(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するαサブユニットと、配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するβサブユニットとを有するシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼにおいて、下記のアミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基置換を含み、酸処理（ｐＨ４．０、３０℃ 、３ ０時間の処理）を施した変異型ニトリルヒドラターゼの反応初速度の、酸処理を施していない変異型ニトリルヒドラターゼの反応初速度に対する比（ 酸処理後の反応初速度／ 酸処理前の反応初速度） の値が、酸処理を施した野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼの反応初速度の、酸処理を施していない野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼの反応初速度に対する比（ 酸処理後の反応初速度／ 酸処理前の反応初速度）の値に対して、１．１倍以上である、変異型ニトリルヒドラターゼ、
（ａ）αサブユニットにおいて、配列番号１のＮ末端から４０番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のＡｓｎへの置換、
（ｂ）αサブユニットにおいて、配列番号１のＮ末端から４３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のＶａｌへの置換、
（ｃ）βサブユニットにおいて、配列番号２のＮ末端から２０５番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のＶａｌへの置換、
（ｄ）βサブユニットにおいて、配列番号２のＮ末端から２０６番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のＧｌｎへの置換、
（ｅ）βサブユニットにおいて、配列番号２のＮ末端から２１５番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のＡｓｎへの置換。
【請求項２】
アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる２つ以上のアミノ酸残基置換を含む、請求項１に記載の変異型ニトリルヒドラターゼ。
【請求項３】
アミノ酸残基置換（ｂ）と、アミノ酸残基置換（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）からなる群から選択される少なくとも１つと、を含む、請求項１又は請求項２に記載の変異型ニトリルヒドラターゼ。
【請求項４】
αサブユニットのアミノ酸配列における、配列番号１のＮ末端から３６番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がＴｒｐである、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の変異型ニトリルヒドラターゼ。
【請求項５】
αサブユニットのアミノ酸配列における、配列番号１のＮ末端から３６番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がＭｅｔ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ又はＡｌａである、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の変異型ニトリルヒドラターゼ。
【請求項６】
αサブユニットのアミノ酸配列が、以下の（１）〜（１３）のうち１つ以上を満たす、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の変異型ニトリルヒドラターゼ：
（１）配列番号１のＮ末端から６番目のアミノ酸残基がＴｈｒ又はＡｌａである、
（２）配列番号１のＮ末端から１３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＬｅｕである、
（３）配列番号１のＮ末端から１９番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＶａｌである、
（４）配列番号１のＮ末端から２７番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＩｌｅである、
（５）配列番号１のＮ末端から４８番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＧｌｎである、
（６）配列番号１のＮ末端から７１番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＨｉｓである、
（７）配列番号１のＮ末端から９２番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＧｌｕである、
（８）配列番号１のＮ末端から９４番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＩｌｅである、
（９）配列番号１のＮ末端から１２６番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＴｙｒである、
（１０）配列番号１のＮ末端から１４８番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＡｓｐである、
（１１）配列番号１のＮ末端から１８８番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＧｌｙである、
（１２）配列番号１のＮ末端から１９７番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＣｙｓである、
（１３）配列番号１のＮ末端から２０４番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＡｒｇである。
【請求項７】
βサブユニットのアミノ酸配列が、以下の（１５）〜（４７）のうち少なくとも１つを満たす、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の変異型ニトリルヒドラターゼ：
（１５）配列番号２のＮ末端から４番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＭｅｔである、
（１６）配列番号２のＮ末端から８番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＡｌａである、
（１７）配列番号２のＮ末端から１０番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＡｓｐである、
（１８）配列番号２のＮ末端から２４番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＩｌｅである、
（１９）配列番号２のＮ末端から３３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＶａｌ又はＭｅｔである、
（２０）配列番号２のＮ末端から３７番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＶａｌ又はＬｅｕである、
（２１）配列番号２のＮ末端から４０番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＩｌｅ、Ｖａｌ又はＬｅｕである、
（２２）配列番号２のＮ末端から４１番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＩｌｅである、
（２３）配列番号２のＮ末端から４６番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＬｙｓである、
（２４）配列番号２のＮ末端から４８番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＶａｌである、
（２５）配列番号２のＮ末端から５１番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＶａｌである、
（２６）配列番号２のＮ末端から６１番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＶａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ又はＴｈｒである、
（２７）配列番号２のＮ末端から７９番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＡｓｎである、
（２８）配列番号２のＮ末端から９６番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＡｒｇである、
（２９）配列番号２のＮ末端から１０７番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＭｅｔである、
（３０）配列番号２のＮ末端から１０８番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＡｓｐ又はＡｒｇである、
（３１）配列番号２のＮ末端から１１０番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＡｓｎである、
（３２）配列番号２のＮ末端から１１２番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＶａｌ又はＩｌｅである、
（３３）配列番号２のＮ末端から１１８番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＶａｌである、
（３４）配列番号２のＮ末端から１２７番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＳｅｒである、
（３５）配列番号２のＮ末端から１４６番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＧｌｙである、
（３６）配列番号２のＮ末端から１５０番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＡｓｎ又はＳｅｒである、
（３７）配列番号２のＮ末端から１６０番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＣｙｓ、Ｔｒｐ又はＭｅｔである、
（３８）配列番号２のＮ末端から１６８番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＧｌｕである、
（３９）配列番号２のＮ末端から１７６番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＡｌａ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ又はＣｙｓである、
（４０）配列番号２のＮ末端から１８６番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＡｒｇである、
（４１）配列番号２のＮ末端から２００番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＧｌｕである、
（４２）配列番号２のＮ末端から２１２番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＴｙｒである、
（４３）配列番号２のＮ末端から２１７番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＶａｌ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ又はＣｙｓである、
（４４）配列番号２のＮ末端から２１８番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＭｅｔ又はＳｅｒである、
（４５）配列番号２のＮ末端から２２６番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＩｌｅである、
（４６）配列番号２のＮ末端から２３０番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＧｌｕである、
（４７）配列番号２のＮ末端から２３１番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＶａｌである。
【請求項８】
下記[１]〜[４８]のいずれかのシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼにおいて、前記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基置換を含む、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の変異型ニトリルヒドラターゼ。
[１]配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号２のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２]配列番号１６のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３]配列番号１７のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[４]配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[５]配列番号１９のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[６]配列番号２０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３５のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[７]配列番号２０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３６のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[８]配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３７のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[９]配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３８のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１０]配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３９のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１１]配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４０のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１２]配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４１のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１３]配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４２のアミ
ノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１４]配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１５]配列番号２２のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１６]配列番号２３のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４５のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１７]配列番号２４のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１８]配列番号２５のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４７のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１９]配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４８のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２０]配列番号２３のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４９のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２１]配列番号１６のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５０のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２２]配列番号２６のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５１のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２３]配列番号２７のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５２のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２４]配列番号２８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２５]配列番号１７のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２６]配列番号２９のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５５のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２７]配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５６のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２８]配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５７のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２９]配列番号３０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５８のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３０]配列番号２９のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５９のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３１]配列番号３１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６０のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３２］配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６１のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３３]配列番号３２のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６２のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３４]配列番号３０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３５]配列番号３０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３６]配列番号３０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６５のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３７]配列番号２５のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３８]配列番号３０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６６のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３９]配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６７のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[４０]配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６８のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[４１]配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６９のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[４２]配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号７０のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[４３]配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号７１のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[４４]配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号７２のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[４５]配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号７３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[４６]上記[１]〜[４５]のニトリルヒドラターゼのうちいずれか１つにおけるαサブユニットのＮ末端から３６番目のアミノ酸残基をＴｒｐ残基とした、ニトリルヒドラターゼ
[４７]上記[１]〜[４６]のうちいずれか１つのニトリルヒドラターゼ（Ａ）のαサブユニット又は該αサブユニットと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるαサブユニットバリアントと、前記ニトリルヒドラターゼ（Ａ）のβサブユニット又は該βサブユニットと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるβサブユニットバリアントと、を有するニトリルヒドラターゼであって、αサブユニット及びβサブユニットのうち少なくとも一方はαサブユニットバリアント又はβサブユニットバリアントである、ニトリルヒドラターゼ
[４８]上記[１]〜[４６]のうちいずれか１つのニトリルヒドラターゼ（Ｂ）におけるαサブユニットにおいて付加、置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸残基（前記（ａ）及び（ｂ）の置換されるアミノ酸残基を除く）の総数が１〜１０であり、かつ、前記ニトリルヒドラターゼ（Ｂ）におけるβサブユニットにおいて、付加、置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸残基（前記（ｃ）〜（ｅ）の置換されるアミノ酸残基を除く）の総数が１〜１０であるニトリルヒドラターゼ
【請求項９】
請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の変異型ニトリルヒドラターゼをコードする核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
発現ベクターである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の形質転換体を培地中で培養すること、並びに培養された形質転換体及び培地のうち少なくとも一方から、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の変異型ニトリルヒドラターゼを回収することを含む変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の製造方法によって得られた変異型ニトリルヒドラターゼ。
【請求項１５】
請求項１〜請求項８及び請求項１４のうちいずれか１項に記載の変異型ニトリルヒドラターゼをニトリル化合物に接触させることを含む、アミド化合物の製造方法。
【請求項１６】
さらに、ｐＨ３．５〜ｐＨ６．５で、アミド化合物を含む溶液から不純物を除去することを含む、請求項１５に記載のアミド化合物の製造方法。
【請求項１７】
さらに、アミド化合物を活性炭により精製することを含む、請求項１５または請求項１６に記載のアミド化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、変異型ニトリルヒドラターゼ、該変異型ニトリルヒドラターゼをコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター及び形質転換体、該変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法、並びにアミド化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニトリルヒドラターゼは、種々の化合物のニトリル基を水和によりアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であり、酵素反応を利用した工業的なアミド化合物の製造プロセスにおいて利用されている。【０００３】
近年、工業的なアミド化合物の製造技術に対する要求水準はますます高くなってきている傾向にある。こうした事情に鑑みて、アミド化合物の製造コストに占めるニトリルヒドラターゼのランニングコストを低減させるべく、種々の検討がこれまでになされている。特に、ニトリルヒドラターゼについては、該酵素の単位重量あたりの活性値を向上させることが可能な変異体に係る技術について、数多くの報告がなされている（特開平９−２７５９７８号公報、特開２００４−１９４５８８号公報、特開２００５−１６０４０３号公報、国際公開第２００４／０５６９９０号、国際公開第２０１０／０５５６６６号、特開２００７−１４３４０９号公報、特開２００８−２５３１８２号公報等）。【０００４】
ここで、酵素反応を利用した工業的なアミド化合物の代表的な製造プロセスにおいては、通常、ｐＨが７〜９となるように調整した溶液中において、ニトリルヒドラターゼの触媒作用を利用してニトリル化合物からアミド化合物を合成させる反応を進行させる反応工程と、上記溶液のｐＨを３．５〜６．５に調整し、該ｐＨにおいて活性炭を用いて前記溶液中に存在するニトリルヒドラターゼに吸着を利用して除去することにより精製されたアミド化合物を得る精製工程とをこの順で行っていた（特開２００１−２７０８５７号公報）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、ニトリルヒドラターゼを利用した工業的なアミド化合物の製造効率を従来にも増して向上させるべく鋭意検討した。その結果、酸性のｐＨ領域において行われる前記精製工程においても、ニトリルヒドラターゼの触媒作用を利用してニトリル化合物からアミド化合物を合成させる反応を進行させ続けることが、その設計指針として有効であることを見出した。【０００６】
しかしながら、一般に、野生型ニトリルヒドラターゼの至適ｐＨは７〜９であり、野生型ニトリルヒドラターゼはｐＨ３．５〜６．５の条件下においては活性が大きく低下する。したがって、野生型ニトリルヒドラターゼを用いても、精製工程において酵素反応は満
足できる程度には生じない。また、上記のとおり種々のニトリルヒドラターゼ変異体が報告されてきたが、これらも精製工程で用いられるような酸性条件下においては活性が大きく低下する。このように、酸性条件下での精製工程においてニトリル化合物からアミド化合物を合成する反応を触媒する酵素活性の良好なｐＨ安定性を示すニトリルヒドラターゼ変異体に関する技術は、これまでに報告されていなかった。特にｐＨ５．０以下といった比較的強い酸性条件下においては、タンパク質は失活する傾向がより高く、このようなｐＨ条件下でも酵素活性が良好に保持されるニトリルヒドラターゼ変異体に関する技術は、これまでに報告されていなかった。【０００７】
そこで、本開示は、ニトリル化合物からアミド化合物の合成反応を触媒する酵素活性のｐＨに対する安定性が向上した、新たな変異点を有する変異型ニトリルヒドラターゼに関する技術を提供する。より具体的には、ｐＨ３．５〜６．５といった酸性領域においても酵素活性を良好に保持する変異型ニトリルヒドラターゼに関する技術を提供する。さらに具体的には、ｐＨが３．５〜５．０という比較的強い酸性領域においても酵素活性を良好に保持する変異型ニトリルヒドラターゼに関する技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、以下の態様を含む。
＜１＞  αサブユニットとβサブユニットとを有するシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼにおいて、下記のアミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基置換を含む、変異型ニトリルヒドラターゼ、
（ａ）αサブユニットのＮ末端から４０番目のアミノ酸残基のＡｓｎへの置換、
（ｂ）αサブユニットのＮ末端から４３番目のアミノ酸残基のＶａｌへの置換、
（ｃ）βサブユニットのＮ末端から２０５番目のアミノ酸残基のＶａｌへの置換、
（ｄ）βサブユニットのＮ末端から２０６番目のアミノ酸残基のＧｌｎへの置換、
（ｅ）βサブユニットのＮ末端から２１５番目のアミノ酸残基のＡｓｎへの置換。【０００９】
＜２＞  アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる２つ以上のアミノ酸残基置換を含む、＜１＞に記載の変異型ニトリルヒドラターゼ。【００１０】
＜３＞  アミノ酸残基置換（ｂ）と、アミノ酸残基置換（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）からなる群から選択される少なくとも１つと、を含む＜１＞又は＜２＞に記載の変異型ニトリルヒドラターゼ。【００１１】
＜４＞  αサブユニットのアミノ酸配列における、Ｎ末端から３６番目のアミノ酸がＴｒｐである、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の変異型ニトリルヒドラターゼ。【００１２】
＜５＞  αサブユニットのアミノ酸配列における、Ｎ末端から３６番目のアミノ酸がＭｅｔ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ又はＡｌａである、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の変異型ニトリルヒドラターゼ。【００１３】
＜６＞  αサブユニットのアミノ酸配列が、以下の（１）〜（１３）のうち１つ以上を満たす、＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の変異型ニトリルヒドラターゼ：
（１）Ｎ末端から６番目のアミノ酸残基がＴｈｒ又はＡｌａである、
（２）Ｎ末端から１３番目のアミノ酸残基がＬｅｕである、
（３）Ｎ末端から１９番目のアミノ酸残基がＶａｌである、
（４）Ｎ末端から２７番目のアミノ酸残基がＩｌｅである、
（５）Ｎ末端から４８番目のアミノ酸残基がＧｌｎである、
（６）Ｎ末端から７１番目のアミノ酸残基がＨｉｓである、
（７）Ｎ末端から９２番目のアミノ酸残基がＧｌｕである、
（８）Ｎ末端から９４番目のアミノ酸残基がＩｌｅである、
（９）Ｎ末端から１２６番目のアミノ酸残基がＴｙｒである、
（１０）Ｎ末端から１４８番目のアミノ酸残基がＡｓｐである、
（１１）Ｎ末端から１８８番目のアミノ酸残基がＧｌｙである、
（１２）Ｎ末端から１９７番目のアミノ酸残基がＣｙｓである、
（１３）Ｎ末端から２０４番目のアミノ酸残基がＡｒｇである。【００１４】
＜７＞  βサブユニットのアミノ酸配列が、以下の（１５）〜（４７）のうち少なくとも１つを満たす、＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の変異型ニトリルヒドラターゼ：
（１５）Ｎ末端から４番目のアミノ酸残基がＭｅｔである、
（１６）Ｎ末端から８番目のアミノ酸残基がＡｌａである、
（１７）Ｎ末端から１０番目のアミノ酸残基がＡｓｐである、
（１８）Ｎ末端から２４番目のアミノ酸残基がＩｌｅである、
（１９）Ｎ末端から３３番目のアミノ酸残基がＶａｌ又はＭｅｔである、
（２０）Ｎ末端から３７番目のアミノ酸残基がＶａｌ又はＬｅｕである、
（２１）Ｎ末端から４０番目のアミノ酸残基がＩｌｅ、Ｖａｌ又はＬｅｕである、
（２２）Ｎ末端から４１番目のアミノ酸残基がＩｌｅである、
（２３）Ｎ末端から４６番目のアミノ酸残基がＬｙｓである、
（２４）Ｎ末端から４８番目のアミノ酸残基がＶａｌである、
（２５）Ｎ末端から５１番目のアミノ酸残基がＶａｌである、
（２６）Ｎ末端から６１番目のアミノ酸残基がＶａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ又はＴｈｒである、
（２７）Ｎ末端から７９番目のアミノ酸残基がＡｓｎである、
（２８）Ｎ末端から９６番目のアミノ酸残基がＡｒｇである、
（２９）Ｎ末端から１０７番目のアミノ酸残基がＭｅｔである、
（３０）Ｎ末端から１０８番目のアミノ酸残基がＡｓｐ又はＡｒｇである、
（３１）Ｎ末端から１１０番目のアミノ酸残基がＡｓｎである、
（３２）Ｎ末端から１１２番目のアミノ酸残基がＶａｌ又はＩｌｅである、
（３３）Ｎ末端から１１８番目のアミノ酸残基がＶａｌである、
（３４）Ｎ末端から１２７番目のアミノ酸残基がＳｅｒである、
（３５）Ｎ末端から１４６番目のアミノ酸残基がＧｌｙである、
（３６）Ｎ末端から１５０番目のアミノ酸残基がＡｓｎ又はＳｅｒである、
（３７）Ｎ末端から１６０番目のアミノ酸残基がＣｙｓ、Ｔｒｐ又はＭｅｔである、
（３８）Ｎ末端から１６８番目のアミノ酸残基がＧｌｕである、
（３９）Ｎ末端から１７６番目のアミノ酸残基がＡｌａ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ又はＣｙｓである、
（４０）Ｎ末端から１８６番目のアミノ酸残基がＡｒｇである、
（４１）Ｎ末端から２００番目のアミノ酸残基がＧｌｕである、
（４２）Ｎ末端から２１２番目のアミノ酸残基がＴｙｒである、
（４３）Ｎ末端から２１７番目のアミノ酸残基がＶａｌ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ又はＣｙｓである、
（４４）Ｎ末端から２１８番目のアミノ酸残基がＭｅｔ又はＳｅｒである、
（４５）Ｎ末端から２２６番目のアミノ酸残基がＩｌｅである、
（４６）Ｎ末端から２３０番目のアミノ酸残基がＧｌｕである、
（４７）Ｎ末端から２３１番目のアミノ酸残基がＶａｌである。【００１５】
＜８＞  下記[１]〜[４９]のいずれかのシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼにおいて、前記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基置換を含む、＜１＞〜＜７＞のいずれか１つに記載の変異型ニトリルヒドラターゼ。
[１]配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号２のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２]配列番号１６のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３]配列番号１７のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[４]配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[５]配列番号１９のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[６]配列番号２０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３５のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[７]配列番号２０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３６のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[８]配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３７のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[９]配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３８のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１０]配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３９のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１１]配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４０のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１２]配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４１のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１３]配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４２のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１４]配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１５]配列番号２２のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１６]配列番号２３のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４５のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１７]配列番号２４のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１８]配列番号２５のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４７のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[１９]配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４８のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２０]配列番号２３のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４９のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２１]配列番号１６のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５０のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２２]配列番号２６のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５１のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２３]配列番号２７のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５２のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２４]配列番号２８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２５]配列番号１７のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２６]配列番号２９のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５５のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２７]配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５６のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２８]配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５７のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[２９]配列番号３０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５８のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３０]配列番号２９のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５９のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３１]配列番号３１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６０のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３２］配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６１のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３３]配列番号３２のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６２のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３４]配列番号３０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３５]配列番号３０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３６]配列番号３０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６５のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３７]配列番号２５のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３８]配列番号３０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６６のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[３９]配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６７のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[４０]配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６８のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[４１]配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６９のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[４２]配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号７０のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[４３]配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号７１のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[４４]配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号７２のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[４５]配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号７３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[４６]上記[１]〜[４５]のニトリルヒドラターゼのうちいずれか１つにおけるαサブユニットのＮ末端から３６番目のアミノ酸残基をＴｒｐ残基とした、ニトリルヒドラターゼ
[４７]上記[１]〜[４６]のうちいずれか１つのニトリルヒドラターゼ（Ａ）のαサブユニット又は該αサブユニットと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるαサブユニットバリアントと、前記ニトリルヒドラターゼ（Ａ）のβサブユニット又は該βサブユニットと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるβサブユニットバリアントと、を有するニトリルヒドラターゼであって、αサブユニット及びβサブユニットのうち少なくとも一方はαサブユニットバリアント又はβサブユニットバリアントである、ニトリルヒドラターゼ
[４８]上記[１]〜[４６]のうちいずれか１つのニトリルヒドラターゼ（Ｂ）におけるαサブユニットにおいて付加、置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸残基（前記（ａ）及び（ｂ）の置換されるアミノ酸残基を除く）の総数が１〜１０であり、かつ、前記ニトリルヒドラターゼ（Ｂ）におけるβサブユニットにおいて、付加、置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸残基（前記（ｃ）〜（ｅ）の置換されるアミノ酸残基を除く）の総数が１〜１０であるニトリルヒドラターゼ【００１６】
＜９＞  ＜１＞〜＜８＞のいずれか１つに記載の変異型ニトリルヒドラターゼをコードする核酸。【００１７】
＜１０＞  ＜９＞に記載の核酸を含むベクター。【００１８】
＜１１＞  発現ベクターである、＜１０＞に記載のベクター。【００１９】
＜１２＞  ＜１１＞に記載の発現ベクターを含む形質転換体。【００２０】
＜１３＞  ＜１２＞に記載の形質転換体を培地中で培養すること、並びに培養された形質転換体及び培地のうち少なくとも一方から、＜１＞〜＜８＞のいずれか１つに記載の変異型ニトリルヒドラターゼを回収することを含む変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法。【００２１】
＜１４＞  ＜１３＞に記載の製造方法によって得られた変異型ニトリルヒドラターゼ。【００２２】
＜１５＞  ＜１＞〜＜８＞及び＜１４＞のうちいずれか１つに記載の変異型ニトリルヒドラターゼをニトリル化合物に接触させることを含む、アミド化合物の製造方法。【００２３】
＜１６＞  さらに、ｐＨ３．５〜ｐＨ６．５で、アミド化合物を含む溶液から不純物を除去することを含む、＜１５＞に記載のアミド化合物の製造方法。【００２４】
＜１７＞  さらに、アミド化合物を活性炭により精製することを含む、＜１５＞または＜１６＞に記載のアミド化合物の製造方法。
【発明の効果】
【００２５】
本開示によれば、ニトリル化合物からアミド化合物の合成反応を触媒する酵素活性のｐＨに対する安定性が向上した、新たな変異点を有する変異型ニトリルヒドラターゼに関する技術を提供することができる。より具体的には、ｐＨ３．５〜６．５といった酸性領域においても酵素活性を良好に保持する変異型ニトリルヒドラターゼに関する技術を提供することができる。さらに具体的には、ｐＨが３．５〜５．０という比較的強い酸性領域においても酵素活性を良好に保持する変異型ニトリルヒドラターゼに関する技術を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
＜変異型ニトリルヒドラターゼ＞
本開示は、αサブユニットとβサブユニットとを有するシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼにおいて、下記のアミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基置換を含む、変異型ニトリルヒドラターゼ（以下、変異型ニトリルヒドラターゼＡともいう）を提供する：
（ａ）αサブユニットのＮ末端から４０番目のアミノ酸残基のＡｓｎへの置換、
（ｂ）αサブユニットのＮ末端から４３番目のアミノ酸残基のＶａｌへの置換、
（ｃ）βサブユニットのＮ末端から２０５番目のアミノ酸残基のＶａｌへの置換、
（ｄ）βサブユニットのＮ末端から２０６番目のアミノ酸残基のＧｌｎへの置換、
（ｅ）βサブユニットのＮ末端から２１５番目のアミノ酸残基のＡｓｎへの置換。
【００２７】
上記（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸残基置換を少なくとも１つ以上含む変異体は、これまでに報告されていなかった。すなわち、前記変異型ニトリルヒドラターゼが含む（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸残基置換は、いずれも、これまでに報告がなされていなかった変異であるといえる。これら（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸残基置換を、以下、アミノ酸残基置換群Ａともいう。そして、上述した変異を含む本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼは、ニトリル化合物からアミド化合物の合成反応に対し、従来のニトリルヒドラターゼ変異体と比べて幅広いｐＨ領域において安定性を有する酵素活性を示すことが可能な酵素である。この点については、実施例にて詳細に説明する。
【００２８】
従来から野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼの変異体を得ようとする試みはされてきたが、これらは主に酵素の至適ｐＨ条件下における酵素活性の向上を目的とするものであって、酵素の至適ｐＨ条件とは反対の酸性条件下におけ
る酵素活性についての検討はされていなかった。至適条件から外れる酸性条件下におけるニトリルヒドラターゼの酵素活性は、本発明者等によって初めて着目されたものであり、上記の新たなアミノ酸残基変異が有効であることを見いだしたものである。
【００２９】
以下に、本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼについてより詳しく説明する。本開示におけるヌクレオチド配列の説明は、当該ヌクレオチド配列を保持している核酸鎖が二本鎖を形成している場合であっても一方の鎖上の配列に着目してなされる場合があるが、二本鎖のうち他方の鎖においては、そのような配列の説明はその相補的な配列へと読み替えて適用すべきである。
本開示において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても当該工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
本開示において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本開示において、組成物中の各成分の量は、組成物中の各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００３０】
本開示において、シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼとは、配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと配列番号２のアミノ酸配列を有するβサブユニットを有する野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼだけでなく、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼに対して、当業者が野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼの改変配列であると認識できる程度に、改変を加えた改変ニトリルヒドラターゼをも含む概念である。シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼの概念に含まれる改変ニトリルヒドラターゼには、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼに対して、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基における別のアミノ酸残基への置換、（ｉｉ）上記（ａ）〜（ｅ）以外の１つ以上のアミノ酸残基の欠失、（ｉｉｉ）アミノ酸残基の挿入、（ｉｖ）αサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のうち一方若しくは両方へのアミノ酸残基の付加、（ｖ）βサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のうち一方若しくは両方へのアミノ酸残基の付加、からなる群から選択される１つ以上の改変を加えた改変ニトリルヒドラターゼも含まれる。
【００３１】
前記改変ニトリルヒドラターゼのαサブユニットにおいて、置換されたアミノ酸残基の数は、例えば、１〜２０であり、あるいは１〜１５であり、あるいは１〜１０であり、あるいは１〜８であり、あるいは１〜７であり、あるいは１〜６であり、あるいは１〜５であり、あるいは１〜４であり、あるいは１〜３であり、あるいは１〜２であり、あるいは１である。置換されたアミノ酸残基の数は０であってもよい。
前記改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、置換されたアミノ酸残基の数は、例えば、１〜２０であり、あるいは１〜１５であり、あるいは１〜１０であり、あるいは１〜８であり、あるいは１〜７であり、あるいは１〜６であり、あるいは１〜５であり、あるいは１〜４であり、あるいは１〜３であり、あるいは１〜２であり、あるいは１である。置換されたアミノ酸残基の数は０であってもよい。
【００３２】
前記改変ニトリルヒドラターゼのαサブユニットにおいて、欠失されたアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１０であり、あるいは１〜７であり、あるいは１〜４であり、あるいは１〜２であり、あるいは１である。欠失されたアミノ酸残基の数は０であってもよい。
前記改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、欠失されたアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１０であり、あるいは１〜７であり、あるいは１〜４であり、あるいは１〜２であり、あるいは１である。欠失されたアミノ酸残基の数は０であってもよい。
【００３３】
前記改変ニトリルヒドラターゼのαサブユニットにおいて、挿入されたアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１０であり、あるいは１〜７であり、あるいは１〜４であり、あるいは１〜２であり、あるいは１である。挿入されたアミノ酸残基の数は０であってもよい。
前記改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、挿入されたアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１０であり、あるいは１〜７であり、あるいは１〜４であり、あるいは１〜２であり、あるいは１である。挿入されたアミノ酸残基の数は０であってもよい。
【００３４】
前記改変ニトリルヒドラターゼのαサブユニットにおいて、置換、欠失又は挿入されたアミノ酸残基の総数は、例えば、１〜２０であり、あるいは１〜１４であり、あるいは１〜８であり、あるいは１〜４であり、あるいは１〜２であり、あるいは１である。末端付加がある場合などは、置換、欠失又は挿入されたアミノ酸残基の総数は、０であってもよい。
前記改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、置換、欠失又は挿入されたアミノ酸残基の総数は、例えば、１〜２０であり、あるいは１〜１４であり、あるいは１〜８であり、あるいは１〜４であり、あるいは１〜２であり、あるいは１である。末端付加がある場合などは、置換、欠失又は挿入されたアミノ酸残基の総数は、０であってもよい。
【００３５】
前記改変ニトリルヒドラターゼのαサブユニットにおいて、末端付加されたアミノ酸残基の数は、例えば、一末端あたり１〜６０であり、あるいは１〜４０であり、あるいは１〜２０であり、あるいは１〜１０であり、あるいは１〜５であり、あるいは１〜３であり、あるいは１である。付加されたアミノ酸残基の数は０であってもよい。
前記改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、末端付加されたアミノ酸残基の数は、例えば、一末端あたり１〜６０であり、あるいは１〜４０であり、あるいは１〜２０であり、あるいは１〜１０であり、あるいは１〜５であり、あるいは１〜３であり、あるいは１である。付加されたアミノ酸残基の数は０であってもよい。
末端付加アミノ酸残基は、例えば分泌シグナル配列であってもよい。末端付加アミノ酸残基はＮ末端のみに、Ｃ末端のみに、あるいはＮ末端及びＣ末端の両方に存在してもよい。
【００３６】
前記改変ニトリルヒドラターゼと野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼとの類似性は配列同一性によっても表現できる。
前記改変ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号１で表される野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列との間で、例えば７０％以上の配列同一性を有し、あるいは８０％以上の配列同一性を有し、あるいは８５％以上の配列同一性を有し、あるいは９０％以上の配列同一性を有し、あるいは９５％以上の配列同一性を有し、あるいは９６％以上の配列同一性を有し、あるいは９７％以上の配列同一性を有し、あるいは９８％以上の配列同一性を有し、あるいは９９％以上の配列同一性を有する。
【００３７】
前記改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号２で表される野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列との間で、例えば７０％以上の配列同一性を有し、あるいは８０％以上の配列同一性を有し、あるいは８５％以上の配列同一性を有し、あるいは９０％以上の配列同一性を有し、あるいは９５％以上の配列同一性を有し、あるいは９６％以上の配列同一性を有し、あるいは９７％以上の配列同一性を有し、あるいは９８％以上の配列同一性を有し、あるいは９９％以上の配列同一性を有する。
【００３８】
なお、配列同士のアラインメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ（１．８３）で行うことができ、初期パラメータ（ギャップオープンペナルティ：１０、ギャップエクステンションペナ
ルティ：０．０５を含む）を使用して行うことができる。
【００３９】
改変ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列を野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列とアラインメントした場合、改変ニトリルヒドラターゼの改変の様式によっては、アラインメントの上で対応するアミノ酸残基同士であっても、上記のように規定されたサブユニットのＮ末端からの距離が異なることがある。本開示においては、このような場合、改変ニトリルヒドラターゼについて、サブユニットのＮ末端からＸ番目のアミノ酸残基とは、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼの当該サブユニットのＮ末端からＸ番目のアミノ酸残基とアラインメント上対応するアミノ酸残基を指す。例えば、本開示における「αサブユニットのＮ末端から４０番目のアミノ酸残基」、「αサブユニットのＮ末端から４０番目のＡｓｐ残基」あるいは「αサブユニットのＮ末端から４０番目のアミノ酸残基であるＡｓｐ残基」とは、改変ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列上においては、αサブユニットのＮ末端から４０番目以外の位置に位置することがありうる。例えば、改変ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのＮ末端から４１番目のアミノ酸残基（必ずしもＡｓｐでなくてもよい）が、アミノ酸残基の挿入の結果、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのＮ末端から４０番目のアミノ酸残基であるＡｓｐ残基に対応することがありうる。このような場合、本開示中の説明における「αサブユニットのＮ末端から４０番目のアミノ酸残基」、「αサブユニットのＮ末端から４０番目のＡｓｐ残基」又は「αサブユニットのＮ末端から４０番目のアミノ酸残基であるＡｓｐ残基」とは、改変ニトリルヒドラターゼ中のαサブユニットのＮ末端から４１番目のアミノ酸残基を指す。
【００４０】
野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼにおいては、配列番号１の先頭に位置するＭｅｔ残基がαサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１番目のアミノ酸残基であり、αサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から４０番目のアミノ酸残基はＡｓｐ残基であり、αサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から４３番目のアミノ酸残基はＡｌａ残基である。また、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼにおいては、配列番号２の先頭に位置するＭｅｔ残基がβサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１番目のアミノ酸残基であり、βサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から２０５番目のアミノ酸残基はＧｌｙ残基であり、βサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から２０６番目のアミノ酸残基はＰｒｏ残基であり、βサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から２１５番目のアミノ酸残基はＴｙｒ残基である。
【００４１】
アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）のうち１つ以上の導入対象として使用することができる改変ニトリルヒドラターゼの配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）が提供するＧｅｎＢａｎｋに登録されているニトリルヒドラターゼの配列、あるいは公知文献に記載のニトリルヒドラターゼの配列から選んで使用することができる。また、上述の特開平９−２７５９７８号公報、特開２００４−１９４５８８号公報、特開２００５−１６０４０３号公報、国際公開第２００４／０５６９９０号、国際公開第２０１０／０５５６６６号に記載されている改変ニトリルヒドラターゼの配列から選んで使用することができる。この場合、これらの特許文献に記載の改良に加えて、アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）のうち１つ以上の導入によりｐＨ安定性の向上という新たな効果も得ることができる。
【００４２】
なお、アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）のうち１つ以上の導入対象として使用することができる改変ニトリルヒドラターゼは、Ｎ末端から３６番目のアミノ酸残基（野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列におけるＮ末端から３６番目のＴｈｒ残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基）がＴｒｐ残基であるもの（以降では、アミノ酸残基置換（ｆ）ともいう）であってもよい。アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）のうち１つ以上に加えてアミノ酸残基置換（ｆ）を有することは、より向上したｐＨ安定性を有する変異型ニトリルヒドラターゼを得る観点から好ましい。言
い換えると、アミノ酸残基置換（ｆ）が存在すると、アミノ酸残基置換（ａ）から（ｅ）による効果がより強くなる傾向にある。
【００４３】
また、例えば、国際公開第２０１０／０５５６６６号には、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列に対して、以下のようなアミノ酸残基置換（以下、アミノ酸残基置換群Ｂともいう）を導入することが記載されている。
【００４４】
αサブユニットのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基置換（αサブユニットのＮ末端を基準とした位置で表わす）
６番目のアミノ酸残基であるＬｅｕをＴｈｒ又はＡｌａに置換
１３番目のアミノ酸残基であるＩｌｅをＬｅｕに置換
１９番目のアミノ酸残基であるＡｌａをＶａｌに置換
２７番目のアミノ酸残基であるＭｅｔをＩｌｅに置換
３６番目のアミノ酸残基であるＴｈｒをＭｅｔ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ又はＡｌａに置換
４８番目のアミノ酸残基であるＡｓｎをＧｌｎに置換
７１番目のアミノ酸残基であるＡｒｇをＨｉｓに置換
９２番目のアミノ酸残基であるＡｓｐをＧｌｕに置換
９４番目のアミノ酸残基であるＭｅｔをＩｌｅに置換
１２６番目のアミノ酸残基であるＰｈｅをＴｙｒに置換
１４８番目のアミノ酸残基であるＧｌｙをＡｓｐに置換
１８８番目のアミノ酸残基であるＴｈｒをＧｌｙに置換
１９７番目のアミノ酸残基であるＧｌｙをＣｙｓに置換
２０４番目のアミノ酸残基であるＶａｌをＡｒｇに置換
【００４５】
βサブユニットのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基置換（βサブユニットのＮ末端を基準とした位置で表わす）
４番目のアミノ酸残基であるＶａｌをＭｅｔに置換
８番目のアミノ酸残基であるＧｌｙをＡｌａに置換
１０番目のアミノ酸残基であるＴｈｒをＡｓｐに置換
２４番目のアミノ酸残基であるＶａｌをＩｌｅに置換
３３番目のアミノ酸残基であるＡｌａをＶａｌ又はＭｅｔに置換
３７番目のアミノ酸残基であるＰｈｅをＶａｌ又はＬｅｕに置換
４０番目のアミノ酸残基であるＴｈｒをＩｌｅ、Ｖａｌ又はＬｅｕに置換
４１番目のアミノ酸残基であるＰｈｅをＩｌｅに置換
４６番目のアミノ酸残基であるＭｅｔをＬｙｓに置換
４８番目のアミノ酸残基であるＬｅｕをＶａｌに置換
５１番目のアミノ酸残基であるＰｈｅをＶａｌに置換
６１番目のアミノ酸残基であるＡｌａをＶａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ又はＴｈｒに置換
７９番目のアミノ酸残基であるＨｉｓをＡｓｎに置換
９６番目のアミノ酸残基であるＧｌｎをＡｒｇに置換
１０７番目のアミノ酸残基であるＰｒｏをＭｅｔに置換
１０８番目のアミノ酸残基であるＧｌｕをＡｓｐ又はＡｒｇに置換
１１０番目のアミノ酸残基であるＧｌｕをＡｓｎに置換
１１２番目のアミノ酸残基であるＬｙｓをＶａｌ又はＩｌｅに置換
１１８番目のアミノ酸残基であるＰｈｅをＶａｌに置換
１２７番目のアミノ酸残基であるＬｅｕをＳｅｒに置換
１４６番目のアミノ酸残基であるＡｒｇをＧｌｙに置換
１５０番目のアミノ酸残基であるＡｌａをＡｓｎ又はＳｅｒに置換
１６０番目のアミノ酸残基であるＡｒｇをＣｙｓ、Ｔｒｐ又はＭｅｔに置換
１６８番目のアミノ酸残基であるＴｈｒをＧｌｕに置換
１７６番目のアミノ酸残基であるＴｙｒをＡｌａ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ又はＣｙｓに置換
１８６番目のアミノ酸残基であるＬｅｕをＡｒｇに置換
２００番目のアミノ酸残基であるＡｌａをＧｌｕに置換
２０６番目のアミノ酸残基であるＰｒｏをＬｅｕに置換
２１２番目のアミノ酸残基であるＳｅｒをＴｙｒに置換
２１７番目のアミノ酸残基であるＡｓｐをＶａｌ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ又はＣｙｓに置換
２１８番目のアミノ酸残基であるＣｙｓをＭｅｔ又はＳｅｒに置換
２２６番目のアミノ酸残基であるＶａｌをＩｌｅに置換
２３０番目のアミノ酸残基であるＡｌａをＧｌｕに置換
２３１番目のアミノ酸残基であるＡｌａをＶａｌに置換
【００４６】
アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）のうち１つ以上の導入対象として使用することができる改変ニトリルヒドラターゼは、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列と比較した場合に、上記アミノ酸残基置換群Ｂから選択される１つ以上のアミノ酸残基置換を含むものであってもよく、これにさらにアミノ酸残基置換（ｆ）を有していてもよい。上記アミノ酸残基置換は２つ以上を組み合わせて含まれていてもよい。そうした組み合わせの例も国際公開第２０１０／０５５６６６号には多数記載されている。また、改変ニトリルヒドラターゼは、もちろん、ニトリルヒドラターゼ活性を有するべきである。
【００４７】
例えば、３つを組み合わせて含んでいる場合は、
αサブユニットにおけるＴｈｒ３６Ｓｅｒ及びＡｓｐ９２Ｇｌｕ並びにβサブユニットにおけるＡｌａ３３Ｖａｌの組み合わせ、
αサブユニットにおけるＭｅｔ９４Ｉｌｅ並びにβサブユニットにおけるＡｌａ６１Ｇｌｙ及びＡｌａ１５０Ａｓｎの組み合わせ、
βサブユニットにおけるＶａｌ４Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１７６Ａｌａ及びＡｓｐ２１７Ｖａｌの組み合わせ
βサブユニットにおけるＡｌａ３３Ｍｅｔ、Ｈｉｓ７９Ａｓｎ及びＴｙｒ１７６Ｔｈｒの組み合わせ、
βサブユニットにおけるＴｈｒ４０Ｖａｌ、Ｃｙｓ２１８Ｍｅｔ及びＶａｌ２２６Ｉｌｅの組み合わせ、
などが例として挙げられる。
【００４８】
また、例えば８つを組み合わせて含んでいる場合は、
αサブユニットにおけるＩｌｅ１３Ｌｅｕ、Ａｌａ１９Ｖａｌ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ及びＰｈｅ１２６Ｔｙｒ並びにβサブユニットにおけるＰｈｅ３７Ｌｅｕ、Ｇｌｎ９６Ａｒｇ、Ｇｌｕ１０８Ａｓｐ及びＡｌａ２００Ｇｌｕの組み合わせ（国際公開第２０１０／０５５６６６号：形質転換体番号５９）、
αサブユニットにおけるＬｅｕ６Ｔｈｒ、Ｍｅｔ２７Ｉｌｅ、Ｔｈｒ３６Ｍｅｔ及びＰｈｅ１２６Ｔｙｒ並びにβサブユニットにおけるＴｈｒ１０Ａｓｐ、Ｐｒｏ１０７Ｍｅｔ、Ｐｈｅ１１８Ｖａｌ及びＡｌａ２００Ｇｌｕの組み合わせ（国際公開第２０１０／０５５６６６号：形質転換体番号６８）、
αサブユニットにおけるＬｅｕ６Ｔｈｒ、Ｔｈｒ３６Ｍｅｔ及びＰｈｅ１２６Ｔｙｒ並びにβサブユニットにおけるＴｈｒ１０Ａｓｐ、Ｐｈｅ１１８Ｖａｌ、Ａｌａ２００Ｇｌｕ、Ｐｒｏ２０６Ｌｅｕ及びＡｌａ２３０Ｇｌｕの組み合わせ（国際公開第２０１０／０５５６６６号：形質転換体番号９２）、
αサブユニットにおけるＬｅｕ６Ｔｈｒ、Ａｌａ１９Ｖａｌ及びＰｈｅ１２６Ｔｙｒ並
びにβサブユニットにおけるＬｅｕ４８Ｖａｌ、Ｈｉｓ７９Ａｓｎ、Ｇｌｕ１０８Ａｒｇ、Ｓｅｒ２１２Ｔｙｒ及びＡｌａ２３０Ｇｌｕの組み合わせ（国際公開第２０１０／０５５６６６号：形質転換体番号８５）、
αサブユニットにおけるＴｈｒ３６Ｍｅｔ、Ｇｌｙ１４８Ａｓｐ及びＶａｌ２０４Ａｒｇ並びにβサブユニットにおけるＰｈｅ４１Ｉｌｅ、Ｐｈｅ５１Ｖａｌ、Ｇｌｕ１０８Ａｓｐ、Ｐｒｏ２０６Ｌｅｕ及びＡｌａ２３０Ｇｌｕの組み合わせ（国際公開第２０１０／０５５６６６号：形質転換体番号９３）、
が例として挙げられる。
【００４９】
また、アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）のうち１つ以上の導入対象として使用することができる改変ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列は、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列と比較して、上記に例示された箇所（アミノ酸残基置換群Ｂ及びアミノ酸残基置換（ｆ））以外のアミノ酸残基におけるアミノ酸残基置換を含んでいてもよい。このような、アミノ酸残基置換群Ｂのうち１つ以上のアミノ酸残基置換及び／又はアミノ酸残基置換（ｆ）に加えて、あるいはアミノ酸残基置換群Ｂのアミノ酸残基の置換もアミノ酸残基置換（ｆ）も無しに、アミノ酸残基置換群Ｂ及びアミノ酸残基置換（ｆ）以外のアミノ酸残基におけるアミノ酸残基置換を含む改変ニトリルヒドラターゼに対しても、アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）のうち１つ以上の導入は、後述のように立体構造上の安定化を通じて、改変ニトリルヒドラターゼが有するｐＨ安定性を向上させる効果を奏する。
【００５０】
上記の野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼ又は改変ニトリルヒドラターゼに対して、アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）のうち１つ以上を導入して、本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼを得ることができる。
【００５１】
前記変異ニトリルヒドラターゼは、アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）及び（ｆ）のうち、表Ｉで示す２つのアミノ酸残基置換の組み合わせを含んでいてもよい。
【００５２】
【表１】
0006757422.tif 000002
【００５３】
前記変異ニトリルヒドラターゼは、アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）及び（ｆ）のうち、表ＩＩで示す３つのアミノ酸残基置換の組み合わせでもを含んでいてもよい。
【００５４】
【表２】
0006757422.tif 000003
【００５５】
前記変異ニトリルヒドラターゼは、アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）及び（ｆ）のうち、表ＩＩＩで示す４つのアミノ酸残基置換の組み合わせを含んでいてもよい。
【００５６】
【表３】
0006757422.tif 000004
【００５７】
前記変異ニトリルヒドラターゼは、アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）及び（ｆ）のうち、表ＩＶで示す５つのアミノ酸残基置換の組み合わせを含んでいてもよい。
【００５８】
【表４】
0006757422.tif 000005
【００５９】
前記変異ニトリルヒドラターゼは、アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）及び（ｆ）の全て（表Ｖで示す６つのアミノ酸残基置換）の組み合わせを含んでいてもよい。
【００６０】
【表５】
0006757422.tif 000006
【００６１】
アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）のうち１つ以上の導入対象として使用することができる改変ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列は、国際公開第２０１０／０５５６６６号等で作製された改変ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列又はこれに類似する配列であってもよい。このため、本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼは、例えば、
αサブユニットのＮ末端から４０番目のアミノ酸残基のＡｓｎへの置換、
αサブユニットのＮ末端から４３番目のアミノ酸残基のＶａｌへの置換、
βサブユニットのＮ末端から２０５番目のアミノ酸残基のＶａｌへの置換、
βサブユニットのＮ末端から２０６番目のアミノ酸残基のＧｌｎへの置換、
βサブユニットのＮ末端から２１５番目のアミノ酸残基のＡｓｎへの置換。
のうち少なくとも１つを、以下のニトリルヒドラターゼ（１）〜（４７）のいずれかに導入したもの（以下、変異型ニトリルヒドラターゼＢともいう）であってもよい：
【００６２】
（１）配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号２のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（２）配列番号１６のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（３）配列番号１７のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（４）配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（５）配列番号１９のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（６）配列番号２０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３５のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（７）配列番号２０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３６のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（８）配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３７のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（９）配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３８のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（１０）配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号３９のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（１１）配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４０のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（１２）配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４１のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（１３）配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４２のアミ
ノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（１４）配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（１５）配列番号２２のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（１６）配列番号２３のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４５のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（１７）配列番号２４のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（１８）配列番号２５のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４７のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（１９）配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４８のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（２０）配列番号２３のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号４９のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（２１）配列番号１６のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５０のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（２２）配列番号２６のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５１のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（２３）配列番号２７のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５２のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（２４）配列番号２８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（２５）配列番号１７のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（２６）配列番号２９のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５５のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（２７）配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５６のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（２８）配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５７のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（２９）配列番号３０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５８のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（３０）配列番号２９のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５９のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（３１）配列番号３１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６０のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（３２）配列番号１８のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６１のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（３３）配列番号３２のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６２のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（３４）配列番号３０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（３５）配列番号３０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（３６）配列番号３０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６５のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（３７）配列番号２５のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号５４のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（３８）配列番号３０のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６６のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（３９）配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６７のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（４０）配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６８のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（４１）配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６９のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（４２）配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号７０のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（４３）配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号７１のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（４４）配列番号２１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号７２のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（４５）配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号７３のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
（４６）上記（１）〜（４５）のニトリルヒドラターゼのうちいずれか１つにおけるαサブユニットのＮ末端から３６番目のアミノ酸残基をＴｒｐ残基とした、ニトリルヒドラターゼ、
（４７）上記（１）〜（４６）のニトリルヒドラターゼのうちいずれか１つである特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるαサブユニットバリアントと、前記特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるβサブユニットバリアントと、を有する改変ニトリルヒドラターゼであって、αサブユニットのアミノ酸配列及びβサブユニットのアミノ酸配列のうち少なくとも一方はαサブユニットバリアント又はβサブユニットバリアントのアミノ酸配列である、改変ニトリルヒドラターゼ。
【００６３】
なお、上記のニトリルヒドラターゼ（２）〜（４５）は、配列番号１のアミノ酸配列を有するαサブユニットと配列番号２のアミノ酸配列を有するβサブユニットとを有するニトリルヒドラターゼ（１）と比較すると以下表６〜表１３に記載のアミノ酸残基において相違しており、国際公開第２０１０／０５５６６６号に形質転換体番号と共に記載されている。以下の表において、変異箇所の欄の数字は、該当するサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端からの位置を表している。また、形質転換体番号とは、国際公開第２０１０／０５５６６６号において付されている番号である。
【００６４】
【表６】
0006757422.tif 000007
【００６５】
【表７】
0006757422.tif 000008
【００６６】
【表８】
0006757422.tif 000009
【００６７】
【表９】
0006757422.tif 000010
【００６８】
【表１０】
0006757422.tif 000011
【００６９】
【表１１】
0006757422.tif 000012
【００７０】
【表１２】
0006757422.tif 000013
【００７１】
【表１３】
0006757422.tif 000014
【００７２】
アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）のうち１つ以上の導入対象として使用することができる改変ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列は、上記（２）〜（４５）の４４のうちのいずれかのニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列であることが好ましく、上記（３）、（１１）、（１８）、（１９）、（２５）、（２７）、（２８）、（２９）、（３２）、（３３）、（３４）、（３５）、（３６）、（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１、（４２）、（４３）、（４４）、及び（４５）のうちのいずれかのニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列であることがより好ましい。
【００７３】
上記（４７）において、αサブユニットバリアントのアミノ酸配列の特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットに対する配列同一性は、８０％以上でもよく、あるいは８５％以上でもよく、あるいは９０％以上でもよく、あるいは９５％以上でもよく、あるいは９６％以上でもよく、あるいは９７％以上でもよく、あるいは９８％以上でもよく、あるいは９９％以上でもよい。同様に、上記（４７）において、βサブユニットバリアントのアミノ酸配列の特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットに対する配列同一性は、８０％以上でもよく、あるいは８５％以上でもよく、あるいは９０％以上でもよく、あるいは９５％以上でもよく、あるいは９６％以上でもよく、あるいは９７％以上でもよく、あるいは９８％以上でもよく、あるいは９９％以上でもよい。また、αサブユニットバリアントとは、上記で規定された配列同一性を満たすが、特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットとは異なるアミノ酸配列を有するαサブユニットのことをいう。βサブユニットバリアントとは、上記で規定された配列同一性を満たすが、特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットとは異なるアミノ酸配列を有するβサブユニットのことをいう。
【００７４】
上記（２）〜（４５）のニトリルヒドラターゼは、国際公開第２０１０／０５５６６６号においてその活性が実施例において確認された（形質転換体番号５、６２、６８、９５及び１１１）ニトリルヒドラターゼであり、また、上記（１）のニトリルヒドラターゼは野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼである。（２）〜（４６）のニトリルヒドラターゼも、アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）のうち１つ以上の導入対象として使用することができる。また、このニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有する他の改変ニトリルヒドラターゼもアミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）のうち１つ以上の導入対象として使用することができる。このため、改変ニトリルヒドラターゼと野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼとの間のアミノ酸配列の差異について説明した事項（配列改変の程度や例についての説明を含む）は、「野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼ」を上記（１）〜（４６）のいずれかのニトリルヒドラターゼと読み替えてそのまま適用できる。また、改変ニトリルヒドラターゼは、もちろん、ニトリルヒドラターゼ活性を有するべきである。
【００７５】
例えば、上記変異型ニトリルヒドラターゼＢが含みうるアミノ酸残基置換及びその組み合わせ、並びにニトリルヒドラターゼのαサブユニットのＮ末端から３６番目のアミノ酸残基については、前記変異型ニトリルヒドラターゼＢは前記表Ｉに記載のアミノ酸残基の組み合わせａ〜ｏ、前記表ＩＩに記載のアミノ酸残基の組み合わせｐ〜ａｉ、前記表ＩＩＩに記載のアミノ酸残基の組み合わせａｊ〜ａｘ、前記表ＩＶに記載のアミノ酸残基の組み合わせａｙ〜ｂｄ、及び前記表Ｖに記載のアミノ酸残基の組み合わせｂｅからなる群から選択されるアミノ酸残基の組み合わせを含んでいてもよい。つまり、上記（１）〜（４６）のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列に対して、このようなアミノ酸残基置換の組み合わせを導入しうる。
【００７６】
また、例えば、上記（４７）のニトリルヒドラターゼは、上記（１）〜（４６）のニトリルヒドラターゼのいずれかに対して、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基における別のアミノ酸残基への置換、（ｉｉ）上記（ａ）〜（ｅ）以外の１つ以上のアミノ酸残基の欠失、（ｉｉｉ）アミノ酸残基の挿入、（ｉｖ）αサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のうち一方若しくは両方へのアミノ酸残基の付加、（ｖ）βサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のうち一方若しくは両方へのアミノ酸残基の付加、からなる群から選択される１つ以上の改変を加えた改変ニトリルヒドラターゼであってもよい。
【００７７】
前記（４７）のニトリルヒドラターゼのαサブユニットにおいて、上記（１）〜（４６）のいずれかのニトリルヒドラターゼのαサブユニットを基準とした場合に置換されたアミノ酸残基の数は、例えば、１〜２０であり、あるいは１〜１５であり、あるいは１〜１０であり、あるいは１〜８であり、あるいは１〜７であり、あるいは１〜６であり、あるいは１〜５であり、あるいは１〜４であり、あるいは１〜３であり、あるいは１〜２であり、あるいは１である。置換されたアミノ酸残基の数は０であってもよい。
前記（４７）のニトリルヒドラターゼβサブユニットにおいて、上記（１）〜（４６）のいずれかのニトリルヒドラターゼのβサブユニットを基準とした場合に置換されたアミノ酸残基の数は、例えば、１〜２０であり、あるいは１〜１５であり、あるいは１〜１０であり、あるいは１〜８であり、あるいは１〜７であり、あるいは１〜６であり、あるいは１〜５であり、あるいは１〜４であり、あるいは１〜３であり、あるいは１〜２であり、あるいは１である。置換されたアミノ酸残基の数は０であってもよい。
【００７８】
前記（４７）のニトリルヒドラターゼのαサブユニットにおいて、上記（１）〜（４６）のいずれかのニトリルヒドラターゼのαサブユニットを基準とした場合に欠失されたアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１０であり、あるいは１〜７であり、あるいは１〜４であり、あるいは１〜２であり、あるいは１である。欠失されたアミノ酸残基の数は０であってもよい。
前記（４７）のニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、上記（１）〜（４６）のいずれかのニトリルヒドラターゼのβサブユニットを基準とした場合に欠失されたアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１０であり、あるいは１〜７であり、あるいは１〜４であり、あるいは１〜２であり、あるいは１である。欠失されたアミノ酸残基の数は０であってもよい。
【００７９】
前記（４７）のニトリルヒドラターゼのαサブユニットにおいて、上記（１）〜（４６）のいずれかのニトリルヒドラターゼのαサブユニットを基準とした場合に挿入されたアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１０であり、あるいは１〜７であり、あるいは１〜４であり、あるいは１〜２であり、あるいは１である。挿入されたアミノ酸残基の数は０であ
ってもよい。
前記（４７）のニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、上記（１）〜（４６）のいずれかのニトリルヒドラターゼのβサブユニットを基準とした場合に挿入されたアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１０であり、あるいは１〜７であり、あるいは１〜４であり、あるいは１〜２であり、あるいは１である。挿入されたアミノ酸残基の数は０であってもよい。
【００８０】
前記（４７）のニトリルヒドラターゼのαサブユニットにおいて、上記（１）〜（４６）のいずれかのニトリルヒドラターゼのαサブユニットを基準とした場合に置換、欠失又は挿入されたアミノ酸残基の総数は、例えば、１〜２０であり、あるいは１〜１４であり、あるいは１〜８であり、あるいは１〜４であり、あるいは１〜２であり、あるいは１である。末端付加がある場合などは、置換、欠失又は挿入されたアミノ酸残基の総数は、０であってもよい。
前記（４７）の改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、上記（１）〜（４６）のいずれかのニトリルヒドラターゼのβサブユニットを基準とした場合に置換、欠失又は挿入されたアミノ酸残基の総数は、例えば、１〜２０であり、あるいは１〜１４であり、あるいは１〜８であり、あるいは１〜４であり、あるいは１〜２であり、あるいは１である。末端付加がある場合などは、置換、欠失又は挿入されたアミノ酸残基の総数は、０であってもよい。
【００８１】
前記（４７）のニトリルヒドラターゼのαサブユニットにおいて、上記（１）〜（４６）のいずれかのニトリルヒドラターゼのαサブユニットを基準とした場合に末端付加されたアミノ酸残基の数は、例えば、一末端あたり１〜６０であり、あるいは１〜４０であり、あるいは１〜２０であり、あるいは１〜１０であり、あるいは１〜５であり、あるいは１〜３であり、あるいは１である。付加されたアミノ酸残基の数は０であってもよい。
前記（４７）のニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、上記（１）〜（４６）のいずれかのニトリルヒドラターゼのβサブユニットを基準とした場合に末端付加されたアミノ酸残基の数は、例えば、一末端あたり１〜６０であり、あるいは１〜４０であり、あるいは１〜２０であり、あるいは１〜１０であり、あるいは１〜５であり、あるいは１〜３であり、あるいは１である。付加されたアミノ酸残基の数は０であってもよい。
【００８２】
前記（４７）のニトリルヒドラターゼは、（１）〜（４６）のいずれかのニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列と比較した場合に、上記アミノ酸残基置換群Ｂから選択される１つ以上のアミノ酸残基置換を含むものであってもよい。上記アミノ酸残基置換は２つ以上を組み合わせて含まれていてもよい。
【００８３】
上記において（４７）のα／βサブユニットバリアントは、特定ニトリルヒドラターゼのα／βサブユニットのアミノ酸配列と比較してのアミノ酸の挿入やアミノ酸残基の欠失は有さず、アミノ酸残基の置換又は末端付加のみを有するものであってもよい。（４７）のα／βサブユニットバリアント中におけるアミノ酸残基の位置については、前述と同様に、特定ニトリルヒドラターゼのα／βサブユニット中の指定されたアミノ酸残基とアラインメント上対応する位置を意味する。
【００８４】
本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼは、
上記ニトリルヒドラターゼ（１）〜（４６）のいずれかのニトリルヒドラターゼである特定ニトリルヒドラターゼに対して、あるいは
特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットに対して７０％以上の配列同一性を有する改変αサブユニット及び特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットに対して７０％以上の配列同一性を有する改変βサブユニットを有するが特定ニトリルヒドラターゼ自体ではない改変ニトリルヒドラターゼに対して、
以下のアミノ酸残基置換のうち少なくとも１つを導入したもの（以下変異型ニトリルヒドラターゼＣともいう）であってもよい：
前記特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのＮ末端から４０番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のＡｓｎへの置換、
前記特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのＮ末端から４３番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のＶａｌへの置換、
前記特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端から２０５番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のＶａｌへの置換、
前記特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端から２０６番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のＧｌｎへの置換、
前記特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端から２１５番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のＡｓｎへの置換。
【００８５】
上記説明において、前記導入前のニトリルヒドラターゼが前記改変ニトリルヒドラターゼである場合、「特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのＮ末端からＡ番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基」とは、前記改変ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列を特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列に対してアラインメントしたときに、特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端からＡ番目のアミノ酸残基と対応する改変ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列上のアミノ酸残基を指し、同様に、「特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端からＡ番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基」とは、前記改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列を特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列に対してアラインメントしたときに、特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端からＡ番目のアミノ酸残基と対応する改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列上のアミノ酸残基を指す。また、前記導入前のニトリルヒドラターゼが特定ニトリルヒドラターゼである場合、「特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのＮ末端からＡ番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基」とは、特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのＮ末端からＡ番目のアミノ酸残基を指し、「特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端からＡ番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基」とは、特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端からＡ番目のアミノ酸残基を指す。
【００８６】
上記改変ニトリルヒドラターゼにおいて、そのαサブユニットの、特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットに対する配列同一性は、８０％以上でもよく、あるいは８５％以上でもよく、あるいは９０％以上でもよく、あるいは９５％以上でもよく、あるいは９６％以上でもよく、あるいは９７％以上でもよく、あるいは９８％以上でもよく、あるいは９９％以上でもよい。同様に、そのβサブユニットの、上記特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットに対する配列同一性は、８０％以上でもよく、あるいは８５％以上でもよく、あるいは９０％以上でもよく、あるいは９５％以上でもよく、あるいは９６％以上でもよく、あるいは９７％以上でもよく、あるいは９８％以上でもよく、あるいは９９％以上でもよい。特に、上記改変ニトリルヒドラターゼにおいて、そのαサブユニットの、特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットに対する配列同一性は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。同様に、上記改変ニトリルヒドラターゼにおいて、そのβサブユニットの、特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットに対する配列同一性は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。改変ニトリルヒドラターゼと野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼとの間のアミノ酸配列の差異について説明した事項（配列改変の程度や例についての説明を含む）は、「野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼ」を特定ニトリルヒドラターゼと読み替えてそのまま適用できる。上記において改変ニトリルヒドラターゼのα／βサブユニットのアミノ酸配列は、特定ニトリルヒドラターゼのα／βサブユニットのアミノ酸配列と比較してのアミノ酸の挿入やアミノ酸残基の欠失は有さず、アミノ酸残基の置換又は末端付加のみを有するものであってもよい。また、改変ニトリルヒドラターゼは、もちろん、ニトリルヒドラターゼ活性を有するべきである。
【００８７】
上記変異型ニトリルヒドラターゼＣが含みうるアミノ酸残基置換及びその組み合わせ、並びに前記特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのＮ末端から３６番目に対応するアミノ酸残基については、前記変異型ニトリルヒドラターゼＣは前記表Ｉに記載のアミノ酸残基の組み合わせａ〜ｏ、前記表ＩＩに記載のアミノ酸残基の組み合わせｐ〜ａｉ、前記表ＩＩＩに記載のアミノ酸残基の組み合わせａｊ〜ａｘ、前記表ＩＶに記載のアミノ酸残基の組み合わせａｙ〜ｂｄ、及び前記表Ｖに記載のアミノ酸残基の組み合わせｂｅからなる群から選択されるアミノ酸残基の組み合わせを含んでいてもよい。つまり、特定ニトリルヒドラターゼ又は改変ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列に対して、このようなアミノ酸残基置換の組み合わせを導入しうる。
【００８８】
また、例えば、前記改変ニトリルヒドラターゼは、（１）〜（４６）のいずれかのニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列と比較した場合に、上記アミノ酸残基置換群Ｂから選択される１つ以上のアミノ酸残基置換を含むものであってもよい。上記アミノ酸残基置換は２つ以上を組み合わせて含まれていてもよい。
【００８９】
なお、以上で説明した改変ニトリルヒドラターゼは、上記で特定されたαサブユニット又はそのＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方に付加配列を加えたポリペプチドと、上記で特定されたβサブユニット又はそのＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方に付加配列を加えたポリペプチドと、を有するニトリルヒドラターゼであってもよい。前記改変ニトリルヒドラターゼのαサブユニットにおいて、末端付加されたアミノ酸残基の数は、例えば、一末端あたり１〜６０であり、あるいは１〜４０であり、あるいは１〜２０であり、あるいは１〜１０であり、あるいは１〜５であり、あるいは１〜３であり、あるいは１である。付加されたアミノ酸残基の数は０であってもよい。前記改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、末端付加されたアミノ酸残基の数は、例えば、一末端あたり１〜６０であり、あるいは１〜４０であり、あるいは１〜２０であり、あるいは１〜１０であり、あるいは１〜５であり、あるいは１〜３であり、あるいは１である。付加されたアミノ酸残基の数は０であってもよい。
改変ニトリルヒドラターゼのαサブユニットにおいて、付加、置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列（前記（ａ）及び（ｂ）の置換されるアミノ酸残基を除く）を含む場合は、置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸残基の総数は１〜１０であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。同様に、改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、付加、置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列（前記（ｃ）〜（ｅ）の置換されるアミノ酸残基を除く）を含む場合は、置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸残基の総数は１〜１０であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。
【００９０】
本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼは、一般的に、上記のとおり規定されたαサブユニット２つと、上記のとおり規定されたβサブユニット２つとが会合して、機能するものである。
【００９１】
本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼは、従来のニトリルヒドラターゼ変異体と異なり、ｐＨ３．５〜６．５等の酸性条件下においても、ニトリル化合物からアミド化合物の合成反応に対して良好な酵素活性を示す。本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼが有する前記酸性条件下における酵素活性の安定性の向上は、ｐＨ５．０以下の領域で特に顕著である。そのため、前記変異型ニトリルヒドラターゼによれば、ニトリルヒドラターゼを利用した工業的なアミド化合物の製造プロセスにおいて、ニトリル化合物からアミド化合物を合成させる反応を進行させる反応工程だけでなく、ｐＨ３．５〜６．５等の酸性条件下で活性炭を用い、該溶液中に存在するタンパク質等の不純物を吸着除去して精製されたアミド化合物を得る精製工程においても、基質であるニトリル化合物をアミド化合物へ転換する該アミド化合物の合成反応を十分に進行させることが可能となる。そのため、前記変異型ニトリルヒドラターゼによれば、従来の酵素を用いる場合と比べて、工業的なアミド化合物の製造プロセスにおいて、目的の生成物であるアミド化合物の製造効率を飛躍的に向上させることが可能である。前記酸性条件は、不要な蛋白質のより効率的な除去のために５．０以下のｐＨ、例えばｐＨ３．５〜ｐＨ５．０で行ってもよい。
【００９２】
また、酸処理（例えばｐＨ４．０、３０℃、３０時間の処理）を施した変異型ニトリルヒドラターゼの反応初速度の、酸処理を施していない変異型ニトリルヒドラターゼの反応初速度に対する比（酸処理後の反応初速度／酸処理前の反応初速度）の値は、酸処理を施
した野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼの反応初速度の、酸処理を施していない野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼの反応初速度に対する比（酸処理後の反応初速度／酸処理前の反応初速度）の値に対して、１．１倍以上の値を示していることが好ましい。
なお、上述した変異型ニトリルヒドラターゼまたは野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのｐＨ安定性は、例えば、以下の方法で評価することができる。
反応条件として、基質であるアクリロニトリルを２．５％（ｖ／ｖ）含む、５０ｍＭトリス塩酸水溶液（ｐＨ８．０）で、反応温度２０℃で１５分から６０分反応させる。反応終了後、生成したアクリルアミドを定量する。アクリルアミド量はＨＰＬＣによって分析することができる。また、酸処理は、例えば、ｐＨ４．０近辺で３０℃、３０時間処理することで行うことができる。具体的には、実施例におけるｐＨ安定性の評価の欄に記載したやり方で評価できる。
【００９３】
例えば、ニトリルヒドラターゼを生産する形質転換体の培養終了液４０μＬを７４０μＬの５４ｍＭトリス塩酸水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、これに２０μＬのアクリロニトリルを添加して２０℃で緩やかに攪拌しながら１５分から６０分間反応させ、反応終了後にＨＰＬＣを用いて反応液の分析を行い、生成したアミド化合物の量（Ｐ）を測定する（あるいは消費されたニトリル化合物の量から計算してもよい）。また、前記形質転換体の培養終了液１０００μＬを取り、遠心分離して回収した菌体に５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）１０００μＬを加え、攪拌しながら３０℃で３０時間処理する（酸処理）。処理後、７８０μＬを遠心分離して菌体を回収し、７８０μＬの５４ｍＭトリス塩酸水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、これに２０μＬのアクリロニトリルを添加して２０℃で緩やかに攪拌しながら１５分から６０分間反応させ、反応終了後にＨＰＬＣを用いて反応液の分析を行い、生成したアミド化合物の量（Ｑ）を測定する（あるいは消費されたニトリル化合物の量から計算してもよい）。反応及び分析はそれぞれの条件について３回以上行う。酸処理後のニトリルヒドラターゼにより得られたアミド化合物の量（Ｑ）を酸処理前のニトリルヒドラターゼにより得られたアミド化合物の量（Ｐ）で除し、商（Ｒ）を求める。商Ｒを野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼについて、及び試験対象のニトリルヒドラターゼについてそれぞれ求め、試験対象のニトリルヒドラターゼにおけるＲの値の、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼにおけるＲに対する比（試験対象／野生型）を求める。この比が１．０を超えていれば、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼと比較してｐＨ安定性が向上していることが示される。
【００９４】
本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼは、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼよりも上記によって求めたＲ値が高いものであり、変異型ニトリルヒドラターゼのＲ値は野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのＲ値の１．１倍以上であることが好ましく、１．２倍以上であることがより好ましく、１．３倍以上であることがより好ましく、１．４倍以上であることがより好ましい。
【００９５】
また、前記変異型ニトリルヒドラターゼは、上述したように、ニトリル化合物からアミド化合物の合成反応に対し、従来の変異型ニトリルヒドラターゼと比べて幅広いｐＨ領域において酵素活性を示すという点で、ｐＨ安定性に優れた酵素である。そして、上述した（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸残基置換がいずれもニトリルヒドラターゼの酵素活性のｐＨ安定性を向上させる要因について、本発明者らが考察した結果、上述した（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸残基置換に関わるアミノ酸は、いずれも、酵素の基質ポケット近傍に存在しているものであることが判明した。上述した（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸残基置換のうち１つ以上を含むことにより、タンパク質の立体構造（フォールディング状態）が幅広いｐＨ領域
において良好な状態に保持されていると考えられる。このため、上記（ａ）から（ｅ）のアミノ酸残基置換は一群のアミノ酸残基置換であると考えられる（アミノ酸残基置換群Ａ）。
【００９６】
また、前記変異型ニトリルヒドラターゼは、αサブユニットとβサブユニットが会合した２量体がその基本構造単位となっており、その２量体が更に会合して４量体を形成する。αサブユニットのＮ末端から１１１番目のアミノ酸残基であるシステイン残基がシステインスルフィン酸（Ｃｙｓ-ＳＯＯＨ）に、Ｎ末端から１１３番目のアミノ酸残基である
システイン残基がシステインスルフェン酸（Ｃｙｓ-ＳＯＨ）にそれぞれ翻訳後修飾を受
け、この修飾アミノ酸残基を介してαサブユニットのポリペプチド鎖とコバルト原子が結合し、活性中心を形成するものである。
【００９７】
野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）由来のニトリルヒドラターゼを形質転換体内で大量に発現できるプラスミド及び同プラスミドにより形質転換された細胞株としては、ＭＴ−１０８２２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５として茨城県つくば市東１-１-１  独立行政法人産業技
術総合研究所特許生物寄託センターに平成８年２月７日より寄託されている）を使用することができる。また、改変ニトリルヒドラターゼは、通常の遺伝子操作技術を用いて得ることができる。タンパク質の立体構造は、一般に、アミノ酸配列の相同性が高い場合、該タンパク質を含む菌株の種属によらず、類似の構造を有する蓋然性が高いとされているため、アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）のうち１つ以上の導入により得られる効果は、改変ニトリルヒドラターゼを含め、上記で規定されたシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼ一般に対して発揮される。そして、得られた変異型ニトリルヒドラターゼは、例えば、ｐＨ８．０における酵素活性に比したｐＨ４．０における酵素活性により評価されるｐＨ安定性が、アミノ酸残基置換（ａ）〜（ｅ）のうち１つ以上の導入前に比して向上していてもよい。
【００９８】
また、前記変異型ニトリルヒドラターゼは、上記（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸残基置換のうち少なくとも１つを含むものである。前記変異型ニトリルヒドラターゼは、（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸残基置換を１つだけ含んでいてもよいし、２つ以上含んでいてもよい。例えば、２つの組み合わせの場合、（ａ）と（ｂ）の組み合わせ、（ａ）と（ｃ）の組み合わせ、（ａ）と（ｄ）の組み合わせ、（ａ）と（ｅ）の組み合わせ、（ｂ）と（ｃ）の組み合わせ、（ｂ）と（ｄ）の組み合わせ、（ｂ）と（ｅ）の組み合わせ、（ｃ）と（ｄ）の組み合わせ、（ｃ）と（ｅ）の組み合わせ、（ｄ）と（ｅ）の組み合わせ、及び（ｄ）と（ｆ）の組み合わせが挙げられる。
【００９９】
３つの組み合わせの場合、例えば、、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の組み合わせ、（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）の組み合わせ、（ａ）、（ｂ）及び（ｅ）の組み合わせ、（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）の組み合わせ、（ａ）、（ｃ）及び（ｅ）の組み合わせ、（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）の組み合わせ、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の組み合わせ、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）の組み合わせ、（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）の組み合わせ、並びに（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の組み合わせが挙げられる。
４つの組み合わせの場合、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の組み合わせ、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）の組み合わせ、（ａ）、（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）の組み合わせ、（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の組み合わせ、及び（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の組み合わせが挙げられる。
もちろん、（ａ）〜（ｅ）は５つ組み合わせて置換しても構わない。
【０１００】
一実施形態においては、前記変異型ニトリルヒドラターゼは、上記（ｂ）のアミノ酸残基置換、及びこれに加えて上記（ａ）及び（ｃ）〜（ｅ）のアミノ酸残基置換からなる群
のうち１つ以上のアミノ酸残基置換を含む。上記（ｂ）のアミノ酸残基置換と共に含まれる上記（ａ）及び（ｃ）〜（ｅ）のアミノ酸残基置換からなる群のうち１つ以上のアミノ酸残基置換は、２つのアミノ酸残基置換であってもよく、３つのアミノ酸残基置換であってもよく、４つのアミノ酸残基置換（つまり、（ａ）及び（ｃ）〜（ｅ）の全て）であってもよい。また、この実施形態においては、前記変異型ニトリルヒドラターゼはさらに前記（ｆ）のアミノ酸残基置換を有していてもよい。
【０１０１】
そして、上述したとおり、（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸残基置換のうち少なくとも１つを導入する対象となる改変ニトリルヒドラターゼは、野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼ又は上述の（１）〜（５）の特定配列に対してアミノ酸の置換等の改変を含むものであってもよい。このため、変異型ニトリルヒドラターゼも、野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼ又は上述の（１）〜（５）の特定配列と比較して、上記（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸残基置換に加えて、上記（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸残基置換以外の位置のアミノ酸残基置換を含んでいてもかまわない。このように他のアミノ酸残基置換を含む変異型ニトリルヒドラターゼであっても、立体構造上特定の位置に位置するアミノ酸残基置換群Ａによる効果は得ることができる。
【０１０２】
一実施形態においては、本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼは、ｐＨ安定性の向上だけでなく、ニトリル化合物からアミド化合物を生成する反応の初速度においても向上を有するものである。つまり、（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸残基置換のうち少なくとも１つを野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼ又は改変ニトリルヒドラターゼに導入することにより、導入前の反応初速度よりも向上した反応初速度を示すニトリルヒドラターゼが得られる。反応初速度は、例えば、変異型ニトリルヒドラターゼを生産する形質転換体の培養終了液４０μＬを７４０μＬの５４ｍＭトリス塩酸水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、これに２０μＬのアクリロニトリルを添加して２０℃で緩やかに攪拌しながら１５分から６０分間反応させ、反応終了後にＨＰＬＣを用いて反応液の分析を行うことにより求めることができる。また、本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼは、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼよりも高い反応初速度をｐＨ８．０で示すことが好ましく、１．１倍以上高い反応初速度を示すことがより好ましく、１．２倍以上高い反応初速度を示すことがより好ましく、１．３倍以上高い反応初速度を示すことがより好ましく、１．４倍以上高い反応初速度を示すことがより好ましい。
【０１０３】
前記変異型ニトリルヒドラターゼは、以下の手法で製造することができる。
例えば、前記変異型ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを用意し、この発現ベクターにより任意の宿主細胞を形質転換して形質転換体または細胞株を取得し、ついで、前記形質転換体や細胞株を培養して変異型ニトリルヒドラターゼを産生することができる。
【０１０４】
ここで、野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列と、配列番号４に示されるヌクレオチド配列とからなる。なお。配列番号３に示されるヌクレオチド配列は、配列番号１からなるアミノ酸配列に対応し、配列番号４に示されるヌクレオチド配列は、配列番号２からなるアミノ酸配列に対応する。
そして、前記変異型ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡは、少なくとも、配列番号３で示されるヌクレオチド配列または配列番号４で示されるヌクレオチド配列における、上記（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸残基置換位置に対応するコドン（計５箇所）のうち１つ以上に下記のようなヌクレオチド置換を有しており、その他の位置においても改変ニトリルヒドラターゼに対応するヌクレオチド置換を有している。
【０１０５】
具体的には、例えば、野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのＮ末端から４０番目のアミノ酸残基であるＡｓｐ残基をＡｓｎに置換した変異体を作製する場合、配列番号３で示されるヌクレオチド配列の５’末端から１１８〜１２０番目のヌクレオチドであるＧＡＣをＡＡＣまたはＡＡＴに置換したＤＮＡを使用すればよい。
【０１０６】
野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのＮ末端から４３番目のアミノ酸残基であるＡｌａ残基をＶａｌに置換した変異体を作製する場合、配列番号３で示されるヌクレオチド配列の５’末端から１２７〜１２９番目のヌクレオチドであるＧＣＣをＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡまたはＧＴＧに置換したＤＮＡを使用すればよい。
【０１０７】
野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端から２０５番目のアミノ酸残基であるＧｌｙ残基をＶａｌに置換した変異体を作製する場合、配列番号４で示されるヌクレオチド配列の５’末端から６１３〜６１５番目のヌクレオチドであるＧＧＧをＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡまたはＧＴＧに置換したＤＮＡを使用すればよい。
【０１０８】
野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端から２０６番目のアミノ酸残基であるＰｒｏ残基をＧｌｎに置換されている変異体を作製する場合、配列番号４で示されるヌクレオチド配列の５’末端から６１６〜６１８番目のヌクレオチドであるＣＣＧをＣＡＡまたはＣＡＧに置換したＤＮＡを使用すればよい。
【０１０９】
野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのＮ末端から２１５番目のアミノ酸残基であるＴｙｒ残基をＡｓｎに置換した変異体を作製する場合、配列番号４で示されるヌクレオチド配列の５’末端から６４３〜６４５番目のヌクレオチドであるＴＡＣをＡＡＣまたはＡＡＴに置換したＤＮＡを使用すればよい。
【０１１０】
また、アミノ酸残基置換（ｆ）に関しては、野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのＮ末端から３６番目のアミノ酸残基であるＴｈｒ残基をＴｒｐに置換した変異体を作製する場合、配列番号３で示されるヌクレオチド配列の５’末端から１０６〜１０８番目のヌクレオチドであるＡＣＧをＴＧＧに置換したＤＮＡを使用すればよい。
【０１１１】
前記発現ベクターは、変異型ニトリルヒドラターゼのαサブユニットをコードする遺伝子及び変異型ニトリルヒドラターゼのβサブユニットをコードする遺伝子を含み、また、各遺伝子の発現に必要な制御領域及び自律複製に必要な領域などの、形質転換体や細胞株による変異型ニトリルヒドラターゼの産生を可能にする要素を必要に応じて含む。発現ベクターが導入される宿主細胞は任意の細胞であってよいが、例えば大腸菌が挙げられる。
【０１１２】
発現に必要な制御領域としては、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む。）、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）、転写終結配列等を挙げることができる。具体的なプロモーター配列の例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター、ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモーター等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーターやｔｒｃプロモーターのように人為的に設計・改変された配列も利用できる。
【０１１３】
リボゾーム結合配列としては、配列番号７４に含まれる、ＴＡＡＧＧＡＧＧＴを有する配列が望ましく、これら制御領域の発現ベクター上での配列順序は、プロモーター配列とリボゾーム結合配列は変異型ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子より５'末端側上
流に位置する事が望ましく、転写終結配列は変異型ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子より３'末端側下流に位置する事が望ましい。また、その様な制御領域により変異型
ニトリルヒドラターゼのαサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子が各々独立のシストロンとして発現されてもよいし、共通の制御領域によりポリシストロンとして発現されてもよい。
【０１１４】
以上の要件を満たしているベクターの例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を含んでいるｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１を挙げる事ができる。
【０１１５】
このようなベクターに前記変異型ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を該変異型ニトリルヒドラターゼの活性の発現に必要な領域と共に挿入することにより、本開示に係る発現ベクターを構築する方法や、該発現ベクターを所望の宿主細胞に形質転換する方法、さらには該形質転換体内でニトリルヒドラターゼを産生させる方法等については、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）等に記載されている分子生物学、生物工学、及び遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法や宿主細胞を採用することができる。
【０１１６】
上述した発現ベクターを所望の宿主細胞に形質転換して得られた形質転換体は、培地で培養することにより、前記発現ベクターが含むニトリルヒドラターゼ遺伝子に基づく変異型ニトリルヒドラターゼを生産することができる。宿主細胞が大腸菌の場合、前記形質転換体を培養する培地としてＬＢ培地やＭ９培地などが一般的に用いられるが、より好ましくはそのような培地に成分としてＦｅイオン及びＣｏイオンを０．１μｇ／ｍＬ以上含ませた培地である。前記形質転換体を培地に植菌した後、適当な培養温度（一般的には、２０℃〜５０℃）で生育させればよい。
【０１１７】
前記変異型ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を発現させて所望の酵素活性を有する変異型ニトリルヒドラターゼを生産する場合、ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質をコードする遺伝子も共に発現させてもよい。
【０１１８】
このニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質とは、該タンパク質の発現の有無が、ニトリルヒドラターゼの活性化を直接左右する性質を有しているタンパク質の事であり、特開平１１−２５３１６８号公報に記載されるシュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼ活性化に関与するタンパク質（ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質）をその代表例として挙げる事が出来る。前記ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質の配列は配列番号７５に示される。
【０１１９】
＜核酸＞
本開示に係る核酸は、前記変異型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する。
前記変異型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を合成する方法として、対応する野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列に変異点を導入する方法や、変異点を含む全ヌクレオチド配列を化学的に合成する方法などが挙げられる。野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列を鋳型として、遺伝子に変異を生じさせる方法としては、例えば、部位特異的変異法（Ｋｒａｍｅｒ，
Ｗ． ａｎｄ ｆｒｉｔａ，Ｈ．Ｊ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖ
ｏｌ．１５４，Ｐ．３５０（１９８７））、リコンビナントＰＣＲ法（ＰＣＲ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特定の部分のＤＮＡを化学
合成する方法、遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法、遺伝子を保有する菌株を紫外線照射する方法、ニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法、市販の突然変異導入キットを使用する方法などが挙げられる。本開示に係る核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【０１２０】
＜ベクター＞
本開示に係るベクターは、前記変異型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列で示される核酸を含むベクターであれば特に限定されず、公知のベクターに前記変異型ニトリルヒドラターゼを導入したものが例として挙げられる。また、前記ベクターはファージベクターであってもプラスミドベクターであってもかまわない。
【０１２１】
＜発現ベクター＞
本開示に係る発現ベクターは、前記変異型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列で示される核酸を含む発現ベクターであれば特に限定されるものではないが、形質転換効率や翻訳効率を向上させるなどの観点より、以下に示すような構成を示すプラスミドベクターやファージベクターであることがより好ましい。
【０１２２】
〔発現ベクターの基本構成〕
発現ベクターは、前記変異型ニトリルヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列を含み、前記宿主細胞を形質転換しうるものであれば特に限定されない。必要に応じて、該ヌクレオチド配列の他に、他の領域を構成するヌクレオチド配列（以下、単に「他の領域」とも言う。）を含んでいてもよい。  他の領域としては、例えば、前記形質転換体が、前記変異型ニトリルヒドラターゼを産生するために必要とする制御領域や、自律複製に必要な領域などが挙げられる。
また、前記形質転換体の選択を容易にするという観点より、選択マーカーとなりうる選択遺伝子をコードするヌクレオチド配列をさらに含んでいてもよい。
前記変異型ニトリルヒドラターゼを産生するために必要となる制御領域としては、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む。）、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）、転写終結配列等を挙げることができる。
【０１２３】
〔酵母を宿主細胞とした場合の発現ベクター〕
酵母を宿主細胞とした場合、発現ベクターとしては、前記変異型ニトリルヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列の他に、プロモーター配列を含んでいることが好ましい。プロモーター配列としては、酵母を宿主細胞とする形質転換体中で前記変異型ニトリルヒドラターゼを発現できるものであればいずれを用いてもよい。
【０１２４】
例えばアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター、ペプチド鎖伸長因子（ＴＥＦ）プロモーター、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーター、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）プロモーター、メタロチオネイン（ＣＵＰ１）プロモーター、抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）プロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターなどのプロモーター配列が用いられる。
なお、上記プロモーター配列の由来は宿主細胞となる酵母に限定されない。
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどのように、外来のプロモーターを用いてもよい。これらは用いる酵素の由来や種類によって適宜選択することができる。
【０１２５】
また、前記発現ベクターは、分泌シグナルを含んでいてもよい。これにより、形質転換
体が前記変異型ニトリルヒドラターゼを産生した場合、細胞外に前記変異型ニトリルヒドラターゼを分泌することが可能となる。
分泌シグナルとしては、宿主細胞となる酵母から前記変異型ニトリルヒドラターゼを分泌できるものであれば、特に限定されない。分泌効率の観点より、αファクターシグナル配列、インベルターゼシグナル配列、酸ホスファターシグナル配列、グルコアミラーゼシグナル配列などを用いることが好ましい。
【０１２６】
以上のようなプロモーター配列や分泌シグナルを含む発現ベクターとしては、具体的にはｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ＹＥｐｌａｃ１９５等が挙げられる。
【０１２７】
〔糸状菌を宿主細胞とした場合の発現ベクター〕
糸状菌を宿主細胞とした場合、発現ベクターとしては、前記変異型ニトリルヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列の他に、プロモーター配列を含んでいることが好ましい。プロモーター配列としては、糸状菌を宿主細胞とする形質転換体中で前記変異型ニトリルヒドラターゼを発現できるものであればいずれを用いてもよい。
【０１２８】
糸状菌に対して適切な発現ベクターは、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．
Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｉｎ：Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ，  Ｌ．Ｌ．（ｅｄｓ．）Ｍｏｒｅ  ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ
Ｆｕｎｇｉ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３９６−４２８に記載されている。
また、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１００、ｐＳＬ１１８０（ファルマシア・インク社製）、ｐＦＢ６及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ｐＲＡＸ、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ｐＴＥＸ等のような一般的に用いられる他の発現ベクターを用いることもできる。
【０１２９】
〔原核生物を宿主細胞とした場合の発現ベクター〕
大腸菌、枯草菌、放線菌などの原核生物を宿主細胞とする場合、発現ベクターは、前記変異型ニトリルヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列の他に、プロモーター配列を含んでいることが好ましい。また、プロモーター配列の他にリボゾーム結合配列や転写終結配列等を含んでいてもよい。
【０１３０】
プロモーター配列の例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター、ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）、アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）、中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）、α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。
また、ｔａｃプロモーターのように独自に改変又は設計されたプロモーター配列も利用できる。
【０１３１】
リボゾーム結合配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主細胞内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。
前記リボゾーム結合配列としては、例えば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列のうち、４ヌクレオチド以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成した配列などが挙げられる。
転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。
これら制御領域の発現ベクター上での配列順序は、特に制限されるものではないが、転写効率を考慮すると５’末端側上流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、目的蛋
白質をコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。
【０１３２】
ここでいう発現ベクターの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を含んでいるｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を含んでいるｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等を発現ベクターとして利用することができる。
また、２種類以上の宿主内での自律複製が可能な発現ベクターの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７等を発現ベクターとして利用することができる。
【０１３３】
〔形質転換体の作製方法〕
本開示に係る形質転換体は、公知の方法により作製することができる。例えば、本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列と、必要に応じて前記他の領域とを含む前記発現ベクターを構築し、該発現ベクターを所望の宿主細胞に形質転換する方法等が挙げられる。具体的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，（２００１）等に記載されている分子生物学、生物工学及び遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法を利用することができる。
【０１３４】
本開示に係る形質転換体は、前記宿主細胞に前記発現ベクターを組み込むだけではなく、必要に応じて前記宿主細胞での使用頻度の低いコドンを、使用頻度の高いコドンにするように、サイレント変異を導入すること等を併せて行い作製することもできる。
これにより、発現ベクターに組み込んだ前記変異型ニトリルヒドラターゼ由来のタンパク質の生産量を増加させることができる可能性がある。
【０１３５】
サイレント変異の導入に関し、宿主細胞でのコドン使用頻度に合わせて発現ベクター上にある該ニトリルヒドラターゼ遺伝子および該ニトリルヒドラターゼ遺伝子を細胞外に分泌させるためのシグナル配列のコドンを調整する方法であれば、サイレント変異導入の手法、変異点、変更するヌクレオチドの種類等は特に制限されない。
【０１３６】
＜変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法＞
本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法は、前記形質転換体を培地中で培養すること、及び培養された形質転換体及び培地のうち少なくとも一方から、前記変異型ニトリルヒドラターゼを回収することを含む。
〔形質転換体の培養方法〕
前記発現ベクターで形質転換して得られた形質転換体の培養の条件は、形質転換前の宿主細胞の培養条件と同様であり、公知の条件を用いることができる。
培地としては炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば合成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。培地に使用する成分としては、公知のものを用いることができる。例えば、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ＮＺアミン及びジャガイモ等の有機栄養源、グルコース、マルトース、しょ糖、デンプン及び有機酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素及び塩化アンモニウム等の窒素源、リン酸塩、マグネシウム、カリウム及び鉄等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わせて使用できる。
なお、前記選択マーカーを含む発現ベクターにより形質転換した形質転換体の培養においては、例えば、前記選択マーカーが薬剤耐性である場合には、それに対応する薬剤を含む培地を使用し、前記選択マーカーが栄養要求性である場合には、それに対応する栄養素を含まない培地を使用する。培地のｐＨは、ｐＨ４〜ｐＨ８の範囲で選べばよい。
培養は前記培地を含有する液体培地中で、前記形質転換体を振とう培養、通気攪拌培養
、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行なうことができる。
培養条件は、前記形質転換体、培地、培養方法の種類により適宜選択すればよく、形質転換体が生育し、本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼを産生できる条件であれば特に制限はない。
培養温度は２０℃〜４５℃、好ましくは２４℃〜３７℃で好気的に培養を行う。
培養期間は１日間〜７日間の範囲で目的の変異型ニトリルヒドラターゼ活性を有する蛋白質の含量が最大になるまで培養すればよい。
【０１３７】
変異型ニトリルヒドラターゼ回収工程
変異型ニトリルヒドラターゼ回収工程は、培養された形質転換体及び培養後の培地のうち少なくともいずれか一方から、前記変異型ニトリルヒドラターゼを回収する工程である。
【０１３８】
形質転換した形質転換体を培養した後、本開示に係る前記変異型ニトリルヒドラターゼを回収する方法は、この分野で慣用されている方法を使用することができる。
本開示に係る前記変異型ニトリルヒドラターゼが形質転換した形質転換体外に分泌される場合は、該形質転換体の培養物を遠心分離、ろ過等を行うことで粗酵素液を容易に得ることができる。また、本開示に係る前記変異型ニトリルヒドラターゼが形質転換した形質転換体内に蓄積される場合は、培養した該形質転換体を遠心分離等の手段により回収し、回収した該形質転換体を緩衝液に懸濁し、リゾチーム処理、凍結融解、超音波破砕などの公知の方法に従い該形質転換体の細胞膜を破壊することにより、粗酵素液を回収すればよい。
【０１３９】
前記粗酵素液を、限外ろ過法などにより濃縮し、防腐剤などを加えて濃縮酵素として利用することが可能である。また、濃縮した後、スプレードライ法などによって前記変異型ニトリルヒドラターゼの粉末酵素を得ることもできる。
回収されたニトリルヒドラターゼ活性を有する粗酵素液について、分離精製を必要とする場合は、例えば、硫酸アンモニウムなどによる塩析、アルコールなどによる有機溶媒沈殿法、透析及び限外ろ過などによる膜分離法、あるいはイオン交換体クロマトグラフィー、逆相高速クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの公知のクロマト分離法を適宜組み合わせて行うことができる。
【０１４０】
本開示に係るアミド化合物の製造方法は、前記変異型ニトリルヒドラターゼをニトリル化合物に接触させることを含む。前記変異型ニトリルヒドラターゼは、ニトリル化合物からアミド化合物を合成する反応を触媒する。アミド化合物の製造方法を、以下により具体的に説明する。
【０１４１】
まず、前記変異型ニトリルヒドラターゼを産生する形質転換体や細胞株を培養し、得られる培養液、細胞または細胞処理物を媒体中にてニトリル化合物と接触させる。これにより前記変異型ニトリルヒドラターゼはニトリル化合物と接触し、前記変異型ニトリルヒドラターゼは、ニトリル化合物を対応するアミド化合物へと変換する。ここでいう細胞処理物とは、該形質転換体からの抽出物や磨砕物、これらの抽出物や磨砕物のニトリルヒドラターゼ活性画分を分離して得られる粗酵素調製物や更に精製して得られる酵素精製物などの後分離物、該形質転換体や該形質転換体の抽出物、磨砕物または後分離物を適当な手段を用いて固定化した固定化物の事を示している。
上述した接触させる温度は、好ましくは、前記変異型ニトリルヒドラターゼが失活しない温度範囲内であり、より好ましくは、０℃〜６０℃、より好ましくは１５℃〜３５℃である。例えば、前記変異型ニトリルヒドラターゼを産生する形質転換体や細胞株を培養した培養液を、ニトリル化合物を含む水溶液中にそのまま添加してもよく、あるいは培養液を遠心処理して菌体を分離し、菌体をニトリル化合物を含む水溶液に添加してもよい。反
応時における水溶液のｐＨは７〜９であることが好ましく、７．５〜８．５であることがより好ましい。ニトリル化合物は水溶液中に、例えば０．２５体積％〜２０．０体積％、より好ましくは２．０体積％〜５．０体積％の濃度で存在してもよい。形質転換体の培養についての詳細は、変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法の項で述べたとおりである。
【０１４２】
上述したニトリル化合物の具体例としては、前記変異型ニトリルヒドラターゼが基質として作用できる化合物であれば特に限定されないが、好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリル、クロトノニトリル、α−ヒドロキシイソブチロニトリル等といった炭素数２〜４のニトリル化合物がその代表例として挙げられる。ニトリル化合物中のニトリル基が水和によりアミド基に変換されるため、例えば、アクリロニトリルはアクリルアミドに変換できる。
【０１４３】
次に、前記変異型ニトリルヒドラターゼを失活させることなく、媒体中に活性炭を添加することにより、前記変異型ニトリルヒドラターゼを触媒として用いたニトリル化合物からアミド化合物の合成反応を終了させずに、生成したアミド化合物を精製する。
【０１４４】
なお、前記変異型ニトリルヒドラターゼとの接触によりニトリル化合物からアミド化合物を製造する反応は、ニトリルヒドラターゼの至適ｐＨに合わせて、例えばｐＨ７〜９といった中性〜塩基性の条件で行う。ｐＨは例えばアンモニアや水酸化ナトリウムといった塩基性物質を緩衝液中で必要に応じて用いることで調節できる。一方、アミド化合物の精製は、例えばｐＨ３．５〜６．５といった酸性条件下で行うことが好ましい。これはアミド化合物含有液中に含まれる不純物、特に蛋白質を、効率的に除去するためである。酸性ｐＨへの変更は、酢酸、プロピオン酸、オクタン酸、吉草酸、塩酸、アクリル酸、メタクリル酸等の酸を用いることで行うことができる。このように、前記アミド化合物の製造方法は、ｐＨ３．５〜６．５の条件で、生成したアミド化合物を含む溶液から不純物を除去する精製工程を含むことが好ましい。この工程では不純物の除去のために活性炭を用いることが好ましい。つまり、一実施形態においては、本開示に係るアミド化合物の製造方法は、さらに、アミド化合物を活性炭により精製することを含む。このため、前記変異型ニトリルヒドラターゼは、好ましくはｐＨ３．５〜６．５の条件において、前記（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸残基置換のうちの少なくとも１つを導入する前よりも向上した酵素活性を有することが好ましい。前記ｐＨ条件は、不要な蛋白質のより効率的な除去のために５．０以下のｐＨで行ってもよい。
【０１４５】
上記のとおり、本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼは、その向上したｐＨ安定性により、ニトリル化合物からアミド化合物を製造するプロセス全体を通じての高い変換効率を達成することが可能である。以上、実施形態について述べたが、これらは例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【実施例】
【０１４６】
以下の実施例により実施形態を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によって何等限定されるものではない。なお、以下の実施例において「変異箇所」とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有する野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼとのアミノ酸配列上の差異の位置を指す。【０１４７】
［比較例１］野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼの取得（１）
３０ｍＬの試験管に１０ｍＬのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃における２０分間のオートクレーブにより該液体培地を滅菌した。この液体培地に対し、終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるようにアンピシリンを添加した後、上記の細胞株ＭＴ−１０８２２を一白金耳植菌し、３７℃で３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。その後、得られた培養液１ｍＬを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により該菌体を分離した。
続いてアルカリＳＤＳ抽出法により、分離して得られた菌体よりプラスミドｐＰＴ−ＤＢ１を調製した。調製したプラスミドを大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、形質転換体（１）を得た。形質転換体（１）は、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼであるニトリルヒドラターゼ（１）を産生する。【０１４８】
［比較例２］変異型ニトリルヒドラターゼの取得（２）
表１４で示すような野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのＮ末端から９２番目のアミノ酸残基であるＡｓｐをＧｌｕに置換した変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（２）を取得するために、宝酒造社製の「ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ」（以後、変異導入キットと呼ぶ）を用いた部位特異的な変異導入を行った。野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼ発現プラスミドｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列番号５のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成は変異導入キットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。
ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列番号１４に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列番号１３に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成は変異導入キットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。【０１４９】
ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（宝酒造社製）を用いてそれぞれのＰＣＲ反応終了液より過剰なプライマー及びｄＮＴＰを除去した後、ＴＥを加えて各々５０μＬの溶液を調製した。該ＴＥ溶液を各０．５μＬずつ含む全量４７．５μＬのアニーリング溶液（組成は変異導入キットに記載の条件による）を調製し、熱変性処理（９８℃）を１０分間行った後、３７℃まで６０分間かけて一定の速度で冷却を行い、続いて３７℃で１５分間保持することによってアニーリング処理を行った。
アニーリング処理液にＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑを０．５μＬ加えて７２℃で３分間加熱処理を行い、ヘテロ２本鎖を完成させた。
これにＭ１３プライマーＭ４（配列番号１２に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列番号１３に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ加えて全量を５０μＬとした後、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことによるＰＣＲ反応Ｎｏ．３を行った。【０１５０】
ＰＣＲ反応Ｎｏ．３の反応終了液５μＬを用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．８重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約２ｋｂの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
続いて、アガロースゲルから約２ＫｂのＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍＬのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。
この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。
精製した約２ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより切断した後、この制限酵素処理液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。
同様に、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによりニトリルヒドラターゼ発現プラスミドｐＰＴ−ＤＢ１を切断し、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約２．７ＫｂのＤＮＡ断片のみを切り出した。
切りだしたアガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍＬのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。
この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。
この様にして得られた約２ｋｂと約２．７ＫｂのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させた後、大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分のヌクレオチド配列を決定し、実施例１記載のプラスミドｐＰＴ−ＤＢ１に、αサブユニットのＮ末端から９２番目のアミノ酸残基であるＡｓｐをＧｌｕとする変異を有していることを確認した。形質転換体（２）は、表１４に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（２）を産生する。【０１５１】
〈ｐＨ安定性の比較〉
こうして得られた形質転換体（２）、及び、そのベースとなったｐＰＴ−ＤＢ１を含む形質転換体（１）を用いたアミド化合物の製造におけるｐＨ安定性を以下の方法により比較した。これによりニトリルヒドラターゼ（２）のニトリルヒドラターゼ（１）と比較した相対的なｐＨ安定性が評価できる。
試験管に４０μｇ／ｍＬの硫酸第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍＬの塩化コバルト・二水和物を含む５ｍＬのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃における２０分間のオートクレーブにより滅菌した。
この培地に終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるようにアンピシリンを添加した後、各形質転換体を一白金耳植菌し、３７℃において２００ｒｐｍにて約２０時間其々培養した。
該培養終了液４０μｌを取り、７４０μＬの５４ｍＭトリス塩酸水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、これに２０μＬのアクリロニトリルを添加して２０℃で緩やかに攪拌しながら１５分から６０分間反応させた。反応終了後、ＨＰＬＣを用いて反応液の分析を行い、ニトリル化合物からアミド化合物を生成する酵素活性を求めた。反応及び分析は各形質転換体に対し３回以上行い、分注操作等でのデータのばらつきを補正した。
同様に、前記培養終了液１０００μｌを取り、遠心分離し回収した菌体に５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）１０００μｌを加え、撹拌しながら３０℃、３０ｈｒ処理した（酸処理）。処理後、７８０μｌを遠心分離し菌体を回収し、７８０μＬの５４ｍＭトリス塩酸水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、これに２０μＬのアクリロニトリルを添加して２０℃で緩やかに攪拌しながら１５分から６０分間反応させた。反応終了後、ＨＰＬＣを用いて反応液の分析を行い、ニトリル化合物からアミド化合物を生成する酵素活性を求めた。反応及び分析は各形質転換体に対し３回以上行い、分注操作等でのデータのばらつきを補正した。【０１５２】
〈分析条件〉
分析機器：  日本分光ＨＰＬＣ
カラム  ：  ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  （１５０×６．００  ｍｍ）
分析温度：  ４０℃
移動相  ：  ３％  アセトニトリル、１０ｍＭ  リン酸
５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）で処理した菌体の活性と処理無しの菌体の酵素活性の比を取りｐＨ安定性とした。形質転換体（２）のｐＨ安定性は野生型（１）と比較し０．８２倍であった。【０１５３】
上記の結果は、ニトリルヒドラターゼの至適条件下で反応初速度を上昇させると考えられている変異であっても（国際公開第２０１０／０５５６６６号参照）、ｐＨ安定性の向上は必ずしももたらされないことを示している。【０１５４】
［実施例１］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（３）
表１４で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（３）を取得するために、配列番号５のプライマーに代えて配列番号７のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にしてプラスミドを得て、形質転換体（３）を得た。形質転換体（３）は、表１４に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（３）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（３）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１４に示す。【０１５５】
［実施例２］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（４）
表１４で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（４）を取得するために、配列番号５のプライマーに代えて配列番号８のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にしてプラスミドを得て、形質転換体（４）を得た。形質転換体（４）は、表１４に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（４）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（４）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１４に示す。【０１５６】
［実施例３］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（５）
表１４で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（５）を取得するために、配列番号５のプライマーに代えて配列番号９のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にしてプラスミドを得て、形質転換体（５）を得た。形質転換体（５）は、表１４に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（５）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（５）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１４に示す。【０１５７】
［実施例４］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（６）
表１４で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（６）を取得するために、配列番号５のプライマーに代えて配列番号１０のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にしてプラスミドを得て、形質転換体（６）を得た。形質転換体（６）は、表１４に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（６）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（６）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１４に示す。【０１５８】
［実施例５］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（７）
表１４で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（７）を取得するために、配列番号５のプライマーに代えて配列番号１１のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にしてプラスミドを得て、形質転換体（７）を得た。形質転換体（７）は、表１４に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（７）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（７）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１４に示す。【０１５９】
【表１４】
0006757422.tif 000015
【０１６０】
表１４に示された結果から、アミノ酸残基置換群Ａに属する各アミノ酸残基置換は、単独で、ニトリルヒドラターゼのｐＨ安定性の向上をもたらすことが分かる。一方、アミノ酸残基置換群Ａに属しない、αサブユニットにおけるＮ末端から９２番目のＡｓｐ残基のＧｌｕへの置換は、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼと比較してのｐＨ安定性の向上をもたらさなかった。【０１６１】
［実施例６］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（８）
表１５で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（８）を取得するために、実施例１のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号６のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にして形質転換体（８）を得た。形質転換体（８）は、表１５に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（８）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（８）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１５に示す。【０１６２】
［実施例７］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（９）
表１５で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（９）を取得するために、実施例２のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号６のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にして形質転換体（９）を得た。形質転換体（９）は、表１５に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（９）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（９）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１５に示す。【０１６３】
［実施例８］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（１０）
表１５で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（１０）を取得するために、実施例３のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号６のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にして形質転換体（１０）を得た。形質転換体（１０）は、表１５に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（１０）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（１０）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１５に示す。【０１６４】
［実施例９］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（１１）
表１５で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する
形質転換体（１１）を取得するために、実施例４のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号６のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にして形質転換体（１１）を得た。形質転換体（１１）は、表１５に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（１１）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（１１）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１５に示す。【０１６５】
［実施例１０］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（１２）
表１５で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（１２）を取得するために、実施例５のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号６のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にして形質転換体（１２）を得た。形質転換体（１２）は、表１５に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（１２）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（１２）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１５に示す。【０１６６】
［実施例１１］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（１３）
表１５で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（１３）を取得するために、実施例１のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号８のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にして形質転換体（１３）を得た。形質転換体（１３）は、表１５に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（１３）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（１３）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１５に示す。【０１６７】
［実施例１２］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（１４）
表１５で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（１４）を取得するために、実施例１のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号９のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にして形質転換体（１４）を得た。形質転換体（１４）は、表１５に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（１４）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（１４）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１５に示す。【０１６８】
［実施例１３］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（１５）
表１５で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（１５）を取得するために、実施例２のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号９のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にして形質転換体（１５）を得た。形質転換体（１５）は、表１５に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（１５）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（１５）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１５に示す。【０１６９】
［実施例１４］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（１６）
表１５で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（１６）を取得するために、実施例２のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号１０のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にして形質転換体（１６）を得た。形質転換体（１６）は、表１５に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（１６）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（１６）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方
法で評価した。得られた結果を表１５に示す。【０１７０】
［実施例１５］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（１７）
表１５で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（１７）を取得するために、実施例２のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号１１のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にして形質転換体（１７）を得た。形質転換体（１７）は、表１５に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（１７）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（１７）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１５に示す。【０１７１】
［実施例１６］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（１８）
表１５で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（１８）を取得するために、比較例１のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号１５のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にして形質転換体（１８）を得た。形質転換体（１８）は、表１５に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（１８）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（１８）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１５に示す。【０１７２】
［実施例１７］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（１９）
表１５で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（１９）を取得するために、実施例３のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号１１のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にして形質転換体（１９）を得た。形質転換体（１９）は、表１５に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（１９）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（１９）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１５に示す。【０１７３】
［実施例１８］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（２０）
表１５で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（２０）を取得するために、実施例４のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号１１のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にして形質転換体（２０）を得た。形質転換体（２０）は、表１５に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（２０）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（２０）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１５に示す。【０１７４】
【表１５】
0006757422.tif 000016
【０１７５】
表１５に示された結果から、アミノ酸残基置換群Ａに属する各アミノ酸残基置換は、互いに組み合わせても、ニトリルヒドラターゼのｐＨ安定性の向上をもたらすことが分かる。また、アミノ酸残基置換群Ａに属するアミノ酸残基置換を互いに組み合わせた場合、あるいはアミノ酸残基置換（ｆ）と組み合わせた場合には、そのｐＨ安定性がより向上する傾向があることが分かる。【０１７６】
［実施例１９］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（２１）
表１６で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（２１）を取得するために、実施例７のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号９のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にして形質転換体（２１）を得た。形質転換体（２１）は、表１６に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（２１）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（２１）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１６に示す。【０１７７】
［実施例２０］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（２２）
表１６で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（２２）を取得するために、実施例１１のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号９のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にして、形質転換体（２２）を得た。形質転換体（２２）は、表１６に記載の変異を有す
るニトリルヒドラターゼ（２２）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（２２）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１６に示す。【０１７８】
［実施例２１］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（２３）
表１６で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（２３）を取得するために、実施例７のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号１１のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にして、形質転換体（２３）を得た。形質転換体（２３）は、表１６に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（２３）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（２３）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１６に示す。【０１７９】
【表１６】
0006757422.tif 000017
【０１８０】
表１６に示された結果から、アミノ酸残基置換群Ａに属する各アミノ酸残基置換は、２つ以上組み合わせても、またさらにアミノ酸残基置換（ｆ）と組み合わせても、ニトリルヒドラターゼのｐＨ安定性の向上をもたらすことが分かる。また、安定化の程度は組み合わせにより向上する傾向があることが分かる。【０１８１】
［実施例２２］  変異型ニトリルヒドラターゼの取得（２４）
表１７で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（２４）を取得するために、実施例７のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号１５のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にして形質転換体（２４）を得た。形質転換体（２４）は、表１７に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（２４）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（２４）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１７に示す。【０１８２】
【表１７】
0006757422.tif 000018
【０１８３】
表１７に示された結果から、アミノ酸残基置換群Ａに属する各アミノ酸残基置換は、３
つ以上組み合わせても、ニトリルヒドラターゼのｐＨ安定性の向上をもたらすことが分かる。また、その向上の程度は一段と高い傾向がある。【０１８４】
［実施例２３］  変異型ニトリルヒドラターゼの反応初速度
野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼ及び表１８で示すアミノ酸残基置換を有するニトリルヒドラターゼの反応初速度を、「ｐＨ安定性の比較」に記載の酸処理前のアミド化合物生成の測定における反応初速度を測定することで調べた結果を表１８に示す。反応初速度の値は、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼにおける反応初速度の値に対する相対値で示す。【０１８５】
【表１８】
0006757422.tif 000019
【０１８６】
表１８に示された結果から、アミノ酸残基置換群Ａに属するアミノ酸残基置換は、ニトリルヒドラターゼの反応初速度の向上ももたらすことが分かる。【０１８７】
［比較例３］  ニトリルヒドラターゼ変異体の取得（２５）
表１９で示すようなアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を含むプラスミド（日本国特許第５５５１０８１号形質転換体番号９２参照）を用いて、比較例２に記載の形質転換と同様の方法によって形質転換体（２５）を得た。形質転換体（２５）は、表１９に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（２５）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（２５）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１９に示す。【０１８８】
［実施例２４］  ニトリルヒドラターゼ変異体の取得（２６）
表１９で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（２６）を取得するために、比較例３のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号８のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にしてプラスミドを得て、形質転換体（２６）を得た。形質転換体（２６）は、表１９に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（２６）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（２６）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表１９に示す。【０１８９】
【表１９】
0006757422.tif 000020
【０１９０】
表１９に示された結果から、アミノ酸残基置換群Ａに属するアミノ酸残基置換は、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのｐＨ安定性を向上させるだけではなく、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼからの改変アミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼのｐＨ安定性の向上ももたらすことが分かる。【０１９１】
［実施例２５］  ニトリルヒドラターゼ変異体の反応初速度
表２０で示すようなアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体の反応初速度を、「ｐＨ安定性の比較」に記載の酸処理前のアミド化合物生成の測定における反応初速度を測定することで調べた結果を表２０に示す。反応初速度の値は、ニトリルヒドラターゼ（２５）における反応初速度の値に対する相対値で示す。【０１９２】
【表２０】
0006757422.tif 000021
【０１９３】
表２０に示された結果から、アミノ酸残基置換群Ａに属するアミノ酸残基置換は、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼの反応初速度を向上させるだけではなく、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼからの改変アミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼの反応初速度の向上ももたらすことが分かる。【０１９４】
［比較例４］  ニトリルヒドラターゼ変異体の取得（２７）
表２１で示すようなアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を含むプラスミド（日本国特許第５５５１０８１号形質転換体番号１１４参照）を用いて、比較例２に記載の形質転換と同様の方法によって形質転換体（２７）を得た。形質転換体（２７）は、表２１に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（２７）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（２７）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表２１に示す。【０１９５】
［実施例２６］  ニトリルヒドラターゼ変異体の取得（２８）
表２１で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（２８）を取得するために、比較例４のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号８のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にしてプラスミドを得て、形質転換体（２８）を得た。形質転換体（２８）は、表２１に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（２８）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（２８）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表２１に示す。【０１９６】
【表２１】
0006757422.tif 000022
【０１９７】
表２１に示された結果から、アミノ酸残基置換群Ａに属するアミノ酸残基置換は、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのｐＨ安定性を向上させるだけではなく、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼからの改変アミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼのｐＨ安定性の向上ももたらすことが分かる。【０１９８】
［実施例２７］  ニトリルヒドラターゼ変異体の反応初速度
表２１で示すようなアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体の反応初速度を、「ｐＨ安定性の比較」に記載の酸処理前のアミド化合物生成の測定における反応初速度を測定することで調べた結果を表２２に示す。反応初速度の値は、ニトリルヒドラターゼ（２７）における反応初速度の値に対する相対値で示す。【０１９９】
【表２２】
0006757422.tif 000023
【０２００】
表２２に示された結果から、アミノ酸残基置換群Ａに属するアミノ酸残基置換は、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼの反応初速度を向上させるだけではなく、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼからの改変アミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼの反応初速度の向上ももたらすことが分かる。【０２０１】
［比較例５］  ニトリルヒドラターゼ変異体の取得（２９）
表２３で示すようなアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を含むプラスミド（特許第５５５１０８１号形質転換体番号３３参照）を用いて、比較例２に記載の形質転換と同様の方法によって形質転換体（２９）を得た。形質転換体（２９）は、表２３に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（２９）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（２９）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表２３に示す。【０２０２】
［実施例２８］  ニトリルヒドラターゼ変異体の取得（３０）
表２３で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体（３０）を取得するために、比較例５のプラスミドを鋳型として用い、配列番号５のプライマーに代えて配列番号８のプライマーを用いること以外は比較例２と同様にしてプラスミドを得て、形質転換体（３０）を得た。形質転換体（３０）は、表２３に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ（３０）を産生する。
ニトリルヒドラターゼ（３０）のｐＨ安定性を上記「ｐＨ安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表２３に示す。【０２０３】
【表２３】
0006757422.tif 000024
【０２０４】
表２３に示された結果から、アミノ酸残基置換群Ａに属するアミノ酸残基置換は、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのｐＨ安定性を向上させるだけではなく、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼからの改変アミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼのｐＨ安定性の向上ももたらすことが分かる。【０２０５】
［実施例２９］  ニトリルヒドラターゼ変異体の反応初速度
表２３で示すようなアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体の反応初速度を、「ｐＨ安定性の比較」に記載の酸処理前のアミド化合物生成の測定における反応初速度を測定することで調べた結果を表２４に示す。反応初速度の値は、ニトリルヒドラターゼ（２９）における反応初速度の値に対する相対値で示す。【０２０６】
【表２４】
0006757422.tif 000025
【０２０７】
表２４に示された結果から、アミノ酸残基置換群Ａに属するアミノ酸残基置換は、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼの反応初速度を向上させるだけではなく、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼからの改変アミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼの反応初速度の向上ももたらすことが分かる。【０２０８】
２０１６年１２月２８日に出願された日本国特許出願２０１６-２５６０５０号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【配列表】
0006757422000001.app