(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧを調製するための方法であって、
ａ）改変されたKistler-Nitschmann 低温エタノール分画プロセスのＢ＋Ｉ工程から沈殿物および上清を回収する工程と、
ｂ）前記工程ａ）で得られた前記沈殿物を均質化し、１７ｖｏｌ％エタノール含有水性酢酸／リン酸緩衝液と、０℃、ｐＨ４．８〜５．３で１〜３時間混合することにより、ＩｇＧを抽出する工程と、その後、
ｃ）残った沈殿物から、抽出されたＩｇＧを含有する前記緩衝液を分離する工程とを含み、
前記沈殿物からＩｇＧを抽出するための方法は、いかなるクロマトグラフィー工程も含まない、方法。
【請求項２】
前記緩衝液に対する前記廃棄沈殿画分の比は、約１：２〜約１：１０である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抽出されたＩｇＧを含有する前記緩衝液は、濾過または遠心分離によって残ったあらゆる沈殿物から分離される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記抽出されたＩｇＧは、前記上清から得られたＩｇＧと組み合わされる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記沈殿物から得られる前記抽出されたＩｇＧは、ＩｇＧ製剤を製造するためにさらに処理が行われる、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＩｇＧ製剤を製造するための前記さらなる処理は、前記緩衝液から前記抽出されたＩｇＧを沈殿させることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記沈殿は、エタノール濃度、温度およびｐＨの１つ以上を調整することによって行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記沈殿により、画分ＩＩが得られる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記得られた沈殿物は、前記Ｂ＋Ｉ上清で得られたＩｇＧに富む画分と組み合わされる、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ｄ）前記工程ｃ）で得られた前記抽出されたＩｇＧを含有する前記緩衝液と、前記工程ａ）で得られた前記改変されたKistler-Nitschmann Ｂ＋Ｉ上清とを組み合わせる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程ｃ）は濾過により行われ、
前記方法は、
ｅ）改変されたKistler-Nitschmann画分ＩＩ沈殿の条件に従って、水性エタノール中で前記抽出されたＩｇＧをインキュベートする工程と、
ｆ）得られたＩｇＧ富化画分ＩＩ沈殿物を回収する工程とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抽出されたＩｇＧ生成物は、８５ｗｔ％以上の単量体および二量体、ならびに１０ｗｔ％以下の重合体および／または凝集体を含む、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記抽出されたＩｇＧ生成物は、純度９０％以上のガンマグロブリンを含む、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を調製するための改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、ヒトに多く存在する抗体アイソタイプである。ＩｇＧは、ウイルス、細菌および菌類等の多様な病原体に結合して、その感染から体を保護する。従って、ＩｇＧは、免疫系が機能する上で重要な役割を果たしている。ヒトには４つのＩｇＧサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４がある。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２は、全てのＩｇＧの９０％近くを占めている、最も一般的な種類のＩｇＧである。参照しやすいように、本明細書では、ＩｇＧに言及する場合、４種類の全てに加えて、これらの任意の組み合わせも含むものとする。「ＩｇＧ」という用語には、さらにＩＶＩＧ（静注用免疫グロブリン）、ＳＣＩＧ（皮下注用免疫グロブリン）およびＩＭＩＧ（筋注用免疫グロブリン）が含まれるものとする。
【０００３】
上記のように、ＩｇＧは、免疫系の機能において重要な役割を果たしている。免疫疾患および自己免疫疾患の患者は、ＩｇＧによる治療の恩恵を受けられることが分かっている。ＩｇＧで治療され得る症状としては、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）および分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）を含む原発性免疫不全症（ＰＩＤ）、ならびに慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫もしくは小児エイズ等の他の疾患またはその後の骨髄移植が原因となる続発性免疫不全症（ＳＩＤ）が挙げられる。他にも治療され得る症状としては、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、川崎病、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、重症筋無力症、慢性炎症性脱髄性多発性神経炎（ＣＩＤＰ）および多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）が挙げられる。また、ＩｇＧは、非常に多くの他のリウマチ疾患、血液疾患および皮膚疾患の治療にも用いられる。
【０００４】
通常、ＩｇＧは、従来の分画法を用いて、プールされたヒト血漿から単離される。ヒトの血液からアルブミンを精製するために、１９４０年代初頭に、Cohnによって低温エタノール分画法が開発された（非特許文献１参照）。これは、「Cohn法６」としても知られている。
【０００５】
この方法は、ｐＨ、エタノール濃度、温度、イオン強度およびタンパク質濃度による所望のタンパク質の溶解度差に基づくものである。Cohn法では、分画の過程を通じて、エタノール濃度は４０％まで増加し、ｐＨは中性から４．８に減少し、温度は室温から−５℃に低下する。処理中に条件が変化するにつれて、異なる血漿タンパク質が順次沈殿するとともに、他のタンパク質はそのまま溶液に留まる。対象となる特定の（複数の）タンパク質によっては、各分画工程で得られた沈殿物および上清の一方または両方をさらに処理してもよい。５つの主なCohn沈殿画分として画分Ｉ〜Ｖがあり、それぞれの画分は、主成分として異なるタンパク質を含んでいる。例えば、アルブミンは画分Ｖから得られるが、ＩｇＧは画分ＩＩ＋ＩＩＩから得ることができる。後に、Cohn画分ＩＩ＋ＩＩＩ（Cohn法６の中間体）を画分ＩＩ（より精製されたＩｇＧ沈殿画分）にさらにサブ分画（sub-fractionation）する方法が開発され、「Oncley法９」と称された（非特許文献２参照）。
【０００６】
Cohn法には、Gerlough法、Hink法およびMulford法等の多くの変形がある。Kistler-Nitschmann法は、Cohn法の周知の別の変形である（非特許文献３参照）。この方法では、Cohn画分ＩＩ＋ＩＩＩ、ＩＩＩおよびＶの代わりに、それぞれ沈殿物Ａ〜Ｃが用いられる。Kistler-Nitschmann法は、Cohn法よりも全体として工程が少ないため、処理が速くなり、エタノールの使用量が削減されるという利点があることから、広く受け入れられている。
【０００７】
他のＩｇＧ精製方法には、イオン交換クロマトグラフィーおよびポリエチレングリコール沈殿により、血漿またはCohn法６の血漿中間体ＩＩ＋ＩＩＩからＩｇＧを直接単離するものがある。この処理による収量は比較的高いとされる。これらの方法のいくつかは、純度、とりわけ肝炎およびＨＩＶ等の血液感染性ウイルスの伝染が懸念される中で中止されている。しかし、特定のウイルス不活性化工程が導入されると、近年、クロマトグラフィー処理にかなりの投資が行われるようになった。とはいえ、その複雑さ、高い資本コストおよび高度な水／廃棄物処理の必要性のため、このような選択肢は、最大で最も資金力のある血漿分画業者にほとんど限定されている。
【０００８】
Cohn法（およびその変形）により、実質的に単量体ＩｇＧが生成される。これは、ＩｇＧ生成物（IgG product）の大部分は単量体であり、二量体およびより大きな凝集体の形を取るＩｇＧは２０％に満たないことを意味している。一般に、ＩｇＧ凝集体の存在は、患者における血漿由来ＩｇＧの投与による不要な免疫応答と関連付けられているので、望ましくない。従って、あらゆる精製方法で得られたＩｇＧ生成物は、できるだけ多くの単量体を含むことが好ましい。
【０００９】
１９９８年から２００６年の間に、ＩｇＧの需要は２倍以上になり、なお増加し続けている。２００８年には、血漿画分の世界市場は１２０億ＵＳドルと見積もられたが、その半分近くがＩｇＧであった。現在、供給は、ヒトドナーから採取された血漿からでなければならない。血漿の供給には限界があるため、当該技術において、収量を向上させたＩｇＧの単離方法を改良する必要がある。しかし、全ての臨床応用にとって重要なのは、例えば、他のプロテアーゼもしくは凝固因子の存在、または血液感染性ウイルス等の他の汚染成分に起因する望ましくない副作用を最小限にするために、高純度のＩｇＧを得ることである。
【００１０】
非特許文献４および非特許文献５には、市販ＩｇＧ製剤の様々な調製方法が記載されている。使用許可されたＩｇＧ生成物のほとんどは、低温エタノール分画（すなわち、Cohn／Oncley法またはその変形）によって生成され、次にイオン交換クロマトグラフィーによって精製される。イオン交換クロマトグラフィーの出発原料として、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ（または、画分Ｉにおいてフィブリノゲンが先に沈殿する場合は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ）を用いることにより、ＩｇＧ損失が最小限に抑えられる。なぜなら、ＩｇＧの主な損失は、Cohn／Oncley（Kistler-Nitschmann）分画法における、この後の画分ＩＩＩ（沈殿物Ｂ）段階で生じるからである。
【００１１】
どんなタンパク質精製スキームでも、本質的なことは、不要なタンパク質および当該処理に不必要とみなされたその他の不要な物質から標的タンパク質を分離することである。このような他の物質には、目的とする生成物にとって望ましくない有害物質または病原物質を含む他の化学的部分が含まれている場合がある。従って、タンパク質精製方法により、一般に、対象となる（複数の）タンパク質と、いわゆる「廃棄物」画分または「副」画分とを含む「生成物画分」が得られる。しかし、そうした否定的な分類は、誤解を招きかねない。このいわゆる「廃棄物画分」にも、他のタンパク質または成分物質の原料としての価値が存在し得るからである。
【００１２】
血漿タンパク質の分野において、この誤解を招くような呼び方の証拠は特許文献１に見出される。特許文献１には、アフィニティークロマトグラフィーによる特定の免疫グロブリンの精製のための供給材料として、「廃棄物画分」を用いることが記載されている。同様に、特許文献２には、勾配電気泳動による免疫グロブリンの精製のための供給材料として、廃棄物画分を用いることが記載されている。特許文献３には、IｇＧ分画から廃棄された画分に存在する凝集免疫グロブリンを精製するための、IｇＧ分画から廃棄された画分の使用が記載されている。
【００１３】
特許文献４には、Ｃ型肝炎病原体のマーカーによる汚染のため「廃棄物」として除かれた(rejected)血漿献血に適用される通常の血漿分画法が説明されており、これによって「廃棄物画分」という用語の別の使い方が示されている。
【００１４】
Cohn／Oncley法およびその変形（以下、主要な処理の流れ（main process stream）とする）におけるＩｇＧ収量は、血漿中の総ＩｇＧ量よりも少ないという未解決の問題が残されている。これは、製造工程でのタンパク質の何らかの変性を反映しているのかもしれない。それに加えて、またはそうでなければ、残留する少量の高品質の免疫グロブリン（すなわち、凝集がなく、主として単量体ＩｇＧである）が、多量体および凝集ＩｇＧ等の他の成分も含む「廃棄物」画分の分離および除去に伴い、それらに捕捉されることで主要な製造分画経路から外れている可能性がある。これにより、不足している血漿出発原料から有用な免疫グロブリンが効率的に回収されなくなり、その結果、患者のための治療薬の利用可能性に影響を与えることになる。
【００１５】
本願において、「廃棄物画分」とは、所望の「主要な生成物画分」から分離された画分として規定される。通常、生成物画分は、所望の標的タンパク質を高純度で含んでいる。いわゆる廃棄物画分には、標的タンパク質の品質、効果または安全性を損なう恐れのある他の成分も存在するとはいえ、いくつかの標的タンパク質が含まれている。実際に、廃棄物画分は、標的タンパク質以外のタンパク質源としての価値があると考えられる。本願における標的タンパク質は、免疫グロブリンＩｇＧである。
【００１６】
従って、ＩｇＧを抽出する血漿の精製において、主要な処理の流れは、ＩｇＧ生成物に至るものである。主要な処理がCohn分画法である場合、主要な生成物画分(product fraction)はCohn画分ＩＩである。ＩｇＧを生成するCohn分画法では、上清Ａ＋Ｉは、さほど多くのＩｇＧを含まないため、「廃棄物」とみなされていた。しかし、図１に示されているように、このような廃棄物でも、さらに精製すれば他の標的タンパク質を生成することができる。例えば、上清Ａ＋Ｉをさらに処理すると、アルブミンを含有するCohn画分Ｖを生成することができる。従って、血漿分画プロセスの対象となる主要なタンパク質がアルブミン以外の場合のみ、上清Ａ＋Ｉは「廃棄物画分」となるのである。
【００１７】
Cohn／Oncley法（およびその変形）によって生成される廃棄物画分は、かなりの量のＩｇＧを含み得ることが判明している。また、廃棄物画分には、出発血漿中の総ＩｇＧ量のうち３０％ものＩｇＧが含まれる可能性があることも示されている。
【００１８】
ゆえに、複雑で費用のかかるクロマトグラフィー工程をさらに必要とせずに、現在利用可能な方法よりも収量が高く、同時に高レベルの純度および安全性を維持することができるＩｇＧを生成するための改良された方法を提供することは有用であるといえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】オーストラリア特許第７１５４２７号
【特許文献２】特開昭６０−１１３４号公報
【特許文献３】国際公開第２０１０／１３２６８６号
【特許文献４】ウクライナ実用新案第４５５５７号公報
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Cohn, E. J. et al., J. Am. Chem. Soc., 68: 459-475, (1946)
【非特許文献２】Oncley, J. L. et al., J. Am. Chem. Soc., 71, 541-550, (1949)
【非特許文献３】P. Kistler and Hs. Nitschmann, Vox Sang. 7: 414-424 (1962)
【非特許文献４】J. A. Hooper, Immunol. Allergy Clin. N. Am. 28 (2008) 765-778
【非特許文献５】Andrea Buchacher and Waltrud Kaar, Chapter 13 of Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use (John Wiley & Sons, Inc., 2013, Editors Joseph Bertolini, Neil Goss and John Curling)
【発明の概要】
【００２１】
今回、驚くべきことに、ＩｇＧを生成する血漿分画法において、従来は「廃棄物」画分とみなされていた沈殿画分から、クロマトグラフィー工程、特にアフィニティークロマトグラフィー工程または陰イオン交換クロマトグラフィー工程を必要とせずに、高純度のＩｇＧ（例えば、８５ｗｔ％以上の単量体および二量体、ならびに１０ｗｔ％以下の重合体および／または凝集体を含有する正常免疫グロブリンについての欧州薬局方モノグラフ０３３８に準拠している）が比較的容易に得ることができた。このような廃棄物画分からＩｇＧを抽出することにより、その後のさらなる精製工程を必要とすることなく、ＩｇＧの総収量を著しく向上することができる。
【００２２】
従って、本発明は、ＩｇＧ供給源として、血漿分画中において生成された廃棄沈殿画分の使用を提供する。廃棄沈殿画分は、ＩｇＧを含有する液体画分（上清）を生成する分画工程中に生成されることが好ましい。
【００２３】
より具体的には、本発明は、血漿分画中において生成され、主要なＩｇＧ製造プロセスの流れから分離された廃棄沈殿画分からＩｇＧを抽出する方法であって、前記廃棄沈殿物と適切な溶媒とを接触させることにより、前記廃棄沈殿物からＩｇＧを抽出することを含む方法を提供する。廃棄沈殿画分は、ＩｇＧを含有する液体画分（上清）を生成する分画工程中に生成されることが好ましい。特に、本発明の方法は、血漿分画中において生成された廃棄沈殿画分からＩｇＧを分離するために、アフィニティークロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー工程も、電気泳動等の電気的処理も必要としない。
【００２４】
別の態様において、本発明は、ＩｇＧを生成するための血漿分画中におけるＩｇＧの収量を向上させる方法であって、血漿分画中において生成され、主要なＩｇＧ製造プロセスの流れから分離された廃棄沈殿画分から、適切な溶媒を用いて、ＩｇＧを抽出することを含む方法を提供する。廃棄沈殿画分は、ＩｇＧを含有する液体画分（上清）を生成する分画工程中に生成されることが好ましい。
【００２５】
別の態様において、本発明は、血漿または血漿画分からＩｇＧを分離する方法であって、
ａ）前記血漿または血漿画分に存在するＩｇＧの大部分を含有する液体画分と、さらなるＩｇＧを含有する廃棄沈殿画分とを生成するために、前記血漿または血漿画分を分画する工程と、
ｂ）前記廃棄沈殿画分から、適切な溶媒を用いて、前記さらなるＩｇＧの少なくとも一部を抽出する工程とを含む方法を提供する。
【００２６】
好ましい態様において、本発明は、ＩｇＧの調製方法であって、
ａ）改変されたKistler-Nitschmann Ｂ＋Ｉ分画プロセスから沈殿物および上清を回収する工程と、
ｂ）前記工程ａ）で得られた前記沈殿物を均質化し、１７ｖｏｌ％エタノール含有水性酢酸／リン酸緩衝液と０℃で１〜３時間混合することにより、前記沈殿物からＩｇＧを抽出する工程と、その後、
ｃ）あらゆる残った沈殿物（any remaining precipate）から、抽出されたＩｇＧを含有する前記緩衝液を分離する工程とを含む方法を提供する。
【００２７】
より好ましくは、本発明の方法は、前記工程ｃ）で得られた前記抽出されたＩｇＧを含有する前記緩衝液と、前記工程ａ）で得られた前記改変されたKistler-Nitschmann Ｂ＋Ｉ上清とを組み合わせる工程をさらに含む。あるいは、本発明の方法において、前記工程ｃ）は濾過により行われるものであり、本発明の方法は、Kistler-Nitschmann画分ＩＩ沈殿の条件に従って、水性エタノール中で前記抽出されたＩｇＧをインキュベートする工程と、得られたＩｇＧ富化画分ＩＩ沈殿物を回収する工程とをさらに含む。
【００２８】
本発明の全ての態様において、廃棄沈殿画分は、Cohn画分ＩＩＩと実質的に同等であることが好ましい。より好ましくは、廃棄沈殿画分は、Cohn画分ＩＩＩもしくはＩ＋ＩＩＩ、Kistler-Nitschmann沈殿物ＢもしくはＢ＋Ｉ、または改変されたKistler-Nitschmann沈殿物ＢもしくはＢ＋Ｉである。
【００２９】
本発明の全ての態様において、液体画分は、Cohn上清ＩＩＩと実質的に同等であることが好ましい。より好ましくは、液体画分は、Cohn上清ＩＩＩもしくはＩ＋ＩＩＩ、Kistler-Nitschmann 上清ＢもしくはＢ＋Ｉ、または改変されたKistler-Nitschmann 上清ＢもしくはＢ＋Ｉである。最も好ましくは、液体画分は、主流のCohn上清ＩＩＩもしくはＩ＋ＩＩＩまたは改変されたKistler-Nitschmann 上清ＢもしくはＢ＋Ｉに再投入されて、ＩｇＧの下流処理に進むことができる。また、液体画分は、別のサブ画分として処理を進めて、画分ＩＩにおいて主流処理に再投入されてもよく、またはそれに続く適切な段階でのさらなる下流処理の後に再投入されてもよい。あるいは、液体画分は、精製ヒトＩｇＧ生成物に至るまで、完全に独立して処理することもできる。
【００３０】
本明細書では、改変されたKistler-Nitschmann法に言及する場合、いずれもロバーツら（Roberts et. al., Biologicals, Vol. 43(2), March 2015, p123-129）に記載されたような方法を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ヒトＩｇＧおよびアルブミンの製造に用いることができる、改変されたKistler-Nitschmann低温エタノール分画プロセスの模式図である。
【図２】図２は、本発明の方法を、改変されたKistler-Nitschmann低温エタノール分画プロセスにどのように組み込むことができるかを示す模式図である。
【図３】図３は、ＩｇＧを生成するための改変されたKistler-Nitschmann低温エタノール分画プロセスを示す模式図である。
【図４】図４は、図３の改変されたKistler-Nitschmann低温エタノール分画法を示す模式図であって、本発明の付加的な画分Ｂ＋Ｉ洗浄工程が、さらに回収されたＩｇＧを処理の流れに再投入する別の段階とともに、組み込まれている。
【図５】図５は、Cohn／Oncley分画法を示す模式図であって、本発明の付加的な画分ＩＩＩ／Ｉ＋ＩＩＩ洗浄工程が、さらに回収されたＩｇＧを処理の流れに再投入する別の段階とともに、組み込まれている。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下の説明において、「液体画分」および「上清」は同義語であり、「沈殿物」および「画分」も同義語である。
【００３３】
本明細書に記載されている方法で得られたＩｇＧ生成物（IgG product）は、純度が高く、最小限の凝集ＩｇＧしか含まないため、欧州薬局方モノグラフ０３３８（２０１５年１月）に示された最低基準を満たしている。従って、本明細書に記載されている方法で直接得られたＩｇＧ生成物は、少なくとも９０％のガンマグロブリンを含む（電気泳動によって測定）。また、上記方法で得られた生成物は、少なくとも８５ｗｔ％の単量体および二量体のＩｇＧ、ならびに１０ｗｔ％未満の重合体および凝集体のＩｇＧを含む（サイズ排除クロマトグラフィーによって測定）。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、凝集体の含有量を分析してもよい。これは、本明細書に記載されている分画プロセスで得られた生成物が欧州薬局方基準を満たすのに十分な純度および品質を有することから、製剤を作成するためのさらなる精製を必ずしも必要としないことを意味する。勿論、本明細書に記載されている分画プロセスで得られたＩｇＧは、より品質の高いＩｇＧ生成物を得るために、または他の製薬用途等のための異なる製品プロファイルを得るために、適切な手段によってさらに処理されてもよい。このようなさらなる処理方法は、当業者に公知であり、特に１つ以上のウイルス不活性化工程を含む場合がある。
【００３４】
低温エタノール分画は、血漿からＩｇＧを単離するために最も広く用いられている方法の一つである。通常、複数のドナーから集めたプール血漿から、クリオプレシピテーションにより、クリオプレシピテートとして第ＶＩＩＩ因子等の凝固因子を取り出す。次に、１つ以上の低温エタノール分画工程でクリオプレシピテートの上清を処理することで、主としてＩｇＧを含有する沈殿画分が最終的に生成される。代表的なCohn／Oncley法およびKistler-Nitschmann法では、このＩｇＧ富化画分は、画分ＩＩまたは沈殿物ＩＩと呼ばれる。その後、上記沈殿物は、さらに精製工程およびウイルス不活性化工程を経て、静注用、皮下注用または筋注用の製薬上許容されるＩｇＧ最終生成物が得られる。
【００３５】
本明細書に記載されている低温エタノール分画法では、「正常血漿」、「高度免疫血漿」（高度免疫抗Ｄ血漿、抗破傷風血漿または抗Ｂ型肝炎血漿等）またはこれらと同等の血漿を用いることができる。
【００３６】
Cohn分画法において、第１の分画工程により、主としてフィブリノゲンおよびフィブロネクチンを含有する画分Ｉが生成される。この工程で得られる上清をさらに処理して、画分ＩＩ＋ＩＩＩを沈殿させ、その後、画分ＩＩＩおよび画分ＩＩを沈殿させる。一般に、画分ＩＩ＋ＩＩＩは、フィブリノゲン、ＩｇＭおよびＩｇＡ等の不純物とともに、約６０％のＩｇＧを含有する。次に、これらの不純物のほとんどは、廃棄物画分とみなされて通常は処分される画分ＩＩＩで取り除かれる。その後、上清を処理することにより、主要なＩｇＧ含有画分である画分ＩＩを沈殿させる。画分ＩＩは、９０％を超えるＩｇＧを含有し得る。上記パーセント値は、ＩｇＧの純度をパーセントで表したものである。純度は、ゲル電気泳動等の当該技術において公知の任意の方法によって測定することができる。
【００３７】
Kistler-Nitschmann法において、画分ＩはCohn法の画分Ｉと同等である。次の沈殿物／画分は、沈殿物Ａ（画分Ａ）と呼ばれる。この沈殿物は、Cohn画分ＩＩ＋ＩＩＩと概ね同等だが、同一ではない。次に、沈殿物を再溶解し、条件を調整して、Cohn画分ＩＩＩと同等である沈殿物Ｂ（画分Ｂ）を沈殿させる。この場合も、沈殿物Ｂは廃棄物画分とみなされて通常は処分される。その後、沈殿物Ｂの上清をさらに処理することにより、Cohn画分ＩＩに相当する沈殿物ＩＩが生成される。
【００３８】
図１に示されているKistler-Nitschmann法の改変では、最初の２つの分画工程を組み合わせて、画分Ｉを回収せずに、第１の沈殿物（Ａ＋Ｉと称される）がフィブリノゲンおよびフィブロネクチンを含むようにすることができる。この沈殿物を再懸濁して、さらなる沈殿工程を経ると、形成された沈殿物（Ｂ＋Ｉと称されることがある）は、フィブリノゲンおよびフィブロネクチンに加えて、ＩｇＭおよびＩｇＡ等の他の不純物を含む。次に、この沈殿工程で得られる上清をさらに処理して、ＩｇＧ富化画分である画分ＩＩが生成される。この処理における沈殿物Ｂ＋Ｉも、ＩｇＧ処理の流れを考慮すると、廃棄物画分とみなされる。
【００３９】
原則として、本発明の方法は、画分ＩＩの生成に先立ち、低温エタノール分画中において生成された沈殿画分、すなわち、Cohn画分ＩＩＩおよびＩ＋ＩＩＩ、ならびにKistler-Nitschmann沈殿物ＢもしくはＢ＋Ｉのいずれかに適用してもよい。本発明の方法は、分画法において、通常は廃棄物画分とみなされる、画分ＩＩの直前の沈殿画分に適用されることが好ましい。また、廃棄沈殿画分は、Cohn画分ＩＩＩもしくはＩ＋ＩＩＩ、Kistler-Nitschmann沈殿物ＢもしくはＢ＋Ｉ、改変されたKistler-Nitschmann沈殿物ＢもしくはＢ＋Ｉ、またはこれらと実質的に同等の画分であることが好ましい。
【００４０】
上記廃棄沈殿画分は、出発血漿プールからのかなりの量のＩｇＧ、場合によっては２５〜３０％ものＩｇＧを含有し得ることが判明している。これは、一つには、沈殿画分中に捕集されている上清によるものであり、また、一つには、ＩｇＧとＩｇＭおよびＩｇＡ等の不純物との共沈によるものであると仮定される。
【００４１】
驚くべきことに、廃棄物画分に簡単な洗浄（抽出）処理を施すことにより、比較的純粋な形（pure form）で、商業的にかなりの割合の「失われた」ＩｇＧを回収できることが判明した。この結果は予期せぬものである。なぜなら、当業者ならば、沈殿物に含まれる比較的高いレベルの他のタンパク質を考慮すると、廃棄沈殿物からのＩｇＧの抽出は困難であり、抽出できたとしても（例えば、凝集および他の不要なタンパク質種またはタンパク質分解活性の観点から）ＩｇＧの純度が低いことを予想したからである。
【００４２】
重要なことは、本発明の方法は、廃棄物画分からさらなるＩｇＧを抽出するために、クロマトグラフィー工程を何も必要としないことである。従って、本発明の方法によれば、クロマトグラフィーを用いなくても、廃棄物画分から比較的純粋なＩｇＧ生成物が得られる。
【００４３】
洗浄処理用の適切な溶媒を選択することにより、ＩｇＧの精製に関する限り、不純物とみなされている沈殿物中のいかなるその他のタンパク質を大量に抽出せずに、廃棄沈殿物からＩｇＧを抽出できることが判明している。従って、沈殿物から不要な不純物を同時に取り除くのではなく、ＩｇＧの分離のために特別に用いられるような溶媒を選択すべきである。
【００４４】
廃棄沈殿画分は、生成された直後に洗浄処理を施すことができる。あるいは、廃棄物画分は、後の処理のために冷凍状態で保管されてもよい。洗浄する前に、沈殿物は、必要に応じて、洗浄処理が行われる温度に平衡させるべきである。一般に、このような平衡化は静的なもの、すなわち、沈殿物の攪拌を伴わないものである。
【００４５】
洗浄処理に用いられる溶媒の種類および量は、回収されるＩｇＧの純度を過度に損なわずに、ＩｇＧの回収が最大化されるように選択しなければならない。廃棄沈殿物からの不純物の抽出を最小限に抑えながらＩｇＧの回収を最適化するには、洗浄／抽出に用いられる溶媒は、当該廃棄沈殿物が得られた分画工程で用いられた溶媒と同一であることが好ましい。
【００４６】
廃棄物画分が（改変された）Kistler-Nitschmann沈殿物ＢもしくはＢ＋Ｉ、またはCohn画分ＩＩＩもしくはＩ＋ＩＩＩである場合、好適な溶媒は、エタノール水溶液である。より好ましくは、このようなエタノール溶液は緩衝化されている。沈殿物から抽出されたＩｇＧが溶液中に留まるように、エタノール濃度、温度およびｐＨを制御する必要がある。
【００４７】
好ましいエタノールの濃度は約１０ｖｏｌ％〜約２０ｖｏｌ％の範囲である。より好ましくは約１１ｖｏｌ％〜約１９ｖｏｌ％の濃度範囲であり、さらにより好ましくは約１２ｖｏｌ％〜約１９ｖｏｌ％の濃度範囲であり、最も好ましくは約１３ｖｏｌ％〜約１７ｖｏｌ％の濃度範囲である。濃度は、約１３ｖｏｌ％および約１７ｖｏｌ％が最も好ましい。「約１３ｖｏｌ％」とは、好ましくは１３±２ｖｏｌ％であり、「約１７ｖｏｌ％」とは、好ましくは１７±２ｖｏｌ％である。
【００４８】
洗浄処理が行われる温度も、回収されるＩｇＧの量および純度に影響を及ぼす。理想的には、洗浄処理の間の温度は、当該廃棄沈殿物が得られた分画工程で用いられた温度と同じ温度で維持される。従って、最適な温度範囲は、当該の画分および分画プロセスによって決まる。一般に、好ましい温度は約−３℃〜約−８℃の範囲であり、約−３℃〜約−７℃の範囲を含む。例えば、廃棄物画分が（改変された）Kistler-Nitschmann沈殿物ＢもしくはＢ＋Ｉである場合、洗浄抽出の間の温度は−５℃±２．０℃が好ましい。廃棄物画分がCohn画分ＩＩＩもしくはＩ＋ＩＩＩである場合、通常、好ましい温度はわずかに低くなり、−６℃±２．０℃が好ましい。
【００４９】
一般に、好ましい温度は約＋３℃〜約−８℃の範囲であり、約−３℃〜約−７℃の範囲を含む。例えば、廃棄物画分が改変されたKistler-Nitschmann沈殿物ＢもしくはＢ＋Ｉである場合、洗浄抽出の間の温度は−２℃±５℃が好ましい。廃棄物画分がCohn画分ＩＩＩもしくはＩ＋ＩＩＩである場合、通常、好ましい温度はわずかに低くなり、−３℃±５．０℃が好ましい。
【００５０】
最適なｐＨ範囲も、画分によって決まる。一般に、好ましいｐＨは約４．８〜約５．３の範囲であり、より好ましくは約５．１〜約５．３の範囲である。例えば、廃棄物画分が（改変された）Kistler-Nitschmann沈殿物ＢもしくはＢ＋Ｉである場合、ｐＨ範囲は５．１±０．０５が好ましい。廃棄物画分がCohn画分ＩＩＩもしくはＩ＋ＩＩＩである場合、ｐＨはわずかに高くなってもよく、５．２±０．０５が好ましい。
【００５１】
特に好ましい実施形態において、廃棄物画分が（改変された）Kistler-Nitschmann沈殿物ＢもしくはＢ＋Ｉである場合、溶媒は１７±２ｖｏｌ％の水性エタノールであり、温度は−５℃±２．０℃であり、ｐＨ範囲は５．１±０．０５である。
【００５２】
特に好ましい実施形態において、廃棄物画分が（改変された）Kistler-Nitschmann沈殿物ＢもしくはＢ＋Ｉである場合、溶媒は１７±２ｖｏｌ％の水性エタノールであり、温度は−２℃±５℃であり、ｐＨ範囲は５．１±０．０５である。
【００５３】
別の特に好ましい実施形態において、廃棄物画分がCohn画分ＩＩＩもしくはＩ＋ＩＩＩである場合、溶媒は１７±２ｖｏｌ％の水性エタノールであり、温度は−６℃±２．０℃であり、ｐＨ範囲は５．２±０．０５である。
【００５４】
別の特に好ましい実施形態において、廃棄物画分がCohn画分ＩＩＩもしくはＩ＋ＩＩＩである場合、溶媒は１７±２ｖｏｌ％の水性エタノールであり、温度は−３℃±５℃であり、ｐＨ範囲は５．２±０．０５である。
【００５５】
別の特に好ましい実施形態において、廃棄物画分が高度免疫血漿またはそれと同等の血漿から調製された、（改変された）Kistler-Nitschmann沈殿物ＢもしくはＢ＋Ｉである場合、溶媒は１３±２ｖｏｌ％の水性エタノールであり、温度は−５℃±２．０℃であり、ｐＨ範囲は５．１±０．０５である。
【００５６】
別の特に好ましい実施形態において、廃棄物画分が高度免疫血漿またはそれと同等の血漿から調製された、（改変された）Kistler-Nitschmann沈殿物ＢもしくはＢ＋Ｉである場合、溶媒は１３±２ｖｏｌ％の水性エタノールであり、温度は−２℃±５℃であり、ｐＨ範囲は５．１±０．０５である。
【００５７】
別の特に好ましい実施形態において、廃棄物画分が高度免疫血漿またはそれと同等の血漿から調製されたCohn画分ＩＩＩもしくはＩ＋ＩＩＩである場合、溶媒は１３±２ｖｏｌ％の水性エタノールであり、温度は−６℃±２．０℃であり、ｐＨ範囲は５．２±０．０５である。
【００５８】
別の特に好ましい実施形態において、廃棄物画分が高度免疫血漿またはそれと同等の血漿から調製されたCohn画分ＩＩＩもしくはＩ＋ＩＩＩである場合、溶媒は１３±２ｖｏｌ％の水性エタノールであり、温度は−３℃±５℃であり、ｐＨ範囲は５．２±０．０５である。
【００５９】
リン酸および酢酸を含む、公知の緩衝液を用いて溶媒を緩衝化してもよい。
【００６０】
一般に、洗浄工程には、溶媒中の廃棄物画分の懸濁が含まれる。懸濁液は、理想的には、均質になるまで混合した後、十分な時間放置してＩｇＧを溶媒中に抽出させる。これは、図２、図４および図５に示されている「抽出」工程および「順化（condition）」工程に該当する。この懸濁／順化／抽出工程の制限時間に具体的な上限値はない。実際には、工程にかかる時間は、処理効率等の外的要因によって制限される。このため、抽出時間は１時間〜２４時間が好ましく、例えば、約２時間〜約１０時間である。また、約２時間（例えば、９０〜１５０分）も適している。
【００６１】
好ましい態様において、本発明は、ＩｇＧの調製方法であって、
ａ）改変されたKistler-Nitschmann Ｂ＋Ｉ分画プロセスから沈殿物および上清を回収する工程と、
ｂ）前記工程ａ）で得られた前記沈殿物を均質化し、１７ｖｏｌ％水性エタノール含有酢酸／リン酸緩衝液と０℃で１〜３時間混合することにより、前記沈殿物からＩｇＧを抽出する工程と、その後、
ｃ）あらゆる残った沈殿物から、抽出されたＩｇＧを含有する前記緩衝液を分離する工程とを含む方法を提供する。
【００６２】
より好ましくは、本発明の方法は、前記工程ｃ）で得られた前記抽出されたＩｇＧを含有する前記緩衝液と、前記工程ａ）で得られた前記改変されたKistler-Nitschmann Ｂ＋Ｉ上清とを組み合わせる工程をさらに含む。あるいは、本発明の方法において、前記工程ｃ）は濾過により行われるものであり、本発明の方法は、改変されたKistler-Nitschmann画分ＩＩ沈殿の条件に従って、水性エタノール中で前記抽出されたＩｇＧをインキュベートする工程と、得られたＩｇＧ富化画分ＩＩ沈殿物を回収する工程とをさらに含む。
【００６３】
洗浄／抽出工程で生成されたＩｇＧを多く含む溶液は、設定されたＩｇＧ標的タンパク質製造の流れから、廃棄物画分が沈殿および／または分離されたときに生成される主要なＩｇＧ含有上清と、ＩｇＧの純度が同じか、または類似していることが好ましい。
【００６４】
ＩｇＧの商業的および治療的価値を考慮すると、出発血漿からのＩｇＧの収量を向上させるのならば、どのようなことでも潜在的重要性が認められる。ゆえに、廃棄物画分からのＩｇＧの回収率（％）が比較的低くても、極めて有用となり得るのである。
【００６５】
生成されたＩｇＧを多く含む溶液は、当該技術において公知の標準的な方法で回収されてもよく、例えば、遠心分離または濾過によって残りの沈殿物から分離されてもよい。遠心分離の場合、上清にＩｇＧが多く含まれることになる（すなわち、抽出されたＩｇＧが含まれることになる）ため、沈殿物は、廃棄されてもよく、本発明によって再処理されてＩｇＧをさらに抽出してもよく、および／または他のタンパク質の抽出に用いられてもよい。濾過の場合、濾液にＩｇＧが多く含まれることになるため、得られた濾過ケーキは、廃棄されてもよく、混入した残留ＩｇＧを回収するためにさらに洗浄されてもよく、本発明によって再処理されてＩｇＧをさらに抽出してもよく、および／または他のタンパク質の抽出に用いられてもよい。好適な濾過材は、当該技術において公知である。濾過を促進するために、キースラガー等のケイ酸塩濾過助剤（例えば、セライト（Celite）（登録商標）またはセルピュア（Celpure）（登録商標））を添加してもよい。
【００６６】
洗浄処理において、溶媒の量は任意に設定できる場合もあるが、理想的には、利用可能な処理装置に合わせて最適化すべきである。溶媒の量が非常に少ないと、得られる懸濁液の粘性が高すぎて、容易に処理できない可能性がある。一方、溶媒の量が非常に多いと、処理が非効率になる恐れがある。従って、処理効率の理由から、一般に、溶媒の量は比較的少なく抑えることが好ましい。例えば、溶媒に対する廃棄物画分の重量は、通常、約１：２〜約１：１０の範囲になる。好ましくは、溶媒の重量は、廃棄物画分の重量のほぼ４倍、すなわち、廃棄物画分と溶媒との重量比は約１：４であればよい。
【００６７】
本発明の処理を用いて生成されたＩｇＧを多く含む溶液は、当該技術において公知の方法でさらに処理されることにより、米国および欧州の両方の薬局方基準に沿った、製薬上許容されるＩｇＧ生成物を得ることができる。好ましくは、標準条件を用いて、溶液から画分ＩＩを沈殿させた後、これをさらに精製して、静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）または皮下注用免疫グロブリン（ＳＣＩＧ）等の製剤を得る。
【００６８】
さらなる精製は、IＶＩＧまたはＳＣＩＧのウイルス安全性を確保するための適切な工程と組み合わせた陰イオンおよび／または陽イオン交換クロマトグラフィーの形をとってもよい（Roberts et. al., Biologicals, Vol. 43(2), March 2015, p123-129参照）。
【００６９】
廃棄物画分から抽出されたＩｇＧを多く含む溶液は、同じ廃棄物画分の他の溶媒抽出および／または他のバッチからの廃棄物画分の溶媒抽出と組み合わせて、別途処理することもできる。しかし、一般に、これらの溶液と、主要な標的タンパク質の下流処理におけるバルクＩｇＧプロセス中間体（bulk IgG process intermediate）とを組み合わせる方がより効率的である。例えば、「廃棄物画分」の溶媒抽出によるＩｇＧと、当該廃棄沈殿物を形成した分画工程で得られるＩｇＧに富む上清とを組み合わせてもよい。これは、同じ分画のバッチからの上清でも、異なるバッチからの上清でもよい。
【００７０】
あるいは、廃棄物画分から抽出されたＩｇＧは、下流処理段階でバルクＩｇＧ中間体と組み合わされる前に、主要なＩｇＧプロセスにおけるのと同じような１つ以上の下流製造工程を経てもよい。例えば、沈殿物Ｂ＋Ｉから洗浄／抽出によって生成されたＩｇＧを多く含む溶液と上清Ｂ＋Ｉとを組み合わせた後、これをさらに処理して最終生成物としてもよい。あるいは、沈殿物Ｂ＋Ｉから洗浄／抽出によって生成されたＩｇＧを多く含む溶液は、上清Ｂ＋Ｉから処理された主要なＩｇＧ画分ＩＩ中間体と組み合わされて、最終生成物に処理される前に、画分ＩＩを沈殿させるエタノール沈殿等の下流処理工程で処理されてもよい。製造装置および関連する物流の利用可能な規模次第では、いずれの選択肢も好ましい。抽出に使用される最適な溶媒は、対象とする次の（複数の）処理工程によって幾分異なることもある。
【００７１】
図４および図５には、抽出されたＩｇＧが主要なIｇＧ処理の流れに再び合流する際の様々な他の合流点が示されている。
【００７２】
本発明の好ましい特徴は、いかなる方法で組み合わせてもよい。従って、本明細書では、明確にするために、別々の実施形態の中で説明されている特徴があるが、それらはどのように組み合わせてもよい。逆に、簡潔にするために、単一の好ましい特徴という文脈で説明されている様々な特徴があるが、それらは単独でも、部分的に組み合わせて示されてもよい。さらに、範囲のある数値を参照する場合、その範囲内のあらゆる数値が含まれる。
【００７３】
上記概要に記載された作用の全てが必要とは限らず、特定の作用の一部が必要でない場合もあれば、記載された作用に加えて、１つ以上のさらなる作用が行われる場合もある。また、作用が記載された順序は、必ずしもそれらが行われる順序ではない。
【００７４】
（実施例）
以下の限定されない実施例により、本発明をさらに説明する。
【００７５】
以下の実施例／表において、濁度分析プラットフォームである「ＳｐａＰｌｕｓ」自動分析器（バインディング・サイト（Binding Site）社、バーミンガム、英国）を用いて、タンパク質含有量について沈殿物および上清を分析した。アッセイプロ（AssayPro）ＥＬＩＳＡキット（供給元：ユニバーサル・バイオロジカルズ（Universal Biologicals）社、ケンブリッジ、英国）を用いて、凝固第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子および第ＸＩＩ因子を分析した。また、ハイフン・バイオフェン（Hyphen BioPhen）色素分析キット（供給元：クアドラテック・ダイアグノスティックス（Quadratech Diagnostics）社、エプソム、英国）を用いて、第ＸＩａ因子を測定した。
【００７６】
下記表１に、Kistler-Nitschmann低温エタノール分画で生成された廃棄物画分（Cohn／Oncley画分ＩＩＩと同等）である、Ｂ＋Ｉ沈殿物の典型的な組成を示す。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
以下に記載される実験の出発原料は、表１に示されている組成と同様の組成を有するＩｇＧ含有沈殿物Ｂ＋Ｉとした。
【００７９】
以下の実施例において、１７ｖｏｌ％エタノール水性緩衝液は、以下のように作成される。
リン酸水素二ナトリウム水和物７．１ｍＭ（１．２７ｇ／Ｌ）
氷酢酸１２．８ｍＭ（０．７７ｇ／Ｌ）
１７ｖｏｌ％エタノール含有リン酸／酢酸緩衝液：９６％エタノール１４１．６ｇをリン酸／酢酸緩衝液８５８．４ｇに添加する（最終ｐＨは〜５．０−５．１）
【００８０】
（実施例１）
第１の実験において、ホモジナイザーを用いて、ｐＨ４．８〜５．２、約−３℃〜−７℃の温度範囲で、１７ｖｏｌ％エタノール水性緩衝液１０００ｇに、沈殿物Ｂ＋Ｉ９７ｇを迅速に再懸濁させた。これにより、緩衝液に対する沈殿物の比は１：１０であった。緩衝液は、適切なｐＨに調整されたリン酸塩および酢酸塩を含有する１７ｖｏｌ％エタノール水溶液（「エタノール緩衝液」）からなる。
【００８１】
第２の実験において、上記と同じ方法により、約−３℃〜−７℃の温度範囲で、１７ｖｏｌ％エタノール含有水溶液（すなわち、エタノール非緩衝液）１０００ｇに、同じ沈殿物Ｂ＋Ｉ９９ｇを再懸濁させた。次に、どちらの再懸濁液も適度な撹拌によって連続的に混合することで、一定の条件下で、２４時間にわたって沈殿物を順化（熟成）した。緩衝再懸濁液および非緩衝再懸濁液の試料をそれぞれ遠心分離して、ＩｇＧ富化液を回収した。また、ＩｇＧおよび対象となる他のいくつかのタンパク質の存在を確かめるために、予め遠心分離した懸濁液およびその上清を分析した（表２）。
【００８２】
【表２】
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【００８３】
表２から明らかなように、リン酸／酢酸緩衝１７ｖｏｌ％エタノール水溶液（「エタノール緩衝液」）および非緩衝エタノール溶液での再懸濁により、いずれもＩｇＧを抽出することに成功した。非緩衝エタノール上清抽出物には、緩衝上清よりも高い濃度のＩｇＧが含まれていたが、緩衝エタノール上清抽出物には、ＩｇＡおよびＩｇＭの割合がはるかに低く、より質の高いＩｇＧが含まれていた。プロテアーゼ活性、第ＸＩ／ＸＩａ因子および第ＸＩＩ因子についても、緩衝エタノール上清抽出物の方が低かった。血栓塞栓性の副作用率が高いことは、ＩＶＩＧ製剤における第ＸＩ因子および第ＸＩａ因子と関係があるとされているため、上清画分中にこれらを再抽出させないことが非常に望ましい。エタノール／水抽出物と異なり、エタノール／緩衝液抽出物は、（画分ＩＩへと進む）上清Ｂ＋Ｉ画分と組成が似ているので、これらの２つの画分を混合することにより、高収量のＩｇＧを含有する同等の純度の単一画分ＩＩを生成することが可能になる。
【００８４】
リン酸／酢酸緩衝水性エタノール上清からのIｇＧの収量は、血漿１リットルあたり０．５５ｇのＩｇＧに相当した。これは、血漿ＩｇＧの収量が〜１０％にまで増加したことを意味する。つまり、ＩｇＧ最終生成物の収量がさらに１０〜２０％増加すると言い換えることができる。
【００８５】
（実施例２）
実施例２の一連の実験において、総体積を減少させるために、再懸濁比を低減する効果を調査した。１つの実験として、緩衝エタノール水溶液１０００ｇに、Ｂ＋Ｉ沈殿物５００ｇを再懸濁させた（緩衝液２部に対して沈殿物１部）。別の実験として、エタノール緩衝液１０００ｇに、同じＢ＋Ｉ沈殿物２５０ｇを再懸濁させた（緩衝液４部に対して沈殿物１部）。分析のため、熟成の間、間隔をおいて試料を採取した（表３）。
【００８６】
【表３】
0006748064.tif 000004
【００８７】
表３のデータによれば、再懸濁比が１：２および１：４の場合、沈殿物からＩｇＧを抽出させることができた。また、１：４の比の方が、抽出されたＩｇＧの収量および特性は向上した。例えば、１：４の上清の濁度（物質の品質の全体的な指標）は、対応する１：２の再懸濁上清より２桁低かった。さらに、ＩｇＭ、ＩｇＡおよび第ＸＩａ因子等の汚染物質の濃度は、１：２の上清と比較して、１：４の上清において著しく低下した。上記双方の実験から得られたデータは、約２時間以上の熟成時間を用いることで、ＩｇＧの特性および収量が維持できることを示している。２時間熟成後のＩｇＧの収量は、１：４の上清および１：２の上清において、それぞれ血漿１リットルあたり０．４７ｇおよび０．４２ｇであった。
【００８８】
（実施例３）
実施例２の結果を確認するために、１：４の比で数回の再懸濁を行った。６回の再懸濁において、異なるバッチの出発原料を用いた。いずれの場合にも、上記のように、水性エタノール緩衝液１０００ｇに、Ｂ＋Ｉ沈殿物２５０ｇを再懸濁させた。最低２時間混合しながら、−５℃で沈殿懸濁液を順化した。順化の最後に、再懸濁液を遠心分離した。再懸濁液および上清の両方を分析した。それぞれの上清のＩｇＧ濃度およびＩｇＧ収量（血漿相当量）を算出した（表４）。
【００８９】
【表４】
0006748064.tif 000005
【００９０】
ＩｇＧの平均収量は、血漿１リットルあたり０．５７ｇであった。分画プロセスの主要な流れに加えることにより、この収量は、著しい収量の増加につながり、処理された血漿１リットルごとに得られるＩｇＧがさらに０．５７ｇ増加することを意味する。
【００９１】
（実施例４）
１７ｖｏｌ％エタノール緩衝液１３３５ｇに、Ｂ＋Ｉ沈殿物３３４ｇを再懸濁させて、−５℃で２時間混合した。次に、遠心分離により、固相から液相（「第１の抽出物」）を分離した。
【００９２】
１７ｖｏｌ％エタノール緩衝液１０９６ｇに、固相沈殿物２７４ｇを再懸濁させて、−５℃で２時間混合した。次に、遠心分離により、固相から液相（「第２の抽出物」）を分離した。
【００９３】
ＩｇＧおよび対象となる他のいくつかのタンパク質の存在を確かめるために、処理ごとに予め遠心分離した懸濁液およびその上清を分析した（表５）。その結果、Ｂ＋Ｉ沈殿物を順次繰り返して抽出することにより、溶媒上清相（solvent supernatant phase）でＩｇＧが生成されて、それに相当する他のタンパク質は減少したことが確認された。
【００９４】
【表５】
0006748064.tif 000006
【００９５】
（実施例５）
沈殿物１部と１７ｖｏｌ％エタノール緩衝液４部とを−５℃で２時間混合することにより、Ｂ＋Ｉ沈殿物の抽出物を調製した。次に、遠心分離により、残余の沈殿物からこの抽出物を分離した。
【００９６】
その後、Ｂ＋Ｉ沈殿物の抽出物とＢ＋Ｉ上清とを体積比１：１０で組み合わせた。Ｂ＋Ｉ上清の組成と、組み合わされたＢ＋Ｉ上清およびＢ＋Ｉ沈殿抽出物の組成とを比較した（表６）。その結果、上清と沈殿抽出物とを組み合わせると、許容されるＩｇＧ純度プロファイルを保持しながら、ＩｇＧ濃度が増加することが確認された。
【００９７】
【表６】
0006748064.tif 000007
【００９８】
（実施例６）
改変されたKistler-Nitschmann法によって分画された血漿からのＢ＋Ｉ沈殿物２５０ｋｇを０℃±２℃で順化し、さらに０℃±２℃で１時間均質化することにより、１７ｖｏｌ％エタノール緩衝液１０００ｋｇに再懸濁させた。次に、混合物を０℃±２℃で２時間熟成した。その後、ｐＨは５．１４であり、伝導率は０．６ｍＳ／ｃｍであった。濾過または遠心分離により、沈殿物から上清抽出物を分離した。この抽出方法および濾過または遠心分離のいずれかによる回収の結果、Ｂ＋Ｉ沈殿物から高純度のＩｇＧを抽出することに成功した（表７）。
【００９９】
【表７】
0006748064.tif 000008
【０１００】
（実施例７）
実施例６における上清抽出物の濾液３１３ｋｇを調整して、イオン強度を３．９ｍＳ／ｃｍとし、エタノール濃度を２５ｖｏｌ％に増加し、さらに１Ｍ水酸化ナトリウムで滴定してｐＨを６．９とした。次に、この濾液を−６．５℃で６時間インキュベートすることにより、画分ＩＩ沈殿物２．４ｋｇを生成し、続いて遠心分離によってこれを収集した。画分ＩＩ（ＦｒＩＩ）沈殿物を水に溶解した（ＦｒＩＩ：水＝１：２）。分析の結果、Ｂ＋Ｉ沈殿物の上清抽出物は、さらなる下流の精製に適合することにより、凝集レベルの低いＩｇＧを生成することが示された。
【０１０１】
【表８】
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【０１０２】
（実施例８）
−３０℃未満で冷凍貯蔵されていたＢ＋Ｉ沈殿物１００ｇを、０℃に制御された容器（オプション（ａ））または０℃に制御された１７ｖｏｌ％エタノール緩衝液を含む容器（オプション（ｂ））のいずれかに入れて、撹拌することなく温度を０℃に上げた。温度は、冷凍前の沈殿物に設置されていたプローブで測定された。沈殿物の温度が０℃±１℃に達すると、オプション（ａ）の沈殿物に１７ｖｏｌ％エタノール緩衝液を添加した。さらに、どちらの沈殿物も、溶媒緩衝液中にＩｇＧを抽出する前に、２時間以上撹拌することによって均質化した（熟成／順化）。次に、残った沈殿物から上清を分離し、分析した。沈殿物を０℃に順化した場合、緩衝液の有無にかかわらず、ＩｇＧの抽出は同じであった（表９）。
【０１０３】
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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