(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸癌患者から採取された生体試料における、C18orf22、C18orf55、CCDC68、CNDP2、CYB5A、LOC400657、LOC440498、MBD2、MBP、MYO5B、NARS、PQLC1、RTTN、SEC11C、SOCS6、TNFRSF11A、TXNL1、TXNL4A、VPS4BおよびZNF407からなる第１遺伝子群の20遺伝子と、ASXL1、C20orf112、C20orf177、CHMP4B、COMMD7、CPNE1、DIDO1、DNAJC5、KIF3B、NCOA6、PHF20、PIGU、PLAGL2、POFUT1、PPP1R3D、PTPN1、RBM39、TAF4およびTCFL5からなる第２遺伝子群の19遺伝子と、ANGPTL2、AXL、C1R、C1S、CALHM2、CTSK、DCN、EMP3、GREM1、ITGAV、KLHL5、MMP2、RAB34、SELM、SRGAP2P1およびVIMからなる第３遺伝子群の16遺伝子との55遺伝子の発現量をそれぞれ測定する測定工程と、
前記測定工程において測定された発現量に基づいて、前記患者の大腸癌の再発リスクを判定する工程と、
を含み、前記判定工程において、
第１および第２遺伝子群の遺伝子の発現量にかかわらず、第３遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第３遺伝子群についての基準値以上である場合に、再発リスクは高いと判定し、
第２遺伝子群の遺伝子の発現量にかかわらず、第３遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第３遺伝子群についての基準値よりも小さく、第１遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第１遺伝子群についての基準値よりも小さい場合、再発リスクは中程度であると判定し、
第３遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第３遺伝子群についての基準値よりも小さく、第１遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第１遺伝子群についての基準値以上であり、第２遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第２遺伝子群についての基準値以上である場合に、再発リスクは中程度であると判定し、
第３遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第３遺伝子群についての基準値よりも小さく、第１遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第１遺伝子群についての基準値以上であり、第２遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第２遺伝子群についての基準値よりも小さい場合に、再発リスクは低いと判定し、
第１遺伝子群についての基準値が、特定の大腸癌患者群の生体試料から予め測定された第１遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値であり、第２遺伝子群についての基準値が、前記特定の大腸癌患者群の生体試料から予め測定された第２遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値であり、第３遺伝子群についての基準値が、前記特定の大腸癌患者群の生体試料から予め測定された第３遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値である、
大腸癌の再発リスクの診断を補助する方法。
【請求項２】
大腸癌患者から採取された生体試料における、C18orf22、C18orf55、CCDC68、CNDP2、CYB5A、LOC400657、LOC440498、MBD2、MBP、MYO5B、NARS、PQLC1、RTTN、SEC11C、SOCS6、TNFRSF11A、TXNL1、TXNL4A、VPS4BおよびZNF407からなる第１遺伝子群の20遺伝子と、ASXL1、C20orf112、C20orf177、CHMP4B、COMMD7、CPNE1、DIDO1、DNAJC5、KIF3B、NCOA6、PHF20、PIGU、PLAGL2、POFUT1、PPP1R3D、PTPN1、RBM39、TAF4およびTCFL5からなる第２遺伝子群の19遺伝子と、ANGPTL2、AXL、C1R、C1S、CALHM2、CTSK、DCN、EMP3、GREM1、ITGAV、KLHL5、MMP2、RAB34、SELM、SRGAP2P1およびVIMからなる第３遺伝子群の16遺伝子との55遺伝子の発現量をそれぞれ測定する測定工程と、
前記測定工程において測定された発現量に基づいて、前記患者の大腸癌の再発リスクを判定する工程と、
を含み、前記判定工程において、
(Ｉ) 前記測定工程において測定された発現量と、再発リスクが高いと判定された患者群の生体試料から予め測定された高リスク群発現量との相関係数を算出し、
前記測定工程において測定された発現量と、再発リスクが中程度と判定された患者群の生体試料から予め測定された中リスク群発現量との相関係数を算出し、
前記測定工程において測定された発現量と、再発リスクが低いと判定された患者群の生体試料から予め測定された低リスク群発現量との相関係数を算出し、
前記生体試料の再発リスクを、最も相関係数の高いリスク群に分類し、分類されたリスク群に対応する再発リスクが、前記患者の大腸癌の再発リスクであると判定するか、又は
(II) 前記測定工程において測定された発現量と、前記高リスク群の発現量と、前記中リスク群の発現量と、前記低リスク群の発現量とを用いてクラスタリング解析を行うことにより、前記生体試料の再発リスクを、最も相関の高いリスク群に分類し、分類されたリスク群に対応する再発リスクが、前記患者の大腸癌の再発リスクであると判定する、
大腸癌の再発リスクの診断を補助する方法。
【請求項３】
前記測定する工程において、
遺伝子の発現量は、マイクロアレイにより測定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
上記再発リスクが中程度とされた群に対し、KRAS遺伝子変異を有する場合は、再発リスクは高い、KRAS遺伝子変異を有していない場合は再発リスクは低いとする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
コンピュータによって実行されるコンピュータプログラムであって、
前記コンピュータプログラムは、前記コンピュータに下記の工程：
大腸癌患者から採取された生体試料における、C18orf22、C18orf55、CCDC68、CNDP2、CYB5A、LOC400657、LOC440498、MBD2、MBP、MYO5B、NARS、PQLC1、RTTN、SEC11C、SOCS6、TNFRSF11A、TXNL1、TXNL4A、VPS4BおよびZNF407からなる第１遺伝子群の20遺伝子と、ASXL1、C20orf112、C20orf177、CHMP4B、COMMD7、CPNE1、DIDO1、DNAJC5、KIF3B、NCOA6、PHF20、PIGU、PLAGL2、POFUT1、PPP1R3D、PTPN1、RBM39、TAF4およびTCFL5からなる第２遺伝子群の19遺伝子と、ANGPTL2、AXL、C1R、C1S、CALHM2、CTSK、DCN、EMP3、GREM1、ITGAV、KLHL5、MMP2、RAB34、SELM、SRGAP2P1およびVIMからなる第３遺伝子群の16遺伝子との55遺伝子のそれぞれの発現量を受信する工程、および
受信した発現量に基づいて、前記患者の大腸癌の再発リスクを判定する工程であって、
第１および第２遺伝子群の遺伝子の発現量にかかわらず、第３遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第３遺伝子群についての基準値以上である場合に、再発リスクは高いと判定し、
第２遺伝子群の遺伝子の発現量にかかわらず、第３遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第３遺伝子群についての基準値よりも小さく、第１遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第１遺伝子群についての基準値よりも小さい場合、再発リスクは中程度であると判定し、
第３遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第３遺伝子群についての基準値よりも小さく、第１遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第１遺伝子群についての基準値以上であり、第２遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第２遺伝子群についての基準値以上である場合に、再発リスクは中程度であると判定し、
第３遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第３遺伝子群についての基準値よりも小さく、第１遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第１遺伝子群についての基準値以上であり、第２遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第２遺伝子群についての基準値よりも小さい場合に、再発リスクは低いと判定する、前記判定工程
を実行させ、第１遺伝子群についての基準値が、特定の大腸癌患者群の生体試料から予め測定された第１遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値であり、第２遺伝子群についての基準値が、前記特定の大腸癌患者群の生体試料から予め測定された第２遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値であり、第３遺伝子群についての基準値が、前記特定の大腸癌患者群の生体試料から予め測定された第３遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値である、
コンピュータプログラム。
【請求項６】
コンピュータによって実行されるコンピュータプログラムであって、
前記コンピュータプログラムは、前記コンピュータに下記の工程：
大腸癌患者から採取された生体試料における、C18orf22、C18orf55、CCDC68、CNDP2、CYB5A、LOC400657、LOC440498、MBD2、MBP、MYO5B、NARS、PQLC1、RTTN、SEC11C、SOCS6、TNFRSF11A、TXNL1、TXNL4A、VPS4BおよびZNF407からなる第１遺伝子群の20遺伝子と、ASXL1、C20orf112、C20orf177、CHMP4B、COMMD7、CPNE1、DIDO1、DNAJC5、KIF3B、NCOA6、PHF20、PIGU、PLAGL2、POFUT1、PPP1R3D、PTPN1、RBM39、TAF4およびTCFL5からなる第２遺伝子群の19遺伝子と、ANGPTL2、AXL、C1R、C1S、CALHM2、CTSK、DCN、EMP3、GREM1、ITGAV、KLHL5、MMP2、RAB34、SELM、SRGAP2P1およびVIMからなる第３遺伝子群の16遺伝子との55遺伝子のそれぞれの発現量を受信する工程、および
受信した発現量に基づいて、前記患者の大腸癌の再発リスクを判定する工程であって、
前記測定工程において測定された発現量と、再発リスクが高いと判定された患者群の生体試料から予め測定された高リスク群発現量との相関係数を算出し、
前記測定工程において測定された発現量と、再発リスクが中程度と判定された患者群の生体試料から予め測定された中リスク群発現量との相関係数を算出し、
前記測定工程において測定された発現量と、再発リスクが低いと判定された患者群の生体試料から予め測定された低リスク群発現量との相関係数を算出し、
前記生体試料の再発リスクを、最も相関係数の高いリスク群に分類し、分類されたリスク群に対応する再発リスクが、前記患者の大腸癌の再発リスクであると判定する、前記判定工程
を実行させる、コンピュータプログラム。
【請求項７】
大腸癌の再発リスクの判定に用いられるコンピュータシステムであって、
プロセッサと、メモリとを含むコンピュータを備え、
前記メモリには、
大腸癌患者から採取された生体試料における、C18orf22、C18orf55、CCDC68、CNDP2、CYB5A、LOC400657、LOC440498、MBD2、MBP、MYO5B、NARS、PQLC1、RTTN、SEC11C、SOCS6、TNFRSF11A、TXNL1、TXNL4A、VPS4BおよびZNF407からなる第１遺伝子群の20遺伝子と、ASXL1、C20orf112、C20orf177、CHMP4B、COMMD7、CPNE1、DIDO1、DNAJC5、KIF3B、NCOA6、PHF20、PIGU、PLAGL2、POFUT1、PPP1R3D、PTPN1、RBM39、TAF4およびTCFL5からなる第２遺伝子群の19遺伝子と、ANGPTL2、AXL、C1R、C1S、CALHM2、CTSK、DCN、EMP3、GREM1、ITGAV、KLHL5、MMP2、RAB34、SELM、SRGAP2P1およびVIMからなる第３遺伝子群の16遺伝子との55遺伝子のそれぞれの発現量を受信する工程と、
受信した発現量に基づいて、前記患者の大腸癌の再発リスクを判定する工程であって、
第１および第２遺伝子群の遺伝子の発現量にかかわらず、第３遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第３遺伝子群についての基準値以上である場合に、再発リスクは高いと判定し、
第２遺伝子群の遺伝子の発現量にかかわらず、第３遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第３遺伝子群についての基準値よりも小さく、第１遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第１遺伝子群についての基準値よりも小さい場合、再発リスクは中程度であると判定し、
第３遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第３遺伝子群についての基準値よりも小さく、第１遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第１遺伝子群についての基準値以上であり、第２遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第２遺伝子群についての基準値以上である場合に、再発リスクは中程度であると判定し、
第３遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第３遺伝子群についての基準値よりも小さく、第１遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第１遺伝子群についての基準値以上であり、第２遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値が、第２遺伝子群についての基準値よりも小さい場合に、再発リスクは低いと判定する、前記判定工程と、
を前記コンピュータに実行させるコンピュータプログラムが記録され、第１遺伝子群についての基準値が、特定の大腸癌患者群の生体試料から予め測定された第１遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値であり、第２遺伝子群についての基準値が、前記特定の大腸癌患者群の生体試料から予め測定された第２遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値であり、第３遺伝子群についての基準値が、前記特定の大腸癌患者群の生体試料から予め測定された第３遺伝子群の遺伝子の発現量の平均値である、
コンピュータシステム。
【請求項８】
大腸癌の再発リスクの判定に用いられるコンピュータシステムであって、
プロセッサと、メモリとを含むコンピュータを備え、
前記メモリが、高リスク群の発現量、中リスク群の発現量および低リスク群の発現量を記憶しており、
前記メモリには、
大腸癌患者から採取された生体試料における、C18orf22、C18orf55、CCDC68、CNDP2、CYB5A、LOC400657、LOC440498、MBD2、MBP、MYO5B、NARS、PQLC1、RTTN、SEC11C、SOCS6、TNFRSF11A、TXNL1、TXNL4A、VPS4BおよびZNF407からなる第１遺伝子群の20遺伝子と、ASXL1、C20orf112、C20orf177、CHMP4B、COMMD7、CPNE1、DIDO1、DNAJC5、KIF3B、NCOA6、PHF20、PIGU、PLAGL2、POFUT1、PPP1R3D、PTPN1、RBM39、TAF4およびTCFL5からなる第２遺伝子群の19遺伝子と、ANGPTL2、AXL、C1R、C1S、CALHM2、CTSK、DCN、EMP3、GREM1、ITGAV、KLHL5、MMP2、RAB34、SELM、SRGAP2P1およびVIMからなる第３遺伝子群の16遺伝子との55遺伝子のそれぞれの発現量を受信する工程と、
受信した発現量に基づいて、前記患者の大腸癌の再発リスクを判定する工程と、
を前記コンピュータに実行させるコンピュータプログラムが記録されており、
前記プロセッサが、
前記高リスク群の発現量、前記中リスク群の発現量および前記低リスク群の発現量を前記メモリから読み出し、
前記受信工程で受信した発現量と、前記高リスク群の発現量との相関係数を算出し、
前記受信工程で受信した発現量と、前記中リスク群の発現量との相関係数を算出し、
前記受信工程で受信した発現量と、前記低リスク群の発現量との相関係数を算出し、
前記生体試料の再発リスクを、最も相関係数の高いリスク群に分類し、分類されたリスク群に対応する再発リスクが、前記患者の大腸癌の再発リスクであると判定し、
前記高リスク群の発現量が、再発リスクが高いと判定された患者群の生体試料から予め測定された前記55遺伝子の発現量を示す値であり、
前記中リスク群の発現量が、再発リスクが中程度と判定された患者群の生体試料から予め測定された前記55遺伝子の発現量を示す値であり、
前記低リスク群の発現量が、再発リスクが低いと判定された患者群の生体試料から予め測定された前記55遺伝子の発現量を示す値である、
コンピュータシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌の再発リスクの診断を補助する方法に関する。特に、大腸癌患者の組織から得た核酸について、所定の遺伝子群に属する遺伝子の発現量データを取得し、取得した発現量データに基づいて、該患者の大腸癌の再発リスクの診断を補助する方法、プログラムおよびコンピュータシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌は、盲腸、結腸、直腸に発生する癌腫の総称である。多くの癌と同様に、大腸癌においても早期の発見がその治療にとって重要である。癌の治療においては、強力な副作用を有する抗癌剤が使用される場合があり、この場合には患者は大きな負担を強いられる。このような患者の負担を低減するために、医師が患者にとって最適な治療法を選択することは重要であり、そのためには、医師は、患者の癌の進行度、悪性度、症状などを的確に把握することが必要である。
【０００３】
また、患者の予後を正確に予測することは、患者の予後におけるQOL（Quality of Life）の向上のために重要である。大腸癌の予後予測を行なうための方法として、組織病理学的手法であるデュークス分類が知られている。デュークス分類は、国際的に広く用いられており、癌の浸潤の度合いに応じてデュークスＡ、Ｂ、ＣおよびＤのいずれかに分類する方法である。デュークス分類は、医師が肉眼で行なう分類法であるため、医師によって誤差が生じやすいという問題がある。また、大腸癌組織を取得した施設の違いにより診断の差が生じやすいという問題もある。
【０００４】
近年、特定の遺伝子の発現量の増減に着目した、遺伝子マーカーを用いる癌の予後予測のための研究が行なわれている。例えば、特許文献１には、大腸癌と診断されたか、または大腸癌の治療を受けた患者における、大腸癌の再発を予測するための分子的解析が開示されている。特許文献１に開示される技術は、特定の大腸癌に対する再発の予後予測を行なうものであり、全ての大腸癌に適用できないという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／０５８４３２号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、種々の症例の大腸癌について、信頼性の高い大腸癌の再発リスクの診断補助方法、プログラムおよびコンピュータシステムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、クラスタ解析により、大腸癌を３つのタイプに分類できることを見出した。そして、この３つのタイプが大腸癌の予後と関連していること、および、得られる結果が十分に安定していることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明によれば、大腸癌患者から採取された生体試料における、18番染色体長鎖上の18q21から18q23までの領域に存在する第１遺伝子群から選択される複数の遺伝子、20番染色体長鎖上の20q11から20q13までの領域に存在する第２遺伝子群から選択される複数の遺伝子、ならびに、ANGPTL2、AXL、C1R、C1S、CALHM2、CTSK、DCN、EMP3、GREM1、ITGAV、KLHL5、MMP2、RAB34、SELM、SRGAP2P1およびVIMを含む第３遺伝子群から選択される複数の遺伝子の発現量をそれぞれ測定する測定工程と、前記測定工程において測定された発現量に基づいて、前記患者の大腸癌の再発リスクを判定する工程と、を含む、大腸癌の再発リスクの診断を補助する方法が提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、信頼性の高い大腸癌再発リスクの診断補助方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の診断補助方法に用いる診断補助装置の一例を示した概略図である。
【図２】診断補助装置のソフトウェアの機能構成を示すブロック図である。
【図３】診断補助装置のハードウェアの構成を示すブロック図である。
【図４】診断補助装置の動作を示すフローチャートの一例である。
【図５】診断補助装置の動作を示すフローチャートの一例である。
【図６】トレーニングセットの症例における再発リスク群分類の結果を示す図である。
【図７】各リスク群の再発リスクを示すKaplan-Meier曲線である。
【図８】トレーニングセットおよびバリデーションセット１の症例における再発リスク群分類の結果を示す図である。
【図９】バリデーションセット２の症例における再発リスク群分類の結果を示す図である。
【図１０】バリデーションセット３の症例における再発リスク群分類の結果を示す図である。
【図１１】バリデーションセット３の症例における再発リスク群分類によるKaplan-Meier曲線である。
【図１２】バリデーションセット４の症例における再発リスク群分類の結果を示す図である。
【図１３】バリデーションセット４の症例における再発リスク群分類によるKaplan-Meier曲線である。
【図１４】トレーニングセットの症例におけるデュークス分類によるKaplan-Meier曲線である。
【図１５】実施例４において中リスク群をKRAS遺伝子変異の有無により層別化した再発リスク分類結果のKaplan-Meier曲線である。
【図１６】実施例５において中リスク群をKRAS遺伝子変異の有無により層別化した再発リスク分類結果のKaplan-Meier曲線である。
【図１７】実施例８のFFPE組織検体18症例における再発リスク群分類の結果を示す図である。
【図１８】実施例８のFFPE組織検体18症例における中リスク群をKRAS遺伝子変異の有無により層別化した再発リスク分類結果のKaplan-Meier曲線である。
【図１９】実施例１０で得られたKaplan-Meier曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本実施形態の大腸癌再発リスクの診断補助方法（以下、「診断補助方法」と記す場合がある。）では、まず、大腸癌患者から採取された生体試料における、18番染色体長鎖上の18q21から18q23までの領域に存在する第１遺伝子群から選択される複数の遺伝子、20番染色体長鎖上の20q11から20q13までの領域に存在する第２遺伝子群から選択される複数の遺伝子、ならびに、ANGPTL2、AXL、C1R、C1S、CALHM2、CTSK、DCN、EMP3、GREM1、ITGAV、KLHL5、MMP2、RAB34、SELM、SRGAP2P1およびVIMを含む第３遺伝子群から選択される複数の遺伝子の発現量をそれぞれ測定する。
【００１２】
「生体試料」としては、大腸癌患者の腫瘍細胞由来の核酸（例えばmRNA）を含むものであれば特に限定されないが、例えば臨床検体を用いることができる。臨床検体として具体的には、血液、血清、手術又は生検により採取した組織などが挙げられる。また、被検者から採取した組織のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料を生体試料として用いてもよい。
【００１３】
本実施形態の方法は、測定工程の前に生体試料からDNAを抽出する工程を含んでいてもよい。生体試料からDNAを抽出する方法は、当該技術において公知の方法により行うことができる。たとえば、生体試料を遠心分離してDNAを含む細胞を沈殿させ、この細胞を物理的手法又は化学的手法によって破壊し、細胞破片を除去することにより、DNA抽出物を得ることができる。この操作は、市販のDNA抽出キットなどを用いて行うこともできる。
【００１４】
本明細書において、「第１遺伝子群」とは、18番染色体長鎖上の18q21から18q23までの領域に存在する遺伝子の総称である。具体的には、第１遺伝子群は、遺伝子シンボルにより、C18orf22（chromosome 18 open reading frame 22）、C18orf55（chromosome 18 open reading frame 55）、CCDC68（coiled-coil domain containing 68）、CNDP2（CNDP dipeptidase 2 (metallopeptidase M20 family)）、CYB5A（cytochrome b5 type A (microsomal)）、LOC400657（hypothetical LOC400657）、LOC440498（heat shock factor binding protein 1-like）、MBD2（methyl-CpG binding domain protein 2）、MBP（myelin basic protein）、MYO5B（myosin VB）、NARS（asparaginyl-tRNA synthetase）、PQLC1（PQ loop repeat containing 1）、RTTN（Rotatin）、SEC11C（SEC11 homolog C (S. cerevisiae)）、SOCS6（suppressor of cytokine signaling 6）、TNFRSF11A（tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11a, NFKB activator）、TXNL1（thioredoxin-like 1）、TXNL4A（thioredoxin-like 4A）、VPS4B（vacuolar protein sorting 4 homolog B (S. cerevisiae)）およびZNF407（zinc finger protein 407）と表される遺伝子を含む。
【００１５】
本明細書において、「第２遺伝子群」とは、20番染色体長鎖上の20q11から20q13までの領域に存在する遺伝子の総称である。具体的には、第２遺伝子群は、遺伝子シンボルにより、ASXL1（additional sex combs like 1 (Drosophila)）、C20orf112（chromosome 20 open reading frame 112）、C20orf177（chromosome 20 open reading frame 177）、CHMP4B（chromatin modifying protein 4B）、COMMD7（COMM domain containing 7）、CPNE1（copine I）、DIDO1（death inducer-obliterator 1）、DNAJC5（DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 5）、KIF3B（kinesin family member 3B）、NCOA6（nuclear receptor coactivator 6）、PHF20（PHD finger protein 20）、PIGU（phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis, class U）、PLAGL2（pleiomorphic adenoma gene-like 2）、POFUT1（protein O-fucosyltransferase 1）、PPP1R3D（protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 3D）、PTPN1（protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 1）、RBM39（RNA binding motif protein 39）、TAF4（TAF4 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-associated factor, 135kDa）およびTCFL5（transcription factor-like 5 (basic helix-loop-helix)）と表される遺伝子を含む。
【００１６】
本明細書において、「第３遺伝子群」とは、生物学的にはストロマ関連遺伝子、EMT関連遺伝子等と呼ばれるものを含む遺伝子の総称である。具体的には、第３遺伝子群は、遺伝子シンボルにより、ANGPTL2（angiopoietin-like 2）、AXL（AXL receptor tyrosine kinase）、C1R（complement component 1, r subcomponent）、C1S（complement component 1, s subcomponent）、CALHM2（calcium homeostasis modulator 2）、CTSK（cathepsin K）、DCN（Decorin）、EMP3（epithelial membrane protein 3）、GREM1（gremlin 1, cysteine knot superfamily, homolog (Xenopus laevis)）、ITGAV（integrin, alpha V (vitronectin receptor, alpha polypeptide, antigen CD51)）、KLHL5（kelch-like 5 (Drosophila)）、MMP2（matrix metallopeptidase 2 (gelatinase A, 72kDa gelatinase, 72kDa type IV collagenase)）、RAB34（RAB34, member RAS oncogene family）、SELM（selenoprotein M）、SRGAP2P1（SLIT-ROBO Rho GTPase activating protein 2 pseudogene 1）およびVIM（Vimentin）と表される遺伝子を含む。本明細書において、第３遺伝子群を「ストロマ関連遺伝子群」と記す場合がある。
【００１７】
本実施形態の診断補助方法においては、これら３つの遺伝子群を用いて、大腸癌の再発リスクを判定する。
【００１８】
本明細書において、「遺伝子の転写産物」とは、遺伝子が転写されることにより得られる産物のことであり、リボ核酸（RNA）、具体的にはメッセンジャーRNA（mRNA）である。
また、本明細書において、「遺伝子の発現量」とは、上記の生体試料中の遺伝子の転写産物の存在量または該存在量を反映する物質の量のことである。よって、本実施形態の診断補助方法では、遺伝子の転写産物（mRNA）の量、またはmRNAから得られる相補デオキシリボ核酸（cDNA）もしくは相補RNA（cRNA）の量を測定できる。通常、生体試料中のmRNAは微量であるので、そこから逆転写およびインビトロ転写（IVT）により得られるcDNAまたはcRNAの量を測定することが好ましい。
【００１９】
生体試料から遺伝子の転写産物を抽出する方法は、当該技術において知られるRNA抽出法を用いて行うことができる。例えば、生体試料を遠心分離して、RNAを含む細胞を沈殿させ、該細胞を物理的手法または酵素的手法によって破壊し、細胞破片を除去することによりRNA抽出物を得ることができる。RNAの抽出は、市販のRNA抽出キットなどを用いて行うこともできる。
【００２０】
上記のようにして得られた遺伝子の転写産物の抽出物から、遺伝子の発現量の測定時に混入していないことが好ましい生体試料由来の混入成分、例えば、生体試料が血液である場合はグロビンのmRNAなどを除去するための処理を行うこともできる。
【００２１】
上記のようにして得られた遺伝子の転写産物の抽出物について、第１〜第３遺伝子群のそれぞれから複数、好ましくは少なくとも５つ選択される遺伝子の発現量を測定する。５つ以上の遺伝子の発現量を測定することにより、所定の遺伝子の発現が偶然高い又は低い場合等に生じる生物学的なばらつき、および測定誤差を低減させることができるため、より高い信頼性をもって、再発リスク診断を補助することができる。
【００２２】
遺伝子の発現量の測定は、それ自体公知の方法に従って行なうことができるが、本実施形態の再発リスク診断補助方法においては、核酸チップを用いる測定方法、いわゆるマイクロアレイを用いる方法が好ましい。
マイクロアレイを用いて遺伝子の発現量を測定する場合、例えば、基板上に固定された20〜25 mer程度の核酸プローブに、遺伝子の転写産物の抽出物または遺伝子の転写産物から作製したcDNAもしくはcRNAを接触させ、ハイブリッドの形成の有無を蛍光、発色、電流などの指標の変化を測定することにより、目的の遺伝子の発現量を測定できる。
上記の核酸プローブは、１つの遺伝子の転写産物に対して少なくとも１つ用いればよく、遺伝子の転写産物の長さなどに応じて、複数のプローブを用いることもできる。プローブの配列は、測定しようとする遺伝子の転写産物の配列に応じて当業者が適宜決定できる。
核酸チップを用いる遺伝子の発現量の測定方法としては、例えば、Affymetrix社により提供されるGeneChipシステムを用いることができる。
【００２３】
核酸チップを用いる場合、遺伝子の転写産物またはそのcDNAもしくはcRNAは、核酸プローブとのハイブリッド形成を容易にするために、断片化してよい。断片化は、当該技術において公知の方法により行うことができ、例えば、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼなどの核酸分解酵素を用いて行うことができる。
【００２４】
測定工程において、複数の遺伝子の発現量の測定は、各々別々に行ってもよいし、一部の遺伝子または全部の遺伝子の測定を同時に行ってもよい。たとえば核酸チップを用いる場合は、複数の遺伝子の発現量の測定を1枚の核酸チップで同時に行うことができる。
【００２５】
核酸チップにおいて核酸プローブと接触させる遺伝子の転写産物またはそのcDNAもしくはcRNAは、通常、5〜20μg程度であればよい。接触条件は、通常、４５℃にて１６時間程度である。
【００２６】
核酸プローブと接触させてハイブリッドを形成した遺伝子の転写産物またはそのcDNAもしくはcRNAは、そのハイブリッド形成の有無およびハイブリッド形成した量について、蛍光物質、色素またはハイブリッド形成したことによる核酸チップ上を流れる電流量の変化などに基づいて検出することができる。
ハイブリッドの形成を、蛍光物質または色素の検出により測定する場合、遺伝子の転写産物またはそのcDNAもしくはcRNAが、蛍光物質または色素の検出のための標識物質で標識されていることが好ましい。このような標識物質は、当該技術において通常用いられるものを用いることができる。通常、ビオチン化ヌクレオチドまたはビオチン化リボヌクレオチドを、cDNAまたはcRNAを合成するときのヌクレオチドまたはリボヌクレオチド基質として混合しておくことにより、得られるcDNAまたはcRNAがビオチンで標識されることができる。cDNAまたはcRNAがビオチン標識されていると、核酸チップ上で、ビオチンに対する結合パートナーであるアビジンまたはストレプトアビジンが結合できる。アビジンまたはストレプトアビジンが、適切な蛍光物質または色素と結合していることにより、ハイブリッドの形成が検出できる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、グリーン蛍光タンパク質（GFP）、ルシフェリン、フィコエリスリンなどが挙げられる。通常、フィコエリスリン−ストレプトアビジンのコンジュゲートが市販されているので、これを用いることが簡便である。
また、アビジンまたはストレプトアビジンに対する標識抗体を、アビジンまたはストレプトアビジンと接触させ、標識抗体の蛍光物質または色素を検出することもできる。
【００２７】
この工程で得られる遺伝子の発現量は、生体試料中の各遺伝子の転写産物の存在量を相対的に表す値であれば、特に限定されない。上記の核酸チップにより測定を行う場合、発現量は、蛍光強度、発色強度、電流量などに基づく核酸チップから得られるシグナルであり得る。
これらのシグナルは、核酸チップ用の測定装置を用いて測定できる。
【００２８】
次いで、本実施形態の判定工程においては、測定工程において得られた遺伝子の発現量のデータに基づいて、大腸癌の再発リスクを判定する。具体的には、以下のようにして大腸癌の再発リスクを判定する。
第3遺伝子群が高発現である場合に、再発リスクは高いと判定される。
第1遺伝子群が低発現であり、且つ第3遺伝子群が低発現である場合に、再発リスクは中程度であると判定される。
第1遺伝子群が高発現であり、第2遺伝子群が高発現であり、且つ第3遺伝子群が低発現である場合に、再発リスクは中程度であると判定される。
第1遺伝子群が高発現であり、第2遺伝子群が低発現であり、且つ第3遺伝子群が低発現である場合に、再発リスクは低いと判定される。
【００２９】
判定工程では、種々の解析方法を用いることができる。例えば、判定対象となる生体試料の遺伝子発現パターンと各患者群の遺伝子発現パターンとに基づいて相関分析(例えば相関係数比較およびクラスタリング等)を行う方法、判定対象となる生体試料の遺伝子の発現量と基準値とを比較する方法等が挙げられる。
【００３０】
１つの好ましい実施形態によると、生体試料の遺伝子発現パターンと各患者群の遺伝子発現パターンとに基づいて相関分析を行うことによって再発リスクが判定される。この方法では、複数の「遺伝子群」を設定するのではなく、再発リスクに応じて複数の患者群を設定する。具体的には、まず、ある患者群を、再発リスクが高いと判定される患者群（以下、「高リスク群」ともいう）、再発リスクが中程度と判定される患者群（以下、「中リスク群」ともいう）および再発リスクが低いと判定される患者群（以下、「低リスク群」ともいう）の3群に分類する。ここで、上記の患者群は、予めクラスタリング解析などにより3群に分類され得る。クラスタリング解析には、各遺伝子群の発現量を用いることができる。たとえば、第3遺伝子群が高発現の群は高リスク群とされる。第1遺伝子群が低発現であり、且つ第3遺伝子群が低発現である群は、中リスク群とされる。第1遺伝子群が高発現であり、第2遺伝子群が高発現であり、且つ第3遺伝子群が低発現である群は、中リスク群であるとされる。第1遺伝子群が高発現であり、第2遺伝子群が低発現であり、且つ第3遺伝子群が低発現である場合に、低リスク群とされる。
【００３１】
これら各患者群のサンプルから解析対象となる遺伝子の発現量を取得し、平均値を算出する。たとえば、高リスク群に100人の患者が含まれ、C18orf22の発現量の平均値を算出する場合、100人の患者のC18orf22の発現量の総和を100で除した値が、高リスク群のC18orf22の発現量の平均値となる。中リスク群および低リスク群でも同様にC18orf22の発現量の平均値が算出される。また、本実施形態では、複数の遺伝子が解析対象となるため、複数の遺伝子の発現量の平均値がそれぞれ算出される。ここで、このようにして得られた高リスク群における発現量の平均値のデータセットを高リスク群発現パターンといい、中リスク群における発現量の平均値のデータセットを中リスク群発現パターンといい、低リスク群における発現量の平均値のデータセットを低リスク群発現パターンという。55遺伝子の発現量を解析する場合は、高リスク群発現パターンには、55の値が含まれることとなる。
【００３２】
各リスク群の発現パターンは、生体試料の遺伝子発現の測定および再発リスクの判定の前に、予め取得される。
【００３３】
次に、生体試料における各遺伝子の発現量が測定される。ここで、測定工程において測定された各遺伝子の発現量のデータセットを生体試料の発現パターンという。55遺伝子の発現量を測定する場合は、生体試料の発現パターンには、55の値が含まれることとなる。
【００３４】
生体試料における各遺伝子の発現パターンと、各リスク群の発現パターンとの相関を分析する。生体試料の発現パターンと最も高い相関を示すリスク群を特定する。特定されたリスク群に対応する再発リスクが、生体試料の再発リスクと判定される。たとえば、生体試料における各遺伝子の発現量が、高リスク群と最も高い相関を示す場合は、この生体試料は再発リスクが高いと判定される。
【００３５】
上記の相関の分析においては、種々の方法を用いることができる。
１つの好ましい実施形態では、たとえば、生体試料の発現パターンと高リスク群発現パターンとの相関係数、生体試料の発現パターンと中リスク群発現パターンとの相関係数、および生体試料の発現パターンと低リスク群発現パターンとの相関係数を算出する。各層間係数を比較し、最も高い相関係数を示すリスク群に生体試料を分類し、再発リスクの判定を行うことができる。たとえば、高リスク群発現パターンとの相関係数が最も高い場合は、生体試料は高リスク群に分類され、再発リスクは高いと判定される。
【００３６】
相関係数の算出は、公知の方法により行うことができる。たとえば、スピアマンの順位相関、ピアソンの積率相関、ケンドールの順位相関などに基づき、相関係数を算出することができる。
【００３７】
もう１つの好ましい実施形態では、各リスク群との相関を分析する方法として、例えば最近接距離法のようなクラスタリング方法による、クラスタリング解析を用いることもできる。たとえば、以下のようにして解析を行うことができる。
予め複数の患者において各遺伝子の発現量を取得しておく（なお、この時点では高リスク群、中リスク群および低リスク群の分類は行われていない）。測定工程において、生体試料における各遺伝子の発現量を測定する。各患者の各遺伝子の発現量と生体試料における各遺伝子の発現量とをクラスタリング解析により高リスク群、中リスク群および低リスク群に分類する。生体試料が分類されたリスク群に基づき、生体試料の再発リスクを判定することができる。
【００３８】
上述の解析手法の他、線形判別、サポートベクターマシンによる判別などを用いることもできる。
【００３９】
別の実施形態では、たとえば、生体試料における第1遺伝子群から選択される遺伝子の発現量と基準値との比較、生体試料における第2遺伝子群から選択される遺伝子の発現量と基準値との比較、および生体試料における第3遺伝子群から選択される遺伝子の発現量と基準値との比較に基づいて再発リスクの判定が行われる。
【００４０】
本実施態様においては、判定工程において、第１および第２遺伝子群からそれぞれ選択される遺伝子の発現量にかかわらず、第３遺伝子群から選択される遺伝子の発現量がその遺伝子群の基準値以上である場合に、再発リスクは高いと判定する。
すなわち、第３遺伝子群から選択される遺伝子の発現量がその遺伝子群の基準値以上である場合には、第１及び第２遺伝子群からそれぞれ選択される遺伝子の発現量がこれらの遺伝子群それぞれの基準値以上であっても、あるいは当該基準値よりも小さくても、再発リスクは高いと判定される。
【００４１】
本実施態様においては、判定工程において、第２遺伝子群から選択される遺伝子の発現量にかかわらず、第３遺伝子群から選択される遺伝子の発現量がその遺伝子群の基準値よりも小さく、第１遺伝子群から選択される遺伝子がその遺伝子群の基準値よりも小さい場合、再発リスクは中程度であると判定する。
すなわち、第３遺伝子群から選択される遺伝子の発現量がその遺伝子群の基準値よりも小さく、かつ、第１遺伝子群から選択される遺伝子の発現量がその遺伝子群の発現量よりも小さい場合には、第２遺伝子群から選択される遺伝子の発現量がその遺伝子群の基準値以上であっても、あるいは当該基準値よりも小さくても、再発リスクは中程度であると判定される。
【００４２】
本実施態様においては、判定工程において、第３遺伝子群から選択される遺伝子の発現量がその遺伝子群の基準値よりも小さく、第１遺伝子群から選択される遺伝子の発現量がその遺伝子群の基準値以上であり、第２遺伝子群から選択される遺伝子の発現量がその遺伝子群の基準値以上である場合に、再発リスクは中程度であると判定する。
【００４３】
本実施態様においては、判定工程において、第３遺伝子群から選択される遺伝子の発現量がその遺伝子群の基準値よりも小さく、第１遺伝子群から選択される遺伝子の発現量がその遺伝子群の基準値以上であり、第２遺伝子群から選択される遺伝子の発現量がその遺伝子群の基準値よりも小さい場合に、再発リスクは低いと判定する。
【００４４】
上記の実施形態において、各遺伝子群の「基準値」は、各遺伝子群が過剰発現をしているか否かを判定することのできる値に設定される。たとえば、第1遺伝子群の「基準値」は以下のように取得される。まず、特定の患者群において、各遺伝子の発現量の平均値を算出する。たとえば、患者群に含まれる各患者のC18orf22発現量をそれぞれ測定し、発現量の総和を患者数で除することにより、患者群のC18orf22発現量の平均値を取得することができる。第1遺伝子群に含まれるその他の遺伝子についても同様に平均値を取得する。これらの遺伝子の平均値の総和を遺伝子数で除することにより、特定の患者群における第1遺伝子群の平均値を取得することができる。この平均値を「基準値」とすることができる。第2遺伝子群および第3遺伝子群についても同様に「基準値」を取得することができる。
【００４５】
ここでは、基準値として「平均値」を例示したが、平均値ではなく中央値や最頻値などを用いてもよい。
【００４６】
この基準値は、測定工程および判定工程を実施する前に、予め取得されていることが好ましい。
【００４７】
本実施形態の好ましい実施形態においては、生体試料における各遺伝子の発現量の総和を、遺伝子数で除して、生体試料の遺伝子発現量の平均値を取得し、この生体試料の遺伝子発現量の平均値が上述の基準値と比較される。
【００４８】
本発明のさらに好ましい実施態様においては、再発リスクが中程度とされた群に対し、KRAS遺伝子に変異を有する場合は再発リスクは高い、KRAS遺伝子に変異を有していない場合は再発リスクは低いと判定する。
【００４９】
KRAS遺伝子とは、12番染色体上の25.36〜25.4 Mbの位置に存在する遺伝子であり、ras癌遺伝子の一種で、上皮成長因子受容体（EGFR）のシグナルを核に伝達し、細胞増殖を促進する機能を持つとされる。KRASのcDNAの塩基配列を配列番号５６として表す。この塩基配列は、ヒトゲノムデータベースGenBankにおいてアクセッション番号AF493917の下公知である。
【００５０】
KRAS遺伝子の変異とは、好ましくは当該遺伝子のエキソン２配列に存在する12及び13番目のコドン(34〜39番目の塩基)にあたるGGTGGCの塩基配列中に起こる変異又はエキソン３配列に存在する61番目のコドン(182〜184番目の塩基)にあたるCAAの塩基配列中に起こる変異を指す。
【００５１】
KRAS変異の有無の測定方法は特に限定されず、当業者に公知の方法を用いて行なうことができる。本実施形態においては、KRAS変異の有無の測定は、シーケンス解析を用いて行なわれ得る。
【００５２】
KRAS遺伝子の変異の種類は特に限定されず、上記コドン中のいずれかの塩基が変異していれば、変異ありと判定することができる。本実施形態においては、好ましくは、KRASタンパク質のアミノ酸配列の変異を引き起こす塩基配列の変異（即ち、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異など、サイレント変異以外の変異）を対象とする。変異の種類は、ヌクレオチドの置換、欠失、削除および付加が考えられるが、本実施形態においては、好ましくは、置換である。このような置換の具体例としては、34番目のGのAによる置換、35番目のGのA、CまたはTによる置換、38番目のGのAによる置換、182番目のCのAによる置換、184番目のAのCまたはTによる置換等が挙げられる。
【００５３】
上記のとおり、KRAS変異の有無を判定基準に加えることによって、中リスク群を高リスク群と低リスク群に分類でき、全体を高低2分類することができる。これにより、中リスク群についても高低いずれかに分類することが可能となり、より多くの症例に対してより有用な情報を提供することができる。
【００５４】
本発明には、患者の大腸癌再発リスクの判定をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品も含まれる。コンピュータプログラム製品は、インターネット等を介してダウンロード可能なプログラムや、当該プログラムを記録した媒体などが例示される。
【００５５】
たとえば、以下のような工程をコンピュータに実行させるためのプログラムが例示される。
大腸癌患者から採取された生体試料における、18番染色体長鎖上の18q21から18q23までの領域に存在する第１遺伝子群から複数選択される遺伝子の発現量を受信し、20番染色体長鎖上の20q11から20q13までの領域に存在する第２遺伝子群から複数選択される遺伝子の発現量を受信し、ならびに、ANGPTL2、AXL、C1R、C1S、CALHM2、CTSK、DCN、EMP3、GREM1、ITGAV、KLHL5、MMP2、RAB34、SELM、SRGAP2P1およびVIMを含む第３遺伝子群から複数選択される遺伝子の発現量を受信する工程；
受信した発現量に基づいて、前記患者の大腸癌の再発リスクを判定する工程。
【００５６】
以下に、本実施形態の方法を実施するのに好適な装置の一形態を、図面を参照して説明する。しかし、本発明はこの実施形態のみに限定されるものではない。図１は、患者の大腸癌再発リスクの判定に用いる診断補助装置の一例を示した概略図である。図１に示された診断補助装置１は、測定装置２と、該測定装置２と接続されたコンピュータシステム３とを含んでいる。
【００５７】
本実施形態においては、測定装置２は、核酸チップ用の測定装置である。この測定装置２は、遺伝子の発現量そのものおよび核酸チップの発色蛍光の色相や蛍光強度のような遺伝子の発現量に関連する情報を取得する。大腸癌患者から採取された生体試料を測定装置２にセットすると、測定装置２は、該生体試料における遺伝子の発現量に関連する情報を取得し、得られた情報をコンピュータシステム３に送信する。
【００５８】
中リスクと判定された検体についてさらに大腸癌再発リスクの高低判定を行なう場合、診断補助装置１は、測定装置２および該測定装置２と接続されたコンピュータシステム３に加えて、さらに変異測定装置４を含む。
本実施形態においては、この変異測定装置４は、生体試料におけるKRAS遺伝子の変異の有無に関する情報を取得する。大腸癌患者から採取された生体試料を変異測定装置４にセットすると、変異測定装置４は、該生体試料におけるKRAS遺伝子の変異の有無に関する情報を取得し、得られた情報をコンピュータシステム３に送信する。
【００５９】
コンピュータシステム３は、コンピュータ本体３ａと、キーボードやマウスからなる入力部３ｂと、ＬＣＤやＣＲＴからなり検体情報や判定結果などを表示する表示部３ｃとを含む。コンピュータシステム３は、測定装置２および変異測定装置４から、それぞれ遺伝子の発現量に関連する情報および必要に応じてKRAS遺伝子の変異の有無に関する情報を受信する。そして、コンピュータシステム３は、これらの情報に基づいて、被検者の大腸癌再発リスクを判定するプログラムを実行する。なお、入力部３ｂから、後述する「２群分類が必要」を入力することができる。
【００６０】
図２は、診断補助装置１のコンピュータ本体３ａのソフトウェアを機能ブロックで示すブロック図である。図２に示されるように、コンピュータは、受信部３０１と、記憶部３０２と、算出部３０３と、判定部３０４と、出力部３０５とを備える。受信部３０１は、測定装置２および必要に応じて変異測定装置４と、ネットワークを介して通信可能に接続されている。判定部３０４には、入力部３ｂを介して大腸癌再発リスク判定の実施に必要な情報、具体的には中リスクと判定された検体についてKRAS遺伝子の変異有無の測定（２群分類）を行なうか否かに関する情報を入力することができる。
【００６１】
受信部３０１は、測定装置２および変異測定装置４から送信された情報を受信する。記憶部３０２は、判定に必要な基準値および遺伝子の発現量を算出するための式や処理プログラムなどを記憶する。算出部３０３は、受信部３０１で取得された情報を用い、記憶された式にしたがって、遺伝子の発現量を算出する。判定部３０４は、受信部３０１によって取得されたか、または算出部３０３によって算出された遺伝子の発現量が、記憶部３０２に記憶された基準値以上であるか否かを判定する。出力部３０５は、判定部３０４による判定結果を、被検者の大腸癌再発リスクの判定結果として表示部３ｃへ出力する。
【００６２】
中リスクと判定された検体についてさらに大腸癌再発リスクの高低判定を行なう場合、受信部３０１は、測定装置２から送信された情報に加えて、さらに変異測定装置４から送信された情報も取得する。記憶部３０２は、判定に必要な基準値および遺伝子の発現量を算出するための式に加えて、さらにKRAS遺伝子の非変異配列を記憶する。算出部３０３は、受信部３０１で取得された情報を用い、記憶された式にしたがって、遺伝子の発現量を算出する。判定部３０４は、受信部３０１によって取得されたか、または算出部３０３によって算出された遺伝子の発現量が、記憶部３０２に記憶された基準値以上であるか否かを判定することに加え、さらに、受信部３０１で取得されたKRAS遺伝子の配列と記憶部３０２に記憶されたKRAS遺伝子の非変異配列とが一致するか否かに基づいてKRAS遺伝子における変異の有無を判定する。出力部３０５は、判定部３０４による判定結果を、被検者の大腸癌再発リスクの判定結果として表示部３ｃへ出力する。
【００６３】
図３は、図２に示すコンピュータ本体３ａのハードウェア構成を示すブロック図である。図３に示されるように、コンピュータ本体３ａは、ＣＰＵ(Central Processing Unit)３０と、ＲＯＭ(Read Only Memory)３１と、ＲＡＭ３２と、ハードディスク３３と、入出力インターフェイス３４と、読出装置３５と、通信インターフェイス３６と、画像出力インターフェイス３７とを備えている。ＣＰＵ３０、ＲＯＭ３１、ＲＡＭ(Random Access Memory)３２、ハードディスク３３、入出力インターフェイス３４、読出装置３５、通信インターフェイス３６および画像出力インターフェイス３７は、バス３８によってデータ通信可能に接続されている。
【００６４】
ＣＰＵ３０は、ＲＯＭ３１に記憶されているコンピュータプログラムおよびＲＡＭ３２にロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３０がコンピュータプログラムを実行することにより、図２に示す各機能が実行される。これにより、コンピュータシステム３が、被検者の大腸癌再発リスクを判定するための診断補助装置として機能する。
【００６５】
ＲＯＭ３１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３１には、前述のようにＣＰＵ３０によって実行されるコンピュータプログラムおよびこれに用いるデータが記録されている。
【００６６】
ＲＡＭ３２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ３２は、ＲＯＭ３１およびハードディスク３３に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ３２はまた、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３０の作業領域として利用される。
【００６７】
ハードディスク３３は、ＣＰＵ３０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム(被検者の大腸癌再発リスクを判定するためのコンピュータプログラム)などのコンピュータプログラムおよび当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
【００６８】
読出装置３５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置３５は、可搬型記録媒体４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。
【００６９】
入出力インターフェイス３４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３４には、キーボード、マウスなどの入力部３ｂが接続されている。操作者は、当該入力部３ｂにより、コンピュータ本体３ａに各種の指令を入力することが可能である。
【００７０】
通信インターフェイス３６は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェイスなどである。コンピュータ本体３ａは、通信インターフェイス３６により、プリンタなどへの印刷データの送信も可能である。
【００７１】
画像出力インターフェイス３７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部３ｃに接続されている。これにより、表示部３ｃは、ＣＰＵ３０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力することができる。表示部３ｃは、入力された映像信号にしたがって画像(画面)を表示する。
【００７２】
次に、診断補助装置１による、被検者の大腸癌再発リスク判定の処理手順を説明する。図４は、大腸癌再発リスク判定のフローチャートである。ここでは、被検者由来の生体試料を用いて得られた発色蛍光の情報から蛍光強度を算出し、得られた蛍光強度から遺伝子の発現量を算出し、得られた発現量が基準値以上であるか否かの判定を行う場合を例として挙げて説明する。しかし、本発明は、この実施形態のみに限定されるものではない。
【００７３】
まず、ステップＳ１−１において、診断補助装置１の受信部３０１は、測定装置２から第３遺伝子群から選択される遺伝子の発現量に関連する発色蛍光の情報を取得する。次に、ステップＳ１−２において、算出部３０３は、取得した情報から蛍光強度を算出し、記憶部３０２に送信する。そして、ステップＳ１−３において、算出部３０３は、記憶された該蛍光強度に基づき、記憶された式にしたがって、遺伝子の発現量を算出する。
【００７４】
その後、ステップＳ１−４において、判定部３０４は、ステップＳ１−３で算出された発現量が、記憶部３０２に記憶された基準値以上であるか否かの判定を行う。ここで、発現量が基準値以上であるとき、ルーチンはステップＳ１−５に進行し、判定部３０４は被検者の大腸癌再発リスクが高いこと(高リスク)を示す判定結果を出力部３０５に送信する。一方、発現量が基準値よりも低いとき、ルーチンはステップＳ１−６に進行する。
【００７５】
ステップＳ１−６において、診断補助装置１の受信部３０１は、測定装置２から第１遺伝子群から選択される遺伝子の発現量に関連する発色蛍光の情報を取得する。次に、ステップＳ１−７において、算出部３０３は、取得した情報から蛍光強度を算出し、記憶部３０２に送信する。そして、ステップＳ１−８において、算出部３０３は、記憶された該蛍光強度に基づき、記憶された式にしたがって、遺伝子の発現量を算出する。
【００７６】
その後、ステップＳ１−９において、判定部３０４は、算出部３０３で算出された発現量が、記憶部３０２に記憶された基準値以上であるか否かの判定を行う。ここで、発現量が基準値以上であるとき、ルーチンはステップＳ１−１１に進行する。また、発現量が基準値よりも低いとき、ルーチンはステップＳ１−１０に進行し、判定部３０４は被検者の大腸癌再発リスクが中程度(中リスク)であると判定し、その後ルーチンはステップＳ１−１７に進行する。
【００７７】
ステップＳ１−１１においては、診断補助装置１の受信部３０１は、測定装置２から第２遺伝子群から選択される遺伝子の発現量に関連する発色蛍光の情報を取得する。次に、ステップＳ１−１２において、算出部３０３は、取得した情報から蛍光強度を算出し、記憶部３０２に送信する。そして、ステップＳ１−１３において、算出部３０３は、記憶された該蛍光強度に基づき、記憶された式にしたがって、遺伝子の発現量を算出する。
【００７８】
その後、ステップＳ１−１４において、判定部３０４は、算出部３０３で算出された発現量が、記憶部３０２に記憶された基準値以上であるか否かの判定を行う。ここで、発現量が基準値以上であるとき、ルーチンはステップＳ１−１５に進行し、判定部３０４は被検者の大腸癌再発リスクが中程度(中リスク)であると判定し、その後ステップＳ１−１７に進行する。一方、ステップＳ１−１４において、発現量が基準値よりも低いとき、ルーチンはステップＳ１−１６に進行し、判定部３０４は被検者の大腸癌再発リスクが低いことを示す判定結果(低リスク)を出力部３０５に送信する。
【００７９】
ステップＳ１−１０またはＳ１−１５を経て大腸癌再発リスクが中程度であると判定された検体について、ステップＳ１−１７において、入力部３ｂから「２群分類が必要」と入力された場合には、これらの検体についてKRAS遺伝子変異測定による大腸癌再発リスクの高低判定を行なう。
【００８０】
「２群分類が必要」と入力されていないとき、ルーチンはステップＳ１−１８に進行し、被検者の大腸癌再発リスクが中程度であることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
【００８１】
一方、２群分類が必要である場合、ルーチンはステップＳ１−１９に進行する。ステップＳ１−１９では、中リスクと判定された検体についてKRAS遺伝子の変異の有無に基づく大腸癌再発リスクの高低判定の処理が行われる。この処理には、変異測定装置４が用いられる。
【００８２】
ステップＳ１−１９において、受信部３０１は、中リスクと判定された被検者のKRAS遺伝子の配列情報を取得する。次に、ステップＳ１−２０において、判定部３０４は、取得したKRAS遺伝子の配列と、記憶部３０２に記憶されたKRAS遺伝子の非変異配列とを比較して、被検者の生体試料中のKRAS遺伝子に変異があるか否かを判定する。KRAS遺伝子に変異がある場合、ルーチンは、ステップＳ１−２１に進行し、判定部３０４は、被検者の大腸癌再発リスクが高いこと(高リスク)を示す判定結果を出力部３０５に送信する。一方、KRAS遺伝子に変異がない場合、ルーチンは、ステップＳ１−２２に進行し、判定部３０４は、被検者の大腸癌再発リスクが低いこと(低リスク)を示す判定結果を出力部３０５に送信する。
【００８３】
そして、ステップＳ１−２３において、出力部３０５は、被検者の大腸癌再発リスクの判定結果を出力し、表示部３ｃに表示させる。これにより、診断補助装置１は、被検者の大腸癌の再発リスクが高いのか、中程度であるのか、または低いのかについて判定することを補助する情報を医師などに提供することができる。
【００８４】
別の実施形態によれば、図１に記載の診断補助装置を用いて、相関係数を算出して再発リスクを判定することもできる。この場合の処理フローを図５に基づいて説明する。なお、この装置の記憶部は、予め高リスク群発現パターン、中リスク群発現パターンおよび低リスク群発現パターンを記憶している。
【００８５】
ステップＳ２−１において、診断補助装置１の受信部３０１は、測定装置２から生体試料における各遺伝子の発現量を示す蛍光情報を取得する。次に、ステップＳ２−２において、算出部３０３は、取得した情報から蛍光強度を算出し、記憶部３０２に送信する。そして、ステップＳ２−３において、算出部３０３は、記憶された蛍光強度に基づいて、各遺伝子の発現量を算出する（ここで、生体試料の発現パターンが取得される）。その後、ステップＳ２−４において、判定部３０４は、記憶部３０２に記憶されている高リスク群発現パターン、中リスク群発現パターンおよび低リスク群発現パターンを読み出し、これらとステップＳ２−３において取得した生体試料の発現パターンとに基づいて、生体試料の発現パターンと高リスク群発現パターンとの相関係数（以下、「相関係数Ｈ」ともいう）、生体試料の発現パターンと中リスク群発現パターンとの相関係数（以下、「相関係数Ｍ」ともいう）、および生体試料の発現パターンと低リスク群発現パターンとの相関係数（以下、「相関係数Ｌ」ともいう）を算出する。
【００８６】
ステップＳ２−５において、相関係数Ｈが最も高いか否かが判定される。すなわち、相関係数Ｈが相関係数Ｍより高く、相関係数Ｈが相関係数Ｌより高い場合、相関係数Ｈが最も高いと判定される。相関係数Ｈが最も高い場合は、ステップＳ２−６において生体試料が高リスク群に分類され、生体試料の再発リスクは高いと判定される。
【００８７】
ステップＳ２−５において、相関係数Ｈが最も高い相関係数ではないと判断された場合、ステップＳ２−７において、相関係数Ｍが最も高いか否かが判定される。すなわち、相関係数Ｍが相関係数Ｈより高く、相関係数Ｍが相関係数Ｌより高い場合、相関係数Ｍが最も高いと判定される。相関係数Ｍが最も高い場合は、ステップＳ２−８において生体試料が中リスク群に分類され、生体試料の再発リスクは中程度と判定される。
【００８８】
ステップＳ２−７において、相関係数Ｍが最も高い相関係数ではないと判断された場合、ステップＳ２−９において、相関係数Ｌが最も高いと判定される。関係数Ｌが最も高い場合は、ステップＳ２−９において生体試料が低リスク群に分類され、生体試料の再発リスクは低いと判定される。
【００８９】
ステップＳ２−１０において、出力部３０５は、被検者の大腸癌再発リスクの判定結果を出力し、表示部３ｃに表示させる。これにより、診断補助装置１は、被検者の大腸癌の再発リスクが高いのか、中程度であるのか、または低いのかについて判定することを補助する情報を医師などに提供することができる。
【００９０】
また、図５のフローチャートでは、相関係数Ｍが最も高いか否かを判断するステップの代わりに、相関係数Ｌが最も高いか否かを判断するステップを含んでいてもよい。また、相関係数Ｈが最も高いか否かを判断するステップの代わりに、相関係数Ｌが最も高いか否かを判断するステップを含んでいてもよい。いずれであっても、相関係数Ｈ、ＭおよびＬの何れが最も高いかを判断することができる。何れの場合でも、判断ステップの実行順序は限定されない。
【００９１】
さらに好ましい実施形態では、図５のフローチャートのステップＳ２−８において再発リスク中と判定された検体について、さらにKRAS遺伝子変異の有無を測定し、再発リスク高低いずれかに２群分類してもよい。このような２群分類を行う場合のフローチャートは、例えば図４におけるステップＳ１−１７〜Ｓ１−２２に示したものと同様であり、これらのステップは、例えば図５のフローチャートのステップＳ２−８の後に行われる。
【００９２】
本発明には、被検者の大腸癌再発リスクの判定に適するシステムも含まれる。
【００９３】
なお、記憶部３０２は、以下の工程をコンピュータシステム３に実行させるためのコンピュータプログラムを記録している：
大腸癌患者から採取された生体試料における、18番染色体長鎖上の18q21から18q23までの領域に存在する第１遺伝子群から複数選択される遺伝子の発現量を受信し、20番染色体長鎖上の20q11から20q13までの領域に存在する第２遺伝子群から複数選択される遺伝子の発現量を受信し、ならびに、ANGPTL2、AXL、C1R、C1S、CALHM2、CTSK、DCN、EMP3、GREM1、ITGAV、KLHL5、MMP2、RAB34、SELM、SRGAP2P1およびVIMを含む第３遺伝子群から複数選択される遺伝子の発現量を受信する工程；
受信した発現量に基づいて、前記患者の大腸癌の再発リスクを判定する工程。
【００９４】
本実施形態の方法では、上記の解析工程で得られた解析結果に基づいて、被検者の大腸癌再発リスクを判定する。例えば、被検者の大腸癌が再発する可能性が高い、そのような可能性が中程度である、または、そのような可能性が低い、との判定結果を提供することができる。上記の判定結果を医師等に提供することによって、大腸癌の再発可能性についての医師等による診断が補助される。
【実施例】
【００９５】
実施例１：大腸癌患者の予後に応じた分類の検討
Affymetrix社GeneChip, Human Genome U133 plus 2.0 ArrayのデータセットGSE14333（NCBI Gene Expression Omnibus (URL; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ )より入手）のうち、大腸癌（結腸癌）患者72症例をトレーニングセットとして使用した。解析ソフトウェアとして、アレイデータ解析用ソフトウェア（Expression Console v1.1(Affymetrix社製)）、表計算用ソフトウェア（Office Excel 2002, 2007(Microsoft社製)）、クラスタ解析用ソフトウェア（Cluster3.0, Java(登録商標) Treeview(入手先；http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm)）、統計解析ソフトウェア（MedCalc(MedCalc社製)）を使用して各種解析を行なった。
データの正規化にはMAS5を使用した。GeneChip上の全プローブのうち、遺伝子シンボルが不明のプローブおよび平均発現シグナル値が300未満のプローブは解析から除外した。対応する遺伝子が重複するプローブについては、平均発現シグナル値が最大のプローブを代表とし、残りは除外した。シグナル値をZ変換した後、最近接距離法にて無教師階層クラスタリングを行なった。類似性尺度はピアソン相関係数とした。
クラスタ解析の結果から、(1)重要な生物学的機能を反映する、(2)特徴的な症例クラスタの生成に寄与する、という２条件を満たすと推定される遺伝子クラスタを機能モジュールとして定義・抽出し、機能モジュールの組合せによるクラスタリングを繰り返し行なうことで再発リスク群分類法の構築を行なった。
【００９６】
図６に、トレーニングセットの症例における再発リスク群分類の結果を示す。以下、全患者症例における遺伝子の発現量の平均値に基づいて、発現量の増減を判断するものとする。例えば、ある遺伝子の発現量が上記した平均値以上である場合には相対的発現量増加と判断され、上記した平均値よりも小さい場合には、相対的発現量減少と判断される。図６に示されるように、トレーニングセットから、18番染色体長鎖上の遺伝子群（以下、「第１遺伝子群」又は「18q Lossモジュール」と記す場合がある。）の相対的発現量減少、および、20番染色体長鎖上の遺伝子群（以下、「第２遺伝子群」又は「20q Ampモジュール」と記す場合がある。）の相対的発現量増加を示す症例を抽出し、これをタイプＢと定義した。トレーニングセットから、18q Lossモジュール及び20q Amp モジュールの発現パターンがタイプＢと逆の症例を抽出し、これをタイプＡと定義した。また、トレーニングセットにおいて、タイプＡおよびタイプＢにおける遺伝子の発現量とは無関係に、ストロマ関連遺伝子群の強発現で特徴づけられる症例が出現したため、これらの症例を独立したタイプＣと定義した。使用した３機能モジュールを構成する遺伝子を表１に示した。
【００９７】
【表１−１】
0006757560.tif 000002
【００９８】
【表１−２】
0006757560.tif 000003
【００９９】
表２に、上記のようにして分類したタイプ毎の症例数（存在比率）及び大腸癌の再発率を示す。
【０１００】
【表２】
0006757560.tif 000004
【０１０１】
全72症例のうち、タイプＡに分類された症例は22症例、タイプＢに分類された症例は24症例、タイプＣに分類された症例は26症例であった。大腸癌の再発率は、タイプＡにおいて4.5％、タイプＢにおいて12.5％、タイプＣにおいて23.1％であった。
【０１０２】
図７に、分類したタイプ毎に作成したKaplan-Meier曲線を示す。図７に示されるように、各タイプにおける手術後の無再発生存率に大きな差異が認められることがわかった。
表２および図７に示される結果から、タイプＡを再発リスクの低い低リスク群、タイプＢを再発リスクが中程度の中リスク群、タイプＣを再発リスクの高い高リスク群として定義できることがわかった。以下、低リスク群、中リスク群、および、高リスク群を総称して、再発リスク群と記す場合がある。
【０１０３】
実施例２：再発リスク群分類の信頼性の検証１
Affymetrix社GeneChip, Human Genome U133 plus 2.0 ArrayのデータセットGSE14333（NCBI Gene Expression Omnibus (URL; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ )より入手）のうち、トレーニングセットで使用しなかった患者74症例をバリデーションセット１として使用した。なお、トレーニングセットの症例とバリデーションセット１の症例とは、それぞれ異なる医療施設にて取得された検体となるように選択されている。
トレーニングセットの72症例にバリデーションセット１の74症例を加えた146症例について、実施例１と同様にして、表１の遺伝子を用いてクラスタリングを行った。
【０１０４】
図８に、トレーニングセットおよびバリデーションセット１の症例における再発リスク群分類の結果を示す。図８に示されるように、トレーニングセットとバリデーションセット１とでは生体試料を取得した施設が異なるが、施設の違いに由来するクラスタを形成することなく、全症例が３つの再発リスク群のいずれかに分類されることがわかった。
【０１０５】
実施例３：再発リスク群分類の信頼性の検証２
大腸癌（結腸癌）患者53症例についてのAffymetrix社GeneChip, Human Genome U133 plus 2.0 ArrayのデータセットGSE18088（NCBI Gene Expression Omnibus (URL; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ より入手）をバリデーションセット２として使用した。この53症例について、実施例１と同様にして、表１の遺伝子を用いてクラスタリングを行った。
【０１０６】
図９に、バリデーションセット２の症例における再発リスク群分類の結果を示す。図９に示されるように、バリデーションセット２は、トレーニングセットとは、生体試料を取得した施設及びGeneChip測定を行なった施設が異なるが、バリデーションセット２における全症例が３つの再発リスク群のいずれかに分類されることがわかった。
表３に、上記のようにして分類したタイプ毎の症例数（存在比率）及び大腸癌の再発率を示す。
【０１０７】
【表３】
0006757560.tif 000005
【０１０８】
全53症例のうち、低リスク群に分類された症例は23症例、中リスク群に分類された症例は25症例、高リスク群に分類された症例は5症例であった。大腸癌の再発率は、低リスク群において8.7％、中リスク群において28.0％、高リスク群において80.0％であった。表３の結果から、バリデーションセット 2は、トレーニングセットとは生体試料を取得した施設及びGeneChip測定を行なった施設が異なるが、各再発リスク群は、施設の違いに影響されることなく、実施例１と同様の結果を示すことがわかった。
【０１０９】
実施例４：再発リスク群分類の信頼性の検証３
大腸癌（結腸癌）患者258症例についてのAffymetrix社GeneChip, Human Genome U133 plus 2.0 ArrayのデータセットGSE39582（NCBI Gene Expression Omnibus (URL; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ より入手）をバリデーションセット３として使用した。この256症例について、実施例１と同様にして、表１の遺伝子を用いてクラスタリングを行った。
【０１１０】
図１０に、バリデーションセット３の症例における再発リスク群分類の結果を示す。図１０に示されるように、バリデーションセット３は、トレーニングセットとは、生体試料を取得した施設及びGeneChip測定を行なった施設が異なるが、バリデーションセット３における全症例が３つの再発リスク群のいずれかに分類されることがわかった。
表４に、上記のようにして分類したタイプ毎の症例数（存在比率）及び大腸癌の再発率を示す。
【０１１１】
【表４】
0006757560.tif 000006
【０１１２】
全258症例のうち、低リスク群に分類された症例は74症例、中リスク群に分類された症例は123症例、高リスク群に分類された症例は61症例であった。大腸癌の再発率は、低リスク群において12.2％、中リスク群において23．6％、高リスク群において39.3％であった。
【０１１３】
図１１に、分類したタイプ毎に作成したKaplan-Meier曲線を示す。図１１に示されるように、各タイプにおける手術後の無再発生存率に大きな差異が認められることがわかった。
表４および図１１の結果から、バリデーションセット３は、トレーニングセットとは生体試料を取得した施設及びGeneChip測定を行なった施設が異なるが、各再発リスク群は、施設の違いに影響されることなく、実施例１と同様の結果を示すことがわかった。
【０１１４】
実施例５：再発リスク群分類の信頼性の検証４
バリデーションセット４として、大腸癌（結腸癌）患者85症例から組織を採取し、凍結保存した。この凍結保存組織85検体を用いてAffymetrix社GeneChip, Human Genome U133 plus 2.0 Arrayで発現解析を行った。この85検体について、実施例１と同様にして、表１の遺伝子を用いてクラスタリングを行った。
【０１１５】
図１２に、バリデーションセット４の症例における再発リスク群分類の結果を示す。図１２に示されるように、バリデーションセット４は、トレーニングセットとは、生体試料を取得した施設及びGeneChip測定を行なった施設が異なるが、バリデーションセット４における全症例が３つの再発リスク群のいずれかに分類されることがわかった。
表５に、上記のようにして分類したタイプ毎の症例数（存在比率）及び大腸癌の再発率を示す。
【０１１６】
【表５】
0006757560.tif 000007
【０１１７】
全85症例のうち、低リスク群に分類された症例は23症例、中リスク群に分類された症例は26症例、高リスク群に分類された症例は36症例であった。大腸癌の再発率は、低リスク群において0％、中リスク群において11．5％、高リスク群において22．2％であった。
【０１１８】
図１３に、分類したタイプ毎に作成したKaplan-Meier曲線を示す。図１３に示されるように、各タイプにおける手術後の無再発生存率に大きな差異が認められることがわかった。
表５の結果から、バリデーションセット４でも実施例１と同様の結果を示すことがわかった。
【０１１９】
上記のとおり、機能モジュール解析により、大腸癌の症例を３つの再発リスク群に分類することができた。それぞれの再発リスク群は異なる再発リスクを有していた。また、実施例１〜５の結果より、再発リスク群の分類は、データセットの入手先に影響されない信頼性の高い分類法であることがわかった。したがって、本実施形態の大腸癌の再発リスク群分類を用いた再発リスクの診断補助方法により、十分に安定した信頼性の高い結果を得られることが示された。
【０１２０】
比較例：従来法（デュークス分類）による予後予測
予後予測性能の比較対照として、トレーニングセットの72症例について、デュークス分類による生存時間解析を行なった結果を図１４に示す。図１４において、デュークスＡは、癌が大腸壁内にとどまっている状態を示し、デュークスＢは、癌が大腸壁を貫いているがリンパ節転移のない状態を示し、デュークスＣは、リンパ節転移のある状態を示す。
【０１２１】
図２および図１４に示されるように、本実施形態の診断補助方法により高リスクと判定された症例は26症例であったのに対し、比較例の判定方法により高リスク（デュークスＣ）と判定された症例は15症例であった。また、比較例の判定方法によりデュークスＡと判定された症例と、デュークスＢと判定された症例の無再発生存率にはほとんど差が無いのに対し、本実施形態の診断補助方法により低リスク群と判定された症例と中リスク群と判定された症例の無再発生存率には差が認められた。この結果から、本実施形態の再発リスク診断補助方法によれば、従来の病理学的分類よりも精度良く再発リスクを判定できることが示唆された。
【０１２２】
実施例６：KRAS遺伝子変異による中リスク群の層別による予後予測性能の向上１
実施例４で行った解析結果で中リスク群とされた検体のうちKRAS遺伝子変異を有する検体を高リスク、KRAS遺伝子変異の無い検体を低リスクとし、全検体を２群に分けた（図１５参照）。具体的には、下記のようにして検体のDNA中のKRAS変異の有無を測定し、その結果に基づいて全検体を２群に分けた。
まず、以下の表６の組成を有するPCR master Mixを調製した。
【０１２３】
【表６】
0006757560.tif 000008
【０１２４】
次いで、ゲノムDNA 10ngを0.5ml PCR tubeへ分注し、全量20μLになるようNuclease free waterを添加した。そして、PCR master Mixを4.8μl/tube添加し、混合した。なお、PCR Master Mixに加えたプライマーは、以下の表７に示したものである。KRAS遺伝子のエキソン２の第12および13コドンを含む領域の増幅には配列番号57および58のプライマー対を、エキソン３の第61コドンを含む領域の増幅には配列番号59および60のプライマー対を用いた。
【０１２５】
【表７】
0006757560.tif 000009
【０１２６】
得られたPCR master MixをThermal Cyclerにセットして以下のプログラムを実施し、KRASのエキソン２配列およびエキソン３配列をPCRにより増幅した。KRAS エキソン２95℃:10min → （94℃:1min →55℃:1min →72℃:1min）x 38 cycle →  72℃:10min→4℃ holdKRAS エキソン３95℃:10min → （94℃:1min →63℃:1min →72℃:1min）x 38 cycle →  72℃:10min→4℃ hold
【０１２７】
増幅後、1％アガロースゲル電気泳動を行ない、単一バンドであることを確認した。その後、0.5ml PCR tubeにPCR産物5μlを分注し、ExoSAP-ITを2μl加え混合し、Thermal Cyclerにセットし、以下のプログラムを実施した。37℃15min→80℃ 15min→4℃ hold
【０１２８】
産物2μlに9.6μlの1 pmol/μlのプライマー(F又はR)、9.4μlのNFWを添加し混合した。シーケンス解析をOperon社に委託して行った。解析対象とした塩基配列と、配列番号1の塩基配列とを比較し、1つでも変異が認められた場合は、KRAS遺伝子に変異あり、とした。実施例４において中リスク群と判断された検体につき、KRAS遺伝子に変異が見られた検体を高リスク群に、KRAS遺伝子に変異が見られなかった検体を低リスク群に分類した。
【０１２９】
結果を図１５に各群のKaplan-Meier曲線を示す。図１５と図１１を比較して、KRAS遺伝子変異の有無を判断基準に加えることで、中リスク群の症例を無再発生存率に大きな差異の認められる高低２つのリスク群へと分類できることがわかった。
【０１３０】
実施例７：KRAS遺伝子変異による中リスク群の層別による予後予測性能の向上２
実施例５で行った解析結果で中リスク群とされた検体のうちKRAS遺伝子変異を有する検体を高リスク、KRAS遺伝子変異の無い検体を低リスクとし、全検体を２群に分けた。
結果を図１６に各群のKaplan-Meier曲線を示す。図１６と図１３を比較して、KRAS遺伝子変異の有無を判断基準に加えることで、中リスク群の症例を無再発生存率に大きな差異の認められる高低２つのリスク群への分類できることがわかった。
【０１３１】
実施例８：ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織を用いた検証
実施例５において使用した凍結保存組織検体85症例のうち18症例からFFPE組織検体を調製した。この18検体を用いて再発リスク群分類を行った。より具体的には、まず、RNAeasy FFPE kit (QIAGEN社)を用いてFFPE組織検体からtotal RNAを抽出した。Sensation Plus FFPE Amplification and 3’ IVT Labeling Kit (Affymetrix社)を用いて核酸チップ前処理を行った。上記で得られたtotal RNAを用いてGene Chip測定を行った。実施例１と同様にして、表１の遺伝子についてクラスタリングを行った。
【０１３２】
図１７に、上記FFPE組織検体18検体について得られた再発リスク群分類の結果を示す。図１７に示されるように、FFPE組織検体を用いた場合にも、表１の遺伝子の発現量に基づいて、大腸癌の症例を３つの再発リスク群に分類できることがわかった。表８に、FFPE組織検体18症例について分類したタイプ毎の症例数（存在比率）及び大腸癌の再発率を示す。
【０１３３】
【表８】
0006757560.tif 000010
【０１３４】
全18症例のうち、低リスク群に分類された症例は4症例、中リスク群に分類された症例は6症例、高リスク群に分類された症例は8症例であった。大腸癌の再発率は、低リスク群において0％、中リスク群において0％、高リスク群において37.5％であった。これらの結果は、FFPE組織検体を用いる場合にも、大腸癌の症例を精度よく再発リスク群分類できることを示す。
【０１３５】
上記のFFPE組織検体について、中リスク群に分類された6症例におけるKRAS遺伝子変異を測定した。その結果、6症例全てにおいて、KRAS遺伝子変異は陰性であり、低リスク群に分類することができた。
図１８に、FFPE組織検体に対して実施例６および７で実施した再発リスク群分類を行った際の各群のKaplan-Meier曲線を示す。図１８に示されるように、FFPE組織検体を用いる場合にも、各タイプにおける手術後の無再発生存率に大きな差異が認められることがわかった。
【０１３６】
図１７および表８の結果から、FFPE組織検体を用いても、実施例１と同様に、大腸癌の症例を、再発リスク群分類できることがわかった。また、図１８の結果から、実施例６及び７と同様に、FFPE組織検体を用いても、KRAS遺伝子変異の有無に基づいて再発リスク群分類の精度を更に高めることができることがわかった。
以下の表９に、凍結保存組織検体での判定結果と、FFPE組織検体での判定結果との相関表を示す。
【表９】
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【０１３７】
一致率は83.3%と非常に高く、この結果からも、FFPE組織検体を用いた場合にも、凍結保存組織検体を用いた場合と同様、再発リスクを判定できることがわかった。
【０１３８】
実施例９：相関係数を用いた再発リスク判定方法
実施例１において分類した、低リスク群、中リスク群および高リスク群において、表1に示される55遺伝子の発現量をそれぞれ測定した。この発現量に基づき、低リスク群発現パターン、中リスク群発現パターンおよび高リスク群発現パターンを取得した。各発現パターン内には、各遺伝子の平均値が含まれる。
【０１３９】
検体として、実施例４と同じ検体を用いた。各検体について表1に示される55遺伝子の発現量をそれぞれ測定した。この発現量に基づき、各検体の発現パターンを取得した。
【０１４０】
検体の発現パターンと、各リスク群の発現パターンとの間の相関係数を、スピアマンの順位相関に基づいて算出した。各検体について最も高い相関係数を示したリスク群を特定した。
【０１４１】
実施例４の結果（クラスタリング解析によるリスク分類）と、実施例９の結果との一致率を表10に示す。
【０１４２】
【表１０】
0006757560.tif 000012
【０１４３】
表10に示されるように、実施例9の結果と実施例4の結果との一致率は83%であった。この結果から、相関係数を用いた場合も、検体の再発リスクを判定できることがわかった。
【０１４４】
実施例１０：KRAS遺伝子変異を用いた再発リスク判定
実施例９で再発リスクが中程度と判定された患者群のKRAS遺伝子変異の有無を検出した。中リスク群のうち、KRAS遺伝子変異を有する検体を再発リスク高、KRAS遺伝子変異の無い検体を再発リスク低に分類した。
【０１４５】
実施例６の結果と実施例１０の結果との一致率を表11に示す。
【０１４６】
【表１１】
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【０１４７】
表11に示されるように、実施例10の結果と実施例6の結果との一致率は85%であった。この結果から、相関係数を用いた場合も、検体の再発リスクを判定できることがわかった。
【０１４８】
また、図１９に、実施例10の結果から作成したKaplan-Meier曲線を示す。図１９に示されるように、KRAS遺伝子変異の有無を判断基準に加えることで、各検体を無再発生存率の大きく異なる高低二つのリスク群に分類することができた。
【符号の説明】
【０１４９】
１      診断補助装置
２      測定装置
３      コンピュータシステム
３ａ    コンピュータ本体
３ｂ    入力部
３ｃ    表示部
４      変異測定装置
３０    ＣＰＵ
３１    ＲＯＭ
３２    ＲＡＭ
３３    ハードディスク
３４    入出力インターフェイス
３５    読出装置
３６    通信インターフェイス
３７    画像出力インターフェイス
３８    バス
４０    記録媒体
３０１  受信部
３０２  記憶部
３０３  算出部
３０４  判定部
３０５  出力部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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