(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が培養される空間を持つ培養容器と、
前記空間へ細胞培養に必要な気体を循環させることができる循環フィルターと、を有し、
前記循環フィルターは、
前記培養容器の側面に設置され、前記空間と前記空間の外部とを連通させる管路、
前記管路の前記培養容器と反対側に位置する末端に設置されるバルブ、
及び前記バルブの内部に設置されるフィルターから構成され、
前記循環フィルターは、前記管路にクリップを装着して前記管路の密閉および開放を選択的に行えることができ、
前記培養容器は、前記クリップが前記管路に装着されて前記空間が密閉された状態での前記空間内への培養液の注入と細胞の接種、脱離、および取得を行うことを可能にし、前記クリップが前記管路から取り外されて前記空間が開放された状態での細胞の培養を可能にする、連続的に細胞を培養する装置であって、
前記空間が密閉された状態での前記注入または前記接種を行うために、前記培養容器の表面に１つ以上の密閉通路が設置されており、
前記密閉通路は、軟質のブロックから構成されて前記空間を密閉し、
注射器の針の刺入時に前記空間に対して流体、気体および細胞の搬出入を可能にするとともに、針が取り除かれると、前記密閉通路の弾性により前記空間が密閉されることを特徴とし、
前記空間が密閉された状態での前記脱離または前記取得を行うために、前記空間にはスクレーパーが設置され、前記スクレーパーの移動または回転によって細胞を掻き取り、
前記スクレーパーは、
外部の位置エネルギーによって移動が可能であること、あるいは、外部の機械的な力によって前記空間の内部表面に接触しながら回転または移動して細胞を掻き取ること、あるいは、磁力によって前記空間の内部表面に接触しながら回転または移動して細胞を掻き取ること、を特徴とし、
前記空間が開放された状態での細胞の培養のために、前記培養容器は、軟質素材からなり、
また、前記培養容器を保管する培養環境手段の内部に陰圧を発生させて前記培養容器の前記空間のサイズ変化を持つようにして、前記循環フィルターを介して培養環境手段内の前記培養容器の前記空間へ細胞の培養に必要な気体を供給することができるようにすることを特徴とし、
さらに、前記培養容器は複数備えられ、この複数の培養容器は前記循環フィルターを介して連続的に並列つなぎされ一体化して気体循環を可能にすることを特徴とする、連続的に細胞を培養する装置。
【請求項２】
前記循環フィルターを介して前記空間の内部へ循環するように出入りする気体は二酸化炭素および酸素の少なくとも１種以上を含むことを特徴とする、請求項１に記載の連続的に細胞を培養する装置。
【請求項３】
前記培養容器は、培養液の温度を０℃〜４２℃に維持する培養環境手段に保管され、生体細胞を培養させるようにすることを特徴とする、請求項１に記載の連続的に細胞を培養する装置。
【請求項４】
前記スクレーパーは、前記空間の前記底面に接触する下部面が複数のブレードを形成することを特徴とする、請求項１に記載の連続的に細胞を培養する装置。
【請求項５】
前記スクレーパーは、上部に培養溝を形成させることにより、培養液の充填および細胞培養を可能にすることを特徴とする、請求項１に記載の連続的に細胞を培養する装置。
【請求項６】
前記スクレーパーは、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリアセタール（ＰＯＭ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエステル（ＰＥＴ）、ポリメチルペンテン（ＰＭＰ）、アイオノマー（ＩＯ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）、ポリスチレン（ＰＳ）、メタクリル樹脂（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡｃ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、フェノール樹脂（ＰＦ）、尿素樹脂（ＵＦ）、メラミン樹脂（ＭＦ）、エポキシ樹脂（ＥＰ）、ポリウレタン（ＰＵＲ）、不飽和ポリエステル樹脂（ＵＰ）および金属から選ばれた材質であることを特徴とする、請求項１に記載の連続的に細胞を培養する装置。
【請求項７】
前記スクレーパーは、前記空間の前記底面に接触する下部面が複数のブレードを形成し、
前記ブレードは、稜角を持つように形成され、前記空間の底面との摩擦によって細胞を前記底面から脱離させることを特徴とする、請求項１に記載の連続的に細胞を培養する装置。
【請求項８】
細胞が培養される空間を持つ培養容器と、前記空間へ細胞培養に必要な気体を循環させることができる循環フィルターと、を有する細胞を培養する装置を準備する段階と、
密閉された前記培養容器の前記空間に培養液を注入した後、細胞を接種して細胞を培養する段階と、
前記培養容器の前記空間で培養された細胞の密度が基準値以上になると、前記付着した細胞を脱離させる段階と、
密閉された状態を維持する前記培養容器から脱離した細胞を収得する段階と、を含んでなる、連続的に細胞を培養する方法であって、
前記循環フィルターは、前記培養容器の側面に設置され、前記空間と前記空間の外部とを連通させる管路、前記管路の前記培養容器と反対側に位置する末端に設置されるバルブ、及び前記バルブの内部に設置されるフィルターから構成され、
細胞を離脱させる段階は、前記管路にクリップを装着して前記空間を密閉した状態で実施し、
細胞を培養する段階は、前記管路からクリップを取り外して前記空間を開放した状態で実施する、連続的に細胞を培養する方法であって、
前記空間が密閉された状態での前記注入または前記接種を行うために、前記培養容器の表面に１つ以上の密閉通路が設置されており、
前記密閉通路は、軟質のブロックから構成されて前記空間を密閉し、
注射器の針の刺入時に前記空間に対して流体、気体および細胞の搬出入を可能にするとともに、針が取り除かれると、前記密閉通路の弾性により前記空間が密閉されることを特徴とし、
前記空間が密閉された状態での前記脱離を行うために、前記空間にはスクレーパーが設置され、前記空間の内部に設置されたスクレーパーが機械的エネルギーまたは位置エネルギーによって移動しながら細胞を掻き取って前記空間の底部から脱離させるか、あるいは、前記空間の内部に設置されたスクレーパーが、前記培養容器の外部に配置された磁力を持つ手段と連動して前記空間の内部で移動しながら細胞を前記空間の底部から脱離させ、
また、前記空間が開放された状態での細胞の培養のために、前記培養容器は、軟質素材からなり、
前記培養容器を保管する培養環境手段の内部に陰圧を発生させて前記培養容器の前記空間のサイズ変化を持つようにして、前記循環フィルターを介して培養環境手段内の前記培養容器の前記空間へ細胞の培養に必要な気体を供給することができるようにすることを特徴とし、
さらに、前記培養容器は複数備えられ、この複数の培養容器は前記循環フィルターを介して連続的に並列つなぎされ一体化して気体循環を可能にすることを特徴とする、連続的に細胞を培養する方法。
【請求項９】
前記細胞を培養する段階は、
前記空間に培養液を注入する段階と、
前記培養液に細胞を接種する段階と、
前記細胞を培養液で増殖させる段階とから構成されることを特徴とする、請求項８に記載の連続的に細胞を培養する方法。
【請求項１０】
前記細胞を収得する段階は、脱離した細胞のうちの一部分を残し、残存した細胞を前記培養容器で繰り返し増殖することができるようにすることを特徴とする、請求項８に記載の連続的に細胞を培養する方法。
【請求項１１】
前記培養容器は、軟質素材からなり、
前記細胞を培養液で反復的に増殖させる段階は、
前記培養容器の前記空間を密閉した状態から開放した状態に転換した状態で、前記培養環境手段に前記培養容器を保管し、
前記培養環境手段の内部に供給される気体と陰圧によって前記培養容器の空間のサイズ変化を持つようにして、前記培養容器の内部に対して気体が繰り返し出入りすることを特徴とする、請求項８に記載の連続的に細胞を培養する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、連続的に細胞を培養する装置および方法に係り、さらに詳しくは、密閉性を保った状態で細胞及び培養液を注入、培養、脱離および収得することができるようにする、連続的に細胞を培養する装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養には、細胞が培養器に付着して増殖する単層培養（付着培養）や、細胞が浮遊状態で増殖する懸濁培養などがある。
【０００３】
ほとんどの動物細胞は、表面に付着して生長し、生長速度が微生物に比べて非常に遅いため、生産性が低く、培養途中で微生物によって汚染されやすい。
【０００４】
しかし、細胞平面付着培養において、既存の方法は、密閉性の維持が難しいため、一定期間の細胞収得過程後には汚染されやすいという問題を持っている。
【０００５】
また、培養細胞を実験室の外部へ移動させるときは、別個の密閉手段を備えなければならないが、未だ完全密閉が成功したことがなく、ほとんど容器を移して培養細胞を移動させる方法を採用している。
【０００６】
しかし、容器を移す場合は、もう１回の継代（ｐａｓｓａｇｅ）になるので、培養細胞の均一性を維持することが難しい。
【０００７】
一方、容器内に付着して培養された細胞を脱離するためには、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を使用する。
【０００８】
これらの酵素は付着面との連結面を溶かして細胞の付着を瓦解させるが、酵素処理に時間がかかるうえ、酵素の毒性により細胞の特性変化や死滅などが生ずるなど様々な問題を起こしている。
【０００９】
細胞の特性はトリプシン処理の回数で変化の程度を分類するが、これはトリプシンの使用が細胞特性を変化させる問題があるという証拠になる。
【００１０】
また、トリプシンを使用すると、培養容器の全面から付着細胞を脱離させる結果をもたらすので、常にこの過程後には一部の細胞を再付着させるための工程を必要とし、再付着確率は１０％以下と低い。
【００１１】
トリプシンを使用しないための方法としては、水の強いせん断力を利用する方法、平板や緩やかな曲面に適用可能なスクレーパーで掻き出す方法、温度反応液化／硬化型固体−液体、液体−固体素材を付着素材として用いる方法、トリプシンではなくコラゲナーゼを用いる方法などが多様に活用されているが、これらは細胞の回収率が低いか不均一であることや、細胞付着面積の制限などが問題となっている。
【００１２】
たとえば、細胞付着ビーズから水のせん断力のみを用いて脱離させる場合、強い渦流を利用しなければならないので、水の方向が均一でないため回収率が一定ではなく、ビーズ同士が衝突しながら、それらの間に挟まれた細胞が損傷を受けるという問題がある。
【００１３】
また、コラーゲン付着素材とコラゲナーゼを用いる場合は、細胞が二重以上積層されたとき、内側では酵素の影響を受けないため全く溶解しない細胞があるか、コラーゲンが全て溶けるまでにかかる時間の間、コラゲナーゼのトリプシン類似機能により細胞を溶かすこともできる危険性があるので、活用が容易ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
かかる問題点を解消するための本発明の連続的に細胞を培養する装置およびこれを用いた培養方法は、培養容器の密閉性を保ちながら、細胞および培養液を選択的かつ反復的に注入、培養、脱離および収得することができるようにして、収得過程で全培養細胞のうちの一部分を除いた細胞を収得し、培養容器の内部に残存している細胞の反復培養を可能とするとともに、培養細胞の汚染防止および均一性の確保を図ることができる。
【００１５】
そこで、本発明の目的は、培養容器を保管しながら細胞増殖の最適の培養環境を与える培養環境手段を用いて、最適の培養温度および細胞増殖に必要な気体を培養容器に供給することができるようにして、細胞培養の増殖性を向上させるようにすることにある。
【００１６】
また、本発明の目的は、密閉状態で培養容器の空間の底部に培養されている細胞を脱離させることができるようにすることにある。
【００１７】
また、本発明の目的は、密閉型の培養容器を用いて移動、保管および管理を容易にすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記目的を達成するために、本発明の連続的に細胞を培養する装置は、選択的に密閉状態を決定することが可能な空間を有する培養容器を用意するが、前記空間が密閉された状態で前記空間内へ培養液の注入と細胞の接種、脱離および収得を行うことを可能にするとともに、前記空間が開放された状態で細胞の培養を可能にする。
【００１９】
本発明によれば、細胞の収得過程で全培養細胞のうちの一部分を除いた細胞を収得し、培養容器の内部に残存している細胞の反復培養を可能にする。
【００２０】
本発明によれば、細胞の収得過程で全体培養細胞を収得した後、培養容器への培養液の注入と細胞の接種、培養、脱離および収得を繰り返し行うことができるようにする。
【００２１】
本発明によれば、前記培養容器には密閉通路を設置し、外部から流体、気体および細胞を空間の内部に対して搬入および搬出する。
【００２２】
本発明によれば、前記培養容器は、空間へ細胞培養に必要な気体を循環させることができる循環フィルターを設置する。
【００２３】
本発明によれば、前記空間にはスクレーパーが設置され、前記スクレーパーの移動によって細胞を掻き取って空間の底面から細胞を脱離させるように構成する。
【００２４】
本発明によれば、前記空間にはスクレーパーが設置されるが、前記スクレーパーの回転によって細胞を掻き取って空間の底面から細胞を脱離させるように構成する。
【００２５】
本発明によれば、前記密閉通路は培養容器の表面に１つ以上設置し、前記密閉通路は軟質のブロックから構成されて空間を密閉し、注射器の針の刺入時に空間に対して流体、気体および細胞の搬出入を可能にするとともに、針が取り除かれると、密閉通路の弾性によって空間が密閉される。
【００２６】
本発明によれば、前記循環フィルターを介して空間の内部へ循環するように出入りする気体は二酸化炭素および酸素の少なくとも１種を含む。
【００２７】
本発明によれば、前記循環フィルターは、培養容器の側面に設置される管路、前記管路の末端に設置されるバルブ、および前記バルブの内部に設置されるフィルターを含んでなる。
【００２８】
本発明によれば、前記培養容器は、培養液の温度を０℃〜４２℃に維持する培養環境手段に保管され、生体細胞を培養させる。
【００２９】
本発明によれば、前記培養容器を保管する培養環境手段の内部に陰圧を発生させて前記培養容器の空気のサイズ変化を持つようにして、循環フィルターを介して培養環境手段内の空間へ細胞培養に必要な気体を供給することができるようにする。
【００３０】
本発明によれば、前記培養容器は一つ以上備えられ、該複数の培養容器は前記循環フィルターを介して連続的に連結されて一体化して気体循環を可能にする。
【００３１】
本発明によれば、前記スクレーパーは、外部の位置エネルギーによって移動が可能である。
【００３２】
本発明によれば、前記スクレーパーは、外部の機械的な力によって空間の内部表面に接触しながら回転または移動して細胞を掻き出す。
【００３３】
本発明によれば、前記スクレーパーは、磁力によって空間の内部表面に接触しながら回転または移動して細胞を掻き出す。
【００３４】
本発明によれば、前記スクレーパーは、空間の底面に接触する下部面が複数のブレードを形成する。
【００３５】
本発明によれば、前記スクレーパーは、上部に培養溝を形成させることにより、培養液の充填および細胞培養を可能にする。
【００３６】
本発明によれば、前記スクレーパーは、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリアセタール（ＰＯＭ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエステル（ＰＥＴ）、ポリメチルペンテン（ＰＭＰ）、アイオノマー（ＩＯ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、メタクリル樹脂（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡｃ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、フェノール樹脂（ＰＦ）、尿素樹脂（ＵＦ）、メラミン樹脂（ＭＦ）、エポキシ樹脂（ＥＰ）、ポリウレタン（ＰＵＲ）、不飽和ポリエステル樹脂（ＵＰ）および金属から選ばれた材質を適用する。
【００３７】
本発明によれば、前記培養容器の外部の下部面に移動部材を近接させて移動させると、スクレーパーと移動部材とが磁力によって連動する。
【００３８】
本発明によれば、前記スクレーパーは、空間の底面に接触する下部面が複数のブレードを形成するが、前記ブレードは、稜角を持つように形成され、空間の底面との摩擦によって細胞を底面から脱離させる。
【００３９】
本発明によれば、前記スクレーパーは、空間の底面に接触する下部面が複数のブレードを形成するが、前記ブレードは、稜角が連設されるように形成され、空間の底面に対して接触または非接触するようにする。
【００４０】
本発明によれば、前記循環フィルターは、管路にクリップを装着して管路の密閉および開放を選択的に行えるようにする。
【００４１】
本発明の連続的に細胞を培養する方法は、密閉された培養容器の内部空間に培養液を注入した後、細胞を接種して細胞を培養する段階と；前記培養容器の空間で培養された細胞の密度が基準値以上になると、前記付着した細胞を脱離させる段階と；密閉された状態を維持する培養容器から脱離した細胞を収得する段階と；を含む。
【００４２】
本発明によれば、前記細胞を培養する段階は、前記空間に培養液を注入する段階と、前記培養液に細胞を接種する段階と、前記細胞を培養液で増殖させる段階とから構成される。
【００４３】
本発明によれば、前記培養液注入、細胞接種、細胞脱離および細胞収得段階は、密閉容器が常に密閉された状態で行われるようにして、収得後に細胞の安定的かつ反復的培養を可能にする。
【００４４】
本発明によれば、前記細胞を脱離させる段階は、空間の内部に設置されたスクレーパーが機械的エネルギーまたは位置エネルギーによって移動しながら細胞を掻き出して空間の底部から脱離させる。
【００４５】
本発明によれば、前記細胞を脱離させる段階は、空間の内部に設置されたスクレーパーが、培養容器の外部に配置された磁力を持つ手段と連動して空間の内部で移動しながら、細胞を空間の底部から脱離させる。
【００４６】
本発明によれば、前記細胞を収得する段階は、脱離した細胞のうちの一部分を残し、残存した細胞を培養容器で繰り返し増殖することができるようにする。
【００４７】
本発明によれば、細胞を培養液で増殖させる段階は、細胞を培養液に接種した後、培養環境手段に培養容器を保管して細胞を培養するが、前記培養環境手段は、０℃〜−４２℃の培養温度を有し、細胞培養に必要な気体を培養容器へ供給することができるようにして最適の培養環境を持たせる。
【００４８】
本発明によれば、前記細胞を培養液で増殖させる段階は、前記密閉容器の空間を密閉状態から開放状態に転換して前記培養環境手段に密閉容器を保管するが、培養環境手段の内部に供給される気体と陰圧によって培養容器の内部に対して気体が繰り返し出入りする。
【００４９】
本発明によれば、前記密閉容器は、外部に対して選択的に開閉されるようにするが、前記培養環境手段からの培養容器の搬出の際に、密閉容器の空間が外部と密閉された後で搬出および輸送されるようにする。
【発明の効果】
【００５０】
上述した問題点を解消するための本発明の連続的に細胞を培養する装置およびこれを用いた培養方法は、培養容器の密閉性を維持しながら、細胞および培養液を選択的且つ反復的に注入、培養、脱離および収得することができるようにして、収得過程で全培養細胞のうちの一部分を除いた細胞を収得し、培養容器の内部に残存している細胞の反復培養を可能にするとともに、培養細胞の汚染防止および均一性を確保することができる。
【００５１】
併せて、本発明の連続的に細胞を培養する装置およびこれを用いた培養方法は、培養容器を保管しながら、細胞増殖の最適の培養環境を与える培養環境手段を通じて、最適の培養温度および細胞増殖に必要な気体を培養容器へ供給することができるようにして、細胞培養の増殖性を向上させるようにする。
【００５２】
また、本発明の連続的に細胞を培養する装置およびこれを用いた培養方法は、密閉型の培養容器を介して移動、保管および管理を容易にするという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明の連続的に細胞を培養する装置を示す斜視図
【図２】本発明の連続的に細胞を培養する装置を示す縦断面図
【図３】本発明の連続的に細胞を培養する装置を示す横断面図
【図４】本発明の連続的に細胞を培養する装置を用いて細胞を培養する段階を示す流れ図
【図５】本発明の連続的に細胞を培養する装置を用いて細胞を培養する段階を示す流れ図
【図６】本発明の連続的に細胞を培養する装置を用いて細胞を培養する段階を示す流れ図
【図７】本発明の連続的に細胞を培養する装置を用いて細胞を培養する段階を示す流れ図
【図８】本発明の連続的に細胞を培養する装置を用いて細胞を培養する段階を示す流れ図
【図９】本発明の連続的に細胞を培養する装置を用いて細胞を培養する段階を示す流れ図
【図１０】本発明の連続的に細胞を培養する装置のスクレーパーの他の実施例を示す斜視図
【図１１】本発明の連続的に細胞を培養する装置のスクレーパーの様々な実施例を示す斜視図
【図１２】本発明の連続的に細胞を培養する装置を保管する培養環境手段を示す斜視図
【図１３】本発明の連続的に細胞を培養する装置の他の実施例を示す斜視図
【発明を実施するための形態】
【００５４】
以下、添付図面を参照して本発明の好適な一実施例を詳細に説明する。
【００５５】
まず、図面中、同一の構成要素または部品は、できる限り同一の参照符号で示していることに留意しなければならない。本発明を説明するにあたり、関連した公知の機能或いは構成に対する具体的な説明は、本発明の要旨を曖昧にしないために省略する。
【００５６】
図１は本発明の連続的に細胞を培養する装置を示す斜視図、図２は本発明の連続的に細胞を培養する装置を示す縦断面図、図３は本発明の連続的に細胞を培養する装置を示す横断面図、図４〜図９は本発明の連続的に細胞を培養する装置を用いて細胞を培養する段階を示す流れ図、図１０は本発明の連続的に細胞を培養する装置のスクレーパーの他の実施例を示す斜視図、図１１は本発明の連続的に細胞を培養する装置のスクレーパーの様々な実施例を示す斜視図、図１２は本発明の連続的に細胞を培養する装置を保管する培養環境手段を示す斜視図、図１３は本発明の連続的に細胞を培養する装置の他の実施例を示す斜視図である。
【００５７】
まず、図１〜図９に示すように、本発明の連続的に細胞を培養する装置は、多角形または円形に形成された培養容器１００が設けられる。
【００５８】
前記培養容器１００は、内部が密閉された空間１０１が形成される。
【００５９】
前記培養容器１００は、軟質のプラスチック材質からなり、外部の圧力または力によって空間１０１のサイズが可変となっている。
【００６０】
前記培養容器１００は、選択的に密閉状態を決定することが可能な空間を持つ培養容器１００を用意するが、前記空間１０１が密閉された状態で前記空間１０１内への培養液の注入と細胞の接種、脱離および収得を行うことを可能にし、前記空間が開放された状態で細胞の培養を可能にする。
【００６１】
また、細胞１１の収得過程で全培養細胞１１のうちの一部分を除いた細胞１１を収得し、培養容器１００の内部に残存している細胞１１の反復培養を可能にする。
【００６２】
また、細胞１１の収得過程で全体培養細胞を収得した後、培養容器１００への培養液の注入と細胞の接種、培養、脱離および収得することを繰り返し行えるようにする。
【００６３】
前記培養容器１００には、前述したような細胞１１の連続的培養を可能とするように密閉通路１１０と循環フィルター１２０がそれぞれ装着される。
【００６４】
まず、密閉通路１１０は、培養容器１００に設置され、空間１０１への培養液１２の注入、培養液１２への細胞１１の接種、細胞１１の収得過程を可能にする。前述した過程の進行状況でも、密閉容器は密閉状態が維持される。
【００６５】
つまり、前記密閉通路１１０は、前記培養容器１００の側面に設置し、外部から流体、気体および細胞１１を空間１０１の内部に対して搬入および搬出することができるようにする。
【００６６】
これを可能にするために、前記密閉通路１１０は培養容器１００の表面に設置し、前記密閉通路１１０は軟質のブロックから構成されて空間１０１に設置される。
【００６７】
このとき、前記密閉通路１１０を介した培養液１２と細胞１１の注入、および外部への細胞１１の収得過程は一般に注射器を用いる。
【００６８】
言い換えれば、注射器の針を密閉通路１１０を貫通して刺入した後、注射器の内部に充填された培養液１２を空間１０１に注入するか、或いは、前記培養容器１００内での培養後に脱離した細胞１１を注射器の陰圧を用いて注射器に吸い込んで外部への収得を可能にする。
【００６９】
また、培養液１２の注入または細胞１１の収得後、密閉通路１１０から針を取り外すと、密閉通路１１０の弾性によって密閉通路１１０自体が密閉されて空間１０１の密閉性を維持させることができる。
【００７０】
また、前記循環フィルター１２０は、培養容器１００の空間１０１内へ細胞１１の培養に必要な気体を注入するために設置される。
【００７１】
すなわち、前記培養容器１００は、細胞１１の培養の際に培養環境手段２００に保管されて適正の温度の提供を受けるとともに、細胞１１の培養に必要な気体の提供を受ける。
【００７２】
このとき、前記培養容器１００は、循環フィルター１２０を介して気体が空間１０１の内外部に対して出入りするようにする。
【００７３】
つまり、図１３に示すように、前記培養容器１００の空間１０１に対する気体の出入りは、培養環境手段２００の内部に陰圧を発生させて前記培養容器１００の空間１０１のサイズ変化を持つようにして、循環フィルター１２０を介して培養環境手段２００内の培養容器の空間１０１に対して細胞１１の培養に必要な気体が出入りできるようにする。
【００７４】
ここで、気体は二酸化炭素および酸素の少なくとも１種を含む。
【００７５】
前記循環フィルター１２０の具体的な構成は次のとおりである。
【００７６】
前記循環フィルター１２０は、培養容器１００の側面に設置される管路１２１、前記管路１２１の末端に設置されるバルブ１２２、および前記バルブ１２２の内部に設置されるフィルター１２３から構成する。
【００７７】
管路１２１にはクリップ１２４を装着することにより、管路１２１の密閉および開放を選択的に行えるようにする。
【００７８】
前記クリップ１２４は、培養容器１００を培養環境手段２００に保管するときには、管路１２１を開放させて空間１０１に対する気体の出入りを可能にし、前記培養環境手段２００から培養容器１００を搬出しようとするときには、クリップ１２４を用いて管路１２１を取り締まって密閉容器の空間１０１を密閉させる。
【００７９】
前記培養容器１００の空間１０１の底面に培養されている細胞１１は、付着力により脱離し難いので、細胞１１の脱離のための別途のツールであるスクレーパー１３０を空間１０１の内部に設置する。
【００８０】
すなわち、前記スクレーパー１３０は、機械的な外力または磁気または位置エネルギーなどを介して空間１０１の内部で回転または移動しながら、細胞１１を掻き取って空間１０１の底面から細胞１１を脱離させる。
【００８１】
特に、図１１に示すように、前記スクレーパー１３０は方形の培養容器に取り付けるように構成したが、細胞が付着可能な面を有する限り、円形、三角形などの多角形など培養容器の形状には制限がない。
【００８２】
まず、前記スクレーパー１３０及び機械的な外力を用いた細胞１１の脱離方法は、次のとおりである。
【００８３】
図１０に示すように、前記空間１０１の底面に中心軸１３３が回転可能に設置され、前記中心軸１３３は、培養容器１００の外部に露出する。該中心軸１３３の回転によってスクレーパー１３０を連動させることにより、空間１０１の底面で回転するスクレーパー１３０が摩擦しながら細胞１１を掻き取って脱離させる。
【００８４】
ここで、前記スクレーパー１３０の回転により細胞１１を脱離させようとする場合、前記培養容器１００は、円筒状に形成され、空間１０１の内周縁に沿ってスクレーパー１３０を中心軸１３３を基準に回転させて細胞１１を脱離させる。
【００８５】
また、磁力を用いた細胞１１の脱離方法は、次のとおりである。
【００８６】
別途に設けられた移動部材１４０を前記培養容器１００の下部外面に近接させるが、前記スクレーパー１３０に磁力で連結されるようにして、移動部材１４０の移動によってスクレーパー１３０を空間１０１の内部で連動させ、スクレーパー１３０が摩擦しながら細胞１１を掻き取って脱離させる。
【００８７】
つまり、スクレーパー１３０と移動部材１４０は、それぞれ金属体１３４または磁性体１４１を設置することにより、磁力によって相互一体に連動することができる。
【００８８】
位置エネルギーを用いた細胞１１の脱離方法は、培養容器１００を傾くように位置させ、自重を有するスクレーパー１３０が空間１０１の底面で滑りながら細胞１１を掻き取って脱離させる。
【００８９】
このように構成されたスクレーパー１３０は、上部に培養溝１３２を形成することにより、培養液１２の充填および細胞１１の培養を可能にする。
【００９０】
つまり、本発明の連続的に細胞１１を培養する装置は、培養液１２を空間１０１に注入し或いは空間１０１およびスクレーパー１３０の培養溝１３２に注入して、培養液１２への細胞１１の接種を行う。
【００９１】
前記スクレーパー１３０は、空間１０１の底面に接触する下部面が複数のブレード１３１を形成する。
【００９２】
ここで、前記スクレーパー１３０は、空間１０１の底面に接触する下部面が複数のブレード１３１を形成するが、前記ブレード１３１は、稜角を持つように形成され、空間１０１の底面との摩擦によって細胞１１を底面から脱離させる。
【００９３】
或いは、前記スクレーパー１３０は、空間１０１の底面に接触する下部面が複数のブレード１３１を形成するが、前記ブレード１３１は、稜角が連設されるように形成され、空間１０１の底面に対して接触または非接触するようにする。
【００９４】
また、前記スクレーパーは、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリアセタール（ＰＯＭ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエステル（ＰＥＴ）、ポリメチルペンテン（ＰＭＰ）、アイオノマー（ＩＯ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）、ポリスチレン（ＰＳ）、メタクリル樹脂（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡｃ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、フェノール樹脂（ＰＦ）、尿素樹脂（ＵＦ）、メラミン樹脂（ＭＦ）、エポキシ樹脂（ＥＰ）、ポリウレタン（ＰＵＲ）、不飽和ポリエステル樹脂（ＵＰ）および金属から選ばれた材質を適用する。
【００９５】
前述したように構成される培養容器１００は、一つ以上備えられ、前記循環フィルター１２０を介して連続的に並列つなぎする。
【００９６】
すなわち、図１３に示すように、複数の培養容器１００は順次並べる。一側に位置した培養容器１００を基準に隣接して並べられた培養容器１００に循環フィルター１２０を順次連結することにより、複数の培養容器１００は一側に位置した培養容器１００の循環フィルター１２０を介して一体化して気体の出入りを可能にする。
【００９７】
前述したように構成された培養装置を介して連続的に細胞を培養する方法は、次のとおりである。
【００９８】
密閉された培養容器１００の内部空間１０１に培養液１２を注入した後、細胞１１を接種して細胞１１を培養する段階と、前記培養容器１００の空間１０１で培養された細胞１１の密度が基準値以上になると、前記付着した細胞１１を脱離させる段階と、密閉された状態を維持する培養容器１００から脱離した細胞１１を収得する段階とを含んでなる。
【００９９】
まず、図４に示すように、細胞１１を培養する段階は、具体的に、前記空間１０１に培養液１２を注入する段階と、前記培養液１２に細胞１１を接種する段階と、前記細胞１１を培養液１２で増殖させる段階とから構成される。
【０１００】
細胞１１を培養液１２で増殖させる段階は、細胞１１を培養液１２に接種した後、培養環境手段２００に培養容器を保管して細胞を培養させる。
【０１０１】
このとき、前記培養環境手段２００は、０℃〜−４２℃の培養温度を有し、細胞１１の培養に必要な気体を培養容器へ供給することができるようにする。
【０１０２】
同時に、前記循環フィルターからクリップの圧迫を解除して管路を開放させる。
【０１０３】
前記培養環境手段２００は、内部へ細胞１１の培養に必要な気体を供給すると同時に、反復的に陰圧を発生させて培養容器１００の内部に対して気体が繰り返し出入りするようにする。
【０１０４】
すなわち、図６に示すように、前記培養容器１００は、軟質素材からなり、陰圧などの外部圧力により圧着されながら空間１０１のサイズが変化する。
【０１０５】
その後、空間１０１のサイズが弾力的に元の状態に戻りながら、培養環境手段２００の内部に存在する気体を空間１０１の内部に吸い込んで気体を出入りさせる。
【０１０６】
ここで、気体の出入りは、培養容器１００に設置された循環フィルター１２０を経て空間１０１に対して気体を出入りさせることにより行われる。
【０１０７】
特に、前記循環フィルター１２０はクリップ１２４を装着するが、前記クリップ１２４は、循環フィルター１２０を選択的に圧迫するか或いは圧迫解除させることにより、循環フィルター１２０の開閉状態を決定することができる。
【０１０８】
その後、前記培養環境手段２００内の培養容器１００で細胞１１の増殖が行われた後、前記細胞１１を収得するためにクリップ１２４を介して循環フィルター１２０を密閉させることにより、前記培養容器１００が密閉状態に転換されるようにする。
【０１０９】
次に、図８に示すように、前記培養環境手段２００から培養容器１００を搬出した後、スクレーパー１３０と磁力作用を有する移動部材１４０を培養容器１００の下部面に密着させた後、移動させると、空間１０１の内部に位置したスクレーパー１３０が連動し、空間１０１の底面に付着した細胞１１を掻き取って脱離させる。
【０１１０】
或いは、前記細胞１１を脱離させる段階は、空間１０１の内部に設置されたスクレーパー１３０が機械的エネルギーを介して回転および移動しながら、細胞１１を掻き取って空間１０１の底面から脱離させる。
【０１１１】
つまり、前記空間１０１の内部にスクレーパー１３０が中心軸１３３を介して回転可能に結合され、前記中心軸１３３は空間１０１の外部に露出する。前記中心軸１３３を回転させてスクレーパー１３０を連動させることにより、細胞１１を掻き取って空間１０１の底面から脱離させる。
【０１１２】
或いは、前記スクレーパー１３０が、位置エネルギーを介して移動しながら、細胞１１を掻き取って空間１０１の底部から脱離させる。
【０１１３】
すなわち、培養容器１００を傾くように位置させ、自重を持つスクレーパー１３０が空間１０１の底面で滑りながら細胞１１を掻き取って脱離させる。
【０１１４】
その後、培養液１２を注入した密閉通路１１０を除いた他の箇所の密閉通路１１０に注射器の針を刺入し、注射器の陰圧を用いて針を経て、培養された細胞１１を注射器に吸い込んで得る。
ここで、図９に示すように、前記細胞１１を収得する段階は、脱離した細胞１１のうちの一部分を残し、残存した細胞１１が反復増殖することができるようにする。
【０１１５】
前述したように、本発明の連続的に細胞１１を培養する方法では、前記培養液１２の注入、細胞１１の接種、細胞１１の培養、細胞１１の脱離および細胞１１の収得段階は密閉容器が常に密閉された状態で行われるようにして、収得後に細胞１１の安定的且つ反復的な培養を可能にする。
【０１１６】
以上で説明した本発明は、前述した実施例及び添付図面によって限定されるものではなく、本発明の技術的思想を外れない範囲内において、様々な置換、変形及び変更を加え得るのは、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者には明らかであろう。
【符号の説明】
【０１１７】
１０      培養装置
１１      細胞
１２      培養液
１００    培養容器
１０１    空間
１１０    密閉通路
１２０    循環フィルター
１２１    管路
１２２    バルブ
１２３    フィルター
１２４    クリップ
１３０    スクレーパー
１３１    ブレード
１３２    培養溝
１３３    中心軸
１３４    金属体
１４０    移動部材
１４１    磁性体
２００    培養環境手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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