(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２種のＤＡ１遺伝子を含んでなる、アブラナ属植物であって、
第１の内因性ＤＡ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が、配列番号２の３５８番に相当する位置にアルギニンの代わりにリシンを含んでなる変異型ＤＡ１タンパク質をコードする変異型ＤＡ１対立遺伝子であり、かつ、
前記第１の内因性ＤＡ１遺伝子の前記変異型ＤＡ１対立遺伝子が、
ａ．配列番号６または配列番号１２と少なくとも９０％の配列同一性を含む変異型ＤＡ１対立遺伝子、および
ｂ．配列番号８または配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を含む変異型ＤＡ１タンパク質をコードする変異型ＤＡ１対立遺伝子
からなる群から選択され、かつ、
前記植物が、前記第１の内因性ＤＡ１遺伝子の前記変異型ＤＡ１対立遺伝子に関してホモ接合型であり、かつ、
他のＤＡ１遺伝子が野生型対立遺伝子を含み、かつ、
前記植物の千粒重が、変異型ＤＡ１対立遺伝子を含まない対応する植物の千粒重に比べて有意に増大している、アブラナ属植物。
【請求項２】
前記植物が４種のＤＡ１遺伝子を含んでなり、かつ、
第１の内因性ＤＡ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が、配列番号２の３５８番に相当する位置にアルギニンの代わりにリシンを含んでなる変異型ＤＡ１タンパク質をコードする変異型ＤＡ１対立遺伝子であり、かつ、
第２の内因性ＤＡ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が、
ａ．配列番号２の３５８番に相当する位置にアルギニンの代わりにリシンを含んでなる変異型ＤＡ１タンパク質をコードする変異型ＤＡ１対立遺伝子、および
ｂ．完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子
からなる群から選択される変異型ＤＡ１対立遺伝子であり、かつ、
前記第２の内因性ＤＡ１遺伝子の前記変異型ＤＡ１対立遺伝子が、
ａ．配列番号６または配列番号１２と少なくとも９０％の配列同一性を含む変異型ＤＡ１対立遺伝子、および
ｂ．ＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子であって、前記ＤＡ１遺伝子が、配列番号８または配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を含むＤＡ１タンパク質をコードする前記変異型ＤＡ１対立遺伝子
からなる群から選択され、かつ、
前記第１及び前記第２の内因性ＤＡ１遺伝子が同一ではなく、かつ
前記植物が、前記第２の内因性ＤＡ１遺伝子の前記変異型ＤＡ１対立遺伝子に関してホモ接合型である、請求項１に記載のアブラナ属植物。
【請求項３】
前記第１の内因性ＤＡ１遺伝子が配列番号６と少なくとも９１％の配列同一性を含み、かつ、前記第２の内因性ＤＡ１遺伝子が配列番号１２と少なくとも９１％の配列同一性を含む、請求項２に記載のアブラナ属植物。
【請求項４】
前記第１の内因性ＤＡ１遺伝子の前記変異型ＤＡ１対立遺伝子が配列番号１７のタンパク質をコードする、請求項３に記載のアブラナ属植物。
【請求項５】
前記第２の内因性ＤＡ１遺伝子の前記変異型ＤＡ１対立遺伝子が完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子であり、前記完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子が２０１１番にＣからＴへの置換を有する配列番号１２の配列を含んでなる、請求項３または４に記載のアブラナ属植物。
【請求項６】
ブラシカ・ラパ（Brassica rapa）、ブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea）、およびブラシカ・ナパス（Brassica napus）からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアブラナ属植物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の植物の細胞、組織または器官。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のアブラナ属植物由来の種子。
【請求項９】
請求項４または５に記載のアブラナ属植物由来の種子であって、そのリファレンスシードがＮＣＩＭＢに受託番号ＮＣＩＭＢ４２１１４として寄託されている前記種子。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のアブラナ属植物の後代、または請求項８もしくは９に記載の種子の後代であって、
前記後代が、少なくとも２種のＤＡ１遺伝子を含んでなり、
第１の内因性ＤＡ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が、請求項１に記載の変異型ＤＡ１対立遺伝子であり、
他のＤＡ１遺伝子が野生型対立遺伝子を含む、前記後代。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の第１の親アブラナ属植物と第２の親アブラナ属植物を交配させること、および実った雑種種子を採種することを含んでなる、雑種種子の生産方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のアブラナ属植物の後代を作出する方法であって、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の第１の親アブラナ属植物と第２の親アブラナ属植物を交配させることを含んでなる、前記方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の変異型ＤＡ１対立遺伝子の有無を、
生体サンプルにおいて請求項１または２に記載の変異型ＤＡ１対立遺伝子を同定するための方法であって、前記生体サンプルを、少なくとも２つのプライマーのセットを用いた増幅反応に付すことを含んでなり、前記プライマーが、
ａ．前記プライマーの一方が変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’または３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プライマーの他方が変異型ＤＡ１対立遺伝子の変異領域を特異的に認識するプライマーのセット、および
ｂ．前記プライマーの一方が変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’または３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プライマーの他方が、それぞれ変異型ＤＡ１対立遺伝子の３’または５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するプライマーのセット
からなる群から選択される、方法
を用いて同定する工程をさらに含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体サンプルを、少なくとも１つの特異的プローブを含んでなる特異的プローブのセットを用いたハイブリダイゼーションアッセイに付す工程をさらに含んでなり、
前記セットが、
ａ．前記プローブの一方が変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’または３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プローブの他方が変異型ＤＡ１対立遺伝子の変異領域を特異的に認識するプローブのセット、および
ｂ．前記プローブの一方が変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’または３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プローブの他方が、それぞれ変異型ＤＡ１対立遺伝子の３’または５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するプローブのセット、および
ｃ．変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する特異的プローブ
からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の第１の内因性ＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子をアブラナ属植物に導入することを含んでなる、アブラナ属種子の千粒重を増大させるための方法。
【請求項１６】
請求項２に記載の第２の内因性ＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子を前記アブラナ属植物に導入することをさらに含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項８または９に記載の種子を播種すること、前記種子から植物を栽培すること、および前記植物から採種することを含んでなる、アブラナ属種子の生産方法。
【請求項１８】
種子を生産するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の植物の使用。
【請求項１９】
ナタネ作物を生産するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の植物の使用。
【請求項２０】
ナタネ油またはナタネ油粕を生産するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の植物の、または請求項８もしくは９に記載の種子の使用。
【請求項２１】
ａ．請求項１〜７のいずれか一項の植物またはその細胞、組織もしくは器官、あるいは請求項８または９の種子を得ること、および
ｂ．前記植物またはその細胞、組織もしくは器官から食品、飼料または工業製品を調製すること
を含んでなる、食品、飼料、または工業製品の生産方法。
【請求項２２】
ａ．前記食品または飼料が油、ミール、種実、デンプン、粉もしくはタンパク質であるか、または
ｂ．工業製品が生物燃料、繊維、工業用化学品、医薬または機能性食品である、
請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種子重が増大した農産物、特にアブラナ属種の分野に関する。より具体的には、本発明は、種子重を調節するための方法および手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
種子重または種子サイズは、アブラナ属作物種における重要な農業形質である。
【０００３】
いくつかの作物種では、量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）は、種子のサイズおよび重量に関してもマッピングがなされている。アブラナ属では、種子重に関するいくつかのＱＴＬがマッピングされている(Cai et al., 2012, BMC Genetics 13: 105; Zhang et al., 2011, Theor Appl Genet 122:21; Fan et al., 2010, Theor Appl Genet 121: 1289)。ＱＴＬマッピングに基づき、２つの候補遺伝子ＢｎＭＩＮＩ３ａおよびＢｎＴＴＧ２ａが候補遺伝子として指定されている(Fan et al., 2010,前掲)。ＢｎＭＩＮＩ３ａおよびＢｎＴＴＧ２ａは、それぞれアラビドプシス(Arabidopsis)ＭＩＮＩ３およびＴＴＧ２のＷＲＫＹ転写因子のアブラナ属同族体である。Ｃａｉら, ２０１２（前掲）は、いくつかの候補収量遺伝子の位置を収量ＱＴＬにマッピングし、アラビドプシス遺伝子ＴＴＧ２およびＧＳ５が収量ＱＴＬ  ＴＳＷＡ１付近に局在し；ＧＷ２がＴＳＷＡ２の同じ位置に局在し；ＣＫＩ１およびＭＮ１がＴＳＷＡ４のピーク付近に局在し；ＭＩＮＩ３がＴＳＷＡ５ｂの信頼区間内に局在し；ＦＩＥがＴＳＷＡ５ａの信頼区間内に局在し；ＡＨＰ３、ＡＨＰ５およびＭＥＡがＴＳＷＡ１０の同じ信頼区間内に局在し；かつＡＧＬ６２、ＧＳ３およびＧＡＳＡ４が、それぞれＴＳＷＣ２ａ、ＴＳＷＣ２ｂ、およびＴＳＷＣ２ｃのピークまたは信頼区間内に局在することを見出した。２つの主要なＱＴＬ、ＴＳＷＡ７ａおよびＴＳＷＡ７ｂについては、このマップから推論され得る候補遺伝子に関する既知情報は無い。
【０００４】
上記遺伝子の他、種子サイズまたは重量の調節に関与する他のいくつかの遺伝子が同定されている（総説としては、Cai et al., 2012（前掲）を参照。さらに、ＲＥＶ遺伝子の種々の変異体を過剰発現するアブラナ属植物が種子サイズおよび千粒重を増大させたことも記載されている（ＷＯ２００７／０７９３５３、ＵＳ２０１１／０２７１４０５）。アラビドプシスにおいて過剰発現された際に種子重を増大させるアブラナ属遺伝子は、ＡＯＸ１（ＷＯ２０１２／１００６８２）およびｗｒｉ１様遺伝子(Liu et al., 2010, Plant Physiol Biochem 48: 9)。種子サイズまたは重量に影響を及ぼす他の遺伝子は、ＭＮＴ（ＷＯ２００５／０８５４５３）、サイトカイニンオキシダーゼ（ＵＳ２００５／０１５００１２）、ＣＹＰ７８Ａ７（ＵＳ２０１０／０２８１５７６）、スクロースイソメラーゼ（ＷＯ２０１２／１１９１５２）、ポリコーム群遺伝子（ＷＯ２００１／０３８５５１）、ジベレリン２０−オキシダーゼ（ＵＳ２００９／０００７２９５）、およびソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＷＯ２００８／１４４６５３）。ＵＳ２０１１／０２６５２２５には、４つのイネ遺伝子が、イネで過剰発現させた際に種子サイズを増大させることが記載されている。ＷＯ２００３／０９６７９７には、いくつかの植物種に由来するいくつかの遺伝子の過剰発現、ならびにアラビドプシスおよびダイズにおける種子サイズおよび重量に及ぼす影響が記載されている。
【０００５】
Li et al (2008, Genes Dev 22:1331)およびＷＯ２００９／０４７５２５には、細胞増殖期間を制限することによって、最終的な種子および器官のサイズを設定する推定ユビキチン受容体をコードするアラビドプシスＤＡ１が記載されている。シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)における遺伝子スクリーニングで、種子および器官のサイズの両方を増大させるｄａ１−１突然変異変異体が同定された。増大した種子質量は、母方植物がｄａ１−１突然変異に関してホモ接合型であった場合にのみ見られた。ｄａ１−１突然変異体は、遺伝子Ａｔ１ｇ１９２７０において、３５８番の保存されているアミノ酸にアルギニンからリシンへの変化を引き起こすと予測されるＧからＡへの一ヌクレオチド変異を含む。ｄａ１−１表現型は、野生型ＤＡ１遺伝子により、および野生型ＤＡ１全長ｃＤＮＡのトランスジェニック発現により補足された。ＤＤＡ１遺伝子の破壊は、明らかな生長表現型を生じなかった。ｄａ１−１突然変異に関してヘテロ接合型の系統は、野生型と同等に近い種子および器官サイズを有していたが、ｄａ１ノックアウト対立遺伝子と組み合わせたｄａ１−１突然変異を有する植物は、ｄａ１−１と類似の表現型を示した。
【０００６】
２つのブラシカ・ラパ(Brassica rapa)ＤＡ１相同分子種ＢｒＤＡ１ａおよびＢｒＤＡ１ｂが同定されている（ＷＯ２００９／０４７５２５）。ＢｒＤＡ１ａのアミノ酸配列はアラビドプシスＤＡ１（ＡｔＤＡ１）アミノ酸配列により近いが、ＢｒＤＡ１ｂはＡｔＤＡ１により類似した生化学的特徴を有すると予測された。３５Ｓ−ＢｒＤＡ１ａを発現するトランスジェニックアラビドプシスｄａ１−１植物は、ｄａ１−１表現型の少なくとも部分的補足を示したが、３５Ｓ−ＢｒＤＡ１ｂトランスジェニック植物は、ｄａ１−１表現型の完全な補足を示した。アラビドプシスＤＡ１のＲ３５８Ｋ突然変異（ＢｒＤＡ１ａＲ３５８Ｋ）に相当する突然変異を有するＢｒＤＡ１ａ  ｃＤＮＡを野生型アラビドプシスで過剰発現させた場合、典型的なｄａ１−１表現型が見られた。
【０００７】
Ｃａｉら，２０１２（前掲）は、ブラシカ・ラパおよびブラシカ・オレラセア(Brassica oleracea)はそれぞれ２コピーのＤＡ１遺伝子を含むことを記載している。相同ＤＡ１遺伝子はＢ．ナパス(B. napus)連鎖地図上に位置決定されており、千粒重（ＴＳＷ）ＱＴＬ遺伝子座と並んでいる。Ｃａｉら（上記参照）により、いくつかの候補収量遺伝子がＴＳＷ  ＱＴＬと関連付けられたが、ＤＡ１は、調べた１１のＴＳＷ  ＱＴＬの１つと共局在することはなかった。
【０００８】
アブラナ属においてＤＡ１遺伝子を用いて種子収量を増大させるためには、種子重に対する種々のＤＡ１遺伝子の相対的関与を理解する必要がなおある。ナタネなどの経済的に重要なアブラナ科(Brassicaceae)植物におけるｄａ１相当する変異型対立遺伝子の単離は、ナタネにおける複二倍性および結果としての対応する遺伝子の機能的冗長性によって複雑なものとなり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
よって、従来技術は、複二倍体アブラナ属種におけるＤＡ１遺伝子の同定、ならびに種子重に対する種々のＤＡ１遺伝子の寄与の教示に乏しい。以下に記載されるように、この問題は解決され、種々の実施形態および特許請求の範囲から明らかとなるように、アブラナ属において種子重を増大させる目的でＤＡ１を改変することができた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様は、少なくとも２つのＤＡ１遺伝子を含んでなり、第１のＤＡ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が変異型ＤＡ１対立遺伝子であり、前記変異型ＤＡ１対立遺伝子が、配列番号２の３５８番に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸を含んでなる変異型ＤＡ１タンパク質をコードする、アブラナ属植物またはその一部を提供することである。別の実施形態では、前記アブラナ属植物またはその一部は、４つのＤＡ１遺伝子をさらに含んでなり、第１のＤＡ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子は、配列番号２の３５８番に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸を含んでなる変異型ＤＡ１タンパク質をコードする変異型ＤＡ１対立遺伝子であり、かつ、第２のＤＡ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子は、配列番号２の３５８番に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸を含んでなる変異型ＤＡ１タンパク質をコードする変異型ＤＡ１対立遺伝子、または前記第２のＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子は、完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子である。特定の実施形態では、前記第１のＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子は、配列番号２の３５８番に相当する位置にアルギニンの代わりにリシンを含んでなる変異型ＤＡ１タンパク質をコードする。なおさらなる実施形態では、本発明によるアブラナ属植物は、変異型ＤＡ１対立遺伝子に関してホモ接合型である。
【００１１】
なおさらなる実施形態では、本発明によるアブラナ属植物の第１のＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子は、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を含む変異型ＤＡ１対立遺伝子、例えば、配列番号６と少なくとも９１％の配列同一性を含む変異型ＤＡ１対立遺伝子、または配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を含む変異型ＤＡ１タンパク質をコードする変異型ＤＡ１対立遺伝子である。別の実施形態では、本発明によるアブラナ属植物の第２のＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子は、配列番号１２と少なくとも９０％の配列同一性を含む変異型ＤＡ１対立遺伝子、例えば、配列番号１２と少なくとも９１％の配列同一性を含む変異型ＤＡ１対立遺伝子、または配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を含むＤＡ１タンパク質をコードするＤＡ１遺伝子の、変異型ＤＡ１対立遺伝子である。特定の実施形態では、本発明によるアブラナ属植物の第１のＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子は配列番号１７のタンパク質をコードし、一方、なおさらなる実施形態では、本発明によるアブラナ属植物の前記第２のＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子は、完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子であり、前記完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子は、２０１１番にＣからＴへの置換を有する配列番号１２の配列を含んでなる。
【００１２】
さらなる実施形態では、少なくとも２つのＤＡ１遺伝子を含んでなり、ＤＡ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子であるアブラナ属植物またはその一部が提供される。さらに別の実施形態では、前記完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子は、配列番号３と少なくとも９６％の配列同一性を含むか、または配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を含むか、または配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を含むか、または配列番号５と少なくとも９６％の配列同一性、または配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性、または配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性(sequenc identity)を含むタンパク質をコードする。
【００１３】
別の実施形態では、本発明によるアブラナ属植物またはその一部は、ブラシカ・ラパ、ブラシカ・オレラセア、およびブラシカ・ナパスからなる群から選択される。
【００１４】
さらなる実施形態は、千粒重が変異型ＤＡ１対立遺伝子を含まない対応する植物の千粒重に比べて有意に増大した、少なくとも１つの変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる本発明による植物を提供することである。
【００１５】
さらに別の実施形態では、そのリファレンスシードがＮＣＩＭＢに受託番号ＮＣＩＭＢ４２１１４として寄託されている、本明細書によるアブラナ属植物由来の種子が提供される。
【００１６】
別の実施形態は、本発明によるアブラナ属植物の後代、または本発明による種子の後代を提供することである。
【００１７】
さらなる実施形態では、生体サンプルにおいて本発明の変異型ＤＡ１対立遺伝子を同定するための方法であって、前記生体サンプルを、少なくとも２つのプライマーのセットを用いた増幅反応に付すことを含んでなり、前記プライマーの１つが変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プライマーの他のものが変異型ＤＡ１対立遺伝子の変異領域を特異的に認識するか；または前記プライマーの１つが変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プライマーの他のものが、それぞれ変異型ＤＡ１対立遺伝子の３’もしくは５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するか；または特異的プローブが変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する方法が提供される。別の実施形態では、生体サンプルにおいて本発明の変異型ＤＡ１対立遺伝子を同定するための方法であって、生体サンプルを、少なくとも２つのプライマーのセットを用いた増幅反応に付すことを含んでなり、生体サンプルを、少なくとも１つの特異的プローブを含んでなる特異的プローブを用いたハイブリダイゼーションアッセイに付すことをさらに含んでなり、前記プローブのセットが、前記プローブの１つが変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プローブの他のものが変異型ＤＡ１対立遺伝子の変異領域を特異的に認識するか；または前記プローブの１つが変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プローブの他のものが、それぞれ変異型ＤＡ１対立遺伝子の３’または５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する場合を含んでなるか；または変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する特異的プローブを含んでなる。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、生体サンプルにおいて、請求項１または２に記載の変異型ＤＡ１対立遺伝子を同定するためのキットであって、プライマーまたはプローブのセットを含んでなり、前記プライマーの１つが変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プライマーの他のものが変異型ＤＡ１対立遺伝子の変異領域を特異的に認識するか；または前記プライマーの１つが変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プライマーの他のものが変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するか；または変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する特異的プローブを含むキットを提供することである。
【００１９】
別の実施形態では、本発明による第１の親アブラナ属植物と第２の親アブラナ属植物を交配させること、および実った雑種種子を採種することを含んでなる、雑種種子の生産方法が提供される。
【００２０】
さらに別の実施形態では、本発明による第１の親アブラナ属植物と第２の親アブラナ属植物を交配させることを含んでなり、場合により、生体サンプルを本発明による少なくとも２つのプライマーのセットを用いた増幅反応に付し、場合により、本発明による少なくとも１つのプローブとハイブリダイズさせることを含んでなる本発明に従って、本発明による変異型ＤＡ１対立遺伝子の有無を同定する工程をさらに含んでなる育種方法が提供される。
【００２１】
アブラナ属植物に、本発明による第１のＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子、および場合により、本発明による第２のＤＡ１遺伝子を導入することを含んでなる、アブラナ属種子の千粒重を増大させるための方法を提供することである。
【００２２】
さらなる実施形態では、請求項１３または１４に記載の種子を播種すること、前記種子から植物を栽培すること、および前記植物から採種することを含んでなる、アブラナ属種子の生産方法が提供される。
【００２３】
さらに、種子を生産するため、またはナタネ作物を生産すること、またはナタネ油もしくはナタネ油粕を生産するために、本発明による植物の使用が提供される。さらに、本発明による種子からの油または油粕が提供される。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、本発明による植物もしくはその一部または種子を得ること、および前記植物またはその一部から食品、飼料または工業製品を調製することを含んでなる、油、ミール、種実、デンプン、粉、もしくはタンパク質などの食品もしくは飼料、または生物燃料、繊維、工業用化学品、医薬、もしくは栄養補助製品などの工業製品の生産方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】配列番号２のアラビドプシスＤＡ１タンパク質と、配列番号５、８、１１、１４、５６、５９、６２、６５、６９、７２、および７５のアブラナ属ＤＡ１タンパク質のタンパク質配列のアラインメント。下線はＵＩＭ１、ＵＩＭ２およびＬＩＭドメインである。配列番号２のアラビドプシスＤＡ１タンパク質の３５８番に相当する位置の保存されているアルギニン残基（Ｒ）を四角で示す。
【図１Ｂ】配列番号２のアラビドプシスＤＡ１タンパク質と、配列番号５、８、１１、１４、５６、５９、６２、６５、６９、７２、および７５のアブラナ属ＤＡ１タンパク質のタンパク質配列のアラインメント。下線はＵＩＭ１、ＵＩＭ２およびＬＩＭドメインである。配列番号２のアラビドプシスＤＡ１タンパク質の３５８番に相当する位置の保存されているアルギニン残基（Ｒ）を四角で示す（図１Ａの続き）。
【図１Ｃ】配列番号２のアラビドプシスＤＡ１タンパク質と、配列番号５、８、１１、１４、５６、５９、６２、６５、６９、７２、および７５のアブラナ属ＤＡ１タンパク質のタンパク質配列のアラインメント。下線はＵＩＭ１、ＵＩＭ２およびＬＩＭドメインである。配列番号２のアラビドプシスＤＡ１タンパク質の３５８番に相当する位置の保存されているアルギニン残基（Ｒ）を四角で示す（図１Ｂの続き）。
【図１Ｄ】配列番号２のアラビドプシスＤＡ１タンパク質と、配列番号５、８、１１、１４、５６、５９、６２、６５、６９、７２、および７５のアブラナ属ＤＡ１タンパク質のタンパク質配列のアラインメント。下線はＵＩＭ１、ＵＩＭ２およびＬＩＭドメインである。配列番号２のアラビドプシスＤＡ１タンパク質の３５８番に相当する位置の保存されているアルギニン残基（Ｒ）を四角で示す（図１Ｃの続き）。
【図２】アブラナ属ＤＡ１−Ａ１（菱形）、ＤＡ１−Ａ２（丸）、ＤＡ１−Ｃ１（四角）、およびＤＡ１−Ｃ２（三角）遺伝子の種々の組織におけるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ相対的発現。１：子葉；２：２週間の根；３：２週間の茎；４：５週間、播種後３３日（ＤＡＳ）の茎；５：３３ＤＡＳの幼葉；６：３３ＤＡＳの頂端分裂組織および最幼葉；７：４２ＤＡＳの小花蕾（＜５ｍｍ）；８：４２ＤＡＳの大花蕾（＞５ｍｍ）；９：５２ＤＡＳの開花花；１０：開花後１４〜２０日（ＤＡＦ）の結莢期２；１１：２１〜２５ＤＡＦの結莢期３；１２：１４〜２０ＤＡＳの種子期２；１３：２１〜２５ＤＡＦの種子期３；１４：２６〜３０ＤＡＦの種子期４；１５：３１〜３５ＤＡＦの種子期５；１６：４２ＤＡＦの種子期６；１７：４９ＤＡＦの種子期７。
【図３Ａ】種々の突然変異体系統の組織における、播種後３３日の幼葉（Ａ）および播種後５週間、３３日の茎（Ｂ）でのアブラナ属ＤＡ１遺伝子の相対的発現。値は、野生型での発現を超える突然変異体系統の発現を表す。黒いバー：突然変異体系統ＹＩＩＮ６０３における相対的発現；灰色のバー：突然変異体系統ＹＩＩＮ６１１における相対的発現；縦縞のバー：突然変異体系統ＹＩＩＮ６１２における相対的発現；横縞のバー：突然変異体系統ＹＩＩＮ６０９における相対的発現；斜線のバー：突然変異体系統ＹＩＩＮ６１５における相対的発現。
【図３Ｂ】種々の突然変異体系統の組織における、播種後３３日の幼葉（Ａ）および播種後５週間、３３日の茎（Ｂ）でのアブラナ属ＤＡ１遺伝子の相対的発現。値は、野生型での発現を超える突然変異体系統の発現を表す。黒いバー：突然変異体系統ＹＩＩＮ６０３における相対的発現；灰色のバー：突然変異体系統ＹＩＩＮ６１１における相対的発現；縦縞のバー：突然変異体系統ＹＩＩＮ６１２における相対的発現；横縞のバー：突然変異体系統ＹＩＩＮ６０９における相対的発現；斜線のバー：突然変異体系統ＹＩＩＮ６１５における相対的発現。
【図４Ａ】種々のＤＡ１突然変異を有するアブラナ属系統における千粒重（ＴＳＷ）（Ａ）および莢の厚さ（ＰＯＤＴ）（Ｂ）。ＴＳＷ値およびＰＯＤＴ値は、野生型分離個体と比較した場合の違いで表す。
【図４Ｂ】種々のＤＡ１突然変異を有するアブラナ属系統における千粒重（ＴＳＷ）（Ａ）および莢の厚さ（ＰＯＤＴ）（Ｂ）。ＴＳＷ値およびＰＯＤＴ値は、野生型分離個体と比較した場合の違いで表す。
【００２６】
一般定義
千粒重（ＴＳＷ）は、１０００種子のグラム重量を意味する。
【００２７】
「作物植物」は、ブラシカ・ナパス（ＡＡＣＣ、２ｎ＝３８）、ブラシカ・ユンセア(Brassica juncea)（ＡＡＢＢ、２ｎ＝３６）、ブラシカ・カリナタ(Brassica carinata)（ＢＢＣＣ、２ｎ＝３４）、ブラシカ・ラパ（ｓｙｎ．  Ｂ．カンペストリス(campestris)）（ＡＡ、２ｎ＝２０）、ブラシカ・オレラセア（ＣＣ、２ｎ＝１８）またはブラシカ・ニグラ(Brassica nigra)（ＢＢ、２ｎ＝１６）などの、作物として栽培される植物種を意味する。この定義には、シロイヌナズナなどの雑草は含まない。
【００２８】
「ＤＡ１遺伝子」または「ＤＡ１対立遺伝子」、本明細書で使用される場合、Ａｔ１ｇ１９２７０．１および配列番号１に記載されるシロイヌナズナのＤＡ１遺伝子のコード配列と少なくとも８０％の配列同一性を含んでなるコード配列を有する遺伝子または対立遺伝子である。
【００２９】
しかし、ＤＡ１遺伝子またはＤＡ１対立遺伝子は、機能的ＤＡ１タンパク質をコードする必要はない。
【００３０】
「ＤＡ１タンパク質」または「ＤＡ１ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、Ａｔ１ｇ１９２７０．１および配列番号２に記載されるシロイヌナズナのＤＡ１タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を含んでなるタンパク質またはポリペプチドである。
【００３１】
「変異型ＤＡ１遺伝子」または「変異型ＤＡ１対立遺伝子は、本明細書で使用される場合、自然集団または育種集団中の植物には見られないが、突然変異誘発または遺伝子ターゲティングなどヒトの介入によって作出されるいずれのＤＡ１遺伝子またはＤＡ１対立遺伝子も意味する。変異型ＤＡ１対立遺伝子は、ノックアウトＤＡ１対立遺伝子、および機能的ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる。
【００３２】
「変異型ＤＡ１タンパク質」または「変異型ＤＡ１ポリペプチド」は、変異型ＤＡ１遺伝子または変異型ＤＡ１対立遺伝子によりコードされるＤＡ１タンパク質またはＤＡ１ポリペプチドである。
【００３３】
「完全ノックアウトｄａ１遺伝子」または「ノックアウトｄａ１対立遺伝子」は、本明細書で使用される場合、非機能的ＤＡ１タンパク質もしくは量が有意に減少したＤＡ１タンパク質をコードするか、または活性が有意に低下したＤＡ１タンパク質をコードするｄａ１遺伝子またはｄａ１対立遺伝子である。前記「完全ノックアウトＤＡ１遺伝子」または「完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子」は、ＤＡ１タンパク質をコードしていなくてもよく、または非機能的ＤＡ１タンパク質をコードしていてもよい変異型ＤＡ１対立遺伝子または変異型ＤＡ１遺伝子であり得る。これらの遺伝子または対立遺伝子は、不活性化遺伝子または対立遺伝子と呼ばれることもある。前記「完全ノックアウトＤＡ１遺伝子」または「完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子」は、ＷＯ２００９／０４７５２５（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されるｄａ１−１変異型シロイヌナズナで過剰発現された際にｄａ１−１表現型を回復しない。
【００３４】
「量が有意に減少したＤＡ１タンパク質」とは、野生型ＤＡ１対立遺伝子により産生されるＤＡ１タンパク質の量に比べて変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる細胞により産生されるＤＡ１タンパク質の量における少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％（すなわち、この対立遺伝子によりＤＡ１タンパク質が産生されない）の減少を意味する。
【００３５】
「機能的ＤＡ１遺伝子」または「機能的ＤＡ１対立遺伝子」は、本明細書で使用される場合、機能的ＤＡ１タンパク質をコードするＤＡ１遺伝子またはＤＡ１対立遺伝子である。前記「機能的ＤＡ１遺伝子」または「機能的ＤＡ１対立遺伝子」は、ＷＯ２００９／０４７５２５（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されるｄａ１−１変異型シロイヌナズナにおいて、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの制御下で過剰発現させた際にｄａ１−１表現型を回復する。
【００３６】
用語「核酸配列」（または核酸分子）とは、本発明によるタンパク質またはタンパク質断片をコードする一本鎖または二本鎖型のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、特にＤＮＡを意味する。「内因性核酸配列」とは、植物細胞内の核酸配列、例えば、アブラナ属細胞の核ゲノム内に存在するＤＡ１遺伝子の内因性対立遺伝子を意味する。「単離された核酸配列」は、もはやその天然環境ではない、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは組換え細菌または植物宿主細胞内の核酸配列を意味して使用される。
【００３７】
用語「遺伝子」は、細胞内で、ＲＮＡ分子に（例えば、イントロン配列を含んでなり、後にスプライシングされて成熟ｍＲＮＡとなるｍＲＮＡ前駆体に、または直接、イントロン配列を含まないｍＲＮＡに）に転写される、調節領域（例えば、プロモーター）に機能的に連結された領域（転写領域）を含んでなるＤＮＡ配列を意味する。従って、遺伝子は、プロモーター、例えば翻訳開始に関する配列を含んでなる５’リーダー配列、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）および例えば転写終結部位を含んでなる３’非翻訳配列などの、機能的に連結された配列を含んでなり得る。「内因性遺伝子」は、「外来遺伝子」、「導入遺伝子」または「キメラ遺伝子」から区別するために使用され、ある植物属、種または品種の植物に由来し、その植物に形質転換により導入されたものではなく（すなわち、それは「導入遺伝子」ではない）、その属、種もしくは品種の植物に通常存在するか、またはそれが通常存在する別の植物属、種または品種の植物からその植物に、通常の育種技術または体細胞雑種形成、例えば、プロトプラスト融合によって導入された遺伝子を意味する。同様に、遺伝子の「内因性対立遺伝子」も、植物形質転換により植物または植物組織に導入されるものではなく、例えば、植物突然変異誘発および／または選抜により作出されるか、または植物の自然集団のスクリーニングにより得られるものである。
【００３８】
「遺伝子の発現」または「遺伝子発現」は、適当な調節領域、特にプロモーターと機能的に連結されたＤＮＡ領域がＲＮＡ分子に転写されるプロセスを意味する。その後、ＲＮＡ分子は細胞内でさらに（転写後プロセスにより）、例えば、ＲＮＡスプライシングおよび翻訳開始およびアミノ酸鎖（ポリペプチド）への翻訳、ならびに翻訳終止コドンによる翻訳終結により処理を受ける。用語「機能的に発現される」は、本明細書では、機能的タンパク質が産生されることを示して使用され、用語「非機能的に発現される」は、有意に減少したもしくは機能（生物活性）の無いタンパク質が産生されること、またはタンパク質が産生されないことを示して使用される（詳しくは下記参照）。
【００３９】
用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は互換的に使用され、特定の作用様式、サイズ、三次元構造または起源に関わらず、アミノ酸鎖からなる分子を意味する。従って、ＤＡ１タンパク質の「断片」または「一部」もなお「タンパク質」と呼ばれることがある。「単離されたタンパク質」は、もはやその天然環境、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは組換え細菌または植物宿主細胞内にないタンパク質を意味して使用される。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「対立遺伝子」は、特定の遺伝子座における遺伝子の１以上の別の形態のいずれかを意味する。生物の二倍体（または複二倍体）細胞において、ある遺伝子の対立遺伝子は染色体上の特定の場所または遺伝子座に位置する。相同染色体対の各染色体に１つの対立遺伝子が存在する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「相同染色体」は、同じ生物学的特徴に関する情報を含み、同じ遺伝子座に同じ遺伝子を、しかしながら、おそらくはそれらの遺伝子の異なる対立遺伝子を含む染色体を意味する。相同染色体は、減数分裂の際に対合する染色体である。ある生物の総ての生物学的特徴を提示する「非相同染色体」は１組となり、細胞内の組の数は倍数性と呼ばれる。二倍体生物は、２組の非相同染色体を含み、各相同染色体は異なる親から受け継がれる。複二倍体種では、本質的に２組の二倍体ゲノムが存在し、これにより、２ゲノムの染色体は「同祖染色体」と呼ばれ（同様に、２ゲノムの遺伝子座または遺伝子は同祖遺伝子座または遺伝子と呼ばれる）。二倍体、または複二倍体の植物種は、特定の遺伝子座に多数の異なる対立遺伝子を含んでなり得る。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ接合型」は、２つの異なる対立遺伝子がある特定の遺伝子座に位置するが、細胞内の対応する相同染色体対上に個々に配置されている場合に存在する遺伝学的状態を意味する。これに対し、本明細書で使用される場合、用語「ホモ接合型」は、２つの同じ対立遺伝子がある特定の遺伝子座に位置するが、細胞内の対応する相同染色体対上に個々に配置されている場合に存在する遺伝学的状態を意味する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子座」は、例えば、遺伝子または遺伝子マーカーが見られる染色体上の１または複数の特定の場所または部位を意味する。
【００４４】
「野生型」は、本明細書で使用される場合、自然界で最もよく見られる植物または遺伝子の典型的形態を意味する。「野生型植物」とは、自然集団または育種集団中の植物を意味する。「野生型対立遺伝子」とは、野生型植物中に存在する遺伝子の対立遺伝子を意味する。
【００４５】
本発明による「植物」という場合には常に、特に断りのない限り、植物部分（細胞、組織または器官、莢、種子、切断部分、例えば、根、葉、花、花粉など）、親の顕著な特徴（特に、種子重）を保持する植物後代、例えば、自殖または交配により得られる種子、例えば、雑種種子（２つの同系親系統を交配させることにより得られる）、ハイブリッド植物およびそれに由来する植物部分も本明細書に包含されると理解される。
【００４６】
「分子アッセイ」（または試験）は、本明細書において、一方または両方のＤＡ１遺伝子座における１以上の特定のＤＡ１対立遺伝子の有無を（直接的または間接的に）示すアッセイを意味する。一実施形態では、それは、特定の（野生型または変異型）対立遺伝子が、任意の個々の植物の遺伝子座においてホモ接合型であるかヘテロ接合型であるかを決定することを可能にする。
【００４７】
「繁殖材料（propagating material）を作出する」とは、本明細書で使用される場合、さらなる植物、植物部分または種子を生産するために当技術分野で公知のいずれの手段にも関し、とりわけ、栄養繁殖法（例えば、高取り法または取り木、株分け、（芽）接ぎ、マイクロプロパゲーション、ストロンまたはランナー、鱗茎、球茎、塊茎および根茎などの貯蔵器官、または発根挿し穂(straiking)、挿し穂(cutting)、ツインスケーリング(twin-scaling)）、有性生殖（別の植物との交配）および無性生殖（例えば、無配偶生殖、体細胞雑種形成）が含まれる。
【００４８】
「突然変異誘発」とは、本明細書で使用される場合、植物細胞（例えば、複数のアブラナ属種子、または花粉などの他の部分など）に細胞のＤＮＡに突然変異を誘発する技術、例えば、化学物質（例えば、エチルメチルスルホネート（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）など）もしくは電磁放射線（中性子（例えば、高速中性子突然変異誘発の場合）、α線、γ線（例えば、コバルト６０源により供給されるもの）、Ｘ線、ＵＶ光など）などの突然変異誘発物質との接触、Ｔ−ＤＮＡ挿入突然変異誘発(Azpiroz-Leehan et al. (1997) Trends Genet 13:152-156)、トランスポゾン突然変異誘発(McKenzie et al. (2002) Theor Appl Genet 105:23-33)、または組織培養突然変異誘発（ソマクローナル変異の誘導）、またはこれらの２つ以上の組合せを施すプロセスを意味する。よって、１以上のＤＡ１対立遺伝子の所望の突然変異誘発は、上記の方法の１つによって行うことができる。照射により作り出される突然変異は、転座または複合体再配列などの大きな欠失またはその他の総体的な傷害である場合が多いが、化学的突然変異誘発物質によって作り出される突然変異は、点突然変異などのより離散した傷害である場合が多い。例えば、ＥＭＳはグアニン塩基をアルキル化して塩基の誤対合をもたらす：すなわち、アルキル化されたグアニンはチミン塩基と対合して主にＧ／ＣからＡ／Ｔへの移行をもたらす。突然変異誘発後、既知の技術を用いて、処理細胞からアブラナ属植物を再分化させる。例えば、得られたアブラナ属種子は、従来の栽培法に従って植え付け、自家受粉後に植物に種子を形成させる。あるいは、例えば、Coventry et al. (1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. of Guelph, Guelph, Ontario, Canada)により記載されているように、倍加半数性植物体を抽出して、すぐにホモ接合型植物を形成することもできる。このような自家受粉の結果として当世代または次世代で形成されるさらなる種子を採種し、変異型ＤＡ１対立遺伝子の存在に関してスクリーニングしてもよい。特定の変異型対立遺伝子に関してスクリーニングするためのいくつかの技術が知られており、例えば、Ｄｅｌｅｔｅａｇｅｎｅ（商標）(Delete-a-gene; Li et al., 2001, Plant J 27: 235-242)では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを用いて、高速中性子突然変異誘発により生成される欠失突然変異体に関してスクリーニングし、ＴＩＬＬＩＮＧ((targeted induced local lesions in genomes);McCallum et al., 2000, Nat Biotechnol 18:455-457)は、ＥＭＳ誘発点突然変異などを同定する。特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の存在に関してスクリーニングするためのさらなる技術は下記の実施例に記載されている。
【００４９】
用語「遺伝子ターゲティング」は、本明細書では、相同組換え、ミスマッチ修復または部位特異的突然変異誘発などの機構を用いる定方向遺伝子改変を意味する。この方法は、内因性配列または植物に従前に導入されている配列に置換、挿入および欠失を行うために使用することができる。遺伝子ターゲティングのための方法は、例えば、ＷＯ２００６／１０５９４６またはＷＯ２００９／００２１５０に見出すことができる。遺伝子ターゲティングは、ノックアウトＤＡ１対立遺伝子などの変異型ＤＡ１対立遺伝子を作出するために使用することができる。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「非天然」または「栽培型」は、植物に関して使用される場合、ヒトによって改変されたゲノムを有する植物を意味する。トランスジェニック植物、例えば、転写された際に、ＤＡ１遺伝子などの内因性遺伝子の発現を低減することができる生物学的に活性なＲＮＡ分子を生じる、従って、ヒトによって遺伝的に改変された転写領域を含んでなる、外因性核酸分子、例えば、キメラ遺伝子を含む、非天然植物である。加えて、突然変異誘発物質への暴露の結果として内因性遺伝子に突然変異、例えば、内因性ＤＡ１遺伝子、（例えば、調節エレメントまたはコード配列）に突然変異を含む植物も、ヒトによって遺伝的に改変されていることから、非天然植物と見なされる。さらに、例えば、同じ種またはブラシカ・ユンセアもしくはラパなどの別の種の植物を用いた、その植物の、マーカーを助けとする育種および選抜または遺伝子移入などの定方向育種プロセスの結果として、その特定の植物種には本来存在しない、内因性遺伝子、例えば、内因性ＤＡ１遺伝子における突然変異を含む、ブラシカ・ナパスなどの特定の種の植物も、非天然植物と見なされる。これに対して、一過性に過ぎないまたは天然の突然変異を含む植物、すなわち、ヒトによって遺伝的に改変されていない植物は、本明細書において定義されるような「非天然植物」ではなく、従って、本発明の範囲内に包含されない。当業者ならば、非天然植物は一般に天然植物と比べた場合に変更されているヌクレオチド配列を有するが、非天然植物はまた、そのヌクレオチド配列を変更することなく、例えば、そのメチル化パターンを改変することにより遺伝的に改変され得ることを理解している。
【００５１】
遺伝子またはタンパク質の「相同分子種（ortholog）」という用語は、本明細書では、その遺伝子またはタンパク質と同じ機能を有するが、それらの遺伝子を保有する種が分岐した時点から（通常）配列が分岐している（すなわち、それらの遺伝子は種分化により共通の祖先から進化した）別の種に見られる同族遺伝子またはタンパク質を意味する。従って、ブラシカ・ナパスＤＡ１遺伝子の相同分子種は、他の植物種（例えば、ブラシカ・ユンセアなど）において、配列比較（例えば、全配列または特定のドメインにわたる配列同一性パーセンテージに基づく）および／または機能分析の両方に基づいて同定することができる。
【００５２】
「品種」は、本明細書ではＵＰＯＶ条約に従って使用され、既知の最低順位の単一植物分類群内の植物グループを意味し、このグループは所与の遺伝子型または遺伝子型の組合せから生じる特徴の発現によって定義することができ、前記特徴の少なくとも１つの発現によって他の任意の植物グループから区別することができ、不変の状態（安定に）で繁殖させるためのその適合性に関する単位と見なされる。
【００５３】
用語「含んでなる」は、記載の部分、工程または成分の存在を明示するが、１以上の付加的部分、工程または成分の素材を排除しないものと解釈されるべきである。従って、ある特定の形質を含んでなる植物は、さらなる形質を含み得る。
【００５４】
用語が単数形（例えば、植物または根）で言及される場合には、複数形（例えば、複数の植物、複数の根）もそこに含まれると理解される。従って、要素を不定冠詞「a」または「an」により示す場合には、文脈がその要素が１つおよび１つだけ存在することを明らかに必要としない限り、その要素が２つ以上存在する可能性を排除しない。従って、不定冠詞「a」または「an」は通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００５５】
本発明の目的では、パーセンテージとして表される、２つの関連するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の「配列同一性」は、最適にアラインされた２つの配列中の、同一の残基を有する位置の数を比較した位置の数で割った商（×１００）を意味する。ギャップ、すなわち、ある残基が一方の配列には存在するが、他方の配列には存在しないというアラインメントの位置は、非同一残基を有する位置と見なされる。２配列の「最適なアラインメント」は、デフォルト設定（ギャップ・オープニング・ペナルティー＝１０（ヌクレオチドの場合）／１０（タンパク質の場合）およびギャップ・エクステンション・ペナルティー＝０．５（ヌクレオチドの場合）／０．５（タンパク質の場合））を用いるThe European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS,  Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16(6): 276-277;例えば、http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html参照)にて、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, J Mol Biol 48(3):443-53)に従って見つける。ヌクレオチドの場合には、使用するデフォルト・スコアリング・マトリックスはＥＤＮＡＦＵＬＬであり、タンパク質の場合には、デフォルト・スコアリング・マトリックスはＥＢＬＯＳＵＭ６２である。
【００５６】
「実質的に同一」または「本質的に類似」とは、本明細書で使用される場合、上記に定義されるように最適にアラインされた際に少なくとも特定の最小パーセンテージの配列同一性（以下に詳しく定義される）を共有する配列を意味する。
【００５７】
「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」は、所与のヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を同定するために使用することができる。ストリンジェント条件は配列依存的であり、環境が異なれば異なる。一般に、ストリンジェント条件は、規定のイオン強度およびｐＨで、特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に一致するプローブとハイブリダイズする温度（規定のイオン強度およびｐＨ下）である。一般に、ストリンジェント条件は、塩濃度がｐＨ７で約０．０２モル、かつ、温度が少なくとも６０℃であるものが選択される。塩濃度が低いほど、および／または温度が高いほど、ストリンジェンシーは増す。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（例えば１００ｎｔのプローブを用いるノーザンブロット）のストリンジェント条件は例えば、０．２×ＳＳＣ中、６３℃、２０分の少なくとも１回の洗浄、または同等の条件を含むものである。
【００５８】
「高ストリンジェンシー条件」は、例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、３．０Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０を含有する）、５×デンハート液（１００×デンハート液は、２％フィコール、２％ポリビニルピロリドン、２％ウシ血清アルブミンを含有する）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および２０μｇ／ｍｌの変性担体ＤＮＡ（平均１２０〜３０００ヌクレオチド長の一本鎖魚類精子ＤＮＡ）および非特異的競合因子を含有する水溶液中、６５℃でのハイブリダイゼーションにより提供することができる。ハイブリダイゼーション後、高ストリンジェンシー洗浄を数段階で行ってよく、最終洗浄（約３０分）は０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度とする。
【００５９】
「中等度ストリンジェンシー条件」は、約６０〜６２℃であること以外は、上記溶液中でのハイブリダイゼーションに等しい条件を意味する。中等度ストリンジェンシー洗浄は、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度で行ってよい。
【００６０】
「低ストリンジェンシー」は、約５０〜５２℃で、上記溶液中でのハイブリダイゼーションに等しい条件を意味する。低ストリンジェンシー洗浄は、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度で行ってよい。Sambrook et al. (1989) and Sambrook and Russell (2001)も参照。
【００６１】
詳細な説明
ブラシカ・ナパス（ゲノムＡＡＣＣ、２ｎ＝４ｘ＝３８）は、二倍体祖先に起源するために２つの二倍体ゲノム（ＡゲノムとＣゲノム）を本質的に含有する異質四倍体（複二倍体）種である。本発明者らにより、ブラシカ・ナパスがそのゲノムに４つのＤＡ１遺伝子を含んでなること、およびＡゲノムおよびＣゲノムが、種子重に影響を及ぼすＤＡ１遺伝子を含んでいることが見出された。
【００６２】
いずれの二倍体ゲノムについても、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ゲノム内の各ＤＡ１遺伝子座に各ＤＡ１遺伝子に対する２つの「対立遺伝子」が存在し得る（一方の対立遺伝子は一方の染色体上に見られる遺伝子配列であり、他方は相同染色体上に見られる）。これらの２つの対立遺伝子のヌクレオチド配列は、任意の所与の植物において同一であっても（ホモ接合型植物）または異なっていてもよい（ヘテロ接合型植物）が、各ＤＡ１遺伝子について存在する、あり得る異なる対立遺伝子の数は、全体としての種集団中では２よりもはるかに大きくなり得る。
【００６３】
本発明の一態様は、少なくとも２つのＤＡ１遺伝子を含んでなり、第１のＤＡ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が変異型ＤＡ１対立遺伝子であり、前記変異型ＤＡ１対立遺伝子が、配列番号２の３５８番に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸を含んでなる変異型ＤＡ１タンパク質をコードする、アブラナ属植物またはその一部を提供することである。別の実施形態では、前記アブラナ属植物またはその一部は、４つのＤＡ１遺伝子をさらに含んでなり、第１のＤＡ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子は、配列番号２の３５８番に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸を含んでなる変異型ＤＡ１タンパク質をコードする変異型ＤＡ１対立遺伝子であり、かつ、第２のＤＡ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子は、配列番号２の３５８番に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸を含んでなる変異型ＤＡ１タンパク質をコードする変異型ＤＡ１対立遺伝子であるか；または前記第２のＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子は、完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子である。特定の実施形態では、前記第１のＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子は、配列番号２の３５８番に相当する位置にアルギニンの代わりにリシンを含んでなる変異型ＤＡ１タンパク質をコードする。なおさらなる実施形態では、本発明によるアブラナ属植物は、変異型ＤＡ１対立遺伝子に関してホモ接合型である。
【００６４】
なおさらなる実施形態では、本発明によるアブラナ属植物の第１のＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子は、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を含む変異型ＤＡ１対立遺伝子、例えば、配列番号６と少なくとも９１％の配列同一性を含む変異型ＤＡ１対立遺伝子、または配列番号８とも９０％の配列同一性を含む変異型ＤＡ１タンパク質をコードする変異型ＤＡ１対立遺伝子である。別の実施形態では、本発明によるアブラナ属植物の第２のＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子は、配列番号１２と少なくとも９０％の配列同一性を含む変異型ＤＡ１対立遺伝子、例えば、配列番号１２と少なくとも９１％の配列同一性を含む変異型ＤＡ１対立遺伝子；または配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を含むＤＡ１タンパク質をコードするＤＡ１遺伝子の、変異型ＤＡ１対立遺伝子である。特定の実施形態では、本発明によるアブラナ属植物の第１のＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子は配列番号８のタンパク質をコードするが、なおさらなる実施形態では、本発明によるアブラナ属植物の前記第２のＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子は完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子であり、前記完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子は、２０１１番におけるＣからＴへの置換を有する配列番号１２の配列を含んでなる。
【００６５】
さらなる実施形態では、少なくとも２つのＤＡ１遺伝子を含んでなり、ＤＡ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子である、アブラナ属植物またはその一部が提供される。さらに別の実施形態では、前記完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子は、配列番号３と少なくとも９６％の配列同一性を含むか、または配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を含むか、または配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を含むか、または配列番号５と少なくとも９６％の配列同一性、もしくは配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性、もしくは配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性(sequenc identity)を含むタンパク質をコードする。
【００６６】
別の実施形態では、本発明によるアブラナ属植物またはその一部は、ブラシカ・ラパ、ブラシカ・オレラセア、およびブラシカ・ナパスからなる群から選択される。
【００６７】
さらなる実施形態は、千粒重が変異型ＤＡ１対立遺伝子を含まない対応する植物の千粒重に比べて有意に増大した、少なくとも１つの変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる本発明による植物を提供することである。
【００６８】
さらに別の実施形態では、そのリファレンスシードがＮＣＩＭＢに受託番号ＮＣＩＭＢ４２１１４として寄託されている、本明細書によるアブラナ属植物由来の種子が提供され、さらに別の実施形態では、本発明によるアブラナ属植物の後代、または本発明による種子の後代が提供される。
【００６９】
また、ＮＣＩＭＢに受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２１１４として寄託されている種子から得られるまたは誘導し得る植物、例えば、ＮＣＩＭＢに受託番号ＮＣＩＭＢ４２１１４として寄託されている種子からの育種により得られるまたは誘導し得る植物も好適である。
【００７０】
少なくとも８０％の配列同一性は、本明細書で使用される場合、少なくとも８０％、もしくは少なくとも８２％、もしくは少なくとも８４％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも８８％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９１％、もしくは少なくとも９２％、もしくは少なくとも９３％、もしくは少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性であり得、もしくは１００％の配列同一性であり得る。
【００７１】
少なくとも９０％の配列同一性は、本明細書で使用される場合、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９１％、もしくは少なくとも９２％、もしくは少なくとも９３％、もしくは少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性であり得、または１００％の配列同一性であり得る。
【００７２】
少なくとも９１％の配列同一性は、本明細書で使用される場合、少なくとも９１％、もしくは少なくとも９２％、もしくは少なくとも９３％、もしくは少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性であり得る。
【００７３】
少なくとも９６％の配列同一性は、本明細書で使用される場合、少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性であり得、または１００％の配列同一性であり得る。
【００７４】
千粒重は、本明細書で使用される場合、１０００種子のグラム重量である。千粒重の有意な増大は、本発明による変異型ＤＡ１対立遺伝子を含まないアブラナ属植物の千粒重に比べて少なくとも５％、または少なくとも８％、または少なくとも１０％、または少なくとも１３％、または少なくとも１４％、または少なくとも１５％、または少なくとも１８％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％の増大である。
【００７５】
本発明による植物は、莢の厚さの増大をさらに伴ってもよい。莢の厚さの増大は、本明細書に記載される莢の厚さを測定するための方法を用い、本発明による変異型ＤＡ１対立遺伝子を含まないアブラナ属植物の値に比べて平均ＰＯＤＴ値の少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも１８％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％の増大であり得る。
【００７６】
本発明による植物は、千粒油重の増大、すなわち、１０００種子当たりの油量の増大をさらに伴ってもよい。１０００種子当たりの油量の増大は、本明細書に記載される莢の厚さを測定するための方法を用い、本発明による変異型ＤＡ１対立遺伝子を含まないアブラナ属植物の１０００種子当たりの油量に比べて少なくとも５％、または少なくとも８％、または少なくとも１０％、または少なくとも１３％、または少なくとも１４％、または少なくとも１５％、または少なくとも１８％、または少なくとも２０％の増大であり得る。
【００７７】
本発明によるアブラナ属植物からの種子は、本発明によるアブラナ属植物を、同じ本発明によるアブラナ属植物からの花粉で受粉させることによって得られる種子、例えば、本発明によるアブラナ属植物を自家受粉させることにより、または隣接する本発明によるアブラナ属植物からの花粉で受粉させることにより得られる種子であり得ると理解され得る。前記種子はまた、本発明によるアブラナ属植物、別のアブラナ属植物、例えば、異なる変異型ＤＡ１対立遺伝子を有するアブラナ属植物からの花粉で、またはさらには本発明による変異型ＤＡ１対立遺伝子を含まないアブラナ属植物からの花粉で受粉させることによっても得ることができる。
【００７８】
本発明による変異型ＤＡ１対立遺伝子は、野生型核酸配列に対して１以上のヌクレオチド欠失、挿入または置換を含んでなる変異型ＤＡ１対立遺伝子であり得る。この１または複数の突然変異は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列における１以上の変化（欠失、挿入および／または置換）の結果であり得る。
【００７９】
前記完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子は、野生型核酸配列に対して１以上のヌクレオチド欠失、挿入または置換を含んでなる変異型ＤＡ１対立遺伝子であり得る。突然変異は、コードされるタンパク質が機能的ＤＡ１タンパク質でなくなるような、コードされるタンパク質のアミノ酸配列における１以上の変化（欠失、挿入および／または置換）の結果であり得る。
【００８０】
用語「位置」は、本発明で使用される場合、本明細書に示されるアミノ酸配列内のアミノ酸の位置、または本明細書に示されるヌクレオチド配列内のヌクレオチドの位置のいずれかを意味する。用語「相当する」は、本明細書で使用される場合には、位置が先行するヌクレオチド／アミノ酸の番号によって決定されるだけではないこともまた含む。
【００８１】
本発明においては、置換され得る所与のヌクレオチドの位置は、コード配列または遺伝子のエキソンおよびイントロンを含め、ＤＡ１配列中のどこかの欠失または付加的ヌクレオチドのために異なる場合がある。同様に、本発明においては、置換され得る所与のアミノ酸の位置は、ＤＡ１ポリペプチド中のどこかのアミノ酸の欠失または付加のために異なる場合がある。
【００８２】
よって、本発明においては、「相当する位置」または「位置に相当する位置」について、ヌクレオチド／アミノ酸が示された番号とは異なるが、類似の隣接するヌクレオチド／アミノ酸もやはり含み得ると理解されるべきである。交換、欠失または付加され得る前記ヌクレオチド／アミノ酸もまた、用語「相当する位置」により含まれる。
【００８３】
所与のＤＡ１ヌクレオチド／アミノ酸配列中のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基が別のＤＡ１ヌクレオチド／アミノ酸配列のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列中のある特定の位置に相当するかどうかを決定するために、熟練者ならば、当技術分野で周知の手段および方法、例えば、手動またはBasic Local Alignment Search Tool or ClustalW (Thompson et al. (1994), Nucleic Acid Res., 22, 4673-4680)を表すＢＬＡＳＴ(Altschul et al. (1990), Journal of Molecular Biology, 215, 403-410)もしくは配列アラインメントを作成するのに適した他の任意の好適なプログラムなどのコンピュータープログラムを使用することによるアラインメントを使用することができる。
【００８４】
配列番号２は、シロイヌナズナＤＡ１タンパク質のアミノ酸配列であり、配列番号５、８、１１、１４および１７は、ブラシカ・ナパス由来ＤＡ１のアミノ酸配列であり、配列番号５６および５９は、ブラシカ・ラパ由来ＤＡ１のアミノ酸配列であり、配列番号６２、６５、６７、および６９は、ブラシカ・オレラセア由来ＤＡ１のアミノ酸配列であり、配列番号７２および７５は、ブラシカ・ニグラ由来ＤＡ１のアミノ酸配列である。よって、配列番号２の３５８番のアミノ酸は、配列番号５および５６の３３８番のアミノ酸に、配列番号８および５９の３５３番のアミノ酸に、配列番号１１および６２の３４１番のアミノ酸に、配列番号１４の３５２番のアミノ酸に、配列番号６５および６９の３５５番のアミノ酸に、配列番号７２の３４０番のアミノ酸に、および配列番号７５の３５７番のアミノ酸に相当する。ＤＡ１タンパク質の配列のアラインメントを図１に示す。
【００８５】
配列番号１は、シロイヌナズナ野生型ＤＡ１をコードするヌクレオチド配列であり、配列番号２は、配列番号１から導き出されたシロイヌナズナアミノ酸配列である。よって、配列番号１のヌクレオチド配列の１０７２〜１０７４番のコドンは、配列番号２の３５８番のアミノ酸をコードする。
【００８６】
配列番号３は、野生型ゲノムＢ．ナパスＤＡ１−Ａ１配列であり、配列番号４は、Ｂ．ナパス野生型ＤＡ１−Ａ１のコード配列であり、配列番号５は、配列番号３および４から導き出されたＢ．ナパスアミノ酸配列である。よって、配列番号４のヌクレオチド配列の１０１２〜１０１４番のコドン、および配列番号３の１６１８〜１６２０番の相当するコドンは、配列番号５の３３８番のアミノ酸をコードする（この位置は、この場合にも、配列番号２の３５８番に相当する）。言い換えれば、配列番号５の３３８番のアミノ酸アルギニン（「Ａｒｇ」（三文字コード）または「Ｒ」（一文字コード））は、配列番号３および４のヌクレオチド配列のそれぞれ１６１８〜１６２０番および１０１２〜１０１４番のコドンによりコードされている。
【００８７】
配列番号６は、野生型ゲノムＢ．ナパスＤＡ１−Ａ２配列であり、配列番号７は、Ｂ．ナパス野生型ＤＡ１−Ａ２のコード配列であり、配列番号８は、配列番号６および７から導き出されたＢ．ナパスアミノ酸配列である。よって、配列番号７のヌクレオチド配列の１０５７〜１０５９番のコドン、および配列番号６の１６７１〜１６７３番の相当するコドンは、配列番号８の３５３番のアミノ酸をコードする（この位置は、この場合にも、配列番号２の３５８番に相当する）。言い換えれば、配列番号８の３５３番のアミノ酸アルギニン（「Ａｒｇ」（三文字コード）または「Ｒ」（一文字コード））は、配列番号６および７のヌクレオチド配列のそれぞれ１６７１〜１６７３番および１０５７〜１０５９番のコドンによりコードされている。
【００８８】
配列番号９は、野生型ゲノムＢ．ナパスＤＡ１−Ｃ１配列であり、配列番号１０は、Ｂ．ナパス野生型ＤＡ１−Ｃ１のコード配列であり、配列番号１１は、配列番号９および１０から導き出されたＢ．ナパスアミノ酸配列である。よって、配列番号１０のヌクレオチド配列の１０２１〜１０２３番のコドン、および配列番号９の１６４６〜１６４８番の相当するコドンは、配列番号１１の３４１番のアミノ酸をコードする（この位置は、この場合にも、配列番号２の３５８番に相当する）。言い換えれば、配列番号１１の３４１番のアミノ酸アルギニン（「Ａｒｇ」（三文字コード）または「Ｒ」（一文字コード））は、配列番号９および１０のヌクレオチド配列のそれぞれ１６４６〜１６４８番および１０２１〜１０２３番のコドンによりコードされている。
【００８９】
配列番号１２は、野生型ゲノムＢ．ナパスＤＡ１−Ｃ２配列であり、配列番号１３は、Ｂ．ナパス野生型ＤＡ１−Ｃ２のコード配列であり、配列番号１４は、配列番号１２および１３から導き出されたＢ．ナパスアミノ酸配列である。よって、配列番号１３のヌクレオチド配列の１０５４〜１０５６番のコドン、および配列番号１２の１６８６〜１６８８番の相当するコドンは、配列番号１４の３５２番のアミノ酸をコードする（この位置は、この場合にも、配列番号２の３５８番に相当する）。言い換えれば、配列番号１４の３５２番のアミノ酸アルギニン（「Ａｒｇ」（三文字コード）または「Ｒ」（一文字コード））は、配列番号１２および１３のヌクレオチド配列のそれぞれ１６８６〜１６８８番および１０５４〜１０５６番のコドンによりコードされている。
【００９０】
配列番号５４は、野生型ゲノムＢ．ラパＤＡ１−Ａ１配列であり、配列番号５５は、Ｂ．ラパ野生型ＤＡ１−Ａ１のコード配列であり、配列番号５６は、配列番号５４および５５から導き出されたＢ．ラパアミノ酸配列である。よって、配列番号５５のヌクレオチド配列の１０１２〜１０１４番のコドン、および配列番号５４の１６２１〜１６２３番の相当するコドンは、配列番号５６の３３８番のアミノ酸をコードする（この位置は、この場合にも、配列番号２の３５８番に相当する）。言い換えれば、配列番号５６の３３８番のアミノ酸アルギニン（「Ａｒｇ」（三文字コード）または「Ｒ」（一文字コード））は、配列番号５４および５５のヌクレオチド配列の１６２１〜１６２３番および１０１２〜１０１４番のコドンによりコードされている。
【００９１】
配列番号５７は、野生型ゲノムＢ．ラパＤＡ１−Ａ２配列である、配列番号５８は、Ｂ．ラパ野生型ＤＡ１−Ａ２のコード配列であり、配列番号５９は、配列番号５７および５８から導き出されたＢ．ラパアミノ酸配列である。よって、配列番号５８のヌクレオチド配列の１０５７〜１０５９番のコドン、および配列番号５７の１６８２〜１６８４番の相当するコドンは、配列番号５９の３５３番のアミノ酸をコードする（この位置は、この場合にも、配列番号２の３５８番に相当する）。言い換えれば、配列番号５９の３５３番のアミノ酸アルギニン（「Ａｒｇ」（三文字コード）または「Ｒ」（一文字コード））は、配列番号５７および５８のヌクレオチド配列のそれぞれ１６８２〜１６８４番および１０５７〜１０５９番のコドンによりコードされている。
【００９２】
配列番号６０は、野生型ゲノムＢ．オレラセアＤＡ１−Ｃ１配列であり、配列番号６１は、Ｂ．オレラセア野生型ＤＡ１−Ｃ１のコード配列であり、配列番号６２は、配列番号６０および６１から導き出されたＢ．オレラセアアミノ酸配列である。よって、配列番号６１のヌクレオチド配列の１０２１〜１０２３番のコドン、および配列番号６０の１６４６〜１６４８番の相当するコドンは、配列番号６２の３４１番のアミノ酸をコードする（この位置は、この場合にも、配列番号２の３５８番に相当する）。言い換えれば、配列番号６２の３４１番のアミノ酸アルギニン（「Ａｒｇ」（三文字コード）または「Ｒ」（一文字コード））は、配列番号６０および６１のヌクレオチド配列のそれぞれ１６４６〜１６４８番および１０２１〜１０２３番のコドンによりコードされている。
【００９３】
配列番号６３は、野生型ゲノムＢ．オレラセアＤＡ１−Ｃ２配列であり、配列番号６４は、Ｂ．オレラセア野生型ＤＡ１−Ｃ２のコード配列のアイソフォーム１であり、配列番号６５は、配列番号６３および６４から導き出されたＢ．オレラセアアミノ酸配列のアイソフォーム１である。配列番号６８は、Ｂ．オレラセア野生型ＤＡ１−Ｃ２のコード配列のアイソフォーム３であり、配列番号６９は、配列番号６３および６８から導き出されたＢ．オレラセアアミノ酸配列のアイソフォーム３である。よって、配列番号６４および６８のヌクレオチド配の１０６３〜１０６５番のコドン、および配列番号６３の１６５８〜１６６０番の相当するコドンは、配列番号６５および６９の３５５番のアミノ酸をコードする（この位置は、この場合にも、配列番号２の３５８番に相当する）。言い換えれば、配列番号６５および６９の３５５番のアミノ酸アルギニン（「Ａｒｇ」（三文字コード）または「Ｒ」（一文字コード））は、配列番号６３のヌクレオチド配列の１６５８〜１６６０番のコドンにより、および配列番号６４および６８のヌクレオチド配列の１０６３〜１０６５番のコドンによりコードされている。
【００９４】
配列番号７０は、野生型ゲノムＢ．ニグラＤＡ１−Ｂ１配列であり、配列番号７１は、Ｂ．ニグラ野生型ＤＡ１−Ｂ１のコード配列であり、配列番号７２は、配列番号７０および７１から導き出されたＢ．ニグラアミノ酸配列である。よって、配列番号７１のヌクレオチド配列の１０１８〜１０２０番のコドン、および配列番号７０の１５１９〜１５２１番の相当するコドンは、配列番号７２の３４０番のアミノ酸をコードする（この位置は、この場合にも、配列番号２の３５８番に相当する）。言い換えれば、配列番号７２の３４０番のアミノ酸アルギニン（「Ａｒｇ」（三文字コード）または「Ｒ」（一文字コード））は、配列番号７０および７１のヌクレオチド配列のそれぞれ１５１９〜１５２１番および１０１８〜１０２０番のコドンによりコードされている。
【００９５】
配列番号７３は、野生型ゲノムＢ．ニグラＤＡ１−Ｂ２配列であり、配列番号７４は、Ｂ．ニグラ野生型ＤＡ１−Ｂ２のコード配列であり、配列番号７５は、配列番号７３および７４から導き出されたＢ．ニグラアミノ酸配列である。よって、配列番号７４のヌクレオチド配列の１０６９〜１０７１番のコドン、および配列番号７３の１７０７〜１７０９番の相当するコドンは、配列番号７５の３５７番のアミノ酸をコードする（この位置は、この場合にも、配列番号２の３５８番に相当する）。言い換えれば、配列番号７５の３５７番のアミノ酸アルギニン（「Ａｒｇ」（三文字コード）または「Ｒ」（一文字コード））は、配列番号７３および７４のヌクレオチド配列のそれぞれ１７０７〜１７０９番および１０６９〜１０７１番のコドンによりコードされている。
【００９６】
一実施形態では、配列番号２の３５８番に相当する位置のアミノ酸は、アルギニン（「Ａｒｇ」（三文字コード）または「Ｒ」（一文字コード））の代わりにリシン（「Ｌｙｓ」（三文字コード）または「Ｋ」（一文字コード））である。
【００９７】
ある核酸配列が本発明のヌクレオチド配列とある特定の程度の同一性を有するかどうかを決定するために、熟練者ならば、当技術分野で周知の手段および方法、例えば、手動または用語「ハイブリダイゼーション」および相同性の程度の定義と関連して以下に詳しく記載するものなどのコンピュータープログラムを使用することによるアラインメントを使用することができる。
【００９８】
本発明の目的では、パーセンテージとして表される、２つの関連するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の「配列同一性」または「配列相同性」（これらの用語は本明細書では互換的に使用される）は、最適にアラインされた２つの配列中の、同一の残基を有する位置の数を比較した位置の数で割った商（×１００）を意味する。ギャップ、すなわち、ある残基が一方の配列には存在するが、他方の配列には存在しないというアラインメントの位置は、非同一残基を有する位置と見なされる。２配列の「最適なアラインメント」は、デフォルト設定（ギャップ・オープニング・ペナルティー＝１０（ヌクレオチドの場合）／１０（タンパク質の場合）およびギャップ・エクステンション・ペナルティー＝０．５  （ヌクレオチドの場合）／０．５（タンパク質の場合））を用いるThe European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS,  Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16(6): 276-277;例えば、http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html参照)にて、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, J Mol Biol 48(3):443-53)に従って見つける。ヌクレオチドの場合には、使用するデフォルト・スコアリング・マトリックスはＥＤＮＡＦＵＬＬであり、タンパク質の場合には、デフォルト・スコアリング・マトリックスはＥＢＬＯＳＵＭ６２である。
【００９９】
ＤＡ１タンパク質をコードする核酸配列
配列表に示すように、ＤＡ１−Ａ１、ＤＡ１−Ａ２、ＤＡ１−Ｃ１、およびＤＡ１−Ｃ２の核酸配列はブラシカ・ナパスから単離されたものであり、ＤＡ１−Ａ１、ＤＡ１−Ａ２の核酸配列はブラシカ・ラパから単離されたものであり、ＤＡ１−Ｃ１、ＤＡ１−Ｃ２の核酸配列はブラシカ・オレラセアから単離されたものであり、ＤＡ１−Ｂ１、ＤＡ１−Ｂ２の核酸配列はブラシカ・ニグラから単離されたものである。野生型ＤＡ１配列が示されるが、これらの配列、およびこれらと本質的に類似する配列の変異型ＤＡ１配列も本明細書の下記および実施例に野生型ＤＡ１配列と比較して記載される。ブラシカ・ナパス、Ｂ．ラパ、Ｂ．オレラセアおよびＢ．ニグラ由来のゲノムＤＡ１タンパク質をコードするＤＮＡは、いずれのイントロンも含んでなる。イントロンを含まないアブラナ属ＤＡ１遺伝子のコード配列またはｃＤＮＡ配列もまた配列表に示される。
【０１００】
「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ１遺伝子」、「ＢｎＤＡ１−Ａ１遺伝子」、「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ１対立遺伝子」、「ＢｎＲＤＡ１−Ａ１対立遺伝子」または「ブラシカ・ナパス由来ＤＡ１−Ａ１」、またはそれらの変異体核酸配列は、本明細書で使用される場合、配列番号３と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、対立遺伝子または配列を意味する。
【０１０１】
「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ２遺伝子」、「ＢｎＤＡ１−Ａ２遺伝子」、「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ２対立遺伝子」、「ＢｎＤＡ１−Ａ２対立遺伝子」または「ブラシカ・ナパス由来ＤＡ１−Ａ２」、またはそれらの変異体核酸配列は、本明細書で使用される場合、配列番号６と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、対立遺伝子または配列を意味する。
【０１０２】
「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ１遺伝子」、「ＢｎＤＡ１−Ｃ１遺伝子」、「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ１対立遺伝子」、「ＢｎＤＡ１−Ｃ１対立遺伝子」または「ブラシカ・ナパス由来ＤＡ１−Ｃ１」、またはそれらの変異体核酸配列は、本明細書で使用される場合、配列番号９と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、対立遺伝子または配列を意味する。
【０１０３】
「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ２遺伝子」、「ＢｎＤＡ１−Ｃ２遺伝子」、「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ２対立遺伝子」、「ＢｎＤＡ１−Ｃ２対立遺伝子」または「ブラシカ・ナパス由来ＤＡ１−Ｃ２」、またはそれらの変異体核酸配列は、本明細書で使用される場合、配列番号１２と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、対立遺伝子または配列を意味する。
【０１０４】
「ブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ１遺伝子」、「ＢｒＤＡ１−Ａ１遺伝子」、「ブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ１対立遺伝子」、「ＢｒＲＤＡ１−Ａ１対立遺伝子」または「ブラシカ・ラパ由来ＤＡ１−Ａ１」、またはそれらの変異体核酸配列は、本明細書で使用される場合、配列番号５４と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、対立遺伝子または配列を意味する。
【０１０５】
「ブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ２遺伝子」、「ＢｒＤＡ１−Ａ２遺伝子」、「ブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ２対立遺伝子」、「ＢｒＤＡ１−Ａ２対立遺伝子」または「ブラシカ・ラパ由来ＤＡ１−Ａ２」、またはそれらの変異体核酸配列は、本明細書で使用される場合、配列番号５７と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、対立遺伝子または配列を意味する。
【０１０６】
「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ１遺伝子」、「ＢｏＤＡ１−Ｃ１遺伝子」、「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ１対立遺伝子」、「ＢｏＤＡ１−Ｃ１対立遺伝子」または「ブラシカ・オレラセア由来ＤＡ１−Ｃ１」、またはそれらの変異体核酸配列は、本明細書で使用される場合、配列番号６０と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、対立遺伝子または配列を意味する。
【０１０７】
「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２遺伝子」、「ＢｏＤＡ１−Ｃ２遺伝子」、「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２対立遺伝子」、「ＢｏＤＡ１−Ｃ２対立遺伝子」または「ブラシカ・オレラセア由来ＤＡ１−Ｃ２」、またはそれらの変異体核酸配列は、本明細書で使用される場合、配列番号６３と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、対立遺伝子または配列を意味する。
【０１０８】
「ブラシカ・ニグラＤＡ１−Ｂ１遺伝子」、「ＢｎｉＤＡ１−Ｂ１遺伝子」、「ブラシカ・ニグラＤＡ１−Ｂ１対立遺伝子」、「ＢｎｉＤＡ１−Ｂ１対立遺伝子」または「ブラシカ・ニグラ由来ＤＡ１−Ｂ１」、またはそれらの変異体核酸配列は、本明細書で使用される場合、配列番号７０と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、対立遺伝子または配列を意味する。
【０１０９】
「ブラシカ・ニグラＤＡ１−Ｂ２遺伝子」、「ＢｎｉＤＡ１−Ｂ２遺伝子」、「ブラシカ・ニグラＤＡ１−Ｂ２対立遺伝子」、「ＢｎｉＤＡ１−Ｂ２対立遺伝子」または「ブラシカ・ニグラ由来ＤＡ１−Ｂ２」、またはそれらの変異体核酸配列は、本明細書で使用される場合、配列番号７３と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、対立遺伝子または配列を意味する。
【０１１０】
「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ１遺伝子」、「ＢｎＤＡ１−Ａ１遺伝子」、「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ１対立遺伝子」、「ＢｎＲＤＡ１−Ａ１対立遺伝子」または「ブラシカ・ナパス由来ＤＡ１−Ａ１」、またはそれらの変異体核酸配列のコード配列は、本明細書で使用される場合、配列番号４と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するコード配列を意味する。
【０１１１】
「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ２遺伝子」、「ＢｎＤＡ１−Ａ２遺伝子」、「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ２対立遺伝子」、「ＢｎＤＡ１−Ａ２対立遺伝子」または「ブラシカ・ナパス由来ＤＡ１−Ａ２」、またはそれらの変異体核酸配列のコード配列は、本明細書で使用される場合、配列番号７と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するコード配列を意味する。
【０１１２】
「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ１遺伝子」、「ＢｎＤＡ１−Ｃ１遺伝子」、「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ１対立遺伝子」、「ＢｎＤＡ１−Ｃ１対立遺伝子」または「ブラシカ・ナパス由来ＤＡ１−Ｃ１」、またはそれらの変異体核酸配列のコード配列は、本明細書で使用される場合、配列番号１０と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するコード配列を意味する。
【０１１３】
「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ２遺伝子」、「ＢｎＤＡ１−Ｃ２遺伝子」、「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ２対立遺伝子」、「ＢｎＤＡ１−Ｃ２対立遺伝子」または「ブラシカ・ナパス由来ＤＡ１−Ｃ２」、またはそれらの変異体核酸配列のコード配列は、本明細書で使用される場合、配列番号１３と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するコード配列を意味する。
【０１１４】
「ブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ１遺伝子」、「ＢｒＤＡ１−Ａ１遺伝子」、「ブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ１対立遺伝子」、「ＢｒＲＤＡ１−Ａ１対立遺伝子」または「ブラシカ・ラパ由来ＤＡ１−Ａ１」、またはそれらの変異体核酸配列のコード配列は、本明細書で使用される場合、配列番号５５と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するコード配列を意味する。
【０１１５】
「ブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ２遺伝子」、「ＢｒＤＡ１−Ａ２遺伝子」、「ブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ２対立遺伝子」、「ＢｒＤＡ１−Ａ２対立遺伝子」または「ブラシカ・ラパ由来ＤＡ１−Ａ２」、またはそれらの変異体核酸配列のコード配列は、本明細書で使用される場合、配列番号５８と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するコード配列を意味する。
【０１１６】
「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ１遺伝子」、「ＢｏＤＡ１−Ｃ１遺伝子」、「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ１対立遺伝子」、「ＢｏＤＡ１−Ｃ１対立遺伝子」または「ブラシカ・オレラセア由来ＤＡ１−Ｃ１」、またはそれらの変異体核酸配列のコード配列は、本明細書で使用される場合、配列番号６１と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するコード配列を意味する。
【０１１７】
「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２遺伝子」、「ＢｏＤＡ１−Ｃ２遺伝子」、「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２対立遺伝子」、「ＢｏＤＡ１−Ｃ２対立遺伝子」または「ブラシカ・オレラセア由来ＤＡ１−Ｃ２」、またはそれらの変異体核酸配列のアイソフォーム１コード配列は、本明細書で使用される場合、配列番号６４と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するコード配列を意味する。
【０１１８】
「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２遺伝子」、「ＢｏＤＡ１−Ｃ２遺伝子」、「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２対立遺伝子」、「ＢｏＤＡ１−Ｃ２対立遺伝子」または「ブラシカ・オレラセア由来ＤＡ１−Ｃ２」、またはそれらの変異体核酸配列のアイソフォーム２コード配列は、本明細書で使用される場合、配列番号６６と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するコード配列を意味する。
【０１１９】
「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２遺伝子」、「ＢｏＤＡ１−Ｃ２遺伝子」、「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２対立遺伝子」、「ＢｏＤＡ１−Ｃ２対立遺伝子」または「ブラシカ・オレラセア由来ＤＡ１−Ｃ２」、またはそれらの変異体核酸配列のアイソフォーム３コード配列は、本明細書で使用される場合、配列番号６８と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するコード配列を意味する。
【０１２０】
「ブラシカ・ニグラＤＡ１−Ｂ１遺伝子」、「ＢｎｉＤＡ１−Ｂ１遺伝子」、「ブラシカ・ニグラＤＡ１−Ｂ１対立遺伝子」、「ＢｎｉＲＤＡ１−Ｂ１対立遺伝子」または「ブラシカ・ニグラ由来ＤＡ１−Ｂ１」、またはそれらの変異体核酸配列のコード配列は、本明細書で使用される場合、配列番号７１と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するコード配列を意味する。
【０１２１】
「ブラシカ・ニグラＤＡ１−Ｂ２遺伝子」、「ＢｎｉＤＡ１−Ｂ２遺伝子」、「ブラシカ・ニグラＤＡ１−Ｂ２対立遺伝子」、「ＢｎｉＤＡ１−Ｂ２対立遺伝子」または「ブラシカ・ニグラ由来ＤＡ１−Ｂ２」、またはそれらの変異体核酸配列のコード配列は、本明細書で使用される場合、配列番号７４と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するコード配列を意味する。
【０１２２】
ＤＡ１−Ａ１遺伝子またはＤＡ１−Ａ１対立遺伝子またはＤＡ１−Ａ１コード配列は、ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ１遺伝子または対立遺伝子またはコード配列およびブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ１遺伝子または対立遺伝子またはコード配列を含んでなることができ；ＤＡ１−Ａ２遺伝子またはＤＡ１−Ａ２対立遺伝子またはＤＡ１−Ａ２コード配列は、ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ２遺伝子または対立遺伝子またはコード配列およびブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ２遺伝子または対立遺伝子またはコード配列を含んでなることができ；ＤＡ１−Ｃ１遺伝子またはＤＡ１−Ｃ１対立遺伝子またはＤＡ１−Ｃ１コード配列は、ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ１遺伝子または対立遺伝子またはコード配列およびブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ１遺伝子または対立遺伝子またはコード配列を含んでなることができ；ＤＡ１−Ｃ２遺伝子またはＤＡ１−Ｃ２対立遺伝子またはＤＡ１−Ｃ２コード配列は、ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ２遺伝子または対立遺伝子またはコード配列およびブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２遺伝子または対立遺伝子またはコード配列を含んでなることができる。
【０１２３】
配列表に配列番号３、６、９および１２（Ｂ．ナパス）、配列番号５４および５７（Ｂ．ラパ）、配列番号６０および６３（Ｂ．オレラセア）および配列番号７０および７３（Ｂ．ニグラ）で示される核酸配列は、各アブラナ属種に由来する野生型ＤＡ１タンパク質をコードする。従って、これらの配列は、それらが単離されたアブラナ属植物に対して内因性である。他のアブラナ属作物種、品種、育種系統またはワイルドアクセッション(wild accessions)も、同じＤＡ１タンパク質またはその変異体をコードする他のＤＡ１対立遺伝子に関してスクリーニング可能である。例えば、核酸ハイブリダイゼーション技術（例えば、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件を用いたサザンブロット分析）またはＰＣＲに基づく技術が、種々のブラシカ・ナパス品種、系統またはアクセッションなどの他のアブラナ属植物に対して内因性のＤＡ１対立遺伝子を同定するために使用可能であるだけでなく、ブラシカ・ユンセア（ＡゲノムおよびＢゲノム上のＤＡ１対立遺伝子）、ブラシカ・カリナタ（ＢゲノムおよびＣゲノム上のＤＡ１対立遺伝子）の植物、器官および組織も他の野生型ＤＡ１対立遺伝子に関してスクリーニングすることができる。このような植物、植物器官または組織をＤＡ１対立遺伝子の存在に関してスクリーニングするためには、配列表に示されるＤＡ１核酸配列、またはこれらのうちのいずれかの変異体もしくは断片を使用してよい。例えば、全配列または断片をプローブまたはプライマーとして使用してよい。例えば、特異的または縮重プライマーを使用して、植物、植物器官または組織のゲノムＤＮＡからＤＡ１タンパク質をコードする核酸配列を増幅させることができる。これらのＤＡ１核酸配列は、標準的な分子生物学的技術を用いて単離および配列決定を行うことができる。次に、その配列がどのＤＡ１対立遺伝子に相当するか、およびその配列によりどのＤＡ１タンパク質またはタンパク質変異体がコードされるかを決定するために、バイオインフォマティクス分析を用いて対立遺伝子を同定することができる。
【０１２４】
核酸配列が機能的ＤＡ１タンパク質をコードするかどうかは、例えば、ＷＯ２００９／０４７５２５（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているものなどのｄａ１−１対立遺伝子を含んでなるアラビドプシス植物、またはＤＡ１−Ａ２もしくはＤＡ１−Ｃ２遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子に関してホモ接合型であるブラシカ・ナパス植物を用いる相補性検定(genetic complementation test)によるなどの、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術によって分析することができる。
【０１２５】
加えて、ＤＡ１核酸配列およびその変異体（またはこれらのいずれかの断片）は、核酸データベースを本質的に類似する配列に関するスクリーニングすることによってｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで同定可能であると理解される。同様に、核酸配列は、化学的に合成することもできる。本発明による核酸分子の断片もまた提供される。
【０１２６】
変異型ＤＡ１タンパク質をコードする核酸配列
野生型核酸配列に対して１以上のヌクレオチド欠失、挿入または置換を含んでなる配列も、このような変異型核酸分子の断片と同様に提供される。このような変異型核酸配列は、以下に詳しく記載するように、様々な既知の方法を用いて作成および／または同定することができる。突然変異は、コードされるＤＡ１タンパク質のアミノ酸配列における１以上の変化（欠失、挿入および／または置換）の結果であり得る。あるいは、核酸配列における突然変異は、コードされるＤＡ１タンパク質の生物活性の、野生型タンパク質に比べての、有意な低下または完全な破壊の結果である。
【０１２７】
一実施形態では、変異型ＤＡ１対立遺伝子は、配列番号２の３５８番に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸、例えばリシンを含んでなる変異型ＤＡ１タンパク質をコードする。
【０１２８】
アルギニンをコードするコドンは、ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、およびＣＧＧである。当業者ならば、これらのコドンにおける種々の一重、二重および三重突然変異がアルギニンをコードしないコドンを生じ得ることがすぐに理解するであろう。
【０１２９】
リシンは、コドンＡＡＡおよびＡＡＧによりコードされる。アルギニンをコードするコドンのいずれかにおける、リシンをコードするコドンを生じる一重突然変異は、従って、ＡＧＡ＝＞ＡＡＡおよびＡＧＧ＝＞ＡＡＧである。アルギニンをコードするコドンのいずれかにおける、リシンをコードするコドンを生じる二重突然変異は、従って、ＡＧＡ＝＞ＡＡＧ；ＡＧＧ＝＞ＡＡＡ；ＣＧＡ＝＞ＡＡＡ；およびＣＧＧ＝＞ＡＡＧである。アルギニンをコードするコドンのいずれかにおける、リシンをコードするコドンを生じる三重突然変異は、従って、ＣＧＴ＝＞ＡＡＡ；ＣＧＴ＝＞ＡＡＧ；ＣＧＣ＝＞ＡＡＡ；ＣＧＣ＝＞ＡＡＧ；ＣＧＡ＝＞ＡＡＧ；およびＣＧＧ＝＞ＡＡＧである。
【０１３０】
アラビドプシスＤＡ１タンパク質では、３５８番のアルギニンは、コドンＡＧＡ（配列番号１の１０７２〜１０７４番）によりコードされ；ＢｎＤＡ１−Ａ１タンパク質では、３３８番のアルギニンはコドンＡＧＡ（配列番号４の１０１２〜１０１４番、配列番号３の１６１８〜１６２０番）によりコードされ；ＢｎＤＡ１−Ａ２タンパク質では、３５３番のアルギニンはコドンＡＧＡ（配列番号７の１０５７〜１０５９番、配列番号６の１６７１〜１６７３番）によりコードされ；ＢｎＤＡ１−Ｃ１タンパク質では、３４１番のアルギニンはコドンＡＧＡ（配列番号１０の１０２１〜１０２３番、配列番号９の１６４６〜１６４８番）によりコードされ；ＢｎＤＡ１−Ｃ２タンパク質では、３５２番のアルギニンはコドンＡＧＡ（配列番号１３の１０５４〜１０５６番、配列番号１２の１６８６〜１６８８番）によりコードされ；ＢｒＤＡ１−Ａ１タンパク質では、３３８番のアルギニンはコドンＡＧＡ（配列番号５５の１０１２〜１０１４番、配列番号５４の１６２１〜１６２３番）によりコードされ；ＢｒＤＡ１−Ａ２タンパク質では、３５３番のアルギニンはコドンＡＧＡ（配列番号５８の１０５７〜１０５９番、配列番号５７の１６８２〜１６８４番）によりコードされ；ＢｏＤＡ１−Ｃ１タンパク質では、３４１番のアルギニンはコドンＡＧＡ（配列番号６１の１０２１〜１０２３番、配列番号６０の１６４６〜１６４８番）によりコードされ；ＢｏＤＡ１−Ｃ２タンパク質（アイソフォーム１および３）では、３５５番のアルギニンはコドンＡＧＡ（配列番号６４および６８の１０６３〜１０６５番、配列番号６３の１６５８〜１６６０番）によりコードされ；ＢｎｉＤＡ１−Ｂ１タンパク質では、３４０番のアルギニンは、コドンＡＧＡ（配列番号７１の１０１８〜１０２０番、配列番号７０の１５１９〜１５２１番）によりコードされ；ＢｎｉＤＡ１−Ｂ２タンパク質では、３５７番のアルギニンはコドンＡＧＡ（配列番号７４の１０６９〜１０７１番、配列番号７３の１７０７〜１７０９番）によりコードされる。
【０１３１】
アブラナ属ＤＡ１遺伝子のＡＧＡコドンは、ＡＡＡコドン（一ヌクレオチド置換）またはＡＡＧコドン（２ヌクレオチドの置換）に変異され得ることは明らかである。
【０１３２】
特定の実施形態では、配列番号６の１６７２番のＧがＡに変異され、アルギニンをコードする１６７１〜１６７３番のＡＧＡコドンの、リシンをコードするＡＡＡコドンへの突然変異が生じる。この突然変異を含んでなる変異型ＤＡ１−Ａ２遺伝子の配列は、配列番号１５で示され、このような突然変異体ＤＡ１−Ａ２遺伝子のコード配列は配列番号１６で示され、このような変異型ＤＡ１−Ａ２遺伝子によりコードされるタンパク質は配列番号１７で示される。
【０１３３】
さらに、第２のＤＡ１遺伝子の変異型対立遺伝子を含んでなるアブラナ属植物が提供され、この場合、前記第２のＤＡ１遺伝子の変異型対立遺伝子は、完全ノックアウトＤＡ１遺伝子である。また、完全ノックアウトＤＡ１遺伝子を含んでなるアブラナ属植物も提供され、この場合、配列番号２の３５８番に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸を含んでなる変異型ＤＡ１タンパク質をコードするＤＡ１対立遺伝子は存在しない。
【０１３４】
基本的に、野生型ＤＡ１タンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸挿入、欠失および／または置換を含んでなるＤＡ１タンパク質をもたらす野生型ＤＡ１核酸配列における突然変異はいずれも、生物活性の有意な低下または不在をもたらし得る。しかしながら、ＤＡ１タンパク質におけるある種の突然変異、例えば、ＵＩＭドメインまたはＬＩＭドメインなどの機能的ドメインの重要な部分が欠損している突然変異は、ＤＡ１タンパク質の生物活性の完全な破壊をもたらす可能性がより高いと理解される。
【０１３５】
核酸分子は、
・「ミスセンス突然変異」、すなわち、あるアミノ酸の、別のアミノ酸での置換をもたらす核酸配列における変化；
・「ナンセンス突然変異」または「終止コドン突然変異」、すなわち、未熟終止コドンの導入、従って、翻訳の終結をもたらす（末端切断型タンパク質が生じる）核酸配列における変化；植物遺伝子は、翻訳終止コドン「ＴＧＡ」（ＲＮＡではＵＧＡ）、「ＴＡＡ」（ＲＮＡではＵＡＡ）および「ＴＡＧ」（ＲＮＡではＵＡＧ）を含み、従って、（リーディングフレームにおいて）翻訳される成熟ｍＲＮＡとなるべきこれらのコドンのうちの１つを生じるいずれのヌクレオチド置換、挿入、欠失も翻訳を終結する；
・その核酸のコード配列に付加された１以上のコドンによる１以上のアミノ酸の「挿入突然変異」；
・その核酸のコード配列において削除された１以上のコドンによる１以上のアミノ酸の「欠失突然変異」；
・その突然変異の下流において異なるフレームで翻訳される核酸配列をもたらす「フレームシフト突然変異」。フレームシフト突然変異は、１以上のヌクレオチドの挿入、欠失または重複などの様々な原因を持ち得る；
・スプライシングの変更をもたらすスプライス部位の変異、これは、ｍＲＮＡプロセシングの変更、および結果として、おそらくは未熟翻訳終結と組み合わさった種々の長さの欠失、置換、または挿入のいずれかを含む、コードされるタンパク質の変更
などの１以上の突然変異を含んでなり得る。
【０１３６】
本出願に定義されるように、「完全ノックアウトｄａ１遺伝子」または「ノックアウトｄａ１対立遺伝子」は、ＷＯ２００９／０４７５２５に記載されるｄａ１−１変異型シロイヌナズナで過剰発現された際にｄａ１−１表現型を回復しないｄａ１遺伝子またはｄａ１対立遺伝子を意味する。
【０１３７】
従って、この定義から、ノックアウトＤＡ１タンパク質は、１以上のミスセンス、ナンセンス、挿入、欠失、フレームシフト、またはスプライス部位突然変異により提供され得ることが明らかである。
【０１３８】
アラビドプシスＤＡ１核酸（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）配列と本発明のＤＡ１核酸配列、特に、アブラナ属ＤＡ１ゲノム配列（配列番号３、６、９、１２、５４、５７、６０、６３、７０、および７３）、コード配列（配列番号４、７、１０、１３、５５、５８、６１、６４、６６、６８、７１、および７４）およびアミノ酸（配列番号５、８、１１、１４、５６、６２、６５、６７、６９、７２、および７５）配列との最適なアラインメントは、これらのアブラナ属配列中において対応する保存されているドメインおよびアミノ酸の位置を決定することを可能とする（アラビドプシスＤＡ１タンパク質配列と配列番号５、８、１１、１４、５６、６２、６５、６７、６９、７２、および７５のアブラナ属ＤＡ１タンパク質配列とのアラインメントについては図１を参照）。
【０１３９】
ＤＡ１対立遺伝子におけるナンセンス突然変異は、本明細書で使用される場合、対応する野生型ＤＡ１対立遺伝子のコードＤＮＡおよび対応するｍＲＮＡ配列に１以上の翻訳終止コドンが導入される、ＤＡ１対立遺伝子における突然変異である。翻訳終止コドンはＴＧＡ（ｍＲＮＡではＵＧＡ）、ＴＡＡ（ＵＡＡ）およびＴＡＧ（ＵＡＧ）である。よって、コード配列においてインフレーム終止コドンの生成をもたらすいずれの突然変異（欠失、挿入または置換）も、翻訳の終結およびアミノ酸鎖の末端切断を生じる。よって、完全ノックアウト変異型ＤＡ１対立遺伝子は、ＣＡＧからＴＡＧへ、ＴＧＧからＴＡＧへ、ＴＧＧからＴＧＡへ、またはＣＡＡからＴＡＡへの突然変異などの一ヌクレオチド置換によってＤＡ１コドン配列にインフレーム終止コドンが導入されるナンセンス突然変異を含んでなり得る(imay comprise)。あるいは、完全ノックアウト変異型ＤＡ１対立遺伝子は、ＣＡＧからＴＡＡへ、ＴＧＧからＴＡＡへ、またはＣＧＧからＴＡＧもしくはＴＧＡへの突然変異などの二重ヌクレオチド置換によってＤＡ１コドン配列にインフレーム終止コドンが導入されるナンセンス突然変異を含んでなり得る。完全ノックアウト変異型ＤＡ１対立遺伝子は、ＣＧＧからＴＡＡへの突然変異などの三重ヌクレオチド置換によってＤＡ１コドン配列にインフレーム終止コドンが導入されるナンセンス突然変異をさらに含んでなり得る。末端切断型タンパク質は、その突然変異の下流のコードＤＮＡによりコードされているアミノ酸（すなわち、ＤＡ１タンパク質のＣ末端部分）を欠き、その突然変異の上流のコードＤＮＡによりコードされているアミノ酸（すなわち、ＤＡ１タンパク質のＮ末端部分）を維持する。
【０１４０】
本明細書の下記の表は、本明細書で提供されるブラシカ・ナパスＤＡ１配列における可能性のあるナンセンス突然変異の範囲を示す。
【０１４１】
【表１】
0006639382.tif 000002
0006639382.tif 000003
0006639382.tif 000004
【０１４２】
【表２】
0006639382.tif 000005
0006639382.tif 000006
0006639382.tif 000007
【０１４３】
【表３】
0006639382.tif 000008
0006639382.tif 000009
0006639382.tif 000010
【０１４４】
【表４】
0006639382.tif 000011
0006639382.tif 000012
0006639382.tif 000013
【０１４５】
【表５】
0006639382.tif 000014
【０１４６】
【表６】
0006639382.tif 000015
【０１４７】
【表７】
0006639382.tif 000016
【０１４８】
【表８】
0006639382.tif 000017
【０１４９】
明らかに、突然変異上記の表に示されるものに限定されず、ＤＡ１対立遺伝子には、配列表に示されるものおよび上記の表に挙げられたもの以外の類似の終結突然変異も存在し得ると理解される。
【０１５０】
ＤＡ１対立遺伝子におけるミスセンス突然変異は、本明細書で使用される場合、１以上のコドンが、対応する野生型ＤＡ１対立遺伝子のコードＤＮＡおよび対応するｍＲＮＡ配列に変更されて、野生型ＤＡ１タンパク質における１以上のアミノ酸の、変異型ＤＡ１タンパク質における１以上の他のアミノ酸での置換をもたらすような、ＤＡ１対立遺伝子における任意の突然変異（欠失、挿入または置換）である。
【０１５１】
ＤＡ１対立遺伝子におけるフレームシフト突然変異は、本明細書で使用される場合、その突然変異の下流において異なるフレームで翻訳される核酸配列をもたらす、ＤＡ１対立遺伝子における突然変異（欠失、挿入、重複など）である。
【０１５２】
ＡＤ１対立遺伝子におけるスプライス部位突然変異は、本明細書で使用される場合、スプライス供与部位またはスプライス受容部位が変異を受けて、ｍＲＮＡのプロセシングの変更、および結果として、種々の長さの挿入、欠失、置換を含み得る、または末端切断型となり得るコードされるタンパク質の変更をもたらす、ＤＡ１対立遺伝子における突然変異（欠失、挿入、置換、重複など）である。
【０１５３】
特定の実施形態では、配列番号３の１３８５番のＣがＴに変異され、グルタミンをコードする１３８５〜１３８７番のＣＡＡコドンの、ＴＡＡ終結コドンへの突然変異が生じ；または配列番号３の１６８３番のＧがＡに変異され、トリプトファンをコードする１６８１〜１６８３番のＴＧＧコドンの、ＴＧＡ終結コドンへの突然変異を生じ；または配列番号３の１９３２番のＣがＴに変異され、グルタミンをコードする１９３２〜１９３４番のＣＡＡコドンの、ＴＡＡ終結コドンへの突然変異が生じ；または配列番号６の１７４４番のＧがＡに変異され、トリプトファンをコードする１７４３〜１７４５番のＴＧＧコドンの、ＴＡＧ終結コドンへの突然変異が生じ；または配列番号６の１９９８番のＣがＴに変異され、グルタミンをコードする１９９８〜２０００番のＣＡＡコドンの、ＴＡＡ終結コドンへの突然変異が生じ；または配列番号６の１９７４番のＣがＴに変異され、グルタミンをコードする１９７４〜１９７６番のＣＡＡコドンの、ＴＡＡ終結コドンへの突然変異が生じ；または配列番号６の１８７４番のＧがＡに変異され、トリプトファンをコードする１８７２〜１８７４番のＴＧＧコドンの、ＴＧＡ終結コドンへの突然変異が生じ；または配列番号９の１４２５番のＣがＴに変異され、グルタミンをコードする１４２５〜１４２７番のＣＡＧコドンの、ＴＡＧ終結コドンへの突然変異が生じ；または配列番号９の１９６０番のＣがＴに変異され、グルタミンをコードする１９６０〜１９６２番のＣＡＡコドンの、ＴＡＡ終結コドンへの突然変異が生じ；または配列番号９の１６７０番のＣがＴに変異され、グルタミンをコードする１６７０〜１６７２番のＣＡＡコドンの、ＴＡＡ終結コドンへの突然変異が生じ；または配列番号９の２００４番のＧがＡに変異され、トリプトファンをコードする２００２〜２００４番のＴＧＧコドンの、ＴＧＡ終結コドンへの突然変異が生じ；または配列番号１２の２０１１番のＣがＴに変異され、グルタミンをコードする２０１１〜２０１３番のＣＡＡコドンの、ＴＡＡ終結コドンへの突然変異が生じる。
【０１５４】
本発明によるアミノ酸配列
シロイヌナズナＤＡ１タンパク質は、Ｎ末端に２つのユビキチン相互作用モチーフ（ＵＩＭ）と１つの亜鉛結合ドメイン（ＬＩＭ）を含有する５３２アミノ酸のタンパク質をコードすると予測される（ＷＯ２００９／０４７５２５およびＬｉら, ２００８、前掲）。ＩＵＭは、ユビキチンと結合し、ユビキチン化を促進するという二重の機能を有する短いペプチドモチーフである。ＬＩＭドメインは、細胞骨格の組織化、器官発生およびシグナル伝達を含む様々な基本的生物プロセスに重要な関与を示す、タンパク質−タンパク質相互作用モチーフである。これら２つのＵＩＭドメインと１つのＬＩＭドメインの位置を図１に示す。
【０１５５】
アブラナ科、特にアブラナ属種、特には、ブラシカ・ナパス、ブラシカ・ラパ、ブラシカ・オレラセアおよびブラシカ・ニグラ由来の野生型（機能的）ＤＡ１アミノ酸配列および変異型ＤＡ１アミノ酸配列（ＤＡ１タンパク質の生物活性の有意な的なまたは不在をもたらす突然変異などの１以上の突然変異を含んでなる）の両方が提供されるだけでなく、他のアブラナ属作物種由来のものも提供される。例えば、Ａゲノムおよび／またはＣゲノムを含んでなるアブラナ属種は、異なるＤＡ１−Ａアミノ酸またはＤＡ１−Ｃアミノ酸をコードし得る。加えて、突然変異誘発法を用いて、野生型ＤＡ１対立遺伝子に突然変異を作出し、それにより、さらなる変異型ＤＡ１タンパク質をコードし得る変異型対立遺伝子を作出することができる。一実施形態では、野生型および／または変異型ＤＡ１アミノ酸配列は、アブラナ属植物内で（すなわち、内因的に）提供される。
【０１５６】
配列表に示されるように、ＤＡ１−Ａ１およびＤＡ１−Ａ２タンパク質のアミノ酸配列は、ブラシカ・ナパスおよびブラシカ・ラパから単離されたものであり、ＤＡ１−Ｂ１およびＤＡ１−Ｂ２タンパク質のアミノ酸配列はブラシカ・ニグラから単離されたものであり、ＤＡ１−Ｃ１およびＤＡ１−Ｃ２タンパク質のアミノ酸配列はブラシカ・ナパスおよびブラシカ・オレラセアから単離されたものである。野生型ＤＡ１配列が示されるが、これらの配列、およびこれらと本質的に類似する配列の変異型ＤＡ１配列も野生型ＤＡ１配列と比較して記載される。
【０１５７】
上記のように、本明細書に記載のアブラナ属のＤＡ１タンパク質は約５１１〜５３３アミノ酸長であり、いくつかの構造的および機能的ドメインを含んでなる。
【０１５８】
本発明による「ＤＡ−Ａ１アミノ酸配列」または「ＤＡ１−Ａ１変異体アミノ酸配列」は、配列番号５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＤＡ１配列と「本質的に類似する」または「本質的に同一である」と言うこともできる。
【０１５９】
本発明による「ＤＡ−Ａ２アミノ酸配列」または「ＤＡ１−Ａ２変異体アミノ酸配列」は、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＤＡ１配列と「本質的に類似する」または「本質的に同一である」と言うこともできる。
【０１６０】
本発明による「ＤＡ−Ｃ１アミノ酸配列」または「ＤＡ１−Ｃ１変異体アミノ酸配列」は、配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＤＡ１配列と「本質的に類似する」または「本質的に同一である」と言うこともできる。
【０１６１】
本発明による「ＤＡ１−Ｃ２アミノ酸配列」または「ＤＡ１−Ｃ２変異体アミノ酸配列」は、配列番号１４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＤＡ１配列と「本質的に類似する」または「本質的に同一である」と言うこともできる。
【０１６２】
本発明による「ブラシカ・ナパスＤＡ−Ａ１アミノ酸配列」または「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ１変異体アミノ酸配列」は、配列番号５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＤＡ１配列と「本質的に類似する」または「本質的に同一である」と言うこともできる。
【０１６３】
本発明による「ブラシカ・ナパスＤＡ−Ａ２アミノ酸配列」または「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ２変異体アミノ酸配列」は、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＤＡ１配列と「本質的に類似する」または「本質的に同一である」と言うこともできる。
【０１６４】
本発明による「ブラシカ・ナパスＤＡ−Ｃ１アミノ酸配列」または「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ１変異体アミノ酸配列」は、配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＤＡ１配列と「本質的に類似する」または「本質的に同一である」と言うこともできる。
【０１６５】
本発明による「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ２アミノ酸配列」または「ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ２変異体アミノ酸配列」は、配列番号１４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＤＡ１配列と「本質的に類似する」または「本質的に同一である」と言うこともできる。
【０１６６】
本発明による「ブラシカ・ラパＤＡ−Ａ１アミノ酸配列」または「ブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ１変異体アミノ酸配列」は、配列番号５６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＤＡ１配列と「本質的に類似する」または「本質的に同一である」と言うこともできる。
【０１６７】
本発明による「ブラシカ・ラパＤＡ−Ａ２アミノ酸配列」または「ブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ２変異体アミノ酸配列」は、配列番号５９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＤＡ１配列と「本質的に類似する」または「本質的に同一である」と言うこともできる。
【０１６８】
本発明による「ブラシカ・オレラセアＤＡ−Ｃ１アミノ酸配列」または「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ１変異体アミノ酸配列」は、配列番号６２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＤＡ１配列と「本質的に類似する」または「本質的に同一である」と言うこともできる。
【０１６９】
本発明によるアイソフォーム１「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２アミノ酸配列」またはアイソフォーム１「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２変異体アミノ酸配列」は、配列番号６５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＤＡ１配列と「本質的に類似する」または「本質的に同一である」と言うこともできる。
【０１７０】
本発明によるアイソフォーム２「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２アミノ酸配列」またはアイソフォーム２「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２変異体アミノ酸配列」は、配列番号６７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＤＡ１配列と「本質的に類似する」または「本質的に同一である」と言うこともできる。
【０１７１】
本発明によるアイソフォーム３「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２アミノ酸配列」またはアイソフォーム３「ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２変異体アミノ酸配列」は、配列番号６９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＤＡ１配列と「本質的に類似する」または「本質的に同一である」と言うこともできる。
【０１７２】
本発明による「ブラシカ・ニグラＤＡ−Ｂ１アミノ酸配列」または「ブラシカ・ニグラＤＡ１−Ｂ１変異体アミノ酸配列」は、配列番号７２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＤＡ１配列と「本質的に類似する」または「本質的に同一である」と言うこともできる。
【０１７３】
本発明による「ブラシカ・ニグラＤＡ−Ｂ２アミノ酸配列」または「ブラシカ・ニグラＤＡ１−Ｂ２変異体アミノ酸配列」は、配列番号７５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＤＡ１配列と「本質的に類似する」または「本質的に同一である」と言うこともできる。
【０１７４】
ＤＡ１−Ａ１アミノ酸配列は、ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ１アミノ酸配列およびブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ１アミノ酸配列を含んでなることができ；ＤＡ１−Ａ２アミノ酸配列は、ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ２アミノ酸配列およびブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ２アミノ酸配列を含んでなることができ；ＤＡ１−Ｃ１アミノ酸配列は、ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ１アミノ酸配列およびブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ１アミノ酸配列を含んでなることができ；ＤＡ１−Ｃ２アミノ酸配列は、ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ２アミノ酸配列およびブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２アミノ酸配列を含んでなることができる。
【０１７５】
よって、本発明は、その変異体および断片を含め、野生型、機能的ＤＡ１タンパク質の両方のアミノ酸配列、ならびにこれらのいずれかの変異型アミノ酸配列を提供する。
【０１７６】
さらに、アミノ酸配列における突然変異は、対応する野生型ＤＡ１タンパク質の生物活性に比べて、ＤＡ１タンパク質の生物活性の有意な低下または完全な破壊をもたらし得る。ＤＡ１タンパク質の生物活性の有意な低下または完全な破壊。
【０１７７】
機能的ＤＡ１タンパク質のアミノ酸配列。
【０１７８】
配列表に示されるアミノ酸配列は、ブラシカ・ナパス由来の野生型ＤＡ１タンパク質である。よって、これらの配列は、それらが単離されたブラシカ・ナパス植物に対して内因性である。他のアブラナ属作物種、品種、育種系統またはワイルドアクセッションも、上記のように、同じアミノ酸配列またはそれらの変異体を有する他の機能的ＤＡ１タンパク質に関してスクリーニング可能である。
【０１７９】
加えて、ＤＡ１アミノ酸配列およびそれらの変異体（またはこれらのいずれかの断片）は、アミノ酸データベースを本質的に類似する配列に関してスクリーニングすることによってｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで同定可能であると理解される。本発明によるアミノ酸分子の断片も提供される。
【０１８０】
変異型ＤＡ１タンパク質のアミノ酸配列。
野生型アミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸欠失、挿入または置換を含んでなるアミノ酸配列も、このような変異型アミノ酸分子の断片と同様に、本発明の別の実施形態である。このような変異型アミノ酸配列は、上記のように、様々な既知の方法を用いて作成および／または同定することができる。この場合にも、このようなアミノ酸分子は、内因性形態および単離された形態の両方で提供される。
【０１８１】
一実施形態では、変異型ＤＡ１タンパク質は、配列番号５および５６の３３８番、配列番号８および５９の３５３番、配列番号１１および６２の３４１番、配列番号１４の３５２番、配列番号６５および６９の３５５番、配列番号７２の３４０番、ならびに配列番号７５の３５７番に相当する位置に、アルギニン(Argninine)以外のアミノ酸、例えば、リシンを含んでなる。
【０１８２】
特定の実施形態では、配列番号８の３５０番にアルギニンの代わりにリシンを含むＤＡ１−Ａ２タンパク質が提供される。この突然変異を含むＤＡ１−Ａ２タンパク質は配列番号１７で示される。
【０１８３】
一実施形態では、アミノ酸配列における突然変異は、野生型タンパク質に対してＤＡ１タンパク質の生物活性の有意な低下または完全な破壊をもたらす。上記のように、基本的に、野生型タンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換を含んでなるタンパク質をもたらすいずれの突然変異も、生物活性の有意な低下または不在をもたらし得る。
【０１８４】
よって、一実施形態では、１もしくは複数の欠失または１もしくは複数の挿入が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて活性が有意に低下したまたは不在である変異型タンパク質をもたらす１以上の欠失または挿入突然変異を含んでなる変異型ＤＡ１タンパク質が提供される。このような変異型ＤＡ１タンパク質は、野生型ＤＡ１タンパク質と比べて、少なくとも１、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、１００、１５０、１７５、１８０またはそれを超えるアミノ酸が欠失または挿入され、それにより、その１もしくは複数の欠失または１もしくは複数の挿入が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて活性が有意に低下したまたは不在である変異型タンパク質をもたらすＤＡ１タンパク質である。
【０１８５】
別の実施形態では、末端切断が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて活性が有意に低下したまたは不在である変異型タンパク質をもたらす末端切断型である変異型ＤＡ１タンパク質が提供される。このような末端切断型ＤＡ１タンパク質は、対応する野生型ＤＡ１タンパク質のＣ末端部分の機能的ドメインを欠き、対応する野生型ＤＡ１タンパク質のＮ末端部分を維持するＤＡ１タンパク質である。
【０１８６】
さらに別の実施形態では、１または複数の置換が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて活性が有意に低下したまたは不在である変異型タンパク質をもたらす１以上の置換突然変異を含んでなる変異型ＤＡ１タンパク質が提供される。このような変異型ＤＡ１タンパク質は、特定の機能を有する保存されているアミノ酸残基が置換されているＤＡ１タンパク質である。
【０１８７】
本発明の一態様において、少なくとも２つのＤＡ１遺伝子を含んでなり、第１のＤＡ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が、配列番号１の３５８番に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸を含んでなる変異型ＤＡ１タンパク質をコードする変異型ＤＡ１対立遺伝子であるアブラナ属植物が提供される。
【０１８８】
ＡゲノムとＣゲノムを含んでなる複二倍体ブラシカ・ナパスは、Ａゲノム上の２つのＤＡ１遺伝子（ＤＡ１−Ａ１およびＤＡ１−Ａ２）とＣゲノム上の２つのＤＡ１遺伝子（ＤＡ１−Ｃ１およびＤＡ１−Ｃ２）の４つのＤＡ１遺伝子を含み、Ａゲノムを含んでなる二倍体ブラシカ・ラパは、ＤＡ１−Ａ１とＤＡ１−Ａ２の２つのＤＡ１遺伝子を含み、Ｃゲノムを含んでなる二倍体ブラシカ・オレラセアは、ＤＡ１−Ｃ１とＤＡ１−Ｃ２の２つのＤＡ１遺伝子を含み、また、Ｂゲノムを含んでなる二倍体ブラシカ・ニグラは、ＤＡ１−Ｂ１とＤＡ１−Ｂ２の２つのＤＡ１遺伝子を含むことが判明した。従って、本発明に好適なのは、２つのＤＡ１遺伝子含んでなり、第１のＤＡ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子(at least one allele a first DA1 gene)が、配列番号１の３５８に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸を含んでなる変異型ＤＡ１タンパク質をコードする変異型ＤＡ１対立遺伝子である、二倍体アブラナ属植物である。前記変異型ＤＡ１対立遺伝子は、ＤＡ１−Ａ１遺伝子の、ＤＡ１−Ａ２遺伝子の、ＤＡ１−Ｃ１遺伝子の、ＤＡ１−Ｃ２遺伝子の、ＤＡ１−Ｂ１遺伝子の、およびＤＡ１−Ｂ２遺伝子の変異型対立遺伝子であり得る。より具体的には、ＤＡ１−Ａ２遺伝子の変異型対立遺伝子を含んでなるブラシカ・ラパ植物、ＤＡ１−Ｃ２遺伝子の変異型対立遺伝子を含んでなるブラシカ・オレラセア植物、およびＤＡ１−Ｂ２遺伝子の変異型対立遺伝子を含んでなるブラシカ・ニグラ植物が好適である。前記アブラナ属植物の第２のＤＡ１遺伝子は、野生型対立遺伝子を含んでなることができ、完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子などの変異型ＤＡ１対立遺伝子も含んでなることができる。
【０１８９】
本発明によるアブラナ属植物はさらに、４つのＤＡ１遺伝子を含んでなるアブラナ属植物であり得る。本明細書には、４つのＤＡ１遺伝子を含んでなり、そのうち２つがＡゲノム上にあり（ＤＡ１−Ａ１およびＤＡ１−Ａ２）、２つがＣゲノム上にある（ＤＡ１−Ｃ１およびＤＡ１−Ｃ２）、ブラシカ・ナパス植物が記載される。４つのＤＡ１遺伝子を含んでなるさらなるアブラナ属植物は、異質四倍体ブラシカ・ユンセア（ＡゲノムとＢゲノム）およびブラシカ・カリナタ（ＢゲノムとＣゲノム）であってもよく、ここで、ＤＡ１遺伝子は、ＤＡ１−Ａ１、ＤＡ１−Ａ２、ＤＡ１−Ｂ１、ＤＡ１−Ｂ２（Ｂ．ユンセアの場合）、ならびにＤＡ１−Ｂ１、ＤＡ１−Ｂ２、ＤＡ１−Ｃ１およびＤＡ１−Ｃ２（Ｂ．カリナタの場合）であり得る。配列番号１の３５８番に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸、例えばリシンを含んでなるタンパク質をコードする、ＤＡ１−Ａ２遺伝子の変異型対立遺伝子、またはＤＡ１−Ｃ２遺伝子の変異型対立遺伝子、またはＤＡ１−Ｂ２遺伝子の変異型対立遺伝子を含んでなるアブラナ属植物が好適である。前記アブラナ属植物は、配列番号１の３５８番に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸、例えばリシンを含んでなるタンパク質をコードする変異型ＤＡ１対立遺伝子であり得る第２のＤＡ１遺伝子の変異型対立遺伝子をさらに含んでなることができ、または前記第２の変異型ＤＡ１対立遺伝子は完全ノックアウトＤＡ１遺伝子であり得る。前記第２のＤＡ１遺伝子の前記変異型ＤＡ１対立遺伝子は、第１のＤＡ１遺伝子以外のＤＡ１遺伝子のいずれの対立遺伝子であってもよい。好適な第２のＤＡ１遺伝子は、ＤＡ１−Ａ２、ＤＡ１−Ｃ２、およびＤＡ１−Ｂ２遺伝子である。４つのＤＡ１遺伝子を含んでなる本発明による好適なアブラナ属植物は、第１のＤＡ１−Ａ２遺伝子の変異型対立遺伝子、もしくは第１のＤＡ１−Ｃ２遺伝子の変異型対立遺伝子、もしくは第１のＤＡ１−Ａ２遺伝子の変異型対立遺伝子および第２のＤＡ１−Ｃ２遺伝子の変異型対立遺伝子、もしくは第１のＤＡ１−Ｃ２遺伝子の変異型対立遺伝子および第２のＤＡ１−Ａ２遺伝子の変異型対立遺伝子を含んでなるブラシカ・ナパス植物、または第１のＤＡ１−Ａ２遺伝子の変異型対立遺伝子、もしくは第１のＤＡ１−Ｂ２遺伝子の変異型対立遺伝子、もしくは第１のＤＡ１−Ａ２遺伝子の変異型対立遺伝子および第２のＤＡ１−Ｂ２遺伝子の変異型対立遺伝子、もしくは第１のＤＡ１−Ｂ２遺伝子の変異型対立遺伝子および第２のＤＡ１−Ａ２遺伝子の変異型対立遺伝子を含んでなるブラシカ・ユンセア植物、または第１のＤＡ１−Ｂ２遺伝子の変異型対立遺伝子、もしくは第１のＤＡ１−Ｃ２遺伝子の変異型対立遺伝子、もしくは第１のＤＡ１−Ｂ２遺伝子の変異型対立遺伝子および第２のＤＡ１−Ｃ２遺伝子の変異型対立遺伝子、もしくは第１のＤＡ１−Ｃ２遺伝子の変異型対立遺伝子および第２のＤＡ１−Ｂ２遺伝子の変異型対立遺伝子を含んでなるブラシカ・カリナタ植物であり、ここで、前記第１のＤＡ１遺伝子の前記変異型対立遺伝子は、配列番号１の３５８番に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸、例えばリシンを含んでなるタンパク質をコードし、前記第２の突然変異体ＤＡ１遺伝子の前記変異型対立遺伝子は、配列番号１の３５８番に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸、例えばリシンを含んでなるタンパク質をコードする突然変異体ＤＡ１遺伝子であるか、または完全ノックアウトＤＡ１遺伝子である。
【０１９０】
本発明のさらなる態様では、少なくとも３つのＤＡ１遺伝子を含んでなり、ＤＡ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子であるアブラナ属植物が提供される。従って、本発明に好適なのは、２つのＤＡ１遺伝子を含んでなり、ＤＡ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子である、ブラシカ・ラパ、ブラシカ・オレラセア、およびブラシカ・ニグラなどのアブラナ属植物である。前記完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子は、ＤＡ１−Ａ１遺伝子の、ＤＡ１−Ａ２遺伝子の、ＤＡ１−Ｃ１遺伝子の、ＤＡ１−Ｃ２遺伝子の、ＤＡ１−Ｂ１遺伝子の、およびＤＡ１−Ｂ２遺伝子の完全ノックアウト対立遺伝子であり得る。より具体的には、ＤＡ１−Ａ１遺伝子、ＤＡ１−Ａ２遺伝子、またはＤＡ１−Ａ１遺伝子とＤＡ１−Ａ２遺伝子の両方の完全ノックアウト対立遺伝子を含んでなるブラシカ・ラパ植物、ＤＡ１−Ｃ２遺伝子の完全ノックアウト対立遺伝子を含んでなるブラシカ・オレラセア植物、およびＤＡ１−Ｂ１遺伝子、ＤＡ１−Ｂ２遺伝子、またはＤＡ１−Ｂ１遺伝子とＤＡ１−Ｂ２遺伝子の両方の完全ノックアウト対立遺伝子を含んでなるブラシカ・ニグラ植物が好適である。
【０１９１】
また、４つのＤＡ１遺伝子を含んでなり、ＤＡ１−Ａ１遺伝子、ＤＡ１−Ａ２遺伝子、ＤＡ１−Ｃ２遺伝子、もしくはＤＡ１−Ｃ２遺伝子の完全ノックアウト対立遺伝子、またはＤＡ１−Ｂ１遺伝子もしくはＤＡ１−Ｂ２遺伝子の完全ノックアウト対立遺伝子、またはそれらの任意の組合せを含んでなる、ブラシカ・ナパス、ブラシカ・ユンセア、およびブラシカ・カリナタなどのアブラナ属植物も好適である。本発明による４つのＤＡ１遺伝子を含んでなる好適なアブラナ属植物は、ＤＡ１−Ａ１遺伝子、もしくはＤＡ１−Ａ２遺伝子、もしくはＤＡ１−Ｃ２遺伝子の完全ノックアウト対立遺伝子、またはそれらの任意の組合せを含んでなるブラシカ・ナパス植物；あるいはＤＡ１−Ａ１遺伝子、もしくはＤＡ１−Ａ２遺伝子、もしくはＤＡ１−Ｂ１遺伝子、もしくはＤＡ１−Ｂ２遺伝子の完全ノックアウト対立遺伝子、またはそれらの任意の組合せを含んでなるブラシカ・ユンセア植物；あるいはＤＡ１−Ｂ１遺伝子、もしくはＤＡ１−Ｂ２遺伝子、もしくはＤＡ１−Ｃ２遺伝子の完全ノックアウト対立遺伝子、またはそれらの任意の組合せを含んでなるブラシカ・カリナタ植物である。
【０１９２】
本発明による方法
変異型ＤＡ１対立遺伝子は、当技術分野で慣例の一定範囲の方法を用いて、例えば、ＤＡ１ゲノムまたはｃＤＮＡの一部または全部を増幅するためのＰＣＲに基づく方法を用いて、作出（例えば、突然変異誘発により誘導）および／または同定することができる。
【０１９３】
突然変異誘発後、植物は、既知の技術を用いて処理種子から栽培するか、または処理細胞から再分化させる。例えば、突然変異誘発種子を、慣行栽培法に従って植え付け、自家受粉後に植物に種子を付けさせることができる。あるいは、例えば、Coventry et al. (1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. of Guelph, Guelph, Ontario, Canada)に記載されているように、処理した小胞子または花粉細胞から倍加半数性植物体を抽出して、すぐにホモ接合型植物を形成することもできる。このような自家受粉の結果として当世代または次世代で形成されるさらなる種子を採種し、当技術分野で慣例の技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく技術（ＤＡ１対立遺伝子の増幅）またはハイブリダイゼーションに基づく技術、例えば、サザンブロット分析、ＢＡＣライブラリースクリーニングなど、および／またはＤＡ１対立遺伝子の直接配列決定を用いて、変異型ＤＡ１対立遺伝子の存在に関してスクリーニングしてもよい。変異型ＤＡ１対立遺伝子において点突然変異（いわゆる一塩基多型またはＳＮＰ）の存在に関してスクリーニングするために、当技術分野で慣例のＳＮＰ検出法、例えば、オリゴライゲーションに基づく技術、一塩基伸長に基づく技術、またはＴＩＬＬＩＮＧなどの制限部位の違いに基づく技術を使用することができる。
【０１９４】
上記のように、特定の野生型ＤＡ１対立遺伝子の突然変異誘発（自然発生的ならびに誘導型）は、結果として生じる変異型ＤＡ１対立遺伝子に１以上の欠失、挿入、または置換ヌクレオチド（以下、「変異領域」と呼ぶ）の存在をもたらす。従って、変異型ＤＡ１対立遺伝子は、野生型ＤＡ１対立遺伝子中の１以上の欠失、挿入、または置換ヌクレオチドの場所および構成によって特徴付けることができる。１以上のヌクレオチドがそれぞれ挿入、欠失、または置換された野生型ＤＡ１対立遺伝子の部位は、本明細書では、「変異領域または配列」とも呼ぶ。「５’または３’フランキング領域または配列」は、本明細書で使用される場合、１以上の欠失、挿入、または置換ヌクレオチドを含むＤＮＡとは異なる少なくとも２０ｂｐ、好ましくは、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、および最大５０００ｂｐのＤＮＡの変異型（または対応する野生型）ＤＡ１対立遺伝子中のＤＮＡ領域または配列、好ましくは、変異型（または対応する野生型ＤＡ１対立遺伝子）中の変異領域のすぐ上流で隣接して位置するか（５’フランキング領域または配列」）、またはすぐ下流で隣接して位置する（３’フランキング領域または配列」）、変異型（または対応する野生型）ＤＡ１対立遺伝子由来のＤＮＡを意味する。「連結領域」は、本明細書で使用される場合、変異領域と５’または３’フランキング領域が互いに連結されている変異型（または対応する野生型）ＤＡ１対立遺伝子のＤＮＡ領域を意味する。従って、「変異領域と５’または３’フランキング領域との間の連結領域にわたる配列」は、変異配列ならびにそれと隣接するフランキング配列を含んでなる。
【０１９５】
一実施形態では、生体サンプルにおいて本発明の変異型ＤＡ１対立遺伝子を同定するための方法であって、前記生体サンプルを少なくとも２つのプライマーのセットを用いた増幅反応に付すことを含んでなり、前記プライマーの１つは、変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プライマーの他のものが変異型ＤＡ１対立遺伝子の変異領域を特異的に認識するか；または前記プライマーの１つが変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プライマーの他のものが、それぞれ変異型ＤＡ１対立遺伝子の３’もしくは５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するか；または特異的プローブが変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する、方法が提供される。別の実施形態では、生体サンプルにおいて本発明の変異型ＤＡ１対立遺伝子を同定するための方法であって、前記生体サンプルを少なくとも２つのプライマーのセットを用いた増幅反応に付すことを含んでなり、前記生体サンプルを、少なくとも１つの特異的プローブを含んでなる特異的プローブのセットを用いたハイブリダイゼーションアッセイに付すことをさらに含んでなり、前記プローブのセットが、前記プローブの１つが変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プローブの他のものが変異型ＤＡ１対立遺伝子の変異領域を特異的に認識するか；または前記プローブの１つが変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プローブの他のものが、それぞれ変異型ＤＡ１対立遺伝子の３’または５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する場合を含んでなるか；または変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する特異的プローブを含んでなる方法が提供される。
【０１９６】
特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子、または特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる植物もしくは植物材料、または特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる植物材料を含んでなる製品を同定するために開発したツールは、変異領域、分子マーカー、またはフランキングおよび／もしくは変異領域の配列を含んでなるゲノム領域の特定の制限地図など、対応する野生型ＤＡ１対立遺伝子のゲノムの特徴と比較した、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子のゲノムの特徴に基づく。
【０１９７】
ひと度、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の配列が決定されれば、分子生物学的技術によって、サンプルの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）中の変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’フランキング、３’フランキングおよび／または変異領域内の配列を特異的に認識するプライマーおよびプローブを開発することができる。例えば、生体サンプル（例えば、植物、植物材料または植物材料を含んでなる製品のサンプル）において変異型ＤＡ１対立遺伝子を同定するためのＰＣＲ法を開発することができる。このようなＰＣＲは、少なくとも２つの特異的「プライマー」に基づき、１つは変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’または３’フランキング領域内の配列を認識し、他のものはそれぞれ変異型ＤＡ１対立遺伝子の３’もしくは５’フランキング領域内の配列を認識するか；または１つは変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域内の配列を認識し、他のものは変異型ＤＡ１対立遺伝子の変異領域内の配列を認識するか；または１つは変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域内の配列を認識し、他のものは、それぞれ特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の３’もしくは５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域にわたる配列を認識する（以下に詳しく記載する通り）。
【０１９８】
これらのプライマーは好ましくは、最適なＰＣＲ条件下で、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域内の配列、変異領域内の配列、または３’もしくは５’フランキングと変異領域との間の連結領域にわたる配列を「特異的に認識する」１５〜３５ヌクレオチドの間の配列を有し、従って、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる核酸サンプルから特異的断片（「変異型ＤＡ１特異的断片」または識別アンプリコン）が増幅される。このことは、最適なＰＣＲ条件下で植物ゲノムから、標的変異型ＤＡ１対立遺伝子だけが増幅され、他の配列は増幅されないことを意味する。
【０１９９】
本発明に好適なＰＣＲプライマーは下記のものであり得る：
・特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子またはその相補物の５’または３’フランキング配列（すなわち、例えば、本発明の変異型ＤＡ１対立遺伝中の、欠失、挿入または置換された１以上のヌクレオチドに５’または３’側で隣接する配列、例えば、上記のナンセンス、ミスセンスもしくはフレームシフト突然変異に５’もしくは３’側で隣接する配列、または上記の表に示される終止コドン突然変異に５’もしくは３’側で隣接する配列、または上記に示したスプライス部位突然変異に５’もしくは３’側で隣接する配列、または上記に示した置換突然変異またはその相補物）から選択される少なくとも１７の連続するヌクレオチド、好ましくは、２０の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含んでなる１７ｎｔ〜約２００ｎｔの長さの範囲のオリゴヌクレオチド（５’フランキング配列を認識するプライマー）；または
・特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子またはその相補物の変異領域の配列（すなわち、例えば、本発明のＤＡ１遺伝子またはその相補物における挿入または置換されたヌクレオチドの配列）から選択される少なくとも１７の連続するヌクレオチド、好ましくは、２０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含んでなる１７ｎｔ〜約２００ｎｔの長さの範囲のオリゴヌクレオチド（変異配列を認識するプライマー）。
【０２００】
当然のことながら、プライマーは、記載の１７の連続するヌクレオチドよりも長くてもよく、例えば、１８、１９、２０、２１、３０、３５、５０、７５、１００、１５０、２００ｎｔ長またはさらに長くてもよい。これらのプライマーは、記載のフランキング配列および変異配列のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列から完全になってもよい。しかしながら、これらのプライマーの５’末端（すなわち、３’側に位置する１７の連続するヌクレオチドの外側）のヌクレオチド配列の重要度は低い。従って、これらのプライマーの５’配列は、必要に応じてフランキング配列または変異配列から選択されるヌクレオチド配列からなってよいが、いくつかの（例えば、１、２、５、１０）のミスマッチを含んでもよい。プライマーの５’配列は、さらに、例えば、制限酵素認識部位を表すヌクレオチド配列などの、フランキング配列または変異配列とは無関連のヌクレオチド配列から完全になってもよい。ミスマッチを含むこのような無関連の配列またはフランキングＤＮＡ配列は、好ましくは、１００以下、より好ましくは５０以下、またはさらには２５ヌクレオチドの長さであるべきである。
【０２０１】
さらに、好適なプライマーは、フランキング配列と変異配列との間の連結領域（すなわち、例えば、本発明の変異型ＤＡ１対立遺伝子における欠失、挿入または置換された１以上のヌクレオチドに５’または３’側で隣接する配列と挿入もしくは置換された１以上のヌクレオチドの配列または欠失した１以上のヌクレオチドとそれぞれ３’もしくは５’側で隣接する配列との間の連結領域、例えば、上記の本発明のＤＡ１遺伝子中のナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異に５’または３’側で隣接する配列とナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異の配列との間の連結領域、または上記の表に示される、可能性のある終止コドン突然変異に５’または３’側で隣接する配列との間の連結領域、または上記に示されるスプライス部位突然変異、もしくは上記に示される置換突然変異に５’もしくは３’側で隣接する配列と、それぞれ可能性のある終止コドン突然変異もしくは置換突然変異の配列との間の連結領域）にわたるヌクレオチド配列を含んでなってもよいし、またはからなってもよく、ただし、前記ヌクレオチド配列は、変異領域またはフランキング領域に排他的に由来するものではない。
【０２０２】
また、適切に選択されるＰＣＲプライマー対は互いに相補的な配列を含んでなるべきでないことも、当業者にはすぐに明らかになるであろう。
【０２０３】
本発明において、「配列番号Ｘで示されるヌクレオチド配列の相補物」は、シャルガフの規則（Ａ←→Ｔ；Ｇ←→Ｃ）に従ってヌクレオチドをそれらの相補的ヌクレオチドで置換し、その配列を５’から３’の方向に、すなわち、示されたヌクレオチド配列と反対の方向に読み取ることによって、示されたヌクレオチド配列から誘導され得るヌクレオチド配列である。
【０２０４】
特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子を同定するために好適なプライマーの例は、実施例に記載される。
【０２０５】
本明細書で使用される場合、「配列番号ＺのＸ番〜Ｙ番のヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチドの両端を含むヌクレオチド配列を示す。
【０２０６】
好ましくは、増幅断片は、５０〜１０００ヌクレオチドの間の長さ、例えば、５０〜５００ヌクレオチドの間の長さ、または１００〜３５０ヌクレオチドの間の長さである。最適なＰＣＲ条件下でこれらのプライマーを用いて特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の特異的同定がなお可能である限り、特異的プライマーは、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域内の配列と、または変異領域内の配列と、または３’もしくは５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域にわたる配列と８０〜１００％の間で同一である配列を有してよい。しかしながら、許容されるミスマッチの範囲は、実験的に容易に決定することができ、当業者に公知である。
【０２０７】
「変異型ＤＡ１特異的断片」の検出および／または同定は、例えば、ゲルまたはキャピラリー電気泳動後のサイズ評価または蛍光に基づく検出法によるなど、様々な方法で行うことができる。変異型ＤＡ１特異的断片はまた、直接配列決定することもできる。増幅されたＤＮＡ断片の検出のための他の配列特異的方法も当技術分野で知られている。
【０２０８】
標準的なＰＣＲプロトコールは、'PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 第2版, 1999)および他の参照文献など、当技術分野において記載がある。特異的プライマーの配列を含め、ＰＣＲの最適条件は、各特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の「ＰＣＲ同定プロトコール」に明示されている。しかしながら、ＰＣＲ同定プロトコールのいくつかのパラメーターは、特定の実験条件に合わせて調整する必要のある場合があり、同等の結果を得るために若干の変更がなされる場合があると理解される。例えば、ＤＮＡの調製に異なる方法を使用する場合には、例えば、使用するプライマー、ポリメラーゼの量、ＭｇＣｌ２濃度またはアニーリング条件の調整を必要とする場合がある。同様に、他のプライマーを使用すれば、ＰＣＲ同定プロトコールに関して他の最適条件が指定される場合がある。しかしながら、これらの調整は当業者には自明であり、上記に挙げたものなどの現行のＰＣＲ適用マニュアルにさらに詳説されている。
【０２０９】
特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子を同定するためのＰＣＲ同定プロトコールの例は、実施例に記載される。
【０２１０】
あるいは、特異的プライマーは、生体サンプルにおいて特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子を同定するための「特異的プローブ」に使用可能な変異型ＤＡ１特異的断片を増幅するためにも使用することができる。生体サンプルの核酸とプローブを、プローブと核酸中のその対応する断片のハイブリダイゼーションを可能とする条件下で接触させると、核酸／プローブハイブリッドが形成される。このハイブリッドの形成は検出可能であり（例えば、核酸またはプローブの標識）、これにより、このハイブリッドの形成は、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の存在を示す。特異的プローブとのハイブリダイゼーション（固相担体上または溶液中）に基づくこのような同定方法は、当技術分野ですでに記載されている。特異的プローブは好ましくは、最適な条件下で、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域内および／または変異領域内の領域（以下、「変異型ＤＡ１特異的領域」と呼ぶ）と特異的にハイブリダイズする配列である。好ましくは、特異的プローブは、特異的領域のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、好ましくは８０〜８５％の間、より好ましくは８５〜９０％の間、特に好ましくは９０〜９５％の間、最も好ましくは９５％〜１００％の間の同一性（または相補性）を有する、１０〜１０００ｂｐの間、５０〜６００ｂｐの間、１００〜５００ｂｐの間、１５０〜３５０ｂｐの間の配列を含んでなる。好ましくは、特異的プローブは、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の特異的領域と同一（または相補的）である約１３〜約１００の連続するヌクレオチドの配列を含んでなる。
【０２１１】
本発明に好適な特異的プローブは以下のものであり得る：
・特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子またはその相補物の５’または３’フランキング配列（すなわち、例えば、本発明の変異型ＤＡ１対立遺伝子における欠失、挿入または置換された１以上のヌクレオチドに５’または３’側で隣接する配列、例えば、上記のナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異に５’または３’側で隣接する配列、または上記の表に示される、可能性のある終止コドン突然変異に５’または３’側で隣接する配列、または上記に示されるスプライス部位突然変異もしくは上記に示される置換突然変異に５’または３’側で隣接する配列）、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される少なくとも１３の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含んでなる、１３ｎｔ〜約１０００ｎｔの長さの範囲のオリゴヌクレオチド（５’フランキング配列を認識するプローブ）；または
・特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子またはその相補物の変異配列（すなわち、例えば、本発明のＤＡ１対立遺伝子またはその相補物における挿入または置換されたヌクレオチドの配列）、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される少なくとも１３の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含んでなる、１３ｎｔ〜約１０００ｎｔの長さの範囲のオリゴヌクレオチド（変異配列を認識するプローブ）。
【０２１２】
これらのプローブは、フランキング配列および変異配列の記載のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列から完全になってもよい。しかしながら、これらのプローブの５’または３’末端のヌクレオチド配列の重要度は低い。従って、これらのプローブの５’または３’配列は、必要に応じてフランキング配列または変異配列から選択されるヌクレオチド配列からなってよいが、フランキング配列または変異配列とは無関連のヌクレオチド配列からなってもよい。このような無関連の配列は、好ましくは５０以下、より好ましくは２５以下、またはさらには２０もしくは１５以下のヌクレオチドの長さであるべきである。
【０２１３】
さらに、好適なプローブは、フランキング配列と変異配列との間の連結領域（すなわち、例えば、本発明の変異型ＤＡ１対立遺伝子における欠失、挿入または置換された１以上のヌクレオチドに５’または３’側で隣接する配列と挿入もしくは置換された１以上のヌクレオチドの配列または欠失した１以上のヌクレオチドとそれぞれ３’もしくは５’側で隣接する配列との間の連結領域、例えば、上記の本発明のＤＡ１遺伝子中のナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異に５’または３’側で隣接する配列とナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異の配列との間の連結領域、または上記の表に示される、可能性のある終止コドン突然変異に５’または３’側で隣接する配列、または上記に示されるスプライス部位突然変異、もしくは上記に示される置換突然変異に５’もしくは３’側で隣接する配列と、それぞれ可能性のある終止コドン突然変異もしくは置換突然変異の配列との間の連結領域）にわたるヌクレオチド配列を含んでなってもよいし、またはからなってもよく、ただし、記載のヌクレオチド配列は、変異領域またはフランキング領域に排他的に由来するものではない。
【０２１４】
特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子を同定するために好適な特異的プローブの例は、実施例に記載される。
【０２１５】
特異的プローブとハイブリダイズする「変異型ＤＡ１特異的領域」の検出および／または同定は、例えば、ゲルまたはキャピラリー電気泳動後のサイズ評価または蛍光に基づく検出法によるなど、様々な方法で行うことができる。特異的プローブとハイブリダイズする「変異型ＤＡ１特異的領域」の検出のための他の配列特異的方法も当技術分野で知られている。
【０２１６】
あるいは、１以上の変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる植物または植物部分は、高速中性子突然変異誘発により作出された欠失突然変異体をスクリーニングするためにＰＣＲを使用する「Ｄｅｌｅｔｅ−ａ−ｇｅｎｅ（商標）」法（Li and Zhang, 2002, Funct Integr Genomics 2:254-258に概説されている）、ＥＭＳにより誘発された点突然変異を、ヘテロ二重鎖分析による塩基対変化を検出するための変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）を用いて同定するＴＩＬＬＩＮＧ(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)法(McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18:455、およびMcCallum et al. 2000, Plant Physiol. 123, 439-442)などの他の方法を用いて作出および同定することもできる。記載のように、ＴＩＬＬＩＮＧは、突然変異のハイスループットスクリーニングを用いる（例えば、変異型−野生型ＤＮＡヘテロ二重鎖のＣｅｌ  １切断とシーケンシングゲルシステムを用いた検出を使用）。従って、１以上の変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる植物または植物部分を同定するためのＴＩＬＬＩＮＧの使用、ならびにこのような植物、植物器官、組織および種子を作出および同定するための方法は本明細書に包含される。よって、一実施形態では、本発明による方法は、植物種子を突然変異誘発（例えば、ＥＭＳ突然変異誘発）する工程、植物個体またはＤＮＡのプール、対象領域のＰＣＲ増幅、ヘテロ二重鎖形成およびハイスループット検出、突然変異植物の同定、変異型ＰＣＲ産物のシーケンシングを含んでなる。他の突然変異誘発および選抜方法もこのような突然変異植物を作出するために同様に使用できると理解される。
【０２１７】
ＤＡ１対立遺伝子に突然変異を導入する代わりに、天然（自然発生的）突然変異対立遺伝子を当技術分野で公知の方法によって同定することもできる。例えば、天然突然変異ＤＡ１対立遺伝子の存在に関して複数の植物または植物部分をスクリーニングするためにＥＣＯＴＩＬＬＩＮＧを使用してもよい(Henikoff et al. 2004, Plant Physiology 135(2):630-6)。上記突然変異誘発技術に関して、好ましくは、Ａゲノムおよび／またはＣゲノムを含んでなるアブラナ属種がスクリーニングされ、従って、同定されたＤＡ１対立遺伝子は、次に、交配（種間または種内交配）および選抜により、ブラシカ・ナパスなどの他のアブラナ属種に導入することができる。育種系統または近縁種におけるＥＣＯＴＩＬＬＩＮＧ天然多形は、ＤＡ１標的のＰＣＲ増幅、ヘテロ二重鎖形成およびハイスループット分析に植物個体または植物プールが使用される、上記のＴＩＬＬＩＮＧ法によってスクリーニングされる。この後、必要とされる突然変異を有する個々の植物の選抜を行うことができ、これをその後、所望の変異型対立遺伝子を組み込むための育種プログラムにおいて使用することができる。
【０２１８】
次に、同定された変異型対立遺伝子の配列を決定することができ、その配列を野生型対立遺伝子と比較して突然変異を同定することができる。場合により、上記に示したように機能を試験することもできる。このアプローチを用いれば、複数の変異型ＤＡ１対立遺伝子（およびこれらを１以上含んでなるアブラナ属植物）を同定することができる。次に、以下に詳しく記載するような交配および選抜法によって、所望の変異型対立遺伝子を所望の野生型対立遺伝子と組み合わすことができる。最後に、所望の数の変異型ＤＡ１と所望の数の野生型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる単一の植物を作出する。
【０２１９】
ＰＣＲプライマーまたは特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の検出のための特異的プローブとして好適なオリゴヌクレオチドはまた、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の接合状態を決定するための方法を開発するために使用することもできる。
【０２２０】
特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の接合状態を決定するためには、変異型および／または対応する野生型ＤＡ１特異的対立遺伝子の存在を判定するためのＰＣＲに基づくアッセイを開発することができる。
【０２２１】
特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の接合状態を決定するためには、野生型ＤＡ１対立遺伝子を特異的に認識する２つのプライマーを、互いに対向する向きに、変異領域がこれらのプライマーの間に位置するように設計することができる。これらのプライマーは、それぞれ５’および３’フランキング配列を特異的に認識するプライマーであり得る。このプライマーのセットは、変異型ならびに対応する野生型ＤＡ１対立遺伝子の、同時の診断的ＰＣＲ増幅を可能とする。
【０２２２】
あるいは、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の接合状態を決定するためには、野生型ＤＡ１対立遺伝子を特異的に認識する２つのプライマーを、互いに対向する向きに、それらの一方が変異領域を特異的に認識するように設計することができる。これらのプライマーは、野生型ＤＡ１対立遺伝子の５’または３’フランキング領域および変異領域の配列をそれぞれ特異的に認識するプライマーであり得る。このプライマーのセットは、変異型ＤＡ１対立遺伝子における変異領域の配列を特異的に認識する第３のプライマーとともに、変異型ＤＡ１対立遺伝子ならびに野生型ＤＡ１対立遺伝子の、同時の診断的ＰＣＲ増幅を可能とする。
【０２２３】
あるいは、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の接合状態を決定するためには、野生型ＤＡ１対立遺伝子を特異的に認識する２つのプライマーを、互いに対向する向きに、それらの一方が５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するように設計することができる。これらのプライマーは、野生型ＤＡ１対立遺伝子の５’または３’フランキング配列、および変異領域と３’または５’フランキング領域との間の連結領域をそれぞれ特異的に認識するプライマーであり得る。このプライマーのセットは、変異型ＤＡ１対立遺伝子の変異領域と３’または５’フランキング領域との間の連結領域をそれぞれ特異的に認識する第３のプライマーとともに、変異型ＤＡ１対立遺伝子ならびに野生型ＤＡ１対立遺伝子の、同時の診断的ＰＣＲ増幅を可能とする。
診断的ＰＣＲ増幅を可能とする。
【０２２４】
あるいは、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の接合状態は、変異型および野生型ＤＡ１対立遺伝子を特異的に認識する別のプライマーセットを使用することによって決定することができる。
【０２２５】
植物が変異型ＤＡ１対立遺伝子または対応する野生型ＤＡ１対立遺伝子に関してホモ接合型である場合、上記の診断的ＰＣＲアッセイは、変異型または野生型ＤＡ１対立遺伝子のいずれかに典型的な、好ましくは長さにおいて典型的な単一のＰＣＲ産物を生じる。植物が変異型ＤＡ１対立遺伝子に関してヘテロ接合型である場合には、２つの特異的ＰＣＲ産物が見られ、これは変異型および野生型ＤＡ１対立遺伝子の両方の増幅を反映している。
【０２２６】
野生型および変異型ＤＡ１特異的ＰＣＲ産物の同定は、例えば、ゲルまたはキャピラリー電気泳動後のサイズの評価によるか（例えば、野生型と変異型のＤＡ１対立遺伝子から増幅された断片間でサイズの違いを生じる、いくつかの挿入または欠失ヌクレオチドを含んでなる変異型ＤＡ１対立遺伝子の場合、その結果、前記断片はゲル上で可視的に分離することができる）；ゲルまたはキャピラリー電気泳動後に２つの異なる断片の有無を評価することによるか（それにより、変異型ＤＡ１対立遺伝子の診断的ＰＣＲ増幅は、場合により、野生型ＤＡ１対立遺伝子の診断的ＰＣＲ増幅から分離して行うことができる）；増幅された断片の直接配列決定によるか；または蛍光に基づく検出法によって行うことができる。
【０２２７】
特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の接合性を決定するために好適なプライマーの例は、実施例に記載される。
【０２２８】
あるいは、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の接合状態を決定するためには、変異型および／または対応する野生型ＤＡ１特異的対立遺伝子の存在を決定するためのハイブリダイゼーションに基づくアッセイを開発することができる。
【０２２９】
特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の接合状態を決定するためには、野生型ＤＡ１対立遺伝子を認識する２つの特異的プローブを、各プローブがＤＡ１野生型対立遺伝子内の配列を特異的に認識し、変異領域が、これらのプローブにより認識される配列の間に位置するように設計することができる。これらのプローブは、５’および３’フランキング配列をそれぞれ特異的に認識するプローブであり得る。これらのプローブの一方、または好ましくは両方の使用は、変異型ならびに対応する野生型ＤＡ１対立遺伝子の、同時の診断的ハイブリダイゼーションを可能とする。
【０２３０】
あるいは、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の接合状態を決定するためには、野生型ＤＡ１対立遺伝子を認識する２つの特異的プローブを、それらの一方がＤＡ１野生型対立遺伝子内の、変異領域の上流または下流、好ましくは変異領域の上流の配列を特異的に認識し、それらの一方が変異領域を特異的に認識するように設計することができる。これらのプローブは、野生型ＤＡ１対立遺伝子の５’または３’フランキング領域、好ましくは５’フランキング領域、および変異領域の配列をそれぞれ特異的に認識するプローブであり得る。これらのプローブの１つ、または好ましくは両方の、場合により、変異型ＤＡ１対立遺伝子における変異領域の配列を特異的に認識する第３のプローブとともに使用することで、変異型および野生型ＤＡ１対立遺伝子の診断的ハイブリダイゼーションが可能となる。
【０２３１】
あるいは、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の接合状態を決定するためには、野生型ＤＡ１対立遺伝子を認識する特異的プローブを、プローブが野生型ＤＡ１対立遺伝子の５’または３’フランキング領域、好ましくは５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するように設計することができる。このプローブは、場合により、変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’または３’フランキング領域、好ましくは５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する第２のプローブとともに、変異型および野生型ＤＡ１対立遺伝子の診断的ハイブリダイゼーションを可能とする。
【０２３２】
あるいは、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の接合状態は、変異型および野生型ＤＡ１対立遺伝子を特異的に認識するプローブの別のセットを用いることにより決定することもできる。
【０２３３】
植物が変異型ＤＡ１対立遺伝子または対応する野生型ＤＡ１対立遺伝子に関してホモ接合型である場合、上記の診断的ハイブリダイゼーションアッセイは、変異型または野生型ＤＡ１対立遺伝子のいずれかに典型的な、好ましくは長さにおいて典型的な単一の特異的ハイブリダイゼーション産物、例えば、１以上のハイブリダイズＤＮＡ（制限）断片を生じる。植物が変異型ＤＡ１対立遺伝子に関してヘテロ接合型である場合には、２つの特異的ハイブリダイゼーション産物が見られ、これは変異型および野生型ＤＡ１対立遺伝子の両方のハイブリダイゼーションを反映している。
【０２３４】
野生型および変異型ＤＡ１特異的ハイブリダイゼーション産物の同定は、例えば、ゲルまたはキャピラリー電気泳動後のサイズの評価によるか（例えば、野生型と変異型のＤＡ１対立遺伝子からのハイブリダイズＤＮＡ（制限）断片間でサイズの違いを生じる、いくつかの挿入または欠失ヌクレオチドを含んでなる変異型ＤＡ１対立遺伝子の場合、その結果、前記断片はゲル上で可視的に分離することができる）；ゲルまたはキャピラリー電気泳動後に２つの異なる特異的ハイブリダイゼーション産物の有無を評価することによるか（それにより、変異型ＤＡ１対立遺伝子の診断的ハイブリダイゼーションは、場合により、野生型ＤＡ１対立遺伝子の診断的ハイブリダイゼーションから分離して行うことができる）；ハイブリダイズＤＮＡ（制限）断片の直接配列決定によるか；または蛍光に基づく検出法によって行うことができる。
【０２３５】
特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の接合性を決定するために好適なプローブの例は、実施例に記載される。
【０２３６】
さらに、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションに基づく増幅方法とは異なる特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子に特異的な検出方法もまた、本明細書で提供される特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子特異的配列情報を用いて開発することができる。このようなもう１つの検出方法は、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）技術（引用することにより本明細書の一部とされる、例えば、米国特許第５，９８５，５５７「核酸の侵入的開裂(Invasive Cleavage of Nucleic Acids)」、同第６，００１，５６７号「インベーダー指向開裂による核酸配列の検出に記載されている通り）としても知られる特定の核酸構造の侵入的開裂に基づくリニアシグナル増幅検出法、ＴａｑｍａｎなどのＲＴ−ＰＣＲに基づく検出法、またはＳＮＰｌｅｘなどの他の検出法を含む。簡単に述べれば、インベーダー（商標）技術では、標的変異型配列を、例えば、変異型配列または５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域にわたる配列のヌクレオチド配列を含んでなる、標識された第１の核酸オリゴヌクレオチドと、そして変異型配列のすぐ下流で隣接する３’フランキング配列を含んでなる第２の核酸オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることができ、ここで、前記第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオチドが重複する。このハイブリダイゼーションにより生じる二重鎖または三重鎖構造は、酵素（Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標））による選択的プローブ切断を可能とし、標的配列が完全な状態で残る。切断された標識プローブはその後、おそらくは、さらなるシグナル増幅をもたらす介在工程を介して検出される。
【０２３７】
本発明のさらなる目的は、生体サンプルにおいて請求項１または２に記載の変異型ＤＡ１対立遺伝子を同定するためのキットであって、プライマーまたはプローブのセットを含んでなり、前記プライマーの１つが変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プライマーの他のものが変異型ＤＡ１対立遺伝子の変異領域を特異的に認識するか；または前記プライマーの１つが変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’もしくは３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プライマーの他のものが、それぞれ変異型ＤＡ１対立遺伝子の３’または５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するか；または変異型ＤＡ１対立遺伝子の５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する特異的プローブを含んでなるキットを提供することである。
【０２３８】
「キット」は、本明細書で使用される場合、本発明の方法、より詳しくは、生体サンプルにおける特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の同定、または特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる植物材料の接合状態の決定の実施を目的とする試薬セットを意味する。より詳しくは、本発明のキットの好ましい実施形態は、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の同定のための上記のような少なくとも２つの特異的プライマー、または接合状態の決定のための少なくとも２つもしくは３つの特異的プライマーを含んでなる。場合により、前記キットは、ＰＣＲ同定プロトコールにおいて本明細書に記載の任意の他の試薬をさらに含んでなり得る。あるいは、本発明の別の実施形態によれば、本キットは、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の同定を目的に、上記のように、そこにおける特定の変異型ＤＡ１の存在を同定するために生体サンプルの核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの特異的プローブ対立遺伝子、または接合状態の決定のための少なくとも２つもしくは３つの特異的プローブを含んでなることができる。場合により、本キットは、特異的プローブを用いて生体サンプルにおける特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子を同定するための、任意の他の試薬（例えば、限定されるものではないが、ハイブリダイズバッファー、標識）をさらに含んでなることができる。
【０２３９】
本発明のキットは、品質管理（例えば、種子ロットの純度）、植物材料または植物材料を含んでなるもしくは植物材料に由来する材料、例えば、限定されるものではないが、食品または飼料製品における特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の有無の検出も目的で、使用することができ、その成分を具体的に調整することができる。
【０２４０】
用語「プライマー」は、本明細書で使用される場合、ＰＣＲなどの鋳型依存的プロセスにおいて新生核酸の合成をプライミングすることができるいずれの核酸も包含する。一般に、プライマーは１０〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであるが、それより長い配列も使用可能である。プライマーは二本鎖形態で提供してもよいが、一本鎖形態が好ましい。プローブはプライマーとして使用することもできるが、標的ＤＮＡまたはＲＮＡと結合するように設計され、増幅プロセスで使用する必要はない。
【０２４１】
用語「認識する」は、特異的プライマーに関して本明細書で使用される場合、特異的プライマーが本方法で示される条件（例えば、ＰＣＲ同定プロトコールの条件）下で特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子中の核酸配列と特異的にハイブリダイズし、それにより、特異性が陽性対照および陰性対照の存在により決定されることを意味する。
【０２４２】
用語「ハイブリダイズする」は、特異的プローブに関して本明細書で使用される場合、そのプローブが標準的なストリンジェンシー条件下で特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子の核酸配列中の特異的領域と結合することを意味する。標準的なストリンジェンシー条件は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載のハイブリダイゼーションのための条件またはSambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY)により記載されているような従来のハイブリダイズ条件を意味し、例えば、以下の工程を含んでなり得る：１）植物ゲノムＤＮＡ断片またはＢＡＣライブラリーＤＮＡのフィルターへの固定、２）６５℃、６×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳおよび２０μｇ／ｍｌ変性担体ＤＮＡ中で１〜２時間の、前記フィルターのプレハイブリダイゼーション、３）標識されたハイブリダイゼーションプローブの添加、４）１６〜２４時間のインキュベーション、５）６８℃、６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３０分１回の前記フィルターの洗浄、６）６８℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での前記フィルターの３回の洗浄（３０ｍｌ中、３０分２開、および５００ｍｌ中、１０分１回）、および７）−７０℃で４〜４８時間のＸ線フィルムへの露光。
【０２４３】
本明細書において使用する場合、「生体サンプル」は、植物、植物材料または植物材料を含んでなる製品のサンプルである。用語「植物」は、任意の成熟段階の植物組織、ならびにそのような任意の植物から採取または任意の植物に由来する任意の細胞、組織、または器官，例えば、限定されるものではないが、任意の種子、葉、茎、花、根、単細胞、配偶子、細胞培養物、組織培養物またはプロトプラストを包含することが意図される。「植物材料」は、本明細書で使用される場合、植物から取得されるまたは植物に由来する材料を意味する。植物材料を含んでなる製品は、植物材料を用いて生産される、または植物材料が混入し得る食品、飼料または他の製品を意味する。本発明に関して、このような生体サンプルは、サンプルにおける核酸の存在を暗示する特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子に特異的な核酸の存在に関して試験されると理解される。よって、生体サンプルにおいて特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子を同定するための本明細書に言及される方法は、特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる核酸の生体サンプルにおける同定を意味する。
【０２４４】
特定のＤＡ１対立遺伝子は、ある植物から別の植物へ１以上の特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子を移入することにより１つの植物において組み合わせ、１以上の特定の変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる植物とすることができ、これらの植物から後代を得ることができ、ならびにこれらの植物から植物細胞、植物部分、および植物種子を誘導することができる。
【０２４５】
２以上の選択された変異型ＤＡ１対立遺伝子を１つの植物において組み合わせることができ、これは
ａ．上記のように、それぞれ１以上の選択された変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる２つ以上の植物を作出および／または同定する工程、
ｂ．１以上の選択された変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる第１の植物と１以上の他の選択された変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる第２の植物を交配させ、その交配からＦ１種子を採種し、場合により、上記のように、第１の植物に由来する１以上の選択された変異型ＤＡ１対立遺伝子を第２の植物に由来する１以上の選択された変異型ＤＡ１対立遺伝子とともに含んでなるＦ１植物を同定する工程、
ｃ．場合により、工程（ｂ）を、選択された総ての変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなるＦ１植物が得られるまで繰り返す工程、
ｄ．場合により、
・上記のように、変異型ＤＡ１対立遺伝子の接合状態を決定することにより、Ｆ１植物が、選択された変異型ＤＡ１対立遺伝子に関してホモ接合型かヘテロ接合型かを同定する工程または
・選択された変異型ＤＡ１対立遺伝子の１以上に関してホモ接合型である植物を下記工程の１つを実施することにより作出する工程
・上記のように、１以上の選択された変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなるＦ１植物の、処理した小胞子または花粉細胞から倍加半数性植物を抽出する工程、
・１以上の選択された変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなるＦ１植物を１世代以上（ｙ）自殖させ、前記自殖個体からＦ１  Ｓｙ種子を採種し、上記のように、１以上の変異型ＤＡ１対立遺伝子に関してホモ接合型であるＦ１  Ｓｙ植物を同定する工程
を含んでなる。
【０２４６】
１以上の変異型ＤＡ１対立遺伝子は、
ａ．上記のように、１以上の選択された変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる第１の植物を作出および／または同定する工程．または上記のように、１以上の選択された変異型ＤＡ１対立遺伝子を１つの植物において組み合わせることによって第１の植物を作出する工程（ここで、第１の植物は、１以上の変異型ＤＡ１対立遺伝子に関してホモ接合型またはヘテロ接合型である）、
ｂ．１以上の変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる第１の植物と１以上の変異型ＤＡ１対立遺伝子を含まない第２の植物を交配させ、その交配からＦ１種子を採種し（ここで、前記種子は、第１の植物がある変異型ＤＡ１対立遺伝子に関してホモ接合型であった場合には、その変異型ＤＡ１対立遺伝子に関してヘテロ接合型となり、また、第１の植物がある変異型ＤＡ１対立遺伝子に関してヘテロ接合型であった場合には、種子の半数はヘテロ接合型となり、種子の半数は不対性(azygous)となり、すなわち、変異型ＤＡ１対立遺伝子を含まない）、場合により、上記のように、１以上の選択された変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる第１のＦ１植物を同定する工程、
ｃ．１以上の選択された変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなるＦ１植物とその１以上の選択された変異型ＤＡ１対立遺伝子を含まない第２の植物を１世代以上（ｘ）戻し交配し、その交配からＢＣｘ種子を採種し、上記のように、毎世代、１以上の選択された変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなるＢＣｘ植物を同定する工程、
ｄ．場合により、以上の選択された変異型ＤＡ１対立遺伝子に関してホモ接合型であるＢＣｘ植物を下記工程の１つを実施することにより作出する工程
・上記のように、１以上の所望の変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなるＢＣｘ植物の、処理した小胞子または花粉細胞から倍加半数性植物を抽出する工程、
・１以上の所望の変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなるＢＣｘ植物を１世代以上（ｙ）自殖させ、前記自殖個体からＢＣｘ  Ｓｙ種子を採種し、上記のように、１以上の所望の変異型ＤＡ１対立遺伝子に関してホモ接合型であるＢＣｘ  Ｓｙ植物を同定する工程
を含んでなる方法を用いて、ある植物から別の植物へ移入することができる。
【０２４７】
第１および第２の植物は、ブラシカ・ナパス植物または別のアブラナ属作物種由来の植物などのアブラナ属植物であり得る。第１の植物は、ブラシカ・ナパス植物または別のアブラナ属作物種由来の植物などのアブラナ属植物であり得、第２の植物は、ブラシカ・ナパス育種系統または別のアブラナ属作物種由来の育種系統などの、アブラナ属育種系統由来の植物であり得る。「育種系統」とは、本明細書で使用される場合、好ましくは、雑種後代を生産するために使用される好ましい遺伝子型および／または表現型により、他の植物系統から区別可能なホモ接合型植物系統である。
【０２４８】
本発明のもう１つの実施形態は、本発明による第１の親アブラナ属植物と第２の親アブラナ属植物を交配させること、および実った雑種種子を採種することを含んでなる、雑種種子の生産方法を提供することである。前記第２の親アブラナ属植物は、必ずしも必要ではないが、本発明による変異型ＤＡ１対立遺伝子を持ち得る。好適な第２の親アブラナ属植物は、第１の親アブラナ属植物と同じ変異型ＤＡ１対立遺伝子を有する植物である。
【０２４９】
さらに別の実施形態では、本発明による第１の親アブラナ属植物と第２の親アブラナ属植物を交配させることを含んでなり、および場合により、生体サンプルを本発明による少なくとも２つのプライマーのセットを用いる増幅反応に付し、場合により、本発明による少なくとも１つのプローブとハイブリダイズさせることを含んでなる、本発明による変異型ＤＡ１対立遺伝子の有無を同定する工程をさらに含んでなる育種方法が提供される。前記第２の親アブラナ属植物は、必ずしも必要ではないが、本発明による変異型ＤＡ１対立遺伝子を持ち得る。好適な第２の親アブラナ属植物は、第１の親アブラナ属植物と同じ変異型ＤＡ１対立遺伝子を有する植物である。
【０２５０】
本発明のさらなる目的は、アブラナ属種子の千粒重を増大させるための方法を提供することであり、前記方法は、アブラナ属植物に、本発明による第１のＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子、および場合により、本発明による第２のＤＡ１遺伝子の変異型ＤＡ１対立遺伝子を導入することを含んでなる。また、アブラナ属植物に本発明による１以上の完全ノックアウトＤＡ１対立遺伝子を導入することを含んでなる、アブラナ属種子の千粒重を増大させるための方法も好適である。
【０２５１】
前記変異型ＤＡ１対立遺伝子は、例えば、本明細書に記載される突然変異誘発または遺伝子ターゲティング法によって導入することもできるし、または前記変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなるアブラナ属植物と交配させることによって導入することもできる。
【０２５２】
さらなる実施形態では、アブラナ属種子の生産方法が提供され、前記方法は、本発明による種子を播種すること、前記種子から植物を栽培すること、および前記植物から採種することを含んでなる。種子は、標準的な農業慣行を用いて播種し、植物を栽培することができる。種子は、例えば、スウェイシング(swathing)上に、またはコンバイン収穫機を用いて採種することができる。
【０２５３】
さらに、種子を生産するため、またはナタネ作物を生産するため、またはナタネ油またはナタネ油粕を生産するための本発明による植物の使用も提供される。さらに、本発明による種子からの油または油粕も提供される。
【０２５４】
本発明のさらなる目的は、本発明による植物もしくはその一部または種子を得ること、および前記植物またはその一部から食品、飼料または工業製品を調製することを含んでなる、油、ミール、種実、デンプン、粉、もしくはタンパク質などの食品もしくは飼料、または生物燃料、繊維、工業用化学品、医薬、もしくは栄養補助製品などの工業製品の生産方法を提供することである。
【０２５５】
本発明による植物は、グルホシネートアンモニウム（Ｌｉｂｅｒｔｙ（登録商標）、Ｂａｓｔａ（登録商標）またはＩｇｎｉｔｅ（登録商標））に対する耐性を付与するｂａｒまたはｐａｔ遺伝子［引用することにより本明細書の一部とされるＥＰ０２４２２３６およびＥＰ０２４２２４６］；またはトウモロコシ由来２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子などの任意の改変型ＥＰＳＰＳ遺伝子［引用することにより本明細書の一部とされるＥＰ０５０８９０９およびＥＰ０５０７６９８］、またはグリホサート（ＲｏｕｎｄｕｐＲｅａｄｙ（登録商標））耐性を付与するグリホサートアセチルトランスフェラーゼもしくはグリホサートオキシドレダクターゼ、またはブロモキシニトリル耐性を付与するためのブロモキシニトリルニトリラーゼ、またはスルホニル尿素、イミダゾリノン、スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン、トリアゾロピリミジンまたはピリミジル（オキシ／チオ）ベンゾエートに対する耐性を付与する任意の改変ＡＨＡＳ遺伝子などの除草剤耐性を付与する内因性遺伝子または導入遺伝子を含んでよく、例えば、現在Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ（登録商標）カノーラとして市販されているナタネイミダゾリノン耐性変異株ＰＭ１およびＰＭ２がある。さらに、本発明による植物は、油含有率の上昇または油組成の改善（例えば、高ラウリン酸を得るための１２：０ＡＣＰチオエステラーゼ増加）を付与する内因性または導入遺伝子、雄性不稔を得るための葯特異的プロモーターの制御下のバルナーゼ、もしくは雄性不稔の回復を付与するための葯特異的プロモーターの制御下のバルスターなどの、受粉制御を付与する内因性または導入遺伝子、オグラ型細胞質雄性不稔および稔性回復核因子などをさらに含んでもよい。
【０２５６】
本発明による植物および種子は、下記の一覧から選択される化学化合物などの化学化合物でさらに処理してもよい。
除草剤：クレトジム、クロピラリド、ジクロホップ、エタメトスルフロン、フルアジホップ、グルホシネート、グリホサート、メタザクロル、キンメラック、キザロホップ、テプラロキシジム、トリフルラリン。
殺真菌剤／ＰＧＲ：アゾキシストロビン、Ｎ−［９−（ジクロロメチレン）−１，２，３，４−テトラヒドロ−１，４−メタノナフタレン−５−イル］−３−（ジフルオロメチル）−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ベンゾビンジフルピル、ベンゾジフルピル）、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、カルボキシン、クロルメコートクロリド、コニオチリウム・ミニタンス(Coniothryrium minitans)、シプロコナゾール、シプロジニル、ジフェノコナゾール、ジメトモルフ、ジモキシストロビン、エピオキシコナゾール、ファモキサドン、フルアジナム、フルジオキソニル、フルオピコリド、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキンコナゾール、フルシラゾール、フルチアニル、フルトリアフル、フルキサピロキサド、イプロジオン、イソピラザム、メフェノキサム、メピコートクロリド、メタラキシル、メトコナゾール、メトミノストロビン、パクロブトラゾール、ペンフルフェン、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロクロラズ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、セダキサン、テブコナゾール、テトラコナゾール、チオファネートメチル、チラム、トリアジメノール、トリフロキシストロビン、バチルス・フィルムス(Bacillus firmus)、バチルス・フィルムスＩ−１５８２株、枯草菌(Bacillus subtilis)、枯草菌ＧＢ０３株、枯草菌ＱＳＴ７１３株、バチルス・プミルス(Bacillus pumulis)、バチルス・プミルスＧＢ３４株。
殺虫剤：アセタミプリド、アルジカルブ、アザジラクチン、カルボフラン、クロラントロニリプロール（Ｒｙｎａｘｙｐｙｒ）、クロチアニジン、シアントラニリプロール（Ｃｙａｚｙｐｙｒ）、（β−）シフルトリン、γ−シハロトリン、λ−シハロトリン、シペルメトリン、デルタメトリン、ジメトエート、ジノテフラン(Dinetofuran)、エチプロール、フロニカミド、フルベンジアミド、フルエンスルホン、フルオピラム、フルピラジフロン、τ−フルバリネート、イミシアホス、イミダクロプリド、メタフルミゾン、メチオカルブ、ピメトロジン、ピリフルキナゾン、スピネトラム、スピノサド、スピロテトラマト、スルホキサフロール、チアクロプリド、チアメトキサム、１−（３−クロロピリジン−２−イル）−Ｎ−［４−シアノ−２−メチル−６−（メチルカルバモイル）フェニル］−３−｛［５−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−テトラゾール−２−イル］メチル｝−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド、１−（３−クロロピリジン−２−イル）−Ｎ−［４−シアノ−２−メチル−６−（メチルカルバモイル）フェニル］−３−｛［５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−テトラゾール−１−イル］メチル｝−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド、１−｛２−フルオロ−４−メチル−５−［（２，２，２−トリフルオルエチル）スルフィニル］フェニル｝−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−アミン、（１Ｅ）−Ｎ−［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］−Ｎ’−シアノ−Ｎ−（２，２−ジフルオロエチル）エタンイミドアミド、バチルス・フィルムス、バチルス・フィルムスＩ−１５８２株、枯草菌、枯草菌ＧＢ０３株、枯草菌ＱＳＴ７１３株、黒きょう菌(Metarhizium anisopliae)Ｆ５２。
【０２５７】
本明細書に言及または引用されている総ての特許、特許出願、および刊行物または公開（インターネット上での公開を含む）は、引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。
【０２５８】
２０９キロバイト（マイクロソフトウィンドウズ（登録商標）で計測したサイズ）のファイル名「BCS 13-2002_ST25.txt」に含まれる配列表は、配列番号１〜配列番号７５の７５配列を含み、電子提出によりともに出願され、引用することにより本明細書の一部とされる。
【０２５９】
特に断りのない限り、実施例では、総ての組換えＤＮＡ技術は、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NYならびにAusubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USAの第1巻および第2巻に記載されているような標準プロトコールに従って実施される。植物の分子研究の標準的な材料および方法は、BIOS Scientific Publications Ltd (UK)とBlackwell Scientific Publications, UKにより共同出版されているR.D.D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax (1993)に記載されている。標準的な分子生物学的技術に関する他の参考文献としては、Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、Brown (1998) Molecular Biology LabFax, 第2版, Academic Press (UK)の第1巻および第2巻が挙げられる。ポリメラーゼ連鎖反応の標準的な材料および方法は、Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory PressおよびMcPherson at al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germanyに見出すことができる。
【０２６０】
配列
配列番号１：  シロイヌナズナＤＡ１コード配列
配列番号２：  シロイヌナズナＤＡ１タンパク質配列
配列番号３：  ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ１ゲノム配列
配列番号４：  ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ１コード配列
配列番号５：  ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ１タンパク質配列
配列番号６：  ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ２ゲノム配列
配列番号７：  ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ２コード配列
配列番号８：  ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ２タンパク質配列
配列番号９：  ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ１ゲノム配列
配列番号１０：  ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ１コード配列
配列番号１１：  ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ１タンパク質配列
配列番号１２：  ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ２ゲノム配列
配列番号１３：  ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ２コード配列
配列番号１４：  ブラシカ・ナパスＤＡ１−Ｃ２タンパク質配列
配列番号１５：  １６７２番にＧからＡへの置換を含んでなるブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ２ゲノム配列
配列番号１６：  ３５３番にＲからＫへの置換を有するＤＡ１タンパク質をコードするブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ２コード配列
配列番号１７：  ３５３番にＲからＫへの置換を有するブラシカ・ナパスＤＡ１−Ａ２タンパク質配列
配列番号１８：  ＤＡ１−Ａ１−ＥＭＳ０３対立遺伝子およびその野生型対応物のためのプライマー１
配列番号１９：  ＤＡ１−Ａ１−ＥＭＳ０３対立遺伝子およびその野生型対応物の検出のためのプライマー２
配列番号２０：  ＤＡ１−Ａ１−ＥＭＳ０３対立遺伝子の検出のためのＦＡＭプローブ
配列番号２１：  ＤＡ１−Ａ１−ＥＭＳ０３対立遺伝子の野生型対応物の検出のためのＶＩＣプローブ
配列番号２２：  ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０１対立遺伝子およびその野生型対応物の検出のためのプライマー１
配列番号２３：  ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０１対立遺伝子およびその野生型対応物の検出のためのプライマー２
配列番号２４：  ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０１対立遺伝子の検出のためのＦＡＭプローブ
配列番号２５：  ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０１対立遺伝子の野生型対応物の検出のためのＶＩＣプローブ
配列番号２６：  ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０５対立遺伝子およびその野生型対応物の検出のためのプライマー１
配列番号２７：  ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０５対立遺伝子およびその野生型対応物の検出のためのプライマー２
配列番号２８：  ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０５対立遺伝子の検出のためのＦＡＭプローブ
配列番号２９：  ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０５対立遺伝子の野生型対応物の検出のためのＶＩＣプローブ
配列番号３０：  ＤＡ１−Ｃ１−ＥＭＳ０２対立遺伝子およびその野生型対応物の検出のためのプライマー１
配列番号３１：  ＤＡ１−Ｃ１−ＥＭＳ０２対立遺伝子およびその野生型対応物の検出のためのプライマー２
配列番号３２：  ＤＡ１−Ｃ１−ＥＭＳ０２対立遺伝子の検出のためのＦＡＭプローブ
配列番号３３：  ＤＡ１−Ｃ１−ＥＭＳ０２対立遺伝子の野生型対応物の検出のためのＶＩＣプローブ
配列番号３４：  ＤＡ１−Ｃ１−ＥＭＳ０３対立遺伝子およびその野生型対応物の検出のためのプライマー１
配列番号３５：  ＤＡ１−Ｃ１−ＥＭＳ０３対立遺伝子およびその野生型対応物の検出のためのプライマー２
配列番号３６：  ＤＡ１−Ｃ１−ＥＭＳ０３対立遺伝子の検出のためのＦＡＭプローブ
配列番号３７：  ＤＡ１−Ｃ１−ＥＭＳ０３対立遺伝子の野生型対応物の検出のためのＶＩＣプローブ
配列番号３８：  ＤＡ１−Ｃ２−ＥＭＳ０２対立遺伝子およびその野生型対応物の検出のためのプライマー１
配列番号３９：  ＤＡ１−Ｃ２−ＥＭＳ０２対立遺伝子およびその野生型対応物の検出のためのプライマー２
配列番号４０：  ＤＡ１−Ｃ２−ＥＭＳ０２対立遺伝子の検出のためのＦＡＭプローブ
配列番号４１：  ＤＡ１−Ｃ２−ＥＭＳ０２対立遺伝子の野生型対応物の検出のためのＶＩＣプローブ
配列番号４２：  ＤＡ１−Ｃ１−ＥＭＳ０４対立遺伝子およびその野生型対応物の検出のためのプライマー１
配列番号４３：  ＤＡ１−Ｃ１−ＥＭＳ０４対立遺伝子およびその野生型対応物の検出のためのプライマー２
配列番号４４：  ＤＡ１−Ｃ１−ＥＭＳ０４対立遺伝子の検出のためのＦＡＭプローブ
配列番号４５：  ＤＡ１−Ｃ１−ＥＭＳ０４対立遺伝子の野生型対応物の検出のためのＶＩＣプローブ
配列番号４６：  ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０２対立遺伝子およびその野生型対応物の検出のためのプライマー１
配列番号４７：  ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０２対立遺伝子およびその野生型対応物の検出のためのプライマー２
配列番号４８：  ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０２対立遺伝子の検出のためのＦＡＭプローブ
配列番号４９：  ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０２対立遺伝子の野生型対応物の検出のためのＶＩＣプローブ
配列番号５０：  ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０３対立遺伝子およびその野生型対応物の検出のためのプライマー１
配列番号５１：  ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０３対立遺伝子およびその野生型対応物の検出のためのプライマー２
配列番号５２：  ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０３対立遺伝子の検出のためのＦＡＭプローブ
配列番号５３：  ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０３対立遺伝子の野生型対応物の検出のためのＶＩＣプローブ
配列番号５４：  ブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ１ゲノム配列
配列番号５５：  ブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ１コード配列
配列番号５６：  ブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ１タンパク質配列
配列番号５７：  ブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ２ゲノム配列
配列番号５８：  ブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ２コード配列
配列番号５９：  ブラシカ・ラパＤＡ１−Ａ２タンパク質配列
配列番号６０：  ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ１ゲノム配列
配列番号６１：  ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ１コード配列
配列番号６２：  ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ１タンパク質配列
配列番号６３：  ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２ゲノム配列
配列番号６４：  ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２コード配列アイソフォーム１
配列番号６５：  ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２タンパク質配列アイソフォーム１
配列番号６６：  ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２コード配列アイソフォーム２
配列番号６７：  ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２タンパク質配列アイソフォーム２
配列番号６８：  ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２コード配列アイソフォーム３
配列番号６９：  ブラシカ・オレラセアＤＡ１−Ｃ２タンパク質配列アイソフォーム３
配列番号７０：  ブラシカ・ニグラＤＡ１−Ｂ１ゲノム配列
配列番号７１：  ブラシカ・ニグラＤＡ１−Ｂ１コード配列
配列番号７２：  ブラシカ・ニグラＤＡ１−Ｂ１タンパク質配列
配列番号７３：  ブラシカ・ニグラＤＡ１−Ｂ２ゲノム配列
配列番号７４：  ブラシカ・ニグラＤＡ１−Ｂ２コード配列
配列番号７５：  ブラシカ・ニグラＤＡ１−Ｂ２タンパク質配列
【実施例】
【０２６１】
実施例１−ＤＡ１遺伝子のＤＮＡ配列の単離
優良春ナタネ育種系統のＤＡ１遺伝子の配列を決定するために、本系統の細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーを次のようにスクリーニングした。
【０２６２】
ＤＡ１配列を含んでなるＢＡＣクローンの単離
優良春ナタネ育種系統のＤＡ１配列を含んでなるＢＡＣクローンを含有する大腸菌(Escherichia coli)コロニーを同定するために、高密度ナイロンフィルター上の各二反復クローンとしてアレイを構成した本系統のＢＡＣライブラリー（平均クローンサイズ１２０ｋｂ超）を、標準的なサザンハイブリダイゼーション手順によってスクリーニングした。
・シロイヌナズナ由来配列を有するプローブを、ナイロン膜上のＤＮＡにハイブリダイズさせるために使用される標準的手順に従って標識した。
・プレハイブリダイゼーションは、下記のハイブリダイゼーションバッファー：６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは３．０Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含有する）、５×デンハート液（１００×デンハート液は、２％フィコール、２％ポリビニルピロリドン、２％ウシ血清アルブミンを含有する）、０．５％ＳＤＳおよび２０μｇ／ｍＬ変性担体ＤＮＡ（平均長１２０〜３０００ヌクレオチドの一本鎖魚類精子ＤＮＡ）３０ｍＬ中、６５℃で２時間行った。
・ハイブリダイゼーションは、次の条件下で行った。
・標識プローブ（２０ｎｇ）を、９５℃で５分間加熱し、氷上で５分間冷やすことによって変性させ、１５ｍＬのハイブリダイゼーションバッファー（プレハイブリダイゼーションと同じバッファー）に加えた。
・ハイブリダイゼーションは６５℃で一晩行った。
・これらのブロットを６５℃にてハイブリダイゼーションチューブ内で３０分間３回（０．１％ＳＤＳを含む６×ＳＳＣ  ３０ｍＬで１回、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ  ３０ｍＬで２回）、および６５℃にてボックス内で０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ  ５００ｍＬで１０分間１回洗浄した。
・Ｋｏｄａｋ  ＢｉｏＭａｘ  ＭＲフィルムを−７０℃で４時間、放射性ブロットに曝した。
・陽性シグナルに基づき、ＤＡ１配列を含んでなるＢＡＣクローンを含有する９つの大腸菌コロニーを、優良春ナタネ育種系統由来のＢＡＣライブラリーをスクリーニングすることによって採取した（陽性総数：９３）（以下、「陽性コロニー」と呼ぶ）。
【０２６３】
全長ＤＡ１配列を含んでなるＢＡＣクローンの単離
ＤＡ１遺伝子の１つの全長ゲノムＤＮＡ配列を有するＢＡＣクローンを含んでなる陽性コロニーを同定するために、陽性コロニーから単離されたＢＡＣクローンＤＮＡおよびブラシカ・ナパスから単離されたゲノムＤＮＡに対してサザンブロット分析を行った。
・ＢＡＣクローンＤＮＡは、２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有する２５ｍＬ  ＬＢ培地(Luria Broth medium)中で増殖させた陽性コロニーから、当技術分野に記載されているアルカリ溶解により単離した。
・ゲノムＤＮＡは、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法(Doyle and Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15)に従い、ブラシカ・ナパスの葉組織から単離した。
・各調製物のＤＮＡ濃度は、エチジウムブロミド（ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（登録商標））を含有する１％ＴＢＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））アガロースゲル（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））上での、１μＬの各サンプルのバンド強度を２５ｎｇ／μＬ  λＤＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を含有する１、２、４、８および２０μＬの溶液のバンド強度と比較することによって評価した。
・１００〜２００ｎｇのＢＡＣクローンＤＮＡおよび１．７μｇゲノムＤＮＡを、最終反応容量２０μＬ中、製造者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）により提案されている条件を適用して制限酵素ＡｓｅＩで消化した。消化時間および／または制限酵素の量は、非特異的分解なく、ゲノムＤＮＡサンプルの完全な消化を確保するように調整した。
・消化後、ＲＮアーゼを含有する２μＬのローディング色素（１２．５ｍＬ  １％キシレンシアノールＦＦ；１２．５ｍＬ  １％ブロモフェノールブルー水容性指示薬；２５ｍＬグリセロール；１００μＬ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０；１μＬ  ＲＮアーゼ（１０ｍｇ／ｍＬ））を消化済みのＤＮＡサンプルに加え、これらのサンプルを３７℃で３０分間インキュベートした。
・これらのサンプルを１％ＴＡＥアガロースゲル上にロードした。
・ＰｓｔＩで消化したファージλＤＮＡ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（登録商標））または１ｋｂｐ  ＤＮＡラダー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をサイズ標準として含めた。
・電気泳動後、ＤＮＡサンプル（消化済みＢＡＣクローンおよびゲノムＤＮＡ）をドライアルカリキャピラリーブロッティングによってナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（登録商標））に転写した。
・ゲノムＤＮＡに関しては、Ｋｏｄａｋ  ＢｉｏＭａｔ  ＭＲフィルムを−７０℃で２日間放射性ブロットに曝したこと以外、ＢＡＣライブラリースクリーニングに関して上記した標準的なサザンハイブリダイゼーション手順によって、消化済みＢＡＣクローンおよびゲノムＤＮＡを含むこれらのナイロン膜をスクリーニングした。
・同定された陽性コロニーのＢＡＣクローンＤＮＡおよびブラシカ・ナパスから単離されたゲノムＤＮＡの制限酵素ＡｓｅＩにより消化およびプローブとのハイブリダイゼーション後に得られたハイブリダイゼーションパターン間の比較に基づき、ＢＡＣクローンを４つの群に分け、これら４つの群のそれぞれについて、全長ＤＡ１配列を含むＢＡＣクローンを選択した（ＤＡ１＿Ａ１、ＤＡ１＿Ａ２、ＤＡ１＿Ｃ１、ＤＡ１＿Ｃ２と呼称）。
・選択された陽性コロニーのＢＡＣクローンに含まれるＤＡ１配列を、４５４ＢＡＣシーケンシング（Ｋｅｙｇｅｎｅ  ＮＶ）により決定した。
【０２６４】
実施例２−ブラシカ・ナパス由来ＤＡ１遺伝子配列の同定
ゲノムＤＮＡ断片の配列決定を行い、ＤＡ１配列の遺伝子およびコード領域をＦＧｅｎｅＳＨ（Ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ，Ｉｎｃ．マウント・キスコ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて決定した。ＢｎＤＡ１配列は、ＦＧｅｎｅＳＨにより示されているように、９つのエキソンを含む。
【０２６５】
配列番号３、６、９および１２は、それぞれＤＡ１＿Ａ１、ＤＡ１＿Ａ２、ＤＡ１＿Ｃ１、およびＤＡ１＿Ｃ２のゲノム配列である。配列番号４、７、１０および１３は、それぞれＤＡ１＿Ａ１、ＤＡ１＿Ａ２、ＤＡ１＿Ｃ１、およびＤＡ１＿Ｃ２のコード配列である。ＤＡ１＿Ａ１、ＤＡ１＿Ａ２、ＤＡ１＿Ｃ１、およびＤＡ１＿Ｃ２によりコードされているタンパク質は、それぞれ配列番号５、８、１１および１４で示される。
【０２６６】
次に、ＤＡ１配列を、ブラシカ・ラパ、ブラシカ・ニグラ、およびブラシカ・オレラセア配列のインハウスデータベースのＢＬＡＳＴホモロジー検索でクエリとして用いた。これらのデータベースにおけるコンティグは、ソフトウエアパッケージＳＯＡＰｄｅｎｏｖｏを用いて短い配列リードの組み立てによって得た。ＢＬＡＳＴ分析の結果、Ｂ．ラパで２つのＤＡ１遺伝子同族体（ＢｒＤＡ１−Ａ１（配列番号５４）およびＢｒＤＡ１−Ａ２（配列番号５７））、Ｂ．オレラセアで２つのＤＡ１遺伝子同族体（ＢｏＤＡ１−Ｃ１（配列番号６０）およびＢｏＤＡ１−Ｃ２（配列番号６３））、およびＢ．ニグラで２つのＤＡ１遺伝子同族体（ＢｎｉＤＡ１−Ｂ１（配列番号７０）およびＢｎｉＤＡ１−Ｂ２（配列番号７３））が同定された。これらの配列に対応するｃＤＮＡを、ＦＧｅｎｅＳＨソフトウエアを用いて予測し、それぞれＢｒＤＡ１−Ａ１、ＢｒＤＡ１−Ａ２、ＢｏＤＡ１−Ｃ１、ＢｎｉＤＡ１−Ｂ１およびＢｎｉＤＡ１−Ｂ２に関して配列番号５５、配列番号５８、配列番号６１、配列番号７１および配列番号７４に示す。ＢｏＤＡ１−Ｃ２では、３つのアイソフォームが予測され、配列番号６４、６６および６８に示す。
【０２６７】
実施例３−アブラナ属ＤＡ１遺伝子の発現
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ発現分析（ブラシカ・ナパスのＢＧＩ  Ｓｏｌｅｘａ  ｍＲＮＡデータに基づく）は、ＢｎＤＡ１−Ａ２およびＢｎＤＡ１−Ｃ２は、特に２週齢植物の根組織（根２週間）および５週齢植物の茎組織（茎５週間  ３３日）で発現が最も高いことを示した（図２）。
【０２６８】
実施例４−変異型ＤＡ対立遺伝子の作出および単離
実施例１で同定されたブラシカ・ナパスのＤＡ１遺伝子において、次のように突然変異を作出および同定した。
・優良春ナタネ育種系統からの３０，０００個の種子（Ｍ０種子）を、脱イオン水または蒸留水で湿らせた濾紙上で２時間、予め吸水させた。種子の半分を０．８％ＥＭＳに、半分を１％ＥＭＳ（Ｓｉｇｍａ：Ｍ０８８０）に曝し、４時間インキュベートした。
・突然変異誘発種子（Ｍ１種子）を３回すすぎ、換気フード内で一晩乾燥させた。３０，０００個のＭ１植物を土壌で栽培し、自殖させてＭ２種子を付けさせた。各Ｍ１植物個体についてＭ２種子を採種した。
・異なるＭ１植物に由来する４８００個体のＭ２植物を２回栽培し、ＣＴＡＢ法(Doyle and Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15)に従い、各Ｍ２植物個体の葉サンプルからＤＮＡサンプルを調製した。
・ＤＡ１遺伝子のタンパク質コード領域に終止コドンおよび別のアミノ酸の導入を引き起こすＤＡ１遺伝子における点突然変異の存在に関して、標準的シーケンシング技術（ＬＧＣ）による直接配列決定と、ＮｏｖｏＳＮＰソフトウエア（ＶＩＢ  Ａｎｔｗｅｒｐ）を用いた点突然変異の存在に関する配列の分析によってＤＮＡサンプルをスクリーニングした。
・このようにして表２に示す変異型ＤＡ１対立遺伝子が同定された。
【０２６９】
【表９】
0006639382.tif 000018
【０２７０】
実施例５−突然変異体アブラナ属ＤＡ１対立遺伝子を含んでなるアブラナ属植物の同定
実施例４で同定されたＤＡ１遺伝子における突然変異を含んでなるアブラナ属植物は次のように同定した。
・Ｍ２植物のＤＮＡサンプルにおいて同定された各変異型ＤＡ１遺伝子について、ＤＡ１突然変異を含んでなるＭ２植物と同じＭ１植物に由来する少なくとも５０個体のＭ２植物を栽培し、各Ｍ２植物個体の葉サンプルからＤＮＡサンプルを調製した。
・ＤＮＡサンプルを、実施例４に上記したように、同定されたＤＡ１点突然変異の存在に関してスクリーニングした。
・同じ突然変異を含んでなるヘテロ接合型およびホモ接合型（電気泳動図に基づいて決定される）  Ｍ２植物を自殖させ、Ｍ３種子を採種した。
【０２７１】
変異型系統の種々の組織での種々のＤＡ１遺伝子の発現を、ブラシカ・ナパス単離された全ＲＮＡに対して、各ＤＡ１遺伝子に特異的なＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて分析した。これらの結果は、ＹＩＩＮ６０３系統がＡ１変異型対立遺伝子のサイレンシングを示さず、幼葉でＣ１対立遺伝子の発現の増加、茎では低下を示したことを示唆した。ＹＩＩＮ６１２系統は、茎でＣ１対立遺伝子のサイレンシングを示し、他の対立遺伝子の発現の増加はなかった。ほとんどの変異型系統では、総ての対立遺伝子が野生型植物と同等の発現レベルであった。一般に、突然変異体における野生型対立遺伝子の過剰発現は見られない（図３）。
【０２７２】
実施例６−変異型ＤＡ１遺伝子を含んでなるアブラナ属植物の種子特徴の分析
種々のＤＡ１遺伝子に関してホモ接合型のアブラナ属植物を温室で栽培し、千粒重（ＴＳＷ）および種子量（５個体の植物当たりのｇ）を測定した。２つの異なる温室試験についてのＴＳＷ値および種子量を表３に示す。
【０２７３】
【表１０】
0006639382.tif 000019
【０２７４】
種々のＤＡ１遺伝子に関してホモ接合型のアブラナ属植物を３か所の圃場で栽培し。千粒重（ＴＳＷ）および莢の厚さ（ＰＯＤＴ）を測定した。莢の厚さは、１＝小さい、５＝平均、９＝厚いの、１〜９の尺度で評価する。ＴＳＷおよびＰＯＤＴの値を表４に示す。変異型ＤＡ１遺伝子を含んでなる植物と野生型分離個体のＴＳＷおよびＰＯＤＴの違いをそれぞれ図４ａおよびｂにグラフで示す。
【０２７５】
【表１１】
0006639382.tif 000020
【０２７６】
さらなる圃場試験における、種々のＤＡ１遺伝子に関してホモ接合型のアブラナ属植物を、カナダおよびベルギーの５か所の圃場で栽培した。スコアパラメーターは、種子収量（ｇ／区画；７．５ｍ２／区画；含水率８％の種子）、千粒重（ＴＳＷ；ｇ／１０００種子）、油含有率（種子に対する％；ＮＩＲ分析）、タンパク質含有率（種子に対する％；ＮＩＲ分析）および千粒油重（ＴＳＯＷ；１０００種子中の油のグラム（ｇ／１０００種子）；ＴＷＳ＊油含有率（％）で計算）であった。２つの異なる圃場試験の値を表５ａおよび５ｂに示す。
【０２７７】
【表１２】
0006639382.tif 000021
【０２７８】
温室および圃場データは、コードされるタンパク質のアルギニンからリシンへの置換をもたらすＤＡ１−Ａ２遺伝子の１６８３番に突然変異を含んでなるＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０５突然変異（ＹＩＩＮ６０９）は、種子重の増大を生じることを示す。この種子重の増大は、ＤＡ１−Ｃ２−ＥＭＳ０２突然変異（ＹＩＩＮ６１５）、すなわち、ＤＡ１−Ｃ２遺伝子の完全ノックアウトと組み合わさった場合にさらに高まる。さらに、完全ノックアウト変異型ＤＡ１−Ａ１およびＤＡ１−Ｃ２対立遺伝子は、ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０５突然変異の不在下でも千粒重および千粒油重を増大させる能力を有する（表４ＡおよびＢ）。圃場データはさらに、ＤＡ１−Ａ２−ＥＭＳ０５突然変異を含んでなる植物が、特にＤＡ１−Ｃ２−ＥＭＳ０２突然変異と組み合わさった場合に、前記ＤＡ１突然変異を含まない野生型植物に比べて莢の厚さを増大させ、かつ、千粒油重を増大させたことを示す。
【０２７９】
実施例７−（優良）アブラナ属系統における変異型ＤＡ１遺伝子の検出および／または移入
ＤＡ１対立遺伝子に点突然変異を含んでなる植物の選抜のために、実施例４に記載のものなどの当技術分野で公知の標準的シーケンシング技術による直接配列決定を使用することができる。あるいは、ＤＡ１対立遺伝子に特定の点突然変異を含んでなる植物を特定の点突然変異を含まない植物から識別するためのＰＣＲアッセイを開発することができる。このように、以下の識別Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲアッセイを、実施例４で同定された変異型対立遺伝子の有無および接合状態を検出するために開発した（表２参照）。
・鋳型ＤＮＡ：
・ホモ接合型またはヘテロ接合型の変異型アブラナ属植物の葉材料から単離されたゲノムＤＮＡ（以下、「ＤＡ１−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ」と呼ばれる変異型ＤＡ１対立遺伝子を含んでなる）。
・野生型ＤＮＡ対照：野生型アブラナ属植物の葉材料から単離されたゲノムＤＮＡ（以下、「ＷＴ」と呼ばれる変異型ＤＡ１対立遺伝子の野生型等価物を含んでなる）。
・陽性ＤＮＡ対照：ＤＡ１−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸを含んでなることが知られるホモ接合型の変異型アブラナ属植物の葉材料から単離されたゲノムＤＮＡ。
・変異型および対応する野生型標的ＤＡ１遺伝子のプライマーおよびプローブを表６に示す。
【０２８０】
一般に、各プライマーセットは、変異型および野生型標的遺伝子の両方を増幅する２つのプライマーからなり、１つのプローブは変異型と野生型の間のヌクレオチドの違いに特異的であり、ＦＡＭプローブは変異型に関するヌクレオチドを含み、ＶＩＣプローブは野生型に関するヌクレオチドを含む。
【０２８１】
【表１３】
0006639382.tif 000022
0006639382.tif 000023
【図１Ａ】
0006639382.tif 000024
【図１Ｂ】
0006639382.tif 000025
【図１Ｃ】
0006639382.tif 000026
【図１Ｄ】
0006639382.tif 000027
【図２】
0006639382.tif 000028
【図３−１】
0006639382.tif 000029
【図３−２】
0006639382.tif 000030
【図４Ａ】
0006639382.tif 000031
【図４Ｂ】
0006639382.tif 000032
【配列表】
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