(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
陰イオン交換カラムをｐＨ４．９以上６．８以下である第１の溶液で平衡化する工程と、
前記陰イオン交換カラムにアルブミンを含む生体試料を注入し、前記第１の溶液で前記アルブミンを酸化型アルブミンと還元型アルブミンに分離させる工程と、
を備えることを特徴とする酸化型及び還元型アルブミンの分析方法。
【請求項２】
さらに、陰イオン交換カラムを用いた液体クロマトグラフィーにおいて、前記陰イオン交換カラムに注入された前記アルブミンを２価の塩化物を含む第２の溶液を用いて、グラジエント法により溶出させる工程を備える、請求項１に記載の酸化型及び還元型アルブミンの分析方法。
【請求項３】
陰イオン交換カラムと、
前記陰イオン交換カラムを平衡化し、生体試料中の酸化型アルブミンと還元型アルブミンを分離するためのｐＨ４．９以上６．８以下である第１の溶液と、
アルブミンを含む試料を注入するための試料注入装置と、
酸化型及び還元型アルブミンを検出するための検出装置と、
前記検出装置において測定された結果を演算するデータ処理装置と、
を備えることを特徴とする酸化型及び還元型アルブミンの分析装置。
【請求項４】
さらに、前記陰イオン交換カラムに吸着及び分離されたアルブミンを溶出させるための２価の塩化物を含む第２の溶液を備える、請求項３に記載の酸化型及び還元型アルブミンの分析装置。
【請求項５】
前記陰イオン交換カラムが第３級アミン基を有するイオン交換樹脂を含む、請求項３又は４に記載の酸化型及び還元型アルブミンの分析装置。
【請求項６】
液体クロマトグラフ用の陰イオン交換カラムと、
液体クロマトグラフを平衡化し、生体試料中の酸化型アルブミンと還元型アルブミンを分離するためのｐＨ４．９以上６．８以下である第１の溶液と、
アルブミンを溶出させるための２価の塩化物を含む第２の溶液と、
を備えることを特徴とする酸化型及び還元型アルブミンの分析キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化型及び還元型アルブミンの分析方法、酸化型及び還元型アルブミンの分析装置、及び酸化型及び還元型アルブミンの分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
酸化ストレスは様々な原因で発生し、例えば、呼吸、白血球等による異物や細菌の処理、薬物の代謝処理等の生理的因子；虚血再還流、過度の運動、精神的又は肉体的ストレス、感染、炎症等の病的因子；喫煙、紫外線、放射線、大気汚染、重金属等の外的因子等が挙げられる。抗酸化防御機構の消去能力を上回る酸化ストレスは、タンパク質、脂質、糖、核酸等の生体分子を酸化修飾し、生理機能の低下、疾病の発症や進行、老化などの一因となることが報告されている。よって、酸化ストレスが一因とされる疾病の治療法や新規治療法開発に、レドックス制御機構が着目されている。
【０００３】
生体内のレドックス状態を評価する指標として、酸化型及び還元型アルブミンの測定値、又それらの比率（％）が有用であることが知られており、これまで様々な測定法が提案されてきた。
例えば、特許文献１は、分子ふるいカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる酸化型及び還元型アルブミンの分析方法が開示されている。また、特許文献２には、条件を最適化したイオン交換カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる酸化型及び還元型アルブミンの分析方法が開示されている。
【０００４】
また、特許文献３には、液体クロマトグラフィー質量分析計（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＬＣ−ＭＳ）を用いて、酸化型及び還元型アルブミンを分析する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６１−１５５３９７号公報
【特許文献２】特公平２−４８０６３号公報
【特許文献３】特許第５０２４０４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１では、５０〜２００ｃｍの長さのカラムを用いて長時間かけて分析する必要があり、さらに、分離が不十分である。
また、特許文献２では、１０ｃｍ以上の長さのカラムを用いて長時間かけて分析する必要がある。さらに、カラムに対する吸着が強いアルブミンをカラムから容易に溶出させるために、酸化型及び還元型アルブミンの分離にはかならずしも最適ではないｐＨ４．８の溶媒液を分離用の第１液に使用している。そして、溶出力を高めるために、エタノール等の有機溶媒を含む溶出用の第２液に使用し、３段階のステップグラジエント法で溶出している。このため、測定が複雑で時間がかかり、分離効率が悪い。
また、特許文献３では、酸化型及び還元型アルブミンを分析するためにＬＣ−ＭＳを使用しているが、装置が高価であり、日常の臨床検査等で実用的且つ簡便に用いるためには、操作性に欠けている。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、短時間且つ簡便で高精度な酸化型及び還元型アルブミンの分析方法及び分析装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］陰イオン交換カラムをｐＨ４．９以上６．８以下である第１の溶液で平衡化する工程と、前記陰イオン交換カラムにアルブミンを含む生体試料を注入し、前記第１の溶液で前記アルブミンを酸化型アルブミンと還元型アルブミンに分離させる工程と、を備えることを特徴とする酸化型及び還元型アルブミンの分析方法。
［２］さらに、陰イオン交換カラムを用いた液体クロマトグラフィーにおいて、前記陰イオン交換カラムに注入された前記アルブミンを２価の塩化物を含む第２の溶液を用いて、グラジエント法により溶出させる工程を備える、［１］に記載の酸化型及び還元型アルブミンの分析方法。
［３］陰イオン交換カラムと、前記陰イオン交換カラムを平衡化し、生体試料中の酸化型アルブミンと還元型アルブミンを分離するためのｐＨ４．９以上６．８以下である第１の溶液と、アルブミンを含む試料を注入するための試料注入装置と、酸化型及び還元型アルブミンを検出するための検出装置と、前記検出装置において測定された結果を演算するデータ処理装置と、を備えることを特徴とする酸化型及び還元型アルブミンの分析装置。
［４］さらに、前記陰イオン交換カラムに吸着及び分離されたアルブミンを溶出させるための２価の塩化物を含む第２の溶液を備える、［３］に記載の酸化型及び還元型アルブミンの分析装置。
［５］前記陰イオン交換カラムが第３級アミン基を有するイオン交換樹脂を含む、［３］又は［４］に記載の酸化型及び還元型アルブミンの分析装置。
［６］液体クロマトグラフ用の陰イオン交換カラムと、液体クロマトグラフを平衡化し、生体試料中の酸化型アルブミンと還元型アルブミンを分離するためのｐＨ４．９以上６．８以下である第１の溶液と、アルブミンを溶出させるための２価の塩化物を含む第２の溶液と、を備えることを特徴とする酸化型及び還元型アルブミンの分析キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、短時間且つ簡便で高精度な酸化型及び還元型アルブミンの分析方法及び分析装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本実施形態における酸化型及び還元型アルブミンの分析装置の概略構成の一例を示す図である。
【図２】本実施形態における酸化型及び還元型アルブミンの分析装置の概略構成の一例を示す図である。
【図３】本実施形態における酸化型及び還元型アルブミンの分析装置の概略構成の一例を示す図である。
【図４】実施例１における健常者血清中のアルブミンを分析した結果を示したクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、必要に応じて図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、各図において、説明に関連しない部分は図示を省略する場合がある。
【００１２】
＜酸化型及び還元型アルブミンの分析方法＞
≪第一実施形態≫
一実施形態において、本発明は、液体クロマトグラフをｐＨ４．９以上７．０以下である第１の溶液で平衡化する工程と、液体クロマトグラフにアルブミンを含む試料を注入し、前記アルブミンを吸着及び分離させる工程と、を備える、酸化型及び還元型アルブミンの分析方法を提供する。
【００１３】
本実施形態の分析方法によれば、短時間且つ簡便で高精度な酸化型及び還元型アルブミンの分析方法を提供することができる。
【００１４】
本明細書において、アルブミンは、分子内に３５個のシステイン残基（Ｃｙｓ）を有し、その内の１７個のシステイン残基についてはシステイン残基同士が分子内でジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成し、残りの１個のシステイン残基は、Ｎ末端から３４番目のシステイン残基（Ｃｙｓ−３４）であって、遊離のメルカプト基（ＳＨ基）を有するシステイン残基として存在するタンパク質を意味する。
また、「還元型アルブミン」とは、上述の通り、Ｃｙｓ−３４のＳＨ基が遊離であるアルブミンを示し、「酸化型アルブミン」とは、Ｃｙｓ−３４にＣｙｓ又はグルタチオン等が結合しているアルブミンを示す。
【００１５】
本明細書において、「アルブミンを含む試料」としては、特別な限定はなく、例えば、血液、唾液、涙液、汗等の体液、尿などの生体試料、細胞の懸濁液、細胞の破砕液等が挙げられる。「アルブミンを含む試料」は、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。また、アルブミンの由来は、哺乳類（例えば、ヒト、サル、ウシ、ウサギ、マウス、ラット等）由来のものであれば、特別な限定はない。
【００１６】
本明細書において、「クロマトグラフィー」とは、固定相（又は担体）の表面又は内部を、移動相が通過する過程で物質を分離する測定方法を意味し、「液体クロマトグラフィー」とは、移動相として液体を用いたクロマトグラフィーを意味する。また、クロマトグラムは測定結果、クロマトグラフは測定装置をそれぞれ意味する。
【００１７】
［平衡化工程］
まず、液体クロマトグラフ内の流路及びカラムをｐＨ４．９以上７．０以下である第１の溶液で平衡化する。第１の溶液のｐＨはｐＨ４．９以上７．０以下であることが好ましく、ｐＨ５．０以上６．８以下がより好ましく、ｐＨ５．５以上６．５以下であることがさらに好ましい。第１の溶液のｐＨが上記範囲内であることにより、アルブミンの吸着及び分離性能を上げることができる。
【００１８】
本実施形態の分析方法において、第１の溶液は、ｐＨを上記範囲内とするために１０〜５００ｍＭの緩衝剤を含むことができる。緩衝剤としては、例えば、酢酸塩、重炭酸塩、クエン酸塩、リン酸塩等が挙げられる。第１の溶液の流量は、１０μＬ〜１０ｍＬ／ｍｉｎであり、特に好ましくは０．３〜５ｍＬ／ｍｉｎである。
【００１９】
［アルブミン吸着及び分離工程］
続いて、液体クロマトグラフにアルブミンを含む試料を注入し、アルブミンを吸着及び分離させる。
【００２０】
本実施形態の分析方法において、試料として用いるアルブミン濃度が１μｇ／ｄＬ以上であり、１μｇ／ｄＬ以上４０ｇ／ｄＬ以下であることが好ましく、１０μｇ／ｄＬ以上３５ｇ／ｄＬ以下であることがより好ましく、１００μｇ／ｄＬ以上３０ｇ／ｄＬ以下であることがさらに好ましい。
【００２１】
本実施形態の分析方法において、使用可能な分析装置は、酸化型及び還元型アルブミンを分析できるものであれば、特別な限定はない。使用可能な分析装置としては、例えば、分子ふるい（ゲルろ過）カラムをセットした高速液体クロマトグラフ（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ：ＨＰＬＣ）、イオン交換カラムをセットしたＨＰＬＣ、アフィニティーカラムを用いたＨＰＬＣ、質量分析計、液体クロマトグラフィー質量分析計（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＬＣ−ＭＳ）等が挙げられる。中でも、日常の臨床検査等で実用的且つ簡便に用いるための操作性及びコストの観点から、分子ふるい（ゲルろ過）カラムを用いたＨＰＬＣ又はイオン交換カラムを用いたＨＰＬＣが好ましい。
【００２２】
（分子ふるい（ゲルろ過）カラムを用いた液体クロマトグラフィー）
分子ふるい（ゲルろ過）カラムを用いた液体クロマトグラフィーでは、主として分子ふるいの原理でアルブミンを他のタンパク質から分離し、さらに、担体の特性や分離条件から酸化型及び還元型アルブミンを分離する。これらの分離は、第１の溶液のみを用いて、アルブミンの吸着、分離及び溶出を行うことができる。
また、カラムから溶出した各フラクションのアルブミン濃度を、例えば、紫外吸光光度検出器、蛍光検出器等を用いて測定してもよい。その場合、上記の検出器を用いて、カラムから溶出した各フラクション中のアルブミン量をそれぞれ測定する方法や、カラムの出口に上記の検出器を連結してカラムからの溶出液を直接検出器に導入し、各フラクション中のアルブミン量を求める方法等を挙げることができる。
その他、分子ふるいカラムを用いた液体クロマトグラフィーの条件は、公知の方法に従って当業者が決定できる。
【００２３】
次に、本実施形態における酸化型及び還元型アルブミンの分析装置について、図１を参照しながら説明する。
本実施形態の分析装置１０は、第１の溶液と、該第１の溶液を格納する容器１と、アルブミンを含む試料を注入するための試料注入装置５と、分子ふるいカラム７と、酸化型及び還元型アルブミンを検出するための検出装置１１と、前記検出装置において測定された結果を演算するデータ処理装置１２と、を備える。まず、装置を起動した後、容器１より第１の溶液がポンプａ３により、流路２、流路４、インジェクター５及び流路６を通って、分子ふるいカラム７まで到達し、液体クロマトグラフ内を平衡化する。
【００２４】
第１の溶液は、上述したものと同様のものを用いることができる。
第１の溶液を格納する容器１は、第１の溶液を格納できるものであれば、特別な限定はなく、例えば、瓶、ビーカー等が挙げられる。また、流路の素材についても、第１の溶液を送液できるものであれば、特別な限定はない。
【００２５】
試料注入装置５は、アルブミンを含む試料を分析装置内に注入できるものであれば、特別な限定はない。例えば、複数の試料を順番に注入することができる自動注入装置（オートサンプラー）、手動で注射器等を用いて注入するインジェクター等が挙げられる。また、試料注入装置５は、試料を低温に保つための冷蔵機能がついたものであることが好ましい。
【００２６】
恒温槽８は、カラムの温度を一定に保つための槽であって、特別な限定はない。恒温槽８内の温度は、特別な限定はなく、アルブミンが熱により変性しない温度であればよい。例えば、４℃以上５０℃以下であってよく、１５℃以上４５℃以下であってよく、２５℃以上４０℃以下であってよい。
【００２７】
分子ふるいカラム７に充填する担体としては、従来、分子ふるいカラムクロマトグラフィーで用いられる担体を用いることができる。例えば、ポリアクリルアミドゲル、デキストラン、アガロース、親水性シリカゲル、ポリビニルアルコール架橋ゲル、メタクリレートポリマーゲル、ポリ酢酸ビニルゲル、それらの複合体等が挙げられる。
担体の形状は、球状、破砕状等挙げることができ、好ましくは球状である。球状の場合、平均粒子径は１〜５００μｍであり、好ましくは１〜２０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。粒子径が上記範囲内にあることにより、通常の高速液体クロマトグラフィーを行うことができ、簡便且つ短時間で結果を得ることができる。
本実施形態における分子ふるいカラム７の形状は特に限定されないが、好ましくは内径１０ｍｍ以下、長さ３０ｃｍ以下であり、より好ましくは内径０．１〜８ｍｍ、長さ１〜１０ｃｍである。また、カラムの容量は特に限定されないが、好ましくは０．０００１ｍＬ以上３０ｍＬ以下であり、より好ましくは０．５ｍＬ以上４ｍＬ以下、さらに好ましくは、０．５ｍＬ以上２ｍＬ以下である。カラムの容量が０．０００１ｍＬ以上０．５ｍＬ以下であり、平均粒子径が上記範囲内のカラムを使用する場合には、アルブミンの精製度が高い試料を用いることが好ましい。また、カラムの容量が０．５ｍＬ以上３０ｍＬであり、平均粒子径が上記範囲内のカラムを使用する場合には、夾雑物を含む尿や血液などの検体中の酸化型及び還元型アルブミンを検体の濾過等の特別な前処理を必要とせず、直接、簡便に、且つ、短時間で分析することができる。
【００２８】
検出器１１としては、特別な限定はなく、例えば、紫外吸光光度検出器、蛍光検出器等が挙げられる。また、データ処理部１２としては、特別な限定はなく、例えば、データ処理システム、パソコン（ＰＣ）等が挙げられる。
検出器１１を通った試料は、廃液タンク１４に排出される。
また、分析装置１０は、その他の構成として、デガッサー、溶液の切り替えバルブ等を備えていてもよい。
【００２９】
（イオン交換カラムを用いた液体クロマトグラフィー）
イオン交換カラムを用いた液体クロマトグラフィーでは、陰イオン交換カラムを用いることが好ましい。陰イオン交換カラムを用いることで、分子ふるいカラムを用いる場合よりも、アルブミンのイオン交換担体への吸着及び分離性能をより高めることができる。その他、陰イオン交換カラムを用いた液体クロマトグラフィーの条件は、公知の方法に従って当業者が決定できる。
【００３０】
次に、本実施形態における酸化型及び還元型アルブミンの分析装置について、図２を参照しながら説明する。図２に示す分析装置２０は、分子ふるいカラム７の代わりに陰イオン交換カラム１５を用いる点で、図１に示す分析装置１０と相違し、その他の構成は分析装置１０と同じである。なお、図２において、図１に示す構成要素と同一のものについては同じ符号を用いている。
【００３１】
本実施形態の分析装置において、「陰イオン交換カラム」とは、正に荷電したイオン交換基を有するイオン交換担体が充填されたカラムを意味する。「正に荷電したイオン交換基」としては、例えば、第１級アミン基、第２級アミン基、第３級アミン基、第４級アミン基等が挙げられる。中でも、第３級アミン基が好ましい。第３級アミン基としては、例えば、ジメチルアミノメチル基、ジメチルアミノエチル基、ジエチルアミノメチル基、ジエチルアミノエチル基、ジプロピルアミノメチル基、ジプロピルアミノエチル基、ジブチルアミノメチル基、ジブチルアミノエチル基、ジペンタンアミノメチル基、ジペンタンアミノエチル基等が挙げられる。中でも、ジエチルアミノエチル基が好ましい。
正に荷電したイオン交換基の量は、イオン交換担体重量当たり０．０５〜５．０ｍｅｑ／ｇであり、好ましくは０．０５〜３．０ｍｅｑ／ｇあり、さらに好ましくは０．１〜２．０ｍｅｑ／ｇである。イオン交換担体に結合したイオン交換基の量を求める方法としては、例えば、特開昭６２−１９２４０５号公報に記載の方法等を挙げることができる。
【００３２】
本実施形態の分析装置において、正に荷電したイオン交換基が固定化された担体としては、従来、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーで用いられる担体を用いることができる。例えば、ＤＥＡＥ−メタクリル（商品名：ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ  ＰＷ、東ソー社製）、ＤＥＡＥ−シリカゲル（商品名：ＴＳＫｇｅｌ  ＳＷ、東ソー社製）、ＤＥＡＥ−ポリビニルアルコール（商品名：Ａｓａｈｉｐａｋ５０２Ｎ、昭和電工社製）、ＤＥＡＥ−ポリヒドロキシメタクリレート（商品名：ＩＥＣ  ＤＥＡＥ８２５、昭和電工社製）等が挙げられる。
【００３３】
本実施形態の分析装置において、担体の形状は、球状、破砕状等挙げることができ、好ましくは球状である。球状の場合、平均粒子径は１〜５００μｍであり、好ましくは１〜２０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。粒子径が上記範囲内にあることにより、通常の高速液体クロマトグラフィーを行うことができ、簡便且つ短時間で結果を得ることができる。
【００３４】
本実施形態の分析装置において、陰イオン交換カラムの容量は、０．０００１ｍＬ以上３０ｍＬ以下であることが好ましく、０．５ｍＬ以上４ｍＬ以下であることがより好ましく、０．５ｍＬ以上２ｍＬ以下であることがさらに好ましい。カラムの容量が０．０００１ｍＬ以上０．５ｍＬ以下であり、平均粒子径が上記範囲内のカラムを使用する場合には、アルブミンの精製度が高い試料を用いることが好ましい。また、カラムの容量が０．５ｍＬ以上３０ｍＬであり、平均粒子径が上記範囲内のカラムを使用する場合には、夾雑物を含む尿や血液などの検体中の酸化型及び還元型アルブミンを検体の濾過等の特別な前処理を必要とせず、直接、簡便に、且つ、短時間で分析することができる。
【００３５】
≪第二実施形態≫
一実施形態において、本発明は、さらに、陰イオン交換カラムを用いた液体クロマトグラフィーにおいて、２価の塩化物を含む第２の溶液を用いて、前記陰イオン交換カラムに吸着及び分離された前記アルブミンをグラジエント法により溶出させる工程を備える、酸化型及び還元型アルブミンの分析方法を提供する。
【００３６】
本実施形態の分析方法によれば、短時間且つ簡便で高精度な酸化型及び還元型アルブミンの分析方法を提供することができる。
【００３７】
まず、液体クロマトグラフ内の流路及びカラムを、ｐＨ４．９以上７．０以下である第１の溶液で平衡化し、続いて、アルブミンを含む試料を注入し、陰イオン交換カラムにアルブミンを吸着及び分離させるまでは、第一実施形態と同様である。
続いて、２価の塩化物を含む第２の溶液を用いて、グラジエント法により、陰イオン交換カラムに吸着及び分離したアルブミンを溶出させる。グラジエント法としては、特別な限定はなく、例えば、リニアグラジエント法、指数関数的な濃度上昇によるグラジエント法、対数関数的な濃度上昇によるグラジエント法、ステップグラジエント法等が挙げられる。中でもリニアグラジエント法が好ましい。２価の塩化物を含む第２の溶液を用いたグラジエント法により、アルブミンを容易に溶出することができる。第２の溶液の流量は、０．１〜１０ｍＬ／ｍｉｎであり、特に好ましくは０．３〜５ｍＬ／ｍｉｎである。
【００３８】
本実施形態の分析方法において、「２価の塩化物」としては、特別な限定はなく、例えば、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化バリウム等が挙げられる。従来では、エタノール等の揮発性の有機溶媒を、アルブミンを溶出させる液として、３ステップでの複雑なグラジエント条件で使用しており、安定性、再現性等の点で好ましい溶出液であるとはいえなかった。これに対し、本実施形態の分析方法では、２価の塩化物を含む第２の溶液を簡便で再現性の良いリニアグラジエント法を使用することにより、高効率且つ高精度にアルブミンを溶出することができる。
【００３９】
本実施形態の分析方法において、第２の溶液は、アルブミンの溶出を妨げないものであれば、他の成分として、１つ以上の緩衝剤（例えば、酢酸塩、重炭酸塩、クエン酸塩、リン酸塩等）を含んでいてもよい。
【００４０】
カラムから溶出した各フラクションのアルブミン濃度を、例えば、紫外吸光光度検出器、蛍光検出器等を用いて測定することができる。その場合、上記の光度計を用いて、カラムから溶出した各フラクション中のアルブミン量をそれぞれ測定する方法や、カラムの出口に上記の検出器を連結してカラムからの溶出液を直接検出器に導入し、各フラクション中のアルブミン量を求める方法等を挙げることができる。
【００４１】
次に、本実施形態における酸化型及び還元型アルブミンの分析装置について、図３を参照しながら説明する。図３に示す分析装置３０は、第２の溶液と、該第２の溶液を格納する容器１６が、流路１７、ポンプｂ１８及び流路１９を介して流路４ｂに合流するように配設されている点で、図２に示す分析装置２０と相違し、その他の構成は分析装置２０と同じである。なお、図３において、図２に示す構成要素と同一のものについては同じ符号を用いている。
【００４２】
まず、第１の溶液で平衡化された陰イオン交換カラムに、ポンプａ３により容器１に格納されている第１の溶液の流量と、ポンプｂ１８により容器１６に格納されている第２の溶液の流量とを調節することで、第２の溶液のグラジエントを形成しながら送液し、陰イオン交換カラム内で吸着及び分離していたアルブミンを溶出させる。
【００４３】
第２の溶液は、上述したものと同様のものを用いることができる。
第２の溶液を格納する容器１６は、第２の溶液を格納できるものであれば、特別な限定はなく、例えば、瓶、ビーカー等が挙げられる。また、流路の素材についても、第２の溶液を送液できるものであれば、特別な限定はない。
【００４４】
≪第三実施形態≫
一実施形態において、本発明は、さらに、アルブミンを含む試料をｐＨ１．０以上７．０未満であり、且つ、糖類を含む還元型生体分子の安定化剤を添加する工程を備える上記の酸化型及び還元型アルブミンの分析方法を提供する。
【００４５】
本実施形態の分析方法によれば、還元型生体分子から酸化型生体分子への経時的な変化を防ぎ、生体内のレドックス状態を反映した測定結果を得ることができる。
【００４６】
［安定剤添加工程］
本実施形態において、液体クロマトグラフを含む分析装置による測定を行う前に、使用するアルブミンを含む試料を、ｐＨ１．０以上７．０未満であり、且つ、糖類を含む還元型生体分子の安定化剤を添加する。安定化剤は溶液でも凍結乾燥した粉体でもよく、予め採血管等に封入していてもよい。その後の工程については、第一実施形態及び第二実施形態と同様である。
【００４７】
本明細書において、「還元型生体分子」とは、酸化の標的となり得る生物の体内に存在する分子を意味し、例えば、酵素、転写因子、シグナル伝達因子、抗体等のうち、遊離のメルカプト基を有するシステイン残基を含むタンパク質；ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；リノール酸、リン脂質、エステル型コレステロール、中性脂肪等の脂質；糖タンパク質、糖ペプチド、プロテオグライカン、糖脂質等の糖質等が挙げられる。中でも、遊離のメルカプト基を有するシステイン残基を含むタンパク質が好ましく、還元型の状態で安定化することができる。
さらに具体的なタンパク質としては、チオレドキシン等のグルタチオン系分子、アルブミン等が挙げられ、アルブミンが好ましい。
【００４８】
本明細書において、「還元型生体分子の安定化」とは、還元型生体分子から酸化型生体分子への経時的な変化を防ぎ、還元型生体分子のままの状態を保つことを意味する。
【００４９】
本実施形態において、還元型生体分子の安定化剤は、ｐＨが酸性であり、具体的には、ｐＨ１．０以上７．０未満であることが好ましく、ｐＨ１．０以上５．０以下であることがより好ましく、ｐＨ１．０以上４．０以下であることがさらに好ましい。ｐＨが上記範囲内であることにより、還元型生体分子から酸化型生体分子への経時的な変化を防ぎ、還元型生体分子を安定化することができる。
【００５０】
本実施形態において、還元型生体分子の安定化剤は、ｐＨを上記範囲内とするためにｐＨ調整剤を使用してもよい。ｐＨ調整剤としては、酸又はアルカリであって、温和な条件でｐＨを調整できるものであれば、特に制限はない。例えば、酸としては、クエン酸、乳酸、リン酸、酢酸、グルコン酸、コハク酸、又はそれらの水和物等が挙げられる。また、アルカリとしては、酢酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素一ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二カリウム等の１価或いは２価の塩又はそれらの水和物等が挙げられる。
【００５１】
本実施形態の安定化剤は、糖類を含む。「糖類」としては、特に限定はなく、例えばデンプン、グリコーゲン等の多糖類；ラフィノース、スタキオース等の少糖類；スクロース、マルトース等の二糖類；六炭糖、五炭糖等の単糖類が挙げられる。中でも、六炭糖が好ましい。六炭糖としては、例えば、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース等のアルドヘキソース；プリコース、フルクトース、ソルボース、タガロース等のケトヘキトース；フコース、フクロース、ラムノース等のデオキシ糖等が挙げられる。中でも、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトースが好ましく、グルコースがより好ましい。
【００５２】
本実施形態の安定化剤において、ｐＨを上記範囲内に保ち、還元型生体分子を酸化する作用を有さないものであれば、他の成分として、１つ以上の塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等）、１つ以上の緩衝剤（例えば、酢酸塩、重炭酸塩、クエン酸塩、リン酸塩等）を含んでいてもよい。
【００５３】
さらに、安定剤を溶解する媒体として、減菌水又は生理学的に適合性の水性電解液を含んでいてもよい。「生理学的に適合性の水性電解液」としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール等、具体的にはエタノール、ポリアルコール等、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール等、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０等と併用してもよい。
【００５４】
アルブミンを含む試料に還元型生体分子の安定化剤を添加することにより、アルブミン中の還元型アルブミンを安定化することができ、さらに、体内のレドックス状態を反映した測定結果を得ることができる。
【００５５】
＜酸化型及び還元型アルブミンの分析キット＞
一実施形態において、本発明は、液体クロマトグラフ用の陰イオン交換カラムと、液体クロマトグラフを平衡化するためのｐＨ４．９以上７．０以下である第１の溶液と、アルブミンを溶出させるための２価の塩化物を含む第２の溶液と、を備える、酸化型及び還元型アルブミンの分析キットを提供する。
【００５６】
本実施形態の分析キットによれば、短時間且つ簡便で高精度な酸化型及び還元型アルブミンを分析することができる。
【００５７】
陰イオン交換カラムとは、正に荷電したイオン交換基を有するイオン交換担体が充填されたカラムを意味する。「正に荷電したイオン交換基」としては、例えば、上述したものと同様のものが挙げられ、中でも、第３級アミン基が好ましい。第３級アミン基としては、例えば、上述したものと同様のものが挙げられ、中でも、ジエチルアミノエチル基が好ましい。
【００５８】
正に荷電したイオン交換基の量は、イオン交換担体重量当たり０．０５〜５．０ｍｅｑ／ｇであり、好ましくは０．０５〜３．０ｍｅｑ／ｇあり、さらに好ましくは０．１〜２．０ｍｅｑ／ｇである。イオン交換担体に結合したイオン交換基の量を求める方法としては、例えば、特開昭６２−１９２４０５号公報に記載の方法等を挙げることができる。
【００５９】
本実施形態の分析キットにおいて、正に荷電したイオン交換基が固定化された担体としては、従来、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーで用いられる担体を用いることができる。例えば、ＤＥＡＥ−メタクリル（商品名：ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ  ＰＷ、東ソー社製）、ＤＥＡＥ−シリカゲル（商品名：ＴＳＫｇｅｌ  ＳＷ、東ソー社製）、ＤＥＡＥ−ポリビニルアルコール（商品名：Ａｓａｈｉｐａｋ５０２Ｎ、昭和電工社製）、ＤＥＡＥ−ポリヒドロキシメタクリレート（商品名：ＩＥＣ  ＤＥＡＥ８２５、昭和電工社製）等が挙げられる。
【００６０】
本実施形態の分析キットにおいて、担体の形状は、球状、破砕状等挙げることができ、好ましくは球状である。球状の場合、平均粒子径は１〜５００μｍであり、好ましくは１〜２０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。粒子径が上記範囲内にあることにより、通常の高速液体クロマトグラフィーを行うことができ、簡便且つ短時間で結果を得ることができる。
【００６１】
本実施形態の分析キットにおいて、陰イオン交換カラムの容量は、０．０００１ｍＬ以上３０ｍＬ以下であることが好ましく、０．５ｍＬ以上４ｍＬ以下であることがより好ましく、０．５ｍＬ以上２ｍＬ以下であることがさらに好ましい。カラムの容量が０．０００１ｍＬ以上０．５ｍＬ以下であり、平均粒子径が上記範囲内のカラムを使用する場合には、アルブミンの精製度が高い試料を用いることが好ましい。また、カラムの容量が０．５ｍＬ以上３０ｍＬであり、平均粒子径が上記範囲内のカラムを使用する場合には、夾雑物を含む尿や血液などの検体中の酸化型及び還元型アルブミンを検体の濾過等の特別な前処理を必要とせず、直接、簡便に、且つ、短時間で分析することができる。
【００６２】
本実施形態の分析キットにおいて、第１の溶液のｐＨはｐＨ４．９以上７．０以下であることが好ましく、ｐＨ５．５以上６．５以下であることがより好ましく、ｐＨ６．０であることがさらに好ましい。第１の溶液のｐＨが上記範囲内であることにより、アルブミンの吸着及び分離性能を上げることができる。
【００６３】
本実施形態の分析キットにおいて、第１の溶液は、ｐＨを上記範囲内とするために１０〜５００ｍＭの緩衝剤を含むことができる。緩衝剤としては、例えば、酢酸塩、重炭酸塩、クエン酸塩、リン酸塩等が挙げられる。
【００６４】
本実施形態の分析キットにおいて、「２価の塩化物」としては、特別な限定はなく、例えば、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化バリウム等が挙げられる。従来では、エタノール等の揮発性の有機溶媒を、アルブミンを溶出させる液として、３ステップでの複雑なグラジエント条件で使用しており、安定性、再現性等の点で好ましい溶出液であるとはいえなかった。これに対し、本実施形態の分析キットでは、２価の塩化物を含む第２の溶液を簡便で再現性の良いリニアグラジエント法を使用することにより、高効率且つ高精度にアルブミンを溶出することができる。
【００６５】
本実施形態の分析キットにおいて、第２の溶液は、アルブミンの溶出を妨げないものであれば、他の成分として、１つ以上の緩衝剤（例えば、酢酸塩、重炭酸塩、クエン酸塩、リン酸塩等）を含んでいてもよい。
【００６６】
本実施形態の分析キットは、上述した酸化型及び還元型アルブミンの分析方法において、好適に用いることができる。また、本実施形態の分析キットを使用可能な分析装置としては、従来、陰イオン交換カラムを用いた液体クロマトグラフィーで用いられる分析装置であればよく、特別な限定はない。
【００６７】
以上、この発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の構成等も含まれる。
【実施例】
【００６８】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳述するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６９】
［実施例１］健常者血清中のアルブミンの分析
（１）試料の調製
健常者から採血して、凝固促進剤としてトロンビンを入れて、血小板や凝固因子を除き、血清試料を調製した。血清試料の採取及び調整時は、還元型アルブミンから酸化型アルブミンへの経時的な変化を抑制するために、氷冷及び冷蔵下で実施し、直ぐに分析を行うか、又は、保存する場合は−８０℃で保存した。
【００７０】
（２）ＨＰＬＣ用溶液の調製
６０ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４を含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を、第１の溶液（アルブミン吸着液）として調製した。続いて、１Ｍ  ＭｇＣｌ２を、第２の溶液（アルブミン溶出液）として調製した。
【００７１】
（３）ＨＰＬＣによるアルブミンの分析
イオン交換基としてＤＥＡＥ（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）を有するイオン交換樹脂が充填された陰イオン交換カラム（７．５ｍｍΦ×５０ｍｍＬ、イオン交換容量０．５５ｍｅｑ／ｇ）を高速液体クロマトグラフ（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ：ＨＰＬＣ）（島津製作所製）にセットし、（２）で調製した第１の溶液で流路及びカラム内を平衡した。（１）で調製した血清３μＬを、ＨＰＬＣのオートサンプラーを用いて、注入すると同時に（分析開始０分）、（２）で調製した第１の溶液と第２の溶液とを用いて、７．５分間かけてリニアグラジエント法（ＭｇＣｌ２の濃度が０％から２５％まで）により、アルブミンを吸着、分離及び溶出させた。ＨＰＬＣの流量は、常に１ｍＬ／ｍｉｎで行った。検出は励起波長２８０ｎｍ、検出波長３４０ｎｍにて蛍光検出により行った。結果を図４に示す。
また、分析開始から７．５分後〜１２分後まで、次の試料を分析できるように、（２）で調製した第１の溶液でＨＰＬＣ系内を初期状態に平衡化した。
【００７２】
図４から、還元型アルブミン及び酸化型アルブミンを十分に分離できることが明らかとなった。
【００７３】
また、下記表１は実施例２の操作を同じ日のうちに１０回繰り返し行った結果を示したものである。また、下記表２は実施例２の操作を異なる日に１０日間に渡り繰り返し行った結果を示したものである。日をまたいだ測定では、サンプルを−８０℃に保管し、測定直前に解凍して使用した。さらに、測定は５重測定を行い、平均値を用いた。
表１及び表２中、γＧは、血清中のγグロブリンタンパクのピーク面積値（積算電圧（ｍＶ）×１０−４値）を表し、ＨＭＡは血清中の還元型アルブミンのピーク面積値を表し、ＨＮＡは血清中の酸化型アルブミンのピーク面積値を表し、ＨＭＡ％は血清に含まれるアルブミン全量中の還元型アルブミンの割合（百分率）を表す。また、ＳＤは標準偏差を表し、ＣＶは変動係数を表す。
【００７４】
【表１】
0006749590.tif 000002
【００７５】
【表２】
0006749590.tif 000003
【００７６】
表１及び表２から、実施例２の分析条件によるアルブミンの分析結果から、日内及び日間の測定の再現性が非常に良い（ＣＶの値が小さい）ことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明によれば、短時間且つ簡便で高精度な酸化型及び還元型アルブミンの分析方法及び分析装置を提供することができる。
【符号の説明】
【００７８】
１…第１の溶液を格納する容器、２，４，４ａ，４ｂ，６，９，１３，１７，１９…流路、３…ポンプａ、５…試料注入装置、７…分子ふるいカラム、８…恒温槽、１１…検出器、１０，２０，３０…酸化型及び還元型アルブミンの分析装置、１２…データ処理部、１４…廃液タンク、１５…陰イオン交換カラム、１６…第１の溶液を格納する容器、１８…ポンプｂ。
【図１】
0006749590.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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