(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス感染に起因するウイルス性婦人科癌の診断を補助する方法であって、
被検対象の患者から採取した細胞における感染ヒトパピローマウイルスの転写産物量を、転写開始点ごとに測定する工程、
前記感染ヒトパピローマウイルスの転写開始点ごとの転写産物量を解析する工程、を含み、
前記測定する工程および前記解析する工程をいずれも経時的に実施し、
前記転写産物がヒトパピローマウイルスの前期プロモーターにより制御される少なくとも一つの転写開始点に由来する転写産物およびヒトパピローマウイルスの後期プロモーターにより制御される少なくとも一つの転写開始点に由来する転写産物であり、
前記解析する工程が、
前記前期プロモーターにより制御される転写開始点群に由来する転写産物の発現量の最大値（Ｔ前期）と、前記後期プロモーターにより制御される転写開始点群に由来する転写産物の発現量の最大値（Ｔ後期）との比Ｒ（Ｔ前期/Ｔ後期）を算出する工程を含み、
Ｒ（Ｔ前期/Ｔ後期）＜１の場合は、前記ウイルス性婦人科癌の進展のリスクが低いと判定し、
１≦Ｒ（Ｔ前期/Ｔ後期）の場合は、前記ウイルス性婦人科癌の進展のリスクが高いと判定する、方法。
【請求項２】
前記細胞が、ウイルスが感染した組織から採取されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記測定する工程および／または解析する工程を、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＣＡＧＥ法、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、免疫測定法、ＳＡＧＥ法、ＣＡＧＥ法、質量分析法および分子間相互作用解析からなる群から選ばれる１種以上の方法を用いて行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルス性婦人科癌が子宮頸癌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記転写産物がｍＲＮＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒトパピローマウイルスが１６型ヒトパピローマウイルスである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス性婦人科癌の診断方法等に関する。より詳細には、ウイルス感染に起因する癌のうち、特に婦人科悪性癌の診断方法およびその予後の予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
婦人科癌には、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、子宮肉腫、絨毛癌（絨毛性疾患）および乳癌などが含まれる。その中でも子宮頸癌は、全世界で三番目に多い婦人科癌であり、年間５３０，０００人の罹患者、そして２７５，０００人の死亡者を出している（非特許文献１）。子宮頸癌は、子宮頸部扁平上皮癌と子宮頸部腺癌に分類され、子宮頸部腺癌は、腺様分化を伴う子宮頸部癌であり、腺上皮を母細胞とする純粋な腺癌の他、腺扁平上皮癌を含み、すべてのタイプの上皮に由来し得る（非特許文献２）。子宮頸部腺扁平上皮癌は、腺上皮を母細胞とする癌細胞と扁平上皮を母細胞とする癌細胞からなる子宮頸部腺癌であり、全子宮頸癌の５〜１０％を占める（非特許文献３）。
【０００３】
ところで、婦人科癌を含む癌のいくつかは、癌ウイルス（腫瘍ウイルス）の感染により引き起こされることが知られている。その中でも、ヒトパピローマウイルス（HPV）は、９０％以上の子宮頸癌の原因となっていることが知られており、１６型、１８型、５２型および５８型を含む多くの型が子宮頸癌と関連し、６型、１１型は尖圭コンジローマ，良性乳頭腫，再発性気道乳頭腫症などの良性疾患を引き起こす（非特許文献４および５）。これらの中でも、HPV16型および１８型による感染が、子宮頸癌の最も一般的な原因であることが知られている（非特許文献６）。
【０００４】
また、子宮頸癌は、異形成上皮（軽度（CIN1）→中等度（CIN2）→高度（CIN3））→上皮内癌→微小浸潤扁平上皮癌→扁平上皮癌の順に進展することが知られている（非特許文献７）。そして、子宮頸癌のための検査としては、一般的に、細胞診検査、各種腫瘍マーカーについての血液検査、組織生検および画像検査等が行われている。しかしながら、例えば、細胞学的特性に基づいて行われる細胞診検査は、細胞の特性の同定に時間がかかるのが一般的である。また、細胞学的特性の同定には比較的高いレベルの熟練度が必要であり、一般的には容易に自動化できるものではない。一方で、子宮頸癌のための検査としては、パパニコロウ染色によるスメアスクリーニングと、ヒトパピローマウイルス検査が広く行われている。しかしながら、この検査方法では、子宮頸部腺癌では偽陰性となり、子宮頸部腺癌の指標とするには問題がある（非特許文献８）。このため、子宮頸部腺癌の検査に適用するのは、一般的ではない。
【０００５】
また、HPV感染由来の癌の検出方法として、HPV感染患者から採取された試料におけるHPVのＥ６／Ｅ７遺伝子の発現ｍＲＮＡレベルを測定して、HPV誘導性の前癌状態を検出する方法が知られている（特許文献１および非特許文献９）。しかしながら、HPVのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡの発現が、必ずしもすべてのHPVによる発癌のリスクを評価しているとは限らない可能性が指摘されている（非特許文献１０）。これらの従来の方法は、特定の進行段階の癌を検出することを目的としたものであり、癌の進行（予後）の予測を行うことはできない。
【０００６】
このような状況下、より精度および感度が高いウイルス性婦人科癌の診断、および、癌の進展（予後）を予測できる方法が依然として求められているといえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−１３６７２９
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Arbyn M, Castellsague X, de Sanjose S, Bruni L, Saraiya M, Bray F, Ferlay J., 2011 Worldwide burden of cervical cancer in 2008. Ann. Oncol. 22: 2675-2686
【非特許文献２】Shingleton IIM, Bell MC, Fremgen A et al., Is there really a difference in survival of women with squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, and adenosquamous cell carcinoma of the cervix? Cancer 1995; 76; 1948-55
【非特許文献３】Thomas G., Cervical cancer: treatment challenges in the developing world. Radiother Oncol. 2006 May; 79(2): 139-41
【非特許文献４】Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA, Shah KV, Snijders PJ, Peto J, Meijer CJ, Munoz N., Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol. 1999 Sep; 189(1): 12-9
【非特許文献５】長阪一憲、矢野哲  HPV（ヒトパピローマウイルス）  臨床検査ガイド2015改訂版  文光堂  842-45
【非特許文献６】Matsumoto K, Oki A, Furuta R, Maeda H, Yasugi T, Takatsuka N, Mitsuhashi A, Fujii T, Hirai Y, Iwasaka T, Yaegashi N, Watanabe Y, Nagai Y, Kitagawa T, Yoshikawa H; Japan HPV And Cervical Cancer Study Group. Predicting the progression of cervical precursor lesions by human papillomavirus genotyping: a prospective cohort study. Int J Cancer. 2011 Jun 15;128(12):2898-910.
【非特許文献７】Holowath P, Miller AB, Roham T. Natural history of dysplasia of the uterine cervix. J Natl Cancer Inst. 1999. 91: 252-258.
【非特許文献８】Pak SC, Martens M, Bekkers R, Crandon AJ, Land R, Nicklin JL, Perrin LC, Obermair A., Pap smear screening history of women with squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix. Aust N Z J Obstet Gynaecol. 2007 Dec; 47(6): 504-7
【非特許文献９】Arbyn M, Roelens J, Cuschieri K, Cuzick J, Szarewski A, Ratnam S, Reuschenbach M, Belinson S, Belinson JL, Monsonego J. The APTIMA HPV assay versus the Hybrid Capture 2 test in triage of women with ASC-US or LSIL cervical cytology: a meta-analysis of the diagnostic accuracy. Int J Cancer. 2013 Jan 1;132(1):101-8
【非特許文献１０】Andersson E, Karrberg C, Radberg T, Blomqvist L, Zetterqvist BM, Ryd W, Lindh  M, Horal P. Type-specific human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by real-time  PCR improves identification of cervical neoplasia. J Clin Microbiol. 2011 Nov;49(11):3794-9
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ウイルス性婦人科癌の診断およびその予後の予測をすることができる新規の方法を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明者は、ウイルス性婦人科癌の患者のウイルス被感染組織の細胞において、ウイルスの転写開始点ごとの転写産物の種類と量が、健常者と比較して特異的に変化することを見出した。さらに、本発明者は、ウイルス性婦人科癌の患者における、このようなウイルス由来の転写産物の種類と量に対する特異的な変化を、転写開始点ごとに測定および解析し、それらの結果に基づいて、ウイルス性婦人科癌の診断およびその予後の診断ができることを見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１１】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）ウイルス性婦人科癌の患者から採取した細胞における感染ウイルスの転写産物量を、転写開始点ごとに測定する工程、
前記感染ウイルスの転写開始点ごとの転写産物量を解析する工程、
を含み、
前記感染ウイルスがヒトパピローマウイルスであり、
前記転写産物がヒトパピローマウイルスの前期プロモーターにより制御される少なくとも一つの転写開始点に由来する転写産物および／またはヒトパピローマウイルスの後期プロモーターにより制御される少なくとも一つの転写開始点に由来する転写産物である、
ウイルス性婦人科癌の診断または予後を予測する方法。
（２）前記細胞が、ウイルスが感染した組織から採取されたものである、（１）に記載の方法。
（３）前記解析する工程が、
前記患者におけるヒトパピローマウイルスの前期プロモーターにより制御される転写開始点群に由来する転写産物の発現量を測定し、
前記患者におけるヒトパピローマウイルスの後期プロモーターにより制御される転写開始点群に由来する転写産物の発現量を測定し、
前記患者の前記各転写開始点群に由来する転写産物の発現量の最大値の比と、前記各転写開始点群に由来する転写産物の発現量の最大値の比についての標準参照値とを比較すること
を含む、（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記解析する工程が、
前記患者におけるヒトパピローマウイルスの前期プロモーターにより制御される転写開始点群に由来する転写産物の発現パターンを検出し、
前記患者におけるヒトパピローマウイルスの後期プロモーターにより制御される転写開始点群に由来する転写産物の発現パターンを検出し、
前記患者の前記各転写開始点群に由来する転写産物の発現量のパターンと、前記各転写開始点群に由来する転写産物の発現量のパターンについての標準参照パターンとを比較すること
を含む、（１）または（２）に記載の方法。
（５）前記転写産物がｍＲＮＡである、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記測定する工程および／または解析する工程を、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＣＡＧＥ法、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、免疫測定法、ＳＡＧＥ法、ＣＡＧＥ法、質量分析法および分子間相互作用解析からなる群から選ばれる１種以上の方法を用いて行う、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記ウイルス性婦人科癌が子宮頸癌である、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
【００１２】
本発明によれば、ウイルス性婦人科癌の患者のウイルス被感染組織の細胞におけるウイルス由来の転写産物を転写開始点ごとに測定および解析することにより、ウイルス性婦人科癌の診断およびその予後の診断をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明における子宮頸癌の各進展段階の標準参照パターンの例（波形グラフ）。
【図２】W12E細胞におけるHPV由来転写産物の転写開始点ごとの発現量を示す表。
【図３】CIN1生検組織細胞におけるHPV由来転写産物の転写開始点ごとの発現量を示す表。
【図４】CaSki/SiHa細胞におけるHPV由来転写産物の転写開始点ごとの発現量を示す表。
【図５】CIN1生検組織細胞、W12E細胞およびCaSki/SiHa細胞におけるHPV16由来転写産物の転写開始点ごとの発現量を示すＣＡＧＥ法のチャート。
【図６】LSIL生検組織細胞および子宮頸癌由来の細胞におけるHPV16由来転写産物の転写開始点ごとの発現量を示すグラフ。
【発明の具体的説明】
【００１４】
［診断方法］
本発明のウイルス性婦人科癌の診断方法は、ウイルス性婦人科癌の患者のウイルス感染細胞における、ウイルス由来の転写産物の発現量を測定および解析する工程を含むことを特徴としている。以下、本発明の診断方法について具体的に説明する。
【００１５】
本発明の診断方法および予後の予測方法は、「ウイルス性婦人科癌」を対象とするものである。本明細書において「ウイルス性婦人科癌」とは、ウイルスの感染により引き起こされる婦人科癌であれば特に限定されない。婦人科癌としては、例えば、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、子宮肉腫、絨毛癌（絨毛性疾患）および乳癌等が挙げられる。これらのうち、本発明の方法の対象となるウイルス性婦人科癌の例としては子宮頸癌が挙げられる。子宮頸癌の中でも、ヒトパピローマウイルス（HPV）により引き起こされる子宮頸癌が例として挙げられる。
【００１６】
本明細書において、本発明の方法の試料として用いることができる「ウイルス感染細胞」（以下、「細胞試料」ともいう）とは、ウイルス性婦人科癌の患者において、当該ウイルス性婦人科癌の原因となるウイルスに感染した組織の細胞のことを意味する。細胞試料は、常法に従って患者から採取したものを用いることができる。患者から細胞試料を採取する方法としては、組織生検などの生検法や、剥離や擦過などの非侵襲的手段による方法を用いることができる。また、採取した細胞は、採取直後に使用することが好ましいが、本発明の方法に適用するまで保存してもよい。細胞を保存する場合には−２０℃以下で保存し、凍結・融解を繰り返さないことが好ましい。
【００１７】
本明細書において「転写産物」とは、塩基修飾やスプライシング等の加工を受ける前のｍＲＮＡ前駆体、および各種加工を受けた後の成熟ｍＲＮＡのいずれをも意味する。本発明の方法の対象となる転写産物は、好ましくは成熟ｍＲＮＡである。なお、本明細書において「ｍＲＮＡ」と記載する場合、特に説明がない限り「成熟ｍＲＮＡ」を意味する。
【００１８】
また、本発明の方法は、転写産物の量を直接的に測定および解析することにより行うこともできるが、転写産物を間接的に測定および解析することによっても行うことができる。転写産物の量の間接的な測定および解析の方法の例としては、逆転写酵素を用いて各転写産物から合成されたｃＤＮＡの量を測定および解析する方法が挙げられる。また、転写産物の量の間接的な測定および解析の他の例としては、各転写産物から翻訳されたタンパク質を測定および解析する方法が挙げられる。
【００１９】
本明細書において「前期プロモーター」とは、HPVゲノムの上流調節領域（URR：upstream regulatory region）にある、主にHPVの初期遺伝子をドライブする領域を意味する。具体的には、前期プロモーターとしては、１６型ヒトパピローマウイルス（HPV16）のｐ９７プロモーター等が挙げられる。
【００２０】
本明細書において「後期プロモーター」とは、主にHPVゲノムのＥ７遺伝子領域にあり、HPVの後期遺伝子をドライブする領域を意味する。具体的には、後期プロモーターとしては、ｐ６７０プロモーター、ｐ７４０プロモーター、ｐ３４１５プロモーター等が挙げられる。
【００２１】
また、前期プロモーターにより制御される転写開始点群における転写産物量と、後期プロモーターにより制御される転写開始点群における転写産物量とを測定および解析する方法に加えて、発癌に関与することが知られているHPVのＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子の発現量を測定および解析することにより、本発明の方法を達成することもできる。
【００２２】
本明細書において「診断方法」とは、上記転写産物の量の測定および解析結果を利用したものであれば特に限定されない。ここで、「診断方法」には、ウイルス性婦人科癌の罹患の有無の診断だけではなく、その進展の程度の診断をも含む。
【００２３】
本発明の診断方法の一態様としては、次の方法が挙げられる。
まず、被検対象の細胞試料におけるHPVの転写開始点ごとの転写産物（ｍＲＮＡ）量を測定する。HPVの前期プロモーターにより制御される転写開始点群（ｎｔＥ群）における最大転写産物量Ｔ前期と、後期プロモーターにより制御される転写開始点群（ｎｔＬ群）における最大転写産物量Ｔ後期の比Ｒ（Ｔ前期／Ｔ後期）を算出する。なお、細胞試料における各転写産物の量は、絶対量および相対量のいずれとして測定されてもよい。細胞試料における各転写産物の量の測定値の例としては、細胞試料全体の転写産物に対する値（ＴＰＭ）、およびウイルス由来の各転写産物に付加されたタグ（ＣＡＧＥタグ）の数等が挙げられるが、これらに限定されない。得られたＲ（Ｔ前期／Ｔ後期）と、対象とするウイルス性婦人科癌ごとに予め設定された上記比の標準参照値とを比較する。比較の結果に基づいて、ウイルス性婦人科癌の罹患の有無、その進展の程度を診断する。
【００２４】
各ウイルス性婦人科癌における標準参照値は、当該ウイルス性婦人科癌の患者や健常者における上記比Ｒ（Ｔ前期／Ｔ後期）の値に基づいて適宜決定することができる。標準参照値は、各ウイルス性婦人科癌の進展の程度ごとに設定してもよい。
【００２５】
また、各ウイルス性婦人科癌における標準参照値は、当該ウイルス性婦人科癌の診断において用いられている各種判断基準や分類方法等と関連付けてもよい。この場合、標準参照値は、関連付けられる判断基準や分類方法ごとに設定することができる。
例えば、HPVの感染により引き起こされる子宮頸癌の進展の程度を診断する場合、標準参照値と子宮頸癌の進展の程度を分類する方法とを関連付けて行うができる。具体的には、例えば「CIN分類」や「ベセスダ分類」等の子宮頸癌の分類方法を、標準参照値と関連付けて診断を行うことができる。
【００２６】
「CIN分類」においては、進展の程度が低い順にCIN1（軽度異形成）、CIN2（中等度異形成）、CIN3（高度異形成）および扁平上皮癌に分類される。また、「ベセスダ分類」においては、LSIL（Low grade SIL(squamous cell intraepithelial lesion)：低悪性度扁平上皮内病変）およびHSIL（High grade SIL：高悪性度扁平上皮内病変）に分類される。CIN分類のCIN1はベセスダ分類のLSILに相当し、CIN2およびCIN3はHSILに相当する。
【００２７】
「ベセスダ分類」を用いた子宮頸癌の診断においては、例えば「標準参照値＝１」と設定することができる。そして、当該標準参照値と子宮頸癌の進展の程度の分類とは、以下のように関連付けられる。
Ｒ（Ｔ前期／Ｔ後期）＜１である場合  LSILと診断する。
１≦Ｒ（Ｔ前期／Ｔ後期）である場合  HSILと診断する。
【００２８】
また、本発明の診断方法を、HPVのＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子の発現量を測定および解析することにより行う場合、例えば、Ｅ６およびＥ７遺伝子のそれぞれに由来する転写産物の量を測定し、両者の比の値と標準参照値との比較結果に基づいてウイルス性婦人科癌の罹患の有無、その進展の程度を診断することができる。この場合にも、対象とするウイルス性婦人科癌ごとに標準参照値等を適宜設定することができる。例えば、HPVの感染により引き起こされる子宮頸癌の場合、上述した診断方法と同様の標準参照値を設定することができる。また、標準参照値を、各ウイルス性婦人科癌の診断において用いられている各種判断基準や分類方法等と関連付けることも同様に可能である。
【００２９】
また、本発明の診断方法の別の態様としては、次の方法が挙げられる。
まず、被検対象の細胞試料におけるHPVの転写開始点ごとの転写産物（ｍＲＮＡ）量を測定する。HPVの前期プロモーターにより制御される転写開始点群（ｎｔＥ群）の転写産物量に基づく転写産物の発現パターンを検出する。さらに、HPVの後期プロモーターにより制御される転写開始点群（ｎｔＬ群）の転写産物量に基づく転写産物の発現パターンを検出する。検出された各転写開始点群の発現パターンと、対象とするウイルス性婦人科癌の種々の進展段階にある患者において検出された上記各転写開始群の発現パターン（標準参照パターン）とを比較し、被検対象の発現パターンがいずれの標準参照パターンに分類されるか（類似しているか）を決定することによって、被検対象のウイルス性婦人科癌の罹患の有無、その進展の程度を診断する。また、前期プロモーターおよび後期プロモーターに加え、他のプロモーターにより制御される転写開始点群の転写産物量に基づく転写産物の発現パターンをさらに検出し、被検対象のウイルス性婦人科癌の罹患の有無、その進展の程度の診断基準とすることもできる。標準参照パターンは、横軸に近位から遠位に向けての転写開始点をとり、縦軸に転写開始点ごとの転写産物の発現量をとるグラフ（チャート）であることが好ましい。また、グラフの形式としては、転写開始点ごとの転写産物の発現量を反映するものであれば特に限定されないが、ヒストグラム、折れ線グラフおよび波形グラフ等が挙げられる。
【００３０】
発現パターンの分類をする際の基準の例としては、発現パターンをグラフ（チャート）等に視覚化した場合のピークの数およびピークの位置等が挙げられる。本明細書において、発現パターンにおける「ピーク」とは、各転写開始点群における各転写開始点の転写産物の発現量のうちの最大値を意味する。前記最大値の下限値は、ウイルス性婦人科癌の種類、および測定・解析に用いられる材料や手法によって適宜設定することができる。上記定義に該当する「ピーク」が存在する場合に、「転写開始点群がピークを有する」と判断する。「ピークの数」としては、一峰性（HPVの全転写開始点を通してピークを有する転写開始点群が一つ）、二峰性（HPVの全転写開始点を通してピークを有する転写開始点群が二つ）および多峰性（HPVの全転写開始点を通してピークを有する転写開始点群が３つ以上）等が挙げられる。また、本明細書において、「ピークの位置」とは、各ピークに対応する転写開始点を制御するプロモーターの種類を意味する。これらの基準を総合して、被検対象の発現パターンと標準参照パターンとを比較し、被検対象の発現パターンがいずれの標準参照パターンに分類されるかを決定する。
【００３１】
ウイルス性婦人科癌のうち、子宮頸癌の各進展段階の標準参照パターンの例としては、図１に示すような波形グラフが挙げられる。図１のＡは、前癌病変（軽度異形成上皮：LSIL）由来の細胞におけるHPV16のｍＲＮＡの発現の標準パターンの例である。図１のＢは、最終的に治療を要した前癌病変（中等度〜高度異形成上皮：HSIL）由来の細胞におけるHPV16のｍＲＮＡの発現の標準パターンの例である。図１のＣは、子宮頸癌由来の細胞におけるHPV16のｍＲＮＡの発現の標準パターンの例である。
また、ウイルス性婦人科癌のうち、子宮頸癌の各進展段階の標準パターンの別の例としては、実施例（図６）に示すようなチャートが挙げられる。
【００３２】
HPVの転写開始点ごとの転写産物量の測定および解析の方法は、特に限定されないが、例えば、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＣＡＧＥ法、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、免疫測定法、ＳＡＧＥ法、ＣＡＧＥ法、質量分析法または分子間相互作用解析を用いて行うことができる。また、これらの２種以上を組み合わせて用いることもできる。これらのうち、ＣＡＧＥ法は、本発明の方法を迅速かつ簡便に行うことができるため好ましい。
【００３３】
さらに、本発明の診断方法を、HPVのＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子の発現量を測定および解析することにより、標準参照値や標準参照パターン等を適宜設定することができる。また、各ウイルス性婦人科癌の診断において用いられている各種判断基準や分類方法等と関連付けてもよい。
【００３４】
［予後の予測方法］
本発明は、ウイルス性婦人科癌の患者のウイルス感染細胞における、ウイルス由来の転写産物の発現量を測定および解析する工程を含む、ウイルス性婦人科癌の予後の予測方法を包含する。すなわち、本発明の診断方法により得られた結果に基づく、ウイルス性婦人科癌の予後の予測方法を包含する。
本明細書において、「予測」は、本発明の診断方法により得られた結果に基づいて、医師が、患者がウイルス性婦人科癌に罹患する可能性があるかを調べる方法、ウイルス性婦人科癌の進展または予後を調べる方法等をいうが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明のウイルス性婦人科癌の予後の予測方法は、単回のウイルス由来の転写産物の発現量の測定・解析および／または発現パターンの検出結果に基づいて行うことができる。また、経時的に複数回の発現量の測定・解析および／または発現パターンの検出を行い、発現量および／または発現パターンを経時的にモニタリングした結果に基づいて行うこともできる。
【００３６】
本発明の予後の予測方法の一態様として、例えば、HPVの感染により引き起こされる子宮頸癌の予後の予測をする場合、被検対象の細胞試料のＲ（Ｔ前期／Ｔ後期）を算出し、Ｒ（Ｔ前期／Ｔ後期）＜１である場合には子宮頸癌の悪化のリスクが低いと判定し、１≦Ｒ（Ｔ前期／Ｔ後期）である場合にはそのリスクが高いと判定する。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に何ら限定されない。
【００３８】
［細胞試料］
本実施例の被検対象となる細胞試料として、HPV16陽性の子宮頸部異形成由来のW12E細胞、軽度異形成に分類される子宮頸部上皮内腫瘍の患者から臨床的に採取した細胞（CIN1 : Cervical Intraepitherial Neoplasma 1）、およびHPV16陽性の子宮頸癌由来のSiHa細胞ならびにCaSki細胞の各細胞系統を用いた。
【００３９】
［転写産物量の測定および解析］
miRNeasy（Qiagen社製）を用いて、各細胞試料から５μｇのＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡの質を、バイオアナライザー（Agilent社製）を用いて評価し、ＲＩＮ（RNA integrity number）＞７．０に標準化した。分光光度計Nano Drop（Thermo SCIENTIFIC社製）を用いた定量により、A260/280およびA260/230のそれぞれの比が１．７未満であることを確認した。
【００４０】
CAGE（Cap Analysis Gene Expression）法を用いて、各細胞試料について、HPV16由来の転写産物（ｍＲＮＡ）の量を転写開始点ごとに測定および解析（可視化）した。具体的には、逆転写酵素を用いて、抽出したｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡを５’末端がキャップ修飾されたＲＮＡに転写し、転写されたＲＮＡにＣＡＧＥ（バーコード）タグを付加した。ＣＡＧＥタグを付加したＲＮＡをHPV16ゲノム上にマッピングし、マッピングされたＣＡＧＥタグの数を１，０００，０００タグ当たりのタグ数として正規化した。正規化した数値を（TPM : Tags per million）と表し、各転写開始点に由来するｍＲＮＡの量をTPMとして定量化した。
【００４１】
各細胞試料において、HPV16ゲノム上にマッピングされたタグの数、マッピングされたタグの合計数および転写産物量（TPM）を表１に示す。
【表１】
0006757950.tif 000002
【００４２】
表１の結果から、各細胞試料においてHPV16ゲノム上にマッピングされたタグの１，０００，０００タグ当たりの数（TPM）は、子宮頸癌由来のSiHa細胞およびCaSki細胞と比較して、子宮頸部異形成（前癌病変）由来のW12E細胞およびCIN1細胞において多かった。すなわち、子宮頸癌由来のSiHa細胞およびCaSki細胞と比較して、子宮頸癌の前癌病変由来のW12E細胞およびCIN1細胞において、HPV16由来のｍＲＮＡの量が多いことが示唆された。
【００４３】
また、各細胞試料における、HPV16の転写開始点ごとのｍＲＮＡの発現量を図２〜４に示す。
子宮頸癌の前癌病変由来のW12E細胞においては、２５のセンス方向の転写開始点と４つのアンチセンス方向の転写開始点が見出された（図２）。
また、子宮頸癌の前癌病変由来のCIN1細胞においては、２５のセンス方向の転写開始点と３つのアンチセンス方向の転写開始点が見出された（図３）。
一方、子宮頸癌由来のSiHa細胞およびCaSki細胞においては、ｐ９７プロモーターに対応する１つのセンス方向の転写開始点のみ見出された（図４）。
すなわち、子宮頸癌の前癌病変由来のW12E細胞およびCIN1細胞においては、HPV16ゲノム上の多くの転写開始点に由来する転写産物が観察されるのに対し、子宮頸癌由来のSiHa細胞およびCaSki細胞においては、HPV16ゲノム上のきわめて限定的な転写開始点に由来する転写産物が観察されるのみであった。
【００４４】
［HPVの前期および後期の各プロモーター制御下の転写開始点群における最大転写産物量に基づく診断方法］
上記各細胞試料におけるHPV16のｍＲＮＡの発現量について、HPV16のｐ９７（前期）プロモーターにより制御される転写開始点群における最大転写産物量Ｔ前期と、ｐ６７０（後期）プロモーターにより制御される転写開始点群における最大転写産物量Ｔ後期との比Ｒ（Ｔ前期／Ｔ後期）を算出した。
その結果、子宮頸癌の前癌病変由来のW12E細胞においてはＲ（Ｔ前期／Ｔ後期）の値が２００であり、CIN1細胞においては０．０１であった。一方、子宮頸癌由来のSiHa細胞においては５００であり、CaSki細胞においては１０００であった。
この結果から、子宮頸癌の進展に伴ってＲ（Ｔ前期／Ｔ後期）の値が増大することが示唆された。すなわち、Ｒ（Ｔ前期／Ｔ後期）の値に基づいて、子宮頸癌の罹患の有無ならびに進展段階の診断、およびその予後の予測をすることができることが示唆された。
【００４５】
［HPVの各転写開始点群の発現パターンに基づく診断方法］
上記各細胞試料におけるHPV16のｍＲＮＡの転写開始点群の発現パターンを検出し、可視化した。その結果（ＣＡＧＥ法のチャート）を図５に示す。
その結果、子宮頸癌の前癌病変由来のW12E細胞およびCIN1細胞においては、ｐ９７（前期）プロモーターにより制御される転写開始点群（ｎｔＥ群）およびｐ６７０（後期）プロモーターにより制御される転写開始点群（ｎｔＬ群）に由来する転写産物の発現量のピークを有する発現パターンが得られた。一方、子宮頸癌由来のSiHa細胞およびCaSki細胞においては、ｎｔＬ群に由来する転写産物の発現量のピークが見られず、ｎｔＥ群に由来する転写産物の発現量のピークのみを有する発現パターンが得られた。
【００４６】
同様に、上記各細胞試料におけるHPV16のｍＲＮＡの転写開始点群のパターンを検出し、可視化した。その結果を図６に示す。図６において、各菱形は横軸に沿ってHPV16のゲノムの各転写開始点の位置を表し、縦軸に沿って各転写開始点に由来する転写産物の発現量（ＴＰＭ）を表す。また、大菱形は各プロモーターにより制御される転写開始点群における最大の発現量（ピーク）を示す転写産物の転写開始点の位置および発現量を表す。子宮頸癌の前癌病変由来のLSIL細胞においては、前期プロモーター群（ｎｔＥ群）および後期プロモーター群（ｎｔＬ群）のそれぞれに由来する転写産物量のピークを表す大菱形が見られた（図６のＡ）。一方、子宮頸癌由来の細胞においては、ｎｔＥ群に由来するピークを表す大菱形が見られたが、ｎｔＬ群に由来するピークを表す大菱形は見られなかった（図６のＢ）。
【００４７】
これらの結果から、子宮頸癌の進展初期段階では、前期プロモーターにより制御される転写開始点群と、後期プロモーターにより制御される転写開始群とのそれぞれに由来する発現量のピークを含む二峰性または多峰性の発現パターンが得られるのに対し、子宮頸癌の進展に伴って、後期プロモーターにより制御される転写開始点群に由来する発現量のピークが減衰・消失し、前期プロモーターにより制御される転写開始点群に由来する発現量のピークのみを有する一峰性の発現パターンに変化することが示唆された。さらに、この発現パターンの変化に基づいて、子宮頸癌の罹患の有無ならびに進展段階の診断、および予後の予測をすることができることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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