(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血病患者がＤＯＴ１Ｌ阻害剤による治療に対して感受性があるかどうかを判定するための方法であって、
（ａ）前記白血病患者から得られた組織サンプル中のＨＯＸクラスター遺伝子ＲＮＡまたはＨＯＸクラスター関連遺伝子ＲＮＡのレベルを、ＨＯＸクラスター遺伝子ＲＮＡまたはＨＯＸクラスター関連遺伝子ＲＮＡに特異的なプライマー対を用いて前記組織サンプル中のＲＮＡを増幅することにより検出すること、
（ｂ）健常ヒト被験者の組織サンプル中で観測されるレベルまたは閾値と比較して、前記白血病患者から得られた組織サンプル中の前記ＨＯＸクラスターＲＮＡまたはＨＯＸクラスター関連ＲＮＡのレベルが上昇する場合、前記白血病患者が、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤による治療に対して感受性があると決定すること、を含み、
前記ＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子が、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ５、およびＭＥＩＳ１のうちの１又は複数であり、
前記白血病患者からの組織サンプルがＮＰＭ１突然変異を含み、かつ
前記白血病患者からの組織サンプルが、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成またはＭＬＬ部分縦列重複を含んでいない、
方法。
【請求項２】
前記プライマー対が、フォワードプライマーとリバースプライマーとを含み、前記フォワードプライマーが、前記ＨＯＸクラスター遺伝子ＲＮＡまたはＨＯＸクラスター関連遺伝子ＲＮＡの５’末端にハイブリダイズし、前記リバースプライマーが、前記ＨＯＸクラスター遺伝子ＲＮＡまたはＨＯＸクラスター関連遺伝子ＲＮＡの３’末端にハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＢ１３、ＰＢＸ３、およびＭＥＩＳ２Ａのうちの少なくとも１つのレベルを検出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組織サンプルが、血液サンプル、骨髄サンプル、またはリンパ節サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
白血病細胞の増殖の阻害における使用のための、治療上有効量のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む組成物であって、前記白血病細胞が、非白血病細胞中のＨＯＸクラスター遺伝子もしくはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現レベルまたはあらかじめ決められた閾値と比較して、ＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現レベルの上昇を呈し、前記白血病細胞が、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成またはＭＬＬ部分縦列重複を示さず、
前記白血病細胞がＮＰＭ１突然変異を含み、
前記ＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子が、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ５、およびＭＥＩＳ１のうちの１又は複数であり、
前記ＤＯＴ１Ｌ阻害剤が、プリン、炭素環置換プリン、および７−デアザプリンからなる群から選択される、
組成物。
【請求項６】
前記白血病細胞が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
白血病に罹患している患者の治療における使用のための、治療上有効量のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む組成物であって、
前記患者が、健常被験者で観測されるレベルまたはあらかじめ決められた閾値と比較して、ＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現レベルの上昇を呈しており、
前記ＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子が、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ５、およびＭＥＩＳ１のうちの１又は複数であり、
前記ＤＯＴ１Ｌ阻害剤が、プリン、炭素環置換プリン、および７−デアザプリンからなる群から選択され、
前記患者がＮＰＭ１突然変異を含み、かつ
前記患者が、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成またはＭＬＬ部分縦列重複を含まない、組成物。
【請求項８】
前記白血病が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＤＯＴ１Ｌ阻害剤が、１００ｎＭ〜１０μＭ、または２５０ｎＭ〜５μＭ、または５００ｎＭ〜１μＭのＩＣ５０でＤＯＴＩＬを阻害する、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
ＤＯＴ１Ｌ阻害剤による治療に対する白血病患者の感受性を判定するための方法であって、
（ａ）前記白血病患者から得られた組織サンプルまたは細胞中のＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現レベルを検出すること、
（ｂ）前記白血病患者から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル中の前記ＨＯＸクラスターまたはＨＯＸクラスター関連のレベルが、非白血病の被験者から得られた対照組織又は細胞サンプル中で観測されるレベルあるいは閾値の少なくとも３倍である場合、前記白血病患者が、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤による治療に対して感受性があると決定すること、を含み、
前記ＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子が、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ５、およびＭＥＩＳ１のうちの１又は複数であり、
前記白血病患者からの組織サンプルがＮＰＭ１突然変異を含み、かつ
前記白血病患者が、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、および／またはＭＬＬ−ＰＴＤを示さない、方法。
【請求項１１】
追加の作用剤を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
前記追加の作用剤がＦＬＴ３阻害剤であり、かつ前記患者がＦＬＴ３における遺伝突然変異を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
治療関連白血病のリスクが高い患者において前記リスクの低減における使用のための、治療上有効量のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む組成物であって、前記患者が、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤により以前に治療されておらず、
前記患者が、健常被験者で観測されるレベルまたはあらかじめ決められた閾値と比較して、ＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現レベルの上昇を呈しており、
前記ＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子が、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ５、およびＭＥＩＳ１のうちの１又は複数であり、
前記ＤＯＴ１Ｌ阻害剤が、プリン、炭素環置換プリン、および７−デアザプリンからなる群から選択され、
前記患者がＮＰＭ１突然変異を含み、かつ
前記患者が、ＭＬＬ転座またはＭＬＬ再構成またはＭＬＬ部分縦列重複を有していない、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１０月２日出願の米国仮特許出願第６１／８８５，９４７号および２０１３年８月２日出願の同第６１／８６１，９２３号に基づく優先権を主張し、それらのそれぞれの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府委託研究または開発
本開示に記載の研究は、国立癌研究所（National Cancer Institute）からの助成金（Ｕ０１ＣＡ１０５４２３）により部分的に資金援助を受けた。米国政府は、本開示に関して一定の権利を有しうる。
【０００３】
配列リストの参照
本出願は、２０１４年８月１日に作成された２０６２０２バイトのサイズを有する「8540231_1.txt」という名称の電子ＡＳＣＩＩ形式のｔｘｔファイルとして配列リストを含む。ｔｘｔファイル「8540231_1.txt」の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
開示の背景
開示の分野
本開示は、概して、癌の検出および治療に関する。より具体的には、本開示は、（ｉ）ＨＯＸクラスター遺伝子発現および／もしくはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇に関連する１つ以上の突然変異を組織サンプルもしくは細胞で検出することにより、またはＨＯＸクラスター遺伝子発現の上昇もしくはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇を検出することにより、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤による治療に対して感受性がある白血病患者を同定する方法、（ｉｉ）ＨＯＸクラスター遺伝子発現および／もしくはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇との関連によりＤＯＴ１Ｌ阻害剤の治療有効性の予測因子となる突然変異を白血病患者の組織サンプルもしくは細胞で同定する方法、ならびに（ｉｉｉ）ＨＯＸクラスター遺伝子発現および／もしくはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇を呈するか、または一方もしくは両方の遺伝子型の遺伝子発現の上昇に関連する突然変異を有すると判定された、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）患者および／または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）白血病患者を含む白血病患者をＤＯＴ１Ｌ阻害剤の投与により治療する方法を提供する。その他に、本開示は、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤による治療に対して感受性がある、ＡＬＬまたはＡＭＬを発症するリスクが高い患者を同定する方法を提供する。本開示はまた、他の治療剤、たとえば、ＦＬＴ３阻害剤、ＡＴＲ阻害剤またはＣＤＫ４／ＣＤＫ６阻害剤、およびＩＤＨ１／２阻害剤と組み合わせたＤＯＴ１Ｌ阻害によるＡＬＬおよびＡＭＬの治療を提供する。
【背景技術】
【０００５】
関連技術の説明
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の治療は、２０年余りの間変化しておらず、ＡＭＬ生存率は、成人では５０％を有意に下回ったままであり、子供では約６０〜７０％である。患者の疾患が治癒するとしても、多くの場合、従来の化学療法レジメンおよび骨髄移植が原因で有意な罹患率である。より有効でより低毒性の治療法が明らかに必要とされている。
【０００６】
白血病誘発をもたらす遺伝子および機序の理解が深まったことにより、白血病細胞の生存および増殖に関与する根底にある遺伝子異常を標的とするいくつかの新しい治療法が開発されるに至った。たとえば、米国特許出願公開第２００９／０２６９５１号、同第２００５／０４８６３４号、および同第２００９／０６１４４３号を参照されたい。かかる治療法の最も顕著な成功例は、急性前骨髄球性白血病を引き起こす遺伝子異常を標的とする全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）の開発、ならびに慢性骨髄性白血病およびある特定のサブタイプの急性リンパ芽球性白血病、たとえば、フィラデルフィア染色体陽性ＡＬＬを引き起こす遺伝子異常を標的とするイマチニブの開発である。それらの治療法は、それらの疾患を有する患者のアウトカムを有意に改善してきており、標準的な化学療法および放射線療法よりも有意に低毒性である。新規な標的法の開発を継続することがきわめて重要である。
【０００７】
ヒストンおよびＤＮＡの修飾を介して遺伝子発現を制御する最近同定されたクラスのタンパク質は、クロマチン構造をモジュレートする新しい治療法の開発の原動力となっている。白血病誘発に関与する遺伝子突然変異は、それらのタンパク質を頻繁に使用して正常細胞を癌細胞に再プログラムする。このプロセスの阻害剤は、癌細胞の顕著な特徴である分化のブロックを解除して、細胞分化を引き起こす遺伝子発現プログラムを再活性化することが、最近の実験により示されている。これは、癌細胞の成長を阻害して最終的に死滅させる。ヒストン修飾を標的とする薬剤、たとえば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤のボリノスタットおよびロミデプシンは、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫の治療用として最近承認されたことから、かかる方法の実現可能性が実証される。
【０００８】
混合系統白血病（ＭＬＬ）遺伝子を含む転座は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）か急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）かにかかわらず、乳児白血病の＞７０％、より年長の子供のＡＭＬ症例の約１０％に見いだされている。Biondi et al., Blood 96(l):24-33 (2000)。ＭＬＬを含む転座はまた、成人白血病および治療関連白血病（Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、およびＡＭＬ）の多くの症例に見いだされ、乳児白血病と同様に、ＭＬＬ生殖系列白血病と比較して予後不良に関連していることが多い。５年生存率が約８０〜９０％に達した小児期ＡＬＬの高い全治療成功率とは対照的に、遺伝的に定義されたＭＬＬ転座型ＡＬＬサブセットでは、依然として約５０％という不十分な生存率が予測されている。
【０００９】
分子レベルでは、ＭＬＬ転座型白血病は、後方ホメオボックスＡ（ＨＯＸＡ）遺伝子クラスターの高レベル発現により特徴付けられる特徴的遺伝子発現プロファイルを呈する。Armstrong et al., Nat. Genet. J.Qill:41-47 (2002)およびFerrando et al., Blood 102(1):262-268 (2003)。
【００１０】
いくつかのＨＯＸクラスター遺伝子は、ＭＬＬによりレギュレートされることが知られており（Yu et al., Nature 378:505-508 (1995)）、このことからＡＬＬおよびＡＭＬでのＨＯＸ遺伝子発現パターンの詳細な比較が促進されてきた。ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＡ５、およびＨＯＸＡ９遺伝子は、従来のＡＬＬでは発現されないかまたはほとんど発現されないが、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、またはＭＬＬ一次縦列重複（ＰＴＤ）を呈する白血病患者のほとんどのサンプルでは、多くの場合、高レベルで発現される。ＨＯＸＣ６は、ＭＬＬ関連白血病で発現レベルの軽度の上昇を示す。ＨＯＸタンパク質のＨＯＸクラスター関連補因子ＭＥＩＳ１は、ＨＯＸＡ９依存性白血病を加速可能であり（Nakamura et al., Nat. Genet. 19:149-153 (1996)）、ＭＬＬ関連白血病でも有意に過剰発現される。Rozovskaia et al., Oncogene 20:874-878 (2001)。
【００１１】
ＨＯＸＡクラスター遺伝子発現は、ＭＬＬ融合駆動型白血病細胞の増殖および生存に必要であることがいくつかのグループにより実証されてきたため、ＨＯＸＡクラスター遺伝子発現を抑制する治療法は、ＭＬＬ転座型白血病に有効なはずである。
【００１２】
共有された白血病誘発機序を薬理学的に標的とすることが容易になると思われることから、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、およびＭＬＬ部分縦列重複を含むキメラＭＬＬ融合タンパク質の発現に対して統合された腫瘍形成機序を解明することにかなりの努力が払われてきた。ＭＬＬ標的遺伝子発現を制御する機序に基づくいくつかの広範なパターンが登場してきた。最も一般的に見られるＭＬＬ転座は、ＭＬＬのＮＨ３末端を通常は核複合体の一部であるタンパク質に融合して有するキメラ融合タンパク質を生成し、その機能は明らかになりつつある。ＡＦ４、ＡＦ９、ＥＮＬ、ＥＬＬ、ＡＦ１０、ＡＦ１７、ＡＦＦ４などの核タンパク質とのＭＬＬ融合は、全体としてＭＬＬ白血病の大部分を占め、いずれも直接的または間接的に転写伸長機構の成分を動員することが見いだされている。Bitoun et al., Hum. Mol. Genet. 16(I):92-106 (2007)、Mueller et al., Blood 110(13):4445-4454 (2007)、Mueller et al., PLoS Bioi, 7(II):el000249 (2009)、Mohan et al., Nat. Rev. Cancer 10(10):721-728 (2010)、Yokoyama et al., Cancer Cell 17(2):198-212 (2010)、およびLin et al., Molecular Cell 37(3):429-437 (2010)。
【００１３】
転写伸長に関連するいくつかの複合体、たとえば、ＥＮＬ関連タンパク質（ＥＡＰ）複合体（Mueller (2009)）、ＡＦ４／ＥＮＬ／Ｐ−ＴＥＦｂ（ＡＥＰ）複合体（Yokoyama (2010)）、超伸長複合体（ＳＥＣ）（Lin (2010)）、およびヒストン３リシン７９（Ｈ３Ｋ７９）メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌを含む複合体（ＤｏｔＣｏｍ）（Mohan (2010)）が報告されてきた。これらは、多くの場合、オーバーラップタンパク質成分を有する。これらのデータから、ＭＬＬ融合媒介腫瘍形成に関与しているのは転写伸長の異常制御であることが示唆される。
【００１４】
野生型ＭＬＬタンパク質は、遺伝子プロモーター近傍のＨ３Ｋ４をメチル化するヒストン３リシン４（Ｈ３Ｋ４）メチルトランスフェラーゼである。この修飾は、造血発生時に遺伝子に被活性化能を付与する。ＤＯＴ１Ｌは、生体内のＨ３Ｋ７９および造血細胞で高発現される遺伝子を含む転写活性遺伝子のプロモーターを修飾するヒストン３リシン７９（Ｈ３Ｋ７９）メチルトランスフェラーゼである。こうして、遺伝子の発現がＭＬＬ媒介Ｈ３Ｋ４メチル化により準備され、その遺伝子発現がＤＯＴ１Ｌ媒介Ｈ３Ｋ７９メチル化により促進される。
【００１５】
酵母での研究により２つの複合体は同様かつ同時にレギュレートされることが示されたことから、Ｈ３Ｋ４およびＨ３Ｋ７９のメチル化は、遺伝子転写時に高度にレギュレートされて協奏的に機能することが示唆される。Lee et al., Cell 131:1084-1096 (2007)。ゲノムワイドな研究によりＭＬＬ転座型のＡＬＬ細胞およびＡＭＬ細胞のＭＬＬ標的遺伝子でＨ３Ｋ７９メチル化の上昇が実証された。Krivtsov et al., Cancer Cell 150):355-368 (2008)、Guenther et al., Genes Dev. 22(24):3403-3408 (2008)、Bernt et al., Cancer Cell 20(l):66-78 (2011)、Copeland et al., Oncogene 32:939-946 (2013)、Krivtsov et al., Nat. Rev. Cancer 1:823-833 (2007)、およびMonroe et al., Exp Hematol 39:77-86 e71-75 (2011)。
【００１６】
コンディショナル機能喪失マウスモデルおよびＲＮＡｉ法を用いたいくつかの研究により、ＭＬＬ融合駆動型白血病でのＤＯＴ１Ｌのきわめて重要な役割が形式的に実証された。Bernt (2011)、Jo et al., Blood 117(18):4759-4768 (2011)、Nguyen et al., Blood 117(25):6912-6922 (2011)、およびChang et al., Cancer Res. 70(24):10234-10242 (2010)。これらの研究により、ＤＯＴ１Ｌの遺伝子不活性化またはＤＯＴ１Ｌの低分子媒介阻害は、ＨＯＸクラスター遺伝子発現の急激な減少を含むＭＬＬ融合標的遺伝子発現の減少をもたらすことが実証される。このことは、抗増殖反応と相関する。
【００１７】
ＭＬＬの転座は、ＤＯＴ１Ｌが誤ってＭＬＬ標的遺伝子を標的とする異常なＭＬＬ融合タンパク質を発現することによりＨ３Ｋ７９メチル化とＨ３Ｋ４メチル化との間の正常な相互作用を撹乱し、その結果、ＨＯＸクラスター遺伝子発現の上昇を含む遺伝子発現の上昇をもたらすという仮説が立てられてきた。この仮説に基づいて、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、ＭＬＬ遺伝子異常を呈する白血病でＤＯＴ１Ｌが誤ってＭＬＬ標的遺伝子を標的とするのをブロックすることにより、Ｈ３Ｋ７９およびＨ３Ｋ４のメチル化のデレギュレートレベルおよびそれにより生じる遺伝子発現の上昇を低減しうると提案されてきた。
【００１８】
注目すべき点として、レトロウイルスプロモーターから発現される場合、ＨＯＸＡ９の形質転換能はＤＯＴ１Ｌの不活性化による影響を受けない。ＨＯＸクラスター関連遺伝子発現産物の例として、ＨＯＸＡ９およびそのヘテロ二量体化パートナーＭＥＩＳ１ａの発現は、ＭＬＬ転座型白血病に対するＤＯＴ１Ｌ阻害剤の抗増殖効果をレスキューする。さらに、ＭＬＬ融合標的遺伝子発現は、より一般的な遺伝子発現よりもＤＯＴ１Ｌにかなり依存することがマイクロアレイベースの遺伝子発現研究により示された（Bernt 2011）。これらの研究により、ＭＬＬ−ＡＦ４、ＭＬＬ−ＡＦ９、ＭＬＬ−ＡＦ１０、およびＭＬＬ−ＥＮＬを含むＭＬＬ融合タンパク質の形質転換活性に対する異常なＨ３Ｋ７９メチル化の重要性が注目され、かつＤＯＴ１ＬがＨＯＸＡクラスター遺伝子発現の継続に必要とされることが示される。これらの結果は、これらの融合がＭＬＬ転座型白血病の大多数に存在するため、潜在的に深い臨床的意味を有する。
【００１９】
以上に記載の遺伝子および低分子阻害剤のデータにより、ＭＬＬ転座型、ＭＬＬ再構成型、およびＭＬＬ部分縦列重複関連の白血病の潜在的治療標的としてＤＯＴ１Ｌが示唆される。治療標的としてのＤＯＴ１Ｌの検証できわめて重要なその次の工程は、低分子阻害剤が遺伝子機能喪失モデルで見いだされたのと類似の反応を呈することを実証することである。
【００２０】
低分子ＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７は、他のメチルトランスフェラーゼと比較してＤＯＴ１Ｌに対して顕著な特異性を有するｓ−アデノシルメチオニンミメティックである（図１）。Daigle et al., Cancer Cell 20(1):53-65 (2011)。ＥＰＺ００４７７７は、中間ｎＭ領域でＭＬＬ転座型白血病細胞系のＨ３Ｋ７９メチル化を阻害する。ＥＰＺ００４７７７は、ＨＯＸＡ９およびＭＥＩＳ１の抑制を含むＭＬＬ融合駆動型遺伝子発現の用量依存性阻害を示す（Bernt 2011）。ＭＶ４−１１白血病細胞およびＭＬＬ−ＡＦ９細胞系Ｍｏｌｍ−１３の成長は、ＤＯＴ１Ｌ阻害に対してかなり感受性があるが、ＭＬＬ生殖系列Ｊｕｒｋａｔ細胞の成長は、ＥＰＺ００４７７７の影響を受けない（Daigle, 2011）。これとは対照的に、ＥＰＺ００４７７７は、Ｈ３Ｋ７９メチル化の阻害にもかかわらずＭＬＬ生殖系列白血病細胞系に対して抗増殖効果を有していない。
【００２１】
全体として、これらのデータから、ＭＬＬ転座型、ＭＬＬ再構成型、およびＭＬＬ部分縦列重複関連の白血病の潜在的治療標的としてＤＯＴ１Ｌの開発を継続することが強く支持され、再発性／難治性血液学的悪性腫瘍の患者においてＤＯＴ１Ｌ阻害剤の効果を評価するように設計された第１相臨床試験（U.S. NIH, Clinical Trial No. NCT01684150）の開始が促進されてきた。
【００２２】
しかしながら、以上に挙げたデータからは、他のタイプの白血病、すなわち、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、またはＭＬＬ部分縦列重複を示さない白血病の潜在的標的としてＤＯＴ１Ｌが支持されない。さらに、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、またはＭＬＬ部分縦列重複を呈する白血病以外の白血病でのＨＯＸクラスターＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現レベルの増加は、ＤＯＴ１Ｌの活性に関連していない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
開示の簡単な概要
本開示は、治療に対して感受性がある患者を同定するための、ならびにＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、および／またはＭＬＬ部分縦列重複（ＰＴＤ）を示さないが、それでもなお上記のＭＬＬ異常の不在にもかかわらず１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇により特徴付けられる、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含むある特定の白血病を治療するための、使用／方法を提供する。患者は、１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇に関連すると判定された１つ以上の突然変異を有しうると共に、かかる突然変異の存在は、ＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現レベルを評価するためのサロゲートとしての役割を果たしうる。本明細書に詳細に記載されるように、かかる白血病は、１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を用いて効果的に治療されうる。したがって、本開示はまた、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤による治療に対して感受性がある白血病サブタイプを同定する。
【００２４】
こうして、本開示は、以上に記載のＭＬＬ異常を呈する患者以外にＤＯＴ１Ｌ阻害剤を投与することにより効果的に治療可能な患者の範囲を大幅に拡大する。本開示は、患者がＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、および／またはＭＬＬ部分縦列重複（ＰＴＤ）を呈するかどうかにかかわらず、１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇により特徴付けられる、白血病を含む疾患または病態を有する患者の治療を提供する。
【００２５】
一実施形態では、本開示は、患者がＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、および／またはＭＬＬ−ＰＴＤ以外の突然変異を有することが知られているかに関係なく、白血病患者がＤＯＴ１Ｌ阻害剤による治療に対して感受性があるかどうかを判定するための方法／使用を提供する。言い換えれば、患者がＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇に関連する突然変異を有する場合、感受性が推測される。これらの方法により、白血病患者の組織サンプルまたは細胞ならびに非白血病ドナー対照の組織サンプルまたは細胞（たとえば、ＨＯＸクラスター遺伝子発現および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇を呈することが知られていない健常ドナーの組織サンプルまたは細胞）で、１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現レベルが決定される。患者のサンプルまたは細胞での１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現レベルを、対照のサンプルまたは細胞での対応する遺伝子の発現レベル（またはあらかじめ決められた標準）と比較することにより、ＨＯＸクラスター遺伝子および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現レベルの上昇が検出され、そのＨＯＸクラスター遺伝子発現および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇は、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の治療有効性の予測因子である。
【００２６】
他の実施形態では、本開示は、白血病患者においてＤＯＴ１Ｌ阻害剤による治療に対する白血病患者の感受性を同定するための追加の方法／使用を提供する。これらの方法により、白血病患者の組織サンプルまたは細胞は、１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇に関連することが知られている、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、および／またはＭＬＬ−ＰＴＤ以外の遺伝子の突然変異、変化、および／または異常の存在に関して検査されるか、またはすでに検査されており、かかる遺伝子の突然変異、変化、および／または異常の検出は、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の治療有効性の予測因子である。かかる遺伝子の突然変異、変化、および／または異常が白血病患者で検出された場合、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤による治療を開始可能である。
【００２７】
さらなる実施形態では、本開示は、白血病の組織サンプルまたは細胞でＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、および／またはＭＬＬ−ＰＴＤ以外の１つ以上の遺伝子の突然変異、変化、および／または異常を同定するための、ならびに白血病の組織サンプルまたは細胞およびＨＯＸクラスター遺伝子発現および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇を示さないことが知られている非白血病対照の組織サンプルまたは細胞で１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現レベルを決定するための、追加の方法／使用を提供し、対照の組織サンプルまたは細胞と対比して白血病の組織サンプルまたは細胞での１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子のレベルの上昇は、白血病の組織サンプルまたは細胞で同定される遺伝子の突然変異、変化、および／または異常の１つ以上を呈する白血病患者においてＤＯＴ１Ｌ阻害剤の治療有効性の予測因子である。
【００２８】
他の実施形態では、本開示は、白血病細胞の増殖を阻害するためのおよび／またはそのアポトーシスを誘導するための方法／使用を提供し、本方法は、（ｉ）１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇に関連することが知られているかまたはそのように判定された、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、および／またはＭＬＬ−ＰＴＤ以外の１つ以上の遺伝子の突然変異、変化、および／または異常を呈することが分かったかまたはそのように判定された白血病細胞を接触させることを含む。本方法は、かかる白血病細胞をＤＯＴ１Ｌ阻害剤に暴露することを含む。
【００２９】
さらに他の実施形態では、本開示は、ＭＬＬ転座またはＭＬＬ再構成またはＭＬＬ−ＰＴＤを有していないが、それでもなお１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇に関連することが知られているかまたはそのように判定される遺伝子の突然変異、変化、および／または異常を呈する白血病患者を治療するための方法／使用を提供する。これらの方法によれば、かかる白血病患者は、１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤、１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む組成物もしくは製剤、および／または白血病の治療に有効な１種以上の他の作用剤と組み合わせて１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む組成物もしくは製剤を投与することにより治療される。
【００３０】
またさらなる実施形態では、本開示は、白血病患者の組織サンプルまたは細胞で、１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇に関連することが知られているかまたはそのように判定される、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、および／またはＭＬＬ−ＰＴＤ以外の１つ以上の遺伝子の突然変異、変化、および／または異常を同定することと、１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤、１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む１種以上の組成物もしくは製剤、および／または白血病の治療に有効な１種以上の他の作用剤と組み合わせて１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む１種以上の組成物もしくは製剤を投与することにより白血病患者を治療することとを含む、白血病患者を治療するための方法／使用を提供する。
【００３１】
さらに他の実施形態では、本開示は、１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤、１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む１種以上の組成物もしくは製剤、および／または白血病の治療に有効な１種以上の他の作用剤と組み合わせて１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む１種以上の組成物もしくは製剤を白血病患者に投与することにより、１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇を呈する白血病患者を治療するための方法／使用を提供する。
【００３２】
さらなる実施形態では、本開示は、治療関連白血病のリスクが高い患者においてそのリスクを低減するための方法／使用を提供し、前記患者は、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤により以前に治療されておらず、本方法は、治療上有効量のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を前記患者に投与することを含み、患者は、ＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の実際の上昇または推測される上昇を呈し、患者は、ＭＬＬ転座またはＭＬＬ再構成またはＭＬＬ部分縦列重複を有していない。
【００３３】
他の実施形態では、本開示は、ＨＯＸクラスター遺伝子および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇を呈する白血病患者を治療するための方法／使用を提供し、前記方法は、１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤、１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む１種以上の組成物もしくは製剤、および／または白血病の治療に有効な１種以上の他の作用剤と組み合わせて１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む１種以上の組成物もしくは製剤を白血病患者に投与することを含み、前記白血病患者は、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、および／またはＭＬＬ−ＰＴＤを示さない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】ＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７による処理後のＨ３Ｋ７９ｍｅ２のヒストンメチル化を示すオートラジオグラフである。Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２は、ＭＬＬ−ＡＦ４転座型細胞系ＭＶ４−１１およびＭＬＬ−ＡＦ９転座型白血病細胞ＭＯＬＭ−１３で０．０４８、０．１９５、０．７８１、３．１２、および１２．５μＭのＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７による処理により阻害される（左側パネル）。
【図１Ｂ】ＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７による処理後のＨ３Ｋ７９ｍｅ２のヒストンメチル化を示すオートラジオグラフである。阻害は、他のヒストンメチルトランスフェラーゼによるメチル化と比較してＨ３Ｋ７９ｍｅに特異的である（右側パネル）。
【図２】ＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７がＭＬＬ転座型細胞系の増殖を選択的に阻害するデータを示したグラフである。６つのＭＬＬ転座型（ＭＬＬ−ＡＦ４、ＭＬＬ−ＡＦ９、ＭＬＬ−ＥＮＬ）細胞系および６つの非再構成ＭＬＬ生殖系列白血病細胞系のＩＣ５０が示されている。
【図３Ａ】１０日間（ｘ軸）にわたり細胞数（ｙ軸）を示す成長曲線である。ヒトＭＬＬ−ＰＴＤ  ＡＭＬ細胞系（ＭＵＴＺ１１）の増殖は、ＤＯＴ１Ｌにより阻害される。指定の細胞系は、１０μＭのＥＰＺ００４７７７またはＤＳＭＯ（対照）により処理され、細胞数は、指定の日数で評価された。
【図３Ｂ】１０日間（ｘ軸）にわたり細胞数（ｙ軸）を示す成長曲線である。ＡＭＬ１−ＥＴＯ（Kasumi）細胞の増殖は、ＤＯＴ１Ｌに対して非感受性である。指定の細胞系は、１０μＭのＥＰＺ００４７７７またはＤＳＭＯ（対照）により処理され、細胞数は、指定の日数で評価された。
【図４】ＧＡＰＤＨと対比したＨＯＸＡ９の相対発現（ｄｄＣＴ）を示す棒グラフであり、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７によるＭＬＬ−ＰＴＤ  ＡＭＬ細胞系ＭＵＴＺ１１細胞の処理後にＨＯＸＡ９発現が減少することを示している。ＭＵＴＺ１１細胞は、ＤＭＳＯ（対照）またはＥＰＺ００４７７７により処理され、ＨＯＸＡ９発現は、７および１０日目に評価された。
【図５Ａ】ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１形質転換マウス細胞でＥＰＺ００４７７７の効果を示している。経時的な（１７日間まで）相対増殖のグラフであり、ＤＭＳＯ処理対象と比較して種々の濃度（０．１、１、および１０μＭ）のＥＰＺ００４７７７を用いたＮＵＰ９８−ＮＳＤ１細胞の処理による増殖の減少を示している。
【図５Ｂ】ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１形質転換マウス細胞でＥＰＺ００４７７７の効果を示している。ＧＡＰＤＨと対比したＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、およびＭＥＩＳ１のｍＲＮＡ発現（ｄｄＣＴ）を示すヒストグラムである。ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１形質転換細胞のＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、およびＭＥＩＳ１のｍＲＮＡレベルに対するＥＰＺ００４７７７の強力な阻害作用が観測される。
【図６Ａ】タモキシフェン（４−ヒドロキシタモキシフェン、４−ＯＨＴ）への暴露日数に対する細胞数のプロットである。これらのデータは、全体として、誘導性ＤＯＴ１Ｌ機能喪失細胞系の発生を示している。Ｃｒｅリコンビナーゼのタモキシフェン（４−ＯＨＴ）誘導は、成長停止（左側パネル）をもたらす。
【図６Ｂ】０日目および１２日目の細胞の顕微鏡写真である。これらのデータは、全体として、誘導性ＤＯＴ１Ｌ機能喪失細胞系の発生を示している。Ｃｒｅリコンビナーゼのタモキシフェン（４−ＯＨＴ）誘導は、分化（右上パネル）をもたらす。
【図６Ｃ】アガロースゲルの写真である。これらのデータは、全体として、誘導性ＤＯＴ１Ｌ機能喪失細胞系の発生を示している。コンディショナルＤＯＴ１Ｌ対立遺伝子（ｆｌｏｘ）は、ｃｒｅ誘導により転座され、１２日間で再出現しない（右下パネル）。
【図７Ａ】異なる白血病細胞系の増殖に対するＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７対媒体対照ＤＭＳＯの効果を示している。ＤＭＳＯ（陰性対照）またはＤＯＴ１Ｌ阻害剤（ＥＰＺ００４７７７）に接触している白血病関連突然変異を呈するヒト細胞系での細胞数対時間のプロットである。ＭＬＬ−ＡＦ９転座型ヒト細胞系（陽性対照）を１０μＭのＥＰＺ００４７７７またはＤＭＳＯ（対照）で処理して、指定の日（３、７、および１０日目）に細胞をカウントした。ＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、ＮＰＭ１突然変異を呈するヒト細胞系の増殖を劇的に阻害したことがこれらのデータから実証される。
【図７Ｂ】異なる白血病細胞系の増殖に対するＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７対媒体対照ＤＭＳＯの効果を示している。ＤＭＳＯ（陰性対照）またはＤＯＴ１Ｌ阻害剤（ＥＰＺ００４７７７）に接触している白血病関連突然変異を呈するヒト細胞系での細胞数対時間のプロットである。ＭＬＬ−ＡＦ９転座型ヒト細胞系（陽性対照）を１０μＭのＥＰＺ００４７７７またはＤＭＳＯ（対照）で処理して、指定の日（３、７、および１０日目）に細胞をカウントした。ＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、ＮＰＭ１突然変異を呈するヒト細胞系の増殖を劇的に阻害したことがこれらのデータから実証される。
【図７Ｃ】異なる白血病細胞系の増殖に対するＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７対媒体対照ＤＭＳＯの効果を示している。ＤＭＳＯ（陰性対照）またはＤＯＴ１Ｌ阻害剤（ＥＰＺ００４７７７）に接触している白血病関連突然変異を呈するヒト細胞系での細胞数対時間のプロットである。ＮＰＭ１突然変異型ヒト細胞系を１０μＭのＥＰＺ００４７７７またはＤＭＳＯ（対照）で処理して、指定の日（３、７、および１０日目）に細胞をカウントした。ＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、ＮＰＭ１突然変異を呈するヒト細胞系の増殖を劇的に阻害したことがこれらのデータから実証される。
【図７Ｄ】異なる白血病細胞系の増殖に対するＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７対媒体対照ＤＭＳＯの効果を示している。ＤＭＳＯ（陰性対照）またはＤＯＴ１Ｌ阻害剤（ＥＰＺ００４７７７）に接触している白血病関連突然変異を呈するヒト細胞系での細胞数対時間のプロットである。ＡＭＬ１−ＥＴＯ転座型ヒト細胞系（陰性対照）を１０μＭのＥＰＺ００４７７７またはＤＭＳＯ（対照）で処理して、指定の日（３、７、および１０日目）に細胞をカウントした。ＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、ＮＰＭ１突然変異を呈するヒト細胞系の増殖を劇的に阻害したことがこれらのデータから実証される。
【図８Ａ】ＭＬＬ−ＡＦ９およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１形質転換細胞のＨ３Ｋ７９ｍｅ２およびアポトーシスに対するＥＰＺ００４７７７の効果を示している。ＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７（１０μＭ）による細胞の処理後のＨ３Ｋ７９ヒストンメチル化の減少を示すオートラジオグラフである。ＭＬＬ−ＡＦ９およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１形質転換細胞をＥＰＺ００４７７７（１０μＭ）により１０日間処理し、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２のタンパク質レベルをウェスタンブロッティングにより決定した。
【図８Ｂ】ＭＬＬ−ＡＦ９およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１形質転換細胞のＨ３Ｋ７９ｍｅ２およびアポトーシスに対するＥＰＺ００４７７７の効果を示している。ＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７がＭＬＬ−ＡＦ９およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１形質転換細胞の両方でアポトーシスを誘導することを示す棒グラフである。ＤＭＳＯ対照または１０μＭのＥＰＺ００４７７７のいずれかによるＭＬＬ−ＡＦ９またはＮＵＰ９８−ＮＳＤ１形質転換細胞の処理の１０日間後にアネキシンＶ染色を評価した。アネキシンＶ陽性細胞のパーセントが示されている。
【図９】陰性対照細胞系ＨＬ６０およびＭＬＬ−ＡＦ９転座を呈する陽性対照細胞系Ｍｏｌｍ−１３と比較して、それぞれＤＮＴＭ３ＡおよびＮＰＭ１突然変異を呈するＡＭＬ細胞系ＯＣＩ−ＡＭＬ２およびＯＣＩ−ＡＭＬ３を含む種々の細胞系で定量ＰＣＲにより評価されたＨＯＸＡ９遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図１０】処理日数に対してプロットされた細胞数のグラフであり、これによりＤＮＴＭ３ＡまたはＮＰＭ１突然変異を有する細胞系がＤＯＴ１Ｌ阻害に対して感受性があることが実証される。細胞系ＯＣＩ−ＡＭＬ２、ＯＣＩ−ＡＭＬ３、Ｍｏｌｍ−１３、およびＨＬ−６０をＤＭＳＯ（対照）または１０μＭのＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７のいずれかで処理した。指定の時点で細胞数を評価し、各時点でＥＰＺ００４７７７処理条件対ＤＭＳＯ（対照）処理条件で存在する細胞のパーセントをグラフに示した。ＯＣＩ−ＡＭＬ２、ＯＣＩ−ＡＭＬ３、およびＭｏｌｍ−１３細胞系は、高レベルのＨＯＸＡ９およびＭＥＩＳ１を発現するが、ＨＬ６０は、ＨＯＸＡ９またはＭＥＩＳ１のいずれかを高レベルで発現しない。
【図１１Ａ】ＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞がＤＯＴ１Ｌ阻害に反応してアポトーシスおよび分化を起こすことを実証する。４、７、または１０日間にわたり１０μＭのＥＰＺ００４７７７またはＤＭＳＯ（対照）で処理されたＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞を示す棒グラフである。アポトーシス細胞のパーセントは、アネキシンＶ染色により評価された。
【図１１Ｂ】ＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞がＤＯＴ１Ｌ阻害に反応してアポトーシスおよび分化を起こすことを実証する。指定の日数（４、７、および１０）にわたり１０μＭのＥＰＺ０４７７７で処理されたＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞の表面マーカーＣｂ１１発現のフローサイトメトリー解析を示す一連のグラフである。Ｃｂ１１マーカー発現の増加は分化を表す。
【図１２Ａ】Ｎｐｍ１ｃＡ／＋ＲｏｓａＳＢ／＋またはＮｐｍ１ｃＡ／＋Ｆｌｔ３ＩＴＤ／＋マウスから単離されたＡＭＬ細胞のグラフであり、レシピエントへの細胞の一次移植後のクローン形成能を検査したものである。Ｎｐｍ１ｃＡ／＋ＲｏｓａＳＢ／＋またはＮｐｍ１ｃＡ／＋Ｆｌｔ３ＩＴＤ／＋マウスから単離されたＡＭＬ細胞は、レシピエントへの細胞移植前に１０μＭのＤＯＴ１Ｌ阻害剤の存在下で６日間培養された。一次移植後、Ｎｐｍ１ｃＡ／＋ＲｏｓａＳＢ／＋およびＮｐｍ１ｃＡ／＋Ｆｌｔ３ＩＴＤ／＋ＡＭＬ細胞を指定の日数（一次移植では７、１４、および１５日間）にわたり媒体対照（ＤＭＳＯ）または１０μＭのＥＰＺ００４７７で処理し、その後、コロニー形成アッセイを行った。１０μＭのＤＯＴ１Ｌ阻害剤によるＡＭＬマウス細胞系の処理の結果、一次移植後のコロニー形成能が有意に減少した。
【図１２Ｂ】Ｎｐｍ１ｃＡ／＋ＲｏｓａＳＢ／＋またはＮｐｍ１ｃＡ／＋Ｆｌｔ３ＩＴＤ／＋マウスから単離されたＡＭＬ細胞のグラフであり、レシピエントへの細胞の二次移植後のクローン形成能を検査したものである。Ｎｐｍ１ｃＡ／＋ＲｏｓａＳＢ／＋またはＮｐｍ１ｃＡ／＋Ｆｌｔ３ＩＴＤ／＋マウスから単離されたＡＭＬ細胞は、レシピエントへの細胞移植前に１０μＭのＤＯＴ１Ｌ阻害剤の存在下で６日間培養された。二次移植後、Ｎｐｍ１ｃＡ／＋ＲｏｓａＳＢ／＋およびＮｐｍ１ｃＡ／＋Ｆｌｔ３ＩＴＤ／＋ＡＭＬ細胞を指定の日数（二次移植では１、１４、および２２日間）にわたり媒体対照（ＤＭＳＯ）または１０μＭのＥＰＺ００４７７で処理し、その後、コロニー形成アッセイを行った。１０μＭのＤＯＴ１Ｌ阻害剤によるＡＭＬマウス細胞系の処理の結果、二次移植後のコロニー形成能が有意に減少した。
【図１３Ａ】in vivoで白血病開始能に対するＤＯＴ１Ｌ阻害の効果を示している。事前にＤＭＳＯまたは１０μＭのＥＰＺ００４７７７のいずれかで６日間処理されたＮｐｍ１ｃＡ／＋ＲｏｓａＳＢ／＋ＡＭＬ細胞が注入された同種同系Ｃ５７／ＢＬ６マウスのカプラン・マイヤー生存曲線（％生存率対経過日数）を示している。ＤＯＴ１Ｌ阻害剤で治療された動物が長期間生存することを示している。
【図１３Ｂ】in vivoで白血病開始能に対するＤＯＴ１Ｌ阻害の効果を示している。Ｎｐｍ１ｃＡ／＋ＲｏｓａＳＢ／＋ＡＭＬ細胞（事前にＤＭＳＯまたは１０μＭのＥＰＺ００４７７７のいずれかで６日間処理された）が注入された動物から１９日目に単離され、ライト・ギムザ染色法で染色された末梢血スミアの画像である。ＥＰＺ００４７７処理細胞の分化を示している（ＤＭＳＯのみに暴露された細胞は分化を示さない）。
【図１３Ｃ】in vivoで白血病開始能に対するＤＯＴ１Ｌ阻害の効果を示している。対照（ＤＭＳＯ）または１０μＭのＥＰＺ００４７７７のいずれかで６日間処理されたＮｐｍ１ｃＡ／＋ＲｏｓａＳＢ／＋ＡＭＬ細胞が注入されたマウスから１９日目に採取されたサンプルの全血球数を示す一連のグラフである。白血球および血小板の数は、血液１マイクロリットル（μＬ）あたりの細胞数として表されている。ヘモグロビンレベルは、１デシリットルあたりのグラム数（ｇ／ｄｌ）で表されている。
【図１４Ａ】ＤＭＳＯまたは１０μＭのＥＰＺ００４７７７による細胞処理後のＮｐｍ１ｃＡ／＋ＲｏｓａＳＢ／＋ＡＭＬ細胞でのＧＡＰＤＨと対比したＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＭＥＩＳ１、ＨＯＸ３Ａ、ＨＯＸＡ４、およびＨＯＸＡ５の相対発現（ｄｄＣＴ）の棒グラフを示している。１０μＭのＥＰＺ００４７７７による細胞系の処理後にＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＭＥＩＳ１、ＨＯＸ３Ａ、ＨＯＸＡ４、およびＨＯＸＡ５の発現が減少することを示している。
【図１４Ｂ】ＤＭＳＯまたは１０μＭのＥＰＺ００４７７７による細胞処理後のＮｐｍ１ｃＡ／＋Ｆｌｔ３ＩＴＤ／＋ＡＭＬ細胞でのＧＡＰＤＨと対比したＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＭＥＩＳ１、ＨＯＸ３Ａ、ＨＯＸＡ４、およびＨＯＸＡ５の相対発現（ｄｄＣＴ）の棒グラフを示している。１０μＭのＥＰＺ００４７７７による細胞系の処理後にＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＭＥＩＳ１、ＨＯＸ３Ａ、ＨＯＸＡ４、およびＨＯＸＡ５の発現が減少することを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
詳細な説明
本開示は、１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇に関連する  −−  ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、およびＭＬＬ部分縦列重複（ＰＴＤ）以外の  −−  １つ以上の遺伝子の突然変異、変化、および／または異常を呈する白血病が、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤媒介の成長阻害および／またはアポトーシスに対して感受性があるという発見に基づく。さらに、（１）１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／もしくは１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇、ならびに／または（２）１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／もしくは１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇に関連する、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、もしくはＭＬＬ部分縦列重複以外の１つ以上の白血病関連の遺伝子の突然変異、変化、および／もしくは異常を呈する白血病は、１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤の投与によって効果的に治療可能である。言い換えれば、ＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇を引き起こす突然変異が存在する可能性がかなり高ければおよびそれが存在する場合、それは、ＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇を予測するサロゲートとして機能可能であるが、かかる突然変異が存在することは必要条件ではない。発現の上昇がなんらかの他の因子の結果であったとしても、ＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇が低減されるであろうため、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤による治療は効果的であると予想される。
【００３６】
野生型ＭＬＬタンパク質は、遺伝子プロモーター近傍のＨ３Ｋ４をメチル化するヒストン３リシン４（Ｈ３Ｋ４）メチルトランスフェラーゼである。この修飾は、造血発生時に被活性化能を付与する。ＤＯＴ１Ｌは、転写活性な遺伝子のプロモーター上および本体上のＨ３Ｋ７９を修飾するヒストン３リシン７９（Ｈ３Ｋ７９）メチルトランスフェラーゼである。こうして、Ｈ３Ｋ４メチル化は遺伝子の発現の「準備」をし、Ｈ３Ｋ７９メチル化は遺伝子発現を可能にするかまたは促進する。
【００３７】
酵母での研究により２つの複合体は同様かつ同時にレギュレートされることが示されたことから、これらの２つの修飾は、遺伝子転写時に高度にレギュレートされて一緒に機能するという仮説が立てられる。ＭＬＬの転座は、Ｈ３Ｋ７９メチル化とＨ３Ｋ４メチル化との間のこの密接な関係を撹乱して不可逆なものとすると共に異常な遺伝子発現をもたらす異常なタンパク質をもたらすという仮説が立てられてきた。
【００３８】
本開示の根底をなす発見がなされる前は、このデレギュレートされた関係がＭＬＬ転座型白血病、ＭＬＬ再構成型白血病、およびＭＬＬ−ＰＴＤ白血病でのＤＯＴ１Ｌ阻害剤の選択性の要因であると考えられていた。しかしながら、本明細書に開示されるように、ＤＯＴ１Ｌは、正常血液発生時のＨＯＸ遺伝子発現および高レベルのＨＯＸ遺伝子発現を有するがＭＬＬ異常を有していない白血病でのＨＯＸ遺伝子発現に独立して必要とされることが見いだされた。こうして、本開示によれば、ＤＯＴ１Ｌ阻害は、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、またはＭＬＬ部分縦列重複を呈する白血病だけでなくＨＯＸ遺伝子発現の上昇に関連する白血病に広く適用可能である。
【００３９】
本明細書にさらに詳細に記載されるこれらのおよび他の発見に基づいて、本開示は、
（１）白血病の組織サンプルまたは細胞がＤＯＴ１Ｌ阻害剤との接触時に成長および／または生存の阻害に対して感受性があるかどうかを予測または判定するための使用／方法、
（２）組織または細胞、とくに白血病の組織または細胞で新たに同定された遺伝子の突然変異、変化、および／または異常が、かかる組織または細胞にＤＯＴ１Ｌ阻害剤との接触時に成長および／または生存の阻害に対する感受性を付与するかどうかを予測または判定するための使用／方法、
（３）組織または細胞を１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤に接触させることにより、（ｉ）ＨＯＸクラスター遺伝子もしくはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇に関連する、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、もしくはＭＬＬ部分縦列重複以外の１つ以上の白血病関連の遺伝子の突然変異、変化、および／もしくは異常を呈するかまたは（ｉｉ）さもなければＨＯＸクラスター遺伝子もしくはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇を呈するかのいずれかである白血病の組織または細胞の成長および／または生存を阻害するための使用／方法、ならびに
（４）１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む組成物を白血病患者に投与することにより、（ｉ）ＨＯＸクラスター遺伝子もしくはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇に関連する、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、もしくはＭＬＬ部分縦列重複以外の１つ以上の遺伝子の突然変異、変化、および／もしくは異常を呈するかまたは（ｉｉ）さもなければＨＯＸクラスター遺伝子もしくはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇を呈するかのいずれかである白血病患者を治療するための使用／方法、
（５）組織もしくは細胞をＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤に接触させることまたは患者にそれらの阻害剤を投与することを含む、以上の第（３）項および第（４）項に概説される特徴を満たす白血病患者の組織もしくは細胞の成長もしくは生存を阻害するためのまたはかかる患者を治療するための使用／方法
を提供する。
【００４０】
本明細書にさらに詳細に記載されるように、同定、予測、判定、阻害、および治療するためのこれらの使用／方法はすべて、（１）組織および／または細胞での１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇と、（２）ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、またはＭＬＬ部分縦列重複でない、ある特定の白血病関連の遺伝子の突然変異、変化、および／または異常と、（３）１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤の投与を含む白血病の治療レジメンの治療有効性との間の新たに発見されたかつこのたび開示された関係に基づく。
【００４１】
（１）ＨＯＸクラスター遺伝子発現および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇を判定するための方法、（２）ＨＯＸクラスター遺伝子発現レベルまたはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現レベルを同時に評価してまたは評価せずに、ＨＯＸクラスター遺伝子発現および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇に関連する、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、またはＭＬＬ部分縦列重複以外の遺伝子の突然変異、変化、および／または異常をヒトの組織サンプルおよび／または細胞で検出するための方法、（３）ＨＯＸクラスター遺伝子発現および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇に関連する、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、またはＭＬＬ部分縦列重複以外の１つ以上の遺伝子の突然変異、変化、および／または異常を呈する白血病の組織または細胞の増殖および／または生存を阻害するためにならびにそれらを呈する白血病患者を治療するために有利に利用しうる例示的なＤＯＴ１Ｌ阻害剤、（４）１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む、医薬組成物などの組成物および製剤、ならびに（５）１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を投与するための方法および１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤の投与を利用する好適な治療レジメンを含む、１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含有する組成物を投与することにより白血病患者を治療するための方法を含む、本開示のこれらのおよび他の態様を本明細書にさらに詳細に記載する。ＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、単独療法としてまたは追加の治療剤、たとえば、ＦＬＴ３阻害剤、およびＡＴＲ阻害剤、ＩＤＨ１／２阻害剤もしくはＣＤＫ４／ＣＤＫ６阻害剤と組み合わせて投与されうる。好適なＡＴＲ阻害剤の例としては、次の市販の化合物ＡＺ２０、ＢＥＺ２３５が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、ＣＤＫ４／ＣＤＫ６阻害剤の例としては、ＬＥＥ０１１が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、ＩＤＨ１／２阻害剤の例としては、ＡＧＩ−６７８０およびＡＧＩ−５１９８が挙げられるが、これらに限定されるものではない。すべてSelleckchem, Boston, MAから利用可能である。
【００４２】
定義
「ＨＯＸクラスター遺伝子」および「ＨＯＸクラスター関連遺伝子」は、当技術分野の慣例に従って定義される。「ＨＯＸクラスター」という用語は、染色体上に遺伝子クラスターとして見いだされる一群のホメオボックス遺伝子（ホメオボックスと呼ばれる１８０塩基対長のＤＮＡ配列を含有する調節遺伝子クラス）を意味する。ＨＯＸクラスター遺伝子は、転写因子であるタンパク質をコードし、胚発生および造血できわめて重要な役割を果たす。ヒトには、これまでに同定された３９種のＨＯＸ遺伝子を有する４つのクラスター（Ａ〜Ｄ）、すなわち、（１）ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１２、およびＨＯＸＡ１３を含む７番染色体上のクラスターＡ、（２）ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９、およびＨＯＸＢ１３を含む１７番染色体上のクラスターＢ、（３）ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１２、およびＨＯＸＣ１３を含む１２番染色体上のクラスターＣ、ならびに（４）ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１２、およびＨＯＸＤ１３を含む２番染色体上のクラスターＤが含まれる。ＨＯＸ遺伝子のＤＮＡ結合特異性は、部分的には、ＨＯＸ補因子として作用しＨＯＸクラスター関連遺伝子として参照される他のタンパク質との相互作用に基づく。明確に定義されたＨＯＸクラスター関連遺伝子の例は、３アミノ酸ループ伸長（ＴＡＬＥ）遺伝子、すなわち、ＰＢＸ３およびＭＥＩＳ遺伝子である。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、「内部対照」という用語はほとんどの組織および細胞で安定的かつ構成的に高レベルで発現されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列、典型的には、ハウスキーピング遺伝子の配列またはその一部を意味するが、他を除外するものではない。ハウスキーピング遺伝子は、一般に病理学的条件および実験条件に影響されない状態を維持するものから選択される。「内部対照」として機能可能な好適な遺伝子としては、たとえば、β−アクチン、β−チューブリン、ＧＡＰＤＨ、およびシクロフィリンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＨＯＸクラスター遺伝子発現および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現および内部対照遺伝子発現（すなわち、非ＨＯＸクラスター遺伝子発現および非ＨＯＸクラスター関連遺伝子発現）のレベルは、（たとえば、ＨＯＸ転写物および非ＨＯＸ転写物の数を定量することにより）決定可能であり、ＨＯＸ遺伝子発現と非ＨＯＸ遺伝子発現との比は、誘導可能であり、かつ所与の白血病の組織サンプル内または細胞内でのＨＯＸクラスター遺伝子発現および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現のレベルは、ＨＯＸ遺伝子発現と非ＨＯＸ遺伝子発現との比により表現可能である。
【００４４】
これとは対照的に、本明細書で用いられる場合、「外部対照」という用語は、非白血病の組織もしくは細胞のＨＯＸクラスター遺伝子もしくはＨＯＸクラスター関連遺伝子またはそれらの遺伝子配列を意味し、かかるＨＯＸクラスター遺伝子もしくはＨＯＸクラスター関連遺伝子またはそれらの遺伝子配列は、非白血病の組織または細胞では発現の上昇を示さないが、対応する白血病の組織または細胞では発現の上昇が検査される。こうして、たとえば、「外部対照」は、白血病の組織サンプルまたは細胞での発現レベル（たとえば、ｍＲＮＡ転写物の数）を対応する非白血病の組織サンプル、たとえば正常ドナーの組織サンプル、または非白血病細胞、たとえばＣＤ３４＋非白血病細胞と比較することにより、所与のＨＯＸクラスター遺伝子または所与のＨＯＸクラスター関連遺伝子が白血病の組織サンプルまたは細胞で発現レベルの上昇を呈するかどうかを評価するために「陰性対照」として使用可能である。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、「遺伝子発現の上昇」という用語、とくに「ＨＯＸクラスター遺伝子発現の上昇」および「ＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇」という用語は、内部対照または外部対照を含む対照と比較して白血病の組織サンプルまたは細胞で少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍上昇する、ＨＯＸクラスター遺伝子およびＨＯＸクラスター関連遺伝子の転写されたｍＲＮＡの量の増加を含む特定の遺伝子産物の発現の増加を意味する。
【００４６】
「固体担体」とは、遊離化学基をオリゴヌクレオチドまたは核酸に結合することを含む方法などの方法の温度条件で溶媒に本質的に不溶な材料を意味する。固体担体は、標的核酸を直接的もしくは間接的のいずれかで結合するように設計されたオリゴヌクレオチドに共有結合可能である。標的核酸がｍＲＮＡである場合、固体担体に装着されるオリゴヌクレオチドは、好ましくはポリＴ配列である。好ましい固体担体は、ミクロンサイズまたはサブミクロンサイズのビーズまたはスフェアなどの粒子である。さまざまな固体担体材料、たとえば、シリカ、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、金属、ポリスチレン、ラテックス、ニトロセルロース、ポリプロピレン、ナイロン、またはそれらの組合せなどが想定される。固体担体は、マグネタイトコアを有する固体担体などのように磁場を利用して一定の位置に引き寄せることが可能である。例示的な支持体としては単分散磁性スフェアが挙げられる。
【００４７】
本明細書で用いられる場合、白血病患者に関係する「組織サンプル」としては、血液サンプル、骨髄サンプル、もしくはリンパ節サンプル、または患者から単離された一群の細胞たとえば白血病細胞が挙げられる。
【００４８】
本明細書で用いられる場合、「核酸増幅条件」という語句は、核酸増幅法を用いて標的核酸またはその相補鎖の複数のコピーの産生を可能にするのに十分な塩濃度、温度、温度サイクルの存在または不在、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、および補因子の存在を含む反応条件を意味する。
【００４９】
増幅プライマーの「標的結合配列」は、標的特異性を決定する部分である。なぜなら、その部分は、標的核酸鎖またはその相補鎖にアニール可能であるが、同一の条件下で非標的核酸鎖に検出可能にアニールしないからである。標的結合配列がハイブリダイズする相補的標的配列は、プライマー結合配列として参照される。
【００５０】
ＨＯＸクラスター遺伝子およびＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇を検出するための方法
ＨＯＸクラスター遺伝子発現およびＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇は、たとえば、マイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む定量ＰＣＲ、およびＲＮＡ配列決定などを含む当技術分野で周知の１つ以上の方法により直接決定可能である。ＨＯＸクラスター遺伝子発現またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇を検出するための本明細書に記載の各方法は、ＨＯＸクラスター遺伝子および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子によりコードされる１つ以上のｍＲＮＡの増幅、ハイブリダイゼーション、および／または配列決定を介する白血病特異的ポリヌクレオチドの検出を共通して有する。
【００５１】
ＨＯＸクラスター遺伝子発現および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇はまた、白血病患者の所与の組織または血液サンプル中の全細胞数と対比した芽細胞（すなわち白血病細胞）のパーセントまたは分率に基づいて評価可能である。この方法により、たとえば、白血病組織サンプル中のＨＯＸクラスター転写物および／またはＨＯＸクラスター関連転写物の数を定量し、白血病組織サンプル中の芽細胞のパーセントまたは分率の逆数を掛け算することが可能である。次いで、得られたＨＯＸクラスター転写物および／またはＨＯＸクラスター関連転写物の数をＨＯＸクラスター遺伝子発現および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の閾値転写物数と対比して評価可能であり、その評価に基づいて、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の投与を含む治療レジメンに対する白血病組織サンプルを提供した白血病患者の反応性を予測可能である。より具体的には、この方法により、閾値転写物数を上回るＨＯＸクラスター遺伝子発現および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の転写物数は、かかるＤＯＴ１Ｌ阻害剤治療レジメンの治療有効性の予測因子である。
【００５２】
ＨＯＸクラスター遺伝子発現またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇は、たとえば、（１）白血病患者の組織サンプルでＨＯＸクラスターＲＮＡまたはＨＯＸクラスター関連ＲＮＡ（および／またはタンパク質）を定量することにより、（２）非白血病対照ドナーの組織サンプルでＨＯＸクラスターＲＮＡまたはＨＯＸクラスター関連ＲＮＡ（および／またはタンパク質）のレベルを定量することにより、および（３）白血病患者の組織サンプル中のＨＯＸクラスターＲＮＡまたはＨＯＸ関連クラスターＲＮＡ（および／またはタンパク質）のレベルを対照ドナーの組織サンプル中のＨＯＸクラスターＲＮＡまたはＨＯＸクラスター関連ＲＮＡ（および／またはタンパク質）のレベルと比較することにより、評価可能である。対照ドナー組織サンプル中のＨＯＸクラスターＲＮＡまたはＨＯＸクラスター関連ＲＮＡ（および／またはタンパク質）と比較して白血病患者組織サンプル中のＨＯＸクラスターＲＮＡまたはＨＯＸクラスター関連ＲＮＡのレベルの上昇は、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤による治療に対する白血病患者の感受性の指標であることは理解されよう。
【００５３】
他の選択肢として、ＨＯＸクラスター遺伝子発現またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇は、（１）白血病患者の組織サンプル中のＨＯＸクラスターＲＮＡまたはＨＯＸクラスター関連ＲＮＡを定量することにより、（２）白血病患者の組織サンプル中の非ＨＯＸクラスターＲＮＡ／非ＨＯＸクラスター関連ＲＮＡ、たとえば、ＧＡＰＤＨまたはアクチンなどのレベルを定量することにより、および（３）白血病患者の組織サンプル中のＨＯＸクラスターＲＮＡまたはＨＯＸクラスター関連ＲＮＡのレベルを白血病患者の組織サンプル中の非ＨＯＸクラスターＲＮＡ／非ＨＯＸクラスター関連ＲＮＡのレベルと比較することにより、評価可能である。白血病患者の組織サンプル中の非ＨＯＸクラスターＲＮＡ／非ＨＯＸクラスター関連ＲＮＡと比較して白血病患者の組織サンプル中のＨＯＸクラスターＲＮＡまたはＨＯＸクラスター関連ＲＮＡのレベルの上昇は、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤による治療に対する白血病患者の感受性の指標であることは理解されよう。
【００５４】
これらの方法のある特定の態様では、ＨＯＸクラスターＲＮＡまたはＨＯＸクラスター関連ＲＮＡは、白血病の組織サンプルもしくは細胞であるか、白血病患者の非白血病の組織サンプルもしくは細胞であるか、または非白血病対照ドナーの組織サンプルもしくは細胞であるかにかかわらず、ＨＯＸクラスターＲＮＡまたはＨＯＸクラスター関連ＲＮＡに特異的なプライマー対を用いて組織サンプル中のＲＮＡを増幅することにより定量可能である（表１参照）。同様に、非ＨＯＸクラスターＲＮＡまたは非ＨＯＸクラスター関連ＲＮＡは、白血病の組織サンプルもしくは細胞であるか、白血病患者の非白血病の組織サンプルもしくは細胞であるか、または非白血病対照ドナーの組織サンプルもしくは細胞であるかにかかわらず、たとえば、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ、β−アクチン、β−チューブリンなど）の１つなど、非ＨＯＸクラスターＲＮＡまたは非ＨＯＸクラスター関連ＲＮＡに特異的なプライマー対を用いて組織サンプル中のＲＮＡを増幅することにより定量可能である。プライマー対は、フォワードプライマーとリバースプライマーとを含み、ＲＮＡがＨＯＸクラスターＲＮＡもしくはＨＯＸクラスター関連ＲＮＡであるかまたは非ＨＯＸクラスターＲＮＡもしくは非ＨＯＸクラスター関連ＲＮＡであるかにかかわらず、フォワードプライマーは、ＲＮＡの５’末端にハイブリダイズし、かつリ前記バースプライマーは、ＲＮＡの３’末端にハイブリダイズする。
【００５５】
白血病の組織および細胞で発現の上昇が評価されるＨＯＸクラスター遺伝子としては、たとえば、１つ以上のＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ１１、およびＨＯＸＡ１３、たとえば、１つ以上のＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、および／またはＨＯＸＡ１０などを含む１つ以上のＨＯＸＡクラスター遺伝子が挙げられる。白血病サンプルで発現の上昇が評価されるＨＯＸクラスター遺伝子としてはまた、たとえば、１つ以上のＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９、およびＨＯＸＢ１３を含む１つ以上のＨＯＸＢクラスター遺伝子が挙げられる。白血病サンプルで発現の上昇が評価されるＨＯＸクラスター関連遺伝子としては、たとえば、１つ以上のＭＥＩＳ１、ＰＢＸ３、およびＭＥＩＳ２Ａが挙げられる。
【００５６】
それらのＨＯＸクラスター遺伝子およびＨＯＸクラスター関連遺伝子のそれぞれによりコードされるｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、表１に示され、同様に、対応する受託番号、配列識別子、および科学文献内の特定の参照文献（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）の引用も示されている。
【００５７】
【表１】
0006639390.tif 000002
【００５８】
ＨＯＸクラスター遺伝子発現またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇を有する白血病の組織サンプルまたは細胞を同定するために、白血病の組織サンプルまたは細胞および非白血病対照の組織サンプルまたは細胞からｍＲＮＡを単離可能であり、所与のｍＲＮＡの発現レベルを決定可能であり、そして白血病の組織サンプルまたは細胞および非白血病対照の組織サンプルまたは細胞で決定されたｍＲＮＡレベルを比較することにより遺伝子発現の上昇を評価可能である。
【００５９】
他の選択肢として、ＨＯＸクラスター遺伝子発現またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇を有する白血病の組織サンプルまたは細胞は、たとえば、白血病の組織サンプルまたは細胞からのｍＲＮＡを単離してから、（ｉ）白血病の組織または細胞でＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子のｍＲＮＡレベルとハウスキーピング対照遺伝子のｍＲＮＡレベルとの比を決定し、（ｉｉ）健常な組織または細胞でＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子のｍＲＮＡレベルとハウスキーピング対照遺伝子のｍＲＮＡレベルとの比を決定し、そして（ｉｉｉ）（ｉ）の比を（ｉｉ）の比と比較して（ｉ）の比が（ｉｉ）の比の少なくとも３倍超であれば発現の上昇が存在すると結論付けることにより、同定可能である。これとの関連で用いられる場合、ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡとは、白血病の組織または細胞および健常な組織または細胞の両方で安定な発現を有する遺伝子のｍＲＮＡを意味する。好適なｍＲＮＡハウスキーピング遺伝子としては、たとえば、β−アクチン、β−チューブリン、ＧＡＰＤＨ、およびシクロフィリンが挙げられる。白血病の組織または細胞でＨＯＸクラスター遺伝子およびＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇を評価する他の方法は、あらかじめ決められた標準曲線との比較によるものである。標準は、たとえば、参照ＨＯＸのＲＮＡ／ＤＮＡ発現（すなわち、正常で上昇のない発現）のｑＰＣＲにより作成可能である。さらに、ｍＲＮＡレベルの他に、ＨＯＸクラスター遺伝子およびＨＯＸクラスター関連遺伝子の上昇は、ＤＮＡおよび／またはタンパク質のレベルを測定することにより決定可能である。
【００６０】
好適な白血病組織サンプルとしては、たとえば、白血病患者の血液、リンパ節、骨髄、および／または腫瘍生検サンプルが挙げられる。好適な非白血病対照組織サンプルとしては、たとえば、健常な無病ドナーなどの非白血病ドナーの血液、リンパ節、および／または骨髄サンプルが挙げられる。非白血病ドナーのかかる血液、リンパ節、および／または骨髄サンプルは、典型的にはＣＤ３４＋細胞を含有する。ドナーの組織サンプルまたは細胞の詳細な性質または起源にかかわらず、ドナーの組織または細胞は、ＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇を示さないことが知られることが不可欠であることは理解されよう。
【００６１】
好適な白血病細胞としては、たとえば、白血病患者のリンパ球または骨髄球が挙げられる。好適な非白血病対照細胞、とくに非白血病ＣＤ３４＋対照細胞としては、たとえば、健常な無病ドナーなどの非白血病ドナーのリンパ球または骨髄球、たとえば、Kasumi-1細胞系を含むＣＤ３４＋細胞系などの１つ以上の細胞系が挙げられる。起源またはアイデンティティーにかかわらず、好適な非白血病対照の組織サンプルまたは細胞は、白血病患者の組織サンプルまたは細胞で発現の上昇が検査されている特定のＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子のレベルの上昇を示さないことは理解されよう。
【００６２】
ＨＯＸクラスター遺伝子発現およびＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の発現上昇を検出するための方法は記載されてきた。たとえば、Armstrong et al., Nat. Genet. 30(1):41-47 (2002)および米国特許出願公開第２００９／０３２４６１８号には、各ＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子に特異的なプライマー対を用いて全ＲＮＡからｃＤＮＡを増幅することにより、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、およびＨＯＸＡ１０、さらにはＨＯＸクラスター遺伝子関連補因子ＭＥＩＳ１を検出および定量することが記載されている。Ferrando et al., Blood 102(0:262-268 (2003)およびFerrando et al., Cancer Cell 1:75-87 (2002)には、発癌性転写因子ＨＯＸ１１およびＨＯＸ１１Ｌ２の発現を定量する定量リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法が記載されている。
【００６３】
次に、ＨＯＸクラスター遺伝子およびＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇の検出に容易に適合可能な、発現レベルを定量するためのこれらのおよび他の方法をさらに詳細に説明する。
【００６４】
マイクロアレイ解析
ＨＯＸクラスター遺伝子発現およびＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇は、白血病患者および／または対照ドナーの組織サンプルまたは細胞から単離されたＲＮＡのマイクロアレイ解析により検出および定量が可能である。マイクロアレイは、複数のＨＯＸクラスター遺伝子およびＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現レベルを同時に評価するのに有効な方法である。しかし、感度に限界があるため、マイクロアレイ法では、低存在量の遺伝子の組織中絶対分布を正確に決定できないことがあるか、またはシグナル飽和が原因でＨＯＸクラスター遺伝子発現およびＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇の程度を過小評価するおそれがある。マイクロアレイ発現プロファイリングにより発現の上昇を示す遺伝子に対して、１つ以上の定量ＰＣＲ法、たとえば、Taqman（商標）プローブ検出（Invitrogen Life Sciences, Carlsbad, CA）または蛍光色素SYBR Greenに基づくＲＴ−ＰＣＲを用いて、さらなる解析を行うことが可能であり、これらは両方とも、感度のより大きいダイナミックレンジを提供する。
【００６５】
簡潔に述べると、マイクロアレイ解析は、発現が検出および／または定量される各ＨＯＸクラスター遺伝子およびＨＯＸクラスター関連遺伝子内のコード配列ならびに／または各非ＨＯＸクラスター遺伝子および非ＨＯＸクラスター関連遺伝子内のコード配列にハイブリダイズするプライマー対を用いて、白血病患者または対照ドナーの組織サンプルまたは細胞から抽出されたＲＮＡをＰＣＲ増幅することを含む。ＰＣＲ産物は、アレイフォーマットでスライド上に点在し、各ＰＣＲ産物は、アレイ中のユニークな位置を占領する。次いで、ＲＮＡが逆転写され、蛍光標識ｃＤＮＡプローブが生成される。蛍光標識ｃＤＮＡプローブを用いてプローブされたマイクロアレイはスキャンされ、蛍光強度が測定される。蛍光強度のレベルは、ハイブリダイゼーション強度と相関し、これは遺伝子発現の相対レベルと関連する。
【００６６】
ＨＯＸクラスター遺伝子発現およびＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の解析は、市販のマイクロアレイ（たとえば、U133Aチップ、Affymetrix, Santa Clara, CA）を用いてまたはカスタムマイクロアレイを用いて行うことが可能である。他の選択肢として、ＨＯＸクラスター遺伝子発現およびＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇は、製造業者の説明書に従って、ならびにSchena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:10614-10619 (1996)およびHeller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:2150-2155 (1997)に記載されるように、Synteniマイクロアレイ（Palo Alto, Calif.）を用いて検出可能である。マイクロアレイハイブリダイゼーションは、Abraham et al. Blood 105:794-803 (2005)に記載の方法に従って行うことが可能である。
【００６７】
プローブレベルデータは、市販のアルゴリズム（たとえば、Affymetrix Microarray Suite 5.0アルゴリズム）またはカスタムアルゴリズムを用いて規格化可能である。非ＨＯＸクラスター遺伝子発現および非ＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の強度値、さらにはＨＯＸクラスター遺伝子発現およびＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の強度値は、市販のプログラム（たとえば、GeneSpring 7.3.1 GX; Agilent Technologies, Santa Clara, CA）またはカスタムアルゴリズムを用いて、ｌｏｇ変換、メジアン中心化、および／または解析が可能である。
【００６８】
いくつかの因子を用いて、ＨＯＸクラスター遺伝子発現およびＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の解析、たとえば、ＧＡＰＤＨの３’：５’比およびアクチンの３’：５’比などの品質を評価することが可能である。理想３’：５’比は１であるが、ハウスキーピング遺伝子の比は３を超えてはならない。
【００６９】
ＨＯＸクラスター遺伝子発現およびＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇は、GeneSpring内で利用可能な１からの偏差に基づくcross-gene誤差モデルを適用することにより計算される分散を用いてウェルチのＡＮＯＶＡ（分散分析）により決定可能である。これは、個々のサンプルに関連する反復不足および分散を克服可能であり、原理的には分散フィルタリングに類似していると考えられる。教師なしクラスタリングは、階層的凝集型アルゴリズムを用いて行うことが可能である。ピアソン相関係数および重心連結は、それぞれ、類似度法および連結法として使用可能である。
【００７０】
可能なサンプル間差を検出するために、個別のサンプル間で１．５倍の発現差を有するおよび／またはベンジャミニ・ホッホバーグ多重検定補正を用いてスチューデントのｔ検定により０．０５の補正ｐ値で統計的に有意である遺伝子をデータセットから抽出することが可能である。差次的発現遺伝子を遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮に関して評価可能である（たとえば、GeneSpringを用いて）。
【００７１】
定量ＰＣＲ
白血病組織サンプル中に存在する白血病細胞の相対数および／または組織サンプルの各白血病細胞内のＨＯＸクラスター遺伝子発現およびＨＯＸクラスター関連遺伝子発現のレベルなどの因子にもよるが、ＨＯＸクラスター遺伝子発現およびＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の検出および／またはそのレベルの定量するために定量ＰＣＲ分析を行うことが好ましいこともある。
【００７２】
たとえば、白血病の組織サンプルもしくは細胞および／または非白血病対照ドナーの組織サンプルもしくは細胞に由来するＨＯＸクラスター遺伝子もしくはＨＯＸクラスター関連遺伝子のｍＲＮＡおよび／または非ＨＯＸクラスター遺伝子／非ＨＯＸクラスター関連遺伝子のｍＲＮＡまたは対応するｃＤＮＡの少なくとも一部を増幅するために、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲベースのアッセイで利用可能である。オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つは、ＨＯＸクラスター遺伝子およびＨＯＸクラスター関連遺伝子に特異的であり、かつそれに特異的な核酸部分断片にハイブリダイズする。増幅されたｃＤＮＡは、任意選択で、検出前に、たとえばゲル電気泳動など分画工程に付してもよい。
【００７３】
ＲＴ−ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅が逆転写と組み合わせて行われる定量ＰＣＲ法である。ＲＮＡは、組織サンプルまたは細胞、たとえば、血液、リンパ節、骨髄、および／または腫瘍生検サンプルから抽出され、ｃＤＮＡ分子を産生するために逆転写される。少なくとも１つの特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅によりｃＤＮＡ分子を増幅し、これを、たとえば、ゲル電気泳動を用いて分離および可視化しうる。増幅は、患者および陰性対照として機能する健常者から採取された組織サンプルまたは細胞で行われうる。増幅反応は、少なくとも２桁の範囲をカバーするｃＤＮＡのいくつかの希釈液で行われうる。非白血病の健常対照ドナーサンプルの同一の希釈液と比較して、検査白血病患者サンプルのいくつかの希釈液で少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、またはそれ以上の増加は、典型的には陽性であると考えられる。
【００７４】
ＨＯＸクラスター遺伝子発現およびＨＯＸクラスター関連遺伝子発現は、さらに特性分析されうるか、または他の選択肢として、定量リアルタイムＰＣＲ法を利用して独自に検出および／または定量されうる。Gibson et al., Genome Research 6:995-1001 (1996)およびHeid et al., Genome Research 6:986-994 (1996)。リアルタイムＰＣＲは、増幅の過程でＰＣＲ産物の蓄積レベルを評価する技術である。この技術は、複数のサンプル中のｍＲＮＡレベルの定量的評価を可能にする。この方法により、対応する非白血病対照ドナーのサンプルもしくは細胞および／または一群の無関係の正常非白血病の組織サンプルまたは細胞と共に、白血病の組織サンプルまたは細胞を検査しうる。
【００７５】
リアルタイムＰＣＲは、たとえば、ABI 7700 PrismまたはGeneAmp（登録商標）5700配列検出システム（Applied Biosystems, Foster City, CA）で行われうる。7700システムでは、一方の末端に５’蛍光レポーター色素および他方の末端に３’クエンチャー色素を有する特異的プローブ（Taqman（商標））と組み合わせて、フォワードおよびリバースプライマーが使用される。５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてリアルタイムＰＣＲを行う場合、プローブは切断されて蛍光を発し始めるため、蛍光の増加により反応をモニターすることが可能である（リアルタイム）。5700システムでは、二本鎖ＤＮＡのみに結合する蛍光色素SYBR（登録商標）greenならびに7700装置と同一のフォワードプライマーおよびリバースプライマーが使用される。プライマー発現プログラム（Applied Biosystems, Foster City, CA）に従って、対応するプライマーおよび蛍光プローブを設計しうる。プライマーおよびプローブの最適濃度は、当業者により最初に決定される。対照（たとえば、β−アクチン特異的）プライマーおよびプローブは、たとえば、Perkin Elmer/Applied Biosystems（Foster City, CA）から市販品として入手しうる。
【００７６】
サンプル中のＨＯＸクラスター遺伝子発現およびＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の量を定量するために、対象の遺伝子を含有するプラスミドを用いて標準曲線が作成される。標準曲線は、リアルタイムＰＣＲで決定されたＣｔ値を用いて作成され、これは、アッセイで使用される初期ｃＤＮＡ濃度に関連付けられる。対象の遺伝子の１０〜１０６コピーの範囲内の標準希釈液であれば、一般に十分である。その他に、対照サンプル配列に対して標準曲線が作成される。これにより、白血病の組織サンプルまたは細胞の初期ＲＮＡ含有量を比較目的の対照の組織サンプルまたは細胞の量に標準化することが可能である。
【００７７】
本明細書に記載のTrizol試薬を用いて、白血病の組織サンプルまたは細胞および非白血病対照の組織サンプルまたは細胞から全ＲＮＡを単離および抽出しうる。１〜２μｇの全ＲＮＡを用いてSuperScript II逆転写酵素（Life Technologies, Carlsbad, CA）により第１鎖合成を４２℃で１時間行って全長ｃＤＮＡを生成しうる。次いで、表１に示されるか、表１で引用された参照文献内に開示されるか、または他に公知であり当業者が容易に入手可能であるＨＯＸクラスターｍＲＮＡ配列およびＨＯＸクラスター関連ｍＲＮＡ配列に基づいて設計されるＨＯＸクラスター遺伝子およびＨＯＸクラスター関連遺伝子に特異的なプライマーを用いて、ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅しうる。
【００７８】
ＲＴ−ＰＣＲの定量的性質を保証するために、検査される白血病患者および非白血病対照ドナーの組織サンプルおよび／または細胞のそれぞれに対する内部対照として、β−アクチンなどのハウスキーピング遺伝子を使用可能である。第１鎖ｃＤＮＡの段階希釈液を調製し、β−アクチン特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲアッセイを行う。次いで、β−アクチン鋳型の線形領域増幅を可能にしかつ初期コピー数の差を反映するのに十分な感度である希釈液を選択する。これらの条件を用いて、各組織の各逆転写反応に対してβ−アクチンレベルを決定する。ＤＮＡ汚染は、ＤＮアーゼ処理によりおよび逆転写酵素を添加することなく調製された第１鎖ｃＤＮＡを使用した場合の陰性ＰＣＲ結果を保証することにより最小限に抑えられる。
【００７９】
Dynabeads mRNA direct microkit（Invitrogen, Life Sciences Technologies, Carlsbad, CA）を用いた例示的なＲＴ−ＰＣＲ反応では、１４．２５μｌのＨ２Ｏ、１．５μｌのＢＳＡ、６μｌの第１鎖緩衝液、０．７５ｍＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、３μｌのRnasin、３μｌの０．１Ｍ  ｄＴＴ、および１．５μｌのSuperscript IIを有する３０μｌの全反応体積で、１０５個以下の細胞を含有するサンプルが検査される。得られた溶液を４２℃で１時間インキュベートし、Ｈ２Ｏで１：５に希釈し、８０℃で２分間加熱してビーズからｃＤＮＡを引き離し、そしてただちにＭＰＳ上に配置する。ｃＤＮＡを含有する上清を新しいチューブに移して、−２０℃で貯蔵する。
【００８０】
ＲＮＡ配列決定
１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇は、白血病患者の組織サンプルもしくは細胞および／または非白血病ドナー対照の組織サンプルもしくは細胞のｍＲＮＡの直接配列決定により決定可能である。他の選択肢として、１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇は、逆転写によるｍＲＮＡからｃＤＮＡへの変換後に決定可能である。
【００８１】
True Single Molecule Sequencing（tSMS（商標））および／またはDirect RNA Sequencing（DRS（商標））は、遺伝子発現の定量に有用な技術であり、容易に適合化可能であり、１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の検出および定量が可能である。これらのシーケンシングバイシンセシス技術は、事前の逆転写またはＰＣＲ増幅を必要とすることなく組織サンプルまたは細胞に由来するｍＲＮＡに対して実施可能である。
【００８２】
Direct RNA sequencing技術（Helicos BioSciences Corporation, Cambridge, MA）および単分子直接ＲＮＡ配列決定を用いたトランスクリプトームプロファイリングは、Ozsoolak et al., Nature 461(7265):814-818 (2009)およびOzsolak and Milos, Methods Mol Biol 733:51-61 (2011)に記載されている。True Single Molecule SequencingおよびDirect RNA Sequencingの技術は、米国特許出願公開第２００８／００８１３３０号、同第２００９／０１６３３６６号、同第２００８／０２１３７７０号、同第２０１０／０１８４０４５号、同第２０１０／０１７３３６３号、同第２０１０／０２２７３２１号、同第２００８／０２１３７７０号、および同第２００８／０１０３０５８号、さらには米国特許第７，６６６，５９３号、同第７，７６７，４００号、同第７，５０１，２４５号、および同第７，５９３，１０９号にさらに記載されており、それらはいずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８３】
ＨＯＸクラスター遺伝子およびＨＯＸクラスター関連遺伝子さらには非ＨＯＸクラスター遺伝子および非ＨＯＸクラスター関連遺伝子によりコードされるｍＲＮＡは、ＨＯＸクラスターｍＲＮＡ配列およびＨＯＸクラスター関連ｍＲＮＡ配列ならびに非ＨＯＸクラスターｍＲＮＡ配列および非ＨＯＸクラスター関連ｍＲＮＡ配列（たとえば、表１に提示されるか、表１で引用された参照文献内に開示されるか、または他に公知であり当業者が容易に入手可能であるもの）に基づいて設計される特異的配列決定プライマーを利用して、True Single MoleculeおよびDirect RNA Sequencingの技術により直接配列決定することが可能である。
【００８４】
ＨＯＸクラスター遺伝子発現および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇を呈する白血病の検出方法
一般的には、白血病細胞は、白血病に関連することが知られている１つ以上の遺伝子の存在に基づいて患者において検出されうるが、それらの遺伝子のサブセットはまた、ＨＯＸクラスター遺伝子発現およびＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇に関連することが知られている。本開示によれば、ＨＯＸクラスター遺伝子発現およびＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇に関連することが知られているかまたはそのように判定される、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、またはＭＬＬ部分縦列重複以外の１つ以上の遺伝子の突然変異、変化、および／または他の異常を呈する白血病患者は、本明細書に記載の１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を投与することによって適切に治療される。
【００８５】
この節には、周知でありかつ組織サンプルまたは細胞で１つ以上の遺伝子の突然変異、変化、および／または他の異常を検出するように当業者が容易に適合化可能である代表的な方法が記載されている。これらの方法としては、たとえば、核酸増幅および配列決定の技術、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を含む核酸ハイブリダイゼーション技術が挙げられる。
【００８６】
突然変異されたかまたは他の方法で改変されたときに患者の白血病に関連することが知られている例示的な遺伝子は、表２および３に示されている。表２には、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、およびＡＳＸＬ１突然変異ならびにＮＵＰ９８−ＮＳＤ１および他のＮＵＰ９８転座を含む白血病関連遺伝子が示されており、これらは、１つ以上の突然変異、再構成、および／または転座（ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、および／またはＭＬＬ部分縦列重複以外）を呈する場合、正常ＣＤ３４＋骨髄細胞でのそれぞれのＨＯＸクラスター遺伝子および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現レベルと比較して、細胞での１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇に関連することが知られている。
【００８７】
白血病患者の組織サンプルまたは細胞における表２の白血病関連遺伝子の１つ以上での１つ以上の突然変異、再構成、転座、および／または他の遺伝子変化もしくは異常の検出および／または存在は、本開示が依拠する発見によれば、１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤との接触により増殖および／または生存の阻害、予防、または終了が可能な白血病の組織サンプルまたは細胞の予測因子である。
【００８８】
こうして、本開示によれば、（１）表２に示される白血病関連遺伝子の１つ以上での１つ以上の突然変異、再構成、転座、および／または他の遺伝子変化もしくは異常、ならびに／あるいは（２）ＨＯＸクラスター遺伝子発現および／もしくはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇に関連すると判定された（たとえば、本明細書に提供される方法に従って）１つ以上の白血病関連遺伝子での１つ以上の突然変異、再構成、転座、および／または他の遺伝子変化もしくは異常を呈する組織または細胞を有する白血病患者は、１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む組成物または製剤を含めて１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を、単独で、２種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤と組み合わせて、および／または他の好適な治療剤と組み合わせて投与することにより、有利に治療されうる。白血病の治療に好適なＤＯＴ１Ｌ阻害剤、組成物、製剤、および他の好適な治療剤は、本明細書にさらに詳細に記載されており、当業者に周知であり、また本明細書で引用された科学文献および特許文献（それぞれ参照により本開示に組み込まれる）に提示されている。
【００８９】
【表２】
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【００９０】
【表３】
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【００９１】
【表４】
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【００９２】
【表５】
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【００９３】
表３は、１つ以上の突然変異、再構成、および／または転座を呈する場合、正常ＣＤ３４＋骨髄細胞でのそれぞれのＨＯＸクラスター遺伝子および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現レベルと比較して、細胞でのＨＯＸクラスター遺伝子および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇に関連することが知られていない白血病関連遺伝子を示している。
【００９４】
白血病患者の組織サンプルまたは細胞における表３の白血病関連遺伝子の１つ以上での１つ以上の突然変異、再構成、転座、および／または他の遺伝子変化もしくは異常の検出および／または存在は、本開示が依拠する発見によれば、１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤との接触により増殖および／または生存の阻害、予防、または終了が可能でない白血病の組織サンプルまたは細胞の予測因子である。
【００９５】
こうして、本開示によれば、表３の白血病関連遺伝子の１つ以上で１つ以上の突然変異、再構成、転座、および／または他の遺伝子変化もしくは異常を呈するが、その他に、（１）表２の白血病関連遺伝子の１つ以上での１つ以上の突然変異、再構成、転座、および／または他の遺伝子変化もしくは異常、（２）１つ以上のＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、および／またはＭＬＬ部分縦列重複、ならびに／あるいは（３）ＨＯＸクラスター遺伝子発現および／もしくはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇に関連すると判定された（たとえば、本明細書に提供される方法に従って）１つ以上の白血病関連遺伝子の１つ以上の突然変異、再構成、転座、および／または他の遺伝子変化もしくは異常を示さない組織または細胞を有する白血病患者は、１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤の投与によって有利に治療されない可能性がある。
【００９６】
【表６】
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【００９７】
【表７】
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【００９８】
【表８】
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【００９９】
表２に示されるＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、およびＡＳＸＬ１遺伝子の１つ以上での突然変異ならびにＮＵＰ９８−ＮＳＤ１および他のＮＵＰ９８転座は、当技術分野で周知でありかつ必要に応じて容易に当業者により適合化可能である１つ以上の遺伝子検出法により検出可能である。
【０１００】
核酸増幅
白血病または対照の組織サンプルまたは細胞のゲノムＤＮＡは、表２に示されるか、表２で引用された参照文献内に開示されるか、または他に公知であり当業者が容易に入手可能であるＮＵＰ９８、ＮＳＤ１、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、およびＡＳＸＬ１配列に基づいて設計される特異的プライマー対を利用してＰＣＲ増幅可能である。次いで、得られたＰＣＲアンプリコンを単離して配列決定および／またはハイブリダイゼーション反応に付すことにより、白血病に関連しさらにはＨＯＸクラスター遺伝子発現および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇に関連するＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、およびＡＳＸＬ１遺伝子の公知の突然変異ならびにＮＵＰ９８−ＮＳＤ１および他のＮＵＰ９８転座のいずれかが、それぞれの白血病患者のゲノムＤＮＡ中に存在するかどうかを判定することが可能である。
【０１０１】
本明細書で用いられる場合、「増幅」という用語は、意図された特定の標的核酸配列の少なくとも一部を含有する標的核酸の複数のコピーの産生を意味する。複数のコピーは、アンプリコンまたは増幅産物として同義的に参照される。本開示の特定の態様では、増幅標的は、完全標的ｍＲＮＡ配列（すなわち、エキソンおよびフランキング非翻訳配列のスプライス転写物）および／または標的ゲノム配列（イントロンおよび／またはエキソンを含む）よりも小さい部分を含有する。たとえば、特定のアンプリコンは、標的ポリヌクレオチドの内側位置にハイブリダイズしてそこから重合を開始する増幅プライマーを用いて標的ポリヌクレオチドの一部を増幅することにより産生されうる。増幅部分は、さまざまな周知の方法のいずれかを用いて検出されうる検出可能標的配列を含有する。
【０１０２】
多くの周知の核酸増幅法は、二本鎖核酸の変性およびプライマーのハイブリダイズを交互に行うのに熱サイクルを必要とするが、他の周知の核酸増幅法は等温性である。ポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号に記載のＰＣＲ）では、変性、対向鎖へのプライマー対のアニーリング、およびプライマー伸長の複数サイクルを用いて指数関数的に標的配列のコピー数を増加させる。ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる変法では、逆転写酵素（ＲＴ）を用いてｍＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製するし、次いで、ＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅してＤＮＡの複数のコピーを産生する。
【０１０３】
リガーゼ連鎖反応（LCR; Weiss, Science 254:1292 (1991)では、標的核酸の近接領域にハイブリダイズする２組の相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドが使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、熱変性、ハイブリダイゼーション、およびライゲーションの繰返しサイクルでＤＮＡリガーゼにより共有結合され、ライゲートされた検出可能二本鎖オリゴヌクレオチド産物が産生される。
【０１０４】
鎖置換増幅（SDA; Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396 (1992)、米国特許第５，２７０，１８４号、および同第５，４５５，１６６号）では、標的配列の対向鎖へのプライマー配列対のアニーリング、二本鎖ヘミホスホロチオエート化プライマー伸長産物を産生するｄＮＴＰαＳ存在下でのプライマー伸長、半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介ニッキング、ならびにプライマーアニーリング、ニッキング、および鎖置換の次のラウンドのために既存の鎖を置き換えて鎖を産生するニックの３’末端からのポリメラーゼ媒介プライマー伸長のサイクルを用いて、産物の幾何級数的増幅をもたらす。耐熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）では、より高い温度で本質的に同一の方法により耐熱性のエンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを使用する（欧州特許第０６８４３１５号）。
【０１０５】
他の増幅方法としては、通常はＮＡＳＢＡとして参照される核酸配列ベースの増幅（米国特許第５，１３０，２３８号）、通常はＱＰレプリカーゼとして参照されるＲＮＡレプリカーゼを用いてプローブ分子自体を増幅するもの（Lizardi et al., BioTechnol 6:1197-1202 (1988)）、転写ベースの増幅方法（Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:1173-1177 (1989)）、自己保持配列複製（Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1874-1878 (1990)）、および通常はＴＭＡとして参照される転写媒介増幅（米国特許第５，４８０，７８４号および同第５，３９９，４９１号）が挙げられる。公知の増幅方法に関するさらなる考察については、Persing, “In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques” in Diagnostic Medical Microbiology: Principles and Applications pp. 51-87 (Persing et al., Eds.; American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1993)を参照されたい。
【０１０６】
ＴＭＡでは、標的領域の複数のＲＮＡ転写物を産生するＲＮＡポリメラーゼと、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの存在下で標的核酸にハイブリダイズして二本鎖プロモーターを形成してそこからＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ転写物を産生するようにする「プロモータープライマー」とが利用される。これらの転写物は、ＲＮＡ転写物にハイブリダイズ可能な第２のプライマーの存在下でのＴＭＡのさらなるラウンドの鋳型となりうる。ＰＣＲ、ＬＣＲ、または熱変性を必要とする他の方法とは異なり、ＴＭＡは、ＲＮアーゼＨ活性を用いてＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を消化することにより、プライマーまたはプロモータープライマーとのハイブリダイゼーションに利用可能なＤＮＡ鎖を作製する等温法である。一般的には、増幅に供される逆転写酵素に関連するＲＮアーゼＨ活性が使用される。
【０１０７】
例示的なＴＭＡ法では、１つの増幅プライマーは、標的結合配列の５’側に位置する二本鎖のときに機能的になるプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドプロモータープライマーであり、増幅される配列の３’側の位置で標的ＲＮＡの結合部位にハイブリダイズ可能である。プロモータープライマーは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ認識に特異的である場合、「Ｔ７プライマー」として参照されうる。特定の状況下では、プロモータープライマーまたはかかるプロモータープライマーのサブ集団の３’末端は、プライマー伸長をブロックまたは低減するように修飾されうる。非修飾プロモータープライマーから、逆転写酵素は、ＲＮアーゼＨ活性により標的ＲＮＡを分解しながら標的ＲＮＡのｃＤＮＡコピーを生成する。次いで、第２の増幅プライマーがｃＤＮＡに結合する。このプライマーは、「Ｔ７プライマー」と区別するために「非Ｔ７プライマー」として参照されうる。この第２の増幅プライマーから、逆転写酵素は、他のＤＮＡ鎖を生成し、一方の末端に機能的プロモーターを有する二本鎖ＤＮＡをもたらす。
【０１０８】
二本鎖のとき、プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合してプロモータープライマーがハイブリダイズされる標的配列の転写を開始可能である。ＲＮＡポリメラーゼは、このプロモーター配列を用いて一般に約１００〜１，０００コピーの複数のＲＮＡ転写物（すなわち、アンプリコン）を産生する。新たに合成された各アンプリコンは、第２の増幅プライマーにアニール可能である。次いで、逆転写酵素は、ＲＮアーゼＨ活性によりこのＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解しながらＤＮＡコピーを生成可能である。次いで、プロモータープライマーは、新たに合成されたＤＮＡに結合して逆転写酵素による二本鎖ＤＮＡの形成を可能にし、これからＲＮＡポリメラーゼにより複数のアンプリコンが産生される。こうして、２つの増幅プライマーを用いて１０億倍の等温増幅を達成可能である。
【０１０９】
プライマー中に追加の機能配列を必要としないプライマーまたは増幅方法（たとえば、ＰＣＲ増幅）では、プライマー配列は、標的結合配列を含むが、他の方法（たとえば、ＴＭＡまたはＳＤＡ）は、標的結合配列に近接して追加の特殊配列（たとえば、プロモータープライマーでは標的結合配列に近接してＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列またはＳＤＡプライマーでは制限エンドヌクレアーゼ認識配列）を含む。
【０１１０】
本開示に係るプライマー配列およびプローブ配列がすべて、市販品として入手されうるかまたは標準的in vitro合成法を用いて合成されうるであることは、当業者であればわかるであろう。また、当業者が、追加の特殊配列（たとえば、プロモーター配列または制限エンドヌクレアーゼ認識配列）を追加するように慣用的方法を用いて本明細書に開示されたプライマー配列を修飾することにより、プライマーをさまざまな増幅方法で使用可能にしうることは、分かるであろう。同様に、本明細書に記載のプロモータープライマー配列は、プロモーター配列を除去することにより、これらの追加の機能配列を使用しない増幅手順が可能な本質的に標的結合配列である増幅プライマーを産生するように修飾可能である。
【０１１１】
「標的配列」とは、本明細書に記載の方法でプライマーおよび／またはプローブたとえば標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて少なくとも一部分が検出可能な核酸鎖のヌクレオチド塩基配列を意味する。標的配列が二本鎖核酸である場合、プライマーおよびプローブは、いずれかの相補鎖を含む標的配列の一部に結合する。
【０１１２】
「等価なＲＮＡ」とは、Ｔを適切なＵで置換してデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と同一のヌクレオチド塩基配列を有するリボ核酸（ＲＮＡ）を意味する。同様に、「等価なＤＮＡ」とは、Ｕを適切なＴで置換してＲＮＡと同一のヌクレオチド塩基配列を有するＤＮＡのことである。「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語が、「脱塩基」残基を含むアナログを含めてＤＮＡもしくはＲＮＡ塩基配列またはＤＮＡ塩基配列とＲＮＡ塩基配列との合成的組合せのいずれかを有する分子構造を意味することは、当業者であればわかるであろう。
【０１１３】
増幅産物またはアンプリコンの「検出」とは、増幅核酸の存在を判定するさまざまな方法のいずれか、たとえば、増幅産物の一部に標識プローブをハイブリダイズする方法を意味する。標識プローブとは、他の配列に特異的に結合し、かつたとえば、蛍光部分、化学発光部分、放射性同位体、ビオチン、アビジン、酵素、酵素基質、または他の反応基でありうる検出可能基を含有するオリゴヌクレオチドのことである。標識プローブは、適切な条件下で化学発光により検出可能なアクリジニウムエステル（ＡＥ）部分を含みうる（たとえば、米国特許第５，２８３，１７４号に記載されるように）。
【０１１４】
他の周知の検出技術としては、たとえば、ゲル濾過、ゲル電気泳動、アンプリコンの可視化、ならびに高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられる。検出工程は定性的または定量的でありうる。
【０１１５】
標的ポリヌクレオチドを精製および検出するためのアッセイは、多くの場合、固体担体上に標的ポリヌクレオチドを捕捉することを含む。固体担体は、標的ポリヌクレオチド精製手順の１つ以上の洗浄工程時に標的ポリヌクレオチドを保持する。１つの技術は、固体担体に固定されたポリヌクレオチドによる標的ポリヌクレオチドの捕捉と、捕捉された標的ポリヌクレオチドへの検出プローブのハイブリダイゼーションとを含む（たとえば、米国特許第４，４８６，５３９号）。標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされない検出プローブは、固体担体から容易に洗浄除去される。こうして、残留する標識は、サンプル中に最初から存在する標的ポリヌクレオチドに関連付けられる。
【０１１６】
他の技術では、メディエーターポリヌクレオチドにより標的ポリヌクレオチドが固体担体に連結されて結合標的が生成されるように、標的ポリヌクレオチドと固体担体に固定されたポリヌクレオチドとの両方にハイブリダイズするメディエーターポリヌクレオチドが使用される（たとえば、米国特許第４，７５１，１７７号）。標識プローブは、結合標的にハイブリダイズ可能であり、非結合標識プローブは、固体担体から洗浄除去可能である。
【０１１７】
本開示に係るプライマーおよびプローブは、さまざまな周知の確立された方法のいずれかにより単離された核酸基質を用いる増幅方法および検出方法で使用されうる。（たとえば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory Manual, 2nd ed., pp. 7.37-7.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)、Lin et al., “Simple and Rapid Sample Preparation Methods for Whole Blood and Blood Plasma” in Diagnostic Molecular Microbiology, Principles and Applications, pp. 605-616 (Persing et al., Eds., American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1993)。
【０１１８】
一具体例では、標的ｍＲＮＡは、増幅に使用可能なｍＲＮＡを生成するように次の手順により調製されうる。簡潔に述べると、組織サンプルまたは細胞（たとえば、末梢血または骨髄細胞）は、細胞懸濁液を、核のＤＮＡまたはＲＮＡの実質的な放出を引き起こすことなく細胞の細胞質膜を溶解させるのに有効な量で少なくとも約１５０ｍＭの可溶性塩たとえばハロゲン化リチウムとキレート化剤と非イオン性界面活性剤と含有する溶解溶液に接触させることにより、溶解される。
【０１１９】
細胞懸濁液および溶解溶液は、約１：１〜１：３の比で混合される。溶解溶液中の界面活性剤濃度は、約０．５〜１．５％（ｖ／ｖ）である。さまざまな公知の非イオン性界面活性剤のいずれかは、溶解溶液に有効であり（たとえば、TRITON（登録商標）タイプ、TWEEN（登録商標）タイプ、およびＮＰタイプ）、典型的には、溶解溶液は、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール界面活性剤、好ましくは１％TRITON（登録商標）X-102を含有する。
【０１２０】
この手順は、細胞懸濁液（たとえば、血液および骨髄）を含有する白血病組織サンプルで有利に使用されうるが、細胞が個別に分離されるようにまたは小さいクランプになるように標準的なミンシング法、スクリーニング法、および／またはタンパク質分解法を用いて細胞が分離されるのであれば、他の組織でも同じように良好に機能する。
【０１２１】
細胞溶解後、放出された全ＲＮＡは安定であり、追加のＲＮアーゼ阻害剤を用いないでも有意なＲＮＡ劣化を伴うことなく室温で少なくとも２時間貯蔵されうる。全ＲＮＡは、さらなる精製を行うことなく増幅に使用されうるか、またはｍＲＮＡは、ｍＲＮＡのポリＡ部分への親和性結合に一般に依存する標準的方法を用いて単離されうる。
【０１２２】
本開示のある特定の態様では、ｍＲＮＡ単離は、不溶性粒子に装着されたポリｄＴオリゴヌクレオチドを含む捕捉粒子を利用する。捕捉粒子は、以上に記載の溶解混合物に添加され、ポリｄＴ部分は、ポリＡｍＲＮＡにアニールされ、そして粒子は、混合物から物理的に分離される。一般的には、超常磁性粒子が使用され、そして容器の外側に磁場を適用することにより分離されうる。たとえば、約１〜１００ピコモル／ｍｇ、１０〜１００ｐｍｏｌ／ｍｇ、または１０〜５０ｐｍｏｌ／ｍｇの濃度で結合されたｄＴ１４またはｄＴ３０のいずれかを有する約３００μｇの粒子（１４０ｍＭ  ＮａＣｌの標準的なリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中）の懸濁液が約１ｍｌの溶解混合物に添加される。
【０１２３】
任意の超常磁性粒子を使用しうるが、典型的には、粒子は、標準的手順を用いてポリｄＴオリゴヌクレオチドが装着されるラテックスまたはシリカ（たとえば、SerodynまたはDynalから市販されている）でコーティングされたマグネタイトコアである（Lund et al., Nuc. Acids Res. 16:10861-10880 (1988)）。粒子を含有する溶解混合物は、約２２〜４２℃で穏やかに約３０分間混合およびインキュベートされ、チューブの外側に磁場を印加してｍＲＮＡを装着した粒子を混合物から分離すると上清が除去される。粒子は、以上に記載の標準的な再懸濁法および磁気分離を用いて、１回以上、一般的には３回洗浄される。次いで、粒子は、緩衝溶液中に懸濁され、そしてただちに増幅に使用可能であるかまたは凍結保存可能である。
【０１２４】
サンプル調製に実質的な影響を及ぼすことなく、いくつかのパラメーターを変更しうる。たとえば、粒子洗浄工程の数を変更しうるか、または他の手段（たとえば、濾過、沈殿、遠心分離）により粒子を上清から分離しうる。固体担体は、特定の標的配列に相補的な固着された核酸捕捉プローブを有しうるか、または標的核酸に非特異的に結合する任意の粒子もしくは固体担体を使用しうる（たとえば、米国特許第５，５９９，６６７号などに記載されているポリカチオン担体）。
【０１２５】
増幅のために、単離ＲＮＡは、標準的な低塩溶出プロセスを用いて捕捉粒子から放出されるか、またはポリｄＴとの塩基対合に関与しないＲＮＡの領域に結合するプライマーを用いてもしくは固相マトリックスとの他の相互作用で粒子上に保持しつつ増幅されうる。以上に記載の正確な体積および割合は、それほど重要ではなく、核物質の有意な放出が起こらないかぎり変更されうる。小スケールの調製には撹拌混合が好適であるが、他の混合手順に置き換えてもよい。しかしながら、凝集が防止されるように白血病患者組織または非白血病対照ドナー組織に由来するサンプルを処理することおよび溶解溶液のイオン強度を少なくとも約１５０ｍＭ、好ましくは１５０ｍＭ〜１Ｍにすることが重要である。なぜなら、より低いイオン強度では、核物質汚染（たとえば、ＤＮＡ）を生じて粘度が増加し、増幅および／または検出の工程が妨害されて偽陽性を生じるおそれがあるからである。ＲＮＡ分解を防止するために溶解溶液ではリチウム塩が好ましいが、１種以上の公知のＲＮアーゼ阻害剤と組み合わされる他の可溶性塩（たとえばＮａＣｌ）が同じように有効であろう。
【０１２６】
他の選択肢として、１つ以上のＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、および／もしくはＡＳＸＬ１遺伝子、ならびに／またはＮＵＰ９８−ＮＳＤ１または他のＮＵＰ９８転座の少なくとも一部を取得するために、以上に記載されるような増幅技術が有用でありうる。そのような増幅技術の１つは、遺伝子の既知の領域の断片を生成するように制限酵素が使用される逆ＰＣＲである（Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186 (1988)を参照されたい）。次に、分子内ライゲーションにより断片を環状化させ、既知の領域に由来するダイバージェントプライマーを用いるＰＣＲ用の鋳型として使用する。
【０１２７】
代替的手法では、リンカー配列に対するプライマーと既知の領域に特異的なプライマーとを用いて増幅を行うことにより、部分配列に隣接する配列を取り出すことが可能である。増幅された配列は、典型的には、同一のリンカープライマーと既知の領域に特異的な第２のプライマーとを用いる第２ラウンドの増幅に付される。既知の配列から両方向に伸長を開始する２つのプライマーを利用するこの手順の変法が、ＰＣＴ特許国際公開第１９９６／０３８５９１号に記載されている。
【０１２８】
他のそのような技術は、既知の配列の５’側または３’側の配列にハイブリダイズする内部プライマーおよび外部プライマーを用いる「ｃＤＮＡ末端の迅速増幅」またはＲＡＣＥである。その他の技術としては、キャプチャーＰＣＲ（Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-119 (1991)）およびウォーキングＰＣＲ（Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19:3055-3060 (1991)）が挙げられる。増幅を利用する他の方法を利用して、全長ｃＤＮＡ配列を取得することも可能である。
【０１２９】
多種多様な標識およびコンジュゲーション技術が当業者に公知であり、種々の核酸アッセイで使用されうる。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプローブを産生するための手段としては、標識化ヌクレオチドを用いる、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、またはＰＣＲ増幅が挙げられる。他の選択肢として、ｍＲＮＡプローブを産生するために、配列またはその任意の一部分をベクター中にクローニングすることが可能である。そのようなベクターは、当技術分野で公知であり、市販されており、かつＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼと標識化ヌクレオチドとを添加することによりin vitroでＲＮＡプローブを合成するために使用可能である。こうした手順は、さまざまな市販のキットを用いて実施可能である。使用しうる好適なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤、さらには基質、補因子、阻害剤、磁性粒子などが挙げられる。
【０１３０】
核酸配列決定
チェーンターミネーション法は、Frederick Sangerにより初めて開発されたものであり、サンガー配列決定法として参照可能である。チェーンターミネーション法では、４つのＰＣＲ反応が行われ、各反応は、３’ヒドロキシル基が欠如したヌクレオチド（たとえば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ）である単一ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）でスパイクされる。ｄｄＮＴＰがＤＮＡの（新生）鎖に組み込まれると、新生鎖の合成が停止され、これにより、さまざまな長さのオリゴヌクレオチドの混合物が形成され、この混合物は、たとえばスラブゲルまたはキャピラリーでＤＮＡ電気泳動を用いて、サイズにより分割可能である。任意の数の検出方法、たとえば、オートラジオグラフィー、ＵＶ光検出、または蛍光色素検出を用いて、４つの反応のそれぞれでオリゴヌクレオチドの相対長さにより測定されるＤＮＡ配列を読み取ることが可能である。色素ターミネーション法はチェーンターミネーション法の変法であり、各タイプのｄｄＮＴＰ（たとえば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ）は異なる色の蛍光色素で標識される。これにより単一ＰＣＲ反応でＤＮＡの配列決定を行いうる。
【０１３１】
大規模並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）は、本明細書に開示された方法で使用可能な高スループット配列決定法である。それは、作製された何十万もの短いＤＮＡ配列に対してアダプターライゲーションおよびそれに続くアダプターデコーディングを利用するビーズベースの方法である。この技術に関するさらなる情報は、Brenner et al., Nat Biotechnol. 18(6):630-634 (2000)、Reinartz et al., Brief Funct Genomic Proteomic. 1(1):95-104 (2002)、および米国特許第６，０１３，４４５号に見いだされうる。
【０１３２】
ポロニー配列決定は、本明細書に開示された方法に従って使用可能な他の高スループット配列決定技術である。ポロニー配列決定は、エマルジョンＰＣＲと自動顕微鏡とライゲーションベースの配列決定化学とを組み合わせたものである。この技術に関するさらなる情報は、米国特許出願公開第２００９／０３１８２９８号、同第２０１１／０１７２１２７号、同第２０１０／００４７８７６号、および同第２００９／００９９０４１号、ならびに米国特許第７，４２５，４３１号に見いだされうる。
【０１３３】
４５４ピロシーケンシングは、本明細書に開示された方法で使用可能な高スループット配列決定法である。４５４ピロシーケンシングでは、ＤＮＡは、油溶液中の水ドロップレット内で増幅され（エマルジョンＰＣＲ）、各ドロップレットは、単一プライマーコート付きビーズに装着された単一ＤＮＡ鋳型を含有してクローンコロニーを形成する。配列決定機は、多くのピコリットル容積のウェルを含有し、それぞれ単一ビーズおよび配列決定酵素を含有する。ルシフェラーゼ発生光を用いて新生ＤＮＡに付加された個別のヌクレオチドを検出し、組み合わされたデータを用いて配列リードアウトを生成する。この技術に関するさらなる情報は、米国特許第６，２１０，８９１号および同第７，６４８，８２４号に見いだされうる。
【０１３４】
本明細書に開示された方法に有用でありうる高スループット配列決定法は、可逆色素ターミネーターを利用するシーケンシングバイシンセシス（ＳＢＳ）技術（Illumina（登録商標）, San Diego, CA）である。局所クローンコロニーが形成されたように、最初に、一本鎖ポリヌクレオチドをスライド上のプライマーに装着して増幅させる。４つの示差的標識ｄｄＮＴＰを添加して１つの塩基対により新生ポリヌクレオチドを伸長し、その後、取り込まれていないヌクレオチドを洗浄除去する。スライドの画像を記録し、各新生ＤＮＡ分子の末端ヌクレオチドを蛍光シグナルの色に基づいて決定する。次いで、色素および末端３’ブロッカーをＤＮＡから化学的に除去し、次のサイクルを可能にする。この技術に関するさらなる情報は、米国特許第７，９８５，５６５号、同第７，１１５，４００号、同第７，９７２，８２０号、および同第７，７９０，４１８号、ならびに米国特許出願公開第２００８／０２８６７９５号、同第２００２／００５５１００号、および同第２００７／００１５２００号に見いだされうる。
【０１３５】
ＳＯＬｉＤ（オリゴヌクレオチドライゲーションおよび検出による配列決定）配列決定は、本明細書に開示された方法で使用可能な他の高スループット配列決定法である。（Applied Biosystems）。この方法は、ライゲーションによる複数のラウンドの配列決定を含み、各ライゲーションプローブは、８塩基長であり、各塩基は、２つのライゲーション反応で効果的にプローブされる。塩基コールは、カメラにより取り込まれた蛍光データに基づいて行われる。この技術に関するさらなる情報は、米国特許出願公開第２００９／０１８１８６０号および米国特許第７，８５１，１５８号に見いだされうる。
【０１３６】
イオン半導体配列決定は、本明細書に開示された方法に有用な高スループット配列決定技術でありうる。イオン半導体配列決定では、ＤＮＡの重合時に放出される水素イオンが検出される。単一鋳型ＤＮＡ鎖を含有するマイクロウェルは、単一ポリヌクレオチドを用いてフラッディングされ、鋳型鎖の先導ヌクレオチドに相補的である場合、ＤＮＡの新生鎖に組み込まれる。検出された水素レベルを用いて、たとえば、ポリヌクレオチドリピートの領域で、２つ以上のヌクレオチドの挿入を検出可能である。この技術に関するさらなる情報は、米国特許第７，２４２，２４１号、同第７，８８８，０１５号、同第７，６４９，３５８号、同第７，６８６，９２９号、および同第８，１１４，５９１号、ならびに米国特許出願公開第２０１０／０１５９４６１号に見いだされうる。
【０１３７】
ＤＮＡナノボール配列決定は、本明細書に開示された方法で利用しうる他の有用な高スループット配列決定技術である。この技術で、ローリングサークル複製を用いてＤＮＡ断片からＤＮＡナノボールを作製する。次いで、ＤＮＡナノボールをマイクロアレイフローセル中に固着可能であり、ここでライゲーションによる非連鎖配列決定と称されるプロセスを用いて長さ約１０ｂｙのリードを生成する（Complete Genomics）。さらに詳しい情報は、米国特許出願公開第２００９／００１１９４３号、同第２００９／０２７０２７３号、同第２０１１／０２６８３４７号、および同第２００９／０２６４２９９号に見いだされうる。
【０１３８】
本明細書に開示された方法によれば、組織サンプルに由来するポリヌクレオチド（たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）からペアエンドタグライブラリーを構築し、これを高スループット配列決定技術を用いて高速および／または正確な配列アセンブリーを増加させることが可能である。ヌクレオチドは、キャプチャーベースの技術を利用して配列決定可能であり、他の選択肢として、ヌクレオチドは、ＰＣＲによる増幅後に配列決定可能である。ヌクレオチドは、メチル化配列を同定するために配列決定前にビスルフィットで処理可能である。メチル化特異的ＰＣＲは、特定の遺伝子座がメチル化されるか決定するために配列決定前に利用可能である。白血病サンプルに由来するポリヌクレオチドは、ペアエンド全エキソーム配列決定（ＷＥＳ）、シャロウメイトペア全ゲノム配列決定（ｓＭＰ−ＷＧＳ）、および／またはペアエンドＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）を用いて、配列決定可能である。白血病サンプルに由来するポリヌクレオチドは、Illumina（登録商標）配列決定を用いて配列決定可能である。
【０１３９】
蛍光in situハイブリダイゼーション
白血病の組織サンプルまたは細胞におけるＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、および／もしくはＡＳＸＬ１ゲノム配列の１つ以上での突然変異ならびに／またはＮＵＰ９８−ＮＳＤ１もしくは他のＮＵＰ９８転座は、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により検出可能である。
【０１４０】
ＦＩＳＨは、染色体上の特定のＤＮＡ配列の存在または不在を検出および位置特定するために使用可能な細胞遺伝学的技術である。ＦＩＳＨでは、高度の配列相補性を示す染色体の部分のみに結合する蛍光タグ付き核酸プローブが使用される。こうして、ＦＩＳＨを利用することにより組織内または細胞内（たとえば、特定の染色体上または特定の細胞内）の特定のヌクレオチド配列を位置特定可能である。こうして、ＦＩＳＨを利用することにより、核型分析、さらには転座、再構成、重複、ならびにＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、および／もしくはＡＳＸＬ１ゲノム配列の１つ以上を含む染色体物質の利得または喪失によるコピー数変動、ならびに／またはＮＵＰ９８−ＮＳＤ１もしくは他のＮＵＰ９８転座の検出が可能である。また、ＦＩＳＨを用いて、白血病の組織および細胞でｍＲＮＡを含む特定のＲＮＡ標的を検出および位置特定することが可能であると共に、白血病の組織内および細胞内の時間空間的遺伝子発現パターンを規定することが可能である。
【０１４１】
また、ＦＩＳＨを利用して組織内または細胞内のｍＲＮＡを位置特定することにより、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、および／もしくはＡＳＸＬ１ゲノム配列の１つ以上での突然変異ならびに／またはＮＵＰ９８−ＮＳＤ１もしくは他のＮＵＰ９８転座を含む白血病に関連する突然変異を有する遺伝子など遺伝子の発現を検出することが可能である。
【０１４２】
ＦＩＳＨ技術の使用が可能なプローブは、白血病の組織または細胞で、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、および／もしくはＡＳＸＬ１ゲノム配列の１つ以上での１つ以上の突然変異ならびに／またはＮＵＰ９８−ＮＳＤ１もしくは他のＮＵＰ９８転座を検出するように、ならびに／あるいはＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、および／もしくはＡＳＸＬ１ゲノム配列ならびに／またはＮＵＰ９８−ＮＳＤ１もしくは他のＮＵＰ９８転座の１つ以上によりコードされるｍＲＮＡを可視化するように、設計可能である。
【０１４３】
好適なプローブは、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、および／もしくはＡＳＸＬ１ゲノム配列ならびに／またはＮＵＰ９８−ＮＳＤ１もしくは他のＮＵＰ９８転座の１つ以上の少なくとも約２０連続ヌクレオチドの二本鎖を含有し、それらのゲノム配列の１つ以上の領域の増幅により作製されるＰＣＲアンプリコンから誘導可能である。プローブは、その標的配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な大きさでなければならないが、ハイブリダイゼーションプロセスを妨害したりまたは非標的配列に非特異的に結合したりするほど大きなものであってはならない。全染色体に沿ってハイブリダイズするプローブ配列の混合物を用いて、遺伝子転座を検出したりまたはクロマチンの染色体外断片を同定したりすることが可能である。プローブの蛍光タグ付けは、ニックトランスレーションによりまたはタグ付きヌクレオチドを用いたＰＣＲにより達成可能である。
【０１４４】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片または凍結組織切片を固定し、次いで、透過化させて標的に到達可能にしうる。間期または中期の染色体を調製し、ガラススライドなどの固体基材に装着させる。次いで、プローブを染色体ＤＮＡに適用して約１２時間インキュベートすることにより、標的ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡへの標的特異的プローブのハイブリダイゼーションを可能にしうる。いくつかの洗浄工程により、ハイブリダイズされていないプローブまたは部分的にハイブリダイズされたプローブを除去する。次いで、標的特異的ハイブリダイゼーションの可視化および／または蛍光顕微鏡法による定量を行う。この際、蛍光色素を励起して画像を記録する技術が利用される。
【０１４５】
ＤＮＡの特定の領域（遺伝子座）に特異的なより小さいプローブの混合物を用いて、欠失突然変異を検出することが可能である。特定の色と組み合わせた場合、遺伝子座特異的プローブ混合物を用いて非常に特定の転座が検出される。
【０１４６】
QuantiGene ViewRNA FISHは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された組織サンプルおよび細胞でＲＮＡ分子の検出および定量を行う技術である。ViewRNA FISHプローブを用いると、実質上バックグラウンドを伴うことなく単分子ＲＮＡ感度が可能になる。各オリゴヌクレオチド対は、分岐状ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）シグナル増幅技術を用いた一連の逐次ハイブリダイゼーション工程を介してシグナル増幅構造の集合（ツリー）のプラットフォームを形成する。各完全集合構造は、標的核酸の４０〜５０ビット／ｓの空間をカバーし、４００倍のシグナル増幅能を有する。
【０１４７】
Stellaris FISH（Single Molecule RNA FISHとしても知られる）は、薄い組織サンプルでｍＲＮＡおよび他の長いＲＮＡ分子の検出および定量を行う方法である。標的は、複数の短い単一標識オリゴヌクレオチドプローブを適用することにより、確実に画像化可能である。ｍＲＮＡの単分子に４８個までの蛍光標識オリゴヌクレオチドを結合させることにより、広視野蛍光顕微鏡画像で各標的ｍＲＮＡの検出および位置特定を正確に行うのに十分な蛍光が提供される。意図されたヌクレオチド配列に結合しないプローブは、バックグラウンドと区別するのに十分な局在蛍光を達成しない。Single-molecule RNA FISHアッセイは、一本鎖または多重鎖で実施可能であり、定量ＰＣＲの追跡実験として使用可能であるか、または蛍光抗体アッセイと同時に画像化可能である。
【０１４８】
Fiber FISHは、従来のＦＩＳＨのように密にコイル状になることなく直線状に伸長されるようにまたは間期ＦＩＳＨのようにランダムコンフォメーションをとるように間期染色体をスライドに装着する技術である。これは、スライドに固定されてから溶解された細胞または精製されたＤＮＡの溶液のいずれかに対して、スライドの長さに沿って機械的剪断を適用することにより（たとえば、染色体コーミングにより）に達成される。染色体の伸長コンフォメーションは、数キロ塩基まで、劇的に高い分解能を可能にする。
【０１４９】
以下は、ゲノム配列内の突然変異を検出するための本明細書に記載の技術さらには当技術分野で公知でありかつ利用可能である他の技術の例示的な適用である。とくに、以下では、ＭＬＬ転座およびＭＬＬ部分縦列重複さらには本明細書に開示されたＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、および／もしくはＡＳＸＬ１ゲノム配列の１つ以上でのさまざまな突然変異ならびに／またはＮＵＰ９８−ＮＳＤ１もしくは他のＮＵＰ９８転座の検出を記載する。本明細書に記載および例示された技術を適合化させることにより、本明細書に記載の種々の技術を他の遺伝子および他の突然変異に広く適用可能であることは、当業者であれば分かるであろう。
【０１５０】
ＭＬＬ転座およびＭＬＬ部分縦列重複（ＰＴＤ）
ＭＬＬ転座およびＭＬＬ部分縦列重複（ＰＴＤ）を有するリンパ芽球性白血病の遺伝子発現プロファイルは、顕著に一貫性があり、他の白血病とは有意に異なり、「混合系統白血病」に因んでＭＬＬとして参照される特有の疾患と考えられる。ＭＬＬ転座を検出するための方法は、米国特許出願公開第２００６／００５７６３０号に記載されている。主成分分析を用いた発現プロファイルの評価により、ＭＬＬと従来のＡＬＬさらにはＡＭＬとが区別される。明らかに好ましくない予後を有するヒト急性白血病のサブセットは、染色体セグメント１１ｑ２３上に混合系統白血病（ＭＬＬ、ＨＲＸ、ＡＵ−１）遺伝子を含む染色体転座を有する。ヒトＭＬＬ遺伝子転座ブレイクポイントに広がるＤＮＡセグメントは、配列番号２５として提供される。
【０１５１】
ＭＬＬ一次縦列重複（ＰＴＤ）を検出するための方法は、米国特許出願公開第２００７０２１２６８７号、Whitman et al., Blood 106:345-352 (2005)、およびCaligiuri et al., Cancer Res. 58:55-59 (1998)に記載されている。かかるＰＴＤは、たとえば、Strout, M. P., et al. PNAS (USA) 95:2390-2395, (1998)に記載されており、これは参照により組み込まれる。ＭＬＬ−ＰＴＤをスクリーニングするための方法としては、ネステッドＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロッティングが挙げられる。従来のネステッド逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、Caligiuri et al., Cancer Res. 56(6):1418-1425 (1996)にすでに記載されるように実施可能である。次いで、クローン化ＰＣＲ産物を配列決定可能である。
【０１５２】
ＭＬＬ−ＰＴＤはまた、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）により検出可能である。プライマー対および二重標識プローブのセットは、ＭＬＬ−ＰＴＤに特有のまたはＭＬＬ  ＰＴＤおよびＭＬＬ  ＷＴ転写物の両方に共通の部位を増幅するように設計される。プライマーおよびプローブのセットは、２つの最も一般的な形態のＭＬＬ  ＰＴＤに特異的な「ユニークアンプリコン」エキソン１１〜エキソン５またはエキソン１２〜エキソン５融合体を増幅するように、ならびにＭＬＬ−ＰＴＤおよびＭＬＬ  ＷＴ転写物の両方に見いだされうる「共通アンプリコン」エキソン１１〜エキソン１２、エキソン１３〜エキソン１４、およびエキソン２６〜エキソン２７接合体を増幅するように、設計可能である。標準曲線は、標的アンプリコンのコピー数の測定が可能になるように構築可能である。次いで、ABI Prism 7700 Sequence Detection System （PE Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて、ＱＲＴ−ＰＣＲデータを収集可能である。
【０１５３】
ｐ３００−ｋＤａ  ＭＬＬ  ＷＴおよびｐ４２０−ｋＤａ  ＭＬＬ  ＰＴＤ  Ｎ末端断片を検出するための免疫ブロッティング分析は、Nakamura et al., Mol. Cell. 10:1119-1128 (2002)に記載されるように実施可能である。簡潔に述べると、核抽出物を４．９％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でサイズ分画する。転写後、Ｎ末端ｐ３００ＭＬＬ  ＷＴ翻訳後切断産物に対するアフィニティー精製抗ＭＬＬ抗体である抗ＭＬＬ  １７０抗体を用いて膜をプローブする。タンパク質は、enhanced chemiluminescence Plus（Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ）を用いて可視化可能である。
【０１５４】
ＭＬＬ  ５’ＣｐＧアイランドは、http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/に記載のアルゴリズムおよびＭＬＬゲノム配列（NCBI GenBank受託番号ＮＴ０３３８９９．６）を用いて同定可能である。メチル化状態は、以上に記載のゲノムＤＮＡのビスルフィットＰＣＲ配列決定（ＢＳ−ＰＣＲ）により評価可能である。Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. (1992)。ＰＣＲは、非メチル化配列の増幅へのバイアス能を最小限に抑えるように最適化可能である。次いで、単一ＰＣＲ産物は、アガロースゲルから精製され、pCR2.1クローニングベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）中にクローニングされ、そして配列決定可能である。本実施例では、最小１０クローン／ＰＣＲが評価されよう。
【０１５５】
ＭＬＬ特異的プライマー対は、ＭＬＬの転写開始部位の上流の領域（ヌクレオチド−１６８〜−２）を増幅するように、設計される。規格化のために、Barlev et al., Mol Cell. 8:1243-1254 (2001)にすでに記載されたＧＡＰＤＨプロモーター特異的プライマーを用いて、ＧＡＰＤＨなどのハウスキーピング遺伝子のＣｈＩＰ解析を行うことが可能である。ＰＣＲ条件は、産物が対数増幅期に検出されるように最適化可能である。相対定量は、SybrGreen色素およびリアルタイムＰＣＲを用いて実施可能である。比較リアルタイムＰＣＲ（２−ΔΔＣＴ）法を用いて、最初に対照レベルと対比してインプットＤＮＡレベルおよび続いてデプシペプチド処理レベルを規格化可能である。
【０１５６】
ＮＰＭ１突然変異
ヌクレオフォスミンＮＰＭ１の突然変異は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）で最も多い後天性分子異常である。ＮＰＭ１をコードする遺伝子のエキソン１２の突然変異は、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＡＭＬの症例の約３５％であり、典型的には、フレームシフトを引き起こして結果としてＮＰＭ１タンパク質の７個のＣ末端アミノ酸を１１個の異なる残基で置き換える４ヌクレオチド挿入を含むことから、２個のＣ末端トリプトファン残基および最後の５個の残基（すなわち、ＶＳＬＲＫ）、最終的には９個のアミノ酸（すなわち、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ）の１つの破壊がＮＰＭ１突然変異機能に重要であることが示唆されてきた。Falini et al., N. Engl. J. Med. 352:254-266 (2005)およびVerhaak et al., Blood 106(12):3747-3754 (2005)。
【０１５７】
ＮＰＭ１の突然変異は、Verhaak et al., Blood 106(12):3747-3754 (2005)に記載の方法により例証されるように、当技術分野で周知のさまざまな方法により検出可能である。ＲＮＡを白血病細胞から単離して、以上に記載されるようにｃＤＮＡ合成を行うことが可能である。Valk et al., N. Engl. J. Med. 350:1617-1628 (2004)およびVan der Reijden and van der Poel et al., Hematol. J. 2:206-209 (2001)。
【０１５８】
エキソン１２のＮＰＭ１突然変異は、たとえば、２５ｍＭデオキシリボヌクレオシド三リン酸［ｄＮＴＰ］、１５ｐｍｏｌプライマー、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、Ｔａｑポリメラーゼ、および１０×緩衝液を含有する反応系で、プライマーＮＰＭ１−ＦＯＲ  ５’−ＣＴＴＣＣＧＧＡＴＧＡＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＧ−３’およびプライマーＮＰＭ１−ＲＥＶ  ５’−ＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＴＴＴＡＴＣＡＡＡＣＡＣＧ−３’を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＧＲ）増幅により決定が可能である［Invitrogen Life Technologies, Breda, Tire Netherlands］。ＮＰＭ１突然変異検出のためのサイクル条件は、９４℃で５分間を１サイクルで、９４℃で１分間、５８℃で１分間、および７２℃で１分間を３０サイクルで、ならびに７２℃で７分間を１サイクルで含む。
【０１５９】
ＰＣＲ産物をTransgenomics（Omaha, NE）WAVE dHPLCシステム（Choy et al., Ann. Hum. Genet. 63(pt 5):383-391 (1999)）を用いるｄＨＰＬＣに付して、サンプルを５６℃および５８℃で流動させることが可能である。異常な高性能液体クロマトグラフィー（ｄＨＰＬＣ）プロファイルを示すサンプルで正確なＮＰＭ１突然変異配列を確認可能であり、そしてMultiscreen-PCR 96-well system（Millipore, Bedford, MA）を用いてＰＣＲ産物を精製し、続いてABI-PRISM3100 genetic analyzer（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いてＮＰＭ１−ＲＥＶにより直接配列決定を行うことが可能である。各ＮＰＭ１突然変異体は、特定のｄＨＰＬＣ  ＷＡＶＥプロファイルを呈する。こうして、各タイプのＮＰＭ１突然変異を特定のｄＨＰＬＣ  ＷＡＶＥプロファイルに基づいて予測することが可能である。
【０１６０】
遺伝子発現プロファイリングは、ＡＭＬを有する個体を包括的に分類してＡＭＬの異質性をさらに解明する強力な方法である。Valk et al., Curr. Opin. Hematol.12:76-81 (2005)。突然変異ＮＰＭ１の作用は、遺伝子発現プロファイリングを用いて研究されており、ＮＰＭ１突然変異に特有のシグネチャーを明らかにした。Alcalay et al., Blood 106:899-902 (2005)。すでに確立された遺伝子発現シグネチャーを有するＡＭＬの特定のサブタイプでＮＰＭ１突然変異クラスターを有するＡＭＬ症例は、ホメオボックス遺伝子特異的発現シグネチャーにかなり関連しており、高い確度で予測可能である。このシグネチャーのプレーヤーの中には、ホメオボックス（ＨＯＸ）転写因子のいくつかのホメオドメイン含有するファミリーメンバーが存在した。
【０１６１】
白血病細胞はまた、Affymetrix HGU133A GeneChips（Affymetrix, Santa Clara, CA）を用いた遺伝子発現プロファイリングおよび教師なしクラスター分析により解析可能である。Valk et al., N Engl J Med. 350:1617-1628 (2004)。遺伝子発現プロファイルに基づく教師なしクラスター解析は、OmniViz（Maynard, MA）の相関図ツール（バージョン３．６）を用いて実施可能である。OmniVizで計算されたピアソン相関値をMicroArray Data Explorer（MADEx）にインポートし、OmniViz教師なしクラスター化の結果および他のパラメーター、たとえば、白血病患者の細胞の臨床的および分子的な特徴の間の関係を可視化することが可能である。ＭＡＤＥｘは、マイクロアレイデータの記憶、取出し、および可視化を確実かつスケール調整可能に行うデータベースシステムである。
【０１６２】
ドミナントホメオボックス（ＨＯＸ）遺伝子特異的シグネチャーは、ＮＰＭ１突然変異を有するＡＭＬに強く関連する。さらに、ＨＯＸＡおよびＨＯＸＢ遺伝子ファミリーのメンバーだけでなく、ＨＯＸ遺伝子関連の３アミノループ伸長（ＴＡＬＥ）遺伝子、ＰＢＸ３、およびＭＥＩＳ１の発現が増加する。
【０１６３】
ＮＰＭ１突然変異予測分析は、ＰＡＭアルゴリズムを用いて実施可能である。Tibshirani et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 99:6567-6572 (2002)。ＡＭＬサンプルは、ＮＰＭ１突然変異を含まないサンプルおよびＮＰＭ１突然変異を含むサンプルからなるトレーニングセット、ならびにＮＰＭ１突然変異が欠如しているサンプルおよびＮＰＭ１突然変異を含むサンプルからなる検証シリーズにランダムに割り当てられる。交差検証を用いて、トレーニングセットのＮＰＭ１の突然変異状態を予測することが可能である。ＮＰＭ１突然変異ＡＭＬ症例は、特有のシグネチャーを有するため、高い確度で予測される。突然変異ＮＰＭ１を有するＡＭＬ症例は、強力なＨＯＸ遺伝子特異的ＳＡＭおよびＰＡＭシグネチャーを呈する。これまでの研究から、過剰発現を持続しかつタンパク質結合パートナーＭＥＩＳ１を有するいくつかのＨＯＸ遺伝子が白血病をもたらすことが実証された。Daser and Rabbitts, Semin. Cancer Biol. 15:175-188 (2005)。
【０１６４】
ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１転座
ＡＭＬでは、再発性ｔ（５；１１）（ｑ３５；ｐ１５．５）転座は、核レセプター結合ＳＥＴドメイン含有タンパク質１（ＮＳＤ１）をヌクレオポリン９８（ＮＵＰ９８）に融合する。Cerveira et al., Leukemia 17:2244-2247 (2003)。ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１は、in vivoでＡＭＬを誘発し、かつin vitroで骨髄系幹細胞の自己再生を持続することが示された。Wang et al., Nat Cell Biol 9:804-812 (2007)。
【０１６５】
機構的に、ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１複合体は、ＨＯＸＡ７およびＨＯＸＡ９に近接したゲノムエレメントに結合し、ヒストンＨ３  Ｌｙｓ３６（Ｈ３Ｋ３６）メチル化およびヒストンアセチル化のレギュレーションを介して分化時にＨＯＸＡ遺伝子座のＥＺＨ２媒介転写抑制を維持する。Wang et al., Nat Cell Biol 9:804-812 (2007)。ＮＵＰ９８  ＦＧリピートドメインの欠失またはメチルトランスフェラーゼ活性の不活性化をもたらすＮＳＤ１の突然変異のいずれかは、ＨＯＸＡ遺伝子活性化および骨髄前駆体不死化の両方を防止することから、ＮＳＤ１のメチルトランスフェラーゼ活性は、腫瘍形成できわめて重要な役割を果たす可能性があることが示唆される。
【０１６６】
ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１転座では、ＮＵＰ９８およびＮＳＣ１  ｍＲＮＡは、インフレームで融合され、ＮＵＰ９８のヌクレオチド１５５２をＮＳＤ１のヌクレオチド３５０６に連結する。相互転写物は、ＮＳＤ１およびＮＵＰ９８  ｍＲＮＡをインフレームで融合し、ＮＳＤ１のヌクレオチド３５０５をＮＵＰ９８のヌクレオチド１５５３に連結する。
【０１６７】
ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１転座は、２５ｍＭデオキシリボヌクレオシド三リン酸［ｄＮＴＰ］、１５ｐｍｏｌプライマー、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、Ｔａｑポリメラーゼ、および１０緩衝液を含有する反応系で、センスＮＵＰ９８−５（５’−ＴＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＧＡＧＣＣＴＴＴＧ−３’）およびアンチセンスＮＳＤ１−１（５’ＴＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＴＴＧＣＴＴＧＧＣ−３’）プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により検出可能である［Invitrogen Life Technologies, Breda, The Netherlands］。ＮＰＭ１突然変異検出のためのサイクル条件は、９４℃で５分間を１サイクルで、９４℃で１分間、５８℃で１分間、および７２℃で１分間を３０サイクルで、ならびに７２℃で７分間を１サイクルで含みうる。
【０１６８】
ＤＯＴ１Ｌ阻害剤
ＤＯＴ１Ｌ阻害剤を用いて白血病患者を治療するためのこのたび開示された方法で好適に利用されうるＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、一般的には、米国特許出願公開第２０１２／０１４２６２５号およびＰＣＴ特許国際公開第２０１２／０７５３８１号、国際公開第２０１２／０７５４９２号、国際公開第２０１２／０７５５００号、および国際公開第２０１２／０８２４３６号、Yu et al., Nat. Commun. 3:1288 (2013)、Yu et al., Nat. Commun. 4:1893 (2013)、Yu et al., Bioorg. Med. Chem. 21(7):1787-1794 (2013)、Yao et al., J. Am. Chem. Soc. 133(42):16746-16749 (2011)、Basavapathruni et al., Chem. Biol. Drug Des. 80(6):971-980 (2012)、およびDaigle et al., Cancer Cell 20(1):53-65 (2011)に開示されている。これらの参考文献さらには本明細書に開示されたすべての他の参照文献は、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかのＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、ＥＰＺ００５６７６、ＥＰＺ００４７７７、ＳＧＣ−０９４６、ＳＹＣ−５２２、ＳＹＣ−５３４、ＳＹＣ−６８７、および他の市販品、たとえば、Selleckchem, Boston, MAまたはOtava Chemicals, Inc. Vaughan, Ontario製の市販品を含めて、市販されている。
【０１６９】
本明細書に開示される方法に使用可能なＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、約１００ｎＭ〜約１０μＭ、または約２５０ｎＭ〜約５μＭまで、または約５００ｎＭ〜約１μＭのＩＣ５０でＤＯＴ１Ｌを阻害し、プリン、７−デアザプリン、および本明細書に記載の炭素環置換プリン化合物を含み、これらは、ＥＰＺ００４７７７（１−（３−（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）プロピル）−３−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニル）ウレア）およびＥＰＺ００５６７６（９Ｈ−プリン−６−アミン，９−［５−デオキシ−５−［［シス−３−［２−［６−（１，１−ジメチルエチル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル］エチル］シクロブチル］（１−メチルエチル）アミノ］−β−Ｄ−リボフラノシル］−）により例証される。
【０１７０】
白血病患者の細胞の増殖および／もしくは生存を阻害するためのまたはかかる患者を治療するためのこのたび開示された方法で好適に利用されうるＤＯＴ１Ｌ阻害剤としては、式Ｉ：
【化１】
0006639390.tif 000010
により表される、国際公開第２０１２／０７５５００号および国際公開第２０１２／０８２４３６号に記載の７−デアザプリン化合物が挙げられる。
【０１７１】
白血病患者の細胞の増殖および／もしくは生存を阻害するためのまたはかかる患者を治療するためのこのたび開示された方法で好適に利用されうるＤＯＴ１Ｌ阻害剤としては、式ＩＩ：
【化２】
0006639390.tif 000011
により表される、国際公開第２０１２／０７５４９２号に記載の炭素環置換プリンおよび７−デアザプリン化合物が挙げられる。
【０１７２】
白血病患者の細胞の増殖および／もしくは生存を阻害するためのまたはかかる患者を治療するためのこのたび開示された方法で好適に利用されうるＤＯＴ１Ｌ阻害剤としては、式ＩＩＩ：
【化３】
0006639390.tif 000012
により表される、米国特許出願公開第２０１２／０１４２６２５号および国際公開第２０１２／０７５３８１号に記載のプリンおよび７−デアザプリン化合物が挙げられる。
【０１７３】
式Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩにより定義された化合物の範囲内に包含される化合物、ならびにそれらの化合物を合成するための方法は、米国特許出願公開第２０１２／０１４２６２５号およびＰＣＴ特許公開国際公開第２０１２／０７５３８１号、国際公開第２０１２／０７５４９２号、国際公開第２０１２／０７５５００号、および国際公開第２０１２／０８２４３６号に示されている。２つの代表的なそのような化合物は、ＥＰＺ００４７７７およびＥＰＺ００５６７６であり、これらは、容易に入手可能な出発材料（たとえば、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）からこれらの化合物を合成するための方法の説明と共に次の節に示される。
【０１７４】
ＥＰＺ００４７７７
低分子ＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７は、ｓ−アデノシルメチオニンミメティックであり、他のメチルトランスフェラーゼと比較してＤＯＴ１Ｌにかなり特異的である。Daigle et al., Cancer Cell 20(1):53-65 (2011)およびYu et al., Nat. Commun, 3:1288 (2013)。ＥＰＺ００４７７７は、ヒトＤＯＴ１Ｌの触媒ドメインのＳ−（５’−アデノシル）−１−メチオニン（ＳＡＭ）結合部位内に結合する。
【０１７５】
ＥＰＺ００４７７７は、０．３ｎＭのＫｉ値でＤＯＴ１Ｌに結合し、in vitroおよび細胞で生化学的に測定したとき、検査された他のメチルトランスフェラーゼと比較してＤＯＴ１Ｌに対して＞１，０００倍の選択性を呈する。Ｄａｉｇｌｅは、主要な白血病誘発ＭＬＬ融合標的遺伝子ＨＯＸＡ９およびＭＥＩＳ１の転写抑制と相関するＭＬＬ融合を有する白血病細胞に対して、ＥＰＺ００４７７７の高選択性抗増殖活性、分化活性、およびアポトーシス活性をさらに確認した。ＭＬＬ融合が欠如している白血病細胞は、ＥＰＺ００４７７７に対して約１／１００の感受性である。このin vitro選択性から、混合系列白血病のマウスモデルで白血病細胞が標的となって長期間生存がもたらされると解釈される。
【０１７６】
ＥＰＺ００４７７７（１−（３−（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）プロピル）−３−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニル）ウレア）の化学構造は、式ＸＩＶ：
【化４】
0006639390.tif 000013
で表される。
【０１７７】
ＥＰＺ００４７７７（１−（３−（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）プロピル）−３−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニル）ウレア）の合成は、ＰＣＴ特許国際公開第２０１２／０７５５００号に記載されている。
【０１７８】
工程１：（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，ＳＲ）−２−（４−（（２，４−ジメトキシベンジル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−Ｓ−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−３，４−ジオールの合成
１−ブタノール（１６．０ｍｌ）中の７−クロロツベルシジン（１．６７ｇ、５．８４ｍｍｏｌ）の懸濁液をＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．２２ｍｌ、７．０１ｍｍｏｌ）および１−（２，４−ジメトキシフェニル）メタンアミン（１．０５ｍｌ、７．０１ｍｍｏｌ）で処理して、１００〜１１０℃で一晩加熱する。２０時間後、ＬＣＭＳは、新しい生成物が形成されて出発材料が消費されることを示唆した。混合物を室温に冷却し、溶媒を高真空下で除去する。フラッシュクロマトグラフィー（２００ｇシリカゲル、５〜１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）により材料を精製することにより、標記化合物（２．１９ｇ、９０％）をフォームとして生成させる。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２０Ｈ２４Ｎ４Ｏ６に対してｍ／ｚ４１７．１（Ｍ＋Ｈ）＋、（ＥＳＩ−）Ｃ２０Ｈ２４Ｎ４Ｏ６に対してｍ／ｚ４１５．２（Ｍ−Ｈ）−、ＨＰＬＣ純度９７％（保持時間２．４１分）。
【０１７９】
工程２：（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（４−（（２，４ジメトキシベンジル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４ｄ［１，３］ジオキソール−４−イル）メタノール
アセトン（７６．５ｍｌ）および２，２−ジメトキシプロパン（１６．５ｍｌ、１３４ｍｍｏｌ）中の（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（４−（（２，４−ジメトキシベンジル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−５−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−３，４−ジオール（３．３０ｇ、７．４５ｍｍｏｌ）の溶液を、１０−カンファースルホン酸（１．７３ｇ、７．４４ｍｍｏｌ）で一度に処理して、反応系を室温で撹拌する。１時間後、ＨＰＬＣによればすべてのＳＭが消費される。重炭酸ナトリウム（１．８８ｇ、２２．３ｍｍｏｌ）の添加により反応をクエンチし、反応混合物を３０分間撹拌すると、その間、沈殿物が形成される。反応混合物を２００ｍｌのＣＨＣ１３と７５ｍｌのＨ２Ｏとの間で分配する。混合物を１５ｍｌのブラインで希釈し、抽出し、そして相を分離する。水性相を５０ｍｌずつのＣＨＣ１３で２回洗浄し、合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水する。溶液を濾過し、そして濃縮してフォームを生成させる。粗生成物をメタノール（１３０ｍｌ、３２００ｍｍｏｌ）に取り込んで、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（１．２７ｇ、６．７０ｍｍｏｌ）で一度に処理する。混合物を室温で２時間撹拌し、その時点で、反応混合物を重炭酸ナトリウム（１．８８ｇ、２２．３ｍｍｏｌ）でクエンチし、そして混合物を３０分間撹拌する。溶媒を真空中で除去し、残渣を５０ｍｌのＨ２Ｏと１５０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２との間で分配し、そして抽出する。有機相を５０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、そして濃縮してフォームを生成させる。フラッシュクロマトグラフィー（１２０ｇシリカゲル、６０〜８０％ＥＡ／ヘプト）により生成物を単離して、標記化合物（２．８３ｇ、８３％）を薄黄色硬質フォームとして生成させる。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２３Ｈ２８Ｎ４Ｏ６に対してｍ／ｚ４５７．４（Ｍ＋Ｈ）＋、（ＥＳＩ−）Ｃ２３Ｈ２８Ｎ４Ｏ６に対してｍ／ｚ４５５．２（Ｍ−Ｈ）、ＨＰＬＣ純度９９％（保持時間３．０８分）。
【０１８０】
工程３：７−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（アジドメチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−Ｎ−（２，４−ジメトキシベンジル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
無水テトラヒドロフラン（３２ｍｌ）中の（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（４−（（２，４ジメトキシベンジル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−７−イル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メタノール（２．８３ｇ、６．２０ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（２．２８ｇ、８．６８ｍｍｏｌ）の溶液を氷／水浴中０℃で冷却する。ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（１．７１ｍｌ、８．６８ｍｍｏｌ）を滴下し、続いてテトラヒドロフラン（５．３ｍｌ、６６ｍｍｏｌ）中のジフェニルホスホン酸アジド（１．８７ｍｌ、８．６８ｍｍｏｌ）の溶液を滴下する。ＤＰＰＡ溶液の添加時、白色乳状沈殿物が生成する。約３０分後、反応混合物を室温に加温し、そして一晩撹拌する。２４時間後、すべての出発材料が消費されたことがＨＰＬＣから示唆される。反応混合物を元の体積の約１／２に濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（１７５ｇシリカゲル、１０〜５５％ＥＡ／ヘプト）により精製することにより、標記化合物（２．４９ｇ、８３％）を微黄色硬質フォームとし生成させる。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２３Ｈ２７Ｎ７Ｏ５に対してｍ／ｚ４８２．２（Ｍ＋Ｈ）＋、（ＥＳＩ−）Ｃ２３Ｈ２７Ｎ７Ｏ５に対してｍ／ｚ４８０．１（Ｍ＋Ｈ）−、ｍ／ｚ５２６．１（Ｍ＋ＣＯ２Ｈ）−、ＨＰＬＣ純度９７％（保持時間３．６４分）。
【０１８１】
工程４：７−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（アミノメチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−Ｎ−（２，４ジメトキシベンジル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
テトラヒドロフラン（５０ｍＬ、６００ｍｍｏｌ）中の（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（アジドメチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−Ｎ−（２，４ジメトキシベンジル）−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−４−アミン（２．４９ｇ、５．１７ｍｍｏｌ）の溶液を、テトラヒドロフラン（７．２４ｍＬ、７．２４ｍｍｏｌ）中の１．０Ｍトリメチルホスフィンの溶液の滴下により処理し、そして混合物を室温で一晩攪拌する。２０時間後、ＨＰＬＣによればすべての出発材料が消費される。反応混合物を水（１．８０ｍＬ、９９．９ｍｍｏｌ）で処理し、室温で２時間撹拌する。反応混合物を濃縮し、粗生成物を９０ｍＬのＣＨ２Ｃｌｚに取り込んで、４つに分けた３０ｍＬずつのＨ２Ｏおよび１５ｍｌのブラインで洗浄する。溶液をＮａ２ＳＯ４で脱水して濾過し、濃縮して油を生成し、これを高真空の適用下でフォームにする。フラッシュクロマトグラフィー（１２０ｇシリカゲル、ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌｚ中３〜１０％の７Ｎ  ＮＨ３）により粗材料を精製することにより、標記化合物（１．７６ｇ、７５％）をフォームとして生成させる。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２３Ｈ２９ＮＯ５に対してｍ／ｚ４５６．２（Ｍ＋Ｈｔ、（ＥＳＩ−）Ｃ２６Ｈ３ＳＮｓＯｓに対してｍ／ｚ４５４．１（Ｍ−ＨＹ、ＨＰＬＣ純度９２％、保持時間２．６５分）。
【０１８２】
工程５：Ｎ−（２．４−ジメトキシベンジル）−７−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（（イソプロピルアミノ）メチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−４−アミン
１，２−ジクロロエタン（３４ｍｌ）中の（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（アミノメチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−Ｎ−（２，４−ジメトキシベンジル）−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−４−アミン（１．７６ｇ、３．８６ｍｍｏｌ）の溶液をアセトン（０．３１ｍｌ、４．２ｍｍｏｌ）および酢酸（０．２２ｍｌ、３．９ｍｍｏｌ）の滴下により処理し、続いてナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（０．９８ｇ、４．６ｍｍｏｌ）で処理し、そして終了まで混合物を室温で撹拌する。１時間後、出発材料が消費されて反応が終了することがＨＰＬＣにより示唆される。反応混合物を６０ｍＬのＣＨ２Ｃｂで希釈し、そして５０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄する。水性相を３０ｍＬのＣＨ２Ｃｂで洗浄し、合わせた有機相を４０ｍＬのブラインで洗浄し、そしてＮａ２ＳＯ４で脱水する。溶液を濾過し、濃縮して標記化合物（１．７６ｇ、９２％）をガラス質として生成させ、これを次の工程で直接使用する。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２６Ｈ３ＳＮｓＯｓに対してｍ／ｚ４９８．３（Ｍ＋Ｈｔ、ＨＰＬＣ純度９０％（保持時間２．７４分）。
【０１８３】
工程６：２−（３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（４−（（２，４−ジメトキシベンジル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）プロピル）イソインドリン−１，３−ジオン
ｙ−ブロモプロピルフタルイミド（２．３７ｇ、８．８５ｍｍｏｌ）、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヨージド（０．２３４ｇ、０．６３２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．４０ｍｌ、８．０４ｍｍｏｌ）、およびＮ−（２，４−ジメトキシベンジル）−７−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（（イソプロピルアミノ）メチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン（３．４２ｇ、６．３２ｍｍｏｌ）の混合物をプロパンニトリル（２５ｍｌ）に取り込んで、９５℃で加熱する。９５℃で４８時間後、反応がほぼ終了することがＨＰＬＣにより示唆される。反応混合物を室温に冷却して、混合物を２００ｍｌのエチルアセテートで希釈し、そして２つに分けた１００ｍｌずつのＨ２Ｏおよび１００ｍｌのブラインで洗浄する。有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、そして濃縮してガラス質を生成させる。フラッシュクロマトグラフィー（２５０ｇシリカゲル、ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｂ中２〜４％の７Ｎ  ＮＨ３）により粗材料を精製することにより、標記化合物（３．１２ｇ、７２％）をフォームとして生成させる。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ３７Ｈ４４Ｎ６Ｏ７に対してｍ／ｚ６８５．２（Ｍ＋Ｈｔ、（ＥＳＩ−）Ｃ３７Ｈ４４Ｎ６Ｏ７に対してｍ／ｚ７２９（Ｍ＋ＨＣＯ２Ｙ、ＨＰＬＣ純度９９％（保持時間３．１７分）。
【０１８４】
工程７：Ｎ１−（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（４−（（２，４−ジメトキシベンジル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）−Ｎ１−イソプロピルプロパン−１，３−ジアミン
２−（３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（４−（（２，４−ジメトキシベンジル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）プロピル）イソインドリン−１，３−ジオン（１．３７ｇ、２．００ｍｍｏｌ）をメタノール（３０ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）中の２Ｍメチルアミンに溶解させる。溶液を室温で５分間攪拌し、次いで５５〜６０℃で加熱する。１時間後、ＨＰＬＣによればＳＭは消費される。反応混合物を室温に冷却し、そして真空中で濃縮する。得られた黄褐色油を２０ｍＬのＭｅＯＨに取り込み、そして濃縮する。この手順を油に対して繰り返す。材料を高真空に配置して固体を生成させる。この固体は、Ｎ−メチルフタルイミドと共に標記化合物を含有していた。また、これを次の工程に使用する。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２９Ｈ４２Ｎ６ＯＳに対してｍ／ｚ５５５．４（Ｍ＋Ｈｔ、ＨＰＬＣ保持時間２．５７分。
【０１８５】
工程８：１−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニル）−３−（３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（４−（（２．４−ジメトキシベンジル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）プロピル）ウレア
メチレンクロリド（４０ｍｌ）中のＮ１−（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（４−（（２，４−ジメトキシベンジル）アミノ）−７Ｈピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）−Ｎ１−イソプロピルプロパン−１，３−ジアミン（１．１１ｇ、２．００ｍｍｏｌ、工程６からの粗製物）の懸濁液をメチレンクロリド（３．５ｍｌ）中の１−ｔｅｒｔ−ブチル−４−イソシアナトベンゼン（０．３６ｍｌ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液の滴下により処理し、そして室温で撹拌する。１時間後、ＨＰＬＣによれば反応は終了する。反応混合物を濃縮してガラス質を生成させる。フラッシュクロマトグラフィー（１００ｇシリカゲル、ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｂ中２〜４％の７Ｎ  ＮＨ３）により粗材料を精製することにより、標記化合物（１．０７ｇ、７３％）をフォームとして生成させる。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ４ｏＨｓｓＮ７Ｏ６に対してｍ／ｚ７３０．４（Ｍ＋Ｈｔ、（ＥＳＩ−）Ｃ４ｏＨｓｓＮ７０６に対してｍ／ｚ７２８．５（Ｍ−ＨＹ、ＨＰＬＣ純度８９％（保持時間３．７８分）。
【０１８６】
工程９：１−（３−（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，ＳＲ）−Ｓ−（４−アミノ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）プロピル）−３−（４−（ｔｅｒｔブチル）フェニル）ウレア
１−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニル）−３−（３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（４−（（２，４−ジメトキシベンジル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）プロピル）ウレア（１．０７ｇ、１．３９ｍｍｏｌ）を、０℃で冷却させたトリフルオロ酢酸（２５ｍｌ）と水（２．５ｍｌ）との混合物に溶解させ、得られた溶液を０℃で３０分間攪拌し、次いで室温に加温する。４時間後、ＨＰＬＣによれば反応は終了することが確認される。反応混合物を真空中で濃縮し、残渣を２５ｍＬのＭｅＯＨに取り込み（白色スラリー）、そして濃縮する。このプロセスを３回繰返し、得られた残渣を高真空下に配置する。材料を１００ｍＬの１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｂに取り込み、２つの７５ｍＬずつに分けた飽和ＮａＨＣＯ３および５０ｍＬの１％水性Ｎａ２ＣＯ３で洗浄する。有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、そして濃縮してガラス質／固体を生成させる。フラッシュクロマトグラフィー（１００ｇシリカゲル、ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌｚ中５〜１０％の７Ｎ  ＮＨ３）により粗材料を精製することにより、標記化合物（０．３５ｇ、４６％）を無色ガラス質として生成させる。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２８Ｈ４１Ｎ７Ｏ４に対してｍ／ｚ５４０．３（Ｍ＋Ｈｔ、（ＥＳＩ−）Ｃ２８Ｈ４１Ｎ７Ｏ４に対してｍ／ｚ５３８．３（Ｍ−Ｈｒ、ｍ／ｚ５８４．４（Ｍ＋ＨＣ０２Ｙ、ＨＰＬＣ純度９８％（保持時間２．８６分）、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ４−ＭｅＯＨ）ｐｐｍ８．０５（ｓ，１Ｈ），７．２７（ｄ，１＝３．７３Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｍ，２Ｈ），７．１８（ｍ，２Ｈ），６．６３（ｄ，１＝３．７３Ｈｚ，１Ｈ），６．１５（ｄ，１＝４．７７Ｈｚ，１Ｈ），４．４６（ｔ，１＝５．０８Ｈｚ，１Ｈ），４．１８（ｔ，１＝５．３９Ｈｚ，１Ｈ），４．１１（ｍ，１Ｈ），３．２２（ｍ，２Ｈ），３．０７（ｍ，１Ｈ），２．８５（ｍ，１Ｈ），２．７２（ｍ，１Ｈ），２．６０（ｔ，１＝６．４３Ｈｚ，２Ｈ），１．６８（ｍ，２Ｈ），１．２８（ｓ，９Ｈ），１．０５（ｄ，１＝６．６３Ｈｚ，３Ｈ），１．０１（ｄ，１＝６．４３Ｈｚ，３Ｈ）。
【０１８７】
工程１０：１−（３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）プロピル）−３−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニル）ウレアヒドロクロリド
５０ｍｌの５０％水性メタノール中の１−（３−（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）プロピル）−３−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニル）ウレア（１．６４ｇ、３．０４ｍｍｏｌ）の溶液を水（３．８７ｍＬ、３．０４ｍｍｏｌ）中の１．０Ｎ塩化水素で処理する。溶液を濃縮してメタノールのほとんどを除去し、そして一晩凍結乾燥させる。混濁混合物を微細フリットに通して濾過し、濾液を真空中で濃縮してＭｅＯＨを除去する。得られた溶液を一晩凍結乾燥させ標記化合物（１．７０ｇ、９７％）を固体として生成させる。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２８Ｈ４１Ｎ７Ｏ４に対してｍ／ｚ５４０．４（Ｍ＋Ｈｔ、ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２８Ｈ４１Ｎ７Ｏ４に対してｍ／ｚ５３８．４（Ｍ＋Ｈｔ、ｍ／ｚ５７４．４（Ｍ＋ＣｌＹ、ＨＰＬＣ純度９７％（保持時間２．８８分）、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ４−ＭｅＯＨ）ｐｐｍ８．１２（ｓ，１Ｈ），７．２９（ｍ，２Ｈ），７．２３（ｍ，３），６．６８（ｍ，１Ｈ），６．０９（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），４．５７（ｍ，１Ｈ），４．３５（ｍ，２Ｈ），３．７９（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），３．５５（ｍ，２Ｈ），３．２６（ｂｒ．ｓ．，４Ｈ），１．９４（ｍ，２Ｈ），１．３５（ｍ，６Ｈ），１．２９（ｓ，９Ｈ）。ＩＣｓｏ＜１０ｎＭ。
【０１８８】
ＥＰＺ００４７７７のin vivo投与は、マウスＭＬＬ異種移植モデルで生存の延長をもたらし、ＭＬＬ転座型白血病の治療に対するＥＰＺ００４７７７の有効性を支持する。
【０１８９】
ＥＰＺ００５６７６
ＥＰＺ００５６７６は、８０ｐＭのＫｉ値を示すＤＯＴ１Ｌメチルトランスフェラーゼ活性および＞２４時間の薬剤標的滞留時間の低分子Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）競合阻害剤である。Daigle et al., Blood Epub Ahead of Print (2013)。化合物は、ＤＯＴ１Ｌに対してかなり選択性があり、検査したすべての他のメチルトランスフェラーゼに対して＞３７，０００倍の選択性を示す。
【０１９０】
ＥＰＺ００５６７６（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−５−（（（（１ｒ，３Ｓ）−３−（２−（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）エチル）シクロブチル）（イソプロピル）アミノ）メチル）テトラヒドロフラン−３，４−ジオールの化学構造は、式Ｖ：
【化５】
0006639390.tif 000014
として表される。
【０１９１】
ＥＰＺ００５６７６（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−５−（（（（１ｒ，３Ｓ）−３−（２−（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）エチル）シクロブチル）（イソプロピル）アミノ）メチル）テトラ−ヒドロフラン−３，４−ジオールの合成は、米国特許出願公開第２００２／０１４２６２５号に記載されている。
【０１９２】
工程１：シスおよびトランスメチル３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ−［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）アミノ）シクロブタンカルボキシレートの合成
ＭｅＯＨ（８０ｍｌ）中のメチル３−オキソシクロブタンカルボキシレート（４．６０ｇ、３５．９４ｍｍｏｌ）、９−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（アミノメチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−９Ｈ−プリン−６−アミン（１１．０ｇ、３５．９４ｍｍｏｌ）およびＴｉ（ｉＰｒＯ）４（４．０ｇ、１４．０８ｍｍｏｌ）の溶液を４５℃で２時間撹拌し、次いで、ＮａＣＮＢＨ３（４．５ｇ、７１．８７ｍｍｏｌ）を添加する。反応系をＲＴで一晩撹拌する。反応を水性飽和ＮａＨＣＯ３（４０ｍｌ）でクエンチし、濾過し、ＤＣＭ（８０ｍｌ×３）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、そして濃縮する。残渣を分取ＨＰＬＣにより精製することにより、標記化合物（６．２ｇ、収量４１％）を取得する。ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：Ｏｎ８．３８−８．３４（ｍ，１Ｈ），７．９０（ｓ，１Ｈ），５．９８（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ），５．７５（ｂｒｓ，２Ｈ），５．４８−５．４６（ｍ，１Ｈ），５．０３−５．０１（ｍ，１Ｈ），４．３５−４．３３（ｍ，１Ｈ），３．６９−３．６６（ｍ，３Ｈ），３．５０−３．１７（ｍ，１Ｈ），３．０５−２．７３（ｍ，３Ｈ），２．４８−２．４４（ｍ，２Ｈ），１．９５−１．９１（ｍ，２Ｈ），１．６２（ｓ，３Ｈ），１．３９（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１９．２［Ｍ＋１］＋。メチル３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ−［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）アミノ）シクロブタンカルボキシレート（６．２ｇ）のシス／トランス混合物をキラルＨＰＬＣ（ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＡＤ−Ｈ  ２０×２５０ｍｍ、５μｍ（Ｄａｉｃｅｌ）、カラム温度：３５℃、移動相：ＣＯ２／メタノール（０．１％ＤＥＡ）＝７０／３０、流量：５０ｇ／分）を介して分離し、純粋シス生成物（３．５ｇ）および純粋トランス生成物（１．７ｇ）を与える。
【０１９３】
工程２：（１Ｓ，３ｓ）−メチル３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ−［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）シクロブタンカルボキシレートの合成
ＣＨ３ＣＮ（１５ｍｌ）中のシスメチル３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ−［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）アミノ）シクロブタンカルボキシレート（２．０ｇ、４．７８ｍｍｏｌ）の溶液に、２−ヨードプロパン（４．０ｇ、２３．９２ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１．０ｇ、７．１８ｍｍｏｌ）を添加する。反応系を密閉チューブ内で９５℃に一晩加熱する。混合物を濾過し、濾液を濃縮し、そしてＳＧＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１２：１）により精製することにより標記化合物（１．９ｇ、収率８６％）を取得する。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ΔＨ８．３７（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｓ，１Ｈ），６．０３（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ），５．５３−５．４８（ｍ，３Ｈ），５．００（ｂｒｓ，１Ｈ），４．２５（ｂｒｓ，１Ｈ），３．６６（ｓ，３Ｈ），３．１９−３．１８（ｍ，１Ｈ），２．９６（ｂｒｓ，１Ｈ），２．８０−２．７８（ｍ，１Ｈ），２．６７−２．５８（ｍ，２Ｈ），２．２０−２．１２（ｍ，４Ｈ），１．６２（ｓ，３Ｈ），１．３９（ｓ，３Ｈ），１．００（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ），０．８４（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６１．４［Ｍ＋１］＋。
【０１９４】
工程３：（１Ｓ，３ｓ）−３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２，２−ジメチルテトラヒ−ドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）シクロブタンカルバルデヒドの合成
ＤＣＭ（５０ｍｌ）中の（１Ｓ，３ｓ）−メチル３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ−［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）シクロブタン−カルボキシレート（１．２ｇ、２．６０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＬＣにより決定して出発材料がすべて消費されるまで、−７８℃でＤＩＢＡＬ−Ｈを滴下する。ＭｅＯＨ（２ｍｌ）を添加し、混合物を室温で３０分に撹拌し、その時点で水（５０ｍｌ）を添加し、そして混合物をＤＣＭで抽出する（５０ｍｌ×２）。有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水し、濃縮して粗標記化合物を取得し、（１．０ｇを使用して）次の工程に直接供する。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ΔＨ９．５６（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），８．３６（ｓ，１Ｈ），７．８８（ｓ，１Ｈ），６．０３（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），５．６６（ｂｒｓ，２Ｈ），５．５０（ｄｄ，Ｊ＝２．０，６．５Ｈｚ，１Ｈ），５．０１（ｄｄ，Ｊ＝３．５，６．５Ｈｚ，１Ｈ），３．３３１−３．３３７（ｍ，１Ｈ），２．９６−２．９７（ｍ，１Ｈ），２．７７−２．５９（ｍ，３Ｈ），２．１４−２．０５（ｍ，４Ｈ），１．６０（ｓ，３Ｈ），１．３９（ｓ，３Ｈ），１．０１（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ），０．８５（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
【０１９５】
工程４：（Ｅ）−エチル３−（（１Ｓ，３ｓ）−３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２，２−ジメチルテト−ラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）シクロブチル）アクリ−レートの合成
ＣＨ３ＣＮ：ＤＣＭ＝５：１（５０ｍｌ）中の（１Ｓ，３ｓ）−３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２，２−ジメチルテトラヒ−ドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）シクロブタンカルバルデヒド（９３０ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ）の溶液にエチル２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（４８４ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ）、ＤＢＵ（３２８ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ）、およびＬｉＣｌ（９１ｍｇ、２．１６＝０１）を添加する。混合物を室温で１時間撹拌し、次いで濃縮する。水（２０ｍｌ）を添加し、そして混合物をＤＣＭ（２５ｍｌ×３）で抽出する。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水し、濃縮し、残渣をＳＧＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝３０：１）により精製することにより標記化合物（９００ｍｇ、収率８３％）を取得する。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ΔＨ８．３６（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｓ，１Ｈ），６．９４−６．９０（ｍ，１Ｈ），６．０３（ｓ，１Ｈ），５．７２−５．８９（ｍ，１Ｈ），５．５７（ｓ，２Ｈ），５．５２（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１Ｈ），５．００（ｄｄ，Ｊ＝３．５，６．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２５（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２１−４．１７（ｍ，２Ｈ），３．１４（ｂｒｓ，１Ｈ），２．９６１−２．９３６（ｍ，１Ｈ），２．７４−２．５２（ｍ，３Ｈ），２．２２−２．１４（ｍ，２Ｈ），１．７９−１．７６（ｍ，２Ｈ），１．６０（ｓ，３Ｈ），１．４０（ｓ，３Ｈ），１．３０−１．２７（ｍ，３Ｈ），１．００（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），０．８２（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：５０１．４［Ｍ＋１］＋。
【０１９６】
工程５：エチル３−（（１Ｓ，３ｒ）−３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２，２−ジメチルテト−ラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）シクロブチル）プロパノエートの合成
ＭｅＯＨ（５０ｍｌ）中の（Ｅ）−エチル３−（（１Ｓ，３ｓ）−３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２，２−ジメチルテト−ラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）シクロブチル）アクリ−レート（９００ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）の溶液にＰｄ／Ｃ（２０ｍｇ）を添加する。混合物を水素雰囲気下、室温で一晩撹拌する。混合物を濾過し、そして濾液を濃縮することにより標記化合物（７００ｍｇ、収率７８％）を取得する。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ΔＨ８．３６（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｓ，１Ｈ），６．０３（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），５．６９（ｓ，２Ｈ），５．５１（ｄｄ，Ｊ＝２．５，８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．９９（ｄｄ，Ｊ＝４．０，７．５Ｈｚ，１Ｈ），４．２６（ｂｒｓ，１Ｈ），４．１３−４．０８（ｍ，２Ｈ），２．９９−２．９２（ｍ，２Ｈ），２．７０６−２．６５５（ｍ，１Ｈ），２．５３９−２．４８６（ｍ，１Ｈ），２．１８−２．０２（ｍ，４Ｈ），１．７６（ｂｒｓ，１Ｈ），１．６５−１．６０（ｍ，５Ｈ），１．４３−１．３７（ｍ，５Ｈ），１．２６−１．２３（ｍ，２Ｈ），０．９７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，３Ｈ），０．７９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：５０３．４［Ｍ＋１］＋。
【０１９７】
工程６：３−（（１Ｓ，３ｒ）−３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）シクロブチルプロパン酸の合成
ＴＨＦ：ＭｅＯＨ＝５：１（３０ｍｌ）中のエチル３−（（１Ｓ，３ｒ）−３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２，２−ジメチルテト−ラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）シクロブチル）プロパノエート（６５０ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＬｉＯＨ．Ｈ２Ｏ（５４３ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を室温で一晩撹拌し、濃縮し、次いでＭｅＯＨ（１０ｍｌ）に溶解させる。１Ｍ  ＨＣｌ溶液をｐＨ＝７になるまで０℃で滴下する。混合物を濃縮し、そして分取ＨＰＬＣを用いて精製することにより標記化合物（１７０ｍｇ）を与える。
【０１９８】
工程７：Ｎ−（２−アミノ−４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニル）−３−−（（１Ｓ，３ｒ）−３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（６−アミ−ノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル−）（イソプロピル）アミノ）シクロブチル）プロパンアミドの合成
ＤＣＭ（１５ｍｌ）中の３−（（１Ｓ，３ｒ）−３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２，２−ジメチルテト−ラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）シクロブチル）プロパ−ン酸（１７０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）の溶液に、４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゼン−１，２−ジアミン（１１７ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（１３７ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（９７ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、およびＴＥＡ（２１７ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を室温で一晩撹拌し、そして濃縮する。飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍｌ）を添加し、そして混合物をＤＣＭ（２０ｍｌ×３）で抽出する。有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水し、そして濃縮する。分取ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１２：１）を用いて粗製物を精製することにより、標記化合物（粗製物１１０ｍｇ）を与える。
【０１９９】
工程８：９−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（（（（１ｒ，３Ｓ）−３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−−２−イル）エチル）シクロブチル）（イソプロピル）アミノ）メチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［−３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−９Ｈ−プリン−６−アミンの合成
ＡｃＯＨ（１０ｍｌ）中のＮ−（２−アミノ−４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニル）−３−（（１Ｓ，３ｒ）−３−（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（６−アミ−ノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メチル−）（イソプロピル）アミノ）シクロブチル）プロパンアミド（１１０ｍｇ）の溶液を６５℃に一晩加熱する。その混合物は濃縮であり、飽和であり、ＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍｌ）が添加されており、およびＤＣＭ（２０ｍｌ×３）を用いて抽出された混合物である。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水し、そして濃縮して標記化合物（粗製物１０５ｍｇ）を与える。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ΔＨ８．３６（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．４８−７．２４（ｍ，３Ｈ），６．０１（ｄ，ｆ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ），５．６０−５．５３（ｍ，３Ｈ），４．９８（ｄｄ，Ｊ＝３．０，６．５Ｈｚ，１Ｈ），４．２２（ｂｒｓ，１Ｈ），２．９７（ｂｒｓ，１Ｈ），２．８７４−２．８４７（ｍ，１Ｈ），２．５６−２．５０（ｍ，３Ｈ），１．８７−１．７８（ｍ，２Ｈ），１．７０−１．５４（ｍ，７Ｈ），１．３５−１．１７（ｍ，１４Ｈ），０．９０（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ），０．８０（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：６０３．５［Ｍ＋１］＋。
【０２００】
工程９：（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−５−（（（（１ｒ，３Ｓ）−３−（２−（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）エチル）シクロブチル）（イソプロピル）アミノ）メチル）テトラ−ヒドロフラン−３，４−ジオールの合成
ＨＣｌ／ＭｅＯＨ（２．５ｍｏｌ／Ｌ）（１０ｍＬ）中の９−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（（（（１ｒ，３Ｓ）−３−（２−（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−−２−イル）エチル）シクロブチル）（イソプロピル）アミノ）メチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロフロ［−３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−９Ｈ−プリン−６−アミン（１０５ｍｇ）の溶液を室温で２時間撹拌し、次いで、濃縮乾固させる。水（０．５ｍＬ）およびＭｅＯＨ（５ｍＬ）中のＫ２ＣＯ３（９６ｍｇ）を添加し、得られた混合物を室温でさらに１０分間撹拌し、次いで濾過する。濾液を濃縮し、残渣を分取ＨＰＬＣ（ｘｂｒｉｄｇｅ  ３０ｍｍ×１５０ｍｍ、移動相：Ａ：水（１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）Ｂ：ＣＡＮ、グラジエント：３５〜４５％のＢで１０分間、４５〜４５％のＢで６分間、２０分間で停止、流量：５０ｍｌ／分）により精製することにより、化合物２（５０ｍｇ、収率：５１％）を白色固体として与える。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）：ΔＨ８．２９（ｓ，１Ｈ），８．２０（ｓ，１Ｈ），７．４７−７．３９（ｍ，３Ｈ），５．９６（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），４．７０−４．７５（ｍ，１Ｈ），４．２６−４．２７（ｍ，１Ｈ），４．０５−４．０６（ｍ，１Ｈ），３．１４０−３．１５５（ｍ，１Ｈ），３．００−２．７６（ｍ，５Ｈ），２．１８−２．１６（ｍ，２Ｈ），１．８７−１．８５（ｍ，２Ｈ），１．５７−１．５５（ｍ，２Ｈ），１．３６（ｓ，９Ｈ），１．０１（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：５６３．４［Ｍ＋１］＋。
【０２０１】
ＥＰＺ００５６７６は、水性溶液に可溶であり、静脈内投与に供すべく製剤化可能である。体循環中のＥＰＺ００５６７６の有効薬動学的半減期は、ラットでは０．２５時間、イヌでは１．５時間である。
【０２０２】
ＭＬＬ再構成型白血病のヌードラット皮下異種移植モデルで２１日間のＥＰＺ００５６７６の連続静脈内注入により、用量依存性抗腫瘍活性を提供する。最高用量では、治療停止後、最大３２日間まで再増殖なしに完全腫瘍退縮が達成される。ＥＰＺ００５６７６で治療されたラットでは、有意な体重減少または明白な毒性は観測されない。したがって、ＥＰＺ００５６７６は、ＭＬＬ再構成型白血病のラット異種移植モデルで強力な有効性を示すＤＯＴ１Ｌの強力な選択的阻害剤である。
【０２０３】
ＥＰＺ００５６７６は、現在、ＭＬＬ遺伝子の１１ｑ２３に転座を含む再発性／難治性白血病または他の進行血液癌を有するヒト患者において第Ｉ相試験で評価が行われている。ＥＰＺ００５６７６は、２１日間にわたり連続静脈内注入を介して投与されている。
【０２０４】
ＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む組成物および製剤
本開示は、ＡＬＬまたはＡＭＬなどの白血病を治療するための１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤および／または１種以上のＥＺＨ２阻害剤を含む治療用組成物を含む組成物を提供する。１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤および／または１種以上のＥＺＨ２阻害剤は、本明細書に記載の疾患または病態を治療または改善する用量で、単独でまたは好適な担体もしくは賦形剤と混合された医薬組成物で、ヒト患者に投与可能である。これらの阻害剤の混合物もまた、単純混合物としてまたは好適に製剤化された医薬組成物で患者に投与可能である。
【０２０５】
本開示の範囲内にある組成物としては、治療剤が患者において白血病細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＤＯＴ１Ｌ阻害剤および／またはＥＺＨ２阻害剤である組成物が挙げられる。各成分の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の範囲内である。有効用量は、特定の阻害剤、プロドラッグの存在、患者、および後者の臨床状態を含むいくつかの因子の関数である。
【０２０６】
ＤＯＴ１Ｌ阻害剤および／またはＥＺＨ２阻害剤を含む組成物は、非経口投与されうる。本明細書で用いられる場合、「非経口投与」という用語は、腸内投与および局所投与以外の投与モード、通常は注射による投与を意味し、例としては、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、経気管、皮下、角質下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、および胸骨内への注射および注入が挙げられるが、これらに限定されるものではない。代替的または併用的に、投与は、経口的でありうる。
【０２０７】
投与量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、仮に行うのであれば併用治療の種類、治療頻度、ならびに所望の効果の性質に依存するであろう。
【０２０８】
ＤＯＴ１Ｌ阻害剤および／またはＥＺＨ２阻害剤を含む組成物は、たとえば、静脈内プッシュまたはボーラスを介する静脈内投与などの非経口投与を行いうる。他の選択肢として、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤および／またはＥＺＨ２阻害剤を含む組成物は、静脈内注入を介して投与されうる。本明細書で用いられる場合、「非経口投与」という用語は、腸内投与および局所投与以外の投与モード、通常は注射による投与を意味し、例としては、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、経気管、皮下、角質下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、および胸骨内への注射および注入が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２０９】
ＤＯＴ１Ｌ阻害剤および／またはＥＺＨ２阻害剤を含む組成物の静脈内注入に好適な投与量は、少なくとも約２ｍｇの阻害剤／ｍ２／日、または少なくとも約１０ｍｇの阻害剤／ｍ２／日、または少なくとも約２０ｍｇの阻害剤／ｍ２／日、または少なくとも発作５０ｍｇの阻害剤／ｍ２／日、または少なくとも約１００ｍｇの阻害剤／ｍ２／日、または少なくとも約２００ｍｇの阻害剤／ｍ２／日、または少なくとも約５００ｍｇの阻害剤／ｍ２／日の投与量を含む。
【０２１０】
ＤＯＴ１Ｌ阻害剤および／またはＥＺＨ２阻害剤を含む組成物は、一般的には、治療上有効量の化合物と薬学的に許容可能な担体とを含む。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容可能」という用語は、連邦政府もしくは州政府の監督官庁により認可されているか、または米国薬局方、もしくは動物で、より特定的にはヒトで使用するための他の一般に公認された薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」という用語は、治療剤と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、または媒体を意味する。そのような医薬担体は、無菌の水および油などの液体、たとえば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源のものでありうる。医薬組成物を静脈内投与する場合、水は好ましい担体である。生理食塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、とくに注射用溶液剤の液体担体として利用可能である。好適な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、穀粉、チョーク、シリカゲル、ナトリウムステアレート、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望により、副次量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有しうる。
【０２１１】
これらの組成物は、溶液剤、サスペンジョン剤、エマルジョン剤、タブレット剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、持続放出製剤などの形態をとることが可能である。組成物は、伝統的な結合剤および担体、たとえば、トリグリセリドを用いて坐剤として製剤化可能である。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、マグネシウムステアレート、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体を含みうる。かかる組成物は、患者への適正な投与形態を提供するように好適量の担体と共に治療上有効量の阻害剤、好ましくは精製された形態の阻害剤を含有するであろう。製剤は、投与形態に適したものにすべきである。
【０２１２】
組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合化された医薬組成物としてルーチン手順に従って製剤化可能である。典型的には、静脈内投与に供される組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液剤である。必要に応じて、組成物は、可溶化剤および局所麻酔剤、たとえば、注射部位の疼痛を和らげるリグノカインを含みうる。一般的には、成分は、個別に、またはユニット製剤で混合一体化されて、たとえば、活性剤の量を表示してアンプルまたはサシェなどの密閉容器内に乾いた凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、供給される。組成物が注入により投与される場合、無菌医薬グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて分配可能である。組成物が注射投与される場合、投与前に成分を混合しうるように、注射用無菌水または生理食塩水のアンプルを提供可能である。
【０２１３】
本明細書に開示される阻害剤は、中性形または塩形として製剤化可能である。薬学的に許容可能な塩としては、塩酸、リン、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるようなアニオンで形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるような陽イオンで形成されるものが挙げられる。
【０２１４】
本開示に係る阻害剤の多くは、薬学的に適合可能な対イオンとの塩（すなわち、薬学的に許容可能な塩）として提供されうる。「薬学的に許容可能な塩」とは、レシピエントへの投与時に直接的または間接的のいずれかで本発明に係る化合物または化合物のプロドラッグを提供可能な任意の非毒性塩を意味する。「薬学的に許容可能な対イオン」とは、被験者への投与時に塩から放出されて毒性がない塩のイオン性部分のことである。薬学的に適合可能な塩は、限定されるものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、およびコハク酸をはじめとする多くの酸で形成されうる。塩は、その対応する遊離塩基形よりも水または他のプロトン性溶媒に対してより可溶性である傾向がある。本発明はそのような塩を包含する。
【０２１５】
ＨＯＸクラスター遺伝子および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇に関連する遺伝子の突然変異、変化、および／または異常を呈する細胞の成長および／または生存を阻害するためのならびにそれらを呈する白血病患者を治療するための方法
本開示は、白血病を治療するために１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤および１種以上のＥＺＨ２阻害剤を含む組成物をヒト患者に投与することを含む治療法をさらに提供する。ただし、この白血病は、１つ以上のＨＯＸＡクラスター遺伝子の高レベルの発現を呈するがＭＬＬ転座を有していない。
【０２１６】
１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子の高レベルの発現により特徴付けられるがＭＬＬ転座を有していない白血病の治療、阻害、および／または予防に有効なＤＯＴ１Ｌ阻害剤および／またはＥＺＨ２阻害剤の量は、標準的な臨床技術により決定可能である。in vitroアッセイは、任意選択で、最適用量範囲の特定を支援するために利用されうる。製剤に利用される正確な用量はまた、投与経路および疾患または障害の重症度に依存するであろう。有効用量は、in vitroまたは動物モデルの試験系から得られる用量−反応曲線から推定されうる。
【０２１７】
本発明に係る化合物または医薬組成物は、ヒトに使用する前に所望の治療活性または予防活性に関してin vitroで次いでin vivoで検査可能である。たとえば、化合物または医薬組成物の治療または予防の有用性を実証するためのin vitroアッセイは、細胞系または患者組織サンプルに対する化合物の作用を含む。細胞系および／または組織サンプルに対する化合物または組成物の作用は、当業者に公知の技術、たとえば、限定されるものではないが増殖アッセイおよびアポトーシスアッセイを利用して決定可能である。本開示によれば、特定の化合物の投与が必要とされるかどうかを判定するために使用可能なin vitroアッセイは、患者組織サンプルが培養下で増殖され、そして化合物に暴露されるかさもなければまたは化合物が投与され、そして組織サンプルに対するかかる化合物の作用が観測されるin vitro細胞培養アッセイを含む。
【０２１８】
本開示は、本明細書に記載の有効量のＤＯＴ１Ｌおよび／またはＥＺＨ２阻害剤の化合物または医薬組成物を被験者に投与することにより治療および阻害を行う方法を提供する。一態様では、化合物は、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を引き起こす物質が化合物に実質的に含まれないように実質的に精製される。
【０２１９】
種々の送達システムが公知であり、本開示に係る組成物の投与に使用可能である。たとえば、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセルへの取込み、レセプター媒介エンドサイトーシス（たとえば、Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)を参照されたい）などは、当業者に公知であろう。
【０２２０】
投与方法としては、真皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されるものではない。阻害剤または組成物は、たとえば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚の内層（たとえば、口腔粘膜、直腸粘膜、腸粘膜など）を介する吸収により、投与されうると共に、他の生物学的活性剤と一緒に投与されうる。投与は、全身的または局所的でありうる。その他に、脳室内および脊髄内への注射を含む任意の好適な経路により中枢神経系内に阻害剤または組成物を導入することが望まれうる。脳室内注射は、たとえば、オンマヤリザーバーなどのリザーバーに装着された脳室内カテーテルにより支援されうる。肺内投与もまた、たとえば、インヘラーまたはネブライザーとエーロゾル化剤を含む製剤とを用いることにより、利用可能である。
【０２２１】
阻害剤または組成物を治療の必要な領域に局所的に投与することが望まれうる。これは、たとえば、手術時に局所注入により、局所適用により、注射により、カテーテルを利用して、坐剤を利用して、またはインプラントを利用して、達成されうるが、これらに限定されるものではなく、また、前記インプラントは、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状の物質、たとえば、シアラスティック膜などの膜または繊維である。
【０２２２】
阻害剤は、リポソームなどの小胞（Langer, Science 249:1527-1533 (1990)）でまたは制御放出系で送達可能である。制御放出系は、治療標的に近接して配置可能であり、こうすれば、全身用量のごく一部が必要となるにすぎない（たとえば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, Vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照されたい）。
【０２２３】
ＤＯＴ１Ｌ阻害剤および／またはＥＺＨ２阻害剤を含む組成物の静脈内注入は、少なくとも約１日間、または少なくとも約３日間、または少なくとも約７日間、または少なくとも約１４日間、または少なくとも約２１日間、または少なくとも約２８日間、または少なくとも約４２日間、または少なくとも約５６日間、または少なくとも約８４日間、または少なくとも約１１２日間にわたり連続しうる。
【０２２４】
ＤＯＴ１Ｌ阻害剤および／またはＥＺＨ２阻害剤を含む組成物の連続静脈内注入は、特定の持続時間にわたり行われ、それに続く他の持続時間を休止期としうる。たとえば、連続注入持続期間は、約１日間から、約７日間まで、約１４日間まで、約２１日間まで、約２８日間まで、約４２日間まで、約５６日間まで、約８４日間まで、または約１１２日間まででありうる。連続注入は、続いて、約１日間から、約２日間まで、約３日間まで、約７日間まで、約１４日間まで、または約２８日間までの休止期となりうる。次いで、連続注入は、以上のように繰り返され、他の休止期がそれに続きうる。
【０２２５】
採用される正確な連続注入プロトコルにかかわらず、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤および／またはＥＺＨ２阻害剤を含む組成物の連続注入は、所望の有効性が達成されるかまたは許容できないレベルの毒性が顕在化するまで継続されることは理解されよう。
【０２２６】
ＨＯＸＡクラスター遺伝子発現を検出するためのキット
本開示はまた、ＨＯＸクラスター遺伝子もしくはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇、ならびに／あるいはＨＯＸクラスター遺伝子および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇に関連する遺伝子の突然変異の存在、たとえば、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、およびＡＳＸＬ１遺伝子の１つ以上での突然変異の存在、および／またはＮＵＰ９８−ＮＳＤ１もしくは他のＮＵＰ９８転座の存在、および／または表２に示される遺伝子のいずれかでの突然変異、変化、および／もしくは異常の存在に関する患者サンプルの検査に使用するためのキットを提供する。
【０２２７】
診断用キットは、ＨＯＸクラスター遺伝子および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子および／または表２に示される遺伝子のいずれかを増幅するためのプライマー対と、プライマー対を利用する増幅反応から作製されるアンプリコンを配列決定および／または検出するためのプローブとを含む。
【０２２８】
ＦＬＴ３阻害剤
特定の実施形態では、本開示は、１種以上のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせてまたは併用して１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を利用することにより、ＨＯＸクラスター遺伝子および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇を呈する細胞の増殖および／または生存を阻害して所望の治療効果を提供する方法、ならびに白血病がそのような発現の上昇に関連する白血病患者を治療するための方法を提供する。
【０２２９】
ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）遺伝子は、造血に影響を及ぼして血液学的な障害および悪性疾患をもたらす膜結合レセプターチロシンキナーゼをコードする。たとえば、Drexler et al., Leukemia 10:588-599 (1996)、Gilliland and Griffin, Blood 100:1532-1542 (2002)、およびStirewalt and Radich, Nat. Rev. Cancer 3:650-665 (2003)を参照されたい。ＦＬＴ３レセプターチロシンキナーゼの活性化は、造血前駆体細胞上および造血幹細胞上に発現されるＦＬＴ３レセプターへのＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の結合を介して開始される。
【０２３０】
ＦＬＴ３は、血液学的悪性疾患で頻繁に突然変異される遺伝子であり、成人急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の約３０％に存在する。Nakao et al., Leukemia 10:1911-1918 (1996)、Kiyoi et al., Leukemia 12:1333-1337 (1998)、Kottaridis et al., Blood 98:1742- 1759 (2001)、Yamamoto et al., Blood 97:2434-2439 (2001)、およびThiede et al., Blood 99:4326-4335 (2002)。
【０２３１】
最も一般的なＦＬＴ３突然変異は、ＦＬＴ３レセプターの膜近傍ドメイン内にインフレーム挿入をもたらす内部縦列重複（ＩＴＤ）である。ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異は、成人ＡＭＬ患者の１５〜３５％に報告されている。Nakao et al., Leukemia 10:1911-1918 (1996)、Kiyoi et al., Leukemia 12:1333-1337 (1998)、Kiyoi et al., Leukemia 11:1447-1452 (1997)、およびSchnittger et al., Blood 100:59-66 (2002)。ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異は、患者予後不良の独立予測因子であり、標準的化学療法後の再発リスクの増加ならびに無病生存および全生存の減少に関連する。AbuDuhier et al., British J. Hematol. 11:190-195 (2000)、Kiyoi et al., Blood 93:3074-3080 (1999)。ＦＬＴ３レセプターの活性化ループに生じるＦＬＴ３点突然変異は、頻度がそれほど高くない。最も一般的に影響を受けるコドンは、アスパルテート８３５（Ｄ８３５）である。Ｄ８３５残基のヌクレオチド置換は、成人急性骨髄性白血病患者の約５〜１０％で起こる。Stirewalt and Radich, Nature Rev. Cancer 3:650-665 (2003)、Yamamoto et al., Blood 97:2434-2439 (2001)、Thiede et al., Blood 99:4326-4335 (2002)、およびBacher et al., Blood 111:2527-2537 (2008)。
【０２３２】
成人ＡＭＬで構成的活性化突然変異ＦＬＴ３の頻度が高いことから、この白血病ではＦＬＴ３遺伝子がきわめて魅力的な薬剤標的になっている。この標的に対してさまざまな度合いの効力および選択性を有するいくつかのＦＬＴ３阻害剤が、ＡＭＬ患者で調べられてきているか、または現在調べられている。Kindler et al., Blood 116:5089-102 (2010)。
【０２３３】
ＦＬＴ３阻害剤は、Ｉ型またはＩＩ型阻害剤として分類される。これらの２つの異なる分類は、リン酸化および非リン酸化レセプター部位への結合の相対親和性および機序に基づく。Ｉ型阻害剤は、キナーゼの活性コンフォメーションを認識する。このコンフォメーションはリン酸転移に寄与する。Ｉ型阻害剤は、一般にヘテロ環式環系で構成される。Liu and Gray, Nat. Chem. Biol. 2:358-354 (2006)。Ｉ型ＦＬＴ３阻害剤の例としては、クレノラニブベシレートおよびミドスタウリンが挙げられる。Muralidhara et al., Cancer Res. 72 8 Supp.:3683 (2012)、およびCools et al., Cancer Res. 64:6385-6389 (2004)。ＦＬＴ３レセプターチロシンキナーゼを構成的にリン酸化させる突然変異はまた、Ｉ型阻害剤に対して感受性がありうる。
【０２３４】
ＩＩ型阻害剤は、典型的にはモチーフ再構成を意味する「ＤＦＧ−ｏｕｔ」として参照される不活性ＦＬＴ３コンフォメーションに結合する。Zhang et al., Nature Rev. Cancer 9:28-39 (2009)。イマチニブ、ソラフェニブ、およびニロチニブ（ＡＭＮ１０７またはＴａｓｉｇｎａ（登録商標）としても知られる）などの阻害剤は、ＩＩ型コンフォメーションに結合する。Manley et al., Biochim. Biophys. Acta. 1754:3-13 (2005)、Wan et al., Cell 116:855-867 (2004)。ＩＩ型阻害剤に対する耐性を付与する突然変異は、ＦＬＴ３レセプターチロシンキナーゼのキナーゼドメインを構成的にリン酸化させる。リン酸化キナーゼを標的とするＩ型阻害剤は、ＩＩ型阻害剤による治療から生じる耐性を克服可能であるため、これらの耐性突然変異を有する疾患の治療に使用できる可能性がある。
【０２３５】
一般的には、ＦＬＴ３阻害剤は、白血病患者を治療するための方法を含むこのたび開示された方法に使用するための１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤と組み合わせて好適に利用されうる。これらは、Leung et al., Leukemia 27:260-268 (2013)、Grunwald and Levis, Int. J. Hematol. 97:683-694 (2013)、Wiernik, Clin. Adv. Hem. & Onc. 8(6):429 (2010)にレビューされており、米国特許第８，５５７，８４７号および同第７，９７７，３３８号（フェニルアセトアミド）、米国特許出願公開第２００３／０２１９８２７号、ＰＣＴ特許国際公開第２０１４／０２７１９９号、国際公開第２０１３／１４２３８２号、国際公開第２００８／０６７２８０号、国際公開第２００６／０２０１４５号、ならびにSato et al., Blood 117(12):3286-3293 (2011)、Levis, Hematology, pp. 220-226 (Am. Soc. Hematol. Educ. Prog., Washington DC, 2013)、Fischer et al., J. Clin. Oncol. 28(28):4339-4345 (2010)、Fischer, Blood 117(12):3247-3248 (2011)、Kindler et al., Blood 116(24):5089-5102 (2010)、およびFathi and Chabner, Oncologist 16:1162-1174 (2011)の科学文献中にさらに詳細に開示されている。
【０２３６】
追加のＦＬＴ３阻害剤は、ＰＣＴ特許国際公開第２００２／０３２８６１号、国際公開第２００２／０９２５９９号、国際公開第２００３／０３５００９号、国際公開第２００３／０２４９３１号、国際公開第２００３／０３７３４７号、国際公開第２００３／０５７６９０号、国際公開第２００３／０９９７７１号、国際公開第２００４／００５２８１号、国際公開第２００４／０１６５９７号、国際公開第２００４／０１８４１９号、国際公開第２００４／０３９７８２号、国際公開第２００４／０４３３８９号、国際公開第２００４／０４６１２０号、国際公開第２００４／０５８７４９号、国際公開第２００４／０５８７４９号、国際公開第２００３／０２４９６９号、米国特許出願公開第２００４／００４９０３２号、ならびにLevis et al., Blood 98(3):885-887 (2001)、Tse et al., Leukemia 15(7):1001-1010 (2001)、Smith et al., Blood 103:3669-3676 (2004)、Griswold et al., Blood 104(9):2912-2918 (2004)、Yee et al., Blood 100(8):2941-2949 (2002)、O’Farrell et al., Blood 101(9):3597-3605 (2003)、Stone et al., Ann. Hematol. 83 Suppl 1:S89-90 (2004)、Murata et al., J. Biol Chem. 278(35):32892-32898 (2003)、およびLevis et al., Curr. Pharm. Design 10:1183-1193 (2004)に開示されている。薬剤標的の薬理学的検証の候補キナーゼ阻害剤の選択は、Uitdehaag et al., Br. J. Pharmacol. 166(3):858-76 (2012)に記載されている。これらの参照文献さらには本明細書に開示されたすべての他の参照文献は、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３７】
これらの方法で使用可能なＦＬＴ３阻害剤としては、２−フェニルアミノピリミジン化合物を含む低分子チロシンキナーゼ阻害剤化合物、イミダゾロチアゾール化合物、２，４，５−置換ピリミジンおよびピリドピリミジン化合物、ピロール置換２−インドリノン化合物、および置換インドロカルバゾール化合物が挙げられる。これらは、当技術分野で周知であり、ＦＬＴ３阻害活性を呈することが示されているか、またはさまざまな疾患、とくに、血液学的悪性疾患ＡＬＬおよびＡＭＬを治療するために調べられているかもしくは調べられてきた特定の化合物により例示される。
【０２３８】
いくつかの低分子ＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、ＡＬＬの管理にルーチン的に用いられ、ＦＬＴ３突然変異型ＡＭＬの治療に供すべく開発中であり、例としては、たとえば、タンデュチニブ（MLN-518またはCT53518としても知られる、COR Therapeutics Inc.およびMillennium Pharmaceuticals Inc.）、CHIR-258（Chiron Corp.）、EBIOおよびIMC-EBIO（ImClone Systems Inc.）、XL 999（Exelixis USA and Symphony Evolution, Inc.）、GTP 14564（Merck Biosciences UK）、AG1295およびAG1296、CEP-5214およびCEP-7055（Cephalon）、ニロチニブ（AM107またはTasigna（登録商標）としても知られる）、ソラフェニブおよびスニチニブ（SU11248、Pfizer USAとしても知られる）、ミドスタウリン（PKC412としても知られる、Novartis AG）、レスタウルチニブ（CEP 701またはKT-555としても知られる、Cephalon）、KW-2449、Quizartinib （AC220としても知られる、Ambit Biosciences）およびクレノラニブが挙げられる。これらのＦＬＴ３阻害剤のうち、レスタウルチニブ、ミドスタウリン、ソラフェニブ、KW-2449、およびAC220は、臨床試験で評価されてきたか、または評価されている。その他に、低分子化合物PLX3397およびAC220は、ＦＬＴ３内部縦列重複（ＩＴＤ）に関連するＡＭＬの患者を治療する特定の目的で開発されてきた。
【０２３９】
白血病患者を治療するための方法を含むこのたび開示された方法に使用するための１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤と組み合わせて好適に利用されうるＦＬＴ３阻害剤は、米国特許第５，５２１，１８４号に記載の２−フェニルアミノピリミジン化合物を含み、低分子ＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤イマチニブ［Ｎ−（４−メチル−３−（４−（ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル）−４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）ベンズアミドメタンスルホン酸］により例示され、式ＶＩ：
【化６】
0006639390.tif 000015
により表される。
【０２４０】
イマチニブ（STI-571としても知られる）は、カナダ、南アフリカ、および米国ではGleevec（登録商標）という名称で、オーストラリア、欧州、および中南米ではGlivec（登録商標）という名称でNovartisから市販されている。イマチニブの他に多種多様な２−フェニルアミノピリミジン化合物の合成は、米国特許第５，５２１，１８４号に開示されている。
【０２４１】
白血病患者を治療するための方法を含むこのたび開示された方法に使用するための１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤と組み合わせて好適に利用されうるＦＬＴ３阻害剤としては、米国特許出願公開第２００７／０２３２６０４号に記載され、式ＶＩＩ：
【化７】
0006639390.tif 000016
により表されるイミダゾロチアゾール化合物が挙げられる。
【０２４２】
式ＶＩＩで示されるイミダゾロチアゾール化合物は、急性骨髄性白血病の治療のためにAmbit Biosciences（San Diego, CA）により開発されているキザルチニブ（ＡＣ２２０としても知られる）により本明細書に例示される。キザルチニブは、化学構造１−（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）イソオキサゾール−３−イル）−３−（４−（７−（２−モルホリノエトキシ）ベンゾ［ｄ］イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−２−イル）フェニル）ウレアを有し、式ＶＩＩａ：
【化８】
0006639390.tif 000017
として表される。
【０２４３】
キザルチニブは、ＦＬＴ３に対して高い親和性を有するＦｌｔ３（ＩＴＤ／ＷＴ）の第２世代ＦＬＴ３阻害剤であり、Ｋｄ値は、Ｆｌｔ３−ＩＴＤに対して１．６ｎＭであり、ＩＣ５０は、Ｆｌｔ３−ＩＴＤに対して１．１ｎＭであり、ＷＴ  ＦＬＴ３に対して４．２ｎＭであり、これは、関連するチロシンキナーゼレセプターＫＩＴ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＲＥＴ、およびＣＳＦ−１Ｒに対するＩＣ５０の約１０倍である。キザルチニブの合成は、米国特許第７，８２０，６５７号およびＰＣＴ特許国際公開第２００７／１０９１２０号、国際公開第２０１１／０５６９３９号、および国際公開第２００９／０３８７５７号に記載されている。
【０２４４】
白血病患者を治療するための方法を含むこのたび開示された方法に使用するための１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤と組み合わせて好適に利用されうるＦＬＴ３阻害剤は、ＰＣＴ特許国際公開第２０１４／０２７１９９号に開示される２，４，５−置換ピリミジン化合物を含み、式ＶＩＩＩ：
【化９】
0006639390.tif 000018
により表される。
【０２４５】
白血病患者を治療するための方法を含むこのたび開示された方法に使用するための１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤と組み合わせて好適に利用されうるＦＬＴ３阻害剤は、ＰＣＴ特許国際公開第２０１３／１４２３８２号に開示されるピリドピリミジン化合物を含み、式ＩＸ：
【化１０】
0006639390.tif 000019
により表される。
【０２４６】
細胞の増殖および／または生存を阻害するためのならびに白血病患者を治療のためのこのたび開示された方法で好適に利用されうるＦＬＴ３阻害剤は、PLX3397（Plexxikon Inc., Berkeley, CA）を含む。PLX3397および関連化合物の合成は、Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110(14):5689-94 (2013)に記載されている。
【０２４７】
細胞の増殖および／または生存を阻害するためのならびに白血病患者を治療するためのこのたび開示された方法で好適に利用されうるＦＬＴ３阻害剤は、タンデュチニブ（MLN518、Ｎ−（４−イソプロポキシフェニル）−４−（６−メトキシ−７−（３−（ピペリジン−１−イル）プロポキシ）キナゾリン−４−イル）ピペラジン−１−カルボキサミド）を含み、式Ｘ：
【化１１】
0006639390.tif 000020
により表される。
【０２４８】
タンデュチニブ（MLN518、CT53518）は０．２２μＭのＩＣ５０を有する強力なＦＬＴ３アンタゴニストであり、ＰＤＧＦＲおよびｃ−Ｋｉｔを阻害し、ＦＬＴ３に対する効力はＣＳＦ−１Ｒの１５〜２０倍であり、同一の標的に対する選択性はＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、およびＫＤＲの＞１００倍である。タンデュチニブは、ＡＭＬの治療用として記載されている。DeAngelo et al., Blood 108:3674-81 (2006)。
【０２４９】
ソラフェニブ（２−ピリジンカルボキサミド，４−［４−［［［［４−クロロ−３−トリフルオロメチル）フェニル］アミノ］カルボニル］アミノ］フェノキシ］−Ｎ−メチル−４−（４−（３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）ウレイド）フェノキシ）ピリジン−２−カルボン酸メチアミド−４−メチルベンゼンスルホネートトシレート（４−（４−｛３−［４−クロロ３−（トリフルオロメチル）フェニル］ウレイド｝フェノキシ）Ｎ２メチルピリジン−２−カルボキサミド４−メチルベンゼンスルホネートとしても知られる））は、次式ＸＩ：
【化１２】
0006639390.tif 000021
により表される。
【０２５０】
ソラフェニブは、BayerおよびOnyx Pharmaceuticalsにより共同開発され、Nexavarとして共同販売されている。ソファフェニブの合成は、米国特許出願公開第２００８／０２６２２３６号に開示されている。
【０２５１】
ピロール置換２−インドリオノンプロテインキナーゼ阻害剤は、米国特許第７，１１９，０９０号、同第６，３９５，７３４号、同第６，５７５，２９３号、および同第７，１２５，９０５号に開示されており、次式ＸＩＩ：
【化１３】
0006639390.tif 000022
により表される。
【０２５２】
スニチニブ（Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド）は、これまでSU11248として知られていたものであり、Pfizer（New York, NY）からSutent（登録商標）という名称で市販されている。スニチニブの合成は、米国特許第６，５７３，２９３号（化合物８０）に開示されており、次式ＸＩＩＩ：
【化１４】
0006639390.tif 000023
により表される。
【０２５３】
置換インドロカルバゾール化合物は、ミドスタウリン（PKC412、（９Ｓ，１０Ｒ，１１Ｒ，１３Ｒ）−２，３，１０，１１，１２，１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１１−（メチルアミノ）−９，１３−エポキシ−１Ｈ，９Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｇｈ：３’，２’，１’−ｌｍ］ピロロ［３，４−ｊ］［１，７］ベンゾジアムゾニン−１−オン）により例示される。これは、ＡＭＬの治療用として研究されている多標的プロテインキナーゼ阻害剤であり（Levis, Best Pract Res Clin Haematol 23(4):489-494 (2010)、次式ＸＩＶ：
【化１５】
0006639390.tif 000024
により表される。
【０２５４】
KW-2449は、多標的阻害剤であり、主にＦｌｔ３を対象として６．６ｎＭのＩＣ５０を有し（Shiotsu et al., Blood 114(8):(2009)、次式ＸＶ：
【化１６】
0006639390.tif 000025
により表される。
【０２５５】
ＤＯＴ１Ｌ阻害剤およびＦＬＴ３阻害剤を利用する組合せ療法
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるようにＦＬＴ３阻害剤の投与前、投与時、または投与後に投与されるＤＯＴ１Ｌ阻害剤の組合せを利用する治療方法を含む方法を提供する。ＨＯＸクラスター遺伝子および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現レベルの上昇を呈する細胞の成長および／または生存を阻害するためのならびにそうした上昇を呈する患者とくに白血病患者を治療するためのこれらの方法では、ＡＬＬまたはＡＭＬなどの白血病を治療するために、１種以上のＦｌｔ３阻害剤と組み合わせて１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む治療用化合物を含む化合物の組合せが利用される。
【０２５６】
これらの方法により、１種以上のＦＬＴ３阻害剤および１種以上のＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、本明細書に記載の疾患または病態を治療または改善する用量で、単独でまたは好適な担体もしくは賦形剤と混合された医薬組成物で、ヒト患者に投与可能である。これらの阻害剤の混合物もまた、単純混合物としてまたは医薬組成物として患者に投与可能である。
【０２５７】
本開示の範囲内にある組成物としては、第１の治療剤がＤＯＴ１Ｌ阻害剤でありかつ第２の治療剤がＦＬＴ３阻害剤である組成物が挙げられる。この場合、第１の治療剤および第２の治療剤は、患者において白血病細胞の増殖を阻害するのに有効な量、時間で、少なくとも実質的に同時にまたは逐次的に投与される。第１および第２の各治療剤の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の範囲内である。有効用量は、特定の阻害剤および患者の臨床状態を含むいくつかの因子の関数である。
【０２５８】
ＤＯＴ１Ｌ阻害剤と組み合わせてＦＬＴ３阻害剤を含む組成物は、非経口投与されうる。本明細書で用いられる場合、「非経口投与」という用語は、腸内投与および局所投与以外の投与モード、通常は注射による投与を意味し、例としては、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、経気管、皮下、角質下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、および胸骨内への注射および注入が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２５９】
他の選択肢として、ＦＬＴ３阻害剤を含む組成物は、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の投与前、投与時、または投与後に投与されうる。たとえば、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の投与は、ＦＬＴ３阻害剤の投与を含む第１の治療レジメンの終了後に行われうる。反対に、ＦＬＴ３阻害剤の投与は、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の投与を含む第１の治療レジメントの終了後に行われうる。
【０２６０】
各阻害剤の投与量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、併用治療の性質、治療頻度、ならびに所望の効果の性質に依存するであろう。
【０２６１】
ＦＬＴ３阻害剤とＤＯＴ１Ｌ阻害剤とを含む組成物の静脈内注入に好適な投与量は、投与される各阻害剤の治療有効性に依存するであろう。たとえば、少なくとも約２ｍｇの第１の阻害剤／ｍ２／日、または少なくとも約１０ｍｇの第１の阻害剤／ｍ２／日、または少なくとも約２０ｍｇの第１の阻害剤／ｍ２／日、または少なくとも約５０ｍｇの第１の阻害剤／ｍ２／日、または少なくとも約１００ｍｇ第１の阻害剤／ｍ２／日、または少なくとも約２００ｍｇの第１の阻害剤／ｍ２／日、または少なくとも約５００ｍｇの第１の阻害剤／ｍ２／日の投与量を含みうる。ここで、第１の阻害剤は、ＦＬＴ３阻害剤またはＤＯＴ１Ｌ阻害剤でありうる。同様に、第２の阻害剤は、少なくとも約２ｍｇの第２の阻害剤／ｍ２／日、または少なくとも約１０ｍｇの第２の阻害剤／ｍ２／日、少なくとも約２０ｍｇの第２の阻害剤／ｍ２／日、少なくとも約５０ｍｇの第２の阻害剤／ｍ２／日、少なくとも約１００ｍｇの第２の阻害剤／ｍ２／日、少なくとも約２００ｍｇの第２の阻害剤／ｍ２／日、または少なくとも約５００ｍｇの第２の阻害剤／ｍ２／日の投与量で投与されうる。第１の阻害剤がＦＬＴ３阻害剤である場合、第２の阻害剤はＤＯＴ１Ｌ阻害剤であることは理解されよう。反対に、第１の阻害剤がＤＯＴ１Ｌ阻害剤である場合、第２の阻害剤はＦＬＴ３阻害剤である。
【０２６２】
ＦＬＴ３阻害剤を含む組成物、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む組成物、およびＦＬＴ３阻害剤とＤＯＴ１Ｌ阻害剤との組合せを含む組成物は、一般的には、治療上有効量の化合物と薬学的に許容可能な担体とを含む。２種の阻害剤が組み合わせて使用されるため、いずれか一方は、閾値下レベルで投与されうるが、それでも依然として治療上有効量であるとみなされる。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容可能」という用語は、連邦政府もしくは州政府の監督官庁により認可されているか、または米国薬局方、もしくは動物で、より特定的にはヒトで使用するための他の一般に公認された薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」という用語は、治療剤と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、または媒体を意味する。そのような医薬担体は、無菌の水および油などの液体、たとえば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源のものでありうる。医薬組成物を静脈内投与する場合、水は好ましい担体である。生理食塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、とくに注射用溶液剤の液体担体として利用可能である。好適な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、穀粉、チョーク、シリカゲル、ナトリウムステアレート、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望により、副次量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有しうる。
【０２６３】
これらのＦＬＴ３阻害剤および／またはＤＯＴ１Ｌ阻害剤組成物は、溶液剤、サスペンジョン剤、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、持続放出製剤などの形態をとることが可能である。組成物は、伝統的な結合剤および担体、たとえば、トリグリセリドを用いて坐剤として製剤化可能である。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、マグネシウムステアレート、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体を含みうる。かかる組成物は、患者への適正な投与形態を提供するように好適量の担体と共に治療上有効量の阻害剤、好ましくは精製された形態の阻害剤を含有するであろう。製剤は、投与形態に適したものにすべきである。
【０２６４】
組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合化された医薬組成物としてルーチン手順に従って製剤化可能である。典型的には、静脈内投与に供される組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液剤である。必要に応じて、組成物は、可溶化剤および局所麻酔剤、たとえば、注射部位の疼痛を和らげるリグノカインも含みうる。一般的には、成分は、個別に、またはユニット製剤で混合一体化されて、たとえば、活性剤の量を表示してアンプルまたはサシェなどの密閉容器内に乾いた凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、供給される。組成物が注入により投与される場合、無菌医薬グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて分配可能である。組成物が注射投与される場合、投与前に成分を混合しうるように、注射用無菌水または生理食塩水のアンプルを提供可能である。
【０２６５】
本明細書に開示される阻害剤は、中性形または塩形として製剤化可能である。薬学的に許容可能な塩としては、塩酸、リン、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるようなアニオンで形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるような陽イオンで形成されるものが挙げられる。
【０２６６】
本開示に係る阻害剤の多くは、薬学的に適合可能な対イオンとの塩（すなわち、薬学的に許容可能な塩）として提供されうる。「薬学的に許容可能な塩」とは、レシピエントへの投与時に直接的または間接的のいずれかで本開示に係る化合物または化合物のプロドラッグを提供可能な任意の非毒性塩を意味する。「薬学的に許容可能な対イオン」とは、被験者への投与時に塩から放出されて毒性がない塩のイオン性部分のことである。薬学的に適合可能な塩は、限定されるものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、およびコハク酸をはじめとする多くの酸で形成されうる。塩は、その対応する遊離塩基形よりも水または他のプロトン性溶媒に対してより可溶性である傾向がある。本開示はそのような塩を包含する。
【０２６７】
１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の高レベルの発現により特徴付けられるがＭＬＬ転座を有していない白血病の治療、阻害、および／または予防に有効なＦＬＴ３阻害剤、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤、および両者の組合せの量は、標準的な臨床技術により決定可能である。in vitroアッセイは、任意選択で、最適用量範囲の特定を支援するために利用されうる。製剤に利用される正確な用量はまた、投与経路および疾患または障害の重症度に依存するであろう。有効用量は、in vitroまたは動物モデルの試験系から得られる用量−反応曲線から推定されうる。
【０２６８】
ＦＬＴ３およびＤＯＴ１Ｌ阻害剤化合物またはＦＬＴ３および／またはＤＯＴ１Ｌ化合物を含む組成物は、ヒトに使用する前に所望の治療活性または予防活性に関してin vitroで次いでin vivoで検査可能である。たとえば、化合物または医薬組成物の治療または予防の有用性を実証するためのin vitroアッセイは、細胞系または患者組織サンプルに対する化合物の作用を含む。細胞系および／または組織サンプルに対する化合物または組成物の作用は、当業者に公知の技術、たとえば、限定されるものではないが増殖アッセイおよびアポトーシスアッセイを利用して決定可能である。本開示によれば、特定の化合物の投与が必要とされるかどうかを判定するために使用可能なin vitroアッセイは、患者組織サンプルが培養下で増殖され、そして化合物に暴露されるかさもなければまたは化合物が投与され、そして組織サンプルに対するかかる化合物の作用が観測されるin vitro細胞培養アッセイを含む。
【０２６９】
本開示は、第２の阻害剤またはその組成物の投与前、投与時もしくは投与と組み合わせて、または投与後に有効量の第１の阻害剤またはその組成物を被験者に投与することにより治療および阻害する方法を提供する。ただし、第１の阻害剤またはその組成物は、ＦＬＴ３阻害剤を含みうると共に、第２の阻害剤またはその組成物は、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含みうる。他の選択肢として、第１の阻害剤またはその組成物は、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含みうると共に、第２の阻害剤またはその組成物は、ＦＬＴ３阻害剤を含みうる。一態様では、化合物は、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を引き起こす物質が化合物に実質的に含まれないように実質的に精製される。
【０２７０】
種々の送達システムが公知であり、本開示に係る組成物の投与に使用可能である。たとえば、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセルへの取込み、レセプター媒介エンドサイトーシス（たとえば、 Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)を参照されたい）などは、当業者に公知であろう。
【０２７１】
投与方法としては、真皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されるものではない。阻害剤または組成物は、任意の好都合な経路、たとえば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚の内層（たとえば、口腔粘膜、直腸粘膜、腸粘膜など）を介する吸収により、投与されうると共に、他の生物学的活性剤と一緒に投与されうる。投与は、全身的または局所的でありうる。その他に、脳室内および脊髄内への注射を含む任意の好適な経路により中枢神経系内に阻害剤または組成物を導入することが望まれうる。脳室内注射は、たとえば、オンマヤリザーバーなどのリザーバーに装着された脳室内カテーテルにより支援されうる。肺内投与もまた、たとえば、インヘラーまたはネブライザーとエーロゾル化剤を含む製剤とを用いることにより、利用可能である。
【０２７２】
ＦＬＴ３阻害剤およびＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、単独でまたは一緒に、リポソームなどの小胞（Langer, Science 249:1527-1533 (1990)）でまたは制御放出系で送達可能である。制御放出系は、治療標的に近接して配置可能であり、こうすれば、全身用量のごく一部が必要となるにすぎない（たとえば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, Vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照されたい）。
【０２７３】
ＦＬＴ３阻害剤、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤、またはその両方を含む組成物の静脈内注入は、少なくとも約１日間、または少なくとも約３日間、または少なくとも約７日間、または少なくとも約１４日間、または少なくとも約２１日間、または少なくとも約２８日間、または少なくとも約４２日間、または少なくとも約５６日間、または少なくとも約８４日間、または少なくとも約１１２日間にわたり連続しうる。
【０２７４】
ＦＬＴ３阻害剤、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む組成物の連続静脈内注入は、特定の持続時間にわたり行われ、それに続く他の持続時間を休止期としうる。たとえば、連続注入持続期間は、約１日間から、約７日間まで、約１４日間まで、約２１日間まで、約２８日間まで、約４２日間まで、約５６日間まで、約８４日間まで、または約１１２日間まででありうる。連続注入は、続いて、約１日間から、約２日間まで、約３日間まで、７日間まで、約１４日間まで、または約２８日間までの休止期となりうる。次いで、連続注入は、以上のように繰り返され、他の休止期がそれに続きうる。
【０２７５】
採用される正確な連続注入プロトコルにかかわらず、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む組成物の連続注入は、所望の有効性が達成されるかまたは許容できないレベルの毒性が顕在化するまで継続されることは理解されよう。
【０２７６】
治療関連白血病を発症するリスクが高くかつＨＯＸ遺伝子クラスター過剰発現またはＨＯＸクラスター関連遺伝子過剰発現に関連する突然変異を呈する患者におけるＤＯＴ１Ｌ阻害剤の使用
治療関連ＡＭＬ（ｔ−ＡＭＬ）および治療関連ＡＬＬ（ｔ−ＡＬＬ）は、造血器悪性疾患および固形悪性疾患などの既存の病態を治療するために使用される細胞傷害化学療法および／または放射線療法により誘発される突然変異の直接の結果として起こると考えられるよく知られた臨床症候群である。癌の治療を受けたすべての患者の約８〜１０％は、平均で治療の５年後にｔ−ＡＭＬを発症するであろう。ｔ−ＡＭＬの発症は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、乳癌、および肺癌を含む種々の原発癌の治療後に報告されてきた。Larson RA, Haematologica, 2009 Apr; 94(4):454-9。具体的には、ＤＮＡに結合してその複製を防止するアルキル化化学療法剤は、治療関連白血病のリスクを増加させることが示されている。さらに、肺癌などの特定のタイプの癌を治療するトポイソメラーゼＩＩ阻害剤の使用もまた、治療関連ＡＭＬを発症するリスクの増加に関連付けられてきた。Bhatia S. Semin Oncol. 2013; Dec; 40(6):666-75。
【０２７７】
ｔ−ＡＭＬおよびｔ−ＡＬＬで観測される細胞遺伝学的異常は、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＡＭＬおよびＡＬＬに見られるものに類似していている。たとえば、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＡＭＬと同様に、ＭＬＬ再構成は、治療関連ＡＭＬの共通した特徴である（Schoch, Blood. 2003 Oct 1; 102 (7):2395-402）。その他に、既知のＮＵＰ９０転座のいくつかは、ｔ−ＡＭＬの患者で同定されてきた（Lam DH, Leukemia, 15(11):1689-95 (2001)）。同様に、ＩＤＨ１およびＩＤＨ１突然変異は、同一のタイプのあり、ｔ−ＡＭＬおよびｄｅ  ｎｏｖｏ  ＡＭＬで同一の頻度で発生することが示されている（Westman, MK, Leukemia (2013)27, 957-959）。全体的に、引用された証拠から、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＡＭＬおよびｔ−ＡＭＬは、ＨＯＸクラスター遺伝子発現の上昇に関連する突然変異の存在を含む共通の生物学的特徴を共有することが強く示唆される。したがって、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、個体が１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の過剰発現を呈する場合、上記のタイプの高リスク個体を治療するのに有用であろう。そのような過剰発現を測定する代わりに、１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇に関連することが知られているかまたはそのように判定される、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、および／またはＭＬＬ−ＰＴＤ以外の遺伝子の突然変異、変化、および／または異常を有することが示される場合、そのような個体を同定可能である。この療法の目的は、そのような過剰発現を減少させることにより、これらの個体がｔ−ＡＬＬおよびｔ−ＡＭＬを発症するリスクを低減させることであろう。
【０２７８】
逆の指示がないかぎり、用語は「オープン」であることが意図されることは理解されよう（たとえば、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（〜を含む）」という用語は、「〜を含むが、これらに限定されるものではない」として解釈されるべきであり、「ｈａｖｉｎｇ（〜を有する）」という用語は、「少なくとも〜を有する」として解釈されるべきであり、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（〜を含む）」という用語は、「〜を含むが、これらに限定されるものではない」として解釈されるべきであるなど）。「少なくとも１つ」、「１つ以上の」などの語句および「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」などの用語は、単数および複数の両方を含む。
【０２７９】
本開示の特徴または態様がマーカッシュグループを利用して記述される場合、本開示はまた、マーカッシュグループの任意の個別のメンバーまたはメンバーのサブグループを利用して記述されることが意図されることもさらに理解されよう。また同様に、本明細書に開示される範囲はすべて、あらゆる可能な部分範囲および部分範囲の組合せを包含する。たとえば、「〜の間」、「〜まで」、「少なくとも〜」、「〜超」、「〜未満」などの表現は、その範囲で挙げられた数を含み、かつ各個別のメンバーを含む。
【０２８０】
さらに、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤を含む方法、キット、組成物に関する上記の節はすべて、ＤＯＴ１ｌ阻害剤とＦＬＴ３阻害剤との組合せまたは併用にあてはまるとみなされる。
【０２８１】
以上以下を問わず、本明細書で引用されるすべての参照文献、たとえば、限定されるものではないが、米国、ＰＣＴ、非米国であるかにかかわらず、特許、特許出願、および特許公開、ならびにすべての技術および／または科学に関する刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８２】
種々の実施形態を本明細書に開示してきたが、当業者であれば他の実施形態が明らかになろう。本明細書に開示される種々の実施形態は、例示を目的としたものであり、限定を意図したものではなく、真の範囲および趣旨は、特許請求の範囲により示される。
【０２８３】
以下の実施例を参照しながら本開示についてさらに説明するが、これらの実施例に限定されるものではない。本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、およびすべての他の刊行物の教示は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【実施例】
【０２８４】
実施例１
ＤＯＴ１Ｌの阻害は、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、またはＭＬＬ部分縦列重複を呈する白血病細胞の成長を阻害する（先行技術）
この実施例では、当技術分野で一般に理解されているように、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、またはＭＬＬ部分縦列重複と、１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇とを呈する白血病が、ＤＯＴ１Ｌ阻害に対して感受性があることを確認する。
【０２８５】
ＤＯＴ１Ｌは、複数の白血病誘発融合オンコプロテインが白血球の発生時に不適切な遺伝子発現を誘発することにより白血球を再プログラムしてその分化をブロックする機序の中心をなすヒストンメチルトランスフェラーゼである。ＤＯＴ１Ｌを阻害すると、白血病関連遺伝子発現シグネチャーが抑制され、ＭＬＬ融合駆動型白血病の分化が誘発される。
【０２８６】
ＨＯＸクラスター遺伝子は、白血病細胞の連続増殖および生存に重要であることが実証されており（Faber et al., HOXA9 is required for Survival in Human MLL-rearranged Acute Leukemias, Blood 113(11):2375-85 (2009)）、かつＡＭＬでのＨＯＸクラスター遺伝子発現の上昇は、有害アウトカムに関連しうることが示唆されている。また、ＭＬＬ転座型白血病では、ＤＯＴ１Ｌヒストンメチルトランスフェラーゼを阻害すると、ＨＯＸクラスター遺伝子発現が減少し、それに対応して細胞増殖が減少することも示されている。
【０２８７】
これらの知見に基づいて、ＤＯＴ１Ｌは、連続増殖および生存をＤＯＴ１Ｌに依存しかつＨＯＸクラスター遺伝子発現の上昇を呈するＭＬＬ転座型白血病の有力な治療標的であると推定された。
【０２８８】
ＭＬＬ転座を含む６つの白血病細胞系およびＭＬＬ転座を含まない６つの細胞系で細胞増殖に対するＩＣ５０を決定する研究が行われた。ＭＬＬ転座型系のＩＣ５０は、次のとおりである。すなわち、MV4-11（ATCC（登録商標）、CRL-9591、Manassas, VA）では１７０ｎＭであり、SEMK2（S, Armstrong, MSKCC）では１．７ｍＭであり、KOPN-8（Creative Bioarray, Shirley, NY）では６２０ｎＭであり、Molm-13（Creative Bioarray, Shirley, NY）では７２０ｎＭであり、そしてTHP-1（ATCC（登録商標）TIB-202）では３ｍＭである。これとは対照的に、非ＭＬＬ転座型細胞系のＩＣ５０は、次のとおりである。すなわち、Jurkat（ATCC（登録商標）CRL-2898）では＞５０ｍＭであり、Kasumi-1（ATCC（登録商標）CRL-2724）では３３ｍＭであり、697（Creative Bioarray, Shirley, NY）では３５ｍＭであり、REH（ATCC（登録商標）CRL-8286）では１４ｍＭであり、そしてHL-60（ATCC（登録商標）CCL-240）では＞５０ｍＭである（図２）。
【０２８９】
ＤＯＴ１ＬおよびＨ３Ｋ７９メチル化への依存性は、ＤＯＴ１Ｌがコンディショナルノックアウトモデルを用いて遺伝子不活性化されたかまたは低分子ＥＰＺ００４７７７を用いて阻害されたかにかかわらず、ネズミＭＬＬ−ＡＦ９形質転換細胞系で同じであった。具体的には、ＨＯＸＡ９／ＭＥＩＳ１形質転換細胞は、ＤＯＴ１Ｌ阻害に対して非感受性であったが、ＭＬＬ−ＡＦ９形質転換細胞は、ＤＯＴ１Ｌ阻害の結果として細胞周期停止およびアポトーシスを起こす。
【０２９０】
ＨＯＸクラスター遺伝子発現の上昇を呈しかつＭＬＬ部分縦列重複（ＭＬＬ−ＰＴＤ）を有する２つのヒト白血病細胞系MUTZ-11（H. Drexler, DSMZ, Braunschweig, DE）およびEOL-1（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を、選択性低分子アミノヌクレオシドＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７（Daigle et al., Cancer Cell 20(1):53-65, 2011）の存在下で、増殖に関して検査した。ＨＯＸＡ遺伝子発現の上昇を示さない細胞系の増殖に影響を及ぼさない濃度の１０μＭのＥＰＺ００４７７７を用いて、MUTZ11およびEOL1細胞系を処理した（図２）。ＥＰＺ００４７７７は、検査された両方のＭＬＬ−ＰＴＤ細胞系の増殖を１０日間にわたり有意に阻害した（図２）。
【０２９１】
ＭＬＬ−ＰＴＤ細胞系MUTZ11の治療の７日後および１０日後、ＨＯＸＡ遺伝子発現を評価した。ＨＯＸＡクラスター遺伝子発現が有意に減少したことから（図４）、ＭＬＬ−ＰＴＤ白血病細胞の連続増殖およびＨＯＸＡクラスター遺伝子発現の上昇にＤＯＴ１Ｌが必要とされることが示唆される。
【０２９２】
実施例２
ＤＯＴ１Ｌを阻害すると、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、ＭＬＬ部分縦列重複のいずれでもないがＨＯＸクラスター遺伝子発現の上昇に関連する遺伝子突然変異を呈する白血病細胞の成長が阻害される
この実施例では、（１）遺伝子中にＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、またはＭＬＬ部分縦列重複（ＭＬＬ−ＰＴＤ）以外の１つ以上の白血病関連突然変異と、（２）１つ以上のＨＯＸクラスター遺伝子および／または１つ以上のＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇とを呈するある特定の白血病の組織および細胞が、ＤＯＴ１Ｌ阻害に対して感受性があり、したがって、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の投与によって有利に治療されうることを実証する。
【０２９３】
ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、およびＭＬＬ−ＰＴＤに関連する白血病の他に、他の白血病、たとえば、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２）、および／またはＡＳＸＬ１遺伝子のいずれかでの１つ以上の突然変異、ならびに／あるいはＮＵＰ９８−ＮＳＤ１および／または他のＮＵＰ９８転座を含む白血病もまた、ＨＯＸクラスター遺伝子および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇を呈する。（ＨＯＸクラスター遺伝子および／またはＨＯＸクラスター関連遺伝子の発現の上昇に関連する（表２）ならびに関連しない（表３）白血病関連遺伝子が開示されている表２および表３を参照されたい）。
【０２９４】
ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、およびＡＳＸＬ１遺伝子の突然変異ならびにＮＵＰ９８−ＮＳＤ１および他のＮＵＰ９８転座を呈し、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成またはＭＬＬ−ＰＴＤのいずれも示さない代表的な白血病で、ＨＯＸクラスター遺伝子発現およびＨＯＸクラスター関連遺伝子発現のレギュレーションならびに細胞の増殖および生存の維持におけるＤＯＴ１Ｌの役割を本開示の一部として評価した。
【０２９５】
ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１融合タンパク質により駆動される白血病細胞もまた、ＨＯＸクラスター遺伝子発現の上昇を呈するが、ＮＳＤ１はＨ３Ｋ３６メチルトランスフェラーゼであるため、これは、おそらく、異常なＨ３Ｋ３６メチル化の結果であろう。Wang et al., NUP98-NSD1 Links H3K36 Methylation to HOX-A Gene Activation and Leukaemogenesis, Nature Cell Biology 9(7):804-12 (2007)。
【０２９６】
本明細書に開示されるように、ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１遺伝子融合を発現する白血病細胞の増殖は、ＥＰＺ００４７７７  ＤＯＴ１Ｌにより阻害される。ＮＳＤ１は異常なＨ３Ｋ３６メチル化を駆動するため、ＮＳＤ１によるヒストンＫ３６メチル化とＤＯＴ１ＬによるＫ７９メチル化との間の重要でかつこれまで認識されていなかった関係が、これらのデータからさらに意味付けられる（図５）。
【０２９７】
また、ＮＰＭ１突然変異ヒトＡＭＬ細胞系ＯＣＩ−ＡＭＬ３（DSMZ, ACC-582; Braunschweig, DE）をＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７で処理して、そのＥＰＺ００４７７７処理ＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞の増殖をＥＰＺ００４７７７の存在下でのＥＰＺ００４７７７感受性ＭＬＬ転座型系およびＥＰＺ００４７７７非感受性ＡＭＬ１−ＥＴＯ転座型細胞系の増殖と比較した。ＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞は、ＭＬＬ転座型系と同程度にＥＰＺ００４７７７による成長阻害に対して感受性があったが、ＡＭＬ１−ＥＴＯ転座型細胞系は、ＥＰＺ００４７７７媒介成長阻害に対して感受性がなかった（図７Ａ〜Ｄ）。
【０２９８】
ＨＯＸクラスター遺伝子発現またはＨＯＸクラスター関連遺伝子発現の上昇を呈するが、ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成またはＭＬＬ−ＰＴＤをいずれも有していない白血病は、ＤＯＴ１Ｌ阻害に反応性であり、しかも白血病細胞を発現するそのような上昇を示すＨＯＸクラスター遺伝子の増殖は、そのような細胞をＥＰＺ００４７７７などのＤＯＴ１Ｌ阻害剤に接触させると低減されることが、この実施例に提示されたデータから実証される。
【０２９９】
さらに、理論による限定を意図するものではないが、ＤＯＴ１ＬによるＨ３Ｋ７９メチル化は、正常造血細胞でのＨＯＸ遺伝子発現の維持に重要であり、かつＨＯＸクラスター遺伝子発現の上昇を呈する患者の白血病の治療では、かかる白血病がＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、またはＭＬＬ−ＰＴＤを有するかにかかわらず、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の臨床的有効性を裏付けることが、本明細書に提示されたデータから示唆される。
【０３００】
実施例３
白血病におけるエピジェネティックレギュレーターの役割を規定するためのマウスモデル系
ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１駆動型白血病のマウスモデル系を開発するために、ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを、造血幹細胞（ＨＳＣ）が濃縮されたＬｉｎ−，Ｓｃａｌ＋，ｃ−Ｋｉｔ＋（ＬＳＫ）マウス骨髄細胞に導入した。この細胞は、培養下で無制限に増殖し、マウスで白血病を誘発する。したがって、ＤＯＴ１Ｌ阻害に関してＮＵＰ９８−ＮＳＤ１形質転換ＨＳＣ濃縮ＬＳＫ細胞を評価可能である。
【０３０１】
ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１形質転換ＨＳＣ濃縮ＬＳＫ細胞をＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７で処理したところ、種々の濃度のＤＯＴ１Ｌ阻害剤への細胞の暴露による増殖欠損から明らかなようにＥＰＺ００４７７７に対して顕著な感受性があることが分かった（図５Ａ）。さらに、ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１形質転換マウス細胞を１０μＭのＤＯＴ１Ｌ阻害剤で７日間処理したところ、ＨＯＸａ７、ＨＯＸａ９、ＨＯＸａ１０、およびＭｅｉｓ１クラスター遺伝子発現の実質的減少を伴ってＨＯＸプロモーター関連Ｈ３Ｋ７９メチル化が有意に低減された（図５Ｂ）。
【０３０２】
正常造血幹細胞（ＨＳＣ）におけるＤＯＴ１Ｌの役割の解明を始めるために、コンディショナルＤＯＴ１ＬノックアウトマウスをＭｘ１−ＣＲＥマウスと交配して、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ｐＩｐＣ）で処理されるとＨＳＣ  ＤＯＴ１Ｌ発現がコンディショナルに不活性化されうるマウスを作製した。
【０３０３】
ＤＯＴ１Ｌの不活性化によりＨＳＣの数および機能が徐々に減少した。こうして数および機能が減少する前に、網羅的遺伝子発現を評価することにより、ＨＳＣにおいてどの遺伝子発現プログラムがＤＯＴ１Ｌ依存性であるか決定した。ＤＯＴ１Ｌの不活性化によりＨＳＣ生命現象に重要ないくつかの遺伝子の発現が減少し、さらにはＨＯＸＡクラスター遺伝子およびＭＥＩＳ１遺伝子の発現が減少した。実際に、いくつかのＭＬＬ融合標的遺伝子は、正常ＨＳＣにおいてＤＯＴ１Ｌ不活性化により発現が減少した。ＤＯＴ１ＬつまりＨ３Ｋ７９メチル化が正常ＨＳＣにおいてＨＯＸＡクラスター遺伝子発現を制御するという事実から、ＨＯＸＡクラスター遺伝子発現の上昇を呈する他の白血病（ＭＬＬ転座、ＭＬＬ再構成、またはＭＬＬ−ＰＴＤを含む白血病以外）もまた、ＤＯＴ１Ｌ阻害に対して感受性があることがさらに実証される。
【０３０４】
実施例４
ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１、および他のＮＵＰ９８転座に関連する白血病におけるＤＯＴ１Ｌ阻害剤の有効性
ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、およびＡＳＸＬ１遺伝子の突然変異ならびにＮＵＰ９８−ＮＳＤ１および他のＮＵＰ９８転座に関連する白血病におけるＤＯＴ１Ｌの役割をさらに解明するために、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤を用いた実験を行う。
【０３０５】
ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１マウス形質転換細胞がＤＯＴ１Ｌ阻害に対して以上に記載のＭＬＬ−ＡＦ９細胞と類似の感受性レベルを呈するかどうかを判定するために、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７がＨ３Ｋ７９メチル化を低減する能力をモニターした。１０μＭのＥＰＺ００４７７７で１０日間処理した後、ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１細胞およびＭＬＬ−ＡＦ９細胞の両方でウェスタンブロッティングによりグローバルＨ３Ｋ７９レベルを決定した。ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１細胞はより高レベルの内因性Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２を呈するが、ＥＰＺ００４７７７処理により両方の細胞型でＨ３Ｋ７９ｍｅ２が完全に抑止された（図８Ａ）。さらに、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤がＮＵＰ９８−ＮＳＤ１形質転換細胞のアポトーシスを誘発するかどうかを検査するために、１０μＭのＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７または媒体対照で細胞を処理した。処理１０日後にアネキシンＶで細胞を染色することによりアポトーシスを評価した。アポトーシスの程度を同様に処理されたＭＬＬ−ＡＦ９形質転換細胞で見いだされるものと比較した。ＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１形質転換細胞において、ＭＬＬ−ＡＦ９形質転換細胞よりも多くのアポトーシスを誘発することが分かった（図８Ｂ）。ＨＯＸＡ９およびＭＥＩＳ１の遺伝子を高レベルで発現する細胞系がＭＬＬ突然変異の存在に依存せずにＤＯＴ１Ｌ阻害剤による処理に対して感受性があるという仮説をさらに検査するために、それぞれＤＮＴＭ３ＡおよびＮＰＭ１の突然変異を呈しかつ高レベルのＨＯＸＡ９発現を呈するがＭＬＬ突然変異を有していない２つの細胞系ＯＣＩ−ＡＭＬ２およびＯＣＩ−ＡＭＬ３を１０μＭのＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７または媒体対照のいずれかで処理した。同時に、ＨＯＸＡ９を発現しないＨＬ６０細胞（陰性対照）、高レベルのＨＯＸＡ９発現を呈しかつＭＬＬ転座を有するＭｏｌｍ−１３細胞（陽性対照）もまた、１０μＭのＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７または媒体対照のいずれかで処理した。
【０３０６】
処理を開始した後、複数の時点で細胞数を評価した。ＯＣＩ−ＡＭＬ２およびＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞は、同じように、それほどでもないがＤＯＴ１Ｌ阻害剤に対してＭＬＬ再構成型細胞系Ｍｏｌｍ−１３よりも感受性があった（図９および１０）。次に、本発明者らは、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤がＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞のアポトーシスを誘導するかどうかを評価し、実際に培養物でアポトーシス細胞の莫大な増加を誘発することを見いだした（図１１Ａ）。フローサイトメトリーにより決定された細胞周期状態から、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤に接触する細胞がアポトーシスを示唆するＳｕｂＧ１蓄積を呈することが示された。細胞表面マーカー発現、たとえば、両方とも骨髄単球性白血病細胞の分化により誘導されるＣＤ１１ｂおよびＣＤ１５発現の特性分析を介して、ＤＯＴ１Ｌ阻害後の分化の証拠を評価した。ＥＰＺ００４７７７によるＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞の処理は、細胞表面分化マーカーＣＤ１１ｂの発現により測定される分化の増加により特徴付けられた（図１１Ｂ）。
【０３０７】
それぞれＤＮＴＭ３ＡおよびＮＰＭ１突然変異を呈するＯＣＩ−ＡＭＬ２およびＯＣＩ−ＡＭＬ３ヒト細胞を１０μＭまでの漸増濃度のＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７で処理した。１１日目にＭＴＴアッセイを行った。ＩＣ５０を調べたところ、ＯＣＩ−ＡＭＬ２およびＯＣＩ−ＡＭＬ３の両方の細胞系に対して０．１５μＭであった。これは、ＭＬＬ融合細胞系に対する旧来のＩＣ５０値よりも低い。
【０３０８】
マウスから単離された造血幹細胞（Ｌｉｎ−  ｃ−ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋  ＣＤ１５０＋  ＣＤ４８−）およびヒト臍帯血由来のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞からのコロニー成長に及ぼすＤＯＴ１Ｌ阻害の影響を評価して、正常な幹細胞および前駆細胞に対するＤＯＴ１Ｌ阻害剤の効力を決定する。第１相臨床試験で検査されているＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００５６７６を用いた前臨床試験は、ヒトおよびネズミＭＬＬ転座型白血病細胞に対して有効な用量でマウスまたはラットにおいて造血毒性を示さなかった。
【０３０９】
実施例５
マウス試験
in vivoでのＤＯＴ１Ｌ阻害の結果を理解するためにマウスモデルを用いた実験を行った。ＡＭＬのマウスモデルを用いてＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７のin vivo有効性を検査する。Ｎｐｍ１ｃＡ／＋ＲｏｓａＳＢ／＋（Vassiliou G, Nature Genetics, 2011）またはＮｐｍ１ｃＡ／−Ｆｌｔ３ＩＴＤ／＋（Mupo A, Leukemia, 2013）などの追加の突然変異と組み合わせてＮＰＭ１ｃ突然変異を含有するように工学操作された動物は、それぞれ、１年以内および６８日以内にＡＭＬを発症する。Ｎｐｍ１ｃＡ／−ＲｏｓａＳＢ／＋またはＮｐｍ１ｃＡ／＋Ｆｌｔ３ＩＴＤ／＋マウスから単離されて１０μＭのＤＯＴ１Ｌ阻害剤の存在下で６日間培養されたＡＭＬ細胞を、レシピエントへの細胞移植後、それらのクローン形成能に関して検査した。一次移植および二次移植の後、Ｎｐｍ１ｃＡ／＋ＲｏｓａＳＢ／＋細胞およびＮｐｍ１ｃＡ／＋Ｆｌｔ３ＩＴＤ／＋ＡＭＬ細胞を、指定の日数（記載の７、１４、１５または２２日間）にわたり媒体対照（ＤＭＳＯ）または１０μＭのＥＰＺ００４７７で処理し（図１２ＡおよびＢ）、その後、コロニー形成アッセイを行った。ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の存在下でＡＭＬマウス細胞系を培養した結果、一次および二次の両方の移植後のコロニー形成能が有意に減少に帰着した（図１２ＡおよびＢ）。コロニー形成に対するＤＯＴ１Ｌ阻害の効力は、より後の時点（１４、１５、および２２日目）でより顕著であった。
【０３１０】
白血病開始能に対するＤＯＴ１Ｌ阻害の効力を評価するために、ＤＭＳＯまたは１０μＭのＥＰＺ００４７７７で事前に６日間処理されたＮｐｍ１ｃＡ／＋ＲｏｓａＳＢ／＋細胞を同種同系Ｃ５７／ＢＬ６マウスに注射した。２つのグループ（ＤＭＳＯおよびＥＰＺ００４７７７）のカプラン・マイヤー生存曲線は、図１３Ａに例示され、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の投与を受けた細胞が注射された動物の生存期間が延長されることを示している。さらに、ライト・ギムザ染色法により染色された末梢血スミアは、ＥＰＺ００４７７処理細胞の分化を示唆する（ＤＭＳＯのみに暴露された細胞では示唆されない）（図１３Ｂ）。最後に、全血球数を解析したところ、ヘモグロビンレベルおよび血小板数のパラレルなわずかな増加を伴って白血球数が有意に減少することが示された（図１３Ｃ）。全体として、これらの結果から、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、ＭＬＬの突然変異、転座、または重複ではなくＮＰＭ１により駆動されるＡＭＬのマウスモデルではin vivoで白血病誘発を軽減することが実証される。
【０３１１】
種々のＨＯＸ遺伝子およびＨＯＸ関連遺伝子のレベルに対するＤＯＴ１Ｌ阻害の効力をｑＰＣＲを用いて評価した。ＥＰＺ００４７７でＮｐｍ１ｃＡ／＋ＲｏｓａＳＢ／＋およびＮｐｍ１ｃＡ／−Ｆｌｔ３ＩＴＤ／＋ネズミＡＭＬ細胞を処理したところ、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＭＥＩＳ１、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、およびＨＯＸＢ５  ｍＲＮＡレベルが有意に減少したことから（図１４ＡおよびＢに、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＭＥＩＳ１、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、およびＨＯＸＢ５のそれぞれに対するＲＮＡレベルが示されている）、ＨＯＸ遺伝子およびＨＯＸ関連遺伝子の発現がＤＯＴ１Ｌ活性に大きく依存していることがさらに示唆される。
【０３１２】
実施例６
マウス試験（予言的）
この実施例では、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、およびＡＳＸＬ１遺伝子の１つ以上での１つ以上の突然変異ならびに／またはＮＵＰ９８−ＮＳＤ１もしくは他のＮＵＰ９８転座に関連する白血病を含む白血病が異種移植されたマウスの作製と、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤のin vivo有効性に関する得られたマウスモデルの検査とを記載する。
【０３１３】
ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、およびＡＳＸＬ１突然変異ならびにＮＵＰ９８−ＮＳＤ１および他のＮＵＰ９８転座に関して白血病サンプル（小児および成人）を特性分析する。連続注入を含むＥＰＺ００５６７６の注入はマウスにおいてＭＬＬ転座型白血病細胞の成長を抑制することが知られている。ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、およびＡＳＸＬ１細胞系、ならびにＮＵＰ９８−ＮＳＤ１または他のＮＵＰ９８転座を呈する細胞系（ならびに対照としてＭＬＬ転座型および／またはＭＬＬ−ＰＴＤ細胞系）を用いて類似の実験を行い、in vivoで低分子阻害剤の活性を決定する。
【０３１４】
最初の実験では、成長速度および薬剤反応特性がすでに知られている細胞系を用いる。Armstrong et al., Inhibition of FLT3 in MLL: Validation of a Therapeutic Target Identified by Gene Expression based Classification, Cancer Cell 3(2):173-83 (2003)。以上に記載のものと同一の細胞系試験でＨ３Ｋ７９ｍｅ２の阻害などのバイオマーカー評価をin vitroで定義し、in vivoで処理された細胞で類似の解析を行う。
【０３１５】
ＤＯＴ１Ｌ阻害剤のin vivo有効性は、ＭＬＬ転座細胞系ＭＶ４−１１が異種移植された免疫不全ラットにおけるＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００５６７６のin vivo有効性が記載されているDaigle et al., Blood (2013, Jun 25) [Epub ahead of print]に記載の方法に従って、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、および／もしくはＡＳＸＬ１細胞系ならびに／またはＮＵＰ９８−ＮＳＤ１もしくは他のＮＵＰ９８転座を呈する細胞系が異種移植された免疫不全ラットで検査可能である。
【０３１６】
ＤＯＴ１Ｌ阻害剤のin vivo有効性は、ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１ネズミ白血病が移植された免疫不全ＮＳＧマウスの作製が記載されているWang et al., NUP98-NSD1 Links H3K36 Methylation to HOX-A Gene Activation and Leukaemogenesis, Nature Cell Biology 9(7):804-12 (2007))に記載の方法に従って、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、および／もしくはＡＳＸＬ１細胞系ならびに／またはＮＵＰ９８−ＮＳＤ１もしくは他のＮＵＰ９８転座を呈する細胞系が異種移植された免疫不全マウスで検査可能である。次いで、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、それらの白血病移植免疫不全マウスでＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、および／もしくはＡＳＸＬ１白血病ならびに／またはＮＵＰ９８−ＮＳＤ１もしくは他のＮＵＰ９８転座を呈する白血病に対して評価される。
【０３１７】
Ｈ３Ｋ７９ＭＥ２の阻害の程度を評価するためにバイオマーカー評価戦略を組み合わせる。このバイオマーカー評価試験は、酵素阻害と、患者における低分子ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の臨床試験評価に関連する反応とを相関付ける。ｎ＝９のグループサイズであれば、両側検定を用いてα＝０．０５、検出力≧８０％で腫瘍負荷時に３０％の差を検出するのに十分である。したがって、ｎ＝９〜１０のグループサイズの動物をin vivo有効性試験に使用する。
【０３１８】
これらの実験は、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、および／もしくはＡＳＸＬ１により媒介される白血病ならびに／またはＮＵＰ９８−ＮＳＤ１もしくは他のＮＵＰ９８転座により媒介される白血病に対するＤＯＴ１Ｌ阻害剤の治療有効性をさらに支持するであろう。
【０３１９】
実施例７
ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、および／もしくはＡＳＸＬ１により媒介される白血病ならびに／またはＮＵＰ９８−ＮＳＤ１もしくは他のＮＵＰ９８転座により媒介される白血病のＤＯＴ１Ｌ抑制に対する感受性をモジュレートする遺伝子の同定（予言的）
ＤＯＴ１ＬがＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１細胞増殖にきわめて重要であろうと仮定すれば、この経路のエンハンサーまたはサプレッサーのいずれかである他の遺伝子もまた、同定される。ＤＯＴ１Ｌ複合体のモジュレーターはすべて、有力な治療標的である。また、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤媒介成長阻害の抑制または増強のいずれかを行う遺伝子を同定すれば、阻害剤と、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１遺伝子との両方の作用機序が明確化される。
【０３２０】
これまでの研究から、ＨＯＸ遺伝子発現および形質転換を誘発する機序の一部としてＮＵＰ９８−ＮＳＤ１がＨ３Ｋ３６メチル化に影響を及ぼすことが実証されたが、Ｈ３Ｋ７９メチル化がこの白血病でどのような役割を果たすかは不明である。ＣｈＩＰ−ｓｅｑ試験は、ＤＯＴ１Ｌ阻害後に起こるヒストン修飾の変化をさらに規定する。本明細書に規定されるスクリーンは、これらの白血病でＤＯＴ１Ｌが果たす役割を明確化する。
【０３２１】
高スループットのゲノムスケールｓｈＲＮＡスクリーニング（ＨＴ−ｓｈＲＮＡ）は、薬剤感受性／耐性の新しい標的の同定をもたらす。実験は、哺乳動物系で低分子または遺伝子機能喪失モデルのいずれかを用いて遺伝子エンハンサー／サプレッサースクリーンと同じように行われる。
【０３２２】
ゲノムワイドなプールＲＮＡｉスクリーンは、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の存在下または不在下で行われる。タモキシフェンによる細胞処理およびＣｒｅリコンビナーゼの活性化を介してコンディショナルにＤＯＴ１Ｌを抑圧可能なＭＬＬ−ＡＦ９形質転換ネズミ白血病系は作製されている。細胞系は、分化し、増殖を停止し、Ｃｒｅ誘導の約６日後にアポトーシスを開始する（図６）。さらに、組換え効率は、ＤＯＴ１Ｌ遺伝子が切除されない細胞の増殖がほとんど見られないほど高い。細胞の成長は、ＤＯＴ１Ｌの再導入により、またはＭＬＬ−ＡＦ９標的遺伝子、ＨＯＸＡ９、およびＭＥＩＳ１の発現により、レスキュー可能である。
【０３２３】
ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１形質転換細胞用として、類似の細胞系が開発される。これらの細胞系は、ＤＯＴ１Ｌの不在下で成長に有利または不利な選択を行うｓｈＲＮＡを同定するｓｈＲＮＡスクリーンに理想的に好適である。
【０３２４】
ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１形質転換細胞は、１０μＭのＥＰ００Ｚ４７７７またはＤＭＳＯで処理される。各細胞系に対して、未処理細胞およびタモキシフェン処理細胞の生物学的レプリケートを５つずつ用いて実験が行われる。ゲノムＤＮＡの単離のためにｃｒｅリコンビナーセ誘導の０、３、６、９、および１２日後に細胞が採取される。ｓｈＲＮＡは、増幅され、バーコード付けされ、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングを用いて配列決定される。
【０３２５】
ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の存在下では枯渇または濃縮されるが不在下ではそうしたことが起こらないｓｈＲＮＡが同定されることにより、これらの遺伝子のノックダウンがＤＯＴ１Ｌ阻害に対する感受性を増大させるかまたは耐性を付与することが示唆される。２つの異なるｓｈＲＮＡが有意なスコアを与えた遺伝子は、候補遺伝子として指定される。候補遺伝子に対して、定量ＰＣＲおよびウェスタンブロットによりｓｈＲＮＡのノックダウンを検証し、追加の細胞系を解析する。遺伝子の非標的発現を介する表現型のレスキューにより、ｓｈＲＮＡスクリーンで同定された遺伝子を検証する。一次スクリーンに含まれない追加の細胞系とくにＭＬＬ転座型系でこれらの遺伝子を調べ、類似の効果を確認する。利用可能な低分子阻害剤による候補タンパク質に対して、各細胞系でＤＯＴ１Ｌ阻害剤に対する表現型結果を生存能、細胞周期、およびアポトーシスに関する決定する。
【０３２６】
実施例８
ＤＯＴ１Ｌの分子効果ならびにＤＯＴ１ＬおよびＥＺＨ２阻害剤の前臨床活性（予言的）
最近の研究からＭＬＬ転座型ヒト白血病の細胞系およびネズミモデルに対するＤＯＴ１Ｌ阻害剤の顕著な活性が実証されており、予備的証拠から他のＡＭＬサブタイプがＤＯＴ１Ｌ酵素活性に依存することが示唆される。
【０３２７】
ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１白血病細胞のＤＯＴ１Ｌ阻害剤処理後に起こるヒストンメチル化の変化が評価される。ＮＳＤ１はＨ３Ｋ３６メチルトランスフェラーゼであるため、ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１はＨＯＸ遺伝子でＨ３Ｋ３６ｍｅ３を誘発する。Wang et al., Nature Cell Biology 9(7):804-12 (2007)。今日まで、Ｈ３Ｋ７９のジメチル化がこのサブタイプの白血病になぜ重要なのかは明らかになっていない。したがって、特定のＨ３Ｋ７９修飾がＤＯＴ１Ｌ阻害後にどのように変化するか調べることに大きな関心が寄せられている。
【０３２８】
ＭＬＬ融合標的遺伝子が規定されている。標的遺伝子発現は、より広範な遺伝子発現よりもＤＯＴ１Ｌに依存する。ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１白血病に対して同一の方法を用いるために、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１標的遺伝子は、ＭＬＬ−ＡＦ９で記載されるように決定される。ＮＨ３末端にビオチン化配列を有し、マウスＨＳＣで発現されるＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１タンパク質が生成される。細胞形質転換時、細胞は、ＮＨ３末端配列をビオチン化する細菌性ＢｉｒＡと共に共トランスフェクトされる。
【０３２９】
ＣｈＩＰｓｅｑは、ストレプトアビジンビーズを用いて行われ、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１が結合される部位が決定される。ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＭＬＬ−ＡＦ９、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１マウスまたはヒト白血病細胞系は、阻害剤で処理され、処理の２４、４８、７２時間後、遺伝子発現変化が評価される。ＭＬＬ−ＰＴＤおよびＭＬＬ−ＡＦ９細胞でのＤＯＴ１Ｌ阻害剤による発現変化は、他の細胞系での変化と比較される。
【０３３０】
遺伝子セット濃縮解析などの標準的遺伝子発現アルゴリズムを用いて、ＭＬＬ融合標的遺伝子の遺伝子発現変化と、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１標的遺伝子の遺伝子発現変化とのオーバーラップ度が決定される。これにより、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１駆動型遺伝子発現プログラムがＤＯＴ１Ｌ阻害剤処理時に逆転されるかが確認される。
【０３３１】
ヒストンメチル化は、すでに記載されているようにＨ３Ｋ７９ｍｅ２に関してＣｈＩＰ−ｓｅｑを行うことにより評価される［１２］。ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１形質転換細胞のＨ３Ｋ３６ｍｅ３は、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３プロファイルがこれらの細胞で異常であるかどうかを判定するために評価される。Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２およびＨ３Ｋ３６ｍｅ３の変化は、これらの修飾が互いにどのように変化するかを判定するために、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤処理後に判定される。これらの実験から、ＤＯＴ１Ｌ阻害は、ＭＬＬ融合依存性白血病と同様に白血病誘発プログラムを逆転することが確認される。
【０３３２】
実施例９
in vitroおよびin vivoでのＥＺＨ２阻害剤と組み合わせたＤＯＴ１Ｌ阻害剤の抗白血病効果（予言的）
本明細書に開示されるように、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１およびＮＰＭ１白血病で有意な活性を呈する。マウスモデル系で標的療法を用いて白血病を効果的に治療するために、組合せ法を評価する。
【０３３３】
いくつかの異なるクロマチン修飾酵素および複合体は、ＭＬＬ転座型ＡＭＬおよび他のサブタイプのＡＭＬに重要であることが示されている。特定的には、ヒストンＨ３Ｋ２７メチルトランスフェラーゼＥＺＨ２は、ＭＬＬ−ＡＦ９白血病細胞の自己再生に必要とされる。Neff et al., Polycomb Repressive Complex 2 is Required for MLL-AF9 Leukemia, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109(13):5028-33 (2012)。ＥＺＨ２は、複数のサブタイプのＡＭＬに重要な機序、すなわち、ｐ１６／ｐ１９の抑制およびＭｙｃ駆動型遺伝子発現プログラムの維持を介して機能する。Wang et al., Nature Cell Biology 9(7):804-12 (2007)。
【０３３４】
ヒストンデメチラーゼＬＳＤ１は、最近、連続ＡＭＬ細胞増殖に重要であることが示され、ＬＳＤ１阻害剤が利用可能になっているため、検査される。Harris et al., The Histone Demethylase KDM1A Sustains the Oncogenic Potential of MLL-AF9 Leukemia Stem Cells, Cancer Cell 21(4):473-87 (2012)。ＤＯＴ１Ｌ阻害剤とＥＺＨ２阻害剤との組合せは、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１白血病モデルを含む白血病モデルで検査される。他の阻害剤は、ＤＯＴ１Ｌ阻害と組み合わせて評価される。
【０３３５】
ＤＯＴ１Ｌ阻害剤とＥＺＨ２阻害剤との組合せは、in vitroで評価される。ＭＬＬ転座型細胞およびＭＬＬ生殖系列細胞でin vitro相乗作用が評価される。類似の実験は、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１白血病細胞で行われる。複数の濃度で２つの異なる化合物の力価測定を可能にするロボットピニングシステムが確立されている。これは、ＤＯＴ１ＬおよびＥＺＨ２阻害剤を評価するために使用されるin vitro相乗作用の詳細な評価を提供する。
【０３３６】
ロボット液体ハンドリングおよび効率的ライブラリープレートデザインは、３８４ウェルプレートの培養細胞と組み合わせて２種の化合物の迅速自動移送を可能にする。用量−反応フォーマットで４つのレプリケートの各作用剤を隣接させて８つのレプリケートの２種の化合物の（５×５）用量アレイが作製される。７〜１０日間インキュベートした後、マルチラベルプレートリーダー上で細胞生存能のサロゲートとしてＡＴＰ含有量が決定される。これらの実験は、細胞数の評価前に細胞系がＤＯＴ１ＬおよびＥＺＨ２阻害剤化合物に７〜１０日間暴露されるように行われる。ＥＺＨ２およびＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、両方とも増殖の阻害に最大１週間を要するため、長期間のインキュベーションが必要である。
【０３３７】
結果は、ChouおよびTalalayの方法に従ってCompuSynパッケージでプロットされる。得られた用量−効果曲線およびアイソボログラムは、相加効果または相乗効果が存在するかの指標である。組合せ指標が取得され、有意な相乗作用が存在するかどうかを判定するために比較される。化合物は分化を誘発するため、マイクロアレイ解析を用いて単一の作用剤および分子の組合せの効果を調べることにより、分化の程度および予想される遺伝子発現変化の組合せがＤＯＴ１ＬおよびＥＺＨ２の機能喪失モデルを用いたこれまでの試験に基づいて予想されるように検出されるかが判定される。
【０３３８】
阻害剤の組合せはin vivoで検査される。ＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、それぞれの化合物の適切な用量およびスケジュールが決定されているマウスモデル系で評価される。ＥＺＨ２阻害剤の用量およびスケジュールは発表されている。McCabe et al., EZH2 Inhibition as a Therapeutic Strategy for Lymphoma with EZH2-activating Mutations, Nature 492(7427):108-12 (2012)。組合せ試験は、ルシフェラーゼを発現するヒトおよびマウスＭＬＬ融合駆動型白血病およびＭＬＬ−ＰＴＤ白血病さらにはＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１白血病細胞のin vivo生物発光をモニターすることにより抗白血病活性を評価するために行われる。Bernt et al., MLL-rearranged Leukemia is Dependent on Aberrant H3K79 Methylation by DOT1L, Cancer Cell 20(1):66-78 (2011)およびStubbs et al., MLL-AF9 and FLT3 Cooperation in Acute Myelogenous Leukemia: Development of a Model for Rapid Therapeutic Assessment, Leukemia 22(1):66-77 (2008)。
【０３３９】
対照動物が施設限界（すなわち、苦痛発生または腫瘍体積限界）に達するまで、マウスは、媒体、個別の阻害剤、または阻害剤の組合せで毎日治療される。主要エンドポイントは、腫瘍負荷（末梢血ＧＦＰ陽性、末梢血中％ヒトＣＤ４５ならびに／または発光イメージングにより評価される）を含む。屠殺時間および副次エンドポイントは、完全病理組織学的検査を含む。
【０３４０】
有効性は、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、およびＮＵＰ９８−ＮＳＤ１白血病と共に移植されたサンプルの原発ヒトＭＬＬ転座型ＡＭＬに対して評価される。これらの研究は、この組合せの臨床解釈を支持するこれらの化合物の重要な前臨床評価を提供する。
【０３４１】
実施例１０
ＡＬＭのマウスモデルでのＮＰＭ１およびＦＬＴ３の二重阻害（予言的）
白血病誘発では、疾患の完全な発症のために２つ以上の遺伝子突然変異が必要とされることが多い。ＡＭＬに存在する遺伝子変化の組合せは、患者予後および治療法に対する反応の主要な決定因子である。ＦＬＴ３およびＮＰＭ１遺伝子の突然変異は、ＡＭＬで最も頻度の高い遺伝子異常であり、重要な予後指標として機能する。ＦＬＴ３は、ＡＭＬ症例の１／３に見いだされ、予後およびアウトカムの不良に関連するが（Thiede C, Blood. 2002 Jun 15;99 (12):4326-35）、ＮＰＭ１突然変異は、ＡＭＬ患者の５０〜６０％に存在し、一般に、化学療法に対する反応の増加および好ましい予後を与える（Schlenk RF, N Engl J Med 2008; 358:1909-1918）。しかしながら、ＮＰＭ１突然変異陽性の患者の約４０％はまた、ＦＬＴ３突然変異をも有し、ＦＬＴ３突然変異の存在は、ＮＰＭ１突然変異のみを有する患者の有益なアウトカムを打ち消す（Gale, RE. Blood. Mar 1 2008; 111(5):2776-84）。その他に、ＦＬＴ３レセプターキナーゼは、ＮＵＰ９８−ＨＯＸ融合体と協働してきわめて侵攻性のＡＭＬを誘発する。最後に、ＦＬＴ３レベルの上昇は、高いＨＯＸ遺伝子発現により特徴付けられるＡＭＬのサブタイプで観測されている（Palmqvist, L. Blood. Aug 1; 2006; 108 (3)）。興味深いことに、最新の研究からＦＬＴ３突然変異は高いＨＯＸクラスター遺伝子発現の原因に結びつかない可能性がかなり高いことが示唆され、白血病誘発に寄与する２つの個別経路の二重阻害の重要性がさらに検証されている（Andreeff M, Leukemia 2008, 22, 2041-2047）。全体として、これらの観測結果から、高いＦＬＴ３発現および／または突然変異を伴うＨＯＸ誘発ＡＭＬおよびＡＬＬでのＦＬＴ３阻害剤の使用は、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤で治療される患者に追加の利点を提供可能であることが示唆される。
【０３４２】
in vivoでＦＬＴ３阻害と組み合わせてＤＯＴ１Ｌ阻害の有効性を検査するために、ＡＭＬのマウスモデルにＦＬＴ３阻害剤キザルチニブ（ＡＣ２２０）と一緒にＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７が投与される。ＦＬＴ３突然変異と組み合わせてＮＰＭ１ｃ突然変異を含有するように工学操作された動物Ｎｐｍ１ｃＡ／＋Ｆｌｔ３ＩＴＤ／＋（Mupo A, Leukemia Sep 2013; 27(9):1917-1920.）は、ＡＭＬを発症して６８日以内に死亡する。二重組合せ療法（ＤＯＴ１ＬおよびＦＬＴ３の両方の阻害）が、いずれかのタンパク質を単独で用いた阻害と比較して、組合せで処理された細胞の白血病誘発能を軽減し、前処理細胞が移植されたマウスに追加の延命効果を提供するかどうかを評価するために、ＥＰＺ００４７７７およびＡＣ２２０の両方の有効性が併行して評価される。マウスを連続注入に付すことは技術的に困難であるため、Ｎｐｍ１ｃＡ／＋Ｆｌｔ３ＩＴＤ／＋マウスから単離されたＡＭＬ細胞が用量依存的にＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７またはＦＬＴ３阻害剤ＡＣ２２０またはその両方の存在下で６日間培養され、実施例５に対応する方式でレシピエントマウスに細胞を移植した後、それらのクローン形成能に関して検査される。一次および二次の両方の移植が行われる。各移植後、Ｎｐｍ１ｃＡ／＋Ｆｌｔ３ＩＴＤ／＋ＡＭＬ細胞が採取され、媒体対照（ＤＭＳＯ）またはＥＰＺ００４７７またはＡＣ２２０またはＥＰＺ００４７７７とＣ２２０の両方で７、１４、および２２日間処理され、その後、コロニー形成アッセイが行われる。ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の存在下でのＡＭＬマウス細胞（Ｎｐｍ１ｃＡ／＋Ｆｌｔ３ＩＴＤ／＋）の培養は、一次および二次の両方の移植後、コロニー形成能を低減することがすでに示されている（図１２ＡおよびＢおよび実施例５）。こうして、コロニー形成能を阻害する二重阻害（ＤＯＴ１Ｌ阻害とＦＬＴ３阻害）の能力は、ＤＯＴ１Ｌ阻害単独およびＦＬＴ３阻害単独のそれぞれと比較される。組合せで治療された細胞のクローン形成能は、いずれかの作用剤単独で処理された細胞のものを有意に下回ることが予想される。
【０３４３】
白血病開始能に対する二重ＤＯＴ１ＬおよびＦＬＴ３阻害の効果をさらに評価するために、０１、１、および１０μＭの各化合物を用いて用量依存的にＤＭＳＯ、またはＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７またはＦＬＴ３阻害剤ＡＣ２２０またはその両方で事前に６日間処理されたＮｐｍ１ｃＡ／−Ｆｌｔ３ＩＴＤ／＋細胞が同種同系Ｃ５７／ＢＬ６マウスに注射される。ＤＯＴ１Ｌ阻害剤でＮｐｍ１ｃＡ／−Ｆｌｔ３ＩＴＤ／＋ＡＭＬ細胞を処理すると生存期間が延長されることが実証されている。ＤＭＳＯで処理された細胞が注射されたマウスは、１９日目に死亡するが、ＥＰ００４７７７（１０μＭ）で処理された細胞が注射された動物は、３１日目に死亡し始める（図１３Ａ）。こうして、ＤＯＴ１ＬおよびＦＬＴ３阻害剤の両方を含む処理は、死亡開始の遅延能に関して評価される（注射の３１日後よりも後）。その他に、用量反応曲線は、いずれかの阻害剤単独と対比して二重阻害実験（ＥＰＺ００４７７７およびＡＣ２２０）の最小必要投与量の情報を与える。これらの結果から、ヒト治療法に示唆を与えるＮＰＭ１およびＦＬＴ３突然変異駆動型ＡＭＬのマウスモデルの生存延長に関してＤＯＴ１ＬおよびＦＬＴ３阻害剤の両方を用いた組合せの有効性の増加が示されることが予想される。ＦＬＴ３阻害剤は、ＡＭＬに対する第１選択の治療剤として使用されているかまたは現在開発されている。第２選択の治療剤としての薬剤組合せの利用能は、白血病に対する利用可能なレパートリーを実質的に増加させるであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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