(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
醸造酵母を親株として、バルプロ酸又はその塩が存在し、かつイノシトールが存在しない条件下で少なくとも合計７日間培養する培養工程、及び培養後の酵母を回収する回収工程を含む、醸造特性が向上した酵母株の作出方法。
【請求項２】
酢酸イソアミル高生産性かつ酢酸低生産性の酵母株の作出方法である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
エタノール高生産性の酵母株の作出方法である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法により、醸造特性が向上した酵母を作出し、作出された酵母を用いてアルコール発酵を行うことを含む、アルコール飲料の製造方法。
【請求項５】
NITE P-02158の受託番号で寄託されている清酒酵母株。
【請求項６】
請求項５記載の清酒酵母株を用いてアルコール発酵を行うことを含む、清酒の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酢酸イソアミル生産性などの醸造特性が向上した酵母株の作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
清酒醸造において、原料米・麹からのイノシトール及び同六リン酸化物であるフィチン酸の持ち込みは、酵母の増殖を活性化する一方、吟醸香の主成分である酢酸イソアミル生産を抑制することが知られている。フィチン酸は米粒中心部に近づくほど減少するため、吟醸酒製造に低精米歩合米が適する理由の一つとなっている。
【０００３】
イノシトール過剰が酢酸イソアミルを減少させる理由は、酵母細胞内でのイノシトールの代謝産物であるホスファチジルイノシトール（イノシトール基含有グリセロリン脂質）による、アルコールアセチルトランスフェラーゼ（アセチル-CoAとイソアミルアルコールより酢酸イソアミルを合成する酵素）の直接阻害によるものとされる（非特許文献１）。
【０００４】
もっとも、醪において酵母が増殖するためにはイノシトールが必要であり、原料米からのフィチン酸の分解による供給に加え、酵母自身によるイノシトール生合成も増殖に重要な因子であることが報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
清酒の風味向上のアプローチの１つとして、酢酸イソアミル生産性の高い酵母の育種が従来より行われている。例えば、特許文献１には、アルコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を遺伝子工学的手法により高発現させた、酢酸イソアミル高生産性の形質転換酵母が開示されている。また、特許文献２には、ロイシンアナログ5’-5’-5’-トリフルオロロイシン耐性変異株・プレステロイドホルモンプレグノロン耐性変異株から酢酸イソアミル高生産性酵母株を選抜する酵母育種法が開示されている。酵母のイノシトール合成能・代謝能に着目した、遺伝子組換えを行わない実用的な清酒酵母育種は全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平０６−０６２８４９号公報
【特許文献２】特開２００２−１９１３５５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】古川, 2005; 神戸大院博士論文「清酒醪におけるイノシトールの成因と酵母の香気生成能およびエタノール耐性の促進に関する研究」, 農博-ろ-69
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、酢酸イソアミル生産性などの醸造特性が向上した醸造酵母を遺伝子組換えによることなく作出することができる新規な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述した通り、イノシトールは酵母による酢酸イソアミル合成を抑制するが、醪において酵母が増殖するためには原料米からの供給と酵母自身による生合成が重要であることから、イノシトールが酵母による酢酸イソアミル合成を抑制するといえども、イノシトール合成能ないしは代謝能が損なわれた清酒酵母は清酒製造に好ましく利用できるかどうか不明である。
【００１０】
分岐鎖脂肪酸バルプロ酸ナトリウムは、酵母に対してイノシトール及びホスファチジルイノシトール合成阻害作用を示す（Ju and Greenberg, 2003; Mol.Microbiol, 49: 1595-1603）とともに、アポトーシス様細胞死を誘導すること（Mitsui et al., 2005; FEBS, 579:723-727）が報告されている。本願発明者らは、バルプロ酸ナトリウム存在下で酵母の培養を繰り返すことにより、イノシトールが制限され、かつアポトーシス様細胞死が強く誘導される環境下でも長期生存が可能となった酵母株を複数株取得したところ、驚くべきことに、小仕込み試験に付した酵母株の全てにおいて、酢酸イソアミル高生産性、酢酸低生産性などの優れた醸造特性が確認された。これにより、イノシトール合成阻害剤や、酵母細胞内で唯一のイノシトール基を含む一次代謝産物と考えられるホスファチジルイノシトールの合成阻害剤を添加したイノシトール不含培地で酵母の培養を長期間続けることで、極めて高い確率で親株よりも醸造特性が向上した酵母株を取得できることを見出し、本願発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、醸造酵母を親株として、バルプロ酸又はその塩が存在し、かつイノシトールが存在しない条件下で少なくとも合計７日間培養する培養工程、及び培養後の酵母を回収する回収工程を含む、醸造特性が向上した酵母株の作出方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法により、醸造特性が向上した酵母を作出し、作出された酵母を用いてアルコール発酵を行うことを含む、アルコール飲料の製造方法を提供する。さらに、本発明は、NITE P-02158の受託番号で寄託されている清酒酵母株を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の清酒酵母株を用いてアルコール発酵を行うことを含む、清酒の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、イノシトール合成阻害剤などの阻害剤を添加したイノシトール不含培地で一定以上の期間醸造酵母を培養するという簡便な工程により、醸造特性が親株よりも向上した酵母株を極めて高い確率で取得することができる。本発明の方法により作出される酵母株は、香気成分である酢酸イソアミルの生産性が高く、かつ、オフフレーバーである酸臭の原因物質である酢酸の生産性が低いという、非常に優れた醸造特性を有する。加えて、該酵母株は、リンゴ酸・コハク酸の生産性が高く、発酵能（エタノール生産性）も高く、製成酒が低アミノ酸度となる。遺伝子組換えによらないため、本発明の方法で得られる酵母株はアルコール飲料生産への実用性が非常に高い。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例で取得したバルプロ酸処理長期生存変異株及び親株について、バルプロ酸ナトリウム（12.5 mM）存在下での生存率を調べた結果である。左は培養液のOD600値、右は酵母の生存率。
【図２】実施例で取得したバルプロ酸処理長期生存変異株及び親株について、オーレオバシジンA感受性を調べた結果である。変異株又は親株を懸濁して凝固させた寒天培地の中央にカップを設置してオーレオバシジンA溶液を注入し、30℃で72時間培養後、培地を写真撮影した。
【図３】実施例で取得したバルプロ酸処理長期生存変異株及び親株について、エタノール耐性を調べた結果である。定常期の各酵母を20%エタノールに懸濁して15℃で静置し、24時間毎に生存率を求めた。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の方法における培養工程では、イノシトール合成阻害剤及びホスファチジルイノシトール合成阻害剤から選択される阻害剤が存在し、かつ、イノシトールが存在しない条件下で醸造酵母を培養する。以下、本明細書において、上記の条件を「イノシトール制限条件」といい、イノシトール制限条件下での培養を「イノシトール制限培養」ということがある。
【００１５】
イノシトール合成阻害剤は、酵母においてイノシトールの合成を阻害する作用を有する物質であれば特に限定されない。具体例としては、バルプロ酸又はその塩（ナトリウム塩やカリウム塩など）、リチウム塩を挙げることができる（Deirdre L. Vaden et al., The Journal of Biological Chemistry, 18:4, 15466-15471 (2001)）。
【００１６】
イノシトールは酵母細胞内でイノシトール含有脂質であるホスファチジルイノシトールに代謝されるが、イノシトールの酵母細胞内での用途はホスファチジルイノシトール合成のみであると考えられている。そのため、本発明における培養工程では、ホスファチジルイノシトール合成阻害剤もイノシトール合成阻害剤と同様に利用することができる。ホスファチジルイノシトール合成阻害剤の具体例としては、イノスタマイシン（Masaya Imoto et al., Journal of Natural Product, 53:4, 825-829 (1990); Yuh Baba et al., Clinical & Experimental Metastasis, 18:3, 273-279 (2000)）を挙げることができるが、これに限定されない。
【００１７】
イノシトール制限条件下での培養は、少なくとも合計７日間行なう。例えば、少なくとも合計１０日間、少なくとも合計１２日間、少なくとも合計１４日間、又は少なくとも合計１６日間であり得る。合計培養日数を満たす限り、イノシトール制限条件下での培養は連続的に行ってもよいし、断続的に行ってもよい。すなわち、１回の連続的な培養としてもよいし、複数回に分けて（たとえば１日ずつ、あるいは数日ずつ）培養してもよい。また、培養工程は、少なくとも２日間、例えば少なくとも３日間、連続したイノシトール制限培養を含んでいてよい。
【００１８】
培養工程においては、イノシトール制限条件下での培養を断続的に実施することが好ましい。すなわち、イノシトール制限条件下での培養と、イノシトールを制限しない条件下（すなわち、イノシトール合成阻害剤が存在せず、かつイノシトールが存在する条件下）での復帰培養とを交互に実施することが好ましい。１回の復帰培養の期間は特に限定されず、１日でもよいし数日間行ってもよい。イノシトール制限培養から復帰培養に移る際は、酵母を集菌して滅菌水等で洗浄し、阻害剤を十分に除去することが望ましい。例えば、醸造酵母を前培養後、(1)１〜３時間程度の予備培養、(2)１〜数日間のイノシトール制限培養、(3)集菌・洗浄、(4)１〜数日間のイノシトール非制限培養、(5)集菌・洗浄、の(1)〜(5)を1サイクルとし、これを数サイクル繰り返すこととしてよい。初期のサイクルでは、イノシトール制限条件下では長期生存できない菌体が大半を占めるため、イノシトール制限培養期間は５日程度以内とすることが好ましいが、後期のサイクル、例えば最終サイクルにおいては、これを超える期間、例えば７〜１０日間程度まで、イノシトール制限培養期間を延長しても差し支えない。
【００１９】
イノシトール制限培養で用いる培地の組成は、イノシトール合成阻害剤及びホスファチジルイノシトール合成阻害剤から選択される阻害剤を含み、かつ、イノシトール不含（酵母エキスやポリペプトンなどのイノシトールを含有する培地成分も不含）である限り特に限定されず、例えば酵母用の培地として一般に用いられるyeast nitrogen base（YNB）を用いた合成培地に阻害剤を添加したものを用いればよい。
【００２０】
阻害剤の培地中濃度は適宜設定することができる。例えば、親株を阻害剤添加したイノシトール不含培地中で培養したときに、２〜３日目に大部分（例えば70％以上、又は80％以上、又は90％以上）が死滅する程度の濃度で阻害剤を用いることができる。あるいは、イノシトール制限培養と復帰培養のサイクルを数サイクル実施する場合には、最初のイノシトール制限培養において酵母菌体の大部分（例えば70％以上、又は80％以上、又は90％以上）が死滅する程度の濃度で阻害剤を用いることとしてもよい。具体的には、バルプロ酸又はその塩、リチウム塩の場合は培地中濃度5mM〜50mM程度、例えば10mM〜20mM程度でよく、イノスタマイシンの場合は1.5〜15μM程度でよい（例えば、Imoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 89, 315-322, March 1998など参照）。
【００２１】
イノシトール非制限培養におけるイノシトールの培地中濃度は100〜300 ppm程度でよい。
【００２２】
醸造酵母には、清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母、焼酎酵母等が包含される。好ましくは、醸造酵母は清酒酵母である。
【００２３】
親株として培養工程に付す醸造酵母としては、紫外線、エックス線、イオンビーム、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート等の変異原で処理されていない醸造酵母を好ましく用いることができる。もっとも、変異原で処理された醸造酵母をさらに本発明の方法に付し、酢酸イソアミル高生産性などの向上した醸造特性をさらに付与することも可能である。
【００２４】
上記の培養工程を実施した後、生存している酵母株を回収する。酵母菌体を含む液体培地を適宜希釈して寒天培地上に塗布し、一定時間培養して増殖したシングルコロニーをそれぞれ回収すればよい。
【００２５】
上記の培養工程を経て回収された醸造酵母は、イノシトール制限条件下でも長期生存が可能な株であり、極めて高い確率で、イソアミルアルコール高生産性を伴わない酢酸イソアミル高生産性、低アミノ酸度、リンゴ酸・コハク酸高生産性、酢酸低生産性、さらには高い発酵能（エタノール高生産性）を示す。従って、培養工程の後に培地から回収した酵母株は、さらなる選抜工程に付すことなく、酢酸イソアミル高生産性などの向上した醸造特性を示す酵母株、ないしはその候補株として取得することができる。
【００２６】
もっとも、上記培養工程を経た酵母株について、酢酸イソアミルの生産性や酢酸の生産性、リンゴ酸の生産性、コハク酸の生産性、発酵能（エタノールの生産性）等の醸造特性を親株と比較評価して選抜する選抜工程ないしは確認工程を実施しても差し支えない。醸造特性の評価は、簡便には、適当な合成培地やYPD培地を用いて培養し、各成分の生産量を測定することにより実施できる。より詳細な評価法としては、小スケールでの醸造試験（小仕込み試験）を挙げることができる。例えば、上記培養工程を経た酵母株及びもとの親株を用いて小仕込み試験を実施し、製成酒の成分を分析して、酢酸イソアミルの生産性、酢酸の生産性、リンゴ酸の生産性、コハク酸の生産性、エタノールの生産性等の少なくともいずれか１つの醸造特性を親株と比較すればよい。製成酒の成分分析は常法により実施できる。酢酸イソアミルについては親株よりも生産性が高いもの、酢酸については親株よりも生産性が低いもの、リンゴ酸やコハク酸などの有機酸については親株よりも生産性が高いもの、エタノールについては親株よりも生産性が高いものを、親株よりも醸造特性が向上したと判断して選抜すればよい。
【００２７】
なお、本発明において、「醸造特性が向上した」とは、酢酸イソアミル高生産性、酢酸低生産性、リンゴ酸高生産性、コハク酸高生産性、及びエタノール高生産性から選択される少なくとも１種の特性を示すことをいう。
【００２８】
清酒酵母等の醸造酵母において、リンゴ酸・コハク酸の生産性と酢酸の生産性には一定の関連があり、酢酸低生産性の醸造酵母株は多くの場合、リンゴ酸・コハク酸高生産性となることがこの分野において知られている。その理由の詳細は不明であるが、本願の作出方法で得られた酵母株でも、酢酸資化能の向上が確認されており、酢酸をリンゴ酸・コハク酸に変換していることが理由のひとつと推察される。従って、リンゴ酸及びコハク酸の高生産性の評価は、酢酸低生産性の評価によって代替することができると考えられる。従って、本発明において、培養工程を経て回収した酵母株について選抜工程（特に香味成分生成能の評価）を行う場合には、酢酸イソアミル生産性及び酢酸生産性のいずれか一方又は両者を評価することとしてもよい。発酵能の評価としてエタノール生産性を評価することも好ましい。
【００２９】
また、本発明の方法により取得される醸造酵母については、以下の性質が確認されている。
(1) イノシトール高要求性を示す。
(1-1) イノシトール添加条件での増殖能が親株よりも高く、かつ、イノシトール制限条件での増殖能が親株よりも低い。
(1-2) イノシトール制限条件での凝集性が高く、イノシトールの添加により凝集が解除される。
(2) 定常期のエタノール耐性が親株よりも高い。
(3) 酢酸の資化能が親株よりも高い。
【００３０】
上記培養工程を経て回収された酵母株が示す向上した醸造特性は、これらの性質によってもたらされていると推察される。従って本発明においては、上記した醸造特性の評価に代えて、あるいは醸造特性の評価と組み合わせて、上記培養工程を経た醸造酵母株について、イノシトール要求性や定常期のエタノール耐性などを評価して選抜する選抜工程を実施してもよい。
【００３１】
イノシトール要求性の評価を行う場合には、例えば、イノシトール(+)阻害剤(-)培地及びイノシトール(-)阻害剤(+)培地における増殖能を調べ（ここでいう「阻害剤」とは、イノシトール合成阻害剤又はホスファチジルイノシトール合成阻害剤である）、前者での増殖能が親株よりも高く、かつ後者での増殖能が親株よりも低い株を選択すればよい。この際に用いる阻害剤及びイノシトールの培地中濃度は、低濃度（例えば、上記培養工程の10分の1程度の濃度）であることが望ましい。
【００３２】
エタノール耐性の評価を行う場合には、例えば、定常期の酵母株を20％〜22％程度のエタノールを含む水溶液ないしは培地に懸濁し、清酒醸造における一般的な発酵温度である15℃程度のやや低温で静置し、一定時間経過後ないしは経時的（例えば２４時間毎）にサンプリングして寒天培地に播種してインキュベートし、生育したコロニーの数をカウントして生存率を評価すればよい。上記培養工程を経た酵母株とともに親株も評価し、生存率が親株よりも高い場合には、当該酵母株はエタノール耐性が高い、ないしは向上した株として選択することができる。
【００３３】
もっとも、上述した通り、上記培養工程を経た酵母株は極めて高い確率で酢酸イソアミル高生産性などの向上した醸造特性を示すため、このような選抜工程は必須ではない。
【００３４】
イノシトール制限条件下で長期生存が可能となった醸造酵母株においては、何らかの変異が生じ、それによって上記のような特性・性質を示すようになると推察される。変異の詳細は不明であるが、それによって本願発明の範囲が制限されるものではない。
【００３５】
本発明の方法により得られる酵母株を用いてアルコール発酵を行えば、風味の優れたアルコール飲料を製造することができる。遺伝子組換え操作を行うことなく醸造特性が向上した酵母株を得ることができるので、アルコール飲料生産への実用化にも有利である。アルコール飲料には、清酒、ビール、ワイン、焼酎等が包含され、中でも好ましい例として清酒を挙げることができるが、これに限定されない。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３７】
１．バルプロ酸処理長期生存変異株の取得
YPD培地（1% (w/v)酵母エキス、2% (w/v)ポリペプトン、2% (w/v)グルコース）で一晩前培養したきょうかい7号（K7）を遠心分離で集菌し、滅菌水で菌体を洗浄した。この菌体を0.1 OD600の密度で、4 mlの0.08% (w/v) complete supplement mixture (FORMEDIUM)を添加したイノシトール不含YNB合成培地（0.19% (w/v) yeast nitrogen base without inositol (FORMEDIUM)、0.5% (w/v)硫酸アンモニウム、2% (w/v)グルコース）に植菌し、30℃で2時間予備振盪培養（180 rpm。以下同様）した。その後、62.5 mM バルプロ酸ナトリウム（VPA）（和光純薬工業）を含む同培地1 mlを添加し（バルプロ酸ナトリウムの終濃度は12.5 mM）、30℃で3日間振盪培養（阻害剤処理）した。その後遠心分離で集菌し、滅菌水で洗浄した後、10 mlの200 ppmイノシトール含有YNB合成培地に懸濁して、30℃で2日間振盪培養（復帰培養）した。その後遠心分離で集菌し、滅菌水で菌体を洗浄した。この「予備培養→阻害剤処理→集菌・洗浄→復帰培養→集菌・洗浄」のサイクルをさらに3回行った（最終サイクルのバルプロ酸ナトリウム処理のみ、7日間行った）。最後の復帰培養後、この培養液を希釈してYPD寒天培地（2% (w/v)寒天を含むYPD培地）に塗布し、30℃で2日間培養後シングルコロニー単離して、バルブロ酸塩存在下でも長期生存可能となった変異株（K7-VPALS）を複数クローン取得した。
【００３８】
２．バルプロ酸処理長期生存変異株のイノシトール・VPA含有培地における増殖能
親株K7（n＝3）及び単離した変異株K7-VPALS 10クローン（それぞれn＝1）をYPD培地で一晩前培養し、0.01 OD600の密度で5 mlの20 ppmイノシトール含有YNB合成培地（イノシトール含有培地）または1 mMバルプロ酸ナトリウム（酵母細胞内のイノシトールの蓄積が約５０％に低下する濃度、Deirdre L. Vaden et al., The Journal of Biological Chemistry, 18:4, 15466-15471 (2001)参照）を含むイノシトール不含YNB合成培地（イノシトール制限培地）に植菌し、30℃で24時間振盪培養した。その後、OD600値を測定した。
【００３９】
結果を表１に示す。単離した変異株10クローン全てが、イノシトール制限培地（YNB(VPA+)）においては親株よりOD600値が低く、イノシトール含有培地（YNB(Ino+)）では親株より同値が高かった。この結果より、得られた変異株はイノシトール要求性が高く、親株K7よりイノシトール合成能または代謝能が低い可能性が示唆された。
【００４０】
【表１】
0006748884.tif 000002
【００４１】
表１中に示したK7-VPALS 10クローンのうち、K7-VPALS_6は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターにNITE P-02158の受託番号で寄託されている（寄託日：２０１５年１１月１１日）。
【００４２】
３．バルプロ酸処理長期生存変異株のバルプロ酸存在下での生存率
12.5 mM VPA を添加したイノシトール不含YNB合成培地に、変異株３クローン（表1のクローン1, 4, 6）及び親株K7を一定量植菌し、30℃で振盪培養した。24時間毎にOD600を測定するとともに、菌体をYPDプレートに塗布してコロニー数から生存率を求めた。
【００４３】
24時間毎のOD600及び生存率（％）を図１に示す。12.5 mMのVPA濃度条件下では、変異株は親株より圧倒的に生存率が高かった。VPAによる細胞死は、メタカスパーゼMca1pを介したアポトーシスであるとされることから（Mitsui et al.: FEBS Lett., 579, 723-757, 2005）、変異株はアポトーシス誘導され難いと考えられた。
【００４４】
４．バルプロ酸処理長期生存変異株のオーレオバシジンA感受性
イノシトールホスホセラミド（イノシトール基含有スフィンゴリン脂質）は酵母の生存に必須であり、オーレオバシジンAはこれを合成するAur1を阻害する（下記参照）。変異株のオーレオバシジンA感受性について調べた。
【００４５】
【化１】
0006748884.tif 000003
一定量の変異株（表1のクローン1）及び親株K7を0または20 ppmイノシトールを含むYNB合成寒天培地に懸濁し、凝固させた。プレートの中心に設置したカップに200μLの50μg/ml オーレオバシジンAを注入し、30℃で72時間培養した。
【００４６】
培養後の寒天培地の写真を図２に示す。イノシトール不含培地（Ino-）において、変異株K7-VPALSは親株よりオーレオバシジンA感受性が高かった。一方、イノシトール含有培地（Ino+）においては両者間でオーレオバシジンA感受性にほとんど差は見られなかった。オーレオバシジンAに対する高感受性は、Aur1の基質となるホスファチジルイノシトールの合成量が親株より少ないためと推定された。
【００４７】
５．バルプロ酸処理長期生存変異株のエタノール耐性
定常期の各酵母（変異株３クローン（表1のクローン1, 4, 6）、親株K7）を20%エタノールに懸濁し、15℃（清酒醸造における一般的な発酵温度）で静置した。24時間毎に、菌体をYPDプレートに塗布してコロニー数から生存率を求めた。
【００４８】
結果を図３に示す。変異株は定常期において親株よりもエタノール耐性が高く、死滅しづらいことが確認された。
【００４９】
６．バルプロ酸処理長期生存変異株の好気的条件下での酢酸資化能
酢酸を単一炭素源とした場合、酵母はグリオキシル酸回路を介してATP生産・糖新生を行う。一方、グルコース欠乏・アミノ酸リッチな条件下（YPA培地など）ではアミノ酸を分解して各種有機酸を合成し、TCA回路・グリオキシル酸回路の両方（主として前者）を介してATP生産・糖新生を行う（下記参照。Lee et al .: Yeast, 28, 153-166 (2011) より加筆・修正の上引用。下線は酢酸を単一炭素源として生育する際の必須遺伝子である。）。
【００５０】
【化２】
0006748884.tif 000004
【００５１】
酢酸を単一炭素源とする合成培地（YNB+Ace）、グルコース不含リッチ培地（YPA。酵母エキス、ポリペプトン、酢酸カリウムより成る培地）、グルコース含有合成培地（YNB+Glc）及びYPD培地に、変異株（表1のクローン1）及び親株K7を一定量植菌した。30℃で振盪培養し、一定時間毎にOD600を測定し、倍加時間（doubling time）及び増殖遅延期間（lag phase period）を求めた。
【００５２】
OD600の測定値より求めた倍加時間（doubling time）及び増殖遅延期間（lag phase period）を表２に示す。好気的条件下では、変異株は、酢酸を単一炭素源とするYNB+Ace培地でのみ、親株よりdoubling timeが短く、lag phase period も大幅に短縮されていた。本変異株ではグリオキシル酸回路が活性化していることが推測された。
【００５３】
【表２】
0006748884.tif 000005
【００５４】
７．バルプロ酸処理長期生存変異株の醸造特性
親株K7及び変異株K7-VPALS 3クローン（表1のクローン1, 4, 6）を清酒小仕込み試験に供した。仕込み・醸造条件は、α化米（精米歩合70%）72.8 g、乾燥麹（精米歩合70%）19.2 g、汲み水（0.052% 乳酸）174 ml、酵母添加量：〜2×109個、仕込み段数1段、発酵温度15℃、発酵期間25日、n＝3とした。発酵終了後、製成酒を遠心分離によって得、各種成分分析を行った。
【００５５】
＜各種成分の分析方法＞
各主成分の分析方法は、有機酸以外については国税庁所定分析法（訓令）、有機酸については木崎らの方法（貴醸酒の熟成における成分変化, 日本醸造協会誌, 93:148-152,1998）により行った。
【００５６】
製成酒の成分分析結果を下記表３に示す。得られた変異株K7-VPALS 3クローンは、親株K7と比してイソアミルアルコール高生産性を伴わない酢酸イソアミル高生産性を示し、加えて低アミノ酸度、リンゴ酸・コハク酸高生産性、酢酸低生産性を示した。酢酸はオフフレーバーである酸臭の原因物質であり、その低生産性酵母の育種法は、脂肪酸合成酵素阻害剤セルレニンの耐性変異株からの選抜法（後藤（山本）ら, 2000; J. Brew. Soc. Japan.,95:533-539）などが知られるが、報告事例は稀である。またK7-VPALS 3クローンによる製成酒はアルコール分がやや高く、25日という長期間の発酵であったにもかかわらず、ピルビン酸が約50 ppm検出されており、未だ発酵の余地を残しているものと考えられ、発酵能が向上していることも確認された。また、これらの変異株は上槽時の酵母生存率が高かったが、これは、上記で確認された定常期における高いエタノール耐性によるものと推察された。酢酸低生産性及びリンゴ酸・コハク酸高生産性は、グリオキシル酸回路の活性化による酢酸資化能の向上によりもたらされているものと推察された。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
これらの3クローンは、全分析項目においてほぼ同値をとっており、また表１の結果より1 mMバルプロ酸ナトリウムを含むイノシトール不含YNB合成培地及び20 ppmイノシトール含有YNB合成培地での増殖能はこれら3クローンを含む全10クローンで同じ傾向を示すことから、バルプロ酸塩処理長期生存変異株を選抜する本育種法では、本清酒小仕込み試験と同様の醸造特性を持つ変異株が極めて高確率で得られるものと思われる。
【００５９】
８．バルプロ酸処理長期生存変異株が有する変異に関する検討
ここで得られた変異株K7-VPALS （表1のクローン1）について、イノシトール不含培地中におけるイノシトール・ホスファチジルイノシトール合成関連遺伝子群（INO1, INO2, INO4, INM1, INM2, ITR1, ITR2, PIS1）の転写量を調べたところ、親株と比べて転写量に大きな差異は認められなかった。また、イノシトール・ホスファチジルイノシトール合成関連酵素（INO1, INM1, INM2, PIS1）のORFにも変異導入はされていないことが明らかとなった。すなわち、これらの変異株は正常なイノシトール合成能を保持していると推定され、表１の結果と合わせると、変異株はイノシトール代謝能が親株よりも低い可能性が考えられる。これら変異株がイノシトール高要求性を示す理由、ないしは原因変異遺伝子は目下不明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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