(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
新生物を有すると診断された対象用の個別化された新生物ワクチンを製造する方法であって、
前記新生物において突然変異を含む複数の配列を同定し、
前記複数の配列を分析して、ネオ抗原ポリペプチドをコードすると予測される、ミスセンス突然変異、ネオＯＲＦ突然変異、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるネオ抗原突然変異を含む少なくとも５つの配列のサブセットを同定し、
下記（ｉ）から（ｖ）の順の優先順位で、前記サブセットの配列にコードされるネオ抗原ポリペプチドをランク付けし、前記優先順位は、
（ｉ）ネオＯＲＦ突然変異を含む配列にコードされる、対象のＨＬＡにＫｄ≦５００ｎＭのＫｄで結合するネオＯＲＦポリペプチド；
（ｉｉ）ミスセンス突然変異を含む配列にコードされる、対象のＨＬＡにＫｄ≦１５０ｎＭのＫｄで結合するポリペプチド、ここで、その天然コグネイトタンパク質はＫｄ≧１０００ｎＭのＫｄを有する；
（ｉｉｉ）ミスセンス突然変異を含む配列にコードされる、対象のＨＬＡにＫｄ≦１５０ｎＭのＫｄで結合するポリペプチド、ここで、その天然コグネイトタンパク質はＫｄ≦１５０ｎＭのＫｄを有する；
（ｉｖ）ネオＯＲＦ突然変異を含む配列にコードされる、対象のＨＬＡにＫｄ＞５００ｎＭのＫｄで結合するネオＯＲＦポリペプチド；ならびに
（ｖ）ミスセンス突然変異を含む配列にコードされる、対象のＨＬＡに１５０ｎＭ＜Ｋｄ≦５００ｎＭのＫｄで結合するポリペプチド、ここで、その天然コグネイトタンパク質は１５０ｎＭ＜Ｋｄ≦５００ｎＭのＫｄを有する、
を含み、そして
上位５位まで〜上位３０位までにランク付けされたネオ抗原ポリペプチド、あるいは前記ネオ抗原ポリペプチドの発現能を有するＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を含む個別化された新生物ワクチンを作製する、
ことを含む前記方法。
【請求項２】
前記個別化された新生物ワクチンが：
前記ネオ抗原突然変異を含む配列にコードされる少なくとも１０個のネオ抗原ポリペプチド；
前記少なくとも１０個のネオ抗原ポリペプチドの発現能を有する１つ以上のＤＮＡ分子；あるいは
前記少なくとも１０個のネオ抗原ポリペプチドの発現能を有する１つ以上のＲＮＡ分子、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個別化された新生物ワクチンが：
前記ネオ抗原突然変異を含む配列にコードされる少なくとも２０個のネオ抗原ポリペプチド；
前記少なくとも２０個のネオ抗原ポリペプチドの発現能を有する１つ以上のＤＮＡ分子；あるいは
前記少なくとも２０個のネオ抗原ポリペプチドの発現能を有する１つ以上のＲＮＡ分子、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも２０個のネオ抗原ポリペプチドが：
５〜５０アミノ酸長；
１５〜３５アミノ酸長；
１８〜３０アミノ酸長；または
６〜１５アミノ酸長、
の範囲である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも２０個のネオ抗原ポリペプチドが、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５アミノ酸長である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記個別化された新生物ワクチンがアジュバントをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アジュバントが、ポリＩＣＬＣ、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ  ＩＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ  １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌ．ＲＴＭ、ベクター系、ＰＬＧＡマイクロパーティクル、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、βグルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、バジメザン、及びＡｓＡ４０４（ＤＭＸＡＡ）からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アジュバントがポリＩＣＬＣである、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府支援研究に基づき行われた発明に対する権利に関する記載
本研究は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの以下の助成、助成番号：ＮＩＨ／ＮＣＩ−１Ｒ０１ＣＡ１５５０１０−０２及びＮＨＬＢＩ−５Ｒ０１ＨＬ１０３５３２−０３による支援を受けた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年４月７日に出願された米国仮特許出願第６１／８０９，４０６号明細書及び２０１３年８月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／８６９，７２１号明細書の利益及びそれに対する優先権を主張し、これらの仮特許出願の内容は参照により本明細書に援用される。
【０００３】
本発明は、新生物を治療するための個別化戦略に関する。より詳細には、本発明は、対象を治療するための個別化された腫瘍ワクチンにおける腫瘍特異的ネオ抗原の患者特異的プールの同定及び使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
毎年約１６０万人の米国人が新生物と診断され、２０１３年には米国内で約５８万人がこの疾患により死亡することが予想される。ここ数十年で新生物の検出、診断、及び治療は著しく向上しており、それにより多くの種類の新生物に関して生存率が著しく上昇している。しかしながら、新生物と診断された人のうち、治療開始後５年でなおも生存している者は約６０％に過ぎず、そのため新生物は米国における主な死亡原因の第２位となっている。
【０００５】
現在、種々の既存の癌療法が、アブレーション技法（例えば、外科手技、極低温／熱処置、超音波、高周波、及び放射線）及び化学的技法（例えば、医薬品、細胞傷害剤／化学療法剤、モノクローナル抗体、及びそれらの様々な組み合わせ）を含め、いくつも存在している。残念ながら、かかる治療法は多くの場合に深刻なリスク、毒性の副作用、及び極めて高いコストを伴うことに加え、有効性も不確かである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国仮特許出願第６１／８０９，４０６号明細書
【特許文献２】米国仮特許出願第６１／８６９，７２１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
患者自身の免疫系によって癌性細胞を標的化しようとする癌療法（例えば、癌ワクチン）について、かかる治療法は上述の欠点のいくつかを軽減／解消し得るため、関心が高まっている。癌ワクチンは、典型的には腫瘍抗原及び免疫刺激性分子（例えば、サイトカイン又はＴＬＲリガンド）で構成され、これらが一緒になって働き抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することで、Ｔ細胞が腫瘍細胞を標的化して破壊する。現在の癌ワクチンは、典型的には共通腫瘍抗原を含有し、これは多くの個体に見られる腫瘍で選択的に発現又は過剰発現する天然タンパク質（即ち、−個体における全ての正常細胞のＤＮＡによりコードされるタンパク質）である。かかる共通腫瘍抗原は特定の種類の腫瘍を同定するには有用であるが、特定の腫瘍型に対するＴ細胞応答を標的化する免疫原としては、免疫を弱める自己トレランス効果に供されるため理想的でない。従って、新生物ワクチンに用い得るより効果的な腫瘍抗原を同定する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、個別化された新生物治療のための戦略に関し、より詳細には、対象の腫瘍を治療するための腫瘍特異的且つ患者特異的ネオ抗原のプールから本質的になる個別化された癌ワクチンの同定及び使用に関する。以下に記載するとおり、本発明は、少なくとも一部には、全ゲノム／エクソームシーケンシングを用いることにより個々の患者の新生物／腫瘍にユニークに存在する全ての又はほぼ全ての突然変異ネオ抗原を同定し得るとともに、この一群の突然変異ネオ抗原を分析することにより、患者の新生物／腫瘍を治療するための個別化された新生物ワクチンとして使用されるネオ抗原の特定の最適化されたサブセットを同定し得るという発見に基づく。
【０００９】
一態様において、本発明は、新生物を有すると診断された対象用の個別化された新生物ワクチンを製造する方法を提供し、この方法は、新生物における複数の突然変異を同定するステップと、複数の突然変異を分析するステップにより、ネオ抗原ペプチドをコードすると予測される少なくとも５つのネオ抗原突然変異のサブセットを同定するステップであって、ネオ抗原突然変異が、ミスセンス突然変異、ネオＯＲＦ突然変異、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、ステップと、同定されたサブセットに基づき、個別化された新生物ワクチンを作製するステップとを含む。
【００１０】
ある実施形態では、本発明は、同定するステップが、新生物のゲノム、トランスクリプトーム、又はプロテオームをシーケンシングするステップをさらに含むことを提供する。
【００１１】
別の実施形態では、分析するステップが、ネオ抗原ペプチドをコードすると予測される少なくとも５つのネオ抗原突然変異のサブセットと関連付けられる１つ以上の特徴を決定するステップであって、特徴が、分子量、システイン含量、親水性、疎水性、電荷、及び結合親和性からなる群から選択される、ステップと；決定された特徴に基づき、少なくとも５つのネオ抗原突然変異の同定されたサブセット内のネオ抗原突然変異の各々をランク付けするステップとをさらに含み得る。ある実施形態では、上位５〜３０位にランク付けされたネオ抗原突然変異を、個別化された新生物ワクチンに含める。別の実施形態では、ネオ抗原突然変異は、図８に示す順序に従いランク付けされる。
【００１２】
一実施形態において、個別化された新生物ワクチンは、ネオ抗原突然変異に対応する少なくとも約２０個のネオ抗原ペプチドを含む。
【００１３】
別の実施形態では、個別化された新生物ワクチンは、ネオ抗原突然変異に対応する少なくとも約２０個のネオ抗原ペプチドの発現能を有する１つ以上のＤＮＡ分子を含む。別の実施形態では、個別化された新生物ワクチンは、ネオ抗原突然変異に対応する少なくとも２０個のネオ抗原ペプチドの発現能を有する１つ以上のＲＮＡ分子を含む。
【００１４】
実施形態において、個別化された新生物ワクチンは、Ｋｄ≦５００ｎＭのネオＯＲＦポリペプチドをコードすると予測されるネオＯＲＦ突然変異を含む。
【００１５】
別の実施形態では、個別化された新生物ワクチンは、Ｋｄ≦１５０ｎＭのポリペプチドをコードすると予測されるミスセンス突然変異を含み、その天然コグネイトタンパク質はＫｄ≧１０００ｎＭ又は≦１５０ｎＭである。
【００１６】
別の実施形態では、少なくとも約２０個のネオ抗原ペプチドは約５〜約５０アミノ酸長の範囲である。別の実施形態では、少なくとも約２０個のネオ抗原ペプチドは約１５〜約３５アミノ酸長の範囲である。別の実施形態では、少なくとも約２０個のネオ抗原ペプチドは約１８〜約３０アミノ酸長の範囲である。別の実施形態では、少なくとも約２０個のネオ抗原ペプチドは約６〜約１５アミノ酸長の範囲である。さらに別の実施形態では、少なくとも約２０個のネオ抗原ペプチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５アミノ酸長である。
【００１７】
一実施形態において、個別化された新生物ワクチンはアジュバントをさらに含む。他の実施形態では、アジュバントは、ポリＩＣＬＣ、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ  ＩＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ  １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌ．ＲＴＭ、ベクター系、ＰＬＧＡマイクロパーティクル、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、βグルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ａｑｕｉｌａ社のＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、バジメザン、及び／又はＡｓＡ４０４（ＤＭＸＡＡ）からなる群から選択される。好ましい実施形態において、アジュバントはポリＩＣＬＣである。
【００１８】
別の態様において、本発明は、新生物を有すると診断された対象を個別化された新生物ワクチンによって治療する方法を含み、この方法は、新生物における複数の突然変異を同定するステップと；複数の突然変異を分析するステップにより、発現ネオ抗原ペプチドをコードすると予測される少なくとも５つのネオ抗原突然変異のサブセットを同定するステップであって、ネオ抗原突然変異が、ミスセンス突然変異、ネオＯＲＦ突然変異、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、ステップと；同定されたサブセットに基づき、個別化された新生物ワクチンを作製するステップと；個別化された新生物ワクチンを対象に投与するステップであって、それにより新生物を治療するステップとを含む。
【００１９】
別の実施形態では、同定するステップは、新生物のゲノム、トランスクリプトーム、又はプロテオームをシーケンシングするステップをさらに含み得る。
【００２０】
さらに別の実施形態では、分析するステップは、発現ネオ抗原ペプチドをコードすると予測される少なくとも５つのネオ抗原突然変異のサブセットと関連付けられる１つ以上の特徴を決定するステップであって、特徴が、分子量、システイン含量、親水性、疎水性、電荷、及び結合親和性からなる群から選択される、ステップと；決定された特徴に基づき、少なくとも５つのネオ抗原突然変異の同定されたサブセット内のネオ抗原突然変異の各々をランク付けするステップとをさらに含み得る。
【００２１】
一実施形態において、上位５〜３０位にランク付けされたネオ抗原突然変異を、個別化された新生物ワクチンに含める。別の実施形態では、ネオ抗原突然変異は、図８に示す順序に従いランク付けされる。
【００２２】
一実施形態において、個別化された新生物ワクチンは、ネオ抗原突然変異に対応する少なくとも２０個のネオ抗原ペプチドを含む。
【００２３】
別の実施形態では、個別化された新生物ワクチンは、ネオ抗原突然変異に対応する少なくとも２０個のネオ抗原ペプチドの発現能を有する１つ以上のＤＮＡ分子を含む。
【００２４】
一実施形態において、個別化された新生物ワクチンは、ネオ抗原突然変異に対応する少なくとも２０個のネオ抗原ペプチドの発現能を有する１つ以上のＲＮＡ分子を含む。
【００２５】
一実施形態において、個別化された新生物ワクチンは、Ｋｄ≦５００ｎＭのネオＯＲＦポリペプチドをコードすると予測されるネオＯＲＦ突然変異を含む。
【００２６】
別の実施形態では、個別化された新生物ワクチンは、Ｋｄ≦１５０ｎＭのポリペプチドをコードすると予測されるミスセンス突然変異を含み、ここで天然コグネイトタンパク質はＫｄ≧１０００ｎＭ又は≦１５０ｎＭである。
【００２７】
一実施形態において、少なくとも２０個のネオ抗原ペプチドは約５〜約５０アミノ酸長の範囲である。一実施形態において、少なくとも２０個のネオ抗原ペプチドは約１５〜約３５アミノ酸長の範囲である。一実施形態において、少なくとも２０個のネオ抗原ペプチドは約１８〜約３０アミノ酸長の範囲である。一実施形態において、少なくとも２０個のネオ抗原ペプチドは約６〜約１５アミノ酸長の範囲である。一実施形態において、少なくとも２０個のネオ抗原ペプチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５アミノ酸長である。
【００２８】
一実施形態において、投与するステップは、作製されたワクチンを２つ以上のサブプールに分割するステップと；サブプールの各々を患者の異なる部位に注入するステップとをさらに含む。一実施形態において、異なる部位に注入されるサブプールの各々は、任意の単一の患者ＨＬＡを標的化するサブプール中の個々のペプチドの数が１個であるか、又は２個以上で可能な限り少ない個数となるようにネオ抗原ペプチドを含む。
【００２９】
一実施形態において、投与するステップは、作製されたワクチンを２つ以上のサブプールに分割するステップをさらに含み、各サブプールは、プール内相互作用を最適化するように選択された少なくとも５個のネオ抗原ペプチドを含む。
【００３０】
一実施形態において、最適化は、同じプールのネオ抗原ペプチド間における負の相互作用を低減することを含む。
【００３１】
別の態様において、本発明は、上述の方法により調製される個別化された新生物ワクチンを含む。
【００３２】
定義
本発明の理解を助けるため、以下にいくつかの用語及び語句を定義する：
具体的に記載されるか又は文脈から明らかである場合を除き、本明細書で使用されるとき、用語「約」は、当該技術分野における通常の許容差の範囲内、例えば平均値の２標準偏差以内であると理解される。約は、記載される値の５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内と理解することができる。文脈から別段明らかでない限り、本明細書に提供される全ての数値が約の用語によって修飾されている。
【００３３】
「薬剤」とは、任意の小分子化学的化合物、抗体、核酸分子、又はポリペプチド、又はそれらの断片が意味される。
【００３４】
「改善する」とは、疾患（例えば、新生物、腫瘍等）の発症又は進行を低下させ、抑制し、減弱させ、減少させ、停止させ、又は安定化させることが意味される。
【００３５】
「改変」とは、本明細書に記載されるような当該技術分野で公知の標準的な方法により検出するときの遺伝子又はポリペプチドの発現レベル又は活性の変化（増加又は減少）が意味される。本明細書で使用されるとき、改変には、発現レベルの１０％の変化、好ましくは発現レベルの２５％の変化、より好ましくは４０％の変化、及び最も好ましくは５０％又はそれ以上の変化が含まれる。
【００３６】
「類似体」とは、同一ではないが、類似の機能的又は構造的特徴を有する分子が意味される。例えば、腫瘍特異的ネオ抗原ポリペプチド類似体は、対応する天然に存在する腫瘍特異的ネオ抗原ポリペプチドの生物学的活性を保持する一方で、天然に存在するポリペプチドと比べて類似体の機能を増強する特定の生化学的修飾を有する。かかる生化学的修飾は、類似体のプロテアーゼ耐性、膜透過性、又は半減期を、例えばリガンド結合を変えることなしに増加させ得る。類似体には非天然アミノ酸が含まれ得る。
【００３７】
語句「併用療法」は、治療剤の共作用から有益な（相加的又は相乗的な）効果をもたらすことが意図される特定の治療レジメンの一部としての、新生物／腫瘍特異的ネオ抗原のプール試料と１つ以上のさらなる治療剤との投与を包含する。併用の有益な効果には、限定はされないが、治療剤の併用によって生じる薬物動態学的又は薬力学的共作用が含まれる。これらの治療剤の併用での投与は、典型的には定義された期間（通常、選択された組み合わせに応じて数分、数時間、数日、又は数週間）にわたって実施される。「併用療法」は、これらの治療剤の逐次的な投与（即ち、各治療剤が異なる時点で投与される）、並びにこれらの治療剤、又は治療剤のうちの少なくとも２つの、実質的に同時の投与を包含することが意図される。実質的に同時の投与は、対象に、例えば一定比率の各治療剤を有する単一のカプセルを投与するか又は複数の治療剤毎の単一カプセルで投与することにより達成し得る。例えば、本発明の一つの組み合わせは、同じ又は異なる時点における腫瘍特異的ネオ抗原のプール試料と少なくとも１つのさらなる治療剤（例えば、化学療法剤、抗血管新生剤、免疫抑制剤、抗炎症剤など）とを含んでもよく、又はそれらは２つの化合物を含む単一の共製剤化医薬組成物として製剤化することができる。別の例として、本発明の組み合わせ（例えば、腫瘍特異的ネオ抗原のプール試料と少なくとも１つのさらなる治療剤）は、同じ又は異なる時点で投与し得る別個の医薬組成物として製剤化されてもよい。各治療剤の逐次的な投与又は実質的に同時の投与は、限定はされないが、経口経路、静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、粘膜組織（例えば、鼻、口、腟、及び直腸）を介した直接吸収、及び眼球経路（例えば、硝子体内、眼球内等）を含む任意の適切な経路によって達成することができる。治療剤は同じ経路によっても、又は異なる経路によっても投与することができる。例えば、特定の組み合わせの一つの成分が静脈内注射で投与されてもよく、一方でその組み合わせの他の１つ又は複数の成分が経口投与されてもよい。これらの成分は、治療上有効な任意の順序で投与されてもよい。
【００３８】
語句「併用」は、併用療法の一部として有用な一群の化合物又は非薬物療法を包含する。
【００３９】
本開示において、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」及び「有している（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらに割り当てられた意味を有することができ、「〜を包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る；「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」又は「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」も同様に、米国特許法において割り当てられた意味を有し、この用語はオープンエンドであり、記載されているもの以外の存在によって記載されているものの基本的な又は新規の特徴が変わらない限り記載されているもの以外の存在を許容するが、但し先行技術の実施形態は除外する。
【００４０】
「対照」とは、標準又は参照条件が意味される。
【００４１】
「疾患」とは、細胞、組織、又は器官の正常機能に損傷を与え又はそれを妨げる任意の病態又は障害が意味される。
【００４２】
「有効量」とは、疾患（例えば、新生物／腫瘍）の症状を未治療の患者と比べて改善するために必要な量が意味される。疾患の治療処置のため本発明の実施に用いられる１つ又は複数の活性化合物の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重、及び全般的な健康に応じて異なる。最終的には、担当の医師又は獣医師が適切な量及び投薬量レジメンを決定することになる。かかる量は、「有効」量と称される。
【００４３】
「断片」とは、ポリペプチド又は核酸分子の一部分が意味される。この一部分は、好ましくは、参照核酸分子又はポリペプチドの全長の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を含有する。断片は、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸を含有し得る。
【００４４】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸塩基の間における、ワトソン・クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合であってもよい水素結合を意味する。例えば、アデニンとチミンは、水素結合の形成によって対合する相補的な核酸塩基である。
【００４５】
「阻害性核酸」とは、哺乳類細胞に投与されると標的遺伝子の発現の（例えば、１０％、２５％、５０％、７５％、又はさらには９０〜１００％の）低下をもたらす二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ、又はそれらの一部分、又はそれらの模倣体が意味される。典型的には、核酸阻害薬は、標的核酸分子、又はそのオルソログの少なくとも一部分を含むか、又は標的核酸分子の相補鎖の少なくとも一部分を含む。例えば、阻害性核酸分子は、本明細書で詳説する核酸の一部又は全ての少なくとも一部分を含む。
【００４６】
「単離ポリヌクレオチド」とは、生物の天然に存在するゲノムにおいて−又は生物に由来する新生物／腫瘍のゲノムＤＮＡにおいて−本発明の核酸分子が由来する遺伝子を含まない核酸（例えば、ＤＮＡ）が意味される。従ってこの用語には、例えば、ベクターに取り込まれた；自己複製プラスミド又はウイルスに取り込まれた；又は原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡに取り込まれた組換えＤＮＡ（例えば、患者の腫瘍に同定されるネオＯＲＦ、リードスルー、又はインデル由来ポリペプチドをコードするＤＮＡ）；又は他の配列と独立した別個の分子（例えば、ＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されるｃＤＮＡ又はゲノム若しくはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡが含まれる。加えて、この用語には、ＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子、並びにさらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡが含まれる。
【００４７】
「単離ポリペプチド」とは、天然でそれに付随する成分から分離されている本発明のポリペプチドが意味される。典型的には、ポリペプチドが天然でそれと結び付いているタンパク質及び天然に存在する有機分子の少なくとも６０重量％を含まないとき、そのポリペプチドは単離されている。好ましくは、この調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、及び最も好ましくは少なくとも９９重量％が本発明のポリペプチドである。本発明の単離ポリペプチドは、例えば、天然の供給源から抽出することによるか、かかるポリペプチドをコードする組換え核酸を発現させることによるか；又はタンパク質を化学的に合成することによって入手し得る。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるか、又はＨＰＬＣ分析によって計測することができる。
【００４８】
「リガンド」は、受容体の構造に相補的な構造を有し且つその受容体との複合体形成能を有する分子を意味すると理解されるべきである。本発明によれば、リガンドは、そのアミノ酸配列に好適な長さ及び好適な結合モチーフを有するペプチド又はペプチド断片を意味し、従ってこのペプチド又はペプチド断片はＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩのタンパク質との複合体形成能を有すると理解されるべきである。
【００４９】
「突然変異」は、本稿の目的上、患者の腫瘍ＤＮＡ試料に見られ、当該の同じ患者の対応する正常ＤＮＡ試料には見られないＤＮＡ配列を意味する。「突然変異」はまた、個々の遺伝子に関する既知の情報に基づく予想される変異に帰することのできない、且つ例えば患者の腫瘍細胞で特異的に改変されている１つ以上の遺伝子のスプライシングパターンにおける新規の変異であると合理的に考えられる患者のＲＮＡの配列パターンも指し得る。
【００５０】
「ネオ抗原」又は「ネオ抗原性の」は、ゲノムによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変する１つ又は複数の腫瘍特異的突然変異によって生じる腫瘍抗原クラスを意味する。
【００５１】
「新生物」とは、不適切に高いレベルの細胞分裂、不適切に低いレベルのアポトーシス、又はその両方によって引き起こされるか又はそれをもたらす任意の疾患が意味される。例えば癌は、新生物の例である。癌の例としては、限定なしに、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、及び固形腫瘍、例えば肉腫及び癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管（ｎｉｌｅ  ｄｕｃｔ）癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｒｏｇｌｉｏｍａ）、シュワン腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫）が挙げられる。リンパ増殖性障害もまた増殖性疾患と考えられる。
【００５２】
具体的に記載されるか又は文脈から明らかである場合を除き、本明細書で使用されるとき、用語「又は」は、包含的であるものと理解される。具体的に記載されるか又は文脈から明らかである場合を除き、本明細書で使用されるとき、用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、単数形又は複数形であるものと理解される。
【００５３】
用語「患者」又は「対象」は、治療、観察、又は実験の対象となる動物を指す。単に例として、対象には、限定はされないが、哺乳動物、例えば限定はされないがヒト又は非ヒト哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、又はネコが含まれる。
【００５４】
「薬学的に許容可能な」は、ヒトを含む動物での使用について連邦若しくは州政府の規制当局によって承認済み若しくは承認見込みであるか、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方に収載されていることを指す。
【００５５】
「薬学的に許容可能な賦形剤、担体又は希釈剤」は、対象に薬剤と共に投与することのできる、且つ治療量の薬剤を送達するのに十分な用量で投与したときにも薬剤の薬理活性を損なわず非毒性である賦形剤、担体又は希釈剤を指す。
【００５６】
本明細書に記載されるとおりのプールされた腫瘍特異的ネオ抗原の「薬学的に許容可能な塩」は、ヒト又は動物の組織と接触して使用しても過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応、又は他の問題又は合併症なしに好適であると当該技術分野で一般に考えられている酸性塩又は塩基性塩であってもよい。かかる塩としては、アミンなどの塩基性残基の無機塩類及び有機酸塩類、並びにカルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩類又は有機塩類が挙げられる。具体的な薬学的塩としては、限定はされないが、塩酸、リン酸、臭化水素酸、リンゴ酸、グリコール酸、フマル酸、硫酸、スルファミン酸、スルファニル酸、ギ酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエチルスルホン酸、硝酸、安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ステアリン酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、パモン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、プロピオン酸、ヒドロキシマレイン酸、ヨウ化水素酸、フェニル酢酸、アルカン酸、例えば、酢酸、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（式中、ｎは０〜４である）などの酸の塩が挙げられる。同様に、薬学的に許容可能なカチオンとしては、限定はされないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム及びアンモニウムが挙げられる。当業者は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｐ．１４１８（１９８５）に掲載されるものを含め、本明細書に提供されるプールされた腫瘍特異的ネオ抗原のさらなる薬学的に許容可能な塩を認識するであろう。一般に、薬学的に許容可能な酸性塩又は塩基性塩は、任意の従来の化学的方法により、塩基部分又は酸部分を含有する親化合物から合成することができる。簡潔に言えば、かかる塩は、遊離酸又は遊離塩基の形態のこれらの化合物を適切な溶媒中で化学量論量の適切な塩基又は酸と反応させることにより調製し得る。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、用語「予防する」、「予防している」、「予防」、「予防的治療」などは、疾患又は病態に罹っていないが、それを発症するリスクがある又はそれを発症し易い対象において疾患又は病態が発症する可能性を低減することを指す。
【００５８】
「プライマーセット」は、例えばＰＣＲに用いられ得るオリゴヌクレオチドのセットを意味する。プライマーセットは、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００個、又はそれ以上のプライマーからなり得る。
【００５９】
「主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のタンパク質又は分子」、「ＭＨＣ分子」、「ＭＨＣタンパク質」又は「ＨＬＡタンパク質」は、詳細には、タンパク質抗原のタンパク質分解切断によって生じるペプチドであって、且つ潜在的なＴ細胞エピトープに相当するペプチドを結合し、それらのペプチドを細胞表面に輸送してそこで特定の細胞、詳細にはナイーブＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球又はＴヘルパー細胞に提示する能力を有するタンパク質を意味すると理解されるべきである。ゲノム中の主要組織適合遺伝子複合体は、遺伝子産物が細胞表面で発現する遺伝領域であって、内因性及び／又は外来性抗原の結合及び提示、ひいては免疫学的過程の調節に重要な遺伝領域を含む。主要組織適合遺伝子複合体は、異なるタンパク質をコードする２つの遺伝子群：ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩの分子に分類される。これらの２つのＭＨＣクラスの分子は異なる抗原源に特化している。ＭＨＣクラスＩの分子は、典型的には内因性に合成された抗原、例えばウイルスタンパク質及び腫瘍抗原を提示し、しかしそれに限定されているわけではない。ＭＨＣクラスＩＩの分子は、外来性供給源、例えば細菌産物に由来するタンパク質抗原を提示する。これらの２つのＭＨＣクラスの細胞生物学及び発現パターンは、これらの異なる役割に適合している。
【００６０】
クラスＩのＭＨＣ分子は重鎖と軽鎖とからなり、約８〜１１アミノ酸の、しかし通常は９又は１０アミノ酸のペプチドを、そのペプチドが好適な結合モチーフを有する場合には結合し、それをナイーブ及び細胞傷害性Ｔリンパ球に提示する能力を有する。クラスＩのＭＨＣ分子が結合するペプチドは、典型的には、限定はされないが、内因性タンパク質抗原に由来する。クラスＩのＭＨＣ分子の重鎖は好ましくはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ又はＨＬＡ−Ｃ単量体であり、軽鎖はβ−２−ミクログロブリンである。
【００６１】
クラスＩＩのＭＨＣ分子はα鎖とβ鎖とからなり、約１５〜２４アミノ酸のペプチドを、そのペプチドが好適な結合モチーフを有する場合には結合し、それをＴヘルパー細胞に提示する能力を有する。クラスＩＩのＭＨＣ分子が結合するペプチドは、通常、細胞外又は外来性タンパク質抗原に由来する。α鎖及びβ鎖は、詳細にはＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰ単量体である。
【００６２】
本明細書に提供される範囲は、その範囲内の全ての値の省略表現であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、又は部分範囲、並びに前述の整数の間に介在する全ての小数値、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、及び１．９などを含むものと理解される。部分範囲に関して、その範囲のいずれかの端点から延びる「入れ子の部分範囲」が特に企図される。例えば、１〜５０の例示的範囲の入れ子の部分範囲は、一方の向きに１〜１０、１〜２０、１〜３０、及び１〜４０、又は他方の向きに５０〜４０、５０〜３０、５０〜２０、及び５０〜１０を含み得る。
【００６３】
「受容体」は、リガンド結合能を有する生体分子又は分子分類を意味すると理解されるべきである。受容体は、細胞、細胞形成又は生物において情報を伝達する働きをし得る。受容体は少なくとも１つの受容体単位を含み、２つ以上の受容体単位を含むことが多く、ここで各受容体単位は、タンパク質分子、詳細には糖タンパク質分子からなり得る。受容体はリガンドの構造を補完する構造を有し、リガンドを結合パートナーとして複合体を形成し得る。細胞の表面上でリガンドと結合した後、受容体の立体構造が変化することによってシグナル情報が伝達され得る。本発明によれば、受容体は、リガンド、詳細には好適な長さのペプチド又はペプチド断片と受容体／リガンド複合体を形成する能力を有するＭＨＣクラスＩ及びＩＩの特定のタンパク質を指し得る。
【００６４】
「受容体／リガンド複合体」はまた、「受容体／ペプチド複合体」又は「受容体／ペプチド断片複合体」、詳細にはクラスＩ又はクラスＩＩのペプチド提示又はペプチド断片提示ＭＨＣ分子も意味すると理解されるべきである。
【００６５】
「低減する」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％の負の変化が意味される。
【００６６】
「参照」とは、標準又は対照条件が意味される。
【００６７】
「参照配列」は、配列比較の基礎として用いられる定義された配列である。参照配列は、特定の配列のサブセット、又はその全体；例えば、完全長ｃＤＮＡ又はゲノム配列のセグメント、又は完全なｃＤＮＡ又はゲノム配列であってもよい。ポリペプチドに関しては、参照ポリペプチド配列の長さは概して少なくとも約１０〜２，０００アミノ酸、１０〜１，５００、１０〜１，０００、１０〜５００、又は１０〜１００であり得る。好ましくは、参照ポリペプチド配列の長さは少なくとも約１０〜５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約１０〜４０アミノ酸、さらにより好ましくは約１０〜３０アミノ酸、約１０〜２０アミノ酸、約１５〜２５アミノ酸、又は約２０アミノ酸であり得る。核酸に関しては、参照核酸配列の長さは概して少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、及びさらにより好ましくは約１００ヌクレオチド又は約３００ヌクレオチド又はそれに近い若しくはそれらの間にある任意の整数であり得る。
【００６８】
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを認識及び結合するが、試料中、例えば生体試料中の他の分子は実質的に認識及び結合しない化合物又は抗体が意味される。
【００６９】
本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチド又はその断片をコードする任意の核酸分子が含まれる。かかる核酸分子は、内在性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を呈し得る。内在性配列と「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とのハイブリダイズ能を有する。「ハイブリダイズする」とは、様々なストリンジェンシー条件下において相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される遺伝子）、又はその一部分の間で対合して二本鎖分子を形成することが意味される（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照）。
【００７０】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び７５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５０ｍＭ  クエン酸三ナトリウム未満、より好ましくは約２５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム未満であり得る。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドが存在しないときに達成することができ、一方、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で達成することができる。ストリンジェントな温度条件としては、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を挙げることができる。種々のさらなるパラメータ、例えばハイブリダイゼーション時間、デタージェント、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、及び担体ＤＮＡを含めるか又は含めないかは、当業者に周知されている。これらの様々な条件を必要に応じて組み合わせることにより、様々なストリンジェンシーレベルが実現する。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、及び１％ＳＤＳ中３０℃で行われ得る。より好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中３７℃で行われ得る。最も好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、及び２００μｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡ中４２℃で行われ得る。これらの条件に関する有用な変形例は、当業者には容易に明らかであろう。
【００７１】
多くの適用について、ハイブリダイゼーションに続く洗浄ステップもまたストリンジェンシーの点で異なり得る。洗浄ストリンジェンシー条件は塩濃度及び温度によって規定され得る。上記のとおり、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させるか、又は温度を上昇させることにより増加させることができる。例えば、洗浄ステップに関するストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭ  ＮａＣｌ及び３ｍＭ  クエン酸三ナトリウム未満、最も好ましくは約１５ｍＭ  ＮａＣｌ及び１．５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム未満であり得る。洗浄ステップに関するストリンジェントな温度条件としては、通常、少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、さらにより好ましくは少なくとも約６８℃の温度を挙げることができる。好ましい実施形態において、洗浄ステップは、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ中２５℃で行われ得る。より好ましい実施形態において、洗浄ステップは、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ中４２℃で行われ得る。より好ましい実施形態において、洗浄ステップは、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ中６８℃で行われ得る。これらの条件に関するさらなる変形例は、当業者には容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技法は当業者に周知されており、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【００７２】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか一つ）又は核酸配列（例えば、本明細書に記載される核酸配列のいずれか一つ）と少なくとも５０％の同一性を呈するポリペプチド又は核酸分子が意味される。好ましくは、かかる配列は、比較に使用される配列とアミノ酸又は核酸レベルで少なくとも６０％、より好ましくは８０％又は８５％、及びより好ましくは９０％、９５％又はさらには９９％同一である。
【００７３】
配列同一性は、典型的には配列解析ソフトウェア（例えば、ジェネティクス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ）、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５の配列解析ソフトウェアパッケージ、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、又はＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測られる。かかるソフトウェアは、様々な置換、欠失、及び／又は他の修飾に相同性の程度を割り当てることにより、同一の又は類似した配列をマッチさせる。保存的置換は、典型的には以下のグループ内での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定する例示的手法では、ＢＬＡＳＴプログラムが、近縁の配列を示すｅ−３〜ｅ−１００の確率スコアで用いられ得る。
【００７４】
「Ｔ細胞エピトープ」は、クラスＩ又はＩＩのＭＨＣ分子によってペプチド提示ＭＨＣ分子又はＭＨＣ複合体の形態で結合され得るとともに、次にこの形態でナイーブＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球又はＴヘルパー細胞によって認識及び結合され得るペプチド配列を意味すると理解されるべきである。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」、「治療された」、「治療している」、「治療」などは、それ（例えば、新生物又は腫瘍）に関連する障害及び／又は症状を低減し又は改善することを指す。除外されるわけではないが、障害又は病態を治療するとは、それに関連する障害、病態、又は症状の完全な消失を要するものではないことは理解されるであろう。
【００７６】
用語「治療効果」は、障害（例えば、新生物又は腫瘍）の症状の１つ以上又はそれに関連する病理の何らかの軽減程度を指す。「治療有効量」は、本明細書で使用されるとき、かかる治療がない場合に予想される以上に、かかる障害を有する患者の生存を延ばし、障害の１つ以上の徴候又は症状を低減し、予防し又は遅延させるなどにおいて細胞又は対象への単回又は頻回用量投与時に有効となる薬剤の量を指す。「治療有効量」は、治療効果を実現するために必要な量の適格性を決めることが意図される。当該技術分野の通常の技術を有する医師又は獣医師は、必要な医薬組成物の「治療有効量」（例えば、ＥＤ５０）を容易に決定し及び処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、医薬組成物中に用いられる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を実現するために必要な用量より低いレベルで開始し、所望の効果が実現するまで投薬量を徐々に増加させてもよい。
【００７７】
医薬組成物は、典型的には１日体重１キログラム当たり約０．０００１ｍｇ〜約２００ｍｇの化合物の投薬量を提供しなければならない。例えば、ヒト患者に対する全身投与の投薬量は、０．０１〜１０μｇ／ｋｇ、２０〜８０μｇ／ｋｇ、５〜５０μｇ／ｋｇ、７５〜１５０μｇ／ｋｇ、１００〜５００μｇ／ｋｇ、２５０〜７５０μｇ／ｋｇ、５００〜１０００μｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、５〜５０ｍｇ／ｋｇ、２５〜７５ｍｇ／ｋｇ、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００〜２５０ｍｇ／ｋｇ、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、５００〜７５０ｍｇ／ｋｇ、７５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１０００〜１５００ｍｇ／ｋｇ、１５００〜２０００ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。医薬投薬量単位剤形は、投薬量単位剤形当たり約０．００１ｍｇ〜約５０００ｍｇ、例えば約１００〜約２５００ｍｇの化合物又は必須成分の組み合わせを提供するように調製される。
【００７８】
「ワクチン」は、疾患（例えば、新生物／腫瘍）の予防及び／又は治療のための免疫を生じさせる組成物を意味すると理解されるべきである。従って、ワクチンは、抗原を含み、且つヒト又は動物においてワクチン接種により特定の防御及び保護物質を生じさせるために使用されることが意図される薬剤である。
【００７９】
本明細書の可変基の任意の定義における化学基のリストの記載には、列挙される基の任意の単一の基又は組み合わせとしての当該可変基の定義が含まれる。本明細書における可変基又は態様に関する実施形態の記載には、任意の単一の実施形態としての実施形態又は任意の他の実施形態若しくはその一部と組み合わせた実施形態が含まれる。
【００８０】
本明細書に提供される任意の組成物又は方法は、本明細書に提供される他の組成物及び方法のいずれかの１つ以上と組み合わせることができる。
【００８１】
以下の詳細な説明を以下の図面と併せて読むと、本開示の上述の及び他の特徴及び利点がさらに良く理解されるであろう：
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、本発明の例示的実施形態に係る、個別化された癌ワクチンを作製するフロープロセスを示す。
【図２】図２は、本発明の例示的実施形態に係る、メラノーマ患者用の癌ワクチンを作成するための治療前ステップのフロープロセスを示す。
【図３】図３は、本発明の例示的実施形態に係る、初期患者集団試験の取り組み手法を示すフローチャートである。第１コホートにおいて５人の患者が予想される安全用量レベルで治療され得る。これらの５人の患者のうち一次安全エンドポイントで又はそれより前に用量制限毒性を生じた患者が２人より少ない場合、当該の用量レベルにさらに１０人の患者をリクルートして患者集団の分析を拡大し得る（例えば、それにより有効性、安全性等を評価し得る）。２人以上に用量制限毒性（ＤＬＴ）が観察された場合、ポリＩＣＬＣの用量を５０％減らすことができ、５人のさらなる患者を治療し得る。これらの５人の患者のうち用量制限毒性を生じた患者が２人より少ない場合、当該の用量レベルにさらに１０人の患者をリクルートし得る。しかしながら、低下させたポリＩＣＬＣレベルで２人以上の患者がＤＬＴを生じた場合、試験は中止となる。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、それぞれ、様々なタイプの個別的な突然変異及びネオＯＲＦの例を示す。
【図５】図５は、本発明の例示的実施形態に係る、プライムブースト法に基づく免疫スケジュールを示す。最初の約３週間にわたって頻回の免疫化が行われ、免疫応答のプライミング期の間における初期の高い抗原曝露が維持され得る。次に患者を８週間休ませることにより記憶Ｔ細胞を生じさせ、次にそれらのＴ細胞をブーストすることにより、強力な継続的応答が維持される。
【図６】図６は、本発明の例示的態様に係る、一次免疫学的エンドポイントを指示するタイムラインを示す。
【図７】図７は、本発明の例示的実施形態に係る、局所免疫抑制の解除を新規免疫の刺激と併せ用いる組み合わせを評価するためのチェックポイント遮断抗体との共治療薬投与に関するタイムラインを示す。このスキームに示されるとおり、チェックポイント遮断治療薬、例えばここで示されるとおりの抗ＰＤＬ１に適切な候補として登録する患者を組み入れ、直ちに抗体で治療してもよく、その間にワクチンが調製され得る。次に患者をワクチン接種し得る。チェックポイント遮断抗体の投与は継続してもよく、又はワクチン接種のプライミング期が行われている間は場合により保留されてもよい。
【図８】図８は、本発明の例示的実施形態に係る、種々のネオ抗原突然変異に関するランクの割当てを示す表である。
【図９】図９は、本発明の例示的実施形態に係る、個々のネオ抗原ペプチドを４つのサブグループのプールにする製剤工程処理を示す略図を示す。
【図１０】図１０は、本発明の例示的実施形態に係る、腫瘍ネオ抗原を体系的に発見する戦略の概略図を示す。癌試料中の腫瘍特異的突然変異は全エクソーム（ＷＥＳ）又は全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）を用いて検出し、変異コールアルゴリズム（例えば、Ｍｕｔｅｃｔ）を適用することにより同定し得る。続いて、十分に検証されているアルゴリズム（例えば、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ）を使用して候補ネオエピトープを予測し、それらの同定を、ペプチド−ＨＬＡ結合に関する実験的検証及びＲＮＡレベルでの遺伝子発現の確認によって精緻化し得る。続いてこれらの候補ネオ抗原を、腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激するその能力について試験し得る。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜図１１Ｃは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）においてネオ抗原を生じる可能性のある点突然変異クラスの頻度を示す。９１例のＣＬＬ症例から作成したＷＥＳ及びＷＧＳデータの分析は、（Ａ）ミスセンス突然変異は、ネオエピトープを生じる可能性のある体細胞性変化の最も高頻度のクラスであり、一方（Ｂ）フレームシフト挿入及び欠失並びに（Ｃ）スプライス部位突然変異はそれほど多く見られないイベントに相当することを明らかにする。
【図１１Ｂ】図１１Ａの続きである。
【図１１Ｃ】図１１Ｂの続きである。
【図１２ＡＢ】図１２Ａ〜図１２Ｄは、機能的に定義されたネオエピトープ及びＣＬＬ症例に対するＮｅｔＭＨＣｐａｎ予測アルゴリズムの適用を示す。図１２Ａは、予測結合親和性に基づきソートした、ＮｅｔＭＨＣｐａｎにより試験された文献に報告されている３３個の機能的に同定された癌ネオエピトープの、その既知の制限的ＨＬＡ対立遺伝子との予測結合（ＩＣ５０）を示す。図１２Ｂは、利用可能なＨＬＡタイピング情報を有する３１人のＣＬＬ患者にわたるＨＬＡ結合親和性＜１５０ｎＭ（黒色）及び１５０〜５００ｎＭ（灰色）の予測ペプチドの数の分布を示す。図１２Ｃは、合成ペプチドとの競合的ＭＨＣ  Ｉ対立遺伝子結合アッセイを用いて４人の患者のペプチドの予測結合（ＮｅｔＭＨＣｐａｎによりＩＣ５０＜５００ｎＭ）を、実験的に決定された結合親和性とを比較するグラフを示す。実験的結合のエビデンス（ＩＣ５０＜５００ｎＭ）を有する予測ペプチドのパーセントを示す。図１２Ｄは、ＨＬＡタイピング及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  ２．０＋遺伝子発現データが利用可能であった２６人のＣＬＬ患者から、全ての体細胞性変異遺伝子（ｎ＝３４７）、及びＩＣ５０＜５００ｎＭの予測ＨＬＡ結合スコアを有するネオエピトープをコードする遺伝子突然変異のサブセット（ｎ＝１８０）について遺伝子発現の分布を調べたことを示す。無し乃至低い：最も低い四分位の発現の範囲内にある遺伝子；中間：中央２つの四分位の発現の範囲内にある遺伝子；及び高い：最も高い四分位の発現の範囲内にある遺伝子。
【図１２ＣＤ】図１２ＡＢの続きである。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｂは、図１２Ｄと同じデータを示すが、９ｍｅｒペプチド（図１３Ａ）及び１０ｍｅｒペプチド（図１３Ｂ）を別個に示す。いずれの場合も、予測ＩＣ５０＜１５０ｎＭ及び１５０〜５００ｎＭのペプチドのパーセンテージを、実験的結合のエビデンスと共に示す。
【図１４ＡＢ】図１４Ａ〜図１４Ｃは、患者１におけるＡＬＭＳ１及びＣ６ＯＲＦ８９の突然変異が免疫原性ペプチドを生じさせることを示す。図１４Ａは、患者１のＣＬＬ細胞において２５個のミスセンス突然変異が同定され、そのうち１３個の突然変異からの３０個のペプチドが患者１のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子と結合すると予測されたことを示す。９個の突然変異からの合計１４個のペプチドがＨＬＡ結合性と実験的に確認された。患者１の移植後Ｔ細胞（７年）を、プール当たり、同様の予測ＨＬＡ結合性を有する６個の突然変異ペプチドの５つのプールによってエキソビボで４週間にわたり毎週刺激し、続いてＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより試験した。図１４Ｂは、プール２のペプチドに対してＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌の増加が検出されたことを示す。陰性対照−無関係のＴａｘペプチド；陽性対照−ＰＨＡ。図１４Ｃは、プール２のペプチドのうち、患者１のＴ細胞が突然変異ＡＬＭＳ１及びＣ６ＯＲＦ８９ペプチドに応答性を有したことを示す（右側のパネル；デュプリケートウェルからの平均結果を表示する）。左側のパネル−突然変異型及び野生型ＡＬＭＳ１及びＣ６ＯＲＦ８９ペプチドの予測及び実験ＩＣ５０スコア（ｎＭ）。
【図１４Ｃ】図１４ＡＢの続きである。
【図１５】図１５は、ＦＮＤＣ３Ｂ、Ｃ６ｏｒｆ８９及びＡＬＭＳ１における突然変異部位付近の配列コンテクストに進化的保存が欠損していることを示す。これらの遺伝子の各々から生じるネオエピトープを枠で囲む。赤色−４種全てにおける保存アミノ酸（ａａ）；青色−４種のうち少なくとも２種で保存されているａａ；黒色−種間での保存の欠如。
【図１６】図１６は、ＦＮＤＣ３Ｂ、Ｃ６ｏｒｆ８９及びＡＬＭＳ１遺伝子に報告される体細胞突然変異の局在を示す。ＣＬＬ患者１及び２のＦＮＤＣ３Ｂ、Ｃ６ｏｒｆ８９及びＡＬＭＳ１に同定されたミスセンス突然変異を、諸癌にわたるこれらの遺伝子の既報告の体細胞突然変異（ＣＯＳＭＩＣデータベース）と比較したもの。
【図１７ＡＢ】図１７は、突然変異ＦＮＤＣ３Ｂが患者２において天然で免疫原性のネオエピトープを生じることを示す。図１７Ａは、患者２のＣＬＬ細胞に２６個のミスセンス突然変異が同定され、そのうち１６個の突然変異からの３７個のペプチドが患者２のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子と結合すると予測されたことを示す。合計で１２個の突然変異からの１８個のペプチドが結合することが実験的に確認された。患者２の移植後Ｔ細胞（約３年）を、エキソビボで２週間、実験的に検証済みの結合性突然変異ペプチド（合計１８個のペプチド）の３個のプールでパルスした自己ＤＣ又はＢ細胞によって刺激した（表Ｓ６を参照）。図１７Ｂは、プール１のペプチドで刺激したＴ細胞においてＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりＩＦＮ−γ分泌の増加が検出されたことを示す。図１７Ｃは、プール１のペプチドのうち、ｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂペプチドに対してＩＦＮ−γ分泌の増加が検出されたことを示す（下パネル；デュプリケートウェルからの平均結果が表示される）。上パネル−ｍｕｔ−及びｗｔ−ＦＮＤＣ３Ｂペプチドの予測及び実験ＩＣ５０スコア。図１７Ｄは、ｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂに応答するＴ細胞が突然変異エピトープに対して特異性を示すが、対応する野生型ペプチドに対しては示さず（濃度：０．１〜１０μｇ／ｍｌ）、多機能性の分泌ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−２であることを示す（ｍｕｔペプチド対ｗｔペプチドに対するＴ細胞応答性の間を比較するための二元配置ＡＮＯＶＡモデリングからのチューキー事後検定）。図１７Ｅは、Ｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ特異的Ｔ細胞がクラスＩ制限的に応答し（左）、ＦＮＤＣ３Ｂ突然変異を包含する３００ｂｐのミニ遺伝子をコードするプラスミドがトランスフェクトされたＨＬＡ−Ａ２  ＡＰＣを認識したため（右）（両側ｔ検定）、内因的にプロセシングされて提示された形態の突然変異ＦＮＤＣ３Ｂを認識することを示す。右上−ウエスタンブロット分析−ｍｕｔ−及びｗｔ−ＦＮＤＣ３Ｂをコードするミニ遺伝子の発現が確認される。図１７Ｆは、ＨＬＡ−Ａ２＋／ｍｕｔ  ＦＮＤＣ３Ｂ四量体によって検出するときｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂエピトープを認識するＴ細胞が、健常ドナー由来のＴ細胞と比較して患者２のＴ細胞により高頻度で検出されることを示す。図１７Ｇは、患者２（三角形）、ＣＬＬ−Ｂ細胞（ｎ＝１８２）及び健康成人ボランティア由来の正常ＣＤ１９＋  Ｂ細胞（ｎ＝２４）におけるＦＮＤＣ３Ｂの発現（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２アレイデータに基づく）を示す。
【図１７Ｃ】図１７ＡＢの続きである。
【図１７Ｄ】図１７Ｃの続きである。
【図１７ＥＦ】図１７Ｄの続きである。
【図１７Ｇ】図１７ＥＦの続きである。
【図１８】図１８は、移植経過に対するｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ特異的Ｔ細胞応答の動態を示す。図１８は、患者２において、ＨＳＣＴ前後の一連の時間点におけるクロノタイプＩｇＨ配列に基づき患者腫瘍特異的Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲアッセイを用いて分子腫瘍負荷が計測されたことを示す（上パネル）。中央のパネル−ペプチドでパルスした自己Ｂ細胞で刺激した後のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによる同種ＨＳＣＴ前後のｗｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ又は無関係の末梢血由来ペプチドと比較したｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ応答性Ｔ細胞の検出。各時点における細胞当たりのＩＦＮ−γ分泌スポットの数をトリプリケートで計測した（ウエルチｔ検定；ｍｕｔ対ｗｔ）。挿入図−０．１〜１０μｇ／ｍｌ（対数目盛）ｍｕｔ−ＦＮＤＣ３ＢペプチドでパルスしたＡＰＣに曝露した後のＨＳＣＴ後３２ヶ月（赤色）と比較したＨＳＣＴ後６ヶ月（紫色）のＴ細胞のＩＦＮ−γ分泌。下パネル−患者２の末梢血におけるＨＳＣＴ前後のネステッドクローン特異的ＣＤＲ３  ＰＣＲによるｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ特異的ＴＣＲ  Ｖβ１１細胞の検出（補足方法を参照）。三角形−試料を調べた時間点；ＮＡ−増幅なし；黒色：増幅が検出された、ここで「＋」は、クローン特異的Ｖβ１１配列の検出可能な発現を有する全ての試料の中央値レベルと比べて２倍までの検出可能な増幅を示し、「＋＋」は２倍を超える増幅を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａ〜図１９Ｄは、患者２におけるｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ特異的ＴＣＲ  Ｖβ特異的プライマーの設計を示す。図１９Ａは、ＩＦＮ−γ捕捉アッセイを用いてＨＳＣＴ後６ヶ月の患者２のＰＢＭＣから検出及び単離されたｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ特異的Ｔ細胞を示す。図１９Ｂは、３５０ｂｐ長のアンプリコンを生じる、ＦＮＤＣ３Ｂ応答性Ｔ細胞によって発現されるＴＣＲ  Ｖβ１１のＲＮＡを示す。図１９Ｃは、Ｖβ１１特異的リアルタイムプライマーがｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂクローン特異的ＣＤＲ３再配列の配列に基づき、定量的ＰＣＲプローブが接合部多様性の領域（オレンジ色）に位置するように設計されたことを示す。図１９Ｄは、スペクトルタイピングによって検出するとき、ＦＮＤＣ３Ｂ応答性Ｔ細胞がＶβ１１についてモノクローナルであったことを示す。
【図１９Ｄ】図１９Ａ〜Ｃの続きである。
【図２０Ａ】図２０Ａ〜図２０Ｇは、癌間にわたるネオ抗原発見パイプラインの適用を示す。図２０Ａは、超並列シーケンシングによって癌間にわたり検出された全体的な体細胞突然変異率の比較を示す。赤色−ＣＬＬ；青色−腎明細胞癌（ＲＣＣ）及び緑色−メラノーマ。ＬＳＣＣ：肺扁平上皮癌、肺ＡｄＣａ：肺腺癌、ＥＳＯ  ＡｄＣａ：食道腺癌、ＤＬＢＣＬ：びまん性ラージＢ細胞リンパ腫、ＧＢＭ：膠芽腫、乳頭状ＲＣＣ：乳頭状腎細胞癌、明細胞ＲＣＣ：腎明細胞癌、ＣＬＬ：慢性リンパ性白血病、ＡＭＬ：急性骨髄性白血病。図２０Ｂの分布は、メラノーマ、明細胞ＲＣＣ及びＣＬＬにおける症例当たりのミスセンス、フレームシフト及びスプライス部位突然変異の数を示し、図２０Ｃは試料当たりに生じた平均ネオＯＲＦ長さを示し、及び図２０Ｄは、ミスセンス及びフレームシフト突然変異から生じたＩＣ５０＜１５０ｎＭ（破線）及び＜５００ｎＭ（実線）の予測ネオペプチドを示す。図２０Ｅは、１３種の癌にわたる症例当たりのミスセンス、フレームシフト及びスプライス部位突然変異の数の分布（箱ひげ図によって示される）を示す。図２０Ｆは、試料当たりに生じた合計ネオＯＲＦ長さを示す。２０Ｇは、ミスセンス及びフレームシフト突然変異から生じたＩＣ５０＜１５０ｎＭ及び＜５００ｎＭの予測ネオペプチドを示す。全ての箱ひげ図について、箱の左端部及び右端部がそれぞれ第２５百分位数値及び第７５百分位数値を表し、一方、中央のセグメントが中央値である。ひげの左端及び右端が最小値及び最大値まで延びる。
【図２０Ｂ】図２０Ａの続きである。
【図２０ＣＤ】図２０Ｂの続きである。
【図２０Ｅ】図２０ＣＤの続きである。
【図２０ＦＧ】図２０Ｅの続きである。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
本発明は、複数の新生物／腫瘍特異的ネオ抗原を含む医薬組成物（例えば、癌ワクチン）の治療有効量を対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することによる、新生物、より詳細には腫瘍を治療するための個別化戦略に関する。以下にさらに詳細に記載するとおり、本発明は、少なくとも一部には、全ゲノム／エクソームシーケンシングを用いることにより個々の患者の新生物／腫瘍にユニークに存在する全ての又はほぼ全ての突然変異ネオ抗原を同定し得るとともに、この一群の突然変異ネオ抗原を分析することにより、患者の新生物／腫瘍を治療するための個別化された癌ワクチンとして使用される特異的な最適化されたネオ抗原サブセットを同定し得るという発見に基づく。例えば、図１に示されるとおり、各患者の新生物／腫瘍ＤＮＡ及び正常ＤＮＡをシーケンシングして腫瘍特異的突然変異を同定し、且つ患者のＨＬＡアロタイプを決定することにより、新生物／腫瘍特異的ネオ抗原の集団を同定し得る。新生物／腫瘍特異的ネオ抗原及びそれらのコグネイト天然抗原の集団は、次に検証済みのアルゴリズムを用いたバイオインフォマティクス解析に供され、どの腫瘍特異的突然変異が患者のＨＬＡアロタイプに結合し得るエピトープを作り出すか、詳細にはどの腫瘍特異的突然変異がコグネイト天然抗原と比べてより有効に患者のＨＬＡアロタイプに結合し得るエピトープを作り出すかが予測され得る。この解析に基づき、患者毎にそれらの突然変異のサブセットに対応する複数のペプチドが設計及び合成され、患者を免疫する際の癌ワクチンとして使用するためまとめてプールされ得る。このネオ抗原であるペプチドは、アジュバント（例えば、ポリＩＣＬＣ）又は別の抗新生物剤と組み合わされてもよい。理論によって拘束されるものではないが、これらのネオ抗原は中枢性胸腺トレランスを回避し（従ってより強力な抗腫瘍Ｔ細胞応答が可能となる）、一方で自己免疫の可能性を（例えば、正常な自己抗原の標的化を回避することにより）低下させるものと予想される。
【００８４】
免疫系は、２つの機能的サブシステムに分類することができる：自然免疫系及び獲得免疫系。自然免疫系は感染に対する防御の最前線であり、最も潜在的能力のある病原体が、例えば認識し得る感染を引き起こし得る前にこの系によって速やかに中和される。獲得免疫系は、抗原と称される、侵入生物の分子構造に応答する。獲得免疫応答には、体液性免疫応答及び細胞媒介性免疫応答を含む２種類がある。体液性免疫応答では、Ｂ細胞によって体液中に分泌される抗体が病原体由来抗原に結合し、種々の機序、例えば補体媒介性溶解を介した病原体の排除をもたらす。細胞媒介性免疫応答では、他の細胞を破壊する能力を有するＴ細胞が活性化される。例えば、疾患に関連するタンパク質が細胞中に存在する場合、それらのタンパク質が細胞内でタンパク質分解によってペプチドに断片化される。次にこのように形成された抗原又はペプチドに特定の細胞タンパク質が付着してそれらを細胞の表面に輸送し、そこでそれらの抗原又はペプチドが身体の分子防御機構、詳細にはＴ細胞に提示される。細胞傷害性Ｔ細胞はこれらの抗原を認識し、そうした抗原を有する細胞を死滅させる。
【００８５】
ペプチドを細胞表面に輸送して提示する分子は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のタンパク質と称される。ＭＨＣタンパク質は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩと称される２種類に分類される。これらの２つのＭＨＣクラスのタンパク質の構造は極めて類似している；しかしながら、これらは非常に異なる機能を有する。ＭＨＣクラスＩのタンパク質は、多くの腫瘍細胞を含め、体のほぼ全ての細胞の表面上に存在する。ＭＨＣクラスＩタンパク質には、通常、内因性タンパク質由来又は細胞内に存在する病原体由来の抗原が負荷され、次にそれがナイーブ又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に提示される。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、樹状細胞、Ｂリンパ球、マクロファージ及び他の抗原提示細胞上に存在する。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は主に、外部抗原供給源から、即ち細胞の外側でプロセシングされるペプチドをＴヘルパー（Ｔｈ）細胞に提示する。ＭＨＣクラスＩタンパク質が結合するペプチドのほとんどは、生物自身の健常宿主細胞に生じる細胞質タンパク質に由来し、通常は免疫応答を刺激しない。従って、クラスＩのかかる自己ペプチド提示ＭＨＣ分子を認識する細胞傷害性Ｔリンパ球は胸腺（中枢性トレランス）で除去されるか、又は胸腺から放出された後に除去又は不活性化され、即ち寛容化される（末梢性トレランス）。ＭＨＣ分子は、非寛容化Ｔリンパ球にペプチドを提示するとき、免疫応答を刺激する能力を有する。細胞傷害性Ｔリンパ球は、その表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＣＤ８分子の両方を有する。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣクラスＩの分子と複合体化したペプチドを認識及び結合する能力を有する。各細胞傷害性Ｔリンパ球は、特異的なＭＨＣ／ペプチド複合体との結合能を有するユニークなＴ細胞受容体を発現する。
【００８６】
ペプチド抗原は、細胞表面に提示される前に、小胞体内で競合的親和性結合によってＭＨＣクラスＩの分子に付着する。ここで、個々のペプチド抗原の親和性は、そのアミノ酸配列及びアミノ酸配列内の定義された位置における特異的結合モチーフの存在に直接関係する。かかるペプチドの配列が分かっている場合、罹患細胞に対する免疫系を、例えばペプチドワクチンを使用して操作することが可能である。
【００８７】
治癒的且つ腫瘍特異的な免疫療法薬の開発を妨げる重大な障害の一つは、自己免疫を回避するための高度に特異的且つ制限的な腫瘍抗原の同定及び選択である。悪性細胞内での遺伝子変化（例えば、逆位、転座、欠失、ミスセンス突然変異、スプライス部位突然変異等）の結果として生じる腫瘍ネオ抗原は、最も腫瘍特異的な抗原クラスに相当する。ネオ抗原は、その同定、最適化されたネオ抗原の選択、及びワクチンに使用されるネオ抗原の作製が技術的に困難であるため、癌ワクチンに使用されることはほとんどなかった。本発明によれば、これらの問題は以下によって対処され得る：
・各患者の対応する生殖系列試料に対する腫瘍の全ゲノム、全エクソーム（例えば、捕捉されたエクソンのみ）、又はＲＮＡシーケンシングを用いてＤＮＡレベルで新生物／腫瘍における全ての又はほぼ全ての突然変異を同定すること；
・同定された突然変異を１つ以上のペプチド−ＭＨＣ結合予測アルゴリズムで解析し、新生物／腫瘍内で発現する、且つ患者ＨＬＡ対立遺伝子と結合し得る複数の候補ネオ抗原Ｔ細胞エピトープを作成すること；及び
・全てのネオＯＲＦペプチド及び予測結合ペプチドのセットから選択された複数の候補ネオ抗原ペプチドを癌ワクチンで使用するために合成すること。
【００８８】
例えば、シーケンシング情報を治療ワクチンに変えるには、以下が含まれる：
（１）個体のＨＬＡ分子に結合することのできる個人的突然変異ペプチドの予測。どの特定の突然変異を免疫原として利用するべきかを効率的に選択するには、患者ＨＬＡ型の同定と、どの突然変異ペプチドが患者のＨＬＡ対立遺伝子に効率的に結合し得るかを予測する能力とが必要である。近年、検証済みの結合及び非結合ペプチドによるニューラルネットワークベースの学習手法では、主要なＨＬＡ−Ａ及び−Ｂ対立遺伝子に関する予測アルゴリズムの精度が進歩している。
【００８９】
（２）薬物をロングペプチドの多重エピトープワクチンとして製剤化すること。実際に可能な限り多くの突然変異エピトープを標的にすることにより、免疫系の多大な能力が活用され、特定の免疫標的化遺伝子産物の下方制御によって免疫エスケープの機会が阻止され、及びエピトープ予測手法の既知の不正確さが補償される。合成ペプチドは、複数の免疫原を効率的に調製し且つ突然変異体エピトープの同定を有効なワクチンに迅速に変えるための特に有用な手段を提供する。ペプチドは夾雑細菌又は動物性物質を含有しない試薬を利用して容易に化学的に合成し、簡単に精製することができる。サイズが小さいため、タンパク質の突然変異領域に明確に焦点を合わせることが可能であり、また、他の成分（非突然変異タンパク質又はウイルスベクター抗原）からの無関係の抗原競合も低下する。
【００９０】
（３）強力なワクチンアジュバントとの併用。有効なワクチンには、強力なアジュバントが免疫応答を惹起することが必要である。以下に記載するとおり、ＴＬＲ３アゴニスト並びにＭＤＡ５及びＲＩＧ３のＲＮＡヘリカーゼドメインであるポリＩＣＬＣが、ワクチンアジュバントに望ましいいくつかの特性を示している。それらの特性には、インビボでの免疫細胞の局所及び全身活性化の誘導、刺激ケモカイン及びサイトカインの産生、並びにＤＣによる抗原提示の刺激が含まれる。さらに、ポリＩＣＬＣは、ヒトにおいて耐久性のあるＣＤ４＋及びＣＤ８＋応答を誘導することができる。重要なことに、ポリＩＣＬＣをワクチン接種した対象及び極めて有効性の高い複製コンピテント黄熱病ワクチンの投与を受けたことがあったボランティアには、転写経路及びシグナル伝達経路の上方制御の点で顕著な類似性が認められた。さらに、最近の第１相研究では、ポリＩＣＬＣを（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅに加えて）ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドワクチンと組み合わせて免疫した卵巣癌患者の９０％超がＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導並びにペプチドに対する抗体反応を示した。同時に、ポリＩＣＬＣは現在までに２５件を上回る臨床試験で広範に試験されており、比較的安全な毒性プロファイルを呈している。
【００９１】
本発明の上述の利点を以下にさらに詳細に記載する。
【００９２】
腫瘍特異的ネオ抗原突然変異の同定
本発明は、少なくとも一部には、新生物／腫瘍内の全ての又はほぼ全ての突然変異（例えば、転座、逆位、大きい及び小さい欠失及び挿入、ミスセンス突然変異、スプライス部位突然変異等）を同定する能力に基づく。詳細には、これらの突然変異は対象の新生物／腫瘍細胞のゲノムに存在し、しかし対象由来の正常組織には存在しない。かかる突然変異は、それが、患者の新生物／腫瘍にユニークな改変アミノ酸配列を有するタンパク質（例えば、ネオ抗原）を生じさせる変化をもたらす場合には、特に興味深い。例えば、有用な突然変異には、（１）タンパク質中の異なるアミノ酸をもたらす非同義突然変異；（２）終止コドンが修飾されるか又は欠失し、Ｃ末端に新規の腫瘍特異的配列を有する長くなったタンパク質の翻訳をもたらすリードスルー突然変異；（３）成熟ｍＲＮＡにイントロンが入り込み、ひいてはユニークな腫瘍特異的タンパク質配列をもたらすスプライス部位突然変異；（４）２つのタンパク質の接合部に腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質を生じる染色体再配列（即ち、遺伝子融合）；（５）新規腫瘍特異的タンパク質配列を有する新規オープンリーディングフレームをもたらすフレームシフト突然変異又は欠失などが含まれ得る。腫瘍細胞において例えばスプライス部位、フレームシフト、リードスルー、又は遺伝子融合突然変異によって生じる突然変異を有するペプチド又は突然変異型ポリペプチドは、正常細胞に対して腫瘍のＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質をシーケンシングすることにより同定し得る。
【００９３】
また、本発明の範囲内には、共通の腫瘍ドライバー遺伝子に由来する個人的ネオ抗原ペプチドもあり、既に同定されている腫瘍特異的突然変異がさらに含まれ得る。例えば、既知の共通の腫瘍ドライバー遺伝子及び共通の腫瘍ドライバー遺伝子における腫瘍突然変異は、ワールドワイドウェブ上の（ｗｗｗ）ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｓｍｉｃで参照することができる。
【００９４】
現在、いくつもの構想によって、ＤＮＡ又はＲＮＡの何百万個もの個々の分子から並行して直接配列情報が入手されているところである。リアルタイム単一分子シーケンシング・バイ・シンテシス技術は、シーケンシングする鋳型に相補的なＤＮＡの新生鎖に蛍光ヌクレオチドが取り込まれるときのその検出に頼る。一つの方法では、３０〜５０塩基長のオリゴヌクレオチドが５’末端でグラスカバースリップに共有結合的に固定化される。これらの固定化された鎖は２つの機能を果たす。第一に、表面に結合したオリゴヌクレオチドに相補的な捕捉テールを有する構成の鋳型である場合、これらの鎖が標的鋳型鎖の捕捉部位として働く。これらの鎖はまた、配列読み取りの基礎をなす鋳型誘導プライマー伸長のプライマーとしても働く。捕捉プライマーは、複数回の色素−リンカーの合成、検出、及び色素を取り除く化学的開裂のサイクルを用いる配列決定の定位置部位として機能する。各サイクルは、ポリメラーゼ／標識ヌクレオチド混合物の添加、リンス、イメージング及び色素の開裂からなる。代替的方法では、ポリメラーゼが蛍光ドナー分子で修飾され、スライドグラス上に固定化される一方で、各ヌクレオチドがγ−リン酸塩に結合したアクセプター蛍光部分で色分けされる。このシステムは、ヌクレオチドが新規鎖に取り込まれることに伴う蛍光タグ標識ポリメラーゼと蛍光修飾ヌクレオチドとの間の相互作用を検出する。他のシーケンシング・バイ・シンテシス技術もまた存在する。
【００９５】
好ましくは、任意の好適なシーケンシング・バイ・シンテシスプラットフォームを使用して突然変異を同定することができる。現在、４つの主要なシーケンシング・バイ・シンテシスプラットフォーム：Ｒｏｃｈｅ／４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓのゲノムシーケンサー、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／ＳｏｌｅｘａのＨｉＳｅｑアナライザー、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤシステム、及びＨｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＨｅｌｉｓｃｏｐｅシステムが利用可能である。シーケンシング・バイ・シンテシスプラットフォームはまた、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ及びＶｉｓｉＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによっても記載されている。これらのプラットフォームの各々を本発明の方法で使用することができる。一部の実施形態では、シーケンシングされる複数の核酸分子を支持体（例えば、固体支持体）に結合させる。核酸を支持体上に固定化するため、鋳型の３’及び／又は５’末端に捕捉配列／ユニバーサルプライミング部位を付加することができる。核酸は、捕捉配列を支持体に共有結合的に結合した相補配列とハイブリダイズすることにより支持体に結合させてもよい。捕捉配列（ユニバーサル捕捉配列とも称される）は、支持体に結合した配列に相補的な、ユニバーサルプライマーとして二重の働きをし得る核酸配列である。
【００９６】
捕捉配列の代替例として、カップリング対（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２５２０７７号明細書に例えば記載されるとおりの抗体／抗原、受容体／リガンド、又はアビジン−ビオチン対など）のメンバーを、当該のカップリング対のそれぞれの第２のメンバーでコーティングされた表面に捕捉されることになる各断片に連結してもよい。捕捉後、配列を、例えば、鋳型依存性のシーケンシング・バイ・シンテシスを含め、実施例及び米国特許第７，２８３，３３７号明細書に例えば記載されるとおりの単一分子検出／シーケンシングによって解析し得る。シーケンシング・バイ・シンテシスでは、表面に結合した分子がポリメラーゼの存在下で複数の標識ヌクレオチド三リン酸に曝露される。鋳型の配列は、成長する鎖の３’末端に取り込まれる標識ヌクレオチドの順序により決定される。これはリアルタイムで又はステップ・アンド・リピート方式で行うことができる。リアルタイム解析については、各ヌクレオチドに異なる光学的標識が取り込まれ、取り込まれたヌクレオチドが複数のレーザーを利用して刺激され得る。
【００９７】
本明細書に記載されるシーケンシング方法に使用される核酸試料を入手するために、任意の細胞型又は組織を利用し得る。好ましい実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡ試料は、新生物／腫瘍又は公知の技術（例えば静脈穿刺）によって得られる体液、例えば血液又は唾液から入手される。或いは、核酸検査は乾燥試料（例えば毛髪又は皮膚）で実施することができる。
【００９８】
個体のＤＮＡ又はＲＮＡ中の特定の突然変異又は対立遺伝子の存在を検出するために、種々の方法が利用可能である。この分野の進歩により、正確で簡単且つ安価な大規模ＳＮＰ遺伝子タイピングがもたらされている。最近では、例えば、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイダイアゴナルゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシーケンシング、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎシステム並びにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰチップなどの様々なＤＮＡ「チップ」技術を含め、いくつかの新技術が記載されている。これらの方法は標的遺伝領域の、典型的にはＰＣＲによる増幅を必要とする。侵入的な開裂による小型シグナル分子の作成と、続く質量分析法又は固定化パッドロックプローブ及びローリングサークル増幅に基づくさらに他の新規に開発された方法によれば、最終的にはＰＣＲの必要性がなくなり得る。特定の一塩基変異多型を検出するための当該技術分野において公知の方法のいくつかを以下に要約する。本発明の方法はあらゆる利用可能な方法を含むことが理解される。
【００９９】
ＰＣＲベースの検出手段は、複数のマーカーの同時の多重増幅を含み得る。例えば、当該技術分野では、サイズが重複しない、且つ同時に分析することのできるＰＣＲ産物が生じるようにＰＣＲプライマーを選択することが周知されている。
【０１００】
或いは、別様に標識した、従って各々を別様に検出することのできるプライマーで異なるマーカーを増幅することが可能である。当然ながら、ハイブリダイゼーションベースの検出手段では、試料中の複数のＰＣＲ産物の示差的検出が可能である。複数のマーカーの多重分析を可能にする他の技術が当該技術分野において公知である。
【０１０１】
ゲノムＤＮＡ又は細胞ＲＮＡにおける一塩基変異多型の分析を促進するいくつかの方法が開発されている。一実施形態において、一塩基多型は、例えば米国特許第４，６５６，１２７号明細書に開示されるとおりの特別なエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを使用して検出することができる。この方法によれば、多型部位の直ちに３’側にある対立遺伝子配列に相補的なプライマーが、特定の動物又はヒトから得られた標的分子とハイブリダイズ可能にされる。標的分子上の多型部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドを含む場合、当該の誘導体が、ハイブリダイズしたプライマーの末端に取り込まれることになる。かかる取り込みにより、プライマーはエキソヌクレアーゼに対して耐性となり、従ってその検出が可能となる。試料のエキソヌクレアーゼ耐性誘導体のアイデンティティが分かっているため、プライマーがエキソヌクレアーゼ耐性になっているという知見により、標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドが反応に使用されたヌクレオチド誘導体のものと相補的であったことが明らかとなる。この方法には、大量の無関係な配列データを決定する必要がないという利点がある。
【０１０２】
本発明の別の実施形態では、多型部位のヌクレオチドのアイデンティティの決定に溶液ベースの方法が用いられる。Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（仏国特許第２，６５０，８４０号明細書；国際公開第１９９１／０２０８７号パンフレット）。米国特許第４，６５６，１２７号明細書の方法にあるとおり、多型部位の直ちに３’側にある対立遺伝子配列に相補的なプライマーが用いられ得る。この方法は、標識ジデオキシヌクレオチド誘導体を使用して当該部位のヌクレオチドのアイデンティティを決定し、誘導体は多型部位のヌクレオチドに相補的な場合に、プライマーの末端に取り込まれることになる。
【０１０３】
Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ又はＧＢＡ（登録商標）として知られる代替的方法が、国際公開第１９９２／１５７１２号パンフレット）に記載されている。ＧＢＡ（登録商標）は、標識ターミネーターと、多型部位の３’側にある配列と相補的なプライマーとの混合物を使用する。従って取り込まれる標識ターミネーターは、評価する標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドによって決まり、且つそれと相補的である。Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（仏国特許第２，６５０，８４０号明細書；国際公開第１９９１／０２０８７号パンフレット）の方法と対照的に、ＧＢＡ（登録商標）方法は好ましくは不均一相アッセイであり、プライマー又は標的分子が固相に固定化される。
【０１０４】
近年、ＤＮＡの多型部位をアッセイするためのいくつかのプライマー誘導ヌクレオチド取り込み手順が記載されている（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９−７７８４（１９８９）；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３６７１（１９９０）；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：６８４−６９２（１９９０）；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３−１１４７（１９９１）；Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９−１６４（１９９２）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，ＧＡＴＡ  ９：１０７−１１２（１９９２）；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１−１７５（１９９３））。これらの方法は、いずれも多型部位の塩基間の区別に標識デオキシヌクレオチドの取り込みに頼る点でＧＢＡ（登録商標）と異なる。かかるフォーマットでは、シグナルは取り込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチドのランで現れる多型は、ランの長さに比例するシグナルを生じ得る（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６−５９（１９９３））。
【０１０５】
腫瘍特異的ネオ抗原を同定する代替的方法は、直接のタンパク質シーケンシングである。タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ））を含めた多次元ＭＳ技法（ＭＳｎ）を用いる酵素消化物のタンパク質シーケンシングもまた、本発明のネオ抗原の同定に用いることができる。かかるプロテオミクス手法は、迅速で高度に自動的な解析を可能にする（例えば、Ｋ．Ｇｅｖａｅｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：１１４５−１１５４（２０００）を参照）。本発明の範囲内で、未知のタンパク質のハイスループットなデノボシーケンシング方法を用いて患者の腫瘍のプロテオームを解析し、発現したネオ抗原を同定し得ることがさらに企図される。例えば、メタショットガンタンパク質シーケンシングを用いて発現したネオ抗原を同定し得る（例えば、Ｇｕｔｈａｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）「メタコンティグアセンブリによるショットガンタンパク質シーケンシング（Ｓｈｏｔｇｕｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａ−ｃｏｎｔｉｇ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １１（１０）：１０８４−９６を参照）。
【０１０６】
腫瘍特異的ネオ抗原はまた、ＭＨＣ多量体を使用してネオ抗原特異的Ｔ細胞応答を同定して同定することもできる。例えば、患者試料中のネオ抗原特異的Ｔ細胞応答のハイスループット解析を、ＭＨＣ四量体ベースのスクリーニング技法を用いて実施してもよい（例えば、Ｈｏｍｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）「ＭＨＣ四量体ベースのスクリーニングによる潜在的マイナー組織適合抗原のハイスループット同定：実現可能性と限界（Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｍｉｎｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｂｙ  ＭＨＣ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ）」６（８）：１−１１；Ｈａｄｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）「ＭＨＣ多量体の多次元コーディングによる抗原特異的Ｔ細胞応答の並列検出（Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｏｆ  ＭＨＣ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ）」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，６（７）：５２０−２６；ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）「腫瘍エクソーム解析がイピリムマブ応答性メラノーマにおけるネオ抗原特異的Ｔ細胞応答性を明らかにする（Ｔｕｍｏｒ  ｅｘｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｎ  Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３１：１−４；及びＨｅｅｍｓｋｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）「癌アンチゲノム（Ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎｏｍｅ）」，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３２（２）：１９４−２０３を参照）。本発明の範囲内で、かかる四量体ベースのスクリーニング技法は腫瘍特異的ネオ抗原の初期同定に用いられ得るか、或いは患者がどのようなネオ抗原に既に曝露されたことがあるかを評価するための、従って本発明のワクチン用の候補ネオ抗原の選択を促進する二次スクリーニングプロトコルとして用いられ得ることが企図される。
【０１０７】
腫瘍特異的ネオ抗原の設計
本発明は、単離ペプチド（例えば、本発明の方法によって同定される腫瘍特異的突然変異を含むネオ抗原ペプチド、既知の腫瘍特異的突然変異を含むペプチド、及び本発明の方法によって同定される突然変異体ポリペプチド又はその断片）をさらに含む。これらのペプチド及びポリペプチドは、本明細書では「ネオ抗原ペプチド」又は「ネオ抗原ポリペプチド」と称される。用語「ペプチド」は、本明細書では、典型的には隣接するアミノ酸のα−アミノ基とα−カルボキシル基との間のペプチド結合によって互いにつながる一続きの残基、典型的にはＬ−アミノ酸を指して、「突然変異体ペプチド」及び「ネオ抗原ペプチド」及び「野生型ペプチド」と同義的に使用される。ポリペプチド又はペプチドは種々の長さであってよく、最低でも、患者のＨＬＡ分子に結合すると予測される小さい領域（「エピトープ」）並びにＮ末端方向及びＣ末端方向の両方に伸長するさらなる隣接アミノ酸を含み得る。ポリペプチド又はペプチドは、その中性（非荷電）形態であっても、或いは塩である形態であってもよく、及びグリコシル化、側鎖酸化、又はリン酸化などの修飾を含まなくてもよく、或いは修飾が本明細書に記載されるとおりのポリペプチドの生物学的活性を破壊しないことを条件として、それらの修飾を含んでもよい。
【０１０８】
特定の実施形態において、少なくとも１つのネオ抗原ペプチド分子のサイズは、限定はされないが、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０個又はそれ以上のアミノ分子残基、及びこれらにおいて導き出し得る任意の範囲を含み得る。具体的な実施形態において、ネオ抗原ペプチド分子は５０アミノ酸以下である。好ましい実施形態において、ネオ抗原ペプチド分子は約２０〜約３０アミノ酸に等しい。
【０１０９】
より長いペプチドをいくつかの方法で設計し得る。例えば、ＨＬＡ結合領域（例えば「エピトープ」）が予測されるか又は分かっている場合、より長いペプチドは以下のいずれかからなり得る：各対応する遺伝子産物のＮ末端及びＣ末端に向かって０〜１０アミノ酸の伸長を有する個々の結合ペプチド。より長いペプチドはまた、各々伸長配列を有する結合ペプチドの一部又は全ての連続からなってもよい。別の例では、長い（１０残基を上回る）ネオエピトープ配列が（例えば新規ペプチド配列をもたらすフレームシフト、リードスルー又はイントロン導入に起因して）腫瘍に存在することがシーケンシングによって明らかになった場合、より長いペプチドは、新規腫瘍特異的アミノ酸のストレッチ全体からなり得る。いずれの例も、より長いペプチドの使用は、樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞による内因性プロセシングを必要とし、より効果的な抗原提示及びＴ細胞応答の誘導をもたらし得る。ある場合には、ポリペプチドの生化学的特性（溶解度又は安定性などの特性）が向上するように、又はペプチドの効率的なプロテアソームプロセシングの可能性が向上するように、伸長配列を改変することが望ましい又は好ましい（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）「アミノペプチダーゼ基質優先性はＨＩＶエピトープ提示に影響を与え、及びＨＩＶ感染個体における免疫エスケープパターンを予測する（Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｆｆｅｃｔｓ  ＨＩＶ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｓｃａｐｅ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ＨＩＶ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）」．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８８：５９２４−３４；Ｈｅａｒｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）「ＭＨＣクラスＩ抗原提示中のサイトゾル及びＥＲにおけるアミノペプチダーゼの特異性及び協働の特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏ−ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｓｏｌ  ａｎｄ  ＥＲ  ｄｕｒｉｎｇ  ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）」．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８４（９）：４７２５−３２；Ｗｉｅｍｅｒｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）「ＭＨＣクラスＩリガンドをトリムするペプチダーゼ（Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ  ｔｒｉｍｍｉｎｇ  ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｌｉｇａｎｄｓ）」．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２５：１−７）。
【０１１０】
ネオ抗原ペプチド及びポリペプチドはＨＬＡタンパク質と結合し得る。好ましい態様において、ネオ抗原ペプチド及びポリペプチドは、対応する天然／野生型ペプチドと比べてより高い親和性でＨＬＡタンパク質と結合し得る。ネオ抗原ペプチド又はポリペプチドは約１０００ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、又は約５０ｎＭ未満のＩＣ５０を有し得る。
【０１１１】
好ましい実施形態において、本発明のネオ抗原ペプチド及びポリペプチドは対象への投与時に自己免疫応答を誘導せず及び／又は免疫トレランスを誘起しない。
【０１１２】
本発明はまた、複数のネオ抗原ペプチドを含む組成物も提供する。一部の実施形態では、この組成物は、少なくとも５個又はそれ以上のネオ抗原ペプチドを含む。一部の実施形態では、この組成物は、少なくとも約６、約８、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、又は約２０個の別個のペプチドを含有する。一部の実施形態では、この組成物は少なくとも２０個の別個のペプチドを含有する。本発明によれば、別個のペプチドのうちの２個又はそれ以上が同じポリペプチドに由来し得る。例えば、好ましいネオ抗原突然変異がネオＯＲＦポリペプチドをコードする場合、ネオ抗原ペプチドの２個以上がそのネオＯＲＦポリペプチドに由来し得る。一実施形態において、ネオＯＲＦポリペプチドに由来する２個以上のネオ抗原ペプチドは、ポリペプチドにわたってタイリングされたアレイを含み得る（例えば、ネオ抗原ペプチドは、ネオＯＲＦポリペプチドの一部分又は全てにわたる一連のオーバーラップするネオ抗原ペプチドを含み得る）。理論によって拘束されるものではないが、各ペプチドがその独自のエピトープを有すると考えられる；従って、１つのネオＯＲＦポリペプチドにわたるタイリングアレイが、異なるＨＬＡ分子に標的化されるポリペプチドを生じ得る。ネオ抗原ペプチドは任意のタンパク質コード遺伝子に由来し得る。ネオ抗原ペプチドが由来し得る例示的ポリペプチドは、例えばＣＯＳＭＩＣデータベースを（ワールドワイドウェブ上の（ｗｗｗ）ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｓｍｉｃで）参照することができる。ＣＯＳＭＩＣはヒト癌の体細胞突然変異に関する包括的な情報をキュレートする。ペプチドは腫瘍特異的突然変異を含有し得る。一部の態様において腫瘍特異的突然変異は共通のドライバー遺伝子にあるか、又は特定の癌タイプに共通のドライバー突然変異である。例えば、共通のドライバー突然変異ペプチドとしては、限定はされないが、以下を挙げることができる：ＳＦ３Ｂ１ポリペプチド、ＭＹＤ８８ポリペプチド、ＴＰ５３ポリペプチド、ＡＴＭポリペプチド、Ａｂｌポリペプチド、ＦＢＸＷ７ポリペプチド、ＤＤＸ３Ｘポリペプチド、ＭＡＰＫ１ポリペプチド、又はＧＮＢ１ポリペプチド。
【０１１３】
ネオ抗原ペプチド、ポリペプチド、及び類似体は、通常はそのタンパク質の一部でないさらなる化学的部分を含むようにさらに修飾することができる。そのような誘導体化部分は、タンパク質の溶解度、生物学的半減期、吸収、又は結合親和性を改善し得る。そのような部分はまた、タンパク質等の任意の望ましい副作用を低減し又は消失させることもできる。これらの部分に関する概要は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（２０００）を参照することができる。
【０１１４】
例えば、所望の活性を有するネオ抗原ペプチド及びポリペプチドが、必要に応じて特定の所望の属性、例えば向上した薬理学的特性を提供する一方で、所望のＭＨＣ分子を結合し且つ適切なＴ細胞を活性化させる非修飾ペプチドの生物学的活性の実質的に全てを増加させるか又は少なくとも維持するように修飾されてもよい。例えば、ネオ抗原ペプチド及びポリペプチドが保存的置換或いは非保存的置換などの種々の変化に供されてもよく、ここでかかる変化は、ＭＨＣ結合性の向上など、その使用上の特定の利点を提供し得る。かかる保存的置換には、あるアミノ酸残基を生物学的及び／又は化学的に類似した別のアミノ酸残基によって置き換えること、例えばある疎水性残基を別の疎水性残基の代わりに、又はある極性残基を別の極性残基の代わりに置き換えることが包含され得る。単一アミノ酸置換の効果はまた、Ｄ−アミノ酸を使用して探ることもできる。かかる修飾は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−３４７（１９８６）、Ｂａｒａｎｙ  ＆  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ  ＆  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．（Ｎ．Ｙ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．１−２８４（１９７９）；及びＳｔｅｗａｒｔ  ＆  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ．，Ｐｉｅｒｃｅ），２ｄ  Ｅｄ．（１９８４）に記載されるとおりの、周知のペプチド合成手順を用いて作製し得る。
【０１１５】
ネオ抗原ペプチド及びポリペプチドはまた、化合物のアミノ酸配列を伸長又は短縮すること、例えば、アミノ酸の付加又は欠失により修飾されてもよい。ネオ抗原ペプチド、ポリペプチド、又は類似体はまた、特定の残基の順序又は組成を改変することによっても修飾し得る。当業者には、生物学的活性に必須の特定のアミノ酸残基、例えば重要な接触部位にあるもの又は保存残基は、概して生物学的活性に有害作用を及ぼすことなしには改変できないことが理解されるであろう。重要でないアミノ酸は、Ｌ−ａ−アミノ酸、又はそれらのＤ−異性体など、タンパク質中に天然に存在するものに限定される必要はなく、β−γ−δ−アミノ酸などの非天然アミノ酸、並びにＬ−ａ−アミノ酸の多くの誘導体を同様に含み得る。
【０１１６】
典型的には、ネオ抗原ポリペプチド又はペプチドは、単一アミノ酸置換を有する一連のペプチドを使用してＭＨＣ結合に対する帯電、疎水性等の効果を決定することにより最適化され得る。例えば、一連の正電荷（例えば、Ｌｙｓ又はＡｒｇ）又は負電荷（例えば、Ｇｌｕ）アミノ酸置換をペプチドの長さに沿って作製してもよく、様々なＭＨＣ分子及びＴ細胞受容体に対する種々の感受性パターンが現れる。加えて、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、又は同様の残基など、小型の比較的中性の部分を使用した複数の置換が用いられてもよい。このような置換はホモオリゴマー又はヘテロオリゴマーであってもよい。置換又は付加される残基の数及び種類は、必須の接触点の間に必要な間隔及び求められる特定の機能的属性（例えば、疎水性と親水性）に依存する。親ペプチドの親和性と比較して、ＭＨＣ分子又はＴ細胞受容体に対する結合親和性の増加もまた、かかる置換によって実現し得る。いずれにしても、かかる置換は、例えば、結合を阻害し得る立体障害及び電荷障害を回避するように選択されたアミノ酸残基又は他の分子断片を用いなければならない。
【０１１７】
アミノ酸置換は、典型的には単一残基の置換である。置換、欠失、挿入又はそれらの任意の組み合わせを併用して最終的なペプチドに至らせてもよい。置換変異体は、ペプチドの少なくとも１つの残基が取り除かれ、その代わりに異なる残基が挿入されているものである。
【０１１８】
ネオ抗原ペプチド及びポリペプチドは、所望の属性を提供するように修飾されてもよい。例えば、Ｔヘルパー細胞応答の誘導能を有する少なくとも１つのエピトープを含有する配列との連結により、ペプチドがＣＴＬ活性を誘導する能力を増強することができる。特に好ましい免疫原性ペプチド／Ｔヘルパーコンジュゲートはスペーサー分子によって連結される。スペーサーは典型的には、生理学的条件下で実質的に非荷電であるアミノ酸又はアミノ酸模倣体などの比較的小型の中性分子で構成される。スペーサーは典型的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、又はその他の、非極性アミノ酸若しくは中性極性アミノ酸の中性スペーサーから選択される。場合により本スペーサーは同じ残基で構成される必要はなく、従ってヘテロ又はホモオリゴマーであってもよいことは理解されるであろう。存在する場合、スペーサーは通例少なくとも１個又は２個の残基であり、より通例では３〜６個の残基であり得る。或いは、ペプチドはスペーサーなしにＴヘルパーペプチドに連結されてもよい。
【０１１９】
ネオ抗原ペプチドはＴヘルパーペプチドに直接か、或いはスペーサーを介して、ペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかで連結し得る。ネオ抗原ペプチド又はＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端がアシル化されてもよい。例示的Ｔヘルパーペプチドには、破傷風トキソイド８３０〜８４３、インフルエンザ３０７〜３１９、マラリアスポロゾイト周囲３８２〜３９８及び３７８〜３８９が含まれる。
【０１２０】
腫瘍特異的ネオ抗原の産生
本発明は、少なくとも一部には、患者の免疫系に腫瘍特異的ネオ抗原のプールを提示する能力に基づく。当業者は、かかる腫瘍特異的ネオ抗原を産生する種々の方法があることを理解するであろう。一般に、かかる腫瘍特異的ネオ抗原は、インビトロ又はインビボのいずれかで産生され得る。腫瘍特異的ネオ抗原はインビトロでペプチド又はポリペプチドとして産生されてもよく、次にそれが個別化された新生物ワクチンに製剤化され、対象に投与されてもよい。以下にさらに詳細に記載するとおり、かかるインビトロ産生は、例えば、種々の細菌、真核生物、又はウイルス組換え発現系のいずれかにおけるＤＮＡ又はＲＮＡ分子からのペプチド／ポリペプチドのペプチド合成又は発現と、続く発現したペプチド／ポリペプチドの精製など、当業者に公知の種々の方法によって行われ得る。或いは、腫瘍特異的ネオ抗原は、腫瘍特異的ネオ抗原をコードする分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス発現系など）を対象に導入し、導入後にコードされた腫瘍特異的ネオ抗原が発現することによりインビボで産生されてもよい。
【０１２１】
インビトロペプチド／ポリペプチド合成
タンパク質又はペプチドは、標準的な分子生物学的技法によるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの発現、天然供給源からのタンパク質又はペプチドの単離、又はタンパク質又はペプチドの化学合成を含め、当業者に公知の任意の技法によって作製することができる。様々な遺伝子に対応するヌクレオチド及びタンパク質、ポリペプチド及びペプチド配列は既に開示されており、当業者に公知のコンピュータ化されたデータベースを参照することができる。一つのかかるデータベースは、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）ウェブサイトにある国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎｂａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースである。既知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示される技法を用いて、又は当業者に公知であろうとおりに増幅し及び／又は発現させることができる。或いは、様々な市販のタンパク質、ポリペプチド及びペプチド調製物が当業者に公知である。
【０１２２】
ペプチドは、夾雑細菌又は動物性物質を含有しない試薬を利用して容易に化学的に合成することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ＲＢ：「固相ペプチド合成Ｉ．テトラペプチドの合成（Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ）」．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４，１９６３）。
【０１２３】
本発明のさらなる態様は、本発明のネオ抗原ペプチドをコードする核酸（例えば、ポリヌクレオチド）を提供し、これは、ネオ抗原ペプチドをインビトロで産生するために用いられ得る。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖及び／又は二本鎖のいずれかの、又は天然の若しくは安定化した形態のポリヌクレオチド、例えばホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉａｔｅ）骨格を有するポリヌクレオチドなど、又はそれらの組み合わせであってよく、それがペプチドをコードする限りはイントロンを含んでも、又は含まなくてもよい。本発明のさらに別の態様は、本発明に係るポリペプチドの発現能を有する発現ベクターを提供する。種々の細胞型に対する発現ベクターは当該技術分野において周知されており、必要以上に実験を行うことなく選択することができる。概して、ＤＮＡが、発現に適切な向き及び正しいリーディングフレームでプラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要であれば、ＤＮＡは、所望の宿主（例えば、細菌）によって認識される適切な転写及び翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結されてもよく、しかしかかる制御は概して発現ベクターにおいて利用可能である。次にベクターは、標準的な技法を用いてクローニング用の宿主細菌に導入される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）。
【０１２４】
本発明は、本明細書に記載される同定された腫瘍特異的ネオ抗原と実質的に相同な変異体及び等価物をさらに包含する。これらは、例えば、保存的置換突然変異、即ち、同様のアミノ酸による１つ以上のアミノ酸の置換を含有し得る。例えば、保存的置換とは、あるアミノ酸を同じ一般的クラス内の別のアミノ酸で、例えば、ある酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で、ある塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で、又はある中性アミノ酸を別の中性アミノ酸により置換することを指す。保存的アミノ酸置換の意図するところは当該技術分野において周知されている。
【０１２５】
本発明はまた、単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びにその発現ベクターを含む宿主細胞も含む。また、本発明の範囲内で、所望のネオ抗原ペプチドをコードするＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子の形態のネオ抗原ペプチドが提供され得ることも企図される。本発明はまた、本発明の１つ以上のネオ抗原ペプチドが単一の発現ベクターによりコードされ得ることも提供する。本発明はまた、本発明の１つ以上のネオ抗原ペプチドがウイルスベースのシステム（例えば、アデノウイルスシステム）を使用してインビボでコードされ及び発現し得ることも提供する。
【０１２６】
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド並びにさらなるコード配列及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡにはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡが含まれ；二本鎖又は一本鎖であってもよく、一本鎖の場合にはコード鎖又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
【０１２７】
実施形態において、ポリヌクレオチドは、例えば宿主細胞からのポリペプチドの発現及び／又は分泌を助けるポリヌクレオチド（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）と同じリーディングフレームで融合した腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドのコード配列を含み得る。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、成熟形態のポリペプチドを形成するため宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有し得る。
【０１２８】
実施形態において、ポリヌクレオチドは、例えばコードされたポリペプチドの精製を可能にして、次にそれが個別化された新生物ワクチンに組み込まれ得るようにするマーカー配列に同じリーディングフレームで融合した腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドのコード配列を含み得る。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーと融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するｐＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであってよく、又はマーカー配列は、哺乳類宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用されるとき、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）タグであってもよい。さらなるタグとしては、限定はされないが、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、イソペプタグ（Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ）、ＳｐｙＴａｇ、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ＧＳＴタグ、蛍光タンパク質タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質タグ）、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、チオレドキシンタグ、ＴＣタグ、Ｔｙタグなどが挙げられる。
【０１２９】
実施形態において、ポリヌクレオチドは、複数のネオ抗原ペプチドの産生能を有する単一のコンカテマー化したネオ抗原ペプチドコンストラクトを作成するため同じリーディングフレームで融合した腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドの１つ以上のコード配列を含み得る。
【０１３０】
実施形態において、本発明は、本発明の腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、又は少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％同一のヌクレオチド配列を有する単離核酸分子を提供する。
【０１３１】
参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列に対して、ポリヌクレオチド配列に参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドにつき最大５個の点突然変異が含まれ得ることを除き同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、参照配列中のヌクレオチドの最大５％が欠失しているか又は別のヌクレオチドに置換されていてもよく、又は参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されていてもよい。参照配列のこれらの突然変異は参照ヌクレオチド配列のアミノ末端又はカルボキシ末端位置又はそれらの末端位置の間のどこかに、参照配列中のヌクレオチド間に個々に散在して、或いは参照配列内で１つ以上の隣接するまとまりとして存在し得る。
【０１３２】
実際問題として、任意の特定の核酸分子が参照配列と少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、及び一部の実施形態では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（ウィスコンシン配列解析パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ）、バージョン８  Ｕｎｉｘ(登録商標)版、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）などの公知のコンピュータプログラムを使用して従来法で決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを使用して２つの配列間における最良の相同性セグメントを見付け出す。Ｂｅｓｔｆｉｔ又は任意の他の配列アラインメントプログラムを使用して特定の配列が本発明に係る参照配列と例えば９５％同一であるかどうかを決定するとき、パラメータの設定は、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって同一性のパーセンテージが計算され、且つ参照配列中のヌクレオチド総数の最大５％の相同性のギャップが許容されるように行われる。
【０１３３】
本明細書に記載される単離された腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の好適な方法によりインビトロで（例えば実験室で）産生することができる。かかる方法は、直接のタンパク質合成方法から、単離ポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を構築し且つそれらの配列を好適な形質転換宿主において発現させるにまでに及ぶ。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は組換え技術を用いて、目的の野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離又は合成することにより構築される。場合により、部位特異的突然変異誘発によって配列に突然変異を誘発し、その機能性類似体を提供し得る。例えば、Ｚｏｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：５６６２−５０６６（１９８４）及び米国特許第４，５８８，５８５号明細書を参照のこと。
【０１３４】
実施形態において、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用した化学合成によって構築され得る。かかるオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づき、且つ目的の組換えポリペプチドを産生する宿主細胞に好ましいコドンを選択して設計することができる。目的の単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列の合成には、標準方法を適用し得る。例えば、完全なアミノ酸配列を使用して逆翻訳された遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの一部分をコードするいくつかの小型オリゴヌクレオチドを合成し、次にライゲートすることができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には相補的アセンブリのための５’又は３’オーバーハングを含む。
【０１３５】
アセンブリ（例えば、合成、部位特異的突然変異誘発、又は別の方法による）の後、目的とする特定の単離ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、場合により所望の宿主でのタンパク質の発現に適切な発現制御配列に動作可能に連結し得る。アセンブリが適切であることは、ヌクレオチドシーケンシング、制限酵素マッピング、及び好適な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確認することができる。当該技術分野において周知のとおり、宿主においてトランスフェクト遺伝子の高い発現レベルを達成するため、選択の発現宿主で機能する転写及び翻訳発現制御配列に動作可能を遺伝子に連結することができる。
【０１３６】
組換え発現ベクターを使用して、腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドをコードするＤＮＡを増幅し及び発現させてもよい。組換え発現ベクターは複製可能なＤＮＡコンストラクトであり、哺乳類、微生物、ウイルス又は昆虫遺伝子に由来する好適な転写又は翻訳調節エレメントに動作可能に連結された腫瘍特異的ネオ抗原ペプチド又は生物学的に同等な類似体をコードする合成の又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を有する。転写単位は概して、以下にさらに詳細に記載するとおり、（１）遺伝子発現において調節的役割を有する１つ又は複数の遺伝子エレメント、例えば転写プロモーター又はエンハンサーと、（２）ｍＲＮＡに転写され且つタンパク質に翻訳される構造配列又はコード配列と、（３）適切な転写及び翻訳開始及び終結配列とのアセンブリを含む。かかる調節エレメントは、転写を制御するオペレーター配列を含み得る。宿主での複製能（通常は複製起点によって付与される）、及び形質転換体の認識を促進するための選択遺伝子が、さらに組み込まれ得る。ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関係しているとき、動作可能に連結されている。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現する場合には、ポリペプチドのＤＮＡに動作可能に連結されている；プロモーターは、それが配列の転写を制御する場合には、コード配列に動作可能に連結されている；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にする位置にある場合には、コード配列に動作可能に連結されている。概して、動作可能に連結されているとは、隣接することを意味し、分泌リーダーの場合には、隣接すること及びリーディングフレームにあることを意味する。酵母発現系での使用が意図される構造エレメントは、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。或いは、組換えタンパク質がリーダー配列又は輸送配列なしに発現する場合、それはＮ末端メチオニン残基を含み得る。場合により、発現した組換えタンパク質からこの残基が続いて切断されることで、最終産物がもたらされ得る。
【０１３７】
発現制御配列及び発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存し得る。多種多様な発現宿主／ベクターの組み合わせを用いることができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、公知の細菌プラスミド、例えば、ｐＣＲ  １、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のプラスミド及びそれらの誘導体、より広い宿主域のプラスミド、例えばＭ１３及び繊維状一本鎖ＤＮＡファージが挙げられる。
【０１３８】
ポリペプチドの発現に好適な宿主細胞としては、適切なプロモーターの制御下にある原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は高等真核細胞が挙げられる。原核生物には、グラム陰性生物又はグラム陽性生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）が含まれる。高等真核細胞には、哺乳類起源の樹立細胞株が含まれる。無細胞翻訳系もまた用いることができる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳類細胞宿主での使用に適切なクローニング及び発現ベクターは、当該技術分野において周知されている（Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５を参照）。
【０１３９】
様々な哺乳類又は昆虫細胞培養系もまた、有利には組換えタンパク質を発現させるために用いられる。哺乳類細胞における組換えタンパク質の発現は、かかるタンパク質が概して正しく折り畳まれ、適切に修飾され、且つ完全に機能性であるため、実施することができる。好適な哺乳類宿主細胞系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，１９８１）によって記載されるサル腎細胞のＣＯＳ−７系、並びに適切なベクターの発現能を有する他の細胞系、例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞系が挙げられる。哺乳類発現ベクターは非転写エレメント、例えば、複製起点、発現させる遺伝子に連結される好適なプロモーター及びエンハンサー、並びに他の５’又は３’フランキング非転写配列、及び５’又は３’非翻訳配列、例えば必須リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与・受容部位、及び転写終結配列を含み得る。昆虫細胞において異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルスシステムが、Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）によってレビューされている。
【０１４０】
形質転換宿主により産生されたタンパク質は、任意の好適な方法により精製することができる。かかる標準方法には、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーなど）、遠心、溶解度差、又は任意の他の標準的なタンパク質精製技法によることが含まれる。アフィニティータグ、例えば、ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどをタンパク質に結合させると、適切なアフィニティーカラムに通すことによる容易な精製が可能となり得る。単離されたタンパク質はまた、タンパク質分解、核磁気共鳴及びＸ線結晶学などの技法を用いて物理的に特徴付けることができる。
【０１４１】
例えば、組換えタンパク質を培養培地中に分泌するシステムからの上清を、初めに、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを使用して濃縮することができる。濃縮ステップの後、濃縮物を好適な精製マトリックスに加えることができる。或いは、陰イオン交換樹脂、例えばペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は基質を用いることができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製において一般的に用いられる他の種類であってもよい。或いは、陽イオン交換ステップを用いることができる。好適な陽イオン交換体としては、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが挙げられる。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えばペンダントメチル基又は他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを用いて癌幹細胞タンパク質−Ｆｃ組成物をさらに精製することができる。前述の精製ステップの一部又は全てを様々な組み合わせで用いて均一な組換えタンパク質を提供することもできる。
【０１４２】
細菌培養物において産生された組換えタンパク質は、例えば、初めに細胞ペレットから抽出し、続いて１回以上濃縮し、塩析し、水溶性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィーステップを行うことにより単離し得る。最終的な精製ステップには高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が用いられてもよい。組換えタンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクリング、音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含む任意の好都合な方法によって破壊することができる。
【０１４３】
インビボペプチド／ポリペプチド合成
本発明はまた、ネオ抗原ペプチド／ポリペプチドを例えばＤＮＡ／ＲＮＡワクチンの形態でインビボで対象に送達するための媒体としての核酸分子の使用も企図する（例えば、本明細書によって全体として参照により援用される国際公開第２０１２／１５９６４３号パンフレット、及び国際公開第２０１２／１５９７５４号パンフレットを参照）。
【０１４４】
一実施形態において、個別化された新生物ワクチンは、例えば本発明に従い同定されるとおりの１つ以上のネオ抗原ペプチド／ポリペプチドをコードする別個のＤＮＡプラスミドを含み得る。上記で考察したとおり、発現ベクターの正確な選択は、発現させるペプチド／ポリペプチドに依存することになり、十分に当業者の技術の範囲内である。ＤＮＡコンストラクト（例えば、筋細胞におけるエピソーム性、非複製、非組込み形態のもの）の予想される持続性が、防御期間の増加をもたらすと予想される。
【０１４５】
別の実施形態では、個別化された新生物ワクチンは、本発明のネオ抗原ペプチド／ポリペプチドをコードするＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子を含み得る。
【０１４６】
別の実施形態では、個別化された新生物ワクチンは、例えばアデノウイルスシステムなど、ヒト患者で使用されるウイルスベースのベクターを含み得る（例えば、本明細書によって全体として参照により援用されるＢａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．「組換えアデノウイルス血清型２６型ＨＩＶ−１  Ｅｎｖワクチン（ＩＰＣＡＶＤ  ００１）の安全性及び免疫原性のファースト・イン・ヒューマン評価（Ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｈｕｍａｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２６  ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｖａｃｃｉｎｅ（ＩＰＣＡＶＤ  ００１））」．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２０１３  Ｊａｎ  １５；２０７（２）：２４０−７を参照）。
【０１４７】
医薬組成物／送達方法
本発明はまた、本発明に係る１つ以上の化合物（その薬学的に許容可能な塩を含む）の有効量を、場合により薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は添加剤との組み合わせで含む医薬組成物にも関する。
【０１４８】
「薬学的に許容可能な誘導体又はプロドラッグ」は、レシピエントへの投与時に本発明の化合物を（直接的又は間接的に）提供する能力を有する本発明の化合物の任意の薬学的に許容可能な塩、エステル、エステルの塩、又は他の誘導体を意味する。特に好ましい誘導体及びプロドラッグは、かかる化合物が哺乳動物に投与されたときに（例えば、経口投与又は眼球投与された化合物の血中へのより容易な吸収を可能にすることによって）本発明の化合物のバイオアベイラビリティを増加させるもの、又は親種と比べて生体コンパートメント（例えば網膜）への親化合物の送達を増強するものである。
【０１４９】
本発明の腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドは単独の医薬活性薬剤として投与することができるが、また１つ以上の他の薬剤及び／又は補助剤と組み合わせて使用されてもよい。組み合わせとして投与される場合、治療剤は、同じ又は異なる時点で投与される別個の組成物として製剤化されてもよく、又は治療剤は単一の組成物として投与されてもよい。
【０１５０】
本発明の腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドは、従来の薬学的に許容可能な担体、補助剤、及び媒体を含有する投薬量単位製剤で、注入により、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、経直腸的に、経腟的に、又は局所的に投与されてもよい。用語の非経口とは、本明細書で使用されるとき、１つ又は複数のリンパ節内、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、輸液法、腹腔内、眼又は眼球、硝子体内、頬内、経皮、鼻腔内、頭蓋内及び硬膜内を含む脳内、足首関節、膝関節、股関節、肩関節、肘関節、手首関節を含む関節内、腫瘍内に直接など、及び坐薬形態を含む。
【０１５１】
本発明の薬学的に活性な化合物は、ヒト及び他の哺乳動物を含めた患者への投与用医薬剤を作製するための従来の薬学方法に従い処理することができる。
【０１５２】
活性化合物の修飾は活性種の溶解度、バイオアベイラビリティ及び代謝速度に影響を及ぼし、従って活性種の送達の制御をもたらし得る。これは、十分に当業者の技術の範囲内にある公知の方法によって誘導体を調製し、且つその活性を試験することにより、容易に評価し得る。
【０１５３】
これらの化学的化合物をベースとする医薬組成物は、上述の腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドを、本明細書に記載されている疾患及び病態（例えば、新生物／腫瘍）の治療に治療上有効な量で、場合により薬学的に許容可能な添加剤、担体及び／又は賦形剤と組み合わせて含む。当業者は、本発明に係る１つ以上の化合物の治療有効量が、治療しようとする感染症又は病態、その重症度、用いられる治療レジメン、使用する薬剤の薬物動態学、並びに治療される患者（動物又はヒト）によって異なり得ることを認識するであろう。
【０１５４】
本発明に係る医薬組成物を調製するため、本発明に係る化合物の１つ以上の治療有効量は、好ましくは、用量が作製されるように従来の医薬配合技法に従い薬学的に許容可能な担体と徹底的に混合される。担体は、例えば、数ある中でもとりわけ、眼球、経口、局所又は非経口、例えば、ゲル、クリーム、軟膏、ローション及び時限放出植込み型製剤など、投与に望ましい調製形態に応じて多種多様な形態をとり得る。経口剤形として医薬組成物を調製する際には、任意の通常の医薬媒体が用いられ得る。従って、懸濁液、エリキシル剤及び溶液などの液体経口製剤には、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤などを含めた好適な担体及び添加剤が用いられ得る。散剤、錠剤、カプセルなどの固形経口製剤には、及び坐薬などの固形製剤には、デンプン、糖担体、例えばデキストロース、マンニトール、ラクトース及び関連する担体、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などを含めた好適な担体及び添加剤が用いられ得る。必要であれば、錠剤又はカプセルは腸溶性コーティングされてもよく、又は標準的な技法によって徐放性であってもよい。
【０１５５】
活性化合物は、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤中に、治療される患者に重大な毒性作用を引き起こすことなしに所望の徴候に治療上有効な量を患者に送達するのに十分な量で含まれる。
【０１５６】
経口組成物は、概して不活性希釈剤又は食用担体を含み得る。経口組成物はゼラチンカプセルに封入されるか又は錠剤に圧縮され得る。経口治療薬投与の目的上、活性化合物又はそのプロドラッグ誘導体は賦形剤と添合され、錠剤、トローチ、又はカプセルの形態で使用され得る。薬剤適合性を有する結合剤、及び／又は補助剤材料が組成物の一部として含まれてもよい。
【０１５７】
錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分、又は類似した性質の化合物のいずれかを含有し得る：微結晶性セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンなどの結合剤；デンプン又はラクトースなどの賦形剤、アルギン酸又はコーンスターチなどの分散剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香味料などの香味剤。投薬量単位剤形がカプセルである場合、それは、上記のタイプの材料に加えて、脂肪油などの液体担体を含有し得る。加えて、投薬量単位剤形は、投薬量単位の物理的形態を修飾する様々な他の材料、例えば、糖、シェラック、又は腸溶剤のコーティングを含有し得る。
【０１５８】
経口投与に好適な本発明の製剤は、カプセル、カシェ剤又は錠剤など、各々が所定量の活性成分を含有する個別的な単位として；散剤又は顆粒として；水性液体又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として；又は水中油型液体エマルション又は油中水型エマルションとして及びボーラスとして等、提供されてもよい。
【０１５９】
錠剤は、圧縮又は成形によって、場合により１つ以上の補助成分を伴い作製されてもよい。圧縮錠剤は、散剤又は顆粒などの自由流動形態の活性成分を、場合により結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、表面活性剤又は分散剤と混合して、好適な機械で圧縮することにより調製し得る。成形錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を好適な機械で成形することにより作製し得る。錠剤は場合によりコーティングされるか又は割線が入れられてもよく、中の活性成分の持続放出又は制御放出を提供するように製剤化されてもよい。
【０１６０】
薬学的に活性な成分のかかる持続放出又は制御放出組成物を製剤化する方法は当該技術分野において公知であり、いくつかの交付済み米国特許に記載されており、その一部としては、限定はされないが、米国特許第３，８７０，７９０号明細書；同第４，２２６，８５９号明細書；同第４，３６９，１７２号明細書；同第４，８４２，８６６号明細書及び同第５，７０５，１９０号明細書（これらの開示は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。コーティングは、化合物を腸に送達するために使用することができる（例えば、米国特許第６，６３８，５３４号明細書、同第５，５４１，１７１号明細書、同第５，２１７，７２０号明細書、及び同第６，５６９，４５７号明細書、及びこれらに引用される文献を参照のこと）。
【０１６１】
活性化合物又はその薬学的に許容可能な塩はまた、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、オブラート、チューインガムなどの構成成分として投与されてもよい。シロップは、活性化合物に加えて、甘味剤としてのスクロース又はフルクトース及び特定の保存剤、色素並びに着色料及び香味料を含有し得る。
【０１６２】
眼球、非経口、皮内、皮下、又は局所適用に使用される溶液又は懸濁液は以下の構成成分を含み得る：滅菌希釈剤、例えば注入用水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性を調整する薬剤。
【０１６３】
一実施形態において、活性化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化されたデリバリーシステムを含め、制御放出製剤など、化合物を体内からの急速な排出から保護し得る担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、及びポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）などの生分解性生体適合性ポリマーが用いられてもよい。かかる製剤の調製方法は当業者に明らかであろう。
【０１６４】
当業者は、錠剤に加えて、活性成分の持続放出又は制御放出を提供するため他の剤形を製剤化し得ることを認識するであろう。かかる剤形としては、限定はされないが、カプセル、顆粒及びジェルキャップが挙げられる。
【０１６５】
リポソーム懸濁液もまた薬学的に許容可能な担体であり得る。これは当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、リポソーム製剤は、適切な１つ又は複数の脂質を無機溶媒中に溶解し、次に溶媒を蒸発させて、容器の表面に乾燥した脂質の薄膜を残すことにより調製し得る。次に容器に活性化合物の水溶液が導入される。次に容器を手で旋回させて容器の側面から脂質材料を遊離させ、脂質凝集物を分散させると、それによりリポソーム懸濁液が形成される。当業者に周知されている他の調製方法もまた、本発明のこの態様で用いることができる。
【０１６６】
製剤は、好都合には単位投薬量剤形で提供されてもよく、従来の製薬技法によって調製されてもよい。かかる技法は、活性成分と１つ又は複数の医薬担体又は１つ又は複数の賦形剤とを会合させるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体と一様に且つ徹底的に会合させることによるか、又は固体担体を微粉化することによるか又は両方により、及び次に、必要であれば生成物を成形することにより調製される。
【０１６７】
口内における局所投与に好適な製剤及び組成物には、香味付けされた基剤、通常スクロース及びアカシア又はトラガカント中に成分を含むロゼンジ；ゼラチン及びグリセリンなどの不活性基剤、又はスクロース及びアカシア中に活性成分を含むトローチ；及び投与しようとする成分を好適な液体担体中に含む洗口剤が含まれる。
【０１６８】
皮膚への局所投与に好適な製剤は、投与しようとする成分を薬学的に許容可能な担体中に含む軟膏、クリーム、ゲル及びペーストとして提供され得る。好ましい局所デリバリーシステムは、投与しようとする成分を含有する経皮パッチである。
【０１６９】
直腸投与用の製剤は、例えばカカオ脂又はサリチル酸塩を含む好適な基剤を伴う坐薬として提供され得る。
【０１７０】
担体が固体である場合の経鼻投与に好適な製剤は、例えば２０〜５００ミクロンの範囲の粒度を有する粗末を含み、これは、嗅薬の投与方法で、即ち鼻に当てるように保持された粉末の容器から鼻道を介して急速吸入することにより投与される。担体が液体である場合の好適な製剤は、例えば鼻腔内スプレーとして又は点鼻液としての投与用液体であり、活性成分の水性又は油性溶液を含む。
【０１７１】
腟内投与に好適な製剤は、活性成分に加えて、当該技術分野において適切であることが知られているとおりの担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡又はスプレー製剤として提供され得る。
【０１７２】
非経口製剤は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は頻回用量バイアルに封入され得る。静脈内投与される場合、好ましい担体としては、例えば生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。
【０１７３】
非経口製剤については、担体は通常、滅菌水又は塩化ナトリウム水溶液を含み得るが、分散を助けるものを含めた他の成分が含まれてもよい。当然ながら、滅菌水が使用され、且つ無菌のまま維持される場合、組成物及び担体もまた滅菌されることになる。また注射用懸濁液が調製されてもよく、この場合、適切な液体担体、懸濁剤などが用いられ得る。
【０１７４】
非経口投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有し得る水性及び非水性滅菌注射溶液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液を含む。これらの製剤は、単位用量又は複数用量容器、例えば密閉されたアンプル及びバイアルで提供されてもよく、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即時調合注射溶液及び懸濁液は、これまでに記載されている種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。
【０１７５】
活性化合物の投与は連続投与（静脈内点滴）から１日数回の経口投与（例えば、Ｑ．Ｉ．Ｄ．）にまで及び得るとともに、眼内又は眼球経路を含め、数ある投与経路の中でもとりわけ、経口、局所、眼内又は眼球、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、経皮（浸透促進剤を含み得る）、頬側及び坐薬投与を含み得る。
【０１７６】
主題の治療薬の適用は局所的であってもよく、従って目的の部位に投与され得る。目的の部位に主題の組成物を提供するため、注入、カテーテルの使用、トロカール、プロジェクタイル、プルロニックゲル、ステント、持続性薬物放出ポリマー又は内部アクセスを提供する他の装置など、様々な技法を用いることができる。患者から摘出したため臓器又は組織にアクセス可能である場合、かかる臓器又は組織が主題の組成物を含有する媒体浴中に入れられてもよく、主題の組成物が臓器に塗布されてもよく、又は任意の好都合な方法で適用されてもよい。
【０１７７】
腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドは、所望の局所的又は全身性生理又は薬理効果の達成において有効な組成物の制御及び持続放出に好適な装置によって投与され得る。この方法は、薬剤の放出が所望される領域に持続放出型薬物送達システムを位置決めするステップと、薬剤を装置から所望の治療領域へと移動させるステップとを含む。
【０１７８】
腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドは、少なくとも１つの公知の他の治療剤、又は前記薬剤の薬学的に許容可能な塩と併用して利用されてもよい。併用療法に用いることのできる公知の治療剤の例としては、限定はされないが、コルチコステロイド（例えば、コルチゾン、プレドニゾン、デキサメタゾン）、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）（例えば、イブプロフェン、セレコキシブ、アスピリン、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈｉｃｉｎ）、ナプロキセン）、アルキル化剤、例えば、ブスルファン、シスプラチン、マイトマイシンＣ、及びカルボプラチン；抗有糸分裂剤、例えば、コルヒチン、ビンブラスチン、パクリタキセル、及びドセタキセル；トポＩ阻害薬、例えば、カンプトテシン及びトポテカン；トポＩＩ阻害薬、例えば、ドキソルビシン及びエトポシド；及び／又はＲＮＡ／ＤＮＡ代謝拮抗薬、例えば、５−アザシチジン、５−フルオロウラシル及びメトトレキサート；ＤＮＡ代謝拮抗薬、例えば、５−フルオロ−２’−デオキシ−ウリジン、ａｒａ−Ｃ、ヒドロキシウレア及びチオグアニン；抗体、例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）及びＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）が挙げられる。
【０１７９】
上記に詳細に挙げた成分に加えて、本発明の製剤は、問題の製剤タイプを考慮した当該技術分野における従来の他の薬剤を含み得ることが理解されなければならず、例えば、経口投与に好適なものが香味剤を含み得る。
【０１８０】
特定の医薬剤形では、プロドラッグ形態の化合物が好ましいこともある。当業者は、本化合物をプロドラッグ形態となるよう容易に修飾し、宿主生物又は患者体内の標的部位への活性化合物の送達を促進するにはどのようにすればよいかを認識しているであろう。当業者はまた、本化合物を宿主生物又は患者体内の標的部位に送達して、化合物の意図された効果を最大化するにおいて、適用可能な場合には、プロドラッグ形態の好ましい薬物動態パラメータを利用し得るであろう。
【０１８１】
好ましいプロドラッグには、水溶解度又は腸膜を介した能動輸送を増強する基が本明細書に記載される製剤の構造に付加されている誘導体が含まれる。例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８８，３１，３１８−３２２；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５；ｐｐ  １−９２；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎ．Ｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８７，３０，４５１−４５４；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌ．：Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，１９９１；ｐｐ  １１３−１９１；Ｄｉｇｅｎｉｓ，Ｇ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １９７５，２８，８６−１１２；Ｆｒｉｉｓ，Ｇ．Ｊ．；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；２  ｅｄ．；Ｏｖｅｒｓｅａｓ  Ｐｕｂｌ．：Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９６；ｐｐ  ３５１−３８５；Ｐｉｔｍａｎ，Ｉ．Ｈ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９８１，１，１８９−２１４を参照のこと。プロドラッグ形態はそれ自体活性であってもよく、又は投与後代謝されると生体内で活性治療剤を提供するようなものであってもよい。
【０１８２】
薬学的に許容可能な塩の形態は、本発明に係る医薬組成物に含めるのに好ましい化学的形態の本発明に係る化合物であり得る。
【０１８３】
本化合物又はその誘導体は、これらの薬剤のプロドラッグ形態を含め、薬学的に許容可能な塩の形態で提供されてもよい。本明細書で使用されるとき、用語の薬学的に許容可能な塩又は複合体とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し且つ正常細胞に対して限られた毒性効果を呈する本発明に係る活性化合物の適切な塩又は複合体を指す。かかる塩の非限定的な例は、とりわけ、（ａ）無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）と形成される酸付加塩、及び酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモン酸、アルギン酸、及びポリグルタミン酸などの有機酸と形成される塩；（ｂ）数ある中でもとりわけ、亜鉛、カルシウム、ナトリウム、カリウムなどの金属カチオンと形成される塩基付加塩などである。
【０１８４】
本明細書における化合物は市販されており、又は合成することができる。当業者は理解し得るとおり、本明細書の式の化合物を合成するさらなる方法が当業者には明らかであろう。加えて、様々な合成のステップを別の順番又は順序で実施して所望の化合物を得てもよい。本明細書に記載される化合物の合成において有用な合成化学変換及び保護基の方法論（保護及び脱保護）は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ．Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９９）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９９）；及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）、及びこれらの続版に記載されるものが含まれる。
【０１８５】
本発明の腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドと共に含まれ得るさらなる薬剤は、１つ以上の不斉中心を含有してもよく、従ってラセミ体及びラセミ混合物、単一エナンチオマー、個々のジアステレオマー及びジアステレオマー混合物として存在し得る。これらの化合物のかかる異性体形態は全て、本発明に明示的に含まれる。本発明の化合物はまた、複数の互変異性型で表されてもよく、そのような場合、本発明は、本明細書に記載される化合物の全ての互変異性型を明示的に含む（例えば、環系のアルキル化は複数の部位のアルキル化をもたらすことができ、本発明はかかる反応生成物の全てのを明示的に含む）。かかる化合物の全てのかかる異性体形態が、本発明に明示的に含まれる。本明細書に記載される化合物の全ての結晶形態が、本発明に明示的に含まれる。
【０１８６】
好ましい単位投薬量製剤は、投与される成分の１日用量又は単位、以上に記載されるとおりの、１日サブ用量、又はそれらの適切な割合を含有するものである。
【０１８７】
本発明の腫瘍特異的ネオ抗原ペプチド及び／又は本発明の組成物で障害又は疾患を治療するための投薬量レジメンは、疾患のタイプ、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、病態の重症度、投与経路、及び用いられる詳細な化合物を含めた種々の要因に基づく。従って、投薬量レジメンは幅広く異なり得るが、標準方法を用いて常法で決定することができる。
【０１８８】
対象に投与される量及び投薬量レジメンは、投与方法、治療される病態の性質、治療される対象の体重及び処方医師の判断など、多くの要因に依存し得る。
【０１８９】
本発明に係る治療活性を有する製剤中に含まれる化合物の量は、疾患又は病態の治療に有効な量である。一般に、剤形中における好ましい本化合物の治療有効量は、通常、使用される化合物、治療される病態又は感染及び投与経路に応じて、患者の約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／日弱〜約２．５ｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日又はそれよりかなり多い範囲であるが、この投薬量範囲の例外が本発明により企図され得る。その最も好ましい形態では、本発明に係る化合物は約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の量で投与される。化合物の投薬量は、治療される病態、詳細な化合物、及び他の臨床学的因子、例えば患者の体重及び状態並びに化合物の投与経路に依存し得る。本発明はヒト及び家畜の両方への使用に適用を有することが理解されるべきである。
【０１９０】
ヒトへの経口投与について、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量が概して十分である。
【０１９１】
薬物送達が局所的ではなく全身性である場合、この投薬量範囲は、概して患者において約０．０４未満〜約４００マイクログラム／ｃｃ血液又はそれ以上の範囲の活性化合物の有効血中レベル濃度を生じる。
【０１９２】
化合物は、好都合には、限定はされないが、単位投薬量剤形当たり０．００１〜３０００ｍｇ、好ましくは０．０５〜５００ｍｇの活性成分を含有するものを含め、任意の好適な単位投薬量剤形で投与される。１０〜２５０ｍｇの経口投薬量が通常好都合である。
【０１９３】
薬物組成物中の活性化合物の濃度は、薬物の吸収、分布、不活性化、及び排泄率並びに当業者に公知の他の要因に依存し得る。投薬量の値はまた、軽減しようとする病態の重症度によっても変わり得ることに留意すべきである。さらに、任意の特定の対象について、具体的な投薬量レジメンは個別の必要性及び組成物投与の投与者又は監督者の専門的な判断に従い時間とともに調整されなければならないこと、及び本明細書に示す濃度範囲は例示に過ぎず、特許請求される組成物の範囲又は実施を限定する意図はないことが理解されるべきである。活性成分は一度に投与されてもよく、又は複数の少量の用量に分割して種々の時間間隔で投与されてもよい。
【０１９４】
特定の実施形態において、化合物は１日１回投与される；他の実施形態では、化合物は１日２回投与される；さらに他の実施形態において、化合物は、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、７日に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、２ヶ月に１回、６ヶ月に１回、又は１年に１回投与される。投与間隔は、個々の患者の必要性に従い調整され得る。長い投与間隔には徐放製剤又はデポー製剤が用いられ得る。
【０１９５】
本発明の化合物は急性の疾患及び疾患状態の治療に使用することができ、また慢性病態の治療に使用されてもよい。特定の実施形態において、本発明の化合物は、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、又は５年、１０年、又は１５年を超える期間；又は例えば、範囲の下端が１４日〜１５年の間の任意の期間であり、且つ範囲の上端が１５日〜２０年の間である日単位、月単位又は年単位の任意の期間範囲（例えば、４週間〜１５年、６ヶ月〜２０年）にわたり投与される。ある場合には、患者の生涯にわたり本発明の化合物が投与されることが有利であり得る。好ましい実施形態において、患者は疾患又は障害の進行を確認するためモニタされ、それに従い用量が調整される。好ましい実施形態において、本発明に係る治療は、少なくとも２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、１年間、２年間、３年間、４年間、又は５年間、１０年間、１５年間、２０年間、又は対象の生涯にわたり有効である。
【０１９６】
本発明は、本明細書に記載される少なくとも１つの腫瘍特異的ネオ抗原を含有する医薬組成物を提供する。実施形態において、この医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤を含有し、これには、それ自体は組成物の投与を受ける対象に有害な免疫応答の発生を引き起こさない、且つ過度の毒性なしに投与され得る任意の医薬品が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容可能」は、哺乳動物、より詳細にはヒトでの使用について連邦政府若しくは州政府の規制当局によって承認済みであるか、又は米国薬局方、欧州薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。これらの組成物はウイルス感染症及び／又は自己免疫疾患の治療及び／又は予防に有用であり得る。
【０１９７】
薬学的に許容可能な担体、希釈剤、及び他の賦形剤に関する周到な考察が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）（これらは本明細書によって参照により援用される）に提供されている。医薬組成物の配合は投与方法に適していなければならない。実施形態において、医薬組成物はヒトへの投与に好適であり、無菌、粒子状物質不含及び／又は非発熱性であり得る。
【０１９８】
薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤としては、限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、滅菌等張緩衝水溶液、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１９９】
湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤及び芳香剤、保存剤、及び抗酸化剤もまた組成物中に存在し得る。
【０２００】
薬学的に許容可能な抗酸化剤の例としては、限定はされないが、以下が挙げられる：（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；及び（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など。
【０２０１】
実施形態において、医薬組成物は、再構成に好適な凍結乾燥粉末などの固体形態、液体溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出製剤、又は散剤で提供される。
【０２０２】
実施形態において、医薬組成物は液体形態で、例えば、医薬組成物中の活性成分の分量及び濃度を指示する密閉容器内に提供される。関連する実施形態では、液体形態の医薬組成物がハーメチックシール容器に提供される。
【０２０３】
本発明の医薬組成物を製剤化する方法は従来どおりであり、当該技術分野において周知されている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓを参照）。当業者は、所望の特性（例えば、投与経路、バイオセーフティ、及び放出プロファイル）を有する医薬組成物を容易に製剤化することができる。
【０２０４】
医薬組成物の調製方法は、活性成分と薬学的に許容可能な担体、及び場合により１つ以上の補助成分とを会合させるステップを含む。医薬組成物は、活性成分を液体担体と一様に且つ徹底的に会合させることによるか、又は固体担体を微粉化することによるか、又は両方により、及び次に、必要であれば生成物を成形することにより調製し得る。医薬組成物の調製に関するさらなる方法論が、多層剤形の調製を含め、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（９ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）（本明細書によって参照により援用される）に記載されている。
【０２０５】
経口投与に好適な医薬組成物は、カプセル、カシェ剤、丸薬、錠剤、ロゼンジ（香味付けされた基剤、通常スクロース及びアカシア又はトラガカントを使用する）、散剤、顆粒の形態であっても、或いは水性又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として、或いは水中油型又は油中水型液体エマルションとして、又はエリキシル剤又はシロップとして、又はトローチとして（ゼラチン及びグリセリンなどの不活性基剤、又はスクロース及びアカシアを使用する）及び／又は洗口剤としての形態などであってもよく、各々が、１つ又は複数の活性成分として本明細書に記載される１つ又は複数の化合物、その誘導体、又はその薬学的に許容可能な塩又はプロドラッグの所定量を含有する。活性成分はまた、ボーラス、舐剤、又はペーストとして投与されてもよい。
【０２０６】
経口投与用の固形剤形（例えば、カプセル、錠剤、丸薬、糖衣剤、散剤、顆粒など）では、活性成分は、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤、例えば、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム、及び／又は以下のいずれかと混合される：（１）充填剤又は増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／又はケイ酸；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／又はアカシアなど；（３）保湿剤、例えば、グリセロール；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム；（５）溶解抑制剤、例えば、パラフィン；（６）吸収促進剤、例えば、第４級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えば、アセチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール；（８）吸収剤、例えば、カオリン及びベントナイト粘土；（９）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの混合物；及び（１０）着色剤。カプセル、錠剤、及び丸薬の場合、医薬組成物は緩衝剤も含み得る。同様のタイプの固体組成物はまた、ソフト及びハード充填ゼラチンカプセル中における充填剤、及び賦形剤、例えばラクトース又は乳糖、並びに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して調製することもできる。
【０２０７】
錠剤は、圧縮又は成形によって、場合により１つ以上の補助成分を伴い作製されてもよい。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム又は架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤、及び／又は分散剤を使用して調製することができる。成形錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状活性成分の混合物を好適な機械で成形することにより作製し得る。
【０２０８】
錠剤、並びに糖衣剤、カプセル、丸薬、及び顆粒などの他の固形剤形は、場合により割線が入れられてもよく、又は腸溶性コーティング及び当該技術分野において周知されている他のコーティングなどのコーティング及びシェルを伴い調製されてもよい。
【０２０９】
一部の実施形態では、活性成分の効果を延ばすため、皮下又は筋肉内注射からの化合物の吸収を遅延させることが望ましい。これは、難水溶性である結晶性又は非晶質物質の液体懸濁物を使用することにより達成し得る。このとき活性成分の吸収速度はその溶解速度に依存し、次に溶解速度は結晶の大きさ及び結晶形に依存し得る。或いは、非経口投与される活性成分の吸収遅延は、化合物を油媒体中に溶解又は懸濁することにより達成される。加えて、注射用医薬剤形の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を取り入れることによりもたらされ得る。
【０２１０】
制御放出非経口組成物は、水性懸濁液、マイクロスフェア、マイクロカプセル、磁性マイクロスフェア、油剤、油懸濁液、エマルションの形態であってもよく、又は活性成分が１つ又は複数の生体適合性担体、リポソーム、ナノ粒子、インプラント又は輸液用器具に組み込まれてもよい。
【０２１１】
マイクロスフェア及び／又はマイクロカプセルの調製に使用される材料には、生分解性／生体内侵食性ポリマー、例えば、ポリグラクチン、ポリ−（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）及びポリ（乳酸）が含まれる。
【０２１２】
制御放出非経口製剤を製剤化する際に用い得る生体適合性担体には、デキストランなどの炭水化物、アルブミン、リポタンパク質又は抗体などのタンパク質が含まれる。
【０２１３】
インプラントに使用される材料は、非生分解性、例えば、ポリジメチルシロキサンであるか、又は生分解性、例えば、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）又はポリ（オルトエステル）などであり得る。
【０２１４】
実施形態において、１つ又は複数の活性成分はエアロゾルによって投与される。これは、化合物を含有する水性エアロゾル、リポソーム製剤、又は固体粒子を調製することにより達成される。非水性（例えば、フルオロカーボン噴射剤）懸濁液が用いられてもよい。医薬組成物はまた、化合物の分解をもたらし得る剪断に薬剤が曝露されることを最小限に抑え得る音波ネブライザーを使用して投与することもできる。
【０２１５】
通常、水性エアロゾルは、１つ又は複数の活性成分の水溶液又は水性懸濁液を従来の薬学的に許容可能な担体及び安定剤と共に配合することにより作製される。担体及び安定剤は特定の化合物の要件によって異なるが、典型的には、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、又はポリエチレングリコール）、無害のタンパク質、例えば、血清アルブミン、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンなどのアミノ酸、緩衝剤、塩類、糖類又は糖アルコール類を含む。エアロゾルは概して等張液から調製される。
【０２１６】
１つ又は複数の活性成分の局所投与又は経皮投与用剤形には、散剤、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入薬が含まれる。１つ又は複数の活性成分は、無菌条件下で薬学的に許容可能な担体と、及び適宜、任意の保存剤、緩衝剤、又は噴射剤と混合することができる。
【０２１７】
本発明での使用に好適な経皮パッチが、Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅｓ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，１９８９）及び米国特許第４，７４３，２４９号明細書、同第４，９０６，１６９号明細書、同第５，１９８，２２３号明細書、同第４，８１６，５４０号明細書、同第５，４２２，１１９号明細書、同第５，０２３，０８４号明細書（これらは本明細書によって参照により援用される）に開示されている。経皮パッチはまた、経陰嚢パッチを含め、当該技術分野において周知されている任意の経皮パッチであってよい。かかる経皮パッチ中の医薬組成物は、当該技術分野において周知の１つ以上の吸収促進剤又は皮膚透過促進剤を含有し得る（例えば、米国特許第４，３７９，４５４号明細書及び同第４，９７３，４６８号明細書（これらは本明細書によって参照により援用される）を参照）。本発明で使用される経皮的治療薬システムは、イオントフォレシス、拡散、又はこれらの２つの効果の併用に基づき得る。
【０２１８】
経皮パッチは、身体への１つ又は複数の活性成分の制御送達を提供するというさらなる利点を有する。かかる剤形は、１つ又は複数の活性成分を適切な媒体中に溶解又は分散させることにより作製し得る。吸収促進剤を使用して、皮膚を通じた活性成分のフラックスを増加させることもできる。かかるフラックスの速度は、律速膜を提供するか、或いは１つ又は複数の活性成分をポリマーマトリックス又はゲル中に分散させるかのいずれかによって制御し得る。
【０２１９】
かかる医薬組成物は、クリーム、軟膏、ローション、リニメント剤、ゲル、ハイドロゲル、溶液、懸濁液、スティック、スプレー、ペースト、硬膏及び他の種類の経皮薬物デリバリーシステムの形態であってもよい。この組成物はまた、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤、例えば、乳化剤、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、保湿剤、浸透促進剤、キレート剤、ゲル形成剤、軟膏基剤、香料、及び皮膚保護剤も含み得る。
【０２２０】
乳化剤の例としては、限定はされないが、天然に存在するゴム、例えばアカシアゴム又はトラガカントゴム、天然に存在するホスファチド、例えば大豆レシチン及びモノオレイン酸ソルビタン誘導体が挙げられる。
【０２２１】
抗酸化剤の例としては、限定はされないが、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸及びその誘導体、トコフェロール及びその誘導体、及びシステインが挙げられる。
【０２２２】
保存剤の例としては、限定はされないが、パラベン、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル又はプロピル及び塩化ベンザルコニウムが挙げられる。
【０２２３】
保湿剤の例としては、限定はされないが、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール及び尿素が挙げられる。
【０２２４】
浸透促進剤の例としては、限定はされないが、プロピレングリコール、ＤＭＳＯ、トリエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、２−ピロリドン及びその誘導体、テトラヒドロフルフリルアルコール、プロピレングリコール、モノラウリン酸プロピレングリコール又はラウリン酸メチルを含むジエチレングリコールモノエチル又はモノメチルエーテル、ユーカリプトール、レシチン、Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ（登録商標）、及びＡｚｏｎｅ（登録商標）が挙げられる。
【０２２５】
キレート剤の例としては、限定はされないが、ＥＤＴＡナトリウム、クエン酸及びリン酸が挙げられる。
【０２２６】
ゲル形成剤の例としては、限定はされないが、カルボポール、セルロース誘導体、ベントナイト、アルギン酸塩、ゼラチン及びポリビニルピロリドンが挙げられる。
【０２２７】
１つ又は複数の活性成分に加えて、本発明の軟膏、ペースト、クリーム、及びゲルは、賦形剤、例えば、動物性及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、又はこれらの混合物を含有し得る。
【０２２８】
散剤及びスプレーは、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物を含有し得る。スプレーは、従来の噴射剤、例えばクロロフルオロ炭化水素、及び揮発性非置換炭化水素、例えばブタン及びプロパンをさらに含有し得る。
【０２２９】
注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に本発明の１つ又は複数の化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより作製される。化合物とポリマーの比率、及び用いられる特定のポリマーの性質に応じて、化合物の放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤はまた、生体組織と適合性のあるリポソーム又はマイクロエマルション中に薬物を封入することによっても調製される。
【０２３０】
皮下インプラントは当該技術分野において周知されており、本発明での使用に好適である。皮下植え込み方法は、好ましくは非刺激性で、機械的に弾性がある。インプラントは、マトリックスタイプ、リザーバタイプ、又はそれらのハイブリッドであってもよい。マトリックスタイプの装置において、担体材料は多孔質又は非多孔質、固体又は半固体、及び１つ又は複数の活性化合物に対して透過性又は不透過性であってもよい。担体材料は生分解性であってもよく、又は投与後にゆっくりと侵食し得る。場合によっては、マトリックスは非分解性であって、しかし代わりに担体材料が分解するマトリックスを通じた活性化合物の拡散に頼る。代替的な皮下インプラント方法はリザーバ装置を利用し、ここでは１つ又は複数の活性化合物が律速膜、例えば、成分濃度と無関係な（ゼロ次動態を有する）膜に取り囲まれている。律速膜に取り囲まれたマトリックスからなる装置もまた使用に好適である。
【０２３１】
リザーバタイプ及びマトリックスタイプの両方の装置とも、ポリジメチルシロキサン、例えばＳｉｌａｓｔｉｃ（商標）、又は他のシリコーンゴムなどを含有し得る。マトリックス材料は、不溶性ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、エチルビニルアセテート、ポリスチレン及びポリメタクリレート、並びにパルミトステアリン酸グリセロール、ステアリン酸グリセロール、及びベヘン酸グリセロールタイプのグリセロールエステルであってもよい。材料は疎水性又は親水性ポリマーであってもよく、場合により可溶化剤を含有する。
【０２３２】
皮下インプラント装置は、例えば米国特許第５，０３５，８９１号明細書及び同第４，２１０，６４４号明細書（これらは本明細書によって参照により援用される）に記載されるとおりの、任意の好適なポリマーで作製された遅延放出カプセルであってもよい。
【０２３３】
一般には、放出の律速及び薬物化合物の皮膚透過を提供するために、少なくとも４つの異なる手法を適用することが可能である。これらの手法は以下である：膜による抑制システム、接着拡散制御システム、マトリックス分散型システム及びマイクロリザーバシステム。制御放出性の経皮及び／又は局所組成物は、これらの手法を好適に取り合わせることにより達成し得ることが理解される。
【０２３４】
膜による抑制システムでは、活性成分は、金属プラスチックラミネートなどの薬物不透過性ラミネートから成形された浅いコンパートメントと、微孔性又は非多孔質高分子膜、例えばエチレン−酢酸ビニル共重合体などの律速高分子膜とに完全にカプセル化されたリザーバ中に存在する。活性成分は律速高分子膜を通って放出される。薬物リザーバでは、活性成分は固体ポリマーマトリックス中に分散しているか、又はシリコーン液などの浸出不可能な粘稠液体媒体中に懸濁されているかのいずれかであり得る。高分子膜の外表面に接着性ポリマーの薄層が貼り付けられており、この経皮システムと皮膚表面との密着した接触を実現する。接着性ポリマーは、好ましくは、低アレルギー性で且つ活性薬物物質と適合性を有するポリマーである。
【０２３５】
接着拡散制御システムでは、活性成分のリザーバは、活性成分を接着性ポリマー中に直接分散させて、次に、例えば溶媒キャスティングにより、活性成分を含有する接着剤を実質的に薬物不透過性の金属プラスチック裏当てのフラットシート上に塗布して薄い薬物リザーバ層を形成することにより形成される。
【０２３６】
マトリックス分散型システムは、活性成分を親水性又は親油性ポリマーマトリックス中に実質的に均一に分散させることにより活性成分のリザーバが形成されることを特徴とする。次に薬物含有ポリマーが、実質的に十分に定義された表面積及び制御された厚さを有する円板に成形される。接着性ポリマーが周囲に沿って塗布され、円板の周りに接着剤のストリップが形成される。
【０２３７】
マイクロリザーバシステムは、リザーバシステムとマトリックス分散型システムとの組み合わせと考えることができる。この場合、活性物質のリザーバは、初めに薬物固体を水溶性ポリマーの水溶液中に懸濁し、次にこの薬物懸濁液を親油性ポリマー中に分散させて、非常に多数の浸出不可能な微小球体の薬物リザーバを形成することにより形成される。
【０２３８】
上述の制御放出、長期放出、及び持続放出組成物のいずれも、約３０分〜約１週間、約３０分〜約７２時間、約３０分〜２４時間、約３０分〜１２時間、約３０分〜６時間、約３０分〜４時間、及び約３時間〜１０時間で活性成分を放出するように製剤化することができる。実施形態において、１つ又は複数の活性成分の有効濃度は、医薬組成物を対象に投与した後、対象体内で４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、又はそれ以上持続する。
【０２３９】
投薬量
本明細書に記載される薬剤が医薬品としてヒト又は動物に投与されるとき、それらはそれ自体で投与することも、又は薬学的に許容可能な担体、賦形剤、若しくは希釈剤と組み合わせた活性成分を含有する医薬組成物として投与することもできる。
【０２４０】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベル及び投与の時間経過は、特定の患者、組成物、及び投与方法に対して、患者に毒性となることなく所望の治療応答を実現するのに有効な活性成分の量が達成されるように変えることができる。概して、本発明の薬剤又は医薬組成物は、ウイルス感染症及び／又は自己免疫疾患に関連する症状を軽減し又は消失させるのに十分な量で投与される。
【０２４１】
例示的用量範囲としては、１日０．０１ｍｇ〜２５０ｍｇ、１日０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、１日１ｍｇ〜１００ｍｇ、１日１０ｍｇ〜１００ｍｇ、１日１ｍｇ〜１０ｍｇ、及び１日０．０１ｍｇ〜１０ｍｇが挙げられる。薬剤の好ましい用量は、患者が耐容し得る、且つ重篤な又は許容できない副作用を生じない最大量である。実施形態において、薬剤は、１日体重１キログラム当たり約１０マイクログラム〜約１００ｍｇ、１日約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、又は１日約１．０ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される。
【０２４２】
実施形態において、医薬組成物は、１〜１０ｍｇの範囲の量、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｍｇの薬剤を含む。
【０２４３】
実施形態において、治療上有効な投薬量は、約０．１ｎｇ／ｍｌ乃至約５０〜１００μｇ／ｍｌの血清中薬剤濃度を生じる。医薬組成物は、典型的には１日体重１キログラム当たり約０．００１ｍｇ〜約２０００ｍｇの化合物の投薬量を提供しなければならない。例えば、ヒト患者に対する全身投与の投薬量は、１〜１０μｇ／ｋｇ、２０〜８０μｇ／ｋｇ、５〜５０μｇ／ｋｇ、７５〜１５０μｇ／ｋｇ、１００〜５００μｇ／ｋｇ、２５０〜７５０μｇ／ｋｇ、５００〜１０００μｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、５〜５０ｍｇ／ｋｇ、２５〜７５ｍｇ／ｋｇ、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００〜２５０ｍｇ／ｋｇ、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、５００〜７５０ｍｇ／ｋｇ、７５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１０００〜１５００ｍｇ／ｋｇ、１５００〜２０００ｍｇ／ｋｇの範囲、５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１５００ｍｇ／ｋｇ、又は２０００ｍｇ／ｋｇであり得る。医薬投薬量単位剤形は、投薬量単位剤形当たり約１ｍｇ〜約５０００ｍｇ、例えば約１００〜約２５００ｍｇの化合物又は必須成分の組み合わせを提供するように調製される。
【０２４４】
実施形態において、約５０ｎＭ〜約１μＭの薬剤が対象に投与される。関連する実施形態では、約５０〜１００ｎＭ、５０〜２５０ｎＭ、１００〜５００ｎＭ、２５０〜５００ｎＭ、２５０〜７５０ｎＭ、５００〜７５０ｎＭ、５００ｎＭ〜１μＭ、又は７５０ｎＭ〜１μＭの薬剤が対象に投与される。
【０２４５】
有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示を踏まえると、十分に当業者の能力の範囲内にある。概して、薬剤の効果のある又は有効な量は、初めに低用量の薬剤を投与し、次に治療対象において所望の効果（例えば、ウイルス感染症又は自己免疫疾患に関連する症状の軽減又は消失）が最小の又は許容される毒性の副作用で観察されるまで投与用量又は投薬量を漸増させることにより決定される。本発明の医薬組成物の投与に適切な用量及び投薬スケジュールを決定するために適用可能な方法は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  ２００５、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ａｎｄ  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００３及び２００５）（これらの各々が本明細書によって参照により援用される）に記載されている。
【０２４６】
併用療法
本明細書に記載される腫瘍特異的ネオ抗原ペプチド及び医薬組成物はまた、別の治療用分子と併用して投与することもできる。治療用分子は、新生物又はその症状を軽減する任意の化合物であり得る。かかる化合物の例としては、限定はされないが、化学療法剤、抗血管新生剤、チェックポイント遮断抗体又は免疫抑制を低減する他の分子などが挙げられる。
【０２４７】
腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドは、さらなる治療剤の投与前、投与中、又は投与後に投与することができる。実施形態において、腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドは、さらなる治療剤の初回投与前に投与される。実施形態において、腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドは、さらなる治療剤の初回投与後（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日又はそれ以上）に投与される。実施形態において、腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドは、さらなる治療剤の初回投与と同時に投与される。
【０２４８】
ワクチン
例示的実施形態において、本発明は、免疫原性組成物、例えば、特異的Ｔ細胞応答を生じさせる能力を有するワクチン組成物に関する。ワクチン組成物は、本明細書に記載される方法によって同定される腫瘍特異的ネオ抗原に対応する突然変異体ネオ抗原ペプチド及び突然変異体ネオ抗原ポリペプチドを含む。
【０２４９】
好適なワクチンは、好ましくは複数の腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドを含有し得る。ある実施形態では、ワクチンは、１〜１００セットのペプチド、より好ましくは１〜５０のかかるペプチド、さらにより好ましくは１０〜３０セットのペプチド、さらにより好ましくは１５〜２５のペプチドを含み得る。別の好ましい実施形態によれば、ワクチンは、約２０個のペプチド、より好ましくは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個の異なるペプチド、さらに好ましくは６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個の異なるペプチド、及び最も好ましくは１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個の異なるペプチドを含み得る。
【０２５０】
本発明の一実施形態において、異なる腫瘍特異的ネオ抗原ペプチド及び／又はポリペプチドは、新生物ワクチン中に使用するために、患者の新生物／腫瘍に対する免疫攻撃が生じる可能性が最大となるように選択される。理論によって拘束されるものではないが、多様な腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドを含めると、新生物／腫瘍に対して幅広いスケールの免疫攻撃が生じ得ると考えられる。一実施形態において、選択された腫瘍特異的ネオ抗原ペプチド／ポリペプチドはミスセンス突然変異によりコードされる。第２の実施形態において、選択された腫瘍特異的ネオ抗原ペプチド／ポリペプチドはミスセンス突然変異とネオＯＲＦ突然変異との組み合わせによりコードされる。第３の実施形態において、選択された腫瘍特異的ネオ抗原ペプチド／ポリペプチドはネオＯＲＦ突然変異によりコードされる。
【０２５１】
選択された腫瘍特異的ネオ抗原ペプチド／ポリペプチドがミスセンス突然変異によりコードされる一実施形態において、ペプチド及び／又はポリペプチドは、患者の特定のＭＨＣ分子と会合するその能力に基づき選択される。ネオＯＲＦ突然変異から誘導されるペプチド／ポリペプチドもまた、患者の特定のＭＨＣ分子と会合するその能力に基づき選択され得るが、また患者の特定のＭＨＣ分子と会合しないと予測される場合であっても選択することができる。
【０２５２】
ワクチン組成物は、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答及び／又は特異的なヘルパーＴ細胞応答を生じさせる能力を有する。
【０２５３】
ワクチン組成物はアジュバント及び／又は担体をさらに含み得る。有用なアジュバント及び担体の例を以下に提供する。組成物中のペプチド及び／又はポリペプチドは、担体、例えば、ペプチドをＴ細胞に提示する能力を有するタンパク質又は例えば樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞と会合することができる。
【０２５４】
アジュバントは、ワクチン組成物に混合すると突然変異体ペプチドに対する免疫応答が増加するか又は他の形で修飾される任意の物質である。担体は、ネオ抗原ペプチドを会合させることが可能な足場構造、例えばポリペプチド又は多糖である。場合により、アジュバントは本発明のペプチド又はポリペプチドと共有結合的又は非共有結合的にコンジュゲートする。
【０２５５】
抗原に対する免疫応答を増加させるアジュバントの能力は、典型的には免疫介在性応答の顕著な増加、又は疾患症状の低減に現れる。例えば、体液性免疫の増加は、典型的には抗原に対して生じる抗体の力価の顕著な増加に現れ、Ｔ細胞活性の増加は、典型的には細胞増殖、又は細胞傷害性、又はサイトカイン分泌の増加に現れる。アジュバントはまた、例えば、一次体液性応答又はＴｈ２応答を一次細胞性応答又はＴｈ１応答に変化させることにより免疫応答も変え得る。
【０２５６】
好適なアジュバントとしては、限定はされないが、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ  ＩＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ  １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌ．ＲＴＭ．ベクター系、ＰＬＧマイクロパーティクル、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、βグルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニンに由来するＡｑｕｉｌａ社のＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．，米国）、マイコバクテリア抽出物及び合成細菌細胞壁模倣体、及び他の専売アジュバント、例えば、ＲｉｂｉのＤｅｔｏｘ、Ｑｕｉｌ又はＳｕｐｅｒｆｏｓが挙げられる。樹状細胞に特異的ないくつかの免疫学的アジュバント（例えば、ＭＦ５９）及びそれらの製剤が以前記載されている（Ｄｕｐｕｉｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１８６（１）：１８−２７；Ａｌｌｉｓｏｎ  Ａ  Ｃ；Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ．１９９８；９２：３−１１）。また、サイトカインを使用してもよい。いくつかのサイトカインが、リンパ組織への樹状細胞遊走に影響を及ぼすこと（例えば、ＴＮＦ−α）、Ｔリンパ球に効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を加速させること（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１及びＩＬ−４）（米国特許第５，８４９，５８９号明細書（具体的に全体として参照により本明細書に援用される））及び免疫アジュバントとして働くこと（例えば、ＩＬ−１２）と直接関係付けられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  Ｄ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６（６）：４１４−４１８）。
【０２５７】
トール様受容体（ＴＬＲ）もまたアジュバントとして使用することができ、これは、「病原体関連分子パターン」（ＰＡＭＰｓ）と称される多くの微生物が共有する保存モチーフを認識するパターン認識受容体（ＰＲＲ）のファミリーの重要なメンバーである。これらの「危険シグナル」の認識により、自然及び適応免疫系の複数の要素が活性化する。ＴＬＲは、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、Ｔ及びＢ細胞、マスト細胞、及び顆粒球などの自然及び適応免疫系の細胞により発現され、細胞膜、リソソーム、エンドソーム、及びエンドリソソームなどの種々の細胞内コンパートメントに局在する。異なるＴＬＲは別のＰＡＭＰｓを認識する。例えば、ＴＬＲ４は、細菌細胞壁に含まれるＬＰＳによって活性化され、ＴＬＲ９は、非メチル化細菌又はウイルスＣｐＧ  ＤＮＡによって活性化され、及びＴＬＲ３は、二本鎖ＲＮＡによって活性化される。ＴＬＲリガンド結合は１つ以上の細胞内シグナル伝達経路の活性化を引き起こし、最終的に炎症及び免疫に関連する多くの主要分子（特に転写因子ＮＦ−κＢ及びＩ型インターフェロン）の産生をもたらす。ＴＬＲ介在性ＤＣ活性化は、ＤＣ活性化の増進、食作用、活性化及び共刺激マーカー、例えばＣＤ８０、ＣＤ８３、及びＣＤ８６の上方制御、流入領域リンパ節へのＤＣの遊走を可能にし且つＴ細胞に対する抗原提示を促進するＣＣＲ７の発現、並びにＩ型インターフェロン、ＩＬ−１２、及びＩＬ−６などのサイトカインの分泌増加を引き起こす。これらの下流イベントは全て、適応免疫応答の誘導に決定的に重要である。
【０２５８】
現在臨床開発中の最も有望な癌ワクチンアジュバントの中には、ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ及び合成二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ＴＬＲ３リガンドポリＩＣＬＣがある。前臨床試験では、ポリＩＣＬＣが、ＬＰＳ及びＣｐＧと比較したとき、炎症誘発性サイトカインのその誘導及びＩＬ−１０の刺激の欠如、並びにＤＣにおける高レベルの共刺激分子の維持に起因して最も効力のあるＴＬＲアジュバントであるものと見られる。さらに、ポリＩＣＬＣは、最近、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６カプソマーからなるタンパク質ワクチンのアジュバントとして非ヒト霊長類（アカゲザル）においてＣｐＧと直接比較された（Ｓｔａｈｌ−Ｈｅｎｎｉｇ  Ｃ，Ｅｉｓｅｎｂｌａｔｔｅｒ  Ｍ，Ｊａｓｎｙ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．「合成二本鎖ＲＮＡはアカゲザルにおいてヒトパピローマウイルスに対するＴヘルパー１及び体液性免疫応答を誘導するためのアジュバントである（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡｓ  ａｒｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  １  ａｎｄ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）」．ＰＬｏＳ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ａｐｒ  ２００９；５（４））。
【０２５９】
ＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドもまた、ワクチンセッティングでアジュバントの効果を増強することが報告されている。理論によって拘束されるものではないが、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、主としてＴＬＲ９を介して自然（非適応）免疫系を活性化させることにより作用する。ＣｐＧにより惹起されたＴＬＲ９活性化は、ペプチド又はタンパク質抗原、生ウイルス又は死滅ウイルス、樹状細胞ワクチン、自己細胞ワクチン、並びに予防ワクチン及び治療ワクチンの両方の中の多糖コンジュゲートを含めた多様な抗原に対する抗原特異的体液性及び細胞性応答を増強する。さらに重要なことには、これは樹状細胞成熟及び分化を増強し、ＣＤ４  Ｔ細胞ヘルプがない場合であっても、Ｔｈｌ細胞の活性化の増進及び強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）生成をもたらす。ＴＬＲ９刺激によって誘導されるＴｈｌバイアスは、通常Ｔｈ２バイアスを促進するミョウバン又は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）などのワクチンアジュバントの存在下であっても維持される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、他のアジュバントと共に、又は抗原が比較的弱い場合に強力な応答を誘導するために特に必要な製剤、例えばマイクロパーティクル、ナノ粒子、脂質エマルション又は同様の製剤中にあって製剤化又は共投与されるとき、さらに高いアジュバント活性を示す。ＣｐＧオリゴヌクレオチドはまた、免疫応答を加速させ、いくつかの実験におけるＣｐＧを含まない完全用量ワクチンに対する応答と同等の抗体応答で、抗原用量を約２桁低減することも可能にする（Ａｒｔｈｕｒ  Ｍ．Ｋｒｉｅｇ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，５，Ｊｕｎ．２００６，４７１−４８４）。米国特許第６，４０６，７０５  Ｂ１号明細書は、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバント及び抗原の併用により抗原特異的免疫応答が誘導されることを記載している。市販のＣｐＧ  ＴＬＲ９アンタゴニストはＭｏｌｏｇｅｎ（Ｂｅｒｌｉｎ、独国）によるｄＳＬＩＭ（ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔｅｍ  Ｌｏｏｐ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ：二重ステムループ免疫調節薬）であり、これは本発明の医薬組成物の好ましい成分である。他のＴＬＲ結合分子、例えば、ＲＮＡ結合ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及び／又はＴＬＲ９もまた用いられ得る。
【０２６０】
キサンテノン誘導体、例えば、バジメザン又はＡｓＡ４０４（５，６−ジメチルキサンテノン（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｘａｎｔｈｅｎｏｎｅ）−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）としても知られる）などもまた、本発明の実施形態に係るアジュバントとして用いられ得る。或いは、本発明のワクチンと並行してかかる誘導体もまた例えば全身性又は腫瘍内送達を介して投与されてもよく、腫瘍部位で免疫を刺激し得る。理論によって拘束されるものではないが、かかるキサンテノン誘導体は、ＩＦＮ遺伝子（ＳＴＩＮＧ）受容体の刺激によってインターフェロン（ＩＦＮ）産生を刺激することにより作用すると考えられる（例えば、Ｃｏｎｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）「マウスＳＴＩＮＧは血管破裂剤５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸に応答して結合し及びシグナル伝達するが、ヒトＳＴＩＮＧはこれを行わない（Ｍｏｕｓｅ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  Ｈｕｍａｎ  ＳＴＩＮＧ，Ｂｉｎｄｓ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ  ５，６−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｅｎｏｎｅ−４−Ａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９０：５２１６−２５及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）「抗癌フラボノイドはマウス選択的ＳＴＩＮＧアゴニストである（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ａｒｅ  Ｍｏｕｓｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＳＴＩＮＧ  Ａｇｏｎｉｓｔｓ）」，８：１３９６−１４０１）を参照）。
【０２６１】
有用なアジュバントの他の例としては、限定はされないが、化学的に修飾されたＣｐＧ（例えばＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（例えばポリｉ：ＣＩ２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡ又はＲＮＡ並びに免疫活性小分子及び抗体、例えば、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレブレックス、ＮＣＸ−４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフィニブ（ｓｏｒａｆｉｎｉｂ）、ＸＬ−９９９、ＣＰ−５４７６３２、パゾパニブ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びＳＣ５８１７５が挙げられ、これらは治療的に及び／又はアジュバントとして作用し得る。本発明との関連において有用なアジュバント及び添加剤の量及び濃度は、当業者により必要以上に実験を行うことなく容易に決定され得る。さらなるアジュバントとしては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム）などのコロニー刺激因子が挙げられる。
【０２６２】
ポリＩＣＬＣは、約５０００ヌクレオチドの平均長さのポリＩ鎖とポリＣ鎖とからなる合成的に調製された二本鎖ＲＮＡであり、ポリリジン及びカルボキシメチルセルロースを添加することにより熱変性及び血清ヌクレアーゼによる加水分解に対して安定化されている。この化合物は、いずれもＰＡＭＰｓファミリーのメンバーであるＴＬＲ３及びＭＤＡ５のＲＮＡヘリカーゼドメインを活性化し、ＤＣ及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化並びにＩ型インターフェロン、サイトカイン、及びケモカインの「天然混合物」の産生を引き起こす。さらには、ポリＩＣＬＣは、２つのＩＦＮ誘導性核酵素系２’５’−ＯＡＳ及びＰ１／ｅＩＦ２ａキナーゼ（ＰＫＲ（４−６）としても知られる）、並びにＲＩＧ−Ｉヘリカーゼ及びＭＤＡ５によって媒介されるより直接的な、広域宿主が標的化される抗感染効果、及び場合により抗腫瘍効果を及ぼす。
【０２６３】
げっ歯類及び非ヒト霊長類において、ポリＩＣＬＣは、ウイルス抗原に対するＴ細胞応答、交差プライミング、並びに腫瘍特異的、ウイルス特異的、及び自己抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を増強することが示された。非ヒト霊長類における最近の研究では、ポリＩＣＬＣは、ＤＣ標的化又は非標的化ＨＩＶ  Ｇａｇ  ｐ２４タンパク質に対する抗体反応及びＴ細胞免疫の発生に必須であることが分かっており、ワクチンアジュバントとしてのその有効性が強調される。
【０２６４】
ヒト対象では、連続全血試料の転写解析により、ポリＩＣＬＣの１回の単回皮下投与を受けた８人の健常ヒトボランティア間で遺伝子発現プロファイルが同様であり、プラセボを受ける４人の対象に対してこれらの８人の対象間に最大２１２個の遺伝子の発現差異があることが明らかになった。顕著なことに、ポリＩＣＬＣ遺伝子発現データを、極めて有効性の高い黄熱病ワクチンＹＦ１７Ｄで免疫されたボランティアからの先行データと比較すると、多数のカノニカルな転写及びシグナル伝達経路が、自然免疫系のものを含め、同じようにピーク時点で上方制御されたことが示された。
【０２６５】
つい最近、癌精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１由来の合成オーバーラップロングペプチド（ＯＬＰ）単独によるか又はＭｏｎｔａｎｉｄｅ−ＩＳＡ−５１との併用、又は１．４ｍｇのポリＩＣＬＣ及びＭｏｎｔａｎｉｄｅとの併用による皮下ワクチン接種の第１相研究で治療された２回目又は３回目の完全臨床寛解中の卵巣癌、卵管癌、及び原発性腹膜癌患者に関する免疫学的分析が報告された。ポリＩＣＬＣ及びＭｏｎｔａｎｉｄｅを加えると、ＯＬＰ単独又はＯＬＰ及びＭｏｎｔａｎｉｄｅと比較してＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の生成及び抗体反応が顕著に増強された。
【０２６６】
本発明に係るワクチン組成物は２つ以上の異なるアジュバントを含み得る。さらに、本発明は、上記のいずれか又はそれらの組み合わせを含めた任意のアジュバント物質を含む治療組成物を包含する。また、ペプチド又はポリペプチドとアジュバントとを任意の適切な順番で別個に投与し得ることも企図される。
【０２６７】
担体は、アジュバントと独立して存在し得る。担体の機能は、例えば、安定性を付与すること、生物学的活性を増加させること、又は血清中半減期を増加させることであり得る。さらに、担体は、Ｔ細胞に対するペプチドの提示を助け得る。担体は、当業者に公知の任意の好適な担体、例えばタンパク質又は抗原提示細胞であってよい。担体タンパク質は、限定はされないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清タンパク質、例えば、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、チログロブリン又はオボアルブミン、免疫グロブリン、又はホルモン、例えば、インスリン又はパルミチン酸であってもよい。ヒトの免疫化には、担体は、ヒトにとって許容可能且つ安全な生理学的に許容可能な担体であってもよい。しかしながら、破傷風トキソイド及び／又はジフテリア（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）トキソイドが、本発明の一実施形態において好適な担体である。或いは、担体はデキストラン、例えばセファロースであってもよい。
【０２６８】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、インタクトな外来抗原それ自体というよりむしろ、ＭＨＣ分子に結合したペプチドの形態の抗原を認識する。ＭＨＣ分子それ自体は抗原提示細胞の細胞表面に位置する。従って、ＣＴＬの活性化は、ペプチド抗原、ＭＨＣ分子、及びＡＰＣの三量体複合体が存在する場合に限り可能である。それに対応して、ＣＴＬは、ＣＴＬの活性化にペプチドのみが用いられる場合でなく、さらにそれぞれのＭＨＣ分子を有するＡＰＣが加わる場合に免疫応答が増強され得る。従って、一部の実施形態では、本発明に係るワクチン組成物は少なくとも１つの抗原提示細胞をさらに含有する。
【０２６９】
抗原提示細胞（又は刺激細胞）は、典型的にはその表面上にＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子を有し、一実施形態では、それ自体はＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子に選択の抗原を負荷する能力を実質的に有しない。以下にさらに詳細に記載するとおり、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子にインビトロで選択の抗原を容易に負荷し得る。
【０２７０】
好ましくは、抗原提示細胞は樹状細胞である。好適には、樹状細胞は、ネオ抗原ペプチドでパルスした自己樹状細胞である。このペプチドは、適切なＴ細胞応答を生じさせる任意の好適なペプチドであってもよい。腫瘍関連抗原由来のペプチドでパルスした自己樹状細胞を使用するＴ細胞療法が、Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２９，３７１−３８０及びＴｊｕａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３２，２７２−２７８に開示されている。
【０２７１】
従って、本発明の一実施形態では、少なくとも１つの抗原提示細胞を含有するワクチン組成物が本発明の１つ以上のペプチドでパルスされるか又はそれを負荷される。或いは、患者から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）がエキソビボでペプチドを負荷され、患者に注入し戻されてもよい。代替例として、抗原提示細胞が、本発明のペプチドをコードする発現コンストラクトを含む。ポリヌクレオチドは任意の好適なポリヌクレオチドであってもよく、樹状細胞を形質導入する能力を有し、従ってペプチドの提示及び免疫の誘導をもたらすことが好ましい。
【０２７２】
治療法
本発明はさらに、対象において新生物／腫瘍特異的免疫応答を誘導する方法、新生物／腫瘍に対するワクチンを接種する方法、本発明のネオ抗原ペプチド又はワクチン組成物を対象に投与することにより対象における癌の症状を治療及び／又は軽減する方法を提供する。
【０２７３】
本発明によれば、上述の癌ワクチンは、癌に罹っている、又は癌を発症するリスクがあると診断された患者に用いられ得る。一実施形態において、患者は、固形腫瘍、例えば、乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、胃、結腸、精巣、頭頸部、膵臓、脳、メラノーマ、及び組織器官の他の腫瘍及び血液腫瘍、例えばリンパ腫及び白血病、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ性白血病、及びＢ細胞リンパ腫を有し得る。
【０２７４】
本発明のペプチド又は組成物は、ＣＴＬ応答を誘導するのに十分な量で投与される。
【０２７５】
本発明のネオ抗原ペプチド、ポリペプチド又はワクチン組成物は、単独で、又は他の治療剤との組み合わせで投与することができる。治療剤は、例えば、化学療法剤又は生物療法剤、放射線、又は免疫療法である。特定の癌について任意の好適な治療処置が投与され得る。化学療法剤又は生物療法剤の例としては、限定はされないが、アルデスロイキン、アルトレタミン、アミホスチン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クラドリビン、シサプリド、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロナビノール、エポエチンアルファ、エトポシド、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、グラニセトロン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、インターフェロンα、イリノテカン、ランソプラゾール、レバミゾール、ロイコボリン、メゲストロール、メスナ、メトトレキサート、メトクロプラミド、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オメプラゾール、オンダンセトロン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ピロカルピン、プロクロロペラジン（ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｅｒａｚｉｎｅ）、リツキシマブ、タモキシフェン、タキソール、塩酸トポテカン、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン及び酒石酸ビノレルビンが挙げられる。前立腺癌治療について、抗ＣＴＬＡ−４を併用し得る好ましい化学療法剤は、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））である。
【０２７６】
加えて、対象に抗免疫抑制剤又は免疫刺激剤がさらに投与されてもよい。例えば、対象に抗ＣＴＬＡ抗体又は抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌｌがさらに投与される。抗体によるＣＴＬＡ−４又はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断は患者における癌性細胞に対する免疫応答を増強し得る。詳細には、ＣＴＬＡ−４遮断はワクチン接種プロトコルに従うとき有効であることが示されている（Ｈｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００５）。
【０２７７】
ワクチン組成物に含める各ペプチドの最適量及び最適投与レジメンは、当業者により必要以上に実験を行うことなく決定され得る。例えば、ペプチド又はその変異体は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射用に調製され得る。ペプチド注入の好ましい方法には、ｓ．ｃ、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、及びｉ．ｖが含まれる。ＤＮＡ注入の好ましい方法には、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ、ｉ．ｐ．及びｉ．ｖが含まれる。例えば、１〜５００ｍｇ、５０μｇ〜１．５ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜５００μｇのペプチド又はＤＮＡの用量が投与されてもよく、それぞれのペプチド又はＤＮＡに依存し得る。この範囲の用量は、過去の試験で使用が成功した（Ｂｒｕｎｓｖｉｇ  Ｐ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００６；５５（１２）：１５５３−１５６４；Ｍ．Ｓｔａｅｈｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＳＣＯ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ２００７；Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ  ３０１７）。ワクチン組成物の他の投与方法は当業者に公知である。
【０２７８】
本発明の医薬組成物は、組成物中に存在するペプチドの選択、数及び／又は量が組織、癌、及び／又は患者特異的となるように作ることができる。例えば、ペプチドの正確な選択は、副作用を回避するように所与の組織における親タンパク質の発現パターンを指針とし得る。選択は、癌の具体的なタイプ、疾患の状態、以前の治療レジメン、患者の免疫状態、及び当然ながら、患者のＨＬＡ−ハプロタイプに依存し得る。さらに、本発明に係るワクチンは、特定の患者の個人的な必要性に従い、個人に合わせた成分を含有し得る。例として、特定の患者における関連するネオ抗原の発現、個人的なアレルギー又は他の治療に起因する望ましくない副作用、及び初回治療ラウンド又はスキーム後の二次治療の調整に従いペプチドの量を変えることが挙げられる。
【０２７９】
本発明のペプチドを含む医薬組成物は、既に癌に罹患している個体に投与され得る。治療上の適用では、組成物は、腫瘍抗原に対する有効なＣＴＬ応答を誘発し且つ症状及び／又は合併症を治癒し又は少なくとも部分的に止めるのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療有効用量」として定義される。この用途に有効な量は、例えば、ペプチド組成物、投与方法、治療される疾患の病期及び重症度、患者の体重及び全般的な健康状態、並びに処方医師の判断に依存し得るが、概して（治療的又は予防的投与のための）初回免疫化について、７０ｋｇの患者に対し約１．０μｇ〜約５０，０００μｇのペプチドの範囲であり、ブースト投薬量が続き、又は約１．０μｇ〜約１０，０００μｇのペプチドの範囲であり、患者の反応及び状態に応じて、及び場合により患者の血中の特定のＣＴＬ活性を計測することにより、数週間乃至数ヶ月間にわたりブーストレジメンが続く。本発明のペプチド及び組成物は、概して重篤な病状、即ち生命を脅かす又は潜在的に生命を脅かす状況、特に癌が転移している場合に用いられ得ることに留意しなければならない。治療用途では、腫瘍の検出又は外科的切除後可能な限り早期に投与を開始しなければならない。この後、少なくとも症状が実質的に寛解するまで、及びその後の期間にわたり、ブースト用量が続く。
【０２８０】
治療処置用の医薬組成物（例えば、ワクチン組成物）は、非経口、局所、経鼻、経口又は局所投与用であることが意図される。好ましくは、医薬組成物は非経口的に、例えば、静脈内、皮下、皮内、又は筋肉内に投与される。組成物は、腫瘍に対する局所的免疫応答を誘導するため外科的切除部位に投与されてもよい。本発明は、ペプチドの溶液を含む非経口投与用の組成物を提供し、ワクチン組成物は、許容可能な担体、好ましくは水性担体中に溶解又は懸濁される。種々の水性担体、例えば、水、緩衝用水、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などを使用し得る。これらの組成物は、従来の周知されている滅菌技法により滅菌され得るか、又は滅菌ろ過され得る。得られた水溶液はそのまま使用するために包装されるか、又は凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌溶液と組み合わされる。組成物は、生理学的条件を近似するため必要に応じて薬学的に許容可能な補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン等を含有し得る。
【０２８１】
医薬製剤中における本発明のペプチドの濃度は幅広く異なり、即ち、重量単位で通常約０．１％未満から少なくとも約２％乃至２０％〜５０％又はそれ以上にまで至り、選択される詳細な投与方法に従い、主として流体容積、粘度等により選択され得る。
【０２８２】
ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、とりわけ、投与方法、送達されるペプチド、及び治療される疾患ステージにより異なる用量で、静脈内投与、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）投与、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）投与等され得る。免疫細胞に標的化するため、リガンド、例えば所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体又はその断片などをリポソームに組み込むことができる。
【０２８３】
固体組成物には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む従来の又はナノ粒子の非毒性固体担体を使用することができる。経口投与に関して、薬学的に許容可能な非毒性組成物は、通常用いられる賦形剤、例えば既に列挙した担体のいずれか、及び略１０〜９５％の活性成分、即ち本発明の１つ以上のペプチドを、より好ましくは２５％〜７５％の濃度で添合することにより形成される。
【０２８４】
エアロゾル投与には、免疫原性ペプチドは好ましくは界面活性剤及び噴射剤と共に微粉化した形態で提供される。ペプチドの典型的な割合は重量単位で０．０１％〜２０％、好ましくは１％〜１０％である。界面活性剤は当然ながら非毒性であり、好ましくは噴射剤に対して可溶性である。かかる薬剤の代表例は、６〜２２個の炭素原子を含有する脂肪酸、例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリック酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ）及びオレイン酸などと脂肪族多価アルコール又はその環状無水物とのエステル又は部分エステルである。混合エステル、例えば混合又は天然グリセリドが用いられてもよい。界面活性剤は重量単位で組成物の０．１％〜２０％、好ましくは０．２５〜５％を占め得る。組成物の残りは通常の噴射剤である。例えば鼻腔内送達に対するレシチンのように、担体もまた必要に応じて含まれ得る。
【０２８５】
本発明のペプチド及びポリペプチドは、細菌又は動物性物質を含有しない試薬を利用して容易に化学的に合成することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ＲＢ：「固相ペプチド合成Ｉ．テトラペプチドの合成（Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ）」．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４，１９６３）。
【０２８６】
治療又は免疫化のため、本発明のペプチドをコードする核酸及び場合により本明細書に記載されるペプチドの１つ以上が患者に投与されてもまたよい。核酸を患者に送達するため、多くの方法が好都合に用いられている。例えば、核酸を「ネイキッドＤＮＡ」として直接送達することができる。この手法は、例えば、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８（１９９０）並びに米国特許第５，５８０，８５９号明細書及び同第５，５８９，４６６号明細書に記載されている。核酸はまた、例えば米国特許第５，２０４，２５３号明細書に記載されるとおりのバリスティックデリバリーを用いて投与されてもよい。ＤＮＡ単独で構成される粒子が投与されてもよい。或いは、ＤＮＡは、金粒子などの粒子に接着させてもよい。
【０２８７】
また、カチオン性化合物、例えばカチオン性脂質に複合体化した核酸を送達することもできる。脂質媒介性遺伝子デリバリー方法が、例えば、国際公開第１９９６／１８３７２号パンフレット；国際公開第１９９３／２４６４０号パンフレット；Ｍａｎｎｉｎｏ  ＆  Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６（７）：６８２−６９１（１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号明細書；国際公開第１９９１／０６３０９号パンフレット；及びＦｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１４（１９８７）に記載されている。
【０２８８】
目的のペプチドをコードするＲＮＡもまた送達に使用することができる（例えば、Ｋｉｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１１を参照）。
【０２８９】
本発明のペプチド及びポリペプチドはまた、ワクシニア又は鶏痘などの弱毒化ウイルス宿主により発現させることもできる。この手法には、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとしてのワクシニアウイルスの使用が関わる。急性的又は慢性的に感染させた宿主又は非感染宿主に導入すると、組換えワクシニアウイルスが免疫原性ペプチドを発現し、従って宿主ＣＴＬ応答を誘発する。免疫化プロトコルにおいて有用なワクシニアベクター及び方法が、例えば米国特許第４，７２２，８４８号明細書に記載される。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４５６−４６０（１９９１））に記載されている。本発明のペプチドの治療投与又は免疫化に有用な多種多様な他のベクター、例えばサルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクターなどが、当業者には本明細書の記載から明らかであろう。
【０２９０】
本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段では、複数のエピトープをコードするミニ遺伝子コンストラクトが用いられる。ヒト細胞での発現用に選択されたＣＴＬエピトープをコードするＤＮＡ配列（ミニ遺伝子）を作成するため、エピトープのアミノ酸配列が逆翻訳される。各アミノ酸のコドン選択の指針とするためヒトコドン使用頻度表を使用する。エピトープをコードするこれらのＤＮＡ配列は直接隣接しており、連続的なポリペプチド配列を作り出す。発現及び／又は免疫原性を最適化するため、ミニ遺伝子設計にさらなるエレメントを組み込んでもよい。逆翻訳され、且つミニ遺伝子配列に含めることのできるアミノ酸配列の例としては、以下が挙げられる：ヘルパーＴリンパ球、エピトープ、リーダー（シグナル）配列、及び小胞体保留シグナル。加えて、ＣＴＬエピトープに隣接する合成の（例えばポリアラニン）又は天然に存在するフランキング配列を含めることにより、ＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示を向上させ得る。
【０２９１】
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖及びマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドをアセンブルすることによりＤＮＡに変換される。オーバーラップオリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）が、周知の技法を用いて適切な条件下で合成され、リン酸化され、精製され及びアニールされる。オリゴヌクレオチドの末端は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用してつなぎ合わされる。ＣＴＬエピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子は、次に所望の発現ベクターにクローニングされ得る。
【０２９２】
標的細胞における発現を確実にするため、当業者に周知の標準的な調節配列がベクターに含められる。いくつかのベクターエレメントが必要である：ミニ遺伝子挿入のための下流クローニング部位を含むプロモーター；効率的な転写終結のためのポリアデニル化シグナル；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点；及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）選択可能マーカー（例えばアンピシリン又はカナマイシン耐性）。この目的のため数多くのプロモーター、例えばヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターを使用することができる。他の好適なプロモーター配列に関しては、米国特許第５，５８０，８５９号明細書及び同第５，５８９，４６６号明細書を参照のこと。
【０２９３】
ミニ遺伝子発現及び免疫原性を最適化するため、さらなるベクター修飾が望ましいこともある。ある場合には、効率的な遺伝子発現のためイントロンが必要であり、１つ以上の合成の又は天然に存在するイントロンがミニ遺伝子の転写領域に組み込まれ得る。ミニ遺伝子発現を増加させるため、ｍＲＮＡ安定化配列を含めることもまた考えられ得る。最近、免疫刺激配列（ＩＳＳ又はＣｐＧ）がＤＮＡワクチンの免疫原性において役割を果たすことが提唱されている。これらの配列は、免疫原性を増強させることが見出された場合には、ベクター中、ミニ遺伝子コード配列の外側に含められ得る。
【０２９４】
一部の実施形態では、ミニ遺伝子によりコードされるエピトープと、免疫原性を増強又は低下させるために含められる第２のタンパク質との産生を可能にするバイシストロニック発現ベクターを使用することができる。有利には共発現した場合に免疫応答を増強し得るタンパク質又はポリペプチドの例には、サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えばＬｅＩＦ）又は副刺激分子が含まれる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープを細胞内標的シグナルにつなぎ合わせ、ＣＴＬエピトープと別個に発現させてもよい。これは、ＣＴＬエピトープと異なる細胞コンパートメントへのＨＴＬエピトープの誘導を可能にし得る。必要であれば、これはＭＨＣクラスＩＩ経路へのＨＴＬエピトープのより効率的な侵入、従ってＣＴＬ誘導の向上を促進し得る。ＣＴＬ誘導と対照的に、免疫抑制分子（例えばＴＧＦ−β）の共発現により免疫応答を特に低下させることが、特定の疾患においては有益であり得る。
【０２９５】
発現ベクターが選択された後、ミニ遺伝子はプロモーターの下流のポリリンカー領域にクローニングされる。このプラスミドは適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に形質転換され、標準的な技法を用いてＤＮＡが調製される。ミニ遺伝子並びにベクター中に含まれる他の全てのエレメントの向き及びＤＮＡ配列は、制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列解析を用いて確認される。正しいプラスミドを有する細菌細胞をマスターセルバンク及びワーキングセルバンクとして保存することができる。
【０２９６】
精製プラスミドＤＮＡは、種々の製剤を使用して注射用に調製することができる。それらのうち最も単純なものは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中での凍結乾燥ＤＮＡの再構成である。種々方法が記載されており、新技術が利用可能になり得る。上述のとおり、核酸は好都合にはカチオン性脂質と製剤化される。加えて、糖脂質、融合性リポソーム、ペプチド及び保護性相互作用性非縮合性（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ，ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ，ｎｏｎ−ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ：ＰＩＮＣ）と総称される化合物を複合体化してプラスミドＤＮＡを精製し、安定性、筋内分散、又は特定の臓器若しくは細胞型への輸送などの変数に影響を与えることもできる。
【０２９７】
標的細胞感作を、ミニ遺伝子によりコードされるＣＴＬエピトープの発現及びＭＨＣクラスＩ提示に関する機能アッセイとして用いることができる。プラスミドＤＮＡが、標準的なＣＴＬクロム遊離アッセイの標的として好適な哺乳類細胞系に導入される。使用されるトランスフェクション方法は最終的な製剤に依存し得る。「ネイキッド」ＤＮＡには電気穿孔が使用されてもよく、一方、カチオン性脂質は直接的なインビトロトランスフェクションを可能にする。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドをコトランスフェクトして、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いたトランスフェクト細胞のエンリッチメントを可能にし得る。これらの細胞は、次にクロム−５１標識され、エピトープ特異的ＣＴＬ系の標的細胞として用いられる。５１  Ｃｒ遊離によって検出される細胞溶解が、ミニ遺伝子によりコードされるＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示が生じたことを示す。
【０２９８】
生体内免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ製剤の機能を試験する第２の手法である。適切なヒトＭＨＣ分子を発現するトランスジェニックマウスをＤＮＡ製剤で免疫する。用量及び投与経路は製剤に依存する（例えばＰＢＳ中ＤＮＡにはＩＭ、脂質複合体化ＤＮＡにはＩＰ）。免疫化の２１日後、脾細胞を回収し、各被験エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間にわたり再刺激する。これらのエフェクター細胞（ＣＴＬ）を、ペプチドが負荷されたクロム−５１標識標的細胞の細胞溶解に関して標準的な技法を用いてアッセイする。ミニ遺伝子によりコードされるエピトープに対応するペプチドのＭＨＣ負荷により感作された標的細胞の溶解が、ＣＴＬの生体内誘導に関するＤＮＡワクチン機能を実証する。
【０２９９】
ペプチドは、エキソビボでＣＴＬを誘発するためにも用いられ得る。得られたＣＴＬを使用して、他の従来型の治療法に応答しないか又はペプチドワクチン治療手法に応答しないであろう患者の慢性腫瘍を治療することができる。特定の腫瘍抗原に対するエキソビボＣＴＬ応答は、組織培養で患者のＣＴＬ前駆細胞（ＣＴＬｐ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）供給源及び適切なペプチドと共にインキュベートすることにより誘導される。適切なインキュベーション時間（典型的には１〜４週間）の間にＣＴＬｐが活性化され、エフェクターＣＴＬに成熟して拡大した後、細胞が患者に注入し戻され、そこでそれらがその特異的標的細胞（即ち、腫瘍細胞）を破壊する。特定の細胞傷害性Ｔ細胞の生成にインビトロ条件を最適化するため、刺激細胞の培養物は適切な無血清培地中に維持される。
【０３００】
活性させる細胞、例えば前駆ＣＤ８＋細胞と刺激細胞をインキュベートする前、刺激細胞の表面上で発現するヒトクラスＩ分子に負荷された状態となるのに十分な分量の、ある量の抗原ペプチドが刺激細胞培養物に加えられる。本発明では、ペプチドの十分な量とは、ペプチドが負荷された約２００個、及び好ましくは２００個以上のヒトクラスＩ  ＭＨＣ分子を各刺激細胞の表面上で発現させることが可能な量である。好ましくは、刺激細胞は、＞２μｇ／ｍｌのペプチドとインキュベートされる。例えば、刺激細胞は、＞３、４、５、１０、１５μｇ／ｍｌ、又はそれ以上のペプチドとインキュベートされる。
【０３０１】
次に静止細胞又は前駆ＣＤ８＋細胞は、培養下で、ＣＤ８＋細胞を活性化するのに十分な期間にわたり適切な刺激細胞と共にインキュベートされる。好ましくは、ＣＤ８＋細胞は抗原特異的様式で活性化される。静止細胞又は前駆ＣＤ８＋（エフェクター）細胞と刺激細胞との比は個体毎に異なり得るとともに、さらに、培養条件に対する個体のリンパ球の従順さ並びに疾患状態の性質及び重症度又は記載の範囲内の治療様式が用いられる他の条件などの変数に依存し得る。しかしながら、好ましくは、リンパ球：刺激細胞比は約３０：１〜３００：１の範囲である。エフェクター／刺激培養物は、治療上使用可能な又は有効な数のＣＤ８＋細胞を刺激するのに必要な時間にわたり維持され得る。
【０３０２】
インビトロでのＣＴＬ誘導には、ＡＰＣ上の対立遺伝子特異的ＭＨＣクラスＩ分子に結合しているペプチドの特異的認識が必要である。ＣＴＬの、特に一次免疫応答における刺激には、ＡＰＣ当たりの特異的ＭＨＣ／ペプチド複合体の数が決定的に重要である。細胞当たりのペプチド／ＭＨＣ複合体は少量であっても、ＣＴＬによる溶解を受け易い細胞にしたり、又は二次ＣＴＬ応答を刺激したりするには十分であるが、一次応答中のＣＴＬ前駆体（ｐＣＴＬ）の活性化を成功させるには、大幅に多い数のＭＨＣ／ペプチド複合体が必要である。細胞上の空の主要組織適合性複合体分子にペプチドを負荷することにより、一次細胞傷害性Ｔリンパ球応答の誘導が可能となる。
【０３０３】
ヒトＭＨＣ対立遺伝子毎に変異細胞系が存在するわけではないため、ＡＰＣの表面から内因性ＭＨＣ関連ペプチドを取り除き、次に得られた空のＭＨＣ分子に目的の免疫原性ペプチドを負荷する技法を用いることが有利である。形質転換されていない（非腫瘍形成性の）非感染細胞、好ましくは患者の自己細胞をＡＰＣとして使用することが、エキソビボＣＴＬ療法の開発に向けたＣＴＬ誘導プロトコルの設計に望ましい。本願は、ＡＰＣの表面から内因性ＭＨＣ関連ペプチドをストリッピングし、続いて所望のペプチドを負荷する方法を開示する。
【０３０４】
安定したＭＨＣクラスＩ分子は、以下のエレメントで形成される三量体複合体である：１）通常８〜１０残基のペプチド、２）そのａｌ及びａ２ドメインにペプチド結合部位を有する膜貫通重鎖多型タンパク質鎖、及び３）非共有結合的に会合した非多型軽鎖、ｐ２ミクログロブリン（ｐ２ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｉｉｎ）。複合体から結合したペプチドを取り除き及び／又はｐ２ミクログロブリンを解離させるとＭＨＣクラスＩ分子が非機能性になって不安定化し、急速な分解がもたらされる。ＰＢＭＣから単離される全てのＭＨＣクラスＩ分子が、それらに結合する内因性ペプチドを有する。従って、第１のステップは、ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩ分子に結合する全ての内因性ペプチドを、その分解を引き起こすことなく取り除くことであり、その後それらに外来性ペプチドを加えることができる。
【０３０５】
ＭＨＣクラスＩ分子から結合したペプチドを取り除く２つの可能な方法として、培養温度を３７℃から２６℃に一晩下げてｐ２ミクログロブリンを不安定化させること、及び弱酸処理を用いて細胞から内因性ペプチドをストリッピングすることが挙げられる。これらの方法により、それまで結合していたペプチドが細胞外環境に遊離し、新しい外来性ペプチドが空のクラスＩ分子に結合することが可能になる。低温インキュベーション方法は、外来性ペプチドをＭＨＣ複合体に効率的に結合させることが可能であるが、２６℃で一晩インキュベートする必要があり、これが細胞の代謝速度を減速させ得る。また、ＭＨＣ分子を能動的に合成しない細胞（例えば、静止ＰＢＭＣ）は、低温手順によっては多量の空の表面ＭＨＣ分子を生じない可能性もある。
【０３０６】
苛酷な酸ストリッピングには、トリフルオロ酢酸、ｐＨ２によるペプチドの抽出、又はイムノアフィニティー精製クラスＩ−ペプチド複合体の酸変性が関わる。ＡＰＣのバイアビリティー及び抗原提示にとって決定的に重要な最適な代謝状態を維持しながら内因性ペプチドを取り除くことが重要であるため、これらの方法はＣＴＬ誘導には実現不可能である。グリシン又はクエン酸リン酸緩衝液などのｐＨ３の弱酸性溶液が、内因性ペプチドの同定及び腫瘍関連Ｔ細胞エピトープの同定に用いられている。この処理は、ＭＨＣクラスＩ分子のみが不安定化する（及び関連ペプチドが遊離する）一方、ＭＨＣクラスＩＩ分子を含め、他の表面抗原はインタクトなままである点で特に有効である。最も重要なことに、弱酸性溶液による細胞の処理は細胞のバイアビリティー又は代謝状態に影響を及ぼさない。内因性ペプチドのストリッピングは４℃、２分間で行われ、且つＡＰＣは適切なペプチドが負荷された後直ちにその機能を果たすことのできる状態にあるため、弱酸処理は迅速である。この技法は、本明細書では、一次抗原特異的ＣＴＬを生じさせるペプチド特異的ＡＰＣの作製に利用される。得られるＡＰＣは、ペプチド特異的ＣＤ８＋  ＣＴＬの誘導において効率が良い。
【０３０７】
活性化ＣＤ８＋細胞は、種々の公知の方法の一つを用いて刺激細胞と効果的に分離し得る。例えば、刺激細胞、刺激細胞に負荷されたペプチド、又はＣＤ８＋細胞（又はそのセグメント）に特異的なモノクローナル抗体を利用して、その適切な相補リガンドに結合させ得る。次に抗体タグ標識分子を適切な手段、例えば周知されている免疫沈降又はイムノアッセイ方法で刺激エフェクター細胞混合物から抽出し得る。
【０３０８】
活性化ＣＤ８＋細胞の細胞傷害性の有効量は、インビトロ使用とインビボ使用との間で、並びにこれらのキラー細胞の最終的な標的である細胞の量及びタイプによって異なり得る。量はまた、患者の状態に応じても異なり、専門家によりあらゆる適切な要因を考慮して決定されなければならない。しかしながら、好ましくは、マウスで使用される約５×１０６〜５×１０７細胞と比較して、成人ヒトに対して約１×１０６〜約１×１０１２、より好ましくは約１×１０８〜約１×１０１１、さらにより好ましくは約１×１０９〜約１×１０１０の活性化ＣＤ８＋細胞が利用される。
【０３０９】
好ましくは、上記で考察したとおり、活性化ＣＤ８＋細胞は、治療しようとする個体にＣＤ８＋細胞を投与する前に細胞培養物から回収される。しかしながら、他の現行の提案される治療様式とは異なり、本方法は、非腫瘍形成性の細胞培養系を使用する点に留意することが重要である。従って、刺激細胞及び活性化ＣＤ８＋細胞の完全な分離が実現される場合、少数の刺激細胞の投与に関連することが知られる固有の危険性はなく、一方、哺乳類腫瘍促進細胞の投与は極めて危険であり得る。
【０３１０】
細胞成分を再導入する方法は当該技術分野において公知であり、Ｈｏｎｓｉｋらに対する米国特許第４，８４４，８９３号明細書及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇに対する米国特許第４，６９０，９１５号明細書に例示されるような手順が挙げられる。例えば、静脈内注入による活性化ＣＤ８＋細胞の投与が適切である。
【０３１１】
ＣＤ８＋細胞活性は、ＣＤ４＋細胞を使用して増進させてもよい。多くの免疫ベースの抗癌療法が、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔリンパ球の両方を使用して患者の腫瘍を標的化する場合に有効性が高まり得るため、腫瘍抗原に対するＣＤ４Ｔ＋細胞エピトープの同定が関心を集めている。ＣＤ４＋細胞はＣＤ８Ｔ細胞応答を増強する能力を有する。動物モデルにおける多くの研究で、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が抗腫瘍応答に関与するとき結果が良好になることが明確に実証されている（例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）「生体内での腫瘍根絶における抗原特異的Ｔヘルパー１型（ＴＨ１）及びＴｈ２細胞の個別的な役割（Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｔｙｐｅ  １（ＴＨ１）ａｎｄ  Ｔｈ２  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）」．Ｊ  Ｅｘ  Ｍｅｄ  １９０：６１７−２７を参照）。異なる種類の癌に対する治療法の開発に適用可能な普遍的なＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープが同定されている（例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０：２２１−２７を参照）。例えば、破傷風トキソイド由来のＨＬＡ−ＤＲ制限ヘルパーペプチドをメラノーマワクチンに使用して、ＣＤ４＋  Ｔ細胞が非特異的に活性化された（例えば、Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）「アジュバントセッティングにおけるメラノーマに対する２つの多ペプチドワクチンの無作為化第ＩＩ相試験の免疫学的及び臨床的結果（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｍｕｌｔｉｐｅｐｔｉｄｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｅｔｔｉｎｇ）」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３（２１）：６３８６−９５を参照）。本発明の範囲内で、かかるＣＤ４＋細胞は、その腫瘍特異性が異なる３つのレベルで適用可能であり得ることが企図される：１）普遍的ＣＤ４＋エピトープ（例えば、破傷風トキソイド）を使用してＣＤ８＋細胞を増進し得る広域レベル；２）天然の腫瘍関連ＣＤ４＋エピトープを使用してＣＤ８＋細胞を増進し得る中間的レベル；及び３）ネオ抗原ＣＤ４＋エピトープを使用してＣＤ８＋細胞を患者特異的に増進し得る患者特異的レベル。
【０３１２】
ＣＤ８＋細胞免疫はまた、ネオ抗原負荷樹状細胞（ＤＣ）ワクチンによっても生じさせ得る。ＤＣはＴ細胞免疫を惹起する強力な抗原提示細胞であり、目的の１つ以上のペプチドを例えば直接的なペプチド注入により負荷すると、癌ワクチンとして使用することができる。例えば、新しく転移性メラノーマと診断された患者が、３つのＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限ｇｐ１００メラノーマ抗原由来ペプチドに対し、ＩＬ−１２ｐ７０産生患者ＤＣワクチンを用いて、自己ペプチドでパルスしたＣＤ４０Ｌ／ＩＦＮ−ｇ活性化成熟ＤＣにより免疫化されることが示された（例えば、Ｃａｒｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）「Ｌ−１２ｐ７０産生患者ＤＣワクチンはＴｃ１分極免疫を誘発する（Ｌ−１２ｐ７０−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｐａｔｉｅｎｔ  ＤＣ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｌｉｃｉｔｓ  Ｔｃ１−ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１２３（８）：３３８３−９４及びＡｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）「ＤＣサブセット及びＴ細胞のインサイチュ調節がマウスにおいて腫瘍退縮を媒介する（Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＣ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，１（８）：１−１０を参照）。本発明の範囲内で、ネオ抗原負荷ＤＣは、合成ＴＬＲ３アゴニストのポリイノシン・ポリシチジン酸−ポリ−Ｌ−リジンカルボキシメチルセルロース（ポリＩＣＬＣ）を使用してＤＣを刺激することで調製され得ることが企図される。ポリＩＣＬＣは、ＣＤ８３及びＣＤ８６の上方制御、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンγ誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、及びＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の誘導、及び最小限のインターロイキン１０（ＩＬ−１０）産生によって評価するとき、ヒトＤＣに対する強力な個々の成熟刺激である。ＤＣは、白血球アフェレーシスによって得られる凍結末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と区別することができ、ＰＢＭＣはＦｉｃｏｌｌ勾配遠心法によって単離し、アリコートで凍結し得る。
【０３１３】
例示として、以下の７日間活性化プロトコルを使用し得る。１日目−ＰＢＭＣを解凍して組織培養フラスコにプレーティングし、組織培養インキュベーターにおいて３７℃で１〜２時間インキュベートした後、プラスチック表面に接着する単球を選択する。インキュベーション後、リンパ球を洗い流し、接着した単球をインターロイキン−４（ＩＬ−４）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下で５日間培養して未熟ＤＣに分化させる。６日目、未熟ＤＣを、ワクチンの品質に関する対照として働き、且つワクチンの免疫原性をブーストし得るキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質でパルスする。ＤＣは刺激されると成熟し、それにペプチド抗原を負荷して一晩インキュベートする。７日目、細胞を洗浄し、４〜２０×１０（６）個の細胞を含む１ｍｌアリコートで速度制御フリーザーを使用して凍結する。ＤＣを患者に注入する前に、最小限の規格に適合するようにＤＣのバッチに対するロットリリース試験を実施し得る（例えば、Ｓａｂａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）「免疫療法のための腫瘍抗原を負荷した成熟樹状細胞の調製（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ  ｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」，Ｊ．Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．Ａｕｇ  １；（７８）．ｄｏｉ：１０．３７９１／５００８５を参照のこと。
【０３１４】
ＤＣワクチンを足場システムに組み込み、患者への送達を促進し得る。ＤＣワクチンによる患者の新生物の治療処置は、宿主樹状細胞を動員する因子を装置内に放出し、抗原が放出される間にアジュバント（例えば、危険シグナル）を局所的に提供することにより常在性の未熟ＤＣを分化させ、且つ活性化された抗原負荷ＤＣのリンパ節（又は所望の作用部位）への放出を促進し、そこでＤＣがＴ細胞と相互作用して癌ネオ抗原に対する強力な細胞傷害性Ｔリンパ球応答を生じ得る生体材料システムを利用し得る。植込み型生体材料を使用して、新生物に対する強力な細胞傷害性Ｔリンパ球応答を患者特異的に生じさせてもよい。次にこの生体材料常在性樹状細胞が、生体材料からの抗原の放出に合わせた、感染を模倣する危険シグナルへのそれらの曝露により活性化され得る。活性化された樹状細胞は、次に生体材料からリンパ節に遊走し、細胞傷害性Ｔエフェクター応答を誘導する。この手法は、以前、腫瘍生検から調製したライセートを使用した前臨床試験において樹立メラノーマの退縮を引き起こすことが実証されており（例えば、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２２０９）「ＤＣサブセット及びＴ細胞のインサイチュ調節がマウスにおいて腫瘍退縮を媒介する（Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＣ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  １（８）：１−１０；Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）「インサイチュで樹状細胞をプログラムする感染模倣材料（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ−ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｔｏ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）」．Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  ８：１５１−８）、かかるワクチンは現在、ダナ・ファーバー癌研究所（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で最近開始された第Ｉ相臨床試験で試験されているところである。この手法はまた、Ｃ６ラット神経膠腫モデルを使用して、膠芽腫の退縮、並びに再燃を予防する強力な記憶応答の誘導をもたらすことも示されている２４。現在の提言では、かかる植込み型のバイオマトリックスワクチンデリバリー足場が腫瘍特異的樹状細胞活性化を増幅し及び維持する能力は、従来の皮下又は節内ワクチン投与により達成され得るものと比べてよりロバストな抗腫瘍免疫感作をもたらし得る。
【０３１５】
本発明の実施には、特に指示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技法を使用し、これらは十分に当業者の範囲内である。かかる技法は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  “Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）などの文献中に詳しく説明されている。これらの技法は本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生に適用可能であり、従って、本発明の作製及び実施において考慮され得る。詳細な実施形態に特に有用な技法を次節で考察する。
【実施例】
【０３１６】
以下の例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、及び治療方法をどのように作製及び使用するかに関する完全な開示及び説明を当業者に提供するため提示され、本発明者らが自らの発明と見なすものの範囲を限定することは意図していない。
【０３１７】
実施例１：癌ワクチン試験プロトコル
上述の組成物及び方法は、図２に示す一般的なフロープロセスに従い高リスクメラノーマ（完全切除ステージＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ及びＩＶＭ１ａ，ｂ）の１５人の患者で試験され得る。患者は、個別化された腫瘍特異的ペプチドとポリＩＣＬＣとの混合物による一連のプライミングワクチン接種を４週間の期間にわたり受け、続いて維持期の間に２回のブーストを受け得る。ワクチン接種は全て皮下送達され得る。ワクチンは、患者における安全性、忍容性、免疫応答及び臨床効果に関して、並びにワクチン作製及び適切な時間フレーム内におけるワクチン接種開始の成功の実現可能性に関して評価され得る。第１コホートは５人の患者からなり、安全性が十分に実証された後、１０人の患者のさらなるコホートが登録され得る（例えば、初回集団研究の手法を示す図３を参照）。ペプチド特異的Ｔ細胞応答に関して末梢血が広範にモニタされ、疾患再発を評価するため患者は最長２年間にわたり追跡され得る。
【０３１８】
上記に記載したとおり、動物及びヒトの両方において、免疫応答の誘導において突然変異エピトープが有効であること及び自発的腫瘍退縮又は長期生存の症例が突然変異エピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答と相関することのエビデンスが多数ある（Ｂｕｃｋｗａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ＰＫ．「「それが抗原である、ばかげている」及びヒト癌のワクチン療法の１０年にわたる他のレッスン（“Ｉｔ  ｉｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ｓ），ｓｔｕｐｉｄ”  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｏｖｅｒ  ａ  ｄｅｃａｄｅ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ）」．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０：２９６−３００（２００８）；Ｋａｒａｎｉｋａｓ  ｅｔ  ａｌ，「長期生存肺癌患者の血中においてＨＬＡ四量体で検出可能な腫瘍特異的突然変異抗原に対する細胞溶解性Ｔリンパ球の高頻度」．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：３７１８−３７２４（２００１）；Ｌｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ，「ヒトメラノーマに対する自己Ｔ細胞の応答は突然変異ネオ抗原によって支配される（Ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｓ  ｄｏｍｉｎａｔｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｎｅｏ−ａｎｔｉｇｅｎｓ）」．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０２：１６０１３（２００５））及びマウス及びヒトにおける優勢な突然変異抗原の発現の改変に対して「免疫編集」を追跡し得ること（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，「癌エクソーム解析は癌免疫編集のＴ細胞依存性機序を明らかにする（Ｃａｎｃｅｒ  ｅｘｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｔ−ｃｅｌｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ）」Ｎａｔｕｒｅ  ４８２：４００（２０１２）；ＤｕＰａｇｅ  ｅｔ  ａｌ，「腫瘍特異的抗原の発現が癌免疫編集の根底にある（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ）」Ｎａｔｕｒｅ  ４８２：４０５（２０１２）；及びＳａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，「新しく診断された膠芽腫患者の上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩペプチドワクチン接種に伴う長期無進行生存後の免疫エスケープ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｅｓｃａｐｅ  ａｆｔｅｒ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｎｔ  ＩＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗｌｙ  ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２８：４７２２−４７２９（２０１０））。
【０３１９】
次世代シーケンシングは、現在、個々の腫瘍におけるコード突然変異、最も一般的には単一アミノ酸変化（例えばミスセンス突然変異；図４Ａ）及び頻度は低いが、フレームシフト挿入／欠失／遺伝子融合、終止コドンにおけるリードスルー突然変異、及び不適切にスプライスされたイントロンの翻訳（例えば、ネオＯＲＦ；図４Ｂ）により生成されるアミノ酸の新規ストレッチなど、個別的な突然変異の存在を迅速に明らかにすることができる。ネオＯＲＦは、その配列の全体が免疫系にとって完全に新規であり、従ってウイルス性又は細菌性の外来抗原に類似しているため、免疫原として特に有益である。従って、ネオＯＲＦは：（１）腫瘍に対して高度に特異的である（即ちいかなる正常細胞においても発現がない）；（２）中枢性トレランスを迂回し、それによりネオ抗原特異的ＣＴＬの前駆体頻度を増加させることができる。例えば、最近、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に由来するペプチドで、治療的抗癌ワクチンにおいて類似の外来配列を利用する力が実証された。ウイルス性癌遺伝子Ｅ６及びＥ７に由来するＨＰＶペプチド混合物のワクチン接種を３〜４回受けた新生物発生前のウイルス誘導性疾患を有する１９人の患者の約５０％が、完全寛解を２４ヶ月以上維持した（Ｋｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，「外陰上皮内新生物に関するＨＰＶ−１６オンコプロテインに対するワクチン接種（Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＰＶ−１６  Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｖｕｌｖａｒ  Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ）」ＮＥＪＭ  ３６１：１８３８（２００９））。
【０３２０】
シーケンシング技術により、各腫瘍が、遺伝子のタンパク質コード内容を改変する複数の患者特異的突然変異を含むことが明らかになっている。かかる突然変異は、単一アミノ酸変化（ミスセンス突然変異によって引き起こされる）から、フレームシフト、終止コドンのリードスルー又はイントロン領域の翻訳（新規オープンリーディングフレーム突然変異；ネオＯＲＦ）に起因する新規アミノ酸配列の長い領域の付加にまで及ぶ改変タンパク質を作り出す。これらの突然変異タンパク質は、天然タンパク質と異なり自己トレランスの免疫抑制効果に供されないため、腫瘍に対する宿主の免疫応答にとって有用な標的である。従って、突然変異タンパク質は免疫原性である可能性が一層高く、また患者の正常細胞と比較して腫瘍細胞に対する特異性もより高い。
【０３２１】
どのミスセンス突然変異が患者のコグネイトＭＨＣ分子との強力な結合ペプチドを生じるかを予測する近年改良されたアルゴリズムを利用して、各患者に最適な突然変異エピトープ（ネオＯＲＦ及びミスセンスの両方）を代表する一組のペプチドを同定し、優先順位を付け、及び最大２０個又はそれ以上のペプチドを免疫化用に調製し得る（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，「免疫学における機械学習競争−ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの予測（Ｍａｃｈｉｎｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３７４：１（２０１１）；Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ  「ニューラルネットワークベースの方法を用いたエピトープの予測（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ）」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３７４：２６（２０１１））。約２０〜３５アミノ酸長のペプチドが合成され、なぜならこのような「長い」ペプチドは樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞において効率的なインターナリゼーション、プロセシング及び交差提示を受け、且つヒトにおいてＣＴＬを誘導することが示されているためである（Ｍｅｌｉｅｆ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ，「合成ロングペプチドワクチンによる樹立された（前）悪性疾患の免疫療法（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ（ｐｒｅ）ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｏｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ８：３５１（２００８））。
【０３２２】
強力且つ特異的な免疫原に加え、有効な免疫応答は免疫系を活性化させるために強力なアジュバントを必要とする（Ｓｐｅｉｓｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｍｅｒｏ，「癌免疫療法のための分子的に定義されたワクチン、及び防御Ｔ細胞免疫（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２：１４４（２０１０））。例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）が、自然免疫系、次には適応免疫系を有効に誘導する、微生物性及びウイルス性病原体「危険シグナル」の強力なセンサーとして登場している（Ｂｈａｒｄｗａｊ  ａｎｄ  Ｇｎｊａｔｉｃ，「ＴＬＲアゴニスト：それは良好なアジュバントか？（ＴＬＲ  ＡＧＯＮＩＳＴＳ：Ａｒｅ  Ｔｈｅｙ  Ｇｏｏｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ？）」Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．１６：３８２−３９１（２０１０））。ＴＬＲアゴニストの中でも、ポリＩＣＬＣ（合成二本鎖ＲＮＡ模倣体）は、骨髄由来樹状細胞の最も強力なアクチベータの一つである。ヒトボランティア試験において、ポリＩＣＬＣは安全で、且つ末梢血細胞において、最も強力な弱毒生ウイルスワクチンの一つである黄熱病ワクチンＹＦ−１７Ｄにより誘導されるものと同等の遺伝子発現プロファイルを誘導することが示されている（Ｃａｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ，「合成二本鎖ＲＮＡはヒトにおいて生菌ウイルスワクチンと同様の自然免疫応答を誘導する（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ａ  ｌｉｖｅ  ｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ）」Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０８：２３５７（２０１１））。Ｏｎｃｏｖｉｒ，Ｉｎｃにより調製されるポリＩＣＬＣのＧＭＰ製剤であるＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）をアジュバントとして利用し得る。
【０３２３】
実施例２：標的患者集団
ステージＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ及びＩＶＭ１ａ，ｂのメラノーマを有する患者は、疾患を完全に外科的に切除したとしても、疾患再発及び死亡のリスクが著しく高い（（Ｂａｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ，「２００９年ＡＪＣＣメラノーマ病期診断及び分類の最終版（Ｆｉｎａｌ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ２００９  ＡＪＣＣ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｓｔａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：６１９９−６２０６（２００９））。この患者集団に利用可能な全身アジュバント療法はインターフェロン−α（ＩＦＮα）であり、これは測定可能な、しかし最低限度の利益を提供し、顕著な、多くの場合に用量制限となる毒性を伴う（Ｋｉｒｋｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，「高リスク切除皮膚メラノーマのインターフェロンα−２ｂアジュバント療法：米国東海岸癌臨床試験グループ試験ＥＳＴ  １６８４（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｆａ−２ｂ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｒｉｓｋ  Ｒｅｓｅｃｔｅｄ  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｅｌａｎｏｍａ：Ｔｈｅ  Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｔｒｉａｌ  ＥＳＴ  １６８４）」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １４：７−１７（１９９６）；Ｋｉｒｋｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，「高リスクメラノーマにおける高用量及び低用量インターフェロンα−２ｂ：群間比較試験Ｅ１６９０／Ｓ９１１１／Ｃ９１９０の初回分析（Ｈｉｇｈ−  ａｎｄ  Ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｌｐｈａ−２ｂ  ｉｎ  Ｈｉｇｈ−Ｒｉｓｋ  Ｍｅｌａｎｏｍａ：Ｆｉｒｓｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｇｒｏｕｐ  Ｔｒｉａｌ  Ｅ１６９０／Ｓ９１１１／Ｃ９１９０）」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １８：２４４４−２４５８（２０００））。これらの患者は、過去の癌を標的化した治療法によるか又は活動中の癌により免疫無防備状態ではなく、従ってワクチンの安全性及び免疫学的影響を評価するための優れた患者集団に相当する。最後に、これらの患者に対する現行の標準治療は、手術後にいかなる治療も指示しないため、ワクチン製剤について８〜１０週間のウィンドウが可能となる。
【０３２４】
標的集団は、完全に切除されていて発病していない、臨床的に検出可能な組織学的に確認されたリンパ節（局所又は遠隔）又はイントランジット転移を有する皮膚メラノーマ患者であり得る（ステージＩＩＩＢの多く（シーケンシング及び細胞系発生に十分な腫瘍組織を有する必要があるため、潰瘍化した原発腫瘍であって但し微小転移リンパ節を有する患者（Ｔ１−４ｂ、Ｎ１ａ又はＮ２ａ）は除外され得る）、ステージＩＩＩＣの全て、及びステージＩＶＭ１ａ、ｂ）。これらは、初期ステージのメラノーマの初回診断患者又は前回の診断後の疾患再発患者であり得る。
【０３２５】
腫瘍摘出：患者をメラノーマに罹患していない状態にする目的で、患者がその原発性メラノーマ（まだ取り除かれていない場合）及び全ての局所転移性疾患の完全切除を受け得る。病理学的評価に十分な腫瘍が摘出された後、残りの腫瘍組織を滅菌容器内の滅菌媒体中に置き、脱凝集用に調製する。腫瘍組織の一部を使用して全エクソーム及びトランスクリプトームシーケンシング及び細胞株作成を行い、残った腫瘍は凍結し得る。
【０３２６】
正常組織摘出：全エクソームシーケンシング用に正常組織試料（血液又は喀痰試料）を採取し得る。
【０３２７】
臨床的に明らかな局所領域の転移性疾患又は完全に切除可能な遠隔リンパ節、皮膚又は肺転移性疾患を有する（しかし切除不能な遠隔又は内臓転移性疾患はない）患者を同定し、試験に組み入れ得る。メラノーマ細胞系樹立用の新鮮な腫瘍組織を得るため（それにより免疫モニタリング計画の一環としてのインビトロ細胞傷害性アッセイ用の標的細胞を作成するため）、手術前の患者の登録が必要である。
【０３２８】
実施例３：用量及びスケジュール
全ての治療前基準を満たした患者について、試験薬が到着し、受入規格に適合した後、可能な限り速やかにワクチン投与を開始し得る。各患者につき４つの別個の試験薬があり、各々が２０個の患者特異的ペプチドのうちの５個を含有し得る。免疫化は、概して図５に示すスケジュールに従い進め得る。
【０３２９】
患者は外来患者診療部で治療され得る。各治療日の免疫化は４回の１ｍｌ皮下注射からなり、リンパ系の異なる領域を標的化して抗原競合を低減するため、各注射を別々の四肢に行い得る。患者が完全腋窩又は鼠径リンパ節郭清を受けたことがある場合、ワクチンは代替として右又は左横隔膜に投与され得る。各注射は、当該患者用の４つの試験薬のうちの１つからなり、各サイクルについて同じ試験薬を同じ四肢に注射し得る。各１ｍｌ注射の組成は以下である：
５個の患者特異的ペプチドを各３００μｇずつ含有する０．７５ｍｌ試験薬
０．２５ｍｌ（０．５ｍｇ）の２ｍｇ／ｍｌポリＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））
【０３３０】
誘導期／プライミング期の間、患者は１、４、８、１５及び２２日目に免疫され得る。維持期には、患者は１２及び２４週目にブースター用量を受け得る。
【０３３１】
血液試料を複数の時点で採取し得る：前（ベースライン；異なる日の２つの試料）；プライミングワクチン接種の間の１５日目；誘導／プライミングワクチン接種後４週間（８週目）；初回ブーストの前（１２週目）及び後（１６週目）；２回目のブーストの前（２４週目）及び後（２８週目）に、各試料につき５０〜１５０ｍｌの血液を採取し得る（１６週目を除く）。一次免疫学的エンドポイントは１６週目であり、従って患者は（患者及び医師の評価に基づき特に指示されない限り）白血球アフェレーシスを受け得る。
【０３３２】
実施例４：免疫モニタリング
免疫戦略は、免疫応答を誘導するための初期の一連の密な間隔の免疫化と、続く記憶Ｔ細胞を樹立させるための休止期間とを含む「プライム−ブースト」手法である。これにブースター免疫化が続き、このブーストの４週間後のＴ細胞応答が最も強い応答を生じるものと予想され、一次免疫学的エンドポイントとなり得る。初めに大域的免疫応答が末梢血単核細胞を使用してこの時点から１８時間エキソビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、全ての免疫エピトープを含むオーバーラップ１５ｍｅｒペプチド（１１ａａオーバーラップ）のプールで刺激してモニタされ得る。このペプチドプールに対するベースライン応答を確立するため、ワクチン接種前試料を評価し得る。必要に応じてさらなるＰＢＭＣ試料を評価し、全ペプチド混合物に対する免疫応答の動態を調べ得る。ベースラインを有意に上回る応答を示す患者については、全１５ｍｅｒのプールをデコンボリューションして、どの特定の免疫ペプチドが免疫原性であったかを決定し得る。加えて、適切な試料に関して個別の場合に応じていくつかのさらなるアッセイを行い得る：
・全１５ｍｅｒプール又はサブプールを細胞内サイトカイン染色アッセイの刺激ペプチドとして使用して、抗原特異的ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、中枢記憶及びエフェクター記憶集団を同定及び定量化し得る
・同様に、これらのプールを使用してこれらの細胞により分泌されるサイトカインのパターンを評価し、ＴＨ１対ＴＨ２表現型を決定し得る
・未刺激細胞の細胞外サイトカイン染色及びフローサイトメトリーを使用してＴｒｅｇ及び骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を定量化し得る。
・応答した患者からのメラノーマ細胞系の樹立に成功し、且つ活性化エピトープを同定することができた場合、突然変異ペプチド及び対応する野生型ペプチドを使用してＴ細胞の細胞傷害性アッセイを行い得る
・一次免疫学的エンドポイントのＰＢＭＣを、図６に示されるとおり、既知のメラノーマ腫瘍関連抗原を刺激剤として使用し、且つ免疫原の中には選択されなかったいくつかのさらなる同定済みの突然変異エピトープを使用することにより、「エピトープの広がり」に関して評価し得る。
【０３３３】
腫瘍試料の免疫組織化学を行い、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＭＤＳＣ、及びＴｒｅｇ浸潤集団を定量化し得る。
【０３３４】
実施例５：転移性疾患患者における臨床的有効性
転移性疾患患者のワクチン治療は、活動中の癌に有効な治療法が必要であること、及び結果としてワクチン調製のための治療休止時間ウィンドウがなくなることによって複雑化する。さらに、これらの癌治療は、患者の免疫系を損ない、場合により免疫応答の誘導を妨げ得る。これらの考慮点を念頭に置き、ワクチン調製のタイミングが時間的に特定の患者集団に対する他の標準治療手法と適合するセッティング及び／又はかかる標準治療が確実に免疫療法手法と両立し得るセッティングが選択され得る。探究され得るセッティングには２つのタイプがある：
【０３３５】
１．チェックポイント遮断との併用：転移性メラノーマの有効な免疫療法としてチェックポイント遮断抗体が登場しており（Ｈｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ，「転移性メラノーマ患者におけるイピリムマブによる生存率の改善（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｍｅｌａｎｏｍａ）」ＮＥＪＭ  ３６３：７１１−７２３（２０１０））、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び腎細胞癌（Ｔｏｐａｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ，「癌における抗ＰＤ−１抗体の安全性、活性、及び免疫関連要因（Ｓａｆｅｔｙ，Ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ＰＤ−１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ）」ＮＥＪＭ  ３６６：２４４３−２４５４（２０１２）；Ｂｒａｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ，「進行癌患者における抗ＰＤ−Ｌ１抗体の安全性及び活性（Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ）」ＮＥＪＭ    ３６６：２４５５−２４６５（２０１２））を含めた他の疾患セッティングにおいて積極的に探究されている。作用機序は明らかになっていないが、局所免疫抑制の解除の逆転及び免疫応答の増強の両方ともに、可能な説明である。強力なワクチンを統合してチェックポイント遮断抗体による免疫応答を惹起すると、複数の動物試験で観察されているとおり、相乗作用がもたらされ得る（ｖａｎ  Ｅｌｓａｓ  ｅｔ  ａｌ  「抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）及び顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）産生ワクチンを使用したＢ１６メラノーマの併用免疫療法は、自己免疫性色素脱失を伴う皮下腫瘍及び転移性腫瘍の拒絶を誘導する」Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９０：３５−３６６（１９９９）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，「抗プログラム死１は、樹立腫瘍を有するマウスに治療利益を提供する顆粒球マクロファージコロニー刺激因子分泌腫瘍細胞免疫療法と相乗作用を及ぼす（Ａｎｔｉ−ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１  ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ  ｗｉｔｈ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｂｅｎｅｆｉｔ  ｔｏ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ）」Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：１６２３−１６３４（２００９）；Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．「癌免疫療法における免疫チェックポイントの遮断（Ｔｈｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２−２６４（２０１２）；Ｃｕｒｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．「ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４併用遮断はＢ１６メラノーマ腫瘍内の浸潤性Ｔ細胞を拡大し、調節性Ｔ細胞及び骨髄性細胞を減少させる（ＰＤ−１  ａｎｄ  ＣＴＬＡ−４  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｅｘｐａｎｄｓ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｉｎ  Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｔｕｍｏｒｓ）」．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１０  Ｍａｒ  ２；１０７（９）：４２７５−８０；Ｃｕｒｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．「ｆｌｔ３リガンドを発現する腫瘍ワクチンはｃｔｌａ−４遮断と相乗作用を及ぼして予め移植された腫瘍を拒絶する（Ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｆｌｔ３  ｌｉｇａｎｄ  ｓｙｎｅｒｇｉｚｅ  ｗｉｔｈ  ｃｔｌａ−４  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｔｏ  ｒｅｊｅｃｔ  ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ）」．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９  Ｏｃｔ  １；６９（１９）：７７４７−５５）。図７に示すとおり、ワクチンが調製されている間に患者は直ちにチェックポイント遮断治療薬を開始することができ、調製後、ワクチン投与が抗体療法と統合される；及び
【０３３６】
２．有益な免疫特性を呈する標準治療レジメンとの併用
ａ）転移性疾患を示す腎細胞癌（ＲＣＣ）患者は、典型的には外科的な減量術を受け、続いて、一般的にはスニチニブ、パゾパニブ及びソラフェニブなどの承認済みのチロシンキナーゼ阻害薬（ＴＫＩ）の一つによる全身治療を受ける。承認済みＴＫＩの中でスニチニブは、ＴＨ１応答性を増加させ、Ｔｒｅｇ及び骨髄由来サプレッサー細胞を減少させることが示されている（Ｆｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ，「スニチニブは腎細胞癌患者において１型免疫抑制を逆転させ、Ｔ調節性細胞を減少させる（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  Ｔｙｐｅ−１  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  Ｔ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ）」Ｃｌｉｎ  Ｃａｎ  Ｒｅｓ  １４：６６７４−６６８２（２００８）；Ｔｅｒｍｅ  ｅｔ  ａｌ，「ＶＥＧＦＡ−ＶＥＧＦＲ経路遮断は結腸直腸癌における腫瘍誘導性調節Ｔ細胞増殖を阻害する（ＶＥＧＦＡ−ＶＥＧＦＲ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ）」（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｕｔｈｏｒ  Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ（２１０２））。免疫系を損なわない承認済み治療薬で患者を直ちに治療可能であることにより、ワクチンの調製に必要なウィンドウが提供され、ワクチン治療薬との相乗作用がもたらされ得る。加えて、複数の動物及びヒト試験においてシクロホスファミド（ＣＴＸ）がＴｒｅｇ細胞に阻害効果を及ぼすことが示されており、且つ最近になってワクチン前の単回用量のＣＴＸが、ワクチンに応答したＲＣＣ患者の生存を改善することが示されている（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，「単回用量シクロホスファミド後の癌ワクチンＩＭＡ９０１に対する多ペプチド免疫応答は、より長い患者生存に関連する」Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８：１２５４−１２６０（２０１２））。これらの免疫相乗作用手法は両方とも、ＲＣＣ中の天然ペプチドワクチンの最近完了した第３相試験において利用されている（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ，進行性／転移性腎細胞癌に対するスニチニブの投与を受けている患者におけるＮＣＴ０１２６５９０１  ＩＭＡ９０１（ＮＣＴ０１２６５９０１  ＩＭＡ９０１  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ／Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ））；
ｂ）或いは、膠芽腫（ＧＢＭ）の標準治療には、手術、回復及びフォローアップ放射線及び低用量テモゾロミド（ＴＭＺ）、続いて４週間の休止期間の後、標準用量ＴＭＺの開始が関わる。この標準治療はワクチン調製のためのウィンドウを提供し、それにワクチン接種の開始と、その後に標準用量ＴＭＺの開始が続く。興味深いことに、転移性メラノーマにおける試験では、標準用量ＴＭＺ治療中のペプチドワクチン接種により、ワクチン接種単独と比較して計測される免疫応答性が増加したことから、さらなる相乗的利益が示唆される（Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ，「テロメラーゼペプチドワクチン接種のテモゾロミドとの併用：ステージＩＶメラノーマ患者における臨床試験（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ：ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｉｎ  ｓｔａｇｅ  ＩＶ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ）」Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：４５６８（２０１１））。
【０３３７】
実施例６：ワクチン調製
患者腫瘍組織を外科的に切除し、腫瘍組織を脱凝集して、ＤＮＡ及びＲＮＡ抽出並びに患者特異的メラノーマ細胞系の樹立に使用される一部を分離し得る。腫瘍組織から抽出されたＤＮＡ及び／又はＲＮＡを使用して全エクソームシーケンシング（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑプラットフォームを使用することによる）を行い、ＨＬＡタイピング情報を決定し得る。本発明の範囲内で、タンパク質ベースの技術（例えば、質量分析法）により、ミスセンス又はネオＯＲＦネオ抗原ペプチドを直接同定し得ることが企図される。
【０３３８】
バイオインフォマティクス解析は以下のとおり行われ得る。エクソーム及びＲＮＡ−ＳＥＱ  ｆａｓｔ  Ｑファイルの配列解析は、多くの患者試料に関するＴＣＧＡなどの大規模プロジェクトで広範に使用され及び検証されている既存のバイオインフォマティクスパイプラインを利用し得る（例えば、Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｓｔｒａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。２つの連続的な解析カテゴリー：データ処理及び癌ゲノム解析がある。
【０３３９】
データ処理パイプライン：Ｐｉｃａｒｄデータ処理パイプライン（ｐｉｃａｒｄ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）はシーケンシングプラットフォームにより開発された。各腫瘍及び正常試料について（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シーケンサーから抽出された生データがＰｉｃａｒｄパイプラインの様々なモジュールを使用して以下の処理に供される：
（ｉ）クオリティリキャリブレーション：Ｉｌｌｕｍｉｎａパイプラインにより報告される元の塩基クオリティスコアが、リードサイクル、レーン、フローセルタイル、問題の塩基、及び先行する塩基に基づきリキャリブレーションされ得る。
（ｉｉ）アラインメント：ＢＷＡ（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄｕｒｂｉｎ，２００９）を使用してリードペアがヒトゲノム（ｈｇ１９）に対してアラインメントされ得る。
（ｉｉｉ）デュプリケートのマーキング：ＰＣＲ及び光学的デュプリケートがリードペアマッピング位置に基づき同定され、最終的なｂａｍファイルにマーキングされ得る。
【０３４０】
Ｐｉｃａｒｄの出力はｂａｍファイルであり（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２００９）（ｓａｍｔｏｏｌｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ＳＡＭ１．ｐｄｆ）、これは所与の試料に関する全てのリードの塩基配列、クオリティスコア、及びアラインメントの詳細を保存する。
【０３４１】
癌突然変異検出パイプライン：Ｐｉｃａｒｄパイプラインからの腫瘍ｂａｍファイル及び対応する正常ｂａｍファイルは以下に記載するとおり解析され得る：
１．クオリティコントロール
（ｉ）試料に関して数十個の部位で行われる最初のＳＮＰフィンガープリンティングを、それらの部位におけるエクソームシーケンシングのパイルアップと比較することにより、シーケンシング中に試料のミックスアップを行い得る。
（ｉｉ）初めに腫瘍試料及び正常試料の両方について同じライブラリに対応するレーンの挿入サイズ分布を比較し、且つ異なる分布を有するレーンを捨てることにより、試料内腫瘍／正常ミックスアップを確認し得る。バイオインフォマティクス解析を腫瘍及び対応する正常エクソーム試料に適用すると、ＤＮＡコピー数プロファイルが得られ得る。腫瘍試料はまた、対応する正常試料と比べて多いコピー数変異も有するはずである。フラットなプロファイルを有しない正常試料に対応するレーンを切り捨て、これは同じ腫瘍試料由来の他のレーンと一致するプロファイルを有しない腫瘍レーンを切り捨てるのと同様である。
（ｉｉｉ）バイオインフォマティクスにより作成されたコピー数プロファイルに基づき腫瘍純度及び倍数性を推定し得る。
（ｉｖ）ＣｏｎｔＥｓｔ（Ｃｉｂｕｌｓｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）を使用して試料の交差試料汚染レベルを決定し得る。
【０３４２】
２．推定インデルの周りの局所的リアラインメント
参照ゲノムに関する真の体細胞及び生殖系列小インデルは、多くの場合にミスアラインメント並びにミスセンス突然変異及びインデルのミスコールをもたらす。これは、ＧＡＴＫ  ＩｎｄｅｌＲｅａｌｉｇｎｅｒモジュール（ワールドワイドウェブ上の（ｗｗｗ）ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇａｔｋにある）を使用して（ＭｃＫｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｄｅｐｒｉｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）、推定インデルの周辺にマッピングされる全てのリードの局所的リアラインメントを行い、それらを網羅的に評価してインデルコールの一貫性及び正しさを確保することにより修正し得る。
【０３４３】
３．体細胞性単一ヌクレオチド変異（ＳＳＮＶ）の同定
ｍｕＴｅｃｔと称されるベイズ統計のフレームワークを使用して患者の腫瘍及び対応する正常試料を分析することにより、体細胞性塩基対置換を同定し得る（Ｃｉｂｕｌｓｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。前処理ステップにおいて、圧倒的多数の低クオリティ塩基又はゲノムとのミスマッチを有するリードがフィルタリングで除かれる。次にＭｕｔｅｃｔは２つの対数オッズ（ＬＯＤ）スコアを計算し、これは、それぞれ腫瘍試料及び正常試料中における変異体の存在及び非存在の信頼度を包含（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）する。処理後段階では、候補突然変異が、キャプチャー、シーケンシング及びアラインメントのアーチファクトを説明するため様々な基準によって実験的にフィルタリングされる。例えば、かかるフィルタの一つは、突然変異を有するリードの向きの分布と遺伝子座にマッピングされるリードの全体的な向きの分布との間の一致を試験し、ストランドバイアスがないことを確実にする。次に最終的な突然変異セットを、Ｏｎｃｏｔａｔｏｒツールで、ゲノム領域、コドン、ｃＤＮＡ及びタンパク質変化を含むいくつかのフィールドによってアノテーションする。
【０３４４】
４．体細胞性の小さい挿入及び欠失の同定
セクション２．２からの局所的リアラインメント出力を使用して、それぞれ腫瘍ｂａｍ単独又は腫瘍及び正常の両方のｂａｍにおける変異体を裏付けるリードの評価に基づき候補体細胞及び生殖系列インデルを予測し得る。ミスマッチの数及び分布並びに塩基クオリティスコアに基づくさらなるフィルタリングが行われ得る（ＭｃＫｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，ＤｅＰｒｉｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。全てのインデルを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）（ワールドワイドウェブ上の（ｗｗｗ）ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｉｇｖにある）を使用して手動で調べ、高フィデリティのコールを確実にし得る。
【０３４５】
５．遺伝子融合検出
遺伝子融合検出パイプラインの最初のステップは、既知の遺伝子配列のライブラリに対する腫瘍ＲＮＡ−Ｓｅｑリードのアラインメントと、続くゲノム座標へのこのアラインメントのマッピングである。ゲノムマッピングは、エクソンを共有する異なる転写変異体にマッピングされる複数のリードペアを共通のゲノム位置に縮める助けとなる。ＤＮＡをアラインメントしたｂａｍファイルは、異なる染色体上にあるか、或いは同じ染色体上の場合少なくとも１ＭＢ離れている２つの異なるコード領域に２つのメイトがマッピングされるリードペアに関して問い合わせを受け得る。また、そのそれぞれ遺伝子においてアラインメントされるペアエンドが（推定）融合ｍＲＮＡ転写物のコーディング−−＞コーディング５’−＞３’の向きと一致する向きであることも必要となり得る。少なくとも２つのかかる「キメラ」リードペアがある遺伝子ペアのリストを、さらなる精緻化に供する最初の推定イベントリストとして列挙し得る。次に、全てのアラインメントされていないリードを、そのメイトが当初アラインメントされたという制約を加えて元のｂａｍファイルから抽出し、上記に記載したとおり得られた遺伝子ペアの遺伝子の１つにマッピングし得る。次に当初アラインメントされなかった全てのかかるリードを、発見された遺伝子ペア間の可能な全てのエクソン−エクソン接合部（完全長、境界から境界まで、コーディング５’−＞３’向き）で作られるカスタムの「参照」とアラインメントする試みが行われ得る。当初アラインメントされなかったかかるリードの一つが遺伝子Ｘのエクソンと遺伝子Ｙのエクソンとの間の接合部に（ユニークに）マッピングされ、且つそのメイトが実際に遺伝子Ｘ又はＹの一方にマッピングされた場合、かかるリードは「融合」リードとしてマークされ得る。遺伝子融合イベントは、エクソン：エクソン接合部の周りに過剰な数のミスマッチがなく、及びいずれの遺伝子においても少なくとも１０ｂｐのカバレッジで、そのメイトに対して正しい相対的向きの少なくとも１つの融合リードがある場合にコールされ得る。高度に相同の遺伝子（例えばＨＬＡファミリー）の間の遺伝子融合は誤りである可能性が高く、フィルタリングで除かれ得る。
【０３４６】
６．クロナリティーの推定
バイオインフォマティクス解析を用いて突然変異のクロナリティーを推定し得る。例えば、ＡＢＳＯＬＵＴＥアルゴリズム（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１２、Ｌａｎｄａｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）を用いて、腫瘍純度、倍数性、絶対コピー数及び突然変異のクロナリティーを推定し得る。各突然変異の対立遺伝子率の確率密度分布を作成し、続いて突然変異の癌細胞率（ＣＣＦ）に変換し得る。突然変異は、それらのＣＣＦが０．９５を超える事後確率がそれぞれ０．５より大きいか又は小さいかに基づきクローナル又はサブクローナルとして分類され得る。
【０３４７】
７．発現の定量化
ＴｏｐＨａｔスイート（Ｌａｎｇｍｅａｄ  ｅｔ  ａｌ，２００９）を使用して、ｈｇ１９ゲノムに対して腫瘍ｂａｍ及び対応する正常ｂａｍのＲＮＡ−Ｓｅｑリードをアラインメントし得る。ＲＮＡ−ＳｅＱＣ（ＤｅＬｕｃａ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）パッケージによりＲＮＡ−Ｓｅｑデータのクオリティを評価し得る。次にＲＳＥＭツール（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）を使用して遺伝子及びアイソフォーム発現レベルを推定し得る。キロベース当たりの生成されたリードの百万分率及びτ推定値を使用して、他の部分に記載されるとおりの各患者において同定されたネオ抗原に優先順位を付け得る。
【０３４８】
８．ＲＮＡ−Ｓｅｑにおける突然変異の検証
全エクソームデータの解析（セクション２．３）によって同定される突然変異を、患者の対応するＲＮＡ−Ｓｅｑ腫瘍ｂａｍファイルにおける存在に関して評価し得る。各変異体遺伝子座について、ベータ二項分布に基づく検出力計算を実施し、それをＲＮＡ−Ｓｅｑデータ中に検出する少なくとも８０％の検出力があることを確実にし得る。キャプチャーにより同定された突然変異は、適切な検出力の部位について突然変異を有するリードが少なくとも２つある場合に検証されたと見なし得る。
【０３４９】
腫瘍特異的突然変異含有エピトープの選択：Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋ、オランダによって提供及び管理されるニューラルネットワークベースのアルゴリズムｎｅｔＭＨＣを使用して、全てのミスセンス突然変異及びネオＯＲＦを突然変異含有エピトープの存在に関して解析し得る。この一群のアルゴリズムは、一連の関連手法の間で最近完了したコンペティションに基づき最高位のエピトープ予測アルゴリズムと評価された（参照）。複数の異なるヒトＨＬＡ  Ａ及びＢ対立遺伝子に関し、１００，０００超の計測された結合及び非結合相互作用を利用して人工ニューラルネットワークベースの手法を用いてアルゴリズムを訓練した。
【０３５０】
アルゴリズムの正確さは、ＨＬＡアロタイプが既知のＣＬＬ患者に見出される突然変異から予測を実施することにより評価した。含まれたアロタイプは、Ａ０１０１、Ａ０２０１、Ａ０３１０、Ａ１１０１、Ａ２４０２、Ａ６８０１、Ｂ０７０２、Ｂ０８０１、Ｂ１５０１であった。予測は各突然変異にわたる全ての９ｍｅｒ及び１０ｍｅｒペプチドについて、ｍｉｄ−２０１１でｎｅｔＭＨＣｐａｎを使用して、行った。これらの予測に基づき、７４個の９ｍｅｒペプチド及び６３個の１０ｍｅｒペプチド（ほとんどが５００ｎＭ未満の予測親和性を有した）を合成し、競合的結合アッセイ（Ｓｅｔｔｅ）を用いて結合親和性を測定した。
【０３５１】
これらのペプチドの予測を、２０１３年３月に最新版のｎｅｔＭＨＣサーバの各々（ｎｅｔＭＨＣｐａｎ、ｎｅｔＭＨＣ及びｎｅｔＭＨＣｃｏｎｓ）を使用して繰り返した。これらの３つのアルゴリズムは、２０１２年のコンペティションで使用された２０のグループの中で最高位のアルゴリズムであった（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ）。次に新しい予測の各々に関して、実測結合親和性を評価した。各一組の予測値及び実測値について、範囲毎の正しい予測の％、並びに試料の数が得られる。各範囲の定義は以下のとおりである：
０−１５０  １５０ｎＭ以下の親和性を有すると予測され、且つ１５０ｎＭ以下の親和性を有することが計測される。
０−１５０＊：１５０ｎＭ以下の親和性を有すると予測され、且つ５００ｎＭ以下の親和性を有することが計測される。
１５１−５００ｎＭ：１５０ｎＭより高いが５００ｎＭ以下の親和性を有すると予測され、且つ５００ｎＭ以下の親和性を有することが計測される。
ＦＮ（＞５００ｎＭ）：偽陰性−５００ｎＭより高い親和性を有すると予測されるが、５００ｎＭ以下の親和性を有することが計測される。
【０３５２】
９ｍｅｒペプチド（表１）については、アルゴリズム間の差はほとんどなく、ｎｅｔＭＨＣ  ｃｏｎｓの１５１〜５００ｎＭ範囲が僅かに高い値であったが、試料数が少ないため重大ではないと判断された。
【０３５３】
【表１】
0006702855.tif 000002
【０３５４】
１０ｍｅｒペプチド（表２）についても同様に、アルゴリズム間の差はほとんどなかったが、但しｎｅｔＭＨＣはｎｅｔＭＨＣｐａｎ又はｎｅｔＭＭＨＣｃｏｎｓと比べて大幅に多い偽陽性を生じた。しかしながら、９ｍｅｒと比較して１０ｍｅｒ予測精度は０〜１５０ｎＭ及び０〜１５０＊ｎＭ範囲で僅かに低く、及び１５１〜５００ｎＭ範囲で大幅に低い。
【０３５５】
【表２】
0006702855.tif 000003
【０３５６】
１０ｍｅｒについては、１５１〜５００ｎＭ範囲では結合体に関して５０％未満の精度であるため、０〜１５０ｎＭ範囲の予測のみを利用し得る。
【０３５７】
任意の個々のＨＬＡ対立遺伝子の試料数が、種々の対立遺伝子についての予測アルゴリズムの正確さに関する任意の結論を引き出すには少な過ぎた。利用可能な最大のサブセット（０〜１５０＊ｎＭ；９ｍｅｒ）のデータを例として表３に示す。
【０３５８】
【表３】
0006702855.tif 000004
【０３５９】
ＨＬＡ  Ｃ対立遺伝子に関しては予測の正確さを判断する利用可能なデータがほとんどないため、ＨＬＡ  Ａ及びＢ対立遺伝子の予測のみを利用し得る（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ）。
【０３６０】
メラノーマ配列情報及びペプチド結合予測の評価は、ＴＣＧＡデータベースからの情報を用いて実施した。種々の患者の２２０例のメラノーマからの情報により、平均して患者当たり約４５０個のミスセンス及び５個のネオＯＲＦがあることが明らかになった。２０人の患者を無作為に選択し、ｎｅｔＭＨＣを使用して全てのミスセンス突然変異の予測結合親和性を計算した（Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ  「ニューラルネットワークベースの方法を用いたエピトープの予測（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ）」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３７４：２６（２０１１））。これらの患者はＨＬＡアロタイプが未知であったため、当該のアロタイプの頻度に基づきアロタイプ毎の予測結合ペプチドの数を調整し（地理的範囲における予想される罹患優性集団［メラノーマについて白人］の骨髄登録データセット）、患者当たりの予測される作用可能な突然変異体エピトープ数を求めた。これらの突然変異体エピトープ（ＭＵＴ）の各々について、対応する天然（ＷＴ）エピトープ結合もまた予測した。Ｋｄ≦５００ｎＭ及び５倍より大きいＷＴ／ＭＵＴ  Ｋｄ比を有する予測ミスセンス結合体の単一のペプチド及び各ネオＯＲＦの完全長にわたるオーバーラップペプチドを利用して、８０％（２０人中１６人）の患者が、ワクチン接種に適切な少なくとも２０個のペプチドを有すると予測された。患者の四分の一は、２０個のペプチドの約半分乃至全てをネオＯＲＦペプチドが構成し得た。従って、メラノーマには、患者の高い割合が十分な数の免疫原性ペプチドを生じると予想するのに十分な突然変異負荷がある。
【０３６１】
実施例７：免疫ペプチドの優先順位付け
免疫化用のペプチドは、いくつかの基準に基づき優先順位が付けられ得る：ネオＯＲＦ対ミスセンス、突然変異ペプチドの予測Ｋｄ、突然変異ペプチドと比較した天然ペプチドの予測親和性の比較可能性、突然変異が発癌ドライバー遺伝子に起こるか、それとも関連経路に起こるか、及びＲＮＡ−Ｓｅｑリード数（例えば、図８を参照）。
【０３６２】
図８に示されるとおり、結合すると予測される（Ｋｄ＜５００ｎＭ）ネオＯＲＦ突然変異のセグメントに由来するペプチドには、これらの完全に新規の配列に対するトレランスの欠如及びそれらの優れた腫瘍特異性に基づき、最も高い優先順位が付けられ得る。
【０３６３】
天然ペプチドが結合しないと予測され（Ｋｄ＞１０００ｎＭ）且つ突然変異ペプチドが強力な／中程度の親和性で結合する（Ｋｄ＜１５０ｎＭ）と予測されるミスセンス突然変異の同様のクラスには、次に高い優先順位が付けられ得る。このクラス（上記で考察されるグループＩ）は、天然に観察されるＴ細胞応答の約２０％に相当する。
【０３６４】
３番目に高い優先順位が、上記で考察されるグループＩＩクラスのうちより強く結合する（＜１５０ｎＭ）サブセットに付けられ得る。このクラスは近似的に天然に観察されるＴ細胞応答のほぼ３分の２を占める。
【０３６５】
ネオＯＲＦ突然変異に由来する残りのペプチドは全て、４番目の優先順位が付けられ得る。結合しないと予測されるにも関わらず、これらは、既知の偽陰性率、ＨＬＡ−Ｃとの潜在的な結合可能性、クラスＩＩエピトープが存在する潜在的可能性及び完全に外来性の抗原を利用する高価値に基づき含められる。
【０３６６】
５番目の優先順位は、予測結合親和性が低い（１５０〜５００ｎＭ）グループＩＩのサブセットに付けられ得る。このクラスは天然に観察されるＴ細胞応答の約１０％を占める。
【０３６７】
予測親和性が低下するに従い、発現レベルに対してより高いストリンジェンシーが適用され得る。各グループ分けの範囲内で、ペプチドが結合親和性に基づきランク付けされ得る（例えば、最も低いＫｄが最も高い優先順位を有し得る）。ミスセンス突然変異の所与のグループ分けの範囲内で、発癌ドライバー突然変異には、より高い優先順位が付けられ得る。全ての既知のヒトタンパク質配列（ＨＧ１９）からキュレートされた約１２６０万個のユニークな９及び１０ｍｅｒの正常ヒトペプチドームライブラリが作成されている。最終的な選択の前に、ミスセンス突然変異及び全てのネオＯＲＦ領域に由来する任意の潜在的予測エピトープをこのライブラリに対してスクリーニングすることができ、完全一致が除外され得る。以下で考察するとおり、有害な生化学的特性を有すると予測される特定のペプチドは除去されるか又は修飾され得る。
【０３６８】
本明細書の技法によれば、ＲＮＡレベルを分析してネオ抗原発現を評価し得る。例えば、ＲＮＡ−Ｓｅｑリードカウントを代理として使用してネオ抗原発現を推定し得る。しかしながら、現在、腫瘍細胞において細胞溶解を惹起するのに必要とされる最小要求ＲＮＡ発現レベルを評価するために利用可能な情報はない。ナンセンス介在分解機構が運命付けられているメッセージの「先駆」翻訳からの発現レベルであっても、標的生成には十分であり得る。従って、本明細書の技法は、初めに、優先順位グループに反比例して変化し得るＲＮＡレベルに対して広い許容限界を設定する。予測親和性が低下するに従い、発現レベルに対してより高いストリンジェンシーが適用され得る。当業者は、さらなる情報が利用可能になるにつれ、かかる限界が調整され得ることを理解するであろう。
【０３６９】
その新規性及び優れた腫瘍特異性に起因して、ネオＯＲＦは標的としての価値が高いため、ＲＮＡ−Ｓｅｑによって検出可能なｍＲＮＡ分子がない場合にも、予測結合エピトープ（Ｋｄ≦５００ｎＭ）を有するネオＯＲＦが利用され得る（ランク１）。予測結合エピトープのない（＞５００ｎＭ）ネオＯＲＦの領域は、概して、あるレベルのＲＮＡ発現が検出される場合に限り利用され得る（ランク４）。強力乃至中程度の予測ＭＨＣ結合親和性（≦１５０ｎＭ）を有する全てのミスセンス突然変異は、概して、ＲＮＡ−Ｓｅｑリードがなかった場合を除き利用され得る（ランク２及び３）。それより低い予測結合親和性のミスセンス突然変異（１５０〜≦５００ｎＭ）は、やや高いレベルのＲＮＡ発現が検出された場合に限り利用される可能性が高い（ランク５）。
【０３７０】
発癌ドライバーは高い優先順位のグループに相当し得る。例えば、ミスセンス突然変異の所与のグループ分けの範囲内で、発癌ドライバー突然変異はより高い優先順位となり得る。この手法は、免疫圧力（例えば、免疫編集）の標的となる遺伝子の観察された下方制御に基づく。下方制御が癌細胞成長の有害効果を有しないこともある他の免疫標的とは対照的に、発癌ドライバー遺伝子の持続的発現は癌細胞生存にとって不可欠であり、従って免疫エスケープ経路を遮断し得る。例示的発癌ドライバーを表３−１に掲載する（例えば、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ；ＧＯＴＥＲＭ＿ＢＰ  遺伝子オントロジー用語−生物学的機能に対する遺伝子の割当て、ワールドワイドウェブ上の（ｗｗｗ）ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ；ＢＩＯＣＡＲＴＡ  シグナル伝達経路に対する遺伝子の割当て、ワールドワイドウェブ上の（ｗｗｗ）ｂｉｏｃａｒｔａ．ｃｏｍ；ＫＥＧＧ  ＫＥＧＧ経路データベースに従う経路に対する遺伝子の割当て、ワールドワイドウェブ上の（ｗｗｗ）ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｒｇｇ／ｐａｔｈｗａｙ．ｈｔｍｌ；ＲＥＡＣＴＯＭＥ  ＲＥＡＣＴＯＭＥ経路に従う経路及び遺伝子相互作用に対する遺伝子の割当て、ワールドワイドウェブ上の（ｗｗｗ）ｒｅａｃｔｏｍｅ．ｏｒｇを参照）。
【０３７１】
【表４】
0006702855.tif 000005
【０３７２】
【表５】
0006702855.tif 000006
【０３７３】
【表６】
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【０３７４】
【表７】
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【０３７５】
実施例８：ペプチド作製及び製剤化
免疫用のＧＭＰネオ抗原ペプチドを、ＦＤＡの規定に従い化学合成、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ＲＢ：「固相ペプチド合成Ｉ．テトラペプチドの合成（Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ）」．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４，１９６３）によって調製し得る。２０個の各約２０〜３０ｍｅｒペプチドの３つの開発ランが実施されている。各ランは同じ施設で実施され、ドラフトＧＭＰバッチ記録を利用して、ＧＭＰランに使用されたものと同じ機器が利用された。各ランで＞５０ｍｇの各ペプチドを作製することに成功し、現在計画されている全てのリリース試験（例えば、外観、ＭＳによるアイデンティティ、ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度、窒素元素による含量、及びＲＰ−ＨＰＬＣによるＴＦＡ含量）によってそれらを試験し、適宜目標規格に適合させた。生成物はまた、プロセスのこの部分に見込まれる時間フレーム（約４週間）の範囲内で作製した。凍結乾燥バルクペプチドを長期安定性試験にかけており、これは最長１２ヶ月までの種々の時点で評価され得る。
【０３７６】
これらのランからの材料を使用して、計画された溶解及び混合手法が試験されている。簡潔に言えば、各ペプチドを１００％ＤＭＳＯ中に高濃度（５０ｍｇ／ｍｌ）で溶解し、水性溶媒中に２ｍｇ／ｍｌに希釈し得る。当初、希釈剤としてＰＢＳを使用し得ると見込まれたが、しかしながら少数のペプチドの塩析は目に見える混濁を生じた。Ｄ５Ｗ（水中５％デキストロース）は、はるかに有効性が高いことが示された；４０個中３７個のペプチドで、清澄な溶液に希釈することに成功した。唯一問題のあるペプチドは、極めて疎水性のペプチドである。計画された免疫ペプチドの予測される生化学的特性を評価し、それに従い合成計画を変更してもよい（より短いペプチドを使用する、合成する領域を予測エピトープの周りでＮ末端又はＣ末端方向にシフトさせる、又は代替的ペプチドを潜在的に利用する）。ＤＭＳＯ／Ｄ５Ｗ中の１０個の別個のペプチドを２回の凍結／解凍サイクルに供し、完全な回復が示された。２つの個々のペプチドをＤＭＳＯ／Ｄ５Ｗ中に溶解し、２つの温度（−２０℃及び−８０℃）で安定下に置いた。これらのペプチドは最長６ヶ月まで評価することになる（ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＭＳ及びｐＨ）。現在までに、１２週の時点で両方のペプチドとも安定しており、２４週目にさらなる時点が評価される。
【０３７７】
図９に示されるとおり、剤形プロセスの設計は、各５個のペプチドからなる患者特異的ペプチドの４つのプールを調製することである。ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイが調製されており、これらのペプチド混合物の評価に適格であるとされている。このアッセイは、単一混合物内の複数のペプチドの良好な分解能を達成し、また個々のペプチドの定量にも用いられ得る。
【０３７８】
膜ろ過（０．２μｍ細孔径）を使用してバイオバーデンを低下させ、最終ろ過滅菌を行い得る。初めに４つの異なる適切なサイズのフィルタタイプを評価し、Ｐａｌｌ、ＰＥＳフィルタ（４６１２番）を選択した。現在までに、５つの異なる各ペプチドの４つの異なる混合物が調製されており、個々に２つのＰＥＳフィルタで順次ろ過した。ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイを利用して各個々のペプチドの回収率を評価した。２０個中１８個のペプチドについては、２回のろ過後の回収率は９０％超であった。２つの極めて疎水性のペプチドについては、小規模で評価したとき回収率は６０％未満であったが、規模を拡大するとほぼ完全に回収された（８７及び９７％）。前述のとおり、選択した配列の疎水性の性質を制限する手法が取られ得る。
【０３７９】
免疫用のＧＭＰネオ抗原ペプチドは、ＦＤＡの規定に従い化学合成、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ＲＢ：「固相ペプチド合成Ｉ．テトラペプチドの合成（Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ）」．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４，１９６３）によって調製し得る。
【０３８０】
実施例９：エンドポイント評価
本試験の一次免疫学的エンドポイントは、エキソビボＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴにより計測されるＴ細胞応答の評価であり得る。ＩＦＮ−γ分泌は、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞によるコグネイトペプチドの認識又は分裂誘発刺激の結果として起こる。ワクチン接種に使用される２０〜３０ｍｅｒペプチドは抗原提示細胞によるプロセシングを受けてより小さいペプチドになる必要があるため、インビボでは多数の異なるＣＤ４＋及びＣＤ８＋決定基がＴ細胞に提示される可能性があり得る。理論によって拘束されるものではないが、免疫系にとって新規の、従って自己トレランスの免疫抑制効果に供されない個別化されたネオ抗原ペプチドと、強力な免疫アジュバントポリＩＣＬＣとの組み合わせは、強力なＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋応答を誘導し得ると考えられる。従って、Ｔ細胞応答がエキソビボで検出可能であり、即ち短期培養を通じてエピトープ特異的Ｔ細胞をインビトロで拡大する必要がないことが予想される。患者は、初めにＥＬＩＳＰＯＴアッセイで刺激物質として完全なペプチド免疫原プールを使用して評価され得る。ロバストな陽性応答を示す患者について、フォローアップ解析で正確な１つ又は複数の免疫原性ペプチドを決定し得る。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴは、エキソビボでＴ細胞活性を検出し且つ特異性を決定するのにロバストで再現性の高いアッセイとして一般に受け入れられている。末梢血単球におけるＴ細胞応答の大きさの解析及び決定基マッピングに加えて、ワクチンによって誘導される免疫応答の他の側面が決定的に重要であり、評価され得る。これらの評価は、スクリーニングアッセイにおいてエキソビボＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答を呈する患者で行われ得る。それらには、Ｔ細胞サブセット（Ｔｈ１対Ｔｈ２、Ｔエフェクター対記憶細胞）の評価、調節性細胞、例えば調節性Ｔ細胞又は骨髄由来のサプレッサー細胞の存在及び存在量の分析、及び患者特異的メラノーマ細胞系の樹立に成功した場合には細胞傷害性アッセイが含まれる。
【０３８１】
実施例１０：ペプチド合成
ＧＭＰペプチドは標準的な固相合成ペプチド化学により合成し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し得る。各個々のペプチドは、種々の適格なアッセイにより分析して外観（目視）、純度（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、アイデンティティ（質量分析法による）、量（窒素元素）、及びトリフルオロ酢酸対イオン（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を評価し、リリースし得る。
【０３８２】
個別化されたネオ抗原ペプチドは、各患者にユニークな最大２０個の別個のペプチドから構成され得る。各ペプチドが、標準的なペプチド結合によりつながった約２０〜約３０個のＬ−アミノ酸の線状ポリマーであり得る。アミノ末端は第一級アミン（ＮＨ２−）であってもよく、カルボキシ末端はカルボニル基（−ＣＯＯＨ）である。哺乳類細胞に一般に見出される標準２０アミノ酸が利用される（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン）。各ペプチドの分子量はその長さ及び配列に基づき異なり、各ペプチドについて計算される。
【０３８３】
個別化されたネオ抗原ペプチドは、色分けされたキャップを備える２ｍｌ  Ｎｕｎｃ  Ｃｒｙｏバイアルが入った箱として供給されてもよく、各バイアルに約４００ｕｇ／ｍｌの濃度の最大５個のペプチドを含有する１．５ｍｌの凍結ＤＭＳＯ／Ｄ５Ｗ溶液が入っている。４つのグループのペプチドの各々につき１０〜１５本のバイアルがあり得る。バイアルは使用時まで−８０℃で保存すべきである。進行中の安定性試験は保存温度及び期間を裏付けている。
【０３８４】
保存及び安定性：個別化されたネオ抗原ペプチドは−８０℃で凍結して保存される。個別化されたネオ抗原ペプチド及びポリＩＣＬＣの解凍して滅菌ろ過したインプロセス中間体及び最終混合物は室温で保つことができるが、４時間以内に使用しなければならない。
【０３８５】
適合性：個別化されたネオ抗原ペプチドは、３分の１の容積のポリＩＣＬＣと使用直前に混合し得る。
【０３８６】
実施例１１：投与
個別化されたネオ抗原ペプチド／ポリペプチドとの混合後、ワクチン（例えば、ペプチド＋ポリＩＣＬＣ）は皮下投与されることになる。
【０３８７】
個別化されたネオ抗原ペプチド／ポリペプチドプールの調製：ペプチドは、各々最大５個のペプチドの４つのプールに共に混合し得る。各プールの選択基準は、ペプチドが結合すると予測される詳細なＭＨＣ対立遺伝子に基づき得る。
【０３８８】
プール組成：プールの組成は、各ペプチドが結合すると予測される詳細なＨＬＡ対立遺伝子に基づき選択し得る。４つのプールは、別個のリンパ節流域（ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｂａｓｉｎ）に流れ出る解剖学的部位に注入され得る。同じＨＬＡ対立遺伝子に結合するペプチド間の抗原競合を可能な限り潜在的に低下させるためにこの手法が選択されたとともに、これには免疫応答の発生における患者の免疫系の幅広いサブセットが関わる。各患者について、最大４つの異なるＨＬＡ  Ａ及びＢ対立遺伝子に結合すると予測されるペプチドを同定し得る。一部のネオＯＲＦ由来ペプチドはいかなる特定のＨＬＡ対立遺伝子とも関連しない。ペプチドを異なるプールに分配する手法は、特定のＨＬＡ対立遺伝子に関連する各組のペプチドを４つのプールの可能な限り多くに広げることであり得る。所与の対立遺伝子について４つより多くの予測ペプチドがある状況がある可能性が極めて高く、そのような場合、特定の対立遺伝子に関連する２つ以上のペプチドを同じプールに割り当てることが必要になり得る。いかなる特定の対立遺伝子にも関連しないネオＯＲＦペプチドは、残りのスロットに無作為に割り当てられ得る。一例を以下に示す。
【０３８９】
【表８】
0006702855.tif 000009
【０３９０】
可能な場合は常に、同じＭＨＣ対立遺伝子に結合すると予測されるペプチドを別個のプールに置き得る。一部のネオＯＲＦペプチドは、患者のいかなるＭＨＣ対立遺伝子にも結合しないと予測され得る。しかしながらこれらのペプチドはなおも利用することができ、その主な理由は、それらが完全に新規であり、従って中枢性トレランスの免疫抑制効果に供されず、従って免疫原性である確率が高いことである。ネオＯＲＦペプチドはまた、いかなる正常細胞にも等価な分子がないため、それの持つ自己免疫の可能性も劇的に低下している。加えて、予測アルゴリズムから生じる偽陰性があり、このペプチドがＨＬＡクラスＩＩエピトープを含み得る可能性がある（ＨＬＡクラスＩＩエピトープは現在のアルゴリズムに基づくと高い信頼性では予測されない）。特定のＨＬＡ対立遺伝子で同定されない全てのペプチドは、個々のプールに無作為に割り当てられ得る。各ペプチドの量は、注入１回当たり３００μｇの各ペプチドの最終用量に基礎を置いている。
【０３９１】
各患者について、製造者により各々５つの合成ペプチドの４つの個別的なプール（「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」及び「Ｄ」と命名される）が調製され、−８０℃で保存されている。免疫当日、１つ又は複数のペプチド成分とポリＩＣＬＣとからなる完全なワクチンを、研究薬局における層流バイオセーフティキャビネットにおいて調製し得る。各一つのバイアル（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）を室温で解凍し、残りのステップのためバイオセーフティキャビネット内に移し得る。０．７５ｍｌの各ペプチドプールをバイアルから抜き取り、別々のシリンジに入れ得る。別途、ポリＩＣＬＣの４つの０．２５ｍｌ（０．５ｍｇ）アリコートを抜き取り、別々のシリンジに入れ得る。次に、各ペプチド−プールが入ったシリンジの内容物を０．２５ｍｌアリコートのポリＩＣＬＣと、シリンジ間で移し替えることにより穏やかに混合し得る。１ｍｌの混合物全てを注射に使用し得る。これらの４つの調製物は「試験薬Ａ」、「試験薬Ｂ」、「試験薬Ｃ」、及び「試験薬Ｄ」と命名され得る。
【０３９２】
注射：免疫化毎に、４つの試験薬の各々を一つの四肢に皮下注射し得る。個々の試験薬それぞれについて、治療期間全体にわたり免疫化毎に同じ四肢に投与し得る（即ち試験薬Ａを１日目、４日目、８日目等に左腕に注射し、試験薬Ｂを１日目、４日目、８日目等に右腕に注射し得る）。完全腋窩又は鼠径リンパ節郭清後の状態にある患者の代替的な解剖学的部位は、それぞれ左及び右横隔膜である。
【０３９３】
ワクチンはプライム／ブーストスケジュールに従い投与し得る。ワクチンのプライミング用量は、上記に示すとおり１、４、８、１５、及び２２日目に投与し得る。ブースト期には、ワクチンは８５日目（１３週目）及び１６９日目（２５週目）に投与し得る。
【０３９４】
少なくとも１用量のワクチン投与を受ける患者は全て、毒性に関して評価可能であり得る。患者が誘導期の間に全てのワクチン接種を受け、且つ維持期に初回ワクチン接種（ブースト）を受けた場合、それらの患者は免疫学的活性に関して評価可能であり得る。
【０３９５】
実施例１２：薬力学試験
免疫戦略は、免疫応答を誘導するための初期の一連の密な間隔の免疫化と、続く記憶Ｔ細胞を樹立させるための休止期間とを含む「プライム−ブースト」手法である。これにブースター免疫化が続き、このブーストの４週間後（初回ワクチン接種の１６週間後）のＴ細胞応答が最も強い応答を生じるものと予想され、一次免疫学的エンドポイントとなり得る。免疫モニタリングが以下に概説するとおり段階的に実施され、誘発される免疫応答の強度及び質が特徴付けられ得る。スキーマＢに示し且つ試験カレンダーに特定されるとおり、初回ワクチン接種より前の２つの別個の時点（ベースライン）及びその後の種々の時点で末梢血を採取し、ＰＢＭＣを凍結し得る。誘導期及び維持期それぞれの完全な一組の試料が採取された後、所与の患者の免疫モニタリングを実施し得る。十分な腫瘍組織を利用可能である場合、腫瘍の一部を使用して、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイで使用する自己メラノーマ細胞系を樹立し得る。
【０３９６】
実施例１３：スクリーニングエキソビボＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ
各患者について、一組のスクリーニングペプチドを合成し得る。スクリーニングペプチドは１５アミノ酸長であり（時に１６ｍｅｒ又は１７ｍｅｒが用いられ得る）、１１アミノ酸がオーバーラップし、各ペプチドの全長又はネオＯＲＦ由来ペプチドについてはネオＯＲＦの全長を網羅する。完全な一組の患者特異的スクリーニングペプチドをほぼ等濃度で共にプールし、各ペプチドの一部はまた個々に保存し得る。ペプチドプールの純度は、エキソビボＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴにおいて確立された低バックグラウンドの５人の健常ドナーのＰＢＭＣを試験することにより確認し得る。最初は、ベースライン及び１６週目（一次免疫学的エンドポイント）で得られたＰＢＭＣをオーバーラップ１５ｍｅｒペプチド（１１アミノ酸のオーバーラップ）の完全なプールで１８時間刺激し、ペプチドワクチンに対する全体的な応答を調べ得る。続くアッセイは、指示されるとおりの他の時点で採取されたＰＢＭＣを利用し得る。エキソビボＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して一次免疫学的エンドポイントで応答が同定されない場合、ＰＢＭＣをより長い期間にわたり（最長１０日間）ペプチドプールで刺激し、再び分析し得る。
【０３９７】
実施例１４：フォローアップエキソビボＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおけるエピトープのデコンボリューション
オーバーラップペプチドプールによって誘発されたエキソビボＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答（少なくとも５５スポット形成単位／１０６  ＰＢＭＣ又はベースラインの少なくとも３倍を超える増加として定義される）が観察された後、ペプチドプールを免疫ペプチドに基づきサブプールにデコンボリューションし、且つエキソビボＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを繰り返すことにより、この応答を誘発する特定の免疫原性ペプチドを同定し得る。応答によっては、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて確認済みの刺激ペプチドに由来するオーバーラップ８〜１０ｍｅｒペプチドを利用することにより、刺激エピトープを正確に特徴付ける試みが行われ得る。適切な試料に関して個別の場合に応じてさらなるアッセイを実施し得る。例えば、
・全１５ｍｅｒプール又はサブプールを細胞内サイトカイン染色アッセイの刺激ペプチドとして使用して、抗原特異的ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、中枢記憶及びエフェクター記憶集団を同定及び定量化し得る
・同様に、これらのプールを使用してこれらの細胞により分泌されるサイトカインのパターンを評価し、ＴＨ１対ＴＨ２表現型を決定し得る
・未刺激細胞の細胞外サイトカイン染色及びフローサイトメトリーを使用してＴｒｅｇ及び骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を定量化し得る。
・応答した患者からのメラノーマ細胞系の樹立に成功し、且つエ活性化ピトープを同定することができた場合、突然変異ペプチド及び対応する野生型ペプチドを使用してＴ細胞の細胞傷害性アッセイを行い得る
・一次免疫学的エンドポイントのＰＢＭＣを、既知のメラノーマ腫瘍関連抗原を刺激剤として使用し、且つ免疫原の中には選択されなかったいくつかのさらなる同定済みの突然変異エピトープを使用することにより、「エピトープの広がり」に関して評価し得る
【０３９８】
ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＭＤＳＣ、及びＴｒｅｇ浸潤集団を定量化するため腫瘍試料の免疫組織化学を行い得る。
【０３９９】
実施例１５：腫瘍ネオ抗原の体系的同定のためのパイプライン
最近のシーケンシング技術及びペプチドエピトープ予測の進歩を利用して、候補腫瘍特異的ＨＬＡ結合ネオ抗原を体系的に発見する二段階パイプラインを作成した。図１０に示すとおり、この手法では、対応する正常ＤＮＡと並行して腫瘍のＤＮＡシーケンシング（例えば、全エクソーム（ＷＥＳ）又は全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）のいずれかによる）から始め、非同義体細胞突然変異が網羅的に同定される（例えば、Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１３；Ｃｉｂｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２を参照）。次に、個人的なクラスＩ  ＨＬＡタンパク質に結合する可能性、ひいてはＣＤ８＋Ｔ細胞に提示される可能性のある、腫瘍突然変異によって生じる候補腫瘍特異的突然変異ペプチドを、例えばＮｅｔＭＨＣｐａｎなどの予測アルゴリズムを使用して予測し得る（例えば、Ｌｉｎ  ２００８；Ｚｈａｎｇ  ２０１１を参照）。候補ペプチド抗原を、ＨＬＡとのそれらの結合及び自己白血病細胞におけるコグネイトｍＲＮＡの発現を実験的に検証することに基づきさらに評価した。
【０４００】
このパイプラインを、シーケンシングしたＣＬＬ試料の大規模データセットに適用した（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１を参照）。ＷＥＳ又はＷＧＳのいずれかによってシーケンシングした９１例の症例から、タンパク質コード領域に合計１８３８個の非同義突然変異が発見され、これはメガ塩基対当たり０．７２（±０．３６ｓ．ｄ．）の平均体細胞突然変異率（範囲、０．０８〜２．７０）、及び患者当たり平均２０個の非同義突然変異（範囲、２〜７６）に相当した（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１を参照）。アミノ酸変化領域を生じ、ひいては免疫学的に認識される可能性があると予想し得る３個の一般的な突然変異クラスを同定した。最も豊富なクラスは、単一アミノ酸（ａａ）変化を引き起こすミスセンス突然変異を含み、ＣＬＬ当たり体細胞突然変異の９０％に相当した。９１例の試料中、９９％がミスセンス突然変異を含み、６９％が１０〜２５個のミスセンス突然変異を有した（例えば、図２Ａを参照）。他の２つの突然変異クラス、フレームシフト及びスプライス部位突然変異（エクソン−イントロン接合部における突然変異）は、全体が腫瘍に特異的な新規アミノ酸配列のより長いストレッチ（ネオオープンリーディングフレーム、又はネオＯＲＦ）を生成し、所与の改変当たりのネオ抗原ペプチドの数が（ミスセンス突然変異と比較して）より多くなる可能性がある。しかしながら、他の癌タイプのデータと一致して、ネオＯＲＦ生成突然変異はＣＬＬにおいてミスセンス突然変異と比べて約１０倍少なかった（例えば、図２Ｂ〜図２Ｃを参照）。ミスセンス突然変異の出現率を所与として、続く実験研究は、ミスセンス突然変異によって生じるネオエピトープの分析に焦点を置いた。
【０４０１】
実施例１６：体細胞ミスセンス突然変異は、個人的ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に結合すると予測されるネオペプチドを生成する
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によるペプチドエピトープのＴ細胞認識には、抗原提示細胞の表面上にあるＨＬＡ分子の結合溝内に結合したペプチドの提示が必要である。３０を超える利用可能なクラスＩ予測アルゴリズム間の最近の比較研究は、ＮｅｔＭＨＣｐａｎが一貫してＨＬＡ対立遺伝子間にわたり高い感度：且つ特異性で機能することを示している（例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１を参照）。
【０４０２】
元は文献においてそれらの機能的活性（即ち、抗新生物細胞溶解性Ｔ細胞応答を刺激する能力）に基づき同定されたか又は免疫原性マイナー組織適合抗原として特徴付けられた３３個の既知の突然変異エピトープの集合に対してＮｅｔＭＨＣｐａｎアルゴリズムを試験し、このアルゴリズムが３３個の既知の突然変異エピトープに関して結合を正しく予測し得るかどうかを決定した（例えば、表４及び表５を参照）。表４及び表５は、ＮｅｔＭＨＣｐａｎを使用したヒト癌間における既知の機能的に誘導された免疫原性突然変異エピトープのＨＬＡ−ペプチド結合親和性を示す。表４はミスセンス突然変異由来のエピトープを示す（ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺癌；ＭＥＬ：メラノーマ；ＣＬＬ：慢性リンパ性白血病；ＲＣＣ：腎明細胞癌；ＢＬＤ：膀胱癌；ＮＲ：未報告；）。黄色：ＩＣ５０＜１５０ｎＭ、緑色：ＩＣ５０  １５０〜５００ｎＭ及び灰色：ＩＣ５０＞５００ｎＭ。
【０４０３】
【表９】
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【０４０４】
【表１０】
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【０４０５】
表５は、マイナー組織適合抗原由来のエピトープを示す（ＭＭ：多発性骨髄腫；ＨＭ：血液系悪性腫瘍；Ｂ−ＡＬＬ：Ｂ細胞急性リンパ性白血病）。
【０４０６】
【表１１】
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【０４０７】
タイリングした全ての９ｍｅｒ及び１０ｍｅｒの可能性の中で、ＮｅｔＭＨＣｐａｎは、３３個全ての機能的に検証済みの突然変異エピトープを、所与の突然変異について可能な選択肢の中で最良の結合ペプチドとして同定した。３３個の突然変異エピトープの各々の分かっている既報告のＨＬＡ制限エレメントに対する予測結合親和性中央値（ＩＣ５０）は、３２ｎＭ（範囲、３〜１１、１９２ｎＭ）であった。予測ＩＣ５０カットオフを１５０及び５００ｎＭに設定することにより、機能的に検証済みのペプチドのそれぞれ８２％及び９１％が捕捉された（例えば、表４及び表５並びに図１２Ａを参照）。
【０４０８】
その高度な感度及び特異性に基づき、次にＮｅｔＭＨＣｐａｎを、ＨＬＡタイピング情報が利用可能であった９１例中３１例のＣＬＬ症例に適用した。慣例により、それぞれ、ＩＣ５０＜１５０ｎＭのペプチドを強力乃至中程度の結合体と見なし、ＩＣ５０  １５０〜５００ｎＭを弱い結合体と見なし、及びＩＣ５０＞５００ｎＭを非結合体と見なした（例えば、Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２を参照）。９１例全てのＣＬＬ症例について、中央値１０個の強力な結合ペプチド（範囲、２〜４０個）及び１２個の中程度乃至弱い結合ペプチド（範囲、２〜４１個）が見出された。全体では、症例当たり中央値２２個（範囲、６〜８１個）のペプチドがＩＣ５０＜５００ｎＭと予測された（例えば、図１２Ｂ及び表６を参照）。詳細には、表６は、利用可能なＨＬＡタイピングを有する３１例のＣＬＬ症例から予測されたペプチドの数及び親和性分布を示す。白人集団における８個の最も一般的なＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を発現する患者を灰色で示す。
【０４０９】
【表１２】
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【０４１０】
実施例１７：予測ＨＬＡ結合ネオペプチドの半数以上がインビトロでＨＬＡタンパク質との直接結合を示した
表７に示すとおり、ＨＬＡ−ペプチド結合予測により作成されたＩＣ５０ｎＭスコアを競合的ＭＨＣ  Ｉ対立遺伝子結合アッセイを用いて検証し、クラスＩ−Ａ及び−Ｂ対立遺伝子に焦点を置いた。この目的で、４例のＣＬＬ症例（患者１〜４）から同定された５００ｎＭ未満の予測ＩＣ５０スコアを有する１１２個の突然変異ペプチド（９又は１０ｍｅｒ突然変異ペプチド）を合成した。実験結果は結合予測と相関した。実験的結合（ＩＣ  ５０＜５００ＮＭとして定義される）は、＜１５０ｎＭ又は１５０〜５００ｎＭのＩＣ５０と予測されたペプチドのそれぞれ７６．５％及び３６％に確認された（例えば、図１２Ｃを参照）。全体では、予測ペプチドの約５４．５％（６１／１１２個）が、個人的なＨＬＡ対立遺伝子との結合体であると実験的に検証された。全体としては、（図１３）に示すとおり、９ｍｅｒペプチドの予測の方が１０ｍｅｒペプチドと比べて、それぞれ予測ペプチド（ＩＣ５０＜５００ｎＭ）の６０％と４４．５％を実験的に検証することができたように、より感度が高かった。
【０４１１】
【表１３】
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【０４１２】
【表１４】
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【０４１３】
【表１５】
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【０４１４】
【表１６】
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【０４１５】
【表１７】
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【０４１６】
実施例１８：ネオ抗原はＣＬＬ腫瘍で発現する
エピトープに対するＣＴＬ応答は、そのエピトープをコードする遺伝子が標的細胞で発現する場合に限り有用であり得る。ＨＬＡに関してシーケンシング及びタイピングされた３１例の患者試料のうち２６例を、ゲノムワイドな発現プロファイリングに供した（例えば、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２を参照）。ＣＬＬ試料中の突然変異を有する３４７個の遺伝子の発現レベルを、低／無し（最も低い四分位）、中程度（中間の２つの四分位）、又は高い（最も高い四分位）の発現を有するものとして分類した。図１２Ｄに示すとおり、３４７個の変異遺伝子の８０％（又は予測ＨＬＡ結合を有する１８０個の突然変異の７９％）が中程度乃至高い発現レベルで発現した。予測クラスＩ結合エピトープを有する２２１個の変異遺伝子のサブセットの間で同程度の高い頻度の発現が観察された（８８．６％）。
【０４１７】
ＲＮＡレベルは遺伝子産物当たりのリード数に基づき決定され、四分位によってランク付けされ得る。「Ｈ」−上位四分位；「Ｍ」−中間の２つの四分位；「Ｌ」−最も低い四分位（リードを有しない遺伝子を除く；「−」−検出可能なリードなし。予測親和性が低下するに従い、発現レベルに対してより高いストリンジェンシーが適用され得る。ＲＮＡ−Ｓｅｑによって検出可能なｍＲＮＡ分子がない場合にも、予測結合体を有するネオＯＲＦを利用した。現在、ネオＯＲＦが活性化Ｔ細胞の標的として有用であるために腫瘍細胞において必要な最小発現レベルが（それが存在する場合に）どの程度かを評価するのに利用可能なデータはない。ナンセンス介在分解機構が運命付けられているメッセージの「先駆」翻訳の発現レベルであっても、標的生成には十分であり得る（（Ｃｈａｎｇ  ＹＦ，Ｉｍａｍ  ＪＳ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ＭＦ：「ナンセンス変異依存分解機構ＲＮＡ監視経路（Ｔｈｅ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｃａｙ  ＲＮＡ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｐａｔｈｗａｙ）」．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７６：５１−７４，２００７）。従って、その新規性及び優れた腫瘍特異性に起因して、ネオＯＲＦは標的としての価値が高いため、ＲＮＡレベルで発現が低い又は検出不能な場合であっても、ネオＯＲＦは免疫原として利用され得る。
【０４１８】
実施例１９：候補ネオエピトープを標的化するＴ細胞がＨＳＣＴ後のＣＬＬ患者１に検出された
ＣＬＬにおける同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後のセッティングを分析し、予測された突然変異ペプチドに対する免疫応答が患者において発生し得たかどうかを決定した。ＨＳＣＴ後の健常ドナーのＴ細胞再構成は宿主の内因性免疫欠損を克服し、また、生体内で宿主における白血病細胞に対するプライミングを可能にすることもできる。分析は、両者とも進行ＣＬＬに対する無関係の用量減量前処置の同種ＨＳＣＴを受けており、且つＨＳＣＴ後４年より長くにわたり持続的寛解を達成していた２人の患者に焦点を置いた（例えば、表８を参照）。移植後Ｔ細胞は移植時から７年（患者１）及び４年（患者２）で採取した。
【０４１９】
表８は、ＣＬＬ患者１及び２の臨床的特徴を示す。両方の患者とも、ＨＳＣＴ後に７（患者１）及び４年（患者２）を上回る進行中の持続的寛解を達成している。Ｍ：男性；ＨＳＣＴ：造血幹細胞移植；ＲＩＣ：用量減量前処置；Ｆｌｕ／Ｂｕ：フルダラビン／ブスルファン；ＧｖＨＤ：移植片対宿主病；ＵＲＤ：無関係のドナー；Ｍｉｓ：ミスセンス；ＦＳ：フレームシフト。
【０４２０】
【表１８】
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【０４２１】
患者（患者１）については、ＷＥＳによって２５個のミスセンス突然変異が同定された。全体では、１３個の突然変異からの３０個のペプチドが個人的ＨＬＡに結合すると予測された（ＩＣ５０＜１５０のペプチド１３個；ＩＣ５０  １５０〜５００ｎＭのペプチド１７個）。図１４Ａに示されるとおり、ペプチド予測の実験的検証により、９個の突然変異に由来する１４個のペプチドについてＨＬＡ結合が確認された。３０個全ての予測ＨＬＡ結合ペプチドをＴ細胞プライミング試験に選択し、６個のペプチド／プールの５つのプールに編成した（例えば、表９を参照）。同程度の予測結合スコアのペプチドは同じプールにまとめた。
【０４２２】
表９は、Ｔ細胞刺激試験用のペプチドプールに含められた患者１のミスセンス突然変異由来のペプチドの概要を提供する。患者１においては、ＨＬＡ−Ａ及び−Ｂ対立遺伝子に結合するＩＣ５０＜５００ｎＭの予測ペプチドの全てを使用した。ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に対する予測結合親和性の降順で掲載した６個のペプチド／プールを含む５個の突然変異ペプチドプール。対応する実験ＨＬＡ−ペプチド結合親和性、野生型ペプチド及びそれらの予測ＩＣ５０スコアを最右列に含める。
【０４２３】
【表１９】
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【０４２４】
【表２０】
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【０４２５】
Ｔ細胞のネオ抗原応答性を、候補ネオ抗原ペプチドプールでパルスした（１週間に１回×４週間）自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を使用してＴ細胞を拡大することにより試験した。図１４Ｂに示すとおり、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける応答性がプール２に対して検出されたが、無関係のペプチド（Ｔａｘペプチド）に対しては検出されなかった。プールのデコンボリューションにより、プール２内の突然変異（ｍｕｔ）ＡＬＭＳ１及びＣ６ｏｒｆ８９ペプチドは免疫原性であることが明らかになった。ＡＬＭＳ１は線毛機能、細胞静止及び細胞内輸送において役割を果たし、この遺伝子の突然変異はＩＩ型糖尿病に関係があるとされている。Ｃ６ｏｒｆ８９は、気管支上皮細胞の細胞周期進行及び創傷修復に関与するボンベシン受容体サブタイプ３と相互作用するタンパク質をコードする。いずれの突然変異部位も遺伝子の保存領域にはなかったとともに、これまでに癌で突然変異することが報告されている遺伝子内にはなかった。両方の標的ペプチドとも、患者１のＨＬＡ対立遺伝子に結合すると実験的に確認することができた１４個の予測ペプチドのサブセットの中にあった。ｍｕｔ及び野生型（ｗｔ）ＡＬＭＳ１の実験的結合スコアは、それぞれ９１及び６６６ｎＭであった；及びｍｕｔ−及びｗｔ−Ｃ６ＯＲＦ８９は、それぞれ１３１及び１．７ｎＭであった（例えば、図１４Ｃ及び表９を参照）。両方の変異遺伝子とも保存領域にはほとんど局在せず、これまで報告されている癌での突然変異部位には局在しなかった（例えば、図１５〜図１６を参照）。
【０４２６】
実施例２０：ＣＬＬ患者２は、天然でプロセシングされる突然変異ＦＮＤＣ３Ｂペプチドに対して免疫を呈した
患者２において、個人的ネオ抗原が長期寛解のセッティングで記憶Ｔ応答に寄与する能力を試験した。この個体から２６個の非同義ミスセンス突然変異が同定された。全体では、１６個の突然変異由来の３７個のペプチドが個人的ＨＬＡ対立遺伝子に結合すると予測され、そのうちの１２個の突然変異由来の１８個のペプチドを実験的に検証することができた（１５個がＩＣ５０＜１５０；３個がＩＣ５０  １５０〜５００ｎＭ）（例えば、図１７Ａを参照）。患者２においては、１８個の全ての実験的に検証されたＨＬＡ結合ペプチドを試験した。６個のペプチド／プールの３つのプールを使用してＴ細胞刺激を実施した（例えば、表１０を参照）。表１０は、Ｔ細胞刺激試験用のペプチドプールに含められた患者２のミスセンス突然変異由来のペプチドの概要を示す。患者２においては、ＨＬＡ−Ａ及び−Ｂ対立遺伝子に結合することが実験的に確認された全てのペプチドを使用した。突然変異ペプチドの実験結合親和性の降順で掲載した６個のペプチド／プールの３つのペプチドプール。対応する野生型ペプチド及びそれらの予測ＩＣ５０スコアを最右列に含める。
【０４２７】
【表２１】
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【０４２８】
同程度の実験的結合スコアを有するペプチドを同じプール内に組み合わせた。突然変異ペプチドプールでパルスした自己ＡＰＣに対するＴ細胞の週１回の刺激を２ラウンド行った後に応答を評価し、図１７Ｂに示すとおり、Ｔ細胞はプール１に対して応答性を有することが分かった。プールのデコンボリューションにより、ｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂがこのプールの中でとりわけ優勢な免疫原性ペプチドであることが明らかになった（ｍｕｔ−及びｗｔ−ＦＮＤＣ３Ｂの実験ＩＣ５０はそれぞれ６．２及び２．７ｎＭであった；例えば、図１７Ｃを参照）。血液悪性腫瘍におけるＦＮＤＣ３Ｂの機能は不明であるが、ＦＮＤＣ３Ｂ発現の下方制御がｍｉＲ−１４３発現を上方制御することが知られ、ｍｉＲ−１４３発現は、前立腺癌幹細胞を分化させ及び前立腺癌転移を促進することが示されている。ＡＬＭＳ１及びＣ６ｏｒｆ８９と同様に、ＦＮＤＣ３Ｂの突然変異は進化的に保存された領域には局在せず、またこれまでに他の癌で報告されている領域にも局在しない（例えば、図１５及び図１６を参照）。
【０４２９】
ｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂに対するＴ細胞応答性は多機能性で（分泌ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２）、且つｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂペプチドに特異的であるが、その野生型対応物には特異的でなかった。種々の濃度のｍｕｔ−及びｗｔ−ＦＮＤＣ３Ｂペプチドに対するＴ細胞応答性を試験することにより、ｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ応答性Ｔ細胞の高いアビディティー及び特異性が明らかになった。Ｔ細胞応答性はクラスＩ遮断抗体（Ｗ６／３２）の存在によって消失し、Ｔ細胞応答性がクラスＩ制限であることが示された（例えば、図１７Ｄ〜図１７Ｅを参照）。さらに、図１７Ｅの右側のパネルに示すとおり、遺伝子突然変異領域を包含する３００塩基対のミニ遺伝子をトランスフェクトしたＨＬＡ−Ａ２発現ＡＰＣに対してＴ細胞応答性が検出されたが、野生型ミニ遺伝子には検出されなかったことから、ｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂペプチドは天然にプロセシングされ、ペプチドを提示したように見えた。
【０４３０】
図１７Ｆに示すとおり、ｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ／Ａ２＋特異的四量体を使用して、プール１で刺激したＴ細胞内に、健康成人ＨＬＡ−Ａ２＋ボランティアの対照ＰＢＭＣ（０．３８％）と比較して別個のｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞集団（集団の２．４２％）を検出した。１８２例のＣＬＬ症例（患者２を含む）及び正常ボランティアから採取した２４例のＣＤ１９＋Ｂ細胞の大規模データセットにおけるＦＮＤＣ３Ｂの遺伝子発現解析から、図１７Ｇに示すとおり、この遺伝子が他のＣＬＬ及び正常Ｂ細胞と比較して患者２において比較的過剰発現することが明らかになった。従って、ＣＬＬ患者２において長寿命のネオ抗原特異的Ｔ細胞を追跡し得たことは明らかである。
【０４３１】
ｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ特異的Ｔ細胞の動態をＨＳＣＴ後の経過との関係で定義するため、ＨＳＣＴ前後の種々の時点から単離された患者２のＴ細胞を２週間刺激し、次にＥＬＩＳＰＯＴでＩＦＮ−γ応答性に関して試験した。ｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ特異的Ｔ細胞の出現が分子的寛解と同時に起こり、これは持続的寛解を伴い長時間持続した。図１８に示されるとおり（上及び中央パネル）、ｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ  Ｔ細胞応答は、ＨＳＣＴ前又はその３ヶ月後まで検出されなかった。ＨＳＣＴ後４ヶ月で初めて分子的寛解が得られ、次にＨＳＣＴ後６ヶ月で初めてｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ特異的Ｔ細胞が検出された。続いて抗原特異的応答性は減弱し（ＨＳＣＴ後１２〜２０ヶ月）、しかしＨＳＣＴ後３２ヶ月に再び強力に検出された。ｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ特異的Ｔ細胞のＴＣＲの分子解析に基づくと、図１９及び表１１に示すとおり、Ｖβ１１が、応答性Ｔ細胞によって用いられる優勢なＣＤＲ３  Ｖβサブファミリーとして同定された）。表１１は、ＴＣＲ  Ｖβサブファミリーの増幅に使用されるプライマーを示す。
【０４３２】
【表２２】
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【０４３３】
【表２３】
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【０４３４】
【表２４】
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【０４３５】
この分子情報を使用してクローン特異的ネステッドＰＣＲアッセイを開発した。このアッセイを適用することにより、正常な健常ボランティアのＰＢＭＣ（ｎ＝３）及びＣＤ８＋Ｔ細胞にはｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂに対して同じ特異性を有するＴ細胞は検出されず（例えば、表１２を参照）、しかし、図１８の下パネルに示すとおり、患者におけるＨＳＣＴ後のＩＦＮ−γ分泌の検出時は同様の動態で検出され得ることが観察された。クローン特異的Ｔ細胞の相対数は時間とともに減少し、ＨＳＣＴ後６ヶ月と比較して３２ヶ月では、より低い濃度のペプチド抗原がＴ細胞応答性を刺激し得たことから、時間とともに潜在的により多くの抗原感受性記憶Ｔ細胞が出現することが示された（例えば、図１８の差込み図を参照）。
【０４３６】
表１２は、患者２におけるＴ細胞受容体特異的プライマーを使用したｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ特異的ＴＣＲ  Ｖβ１１の検出を示す。ｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ特異的ＴＣＲ  Ｖβ１１クローンを検出するリアルタイムＰＣＲアッセイを設計した。このクローンは健常ドナーＰＢＭＣ（ｎ＝３）又はＣＤ８  Ｔ細胞では検出できなかったが、患者２のｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ応答性Ｔ細胞由来のｃＤＮＡでは（ＨＳＣＴ後６ヶ月に）明確に検出可能であった。ＰＣＲ産物は１８Ｓ  リボソームＲＮＡで正規化した。−、陰性：増幅なし；＋、陽性：増幅が検出される；＋＋、二重陽性：増幅が検出され且つ増幅レベルが全ての陽性試料の中央値より高い。
【０４３７】
【表２５】
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【０４３８】
実施例２１：多様な癌にわたり多数の候補ネオ抗原が予測された
ＣＬＬの全体的な体細胞突然変異率は他の血液悪性腫瘍と同程度であるが、固形腫瘍の悪性腫瘍と比較すると低い（例えば、図２０Ａを参照）。腫瘍型及び突然変異率が候補ネオ抗原の存在量及びクオリティにどのような影響を及ぼすかを調べるため、高い（メラノーマ（ＭＥＬ））、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）及び腺癌（ＬＵＡＤ）、頭頸部癌（ＨＮＣ）、膀胱癌、結腸直腸腺癌、中程度（膠芽腫（ＧＢＭ）、卵巣癌、腎明細胞癌（明細胞ＲＣＣ）、及び乳癌）及び低い（ＣＬＬ及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）癌を含めた１３種の悪性腫瘍の公的に利用可能なＷＥＳデータにパイプラインを適用した。この解析を実施するため、ＷＥＳデータからのＨＬＡタイピングの推測が可能な最近記載されたアルゴリズムもまた実施した（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。
【０４３９】
これらの固形悪性腫瘍における全体的な突然変異率のオーダーはＣＬＬより高く、ミスセンス突然変異の中央値の増加と関連した。例えば、それぞれ、メラノーマは症例当たり３００個のミスセンス突然変異（範囲、３４〜４２７６個）の中央値を示し、一方でＲＣＣは４１個（範囲、１０〜１０１個）を有した。ＲＣＣ及びメラノーマにおけるフレームシフト及びスプライス部位突然変異はＣＬＬと比較したとき頻度が２〜３倍増加したに過ぎず、試料当たりの合計ネオＯＲＦ長さはやや増加した（５〜１３倍）に過ぎなかった。全体として、ミスセンスから生成されたＩＣ５０＜５００ｎＭの予測ネオペプチド数の中央値及び試料当たりのフレームシフトイベントは突然変異率に比例した；これはメラノーマ（４８８；範囲、１８〜５８１１）及びＲＣＣ（８０；範囲、６〜４０７））に関して、ＣＬＬ（２４；範囲２〜１２４）と比較してそれぞれ約２０〜４倍高かった。ＩＣ５０＜１５０ｎＭのよりストリンジェントな閾値では、対応する予測ネオペプチド数は、図２０Ｂ及び表１３に示すとおり、メラノーマ、ＲＣＣ及びＣＬＬについてそれぞれ２１２個、３５個及び１０個であった）。
【０４４０】
表１３は、全１３種の癌の突然変異クラスの分布、合計ネオＯＲＦサイズ及び予測結合ペプチド数を示す。ＭＥＬ：メラノーマ、ＬＵＳＣ：肺扁平上皮癌、ＬＵＡＤ：肺腺癌、ＢＬＣＡ：膀胱、ＨＮＳＣ：頭頸部癌、ＣＯＡＤ：結腸腺癌、ＲＥＡＤ：腎腺癌、ＧＢＭ：膠芽腫、ＯＶ：卵巣癌、ＲＣＣ：腎明細胞癌、ＢＲＣＡ：乳癌、ＣＬＬ：慢性リンパ性白血病、ＡＭＬ：急性骨髄性白血病。＊−ミスセンス及びフレームシフト突然変異に基づく予測ペプチド数。
【０４４１】
【表２６】
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【０４４２】
実施例２２：クローナル突然変異に対処するための臨床戦略
「クローナル」突然変異は腫瘍内のあらゆる癌細胞に見られるものであり、一方「サブクローナル」突然変異は統計的に全ての癌細胞にあるわけではなく、従って腫瘍内のサブ集団に由来するものである。
【０４４３】
本明細書の技法によれば、バイオインフォマティクス解析を用いて突然変異のクロナリティーを推定し得る。例えば、ＡＢＳＯＬＵＴＥアルゴリズム（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１２、Ｌａｎｄａｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）を用いて、腫瘍純度、倍数性、絶対コピー数及び突然変異のクロナリティーを推定し得る。各突然変異の対立遺伝子率の確率密度分布を作成し、続いて突然変異の癌細胞率（ＣＣＦ）に変換し得る。突然変異は、それらのＣＣＦが０．９５を超える事後確率がそれぞれ０．５より大きいか又は小さいかに基づきクローナル又はサブクローナルとして分類され得る。
【０４４４】
本開示の範囲内で、ネオ抗原ワクチンがクローナルタイプ、サブクローナルタイプ又は両方のタイプの突然変異に対するペプチドを含み得ることが企図される。その判断は、患者の病期及びシーケンシングされる１つ又は複数の腫瘍試料に依存し得る。アジュバントセッティングの初期臨床試験については、ペプチド選択の間にこれらの２つの突然変異タイプを区別することは必要ない場合もあるが、しかしながら当業者は、かかる情報が、いくつもの理由から、さらなる研究の指針とするのに有用であり得ることを理解するであろう。
【０４４５】
第一に、対象となる腫瘍細胞は遺伝的に不均一性であり得る。複数の研究が発表されており、そこでは種々の疾患進行ステージに相当する腫瘍が不均一性に関して評価されている。それには、前癌性疾患（骨髄異形成症候群）から白血病（続発性急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］）への進化（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２）、治療によって誘導されたＡＭＬ寛解後の再燃（Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２）、原発性から転移性乳癌及び髄芽腫への進化（Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ２０１２）、及び原発性から高転移性膵癌及び腎癌への進化（Ｙａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２；Ｇｅｒｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２）を調べることが含まれる。ほとんどの研究がゲノム又はエクソームシーケンシングを利用したが、一つの研究はコピー数変異及びＣｐＧメチル化パターン変異もまた評価した。これらの試験は、遺伝的イベントが癌細胞の成長中に獲得され、それにより突然変異プロファイルが変化することを示している。最も早期に検出可能な突然変異（「ファウンダー突然変異」）の多く、通常ほとんど（４０％〜９０％）が、あらゆる進化した変異体に持続するが、進化クローンにユニークな新規突然変異が実に生じ、それらは種々の進化クローン間で異なり得る。これらの変化は宿主／癌細胞の「環境」圧力及び／又は治療介入によって駆動され、従ってより高転移性の疾患又は過去の治療介入が概してより重大な不均一性をもたらし得る。
【０４４６】
第二に、最初に各患者につき一つの腫瘍がシーケンシングされ得ることが企図され、これによりその特定の時点に関する遺伝的変異のプロファイルのスナップショットが提供され得る。シーケンシングされる腫瘍は、臨床的に明らかなリンパ節、イントランジット転移／衛星転移、又は切除可能な内臓転移に由来し得る。最初に試験した患者のいずれも、臨床的に多部位に進行した疾患を有しない；しかしながら、本明細書に記載される技法は多部位に進行した癌を有する患者に幅広く適用され得ることが企図される。この腫瘍細胞集団の範囲内で、「クローナル突然変異」は、ファウンダー突然変異と、切除された腫瘍を播種した細胞に存在する任意の新規突然変異との両方から構成され、サブクローナル突然変異は、切除した腫瘍の成長中に進化したものを表す。
【０４４７】
第三に、ワクチンにより誘導したＴ細胞が標的化する際に臨床的に重要な腫瘍細胞は、多くの場合に切除された腫瘍細胞ではなく、むしろ所与の患者の体内にある他の現在検出不能な腫瘍細胞である。これらの細胞は原発腫瘍から直接、又は切除された腫瘍から広がっていることもあり、播種腫瘍内の優位又は準優位な集団に由来していることもあり、及び外科的に切除した部位で遺伝的にさらに進化していることもある。これらのイベントは現在予測不可能である。
【０４４８】
従って、外科的に切除したアジュバントセッティングには、切除された腫瘍に見られるクローナル又はサブクローナルの突然変異が他の切除されない癌細胞を標的化するための最適な選択肢に相当するかどうかを決定する先験的な方法はない。例えば、切除された腫瘍内のサブクローナルの突然変異が、切除された腫瘍内のサブクローナル突然変異を含むサブ細胞集団から他の部位に播種された場合、そうした他の部位ではクローナルであり得る。
【０４４９】
しかしながら他の疾患セッティング、例えば患者が多発性及び転移性病変を有するセッティングでは、２つ以上の病変（又は病変の一部）又は異なる時点の病変をシーケンシングすることにより、有効なペプチド選択に関してより多くの情報が提供され得る。クローナル突然変異は、典型的にはワクチン用のネオ抗原エピトープの設計において優先順位が付けられ得る。場合によっては、特に腫瘍が進化し、且つ個々の患者に関する転移性病変からのシーケンシングの詳細が評価されるようなとき、ペプチド選択の一環として考慮するため特定のサブクローナル突然変異に優先順位が付けられ得る。
【０４５０】
実施例２３：個別化癌ワクチンは腫瘍ネオ抗原に対する免疫を刺激する
網羅的なバイオインフォマティクスとＣＬＬ及び他の癌における機能的データとの上述の詳説した統合は、いくつかの新規の生物学的洞察をもたらす。第一に、ＣＬＬは比較的低い突然変異率の癌であるが、それにも関わらず、長期Ｔ細胞応答を誘発した、体細胞突然変異によって生成されるエピトープを同定することが可能であった。３１例のＣＬＬ試料からの全エクソームシーケンシングデータから、症例当たり中央値２２個（範囲、６〜８１個）のペプチドが、中央値１６個（範囲、２〜７５個）のミスセンス突然変異に由来してＩＣ５０＜５００ｎＭで個人的ＨＬＡ−Ａ及び−Ｂ対立遺伝子に結合すると予測されることが明らかになった。ＩＣ５０＜１５０ｎＭ及び５００ｎＭの予測ペプチドのそれぞれ約７５％及び半数（５４．５％）が、患者のＨＬＡ対立遺伝子に結合することが実験的に検証された。ＲＮＡ発現解析から、予測突然変異ペプチドに対応するコグネイト遺伝子のほぼ９０％がＣＬＬ細胞で発現したことが示され、且つ試験した３例の各々で（データは示さず）突然変異対立遺伝子からの転写物の発現が検出されたことが確認された。全ネオエピトープのごく一部のみが自然Ｔ細胞応答を生じたが、しかしながらこの応答は、移植から数年後になおも検出可能であった；全ての予測し且つ試験された突然変異ペプチドの約６％（３／４８個）又は実験的に検証され且つ試験された突然変異ペプチドの９％（３／３２個）が、患者Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌応答を刺激した。低突然変異率の腫瘍であるＣＬＬにおけるこのネオエピトープ発見率は、顕著には、高突然変異率の癌であるメラノーマで最近報告された率（４．５％、又は１１／２４７個のペプチド；Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＰＦ，Ｌｕ  ＹＣ，Ｅｌ−Ｇａｍｉｌ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ：「適合移植腫瘍応答性Ｔ細胞によって認識される突然変異抗原を同定するためのエクソームシーケンシングデータのマイニング（Ｍｉｎｉｎｇ  ｅｘｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｍｕｔａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｔｕｍｏｒ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２０１３）と同程度である。従って、低突然変異率の腫瘍を含め、幅広い癌にわたり機能的ネオエピトープを体系的に発見することができる。
【０４５１】
第２の重要な知見は、ＣＬＬネオエピトープに対するＴ細胞応答が（数年のオーダーで）長寿命で、持続的疾患寛解を伴い、且つ記憶Ｔ細胞応答と一致する時間フレームでインビトロ刺激の間に生成されたことである。これらの研究は、腫瘍ネオ抗原に対する応答が有効な免疫応答に寄与するという増えつつある文献に加わる。従って、ミスセンス突然変異から生成された予測ペプチドの約５％が検出可能なＴ細胞応答を生じたが、応答の動態は、進行中の抗白血病監視機能における可能性のある役割を示唆している。ネオ抗原特異的Ｔ細胞応答の機能的影響はＣａｓｔｌｅらの最近の研究によって裏付けられ（Ｃａｓｔｌｅ  ＪＣ，Ｋｒｅｉｔｅｒ  Ｓ，Ｄｉｅｋｍａｎｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ：「腫瘍ワクチン接種にミュータノームを利用する（Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｏｍｅ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）」．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７２：１０８１−１０９１，２０１２）、彼らはＢ１６マウスメラノーマのＷＥＳ及びペプチド−ＨＬＡ対立遺伝子結合体の予測によって候補ネオエピトープを同定した。これらの予測エピトープのサブセットは、突然変異ペプチドに特異的で且つ野生型対応物には特異的でなかった免疫応答を誘発したのみならず、また疾患を治療的及び予防的のいずれにも制御可能であった。腫瘍ネオ抗原の相対的寄与を他のタイプのＣＬＬ抗原、例えば過剰発現した又は共通の天然抗原（メラノーマと対照的に、ＣＬＬ腫瘍抗原は十分に特徴付けられていない）、又はＧｖＬ応答と直接比較することは困難であったが、長期生存のメラノーマ患者由来の抗原特異的Ｔ細胞応答の事前の特徴付けから、抗ネオ抗原免疫が、共通の過剰発現腫瘍抗原に対する免疫と比べてより長期にわたり、時間が経過しても持続することが示唆される。
【０４５２】
第三に、これらの結果は、腫瘍特異的「幹（ｔｒｕｎｋ）」突然変異を標的化することは、免疫学的観点から強い影響力を有し得るという概念を浮かび上がらせる。２人の患者における免疫原性ネオ抗原の３つ全て（突然変異ＦＮＤ３ＣＢ、ＡＬＭＳ１、Ｃ６ｏｒｆ８９）が、発癌プロセスに直接寄与しないパッセンジャー突然変異であるものと思われ、癌塊の大部分に影響を及ぼすクローナルであった。これらの免疫原性突然変異のいくつかの特徴は、それらがパッセンジャー突然変異であることを示唆している：突然変異周辺での配列保存の欠如及び観察部位における他の癌で既報告の突然変異の欠如。クローナル進化は癌の基本的特徴であるため、癌ドライバーの免疫学的ターゲティングは、それらが選択圧に直面しても維持されることを必要とし得る腫瘍機能におけるそれらの不可欠性を所与として、最小限の抗原ドリフトの利点を有し得ると仮定されている。かかる利点の可能性はあり得るが、明らかに必要条件ではない。加えて、ドライバー突然変異は必ずしも免疫原性ペプチドを生じるとは限らない。例えば、患者２におけるＴＰ５３−Ｓ８３Ｒ突然変異は、そのクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ又は−Ｂ対立遺伝子のいずれに対する＜５００ｎＭの予測エピトープも生成しなかった。
【０４５３】
最後に、文献からのネオ抗原データの結合特性（表４）並びにＣＬＬにおけるデータからの候補ネオエピトープの分析により、Ｔ細胞応答を有効に生じる可能性が最も高い点突然変異のタイプに関する概念的洞察が明らかになった。免疫原性ネオエピトープの一貫性のある特徴は予測結合親和性＜５００ｎＭ（３個中３個の免疫原性ＣＬＬペプチド及び３３個中３０個［９１％］の過去の機能性ネオエピトープ）であり、それらの大多数（９２％）が＜１５０ｎＭの予測親和性を示したことが分かった。しかしながら予想外にも、ほとんどの場合に（３個中３個の免疫原性ＣＬＬペプチド及び３３個中２７個［８２％］の過去の機能性エピトープ）、対応する野生型エピトープもまた、同等の強力な／中程度の親和性（＜１５０ｎＭ、表４のグループ１）又は弱い親和性（１５０〜５００ｎＭ、表４のグループ２）で結合することが予測された。これらのデータは、ネオ抗原に対する天然に存在するＴ細胞応答の中には、２つのタイプの突然変異が一般的に観察されるという見解を裏付ける：（１）実質的にＭＨＣ対立遺伝子に対するより良好な結合を、恐らくはＭＨＣとの相互作用の向上に起因してもたらす位置にある突然変異（突然変異ＡＬＭＳ１並びに３３個中６個（１８％）の過去の機能的に同定されたネオエピトープ［「グループ３」、表４］）、又は（２）ＭＨＣと顕著には相互作用しないが、代わりに恐らくはＴ細胞受容体結合を変化させる位置にある突然変異（（３個中２個のＣＬＬエピトープ［ＦＮＤＣ３Ｂ及びＣ６ｏｒｆ８９］及び３３個中２４個（７３％）の天然で免疫原性のネオエピトープ［「グループ１」及び「グループ２」、表４］）。これら２つのタイプの突然変異の違いは、ペプチドを「鍵」と見なすことができ、細胞溶解を刺激して突然変異がＭＨＣ又はＴＣＲ結合を独立して変化させることを可能にするためには、この鍵がＭＨＣ及びＴＣＲの両方の「鍵穴」に合わなければならないという概念と一致する。移植片対宿主病に対するマイナー組織適合抗原（ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｉｌｉｔｙ  ａｎｔｉｇｅｎ）の寄与を除き、これらの患者においては、例え突然変異ペプチドに対して反応を起こし、且つコグネイト天然ペプチドが強い結合体であると予測される患者であっても、ネオ抗原に関係付けられる自己免疫性の続発症の報告はない。この結果は、ＭＨＣ結合性天然ペプチドが通常はネガティブ選択過程に関与し、そこではそれらの天然ペプチドに応答するＴＣＲを有するＴ細胞が胸腺で欠失され又は反応不顕性にされるが、しかしＴ細胞レパートリーは、Ｔ細胞受容体に対する突然変異ペプチドの提示が変化するため、ネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｔｉｏｐｅ）ペプチドに対する特異的免疫反応の発生に適応し得るという見解と一致している。患者における各個々の腫瘍が、環境に応じて進化し続け得る幅広い共通の遺伝子変化及び個人的な遺伝子変化の両方を有し得ること、及びこの進行が、多くの場合に治療抵抗性をもたらし得ることは明らかである。腫瘍のユニークさ及び可塑性を所与とすれば、最適な治療は各腫瘍に存在する正確な突然変異に基づきカスタマイズされる必要があってよく、抵抗性を回避するため複数のノードを標的化する必要があってよい。ヒトＣＴ���の膨大なレパートリーには、複数の個別化された腫瘍抗原を標的化するような治療法を作り出せる可能性がある。上記で考察したとおり、本開示は、超並列シーケンシングを、ＨＬＡ結合ペプチドを有効に予測するアルゴリズムと組み合わせて使用して、腫瘍特異的突然変異を有するＣＴＬ標的抗原を体系的に同定可能であることを示す。有利には、本開示は、種々の突然変異率が低い癌及び高い癌における腫瘍ネオ抗原の予測を可能にし、ＣＬＬ患者において白血病ネオ抗原を標的化する長寿命のＣＴＬを実験的に同定する。本開示は、腫瘍ネオ抗原を標的化する防御免疫の存在を裏付け、個別化された腫瘍ワクチン用のネオ抗原の選択方法を提供する。
【０４５４】
上記に詳細に考察したとおり、本明細書に記載される技法を、同種ＨＳＣＴ後の抗腫瘍免疫応答を伴う臨床的に明らかな長期寛解を生じたＣＬＬ患者のユニークな群に適用した。これらの移植片対白血病応答は、典型的には、造血細胞を標的化するアロ反応性免疫応答に起因している。しかしながらｄ上述の結果は、ＧｖＬ応答が、個人的白血病ネオ抗原を認識するＣＴＬにも関連付けられることを示している。これらの結果は、アロ抗原よりむしろ、腫瘍に対して特異性を有するＧｖＬ関連ＣＴＬの存在を示すデータと一致する。ネオ抗原応答性ＣＴＬは癌監視に重要であると仮定されており、これは、長期メラノーマ生存者の研究から、ネオ抗原を標的化するＣＴＬが、非突然変異過剰発現腫瘍抗原に対するものと比べて有意に豊富にあり、持続性であることが分かったためである（Ｌｅｎｎｅｒｚ  Ｖ，Ｆａｔｈｏ  Ｍ，Ｇｅｎｔｉｌｉｎｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ：「ヒトメラノーマに対する自己Ｔ細胞の応答は突然変異ネオ抗原により支配される（Ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｓ  ｄｏｍｉｎａｔｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ）」．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０２：１６０１３−８，２００５）。上記に提供するデータはこのメラノーマ研究と一致し、なぜならＣＬＬ患者におけるネオ抗原特異的Ｔ細胞応答は（それらの迅速なインビトロ刺激動態に基づけば）長寿命な（数年のオーダーで）記憶Ｔ細胞であり、且つ持続的疾患寛解と関連付けられることが分かったためである。従って、ネオ抗原応答性ＣＴＬは、移植ＣＬＬ患者の白血病の管理において積極的な役割を果たす可能性がある。
【０４５５】
より一般的には、多くの腫瘍にわたるネオ抗原の存在量を推定し、点突然変異当たり約１．５個のＩＣ５０＜５００ｎＭのＨＬＡ結合ペプチド及びフレームシフト突然変異当たり約４個の結合ペプチドであることが分かった。予想どおり、予測ＨＬＡ結合ペプチド率は腫瘍型当たりの体細胞突然変異率を反映した（例えば、図２０を参照）。２つの手法を用いて予測結合親和性とＣＴＬを誘導する免疫原性ネオ抗原との間の関係を調べた。既発表の免疫原性腫瘍ネオ抗原（即ち患者において応答性ＣＴＬが観察されたもの）に上述の技法を適用し、機能性ネオ抗原の大多数（９１％）がＩＣ５０＜５００ｎＭでＨＬＡに結合すると予測されることが実証された（野生型対応エピトープの約７０％は同程度の親和性で結合することが予測される）（例えば、表４を参照）。この試験はネオ抗原のゴールドスタンダードセットを使用し、本明細書に記載される技法が真陽性を正しく分類することが確認された。プロスペクティブなネオエピトープ予測と、続く機能検証から、予測されたエピトープの６％（３／４８個）が患者においてネオ抗原特異的Ｔ細胞応答に関連したことが示された−これは最近メラノーマで見出された４．８％の率と同等であった。低比率が必ずしもアルゴリズムの低い予測精度を意味するものではない。むしろ、真のネオ抗原の数は以下の理由から大幅に過小評価される：（ｉ）同種ＨＳＣＴは、少数のネオ抗原特異的Ｔ細胞記憶クローンのみを誘導する可能性が高い一般的な細胞療法である；及び（ｉｉ）標準的なＴ細胞拡大方法は、レパートリーの非常に大きい部分に相当するが、しかしはるかに低い前駆体頻度であるナイーブＴ細胞を検出するのに十分な感度を有しない。ネオＯＲＦを標的化するＣＴＬの頻度はまだ計測されていないが、本発明の範囲内で、このネオ抗原クラスは特異性がより高く（野生型対応物を欠いていることで）且つ免疫原性がより高い（胸腺トレランスを回避する結果として）と見られるため、優れた候補ネオエピトープであり得ることが特に企図される。
【０４５６】
本開示は、進行中である極めて強力なワクチン接種試薬の開発によって、腫瘍ネオ抗原に対する免疫を有効に刺激する個別化癌ワクチンの生成を実現可能にする技法を提供する。
【０４５７】
材料及び方法
患者試料：ダナ・ファーバー癌研究所（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＤＦＣＩ）の臨床研究プロトコルに登録された患者からヘパリン添加血液を採取した。全ての臨床プロトコルはＤＦＣＩヒト被験者保護委員会（Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。患者試料由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心法により単離し、１０％ＤＭＳＯで凍結保存し、分析時まで気相液体窒素中に保管した。一部の患者について、分子タイピング又は血清学的タイピングのいずれかによりＨＬＡタイピングを実施した（組織タイピング研究所（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院（Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）。
【０４５８】
ＣＬＬ及び他の癌の全エクソームキャプチャーシーケンシングデータ：ｄｂＧａＰデータベースからメラノーマに関するリストを入手し（ｐｈｓ０００４５２．ｖ１．ｐ１）、ＴＣＧＡ（Ｓａｇｅ  Ｂｉｏｎｅｔｗｏｒｋｓのシナプスリソース（ワールドワイドウェブ上の（ｗｗｗ）ｓｙｎａｐｓｅ．ｏｒｇ／＃！Ｓｙｎａｐｓｅ：ｓｙｎ１７２９３８３にある）から利用可能）を通して１１種の他の癌に関して入手した。二段階の尤度に基づく手法を用いてこれらの１３種の腫瘍型にわたる２４８８個の試料のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ遺伝子座をシーケンシングした。このデータを表１４にまとめる。簡潔に言えば、ＩＭＧＴデータベースに基づき、全ての既知のＨＬＡ対立遺伝子（６５９７個のユニークなエントリ）からなる専用の配列ライブラリを構築した。このリソースから、３８ｍｅｒの二次ライブラリを作成し、ＨＬＡ遺伝子座から生じる推定リードを全配列リードから、それに対する完全一致に基づき抽出した。次に抽出されたリードを、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎソフトウェア（ワールドワイドウェブ上の（ｗｗｗ）ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにある）を使用してＩＭＧＴベースのＨＬＡ配列ライブラリとアラインメントし、二段階尤度計算によってＨＬＡ対立遺伝子を推測した。第一段階では、集団ベースの頻度を各対立遺伝子の事前尤度として使用し、アラインメントしたリードのクオリティ及び挿入サイズ分布に基づき事後尤度を計算した。ＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣ遺伝子の各々について最も高い尤度の対立遺伝子を第１の対立遺伝子セットとして同定した。次に第１の勝者セットと併せた尤度計算値の発見的重み付け戦略を使用して、第２の対立遺伝子セットを同定した。
【０４５９】
表１４は、癌間でのネオ抗原負荷推定値に関するＴＣＧＡ患者ＩＤを示す。ＬＵＳＣ（肺扁平上皮癌）、ＬＵＡＤ（肺腺癌）、ＢＬＣＡ（膀胱）、ＨＮＳＣ（頭頸部）、ＣＯＡＤ（結腸）及びＲＥＡＤ（直腸）、ＧＢＭ（膠芽腫）、ＯＶ（卵巣の）、ＲＣＣ（腎明細胞癌）、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）及びＢＲＣＡ（乳房）。
【０４６０】
【表２７】
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【０４６１】
【表２８】
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【０４６２】
【表２９】
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【０４６３】
【表３０】
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【０４６４】
【表３１】
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【０４６５】
【表３２】
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【０４６６】
【表３３】
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【０４６７】
【表３４】
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【０４６８】
【表３５】
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【０４６９】
【表３６】
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【０４７０】
【表３７】
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【０４７１】
【表３８】
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【０４７２】
【表３９】
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【０４７３】
【表４０】
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【０４７４】
【表４１】
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【０４７５】
【表４２】
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【０４７６】
【表４３】
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【０４７７】
【表４４】
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【０４７８】
【表４５】
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【０４７９】
【表４６】
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【０４８０】
【表４７】
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【０４８１】
【表４８】
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【０４８２】
【表４９】
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【０４８３】
【表５０】
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【０４８４】
【表５１】
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【０４８５】
【表５２】
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【０４８６】
【表５３】
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【０４８７】
【表５４】
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【０４８８】
【表５５】
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【０４８９】
【表５６】
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【０４９０】
【表５７】
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【０４９１】
【表５８】
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【０４９２】
【表５９】
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【０４９３】
【表６０】
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【０４９４】
【表６１】
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【０４９５】
【表６２】
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【０４９６】
【表６３】
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【０４９７】
【表６４】
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【０４９８】
【表６５】
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【０４９９】
【表６６】
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【０５００】
【表６７】
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【０５０１】
【表６８】
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【０５０２】
【表６９】
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【０５０３】
【表７０】
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【０５０４】
【表７１】
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【０５０５】
【表７２】
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【０５０６】
【表７３】
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【０５０７】
【表７４】
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【０５０８】
【表７５】
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【０５０９】
【表７６】
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【０５１０】
【表７７】
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【０５１１】
【表７８】
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【０５１２】
【表７９】
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【０５１３】
【表８０】
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【０５１４】
【表８１】
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【０５１５】
【表８２】
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【０５１６】
個人的ＨＬＡ対立遺伝子に結合性を有する遺伝子突然変異由来のペプチドを予測するためのパイプライン：ＮｅｔＭＨＣｐａｎ（バージョン２．４）を使用して、各体細胞突然変異から生成された可能な全ての９ｍｅｒ及び１０ｍｅｒペプチド並びに対応する野生型ペプチドにわたりＭＨＣ結合親和性を予測した。これらのタイリングしたペプチドを、患者のＨＬＡプロファイルにおける各クラスＩ対立遺伝子に対するそれらの結合親和性（ＩＣ５０ｎＭ）に関して分析した。１５０ｎＭ未満のＩＣ５０値は、予測される強力乃至中程度の結合体と見なし、１５０〜５００ｎＭのＩＣ５０は、予測される弱い結合体と見なし、一方、ＩＣ５０＞５００ｎＭは非結合体と見なした。ＨＬＡ分子に結合（ＩＣ５０＜５００ｎＭ）する予測ペプチドの実験的な確認を、競合的ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子結合アッセイを用いて行い、これは他の部分に詳細に記載されている（Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．２８及びＳｉｄｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。
【０５１７】
抗原の供給源：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｇａｒｄｎｅｒ，ＭＡ）；又はＲＳ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）からペプチドを＞９５％純度（高速液体クロマトグラフィーによって確認した）に合成した。ペプチドをＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍｌ）中に再構成し、使用時まで−８０℃で保存した。ｍｕｔ又はｗｔ  ＦＮＤＣ３Ｂを包含する３００ｂｐの配列で構成されたミニ遺伝子を、以下のプライマーを使用して患者２の腫瘍から発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にＰＣＲクローニングした：５’プライマー：ＧＡＣＧＴＣＧＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＣＣＧＧＡＡＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＧ；３’プライマー：ＣＣＣＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＡＴＴＣＴＡＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＧＴＡＡＡ。Ａｍａｘａヌクレオフェクション（溶液Ｖ、プログラムＴ１６、Ｌｏｎｚａ  Ｉｎｃ；Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）によってＨＬＡ−Ａ２を安定にトランスフェクトされた２００万個のＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ）に２０μｇのこのプラスミドを導入することにより、ミニ遺伝子を抗原提示標的細胞で発現させた。１０％ウシ胎仔血清（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、１％ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、及び１％Ｌ−グルタミン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を補足したＲＰＭＩ培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）で細胞をインキュベートした。ヌクレオフェクションの２日後に免疫アッセイのため細胞を回収した。
【０５１８】
ＣＬＬ症例における遺伝子発現の解析：既報告のマイクロアレイデータ（ＮＣＩ遺伝子発現オムニバス（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ）受託番号ＧＳＥ３７１６８）を再解析した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣＥＬファイルを、Ｒのａｆｆｙパッケージを使用して処理した。バックグラウンド補正に、観察された強度を指数分布シグナルと正規分布ノイズとの混合としてモデル化するロバストマルチチップ解析（Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉｃｈｉｐ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＲＭＡ）アルゴリズムを使用した。この後、アレイ間の四分位正規化によって異なる条件下での遺伝子発現の比較を促進した。最後にメディアンポリッシュ法を用いて個々のプローブレベルを要約し、ロバストなプローブセットレベル値を求めた。遺伝子レベル値は、各遺伝子について最大平均発現を有するプローブを選択することにより得た。Ｃｏｍｂａｔプログラムを使用してデータのバッチ効果を取り除いた。
【０５１９】
患者ＰＢＭＣからの抗原特異的Ｔ細胞の作成及び検出：３％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、１％Ｌ−グルタミン及び１％ＨＥＰＥＳ緩衝液を補足したＲＰＭＩ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中において１２０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ及び７０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の存在下で培養した免疫磁気分離ＣＤ１４＋細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ａｕｂｕｒｎ  ＣＡ）から、自己樹状細胞（ＤＣ）を作成した。３日目及び５日目、さらなるＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を添加した。６日目、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの添加に加え、細胞を３０μｇ／ｍｌポリＩ：Ｃ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に曝露して成熟を生じさせた（４８時間）。患者ＰＢＭＣから免疫磁気選択法（ＣＤ１９＋マイクロビーズ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によってＣＤ１９＋Ｂ細胞を単離し、２４ウェルプレートに１×１０６細胞／ウェルで播種した。Ｂ細胞を、１０％ヒトＡＢ血清（ＧｅｍＣｅｌｌ、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）、５μｇ／ｍＬインスリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１５μｇ／ｍＬゲンタマイシン、ＩＬ−４（２ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及びＣＤ４０Ｌ−Ｔｒｉ（１μｇ／ｍｌ）を補足したＢ細胞培地（イスコフ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）で培養した。３〜４日おきにＣＤ４０Ｌ−Ｔｒｉを補充した。一部の実験については、ＣＤ４０Ｌ−Ｔｒｉで活性化して拡大したＣＤ１９＋Ｂ細胞をＡＰＣとして使用した。
【０５２０】
患者ＰＢＭＣからの抗原特異的Ｔ細胞の作成：ＣＬＬ患者からペプチド応答性Ｔ細胞を作成するため、移植前及び移植後ＰＢＭＣから免疫磁気選択したＣＤ８＋Ｔ細胞（５×１０６／ウェル）を（ＣＤ８＋マイクロビーズ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）、それぞれ自己ペプチドプールでパルスしたＤＣ（４０：１比）又はＣＤ４０Ｌ−Ｔｒｉで活性化して照射したＢ細胞（４：１比）と共に、１０％ＦＢＳ及び５〜１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−７、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５を補足した完全培地中で培養した。ＡＰＣはペプチドプール（１０μＭ／ペプチド／プール）で３時間パルスした。ＣＤ８＋Ｔ細胞はＡＰＣで毎週刺激し直した（１〜３週間にわたり、７日目に開始）。
【０５２１】
抗原特異的Ｔ細胞の検出：２回目及び４回目の刺激から１０日後、ペプチドプールに対するＴ細胞特異性をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより試験した。ＥＬＩＳＰＯＴプレートで５０，０００個のＣＤ８＋Ｔ細胞／ウェル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）と２４時間コインキュベートした、試験及び対照ペプチドでパルスしたＣＤ４０Ｌ活性化Ｂ細胞（５０，０００細胞／ウェル）を使用して、ＩＦＮ−γ放出を検出した。捕捉抗体及び検出抗体を使用して指示通りに（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ、Ｍａｒｉｅｍｏｎｔ，ＯＨ）ＩＦＮ−γを検出し、イメージングした（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔシリーズアナライザー；Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）。ＭＨＣクラスＩに対するＴ細胞応答性の依存性を試験するため、初めに、クラスＩ遮断抗体（Ｗ６／３２）と３７℃で２時間コインキュベートしたＡＰＣでＥＬＩＳＰＯＴプレートをコーティングし、その後、ウェルにＴ細胞を導入した。ＭＨＣクラスＩ四量体を使用して指示通り（Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ａｔｌａｎｔａ  ＧＡ）Ｔ細胞の特異性を試験した。四量体染色のため、５×１０５細胞を１μｇ／ｍＬ  ＰＥ標識四量体と４℃で６０分間インキュベートし、次に抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ８−ＡＰＣ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を添加して４℃でさらに３０分間インキュベートした。試料当たり最低１００，０００個のイベントが取得された。Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスビーズベースの技術を用いて、製造者の推奨（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に従い培養上清を分析することにより、培養ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−２の分泌を検出した。端的には、蛍光標識したマイクロスフェアを特異的サイトカイン捕捉抗体でコーティングした。培養上清試料とインキュベートした後、捕捉されたサイトカインをビオチン化検出抗体と、続いてストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲートによって検出し、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を計測した（Ｌｕｍｉｎｅｘ  ２００ビーズアレイ機器；Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ）。標準曲線に基づきサイトカインレベルをビーズビューソフトウェア（Ｂｅａｄ  Ｖｉｅｗ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）プログラム（Ｕｐｓｔａｔｅ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で計算した。ＴＣＲ  Ｖβクロノタイプの検出及び定量化については、ＩＦＮ−γ分泌アッセイ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を製造者の指示に従い及び先述のとおり用いて患者２のＴ細胞系からｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ特異的Ｔ細胞をエンリッチした。
【０５２２】
統計的考察：ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＬ−２放出の形態のｍｕｔ対ｗｔペプチドに対するＴ細胞応答性に関して二元配置ＡＮＯＶＡモデルを構築し、これには適宜、相互作用項と共に固定効果として濃度及び突然変異状態を含めた。これらのモデルのＰ値は、テューキー法を用いた事後多重比較のため調整した。ＩＦＮ−γを正規化して比較するため、ｔ検定を実施して、正規化した比が１に等しいという仮説を検証した。群間における連続計測値の他の比較については、ウエルチｔ検定を使用した。報告される全てのＰ値は両側性であり、多重比較のための適切な調整を伴い０．０５水準で有意と見なした。分析はＳＡＳ  ｖ９．２で実施した。
【０５２３】
ＴＣＲ  Ｖβクロノタイプの検出及び定量化：ｍｕｔ−ＦＮＤＣ３Ｂ特異的ＴＣＲ  Ｖβを検出するため、ペプチド特異的ＩＦＮ−γがエンリッチされたＴ細胞集団からの二段階ネステッドＰＣＲを実施した。簡単に言えば、２４個の既知のＶβサブファミリーの中に優位なＶβサブファミリーが同定された。初めに、Ｖβフォワードプライマーの５つのプール（プール１：Ｖβ１〜５．１；プール２：Ｖβ５．２〜９；プール３：Ｖβ１０〜１３．２；プール４：Ｖβ１４〜１９；及びプール５：Ｖβ２０、２２〜２５）を作成した。Ｔ細胞クローンから抽出したＲＮＡ（ＱＩＡａｍｐ  ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉキット；Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を、ランダムヘキサマーを使用してｃＤＮＡに逆転写し（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、５つの別個の２０μｌ容積反応液中でＰＣＲ増幅した。第二に、Ｔ細胞クローン由来ｃＤＮＡを再度増幅し、５つの個々のプライマーの各々がＦＡＭコンジュゲートＣβリバース（内部）プライマーと一緒に陽性プール中に含まれた。続いて、４μｌのこのＰＣＲ産物を、１μｌのクローンＣＤＲ３領域特異的プライマー及びプローブ、並びに１０μｌのＴａｑｍａｎ  ＦａｓｔユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって合計２０μｌの容積で増幅した。ＰＣＲ増幅条件は以下であった：９５℃で２０分×１サイクル、及び９５℃で３秒と、続いて６０℃で３０秒を４０サイクル（７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲサイクラー；Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。試験転写物を、以前記載されているとおり２＾（Ｓ１８  ｒＲＮＡ  ＣＴ−標的ＣＴ）を計算することによりＳ１８リボソームＲＮＡ転写物に対して定量化した。
【０５２４】
分子腫瘍量の検出：先述のとおり、ＶＨ特異的ＰＣＲプライマーのパネルを使用して患者２のクロノタイプＩｇＨ配列を同定した。この配列に基づき、定量的Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲアッセイを、配列特異的プローブが接合部多様性領域に位置するように設計した（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。このＴａｑｍａｎアッセイを腫瘍のｃＤＮＡに適用した。ＰＣＲ反応は全て、以下からなった：５０℃で１分×１サイクル、９５℃で１０分×１サイクル、及び９５℃で１５秒と、続く６０℃で１分を４０サイクル。反応は全て、７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して実施した。試験転写物はＧＡＰＤＨに対して定量化した。
【０５２５】
参考文献
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Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ  ＡＭ，Ｓｕｃｉｕ  Ｓ，Ｔｅｓｔｏｒｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｕｌｃｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｇｅ  ａｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｒｉａｌｓ  ＥＯＲＴＣ  １８９５２  ａｎｄ  ＥＯＲＴＣ  １８９９１．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｊａｎ  ２０１２；４８（２）：２１８−２２５．
Ｓｏｓｍａｎ  ＪＡ，Ｍｏｏｎ  Ｊ，Ｔｕｔｈｉｌｌ  ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｐｈａｓｅ  ２  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｔａｇｅ  ＩＶ  ｍｅｌａｎｏｍａ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｓ９４３０．Ｃａｎｃｅｒ．Ｏｃｔ  １５  ２０１１；１１７（２０）：４７４０−４７０６．
Ｆｌａｈｅｒｔｙ  ＫＴ，Ｈｏｄｉ  ＦＳ，Ｆｉｓｈｅｒ  ＤＥ．Ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｄｒｕｇｓ：ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｍａｙ  ２０１２；１２（５）：３４９−３６１．
Ｍｏｃｅｌｌｉｎ  Ｓ，Ｐａｓｑｕａｌｉ  Ｓ，Ｒｏｓｓｉ  ＣＲ，Ｎｉｔｔｉ  Ｄ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｍｅｌａｎｏｍａ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ａｐｒ  ７  ２０１０；１０２（７）：４９３−５０１．
Ｐｉｒａｒｄ  Ｄ，Ｈｅｅｎｅｎ  Ｍ，Ｍｅｌｏｔ  Ｃ，Ｖｅｒｅｅｃｋｅｎ  Ｐ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ  ａｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｐｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ：ａ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．２００４；２０８（１）：４３−４８．
Ｗｈｅａｔｌｅｙ  Ｋ，Ｉｖｅｓ  Ｎ，Ｈａｎｃｏｃｋ  Ｂ，Ｇｏｒｅ  Ｍ，Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ  Ａ，Ｓｕｃｉｕ  Ｓ．Ｄｏｅｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ａ  ｗｏｒｔｈｗｈｉｌｅ  ｂｅｎｅｆｉｔ？  Ａ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｔｒｉａｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ａｕｇ  ２００３；２９（４）：２４１−２５２．
Ｂｕｃｋｗａｌｔｅｒ  ＭＲ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ＰＫ．“Ｉｔ  ｉｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ｓ），ｓｔｕｐｉｄ”ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｏｖｅｒ  ａ  ｄｅｃａｄｅ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｏｃｔ  ２００８；２０（５）：２９６−３００．
Ｂａｕｒａｉｎ  ＪＦ，Ｃｏｌａｕ  Ｄ，ｖａｎ  Ｂａｒｅｎ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｔｉ−ｍｅｌａｎｏｍａ  ＣＴＬ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｎｅｗ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ｇｅｎｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｊｕｎ  １  ２０００；１６４（１１）：６０５７−６０６６．
Ｃｈｉａｒｉ  Ｒ，Ｆｏｕｒｙ  Ｆ，Ｄｅ  Ｐｌａｅｎ  Ｅ，Ｂａｕｒａｉｎ  ＪＦ，Ｔｈｏｎｎａｒｄ  Ｊ，Ｃｏｕｌｉｅ  ＰＧ．Ｔｗｏ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｏｎ  ａ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｒｅｓｕｌｔ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｎｏｖ  １５  １９９９；５９（２２）：５７８５−５７９２．
Ｈｕａｎｇ  Ｊ，Ｅｌ−Ｇａｍｉｌ  Ｍ，Ｄｕｄｌｅｙ  ＭＥ，Ｌｉ  ＹＦ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ，Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＰＦ．Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤＫＮ２Ａ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ｌｏｃｕｓ  ａｎｄ  ａ  ｍｕｔａｔｅｄ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍａｙ  １５  ２００４；１７２（１０）：６０５７−６０６４．
Ｋａｒａｎｉｋａｓ  Ｖ，Ｃｏｌａｕ  Ｄ，Ｂａｕｒａｉｎ  ＪＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｗｉｔｈ  ＨＬＡ  ｔｅｔｒａｍｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｏｆ  ａ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｌｏｎｇ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｍａｙ  １  ２００１；６１（９）：３７１８−３７２４．
Ｌｅｎｎｅｒｚ  Ｖ，Ｆａｔｈｏ  Ｍ，Ｇｅｎｔｉｌｉｎｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｓ  ｄｏｍｉｎａｔｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．Ｎｏｖ  １  ２００５；１０２（４４）：１６０１３−１６０１８．
Ｚｏｒｎ  Ｅ，Ｈｅｒｃｅｎｄ  Ｔ．Ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ａ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｔａｒｇｅｔｓ  ａ  ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｆｅｂ  １９９９；２９（２）：５９２−６０１．
Ｋａｎｎａｎ  Ｓ，Ｎｅｅｌａｐｕ  ＳＳ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ  ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｏｃｔ  ２００９；４（４）：１８９−１９５．
Ｋｅｎｔｅｒ  ＧＧ，Ｗｅｌｔｅｒｓ  ＭＪ，Ｖａｌｅｎｔｉｊｎ  ＡＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔｒｉａｌ  ｗｉｔｈ  ｌｏｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅ６  ａｎｄ  Ｅ７  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  １６  ｉｎ  ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｓｈｏｗｓ  ｌｏｗ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｏｂｕｓｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｊａｎ  １  ２００８；１４（１）：１６９−１７７．
Ｋｅｎｔｅｒ  ＧＧ，Ｗｅｌｔｅｒｓ  ＭＪ，Ｖａｌｅｎｔｉｊｎ  ＡＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＰＶ−１６  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｖｕｌｖａｒ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｎｏｖ  ５  ２００９；３６１（１９）：１８３８−１８４７．
Ｗｅｌｔｅｒｓ  ＭＪ，Ｋｅｎｔｅｒ  ＧＧ，Ｐｉｅｒｓｍａ  ＳＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ４＋  ａｎｄ  ＣＤ８＋  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｂｙ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  Ｅ６  ａｎｄ  Ｅ７  ｌｏｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｊａｎ  １  ２００８；１４（１）：１７８−１８７．
Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  Ｃ，Ｌｕｎｄ  Ｏ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｍ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｎｏｖ  ３０  ２０１１；３７４（１−２）：２６−３４．
Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ＲＤ，Ｏｌｄ  ＬＪ，Ｓｍｙｔｈ  ＭＪ．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ：ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ’ｓ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｍａｒ  ２５  ２０１１；３３１（６０２４）：１５６５−１５７０．
Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｌａｎｏｍａ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ＰＲＥＸ２  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８５，５０２−６（２０１２）．
Ｃａｒｔｅｒ，ＳＬ．ｅｔ  ａｌ．Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ＤＮＡ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３０，４１３−２１（２０１２）．
Ｃｈａｐｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｉｔｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７１，４６７−７２（２０１１）．
Ｃｉｂｕｌｓｋｉｓ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．ＣｏｎｔＥｓｔ：ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｃｒｏｓｓ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｉｎ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７，２６０１−２（２０１１）．
Ｃｉｂｕｌｓｋｉｓ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｍｐｕｒｅ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｓａｍｐｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２０１３）Ｆｅｂ  １０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２５１４．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］．
ＤｅＬｕｃａ，ＤＳ．ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ−ＳｅＱＣ：ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｍｅｔｒｉｃｓ  ｆｏｒ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２８，１５３０−２（２０１２）．
ＤｅＰｒｉｓｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４３，４９１−４９８（２０１１）．
Ｌａｎｄａｕ，ＤＡ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｓｕｂｃｌｏｎａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｃｅｌｌ  １５２，７１４−２６（２０１３）．
Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０，Ｒ２５（２００９）．
Ｌｉ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．ＲＳＥＭ：ａｃｃｕｒａｔｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｄａｔａ  ｗｉｔｈ  ｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｏｍｅ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １２，３２３（２０１１）．
Ｌｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐ  ｆｏｒｍａｔ  ａｎｄ  ＳＡＭｔｏｏｌｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，２０７８−９（２００９）．
Ｌｉ  Ｈ．ａｎｄ  Ｄｕｒｂｉｎ  Ｒ．Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，１７５４−６０（２００９）．
ＭｃＫｅｎｎａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｋｉｔ：ａ  ＭａｐＲｅｄｕｃｅ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２０，１２９７−３０３（２０１０）．
Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ＪＴ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｖｉｅｗｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２９，２４−２６（２０１１）．
Ｓｔｒａｎｓｋｙ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３，１１５７−６０（２０１１）．
Ｇａｒｒａｗａｙ，Ｌ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ，Ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｃｅｌｌ．１５３，１７−３７（２０１３）．
Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．３７４，２６−３４（２０１１）．
Ｓｅｔｔｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３，５５８６−５５９２（１９９４）．
Ｌｕ，Ｙ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ  １ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ  Ｉｓ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｅｄ  Ｔｏ  Ｔｒｅａｔ  ａ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｗｈｏ  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄ  ａ  Ｄｕｒａｂｌｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０，６０３４−６０４２（２０１３）．
Ｓｙｋｕｌｅｖ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｎ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  ｃａｎ  ｅｌｉｃｉｔ  ａ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．４，５６５−５７１（１９９６）．
Ｃａｒｔｅｒ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ＤＮＡ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０：４１３−２１（２０１２）．
Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｓｕｐｅｒｔｙｐｅｓ：ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ａｎｄ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，１（２００８）．
Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ．４８９，５１９−５２５（２０１２）．
Ｄｉｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｋｅｙ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ．４５５，１０６９−１０７５（２００８）．
Ｓｔｒａｎｓｋｙ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３，１１５７−１１６０（２０１１）．
Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ．４８７，３３０−３３７（２０１２）．
Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｎａｔｕｒｅ．４５５，１０６１−１０６８（２００８）．
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ．４７４，６０９−６１５（Ｊｕｎ  ３０，２０１１）．
Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ．４９９，４３−４９（２０１３）．
Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ  ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３６８，２０５９−２０７４（２０１３）．
Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｏｒｔｒａｉｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ．４９０，６１−７０（２０１２）．
【０５２６】
他の実施形態
前述の記載から、本明細書に記載される発明の変形及び改良を行い、それを様々な使用及び条件に適合（ａｄｏｐｔ）させ得ることは明らかであろう。かかる実施形態もまた以下の特許請求の範囲内にある。
【０５２７】
本明細書の可変物の任意の定義において要素を列挙する記載は、列挙される要素の任意の単一の要素又は組み合わせ（又は部分的組み合わせ）としての当該の可変物の定義を含む。本明細書の実施形態の記載は、任意の単一の実施形態として又は任意の他の実施形態若しくはその一部との組み合わせでの当該の実施形態を含む。
【０５２８】
参考文献の援用
本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、各々独立した特許及び刊行物が参照による援用を具体的且つ個々に指示されたものとする場合と同程度まで参照により本明細書に援用される。
【図１】
0006702855.tif 000084
【図２】
0006702855.tif 000085
【図３】
0006702855.tif 000086
【図４】
0006702855.tif 000087
【図５】
0006702855.tif 000088
【図６】
0006702855.tif 000089
【図７】
0006702855.tif 000090
【図８】
0006702855.tif 000091
【図９】
0006702855.tif 000092
【図１０】
0006702855.tif 000093
【図１１Ａ】
0006702855.tif 000094
【図１１Ｂ】
0006702855.tif 000095
【図１１Ｃ】
0006702855.tif 000096
【図１２ＡＢ】
0006702855.tif 000097
【図１２ＣＤ】
0006702855.tif 000098
【図１３】
0006702855.tif 000099
【図１４ＡＢ】
0006702855.tif 000100
【図１４Ｃ】
0006702855.tif 000101
【図１５】
0006702855.tif 000102
【図１６】
0006702855.tif 000103
【図１７ＡＢ】
0006702855.tif 000104
【図１７Ｃ】
0006702855.tif 000105
【図１７Ｄ】
0006702855.tif 000106
【図１７ＥＦ】
0006702855.tif 000107
【図１７Ｇ】
0006702855.tif 000108
【図１８】
0006702855.tif 000109
【図１９Ａ】
0006702855.tif 000110
【図１９Ｂ】
0006702855.tif 000111
【図１９Ｃ】
0006702855.tif 000112
【図１９Ｄ】
0006702855.tif 000113
【図２０Ａ】
0006702855.tif 000114
【図２０Ｂ】
0006702855.tif 000115
【図２０ＣＤ】
0006702855.tif 000116
【図２０Ｅ】
0006702855.tif 000117
【図２０ＦＧ】
0006702855.tif 000118
【配列表】
0006702855000001.app