(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩＩまたはＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＶの病変を有すると特徴づけられた個人の非全身性の乳房の異常を処置する方法に使用するための薬剤の製造における治療薬の使用であって、
前記方法は、マンモグラフィ装置によって加えられた圧力によるマンモグラム画像化中に取得された個人の管内流体において、乳房の異常と関連付けられた少なくとも１つのバイオマーカーの増加した存在または減少した存在を検出することを含み、
少なくとも１つのバイオマーカーは、変化したｍｉＲＮＡシグネチャまたはプロフィールを含む、使用。
【請求項２】
個人の管内流体の圧出は、個人の乳頭へのアトロピンまたはオキシトシンの投与により刺激される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
少なくとも１つのバイオマーカーは、ＣＫ５、ＣＫ１４、ＣＫ７、ＣＫ１８、およびｐ６３からなる群から選択される抗原をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
少なくとも１つのバイオマーカーは、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１、またはＧａｌ−ＧａｌＮＡｃ、またはｕＰＡ、ＰＡＩ−１またはＧａｌＮａｃトランスフェラーゼ遺伝子の変化したＤＮＡメチル化のパターンをさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
治療薬は、アントラサイクリン、プラチナ製剤、タキサン、またはこれらの組み合わせである、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
治療薬は、アド−トラスツズマブエムタンシン、アルブミン結合パクリタキセル、アナストロゾール、酪酸、カペシタビン、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ドセタキセル、ドキソルビシンＨＣｌ、エピルビシンＨＣｌ、エリブリン、エベロリムス、エキセメスタン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲムシタビンＨＣｌ、酢酸ゴセレリン、イクサベピロン、ラパチニブジトシラート、レトロゾール、リポソームドキソルビシン、酢酸メゲストロール、メトトレキセート、ミトキサントロン、パクリタキセル、パミドロン酸二ナトリウム、ペルツズマブ、ラロキシフェン、タモキシフェン、タモキシフェン派生体、Ｎ−デスメチルタモキシフェン、エンドキシフェン、シス−タモキシフェン、トレミフェン、トラスツズマブ、ビノレルビン、またはこれらの組み合わせである、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
治療薬は、ＳＥＲＭ、ＳＥＲＤ、ＡＩ、これらの薬学的な塩、またはこれらの組み合わせである、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
ＳＥＲＭは、タモキシフェン、タモキシフェン派生体、シス−タモキシフェン、エンドキシフェン、デスメチルタモキシフェン、ラソフォキシフェン、ラロキシフェン、ベンゾチオフェン、バゼドフォキシフェン、アルゾキシフェン、ミプロキシフェン、レボルメロキシフェン、ドロロキシフェン、クロミフェン、イドキシフェン、トレミフェン、ＥＭ６５２、およびＥＲＡ−９２からなる群から選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
治療薬は、少なくとも１つのオメガ３脂肪酸および少なくとも１つのビタミンＤ化合物をさらに含む、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
個人は、ＣＣＨ、ＡＤＨ、ＤＣＩＳ、またはＩＤＣを有するとさらに特徴づけられる、
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
治療薬は、タモキシフェンまたはタモキシフェン派生体である、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
治療薬は、エンドキシフェンである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
治療薬は、フルベストラントをさらに含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
治療薬は、抗腫瘍抑圧遺伝子ｍｉＲＮＡの抑制物質を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
治療薬は、ｏｎｃｏｍｉｒの活性化剤を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１６】
治療薬は、ＤＮＡメチル化の活性化剤またはＤＮＡメチル化剤を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１７】
ｍｉＲＮＡは、Ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４５４、ｍｉＲ−６５０、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−５６６、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−５３９、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−６３８、ｍｉＲ−５７２、ｍｉＲ−６７１−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−６４４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−５５７、ｍｉＲ−１２０７−５ｐ、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−５５６−３ｐ、ｍｉＲ−９３３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−５７５、Ｌｅｔ−７ｆ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−１２６８、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−６３４、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−５７２、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−８７７、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１９３ａ、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−５１９ｃ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−５４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８３＊、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−２９ａ＊、ｍｉＲ−５０６、ｍｉＲ−３１４３、ｍｉＲ−４３２４、ｍｉＲ−５６９、ｍｉＲ−５４８ｅ、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−３６７２、ｍｉＲ−５４４ｂ、ｍｉＲ−１３５ｂ、ｍｉＲ−２１１７、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−３７８＊、ｍｉＲ−１３５ａ、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１４年６月４日に出願された米国仮特許出願第６２／００７，８３０号の利益を主張し、参照によってその全体が本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は女性の癌において際立って最も一般的な形態であり、かつ人間の癌による死において２番目の主要な死因である。乳癌の診断および処置における進歩にもかかわらず、この疾患の罹患率は、１９４０年以来１年当たり約１％の比率で着実に上昇している。現在は、北アメリカ在住の女性が生涯のうちに乳癌になる可能性は、８人のうち１人である。
【０００３】
現在においてマンモグラフィの広範囲に普及した使用は、乳癌の改善された検知をもたらした。それにもかかわらず、乳癌による死亡率は、女性１００，０００人当たり約２７人の死亡から変化しなかった。マンモグラフィにおいて広く容認された予測値リスク診断および品質保証ツールである乳腺画像報告データシステム（ＢＩ−ＲＡＤＳ）は、乳房の病変を０からＶＩまでのいくつかのＢＩ−ＲＡＤＳカテゴリに分類し、ＢＩ−ＲＡＤＳの分類に基づいて、診断上および疾患管理の提案を行うため、内科医に利用されている。おそらくは高い程度に間違ったＢＩ−ＲＡＤＳカテゴリへの誤った指定、およびその臨床の要素に対する影響により、極めて頻繁に、処置の選択肢および生存率が厳しく制限されてしまう進行し過ぎた段階で乳癌は発見される。実際に、女性がＢＩ−ＲＡＤＳ分類に基づいて入手する情報は、追加の診断のために呼び戻されるか呼び戻されないかの違い、および早期発見の失敗を意味する可能性がある。スケールの小さい側（すなわち、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩまたはＩＩ）、およびスケールの大きい側（ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＶまたはＶ）において放射線専門医中の高いレベルの一致または合意が存在する一方、カテゴリＩＩおよびＩＩＩへの乳房の病変の指定においては放射線専門医の間でより高い程度の不一致が観察されるようである。Ｉｎｔｅｒ−  ａｎｄ  ｉｎｔｒａ−ｒａｄｉｏｌｏｇｉｓｔ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＢＩ−ＲＡＤＳ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒｏｕｐｓ  ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｍａｍｍｏｇｒａｍｓ．Ｒｅｄｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｒａｄｉｏｌ．８５（１０１９）；２０１２  Ｎｏｖ，ｐａｇｅｓ  １４６５−１４７０；Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ＢＩ−ＲＡＤＳ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｒａｄｉｏｌｏｇｉｓｔｓ：ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ  ｏｆ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ａｓｓｉｇｎｅｄ  ｔｏ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｍａｍｍｏｇｒａｍｓ．Ｌｅｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ．Ｊ．  Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌｏｇｙ．２００２  １７９（１），ｐａｇｅｓ１５−２０．したがって、より効果的な疾患分類、乳房の病変の早期発見、および乳房の異常の診断に対する未だ対処されていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
特定の実施形態では、マンモグラフィ中に個人の乳頭から取得した管内流体をスクリーニングして、乳房の異常と関連付けられた少なくとも１つのバイオマーカーを得る工程を含む、診断または予後判定が必要な個人の乳房の異常の診断または予後判定の方法が本明細書に記載される。特定の実施形態では、診断または予後判定が必要な個人の乳房の異常の診断または予後判定の方法は、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩＩまたはＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＶの病変を持っている個人の診断または予後判定のために特に有用である。いくつかの実施形態では、方法はさらに乳頭を収集装置に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、収集装置は固体相のサンプル収集媒体を含む。いくつかの実施形態では、収集装置はさらに装置を乳房に接続する乳房結合部材を含む。いくつかの実施形態では、固体相のサンプル収集媒体は、吸収性の紙、顕微鏡用のスライドガラス、毛細管チューブ、収集チューブ、カラム、マイクロカラム、ウェル、プレート、膜、フィルタ、樹脂、無機のマトリックス、ビーズ、微粒子のクロマトグラフィーの媒体、プラスチック微粒子、ラテックス粒子、コーティングされたチューブ、コーティングされたテンプレート、コーティングされたビーズ、コーティングされたマトリックス、およびそれらの組み合わせより選択される。いくつかの実施形態では、方法はさらに、マンモグラフィ前に個人の乳房の乳管からケラチンを取り除く工程を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、マンモグラフィ前に個人の乳頭にアトロピンを投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、マンモグラフィの実施前に個人にオキシトシンを投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、スクリーニングは管内流体からの細胞を、ＣＫ５、ＣＫ１４、ＣＫ７、ＣＫ１８、およびｐ６３からなる群より選択された抗原に結合する抗体に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーは、細胞学、タンパク質、糖タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子突然変異、一塩基変異多型、ＤＮＡコピー数、ＤＮＡ、ヒストンおよび／またはタンパク質のメチル化、ｍｉＲＮＡ、マイクロバイオーム、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、スクリーニングは管内流体からの細胞を、ＣＫ５、ＣＫ１４、ＣＫ７、ＣＫ１８、およびｐ６３からなる群より選択された抗原に結合する抗体に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、スクリーニングは管内流体のサンプル中において、少なくとも１つ以上のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の存在および／またはレベルを判断する工程、ｍｉＲＮＡシグネチャをプロファイリングする工程、あるいはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは表３、表４、表５、およびそれらの組み合わせより選択される。いくつかの実施形態では、管内流体サンプル中のｍｉＲＮＡはエクソソームである（ｅｘｏｓｏｍａｌ）。いくつかの実施形態では、スクリーニングは増幅、シーケンシング、制限長多型性解析、マイクロアレイ解析、多重の解析、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、管内流体の細胞をｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびＧａｌ−ＧａｌＮＡｃに結��する抗体に接触させる工程、表５に記載されている変化したｍｉＲＮＡシグネチャを管内流体のサンプル中で検知する工程、または、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ遺伝子の変化したＤＮＡメチル化のパターンを管内流体のサンプル中で検知する工程を含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、方法はさらに、スクリーニングの結果に基づいた個人のための処置レジメンを決定または修正する工程を含む。いくつかの実施形態では、処置レジメンは治療薬、放射線処置および／または乳房組織の外科的な切除を含む。いくつかの実施形態では、治療薬は、アントラサイクリン（例えばドキソルビシン、またはエピルビシン）、プラチナ製剤、タキサン（例えば、パクリタキセルまたはドセタキセル）またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、治療薬は、アド−トラスツズマブエムタンシン、アルブミン結合パクリタキセル、アナストロゾール、酪酸、カペシタビン、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ドセタキセル、ドキソルビシンＨＣｌ、エピルビシンＨＣｌ、エリブリン、エベロリムス、エキセメスタン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲムシタビンＨＣｌ、酢酸ゴセレリン、イクサベピロン、ラパチニブジトシラート、レトロゾール、リポソームドキソルビシン、酢酸メゲストロール、メトトレキセート、ミトキサントロン、パクリタキセル、パミドロン酸二ナトリウム、ペルツズマブ、ラロキシフェン、タモキシフェン、またはタモキシフェン派生体（４−ヒドロキシタモキシフェン、Ｎ−デスメチルタモキシフェン、およびシス−タモキシフェン等）、トレミフェン、トラスツズマブ、ビノレルビン、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、治療薬は、アド−トラスツズマブエムタンシン、アルブミン結合パクリタキセル、アナストロゾール、酪酸、カペシタビン、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ドセタキセル、ドキソルビシンＨＣｌ、エピルビシンＨＣｌ、エリブリン、エベロリムス、エキセメスタン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲムシタビンＨＣｌ、酢酸ゴセレリン、イクサベピロン、ラパチニブジトシラート、レトロゾール、リポソームドキソルビシン、酢酸メゲストロール、メトトレキセート、ミトキサントロン、パクリタキセル、パミドロン酸二ナトリウム、ペルツズマブ、ラロキシフェン、タモキシフェン、タモキシフェン派生体、４−ヒドロキシタモキシフェン、Ｎ−デスメチルタモキシフェン、エンドキシフェン、シス−タモキシフェン、トレミフェン、トラスツズマブ、ビノレルビン、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、治療薬は、ＳＥＲＭ、ＳＥＲＤ、ＡＩ、それらの薬学的な塩、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、治療薬は、さらに少なくとも１つのオメガ３脂肪酸、および少なくとも１つのビタミンＤ化合物を含む。
【０００６】
特定の実施形態では、個人の乳房のマンモグラフィ中に取得した管内流体のサンプルに対してスクリーニングを行い乳房の異常のマーカーを選別する工程を含む、診断または予後判定が必要な個人の乳房の異常の診断または予後判定の方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、管内流体のサンプルは乳房液、細胞全体、細胞の小片、細胞膜、選択された液体、管内流体の細胞または他の固体の破片、同様にタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、脂質、糖、オリゴサッカライド、糖脂質、ヌクレオチド（ＤＮＡとＲＮＡポリヌクレオチドを含む）、および他の、管内流体の生化学的かつ分子的な成分を含む。いくつかの実施形態では、方法は収集装置を乳房に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、マンモグラフィ装置によって加えられた圧力は、乳房からの管内流体の圧出をもたらす。いくつかの実施形態では、管内流体のサンプルは収集装置によって収集される。いくつかの実施形態では、管内流体のサンプルは乳房の異常のバイオマーカーを選別するために、スクリーニングを行われる。
【０００７】
定義
用語「個人」、「対象」または「患者」は、互換的に使用される。本明細書において使用されるように、それらはあらゆる哺乳類（すなわち、分類学の分類における動物界脊索動物門脊椎動物亜門哺乳毛の範囲内のあらゆる目、科、および属）を意味する。いくつかの実施形態では、哺乳類はヒトである。前記の用語はいずれも、医療従事者（例えば医者、正看護師、ナースプラクティショナー、医師助手、用務員またはホスピス職員）の監督（例えば、持続的または断続的）を特徴とする状態を必要とせず、その状態に限定されない。
【０００８】
本明細書において使用されるように、「乳房の異常」は乳房のあらゆる異常を意味する。乳房の異常は、乳房の良性の病変、および乳癌を含む。良性の乳房の病変は、限定されないが、乳腺密度の高い乳房、乳腺炎、円柱細胞過形成、非定型性を有する円柱細胞の過形成、管の過形成、小葉過形成、異型乳管過形成および異型の小葉過形成を含む。
【０００９】
本明細書において使用されるように、「乳癌」は乳腺細胞のあらゆる悪性腫瘍を意味する。いくつかのタイプの乳癌が存在している。典型的な乳癌は、限定されないが、非浸潤性乳管内癌、上皮内小葉癌、侵襲性の（または浸潤性の）腺管癌、侵襲性の（または浸潤性の）小葉癌、炎症性乳癌、三種陰性乳癌、ＥＲ＋乳癌、ＨＥＲ２＋乳癌、腺様嚢胞性（または腺様嚢胞の）癌、低級な腺扁平上皮癌、髄様癌、ムチンの（またはコロイドの）癌、乳頭状癌、管状腺癌、化生性癌、および微小乳頭状癌を含む。単一の乳房腫瘍はこれらのタイプの組み合わせ、または侵襲性および原位置の癌の混合体になり得る。
【００１０】
本明細書において使用される用語「診断」は、乳房の異常、または乳房の異常の分子サブタイプの同定等、分子的または病理学的な状態、疾患または症状の同定を意味する。
【００１１】
本明細書において使用される用語「予後判定」は、乳房の異常の再発、転移の伝播および薬剤抵抗性を含む、乳癌に起因する死または進行の可能性の予測を意味する。用語「予測」は、観察、経験または科学的な推論に基づいて、予想または推定する行為を言及する場合がある。一実施例において、医師は、患者が、一次腫瘍の外科的な摘出および／または癌再発のない一定の期間の化学療法の後に生存する可能性を予測する場合がある。
【００１２】
現行の診断方法
マンモグラムは乳房のＸ線である。これは、腫瘤および／または微細石灰化の視覚化を可能にする、乳房組織の画像を作成するためにイオン化放射線を使用する。マンモグラムは異常のサインや症状のない女性の乳房の異常を検査する、および、しこりまたは他の疾患のサインまたは症状が発見された後に乳房の異常を検査するために使用される。
【００１３】
マンモグラフィは、年齢４０歳から７４歳の女性の癌による死亡数を減少させる。しかし、マンモグラフィには次のものを含むいくつかの欠点がある：偽陽性の結果および過剰診断、偽陰性の結果および過小診断、および放射線被曝。偽陽性の結果は、乳癌が存在していない時に、存在を示すとして放射線専門医がマンモグラムを誤って解釈する場合に生じる。偽陽性の結果は過剰診断および過剰処置を導く。研究は、１０年に１回のマンモグラム後に偽陽性の結果を起こす可能性は約５０〜６０パーセントであると示している。偽陽性は特に、マンモグラムが非浸潤性乳管内癌（ＤＣＩＳ、異常細胞が胸管の裏で癌の構造になり得る非侵襲性の腫瘍）を明らかにする際に、特に見られる。これは過剰診断および過剰処置を導く。偽陰性の結果は癌の過小診断および進行を導く。偽陰性の結果は、乳腺密度の高い乳房である、あるいは、小葉状の癌、ムチンの癌または急速に成長する癌になっている個人においてよく見られる。多くの更年期前の女性は乳腺密度の高い乳房を有し、多くの閉経後の女性がさらに乳腺密度の高い乳房を有している。マンモグラフィは、１５％から３０％までの乳腺密度の乳房である女性から癌を発見する感度を有する事が出来る。
【００１４】
マンモグラフィにおける広く容認された予測値リスク診断、および品質保証ツールは、乳腺画像報告データシステム（ＢＩ−ＲＡＤＳ）である。乳房の病変は０からＶＩまでのいくつかのＢＩ−ＲＡＤＳカテゴリに分類される。医師は乳房の異常の管理ツールとしてＢＩ−ＲＡＤＳを使用して、勧告をする。
【００１５】
【表１】
0006757935.tif 000002
【００１６】
スケールの小さい側（すなわち、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩまたはＩＩ）、およびスケールの大きい側（ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＶまたはＶ）において観察者間の高いレベルの一致が存在する一方、ＢＩ−ＲＡＤＳカテゴリＩＩおよびＩＩＩの間で観察者間の一致のより高いレベルの欠落（すなわち不一致）が報告された。（Ｉｎｔｅｒ−  ａｎｄ  ｉｎｔｒａ−ｒａｄｉｏｌｏｇｉｓｔ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＢＩ−ＲＡＤＳ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒｏｕｐｓ  ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｍａｍｍｏｇｒａｍｓ．  Ｒｅｄｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｒａｄｉｏｌ．  ８５（１０１９）；  ２０１２  Ｎｏｖ，  ｐａｇｅｓ  １４６５−１４７０；  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ＢＩ−ＲＡＤＳ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｒａｄｉｏｌｏｇｉｓｔｓ：  ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ  ｏｆ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ａｓｓｉｇｎｅｄ  ｔｏ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｍａｍｍｏｇｒａｍｓ．  Ｌｅｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌｏｇｙ．  ２００２；  １７９（１）．  ｐａｇｅｓ  １５−２０）最も高い不一致を有する診断は「恐らく良性の所見」（カテゴリＩＩＩ）で、５３．５％であった。例えば、ＢＩ−ＲＡＤＳカテゴリＩＩおよびＩＩＩ、またはカテゴリＩＶａおよびＩＶｂへの分類に関する放射線技師の間の不一致は、放射線技師の一人は良性の病変を検出しても個人にさらなる診断のために呼び戻す理由を見出さず、別の放射線技師はおそらく良性である病変を発見してさらなる診断を推奨するという事を意味し、これは主観的な評価のようである。（Ｒｅｄｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．；  ＢＩ−ＲＡＤＳ  Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｆｏｒ  ＵＳ  ａｎｄ  Ｍａｍｍｏｇｒａｐｈｙ：  Ｉｎｔｅｒｏｂｓｅｒｖｅｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｖａｌｕｅ．  Ｌａｚａｒｕｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ．  ２００６，  ２３９（２），  ｐａｇｅｓ  ３８５−３９１）実際のところ、次にとる手段を変更するために女性が得る情報は、さらなる診断のための再診である。しかし、放射線技師コミュニティー内において、ＢＩ−ＲＡＤＳカテゴリＩＩＩおよびＩＶの最終診断の指定に関して、高度の誤った指定とその臨床的な要素への影響から、いくらかの緊張状態が存在している。したがって、より優れた疾患の分類、乳房の病変の早期発見、および乳房の異常の診断の未解決の必要性が存在する。
【００１７】
乳房の異常
正常な乳房は２層構造の管および小葉から成る。管腔の分泌細胞は、中空の内腔を囲み、これは、基底膜と直接接触する位置にある筋上皮細胞の層に囲まれる。
【００１８】
乳房の過形成
過形成（上皮過形成、または増殖性の乳房の疾患としても知られている）は、管または小葉を覆う細胞の異常増殖である。過形成が管内にある場合、それを乳管過形成または管上皮過形成と呼ぶ。それが小葉に影響を与える場合、小葉過形成として言及される。
【００１９】
通常コア針生検または外科的生検で過形成を診断する。細胞が顕微鏡でどのように見えるかに基づいて、過形成は軽度の過形成、通常の過形成または異型の過形成であると区別する。軽度の過形成は、乳癌の危険を増大しない。通常の過形成としても知られている、通常の型（異型性のない）の過形成は、乳房に異常を持たない女性の約１．５から２倍まで癌の危険を増大する。異型の過形成（異型乳管過形成［ＡＤＨ］または異型の小葉過形成［ＡＬＨ］のいずれか）は、乳房に異常を持たない女性の４倍から５倍まで癌の危険を増大する。
【００２０】
さらに、マンモグラフィのスクリーニングの広範囲の採用によって、円柱細胞の過形成（ＣＣＨ）を含む乳房の円柱細胞の病変（ＣＣＬ）は乳房生検中に頻繁に発見されるようになった。既知の前癌性、および癌性の変化の付近にＣＣＬが存在する事は、ＣＣＬは前悪性であり得る事を示唆し、ＣＣＬ、および低悪性度のＤＣＩＳが高い頻度で発生する事は、一般に同一または隣接している乳管終末組織（ＴＤＬＵ）に発生するＣＣＬ、およびＤＣＩＳと同一の乳房で存在するとして知られている。より高度なＣＣＬ、および異型の過形成、およびＤＣＩＳにおける細胞学的および構造的な変化の類似性により、ＣＣＬは異型の乳房増殖および乳癌の前兆を示すものとして提案される。
【００２１】
乳癌
乳癌は、通常は小葉の細胞または管のいずれかにおいて発症する。乳癌は、癌性の管の細胞および小葉の細胞の混合物を含む事を意味する「混合腫瘍」である場合がある。そのような場合は、癌は腺管癌として処置される。乳房に１つを超える腫瘍がある場合、乳癌は多巣性または多中心性であるとして記述される。多巣性の乳癌では、腫瘍は全て最初の腫瘍から発生し、それらは通常は乳房の同じ部分に存在する。癌が多中心性の場合、それは腫瘍が全て別々に生じたことを意味し、それらは多くの場合乳房の異なる領域にある。
【００２２】
侵襲性対非侵襲性：マンモグラフィの現在の欠点への取り組み
非侵襲性の癌は乳房の管または小葉内に留まる。それらは乳房内または乳房を超えて正常組織内へ成長せず、または侵入もしない。時々、非侵襲性の癌は上皮内癌（「同じ場所中の」）と呼ばれ、多数がそれらを前癌と考える。
【００２３】
侵襲性の癌は正常で健康な組織へ拡大または移動する。大半の乳癌は侵襲性である。癌が非侵襲性か侵襲性かは処置選択および処置に対する反応に影響する事になる。
【００２４】
乳癌は侵襲性かつ非侵襲性であり得る。これは、癌の一部が正常組織内へと成長し、癌の一部が乳管または乳腺小葉の内部に留まった事を意味する。この場合、これらの癌は侵襲性として処置される事になる。
【００２５】
大半の場合、乳癌は下記の１つとして分類される：ＤＣＩＳ（乳管上皮内癌）；ＭＩＣ（微侵襲性の乳癌）；ＭＩＣＢおよびＤＣＩＭ。ＤＣＩＳは乳管の内部で留まる非侵襲性の癌である。ＭＩＣはＤＣＩＳのサブタイプである。それは、１．０ｍｍ未満であるサイズを有し、１０％以下のＭＩＣ細胞が管組織（本来の腫瘍部位）を離れている。
【００２６】
ＬＣＩＳ（上皮内小葉癌）：ＬＣＩＳは小葉の内部に留まる細胞の異常増殖である。これは侵襲性の癌を形成する危険の増大を示す。ＩＤＣ（侵襲性の腺管癌）は最も一般的なタイプの乳癌である。侵襲性の腺管癌（ＩＤＣ）は乳管で発症するが、乳房の内部の周囲の正常組織内へと成長する。ＩＬＣ（侵襲性の小葉癌）は小葉の内部で発症するが、乳房の内部の周囲の正常組織内へと成長する。
【００２７】
【表２】
0006757935.tif 000003
【００２８】
【表３】
0006757935.tif 000004
【００２９】
分子のサブタイプ
遺伝子発現解析は４つの主要な生物学上別個である内因性のサブタイプに乳癌を分類する：管腔様Ａ、管腔様Ｂ、ヒト表皮成長因子受容体−２（ＨＥＲ２）過剰発現、および基底様／三種陰性。これらの分子のサブタイプは予後判定および予測価を有する。異なる分子のサブグループの予後判定および化学療法の感受性は異なっている。
【００３０】
ＥＲ＋乳癌は、癌細胞の表面上のエストロゲン受容体の存在を特徴とする。ＥＲ＋癌細胞の増大は、エストロゲンの有効性に関係している。処置の選択肢としてエストロゲン（例えばタモキシフェン）を遮断するＥＲ＋乳癌化学療法剤が存在する。
【００３１】
ＨＥＲ２＋乳癌は、癌細胞の細胞表面のＨＥＲ２の過剰を特徴とする。ＨＥＲ２＋癌は多くの場合付加的な化学療法剤と組み合わせてトラスツズマブで処置される。
【００３２】
三種陰性乳癌は、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体を欠き、表面上にＨＥＲ２タンパク質の過剰が無い細胞を特徴とする乳癌である。三種陰性乳癌は、多くの場合他の乳癌より侵襲性である。腫瘍細胞がエストロゲンとプロゲステロン受容体を欠くため、ホルモン療法（例えばタモキシフェン）は有効ではない。さらに、細胞がＨＥＲ２タンパク質を欠くため、ＨＥＲ２を標的とする薬（例えばトラスツズマブ）は効果がない。
【００３３】
管腔様癌
大半の乳癌は管腔様腫瘍である。管腔様腫瘍細胞は、乳管を覆う内部の（管腔）細胞で発症する乳癌の細胞のように見える。
【００３４】
管腔様Ａ乳癌はＥＲ＋および／またはＰＲ＋、ＨＥＲ２−、低Ｋｉ６７値である。乳癌の約４２−５９％は管腔様Ａである。管腔様Ａ腫瘍は低い、または中程度の腫瘍悪性度になる傾向である。４つのサブタイプのうち、管腔様Ａ腫瘍は、かなり高い生存率およびかなり低い再発率で、最良の予後判定を持つ傾向である。管腔様Ａ腫瘍の約１５％のみがｐ５３変異、すなわちより悪い予後判定に繋がる要素を持つ。
【００３５】
管腔様Ｂ乳癌は、ＥＲ＋および／またはＰＲ＋、ＨＥＲ２＋（または高Ｋｉ６７値を有するＨＥＲ−）である。乳癌の約６−１７％は管腔様Ｂである。管腔様Ｂ乳癌を持つ女性は管腔様Ａ乳癌を持つ女性よりも若い年齢の時に診断される。管腔様Ａ腫瘍と比較して、管腔様Ｂ腫瘍は、さらに次のものを含むより悪い予後判定を導く要素を持つ傾向がある：より悪性の腫瘍悪性度；より大きな腫瘍サイズ；およびｐ５３遺伝子変異。一般に、管腔様Ｂ腫瘍を持った女性は、管腔様Ａ腫瘍を持つ女性ほど高くないが、かなり高い生存率を有する。
【００３６】
基底様
乳癌のおよそ１４−２０％は基底様である。基底様の乳癌は、免疫表現型のマーカーＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２が三種陰性であるがＣＫ５／６が発現している点で管腔様癌と異なる。基底様の乳癌は増加した低酸素症および高い腫瘍悪性度を示し、高度な細胞増殖、および悪い臨床の結果が特徴である悪性の表現型を有する。大半のＢＲＣＡ１乳癌および多くのＢＲＣＡ２乳癌は両方とも三種陰性／基底様である。三種陰性／基底様の腫瘍は多くの場合、エストロゲン受容体陽性のサブタイプ（管腔様Ａおよび管腔様Ｂ腫瘍）と比較して悪性で、より悪い予後判定である。三種陰性／基底様の腫瘍は、通常は手術、放射線処置、および化学療法のある程度の組み合わせで処置される。これらの腫瘍は、ホルモン受容体陰性、およびＨＥＲ２／ｎｅｕ陰性であるため、ホルモン療法またはトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））で処置することが出来ない。
【００３７】
乳房の異常の診断または予後判定の方法
特定の実施形態では、個人の乳房のマンモグラフィ中に取得した管内流体のサンプルに対してスクリーニングを行い乳房の異常のマーカーを選別する工程を含む、診断または予後判定が必要な個人の乳房の異常の診断または予後判定の方法が本明細書に記載される。これらの診断または予後判定が必要な個人の乳房の異常の診断または予後判定の方法は、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩ−Ｖの病変、好ましくは、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩ−ＩＶの病変、および、さらに好ましくは、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩＩ−ＩＶの病変を持つ個人の診断または予後判定に特に有用である。いくつかの実施形態では、方法は管腔様、および基底様の癌を区別するために有用である。他の実施形態では、方法は、前癌と癌、過形成と癌、および侵襲性と非侵襲性の癌を区別するために有用である。いくつかの実施形態では、管内流体のサンプルは乳房液を含む、細胞全体、細胞の小片、細胞膜、選択された液体、管内流体の細胞または他の固体の破片、同様にタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、脂質、糖、オリゴサッカライド、糖脂質、ヌクレオチド（細胞結合性、および無細胞のＤＮＡ（例えばｃｆＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ）、ならびに細胞結合性および無細胞のＲＮＡポリヌクレオチド、無細胞のＤＮＡおよび無細胞のＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡ）を含む）および他の同様の管内流体の生化学的かつ分子的な成分を含む。いくつかの実施形態では、方法は収集装置を乳房に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、マンモグラフィ装置によって加えられた圧力は、乳房からの管内流体の圧出をもたらす。いくつかの実施形態では、圧出される流体の量は１マイクロリットル未満である。いくつかの実施形態では、圧出される流体の量は１ナノリットル未満である。いくつかの実施形態では、圧出される流体の量は１ナノリットルから１ピコリットルの間である。いくつかの実施形態では、圧出される流体の量は１ピコリットル、２ピコリットル、３ピコリットル、４ピコリットル、５ピコリットル、６ピコリットル、７ピコリットル、８ピコリットル、９ピコリットル、１０ピコリットル、１０から１５ピコリットルの間、または１５から２０ピコリットルの間である。いくつかの実施形態では、管内流体のサンプルは収集装置によって収集される。いくつかの実施形態では、管内流体のサンプルは、乳房の異常のバイオマーカーを選別するためにスクリーニングされる。いくつかの実施形態では、方法はさらに乳房の乳頭の清浄化を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらにマンモグラフィ前に個人にオキシトシンを投与する工程を含む。
【００３８】
収集装置
特定の実施形態では、個人の乳房のマンモグラフィ中に取得した管内流体のサンプルに対してスクリーニングを行い乳房の異常のマーカーを選別する工程を含む、診断または予後判定が必要な個人の乳房の異常の診断または予後判定の方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、方法は収集装置を乳房に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、管内流体のサンプルは収集装置によって収集される。いくつかの実施形態では、収集装置は装着可能である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、収集装置は固体相のサンプル収集媒体を含む。いくつかの実施形態では、収集装置はさらに装置を乳房に接続する乳房結合部材を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、固体相のサンプル収集媒体は吸収性の紙である。いくつかの実施形態では、吸収性の紙は流体を吸収する。いくつかの実施形態では、吸収性の紙はタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、吸収性の紙はヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせに結合する。いくつかの実施形態では、吸収性の紙は細胞に結合しない。
【００４１】
いくつかの実施形態では、収集装置は吸収性の紙を含む。いくつかの実施形態では、吸収性の紙は流体を吸収する。いくつかの実施形態では、吸収性の紙はタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、吸収性の紙はヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせに結合する。いくつかの実施形態では、吸収性の紙は細胞に結合しない。
【００４２】
本明細書において記載された方法における使用のための吸収性の紙（それらはまた、本明細書において「膜」と呼ばれる場合がある）は、上皮細胞、および、例えばタンパク質、炭水化物、脂質、核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡ、その他のようなバイオマーカーの収集に適している任意の物質で製造される。吸収性の紙は、例えば、ニトロセルロース、微細セルロース、混合セルロースエステル、または他の管内流体のサンプルの収集のために適正な物質で製造されたものを含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、吸収性の紙は乳頭および／または乳輪の切り傷（ｐａｐｅｒ  ｃｕｔｓ）を引き起こさない。いくつかの実施形態では、吸収性の紙は乳頭および／または乳輪の切り傷を引き起こさないよう形作られる。
【００４４】
吸収性の紙は、大型の紙材料から金属の鋳型で紙を打ち抜く事で形成される。吸収性の紙は乳頭を覆う、または部分的に覆うのに十分な大きさである。いくつかの実施形態では、吸収性の紙は乳頭を覆うのに十分な大きさである。従って、吸収性の紙は、任意の大きさの吸収性の紙における平均の寸法Ａにおける直径または長さで約１．０インチから約３．０インチであり得る。吸収性の紙は、例えば直径が、約１．０、約１．１、約１．１５、約１．２、約１．２５、約１．３、約１．３５、約１．４、約１．４５、約１．５、約１．５５、約１．６、約１．６５、約１．７、約１．７５、約１．８、約１．８５、約１．９、約１．９５、約２．０、約２．１、約２．１５、約２．２、約２．２５、約２．３、約２．３５、約２．４、約２．４５、約２．５、約２．５５、約２．６、約２．６５、約２．７、約２．７５、約２．８、約２．８５、約２．９、約３．０インチであり得る。いくつかの実施形態では、吸収性の紙は乳房の乳輪を覆う、または部分的に覆う。いくつかの実施形態では、吸収性の紙は乳房の乳輪を覆う。いくつかの実施形態では、吸収性の紙は乳房の乳輪を部分的に覆う。いくつかの実施形態では、吸収性の紙は乳頭を覆い、乳房の乳輪までは広がらない。
【００４５】
吸収性の紙の厚さは最適なサンプルの収集を可能にするために変更され、厚さが約０．０００１インチから約０．１インチである材料を含む場合がある。例えば、吸収性の紙は、約０．０００１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、または約０．１インチの厚さであり得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、固体相のサンプル収集媒体は顕微鏡のスライドガラス、毛細管チューブ、収集チューブ、カラム、マイクロカラム、ウェル、プレート、膜、フィルタ、樹脂、無機のマトリックス、ビーズ、微粒子のクロマトグラフィーの媒体、プラスチック微粒子、ラテックス粒子、コーティングされたチューブ、コーティングされたテンプレート、コーティングされたビーズ、コーティングされたマトリックス、またはそれらの組み合わせを含む。
【００４７】
オキシトシン
特定の実施形態では、個人の乳房のマンモグラフィ中に取得した管内流体のサンプルに対してスクリーニングを行い乳房の異常のマーカーを選別する工程を含む、診断または予後判定が必要な個人の乳房の異常の診断または予後判定の方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、方法はさらに、マンモグラフィ実施前にオキシトシン、またはカルベトシンを含むその類似体を個人に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、マンモグラフィ実施前にカルベトシンを個人に投与する工程を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、オキシトシン、またはカルベトシンを含むその類似体は、肺胞管の組織の筋上皮性の短縮を刺激し、個人の乳頭からの管内流体の圧出をもたらす。いくつかの実施形態では、オキシトシン、またはカルベトシンを含むその類似体は、鼻腔内に投与される。いくつかの実施形態では、オキシトシン、またはカルベトシンを含むその類似体は、筋肉内、または血管内の注入によって投与される。いくつかの実施形態では、オキシトシン、またはカルベトシンを含むその類似体は、乳頭からの管内流体の圧出を刺激するのに有効な量で投与される。
【００４９】
一度十分な投与後の期間が経過し、オキシトシンが標的に達して標的の肺管組織を刺激することが可能になったならば、管内流体は乳頭から直接収集される。管内流体を収集した後、乳房の異常のバイオマーカーの存在および／または量を判断するために管内流体上で生物検定を行う。
【００５０】
任意の適切なオキシトシン、またはカルベトシンを含むその類似体は、本明細書に記載される方法の調製に使用される。
【００５１】
乳房の事前準備
特定の実施形態では、個人の乳房のマンモグラフィ中に取得した管内流体のサンプルに対してスクリーニングを行い乳房の異常のマーカー、および／またはＴ細胞マーカー等の特定の乳房の異常においてより良い臨床的な結果と関連するマーカーを選別する工程を含む、診断または予後判定が必要な個人の乳房の異常の診断または予後判定の方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、方法はさらに、乳房の乳頭の清浄化を含む。
【００５２】
乳頭は任意の適した方法で清浄化される。いくつかの実施形態では、乳頭は無菌化される。いくつかの実施形態では、乳頭から細片（例えばケラチン栓）が取り除かれ、乳頭の管への接触を増大させる。いくつかの実施形態では、乳頭は非角質化ゲルを含むマイルドスクラブで洗浄（ｓｃｒｕｂｂｅｄ）される。いくつかの実施形態では、乳頭は剥離剤を用いて洗浄される。本明細書において記載された方法により任意の適切な剥離剤が使用され得る。適切な剥離剤の例は、限定されないが、マイクロファイバー布、粘着性の剥離シート、微細なビーズのスクラブ洗顔料、クレープ紙、粉砕されたアンズの種またはアーモンドの殻、糖または食塩の結晶、軽石、およびスポンジ、ヘチマの繊維、ブラシ、サリチル酸、グリコール酸、果物の酵素、クエン酸、リンゴ酸、アルファヒドロキシ酸（ＡＨＡ）、およびベータヒドロキシ酸（ＢＨＡ）等の研磨剤を含む。いくつかの実施形態では、乳頭の洗浄は乳頭の腺管の開放をもたらす。いくつかの実施形態では、洗浄後の乳頭の腺管は直径が約０．１から約０．３ｍｍである。
【００５３】
乳頭の腺管には、腺管の管腔を閉ざしたまま保つ傾向がある円形の平滑筋が存在する。いくつかの実施形態では、個人にアトロピン、または、トロピカミドまたはフェニレフリン等の関連する筋弛緩剤が投与される。
【００５４】
管内流体の処理
特定の実施形態では、個人の乳房のマンモグラフィ中に取得した管内流体のサンプルに対してスクリーニングを行い乳房の異常のマーカーを選別する工程を含む、診断または予後判定が必要な個人の乳房の異常の診断または予後判定の方法が本明細書に記載される。いくつかの実例では、固体相のサンプルの収集媒体は、マンモグラフィ中に取得された管内流体の収集に続いて洗浄される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、固体相のサンプルの収集媒体の洗浄は、粘着性の干渉する物質を除去する。いくつかの実施形態では、固体相の収集媒体の洗浄は、緩衝液、洗剤、または水に媒体を接触させる工程を含む。典型的な洗浄剤は、限定されないが、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）、およびミリスチルトリメチルアンモニウムブロミドを含む。いくつかの実施形態では、限定されないが、顕微鏡検査法、免疫細胞化学、および流動細胞計測法を含む方法を使用して、このような洗浄液の流出を分析する。例えば、いかなる細胞も除去するために管内流体のサンプルを含んでいる吸収性の紙または細胞膜を洗浄した後に、洗浄液は顕微鏡検査法によって評価され、流出液中の細胞の数量が定量される。いくつかの実施形態では、流出液中に存在するあらゆる細胞の形態が判定される。いくつかの実施形態では、流出液中に存在する細胞は、細胞が通常のプロフィールを有するか癌細胞を示す１つ以上のマーカーを持つかを判定するために、１つまたはそれ以上の細胞外および／または細胞内のマーカーに染色される。例えば、細胞は、細胞が癌細胞か通常の細胞かを示し得るＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ６３、サイクリン、サイトケラチン、Ｈｅｒ２、または任意の他のマーカーの存在、欠落、またはレベルに基づいて、そのようなマーカーの存在または欠落を解析され得る。
【００５６】
他の実施形態では、管内流体のサンプルを含んでいる吸収性の紙または膜を洗浄した後、洗浄液は、タンパク質、ｃｆＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡ等のＤＮＡ、ならびに無細胞のＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、および成熟しているｍｉＲＮＡを含む）等のＲＮＡの存在を評価される。ＤＮＡまたはＲＮＡは抽出され、その後、本明細書において記載されるようなさらなる解析の対象とされる。実行され得る解析の例は、限定されないが、ＤＮＡコピー数の変化、染色体異常、ＤＮＡ変異（重複、欠失、逆位等）および一塩基多型（ＳＮＰｓ）、ＤＮＡメチル化、ヒストンメチル化、およびタンパク質メチル化ｍｉＲＮＡ発現またはシグネチャ、レクチンシグネチャの変化、およびマイクロバイオームの変化の判定を含む。
【００５７】
さらに他の実施形態では、管内流体のサンプルを含んでいる吸収性の紙または膜等の固体相の収集媒体を洗浄した後、固体相の収集媒体は本明細書において記載されるようなさらなる解析の対象とされる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、アッセイに先立って、または同時的に、サンプルの起源および／またはマンモグラフィに収集された管内流体のサンプルの品質を確認するために、予備的評価が実施される。そのような予備的診断の焦点は、マンモグラフィ中に取得された管内流体から収集されたサンプルが確かに乳房由来であり、乳頭を覆う皮膚からの汗等他の可能性のある不純物で汚染されていないかを確認する事である。サンプルの確認のための他の乳房流体のマーカーは、限定されないが、正常および癌の乳房の上皮細胞で特徴的に示されるサイトケラチン、および人乳の脂質グロブリン（ＨＭＦＧ）タンパク質の糖タンパク質成分に対応するヒト乳房の上皮の抗原（ＨＭＥ−Ａｇｓ）を含む。
【００５９】
スクリーニングと分類
特定の実施形態では、個人の乳房のマンモグラフィ中に取得した管内流体のサンプルに対してスクリーニングを行い乳房の異常のマーカーを選別する工程を含む、診断または予後判定が必要な個人の乳房の異常の診断または予後判定の方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、本明細書において記載される方法は、特にＢＩ−ＲＡＤＳカテゴリＩＩ−ＩＶを持つ個人において、マンモグラフィに付随して使用されるコンパニオン診断法として有用である。従って、いくつかの好ましい実施形態では、個人の乳房のマンモグラフィ中に取得した管内流体のサンプルに対してスクリーニングを行い乳房の異常と関連付けられた少なくとも１つのマーカーを選別する工程を含む、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩＩまたはＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＶの病変を持っている個人の乳房の病変の診断または予後判定の方法が、本明細書において記載される。
【００６０】
他の実施形態では、方法は、処置の選択、患者の再発および疾患の再発のような治療の結果、および化学療法、ホルモン療法、放射線処置等の療法に対する生存率と反応を予測する際に有用である。さらに他の実施形態では、本明細書において記載される方法は、個人の治療上の処置に対する反応をモニタリングする際に有用である。
【００６１】
管内流体のサンプルで判断可能な乳房の病変のマーカーは、細胞学、遺伝子変異（置換、欠失および逆位を含む）、一塩基変異多型（ＳＮＰｓ）、ＤＮＡコピー数、ＤＮＡメチル化のパターンまたはシグネチャ、ヒストンメチル化のパターンまたはシグネチャ、ｍｉｃｒｏＲＮＡパターン、マイクロバイオームのパターン、他の疾患バイオマーカーまたはそれらの組み合わせを含む。本発明の目的で有用な乳房の疾患マーカーの一般的かつ、非網羅的な検討には、Ｈｉｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ，  ２０１４，  ｖｏｌ  ２０１４，  ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ５１３１５８；  Ｐｕｌｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ．  ２０１４，  ｖｏｌ  ５，  ｐａｇｅｓ  ５５９−５７１；  Ｌａｒｉ  ａｎｄ  Ｋｅｕｒｅｒ，  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ．  ２０１１，  ｖｏｌ  ２，  ｐａｇｅｓ  ２３２−２６１を参照、上記の全体が、本明細書に組み込まれる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、スクリーニングは細胞学、免疫組織化学、免疫細胞化学、ＦＩＳＨ、ＩＣＨ、ＲＩＡ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、スクリーニングはＥＬＩＳＡを含む。他の実施形態では、スクリーニングは、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ、およびミトコンドリアＤＮＡを含む）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、無細胞またはエクソソームに含まれるｍｉＲＮＡ、およびミトコンドリアＲＮＡを含む）、脂肪酸および糖タンパク質、ならびにレクチンの、増幅、シーケンシング、制限酵素断片長多型、およびマイクロアレイまたは多重の診断を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、増幅は、限定されないが、逆転写酵素（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）リアルタイムＰＣＲ、等温のＰＣＲ、多重のＰＣＲ、メチル化に特異的なＰＣＲ等を含むリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、実施される。
【００６４】
他の実施形態では、シーケンシングはジデオキシシーケンシング、逆停止（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）シーケンシング、次世代シーケンシング、バーコードシーケンシング、ペアエンドシーケンシング、ピロシーケンス、多重のシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、連結によるシーケンシング、単一の分子のシーケンシング、合成による単一の分子のリアルタイムのシーケンシング、亜硫酸水素塩シーケンシング、全ゲノムシーケンシング、および全エクソームシーケンシングである。さらに他の実施形態では、シーケンシングはＲＮＡ−ｓｅｑ、全トランスクリプトームショット癌シーケンシング、およびｍＲＮＡ−Ｓｅｑによる。
乳房の異常が微生物の腸内毒素症に関連するいくつかの実施形態では、１６Ｓ  ＲＮＡシーケンシングが好ましい。いくつかの好ましい実施形態では、シーケンシングはディープシーケンシング、またはウルトラディープシーケンシングである。
【００６５】
当業者は、スクリーニングは本明細書において記載される方法の任意の組み合わせを含み、当該技術分野で既知の他の方法を含む事が、本発明の範囲内である事を認識するだろう。
【００６６】
いくつかの好ましい実施形態では、単離細胞、複数細胞、管内流体のサンプルの単一の核および複数の核を使用して検査を実施する。他の好ましい実施形態では、スクリーニングは無細胞の管内流体のサンプル上で実施される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡのメチル化のスクリーニングまたは評価は、重亜硫酸塩シーケンシング、メチル化感受性ＰＣＲ、メチル化されたＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）、メチル感受性の単一のヌクレオチドプライマーエクステンション（ＭＳ−ＳＮｕＰＥ）、ゲノム全域に渡るメチル化プロファイリング、メチル化感受性の制限酵素分析、ＣＯＢＲＡ法（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、メチル化に特異的な量子ドット蛍光共鳴エネルギー移動（ＭＳ−ｑＦＲＥＴ）、全体のゲノムマッピング、またはそれらの組み合わせのいずれか１つ以上を使用して、実施される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡメチル化のスクリーニングはさらに、マイクロアレイまたは多重のハイブリダイゼーション、遺伝子発現、コピー数の解析、次世代シーケンシング、またはそれらの組み合わせを含む。
【００６８】
乳管は２つのタイプの上皮細胞、すなわち内部の管腔の細胞および外部の基底状／筋上皮性の細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの発現（例えば、免疫組織化学的な染色による、差次的な遺伝子発現による、ｍｉＲＮＡパターン／シグネチャ、およびＤＮＡメチル化のパターン／シグネチャ、ヒストンメチル化のパターン／シグネチャなど）、遺伝子型判定、遺伝子変異（欠失、挿入、重複および逆位）、ＳＮＰ等を含む遺伝標識の欠如または存在の判断は、管腔様および基底様の乳癌、過形成、前癌、非侵襲性および侵襲性の癌および転移した癌を識別するために使用される。いくつかの好ましい実施形態では、バイオマーカーの発現（例えば、免疫組織化学的な染色、ｍｉＲＮＡパターン／シグネチャの変化、および、ＤＮＡおよび／またはヒストンメチル化のパターン／シグネチャ）は、通常のタイプの過形成および異型の過形成、ＣＣＬおよび過形成、前癌と癌、侵襲性および非侵襲性の癌等を識別するために使用される。腫瘍タンパク質ｐ６３（または形質転換関連のタンパク質６３）は、核の転写因子のｐ５３ファミリーのメンバーである。ｐ６３の存在は基底の上皮の層を特徴づける。いくつかの実施形態では、管内流体のサンプル中のｐ６３の存在は、乳癌が基底様の乳癌であることを示す。
【００６９】
サイトケラチン（ＣＫ）５、およびＣＫ１４の存在は基底の上皮の層を特徴づける。いくつかの実施形態では、管内流体のサンプル中のＣＫ５およびＣＫ１４の存在は、乳癌が基底様の乳癌であることを示す。さらに、ＣＫ５およびＣＫ１４の存在は前駆体および筋上皮細胞を特徴づける。いくつかの実施形態では、管内流体のサンプル中のＣＫ５およびＣＫ１４の存在は、細胞が筋上皮細胞または前駆細胞であることを示す。
【００７０】
ＣＫ７およびＣＫ１８の存在は管腔の上皮の層を特徴づける。いくつかの実施形態では、管内流体のサンプル中のＣＫ７およびＣＫ１８の存在は、乳癌が管腔の乳癌であることを示す。
【００７１】
通常の管の過形成は、ＣＫ５／１４およびＣＫ７／１８の両方の発現を有する管腔の染色パターンを表示する。残基ｐ６３は筋上皮の核内で観察される。いくつかの実施形態では、ＣＫ５、ＣＫ１４、ＣＫ７およびＣＫ１８の存在は、過形成が通常の送管の過形成であることを示す。
【００７２】
異型乳管過形成または非浸潤性乳管内癌は差異がある腺の免疫表現型（ＣＫ７／ＣＫ１８陽性）を表示するが、筋上皮を除いてＣＫ５／１４陰性である。いくつかの実施形態では、ＣＫ７／ＣＫ１８の存在およびＣＫ５／１４の欠如は、過形成が異型乳管過形成であることを示す。
【００７３】
侵襲性の乳房の病変は、筋上皮細胞（ＣＫ５／１４および／またはｐ６３）の数量の減少または欠如、および腺の上皮細胞（ＣＫ７／１８）の存在によって同定される。いくつかの実施形態では、乳癌が疑われる状況における減少した、またはストレス下の筋上皮細胞の存在は、浸潤性への過渡期、および、おそらく侵襲性の状態を示す。主要な乳癌は、管腔（管壁）細胞の数量の増加、および筋上皮細胞の数量の減少を示す。乳癌が生体内原位置から浸潤性して、最終的に侵襲性に進化するに従って、筋上皮細胞の相対数は減少する。発見物が管腔の細胞の正常数より大きい場合、それは、筋上皮細胞が数量において減少していることを示唆し、故に懸念材料が存在する。いくつかの実施形態では、筋上皮細胞の欠如または数量の減少、および腺の上皮細胞の存在は、病変が侵襲性であることを示す。
【００７４】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーの発現は免疫組織化学によって判断される。いくつかの実施形態では、免疫組織化学的な方法は直接的な方法である。いくつかの実施形態では、マンモグラフィと同時に取得された管内流体のサンプルから分離された細胞は、標的の抗原（例えばｐ６３、ＣＫ５、ＣＫ７、ＣＫ１４、ＣＫ１８、ＥＲ、ＰＲ、Ｈｅｒ−２、Ｋｉ６７、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびガラクトース−Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ））に結合する標識抗体に接触させられる。本明細書において記載される方法により任意の適切な標識が使用される。いくつかの実施形態では、標識は色素（または染料）である。いくつかの実施形態では、各抗体に対して異なる色素が使用される。いくつかの実施形態では、同一の細胞タイプの中にあるバイオマーカーに結合する抗体に対して同一の色素が使用される。例えば、第１の色素が管腔様の乳癌細胞（ＣＫ７／１８）中に存在するバイオマーカーに結合する抗体に対して使用され、第２の色素が基底様の乳癌細胞（ＣＫ５／１４およびｐ６３）中に存在するバイオマーカーに結合する抗体に対して使用される。
【００７５】
いくつかの実施形態において、免疫組織化学的な方法は間接的な方法である。いくつかの実施形態では、管内流体のサンプルから分離された細胞は、標識化されていない主要な抗体に接触させられ、標的抗原（例えばｐ６３、ＣＫ５、ＣＫ７、ＣＫ１４、ＣＫ１８）に結合し、標識化された二次抗体は主要な抗体に結合する。いくつかの実施形態では、主要な抗体はバイオマーカー（例えば、ＣＫ５、ＣＫ７、ＣＫ１４、ＣＫ１８，またはｐ６３）に結合する。いくつかの実施形態では、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）二次抗体は、ＣＫ５／１４およびｐ６３に結合する抗体に結合する。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）二次抗体は、ＣＫ７／１８に結合している抗体に結合する。いくつかの実施形態では、例えば主要な抗体がマウスの抗体である場合二次抗体は、例えば、ウサギの抗マウスの抗体になるように、二次抗体は主要な抗体の出所の種に基づく主要な抗体と反応するように産生される。好ましい実施形態では、抱合型のヤギの抗マウスのポリアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）および抱合型のヤギの抗ウサギのポリホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、二次抗体として使用され、マウスおよびウサギのＩｇＧの重鎖および軽鎖の両方と反応する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、クロモゲン（例えば３、３’ジアミノベンジジン  （ＤＡＢ））はＨＲＰに結合し、発色性の反応生成物を生成する。クロモゲンがＤＡＢである場合、クロモゲン反応生成物は茶色である。クロモゲンがＢａｊｏｒａｎ  Ｐｕｒｐｌｅである場合、クロモゲン反応生成物はラベンダーパープルである。
【００７７】
いくつかの実施形態では、クロモゲン（例えばＦａｓｔ  Ｒｅｄ（ＦＲ））はＡＰに結合し、発色性の反応生成物を生成する。クロモゲンがＦＲである場合、クロモゲン反応生成物は赤またはピンクである。いくつかの実施形態では、管内流体のサンプルから分離された細胞は、主要な抗体との接触前に過酸化物ブロックと接触させられる。クロモゲンがＦｅｒａｎｇｉ  Ｂｌｕｅである場合、クロモゲン反応生成物は明るいロイヤルブルーである。
【００７８】
いくつかの実施形態では、細胞は対比染色される。いくつかの実施形態では、細胞はヘマトキシリン、ヌクレアファストレッド（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ）、メチルグリーン、またはメチルブルーで対比染色される。
【００７９】
特定の実施形態において、乳癌を基底様として分類する以下を含む方法が本明細書において記載される：（ａ）マンモグラフィ中に得た管内流体のサンプル中の複数の細胞をＣＫ５、ＣＫ１４、ＣＫ７およびＣＫ１８に結合する抗体に接触させる工程；および（ｂ）ＣＫ５とＣＫ１４の抗体が細胞へ結合する場合に、基底様として癌を分類すること。いくつかの実施形態では、基底様として、乳癌を分類する方法は次のものを含む：（ａ）マンモグラフィ中に得た管内流体のサンプル中の複数の細胞をＣＫ５、ＣＫ１４、ＣＫ７、ＣＫ１８、およびｐ６３に結合する抗体に接触させる工程；および（ｂ）ＣＫ５、ＣＫ１４およびｐ６３の抗体がマンモグラフィ中に収集された管内流体のサンプル中の複数細胞へ結合する場合、基底様として癌を分類する工程。
【００８０】
ある実施形態において、管腔として乳癌を分類する方法が本明細書に開示され、以下を含む：（ａ）マンモグラフィの間に取得された管内流体のサンプル中の複数の細胞と、ＣＫ５、ＣＫ１４、ＣＫ７、ＣＫ１８およびｐ６３に結合する一次抗体とを接触させる工程；および（ｂ）（ｉ）抗ＣＫ７および抗ＣＫ１８一次抗体が複数の細胞に結合する場合、および（ｉｉ）抗ＣＫ５、抗ＣＫ１４および抗ｐ６３一次抗体がマンモグラフィ中に取得された管内流体のサンプル中の複数の細胞と結合しない場合に、癌を管腔として分類する工程。
【００８１】
ある実施形態において、通常の乳管過形成として、過形成を分類する方法が本明細書に開示され、次のものを含む：（ａ）マンモグラフィ中に取得された管内流体のサンプル中の複数の細胞と、ＣＫ５、ＣＫ１４、ＣＫ７、ＣＫ１８およびｐ６３と結合する一次抗体とを接触させる工程；  および、（ｂ）ＣＫ５、ＣＫ１４、ＣＫ７、ＣＫ１８およびｐ６３一次抗体が、マンモグラフィ中に取得された管内流体のサンプル中の複数の細胞と結合する場合に、過形成を通常の乳管過形成として分類する工程。
【００８２】
ある実施形態において、異型乳管過形成として過形成を分類する方法が本明細書に開示され、次のものを含む：（ａ）マンモグラフィ中に取得された管内の流体のサンプル中の複数の細胞と、ＣＫ５、ＣＫ１４、ＣＫ７、ＣＫ１８およびｐ６３に結合する一次抗体とを接触させる工程；および、（ｂ）（ｉ）ＣＫ７とＣＫ１８の一次抗体が、マンモグラフィ中に取得された管内流体のサンプル中の複数の細胞と結合する場合に、異型乳管過形成として過形成を分類する工程。いくつかの実施形態において、異型乳管過形成として過形成を分類する方法があり、次のものを含む：（ａ）マンモグラフィ中に取得された管内流体のサンプル中の複数の細胞とＣＫ５、ＣＫ１４、ＣＫ７、ＣＫ１８およびｐ６３に結合する一次抗体とを接触させる工程；および、（ｂ）ＣＫ５、ＣＫ１５およびｐ６３がマンモグラフィ中に取得された管内流体のサンプル中の複数の細胞と結合する場合に、異型乳管過形成として過形成を分類する。
【００８３】
ある実施形態において、侵襲的こととして乳癌を分類する方法が本明細書に開示され、次のものを含む：（ａ）マンモグラフィ中に取得された管内流体のサンプル中の複数の細胞とＣＫ５、ＣＫ１４、ＣＫ７、ＣＫ１８およびｐ６３に結合する一次抗体とを接触させる工程；および（ｂ）ＣＫ５、ＣＫ１４およびｐ６３一次抗体に結合する細胞の、ＣＫ７およびＣＫ１８一次抗体に結合する細胞に対する比率が、侵襲的コントロールに対し等しいかそれ以下の場合に、侵襲的として癌を分類する工程。いくつかの実施形態において、管内流体のサンプル中の細胞は、ＣＫ５、ＣＫ１４およびｐ６３と結合しない。
【００８４】
ある実施形態において、非侵入性として乳癌を分類する方法が本明細書に開示され、次のものを含む：（ａ）マンモグラフィ中に取得された管内流体のサンプル中の複数の細胞をＣＫ５、ＣＫ１４、ＣＫ７、ＣＫ１８およびｐ６３に結合する一次抗体と接触させる工程；および（ｂ）ＣＫ５、ＣＫ１４およびｐ６３一次抗体に結合する細胞の、ＣＫ７およびＣＫ１８一次抗体に結合する細胞に対する比率が、非侵襲性コントロールと等しいか、それ以上である場合に、非侵襲性として癌を分類する工程。
【００８５】
乳腺疾患を検出する方法が本明細書に開示され、マンモグラフィ中に個人から収集された管内流体サンプルからの細胞と、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびＧａｌ−ＧａｌＮＡｃに結合する抗体とを接触させる工程を含む。いくつかの好ましい実施形態において、乳腺疾患を検出する方法は、マンモグラフィ中にＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩ、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩＩまたはＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＶ病変を有する個人から収集された管内流体サンプルからの細胞を、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびＧａｌ−ＧａｌＮＡｃに結合する抗体と接触させる工程を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、方法は、管内流体サンプルをインドールアミン２、３−ジオキシゲナーゼ−１（ＩＤＯ−１）、インドールアミン２、３−ジオキシゲナーゼ−２（ＩＤＯ−２）、チロシン２．３のジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）またはそれらの組合せのような、酵素を分解するトリプトファンのうちのいずれか１つ以上に対する抗体と接触させる工程を含む。ＩＤＯ−１、ＩＤＯ−２およびＴＤＯ活性はＴｒｅｇｓによって制御Ｔ細胞活性に関係し、癌被処置者の免疫抑制を制御し、および、腫瘍の免疫耐性を与える。ＩＤＯ−１、ＩＤＯ−２およびＴＤＯは腫瘍回避を援助すると言われている。したがって、ここで開示された方法は、侵襲的として乳癌を分類するのに有用であり、次のものを含む：（ａ）マンモグラフィ中に取得された管内流体のサンプル中の１以上の細胞とＩＤＯ−１、ＩＤＯ−２、ＴＤＯまたはそれらの組合せに結合する一次抗体とを接触させる工程；および（ｂ）ＩＤＯ−１、ＩＤＯ−２、ＴＤＯまたはその組合せに結合する細胞の比率が非侵入性コントロールと等しいか、それ以上の場合に、侵襲的として癌を分類する工程。いくつかの好ましい実施形態において、乳腺疾患を検出する方法が本明細書に開示され、マンモグラフィ中に収集された管内流体サンプルから細胞を、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩ、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩＩまたはＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＶ病変を有する個人からのＩＤＯ−１、ＩＤＯ−２  ＴＤＯまたはそれらの組合せに結合する抗体を接触させる工程を含む。
【００８７】
いくつかの実施形態において、管内流体サンプルの収集に続けて、吸収紙が洗浄され、流出液が収集され、細胞数が評価される。サンプルが無細胞である場合、いくつかの実施形態において乳癌に対する低い危険性を持つとして、患者が同定される。サンプルが１個の細胞を含む場合、いくつかの実施形態において、乳癌に対する低い危険性を持つとして、患者が同定され、および随意に、細胞はバイオマーカー表現のために分析される。サンプルが２個以上の細胞を含む場合には、いくつかの実施形態において、乳癌に対する危険性をゆするとして、患者は同定される。また、細胞はバイオマーカー表現のために分析される。
【００８８】
いくつかの実施形態において、もし在れば、前記サンプルにおいて、限定されないが、細胞の細胞学、顕微鏡検査法、流動細胞計測法、免疫組織化学またはそれらの組合せを含む任意の適切な方法も使用して分析される。１つの限定されない実施例において、細胞サンプルは溶血素とエオシンで色付けされてもよい。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法によって測定されたタンパク質は、サンプルの蛋白含有量の合計である。いくつかの実施形態において、吸収紙はコロイド金またはコロイド銀製剤に暴露され、全蛋白内容物（濃縮）は任意の適切な方法も使用して決定される。いくつかの実施形態において、吸収紙は、個人の乳房と接触する前に、あらかじめロードされるか、または、あらかじめコロイド金またはコロイド銀製剤で覆われる。この関係において使用される用語「コロイド金属粒子状物質」は、粒子状物質の分散、好ましくは金属または金属化合物で覆われた金属、金属化合物または核から成るゾルを含むことを意味する。
【００９０】
本明細書で使用される用語「金コロイド」および「コロイド金組成物」は流体において平等に分散した、サブマイクロメーター大の金粒子の懸濁液（例えば水または水性緩衝液）を意味する。定量化分析において利用されたコロイド金組成物は高度に濃縮された金粒子を含んでいる。１実施例において、コロイド金組成物は、３．５×１０１２から７．０×１０１２粒子状物質／ｍｌまでの範囲、例えば（３．５−５．２５）ｘ１０１２粒子状物質／ｍｌ、の金粒子濃縮を有する。
【００９１】
いくつかの実施形態において、マンモグラフィ中に取得された管内流体のサンプルの全蛋白濃縮は決定され、サンプルの全蛋白濃縮が３００ｎｇを超える場合、患者は乳癌のさらに検査のために同定される。いくつかの実施形態において、マンモグラフィ中に取得された管内流体のサンプルの全蛋白濃度が決定され、サンプルの全蛋白濃縮が２００ｎｇタンパク質以下の場合、患者は乳癌に対する低い危険にあることとして同定される。いくつかの実施形態において、マンモグラフィ中に取得された管内流体のサンプルの全蛋白濃度は決定され、サンプルの全蛋白濃度が約３００ｎｇから約２ｕｇまでである場合、患者は乳癌に対する高い危険度にあることとして同定される。
【００９２】
いくつかの実施形態において、マンモグラフィ中に取得された管内流体のサンプルが約５０ｐｇから約０．５ｎｇまでのタンパク質を含み、細胞を含んでいない場合、患者は乳癌に対する低い危険度にあるとして同定される。
【００９３】
いくつかの実施形態において、マンモグラフィ中に取得された管内流体のサンプルが少なくとも約３００ｎｇのタンパク質および２個以上の細胞を含んでいるならば、患者は乳癌のさらなる評価のために同定されるか、または、乳癌用、中程度または高度の危険性であると診断される。いくつかの実施形態において、マンモグラフィ中に取得された管内流体のサンプルの細胞分画は、約２個から約５０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、マンモグラフィ中に取得された管内流体のサンプルの細胞分画は、少なくとも１０個の細胞を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態において、管内流体サンプルはｍｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、無細胞またはエキソームである。いくつかの実施形態において、管内流体サンプルのスクリーニングは、管内流体サンプルにおける、１以上のｍｉＲＮＡの存在及び／又レベルを決定する工程、ｍｉＲＮＡシグネチュアの分析、あるいはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｏｎｃｏｍｉｒｓ、腫瘍抑制因子ｍｉＲＮＡ、またはそれらの組合せを含む。当業者は、ｍｉＲＮＡパターンまたはシグネチャはｏｎｃｏｍｉｒｓおよび腫瘍抑制因子ｍｉＲＮＡの両方を含み、このシグネチャは乳腺疾患のない個人と比較して、乳腺疾患を持った個人において変化するかもしれないことを認識するだろう。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡシグネチャは、乳腺疾患を持った個人の１または両乳房で変化するかもしれない。ある実施形態において、管内流体サンプルは、管内流体サンプルにおいて、ｍｉＲＮＡの少なくとも一部に結合することができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む個人を階層化するか分類するためにスクリーニングされる。他の実施形態において、管内流体サンプルは、管内の流体サンプル中のｍｉＲＮＡの少なくとも一部に結合することができる複数のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む個人を階層化するか分類するためにスクリーニングされる。他の実施形態において、管内流体サンプルは、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩＩまたはＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＶ病変を有する個人をさらに分類するためにスクリーニングされる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、乳腺疾患を有するとして個人を分類する方法が本明細書に開示され、次のものを含む：ａ）マンモグラフィ中に個人の乳頭からの管内流体サンプルを取得する工程、およびｂ）管内流体における表３、表４、表５またはそれらの組合せから選択した、１以上のｍｉＲＮＡの存在を検出する工程であって、そこにおいて、ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡに対する閾値より上の測定値を有する場合に、ｍｉＲＮＡの存在が検出される工程；およびｃ）検出されたｍｉＲＮＡが前記閾値より上の測定値を有するならば乳腺疾患を有する個人を分類する工程。
【００９６】
いくつかの実施形態において、乳腺疾患を含むことを有するとして個人を分類する方法が本明細書に開示され、次のものを含む：ａ）マンモグラフィを受ける個人の乳頭からの管内流体サンプルを取得する工程、および、ｂ）管内流体において表３、表４、表５またはそれらの組合せから選択した、１以上のｍｉＲＮＡの減少した存在を検出する工程であって、そこにおいて、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡに対する閾値よりも下の測定値を有する場合に、ｍｉＲＮＡの減少した存在を検出する工程；およびｃ）検出されたｍｉＲＮＡが前記閾値より下の測定値を有するならば乳腺疾患を有する個人を分類する工程。
【００９７】
【表４】
0006757935.tif 000005
【００９８】
【表５】
0006757935.tif 000006
【００９９】
【表６】
0006757935.tif 000007
【０１００】
【表７】
0006757935.tif 000008
【０１０１】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡの存在は、この技術分野において公知のＰＣＲ方法のうちの任意のものを使用して検出される。そのようなＰＣＲ方法は、限定されないが、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、半量的ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、多重ＰＣＲまたは等温のＰＣＲを含む。他の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、マイクロアレイまたはバイオチップ上で、またはハイブリダイゼーション溶液において含まれるかもしれない１以上のｍｉＲＮＡプローブへのハイブリダイゼーションによって検出され得る。いくつかの好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡシグネチャはｍｉＲＮＡマイクロアレイまたは多重のハイブリダイゼーション、および分析によって決定され得る。いくつかの実施形態において、１以上のｍｉＲＮＡプローブは固体相サンプル収集培地（多重状態で、またはマイクロアレイ上で）に結合され得る。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡプローブは、ガラス、修正済か機能的にされたガラス、プラスチック、ナイロン、セルロースまたはニトロセルロース紙剤のような物質、樹脂剤、シリカまたはシリカ系物質で製作された、固体相サンプル収集培地などに結合され得る。ｍｉＲＮＡプローブは、固体相サンプル収集培地に共有結合または非共有結合で結合され得る。
【０１０２】
診断または予後は、乳腺疾患の被処置者からのサンプルと比較した、通常の被処置者からの管内流体サンプル中のｍｉＲＮＡの差異の表現に基づいてもよい。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ＣＣＨ、ＡＤＨ、ＤＣＩＳまたはＩＤＣに対する危険性または保有状態として個人を分類する方法は、次のものを含む：ａ）マンモグラフィ中に個人の乳頭からの管内流体を取得する工程、ｂ）表３から選択された少なくとも１つのｍｉＲＮＡの変更された表現を検出する工程。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、円柱細胞過形成を有するとして個人を分類する方法は、次のものを含む：ａ）マンモグラフィ中に個人の乳頭からの管内流体を取得する工程、ｂ）表３から選択されたｍｉＲＮＡの変更された表現を検出する工程。ＣＣＨを有するとして個人を分類するための好適な実施形態は、以下の群から選択された、少なくとも１以上のｍｉＲＮＡをスクリーニングする工程を含む；マンモグラフィ中に個人の乳頭から取得されたＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩ、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩＩまたはＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＶ病変を有する個人の管内流体サンプルにおける、Ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４５４、ｍｉＲ−６５０、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−５６６、ｍｉＲ４９７、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−５３９およびｍｉＲ−２２１、Ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１８３、及び／又はｍｉＲ−４５４の表現の変更は、上皮細胞のＣＣＨを示し、一方、ｍｉＲ−６５０、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−５６６、ｍｉＲ４９７、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−５３９、及び／又はｍｉＲ−２２１の表現の変更は、ストロマの起原のＣＣＨを示すだろう。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、異型乳管過形成を有するとして個人を分類する方法は、次のものを含む：ａ）マンモグラフィ中に個人の乳頭からの管内流体を取得する工程、および
ｂ）表３から選択された少なくとも１つのｍｉＲＮＡの変更された表現を検出する工程。ＡＤＨを有するとして個人を分類するための好適な実施形態は、マンモグラフィ中に個人の乳頭から取得された、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩＩまたはＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＶ病変を有している個人の管内流体サンプルにおける、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−６３８、ｍｉＲ−５７２、ｍｉＲ−６７１−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−１５ｂおよびｍｉＲ−６４４から成る群から選択された少なくとも１以上のｍｉＲＮＡをスクリーニングする工程を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、ＤＣＩＳを有するとして個人を分類する方法は、次のものを含む：ａ）マンモグラフィ中に個人の乳頭からの管内流体を取得する工程、およびｂ）表３から選択された少なくとも１つのｍｉＲＮＡの変更された表現を検出する工程。ＤＣＩＳを有するとして個人を分類するための好適な実施形態は、マンモグラフィ中に個人の乳頭から取得された、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩＩまたはＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＶ病変を有している個人の管内流体サンプルにおいて、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−５５７、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２０７−５ｐ、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−５５６−３ｐおよびｍｉＲ−５５６−３ｐから成る群から選択された少なくとも１以上のｍｉＲＮＡをスクリーニングする工程を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ＩＤＣを有するとして個人を分類する方法は、次のものを含む：ａ）マンモグラフィ中に個人の乳頭からの管内流体を取得する工程、ｂ）表３から選択された少なくとも１つのｍｉＲＮＡの変更された表現を検出する工程。ＩＤＣを有するとして個人を分類するための好適な実施形態は、マンモグラフィ中に個人の乳頭から取得された、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩＩまたはＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＶ病変を有している個人の管内流体サンプルにおいて、ｍｉＲ−９３３、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ６３８およびｍｉＲ−５７５、Ｌｅｔ７−ｆ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−６７１−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−１２６８、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−６３４、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−５７２、ｍｉＲ−９３３、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−８７７、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−１９３ａ、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｄから成る群から選択された少なくとも１以上のｍｉＲＮＡをスクリーニングする工程を含む。
【０１０８】
表４に開示された腫瘍抑制因子ｍｉＲＮＡの標的は、乳癌に関係し、この技術分野において公知である（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒａｉｔｓ  ｂｙ  ｔｕｍｏｒ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  Ｇｒａｍｍａｔｉｋａｋｉｓ，  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１３，ｖｏｌ１４，ｐａｇｅｓ１８２２−１８４２；ｍｉｃｒｏＲＮＡ  １７／２０  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｙｕ，ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．２０１０，ｖｏｌ．１０７（１８），  ｐａｇｅｓ８２３１−８２３６，ｅａｃｈ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｅｎｔｉｒｅｔｙ  ｈｅｒｅｉｎ）。当業者は、そのような標的が、本発明の範囲内に落ち着き、本明細書に開示される方法が、乳腺疾患のバイオマーカーとしての標的を含むことを認識するだろう。
【０１０９】
【表８】
0006757935.tif 000009
【０１１０】
いくつかの実施形態において、マンモグラフィを受ける個人を、乳癌（ＣＣＨ，ＡＤＨ，  ＤＣＩＳ，ＩＤＣ，またはＬＣＩＳ）の危険性がある、または保有しているとして分類する方法は、マンモグラフィ中に個人の乳頭からの管内流体サンプルを取得する工程、および、表５にリストされた、個人における、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびＧａｌ−ＧａｌＮＡｃ表現を制御するｍｉＲＮＡの変更された表現をスクリーニングする工程、を含む。いくつかの好ましい実施形態において、表５にリストされたＩＤＯ１表現を制御するｍｉＲＮＡの表現がスクリーニングされる。好適な実施形態は、マンモグラフィ中に個人の乳頭から取得された、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩＩまたはＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＶ病変を有している個人の管内流体サンプルにおいて、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびＧａｌ−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ表現を制御する、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ１９３ａ、ｍｉＲ１９３ｂ、ｍｉＲ１８１ａ、ｍｉＲ１４３、ｍｉＲ１４５、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｄから成る群から選択されたｍｉＲＮＡの変更された表現をスクリーニングする工程を含む。いくつかの好ましい実施形態において、ＩＤＯ−１を制御するｍｉＲＮＡ  １８１ａもスクリーニングされる。いくつかの実施形態において、管腔Ａ様乳癌を有するとして被処置者を分類する方法は、次のものを含む：ａ）マンモグラフィを受ける被処置者の乳頭からの管内流体サンプルを取得する工程、およびｂ）ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ１８１ａおよびｍｉＲ−６５２から成る群から選択された少なくとも１つのｍｉＲＮＡの変更された表現を検出する工程。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、浸潤性乳癌の危険性があるまたは保有しているとして被処置者を分類する方法は、マンモグラフィを受ける被処置者から管内流体サンプルを取得する工程、およびｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびＧａｌＮａｃトランスフェラーゼを制御するｍｉＲＮＡの変更されたシグネチャをスクリーニングする工程を含む。ＧａｌＮａｃトランスフェラーゼ３、６および７は好ましいＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼである。より好ましいＧａｌＮａｃトランスフェラーゼは、Ｂ３ＧＡＬＴ１やＢ３ＧＡＬＴ５のような、ベータ１−３ガラクトシルトランスフェラーゼである。そのような方法は、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびＧａｌ−ＧａｌＮａｃ表現をアップレギュレートする変更されたｍｉＲＮＡシグネチャをスクリーニングする工程を含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＩＤＯ−１、ＩＤＯ−２、ＴＤＯまたはそれらの組合せを制御するｍｉＲＮＡの変更されたシグネチャのスクリーニングを含む。ＩＤＯ１および−２、および、ＴＤＯは腫瘍回避を支援するものとして知られており、癌関連の免疫抑制に関連している。いくつかの実施形態において、方法は、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１、ＧａｌＮａｃトランスフェラーゼおよびＩＤＯ−１を制御するｍｉＲＮＡの変更されたシグネチャのスクリーニングを含む。従っていくつかの好ましい実施形態において、浸潤性乳癌の危険性がある∪保有しているとして被処置者を分類する方法は、次のものを含む：ａ）マンモグラフィを受ける被処置者の乳頭からの管内流体サンプルを取得する工程、およびｂ）ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ１９３ａ、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−５４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８３＊、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−２９ａ＊、ｍｉＲ−５０６、ｍｉＲ−３１４３、ｍｉＲ−４３２４、ｍｉＲ−５６９、ｍｉＲ−５４８ｅ、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−３６７２、  ｍｉＲ−５４４ｂ、ｍｉＲ−１３５ｂ、ｍｉＲ−２１１７、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−３７８＊、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｄの変更されたレベルを検知する工程。ｍｉＲ１９３ａ、ｍｉＲ−１９３ｂ、およびｍｉＲ−１８１ａレベルの下降、およびｍｉＲ３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｄレベルの上昇は、浸潤性乳癌の増加した危険性を示すであろう。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−４９４およびｍｉＲ−１８３の増加した存在またはアップレギュレーションは、癌転移または癌進行の増加した危険度及び／又は予後不良を示すだろう。他の実施形態において、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃおよびｍｉＲ−１３０８のアップレギュレーションは、乳腺疾患の転移のポテンシャルを示すだろう。いくつかの好ましい実施形態において、ｍｉＲ−２００ｂおよびｍｉＲ−２００ｃのような、ｍｉＲ−２００ファミリーのｍｉＲＮＡメンバーは、好ましい診断的、兆候的、及び／又は予測的な転移性疾患マーカーである。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、乳腺疾患を有するとして個人を分類する方法が本明細書に開示され、次のものを含む：ａ）マンモグラフィ中に個人の乳頭からの管内の流体サンプルを取得する工程；ｂ）管内の流体サンプルを使用して、個人のＤＮＡメチル化シグネチャを評価する工程；およびｃ）個人のＤＮＡメチル化シグネチャに基づいて、乳腺疾患を有するとして個人を分類する工程。いくつかの実施形態において、個人は、管内流体サンプル中のＤＮＡメチル化シグネチャに基づいて、管腔のＡ、管腔のＢまたは基底様乳癌である乳腺疾患を保有するとして分類される。他の実施形態において、特定遺伝子のＤＮＡメチル化シグネチャに基づいて、低生存率及び／又は再発の危険性または保有しているとして、個人は診断または予後判定され得る。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、個人は、表６にリストされた遺伝子の少なくとも１以上のＤＮＡ超メチル化を有する。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、個人はＤＮＡ超メチル化を有する、のＤＮＡメチル化に弱い遺伝子で少なくとも１以上である。例えば限定なしで、遺伝子の超メチル化または脱メチル化ｕＰＡおよびＰＡＩ−１のように乳癌の増加した危険度を示すだろう。
【０１１６】
いくつかの好ましい実施形態において、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩＩまたはＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＶ病変を有する個人における乳腺疾患を診断または予後判定する方法は、次のものを含む：ａ）マンモグラフィ中に個人の乳頭からの管内流体サンプルを取得する工程；および
ｂ）管内流体サンプルを使用して、個人のＤＮＡメチル化シグネチャを評価する工程。
【０１１７】
この発明の目的において有用な、広範囲のゲノムおよび特定遺伝子ＤＮＡメチル化プロファイリングに対する方法は、この技術分野において知られており、上に述べたそのような方法の非徹底的なリストを含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡメチル化をスクリーニングし、または評価することが、亜硫酸水素塩シーケンシング、メチル化感受性ＰＣＲ、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）、メチル感受性単一のヌクレオチド・プライマー伸張（ＭＳ−ＳＮｕＰＥ）、ゲノム規模メチル化プロファイリング、メチル化感受性制限酵素分析、結合した亜硫酸水素塩限定解析、メチル化特異性量子ドット蛍光共鳴エネルギー転移（ＭＳ−ｑＦＲＥＴ）、全ゲノムマッピングまたはそれらの組合せによって行なわれる。いくつかの実施形態において、好ましい査定方法はゲノム規模でのＤＮＡメチル化プロファイリングである。ＤＮＡメチル化プロファイリング方法は、この技術分野において公知である（Ｄｅｄｅｕｒｗａｅｒｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１１）。たとえばＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ２７  Ｂｅａｄ  ｃｈｉｐ  （Ｉｌｌｕｍｉｎａ）などの、このような分析の商用資源が利用可能である。
【０１１８】
【表９】
0006757935.tif 000010
【０１１９】
ある実施形態において、乳房ＣｐＧ島メチル化剤表現型（Ｂ−ＣＩＭＰ）であるとして個人を分類する方法が本明細書に開示され、は、次のものを含む：ａ）マンモグラフィ中に個人の乳頭からの管内流体を取得する工程；および、ｂ）個人のＣｐＧ島メチル化表現型を区別する工程；であって、そこでは、個人がＢ−ＣＩＭＰであると特徴づけられた場合に、個人が乳癌転移の低い危険度及び／又はを生存率の向上を有すると言われる。Ｂ−ＣＩＭＰとして個人の表現型を区別する方法は、この技術分野において公知である（Ｆａｎｇ，Ｆ  ｅｔ．ａｌ，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１１，３：７５ｒａ２５）。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、乳腺疾患を有するとして個人を分類する方法が本明細書に開示され、次を含む：ａ）マンモグラフィ中に個人の乳頭からの管内流体サンプルを取得する工程、ｂ）管内流体サンプルを使用して個人のＤＮＡメチル化表現型を決定する工程；およびｃ）乳房ＣｐＧ島メチル化剤表現型として、個人のＤＮＡメチル化シグネチャを区別する工程を含み、そこでは、個人が乳房ＣｐＧ島メチル化剤表現型を有していると分類される場合に、乳癌転移の低い危険度及び／又は生存率の向上を有するといわれる。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、管腔乳癌の危険性がある、または保有しているとして個人を分類する方法は、次のものを含む：ａ）マンモグラフィ中の個人の乳頭からの管内流体サンプルの取得、および、ｂ）ＲＡＳＳＦ１、ＦＺＤ９、ＰＴＧＳ２、ＭＭＥ、ＨＯＸＡ９、ＰＡＸ６、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＦＡＢＰ３、ＦＧＦＰ３、ＧＡＳ７、ＨＤＡＣ９、ＨＯＸＡ１１、ＭＭＥ、ＰＡＸ６、ＰＯＭＣ、およびＲＢＰ１から成る群から選択された、１以上の遺伝子のＤＮＡメチル化状態を決定する工程であって、そこにおいて、遺伝子が超メチル化された場合に、管腔乳癌の危険性がある、または保有しているとして、個人が特徴づけられる。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、基底様に乳癌の危険性がある、または保有しているとして、個人を分類する方法は、次を含む：ａ）マンモグラフィ中の個人の乳頭からの管内流体サンプルを取得する工程、および、ｂ）ＣＤＨ１７、ＥＷＰＨＸ１、ＴＦＦ１、ＲＡＲＡ、ＭＥＳＴ、ＢＣＲ、Ｃ４Ｂ、ＳＥＰＴ５、ＳＥＲＰＩＮＡ５、およびＴＨＹ１から成る群から選択される、１以上の遺伝子のＤＮＡメチル化状態を決定する工程であって、そこにおいて、遺伝子が超メチル化された場合に、管腔乳癌の危険性がある、または保有しているとして、個人が特徴づけられる。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、管腔乳癌の危険性がある、または保有しているとして、個人を分類する方法は、次を含む：ａ）マンモグラフィ中に個人の乳頭からの管内流体サンプルを取得する工程、および、ｂ）ＤＮＡメチル化状態ｕＰＡおよびＰＡＩ−１を決定する工程であって、そこにおいて、遺伝子が超メチル化された場合に、管腔乳癌の危険性がある、または保有しているとして、個人が特徴づけられる。
【０１２４】
他の好ましい実施形態は、マンモグラフィ中に個人の乳頭から得られた管内流体サンプルを使用して、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩＩまたはＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＶ病変を有する個人における、ＡＣＡＤＬ、ＲＥＣＫおよびＳＦＲ２の変更されたＤＮＡメチル化を評価する工程を含む。個人における、１以上のＡＣＡＤＬ、ＲＥＣＫおよびＳＦＲ２遺伝子の増加したＤＮＡメチル化は、再発の増加した危険度及び／又は低い生存率を示し得る。いくつかの好ましい実施形態において、マンモグラフィ中に個人の乳頭から得られた管内流体サンプルを使用して、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩＩまたはＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＶ病変を有する個人におけるｕＰＡおよびＰＡＩ−１遺伝子の変更されたＤＮＡメチル化を評価する工程を含む。ｕＰＡおよびＰＡＩ−１遺伝子の超メチル化は乳癌の増加した危険を示すだろう。
【０１２５】
治療法
本明細書に開示される、ある実施形態において、診断するまたは予後判定を必要とする個人における乳腺疾患を診断または予後判定する方法は、個人の乳房のマンモグラフィ中に取得された管内流体サンプルから乳腺疾患のマーカーをスクリーニングする工程を含む。いくつかの実施形態において、さらに方法は、スクリーニングの結果に基づいて、被処置者に対する処置コースを決定する工程を含む。いくつかの実施形態において、方法はＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＩＩまたはＢＩ−ＲＡＤＳ  ＩＶ病変を有する個人に対する処置コースを決定する工程を含む。いくつかの実施形態において、医師は、スクリーニングの結果に基づいて、個人への処置レジメンを処方する。いくつかの実施形態において、処置レジメンは治療薬、放射線治療、及び／又は乳房組織の外科的切除を含む。いくつかの実施形態において、処置レジメンは複数の治療薬を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、治療薬は、アントラサイクリン（例えばドキソルビシンまたはエピルビシン）、白金剤、タキサン（例えばパクリタキセルまたはドセタセル）またはそれらの組合せである。いくつかの実施形態において、治療薬は、トラスツズマブ・エムタンシン、アルブミン結合パクリタキセル、アナストロゾール、カペシタビン、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ドセタセル、ドキソルビシンＨＣｌ、エピルビシンＨＣｌ、エリブリン、エベロリムス、エキセメスタン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲムシタビンＨＣｌ、酢酸ゴセレリン、イクサベピロン、ラパチニブジトシラート、レトロゾール、リポソーム・ドキソルビシン、酢酸メゲストロール、メトトレザト、ミトキサントロン、パクリタキセル、パミドロン酸二ナトリウム、ペルツマブ、ラロキシフェン、タモキシフェン、トレミフェン、トラスツズマブ、ビノレルビンまたはそれらの組合せである。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、治療薬は、ＳＥＲＭ、ＳＥＲＤ、ＡＩ、それらの薬学的塩、または、それらの組合せである。いくつかの実施形態において、ＳＥＲＭは、タモキシフェン、シス形タモキシフェン、４−ハイドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）、エンドキシフェン、デスメチルタモキシフェン、ラソフォクシフェン、ラロキシフェン、ベンゾチオフェン、ベンズドフォキシフェン、アルゾキシフェン、ミプロキシフェン、レボルメロキシフェン、ドロロキシフェン、クロミフェン、イドキシフェン、トレミフェン、ＥＭ６５２およびＥＲＡ−９２から成る群から選択される。好ましくは、いくつかの実施形態において、治療薬は、タモキシフェンまたはタモキシフェン派生物（たとえば４−ヒドロキシタモキシフェン、Ｎ−デスメチルタモキシフェン、エンドキシフェンおよびシス形タモキシフェン）である。いくつかの実施形態において、ＳＥＲＤはフルベストラント、ＡＲＮ−８１０またはＣＨ４９８６３９９を含む。いくつかの実施形態において、ＡＩはアナストロゾール、エキセメスタンおよびレトロゾールから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、複数の治療薬は、ＳＥＲＤ（ＳＥＲＭ）、ＡＩ、製薬の塩、それら、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、治療薬は少なくとも１つのオメガ−３脂肪酸および少なくとも１つのビタミンＤ化合物を含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、治療薬は酪酸である。いくつかの実施形態において、治療薬はドキソルビシンである。いくつかの実施形態において、治療薬はエピルビシンである。いくつかの実施形態において、治療薬はパクリタキセルである。いくつかの実施形態において、治療薬はドセタセルである。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、治療薬は、表３、表４、表５またはそれらの組合せにおいて本明細書に開示される抗腫瘍抑圧遺伝子ｍｉＲＮＡの抑制物質である。そのような抗腫瘍抑圧遺伝子ｍｉＲＮＡの限定しない実施例はｐ６３である。他の実施形態において、治療薬は、表３、表４、表５またはそれらの組合せにおいて本明細書に開示されるｏｎｃｏｍｉｒの活性化剤である。いくつかの実施形態において、治療薬は本明細書に開示される人間または人類以外のｍｉＲＮＡの配列に基づく。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡの阻害剤はアンチセンス・オリゴヌクレオチドである。抗感覚オリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、またはそれらの組合せを含むことができる。アンチセンスヌクレオチドは例えば糖や骨格修飾物などの１以上の化学的修飾を有するかもしれない。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、治療薬は、本明細書に開示されるような、乳腺疾患において超メチル化される遺伝子のＤＮＡ超メチル化の阻害剤である。当業者は、ＤＮＡ超メチル化の阻害が、乳腺疾患に関係される特定遺伝子の遺伝子抑制効果を低減するだろうということを認識するだろう。他の実施形態において、治療薬はＤＮＡメチル化の活性化剤またはＤＮＡメチル化剤である。そのような場合、細胞増殖と腫瘍形成に関係する遺伝子は沈黙させられるか、または発現が抑制されるであろう。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、治療薬は併用療法である。併用療法が投与される場合、各薬剤は他の薬剤と組み合わせて（例えば同時に）または単独で投与されてもよい。さらに、薬剤はすべて請求項に記載の方法に従って投与されてもよい。代わりに、薬剤のうちの一部は、請求項に記載の方法に従って投与されてもよく、一方、他のものは体系的に投与される。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、併用療法はＣＡＦ：シクロホスファミド、ドキソルビシンおよび５−ＦＵである。いくつかの実施形態において、併用療法はＴＡＣ：ドセタセル、ドキソルビシンおよびシクロホスファミドである。いくつかの実施形態において、併用療法はＡＣ→Ｔ：パクリタキセルまたはドセタセルにより後続される、ドキソルビシンとシクロホスファミドである。いくつかの実施形態において、併用療法はＦＥＣ：→Ｔ：ドセタセルまたはパクリタキセルにより後続される、５−ＦＵ、エピルビシン、およびシクロホスファミドである。いくつかの実施形態において、併用療法はＴＣ：ドセタセルとシクロホスファミドである。いくつかの実施形態において、併用療法はＴＣＨ：ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍に対する、ドセタセル、カルボプラチンおよびトラスツズマブである。いくつかの実施形態において、併用療法はＣＭＦ：シクロホスファミド、メトトレザトおよび５−フルオロウラシルである。いくつかの実施形態において、併用療法はＡ→ＣＭＦ：ＣＭＦが後続するドキソルビシンである。いくつかの実施形態において、併用療法はＥＣ：エピルビシンとシクロホスファミドである。いくつかの実施形態において、併用療法はＡＣ：ドキソルビシンとシクロホスファミドである。
【実施例】
【０１３３】
本発明は、次の実施例の参照を通じて一層よく理解され得る。これらの実施例は、典型的な実施形態だけについて記述するために含まれており、本発明の全体を包含すると解釈されるべきでない。
【０１３４】
実施例１
マンモグラフィ中に取得された管内流体サンプルの検査
【０１３５】
吸収紙は固体の相収集媒体として利用される。個人は、マンモグラフィの前にオキシトシンが投与された。両乳房の乳頭は清浄化され、ケラチン栓が除去される。ニトロセルロースフィルターが両方の乳頭に取り付けられる。各乳房がマンモグラフィ装置に配置され、マンモグラフィが実行される。
【０１３６】
マンモグラフィ中に取得された管内流体サンプルの収集に続いて、ニトロセルロースフィルターは任意の適切なバッファ洗浄溶液（例えば燐酸塩緩衝食塩水）を使用して洗浄される。流出液は修飾された細胞学バイアルに収集され、遠心分離される。細胞は流出液から単離され清潔なガラス顕微鏡スライドガラスの中央部に転送され、カバーグラスが適用される。スライドは大気乾燥に可能にされ、次に、例えば、無水アルコールで固定される。
【０１３７】
モノクローナル抗体ＣＫ５、ＣＫ１４、ｐ６３、およびラビットモノクローナル抗体ＣＫ７およびＣＫ１８は、単一の抗体希釈剤で多重化され、顕微鏡検査法スライドに適用される。
その後、ヤギ抗マウスＨＲＰおよびヤギ抗ラビット−ＡＰのカクテルからできているビオチンフリー多重染色検出試薬が適用される。ＤＡＢおよび高速レッド・クロモゲンが連続して適用される。細胞はヘマトキシリンで逆染色される。
【０１３８】
【表１０】
0006757935.tif 000011
【０１３９】
分析の結果は、マンモグラムＸ線の結果と比較される。結果が一貫しているならば、追加分析は実行されない。結果が一貫しない場合、追加分析または試験が実施される。
【０１４０】
実施例２
マンモグラフィ中に取得された管内流体サンプルの処置
【０１４１】
吸収紙は固体の相収集媒体として利用される。個人はマンモグラフィの前にオキシトシンが投与される。両乳房の乳頭は正常化され、ケラチン栓が除去される。ニトロセルロースフィルターが両方の乳頭に取り付けられる。各乳房がマンモグラフィ装置に配置されて、マンモグラフィが実行される。
【０１４２】
マンモグラフィ中に取得された管内流体サンプルの収集に続いて、ニトロセルロースフィルターが、任意の適切なバッファ洗浄溶液（例えば燐酸塩緩衝食塩水）を使用して洗浄される。流出液は、修飾された細胞学バイアルに収集され、遠心分離される。細胞は流出液から単離され清潔なガラス顕微鏡スライドガラスの中央部に転送され、カバーグラスが適用される。スライドは大気乾燥に可能にされ、次に、例えば無水アルコールで固定される。
【０１４３】
前処理
細胞は、過酸化物ブロック−ＢｉｏｃａｒｅのＰｅｒｏｘｉｄａｚｅｄ  １に接触される。
【０１４４】
次に、熱回収前処理を実行する。ＢｉｏｃａｒｅのＤｅｃｌｏａｋｉｎｇチャンバで、３０分間９５℃に、Ｄｉｖａ溶液をあらかじめ加熱する。次に、あらかじめ加熱した溶液にスライドを入れ、４０分間９５℃で、加圧下で回収する。代わりに、４５−６０分間組織切片に蒸気を当てるか、または９５℃で４０分の水浴を使用する。溶液は２０分間冷却され、次いで、蒸留水で洗浄される。
【０１４５】
タンパク質ブロックの適用―Ｂｉｏｃａｒｅの  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｓｎｉｐｅｒを用いて、室温で１０−１５分間、インキュベートする。
【０１４６】
室温で３０−６０分間、一次抗体（すなわちＣＫ５、ＣＫ１４、ＣＫ７、ＣＫ１８およびｐ６３に対する抗体）とともに、スライドをインキュベートする。
【０１４７】
ＢｉｏｃａｒｅのＭＡＣＨ  ２Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔａｉｎ  ２を使用して、室温で３０分間スライドをインキュベートする。
【０１４８】
ＢｉｏｃａｒｅのＢｅｔａｚｏｉｄ  ＤＡＢを使用する場合は、室温で５分間インキュベートする。
【０１４９】
ＢｉｏｃａｒｅのＶｕｌｃａｎ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄを用いて、室温で１０−２０分間インキュベートする。脱イオン水ですすぐ。
【０１５０】
脱イオン水ですすぐ。ヘマトキシリンで３０−６０秒間インキュベートする。脱イオン水ですすぐ。Ｔａｃｈａのブルーイング溶液を１分間適用する。
【０１５１】
光学顕微鏡で、細胞を視覚化する。
【０１５２】
実施例３
管内流体の検査
【０１５３】
この試験は３人の健康で、妊娠していず、乳を分泌しない女性被処置者に関する単一施設試験であった。被処置者はクリニックを訪問した順序で登録された。
【０１５４】
原発性の試験目的は、ニトロセルロースフィルター上のタンパク質の存在によって決定されるような、マンモグラム処置の間に管内流体を生成する３０−６５歳の女性のパーセンテージを決定することだった。
【０１５５】
第２の目的は、（もしあれば）細胞の存在およびタイプに対して、管内流体を細胞学的に評価することであった。
【０１５６】
方法論：
簡潔に言えば、風袋重量を計られたニトロセルロースフィルターが、これを各乳頭（各乳房に対し１つ）に取着することによって、マンモグラフィ中に圧出された管内流体を収集するために使用された。被処置者の１つの組において、マンモグラムが実行された。被処置者の第２の組において、マンモグラムは実行されなかった（対照群）。管内流体試料を含んでいるフィルタの洗浄から収集された細胞は、細胞診を行った。
【０１５７】
検査：
試験の主要評価項目は、マンモグラフィを受ける場合に、ニトロセルロースフィルター上のタンパク質の存在によって決定されるものとして、管内流体を生成する試験を完了した女性のパーセンテージであった。
【０１５８】
第２の評価項目は、細胞学的評価によって決定されるものとして、管内流体サンプル中の細胞の存在であった。
【０１５９】
結果：
これらの被処置者群から得られたフィルタになされたタンパク質試験に関し、対照群から得られたサンプルのどれも、タンパク質の存在を示さなかった。マンモグラムを受けた群からのフィルタはすべて、タンパク質の存在を示した。
【０１６０】
実施例４
管内流体サンプル中のｍｉＲＮＡの検出
【０１６１】
管内流体サンプルは、乳房に装置を取着する乳房係合部材を含む収集装置を使用して、マンモグラフィを受ける女性の被処置者の両乳房の乳頭から吸引される。管内流体サンプルは、吸収紙のような固体相サンプル収集媒体上に収集される。吸収紙上で吸収された管内流体サンプルは洗浄され、ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡを含む）の全量が、引き続き単離される。
【０１６２】
４００μＬのＴｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）が、１ｃｍ×１ｃｍおよび１インチ×１インチの寸法の管内流体サンプルを含む吸収紙を含む２本のｍＬ微量遠心管チューブに添加された。チューブは、ｖｏｒｔｅｘｅｒ上で、４℃°で、３０分間２０００ｒｐｍで攪拌される。引き続き、１．２ｍＬのＴｒｉｚｏｌ（登録商標）、次いで０．２４ｍＬのクロロホルムがさらに添加された後、チューブは室温で５分間再び攪拌され、さらにあと２分後に、１５分間４℃で、１４０００ｇで遠心分離された。頂部水相が収集され、等容積の７５％のエタノールと混合され、製造業者のプロトコルに従って、２４プラス装置（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に対し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ回転カラム上で処理された（ＱＩＡｖａｃ（登録商標）上のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））。ＲＮＡは１００μＬの水を使用して、回転カラムから溶出され、さらなる使用まで−８０℃で保存された。
【０１６３】
２００μＬのＢＡＮおよび１０μＬのポリアクリルキャリヤーを含むれ棄却されたＴＲＩｚｏｌ試薬は、ＲＮＡ回収および産生を向上させるためのいくつかのサンプルと共に使用されてもよい。随意に、単離されたＲＮＡの可視化を向上させるため、および単離プロトコルからクロロホルムとブロモクロロプロパンを除去するために、ブロモアニゾールがこの相分離の間に混合物に加えられてもよい。
【０１６４】
他のサンプルからのｍｉＲＮＡを含んでいるＲＮＡが、ＮａｎｏＤｒｏｐ吸光度測定法またはアジレント定量化方法を使用して定量される。少なくともいくつかのサンプル中のｍｉＲＮＡの濃度および完全性が、アジレントバイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）を用いたＲＮＡ  ６０００  ｎａｎｏ  ＬａｂＣｈｉｐ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  Ａｓｓａｙを使用して、確認される。
【０１６５】
ＲＮＡは、各ｍｉＲＮＡ標的に特異的であるステムループＲＴプライマーを使用して逆転写され、標準的な時間および条件に従って、１反応当たり５０μＭ濃度となるようにヌクレアーゼ除外水で希釈される。その後、ＤＮＡはさらなる使用まで、約−２０℃で保存され得る。ｍｉＲＮＡ表現レベルの相対的な定量化は、標的ｍｉＲＮＡの発現レベルを標準化するために、ｍｉＲ−１６及び／又は他の安定表現された小型ＲＮＡの発現レベルを使用して、リアルタイムＰＣＲによって実施され得る。反応はすべて３回繰り返して実行され、インターアッセイコントロール（ｉｎｔｅｒａｓｓａｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を使用する。データは、標的ｍｉＲＮＡの相対量を決定するために、２−デルタデルタＣＴ法を使用して分析され得る。
【０１６６】
いくつかのサンプルについては、成熟ｍｉＲＮＡのレベルは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡを使用して、測定される（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）適用，ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。ＴａｑＭａｎｍｉＲＮＡ逆転写キットは、ｍｉＲＮＡ特異性オリゴヌクレオチドを使用して、３０分間、４２℃で、９．９μＬＲＮＡを逆転写するために使用される。ｍｉＲＮＡ特異性プライマーおよび１．３３μＬのＲＴ反応物が、４０または４２−サイクル量的ＰＣＲの３倍にするのに使用され、ＳＤＳＴＭソフトウェア（バージョン２．３、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）作製）が、定量化サイクル（Ｃｑ）値を、３倍ＰＣＲ反応から得られた平均値として同定するために使用される。
【０１６７】
スクリーニングされる、管内流体サンプルにおいて循環している標的ｍｉＲＮＡは、表３、表４および表５にリストされる。例えば、循環ｍｉＲ−１９５は、心筋梗塞（ＭＩ）と同様、初期段階の乳癌に対するマーカーである（Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬＯＳ  ＯＮＥ．２０１２，ｖｏｌ．７（１２）ｅ５０９２６）。血液中におけるｍｉＲ−１９５レベルの増加は、乳癌患者およびＭＩにおいて観察される。他の実施例として、高ｍｉＲ−２６ａは、減少したＥＺＨ２表現、および転移性乳癌中のタモキシフェン上の好ましい結果と関連づけられる（Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．２０１２，１３３：９３７−９４７）。しかしながら、ＮＡＦにおける、循環ｍｉＲ−１９５またはｍｉＲ２６ａのレベルは、知られていない。ＮＡＦにおける循環ｍｉＲＮＡ−１９５およびｍｉＲ−２６ａが判定される。
【０１６８】
統計分析および画像的プロットが、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）およびエクセルソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用して、実行される。全てのＴ検定およびマン・ホイットニーＵ検定は、すべて両側検定である。
【０１６９】
当業者は、ｍｉＲＮＡに対するスクリーニング、およびタモキシフェンのような薬剤による処置に対する個人の反応、および、ｍｉＲＮＡ表現およびシグネチャに基づいて、タモキシフェンを用いた処置の結果としてのＭＩのような副作用の可能性を予測する能力を含む、本明細書に開示される方法が、本発明の範囲に含まれることを容易に認識するだろう。
【０１７０】
実施例５
管内流体サンプル中のＤＮＡメチル化シグネチャの検出
【０１７１】
管内流体サンプルは、乳房に装置を取着する乳房結合部材を含む収集装置を使用して、マンモグラフィを受ける女性の被処置者の両乳房の乳頭から吸引される。管内流体サンプルは、吸収紙のような、固体相サンプル収集媒体上に収集される。吸収紙上で吸収された管内流体サンプルは洗浄され、Ｑｉａｇｅｎ−ＤＮＡｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（登録商標）を使用し、提供者の指示（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従って、洗浄液からＤＮＡが抽出される。ＤＮＡは、メーカーの取り扱い説明書に従って、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出される。ＤＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００  ＵＶ−ｉｓスペクトロフォトメーター（ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用して定量化される。位置特異性ＣｐＧメチル化は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ２７  Ｂｅａｄ  Ｃｈｉｐｓ  ｂａｓｅｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して分析される。このアレイは、１４，０００を超える遺伝子から選択された２７と、５７８のＣｐＧ部位を分析するために開発された。これは、単一ヌクレオチド分析において、１サンプル当たりすべての部位の照合を可能にする。ゲノムＤＮＡは、Ｚｙｍｏ  ＥＸ  ＤＮＡメチル化キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、製造業者のプロトコルおよびチップ処理に従って、亜硫酸水素ナトリウムで処置され、データ解析は製造業者のプロトコルを使用して実行される。ビード配列データの品質はＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ（登録商標）メチル化モジュールソフトウェアを用いて、チェックされる。
【０１７２】
特定の実施形態の前述の説明は、非常に十分に本発明の一般的な性質を明らかにし、それは、他者が、現在の知識を適用することによって、様々な適用のために、不適当な実験作業をせず、類似の概念から離れることなく、そのような特定の実施形態を容易に変更及び／又は適合することが可能であり、したがって、そのような適応および変更は、開示された実施形態の相当物の意味および範囲内で理解されることを意図していると言うべきである。本発明は、特定の実施形態との関連性に基づいて記載されるが、多くの代替案、修飾および変化が当業者おいて容易に理解されることは明白である。従って、それは、添付された特許請求の範囲の精神内および広い範囲内にあるような代替案、変更および変化をすべて包含することが意図される。
【０１７３】
本発明の精神および範囲内の様々な変化および修飾が、この記載から当業者に明白になるので、詳細説明と具体例は例示のためにのみ与えられると、理解されるべきである。当業者は同様に、本発明のある特徴は、別の実施形態の文脈において記載されるが、明瞭性のために、単一の実施形態の組合せにおいて提供されてもよいと認識するだろう。反対に、本発明の様々な特徴は、簡潔さのために、単一の実施形態において記載され、同様に別々にまたは任意の適切な副次的組合せにおいて提供されてもよい。