(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣ（配列番号９０）のアミノ酸配列を含むＡ−鎖ペプチド；
ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＢ−鎖ペプチド、および、
ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むカルボキシ末端部分（ＣＴＰ）ペプチド、
を有するＯ−グリコシル化インスリンであるコンジュゲート、および
薬学的に許容され得るキャリアまたは塩、を含む、
組成物であって、
前記Ｏ−グリコシル化インスリンであるコンジュゲートは、構造（Ｂ−鎖）−（ＣＴＰペプチド）−（Ａ鎖）を有する一本鎖のインスリンであり、
前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基が、Ｏ−グリカンに共有結合され、前記組成物中の主なＯ−グリカンが、マンノース、マンノビオース、マンノトリオースまたはマンノテトロースであり；
および、前記インスリンが、１７個までのアミノ酸置換をさらに含んでもよく、そして、前記ＣＴＰペプチドは、構造（Ｂ−鎖）−（ＣＴＰペプチド）−（Ａ−鎖）を有する一本鎖のインスリンを産生するために、前記Ｂ−鎖を前記Ａ−鎖に共有結合させる結合性ペプチドである、
前記組成物。
【請求項２】
組成物が、前記主なＯ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースであるコンジュゲートを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
組成物が、５０モル％より多くの前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースであるコンジュゲートを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
組成物が、８０モル％より多くの前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースであるコンジュゲートを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記マンノース残基が、α１，２−結合により、隣接するマンノース残基に共有結合される、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
組成物が、５０、６０、７０、８０、９０または９５モル％より多くの前記Ｏ−グリカンが、マンノースであるコンジュゲートを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、検出可能な、β−結合マンノース、ホスホマンノースまたはβ−結合マンノースおよびホスホマンノースを欠いている、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
（ａ）多数のコンジュゲートであり、
該コンジュゲートは、Ｏ−グリコシル化インスリンであって、
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣ（配列番号９０）のアミノ酸配列を含むＡ−鎖ペプチド；
ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＢ−鎖ペプチド、および、
ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むカルボキシ末端部分（ＣＴＰ）ペプチド、を含むコンジュゲート、および
（ｂ）薬学的に許容され得るキャリアまたは塩、
を含む、薬学的製剤であって、
ここで、
前記Ｏ−グリコシル化インスリンであるコンジュゲートは、構造（Ｂ−鎖）−（ＣＴＰペプチド）−（Ａ鎖）を有する一本鎖のインスリンであり、
前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基が、Ｏ−グリカンに共有結合され、前記製剤中の主なＯ−グリカンが、マンノース、マンノビオース、マンノトリオースまたはマンノテトロースであり；
そしてここで、前記インスリンが、１７個までのアミノ酸置換をさらに含んでもよく、そして、前記ＣＴＰペプチドは、構造（Ｂ−鎖）−（ＣＴＰペプチド）−（Ａ−鎖）を有する一本鎖のインスリンを産生するために、前記Ｂ−鎖を前記Ａ−鎖に共有結合させる結合性ペプチドである、薬学的製剤。
【請求項９】
前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースであるコンジュゲートを含む、請求項８記載の薬学的製剤。
【請求項１０】
５０モル％より多くの前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースであるコンジュゲートを含む、請求項８記載の薬学的製剤。
【請求項１１】
８０モル％より多くの前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースであるコンジュゲートを含む、請求項８記載の薬学的製剤。
【請求項１２】
前記マンノース残基が、α１，２−結合により、隣接するマンノース残基に共有結合されるコンジュゲートを含む、請求項８記載の薬学的製剤。
【請求項１３】
５０、６０、７０、８０、９０または９５モル％より多くの前記Ｏ−グリカンが、マンノースであるコンジュゲートを含む、請求項８記載の薬学的製剤。
【請求項１４】
前記薬学的製剤が、検出可能な、β−結合マンノース、ホスホマンノースまたはβ−結合マンノースおよびホスホマンノースを欠いている、請求項８記載の薬学的製剤。
【請求項１５】
（ａ）  ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣ（配列番号９０）のアミノ酸配列を含むＡ−鎖ペプチド；
ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＢ−鎖ペプチド、および、
ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むカルボキシ末端部分（ＣＴＰ）ペプチド、を有するＯ−グリコシル化インスリン、
および
（ｂ）薬学的に許容され得るキャリア、
を含む組成物であって、
ここで、前記Ｏ−グリコシル化インスリンは、構造（Ｂ−鎖）−（ＣＴＰペプチド）−（Ａ鎖）を有する一本鎖のインスリンであり、
前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基が、Ｏ−グリカンに共有結合され、前記組成物中の主なＯ−グリカンが、マンノース、マンノビオース、マンノトリオースまたはマンノテトロースであり；
そしてここで、前記インスリンが、１７個までのアミノ酸置換をさらに含んでもよく、そして、前記ＣＴＰペプチドは、構造（Ｂ−鎖）−（ＣＴＰペプチド）−（Ａ−鎖）を有する一本鎖のインスリンを産生するために、前記Ｂ−鎖を前記Ａ−鎖に共有結合させる結合性ペプチドであり、
ここで、１つ以上のＯ−グリカンが、糖尿病の処置に使用された場合、前記１つ以上のＯ−グリカンを有するインスリンの少なくとも１つの薬物動態学的または薬力学的な特性を糖類の血清濃度に感受性にする、組成物。
【請求項１６】
前記主なＯ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースである、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
前記マンノース残基が、α１，２−結合により、隣接するマンノース残基に共有結合される、請求項１５記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、検出可能な、β−結合マンノース、ホスホマンノースまたはβ−結合マンノースおよびホスホマンノースを欠いている、請求項１５記載の組成物。
【請求項１９】
糖尿病を処置するための、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物または薬学的製剤。
【請求項２０】
糖尿病を処置するための、
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣ（配列番号９０）のアミノ酸配列を含むＡ−鎖ペプチド；
ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＢ−鎖ペプチド、および、
ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むカルボキシ末端部分（ＣＴＰ）ペプチド、を有する、Ｏ−グリコシル化インスリンであり、
ここで、前記Ｏ−グリコシル化インスリンであるコンジュゲートは、構造（Ｂ−鎖）−（ＣＴＰペプチド）−（Ａ鎖）を有する一本鎖のインスリンであり、
そしてここで、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基が、Ｏ−グリカンに共有結合され、前記Ｏ−グリコシル化インスリン中の主なＯ−グリカンが、マンノース、マンノビオース、マンノトリオースまたはマンノテトロースであり；
前記インスリンが、１７個までのアミノ酸置換をさらに含んでいてもよく、そして、前記ＣＴＰペプチドが、構造（Ｂ−鎖）−（ＣＴＰペプチド）−（Ａ−鎖）を有する一本鎖のインスリンを産生するために、前記Ｂ−鎖を前記Ａ−鎖に共有結合させる結合性ペプチドである、Ｏ−グリコシル化インスリン。
【請求項２１】
前記Ｏ−グリカンが、検出可能な、β−結合マンノース、ホスホマンノースまたはβ−結合マンノースおよびホスホマンノースを欠いている、請求項２０記載のＯ−グリコシル化インスリン。
【請求項２２】
（ａ）糖タンパク質上のＯ−グリカンについて、検出可能なβ−マンノシルトランスフェラーゼ活性；検出可能なホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性、または、検出可能なβ−マンノシルトランスフェラーゼ活性および検出可能なホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を示さない、酵母または糸状菌の宿主細胞を提供する工程；
（ｂ）前記宿主細胞を、Ｏ−グリコシル化インスリンをコードする核酸分子により形質転換する工程；
（ｃ）前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記Ｏ−グリコシル化インスリンを発現するための、培地および条件下において培養する工程；および、
（ｄ）Ｏ−グリコシル化インスリンを、前記培地から回収する工程を含む、
酵母または糸状菌の宿主細胞中で、請求項２０に記載のＯ−グリコシル化インスリンを製造するための方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞が、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現の欠失または破壊を有する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主細胞が、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現の欠失または破壊を有する、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記宿主細胞が、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子、および、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現の欠失または破壊を有する、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞が、さらに、α１，２−マンノシダーゼをコードする核酸分子を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
糖尿病を処置するための組成物または製剤を調製するための、請求項２０に記載のＯ−グリコシル化インスリンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１）発明の分野
本発明は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのベータサブユニット（ｈＣＧβ）のアミノ酸１１２−１１８から１４２を含むカルボキシ末端部分（ＣＴＰ）ペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を含むインスリンまたはインスリン類似体であり、前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体のＣＴＰペプチドが、Ｏ−グリコシル化されている、インスリンまたはインスリン類似体を含む組成物および製剤に関する。具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化インスリン類似体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて産生される。更なる実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰ系インスリン類似体は、主にマンノトリオースおよびマンノテトロースのＯ−グリカンまたは主にマンノースＯ−グリカンを含む。
【背景技術】
【０００２】
（２）関連技術の説明
インスリンは、ほとんどの高等な真核生物、例えば、ヒトにおいて、適切なグルコースレベルを維持するのに必須のペプチドホルモンである。糖尿病は、個体が、インスリンを産生できなくなる、または、インスリン抵抗性になる疾患である。Ｉ型糖尿病は、膵臓のインスリン産生ベータ細胞の自己免疫破壊から生じる糖尿病型である。ＩＩ型糖尿病は、インスリン抵抗性および関連するインスリン不全における、高い血中グルコースにより特徴付けられる代謝障害である。未処置のままでは、Ｉ型またはＩＩ型の糖尿病を有する個体は、死ぬであろう。治癒しないが、インスリンは、実質的に全ての型の糖尿病において、グルコースを低下させるのに効果的である。残念ながら、その薬理学は、グルコース感受性ではない。したがって、生命を脅かす低血糖をもたらし得る過剰な作用をし得る。矛盾する薬理学は、インスリン治療の特徴である。したがって、低血糖を生じさせることなく、血中グルコースを正常化するのは極端に困難である。さらに、天然のインスリンは、作用の持続時間が短いものであり、基礎的なグルコースの制御に使用するのに適するような修飾を必要とする。インスリン治療における１つの中心となる目的は、１日１回のタイミングで、作用を提供可能なインスリン製剤を設計することである。インスリン投与の作用時間を延長するためのメカニズムとしては、注入部位でのインスリンの溶解性を低下させること、または、糖、ポリエチレングリコール、疎水性リガンド、ペプチドまたはタンパク質を、前記インスリンに共有結合させることがあげられる。
【０００３】
前記インスリンの溶解性を低下させる分子アプローチとしては、（１）亜鉛および／またはプロタミンを含む不溶性懸濁液として前記インスリンを製剤化すること、（２）アミノ酸の置換および／または付加、例えば、カチオン性アミノ酸により、その等電点を向上させて、生理学的ｐＨにおいて分子を不溶性にすること、または、（３）前記インスリンの溶解性を低下させ、血清アルブミンを結合させる疎水性リガンドを含むように、前記インスリンを共有的に修飾することがあげられてきた。これらのアプローチは全て、注入部位での分子の沈着およびその後の再可溶化ならびに活性なホルモン型での血中への分子の輸送を生じさせる、固有の変異性により制限されてきた。前記インスリンの再可溶化が作用のより長い持続時間を提供するとしても、前記インスリンは、血清グルコースレベルに対して依然として応答性でなく、低血糖のリスクが残る。
【０００４】
インスリンは、低活性の一本鎖プロインスリン前駆体から、酵素処理により生合成的に生じる、２つの鎖のヘテロ二量体である。ヒトインスリン類似体は、ジスルフィド結合により互いに結合され、合計５１個のアミノ酸を有する、２つのペプチド鎖、「Ａ−鎖ペプチド」（配列番号３３）および「Ｂ−鎖ペプチド」（配列番号２５）からなる。前記Ｂ−鎖のＣ末端領域および前記Ａ−鎖の２つの末端は、インスリン受容体に対する高い親和性結合のための部位を構築する三次元構造で会合する。インスリン分子は、Ｎ−グリコシル化を含まない。
【０００５】
インスリン分子は、前記分子の薬物動態学的または薬力学的特性を修飾する努力において、前記分子に種々の部分を結合させることにより修飾されてきた。例えば、アシル化インスリン類似体は、数多くの刊行物に開示されてきた。前記刊行物としては、例えば、米国特許第５，６９３，６０９号および同第６，０１１，００７号明細書（特許文献１および２）があげられる。ＰＥＧ化インスリン類似体は、数多くの刊行物、例えば、米国特許第５，６８１，８１１号；同第６，３０９，６３３号；同第６，３２３，３１１号；同第６，８９０，５１８号；同第６，８９０，５１８号；および同第７，５８５，８３７号明細書（特許文献３〜８）等において開示されてきた。複合糖質化インスリン類似体は、数多くの刊行物、例えば、国際公開第０６０８２１８４号、同第０９０８９３９６号、同第９０１０６４５号パンフレット、米国特許第３，８４７，８９０号；同第４，３４８，３８７号；同第７，５３１，１９１号および同第７，６８７，６０８号明細書（特許文献９〜１５）等において開示されてきた。ＰＥＧ化等についてのグリカン構造を含ませるためのインスリン等のペプチドの再設計は、例えば、米国特許第７，１３８，３７１号明細書および米国特許出願公開第２００９００５３１６７号明細書（特許文献１６および１７）等の刊行物に開示されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，６９３，６０９号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０１１，００７号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６８１，８１１号明細書
【特許文献４】米国特許第６，３０９，６３３号明細書
【特許文献５】米国特許第６，３２３，３１１号明細書
【特許文献６】米国特許第６，８９０，５１８号明細書
【特許文献７】米国特許第６，８９０，５１８号明細書
【特許文献８】米国特許第７，５８５，８３７号明細書
【特許文献９】国際公開第０６０８２１８４号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第０９０８９３９６号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第９０１０６４５号パンフレット
【特許文献１２】米国特許第３，８４７，８９０号明細書
【特許文献１３】米国特許第４，３４８，３８７号明細書
【特許文献１４】米国特許第７，５３１，１９１号明細書
【特許文献１５】米国特許第７，６８７，６０８号明細書
【特許文献１６】米国特許第７，１３８，３７１号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第２００９００５３１６７号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのベータサブユニット（ｈＣＧβ）の１１２−１１８位から１４５位において見出されたカルボキシ末端部分（ＣＴＰ）ペプチド、または、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を含むように修飾され、前記ＣＴＰペプチドが、Ｏ−グリコシル化されている、インスリンまたはインスリン類似体を提供する。具体的な態様では、前記変異体は、少なくとも２つのＯ−グリコシル化部位を含む。
【０００８】
本発明は、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有するインスリンおよびインスリン類似体（以下、「Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有するインスリンおよびインスリン類似体」の用語は、「ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体」と呼ばれる場合がある。）を含む、組成物および製剤、前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を酵母中で製造するための方法、ならびに、前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を使用するための方法をさらに提供する。本発明の具体的な態様では、前記ＣＴＰペプチドは、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１）のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、前記タンパク質が真核細胞発現系において発現される場合、Ｏ−結合グリコシル化を生じやすい。前記ＣＴＰペプチドは、前記インスリン類似体の本来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を損なうことなく、２つの鎖のインスリン類似体における前記Ｂ−鎖のＮ−末端および／またはカルボキシ末端に共有結合されてもよい。さらに、前記ＣＴＰペプチドは、天然のプロインスリンＣ−ペプチドで保持し得ない方法において、高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を保持しながら、一本鎖インスリン類似体を形成するために、前記インスリンのＢおよびＡの鎖を結合させるのにも使用されてもよい。
【０００９】
したがって、本発明は、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド（前記ＣＴＰペプチドが、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のＯ−グリカンをその上に含む。）または、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含む、前記ＣＴＰペプチドの部分変異体を有するインスリンおよびインスリン類似体を提供する。本願明細書に開示されるＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体分子は、前記ＣＴＰペプチドのセリンまたはスレオニン残基に、α１−結合において結合された１つ以上のＯ−グリカンを含む。この場合、前記Ｏ−グリカンは、１つ、２つ、３つまたは４つのマンノース残基を含む。この場合、前記マンノース残基の還元端は、前記ＣＴＰペプチドのセリンまたはスレオニンに対するα１結合においてである。更なる態様では、前記インスリンまたはインスリン類似体のＣＴＰペプチド上の少なくとも１つのＯ−グリカンは、マンノース、マンノビオース、マンノトリオースまたはマンノテトロースのＯ−グリカン構造を含む（図１３Ｂを参照のこと。）。
【００１０】
更なる実施形態では、本発明は、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、そのＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有し、前記ＣＴＰペプチドが、その上に１つ以上のＯ−グリカンを含むインスリンおよびインスリン類似体を含む組成物を提供する。本発明の具体的な態様では、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有し、前記組成中の主なＯ−グリカンが、マンノース、マンノビオース、マンノトリオースまたはマンノテトロースであるインスリンおよびインスリン類似体を含む組成物が提供される（図１３Ｂを参照のこと。）。更なる態様では、本発明は、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有するインスリンおよびインスリン類似体を含み、前記組成中の主なＯ−グリカンが、マンノース、マンノビオース、マンノトリオースまたはマンノテトロースであるインスリンおよびインスリン類似体を含む組成物を提供する。更なる態様では、本発明は、マンノトリオースおよびマンノテトロースが、主なＯ−グリカンである、Ｏ−グリコシル化Ｃ−末端ペプチド（ＣＴＰ）系インスリンまたはインスリン類似体分子を含む組成物を提供する。更なる態様では、本発明は、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有し、マンノトリオースが、主なＯ−グリカンであるインスリンおよびインスリン類似体を含む組成物を提供する。更なる態様では、本発明は、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有し、マンノテトロースが、主なＯ−グリカンであるインスリンおよびインスリン類似体を含む組成物を提供する。
【００１１】
更なる実施形態では、本発明は、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有するインスリンおよびインスリン類似体と、薬学的に許容され得るキャリアまたは塩とを含み、前記ＣＴＰペプチドが、その上に１つ以上のＯ−グリカンを含む組成物を提供する。本発明の具体的な態様では、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有するインスリンおよびインスリン類似体と、薬学的に許容され得るキャリアまたは塩とを含み、前記組成中の主なＯ−グリカンが、マンノース、マンノビオース、マンノトリオースまたはマンノテトロースである組成物が提供される。更なる態様では、本発明は、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有するインスリンおよびインスリン類似体と、薬学的に許容され得るキャリアまたは塩とを含み、前記組成中の主なＯ−グリカンが、マンノース、マンノビオース、マンノトリオースまたはマンノテトロースである組成物を提供する。更なる態様では、本発明は、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有するインスリンおよびインスリン類似体と、薬学的に許容され得るキャリアまたは塩とを含み、マンノトリオースおよびマンノテトロースが、主なＯ−グリカンである組成物を提供する。更なる態様では、本発明は、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有するインスリンおよびインスリン類似体と、薬学的に許容され得るキャリアまたは塩とを含み、マンノトリオースが、主なＯ−グリカンである組成物を提供する。更なる態様では、本発明は、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有するインスリンおよびインスリン類似体と、薬学的に許容され得るキャリアまたは塩とを含み、マンノテトロースが、主なＯ−グリカンである組成物を提供する。
【００１２】
更なる態様では、本発明は、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有するインスリンおよびインスリン類似体と、薬学的に許容され得るキャリアまたは塩とを含み、前記ＣＴＰペプチドが、その上に１つ以上のＯ−グリカンを含む薬学的組成物を提供する。本発明の具体的な態様では、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有するインスリンおよびインスリン類似体と、薬学的に許容され得るキャリアまたは塩とを含み、前記組成中の主なＯ−グリカンが、マンノース、マンノビオース、マンノトリオースまたはマンノテトロースである薬学的組成物が提供される。更なる態様では、本発明は、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有するインスリンおよびインスリン類似体と、薬学的に許容され得るキャリアまたは塩とを含み、前記組成中の主なＯ−グリカンが、マンノース、マンノビオース、マンノトリオースまたはマンノテトロースである薬学的組成物を提供する。更なる態様では、本発明は、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有するインスリンおよびインスリン類似体と、薬学的に許容され得るキャリアまたは塩とを含み、マンノトリオースおよびマンノテトロースが、主なＯ−グリカンである薬学的組成物を提供する。更なる態様では、本発明は、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有するインスリンおよびインスリン類似体と、薬学的に許容され得るキャリアまたは塩とを含み、マンノトリオースが、主なＯ−グリカンである薬学的組成物を提供する。更なる態様では、本発明は、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有するインスリンおよびインスリン類似体と、薬学的に許容され得るキャリアまたは塩とを含み、マンノテトロースが、主なＯ−グリカンである薬学的組成物を提供する。
【００１３】
本発明の更なる態様では、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣ（配列番号９０）のアミノ酸配列を含むＡ−鎖ペプチド；ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＢ−鎖ペプチド；および、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＣＴＰペプチドを有するＯ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体であり、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基が、Ｏ−グリカンに共有結合され；前記インスリンまたはインスリン類似体が、さらに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個までのアミノ酸置換を含んでもよく、前記ＣＴＰペプチドが、前記Ｂ−鎖ペプチドのＮ−末端、前記Ａ−鎖ペプチドのＣ−末端、前記Ｂ鎖ペプチドのＣ−末端に、ペプチド結合により共有結合され、または、前記ＣＴＰペプチドが、構造（Ｂ−鎖）−（ＣＴＰペプチド）−（Ａ−鎖）を有する一本鎖のインスリンまたはインスリン類似体を産生するために、前記Ｂ−鎖ペプチドを前記Ａ−鎖ペプチドに共有結合させる結合性ペプチドである、Ｏ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と、薬学的に許容され得るキャリアまたは塩とを含む組成物が提供される。前記インスリンまたはインスリン類似体は、３つのジスルフィド結合を有する。第１のジスルフィド結合は、配列番号２の６と１１位とにおけるシステイン残基間であり、第２のジスルフィド結合は、配列番号３の３位と配列番号２の７位とにおけるシステイン残基間であり、第３のジスルフィド結合は、配列番号３の１５位と配列番号２の２０位とにおけるシステイン残基間である。更なる態様では、少なくとも２つ、３つまたは４つのＯ−グリカンが、前記ＣＴＰペプチドに結合される。
【００１４】
本発明の更なる態様では、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣ（配列番号９０）のアミノ酸配列を含むＡ−鎖ペプチド；ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＢ−鎖ペプチド；および、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＣＴＰペプチドを有するＯ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体分子であり、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基が、Ｏ−グリカンに共有結合され；前記インスリンまたはインスリン類似体が、さらに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個までのアミノ酸置換を含んでもよく、前記ＣＴＰペプチドが、前記Ｂ−鎖ペプチドのＮ−末端、前記Ａ−鎖ペプチドのＣ−末端、前記Ｂ鎖ペプチドのＣ−末端に、ペプチド結合により共有結合され、または、前記ＣＴＰペプチドが、（Ｂ−鎖）−（ＣＴＰペプチド）−（Ａ−鎖）を有する一本鎖のインスリンまたはインスリン類似体を産生するために、前記Ｂ−鎖ペプチドを前記Ａ−鎖ペプチドに共有結合させる結合性ペプチドである、Ｏ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体分子と、薬学的に許容され得るキャリアまたは塩とを含む薬学的組成物が提供される。前記インスリンまたはインスリン類似体は、３つのジスルフィド結合を有する。第１のジスルフィド結合は、配列番号２の６と１１位とにおけるシステイン残基間であり、第２のジスルフィド結合は、配列番号３の３位と配列番号２の７位とにおけるシステイン残基間であり、第３のジスルフィド結合は、配列番号３の１５位と配列番号２の２０位とにおけるシステイン残基間である。更なる態様では、２つ、３つまたは４つのＯ−グリカンが、前記ＣＴＰペプチドに結合される。
【００１５】
上記実施形態のいずれかの更なる態様では、前記インスリンまたはインスリン類似体は、前記Ａ−鎖ペプチドが、２つのジスルフィド結合により前記Ｂ−鎖に共有結合される、Ａ−鎖ペプチドおよびＢ−鎖ペプチドを含むヘテロ二量体分子、または、結合性ペプチドにより前記Ｂ−鎖ペプチドに結合されたＡ−鎖ペプチドを含み、前記Ａ−鎖および前記Ｂ−鎖が、２つのジスルフィド結合により共有結合され、前記ＣＴＰペプチドが、前記Ｂ−鎖のＮ−末端または前記Ａ−鎖のＣ末端に共有結合される、一本鎖分子である。
【００１６】
上記実施形態のいずれかの更なる態様では、前記インスリンまたはインスリン類似体は、前記Ａ−鎖ペプチドが、２つのジスルフィド結合により前記Ｂ−鎖に共有結合される、Ａ−鎖ペプチドおよびＢ−鎖ペプチドを含む一本鎖分子、または、結合性ペプチドにより前記Ｂ−鎖ペプチドに結合されたＡ−鎖ペプチドを含み、前記Ａ−鎖および前記Ｂ鎖が、２つのジスルフィド結合により共有結合され、前記ＣＴＰペプチドが、構造Ｂ−鎖−ＣＴＰペプチド−Ａ−鎖を有する一本鎖のインスリンまたはインスリン類似体を提供するために、前記Ｂ−鎖を前記Ａ−鎖に共有結合させる結合性ペプチドである、一本鎖分子である。
【００１７】
上記実施形態のいずれかの更なる態様では、前記アミノ酸置換は、配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するＡ−鎖ペプチドの５、８、９、１０、１２、１４、１５、１７、１８および２１位、ならびに／または、配列番号４に示されたアミノ酸配列を有するＢ−鎖ペプチドの１、２、３、４、５、９、１０、１３、１４、１７、２０、２１、２２、２３、２６、２７、２８、２９および３０位から選択される。
【００１８】
上記実施形態のいずれかの更なる態様では、前記Ａ−鎖ペプチドの２１位におけるアミノ酸は、Ｇｌｙであり、前記Ｂ−鎖ペプチドは、前記Ｂ−鎖ペプチドの３０位におけるＴｈｒに共有結合されるジペプチドＡｒｇ−Ａｒｇを含む。別の態様では、前記Ｂ−鎖ペプチドの２８および２９位におけるアミノ酸はそれぞれ、リジンおよびプロリンである。別の態様では、前記Ｂ−鎖ペプチドの２８位におけるアミノ酸は、アスパラギン酸である。別の態様では、前記Ｂ−鎖ペプチドの３位におけるアミノ酸は、リジンであり、前記Ｂ−鎖ペプチドの２９位は、グルタミン酸である。
【００１９】
一般的に、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンおよびインスリン類似体は、２１個のアミノ酸を含むＡ−鎖ペプチドおよび３０個のアミノ酸を含むＢ−鎖ペプチドを有する。ただし、具体的な態様では、前記Ｂ−鎖ペプチドは、３０位におけるスレオニン残基を欠いているか（ｄｅｓＢ３０）、または、他の態様では、前記Ｂ−鎖ペプチドの、１から４および／または２６から３０位における１つ以上のアミノ酸が欠失している。前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系ヘテロ二量体および一本鎖のインスリンおよびインスリン類似体の具体的な実施形態では、前記Ｂ−鎖ペプチドは、アミノ酸２６−３０を欠いている（ｄｅｓＢ２６−３０）。
【００２０】
上記組成の更なる態様では、前記Ｏ−グリカンの占有度は、１モルのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）系インスリンまたはインスリン類似体あたりに、少なくとも１モルのＯ−グリカンである。更なる態様では、前記Ｏ−グリカンの占有度は、１モルのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）系インスリンまたはインスリン類似体あたりに、少なくとも２モルのＯ−グリカンである。更なる態様では、前記Ｏ−グリカンの占有度は、１モルのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）系インスリンまたはインスリン類似体あたりに、少なくとも３モルのＯ−グリカンである。具体的な態様では、前記Ｏ−グリカンの占有度は、１モルのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）系インスリンまたはインスリン類似体あたりに、約１から４モルのＯ−グリカンである。
【００２１】
上記組成の更なる態様では、少なくとも４０モル％のＯ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースであり、少なくとも５０モル％のＯ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースであり、少なくとも６０モル％のＯ−グリカンが、マンのトリオースまたはマンノテトロースであり、少なくとも７０モル％のＯ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースであり、少なくとも８０モル％のＯ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースであり、少なくとも９０モル％のＯ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースであり、少なくとも９５モル％のＯ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースであり、少なくとも９８モル％のＯ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースであり、または、少なくとも９９モル％のＯ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースである。
【００２２】
上記組成の更なる態様では、少なくとも４０モル％のＯ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースであり、少なくとも５０モル％のＯ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースであり、少なくとも６０モル％のＯ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースであり、少なくとも７０モル％のＯ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースであり、少なくとも８０モル％のＯ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースであり、少なくとも９０モル％のＯ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースであり、少なくとも９５モル％のＯ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースであり、少なくとも９８モル％のＯ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースであり、少なくとも９９モル％のＯ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースである。
【００２３】
上記組成の更なる態様では、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、少なくとも１つのＯ−グリカンを含む。
【００２４】
上記組成の更なる態様では、前記Ｏ−グリカンを含むマンノース残基は、α１，２結合により、隣接するマンノース残基に共有結合される。更なる態様では、前記Ｏ−グリカンは、β１，２結合における隣接するマンノース残基に結合した検出可能なマンノース残基を欠いており、リン酸原子に共有結合した検出可能なマンノース残基を欠いている。このため、検出可能な、β−結合マンノース残基、ホスホマンノース残基またはβ−結合マンノースおよびホスホマンノースの残基を欠いている組成のＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体が提供される。
【００２５】
本発明は、さらに、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、酵母または糸状菌の宿主細胞中で製造するための方法を提供する。一般的には、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を産生するのに使用される前記宿主細胞は、糖タンパク質上のＯ−グリカンについて、ほとんど検出できないか、または、検出できないβ−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示す。別の態様では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を産生するのに使用される前記宿主細胞は、糖タンパク質上のＯ−グリカンについて、ほとんど検出できないか、または、検出できないホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を示す。更なる態様では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を産生するのに使用される前記宿主細胞は、糖タンパク質上のＯ−グリカンについて、ほとんど検出できないか、または、検出できない、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示す。具体的な態様では、前記宿主細胞は、さらに、糖タンパク質上のＯ−グリカンについて、ほとんど検出できないか、または、検出できない開始α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示す。更なる態様では、前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を産生するのに使用される前記宿主細胞は、糖タンパク質上のＯ−グリカンについて、ほとんど検出できないか、または、検出できない、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性および開始α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示す。
【００２６】
したがって、本発明は、検出可能なβ−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さない、酵母または糸状菌の宿主細胞を提供する工程；前記宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換する工程；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養する工程；および、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、酵母または糸状菌の宿主細胞中で製造するための方法を提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、検出可能なホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を示さない、酵母または糸状菌の宿主細胞を提供する工程；前記宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換する工程；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養する工程；および、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、酵母または糸状菌の宿主細胞中で製造するための方法を提供する。
【００２８】
更なる態様では、本発明は、検出可能なβ−マンノシルトランスフェラーゼ活性およびホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を示さない、酵母または糸状菌の宿主細胞を提供する工程；前記宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換する工程；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養する工程；および、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、酵母または糸状菌の宿主細胞中で製造するための方法を提供する。
【００２９】
上記方法の具体的な態様では、前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａからなる群から選択される。
【００３０】
本発明は、さらに、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現が抑制されている、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞を提供する工程；前記宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換する工程；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養する工程；および、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞中で製造するための方法を提供する。更なる態様では、少なくともＢＭＴ２遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、２つ以上のＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子それぞれの発現が抑制される。
【００３１】
本発明は、さらに、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現が抑制されている、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞を提供する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞中で製造するための方法を提供する。更なる態様では、少なくともＰＮＯ１遺伝子の発現は、抑制され；前記宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換し；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養し；および、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する。更なる態様では、ＭＭＮ４Ｌ１遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＰＮＯ１およびＭＭＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＭＮＮ４遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＭＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が抑制される。
【００３２】
本発明は、さらに、宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換する工程；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養する工程；および、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、開始α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードするＯＣＨ１遺伝子の発現が抑制されている酵母宿主細胞中で製造するための方法を提供する。
【００３３】
本発明は、さらに、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現およびホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現が抑制されている、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞を提供する工程；前記宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換する工程；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養する工程；および、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞中で製造するための方法を提供する。更なる態様では、少なくともＢＭＴ２遺伝子およびＰＮＯ１遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、２つ以上のＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１遺伝子それぞれの発現が抑制される。更なる態様では、少なくともＢＭＴ２遺伝子ならびにＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、２つ以上のＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、少なくともＢＭＴ２遺伝子ならびにＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、２つ以上のＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子それぞれの発現が抑制される。前述の態様のいずれか１つの更なる態様では、前記宿主は、さらに、開始α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードするＯＣＨ１遺伝子の発現の抑制を含む。
【００３４】
前述の態様のいずれかにおいて、上記言及された遺伝子のいずれかの発現の抑制は、前記遺伝子またはその一部（例えば、遺伝子産物またはプロモータをコードするオープン・リーディング・フレーム）を欠失させるか、または、異種核酸分子を、前記遺伝子産物をコードするオープン・リーディング・フレーム内に挿入することにより、前記遺伝子を破壊することにより達成されてもよい。いずれの場合でも、前記遺伝子は、検出可能な活性、例えば、場合によって、検出可能な、β−マンノシルトランスフェラーゼ、ホスホマンノシルトランスフェラーゼまたはα１，６−マンノシルトランスフェラーゼの活性を有する遺伝子産物の産生ができなくなる。他の態様では、上記言及された１つ以上の遺伝子の発現は、遺伝子転写および／またはｍＲＮＡ翻訳の阻害剤を使用して抑制される。前記阻害剤としては、制限されず、化合物、１つまたは複数の遺伝子をコードする１つ以上のｍＲＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ、または、１つまたは複数の遺伝子をコードする１つ以上のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡがあげられる。
【００３５】
具体的な態様では、前記β−マンノシルトランスフェラーゼ、ホスホマンノシルトランスフェラーゼおよび／またはα１，６−マンノシルトランスフェラーゼの活性は、β−マンノシルトランスフェラーゼ、ホスホマンノシルトランスフェラーゼおよび／またはα１，６−マンノシルトランスフェラーゼの活性の１つ以上の化学阻害剤の存在下におけるタイミングで、前記宿主細胞を培養することにより阻害される。例えば、前記宿主細胞は、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の発現が誘導されると同時に、または、同誘導の直前に、前記阻害剤の存在下において培養される。
【００３６】
本発明は、さらに、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む、下等な真核生物の宿主細胞を提供する。前記宿主細胞は、上記された遺伝的背景を有し得る。例えば、本発明は、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の欠失または破壊を含み、ＣＴＰ系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む、下等な真核生物の宿主細胞を提供する。別の実施形態では、本発明は、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の欠失または破壊を含み、ＣＴＰ系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む、下等な真核生物の宿主細胞も提供する。更なる実施形態では、本発明は、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の欠失または破壊；ホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の欠失または破壊を含み、ＣＴＰ系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む、下等な真核生物の宿主細胞を提供する。前記実施形態において、前記核酸分子は、前記宿主細胞のゲノム内に組み込まれてもよいし、前記宿主細胞中で、染色体外的に、例えば、プラスミドベクター、ミニ−染色体等で存在してもよい。
【００３７】
更なる実施形態では、前記宿主細胞は、さらに、α１，２  マンノシダーゼ活性をコードする核酸分子を含み、前記宿主細胞は、主にまたは唯一、１つのマンノース残基からなるＯ−グリカンを産生する。このため、前記宿主細胞は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％より多くのＯ−グリコシル化部位がマンノース残基で占有されている、マンノースＯ−グリカン構造を有するＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を産生する。更なる実施形態では、前記α１，２  マンノシダーゼ活性は、そのＮ−末端において、分泌経路に融合タンパク質を向ける異種性細胞標的ペプチドに融合された、α１，２  マンノシダーゼの触媒ドメインを含む融合タンパク質により提供される。
【００３８】
本発明は、さらに、本願明細書に開示された宿主細胞のいずれか１つにより産生される、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を提供する。
【００３９】
本発明は、さらに、本願明細書に開示されたＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子を提供する。具体的な態様では、前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする前記ＯＲＦは、前記核酸分子上の第２のＯＲＦから下流である。前記核酸分子は、プレ−プロペプチド、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルファ接合因子をコードして、前記プレ−プロペプチドが前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体のＮ−末端に融合された、融合タンパク質をコードする１つの連続したＯＲＦを提供する。更なる態様では、前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子は、誘導性プロモータ、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＯＸ１プロモータに操作可能に結合される。具体的な態様では、前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードするコドンは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて一般的に使用されるコドンに修飾される。更なる実施形態では、前記宿主細胞は、さらに、α１，２  マンノシダーゼ活性をコードする核酸分子を含み、更なる実施形態では、前記活性は、そのＮ−末端において、分泌経路に融合タンパク質を向ける異種性細胞標的ペプチドに融合された、α１，２  マンノシダーゼの触媒ドメインを含む融合タンパク質である。
【００４０】
糖尿病の処置のための、医薬、組成物または製剤を調製するための、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の使用が、さらに提供される。糖尿病を処置するための、本願明細書に開示された組成物がさらに提供される。例えば、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣ（配列番号９０）のアミノ酸配列を含むＡ−鎖ペプチド；および、ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＢ−鎖ペプチド；および、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＣＴＰペプチドを有し、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基が、Ｏ−グリカンに共有結合され；インスリンまたはインスリン類似体分子が、１７個までのアミノ酸置換、および／または、前記分子のＮ−末端またはＣ−末端に共有結合される３から３５個のアミノ酸のポリペプチドをさらに含んでよい、Ｏ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と、薬学的に許容され得るキャリアまたは塩とである。更なる態様では、２つ、３つまたは４つのＯ−グリカンが、前記ＣＴＰペプチドに結合される。
【００４１】
定義
本願明細書で使用する時、「インスリン」の用語は、動物の身体における炭水化物の代謝に影響を及ぼし、糖尿病の処置に価値のある、膵臓の有効成分を意味する。前記用語は、構造、用途および意図した作用において、天然由来のインスリンと同じまたは類似し、糖尿病の処置に価値のある、合成的およびバイオテクノロジー的に誘導された生成物を含む。
【００４２】
前記「インスリン」または「インスリン分子」の用語は、配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するＡ−鎖ペプチドと、配列番号４に示されたアミノ酸配列を有するＢ−鎖ペプチドとを含み、前記Ａ鎖の６と１１位とのシステイン残基が、ジスルフィド結合において結合され、前記Ａ鎖の７位と前記Ｂ鎖の７位とにおけるシステイン残基が、ジスルフィド結合において結合され、前記Ａ鎖の２０位と前記Ｂ鎖の１９位とにおけるシステイン残基が、ジスルフィド結合において結合されている、５１個のアミノ酸のヘテロ二量体を指定する総称である。
【００４３】
本願明細書で使用する時、「インスリン類似体」の用語は、天然のＡ−鎖ペプチドおよび／またはＢ−鎖ペプチドの１つ以上の（１又は複数の）修飾を含む、任意のヘテロ二量体類似体または一本鎖類似体を含む。修飾としては、制限されず、Ａ４、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１６、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置での天然のアミノ酸についてのアミノ酸の置換；Ｂ１−４およびＢ２６−３０位のいずれかまたは全ての欠失；または、１つ以上のアシル、ポリエチルグリシン（ＰＥＧ）または１つ以上の糖類部分；またはそれらの組み合わせの直接的、または、ポリマー性または非ポリマー性のリンカーによるコンジュゲートがあげられる。インスリン類似体の例としては、制限されず、国際公開第２０１０００８０６０６号、同第２００９／０９９７６３号および同第２０１００８０６０９号パンフレットに開示された、ヘテロ二量体および一本鎖類似体があげられる。それらの開示は、参照により本願明細書に組み込まれる。一本鎖インスリン類似体の例としては、制限されず、国際公開第９６３４８８２号、同第９５５１６７０８号、同第２００５０５４２９１号、同第２００６０９７５２１号、同第２００７１０４７３４号、同第２００７１０４７３６号、同第２００７１０４７３７号、同第２００７１０４７３８号、同第２００７０９６３３２号、同第２００９１３２１２９号パンフレット；米国特許第５，３０４，４７３号および同第６，６３０，３４８号明細書；ならびに、Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０５：９８１−９８６（１９９５）に開示されたものもあげられる。それらの開示はそれぞれ、参照により本願明細書に組み込まれる。
【００４４】
前記「インスリン類似体」の用語は、さらに、インスリン受容体にほとんど検出可能な活性を有さないか、または、同活性を有さないが、前記インスリン受容体における活性を有する１つ以上のアミノ酸修飾または置換を含むように修飾されており、天然のインスリンと比較して、前記インスリン受容体における少なくとも１％、１０％、５０％、７５％または９０％の活性を有し、さらに、少なくとも１つのＮ−結合グリコシル化部位を含む、一本鎖およびヘテロ二量体のポリペプチド分子を含む。具体的な態様では、前記インスリン類似体は、前記インスリン受容体において、天然のインスリンの２×から１００×未満の活性を有する、部分アゴニストである。他の態様では、前記インスリン類似体は、前記インスリン受容体、例えば、（参照により本願明細書に組み込まれる）国際公開第２０１００８０６０７号パンフレットに開示されたＩＧＦＢ１６Ｂ１７誘導体ペプチドにおける向上した活性を有する。インスリン成長ホルモン受容体における低下した活性および前記インスリン受容体における向上した活性を有するこれらのインスリン類似体は、ヘテロ二量体および一本鎖類似体の両方を含む。
【００４５】
本願明細書で使用する時、前記「一本鎖インスリン」または「一本鎖インスリン類似体」の用語は、前記Ａ−鎖ペプチドまたは機能的類似体および前記Ｂ−鎖ペプチドまたは機能的類似体が、２から３５個のアミノ酸のペプチドもしくはポリペプチド、または、非ペプチドのポリマー性もしくは非ポリマー性のリンカーにより共有結合され、天然のインスリンと比較して、前記インスリン受容体におけるインスリンの少なくとも１％、１０％、５０％、７５％または９０％の活性を有する、構造的に関連するタンパク質群を包含する。前記一本鎖インスリンまたはインスリン類似体は、さらに、３つのジスルフィド結合を含む。第１のジスルフィド結合は、前記Ａ鎖またはその機能的類似体の６と１１位とにおけるシステイン残基間であり、第２のジスルフィド結合は、前記Ａ鎖またはその機能的類似体の７位と前記Ｂ鎖またはその機能的類似体の７位とにおけるシステイン残基間であり、第３のジスルフィド結合は、前記Ａ鎖またはその機能的類似体の２０位と前記Ｂ鎖またはその機能的類似体の１９位とにおけるシステイン残基間である。
【００４６】
本願明細書で使用する時、「結合性ペプチド」または「Ｃ−ペプチド」の用語は、一本鎖プレプロインスリン様分子のＢ−Ｃ−Ａのポリペプチド配列における結合部分「Ｃ」を意味する。具体的には、天然のインスリン鎖において、前記Ｃ−ペプチドは、前記Ｂ−鎖の３０位におけるアミノ酸と、前記Ａ−鎖の１位におけるアミノ酸とを結合する。前記用語は、天然のインスリンＣ−ペプチド（配列番号５）、サルのＣ−ペプチドと、前記Ｂ−鎖を前記Ａ−鎖に結合する、３から３５個のアミノ酸の任意の他のペプチドとの両方を意味するため、一本鎖インスリン類似体（例えば、米国特許出願公開第２００９０１７０７５０号および同第２００８００５７００４号明細書ならびに国際公開第９６３４８８２号パンフレットを参照のこと。）および、例えば、国際公開第９５１６７０８号パンフレットおよび米国特許第７，１０５，３１４号明細書に開示されたインスリン前駆体分子において、前記Ａ−鎖ペプチドに前記Ｂ−鎖ペプチドを結合させる任意のペプチドを包含することを意味し得る。本願明細書に示され、２０１１年１２月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／５７８，０５２号に開示されたように、前記結合性ペプチドは、前記ＣＴＰペプチドでもよい。
【００４７】
本願明細書で使用する時、前記「プレ−プロインスリン類似体前駆体」の用語は、リーダーペプチドを含む融合タンパク質を意味する。前記リーダーペプチドは、前記プレプロ−インスリン類似体前駆体を、前記宿主細胞の分泌経路に向け、前記Ｂ−鎖ペプチドまたはＢ−鎖ペプチド類似体のＮ−末端に融合される。前記Ｂ−鎖ペプチドまたはＢ−鎖ペプチド類似体は、前記Ｃ−ペプチドのＮ−末端に融合され、次に、そのＣ−末端において、前記Ａ−鎖ペプチドまたはＡ−鎖ペプチド類似体のＮ−末端に融合される。前記融合タンパク質は、前記リーダーペプチドのＣ−末端と前記Ｂ−鎖ペプチドまたはＢ−鎖ペプチド類似体のＮ−末端との間に、１つ以上の伸長またはスペーサペプチドを含んでもよい。存在する場合、前記伸長またはスペーサペプチドは、前記Ｂ−鎖またはＢ−鎖類似体のＮ−末端を、発酵中のプロテアーゼ消化から保護し得る。天然のヒトプレ−プロインスリンは、配列番号６に示されたアミノ酸配列を有する。
【００４８】
本願明細書で使用する時、前記「プロインスリン類似体前駆体」の用語は、前記プレ−プロインスリン類似体前駆体のシグナルまたはプレ−ペプチドが除去されている分子を意味する。
【００４９】
本願明細書で使用する時、前記「インスリン類似体前駆体」の用語は、前記プロインスリン類似体前駆体のプロペプチドが除去されている分子を意味する。前記インスリン類似体前駆体は、前記Ｂ−鎖ペプチドまたはＢ−鎖ペプチド類似体のＮ−末端において、伸長またはスペーサペプチドを含んでもよい。前記インスリン類似体前駆体は、それがＣ−ペプチドを含むために、一本鎖分子である。ただし、前記インスリン類似体前駆体は、ヒトインスリンと同様に正確に位置したジスルフィドブリッジ（３つ）を含むであろうし、１つ以上のその後の化学的および／または酵素的プロセスにより、ヘテロ二量体または一本鎖のインスリン類似体に変換されてもよい。
【００５０】
本願明細書で使用する時、前記「リーダーペプチド」の用語は、プレ−ペプチド（前記シグナルペプチド）およびプロペプチドを含むポリペプチドを意味する。
【００５１】
本願明細書で使用する時、前記「シグナルペプチド」の用語は、前駆体型のタンパク質の上のＮ−末端ペプチドとして存在するプレ−ペプチドを意味する。前記シグナルペプチドの機能は、小胞体内に付着される、発現されたポリペプチドの移行を容易にすることである。前記シグナルペプチドは、通常、このプロセスの経過中に開裂される。前記シグナルペプチドは、前記ポリペプチドを産生するのに使用される有機体に対して、異種または相同でもよい。使用され得る数多くのシグナルペプチドは、酵母のアスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチドまたは任意の機能的類似体（Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．ＹＥＡＳＴ  ６：１２７  １３７（１９９０）および米国特許第５，７２６，０３８号明細書）、ならびに、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの接合因子α１遺伝子（ＳｃＭＦα１）遺伝子のシグナルペプチド（Ｔｈｏｒｎｅｒ（１９８１）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ  １４３  １８０，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹおよび米国特許第４，８７０，００８号明細書）を含む。
【００５２】
本願明細書で使用する時、前記「プロペプチド」の用語は、それが付着されている前記発現されたポリペプチドを、小胞体からゴルジ体に、さらに、培養培地内への分泌のために、分泌小胞に向かわせる（すなわち、細胞壁を越える、または、少なくとも細胞膜を通る、酵母細胞の細胞周辺腔内へのポリペプチドの移出）機能のペプチドを意味する。前記プロペプチドは、ＳｃＭＦα１でもよい（例えば、米国特許第４，５４６，０８２号および同第４，８７０，００８号明細書を参照のこと。）。代替的に、前記プロ−ペプチドは、合成のプロペプチドでもよく、それは、天然には見出されないプロペプチドと言われ、例えば、制限されず、米国特許第５，３９５，９２２号；同第５，７９５，７４６号；および同第５，１６２，４９８号明細書ならびに国際公開第９８３２８６７号パンフレットに開示されたものである。前記プロペプチドは、好ましくは、Ｃ−末端におけるエンドペプチダーゼ処理部位、例えば、Ｌｙｓ−Ａｒｇ配列またはその任意の機能的類似体を含むであろう。
【００５３】
本願明細書で使用する時、前記「インスリン」の用語について、「ｄｅｓＢ３０」または「Ｂ（１−２９）」の用語は、Ｂ３０のアミノ酸残基を欠いているインスリンＢ−鎖ペプチドを意味する。「Ａ（１−２１）」は、前記インスリンのＡ鎖を意味する。
【００５４】
本願明細書で使用する時、「直接Ｎ−末端に」は、アミノ酸残基またはペプチド配列が、そのＣ−末端において、別のアミノ酸残基またはアミノ酸配列のＮ−末端に、ペプチド結合により直接結合される状態を説明するのを意味する。
【００５５】
本願明細書で使用する時、アミノ酸「修飾」は、アミノ酸の置換または、アミノ酸への／アミノ酸からの化学基の付加および／または除去によるアミノ酸の誘導体化を意味し、ヒトのタンパク質中に一般的に見出される２０個のアミノ酸、ならびに、非定型または非天然由来のアミノ酸のいずれかによる置換を含む。非定型アミノ酸の商業的供給元としては、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＣｈｅｍＰｅｐ  Ｉｎｃ．（Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）およびＧｅｎｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）があげられる。非定型アミノ酸は、商業的供給元から購入されてもよいし、新たに合成されてもよいし、または、化学的に修飾もしくは天然由来のアミノ酸から誘導体化してもよい。
【００５６】
本願明細書で使用する時、アミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸残基の、異なるアミノ酸残基による置換えを意味する。本出願全体を通して、文字および数による特定のアミノ酸位置（例えば、Ａ５位）への全ての言及は、各天然のヒトインスリンのＡ−鎖（配列番号２）もしくはＢ−鎖（配列番号４）における前記Ａ−鎖（例えば、Ａ５位）または前記Ｂ−鎖（例えば、Ｂ５位）のいずれかのその位置、またはその任意の類似体における対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸を意味する。
【００５７】
「糖タンパク質」の用語は、１つ以上のオリゴ糖がそれに共有結合される１つ以上の結合基を含む、任意のグリコシル化インスリン類似体、例えば、一本鎖インスリン類似体を含むと意味する。
【００５８】
本願明細書で使用する時、「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」または単に「宿主細胞」）の用語は、組換えベクターが導入されている細胞を意味することを意図する。このような用語は、特定の対象の細胞だけでなく、このような細胞の子孫も意味することを意図すると理解されるべきである。特定の修飾が、変異または環境影響により、後の世代に生じる場合があるために、このような子孫は、実際には、親細胞と同一ではない場合があるが、それでも、本願明細書で使用する時の前記「宿主細胞」の用語の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞は、単離された細胞または培養において増殖した細胞系統でもよいし、または、生きた組織または器官に属する細胞でもよい。宿主細胞は、糖タンパク質を産生するように遺伝子操作されている、酵母、糸状菌、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞ならびに原核生物および古細菌でもよい。
【００５９】
糖タンパク質の調製物に存在するグリカンの「モルパーセント」または「モル％」に言及する場合、前記用語は、β−除去により放出され、ついで、糖型組成により影響を受けない方法（例えば、放出されたグリカンプールを、蛍光タグ、例えば、２−アミノベンズアミドにより標識し、ついで、高性能液体クロマトグラフィーまたはキャピラリ電気泳動により分離し、ついで、蛍光強度によりグリカンを定量すること）により定量される、Ｏ−結合オリゴ糖のプールに存在する特定のグリカンのモルパーセントを意味する。実施形態では、糖タンパク質の調製物中の特定のグリカンのモルパーセントは、２０％と１００％との間、好ましくは、２５％、３０％、３５％、４０％または４５％より高く、より好ましくは、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％より高く、最も好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％より高いであろう。
【００６０】
前記「操作可能に結合された」発現制御配列の用語は、前記発現制御配列が、所望の遺伝子を制御するために、所望の遺伝子と連続しており、発現制御配列が、ｔｒａｎｓにおいて、または、所望の遺伝子を制御する距離において作用する、結合を意味する。
【００６１】
前記「発現制御配列」または「調節配列」の用語は、互換的に使用され、本願明細書で使用する時、それらが操作可能に結合されるコード配列の発現に作用するのに必須のポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、転写、転写後イベントおよび核酸配列の翻訳を制御する配列である。発現制御配列としては、適切な転写開始、終了、プロモータおよびエンハンサの配列；効率的なＲＮＡ処理シグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を向上させる配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質の安定性を向上させる配列；および、必要に応じて、タンパク質の分泌を向上させる配列があげられる。このような制御配列の性質は、宿主有機体により異なる。原核生物において、このような制御配列としては、一般的に、プロモータ、リボソーム結合部位および転写終了配列があげられる。前記「制御配列」の用語は、哺乳類において、その存在が発現に必須の全ての成分を含み、存在が有益である更なる成分、例えば、リーダ配列および融合パートナー配列も含み得ることを意図する。
【００６２】
「遺伝子導入する」、「遺伝子導入」、「遺伝子導入すること」等の用語は、異種核酸を真核生物の細胞、高等および下等の両方の真核生物の細胞内に導入することを意味する。歴史的に「形質転換」の用語は、原核生物、酵母または糸状菌の細胞内への核酸の導入を説明するのに使用されてきた。ただし、前記「遺伝子導入」の用語は、任意の原核生物または真核生物の細胞、例えば、酵母および糸状菌の細胞内への核酸の導入を意味するのにも使用される。さらに、原核生物または真核生物の細胞内への異種核酸の導入は、ウイルスもしくは細菌の感染または弾道的ＤＮＡ移行によっても生じてもよい。前記「遺伝子導入」の用語は、適切な宿主細胞におけるこれらの方法を意味するのにも使用される。
【００６３】
前記「真核生物」の用語は、有核細胞または生物を意味し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、動物細胞および下等な真核生物の細胞があげられる。
【００６４】
前記「下等な真核生物の細胞」としては、酵母および糸状菌があげられる。酵母および糸状菌としては、制限されず、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、任意のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａがあげられる。
【００６５】
本願明細書で使用する時、「主に」の用語またはバリエーション、例えば、「主な（ｔｈｅ  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ）」または「主な（ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ）」は、前記インスリン類似体がＰＮＧａｓｅで処理され、放出されたグリカンが質量分析法、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳまたはＨＰＬＣにより分析された後の、Ｏ−グリカン合計の最も高いモルパーセント（％）を有するグリカン種を意味すると理解されるであろう。すなわち、「主に」の表現は、任意の他の個々の実体より高いモルパーセントで存在する、個々の実体、例えば、特定の糖型として規定される。例えば、組成が、Ａ種が４０モルパーセント、Ｂ種が３５モルパーセントおよびＣ種が２５モルパーセントからなる場合、前記組成は、主にＡ種を含み、Ｂ種が、次の最も主な種であろう。
【００６６】
本願明細書で使用する時、「薬学的に許容され得るキャリア」の用語は、標準的な薬学的キャリア、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン、例えば、油／水または水／油のエマルジョンおよび種々の種類の湿潤剤のいずれかを含む。前記用語は、米国連邦政府の監督官庁により承認され、または、動物、例えば、ヒトに使用するために米国薬局方に列記された薬剤のいずれかも包含する。
【００６７】
本願明細書で使用する時、「薬学的に許容され得る塩」の用語は、親化合物の生物学的活性を保持し、生物学的または他の方法で望ましくなくない化合物の塩を意味する。本願明細書に開示された多くの化合物は、酸性および／または塩基性の塩を、アミノおよび／またはカルボキシルの基またはそれに類似する基の存在により形成可能である。
【００６８】
薬学的に許容され得る塩基付加塩は、無機または有機の塩基から調製され得る。無機塩基から派生される塩としては、単に例として、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウムの塩があげられる。有機塩基から派生される塩としては、制限されず、一級、二級および三級のアミンの塩があげられる。
【００６９】
薬学的に許容され得る酸付加塩は、無機または有機の酸から調製され得る。無機酸から派生される塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等があげられる。有機酸から派生される塩としては、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエン−スルホン酸、サリチル酸等があげられる。
【００７０】
本願明細書で使用する時、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」の用語は、特定の障害もしくは症状の予防または特定の障害もしくは症状に関連する兆候の緩和および／または前記兆候の予防もしくは除去を含む。例えば、本願明細書で使用する時、「糖尿病を処置すること」の用語は、一般的に、グルコースの血中レベルを、正常なレベル近くに維持することを意味するであろうし、所定の状況に応じて、血中グルコースレベルを向上または低下させることを含んでもよい。
【００７１】
本願明細書で使用する時、「有効」量または「治療的に有効量」のインスリン類似体は、無毒性であるが、所望の効果を提供するのに十分な量のインスリン類似体を意味する。例えば、１つの所望の効果は、低血糖の予防または処置であろう。「有効」である量は、個体の年齢および全体的な症状、投与方式等に応じて、対象ごとに変動するであろう。このため、正確な「有効量」を特定するのが常に可能ではない。ただし、任意の個々の場合における適切な「有効」量は、ルーチンな実験を使用して、当業者により決定されてもよい。
【００７２】
「非経口」の用語は、消化管を経由せず、一部の他の経路、例えば、経鼻、吸入、皮下、筋肉内、髄腔内または静脈内によることを意味する。
【００７３】
本願明細書で使用する時、「薬物動態学的」の用語は、タンパク質の遊離、吸収、分布、代謝および排出に関連する分野において一般的に使用されるインスリンまたはインスリン類似体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける特性を意味する。このような薬物動態学的特性としては、制限されず、用量、投与間隔、濃度、排出速度、排出速度定数、曲線下面積、分布量、任意の組織または細胞におけるクリアランス、血中でのタンパク質分解的分解、生物学的利用能、血漿への結合、半減期、初回通過消失、排出速度、Ｃｍａｘ、ｔｍａｘ、Ｃｍｉｎ、吸収速度および変動があげられる。
【００７４】
本願明細書で使用する時、「薬力学的」の用語は、タンパク質の生理学的作用に関連する分野において一般的に使用されるインスリンまたはインスリン類似体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける特性を意味する。このような薬力学的特性としては、制限されず、最大グルコース注入速度、最大グルコース注入速度に対する時間およびグルコース注入速度曲線下の面積があげられる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】プラスミドｐＧＬＹ９３１６のマップを示す。前記プラスミドは、ＴＲＰ２またはＡＯＸ１の遺伝子座を標的とし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルファ接合因子シグナル配列を使用する空の発現カセットを含む、ロールイン組込みプラスミドである。
【図２Ａ】株ＹＧＬＹ２６２６８の構築を示す。
【図２Ｂ】株ＹＧＬＹ２６２６８の構築を示す。
【図３】プラスミドｐＧＬＹ６のマップを示す。プラスミドｐＧＬＹ６は、ＵＲＡ５遺伝子座を標的とし、一方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子の５’領域由来のヌクレオチド配列（ＰｐＵＲＡ５−５’）を含む核酸分子のそばに隣接し、他方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子の３’領域由来のヌクレオチド配列（ＰｐＵＲＡ５−３’）を含む核酸分子のそばに隣接する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのインベルターゼ遺伝子または転写ユニット（ＳｃＳＵＣ２）を含む組込みベクターである。
【図４】プラスミドｐＧＬＹ４０のマップを示す。プラスミドｐＧＬＹ４０は、ＯＣＨ１遺伝子座を標的とし、ｌａｃＺリピート（ｌａｃＺリピート）を含む核酸分子に隣接し、次に、一方側において、ＯＣＨ１遺伝子の５’領域由来のヌクレオチド配列（ＰｐＯＣＨ１−５’）を含む核酸分子のそばに隣接し、他方側において、ＯＣＨ１遺伝子の３’領域由来のヌクレオチド配列（ＰｐＯＣＨ１−３’）を含む核酸分子のそばに隣接する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子または転写ユニット（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子を含む組込みベクターである。
【図５】プラスミドｐＧＬＹ４３ａのマップを示す。プラスミドｐＧＬＹ４３ａは、ＢＭＴ２遺伝子座を標的とし、ｌａｃＺリピート（ｌａｃＺリピート）を含む核酸分子のそばに隣接する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子または転写ユニット（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子に隣接する、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）トランスポータ遺伝子または転写ユニット（ＫｌＧｌｃＮＡｃＴｒａｎｓｐ．）を含む核酸分子を含む組込みベクターである。前記隣接する遺伝子は、一方側において、ＢＭＴ２遺伝子の５’領域由来のヌクレオチド配列（ＰｐＢＳ２−５’）を含む核酸分子のそばに隣接し、他方側において、ＢＭＴ２遺伝子の３’領域由来のヌクレオチド配列（ＰｐＢＳ２−３’）を含む核酸分子のそばに隣接する。
【図６】プラスミドｐＧＬＹ４８のマップを示す。プラスミドｐＧＬＹ４８は、ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子座を標的とし、５’端において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＡＰＤＨプロモータを含む核酸分子（ＰｐＧＡＰＤＨ  Ｐｒｏｍ）に、および、３’端において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＹＣ終了配列を含む核酸分子（ＳｃＣＹＣ  ＴＴ）に操作可能に結合され、ｌａｃＺリピート（ｌａｃＺリピート）に隣接するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子または転写ユニット（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子に隣接する、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポータのマウス類似体のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）をコードする核酸分子（ＭｍＧｌｃＮＡｃＴｒａｎｓｐ．）を含む発現カセットを含む組込みベクターである。前記発現カセットは共に、一方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ｌ１遺伝子の５’領域由来のヌクレオチド配列（ＰｐＭＮＮ４Ｌ１−５’）を含む核酸分子のそばに隣接し、他方側において、ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子の３’領域由来のヌクレオチド配列（ＰｐＭＮＮ４Ｌ１−３’）を含む核酸分子のそばに隣接する。
【図７】プラスミドｐＧＬＹ４５のマップを示す。プラスミドｐＧＬＹ４５は、ＰＮＯ１／ＭＮＮ４遺伝子座を標的とし、ｌａｃＺリピート（ｌａｃＺリピート）を含む核酸分子に隣接し、次に、一方側において、ＰＮＯ１遺伝子の５’領域由来のヌクレオチド配列（ＰｐＰＮＯ１−５’）を含む核酸分子のそばに隣接し、他方側において、ＭＮＮ４遺伝子の３’領域由来のヌクレオチド配列（ＰｐＭＮＮ４−３’）を含む核酸分子のそばに隣接する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子または転写ユニット（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子を含む組込みベクターである。
【図８】プラスミドｐＧＬＹ３４１９（ｐＳＨ１１１０）のマップを示す。プラスミドｐＧＬＹ３４３０（ｐＳＨ１１１５）は、ｌａｃＺリピート（ｌａｃＺリピート）に隣接し、一方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＢＭＴ１遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰＢＳ１  ５’）に隣接し、他方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＢＭＴ１遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰＢＳ１  ３’）に隣接する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子または転写ユニット（ＰｐＵＲＡ５）を含む発現カセットを含む組込みベクターである。
【図９】プラスミドｐＧＬＹ３４１１（ｐＳＨ１０９２）のマップを示す。プラスミドｐＧＬＹ３４１１（ｐＳＨ１０９２）は、ｌａｃＺリピート（ｌａｃＺリピート）に隣接し、一方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＢＭＴ４遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ４  ５’）に隣接し、他方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＢＭＴ４遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ４  ３’）に隣接する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子または転写ユニット（ＰｐＵＲＡ５）を含む発現カセットを含む組込みベクターである。
【図１０】プラスミドｐＧＬＹ３４２１（ｐＳＨ１１０６）のマップを示す。プラスミドｐＧＬＹ４４７２（ｐＳＨ１１８６）は、ｌａｃＺリピート（ｌａｃＺリピート）に隣接し、一方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＢＭＴ３遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ３  ５’）に隣接し、他方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＢＭＴ３遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ３  ３’）に隣接する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子または転写ユニット（ＰｐＵＲＡ５）を含む発現カセットを含む。
【図１１】プラスミドｐＧＬＹ６３０１のマップを示す。プラスミドｐＧＬＹ６３０１は、ＬｍＳＴＴ３Ｄを発現し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＵＲＡ６遺伝子座を標的とする組込みプラスミドである。ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードする発現カセットは、５’端において、誘導性Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＡＯＸ１プロモータ配列を有する核酸分子に、および、３’端において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＹＣ転写終了配列を有する核酸分子に操作可能に結合された、Ｐ．における最適な発現のためにコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦをコードする核酸分子を含む。選択のために、前記プラスミドは、亜ヒ酸抵抗性を付与するために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＲＲ３遺伝子を含む核酸分子を含む。
【図１２】ジストログリカン型  Ｏ−グリコシル化に対する、ムチン型  Ｏ−グリコシル化の比較を示す。
【図１３Ａ】検出可能な、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性およびホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くように遺伝子操作されたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＧＦＩ株１．０）において産生されるマンノテトロースＯ−グリカン、または、検出可能な、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性およびホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を欠いており、α１，２−マンノシルトランスフェラーゼ活性を発現するように遺伝子操作されたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＧＦＩ株２．０）において産生されるマンノースＯ−グリカンと比較した、野生型のＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて典型的に産生されるＯ−グリカンの構造を示す。ＧＦＩ株１．０については、マンノース、マンノビオースまたはマンノトリオースのＯ−グリカンが示されない。
【図１３Ｂ】タンパク質上のＯ−グリカンについて、検出可能なβ−マンノシルトランスフェラーゼ活性およびホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を示さない宿主細胞、例えば、検出可能なβ−マンノシルトランスフェラーゼ活性およびホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くように遺伝子操作されたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＧＦＩ株１．０）において産生される、マンノース、マンノビオース、マンノトリオースおよびマンノテトロースのＯ−グリカンの構造を示す。
【図１４−１】Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリン類似体Ｄ１１３９０１およびＤ１１３７０２（ＳＣＩ：ＣペプチドＣＴＰ；配列番号４５）のＱ−ＴＯＦ分析を示す。上段のパネルは、ＰＮＧａｓｅ（ＰＮＧ）処理前のＯ−グリカンプロファイルを示す。下段のパネルは、ＰＮＧａｓｅ処理後のプロファイルを示す。表は、前記類似体についてのＯ−グリカン占有度および鎖長を示す。
【図１４−２】Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリン類似体Ｄ１１３９０１およびＤ１１３７０２（ＳＣＩ：ＣペプチドＣＴＰ；配列番号４５）のＱ−ＴＯＦ分析を示す。上段のパネルは、ＰＮＧａｓｅ（ＰＮＧ）処理前のＯ−グリカンプロファイルを示す。下段のパネルは、ＰＮＧａｓｅ処理後のプロファイルを示す。表は、前記類似体についてのＯ−グリカン占有度および鎖長を示す。
【図１５】非糖尿病のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける経時的な血中グルコースレベルのα−メチル−マンノース（α−ＭＭ）の有無による、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系類似体Ｄ１１３９０１およびＤ１１３７０２の効果を示す。
【図１６】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける経時的な血漿インスリンレベルのα−ＭＭの有無による、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系類似体Ｄ１１３９０１およびＤ１１３７０２の効果を示す。
【図１７】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、血中グルコース％ＡＯＣおよび血漿インスリンＡＵＣのα−ＭＭの有無による、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系類似体Ｄ１１３９０１およびＤ１１３７０２の効果を示す（ＡＵＣは、「曲線下面積」を意味する。）。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
本発明は、Ｏ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の分子、Ｏ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の分子を含む組成物および薬学的製剤、前記Ｏ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を産生するための方法、ならびに、前記Ｏ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を使用するための方法を提供する。前記Ｏ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は、Ｏ−グリコシル化により修飾された、少なくとも１つの薬力学的（ＰＤ）または薬物動態学的（ＰＫ）な特性を有する。本願明細書に記載されたＯ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を含む組成物および製剤は、糖尿病の処置および治療に有用であり得る。
【００７７】
ヒトまたは哺乳類において産生されるインスリンは、天然には、Ｏ−結合グリコシル化を含まないため、本発明では、前記インスリンまたはインスリン類似体は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのベータサブユニット（ｈＣＧβ）の１１２−１１８位から１４５位において見出されたカルボキシ末端部分（ＣＴＰ）ペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を含むように修飾される。前記ＣＴＰペプチドは、そのｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスパターンを変更するために、Ｎ−末端またはＣ−末端において、生物学的に活性な分子を修飾するのに、当該分野において使用されてきた。生物学的に活性な分子の血清半減期を延長させるための前記ＣＴＰペプチドの使用は、数多くの米国特許の主題であった（例えば、米国特許第５，７０５，４７８号；同第５，７１２，１２２号；同第５，７５９，８１８号；同第５，５８５，３４５号；同第６，２２５，４４９号；同第６，６３５，２５６号；同第６，９８７，１７２号；および同第７，４４２，３７６号明細書を参照のこと。）。
【００７８】
本発明の具体的な態様では、前記ＣＴＰペプチドは、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む。前記ＣＴＰペプチドは、本願明細書に記載されたように、哺乳類の宿主細胞中でＯ−グリコシル化される性質を有し、さらに、下等な真核生物中でも、Ｏ−グリコシル化され得る。哺乳類の宿主細胞では、前記ＣＴＰペプチドは、配列番号１の４、１０、１５および２１位におけるセリン残基においてＯ−グリコシル化される。
【００７９】
真核生物では、Ｎ−結合グリカンおよびＯ−結合グリカンは、２つの主要な種類のグリコシル化である。Ｎ−結合グリコシル化（Ｎ−グリコシル化）は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）のアスパラギン（Ａｓｎ）に対するβ−グルコシルアミン結合により特徴付けられる（Ｓｐｉｒｏ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．１２：４３Ｒ−５６Ｒ（２００２））。コンセンサス配列モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒが、Ｎ−グリコシル化に必須であることが十分確立されてきた（Ｂｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４：１６３３−１６４９（２００４））。Ｏ−結合グリコシル化（Ｏ−グリコシル化）の大部分の存在型は、ムチン型のものである。前記ムチン型は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチド  Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの酵素により、セリン／スレオニン（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）側鎖のヒドロキシル基に結合される、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）により特徴付けられる（Ｈａｎｇ  ＆  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：５０２１−５０３４（２００５）；Ｊｕｌｅｎｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．１５：１５３−１６４（２００５）；図１２）。ムチン型Ｏ−グリカンは、さらに、ガラクトースおよびシアル酸残基を含み得る。ムチン型Ｏ−グリコシル化は、一般的には、哺乳類中で、多くの、分泌され、膜結合したムチンにおいて見出されるが、他の高等な真核生物においても存在する（Ｈａｎｉｓｈ，Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．．３８２：１４３−１４９（２００１））。病原体および環境被害に対して表皮表面を防御するのに重要な役割を果たす粘液、ゲルの主な成分として、ムチンは、フレームワークの組織化および粘液のレオロジー特性の付与を担う。ムチンにより示された上記特性の範囲を超えて、ムチン型Ｏ−グリコシル化は、種々のタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能を調節することも公知である（Ｈａｎｇ  ＆  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：５０２１−５０３４（２００５））。例えば、ムチン様グリカンは、炎症反応中に、受容体結合リガンドとして機能し得る（ＭｃＥｖｅｒ  ＆  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｊ．Ｃｈｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：４８５−４９１（１９９７））。
【００８０】
別型のＯ−グリコシル化は、Ｏ−マンノース型グリコシル化のそれである（Ｔ．Ｅｎｄｏ，ＢＢＡ  １４７３：２３７−２４６（１９９９））。哺乳類の組織では、この型のグリコシル化は、２つの型に細分化され得る。第１の型は、タンパク質のセリンまたはスレオニン残基への１つのマンノースの付加である。これは、稀に発生するが、少数のタンパク質、例えば、ＩｇＧ２の軽鎖において発生することが説明されてきた（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．１１５６：１８３−１８７（２００７））。哺乳類系におけるより一般的な型のＯ−マンノース型グリコシル化は、ジストログリカン型のそれである。前記ジストログリカン型は、Ｏ−結合マンノース  β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１（ＰＯＭＧｎＴ１）により、α１結合におけるセリン／スレオニン側鎖のヒドロキシル基に結合されるマンノース残基に結合される、β−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）により特徴付けられる（Ｔ．Ｅｎｄｏ，ＢＢＡ  １４７３：２３７−２４６（１９９９）；図１２）。ジストログリカン型Ｏ−グリカンは、さらに、ガラクトースおよびシアル酸残基を含み得る。Ｎ−グリコシル化と異なり、前記コンセンサスモチーフは、ムチンまたはジストログリカン  Ｏ−グリコシル化部位の配列関係において特定されてこなかった。
【００８１】
ムチン型Ｏ−グリコシル化は、主に、細胞表面タンパク質および分泌タンパク質において見出される。ジストログリカン型Ｏ−グリコシル化は、主に、細胞外マトリクスを含むタンパク質と会合される。ムチン−およびジストログリカン−型Ｏ−グリカンは両方とも、末端シアル酸残基を有する場合がある。図１２に示されるように、前記末端シアル酸残基は、先行するガラクトース残基とのα２，３結合にある。一部の例では、図１２に示されたように、ムチン型Ｏ−グリカンは、分岐したα２，６シアル酸残基も有し得る。組換え非ヒト細胞系統から取得された糖タンパク質における前記各型の構造に存在するシアル酸は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）およびＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）の混合物を含み得る。ただし、哺乳類細胞から取得された糖タンパク質とは対照的に、ヒト細胞から取得された糖タンパク質における各型の構造に存在するシアル酸は、ＮＡＮＡから構成される。このため、哺乳類細胞培養から取得された糖タンパク質の組成は、非ヒト哺乳類細胞において産生される糖タンパク質と会合される構造を有するシアル化Ｏ−グリカンを含む。
【００８２】
ヒトおよび哺乳類系とは対照的に、糸状菌、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて、Ｏ−グリコシル化は、５つまたは６つまでのマンノース残基を含み得るＯ−グリカンを産生する（例えば、Ｔａｎｎｅｒ  ＆  Ｌｅｈｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９０６：８１−８９（１９８７）；Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓ  ＆  Ｏｒｌｅａｎ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：５４０−５５０（１９９３）；Ｔｒｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＧｌｙｃｏＢｉｏｌ．１４：２６５−２７４（２００４）；Ｌｏｍｍｅｌ  ＆  Ｓｔｒａｈｌ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．１９：８１６−８２８（２００９）を参照のこと。）。図１３Ａに示される野生型のＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、末端マンノース残基がリン酸化され得る、６つまでのマンノース残基からなるＯ−マンノース型Ｏ−グリカンを産生し得る。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ活性を抑制し、これにより、β結合マンノース残基なしに電荷を含まないＯ−グリカンをもたらし、Ｏ−グリコシル化部位占有度を低下させるタンパク質ＰＭＴ阻害剤、および、電荷を含まないＯ−グリカンの鎖長を短くする分泌型α１，２−マンノシダーゼの存在下において、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠いている前記Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを培養することにより、Ｏ−マンノース減少グリカン（またはマンノース減少Ｏ−グリカン）が産生され得る（例えば、米国特許出願公開第２００９０１７０１５９号明細書ならびに米国特許第７，２５９，００７号および同第７，４６５，５７７号明細書を参照のこと。）。前記コンセンサスモチーフは、糸状菌のＯ−グリコシル化部位の配列関係において特定されてきていない。
【００８３】
本発明は、インスリンおよびインスリン類似体であって、アミド（ペプチド）結合により、前記インスリンまたはインスリン類似体に共有結合される、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのベータサブユニット（ｈＣＧβ）の１１２−１１８位から１４５位において見出される少なくとも１つのカルボキシ末端部分（ＣＴＰ）ペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を含み、前記ＣＴＰペプチドまたはその部分変異体が、Ｏ−グリカンによりＯ−グリコシル化されており、その上の各Ｏ−グリカンが、１つ、２つ、３つまたは４つのマンノース残基（それぞれ、マンノース、マンノビオース、マンノトリオースまたはマンノテトロースのＯ−グリカン構造（図１３Ｂに示される構造）を含むインスリンおよびインスリン類似体を提供する。前記Ｏ−グリカンの還元端におけるマンノースは、前記ＣＴＰペプチドまたはその部分変異体のセリンまたはスレオニンの残基に、α１結合において共有結合される。各マンノース残基は、さらに、α１，２結合において、先行するマンノース残基の非還元端に、その還元端において結合される。更なる実施形態では、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１）の前記配列の、１、２、３、４、１０、１３、１５、２１および２３位から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つまたは４つの（１又は複数の）Ｏ−グリコシル化部位が、Ｏ−グリカンにより占有される。具体的な実施形態では、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１）の前記配列の４、１０、１５および２１位から選択される少なくとも１つのセリン残基が、Ｏ−グリカンにより占有される。具体的な実施形態では、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１）の前記配列の４、１０、１５および２１位から選択される少なくとも２つのセリン残基が、Ｏ−グリカンにより占有される。具体的な実施形態では、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１）の前記配列の４、１０、１５および２１位から選択される少なくとも３つのセリン残基が、Ｏ−グリカンにより占有される。具体的な実施形態では、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１）の前記配列の４、１０、１５および２１位におけるセリン残基がそれぞれ、Ｏ−グリカンにより占有される。
【００８４】
一部の実施形態では、前記ＣＴＰペプチドのＣ−末端および／またはＮ−末端は、さらに、１つまたは２つの塩基性アミノ酸、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、Ｌｙｓ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ａｒｇを含んでもよい。例えば、具体的な態様では、前記ＣＴＰペプチドは、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＫ（配列番号９１）、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＲ（配列番号９２）、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＫＲ（配列番号９３）または、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＲＲ（配列番号９４）のアミノ酸配列を含む。更なる実施形態では、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも２つのＯ−グリコシル化部位が、Ｏ−グリカンにより占有される。更なる実施形態では、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも３つのＯ−グリコシル化部位が、Ｏ−グリカンにより占有される。更なる実施形態では、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも４つのＯ−グリコシル化部位が、Ｏ−グリカンにより占有される。更なる実施形態では、前記インスリンおよびインスリン類似体は、少なくとも１つのカルボキシ末端部分（ＣＴＰ）ペプチドの一部を含む。ただし、前記ＣＴＰペプチドの一部が、少なくとも１つのＯ−グリコシル化部位を含むという条件である。具体的な実施形態では、その上のＯ−グリカンは、マンノース、マンノビオース、マンノトリオースおよび／またはマンノテトロースの構造からなり、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトースおよび／またはシアル酸（ＮＡＮＡおよび／またはＮＧＮＡ）残基を欠いている。
【００８５】
更なる実施形態では、少なくとも１つのＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、そのＣ−末端において、前記Ｂ−鎖または前記Ａ−鎖のＮ−末端に共有結合される。別の実施形態では、少なくとも１つのＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、そのＮ−末端において、前記Ａ−鎖または前記Ｂ−鎖のＣ−末端に共有結合される。更なる実施形態では、少なくとも１つのＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、そのＣ−末端において、前記Ｂ−鎖または前記Ａ−鎖のＮ−末端に共有結合され、少なくとも１つのＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、そのＮ−末端において、前記Ａ−鎖または前記Ｂ−鎖のＣ−末端に共有結合される。更なる実施形態では、少なくとも１つのＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、そのＣ−末端において、前記Ｂ−鎖のＮ−末端に共有結合され、少なくとも１つのＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、そのＮ−末端において、前記Ａ−鎖または前記Ｂ−鎖のペプチドにおけるＣ−末端に共有結合される。更なる実施形態では、少なくとも１つのＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、そのＣ−末端において、前記Ａ−鎖のＮ−末端に共有結合され、少なくとも１つのＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、そのＮ−末端において、前記Ａ−鎖またはＢ−鎖のＣ−末端に共有結合される。更なる実施形態では、少なくとも１つのＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、そのＣ−末端において、前記Ｂ−鎖のＮ−末端に共有結合され、少なくとも１つのＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、そのＮ−末端において、前記Ｂ−鎖のＣ−末端に共有結合される。更なる実施形態では、少なくとも１つのＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、そのＣ−末端において、前記Ａ−鎖のＮ−末端に共有結合され、少なくとも１つのＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、そのＮ−末端において、前記Ａ−鎖のＣ−末端に共有結合される。更なる実施形態では、少なくとも１つのＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、そのＣ−末端において、前記Ａ−鎖のＮ−末端に共有結合され、少なくとも１つのＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、そのＮ−末端において、前記Ｂ−鎖のＣ−末端に共有結合される。更なる実施形態では、少なくとも１つのＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、そのＣ−末端において、前記Ｂ−鎖のＮ−末端に共有結合され、少なくとも１つのＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、そのＮ−末端において、前記Ａ−鎖のＣ−末端に共有結合される。上記実施形態の更なる態様では、１、２、３、４、５、６または７から２０個のアミノ酸の介在ペプチドは、前記ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体と、前記Ａ−鎖またはＢ−鎖の末端との間に配置される。上記実施形態では、前記インスリンまたはインスリン類似体は、ヘテロ二量体分子または一本鎖分子でもよい。前記ヘテロ二量体または一本鎖の態様のいずれかにおいて、前記Ａ−鎖およびＢ−鎖は、ジスルフィド結合により互いに共有結合される。
【００８６】
更なる実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、一本鎖分子であり、前記ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、少なくとも１つのＯ−グリカンが、前記ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体に結合され、その上の各Ｏ−グリカンが、１つ以上のマンノース残基を含む、構造：（Ｂ−鎖）−（ＣＴＰペプチド）−（Ａ−鎖）を含む分子を提供するために、前記Ａ−鎖および前記Ｂ−鎖を結合させる。更なる実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系一本鎖インスリンまたはインスリン類似体は、さらに、前記Ｂ−鎖のＮ−末端および／または前記Ａ−鎖のＣ−末端に共有結合された、少なくとも１つのＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を含む。
【００８７】
前記結合性ペプチドが前記ＣＴＰペプチドでない実施形態では、前記結合性ペプチドは、３つのアミノ酸残基から、ヒトインスリン中の天然のＣ−ペプチドの長さに対応する長さまで変動してもよい。ただし、前記非ＣＴＰ結合性ペプチドは、通常、前記ヒトのＣ−ペプチドより短く、典型的には、前記ペプチド鎖中の３から約３５、３から約３０、４から約３５、４から約３０、５から約３５、５から約３０、６から約３５または６から約３０、３から約２５、３から約２０、４から約２５、４から約２０、５から約２５、５から約２０、６から約２５または６から約２０、３から約１５、３から約１０、４から約１５、４から約１０、５から約１５、５から約１０、６から約１５または６から約１０、または、６−９、６−８、６−７、７−８、７−９または７−１０個のアミノ酸残基の長さを有するであろう。一本鎖ペプチドは、米国特許出願公開第２００８００５７００４号明細書、米国特許第６，６３０，３４８号明細書、国際公開第２００５０５４２９１号、同第２００７１０４７３４号、同第２０１００８０６０９号、同第２０１０００９９６０１号および同第２０１１１５９８９５号パンフレットに開示されている。それらの文献はそれぞれ、参照により本願明細書に組み込まれる。さらに、薬学的に許容され得るキャリア、塩またはそれらの組み合わせを含む上記組成物および製剤が提供される。
【００８８】
具体的な実施形態では、前記結合性ペプチドは、式Ｇｌｙ−Ｚ１−Ｇｌｙ−Ｚ２を含み、式中、Ｚ１は、Ａｌａまたはチロシン以外の別のアミノ酸であり、Ｚ２は、２−３５個のアミノ酸のペプチドである。
【００８９】
具体的な実施形態では、前記結合性ペプチドは、ＧＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号５６）、ＧＡＧＳＳＳＳＲＲＡ（配列番号５７）、ＧＡＧＳＳＳＳＲＲ（配列番号５８）、ＧＧＧＰＲＲ（配列番号５９）、ＧＧＧＰＧＡＧ（配列番号６０）、ＧＧＧＧＧＫＲ（配列番号６１）またはＧＧＧＰＧＫＲ（配列番号６２）である。
【００９０】
具体的な実施形態では、前記結合性ペプチドは、ＶＧＬＳＳＧＱ（配列番号６３）またはＴＧＬＧＳＧＲ（配列番号６４）である。他の態様では、前記結合性ペプチドは、ＲＲＧＰＧＧＧ（配列番号６５）、ＲＲＧＧＧＧＧ（配列番号６６）、ＧＧＡＰＧＤＶＫＲ（配列番号６７）、ＲＲＡＰＧＤＶＧＧ（配列番号６８）、ＧＧＹＰＧＤＶＬＲ（配列番号６９）、ＲＲＹＰＧＤＶＧＧ（配列番号７０）、ＧＧＨＰＧＤＶＲ（配列番号７１）またはＲＲＨＰＧＤＶＧＧ（配列番号７２）である。
【００９１】
前記Ｏ−グリコシル化ヘテロ二量体または一本鎖インスリン類似体の具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は、少なくともＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣ（配列番号９０）のアミノ酸配列を含むＡ−鎖ペプチド；少なくともＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＢ−鎖ペプチド、および、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのベータサブユニット（ｈＣＧβ）のアミノ酸１１２−１１８から１４２を含むカルボキシ末端部分（ＣＴＰ）ペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を有する。この場合、前記ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体の、少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ｏ−グリカンに共有結合される。前記インスリンまたはインスリン類似体は、前記Ａ−鎖ペプチドおよび／または前記Ｂ−鎖ペプチドの天然のアミノ酸配列における、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個までのアミノ酸置換をさらに含んでもよい。前記ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、ペプチド結合により、前記Ｂ−鎖のＮ−末端、前記Ａ−鎖のＣ−末端に共有結合され、または、前記ＣＴＰペプチドまたは、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体は、構造（Ｂ−鎖）−（ＣＴＰペプチド）−（Ａ−鎖）を有する一本鎖のインスリンまたはインスリン類似体を産生するために、前記Ｂ−鎖を前記Ａ−鎖に共有結合させる結合性ペプチドである。前記インスリンまたはインスリン類似体は、３つのジスルフィド結合を有する。第１のジスルフィド結合は、配列番号９０の６と１１位とにおけるシステイン残基間であり、第２のジスルフィド結合は、配列番号３の３位と配列番号９０の７位とにおけるシステイン残基間であり、第３のジスルフィド結合は、配列番号３の１５位と配列番号９０の２０位とにおけるシステイン残基間である。
【００９２】
本発明は、さらに、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系ヘテロ二量体または一本鎖のインスリンまたはインスリン類似体の１つ以上の種を含む組成物および薬学的組成物を提供する。前記組成物および薬学的組成物は、さらに、薬学的に許容され得るキャリアを含んでもよい。Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系ヘテロ二量体または一本鎖のインスリンまたはインスリン類似体の組成は、主に、マンノース、マンノビオース、マンノトリオースまたはマンノテトロースのＯ−グリカンを含んでもよい。更なる態様では、主なＯ−グリカンは、マンノトリオースまたはマンノテトロースである。更なる態様では、主なＯ−グリカンは、マンノトリオースとマンノテトロースとの組み合わせである。更なる態様では、主なＯ−グリカンは、ほとんど検出できない、または、検出できないマンノビオース、マンノトリオースまたはマンノテトロースを伴うマンノースである。
【００９３】
上記組成の更なる態様では、少なくとも４０モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースである、少なくとも５０モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースである、少なくとも６０モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースである、少なくとも７０モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースである、少なくとも８０モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースである、少なくとも９０モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースである、少なくとも９５モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースである、少なくとも９８モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースである、あるいは、少なくとも９９モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースである。
【００９４】
上記組成の更なる態様では、少なくとも４０モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースである、少なくとも５０モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースである、少なくとも６０モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースである、少なくとも７０モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースである、少なくとも８０モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースである、少なくとも９０モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースである、少なくとも９５モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースである、少なくとも９８モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースまたはマンノテトロースである、あるいは、少なくとも９９モル％の前記Ｏ−グリカンが、マンノトリオースおよびマンノテトロースである。
【００９５】
上記組成の更なる態様では、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系ヘテロ二量体または一本鎖のインスリンまたはインスリン類似体は、少なくとも１つのＯ−グリカンを含む。上記組成の更なる態様では、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系ヘテロ二量体または一本鎖のインスリンまたはインスリン類似体は、２つ以上のＯ−グリカンを含む。上記組成の更なる態様では、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系ヘテロ二量体または一本鎖のインスリンまたはインスリン類似体は、３つ以上のＯ−グリカンを含む。上記組成の更なる態様では、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系ヘテロ二量体または一本鎖のインスリンまたはインスリン類似体は、２つ以上のＯ−グリカンを含む。上記組成の更なる態様では、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系ヘテロ二量体または一本鎖のインスリンまたはインスリン類似体は、４つのＯ−グリカンを含む。
【００９６】
上記組成の更なる態様では、前記組成物中のＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系ヘテロ二量体または一本鎖のインスリンまたはインスリン類似体の主な種は、１分子のタンパク質（Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系ヘテロ二量体または一本鎖のインスリンまたはインスリン類似体）あたりに、少なくとも６分子のマンノースを含む。１分子のタンパク質あたりに、６分子のマンノースを含む主な種は、Ｏ−グリコシル化部位占有度および鎖長の任意の組み合わせを有してもよい。例えば、１つの部位が、４つのマンノース残基（マンノテトロース）のＯ−グリカンにより占有される場合、例えば、（ｉ）別の部位が、２つのマンノース残基（マンノビオース）のＯ−グリカンにより占有されてもよく、または、（ｉｉ）２つの他の部位がそれぞれ、１つのマンノースのＯ−グリカンにより占有されてもよい。別の例として、１つの部位が、３つのマンノース残基（マンノトリオース）のＯ−グリカンにより占有される場合、例えば、（ｉ）別の部位が、３つのマンノース残基（マンノトリオース）のＯ−グリカンにより占有されてもよく、または、（ｉｉ）２つの他の部位が、Ｏ−グリカンにより占有され、１つは、マンノースにより占有され、他は、マンノビオースにより占有されてもよく、または、（ｉｉｉ）３つの他の部位がそれぞれ、１つのマンノース残基のＯ−グリカンにより占有されてもよい。別の例として、１つの部位が、２つのマンノース残基（マンノビオース）のＯ−グリカンにより占有される場合、例えば、（ｉ）別の２つの部位がそれぞれ、２つのマンノース残基（マンノビオース）のＯ−グリカンにより占有されてもよく、または、（ｉｉ）２つの他の部位がそれぞれ、Ｏ−グリカンにより占有され、１つが、マンノースにより占有され、他が、マンノビオースにより占有されてもよい。
【００９７】
前記Ｏ−結合グリカンは、非グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と比較して、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体に、１つ以上の有益な特性、例えば、制限されず、（ｉ）向上または延長した薬物動態学的（ＰＫ）特性、（ｉｉ）向上した薬力学的（ＰＤ）特性、（ｉｉｉ）低下した副作用、例えば、低血糖、（ｉｖ）前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体が糖類応答性または感受性活性を示し得ること、（ｖ）インスリン受容体（ＩＲ）に対する親和性と比較したインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）に対する低下した親和性の提示、（ｖｉ）ＩＲ−ＡまたはＩＲ−Ｂのいずれかに対する好ましい結合の提示、（ｖｉｉ）前記インスリン受容体に対する向上したオン−レート、低下したオン−レートおよび／または低下したオフ−レートの提示、ならびに／または、（ｖｉｉｉ）送達経路の変更、例えば、皮下、静脈内または筋肉内の投与に対する、経口、経鼻または肺投与、を付与してもよい。
【００９８】
Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、１つ以上の上記特性を付与してもよく、現在の糖尿病治療を超える顕著な改善を提供する場合がある。例えば、Ｏ−グリカンは、治療用タンパク質のＰＫ／ＰＤ特性を変化させることが公知である（例えば、米国特許第６，６８９，３６５号明細書を参照のこと。）。現在上市されているインスリン治療は、組換えヒトインスリンおよび、インスリン類似体と呼ばれるヒトインスリンの変異した変異体からなる。これらの類似体は、（１又は複数の）アミノ酸変異および配合バッファーの組み合わせにより、変化したｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ特性を示す。本願明細書に開示されたように、インスリンに対するＯ−グリカンの付加は、現在の全てのインスリン治療において欠けている、身体におけるインスリン作用を調節するための別の次元を加える。直接的またはポリマー性もしくは非ポリマー性リンカーによるかのいずれかにおいて、糖類またはオリゴ糖部分にコンジュゲートしたインスリンは、例えば、米国特許第３，８４７，８９０号；同第７，３１７，０００号明細書；国際公開第８１００３５４号；同第８４０１８９６号；同第９０１０６４５号；同第２００４０５６３１１号；同第２００７０４７９７７号；同第２０１００８８２９４号パンフレット；および欧州特許第０１１９６５０号明細書）に先に記載されている。本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化インスリン類似体の特徴は、Ｏ−グリカンが天然由来の結合においてそれに結合されることであり、前記結合は、Ｏ−結合グリコシル化能を有する任意の生物により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生じ得る、天然の化学結合である。
【００９９】
３０年間にわたって、インスリンの研究者は、既存のインスリン治療を改善する試みにおいて、化学的リンカーまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける酵素反応を使用して、インスリンに糖類を結合させることを記載してきた。インスリンへの糖部分の化学的結合の概念は、１９７９年に、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂｒｏｗｎｌｅｅにより、生理学的血中グルコースレベルの関数として、インスリンの生物学的利用能を調節する機構として、最初に導入された（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ  ＆  Ｃｅｒａｍｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０６：１１９０（１９７９））。Ｂｒｏｗｎｌｅｅの提案における主な制限は、グリコシル化されたインスリン誘導体に相互作用するコンカナバリンの毒性であった。酵母において産生されたインスリンにおけるＯ−結合マンノースグリカンの存在を記載する文献が報告されているが、このグリカンは、除去されるべき混入物と考えられた（Ｋａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２３：１０３５（２００９）；国際公開第９９５２９３４号および同第２００９１０４１９９号パンフレット）。したがって、一実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＯ−グリカンがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて結合される、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体（前駆体型または成熟型において、ヘテロ二量体型において、または、一本鎖型においてのいずれか）を提供する。この場合、前記Ｏ−グリカンは、前記Ｏ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の少なくとも１つの治療特性を変化させ、例えば、前記インスリンまたはインスリン類似体を少なくとも１つの修飾された薬物動態学的（ＰＫ）および／または薬力学的特性（ＰＤ）；例えば、延長した血清半減期、溶液における改善した安定性、糖類調節インスリンであることが可能である等の特性を有する分子にする。
【０１００】
現在、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが、商業的に利用可能な組換えインスリンおよびインスリン類似体を産生するのに使用される。これらの３つの生物の中でも、酵母であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのみが、タンパク質にＯ−グリカンを付加する生得的な能力を有する。一般的には、酵母におけるＯ−グリコシル化は、その上のＯ−グリカンが、糸状菌型の高いマンノース構造を有する、糖タンパク質の産生をもたらす。過去１０年にわたって、グリコシル化パターンが内在性のグリコシル化パターンから変化している酵母株が構築されてきた。例えば、本願明細書に開示された糖鎖操作されたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株を使用して、前記Ｏ−グリカンの組成が、予め決定され、制御されてもよい。このため、前記糖鎖操作された酵母のプラットホームは、Ｏ−グリコシル化インスリンおよびインスリン類似体を産生するのに十分適している。Ｏ−グリコシル化インスリンは、哺乳類細胞の培養において発現されてもよいが、現在、組換え的にインスリンを産生するための実行不可能な手段であると思われる。哺乳類細胞の培養は、通常、最適な細胞生存力および適応性にために、インスリンの添加を必要とするためである。インスリンが正常な哺乳類細胞の発酵プロセスにおいて代謝されるため、分泌されたＯ−グリコシル化インスリン類似体は、前記細胞によりおそらく使用され、前記Ｏ−グリコシル化インスリン類似体の低下した産生をもたらす。哺乳類細胞の培養を使用することに対する更なる不利益は、酵母細胞培養において行われるのと同じ程度にグリカンプロファイルを修飾またはカスタマイズすることが現在できないことである（Ｓｅｔｈｕｒａｍａｎ  ＆  Ｓｔａｄｈｅｉｍ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：３４１（２００６））。
【０１０１】
本願明細書に記載されたＯ−グリコシル化インスリン類似体を産生する多くの利益が存在する。遺伝子操作された（または糖鎖操作された）Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、インスリンについての他の酵母系インスリン産生系の魅力的な特性、例えば、発酵性および収量を提供する。遺伝子操作は、インスリン前駆体のｉｎ  ｖｉｖｏ成熟が、酵素反応および精製の処理工程を省略するのを可能にする。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＯ−グリコシル化に関連して、糖鎖操作されたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、前記酵母細胞が前記グリカンの供給源であるのと同様に、化学合成およびＯ−グリカン部分の供給源を必要とせず、改善された収率およびより低い商品原価をもたらす場合がある。本願明細書に記載されたように、種々のマンノース鎖長および種々の度合いの部位占有度のＯ−グリカンを有する、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現する、糖鎖操作されたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株が選択され得る。前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応を使用して合成するのに費用がかかる場合がある。さらに、リンカードメインおよび非天然グリカンは、一部の場合には、Ｏ−結合Ｏ−グリカンより高い免疫原性であるため、インスリン治療の有効性を低下させる場合がある。最後に、インスリンにおけるＯ−結合グリカン構造は、スクリーニングされ得るＯ−グリカン類似体の量をかなり拡張するために、さらに、酵素的または化学的反応により修飾されてもよい。したがって、最適なＯ−グリカンが、純粋に合成戦略を使用するより、素早く、少ないコストで特定され得る。
【０１０２】
Ｉ．インスリン類似体
本願明細書に開示された、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の種々の実施形態では、前記インスリン類似体は、アミノ酸残基、例えば、リジンまたはアスパラギン酸への、Ｂ２８位における置換を含んでもよい。例えば、インスリンリスプロ（ＨＵＭＡＬＯＧ）は、前記Ｂ−ペプチドのＣ−末端における最後から２番目のリジンおよびプロリン残基が逆転している、素早く作用するインスリン類似体であり（ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン；配列番号２および配列番号７３）、インスリン多量体の形成を低下させる。インスリンアスパルト（ＮＯＶＯＬＯＧ）は、Ｂ２８位におけるプロリンがアスパラギン酸により置換されている、別の素早く作用するインスリン変異体であり（ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン；配列番号２および配列番号７４）、多量体の低下した形成をもたらす。したがって、２８位のアミノ酸におけるリジン残基が別のアミノ酸に置き換えられている、本願明細書に開示されたそれらのＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、多量体を形成する能力を低下している場合があるため、速い作用のプロファイルを示す場合がある。一部の実施形態では、Ｂ２８および／またはＢ２９位における変異は、インスリンポリペプチドにおける他の位置での１つ以上の変異を伴う。例えば、インスリングルリシン（ＡＰＩＤＲＡ）は、Ｂ３位におけるアスパラギンがリジン残基により置き換えられており、Ｂ２９位におけるリジンがグルタミン酸残基により置き換えられている、さらに別の素早く作用するインスリン変異体である（ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン；配列番号２および配列番号７５）。
【０１０３】
種々の実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、ヒトインスリンに対してシフトしている等電点を有する。一部の実施形態では、前記等電点のシフトは、１つ以上のアルギニン、リジンまたはヒスチジンを、前記インスリンのＡ−鎖ペプチドのＮ−末端および／または前記インスリンのＢ−鎖ペプチドのＣ−末端に付加することにより達成される。このようなインスリンポリペプチドの例としては、ＡｒｇＡ０−ヒトインスリン（配列番号：７９および配列番号４）、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン（配列番号２および配列番号７８）、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン（配列番号７７および配列番号７８）、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン（配列番号７９および配列番号７８）およびＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン（配列番号８０および配列番号７８）があげられる。更なる例としては、インスリングラルギン（ＬＡＮＴＵＳ）が、ＡｓｎＢ２１がグリシンにより置き換えられており、２つのアルギニン残基が前記Ｂ−ペプチドのＣ−末端に共有結合されている、例示となる長く作用するインスリン類似体である。これらのアミノ酸変更の影響は、前記分子の等電点のシフトであったため、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ４から６．５）で可溶性であるが、生理学的ｐＨでは不溶性である分子を産生する。インスリングラルギンの溶液が筋肉内に注入される場合、前記溶液のｐＨが中和され、前記インスリングラルギンは、注入後２４時間の期間にわたって、明確なインスリンのピークなしに、前記インスリングラルギンをゆっくり放出する微小沈殿物を形成する。これにより、低血糖を引き起こすリスクを低下させる。このプロファイルは、患者の基礎的なインスリンを提供するのに、１日１回の投与を可能にする。このため、一部の実施形態では、前記インスリン類似体は、Ａ２１位におけるアミノ酸がグリシンであるＡ−鎖ペプチドと、Ｂ３１およびＢ３２位におけるアミノ酸がアルギニンであるＢ−鎖ペプチドとを含む。本開示は、これらの変異および、本願明細書に記載された任意の他の変異の全ての、単独および複数の組み合わせを包含する（例えば、ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン）。
【０１０４】
種々の実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、前記Ｂ−鎖のＮ−またはＣ−末端において、１つ以上のアミノ酸を欠いている。例えば、特定の実施形態では、前記Ｂ−鎖ペプチドは、少なくとも１つのＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９またはＢ３０の残基を欠いている。具体的な実施形態では、前記Ｂ−鎖ペプチドは、残基の組み合わせを欠いている。例えば、前記Ｂ−鎖は、Ｂ１−Ｂ２、Ｂ１−Ｂ３、Ｂ１−Ｂ４、Ｂ２９−Ｂ３０、Ｂ２８−Ｂ３０、Ｂ２７−Ｂ３０および／またはＢ２６−Ｂ３０のアミノ酸残基を欠いていてもよい。一部の実施形態では、これらの欠失は、（例えば、ｄｅｓ（Ｂ２９）−インスリンリスプロ、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリンアスパルト等を産生するのに限定することなく）前述のインスリン類似体のいずれかに適用してもよい。実施形態では、・・・
一部の実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、前記Ａ−鎖ペプチドまたはＢ−鎖のＮ−またはＣ−末端において、更なるアミノ酸残基を含んでもよい。一部の実施形態では、１つ以上のアミノ酸残基が、Ａ０、Ａ２２、Ｂ０および／またはＢ３１位に位置してもよい。一部の実施形態では、１つ以上のアミノ酸残基が、Ａ０位に位置する。一部の実施形態では、１つ以上のアミノ酸残基が、Ａ２２位に位置する。一部の実施形態では、１つ以上のアミノ酸残基が、Ｂ０位に位置する。一部の実施形態では、１つ以上のアミノ酸残基が、Ｂ３１位に位置する。具体的な実施形態では、前記グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は、Ａ０、Ａ２２、Ｂ０またはＢ３１位における任意の更なるアミノ酸残基を含まない。
【０１０５】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の１つ以上のアミド化アミノ酸が、酸性アミノ酸または別のアミノ酸により置き換えられている。例えば、グリコシル化位置以外の位置でのアスパラギンは、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸または別の残基により置き換えられていてもよい。同様に、グルタミンは、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸または別の残基により置き換えられていてもよい。具体的には、ＡｓｎＡ１８、ＡｓｎＡ２１もしくはＡｓｎＢ３またはそれらの残基の任意の組み合わせが、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸または別の残基により置き換えられていてもよい。ＧｌｎＡ１５もしくはＧｌｎＢ４または両方が、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸または別の残基により置き換えられていてもよい。具体的な実施形態では、前記インスリン類似体は、２１位において、アスパラギン酸もしくは別の残基、または、Ｂ３位において、アスパラギン酸もしくは別の残基、または、両方を有する。
【０１０６】
当業者は、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体におけるさらに他のアミノ酸を、前記分子の生物学的活性を保持したまま、他のアミノ酸により置き換え可能であることを認識するであろう。例えば、制限されず、下記修飾も、当該分野において広く受け入れられる：アスパラギン酸によるＢ１０位のヒスチジン残基の置換え（ＨｉｓＢ１０からＡｓｐＢ１０）；アスパラギン酸によるＢ１位のフェニルアラニン残基の置換え（ＰｈｅＢ１からＡｓｐＢ１）；アラニンによるＢ３０位のスレオニン残基の置換え（ＴｈｒＢ３０からＡｌａＢ３０）；アラニンによるＢ２６位のチロシン残基の置換え（ＴｙｒＢ２６からＡｌａＢ２６）；および、アスパラギン酸によるＢ９位のセリン残基の置換え（ＳｅｒＢ９からＡｓｐＢ９）。
【０１０７】
種々の実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、延長した作用プロファイルを有する。このため、特定の実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、脂肪酸によりアシル化されていてもよい。すなわち、前記インスリン類似体上のアミノ基と、前記脂肪酸のカルボン酸基との間で、アミド結合が形成される。前記アミノ基は、前記インスリン類似体のＮ−末端アミノ酸のアルファ−アミノ基でもよいし、または、前記インスリン類似体のリジン残基のイプシロン−アミノ基でもよい。前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、野生型のヒトインスリンに存在する、３つのアミノ酸の１つ以上においてアシル化されてもよいし、または、前記野生型のヒトインスリン配列内に導入されているリジン残基においてアシル化されてもよい。具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、Ｂ１位においてアシル化されてもよい。特定の実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、Ｂ２９位においてアシル化されてもよい。特定の実施形態では、前記脂肪酸は、ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデシル酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデシル酸（Ｃ１７）およびステアリン酸（Ｃ１８）から選択される。例えば、インスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ）は、ＴｈｒＢ３０が欠失しており（ｄｅｓＢ３０）、Ｃ１４脂肪酸鎖（ミリスチン酸）がγＥリンカーを介して、ＬｙｓＢ２９に結合されている、長く作用するインスリン変異体である（配列番号２および配列番号８１）。インスリンデグルデクは、ＴｈｒＢ３０が欠失しており、Ｃ１６脂肪酸鎖（パルミチン酸）がγＥリンカーを介して、ＬｙｓＢ２９に結合されている、長く作用するインスリン変異体である（配列番号２および配列番号７６）。
【０１０８】
１つ以上のＯ−結合グリコシル化部位を含む前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、例えば、Ａ１９、Ｂ１６またはＢ２５位におけるアミノ酸の４−アミノフェニルアラニンへの修飾、または、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１６、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置での１つ以上のアミノ酸置換、または、Ｂ１−４およびＢ２６−３０位のいずれかもしくは全ての欠失を含む、天然のＡ−鎖および／またはＢ−鎖の修飾された誘導体を含む、ヘテロ二量体類似体および一本鎖類似体を含む。インスリン類似体の例は、例えば、国際公開第９６３４８８２号、同第９５５１６７０８号；同第２０１０００８０６０６号、同第２００９／０９９７６３号および同第ＷＯ２０１００８０６０９号パンフレット、米国特許第６，６３０，３４８号明細書ならびに、Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０５：９８１−９８６（１９９５）に見出され得る。それらの開示は、参照により本願明細書に組み込まれる。更なる実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、アシル化および／またはペグ化されてもよい。
【０１０９】
一部の実施形態では、前記Ａ−ペプチドのＮ−末端、前記Ｂ−ペプチドのＮ−末端、Ｂ２９位におけるＬｙｓのイプシロン−アミノ基または、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体中の任意の他の利用可能なアミノ基は、一般式：
【化１】
0006735561.tif 000002
【０１１０】
の脂肪酸部分に共有結合される。
【０１１１】
式中、Ｘは、インスリンポリペプチドのアミノ基であり、Ｒは、ＨまたはＣ１−３０アルキル基であり、前記インスリン類似体は、１つ以上のＮ−結合グリコシル化部位を含む。一部の実施形態では、Ｒは、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ３−１９アルキル基、Ｃ５−１８アルキル基、Ｃ６−１７アルキル基、Ｃ８−１６アルキル基、Ｃ１０−１５アルキル基またはＣ１２−１４アルキル基である。特定の実施形態では、前記インスリンポリペプチドは、Ａ１位において、前記部分にコンジュゲートされる。具体的な実施形態では、前記インスリンポリペプチドは、Ｂ１位において、前記部分にコンジュゲートされる。具体的な実施形態では、前記インスリンポリペプチドは、Ｂ２９位におけるＬｙｓのイプシロン−アミノ基において、前記部分にコンジュゲートされる。具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体のＢ２８位は、Ｌｙｓであり、ＬｙｓＢ２８のイプシロン−アミノ基は、前記脂肪酸部分にコンジュゲートされる。具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体のＢ３位は、Ｌｙｓであり、ＬｙｓＢ３のイプシロン−アミノ基は、前記脂肪酸部分にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、前記脂肪酸鎖は、８−２０個の炭素長である。具体的な実施形態では、前記脂肪酸は、オクタン酸（Ｃ８）、ノナン酸（Ｃ９）、デカン酸（Ｃ１０）、ウンデカン酸（Ｃ１１）、ドデカン酸（Ｃ１２）またはトリデカン酸（Ｃ１３）である。特定の実施形態では、前記脂肪酸は、ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデカン酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデカン酸（Ｃ１７）、ステアリン酸（Ｃ１８）、ノナデカン酸（Ｃ１９）またはアラキドン酸（Ｃ２０）である。
【０１１２】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン（インスリンリスプロ）、ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン（インスリンアスパルト）、ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン（インスリングルリジン）、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン（インスリングラルギン）、ＮεＢ２９−ミリストイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン（インスリンデテミル）、ＡｌａＢ２６−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１ＧｌｕＢ１３−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ２７）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ２８−Ｂ３０）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂｌ）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂｌ−Ｂ３）−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１１３】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−パルミトイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−パルミトイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。具体的な実施形態では、前記グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を含むアスパラギン残基に結合される、本願明細書に開示された少なくとも１つのＮ−グリカンを含む。
【０１１４】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−パルミトイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ３０−ミリストイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ３０−パルミトイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−パルミトイル−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−リトコリル（ｌｉｔｈｏｃｏｌｙｌ）−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１１５】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＢ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１１６】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリンポリペプチド：ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ３０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ａｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１１７】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１１８】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１１９】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２０】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２１】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２２】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２３】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２４】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２５】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２６】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２７】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２８】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロオピニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロオピニル−ＮαＡ１−プロオピニル−ＮαＢ１−プロオピニル−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２９】
具体的な実施形態では、本開示のＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３０】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３１】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３２】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３３】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３４】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３５】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３６】
具体的な実施形態では、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２８−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３７】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３８】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２８−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢｌ−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３９】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２８−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１４０】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１４１】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１４２】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１４３】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１４４】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２８−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢｌ−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１４５】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２８−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１４６】
具体的な実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、下記インスリン類似体：ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ｄｅｓ（Ｂ２６）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＡｓｐＢ１ＡｓｐＢ３ＡｓｐＢ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、の１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１４７】
前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、前述の変異および／または化学修飾のいずれか１つを含む、修飾型の非ヒトインスリン（例えば、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリン等）をさらに含む。これらおよび他の修飾インスリン分子は、米国特許第６，９０６，０２８号；同第６，５５１，９９２号；同第６，４６５，４２６号；同第６，４４４，６４１号；同第６，３３５，３１６号；同第６，２６８，３３５号；同第６，０５１，５５１号；同第６，０３４，０５４号；同第５，９５２，２９７号；同第５，９２２，６７５号；同第５，７４７，６４２号；同第５，６９３，６０９号；同第５，６５０，４８６号；同第５，５４７，９２９号；同第５，５０４，１８８号；同第５，４７４，９７８号；同第５，４６１，０３１号；および同第４，４２１，６８５号明細書；ならびに、米国特許第７，３８７，９９６号；同第６，８６９，９３０号；同第６，１７４，８５６号；同第６，０１１，００７号；同第５，８６６，５３８号；および同第５，７５０，４９７号明細書において、詳細に記載されている。それらの開示全体は、参照により組み込まれる。
【０１４８】
種々の実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、３つの野生型ジスルフィド結合を含む（すなわち、１つは、前記Ａ−鎖の７位と前記Ｂ−鎖の７位との間であり、第２は、前記Ａ−鎖の２０位と前記Ｂ−鎖の１９位との間であり、第３は、前記Ａ−鎖の６位と１１位との間である。）。
【０１４９】
一部の実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、インスリン受容体についての親和性を低下させるために、修飾および／または変異される。特定の理論に拘束されないが、修飾（例えば、アシル化）または変異によりインスリン分子の受容体親和性を低下させることは、インスリン分子が血液から除去される速度を低下させ得ると考えられる。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける低下したインスリン受容体親和性は、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体についての、優れたｉｎ  ｖｉｖｏ活性になる。
【０１５０】
ＩＩ．インスリンタンパク質の操作および糖鎖設計の統合
ａ．薬物動態学的（ＰＫ）／薬力学的（ＰＤ）改善
Ｉ型糖尿病のクオリティ・オブ・ライフは、患者における基礎的レベルのインスリンを提供する１日１回のインスリン類似体であるインスリングラルギンの導入により顕著に改善された。Ｉ型糖尿病患者が我慢しなければならない、反復的な血中モニタリングおよび皮下注入のために、注入の頻度低下が、糖尿病処置における歓迎される利益であろう。１日１回の注入に合致するために、薬物動態学的プロファイルを改善することは、任意の新たなインスリン治療のために、かなり求められている。実際に、毎月１回のインスリンが、近年動物モデルにおいて報告されてきた（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０７：１３２４６（２０１０）；米国特許出願公開第２００９００９０２５８８１８号明細書）。多くの戦略が、インスリンのＰＫプロファイルを改善するのに探究されているが、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、他の戦略では達成できない糖尿病患者に対する利益を提供し得る。
【０１５１】
ｂ．糖類−応答性または−感受性のＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体
インスリンへの糖部分の化学的結合により、生理学的血中グルコースレベルの関数として、インスリンの生物学的利用能を調節する概念は、まず、１９７９年に、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂｒｏｗｎｌｅｅにより導入された（前掲のＢｒｏｗｎｌｅｅ  ＆  Ｃｅｒａｍｉ）。前記概念の主な制限は、グリコシル化されたインスリン誘導体に相互作用するコンカナバリンＡの毒性であった。この最初の報告以来、多くの報告が、グルコース調節インスリンについての可能性のある改善について公開されてきたが、今日においても、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＯ−結合グリコシル化を介して、糖を結合させる報告はない（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．８：６６４（１９９７））。
【０１５２】
１９７９年におけるＢｒｏｗｎｌｅｅの概念以来、数多くの種々の戦略が、血中グルコースレベルが低い場合、インスリンをインスリンリザーバ中に隔離するように進化してきた。これらは、マンノース結合レクチンであるコンカナバリンＡを含む。コンカナバリンＡは、高い血中グルコース濃度により、結合したインスリン−糖複合体を放出するのが説明された。ごく最近、参照により本願明細書に組み込まれる、米国特許第７，５３１，１９１号明細書ならびに国際公開第２０１００８８２６１号および同第２０１００８８２８６号パンフレットには全て、外来性の多価糖類結合分子（例えば、レクチンまたは修飾レクチン）に結合したインスリン−糖類コンジュゲートを含む微小粒子が患者に投与され得る系が開示されている。この場合、前記微小粒子から放出されたインスリン−糖類コンジュゲートの量および持続時間は、糖類、例えば、グルコースの血清濃度の関数である。他の戦略は、修飾レクチン、内在性受容体、内在性レクチンおよび／または糖結合タンパク質を使用することを含む。このような例としては、修飾されたＣｏｎＡ分子、マンノース結合レクチン、マンノース受容体、マンノース結合タンパク質およびＤＣ−ＳＩＧＮがあげられる。例えば、米国特許出願公開第２０１１３０１０８３号明細書には、特定のインスリン−コンジュゲートが高親和性の糖類リガンドを含むように修飾される場合、それらは、外来性の多価の糖類結合分子、例えば、ＣｏｎＡが存在しなくても、糖類の濃度変化に応答するＰＫ／ＰＤプロファイルを示すようになされ得ることが開示されている。
【０１５３】
糖類−応答性または−感受性のインスリンは、内在性インスリン放出の生理学的脈動に類似し得る１つの治療メカニズムである。膵臓ベータ細胞からのインスリン放出を引き起こす主な刺激は、高い血中グルコースである。類似するメカニズムにおいて、高いグルコース濃度により、循環内の保護されたプールから放出される治療用グリコシル化インスリンは、振動法において機能し得る。Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、糖類−応答性または−感受性のインスリン治療を支持する方法で機能し得る。図１５−１７に示されたように、非糖尿病マウスに投与されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体のＰＤは、（米国特許出願公開第２０１１０３０１０８３号明細書に示されたように）前記マウスに対して、α−メチルマンノースの血清レベル、種々の糖類、例えば、マンノースへの種々のレクチンの結合の阻害剤に感受性であった。
【０１５４】
したがって、具体的な実施形態では、前記ヘテロ二量体または一本鎖の、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、糖類、例えば、グルコース、フコース、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトースまたはα−メチルマンノースの血清濃度に応答性または感受性である、少なくとも１つのＰＫおよび／またはＰＤの特性を表わす。更なる実施形態では、天然のＡ−鎖ペプチドおよびＢ−鎖ペプチドまたは、１、２、３、４、５個以上のアミノ酸置換および／または欠失を含むそれらの類似体を含む、糖類−応答性または−感受性の、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体が提供される。一般的には、本願明細書において個体に投与された前記糖類−応答性または−感受性の、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体のＰＫおよび／またはＰＤは、個体における糖類、例えば、グルコース、フコース、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトースまたはα−メチルマンノースの血清濃度により影響を受ける。前記糖類の血清濃度は、前記個体に糖類を投与することにより影響を受ける場合があり、または、前記個体の生理学的状態により影響を受ける場合がある。
【０１５５】
ｃ．長く作用する糖類−応答性または−感受性の、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体
上記されたように、前記糖類−応答性または−感受性インスリンの機能は、さらに、１日あたりの投与回数を減らすのに最適化され得る。例えば、インスリングラルギンの物理化学的特性をさらに含む、糖類−応答性の、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体が、さらに提供される。前記インスリングラルギンは、中性ｐＨにおけるその非溶解性により、基礎的なインスリン治療として作用する。中性ｐＨでの非溶解性の結果は、１日１回の注入を可能にする皮下徐放性製剤における遅い再溶解プロセスである。インスリングラルギンは、前記Ｂ−鎖の端部において２つのアルギニン残基を含み、前記Ａ−鎖の端部におけるグリシンをアスパラギンに置換するように修飾された。これらの３つの変化は、前記タンパク質のｐＩを向上させる。したがって、それは、低いｐＨ配合バッファー中で可溶性であるが、生理学的ｐＨにおいて不溶性である。これらの変化は、本願明細書に開示された糖類−応答性または−感受性の、糖類−応答性Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体に包含されてもよい。インスリングラルギンに類似するｐＩを有するＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、長く作用する糖類−応答性または−感受性のインスリン治療を提供する場合がある。
【０１５６】
ｈ．Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体のＰＤおよびＰＫ
本願明細書に開示された種々の実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の薬物動態学的および／または薬力学的挙動は、糖類、例えば、制限されず、グルコースおよびアルファ−メチル−マンノースの血清濃度におけるバリエーションにより修飾される場合がある。
【０１５７】
例えば、薬物動態学的（ＰＫ）観点から、血清濃度曲線は、糖類（例えば、グルコース）の血清濃度が向上した場合、または、前記糖類の血清濃度が閾値を超える（例えば、正常なグルコースレベルより高い）場合、上方にシフトする場合がある。
【０１５８】
具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の血清濃度曲線は、哺乳類に投与された場合、絶食状態下と高血糖状態下とでは実質的に異なる。本願明細書で使用する時、前記「実質的に異なる」の用語は、２つの曲線が、スチューデントのｔ検定（ｐ＜０．０５）により決定される場合、統計学的に異なることを意味する。本願明細書で使用する時、前記「絶食状態」の用語は、前記血清濃度曲線が、５名以上の絶食した非糖尿病の個体からのデータを組み合わせることにより取得されたことを意味する。具体的な実施形態では、絶食した非糖尿病の個体は、血液が採取される時点で糖尿病の兆候を表わさず、血液採取時の１２時間以内に食事をしていない、ランダムに選択された１８−３０歳のヒトである。本願明細書で使用する時、前記「高血糖状態」の用語は、前記血清濃度曲線が、高血糖状態（絶食状態下において観察される平均グルコース濃度より少なくとも１００ｍｇ／ｄＬ高いグルコースＣｍａｘ）が、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、本願明細書に開示されたグリコシル化インスリン類似体とグルコースとの同時投与により誘導される、５名以上の絶食した非糖尿病の個体からのデータを組み合わせることにより取得されたことを意味する。
【０１５９】
本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体とグルコースとの同時投与は、前記Ｏ−グリコシル化インスリン類似体が、血清において検出可能なレベルで存在する期間中に、グルコースＣｍａｘが生じることを、単に必要とする。例えば、グルコース注入（または摂取）は、前記グリコシル化インスリン類似体が投与される直前、同投与と同時または同投与の直後に起こるタイミングであり得る。具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体とグルコースとは、種々の経路により、または、種々の位置において投与される。例えば、具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、皮下に投与され、一方、グルコースは、経口的または静脈内に投与される。
【０１６０】
具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の血清Ｃｍａｘは、絶食状態と比較して、高血糖状態下においてより高い。さらにまたは代替的に、具体的な実施形態では、前記グリコシル化インスリン類似体の血清の曲線下面積（ＡＵＣ）は、絶食状態と比較して、高血糖状態下においてより高い。種々の実施形態では、前記グリコシル化インスリン類似体の血清排出速度は、絶食状態と比較して、高血糖状態下においてより遅い。具体的な実施形態では、前記グリコシル化インスリン類似体の血清濃度曲線は、一方が短く、一方が長い半減期の二成分双指数モデルに適合され得る。前記長い半減期は、特に、グルコース濃度に感受性である場合がある。このため、具体的な実施形態では、前記長い半減期は、絶食状態と比較して、高血糖状態下においてより長い。具体的な実施形態では、前記絶食状態は、１００ｍｇ／ｄＬ未満（例えば、８０ｍｇ／ｄＬ、７０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、５０ｍｇ／ｄＬ等）のグルコースＣｍａｘを含む。具体的な実施形態では、前記高血糖状態は、２００ｍｇ／ｄＬを超える（例えば、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、５００ｍｇ／ｄＬ、６００ｍｇ／ｄＬ等）のグルコースＣｍａｘを含む。他のＰＫパラメータ、例えば、平均血清滞留時間（ＭＲＴ）、平均血清吸収時間（ＭＡＴ）等が、前述のパラメータのいずれかに代えて、または同パラメータと共に使用され得たことが理解されるであろう。
【０１６１】
ヒト、イヌ、ネコおよびラットにおける正常範囲のグルコース濃度は、６０から２００ｍｇ／ｄＬである。当業者は、種々の正常範囲を有する種についての下記値を推定可能であろう（例えば、ミニブタにおける正常範囲のグルコース濃度は、４０から１５０ｍｇ／ｄｌである。）。一般的には、５０ｍｇ／ｄＬを下回るグルコース濃度は、低血糖と考えられ、２００ｍｇ／ｄＬを超えるグルコース濃度は、高血糖と考えられる。具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体のＰＫ特性は、グルコースクランプ法を使用して試験されてもよい（実施例を参照のこと。）。本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の血清濃度曲線は、５０および２００ｍｇ／ｄＬ、５０および３００ｍｇ／ｄＬ、５０および４００ｍｇ／ｄＬ、５０および５００ｍｇ／ｄＬ、５０および６００ｍｇ／ｄＬ、１００および２００ｍｇ／ｄＬ、１００および３００ｍｇ／ｄＬ、１００および４００ｍｇ／ｄＬ、１００および５００ｍｇ／ｄＬ、１００および６００ｍｇ／ｄＬ、２００および３００ｍｇ／ｄＬ、２００および４００ｍｇ／ｄＬ、２００および５００ｍｇ／ｄＬ、２００および６００ｍｇ／ｄＬ等のグルコース濃度で投与される場合、実質的に異なる場合がある。さらにまたは代替的に、血清Ｔｍａｘ、血清Ｃｍａｘ、平均血清滞留時間（ＭＲＴ）、平均血清吸収時間（ＭＡＴ）および／または血清半減期は、前記２つのグルコース濃度において実質的に異なる場合がある。以下に検討されるように、具体的な実施形態では、１００ｍｇ／ｄＬおよび３００ｍｇ／ｄＬが、比較グルコース濃度として使用されてもよい。ただし、本開示は、比較グルコース濃度の別のペア、例えば、制限されず、下記ペア：５０および２００ｍｇ／ｄＬ、５０および３００ｍｇ／ｄＬ、５０および４００ｍｇ／ｄＬ、５０および５００ｍｇ／ｄＬ、５０および６００ｍｇ／ｄＬ、１００および２００ｍｇ／ｄＬ、１００および４００ｍｇ／ｄＬ、１００および５００ｍｇ／ｄＬ、１００および６００ｍｇ／ｄＬ、２００および３００ｍｇ／ｄＬ、２００および４００ｍｇ／ｄＬ、２００および５００ｍｇ／ｄＬ、２００および６００ｍｇ／ｄＬ等のいずれか１つによるこれらの各実施形態を包含することを理解されたい。したがって、具体的な実施形態では、前記Ｎ−グルコシル化インスリン類似体のＣｍａｘは、前記２つのグルコース濃度（例えば、３００  ｖｓ  １００ｍｇ／ｄＬのグルコース）の高い方で哺乳類に投与された場合に、より高い。
【０１６２】
具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体のＣｍａｘは、前記２つのグルコース濃度（例えば、３００  ｖｓ  １００ｍｇ／ｄＬのグルコース）の高い方で哺乳類に投与された場合、少なくとも５０％（例えば、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも４００％）より高い。具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体のＡＵＣは、前記２つのグルコース濃度（例えば、３００  ｖｓ  １００ｍｇ／ｄＬのグルコース）のより高い方で哺乳類に投与された場合、より高い。具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体のＡＵＣは、前記２つのグルコース濃度（例えば、３００  ｖｓ  １００ｍｇ／ｄＬのグルコース）の高い方で哺乳類に投与された場合、少なくとも５０％（例えば、少なくとも、例えば、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも４００％）より高い。
【０１６３】
具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の血清排出速度は、前記２つのグルコース濃度（例えば、３００  ｖｓ  １００ｍｇ／ｄＬのグルコース）の高い方で哺乳類に投与された場合、より遅い。特定の実施形態では、前記Ｎ−グリコシル化インスリン類似体の血清排出速度は、前記２つのグルコース濃度（例えば、１００  ｖｓ  ３００ｍｇ／ｄＬのグルコース）の低い方で哺乳類に投与された場合、少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも４００％）より速い。
【０１６４】
具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の血清濃度曲線は、一方が短く、一方が長い半減期の二成分双指数モデルを使用して適合され得る。前記長い半減期は、特に、グルコース濃度に感受性である場合がある。このため、具体的な実施形態では、前記長い半減期は、前記２つのグルコース濃度（例えば、３００  ｖｓ  １００ｍｇ／ｄＬのグルコース）の高い方で哺乳類に投与された場合、より長い。
【０１６５】
具体的な実施形態では、前記長い半減期は、前記２つのグルコース濃度（例えば、３００  ｖｓ  １００ｍｇ／ｄＬのグルコース）の高い方で哺乳類に投与された場合、少なくとも５０％（例えば、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも４００％）より長い。
【０１６６】
具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の血清濃度曲線が、２種類のグルコース濃度（例えば、３００  ｖｓ  １００ｍｇ／ｄＬのグルコース）で取得され；２つの曲線が、一方が短く、一方が長い半減期の二成分双指数モデルを使用して適合され；前記２つのグルコース濃度下において取得された長い半減期が比較される方法が提供される。具体的な実施形態では、この方法は、１つ以上の本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体のグルコース感受性を試験または比較するためのアッセイとして使用されてもよい。
【０１６７】
具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体、および、インスリンの非グリコシル化バージョンの血清濃度曲線が同じ条件（例えば、絶食条件）下において取得され；２つの曲線が、一方が短く、一方が長い半減期の二成分双指数モデルを使用して適合され；本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体、および、非グリコシル化バージョンについて取得された長い半減期が比較される方法が提供される。具体的な実施形態では、この方法は、前記非グリコシル化バージョンまたは天然のインスリンより速やかに排出される、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を特定するためのアッセイとして使用されてもよい。
【０１６８】
具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の血清濃度曲線は、高血糖状態下において哺乳類に投与された場合、前記類似体の非グリコシル化バージョンの血清濃度曲線と実質的に同じである。本願明細書で使用する時、前記「実質的に同じ」の用語は、スチューデントのｔ−検定（ｐ＞０．０５）により決定される場合、２つの曲線間に統計学的差異が存在しないことを意味する。具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の血清濃度曲線は、絶食状態下において投与された場合、前記類似体の非グリコシル化バージョンの血清濃度曲線とは実質的に異なる。具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の血清濃度曲線は、高血糖状態下において投与された場合、前記類似体の非グリコシル化バージョンの血清濃度曲線と実質的に同じであり、絶食状態下において投与された場合、実質的に異なる。
【０１６９】
具体的な実施形態では、前記高血糖状態は、２００ｍｇ／ｄＬを超える（例えば、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、５００ｍｇ／ｄＬ、６００ｍｇ／ｄＬ等）のグルコースＣｍａｘを含む。具体的な実施形態では、前記絶食状態は、１００ｍｇ／ｄＬ未満（例えば、８０ｍｇ／ｄＬ、７０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、５０ｍｇ／ｄＬ等）のグルコースＣｍａｘを含む。前述のＰＫパラメータ、例えば、血清Ｔｍａｘ、血清Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、平均血清滞留時間（ＭＲＴ）、平均血清吸収時間（ＭＡＴ）および／または血清半減期のいずれかが比較され得ることが理解されるであろう。
【０１７０】
薬力学的（ＰＤ）観点から、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の生体活性は、グルコース濃度が向上した場合、または、グルコース濃度が閾値を超える、例えば、正常なグルコースレベルより高い場合に、向上し得る。具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の生体活性は、絶食状態下において投与された場合、高血糖状態と比較してより低い。
【０１７１】
具体的な実施形態では、前記絶食状態は、１００ｍｇ／ｄＬ未満（例えば、８０ｍｇ／ｄＬ、７０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、５０ｍｇ／ｄＬ等）のグルコースＣｍａｘを含む。具体的な実施形態では、前記高血糖状態は、２００ｍｇ／ｄＬを超える（例えば、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、５００ｍｇ／ｄＬ、６００ｍｇ／ｄＬ等）のグルコースＣｍａｘを含む。
【０１７２】
具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体のＰＤ特性は、一定のグルコース濃度を維持するのに必要とされるグルコースかん流速度（ＧＩＲ）を測定することにより試験されてもよい。このような実施形態に基づいて、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の生体活性は、５０および２００ｍｇ／ｄＬ、５０および３００ｍｇ／ｄＬ、５０および４００ｍｇ／ｄＬ、５０および５００ｍｇ／ｄＬ、５０および６００ｍｇ／ｄＬ、１００および２００ｍｇ／ｄＬ、１００および３００ｍｇ／ｄＬ、１００および４００ｍｇ／ｄＬ、１００および５００ｍｇ／ｄＬ、１００および６００ｍｇ／ｄＬ、２００および３００ｍｇ／ｄＬ、２００および４００ｍｇ／ｄＬ、２００および５００ｍｇ／ｄＬ、２００および６００ｍｇ／ｄＬ等のグルコース濃度で投与された場合、実質的に異なる場合がある。したがって、具体的な実施形態では、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の生体活性は、前記２つのグルコース濃度（例えば、３００  ｖｓ  １００ｍｇ／ｄＬのグルコース）の高い方で哺乳類に投与された場合、より高い。特定の実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の生体活性は、前記２つのグルコース濃度（例えば、３００  ｖｓ  １００ｍｇ／ｄＬのグルコース）の高い方で哺乳類に投与された場合、少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％または少なくとも１００％）より高い。
【０１７３】
本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体についてのＰＤ挙動は、最小血中グルコース濃度に達する時間（Ｔｎａｄｉｒ）、血中グルコースレベルが初期値の特定の割合（例えば、初期値の７０％または１０  Ｔ７０％  ＢＧＬ）を下回り続ける継続時間等を比較することにより観察され得る。一般的には、本願明細書で検討されたＰＫおよびＰＤの特徴のいずれかは、各種の公開された薬物動態学的および薬力学的な方法のいずれかに基づいて決定され得ることが理解されるであろう。（例えば、皮下送達に適した方法について、Ｂａｕｄｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．９：１７６−１８３（１９９８）を参照のこと。）。前記ＰＫおよび／またはＰＤの特性は、任意の哺乳類（例えば、ヒト、ラット、ネコ、ミニブタ、イヌ等）において測定されてもよい。
【０１７４】
具体的な実施形態では、ＰＫおよび／またはＰＤの特性は、ヒトにおいて測定される。具体的な実施形態では、ＰＫおよび／またはＰＤの特性は、ラットにおいて測定される。具体的な実施形態では、ＰＫおよび／またはＰＤの特性は、ミニブタにおいて測定される。具体的な実施形態では、ＰＫおよび／またはＰＤの特性は、イヌにおいて測定される。前述のものは、本願明細書に開示された糖類−応答性または−感受性の、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の文脈において記載されたが、同じ特性およびアッセイは、他の糖類、例えば、外来性の糖類、例えば、マンノース、Ｌ−フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、アルファ−メチルマンノース等の血清濃度に応答性である、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体に適用することも理解されるであろう。一部の態様では、絶食状態と高血糖状態下とにおけるＰＫおよび／またはＰＤの特性を比較するのに代えて、前記ＰＫおよび／またはＰＤの特性は、外来性の糖類の投与の有無により、絶食状態下において比較されてもよい。本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、種々のＣｍａｘ値の所定の外来性糖類に応答するように設計されてもよいことを理解されたい。
【０１７５】
ＩＩＩ．Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を産生するための宿主細胞
一般的には、細菌細胞、例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉおよび酵母細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが、インスリンおよびインスリン類似体の商業的産生に使用されてきた。例えば、Ｔｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：６７６６−６７７０（１９８６）、米国特許第４，９１６，２１２号；同第５，６１８，９１３号；および同第７，１０５，３１４明細書には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるインスリン産生が開示されている。国際公開第２００９１０４１９９号パンフレットには、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるインスリン産生が開示されている。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるインスリン産生は、数多くの刊行物、例えば、Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：５４０１−５４０４（１９８１）および米国特許第５，２２７，２９３号明細書に開示されている。酵母細胞においてインスリンを産生することの利点は、インスリン分子が、正確なジスルフィド結合を有する正確に折り畳まれた構成で、宿主細胞から分泌されることである。ついで、前記インスリン分子は、インスリンヘテロ二量体を産生するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて酵素的に処理され得る。対照的に、Ｅ．  ｃｏｌｉにおいて産生されたインスリンは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて処置されない。代わりに、それは、不正確に折り畳まれた構成における封入体に隔離される。前記封入体は、正確な構成のインスリンヘテロ二量体を産生するために、前記細胞から収集され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける一連の反応において処理される。インスリンは、Ｎ−結合およびＯ−結合グリコシル化部位を欠いているために、通常、糖タンパク質とは考えられないが、インスリンがＥ．  ｃｏｌｉではなく酵母において産生される場合、合成されたインスリンの小さな個体群が、Ｏ−グリコシル化されると思われる。これらのＯ−グリコシル化分子は、それを除去するための方法が開発されてきた、混入物であると考えられる（例えば、米国特許第６，１８０，７５７号明細書および国際公開第２００９１０４１９９号パンフレットを参照のこと。）。
【０１７６】
本発明の具体的な態様では、前記宿主細胞は、酵母細胞または糸状菌の宿主細胞である。酵母および糸状菌の宿主細胞としては、制限されず、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、任意のＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、任意のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａがあげられる。一般的には、本願明細書におけるＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を産生するのに選択または選出された宿主細胞は、糖タンパク質上のＯ−グリカンについて、検出可能なβ１，２−結合マンノースおよび／またはホスホマンノース活性を示さない。検出可能なβ１，２−結合マンノースおよび／またはホスホマンノース活性を典型的に示す宿主細胞では、前記宿主細胞は、糖タンパク質上のＯ−グリカンについて、検出可能なβ１，２−結合マンノースおよび／またはホスホマンノース活性を示さないように、したがって、検出可能なβ１，２−結合マンノースおよび／またはホスホマンノースの残基を欠いた糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。
【０１７７】
具体的な実施形態では、前記宿主細胞は、検出可能なβ１，２−結合マンノースまたはホスホマンノースの残基を欠いた糖タンパク質を産生する、酵母の宿主細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、メタノール資化性酵母、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＯｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、それらの変異体およびそれらの遺伝子操作変異体である。この方法では、糖タンパク質組成は、特定の所望の糖型が前記組成において主であるように産生され得る。
【０１７８】
下等な真核生物の宿主細胞、例えば、酵母の使用は、これらの細胞が、比較的均質な組成の糖タンパク質を産生可能であり得るという点でさらに有益である。したがって、前記糖タンパク質の主な糖型は、前記組成における３０モル％より高い前記糖型として存在してもよい。具体的な態様では、主な糖型は、前記組成における４０モル％、５０モル％、６０モル％、７０モル％より高く、最も好ましくは、８０モル％より高い糖タンパク質において存在する。このようなことは、選択された内在性のグリコシル化酵素を除去することにより達成され得る。
【０１７９】
本発明の具体的な態様では、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を産生するための宿主細胞としては、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子であるＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｂの一方または両方の発現を欠失または破壊することにより、検出可能なホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くように遺伝子操作されている、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株があげられ（例えば、米国特許第７，１９８，９２１号および同第７，２５９，００７号明細書を参照のこと。それらの開示は全て、参照により本願明細書に組み込まれる。）。更なる態様では、ＭＮＮ４Ａ遺伝子の発現を欠失または破壊することも、前記遺伝子操作に含み得る。破壊は、特定の酵素をコードするオープン・リーディング・フレームを破壊すること、または、前記オープン・リーディング・フレームの発現を破壊すること、または、１つ以上のβ−マンノシルトランスフェラーゼおよび／またはホスホマンノシルトランスフェラーゼをコードするＲＮＡの翻訳を、干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等を使用して抑制することを含む。前記宿主細胞は、さらに、特定のＮ−グリカン構造を産生するように修飾された、前述の宿主細胞のいずれか１つを含み得る。
【０１８０】
α−マンノシダーゼに抵抗性であるβ−結合マンノース残基を有するＯ−グリカンの確率を低下または除去するために、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を産生するための、組換え糖鎖操作されたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞が、検出可能なα−マンノシダーゼ抵抗性Ｏ−グリカンを欠くように遺伝子操作される。前記遺伝子操作は、１つ以上のβ−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４）を欠失または破壊することにより達成され得る（米国特許第７，４６５，５７７号明細書、米国特許第７，７１３，７１９号明細書ならびに国際公開第２０１１０４６８５５号パンフレットを参照のこと。各文献は、参照により本願明細書に組み込まれる。）。ＢＭＴ２ならびに１つ以上のＢＭＴ１、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の欠失または破壊も、宿主細胞タンパク質に対する抗体に対する糖タンパク質を含む組成の検出可能な交叉反応を低下または除去する。具体的な態様では、前記宿主細胞は、ＢＭＴ２、ＢＭＴ１、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の検出可能な発現を欠いている。
【０１８１】
更なる実施形態では、前記宿主細胞は、糖タンパク質上のＮ−グリカンについて、開始α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さない。例えば、酵母において、このようなα１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性は、ＯＣＨ１遺伝子によりコードされ、ＯＣＨ１遺伝子の発現の欠失または破壊（ｏｃｈ１Δ）は、酵母、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、高マンノースまたは高マンノシル化Ｎ−グリカンの産生を阻害する（例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第７，０２９，８７２号明細書；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第６，８０３，２２５号明細書；およびＣｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ、欧州特許第１２１１３１０号明細書を参照のこと。それらの開示は、参照により本願明細書に組み込まれる。）。このため、一実施形態では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を産生するための宿主細胞は、ＯＣＨ１遺伝子の発現の欠失または破壊（ｏｃｈ１Δ）を含み、少なくとも１つのＣＴＰペプチドを有するインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む。
【０１８２】
糖タンパク質の収量は、一部の状況において、哺乳類またはヒトのシャペロンタンパク質をコードする核酸分子を過剰発現させ、または、１つ以上の内在性シャペロンタンパク質をコードする遺伝子を、１つ以上の哺乳類またはヒトのシャペロンタンパク質をコードする核酸分子により置き換えることにより改善され得る。さらに、前記宿主細胞中での哺乳類またはヒトのシャペロンタンパク質の発現が、前記細胞におけるＯ−グリコシル化を制御するのと思われる。このため、さらに、本願明細書には、シャペロンタンパク質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の機能が、低下または除去されており、前記シャペロンタンパク質の少なくとも１つの哺乳類またはヒトのホモログをコードするベクターが、前記宿主細胞中で発現される、前記宿主細胞が含まれる。内在性の宿主細胞シャペロンおよび哺乳類またはヒトのシャペロンタンパク質が発現されている宿主細胞も含まれる。更なる態様では、前記下等な真核生物の宿主細胞は、酵母または糸状菌の宿主細胞である。ヒトのシャペロンタンパク質が収量を改善し、組換えタンパク質のＯ−グリコシル化を低下または抑制するために導入される、前記宿主細胞のシャペロンの使用例は、国際公開第２００９１０５３５７号および同第２０１００１９４８７号パンフレット（それらの開示は、参照により本願明細書に組み込まれる。）に開示されてきた。
【０１８３】
一部の実施形態では、前記宿主細胞は、異種性の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸分子をさらに含んでもよい。前記核酸分子は、内在性の宿主細胞ヘテロ−オリゴマー性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含む１つ以上の必須のサブユニットの致死性変異を機能的に抑制可能であり、前記宿主細胞中での糖タンパク質の発現前または同発現と同時のいずれかで、組換え宿主細胞中で過剰発現される。Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ  ＳＴＴ３Ａのタンパク質、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ  ＳＴＴ３Ｂのタンパク質およびＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ  ＳＴＴ３Ｄのタンパク質は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ＳＴＴ３遺伝子座の欠失の致死性表現型を抑制することが示されてきた、単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼである（Ｎａｓｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９：３７５８−３７６８（２００８））。Ｎａｓｅｂ  ｅｔ  ａｌ．（同上）には、さらに、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ  ＳＴＴ３Ｄのタンパク質が、ＷＢＰ１、ＯＳＴ１、ＳＷＰ１またはＯＳＴ２の遺伝子座における欠失の致死性表現型を抑制し得たことが示された。Ｈｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９：１６０−１７１（２００９））には、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ  ＳＴＴ３Ａ（ＳＴＴ３−１）、ＳＴＴ３Ｂ（ＳＴＴ３−２）およびＳＴＴ３Ｄ（ＳＴＴ３−４）のタンパク質が、ＯＳＴ２、ＳＷＰ１およびＷＢＰ１の遺伝子座における欠失を、機能的に補完し得ることが教示されている。ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／２５８７８号（国際公開第２０１１１０６３８９号パンフレット、同文献は、参照により本願明細書に組み込まれる。）に示されるように、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ  ＳＴＴ３Ｄ（ＬｍＳＴＴ３Ｄ）のタンパク質は、Δｓｔｔ３変異の致死性表現型ならびに、Δｗｂｐ１、Δｏｓｔ１、Δｓｗｐ１およびΔｏｓｔ２変異の少なくとも１つの致死性表現型を抑制可能である、異種性の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼである。
【０１８４】
したがって、異種性の単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第１の核酸分子；および、少なくとも１つのＣＴＰペプチドを含むインスリンまたはインスリン類似体をコードする第２の核酸分子を含み、前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内在性の宿主細胞遺伝子が発現される、酵母または糸状菌の宿主細胞がさらに提供される。これは、内在性のＳＴＴ３遺伝子の発現を含む。酵母におけるそれは、ＳＴＴ３遺伝子である。
【０１８５】
一般的には、上記方法および宿主細胞において、前記単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１つの必須のタンパク質における変異の致死性表現型を機能的に抑制可能である。更なる態様では、前記ＯＴａｓｅ複合体の必須のタンパク質は、ＳＴＴ３遺伝子座、ＷＢＰ１遺伝子座、ＯＳＴ１遺伝子座、ＳＷＰ１遺伝子座もしくはＯＳＴ２遺伝子座またはそれらのホモログによりコードされる。更なる態様では、例えば、前記単一サブユニットのオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ  ＳＴＴ３Ｄタンパク質である。
【０１８６】
一部の実施形態では、前記宿主細胞は、Ｐｍｔｐ阻害剤の存在下において増殖される。前記阻害剤は、制限されず、ベンジリデンチアゾリジンジオンを含み得る。使用され得るベンジリデンチアゾリジンジオンの例は、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオオキソ−３−チアゾリジン酢酸；５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオオキソ−３−チアゾリジン酢酸；および、５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオオキソ−３−チアゾリジン酢酸である。前記Ｐｍｔｐ阻害剤の使用は、前記Ａ−鎖またはＢ−鎖のアミノ酸配列内の望ましくない、または、不適切なＯ−グリコシル化を低下させる場合がある。
【０１８７】
したがって、本発明は、糖タンパク質上のＯ−グリカンについて、ほとんど検出できない、または、検出できないβ−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示し、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む、下等な真核生物の宿主細胞を提供する。別の実施形態では、本発明は、糖タンパク質上のＯ−グリカンについて、ほとんど検出できない、または、検出できないホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を示し、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む、下等な真核生物の宿主細胞も提供する。更なる実施形態では、本発明は、糖タンパク質上のＯ−グリカンについて、ほとんど検出できない、または、検出できないβ−マンノシルトランスフェラーゼ活性、および、ほとんど検出できない、または、検出できないホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を示し、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む、下等な真核生物の宿主細胞を提供する。実施形態では、前記核酸分子は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれてもよいし、または、前記宿主細胞中で、染色体外的に、例えば、プラスミドベクター、ミニ−染色体等で存在してもよい。
【０１８８】
本発明は、さらに、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の欠失または破壊を含み、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む、下等な真核生物の宿主細胞を提供する。別の実施形態では、本発明は、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の欠失または破壊を含み、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む、下等な真核生物の宿主細胞も提供する。更なる実施形態では、本発明は、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の欠失または破壊；ホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の欠失または破壊を含み、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む、下等な真核生物の宿主細胞を提供する。実施形態では、前記核酸分子は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれてもよいし、または、前記宿主細胞中で、染色体外的に、例えば、プラスミドベクター、ミニ−染色体等で存在してもよい。
【０１８９】
本発明は、さらに、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現の欠失または破壊、および、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの宿主細胞を提供する。更なる態様では、少なくともＢＭＴ２遺伝子の発現が、欠失または破壊される。更なる態様では、２つ以上のＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子それぞれの発現が抑制される。
【０１９０】
本発明は、さらに、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現の欠失または破壊、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの宿主細胞を提供する。更なる態様では、ＭＭＮ４Ｌ１遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＰＮＯ１およびＭＭＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が、欠失または破壊される。更なる態様では、ＭＮＮ４遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＭＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が抑制される。
【０１９１】
本発明は、さらに、開始α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードするＯＣＨ１遺伝子の発現の欠失または破壊ならびに、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む、酵母宿主細胞を提供する。
【０１９２】
本発明は、さらに、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現の欠失または破壊、および、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現の欠失または破壊、ならびに、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの宿主細胞を提供する。更なる態様では、少なくともＢＭＴ２遺伝子およびＰＮＯ１遺伝子の発現が、欠失または破壊される。更なる態様では、２つ以上のＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１遺伝子の発現が、欠失または破壊される。更なる態様では、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１遺伝子それぞれの発現が、欠失または破壊される。更なる態様では、少なくともＢＭＴ２遺伝子ならびにＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が、欠失または破壊される。更なる態様では、２つ以上のＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が、欠失または破壊される。更なる態様では、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子それぞれの発現が、欠失または破壊される。更なる態様では、少なくともＢＭＴ２遺伝子ならびにＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が、欠失または破壊される。更なる態様では、２つ以上のＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が、欠失または破壊される。更なる態様では、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子それぞれの発現が、欠失または破壊される。前述の態様のいずれか１つの更なる態様では、前記宿主は、開始α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードするＯＣＨ１遺伝子の発現の欠失または破壊をさらに含む。
【０１９３】
本発明は、さらに、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、酵母または糸状菌の宿主細胞中で製造するための方法を提供する。一般的に、本願明細書に開示されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を産生するのに使用される前記宿主細胞は、糖タンパク質上のＯ−グリカンについて、ほとんど検出できない、または、検出できないβ−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示す。別の態様では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を産生するのに使用される前記宿主細胞は、糖タンパク質上のＯ−グリカンについて、ほとんど検出できない、または、検出できないホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を示す。更なる態様では、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を産生するのに使用される前記宿主細胞は、糖タンパク質上のＯ−グリカンについて、ほとんど検出できない、または、検出できないホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示す。具体的な態様では、前記宿主細胞は、さらに、糖タンパク質上のＯ−グリカンについて、ほとんど検出できない、または、検出できない開始α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示す。更なる態様では、前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を産生するのに使用される前記宿主細胞は、糖タンパク質上のＯ−グリカンについて、ほとんど検出できない、または、検出できないホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性および開始α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示す。
【０１９４】
したがって、本発明は、検出可能なβ−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さない酵母または糸状菌の宿主細胞を提供する工程；前記宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換する工程；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養する工程；ならびに、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、酵母または糸状菌の宿主細胞中で製造するための方法を提供する。
【０１９５】
別の実施形態では、本発明は、検出可能なホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を示さない酵母または糸状菌の宿主細胞を提供する工程；前記宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換する工程；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養する工程；ならびに、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、酵母または糸状菌の宿主細胞中で製造するための方法を提供する。
【０１９６】
更なる実施形態では、本発明は、検出可能なβ−マンノシルトランスフェラーゼ活性およびホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を示さない酵母または糸状菌の宿主細胞を提供する工程；前記宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換する工程；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養する工程；ならびに、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、酵母または糸状菌の宿主細胞中で製造するための方法を提供する。
【０１９７】
上記方法の具体的な態様では、前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａからなる群から選択される。
【０１９８】
本発明は、さらに、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現が、欠失または破壊されているＰｉｃｈｉａ種の宿主細胞を提供する工程；前記宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換する工程；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養する工程；ならびに、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、Ｐｉｃｈｉａ種の宿主細胞中で製造するための方法を提供する。更なる態様では、少なくともＢＭＴ２遺伝子の発現が、欠失または破壊される。更なる態様では、２つ以上のＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子それぞれの発現が、欠失または破壊される。
【０１９９】
本発明は、さらに、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現が、欠失または破壊されているＰｉｃｈｉａ種の宿主細胞を提供する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、Ｐｉｃｈｉａ種の宿主細胞中で製造するための方法を提供する。更なる態様では、少なくともＰＮＯ１遺伝子の発現が、欠失または破壊され；前記宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換する工程；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養する工程；ならびに、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する工程を含む。更なる態様では、ＭＭＮ４Ｌ１遺伝子の発現が、欠失または破壊される。ＰＮＯ１およびＭＭＮ４Ｌ１遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＭＮＮ４遺伝子の発現が、欠失または破壊される。更なる態様では、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＭＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が、欠失または破壊される。
【０２００】
本発明は、さらに、宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換する工程；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養する工程；ならびに、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、開始α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードするＯＣＨ１遺伝子の発現が欠失または破壊されている酵母の宿主細胞中で製造するための方法を提供する。
【０２０１】
本発明は、さらに、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現、および、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現が抑制されているＰｉｃｈｉａ種の宿主細胞を提供する工程；前記宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換する工程；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養する工程；ならびに、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、Ｐｉｃｈｉａ種の宿主細胞中で製造するための方法を提供する。更なる態様では、少なくともＢＭＴ２遺伝子およびＰＮＯ１遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、２つ以上のＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１遺伝子それぞれの発現が抑制される。更なる態様では、少なくともＢＭＴ２遺伝子ならびにＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、２つ以上のＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子それぞれの発現が抑制される。更なる態様では、少なくともＢＭＴ２遺伝子ならびにＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、２つ以上のＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子それぞれの発現が抑制される。前述の態様のいずれか１つの更なる態様では、前記宿主は、さらに、開始α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードするＯＣＨ１遺伝子の発現の抑制を含む。
【０２０２】
本発明は、さらに、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現が、欠失または破壊されているＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓの宿主細胞を提供する工程；前記宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換する工程；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養する工程；ならびに、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓの宿主細胞中で製造するための方法を提供する。更なる態様では、少なくともＢＭＴ２遺伝子の発現が、欠失または破壊される。更なる態様では、２つ以上のＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子それぞれの発現が、欠失または破壊される。
【０２０３】
本発明は、さらに、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現が、欠失または破壊されているＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓの宿主細胞を提供する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓの宿主細胞中で製造するための方法を提供する。更なる態様では、少なくともＰＮＯ１遺伝子の発現が、欠失または破壊されており；前記宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換し；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養し；ならびに、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する。更なる態様では、ＭＭＮ４Ｌ１遺伝子の発現が、欠失または破壊される。更なる態様では、ＰＮＯ１およびＭＭＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＭＮＮ４遺伝子の発現が、欠失または破壊される。更なる態様では、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＭＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が、欠失または破壊される。
【０２０４】
本発明は、さらに、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現、および、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１つ以上の遺伝子の発現が抑制されているＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの宿主細胞を提供する工程；前記宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換する工程；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養する工程；ならびに、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの宿主細胞中で製造するための方法を提供する。更なる態様では、少なくともＢＭＴ２遺伝子およびＰＮＯ１遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、２つ以上のＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１遺伝子それぞれの発現が抑制される。更なる態様では、少なくともＢＭＴ２遺伝子ならびにＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、２つ以上のＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子それぞれの発現が抑制される。更なる態様では、少なくともＢＭＴ２遺伝子ならびにＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、２つ以上のＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子の発現が抑制される。更なる態様では、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の遺伝子ならびにＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１の遺伝子それぞれの発現が抑制される。前述の態様のいずれか１つの更なる態様では、前記宿主は、さらに、開始α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードするＯＣＨ１遺伝子の発現の抑制を含む。
【０２０５】
前述の態様のいずれかにおいて、上記言及された遺伝子のいずれかの発現の欠失または破壊は、前記遺伝子または、前記ＣＴＰペプチドの少なくとも１つまたは２つのＯ−グリコシル化部位を含むその部分変異体を欠失させるか、または、異種核酸分子を、前記β−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードするオープン・リーディング・フレーム内に挿入することにより前記遺伝子を破壊することにより達成されてもよい。いずれの場合でも、欠失または破壊された前記遺伝子は、場合によって、β−マンノシルトランスフェラーゼ、ホスホマンノシルトランスフェラーゼまたはα１，６−マンノシルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質産物を産生できなくなる。他の態様では、上記言及された１つ以上の遺伝子の活性は、阻害剤を使用して破壊される。前記阻害剤としては、制限されず、化合物、１つまたは複数の遺伝子をコードする１つ以上のｍＲＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ、または、１つまたは複数の遺伝子をコードする１つ以上のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡがあげられる。
【０２０６】
上記宿主細胞または前記宿主細胞を使用する方法の更なる態様では、前記宿主細胞は、主に１つのマンノース残基を含むＯ−グリカン、例えば、マンノースＯ−グリカンを産生するように遺伝子操作される。このため、前記宿主細胞は、さらに、α１，２−マンノシダーゼ活性をコードする核酸分子を含む。更なる態様では、前記核酸分子は、分泌経路にキメラα１，２−マンノシダーゼを向ける異種性の細胞標的ペプチドに操作可能に結合または融合された、α１，２−マンノシダーゼの触媒ドメインを含むキメラα１，２−マンノシダーゼをコードする融合タンパク質をコードする。具体的な態様では、前記α１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインに融合された細胞標的ペプチドは、配列番号８５によりコードされる、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルファ接合因子プレシグナルペプチド（配列番号８６）、または、配列番号４１によりコードされるプレ−プロペプチド（配列番号７）である。具体的な態様では、糸状菌のα１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインは、前記分泌経路を標的とし、前記宿主細胞からの分泌に融合タンパク質を向ける細胞標的ペプチドに融合される。一般的には、前記α１，２−マンノシダーゼ活性は、それが前記分泌経路を通過する際に、糖タンパク質上のＯ−グリカンをトリミング可能であり、細胞外で前記糖タンパク質上のＯ−グリカンをさらにトリミングする場合がある。具体的な態様では、前記α−１，２−マンノシダーゼは、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種から選択される。具体的な態様では、前記α１，２−マンノシダーゼは、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉｅａまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒから選択される。更なる態様では、前記α１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来であり、配列番号８７に示されたヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
【０２０７】
本発明の具体的な態様では、さらに、前記宿主細胞を、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子により形質転換する工程；前記形質転換された宿主細胞を、前記宿主細胞中で前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を発現するための、培地および条件下において培養する工程；ならびに、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、前記培地から回収する工程を含む、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を、開始α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする宿主細胞のＯＣＨ１遺伝子の発現が、欠失または破壊されている、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞中で製造するための方法が提供される。
【０２０８】
プロモータは、遺伝子発現を制御するためのＤＮＡ配列エレメントである。具体的には、プロモータは、転写開始位置を特定し、ＴＡＴＡボックスおよび上流のプロモータエレメントを含み得る。選択されるプロモータは、選択される具体的な宿主系において操作可能であることが期待されるであろうものである。例えば、酵母のプロモータは、酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが、宿主細胞である場合に使用される。一方、糸状菌のプロモータは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａまたはＴｒｉｃｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ等の宿主細胞に使用されるであろう。酵母のプロモータの例としては、制限されず、ＧＡＰＤＨ、ＡＯＸ１、ＳＥＣ４、ＨＨ１、ＰＭＡ１、ＯＣＨ１、ＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＧＡＰ、ＴＰＩ、ＣＹＣ１、ＡＤＨ２、ＰＨＯ５、ＣＵＰ１、ＭＦα１、ＦＬＤ１、ＰＭＡ１、ＰＤＩ、ＴＥＦ、ＲＰＬ１０およびＧＵＴ１のプロモータがあげられる。Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８（１９９２）には、酵母のプロモータおよび発現ベクターのレビューが提供されている。Ｈａｒｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３６：ｅ７６（ｐｕｂ  ｏｎ−ｌｉｎｅ  ６  Ｊｕｎｅ  ２００８）には、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける異種タンパク質の微調整発現用のプロモータライブラリが記載されている。
【０２０９】
本願明細書に開示された核酸分子に操作可能に結合される前記プロモータは、構成型プロモータまたは誘導型プロモータであり得る。誘導型プロモータ、例えば、ＡＯＸ１プロモータは、インデューサに対する応答における転写因子の結合に基づく向上または低下した速度において、転写に向かわせるプロモータである。本願明細書で使用する時、転写因子としては、プロモータの調節または制御領域に結合することができ、これにより、転写に影響を及ぼし得る任意の因子があげられる。前記宿主細胞内でのＲＮＡ合成または前記転写因子のプロモータ結合能は、前記宿主をインデューサに曝すこと、または、前記宿主細胞培地から、インデューサを除去することにより制御され得る。したがって、誘導型プロモータの発現を調節するために、インデューサは、前記宿主細胞の増殖培地に添加され、または、同培地から除去される。このようなインデューサは、糖、リン酸塩、アルコール、金属イオン、ホルモン、加熱、冷却等を含み得る。例えば、酵母において一般的に使用されるインデューサは、グルコース、ガラクトース、アルコール等である。
【０２１０】
選択される転写終了配列は、選択された具体的な宿主細胞において操作可能であるものである。例えば、酵母の転写終了配列は、酵母の宿主細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが前記宿主細胞である場合、発現ベクターに使用される。一方、糸状菌の転写終了配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａまたはＴｒｉｃｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ等の宿主細胞に使用されるであろう。転写終了配列としては、制限されず、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＹＣ転写終了配列（ＳｃＣＹＣ  ＴＴ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのＡＬＧ３転写終了配列（ＡＬＧ３  ＴＴ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのＡＬＧ６転写終了配列（ＡＬＧ６  ＴＴ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのＡＬＧ１２転写終了配列（ＡＬＧ１２  ＴＴ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのＡＯＸ１転写終了配列（ＡＯＸ１  ＴＴ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのＯＣＨ１転写終了配列（ＯＣＨ１  ＴＴ）およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのＰＭＡ１転写終了配列（ＰＭＡ１  ＴＴ）があげられる。他の転写終了配列は、実施例および当該分野において見出され得る。
【０２１１】
遺伝子操作された酵母について、選択性マーカーは、組換え宿主細胞を構築するのに使用されることができ、薬剤抵抗性マーカーおよび、前記酵母の宿主細胞による、必須の細胞栄養素、例えば、アミノ酸の合成を可能にする遺伝子機能を含む。酵母において一般的に使用される薬剤抵抗性マーカーとしては、クロラムフェニコール、カナマイシン、メトトレキサート、Ｇ４１８（ゲネチシン）、Ｚｅｏｃｉｎ等があげられる。前記酵母の宿主細胞による、必須の細胞栄養素の合成を可能にする遺伝子機能は、対応するゲノム機能における栄養要求性変異を有する利用可能な酵母株により使用される。一般的な酵母選択性マーカーは、ロイシン（ＬＥＵ２）、トリプトファン（ＴＲＰ１およびＴＲＰ２）、プロリン（ＰＲＯ１）、ウラシル（ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、ＵＲＡ６）、ヒスチジン（ＨＩＳ３）、リジン（ＬＹＳ２）、アデニン（ＡＤＥ１またはＡＤＥ２）等を合成するための遺伝子機能を提供する。他の酵母選択性マーカーとしては、亜ヒ酸塩の存在下で増殖される酵母細胞に対して、亜ヒ酸塩抵抗性を付与するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＲＲ３遺伝子があげられる（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，１３：８１９−８２８（１９９７）；Ｗｙｓｏｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３００６１−３００６６（１９９７））。数多くの適切な組込み部位としては、米国特許第７，４７９，３８９号明細書（その開示は、参照により本願明細書に組み込まれる。）に列挙されたものがあげられ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび他の酵母または糸状菌について公知の遺伝子座に対するホモログを含む。酵母内にベクターを組み込むための方法は、周知である（例えば、米国特許第７，４７９，３８９号、同第７，５１４，２５３号明細書、米国特許出願公開第２００９０１２４００号明細書および国際公開第２００９／０８５１３５号パンフレットを参照のこと。それらの開示は全て、参照により本願明細書に組み込まれる。）。挿入部位の例としては、制限されず、Ｐｉｃｈｉａ  ＡＤＥ遺伝子；Ｐｉｃｈｉａ  ＴＲＰ（例えば、ＴＲＰ１からＴＲＰ２）遺伝子；Ｐｉｃｈｉａ  ＭＣＡ遺伝子；Ｐｉｃｈｉａ  ＣＹＭ遺伝子；Ｐｉｃｈｉａ  ＰＥＰ遺伝子；Ｐｉｃｈｉａ  ＰＲＢ遺伝子；およびＰｉｃｈｉａ  ＬＥＵ遺伝子があげられる。Ｐｉｃｈｉａ  ＡＤＥ１およびＡＲＧ４の遺伝子は、Ｌｉｎ  Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２６３：１５９−１６９（２００１）および米国特許第４，８１８，７００号明細書に記載されている（それらの開示は、参照により本願明細書に組み込まれる。）。ＨＩＳ３およびＴＲＰ１の遺伝子は、Ｃｏｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  １４：８６１−８６７（１９９８）に記載されている。ＨＩＳ４は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５６１８０に記載されている。
【０２１２】
前記酵母細胞の形質転換は、当該分野において周知であり、例えば、それ自体公知の方法において、プロトプラストの形成後の形質転換により達成されてもよい。前記細胞を培養するのに使用される培地は、酵母生物を増殖させるのに適した任意の従来の培地でもよい。かなりの割合の分泌されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体前駆体は、正確に処理された形態において、前記培地中に存在するであろうし、種々の手法、例えば、制限されず、遠心、ろ過により前記培地から前記酵母細胞を分離すること、または、前記インスリン前駆体をイオン交換マトリクスもしくは逆相吸着マトリクスにより捕捉すること、上清もしくはろ液のタンパク質性成分を、塩、例えば、硫酸アンモニウムにより沈殿させ、続けて、各種のクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等により精製することにより、前記培地から回収されてもよい。
【０２１３】
前記分泌されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体分子は、米国特許第５，３９５，９２２号明細書および欧州特許第７６５，３９５号明細書に記載されているように、Ｎ−末端伸長またはスペーサペプチドを含んでもよい前駆体分子でもよい。前記両文献は、参照により本願明細書に組み込まれる。前記Ｎ−末端伸長またはスペーサは、シグナルペプチドもしくはプロペプチドと前記Ｂ−鎖のＮ−末端との間に位置するペプチドである。前記分泌経路の通過中に、シグナルペプチドおよびプロペプチドを除去した後に、前記Ｎ−末端伸長ペプチドは、Ｎ−グリコシル化インスリン前駆体に結合したままである。このため、発酵中に、前記Ｂ−鎖のＮ−末端は、酵母のプロテアーゼのタンパク質分解活性に対して保護され得る。前記Ｎ−末端伸長またはスペーサペプチドの存在は、前記タンパク質の化学処理中における、Ｎ−末端アミノ基の保護として機能する場合がある。すなわち、それは、ＢＯＣ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）または類似する保護基についての置換基として機能してもよい。前記Ｎ−末端伸長またはスペーサは、回収されたＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体前駆体から、塩基性アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ）に特異的なタンパク質分解酵素により除去されてもよい。したがって、前記末端伸長は、Ｌｙｓ残基において開裂される。このようなタンパク質分解酵素の例は、トリプシン、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓのプロテアーゼまたはＬｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓのエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃである。
【０２１４】
前記培養培地内への分泌および回収後、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体前駆体は、任意選択によるＮ−末端伸長またはスペーサペプチド、および、前記ＣＴＰペプチドが結合性ペプチドでない場合はＣ−ペプチドを除去するために、種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ手法に供されて、ｄｅｓＢ３０  Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を産生してもよい。ついで、前記ｄｅｓＢ３０  Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体は、Ｂ３０位にＴｈｒを付加することにより、Ｂ３０インスリンに変換されてもよい。前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体前駆体を、トリプシンまたは、Ｌ−スレオニンエステルの存在下におけるＬｙｓ−Ｃにより消化することにより、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体前駆体を、Ｂ３０ヘテロ二量体に変換し、続けて、米国特許第４，３４３，８９８号または同第４，９１６，２１２号明細書に記載されているように、塩基性もしくは酸性の加水分解により、スレオニンエステルのＬ−スレオニンに変換する。それらの開示は、参照により本願明細書に組み込まれる。前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体  ｄｅｓＢ３０インスリンは、米国特許第５，７５０，４９７号および同第５，９０５，１４０号明細書に開示されているように、アシル化誘導体にも変換されてもよい。それらの開示は、参照により本願明細書に組み込まれる。
【０２１５】
本発明は、さらに、本願明細書に開示されたＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子を提供する。具体的な態様では、前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードするＯＲＦは、前記核酸分子上の第２のＯＲＦから下流にあるフレーム内にあり、プレ−プロペプチド、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルファ接合因子プレ−プロペプチドをコードして、前記プレ−プロペプチドが前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体のＮ−末端に融合される、融合タンパク質をコードする１つの連続したＯＲＦを提供する。更なる態様では、前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子は、誘導性プロモータ、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのＡＯＸ１プロモータに操作可能に結合される。具体的な態様では、前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードするコドンは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて一般的に使用されるコドンに修飾される。
【０２１６】
前記プロペプチドは、配列番号７に示されたアミノ酸配列を有する、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルファ接合因子プレ−プロペプチドでもよい。前記アミノ酸配列は、配列番号４１に示された核酸配列によりコードされてもよい（米国特許第４，５４６，０８２号および同第４，８７０，００８号明細書を参照のこと。）。代替的に、前記プロ−ペプチドは、合成のプロペプチド、すなわち、天然に見出されないプロペプチド、例えば、制限されず、米国特許第５，３９５，９２２号；同第５，７９５，７４６号；および同第５，１６２，４９８号明細書ならびに国際公開第９８３２８６７号パンフレットに開示されたものでもよい。前記プロペプチドは、好ましくは、そのＣ−末端においてエンドペプチダーゼ処理部位、例えば、Ｌｙｓ−Ａｒｇ配列またはその任意の機能的類似体を含むであろう。別の実施形態では、前記プレ−プロペプチドは、ＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＫＲ（配列番号８２）のアミノ酸配列を有するＴＡ５７プロペプチドのＮ−末端に融合した、ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧ（配列番号２６）のアミノ酸配列を有するＹｐｓ１ｓｓシグナル配列ペプチドを含んでもよい。ＥＥＧＥＰＫ（配列番号８３）のアミノ酸配列を有するＮ−末端スペーサが、前記プレ−プロペプチドのＣ−末端アミノ酸に融合されてもよい。前記Ｙｐｓ１ｓｓペプチドは、米国特許第５，６３９，６４２号および同第５，７２６，０３８号明細書に開示された合成リーダまたはシグナルペプチドである。同文献は、参照により本願明細書に組み込まれる。前記ＴＡ５７プロペプチドおよびＮ−末端スペーサは、Ｋｊｅｌｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １７０：１０７−１１２（１９９６）ならびに米国特許第６，７７７，２０７号および同第６，２１４，５４７号明細書に記載されている。同文献は、参照により本願明細書に組み込まれる。
【０２１７】
ＶＩ．持続性放出製剤
特定の実施形態では、持続性方式において（すなわち、可溶性の組換えヒトインスリンより持続性の高い吸収プロファイルを示す方式において）、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体を投与するのが有益である場合がある。これは、典型的なグルコースの変動タイムスケール（すなわち、時間よりむしろ分）に、より密接に関連するタイムスケールにおけるグルコースの変動に応答し得る、持続性レベルのグリコシル化インスリンを提供するであろう。特定の実施形態では、前記持続性放出製剤は、非高血糖状態（すなわち、絶食状態）下における哺乳類に投与された場合、前記グリコシル化インスリンのゼロオーダーの放出を示し得る。持続性の吸収プロファイルを提供する任意の製剤が使用されてもよいことが、理解されるであろう。特定の実施形態では、これは、前記グリコシル化インスリンを、全身性循環内でのその放出特性を遅らせる他の成分と組み合わせることにより達成されてもよい。例えば、ＰＺＩ（プロタミン亜鉛インスリン）製剤が、この目的に使用されてもよい。一部の場合には、前記亜鉛含量は、約０．０５から約０．５ｍｇ亜鉛／ｍｇグリコシル化インスリンの範囲である。
【０２１８】
このため、特定の実施形態では、本開示の製剤は、約０．０５から約１０ｍｇプロタミン／ｍｇグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を含む。例えば、約０．２から約１０ｍｇプロタミン／ｍｇグリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体、例えば、約１から約５ｍｇプロタミン／ｍｇグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体。
【０２１９】
特定の実施形態では、本開示の製剤は、約０．００６から約０．５ｍｇ亜鉛／ｍｇグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を含む。例えば、約０．０５から約０．５ｍｇ亜鉛／ｍｇグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体、例えば、約０．１から約０．２５ｍｇ亜鉛／ｍｇＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体。
【０２２０】
特定の実施形態では、本開示の製剤は、約１００：１から約５：１、例えば、約５０：１から２０約５：１、例えば、約４０：１から約１０：１の範囲の比（ｗ／ｗ）における、プロタミンおよび亜鉛を含む。特定の実施形態では、本開示のＰＺＩ製剤は、約２０：１から約５：１、例えば、約２０：１から約１０：１、約２０：１から約１５：１、約１５：１から約５：１、約１０：１から約５：１、約１０：１から約１５：１の範囲の比（ｗ／ｗ）における、プロタミンおよび亜鉛を含む。
【０２２１】
特定の実施形態では、本開示の製剤は、抗菌性保存剤（例えば、ｍ−クレゾール、フェノール、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）を含む。特定の実施形態では、前記抗菌性保存剤は、ｍ−クレゾールである。例えば、特定の実施形態では、製剤は、約０．１から約１．０％ｖ／ｖのｍ−クレゾールを含む。例えば、約０．１から約０．５％ｖ／ｖのｍ−クレゾール、例えば、約０．１５から約０．３５％ｖ／ｖのｍ−クレゾール。
【０２２２】
特定の実施形態では、本開示の製剤は、等張剤としてポリオール（例えば、マンニトール、プロピレングリコールまたはグリセロール）を含む。特定の実施形態では、前記等張剤は、グリセロールである。特定の実施形態では、前記等張剤は、塩、例えば、ＮａＣｌである。例えば、製剤は、約０．０５から約０．５Ｍ  ＮａＣｌ、例えば、約０．０５から約０．２５Ｍ  ＮａＣｌまたは約０．１から約０．２Ｍ  ＮａＣｌを含んでもよい。
【０２２３】
特定の実施形態では、本開示の製剤は、非グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の量を含む。特定の実施形態では、製剤は、約１００：１から１：１、例えば、約５０：１から２：１または約２５：１から２：１の範囲におけるモル比の、非グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体に対するグリコシル化インスリン類似体を含む。
【０２２４】
本開示は、小分子製剤の分野において周知の標準的な持続性（延長性とも呼ばれる）放出製剤の使用も包含する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５を参照のこと。）。
【０２２５】
本開示は、段階的原理に基づいて、グリコシル化インスリン類似体を送達するためのポンプまたは束縛拡散による装置の使用も包含する。特定の実施形態では、長く作用する製剤は、（さらにまたは代替的に）長く持続するようにインスリンを修飾することにより提供されてもよい。例えば、前記インスリン類似体は、インスリングラルギンまたはインスリンデテミルでもよい。インスリングラルギンは、Ａｓｎ−Ａ２１がグリシンにより置き換えられており、２つのアルギニンが前記Ｂ鎖のＣ−末端に付加されている、例示となる長く作用するインスリン類似体である。これらの変化の作用は、等電点をシフトさせて、ｐＨ４において完全に可溶性の溶液を調製することである。インスリンデテミルは、Ｔｈｒ−Ｂ３０が欠失しており、Ｃ１４脂肪酸鎖がＬｙｓ−Ｂ２９に結合されている、別の長く作用するインスリン類似体である。
【０２２６】
下記実施例は、本発明の更なる理解を促すことを意図する。
【０２２７】
［実施例］
［実施例１］
この実施例は、ＣＴＰペプチドを含むヒトインスリン類似体をコードするプラスミド発現ベクターの構築を実証する。これらの発現ベクターは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるタンパク質発現用に設計されている。ただし、言及されたインスリン類似体のＡ−およびＢ−鎖ペプチドをコードする核酸分子は、Ｏ−グリコシル化糖タンパク質を産生可能な他の宿主細胞、例えば、哺乳類細胞および糸状菌、植物、昆虫または細菌の細胞におけるタンパク質発現用に設計された発現ベクター内に包含され得る。
【０２２８】
以下に開示された発現ベクターは、Ｎ−末端において、および／または、結合性ペプチドとして、ＣＴＰペプチドを含むプレ−プロインスリン類似体前駆体分子をコードする。前記酵母の宿主細胞中での前記プレ−プロインスリン類似体前駆体をコードするベクターの発現中に、前記プレ−プロインスリン類似体前駆体は、シグナルペプチドが除去され、前記分子が、ジスルフィド結合により互いに保持された構造に折りたたまれ、天然のヒトインスリンについてのそれと同じ構成を有する、グリコシル化プロインスリン類似体前駆体に処理される、分泌経路に輸送される。前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体前駆体は、前記分泌経路を通って輸送され、ついで、前記プロペプチドが、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体前駆体分子、または、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の一本鎖分子を形成するために除去される、小胞に向けられ、ついで、前記前駆体分子の場合には、前記宿主細胞から分泌され、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体ヘテロ二量体を産生するために、さらに、トリプシンまたはエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ消化を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて処理されてもよい。
【０２２９】
プラスミドｐＧＬＹ９３１６（図１）は、表１に列記されたインスリン発現プラスミドを生成するのに使用された、空の発現プラスミドである。プラスミドｐＧＬＹ９３１６は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのＡＯＸ１プロモータ（配列番号８）に対して上流に操作可能に結合され、マルチクローニングサイトおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのＡＯＸ１転写終了配列（配列番号９）に対して下流に操作可能に結合された、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルファ接合因子シグナル配列およびプロペプチド（配列番号４１によりコードされる配列番号７）をコードする核酸分子を含む。前記プラスミドは、さらに、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＥＦ１プロモータ（配列番号１１）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＹＣ転写終了配列（配列番号１２）に操作可能に結合された、Ｚｅｏｃｉｎ抵抗性選択マーカーをコードする発現カセット（配列番号１０）を含む。前記プラスミドベクターは、組込み用のＴＲＰ２遺伝子座（配列番号１３）またはＡＯＸ１プロモータ（配列番号８）を標的とする。表１に示された発現プラスミドを生成するために、列記されたインスリン／ＣＴＰ類似体をコードする核酸分子を、前記Ｂ−鎖ペプチドのＮ−末端に融合されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルファ接合因子シグナル配列およびプロペプチドを含む融合タンパク質をコードするために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルファ接合因子シグナル配列およびプロペプチドをコードするオープン・リーディング・フレームを有するフレームにおける前記マルチクローニングサイト内に挿入した。前記インスリン／ＣＴＰをコードするコドンを、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現用に最適化させた。前記インスリン／ＣＴＰをコードする各オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）について、前記ＯＲＦの５’端を、ＧＡＧＴＣＣＴＣＴＴ（配列番号５４）のヌクレオチド配列に結合させ、前記ＯＲＦの３’端を、ＴＡＡＴＡＧＧＧＣＣＧＧＣＣ（配列番号５５）のヌクレオチド配列に結合させた。
【０２３０】
表１に列記された子孫インスリン前駆体発現プラスミドを、前記インスリン／ＣＴＰ類似体をコードする核酸分子を挿入することにより構築し、ＭｌｙＩおよびＦｓｅＩにより、発現プラスミドｐＧＬＹ９３１６のマルチクローニングサイト中のＳｔｕＩとＦｓｅＩとの制限酵素部位間で消化した。
【表１】
0006735561.tif 000003
【０２３１】
前記プレ−プロインスリン類似体前駆体をコードする発現カセットを含む発現ベクターを、宿主細胞のゲノム内に組み込み、前記プレ−プロインスリン類似体前駆体を前記宿主細胞ゲノム内に組み込まれた前記発現カセットから発現する、酵母の宿主細胞内に形質転換する。前記プレ−プロインスリン類似体前駆体は、それがジスルフィド結合により折りたたまれ、Ｏ−グリコシル化される、分泌経路に向かう。ついで、前記プロインスリン類似体前駆体は、前記プロペプチドが除去され、プレ−Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系プロインスリン類似体前駆体が、前記宿主細胞から、精製されてもよい培養培地内に分泌される、小胞に輸送される。前記結合性ペプチドが、Ｃ−末端において１つまたは２つの塩基性アミノ酸残基を有するＣＴＰペプチド（例えば、配列番号９１のアミノ酸配列を有するＣＴＰ＋Ｋ）、または、末端Ｌｙｓ、例えば、ＡＡＫ（配列番号８４）を有するＣＴＰペプチド以外の結合性ペプチドであり、前記ＣＴＰペプチドが、前記Ｂ−鎖のＮ−末端（Ｎ−スペーサ）である場合、前記前駆体は、前記ＣＴＰペプチドが前記Ｂ−鎖ペプチドのＣ−末端または前記Ｂ−鎖ペプチドのＮ−末端それぞれにある、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリン類似体二量体を提供するために、さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（細胞外）において処理されてもよい。トリプシンまたはエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理に基づいて産生された前記ヘテロ二量体インスリン類似体は、Ｂ３０チロシン残基を欠いているため、前記インスリン類似体は、ｄｅｓＢ３０類似体である。ただし、当該分野において公知のように、ｄｅｓＢ３０インスリン類似体は、天然のインスリンのそれと実質的に異ならないインスリン受容体における活性を有する。前記結合性ペプチドが前記ＣＴＰペプチドであるインスリン類似体について、前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリン類似体は、一本鎖分子である。
【０２３２】
［実施例２］
前記ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の発現およびＯ−グリコシル化を試験するために、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＹＧＬＹ２６２６８を、図２に模式的に図示されたように構築した。簡潔には、前記株を、以下のように構築した。
【０２３３】
酵母株を、（エレクトロポレータの製造メーカーであるＢｉｏＲａｄにより推奨される標準的な技術を使用する）エレクトロポレーションにより形質転換した。一般的に、酵母の形質転換は、下記の通りとした。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、５０ｍＬのＹＰＤ培地（イーストエキストラクト（１％）、ペプトン（２％）、デキストロース（２％））において、約０．２から６の間の光学密度（「ＯＤ」）に、オーバーナイト増殖させた。氷上での３０分間のインキュベート後、細胞を、２５００−３０００ｒｐｍでの５分間の遠心により、ペレット化した。培地を除去し、細胞を、氷冷の滅菌した１Ｍ  ソルビトールで３回洗浄した。その後、０．５ｍｌの氷冷の滅菌した１Ｍ  ソルビトールに再懸濁した。１０μＬのＤＮＡ（５−２０μｇ）および１００μＬの細胞懸濁液を、エレクトロポレーションのキュベット中で組み合わせ、氷上で５分間インキュベートした。エレクトロポレーションは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓプロトコル（２ｋＶ、２５μＦ、２００Ω）の事前設定に基づくＢｉｏ−Ｒａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌにおいてとし、直ちに、続けて、１ｍＬのＹＰＤＳリカバリー培地（１Ｍ  ソルビトールを添加したＹＰＤ培地）を添加した。形質転換された細胞を、室温（２６℃）で、４時間からオーバーナイト回復させた。その後、前記細胞を選択培地に播種した。
【０２３４】
プラスミドｐＧＬＹ６（図３）は、ＵＲＡ５遺伝子座を標的とする組込みベクターである。それは、一方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子の５’領域由来のヌクレオチド配列（配列番号１５）を含む核酸分子のそばに隣接し、他方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子の３’領域由来のヌクレオチド配列（（配列番号１６）を含む核酸分子のそばに隣接する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのインベルターゼ遺伝子または転写ユニット（ＳｃＳＵＣ２；配列番号１４）を含む核酸分子を含む。プラスミドｐＧＬＹ６は、直線化し、前記直線状のプラスミドを、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ  １１４３０内に形質転換して、ＳｃＳＵＣ２遺伝子が、二重交叉相同組換えにより、ＵＲＡ５遺伝子座内に挿入された前記数多くの株を産生する。株ＹＧＬＹ１−３を、産生された前記株から選択した。同株は、ウラシルについての栄養要求性である。
【０２３５】
プラスミドｐＧＬＹ４０（図４）は、ＯＣＨ１遺伝子座を標的とし、ｌａｃＺリピートを含む核酸分子（配列番号１８）のそばに隣接し、次に、一方側において、ＯＣＨ１遺伝子の５’領域由来のヌクレオチド配列（配列番号１９）を含む核酸分子のそばに隣接し、他方側において、ＯＣＨ１遺伝子の３’領域由来のヌクレオチド配列（配列番号２０）を含む核酸分子のそばに隣接する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子または転写ユニット（配列番号１７）を含む核酸分子を含む組込みベクターである。プラスミドｐＧＬＹ４０を、ＳｆｔＩにより直線化した。前記直線状のプラスミドを、株ＹＧＬＹ１−３内に形質転換して、前記ｌａｃＺリピートのそばに隣接するＵＲＡ５遺伝子が、二重交叉相同組換えにより、ＯＣＨ１遺伝子座内に挿入された数多くの株を産生する。株ＹＧＬＹ２−３を、産生された前記株から選択した。同株は、ＵＲＡ５についての原栄養性である。株ＹＧＬＹ２−３を、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）の存在下において対比選択して、ＵＲＡ５遺伝子が失われており、前記ｌａｃＺリピートのみがＯＣＨ１遺伝子座に残っている数多くの株を産生した。これは、ウラシルについての栄養要求性株になる。株ＹＧＬＹ４−３を選択した。
【０２３６】
プラスミドｐＧＬＹ４３ａ（図５）は、ＢＭＴ２遺伝子座を標的とし、ｌａｃＺリピートを含む核酸分子のそばに隣接する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子または転写ユニットを含む核酸分子に隣接する、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）トランスポータ遺伝子または転写ユニット（ＫＩＭＮＮ２−２、配列番号２１）を含む核酸分子を含む組込みベクターである。前記隣接する遺伝子は、一方側において、ＢＭＴ２遺伝子の５’領域由来のヌクレオチド配列（配列番号２２）を含む核酸分子のそばに隣接し、他方側において、ＢＭＴ２遺伝子の３’領域由来のヌクレオチド配列（配列番号２３）を含む核酸分子のそばに隣接する。プラスミドｐＧＬＹ４３ａを、ＳｆｔＩにより直線化した。前記直線状のプラスミドを、株ＹＧＬＹ４−３内に形質転換して、ＫＩＭＮＮ２−２遺伝子および前記ｌａｃＺリピートに隣接するＵＲＡ５遺伝子が、二重交叉相同組換えにより、ＢＭＴ２遺伝子座内に挿入された数多くの株を産生した。ＢＭＴ２遺伝子は、Ｍｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：９７２４−９７３６（２００８）および米国特許第７，４６５，５５７号明細書に開示されている。株ＹＧＬＹ６−３を、産生された前記株から選択した。同株は、ウラシルについての栄養要求性である。株ＹＧＬＹ６−３を、５−ＦＯＡの存在下において対比選択して、ＵＲＡ５遺伝子が失われており、前記ｌａｃＺリピートのみが残っている株を産生した。これは、ウラシルについての栄養要求性株になる。株ＹＧＬＹ８−３を選択した。
【０２３７】
プラスミドｐＧＬＹ４８（図６）は、ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子座を標的とし、５’端において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＡＰＤＨプロモータを含む核酸分子（配列番号２５）に、および、３’端において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＹＣ終了配列を含む核酸分子（配列番号１２）に操作可能に結合され、ｌａｃＺリピートのそばに隣接するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子を含む核酸分子に隣接する、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポータのマウス類似体のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）をコードする核酸分子（配列番号２４）を含む発現カセットを含む。前記発現カセットは互いに、一方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ｌ１遺伝子の５’領域由来のヌクレオチド配列（配列番号２７）を含む核酸分子のそばに隣接し、他方側において、ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子の３’領域由来のヌクレオチド配列（配列番号２８）を含む核酸分子のそばに隣接する。プラスミドｐＧＬＹ４８を、ＳｆｔＩにより直線化した。前記直線状のプラスミドを、株ＹＧＬＹ８−３内に形質転換して、マウスのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポータおよびＵＲＡ５遺伝子をコードする発現カセットが、二重交叉相同組換えにより、ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子座内に挿入された数多くの株を産生した。ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子（ＭＮＮ４Ｂとも呼ばれる）は、米国特許第７，２５９，００７号明細書に開示されている。株ＹＧＬＹ１０−３を、産生された前記株から選択し、ついで、５−ＦＯＡの存在下において対比選択して、ＵＲＡ５遺伝子が失われており、前記ｌａｃＺリピートのみが残っている、数多くの株を産生した。株ＹＧＬＹ１２−３を選択した。
【０２３８】
プラスミドｐＧＬＹ４５（図７）は、ＰＮＯ１／ＭＮＮ４遺伝子座を標的とし、ｌａｃＺリピートを含む核酸分子のそばに隣接し、次に、一方側において、ＰＮＯ１遺伝子の５’領域由来のヌクレオチド配列（配列番号２９）を含む核酸分子のそばに隣接し、他方側において、ＭＮＮ４遺伝子の３’領域由来のヌクレオチド配列（配列番号３０）を含む核酸分子のそばに隣接する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子または転写ユニットを含む核酸分子を含む組込みベクターである。プラスミドｐＧＬＹ４５を、ＳｆｔＩにより直線化した。前記直線状のプラスミドを、株ＹＧＬＹ１２−３内に形質転換して、ｌａｃＺリピートのそばに隣接するＵＲＡ５遺伝子が、二重交叉相同組換えにより、ＰＮＯ１／ＭＮＮ４遺伝子座内に挿入された数多くの株を産生した。ＰＮＯ１遺伝子は、米国特許第７，１９８，９２１号明細書に開示されている。ＭＮＮ４遺伝子（ＭＮＮ４Ｂとも呼ばれる）は、米国特許第７，２５９，００７号明細書に開示されている。株ＹＧＬＹ１４−３を、産生された前記株から選択し、ついで、５−ＦＯＡの存在下において対比選択して、ＵＲＡ５遺伝子が失われており、前記ｌａｃＺリピートのみが残っている、数多くの株を産生した。株ＹＧＬＹ１６−３を選択した。
【０２３９】
プラスミドｐＧＬＹ３４１９（図８）は、一方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＢＭＴ１遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号３１）に隣接し、他方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＢＭＴ１遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号３２）に隣接する、ｌａｃＺリピートのそばに隣接する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子を含む発現カセットを含む組込みベクターである。プラスミドｐＧＬＹ３４１９を直線化した。前記直線状のプラスミドを、株ＹＧＬＹ１６−３内に形質転換して、前記ＵＲＡ５発現カセットが、二重交叉相同組換えにより、ＢＭＴ１遺伝子座内に挿入された数多くの株を産生した。株ＹＧＬＹ６６９８および株ＹＧＬＹ６６９７を、産生された前記株から選択した。同株は、ウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンについて原栄養性である。ついで、前記株を、５−ＦＯＡの存在下において対比選択して、現在ウリジンについて栄養要求性である数多くの株を産生した。株ＹＧＬＹ６７２０およびＹＧＬＹ６７１９を選択した。
【０２４０】
プラスミドｐＧＬＹ３４１１（図９）は、ｌａｃＺリピート（ｌａｃＺリピート）のそばに隣接し、一方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＢＭＴ４遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号３３）に隣接し、他方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＢＭＴ４遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号３４）に隣接する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子を含む発現カセットを含む組込みベクターである。プラスミドｐＧＬＹ３４１１を直線化した。前記直線状のプラスミドを、株ＹＧＬＹ６７２０およびＹＧＬＹ６７１９内に形質転換して、前記ＵＲＡ５発現カセットが、二重交叉相同組換えにより、ＢＭＴ４遺伝子座内に挿入された数多くの株を産生した。株ＹＧＬＹ６７４９および株ＹＧＬＹ６７４３を、産生された前記株から選択した。同株は、ウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンについて原栄養性である。ついで、前記株を、５−ＦＯＡの存在下において対比選択して、現在ウリジンについて栄養要求性である数多くの株を産生した。その中から、株ＹＧＬＹ７７４９およびＹＧＬＹ６７７３を選択した。
【０２４１】
プラスミドｐＧＬＹ３４２１（図１０）は、ｌａｃＺリピートのそばに隣接し、一方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＢＭＴ３遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号３５）に隣接し、他方側において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＢＭＴ３遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号３６）に隣接する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子を含む発現カセットを含む組込みベクターである。プラスミドｐＧＬＹ３４１９を直線化した。前記直線状のプラスミドを、株ＹＧＬＹ７７４９およびＹＧＬＹ６７７３内に形質転換して、前記ＵＲＡ５発現カセットが、二重交叉相同組換えにより、ＢＭＴ１遺伝子座内に挿入された数多くの株を産生した。株ＹＧＬＹ７７６０および株ＹＧＬＹ７７５４を、産生された前記株から選択した。同株は、ウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンについて原栄養性である。
【０２４２】
プラスミドｐＧＬＹ６３０１（図１１）は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＵＲＡ６遺伝子座を標的とする、ロールイン組込みプラスミドである。ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードする発現カセットは、５’端において、誘導性Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＡＯＸ１プロモータ配列（配列番号８）を有する核酸配列に、および、３’端において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＹＣ転写終了配列（配列番号１２）を有する核酸分子に操作可能に結合された、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける効果的な発現のためにコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｄ  ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号３７）を含む。形質転換体を選択するために、前記プラスミドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＲＲ３  ＯＲＦをコードする発現カセットを含む。前記ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号３８）は、５’端において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＲＰＬ１０プロモータ配列（配列番号３９）を有する核酸分子に、および、３’端において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＹＣ転写終了配列（配列番号１２）を有する核酸配列に操作可能に結合される。前記プラスミドは、さらに、ＵＲＡ６遺伝子座（配列番号４０）を標的とする核酸分子を含む。株ＹＧＬＹ７７６０を、ｐＧＬＹ６３０１で形質転換して、数多くの株を産生した。その中から、株ＹＧＬＹ２６２６８を選択した。
【０２４３】
［実施例３］
種々のＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリン類似体を産生可能な株を、下記のように増殖させ得る。初代培養を、２ｍＬのＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋの関連株を含む５００ｍＬのＢＳＧＹ培地を含む、２つの２．８リットル（Ｌ）のバッフル付きＦｅｒｎｂａｃｈフラスコを植菌することにより調製する。４８時間の培養後、前記細胞を、前記バイオリアクタを植菌するために移す。発酵バッチ培地は、培地１リットルあたりに、４０ｇのグリセロール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１８．２ｇのソルビトール（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｇｅｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、２．３ｇの一塩基性リン酸カリウム（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ、ＮＪ）、１１．９ｇの二塩基性リン酸カリウム（ＥＭＤ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）、１０ｇのイーストエキストラクト（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、２０ｇのＨｙ−Ｓｏｙ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、ＮＹ）、１３．４ｇのＹＮＢ（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）および４×１０−３ｇのビオチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む。
【０２４４】
発酵を、１５Ｌの皿底ガラスのオートクレーブ可能なバイオリアクタおよび４０ＬのＳＩＰバイオリアクタ（それぞれ８Ｌ＆２０Ｌの開始容量）（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）において行い得る。
【０２４５】
組換え宿主細胞を増殖させるためのＤａｓＧｉｐプロトコルは、実質的に下記の通りである。
【０２４６】
接種シードフラスコを、（単独コロニーから単離した）酵母パッチから、０．５Ｌのバッフル付きフラスコ中の０．１Ｌの、４％  ＢＳＧＹ（マルチトールを含まない）内のアガープレート上に植菌する。シードフラスコを、１８０ｒｐｍおよび２４℃で（Ｉｎｎｏｖａ  ４４、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、４８時間増殖させる。
【０２４７】
培養を、１Ｌのバイオリアクタ（ｆｅｄｂａｔｃｈ−ｐｒｏ、ＤＡＳＧＩＰ  ＢｉｏＴｏｏｌｓ）において行う。０．５４Ｌの、０．２２μｍろ過した４％  ＢＳＧＹ培地（４滴／ＬのＳｉｇｍａ  ２０４消泡剤を含む）を、容器に充填し、１２１℃で６０分間オートクレーブする。滅菌および冷却後、曝気、振とうおよび温度を、０．７ｖｖｍ、４００ｒｐｍおよび２４℃にそれぞれ設定する。ｐＨを、３０％  水酸化アンモニウムを使用して、６．５に調節し、６．５で制御する。
【０２４８】
調製したバイオリアクタの植菌を、シードフラスコからの６０ｍＬにより無菌的に行う。振とうを、２０％  溶存酸素（ＤＯ）飽和を維持するために傾斜させた。前記溶存酸素の急な向上に示された最初のグリセロール充填を消費した後に、５ｍｇ／Ｌのビオチンおよび３２．３ｍｇ／Ｌ（または１０．８ｍｇ／Ｌ）のＰＭＴｉ−４を含む５０％  ｗ／ｗ  グリセロール溶液により、３．６８ｍＬ／時間において８時間供給するのを開始した。前記グリセロール供給バッチ段階中に、０．３７５ｍＬのＰＴＭ２塩を、手動で注入した。グリセロール供給バッチの完了後、０．５時間の飢餓期間および誘導段階の開始を続けた。２．５ｍｇ／Ｌのビオチンおよび６．２５ｍＬ／ＬのＰＴＭ２塩を含む５０％ｖ／ｖ  メタノール溶液の連続供給を、２．１６ｍＬ／時間の一定速度で開始する。（メタノールにおける）０．２５ｍＬの、１．９ｍｇ／ｍＬ（１×）または０．６３ｍｇ／ｍＬ（１／３×）のＰＭＴｉ−４の注入を、誘導の各２４時間後に添加した。一般的には、個々の発酵を、誘導の３６−１１０時間以内に収集する。培養液を、８５００ｒｐｍでの４０分間の遠心（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ＲＣ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により浄化する。得られた上清を、精製に供した。
【表２】
0006735561.tif 000004
【表３】
0006735561.tif 000005
【０２４９】
ＰＭＴｉ−４は、米国特許出願公開第２０１１００７６７２１号明細書において、実施例４の化合物として開示されたＰＭＴ阻害剤であり、構造
【化２】
0006735561.tif 000006
【０２５０】
を有する。
【０２５１】
［実施例４］
この実施例では、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰ結合性ペプチドを含む一本鎖インスリン分子（ＳＣＩ：前記ＣＴＰペプチドおよび前記ａ−鎖の結合において、Ｋを有するＣペプチドＣＴＰ；配列番号４５を参照のこと。）を、上記されたように、１×（Ｄａｓ  Ｇｉｐ  Ｒｕｎ  ＃Ｄ１１３９０１）または１／３×（Ｄａｓ  Ｇｉｐ  ｒｕｎ  ＃Ｄ１１３７０２）でのＰｍｔｉ−４の存在下において増殖させたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの宿主細胞中で産生させた。
【０２５２】
Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系一本鎖インスリン（ＳＣＩ）類似体を精製するために、上清培地を、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ＲＣ（ｋｅｎｄｏ、Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ、ＮＣ）において、１３，０００ｇで１５分間の遠心により浄化し、続けて、４．５にｐＨを調節し、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ２  ０．２μｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ）を使用してろ過する。ろ液を、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣカラム、同じｐＨに調節された多峰性カチオン交換クロマトグラフィー樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に載せる。ｐＨ７での溶出後に得られたプールを収集し、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＲＰＣカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＳＯＵＲＣＥ  １５ＲＰＣが充填された逆相カラムクロマトグラフィー、ポリスチレン／ジビニルベンゼン製の硬質の単分散の１５μｍのビーズに基づく、ポリマー性の逆相クロマトグラフィー媒体に載せる。前記樹脂を、ｐＨ３．５において平衡化し、同じｐＨにおいて、１２．５％から２０％  ２−プロパノールの段階的溶出を使用して溶出した。
【０２５３】
四重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）質量分光（ＭＳ）分析
タンパク質の品質およびインスリン類似体のグリコシル化を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｑ−ＴＯＦ  ６５２０質量分光計（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステムおよび、脱塩カートリッジを接続したＷａｔｅｒｓ  ＭａｓｓＰＲＥＰ（商標）（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を含む、液体クロマトグラフィー−質量分光（ＬＣ−ＭＳ）システムを使用して分析する。前記質量分光計を、プロファイルフォーマットにおいて、６００−２７００ｍ／ｚの収集質量範囲を有するポジティブモードにおいて動作させる。二重エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ソースの温度を、３５０℃に設定する。乾燥ガスを、１３Ｌ／時間に設定した。ネブライザを、４５ｐｓｉｇ（０．４１ＭＰａ）に設定する。Ｖｃａｐ、ＦｒａｇｍｅｎｔｏｒおよびＳｋｉｍｍｅｒの電圧をそれぞれ、４５００、１５０および３０に設定する。インスリン類似体サンプルを、前記ＬＣ−ＭＳ上に載せ、１ｍＬ／分で２分間１００％  バッファーＡ（０．１％  水におけるギ酸）を流して脱塩し、ついで、１００％  バッファーＢ（０．１％  ギ酸、１０％  水および９０％  アセトニトリル）により、０．４ｍＬ／分で５分間溶出した。収集したＭＳデータを、Ｍａｓｓ  Ｈｕｎｔｅｒ  ＢｉｏＣｏｎｆｉｒｍソフトウェアにより、畳み込みを解く。
【０２５４】
図１４は、Ｄ１１３９０１およびＤ１１３７０２のＱ−ＴＯＦ分析を示す。上段のパネルは、主なＯ−グリコシル化種が、その上に６つのマンノース残基を有する分子に対応し、９８９９．５位であることを示す。右に移動する連続的な小さい各ピークは、更なるマンノース残基を連続的に有するＯ−グリコシル化種に対応する。例えば、１０５０９．９位でのピークは、１１個のマンノース残基を有する種に対応する。１１４８２．４位でのピークは、１７個のマンノース残基を有する種に対応する。下段のパネルは、前記インスリン分子をＰＮＧａｓｅ（ＰＮＧ）により処理した後のプロファイルを示す。ＰＮＧａｓｅは、糖タンパク質からＮ−グリカンを除去するであろう。一方、Ｏ−グリカンは、ＰＮＧａｓｅ活性に対して抵抗性である。前記下段のパネルは、前記Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳプロファイルが、ＰＮＧａｓｅ処理によって変化しないことを示し、前記プロファイルが、Ｏ−グリカンを示し、Ｎ−グリカンをまったく含まないことを示す。
【０２５５】
前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリン類似体を産生するのに使用した前記宿主におけるＯ−グリカンについての最大鎖長が４つのマンノース残基（マンノテトロース）であり、前記ＣＴＰペプチドが４つのＯ−グリコシル化部位を有することを念頭に置くと、主な種の６つのマンノース残基は、下記：（ｉ）１つの部位を占有するマンノテトロースおよび他の３つの部位の１つを占有するマンノビオース、（ｉｉ）１つの部位を占有するマンノテトロースおよび他の３つの部位の２つを占有するマンノース、（ｉｉｉ）１つの部位を占有するマンノトリオースおよび他の３つの部位のそれぞれを占有するマンノース残基、（ｉｖ）１つの部位を占有するマンノトリオースおよび他の３つの部位の１つを占有するマンノトリオース、（ｖ）１つの部位を占有するマンノトリオース、第２の部位を占有するマンノビオースおよび第３の部位を占有するマンノース、（ｖｉ）３つの部位のそれぞれを占有するマンノビオース、または、（ｖｉｉ）２つの部位を占有するマンノビオースおよび他の２つの部位のそれぞれを占有するマンノース、のように、前記４つのＯ−グリコシル化部位にわたって分布している可能性がある。
【０２５６】
図１４における表は、前記組成における１モルのタンパク質あたりのモル  マンニトールが約２．３から２．５であることを示し、１モルのタンパク質あたりに約２−３モルのＯ−グリカンが存在することを示す。前記表は、前記組成における主なＯ−グリカンがマンノトリオースであり、２番目に最も高い存在度の種であるマンノテトロース、ならびに、少量のマンノースおよびマンノビオースを伴うことも示す。前記表は、前記Ｐｍｔｐ阻害剤の３倍の向上は、Ｏ−グリカンの存在度またはＯ−グリカンの鎖長にほとんど影響を及ぼさないことも示す。
【０２５７】
表４に、ヒューマリン（組換えヒトインスリン）とＮ−スペーサＣＴＰを有するＤ１１３９０３とを比較した、上記Ｄ１１３９０１およびＤ１１３７０２のＯ−グリカン分析をまとめる。前記表は、α１，２−マンノシダーゼにより処理していない種について、主なＯ−グリカンがマンノトリオースであり、２番目に最も高い存在度のＯ−グリカンであるマンノテトロースを伴うことを示す。前記表は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのキメラα１，２−マンノシダーゼにより処理したＤ１１３９０１が、主なＯ−グリカンの鎖長が１つのマンノース残基であり、マンノビオース、マンノトリオースまたはマンノテトロースは検出できなかった組成を提供することも示す。
【表４】
0006735561.tif 000007
【０２５８】
［実施例５］
前記Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリン類似体について、糖類応答性または感受性を示す可能性を研究するために、１２から１３週齢におけるＣ５７ＢＬ／６マウスを、皮下（ｓ．ｃ．）注射による、生理食塩水におけるＯ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系類似体Ｄ１１３９０１およびＤ１１３７０２の投与前２時間、絶食させた。同時に、動物に、α−メチルマンノース（α−ＭＭ）溶液（生理食塩水における２１．５％ｖ／ｖ、１０ｍｌ／ｋｇ）または媒体の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与をした。血中グルコースを、血糖計（ＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ  ＬｉｆｅＳｃａｎ；Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）を使用して、投与後０、次に、３０、６０、９０および１２０分の時点で測定した。グルコースの曲線にわたる面積（ＡＯＣ）を、（１００％として）時間０のグルコースに正規化した値を使用して算出した。インスリンを、ｉｓｏ−インスリンＥＬＩＳＡキットにより測定した。図１５、図１６および図１７に示された結果は、前記分子が、α−ＭＭの血清濃度に応答性または感受性であることを示す。
【０２５９】
［実施例６］
主に長さが１つのマンノース残基であるＯ−グリカンを有する糖タンパク質を産生可能なＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株を提供するために、株ＹＧＬ７７６０またはＹＧＬＹ２６２６８を、（Ｉ）前記分泌経路にキメラタンパク質を向けるための、Ｎ−末端において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのαＭＡＴプレシグナルペプチド（ａＭＡＴＴｒＭａｎ）に融合したＴ．ｒｅｓｓｅｉのα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン、および、（２）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子または転写ユニットをコードする発現カセットを含むプラスミドベクターにより形質転換する。ａＭＡＴＴｒＭａｎをコードする発現カセットは、５’端において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのαＭＡＴプレシグナルペプチドをコードする核酸分子（配列番号８６のアミノ酸配列をコードする配列番号８５）に融合した、Ｔ．ｒｅｓｓｅｉの触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号８７）を含む。前記核酸分子は、５’端において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＡＯＸ１プロモータを含む核酸分子に、および、３’端において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＹＣ転写終了配列を含む核酸分子に操作可能に結合される。前記ＵＲＡ５発現カセットは、ｌａｃＺリピートを含む核酸分子のそばに隣接する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ５遺伝子または転写ユニットを含む核酸分子を含む。前記カセットは、さらに、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓゲノム中の特定の遺伝子座に前記ベクターを向けるヌクレオチド配列を提供する。例えば、２つのタンデムカセットは、一方側において、ＰＲＯ１遺伝子の５’領域由来のヌクレオチド配列（配列番号８８）を含む核酸分子のそばに隣接し、および、他方側において、ＰＲＯ１遺伝子の３’領域由来のヌクレオチド配列（配列番号８９）を含む核酸分子のそばに隣接してもよい。ゲノムに組み込まれた発現カセットを含む株を選択し、ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体をコードするプラスミドベクターにより形質転換してもよい。
【０２６０】
上記された条件下における上記株でのＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体の発現により、主なＯ−グリカン構造がマンノースである、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰペプチド系インスリンまたはインスリン類似体が産生される。
【０２６１】
配列
前記実施例に開示された一部の株を産生するのに使用した配列は、下記表に提供される。
【表５】
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【０２６２】
本発明は、例証された実施形態に関連して、本願明細書に記載されるが、本発明は、それに限定されないことを理解されたい。当該分野において通常の知識を有するものおよび本願明細書における教示へのアクセスを有するものは、その範囲内で、更なる修飾および実施形態を認識するであろう。したがって、本発明は、本願明細書に添付された特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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