は細胞レベルでのｃ−Ｆｏｓの蓄積を招き、該蓄積は異常である。
【００６０】
ｃ−Ｆｏｓの産生の増加に関連した癌の非限定的な一覧には頸部肝細胞癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膵臓癌、乳癌、骨肉腫および子宮内膜癌が含まれる。
【００６１】
したがって、本発明は、結腸癌、膵臓癌、黒色腫、卵巣癌、肺癌、甲状腺癌、白血病、若年性骨髄単球性白血病、神経膠腫、神経線維腫、頸部肝細胞癌、乳癌、骨肉腫および子宮内膜癌からなる群から選択される癌を予防および／または治療するための使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターに関するものであり、ここで、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターは、少なくとも１つの細胞透過性配列と、配列番号２９（ＦＶＦＴＹＰＥＡ）を含むｃ−Ｆｏｓのドッキングドメイン配列に対応するアミノ酸配列とを含む。
【００６２】
本発明は更に、血管平滑筋細胞、線維芽細胞および神経鞘細胞からなる群から選択される細胞の増殖を抑制および／または予防するための使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターに関するものであり、ここで、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターは、少なくとも１つの細胞透過性配列と、配列番号２９（ＦＶＦＴＹＰＥＡ）を含むｃ−Ｆｏｓのドッキングドメイン配列に対応するアミノ酸配列とを含む。
【００６３】
最後に、本発明のペプチドは、先行技術において使用される古典的な増殖インヒビター、例えばラパマイシンまたはパクリタキセルより低い用量で抗増殖作用を示すことを、本発明者らは示している。したがって、本発明のペプチドはより低い用量において非常に効率的であり、このことは潜在的副作用を抑制する。
【００６４】
第２の態様において、本発明は、転移の予防方法における使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターに関するものであり、ここで、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターは、
・少なくとも１つの細胞透過性配列と、
・配列番号２９（ＦＶＦＴＹＰＥＡ）を含むｃ−Ｆｏｓのドッキングドメイン配列に対応するアミノ酸配列
とを含むペプチドである。
【００６５】
本明細書中で用いる「転移」なる語は、癌細胞が１つの器官または組織から別の非隣接器官または組織へと広がる過程を意味する。典型的には、癌細胞の広がりはリンパまたは血液を介して生じる。
【００６６】
本発明のペプチドは、それが浸潤性の抑制特性を有するため、転移を予防するための非常に有望な方法を構成する。
【００６７】
本発明者らは、この結果を創傷治癒試験において確証した。驚くべきことに、本発明者らは本発明のペプチドの有益な効果を示しているが、全体的なＭＥＫインヒビター（すなわち、Ｕ０１２６）は適当でないことが判明した。
【００６８】
好ましくは、本発明のペプチドは、結腸癌、膵臓癌、黒色腫、卵巣癌、肺癌、甲状腺癌、白血病、若年性骨髄単球性白血病、神経膠腫、神経線維腫、頸部肝細胞癌、乳癌、骨肉腫および子宮内膜癌の癌細胞から選択される癌細胞の広がりを妨げる。
【００６９】
第３の態様において、本発明は、ステント上の血管平滑筋細胞の増殖を抑制および／または予防するための使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターに関するものであり、ここで、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターは、
・少なくとも１つの細胞透過性配列と、
・配列番号２９（ＦＶＦＴＹＰＥＡ）を含むｃ−Ｆｏｓのドッキングドメイン配列に対応するアミノ酸配列
とを含むペプチドであり、該ステントは、心血管疾患に罹患した患者を治療するために使用される。
【００７０】
典型的には、該ステントは、心血管疾患、好ましくは冠動脈疾患に罹患したかまたは罹患している患者において使用された。もう１つの実施形態においては、該患者は血管形成術を受けたかまたは受けている。
【００７１】
好ましくは、該ステントは薬物溶出性ステントである。本明細書中で用いる「薬物溶出性ステント」は、細胞増殖を阻止する物質に関連したステントを意味する。本発明の文脈においては、該物質は、本明細書に開示されているペプチドである。
【００７２】
ステントの使用は再狭窄を招きうることがよく知られている。この特定の場合において、本発明のペプチドは血管平滑筋細胞の増殖およびステント内へのその浸潤の抑制および／または予防に非常に有用である。
【００７３】
この非常に特定の実施形態においては、本発明のペプチドは、典型的には血管形成術において、薬物溶出性ステントとして使用されうる。
【００７４】
もう１つの実施形態においては、該ペプチドは内皮細胞の増殖を妨げない。
【００７５】
したがって、このように、本発明者らは、癌の治療および／または予防、病的細胞の浸潤および転移過程の抑制、ならびに例えば心血管疾患の治療の場合において、血管形成術またはステント移植を受けた患者における血管平滑筋細胞の増殖の抑制および／または予防に使用されうる非常に有望なペプチドを開発した。
【００７６】
該ペプチドは、
・血管平滑筋細胞、線維芽細胞および神経鞘細胞に対する抗増殖特性を有すること、
・毒性を有さないこと、および
・浸潤を抑制すること
が判明した。
【００７７】
第４の態様において、本発明は更に、神経線維腫症を治療および／または予防するための使用のためのｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターに関するものであり、ここで、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターは、少なくとも１つの細胞透過性配列と、配列番号２９（ＦＶＦＴＹＰＥＡ）を含むｃ−Ｆｏｓのドッキングドメイン配列に対応するアミノ酸配列とを含む。好ましくは、該インヒビターは末梢神経鞘腫瘍の治療および／または予防に使用される。
【００７８】
このように、本発明者らは、悪性ＮＦ１細胞増殖、好ましくは末梢神経鞘腫瘍に対する本発明のペプチドの有効性を示した。
【００７９】
腫瘍における該ペプチドの役割に加えて、該結果は、本発明のペプチドが神経線維腫症の治療方法において有用でありうることを証明している。
【００８０】
本明細書中で用いる「神経線維腫症」は、特に中枢神経系および末梢神経系において高い腫瘍形成リスクを有する、臨床的および遺伝的に特徴的である幾つかの遺伝的病態を意味する。神経線維腫症は以下のとおりに分類されうる：
・Ｉ型神経線維腫症（これにおいては、神経および他の組織を圧迫することにより重大な損傷を引き起こしうる良性でありうる腫瘍（神経線維腫）を神経組織が成長させる）、
・ＩＩ型神経線維腫症（これにおいては、両側性聴神経腫（神経鞘腫としても公知の内耳神経または第８脳神経（ＣＮ  ＶＩＩＩ）の腫瘍）が発生し、しばしば、聴力損失につながる）、
・神経鞘腫症（これにおいては、痛みを伴う神経鞘腫が脳神経、脊髄神経および末梢神経上に発生する）。
【００８１】
本明細書中で用いる神経線維腫症なる語は前記範疇の病態の全てを含む。好ましくは、本発明の文脈においては、該神経線維腫症は神経線維腫症Ｉである。
【００８２】
好ましくは、本発明のペプチドの細胞透過性配列は、
・ＨＩＶ−ＴＡＴ配列（配列番号２）、
・ペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）（配列番号３）、
・７〜１１個のアルギニンのアミノ酸配列（配列番号４〜８）、
・Ｘ７／１１Ｒ配列（ここで、該配列は、配列番号９〜１２のような配列内にランダムに位置する７〜１１個のアルギニンを含む７〜２５アミノ酸配列、好ましくは７〜２０アミノ酸配列である）、および
・配列番号１３〜１７のような、Ｄｅ  Ｃｏｕｐａｄｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ（２００５）３９０，４０７−４１８およびＷＯ０１／６４７３８に記載されている細胞透過性配列としてのＶｅｃｔｏｃｅｌｌ（登録商標）に由来する配列
を含む群から選択される。
【００８３】
Ｘ７／１１Ｒ配列およびＤＰＶ配列の非限定的な例を以下の表に示す。
【００８４】
【表１】
0006735676.tif 000003
【００８５】
本発明の１つの実施形態においては、本発明のペプチドインヒビターの細胞透過性配列およびドッキングドメインは、当技術分野で公知のいずれかの適当な方法により、化学結合（化学的カップリング）により連結されうる。
【００８６】
本発明のもう１つの実施形態においては、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターは核移行シグナル（ＮＬＳ）配列および／または核外移行シグナル（ＮＥＳ）配列を更に含む。
【００８７】
該ＮＬＳおよびＮＥＳ配列は当技術分野でよく知られており、２〜２０アミノ酸、好ましくは３、４、５、．．．、１８、１９または２０アミノ酸を含む。
【００８８】
１つの実施形態においては、該ＮＬＳおよびＮＥＳ配列は以下の表において選択される。
【００８９】
【表２】
0006735676.tif 000004
【００９０】
もう１つの実施形態においては、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターは、細胞透過性配列と該ペプチドインヒビターの配列の残部との間の細胞内での切断を可能にする酵素切断部位を更に含む。
【００９１】
１つの実施形態においては、該酵素切断部位は、細胞質内グルタチオンによる細胞内切断を可能にする２つの連続的システイン残基を含む。
【００９２】
好ましい実施形態においては、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターは配列番号２６（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＣＴＴＹＴＳＳＦＶＦＴＹＰＥＡＤＳＦＰ）の配列を有する。
【００９３】
したがって、本発明の１つの実施形態においては、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターは配列番号２６のアミノ酸配列から実質的になる。
【００９４】
あるいは、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターは配列番号３６（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＣＴＴＹＴＳＳＦＶＦＴＹＰＥＡＤＳＦＰＳ）の配列を有する。
【００９５】
したがって、本発明のもう１つの実施形態においては、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターは配列番号３６のアミノ酸配列から実質的になる。
【００９６】
本発明においては、「から実質的になる」は、本発明のペプチドが、該ペプチドのコア配列として機能するペプチドの部分を必ずしも構成しない、Ｎおよび／またはＣ末端に位置する追加的なアミノ酸伸長を、配列番号２６のいずれかの配列に加えて含有することを意味するものとする。
【００９７】
本発明の１つの実施形態においては、該ペプチドインヒビターを構成するアミノ酸はＬエナンチオマーである。本発明のもう１つの実施形態においては、該ペプチド配列のアミノ酸の１以上はそのＤエナンチオマーで置換されうる。本発明のもう１つの実施形態においては、該ペプチドインヒビターは全て、該ペプチド配列のＤレトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）形態である。
【００９８】
本発明のペプチドインヒビターはＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸または両方の組合せの重合体でありうる。例えば、該ペプチドはＤレトロ−インベルソペプチドである。「レトロ−インベルソ異性体」なる語は、配列の方向が逆であり、各アミノ酸残基のキラリティが逆転している直鎖状ペプチドの異性体を意味する。Ｄ−エナンチオマーおよび逆合成を組合せる正味の結果は、各アミド結合におけるカルボニルおよびアミノ基の位置が交換され、一方、各アルファ炭素における側鎖基の位置が維持されていることである。特に示されていない限り、本発明のいずれかの与えられるＬ−アミノ酸配列は、対応する天然Ｌ−アミノ酸配列に関する配列の逆のものを合成することにより、Ｄレトロ−インベルソペプチドとして製造されうる、と推定される。
【００９９】
ｃ−Ｆｏｓのペプチドインヒビターは当技術分野で公知の通常の技術により得られうる。例えば、該ペプチドインヒビターは、通常の固相合成または液相合成のような化学合成により得られうる。Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）またはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）をアミノ保護基として使用する固相合成が好適である。
【０１００】
また、該ペプチドインヒビターは遺伝子工学法により生合成されうる。このアプローチは、比較的長いペプチド鎖を有するポリペプチドを製造する場合に適している。すなわち、所望のインヒビターペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む）を有するＤＮＡを合成する。ついで、該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるのに要する種々の調節要素（プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、および発現レベルを制御するための種々のシス要素を含む）と共にこのＤＮＡからなる遺伝子発現構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。一般的な技術は、この組換えベクターを特定の宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、細菌細胞または動物（哺乳類）細胞）内に導入し、ついでこれらの宿主細胞、またはこれらの細胞を含有する組織もしくは生物を特定の条件下で培養するというものである。このようにして、標的ポリペプチドが該細胞内で発現され、産生されうる。ついで該ポリペプチドを宿主細胞（またはそれが分泌される場合には、培地）から単離し、精製し、それにより、所望のインヒビターペプチドを得る。当技術分野において通常用いられる方法は、組換えベクターを構築し構築ベクターを宿主細胞内に導入するために適合化されうる。例えば、宿主細胞における効率的な高容量産生を達成するために、融合タンパク質発現系が使用されうる。すなわち、該インヒビターペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、この合成ＤＮＡを適当な融合タンパク質発現ベクター（例えば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質発現ベクター、例えばＮｏｖａｇｅｎ  ｐＥＴ系列またはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｐＧＥＸ系列のベクター）内の適当な部位内に導入する。ついで宿主細胞（典型的には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））をこのベクターで形質転換する。得られた形質転換体を培養して、標的融合タンパク質を得る。該タンパク質を抽出し、精製する。得られた精製融合タンパク質を特定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した標的ペプチド断片をアフィニティクロマトグラフィーのような方法により集める。本発明のインヒビターペプチドは、そのような通常の融合タンパク質発現系（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＧＳＴ／Ｈｉｓ系を使用するもの）を用いて製造されうる。あるいは、無細胞タンパク質合成系のための鋳型ＤＮＡ（すなわち、該インヒビターペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ断片）を構築することが可能であり、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸など）を使用する無細胞タンパク質合成系により標的ポリペプチドをインビトロで合成することが可能である。
【０１０１】
前記のｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターをコードする核酸配列は、当技術分野で公知のいずれかの方法により（例えば、該配列の３’および５’末端にハイブリダイズしうる合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅により、または与えられた遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチド配列を使用するｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーからのクローニングにより）得られうる。
【０１０２】
発現ベクターは、前記のｃ−Ｆｏｓの、１以上の選択的インヒビターの組換え発現によっても得られる。「発現ベクター」なる語は、二本鎖または一本鎖である環状または直鎖状のＤＮＡまたはＲＮＡを示すために本明細書中で用いられる。それは、宿主細胞内または単細胞もしくは多細胞宿主生物内に導入される前記の少なくとも１つの核酸を更に含む。
【０１０３】
該発現ベクターは、好ましくは、前記のｃ−Ｆｏｓの、１以上の選択的インヒビターをコードする核酸を含む。また、本発明の発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞における挿入ポリヌクレオチドの発現を駆動する、ウイルス、細菌、植物、哺乳動物および他の真核生物由来のエンハンサー／プロモーターのような種々の調節要素を含む、発現を支持する適当な要素（例えば、インスレーター、境界要素またはマトリックス／スカフォールド結合）を含む。幾つかの実施形態においては、該調節要素は異種である（すなわち、天然遺伝子プロモーターではない）。あるいは、必要な転写および翻訳シグナルは、遺伝子および／またはそれらの隣接領域のための天然プロモーターによっても供給されうる。
【０１０４】
本明細書中で用いる「プロモーター」なる語は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位の、またはプロモーター機能を調節するように相互作用する他のＤＮＡ配列の存在によって構造的に特定される、１以上の本発明核酸配列の転写を制御するように機能するＤＮＡの領域を意味する。プロモーターの機能的発現促進性断片は、プロモーターとしての活性を保有する短縮化またはトランケート化プロモーター配列である。プロモーター活性は、当技術分野で公知のいずれかのアッセイにより測定されうる。
【０１０５】
本明細書中で用いる「エンハンサー領域」は、典型的には、１以上の遺伝子の転写を増強するように機能するＤＮＡの領域を意味する。より詳細には、本明細書中で用いる「エンハンサー」なる語は、発現される遺伝子に対するその位置および配向には無関係に、遺伝子の発現を増強、強化、改善または改良するＤＮＡ調節要素であり、これは２以上のプロモーターの発現を増強、強化、改善または改良しうる。本発明の発現ベクターに関する前記のプロモーター／エンハンサー配列は植物、動物、昆虫または真菌調節配列を利用しうる。例えば、プロモーター／エンハンサー要素は酵母および他の真菌から使用されうる（例えば、ＧＡＬ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターまたはグリア線維性酸性タンパク質プロモーター）。代替的または追加的に、それらは動物転写制御領域を含みうる。
【０１０６】
また、発現ベクターは増幅マーカーを含みうる。この増幅マーカーは、例えばアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）およびＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸耐性（ＣＡＤ）からなる群から選択されうる。
【０１０７】
本発明に適した例示的な発現ベクターまたはそれらの誘導体には特に、ヒトまたは動物ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、レンチウイルス）；昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルス）；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダファージ）；プラスミドベクター、例えばｐｃＤＮＡ３およびコスミドベクターが含まれる。本発明に適した好ましい発現ベクターとしては、アデノウイルスベクター、例えばヘルパー依存性アデノウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが挙げられる。
【０１０８】
本発明のもう１つの目的は、
・結腸癌、膵臓癌、黒色腫、卵巣癌、肺癌、甲状腺癌、白血病、若年性骨髄単球性白血病、神経膠腫、神経線維腫、頸部肝細胞癌、乳癌、骨肉腫および子宮内膜癌からなる群から選択される癌、および／または
・神経線維腫症、好ましくは神経線維腫症Ｉ（ＮＦ１）
を予防および／または治療するための使用のための、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターの少なくとも１つを含む医薬組成物である。
【０１０９】
本発明の１つの実施形態においては、該医薬組成物は、
ａ）前記のｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターの少なくとも１つ、
ｂ）前記のペプチドをコードする核酸、または
ｃ）前記の核酸を含む発現ベクター
を含む。
【０１１０】
本発明のｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビター、それをコードする核酸配列、または該核酸配列を含む発現ベクターは医薬組成物中に製剤化されうる。これらの組成物は、前記物質の１つに加えて、医薬上許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤または当業者によく知られた他の物質を含みうる。そのような物質は無毒性であるべきであり、有効成分の効力を損なうものであるべきではない。担体または他の物質の厳密な性質は投与経路、例えば経口、静脈内、皮膚または皮下、鼻腔内、筋肉内、腹腔内またはパッチ経路に左右されうる。
【０１１１】
治療の処方、例えば、投与量などに関する決定は一般医および他の医師の責任において行われ、典型的には、治療されるべき障害、個々の患者の状態、運搬の部位、投与方法および実施者に公知の他の要因を考慮する。
【０１１２】
治療適用においては、本発明のｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターは、非経口、局所、経口、肺（例えば、吸入）または局所投与を含むいずれかの有効な手段による投与を意図した医薬組成物中に含まれる。
【０１１３】
好ましくは、該医薬組成物は非経口的に、例えば静脈内、皮下、皮内または筋肉内または鼻腔内に投与される。
【０１１４】
本発明の１つの実施形態においては、本発明の医薬組成物は鼻腔内経路により投与される。
【０１１５】
本発明のもう１つの実施形態においては、本発明の医薬組成物は静脈内に投与される。
【０１１６】
１つの実施形態においては、血液脳関門を通過する能力を有するペプチドは、当業者に公知の方法を用いて、例えば全身、鼻腔内などに投与されうる。もう１つの実施形態においては、血液脳関門を通過する能力を有さない、より大きなペプチドが、当業者によく知られた技術を用いてカニューレにより、または脳室内（ＩＣＶ）注射により哺乳乳動物の脳に投与されうる。
【０１１７】
１つの実施形態においては、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解または懸濁された前記の本発明のペプチドの溶液を含む非経口投与用の組成物を提供する。例えば水、緩衝水、０．４％  食塩水、０．３％  グリシン、ヒアルロン酸などを含む種々の水性担体が使用されうる。これらの組成物は通常のよく知られた滅菌技術により滅菌可能であり、あるいはそれらは滅菌濾過されうる。得られた水溶液は、そのままの使用のためにパッケージされることが可能であり、あるいは凍結乾燥されることが可能であり、凍結乾燥製剤は投与前に無菌溶液と一緒にされる。該組成物は、ｐＨ調節および緩衝剤、浸透圧調節剤、湿潤剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含む、生理的条件に近づけるための医薬上許容される補助物質を、必要に応じて含有しうる。
【０１１８】
固体組成物の場合、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む通常の無毒性固体担体が使用されうる。経口投与の場合、医薬上許容される無毒性組成物は、通常使用される賦形剤のいずれか（例えば、既に挙げられている担体）、および一般には１０〜９５％、より好ましくは２５％〜７５％の濃度の有効成分を配合することにより形成される。
【０１１９】
エアロゾル投与の場合、ＮＡＰまたはＡＤＮＦポリペプチドは、好ましくは、微細形態で界面活性剤および噴射剤と共に供給される。界面活性剤は、もちろん、無毒性でなければならず、好ましくは、噴射剤に可溶性である。そのような物質の代表例としては、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物とのカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ）酸およびオレイン酸のような６〜２２個の炭素原子を含有する脂肪酸のエステルまたは部分エステルが挙げられる。混合エステル、例えば混合または天然グリセリドが使用可能である。所望により、例えば鼻腔内運搬のためのレシチンのような担体も含まれうる。１つの具体例には、１ミリリットル当たり７．５ｍｇのＮａＣｌ、１．７ｍｇのクエン酸一水和物、３ｍｇのリン酸二ナトリウム二水和物および０．２ｍｇの塩化ベンザルコニウム溶液（５０％）を含む溶液が含まれる（Ｇｏｚｅｓら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９（１−２）：１６７−７０（２００２））。
【０１２０】
本発明のもう１つの目的は、前記のｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターの少なくとも１つの治療的有効量または前記の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、癌の予防および／または治療を要する対象における癌の予防および／または治療方法である。
【０１２１】
既に記載されている技術的データの全てがこの場合に適用可能である。
【０１２２】
１つの実施形態においては、本発明のｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターを、癌を予防および／または治療するのに十分な量で患者に投与する。これを達成するのに適した量は「治療的有効量」として定義される。この使用に有効な量は、例えば、使用される個々のペプチドインヒビター、予防されるべき疾患または障害のタイプ、投与経路患者の体重および全身健康状態、ならびに処方医師の判断に左右される。
【０１２３】
例えば、１日１回（例えば、夜）鼻腔内投与される１００ｎｇ〜１０ｍｇ用量の範囲内に含まれるペプチドインヒビターの量が治療的有効量となろう。あるいは、投与量はこの範囲外または異なるスケジュールのものでありうる。例えば、投与量は０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０，０００ｍｇ／ｋｇの範囲であることが可能であり、好ましくは、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたは５００ｍｇ／ｌ  ｇ（１用量当たり）である。用量は１時間ごとに、４、６または１２時間ごとに、食事と共に、毎日、２、３、４、５、６または７日ごとに、毎週、２、３、４週ごとに、毎月あるいは２、３または４カ月ごとに、あるいはそれらのいずれかの組合せで投与されうる。投与持続期間は、治療される状態に応じて、１回の（急性）投与、あるいは数日間、数週間、数カ月間または数年間にわたりうる。
【０１２４】
１つの実施形態においては、本発明は、以下の疾患の予防および／または治療を要する対象における、
・結腸癌、膵臓癌、黒色腫、卵巣癌、肺癌、甲状腺癌、白血病、若年性骨髄単球性白血病、神経膠腫、神経線維腫、頸部肝細胞癌、乳癌、骨肉腫および子宮内膜癌からなる群から選択される癌、ならびに／または
・神経線維腫症
の予防および／または治療方法に関するものであり、該方法は、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターの少なくとも１つの治療的有効量を投与することを含み、該ペプチドは、少なくとも１つの細胞透過性配列と、配列番号２９（ＦＶＦＴＹＰＥＡ）を含むｃ−Ｆｏｓのドッキングドメイン配列に対応するアミノ酸配列とを含む。
【０１２５】
本発明はまた、血管平滑筋細胞、線維芽細胞および神経鞘細胞からなる群から選択される細胞系の増殖を抑制および／または予防するための方法に関するものであり、該方法は、ｃ−Ｆｏｓの選択的インヒビターの少なくとも１つの治療的有効量を投与することを含み、該ペプチドは、少なくとも１つの細胞透過性配列と、配列番号２９（ＦＶＦＴＹＰＥＡ）を含むｃ−Ｆｏｓのドッキングドメイン配列に対応するアミノ酸配列とを含む。
【０１２６】
本発明はまた、転移の予防方法、ステント上の細胞の増殖の抑制および／または予防するための方法、ならびに神経線維腫症の予防および／または治療方法に関する。
【０１２７】
既に開示されている技術的データの全てがこの場合に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】Ｒａｓ−ＥＲＫシグナリング経路およびヒトの癌における突然変異を要約した図。
【図２】ペプシグナルの概念。パネルＡは、従来使用されている古典的ＭＥＫインヒビターの作用メカニズムを示す。それらはＥＲＫの上流で作用し、全てのＥＲＫ基質の活性化を無差別に遮断する。パネルＢは、ＥＲＫの下流で作用する唯一の生体分子である「ペプシグナル（ｐｅｐｓｉｇｎａｌ）」の特殊性を例示する。それらは、ＥＲＫに対する、与えられた基質のＤＥＦドッキングドメインを模倣したものであり、したがって、関心のある与えられた基質の、非常に特異的な抑制的影響を示す。
【図３】本発明のペプチドであるＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−ＦｏｓはｖＳＭＣ細胞の血清誘導性増殖を阻止するが、ペプチドＴＡＴ−ＤＥＦ−Ｅｌｋ−１は阻止しない。第１日に、ウェル当たり１０  ０００個の細胞を１０％  血清の存在下で増殖させた。１周期の細胞分裂（約３２時間）の後、該細胞を飢餓させ（０．１％  血清）、ついでそれらを、ＴＡＴ−ＤＥＦ−Ｅｌｋ−１、ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓまたは細胞増殖の古典的インヒビター（Ｕ０１２６、ＥＲＫインヒビター；ＶＩＶＩＴまたはパクリタキセル）の存在下または非存在下、ＢｒｄＵの存在下、１０％  ＦＢＳ（血清）中で３２時間増殖させて、分裂細胞を標識した。ニューロン細胞における本発明者らの過去の結果（Ｌａｖａｕｒら，２００７）に基づいて、ペプシグナルの、３つの異なる用量（３〜１２μＭ）を試験した。ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−ＦｏｓはｖＳＭＣ増殖の抑制において効率的であるが、ＴＡＴ−ＤＥＦ−Ｅｌｋ−１はそうではないことに注目されたい；ｎ＝３；一元配置ＡＮＯＶＡ；ダネット（Ｄｕｎｅｔｔ）事後検定；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（１０％  血清で処理された群と比較された場合）。
【図４】本発明のペプチドであるＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓの、ｖＳＭＣ細胞の血清誘導性増殖の抑制に対する効力：単一および複数適用の比較。図３におけるものと同じプロトコルを用いて、中止後、１０％  ＦＢＳ（血清）の存在下、細胞を増殖させた。ペプチドＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓを第１日（中止後の第１日）に１回（６または１２μＭ）適用し、２４、４８または７２時間後、ＢｒｄＵアッセイを用いて増殖を試験した。示されている場合には、ペプチドの複数適用を２４時間ごとに行った（「ｍ」）。ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓ  １２μＭはここでは報告されていないことに注意されたい；ｎ＝３；二元配置ＡＮＯＶＡ；ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）事後検定；＊＊＊ｐ＜０．００１（１０％  血清で処理された群と比較された場合）。
【図５】ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−ＦｏｓはＨＣＡＥＣに対する抗増殖特性を欠いている。図３におけるものと同じプロトコルを用いて、中止後、１０％  血清の存在下、細胞を増殖させた。ペプチドＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓを中止の１日後に単一用量で適用した。ＢｒｄＵアッセイを用いて増殖を試験した；ｎ＝３；一元配置ＡＮＯＶＡ；ダネット（Ｄｕｎｅｔｔ）事後検定；＊ｐ＜０．０５（１０％  血清で処理された群と比較された場合）。
【図６】ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓの抗増殖特性。第１日に、ウェル当たり１０  ０００個の細胞を１０％  血清の存在下で増殖させた。１周期の細胞分裂（約２２時間）の後、該細胞を飢餓させ（０．１％  血清）、ついでそれらを、ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓ（１、３、６または１２μＭ）または細胞増殖の古典的インヒビター（Ｕ０１２６、ＥＲＫインヒビター；ＶＩＶＩＴまたはパクリタキセル）の存在下または非存在下、ＢｒｄＵの存在下、１０％  血清中で３時間増殖させて、分裂細胞を標識した。棒グラフは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の、２つの異なる染色で行った２つの実験から得られたＢｒｄＵ陽性細胞の平均％である。
【図７】ｖＳＭＣに対するＴＡＴ−ＤＥＦ−Ｃ−Ｆｏｓの毒性。１０％  血清の適用の後、示されている時間の終了時にヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）染色を用いて細胞生存性を試験した。Ａ）ペプチドを３、６または１２μＭで適用した。血清適用の２４時間後、細胞を固定した。Ｂ）血清適用の２４、４８または７２時間後、細胞を固定した。示されている場合には、ペプチドの複数適用を２４時間ごとに行った（「ｍ」）。ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓ  １２ｍは複数適用後にこの用量で毒性であったため、これは報告されていないことに注意されたい。ヘキスト陽性細胞の数をイメージ取得後に計数し、専用ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ）を使用して自動化計数を行った。統計：二元配置ＡＮＯＶＡおよびそれに続くボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）検定；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（２４時間と比較された場合）。
【図８】ｖＳＭＣにおける創傷治癒試験におけるＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓペプチドの抑制的役割。１０％  血清と同時に該ペプチドを１回適用した。病変の２４、４８および７２時間後、病変のサイズに対する細胞数の百分率として浸潤性を計算した。全体的ＭＥＫインヒビター（Ｕ０１２６）の効果の欠如に注目されたい。また、選択された全ての時点における１２μＭのＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓペプチドの抑制的役割にも注目されたい。
【図９】ＮＦ１患者からのＭＰＮＳＴに対するＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓとラパマイシンとの効果の比較。悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）からのヒト細胞系を、漸増量のＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓ、または対照として、ラパマイシン（この細胞系に対する増殖のインヒビターとして古典的に使用されているｍＴＲＯ経路のインヒビター）で処理した。ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓペプチドは、ラパマイシンと比較して非常に低い用量でＭＰＮＳＴの増殖を抑制した（ＩＣ５０はＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓに関しては約１０μＭであり、ラパマイシンに関しては１０ｍＭである）。これは、この悪性細胞系の増殖の抑制に関して該ペプチドが非常に効率的であることを示している。
【図１０】ｓＮＦ９６．２に対する４つの異なるペプチドの抑制効果。以下のとおりに悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）細胞系上で４つの異なるペプチドを試験する：    ・ペプチドＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓ、    ・ペプチドＴＡＴ−ＤＥＦ−Ｅｌｋ−１、    ・ペプチドＴＡＴ−ＤＥＦ−ＪｕｎＢ、および    ・ペプチド  ペネトラチン−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓ。
【実施例】
【０１２９】
実施例１：ｖＳＭＣ、ＮＦ１患者からのＭＰＮＳＴおよびＮＩＨ３Ｔ３細胞系に対するＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓペプチドの抗増殖特性
方法
細胞系
０．０５ｍｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、０．０１ｍｇ／ｍｌ  インスリン、０．０１ｍｇ／ｍｌ  トランスフェリン、１０ｎｇ／ｍｌ  亜セレン酸ナトリウム、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳで補足されたＤＭＥＭ  Ｆ１２Ｋ培地内で初代血管平滑筋細胞（ｖＳＭＣ）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９９９）を増殖させた。
【０１３０】
初代ヒト冠状動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ  Ｃ１２２２２）を内皮細胞増殖培地ＭＶ２（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）内で増殖させた。
【０１３１】
１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンで補足されたＤＭＥＭ内でＮＩＨ３Ｔ３マウス胚線維芽細胞を増殖させた。
【０１３２】
悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ：ＮＦ１患者からのもの）をＭｉｃｈｅｌ  Ｖｉｄｅａｕｄ研究所から入手した。２０００個の細胞を、中止後、１５％  血清の存在下で増殖させた。
【０１３３】
培養物を、加湿された９５％の空気および５％のＣＯ２中、３７℃で維持した。
【０１３４】
医薬化合物
本発明者らにより使用された化合物は以下のとおりである。
【０１３５】
【化２】
0006735676.tif 000005
【０１３６】
ＴＡＴ−ＤＥＦ−Ｅｌｋ−１およびＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−ＦＯＳペプチドを、Ｇｅｎｅｃｕｓｔによる「Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成装置（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を使用して、それらのＬ立体配置で合成した。ペプチドをＨＰＬＣにより精製し（＞９９％）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）により分析した。ストック溶液（１ｍＭ）を滅菌水中で調製し、使用まで−２０℃で保存した。
【０１３７】
増殖および毒性アッセイ
ウェル当たり１０  ０００個の細胞を完全培地の存在下で増殖させた。１周期の細胞分裂（ＨＣＡＥＣおよびｖＳＭＣに関しては約３２時間、ＮＩＨ３Ｔ３に関しては２４時間）の後、該細胞を更に１周期にわたって飢餓させた（０．１％  血清または栄養サプリメント（ＨＣＡＥＣの場合））。ついでそれらを「ペプシグナル」（３、６または１２μＭ）、ＭＥＫインヒビターＵ０１２６（１０μＭ）または細胞増殖の古典的インヒビターであるパクリタキセル（１０ｎＭ）、ＶＩＶＩＴ（１００μＭ）のそれぞれの存在下または非存在下、完全培地内で２４〜７２時間増殖させた。分裂中の細胞の可視化を可能にするＢｒｄＵ取り込みの後、増殖を分析した。ＨＣＡＥＣおよびｖＳＭＣの場合には、ｂｒｄＵをインヒビターと共に加えた。ＮＩＨ３Ｔ３の場合には、最後の３時間の間のみ、それを加えた。細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定した。
【０１３８】
全ての核の標識およびそれによりそれらの定量を可能にする固定後のヘキスト染色により毒性を分析した。無傷核を有する核のみを考慮した。ＢｒｄＵ陽性細胞を定量するためにＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を使用した。ヘキスト陽性細胞の総数に対する陽性細胞の数の百分率を示した。
【０１３９】
創傷治癒アッセイ
細胞を２４ウェルプレート内でコンフルエント単層として培養した（ウェル当たり３００００細胞をプレーティング）。該単層を０．１％  血清（またはＨＣＡＥＣの場合には栄養サプリメント）中で２４時間飢餓させ、２００μｌピペットの先端でウェルを横切る線の創傷を加え、ついでそれを、Ｕ０１２６（１０μΜ）、パクリタキセル（１０ｎＭ／ｌ）、ＶＩＶＩＴ（１００μΜ）またはＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−ＦＯＳ（３、６、１２μＭ）の存在下または非存在下、１０％  血清（またはＨＣＡＥＣの場合は栄養サプリメント）と共に２４〜７２時間インキュベートした。細胞を４％  パラホルムアルデヒド中で固定し、ついでクレシルバイオレット染料（メタノール中、１％）で染色した。顕著な創傷の位置を可視化するために写真を撮影した。創傷治癒効果を、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪプログラムを使用して測定し、病変の回復の百分率として表した。
【０１４０】
結果
１）ｖＳＭＣに対するＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓの抗増殖特性
本発明者らは、まず、ＴＡＴ−ＤＥＦ−Ｅｌｋ−１、ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓ、ＥＲＫの古典的インヒビターおよび細胞増殖の古典的インヒビターの抗増殖特性をｖＳＭＣ上で試験し、比較した（図３）。本発明者らは、血清（１０％）により誘導される細胞増殖およびＢｒｄＵ取り込みの古典的プロトコルを用いた。ニューロン細胞における本発明者らの過去の結果（Ｌａｖａｕｒら，２００７を参照されたい）に基づいて、３つの異なる用量（３〜１２μＭ）のペプシグナルを試験した。ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓは３、６および１２μＭで抗腫瘍特性を示す（がＴＡＴ−ＤＥＦ−Ｅｌｋ−１は示さない）ことを、本発明者らは見出した。結果は６および１２μＭの用量において再現性がより高かったため、他の実験は６または１２μＭで行った。１２μＭにおいては、この抗腫瘍効果はＥＲＫの古典的インヒビター、またはこの細胞系に対して古典的に使用される細胞増殖のインヒビターに匹敵した（図３ｃ）。
【０１４１】
ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓの特有の適用がｖＳＭＣの増殖を効率的に抑制したことを確認したため、本発明者らは複数の周期の後のその抗増殖特性を決定することにした。この実験においては、ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓペプチドの単一および複数適用を試験した。本発明者らは、ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓペプチドが細胞増殖の抑制に関して６μＭでの単一および複数適用において同等に効率的であることを見出した（図４）。１２μＭの用量においては、該ペプチドの１回の適用が、増殖抑制を迅速に（僅か２４時間で）得るのに必要かつ十分であった。この用量においては、複数の適用は毒性であった。
【０１４２】
化合物の抗増殖特性は、細胞外刺激および環境に応じて、細胞系および／または器官に非常に特異的でありうるため、本発明者らは内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）の血清誘導性増殖に対するＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓの効力を試験することにした（図５）。
【０１４３】
この細胞系においては、増殖の古典的インヒビター（ＶＩＶＩＴ、パクリタキセル）およびＥＲＫインヒビター（Ｕ０１２６）は、ＨＣＡＥＣ細胞増殖を抑制するのに効率的であったが、ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃペプチドはどの用量においても効果を欠いていた。したがって、このデータは、ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃの抗増殖特性が細胞特異的であることを示している。
【０１４４】
２）悪性ＮＦ１に対するＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃの抗増殖特性
本発明者らは悪性ＮＦ１細胞増殖に対するＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃの効力を試験した（図９）。この目的のために、ＮＦ１患者からの悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）からのヒト細胞系を使用した。
【０１４５】
ＭＰＮＳＴ細胞系は、ＮＦ１診断基準を満たす患者においてＭＰＮＳＴ（悪性末梢神経鞘腫瘍）と診断された、末梢神経鞘に関連した再発性腫瘤から誘導された。該細胞は、それが、細胞質シュワン細胞マーカーＳ１００およびｐ７５の両方に関して免疫陽性であるクローン性形態学的特徴を示す均質シュワン細胞様集団になるまで、培養における初代腫瘍物の多数継代から誘導された。
【０１４６】
対照として、本発明者らは、この細胞系に対する増殖のインヒビターとして古典的に使用されているｍＴＯＲ経路のインヒビターであるラパマイシンを選択した。ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃペプチドは、ラパマイシンと比較して非常に低い用量でＭＰＮＳＴの増殖を抑制した（ＩＣ５０はＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓに関しては約１０μＭであり、ラパマイシンに関しては１０ｍＭである）。これは、この悪性細胞系の増殖の抑制に関して該ペプチドが非常に効率的であることを示している。
【０１４７】
３）線維芽細胞に対するＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃの抗増殖特性
次に、本発明者らは線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞）に対するＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃペプチドの効力を試験した（図６）。この細胞系においては、ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃペプチドの効力は低い用量（１〜１２μＭ）で見出されたが、ＥＲＫインヒビターＵ０１２６は増殖を抑制しなかった。このデータは線維芽細胞増殖に関するｃ−Ｆｏｓに対するＥＲＫ活性の特異性を示している。
【０１４８】
４）ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃは毒性を有さない
増殖の古典的インヒビター、ＭＥＫインヒビターまたはペプチド（漸増用量）を、１０％  血清の存在下、ｖＳＭＣに単一適用で適用し（図７Ａ）、ＰＦＡ固定およびヘキスト染色の後、毒性を評価した。生細胞の計数を行い、ヘキスト陽性細胞数（核標識完全性を示す）として表した。この細胞系に対する細胞増殖の古典的インヒビター（ＶＩＶＩＴ）が毒性を示したのとは対照的に、細胞増殖を抑制するために用いた用量（３〜１２μＭ）のＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃの存在下では毒性は全く観察されなかった（図３Ｂを参照されたい）。本発明者らはまた、複数適用後のＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃの毒性を評価した（図７Ｂ）。この実験においては、該ペプチドを血清の存在下で２４時間ごとに適用した。該細胞を固定し、ヘキストで染色した（２４、４８または７２時間の時点で行った）。６μＭにおいては、該ペプチドは、どのような適用回数でも、ヘキスト陽性細胞の数を変化させなかった。１２μＭにおいては、それは４８および７２時間後に毒性を示した。
【０１４９】
５）ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−ＦｏｃはｖＳＭＣに対する抗浸潤特性を有する
創傷治癒プロトコルを用いて浸潤特性を調べた。ｖＳＭＣ細胞のクレシルバイオレット染色の後、病変回復の百分率を測定した（図８）。２４時間の時点で、参照化合物ＶＩＶＩＴは浸潤の有意な抑制を示した（約３０％の回復；一方、血清のみの存在下では７８％）。この抑制は維持された。なぜなら、それは７８時間の血清適用の後に尚も有意であったからである（３５％の回復；一方、血清のみの存在下では１１０％）。しかし、その毒性作用ゆえに、この抑制は細胞死に関連づけられうる。
【０１５０】
パクリタキセルは、ｖＳＭＣ浸潤に対して、有意であるが一過性の効果を示した。用いたどの用量においても、古典的ＭＥＫインヒビターは浸潤を阻止しなかった。これとは対照的に、本発明者らは、種々の時点において、１２μＭのＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃペプチドの有意な効果を見出した（図８）。６μＭにおいては、２４時間における傾向にもかかわらず、ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃペプチドは細胞浸潤に対する有意な効果を示さなかった。
【０１５１】
結論：
ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−ＦｏｃペプチドはｖＳＭＣ、ＰＮＭＴおよびＮＩＨ３Ｔ３細胞系に対する抗増殖特性を有する。
【０１５２】
その効力は用量依存的であるが、それは、複数適用後、より高い用量では毒性となる。
【０１５３】
ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃは浸潤を抑制する。
【０１５４】
ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃペプチドは、ＴＡＴ−ＤＥＦ−Ｅｌｋ−１または全体的ＭＥＫインヒビターと比較して特異的特性を有する。
【０１５５】
実施例２：悪性ＮＦ１細胞（ＭＰＮＳＴ）の増殖に対するＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓ、ＴＡＴ−ＤＥＦ−Ｅｌｋ−１、ＴＡＴ−ＤＥＦ−ＪｕｎＢ、ペネトラチン−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓの特性の比較
方法
本発明者らは更に、末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）細胞系ｓＮＦ９６．２（これは参照番号ＡＴＣＣ（Ｒ）ＣＲＬ−２８８４（ＴＭ）としてＡＴＣＣに寄託されている）において、４つの異なるペプチドを試験した。
【０１５６】
本発明者により使用された化合物は以下のとおりである。
【０１５７】
【化３】
0006735676.tif 000006
【０１５８】
第０日に細胞を完全培地（１０％  ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ）内で培養した。ついで第２日にそれを飢餓させた（０．１％  ウシ胎児血清と共にＤＭＥＭを含む培地内で２４時間、およびそれに続く、ＤＭＥＭのみにおいて２４時間）。
【０１５９】
第４日に、２〜１００μＭのペプシグナルペプチドの用量漸増レジメンで該細胞をインキュベートした。
【０１６０】
９６時間後に増殖試験を行った。
【０１６１】
増殖をＭＴＴアッセイにより分析した。ＭＴＴアッセイは、細胞生存度を評価するための比色アッセイである。生存度は細胞の代謝活性により測定され、これはミトコンドリア  コハク酸デヒドロゲナートの活性により決定される。典型的には、細胞培地が黄色から青になり、呈色の強度は生細胞数に比例する。呈色は５７０ｎｍにおける原子吸光分光法により決定される。
【０１６２】
結果
本発明者らは３つの独立した実験を行った。この場合、各点は、各実験に関して二重重複で行った。
【０１６３】
結果は図１０に示されており、以下のとおりに要約される。ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−ＦｏｃのＩＣ５０は約１０μＭである（図１０）。１００μＭの濃度において、該ペプチドは全抑制を示している。
【０１６４】
ペプチド  ペネトラチン−ＤＥＦ−ｃ−ＦｏｃはＭＰＮＳＴに対する抗増殖特性を示すが（図１０）、ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃペプチドより低い効力を示す（１００μＭの濃度において約６６％の抑制）。
【０１６５】
ペプチドＴＡＴ−ＤＥＦ−ＪｕｎＢも抗増殖特性を示すが、ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｃペプチドより低い効力を示す。
【０１６６】
最後に、ペプチドＴＡＴ−ＤＥＦ−Ｅｌｋ１は低い抗増殖特性を有する（図１０）。増殖の抑制は、より高い用量でさえも、５０％に達しない。
【０１６７】
結論
結論として、ペプチドＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓおよびペネトラチン−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓは共に、ＭＰＮＳＴに対する抑制効果を示す。しかし、ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓのほうが高い効力を示す。
【０１６８】
また、ＴＡＴ−ＤＥＦ−ＪｕｎｂおよびＴＡＴ−ＤＥＦ−Ｅｌｋ−１も何らかの効果を示すが、これは、ＴＡＴ−ＤＥＦ−ｃ−Ｆｏｓによってもたらされる効果を遥かに下回る。
【０１６９】
最後に、本発明者らの結果は、ＴＡＴ配列を含有するペプチドが、ペネトラチン配列を有するペプチドより優れた効果をもたらすことを示している。
【図１】
0006735676.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006735676.tif 000017
【配列表】
0006735676000001.app