(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＣＲが認識可能なペプチド配列を同定するための方法であって、
ｉ．複数の哺乳類細胞を提供すること、ここで
−  少なくとも２個の哺乳類細胞はライブラリーのメンバーを発現し；
−  前記ライブラリーの少なくとも２個のメンバーはトランスジェニック抗原受容体をコードし；
−  前記トランスジェニック抗原受容体は：
・  ＭＨＣ１またはＭＨＣ２の細胞外部位、
・  前記細胞外部位内に含まれるオリゴペプチド、ここで該オリゴペプチドは該ライブラリーの少なくとも２個のメンバーについて異なり、及びここで該オリゴペプチドはＴ細胞受容体による認識に適した方法で提示され、
・  Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の膜貫通部位、及び
・  ＴＣＲα鎖の細胞内部位及びＴＣＲβ鎖の細胞内部位、
を含み；
−  前記トランスジェニック抗原受容体はレポータータンパク質に機能的に連結しており、それによって、同種Ｔ細胞受容体の前記トランスジェニック抗原受容体への結合が前記レポーター遺伝子の活性化をもたらし、
ｉｉ．前記複数の哺乳類細胞をＴリンパ球の調製物と接触させること、
ｉｉｉ．前記レポータータンパク質の検出可能なレベルにしたがって、前記複数の哺乳類細胞から検出可能なレポータータンパク質を示す細胞を分離し、活性化細胞を得ること、
ｉｖ．前記活性化細胞からＤＮＡを単離すること、並びに
ｖ．前記トランスジェニック抗原受容体に含まれる前記オリゴペプチド配列の配列を決定すること、
を含む、ＴＣＲが認識可能なペプチド配列を同定するための方法。
【請求項２】
ＴＣＲが認識可能なペプチド配列を同定するための方法であって、
ｉ．哺乳類細胞を提供すること、ここで
−  前記哺乳類細胞はトランスジェニック抗原受容体を発現し；
−  前記トランスジェニック抗原受容体分子は
・  Ｔ細胞受容体による認識に適した方法で提示されたオリゴペプチドを含むＭＨＣ１またはＭＨＣ２の細胞外部位、
・  Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の膜貫通部位、及び
・  ＴＣＲα鎖の細胞内部位及びＴＣＲβ鎖の細胞内部位、
を含み；
−  前記トランスジェニック受容体は、レポータータンパク質と機能的に連結し、それによって、同種Ｔ細胞受容体の前記トランスジェニック抗原受容体への結合が前記レポーター遺伝子の活性化をもたらし、
ｉｉ．前記哺乳類細胞をＴリンパ球の調製物と接触させ、それによって、前記レポーター遺伝子の活性化により、活性化した哺乳類細胞を得ること、
ｉｉｉ．前記活性化した哺乳類細胞からＤＮＡを単離すること、並びに
ｉｖ．前記トランスジェニックキメラ抗原受容体中にコードされる前記オリゴペプチド配列の配列を決定すること、
を含む、ＴＣＲ認識ペプチド配列を同定するための方法。
【請求項３】
前記トランスジェニック抗原受容体が、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体であって、ここで
ａ．前記第１のポリペプチドは主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣクラスＩ）α鎖の細胞外部分を含み、及び前記第２のポリペプチドはβ２ミクログロブリン部位を含み、または、
ｂ．前記第１のポリペプチドは主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）α鎖の細胞外部分を含み、及び前記第２のポリペプチドは主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）β鎖の細胞外部分を含み、
ここで、前記第１及び前記第２のポリペプチド鎖の少なくとも１つは、さらに前記細胞外ＭＨＣ部位へ共有結合したオリゴペプチドを含み；前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドの１つは、さらにＴ細胞受容体α鎖の細胞内部位または細胞内尾部、膜貫通部位、及びヒンジ領域を含み、並びに、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドの他方は、Ｔ細胞受容体β鎖の細胞内部位、膜貫通部位及びヒンジ領域を含む、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体であって、ここで、
ａ．前記第１のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣクラスＩ）α鎖の細胞外部分を含み、及び前記第２のポリペプチドはβ２ミクログロブリン部位を含み、または、
ｂ．前記第１のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）α鎖の細胞外部分を含み、及び前記第２のポリペプチドは主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）β鎖の細胞外部分を含み、
前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドの１つは、さらにＴ細胞受容体α鎖の細胞内部位または細胞内尾部、膜貫通部位及びヒンジ領域を含み、並びに、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドの他方は、Ｔ細胞受容体β鎖の細胞内部位、膜貫通部位及びヒンジ領域を含む、
前記第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体。
【請求項５】
前記第１及び前記第２のポリペプチド鎖の少なくとも１つは、さらにＴ細胞受容体によって認識可能なオリゴペプチドを含み、前記オリゴペプチドは前記細胞外ＭＨＣ部位へ共有結合で連結する、請求項４に記載の第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体。
【請求項６】
ＭＨＣ分子の細胞外部分が、
ｉ．前記第１のポリペプチド部分を形成するＭＨＣクラスＩα１、α２及びα３の各々、または、
ｉｉ．前記第１のポリペプチド部分を形成するＭＨＣクラスＩＩα１及びＭＨＣクラスＩＩα２、並びに前記第２のポリペプチド部分を形成するＭＨＣクラスＩＩβ１及びＭＨＣクラスＩＩβ２部位、及び／または、
ｉｉｉ．ここでＭＨＣ分子の細胞外部分は、ＩＭＧＴ  ＨＬＡデータベースに記載されているヒト主要組織適合遺伝子複合体遺伝子ファミリーＨＬＡのメンバーから選択される、
を含む、請求項４又は５に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体。
【請求項７】
前記オリゴペプチド配列が、
ａ．該ＭＨＣα１部位配列の１、２、３、４又は５アミノ酸後に挿入され、及び／または
ｂ．前記オリゴペプチドが、長さが８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０または４０アミノ酸である、
請求項４〜６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体。
【請求項８】
配列番号００７に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド及び配列番号００８に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドを含む、請求項４〜７のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体。
【請求項９】
請求項４〜８のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体をコードする核酸分子。
【請求項１０】
細胞であって、
ｉ．請求項４〜８のいずれか１項に記載の該キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体、及び
ｉｉ．前記キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体に機能的に連結したエフェクター機能、を含む、前記細胞。
【請求項１１】
前記エフェクター機能が：
ｉ．レポータータンパク質、及び／または
ｉｉ．該キメラ抗原受容体ポリペプチドへ結合した細胞において、細胞死を誘導することができるタンパク質、
である、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記レポータータンパク質が：
ｉｉｉ．蛍光タンパク質、または
ｉｖ．ルシフェラーゼタンパク質、または
ｖ．抗生物質耐性遺伝子によってコードされるタンパク質、または
ｖｉ．Ｃｒｅリコンビナーゼ、または
ｖｉｉ．ＣＡＳ−９ヌクレアーゼ、または
ｖｉｉｉ．ＣＡＳ−９キメラ転写抑制因子または転写活性化因子
から選択される、
請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
抗原に対して反応性が低下しているＴリンパ球の調製物を得る方法であって、
ｉ．患者から得られたＴリンパ球の調製物を提供すること、
ｉｉ．前記Ｔリンパ球の調製物を、キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体を含む請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の細胞の調製物と接触させること、
ここで、前記細胞は、キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体へ結合した細胞において、エフェクター機能が細胞死を誘導することを特徴とする、
上記工程を含む、抗原に対して反応性が低下しているＴリンパ球の調製物を得る方法。
【請求項１４】
移植拒絶、１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病及び炎症性腸症候群を含む、自己免疫疾患または免疫機能不全の治療または予防に使用するための請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１５】
患者の抗原ペプチドに対する免疫応答を検出するための方法であって、
ｉ．請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の細胞を提供すること、ここで前記細胞は、前記キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体へ機能的に連結するレポータータンパク質を含み、
ｉｉ．前記患者の血液試料をエクスビボで提供すること、
ｉｉｉ．前記哺乳類細胞を前記血液試料へ接触させること、及び
ｉｖ．前記哺乳類細胞中の前記レポータータンパク質を検出すること、
上記工程を含む、
患者の抗原ペプチドに対する免疫応答を検出するための方法。
【請求項１６】
ｉ．レポータータンパク質の発現にしたがって、該哺乳類細胞を分離すること、
ｉｉ．前記分離した哺乳類細胞からＤＮＡを単離すること、及び
ｉｉｉ．請求項４〜８のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体中にコードされた抗原−ペプチドの配列を決定すること、
上記工程をさらに含む、
請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ほとんどのＴ細胞は、αβＴ細胞受容体（ＴＣＲｓ）を発現し、そして他の細胞上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示されたペプチド（エピトープ）の形で抗原を認識する。細胞傷害性Ｔリンパ球の該ＴＣＲｓは、体内のほとんどすべての細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるエピトープを認識する。ヘルパーＴ細胞の該ＴＣＲｓは、マクロファージ、樹状細胞及びＢ細胞を含む抗原提示免疫細胞の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるエピトープを認識する。Ｔ細胞によるエピトープの効率的な認識は、さらにＴ細胞表面の糖タンパク質が関与する：つまりＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子それぞれに結合する、細胞傷害性Ｔリンパ球上のＣＤ８（ＣＤ８＋Ｔ細胞）、及びヘルパーＴ細胞上のＣＤ４（ＣＤ４＋Ｔ細胞）である。ＴＣＲのエピトープへの結合は、Ｔリンパ球の核へシグナルを送り、Ｔ細胞応答を誘導することができる。
【０００２】
Ｔ細胞の抗原特異性の明瞭かつ効率的な同定は、効率的な免疫療法及び診断ツールの開発のための大きな可能性を担っている。特に：
−  採用されるＴ細胞治療の安全性を評価するのに役立つかもしれないし、
−  自己免疫疾患、癌の治療において及び新しいワクチンの開発において、新しいアプローチを可能にするかもしれない。
【０００３】
しかし、ＴＣＲｓはＭＨＣ−ペプチド複合体に低親和性で結合し、これはファージディスプレイ及び酵母ディスプレイの方法を非効率的にする。位置走査コンビナトリアルペプチドライブラリーのような代わりの方法はＴＣＲの交差反応性の利点を利用し、そしてペプチドプールを使用して、Ｔ細胞活性化をもたらすモチーフを定義する。類似の親和性制約は別として、これらの取り扱いにくい方法は擬陽性の結果を高確率で被る。ランダムペプチド配列を調べるため、同定したペプチドのモチーフは明瞭でないか、または天然タンパク質と明確な相同性を有さない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の根底にある課題は、インビトロ及びインビボにおける使用のためのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原性ペプチド特異性の直接的でかつ感受性の、偏りのない同定のための方法を提供することである。該課題は独立請求項の主題によって解決される。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１ａ】図１は、ＭＣＲ２センサー（ＭＨＣ  ＩＩ由来の細胞外部分を有するキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体）の構造及び抗原特異的反応性を示す。図１ａは、ＭＣＲ２及びＭＣＲ２とペプチド特異的ＴＣＲとの相互作用の模式図を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、ＢＥＫＯ胸腺細胞表面上でのＭＣＲ２（ｇｐ６１）の発現を示す。
【図１ｃ】図１ｃは、Ｇｐ６１特異的ＳｍａｒｔａまたはＯＶＡ特異的ＯＴ−ＩＩ  ＴＣＲトランスジェニックＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養したＢＥＫＯ細胞中のＭＣＲ２（ｇｐ６１）（左図）またはＭＣＲ２（ＯＶＡ）（右図）のダウンレギュレーションのタイムコースを示す。値は、共培養開始時の平均蛍光強度に対する割合として示したＭＣＲ２レベルを示す。
【図１ｄ】図１ｄは、ＳｍａｒｔａまたＯＶＡ特異的ＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養したＭＣＲ２（ｇｐ６１）またはＭＣＲ２（ＯＶＡ）を形質導入したＨ１８．３．１３細胞中のペプチド特異的ＮＦＡＴ活性（ＧＦＰ発現）のタイムコースを示す。ヒストグラムは、示された時点でのＭＣＲ２（ｇｐ６１）＋細胞におけるＮＦＡＴ活性化測定値の例を示す。
【図１ｅ】図１ｅは、ペプチド特異的レポーター細胞の感受性を示す。ＭＣＲ２（ｇｐ６１）＋Ｈ１８．３．１３細胞をＭＣＲ２（ＯＶＡ）＋Ｈ１８．３．１３細胞で希釈し、そして未処理（三角）または、Ｓｍａｒｔａ  ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した後（四角）のＮＦＡＴ活性を測定した。グラフは、ＧＦＰ＋Ｈ１８．３．１３細胞の割合とＭＣＲ２（ｇｐ６１）を有する細胞の割合との間で線形相関（Ｒ＞９９）を示す。
【図１ｆ】図１ｆは、ＭＣＲ２＋レポーター細胞における強固なＮＦＡＴ活性化を誘導することができるペプチド特異的Ｔ細胞の最小頻度を示す。Ｓｍａｒｔａ及びＯＴ−ＩＩトランスジェニックマウスの由来の脾細胞を異なる比率で混合し、ＭＣＲ２（ｇｐ６１）＋またはＭＣＲ２（ＯＶＡ）＋Ｈ１８．３．１３細胞を刺激するために使用した。グラフは、共培養８時間後のペプチド特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合の関数としてＭＣＲ２（ｇｐ６１）＋Ｈ１８．３．１３細胞またはＭＣＲ２（ＯＶＡ）＋  Ｈ１８．３．１３細胞の中のＧＦＰ＋細胞の割合を示す。
【図１ｇ】図１ｇは、レポーター細胞において応答を惹起することができるペプチド特異的Ｔ細胞の最小数を示す。異なる数のＳｍａｒｔａまたはＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４＋細胞と一晩共培養したＭＣＲ２（ｇｐ６１）＋（左図）及びＭＣＲ２（ＯＶＡ）＋（右図）Ｈ１８．３．１３細胞におけるＮＦＡＴ活性化である。
【図１ｈ】図１ｈは、ＭＣＲ２（ｇｐ６１）＋Ｈ１８．３．１３細胞の活性化によって検出された感染マウスの血液中（ｎ＝３）のＬＣＭＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の動態を示す。感染後の異なる日に採取した血液と一晩共培養後のＧＦＰ＋レポーター細胞の割合を示している。未処理のＳｍａｒｔａマウス由来の血液は陽性対照として使用した。
【図２ａ】図２は、ｇｐ６１ミモトープのスクリーニングを示す。図２ａは、ＲＳＳ組換えシグナル配列、ＭＣＲ２（ｇｐ６１−ＲＳＳ）ミモトープライブラリーの作成（材料及び方法参照）に基づく、ＲＡＧを介したペプチドランダム化のスキームを示す。
【図２ｂ】図２ｂは、ライブラリーにおいて見出された改変したｇｐ６１配列の例（新しいアミノ酸配列は灰色で示している）。
【図２ｃ】図２ｃは、ＭＣＲ２（ｇｐ６１−ＲＳＳ）ライブラリーまたは、対照としてＭＣＲ２（ｇｐ６１）若しくはＭＣＲ２（ＯＶＡ）をＮＦＡＴ−ＦＴレポーターを有する１６．２ｃ１１細胞への形質導入、及びＳｍａｒｔａまたはＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４＋Ｔ細胞ハイブリドーマとの共培養を示す。Ｇｐ６１特異的Ｓｍａｒｔａハイブリドーマ（上部右パネル）と９時間共培養後ＮＦＡＴ活性化（青色ＦＴ蛍光）を示す単一のＭＣＲ２（ｇｐ６１−ＲＳＳ）＋細胞を単離し、増殖させた。
【図２ｄ】図２ｄは、Ｓｍａｒｔａハイブリドーマ（上部右パネル）と共培養したＭＣＲ２（ｇｐ６１）＋１６．２ｃ１１細胞、ＭＣＲ２（ｇｐ６１Ｓ）＋１６．２ｃ１１細胞及びＭＣＲ２（ｇｐ６１Ｎ）＋１６．２ｃ１１細胞の活性化を示す。
【図２ｅ】図２ｅは、元のｇｐ６１及びＭＣＲ２（ｇｐ６１−ＲＳＳ）ライブラリーにおいて発見された２つの新しいｇｐ６１ミモトープの配列を示す。
【図２ｆ】図２ｆは、異なる濃度のｇｐ６１ミモトープでパルスした樹状細胞と３日間共培養後、Ｓｍａｒｔａ  ＣＤ４＋Ｔ細胞で希釈したＣＦＳＥ（ヒストグラム）及び１００ｎＭの濃度でのサイトカイン産生（ドットプロット）を示す。
【図３ａ】図３は、新しいＬＣＭＶエピトープの探索を示す。図３ａは、ＬＣＭＶに感染したマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞をｐ．ｉ．５日目または８日目の脾臓から精製し、ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターを有するＢＷ５１４７細胞と融合させた。得られたハイブリドーマの反応性は、ＬＣＭＶまたはｇｐ６１をパルスした樹状細胞と共培養後のＧＦＰの発現によって決定した。図３ａは、異なる型の反応性の例のヒストグラムである（ＬＣＭＶ−色なし、またはｇｐ６１−中がダークグレイ色）。
【図３ｂ】図３ｂは、ＬＣＭＶに感染したマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞をｐ．ｉ．５日目または８日目の脾臓から精製し、ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターを有するＢＷ５１４７細胞と融合させた。得られたハイブリドーマの反応性は、ＬＣＭＶまたはｇｐ６１をパルスした樹状細胞と共培養後のＧＦＰの発現によって決定した。図３ｂは、データを要約した表である。
【図３ｃ】図３ｃは、自然発生するペプチド（ＮＰＬｓ）を濃縮したライブラリーを構築するためのクローニング戦略のスキームを示す。ＯＲＦ−オープンリーディングフレームは、天然のタンパク質の配列を指示する。
【図３ｄ】図３ｄは、ＭＣＲ２（ＬＣＭＶ−ＮＰＬ）＋１６．２ｃ１１レポーター細胞の、未知のペプチド特異性のＬＣＭＶ−反応性ハイブリドーマ（Ｈ２、Ｈ３、Ｈ１４及びＨ３０）との共培養を示す。活性化したレポーター細胞を単離し、増殖し、そして対応するハイブリドーマと再び共培養した。十分な濃縮を達成するために、この操作を３回繰り返した。ドットプロットは、２〜３回共培養後のＮＦＡＴ活性化の例を示す。
【図３ｅ】図３ｅは、３回目の濃縮後、単一細胞を単離し、増殖し、そしてそれらの反応性をハイブリドーマとの共培養によって確認した（ヒストグラムはＮＦＡＴ反応性の例を示す）。右の表は、反応性クローンの頻度を示している。主要なＮＰ３１１エピトープ及び新しいＮＰ５４７エピトープを表す、ＭＣＲ２構成物由来のペプチド配列を下に示す。
【図４】図４は、Ｈ１８．３．１３レポーター細胞株へ形質導入したＭＣＲ１（ＭＨＣＩ；ｇｐ３３／Ｈ２−Ｈｂ由来の細胞外部分を有する、キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体）分子の機能試験を示す。（Ａ）αＭＨＣ−Ｉ抗体で被覆したウェルで一晩培養した後、ＭＣＲ−１形質導入した細胞においては、ＮＦＡＴ活性化は誘導されたが、対照細胞では誘導されなかった。
【図５ａ】図５ａは、ハイブリドーマＨ３及びＨ４との共培養によって、１回、２回、３回の濃縮後のＭＣＲ２（ＬＣＭＶ−ＮＰＬ）＋１６．２ｃ１１細胞の活性化を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、最終共培養後、ハイブリドーマＨ９を用いたランダムペプチドＭＣＲ２ライブラリーのスクリーニングに由来するＭＣＲ２＋１６．２ｃ１１クローンの活性化の例を示している。Ｈ９反応性ペプチドの濃縮前後のライブラリーから回収された配列の例を示す。
【図６ａ】図６はＭＣＲ２センサーのペプチド特異的反応性及び感受性を示す。図６ａは、対照としてＳｍａｒｔａ  ＣＤ４＋Ｔ細胞で、またはＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４＋Ｔ細胞で共培養したＭＣＲ２（ＯＶＡ）＋Ｈ１８．３．１３細胞中のペプチド特異的ＮＦＡＴ活性化（ＧＦＰレポーター発現）のタイムコースを示す。
【図６ｂ】図６ｂは、ペプチド特異的レポーター細胞の感受性を示す。ＭＣＲ２（ＯＶＡ）＋Ｈ１８．３．１３細胞を、ＭＣＲ２（ｇｐ６１）＋Ｈ１８．３．１３細胞で希釈し、そしてＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４＋Ｔ細胞で共培養後にＮＦＡＴ活性化を測定した。グラフは、ＧＦＰ＋Ｈ１８．３．１３細胞の割合とＭＣＲ２を有する細胞の割合との間で線形相関（Ｒ＞０．９９）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
用語及び定義
アミノ酸配列はアミノ末端からカルボン酸末端へ向かって与えられる。配列位置についての大文字記載は１文字コードのＬ−アミノ酸を指す（ストライヤー，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版ｐ．２１）。アミノ酸配列位置について小文字の記載は対応するＤ−または（２Ｒ）−アミノ酸を指す。
【０００７】
本発明の文脈において、同一性または配列同一性という用語は、遺伝子学及び生物情報学の分野において公知のその意味で使用される；それらは、位置ごとの配列比較結果を表す単一の定量的パラメーターを指す。配列比較の方法は当該分野で公知である；公開されているＢＬＡＳＴアルゴリズムが一例である。
【０００８】
アミノ酸配列の比較について、そのような例の１つは、以下のようなデフォルト設定を使用するＢＬＡＳＴＰアルゴリズムである：期待閾値：１０；ワードサイズ：３；クエリ範囲内の最大一致：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在１１，拡張１；構成調整：条件付き構成スコアマトリックス調整。更なる詳細がない場合は、これらの設定は以下に示すアミノ酸同一性値の決定について使用される。
【０００９】
核酸配列の比較について、そのような例の１つは、以下のようなデフォルト設定を使用するＢＬＡＳＴＮアルゴリズムである：期待閾値：１０；ワードサイズ；２８；クエリの範囲内の最大一致：０；マッチ／ミスマッチスコア：１．−２；ギャップコスト：リニア。さらなる詳細がない場合、これらの設定は、以下に示す核酸配列同一性値の決定に使用される。
【００１０】
本明細書の文脈において、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）という用語は、細胞生物学及び生化学の分野において公知のその意味で使用される；それは、Ｔ細胞受容体による認識について適した方法で、タンパク質の断片であるペプチドを提示する細胞表面分子を指す。免疫システムによって認識されるペプチドは本明細書の文脈においては、エピトープまたは抗原ペプチドまたはオリゴペプチドと呼ばれる。
【００１１】
ＭＨＣ分子には、２つの主要なクラスがある：クラスＩ及びクラスＩＩ。
【００１２】
ＭＨＣクラスＩは、α１、α２、α３の３つの部位を含むα鎖として存在する。該α３部位は非ＭＨＣ分子β２ミクログロブリンと相互作用する。表示または提示されるペプチドは、α１／α２ヘテロ二量体の中央部分にあるペプチド結合溝によって保持される。該α３サブユニットは、該ＭＨＣクラスＩ分子を細胞膜へ固定する膜貫通部位を含む。
【００１３】
ＭＨＣクラスＩＩは、α及びβの２つの鎖で形成され、それぞれα１及びα２並びにβ１及びβ２の２つの部位を有する。該ペプチド結合溝（ペプチドエピトープを提示または表示するＭＨＣクラスＩＩ分子によって形成される構造要素）は、α１及びβ１のヘテロ二量体によって形成される。該α２及びβ２サブユニットはＭＨＣクラスＩＩ分子を細胞膜へ固定する膜貫通部位を含む。
【００１４】
ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子はそれらの未成熟型において、新しい合成タンパク質の大部分のようなシグナルペプチドを含み、それは分泌経路へ向かうようになっている。該ＭＨＣシグナルペプチド配列はＭＨＣ  ｍＲＮＡ分子上のＭＨＣα１部位の上流（５’）に位置する。シグナルペプチドを切断後、該ＭＨＣ分子は成熟ＭＨＣ分子と呼ばれる。
【００１５】
本明細書の文脈において、β２ミクログロブリン部位という用語は、細胞生物学及び生化学の分野において公知のその意味で使用される；それは、ＭＨＣクラスＩヘテロ二量体分子の一部である非ＭＨＣ分子を指す。言い換えれば、それはＭＨＣクラスＩヘテロ二量体のβ鎖を構成する。
【００１６】
本明細書の文脈において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）という用語は、細胞生物学及び生化学の分野において公知のその意味で使用される；これは主要組織適合遺伝子複合体分子に結合する抗原を認識することができるＴ細胞の表面上に見出される分子を指す。ＴＣＲは高可変のα及びβ鎖で構成されるジスルフィド架橋膜固定のヘテロ二量体である。それぞれの鎖は、可変（Ｖ）領域及び定常（Ｃ）領域の２つの細胞外部位を含む。該可変領域はペプチド−ＭＨＣ複合体へ結合する；該定常領域は、細胞膜の近位にあり、ヒンジ領域、膜貫通領域及び短い細胞質尾部が続く。
【００１７】
本明細書の文脈において、Ｔ細胞受容体複合体という用語は、細胞生物学及び生化学の分野において公知のその意味で使用される；該用語は、ＣＤ３ε／δ及びＣＤ３γ／εの２つのヘテロ二量体シグナル分子、並びにＣＤ２４７ζ／ζ（ＴＣＲζ鎖またはゼータ鎖として知られる）のホモ二量体と、ヘテロ二量体ＴＣＲα／βとの八量体複合体を指す。各サブユニットの膜貫通部位中のイオン化可能な残基は、複合体を共に保持する相互作用の極性ネットワークを形成する。ＴＣＲα／βの細胞質尾部は非常に短いため、シグナル伝達に関与せず、これらのシグナル伝達分子は、誘導されたＴＣＲから細胞へのシグナル伝達において、不可欠である。細胞質膜下流の最も一般的な分子活性化または分子制御についての機構は、プロテインキナーゼによるリン酸化／脱リン酸化を介する。ＣＤ３及びＣＤ２４７ζの細胞内部分は、チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーによる標的となる免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。
【００１８】
本明細書の文脈において、機能的に連結されるという用語は、２つの異なる機能の活性状態の関連を指す。例えば、受容体ポリペプチド（機能１）はレポーター遺伝子及びそのプロモーター（機能２）へ機能的に連結されてもよい；それから、該受容体が活性状態を変化する（例えば活性化する）場合、該レポーター遺伝子のプロモーターもその活性状態を変化させ（例えば活性化）、レポーター遺伝子を転写する。そのような非限定的な例の１つとしては、当該分野で公知の活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）シグナル経路がある。Ｔ細胞においての天然ＴＣＲの活性化（機能１）は、ＮＦＡＴ標的遺伝子（機能２）の発現をもたらすＮＦＡＴ転写因子の核移行を開始するプロテインキナーゼ及びホスファターゼの活性化をもたらす。言い換えれば、ＴＣＲは、ＮＦＡＴ標的遺伝子の発現に機能的に連結されている。
【００１９】
本明細書の文脈において、レポーター遺伝子の活性化という用語は、レポーター遺伝子の活性状態の変化を指す。そのような活性状態の変化の例のひとつとしては、レポーター遺伝子のプロモーターの活性化である。該活性化は、レポーター遺伝子の転写／翻訳の増加をもたらす。別の例では、レポータータンパク質の阻害剤の切断により、結果として活性レポータータンパク質の量を増加させる。
【００２０】
本明細書の文脈において、トランスジェニックという用語は、細胞生物学の分野において公知のその意味で使用される；該用語は、外因性核酸配列が生体に導入され、この生体で内在的に所有していない新しい特性を示すことを指す。
【００２１】
本明細書の文脈において、抗原受容体という用語は、細胞生物学及び免疫学の分野において公知のその意味で使用される；該用語は抗原またはエピトープに結合できる表面受容体を指す。抗原受容体の例では、Ｂ細胞受容体及びＴ細胞受容体である。
【００２２】
本明細書の文脈において、キメラ抗原受容体という用語は、抗原受容体の部分を有する人工的に設計された受容体を指す。非限定的な例としては、ＭＨＣ部位及び／または抗原ペプチド配列へ融合させた、Ｔ細胞受容体またはＢ細胞受容体由来の部位を含むハイブリッド受容体がある。
【００２３】
本明細書の文脈において、オリゴペプチド又はオリゴペプチド配列という用語は、もっぱらＴ細胞活性オリゴペプチドを指し、該Ｔ細胞活性オリゴペプチドは、細胞上のＭＨＣ分子に関して提示されるとき、同種Ｔ細胞受容体によって認識される場合、Ｔ細胞応答を誘発し得る。本発明の（より長い）ポリペプチド中に含まれるオリゴペプチド配列について言及する場合、当業者は、ＭＨＣ分子上に提示された時にＴＣＲによって認識することができるオリゴペプチド配列を指すことは理解するであろう。該オリゴペプチド配列は、該ＭＨＣ提示Ｔ細胞活性ペプチドに加えて、ＭＨＣ分子にＴ細胞活性ペプチドを適合させ得る様々なアミノ酸リンカーも含む。リンカーの長さ及び配列の例を以下に示す。
【００２４】
本発明の第１の側面において、ＴＣＲが認識するペプチド配列の同定のための方法を提供し、その方法は、以下の工程を含む：
ｉ．複数の哺乳類細胞を提供することであり、ここで、
−  該複数の哺乳類細胞の各々は、ライブラリーのメンバーを発現し、
−  該ライブラリーの各メンバーは、トランスジェニック抗原受容体分子をコードし、
−  該トランスジェニック抗原受容体分子は、
・ＭＨＣ１またはＭＨＣ２の細胞外部位、
・該細胞外部位配列のポリペプチド配列中（配列中という用語は、該オリゴペプチドが細胞外部位配列のＮ及びＣ境界の間のいずれかに、またはその各末端のいずれかに含まれ得ることを意味する。）に含まれるオリゴペプチド、ここで該オリゴペプチドは該ライブラリーの各メンバーについて異なり、及びここで、該オリゴペプチドはＴ細胞受容体による認識に適した方法で提示され、
・Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の膜貫通部位、及び
・ＴＣＲの細胞内部位、
を含み、
−  前記トランスジェニック抗原受容体分子はレポータータンパク質に機能的に連結しており、これにより同種Ｔ細胞受容体の該トランスジェニック抗原受容体への結合がレポーター遺伝子の活性化をもたらす。
ｉｉ．複数の哺乳類細胞を、Ｔリンパ球の表面に発現するＴ細胞受容体を介して該トランスジェニック抗原受容体中に含まれるオリゴペプチド配列へ結合可能なＴリンパ球の調製物と、接触させること。
ｉｉｉ．検出可能なレポータータンパク質のレベルにしたがって、前記複数の哺乳類細胞から検出可能なレポータータンパク質を有する細胞を分離し、活性化細胞を得ること。
ｉｖ．該活性化細胞から発現したライブラリーメンバーをコードするＤＮＡを単離すること。
ｖ．該活性化細胞中で発現したトランスジェニック抗原受容体中に含まれるオリゴペプチド配列の配列を決定すること。該オリゴペプチドの決定された配列は該ＴＣＲの認識可能なペプチド配列である。
【００２５】
言い換えれば、本発明の方法は、オリゴペプチドの抗原としての可能性を評価すること、または正確に言えば、特定のオリゴペプチド配列の、同種Ｔ細胞応答を惹起するＭＨＣ提示エピトープへとなり得る可能性を評価すること、を可能にする。この評価を達成するために、潜在的に抗原性オリゴペプチドを含むトランスジェニック抗原受容体のライブラリーが必要とされる。ライブラリーのメンバーは複数の細胞の各哺乳類細胞で発現し、ここでオリゴペプチド配列はライブラリーの各メンバーについて異なることができる。オリゴペプチドはＴ細胞受容体による認識に適した方法でトランスジェニック抗原受容体によって提示される。提供されたＴリンパ球によるそれらのＴ細胞受容体を介した抗原オリゴペプチドの結合は、トランスジェニック抗原受容体へ機能的に連結するレポータータンパク質を活性化する。該哺乳類細胞は検出可能なレポーターのレベルに従って分離される。分離した哺乳類細胞からＤＮＡを単離し、そして含まれるオリゴペプチドＤＮＡの配列を決定する。この方法によって回収されるすべてのオリゴペプチドはＴ細胞受容体によって認識される。
【００２６】
トランスジェニック抗原受容体は、Ｔ細胞受容体による認識に適した方法で提示されるオリゴペプチド、ＭＨＣ１またはＭＨＣ２の細胞外部位、Ｔ細胞受容体の膜貫通部位及びＴ細胞受容体の細胞内部位を含む。該オリゴペプチド及び該異なる部位は共有結合して、単一のポリペプチド鎖（細胞外−膜貫通−細胞内）を形成する。一実施態様では、該トランスジェニック状態はさらに、細胞外部位と膜貫通部位との間に位置するＴ細胞受容体のヒンジ領域を含む。
【００２７】
本明細書の文脈において、発現するまたは発現という用語は、細胞生物学及び分子生物学の分野におけるそれら意味で使用される；該用語はＤＮＡ配列及び由来するｍＲＮＡの転写及び翻訳を指す。
【００２８】
一実施態様では、工程ｉｉｉ．に記載の検出可能なレポータータンパク質のレベルにしたがって、複数の哺乳類細胞からの検出可能なレポータータンパク質を有する細胞の分離は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回実施される。この実施態様は、複雑性が高いライブラリーを使用する場合に特に有利である。
【００２９】
本発明の別の側面によれば、ＴＣＲが認識可能なオリゴペプチド配列の同定のための方法
が提供される。該方法は以下を含む：
ｉ．哺乳類細胞を提供することであり、ここで、
−  該哺乳類細胞はトランスジェニック抗原受容体分子を発現し、
−  該トランスジェニック抗原受容体分子は、
・Ｔ細胞受容体による認識に適した方法で提示されるオリゴペプチドを含むＭＨＣ１またはＭＨＣ２の細胞外部位、
・Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の膜貫通部位、及び
・ＴＣＲの細胞内部位
を含み、
−  該トランスジェニック抗原受容体分子はレポータータンパク質と機能的に連結しており、それによってＴ細胞受容体のトランスジェニック抗原受容体への結合が前記レポーター遺伝子の活性化をもたらす。
ｉｉ．哺乳類細胞を、Ｔリンパ球の表面に発現しているＴ細胞受容体を介してトランスジェニック抗原受容体に含まれるオリゴペプチドへ結合可能なＴリンパ球の調製物と、接触させること。Ｔ細胞受容体のトランスジェニック抗原受容体への結合は、レポーター遺伝子を活性化させ、活性化した哺乳類細胞が得られる。
ｉｉｉ．該活性化した哺乳類細胞から発現したライブラリーメンバーをコードするＤＮＡを単離する。
ｉｖ．トランスジェニック抗原受容体中に含まれるオリゴペプチド配列の配列を決定する。
【００３０】
一実施態様では、該トランスジェニック抗原受容体はさらにヒンジ領域を含む。
【００３１】
本発明の第１及び第２の側面に記載の一実施態様では、該トランスジェニック抗原受容体は当該分野で既に知られているトランスジェニック抗原受容体である。当該分野で公知の適切なトランスジェニック抗原受容体の例は、Ｊｙｏｔｈｉら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０，１２１５−１２２０（２００２）；Ｇｅｉｇｅｒら，Ｂｌｏｏｄ  ９８（８）２３６４−２３７１（２００１）；  ＵＳ２００８２８６３１２Ａ１；Ｍｅｋａｌａら，ＰＮＡＳ  １０２（３３），１１８１７−１１８２２，（２００５）；．Ｍｏｉｓｉｎｉら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００８），１８０：３６０１−３６１１；Ｓｃｏｔｔら，Ｊ  Ａｕｔｉｍｍ  ３５，３９０−３９７（２０１０）に記載されている。
【００３２】
本発明の上記側面のいずれかの一実施態様において、該トランスジェニック抗原受容体は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む、キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体であり、及び
ａ．該第１のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣクラスＩ）α鎖の細胞外部位を含み、及び該第２のポリペプチドは、β２ミクログロブリン部位を含み、または
ｂ．該第１のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）α鎖の細胞外部位を含み、及び該第２のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）β鎖の細胞外部位を含む。
【００３３】
該第１の及び第２のポリペプチド鎖の少なくとも１つは、細胞外ＭＨＣ分子部位へ共有結合するオリゴペプチドをさらに含み、ここで該オリゴペプチドはＴ細胞受容体によって認識される。
【００３４】
一実施態様では、該オリゴペプチド配列は、４から１６のアミノ酸、特に６、８、１０、１２または１４アミノ酸の長さのリンカー配列をさらに含む。一実施態様では、該リンカーは、主にグリシンと、セリン、スレオニン及びアラニンのうちの１つとから構成される。一実施態様では、該リンカーはグリシン及びセリンのみを含む。
【００３５】
該第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの１つは、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞内部位又は細胞内尾部、膜貫通部位及びヒンジ領域をさらに含み、該第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの他方は、Ｔ細胞受容体β鎖の細胞内部位、膜貫通部位及びヒンジ領域を含む。
【００３６】
一実施態様では、該オリゴペプチド配列及びグリシン−セリンリンカーはＭＨＣシグナル／リーダーペプチドの最後のアミノ酸とＭＨＣα１部位またはβ１部位の最初のアミノ酸との間に挿入される。
【００３７】
一実施態様では、該オリゴペプチド配列及びリンカー配列は、ＭＨＣα１部位配列またはβ１部位配列の１、２、３、４または５アミノ酸後に挿入される。該ペプチドのβ鎖（β１部位）への結合は、最も一般的に見出される方向でＭＨＣ分子に該ペプチドを挿入するだろう。該ペプチドのα鎖への結合は、逆向きに該ペプチドが挿入される。
【００３８】
一実施態様では、ＭＨＣ分子の細胞外部分は、ＩＭＧＴ／ＨＬＡ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／）のような専門データベースにおいて、当業者が利用可能な、ヒト主要組織適合遺伝子複合体ファミリーＨＬＡから選択される。あるいは、ＨＬＡ配列は、患者の血液または組織試料から抽出されたＲＮＡに由来する。
【００３９】
一実施態様では、該オリゴペプチドは、長さが８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０または４０アミノ酸（ＡＡ）である。ＭＨＣクラスＩペプチドの大半は８〜１０アミノ酸長であるが、一方でＭＨＣクラスＩＩは、結合の間隙が開いているため、より長いペプチドを提示することができるにもかかわらず、実際のエピトープは１０〜１２ＡＡの範囲である。本明細書中に開示した方法においては、該ペプチドは２０より長くてもよい（図３参照、本発明の方法で見出したＬＣＭＶペプチドは２４ＡＡを含む）。一実施態様では、より大きなオリゴペプチドが利用され、これにより、１つのペプチド上のより結合するレジスターのスクリーニングが可能になる。
【００４０】
一実施態様では、第１及び／または第２のポリペプチド中のトランスジェニック抗原受容体の細胞内部分、膜貫通部分及びヒンジ領域は、同じＴＣＲ鎖に由来しない。言い換えれば、ＴＣＲα鎖のヒンジ領域または膜貫通部位は、ＴＣＲβ鎖の膜貫通部位または細胞内部位へ連結することができ、逆もまた同様である。
【００４１】
一実施態様では、本発明の第２の側面に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体は、配列番号００７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド及び配列番号００８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドを含む。
【００４２】
本発明の第３の側面によれば、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体が提供される。該第１のポリペプチドは、１つまたは複数のジスルフィド結合によって該第２のポリペプチドに連結されており、及び
ａ．該第１のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣクラスＩ）α鎖の細胞外部分を含み、及び該第２のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣクラスＩ）関連β２ミクログロブリン部位を含み、または
ｂ．該第１のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）α鎖の細胞外部位を含み、及び該第２のポリペプチドは主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）β鎖を含む。
【００４３】
該第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの１つは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖のヒンジ領域、膜貫通部位（及び細胞内部位または尾部）をさらに含み、該第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの他方は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖のヒンジ領域、膜貫通部位（及び細胞内部位または尾部）を含む。
【００４４】
言い換えれば、該キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体は、その同種ＴＣＲによってポリペプチド（エピトープ）が認識及び結合されるように、ＭＨＣ環境中にオリゴペプチド（エピトープ）を提示することができる。その同種ＴＣＲの結合は、該キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体と関連するＣＤ３及びＣＤ２４７の細胞内部位の活性化をもたらし、それはＮＦＡＴの活性化をもたらす。
【００４５】
一実施態様では、ＭＨＣ分子の細胞外部位は、
ｉ．（該第２のポリペプチドのβ２ミクログロブリンに加えて）該第１のポリペプチドのＭＨＣクラスＩα１及びα２及びα３部位、または
ｉｉ．該第１のポリペプチドのＭＨＣクラスＩＩα１及びα２部位、並びに該第２のポリペプチドのＭＨＣクラスＩＩβ１及びβ２部位、
を含む。
【００４６】
一実施態様では、該第１のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣクラスＩ）α鎖の細胞外部位全体を実質的に含む。一実施態様では、第１のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣクラスＩ）の細胞外部位である。
【００４７】
一実施態様では、該第２のポリペプチドは、β２ミクログロブリンに関連する主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣクラスＩ）の細胞外部位全体を実質的に含む。一実施態様では、該第２のポリペプチドはβ２ミクログロブリンに関連する主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣクラスＩ）である。
【００４８】
別の一実施態様では、該第１のポリペプチドは主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）α鎖の細胞外部位全体を実質的に含む。一実施態様では、該第１のポリペプチドは主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）α鎖の細胞外部位である。一実施態様では、該第２のポリペプチドは主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）β鎖全体を実質的に含む。一実施態様では、該第２のポリペプチドは主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）β鎖である。
【００４９】
一実施態様では、該第１及び第２のポリペプチド鎖の少なくとも１つは、ＭＨＣ細胞外部位へ共有結合する抗原ペプチドをさらに含み、ここで、前記オリゴペプチドはＴ細胞受容体によって認識されることができる。
【００５０】
一実施態様では、該抗原ペプチド配列及びグリシン−セリンリンカーは、該ＭＨＣシグナル／リーダーペプチドの最後のアミノ酸とＭＨＣα１部位またはβ１部位の最初のアミノ酸との間に挿入される。
【００５１】
一実施態様では、抗原−ペプチド配列及びリンカー配列は該ＭＨＣα１部位配列またはβ１部位配列の１、２、３、４または５アミノ酸後に挿入される。
【００５２】
一実施態様では、該ＭＨＣ分子の細胞外部分は、ＩＭＧＴ／ＨＬＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／）のような専門データベースで利用可能なヒト主要組織適合遺伝子複合体ファミリーＨＬＡから選択される。あるいは、該ＨＬＡ配列は患者の血液または組織試料から抽出されたＲＮＡに由来する。
【００５３】
一実施態様では、該オリゴペプチドは、長さが８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０または４０アミノ酸である。ＭＨＣクラスＩペプチドの大半は、８〜１０アミノ酸長であるが一方で、ＭＨＣクラスＩＩは、結合の間隙が開いているため、より長いペプチドを提示することができるにもかかわらず、実際のエピトープは１０〜１２ＡＡ以内である。本明細書で開示された方法では、該ペプチドは２０より長くてもよい（図３参照  本発明の方法で見出したＬＣＭＶペプチドは２４ＡＡを含む）。より大きなオリゴペプチドを有することは、１つのペプチド上のより多くの結合レジスターをスクリーニングできる点で有利である。
【００５４】
一実施態様では、該第１及び／または第２のペプチドにおける該キメラ抗原受容体ポリペプチドのヒンジ領域、膜貫通部位及び細胞外部分は同一のＴＣＲ鎖に由来しない。言い換えれば、ＴＣＲα鎖の該ヒンジ領域または、膜貫通部位は、ＴＣＲβ鎖の膜貫通部位または細胞内部位へ連結することができ、逆もまた同様である。
【００５５】
本願発明の第４の側面によれば、本願第３の側面に記載の該キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体をコードする核酸分子、特に哺乳類宿主細胞内で実施可能なプロモーター配列を有する核酸分子が提供される。
【００５６】
本発明の第５の側面によれば、本発明の第４の側面に記載の核酸分子を含むまたは発現する細胞、特に哺乳類細胞が提供される。
【００５７】
本発明の第６の側面によれば、細胞、特に哺乳類細胞、より特に哺乳類Ｔリンパ球が提供され、
ｉ．本発明の第５の側面に記載の該キメラ抗原受容体ポリペプチド
ｉｉ．該キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体へ機能的に連結したエフェクター機能、
を含む。
【００５８】
一実施態様では、該エフェクター機能は以下のとおりである：
ｉ．レポータータンパク質、及び／または
ｉｉ．該キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体へ結合した細胞において、細胞死、特にアポトーシスを誘導する能力。
【００５９】
一実施態様では、該レポータータンパク質は以下から選択される：
ｉ．蛍光タンパク質、
ｉｉ．ルシフェラーゼタンパク質、
ｉｉｉ．抗原耐性遺伝子、
ｉｖ．Ｃｒｅリコンビナーゼ、
ｖ．ＣＡＳ−９ヌクレアーゼ、または
ｖｉ．ＣＡＳ−９キメラ転写抑制因子または転写活性化因子。
【００６０】
本発明の第７の側面によれば、抗原に対して反応性が低下しているＴリンパ球の調製物を得るための方法が提供される。該方法は以下を含む：
ｉ．患者から得られるＴリンパ球の調製物を提供すること、
ｉｉ．本発明の第５または第６の側面に記載の哺乳類細胞とＴリンパ球調製物とを接触させること、
ここで、該哺乳類細胞は、該エフェクター機能が、該キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体へ結合した細胞において、細胞死、特にアポトーシスを誘導することができることを特徴とする。
【００６１】
言い換えれば、哺乳類細胞の該キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体内に提供されるオリゴペプチド配列に結合できる特異的なＴリンパ球は、細胞死、特にアポトーシスを与えられる。
【００６２】
本発明の第８の側面によれば、それを必要とする患者において使用するための、特定の抗原に対して活性を有するＴリンパ球を減少させるための方法が提供される。該方法は以下の工程を含む：
ｉ．本発明の第４の側面に記載の哺乳類細胞の調製物を提供すること、
ｉｉ．患者へ該哺乳類細胞を投与すること、
ここで、該哺乳類細胞は、該エフェクター機能が、該キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体へ結合した細胞の細胞死、特にアポトーシスを誘導することができることを特徴とする。
【００６３】
言い換えれば、該キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体中に提示されたオリゴペプチド配列へ結合可能なＴリンパ球を選択的に減少させる。これは、例えばそれを必要とする患者において自己反応性Ｔリンパ球の減少または除去のために使用することができる。
【００６４】
一実施態様では、この方法は、アレルギーのような自己免疫疾患を治療するために使用される。一実施態様では、この方法は、移植後の臓器拒絶の予防及び治療のために使用される。
【００６５】
本発明の第９の側面によれば、本発明の第４の側面に記載の哺乳類細胞は、これに限られないが１型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、クローン病及び炎症性腸症候群を含む免疫機能不全、移植拒絶反応、または自己免疫疾患の治療または予防においての使用のために提供される。言い換えれば、該哺乳類細胞は、特定の疾病に関連する抗原に対して活性を有するＴリンパ球の減少のために使用される。
【００６６】
本発明の第１０の側面によれば、患者のオリゴペプチドへの免疫応答を検出するための方法が提供される。該方法は以下の工程を含む：
ｉ．本発明の第４の側面に記載の哺乳類細胞を提供し、ここで前記細胞は、前記キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体ヘ機能的に連結したレポータータンパク質を含み、
ｉｉ．免疫応答に関連するＴリンパ球を含む患者の血液サンプルをエクスビボで提供し、
ｉｉｉ．エフェクター機能を実施可能にする条件下で哺乳類細胞を血液サンプルと接触させ、及び、
ｉｖ．哺乳類細胞内のレポータータンパク質を検出する。
【００６７】
言い換えれば、該個体の血液中で、該使用されたオリゴペプチドに結合可能なＴリンパ球が濃縮され、結果として強力なレポータータンパク質の発現が得られた場合、これは該オリゴペプチドに対する免疫応答を表す。
【００６８】
一実施態様では、この方法において使用する該オリゴペプチドはウイルス、バクテリア、菌類または寄生生物に由来する。
【００６９】
一実施態様では、本発明の第９の側面に記載の該方法は、
ｉ．該レポータータンパク質の発現にしたがって哺乳類細胞を分離すること、
ｉｉ．分離した哺乳類細胞からＤＮＡを単離すること、及び
ｉｉｉ．本発明の第５の側面に記載の該キメラ抗原−受容体ポリペプチドヘテロ二量体にコードされるオリゴペプチドの配列を決定すること、
の工程をさらに含む。
【００７０】
言い換えれば、キメラ抗原−受容体ポリペプチドヘテロ二量体中の異なるオリゴペプチドを有する本発明の第４の側面に記載の哺乳類細胞が複数使用される。それらのオリゴペプチドの各々は、特定の病原体、アレルゲン、腫瘍または炎症組織（自己免疫患者の場合）に由来する。これにより、多数の異なる免疫応答についての同時検査が可能となる。１つの非限定的な例としては、診断ツールとしての使用である。
【００７１】
例えば、リンカー配列、リンカー長といった単一の分離可能な特徴についての代替物が本明細書において「実施態様」として示されている場合、そのような代替物は本明細書で開示された本発明の個々の実施態様から自由に組み合わせてもよい。当業者は、特定の実施態様として記載された本発明の単離された特徴は、記載された任意の他の特徴と組み合わせられることを理解する。
【００７２】
以下の例及び図によって本発明はさらに説明することができ、それによってさらなる実施態様及び利点が記述される。これらの例は本発明を説明するものであって、範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００７３】
実施例１：開示されたキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体を用いた哺乳類細胞におけるＴ細胞エピトープのスクリーニング
【００７４】
同種Ｔ細胞エピトープを同定する現在の方法は、原則として２つの主要なアプローチに基づいている。第１のアプローチは、ＭＨＣ四量体を有するＴ細胞を染色することによって、または組換えＴＣＲｓを有するペプチド−ＭＨＣ複合体を提示するファージ、酵母もしくは昆虫細胞を染色することによって、物理的ＭＨＣ−ＴＣＲ相互作用を検出することに依拠している。第２のアプローチは、ペプチドプールまたは、位置走査コンビナトリアルペプチドライブラリーを提示する樹状細胞（ＤＣｓ）との共培養におけるＴ細胞活性化の測定に依拠している。ＭＨＣ四量体ライブラリーのスクリーニングは、既知のまたは予測された抗原の認識の微細な特異性を決定するのに効果的であるが、すべてのペプチド−ＭＨＣ四量体が等しい力で結合するわけではないので、低親和性相互作用は簡単に見逃される（例えば、ＯＶＡ特異的ＯＴ−ＩＩ及びｇｐ６１特異的Ｓｍａｒｔａ２  Ｔ細胞を個々に同様に染色するためには、ＯＶＡ−Ｉ−Ａｂ四量体はｇｐ６１−Ｉ−Ａｂ四量体の４００倍以上必要である）。類似の親和性の制約は、現在のペプチド−ＭＨＣ提示法に適用され、可溶性ＴＣＲｓが使用される。さらに、ファージまたは酵母細胞上で効率的な表面発現を可能にするには、ＭＨＣ分子を変異させる必要がある。位置走査コンビナトリアルペプチドライブラリーのスクリーニングは、ＴＣＲの交差反応性の利点を利用し、ペプチドプールを用いて、Ｔ細胞活性化をもたらすモチーフを決定する。天然に存在するペプチドに類似するＴ細胞エピトープがこの方法で見出されているが、同定されたペプチドはしばしば既知のタンパク質と明確な相同性を持たず、バイオインフォマティクスアプローチの助けを借りる必要がある。
【００７５】
本発明者らは、本明細書において、哺乳類細胞において直接的な、不偏性の、感受性の及び効率的なエピトープスクリーニングを可能にする普遍的なシステムの開発を開示する。このような方法は：ｉ）ＡＰＣｓの複雑な混合物を提供し、各々は独特の天然に存在する配列のペプチドを提示する；ｉｉ）同種ペプチドを提示するＡＰＣｓを同定及び分離する効率的な方法を提供する；ｉｉｉ）その手順を反復して繰り返す可能性を提供し、そしてｉｖ）クローニングによってペプチド配列を容易に回収できるようにする。第１の基準を満たすＡＰＣｓを産生するために、発明者は「単一ペプチド」マウスを作製するアプローチに従い、異なるペプチド−ＭＨＣ提示システムを構築した。組換えＤＮＡ技術によって、ペプチドを直接ＭＨＣ分子に結合させ、安定した複合体を作製し、他のペプチドが結合するのを防止した。そのようなペプチド−ＭＨＣ複合体のライブラリーをＭＨＣ欠損細胞へ形質移入させることで、独自のペプチドを提示する細胞プールを得る（詳細は材料及び方法を参照）。理想的には、特定のＴ細胞についての同種のペプチドを担持するＡＰＣｓの同定は、該ペプチド−ＭＨＣ複合体が特異的なＴ細胞のＴＣＲｓと結合するとすぐに容易に測定可能になるシグナルを必要とする。したがって、該ペプチド−ＭＨＣ融合分子は、低親和性相互作用を感知するために調整されたＴＣＲ複合体へ結合する。直接のゼータ鎖（ＣＤ２４７）融合体は、様々なキメラ抗原受容体を構成するために首尾よく使用されている。しかし、天然のＴＣＲ複合体に可能な限り近く類似した分子センサーを作製するために、ペプチドＭＨＣ複合体は、ヒンジ領域、膜貫通（ＴＭ）及び細胞内（ＩＣ）部位からなる切断型ＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖を融合した。ペプチド−ＭＨＣをＴＣＲシグナル伝達機構全体へ接続することで、より生理学的なシグナルがもたらされる。このＭＨＣ−ＴＣＲキメラは本明細書の文脈中でＭＣＲとして称される。そのような分子は、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞ハイブリドーマへ形質移入する際に、ＮＦＡＴ−ＥＧＦＰレポーターシステムを用いた特定のＴ細胞のＴＣＲｓによってペプチド−ＭＨＣ結合の直接的な観測が可能となる（図２ａ）ペプチド−ＭＨＣ分子ライブラリーを有する細胞と抗原特異的Ｔ細胞クローンまたはハイブリドーマとを共培養することにより、哺乳類細胞における大規模に平行した機能的スクリーニングによって、Ｔ細胞の同種ペプチド特異性を直接的に同定することができる。
【００７６】
したがって、ＭＣＲは、ＭＨＣクラスＩＩ限定Ｔ細胞の同種ペプチドのスクリーニングのために設計し、クローン化される。以下ＭＣＲ２という。ＭＣＲ２は２つの鎖：切断型ＴＣＲαへ連結されたＩ−ＡｂＭＨＣクラスＩＩα鎖の細胞外部位を含むα鎖、並びに切断型ＴＣＲβへ連結したＩ−ＡｂＭＨＣクラスＩＩβ鎖の細胞外部位及びペプチド（主要ＬＣＭＶ由来のエピトープ、ｇｐ６１）を含むβ鎖の２つの鎖からなる（図１ａ）。第２のＭＣＲ２もまたＯＶＡペプチドを担持してクローン化され、該２つを、それぞれＭＣＲ２（ｇｐ６１）及びＭＣＲ２（ＯＶＡ）と命名した。ＭＨＣ−ＩＩ−ＴＣＲ−ＢＥＫＯ胸腺腫細胞株へのＭＣＲｓの形質導入後、それらの発現は、抗ＭＨＣ−ＩＩ抗体で染色することで確認した。図１ｂに示すとおり、該ＭＣＲ２は細胞表面上に効率的に発現した。これはＴＣＲ複合体のＣＤ３構成要素と会合したことを示している。特異性を確認するために、ＭＣＲ２（ｇｐ６１）またはＭＣＲ２（ＯＶＡ）を発現しているＢＥＫＯ細胞を、精製したＳｍａｒｔａ２またはＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した。非常に早く、表面からペプチド特異的なＭＣＲ２のダウンレギュレーションが、従来のＴＣＲｓと同一の動態で観測された。ＭＣＲ２（ｇｐ６１）は、Ｓｍａｒｔａ２  Ｔ細胞と共培養した場合はダウンレギュレートされ、ＯＴ−ＩＩＴ細胞存在下では、ダウンレギュレートされなかった（図１ｃ左パネル）。逆もＭＣＲ２（ＯＶＡ）に当てはまり、ＭＣＲ２システムの特異性が強調された。我々はさらに、ＮＦＡＴ−ＥＧＦＰレポーターを担持するＴＣＲ−欠損Ｔ細胞ハイブリドーマ（Ｈ１８．３．１３）へ形質導入することによって、ＭＣＲ２がＮＦＡＴ活性化を惹起する能力を評価した。再び、ＮＦＡＴ応答はＭＣＲ２を担持するハイブリドーマをペプチド特異的Ｔ細胞と共培養した場合のみ惹起された。該応答は２時間後には既に強固で容易に測定可能であった（図１ｄ最右パネル）。
【００７７】
本願発明者らは、異なる比率でＭＣＲ２（ｇｐ６１）＋及びＭＣＲ２（ＯＶＡ）＋レポーター細胞を混合し、Ｓｍａｒｔａ２またはＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４＋Ｔ細胞との共培養後にＮＦＡＴ活性化を測定することによって、ＭＣＲシステムの感度を試験した。図１ｅに示すとおり、１／１００００を超える頻度で存在する細胞中の特異的なＮＦＡＴレポーター発現を直接検出することが可能であった。重要なことに、検出したＮＦＡＴ−ＥＧＦＰが発現している細胞の割合と「Ｔ細胞／イドタイプ（ｉｄｏｔｙｐｅ）−特異的」ＭＣＲ２と担持する細胞の割合との間で線形相関が観測され、たとえバックグランドと区別することができなくても１／１００００より低い頻度で存在する特異的な細胞はなおＮＦＡＴ−ＥＧＦＰ＋であると示された。ＭＣＲ２＋細胞において強固なＮＦＡＴ活性化を惹起することができた、異種の集合におけるペプチド特異的Ｔ細胞の最も低い頻度もまた決定された。Ｓｍａｒｔａ２及びＯＴ−ＩＩマウスから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞（図１ｆ上部パネル）または、未分類の脾臓細胞（図１ｆ下部パネル）を異なる比率で混合し、ＭＣＲ２（ｇｐ６１）＋又はＭＣＲ２（ＯＶＡ）＋細胞を刺激させるために使用した。わずか１％のペプチド特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞でさえ、Ｔ細胞が過剰に提供されたとき、ＭＣＲ２＋細胞中でＮＦＡＴ−活性化の最大値の５０％が惹起された。注目すべきことに、図１ｇ（左パネル）に示すとおり、単一のＳｍａｒｔａ２  ＣＤ４＋Ｔ細胞でさえ、ＭＣＲ２（ｇｐ６１）＋細胞中で有意なＮＦＡＴ−ＥＧＦＰ活性化を惹起することができ、一方でＭＣＲ２（ＯＶＡ）＋細胞の場合は、おそらく相互作用の親和性が低いため、５細胞は必要である（図１右図）。これらの結果は、ＭＣＲ技術が患者から採取された血液中のＴ細胞の特異性を観測するための高感度診断ツールとして使用できることを示している。実際、ＭＣＲ２（ｇｐ６１）＋レポーター細胞は、ＬＣＭＶ感染動物の血液中の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の効率的な追跡に使用することができる（図１ｈ）。これらの結果は、ＭＣＲ法の素晴らしい感度を示している。
【００７８】
複雑なライブラリー中のまれな特異的ペプチドを見出すために、開示された発明を使用するためには、ＮＦＡＴ−ＥＧＦＰ＋レポーター細胞の共培養と単離のサイクルを複数回反復する必要がある。刺激の後続の回におけるＮＦＡＴ活性化の効率的な検出は、その前の回の惹起されたＮＦＡＴレポーターシグナルの迅速な消失に依存するため、非常に安定したＥＧＦＰは遅い蛍光タイマー（ｓＦＴ）と置換した。このｍＣｈｅｒｒｙの変異体は時間とともに「色」が変化し、経時的に新しい（青−ｍＣｈｅｒｒｙ）と古い（赤−ｍＣｈｅｒｒｙ）ＮＦＡＴ活性化を区別することができ、したがって、後続の刺激の間隔をより短くすることができる。
【００７９】
第１に、開示され発明は、ＲＡＧを介した再構成を通じてｇｐ６１の中央残基のランダム化によって作製したＭＣＲ２（ｇｐ６１−ＲＳＳ）ライブラリー中のｇｐ６１ミモトープの検索に適用した（図２ａ並びに、材料及び方法）。無作為に選ばれたクローンは一貫してｇｐ６１配列の独特の突然変異体を含んでいた（図２ａ）このライブラリーをＮＦＡＴ−ｓＦＴを担持するレポーター細胞（１６．２ｃ１１）へ形質導入した後、ＭＣＲ２＋細胞を単離し、増殖し、ｇｐ６１特異的またはＯＶＡ特異的Ｔ細胞ハイブリドーマと共培養した（図２ｂ）。ＭＣＲ２（ｇｐ６１−ＲＳＳ／ＩＡｂ）＋１６．２ｃ１１細胞の約１０％はｇｐ６１特的ハイブリドーマと共培養したとき、青色ＮＦＡＴ−レポーター活性化が示された。これらの細胞を単一細胞として単離し、増殖し、再びスクリーニングした（図２ｃ）。試験した２４個のクローンの全ては、ｇｐ６１特異的ハイブリドーマとの再刺激に応答した。それらのクローン由来のＭＣＲｓのペプチド部分のＰＣＲ増幅及び配列決定により、２つの新しいミモトープと本来のｇｐ６１ペプチドが明らかとなった（図２ｃ）。Ｇｐ６１の９位のリジンをセリン（ｇｐ６１Ｓ）またはアスパラギン（ｇｐ６１Ｎ）に変異させており、これはＳｍａｒｔａ２  Ｔ細胞活性化のために必要ではないことを示している。樹状細胞とＴ細胞の共培養において、両方のミモトープは強固なＳｍａｒｔａ２  Ｔ細胞応答を誘導した。興味深いことに、ｇｐ６１Ｎは、元のペプチドと類似して、増殖及びＴｈ１様サイトカインの産生を誘導する一方で、次善のｇｐ６１Ｓは増殖促進にあまり効果的では無かったが、強力なＴｈ２様サイトカイン応答を誘導した。
【００８０】
最後に、感染後５日及び８日後のＬＣＭＶ感染動物から採取したＣＤ４＋Ｔ細胞ハイブリドーマを用いて、新規ＬＣＭＶエピトープについてスクリーニングを行った（図３ａ及びｂ）。該ハイブリドーマは、ＬＣＭＶに対する反応性の立証を可能にし、そしてさらなる解析のためのｇｐ６１非反応性ハイブリドーマを選択するＮＦＡＴ−ＥＧＦＰレポーターを担持する（図３ｂ）。５つのそのようなハイブリドーマ（強く応答するＨ３０、Ｈ１４、Ｈ２及び弱く応答するＨ４、Ｈ３）は、ＬＣＭＶ糖タンパク質（ＧＰ）及び核タンパク質（ＮＰ）の重複するペプチドを可能なかぎり全て含むＭＣＲ２分子ライブラリーを、形質導入した１６．２ｃ１１レポーター細胞をスクリーニングするために使用された。この「純粋ペプチドライブラリー」（ＧＰＬ）は、ＧＰ及びＮＰをコードするｃＤＮＡのランダム断片をＭＣＲ２ベクターへクローニングすることで作製され（図３ｃ）、回収したペプチドの多くは（１／６）天然のタンパク質を示すことから、ランダムの、またはコンビナトリアルペプチドライブラリーに対して有意な利点を有する。実際、５つのハイブリドーマのうち４つについては、該ＬＣＭＶ特異的標的ペプチドは直接同定した。ハイブリドーマの３つ（Ｈ３０、Ｈ１４及びＨ２）は、既知の主要ＬＣＭＶエピトープＮＰ３１１を認識し、及びＨ３は新しいエピトープＮＰ５４７と反応した（図３ｄ）。第５のハイブリドーマ（Ｈ４）は、スクリーニングの３回反復後でさえ、反応性レポーター細胞についての濃縮を得られなかった。このハイブリドーマにおいてＴＣＲ表面発現の試験を行い、ＴＣＲ陰性であることが判明した。該ＴＣＲはおそらく初期のＬＣＭＶ特異的スクリーニング後の増幅中に失われた。この結果はさらに開示した方法のＴＣＲ特異性を立証する。１つの追加したハイブリドーマ（Ｈ９）を、ランダムペプチドを担持するＭＣＲ２ライブラリーのスクリーニングに使用し、いくつかの強力な反応性ペプチドを見出したが、それらは、いずれのＬＣＭＶペプチドに類似していなかった。これは、Ｔ細胞エピトープスクリーニングについてランダムペプチドライブラリーよりＧＰＬを使用した戦略の方がより良いことをさらに支持する。
【００８１】
本明細書では新しい分子センサーを開示し、それは優れた特異性、感度及び早い速度で、ＡＰＣ側でのペプチド−ＭＨＣ−ＴＣＲ相互作用の検出を可能にする。このレポーターを用いることで、不偏性で機能的なＴ細胞エピトープスクリーニングについて、新しいアプローチが確立された。これは、優れた感度を有する発現クローニングの多様性と蛍光活性化細胞の単離のハイスループット性能を組み合わせており、哺乳類細胞におけるペプチドライブラリーの効果的な反復スクリーニングを可能にする。この全てが、当該技術分野において知られている方法に対して顕著な利点を提供する。第１にＭＣＲｓとＴＣＲｓとの間の多価相互作用のおかげで、高親和性及び低親和性結合は類似のＮＦＡＴレポーターシグナルを生成し（図１ｄ）、したがって低親和性リガンドは見逃されにくい。実際、ＬＣＭＶエピトープは広く研究されてきたにもかかわらず、新規のエピトープ−ＮＰ５４７が同定され得た。第２に、ペプチドは、ヒト細胞の表面上に発現した天然ＴＣＲ及びＭＨＣ分子の状況においてスクリーニングされるため、個々のＴＣＲｓの組換え工学またはＭＨＣの突然変異誘発は必要ではない。第３に、ＬＣＭＶウイルスペプチドスクリーニングによって例示されるように、該ＭＣＲ技術は目的のＴ細胞によって標的とされる病原体／細胞／組織に由来するペプチドを高濃縮したライブラリーの効率的なスクリーニングを容易にする。
【００８２】
ＭＣＲに基づくアプローチは、用途が広く、使い易く、そして強力なＴ細胞の抗原特異性を同定する方法を提供する。そのように、基礎および臨床研究の様々な分野に衝撃を与えるかもしれない。規定するエフェクター腫瘍浸潤Ｔ細胞の特異性を定義することにより新規腫瘍抗原の発見を可能にする。自己反応組織浸潤性Ｔ細胞の特異性を定義することは、自己免疫疾患のための抗原特異的な治療の開発において助けとなる。これに関して、ＭＣＲはまた、ペプチド特異的なＴ細胞に対してＴ細胞エフェクター機能の効率的な方向転換について可能にし、望ましくない特異性からレパートリーを除去することを可能にするかもしれない。さらに、ミモトープライブラリーのスクリーニングは、高親和性ペプチド変異体の発見及び患者の血液中に循環するＴ細胞の抗原反応性について高感度フローサイトメトリーに基づく試験の開発に繋がるだろう。
【００８３】
材料及び方法
マウス
Ｃ５７／Ｂｌ６マウスはチャールズリバーから購入した。Ｓｍａｒｔａ２及びＯＴ−ＩＩマウスはＲＴＨマウス施設で繁殖させた。
【００８４】
細胞株
Ｂｅｋｏは、ＴＣＲβ欠損マウス由来の自発性胸腺腫細胞株である。Ｈ１８．３．１３レポーター細胞株は、ＮＦＡＴ−ＥＧＦＰレポーター（ＥＧＦＰをコードする配列の上流に挿入された、３つのＮＦＡＴ結合部位ＡＣＧＣＣＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＡＡＣＡＧＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣ（配列番号００１）をそれぞれ含む、最小ヒトＩＬ−２プロモーターの４コピーを担持している）をＴＣＲ−Ｂ６Ｔ細胞へレトロウイルス形質導入によって作製した。１６．２ｃ１１レポーター細胞株は、ＮＦＡＴ−ｓＦＴレポーター構成物及びマウスエコトロピックレテロウイルスレセプターＳｌｃ７ａ１をコードするベクターを１６．２Ｔ細胞ハイブリドーマへ形質移入することによって作製した。
【００８５】
ハイブリドーマの産生
単離したＴ細胞または胸腺細胞を、２〜３日間マウスＩＬ−２存在下で、プラスチック結合抗ＣＤ３ε及び抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化した。等量の活性化Ｔ細胞及びＴＣＲα−β−ＢＷ５１４７融合パートナーはＰＥＧ−１５００を用いて融合し、そして１００ｍＭヒポキサンチン、４００ｎＭアミノプテリン及び１６ｍＭチミジン（ＨＡＴ）存在下で限界希釈してプレートへ被覆した。
【００８６】
ＭＣＲ２のクローニング
該ＭＣＲ２α及びβ鎖は標準的な技術によってクローン化され及び以下の部分を含む：
ＭＣＲ２α鎖：ＧＧＳＧＧＳＡＱ（配列番号００２）リンカーによってＴＣＲα鎖定常領域８７〜１３７残基に連結された該ＭＨＣ−ＩＩ  Ｉ−Ａｂα鎖１〜２０８残基。
ＭＣＲ２β鎖：ＡＱＳＧＧＳＧＧＳＡＱ（配列番号００３）リンカーによってＴＣＲβ鎖定常領域（Ｃ１）１２３〜１７３残基に連結された該ＭＨＣ−ＩＩ  Ｉ−Ａｂβ鎖１〜２１７残基。ＭＣＲ２（ｇｐ６１）残基において、ＭＨＣ−ＩＩ部分の２９位及び３０位におけるＤＳは、アミノ酸配列ＳＧＬＮＧＰＤＩＹＫＧＶＹＱＦＫＳＶＧＳＧＧＳＧＧＳＧＤＳ（配列番号００４）によって置換した。ＭＣＲ２（ＯＶＡ）においては、同じ残基はアミノ酸配列ＳＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲＧＳＧＧＳＧＧＳＧＤＳ（配列番号００５、ＯＶＡペプチドを含む）によって置換した。
【００８７】
レポーター細胞株及び単離された胸腺細胞のレトロウイルス形質導入
ＭＣＲα及びＭＣＲβはｐＭＹｉｒｅｓＧＦＰレトロウイルスベクターにクローニングし、ＭＣＲβがＧＦＰで置換するようにした。該研究を通して、我々はこのベクター（ｐＭＹ−ＭＣＲαｉｒｅｓＭＣＲβ）を用いて種々のペプチドを含むＭＣＲを作製し、それらをＭＣＲ（「ペプチド」／「ＭＨＣハプロタイプ」）と呼んだ。  レトロウイルス含有上清を、エコトロピックＰｈｏｅｎｉｘパッケージング細胞株で産生し、レポーター細胞株を感染させ、細胞を単離するために使用した。
【００８８】
ミモトープライブラリーのＲＡＧを介した作製
Ｇｐ６１ミモトープライブラリーを作製するために、ＭＣＲ２（ｇｐ６１−ＲＳＳ−ＥＧＦＰ−ＲＳＳ／Ｉ−Ａｂ）構成物は、ＭＣＲ２（ｇｐ６１）構成物中のｇｐ６１ペプチドの中間にＥＧＦＰ及びＲＡＧ組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を含むスタッファーフラグメントを挿入することによって作製した（図２ａ）。この構成物をＴｓｔ−４／ＤＬＬ１３２上で培養し、単離したＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性（ＤＮ）胸腺細胞へ形質導入した。１週間培養後（その間、ＤＮ細胞がＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性（ＤＰ）細胞となり、ＲＡＧを介した再編成によってＲＳＳ−ＥＧＦＰ−ＲＳＳスタッファーと同様にそれらのＴＣＲ遺伝子が組換わる）、ＥＧＦＰが低レベル発現の細胞を単離し、ｃＤＮＡを作製した。組換えＭＣＲ２（ｇｐ６１−ＲＳＳ−ＥＧＦＰ−ＲＳＳ／Ｉ−Ａｂ）の該ペプチドコード部分を該ｃＤＮＡかＰＣＲ増幅し、ＭＣＲ２（ｇｐ６１−ＲＳＳ／Ｉ−Ａｂ）ミモトープライブラリーを作製する空のＭＣＲ２（Ｉ−Ａｂ）ベクターにクローニングした。
【００８９】
純粋及びランダムなペプチドライブラリーの作製とスクリーニング
ＭＣＲ２−ＬＣＭＶ純粋重複ペプチドライブラリーを作製するために、時間を制限してＧＰ及びＮＰタンパク質をコードするＤＮＡを消化した（タカラ  ＤＮＡ断片化キット）。該断片をクローニング位置に隣接するベクター配列へ相同のリンカーで結合し、ＰＣＲ増幅し、ギブソンアッセンブリーによってｐＭＹ−ＭＣＲ２ベクターへクローニングし、２×１０６クローンを作製するバクテリアへ形質移入した。１６．２ｃ１１細胞へ該ライブラリーを形質導入し、そして０．５×１０６ＭＣＲ低細胞及び２．２×１０４ＭＣＲ高細胞を単離した。
【００９０】
ＭＣＲ２ランダムペプチドライブラリーは、オリゴヌクレオチド（ＧＧＴＮＮＮＮＮＮＴＷＣＮＮＮＮＮＮＢＣＣＮＮＮＳＣＣＮＮＮＮＮＮＫＣＣＮＮＮＧＧＡ）（配列番号００６）を上記のストラテジーを用いてＭＣＲ２ベクターにクローニングすることによって作製した。このオリゴヌクレオチドは、ＴＣＲに面する位置でランダムなアミノ酸をコードしたが、アンカー残基は部分的に固定され、良好な提示を確実にした。複雑さは５．５×１０６細菌クローンであり、形質導入後に１１．５×１０６の個々のＭＣＲ２＋細胞を単離した。
【００９１】
ＭＣＲダウンレギュレーションアッセイ
他に特に記載のない限り、ＭＣＲ２＋Ｂｅｋｏ細胞は、示したドナーマウスから単離した５倍過剰のＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した。
【００９２】
ＭＣＲ＋Ｈ１８．３．１３または１６．２ｃ１１細胞への刺激
他に特に記載のない限り、ＭＣＲ＋細胞は、示したドナーマウスから単離した５倍過剰のＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞ハイブリドーマと８〜１２時間共培養した。
【００９３】
実施例２：キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体
第１のポリペプチド、α鎖（配列番号００７）：
ＭＰＲＳＲＡＬＩＬＧＶＬＡＬＴＴＭＬＳＬＣＧＧＥＤＤＩＥＡＤＨＶＧＴＹＧＩＳＶＹＱＳＰＧＤＩＧＱＹＴＦＥＦＤＧＤＥＬＦＹＶＤＬＤＫＫＥＴＶＷＭＬＰＥＦＧＱＬＡＳＦＤＰＱＧＧＬＱＮＩＡＶＶＫＨＮＬＧＶＬＴＫＲＳＮＳＴＰＡＴＮＥＡＰＱＡＴＶＦＰＫＳＰＶＬＬＧＱＰＮＴＬＩＣＦＶＤＮＩＦＰＰＶＩＮＩＴＷＬＲＮＳＫＳＶＡＤＧＶＹＥＴＳＦＦＶＮＲＤＹＳＦＨＫＬＳＹＬＴＦＩＰＳＤＤＤＩＹＤＣＫＶＥＨＷＧＬＥＥＰＶＬＫＨＷＥＰＥＧＧＳＧＧＳＡＱＳＤＶＰＣＤＡＴＬＴＥＫＳＦＥＴＤＭＮＬＮＦＱＮＬＳＶＭＧＬＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ
アミノ酸１〜２０８はＭＨＣ２α鎖に由来する。アミノ酸２０９〜２１６はリンカー配列である。アミノ酸２１７−２６７はＴＣＲαに由来する。
【００９４】
第２のポリペプチド（配列番号００８）：
ＭＡＬＱＩＰＳＬＬＬＳＡＡＶＶＶＬＭＶＬＳＳＰＲＴＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＤＳＥＲＨＦＶＹＱＦＭＧＥＣＹＦＴＮＧＴＱＲＩＲＹＶＴＲＹＩＹＮＲＥＥＹＶＲＹＤＳＤＶＧＥＨＲＡＶＴＥＬＧＲＰＤＡＥＹＷＮＳＱＰＥＩＬＥＲＴＲＡＥＬＤＴＶＣＲＨＮＹＥＧＰＥＴＨＴＳＬＲＲＬＥＱＰＮＶＶＩＳＬＳＲＴＥＡＬＮＨＨＮＴＬＶＣＳＶＴＤＦＹＰＡＫＩＫＶＲＷＦＲＮＧＱＥＥＴＶＧＶＳＳＴＱＬＩＲＮＧＤＷＴＦＱＶＬＶＭＬＥＭＴＰＲＲＧＥＶＹＴＣＨＶＥＨＰＳＬＫＳＰＩＴＶＥＷＲＡＱＳＧＧＳＧＧＳＡＱＧＲＡＤＣＧＩＴＳＡＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＴＬＶＶＭＡＭＶＫＲＫＮＳ
アミノ酸１〜２６はリーダーペプチドである。アミノ酸２７と２８の間は、提示するオリゴペプチドの挿入部位である。アミノ酸２９〜３６はリンカー配列である。アミノ酸３７〜２２８は、ＭＨＣ２βに由来する。アミノ酸２２９〜２３６はリンカー配列である。アミノ酸２３７〜２８７はＴＣＲβに由来する。
【００９５】
配列番号００８のアミノ酸２７と２８の間（ＧＧ）に挿入されるペプチド：
【００９６】
Ｇｐ６１（配列番号００９）：
ＬＮＧＰＤＩＹＫＧＶＹＱＦＫＳＶ
【００９７】
ＯＶＡ  （配列番号０１０）：
ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ
【図１ａ】
0006718450.tif 000002
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図１ｇ】
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【図１ｈ】
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【図２ａ】
0006718450.tif 000010
【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
0006718450.tif 000013
【図２ｅ】
0006718450.tif 000014
【図２ｆ】
0006718450.tif 000015
【図３ａ】
0006718450.tif 000016
【図３ｂ】
0006718450.tif 000017
【図３ｃ】
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【図３ｄ】
0006718450.tif 000019
【図３ｅ】
0006718450.tif 000020
【図４】
0006718450.tif 000021
【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【配列表】
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