(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己組み込み型ヒドロゲルであって、
水溶性高分子を含み、該水溶性高分子が、
酸素原子又は窒素原子を含む、少なくとも1個の官能基を有する繰り返し単位であって、少なくとも1つのグルコース単位又2つのβ(1→4)結合D-グルコース単位が含まれる繰り返し単位と、
前記繰り返し単位の前記少なくとも1個の官能基である酸素原子又は窒素原子に共有結合し、ウレイド-ピリミジノンを含むペンダント分子鎖と、
を含む前記自己組み込み型ヒドロゲル。
【請求項２】
前記ヒドロゲルがコア-シェル構造を有さない、請求項１に記載の自己組み込み型ヒドロゲル。
【請求項３】
前記水溶性高分子が修飾デキストランであり、前記繰り返し単位が、少なくとも1つのグルコース単位を含有する、請求項１に記載の自己組み込み型ヒドロゲル。
【請求項４】
前記水溶性高分子が修飾セルロースであり、前記繰り返し単位には、2つのβ(1→4)結合D-グルコース単位が含まれる、請求項１に記載の自己組み込み型ヒドロゲル。
【請求項５】
前記ペンダント分子鎖には、前記ウレイド-ピリミジノンを、前記繰り返し単位の前記少なくとも1個の官能基である酸素原子、硫黄原子又は窒素原子に結合させるイソシアネートが含まれる、請求項１に記載の自己組み込み型ヒドロゲル。
【請求項６】
前記ペンダント分子鎖には、前記ウレイド- ピリミジノンを、前記繰り返し単位の前記少なくとも1個の官能基である酸素原子、硫黄原子又は窒素原子に結合させる、活性化エステル、エポキシ基又は塩化アシル基が含まれる、請求項１に記載の自己組み込み型ヒドロゲル。
【請求項７】
前記ウレイド- ピリミジノンの置換密度が8.1以下である、請求項１に記載の自己組み込み型ヒドロゲル。
【請求項８】
水溶性高分子の主鎖に結合したヒドロキシル基又はアミン基に、ウレイド-ピリミジノン-イソシアネートをグラフト化させることによって、前記ウレイド-ピリミジノン-イソシアネートを含むペンダント分子鎖を形成することを含み、前記水溶性高分子はデキストラン又はセルロースから選ばれる、自己組み込み型ヒドロゲルの製造方法。
【請求項９】
イソシアネートを2-アミノ-4-ヒドロキシ-6-メチルピリミジンと反応させることによって、ウレイド-ピリミジノン-イソシアネートを形成することを、さらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
水溶性高分子を第1の溶媒中に溶解して、第1の溶液を形成することと、
前記ウレイド-ピリミジノン-イソシアネートを第2の溶媒中に溶解して、第2の溶液を形成することと、
前記第1の溶液の少なくとも一部を前記第2の溶液と混合して、混合物を形成することと、
撹拌下で前記混合物に触媒を加えることと、
前記混合物を所定の温度で所定の時間硬化させて、自己組み込み型ヒドロゲルを形成することと、
前記自己組み込み型ヒドロゲルを溶媒交換過程に暴露することと、
をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記水溶性高分子に対する前記ウレイド-ピリミジノン-イソシアネートの供給比を変更することによって、ウレイド-ピリミジノンの置換密度を制御すること、をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2015年4月2日に出願された米国仮出願第62/142,256号の利益を主張し、当該仮出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載(STATEMENT REGARDING FEDERALLY SPONSORED RESEARCH OR DEVELOPMENT)
本発明は、米国国立衛生研究所(NIH)及び米国国立歯科衛生研究所(the National Institute of Dental and Craniofacial Research) (NIDCR)によって契約された助成番号DE015384、DE017689及びDE022327、及び米国科学財団(NSF)によって契約された助成番号DMR-1206575、及び米国国防総省(DoD)によって契約された助成番号W81XWH-12-2-0008の下、政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を保有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
再生医療技術は、三次元(3D)テンプレートの役割を果たすことができる足場材料、及び／又はドラッグデリバリー機構の役割を果たすことができる薬物担体を利用することが多い。組織再生は、組織が喪失又は罹患した患者に対する潜在的な処置であり得る。しかしながら、2種類以上の組織からなる組織複合体の再生は、組織設計に課題を提示する。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の例の特徴は、次の詳細な説明及び図面を参照することによって明らかになり、同様の参照符号は、同一でない可能性があるが同様の構成要素に対応する。簡潔にするために、先述した機能を有する参照符号又は特徴は、これらが現れる他の図面に関して説明されていても、説明されていなくてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図1(a)は、ウレイド-ピリミジノンの四重水素結合、及びウレイド-ピリミジノンの解離と会合の概略図である。  図1(b)は、修飾水溶性高分子の例とそのずり減粘性及び自己回復特性の概略図である。
【図２】図2は、デキストラン-ウレイド-ピリミジノン(DEX-Upy)ヒドロゲルを形成する方法の例における合成ステップを示す。
【図３】図3は、ジメチルスルホキシド(DMSO)-d6中の置換密度(DS)が5.5で濃度が10% (w/w）である例示的なDEX-Upyヒドロゲルの1H NMR特性評価を示すグラフである。
【図４】図4は、分離した未染色及びロッドアミン染色ヒドロゲル（左上）、並びに種々の形態、例えば、2つの半部分を有する円筒状（右上及び左下）、ヒドロゲルが交互に配置された棒状（中央下）、及びコア-シェル構造（右下）の自己組込み型ヒドロゲル(self-integrated hydrogels)を含む、DEX-Upyヒドロゲル（DS 5.5、10% w/w）の複数の例の白黒写真が含む（スケールバー=5 mm）。
【図５】図5(a)〜5(d)は、種々のヒドロゲルのレオロジー特性を示すグラフであり、図5(a)は、12.5%及び10% w/wの濃度を有するDEX-Upyヒドロゲル(DS 5.5)の動的弾性率の周波数スペクトルであり、図5(b)は、増加する応力下でのヒドロゲル（DS 5.5、10% w/w）の動的弾性率を示し、図5(c)は、時間（秒）の関数としての周期的な高応力(100Pa)及び低応力(0.1Pa)応力下でのヒドロゲル（DS 5.5、10% w/w）の動的弾性率を示し、図5(d)は、温度に伴うヒドロゲル（DS5.5、10% w/w）の動的弾性率の変化を示す。
【図６】図6は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中、37℃における12.5%及び10% w/wの濃度を有するDEX-Upyヒドロゲル(DS 5.5)のインビトロ分解を示すグラフである。
【図７】図7は、PBS中37℃における10% w/wの濃度を有するDEX-Upyヒドロゲル(DS 5.5)からの、ドキシサイクリン(DOXY)及びウシ血清アルブミン（BSA）のインビトロ放出を示すグラフである。
【図８】図8(a)は、軟骨細胞及びウサギ骨髄由来細胞(BMSC)を封入した自己組込み型ヒドロゲル構築物の調製の概略図である。  図8(b)は、軟骨細胞を緑色に染色し、BMSCを赤色に染色した、ヒドロゲル構築物内に封入された細胞の白黒共焦点画像である。
【図９】図9(a)〜9(e)は、細胞-ゲル構築物の皮下埋め込みの結果を示し、図9(a)は、アリザリンレッドによって染色したBMSC/BMP-2（骨形成タンパク質）のみの群の断面の白黒写真であり（陽性染色は石灰化骨組織を表す。）、図9(b)は、アルシアンブルーによって染色した軟骨細胞のみの群の断面の白黒写真であり（陽性染色は軟骨組織を表す。）、図9(c)は、アリザリンレッドとアルシアンブルーの両方によって染色した軟骨細胞とBMSC/BMP-2の両方を有する自己組込み群の白黒断面であり、図9(d)は、図9(c)の界面領域の拡大白黒画像であり、そして、図9(e)は、画像解析ソフトウェア(Adobe Photoshop)を用いた骨量及び軟骨量の定量を示すグラフである。
【図１０】図10は、ポリビニルアルコール及びウレイド-ピリミジノンによって形成されたヒドロゲルの白黒写真である。
【図１１】図11は、キトサン及びウレイド-ピリミジノンによって形成されたヒドロゲルの白黒写真である。
【図１２】図12は、ヒドロキシエチルセルロース及びウレイド-ピリミジノンによって形成されたヒドロゲルの白黒写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
詳細な説明
本明細書には、組織工学、ドラッグデリバリー、組織バルキング(tissue bulking)、接着剤、化粧料、創傷被覆材及び縫合剤を含む、種々の用途に用いることが可能な自己組込み型ヒドロゲルが開示されている。単一の組織又は多組織複合体は、本明細書に開示されているヒドロゲルを用いて再生し得る(may by regenerated)。ヒドロゲルは、適切な細胞及び／又は生体分子がその中に組み込まれ／封入された後、穏やかな条件下で自己組み込みすることができる。これによって、空間的に画定された領域における組織（場合によっては、複数の種類の組織）を再生し、さらに、組織をシームレスに一体化することもできる。本明細書に示されている一部の例は、骨-軟骨組織複合体の再生を示し、これは、自然の組織生着(native tissue integration)に似ている。ただし、自己組込み型ヒドロゲルの用途は、これらの例に限定されず、自己組込み型ヒドロゲルは、種々の組織複合体を設計する可能性を有している。
【０００７】
本明細書に開示されている自己組込み型ヒドロゲルは、協同的かつ高度に特異的な物理相互作用を介して自己集合することが可能な超分子ヒドロゲルである。ただし、本明細書に開示されているヒドロゲルは、小さなペプチドによる大きなナノ構造体への協同集合(cooperative assembly)と同等ではない。正確に言えば、本明細書に開示されている超分子ヒドロゲルは、繰り返し単位と、繰り返し単位に共有結合したペンダント分子鎖(pendant chain)とを含む水溶性高分子から形成される。繰り返し単位は、生体適合性モノマー又はコモノマーであり、ペンダント分子鎖には、多重水素結合を有する単位が含まれる。主鎖に沿った多重水素結合単位は、水溶性高分子に、強力であるが可逆的な相互作用を形成する能力を提供する。強力であるが可逆的な相互作用の一時的な性質は、水溶性高分子に、外部からの刺激又は介入なしに、自己癒合、自己組み込み又は自己回復能力を提供する。この特性によって、それぞれの種類の細胞及び／又はシグナル伝達生体分子を担持し得る、別個のヒドロゲル片が組み込まれて、特定の組織複合体の構造を形成することができる。
【０００８】
加えて、生体適合性モノマーと多重水素結合単位ペンダント分子鎖との組合せによって、本明細書に開示されているレオロジー測定値における降伏挙動によって証明されているように、ずり減粘性を有する（すなわち、剪断応力の速度が増加するとともに粘度が低下する）超分子ヒドロゲルが提供される。ずり減粘性は、（例えば、シリンジを介して）注入可能な超分子ヒドロゲルに寄与する。ヒドロゲルは注入可能であるため、予備的に成形するか又は外科的に埋め込む必要はない。さらに、注入性能によって、不規則な組織欠損、例えば、歯欠損、骨折、磨耗／罹患軟骨、及び椎間板、脊髄、脳のような種々の軟組織などを充填するように、ヒドロゲルを適応させる。
【０００９】
ずり減粘性と自己組込み特性の両方によって、注入前にゲル状態にある超分子ヒドロゲルを注入し、注入直後にゲル状態に回復させることができる。
【００１０】
上述したように、ヒドロゲルは、繰り返し単位と、繰り返し単位に共有結合したペンダント分子鎖とを含む水溶性高分子から形成される。通常、水溶性高分子は、修飾デキストラン、修飾ポリ（ビニルアルコール）、修飾キトサン、修飾セルロース、又は本明細書に開示されているペンダント基によって修飾された他の水溶性高分子であり得る。水溶性高分子は、それぞれの繰り返し単位に結合したペンダント基により、多官能性高分子(multi-functionalized polymer)である。
【００１１】
繰り返し単位は、少なくとも1個の官能基を有する。官能基は、（イソシアネートを含む）ペンダント基を共有結合させるように、イソシアネート又はイソシアネートに結合した別の官能基と反応することが可能な官能基であり得る。例として、繰り返し単位の官能基としては、酸素原子、硫黄原子又は窒素原子が挙げられる。修飾された水溶性高分子において、酸素原子、硫黄原子又は窒素原子は、ペンダント分子鎖を繰り返し単位に共有結合させる。繰り返し単位の例としては、グルコース単位、ビニルアルコール、D-グルコサミン、2つのβ(1→4)結合D-グルコース単位、水溶性主鎖を形成する他の繰り返し単位が挙げられ、そして、ペンダント分子鎖を共有結合する適切な官能基が挙げられる。
【００１２】
本明細書に開示されている例において、ペンダント分子鎖としては、ウレイド-ピリミジノンが挙げられる。一部の例では、ウレイド-ピリミジノンは、イソシアネートを介して繰り返し単位の酸素原子、硫黄原子又は窒素原子に共有結合している。他の例では、ウレイド-ピリミジノンは、別の官能基を介して繰り返し単位の酸素原子、硫黄原子又は窒素原子に共有結合している。これらの他の例では、ウレイド-ピリミジノンは、他の官能基、例えば、ヒドロキシル基、アミン基、チオール基と反応したイソシアネートに結合している。この反応によって、繰り返し単位の酸素原子、硫黄原子又は窒素原子に共有結合することが可能なペンダント分子鎖の末端基が生成する。また、イソシアネート以外に、活性化エステル、エポキシ基及び塩化アシル基などの官能基も、ウレイド-ピリミジノンの結合に用いることができる。
【００１３】
ウレイド-ピリミジノンは、多重水素結合単位である。具体的には、ウレイド-ピリミジノンは、単一の水素結合よりもはるかに高い結合強度を有する四重水素結合配列である。図1(a)は、ウレイド-ピリミジノンの多重水素結合（図1(a)の左端）と、解離及び会合を含むその動的相互作用の概略図である。
【００１４】
相互作用の強さは、ヒドロゲルが、可逆的相互作用の解離により侵食するか又は分解するため、ヒドロゲルの浸食性にも影響を及ぼし得る。強い超分子相互作用は、共有結合と同様に機能し、これによって、物理的侵食の影響を受けない。ウレイド-ピリミジノン多重水素結合相互作用によって、ヒドロゲルに適切な侵食性、ひいては生体分子放出プロファイルが提供される。
【００１５】
本明細書に開示されているヒドロゲルは、毒性成分又は非生理的pH条件を利用しない、穏やかな製造工程によって形成され得る。穏やかな製造工程では、水、PBSなどの穏やかな溶媒と、6〜8の生理的pH条件と、を用いる。ウレイド-ピリミジノン含有ペンダント基は、酸素原子、硫黄原子又は窒素原子を含む官能基との反応によって、水溶性高分子の繰り返し単位にグラフト化される。方法の一部の例では、最初に、ウレイド-ピリミジノンをイソシアネートに結合させ、そして、これを、酸素原子、硫黄原子又は窒素原子を含む繰り返し単位官能基にグラフト化させる。
【００１６】
ヒドロゲルを形成する方法の一例として、ウレイド-ピリミジノン含有ペンダント基は、最初に、ウレイド-ピリミジノンをイソシアネートに結合させることによって形成されてもよい。選択された水溶性高分子を溶媒中に溶解して、溶液を形成してもよい。ウレイド-ピリミジノン含有ペンダント基を、触媒とともに溶液に加えて、混合物を形成してもよい。次いで、混合物を所定の時間（例えば、約0.5時間〜約20時間の範囲）、所定の温度（例えば、約60℃〜約150℃の範囲）で反応させてもよい。この反応生成物を別の適切な溶媒中に溶解し、約60〜90℃で約0.5〜1時間撹拌して、ヒドロゲルを形成してもよい。
【００１７】
別の例では、選択された水溶性高分子を第1の溶媒中に溶解して、第1の溶液を形成してもよい。ウレイド-ピリミジノン含有ペンダント基は、第2の溶媒（第1の溶媒と同じであるか又は異なる。）中に溶解して、第2の溶液を形成してもよい。第1の溶液の少なくとも一部は、第2の溶液の少なくとも一部と混合して、混合物を形成する。第2の溶液に対する第1の溶液の比は、10:1〜1:1であってもよい。次いで、混合物を所定の時間（例えば、約0.5時間〜約20時間の範囲）、所定の温度（例えば、約60℃〜約150℃の範囲）撹拌及び硬化させてもよい。一部の例では、溶媒を水と交換する付加的な処理を含めてもよい。
【００１８】
方法の複数の具体例を、実施例の節において更に詳細に説明する。
【００１９】
ウレイド-ピリミジノンのグラフト密度は、水溶性高分子に対するウレイド-ピリミジノン含有ペンダント基の供給比を変更することによって制御することができる。グラフト密度を制御することによって、多官能性高分子は、頑強なヒドロゲルを形成することができる。多官能性高分子の1H NMRを行って構造を確認し、特徴ピーク下の面積の比を算出することによって、置換密度（DS、100の繰り返し単位当たりのウレイド-ピリミジノン単位の数）を推定することができる。一部の例において、ヒドロゲルは、ウレイド-ピリミジノンの密度が8.1以下である場合に形成される。非常に高いウレイド-ピリミジノングラフト密度を有するポリマーは、水溶性が不十分であるため、ヒドロゲルの調製には適していない。
【００２０】
本明細書に開示されている水溶性高分子は、適切なウレイド-ピリミジノングラフト密度によって、ヒドロゲルを形成することができる。ヒドロゲルネットワークは、ウレイド-ピリミジノン(UPy)水素結合を介して形成される（図1(b)のゲルを参照）。ヒドロゲルは、シリンジ内に充填され、その後、針を通して注入され得る。ヒドロゲルは、注入時に剪断応力下で液体のように作用し、注入直後に凝固する（ずり断減粘挙動）。これらの挙動の例は図1(b)に示されており、ウレイド-ピリミジノンの解離、及び10Pa〜1kPaの範囲の剪断応力を受けたときのヒドロゲルのずり断減粘を示し、そして、ウレイド-ピリミジノンの会合、及び剪断応力除去におけるヒドロゲルの自己回復を示している。
【００２１】
種々の形状のヒドロゲルは、これらを種々の形状の型内に注入することによって製造することができる。
【００２２】
ヒドロゲルは、染色されるか又は透明であり得る。適切な染料を用いることができ、これをヒドロゲルに直接加えることができる。
【００２３】
ヒドロゲルが薬物／タンパク質の送達に用いられる場合、薬物又はタンパク質は、ヒドロゲル内に封入され得る。これは、薬物又はタンパク質を適切な溶媒中に溶解し、そして、溶解した薬物又はタンパク質を、凝固前にヒドロゲル溶液中に加えることによって、行うことができる。薬物含有溶液の量は、通常、総ヒドロゲル体積の1/3未満である。
【００２４】
また、細胞をヒドロゲルに組み込むこともできる。ヒドロゲルが完全に固まる前に、（通常、適切な培地中の）細胞をヒドロゲルに加え、その中で混合することができる。
【００２５】
本開示を更に例示するために、実施例を本明細書に示す。これらの実施例は例示の目的で示され、そして、本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことが理解される。実施例の節を通して、ウレイド-ピリミジノンは「UPy」と称する。
【実施例】
【００２６】
実施例
実施例1
【００２７】
デキストラン-ウレイド-ピリミジノン(DEX-Upy)ヒドロゲルの合成及び調製
【００２８】
DEX-UPyポリマーヒドロゲルを合成するために、イソシアネート基とグルコース単位のヒドロキシル基との反応によって、ウレイド-ピリミジノンをデキストラン主鎖にグラフト化させた。この反応を図2に示す。
【００２９】
最初に、2-アミノ-4-ヒドロキシ-6-メチルピリミジン（11.2g、Sigma社製）を、100 mlの1,6-ヘキサンジイソシアネート（Sigma社製）に加え、18時間、100℃まで加熱した（iで示す。）（図2の反応1）。次いで、反応溶液に1000 mlのペンタン（Sigma社製）を注ぎ、マグネチックバーによって撹拌して、未反応のヘキサンジイソシアネートを洗浄した。生成物をろ過し、ペンタンによって更に5回洗浄した。回収した白色粉末（UPy-イソシアネート）を、真空下で一晩乾燥させた。UPyグラフト化デキストランを合成するために、磁気撹拌しながら、窒素雰囲気下で、デキストラン（2g、分子量70,000）を70 mlの無水ジメチルスルホキシド（DMSO、Sigma社製）中に溶解し、続いて、UPy-イソシアネート(0.4g)及びジブチルスズジラウレート （DBTDL、0.586 ml、Sigma社製）を加えた（図2のii）。反応を120℃で16〜18時間行った（図2のii）。得られた溶液をイソプロパノール（700 ml、Fisher Scientific社製）に注ぎ、3回沈殿させた。粉末を一晩真空乾燥させて、水中に再溶解した。この水溶液を冷凍庫内で凍結させ、3日間凍結乾燥させた。
【００３０】
ヒドロゲルを製造するために、約100 mgのDEX-UPyポリマーを900 μlの滅菌PBS (pH7.4)中に、約70℃で1時間、磁気撹拌下で溶解した。その後、溶液をシリンジ内に充填し、ポリジメチルシロキサン(PDMS)型内に注入した。レオロジー特性の測定のために、ヒドロゲルを4℃の冷蔵庫内に一晩入れて、完全にゲル化させた。
【００３１】
UPyのグラフト密度は、デキストランに対するUPyの供給比を変更することによって制御することができる。1H NMRを行って、DEX-UPyの構造を確認した（図3）。特徴的なピーク下の面積の比を算出することによって、置換密度（DS、100のグルコース単位当たりのUPy単位の数）を推定した。本実施例では、1H NMR特性評価をVarian MR400（コバルト）分光計を用いて行った。UPy-イソシアネートの溶媒としてCDCl3を、そしてDEX-UPyの溶媒としてDMSO-d6を用いた。UPyの密度が十分に高い場合、多官能性高分子(DEX-UPy)は、頑強なヒドロゲルを形成することができた。例えば、DEX-UPy-2（DS5.5、10% w/w）は、高温（約70℃）で水中に溶解し、室温に冷却した後、安定なヒドロゲルを形成することができたのに対して、純粋なデキストラン及びグラフト密度が非常に低いDEX-UPy（DEX-UPy-1、DS 2.8）は、同じ条件下で透明な溶液を形成した。非常に高いUPyグラフト密度(DS≧8.1)を有するポリマーは、水溶性が不十分であるため、ヒドロゲルの調製に用いることができなかった。適切なUPyグラフト密度によって、DEX-UPyポリマーはヒドロゲルを形成し、これをシリンジ内に充填し、その後、26G針を通して注入した。ヒドロゲルは、注入時に剪断応力下で液体のように作用し、注入直後に凝固したが、これは、そのずり断減粘挙動の証拠である。
【００３２】
自己組込み能を例証するために、ヒドロゲルディスクをブレードによって種々の部分に切断し、その後、手動により一つに集めた（例えば、図4の左上の画像）。ヒドロゲルのうちの1つをロダミン（符号10'、図4を参照）によって染色し、ヒドロゲルのうちのもう1つをその元の色（符号10、図4を参照）のままにして、これらのヒドロゲル片間の界面を明らかにした。ヒドロゲル10、10'は、新しい面が互いに接すると、数分以内に組み込まれることが分かった。図4に示されているように、種々のパターンを実現することができ、例えば、2つの半部分（それぞれの半部分はヒドロゲル10、10'のうちの1つである。）を有する円筒体12、結合したディスクのロッド14（それぞれのディスクはヒドロゲル10、10'のうちの1つである。）、及びコア（ヒドロゲル10'から形成される。）とシェル（ヒドロゲル10から形成される。）とからなる一体型円筒体16を実現することができた。図4の写真は、ヒドロゲル10、10'が互いに再結合した2分後に撮影したものである。
【００３３】
DEX-Upyヒドロゲルのずり減粘及び回復のレオロジー測定
【００３４】
ずり減粘とその後の回復に関連する機械特性を定量するために、AR2000レオメーター（TA instruments社（米国）製）を用いて、ヒドロゲルのレオロジー特性を測定した。すべての試験には、径が40 mmの平行板を用いた。平行板間の間隙の距離は、0.4 mmであった。周波数スペクトル測定において、0.1Paの一定の応力を加えた（図5(a)、以下に論じる。）。周波数スペクトル以外の測定では、一定の1 rad/sの角速度を用いた。ずり減粘（図5(b)）及び自己回復（図5(c)）試験に用いた高応力及び低応力はそれぞれ、100Pa及び0.1Paであった。弾性率の自己回復を、3サイクルの高応力及び低応力後に検証した。温度安定性試験（図5(d)、以下に論じる。）のために、室温（〜18℃〜約22℃）から約70℃まで、2℃/分の昇温速度で、加熱過程時の弾性率を測定した。
【００３５】
図5(a)〜5(d)は、ヒドロゲルのレオロジー特性を示すグラフである。図5(a)には、12.5%及び10% w/wの濃度を有するDEX-UPy (DS 5.5)ヒドロゲルの動的弾性率（貯蔵弾性率G'、損失弾性率G''）の周波数スペクトルが示されており、0.1Paの一定の応力を加えた。10% (w/w)のDEX-UPy (DS 5.5)高分子溶液から製造されたヒドロゲルは、170Paの貯蔵弾性率を有していたが、12.5% (w/w)の濃度を有する同じポリマーから製造されたヒドロゲルは、700Paの貯蔵弾性率を有していた。これらの結果は、ポリマー濃度とポリマーの機械特性との間の非線形の関係を示す。
【００３６】
図5(b)には、増加する応力下での10% (w/w)ヒドロゲル(DS 5.5)の動的弾性率を示している。本実施例では、静的に貯蔵されたゲルから、シリンジからのゲルの機械的注入までの変化を模倣して、ヒドロゲルに剪断力を加えた。ヒドロゲルは、臨界剪断応力レベルにおいて得られ、その機械的完全性を失ったが、これは、針を通して注入されたヒドロゲルの状態に対応している。臨界剪断応力レベルでは、貯蔵弾性率(G')が損失弾性率(G'')を下回った。この現象は、ずり減粘性の実証である。
【００３７】
さらに、ヒドロゲルに、周期的な高応力及び低応力（それぞれ、σH及びσL）を加えた。図5(c)は、周期的な高応力(100Pa)及び低応力(0.1Pa)下での10% (w/w)ヒドロゲル(DS 5.5)の動的弾性率を示している。低応力下では、DEX-UPyはゲルのように作用した。具体的には、低応力レベルでは、ゲルは安定を維持し、G'はG''よりも高かった。高応力レベルでは、ゲルは、G'がG''よりも低い液体状の状態（ゾル）に変化した。高応力を除去した後、ゲル状態は即座に（数秒以内に）回復した。ヒドロゲルは、機械特性を著しく損なうことなく、多くの周期にわたって、ずり減粘及び回復することができた。
【００３８】
加熱時の10% (w/w)ヒドロゲル(DS 5.5)の安定性を、温度に対するレオロジー特性の変化を測定することによって検証した。図5(d)は、温度に伴う10% (w/w)ヒドロゲル(DS 5.5)の動的弾性率の変化を示す。ヒドロゲルを、室温から2℃/分の速度で加熱しながら軟化させた（すなわち、加熱により弾性率を低下させた）が、70℃であってもゲル状態を維持した。
【００３９】
DEX-Upyヒドロゲルのインビトロ分解／浸食
【００４０】
DEX-UPyヒドロゲルは、主に物理的侵食プロセスによって分解され、その間、親水性高分子ゲルは解離し、水性環境に拡散する。分解／侵食を試験するために、10% (w/w)のDEX-UPy (DS 5.5)高分子溶液と、12.5% (w/w)のDEX-UPy (DS 5.5)高分子溶液から製造されたヒドロゲルをシリンジ内に充填し、4℃で一晩冷蔵庫内に保存した。次いで、ヒドロゲルを1.5 mlのエッペンドルフチューブに注入した。チューブ内の100 mgのヒドロゲルごとに、1 mlのPBS (pH7.4)を加えた。チューブを、37℃のインキュベーター内で、100 rpmの振盪速度により振盪機において培養した。それぞれの所定の時点において、3つの試料を採集し、凍結乾燥させた。乾燥重量を、0.1 mgまで正確な天秤で測定した。乾燥重量損失を算出して、浸食を定量した。その結果を図6に示す。
【００４１】
図6のデータは、10%の濃度及び5.5%のUPy含有量（すなわち、10% (w/w)のDEX-UPy (DS 5.5)）のヒドロゲルが、4週間で57%の質量を失ったのに対して、12.5%の濃度及び同じUPy含有量（すなわち、12% (w/w)のDEX-UPy (DS 5.5)）のヒドロゲルが、更に遅く分解し、同じ期間に47%の質量を失ったことを示す。これらのヒドロゲルの分解プロファイルは、一時的なテンプレートの必要性が通常数週間から数か月である、多くの組織型の設計に適していると考えられる。
【００４２】
DEX-Upyヒドロゲルのインビトロ薬物放出
【００４３】
薬物又はタンパク質は、ヒドロゲル内に封入され、経時的（例えば、数日から数か月の期間）に放出され得るが、これは、薬物又はタンパク質のサイズ及び特性に依存する。薬物放出を試験するために、DEX-UPy粉末をPBS中に溶解して、濃度11% (w/w)のヒドロゲルを調製した。ドキシサイクリン（DOXY、小分子のモデル薬物）と、ウシ血清アルブミン（BSA、モデルタンパク質）をPBS中にあらかじめ溶解し、これらが凝固する前に、DEX-UPy溶液の試料にそれぞれ加えた。ヒドロゲルの最終濃度は10%であり、薬物濃度又はタンパク質濃度は総重量の0.5%であった。ヒドロゲルをそれぞれのシリンジ内に充填した。60 μgのヒドロゲルを、1.5 mlのエッペンドルフチューブの底に注入した。その後、チューブに1 mlのPBSを加えた。それぞれの時点において500 μlの溶液をサンプリングし、500 μlの新しいPBSを加えた。
【００４４】
放出結果を図7に示す。放出されたDOXYの濃度を、UV分光光度計（日立社製、U-2910）を用い、273 nmにおいてUV吸光度を定量することにより測定した。濃度を、あらかじめ確立されている標準濃度強度曲線を用いて決定した。図示されているように、DOXYは、最初の1週間でインビトロにおいてほぼ完全に放出された。放出されたBSAの濃度を、標準的な手順に従って、Micro BCATM Protein Assay Kit（Thermo Scientific社製）を用いて決定した。BSAは1か月以上にわたって放出され、重大なバースト放出はなかった。BSAの約10%が1日目に放出された。4週間の全試験期間中、BSAについて、ほぼ直線的な放出を達成した。このタンパク質／増殖因子の徐放プロファイルは、組織工学用途に非常に望ましい。
【００４５】
DEX-Upyヒドロゲルによる細胞の封入及び生体適合性
【００４６】
軟骨細胞及び骨髄幹細胞を含む種々の種類の細胞を、DEX-Upyヒドロゲル内に封入し培養した。
【００４７】
関節軟骨を、無菌条件下で4週齢のニュージーランドホワイトウサギ(New Zealand white rabbits)（Harlan Sprague Dawley社（ミシガン州、米国））の大腿骨頭並びに膝（顆状突起及び膝蓋骨溝）から得て、付着性の結合組織を取り除き、小片に細かく刻んだ。0.2%のII型コラゲナーゼによって16時間消化した後、初代軟骨細胞を回収し、2回継代した。軟骨細胞を、20% (v/v)のウシ胎児血清(FBS)を含む高グルコースDMEM（Gibco社製）培地中で培養した。18ゲージの注射針を用い、吸引によって、大腿骨髄からウサギ骨髄由来細胞(BMSC)を採取し、10 mlの骨髄を1000Uのヘパリンに集めた。骨髄を細胞ストレーナによってろ過して、脂肪組織及び血栓を除去し、そして、600 rpmで30分間遠心分離した。ウサギBMSCを回収し、75 cm2フラスコ内の、10%ウシ胎仔血清（Gibco社製）を含む低グルコースα-MEM（Gibco社製）中で培養した。
【００４８】
水中に溶解する前に、DEX-UPy粉末を、121℃で25分間、オートクレーブによって滅菌した。ヒドロゲル(11% (w/w))を、先述のようにPBS中で調製した。ヒドロゲル溶液を室温に冷却した後、培地中に軟骨細胞又はBMSCを加え、撹拌しながら混合し、ヒドロゲルの最終濃度を10% (v/v)に希釈した。細胞密度は100万/mlであった。細胞を更に十分に視覚化するために、軟骨細胞及びBMSCをそれぞれ、標準的な手順に従って、ER-Tracker（商標）Green（BODIPY（登録商標）FL グリベンクラミド、Invitrogen社製）及びMitoTracker（登録商標）Red CMXRos（Invitrogen社製）によって標識した。
【００４９】
細胞-ヒドロゲル混合物をシリンジ内に充填し、12穴培養プレートに注入し、続いて、DMEM培地（Gibco社製）を加えた。培地を週に2回交換した。
【００５０】
共焦点画像（図示しない。）を撮影し、画像は、両種類の細胞の均一な分布を示した。live-dead assay（これも結果を示していない。）は、軟骨細胞とBMSCの両方が、2週間の培養後に検討したように、ヒドロゲル中で高い生存率を維持したことを確認し、このことは、DEX-UPyヒドロゲルが哺乳動物細胞と高度に生体適合性であることを示した。
【００５１】
自己組込み型細胞-DEX-Upyヒドロゲル構築物の調製
【００５２】
骨-軟骨複合組織設計のための自己組込み型足場を調製した。最終細胞密度が1000万個/mlであることを除いて、先の節において説明したように、軟骨細胞（軟骨形成のためのもの）、及びBMSCと骨形成タンパク質2（BMP-2、骨再生のためのもの）を、ヒドロゲルの2つの部分に別々に封入した。軟骨細胞含有ヒドロゲルは、図8(a)において符号22で表示され、BMSC及びBMP-2含有ヒドロゲルは、図8(a)において符号24で表示されている。細胞を更に十分に視覚化するために、軟骨細胞及びBMSCをそれぞれ、ER-Tracker（商標）Green（BODIPY（登録商標）FL グリベンクラミド、Invitrogen社製）及びMitoTracker（登録商標）Red CMXRos（Invitrogen社製）によって標識した。次いで、細胞含有ヒドロゲルを、中央において、バッフルフィルム（図8(a)において符号18で表示、ポリテトラフルオロエチレン、すなわちTEFLON（登録商標）から形成）によって分離された、ディスク状のPDMS型の両側（図8(a)において符号20で表示、内径4 mm、外径7 mm、及び厚さ2 mm）に注入した。その後、フィルム18を除去して、軟骨細胞含有ヒドロゲルとBMSC含有ヒドロゲルとを一体化させた。完全なゲル化に十分な時間を確保するために、培養プレートを60分間インキュベーター内に入れた後に、培地を加えた。一体化したヒドロゲルを、DMEM培地（Gibco社製）中で2日間培養した後、共焦点顕微鏡(Olympus Fluoview 500)下で観察した。バッフルフィルムを除去した直後に、2つの成分が自己組み込みされた。
【００５３】
図8(a)は、PDMS型20、PDMS型20のバッフルフィルム18により分離された側への細胞含有ヒドロゲル22、24の注入、バッフルフィルム18の除去、及び、一体型細胞-ゲル構築物26への2つのヒドロゲル22、24の一体化を概略的に示している。図8Bの白黒共焦点画像は、一体型細胞-ゲル構築物26中の軟骨細胞含有ヒドロゲル24とBMSC及びBMP-2含有ヒドロゲル22との間の明確な界面を示し、関節における密接な骨-軟骨界面を模倣している。2つの細胞充填ゲルを一体化させて骨-軟骨複合体を構築するのに、外部介入は必要ではなかった。
【００５４】
マウスにおける自己組込み型ヒドロゲル構築物の皮下埋め込み
【００５５】
すべての動物の手順は、ミシガン大学の動物実験委員会(the Institutional Animal Care and Use Committee)の指針に基づいて実施した。ヌードマウス（6〜8週齢、NU/NU、Charles River Laboratories社（米国））を、平衡酸素中の2.5%イソフルランによって麻酔した。上述したものと同じ方法を用いて、3つの群の細胞-ゲル構築物（軟骨細胞のみ、BMSC/BMP-2のみ、及び両側の2種類の細胞を含む自己組込み型ヒドロゲル）を製造した。すべての構築物中の軟骨細胞とBMSCの細胞密度は、ともに1000万個/mlであった。BMP-2の濃度は、50 μg/mlであった。
【００５６】
細胞-ゲル構築物をマウスの皮下に埋め込み、本明細書に開示されている自己組込み型ヒドロゲルを用い、骨軟骨複合体を設計する可能性について評価した。それぞれの細胞-ゲル構築物を皮下ポケットに埋め込み、それぞれのマウスには4つの埋込物が収容された。埋込物はヌードマウスに無作為に配置され、1群当たり4つの検体があった。構築物を8週間後に回収し、線維性被膜を除去した。
【００５７】
試料を組織学的検査に用いた。具体的には、埋め込んだ検体を採集し、4℃で8時間、10%緩衝ホルマリン中で固定した。次いで、固定した組織を、Tissue-Tek（商標）CRYO-OCT化合物（Sakura Finetek USA社製）中に浸漬し、その後、-80℃で一晩保存した。検体を10 μmの厚さで凍結切片にし、アルシアンブルー及び／又はアリザリンレッドを用いて染色した。組織学的切片における石灰化組織（アリザリンレッド、骨のためのもの）及び硫酸化グリコサミノグリカンの陽性染色（アルシアンブルー、軟骨のためのもの）によってそれぞれ、単一細胞群内の軟骨及び骨の形成を検証した（図9(a)及び9(b)において白黒により示されている。）。結果は、骨組織と軟骨組織の両方の成長を裏付けるうえで、本明細書に開示されているヒドロゲルの性能を実証している。
【００５８】
自己組込み型骨軟骨埋込物を、アルシアンブルーとアリザリンレッドの両方を用いて染色した（図9(c)において白黒により示されている。）。骨組織と軟骨組織は、ともに、これらの空間的に画定された領域内で識別された。BMSC/BMP-2側（図9(c)の左側）は、骨に対して陽性染色を示したが、軟骨細胞側（図9(c)の右側）は軟骨のみに対して陽性染色を示した。再生した骨組織及び軟骨組織は、拡大画像（図9(d)において白黒により示されている。）に示されているように、密接に一体化された。このようなシームレスな骨と軟骨の一体化は、関節機能において望ましい。
【００５９】
4つの異なる試料からの10の切片を用いて、骨組織及び軟骨組織の量を定量した。その結果を図9(e)に示す。結果は、軟骨が骨（30%と近似的に等しい。）よりも大きな量（70%と近似的に等しい。）を占めていたことを示している。2種類の組織間の再生組織量の差を以下に論じる。
【００６０】
図9(c)〜9(e)の結果は、自然の組織に似ている骨-軟骨組織複合体が、埋め込み8週間後に形成され、さらに、2種類の組織間のシームレスな一体化が達成されることを確認した。このため、本明細書に開示されているヒドロゲルは、新しい分類の足場材料を表し、種々の組織複合体を設計する大きな可能性を有する。
【００６１】
実施例2
【００６２】
透明なデキストラン-ウレイド-ピリミジノン(DEX-Upy)ヒドロゲルの合成及び調製
【００６３】
淡黄色がヒドロゲルに望ましい場合には、アミノ化を用いることができる。例では、デキストランのアミノ化は、50 mLの無水ジメチルスルホキシド(DMSO)中にデキストラン（10 mmol糖単位、分子量70,000）を最初に溶解した後、1,1'-カルボニルジイミダゾール(7.5 mmol)を加えることを含む。反応は、窒素雰囲気下で、室温で約4時間行うことができる。次いで、溶液に1,6-ヘキサンジアミン(20 mmol)を加え、そして、この溶液を室温で一晩撹拌する。その後、反応生成物を、脱イオン水に対する透析（分子量カットオフ=6000〜8000 Da）によって精製する。2日間の凍結乾燥後に、精製されたアミノ化デキストランが得られる。
【００６４】
ただし、透明なDEX-UPyヒドロゲルは、最初にデキストランのアミノ化を行う必要なしに、調製することができる。
【００６５】
透明なDEX-UPyヒドロゲルを形成するために、メチルイソシトシンのカルボニルジイミダゾール(CDI)活性化を最初に行う。これは、40 mlのDMSO中に2-アミノ-4-ヒドロキシ-6-メチルピリミジン(2-Amino-4-hydroxy-6-methypyrimidine) (8 mmol)及びCDI (10.4 mmol)を懸濁させること、この懸濁液を80℃に加熱すること、そして、その温度で懸濁液を1時間維持することを含む。反応混合物を室温に冷却し、200 mlのアセトンを加えた。沈殿物をろ過し、真空中で一晩乾燥させた。
【００６６】
デキストラン(0.5g)を15 mlのDMSO中に溶解し、CDI活性化メチル-イソシトシン(0.06g)を穏やかな加熱下でDMF中に溶解した。次いで、DMFの溶液を撹拌下でDMSOに加えた。反応を室温で20時間行った。その後、反応生成物を脱イオン水に対する透析によって2日間精製し、3日間凍結乾燥させた。
【００６７】
結果は示されていないが、2つの別個の透明ヒドロゲルが自己組み込みをすることができた。
【００６８】
実施例3
【００６９】
ポリビニルアルコール-ウレイド-ピリミジノン(PVA-Upy)ヒドロゲルの合成及び調製
【００７０】
PVA (1g)を、10%の重量濃度を有する10 mlの無水ジメチルスルホキシド(DMSO)中に最初に溶解した。溶解を促進するために、中程度の加熱又は超音波処理を用いた。0.4gのUPy-イソシアネートを分けて10 mlのDMSO中に溶解した。これらの2つの溶液を所定の比率に従って混合し、続いて、触媒として1滴のDBTDLを加えた。重量に関する供給比(PVA:UPy)は2:0.4であり、PVA濃度は4.8%であった。混合溶液を撹拌した後、100℃で3時間硬化させた。ゲルを脱イオン水中に24時間沈めて、DMSOを水に置換し、未反応の分子を洗い流した。図10は、調製されたPVA-UPyヒドロゲルの例の写真である。
【００７１】
実施例4
【００７２】
キトサン-ウレイド-ピリミジノン(CHI-Upy)ヒドロゲルの合成及び調製
【００７３】
100 mgのキトサンを1.9 mlの水／乳酸(20:1)溶液中に溶解することによって、5%のキトサン溶液を調製した。UPy-イソシアネートを分けてDMSO中に溶解した。ゲルを製造するために、400 μlのキトサン溶液を、1.6 mlのUPy-イソシアネート溶液によって2:0.8の重量比で希釈した。混合溶液に1滴のDBTDLを加えた。十分に撹拌した後、溶液を100℃で1時間硬化させた。ゲルを脱イオン水によって24時間溶媒交換した。図11は、調製されたCHI-UPyヒドロゲルの例の写真である。
【００７４】
実施例5
【００７５】
ヒドロキシエチルセルロース-ウレイド-ピリミジノン(HEC-Upy)ヒドロゲルの合成及び調製
【００７６】
UPyグラフト化HECを合成するために、磁気撹拌しながら、窒素雰囲気下で、1gのHEC（通常、Mv=90000、Aldrich社製）を100 mlの無水DMSO中に溶解し、続いて、UPy-イソシアネート(0.2g)及び3滴のDBTDLを加えた。反応は120℃で16時間行った。得られた溶液を、アセトン（1000 ml、Fisher Scientific社製）によって沈殿させた。粉末を真空乾燥させ、水中に再溶解した。水溶液を冷凍庫内で凍結し、3日間凍結乾燥させた。
【００７７】
ヒドロゲルを製造するために、50 mgのHEC-UPyポリマーを、約70℃で磁気撹拌しながらPBS (950 μl)中に溶解した。溶液を、4℃の冷凍庫内に一晩入れた。形成されたヒドロゲルを図12に示す。
【００７８】
本明細書に開示されているヒドロゲルの例は、注入可能であり、自己組み込みする。ヒドロゲルの断片が互いに接すると、数分以内に自己組み込みが生じる。これは、鎖の末端においてウレイド-ピリミジノンにより官能化されたポリエチレングリコール(PEG)ポリマーで観察される自己組み込みとは異なるが、これは、このような組み込みが、ゆっくりとした動態が関与することにより、数時間から数日かかることがあるためである。対照的に、本明細書に開示されている修飾水溶性高分子は、高分子主鎖に沿って多数の多重水素結合単位(UPy)を含有する。実施例に示されているように、安定なヒドロゲルは、PEG-UPyヒドロゲルにおけるような付加的な疎水性相互作用又は尿素部位に頼ることなく、UPy相互作用から形成することができる。したがって、ゲル化及び再接着（自己組み込み）は、はるかに短い時間（例えば、数分）で生じる。
【００７９】
さらに、本明細書に開示されているDEX-Upyヒドロゲルは、これらの浸食（「分解」）プロファイルによって示されるように、疎水性修飾PEGヒドロゲルよりも実質的に安定している。PEGヒドロゲルは、24時間以内にインビトロにおいて積荷を完全に浸食及び放出することを示したのに対して、実施例1において試験されたDEX-UPyヒドロゲルは、1か月以上にわたって完全性を維持していた。さらに、DEX-UPyヒドロゲルは、1か月以上にわたってほぼ直線的にタンパク質薬物を放出することが可能であることが示され、これによって、薬物の治療有効性が大きく向上する。
【００８０】
生体適合性高分子と複数のUPy単位とを組み合わせた、本明細書に開示されている例示的ヒドロゲルは、注入可能であり、いかなる外部刺激も用いることなく、迅速に自己組み込みし、これによって、封入された細胞又は生体分子への潜在的な害が防止される。これらの特性は、組織工学用途に特に有益である。
【００８１】
本明細書に開示されているヒドロゲルの自己組込み特性によって、ヒドロゲルを多組織複合体の設計に用いることもできる。複合体組織の再生は、空間的に画定された領域において種々の細胞／生体分子を組み込む足場を必要とするため、非常に困難である。一例は、緊密に結合した骨と軟骨が同時に形成され、シームレスに一体化される必要がある骨軟骨欠損である。実施例1に示されているインビボの結果は、このような場合における自己組込み型ヒドロゲルの有用性を確認している。これらの結果において、骨組織及び軟骨組織は、BMSC/BMP-2及び軟骨細胞がそれぞれ最初に封入された自己組込み構築物の両側に分布していた。組織学的結果は、2つの異なる組織の良好な一体化を確認し、これらは、自然の組織の組織構造に似ていた。さらに、組織切片の定量分析に基づいて、軟骨は骨よりも大きな量を占めることが分かった。多数の研究は、BMSCと軟骨細胞との共培養が、混合状態又は密接した状態のいずれかにおいて、BMSCの軟骨細胞への分化を誘導することを示している。軟骨細胞は界面領域でBMSCから誘導され、このため、元の境界を越えて軟骨形成が生じ、これによって、骨形成よりも軟骨が生じ、これらの2種類の組織間がシームレスに一体化したと考えられている。等量の骨及び軟骨を生成するために、更に小さな初期体積の軟骨細胞含有ヒドロゲルを用いることができる。
【００８２】
本明細書に開示されているヒドロゲルは、全体として、生体適合性でかつ生分解性であり、生体分子を持続的に放出することが可能である。
【００８３】
本明細書を通して、「一例(one example)」、「別の例(another example)」、「例(example)」などは、例に関連して説明した特定の要素（例えば、特徴、構造及び／又は特性）が、本明細書に説明されている少なくとも1つの例に含まれ、他の例には存在していても存在していなくてもよいことを意味する。加えて、あらゆる例の説明されている要素は、文脈上他に明確に指示されていない限り、種々の例において、適切に組み合わせてもよいことが理解される。
【００８４】
本明細書に示されている範囲には、記述されている範囲及び記述されている範囲内のあらゆる値又は部分範囲(sub-range)が含まれることが理解される。例えば、室温（〜18℃から約22℃）から約70℃という範囲は、おおよその室温（〜18℃から約22℃）から約70℃という明示的に列挙された限界を含むだけでなく、25℃、34.5℃、68℃などの個々の値、及び約30℃〜約65℃、約19℃〜約59℃などの部分範囲も含むものと解釈される。さらに、値を説明するのに「約(about)」が用いられる場合、これは、記述されている値からのわずかな変動（最大+/-10%）を包含することを意味する。
【００８５】
本明細書に開示されている例の説明及び記述(claiming)において、単数形「a」、「an」及び「the」には、文脈上他に明確に指示されていない限り、複数の指示対象が含まれる。
【００８６】
複数の例を詳細に説明してきたが、開示されている例は変更してもよいことが理解される。したがって、上述の説明は、非限定的であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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