(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
瘢痕皮膚組織の外観を軽減または最小限にするためのトロポエラスチン組成物において、
該トロポエラスチン組成物は、治療上有効量のトロポエラスチン、および該組成物からのトロポエラスチンの持続放出を可能にする架橋ヒアルロン酸を含み、
該トロポエラスチン組成物は、瘢痕皮膚組織において形成された創傷と接触させられ、該創傷は、該創傷の周りに位置する複数の表皮細胞を含み、それにより創縁を形成し、
該トロポエラスチン組成物は、それが、創傷の再上皮化を可能にする期間にわたり創縁と持続接触するのを可能にする条件で創傷と接触させられ、
創傷の再上皮化は、瘢痕皮膚組織の外観を最小限にする、
トロポエラスチン組成物。
【請求項２】
前記トロポエラスチン組成物が、前記トロポエラスチン組成物と前記創縁との持続接触を可能にする粘度または接着性を有するゲルの形態である、請求項１に記載のトロポエラスチン組成物。
【請求項３】
前記トロポエラスチン組成物が、固相の頂端表面上に提供され、かつ前記固相が、前記固相の頂端表面を前記創縁にアライメントさせることにより前記トロポエラスチン組成物と前記創縁との持続接触を可能にするように創床に配置される、請求項１に記載のトロポエラスチン組成物。
【請求項４】
前記固相が、ドレッシング、ステント、足場、バルキング剤、またはプロテーゼである、請求項３に記載のトロポエラスチン組成物。
【請求項５】
トロポエラスチン組成物の溶液が、トロポエラスチンと前記創縁との持続接触を可能にする条件で前記創縁上に注射されることにより、前記トロポエラスチン組成物が前記創縁と接触させられる、請求項１に記載のトロポエラスチン組成物。
【請求項６】
前記創縁に提供されるトロポエラスチンの治療上有効量が、約０．１ｍｇ〜２５０ｍｇ／ｍｌである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のトロポエラスチン組成物。
【請求項７】
前記トロポエラスチン組成物が、約１〜２週間以下の期間にわたり前記創縁と持続接触した状態で提供される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のトロポエラスチン組成物。
【請求項８】
前記トロポエラスチン組成物が、創床と接触させられない、請求項１〜７のいずれか一項に記載のトロポエラスチン組成物。
【請求項９】
前記トロポエラスチン組成物が、架橋トロポエラスチンを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のトロポエラスチン組成物。
【請求項１０】
瘢痕皮膚組織の外観を軽減または最小限にすることが、瘢痕皮膚組織の除去を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のトロポエラスチン組成物。
【請求項１１】
前記トロポエラスチン組成物が、前記瘢痕皮膚組織において形成された複数の創傷と接触させられる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のトロポエラスチン組成物。
【請求項１２】
前記複数の創傷が、瘢痕皮膚組織に沿った微小刺傷形成により形成される、請求項１１に記載のトロポエラスチン組成物。
【請求項１３】
前記創傷が、皮膚領域のレーザー処置により形成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のトロポエラスチン組成物。
【請求項１４】
前記皮膚領域においてレーザー処置により形成された前記創傷が垂直チャネルを形成する、請求項１３に記載のトロポエラスチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創傷治癒、特定的には創傷の再上皮化の改善に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書でいずれかの先行技術が参照されても、この先行技術がオーストラリアもしくはいずれか他の法域で共通一般知識の一部を形成すること、またはこの先行技術の妥当性が当業者により確認、理解、および考慮されると適正に予想されうること、を承認するとみなされるものではなく、いずれかの形で示唆するとみなされるべきものでもない。
【０００３】
皮膚は、２層すなわち表皮と真皮で構成され、後者は、下側脂肪構造すなわち皮下組織に接続されている。表皮は、皮膚の最も薄くかつ最も外側の要素であり、主にケラチノサイト細胞よりなる。真皮は、コラーゲン、弾性線維、ならびに原線維間のグリコサミノグリカンゲル、塩、および水で構成される密性結合組織である。
【０００４】
表皮および真皮は、下方に突出する表皮突起と上方に突出する真皮乳頭とによりインターロックされる。それらは、糖タンパク質とプロテオグリカンとで構成されるきわめて特殊な形態の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）である基底膜により分離される。
【０００５】
真皮は、２つの構造上異なる層、すなわち、表面の薄い真皮乳頭層とより深い真皮網状層とからなる。真皮乳頭層は、微細弾性線維を含有する結合組織からなり、すでに考察したように真皮と表皮とを接続する真皮乳頭として知られる小さい指状突起の形状をとる。真皮網状層は、網状構造に交絡したコラーゲン束と厚い水平整列弾性線維とを含有する密性不規則性結合組織を含む。
【０００６】
創傷治癒は、組織が傷害後にそれ自体を修復または再生する複雑なプロセスである。いくつかの組織は、再生可能であるが、適切な条件が見いだされない場合、線維症を伴う修復機序に向かう傾向を示しうる。皮膚は一例である。他の組織は、再生可能ではなく、線維症および瘢痕形成をもたらす修復機序のみを引き起こしうる。
【０００７】
創傷治癒の古典的モデルは、逐次的であるがオーバーラップした３つまたは４つの病期、すなわち、（１）止血期、（２）炎症期、（３）増殖期、および（４）リモデリング期に分割されうる。増殖期は、血管形成、コラーゲン沈着、肉芽組織形成、および再上皮化により特徴付けられる。
【０００８】
血管形成は、線維芽細胞増殖と同時に行われる。線維芽細胞および上皮細胞の活性には酸素および栄養素が必要とされるので、血管形成は、創傷治癒の他の段階に必要不可欠である。このプロセスによれば、血流に由来する内皮細胞および他の血管細胞の幹細胞ならびに非傷害血管の一部が、仮足を発生してＥＣＭを介して創傷部位に入り込むことにより新しい血管を構築する。内皮細胞は、フィブリン痂皮上に見いだされるフィブロネクチンにより、ならびに他の細胞により放出される、たとえば、低酸素環境時にマクロファージおよび血小板から放出される血管形成因子により走化的に、創傷領域に引き寄せられる。遊走するために、内皮細胞は、血餅およびＥＣＭの一部分を分解するコラゲナーゼおよびプラスミノーゲンアクチベーターを必要とする。亜鉛依存性メタロプロテイナーゼは、基底膜およびＥＣＭを消化して、細胞遊走、増殖、および血管形成を可能にする。組織が適正に灌流された場合、内皮細胞の遊走および増殖は低減される。最終的に、もはや必要でない血管は、アポトーシスにより死滅する。
【０００９】
コラーゲンの産生および沈着は、フィブリン−フィブロネクチン血餅よりも高い耐力性を提供することにより創傷の強度を増加させるので、重要である。また、炎症、血管形成、および結合組織構築に関与する細胞は、線維芽細胞により配設されたコラーゲンマトリックス上に結合し、成長し、かつ分化する。ＩＩＩ型コラーゲンおよびフィブロネクチンは、一般的には、主に創傷サイズに依存して約１０時間〜３日間の間のどこかで、認知可能な量で産生を開始している。それらの沈着は、１〜３週間でピークに達する。それらは、より強力なＩ型コラーゲンにより置き換えられる成熟の後期まで、優位な伸張性物質である。たとえ線維芽細胞が新しいコラーゲンを産生していても、コラゲナーゼおよび他の因子がそれを分解する。損傷直後、合成が分解を上回るので、創傷のコラーゲンレベルは上昇するが、その後、生成および分解が等しくなるので、正味のコラーゲン増加はない。この恒常性は、後続の成熟期の開始のシグナルとなる。線維芽細胞は、傷害後の最初の２日間または３日間は、主に遊走および増殖するが、その後は、以上に記載したように、創傷部位にコラーゲンマトリックスを配設する主要細胞である。この線維芽細胞の起源は、近接する非傷害皮膚組織であると考えられる。最初に、線維芽細胞は、炎症期の終了までに形成されるフィブリン架橋線維を利用して創傷を横切って遊走し、続いて、フィブロネクチンに接着する。次いで、線維芽細胞は、創床中に基質を堆積し、その後、遊走のために接着可能なコラーゲンを堆積することにより、肉芽組織の形成の基礎を築く。肉芽組織は、痕跡組織として機能し、損傷の２〜５日後、炎症期にすでに創傷に現れ始め、創床が覆われるまで成長し続ける。肉芽組織は、新しい血管、線維芽細胞、炎症細胞、内皮細胞、筋線維芽細胞、および新しい一時的細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分からなる。一時的ＥＣＭは、正常組織のＥＣＭとは組成が異なり、その成分は、線維芽細胞に由来する。そのような成分は、フィブロネクチン、コラーゲン、グリコサミノグリカン、エラスチン、糖タンパク質、およびプロテオグリカンを含む。その主成分は、フィブロネクチンおよびヒアルロナンであり、かなり水和されたマトリックスを生成して細胞遊走を促進する。その後、この一時的マトリックスは、非傷害組織に見いだされるものにかなりよく類似したＥＣＭで置き換えられる。肉芽形成期の終了時、線維芽細胞は、アポトーシスを起こして、肉芽組織を細胞に富んだ環境から主にコラーゲンよりなる環境に変換する。
【００１０】
上皮細胞が新しい組織を横切って遊走して創傷と環境との間に障壁を形成するので、開放創内への肉芽組織の形成は、再上皮化期の開始を可能にする。創縁および毛嚢、汗腺、皮脂（油）腺などの真皮付属器に由来する基底ケラチノサイトは、創傷治癒の上皮化期に関与する主要細胞である。それらは、創傷部位を横切ってシート状に前進しかつその縁で増殖し、中間で出合った時に移動を停止する。
【００１１】
ケラチノサイトは、最初に増殖することなく遊走する。遊走は、損傷の数時間後程度の早期に開始可能である。しかしながら、上皮細胞は、横切って遊走するために生存細胞を必要とするので、創傷が深い場合、最初に肉芽組織で充填しなければならない。したがって、遊走の開始時期はさまざまであり、損傷の約１日後に始まりうる。創縁の細胞は、遊走のためにより多くの細胞が提供されるように、損傷後の２日目および３日目に増殖する。
【００１２】
基底膜が破壊されない場合、上皮細胞は、非傷害皮膚で行われるのと同様に基底層の細胞の分裂および上方への遊走により３日以内に置き換えられる。しかしながら、基底膜が創傷部位で破壊された場合、創縁から、および生存ケラチノサイトで裏打ちされて真皮に入り込んだ毛嚢、汗腺、油腺などの皮膚付属器から、再上皮化を行わなければならない。創傷が非常に深い場合、皮膚付属器もまた破滅されうるので、遊走は創縁のみから行われうる。
【００１３】
創傷部位上へのケラチノサイトの遊走は、接触阻害の欠如によりおよび一酸化窒素などの化学物質により刺激される。遊走し始める前に、細胞は、通常はその細胞骨格の中間径フィラメントにより細胞を他の細胞におよびＥＣＭに固着しているそのデスモソームおよびヘミデスモソームを溶解しなければならない。糖タンパク質で作製されて通常は細胞をその細胞骨格により基底膜に固着しているインテグリンと呼ばれる膜貫通レセプタータンパク質が、細胞の中間径フィラメントから放出されてアクチンフィラメントに再配置されることにより、遊走時にＥＣＭへの仮足の結合部として機能する。したがって、ケラチノサイトは基底膜から脱離して、創床に進入することが可能である。
【００１４】
遊走し始める前に、ケラチノサイトは、形状を変化させてより長くかつより平坦になり、膜状仮足のような細胞プロセスおよびさざ波のように見える広範なプロセスに拡張される。アクチンフィラメントおよび仮足が形成される。遊走時、仮足上のインテグリンはＥＣＭに結合し、突起中のアクチンフィラメントは細胞を押し進める。インテグリンを介するＥＣＭ中の分子との相互作用は、アクチンフィラメント、膜状仮足、および糸状仮足の形成をさらに促進する。
【００１５】
上皮細胞は、遊走するために互いに重なって上昇する。上皮細胞のこの成長シートは、多くの場合、上皮舌と呼ばれる。基底膜に結合する最初の細胞は、基底層を形成する。これらの基底細胞は、創床を横切って遊走し続け、それらの上の上皮細胞も同様に、滑って進む。この遊走が急速に起こるほど、より少ない瘢痕が存在することになろう。
【００１６】
ＥＣＭのフィブリン、コラーゲン、およびフィブロネクチンは、分裂および遊走するように細胞にさらにシグナル伝達しうる。線維芽細胞のように、遊走ケラチノサイトは、炎症時に堆積されたフィブリンで架橋されたフィブロネクチンを結合部位として用いて横切ってゆっくり広がる。
【００１７】
ケラチノサイトが遊走すると、それらは、肉芽組織上に移動するが、痂皮（形成された場合）の下ではそれを下側組織から分離する。上皮細胞は、死滅組織や細菌物質などのデブリを貪食する能力を有するが、そうでなければ、それらにより通路が塞がれるであろう。形成されたいずれの痂皮も溶解しなければならないので、ケラチノサイト遊走は、乾燥環境ではより大きいより強靭な痂皮の形成がもたらされることから、湿潤環境により最も良好に促進される。組織に沿って進むために、ケラチノサイトは、血餅、デブリ、およびＥＣＭの一部を溶解して通り抜けなければならない。それらは、プラスミノーゲンを活性化するプラスミノーゲンアクチベーターを分泌することにより、それをプラスミンに変換して痂皮を溶解する。細胞は、生組織上のみを遊走可能であるので、それらは、コラゲナーゼおよびプロテアーゼたとえばマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を分泌して、行く手にある、とくに遊走シートの前にある、ＥＣＭの損傷部分を溶解しなければならない。ケラチノサイトはまた、線維芽細胞により配設された新しいＥＣＭを代わりに用いてタンパク質分解により基底膜をリモデリングして横切ってゆっくり広がる。
【００１８】
ケラチノサイトが遊走し続けると、創縁で新しい上皮細胞を形成してそれを置き換えることにより、より多くの細胞を前進シートに提供しなければならない。遊走ケラチノサイトの背後での増殖は、通常、損傷の数日後に始まり、上皮化のこの段階では正常組織の１７倍の速度で行われる。全創傷領域が再表面形成されるまで、増殖する上皮細胞のみが、創縁に存在する。
【００１９】
インテグリンおよびＭＭＰにより刺激された成長因子は、創縁で細胞を増殖させる。ケラチノサイト自体もまた、成長因子および基底膜タンパク質を含めて因子を産生および分泌することにより、上皮化および治癒の他の病期の両方を支援する。成長因子はまた、ケラチノサイトでの抗微生物ペプチドおよび好中性走化性サイトカインの産生の刺激による皮膚創傷の先天性免疫防御にも重要である。
【００２０】
ケラチノサイトは、両側の細胞が中間で出合うまで創床を横切って遊走を続けて、その中間の点で接触阻害により遊走停止を引き起こす。遊走を終了した時、ケラチノサイトは、新しい基底膜を形成するタンパク質を分泌する。細胞は、遊走を開始するために行われたモルホロジー変化を逆転し、デスモソームおよびヘミデスモソームを再構築し、そして再び基底膜に固着された状態になる。基底細胞は、正常皮膚で行われるのと同様に分裂および分化を開始して、再上皮化皮膚に見いだされた層を再構築する。
【００２１】
創傷治癒とくに組織再生は、一連の因子および条件により影響を受ける。これらの因子または条件が利用可能でない場合、アウトカムは、組織修復ならびに再生ではなく線維症、慢性炎症、および／または潰瘍化でありうる。関連因子の例としては、創傷のタイプ、サイズ、位置などの局所性因子、および血管供給の妥当性、感染の存在、移動、代謝状態などの全身性因子が挙げられる。
【００２２】
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２５：１４０７−１４１４には、創傷の再上皮化におけるハイブリッドペプチドの使用が考察されている。とくに、エラスチン由来ペプチドＶＧＶＡＰＧは、陰性対照と比較して再上皮化の増加も再生組織体積の増加も示さないことが、研究により示された。創傷の再上皮化および再上皮化の支援に有効な肉芽組織形成の両方との関連で、創傷治癒にはラミニン由来ペプチドのほうが好ましいことが、研究により実証された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
創傷の治癒とくに皮膚創傷または真皮組織創傷の治癒の改善または代替法の必要性が残っている。
【００２４】
特定的には、創傷の再上皮化の改善の必要性が存在する。
【００２５】
また、たとえば、創傷治癒とくに再上皮化などを支えるプロセスの進行速度の改善または加速により、創傷治癒プロセスを加速する必要性も存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、以上に挙げた必要性の１つ以上に対処しようとするものであるか、または創傷治癒の改善を提供しようとするものであり、一実施形態では、
・創傷を有する個体を提供することであって、創傷が、創傷の周りに位置する複数の表皮細胞を含むことにより創縁を形成する、提供することと、
・創傷の再上皮化を可能にする期間にわたりトロポエラスチンと創縁との持続接触を可能にする条件で創縁と治療上有効量のトロポエラスチンとを接触させることであって、
創傷の再上皮化が創傷の治癒を可能にし、
それにより創傷が治癒する、接触させることと、
を含む、創傷を治癒する方法を提供する。
【００２７】
他の実施形態では、
・創傷を有する個体を提供することであって、創傷が、創傷の周りに位置する複数の表皮細胞を含むことにより創縁を形成する、提供することと、
・創傷の再上皮化を可能にする期間にわたりトロポエラスチンと創縁との持続接触を可能にする条件で創縁と治療上有効量のトロポエラスチンとを接触させることであって、
それにより創傷の再上皮化が改善される、接触させることと、
を含む、創傷の再上皮化を改善するプロセスが提供される。
【００２８】
他の実施形態では、
・瘢痕組織を有する個体を提供することと、
・瘢痕組織に創傷を形成することであって、創傷が、創傷の周りに位置する複数の表皮細胞を含むことにより創縁を形成する、形成することと、
・創傷の再上皮化を可能にする期間にわたりトロポエラスチンと創縁との持続接触を可能にする条件で創縁と治療上有効量のトロポエラスチンとを接触させることであって、
創傷の再上皮化が瘢痕組織を最小限にし、
それにより瘢痕組織が最小限になる、接触させることと、
を含む、瘢痕組織を最小限にする方法が提供される。
【００２９】
他の実施形態では、創傷の治癒に使用するためのまたは創傷の再上皮化の改善に使用するためのトロポエラスチンであって、治療上有効量のトロポエラスチンが、創傷の再上皮化を可能にする期間にわたりトロポエラスチンと創縁との持続接触を可能にする条件で創縁と接触される、トロポエラスチンが提供される。
【００３０】
他の実施形態では、創傷を治癒するためのまたは創傷の再上皮化を改善するためのトロポエラスチンの使用であって、治療上有効量のトロポエラスチンが、創傷の再上皮化を可能にする期間にわたりトロポエラスチンと創縁との持続接触を可能にする条件で創縁と接触される、トロポエラスチンの使用が提供される。
【００３１】
他の実施形態では、創傷を治癒するためのまたは創傷の再上皮化を改善するための医薬の製造におけるトロポエラスチンの使用であって、治療上有効量のトロポエラスチンが、創傷の再上皮化を可能にする期間にわたりトロポエラスチンと創縁との持続接触を可能にする条件で創縁と接触される、トロポエラスチンの使用が提供される。
【００３２】
以上に記載の実施形態では、トロポエラスチンは、創床ではなく創縁との接触のために提供されうる。
【００３３】
以上に記載の実施形態では、トロポエラスチンは、モノマー形で提供されうるか、または架橋形もしくは非架橋形で提供されうる。
【００３４】
以上に記載の実施形態では、トロポエラスチンは、架橋ヒアルロン酸ゲルとブレンドされて、トロポエラスチンの持続放出を可能にする製剤を形成しうる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】（Ａ）ブタの創傷の治療の概略図。創傷は、Ｉｎｔｅｇｒａ（青丸）で覆われたか、または、１０％ｒＨ  ＴＥが組み込まれたＩｎｔｅｇｒａ真皮テンプレート（エラスチン化Ｉｎｔｅｇｒａ、緑丸）もしくは４％ｒＨ  ＴＥヒドロゲル（黄丸）上に置かれたＩｎｔｅｇｒａ真皮テンプレートで治療された。（Ｂ）創傷の生検部位およびドレッシング部位の概略図。
【図２】線維芽細胞の存在、新しいコラーゲン沈着、およびエラスチン線維の存在を示す、エラスチン化Ｉｎｔｅｇｒａで治療された部位のＶＶＧ染色生検切片。
【図３】手術の２週間後に採取されたコア生検サンプルのＶＶＧ染色で観測されたさまざまなタイプの真皮の比較。Ａ）元の真皮、Ｂ）形成されたばかりの外観と正常な外観との中間の真皮（円で囲まれた部分）、Ｃ）形成されたばかりの外観の真皮（円で囲まれた部分：それほど好酸球性でない染色コラーゲン線維が、正常な外観の真皮よりも薄くかつそれほど組織化されていない細胞性の状態で現れる）、Ｄ）正常な外観の真皮（円で囲まれた部分：それほど好酸球性でない染色コラーゲン線維が、形成されたばかりの外観の真皮よりも厚くかつより組織化されたそれほど細胞性でない状態で現れる）。
【図４】Ｉｎｔｅｇｒａ真皮テンプレート＋４％ｒＨ  ＴＥヒドロゲルで治療された手術の２週間後の創傷部位の組織切片。エラスチン線維は、正常な外観に見える真皮組織で目視可能なｒＨ  ＴＥゲルの下側の真皮のベースの方向を向いてように見える。ｒＨ  ＴＥヒドロゲル内にも、類似の外観の真皮組織が見られた。
【図５】手術の２週間後に採取されたコア生検サンプルの真皮の各層内の血管の数の比較。エラスチン化Ｉｎｔｅｇｒａと、同一のブタの対応する頭側（ｃｒａｎ）または尾側（ｃａｕｄ）の対照Ｉｎｔｅｇｒａ真皮テンプレート単独と、を比較した。ＶＶＧ染色コア生検サンプルを１００×の倍率で検査し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて評価した。真皮の複数のレベルで顕微鏡写真を得た。皮下組織が丁度視野外になるようにカメラで見える視野を移動させることにより、真皮の最初のレベル（レベル１）を取得した。サンプルを表皮の方向に０．５ＦＯＶ（顕微鏡下で観測した場合）移動させることにより、後続のレベルを取得した。したがって、皮下組織の上側のレベル２は、レベル１の画像から０．５ＦＯＶ（顕微鏡下で観測した場合）離れている。真皮の各レベルで３つの画像、すなわち、サンプルの両方の縁で１つずつの画像および中間で１つの画像を得た。顕微鏡下の各ＦＯＶは２．５ｍｍの直径を有し、一方、カメラにより得られた各画像は６５０μｍの幅であったので、真皮の異なるレベルで得られた画像は同一の血管を含有しないことが、この方法により保証された。血管に対する基準は、ａ）ルーメンサイズが１０μｍ以上でなければならないこと、およびｂ）ルーメンが、暗色長尺状核を有する少なくとも２つの細胞により裏打ちされていなければならないこと、であった。ルーメン内の血液細胞の存在および／または血管壁の中膜中の平滑筋細胞の存在により、血管のアイデンティティーが明確に確認されることもあった。
【図６】（Ａ）Ｉｎｔｅｇｒａのみで治療されたサンプルの真皮中への表皮の小突起の例。（Ｂ）エラスチン化Ｉｎｔｅｇｒａサンプルの表皮の類表皮突起（ｒｅｔｅ  ｌｉｋｅ  ｒｉｄｇｅ）の例。
【図７】組換えヒトトロポエラスチンは、線維芽細胞およびケラチノサイトの動員ならびに再生組織の血管新生に寄与する走化性シグナリングを介して創傷修復プロセスに寄与すると提案されている。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明者らは、トロポエラスチンが全層皮膚創傷の再上皮化を改善することを見いだした。
【００３７】
重要なこととして、本明細書の実施例に示されるように、本発明者らは、トロポエラスチンと、創傷の周りに縁を形成する表皮細胞の形態の創縁と、の接触が、皮膚再上皮化の改善に重要であることを見いだした。決定的に重要なこととして、創縁との持続接触が制限されてトロポエラスチンが創床に提供された場合、創傷の再上皮化の改善は、たとえあったとしてもごくわずかである。
【００３８】
仮説により拘束することを望むものではないが、本明細書に見られる創傷治癒の改善を提供するのは、トロポエラスチンと創縁との持続接触もしくは存続接触または少なくとも創縁の近傍への存続配置であると、本発明者らは考えている。さらにまた、仮説により拘束することを望むものではないが、創縁に接触した状態で配置された場合またはその近傍に位置決めされた場合、創傷治癒プロセス時に発現される種々のプロテアーゼは、トロポエラスチンのタンパク質分解断片を生成しうるかまたは創傷治癒および組織再生の種々のプロセスに有利なトロポエラスチンのモノマーの放出を促進しうると考えられる。これらのプロセスは、血管新生、細胞の走化性、遊走、および増殖、ならびに基質の形成を含むことが、本明細書の実施例から示される。
【００３９】
治療および化粧の両方の観点から、創傷を機能的表皮組織で閉鎖することが決定的に重要でありうるので、再上皮化の改善は重要である。創傷閉鎖が見られない場合、組織再生プロセスは、組織修復および線維症とより類似した状態になる傾向があり、標準以下の機能および外観を有する組織の形成をもたらすという危険性が存在する。慢性炎症および潰瘍化の危険性も存在する。再上皮化の程度および再上皮化の期間に関する上皮化の改善は、これとの関連で意味がある。
【００４０】
今日まで、エラスチン由来ペプチドの生物活性に関する初期のｉｎ  ｖｉｔｒｏデータは限られているが、ＶＧＶＡＰＧなどのエラスチン由来ペプチドは、本明細書に記載の改善を得るのに有効でないことが、初期のｉｎ  ｖｉｖｏ創傷モデルにより示されているので、以上に記載の知見は、とくに驚くべきことであると考えられる。たとえば、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｓｕｐｒａを参照されたい。仮説により拘束することを望むものではないが、少なくとも創傷再上皮化に関するかぎり、本明細書に記載の創傷構造に基づいてこれらのペプチドを究明できなかったことは、本明細書に記載の改善がこれらの初期の研究では見られなかったことを意味すると考えられる。
【００４１】
したがって、一実施形態では、創傷を治癒する方法が提供される。本方法は、創傷を有する個体を提供することを含む。創傷は、皮膚組織に対するなんらかの傷害から生じうる。傷害の例としては、熱傷、裂傷、擦傷、切傷、刺傷、または破裂が挙げられる。
【００４２】
一般的には、傷害は、表皮層および真皮層の破損、破裂、または損傷を引き起こすものである。それはまた、皮下組織、筋肉、または骨を含めて、真皮の下側組織の損傷を引き起こしうる。したがって、創傷は、表在性創傷、部分層創傷、または全層創傷でありうる。
【００４３】
一般的には、本発明は、肉芽組織形成と、血管形成、コラーゲン沈着などを含む関連プロセスと、再上皮化と、を含む、真皮領域および表皮領域に適用される再生プロセスを対象とする。
【００４４】
傷害は、意図的なもの、たとえば、手術によるものであってもよいし、偶発的なもの、たとえば、外傷によるものであってもよい。
【００４５】
創傷は、創傷の周りに位置する複数の表皮細胞を含むことにより創縁を形成する。典型的には、傷害は、通常は創傷が形成された領域上に表皮層を形成する上皮細胞の不在により特徴付けられる組織の損傷領域を形成するであろう。傷害部位の周りに位置する実質的に非傷害の組織は、一般的には、表皮細胞の正常表皮層を含有する。創縁を形成するのは、創傷に近接するこれらの細胞である。一般に理解されているように、創縁は、再上皮化プロセス時に上皮細胞の増殖部位になる。
【００４６】
本発明によれば、創縁は、トロポエラスチンと創縁との持続接触を可能にする条件でトロポエラスチンまたはエラスチン由来断片と接触される。これは、本発明での重要な工程であると考えられる。本明細書の実施例に記載したように、再上皮化は、トロポエラスチンが創縁と接触した状態である場合またはその近傍に位置する場合に観測される傾向がある。たとえば、再上皮化は、より完全でありうるかまた自然に構造化されうるとともに、再上皮化の速度は、加速されうる。これらの特徴のいくつかは、たとえば、トロポエラスチンが創床と接触した状態で配置されているにすぎない場合、見られない。
【００４７】
本明細書に記載されるように、創床は、一般的には、傷害から生じた真皮組織表面であり、その上に最終的に肉芽組織が機能的再生プロセスで形成される。「創縁の近傍に位置する」とは、創縁との接触のためのトロポエラスチンまたはそのタンパク質分解断片の拡散を容易にすべく創縁の近くに、トロポエラスチンまたはその種々のタンパク質分解断片が位置するように、トロポエラスチンが提供されることを意味する。これとの関連では、創床内または創床上のみのトロポエラスチンまたはそのエラスチン由来断片の位置は、トロポエラスチンが創縁に添加された場合に観測されうる再上皮化を提供しないように、本明細書に示されている。したがって、トロポエラスチンの位置が創縁の近傍である本発明によれば、創床のみへのトロポエラスチンの投与は見られない。
【００４８】
トロポエラスチンまたはエラスチン由来断片と創縁との接触を可能にするいくつかの方法が存在する。一実施形態では、トロポエラスチンは、創縁との存続接触を可能にする形態で提供される。たとえば、トロポエラスチンは、ゲル、したがって、その中のトロポエラスチンまたは断片と、創縁と、の接触の維持を可能にする粘度または接着性を有するゲルの形態で提供されうる。特定のゲル製剤の例としては、国際公開第２０１２０６８６１９号パンフレットで一般的に考察されたものが挙げられる。
【００４９】
他の実施形態では、トロポエラスチンは、固相（したがって、固相中または固相上に位置するトロポエラスチン）と創縁との持続接触に関して適合化されたドレッシング、ステント、デバイスなどの固相中または固相上に提供される。たとえば、足場の頂端表面が創縁にアライメントされて、トロポエラスチンまたはエラスチン由来ペプチドが、ゲルまたは他の形態で、創縁と接触した足場などの頂端表面上に提供されうるように、足場、バルキング剤、プロテーゼなどの固相を創床内に配置しうる。特定の固相配置の例としては、任意選択でコラーゲンなどの他の結合組織分子を併用したトロポエラスチンのエレクトロスピニングを含むもの、およびコラーゲンなどの他の結合組織分子との共沈を含むものが挙げられる。
【００５０】
代替法では、トロポエラスチンと創縁との持続接触を可能にするは、トロポエラスチンが提供される条件自体である。たとえば、トロポエラスチンを溶媒中に提供してこれを創縁上にスプレーまたは塗布し、次いで、創縁から溶媒を蒸発させるための条件を提供することにより、トロポエラスチンまたはその断片と創縁とを接触させた状態にしうる。
【００５１】
トロポエラスチンまたはエラスチン由来断片は、典型的には、治療上有効量で提供される。これは、一般的には、再上皮化の程度または再上皮化を終了するまでの期間のいずれかとの関連では、トロポエラスチンまたはエラスチン由来断片がそのように提供されない状況での再上皮化の程度または再上皮化するまでの期間と比較して、再上皮化の改善をもたらす任意の量である。一般的には、トロポエラスチンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌの濃度で提供されるが、これは、以上で考察された皮膚組織の再生に関連する種々の因子に依存するであろう。この範囲内では、次の濃度、すなわち、１ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、および２００ｍｇ／ｍｌがとくに有用でありうる。
【００５２】
したがって、一実施形態では、
・創傷を有する個体を提供することであって、創傷が、創傷の周りに位置する複数の表皮細胞を含むことにより創縁を形成する、提供することと、
・創傷の再上皮化を可能にする期間にわたりトロポエラスチンと創縁との持続接触を可能にする条件で創縁と約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌの濃度のトロポエラスチンとを接触させることであって、創傷の再上皮化が創傷の治癒を可能にし、それにより創傷が治癒する、接触させることと、
を含む、創傷を治癒する方法が提供される。この実施形態では、トロポエラスチンは、トロポエラスチンと創縁との持続接触のために創縁に適用可能な形態で使用されるように提供されうる。そのような形態はゲルでありうる。好ましくは、この実施形態では、トロポエラスチンは、好ましくは創床と接触させることなく、約１〜数週間以下の期間にわたり創縁と持続接触した状態で提供される。
【００５３】
本発明によれば、トロポエラスチンまたはエラスチン由来ペプチドは、創傷の再上皮化を可能にする期間にわたり提供される。期間は、一般的には、以上に述べた組織再生に関連する創傷の性質および他の因子に依存する。創傷が外傷から生じた軽度急性創傷である場合、約１〜２週間以下の期間にわたり創縁と持続接触した状態でトロポエラスチンを提供することが必要でありうる。これには、トロポエラスチンの１回のみの適用が必要とされうる。創傷が清浄な外科的創傷であるの場合も、同じのことが当てはまりうるが、これは、創傷のサイズおよび性質に依存する。創傷がより複雑である場合、たとえば、真皮組織もしくは下側組織の実質的な損失をもたらす場合、または重度外傷もしくは慢性傷害の場合、投与スケジュールに従って、たとえば、創傷が慣例に従ってドレッシングおよび清浄化される期間に合わせて、トロポエラスチンを提供することが必要でありうる。こうした状況では、１〜３週間もしくはそれ以上の期間にわたり毎日１回、または１〜３週間もしくはそれ以上にわたり創縁での治療上有効量のトロポエラスチンの持続放出を可能にする形態で、トロポエラスチンを創縁に添加することが必要でありうる。
【００５４】
本発明の以上の実施形態では、創傷の治癒をもたらすのは、創傷治癒プロセス時にトロポエラスチンと創縁との持続接触から生じる創傷の再上皮化の改善である。この実施形態では、本明細書の実施例により確証されるように、トロポエラスチンと創床との実質的な接触を伴うことなく再上皮化を改善することが可能である。
【００５５】
一般に理解されているように、創床は、一般的には、真皮層内に形成され、真皮層の下に位置する皮下層または他の層まで延在しうる。一般に理解されている創床は、正常非傷害組織、とくに創傷内に位置する真皮組織の表面である。創床は、それ以外に、肉芽組織形成が起こる創傷の部分として定義されうる。創床は、一般的には、表皮組織を含まないので、創床自体は、本明細書で参照される「創縁」を含有しない。より詳細には、一般に理解されているように、真皮層が貫通された皮膚創傷（たとえば、部分層創傷または全層創傷）はすべて、創縁および創床を有するであろう。表在性の皮膚創傷は、創縁を有するであろうが、実質的な創床を有していないであろう（実際に、表在性創傷は、単に暴露された真皮組織を有しうるが、それ以外は非傷害真皮組織を有する）。したがって、一般に理解されているように、本発明によれば、「創縁」および「創床」は、２つの異なる概念である。
【００５６】
本明細書に記載の本発明の特定の一適用は、瘢痕および関連する線維性組織のリモデリングまたは実質的な除去である。一般に理解されているように、瘢痕組織は、組織修復の結果として生じる。最終結果として、瘢痕または線維症が位置する関連組織の構造的側面および機能的側面が欠如した組織構造が形成される。特定的には、本明細書に記載の創傷構造に対応するトロポエラスチンまたはエラスチン由来断片の位置を用いれば、組織再生の主要な態様を誘導可能になり、瘢痕組織で創傷プロセスおよび創傷治癒プロセスを誘導可能になるという知見が得られる。したがって、他の実施形態では、
・瘢痕組織を有する個体を提供することと、
・瘢痕組織に創傷を形成することであって、創傷が、創傷の周りに位置する複数の表皮細胞を含むことにより創縁を形成する、形成することと、
・創傷の再上皮化を可能にする期間にわたりトロポエラスチンと創縁との持続接触を可能にする条件で創縁と治療上有効量のトロポエラスチンとを接触させることであって、
創傷の再上皮化が瘢痕組織を最小限にし、
それにより瘢痕組織が最小限になる、接触させることと、
を含む、瘢痕組織を最小限にする方法が提供される。
【００５７】
一実施形態では、瘢痕組織を最小限にすることは、瘢痕組織の除去を意味する。他の実施形態では、皮膚の所与の領域で瘢痕組織の体積を最小限にすることにより、またはその存在量を最小限にすることにより、瘢痕組織を最小限にする。
【００５８】
創傷は、当技術分野で公知の種々の技術により生成されうる。とくに好ましい技術の１つは、瘢痕内に複数の創傷が形成されるように瘢痕組織に沿って複数の微小刺傷を形成することを含む。次いで、本明細書に記載の組織再生プロセスが可能になるように、創縁または創床と持続接触した状態で、トロポエラスチンまたはエラスチン由来ペプチドを提供する。
【００５９】
一実施形態では、トロポエラスチンは、トロポエラスチンモノマーが架橋されない形態で提供される。
【００６０】
他の実施形態では、トロポエラスチンは、リシルオキシダーゼも他の架橋試薬も含まない組成物の形態で提供される。
【００６１】
他の実施形態では、トロポエラスチンは、アミノ酸ベースの抗酸化剤を含まない組成物の形態で提供される。
【００６２】
一般的には、本発明で使用するためのトロポエラスチンは、組換えトロポエラスチンまたは合成トロポエラスチンであり、無細胞組成物で提供される。
【００６３】
本明細書で用いられる場合、文脈上他の解釈が必要とされる場合を除いて、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（〜を含む）」という用語およびその用語の変化形（「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ」など）は、さらなる添加物、成分、整数、または工程を除外するものではない。
【００６４】
本発明の態様を、以下、さらに記載する：
［項１］
創傷を治癒する方法であって、
・  創傷を有する個体を提供することであって、前記創傷が、前記創傷の周りに位置する複数の表皮細胞を含むことにより創縁を形成する、提供することと、
・  前記創傷の再上皮化を可能にする期間にわたりトロポエラスチンと前記創縁との持続接触を可能にする条件で前記創縁と治療上有効量のトロポエラスチンとを接触させることであって、
前記創傷の再上皮化が前記創傷の治癒を可能にし、
それにより前記創傷が治癒する、接触させることと、
を含む、創傷を治癒する方法。
［項２］
前記トロポエラスチンが、前記トロポエラスチンと前記創縁との持続接触を可能にする粘度または接着性を有するゲルの形態で提供される、上記項１に記載の方法。
［項３］
前記トロポエラスチンが、固相の頂端表面上に提供され、かつ前記固相が、前記固相の頂端表面を前記創縁にアライメントさせることにより前記トロポエラスチンと前記創縁との持続接触を可能にするように創床に配置される、上記項１に記載の方法。
［項４］
前記固相が、ドレッシング、ステント、足場、バルキング剤、またはプロテーゼである、上記項３に記載の方法。
［項５］
トロポエラスチンの溶液が、前記溶液からの溶媒の蒸発を可能にする条件で前記創縁上にスプレーされることにより、トロポエラスチンと前記創縁との持続接触を可能にする、上記項１に記載の方法。
［項６］
前記トロポエラスチンが、約０．１ｍｇ〜２５０ｍｇ／ｍｌの量で前記創縁に提供される、上記項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
［項７］
前記トロポエラスチンが、約１〜２週間以下の期間にわたり前記創縁と持続接触した状態で提供される、上記項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
［項８］
前記トロポエラスチンが、前記トロポエラスチンと前記創床との持続接触を可能にするように前記創床と接触されない、上記項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
本発明のさらなる態様および以上の節に記載の態様のさらなる実施形態は、例として与えられた以下の説明から、および添付の図面を参照すれば、明らかになるであろう。
【００６５】
本明細書に開示および規定される本発明が本文もしくは図面に挙げたまたはそれらから明らかな個々の特徴の２つ以上のすべての代替的組合せに拡張されることは、理解されよう。これらのさまざまな組合せはすべて、本発明の種々の代替的態様を構成する。
【実施例】
【００６６】
実施例１  全層外科的創傷の真皮再生
本研究では、ｒＨ  ＴＥを併用してまたは併用せずにＩｎｔｅｇｒａ真皮テンプレートを適用した後のブタモデルでの全層外科的創傷の真皮再生に及ぼす組換えヒトトロポエラスチン（ｒＨ  ＴＥ）の影響を評価した。２週間での再生真皮の分析により、Ｉｎｔｅｇｒａ真皮テンプレート中のｒＨ  ＴＥの存在が創傷修復プロセスの改善をもたらすことが明らかにされた。線維芽細胞の数の増加、コラーゲン沈着の上昇、再生真皮組織の血管新生の増加、および再生真皮内で検出されたエラスチン線維のレベルの増加により、改善は顕著であった。これらのイベントは、ｒＨ  ＴＥの存在により創傷の上皮化の改善をもたらすケラチノサイト増殖の増加を伴った。
【００６７】
材料および方法
テストアイテム
本研究では、以下の３つの製品を評価した。
・  対照：  Ｉｎｔｅｇｒａ真皮テンプレート
・  テストＡ：  １０％ｒＨ  ＴＥ（エラスチン化Ｉｎｔｅｇｒａ）が組み込まれたＩｎｔｅｇｒａ真皮テンプレート
・  テストＢ：  ４％ｒＨ  ＴＥヒドロゲル上に置かれたＩｎｔｅｇｒａ真皮テンプレート
【００６８】
全層ブタモデル
本研究では、以下の画像に示されるように、それぞれ動物の各側に２つずつ４つの創傷部位を有する２匹のブタを利用した。
【００６９】
図１Ａに示されるように、各ブタに対して、一方の側の２つの創傷をＩｎｔｅｇｒａで覆い、他方の側の２つの創傷をテストＡおよびＢとして治療した。
【００７０】
・  ０日目
ｏ  以上の図に記載されるように、５ｃｍの直径を有する４つの全層円形切除創傷を各ブタの上背部に形成した。
ｏ  以上の図に記載されるように、各創傷を対照Ｉｎｔｅｇｒａ真皮テンプレートまたはテストアイテムＡもしくはＢのいずれかで治療した。
【００７１】
・  ７日目（１週目）
ｏ  すべての創傷に対してドレッシングを交換する。
【００７２】
・  １４日目（２週目）
ｏ  図１Ｂに示されるように、創傷の縁から数ｍｍ離れた各創傷部位から４ｍｍの生検を採取した。
【００７３】
創傷分析
手術および治療の２週間後、最初に、創傷部位でサンプリングを行った。以上に記載したように、創傷部位の生検を行った。サンプルを病理組織診断および免疫組織化学分析に付して、線維芽細胞の浸潤、コラーゲンおよびエラスチンの沈着、再生組織の血管新生、ならびに上皮の再生を評価した。
【００７４】
結果
Ｉｎｔｅｇｒａ真皮テンプレートの線維芽細胞浸潤：
線維芽細胞数は、すべての構築物で増加したが、ｒＨ  ＴＥの存在下でより上昇した。効果は、ｒＨ  ＴＥが全構築物に浸透したエラスチン化Ｉｎｔｅｇｒａで最も顕著であった。
【００７５】
コラーゲンおよびエラスチンの沈着：
図２に示されるヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色ならびにバーヘフ−ワンギーソン（ＶＶＧ）染色により実証されるように、線維芽細胞レベルの上昇は、ｒＨ  ＴＥの存在下でコラーゲン沈着の増加をもたらした。
【００７６】
生検切片のＶＶＧ染色により、各治療部位から採取された生検切片中のエラスチン（すなわち、ｒＨ  ＴＥではない）の存在を評価した。内因性エラスチン線維と、真皮修復プロセス時に再生されたかもしれないものと、を正確に識別することができなかったので、修復真皮組織内のエラスチン線維の存在または不在に関して、各治療部位の組織切片を単純にスコア付けした。Ｉｎｔｅｇｒａ真皮テンプレート単独、Ｉｎｔｅｇｒａ真皮テンプレート＋４％ｒＨ  ＴＥヒドロゲル、およびエラスチン化Ｉｎｔｅｇｒａの研究で分析された切片の全数は、それぞれ、３２、１６、および１６であった。結果を以下の表１にまとめる。
【００７７】
【表１】
0006639587.tif 000002
【００７８】
ＶＶＧ染色生検切片の分析時に遭遇した真皮組織の例を図３に提供する。それに加えて、ｒＨ  ＴＥヒドロゲルに近接した真皮組織内に存在するエラスチン線維の例を図４に提供する。
【００７９】
再生真皮の血管新生：
病理組織診断により再生真皮内の血管新生のレベルを評価した。図５に記載されるように、皮下組織から開始して表皮の方向に順次移動することにより、生検切片組織の異なるレベルで血管の数を顕微鏡下で評価した。図５に提示されたデータから分かるように、Ｉｎｔｅｇｒａ真皮テンプレート内のｒＨ  ＴＥの存在（エラスチン化Ｉｎｔｅｇｒａ）は、とくにＩｎｔｅｇｒａ真皮テンプレートで治療された部位と比較して、表在性真皮の方向に再生組織内の血管の数の増加をもたらした。４％ｒＨ  ＴＥゲル上のＩｎｔｅｇｒａ真皮テンプレートで治療された部位でも、類似の傾向が見られた。
【００８０】
上皮の再生：
創傷部位での上皮の再生は、他のテストアイテムおよび対照アイテムよりも優れたエラスチン化Ｉｎｔｅｇｒａの最も顕著な利点の１つであった。表２に詳述されるようにおよび図６に示されるように、エラスチン化Ｉｎｔｅｇｒａは、２週目までに創傷部位のほとんど完全な再上皮化をもたらし、より自然な真皮−表皮接合の指標となる類表皮突起の存在を伴った。
【００８１】
【表２】
0006639587.tif 000003
【００８２】
結論および考察
データは、図７に示されるモデルにより説明される。このモデルでは、ｒＨ  ＴＥは、エラスチン化Ｉｎｔｅｇｒａ内に組み込まれた場合、生物学的刺激を真皮修復プロセスに提供する。これは、より高いレベルの線維芽細胞浸潤、再生組織の血管新生、および創傷部位の上皮化をもたらす。これらの利点は、エラスチン化Ｉｎｔｅｇｒａの使用により皮膚移植の必要性が排除されることを意味する。トロポエラスチンは、単球（血管新生に寄与し、たとえば、線維細胞に分化する）および線維芽細胞を含む組織修復プロセスに関与する細胞に対して走化性であるので、この生物学的刺激は、組織修復プロセスに寄与する際のｒＨ  ＴＥの既知の性質と一致する［Ａｌｍｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２］。
【００８３】
効果がｒＨ  ＴＥの存在によることの確認は、線維芽細胞浸潤および血管新生の増加に関して類似の傾向を示したＩｎｔｅｇｒａ真皮テンプレート＋４％ｒＨ  ＴＥヒドロゲルか得られた。ヒドロゲルを用いた局所送達に関して予想されるように、効果は、ｒＨ  ＴＥ含有ゲルが適用されたより深い真皮に限定された。これらの効果は、主に、真皮のより深い層に制限されたので、上皮の再生は見られなかった。すなわち、ｒＨ  ＴＥゲルは、Ｉｎｔｅｇｒａ真皮テンプレートにより表在性真皮および表皮から分離された。我々は、再生真皮のこれらの生検でより多くのエラスチン線維を見た。これは、おそらく、ｒＨ  ＴＥの持続放出によるものであろう。ｒＨ  ＴＥゲルは、徐々にゲルから浸出する非修飾の全長トロポエラスチンモノマーを含有することにより、弾性線維を構築するために再生線維芽細胞により利用されうるトロポエラスチンを供給する。一次ヒト皮膚線維芽細胞は、細胞成長のために基質としてｒＨ  ＴＥを利用し、そしてリシルオキシダーゼ（その活性はＢＡＰＮにより阻害される）に依存しかつ成熟エラスチン線維をもたらす（エラスチン線維について弾性および特徴的蛍光性を測定することにより実証される）プロセスで、ｒＨ  ＴＥをエラスチン線維にリモデリングする［Ｗｅｉｓｓ  ｌａｂ，ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｄａｔａ］。
【００８４】
結論として、これらの研究が少数の動物で行われることを認識して、Ｉｎｔｅｇｒａ真皮テンプレート内へのｒＨ  ＴＥの組込みにより、真皮および表皮の再生を実質的に加速可能であると思われる。
【００８５】
実施例２：  エレクトロスピニング、共沈物、およびゲルをベースとする製剤の使用。
本研究では、それぞれ動物の各側に２つずつ４つの直径５ｃｍの円形創傷部位を有するブタを利用した。各ブタに対して、一方の側の２つの創傷を市販の皮膚テンプレート製品で覆い、他方の側の２つの創傷をテストアイテムＡ、Ｂ、またはＣのいずれかで治療した。
【００８６】
・  ０日目
ｏ  以上の図に記載されるように、５ｃｍの直径を有する４つの全層円形切除創傷を各ブタの上背部に形成した。
ｏ  各創傷を対照皮膚テンプレートまたはテストアイテムＡ、Ｂ、もしくはＣのいずれかで治療した。
【００８７】
・  ７日目（１週目）
ｏ  すべての創傷に対してドレッシングを交換する。
【００８８】
・  １４日目（２週目）
ｏ  図１Ｂに示されるように、創傷の縁から数ｍｍ離れた各創傷部位から４ｍｍの生検を採取した。
【００８９】
創傷分析
手術および治療の２週間後、最初に、創傷部位でサンプリングを行った。以上に記載したように、創傷部位の生検を行った。サンプルを病理組織診断および免疫組織化学分析に付して、線維芽細胞の浸潤、コラーゲンおよびエラスチンの沈着、再生組織の血管新生、ならびに上皮の再生を評価した。
【００９０】
テストアイテムＡの作製：  エレクトロスパン足場
１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＰ）中の２０％（ｗ／ｖ）タンパク質溶液で、さまざまな割合のトロポエラスチンおよびコラーゲンを組み合わせた。これらは、１００％トロポエラスチン、８０％トロポエラスチンと２０％コラーゲン、６０％トロポエラスチンと４０％コラーゲン、５０％トロポエラスチンと５０％コラーゲン、および１００％コラーゲンを含んでいた。ブラント１８ゲージ針を備えたシリンジに溶液を充填し、シリンジポンプを用いて３ｍｌ  ｈ１の流量に調整した。針を２０ｋＶ正電源に接続し、２０ｃｍのコレクター距離にある接地された直径３０ｍｍの円形黄銅コレクターに方向付けた。エレクトロスパン足場を化学架橋して水性環境でその構造を安定化させた。足場をオープンステージデシケーター内に配置し、個別の２５％（ｖ／ｖ）水性グルタルアルデヒド溶液からの蒸気により架橋し、次いで、０．２Ｍグリシン溶液中に一晩浸漬することによりクエンチした。次いで、足場をＰＢＳ中で繰返し洗浄した。Ｒｎｊａｋ−  Ｋｏｖａｃｉｎａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２０１２  Ｏｃｔ；８（１０）：３７１４−２２を参照されたい。このアイテムは、以下のテストアイテムＢよりも有意に架橋される。それは、細胞浸潤に対してより適合しやすい傾向がある。
【００９１】
テストアイテムＢの作製：  トロポエラスチンが組み込まれたコラーゲンスポンジ
０．０５Ｍ酢酸（ｐＨ３．２）中で１０％ｗ／ｗトロポエラスチンと混合されたＩ型ウシコラーゲンの白色共沈物をフリーズドライにより高多孔性白色膜に変換した。液体窒素中で初期棚温度スナップ凍結を調整することにより、平均細孔直径の制御を達成した。続いて、乾燥固体を２４時間にわたり１０５℃および６ｋＰａ真空に暴露し、コラーゲンのポリペプチド鎖間に共有結合架橋を導入した。０．０５Ｍ酢酸中に０．２５％水性グルタルアルデヒドを含有する浴に構築物を浸漬し、コラーゲンをさらに共有結合架橋させた。構築物を２４時間にわたり脱イオン水中で濯いだ。Ｋａｎｅｍａｔｓｕ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００４  Ａｕｇ；２５（１８）：４５１３−２０を参照されたい。これは、以上のテストアイテムＡよりも耐分解性である傾向がある。
【００９２】
テストアイテムＣの作製：  トロポエラスチンゲルを下側に有するコラーゲンスポンジ
本質的に国際公開第２０１２０６８６１９号パンフレットに記載されるとおり、全長トロポエラスチンをヒアルロン酸ゲルに組み込んで、使用前にシリンジに充填した。ゲルを暴露創床の表面上に適用し、次いで、トロポエラスチンを省略したがテストアイテムＢに対して記載されたように生成されたコラーゲンスポンジで覆った。
【００９３】
実施例３：  ブタ穿刺皮膚モデルでの上皮再生の評価
背を横切って１０ヶ所までの２ｃｍ×２ｃｍ部位でブタをそれぞれ治療した。各部位に以下の３つの治療方法の１つを施した。
１）部位Ａ：  治療される皮膚領域を横切って約２ｍｍずつ離間させてマイクロコアリング針を用いて刺創を施した。針処置後、１％〜５％ｗ／ｖトロポエラスチンタンパク質を含有するゲルを治療領域に局所適用し、Ｔｅｇａｄｅｒｍドレッシングにより所定の位置に保持することにより、ゲルの維持および刺傷部位への移行を可能にした。
２）部位Ｂ：  皮下注射針を用いて刺創を施した。各刺傷は、皮膚組織の上側真皮中への０．０５〜０．５ｍｌの１〜５％ｗ／ｖトロポエラスチンゲルの注射を含んでいた。治療される皮膚領域を横切って約２ｍｍ離間させて刺傷／注射を施し、続いて、創傷ドレッシングを施した。
３）部位Ｃ：  クロスハッチング注射技術を用いて上側真皮中への０．５〜２ｍｌの１〜５％ｗ／ｖトロポエラスチンゲルの留置を施し、続いて、約２ｍｍ離間させてマイクロコアリング針を用いて治療領域を横切って刺創を施した。
【００９４】
０日目、７日目、および２８日目、写真撮影およびパンチ生検を行った。サンプルを病理組織診断および免疫組織化学分析に付して、線維芽細胞の浸潤、コラーゲンおよびエラスチンの沈着、再生組織の血管新生、ならびに上皮の再生を評価した。
【００９５】
実施例４：  ブタ皮膚モデルへのトロポエラスチンのレーザー支援送達後の上皮再生の評価
皮膚への局所適用薬剤の送達を支援する垂直チャネルをフラクショナルレーザーリサーフェイシングにより約３ｍｍの深さで皮膚内に形成する。背を横切って１０ヶ所までの２ｃｍ×２ｃｍ部位でブタをそれぞれ治療した。本質的にＨａｅｄｅｒｓｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０（Ｌａｓｅｒｓ  Ｓｕｒｇ  Ｍｅｄ．４２（２）：１１３−２２）により記載されるとおり、フラクショナルシングルホールＣＯ２レーザーを用いて各部位を治療した。レーザー処置に続いて、テスト部位に以下のいずれかを施した。
・  １〜５％ｗ／ｖトロポエラスチンを含有するヒアルロン酸ゲル、または
・  ヒアルロン酸ゲル対照
【００９６】
０日目、７日目、および２８日目、写真撮影およびパンチ生検を行った。サンプルを病理組織診断および免疫組織化学分析に付して、線維芽細胞の活性、コラーゲンおよびエラスチンの沈着、血管新生、ならびに上皮の再生を評価した。
【００９７】
参考文献
Ａｌｍｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２．Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ．Ｂｉｒｔｈ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｔ  Ｃ）９６：２４８−２５７。
【図１】
0006639587.tif 000004
【図２】
0006639587.tif 000005
【図３】
0006639587.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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