(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）から（ｅ）を含む、以下の（１）及び（２）の特徴を有する多孔性架橋セルロースゲルの製造方法：
（ａ）セルロースをアルカリ水溶液に溶解することにより、セルロース溶液を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたセルロース溶液と、有機溶媒及び乳化剤を混合することにより、セルロース分散液を得る工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られたセルロース分散液を０℃以上１５℃以下にし、ゲル化剤を添加することにより、多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルを、少なくとも２つ以上のグリシジル基を有するグリシジルエーテル類と反応させることにより、多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲルを、セルロースの水酸基と反応し得る官能基を２つ以上有する架橋剤と反応させることにより、多孔性架橋セルロースゲルを得る工程、
（１）以下の操作（i）から（v）により測定される空孔率が９０％以上であること、
（i）前記多孔性架橋セルロースゲルをクロマトグラフィー用カラムに充填する、
（ii）水を溶出液として、前記カラムからの分子量２００万のブルーデキストランと塩化ナトリウムの溶出容積を測定する、
（iii）前記カラムのカラム容積から、操作（ii）で測定した分子量２００万のブルーデキストランの溶出容積を引くことにより、ゲル容積を算出する、
（iv）操作（ii）で測定した塩化ナトリウムの溶出容積から、操作（ii）で測定した分子量２００万のブルーデキストランの溶出容積を引くことにより、細孔容積を算出する、
（v）操作（iv）で算出した細孔容積を操作（iii）で算出したゲル容積で除することにより、空孔率を算出する、
（２）平均粒子径が３０μｍ以上１５０μｍ以下であり、内径６．６ｍｍのクロマトグラフィー用カラムに高さ２２０ｍｍ±５ｍｍとなるように充填し、２５℃の水をカラム内に線速度１５００ｃｍ／時で通液した条件でのカラム圧力損失が０．４ＭＰａ以下であること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフィー用充填剤、特に抗体医薬品等のバイオ医薬品精製用吸着剤として有用な多孔性架橋セルロースゲル、及びその製造方法に関する。より詳しくは、高い空孔率と機械的強度を併せ持つ多孔性架橋セルロースゲル、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質やワクチンなどのバイオ医薬品の開発が活発になっており、特に抗体を原料とした抗体医薬品の市場は急激に成長している。一般的に、バイオ医薬品製造の精製工程では多孔性担体を充填剤として用いたカラムクロマトグラフィーが使用されており、例えばイオン交換基を導入した充填剤や、精製対象物質に対するアフィニティーリガンドを導入した充填剤が使用されている。特に抗体医薬品精製においては、抗体を効率よく精製できることから、抗体に対するアフィニティーリガンドを導入した充填剤を用いたアフィニティークロマトグラフィーが多用されている。【０００３】
最近のバイオ医薬品市場の急激な成長に伴い、生産性の向上を目的として精製対象物質の吸着容量が高く且つ高流速処理が可能な機械的強度に優れたクロマトグラフィー用充填剤が求められている。充填剤の高吸着容量化は、充填剤として使用する多孔性担体の粒子径を小さくする方法や、多孔性担体の空孔率を高くする方法により達成される。しかしながら、多孔性担体の粒子径を小さくするとカラム圧力損失が大きくなるため流速を上げることが困難となり、また、多孔性担体の空孔率を高くすると担体の機械的強度が低くなるため、高流速処理が困難となる場合がある。【０００４】
従来の多孔性担体としては、例えば特許文献１が開示するようなシリカゲル系担体、例えば特許文献２が開示するような合成高分子系担体が知られている。さらに、天然高分子である多糖類を原料とした多糖系担体として、例えば特許文献３が示すような多孔性架橋アガロースゲル、例えば特許文献４が示すような多孔性セルロースゲル、例えば特許文献５が示すようなアガロース、プルラン、デキストランなどの多糖類とセルロースを原料とした多糖複合粒子が知られている。また、架橋処理により機械的強度を高めた多孔性架橋セルロースゲルとして、例えば特許文献６では多孔性未架橋セルロースゲルをグリシジルエーテル類で架橋した多孔性架橋セルロースゲルを得る方法が開示されている。また、特許文献７では、特許文献４に記載の方法で製造した未架橋多孔性セルロースゲルをエピクロロヒドリンで架橋した多孔性架橋セルロースゲルを得る方法が開示されている。【０００５】
しかしながら、シリカゲル系担体は機械的強度及び空孔率は高いが、精製対象物質の吸着容量が低い傾向にあり、さらにアルカリ耐性が弱いため、アルカリ性条件下での使用や洗浄処理が困難である。合成高分子系担体は、アルカリ耐性及び機械的強度は良好であるが、空孔率や精製対象物質の吸着容量が低い傾向にあり、また、疎水性が強いために精製対象物質以外の物質が非特異的に吸着する傾向が強く、不純物が混入する可能性がある。多糖系担体は、アルカリ耐性、空孔率、精製対象物質の吸着容量は良好であるが、高流速処理が可能なクロマトグラフィー用充填剤として使用するには機械的強度が不十分である。また、特許文献４及び特許文献６に記載の多孔性セルロースゲルの製造方法では、１００℃以上の高温を必要とする工程が含まれることから工業的規模で製造する場合には大型の設備や多大なエネルギーが必要となり、さらに、特許文献５に記載の多糖複合粒子の製造方法では多糖類の溶剤として高価なイオン液体を使用しており、従って、これらの方法は高価な製造方法となる点が課題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平６−２８１６３８号公報
【特許文献２】特開２００９−２４４０６７号公報
【特許文献３】特表２０００−５０８３６１号公報
【特許文献４】特開平１０−１９５１０３号公報
【特許文献５】特開２０１２−１２６７９７号公報
【特許文献６】特開２０１１−２５２９２９号公報
【特許文献７】特開２００９−２４２７７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、高い空孔率と機械的強度を併せ持ち、アフィニティーリガンドを導入した場合の精製対象物質の吸着容量が高いなど、前述した従来の多孔性担体の課題を解決した多孔性架橋セルロースゲルの製造方法及び当該多孔性架橋セルロースゲルを提供することにある。より具体的には、当該多孔性架橋セルロースゲルを用いたクロマトグラフィー用充填剤及び抗体精製用吸着剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、セルロース溶液と有機溶媒を混合して得られた０℃以上１５℃以下のセルロース分散液にゲル化剤を添加することにより多孔性未架橋セルロースゲルを得たのち、多孔性未架橋セルロースゲルをセルロースの水酸基と反応し得る官能基間の原子数が異なる２種類の多官能性架橋剤を使用した架橋処理を行うことにより、高い空孔率と機械的強度を併せ持つ多孔性架橋セルロースゲルが得られることを見いだした。さらに本発明の多孔性架橋セルロースゲルに、抗体に対するアフィニティーリガンドを固定化した抗体精製用吸着剤が高い抗体吸着量を有し、抗体精製用吸着剤として優れた性能を持つことを見いだし、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち本発明は、以下の（１）から（６）に記載した発明を提供するものである。【００１０】
（１）以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特徴を有する多孔性架橋セルロースゲル。【００１１】
（Ａ）以下の操作（ａ）から（ｅ）により測定される空孔率が９０％以上であること。【００１２】
（ａ）前記多孔性架橋セルロースゲルをクロマトグラフィー用カラムに充填する。【００１３】
（ｂ）水を溶出液として、前記カラムからの分子量２００万のブルーデキストランと塩化ナトリウムの溶出容積を測定する。【００１４】
（ｃ）前記カラムのカラム容積から操作（ｂ）で測定した分子量２００万のブルーデキストランの溶出容積を引くことにより、ゲル容積を算出する。【００１５】
（ｄ）操作（ｂ）で測定した塩化ナトリウムの溶出容積から、操作（ｂ）で測定した分子量２００万のブルーデキストランの溶出容積を引くことにより、細孔容積を算出する。【００１６】
（ｅ）操作（ｄ）で算出した細孔容積を操作（ｃ）で算出したゲル容積で除することにより、空孔率を算出する。【００１７】
（Ｂ）平均粒子径が３０μｍ以上１５０μｍ以下であり、内径６．６ｍｍのクロマトグラフィー用カラムに高さ２２０ｍｍ±５ｍｍとなるように充填し、２５℃の水をカラム内に線速度１５００ｃｍ／時で通液した条件でのカラム圧力損失が０．４ＭＰａ以下であること。【００１８】
（２）以下の工程（ａ）から（ｅ）を含む、（１）記載の多孔性架橋セルロースゲルの製造方法：
（ａ）セルロースをアルカリ水溶液に溶解することにより、セルロース溶液を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたセルロース溶液と、有機溶媒及び乳化剤を混合することにより、セルロース分散液を得る工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られたセルロース分散液を０℃以上１５℃以下にし、ゲル化剤を添加することにより、多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルを、少なくとも２つ以上のグリシジル基を有するグリシジルエーテル類と反応させることにより、多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲルを、セルロースの水酸基と反応し得る官能基を２つ以上有する架橋剤と反応させることにより、多孔性架橋セルロースゲルを得る工程。【００１９】
（３）上記（１）に記載の多孔性架橋セルロースゲルを含む、クロマトグラフィー用充填剤。【００２０】
（４）上記（３）に記載のクロマトグラフィー用充填剤を用いる、タンパク質の精製方法。【００２１】
（５）上記（１）に記載の多孔性架橋セルロースゲルに、アフィニティーリガンドを固定化してなる、抗体精製用吸着剤。【００２２】
（６）上記（５）に記載のアフィニティーリガンドが、プロテインＡ又はＦｃ結合性タンパク質である、抗体精製用吸着剤。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の製造方法により得られる多孔性架橋セルロースゲルは、高い空孔率と高い機械的強度を併せ持ち、クロマトグラフィー用充填剤として好適な細孔特性及び粒子径を有していることから、特にバイオ医薬品の精製工程で使用されるクロマトグラフィー用充填剤として好適である。また、本発明の多孔性架橋セルロースゲルの製造方法は、従来の多孔性セルロースゲルの製造方法に比べて、大型設備、多大なエネルギー及び高価な原料を必要としない製造方法である。さらに、本発明の製造方法により得られる多孔性架橋セルロースゲルに、抗体に対するアフィニティーリガンドを固定化することにより得られる抗体精製用吸着剤は、抗体に対する吸着容量が高く、さらにカラム圧力損失が低く高流速処理が可能であることから、抗体医薬品の精製工程における生産性を著しく向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１、２、３で製造した多孔性架橋セルロースゲル１、３、５と、比較例４で評価した市販多孔性架橋セルロースゲル（セルファインＧＣＬ−２０００）の、流速とカラム圧力損失を示したグラフである。
【図２】実施例７で製造した多孔性架橋セルロースゲル１０と比較例６及び７で製造した多孔性架橋セルロースゲル１２及び１３の流速とカラム圧力損失の関係を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
【００２６】
本発明の多孔性架橋セルロースゲルは、（Ａ）空孔率が９０％以上であること、（Ｂ）平均粒子径が３０μｍ以上１５０μｍ以下であり、内径６．６ｍｍのクロマトグラフィー用カラムに高さ２２０ｍｍ±５ｍｍとなるように充填し、２５℃の水をカラム内に線速度１５００ｃｍ／時で通液した条件でのカラム圧力損失が０．４ＭＰａ以下であること、の２つの特徴を併せ持つことを特徴とする。
【００２７】
本発明の多孔性架橋セルロースゲルの（Ａ）空孔率が９０％以上であるとの特徴は、以下の（ａ）から（ｅ）に記載の操作により測定されるものである。なお、当該測定方法は液体クロマトグラフィーの分野では多孔性担体の空孔率測定法として一般的な方法である。
【００２８】
（ａ）本発明の多孔性架橋セルロースゲルをクロマトグラフィー用カラムに充填する。
【００２９】
（ｂ）水を溶出液として、前記カラムからの分子量２００万のブルーデキストランと塩化ナトリウムの溶出容積を測定する。
【００３０】
（ｃ）前記カラムのカラム容積から操作（ｂ）で測定した分子量２００万のブルーデキストランの溶出容積を引くことにより、ゲル容積を算出する。
【００３１】
（ｄ）操作（ｂ）で測定した塩化ナトリウムの溶出容積から、操作（ｂ）で測定した分子量２００万のブルーデキストランの溶出容積を引くことにより、細孔容積を算出する。
【００３２】
（ｅ）操作（ｄ）で算出した細孔容積を操作（ｃ）で算出したゲル容積で除することにより、空孔率を算出する。
【００３３】
すなわち、塩化ナトリウムの溶出容積（Ｖｎ）、分子量２００万のブルーデキストランの溶出容積（Ｖｏ）及びカラム容積（Ｖｃ）を用い、以下に示した計算式から空孔率を算出することができる
空孔率（％）＝（（Ｖｎ−Ｖｏ）／（Ｖｃ−Ｖｏ））ｘ１００。
【００３４】
多孔性担体である本発明の多孔性架橋セルロースゲルをクロマトグラフィー用充填剤あるいは抗体精製用吸着剤として使用する場合、精製対象物質の高吸着容量化は、空孔率を高くする方法や粒子径を小さくする方法により達成されるが、空孔率を高くしすぎた場合には機械的強度が低下し、流速をカラム断面積で除した値である線速度が増加するに従って圧密化が生じてカラム圧力損失が増加するため、高流速処理が困難となる。また、カラム圧力損失は粒子径の二乗に反比例して増加することから、粒子径を小さくしすぎた場合、同様にカラム圧力損失が増加して高流速処理が困難となる。
【００３５】
一方、多孔性担体の高強度化は、担体を構成する固体成分濃度を高くすることや、架橋剤の使用量を増加させることで達成されるが、固体成分濃度を高くしすぎた場合及び架橋剤の使用量を多くしすぎた場合には多孔性担体の空孔率が低下するため、精製対象物質に対する吸着容量が低下する。
【００３６】
このように高吸着容量化と高強度化の双方を達成するためには、適切な空孔率、機械的強度及び粒子径を持つ多孔性担体が必要であるが、後述する本発明の製造方法により、高い吸着容量と高い機械的強度を併せ持つ多孔性架橋セルロースゲルを製造することができる。
【００３７】
本発明の多孔性架橋セルロースゲルの空孔率は、精製対象物質に対する高い吸着容量と高流速処理が可能な高い機械的強度の双方を達成させる点で、９０％以上である必要があり、９０％以上９５％以下であることが好ましい。また、本発明の多孔性架橋セルロースゲルの機械的強度は、同様の理由により、前述の条件により測定されるカラム圧力損失が０．４ＭＰａ以下である必要があり、０．３ＭＰａ以下であることが好ましい。さらに、本発明の多孔性架橋セルロースゲルの平均粒子径は、同様の理由により、３０μｍ以上１５０μｍ以下である必要があり、精製対象物質に対する吸着容量をさらに高められる点で、４０μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましい。加えて、本発明の多孔性架橋セルロースゲルの、デキストランやプルランなどの多糖類の排除限界分子量は、精製対象物質に対する高い吸着容量を達成させる点で、５００，０００から５，０００，０００であることが好ましく、１，０００，０００から３，０００，０００であることがより好ましい。多糖類の排除限界分子量の測定方法は、クロマトグラフィー用充填剤の分野において、一般的な多糖類の排除限界分子量の測定方法であれば特に制限はなく、具体的には、生物化学実験法１１「ゲル濾過法」第２版（学会出版センター）や、特開２０１２−１４１２１２に記載の方法を例示することができる。
【００３８】
本発明の多孔性架橋セルロースゲルの平均粒子径は、光学顕微鏡を用いて１０から２００μｍの目盛り付きスライドグラスの画像を撮影したのち、同じ倍率で測定対象の複数個の粒子の画像を撮影し、物差しを用いて撮影した複数個（例えば、１００個以上）の粒子の長径を測定し、その平均値を算出することで求めることができる。
【００３９】
また、多孔性架橋セルロースゲルの粒子径はステンレス製ＪＩＳ標準ふるいなどを使用した湿式分級法により所望の範囲に調整することが可能であり、例えば、目開き４５μｍのふるいと目開き９０μｍのふるいを使用した湿式分級により、４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲルを得ることができる。
【００４０】
後述の実施例１から３と、比較例４との比較から示されるように、本発明の多孔性架橋セルロースゲルが示すカラム圧力損失は、本発明の多孔性架橋セルロースゲルと同程度の空孔率を持ち、粒子径の大きいセルファインＧＣＬ−２０００（ＪＮＣ製、多孔性架橋セルロースゲル）を同一条件で測定した場合のカラム圧力損失よりも低く、さらに、バイオ医薬品の精製工程で一般的に使用される長さを持つクロマトグラフィー用カラムで測定されたものであることから、高流速処理が可能なクロマトグラフィー用充填剤として有用性が高いものである。なお、本発明の多孔性架橋セルロースゲルの具体的なカラムへの充填方法、多糖類の排除限界分子量の測定方法、空孔率及びカラム圧力損失の測定方法は、実施例に示したとおりである。
【００４１】
本発明における多孔性架橋セルロースゲルの製造方法は、
（ａ）セルロースをアルカリ水溶液に溶解することにより、セルロース溶液を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたセルロース溶液と、有機溶媒及び有機溶媒に可溶な乳化剤を含む溶液を混合することにより、セルロース分散液を得る工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られたセルロース分散液を０℃以上１５℃以下にし、ゲル化剤を添加することにより、多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルを、少なくとも２つ以上のグリシジル基を有するグリシジルエーテル類と反応させることにより、多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲルを、セルロースの水酸基と反応し得る官能基を２つ以上有する架橋剤と反応させることにより、多孔性架橋セルロースゲルを得る工程、
を含むことを特徴とする。
【００４２】
以下に工程（ａ）から工程（ｅ）の各工程の詳細を説明する。
【００４３】
（ａ）セルロースをアルカリ水溶液に溶解することにより、セルロース溶液を得る工程
工程（ａ）で使用することができるセルロースは、セルロース溶液を得ることができれば特に制限はないが、容易に入手可能な点で木材パルプなどの植物由来セルロース、酢酸菌などの微生物が産生する微生物由来セルロースが好ましく、安価に入手可能な点で植物由来セルロースがより好ましい。また、植物由来セルロースは木材パルプ由来セルロース、木綿由来セルロース、麻由来セルロースなど、異なる植物種由来のセルロースを単独あるいは混合して使用することもできる。
【００４４】
後述の実施例７と実施例８において、原料として使用するセルロースの由来以外は同一条件で製造した多孔性架橋セルロースゲルの空孔率と機械的強度を比較すると、木綿由来セルロースを原料として使用することにより、高い空孔率と機械的強度を達成できることから、由来の異なるセルロースを単独で使用する場合には、木綿由来セルロースを使用することが好ましい。
【００４５】
工程（ａ）で使用するセルロースの平均重合度は、セルロース溶液を得ることができれば特に制限はないが、平均重合度の低いセルロースを使用すると得られる多孔性セルロースゲルの機械的強度が低下する場合がある。一方、平均重合度の高いセルロースを使用すると、セルロースの溶解性が低下するため、セルロースを完全に溶解することが困難となる場合がある。従って、工程（ａ）で使用するセルロースの平均重合度は１００以上１０００以下であることが好ましく、より好ましくは１００以上５００以下である。セルロースの平均重合度は、例えば、「日本電機工業会企画ＪＥＭ１４５５：変圧器用絶縁紙の平均重合度測定方法」に記載の方法、すなわち、セルロースを銅・エチレンジアミン溶液に溶解したのち、オストワルド粘度測定計を使用した粘度測定方法により、求めることができる。平均重合度が１００以上５００以下のセルロースは市販品を使用してもよく、例えば木材パルプ由来セルロースとしては旭化成製セオラスシリーズ、木綿由来セルロースとしてはＡＤＶＡＮＴＥＣ製濾紙粉末シリーズを使用することができる。これらの中ではセルロース溶液調製の容易さや重合度の点で、旭化成製セオラスシリーズではＰＨ−１０１、ＡＤＶＡＮＴＥＣ製濾紙粉末シリーズでは濾紙粉末Ｃ（３００メッシュ以上）が好ましい。
【００４６】
工程（ａ）で得られるセルロース溶液中のセルロース濃度は、セルロース濃度を低くすると得られる多孔性セルロースゲルの空孔率は高くなるが機械的強度が低下する場合があり、一方、セルロース濃度を高くすると多孔性セルロースゲルの空孔率が低下する場合がある。従って、セルロース濃度は２重量％以上１０重量％以下であることが好ましく、より好ましくは４重量％以上８重量％以下である。
【００４７】
工程（ａ）で使用することができるアルカリ水溶液は、セルロース溶液が得られれば特に制限はないが、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウムと尿素及び／又はチオ尿素の混合水溶液が好ましい。アルカリ水溶液が水酸化ナトリウム水溶液の場合、セルロース溶液を得るためには、例えば２０℃から３０℃でセルロースを水酸化ナトリウム水溶液に添加して得られた懸濁液を凍結させたのち、２０℃から３０℃で懸濁液を溶解する操作を繰り返すなど、セルロース溶液を凍結させる操作が入る方法が一般的である。一方、水酸化ナトリウムと尿素及び／又はチオ尿素の混合水溶液の場合、後述する濃度範囲の水酸化ナトリウムと尿素及び／又はチオ尿素の混合水溶液を使用することにより、凍結させることなく、２０℃から３０℃、または必要に応じて０℃から２０℃の間に冷却して攪拌することにより、セルロース溶液を得ることができる。従って、セルロースの溶解操作が容易である点で、水酸化ナトリウムと尿素及び／又はチオ尿素の混合水溶液がより好ましい。また、後述の多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程（工程（ｃ））において、工程（ｄ）で使用しない粒子径の大きい多孔性未架橋セルロースゲルの生成を抑制できる点で、アルカリ水溶液は水酸化ナトリウムと尿素及びチオ尿素の混合水溶液、あるいは水酸化ナトリウムとチオ尿素の混合水溶液がさらに好ましい。
【００４８】
工程（ａ）で使用するアルカリ水溶液が水酸化ナトリウムと尿素の混合水溶液の場合、混合水溶液中の水酸化ナトリウム及び尿素濃度が低いとセルロースの溶解が困難である一方、水酸化ナトリウム及び尿素濃度が高いとセルロースの分解や変性が起こる可能性がある。従って、アルカリ水溶液中の水酸化ナトリウム濃度は５重量％以上１２重量％以下、尿素濃度は４重量％以上３０重量％以下が好ましく、より好ましくは、水酸化ナトリウム濃度は７重量％以上１０重量％以下、尿素濃度は６重量％以上２８重量％以下である。また、水酸化ナトリウムと尿素の重量比はセルロース溶液が得られれば特に制限はないが、０℃から２５℃の間で攪拌することによりセルロース溶液を得るためには水酸化ナトリウム濃度に対して適切な尿素濃度にする必要があり、例えば、水酸化ナトリウム濃度が７重量％の場合には尿素濃度を１５重量％以上２８重量％以下、水酸化ナトリウム濃度が８重量％の場合には尿素濃度を１０重量％以上２８重量％以下、水酸化ナトリウム濃度が９〜１０重量％の場合には尿素濃度を６重量％以上２８重量％以下にすることでセルロース溶液を得ることができる。
【００４９】
工程（ａ）で使用するアルカリ水溶液が水酸化ナトリウムとチオ尿素の混合水溶液の場合、前述の理由により、水酸化ナトリウム濃度は６重量％以上１２重量％以下、チオ尿素濃度は３重量％以上８重量％以下が好ましく、より好ましくは、水酸化ナトリウム濃度は８重量％以上１０重量％以下、チオ尿素濃度は４重量％以上７重量％以下である。また、水酸化ナトリウムとチオ尿素の混合水溶液の場合、チオ尿素の水への溶解度が低いため、水酸化ナトリウムと尿素の混合水溶液の場合に比べて水酸化ナトリウム濃度を高くする方が好ましい。
【００５０】
工程（ａ）で使用するアルカリ水溶液が水酸化ナトリウムと尿素とチオ尿素の混合水溶液の場合、前述の理由により、水酸化ナトリウム濃度は６重量％以上１２重量％以下、尿素濃度は２重量％以上２０重量％以下、チオ尿素濃度は１重量％以上６重量％以下が好ましく、より好ましくは、水酸化ナトリウム濃度は８重量％以上１０重量％以下、尿素濃度は３重量％以上１５重量％以下、チオ尿素濃度は２重量％以上５重量％以下である。また、水酸化ナトリウムと尿素とチオ尿素の重量比はセルロース溶液が得られれば特に制限はないが、尿素濃度を高くするとチオ尿素が溶解しない場合があることから、適切な尿素濃度及びチオ尿素濃度に調整する必要があり、例えば、水酸化ナトリウム濃度が９〜１０重量％の場合、尿素濃度を３重量％以上１０重量％以下、チオ尿素濃度を２重量％以上４重量％以下にすることでセルロース溶液を得ることができる。
【００５１】
アルカリ水溶液にセルロースを溶解する方法は、前述の水酸化ナトリウムと尿素及び／又はチオ尿素の混合水溶液にセルロースを添加したのち、２０℃から３０℃、または必要に応じて０℃から２０℃の間に冷却して攪拌する方法が好ましい。一般的に、セルロースはアルカリ水溶液の凝固点以上２０℃以下の温度で溶解しやすいことが知られているが、冷却したアルカリ水溶液にセルロースを添加する場合、添加方法が適切でないと溶解に時間がかかる場合がある。従って、アルカリ水溶液にセルロースを溶解する方法は、２０℃から３０℃のアルカリ水溶液にセルロースを添加してセルロースを分散させたのち、０℃から２０℃の間に冷却して攪拌する方法がより好ましい。なお、セルロースの溶解は、目視によりセルロースを添加したアルカリ水溶液の状態が懸濁状態から透明になったことを確認することによりできる。
【００５２】
本発明の方法によれば、特表２００８−５４２５６０号公報に開示されている、−１５℃から−８℃に予冷した水酸化ナトリウムと尿素の混合水溶液に０℃から２０℃でセルロースを添加して溶解させる方法と比べ、０℃以下に冷却することなくセルロース溶液を得ることができる。また、特開２０１１−２３１１５２号公報に開示されている、水酸化ナトリウムと尿素及び／又はチオ尿素の混合水溶液に１０℃から１５℃で木材パルプ由来セルロースを溶解する方法と比べ、木材パルプ由来セルロース以外の木綿由来セルロースや微生物由来セルロースからもセルロース溶液を得ることができる。
【００５３】
（ｂ）工程（ａ）で得られたセルロース溶液と、有機溶媒及び乳化剤を混合することにより、セルロース分散液を得る工程
工程（ｂ）で使用することができる有機溶媒は、セルロース分散液の安定性の点で２０℃における比重が０．６から１．５の有機溶媒が好ましい。具体的には、ペンタン、ヘキサン、オクタンなどの炭素数が５から８の脂肪族炭化水素類、トルエン、キシレン、エチルベンゼンなどの炭素数６から１０の芳香族炭化水素類、モノクロロベンゼン、ｏ−ジクロロベンゼンなどのハロゲン化芳香族炭化水素類、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、アニソールなどのエーテル類、酢酸ベンジル、酢酸シクロヘキシルなどのエステル類を例示することができる。これらの中ではトルエン、キシレン、エチルベンゼンなどの芳香族炭化水素類やアニソールなどの芳香族炭化水素を含むエーテル類が好ましく、トルエン、キシレン、エチルベンゼンなどの芳香族炭化水素類がより好ましい。また、有機溶媒の使用量に特に制限はないが、生産性を高める点で、セルロース溶液に対して１から５倍容積使用することが好ましく、１から３倍容積使用することがより好ましい。
【００５４】
工程（ｂ）で使用することができる乳化剤は、前述の有機溶媒に溶解する乳化剤であれば特に制限はないが、セルロース溶液の乳化作用が高い点でメチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロースなどのセルロース誘導体類、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエートなどのソルビタン脂肪酸エステル類が好ましく、これらの中ではセルロース誘導体類がより好ましい。また、有機溶媒への乳化剤の添加量は、セルロース溶液の乳化作用の点で、有機溶媒に対して乳化剤を０．１から３重量％添加することが好ましく、より好ましくは０．５から２重量％である。
【００５５】
工程（ａ）で得られたセルロース溶液と、前述の有機溶媒及び乳化剤を含む溶液を混合する方法はセルロース分散液が得られれば特に制限はないが、セルロース溶液の乳化状態の制御が容易である点で攪拌翼を用いた撹拌による方法が好ましい。混合する温度は前述の有機溶媒の沸点以下であれば特に制限はないが、混合操作が容易である点で０℃以上５０℃以下であることが好ましく、０℃以上３５℃以下であることがより好ましい。具体的には、０℃以上３５℃以下の有機溶媒及び有機溶媒に可溶な乳化剤を含む溶液を攪拌した条件のもと、０℃以上３５℃以下のセルロース溶液を添加することでセルロース分散液を得ることができる。また、撹拌速度は、工程（ｃ）で得られる多孔性未架橋セルロースゲルが所望の粒子径となるよう、使用する容器、撹拌翼の大きさや形状及び乳化剤濃度によって適切な撹拌速度に調節すればよい。
【００５６】
（ｃ）工程（ｂ）で得られた０℃以上１５℃以下のセルロース分散液に、ゲル化剤を添加することにより、多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程
セルロース分散液にゲル化剤を添加して多孔性未架橋セルロースゲルを得る方法は多くの方法が公知であり、これらの方法に従えば、分散液の温度に関係なく、セルロース分散液にゲル化剤を添加することでセルロースゲルを得ることは可能である。
【００５７】
一方、工程（ａ）で得られたセルロース溶液の温度による透明度の変化を観察すると、０℃以上１５℃以下では透明であったセルロース溶液が、１５℃以上に加温すると温度上昇とともにセルロースの溶解性が低下してセルロース溶液の透明度が低下する現象が確認される場合がある。後述の実施例１から３と、比較例１から３との比較から示されるように、セルロース溶液の透明度が低下する１５℃以上のセルロース分散液にゲル化剤を添加する場合に比べて、セルロース溶液が透明な状態である０℃以上１５℃以下のセルロース分散液にゲル化剤を添加することにより、空孔率の高い多孔性セルロースゲル及び抗体吸着量の高い抗体精製用吸着剤を得ることができる。従って、工程（ｂ）で得られたセルロース分散液は、ゲル化剤を添加する前に０℃以上１５℃以下の状態にしておく必要があり、０℃以上１０℃以下の状態にしておくことが好ましい。
【００５８】
セルロース分散液の撹拌は、分散液の温度が０℃以上１０℃以下の状態になったことを確認したのち、１５分から３時間撹拌を継続することが好ましく、３０分から２時間継続することがより好ましい。また、撹拌速度は前述の工程（ｂ）の攪拌速度を維持することが好ましいが、分散液の状態により適宜調節してもよい。
【００５９】
工程（ｃ）で使用することができるゲル化剤はセルロース溶液をゲル化させることができれば特に制限はなく、具体的にはメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノールなどの炭素数が１から４のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、塩酸、希硫酸などの酸性水溶液、硫酸ナトリウム水溶液、硫酸マグネシウム水溶液などの無機塩水溶液を例示することができる。これらゲル化剤はセルロース分散液に直接添加してもよいが、酸性水溶液及び無機塩水溶液などの有機溶媒に不溶なゲル化剤は、前述の有機溶媒に可溶な乳化剤を含む有機溶媒で乳化することにより得られるＷ／Ｏ型エマルションとして添加してもよい。これらのゲル化剤の中では、有機溶媒に可溶である点でアルコール類やケトン類が好ましく、アルコール類がより好ましく、メタノールがさらに好ましい。また、ゲル化剤の添加量は、ゲル化を確実に行う点でセルロース分散液に対して０．２から１倍容積使用することが好ましく、０．２から０．５倍容積使用することがより好ましい。
【００６０】
ゲル化剤の添加方法は、セルロース分散液にゲル化剤全量を一度に添加すると粒子状のセルロースゲル同士が結合した塊状セルロースゲルが得られる場合があることから、滴下漏斗や送液ポンプを用いてセルロース分散液にゲル化剤を徐々に添加する方法が好ましく、送液ポンプを用いて一定速度でゲル化剤を添加する方法がより好ましい。ゲル化剤の添加速度は、得られるセルロースゲルの収率を高める点で、セルロース分散液の容積に対して毎分０．００１から０．０５倍容積のゲル化剤を添加することが好ましく、毎分０．００５から０．０３倍容積のゲル化剤を添加することがより好ましい。また、添加するゲル化剤の温度は、セルロース分散液の温度上昇を抑制する点で、あらかじめ０℃以上１５℃以下の状態にしておくことが好ましく、０℃以上１０℃以下の状態にしておくことがより好ましい。セルロース分散液にゲル化剤を添加終了後、好ましくは５分から１時間、より好ましくは１０分から３０分間、撹拌を継続することにより、セルロースゲルを含むセルロースゲル懸濁液を得ることができる。
【００６１】
得られたセルロースゲル懸濁液は、洗浄用溶媒を用いて有機溶媒及び乳化剤を除いたのち、水を用いて水酸化ナトリウムと尿素及び／又はチオ尿素などのアルカリ成分を除くことにより多孔性未架橋セルロースゲルを得ることができる。具体的には、セルロースゲル懸濁液に洗浄用溶媒を添加し、ろ過あるいはデカンテーションなどの方法を繰り返してセルロースゲルを洗浄用溶媒で洗浄したのち、同様に水を用いて洗浄液のｐＨが中性になるまでセルロースゲルを洗浄することにより、多孔性未架橋セルロースゲルを得ることができる。
【００６２】
工程（ｃ）で使用することができる洗浄用溶媒は、工程（ｂ）で用いた有機溶媒及び乳化剤を溶解可能であり且つ水溶性であることが好ましく、具体的には、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、エチレングリコール、グリセロールなどのアルコール類を例示することができる。これらのアルコール類は単独で使用することもできるが、数種のアルコール類の混合物や、アルコール類と水との混合物を使用することもできる。また、洗浄用溶媒の使用量は、洗浄が不十分であると有機溶媒及び乳化剤が残存する可能性があることから、工程（ｂ）で用いた有機溶媒に対して５から３０倍容積使用することが好ましく、１０から２０倍容積使用することがより好ましい。
【００６３】
（ｄ）工程（ｃ）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルを、少なくとも２つ以上のグリシジル基を有するグリシジルエーテル類と反応させることにより、多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｄ）及び工程（ｅ）は、工程（ｃ）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルを、セルロースの水酸基と反応し得る官能基間の原子数が異なる２種類の架橋剤を用いて架橋することにより、多孔性架橋セルロースゲルを得る工程である。
【００６４】
工程（ｄ）は、工程（ｃ）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルに溶媒を添加した懸濁液に、架橋剤であるグリシジルエーテル類を添加して撹拌条件下で加熱したのち、反応を促進させる塩基とセルロースを還元する還元剤を添加し、さらに撹拌条件下で加熱することにより、多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程である。
【００６５】
工程（ｄ）で使用することができるグリシジルエーテル類は、得られる多孔性架橋セルロースゲルの機械的強度を高める点で少なくとも２つ以上のグリシジル基を有するグリシジルエーテル類を使用することが好ましく、具体的にはエチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、テトラエチレングリコールジグリシジルエーテル、レゾルシノールジグリシジルエーテルなどのジグリシジルエーテル類、グリセロールトリグリシジルエーテル、エリスリトールトリグリシジルエーテル、ジグリセロールトリグリシジルエーテルなどのトリグリシジルエーテル類、エリスリトールテトラグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテルなどのテトラグリシジルエーテル類を例示することができる。これらの中では、グリセロールジグリシジルエーテル、グリセロールトリグリシジルエーテル、エリスリトールトリグリシジルエーテル、エリスリトールテトラグリシジルエーテルがより好ましい。これらのグリシジルエーテル類は単独で使用することもできるが、数種の混合物を使用することもできる。前述のグリシジルエーテル類は市販品を使用してもよく、例えば、ナガセケムテックス製デナコールＥＸ−３１３（グリセロールポリグリシジルエーテル）及びデナコールＥＸ−６１４Ｂ（ソルビトールポリグリシジルエーテル）を使用することができる。
【００６６】
工程（ｄ）で使用することができる溶媒は、多孔性未架橋セルロースゲルの懸濁液が得られれば特に制限はなく、水、有機溶媒、及びこれらの混合物を利用することができる。有機溶媒としてはアセトン、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテルなどのエーテル類、ジメチルホルムアミドなどの含窒素溶媒、ジメチルスルホキシドなどの含硫黄溶媒などを例示することができる。これらの溶媒の中では多孔性未架橋セルロースゲルの分散性及びグリシジルエーテル類の溶解性が高い点で、水と１，４−ジオキサン、水とジメチルホルムアミド、水とジメチルスルホキシドの混合溶媒が好ましい。
【００６７】
溶媒の使用量に特に制限はないが、多孔性未架橋セルロースゲルの分散性を高める点で、多孔性未架橋セルロースゲルの含水重量に対して０．５から３倍量の溶媒を使用することが好ましい。また、前述の有機溶媒と水の混合比率にも特に制限はないが、反応液全体に対する前述の有機溶媒の比率が２０から８０重量％であることが好ましい。
【００６８】
架橋剤の使用量は、使用量が少ない場合には得られる多孔性架橋セルロースゲルの機械的強度が低下する一方、使用量が多い場合には架橋剤同士が反応することにより反応液全体が固化する場合があることから、多孔性未架橋セルロースゲルに含まれる乾燥セルロース重量に対して１から５倍量の架橋剤を使用することが好ましく、より好ましくは１．５から３倍量である。多孔性未架橋セルロースゲルに含まれる乾燥セルロース重量は、例えば、エー・アンド・デイ製加熱乾燥式水分計などを用いて、含水状態の多孔性未架橋セルロースゲルを加熱乾燥することにより測定することができる。
【００６９】
工程（ｄ）の反応温度は３０から７０℃が好ましく、より好ましくは４０から６０℃である。反応液の撹拌方法はセルロースゲルの破壊を抑制する点で、撹拌翼を使用する方法が好ましい。また、撹拌速度についてはセルロースゲルが懸濁液中で良好に分散できれば特に制限はない。
【００７０】
反応容器に工程（ｃ）で得られた多孔性未架橋セルロースゲル、溶媒及び架橋剤であるグリシジルエーテル類を添加し、攪拌条件下、前述の温度で３０から６０分加熱したのち、架橋反応を促進させる目的で反応液に塩基を添加することが好ましい。具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基類やトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどの有機塩基類を例示することができる。これらの中では水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基類が好ましく、水酸化ナトリウムがより好ましい。塩基の添加量に特に制限はないが、多孔性未架橋セルロースゲルに含まれる乾燥セルロース重量に対して０．５から２倍量であることが好ましい。
【００７１】
また、反応液にはセルロースの還元末端を還元する目的で、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボランなどの還元剤を添加することが好ましく、これらの中では水素化ホウ素ナトリウムがより好ましい。還元剤の添加量に特に制限はなく、多孔性未架橋セルロースゲルに含まれる乾燥セルロース重量に対して０．０１から０．０５倍量であることが好ましい。
【００７２】
塩基及び還元剤を添加後、反応温度を３０から７０℃、好ましくは４０から６０℃に維持したまま、さらに８から２４時間撹拌を継続することが好ましい。反応後、反応液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターなどを使用して水で洗浄することにより、目的の多孔性部分架橋セルロースゲルを得ることができる。
【００７３】
（ｅ）工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲルを、セルロースの水酸基と反応し得る官能基を２つ以上有する架橋剤と反応させることにより、多孔性架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｅ）は、工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲルに溶媒を添加した懸濁液を撹拌条件下で加熱したのち、セルロースを還元する還元剤、セルロースの水酸基と反応し得る官能基を２つ以上有する架橋剤及び架橋反応を促進させる塩基を添加し、さらに撹拌条件下で加熱することにより、多孔性架橋セルロースゲルを得る工程である。
【００７４】
工程（ｅ）で使用することができる溶媒としては、多孔性部分架橋セルロースゲルの懸濁液が得られれば特に制限はなく、水、無機塩水溶液、有機溶媒及びこれらの混合物を利用することができる。無機塩としては、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどを例示することができる。また、有機溶媒としては、アセトン、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、１，４−ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテルなどのエーテル類、ジメチルホルムアミドなどの含窒素溶媒、ジメチルスルホキシドなどの含硫黄溶媒などを例示することができる。これらの溶媒の中では架橋反応の効率を高める点で、水あるいは無機塩水溶液が好ましく、硫酸ナトリウム水溶液がより好ましい。
【００７５】
溶媒の使用量に特に制限はないが、多孔性部分架橋セルロースゲルの分散性を高める点で、多孔性部分架橋セルロースゲルの含水重量に対して０．５から３倍量の溶媒を使用することが好ましい。また、無機塩水溶液中の無機塩濃度も無機塩水溶液が得られれば特に制限はないが、無機塩濃度が高すぎると反応液を２０℃から２５℃にまで冷却した場合に無機塩の結晶が析出してくる場合があることから、例えば、無機塩が硫酸ナトリウムの場合、１５から２５重量％であることが好ましい。
【００７６】
工程（ｅ）の反応温度は３０から７０℃が好ましく、より好ましくは４０から６０℃である。反応液の撹拌方法はセルロースゲルの破壊を抑制する点で、撹拌翼を使用する方法が好ましい。また、撹拌速度についてはセルロースゲルが懸濁液中で良好に分散できれば特に制限はない。
【００７７】
反応容器に工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲル及び前述の溶媒を添加して得られたセルロース懸濁液を、攪拌条件下、前述の温度で３０から６０分加熱したのち、セルロースの還元末端を還元する目的で還元剤を添加することが好ましい。具体的には、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボランを例示することができ、これらの中では水素化ホウ素ナトリウムがより好ましい。還元剤の添加量に特に制限はないが、多孔性部分架橋セルロースゲルに含まれる乾燥セルロース重量に対して０．０１から０．０５倍量であることが好ましい。
【００７８】
次に還元剤を添加したセルロース懸濁液に、セルロースの水酸基と反応し得る官能基を２つ以上有する架橋剤及び架橋反応を促進させる塩基を添加することにより、多孔性部分架橋セルロースゲルの架橋反応を行う。
【００７９】
工程（ｅ）で使用することができる、セルロースの水酸基と反応し得る官能基を２つ以上有する架橋剤は、工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲルの機械的強度をさらに高める点で、工程（ｄ）で使用したグリシジルエーテル類よりもセルロースの水酸基と反応し得る官能基間の原子数の少ない架橋剤を使用することが好ましい。具体的には、エピクロロヒドリンやエピブロモヒドリンなどのエピハロヒドリン類、１，２−ジクロロエタン、１，２−ジブロモエタン、１，２−ヨードエタン、１，２−ジクロロプロパン、１，３−ジクロロプロパン、１，２−ジブロモプロパン、１，３−ジブロモプロパン、１，３−ジヨードプロパン、１−ブロモ−３−クロロプロパンなどのハロゲン化炭化水素類、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、２，３−ジクロロ−１−プロパノール、２，３−ジブロモ−１−プロパノールなどの含ハロゲンアルコール類を例示することができる。これらの中では無機塩水溶液中でのセルロースの水酸基との反応性が高い点でエピクロロヒドリンやエピブロモヒドリンなどのエピハロヒドリン類が好ましく、エピクロロヒドリンがより好ましい。
【００８０】
架橋剤の使用量に特に制限はないが、使用量が少ない場合には得られる多孔性架橋セルロースゲルの機械的強度が低下することから、工程（ｃ）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルに含まれる乾燥セルロース重量に対して０．５から８倍量の架橋剤を使用することが好ましく、０．５から５倍量がより好ましい。また、架橋剤の添加方法は必要量を連続的あるいは段階的に２から１２時間、より好ましくは４から８時間かけることが好ましい。
【００８１】
工程（ｅ）で使用することができる塩基は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基類やトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどの有機塩基類を例示することができる。これらの中では水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基類が好ましく、水酸化ナトリウムがより好ましい。塩基の添加量に特に制限はないが、多孔性未架橋セルロースゲルに含まれる乾燥セルロース重量に対して０．５から２倍量であることが好ましい。また、塩基の添加方法は必要量を連続的あるいは段階的に２から１２時間、より好ましくは４から８時間かけることが好ましく、前述の架橋剤と同時に連続的あるいは段階的に添加することがより好ましい。
【００８２】
架橋剤及び塩基を添加したのち、反応液の温度を３０から７０℃、好ましくは４０から６０℃に維持したまま、さらに８から２４時間撹拌を継続することが好ましく、１２から２４時間撹拌を継続することがより好ましい。反応後、反応液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターなどを使用して水で洗浄することにより、目的の多孔性架橋セルロースゲルを得ることができる。
【００８３】
さらに、工程（ｅ）の後、前述の方法により分級を行うことにより、平均粒子径が３０μｍ以上１５０μｍ以下の本発明の多孔性架橋セルロースゲルを得ることができる。
【００８４】
本発明の多孔性架橋セルロースゲルは多孔性であることから、ゲルの細孔径分布などの細孔特性により、例えば分子量の異なる測定対象物質を分離することができる。液体クロマトグラフィーの分野では多孔性担体の細孔特性を示す指標としてゲル分配係数（Ｋａｖ）が使用されることが多く、種々の分子量既知の測定対象物質に対するＫａｖを求めることにより、細孔特性を把握することができる。
【００８５】
Ｋａｖは、例えば、生物化学実験法１１「ゲル濾過法」第２版（学会出版センター）等に記載の方法により測定することができる。具体的には、前述の空孔率算出式と同様に、分子量既知の測定対象物質の溶出容積（Ｖｅ）、カラム容積（Ｖｃ）及び分子量２００万のブルーデキストランの溶出容積（Ｖｏ）を用いて、以下に示した計算式から算出することができる。
Ｋａｖ＝（Ｖｅ−Ｖｏ）／（Ｖｃ−Ｖｏ）。
【００８６】
本発明の多孔性架橋セルロースゲルの具体的なＫａｖの測定方法は、実施例に示したとおりである。
【００８７】
また、本発明の多孔性架橋セルロースゲルのＫａｖは、本発明の工程（ａ）におけるセルロース溶液中のセルロース、水酸化ナトリウム、尿素及び／又はチオ尿素の各構成成分の濃度や、工程（ｄ）及び工程（ｅ）における架橋剤濃度や反応温度などの架橋条件を調節することにより調整することができる。これらＫａｖを調整可能な変数の中ではセルロース濃度が最も重要であり、本発明の多孔性架橋セルロースゲルでは、セルロース濃度を２重量％以上１０重量％以下、より好ましくは４重量％以上８重量％以下とすることで、後述の実施例にて示されるように、クロマトグラフィー用充填剤として好適なＫａｖを得ることができる。
【００８８】
本発明の多孔性架橋セルロースゲルは、抗体医薬品などのバイオ医薬品の分離精製に利用可能な細孔特性及び粒子径を有していることから、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、共有結合クロマトグラフィー、キレートクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー用充填剤として好適に用いることができる。また、本発明の多孔性架橋セルロースゲルは、精製対象物質に対して高い吸着容量が期待できる高い空孔率と高流速処理が可能な高い機械的強度を併せ持つことから、特にバイオ医薬品の精製工程において多用されるイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤として好適に用いることができる。
【００８９】
本発明における多孔性架橋セルロースゲルをクロマトグラフィー用充填剤として使用するタンパク質の精製方法は、一般的なクロマトグラフィー操作による方法であれば特に制限はないが、本発明の多孔性架橋セルロースゲルは機械的強度が高く高流速処理が可能であることから、クロマトグラフィー用カラムに充填して使用する方法が好ましい。クロマトグラフィー用カラムのサイズ（内径や長さ）は、精製対象物質を含む溶液などの精製原料の処理量に応じて、適切なサイズのカラムを使用すればよい。
【００９０】
本発明の多孔性架橋セルロースゲルを前述のクロマトグラフィー用充填剤として使用する場合、他のクロマトグラフィー用充填剤において一般的な方法により、用途に応じた各種官能基を多孔性架橋セルロースゲルに導入することができる。例えば、本発明の多孔性架橋セルロースゲルに荷電基を導入することによりイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を、また、アルキル基やアリール基などの疎水性基を導入することにより疎水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。本発明の多孔性架橋セルロースゲルに荷電基あるいは疎水性基を導入する方法は、一般的な多糖系多孔性担体に荷電基あるいは疎水性基を導入する方法であれば特に制限されない。
【００９１】
また、本発明の多孔性架橋セルロースゲルにエポキシ基、ホルミル基、アミノ基、マレイミド基、カルボキシル基などのアフィニティーリガンド固定化用官能基を導入したのち、コンカナバリンＡなどの糖鎖に対するアフィニティーリガンドや、プロテインＡ、プロテインＧ、Ｆｃ結合性タンパク質などの抗体に対するアフィニティーリガンドを固定化することにより、各精製対象物質に対するアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。
【００９２】
本発明の多孔性架橋セルロースゲルにエポキシ基を導入する方法としては、例えば、本発明の多孔性架橋セルロースゲルを、エピクロロヒドリン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルなどのエポキシ基含有化合物を塩基性条件下で反応させる方法を例示することができる。本発明の多孔性架橋セルロースゲルにホルミル基を導入する方法としては、例えば、本発明の多孔性架橋セルロースゲルをグルタルアルデヒドなどの２官能性アルデヒド類を反応させる方法や、多孔性架橋セルロースゲルを過ヨウ素酸ナトリウムなどの酸化剤と反応させる方法を例示することができる。また、前述の方法によりエポキシ基を導入した多孔性架橋セルロースゲルと、Ｄ−グルカミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、α−チオグリセロールなどの化合物を反応させることで隣接する水酸基を導入した多孔性架橋セルロースゲルを、過ヨウ素酸ナトリウムなどの酸化剤と反応させる方法を例示することができる。本発明の多孔性架橋セルロースゲルにアミノ基を導入する方法としては、例えば、前述の方法によりエポキシ基を導入した多孔性架橋セルロースゲルを、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリス（２−アミノエチル）アミンなどの少なくとも２つ以上のアミノ基を有する化合物と反応させる方法を例示することができる。本発明の多孔性架橋セルロースゲルにマレイミド基を導入する方法としては、例えば、前述の方法によりアミノ基を導入した多孔性架橋セルロースゲルを、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル、４−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジル、６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジルなどの化合物と反応させる方法を例示することができる。本発明の多孔性架橋セルロースゲルにカルボキシル基を導入する方法としては、例えば、本発明により得られた多孔性架橋セルロースゲルをモノクロロ酢酸、モノブロモ酢酸などのハロ酢酸と塩基性条件下で反応させる方法の他に、前述の方法によりエポキシ基を導入した多孔性架橋セルロースゲルを、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などのアミノ酸類、β−アラニン、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸などのアミノ基含有カルボン酸類、チオグリコール酸やチオリンゴ酸などの含硫黄カルボン酸類と塩基性条件下で反応させる方法を例示することができる。
【００９３】
前述のアフィニティーリガンド固定化用官能基を導入した多孔性架橋セルロースゲルにアフィニティーリガンドを固定化する方法は、一般的なアフィニティーリガンドの固定化方法であれば特に制限されない。例えば、アフィニティーリガンド固定化用官能基がエポキシ基の場合、本発明の多孔性架橋セルロースゲルに導入したエポキシ基と、アフィニティーリガンド中の活性官能基（リジンのアミノ基あるいはシステインのメルカプト基）を塩基性条件下で反応させる方法を例示することができる。固定化用官能基がホルミル基の場合、本発明の多孔性架橋セルロースゲルに導入したホルミル基と、アフィニティーリガンド中のリジンのアミノ基を、ｐＨ８から１２の条件下、１０から４０℃で反応させたのち、水素化ホウ素ナトリウムやジメチルアミンボランなどの還元剤を添加して、さらに１０から４０℃で反応させる方法を例示することができる。固定化用官能基がアミノ基あるいはカルボキシル基の場合、本発明の多孔性架橋セルロースゲルに導入したアミノ基あるいはカルボキシル基と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の存在下、アフィニティーリガンド中のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸のカルボキシル基あるいはリジンのアミノ基を、ｐＨ４から７の条件下、１０から４０℃で反応させる方法を例示することができる。固定化用官能基がマレイミド基の場合、本発明の多孔性架橋セルロースゲルに導入したマレイミド基と、アフィニティーリガンド中のシステインのメルカプト基を、ｐＨ６から８の条件下、１０から４０℃で反応させる方法を例示することができる。
【００９４】
これらのアフィニティーリガンドの固定化方法の中では、固定化収率が高い点で、多孔性架橋セルロースゲルに導入したホルミル基、カルボキシル基、マレイミド基とアフィニティーリガンドの活性官能基を反応させる方法が好ましく、多孔性架橋セルロースゲルに導入したホルミル基あるいはマレイミド基とアフィニティーリガンドの活性官能基を反応させる方法がより好ましい。
【００９５】
さらに、精製対象物質に対する吸着容量を高める点で、本発明の多孔性架橋セルロースゲルの水酸基とアフィニティーリガンドの活性官能基の間に導入したスペーサー原子（以下、スペーサー）を介してアフィニティーリガンドを固定化させる方法がさらに好ましい。スペーサーの原子数は、アフィニティーリガンドが精製対象物質に対する吸着能を有している限り特に制限はないが、アフィニティーリガンドと精製対象物質の接触効率を高めて吸着容量を高める点で、２原子から５０原子であることが好ましく、３原子から３０原子であることがより好ましい。
【００９６】
本発明の多孔性架橋セルロースゲルにホルミル基あるいはマレイミド基を導入した多孔性架橋セルロースゲルへのアフィニティーリガンド固定化量は、精製対象物質の吸着量を高める点及び製造原価を低減させる点で、１ｍＬの多孔性架橋セルロースゲル当り、１ｍｇ以上１００ｍｇ以下であることが好ましく、５ｍｇ以上５０ｍｇ以下がより好ましく、５ｍｇ以上３０ｍｇ以下がさらに好ましい。多孔性架橋セルロースゲルへのアフィニティーリガンド固定化量は、固定化反応液及び反応後のゲル洗浄液を回収し、アフィニティーリガンド由来の吸光度を測定することにより未反応のアフィニティーリガンド量を求めたのち、固定化反応に使用したアフィニティーリガンド量から未反応のアフィニティーリガンド量を差し引くことで算出することができる。また、本発明の多孔性架橋セルロースゲルへの前述の各種官能基及びアフィニティーリガンドの導入量はクロマトグラフィー用充填剤の用途に合わせて決定すればよく、各種官能基導入量は反応条件を変更することにより調整することができる。本発明の多孔性架橋セルロースゲルへのアフィニティーリガンド固定化用官能基の導入及びアフィニティーリガンド固定化の具体的な方法は、実施例に示したとおりである。
【００９７】
前述の方法に従って、本発明の多孔性架橋セルロースゲルにアフィニティーリガンド固定化用官能基を導入した多孔性架橋セルロースゲルに、プロテインＡ、プロテインＧ、Ｆｃ結合性タンパク質などの抗体に対するアフィニティーリガンドを導入することにより、後述の実施例にて示されるように、抗体精製に好適な抗体吸着容量が高いアフィニティークロマトグラフィー用充填剤、すなわち、抗体精製用吸着剤を得ることができる。
【００９８】
抗体精製用吸着剤の作製に使用する、抗体に対するアフィニティーリガンドとしては、後述の実施例にて示されるように、低いリガンド固定化量で高い抗体吸着量を実現できる点で、プロテインＡ又はＦｃ結合性タンパク質が好ましく、プロテインＡがより好ましい。
【実施例】
【００９９】
以下、実施例及び比較例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【０１００】
なお、以下の実施例及び比較例において、セルロースゲルを重量で記載した場合、特段の説明がない限り、水に懸濁したセルロースゲルをグラスフィルターなどでろ過したのちに秤量した含水重量であり、また、「容積」で記載した場合、特段の説明がない限り、水に懸濁したセルロースゲルを目盛付き容器に添加し、１２時間以上放置したときの沈降容積を目視により測定したものである。【０１０１】
（実施例１）  多孔性架橋セルロースゲル１の製造
実施例１は、７重量％水酸化ナトリウムと２２重量％尿素の混合水溶液に木綿由来セルロースを溶解して調製した６％セルロース溶液からの多孔性架橋セルロースゲルの製造及びクロマトグラフィー用充填剤としての特性評価に関するものである。
（１）多孔性架橋セルロースゲル１の製造
（ａ）セルロース溶液を得る工程
５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（関東化学製、１４０．６ｇ）と尿素（関東化学製、７４．６ｇ）と水（１２３．８ｇ）を混合して調製した７重量％水酸化ナトリウム−２２重量％尿素混合水溶液（３００ｍＬ）に、ＡＤＶＡＮＴＥＣ製濾紙粉末Ｃ（１８．０ｇ、平均重合度１７６）を２５℃で添加し、氷冷下で２時間撹拌することにより、透明なセルロース溶液１を得た。
（ｂ）セルロース分散液を得る工程
工程（ａ）で得られたセルロース溶液１を２５℃で１時間撹拌したのち、エチルセルロース（関東化学製、４５ｃＰ、３．６０ｇ）を含むトルエン（関東化学製、４００ｍＬ）に２５℃で添加し、撹拌羽根を用いて５００ｒｐｍで１０分間撹拌することによりセルロース分散液１を得た。
（ｃ）多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程
２５℃で５００ｒｐｍでの撹拌を継続した条件で、工程（ｂ）で得られたセルロース分散液１を氷冷し、分散液の温度が５℃以下になったことを確認したのち、さらに氷冷下で１時間撹拌を継続した。次に、セルロース分散液の温度が０℃から１０℃の範囲となるよう冷却した条件で、５００ｒｐｍでの撹拌を継続したセルロース分散液に氷冷したメタノール（関東化学製、２００ｍＬ）を毎分１０ｍＬの速度で添加したのち、さらに氷冷下で１０分間撹拌を継続することにより、セルロースゲル懸濁液を得た。得られたセルロースゲル懸濁液を１．２Ｌのエタノールで５回、３．５Ｌの水で５回、順次洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル１（３５０ｍＬ）と粒子径１５０μｍ以上の多孔性未架橋セルロースゲル１（６０ｍＬ）を得た。
（ｄ）多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｃ）で得られた粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル１（２２０．３ｇ、含水率９２．０％、乾燥セルロース１７．６ｇ）、１，４−ジオキサン（関東化学製、２６４．０ｇ）、水（６１．３ｇ）、デナコールＥＸ−３１３（ナガセケムテックス製、３５．２ｇ）を混合し、５０℃で３０分間撹拌したのち、水素化ホウ素ナトリウム（関東化学製、５２８ｍｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学製、１７．６ｇ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性部分架橋セルロースゲル１を得た。
（ｅ）多孔性架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲル１全量と、無水硫酸ナトリウム（和光純薬製）と水から調製した２５重量％硫酸ナトリウム水溶液（４４２．５ｇ）を混合し、５０℃で３０分間撹拌した。次に、反応液に水素化ホウ素ナトリウム（関東化学製、５２８ｍｇ）を添加したのち、５０℃での撹拌を継続した条件で、エピクロロヒドリン（東京化成製、４．４１ｇ）と４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学製、４．４１ｇ）を３０分間隔で１２回添加し、エピクロロヒドリンと４８％水酸化ナトリウム水溶液の添加終了後、さらに５０℃で１５時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却し、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲル１（２００ｍＬ）を得た。
（２）排除限界分子量測定
前述の工程（ｅ）で得られた４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲル１の、多糖類の排除限界分子量の測定は、特開２０１２−１４１２１２に記載の方法で行った。多孔性架橋セルロースゲル１を、グラスフィルターを使用して０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄したのち、吸引ろ過することにより、サクションドライした多孔性架橋セルロースゲル１を得た。次に、サクションドライした多孔性架橋セルロースゲル１（２０．０ｇ）を０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液（３０．０ｇ）に分散させ、リザーバーステンレス製カラム（内径１０．７ｍｍ、長さ３００ｍｍ）と出口にステンレス製焼結フィルターを取り付けたステンレス製カラム（内径１０．７ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、カラム容積１３．５ｍＬ）を接続したものに注ぎ、チューブポンプに接続して、０．１５ＭＰａの定圧で０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）を送液した。送液停止後、カラム内圧力が大気圧まで低下したのを確認後、リザーバーとカラムを切り離し、カラム上面の多孔性架橋セルロースゲル１を擦切り、ステンレス製焼結フィルターを取り付けた。【０１０２】
多孔性架橋セルロースゲル１を充填したカラムをＨＰＬＣシステム（定量ポンプ：東ソー製ＤＰ−８０２０、オートサンプラ：東ソー製ＡＳ−８０２０、示差屈折計：東ソー製ＲＩ−８０２０）に接続し、示差屈折計をデータ処理システム（東ソー製ＳＣ−８０２０）に接続した。次に、純水を１ｍＬ／分の流速で通液して、０．２％エチレングリコール水溶液４０μＬをオートサンプラから注入し、エチレングリコールのピークの非対称係数が０．８〜１．２の範囲にあることを確認した。次に、流速０．４８ｍＬ／分で、０．２％のデキストラン水溶液（ＳＩＧＭＡ製、分子量４×１０７）、０．２％の８種類のプルラン水溶液（昭和電工製Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２、重量平均分子量Ｍｗがそれぞれ７８．７×１０４、４０．４×１０４、２１．２×１０４、１１．２×１０４、４．７３×１０４、２．２８×１０４、１．１８×１０４、０．５９×１０４であり、Ｍｗ／Ｍｎの値がそれぞれ１．２３、１．１３、１．１３、１．１２、１．０６、１．０７、１．１０、１．０９であるプルラン）及びエチレングリコールをそれぞれ４０μＬ注入して溶出容積を測定した。各測定サンプルの溶出容積をｘ軸に、各測定サンプルの分子量をｙ軸にプロットし、デキストランの溶出容積を分配係数０、エチレングリコールの溶出容積を分配係数１とし、分配係数が０．５以上を１点含めたそれ以下の３点から５点で直線を引き、デキストランの溶出容積との切片から排除限界分子量を求めた結果、多孔性架橋セルロースゲル１の排除限界分子量は１１４万であった。
（３）空孔率及びＫａｖ測定
多孔性架橋セルロースゲル１のＫａｖ及び空孔率の測定は、以下に記載の方法で行った。まず始めに、多孔性架橋セルロースゲル１を水に懸濁したのち、リザーバーカラム及びポンプを用いて水を通液することにより、オムニフィット製ガラスカラム（内径６．６ｍｍ、長さ２２０ｍｍ、カラム容積７．５ｍＬ）に最密充填となるように充填した。次に、多孔性架橋セルロースゲルを充填したカラムをＨＰＬＣシステム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ）に接続したのち、水を０．３ｍＬ／分で通液し、０．２％分子量２００万のブルーデキストラン水溶液（シグマ製）と、塩化ナトリウム（和光純薬製）と水から調製した０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液をそれぞれ１０μＬ注入してカラムからの溶出容積を測定した。カラム容積（Ｖｃ）、分子量２００万のブルーデキストランの溶出容積（Ｖｏ）及び塩化ナトリウムの溶出容積（Ｖｎ）の値を用い、前述の空孔率算出式より多孔性架橋セルロースゲル１の空孔率を算出した結果、空孔率は９１．３％であった。【０１０３】
次に、カラムに０．５ｍＬ／分の流速で、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（和光純薬製、以下Ｔｒｉｓとする）と希塩酸から調製した０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に、終濃度が０．１Ｍとなるように塩化カリウム（和光純薬製）を添加して調製したＨＰＬＣ溶出液を４０ｍＬ以上通液したのち、前述のＨＰＬＣ溶出液を０．３ｍＬ／分で通液し、Ｋａｖ測定対象タンパク質溶液として０．２％チトクロムＣ溶液（シグマ製、分子量１２４００）、０．５％アルブミン溶液（シグマ製、分子量６６０００）、０．５％アポフェリチン（シグマ製、分子量４４３０００）及び０．６％チログロブリン（シグマ製、分子量６６９０００）を用い、各溶液を１０μＬ注入してカラムからの溶出容積を測定した。なお、測定対象タンパク質溶液は、測定対象タンパク質を前述のＨＰＬＣ溶液に溶解することにより調製した。各測定対象タンパク質の溶出容積（Ｖｅ）、カラム容積（Ｖｃ）及び分子量２００万のブルーデキストランの溶出容積（Ｖｏ）の値を用い、前述のＫａｖ算出式より多孔性架橋セルロースゲル１のＫａｖを算出した結果、チトクロムＣに対して０．９１、アルブミンに対して０．７８、アポフェリチンに対して０．６６、チログロブリンに対して０．６０であった。
（４）カラム圧力損失測定
多孔性架橋セルロースゲル１のカラム圧力損失の測定には、前述の（２）で充填したカラムとＨＰＬＣシステムを使用した。カラム圧力損失測定は、カラムに０．５ｍＬ／分（線速度８８ｃｍ／時）の流速で少なくとも４０ｍＬ以上の水を通液することによりカラム内を平衡化したのち、０．５ｍＬ／分の流速で水を通液し、１分後のＨＰＬＣシステムのポンプ圧力を読み取り、ＨＰＬＣシステムの最大流速である１０ｍＬ／分（線速度１７５５ｃｍ／時）まで１分間隔で流速を０．５ｍＬ／分ずつ上昇させ、各流速における１分後のポンプ圧力を読みとることで行なった。なお、カラム圧力損失は、カラムに充填剤を充填した状態で水を通液した場合の各流速におけるＨＰＬＣシステムのポンプ圧力から、カラムに水を満たした状態で水を通液した場合の各流速におけるＨＰＬＣシステムのポンプ圧力を差し引くことにより算出した。多孔性架橋セルロースゲル１のカラム圧力損失を測定した結果、線速度１４９１ｃｍ／時（流速８．５ｍＬ／分）でのカラム圧力損失は０．２６ＭＰａであった。
（５）多孔性架橋セルロースゲルのホルミル化
工程（ｅ）で得られた粒子径４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲル１（３．０ｇ）、過ヨウ素酸ナトリウム（関東化学社製）と水から調製した過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍＬ）、水（１．５ｍＬ）を混合し、２５℃で６０分間撹拌することにより、多孔性架橋セルロースゲル１のホルミル化反応を行なった。反応後、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性架橋セルロースゲル１をホルミル化した多孔性架橋セルロースゲル１Ｆを得た。
（６）ホルミル化多孔性架橋セルロースゲルへのプロテインＡ固定化
前述の（４）で得られた多孔性架橋セルロースゲル１Ｆに水を添加することで調製した５０容積％懸濁液（１００μＬ）を容器（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、ミニバイオスピンクロマトグラフィーカラム、容積１．２ｍＬ）に添加し、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ１１．０、１５０μＬ）で５回洗浄した。なお、多孔性架橋セルロースゲル１Ｆの５０容積％懸濁液は、水で懸濁した多孔性架橋セルロースゲル１Ｆをメスシリンダー内で沈降させ、時々タッピングを行なって容積が一定になるまで放置したのち、多孔性架橋セルロースゲル１Ｆの容積が５０％となるよう、水を添加することで調製した。【０１０４】
次に、多孔性架橋セルロースゲル１Ｆ（５０μＬ）が入った容器に、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ１１．０、１２０μＬ）と、プロテインＡ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製）とＤ−ＰＢＳ（−）（和光純薬社製）から調製したプロテインＡ溶液（３０．５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ）を添加して３０℃で１時間撹拌した。次に、水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製）と水から調製した水素化ホウ素ナトリウム水溶液（１５ｍｇ／ｍＬ、１０μＬ）を添加し、さらに３０℃で１時間撹拌することにより、プロテインＡを多孔性架橋セルロースゲル１Ｆに固定化した。固定化反応後、Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬社製）を希塩酸によりｐＨを７．０に調整したＰＢＳ溶液（以下、ＰＢＳ７．０溶液とする）で洗浄することにより、多孔性架橋セルロースゲル１ＦにプロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤１ＦＰを得た。【０１０５】
反応液及び洗浄液を回収し、２８０ｎｍの吸光度を測定することにより未反応のプロテインＡ量を算出したのち、反応に使用したプロテインＡ量から未反応のプロテインＡ量を差し引くことで抗体精製用吸着剤１ＦＰへのプロテインＡ固定化量を算出した結果、固定化量はゲル１ｍＬあたり１０．７ｍｇであった。
（７）プロテインＡ固定化多孔性架橋セルロースゲルの抗体吸着量測定
前述の（５）で調製した抗体精製用吸着剤１ＦＰ（５０μＬ）をＰＢＳ７．０溶液（２００μＬ）で５回洗浄したのち、反応容器にＰＢＳ７．０溶液（１４０μＬ）と、濃度が１５０ｍｇ／ｍＬのガンマグロブリン製剤（一般財団法人化学及血清療法研究所製、７０μＬ）を添加し、２５℃で２時間撹拌することにより、抗体精製用吸着剤１ＦＰに抗体を吸着させた。【０１０６】
撹拌終了後、抗体を吸着させた抗体精製用吸着剤１ＦＰをＰＢＳ７．０溶液（１５０μＬ）で４回洗浄したのち、回収した洗浄液の２８０ｎｍの吸光度測定により未吸着の抗体量を算出した。次に、抗体を吸着させた抗体精製用吸着剤１ＦＰを０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０、１５０μＬ）で４回洗浄することにより抗体を脱着した。回収したクエン酸緩衝液による洗浄液の２８０ｎｍの吸光度を測定することにより抗体吸着量を算出した結果、抗体精製用吸着剤１ＦＰの抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり６５．２ｍｇであった。
（８）プロテインＡを固定化していない多孔性架橋セルロースゲルの抗体吸着量測定
抗体精製用吸着剤１ＦＰの代わりに、プロテインＡを固定化していない多孔性架橋セルロースゲル１を用い、前述の（６）に記載の方法により多孔性架橋セルロースゲル１の静的抗体吸着量を測定した結果、多孔性架橋セルロースゲル１の静的抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり０．７ｍｇであった。従って、多孔性架橋セルロースゲル１への抗体の非特異的吸着は低いことが明らかになった。【０１０７】
（比較例１）  多孔性架橋セルロースゲル２の製造
比較例１は、実施例１と同様に７重量％水酸化ナトリウムと２２重量％尿素の混合水溶液に木綿由来セルロースを溶解して調製した６％セルロース溶液を使用し、実施例１の工程（ｃ）におけるゲル化剤の添加温度を２５℃として行なった場合の多孔性架橋セルロースゲルの製造及びクロマトグラフィー用充填剤としての特性評価に関するものである。
（１）多孔性架橋セルロースゲル２の製造
（ａ）セルロース溶液を得る工程
５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１０３．１ｇ）と尿素（関東化学社製、５４．７ｇ）と水（１２８．８ｇ）を混合して調製した７重量％水酸化ナトリウム−２２重量％尿素混合水溶液（２２０ｍＬ）に、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製濾紙粉末Ｃ（１３．２ｇ、平均重合度１７６）を２５℃で添加し、氷冷下で２時間撹拌することにより、透明なセルロース溶液２を得た。
（ｂ）セルロース分散液を得る工程
工程（ａ）で得られたセルロース溶液２を２５℃で１時間撹拌したのち、エチルセルロース（関東化学社製、４５ｃＰ、４．６８ｇ）を含むトルエン（関東化学社製、５２０ｍＬ）に２５℃で添加し、撹拌羽根を用いて５００ｒｐｍで１０分間撹拌することによりセルロース分散液２を得た。
（ｃ）多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程
２５℃で５００ｒｐｍでの撹拌を継続した条件で、工程（ｂ）で得られたセルロース分散液２に２５℃のメタノール（関東化学社製、１８０ｍＬ）を毎分１０ｍＬの速度で添加したのち、さらに２５℃で３０分間撹拌を継続することにより、セルロースゲル懸濁液を得た。得られたセルロースゲル懸濁液を１．２Ｌのエタノールで５回、３．５Ｌの水で５回、順次洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル２（２６０ｍＬ）と粒子径１５０μｍ以上の多孔性未架橋セルロースゲル２（３５ｍＬ）を得た。
（ｄ）多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｃ）で得られた粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル２（１５６．０ｇ、含水率９１．８％、乾燥セルロース１２．８ｇ）、１，４−ジオキサン（関東化学社製、１９２．０ｇ）、水（４８．８ｇ）、デナコールＥＸ−３１３（ナガセケムテックス社製、２５．６ｇ）を混合し、５０℃で３０分間撹拌したのち、水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、３８４ｍｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１２．８ｇ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性部分架橋セルロースゲル２を得た。
（ｅ）多孔性架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲル２全量と、無水硫酸ナトリウム（和光純薬社製）と水から調製した２５重量％硫酸ナトリウム水溶液（４４２．５ｇ）を混合し、５０℃で３０分間撹拌した。次に、反応液に水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、３８４ｍｇ）を添加したのち、５０℃での撹拌を継続した条件で、エピクロロヒドリン（東京化成社製、３．２０ｇ）と４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、３．２０ｇ）を３０分間隔で１２回添加し、エピクロロヒドリンと４８％水酸化ナトリウム水溶液の添加終了後、さらに５０℃で１５時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却し、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲル２（１４０ｍＬ）を得た。
（２）空孔率及びＫａｖ測定
実施例１に記載の方法により算出した多孔性架橋セルロースゲル２の空孔率は８９．０％であった。従って、多孔性架橋セルロースゲル２の空孔率は実施例１で製造した多孔性架橋セルロースゲル１に比較して低下することが明らかとなった。同じく実施例１に記載の方法により算出した多孔性架橋セルロースゲル２のＫａｖは、チトクロムＣに対して０．８８、アルブミンに対して０．７６、アポフェリチンに対して０．６３、チログロブリンに対して０．５７であった。
（３）カラム圧力損失測定
実施例１に記載の方法により測定した多孔性架橋セルロースゲル２のカラム圧力損失は、線速度１４９１ｃｍ／時（流速８．５ｍＬ／分）において０．２０ＭＰａであった。
（４）多孔性架橋セルロースゲルのホルミル化、プロテインＡ固定化及び抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル２をホルミル化した多孔性架橋セルロースゲル２Ｆを得たのち、プロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤２ＦＰを得た。実施例１に記載の方法により算出した抗体精製用吸着剤２ＦＰのプロテインＡ固定化量はゲル１ｍＬあたり１１．５ｍｇであった。同じく実施例１に記載の方法により算出した抗体精製用吸着剤２ＦＰの抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり５５．９ｍｇであった。従って、抗体精製用吸着剤２ＦＰの抗体吸着量は、実施例１で製造した抗体精製用吸着剤１ＦＰに比較して低下することが明らかとなった。【０１０８】
（実施例２）  多孔性架橋セルロースゲル３の製造
実施例２は、９重量％水酸化ナトリウムと４重量％尿素と４重量％チオ尿素の混合水溶液に木綿由来セルロースを溶解して調製した６％セルロース溶液からの多孔性架橋セルロースゲルの製造及びクロマトグラフィー用充填剤としての特性評価に関するものである。
（１）多孔性架橋セルロースゲル３の製造
（ａ）セルロース溶液を得る工程
５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１７７．６ｇ）と尿素（関東化学社製、１３．３ｇ）とチオ尿素（関東化学社製、１３．３ｇ）と水（１２８．８ｇ）を混合して調製した９重量％水酸化ナトリウム−４重量％尿素−４重量％チオ尿素混合水溶液（３００ｍＬ）に、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製濾紙粉末Ｃ（１８．０ｇ、平均重合度１７６）を２５℃で添加し、氷冷下で２時間撹拌することにより、透明なセルロース溶液３を得た。
（ｂ）セルロース分散液を得る工程
工程（ａ）で得られたセルロース溶液３を使用し、実施例１に記載した方法により、セルロース分散液３を得た。
（ｃ）多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｂ）で得られたセルロース分散液３を使用し、実施例１に記載した方法により、粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル３（３５０ｍＬ）と粒子径１５０μｍ以上の多孔性未架橋セルロースゲル３（２５ｍＬ）を得た。従って、工程（ａ）で水酸化ナトリウムと尿素とチオ尿素の混合水溶液を使用することにより、水酸化ナトリウムと尿素の混合水溶液を使用した実施例１よりさらに、粒子径１５０μｍ以上の多孔性未架橋セルロースゲルの生成を抑制することができる。
（ｄ）多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｃ）で得られた粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル３（２２１．５ｇ、含水率９２．０％、乾燥セルロース１７．７ｇ）、１，４−ジオキサン（関東化学社製、２６５．５ｇ）、水（６１．７ｇ）、デナコールＥＸ−３１３（ナガセケムテックス社製、３５．４ｇ）を混合し、５０℃で３０分間撹拌したのち、水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、５３１ｍｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１７．７ｇ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性部分架橋セルロースゲル３を得た。
（ｅ）多孔性架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲル３全量と、無水硫酸ナトリウム（和光純薬社製）と水から調製した２５重量％硫酸ナトリウム水溶液（４４２．５ｇ）を混合し、５０℃で３０分間撹拌した。次に、反応液に水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、５３１ｍｇ）を添加したのち、５０℃での撹拌を継続した条件で、エピクロロヒドリン（東京化成社製、４．４３ｇ）と４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、４．４３ｇ）を３０分間隔で１２回添加し、エピクロロヒドリンと４８％水酸化ナトリウム水溶液の添加終了後、さらに５０℃で１５時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却し、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲル３（２３５ｍＬ）を得た。
（２）排除限界分子量、空孔率及びＫａｖ測定
実施例１に記載の方法により測定した多孔性架橋セルロースゲル３の多糖類の排除限界分子量は１４０万であった。同じく実施例１に記載の方法により算出した多孔性架橋セルロースゲル３の空孔率は９０．８％であった。同じく実施例１に記載の方法により算出した多孔性架橋セルロースゲル３のＫａｖは、チトクロムＣに対して０．９１、アルブミンに対して０．７７、アポフェリチンに対して０．６６、チログロブリンに対して０．５９であった。
（３）カラム圧力損失測定
実施例１に記載の方法により測定した多孔性架橋セルロースゲル３のカラム圧力損失は、線速度１４９１ｃｍ／時（流速８．５ｍＬ／分）において０．２１ＭＰａであった。
（４）多孔性架橋セルロースゲルのホルミル化、プロテインＡ固定化及び抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル３をホルミル化した多孔性架橋セルロースゲル３Ｆを得たのち、プロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤３ＦＰを得た。実施例１に記載の方法により算出した抗体精製用吸着剤３ＦＰのプロテインＡ固定化量はゲル１ｍＬあたり１１．３ｍｇであった。同じく実施例１に記載の方法により算出した抗体精製用吸着剤３ＦＰの抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり６６．３ｍｇであった。
（５）プロテインＡを固定化していない多孔性架橋セルロースゲルの静的抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により測定したプロテインＡを固定化していない多孔性架橋セルロースゲル３の静的抗体吸着量は、ゲル１ｍＬあたり０．６ｍｇであった。従って、多孔性架橋セルロースゲル３への抗体の非特異的吸着は低いことが明らかになった。【０１０９】
（比較例２）  多孔性架橋セルロースゲル４の製造
比較例２は、実施例２と同様に９重量％水酸化ナトリウムと４重量％尿素と４重量％チオ尿素の混合水溶液に木綿由来セルロースを溶解して調製した６％セルロース溶液を使用し、実施例２の工程（ｃ）におけるゲル化剤の添加温度を２５℃として行なった場合の多孔性架橋セルロースゲルの製造及びクロマトグラフィー用充填剤としての特性評価に関するものである。また、比較例２では、有機溶媒とセルロース溶液の混合比を、実施例２と同一条件にして多孔性架橋セルロースゲルを製造した。
（１）多孔性架橋セルロースゲル４の製造
（ａ）セルロース溶液を得る工程
実施例２に記載した方法により、透明なセルロース溶液４を得た。
（ｂ）セルロース分散液を得る工程
工程（ａ）で得られたセルロース溶液４を使用し、実施例２に記載した方法により、セルロース分散液４を得た。
（ｃ）多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程
２５℃で５００ｒｐｍでの撹拌を継続した条件で、工程（ｂ）で得られたセルロース分散液４に２５℃のメタノール（関東化学社製、２００ｍＬ）を毎分１０ｍＬの速度で添加したのち、さらに２５℃で１０分間撹拌を継続することにより、セルロースゲル懸濁液を得た。得られたセルロースゲル懸濁液を１．２Ｌのエタノールで５回、３．５Ｌの水で５回、順次洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル４（２００ｍＬ）と粒子径１５０μｍ以上の多孔性未架橋セルロースゲル４（２００ｍＬ）を得た。従って、ゲル化剤の添加温度を２５℃で行なった比較例２では、ゲル化剤の添加温度を１０℃以下で行なった実施例２と比較して、粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲルの収量が低下することが明らかとなった。【０１１０】
また、多孔性未架橋セルロースゲル４の形状を光学顕微鏡で観察した結果、粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル４は１個の粒子が単独で存在した粒子状のセルロースゲルとして観察されたが、粒子径１５０μｍ以上の多孔性未架橋セルロースゲル４は粒子状のセルロースゲル同士が多数付着した塊状のセルロースゲルとして観察された。
（ｄ）多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｃ）で得られた粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル４（９８．３ｇ、含水率９２．０％、乾燥セルロース７．９ｇ）、１，４−ジオキサン（関東化学社製、１１８．５ｇ）、水（２８．１ｇ）、デナコールＥＸ−３１３（ナガセケムテックス社製、１５．８ｇ）を混合し、５０℃で３０分間撹拌したのち、水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、２３７ｍｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、７．９ｇ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性部分架橋セルロースゲル４を得た。
（ｅ）多孔性架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲル４全量と、無水硫酸ナトリウム（和光純薬社製）と水から調製した２５重量％硫酸ナトリウム水溶液（４４２．５ｇ）を混合し、５０℃で３０分間撹拌した。次に、反応液に水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、２３７ｍｇ）を添加したのち、５０℃での撹拌を継続した条件で、エピクロロヒドリン（東京化成社製、１．９８ｇ）と４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１．９８ｇ）を３０分間隔で１２回添加し、エピクロロヒドリンと４８％水酸化ナトリウム水溶液の添加終了後、さらに５０℃で１５時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却し、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲル４（８５ｍＬ）を得た。
（２）空孔率及びＫａｖ測定
実施例１に記載の方法により算出した多孔性架橋セルロースゲル４の空孔率は８８．８％であった。従って、多孔性架橋セルロースゲル４の空孔率は実施例２で製造した多孔性架橋セルロースゲル３に比較して低下することが明らかとなった。【０１１１】
同じく実施例１に記載の方法により算出した多孔性架橋セルロースゲル４のＫａｖは、チトクロムＣに対して０．８７、アルブミンに対して０．７３、アポフェリチンに対して０．６３、チログロブリンに対して０．５５であった。
（３）カラム圧力損失測定
実施例１に記載の方法により測定した多孔性架橋セルロースゲル４は、線速度１４９１ｃｍ／時（流速８．５ｍＬ／分）において０．１８ＭＰａであった。
（４）多孔性架橋セルロースゲルのホルミル化、プロテインＡ固定化及び抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル４をホルミル化した多孔性架橋セルロースゲル４Ｆを得たのち、プロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤４ＦＰを得た。実施例１に記載の方法により算出した抗体精製用吸着剤４ＦＰのプロテインＡ固定化量はゲル１ｍＬあたり１１．５ｍｇであった。同じく実施例１に記載の方法により算出した抗体精製用吸着剤４ＦＰの抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり５４．５ｍｇであった。従って、抗体精製用吸着剤４ＦＰの抗体吸着量は、実施例２で製造した抗体精製用吸着剤３ＦＰに比較して低下することが明らかとなった。【０１１２】
（実施例３）  多孔性架橋セルロースゲル５の製造
実施例３は、１０重量％水酸化ナトリウムと６重量％チオ尿素の混合水溶液に木綿由来セルロースを溶解して調製した６％セルロース溶液からの多孔性架橋セルロースゲルの製造及びクロマトグラフィー用充填剤としての特性評価に関するものである。
（１）多孔性架橋セルロースゲル５の製造
（ａ）セルロース溶液を得る工程
５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１９７．３ｇ）とチオ尿素（関東化学社製、２０．０ｇ）と水（１１５．７ｇ）を混合して調製した１０重量％水酸化ナトリウム−６重量％チオ尿素混合水溶液（３００ｍＬ）に、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製濾紙粉末Ｃ（１８．０ｇ、平均重合度１７６）を２５℃で添加し、氷冷下で２時間撹拌することにより、透明なセルロース溶液５を得た。
（ｂ）セルロース分散液を得る工程
工程（ａ）で得られたセルロース溶液５を２５℃で１時間撹拌したのち、エチルセルロース（関東化学社製、４５ｃＰ、３．６０ｇ）を含むトルエン（関東化学社製、４００ｍＬ）に２５℃で添加し、撹拌羽根を用いて４５０ｒｐｍで１０分間撹拌することによりセルロース分散液５を得た。
（ｃ）多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程
２５℃で４５０ｒｐｍでの撹拌を継続した条件で、工程（ｂ）で得られたセルロース分散液５を氷冷し、分散液の温度が５℃以下になったことを確認したのち、さらに氷冷下で１時間撹拌を継続した。次に、セルロース分散液の温度が０℃から１０℃の範囲となるよう冷却した条件で、５００ｒｐｍでの撹拌を継続したセルロース分散液に氷冷したメタノール（関東化学社製、２００ｍＬ）を毎分１０ｍＬの速度で添加したのち、さらに氷冷下で１０分間撹拌を継続することにより、セルロースゲル懸濁液を得た。得られたセルロース懸濁溶液を１．２Ｌのエタノールで５回、３．５Ｌの水で５回、順次洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル５（３００ｍＬ）と粒子径１５０μｍ以上の多孔性未架橋セルロースゲル５（２５ｍＬ）を得た。従って、工程（ａ）で水酸化ナトリウムとチオ尿素の混合水溶液を使用することにより、水酸化ナトリウムと尿素の混合水溶液を使用した実施例１よりさらに、粒子径１５０μｍ以上の多孔性未架橋セルロースゲルの生成を抑制することができる。
（ｄ）多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｃ）で得られた粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル５（２２７．１ｇ、含水率９２．２％、乾燥セルロース１７．７ｇ）、１，４−ジオキサン（関東化学社製、２６５．５ｇ）、水（５６．１ｇ）、デナコールＥＸ−３１３（ナガセケムテックス社製、３５．４ｇ）を反応容器に添加して５０℃で３０分間撹拌したのち、水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、５３１ｍｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１７．７ｇ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌を継続した。反応終了後、反応液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性部分架橋セルロースゲル５を得た。
（ｅ）多孔性架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲル５全量と、無水硫酸ナトリウム（和光純薬社製）と水から調製した２５重量％硫酸ナトリウム水溶液（４４２．５ｇ）を反応容器に添加して５０℃で３０分間撹拌した。次に、反応液に水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、５３１ｍｇ）を添加したのち、５０℃での撹拌を継続した条件で、エピクロロヒドリン（東京化成社製、４．４３ｇ）と４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、４．４３ｇ）を３０分間隔で１２回添加し、エピクロロヒドリンと４８％水酸化ナトリウム水溶液の添加終了後、さらに５０℃で１５時間撹拌を継続した。反応終了後、反応液を４０℃以下に冷却し、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲル５（１９０ｍＬ）を得た。
（２）排除限界分子量、空孔率及びＫａｖ測定
実施例１に記載の方法により測定した多孔性架橋セルロースゲル５の多糖類の排除限界分子量は１５０万であった。同じく実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル５の空孔率を算出した結果、空孔率は９０．６％であった。また、実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル５のＫａｖを算出した結果、チトクロムＣに対して０．８９、アルブミンに対して０．７６、アポフェリチンに対して０．６８、チログロブリンに対して０．５９であった。
（３）カラム圧力損失測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル５のカラム圧力損失を測定した結果、線速度１４９１ｃｍ／時（流速８．５ｍＬ／分）でのカラム圧力損失は０．２４ＭＰａであった。
（４）多孔性架橋セルロースゲルのホルミル化、プロテインＡ固定化及び抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル５をホルミル化した多孔性架橋セルロースゲル５Ｆを得たのち、プロテインＡを固定化した多孔性架橋セルロースゲル５ＦＰを得た。【０１１３】
同じく実施例１に記載の方法により多孔性架橋セルロースゲル５ＦＰのプロテインＡ固定化量を算出した結果、固定化量はゲル１ｍＬあたり１１．５ｍｇであった。同様に、多孔性架橋セルロースゲル５ＦＰの抗体吸着量を算出した結果、抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり６２．４ｍｇであった。
（５）プロテインＡを固定化していない多孔性架橋セルロースゲルの抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により、プロテインＡを固定化していない多孔性架橋セルロースゲル５の静的抗体吸着量を測定した結果、静的抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり０．６ｍｇであった。従って、多孔性架橋セルロースゲル５への抗体の非特異的吸着は低いことが明らかになった。【０１１４】
（比較例３）  多孔性架橋セルロースゲル６の製造
比較例３は、実施例３と同様に１０重量％水酸化ナトリウムと６重量％チオ尿素の混合水溶液に木綿由来セルロースを溶解して調製した６％セルロース溶液を使用し、実施例３の工程（ｃ）におけるゲル化剤の添加温度を２５℃として行なった場合の多孔性架橋セルロースゲルの製造及びクロマトグラフィー用充填剤としての特性評価に関するものである。
（１）多孔性架橋セルロースゲル６の製造
（ａ）セルロース溶液を得る工程
５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１４４．７ｇ）とチオ尿素（関東化学社製、１４．７ｇ）と水（８４．９ｇ）を混合して調製した１０重量％水酸化ナトリウム−６重量％チオ尿素混合水溶液（２２０ｍＬ）に、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製濾紙粉末Ｃ（１３．２ｇ、平均重合度１７６）を２５℃で添加し、氷冷下で２時間撹拌することにより、透明なセルロース溶液６を得た。
（ｂ）セルロース分散液を得る工程
工程（ａ）で得られたセルロース溶液６を使用し、比較例１に記載した方法により、セルロース分散液６を得た。
（ｃ）多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｂ）で得られたセルロース分散液６を使用し、比較例１に記載した方法により、粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル６（２２０ｍＬ）と粒子径１５０μｍ以上の多孔性未架橋セルロースゲル６（３０ｍＬ）を得た。
（ｄ）多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｃ）で得られた粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル６（１２５．２ｇ、含水率８９．８％、乾燥セルロース１２．８ｇ）、１，４−ジオキサン（関東化学社製、１９２．０ｇ）、水（７９．６ｇ）、デナコールＥＸ−３１３（ナガセケムテックス社製、２５．６ｇ）を反応容器に添加して５０℃で３０分間撹拌したのち、水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、３８４ｍｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１２．８ｇ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌を継続した。反応終了後、反応液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性部分架橋セルロースゲル６を得た。
（ｅ）多孔性架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲル６全量と、無水硫酸ナトリウム（和光純薬社製）と水から調製した２５重量％硫酸ナトリウム水溶液（４４２．５ｇ）を反応容器に添加して５０℃で３０分間撹拌した。次に、反応液に水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、３８４ｍｇ）を添加したのち、５０℃での撹拌を継続した条件で、エピクロロヒドリン（東京化成社製、３．２０ｇ）と４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、３．２０ｇ）を３０分間隔で１２回添加し、エピクロロヒドリンと４８％水酸化ナトリウム水溶液の添加終了後、さらに５０℃で１５時間撹拌を継続した。反応終了後、反応液を４０℃以下に冷却し、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲル６（１１５ｍＬ）を得た。
（２）空孔率及びＫａｖ測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル６の空孔率を算出した結果、空孔率は８６．５％であった。従って、多孔性架橋セルロースゲル６の空孔率は実施例３で製造した多孔性架橋セルロースゲル５に比較して低下することが明らかとなった。【０１１５】
また、実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル６のＫａｖを算出した結果、チトクロムＣに対して０．８４、アルブミンに対して０．７０、アポフェリチンに対して０．５８、チログロブリンに対して０．５２であった。
（３）カラム圧力損失測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル６のカラム圧力損失を測定した結果、線速度１４９１ｃｍ／時（流速８．５ｍＬ／分）でのカラム圧力損失は０．１６ＭＰａであった。
（４）多孔性架橋セルロースゲルのホルミル化、プロテインＡ固定化及び抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル６をホルミル化した多孔性架橋セルロースゲル６Ｆを得たのち、プロテインＡを固定化した多孔性架橋セルロースゲル６ＦＰを得た。【０１１６】
同じく実施例１に記載の方法により多孔性架橋セルロースゲル６ＦＰのプロテインＡ固定化量を算出した結果、固定化量はゲル１ｍＬあたり１１．５ｍｇであった。同様に、多孔性架橋セルロースゲル６ＦＰの抗体吸着量を算出した結果、抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり５３．１ｍｇであった。従って、多孔性架橋セルロースゲル６ＦＰの抗体吸着量は、実施例３で製造した多孔性架橋セルロースゲル５ＦＰに比較して低下することが明らかとなった。【０１１７】
実施例１から３と、比較例１から３の結果をまとめて表１に示す。工程（ｃ）においてゲル化剤添加時の温度を０℃から１０℃として製造した多孔性架橋セルロースゲル１、３、５は空孔率が９０％以上であったのに対して、ゲル化剤添加時の温度を２５℃として製造した多孔性架橋セルロースゲル２、４、６の空孔率は９０％以下であった。さらに、多孔性架橋セルロースゲル１、３、５それぞれにプロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤１ＦＰ、３ＦＰ、５ＦＰの抗体吸着量は、多孔性架橋セルロースゲル２、４、６それぞれにプロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤２ＦＰ、４ＦＰ、６ＦＰに比較して高いことが明らかとなった。【０１１８】
【表１】
0006764464.tif 000002
【０１１９】
（比較例４）  市販の多孔性架橋多糖系ゲルの特性評価
比較例４では、市販の多孔性架橋多糖系ゲルであるセルファインＧＣＬ−２０００（ＪＮＣ社製、多孔性架橋セルロースゲル、粒子径４０−１３０μｍ）を用い、実施例１に記載の方法によりクロマトグラフィー用充填剤としての特性を評価した。
（１）Ｋａｖ及び空孔率測定
実施例１に記載の方法により算出したセルファインＧＣＬ−２０００の空孔率は８９．６％であった。同じく実施例１に記載の方法により算出したセルファインＧＣＬ−２０００のＫａｖは、チトクロムＣに対して０．６６、アルブミンに対して０．４２、アポフェリチンに対して０．２６、チログロブリンに対して０．１９であった。
（２）カラム圧力損失測定
実施例１に記載の方法により測定したセルファインＧＣＬ−２０００のカラム圧力損失は、流速４．０ｍＬ／分（線速度７０２ｃｍ／時）において０．２５ＭＰａであったが、流速を４．５ｍＬ／分に上げるとポンプの圧力がＨＰＬＣシステムの限界に達し、通液できなくなった。【０１２０】
実施例１及び２と、比較例３における流速とカラム圧力損失の関係を示したグラフを図１に示した。図１から明らかなように、実施例１、２、３で製造した多孔性架橋セルロースゲル１、３、５のカラム圧力損失は、セルファインＧＣＬ−２０００よりも低いことが明らかとなった。
（３）市販多孔性架橋多糖系ゲルのホルミル化、プロテインＡ固定化及び抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により、セルファインＧＣＬ−２０００からホルミル化セルファインＧＣＬ−２０００を得たのち、プロテインＡ固定化セルファインＧＣＬ−２０００を得た。実施例１に記載の方法により算出したプロテインＡ固定化セルファインＧＣＬ−２０００のプロテインＡ固定化量はゲル１ｍＬあたり１０．９ｍｇであった。同じく実施例１に記載の方法により算出したプロテインＡ固定化セルファインＧＣＬ−２０００の抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり３１．８ｍｇであった。従って、多孔性架橋セルロースゲル１、３、５それぞれにプロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤１ＦＰ、３ＦＰ、５ＦＰは、同様の方法によりプロテインＡを固定化したセルファインＧＣＬ−２０００に比べて抗体吸着量が高いことが明らかとなった。【０１２１】
実施例１から実施例３及び比較例４の結果を表２に示す。【０１２２】
【表２】
0006764464.tif 000003
【０１２３】
（実施例４）  多孔性架橋セルロースゲル７の製造
実施例４は、７重量％水酸化ナトリウムと２２重量％尿素の混合水溶液に木綿由来セルロースを溶解して調製した５％セルロース溶液からの多孔性架橋セルロースゲルの製造及びクロマトグラフィー用充填剤としての特性評価に関するものである。
（１）多孔性架橋セルロースゲル７の製造
（ａ）セルロース溶液を得る工程
５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１４０．６ｇ）と尿素（関東化学社製、７４．６ｇ）と水（１２３．８ｇ）を混合して調製した７重量％水酸化ナトリウム−２２重量％尿素混合水溶液（３００ｍＬ）に、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製濾紙粉末Ｃ（１５．０ｇ、平均重合度１７６）を２５℃で添加し、氷冷下で２時間撹拌することにより、透明なセルロース溶液７を得た。
（ｂ）セルロース分散液を得る工程
工程（ａ）で得られたセルロース溶液７を２５℃で１時間撹拌したのち、エチルセルロース（関東化学社製、４５ｃＰ、３．４０ｇ）を含むトルエン（関東化学社製、４００ｍＬ）に２５℃で添加し、撹拌羽根を用いて４５０ｒｐｍで１０分間撹拌することによりセルロース分散液７を得た。
（ｃ）多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程
２５℃で４５０ｒｐｍでの撹拌を継続した条件で、工程（ｂ）で得られたセルロース分散液７を氷冷し、分散液の温度が５℃以下になったことを確認したのち、さらに氷冷下で１時間撹拌を継続した。次に、セルロース分散液の温度が０℃から１０℃の範囲となるよう冷却した条件で、４５０ｒｐｍでの撹拌を継続したセルロース分散液に氷冷したメタノール（関東化学社製、２００ｍＬ）を毎分１０ｍＬの速度で添加したのち、さらに氷冷下で１０分間撹拌を継続することにより、セルロースゲル懸濁液を得た。得られたセルロースゲル懸濁液を１．２Ｌのエタノールで５回、３．５Ｌの水で５回、順次洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル７（３５０ｍＬ）と粒子径１５０μｍ以上の多孔性未架橋セルロースゲル７（４５ｍＬ）を得た。
（ｄ）多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｃ）で得られた粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル７（２３１．３ｇ、含水率９３．８％、乾燥セルロース１４．３ｇ）、１，４−ジオキサン（関東化学社製、２８６．０ｇ）、水（６９．０ｇ）、デナコールＥＸ−３１３（ナガセケムテックス社製、２８．６ｇ）を混合し、５０℃で３０分間撹拌したのち、水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、４２９ｍｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１４．３ｇ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性部分架橋セルロースゲル７を得た。
（ｅ）多孔性架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲル７全量と、無水硫酸ナトリウム（和光純薬社製）と水から調製した２５重量％硫酸ナトリウム水溶液（３５７．５ｇ）、を混合し、５０℃で３０分間撹拌した。次に、反応液に水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、４２９ｍｇ）を添加したのち、５０℃での撹拌を継続した条件で、エピクロロヒドリン（東京化成社製、４．７８ｇ）と４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、４．７８ｇ）を３０分間隔で１２回添加し、エピクロロヒドリンと４８％水酸化ナトリウム水溶液の添加終了後、さらに５０℃で１５時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却し、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲル７（１９５ｍＬ）を得た。
（２）排除限界分子量、空孔率及びＫａｖ測定
実施例１に記載の方法により測定した多孔性架橋セルロースゲル７の多糖類の排除限界分子量は１９４万であった。同じく実施例１に記載の方法により算出した多孔性架橋セルロースゲル７の空孔率は９２．６％であった。同じく実施例１に記載の方法により算出した多孔性架橋セルロースゲル７のＫａｖは、チトクロムＣに対して０．９２、アルブミンに対して０．８０、アポフェリチンに対して０．７０、チログロブリンに対して０．６３であった。
（３）カラム圧力損失測定
実施例１に記載の方法により測定した多孔性架橋セルロースゲル７のカラム圧力損失は、線速度１４９１ｃｍ／時（流速８．５ｍＬ／分）において０．２６ＭＰａであった。
（４）多孔性架橋セルロースゲルのホルミル化、プロテインＡ固定化及び抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル７をホルミル化した多孔性架橋セルロースゲル７Ｆを得たのち、プロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤７ＦＰを得た。実施例１に記載の方法により算出した抗体精製用吸着剤７ＦＰのプロテインＡ固定化量はゲル１ｍＬあたり１０．８ｍｇであった。同じく実施例１に記載の方法により算出した抗体精製用吸着剤７ＦＰの抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり６４．９ｍｇであった。【０１２４】
（実施例５）  多孔性架橋セルロースゲル８の製造
実施例５は、９重量％水酸化ナトリウムと４重量％尿素と４重量％チオ尿素の混合水溶液に木綿由来セルロースを溶解して調製した５％セルロース溶液からの多孔性架橋セルロースゲルの製造及びクロマトグラフィー用充填剤としての特性評価に関するものである。
（１）多孔性架橋セルロースゲル８の製造
（ａ）セルロース溶液を得る工程
５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１７７．６ｇ）と尿素（関東化学社製、１３．３ｇ）とチオ尿素（関東化学社製、１３．３ｇ）と水（１２８．８ｇ）を混合して調製した９重量％水酸化ナトリウム−４重量％尿素−４重量％チオ尿素混合水溶液（３００ｍＬ）に、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製濾紙粉末Ｃ（１５．０ｇ、平均重合度１７６）を２５℃で添加し、氷冷下で２時間撹拌することにより、透明なセルロース溶液８を得た。
（ｂ）セルロース分散液を得る工程
工程（ａ）で得られたセルロース溶液８を２５℃で１時間撹拌したのち、エチルセルロース（関東化学社製、４５ｃＰ、３．４０ｇ）を含むトルエン（関東化学社製、４００ｍＬ）に２５℃で添加し、撹拌羽根を用いて５００ｒｐｍで１０分間撹拌することによりセルロース分散液８を得た。
（ｃ）多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｂ）で得られたセルロース分散液８を使用し、実施例１に記載した方法により、粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル８（３８０ｍＬ）と粒子径１５０μｍ以上の多孔性未架橋セルロースゲル８（４０ｍＬ）を得た。
（ｄ）多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｃ）で得られた粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル８（２１０．７ｇ、含水率９３．０％、乾燥セルロース１４．７ｇ）、１，４−ジオキサン（関東化学社製、２９４．０ｇ）、水（９８．０ｇ）、デナコールＥＸ−３１３（ナガセケムテックス社製、２９．４ｇ）を混合し、５０℃で３０分間撹拌したのち、水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、４４１ｍｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１４．７ｇ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性部分架橋セルロースゲル８を得た。
（ｅ）多孔性架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲル８全量と、無水硫酸ナトリウム（和光純薬社製）と水から調製した２５重量％硫酸ナトリウム水溶液（３６７．５ｇ）、を混合し、５０℃で３０分間撹拌した。次に、反応液に水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、４４１ｍｇ）を添加したのち、５０℃での撹拌を継続した条件で、エピクロロヒドリン（東京化成社製、４．９２ｇ）と４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、４．９２ｇ）を３０分間隔で１２回添加し、エピクロロヒドリンと４８％水酸化ナトリウム水溶液の添加終了後、さらに５０℃で１５時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却し、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲル８（１８０ｍＬ）を得た。
（２）排除限界分子量、空孔率及びＫａｖ測定
実施例１に記載の方法により測定した多孔性架橋セルロースゲル８の多糖類の排除限界分子量は２０４万であった。同じく実施例１に記載の方法により算出した多孔性架橋セルロースゲル８の空孔率は９１．４％であった。同じく実施例１に記載の方法により算出した多孔性架橋セルロースゲル８のＫａｖは、チトクロムＣに対して０．９２、アルブミンに対して０．８０、アポフェリチンに対して０．７０、チログロブリンに対して０．６３であった。
（３）カラム圧力損失測定
実施例１に記載の方法により測定した多孔性架橋セルロースゲル８のカラム圧力損失は、線速度１４９１ｃｍ／時（流速８．５ｍＬ／分）において０．２８ＭＰａであった。
（４）多孔性架橋セルロースゲルのホルミル化、プロテインＡ固定化及び抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル８をホルミル化した多孔性架橋セルロースゲル８Ｆを得たのち、プロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤８ＦＰを得た。実施例１に記載の方法により算出した抗体精製用吸着剤８ＦＰのプロテインＡ固定化量はゲル１ｍＬあたり１１．１ｍｇであった。同じく実施例１に記載の方法により算出した抗体精製用吸着剤８ＦＰの抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり５９．４ｍｇであった。【０１２５】
（実施例６）  多孔性架橋セルロースゲル９の製造
実施例６は、１０重量％水酸化ナトリウムと６重量％チオ尿素の混合水溶液に木綿由来セルロースを溶解して調製した５％セルロース溶液からの多孔性架橋セルロースゲルの製造及びクロマトグラフィー用充填剤としての特性評価に関するものである。
（１）多孔性架橋セルロースゲル９の製造
（ａ）セルロース溶液を得る工程
５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１９７．３ｇ）とチオ尿素（関東化学社製、２０．０ｇ）と水（１１５．７ｇ）を混合して調製した１０重量％水酸化ナトリウム−６重量％チオ尿素混合水溶液（３００ｍＬ）に、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製濾紙粉末Ｃ（１５．０ｇ、平均重合度１７６）を２５℃で添加し、氷冷下で２時間撹拌することにより、透明なセルロース溶液９を得た。
（ｂ）セルロース分散液を得る工程
工程（ａ）で得られたセルロース溶液９を使用し、実施例４に記載した方法により、セルロース分散液９を得た。
（ｃ）多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｂ）で得られたセルロース分散液９を使用し、実施例４に記載した方法により、粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル９（３５０ｍＬ）と粒子径１５０μｍ以上の多孔性未架橋セルロースゲル９（２５ｍＬ）を得た。
（ｄ）多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｃ）で得られた粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル９（１９４．１ｇ、含水率９２．５％、乾燥セルロース１４．６ｇ）、１，４−ジオキサン（関東化学社製、２９２．０ｇ）、水（１１２．５ｇ）、デナコールＥＸ−３１３（ナガセケムテックス社製、２９．２ｇ）を反応容器に添加して５０℃で３０分間撹拌したのち、水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、４３８ｍｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１４．６ｇ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌を継続した。反応終了後、反応液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性部分架橋セルロースゲル９を得た。
（ｅ）多孔性架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲル９全量と、無水硫酸ナトリウム（和光純薬社製）と水から調製した２５重量％硫酸ナトリウム水溶液（３６５．０ｇ）、を反応容器に添加して５０℃で３０分間撹拌した。次に、反応液に水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、４３８ｍｇ）を添加したのち、５０℃での撹拌を継続した条件で、エピクロロヒドリン（東京化成社製、４．８５ｇ）と４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、４．８５ｇ）を３０分間隔で１２回添加し、エピクロロヒドリンと４８％水酸化ナトリウム水溶液の添加終了後、さらに５０℃で１５時間撹拌を継続した。反応終了後、反応液を４０℃以下に冷却し、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲル９（２１０ｍＬ）を得た。
（２）排除限界分子量、空孔率及びＫａｖ測定
実施例１に記載の方法により測定した多孔性架橋セルロースゲル９の多糖類の排除限界分子量は２１０万であった。同じく実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル９の空孔率を算出した結果、空孔率は９１．２％であった。また、実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル９のＫａｖを算出した結果、チトクロムＣに対して０．９２、アルブミンに対して０．８１、アポフェリチンに対して０．７３、チログロブリンに対して０．６５であった。
（３）カラム圧力損失測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル９のカラム圧力損失を測定した結果、線速度１４９１ｃｍ／時（流速８．５ｍＬ／分）でのカラム圧力損失は０．２６ＭＰａであった。
（４）多孔性架橋セルロースゲルのホルミル化、プロテインＡ固定化及び抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル９をホルミル化した多孔性架橋セルロースゲル９Ｆを得たのち、プロテインＡを固定化した多孔性架橋セルロースゲル９ＦＰを得た。【０１２６】
同じく実施例１に記載の方法により多孔性架橋セルロースゲル９ＦＰのプロテインＡ固定化量を算出した結果、固定化量はゲル１ｍＬあたり１１．８ｍｇであった。同様に、多孔性架橋セルロースゲル９ＦＰの抗体吸着量を算出した結果、抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり５８．９ｍｇであった。【０１２７】
実施例４から６の結果を、実施例１から３の結果と併せて表３に示す。【０１２８】
【表３】
0006764464.tif 000004
【０１２９】
（実施例７）  多孔性架橋セルロースゲル１０の製造
実施例７は、８重量％水酸化ナトリウムと１７重量％尿素の混合水溶液に木綿由来セルロースを溶解して調製した５％セルロース溶液からの多孔性架橋セルロースゲルの製造及びクロマトグラフィー用充填剤としての特性評価に関するものである。
（１）多孔性架橋セルロースゲル１０の製造
（ａ）セルロース溶液を得る工程
５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１６０．７ｇ）と尿素（関東化学社製、５７．６ｇ）と水（１２０．７ｇ）を混合して調製した８重量％水酸化ナトリウム−１７重量％尿素混合水溶液（３００ｍＬ）に、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製濾紙粉末Ｃ（１５．０ｇ、平均重合度１７６）を２５℃で添加し、氷冷下で２時間撹拌することにより、透明なセルロース溶液１０を得た。
（ｂ）セルロース分散液を得る工程
工程（ａ）で得られたセルロース溶液１０を使用し、実施例３に記載した方法により、セルロース分散液１０を得た。
（ｃ）多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｂ）で得られたセルロース分散液１０を使用し、実施例３に記載した方法により、粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル１０（３５０ｍＬ）と粒子径１５０μｍ以上の多孔性未架橋セルロースゲル１０（４０ｍＬ）を得た。
（ｄ）多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｃ）で得られた粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル１０（２２７．６ｇ、含水率９３．８％、乾燥セルロース１４．１ｇ）、１，４−ジオキサン（関東化学社製、２８２．０ｇ）、水（６８．５ｇ）、デナコールＥＸ−３１３（ナガセケムテックス社製、２８．２ｇ）を混合し、５０℃で３０分間撹拌したのち、水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、４２３ｍｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１４．１ｇ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性部分架橋セルロースゲル１０を得た。
（ｅ）多孔性架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲル１０全量と、無水硫酸ナトリウム（和光純薬社製）と水から調製した２５重量％硫酸ナトリウム水溶液（３５２．５ｇ）、を混合し、５０℃で３０分間撹拌した。次に、反応液に水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、４２３ｍｇ）を添加したのち、５０℃での撹拌を継続した条件で、エピクロロヒドリン（東京化成社製、４．７０ｇ）と４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、４．７０ｇ）を３０分間隔で１２回添加し、エピクロロヒドリンと４８％水酸化ナトリウム水溶液の添加終了後、さらに５０℃で１５時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却し、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲル１０（１８５ｍＬ）を得た。
（２）空孔率及びＫａｖ測定
実施例１に記載の方法により算出した多孔性架橋セルロースゲル１０の空孔率は９１．４％であった。同じく実施例１に記載の方法により算出した多孔性架橋セルロースゲル１０のＫａｖは、チトクロムＣに対して０．９２、アルブミンに対して０．７９、アポフェリチンに対して０．６７、チログロブリンに対して０．６１であった。
（３）カラム圧力損失測定
実施例１に記載の方法により測定した多孔性架橋セルロースゲル１０のカラム圧力損失は、線速度１４９１ｃｍ／時（流速８．５ｍＬ／分）においてカラム圧力損失は０．２３ＭＰａであった。
（４）多孔性架橋セルロースゲルのホルミル化、プロテインＡ固定化及び抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル１０をホルミル化した多孔性架橋セルロースゲル１０Ｆを得たのち、プロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤１０ＦＰを得た。実施例１に記載の方法により算出した抗体精製用吸着剤１０ＦＰのプロテインＡ固定化量はゲル１ｍＬあたり１１．０ｍｇであった。同じく実施例１に記載の方法により算出した抗体精製用吸着剤１０ＦＰの抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり６２．５ｍｇであった。【０１３０】
（比較例５）  多孔性架橋セルロースゲル１１の製造
比較例５では、実施例７と同様に８重量％水酸化ナトリウムと１７重量％尿素の混合水溶液に、木綿由来セルロースを溶解して調製した５％セルロース溶液から多孔性未架橋セルロースゲルを得たのち、実施例７における工程（ｅ）を省略して多孔性架橋セルロースゲルを製造した。
（１）多孔性架橋セルロースゲル１１の製造
工程（ａ）から工程（ｃ）までの工程を実施例７に記載した方法で行うことにより、粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル１１を得た。
（ｄ）多孔性架橋セルロースゲルを得る工程
粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル１１（２９．１ｇ、含水率９１．４％、乾燥セルロース２．５ｇ）、１，４−ジオキサン（関東化学社製、５０．０ｇ）、水（２３．４ｇ）、デナコールＥＸ−３１３（ナガセケムテックス社製、５．０ｇ）を混合し、５０℃で３０分間撹拌したのち、水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、７５ｍｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、２．５ｇ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却し、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲル１１（２８ｍＬ）を得た。
（２）空孔率及びＫａｖ測定
実施例１に記載の方法により、粒子径が４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲル１１をカラムに充填し、水を０．３ｍＬ／分で通液したところ、カラム圧力損失が１ＭＰａを超えた状態となり、さらに流速を０．５ｍＬ／分に上げるとポンプの圧力がＨＰＬＣシステムの限界に達し、通液できなくなった。従って、多孔性架橋セルロースゲル１１のＫａｖ、空孔率、及びカラム圧力損失測定は行わなかった。【０１３１】
（比較例６）  多孔性架橋セルロースゲル１２の製造
比較例６では、実施例７と同様に８重量％水酸化ナトリウムと１７重量％尿素の混合水溶液に木綿由来セルロースを溶解して調製した５％セルロース溶液から多孔性未架橋セルロースゲルを得たのち、実施例７における工程（ｄ）を特許文献６の実施例１、４及び７に記載の方法に従って行い、且つ工程（ｅ）を省略した方法により、多孔性架橋セルロースゲルを製造した。
（１）多孔性架橋セルロースゲル１２の製造
工程（ａ）から工程（ｃ）までの工程を実施例７に記載した方法で行うことにより、粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル１２を得た。
（ｄ）多孔性架橋セルロースゲルを得る工程
粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル１２（３０．０ｇ、含水率９１．５％、乾燥セルロース２．６ｇ）と、水酸化ナトリウム（和光純薬社製）と水から調製した０．６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（３０．０ｍＬ）を混合し、４０℃で３０分間撹拌した。次に水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、６０ｍｇ）とデナコールＥＸ−３１３（ナガセケムテックス社製、３０．０ｍＬ）を添加して５０℃で５時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性架橋セルロースゲル１２Ａを得た。【０１３２】
得られた多孔性架橋セルロースゲル１２Ａ全量を耐熱ガラス製容器に添加し、オートクレーブ（トミー精工社製ＳＳ−２４５）を用いて１２１℃で４０分間加熱した。容器を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性架橋セルロースゲル１２Ｂを得た。【０１３３】
次に、得られた多孔性架橋セルロースゲル１２Ｂ全量と、水酸化ナトリウム（和光純薬社製）と水から調製した０．６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（３０．０ｍＬ）を混合し、４０℃で３０分間撹拌した。さらに、反応液に水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、６０ｍｇ）とデナコールＥＸ−３１３（ナガセケムテックス社製、３０．０ｍＬ）を添加して５０℃で５時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性架橋セルロースゲル１２Ｃを得た。【０１３４】
得られた多孔性架橋セルロースゲル１２Ｃ全量を耐熱ガラス製容器に添加し、オートクレーブ（トミー精工社製ＳＳ−２４５）を用いて１２１℃で４０分間加熱した。容器を４０℃以下に冷却し、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲル１２（４０ｍＬ）を得た。
（２）空孔率及びＫａｖ測定
実施例１に記載の方法により算出した多孔性架橋セルロースゲル１２の空孔率は８６．７％であった。同じく実施例１に記載の方法により算出した多孔性架橋セルロースゲル１２のＫａｖは、チトクロムＣに対して０．８０、アルブミンに対して０．７０、アポフェリチンに対して０．６２、チログロブリンに対して０．５８であった。
（３）カラム圧力損失測定
実施例１に記載の方法により測定した多孔性架橋セルロースゲル１２のカラム圧力損失は、流速２．０ｍＬ／分（線速度３５１ｃｍ／時）において１．５６ＭＰａとなり、流速を２．５ｍＬ／分に上げるとポンプの圧力がＨＰＬＣシステムの限界に達し、通液できなくなった。
（４）多孔性架橋セルロースゲルのホルミル化、プロテインＡ固定化及び抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル１２をホルミル化した多孔性架橋セルロースゲル１２Ｆを得たのち、プロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤１２ＦＰを得た。実施例１に記載の方法により算出した抗体精製用吸着剤１２ＦＰのプロテインＡ固定化量はゲル１ｍＬあたり１１．３ｍｇであった。同じく実施例１に記載の方法により算出した抗体精製用吸着剤１２ＦＰの抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり４４．１ｍｇであった。従って、抗体精製用吸着剤１２ＦＰの抗体吸着量は、実施例７で製造した抗体精製用吸着剤１０ＦＰに比較して低下することが明らかとなった。【０１３５】
（比較例７）  多孔性架橋セルロースゲル１３の製造
比較例７では、実施例７と同様に８重量％水酸化ナトリウムと１７重量％尿素の混合水溶液に木綿由来セルロースを溶解して調製した５％セルロース溶液から多孔性未架橋セルロースゲルを得たのち、実施例７における工程（ｄ）を省略して多孔性架橋セルロースゲルを製造した。
（１）多孔性架橋セルロースゲル１３の製造
工程（ａ）から工程（ｃ）までの工程を実施例７に記載した方法で行うことにより、粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル１３を得た。
（ｅ）多孔性架橋セルロースゲルを得る工程
粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル１３（８７．３ｇ、含水率９１．５％、乾燥セルロース７．４ｇ）と、無水硫酸ナトリウム（和光純薬社製）と水から調製した２５重量％硫酸ナトリウム水溶液（１８５．０ｇ）、を混合し、５０℃で３０分間撹拌した。次に、反応液に水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、２２２ｍｇ）を添加したのち、５０℃での撹拌を継続した条件で、エピクロロヒドリン（東京化成社製、２．４７ｇ）と４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、２．４７ｇ）を３０分間隔で１２回添加し、エピクロロヒドリンと４８％水酸化ナトリウム水溶液の添加終了後、さらに５０℃で１５時間撹拌を継続した。反応後、反応液を４０℃以下に冷却し、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲル１３（１０５ｍＬ）を得た。
（２）空孔率及びＫａｖ測定
実施例１に記載の方法により算出した多孔性架橋セルロースゲル１３の空孔率は８９．８％であった。同じく実施例１に記載の方法により算出した多孔性架橋セルロースゲル１３のＫａｖは、チトクロムＣに対して０．９０、アルブミンに対して０．７５、アポフェリチンに対して０．６７、チログロブリンに対して０．６３であった。
（３）カラム圧力損失測定
実施例１に記載の方法により測定した多孔性架橋セルロースゲル１３のカラム圧力損失は、流速４．５ｍＬ／分（線速度７９０ｃｍ／時）においてカラム圧力損失が１．４４ＭＰａとなり、流速を５．０ｍＬ／分に上げるとポンプの圧力がＨＰＬＣシステムの限界に達し、通液できなくなった。
（４）多孔性架橋セルロースゲルのホルミル化、プロテインＡ固定化及び抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル１３をホルミル化した多孔性架橋セルロースゲル１３Ｆを得たのち、プロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤１３ＦＰを得た。実施例１に記載の方法により算出した抗体精製用吸着剤１３ＦＰのプロテインＡ固定化量はゲル１ｍＬあたり１１．５ｍｇであった。同じく実施例１に記載の方法により算出した抗体精製用吸着剤１３ＦＰの抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり５５．４ｍｇであった。従って、抗体精製用吸着剤１３ＦＰの抗体吸着量は、実施例７で製造した抗体精製用吸着剤１０ＦＰに比較して低下することが明らかとなった。【０１３６】
実施例７で製造した多孔性架橋セルロースゲル１０と、比較例６及び７で製造した多孔性架橋セルロースゲル１２及び１３の流速とカラム圧力損失の関係を示したグラフを図２に示した。図２から明らかのように、実施例７で製造した多孔性架橋セルロースゲル１０のカラム圧力損失は、比較例６及び７で製造した多孔性架橋セルロースゲル１２及び１３よりも低いことが明らかとなった。【０１３７】
実施例７、比較例６及び７の結果をまとめて表４に示す。【０１３８】
【表４】
0006764464.tif 000005
【０１３９】
（実施例８）  多孔性架橋セルロースゲル１４の製造
実施例８は、８重量％水酸化ナトリウムと１７重量％尿素の混合水溶液に木材パルプ由来セルロースを溶解して調製した５％セルロース溶液からの多孔性架橋セルロースゲルの製造及びクロマトグラフィー用充填剤としての特性評価に関するものである。
（１）多孔性架橋セルロースゲル１４の製造
（ａ）セルロース溶液を得る工程
ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製濾紙粉末Ｃの代わりに旭化成社製セオラスＰＨ−１０１（１５．０ｇ、平均重合度１７３）を用いた以外は実施例７に記載した方法により、透明なセルロース溶液１４を得た。
（ｂ）セルロース分散液を得る工程
工程（ａ）で得られたセルロース溶液１４を２５℃で１時間撹拌したのち、エチルセルロース（関東化学社製、４５ｃＰ、３．６０ｇ）を含むトルエン（関東化学社製、４００ｍＬ）に２５℃で添加し、撹拌羽根を用いて５００ｒｐｍで１０分間撹拌することによりセルロース分散液１４を得た。
（ｃ）多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｂ）で得られたセルロース分散液１４を使用し、実施例１に記載した方法により、粒子径１５０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル１４（３５０ｍＬ）と粒子径１４０μｍ以上の多孔性未架橋セルロースゲル１４（５０ｍＬ）を得た。
（ｄ）多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｃ）で得られた粒子径１４０μｍ以下の多孔性未架橋セルロースゲル１４（１７８．８ｇ、含水率９２．１％、乾燥セルロース１４．１ｇ）、１，４−ジオキサン（関東化学社製、２８２．０ｇ）、水（６８．５ｇ）、デナコールＥＸ−３１３（ナガセケムテックス社製、２８．２ｇ）を反応容器に添加して５０℃で３０分間撹拌したのち、水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、４２３ｍｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１４．１ｇ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌を継続した。反応終了後、反応液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性部分架橋セルロースゲル１４を得た。
（ｅ）多孔性架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲル１４全量と、無水硫酸ナトリウム（和光純薬社製）と水から調製した２５重量％硫酸ナトリウム水溶液（３５２．５ｇ）、を反応容器に添加して５０℃で３０分間撹拌した。次に、反応液に水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製、４２３ｍｇ）を添加したのち、５０℃での撹拌を継続した条件で、エピクロロヒドリン（東京化成社製、４．７０ｇ）と４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、４．７０ｇ）を３０分間隔で１２回添加し、エピクロロヒドリンと４８％水酸化ナトリウム水溶液の添加終了後、さらに５０℃で１４時間撹拌を継続した。反応終了後、反応液を４０℃以下に冷却し、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄したのち、篩いを用いて分級することにより、粒子径４５μｍ以上９０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲル１４（１６５ｍＬ）を得た。
（２）空孔率及びＫａｖ測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル１４の空孔率を算出した結果、空孔率は９０．５％であった。また、実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル１４のＫａｖを算出した結果、チトクロムＣに対して０．９１、アルブミンに対して０．７８、アポフェリチンに対して０．６９、チログロブリンに対して０．６４であった。
（３）カラム圧力損失測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル１４のカラム圧力損失を測定した結果、線速度１４９１ｃｍ／時（流速８．５ｍＬ／分）でのカラム圧力損失は０．２７ＭＰａであった。
（４）多孔性架橋セルロースゲルのホルミル化、プロテインＡ固定化及び抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル１４をホルミル化した多孔性架橋セルロースゲル１４Ｆを得たのち、プロテインＡを固定化した多孔性架橋セルロースゲル１４ＦＰを得た。【０１４０】
同じく実施例１に記載の方法により多孔性架橋セルロースゲル１４ＦＰのプロテインＡ固定化量を算出した結果、固定化量はゲル１ｍＬあたり１１．１ｍｇであった。同様に、多孔性架橋セルロースゲル１４ＦＰの抗体吸着量を算出した結果、抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり６２．６ｍｇであった。【０１４１】
実施例４、７、８の結果をまとめて表５に示す。【０１４２】
【表５】
0006764464.tif 000006
【０１４３】
（実施例９）  スペーサーを介してプロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤の製造−１
実施例９では、多孔性架橋セルロースゲルにスペーサー（６原子）を介してプロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤を製造し、その抗体吸着量を測定した。
（１）多孔性架橋セルロースゲルへのスペーサー導入及びホルミル化
実施例１で製造した多孔性架橋セルロースゲル１（３．０ｇ）、水（３．０ｇ）、ジメチルスルホキシド（３．０ｇ）、エピクロロヒドリン（東京化成社製、０．６ｇ）を混合し、３０℃で３０分間攪拌したのち、４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、１．６４ｍＬ）を添加し、さらに３０℃で３時間撹拌することによりエポキシ化反応を行なった。反応後、グラスフィルターを使用してろ液が中性になるまで多量の水で洗浄することにより、エポキシ化多孔性架橋セルロースゲルを得た。【０１４４】
次にエポキシ化多孔性架橋セルロースゲル（３．０ｇ）と、Ｄ−グルカミン（東京化成社製）と水から調製したＤ−グルカミン水溶液（９０ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍＬ）、水（３．０ｍＬ）を混合し、４０℃で１６時間撹拌することによりアミノ化反応を行なった。反応後、グラスフィルター上でろ液が中性になるまで多量の水で洗浄することにより、アミノ化多孔性架橋セルロースゲルを得た。【０１４５】
アミノ化多孔性架橋セルロースゲル（３．０ｇ）と、過ヨウ素酸ナトリウム（関東化学社製）と水から調製した過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍＬ）、水（１．５ｍＬ）を混合し、２５℃で６０分間撹拌することによりホルミル化反応を行なった。反応後、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性架橋セルロースゲル１にスペーサーを導入したのち、ホルミル基を導入した多孔性架橋セルロースゲル１Ｓを得た。【０１４６】
同様の手法により、実施例２で製造した多孔性架橋セルロースゲル３及び実施例３で製造した多孔性架橋セルロースゲル５から、ホルミル基を導入した多孔性架橋セルロースゲル３Ｓ及び多孔性架橋セルロースゲル５Ｓを得た。
（２）ホルミル化多孔性架橋セルロースゲルへのプロテインＡ固定化
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル１ＳにプロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤１ＳＰを得た。同じく実施例１に記載の方法により抗体精製用吸着剤１ＳＰのプロテインＡ固定化量を算出した結果、固定化量はゲル１ｍＬあたり１１．０ｍｇであった。【０１４７】
同様の手法により、多孔性架橋セルロースゲル３Ｓ及び５Ｓから抗体精製用吸着剤３ＳＰ及び５ＳＰを得た。前述の方法により抗体精製用吸着剤３ＳＰ及び５ＳＰのプロテインＡ固定化量を算出した結果、抗体精製用吸着剤３ＳＰの固定化量はゲル１ｍＬあたり１０．９ｍｇ、抗体精製用吸着剤５ＳＰの固定化量はゲル１ｍＬあたり１１．２ｍｇであった。
（３）プロテインＡ固定化抗体精製用吸着剤の抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により、抗体精製用吸着剤１ＳＰの抗体吸着量を算出した結果、抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり７８．５ｍｇであった。同様の手法により抗体精製用吸着剤３ＳＰ及び抗体精製用吸着剤５ＳＰの抗体吸着量を測定した結果、抗体精製用吸着剤３ＳＰの抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり８０．７ｍｇ、抗体精製用吸着剤５ＳＰの抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり７３．７ｍｇであった。下記にて、スペーサー（６原子）を介してプロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤１ＳＰ、３ＳＰ、５ＳＰの構造を示す。【０１４８】
【化１】
0006764464.tif 000007
【０１４９】
（実施例１０）  スペーサーを介してプロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤の製造−２
実施例１０では、実施例９よりも長いスペーサー（１５原子）を介してプロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤を製造し、その抗体吸着量を測定した。
（１）多孔性架橋セルロースゲルへのスペーサー導入及びホルミル化
実施例１で製造した多孔性架橋セルロースゲル１（３．０ｇ）、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（アルドリッチ社製、０．６ｇ）、０．２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（１．５ｍＬ）、水（１．５ｇ）を混合し、５０℃で８時間撹拌することによりエポキシ化反応を行なった。反応後、グラスフィルターを使用してろ液が中性になるまで多量の水で洗浄することにより、エポキシ化多孔性架橋セルロースゲルを得た。【０１５０】
次にエポキシ化多孔性架橋セルロースゲル（３．０ｇ）と、Ｄ−グルカミン（東京化成社製）と水から調製したＤ−グルカミン水溶液（９０ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍＬ）、水（３．０ｍＬ）を混合し、４０℃で１６時間撹拌することによりアミノ化反応を行なった。反応後、グラスフィルター上でろ液が中性になるまで多量の水で洗浄することにより、アミノ化多孔性架橋セルロースゲルを得た。【０１５１】
アミノ化多孔性架橋セルロースゲル（３．０ｇ）と、過ヨウ素酸ナトリウム（関東化学社製）と水から調製した過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍＬ）、水（１．５ｍＬ）を混合し、２５℃で６０分間撹拌することによりホルミル化反応を行なった。反応後、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性架橋セルロースゲル１にスペーサーを導入したのち、ホルミル基を導入した多孔性架橋セルロースゲル１Ｌを得た。【０１５２】
同様の手法により、実施例２で製造した多孔性架橋セルロースゲル３及び実施例３で製造した多孔性架橋セルロースゲル５から、ホルミル基を導入した多孔性架橋セルロースゲル３Ｌ及び多孔性架橋セルロースゲル５Ｌを得た。
（２）ホルミル化多孔性架橋セルロースゲルへのプロテインＡ固定化
実施例１に記載の方法により、多孔性架橋セルロースゲル１ＬにプロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤１ＬＰを得た。同じく実施例１に記載の方法により抗体精製用吸着剤１ＬＰのプロテインＡ固定化量を算出した結果、固定化量はゲル１ｍＬあたり１１．５ｍｇであった。【０１５３】
同様の手法により、多孔性架橋セルロースゲル３Ｌ及び５Ｌから抗体精製用吸着剤３ＬＰ及び５ＬＰを得た。前述の方法により抗体精製用吸着剤３ＬＰ及び５ＬＰのプロテインＡ固定化量を算出した結果、抗体精製用吸着剤３ＬＰの固定化量はゲル１ｍＬあたり１１．１ｍｇ、抗体精製用吸着剤５ＬＰの固定化量はゲル１ｍＬあたり１０．９ｍｇであった。
（３）プロテインＡ固定化抗体精製用吸着剤の抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により、抗体精製用吸着剤１ＬＰの抗体吸着量を算出した結果、抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり８３．７ｍｇであった。同様の手法により抗体精製用吸着剤３ＬＰ及び抗体精製用吸着剤５ＬＰの抗体吸着量を測定した結果、抗体精製用吸着剤３ＬＰの抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり８４．６ｍｇ、抗体精製用吸着剤５ＬＰの抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり７６．７ｍｇであった。下記にて、１５原子のスペーサーを介してプロテインＡを固定化した抗体精製用吸着剤１ＬＰ、３ＬＰ、５ＬＰの構造を示す。【０１５４】
【化２】
0006764464.tif 000008
【０１５５】
実施例９及び１０の結果を、実施例１から３の結果と併せ、まとめて表６に示す。短いスペーサー（６原子）を導入した抗体精製用吸着剤１ＳＰ、３ＳＰ及び５ＳＰの抗体吸着量は、スペーサーを導入していない抗体精製用吸着剤１ＦＰ、３ＦＰ及び５ＦＰと比較して高くなり、さらに、長いスペーサー（１５原子）を導入した抗体精製用吸着剤１ＬＰ、３ＬＰ及び５ＬＰの抗体吸着量は、短いスペーサーを導入した抗体精製用吸着剤１ＳＰ、３ＳＰ及び５ＳＰと比較してさらに高くなることが明らかとなった。【０１５６】
【表６】
0006764464.tif 000009
【０１５７】
（実施例１１）  スペーサーを導入してＦｃ結合性タンパク質を固定化した抗体精製用吸着剤の製造
実施例１１では、多孔性架橋セルロースゲルにスペーサーを導入したのち、マレイミド化、Ｆｃ結合性タンパク質固定化を順次行なうことによりＦｃ結合性タンパク質固定化多孔性架橋セルロースゲルを製造し、その抗体吸着量を測定した。
（１）多孔性架橋セルロースゲルへのスペーサー導入及びマレイミド化
実施例１で製造した多孔性架橋セルロースゲル１（２．０ｇ）、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（アルドリッチ社製、１．０ｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、３１ｍｇ）、水（３．０ｇ）を混合し、５０℃で８時間撹拌することによりエポキシ化反応を行なった。反応後、グラスフィルターを使用してろ液が中性になるまで多量の水で洗浄することにより、エポキシ化多孔性架橋セルロースゲルを得た。【０１５８】
次にエポキシ化多孔性架橋セルロースゲル（２．０ｇ）とエチレンジアミン（東京化成社製、１．０ｇ）、水（４．０ｇ）を混合し、５０℃で４時間撹拌することによりアミノ化反応を行なった。反応後、グラスフィルター上でろ液が中性になるまで多量の水で洗浄することにより、アミノ化多孔性架橋セルロースゲルを得た。【０１５９】
得られたアミノ化多孔性架橋セルロースゲル（１．０ｇ）と、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（東京化成社製、８．０ｍｇ）、１，４−ジオキサン（関東化学社製、２．０ｍＬ）を混合し、３５℃で４時間撹拌することにより、マレイミド化反応を行なった。反応後、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、多孔性架橋セルロースゲル１にスペーサーを導入したのち、マレイミド基を導入した多孔性架橋セルロースゲル１Ｍを得た。同様の手法により、実施例２で製造した多孔性架橋セルロースゲル３及び実施例３で製造した多孔性架橋セルロースゲル５から、ホルミル基を導入した多孔性架橋セルロースゲル３Ｍ及び多孔性架橋セルロースゲル５Ｍを得た。
（２）マレイミド化多孔性架橋セルロースゲルへのＦｃ結合性タンパク質固定化
マレイミド化多孔性架橋セルロースゲルへのＦｃ結合性タンパク質の固定化は、特開２０１４−１８７９９３公報に開示されている方法を利用して行なった。【０１６０】
前述の多孔性架橋セルロースゲル１Ｍに水を添加することで調製した５０容積％懸濁液（１００μＬ）を反応容器（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、ミニバイオスピンクロマトグラフィーカラム）に添加し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、１５０μＬ）で５回洗浄した。なお、マレイミド化多孔性架橋セルロースゲル１Ｍの５０容積％懸濁液は、水で懸濁したマレイミド化多孔性架橋セルロースゲル１Ｍをメスシリンダー内で沈降させ、時々タッピングを行なって容積が一定になるまで放置したのち、マレイミド化多孔性架橋セルロースゲル１Ｍの容積が５０％となるよう、水を添加することで調製した。【０１６１】
次に、リン酸緩衝液で洗浄した多孔性架橋セルロースゲル１Ｍ（５０μＬ）が入った反応容器に、特開２０１４−１８７９９３公報に記載の方法で作製されたＦｃ結合性タンパク質溶液（ＦｃＲｍ６８−ＣＧ、濃度９．２ｍｇ／ｍＬ、１５０μＬ）及び１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５、７．５μＬ）を添加し、３５℃で３時間撹拌することにより、Ｆｃ結合性タンパク質を多孔性架橋セルロースゲル１Ｍに固定化した。固定化反応後、ＰＢＳ７．０溶液及び５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で洗浄することにより、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した抗体精製用吸着剤１ＭＦを得た。【０１６２】
反応液及び洗浄液を回収し、２８０ｎｍの吸光度を測定することにより未反応のＦｃ結合性タンパク質量を求めたのち、反応に使用したＦｃ結合性タンパク質量から未反応のＦｃ結合性タンパク質量を差し引くことで抗体精製用吸着剤１ＭＦのＦｃ結合性タンパク質固定化量を算出した結果、固定化量はゲル１ｍＬあたり２２．５ｍｇであった。同様の手法により、多孔性架橋セルロースゲル３Ｍ及び５Ｍから抗体精製用吸着剤３ＭＦ及び５ＭＦを得た。また、前述の方法により抗体精製用吸着剤３ＭＦ及び５ＭＦのＦｃ結合性タンパク質固定化量を算出した結果、抗体精製用吸着剤３ＭＦの固定化量はゲル１ｍＬあたり２０．８ｍｇ、抗体精製用吸着剤５ＭＦの固定化量はゲル１ｍＬあたり１９．２ｍｇであった。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質固定化多孔性架橋セルロースゲルの抗体吸着量測定
実施例１に記載の方法により算出した抗体精製用吸着剤１ＭＦ、３ＭＦ、５ＭＦの抗体吸着量は、抗体精製用吸着剤１ＭＦがゲル１ｍＬあたり６８．３ｍｇ、抗体精製用吸着剤３ＭＦがゲル１ｍＬあたり６６．９ｍｇ、抗体精製用吸着剤５ＭＦがゲル１ｍＬあたり６２．３ｍｇであった。
【産業上の利用可能性】
【０１６３】
以上説明したように、本発明の製造方法により得られる多孔性架橋セルロースゲルは、高い空孔率と高い機械的強度を併せ持ち、クロマトグラフィー用充填剤として好適な細孔特性及び粒子径を有している。そのため、本発明の多孔性架橋セルロースゲルは、特にバイオ医薬品の精製工程で使用されるクロマトグラフィー用充填剤として好適である。【０１６４】
また、本発明の多孔性架橋セルロースゲルの製造方法は、従来の多孔性セルロースゲルの製造方法に比べて、大型設備、多大なエネルギー及び高価な原料を必要としない製造方法である。【０１６５】
さらに、本発明の製造方法により得られる多孔性架橋セルロースゲルに、抗体に対するアフィニティーリガンドを固定化することにより得られる抗体精製用吸着剤は、抗体に対する吸着容量が高く、さらにカラム圧力損失が低く高流速処理が可能である。そのため、本発明の抗体精製用吸着剤は、抗体医薬品の精製工程における生産性を著しく向上させることができる。【０１６６】
したがって、本発明は、抗体医薬品等のバイオ医薬品の製造において特に有用である。
【図１】
0006764464.tif 000010
【図２】
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