(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式１：
［一般式１］
（Ｍａｎ）ｍ−ＳＡ−（Ｄ）ｎ
（式中、
Ｍａｎは、マンノシル基であり、
ＳＡは、血清アルブミンであり、
Ｄは、青色色素であり、
ｍは、１〜４２の整数であり、および
ｎは、１〜３４の整数である）
で表され、
ここで青色色素が、ブリリアントブルーＧ、ナフトールブルーブラック、エバンスブルー、パテントブルーＶＦ、およびリアクティブブルー４からなる群より選択される１以上の青色色素である、青色色素カップリングマンノシル血清アルブミン複合体。
【請求項２】
血清アルブミン（ＳＡ）が還元型血清アルブミンである、請求項１に記載のマンノシル血清アルブミン複合体。
【請求項３】
血清アルブミンおよび色素が１：１〜１０のモル比で混合されている、請求項１に記載のマンノシル血清アルブミン複合体。
【請求項４】
マンノシル血清アルブミン複合体が、マンノシル基（Ｍａｎ）に結合したリンカーをさらに含む、請求項１に記載のマンノシル血清アルブミン複合体。
【請求項５】
リンカーが、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ４〜Ｃ１０アリール、モノペプチド、ジペプチド、オリゴペプチド、Ｃ４〜Ｃ１０シクロアルキル、ベンジル、チオエーテル、エーテル、アミン、ヒドラジン、ペントース、ヘキソース、およびアルコールからなる群より選択される１以上のリンカーである、請求項４に記載のマンノシル血清アルブミン複合体。
【請求項６】
マンノシル基に結合したリンカーを含有するマンノシル血清アルブミン複合体が、以下の式１：
【化１】
0006748789.tif 000006
（式中、ＳＡは血清アルブミンである）
で表される構造を有する、請求項４に記載のマンノシル血清アルブミン複合体。
【請求項７】
請求項１に記載の青色色素カップリングマンノシル血清アルブミン複合体に放射性同位体元素が結合した、放射性同位体元素標識マンノシル血清アルブミン複合体。
【請求項８】
放射性同位体が、金属放射性同位体である、請求項７に記載のマンノシル血清アルブミン複合体。
【請求項９】
放射性同位体が、９９ｍＴｃ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、６７Ｃｕ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、および１０９Ｐｄからなる群から選択される１以上の放射性同位体である、請求項７に記載のマンノシル血清アルブミン複合体。
【請求項１０】
マンノシル血清アルブミン複合体が、マンノシル基（Ｍａｎ）に結合したリンカーをさらに含む、請求項７に記載のマンノシル血清アルブミン複合体。
【請求項１１】
請求項１または７に記載の複合体を含むリンパ節プロービング組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、色素カップリングマンノシル血清アルブミン複合体およびこれを含むリンパ節プロービング組成物に関する。
【０００２】
２．関連技術の説明
乳がん、黒色腫、肺がん、食道がん、および胃がんを含む種々のがんの外科手術の範囲は、癌の転移部位を確認した後に決定される。特に、これらのがんは、リンパ節に転移する傾向があり、がんの部位に最も近いリンパ節を見出すことが非常に重要であり、これは、外科手術の間の前哨リンパ節と呼ばれる。染色試薬または放射性コロイドがしばしば、この目的のために使用される。
【０００３】
クマシーブルー、パテントブルー、またはエバンスブルーは、染色試薬として使用される。染色試薬ががん組織のまわりの皮下に注射される際、それは、アルブミンに即時に結合し、リンパ節に移動し、そして、リンパ節を青色に染色し得、これにより、前哨リンパ節を検出することができる。しかしながら、アルブミン結合体化試薬は、長い時間リンパ節にどどまることはなく、時間経過後に、前哨リンパ節を区別することは困難である。色素は、組織の内側の少し深い場所に存在していても、可視ではないため、リンパ節が存在すると推定される部分を深く切除することによってのみ見ることができるという不可避の問題が存在する。
【０００４】
従って、前哨リンパ節に高効率で蓄積され得る放射性同位体（アンチモン硫黄コロイドＴｃ−９９ｍ、硫黄コロイドＴｃ−９９ｍ、フィチン酸Ｔｃ−９９ｍ、アルブミンナノコロイドＴｃ−９９ｍ、およびスズコロイドＴｃ−９９ｍなど）で標識された種々のコロイドが使用される。これらがインビボで投与される場合、これらのコロイドは、外科手術前に画像を介して前哨リンパ節の位置を表示し得る。外科手術の間において、リンパ節は、ガンマプローブを使用することによって正確に位置づけられ得る。しかしながら、コロイド粒子は、サイズが大きすぎるので、これらは、注射後にリンパ節に移動することはできず、その代わり、コロイド粒子のほとんどは、注射の部位にとどまることから、放射活性が、実際のリンパ節中ではなく他の部位において高度に検出可能であることが示唆される。
【０００５】
Navidia Co., USAは、リンパ節中のマクロファージの表面に存在するマンノースレセプターへ結合する、放射性医薬品としてのＴｃ−９９ｍ（準安定なテクネチウム９９）標識マンノース結合体化デキストランであるチルマノセプトＴｃ−９９ｍを開発した。上記に関し、韓国特許番号第１０−０５５７００８号は、Ｔｃ−９９ｍ−マンノシル化ヒト血清アルブミン（ＭＳＡ）を記載している。
【０００６】
これらの放射性医薬品は、サイズがコロイドより小さいので、これらは、注射部位からリンパ節へ大量に迅速に移動し得、これらは、改善された画像および優れた検出率を提供し得ることが示唆される。しかしながら、かかる放射性材料を含有する医薬は、外科医によって直接見ることはできず、アシスタントが、ガンマプローブを連続して保持しなければならない。韓国特許公開番号第１０−２０１６−００２０２９６号には、近赤外蛍光を発するインドシアニングリーンでＴｃ−９９ｍ−ＭＳＡがさらに標識された組成物を記載している。しかしながら、それはまた、近赤外線を画像化するための特別な装置を必要とし、手術者が組織中の色を直接見て外科手術を実施することは可能ではなく、画像モニター上に重複する画像を見ながら外科手術をするので、不便である。
【０００７】
したがって、本発明者らは、裸眼で直接同定し得る前哨リンパ節プロービング組成物を開発することを試みた。我々の研究の間に、本発明者らは、色素が、リンパ節のマクロファージの表面に存在するマンノースレセプターに結合するＭＳＡに結合体化された場合、それは、色素単独が注射される場合よりもリンパ節中に長くとどまることができることを確認し、かなり長い時間が経過した後でも裸眼での観察が可能であることが示唆された。本発明者らはまた、色素がＴｃ−９９ｍ−ＭＳＡ、Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋ、またはコロイドＴｃ−９９ｍのような放射性医薬品と同時処理された場合、ガンマ線検出と共に、リンパ節の視覚検出が可能であることを確認し、本発明の完成を導いた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、色素カップリングマンノシル血清アルブミン複合体およびこれを含むリンパ節プロービング組成物を提供することである。
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の一般式１：
［一般式１］
（Ｍａｎ）ｍ−ＳＡ−（Ｄ）ｎ
（式中、
Ｍａｎは、マンノシル基であり、
ＳＡは、血清アルブミンであり、
Ｄは、色素であり、
Ｍは、１〜４２の整数であり、および
ｎは、１〜３４の整数である）
で表される色素結合マンノシル血清アルブミン複合体を提供する。
【００１０】
本発明はまた、以下の一般式２：
［一般式２］
（Ｍａｎ）ｍ−ＳＡ−（Ｄ）ｎ−ＲＩ
（式中、
Ｍａｎは、マンノシル基であり、
ＳＡは、血清アルブミンであり、
Ｄは、色素であり、
ＲＩは、放射性同位体であり、
Ｍは、１〜４２の整数であり、および
ｎは、１〜３４の整数である）
で表される、色素および放射線同位体カップリングマンノシル血清アルブミン複合体を提供する。
【００１１】
本発明はまた、上記複合体から選択される１以上の複合体を含むリンパ節プロービング組成物を提供する。
本発明はまた、上記組成物を含むキットを提供する。
【００１２】
本発明はまた、上記複合体から選択される１以上の複合体を対象に投与する工程を含む、リンパ節をプロービングするための方法を提供する。
さらに、本発明は、リンパ節プロービング組成物の調製のための上記複合体の１以上の使用を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の色素カップリングマンノシル血清アルブミン複合体は、マウスに投与される場合、鼠径部リンパ節中に長期間、濃縮状態で存在することが裸眼で観察され得る。従って、複合体およびこれを含む組成物は、リンパ節をプロービングするために効果的に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、例２で使用された色素のエバンスブルー、パテントブルーＶＦ、ブリリアントブルーＲ、ブリリアントブルーＧ、リアクティブブルー４、ナフトールブルー、およびニトラジンイエローの化学式を示す図である。
【図２】図２は、チオウレア結合が形成されるマンノシル基および血清アルブミンの構造を示す図である。
【００１５】
【図３】図３は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって確認される、ＭＳＡの高Ｔｃ−９９ｍ標識効率を示す図である。
【図４】図４は、異なる濃度で希釈されたブリリアントブルーＧ、ブリリアントブルーＲ、ナフトールブルーブラック、エバンスブルー、パテントブルーＶＦ、ニトラジンイエロー、またはリアクティブブルー４自体のような色素または色素カップリングＭＳＡの色が、組織または血液と対照的な暗い色を示すか否かを調査するために実施された、裸眼による観察の結果を示す図である。
【００１６】
【図５】図５は、動物モデルの膝窩リンパ節中のナフトールブルーブラックカップリングＴｃ−９９ｍ−ＭＳＡの時間依存性観察を示す写真のセットである。
【図６】図６は、動物モデルの膝窩リンパ節中のエバンスブルーカップリングＴｃ−９９ｍ−ＭＳＡの時間依存性観察を示す写真のセットである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書中の以下において、本発明を詳細に説明する。
本発明は、以下の一般式１：
［一般式１］
（Ｍａｎ）ｍ−ＳＡ−（Ｄ）ｎ
（式中、
Ｍａｎは、マンノシル基であり、
ＳＡは、血清アルブミンであり、
Ｄは、色素であり、
Ｍは、１〜４２の整数であり、および
ｎは、１〜３４の整数である）
で表される色素カップリングマンノシル血清アルブミン複合体を提供する。
【００１８】
本明細書で使用される用語「マンノシル基」または「マンノース」は、動物および植物の糖タンパク質の成分を示してもよい。一般に、それは、リポ多糖、植物マンナン、または微生物マンナンのＯ抗原の成分であり得る。リンパ節を検出するために、リンパ節の免疫細胞中に存在するマンノースレセプターに強力に結合し得る材料が必要である。本発明のマンノシル基カップリング血清アルブミン複合体は、リンパ節の免疫細胞中のマンノースレセプターに強力に結合し、リンパ節に蓄積される。従って、かかる材料は、それを検出材料で標識することによりリンパ節を検出するために使用される。
【００１９】
本明細書で使用される用語「血清アルブミン」は、単一のポリペプチド鎖から構成される、血漿に含まれるタンパク質の一種を示す。血清アルブミンは、血漿タンパク質の約５０〜６０％（４ｇ/ｄｌ）を占め、水に容易に溶解される。血清アルブミンは、全部で５８のリジン基を含有し、Ｎ末端を含む場合、そこに存在するアミノ基の総数は５９個だろう。従って、理論的には、最大５９個のマンノシル基がアミノ基に結合し得る。血清アルブミンの分子量は、６６，４６２であり、等電点（ＩＥＰ）は４．８である。特に、分子の長軸および短軸のサイズは、それぞれ８ｎｍおよび６ｎｍであり、その小さいサイズに起因してリンパ節に迅速に吸収される得ることを示す。
【００２０】
上記血清アルブミン（ＳＡ）は、還元型血清アルブミンであり得、還元型血清アルブミンは、チオール基を含み得る。チオール基は、アミノ酸の１つであるシステインに含有される官能基であり、システインが酸化されてシスチンを形成する場合、酸化還元反応に関与し、それにより、放射性同位体が容易に結合され得るように血清アルブミンのジスルフィドを還元し得る。上記のプロセスは、血清アルブミンの構造変化を最小化し、そして、血清アルブミンのインビボ生理学的機能の変化を最小化する。上記チオール基を含有する還元剤は、当業者によく知られている任意の還元剤であり得る。特に、２−メルカプトエタノール、１，４−ジチオドラトール（１，４−ｄｉｔｈｉｏｄｒａｔｏｌ）、２−アミノエタンチオール、チオグリコール酸、システイン、およびグルタチオンからなる群より選択される１以上の材料であり得る。
【００２１】
上記血清アルブミンは、１７のジスルフィド結合を含有する。それで、適切な還元剤によって還元される場合、約２〜３４のチオール基が、血清アルブミン中に形成され得る。血清アルブミン中に産生されたチオール基は、嫌気的条件で安定であり、安定性は、ｐＨ６未満の低ｐＨで増加する。液体窒素温度での迅速な凍結により、チオール基の混入または喪失なしで長期貯蔵が可能となる。
【００２２】
色素（Ｄ）は、投与される組織または血液の色と対照的であり得る。特に、色素の色は、藍色、青色、紫色、黒色または緑色であり得、可視光領域で光を発する当業者に公知の任意の色素が、使用され得る。本発明の態様に従って、色素の色は青色であり得る。
【００２３】
上記色素（Ｄ）は、本発明において調製され得るか、または、購入され得る。色素の調製のために、化学合成または組換え技術のような、標準的な分子化学的方法、物理化学的方法または分子生物学的方法が使用され得る。色素（Ｄ）は、アルブミン分子に強力に結合し得る。特に、色素は、ブリリアントブルーＲ、ブリリアントブルーＧ、ナフトールブルーブラック、エバンスブルー、パテントブルーＶＦ、ニトラジンイエロー、およびリアクティブブルー４からなる群より選択され得る。本発明の好ましい態様において、色素は、ナフトールブルーブラックまたはエバンスブルーであり得る。
【００２４】
血清アルブミンおよび色素の混合比は、１：１〜１０、好ましくは、１：２〜６、およびより好ましくは１：３〜５である。
【００２５】
本発明に従う複合体は、マンノシル基（Ｍａｎ）に結合されたリンカーをさらに含有し得る。本明細書中のリンカーは、置換または未置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ４〜Ｃ１０アリール、モノペプチド、ジペプチド、オリゴペプチド、Ｃ４〜Ｃ１０シクロアルキル、ベンジル、チオエーテル、エーテル、アミン、ヒドラジン、ペントース、ヘキソース、およびアルコールからなる群より選択される１以上のリンカーであり得る。マンノシル基（Ｍａｎ）に結合されたリンカーを含有する複合体は、以下の式１：
【化１】
0006748789.tif 000002
（式中、ＳＡは血清アルブミンである）
で示される構造を有し得る。
【００２６】
本発明の好ましい態様において、ブリリアントブルーＧ、ブリリアントブルーＲ、ナフトールブルーブラック、エバンスブルー、パテントブルーＶＦ、ニトラジンイエロー、またはリアクティブブルー４にカップリングされたＭＳＡを調製した（例１を参照）。次いで、本発明者らは、ナフトールブルーブラックおよびエバンスブルーが、マンノース結合体化ヒト血清アルブミンに安定して結合されたことを確認し（表１を参照）、裸眼で観察された色は最も強かった（図４を参照）。
【００２７】
本発明者らは、ナフトールブルーブラックおよびエバンスブルーとそれぞれカップリングさせたＴｃ−９９ｍ−ＭＳＡを調製し、次いで、動物モデルにそれらを投与した。本発明者らは、裸眼によって、上記色素カップリングＴｃ−９９ｍ−ＭＳＡが、凝固するほど長い時間、膝窩リンパ節中に保持されることを観察した（図５および６を参照）。
【００２８】
従って、色素カップリングマンノシル血清アルブミン複合体およびこれを含む組成物は、リンパ節をプロービングするために効果的に使用され得る。
【００２９】
本発明はまた、以下の一般式２：
［一般式２］
（Ｍａｎ）ｍ−ＳＡ−（Ｄ）ｎ−ＲＩ
（式中、
Ｍａｎは、マンノシル基であり、
ＳＡは、血清アルブミンであり、
Ｄは、色素であり、
ＲＩは、放射性同位体であり、
Ｍは、１〜４２の整数であり、および
ｎは、１〜３４の整数である）
で表される、色素および放射性同位体カップリングマンノシル血清アルブミン複合体を提供する。
【００３０】
上記式において、マンノシル基、血清アルブミン、および色素は、上記の特徴を有し得る。マンノシル基（Ｍａｎ）は、リンカー結合体化マンノシル基をさらに含み得る。本明細書中のリンカーは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ４〜Ｃ１０アリール、モノペプチド、ジペプチド、オリゴペプチド、Ｃ４〜Ｃ１０シクロアルキル、ベンジル、チオエーテル、エーテル、アミン、ヒドラジド、ペントース、ヘキソースおよびアルコールからなる群より選択される１以上のリンカーであり得る。
【００３１】
上記放射性同位体は、金属放射性同位体であり得る。特に、上記放射性同位体は、９９ｍＴｃ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、６７Ｃｕ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉおよび１０９Ｐｄからなる群より選択される１以上の放射性同位体であり得る。上記放射性同位体は、マンノシル血清アルブミンのチオール基との結合によって安定的に標識され得る。放射性同位体が体内に非経口投与される場合、それは、リンパ節に蓄積され、従って、慣用的な核医学装置を使用するリンパ節機能の画像化のために使用され得る。
【００３２】
本発明はまた、上記一般式１または２で表されるマンノシル血清アルブミン複合体を含むリンパ節プロービング組成物を提供する。上記組成物中に含まれるマンノシル血清アルブミン複合体は、上記特徴を有し得る。
【００３３】
上記組成物は、同じまたは類似の効果を示す材料と混合され得るか、または、同時処理され得る。
例としては、上記組成物は、約１００〜１，０００ｍｇの濃度で色素カップリングＭＳＡを含有する、薬学的に許容可能な非発熱性滅菌組成物または注射バイアルであり得る。
【００３４】
上記組成物の非経口投与のための処方物は、滅菌水溶液、水不溶性賦形剤、懸濁液、エマルジョン、凍結乾燥調製物、および坐薬である。水不溶性賦形剤および懸濁液は、活性化合物（単数または複数）に加えて、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エチロレートのような注射可能エステルなどを含有し得る。坐薬は、活性化合物（単数または複数）に加えて、ウイテプゾール、マクロゴール、ツイーン６１、カカオバター、ラウリンバター、グリセロゼラチンなどを含有し得る。
【００３５】
本発明の組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別および健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄速度および疾患の重篤度によって調整され得るが、いかなる方法も、本発明の範囲を制限することはできない。
【００３６】
本発明はまた、上記リンパ節プロービング組成物を含むキットを提供する。上記キットに含まれる一般式１または２で表されるマンノシル血清アルブミン複合体は、上記特徴を有し得る。
【００３７】
上記キットは、ｐＨの調節のための緩衝液をさらに含み得る。特に、本明細書中の緩衝液は、酢酸、リン酸、クエン酸、フマル酸、酪酸、コハク酸、酒石酸、炭酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルカル酸、ホウ酸、アスコルビン酸、ゲンチジン酸およびそれらのナトリウムまたはカリウム塩からなる群より選択される１以上の緩衝液であり得る。
【００３８】
上記緩衝液は、ｐＨ５〜ｐＨ９で、好ましくは、ｐＨ６〜ｐＨ８で存在する。緩衝液は、１〜１０Ｍ、好ましくは、２〜８Ｍ、より好ましくは、３〜７Ｍの濃度で含まれ得る。上記緩衝液は、キットを製造する際に溶解、凍結、または凍結乾燥および密封して、提供され得る。
【００３９】
キットはさらに、抗酸化剤および賦形剤を含み得る。この時点において、本明細書中の抗酸化剤は、放射線分解によって放射性同位体標識ＭＳＡの分解を防止し、これは、ビタミンＣおよびゲンチジン酸によって例示される。抗酸化剤および賦形剤は、キットの０〜５００ｍｇ／ユニット投与量の濃度で含まれ得る。
【００４０】
キットは、滅菌容器で、不活性ガスの存在下で凍結または凍結乾燥して提供され得る。キットはさらに、病院で使用されるべき注射薬を生成するために、緩衝液滅菌バイアル、生理食塩水、シリンジ、フィルター、カラムおよび他の補助装置を含み得る。かかる改変は、当該分野の技術常識を有する当業者に周知である。
【００４１】
本発明はまた、リンパ節をプロービングするための方法を提供し、本発明に従う１以上の複合体を対象に投与するステップを含む。
上記複合体は、上記特徴を有し得る。特に、上記複合体は、一般式１または２で表されるマンノシル血清アルブミン複合体であり得る。
対象は、哺乳動物、特にヒトであり得る。
【００４２】
さらに、本発明は、リンパ節プロービング組成物の調製のための本発明の複合体の１以上の使用を提供する。
上記複合体は、上記特徴を有し得る。特に、上記複合体は、一般式１または２で表されるマンノシル血清アルブミン複合体であり得る。
【００４３】
本発明の実践的なおよび現在の好ましい態様は、以下の例に示されるとおり例示的である。
しかしながら、当業者は、これらの開示を考慮して、本発明の精神および範囲内で、改変および改善を行ってもよいことが理解される。
【００４４】
例１：ＭＳＡの調製
２６８ｍｇのヒト血清アルブミン(Green Cross Corp., Korea)を、２５ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解し、これに、２５ｍｇのマンノピラノシル−フェニルイソシアネートを添加し、続いて、室温で２０時間撹拌した。チオウレア結合の形成は、図２に示されるとおり、マンノシル基と血清アルブミンとの間の共有結合を誘導するのを可能にした。撹拌した反応混合物を、セファデックスＧ−２５カラム(Pharmacia, Uppsala, Sweden)を使用してＰＢＳ（ｐＨ７）で溶出した。その結果、高品質のＭＳＡを得た。
【００４５】
例２：色素カップリングＭＳＡの調製
例１で得たＭＳＡを、以下の方法によって色素にカップリングさせた。
特に、色素のブリリアントブルーＧ（ＢＧ）、ブリリアントブルーＲ（ＢＲ）、ナフトールブルーブラック（ＮＢＢ）、エバンスブルー（ＥＢ）、パテントブルーＶＦ（ＰＢＶＦ）、ニトラジンイエロー（ＮＹ）、およびリアクティブブルー４（ＲＢ４）（図１）の各々を、１ｍＭの濃度で滅菌水に溶解した。２ｍｌの２００ｍｇ／ｍＬ  ＭＳＡをそこに添加して、総容量３ｍＬで反応混合液を調製した。反応は、３７℃で２時間誘導した。
【００４６】
反応の完了の際、ＭＳＡにカップリングしていない色素の量を、色素カップリングＭＳＡを用いて、１時間毎に薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を実施することによって測定した。この時点で、メタノールおよび塩化メチレン（ＭｅＯＨ：ＭｅＣｌ２）混合物を、溶媒として使用して、結果物を、ＬＡＳ３０００（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ）を使用してマルチゲージ(multi-gauge)３．０ソフトウェアによって定量分析した。
【００４７】
【表１】
0006748789.tif 000003
【００４８】
【表２】
0006748789.tif 000004
【００４９】
その結果、表１に示されるとおり、ＭＳＡにカップリングした全ての色素は、元の場所から移動せず、ＭＳＡにカップリングした各色素の保持係数（Ｒｆ）は全て０であった。各色素の保持係数は、０．２５〜０．９であった（表１）。表２に示されるとおり、ＢＲおよびＮＹ以外の、ＢＧ、ＮＢＢ、ＥＢ、ＰＢＶＦ、およびＲＢ４は全て、ＭＳＡに安定かつ強力に結合できる色素として使用できることが確認された（表２）。
【００５０】
例３：Ｔｃ−９９ｍ標識ＭＳＡの調製
Ｔｃ−９９ｍは、例１で調製したＭＳＡを使用して、以下の方法により標識した。
第一に、血清アルブミンのジスルフィドを還元して、放射性同位体に結合させた。特に、４０μｌの０．３Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、４０μｌの１Ｍ炭酸水素ナトリウム、および１０μｌの１．５Ｍ  β−メルカプトエタノールを、それぞれ、１ｍＬのＭＳＡ（１３．６ｍｇ／ｍＬ）に添加して、３７℃で１時間反応させた。反応混合物を、セファデックスＧ−２５カラムにロードし、その結果、ジスルフィド還元マンノシル血清アルブミンを得た。０．３ｍＬのグルカル酸溶液（２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０、６μｇのＳｎＣｌ２. ２Ｈ２Ｏ含有）を、得られた１ｍＬのジスルフィド還元マンノシル血清アルブミン（１３．６ｍｇ／ｍＬ）に添加し、続いて、混合した。タンパク質１ｍｇと等価の混合液を、各バイアルに分配し、これに、９９Ｍｏ／９９ｍＴｃ発生装置(Samyoung Unitech Co., Ltd.)から溶出した過テクネチウム酸（９９ｍＴｃＯ４−）含有生理食塩水を２〜５ｍＬ添加した。反応混合液を、室温で１０〜３０分反応させて、その結果、Ｔｃ−９９ｍで標識したＭＳＡを調製した。ＴＬＣを実施して、標識効率を測定した。
その結果、図３に示されるとおり、ＭＳＡのＴｃ−９９ｍ標識効率は非常に高いことが確認された（図３）。
【００５１】
例４：色素およびＴｃ−９９ｍ標識ＭＳＡの調製
例３で調製したＴｃ−９９ｍ−ＭＳＡの５０μｌを、例２で調製した色素カップリングＭＳＡの３００μｌに添加し、続いて、ボルテックスを使用して室温で１分間混合した。その結果、色素およびＴｃ−９９ｍ標識ＭＳＡを調製した。
【００５２】
実験例１：色素カップリングＭＳＡの視覚的観察
例２で調製した色素カップリングＭＳＡの色を、裸眼によって観察した。
特に、色素カップリングＭＳＡを、滅菌水を用いて１／２に連続希釈し、溶液を２ｍＬバイアルに添加した（１ｍＬ／バイアル）。次いで、白色の背景で、写真を撮影し、色を観察した。この時点で、ＭＳＡにカップリングしていない色素を含有する溶液を、対照として使用した。
【００５３】
その結果、図４に示されるように、ＢＲ、ＢＧ、ＮＢＢ、ＥＢ、ＰＢＶＦ、およびＲＢ４は、組織または血液の色と対照的な、暗い色を示し、これらは、視覚的観察に適していることが確認された（図４）。特に、アルブミンと結合するＮＢＢおよびＥＢの割合は高く（表２）、裸眼で観察される色は最も暗く、これらは最も適した色素であることが確認された。
【００５４】
実験例２：色素カップリングＭＳＡの分子吸光係数の測定
例２で調製した色素カップリングＭＳＡの分子吸光係数を、以下のとおり測定した。
【００５５】
色素カップリングＭＳＡ溶液を、９６ウェルプレートにロードし、これを、３５０ｎｍ〜８５０ｎｍの範囲の可視光でスキャンして、Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific Inc., Finland)分光計を使用して、吸収スペクトルのピークにおける吸光度を測定した。分子吸光係数を、ランベルト・ベールの法則に従って、１ｃｍ長あたりの吸光度を計算することによって測定した。
【００５６】
【表３】
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【００５７】
その結果、表３に示されるとおり、ＲＢ４およびＮＹは、相対的に低い分子吸光係数を示したが、ＰＢＶＦは、最も高い分子吸光係数を示した（表３）。
【００５８】
実験例３：色素およびＴｃ−９９ｍ標識ＭＳＡのリンパ節プロービング効果の確認
例４で調製したＮＢＢまたはＥＢカップリングＴｃ−９９ｍ−ＭＳＡのリンパ節プロービング効果は、以下の方法によって、動物モデルにおいて確認した。
特に、３５μｌのＮＢＢまたはＥＢカップリングＴｃ−９９ｍ−ＭＳＡを、ハミルトンシリンジを使用して、マウスの足底に皮下注射した。マウスを麻酔した後、皮膚をはがして、色素の動きを裸眼によって観察した。他方、放射活性材料のＴｃ−９９ｍは、ＳＰＥＣＴ／ＣＴによって観察した。
【００５９】
その結果、図５および６に示されるように、色素および放射活性は全て、ＮＢＢカップリングＴｃ−９９ｍ−ＭＳＡの投与の１０分後にマウスの膝窩リンパ節に濃縮されており、これは、２時間続いた（図５）。一方、ＥＢカップリングＴｃ−９９ｍ−ＭＳＡの投与の１０分後、色素および放射活性の両方が、マウス膝窩リンパ節において濃縮されていることが観察され、これは、４時間続いた（図６）。上記結果から、ＮＢＢまたはＥＢカップリングＴｃ−９９ｍ−ＭＳＡは、リンパ節をプロービングするための有効な薬剤として使用され得ることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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