(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫ細胞または臍帯血単核球を構成する細胞のＮＯ産生能を増強する方法であって、
ＮＫ細胞または臍帯血単核球を構成する細胞を、その水溶液が低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示すハイドロゲル形成性の高分子を含む水溶液中に低温ゾル状態で包埋すること、および
前記細胞を含む前記水溶液を高温ゲル状態とし、該細胞を微小重力下で培養すること、を含む前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法を含む、ＮＯ産生能が増強されたＮＫ細胞または臍帯血単核球を構成する細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の機能増強方法に関し、詳しくは人あるいは所定の動物の骨髄、臍帯血又は末梢血から採取した幹細胞やNK（Natural Killer）細胞などの免疫細胞の機能を増強する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に「宇宙は無重力」と表現されるが、正確には「無重力」ではなく「微小重力」という。例えば、スペースシャトル内では10-3G、宇宙ステーション「きぼう」内では10-4G程度の重力環境である。宇宙船の中にある対象物と、宇宙船が同じスピードで地球の周りを自由落下しているため、擬似的「無重力」環境が生じる。放物線を描いて上昇、下降する飛行機内でも、放物線の頂上で20秒から30秒の間「微小重力」環境が創り出される。
重力分散型模擬微小重力装置（３D−クリノスタット）は、直交二軸のまわりに試料を360°回転させ重力ベクトルをX、Y、Z軸方向に分散、相殺させることにより宇宙環境と同じ10-3Gの環境を作り出す装置である。
上記の重力分散型模擬微小重力装置を使用してES細胞やiPS細胞などの幹細胞を培養すると未分化状態を維持できること（特開2003-9852）など、このような微小重力環境が細胞や組織に様々な変化、例えば増殖、分化、活性化、細胞活性の阻害などをもたらすことから、再生医療分野で微小重力環境が重要となっている。
【０００３】
ナチュラルキラー（NK）細胞は、抗原による事前感作を要することなく、癌細胞を破壊する能力を持った大型の顆粒リンパ球である。自己免疫強化療法（AIET）は、インターロイキンを用いた体外増殖培養により活性化された患者自身のNK細胞やTリンパ球を悪性腫瘍患者に投与し、癌細胞に対してNK細胞やTリンパ球の細胞毒性を発揮させる治療様式である。
NK細胞の事前感作無しで癌細胞を殺傷する特殊な能力は、特に固形癌に対する攻撃、あるいは血液癌における造血幹細胞移植において、NK細胞がドナー細胞移植を助けて、骨髄移植の致命的な副作用として知られる移植片宿主拒絶反応（GVHD）を防止することに有効である。
【０００４】
骨髄単核球（BMMNCs）と臍帯血単核球（UCBMNCs）は2つの主たる幹細胞、すなわち造血幹細胞（HSC）と間葉系幹細胞（MSC）を含んでいる。HSCは血管新生の主要な役割を担い、MSCは細胞外マトリックス構築の中で独特の免疫調整機能を持つ。HSCとMSCの応用は必然的にそれらの主要な生物学的機能である血管新生と細胞外マトリックス構築にそれぞれ基づいたものとなる。
【０００５】
一酸化窒素（NO）は、前記３種類（NK細胞、BMMNCs、UCBMNCs）いずれの細胞でも、その生理学的機能と組織学的機能のいくつかに関与する重要な生物学的分子である。NOは主要な生物学的シグナル伝達分子であり、血管拡張、神経変調、血管恒常性などや、免疫反応で重要な役割を果たす。NOは一酸化窒素合成酵素（NOS）という酵素による触媒反応で生成される。誘導性一酸化窒素合成酵素（iNOS）は免疫反応でのNO生成で働き、内皮細胞一酸化窒素合成酵素（eNOS）は血管新生に関与する。
NK細胞の場合、NOはNK細胞の活性化を制御し、細胞殺傷を仲介する。BMMNCsの場合、NOはBMMNCsのeNOSを活性化し血管新生を増強する。UCBMNCsの場合、NOはUCBMNCsの内皮前駆細胞のeNOSを発現させる。このように、NOの増大は、細胞の生物学的特性を強めることを助長する。
【０００６】
微小重力刺激がiNOS経路によるNO産生を介した血管新生を促進することが知られている（Siamwala JH, Majumder S, Tamilarasan KP, Muley A, Reddy SH, Kolluru GK, Sinha  S, Chatterjee S. Simulated microgravity promotes nitric oxide-supported angiogenesis via the iNOS-cGMP-PKG pathway in macrovascular endothelial cells. FEBS Lett. 2010 Aug 4;584(15):3415-23）。NK細胞の場合、宇宙飛行（Buravkova LB, Grigor'eva OV, Rykova MP, Grigor'ev AI. Cytotoxic activity of natural killer cells in vitro under microgravity Dokl Biol Sci. 2008 Jul-Aug;421:275-7））と微小重力がNK細胞の細胞毒性を低下させるが、この作用はインターロイキン-15単独、あるいはインターロイキン-12によって中和されることも知られている（Li Q, Mei Q, Huyan T, Xie L, Che S, Yang H, Zhang M, Huang Q. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 2013 Aug;13(8):703-14）。インターロイキンによる細胞活性化は、AIETや生体内での細胞活性化にも利用されている。
【０００７】
骨髄間葉系細胞を微小重力下で培養すると、高い遊走能を保持したまま未分化状態を維持し、通常培養に比べて、脊髄外傷に対する移植において良好な結果が得られている（Mitsuhara T, Takeda M, Yamaguchi S, Manabe T, Matsumoto M, Kawahara Y, Yuge L, Kurisu K. Simulated microgravity facilitates cell migration and neuroprotection after bone marrow stromal cell transplantation in spinal cord injury. Stem Cell Res Ther. 2013 Apr 1;4(2):35）。
造血幹細胞を微小重力下で培養すると、通常重力培養に比べて、細胞数と前駆細胞数の増大が見られた（Plett PA, Frankovitz SM, Abonour R, Orschell-Traycoff CM. Proliferation of human hematopoietic bone marrow cells in simulated microgravity. In vitro Cell Dev Biol Anim. 2001 Feb;37(2):73-8）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Siamwala JH, Majumder S, Tamilarasan KP, Muley A, Reddy SH, Kolluru GK, Sinha  S, Chatterjee S. Simulated microgravity promotes nitric oxide-supported angiogenesis via the iNOS-cGMP-PKG pathway in macrovascular endothelial cells. FEBS Lett. 2010 Aug 4;584(15):3415-23）
【非特許文献２】Buravkova LB, Grigor'eva OV, Rykova MP, Grigor'ev AI. Cytotoxic activity of natural killer cells in vitro under microgravity Dokl Biol Sci. 2008 Jul-Aug;421:275-7）
【非特許文献３】Li Q, Mei Q, Huyan T, Xie L, Che S, Yang H, Zhang M, Huang Q. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 2013 Aug;13(8):703-14
【非特許文献４】Mitsuhara T, Takeda M, Yamaguchi S, Manabe T, Matsumoto M, Kawahara Y, Yuge L, Kurisu K. Simulated microgravity facilitates cell migration and neuroprotection after bone marrow stromal cell transplantation in spinal cord injury. Stem Cell Res Ther. 2013 Apr 1;4(2):35
【非特許文献５】Plett PA, Frankovitz SM, Abonour R, Orschell-Traycoff CM. Proliferation of human hematopoietic bone marrow cells in simulated microgravity. In vitro Cell Dev Biol Anim. 2001 Feb;37(2):73-8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、微小重力下で培養するだけでは、各種細胞の機能を増強することが十分ではなかった。本発明は、NK細胞のNO産生能など、各種細胞の機能をより増強する方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ヒトの体内にあって癌を殺傷するNK細胞が、その水溶液が低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示すハイドロゲル形成性の高分子を少なくとも含む水溶液中に低温ゾル状態で包埋した後、前記細胞を含む前記水溶液を高温ゲル状態とし、さらに微小重力を短時間負荷されることで、癌を殺傷する能力が増強されることを見出した。フローサイトメトリーによる分析から細胞数やCDマーカー陽性率の上昇が認められた。同様に、臍帯血細胞や骨髄細胞でも上記と同様の増大が認められた。これらの細胞における上記のような細胞能力の増強は、固形臓器癌の処置やいくつかの血液癌への対処、骨髄移植を受けた患者の処置などに多大な有用性がある。この細胞増強方法は再生医療において、細胞の回収、回復、復活、復元方法としてより有効に用いられる。
【発明の効果】
【００１１】
以上に説明したように、本発明によればNK細胞、臍帯血細胞や骨髄細胞の機能を効率良く増強することができ、固形臓器癌の処置やいくつかの血液癌への対処、骨髄移植を受けた患者の処置などに多大な有用性がある。この細胞増強方法は再生医療において、細胞の回収、回復、復活、復元方法としてより有効に用いられる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の内容について詳細に説明する。
本発明の微小重力環境は宇宙空間や放物線を描いて上昇、下降する飛行機内の環境を利用しても良いが、地上で簡便に実施できる点からは、重力分散型模擬微小重力装置（３D−クリノスタット）を用いることが好ましい。
重力分散型模擬微小重力装置は、直交二軸のまわりに試料を360°回転させ重力ベクトルをX、Y、Z軸方向に分散、相殺させることにより宇宙環境と同じ10-3Gの環境を作り出す装置である。
【００１３】
（ハイドロゲル形成性の高分子、TGP）
本発明の「ハイドロゲル形成性高分子」（Thermoreversible Gelation Polymer, TGP）とは、架橋（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）構造ないし網目構造を熱可逆的に生成し、該構造に基づき、その内部に水等の分散液体を保持するハイドロゲルを熱可逆的に形成可能な性質を有する高分子をいう。又、「ハイドロゲル」とは高分子からなる架橋ないし網目構造と該構造中に支持ないし保持された水を含むゲルをいう。
【００１４】
（ゾル−ゲル転移温度）
本発明において「ゾル状態」、「ゲル状態」および「ゾル−ゲル転移温度の定義および測定は、文献（H. Yoshioka ら、Journal of Macromolecular Science, A31(1), 113 (1994)）に記載された定義および方法に基づく。即ち、観測周波数１Ｈｚにおける試料の動的弾性率を低温側から高温側へ徐々に温度を変化（１℃／１分）させて測定し、該試料の貯蔵弾性率（Ｇ´、弾性項）が損失弾性率（Ｇ″、粘性項）を上回る点の温度をゾル−ゲル転移温度とする。一般に、Ｇ″＞Ｇ´の状態がゾルであり、Ｇ″＜Ｇ´の状態がゲルであると定義される。このゾル−ゲル転移温度の測定に際しては、下記の測定条件が好適に使用可能である。
＜動的・損失弾性率の測定条件＞
測定機器（商品名）：ストレス制御式レオメーター  AR500、TAインスツルメント社製
試料溶液（ないし分散液）の濃度（ただし「ゾル−ゲル転移温度を有するハイドロゲル形成性高分子」の濃度として）：１０（重量）％
試料溶液の量：約０．８ ｇ
測定用セルの形状・寸法：アクリル製平行円盤（直径４．０ｃｍ）、ギャップ６００μｍ
測定周波数：1Hz
適用ストレス：線形領域内。
【００１５】
本発明においては、上記ゾル−ゲル転移温度は０℃より高く、37℃以下であることが好ましく、更には、5℃より高く35℃以下（特に10℃以上33℃以下である）ことが好ましい。
このような好適なゾル−ゲル転移温度を有するTGPは、後述するような具体的な化合物の中から、上記したスクリーニング方法（ゾル−ゲル転移温度測定法）に従って容易に選択することができる。
上述したような熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す（すなわち、ゾル−ゲル転移温度を有する）限り、本発明のTGPは特に制限されない。
その水溶液がゾル−ゲル転移温度を有し、該転移温度より低い温度で可逆的にゾル状態を示す高分子の具体例としては、例えば、ポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等に代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のエーテル化セルロース；キトサン誘導体（K.R.Holme.et al. Macromolecules,２４，３８２８（１９９１））等が知られている。
【００１６】
（好適なハイドロゲル形成性高分子）
本発明のTGPとして好適に使用可能な、架橋形成に疎水結合を利用したハイドロゲル形成性高分子は、曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなることが好ましい。
該親水性のブロックは、ゾル−ゲル転移温度より低い温度で該ハイドロゲルが水溶性になるために存在することが好ましく、また曇点を有する複数のブロックは、ハイドロゲルがゾル−ゲル転移温度より高い温度でゲル状態に変化するために存在することが好ましい。
換言すれば、曇点を有するブロックは該曇点より低い温度では水に溶解し、該曇点より高い温度では水に不溶性に変化するために、曇点より高い温度で、該ブロックはゲルを形成するための疎水結合からなる架橋点としての役割を果たす。すなわち、疎水性結合に由来する曇点が、上記ハイドロゲルのゾル−ゲル転移温度に対応する。
ただし、該曇点とゾル−ゲル転移温度とは必ずしも一致しなくてもよい。これは、上記した「曇点を有するブロック」の曇点は、一般に、該ブロックと親水性ブロックとの結合によって影響を受けるためである。
【００１７】
本発明に用いるハイドロゲルは、疎水性結合が温度の上昇と共に強くなるのみならず、その変化が温度に対して可逆的であるという性質を利用したものである。１分子内に複数個の架橋点が形成され、安定性に優れたゲルが形成される点からは、TGPが「曇点を有するブロック」を複数個有することが好ましい。
一方、上記TGP中の親水性ブロックは、前述したように、該TGPがゾル−ゲル転移温度よりも低い温度で水溶性に変化させる機能を有し、上記転移温度より高い温度で疎水性結合力が増大しすぎて上記ハイドロゲルが凝集沈澱してしまうことを防止しつつ、含水ゲルの状態を形成させる機能を有する。
さらに本発明に用いるTGPは、生体内で分解、吸収されるものであることが望ましい。すなわち、本発明のTGPが生体内で加水分解反応や酵素反応により分解されて、生体に無害な低分子量体となって吸収、排泄されることが好ましい。
本発明のTGPが曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなるものである場合には、曇点を有するブロックと親水性のブロックの少なくともいずれか、好ましくは両方が生体内で分解、吸収されるものであることが好ましい。
【００１８】
（曇点を有する複数のブロック）
曇点を有するブロックとしては、水に対する溶解度−温度係数が負を示す高分子のブロックであることが好ましく、より具体的には、ポリプロピレンオキサイド、プロピレンオキサイドと他のアルキレンオキサイドとの共重合体、ポリＮ−置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ−置換メタアクリルアミド誘導体、Ｎ−置換アクリルアミド誘導体とＮ−置換メタアクリルアミド誘導体との共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物からなる群より選ばれる高分子が好ましく使用可能である。
曇点を有するブロックを生体内で分解、吸収されるものとするには、曇点を有するブロックを疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸から成るポリペプチドとすることが有効である。あるいはポリ乳酸やポリグリコール酸などのポリエステル型生分解性ポリマーを生体内で分解、吸収される曇点を有するブロックとして利用することもできる。
上記の高分子（曇点を有するブロック）の曇点が４℃より高く４０℃以下であることが、本発明に用いる高分子（曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合した化合物）のゾル−ゲル転移温度を0℃より高く37℃以下とする点から好ましい。
ここで曇点の測定は、例えば、上記の高分子（曇点を有するブロック）の約１質量％の水溶液を冷却して透明な均一溶液とした後、除々に昇温（昇温速度約１℃／ｍｉｎ）して、該溶液がはじめて白濁する点を曇点とすることによって行うことが可能である。
【００１９】
本発明に使用可能なポリＮ−置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ−置換メタアクリルアミド誘導体の具体的な例を以下に列挙する。
ポリ−Ｎ−アクロイルピペリジン；ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド；ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−イソプロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン；ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド。
上記の高分子は単独重合体（ホモポリマー）であっても、上記重合体を構成する単量体と他の単量体との共重合体であってもよい。このような共重合体を構成する他の単量体としては、親水性単量体、疎水性単量体のいずれも用いることができる。一般的には、親水性単量体と共重合すると生成物の曇点は上昇し、疎水性単量体と共重合すると生成物の曇点は下降する。従って、これらの共重合すべき単量体を選択することによっても、所望の曇点（例えば４℃より高く４０℃以下の曇点）を有する高分子を得ることができる。
【００２０】
（親水性単量体）
上記親水性単量体としては、Ｎ−ビニルピロリドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルメタアクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、酸性基を有するアクリル酸、メタアクリル酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸等、並びに塩基性基を有するＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
（疎水性単量体）
一方、上記疎水性単量体としては、エチルアクリレート、メチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート等のアクリレート誘導体およびメタクリレート誘導体、Ｎ−ｎ−ブチルメタアクリルアミド等のＮ−置換アルキルメタアクリルアミド誘導体、塩化ビニル、アクリロニトリル、スチレン、酢酸ビニル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
（親水性のブロック）
一方、上記した曇点を有するブロックと結合すべき親水性のブロックとしては、具体的には、メチルセルロース、デキストラン、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリＮ−ビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリＮ−メチルアクリルアミド、ポリヒドロキシメチルアクリレート、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸およびそれらの塩；ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられる。
また親水性のブロックは生体内で分解、代謝、排泄されることが望ましく、アルブミン、ゼラチンなどのたんぱく質、ヒアルロン酸、ヘパリン、キチン、キトサンなどの多糖類などの親水性生体高分子が好ましく用いられる。
【００２３】
曇点を有するブロックと上記の親水性のブロックとを結合する方法は特に制限されないが、例えば、上記いずれかのブロック中に重合性官能基（例えばアクリロイル基）を導入し、他方のブロックを与える単量体を共重合させることによって行うことができる。また、曇点を有するブロックと上記の親水性のブロックとの結合物は、曇点を有するブロックを与える単量体と、親水性のブロックを与える単量体とのブロック共重合によって得ることも可能である。また、曇点を有するブロックと親水性のブロックとの結合は、予め両者に反応活性な官能基（例えば水酸基、アミノ基、カルボキシル基、イソシアネート基等）を導入し、両者を化学反応により結合させることによって行うこともできる。この際、親水性のブロック中には通常、反応活性な官能基を複数導入する。また、曇点を有するポリプロピレンオキサイドと親水性のブロックとの結合は、例えば、アニオン重合またはカチオン重合で、プロピレンオキサイドと「他の親水性ブロック」を構成するモノマー（例えばエチレンオキサイド）とを繰り返し逐次重合させることで、ポリプロピレンオキサイドと「親水性ブロック」（例えばポリエチレンオキサイド）が結合したブロック共重合体を得ることができる。このようなブロック共重合体は、ポリプロピレンオキサイドの末端に重合性基（例えばアクリロイル基）を導入後、親水性のブロックを構成するモノマーを共重合させることによっても得ることができる。更には、親水性のブロック中に、ポリプロピレンオキサイド末端の官能基（例えば水酸基）と結合反応し得る官能基を導入し、両者を反応させることによっても、本発明に用いる高分子を得ることができる。また、ポリプロピレングリコールの両端にポリエチレングリコールが結合した、プルロニック  Ｆ−１２７（商品名、旭電化工業（株）製）等の材料を連結させることによっても、本発明に用いるTGPを得ることができる。
【００２４】
この曇点を有するブロックを含む態様における本発明の高分子は、曇点より低い温度においては、分子内に存在する上記「曇点を有するブロック」が親水性のブロックとともに水溶性であるので、完全に水に溶解し、ゾル状態を示す。しかし、この高分子の水溶液の温度を上記曇点より高い温度に加温すると、分子内に存在する「曇点を有するブロック」が疎水性となり、疎水的相互作用によって、別個の分子間で会合する。
一方、親水性のブロックは、この時（曇点より高い温度に加温された際）でも水溶性であるので、本発明の高分子は水中において、曇点を有するブロック間の疎水性会合部を架橋点とした三次元網目構造を持つハイドロゲルを生成する。このハイドロゲルの温度を再び、分子内に存在する「曇点を有するブロック」の曇点より低い温度に冷却すると、該曇点を有するブロックが水溶性となり、疎水性会合による架橋点が解放され、ハイドロゲル構造が消失して、本発明のTGPは、再び完全な水溶液となる。このように、好適な態様における本発明の高分子のゾル−ゲル転移は、分子内に存在する曇点を有するブロックの該曇点における可逆的な親水性、疎水性の変化に基づくものであるので、温度変化に対応して、完全な可逆性を有する。
本発明者らの検討によれば、上記したTGPの水中における微妙な親水性−疎水性のバランスが、細胞を水中で低温保存する際の細胞の安定性に寄与しているものと考えられる。
【００２５】
（ゲルの溶解性）
上述したように水溶液中でゾル−ゲル転移温度を有する高分子を少なくとも含む本発明のハイドロゲル形成性の高分子は、該ゾル−ゲル転移温度より高い温度（ｄ℃）で実質的に水不溶性を示し、ゾル−ゲル転移温度より低い温度（ｅ℃）で可逆的に水可溶性を示す。
上記した高い温度（ｄ℃）は、ゾル−ゲル転移温度より１℃以上高い温度であることが好ましく、２℃以上（特に５℃以上）高い温度であることが更に好ましい。また、上記「実質的に水不溶性」とは、上記温度（ｄ℃）において、水１００ｍｌ（リットル）に溶解する上記高分子の量が、５．０ｇ以下（更には０．５ｇ以下、特に０．１ｇ以下）であることが好ましい。
一方、上記した低い温度（ｅ℃）は、ゾル−ゲル転移温度より（絶対値で）１℃以上低い温度であることが好ましく、２℃以上（特に５℃以上）低い温度であることが更に好ましい。また、上記「水可溶性」とは、上記温度（ｅ℃）において、水１００ｍｌ（リットル）に溶解する上記高分子の量が、０．５ｇ以上（更には１．０ｇ以上）であることが好ましい。更に「可逆的に水可溶性を示す」とは、上記TGPの水溶液が、一旦（ゾル−ゲル転移温度より高い温度において）ゲル化された後においても、ゾル−ゲル転移温度より低い温度においては、上記した水可溶性を示すことをいう。
上記高分子は、その１０％水溶液が５℃で、１０〜３，０００センチポイズ  （更には５０〜１，０００センチポイズ）の粘度を示すことが好ましい。このような粘度は、例えば以下のような測定条件下で測定することが好ましい。
粘度計：ストレス制御式レオメータ（機種名：AR500、TAインスツルメンツ社製）
ローター直径：６０ｍｍ
ローター形状：平行平板
【００２６】
本発明のTGPの水溶液は、上記ゾル−ゲル転移温度より高い温度でゲル化させた後、多量の水中に浸漬しても、該ゲルは実質的に溶解しない。上記TGPが形成するハイドロゲルの上記特性は、例えば、以下のようにして確認することが可能である。
すなわち、TGP０．１５ｇを、上記ゾル−ゲル転移温度より低い温度（例えば氷冷下）で、蒸留水１．３５ｇに溶解して１０wt％の水溶液を作製し、該水溶液を径が３５ｍｍのプラスチックシャーレ中に注入し、３７℃に加温することによって、厚さ約１．５ｍｍのゲルを該シャーレ中に形成させた後、該ゲルを含むシャーレ全体の重量（ｆグラム）を測定する。次いで、該ゲルを含むシャーレ全体を２５０ｍｌ（リットル）中の水中に３７℃で１０時間静置した後、該ゲルを含むシャーレ全体の重量（ｇグラム）を測定して、ゲル表面からの該ゲルの溶解の有無を評価する。この際、本発明のハイドロゲル形成性の高分子においては、上記ゲルの重量減少率、すなわち（ｆ−ｇ）／ｆが、５．０％以下であることが好ましく、更には１．０％以下（特に０．１％以下）であることが好ましい。
【００２７】
本発明のTGPの水溶液は、上記ゾル−ゲル転移温度より高い温度でゲル化させた後、多量（体積比で、ゲルの０．１〜１００倍程度）の水中に浸漬しても、長期間に亘って該ゲルは溶解することがない。このような本発明に用いる高分子の性質は、例えば、該高分子内に曇点を有するブロックが２個以上（複数個）存在することによって達成される。
これに対して、ポリプロピレンオキサイドの両端にポリエチレンオキサイドが結合してなる前述のプルロニックＦ−１２７を用いて同様のゲルを作成した場合には、数時間の静置で該ゲルは完全に水に溶解することを、本発明者らは見出している。
非ゲル化時の細胞毒性をできる限り低いレベルに抑える点からは、水に対する濃度、すなわち｛（高分子）／（高分子＋水）｝×１００（％）で、２０％以下（更には１５％以下、特に１０％以下）の濃度でゲル化が可能なTGPを用いることが好ましい。
本発明に用いられるTGPの分子量は3万以上3,000万以下が好ましく、より好ましくは10万以上1,000万以下、さらに好ましくは50万以上500万以下である。
【実施例】
【００２８】
以下にTGPの製造例および本発明の実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は特許請求の範囲により限定されるものであり、以下の実施例によって限定されるものではない。
製造例１
ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイド共重合体（プロピレンオキサイド／エチレンオキサイド平均重合度約６０／１８０、旭電化工業（株）製：プルロニックＦ−１２７）１０ｇを乾燥クロロホルム３０ｍｌ（リットル）に溶解し、五酸化リン共存下、ヘキサメチレンジイソシアネート０．１３ｇを加え、沸点還流下に６時間反応させた。溶媒を減圧留去後、残さを蒸留水に溶解し、分画分子量３万の限外濾過膜（アミコンＰＭ-30）を用いて限外濾過を行い、高分子量重合体と低分子量重合体を分画した。得られた水溶液を凍結して、Ｆ−１２７高重合体およびＦ−１２７低重合体を得た。
上記により得たＦ−１２７高重合体（本発明のハイドロゲル形成性高分子、ＴＧＰ−１）を、氷冷下、８質量％の濃度で蒸留水に溶解した。この水溶液をゆるやかに加温していくと、２１℃から徐々に粘度が上昇し、約２７℃で固化して、ハイドロゲルとなった。このハイドロゲルを冷却すると、２１℃で水溶液に戻った。この変化は、可逆的に繰り返し観測された。一方、上記Ｆ−１２７低重合体を、氷点下８質量％の濃度で蒸留水に溶解したものは、６０℃以上に加熱しても全くゲル化しなかった。
【００２９】
製造例２
トリメチロールプロパン１モルに対し、エチレンオキサイド１６０モルをカチオン重合により付加して、平均分子量約７０００のポリエチレンオキサイドトリオールを得た。
上記により得たポリエチレンオキサイドトリオール１００ｇを蒸留水１０００ｍｌ（リットル）に溶解した後、室温で過マンガン酸カリウム１２ｇを徐々に加えて、そのまま約１時間、酸化反応させた。固形物を濾過により除いた後、生成物をクロロホルムで抽出し、溶媒（クロロホルム）を減圧留去してポリエチレンオキサイドトリカルボキシル体９０ｇを得た。
上記により得たポリエチレンオキサイドトリカルボキシル体１０ｇと、ポリプロピレンオキサイドジアミノ体（プロピレンオキサイド平均重合度約６５、米国ジェファーソンケミカル社製、商品名：ジェファーミンＤ−４０００、曇点：約９℃）１０ｇとを四塩化炭素１０００ｍｌ（リットル）に溶解し、ジシクロヘキシルカルボジイミド１．２ｇを加えた後、沸点還流下に６時間反応させた。反応液を冷却し、固形物を濾過により除いた後、溶媒（四塩化炭素）を減圧留去し、残さを真空乾燥して、複数のポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとが結合した本発明のハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−２）を得た。これを氷冷下、５質量％の濃度で蒸留水に溶解し、そのゾル−ゲル転移温度を測定したところ、約１６℃であった。
【００３０】
製造例３
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（イーストマンコダック社製）９６ｇ、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（国産化学（株）製）１７ｇ、およびｎ−ブチルメタクリレート（関東化学（株）製）７ｇをクロロホルム４０００ｍｌ（リットル）に溶解し、窒素置換後、Ｎ，Ｎ’−アゾビスイソブチロニトリル１．５ｇを加え、６０℃で６時間重合させた。反応液を濃縮した後、ジエチルエーテルに再沈（再沈殿）した。濾過により固形物を回収した後、真空乾燥して、７８ｇのポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）を得た。
上記により得たポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）に、過剰のイソプロピルアミンを加えてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）を得た。このポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）の水溶液の曇点は１９℃であった。
前記のポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）１０ｇ、および両末端アミノ化ポリエチレンオキサイド（分子量６，０００、川研ファインケミカル（株）製）５ｇをクロロホルム１０００ｍｌ（リットル）に溶解し、５０℃で３時間反応させた。室温まで冷却した後、イソプロピルアミン１ｇを加え、１時間放置した後、反応液を濃縮し、残渣をジエチルエーテル中に沈澱させた。濾過により固形物を回収した後、真空乾燥して、複数のポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）とポリエチレンオキサイドとが結合した本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP-5）を得た。
このようにして得たTGP-5を氷冷下、５質量％の濃度で蒸留水に溶解し、そのゾル−ゲル転移温度を測定したところ、約２１℃であった。
【００３１】
製造例４
（滅菌方法）
上記した本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP-5）の２．０ｇを、ＥＯＧ（エチレンオキサイドガス）滅菌バッグ（ホギメディカル社製、商品名：ハイブリッド滅菌バッグ）に入れ、ＥＯＧ滅菌装置（イージーパック、井内盛栄堂製）でＥＯＧをバッグに充填し、室温にて一昼夜放置した。さらに４０℃で半日放置した後、ＥＯＧをバッグから抜き、エアレーションを行った。バッグを真空乾燥器（４０℃）に入れ、時々エアレーションしながら半日放置することにより滅菌した。
この滅菌操作により高分子のゾル−ゲル転移温度が変化しないことを、別途確認した。
【００３２】
製造例５
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３７ｇと、ｎ−ブチルメタクリレート３ｇと、ポリエチレンオキサイドモノアクリレート（分子量４，０００、日本油脂（株）製：ＰＭＥ−４０００）２８ｇとを、ベンゼン３４０ｍｌ（リットル）に溶解した後、２，２´−アゾビスイソブチロニトリル０．８ｇを加え、６０℃で６時間反応させた。得られた反応生成物にクロロホルム６００ｍｌ（リットル）を加えて溶解し、該溶液をエーテル２０Ｌ（リットル）に滴下して沈澱させた。得られた沈殿を濾過により回収し、該沈澱を約４０℃で２４時間真空乾燥した後、蒸留水６Ｌに再び溶解し、分画分子量１０万のホローファイバー型限外濾過膜（アミコン社製Ｈ１Ｐ１００−４３）を用いて１０℃で２ｌまで濃縮した。該濃縮液に蒸留水４ｌを加えて希釈し、上記希釈操作を再度行った。上記の希釈、限外濾過濃縮操作をさらに５回繰り返し、分子量１０万以下のものを除去した。この限外濾過により濾過されなかったもの（限外濾過膜内に残留したもの）を回収して凍結乾燥し、分子量１０万以上の本発明のハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−４）６０ｇを得た。
上記により得た本発明のハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−４）１ｇを、９ｇの蒸留水に氷冷下で溶解した。この水溶液のゾル−ゲル転移温度を測定したところ、該ゾル−ゲル転移温度は２５℃であった。
【００３３】
製造例６
製造例３の本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP-5）を１０質量％の濃度で蒸留水に溶解し、３７℃におけるηを測定したところ、５．８×１０5  Ｐａ・ｓｅｃであった。一方、寒天を２質量％の濃度で蒸留水に９０℃で溶解して、１０℃で１時間ゲル化させた後、３７℃におけるηを測定したところ、そのηは機器の測定限界（１×１０7Ｐａ・ｓｅｃ）を越えていた。
【００３４】
製造例７
N−イソプロピルアクリルアミド71.0ｇおよびn−ブチルメタクリレート4.4ｇをエタノール1117ｇに溶解した。これにポリエチレングリコールジメタクリレート（PDE6000、日本油脂株式会社製）22.6ｇを水773ｇに溶解した水溶液を加え、窒素気流下70℃に加温した。窒素気流下70℃を保ちながら、N,N,N’,N’-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）0.8ｍLと10％過硫酸アンモニウム（APS）水溶液8ｍLを加え30分間攪拌反応させた。さらにTEMED0.8ｍLと10％APS水溶液8ｍLを30分間隔で4回加えて重合反応を完結させた。反応液を10℃以下に冷却後、10℃の冷却蒸留水5Lを加えて希釈し、分画分子量10万の限外ろ過膜を用いて10℃で2Lまで濃縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水4Lを加えて希釈し、上記限外ろ過濃縮操作を再度行った。上記の希釈、限外ろ過濃縮操作を更に5回繰り返し、分子量10万以下のものを除去した。この限外ろ過によりろ過されなかったもの（限外ろ過膜内に残留したもの）を回収して凍結乾燥し、分子量10万以上の本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP−5）72ｇを得た。
上記により得た本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP−5）1ｇを、9ｇの蒸留水に氷冷下で溶解した。この水溶液のゾル−ゲル転移温度を測定したところ、該ゾル−ゲル転移温度は20℃であった。
【００３５】
製造例８
N−イソプロピルアクリルアミド42.0ｇおよびn−ブチルメタクリレート4.0ｇをエタノール592ｇに溶解した。これにポリエチレングリコールジメタクリレート（PDE6000、日本油脂株式会社製）11.5ｇを水65.1ｇに溶解した水溶液を加え、窒素気流下70℃に加温した。窒素気流下70℃を保ちながら、N,N,N’,N’-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）0.4ｍLと10％過硫酸アンモニウム（APS）水溶液4ｍLを加え30分間攪拌反応させた。さらにTEMED0.4ｍLと10％APS水溶液4ｍLを30分間隔で4回加えて重合反応を完結させた。反応液を5℃以下に冷却後、5℃の冷却蒸留水5Lを加えて希釈し、分画分子量10万の限外ろ過膜を用いて5℃で2Lまで濃縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水4Lを加えて希釈し、上記限外ろ過濃縮操作を再度行った。上記の希釈、限外ろ過濃縮操作を更に5回繰り返し、分子量10万以下のものを除去した。この限外ろ過によりろ過されなかったもの（限外ろ過膜内に残留したもの）を回収して凍結乾燥し、分子量10万以上の本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP−6）40ｇを得た。
上記により得た本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP−6）1ｇを、9ｇの蒸留水に氷冷下で溶解した。この水溶液のゾル−ゲル転移温度を測定したところ、該ゾル−ゲル転移温度は7℃であった。
【００３６】
製造例９
N−イソプロピルアクリルアミド45.5ｇおよびn−ブチルメタクリレート0.56ｇをエタノール592ｇに溶解した。これにポリエチレングリコールジメタクリレート（PDE6000、日本油脂株式会社製）11.5ｇを水65.1ｇに溶解した水溶液を加え、窒素気流下70℃に加温した。窒素気流下70℃を保ちながら、N,N,N’,N’-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）0.4ｍLと10％過硫酸アンモニウム（APS）水溶液4ｍLを加え30分間攪拌反応させた。さらにTEMED0.4ｍLと10％APS水溶液4ｍLを30分間隔で4回加えて重合反応を完結させた。反応液を10℃以下に冷却後、10℃の冷却蒸留水5Lを加えて希釈し、分画分子量10万の限外ろ過膜を用いて10℃で2Lまで濃縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水4Lを加えて希釈し、上記限外ろ過濃縮操作を再度行った。上記の希釈、限外ろ過濃縮操作を更に5回繰り返し、分子量10万以下のものを除去した。この限外ろ過によりろ過されなかったもの（限外ろ過膜内に残留したもの）を回収して凍結乾燥し、分子量10万以上の本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP−7）22ｇを得た。
上記により得た本発明のハイドロゲル形成性高分子（TGP−7）1ｇを、9ｇの蒸留水に氷冷下で溶解した。この水溶液のゾル−ゲル転移温度を測定したところ、該ゾル−ゲル転移温度は37℃であった。
【実施例１】
【００３７】
NK細胞を通常培地で通常重力下(a)または微小重力下(b)で６時間培養したものと、ゾル−ゲル転移温度20℃のTGP培地で通常重力下(c)または微小重力下(d)で６時間培養したものについて、細胞数とNOレベル、FACS分析結果を比較した。
国内規制ガイドラインに沿って自己免疫強化療法（AIET）の患者にインフォームドコンセントを得た上で、末梢血を採取した。細胞の分離と培養は、GMP適合クラス10,000のクリーンルーム内で実施した。採取した末梢血は室温3,000rpmｘ10分間の遠心分離後、上澄みの血漿を滅菌遠心チューブに、沈殿の血球ペレットを別の滅菌遠心チューブに移した。血漿は56℃x30分間の熱処理により不活性化し、再度室温3,000rpmｘ10分間の遠心分離した。上澄みの血漿を滅菌遠心チューブに入れ、−20℃で保存した。単核球を分離するため、リン酸緩衝液（PBS）を滅菌遠心チューブに入れた血球ペレットと１：１の容量比で良く混合した。さらにリンフォプレップ溶液（Axis-Shield, Norway, Cat# LYS3773）を１：２の容量比で血球PBS混合物（すなわち、15ｍLのリンフォプレップ溶液と30ｍLの血球PBS混合物）に重層した。この遠心チューブを室温1,500rpmｘ10分間遠心分離した。末梢血単核球（PBMNCs）は分離層を乱さないようにしてピペットで取り出し、滅菌容器に移した。分離されたPBMNCsに2：1の容量比でPBSを加えた。室温1,200rpmｘ10分間遠心分離した後、上澄みを廃棄した。沈殿ペレットを30ｍLのPBSと緩やかに混合した。このPBMNCsのPBS分散液20μLを取り出し、細胞数計測を行った。残りは室温1,200rpmｘ10分間遠心分離した後、上澄みを廃棄し、細胞培養のためPBSを加えて保存した。細胞数計測はトリパンブルー排除法により行った。PBMNCsは1ｘ10＾6 cslls/mLの細胞密度となるように所定量のOptimizer media（(Invitrogen, USA)）に分散して、NK細胞培養用フラスコ（Biotherapy Institute, 東京）で39℃ｘ24時間培養後、37℃ｘ24時間5％CO2下で培養した。フラスコ内の細胞を、フラスコ洗浄PBS液と合わせて、室温1,200rpmｘ8分間遠心分離した。NK細胞はインターロイキン-２（（Novartis Pharma AG, Basel, Switzerland））を含むOpTmizer Basal Culture Medium （(Invitrogen, USA)）に分散し、フラスコ中37℃で10日〜14日間5％CO2下で培養した。フィーダーレイヤーや動物由来の血清は全行程中全く使用しなかった。
NK細胞は、通常培地群とTGP培地群に分けた。通常培地群は、各２ｍLの滅菌マイクロ遠心管にALyS505培地（（Cell Science & Technology Inst., Inc. Japan））に分散させたNK細胞約2万個を入れた。TGP培地群は、各２ｍLの滅菌マイクロ遠心管にTGP培地に分散させたNK細胞約2万個を入れた。TGPは凍結乾燥品（Mebiol Gel, メビオール株式会社、平塚市）1ｇをALyS505培地10ｍLに溶解し、低温ゾル状態で細胞を分散させた。
通常培地群とTGP培地群をそれぞれ、通常重力群と微小重力群に分けた。微小重力群は、微小重力環境細胞培養装置Zeromo（CL-5000、株式会社  北川鉄工所製）を用い、微小重力モード（1/1000G）で37℃６時間の培養を行った。通常重力群は通常環境で37℃６時間の培養を行った。
その後、回収したNK細胞について、生細胞数計測、NOレベル、FACS分析の測定を行った。
【００３８】
NOレベルの測定は、Griess アッセイで行った。NOの水溶液中半寿命は3-5秒と短いため、直接検出は非常に困難であるが、NOの酸化物NO2やNO3は安定である。Griess アッセイは培養液上澄み中のNO2を呈色反応で検出する標準的な方法である。
Griessアッセイの吸光度で比較すると、NOレベルは通常培地で通常重力下(a)0.090、微小重力下(b)0.084、TGP培地で通常重力下(c)0.126、微小重力下(d)0.154であった。すなわち、NK細胞のNOレベルは、通常培地通常重力下に比べTGP培地微小重力下で1.7倍増強された。
細胞数は初期細胞数を１とした相対値で、通常培地で通常重力下(a)1.02、微小重力下(b)1.32、TGP培地で通常重力下(c)1.65、微小重力下(d)1.27であった。
【表１】
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【実施例２】
【００３９】
臍帯血単核球（UCBMNCs）細胞を通常培地で通常重力下(a)または微小重力下(b)で６時間培養したものと、TGP培地で通常重力下(c)または微小重力下(d)で６時間培養したものについて、細胞数とNOレベル、FACS分析結果を比較した。
UCBMNCsは、インドの臍帯血バンクから移植医療に使用されなかったものから分離した。細胞の分離と培養は、GMP適合クラス10,000のクリーンルーム内で実施した。採取した末梢血は室温3,000rpmｘ10分間の遠心分離後、上澄みの血漿を捨て、沈殿の血球ペレットを別の滅菌遠心チューブに移した。リン酸緩衝液（PBS）を滅菌遠心チューブに入れた血球ペレットと１：１の容量比で良く混合した。血球のPBS分散液にフィコール溶液（英国GE Healthcare LifeSciences社製、カタログ番号17030010）を、容積比２：１（例えば血球分散液30ｍLにフィコール溶液15ｍL）で重層させた。室温で1,500ｒｐｍ30分間遠心後、分離層を撹乱しないようにしつつ臍帯血単核球細胞層を別の滅菌容器に移し、骨髄単核球細胞層の２倍量のPBSを加えた。室温で1,200ｒｐｍ10分間遠心後、上澄みをピペットで除去した。沈殿細胞に30ｍｌ（リットル）のリン酸緩衝液を加えて穏やかに撹拌し、20μｌを採取して細胞数を計測した。細胞数の計測は、20μｌの細胞分散液に20μｌのチュルク染色液を加え、10μｌを採取して生細胞数を計測した。30ｍｌ（リットル）の細胞分散液を室温で1,200ｒｐｍで8分間遠心後、上澄みをピペットで除去した。
UCBMNCs細胞は、通常培地群とTGP培地群に分けた。通常培地群は、各２ｍLの滅菌マイクロ遠心管に、IMDM（（Gibco≡, Life Technologies Corp, USA））培地に分散させたUCBMNCs 細胞約2万個を入れた。TGP培地群は、各２ｍLの滅菌マイクロ遠心管にTGP培地に分散させたUCBMNCs細胞約2万個を入れた。TGPは凍結乾燥品（Mebiol Gel, メビオール株式会社、平塚市）1ｇをIMDM10ｍLに溶解し、低温ゾル状態で細胞を分散させた。室温でTGP溶液をゲル化させ、市販のヒト血清を重層させた。その後、37℃5％CO2環境下7−14日間培養した。
通常培地群とTGP培地群をそれぞれ、通常重力群と微小重力群に分けた。微小重力群は、微小重力環境細胞培養装置Zeromo（CL-5000、株式会社  北川鉄工所製）を用い、微小重力モード（1/1000G）で37℃６時間の培養を行った。通常重力群は通常環境で37℃６時間の培養を行った。
その後、回収したUCBMNCs細胞について、生細胞数計測、NOレベル、FACS分析の測定を行った。
【００４０】
NOレベルの測定は、DAR（ジアミノローダミン）アッセイで行った。DARアッセイは細胞中あるいは上澄み中のNOを直接検出する蛍光色素による方法である。蛍光強度で相対的に比較すると、NOレベルは通常培地で通常重力下(a)1.75、微小重力下(b)2.69、TGP培地で通常重力下(c)2.35、微小重力下(d)3.10であった。すなわち、UCBMNCs細胞のNOレベルは、通常培地通常重力下に比べTGP培地微小重力下で1.8倍増強された。
細胞数は初期細胞数を１とした相対値で、通常培地で通常重力下(a)1.17、微小重力下(b)1.29、TGP培地で通常重力下(c)1.17、微小重力下(d)1.29であった。
【表２】
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すなわち、UCBMNCs細胞のCD34陽性細胞数は通常培地微小重力下に比べTGP培地微小重力下で13.6倍も増強された。
【実施例３】
【００４１】
骨髄単核球（BMMNCs）細胞を通常培地で通常重力下(a)または微小重力下(b)で６時間培養したものと、TGP培地で通常重力下(c)または微小重力下(d)で６時間培養したものについて、NOレベルとFACS分析結果を比較した。
ヒトから採取した骨髄を滅菌遠心管に入れ、室温で3,000ｒｐｍ10分間遠心後、上澄みをピペットで除去した。15ｍｌ（リットル）の沈殿細胞に15ｍｌ（リットル）のリン酸緩衝液（米国LifeTechnologies社製、カタログ番号70011-044）を加えて分散させ、15ｍｌ（リットル）のフィコール溶液（英国GE Healthcare LifeSciences社製、カタログ番号17030010）を重層させた。室温で1,500ｒｐｍ30分間遠心後、分離層を撹乱しないようにしつつ骨髄単核球細胞層を別の滅菌容器に移し、骨髄単核球細胞層の２倍量のリン酸緩衝液を加えた。室温で1,200ｒｐｍ10分間遠心後、上澄みをピペットで除去した。沈殿細胞に30ｍｌ（リットル）のリン酸緩衝液を加えて穏やかに撹拌し、20μｌを採取して細胞数を計測した。細胞数の計測は、20μｌの細胞分散液に20μｌのチュルク染色液を加え、10μｌを採取して生細胞数を計測した。30ｍｌ（リットル）の細胞分散液を室温で1,200ｒｐｍで8分間遠心後、上澄みをピペットで除去した。
以下、実施例２と同様の実験を行い、BMMNCs細胞について、NOレベルとFACS分析の測定を行った。
【００４２】
NOレベルの測定は、DARアッセイで行い、蛍光強度で相対的に比較すると、NOレベルは通常培地で通常重力下(a)0.95、微小重力下(b)0.78、TGP培地で通常重力下(c)0.87、微小重力下(d)2.90であった。すなわち、UCBMNCs細胞のNOレベルは、通常培地通常重力下に比べTGP培地微小重力下で3.1倍増強された。
【表３】
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すなわち、BMMNCs細胞のCD34陽性細胞数は通常培地通常重力下に比べTGP培地微小重力下で2.7倍も増強された。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
以上、具体的に説明したように、本発明によればNK細胞、臍帯血細胞や骨髄細胞の機能を効率良く増強することができ、固形臓器癌の処置やいくつかの血液癌への対処、骨髄移植を受けた患者の処置などに多大な有用性がある。
この細胞増強方法は再生医療において、細胞の回収、回復、復活、復元方法としてより有効に用いられる。