(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型核酸鎖をシーケンシングする核酸シーケンシング方法であって、
（ａ）固体支持体型の電荷センサに付着させたポリメラーゼを提供するステップと；
（ｂ）前記ポリメラーゼをヌクレオチド三リン酸の混合物および前記鋳型核酸鎖に接触させるステップであって、
前記混合物は異なるタイプのヌクレオチド三リン酸を含み、
前記混合物において、前記ヌクレオチド三リン酸の第１の２タイプは、前記ヌクレオチド三リン酸の第２の２タイプと比較し、第１の識別可能な状態にあり、
前記ポリメラーゼは、ヌクレオチドを前記混合物から前記鋳型核酸鎖に対する新生鎖に組み込む、ステップと；
（ｃ）前記ヌクレオチドの組み込みを前記電荷センサにより検出することにより第１シグナルパターンを得るステップであって、
前記混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸は、前記第２の２タイプのヌクレオチド三リン酸により生じるシグナルとは識別されるシグナルを生じさせる、ステップと；
（ｄ）前記ポリメラーゼ、前記鋳型核酸、およびヌクレオチド三リン酸の第２混合物を用いてステップ（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことにより、第２シグナルパターンを得るステップであって、
前記第２混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸の一方は、該第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸のもう一方と比較し、識別可能な状態にある、ステップと；
（ｅ）前記第１シグナルパターンと前記第２シグナルパターンを比較して、前記鋳型核酸の配列を決定するステップとを含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）の前記識別可能な状態は、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸に付着している非天然部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｄ）の前記識別可能な状態は、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸の１つに付着している非天然部分を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記識別可能な状態は、ステップ（ｄ）と比較してステップ（ｂ）において異なる非天然部分を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）の前記識別可能な状態は、前記混合物において、前記第２の２タイプのヌクレオチド三リン酸の量または濃度と比較し、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸をより少量またはより低濃度で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｄ）の前記識別可能な状態は、前記第２混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸の一方の量または濃度と比較し、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸のもう一方をより少量またはより低濃度で含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記鋳型核酸鎖は環状である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記混合物の異なるタイプのヌクレオチド三リン酸は、鋳型核酸鎖の４つの異なるヌクレオチドと相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２混合物の異なるタイプのヌクレオチド三リン酸は、前記鋳型核酸鎖の４つの異なるヌクレオチドと相補的である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記電荷センサは電荷センサのアレイの一部であり、それにより、ステップ（ａ）は、前記アレイにおいて固体支持体型の電荷センサにそれぞれ付着させた複数のポリメラーゼを提供するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）は前記ポリメラーゼを前記ヌクレオチド三リン酸の混合物に接触させるステップを含み、ステップ（ｃ）は、前記ヌクレオチドの組み込みを前記アレイの電荷センサにより検出するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）中に、前記混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸は、前記第２の２タイプのヌクレオチド三リン酸により生じるシグナル変化の極性とは反対の極性を有するシグナル変化を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｄ）中に、前記第２混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸の一方は、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸のもう一方により生じるシグナル変化の極性とは反対の極性を有するシグナル変化を生じさせる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）中に、前記混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸は、前記第２の２タイプのヌクレオチド三リン酸により生じるシグナル変化と比較し、シグナル変化を遅延させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｄ）中に、前記第２混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸の一方は、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸のもう一方により生じるシグナル変化と比較し、シグナル変化を遅延させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｃ）中に、前記混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸は、前記第２の２タイプのヌクレオチド三リン酸により生じるシグナル変化と比較し、シグナル変化の強度を減衰させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｄ）中に、前記第２混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸の一方は、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸のもう一方により生じるシグナル変化と比較し、シグナル変化の強度を減衰させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｃ）中に、前記混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸は、前記第２の２タイプのヌクレオチド三リン酸により生じるシグナル変化と比較し、シグナル変化の強度を強化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｄ）中に、前記第２混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸の一方は、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸のもう一方により生じるシグナル変化と比較し、シグナル変化の強度を強化する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｃ）中に、前記混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸は、前記第２の２タイプのヌクレオチド三リン酸により生じるシグナル変化と比較し、シグナル変化の期間を長くする、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｄ）中に、前記第２混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸の一方は、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸のもう一方により生じるシグナル変化と比較し、シグナル変化の期間を長くする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｃ）中に、前記混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸は、前記第２の２タイプのヌクレオチド三リン酸により生じるシグナル変化と比較し、シグナル変化の期間を短くする、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｄ）中に、前記第２混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸の一方は、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸のもう一方により生じるシグナル変化と比較し、シグナル変化の期間を短くする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記電荷センサは、ＳＷＮＴ  ＦＥＴ、ナノワイヤＦＥＴ、ＦｉｎＦＥＴ、トライゲートＦＥＴ、トンネリングＦＥＴ、磁性センサ、電気化学的センサ、およびナノ電気機械的センサからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記電荷センサは、ナノワイヤＦＥＴであり、前記ナノワイヤＦＥＴは、シリコンナノワイヤＦＥＴである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記固体支持体型の電荷センサは、導電チャネルを含む電界効果トランジスタであり、前記導電チャネルは、半導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
鋳型核酸鎖をシーケンシングする核酸シーケンシング方法であって、
（ａ）固体支持体型の電荷センサに付着させたポリメラーゼをヌクレオチド三リン酸の混合物および前記鋳型核酸鎖に接触させるステップであって、
前記混合物は異なるタイプのヌクレオチド三リン酸を含み、
前記混合物において、前記ヌクレオチド三リン酸の第１タイプは、その他のヌクレオチド三リン酸により生じるシグナル変化の極性とは反対の極性を有するシグナル変化を生じさせる非天然部分を含み、
前記ポリメラーゼは、ヌクレオチドを前記混合物から前記鋳型核酸鎖に対する新生鎖に組み込む、ステップと；
（ｂ）前記ヌクレオチドの組み込みを前記電荷センサにより検出するステップであって、
前記混合物において、前記第１タイプのヌクレオチド三リン酸は、その他のヌクレオチド三リン酸により生じるシグナルと比較し、極性が特異的なシグナルを生じさせる、ステップとを含む、方法。
【請求項２８】
ステップ（ｂ）で第１シグナルパターンを取得し、
更に、（ｃ）前記ポリメラーゼ、前記鋳型核酸、およびヌクレオチド三リン酸の第２混合物を用いてステップ（ａ）およびステップ（ｂ）を繰り返すことにより、第２シグナルパターンを得るステップであって、
前記第２混合物中の前記ヌクレオチド三リン酸の第２タイプは、前記第２混合物中のその他のヌクレオチド三リン酸により生じるシグナル変化の極性とは反対の極性を有するシグナル変化を生じさせる非天然部分を含み、
前記第２混合物中の前記第２タイプのヌクレオチド三リン酸は、前記第２混合物中のその他のヌクレオチド三リン酸により生じるシグナルと比較し、極性が特異的なシグナルを生じさせる、ステップと；
（ｄ）前記第１シグナルパターンと前記第２シグナルパターンを比較して、前記鋳型核酸の配列を決定するステップとを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
（ｅ）前記ポリメラーゼ、前記鋳型核酸、およびヌクレオチド三リン酸の第３混合物を用いてステップ（ａ）およびステップ（ｂ）を繰り返すことにより、第３シグナルパターンを得るステップであって、
前記第３混合物中の前記ヌクレオチド三リン酸の第３タイプは、前記第３混合物中のその他のヌクレオチド三リン酸により生じるシグナル変化の極性とは反対の極性を有するシグナル変化を生じさせる非天然部分を含み、
前記第３混合物中の前記第３タイプのヌクレオチド三リン酸は、前記第３混合物中のその他のヌクレオチド三リン酸により生じるシグナルと比較し、極性が特異的なシグナルを生じさせる、ステップを更に含み、
ステップ（ｄ）は、前記第１シグナルパターン、前記第２シグナルパターン、および前記第３シグナルパターンを比較して、前記鋳型核酸の配列を決定することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
（ｆ）前記ポリメラーゼ、前記鋳型核酸、およびヌクレオチド三リン酸の第４混合物を用いてステップ（ａ）およびステップ（ｂ）を繰り返すことにより、第４シグナルパターンを得るステップであって、
前記第４混合物中の前記ヌクレオチド三リン酸の第４タイプは、前記第４混合物中のその他のヌクレオチド三リン酸により生じるシグナル変化の極性とは反対の極性を有するシグナル変化を生じさせる非天然部分を含み、
前記第４混合物中の前記第４タイプのヌクレオチド三リン酸は、前記第４混合物中のその他のヌクレオチド三リン酸により生じるシグナルと比較し、極性が特異的なシグナルを生じさせる、ステップを更に含み、
ステップ（ｄ）は、前記第１シグナルパターン、前記第２シグナルパターン、前記第３シグナルパターン、および前記第４シグナルパターンを比較して、前記鋳型核酸の配列を決定することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ａ）の前記混合物は、前記混合物中のその他のタイプのヌクレオチド三リン酸の量または濃度と比較し、前記第１タイプのヌクレオチド三リン酸をより少量またはより低濃度で含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ｂ）中に、前記混合物において、前記第１タイプのヌクレオチド三リン酸は、その他のヌクレオチド三リン酸により生じるシグナル変化と比較し、シグナル変化を遅延させる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記鋳型核酸鎖は環状である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記混合物の異なるタイプのヌクレオチド三リン酸は、鋳型核酸鎖の４つの異なるヌクレオチドと相補的である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記電荷センサは電荷センサのアレイの一部である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記電荷センサは、ＳＷＮＴ  ＦＥＴ、ナノワイヤＦＥＴ、ＦｉｎＦＥＴ、トライゲートＦＥＴ、トンネリングＦＥＴ、磁性センサ、電気化学的センサ、およびナノ電気機械的センサからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記電荷センサは、ナノワイヤＦＥＴであり、前記ナノワイヤＦＥＴは、シリコンナノワイヤＦＥＴである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記固体支持体型の電荷センサは、導電チャネルを含む電界効果トランジスタであり、前記導電チャネルは、半導体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリメラーゼは、前記固体支持体型の電荷センサに共有結合的に付着している、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
鋳型核酸鎖をシーケンシングする核酸シーケンシング方法であって、
（ａ）固体支持体型の電荷センサに付着させたポリメラーゼをヌクレオチド三リン酸の混合物および前記鋳型核酸鎖に接触させるステップであって、
前記混合物は異なるタイプのヌクレオチド三リン酸を含み、
前記ヌクレオチド三リン酸の第１タイプは、第１の極性を有するシグナル変化を生じさせ、ヌクレオチド組み込み動力学の第１の状態を示し、
前記ヌクレオチド三リン酸の第２タイプは、前記第１の極性を有するシグナル変化を生じさせ、前記第１の状態よりも速いヌクレオチド組み込み動力学の第２の状態を示し、
前記ヌクレオチド三リン酸の第３タイプは、前記第１の極性とは反対の第２の極性を有するシグナル変化を生じさせ、ヌクレオチド組み込み動力学の前記第１の状態を示し、
前記ヌクレオチド三リン酸の第４タイプは、前記第２の極性を有するシグナル変化を生じさせ、ヌクレオチド組み込み動力学の前記第２の状態を示し、
前記ポリメラーゼは、ヌクレオチドを前記混合物から前記鋳型核酸鎖に対する新生鎖に組み込む、ステップと；
（ｂ）前記ヌクレオチドの組み込みを前記電荷センサにより検出するステップであって、
前記ヌクレオチド三リン酸の各タイプは、特異的なシグナルを生じさせる、ステップとを含む、方法。
【請求項４１】
前記電荷センサは、ＳＷＮＴ  ＦＥＴ、ナノワイヤＦＥＴ、ＦｉｎＦＥＴ、トライゲートＦＥＴ、トンネリングＦＥＴ、磁性センサ、電気化学的センサ、およびナノ電気機械的センサからなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記電荷センサは、ナノワイヤＦＥＴであり、前記ナノワイヤＦＥＴは、シリコンナノワイヤＦＥＴである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記固体支持体型の電荷センサは、導電チャネルを含む電界効果トランジスタであり、前記導電チャネルは、半導体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリメラーゼは、前記固体支持体型の電荷センサに共有結合的に付着している、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により与えられた認可番号１Ｒ０１−ＧＭ１０６９５７の下、政府の援助を受けなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本開示は、概して、バイオセンサに基づく検出に関し、具体的には、核酸シーケンシングのために用いることが可能なバイオセンサに関する。
【０００３】
ＤＮＡをシーケンシングするための現在利用可能な商業用プラットフォームは比較的高価である。これらのプラットフォームの大多数は、成長中のポリマー構造への各モノマー（つまり、ヌクレオチド）の付加を検出しながらＤＮＡポリマーが合成されることから「シーケンシング・バイ・シンセシス」と呼ばれるアプローチを用いる。鋳型ＤＮＡ鎖が新しいＤＮＡポリマーの合成を厳密に指示することから、合成中に成長鎖に付加された一連のヌクレオチドモノマーから鋳型ＤＮＡの配列を推測することが可能である。反応のモニタリングには、レーザ、検出用光学機器、および複雑な液体送達システムなどの比較的高価なハードウェアが用いられる。今日までに最も成功した商業用プラットフォームも、合成による配列決定が開始可能となる前でさえ、ＤＮＡ鋳型を増幅するために高価な試薬とハードウェアを必要とする。これらのプラットフォームの複雑さおよび費用が、ＤＮＡシーケンシング技術を明らかに必要とするいくつかの臨床的および研究的状況において該プラットフォームを使用する妨げとなっている。
【０００４】
したがって、核酸シーケンシングのプラットフォームをより費用効果が高く、迅速で便利なものにするために、該プラットフォームを改善するニーズが存在する。本開示は、このニーズに対応するとともに、他の利点も提供する。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、核酸をシーケンシングする方法を提供する。本方法は、（ａ）固体支持体型の電荷センサに付着させたポリメラーゼを提供するステップと；（ｂ）前記ポリメラーゼをヌクレオチド三リン酸の混合物と接触させるステップであって、前記混合物は異なるタイプのヌクレオチド三リン酸を含み、前記混合物において、前記ヌクレオチド三リン酸の第１タイプはその他のタイプのヌクレオチド三リン酸と比較し識別可能な状態にあり、前記混合物において、前記ヌクレオチド三リン酸の第２タイプは他のタイプのヌクレオチド三リン酸と比較し識別可能な状態になく、前記ポリメラーゼはヌクレオチドを前記混合物から鋳型核酸鎖に対する新生鎖に組み込む、ステップと；（ｃ）前記ヌクレオチドの組み込みを前記電荷センサを介して検出することにより第１シグナルパターンを得るステップであって、前記混合物において、前記第１タイプのヌクレオチド三リン酸は他のヌクレオチド三リン酸により生成されるシグナルと比較し特異的なシグナルを生成する、ステップと；（ｄ）前記ポリメラーゼ、前記鋳型核酸、およびヌクレオチド三リン酸の第２混合物を用いて、ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）を繰り返すことにより第２シグナルパターンを得るステップであって、前記第２混合物において、前記第２タイプのヌクレオチド三リン酸は、その他のタイプのヌクレオチドと比較し識別可能な状態にあり、前記第２混合物において、前記第１タイプのヌクレオチド三リン酸は、その他のタイプのヌクレオチド三リン酸と比較し識別可能な状態にない、ステップと；（ｅ）前記第１シグナルパターンと前記第２シグナルパターンを比較して、前記鋳型核酸の配列を決定するステップとを含み得る。
【０００６】
また、（ａ）固体支持体型の電荷センサに付着させたポリメラーゼを提供するステップと；（ｂ）前記ポリメラーゼをヌクレオチド三リン酸の混合物と接触させるステップであって、前記混合物は異なるタイプのヌクレオチド三リン酸を含み、前記混合物において、前記ヌクレオチド三リン酸の第１の２タイプは第２の２タイプのヌクレオチド三リン酸と比較し第１の識別可能な状態にあり、前記ポリメラーゼはヌクレオチドを、前記混合物から鋳型核酸鎖に対する新生鎖に組み込む、ステップと；（ｃ）前記ヌクレオチドの組み込みを前記電荷センサを介して検出することにより第１シグナルパターンを得るステップであって、前記混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸は第２の２タイプのヌクレオチド三リン酸により生成されるシグナルとは識別されるシグナルを生成する、ステップと；（ｄ）前記ポリメラーゼ、前記鋳型核酸、およびヌクレオチド三リン酸の第２混合物を用いて、ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）を繰り返すことにより第２シグナルパターンを得るステップであって、前記第２混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸の一方は、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸のもう一方と比較し、識別可能な状態にある、ステップと；（ｅ）前記第１シグナルパターンと前記第２シグナルパターンを比較して、前記鋳型核酸の配列を決定するステップとを含む、核酸シーケンシング法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＳＷＮＴ  ＦＥＴに固定された単一酵素を示す図である。
【図２】テザーを介して電荷センサに付着したポリメラーゼを示す図である。
【図３】ナノワイヤ電荷センサの近傍における、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片の電荷残基を示す図である。
【図４】図４Ａ：ポリメラーゼ活性の触媒サイクルを示す図である。図４Ｂ：ヌクレオチドのプライムド鋳型核酸への組み込み時に、ＳＷＮＴ  ＦＥＴに付着したポリメラーゼにより検出される例示的シグナルを示す図である。
【図５】天然ｄＡＴＰおよびリン酸修飾ｄＡＴＰの組み込み時（左）、および２−チオｄＴＴＰの組み込み時（右）に、ＳＷＮＴ  ＦＥＴに付着したポリメラーゼにより検出される例示的シグナルを示す図である。
【図６】図６Ａ：γ−ＡＮＳヌクレオチド修飾の化学構造を示す図である。図６Ｂ：天然（ｄＡＴＰ）およびγ−ＡＮＳ修飾ヌクレオチド（ｄＴＴＰ）の混合物を処理するポリメラーゼからのＦＲＥＴシグナルを示す図である。γ−ＡＮＳｄＴＴＰでのクローズド状態の期間は天然ヌクレオチドよりも＞１０ｘ長く、塩基の同一性を判断することを可能にする。
【図７】図７Ａ：ＳＷＮＴ  ＦＥＴに付着したポリメラーゼを用いたシーケンシング反応時に核酸に組み込まれる、４つの異なるヌクレオチドタイプを特異的に特定するのに用いることが可能なパラメータの組み合わせである。示すように、転極および動的修飾を組み合わせた修飾ヌクレオチドは、４つの異なる塩基をコードすることが可能である。図７Ｂ：ＳＷＮＴ  ＦＥＴに付着したポリメラーゼを用いたシーケンシング反応時に核酸に組み込まれる、４つの異なるヌクレオチドタイプを特異的に特定するのに用いることが可能なパラメータの組み合わせである。示すように、転極および動的修飾を組み合わせた修飾ヌクレオチドは、４つの異なる塩基をコードすることが可能である。
【図８】図８Ａ：いかなる時でもポリメラーゼは３つの天然ｄＮＴＰおよび１つの修飾ｄＮＴＰの混合物と接触している、シーケンシングスキームを示す図である。４つの異なるランについての電流トレースのアライメントは、ＤＮＡの４つの塩基全ての特異的な特定を可能にする。図８Ｂ：いかなる時でもポリメラーゼは３つの天然ｄＮＴＰおよび１つの修飾ｄＮＴＰの混合物と接触している、シーケンシングスキームを示す図である。４つの異なるランについての電流トレースのアライメントは、ＤＮＡの４つの塩基全ての特異的な特定を可能にする。
【図９】図９Ａ：いかなる時でもポリメラーゼは２つの天然ｄＮＴＰおよび２つの修飾ｄＮＴＰの混合物と接触している、シーケンシングスキームを示す図である。２つの異なるランについての電流トレースのアライメントは、ＤＮＡの４つの塩基全ての特異的な特定を可能にする。図９Ｂ：いかなる時でもポリメラーゼは２つの天然ｄＮＴＰおよび２つの修飾ｄＮＴＰの混合物と接触している、シーケンシングスキームを示す図である。２つの異なるランについての電流トレースのアライメントは、ＤＮＡの４つの塩基全ての特異的な特定を可能にする。
【図１０】正確性を高め、鋳型の「ラップ（ｌａｐ）」についての電流トレースを整列させる手段としての環状鋳型を、異なる類似体（例えば、異なるラップ時に存在する異なるヌクレオチド修飾）を有するｄＮＴＰ混合物を用いてシーケンシングするように構成した、処理能力の高いポリメラーゼを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本開示の実施形態は、概して、核酸シーケンシング手順において検出されるヌクレオチド組み込み事象などの用途における単一分子検出に有用な、装置、組成、および方法に関する。高い処理能力で長いシーケンシングリードを提供する改良した検出システムに対するニーズがある。本明細書に記載する本発明の実施形態は、このニーズを満たし、また他の利点も提供する。
【０００９】
本開示は、核酸分子をシーケンシングする方法を提供する。本方法は、ポリメラーゼに触媒される、核酸鋳型に対する新生核酸鎖へのヌクレオチド組み込みを利用する。ポリメラーゼは、ヌクレオチド組み込み事象を検出する電荷センサに付着し得る。それぞれが電荷センサにおいて特異的なシグニチャを生成する、１つまたは複数の非天然ヌクレオチドタイプを用いて、鋳型核酸の異なるヌクレオチドを特異的に特定することが可能である。
【００１０】
一部の実施形態では、混合物に存在する１つまたは複数の非天然ヌクレオチドは、混合物の他のヌクレオチドと比較し転極を有するシグナル変化を生成するだろう。あるいは、または、加えて、混合物において用いる１つまたは複数の非天然ヌクレオチドは、ヌクレオチド組み込みの遅延または組み込み速度の減少を引き起こすだろう。あるいは、または、加えて、本方法で用いる１つまたは複数の非天然ヌクレオチドは、著しく変わったシグナル高さをもたらすだろう。これらのシグナルパラメータは、ポリメラーゼ活性時に、非天然ヌクレオチドと相補的な鋳型核酸のヌクレオチドを識別するために、検出することが可能である。
【００１１】
特定の実施形態では、非天然ヌクレオチドに存在する非天然部分または修飾は、ポリメラーゼ立体配座において（前記部分または修飾を欠くヌクレオチドによりもたらされる立体配座と比較し）変化をもたらすことにより、ポリメラーゼが付着する電荷センサにより検出される１つまたは複数のシグナルパラメータにおいて特異的なシグニチャをもたらし得る。例示的なシグナルパラメータとしては、限定されるわけではないが、シグナル期間、シグナル高さ、シグナル立ち上がり時間、シグナル立ち下り時間、およびシグナルノイズが挙げられる。
【００１２】
本方法の一部の実施形態は、４つの異なるタイプのヌクレオチド三リン酸の混合物を利用し、ここにおいて、該ヌクレオチド三リン酸タイプの１つは、その他３つのタイプ（つまり、「高」ヌクレオチド）と比較し、実質的により少量またはより低濃度で存在する（つまり、「低」ヌクレオチド）。結果として、低ヌクレオチドの組み込みは、相対遅延または組み込み速度の減少として検出可能となるだろう。このシグニチャを利用して、低ヌクレオチドと相補的であるヌクレオチドタイプの、鋳型における場所を特定することが可能である。いくつかのシーケンシングランは、同じ鋳型で完了することが可能であり、各ランは「低」状態の異なるヌクレオチドを用いて実行する。異なるランからのシグナルパターンを比較して、鋳型配列を決定することが可能である。
【００１３】
３「高」−１「低」のヌクレオチド三リン酸混合物の観点では、上記実施形態が挙げられる。例えば、１「高」−３「低」混合物または２「高」−２「低」混合物を含む他の混合物も同様に用いることが可能である。異なる濃度のヌクレオチドを用いることに関し、さらに有用な混合物構成が米国特許第７５５６９２２号明細書に記載されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００１４】
特定の実施形態では、鋳型核酸は環状である。環状鋳型の使用は、ポリメラーゼを置換する必要がなく、代わりに鋳型周りに多数のラップを作成し得、各ラップは事実上、鋳型の反復シーケンシングであることから、反復シーケンシングラン向けの便利なフォーマットを提供し得る。
【００１５】
環状鋳型を利用する一部の実施形態では、ポリメラーゼは５’エキソヌクレアーゼ活性を含み、ポリメラーゼが鋳型周りで複数回進行する際に、環状鋳型から移動させるべき核酸鎖を消化することが可能である。
【００１６】
鋳型が線状であろうと環状であろうと、同一の鋳型で実行される異なるシーケンシングランに、異なるプライマーを用いることが可能である。異なるプライマーは、鋳型の異なる場所にハイブリダイズするように設計することが可能である。このように、ランはそれぞれ、鋳型の異なる場所で開始されるが、各ランでシーケンシングされる鋳型の部分の間には実質的なオーバーラップが存在し得る。各ランから生じるシグナルパターンは、配列コールおよびエラーチェックを容易にするために、各ランでの予期される開始部位に基づき、整列させることが可能である。
【００１７】
本明細書に記載する方法で用いる電荷センサは、ＳＷＮＴ  ＦＥＴ、ナノワイヤＦＥＴ、ＦｉｎＦＥＴ、トライゲートＦＥＴ、トンネリングＦＥＴ、または別の電界感応装置を用いた電界効果により、ポリメラーゼによるヌクレオチドの組み込みを検出することが可能である。一部の実施形態では、センサは磁性、電気化学的、またはナノ電気機械的である。
【００１８】
本明細書で用いる用語は、他に明記しない限り、通常の意味でとるものと理解されたい。本明細書で用いるいくつかの用語の例およびそれらの定義を以下に述べる。
【００１９】
本明細書で用いる場合、用語「アレイ」は、１つまたは複数の固相基板に付着する電荷センサまたは分子の集合体を指し、その結果、電荷センサまたは分子は、それらの相対的場所に従って互いに識別できるものとする。アレイは、固相基板上の異なるアドレス指定可能な場所（例えば、異なる電荷センサ）にそれぞれが位置する異なる分子を含むことができる。あるいは、アレイは、それぞれが異なる分子を担持する個別の固相基板を含むことができ、この場合、異なるプローブ分子は、固相基板が付着する表面における固相基板の場所に従って、識別することが可能である。アレイの分子は、核酸プライマー、核酸プローブ、核酸鋳型、またはポリメラーゼのような核酸酵素とすることができる。
【００２０】
本明細書で用いる場合、用語「付着した（ａｔｔａｃｈｅｄ）」は、互いに接合、固着、接着、連結、または結合している２つの物の状態を指す。例えば、ポリメラーゼのような反応成分は、電荷センサのような固相成分に対して共有結合性または非共有結合性の結合によって付着することが可能である。共有結合は原子間で電子対を共有することに特徴がある。非共有結合は、電子対の共有を伴わない化学的結合であって、例えば、水素結合、イオン結合、ファン・デル・ワールス力、親水性相互作用、および疎水性相互作用が挙げられる。
【００２１】
本明細書で使用する場合、用語「電荷センサ」は、その表面でのまたは包囲する電界内における摂動を電気シグナルに変換する検出デバイスを意味することを意図する。例えば、電荷センサは、反応成分の到来または離脱を電気シグナルに変換することが可能である。電荷センサは、また、２つの反応成分間の相互反応、または単一反応成分における配座変化を電気信号に変換することもできる。例示的な電荷センサとしては、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）、例えば、単一壁カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）に基づくＦＥＴ、シリコンナノワイヤ（ＳｉＮＷ）ＦＥＴ、グラフェンナノリボンＦＥＴ（およびＭｏＳ２、シリセン等のような２次元材料から作製した関連のナノリボンＦＥＴ）、トンネルＦＥＴ（ＴＦＥＴ）、および急峻閾値下勾配デバイス（例えば、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５１ｓｔ  Ａｎｎｕａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｇ  １−６，ＩＳＢＮ：９７８−１−４５０３−２７３０−５  （２０１４）ａｎｄ  Ｉｏｎｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７９，３２９−３３７（２０１１）参照）が挙げられる。本発明による方法および装置に使用することができるＦＥＴセンサおよびＳＷＮＴセンサの例としては、米国特許出願公開第２０１３／００７８６２２号明細書に記載されているものがあり、これは、参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「立体配座シグナル変化」は、分子の一部における構造、形状、または配置の変化に応じた分子からの検出可能なシグナルの発現、消失、または変更を意味する。例えば、このシグナル変化は、分子の第２部分と相互作用するように、分子の第１部分と標識の相互作用が変化することに起因し得る。
【００２３】
本明細書に用いる場合、用語「立体配座的に標識付けした」は、分子に関し用いる場合、分子構造の変化、分子形状の変化、または分子の一部における配置の変化に応答する少なくとも１つの標識を有することを意味する。分子は、例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素、エキソヌクレアーゼ、または他の核酸酵素とすることができる。分子の一部は、例えば、分子構造内における原子間に生ずる１つまたは複数の化学的結合部周りの回転に起因して相対位置が変化する原子とすることができる。分子の一部は、当業界で一般的に知られているような巨大分子の領域とすることができる。例えば、ポリメラーゼは、フィンガ（指）領域、パーム（掌）領域、およびサム（親指）領域と称される領域を含んでいる。タンパク質の場合、その一部は、第２級、第３級、または第４級の構造領域とすることができる。標識は、例えば、共有結合によって分子に付着させることができる。しかし、標識は、分子に付着させる必要はなく、例えば、分子の近傍に位置付けるだけでもよい。特定の実施形態において、標識は、ヌクレオチドまたは核酸のような分子の反応物または生成物に付着しない。
【００２４】
本明細書で用いる場合、用語「異なる（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）」は、核酸に関し使用する場合には、核酸が互いに同一でないヌクレオチド配列を有することを意味する。２つ以上の異なる核酸は、それらの全長に沿って異なるヌクレオチド配列を有することができる。あるいは、２つ以上の異なる核酸は、それらの長さの大部分に沿って異なるヌクレオチド配列を有することができる。例えば、２つ以上の異なる核酸は、２つ以上の分子にとって互いに異なる標的ヌクレオチド配列を有する一方で、２つ以上の分子において同一の普遍的配列部分を有することもできる。用語「異なる」は、ポリメラーゼおよび核酸酵素のような他の分子にも同様に適用することができる。
【００２５】
本明細書で用いる場合、用語「識別可能な状態」は、ヌクレオチド三リン酸の混合物中の特定のタイプのヌクレオチド三リン酸に関して用いる場合、該特定のタイプのヌクレオチド三リン酸が、他のヌクレオチド三リン酸と比較し、検出状態下で特異的に表れる特徴または特性を有することを意味することを意図する。例示的な識別可能な状態としては、限定されるわけではないが、混合物中の他のヌクレオチド三リン酸の量もしくは濃度よりも大幅に少ない量もしくは低濃度で存在すること、混合物中の他のヌクレオチド三リン酸の量もしくは濃度よりも大幅に多い量もしくは高濃度で存在すること、混合物中の他のヌクレオチド三リン酸に存在しない化学部分もしくは修飾を有していること、または、混合物中の他のヌクレオチド三リン酸に存在する化学的部分もしくは修飾を欠いていることが挙げられる。識別可能な状態は、ヌクレオチドタイプがポリメラーゼと相互作用する場合に表れ得る。
【００２６】
本明細書で用いる場合、用語「各（ｅａｃｈ）」は、事項の集合に関し使用する場合、集合における個別事項を特定することを意図するが、必ずしも集合におけるすべての事項について言及するものではない。例外は、明確な記述または文脈がそうでないと明言する場合に起き得る。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「標識（ｌａｂｅｌ）」は、反応成分に関し用いる場合には、検出可能な反応成分または反応成分の検出可能な部分を意味することを意図する。有用な標識は、電荷センサが検出できる電荷標識である。標識は、検出すべき反応成分に固有のもの（例えば、ポリメラーゼの荷電アミノ酸）とすることができる、または標識は、反応成分に固有でないのもの（例えば、アミノ酸の非天然的に生じた修飾）とすることができる。
【００２８】
本明細書で用いる場合、用語「非天然（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ）」は、分子部分に関し用いる場合、人間による技術的介入によって摂動を受けない自然の環境または生体系における分子に付着することが見られない部分に言及することを意図する。典型的には、非天然部分は分子の合成的修飾部であり、これにより分子は、非修飾分子または天然修飾部を有する分子とは構造的または化学的に識別される。本明細書で用いる場合、用語「非天然（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ）」は、プロセスで用いる類似体（アナログ）に関し用いる場合、プロセスが生ずる自然環境内では見られない類似体を意味することを意図する。典型的に、非天然類似体は、類似体が属する分類における他タイプの分子とは構造的または化学的に識別される合成類似体である。分子は、該分子の天然類似体で見られる部分の欠如により非天然になり得ることが理解されよう。
【００２９】
本明細書で用いる場合、用語「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」は、当該技術におけるその用途と合致していることを意図し、自然発生的核酸またはその機能類似体（アナログ）を含む。特に有用な機能類似体は、配列特異的に核酸と交雑することができる、または特定ヌクレオチド配列を複製するための鋳型として使用できるものである。自然発生的核酸は、概して、リン酸ジエステル結合を含む主鎖を有する。類似体構造は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）のような当該技術で既知の様々な構造のうち任意なものを含む代替的主鎖結合を有し得る。自然発生的核酸は、概して、デオキシリボース糖（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に見られる）、またはリボース糖（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）に見られる）を有する。
【００３０】
核酸は、当技術分野で既知である種々の類似体糖部分のうち任意なものを含み得る。核酸は、天然または非天然の塩基を含むことができる。この点に関して、天然デオキシリボ核酸は、アデニン、チアミン、シトシン、またはグアニンからなる群から選択される１つまたは複数の塩基を有することができ、リボ核酸は、ウラシル、アデニン、シトシン、またはグアニンからなる群から選択される１つまたは複数の塩基を有することができる。核酸に含めることができる有用な非天然の塩基は当技術分野で既知である。
【００３１】
本明細書で用いる場合、用語「ヌクレオチド」は、天然のヌクレオチド、その類似体、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、およびヌクレオチドとして知られている他の分子を含むことを意図する。この用語は、ポリマー内に存在するモノマー（単量体）のユニットを指して、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡの鎖に存在するサブユニットを特定するために用いることができる。この用語は、また、必ずしもポリマーに存在する必要はない、例えば、ポリメラーゼによって鋳型依存的にポリヌクレオチドに取り込まれ得る分子に存在する必要はない分子を指すのにも用いることができる。この用語は、例えば、５’炭素に０、１、２、３個、またはそれ以上のリン酸塩を有するヌクレオシドユニットを指すことができる。例えば、テトラホスフェート・ヌクレオチドおよびペンタホスフェート・ヌクレオチドが特に有用であり得る。例示的な天然ヌクレオチドとしては、限定しないが、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＡＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＡＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＣＭＰ、およびｄＧＭＰが挙げられる。
【００３２】
非天然ヌクレオチドには、自然生体系で存在しない、または自然環境、例えば、ポリメラーゼを発現させる非組み換え細胞内のポリメラーゼによってはポリヌクレオチド内にほとんど組み込まれないヌクレオチドが含まれる。特に有用な非天然ヌクレオチドとしては、同一ワトソン・クリック相補的塩基と塩基対合する天然ヌクレオチドのような別のヌクレオチドがポリメラーゼによって鎖に組み込まれる速度よりも著しく速いまたは遅い速度で、ポリメラーゼによって鎖に組み込まれるヌクレオチドが挙げられる。例えば、非天然ヌクレオチドは、天然ヌクレオチドの組み込み速度に比べると、少なくとも２倍差、５倍差、１０倍差、２５倍差、５０倍差、１００倍差、１０００倍差、１００００倍差、またはそれ以上の倍差の速度で取り込まれることがあり得る。非天然ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに組み込まれた後、さらに拡張可能となり得る。例としては、３’水酸基を有するヌクレオチド類似体、または３’位置に可逆的ターミネーター部分を有し、この部分は除去されて、ヌクレオチド類似体を組み込んだポリヌクレオチドの更なる伸長を可能にする、ヌクレオチド類似体が挙げられる。使用可能な可逆的ターミネーターの例は、例えば、米国特許第７，４２７，６７３号明細書、同第７，４１４，１１６号明細書、および同第７，０５７，０２６号明細書、ならびに国際公開第９１／０６６７８号および同第０７／１２３７４４号があり、これら文献は、参照によって本明細書に組み込まれるものとする。一部の実施形態では、３’ターミネーター部分を有するヌクレオチド類似体、または３’水酸基がないヌクレオチド類似体（例えば、ジデオキシヌクレオチド類似体）を、ヌクレオチド類似体を組み込んだポリヌクレオチドがそれ以上伸長しない条件下で用いることが可能であることが理解されよう。一部の実施形態では、ヌクレオチドは可逆的ターミネーター部分を含まない、またはヌクレオチドは非可逆的ターミネーター部分を含まない、またはヌクレオチドは全くターミネーター部分を含まないものとする。５’位置に修飾物を有するヌクレオチド類似体も有用である。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「固体支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）」は、水性液体内で不溶性である剛性基板を指す。この基板は、非多孔質または多孔質とすることができる。基板は、オプションとして、液体を吸収できるものとする（例えば、多孔性に起因して）ものの、基板は、典型的には、液体を吸収するときは実質的には膨張せず、また液体が乾燥によって除去されるとき実質的には収縮しない十分な剛性を有する。非多孔質固体支持体は、概して、液体またはガスに対して不浸透性である。例示的な固体支持体としては、限定するものではないが、ガラスおよび改質もしくは機能化したガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、スチレンおよび他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）、環状オレフィン、ポリイミド等々を含む）、ナイロン、セラミックス、樹脂、ゼオノア、シリカもしくはシリコンおよび改質シリコンを含むシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、光ファイバ束、ならびにポリマーがある。一部の実施形態にとって特に有用な固体支持体はフローセル装置内に位置する。
【００３４】
本明細書で用いる場合、用語「タイプ（または「種」）」は、同一の化学構造を共有する分子を特定するのに用いる。例えば、ヌクレオチドの混合物には、いくつかのｄＣＴＰ分子を含むことが可能である。これらｄＣＴＰ分子は、互いに同一のタイプまたは種であると理解されたい。同様に、同一のヌクレオチド配列を有する個別ＤＮＡ分子は同一のタイプまたは種である。
【００３５】
以下に記載するおよび特許請求の範囲に記載する実施形態は、上述の定義を考慮することによって理解できる。
【００３６】
本明細書に記載の方法および装置により、長い核酸シークエンシングの読み取り；迅速な読み取り；シークエンシングの高い処理能力；およびシークエンシングの拡張性のあるプラットフォームを提供することが可能である。一部の実施形態において、１回の読み取り精度のいかなる低下も、並列的に行う読み取り数における処理能力を提供する、本明細書に記載の方法および装置の機能により重複読み取りを複数行うことによって軽減することが可能である。
【００３７】
本開示は、核酸シーケンシング法を提供する。本方法は、（ａ）固体支持体型の電荷センサに付着させたポリメラーゼを提供するステップと；（ｂ）前記ポリメラーゼをヌクレオチド三リン酸の混合物と接触させるステップであって、前記混合物は異なるタイプのヌクレオチド三リン酸を含み、前記混合物において、前記ヌクレオチド三リン酸の第１タイプはその他のタイプのヌクレオチド三リン酸と比較し識別できる状態にあり、前記混合物において、前記ヌクレオチド三リン酸の第２タイプは他のタイプのヌクレオチド三リン酸と比較し識別できる状態になく、前記ポリメラーゼはヌクレオチドを、前記混合物から鋳型核酸鎖に対する新生鎖に組み込む、ステップと；（ｃ）前記ヌクレオチドの組み込みを前記電荷センサを介して検出することにより第１シグナルパターンを得るステップであって、前記混合物において、前記第１タイプのヌクレオチド三リン酸は他のヌクレオチド三リン酸により生成されるシグナルと比較し特異的なシグナルを生成する、ステップと；（ｄ）前記ポリメラーゼ、前記鋳型核酸、およびヌクレオチド三リン酸の第２混合物を用いて、ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）を繰り返すことにより第２シグナルパターンを得るステップであって、前記第２混合物において、前記第２タイプのヌクレオチド三リン酸は、その他のタイプのヌクレオチドと比較し識別できる状態にあり、前記第２混合物において、前記第１タイプのヌクレオチド三リン酸は、その他のタイプのヌクレオチド三リン酸と比較し識別できる状態にない、ステップと；（ｅ）前記第１シグナルパターンと前記第２シグナルパターンを比較して、前記鋳型核酸の配列を決定するステップとを含み得る。
【００３８】
例示的な方法を図１に示す。ここで、ポリメラーゼは、ヌクレオチドがプライムドＤＮＡ鋳型に組み込まれ得る反応部位を生じさせる。ポリメラーゼは、電荷センサ（例えば、単一壁カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ））に付着する。装置は、単一分子感度を提供する。反応部位における電荷分布の変化（例えば、ポリメラーゼ立体配座変化、ヌクレオチド取り込み、電荷タグの到来または離脱など）をゲートに伝達し、また検出することができる。
【００３９】
図１に示す構成の別の選択肢は、ポリメラーゼをテザーを介して電荷センサに付着させることである。例示的な実施形態を図２に示す。簡単に言うと、ポリメラーゼ１を、テザー３により、シリコンナノワイヤ製の電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）２のゲート５に固定する。オプションとして、テザー３は、テザーのポリメラーゼ近傍末端の正電荷６、およびテザーのポリメラーゼから遠位でありゲート５に付着した末端の負電荷７によって示されるように、導電性ポリマー鎖とすることができる。シーケンシングするｓｓＤＮＡ４は、ヌクレオチドおよび他の試薬とともに溶液内に導入された後に、ポリメラーゼ１に結合する。相補鎖が合成されるとき、ポリメラーゼ１の立体配座変化の結果として、またはヌクレオチドの存在に起因して、ＦＥＴ２の近傍の電荷分布に乱れが生じる。電荷分布におけるそれらの変更をナノワイヤＦＥＴ２によって感知し、またＦＥＴ相互コンダクタンス電流の変調として検出する。
【００４０】
上記例はＳＷＮＴおよびＦＥＴの電荷センサについて記載するが、任意の種々の電荷センサを用いることが可能である。有用な電荷センサとしては、反応事象を迅速かつ都合よく検出可能な信号に変換できるように、変換素子と直接空間接触する反応成分を取り込むことが可能な分析デバイスが挙げられる。電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）に基づくデバイスは、反応成分（例えば、ポリメラーゼ）とトランジスタ表面との間の相互作用を読取り可能な電気信号に直接変換することが可能である。標準的ＦＥＴにおいて、電流は２つの電極（ソースおよびドレイン）に接続した導電経路（チャネル）に沿って流れる。ソースとドレインとの間のチャネル伝導性は、薄い誘電体層を介して容量結合することができる第３（ゲート）電極によってオン／オフ切り換えされる。
【００４１】
特定の実施形態において、ＦＥＴは、単一分子の検出を行うよう構成する。より具体的には、これら電荷センサは、単一分子反応の動力学をモニタリングするよう構成することができる。電界効果トランジスタにおいて一般的に見られる任意のタイプの導電チャネルを本明細書に記載の装置または方法に使用することが可能である。例示的な導電チャネルは、金属、金属酸化物、半導体、またはナノワイヤもしくはグラフェンのようなナノメートル規模の導体から形成される。
【００４２】
単一分子の検出に特に有用な電荷センサは単一壁カーボン・ナノチューブ（ＳＷＮＴｓ）である。例えば、Ｓｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ．Ｌｅｔｔ．３：４５９（２００３）；Ｓｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．６：２０８９（２００４）；Ｂｅｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ．Ｌｅｔｔ．３，７２７（２００３）；Ｇｒｕｎｅｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３８４：３２２（２００５）；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，４９８４（２００３）、および米国特許出願公開第２０１３／００７８６２２号明細書を参照されたい（これらの文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする）。ＳＷＮＴは、典型的には、直径が約１ナノメートルのオーダーの極めて小さい導体である。
【００４３】
ＳＷＮＴは、化学選択的ポリマー、金属、金属酸化物、ナノ粒子、またはタンパク質、核酸もしくは抗体のような反応成分でコーティングすることが可能である。例えば、Ｂｅｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ．Ｌｅｔｔ．３：７２７（２００３）；およびＳｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，４９８４（２００３）を参照されたい。単一ポリメラーゼは、本明細書に記載の方法を用いてこれらＳＷＮＴおよび他の電荷センサに付着させることが可能である。
【００４４】
一部の実施形態において、単一ポリメラーゼは、Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１５，７７（２００７）に記載の技術を用いて（この文献は参照によって本明細書に組み込まれるものとする）、電荷センサ上に単独の共有結合欠損を作成することによって電荷センサに付着させることが可能である。例えば、ＳＷＮＴは単独の欠損を有するよう生産することが可能であり、その結果、種々の付着用の化学的構造を用いて、ＳＷＮＴの残りの部分を追加のポリメラーゼでコーティングすることなく、単一ポリメラーゼを反応性欠損部位に選択的に結合できるようにする。ＳＷＮＴは、例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３，３８３８（２００１）に記載の技術を用いて（この文献は参照によって本明細書に組み込まれるものとする）、非共有結合手段によりポリメラーゼを付着することが可能である。これらの方法は、本明細書に記載のように変更して、単一ポリメラーゼを非共有結合的にＳＷＮＴに信頼性をもって結合させることができる。
【００４５】
ＳＷＮＴは、１電子ボルトからゼロ電子ボルトまで効果的に変化させることが可能な電子バンドギャップを有する半導体である。単一分子感知デバイスは、ゲート電極の有無に関係なく、任意のタイプのＳＷＮＴワイヤから、ガラス、プラスチックまたはシリコンの基板上に作製することができることから、ＳＷＮＴは導電チャネルとして有用である。単一分子の検出に有用なＳＷＮＴおよびその構成は、米国特許出願公開第２０１３／００７８６２２号明細書に記載されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【００４６】
本明細書に記載の装置または方法に使用するよう変更できる他の電荷センサとしては、限定するわけではないが、シリコンナノワイヤ（ＳｉＮＷ）に基づくＦＥＴ、ＩＩＩ−Ｖ材料で形成したＦＥＴ、シリコンＦｉｎＦＥＴ、グラフェンナノリボンＦＥＴ、ならびにＭｏＳ２、シリセンなどの他の２次元材料から作製したナノリボンＦＥＴ、トンネルＦＥＴ（ＴＦＥＴ）、および急峻閾値下勾配デバイス（例えば、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５１ｓｔ  Ａｎｎｕａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｇ  １−６，ＩＳＢＮ：９７８−１−４５０３−２７３０−５（２０１４）ａｎｄ  Ｉｏｎｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７９，３２９−３３７（２０１１）参照）が挙げられる。
【００４７】
特定の実施形態において、本開示の装置または方法は、単一分子電荷センサとして極微細なＦｉｎＦＥＴトランジスタを使用する。ＦｉｎＦＥＴセンサは、最先端半導体製造業者の開発の下、既にテクノロジーから恩恵を受けている。さらに、既に公表されたコンポーネントを用いることができ、これらコンポーネントとしては、限定するわけではないが、（１）Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３５，３１９（２０１２）に記載されているような、酵素処理能力をリアルタイムで観測するためにＣＮＴに対するリゾチームの固定に用いるコンポーネント、（２）Ｏｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３５，７８８５（２０１３）に記載されているような、ＣＮＴに対しＰｏｌ１クレノウ断片を固定し、ＤＮＡ処理能力をリアルタイムで観測するために用いるコンポーネント、（３）Ｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，ＮａｎｏＬｅｔｔ  １３，６２５（２０１３）に記載されているような、タンパク質のアロステリックな挙動に起因して電荷残基を移動させる変換メカニズムの解明に用いるコンポーネントが挙げられる。本方法は、米国特許出願公開第２０１３／００７８６２２号明細書に記載の装置および方法を採用することも可能である。上記の参考文献はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００４８】
理論に限定されることを意図するわけではないが、電荷センサの近傍にあるポリメラーゼ上の電荷残基の動きは、電荷センサによって感知される外部電界を作成すると考えられる。例えば、ポリメラーゼのＳＷＮＴ  ＦＥＴへの付着点の近傍にある場合に電界効果を引き起こすと考えられるＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片の電荷残基を、図３に示す。
【００４９】
図４Ａは、ポリメラーゼ活性の触媒サイクルの図を示す。ポリメラーゼがその触媒サイクルを経ると、立体配座変化（例えば、図３に示す残基または他の残基における）は、核ヌクレオチドが組み込まれる際に、時間依存性の過渡信号を引き起こし得る。ヌクレオチドのプライムド鋳型核酸への組み込み時に、ＳＷＮＴ  ＦＥＴに付着したポリメラーゼにより検出される例示的シグナルを図４Ｂに示す。
【００５０】
一部の実施形態では、立体配座変化の電子的モニタリングからのシグナルは、例えば、電荷センサによって検出される電流変調の持続時間および強度が、核ポリメラーゼサイクルに付加されるヌクレオチドタイプに基づき識別できない場合は、塩基を区別することはできない。このような実施形態では、ポリメラーゼにより鋳型鎖に付加される塩基の数を検出することは可能である。また、単一ヌクレオチドタイプを一度に流すこと、および、ヌクレオチド付加の検出と、ポリメラーゼと接触していることが分かっているヌクレオチドタイプとを関連付けることが可能である。しかしながら、他の実施形態では、いくつかの異なるヌクレオチドタイプの存在下で電荷センサにより検出されるポリメラーゼの塩基区別を達成することが望まれる。単一ヌクレオチドタイプとは反対に、異なるヌクレオチドタイプの混合物を用いる利点は、配列解析がより迅速で費用効果が高く（例えば、流体ステップの数の減少による）、シーケンシングの精度が高まる（例えば、ポリメラーゼがより複雑なヌクレオチドタイプレパートリーとアクセスする場合に、エラーの発生が低減することによる）ことである。
【００５１】
特徴的なシグナルパラメータの検出に基づき異なるヌクレオチドタイプを識別するように、代替実施形態を構成することが可能である。１つのそのようなシグナルパラメータは、ヌクレオチド三リン酸の特定のタイプが新生核酸に組み込まれる際に検出されるシグナル変化の極性である。例えば、第１ヌクレオチドタイプは、ポリメラーゼにより新生核酸鎖に組み込まれる際、シグナル極性に正の変化をもたらし得、これは、ポリメラーゼが第２タイプのヌクレオチドを新生核酸鎖に組み込む際に生成されるシグナル極性の負の変化と識別することが可能である。
【００５２】
ヌクレオチド三リン酸は非天然部分を含み得、これは、ヌクレオチド三リン酸が新生核酸鎖に組み込まれる際に電荷センサに付着させたポリメラーゼにより観察されるシグナル変化の極性に影響を与える。特定の実施形態では、非天然部分はポリメラーゼとの相互作用を生成し得、これは、該ポリメラーゼと該部分を欠いた他のヌクレオチド三リン酸との相互作用とは識別することができる。例えば、天然ヌクレオチドデオキシアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシシトシン三リン酸（ｄＣＴＰ）、およびデオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）は、電荷センサに付着させたポリメラーゼと相互作用する際に、いくつかのヌクレオチド類似体と同じ極性のシグナルを生成する。１つまたは複数の天然ヌクレオチド三リン酸が、識別可能な方法でシグナル極性を変える非天然部分を有する類似体と、シーケンシング中に鋳型鎖において同種のヌクレオチドと塩基対合する類似体の機能に悪影響を与えることなく交換される場合、混合物を用いることが可能である。同種のヌクレオチドタイプは、ヌクレオチド三リン酸類似体が組み込まれる際に検出される特異的なシグナル極性に基づき、鋳型の他のヌクレオチドタイプとは識別することが可能である。
【００５３】
反対極性のシグナルを生成する２つのヌクレオチド三リン酸タイプの例を、図５に示す具体的には、アルファ−チオ−ｄＡＴＰが、ポリチミン鋳型を用いて、電荷センサに付着させたポリメラーゼにより新生鎖に組み込まれ得、その結果、シグナル極性において負の変化が生じる。対称的に、鋳型ポリアデノシン鋳型に対し同一のセンサ付きポリメラーゼにより組み込まれる場合、２−チオ−ｄＴＴＰは、シグナル極性に正の変化をもたらすだろう。このように、アルファ−チオ−ｄＡＴＰおよび２−チオ−ｄＴＴＰを用いて、本明細書に記載する電荷センサに付着させたポリメラーゼを用いて鋳型におけるＴ位置とＡ位置を識別することが可能である。シグナル変化の極性における変化に基づき識別することが可能な他のヌクレオチド三リン酸類似体を、本明細書に記載の方法で用いることが可能である。
【００５４】
センサ付きポリメラーゼにより新生核酸鎖に組み込まれるヌクレオチド三リン酸のタイプに基づき異なり得る別のシグナルパラメータは、組み込み事象の速度または持続時間である。組み込みの速度または持続時間は、反応条件または反応で用いるヌクレオチド三リン酸の化学構造により影響を受け得る。操作可能な反応条件の例は、用いるヌクレオチド三リン酸の相対濃度である。ヌクレオチド三リン酸の特定のタイプは、比較的少量または低濃度で存在し得、これは、（他のヌクレオチドタイプと比較して、）該ヌクレオチドタイプの組み込み速度の減少またはその組み込みのより長時間の遅延をもたらすだろう。この差は、典型的には、平均速度または平均遅延の差として観察されるだろうが、閾値、最小値、または最大値などの他の尺度も同様に観察され得る。
【００５５】
ヌクレオチド三リン酸は、組み込み速度または組み込みの持続時間に影響を与える非天然部分を含み得る。図６Ａはγ−ＡＮＳヌクレオチド修飾の化学構造を示し、これは、ヌクレオチド三リン酸の５’位置に組み込まれて、５’修飾を欠く同一のヌクレオチドヌクレオチド三リン酸と比較し、クローズド状態でポリメラーゼが費やす持続時間を増加させ得る。図６Ｂに示すように、天然ｄＡＴＰおよびγ−ＡＮＳ修飾ｄＴＴＰの混合物の存在下で、ポリメラーゼについて検出される光学シグナルは、γ−ＡＮＳｄＴＴＰがある場合のクローズド状態の持続時間は、天然ヌクレオチドで観察されるよりも１０倍超長い。米国特許出願公開第２０１１／０３１２５２９号明細書を参照されたい（この文献は参照によって本明細書に組み込まれるものとする）。
【００５６】
ヌクレオチドの時間ベースまたは動力学的な区別を用いる方法は、電荷センサにおける試薬の極めて急速な混合とリアルタイム検出を組み合わせて用いることにより容易になり得る。この混合は、利用可能なストップトフロー装置に従いサブミリ秒の時間スケールで生じさせることが可能である。試薬の急速混合は、急速流体、能動的または受動的な混合、および拡散による限界を克服するための反応の適正閉じ込め（例えば、混合ブラウジング）を使用して達成することができる。ストップトフロー送給は特に有用である。ストップトフロー送給は、流体の急速流を使用して流体を検出部位に送給し、次にその流れを急激に停止させる。送給される流体は、典型的には、検出部位の等量の流体体積を置き換える。流体は、電荷センサに付着させたポリメラーゼなどの固相検体と混合できる。ストップトフロー流体送給の不感時間は、例えば、２ミリ秒（ｍｓｅｃ）未満とすることができる。したがって、不感時間は、２ｍｓｅｃ、１．５ｍｓｅｃ、１ｍｓｅｃ、０．８ｍｓｅｃ、０．６ｍｓｅｃ、０．５ｍｓｅｃ、または０．４ｍｓｅｃより長くないものとすることができる。有用なストップトフローおよび急速混合流体システムについては、例えば、Ｃｈａｎｃｅ，Ｂ．Ｊ．Ｆｒａｎｋ  Ｉｎｓｔ．，２２９，６１３（１９４０）、および米国特許出願公開第２０１３／０１６５３２８号明細書を参照されたい（これらの文献はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれるものとする）。
【００５７】
電荷センサに付着させたポリメラーゼの時間ベースまたは動力学的な測定の配列を用いて、相補鎖を合成するポリメラーゼが用いる鋳型核酸の配列を決定することができる。鋳型鎖の配列は、伸長している鎖に組み込まれるヌクレオチド配列から推測できることを理解されたい。このようにして、１つの鎖の配列決定は、その相補鎖の配列決定を含むと理解されたい。
【００５８】
種々のヌクレオチド種のうち任意のものが本明細書に記載の方法または組成に有用であり得る。例えば、天然に存在するヌクレオチド、例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＡＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＡＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＣＭＰ、およびｄＧＭＰを使用することができる。典型的には、ｄＮＴＰヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ鎖に組み込まれ、ＮＴＰヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡ鎖に組み込まれる。特定の実施形態において、例えば、ＮＴＰまたはその類似体がＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡに組み込まれ得る場合、およびＮＴＰまたはその類似体を用いるＤＮＡポリメラーゼの遷移の速度または持続時間が、他のヌクレオチドを用いたＤＮＡポリメラーゼの遷移の速度または持続時間から識別できる場合に、ＮＴＰヌクレオチドまたはその類似体はＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡに組み込まれ得る。あるいは、例えば、ｄＮＴＰまたはその類似体がＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡに組み込まれ得る場合、およびｄＮＴＰまたはその類似体を用いたＲＮＡポリメラーゼの遷移の速度または持続時間が、他のヌクレオチドを用いたＲＮＡポリメラーゼの遷移の速度または持続時間から識別できる場合に、ｄＮＴＰヌクレオチドおよびその類似体はＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡに組み込まれ得る。さらに、例えば、ｄＮＴＰまたはその類似体が逆転写酵素によってＲＮＡ鋳型からＤＮＡに組み込まれ得る場合、およびｄＮＴＰまたはその類似体を用いた逆転写酵素の遷移の速度または持続時間が、他のヌクレオチドを用いた逆転写酵素の遷移の速度または持続時間から識別できる場合に、ｄＮＴＰヌクレオチドおよびその類似体は、逆転写酵素によってＲＮＡ鋳型からＤＮＡに組み込まれ得る。速度または持続時間の相対的差異は、速度の相対的上昇、持続時間の相対的増加、速度の相対的減少、または持続時間の相対的減少であり得る。
【００５９】
非天然ヌクレオチド類似体も有用である。特に有用な非天然ヌクレオチド類似体としては、限定するわけではないが、別のヌクレオチドを用いたポリメラーゼ遷移の速度または持続時間から識別され得る、検出可能に異なるポリメラーゼ遷移の速度または持続時間を生成するものが挙げられる。例えば、非天然ヌクレオチド類似体は、天然に存在するヌクレオチドなどの別のヌクレオチドを用いたポリメラーゼの同一遷移における速度または持続時間から識別され得る、検出可能に異なるポリメラーゼ遷移の速度または持続時間を役立つように生成することができる。用いることが可能な例示的なヌクレオチド類似体としては、限定するわけではないが、ｄＮＴＰαＳ；ＮＴＰαＳ；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：２０３７−２０４５（２００６）（参照によって本明細書に組み込まれるものとする）において特定された、ＩＣＳ、３ＭＮ、７ＡＩ、ＢＥＮ、ＤＭ５、ＴＭ、２Ｂｒ、３Ｂｒ、４Ｂｒ、２ＣＮ、３ＣＮ、４ＣＮ、２ＦＢ、３ＦＢ、ＭＭ１、ＭＭ２、およびＭＭ３のような非天然核酸塩基を有するヌクレオチド；Ｐａｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４８：１８０−１８９（２００９）（参照によって本明細書に組み込まれるものとする）に記載のような、２−アミノ−１−デアザプリン、１−デアザプリン、２−ピリジン、ヒポキサンチン、プリン、６−Ｃｌ−プリン、２−アミノ−ｄＡ、２−アミノ−プリンもしくは６−Ｃｌ−２−アミノ−プリンを含む非天然ヌクレオ塩基を有するヌクレオチドまたはＫｒｕｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１６：２４２−８（２００９）（参照によって本明細書に組み込まれるものとする）に記載のような、イソ−Ｇ、イソ−Ｃ、５ＳＩＣＳ、ＭＭＯ２、Ｄｓ、Ｐａ、ＦＩ、ＦＢ、ｄＺ、ＤＮＢ、チミン同配体、５−ＮＩ、アゾール−カルボキサミド、ｘＡ、Ｉｍ−Ｎｏ、Ｊ，Ａ＊、Ｔ＊を含む非天然ヌクレオ塩基を有するヌクレオチドが挙げられる。
【００６０】
５’修飾を有する非天然ヌクレオチド類似体は特に有用である。非天然ヌクレオチド類似体は、典型的には、三リン酸塩を有するが、より多くのまたはより少ないリン酸塩を有することも可能である。特定の実施形態において、非天然ヌクレオチドのαリン酸塩、βリン酸塩、またはγリン酸塩のうち１つまたは複数は、酸素以外の部分に共有結合的に付着する。リン酸塩に付着した、さもなければ５’位置に存在する部分は、負電荷、正電荷、金属キレート活性、または立体容積をもたらし得る。例示的な部分としては、限定するわけではないが、ヒスチジン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、チロシン、システイン、グリシンアラニン、もしくはプロリンのようなＬ−光学異性体あるいはＲ−光学異性体型のアミノ酸；アミノ基；マグネシウムもしくはマンガンなどのキレートされた金属；メチル基；臭素、塩素、もしくはヨウ素のようなハロゲン；チオール基；電子求引基；電子供与基；芳香族アミン；または脂肪族アミンが挙げられる。これらおよび他の部分は、ポリメラーゼまたは他の核酸酵素と相互作用する実施形態において有利であり、こうした相互作用は、酵素がそのような部分のないヌクレオチドと行う相互作用とは異なる。このようにして、各ヌクレオチド種におけるそのような部分の有無を活用して、シーケンシング法において、例えば、ヌクレオチド種に作用する核酸酵素における立体配座シグナル変化の速度、持続時間、および／または強度に基づいてヌクレオチド種を識別することができる。
【００６１】
反応成分または方法は、１つまたは複数のヌクレオチド種を含むことが可能である。例えば、配列解析に用いる反応成分または方法は、合成されている核酸鋳型において、４つの各ヌクレオチド種を用いてワトソン・クリック塩基対を形成することができる４つの異なるヌクレオチド種を含み得る。特定の実施形態は、少なくとも２つの異なるヌクレオチド種、少なくとも３つの異なるヌクレオチド種、少なくとも４つの異なるヌクレオチド種、またはそれ以上の異なるヌクレオチド種を含み得る。少なくとも２つのヌクレオチド種は非天然ヌクレオチド類似体とすることができ、少なくとも３つの異なるヌクレオチド種は非天然ヌクレオチド類似体とすることができ、または少なくとも４つの異なるヌクレオチド種は非天然ヌクレオチド類似体とすることができる。このようにして、反応成分または方法は、天然ヌクレオチドおよび非天然ヌクレオチド類似体の混合物を含み得る。あるいは、反応成分は、天然ヌクレオチドを欠き、その代わりに非天然ヌクレオチド類似体のみを有するものとすることができる。この反応は、非天然ヌクレオチド類似体のみがポリメラーゼによって成長する核酸に組み込まれる条件下で行うことができる。
【００６２】
一部の実施形態において、反応成分または方法は、核酸鋳型内の１つのヌクレオチド種とのみ塩基対合するヌクレオチド種を含み得る。例えば、方法は、異なるヌクレオチド種が、別個の連続反応でポリメラーゼおよび核酸と接触する条件下で行うことができる。特に、Ａと塩基対合するヌクレオチド種を第１反応に加え、Ｃと塩基対合するヌクレオチド種を第２反応に加え、Ｔと塩基対合するヌクレオチド種を第３反応に加え、またＧと塩基対合するヌクレオチド種を第４反応に加えることが可能である。これら反応は、第１、第２、第３、および第４というが、単に該反応が別個であることを示すに過ぎず、必ずしも本明細書に記載の方法においてヌクレオチド種を加える順を限定するものではない。むしろ、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧと塩基対合するヌクレオチド種は、方法の特定の実施形態では任意の所望または適切な順で加えることができる。典型的には、シーケンシング法において、所定の鋳型核酸の４つの異なるヌクレオチド種と塩基対合するヌクレオチド種を順に加えて、シーケンシング法のサイクルを完了させる。しかしながら、４つよりも少ないヌクレオチドの添加を一部の実施形態で用いることができる。さらに、２つ以上だが２、３、または４つ以下のヌクレオチド種と塩基対合するヌクレオチドの混合物を用いることが可能であることを理解されたい。同様に、３つ以上だが３または４つ以下のヌクレオチド種と塩基対合するヌクレオチドの混合物を用いることが可能であるか、または４つ以上だが４つ以下のヌクレオチド種と塩基対合するヌクレオチドの混合物を用いることが可能である。
【００６３】
本開示は、（ａ）固体支持体型の電荷センサに結合させたポリメラーゼを提供するステップと；（ｂ）前記ポリメラーゼをヌクレオチド三リン酸の混合物と接触させるステップであって、前記混合物は異なるタイプのヌクレオチド三リン酸を含み、前記混合物において、前記ヌクレオチド三リン酸の第１の２タイプは第２の２タイプのヌクレオチド三リン酸と比較し第１の識別可能な状態にあり、前記ポリメラーゼはヌクレオチドを、前記混合物から鋳型核酸鎖に対する新生鎖に組み込む、ステップと；（ｃ）前記ヌクレオチドの組み込みを前記電荷センサを介して検出することにより第１シグナルパターンを得るステップであって、前記混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸は前記第２の２タイプのヌクレオチド三リン酸により生成されるシグナルとは識別されるシグナルを生成する、ステップと；（ｄ）前記ポリメラーゼ、前記鋳型核酸、およびヌクレオチド三リン酸の第２混合物を用いて、ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）を繰り返すことにより第２シグナルパターンを得るステップであって、前記第２混合物において、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸の一方は、前記第１の２タイプのヌクレオチド三リン酸のもう一方と比較し、識別可能な状態にある、ステップと；（ｅ）前記第１シグナルパターンと前記第２シグナルパターンを比較して、前記鋳型核酸の配列を決定するステップとを含む、核酸シーケンシング法も提供する。
【００６４】
一部の実施形態は、上記のシグナルパラメータの組み合わせを利用して、シーケンシングされる核酸の多数のタイプの塩基を識別することが可能である。１つまたは複数のパラメータの差異を利用して、少なくとも２つ、３つ、または４つの異なるヌクレオチドタイプを識別することが可能である。用いるパラメータ次第で、特定の実施形態は、多くて２つまたは３つの異なるヌクレオチドタイプを識別することができる。
【００６５】
異なるパラメータの組み合わせ使用の例は、図７Ａに示すマトリックスおよび図７Ｂに示す真理値表に照らして理解することが可能である。この場合、４つの異なるヌクレオチドタイプは、同じ鋳型について実行されるいくつかのシーケンシングランにおいて、シグナル極性変化の２つの異なる状態およびヌクレオチド組み込み動力学の２つの異なる状態の組み合わせに基づき、識別される。組み合わせ法を用いて、シーケンシングランで識別される異なる標識数を超える、核酸のいくつかの異なるヌクレオチドタイプを特定することが可能である。シーケンシングに用いることが可能な状態および段階の例示的な組み合わせは、米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２号明細書に記載されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００６６】
特定の実施形態は、同一の核酸を複数回リシーケンシングするという戦略を用いるが、毎回異なるヌクレオチド三リン酸混合物を用いる。例えば、電荷センサに付着させたポリメラーゼを用いて、３つの天然ｄＮＴＰと、天然ｄＮＴＰと比較し電流トレースにおいて特異的なシグニチャを生成する１つの非天然ｄＮＴＰを含有するｄＮＴＰ混合物を用いて、核酸分子をシーケンシングすることが可能である。図８Ａのマトリックスおよび図８Ｂの真理値表に示すように、第１ランは、特異的なシグニチャを生成するｄＣＴＰの非天然類似体とともに、天然のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＧＴＰを用いることが可能であり；第２ランは、特異的なシグニチャを生成するｄＡＴＰの非天然類似体とともに、天然のｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＧＴＰを用いることが可能である。４つの異なるランからの電流パターンを整列させることにより、パターン認識を介して鋳型鎖のヌクレオチド配列を決定することが可能であり、個々のベースコールを行うことが不要になる。
【００６７】
図８の組み合わせ法は、３つの天然ヌクレオチドと単一の非天然類似体の使用に関して例示されるものだが、天然および／または非天然のヌクレオチド三リン酸の異なる組み合わせを用いて同様の結果が達成可能であることを理解されたい。例えば、非天然ヌクレオチド三リン酸を用いる必要はない。むしろ、４つの異なる非天然類似体を用いることが可能である。
【００６８】
さらに、図８に関連して例示されるように、それぞれ４つの特異的に検出可能なヌクレオチド三リン酸類似体のうち１つを用いて同一の核酸伸長を通る、４つの異なるランを用いることが可能だが、４つ未満のランを用いて、配列中の４つの異なるヌクレオチドタイプの場所を決定することも可能である。例えば、図９Ａのマトリックスおよび図９Ｂの真理値表に示すような代替戦略は、同一の核酸伸長を通る２つの異なるシーケンシングランのみを用いる。この例では、第１ランは２つのタイプのシグナルを生成し、第１シグナルタイプはＧおよびＣに関して劣化し、第２シグナルタイプはＴおよびＡに関して劣化する。しかしながら、第２ランを用いて、第１ランのパターンと比較した場合にＧとＣを識別し、またＴをＡと識別するシグナルパターンを得ることが可能である。特に、第１ヌクレオチドタイプは、両ランで同一の特定のシグナルを生成し（例えば、図９のＣ）、第２ヌクレオチドタイプは、第２ランではなく第１ランでそうした特定のシグナルを生成し（例えば図９のＧ）、第３ヌクレオチドタイプは第１ランではなく第２ランでそうした特定のシグナルを生成し（例えば、図９のＴ）、第４ヌクレオチドタイプはどのランにおいてもそうした特定のシグナルは生成しない。したがって、両ランの比較により、４つのヌクレオチドタイプ全てが明瞭に特定されるだろう。この例では、特定のシグナルタイプは、例えば、非天然部分に起因して生成され得る。そのため、そうした部分は、第１ランではｄＧＴＰとｄＣＴＰには存在するが、ｄＡＴＰとｄＴＴＰには存在せず、第２ランでは該部分はｄＴＴＰとｄＣＴＰには存在するが、ｄＧＴＰとｄＡＴＰには存在しない。本明細書の他で例示されるような特徴的なシグナルパラメータを生成する他の条件または化学修飾を差別的にランに適用して、同様の結果を達成することが可能である。
【００６９】
シグナルパターンにおける特異的なシグニチャは、例えば、電流変調；ポリメラーゼの検出可能状態の持続時間（例えば、ポリメラーゼのオープン状態またはクローズド状態の持続時間）；電流変調の振幅；または他の、修飾ヌクレオチドの特異的特定を可能にするシグナル特徴、例えば、ノイズ、電流パルスの立ち上がり時間／立ち下り時間、パルスの立ち上がり縁および／または立ち下り縁の形を含む、種々のシグナルパラメータの何れかに由来し得ることを理解されたい。
【００７０】
一部の実施形態では、処理能力の高いポリメラーゼを用いた環状鋳型を用いて、反復シーケンシングを達成することが可能である。図１０を参照されたい。これはコンセンサスシーケンシングを可能にし、ここではシーケンシング深度の増加を介してランダムエラーが排除される。別の方法は、パターンアライメントの場所マーカとして機能するシーケンシングプライマーを用いることである。多数のランを、鋳型の異なる場所にハイブリダイズする特異的プライマーを用いて実行することが可能である。多数の鋳型リードを比較する場合、既知のハイブリダイゼーション場所を用いることが可能である。このような方法を利用して、ゲノムスケールカバレッジを達成することが可能である。
【００７１】
ＳＷＮＴ  ＦＥＴに関し一部の実施形態を本明細書で例示したが、任意の電界効果感応電気デバイスが、原則的には、電荷残基の動きの検出に適していることが当業者には明らかであろう。例えば、Ｓｉナノワイヤ（Ｙｉ  Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｎｏｌｅｔｔ，ｐ．１４９，２００３）、導電性ポリマーナノチューブ（Ａ．Ｌ．Ｂｒｉｓｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｍａｔｅｒ．Ｔｏｄａｙ  ｐ．２８，２００８）、Ｆｉｎ−ＦＥＴ、およびトライゲートＦＥＴ（Ｘ．Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，ＩＥＤＭ，ｐ．６７，１９９９）、およびトンネリングＦＥＴ（Ｄ．Ｓａｒｋａｒ，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．Ｐ．１４３１０８，２０１２）は全て、本出願に適切なセンサである。これらの参考文献は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。加えて、塩基区別のために提案した方法は電界効果センサ以外に拡張可能かつ適用可能であり、磁性センサ、電気化学センサ、トンネリングセンサ、およびナノ電気化学（ＮＥＭＳ）センサに等しく適用可能であることが明らかであろう。
【００７２】
本開示は、いくつかの異なる核酸分子を並行してシーケンシングする多重方法を提供する。複数の電荷センサを電荷センサアレイの形式で設けることが可能である。このアレイは、少なくとも１０個、１００個、１×１０３個、１×１０４個、またはそれ以上個数の電荷センサを含むことが可能である。各個別の電荷センサは、アレイにおける他の電荷センサから離れたアレイにおける離散場所で配置することが可能である。例えば、各電荷センサは、固体支持体におけるウェルまたは窪みに設けることが可能である。互いに離れているときでさえも、これら場所は、オプションとして、バルク溶液に接触する流体内に存在し得る。このような構成において、共通試薬をバルク流体送給ですべての電荷センサに送給することによって、多重反応が電荷センサアレイ上で起き得る。核酸シークエンシング反応を例に挙げると、ヌクレオチドはバルク溶液によりウェル（または他の形体）のアレイに送給することができ、各ウェル（または他の形体）は、個別のシークエンシング反応をホスティングする。ヌクレオチド送給が、ウェル（または他の形体）における並列的シークエンシング反応をもたらすだろう。
【００７３】
ナノワイヤのような電荷センサの寸法は、１０ｎｍ未満の幅、および１００ｎｍ超の長さであり得る。ナノワイヤまたは他の電荷センサは、１０ｎｍ×１０ｎｍ、５０ｎｍ×１００ｎｍ、またはそれより大きいウェル内に配置することが可能である。例えば、電荷センサが存在するウェルは、少なくとも１００ｎｍ２、１０００ｎｍ２、５０００ｎｍ２、１×１０４ｎｍ２、またはそれより大きい表面上に開口を有することが可能である。電荷感知素子からのシグナルを読み出す回路は、固体支持体の１ミクロン×１ミクロン、またはそれより大きい面積を占め得る。
【００７４】
アレイの密度は、１ｃｍ２あたり２〜１０億個以上にわたる異なる反応部位とすることができる。極めて高密度のアレイが本発明に有用であり、例えば、少なくとも約１０，０００，０００反応部位／ｃｍ２であり、例えば、少なくとも約１００，０００，０００反応部位／ｃｍ２、１，０００，０００，０００反応部位／ｃｍ２、約２，０００，０００，０００反応部位／ｃｍ２にも達する、またはそれ以上の密度もあり得る。高密度アレイは、例えば、約１００，０００反応部位／ｃｍ２〜約１０，０００，０００反応部位／ｃｍ２の範囲にわたる密度にすることもできる。本発明に有用な中密度は、約１０，０００反応部位／ｃｍ２〜約１００，０００反応部位／ｃｍ２である。低密度アレイは、概して約１０，０００反応部位／ｃｍ２よりも少ない密度である。
【００７５】
例えば、電荷センサのアレイを採用する実施形態を含む多数の実施形態を、単一ポリメラーゼ分子を各電荷センサに付着させるよう構成することが可能である。例えば、多数の実施形態における電荷センサはほぼ全て、単一ポリメラーゼを付着させることができる。さらに、同一種のポリメラーゼを各電荷センサに付着させることができる。この構成は各電荷センサから期待される均一出力を提供し得るが、それぞれ別の電荷センサに接触することになる他の反応成分では相違する出力を提供する。
【００７６】
種々のポリメラーゼのうち任意のものを本明細書に記載する方法、または、例えば、生体系から単離したタンパク質ベースの酵素及およびその機能的変異体を含む組成に使用することが可能である。以下に例示するような特定のポリメラーゼに対する言及は、別段の指示がない限り、それらの機能的変異体も含むと理解されたい。ポリメラーゼの特に有用な機能は、既存の核酸を鋳型として用いて、核酸鎖の重合化（ポリメリゼーション）を触媒する点である。有用な他の機能は、本明細書のいたるところに記載されている。有用なポリメラーゼの例としては、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。例示的ＤＮＡポリメラーゼとしては、構造的ホモロジーによってＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ，およびＲＴと特定されるファミリーに分類されるものが挙げられる。ファミリーＡにおけるＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼγ、大腸菌ＤＮＡＰｏｌＩ、サーマス・アクアチクスＰｏｌＩ、および枯草菌ステアロ好熱性ＰｏｌＩが挙げられる。ファミリーＢにおけるＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、真核生物ＤＮＡポリメラーゼα、δ、およびε；ＤＮＡポリメラーゼζ；Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＢ６９バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ファミリーＣとしては、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩアルファサブユニットが挙げられる。ファミリーＤとしては、例えば、古細菌のユリアーキオータ門サブドメイン由来のポリメラーゼが挙げられる。ファミリーＸにおけるＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、真核生物ポリメラーゼＰｏｌβ、Ｐｏｌσ、ＰｏｌλおよびＰｏｌμ、ならびに出芽酵母Ｐｏｌ４が挙げられる。ファミリーＹにおけるＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｐｏｌη、Ｐｏｌイオータ、Ｐｏｌカッパ、大腸菌Ｐｏｌ  ＩＶ（ＤＩＮＢ）、および大腸菌ＰｏｌＶ（ＵｍｕＤ’２Ｃ）が挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼのＲＴ（逆転写酵素）ファミリーとしては、例えば、レトロウイルス逆転写酵素及および真核生物テロメラーゼが挙げられる。典型的なＲＮＡポリメラーゼとしては、限定するわけではないが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼなどのウイルスＲＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ、およびＲＮＡポリメラーゼＶのような真核生物ＲＮＡポリメラーゼ；ならびに古細菌ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００７７】
上述の分類は説明目的のために提示するものである。分類系の変形例もあり得ることを理解されたい。例えば、少なくとも１つの分類系ファミリーＣポリメラーゼは、ファミリーＸのサブカテゴリとして分類されていた。さらに、ポリメラーゼは、機能的かまたは構造的か、すなわち、上記で例示した構造的特徴とオーバーラップするかしないかの他の特徴に基づいて分類することが可能である。いくつかの例示的特徴を以下に詳細に記載する。
【００７８】
固有の３’−５’校正エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、一部の実施形態に有用であり得る。実質的に３’−５’校正エキソヌクレアーゼ活性を持たないポリメラーゼも、一部の実施形態において、例えば、多くのシーケンシング実施形態において有用である。エキソヌクレアーゼ活性がないことは、野生タイプ特徴、または変異型もしくは改変型ポリメラーゼ構造によって付与される特徴であり得る。例えば、エキソマイナスクレノウ断片は、３’−５’校正エキソヌクレアーゼ活性を持たないクレノウ断片の突然変異型である。クレノウ断片およびそのエキソマイナス変異体は、本明細書に記載の方法または組成に有用であり得る。
【００７９】
ポリメラーゼはその処理能力に基づいて特徴付けすることが可能である。ポリメラーゼは、少なくとも約５０個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、１，０００個のヌクレオチド、１０，０００個のヌクレオチド、１００，０００個のヌクレオチド、またはそれ以上の平均処理能力を有し得る。あるいは、または、さらに、本明細書に記載のように用いられるポリメラーゼの平均処理能力は、例えば、多くとも１００万個のヌクレオチド、１００，０００個のヌクレオチド、１０，０００個のヌクレオチド、１，０００個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、または５０個のヌクレオチドであり得る。ポリメラーゼは、処理速度またはヌクレオチド組み込み速度に基づいて特徴付けすることもできる。例えば、多くの天然ポリメラーゼは、１秒あたり少なくとも１，０００個のヌクレオチドの速度でヌクレオチドを組み込むことができる。一部の実施形態では、それより遅い速度が望ましい場合があり得る。例えば、適正なポリメラーゼおよび反応条件を用いて、最大でも１秒あたり５００個のヌクレオチド、１秒あたり１００個のヌクレオチド、１秒あたり１０個のヌクレオチド、１秒あたり１個のヌクレオチド、１０秒あたり１個のヌクレオチド、１分あたり１個のヌクレオチド、またはそれより遅い平均速度を達成することが可能である。本明細書の他の箇所でさらに詳細に説明するように、組み込み速度が天然に存在するヌクレオチドよりも遅いまたは速いヌクレオチド類似体を用いることが可能である。種々のソースのうち任意なものに由来するポリメラーゼを修飾して、平均処理能力もしくは平均処理速度（例えば、ヌクレオチド組み込み平均速度）またはその両方を増加または減少させることが可能であることを理解されたい。したがって、望ましい反応速度は、適切なポリメラーゼ、ヌクレオチド類似体、核酸鋳型、および他の反応条件を用いて達成することが可能である。
【００８０】
用いる実施形態に応じて、ポリメラーゼは好熱性または熱失活性のいずれかとすることが可能である。好熱性ポリメラーゼは、典型的には、高温条件またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で採用されるような熱サイクリング条件に有用である。好熱性ポリメラーゼとしては、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼに限定されるわけではなく、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。非好熱性有機物から単離した多くのポリメラーゼは熱失活性である。例としては、ファージからのＤＮＡポリメラーゼである。種々のソースのうち任意なものに由来するポリメラーゼを修飾して、高温条件に対する耐性を増加または低下させることが可能であることを理解されたい。ヒートスパイク（つまり、短期間の温度上昇）を用いて、アレイ内の１つまたは複数の熱失活性ポリメラーゼは不活化するとともに、好熱性ポリメラーゼは、シーケンシング反応の後続反応または後続サイクルのために、活性状態のままにすることが可能である。
【００８１】
ポリメラーゼは、当技術分野で既知の種々の化学物質のうち任意のものを用いて電荷センサに付着させることができる。例えば、化学的リンカーを用いることが可能である。多くの実施形態において、電荷センサの表面は、ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、ＨｆＯ２、Ｔａ２Ｏ５のうち１つとする。他の酸化物、例えばランタニド系元素のグループからの酸化物を使用することも可能である。窒化物および酸窒化物もあり得る。付着は、表面水酸基により都合よく行うことが可能である。特定の実施形態において、ポリメラーゼ（または、ポリメラーゼに付着するリンカー分子）は、官能基を含む。リンカーは、電荷センサと相互作用する第１官能基と、ポリメラーゼと相互作用する第２官能基を有し得る。例示的な第１官能基としては、ピレン、ベンゼン、シクロヘキサン、および２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノンが挙げられる。例示的な第２官能基としては、マレイミドがある。サーモ・フィッシャー社（マサチューセッツ州ウォルサム）またはシグマ・アルドリッチ社（ミズーリ州セントルイス）によって販売されているような、タンパク質を表面または他の部分に共有結合的に結合させることが知られている他の化学物質を用いることが可能である。テザーに付着するポリメラーゼにおける化学基は、チオール、アミン、またはカルボキシル基とすることが可能である。
【００８２】
ポリメラーゼは、受容体とリガンドとの間に形成されるような非共有結合性の結合によって電荷センサに付着することが可能である。特に有用な結合は、ストレプトアビジン（またはその変異体もしくは類似体）とビオチン（またはその類似体）との間における結合、相補的核酸相互間における結合、抗体とエピトープとの間における結合、等々である。
【００８３】
一部の実施形態において、導電性テザーを用いてポリメラーゼを電荷センサに付着させる。例示的導電性テザーとしては、ドープしたポリチオフェン、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリアニリン、ポリフルオレン、ポリフェニレン、ポリピレン、ポリアズレン、ポリナフタレン、ポリカルバゾール、ポリインドール、またはポリアゼピンを含む構造を有するものが挙げられる。これらテザー構造の電荷ドーピングは、ポリマーの酸化によって達成することが可能である。導電性テザーおよびそれらを生成する例示的な方法は、Ｖｅｒｎｉｔｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｕｓｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．６６：４４３ｆｆ（１９９７）；ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．４０：２５８１−２５９０（２００１）；またはＭｃＮｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．１６：１０５６−７５（１９６３）に記載されており、これの文献はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
特定の実施形態において、固体支持体は、ウェル、チューブ、チャネル、キュベット、ペトリプレート、またはボトル等といった容器内または容器の一部とすることが可能である。特に有用な容器は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８号明細書またはＢｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：５３−５９（２００８）に記載されているようなフローセルであり、これらの文献はそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれるものとする。例示的なフローセルは、イルミナ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から市販されているものである。フローセルは、電荷センサ上で行われるシーケンシング反応中に、バルク試薬を電荷センサのアレイに送給するのに都合がよい。核酸シーケンシング反応などの循環プロセスは、フローセルデバイスに特に適している。特に有用な別の容器は、多重ウェルプレートまたはマイクロタイタープレート中のウェルである。
【００８５】
本発明方法または装置に用いる核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの類似体から成り得る。標的核酸のソースは、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、または天然ソースに由来する他の核酸とすることができる。一部の場合において、このようなソースに由来する標的核酸は、本明細書に記載の方法または組成に用いる前に増幅させることが可能である。限定するわけではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリング・サークル増幅（ＲＣＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、またはランダムプライム増幅（ＲＰＡ）を含む、種々の既知の増幅技術のうち任意のものを使用することができる。本明細書に記載の方法または装置で用いる前の核酸の増幅はオプションであることを理解されたい。このように、核酸は、本明細書に記載の方法および組成の一部の実施形態では、使用前に増幅しないこともある。標的核酸は、オプションとして、合成ライブラリから抽出することが可能である。合成核酸は、天然のＤＮＡもしくはＲＮＡ組成を有することができ、またはそれらの類似体とすることができる。
【００８６】
核酸を抽出できる例示的な生物サンプルとしては、例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、有蹄動物、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ネコ、イヌ、霊長類、ヒトもしくは非ヒト霊長類などの哺乳動物；シロイヌナズナ、トウモロコシ、ソルガム、オート麦、小麦、米、菜種、もしくは大豆のような植物；緑藻クラミドモナスのような藻類；シノラブディス・エレガンスのような線形動物；キイロショウジョウバエ、蚊、ミバエ、ミツバチもしくは蜘蛛のような昆虫；ゼブラフィッシュのような魚類；は虫類；カエルもしくはアフリカツメガエルのような両生類；キイロタマホコリカビ；ニューモシスティス・カリニ、トラフグ、酵母、サッカロマイセス・セレビシアもしくはシゾサッカロミセス・ポンベのような菌類；または熱帯熱マラリア原虫からのものが挙げられる。標的核酸は、バクテリア、大腸菌、ブドウ球菌もしくは肺炎マイコプラズマのような原核生物；古細菌；Ｃ型肝炎ウイルス、エボラウイルスもしくはヒト免疫不全ウイルスのようなウイルス；またはウイロイドから抽出することも可能である。標的核酸は、上述した生物の均質な培養物もしくは個体群から、または代案的に、例えば、群落もしくは生態系における数種の異なる生物の集合体から抽出することが可能である。
【００８７】
核酸は、天然のソースから抽出する必要はなく、その代わりに既知の技術を用いて合成することができる。例えば、遺伝子発現プローブまたは遺伝子型決定プローブを合成し、本明細書に記載の方法および装置に用いることが可能である。
【００８８】
一部の実施形態において、核酸は、１つまたは複数のより大きい核酸の断片として得ることが可能である。断片化は、例えば、噴霧化、超音波処理、化学的開裂、酵素開裂、または物理的剪断を含む、当技術分野で既知の種々の技術のうち任意なものを用いて実施することが可能である。断片化は、より大きい核酸の一部のみを複製することによりアンプリコンを生成する特定の増幅技術を使用によっても生じ得る。例えば、ＰＣＲ増幅は、増幅中に隣接するプライマーがハイブリダイズする場所の間の原鋳型におけるヌクレオチド配列の長さによって規定されるサイズを有する断片を生成する。
【００８９】
核酸またはそのアンプリコンの集合の平均鎖長さは、本明細書に記載の方法または装置の特定の用途にとって望ましいまたは適切なものである。例えば、平均鎖長さは、約１００，０００個未満のヌクレオチド、５０，０００個未満のヌクレオチド、１０，０００個未満のヌクレオチド、５，０００個未満のヌクレオチド、１，０００個未満のヌクレオチド、５００個未満のヌクレオチド、１００個未満のヌクレオチド、または５０個未満のヌクレオチドとすることができる。あるいは、またはさらに、平均鎖長さは、１０個超のヌクレオチド、５０個超のヌクレオチド、１００個超のヌクレオチド、５００個超おヌクレオチド、１，０００個超のヌクレオチド、５，０００個超のヌクレオチド、１０，０００個超のヌクレオチド、５０，０００個超のヌクレオチド、または約１００，０００個超のヌクレオチドとすることができる。核酸またはそのアンプリコンの集合における平均鎖長さは、上述の最大値および最小値のセットの間の範囲にあるものとすることができる。
【００９０】
一部の場合において、核酸の集合は、ある条件下で生成することができるか、さもなければその集合要素の最大長さを有するよう構成することができる。例えば、本明細書に記載の方法の１つまたは複数のステップで用いられる集合要素の最大長さは、約１００，０００個未満のヌクレオチド、５０，０００個未満のヌクレオチド、１０，０００個未満のヌクレオチド、５，０００個未満のヌクレオチド、１，０００個未満のヌクレオチド、５００個未満のヌクレオチド、１００個未満のヌクレオチド、または５０個未満のヌクレオチドとすることができる。あるいは、または、さらに、核酸またはそのアンプリコンの母集合は、ある条件下で生成することができるか、さもなければその集合要素の最小長さを有するよう構成することができる。例えば、本明細書に記載の方法の１つまたは複数のステップで用いられるか、または、特定組成に存在する集合要素の最小長さは、約１０個超のヌクレオチド、５０個超のヌクレオチド、１００個超のヌクレオチド、５００個超のヌクレオチド、１，０００個超のヌクレオチド、５，０００個超のヌクレオチド、１０，０００個超のヌクレオチド、５０，０００個超のヌクレオチド、または約１００，０００個超のヌクレオチドとすることができる。集合における核酸の最大鎖長さおよび最小鎖長さは、上述の最大値および最小値のセットの間の範囲にあるものとすることができる。
【００９１】
本明細書全体にわたり種々の刊行物、特許、または特許出願に言及した。これら文献の開示は、本発明が関与する従来技術についてより完全に記述するため、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【００９２】
用語「含み（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載の要素だけを含むのではなく、任意の付加的要素をも包含し、非限定的であることを意図する。
【００９３】
本発明を上述の実施例に関連して説明してきたが、本発明から逸脱することなく、種々の変更を加えることが可能であることを理解されたい。したがって、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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