(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）： 
【化１】
0006749599.tif 000008
（式中、Ｒは独立に水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、または炭素数２〜６のアシル基であり、
Ｒ１およびＲ２はベンゼン環上の置換基であり、独立にハロゲン原子、または炭素数１〜５のアルキル基であり、
ｍおよびｎはそれぞれＲ１およびＲ２の数を表し、０〜３であり、
Ｒ３は独立に水素原子または炭素数１〜５のアルキル基である）
で表される化合物。
【請求項２】
前記ＲおよびＲ３が水素原子であり、ｍおよびｎが０である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
（Ａ）杜仲葉を水または水／アルコール混合溶媒で抽出して抽出液を得る工程、
（Ｂ）当該抽出液をアルコールで抽出して、水相とアルコール相を得る工程、ならびに
（Ｃ）前記水相を、順相クロマトグラフィー、次いで逆相クロマトグラフィーにより分離精製する工程、
を含む、請求項２に記載の化合物の製造方法。
【請求項４】
前記工程（Ｃ）が、
（Ｃ１）水／アセトニトリル混合溶媒を展開溶媒として用いた親水性相互作用クロマトグラフィーにより前記水相の分離を行い、水／アセトニトリル分画溶液を得る工程、
（Ｃ２）メタノール／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用いた逆相分配クロマトグラフィーにより前工程で得た溶液の分離を行い、メタノール／水／酢酸分画溶液を得る工程、
（Ｃ３）アセトニトリル／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用いた極性基内包型逆相分配クロマトグラフィーにより前工程で得た溶液の分離を行い、アセトニトリル／水／酢酸分画溶液を得る工程、
を含む、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記工程（Ｃ２）が、アセトニトリル／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用いた逆相分配クロマトグラフィーにより前記メタノール／水／酢酸分画溶液の分離を行い、アセトニトリル／水／酢酸分画溶液を得る工程をさらに含み、かつ
前記（Ｃ３）工程が、当該アセトニトリル／水／酢酸分画溶液を分離する工程である、
請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記杜仲葉が、生葉を乾燥しかつ粉末にして得た乾燥粉末または生葉を粉砕して得たスムージーである、請求項３〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記工程（Ｂ）におけるアルコールが、炭素数４〜１０のアルコールである、請求項３〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１または２に記載の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項９】
杜仲生葉を凍結乾燥によって乾燥粉末にする工程をさらに含み、前記工程（Ａ）において当該乾燥粉末を抽出に供する、請求項３に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリグナン系化合物に関し、より詳しくはガン幹細胞の生育阻害活性を有するリグナン系化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガン幹細胞は腫瘍組織に少量含まれる幹細胞の性質を持った細胞種である。ガン幹細胞は通常のガン細胞のように細胞分裂が盛んでなくほとんど休眠しているような状態であるため、盛んな細胞活性を標的とする既存の抗ガン剤は有効でない。ガン幹細胞は自己複製能と造腫瘍能があり、正常組織内に移入されると元の腫瘍組織と同様の腫瘍を形成するため、ガンの転移や再発の主要な原因となっている。しかしガン幹細胞の生育を阻害する有効な薬剤は開発されておらず、その開発はガン研究における重要な研究対象となっている。
【０００３】
従来、ガン幹細胞は腫瘍組織から取り出されて研究に用いられてきた。しかしガン幹細胞は腫瘍組織に微量しか含まれていないため、抗ガン細胞物質のスクリーニングなど大量のガン幹細胞を必要とする研究には不向きであった。このため共同発明者の横浜市立大学医学部梁明秀教授は、iPS技術を用いてガン幹細胞の性質を持つ培養細胞系（iCSCL-10A）を確立することに成功した。本培養細胞を用いることによって、ガン幹細胞の生育阻害活性の検定が可能となった。
【０００４】
トチュウ（杜仲、Eucommia ulmoides）は主に中国の四川・湖南省等に分布している自然の樹木である。杜仲葉は、現在では「杜仲茶」などの健康食品として多く食されているが、中国西部の民族学的調査によると「羌族」などの少数民族で古くから茶や粥として食されてきたことが明らかになっている。その最大摂取量に関して杜仲葉エキスで２０ｇ／日（葉重量に換算して約１００ｇ）との記述があり、この範囲での摂取量と安全性については問題のないことが示唆されている。また、現存種が一科一属一種（トチュウ科トチュウ属トチュウ種）であため、種内変異の幅が小さく含有成分の質的量的偏りが少ないことから、遺伝学的観点からも安定した素材である。
【０００５】
杜仲葉はイリドイドやポリフェノールを含むことが知られており（例えば特許文献１〜３）、さらに杜仲葉から分離されたイリドイド、フェニルプロパノイド、フラボノイドを含むいくつかのタイプの二次代謝産物が特定の対生物作用を示すことが現在までの研究で明らかとなっている（例えば非特許文献１〜４等）。pinoresinol di-O-β-d-glucopyranosideやgeniposidic acidは杜仲葉特有の化合物である。イリドイド類のgeniposidic acidは杜仲葉中の含有量も高く、これが体内に吸収されると副交感神経に働きかけ末梢血管の周りの筋肉を弛緩することで降圧作用をもたらすことが知られている。また、geniposidic acidは内臓脂肪の減少や体重増加の抑制に働きかけるアディポネクチンを増加させてコレステロール値の上昇を抑制するということも知られている。その他、杜仲葉由来の化学物質として、genipinとgeniposideは消炎剤、血栓阻害および抗腫瘍活性を示し、chlorogenic acidは抗菌性、抗酸化性および抗突然変異性を示し、baicalein、wogoninおよびoroxylin Aを含むフラボノイドは抗酸化力、抗炎症性、抗ウイルス性を示すことなどが報告されている。
【０００６】
この他、特許文献４にはリグナン類似構造を有する化合物としてフェノール性二量体化合物が開示されている。当該化合物はリパーゼ阻害作用を有するとされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４８４６８３８号
【特許文献２】特許第５０１４３２０号
【特許文献３】特許第５３２３００３号
【特許文献４】特開２０１２−１１６７５６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Isoguro et al., Studies on iridoid-related compounds. IV. Antitumor activity of iridoid aglycones. Chem. Pharm. Bull. 34: 2375-2379, 1986;
【非特許文献２】Ikemoto et al., Antitumor effects of Scutellariae radix and its components baicalein, baicalin, and wogonin on bladder cancer cell lines. Urology 55, 951-955, 2000;
【非特許文献３】Zhang et al., Studies on bioactivities of chlorogenic acid and its analogues. Chin. Tradit. Herbal Drags 32: 173-176, 2001
【非特許文献４】Tang et al., Simultaneous determination of ten bioactive constituents in Eucommia ulmoides leaves and Tochu tea products by high-performance liquid chromatography-diode array detector-mass spectrometry (HPLC-DAD-MS). J. Trad. Med., 25, 112-118, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述のとおり、ガン幹細胞の生育を阻害する有効な薬剤は未だ開発されておらず、その開発が必要とされている。かかる事情を鑑み、本発明はガン幹細胞の生育を阻害する活性を有する化合物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは後述の式（１）で表される化合物がガン幹細胞の生育を阻害する活性を有することを見出し、本発明を完成させた。前記課題は、以下の本発明により解決される。
［１］後述する一般式（１）で表される化合物。
［２］前記ＲおよびＲ３が水素原子であり、ｍおよびｎが０である、［１］に記載の化合物。
［３］（Ａ）杜仲葉を水または水／アルコール混合溶媒で抽出して抽出液を得る工程、
（Ｂ）当該抽出液をアルコールで抽出して、水相とアルコール相を得る工程、ならびに
（Ｃ）前記水相を、順相クロマトグラフィー、次いで逆相クロマトグラフィーにより分離精製する工程、を含む、［２］に記載の化合物の製造方法。
［４］前記工程（Ｃ）が、
（Ｃ１）水／アセトニトリル混合溶媒を展開溶媒として用いた親水性相互作用クロマトグラフィーにより前記水相の分離を行い、水／アセトニトリル分画溶液を得る工程、
（Ｃ２）メタノール／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用いた逆相分配クロマトグラフィーにより前工程で得た溶液の分離を行い、メタノール／水／酢酸分画溶液を得る工程、
（Ｃ３）アセトニトリル／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用いた極性基内包型逆相分配クロマトグラフィーにより前工程で得た溶液の分離を行い、アセトニトリル／水／酢酸分画溶液を得る工程、を含む、［３］に記載の製造方法。
［５］前記工程（Ｃ２）が、アセトニトリル／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用いた逆相分配クロマトグラフィーにより前記メタノール／水／酢酸分画溶液の分離を行い、アセトニトリル／水／酢酸分画溶液を得る工程をさらに含み、かつ
前記（Ｃ３）工程が、当該アセトニトリル／水／酢酸分画溶液を分離する工程である、［４］に記載の製造方法。
［６］前記杜仲葉が、生葉を乾燥しかつ粉末にして得た乾燥粉末または生葉を粉砕して得たスムージーである、［３］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］前記工程（Ｂ）におけるアルコールが、炭素数４〜１０のアルコールである、［３］〜［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］前記［１］または［２］に記載の化合物を含む、医薬組成物。
［９］杜仲生葉を凍結乾燥によって乾燥粉末にする工程をさらに含み、前記工程（Ａ）において当該乾燥粉末を抽出に供する［３］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によりガン幹細胞の生育を阻害する活性を有する化合物を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一態様の概要を示す概要図である。
【図２】図２Ａは実施例４の抗ガン活性試験結果（２Ｄ培養）を示す図であり、図２Ｂは比較例１の同試験結果を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは実施例５の抗ガン活性試験結果（３Ｄ培養）を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは比較例２の同試験結果を示す図である。
【図４】実施例５および比較例２における培地の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明において「〜」はその両端の値を含む。すなわち「Ｘ〜Ｙ」との記載はＸおよびＹを含むことを意味する。
【００１４】
１．化合物
本発明の化合物は式（１）で表される。当該化合物はクロロゲン酸が二重結合部位で二量化してシクロブタン環構造を形成しているリグナン系化合物である。
【００１５】
【化１】
0006749599.tif 000002
【００１６】
式中、Ｒは独立に水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、または炭素数２〜６のアシル基である。独立にとは、各Ｒが同一であってもよいし異なっていてもよいことを意味する。他の基についても同様である。本発明においてアルキル基は直鎖状および分岐状のアルキル基を含む。製造し易さの観点から、Ｒは水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、または炭素数２〜４のアシル基であることが好ましい。
【００１７】
Ｒ１およびＲ２はベンゼン環上の置換基であり、独立にハロゲン原子、炭素数１〜５のアルキル基、または炭素数２〜５のアルキレン基である。本発明においてアルキレン基は直鎖状および分岐状のアルキレン基を含む。ハロゲン原子としてはフッ素原子または塩素原子が、前記アルキル基としては炭素数１〜３のアルキル基が、前記アルキレン基としては炭素数２〜３のアルキレン基が好ましい。ｍおよびｎはそれぞれＲ１およびＲ２の数を表し、０〜３である。製造し易さの観点から、ｍおよびｎは０〜２が好ましく、０がより好ましい。
【００１８】
Ｒ３は独立に水素原子または炭素数１〜５のアルキル基である。製造し易さの観点から、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましい。
【００１９】
２．化合物の製造方法
本発明の化合物は、（Ａ）杜仲葉を水または水／アルコール混合溶媒で抽出して抽出液を得る工程、
（Ｂ）当該抽出液をアルコールで抽出して、水相とアルコール相を得る工程、ならびに
（Ｃ）前記水相を、順相クロマトグラフィー、次いで逆相クロマトグラフィーにより分離精製する工程、を含む方法で製造されることが好ましい。以下、各工程について説明する。
【００２０】
（１）工程Ａ
本工程では、杜仲葉を水または水／アルコール混合溶媒で抽出する。杜仲葉とは前述のとおりトチュウ科トチュウ属トチュウ種の植物の葉である。ここで使用するアルコールは、水に溶解して混合溶媒となるものであれば限定されないが、メタノールやエタノールが好ましい。アルコールの濃度は混合溶媒中５０〜８０重量％が好ましい。杜仲葉と水、または水／アルコール混合溶媒の重量比は１：２〜１：５程度が好ましい。水を用いる場合はその温度を７０〜１００℃程度とすることが好ましい。本工程では、水／アルコール混合溶媒で抽出した後の杜仲葉を、さらに前記温度の熱水で抽出してもよい。
【００２１】
杜仲葉としては加工を施していない生葉、生葉を乾燥した乾燥葉、または乾燥葉を粉末にした乾燥粉末を使用できる。乾燥粉末（以下「杜仲茶」ともいう）を使用すると、抽出効率を高めることができ、さらには自己消化による経時劣化を抑制できるので好ましい。乾燥葉とは、水分量が５重量％以下である葉をいう。乾燥葉の製造方法は、例えば特許第４３４０８１２号に開示されている。粉末とは、通常、杜仲茶として市販されている程度の大きさの粉をいう。
【００２２】
杜仲生葉は２０〜２６℃で発酵して有効成分を消失するので、杜仲生葉を２０℃未満の環境下で乾燥させることが好ましい。乾燥温度は、より好ましくは１０℃以下、さらに好ましくは３℃以下、よりさらに好ましくは０℃以下である。乾燥時の雰囲気の湿度は好ましくは６０％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１５％以下である。あるいは、２６℃を超える温度で杜仲生葉を乾燥させてもよい。この場合の温度は、好ましくは５０℃以上、より好ましくは６０℃以上、よりさらに好ましくは７０℃以上である。乾燥時の雰囲気の湿度は好ましくは６０％以下、より好ましくは２０％以下、よりさらに好ましくは１５％以下である。乾燥雰囲気を窒素存在下あるいは減圧下としてもよい。
【００２３】
この他、杜仲生葉を粉砕してスムージーにしてこれを凍結乾燥させる、あるいは杜仲生葉を凍結した後、粉砕し凍結乾燥してもよい。スムージーとは杜仲生葉を粉砕して得られるスラリー状物である。杜仲葉はグッタベルカで覆われた屈強の葉脈を持っており、葉の部分と葉脈では、乾燥の時間を大きく異にする。このグッタベルカのため、気流式の粉砕機を使用しても１５〜２０μｍの粉体しか得られない。このサイズは抹茶の粒径（１０〜２０μｍ）よりも大きい。しかし、杜仲生葉を凍結すると葉脈部分に多くの穴が生じて繊維を切断しやすくなる。よって、杜仲生葉を凍結乾燥することでより小さな粒径である６〜１０μｍの粉末を得ることができる。このような微粉末杜仲葉は、前記リグナン系化合物を効率よく抽出できるという点で有用である。
【００２４】
さらに、杜仲葉は前記リグナン系化合物の他に、抗癌作用に有効とされるフラボノイドなどのポリフェノール、ゲニポシドサンやアスペルロシドのイリドイド類、ポリフェノールの吸収に必要とされるビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、葉酸、食物繊維を含んでいる。前述のように杜仲生葉を乾燥すると、これらの成分の消失を低減することができる。
【００２５】
（２）工程Ｂ
本工程では、当該抽出液をアルコールで抽出して水相とアルコール相を得る。本工程で使用するアルコールは水相と分離するものであれば限定されない。すなわち、工程Ｂにおけるアルコールは工程Ａにおけるアルコールとは異なる。作業容易性等の観点から、炭素数が４〜１０のアルコールが好ましく、中でもブタノール、ペンタノール、またはヘキサノールが好ましい。これらのアルコールは直鎖状および分岐状のものも含む。抽出は、前記抽出液の量の２０〜５０体積％のアルコールを用いて複数回行ってもよい。本工程で得られる水相に目的化合物が存在する。
【００２６】
（３）工程Ｃ
本工程では、前工程で得た水相を順相クロマトグラフィー、次いで逆相クロマトグラフィーで分離精製する。順相クロマトグラフィーとは固定相の極性が移動相の極性より高いクロマトグラフィーである。逆相クロマトグラフィーとは移動相の極性が固定相の極性より高いクロマトグラフィーである。これらの分離精製は公知のカラムを使用して実施できる。以下に好ましい態様を説明する。
【００２７】
順相クロマトグラフィーによる分離精製として親水性相互作用クロマトグラフィーにより前記水相の分離を行う（工程Ｃ１）。水／アセトニトリル混合溶媒を展開溶媒として用いることが好ましい。本工程では固定担体としてシリカゲルを充填したカラム等の公知のカラムを使用できる。後述する実施例に示す方法等で各画分の活性を調べることでいずれの画分に目的化合物が含まれているかを特定できる。例えば固定担体としてシリカゲルを充填したカラムを用いた場合、アセトニトリル濃度が７０〜９０体積％の水／アセトニトリル混合溶媒での分画溶液を得ることが好ましい。
【００２８】
次いで、逆相クロマトグラフィーによる分離精製として、前工程Ｃ１で得た目的化合物を含む分画溶液を逆相分配クロマトグラフィーにより分離する（工程Ｃ２）。メタノール／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用いることが好ましい。本工程においては固定担体としてオクタデシルシリル基（ＯＤＳ）で表面が修飾されたシリカゲルを充填したカラム等の公知のカラムを使用できる。当該カラムを用いる場合、メタノール濃度が５〜２０体積％かつ酢酸濃度が０．０５〜０．２体積％のメタノール／水／酢酸混合溶媒での分画溶液を得ることが好ましい。
【００２９】
工程Ｃ２において、メタノール／水／酢酸混合溶媒での分画溶液をアセトニトリル／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用い、前記逆相分配クロマトグラフィーにより再度分離する工程を設けてもよい。再分離により、より高程度で目的化合物を単離することができる。この場合、アセトニトリル濃度が５〜２０体積％かつ酢酸濃度が０．０５〜０．２体積％の混合溶媒での分画溶液を得ることが好ましい。
【００３０】
逆相クロマトグラフィーによる分離精製として、前工程Ｃ２で得た目的化合物を含む分画溶液を極性基内包型逆相分配クロマトグラフィーにより分離する（工程Ｃ３）。アセトニトリル／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用いることが好ましい。本工程においては固定担体として極性基を介してオクタデシル基を化学結合させた極性基内包型のシリカゲルを充填したカラム等の公知のカラムを使用できる。当該カラムを用いる場合、アセトニトリル濃度および酢酸濃度が５〜２０体積％および０．０５〜０．２体積％のアセトニトリル／水／酢酸混合溶媒での分画溶液を得ることが好ましい。
【００３１】
前記工程で得た分画溶液中には精製された目的化合物が含まれており、この溶液から溶媒を除去することで目的化合物を単離できる。この場合に得られるのは式（１）において、ＲおよびＲ３が水素原子であり、ｍおよびｎが０である化合物（式（１ａ））である。Ｒ等を水素原子以外とする化合物は、式（１ａ）の化合物を公知の方法で修飾することで得ることができる。例えばＲがアセチル基である化合物は、式（１ａ）の化合物を無水酢酸でアセチル化すること等により得ることができる。
【００３２】
【化２】
0006749599.tif 000003
【００３３】
３．用途
本発明の化合物はガン幹細胞の生育を阻害する活性を有する。よって当該化合物は抗ガン活性を有する治療薬および医薬組成物として有用である。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。使用した分析機器は以下のとおりである。
（１）ＮＭＲ
1H-NMR (400 MHz)、13C-NMR (100 MHz)、2D-NMR：5mmのBBFOプローブを配置したAVANCE III FT-NMR spectrometer (Bruker BioSpin製)で記録した。
ケミカルシフト（δ）は溶媒シグナルを基準とした。結合定数（H-7、H-7’、H-8、H-8’）はiNMR version 5.4.4 (nucleomatica, Molfetta, Italy; http://  www.inmr.net)に基づくスピンシミュレーションにより決定した。
（２）比旋光度
ハロゲンランプおよび589nmフィルターを備えたP-2100ポーラメータ（日本分光株式会社製）を用いた。
（３）高分解能質量分析
JMS-BU25 (GCmate II) 質量分析計（日本電子株式会社製）を用いた。
【００３６】
［実施例１］式（１ａ）の化合物の製造
工程Ａ
杜仲葉の乾燥粉末（杜仲茶、有限会社碧山園製）を準備した。１２６ｇの杜仲茶を５００ｍＬの７０体積％メタノール水溶液で抽出して第一抽出液を得た。次いで、当該抽出操作を行った後の杜仲茶を５００ｍＬの熱水（１０５℃）で再度抽出して第二抽出液を得た。第一抽出液と第二抽出液を合わせて抽出液とした。当該抽出液を減圧下で濃縮した。
【００３７】
工程Ｂ
当該濃縮液に対して１／３の体積の１−ブタノールを用いて、当該濃縮液を３回抽出し、水相と１−ブタノール相を得た。水相の一部を取出し、適量のセライト（セライト５４５、純正化学株式会社製）を加えた後、乾燥濃縮した。取出した水相の量は、杜仲茶（乾燥粉末）にして１８．５ｇ相当量であり、全水相の量をＷ（ｇ）とするとき、Ｗ×１８．５／１２６である。
【００３８】
工程Ｃ１
親水性相互作用クロマトグラフィーを用いて濃縮した水相を分離した。カラムとして、アセトニトリル濃度が９０体積％の水／アセトニトリル混合溶媒で平衡させたＤＩＯＬ  ＭＢ１００−７５／２００（５００ｇ、富士シリシア化学株式会社製）を用いた。当該カラムに、アセトニトリル濃度が９０体積％の混合溶媒２，５００ｍＬおよびアセトニトリル濃度が８０体積％の混合溶媒２，５００ｍＬを通液し、それぞれ６２５ｍＬの溶出液を得た。同じ操作をもう一度繰返し（合計で２回行い）、それぞれの混合溶媒に関して杜仲茶（乾燥粉末）にして３７ｇ相当量の溶出液を得た。当該溶液の画分について活性をスクリーニングし、活性成分を含む第６画分および第７画分を得た。これはアセトニトリル濃度が８０体積％の混合溶媒の第２および第３分画溶液に該当する。
【００３９】
工程Ｃ２
前記の第６画分および第７画分を合わせて、逆相分配クロマトグラフィーを用いた分離工程に供した。カラムとしてＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８  ＨＰＬＣ（φ１４×１５０ｍｍ、５μｍ、ジーエルサイエンス株式会社製）を用いた。展開溶媒としてメタノール／水／酢酸混合溶媒を用い、０．１体積％酢酸水溶液からメタノールへの直線勾配溶出法を採用した（３ｍＬ／分で２０分）。溶出液は１分毎に採取した。４〜５分の分画溶液に活性が認められたので、前記カラムを用いて当該分画溶液を再度分離した。この際、展開溶媒としてアセトニトリル（１０体積％）／水／酢酸（０．１体積％）混合溶媒（３ｍＬ／分）を用いた。ＵＶ検出器で２５４ｎｍの吸収をモニタした。１５．５分付近の画分に活性が認められた。
【００４０】
工程Ｃ３
前記活性が認められた画分をさらに極性基内包型逆相分配クロマトグラフィーを用いた分離工程に供し精製した。カラムとしてＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−ＥＰ（φ６×２５０ｍｍ、５μｍ、ジーエルサイエンス株式会社製）を用いた。展開溶媒としてアセトニトリル（１０体積％）／水／酢酸（０．１体積％）混合溶媒（１ｍＬ／分）を用いた。本発明の化合物が１３．３分の画分に認められた。
【００４１】
前記画分から溶媒を除去することにより、精製された式（１ａ）で表される本発明の化合物を得た。当該化合物は無色でアモルファスであった。
【００４２】
分析結果は以下のとおりである。
ESI-MS m/z (rel. int.): 191 (88), 243 (21), 353 (13), 4 (2.5), 707 ([M-H]−, 100);
FAB-HRMS (negative) m/z ([M-H]− ): calcd. for C 32 H 35 O 18, 707.1824; found, 707.1781
NMR：表１
[α] 20D : -30.2 (c 0.136, MeOH)
【００４３】
【表１】
0006749599.tif 000004
【００４４】
［実施例２］式（１ａ）の化合物のアセチル化
３ｍｇの式（１ａ）で表される化合物、２００μＬのピリジン、および１００μＬの無水酢酸を混合して、室温で２晩反応させた。反応生成物を減圧下で濃縮し、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−ＥＰ（φ６×２５０ｍｍ、５μｍ、ジーエルサイエンス株式会社製）を用いた液体クロマトグラフィーにて精製した。０．１体積％酢酸水溶液からアセトニトリルへの直線勾配溶出法（２０分）を採用し、その後はアセトニトリルを通液した（１ｍＬ／分）。その結果、２０．０分に単一ピークが認められ、これが完全にアセチル化された式（１ｂ）で表される化合物であることを確認した。
【００４５】
【化３】
0006749599.tif 000005
【００４６】
分析結果は以下のとおりである。
1H-NMR：
【００４７】
【化４】
0006749599.tif 000006
【００４８】
［実施例３］式（１ａ）の化合物の製造
杜仲茶のかわりに杜仲葉の生葉５０ｇを用いた以外は同様にして実施例１を実施した。その結果、式（１ａ）の化合物を製造できたことを確認した。発明者らは最初に杜仲茶（乾燥粉末）から本願発明の化合物を製造することを見出したが、本例で示すように生葉からも本願発明の化合物を製造できることを確認した。
【００４９】
［実施例４］抗ガン特性（２Ｄ培養における評価）
本発明の化合物の抗ガン特性を、横浜市立大学梁明秀教授により作製された癌幹細胞モデルであるiCSCL-10A細胞の２つのクローンおよび乳癌細胞株であるMCF-7およびMDA-MB-231細胞を用いて、以下のように評価した。これらの細胞の詳細は、国際公開第２０１２／１６５２８７号、”Induction of cells with cancer stem cell properties from nontumorigenic human mammary epithelial cells by defined reprogramming factors.” Nishi M, Sakai Y, Akutsu H, Nagashima Y, Quinn G, Masui S, Kimura H, Perrem K, Umezawa A, Yamamoto N, Lee SW, Ryo A.Oncogene. 33(5):643-52, 2014、および”Induced cancer stem-like cells as a model for biological screening and discovery of agents targeting phenotypic traits of cancer stem cell”. Nishi M, Akutsu H , Kudoh A , Kimura H , Yamamoto N, Umezawa A , Lee SW, Ryo A. Oncotarget 5(18):8665-80, 2014に記載されている。
【００５０】
１）実施例１で得た化合物をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解して、０．５μＭ、１．０μＭ、５．０μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭの溶液を調製した。
２）iCSCL-10A細胞の２つのクローンについて、それぞれ４×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度の溶液を調製した。またMCF-7およびMDA-MB-231細胞についてそれぞれ２×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度の溶液を調製した。
３）前記細胞を含む溶液を９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種した。ウェル中の細胞濃度は、iCSCL-10Aでは４×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ、MCF-7およびMDA-MB-231では２×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌであった。
４）３７℃で２４時間インキュベートした後、１）で調製した実施例１で得た化合物を含む溶液を各ウェルに１０μＬずつ添加した。
５）その後、３７℃で２４時間インキュベートし、顕微鏡および細胞増殖アッセイキット（Cell Counting kit-8、株式会社同仁化学研究所製）を用いて細胞の増殖度合いを評価した。
６）コントロールとして実施例１で得た化合物の代わりに同量のＰＢＳを用いて同試験を行った。
７）結果を図２Ａに示す（コントロールの結果を１．０とし、これに対する比を縦軸にプロットした）。
【００５１】
［比較例１］
実施例１で得た化合物の代わりにクロロゲン酸を用いて実施例４と同じ試験を行った結果を示す。
【００５２】
【化５】
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【００５３】
図２に結果を示す。図２Ａから本発明の化合物は比較的低濃度においてもガン幹細胞に対して高い育成阻害活性を示すことが明らかである。また、本発明の化合物は比較的高濃度においては乳ガン細胞に対しても育成阻害活性を示すことも明らかである。一方、図２Ｂに示すとおり、クロロゲン酸ではこのような活性は認められなかった。
【００５４】
［実施例５］抗ガン特性（３Ｄスフェロイド培養における評価）
本発明の化合物の抗ガン特性を、癌幹細胞モデルであるiCSCL-10A細胞を用いて以下のように評価した。
１）実施例１で得た化合物をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解して、０．５μＭ、１．０μＭ、５．０μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭの溶液を調製した。
２）９６ウェルプレート（Ultra-Low Attachment Plat、コーニング社製）の各ウェルに、１００μＬのスフェロイド培地（DMEM/F12 (1:1)（ロンザ社製）、インシュリン（sigma aldrich社製）５μｇ／ｍＬ、ヒドロコルチゾン（sigma aldrich社製）０．５μＭ、ＥＧＦ（sigma aldrich社製）２０ｎｇ／ｍＬ、Ｂ−２７（登録商標、ライフテクノロジー社製）２％、ｐ／ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン、ライフテクノロジー社製）１％）を入れた。
３）１６０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度となるように各ウェルに前記細胞を播種した。
４）３７℃で４日間インキュベートした後、１）で調製した実施例１で得た化合物を含む溶液を各ウェルに１０μＬずつ添加した。
５）その後、３７℃で７２時間インキュベートし、細胞増殖アッセイキット（CellTiter-Glo TM  、プロメガ株式会社製）を用いて細胞の増殖度合いを評価した。
６）コントロールとして実施例１で得た化合物の代わりに同量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて同試験を行った。
７）結果を図３Ａに示す（コントロールの結果を１．０とし、これに対する比を縦軸にプロットした）。
【００５５】
［比較例２］
本発明の化合物の代わりにクロロゲン酸を用いて実施例５と同じ試験を行った結果を示す。
【００５６】
［参考例１］
杜仲生葉を凍結し、ミキサーを使用して葉の葉脈を切断し、スムージーを得た。このスムージーを−４０℃で予備乾燥し、−３０℃で４８時間乾燥し、乾燥粉末を得た。得られた粉末は粒径が６〜１０μｍであり、極めて粒子の細かい溶解性の良い杜仲葉粉末を得ることができた。
【００５７】
抗ガン特性試験の結果を図３に、７２時間インキュベート後の培地の写真を図４に示す。図３Ａから本発明の化合物は３Ｄスフェロイド培養においてもガン幹細胞に対して高い育成阻害活性を示すことが明らかである。一方、図３Ｂに示すとおり、クロロゲン酸ではこのような活性は認められなかった。３Ｄスフェロイド培養は単層の２Ｄ培養とは異なりその組織本来の機能を高く再現すると考えられる。よって、本発明の化合物はガン幹細胞の自己複製阻害効果を有することが明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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