(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第１の認識可能なタグを含む発現可能なタンパク質をコードする核酸配列を、内因性ＤＮＡＫタンパク質またはＤＮＡＫタンパク質ホモログおよび第２の認識可能なタグを発現するように遺伝的に修飾されている染色体を有する細胞に、挿入すること（ただし、発現可能なタンパク質は内因性ＤＮＡＫタンパク質又はＤＮＡＫタンパク質ホモログではなく、第１の認識可能なタグと第２の認識可能なタグとは同じではない）、
ｂ）核酸によりコードされる発現可能なタンパク質を発現させること、
ｃ）発現可能なタンパク質と内因性タンパク質を含む、細胞溶解物を抽出すること、
ｄ）第２の認識可能なタグを標的にすることによって細胞溶解物から内因性ＤＮＡＫタンパク質又はＤＮＡＫタンパク質ホモログを除去することを含み、かつ、実質的に細胞溶解物から発現可能なタンパク質を除去しない、タンパク質精製手順に、細胞溶解物を適用することによって内因性ＤＮＡＫタンパク質又はＤＮＡＫタンパク質ホモログを精製すること、および
ｅ）核酸によりコードされる発現可能なタンパク質を、第１の認識可能なタグを標的にすることによって精製すること
を含み、工程ｄおよびｅは、いずれの順で行われてもよく、前記細胞は細菌細胞である、タンパク質の単離方法。
【請求項２】
第２の認識可能なタグが、タンパク質タグである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質タグが、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨｉｓタグまたはＭｙｃタグである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質精製手順が、固相支持体または液相支持体単離を利用する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
内因性ＤＮＡＫタンパク質又はＤＮＡＫタンパク質ホモログの精製工程が少なくとも１回繰り返されてもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞溶解物内の他の混入物を標的にする追加の精製工程に用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
内因性ＤＮＡＫタンパク質又はＤＮＡＫタンパク質ホモログのタンパク質精製手順は、内因性ＤＮＡＫタンパク質又はＤＮＡＫタンパク質ホモログに結合する別のタンパク質も単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
遺伝的に修飾された染色体は、染色体ＤＮＡＫ遺伝子の欠失を含み、かつ、内因性ＤＮＡＫタンパク質又はＤＮＡＫタンパク質ホモログおよび第２の認識可能なタグの核酸配列を含む形質転換されたベクターによって置換される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質の単離方法、すなわち単離手順中のＤＮＡＫの除去を含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
相当量の純粋なタンパク質の入手は、無数の生物学的研究において必須であり、タンパク質の生化学的特性決定に不可欠である。増殖の容易さ、よく特性決定された遺伝子、および遺伝子発現のための多数のツールにより、長い間、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）は、タンパク質過剰産生のために選択される生物とされてきた。
ＤＮＡＫは広範囲の新たに合成されたポリペプチドと相互作用することによりシャペロンとして作用する豊富なタンパク質（大腸菌の全タンパク質の約１％）である。シャペロンタンパク質は、新たに発現されたタンパク質の適したフォールディングおよびオリゴマーへの集合を助け、したがって相互作用によるタンパク質凝集を防止する。他のタンパク質とのＤＮＡＫ結合はＤＮＡＫがＡＤＰに結合するときに生じ、ＡＴＰに結合するとこれらのタンパク質を放出する。ＤＮＡＫはまた、予め形成されたタンパク質凝集体を解離するために必要な因子であり、プロテアーゼ特異的チャネルを介した損傷タンパク質の分解に関与する。
【０００３】
タンパク質産生にとって重要である一方、ＤＮＡＫ汚染は、タンパク質精製において深刻な問題をもたらす。ＤＮＡＫは、細菌宿主株に対して内因性でない多くのタンパク質に結合する可能性がある。さらに、ＤＮＡＫ汚染は、組換え融合タンパク質産生の分離を妨げ、フォールディング−再フォールディング実験分析の害となり、シャペロンが微量しか存在しない場合であってもラットおよびウサギにおいて強い抗原応答を引き起こす可能性があり、それによって抗体産生に影響を及ぼす。
いくつかの組換えタンパク質の単離方法は、ＤＮＡＫ汚染を排除するために大腸菌ＤＮＡＫ欠失株を利用するが、単離された組換えタンパク質の溶解性および品質を改善するためにＤＮＡＫが必要とされない場合にのみ利用する。それでもこれらの欠失株は、増殖の許容温度の範囲がより狭く、組換えタンパク質の全体的な収率ならびに株の安定性を低下させ得る複数の細胞の欠損を示す。
融合タンパク質産生を含む他の方法は、組換えタンパク質の推定上のＤＮＡＫ結合部位を取り囲む適切なアミノ酸を決定し、ＤＮＡＫに対する推定上の親和性を減少させるために配列を改変するソフトウェアに基づくアルゴリズムを利用する。樹脂に結合したこれらの融合タンパク質を精製すると、溶出前に、ＭｇＡＴＰ＋可溶性変性大腸菌タンパク質を使用してタンパク質を洗浄する。しかしながら、そのような方法は、限定された数の場合にのみ効果的であり、一般に全ての融合タンパク質に対して効果的ではない。また、それらは、推定上のＤＮＡＫ結合部位を本来的に含むそれらの単離された組換えタンパク質の汚染を排除しない。さらに、この手順の薬剤の試薬は高価であり、商業的または治療的使用には適していないものもある（例えば、グリセロール）。
【０００４】
別の方法は、ヌクレオチド結合状態のいずれかでＤＮＡＫに結合するコシャペロンタンパク質を用いる。コシャペロンタンパク質はＮ末端でヒスチジンタグが付加されており、この融合組換えタンパク質はニッケルアフィニティークロマトグラフィーによる一段階精製によって単離された。このコシャペロンを介してＤＮＡＫを除去する能力にもかかわらず、この方法はＤＮＡＫを完全に排除するものではなく、より高いレベルで標的組換えタンパク質を発現するために必要な細胞資源を減少させるさらなる組換えタンパク質の形質転換に依存する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、組換えタンパク質精製中にＤＮＡＫを除去する方法である。この方法は、タグ付きＤＮＡＫを発現することができる組換えタンパク質産生のために一般に使用される細菌株の使用を必要とする。細菌株は、大腸菌であってよい。タンパク質タグは、ＤＮＡＫ遺伝子のゲノムコピーに組み込まれ、内因的にタグ付きＤＮＡＫを産生する株をもたらし得る。株は、内因性ＤＮＡＫが欠失し、導入されたベクターからタグ付きＤＮＡＫが発現される変異株であり得る。タグは、ＤＮＡＫまたはＤＮＡＫとしての同様の機能を有するＤＮＡＫのホモログに付加してよい。タグは、ヒスチジンタグ、ｍｙｃタグまたは任意の同等のタグであってもよく、ここで、タグは、樹脂ベースの固相もしくは液相法、またはタンパク質の単離のためのタグの使用を用いる任意の他の精製技術と共に使用される場合、タグ付きタンパク質の除去に効果的である。
【０００６】
ＤＮＡＫの存在は、細菌培養物の最適な複製のために重要であり、それにより、標的組換えタンパク質のより大きな発現および収率を可能にする。タンパク質タグをコードするヌクレオチド配列は、ＤＮＡＫの機能に影響を及ぼさないＤＮＡＫ配列の任意の領域に挿入してよく、したがって細菌増殖を損なわない。
タグ付きＤＮＡＫ細菌株は、最初に標的組換えタンパク質のベクターで形質転換される。形質転換された細菌培養物を最適な増殖レベルまでインキュベートした後、細胞抽出物を標準的な単離手段によって収集してよい。次いで、細胞抽出物は、タグ付きＤＮＡＫに向けられたタグのリガンドを含む樹脂に適用してよい。クロマトグラフィーで使用する場合、ＤＮＡＫおよび任意のＤＮＡＫ結合タンパク質は樹脂に結合したままであり、溶出液は標的組換えタンパク質を含む。標的組換えタンパク質のさらなる単離を用いてよい。別の方法では、標的組換えタンパク質を最初に単離した後、タグ付きＤＮＡＫを除去してよい。他の方法は、タグ付きＤＮＡＫ単離のその後のラウンドを含んでよい。
本発明の特性である新規な特徴は、それらの構造および操作方法の両方に関して、それらのさらなる目的および利点と共に、本発明の好ましい実施形態が例により図示されている添付図面に関連して考慮される以下の説明から理解されるであろう。しかしながら、図面は例示および説明のみを目的とし、それらは本発明の限定の定義として意図されるものではないことが明確に理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＤＮＡＫ除去の有効性を示す代表的なゲルの図である。
【図２】ＤＮＡＫ単離バンドの同定についてゲル中に示すように、バンド１上で使用される質量分析データの図である。
【図３】図２に示すバンド１のＭＡＳＣＯＴデータの図である。
【図４】ＤＮＡＫ単離バンドの同定についてゲル中に示すように、バンド２上で使用される質量分析データの図である。
【図５】図４に示すバンド１のＭＡＳＣＯＴデータの図である。
【図６】野生型ＢＬ２１株の増殖曲線の図である。
【図７】ＢＬ２１  ＤＮＡＫ  ＳＴＲＥＰ株の増殖曲線の図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（ｉ）定義
以下の定義は、特に指示しない限り、本願の全ての態様および実施形態に適用する。
用語「ＤＮＡＫ」は、ファージラムダＤＮＡ複製の開始に必須の役割を果たす大腸菌タンパク質を指し、ＤｎａＪタンパク質を用いてＡＴＰ依存的様式で作用して、ラムダＯおよびＰタンパク質をプレプライモソーム複合体から放出する。ＤｎａＫはまた、おそらくＤｎａＡタンパク質との類似の相互作用によって、染色体ＤＮＡ複製に関与する。また、タンパク質は高浸透圧ショックに対する応答に能動的に関係する。
用語「ＧｒｐＥ」は、ＤｎａＫおよびＧｒｐＥに関連して、ストレス変性タンパク質の凝集を防止することによって高浸透圧および熱ショックに対する応答に能動的に関係する大腸菌タンパク質を指す。それはＤｎａＫのヌクレオチド交換因子であり、温度センサーとして機能し得る。フォールディングされていないタンパク質は、最初はＤｎａＪに結合する；ＤｎａＪ結合タンパク質と相互作用すると、ＤｎａＫはその結合したＡＴＰを加水分解し、これにより安定な複合体を形成する。ＧｒｐＥはＤｎａＫからＡＤＰを放出する；ＤｎａＫへのＡＴＰ結合は、基質タンパク質の放出を誘発し、したがって反応サイクルを完了する。ＤｎａＪ、ＤｎａＫおよびＧｒｐＥ間のＡＴＰ依存性相互作用のいくつかのラウンドは、十分に効率的なフォールディングのために必要である。
【０００９】
「プラスミド」は、独立して複製される環状二本鎖ＤＮＡ断片を指すベクターである。プラスミドは、大腸菌ｏｒｉＣなどの複製開始点、限定されるものではないが、β−ラクタム、マクロライド、およびアミノグリコシド抗生物質に対する耐性を与える選択可能な抗生物質耐性遺伝子、発現制御下のプロモーター配列、ならびに制限部位を有する多重クローニング部位を含み得る。
【００１０】
プラスミドは、「発現プラスミド」であってよい。発現プラスミドは、クローニングされた遺伝子の発現を可能にする。発現プラスミドは、プラスミドの多重クローニング部位、リボソーム結合部位、開始コドン、終止コドン、および転写配列の終結にクローニングされた遺伝子の遺伝子発現の調節および誘導を可能にする誘導性プロモーター領域を含む。
用語「プロモーター配列」は、遺伝子の転写開始部位の上流または下流のいずれかのＤＮＡ領域である。本明細書で使用する場合、細菌プロモーターは、転写開始の上流の−３５位置にＴＴＧＡＣＡの必要なコンセンサス配列、および−１０位置にプリブノーボックスＴＡＴＡＡＴ配列を含み、−３５領域の上流にＵＰエレメントも含み得る。
【００１１】
「ＢＬ２１−（ＤＥ３）」は、形質転換およびタンパク質発現について化学的にコンピテントな大腸菌株である。この株は、Ｔ７プロモーターの制御下でタンパク質を発現し得る。この株は、プロテアーゼＬｏｎおよびＯｍｐＴが欠損している。
【００１２】
用語「形質転換」は、化学的または電気的手段を介する膜透過性を用いる方法によって、細菌に外因性遺伝物質を導入するプロセスを指す。形質転換の実施には、大腸菌などのコンピテント細菌細胞のアリコートにプラスミドなどの遺伝物質を添加し、混合物を氷上でインキュベートすることを伴う。次いで、細菌細胞をエレクトロポレーションするか、または４２℃で約１分間置いた後、氷上でインキュベートするために戻す。次いで、コロニーが目に見えるようになるまで、細菌細胞を寒天プレート上で一晩増殖させる。寒天プレートは、コロニー選択のための抗生物質または栄養条件を含んでよい。
用語「トランスフェクション」は、意図的に核酸を細胞に導入するプロセスを指す。この用語は、多くの場合、真核細胞における非ウイルス性の方法に使用される。他の方法および細胞型を指してもよいが、他の用語が好ましい：「形質転換」は、より多くの場合、植物細胞を含む非動物真核細胞である細菌における非ウイルス性のＤＮＡ転移を記載するために使用される。動物細胞では、形質転換はこれらの細胞における癌状態（発癌）の進行を指すためにも使用されるため、トランスフェクションが好ましい用語である。「形質導入」は、多くの場合、ウイルス媒介性のＤＮＡ転移を記載するために使用される。Nature Methods 2, 875-883 (2005)。
用語「相同配列」は、対応する参照配列と少なくとも７０％〜９９％相同であるアミノ酸またはヌクレオチド配列を指す。９０％同一である配列は、参照配列中の１０アミノ酸あたり１つ以下の異なるアミノ酸を有する。２つ以上の配列間の相同性の百分率は、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math2:482c、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:433、またはPearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Sci. 85:2444の相同性アルゴリズムを使用して同定され得る。配列アラインメントの方法は、当業者には知られている。ＮＣＢＩハンドブック(2002)に記載されているようなＢＬＡＳＴ、またはSievers et. al. Mol. Sys. Bio. 7:539 (2011)に記載されているようなＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａなどの、上述または別の配列比較アルゴリズムを用いるコンピュータベースプログラムを使用してよい。
【００１３】
「相同組換え」は、２つの類似または同一のＤＮＡ分子間でヌクレオチド配列が交換される遺伝子組換えの一種を指す。これは、二本鎖切断として公知のＤＮＡの両方の鎖に生じる有害な切断を正確に修復するために、細胞によって最も広く使用されている。相同組換えは、異なる生物および細胞型の間で大きく異なるが、大部分の形態は同様の基本的な工程を伴う。二本鎖切断が生じた後、切断の５’末端周辺のＤＮＡ切片は、切除と呼ばれるプロセスで切断される。これに続く鎖侵入工程では、切断されたＤＮＡ分子の突出３’末端が、切断されていない類似または同一のＤＮＡ分子に「侵入」する。鎖侵入後、さらなる一連の事象は、以下で論じる２つの主要経路（モデル参照）のいずれかに続いてよい；ＤＳＢＲ（二本鎖切断修復）経路またはＳＤＳＡ（合成依存性鎖アニーリング）経路。相同組換えは、ウイルスと同様に、生命の３つのドメイン全てにわたって保存されており、これはほぼ普遍的な生物学的メカニズムであることが示唆される。Alberts, B et al (2002).「Chapter 5: DNA Replication, Repair, and Recombination」。
【００１４】
「組換え」ＤＮＡまたはタンパク質は、複数の供給源から遺伝物質を集め、その他生物学的生物に見られない配列を作製するために、遺伝子組換え（分子クローニングなど）の実験室的方法によって形成されたＤＮＡ分子を指すために使用され、または、組換えＤＮＡにコードされるタンパク質を指すために使用される。組換えＤＮＡは、キメラＤＮＡと呼ばれることもある。
「制限エンドヌクレアーゼ」は、制限部位として公知の特異的認識ヌクレオチド配列でまたはその近くでＤＮＡを切断する酵素を指す。Roberts RJ (November 1976).「Restriction endonucleases」。CRC Crit. Rev. Biochem. 4 (2): 123-64。
用語「増幅」は、遺伝子配列の大量複製の動作を指す。遺伝子配列の増幅は、目的の遺伝子配列のフランキング末端にハイブリダイズするプライマーを使用するＰＣＲによって実施してよい。遺伝子配列の増幅は、プラスミドで細菌を形質転換することによって、または目的の組換え遺伝子配列を保有するウイルスで宿主細胞をトランスフェクトすることによってインビボで実施してもよい。
【００１５】
用語「タンパク質発現」は、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞または動物細胞などの宿主細胞内でのタンパク質の産生を指す。発現プラスミドなどのプロモーターの制御下にある組換えタンパク質のコード配列を保有するベクターを宿主細胞に挿入する。次いで、組換え遺伝子の発現を制御するプロモーターが誘導され、組換え遺伝子によってコードされたタンパク質が宿主細胞内で産生される。
【００１６】
用語「タンパク質コード配列」は、ポリペプチドをコードする遺伝子の一部を指す。コード配列は、ＡＴＧ翻訳開始コドンと、ＴＡＧ、ＴＡＡ、またはＴＧＡ翻訳終止コドンの位置との間に位置する。真核生物遺伝子に典型的なものとして、コード配列は、転写されてポリペプチドに翻訳される遺伝子配列である遺伝子の「エクソン」を含んでよく、転写されるがポリペプチドに翻訳されない遺伝子配列である遺伝子の「イントロン」を除外してよい。
用語「タンパク質精製」は、タンパク質を精製するプロセスを指し、目的のタンパク質を満足できるレベルの純度で分離および単離するために使用される任意の技術を用いてよい。タンパク質精製は、サイズ、電荷、結合親和性、および生物学的活性などのタンパク質の様々な性質を利用する。液体カラムクロマトグラフィーは、発現されたタンパク質を含む細胞溶解物が、目的のタンパク質に対して特定の結合親和性を有する「樹脂」上を通過するタンパク質精製において、一般に使用される。樹脂は、イオン交換、疎水性相互作用、サイズ排除、逆相、または親和性タグクロマトグラフィーを介してタンパク質の精製を支持する化学的性質を有する化合物またはポリマーである。タンパク質はまた、目的のタンパク質試料を含むポリアクリルアミドゲルの切除片由来のタンパク質のエレクトロポレーションなどの非クロマトグラフィー技術によって精製してもよい。
【００１７】
用語「ＭＡＬＤＩ」は、化合物ならびにポリペプチドおよびタンパク質などの生体分子をそれらの分子量を決定することによって分析するために使用される質量分析技術であるマトリックス支援レーザー脱離イオン化を指す。トリプシンなどのプロテアーゼによる酵素消化によって、ＭＡＬＤＩのためにタンパク質試料を最初に調製する。次いで、試料をマトリックスに化学的に結合させ、次いで、質量分析計に導入する。パルスレーザービームは試料を標的にし、その結果、固相から気相へのポリペプチドの脱着およびイオン化が起こる。気化イオンは検出器に向かって電界中で加速する。次いで、ペプチド断片を、それらの質量電荷比に基づいて、ペプチドマスフィンガープリンティングまたはタンデム質量分析によって同定する。ペプチド質量は分子量ピークの一覧表として表示され、次いで、元々のタンパク質試料の統計学的同定が可能となるＳｗｉｓｓｐｒｏｔなどの公知のペプチド質量のデータベースと比較される。
本明細書で使用する場合、用語「ＭＡＳＣＯＴ」は、質量分析タンパク質データの同定および特性決定に使用される検索エンジンであるＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と呼ばれるアルゴリズムを指す。確率的なスコアリング（ｐｒｏｂａｌｉｓｔｉｃ  ｓｃｏｒｉｎｇ）は、一致したタンパク質のどれが偶然に生じる可能性が最も低いかに依存しており、したがって最も有意な一致と共に返される。８５以上のタンパク質スコア（ｐ＜０．０５に相当）が有意であると考えられる。
【００１８】
「タンパク質タグ」は、タグの特性および親和性に基づくタンパク質精製、同定、または活性を助ける組換えタンパク質に、新たな特性を提供する組換えタンパク質内のアミノ酸配列を指す。タンパク質タグは、ビオチンタグなどの新規な酵素特性を組換えタンパク質に提供し得、またはタグは、緑色蛍光タンパク質もしくは赤色蛍光タンパク質をコードする蛍光タグなどを用いたタンパク質同定手段を提供し得る。タンパク質タグは、タンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加され得る。タンパク質精製に使用される一般的なタンパク質タグは、ニッケルまたはコバルトなどの金属イオンをキレート化したタンパク質精製マトリックスにタンパク質が結合することを可能にする、一連の約６個のヒスチジンアミノ酸残基が付加されるポリＨｉｓタグである。タンパク質精製に一般に使用される他のタグとしては、Ｓｔｒｅｐタグ、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、およびＦＬＡＧタグが挙げられる。「エピトープタグ」などのタグはまた、タンパク質が抗体に対する親和性を有するようにすることができる。一般的な抗体エピトープタグとしては、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、およびＨＡ１０タグが挙げられる。
【００１９】
用語「融合タンパク質」または「融合したタンパク質」は、単一の遺伝子によってコードされるタンパク質を指し、単一の遺伝子は、少なくとも２つ以上の別個のタンパク質を元々コードするコード配列で構成される。融合タンパク質は、２つ以上の別個のタンパク質の機能的ドメインを保持し得る。融合タンパク質のコード配列の一部は、エピトープタグをコードし得る。抗体様タンパク質に関して本明細書に記載されているように、融合タンパク質はまた、その用途に基づいて変化する機能的役割を有する様々なタンパク質をコードする配列を含み得る。
「ポリペプチド」
【００２０】
「クロマトグラフィー」は、混合物を分離するための一連の実験室的技術の総称である。混合物は、移動相と呼ばれる流体中に溶解されて、固定相と呼ばれる別の物質を保持する構造を通してそれを移動させる。固定相は、「樹脂」と称されることがある。混合物の様々な成分は異なる速度で移動し、それらを分離させる。分離は、移動相と固定相との間の差次的な分配に基づく。化合物の分配係数のわずかな差異が、固定相上での差次的な保持をもたらし、それによって分離を変化させる。
【００２１】
クロマトグラフィーは分取または分析的であってよい。分取クロマトグラフィーの目的は、より高度な使用のために混合物の成分を分離することである（したがって、精製の形態である）。分析クロマトグラフィーは、通常、より少量の物質を用いて行われ、混合物中の分析物の相対的な割合を測定するためのものである。２つは互いに排他的ではない。
サイズ排除クロマトグラフィーまたはカラム（ＳＥＣ）は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）またはゲル濾過クロマトグラフィーとしても公知であり、分子のサイズによって（またはより正確には分子の流体力学的直径または流体力学的体積によって）分子を分離する。より小さい分子は培地の細孔に入ることができ、したがって、分子は捕捉され、移動相の流れから除去される。細孔内の平均滞留時間は、検体分子の有効サイズに依存する。しかしながら、パッキングの平均細孔サイズよりも大きい分子は除外されることから、本質的に保持されず、そのような種は最初に溶出される。一般にこれは、低分解能クロマトグラフィー技術であり、したがって多くの場合、精製の仕上げとなる「最終精製」工程のために確保される。特にこれは天然溶液条件下で行うことができるため、精製されたタンパク質の三次構造および四次構造を決定するためにも有用である。
【００２２】
「アフィニティークロマトグラフィー」は、抗原と抗体、酵素と基質、または受容体とリガンドとの間などの非常に特異的な相互作用に基づいて生化学的混合物を分離する方法である。用語「カラム」は、結合した樹脂の一種の説明と組み合わせて代わりに使用してよい。
分子クローニングにおいて、「ベクター」は、外来遺伝物質を他の細胞に人工的に運ぶための媒体として使用されるＤＮＡ分子であり、複製および／または発現されることが可能である。外来ＤＮＡを含むベクターは、組換えＤＮＡと呼ばれる。ベクターの４つの主なタイプは、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、および人工染色体である。全ての設計されたベクターに共通するのは、複製開始点、マルチクローニングサイト、および選択可能マーカーである。
【００２３】
用語、フリッパーゼ認識標的「ＦＲＴ」は、相同組換えを部分的に担うフリッパーゼと呼ばれる酵素によって認識されるＤＮＡ配列を指す。３４ｂｐ最小ＦＲＴ部位配列は、フリッパーゼ（Ｆｌｐ）が８ｂｐスペーサーに隣接する１３ｂｐである５’−ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣ−３’アームの両方に結合するための配列「５’ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣｔｃｔａｇａａａＧｔＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ３’」、すなわち逆方向の部位特異的組換え（クロスオーバー領域）を有する。ＦＲＴ媒介性切断は、上鎖上の非対称８ｂｐコア領域（５’ｔｃｔａｇａａａ３’）の直前で、さらに下鎖上のこの配列の後方で生じる。いくつかのバリアントＦＲＴ部位が存在するが、通常、組換えは２つの同一のＦＲＴ間でのみ生じることが可能でありながら、一般に、非同一（「異種特異的」）ＦＲＴの間では生じない。Zhu XD, Sadowski PD (1995). XD, Sadowski PD (1995)。「多くの利用可能な構築物は、上流要素から同じ方向に１塩基対離れた追加のアーム配列（５’−ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＣ−３’）を含む：「５’ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣｃＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣｔｃｔａｇａａａＧｔＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ３’」」。このセグメントは、切除のためには不要であるが、リコンビナーゼ媒介性のカセット交換を含む組込みには必須である。
【００２４】
「ＦＬＰリコンビナーゼによる切断依存性ライゲーション」。Journal of Biological Chemistry 270 (39): 23044-54 Schlake T, Bode J (1994)。「定義された染色体座位での発現カセットの交換のための変異ＦＬＰ認識標的（ＦＲＴ）部位の使用」。Biochemistry 33 (43): 12746-12751。
【００２５】
（ｉｉ）本願のポリペプチド配列および薬剤
精密な改変は、Link et al., 1997の方法を使用して大腸菌のゲノムで行われた。組込みは、ｐＫＯプラスミド、ｐＭＨ９およびｐＴＯＦ２４に基づく。(Merlin et al. 2002)。これらのプラスミドは、以下の特徴：クロラムフェニコール耐性遺伝子、３０℃で機能性であるが３７〜４２℃では機能性でない温度感受性ＯＲ１、および増殖培地中でスクロースの存在に感受性のある細胞をもたらすｓａｃＢ遺伝子を有する。ｐＫＯプラスミドに挿入されたＤＮＡＫの配列の代表的な実施形態は、配列番号１である。
大腸菌ゲノムと相同性のある８００ｂｐ領域を、ｐＫＯプラスミドのＰｓｔＩおよびＳａｌＩの制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングする。８００ｂｐ領域は、クロスオーバーＰＣＲを使用して構築してよい。８００ｂｐＤＮＡは、タグをコードするヌクレオチド配列などの追加の改変を含む。任意のそのような改変は、タグをコードするヌクレオチド配列の位置の両側に隣接する４００ｂｐの相同性を有する。改変には、特有の制限部位を追加することも含んでよい。
代表的な実施形態では、タグ付きＤＮＡＫ遺伝子を増幅するために使用され得るプライマーは、配列番号２および３に示される。他のプライマーおよびタグの位置および相同組換えの部位を使用して、タグ付きＤＮＡＫ遺伝子を増幅してもよいことは、当業者には理解される。
【００２６】
タグで修飾された増幅されたＤＮＡＫ配列を、発現ベクター内に存在する２つのＦＲＴカセットの間に挿入した。
本出願では、タグ付きＤＮＡＫ遺伝子配列の一実施形態は、配列番号９に示すようなＤＮＡ組換えを介してＣ末端の終末に付加されたアミノ酸Ｓｔｒｅｐタグ配列（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ）を含んでよい。タグをＮ末端領域に付加することもできる。別の実施形態では、Ｆｌａｇタグ、ＨｉｓタグまたはＭｙｃタグなどのような他のタグを使用してもよい。
代表的な実施形態では、組換えプラスミドは、３０℃でクロラムフェニコール選択を用いて受容細胞に形質転換された。受容細胞は、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などであってよい。次いで、ＤＮＡＫ株を大腸菌染色体と相同的に組み換えた。
【００２７】
ＤＮＡＫのホモログを含む他の細胞は、この代表的な実施形態に基づく認識可能なタグを含むホモログで遺伝的に修飾され得ることは、当業者に周知である。認識可能なタグをコードするヌクレオチド配列を有するプライマーを用いてＤＮＡＫホモログを増幅するために、プライマーを構築してよい。
コロニーをＬＢ寒天プレート上でクロラムフェニコールと共に４２℃で一晩増殖させ、コロニーをサイズに基づいて選択した。次いで、成功した相同組換えを示した選択されたコロニーを、３７℃で５％Ｗ／Ｖスクロースを含むＬＢ寒天上で増殖のために交差選択した。次いで、交差選択されたコロニーを、５％スクロースを含むＬＢ寒天上、ならびに５％スクロースおよび５％クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天上で、同時に「パッチテスト」した。クロラムフェニコール感受性コロニーをＰＣＲによりスクリーニングし、配列決定した。
修飾ＤＮＡＫまたは天然に生じるＤＮＡＫのホモログを、相同組換えされたタグ付きＤＮＡＫコード遺伝子を含む株から単離して、付加されたタグを使用してタンパク質配列を確認した。タグを標的とするクロマトグラフィーまたは同等の方法を使用して、得られたタンパク質を単離してよい。
【００２８】
本実施形態では、修飾株の細菌溶解物ＢＬ２１−ＤＮＡＫ−ｓｔｒｅｐをＳｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎ樹脂カラムに適用してよい。次いで、図２に示すように、溶出画分をＳＤＳ−タンパク質ゲル上で泳動してよい。Ｓｔｒｅｐタグが付加されたＤＮＡＫは、その推定分子量７２．４ｋＤａに相当する分子量で示されている。さらなる低分子量バンドもまた観察され、その後の分析は、タンパク質の同一性が、ＤＮＡＫの一般に関連したコシャペロンタンパク質であるＧｒｐＥであったことを明らかにした。以下のデータを参照されたい。（Sugimoto et al, Prot. Exp. And Pur., 60 31-36 (2008)）。
【００２９】
次いで、バンドをゲルから抽出し、配列決定のために調製してよい。Ｓｔｒｅｐタグが付加されたＤＮＡＫは、部分的に消化され、得られた断片をＭＡＬＤＩマスフィンガープリント分析の目的のために単離してよい。本発明では、修飾タンパク質に部分的なトリプシン消化を施した。次いで、消化された断片をＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭＡＬＤＩ  ｍｉｃｒｏＭＸ質量分析計に通した。図２は、図２の修飾ＤＮＡＫ分子のバンド１のゲルに対応する質量分析データを示す。次いで、図３に示すように、質量分析計データを、最も高いタンパク質スコアである４１２を有するＤＮＡＫ遺伝子産物（大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ｓｔｒ．ＥＤＬ９３３１）と一致させたＭＡＳＣＯＴアルゴリズムを使用して、データを分析した。
図４のＳＤＳ−ＰＡＧＥからのバンド２はまた、ＭＡＬＤＩ下でも分析され、ｇｒｐＥ遺伝子産物（大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ｓｔｒ．ＥＤＬ９３３）に対して１８５のＭＡＳＣＯＴタンパク質スコアを有した。修飾ＤＮＡＫがＧｒｐＥと結合して共に溶出されることが可能なように、ＧｒｐＥとＳｔｒｅｐタグが付加されたＤＮＡＫとの共溶出は、その構造的および機能的確認を保持していることを示す。
【００３０】
ＭＡＳＣＯＴ結果に基づいて、部分的なタンパク質配列を図５に示す。
内因性タンパク質の細菌株を研究することに関して、本発明は細菌の生存能力および増殖を犠牲にしない。代表的な修飾株では、次いで、得られた修飾株の増殖をモニターしてよい。代表的な実施形態では、修飾株ＢＬ２１−ＤＮＡＫ  Ｓｔｒｅｐ株および野生型ＢＬ２１（ＤＥ３）株をＬＢ培地に別々に播種し、中期対数増殖期と一致する６３０分（１０．５時間）にわたって増殖を観察した。中期対数増殖期は、組換えタンパク質を細菌中で発現させる場合の増殖期に最適である。図６および７を参照されたい。増殖曲線は、この期間にわたる細菌増殖に実質的な差はなかったことを示した。
【００３１】
図１に示すように、ＤＮＡＫの機能性が依然としてＧｒｐＥと機能的に相互作用可能であるとすれば、タンパク質レベルの発現はタグ付きＤＮＡＫの存在による影響を受けないままである。ＤＮＡＫ除去はまた、ＤＮＡＫを除去するために使用された以前の方法よりもはるかに優れている。代表的な実施形態では、３０ｋＤａおよび３６ｋＤａモノマータンパク質を最終的に発現する組換えタンパク質ベクターで形質転換させたＢＬ２１−ＤＮＡＫ株を、中期対数期まで増殖させた。図１Ａに示すように、細胞溶解物を単離し、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）に適用した。天然組換えタンパク質の流体力学的分子量範囲に対応する画分にて見出された組換えタンパク質を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でレーン１の最も早い回収画分で泳動した。ＤＮＡＫバンドは約７２ｋＤａで観察された。
レーン２〜８のＳＥＣ画分をプールし、重力流Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ樹脂カラムに適用した。図２Ｂは、２．５ｍＭのＤ−デスチオビオチン（Ｄ−Ｄｅｓｔｈｉｏｂｔｉｏｎ）によって溶出された入力試料（レーン１）および溶出画分（レーン２〜５）のレーンのアリコートを示す。タグ付きＤＮＡＫタンパク質は、３０ｋＤａまたは３６ｋＤａ組換えタンパク質の検出可能な存在なしに目に見えて残る唯一のタンパク質であった。
【００３２】
図１Ｃは、ＳＥＣに再適用された図１Ｂに使用されるＳｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎ樹脂カラムからのプールされたフロー画分を示す。汚染しているタグ付きＤＮＡＫは、組換えタンパク質の最小損失で有意に除去された。図１Ｄは、タグ付きＤＮＡＫと組み合わせた微量の結合タンパク質が依然として存在することを示す。
（ｉｉｉ）使用
本発明は、細菌の生存能力、最適なタンパク質産生レベル、ならびに発現された組換えタンパク質の適したフォールディングおよび形成に影響を与えることなく、別の標的化単離タンパク質のＤＮＡＫ汚染を減少させる問題に対する非常に重要な解決法を提供する。本発明はまた、商業応用または治療応用に使用される組換え試料に対して、高価な、または禁止されている試薬の使用を必要としない。
【００３３】
認識可能なタグは、細菌増殖と同様に、ＤＮＡＫの機能を著しく損なわないＤＮＡＫ配列の任意の領域に挿入してよい。しかしながら、ＤＮＡＫ機能を部分的に損なうタグは、ＤＮＡＫに対する弱い親和性を有する組換えタンパク質に使用してよい。タグは、タンパク質タグであってよく、限定されるものではないが、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、またはＦｌａｇタグであってよい。選択性および単離性を高めるために、複数のタグをＤＮＡＫに付加してよい。
タグはまた、認識可能なリボ核酸タグであってもよく、これによりＤＮＡＫの発現は、タグを認識して翻訳を阻害する因子によってＲＮＡレベルで停止され得る。そのようなタグは、細菌の様々な増殖期の間にＤＮＡＫ産生を阻害する別の手段を提供し得る。
本発明の代表的な実施形態の１つはＢＬ２１株を利用するが、任意の細菌株およびその染色体ＤＮＡＫ遺伝子は、本発明において提供されるように修飾されてよい。
本発明は、酵母などの真核細胞または哺乳動物細胞もしくは細胞株に存在するＤＮＡＫホモログまたは他のシャペロンタンパク質を置換するために使用してよい。そのような適用は、翻訳後修飾を必要とする組換えタンパク質発現の商業応用を改善し得る。
【００３４】
本発明では、タグ付きＤＮＡＫ細菌株は、標的組換えタンパク質のベクターで形質転換されてよい。形質転換された細菌培養物を最適な増殖レベルまでインキュベートした後、当業者公知の標準的な単離手段によって、細胞抽出物を収集してよい。次いで、細胞溶解物を、タグ付きＤＮＡＫタンパク質のタグを標的とする単離方法に適用してよい。そのような方法には、クロマトグラフィーまたはチューブもしくは同等の固体支持体に結合した樹脂などの固相支持体単離が含まれる。代替では、液相分離を用いてよい。液相分離の一例は、ＤＮＡＫに結合したタグによって結合され得るリガンドに結合した磁気ビーズを含んでよい。
【００３５】
別の方法では、標的組換えタンパク質を最初に単離した後、タグ付きＤＮＡＫを除去してよい。他の方法は、タグ付きＤＮＡＫ単離のその後のラウンドを含んでよい。
この細菌株の使用はまた、高価な精製手順のコストを節約する。組換えタンパク質発現および単離は、研究および商業産業において最も広く使用されている方法の１つである。ＡＴＰおよびグリセロールなどの試薬は排除することができる。さらに、内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ）ＤＮＡＫタグ株を有することにより、プラスミドを用いて細菌株をＤＮＡＫ欠失株に形質転換する必要性が減少し、これにより実験結果の一貫性が大きく向上し、コストおよび時間の削減をもたらす。
ＤＮＡＫタグプラスミドの必要性を排除することにより、細菌増殖の間に組換えタンパク質プラスミドまたはＤＮＡＫタグプラスミドが失われる機会も減少する。
ＤＮＡＫタグ細菌株を使用して、組換えタンパク質以外のＤＮＡＫまたはＤＮＡＫ結合タンパク質から生じる免疫応答の機会が排除または低減される治療的使用のための組換えタンパク質を産生してよい。さらに、本発明の株の使用は、単離された組換えタンパク質の医薬調製物中に存在する場合に、毒性効果を有し得る試薬の使用の必要性を減少させる。
【００３６】
ＤＮＡＫに結合することが公知の特定のタンパク質が、その特定のタンパク質が発現されＤＮＡＫタグ株から単離される際に単離され得る場合、タグ付きＤＮＡＫを使用してもよい。これは、診断および研究応用の両方に有用であり得る。
タグ付きＤＮＡＫアミノ酸配列はまた、プロテアーゼ感受性認識部位で修飾することができ、任意の微量のＤＮＡＫをさらに減少させるために、そのような認識部位をタグ付きＤＮＡＫと共に用いてよい。
本明細書は本発明の特定の実施形態を説明しているが、当業者は、本発明の概念を逸脱することなく本発明の変化形を考案することができる。
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本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕ａ）ＤＮＡＫタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチドおよび認識可能なタグをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝的に改変された遺伝子配列
を含む細菌であって、
ｂ）該遺伝子配列は天然に存在しない、細菌。
〔２〕認識可能なタグをコードする前記ヌクレオチド配列が、ＤＮＡＫのＮ末端またはＣ末端をコードするヌクレオチドの近くまたは内部の前記遺伝子配列上に位置する、前記〔１〕に記載の細菌。
〔３〕認識可能なタグがタンパク質タグであってよい、前記〔１〕に記載の細菌。
〔４〕ＤＮＡＫのヌクレオチド配列と認識可能なタグをコードするヌクレオチド配列との間にリンカー配列が挿入される、前記〔１〕に記載の細菌。
〔５〕ＤＮＡＫの天然に生じる遺伝子配列が欠失した、前記〔１〕に記載の細菌。
〔６〕ＤＮＡＫの天然に生じる遺伝子配列が修飾されており、該修飾が、ＤＮＡＫの天然に生じる遺伝子配列の発現を実質的に停止させた、前記〔１〕に記載の細菌。
〔７〕前記遺伝子配列が、細菌の染色体ＤＮＡと、認識可能なタグおよびＤＮＡＫの遺伝子配列の少なくともいくつかの部分をコードするヌクレオチド配列を含む核酸との相同組換えによって作製された、前記〔１〕に記載の細菌。
〔８〕前記〔７〕に記載の相同組換えであって、組換えの特異的部位が、ＤＮＡＫの天然に生じる遺伝子配列の少なくとも一部の置換を可能にし、認識可能なタグを導入するものである、相同組換え。
〔９〕前記〔７〕に記載の核酸であって、プラスミドＤＮＡの一部である、核酸。
〔１０〕ａ）ＤＮＡＫまたはＤＮＡＫホモログおよび認識可能なタグを含む内因性タンパク質を発現するように染色体が遺伝的に修飾されている細胞に、タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトすること、
ｂ）核酸によりコードされるタンパク質を発現させること、
ｃ）細胞溶解物を抽出すること、および
ｄ）認識可能なタグに結合する方法により内因性タンパク質を除去することによって細胞溶解物を精製すること
を含む、タンパク質の単離方法。
〔１１〕前記細胞が細菌細胞である、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記認識可能なタグがタンパク質タグである、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１３〕精製工程が固相支持体または液相支持体単離手順を利用する、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１４〕精製工程が少なくとも１回繰り返され得る、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１５〕細胞溶解物中の他の汚染物質を標的とする他の精製工程が用いられる、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１６〕内因性タンパク質の精製工程が、内因性タンパク質と関連し得る別のタンパク質も単離する、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１７〕ａ）ＤＮＡＫまたはＤＮＡＫホモログおよびタンパク質タグを含む内因性タンパク質を発現するように染色体が遺伝的に修飾されている細菌細胞に、タンパク質をコードする核酸を形質転換すること、
ｂ）核酸によりコードされるタンパク質を発現させること、
ｃ）細胞溶解物を抽出すること、および
ｄ）タンパク質タグに結合する方法により内因性タンパク質を除去することによって細胞溶解物を精製すること
を含む、タンパク質の単離方法。
〔１８〕タンパク質タグが、Ｎ末端またはＣ末端の近くに位置する、前記〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕精製工程が固相支持体または液相支持体単離手順を利用する、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２０〕内因性タンパク質の精製工程が、当該内因性タンパク質と関連し得る別のタンパク質も単離する、前記〔１７〕に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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