(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体を付着させた基板を培地に載置することにより微生物を培養し、その後前記基板を蛍光染色剤溶液へ浸漬して染色を行うことにより微生物のコロニーを検出する微生物検出装置であって、
前記蛍光染色剤により染色された前記検体を付着させた前記基板に対して励起光を照射し、前記基板を撮像して基板画像を取得する撮像部と、
前記検体の染色後、所定の周期で前記撮像部に前記基板画像を取得させ、前記所定周期毎の前記基板画像上の１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求め、前記基板画像の背景の輝度を基準として前記各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する輝度補正手段と、
前記検体の染色後所定の検査時間において、時間経過に伴い、前記補正輝度が所定値を超えたこと及び前記補正輝度の変化率が所定値を超えたことのうちの少なくとも１つが生じた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する判定手段と、
を備え、
前記撮像部は、前記基板が蓋付き容器に収容された状態で前記基板画像を取得し、
前記蓋付き容器の蓋は透光性を備え、且つその内面に結露防止部が形成されている又は外部に結露防止具が設けられており、
前記微生物コロニーの検出後に前記基板を培地に載置することにより培養を続行可能にすることを特徴とする微生物検出装置。
【請求項２】
前記判定手段は、前記補正輝度が所定値を超え且つ前記補正輝度の変化率が所定値を超えた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する請求項１記載の微生物検出装置。
【請求項３】
前記判定手段は、前記補正輝度の変化率が正の値となり、その後負の値となった場合は、前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する請求項１又は２に記載の微生物検出装置。
【請求項４】
検体を付着させた基板を所定の時間培地に載置することにより微生物を培養し、その後前記基板を蛍光染色剤溶液へ浸漬して染色を行うことにより微生物のコロニーを検出する微生物検出方法であって、
前記蛍光染色剤により染色された前記検体を付着させた前記基板に対して励起光を照射し、前記基板を撮像して基板画像を取得する撮像工程と、
前記検体の染色後、所定の周期で前記撮像工程により前記基板画像を取得させ、前記所定周期毎の前記基板画像上の１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求め、前記基板画像の背景の輝度を基準として前記各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する輝度補正工程と、
前記検体の染色後所定の検査時間において、時間経過に伴い、前記補正輝度が所定値を超えたこと及び前記補正輝度の変化率が所定値を超えたことのうちの少なくとも１つが生じた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する判定工程と、
を備え、
前記微生物コロニーの検出後に前記基板を培地に載置することにより培養を続行可能にすることを特徴とする微生物検出方法。
【請求項５】
前記判定工程は、前記補正輝度が所定値を超え且つ前記補正輝度の変化率が所定値を超えた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する請求項４記載の微生物検出方法。
【請求項６】
前記判定工程は、前記補正輝度の変化率が正の値となり、その後負の値となった場合は、前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する請求項４又は５に記載の微生物検出方法。
【請求項７】
前記撮像工程は、前記基板が蓋付き容器に収容された状態で前記基板画像を取得し、
前記蓋付き容器の蓋は透光性を備え、且つその内面に結露防止部が形成されている又は外部に結露防止具が設けられている請求項４乃至６のいずれかに記載の微生物検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中に微生物が含まれているかを検出するための微生物検出装置、微生物検出プログラム及び微生物検出方法に関する。更に詳しくは、短時間で微生物コロニーを検出し、検出時に微生物を死滅させることがない微生物検出装置、微生物検出プログラム及び微生物検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
加工食品等の製品を製造して出荷する際に、細菌等の微生物が含まれていないかを確認するための微生物検査が行われている。この微生物検査は、通常、検出対象となる食品を粉砕後、撹拌させた精製水である検体を寒天平板に付着又は混和させ、その後、微生物が目視可能となる幅約１００μｍ以上の微生物コロニーになるように一定期間培養し、次いで、微生物コロニーを目視によって探すことによって検査する寒天平板培養試験に準じた検査が行われている。
しかし、この検査方法は培養の期間として通常１日以上かかるため、より短時間で検査できる方法が望まれている。これに対していくつかの検査方法が提案されている（例えば特許文献１を参照。）。
【０００３】
特許文献１に記載される微生物検査方法は、検査対象の微生物が有する酵素に反応して蛍光物質を生ずる非蛍光物質を平板培地に拡散させ、平板培地の表面に光を照射して蛍光を発する箇所の個数から前記検体に含まれる検査対象の微生物コロニーの個数を測定している。また、個数の測定は、スキャナで行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平０７−１４７９９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載されているような従来の微生物検査方法では、食材の端切れやゴミ等の夾雑物が付着していた場合に、これら夾雑物が蛍光物質と混同される自家蛍光を放ったり、染色によって蛍光を放ったりすることがあり、微生物コロニーとの区別が困難になるという問題があった。
また、培養時間が短いと微生物コロニーが小さく、微生物コロニーの大きさと夾雑物の大きさとの違いが少なくなって、両者を区別することが困難となるという問題があった。
ＡＴＰ等の細胞内の物質を検出することで、短時間で微生物を検出する方法も知られているが、細胞内の物質を検出するために細胞が破壊されてしまう。このような検査方法では、１つの検体について微生物を検査した後に別の試験を行うことが不可能になり、例えば寒天平板培養試験を引き続き行うことができない。このため、複数の検体を用意する必要が生じ、検査に手間を要した。
【０００６】
本発明は、上記現状に鑑みてなされたものであり、短時間で微生物コロニーを検出し、検出時に微生物を死滅させることがない微生物検出装置、微生物検出プログラム及び微生物検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１．検体を付着させた基板を培地に載置することにより微生物を培養し、その後前記基板を蛍光染色剤溶液へ浸漬して染色を行うことにより微生物のコロニーを検出する微生物検出装置であって、前記蛍光染色剤により染色された前記検体を付着させた前記基板に対して励起光を照射し、前記基板を撮像して基板画像を取得する撮像部と、前記検体の染色後、所定の周期で前記撮像部に前記基板画像を取得させ、前記所定周期毎の前記基板画像上の１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求め、前記基板画像の背景の輝度を基準として前記各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する輝度補正手段と、前記検体の染色後所定の検査時間において、時間経過に伴い、前記補正輝度が所定値を超えたこと及び前記補正輝度の変化率が所定値を超えたことのうちの少なくとも１つが生じた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する判定手段と、を備え、前記撮像部は、前記基板が蓋付き容器に収容された状態で前記基板画像を取得し、前記蓋付き容器の蓋は透光性を備え、且つその内面に結露防止部が形成されている又は外部に結露防止具が設けられており、前記微生物コロニーの検出後に前記基板を培地に載置することにより培養を続行可能にすることを特徴とする微生物検出装置。
２．前記判定手段は、前記補正輝度が所定値を超え且つ前記補正輝度の変化率が所定値を超えた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する前記１．記載の微生物検出装置。
３．前記判定手段は、前記補正輝度の変化率が正の値となり、その後負の値となった場合は、前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する前記１．又は２．に記載の微生物検出装置。
４．検体を付着させた基板を所定の時間培地に載置することにより微生物を培養し、その後前記基板を蛍光染色剤溶液へ浸漬して染色を行うことにより微生物のコロニーを検出する微生物検出方法であって、前記蛍光染色剤により染色された前記検体を付着させた前記基板に対して励起光を照射し、前記基板を撮像して基板画像を取得する撮像工程と、前記検体の染色後、所定の周期で前記撮像工程により前記基板画像を取得させ、前記所定周期毎の前記基板画像上の１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求め、前記基板画像の背景の輝度を基準として前記各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する輝度補正工程と、前記検体の染色後所定の検査時間において、時間経過に伴い、前記補正輝度が所定値を超えたこと及び前記補正輝度の変化率が所定値を超えたことのうちの少なくとも１つが生じた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する判定工程と、を備え、前記微生物コロニーの検出後に前記基板を培地に載置することにより培養を続行可能にすることを特徴とする微生物検出方法。
５．前記判定工程は、前記補正輝度が所定値を超え且つ前記補正輝度の変化率が所定値を超えた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する前記４．記載の微生物検出方法。
６．前記判定工程は、前記補正輝度の変化率が正の値となり、その後負の値となった場合は、前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する前記４．又は５．に記載の微生物検出方法。
７．前記撮像工程は、前記基板が蓋付き容器に収容された状態で前記基板画像を取得し、前記蓋付き容器の蓋は透光性を備え、且つその内面に結露防止部が形成されている又は外部に結露防止具が設けられている前記４．乃至６．のいずれかに記載の微生物検出方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の微生物検出装置によれば、検体を付着させた基板を培地に載置することにより微生物を培養し、その後前記基板を蛍光染色剤溶液へ浸漬して染色を行うことにより微生物のコロニーを検出する微生物検出装置であって、前記蛍光染色剤により染色された前記検体を付着させた前記基板に対して励起光を照射し、前記基板を撮像して基板画像を取得する撮像部と、前記検体の染色後、所定の周期で前記撮像部に前記基板画像を取得させ、前記所定周期毎の前記基板画像上の１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求め、前記基板画像の背景の輝度を基準として前記各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する輝度補正手段と、前記検体の染色後所定の検査時間において、時間経過に伴い、前記補正輝度の変化率が所定値を超えた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する判定手段と、を備えるため、微生物コロニーの蛍光輝度と夾雑物及び基板背景の蛍光輝度とが同程度の輝度であったり、微生物コロニーと夾雑物の面積の大きさに差がなかったりする短時間の培養条件であっても、誤検出することなく微生物コロニーの検出を行うことができる。
また、本微生物検出装置による検出は、蛍光の撮像によるものであり、蛍光染色剤による染色の際に微生物を破壊するものではないため、本装置による検出後も寒天平板培養試験のための培養を続行することができる。これにより、１つの検体について本微生物検出装置により検査を行った後、同じ検体を用いて寒天平板培養試験等を行うことができるため、検出結果の検証も容易にすることができる。
【０００９】
前記判定手段は、前記補正輝度が所定値を超え且つ前記補正輝度の変化率が所定値を超えた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する場合は、補正輝度の大きさとその時間的変化とから微生物コロニーと夾雑物とを判別することにより、微生物コロニーをより高精度で検出することができる。
前記判定手段は、前記補正輝度の変化率が正の値となり、その後負の値となった場合は、前記区画に微生物コロニーが存在すると判定すれば、輝度が上昇した後、蛍光染色剤の消費等により輝度が減少する微生物コロニーを、確実に検出することができる。
前記輝度補正手段は、前記基板画像上の前記各区画の輝度の値から前記背景の輝度の値を減算することにより前記補正輝度を算出する場合は、容易に補正輝度を求め、微生物コロニーと夾雑物とを判別可能にすることができる。
前記撮像手段は、前記基板が蓋付き容器に収容された状態で前記基板画像を取得し、前記蓋付き容器の蓋は透光性を備え、且つその内面に結露防止部が形成されている又は外部に結露防止具が設けられている場合は、蓋付き容器の蓋が基板より低温となり結露しやすい状態になっても結露防止部により結露を防止することができる。
【００１０】
微生物のコロニーを検出する微生物検出プログラムによれば、前記微生物検出装置に好適な機能をコンピュータ上に実現することができる。
微生物のコロニーを検出するための微生物検出方法によれば、微生物コロニーの蛍光輝度と夾雑物及び基板背景の蛍光輝度とが同程度の輝度であったり、微生物コロニーと夾雑物の面積に大きさに差がなかったりする短時間の培養条件であっても、誤検出することなく微生物コロニーの検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本発明について、本発明による典型的な実施形態の非限定的な例を挙げ、言及された複数の図面を参照しつつ以下の詳細な記述にて更に説明するが、同様の参照符号は図面のいくつかの図を通して同様の部品を示す。
【図１】本微生物検出装置の構成を説明するための模式図である。
【図２】撮像期間における微生物、夾雑物及び基板の蛍光輝度の変化を示すグラフであり、(a)は輝度値、(b)は補正した輝度値、(c)は補正した輝度の変化率を示す。
【図３】蓋付き容器の外観を示す斜視図である。
【図４】蓋付き容器における容器本体の構造を説明するための模式断面図である。
【図５】蓋付き容器における蓋部の構造を説明するための模式断面図である。
【図６】微生物画素検出部による微生物検出の手順を説明するためのフローチャートである。
【図７】他の微生物画素検出部による微生物検出の手順を説明するためのフローチャートである。
【図８】撮像期間における微生物、夾雑物及び基板の蛍光輝度の変化を示すグラフである、(a)は輝度値、(b)は補正した輝度値、(c)は補正した輝度の変化率を示す。
【図９】撮像期間における微生物、夾雑物及び基板の蛍光輝度の変化を示すグラフである、(a)は輝度値、(b)は補正した輝度値、(c)は補正した輝度の変化率を示す。
【図１０】撮像期間における微生物、夾雑物及び基板の蛍光輝度の変化を示すグラフである、(a)は輝度値、(b)は補正した輝度値、(c)は補正した輝度の変化率を示す。
【図１１】蛍光顕微鏡により基板を撮像した画像である。
【図１２】図１１と同じ位置を撮像部により撮像された基板画像の一部である。
【図１３】本微生物検出装置による撮像を済ませた後に更に培養を続けた基板の表面を表す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ここで示される事項は例示的なもの及び本発明の実施形態を例示的に説明するためのものであり、本発明の原理と概念的な特徴とを最も有効に且つ難なく理解できる説明であると思われるものを提供する目的で述べたものである。この点で、本発明の根本的な理解のために必要である程度以上に本発明の構造的な詳細を示すことを意図してはおらず、図面と合わせた説明によって本発明の幾つかの形態が実際にどのように具現化されるかを当業者に明らかにするものである。
【００１３】
１．微生物検出装置
本実施形態に係る微生物検出装置（１）は、蛍光染色剤により染色されて励起光により蛍光を発するようになった検体を付着させた基板（６）の画像から微生物のコロニーを検出する検出装置であり、撮像部（２）と、輝度補正手段（４１）と、判定手段（４６）とを備える（図１を参照。）。また、計数手段（４７）を備えることができる。輝度補正手段（４１）、判定手段（４６）及び計数手段（４７）は、情報処理部（４）上に備えることができる。
【００１４】
前記検体は、微生物のコロニーの有無や数を検出する対象物であり、例えば、食品、飲料水、化粧品、原水、排水、工業用水、環境試料等を精製水に溶解させて調製した液状物を挙げることができる。微生物検出装置（１）により検出する微生物は特に問わず、例えば、大腸菌、腸炎ビブリオ、サルモネラ、リステリア、クロストリジウム、バチルス等の、グラム陽性、グラム陰性、好気性、嫌気性を問わずコロニーを形成する細菌等を挙げることができる。
前記蛍光染色剤は、検出対象となる微生物コロニーを選択的に染色できるものであればよく、検出する微生物によって適宜選択される。微生物の活性を利用する蛍光染色剤として、例えば、微生物のエステラーゼ活性により染色されるフルオレセインジアセテート等のＦＤＡ系染色剤、呼吸活性により染色されるＣＴＣ等のテトラゾリウム塩系染色剤等を挙げることができる。また、微生物の核や細胞壁に非特異的に結合する染色剤として、プロピジウムイオダイド、エチジウムブロマイド、ＤＡＰＩ、メチレンブルー、サフラニン、フクシン、クリスタルバイオレット、ゲンチアナバイオレット等を挙げることができる。また、検出対象となる微生物の染色を行うことなく、検出対象となる微生物が生産する酵素等により、酵素の誘導体から蛍光物質を代謝されてもよい。そのような酵素の例として、大腸菌が生成するβグルクロニダーゼ、βガラクトシダーゼ、βグルコシダーゼ等を挙げることができる。
【００１５】
前記基板（６）は、検体を付着させることができるものであればよく、検体中の微生物を培養するための培地や、メンブレンフィルタ等の濾過材等を例示することができる。
微生物検出装置（１）によって微生物コロニーが検出可能となるのに必要な時間は、検出対象となる微生物の種類はいうまでもなく、撮像部（２）の撮像解像度等によっても変化する。例えば、大腸菌を検出対象とする場合、通常、培養開始時点より３〜６時間で１つの大腸菌の数が１００〜１００００、径が約２０μｍ以上の微生物コロニーとなり、一般的な撮像素子を用いた撮像部（２）を用いて判別が可能となる。
【００１６】
以下、図１を参照しつつ微生物検出装置１を詳細に説明する。微生物検出装置１は、撮像部２と、情報処理部４とから構成することができる。情報処理部４には、輝度補正手段４１、判定手段４６等が備えられる。
（撮像部）
撮像部２は、少なくとも光源２３及び撮像素子２８を備え、光源２３から発せられる励起光が照射されている基板６を、撮像素子２８により撮像することにより基板画像を取得する。
撮像部２の具体的な構成は任意に選択することができ、例えば、基板６の載置台２２、励起光を発する光源２３、載置台２２に励起光を照射する落射照明部２４、基板６の撮像を行う撮像素子２８等から構成することができる。尚、撮像部２には、染色剤の反応条件を維持するための加熱手段等の温度維持手段を備えることができる。
載置台２２は、基板６を載置又は固定するための台であり、その載置方法及び固定方法は特に問わない。
光源２３は、検出対象となる微生物コロニーの蛍光の励起光を発するための光源であり、波長やエネルギーにより過度に光殺菌性を示さないのであればその種類を特に問わない。例えば、光源２３として、ＬＥＤランプ、水銀ランプ、ハロゲンランプ、レーザ発振器等を挙げることができる。
落射照明部２４は、基板に照射する光源の光路と、基板を撮像する撮像素子の光路の光軸と、を同一にするためのものであり、ダイクロイックミラーやプリズム等を組み合わせて構成することができる。
【００１７】
撮像素子２８は、微生物コロニーから発する蛍光の波長により基板６を撮像して、その画像（基板画像）を得ることができる手段であればよく、ＣＣＤイメージセンサ、ＣＭＯＳイメージセンサ、ＳＩＴイメージセンサ等を例示することができる。また、撮像素子は、エリアイメージセンサによって面状に撮像してもよいし、リニアイメージセンサによる走査を行って画像を得ても良い。
また、ダイクロイックミラーや光学フィルタ等を任意に組み合わせて、撮像素子２８に到達する蛍光の波長を限定することができる。
【００１８】
撮像部２によって撮影される基板６の画像は、複数枚の静止画として撮像してもよいし、動画として撮像してもよい。
また、撮像する基板６をそのまま載置台２２に載置して撮像してもよいし、基板６を容器７に入れて保護された状態で撮像してもよい。基板６を容器７に収容した状態で撮像部２により撮像を行う場合、図３、５に例示するように、通常透光性を備える蓋７２によって蓋がされた状態とし、上方から励起光を照射して撮像するようにすることができる。この場合、蓋７２の内面に結露防止部７５が形成されていることが好ましい。培養温度は室温より高いことが多く、検体が付着する基板６を入れた容器の蓋７２が外気によって冷やされ、蓋７２の内面に接する容器内の水蒸気が結露することにより蓋７２が曇り、撮像が困難になることがあるからである。
結露防止部７５は、蓋７２の透光性を維持しつつ、何らかの手段により蓋７２の内面が結露しないようにするための手段を備えていればよい。例えば、親水性の薬剤や界面活性剤等を蓋の内面に塗布等をすることを挙げることができる。また、透光性樹脂の蓋７２の内面表面に親水性官能基を付与したり、表面形状を変えたりすることによって表面を親水性とする親水性プラスチック加工等を行ってもよい。
また、結露防止部７５の代わりに蓋７２の外部に結露防止具が設けられてもよい。結露防止具は、蓋７２を覆うように設けられる透光性を備えるガラスヒータや、撮像時に各光路の外へ移動可能なヒータ等を挙げることができ、蓋７２の加温を行うことで蓋７２の内面の結露を防止することができる。
更に、蓋７２の結露を防止する方法として、基板６を容器本体７１に固定し、蓋７２が下方に向くように倒立させた状態で、下面に位置する蓋７２から撮像素子２８を用いて撮影する方法を挙げることができる。
【００１９】
（輝度補正手段）
輝度補正手段４１は、検体の染色後、所定の周期で撮像部２に基板画像を取得させ、所定周期毎の基板画像上の１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求め、基板画像の背景の輝度を基準として各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する手段である。
また、検査をするために要する時間は微生物の種類の他、撮像部の解像度等の条件にもよるが、例えば、大腸菌を対象とする場合、通常、検体の染色後１〜５０分間程度となる。上記検査時間において、輝度補正手段４１は、所定の周期で撮像部２に基板画像を取得させ、各時点の基板画像について所定の処理を行うように構成される。上記所定の周期は、時間の経過に伴う微生物コロニーからの蛍光の輝度変化を検出可能な間隔であればよく、例えば３０秒〜１０分程度とすることができる。また、周期は必ずしも一定である必要はなく、検体の染色後の経過時間によって変更されてもよい。
【００２０】
前記区画とは、基板画像において微生物コロニーを検出するための単位となるブロックであり、そのブロックの大きさは適宜選択されればよい。すなわち、１つの区画は、１つの画素であってもよいし、複数の画素（例えば、２×２、３×３等）からなる領域であってもよい。１つの区画の大きさは、検出しようとする微生物コロニーの大きさより小さいことが好ましい。区画の大きさが検出すべき微生物コロニーの大きさよりも大きいと、区画内に微生物コロニー周辺の背景が含まれて、正確に検出できなくなるからである。
輝度補正手段４１は、基板画像を上記区画毎に分割して、各区画の輝度を取得するようにすることができる。１つの区画が複数の画素からなる場合には、各画素で検出された輝度の平均値等を当該区画の輝度とすることができる。
【００２１】
輝度補正手段４１は、基板画像の背景の輝度（以下、背景輝度という。）を基準として、各区画の輝度を補正した補正輝度を算出するように構成されている。上記背景輝度は、基板画像において、微生物や、食材の端切れ・ゴミ等の夾雑物が存在しない領域の輝度である。輝度補正手段４１は、基板画像の全体から種々の方法で背景輝度を算出することが可能である。
背景輝度の具体的な算出方法は特に限定されない。通常、微生物や夾雑物等が存する区画数は、基板画像の全体の区画数に比べて僅かである。このため、例えば、同程度の輝度値となる区画数が最も多い区画の輝度を背景輝度とすることができる。具体的には、基板画像の輝度別の画素数を示すヒストグラムを生成し、そのヒストグラム中で最も大きな山となる箇所を背景輝度とすることができる。また、基板画像全体の輝度の平均値を背景輝度とすることもできる。その他、適宜選択した区画の輝度又は複数の区画の輝度の平均値等を背景輝度としてもよい。
【００２２】
輝度補正手段４１は、上記のように算出した背景輝度を基準として、基板画像全体の区画毎の輝度を補正した補正輝度を算出するように構成される。具体的な補正の方法は特に限定されず、例えば、各区画の輝度から上記背景輝度を差し引いた値を補正輝度とすることができる（図２（ａ）、（ｂ）を参照。）。また、背景輝度に対する各区画の輝度の比率を、補正輝度としてもよい。
【００２３】
輝度補正手段４１は、所定の周期で基板画像を取得する毎に、背景輝度及び補正輝度を算出するように構成することができる。取得した基板画像のデータ、背景輝度、及び区画毎の補正輝度は、情報処理部４内に備えられた記憶装置に格納しておくことができる。
また、輝度補正手段４１は、所定の周期で取得した基板画像のデータを記憶装置に格納しておき、検査中の適宜のタイミング又は検査終了後に、蓄積された基板画像のデータに基づいて各時点における背景輝度及び区画毎の補正輝度を算出するように構成することもできる。
【００２４】
（判定手段）
判定手段４６は、撮像時間経過に伴い、補正輝度が所定値を超えたこと及び補正輝度の変化率が所定値を超えたことのうちの少なくとも１つが生じた区画に微生物コロニーが存在すると判定する手段である。この判定をするためには、微生物コロニーと夾雑物とを識別する必要がある。
【００２５】
基板上の検体には、検出対象となる微生物の他に夾雑物が含まれている場合がある。例えば、図２（ａ）は、基板上に微生物（１、２、３）及び夾雑物が存在した場合の、染色後の経過時間に対する基板画像上の蛍光輝度の変化を表している。本例においては、微生物（１、２、３）が存する区画の蛍光輝度はいずれも、時間経過に伴い一旦増加し、その後減少している。これに対して、夾雑物が存する区画の蛍光輝度は、時間経過に伴い単調増加している。また、背景輝度は、時間経過に伴いより低いレベルで単調増加している。
【００２６】
図２（ｂ）は、図２（ａ）に示した各区画の蛍光輝度から背景輝度を差し引いた補正輝度の変化を示している。微生物（１、２、３）が存する区画の補正輝度はいずれも、時間経過に伴い一旦増加し、その後減少している。これに対して、夾雑物が存する区画の補正輝度は、微生物が存する区画の補正輝度よりも小さく、且つ時間経過によらずほぼ一定の値である。
図２（ｃ）は、図２（ｂ）に示した各区画の補正輝度について、１周期（５分）前の値からの変化率を表している。１又は複数の周期を単位とする補正輝度の変化率を、補正輝度の変化率とする。そうすると、微生物（１、２、３）が存する区画の補正輝度の変化率は相対的に大きな値であり、時間経過に伴い正の値となり、その後負の値となる。これに対して、夾雑物が存する区画の補正輝度の変化率は、微生物が存する区画の補正輝度の変化率よりもはるかに小さく、ほぼゼロとなる。
【００２７】
以上のような微生物（１、２、３）の蛍光輝度、夾雑物の蛍光輝度、及び背景輝度の変化から、判定手段４６は、撮像時間経過に伴い、補正輝度の変化量が所定値（図２（ｂ）に示すＳ０）を超えた場合には、その区画に微生物コロニーが存在すると判定することができる。
また、判定手段４６は、撮像時間経過に伴い、補正輝度の変化率が所定値（図２（ｃ）に示すＳ１）を超えた場合には、その区画に微生物コロニーが存在すると判定することができる。
更に、判定手段４６は、撮像時間経過に伴い、補正輝度が所定値を超え、且つ補正輝度の変化率が所定値を超えた場合には、その区画に微生物コロニーが存在すると判定することができる。
また、判定手段４６は、補正輝度の変化率が正の値となり、その後、負の値となった場合は、その区画に微生物コロニーが存在すると判定するようにすることもできる。
【００２８】
微生物の種類や染色条件によっては、蛍光輝度の変化が図２に示したような変化とは異なる場合もあるが（後述）、上記の判定方法を適宜選択することによって、微生物コロニーを検出することが可能となる。
なお、図２に示したように、微生物コロニーの蛍光輝度が一旦増加した後に減少するのは、蛍光染色剤の微生物による消費等が生じるためである。このように、微生物コロニーの蛍光の輝度がある時間まで増加した後に減少し、夾雑物及び背景の輝度に近い輝度となる場合も、微生物コロニーと夾雑物及び基板とを明確に区別することが可能である。
【００２９】
（計数手段）
微生物検出装置１には、微生物コロニーの計数手段４７を備えることができる。上記のとおり、輝度補正手段４１及び判定手段４６により、基板画像から微生物コロニーの存在する区画を検出することができる。計数手段４７は、その微生物コロニーの数や大きさを算出する手段である。
１つの微生物コロニーを判断する具体的な方法は特に問わず、微生物コロニーであると判定された区画が隣接して存在する場合には、合わせて１つの微生物コロニーと判断することができる。例えば、微生物コロニーであると判定された複数の区画が隣接しており、それぞれの補正輝度の大きさや変化率の値が一定の範囲である場合には、それらの区画をまとめて１つの微生物コロニーと判断することができる。そして、計数手段４７は、基板画像上の微生物コロニーの数を算定することができる。また、計数手段４７は、１つの微生物コロニーを構成する区画数又は画素数から、その微生物コロニーの大きさ（面積）を算定することができる。
【００３０】
以上の輝度補正手段４１、判定手段４６、計数手段４７は、ハードウェア、ソフトウェアのいずれによって実現されてもよい。通常は、撮像部２とのインターフェースを備えたコンピュータ上で動作するプログラムによって実現することができる。
【００３１】
２．微生物検出プログラム
微生物のコロニーを検出する微生物検出プログラムは、前記撮像部２を用いて基板画像を取得する撮像機能と、前記輝度補正手段４１をコンピュータ上に実現させる輝度補正機能と、前記判定手段４６をコンピュータ上に実現させる判定機能と、を備える。また、前記計数手段４７をコンピュータ上に実現させる計数機能を備えることができる。
図６に示すように、撮像機能は、蛍光染色剤により染色された検体を付着させた基板に対して励起光を照射し、前記基板を撮像して基板画像を取得させる（Ｓ１１）。
輝度補正機能は、前記検体の染色後所定の周期で前記撮像機能により前記基板画像を取得させ、所定周期毎の基板画像上の１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求め、基板画像の背景の輝度を算出し（Ｓ１２）、その背景の輝度を基準として各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する（Ｓ１３）。
判定機能は、時間経過に伴い、補正輝度が所定値を超えたこと及び前記補正輝度の変化率が所定値を超えたことのうちの少なくとも１つが生じた区画に微生物コロニーが存在すると判定する（Ｓ１４）。
計数機能は、検出した微生物コロニーの数や大きさを算出する（Ｓ１５）。
【００３２】
また、前記図２に示したような蛍光輝度が一旦増加した後に減少する輝度変化を生じる検体について適用することができる、微生物検出プログラムの処理の流れを図７に例示する。
撮像ステップＳ２１、背景輝度算出ステップＳ２２、補正輝度算出ステップＳ２３、計数ステップＳ２７は、それぞれ図６に示したステップＳ１１、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１５と同じであるため、説明を省略する。
【００３３】
[a]第１判定ステップ
第１判定ステップＳ２４として、各区画の補正輝度と、その１周期前の基板画像の同じ区画の補正輝度の差を算出し、その差が所定値以上大きい場合は、微生物コロニーが存在する可能性がある推定区画Ａとして検出する。
[b]第２判定ステップ
第２判定ステップＳ２５では、各区画の補正輝度から、その１周期前の基板画像の同じ区画の補正輝度を差し引き、その差が負であって絶対値が所定値を超える場合は、微生物コロニーが存在する可能性がある推定区画Ｂとして検出する。
[c]第３判定ステップ
第３判定ステップＳ２６では、推定区画Ａとして検出され、その後に推定区画Ｂとして検出された区画を、微生物コロニーが存在する区画Ｃと判定する。即ち、基板画像上の同じ位置であって、過去に推定区画Ａとして検出され、その後に推定区画Ｂとして検出されたが区画を、微生物コロニーがある区画Ｃと判定する。
【００３４】
３．微生物検出方法
以下、実施例に基づいて微生物検出方法を具体的に説明する。
本微生物検出方法は、図１に示したような前記微生物検出装置１を用いて微生物のコロニーを検出する。
撮像部２は、筐体２１内に設けられており、基板６の載置台２２と、載置台２２の上方に配置される落射照明部２４と、落射照明部２４の上方に配置される撮像素子２８と、落射照明部２４の側方に配置される光源２３を備える。筐体２１内は加熱手段等によって、一定の温度に保たれている。
落射照明部２４は光学フィルタ２６、及びダイクロイックミラー２５により、側方から入射する光源２３からの励起光を下方の載置台２２側に反射させる。また、載置台２２から発せされる蛍光を、光学フィルタ２７を介して上方の撮像素子２８に透過させる。更に、側方からの入射光は光学フィルタ２６、及びダイクロイックミラー２５により励起光として必要な波長に制限され、下方からの入射光は、ダイクロイックミラー２５及び光学フィルタ２７により蛍光付近の波長に制限される。撮像素子２８は、ＣＣＤイメージセンサを用いたカメラを用いる。
情報処理部４は、パーソナルコンピュータ等のコンピュータ装置であり、前記微生物検出プログラムを実行することができる。
基板６は、蓋付き容器７内に収容された状態で載置台２２に載置される。蓋付き容器７は樹脂製であり、図３〜５に示すように、容器本体７１と、容器本体７１に被せる蓋部７２とを備える。また、蓋部７２の天面は励起光及び蛍光に対して透光性を備え、内面側（容器本体７１と対向する面）には、界面活性剤の塗布や親水性プラスチック加工等により形成された結露防止部７５を備える。
【００３５】
先ず、検出対象を溶解させた精製水である検体を、基板６であるメンブレンフィルタによって濾過する。濾過によって検体に微生物が含まれていれば基板６に付着する。次いで、この基板６をプレート上の寒天平板培地に載置し、３７℃に保った恒温槽内で培養を行う。この培養時間は、大腸菌であれば３〜６時間である。
培養時間を経過したとき、基板上に大腸菌が付着していれば、図１１に示すように大腸菌の数が１つの状態から１００〜１００００、幅１０〜２０μｍのコロニーになる。
上記培養時間が経過した基板６を、蛍光染色剤の溶液を入れた容器本体７１内に収納し、浸漬させることで染色させる。その後、蓋部７２により蓋をして、載置台２２に載置する。
【００３６】
上記のように、検体を染色した後、以下の撮像工程、輝度補正工程、判定工程、計数工程を実施する。
（撮像工程）
撮像工程では、蛍光染色剤により染色された検体を付着させた基板６に対して、励起光を照射し、基板６を撮像素子２８によって撮影して基板画像を取得する。励起光の波長は撮像素子２８に入射する蛍光の波長より短く、一般的に３７０〜６５０μｍであり、光源２３の光を落射照明部２４を介して蓋付き容器７の上方から照射する。
【００３７】
（輝度補正工程）
輝度補正工程は、前記撮像工程により基板画像を取得させる（画像取得ステップ）。画像取得ステップによる基板画像の取得は、前記検体の染色後５分周期で３０分間にわたり繰り返して行い、複数の基板画像を得る。撮影された基板画像の一例を、図１２に示す。
なお、一連の撮像が完了した後は、蓋付き容器７から基板６を取り出して、再度プレートに載置して培養器に戻し、培養の継続を行うことができる。
輝度補正工程では、５分毎に取得される前記基板画像において、１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求める。例えば、基板画像を格子状に分割し、各格子で囲まれた正方形のブロックを１つの区画とし、その区画に含まれる複数画素の平均輝度を、その区画の輝度とする。そして、各基板画像の背景輝度を算出する（背景輝度算出ステップ）。次に、算出された背景輝度を基準として各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する（補正輝度算出ステップ）。
【００３８】
上記背景輝度算出ステップでは、撮像された基板画像の輝度別の画素（区画）数を示すヒストグラムを生成し、そのヒストグラム中で最も大きな山となる箇所を背景輝度として算出する。また、各基板画像について背景輝度を算出する。
次に、上記補正輝度算出ステップでは、各基板画像の区画毎の輝度を背景輝度により補正した補正輝度を求める。各区画の補正輝度は、それぞれの区画の輝度から背景輝度を差し引いた値とする。
【００３９】
（判定工程）
次いで、判定工程として、各基板画像の各区画に微生物コロニーが存在するか否かの判定を行う。前記のとおり、補正輝度が所定値を超えた場合、補正輝度の変化率が所定値を超えた場合、補正輝度の変化率が正の値から負の値に変化した場合等には、その区画に微生物コロニーが存在すると判定することができる。検出対象の微生物の種類等に応じてこれらの判定条件を選択し又は組み合わせて、微生物コロニーが存在するか否かを判定するようにすることができる。また、微生物コロニーが存在すると判定された複数の区画が隣接している場合は、１つの微生物コロニーとして取り扱うことができる。
以上により、微生物コロニーの大きさが、夾雑物の大きさと差がない場合であっても明確に区別することができる。また、微生物コロニーの区画の蛍光輝度が、夾雑物や基板の背景の蛍光輝度と大きく差がない場合であっても、微生物コロニーを明確に区別することができる。
【００４０】
（計数工程）
その後、各基板画像上の微生物コロニーの数を計数する計数工程を行うことができる。微生物コロニーの数は、各基板画像において微生物コロニーが検出された区画の数とすることができる。微生物コロニーが存在すると判定された複数の区画が隣接している場合は、１つの微生物コロニーとして取り扱うことができる。また、１つの微生物コロニーを構成する区画数から、その微生物コロニーの大きさ（面積）を求めることができる。
【００４１】
本微生物検出方法によれば、蛍光染色剤の添加及び励起光の照射だけで微生物コロニーを検出するため、基板６上の微生物が死滅し難く、本微生物検出方法の実施後に基板６の培養を継続することができる。培養を継続することによって、図１３に示すように目視可能な大きさまで微生物コロニーを成長させることができ、目視により微生物コロニーを計数することもできる。このため、微生物の検出をするために、培地を複数用意する必要がない。
【００４２】
本微生物検出方法により基板画像上の輝度の変化を計測した例を、図２及び図８〜９に示す。ただし、各グラフに示す微生物、夾雑物、背景輝度を求めた各区画の位置は、本微生物検出方法による全ての撮像が終わった時点の基板を、図１１に示すように蛍光顕微鏡によって観察して確認した区画（図１２の輝点を参照）に従った。
図２及び図８〜９において、(a)は、撮像素子２８で得られた基板画像の各区画の蛍光輝度の変化を示している。また、(b)は、背景輝度により各区画の輝度を補正した補正輝度の変化を示している。更に、(c)は、補正輝度の変化率を示している。
【００４３】
図８（及び前記の図２）は、４時間培養後、蛍光染色剤としてＦＤＡ（フルオレセインジアセテート）を用いて染色させた基板６の輝度の変化を示すグラフである。ここで、各微生物（４、５）は、図１１及び１２に示したように、本微生物検出方法による計測完了後、蛍光顕微鏡で観察して位置を特定した微生物コロニーである。また、各夾雑物１、２は、大きさが約１００μｍのキャベツ片を検体中に含め、基板６による濾過を行うことで基板６に付着させた。
【００４４】
図８において、（ａ）を見れば、補正前の輝度の大きさからは、検体中の微生物４、５と、各夾雑物と、基板の背景とを区別することが困難である。しかし、同図（ｂ）に示される補正輝度の変化を見ると、微生物４、５は、計測開始から約５分間において、夾雑物１、２に比べて、補正輝度が大きく上昇し、補正輝度の変化率も大きい。これに対して、夾雑物１、２の補正輝度は大きく変化していない。また、同図（ｃ）を見ても、計測開始から約５分間において、微生物４、５の補正輝度変化率は、夾雑物１、２と比較して際立っている。
したがって、図８に示すような検体については、染色後の短時間における基板画像に基づいて算出される補正輝度の変化から、微生物コロニーの検出が可能である。
【００４５】
図９及び１０は、基板６としてメンブレンフィルタではなく寒天平板を用いて、５時間培養後、蛍光染色剤としてテトラゾリウム塩類であるＣＴＣを用いて寒天平板上に生育した微生物コロニーを直接染色した際の基板画像の輝度の変化を示すグラフである。基板には、夾雑物として、大きさが約２０μｍのキャベツ片が付着している。
図９（ａ）を見れば、補正前の輝度の大きさからは、検体中の微生物６〜８と、夾雑物と、基板の背景とを区別することが困難である。しかし、同図（ｂ）に示される補正輝度の変化を見ると、微生物６〜８は、計測開始から約１０分間において、夾雑物に比べて、補正輝度が大きく上昇している。これに対して、夾雑物の補正輝度は大きく変化していない。また、同図（ｃ）を見ても、計測開始から約１０分間において、微生物６〜８の補正輝度変化率は、夾雑物と比較して際立っている。
したがって、図９に示すような検体についても、染色後の短時間における基板画像に基づいて算出される補正輝度の変化から、微生物コロニーの検出が可能である。
【００４６】
また、図１０に示す例においても、微生物９〜１１は、計測開始から５分程度の間に補正輝度が大きく増加している（同図（ｂ）、（ｃ））。これに対して、夾雑物の補正輝度は大きく変化していない。
したがって、図１０に示すような検体についても、染色後の短時間における基板画像に基づいて算出される補正輝度の変化から、微生物コロニーの検出が可能である。
【００４７】
本発明は以上で詳述した実施形態に限定されず、本発明の請求項に示した範囲で様々な変形又は変更が可能である。
【符号の説明】
【００４８】
１；微生物検出装置、
２；撮像部、２１；筐体、２２；載置台、２３；光源、２４；落射照明部、２５；ダイクロイックミラー、２６、２７；光学フィルタ、２８；撮像素子、
４；情報処理部、４１；輝度補正手段、４６；判定手段、４７；計数手段、
６；基板（メンブレンフィルタ）、
７；蓋付き容器、７１；容器本体、７２；蓋部、７５；結露防止部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006692075.tif 000009
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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