(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）活性を決定するためのエクスビボの方法であって、
対象から得た血漿試料を血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）系の活性化剤と共にインキュベートすることであって、ここで前記活性化剤は、外因性の第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ）であること、
前記インキュベーションの前および後の血漿試料において、インタクト高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、切断型ＨＭＷＫ、もしくはその両方のレベルを測定すること、および
前記活性化後の試料中のインタクトＨＭＷＫの低減または切断型ＨＭＷＫの増加に基づいて前記試料中のｐＫａｌ活性を決定すること
を含む方法。
【請求項２】
試料中の血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）活性を決定するためのエクスビボの方法であって、
ｐＫａｌを含む試料に、ｐＫａｌ系活性化剤およびｐＫａｌ基質を添加することであって、ここで前記ｐＫａｌ系活性化剤は、第ＸＩＩａ因子であること、
前記試料を、前記ｐＫａｌ系活性化剤と前記ｐＫａｌ基質と共にインキュベートすること、および
前記ｐＫａｌ基質の切断速度に基づいてｐＫａｌの活性を測定すること
を含む方法。
【請求項３】
インタクトＨＭＷＫおよび切断型ＨＭＷＫのレベルがウェスタンブロット解析によって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料は、対象の血漿試料である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記試料およびｐＫａｌ系活性化剤がｐＫａｌ阻害剤候補の存在下でインキュベートされ、前記方法は血漿カリクレインの活性に対するｐＫａｌ阻害剤候補の効果を評価することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記試料中のｐＫａｌ活性を既定の値と比較することをさらに含み、ここで前記既定の値は、健康な対象のｐＫａｌ活性を表し、もし前記試料中のｐＫａｌ活性が前記既定の値と比較して増加している場合、前記対象はｐＫａｌ関連疾患を有するかその危険性があることを示す、請求項１または４に記載の方法。
【請求項７】
前記疾患が遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記対象がｐＫａｌ関連疾患を有するヒト患者であり、かつ該疾患の治療が行われており、そして前記血漿試料が、前記治療の過程の後もしくは前記治療の過程の最中に得られる、請求項１、３、または４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記治療の過程の最中のｐＫａｌ活性を比較することをさらに含み、もし前記治療の最中にわたって前記ｐＫａｌ活性が低減すれば、前記治療が有効であることを示す、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者が遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）を有し、かつｐＫａｌ阻害剤によって治療される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｐＫａｌ阻害剤がＤＸ−２９３０である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記基質がｐＫａｌによる切断の後に検出可能なシグナルを遊離できる標識に結合し、そして基質の切断速度が、検出可能なシグナルの大きさに基づいて決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記血漿試料が、前記ｐＫａｌ系活性化剤、前記ｐＫａｌ基質、およびｐＫａｌ阻害剤候補と共にインキュベートされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｐＫａｌ阻害剤候補がｐＫａｌに結合する抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がＤＸ−２９３０である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
アッセイがマイクロプレート中で実施される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１３年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／８９３，５０５号の出願日の優先権、および２０１４年２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／９３９，８３７号の出願日の優先権を主張するものであり、その全体が本明細書における参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）は、循環系における主要なブラジキニン産生酵素である。ｐＫａｌの活性化は、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）に関連する疾患病理に関係している接触系を介して起きる。ブラジキニンは、疼痛、炎症、浮腫および血管新生の重要な媒介因子である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本開示の要約
血漿カリクレイン（ＰＫａｌ）は、接触系のセリンプロテアーゼ構成要素であり、かつ循環系における主要なブラジキニン産生酵素である。接触系は、異物もしくは負に帯電した表面への曝露の際の第ＸＩＩａ因子によって、またはプロリルカルボキシペプチダーゼにより内皮細胞表面上で活性化される（Ｓａｉｎｚ  Ｉ．Ｍ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ９８、７７〜８３、２００７）。血漿カリクレインの活性化は、第ＸＩＩ因子のそのフィードバック活性化を介して内因性の凝固を増幅し、そして炎症促進性のノナペプチドであるブラジキニンの産生を介して炎症を増強する。循環中の主要なキニノゲナーゼとして、血漿カリクレインは、脈管系におけるブラジキニンの産生に大きな役割を果たす。血漿カリクレインの主要な天然の阻害剤である、Ｃ１−阻害因子タンパク質の遺伝的欠損は、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）をもたらす。ＨＡＥに罹患した患者は、多くの場合、未知のトリガーによって引き起こされる痛みを伴う浮腫の急性発作に苦しめられる（Ｚｕｒａｗ  Ｂ．Ｌ．ら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５９、１０２７〜１０３６、２００８）。動物モデルにおける薬剤の使用もしくは遺伝的研究を通じて、血漿カリクレイン−キニン系（血漿ＫＫＳ）は、さまざまな疾患に関与している。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、本明細書に記載されるようなＨＭＷＫエクスビボ活性化アッセイ、内因性の切断型ＨＭＷＫアッセイ、および、ｐＫａｌエクスビボ活性化アッセイを含む数多くのバイオマーカーアッセイの開発に基づく。そのようなアッセイは、対象の血漿における血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）系の活性化レベルの測定に使用できる。それらはまた、ｐＫａｌ系の調節（阻害もしくは活性化）におけるその活性について候補化合物を評価するのに利用できる。
【０００５】
一態様において、本開示は、エクスビボ活性化方法を特徴とし、該方法は、（ｉ）対象より得た血漿試料を血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）系の活性化剤（例えば第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ））と共にインキュベートすること、（ｉｉ）インキュベーションの前後の血漿試料において、インタクト高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、切断型ＨＭＷＫ、またはその両方の濃度を測定すること、および（ｉｉｉ）活性化後の試料においてインタクトＨＭＷＫの低減を決定することを含む。任意選択で、血漿試料および活性化剤は、ｐＫａｌ調節剤候補（例えばＤＸ２９３０のような阻害剤候補もしくは活性化剤候補）の存在下でインキュベートされる。該方法は、ｐＫａｌ調節剤候補の活性を評価することをさらに含み得る。ある実施態様において、インタクトＨＭＷＫおよび切断型ＨＭＷＫの濃度は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅウェスタンブロット解析のようなウェスタンブロット解析によって測定される。
【０００６】
他の態様において、本開示は、対象における血漿活性化を評価する方法を特徴とし、該方法は、対象由来の血漿試料を提供すること、および血漿試料中の切断型ＨＭＷＫ濃度を測定することを含む。切断型ＨＭＷＫの濃度は、例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅウェスタンブロット解析のようなウェスタンブロットによって測定され得る。ある実施態様において、対象は、ｐＫａｌ系に関連する疾患を有するかもしくはそれを有する疑いがある。代替的にもしくはさらに、対象はｐＫａｌ阻害剤によって処置される。本明細書に記載される方法の任意のものは、ｐＫａｌ阻害剤の有効性を評価することをさらに含み、ここで、処置前の濃度と比較して処置後の切断型ＨＭＷＫの濃度が低減すれば、ｐＫａｌ阻害剤が有効であることを示している。
【０００７】
さらに他の態様において、本開示は、試料（例えば対象由来の血漿試料）中のｐＫａｌ活性を決定するエクスビボアッセイを提供し、該アッセイは（ｉ）試料を、ｐＫａｌ基質の存在下でｐＫａｌ系活性化剤（例えば第ＸＩＩａ因子もしくはＦＸＩＩａ）とインキュベートすること、および（ｉｉ）基質の切断速度に基づいてｐＫａｌの活性を測定することを含む。ある例において、基質を、ｐＫａｌによる切断の後に検出可能なシグナルを遊離できる標識に結合させ、検出可能なシグナルの大きさに基づいて基質の切断速度を決定する。ある例において、血漿試料を、活性化剤、ｐＫａｌ基質、およびｐＫａｌ調節剤候補（例えば、阻害剤調節剤もしくは活性化剤調節剤）と共にインキュベートする。方法は、ｐＫａｌ調節剤候補（例えばＤＸ−２９３０）の活性を評価することをさらに含み、ｐＫａｌ阻害剤候補の非存在下でのｐＫａｌ活性レベルと比較してｐＫａｌ調節剤候補の存在下でのｐＫａｌ活性レベルが変化すれば、阻害剤候補が有効であることを示している。例えば、ｐＫａｌ活性レベルの低減は、ｐＫａｌ調節剤候補がｐＫａｌ阻害剤であることを示し、一方で、ｐＫａｌ活性レベルの上昇は、ｐＫａｌ調節剤候補がｐＫａｌ活性化剤であることを示す。本明細書に記載されるアッセイ法の任意のものは、マイクロプレート中で実施できる。
【０００８】
本明細書に記載されるアッセイ法の任意のものにおいて、方法は、対象がｐＫａｌに関連する疾患（例えばＨＡＥ）を有するかもしくはその危険性があるかを評価することをさらに含んでいてよく、既定の値と比較して切断型ＨＭＷＫの濃度が上昇すれば、対象が該疾患を有するかもしくはその危険性があることを示している。ある実施態様において、対象は、ｐＫａｌに関連する疾患（例えばＨＡＥ）を有し、疾患の治療（例えばＤＸ２９３０のようなｐＫａｌ阻害剤）が行われるヒト患者であり得る。血漿試料は、治療の過程の後もしくはその最中に得ることができる。ある実施態様において、該方法は、治療の有効性を評価することをさらに含み、治療（例えばＤＸ２９３０のようなｐＫａｌ阻害剤）前と比較して切断型ＨＭＷＫの濃度が低減すれば、もしくは治療（例えばＤＸ２９３０のようなｐＫａｌ阻害剤）の過程にわたって切断型ＨＭＷＫの濃度が低減すれば、該治療が有効であることを示している。
【０００９】
さらに本開示は、例えばｐＫａｌ媒介もしくはブラジキニン媒介の障害の危険性があるかもしくはそれに罹患している対象を評価する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載されるアッセイ法の任意のものを含み得る。提供される方法は、血漿カリクレイン媒介血管浮腫（ＫＭＡ）、もしくはｐＫａｌに媒介される他の疾患を持つ患者の、評価および治療に有用な分析を可能にする。
【００１０】
さらに、本開示の実施態様は、バイオマーカー、ならびに患者、例えば血漿カリクレインによって産生されるブラジキニンによって引き起こされる浮腫に苦しむ患者の同定および治療におけるその使用を提供する。本明細書に開示される方法、組成物およびデバイスは、多くの点で有用である。例えば、ｐＫａｌマーカーの濃度は、接触系活性化の上昇に関連する障害を同定するのに利用できる。初回スクリーニングの後に、例えば疾患の前臨床モデルにおいて、血漿カリクレイン阻害剤（例えばＤＸ−８８、ＥＰＩＫＡＬ２もしくはＤＸ−２９３０）によるインビトロもしくはインビボ試験を行うことができる。本明細書に開示されるマーカーはまた、薬力学バイオマーカーとして、またはそれ以外にカリクレイン阻害剤に対する対象の応答をモニターするのに利用できる。本明細書に開示されるマーカーは、例えば、ＨＡＥ、非ヒスタミン依存性特発性血管性浮腫、関節リウマチ、クローン病、狼瘡、アルツハイマー病、敗血症性ショック、熱傷損傷、脳虚血／再潅流傷害、脳浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、黄斑浮腫、血管炎、動脈もしくは静脈の血栓症、補助人工心臓もしくはステントに関連した血栓症、血栓症を伴うヘパリン起因性血小板減少、血栓塞栓症、不安定狭心症を伴う冠動脈性心疾患、浮腫、眼疾患、痛風、腸疾患、口腔粘膜炎、神経因性疼痛、炎症性疼痛、脊柱管狭窄症変性脊椎疾患、術後イレウス、大動脈瘤、変形性関節症、遺伝性血管浮腫、肺塞栓症、脳卒中、頭部外傷もしくは腫瘍周囲脳浮腫、敗血症、急性中大脳動脈（ＭＣＡ）虚血事象（脳卒中）、再狭窄（例えば血管形成術後）、全身性エリテマトーデス腎炎、自己免疫疾患、炎症性疾患、心血管疾患、神経疾患、タンパク質ミスフォールディングに関連する疾患、血管新生に関連する疾患、高血圧性腎症および糖尿病性腎症、アレルギーおよび呼吸器疾患（例えば、アナフィラキシー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、持続性鼻炎）および組織損傷（例えば、熱傷もしくは化学的損傷）のような、血漿カリクレインによって媒介される疾患の治療を可能にするため、ｐＫａｌ媒介もしくはブラジキニン媒介障害の予防的治療における投与を管理するために、コンパニオン診断に利用できる。
【００１１】
一態様において、本開示は、対象を評価若しくは治療する方法、例えば、ブラジキニン媒介血管性浮腫のようなｐＫａｌ媒介障害をヒスタミン媒介障害と区別する、またはｐＫａｌ媒介障害の将来の発作を予測する方法を提供し、該方法は、例えばプレカリクレイン、活性ｐＫａｌ、α２Ｍ−ｐＫａｌ、Ｃｌ−ＩＮＨ−ｐＫａｌ、インタクトキニノーゲン、および切断型キニノーゲンのような本明細書に開示されるｐＫａｌ活性化と相関する一つもしくはそれ以上のマーカー（ｐＫａｌマーカー）の濃度を取得すること、例えば決定することによって前記対象を評価もしくは治療することを含む。ある実施態様において、方法は、ヒスタミン媒介炎症応答と相関する一つもしくはそれ以上のマーカー（Ｈマーカー）、例えばトリプターゼの濃度を取得すること、例えば検出することを含む。
【００１２】
ある実施態様において、前記ｐＫａｌ媒介障害は、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤもしくはＩＢＳである。ある実施態様において、前記ｐＫａｌ媒介障害は、非ヒスタミン依存性特発性血管性浮腫、関節リウマチ、クローン病、狼瘡、アルツハイマー病、敗血症性ショック、熱傷損傷、脳虚血／再潅流傷害、脳浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、黄斑浮腫、血管炎、動脈もしくは静脈の血栓症、補助人工心臓もしくはステントに関連した血栓症、血栓症を伴うヘパリン起因性血小板減少、血栓塞栓症、不安定狭心症を伴う冠動脈性心疾患、浮腫、眼疾患、痛風、腸疾患、口腔粘膜炎、神経因性疼痛、炎症性疼痛、脊柱管狭窄症変性脊椎疾患、術後イレウス、大動脈瘤、変形性関節症、遺伝性血管浮腫、肺塞栓症、脳卒中、頭部外傷もしくは腫瘍周囲脳浮腫、敗血症、急性中大脳動脈（ＭＣＡ）虚血事象（脳卒中）、再狭窄（例えば血管形成術後）、全身性エリテマトーデス腎炎、自己免疫疾患、炎症性疾患、心血管疾患、神経疾患、タンパク質ミスフォールディングに関連する疾患、血管新生に関連する疾患、高血圧性腎症および糖尿病性腎症、アレルギーおよび呼吸器疾患（例えば、アナフィラキシー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、持続性鼻炎）および組織損傷（例えば、熱傷もしくは化学的損傷）から選択される。
【００１３】
別の態様において、本開示は、対象を評価もしくは治療する方法を提供し、前記対象は、例えばブラジキニン媒介血管浮腫のようなｐＫａｌ媒介障害と、ヒスタミン関連障害との両方に一致する症状を有し、該方法は、ａ）任意選択で、前記対象がｐＫａｌ媒介障害およびヒスタミン関連障害の一つもしくは両方に一致する、例えば浮腫もしくは腹部不快感のような症状を有することを決定すること、ｂ）前記対象が、前記症状に対して抗ヒスタミン療法により治療されていなかった場合、前記対象を抗ヒスタミン療法で治療することｃ）例えばプレカリクレイン、活性ｐＫａｌ、α２Ｍ−ｐＫａｌ、Ｃｌ−ＩＮＨ−ｐＫａｌ、インタクトキニノーゲン、および切断型キニノーゲンのようなｐＫａｌ活性化に関連する一つもしくはそれ以上のマーカー（ｐＫａｌマーカー）の濃度を取得すること、例えば検出すること、ｄ）前記濃度が既定の基準を満たす場合、例えば参照の濃度であるかもしくはそれ以上である場合、該対象をカリクレイン阻害剤療法のために選択するか、もしくは前記対象にカリクレイン阻害剤を投与して、これによって前記対象を評価もしくは治療することを含む。ある実施態様において、該方法は、該対象をカリクレイン阻害剤療法のために選択することを含む。ある実施態様において、該方法は、前記対象にカリクレイン阻害剤を投与することを含む。ある実施態様において、該対象をカリクレイン阻害剤療法のために選択することもしくは前記対象にカリクレイン阻害剤を投与することは、該対象が前記抗ヒスタミン療法に許容可能な応答を示したことが決定される前に、例えば、前記抗ヒスタミン療法による治療の１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、もしくは１０時間以内に起こる。ある実施態様において、前記対象がｐＫａｌ媒介障害およびヒスタミン関連障害の両方に一致する症状を有することの決定と、ｐＫａｌマーカーの濃度を決定するために前記患者から試料を取得することは、互いに３０分、１時間、２時間もしくは３時間以内に行われるか、または、医療供給者への同じ受診時に行われる。
【００１４】
ある実施態様において、前記ｐＫａｌ阻害剤は、ＤＸ−８８、ＤＸ−２９３０もしくはＥｐｉＫａｌ−２より選択される。
【００１５】
ある実施態様において、方法は、ヒスタミン媒介炎症応答と相関する一つもしくはそれ以上のマーカー（Ｈマーカー）の濃度を取得すること、例えば決定することを含む。ある実施態様において、前記対象は、ｐＫａｌ媒介障害への感受性について評価される。ある実施態様において、前記対象は、ｐＫａｌ媒介障害、例えば浮腫、例えばＨＡＥに、例えば一致する症状を有する。ある実施態様において、前記対象は望まれないｐＫａｌ活性化を特徴とする障害の症状を有し、そして前記対象は、抗ヒスタミン療法を投与されている。特定の実施態様において、前記抗ヒスタミン療法は、本明細書に開示される決定ステップの前もしくは後、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、もしくは１０時間以内に投与される。特定の実施態様において、該方法は、例えば、本明細書に開示される評価もしくは決定の前、その後、もしくはその最中に、前記対象に抗ヒスタミン療法を投与することをさらに含む。
【００１６】
ある実施態様において、前記決定もしくは評価に応じて、前記対象にカリクレイン阻害剤を投与する。ある実施態様において、前記対象は、以下の症状もしくは特性：再発性の腫脹発作；完全にもしくは大部分が末梢性である腫脹、例えば該対象は腹部腫脹もしくは気道の腫脹を有しない；じんましん；発赤、痛み、および感染の証拠のない腫脹；抗ヒスタミン剤またはコルチコステロイド療法への無応答；または非ヒスタミン媒介浮腫を有すること、の一つもしくはそれ以上またはその全てを有する。ある実施態様において、該対象は例えばＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤもしくはＩＢＳのようなｐＫａｌ媒介障害の病歴を持たない；該対象はＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤもしくはＩＢＳのようなｐＫａｌ媒介障害の病歴を持つ；該対象はＨＡＥの病歴を持たない；該対象はＨＡＥの病歴を持つ；該対象はＩＡＥの病歴を持たない；該対象はＩＡＥの病歴を持つ；該対象はＩＢＤもしくはＩＢＳの病歴を持たない；該対象はＩＢＤもしくはＩＢＳの病歴を持つ；該対象は例えば食物アレルギーのようなヒスタミン媒介障害の病歴を持たない；該対象は例えば食物アレルギーのようなヒスタミン媒介障害の病歴を持つ；該対象は例えばＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤもしくはＩＢＳのようなｐＫａｌ媒介障害の病歴を持たず、かつ例えば食物アレルギーのようなヒスタミン媒介障害の病歴を持たない；または該対象は例えばＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤもしくはＩＢＳのようなｐＫａｌ媒介障害の病歴を持たず、かつ例えば食物アレルギーのようなヒスタミン媒介障害の病歴を持つ；該対象は例えばＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤもしくはＩＢＳのようなｐＫａｌ媒介障害の病歴を持ち、かつ例えば食物アレルギーのようなヒスタミン媒介障害の病歴を持たない；または該対象は例えばＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤもしくはＩＢＳのようなｐＫａｌ媒介障害の病歴を持ち、かつ例えば食物アレルギーのようなヒスタミン媒介障害の病歴を持つ。
【００１７】
ある実施態様において、対象は、例えばＨＡＥのための、例えば予防的治療としてカリクレイン阻害剤による治療を受けており、そしてカリクレイン阻害剤に対する対象の応答は、評価もしくはモニターされ、そして任意選択で前記モニタリングに応じて、治療が選択もしくは投与され、例えば決定に応じて、カリクレイン阻害剤の用量が調整される。ある実施態様において、ｐＫａｌマーカーの決定は、コンパニオン診断の状況で実施され、そして任意選択で、、その決定に基づいて、治療薬が投与されるか、もしくは投与が中止される。ある実施態様において、前記取得に応じて、例えばＨＡＥもしくはＩＥＡの発作のような切迫する急性発作を同定する。特定の実施態様において、前記対象は、突発性血管浮腫感受性について評価される。特定の実施態様において、前記評価は、前記対象が、ｐＫａｌ媒介障害、例えばブラジキニン媒介障害、例えばｐＫａｌ媒介血管浮腫に罹患しているか、またはヒスタミン媒介障害、例えばアレルギー食物反応に罹患しているかを決定することを含む。
【００１８】
ある実施態様において該対象は、例えばＨＡＥもしくはＩＡＥのようなｐＫａｌ媒介障害の病歴を持たない。ある実施態様において、該対象は、例えばＨＡＥもしくはＩＡＥのようなｐＫａｌ媒介障害の病歴を持つ。ある実施態様において、該対象は、例えばＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤもしくはＩＢＳのようなｐＫａｌ媒介障害の病歴を持たない；該対象は例えばＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤもしくはＩＢＳのようなｐＫａｌ媒介障害の病歴を持つ；該対象はＨＡＥの病歴を持たない；該対象はＨＡＥの病歴を持つ；該対象はＩＡＥの病歴を持たない；該対象はＩＡＥの病歴を持つ；該対象は、ＩＢＤもしくはＩＢＳの病歴を持たない；該対象はＩＢＤもしくはＩＢＳの病歴を持つ；該対象は例えば食物アレルギーのようなヒスタミン媒介障害の病歴を持たない；該対象は例えば食物アレルギーのようなヒスタミン媒介障害の病歴を持つ；該対象は例えばＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤもしくはＩＢＳのようなｐＫａｌ媒介障害の病歴を持たず、かつ例えば食物アレルギーのようなヒスタミン媒介障害の病歴を持たない；または該対象は例えばＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤもしくはＩＢＳのようなｐＫａｌ媒介障害の病歴を持たず、かつ例えば食物アレルギーのようなヒスタミン媒介障害の病歴を持つ；該対象は例えばＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤもしくはＩＢＳのようなｐＫａｌ媒介障害の病歴を持ち、かつ例えば食物アレルギーのようなヒスタミン媒介障害の病歴を持たない；または該対象は例えばＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤもしくはＩＢＳのようなｐＫａｌ媒介障害の病歴を持ち、かつ例えば食物アレルギーのようなヒスタミン媒介障害の病歴を持つ。
【００１９】
ある実施態様において、本明細書に開示されるようなｐＫａｌマーカーのようなｐＫａｌマーカーは、抗体に基づく試薬によって検出される。ある実施態様において、ｐＫａｌマーカーは、サンドイッチイムノアッセイによって検出される。ある実施態様において、該方法は、例えばサンドイッチイムノアッセイによってα２Ｍ−ｐＫａｌおよびＣ１−ＩＮＨ−ｐＫａｌの濃度を取得すること、例えば検出することを含む。ある実施態様において、該方法は、例えばウェスタンブロットのような電気泳動分離アッセイによって、キニノーゲン、例えば、インタクトもしくは切断型キニノーゲンの一つもしくは両方の濃度を取得すること、例えば検出することを含む。ある実施態様において、ｐＫａｌマーカーは、Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）アッセイによって検出される。Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）は、当技術分野において公知である（例えば、Ｒｕｓｔａｎｄｉら、Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｍｏｎ（商標），  ａ  ｎｅｗ  ＣＥ−ｂａｓｅｄ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｓ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２０１２、９月；３３（１７）：２７９０〜２７９７を参照できる）。Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）製品はまた、市販されている（例えば、カリフォルニア州のＳａｎｔａ  ＣｌａｒａのＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅを参照できる）。
【００２０】
ある実施態様において、例えばプレカリクレイン、活性ｐｒｅＫａｌ、α２Ｍ−ｐＫａｌもしくはＣ１ＮＨ−ｐＫａｌのような第一のｐＫａｌマーカーがサンドイッチイムノアッセイによって検出され、例えばキニノーゲンのような第二のｐＫａｌマーカーは、他の産物からの検体の分離、例えば電気泳動による分離、例えばＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔもしくはＳｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）による分離に基づくアッセイにおいて検出される。ある実施態様において、ｐＫａｌマーカーの検出は定性的である。ある実施態様において、ｐＫａｌマーカーの検出は定量的である。特定の実施態様において、該方法は、Ｃ１−ＩＮＨ−ｐＫａｌおよびα２Ｍ−ｐＫａｌの濃度を決定することを含む。特定の実施態様において、該方法は、活性ｐＫａｌの濃度を決定することを含む。特定の実施態様において、プレカリクレイン、活性ｐＫａｌ、α２Ｍ−ｐＫａｌ、Ｃ１−ＩＮＨ−ｐＫａｌ、インタクトキニノーゲンおよび切断型キニノーゲンの濃度がそれぞれ検出される。
【００２１】
ある実施態様において、該方法は、例えばプレカリクレイン、活性ｐＫａｌ、α２Ｍ−ｐＫａｌ、Ｃ１−ＩＮＨ−ｐＫａｌ、インタクトキニノーゲンもしくは切断型キニノーゲンのようなｐＫａｌマーカーの濃度を基準値と比較することを含む。ある実施態様において、前記基準値は、ＨＡＥにおける、例えば1人もしくはそれ以上のＨＡＥ対象における前記ｐＫａｌマーカーの濃度の関数である。ある実施態様において、前記基準値は、発作時のＨＡＥ、例えば急性発作時の1人もしくはそれ以上のＨＡＥ対象における前記ｐＫａｌマーカーの濃度の関数である。ある実施態様において、前記基準値は、ＩＡＥにおける、例えば１人もしくはそれ以上のＩＡＥ対象におけるｐＫａｌマーカーの濃度の関数である。ある実施態様において、前記基準値は、急性発作時のＩＡＥ、例えば急性発作時の1人もしくはそれ以上のＩＡＥ対象におけるｐＫａｌマーカーの濃度の関数である。ある実施態様において、前記基準値は、例えばＨＡＥもしくはＩＡＥの病歴のない１人もしくはそれ以上の対象におけるＨＡＥもしくはＩＡＥの非存在下でのｐＫａｌマーカーの濃度の関数である。
【００２２】
ある実施態様において、該方法は、例えば比較に応じて、対象を分類すること、例えば対象をｐＫａｌ媒介障害の危険性に関して分類すること、または前記対象に治療を投与するかもしくは治療を中止するステップを含む。ある実施態様において、該方法は、例えば比較に応じて、前記対象のために治療を選択することを含む。ある実施態様において、該方法は、比較に応じて、例えばカリクレイン結合剤、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストもしくはＣ１−ＩＮＨ補充剤のような治療を前記対象に投与するかもしくは投与を中止することを含む。ある実施態様において、前記治療は、ｐＫａｌ阻害剤、例えばＤＸ−８８、ＥｐｉＫａｌ−２およびＤＸ−２９３０から選択されるｐＫａｌ阻害剤の投与である。
【００２３】
ある実施態様において、前記対象からの試料を、本明細書に開示される以下の二つ以上のマーカーの捕捉剤、例えばプレカリクレイン、例えば抗プレカリクレイン抗体；活性ｐＫａｌ、例えば抗活性ｐＫａｌ抗体；α２Ｍ−ｐＫａｌ、例えば抗α２Ｍ−ｐＫａｌ抗体；Ｃ１ＩＮＨ−ｐＫａｌ、例えば抗Ｃ１ＩＮＨ−ｐＫａｌ抗体；またはＨマーカー、例えば抗Ｈマーカー抗体を含む基質と接触させ、任意選択で、少なくとも一つの捕捉剤はｐＫａｌマーカーの捕捉剤である。
【００２４】
ある実施態様において、該方法は、前記対象より、例えば血液もしくは血漿の試料のような試料を取得することを含む。
【００２５】
ある実施態様において、前記基質は、Ｃ１−ＩＮＨ−ｐＫａｌの捕捉剤、およびα２Ｍ−ｐＫａｌの捕捉剤を含む。ある実施態様において、前記基質は、例えば抗プレカリクレイン抗体のようなプレカリクレインの捕捉剤、例えば抗活性化ｐＫａｌ抗体のような活性ｐＫａｌの捕捉剤、の一つもしくは両方をさらに含む。
【００２６】
ある実施態様において、（第一のマーカーの）第一の捕捉剤および（第二のマーカーの）第二の捕捉剤は、第一のマーカーの存在を示すシグナルが第二のマーカーの存在を示すシグナルと区別できるように、基質上に配置される。ある実施態様において、（第一のマーカーの）前記第一の捕捉剤は、第一の位置もしくはアドレスに配置され、そして（第二のマーカーの）前記第二の捕捉剤は第二の位置もしくはアドレスに配置される。ある実施態様において、前記第一の位置もしくはアドレスと前記第二の位置もしくはアドレスは、前記基質上で重なり合わない。ある実施態様において、前記第一の捕捉剤は、第一のｐＫａｌマーカーの捕捉剤である。ある実施態様において、前記第一の捕捉剤は第一のｐＫａｌマーカーの捕捉剤であり、そして前記第二の捕捉剤は第二のｐＫａｌマーカーの捕捉剤である。ある実施態様において、前記第一の捕捉剤はｐＫａｌマーカーの捕捉剤であり、そして前記第二の捕捉剤はＨマーカーの捕捉剤である。ある実施態様において、前記第一のマーカーは２Ｍ−ｐＫａｌであり、前記第二のマーカーはＣ１ＩＮＨ−ｐＫａｌである。ある実施態様において、２Ｍ−ｐＫａｌの捕捉剤は、抗２Ｍ−ｐＫａｌ抗体であり、Ｃ１ＩＮＨ−ｐＫａｌの捕捉剤は抗Ｃ１ＩＮＨ―ｐＫａｌ抗体である。
【００２７】
ある実施態様において、該方法は、検出可能な、例えば標識された抗２Ｍ−ｐＫａｌ抗体および検出可能な、例えば標識された抗Ｃ１ＩＮＨ−ｐＫａｌ抗体と、基質とを接触させて、ｐＫａｌマーカーの存在もしくは量を測定することを含む。ある実施態様において、前記抗体は、着色産物を産生する、光子を放出する、光子を吸収する、基質を変化させる、もしくは基質の導電率を変化させる部分によって標識される。ある実施態様において、前記抗体は、電気化学発光を利用する部分によって標識される。ある実施態様において、前記抗体は、レジニウム（ｒｅｓｉｎｉｕｍ）によって標識される。ある実施態様において、前記基質は、メソスケールディスカバリデバイス（ｍｅｓｏ  ｓｃａｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｄｅｖｉｃｅ）中で提供される。ある実施態様において、前記基質は血液および血漿の一つもしくはその両方と共に使用するのに好適なディップスティックデバイス（ｄｉｐ−ｓｔｉｃｋ  ｄｅｖｉｃｅ）として提供される。ある実施態様において、前記第一の捕捉剤および前記第二の捕捉剤は、共通のもしくは流体接続されたチャンバー、例えばチャンバー、例えばマルチチャンバデバイス中の例えばウェルもしくはくぼみ、例えばマルチウェルプレートに配置される。特定の実施態様において、前記第一の捕捉剤と前記第二の捕捉剤は、基質上にプリントされる。
【００２８】
ある実施態様において、第一のｐＫａｌマーカーの前記捕捉剤は、前記基質上の第一の位置にあり、そして第二のｐＫａｌマーカーの前記捕捉剤は、前記基質上の第二の位置にあり、そして、前記第一のおよび第二の位置は、第一のｐＫａｌマーカーの存在を示すシグナルが、第二のｐＫａｌマーカーからのシグナルと区別できるように配置される。ある実施態様において、前記基質は、第三の位置で第三のマーカーの捕捉剤を含み、そして第三の位置は、第三のマーカーの存在を示すシグナルが前記第一および第二のマーカーからのシグナルと区別できるように前記基質上に配置される。ある実施態様において、前記第一の捕捉剤は、α２Ｍ−ｐＫａｌもしくはＣ１ＩＮＨ−ｐＫａｌに特異的である。ある実施態様において、前記第一の捕捉剤はα２Ｍ−ｐＫａｌに特異的であり、そして前記第二の捕捉剤はＣ１ＩＮＨ−ｐＫａｌに特異的である。
【００２９】
ある実施態様において、試料中のｐＫａｌマーカーの濃度の決定は、基質と前記試料との接触の、１時間、２時間、３時間、４時間もしくは５時間以内に行うことができる。ある実施態様において、試料中の２つのｐＫａｌマーカーの濃度の決定は、基質と前記試料との接触の、１時間、２時間、３時間、４時間もしくは５時間以内に行うことができる。ある実施態様において、２つのｐＫａｌマーカーの濃度の決定は、同時に実施されるアッセイにおいて、例えば試験のインキュベーションもしくは他の間隔が互いに重なり合うアッセイにおいて行うことができる。
【００３０】
他の態様において、本開示は、例えば本明細書に記載されるような複数のｐＫａｌマーカーの捕捉剤を含む基質を提供する。
【００３１】
さらなる態様において、本開示は、障害がｐＫａｌ阻害剤による治療に感受性であるか否かを決定する方法を提供し、該方法は、例えば、前記障害に罹患する対象において、または前記障害の動物モデルにおいて、例えば本明細書に記載される一つもしくはそれ以上のｐＫａｌマーカーの濃度を評価すること、決定された濃度を基準と比較することを含み、濃度が既定の基準を満たす場合、例えば、濃度が基準濃度であるかもしくはそれ以上である場合、ｐＫａｌ阻害剤による治療に感受性の障害であることを示す。ある実施態様において、該方法は、インビトロもしくはインビボにおいて、または前記障害の動物モデルにおいて、カリクレイン阻害剤の効果を評価することを含む。
【００３２】
他の態様において、本開示は、例えばブラジキニン媒介障害のようなｐＫａｌ媒介障害を持つ対象を治療する方法を提供し、該方法は、例えば本明細書に記載される方法によって本明細書に記載されるｐＫａｌマーカーの濃度を評価すること、決定すること、そして前記評価に応じて、治療を選択すること、例えばカリクレイン阻害剤の用量もしくは投与回数の一つもしくはその両方を選択することを含む。ある実施態様において、該方法は、前記対象にカリクレイン阻害剤を投与することを含む。ある実施態様において、前記患者は前記評価の前にカリクレイン阻害剤を投与されている。ある実施態様において、方法は、前記選択された用量もしくは回数でカリクレイン阻害剤を投与することを含む。
【００３３】
さらなる態様において、本開示は、障害がｐＫａｌ阻害剤による治療に感受性であるか否かを決定する方法を提供し、該方法は、例えば前記障害を罹患する対象または前記障害の動物モデルにおいて、例えば本明細書に記載される一つもしくは複数のｐＫａｌマーカーの濃度を評価すること、決定された濃度と基準とを比較することを含み、濃度が既定の基準を満たす場合、例えば濃度が基準濃度であるかもしくはそれ以上である場合、ｐＫａｌ阻害剤による治療に感受性の障害であることを示す。ある実施態様において、方法は、インビトロもしくはインビボにおいて、または前記障害の動物モデルにおいて、カリクレイン阻害剤の効果を評価することを含む。
【００３４】
他の態様において、本開示は、接触活性化が最少となるように、試料、例えば血液を採取するための方法およびデバイスを特徴とする。ある実施態様において、本開示は、本明細書に記述の捕捉試薬、例えばカリクレイン阻害剤、例えばＤＸ−８８と配列が類似しているポリペプチド、例えばＤＸ−８８と１個、２個もしくは５個未満のアミノ酸残基が異なるポリペプチド、例えばＥＰＩＫＡＬ−２がその中に入っている容器を特徴とする。容器は、例えば開口部、口、隔壁などを備え、同じ容器内で、対象からの試料、例えば血液の採取と、試料中のｐＫａｌ関連マーカー、例えばｐＫａｌ１と捕捉剤との結合が可能となるように、構成される。結合種、例えばｐＫａｌの測定は、同じ容器内で行うことができ、または実施態様よっては、基質を、測定前に容器から取り出して、例えば測定を他のデバイス上もしくはその中で行うことができる。ある実施態様において、容器の容量は、０．５〜１００ｍｌ、０．５〜５０ｍｌ、０．５〜１０ｍｌ、１〜１００ｍｌ、１〜５０ｍｌ、１〜２５ｍｌである。ある実施態様において、捕捉剤、例えばｐＫａｌ捕捉試薬は、容器の内部表面に配置される。捕捉試薬を、第一の特異的結合パートナーが結合している表面に結合させて、第二の特異的な結合パートナーを捕捉試薬に結合させることができる。特異的結合パートナーの例は、ビオチンとアビジンである。ある実施態様において、ビオチニル化された捕捉試薬、例えばｐＫａｌ捕捉試薬、例えばカリクレイン阻害剤、例えばＤＸ−８８と配列が類似するポリペプチド、例えば、ＤＸ−８８と１個、２個もしくは５個未満のアミノ酸残基が異なるポリペプチド、例えばＥｐｉｋａｌ−２を、アビジンでコートされた容器の表面に配置する。
【００３５】
本開示は、評価および治療に有用である、血漿カリクレイン媒介血管浮腫（ＫＭＡ）もしくはｐＫａｌに媒介される他の疾患を持つ患者を同定することのできるバイオマーカーを提供する。
【００３６】
バイオマーカーを介してｐＫａｌ活性化を示すことが示された患者は、ＨＡＥに関連する急性浮腫発作の治療に承認されたｐＫａｌの低分子タンパク質阻害剤である、ＤＸ−８８のような、ｐＫａｌ阻害剤による治療の候補である。他のｐＫａｌ阻害剤は、完全なヒト抗体の阻害剤であるＤＸ−２９３０を含む。ある実施態様において、バイオマーカーを介してｐＫａｌ活性化を示すことが示された患者は、例えば、インカチバント（Ｆｉｒａｚｙｒ（登録商標））のようなブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストによる治療の候補である。ある実施態様において、バイオマーカーを介してｐＫａｌ活性化を示すことが示された患者は、例えば、精製ヒト低温殺菌ナノ濾過Ｃ１−ＩＮＨ濃縮物（Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）のようなＣ１−ＩＮＨ補充剤による治療の候補である。
【００３７】
本開示の実施態様は、バイオマーカー、ならびに患者、例えば、血漿カリクレインによって産生されるブラジキニンによって引き起こされる浮腫に苦しむ患者の同定および治療におけるその使用を提供する。本明細書に開示される方法、組成物およびデバイスは、多くの点で有用である。例えば、ｐＫａｌマーカーの濃度は、接触系活性化の増加に関連する障害を同定するのに使用できる。初回スクリーニングの後に、血漿カリクレイン阻害剤（例えば、ＤＸ−８８、ＥＰＩＫＡＬ−２もしくはＤＸ−２９３０）による、例えば疾患の前臨床モデルにおけるインビトロもしくはインビボ試験を行うことができる。本明細書に開示されるマーカーは、薬力学バイオマーカーとして、または他にもカリクレイン阻害剤に対する対象の応答をモニターするためにも利用できる。本明細書に開示されるマーカーは、血漿カリクレインによって媒介される疾患の治療を可能にするため、ＨＡＥの予防的治療の際の用量を管理するため、もしくは切迫する急性ＨＡＥ発作を同定するために、コンパニオン診断において使用できる。
【００３８】
他の例示的な実施態様は、マイクロプレートに基づくｐＫａｌ活性アッセイを含み、該アッセイは（ａ）対象からの血漿試料を提供すること、（ｂ）ｐＫａｌによる切断後に検出可能なシグナルを放出できる標識に結合しているｐＫａｌ基質の存在下で、ｐＫａｌ系の活性化剤と共に血漿試料をインキュベートすること、（ｃ）検出可能なシグナルの濃度に基づいてｐＫａｌの活性を測定することを含む。活性化剤は、第ＸＩＩａ因子であり得る。ある例において、血漿試料は、活性化剤、ｐＫａｌ基質およびｐＫａｌ阻害剤候補と共にインキュベートされ得る。ある例において、該方法は、ｐＫａｌ阻害剤候補の活性を評価することをさらに含み、ｐＫａｌ阻害剤候補の非存在下でのｐＫａｌ活性のレベルと比較してｐＫａｌ阻害剤候補の存在下でのｐＫａｌ活性のレベルが低減すれば、該阻害剤候補が有効であることを示す。
【００３９】
本開示の一つもしくはそれ以上の実施態様の詳細は、以下の説明において説明される。本開示の他の特徴もしくは利点は、以下の図および、いくつかの実施態様の詳細な説明、ならびに添付した特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】血漿カリクレインの接触系活性化に含まれる要素の描写である。切断型ＨＭＷＫは、ウェスタンブロットにより決定することができる。α２Ｍ−ｐＫａｌおよびＣ１ＩＮＨ−ｐＫａｌは、イムノアッセイ（ＭＳＤプラットフォーム）によって決定することができる。
【図２】ウェスタンブロット解析による切断型キニノーゲンの検出を示す。試料を、還元条件においてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３〜８％Ｔｒｉｓ−酢酸）を用いて分析した後、ＰＶＤＦメンブレンに転写してイムノブロットを行った。レーン１は５０ｎＭのインタクトキニノーゲン、レーン２は、５０ｎＭの切断型キニノーゲン、レーン３は、５０ｎＭの低分子量キニノーゲン、レーン４は、１：２０クエン酸ナトリウム加ヒト血漿（ガラス製採血管）、レーン５は、カリクレイン処置された、１：２０クエン酸ナトリウム加ヒト血漿（プラスチック製採血管）、レーン６は、１：２０クエン酸ナトリウム加ヒト血漿（プラスチック製採血管）、レーン７は、２０ｎＭ２本鎖キニノーゲンを添加した、１：２０クエン酸ナトリウム加ヒト血漿（プラスチック製採血管）である。
【図３】Ｃ１ＩＮＨ−ｐＫａｌ複合体の精製を示す。陽イオン交換クロマトグラム（パネルＡ）は、Ｃ１ＩＮＨ、ｐＫａｌおよび複合体の分離を示す。陽イオン交換からの分画を回収して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（パネルＢ）。
【図４】ヒト血漿中のＣ１ＩＮＨ−ｐＫａｌを検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ標準曲線を示す。マウス抗ｐＫａｌ（クローン１３Ｇ１１）を固相にして、ヤギ抗Ｃ１阻害因子を検出のために使用した。
【図５】ヒト血漿中のＣ１ＩＮＨ−ｐＫａｌを検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ標準曲線を示す。ヤギ抗Ｃ１−ＩＮＨを固相にして、マウス抗ｐＫａｌ（クローン１３Ｇ１１）を検出のために使用した。
【図６】α２Ｍ−ｐＫａｌ複合体の精製を示す。複合体を、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製して（パネルＡ）、分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（パネルＢ）。
【図７】α２Ｍ−ｐＫａｌ複合体の定量を示す。血漿カリクレインの活性は、過剰量のα２Ｍを添加すると、プラトーレベルに減少したことが示された（パネルＡ）。ｐＫａｌに対して１０倍過剰のα２Ｍを用いて標準曲線を作成し、複合体中のｐＫａｌの濃度に従って本発明者らの精製α２Ｍ−ｐＫａｌ複合体のモル濃度を決定した。
【図８】ヒト血漿中のα２Ｍ−ｐＫａｌを検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ標準曲線を示す。抗α２Ｍを固相にして、マウス抗ｐＫａｌ（クローン１３Ｇ１１）を検出のために使用した。
【図９】ヒト血漿中のα２Ｍ−ｐＫａｌを検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ標準曲線を示す。マウス抗ｐＫａｌ（クローン１３Ｇ１１）を固相にして、抗α２Ｍを検出のために使用した。
【図１０】硫酸デキストランによる活性化後の正常ヒト血漿中のＣ１ＩＮＨ−ｐＫａｌおよびα２Ｍ−ｐＫａｌの複合体の検出を示す。
【図１１】発作時に得た患者の試料中のインタクトキニノーゲン（すなわち１本鎖）の検出を示す。患者の血漿試料を、抗プロテアーゼカクテルを含むクエン酸加採血管に採取した。
【図１２】マイクロプレートに基づくｐＫａｌ活性アッセイの略図であり、記載の実験は、処置したサルにおけるｐＫａｌ活性に対するＤＸ−２９３０の阻害活性を示す。
【図１３】プラセボ／溶媒を処置したサルからの血漿ならびにこの同じ血漿中に添加したＤＸ−２９３０対照における実験を示す。
【図１４】ＨＡＥ患者（ＣＭ、ＤＧ、ＢＢおよびＧＲ）からの血漿試料中のＨＭＷＫを示す。試料を、抗プロテアーゼ阻害剤カクテル中で採取した。ＭＷ：マーカー、Ｃ：１本鎖（６．４４μｇ／ｍｌ）＋２本鎖（１．５４μｇ／ｍｌ）、１：ＣＭ基礎状態、２：ＣＭ発作、３：ＤＧ基礎状態、４：ＤＧ発作、５：ＢＢ基礎状態、６：ＢＢ発作、７：ＧＲ基礎状態、８：ＧＲ発作、および９：プールされた正常血漿。
【図１５】ウェスタンブロット解析によって決定したＨＡＥ患者からの試料中の１本鎖ＨＭＷＫの濃度を示す。
【図１６】カニクイザルにおけるｐＫａｌ活性化に対するＤＸ−２９３０の阻害活性を示す。複数の用量のＤＸ−２９３０を、４日目のＡＰＴＴ血漿試料（カオリンもしくは１５μｇ／ｍｌの硫酸デキストランによる血漿活性化を伴ってもしくは伴わずに）のカニクイザルキニノーゲンのウェスタンブロット解析において使用した。
【図１７】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅウェスタン解析と従来のウェスタンブロット解析の両方を用いた、一例であるｐＫａｌ阻害剤Ｄｘ−２９３０の阻害活性を試験するための、例示的なＨＭＷＫエクスビボ活性化アッセイを図解する。本明細書に記載されるＨＭＷＫエクスビボ活性化アッセイは、最低濃度のＤＸ−２９３０がｐＫａｌ活性化を阻害することを示し、これは正常ヒト血漿中で内因性のＣ１阻害因子単独よりも優れていた。
【図１８】ＤＸ２９３０の適定を伴う、第ＸＩＩａ因子活性化血漿のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅの未加工データを示すＨＭＷＫエクスビボ活性化アッセイを示す。
【図１９】ウェスタンブロット解析によって決定した、３０分活性化後の血漿中のヒトＨＭＷキニノーゲンの検出を示す。
【図２０】血漿活性化の検出における、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ解析と従来のウェスタンブロット解析との間の比較を示す。
【図２１】血漿活性化の検出における、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ解析と従来のウェスタンブロット解析との間の比較を示す。
【図２２】未希釈の血漿試料ＢＲＨ７４５０４７における第ＸＩＩａ因子活性化の３０分後の１本鎖ＨＭＷＫの低減のパーセントを示す。
【図２３】未希釈の血漿試料ＢＲＨ７４５０４８における第ＸＩＩａ因子活性化の３０分後の１本鎖ＨＭＷＫの低減のパーセントを示す。
【図２４】未希釈の血漿試料ＢＲＨ７４５０６４における第ＸＩＩａ因子活性化の３０分後の１本鎖ＨＭＷＫの低減のパーセントを示す。
【図２５】未希釈の血漿試料ＢＲＨ７４５０６２における第ＸＩＩａ因子活性化の３０分後の１本鎖ＨＭＷＫの低減のパーセントを示す。
【図２６】未希釈の血漿試料ＢＲＨ７４５０４９、ＢＲＨ７４５０６２およびＢＲＨ７４５０６３における第ＸＩＩａ因子活性化の３０分後の１本鎖ＨＭＷＫの低減のパーセントを示す。
【図２７】さまざまな濃度の第ＸＩＩａ因子を含む血漿中の、１本鎖ＨＭＷＫの低減を示すグラフである。
【図２８】本明細書に記載される内因性で切断されるキニノーゲンアッセイにより決定した、正常、基本およびＨＡＥ発作患者における、２本鎖ＨＭＷＫの濃度を示す。
【図２９】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｌｅウェスタンブロットおよび従来のウェスタンブロットによって決定した、ＨＡＥ試料中の内因性に切断されるキニノーゲンを示すグラフである。
【図３０】ＨＡＥ患者からの試料における内因性の切断型キニノーゲンの濃度を示す。レーン１：精製された１本鎖および２本鎖のＨＭＷＫ。レーン２：クエン酸と共に採取した正常ヒト血漿試料。
【図３１】ＤＸ−２９３０で処置したサルからの血漿試料におけるｐＫａｌ活性のパーセント阻害、ならびにインビトロにおいてＤＸ−８８（エカランチド）、Ｃ１−ＩＮＨもしくはＤＸ−２９３０を添加した血漿試料中のｐＫａｌ活性のパーセント阻害を示すグラフである。パーセント阻害は、例示的なエクスビボｐＫａｌ活性化アッセイを用いて測定した。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。
【図３２】異なる用量のＤＸ−２９３０によって処置したヒトおよびサルからの血漿におけるｐＫａｌ活性のエクスビボでのパーセント阻害を示すグラフである。パーセント阻害は、例示的なエクスビボｐＫａｌ活性化アッセイを用いて測定した。破線は、エカランチドの治療的有効量のＣｍａｘにマッチする濃度である８０ｎＭのＤＸ−２９３０に関して観察されたパーセント阻害を示す。
【図３３】溶媒対照群における対応する試料に対して、それぞれの用量の群のそれぞれの日の投与後の平均阻害を比較する、ＤＸ−２９３０フェーズ１試験からの血漿試料中の「ｐＫａｌ活性の％阻害」を示す一連のプロットである。エラーバーは標準誤差である。
【図３４】第ＸＩＩａ因子による処置後のＤＸ−２９３０フェーズ１ａ対象からのウェスタンブロットデータを示すグラフである。エラーバーは、対象間の標準偏差を用いて計算した。群１の対象に、０．１ｍｇ／ｋｇを投与し、群２の対象に、０．３ｍｇ／ｋｇを投与し、群３の対象に、１ｍｇ／ｋｇを投与し、そして群４の対象に３ｍｇ／ｋｇを投与した。
【図３５】第ＸＩＩａ因子による処置を行わなかったＤＸ−２９３０フェーズ１ａ対象からのウェスタンブロットデータのグラフを示す。エラーバーは対象間の標準偏差を用いて計算した。群１の対象に、０．１ｍｇ／ｋｇを投与し、群２の対象に、０．３ｍｇ／ｋｇを投与し、群３の対象に、１ｍｇ／ｋｇを投与し、そして群４の対象に３ｍｇ／ｋｇを投与した。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本明細書において、対象の試料中で、インタクト高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、切断型ＨＭＷＫ、および／もしくはｐＫａｌ活性のような血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）系に関連するバイオマーカーの濃度を測定するアッセイを記載する。ある実施態様において、アッセイは、対象から得た試料をｐＫａｌ系の活性化剤と共にインキュベートすること、インタクト高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、切断型ＨＭＷＫおよび／もしくはｐＫａｌ活性のレベルを測定することを含む。そのようなアッセイは、例えば、対象がｐＫａｌに関連する疾患を有するかもしくはその危険性があるかを評価するため、ｐＫａｌに関連する疾患の治療を評価するため、ならびに、薬剤候補、例えば、ｐＫａｌ阻害剤のようなｐＫａｌ調節剤を同定するために有用である。そのようなアッセイはまた、例えばｐＫａｌに関連する疾患の治療などの治療のために、患者を選択するために有用である。
【００４２】
定義
便宜のため、本開示のさらなる説明の前に、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語をここで定義する。他の用語は、明細書に現れるときに定義する。
【００４３】
単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数への言及を含む。
【００４４】
本明細書において使用されるとき、「取得する」もしくは「取得」は、物理的実体もしくは値を「直接取得」もしくは「間接取得」することによって、物理的実体もしくは値、例えば数値の所持を得ることを指す。「直接取得」は、物理的実体もしくは値を得るために、プロセスを実施する（例えば、試料にアッセイもしくは試験を行うか、または、用語が本明細書で定義されるように「試料を分析する」）ことを意味する。「間接取得」は、他の団体もしくは供給源（例えば、物理的実体もしくは値を直接取得した第三者団体の研究室）から物理的実体もしくは値を受け取ることを指す。物理的実体の直接取得は、物理的物質、例えば開始物質の物理的な変化を含むプロセスを実施すること、例えば試料を分析することを含む。例示的な変化には、二つ以上の開始物質から物理的実体を作製すること、物質をせん断もしくは断片化すること、物質を分離もしくは精製すること、二つ以上の分離した実体を混合物に混合すること、共有結合もしくは非共有結合の破壊もしくは形成を含む化学反応を実施することが挙げられる。値を直接取得することは、試料若しくは別の物質の物理的変化を含むプロセスを行うこと、例えば物質、例えば試料、検体もしくは試薬の物理的変化（本明細書において時に「物理的分析」と呼ばれる）を含む分析プロセスを実施すること、分析方法、例えば以下の一つもしくはそれ以上を含む方法：物質、例えば検体、またはその断片もしくは他の誘導体を、他の物質から分離もしくは精製すること；検体またはその断片もしくは他の誘導体を、他の物質、例えば緩衝液、溶媒もしくは反応物と混合すること；または検体もしくはその断片もしくは他の誘導体の構造を、例えば検体の第一の原子と第二の原子との間の共有結合もしくは非共有結合を破壊もしくは形成することによって変化させること；または試薬もしくはその断片もしくは他の誘導体の構造を、例えば試薬の第一の原子と第二の原子との間の共有結合もしくは非共有結合を破壊もしくは形成することによって変化させること、を実施することを含む。
【００４５】
本明細書において使用されるとき、試料を「分析する」は、試料もしくは他の物質、例えば開始物質の物理的変化を含むプロセスを実施することを含む。例示的な変化には、二つ以上の開始物質からの物理的実体の作製、物質のせん断もしくは断片化、物質の分離もしくは精製、二つ以上の分離した実体の混合物への混合、共有結合もしくは非共有結合の破壊もしくは形成を含む化学反応の実施が挙げられる。試料の分析は、物質、例えば試料、検体もしくは試薬の物理的変化（本明細書においてしばしば「物理的分析」と呼ばれる）を含む分析プロセスを実施すること、分析方法、例えば以下の一つもしくはそれ以上を含む方法：物質、例えば検体、もしくはその断片もしくは他の誘導体を、他の物質から分離もしくは精製すること；検体もしくはその断片もしくは他の誘導体を、他の物質、例えば緩衝液、溶媒もしくは反応物と混合すること；または検体もしくはその断片もしくはその誘導体の構造を、例えば検体の第一の原子と第二の原子との間の共有結合もしくは非共有結合を破壊もしくは形成することによって変化させること；または試薬またはその断片もしくはその誘導体の構造を、例えば試薬の第一の原子と第二の原子との間の共有結合もしくは非共有結合を破壊もしくは形成することによって変化させること、を実施することを含み得る。
【００４６】
本明細書において使用されるとき、用語「アゴニスト」は、タンパク質の生物活性を模倣もしくはアップレギュレートする（例えば増強もしくは補足する）剤を指す。アゴニストは、野生型のタンパク質、または野生型のタンパク質の少なくとも一つの生物活性を持つその誘導体であり得る。アゴニストは、タンパク質の少なくとも一つの生物活性を増加させる化合物であり得る。アゴニストは、ポリペプチドと他の分子、例えば標的ペプチドもしくは核酸との相互作用を増加させる化合物であり得る。
【００４７】
本明細書において使用されるとき、用語「アンタゴニスト」は、タンパク質の生物活性の少なくとも一つをダウンレギュレートする（例えば抑制もしくは阻害する）剤を指す。アンタゴニストは、タンパク質と他の分子、例えば標的ペプチドもしくは酵素基質との相互作用を阻害もしくは減少させる化合物であり得る。アンタゴニストは、存在する発現タンパク質の量を低減もしくは阻害する化合物であり得る。典型的には、タンパク質もしくは遺伝子を阻害することは、本明細書に記載されるかまたは当技術分野に認識される一つもしくはそれ以上の方法によって測定されるとき、タンパク質もしくは遺伝子の発現もしくは関連する活性を少なくとも１０％もしくはそれ以上、例えば２０％、３０％、４０％もしくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくはそれ以上減少させること、または、発現もしくは関連する活性を、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍もしくはそれ以上減少させることを指す。
【００４８】
本明細書で用いられるとき、「結合親和性」は、見かけの会合定数もしくはＫａを指す。Ｋａは、解離定数（Ｋｄ）の逆数である。結合タンパク質は、特定の標的分子に対して、例えば、少なくとも１０５Ｍ−１、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１および１０１１Ｍ−１の結合親和性を有し得る。第二の標的と比較して第一の標的に対する結合タンパク質のより高い親和性結合は、第一の標的との結合に対するＫａが、第二の標的との結合に対するＫａ（もしくは数値Ｋｄ）よりも高い（もしくはより小さい数値Ｋｄ）ことによって示され得る。そのような場合、結合タンパク質は、第二の標的（例えば、第二の立体構造での同じタンパク質もしくはそれらの模倣体、または第二のタンパク質）と比較して、第一の標的（例えば、第一の立体構造でのタンパク質もしくはそれらの模倣体）に対して特異性を有する。結合親和性の差（例えば特異性もしくは他の比較）は、少なくとも、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３７．５倍、５０倍、７０倍、８０倍、９１倍、１００倍、５００倍、１０００倍、もしくは１０５倍であり得る。
【００４９】
結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴もしくは（例えば、蛍光アッセイを用いる）分光法を含むさまざまな方法によって決定できる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、ＴＲＩＳ緩衝液（５０ｍＭのＴＲＩＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）中である。これらの技術を用いて、結合タンパク質（もしくは標的）の濃度の関数として、結合している結合タンパク質および遊離の結合タンパク質の濃度を測定することができる。結合している結合タンパク質の濃度（［結合している］）は、遊離の結合タンパク質の濃度（［遊離］）および標的上の結合タンパク質に対する結合部位の濃度と、以下の式
［結合している］＝Ｎ  ［遊離］／（（１／Ｋａ）＋［遊離］）
で表される関係を有し、ここで（Ｎ）は、標的分子当たりの結合部位の数である。
【００５０】
しかし、Ｋａを正確に決定することは必ずしも必要ではなく、その理由は、時に、例えばＥＬＩＳＡもしくはＦＡＣＳ分析のような方法を用いて決定され、Ｋａに比例し、したがって、より高い親和性が、例えば２倍高いか否かを決定することなどの比較のために使用できる親和性の定量的測定を得ること、親和性の定性的測定を得ること、または、機能的アッセイ、例えばインビトロもしくはインビボのアッセイにおける活性によって親和性の推定値を得ることで十分であるためである。
【００５１】
用語「結合タンパク質」は、標的分子と相互作用できるタンパク質を指す。この用語は、「リガンド」と相互交換可能に使用される。「血漿カリクレイン結合タンパク質」は、血漿カリクレインと相互作用（例えば結合）できるタンパク質を指し、特に、選択的もしくは特異的に、血漿カリクレインと相互作用および／もしくは血漿カリクレインを阻害するタンパク質を含む。タンパク質は、タンパク質の非存在下での同じ条件における血漿カリクレインの活性と比較して血漿カリクレインの活性の低減を引き起こす場合、血漿カリクレインを阻害する。ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は抗体である。
【００５２】
用語「捕捉試薬」は、そのリガンドに特異的に結合する部分を指す。本明細書において使用されるとき、用語「複合体」もしくは「複合体形成」は、互いに対して特異的親和性を持つ要素間の複合体を指す。
【００５３】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を持つアミノ酸残基と置換されているものである。類似の側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されてきた。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、ならびに芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００５４】
バイオポリマーのモチーフ配列は、変異アミノ酸であり得る位置を含み得る。例えば、そのような文脈における記号「Ｘ」は他に特定されない限り任意のアミノ酸（例えば２０種の天然アミノ酸の任意のもの）を指し、例えば、任意の非システインアミノ酸を指す。他に許容されるアミノ酸はまた、例えば括弧およびスラッシュを用いて表記することができる。例えば、「Ａ／Ｗ／Ｆ／Ｎ／Ｑ」は、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、アスパラギンおよびグルタミンがその特定の位置において許容されることを意味する。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、「検出試薬」は、検出される部分に結合する部分を指す。典型的には、検出試薬は例えば蛍光のようなシグナルを発生するか、もしくは測定可能な化合物を産生する。
【００５６】
「エピトープ」は、結合タンパク質（例えば、Ｆａｂもしくは全長抗体のような抗体）が結合する標的化合物上の部位を指す。標的化合物がタンパク質である場合、部位はすべてアミノ酸構成要素からなることができるか、もしくは部位がすべてタンパク質のアミノ酸の化学修飾（例えばグリコシル部分）からなることができるか、またはそれらの組み合わせからなることができる。重なるエピトープは、少なくとも一つの共通のアミノ酸残基、グリコシル基、リン酸基、硫酸基、もしくは他の分子構造を含む。
【００５７】
第一の結合タンパク質が、標的化合物上で第二の結合タンパク質が結合する部位と同じ部位に結合する場合、または第二の結合タンパク質が結合する部位と重なる（例えば、アミノ酸配列もしくは他の分子特徴（例えばグリコシル基、リン酸基もしくは硫酸基）に関して、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％重なる）部位に結合する場合、第一の結合タンパク質（例えば抗体）は、第二の結合タンパク質（例えば抗体）と「同じエピトープに結合する」。
【００５８】
第一の結合タンパク質のそのエピトープに対する結合が、そのエピトープへと結合する第二の結合タンパク質の量を減少させる（例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％もしくはそれ以上）場合、第一の結合タンパク質（例えば抗体）が、第二の結合タンパク質（例えば抗体）と「結合に関して競合する」。競合は、直接的（例えば、第一の結合タンパク質が、第二の結合タンパク質が結合するエピトープと同じエピトープに結合するかまたは、第二の結合タンパク質が結合するエピトープと重なるエピトープに結合する）であっても、間接的（例えば、第一の結合タンパク質のそのエピトープに対する結合が標的化合物の立体構造変化を引き起こし、それによってそのエピトープに対する第二の結合タンパク質の結合能が低減する）であってもよい。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、「機能的な」生物学的分子は、その生物学的分子が特徴付けられる特性および／もしくは活性を示す形態にある生物学的分子である。
【００６０】
２つの配列の間の「相同性」もしくは「配列同一性」（これらの用語は本明細書において相互交換可能に使用される）の計算は、以下のように実施される。配列は、最適比較の目的のために整列させる（例えば最適アラインメントのために、第一のおよび第二のアミノ酸もしくは核酸の配列の一方もしくは両方にギャップを導入でき、非相同性配列は、比較の目的のために度外視できる）。最適アラインメントを、１２のギャップペナルティ、４のギャップ拡張ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティでＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスによるＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いた最良のスコアとして決定する。次に、対応するアミノ酸位置もしくはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを比較する。第一の配列中の位置が、第二の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドによって占められているとき、それら分子は、その位置において同一である（本明細書において使用されるとき、アミノ酸もしくは核酸の「同一性」は、アミノ酸もしくは核酸の「相同性」と等価である）。２個の配列の間のパーセント同一性は、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【００６１】
好ましい実施態様において、比較目的で整列させる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％もしくは１００％である。例えば、参照配列は、イムノグロブリン可変ドメイン配列の長さであってよい。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、用語「低ストリンジェント、中ストリンジェント、高ストリンジェントもしくは非常に高いストリンジェントな条件下でのハイブリダイズ」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を記載する。ハイブリダイゼーション反応を実施するためのガイダンスは、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６．」に見出すことができる。水性および非水性の方法がその参考文献に記載され、いずれも使用することができる。本明細書に言及される具体的なハイブリダイゼーションの条件は、以下の：（１）約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中の後に、少なくとも５０℃（低ストリンジェント条件において、洗浄温度は５５℃まで上昇させることができる）で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の洗浄を行う低ストリンジェントハイブリダイゼーション条件、（２）約４５℃で６×ＳＳＣ中の後に、６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回もしくはそれ以上の洗浄を行う中ストリンジェントハイブリダイゼーション条件、（３）約４５℃で６×ＳＳＣ中の後に、６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回もしくはそれ以上の洗浄を行う高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件であり、そして（４）非常に高いストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、６５℃で０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳの後に、６５℃で０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中での１回もしくはそれ以上の洗浄を行う。非常に高いストリンジェント条件（４）は、好ましい条件であり、他に特定されない限り、使用されるべきものである。本開示は、例えば本明細書に記載される結合タンパク質をコードする核酸のような、本明細書に記載される核酸もしくはその相補体に、低、中、高もしくは非常に高いストリンジェントでハイブリダイズする核酸を含む。該核酸は、参照核酸の長さと同じであるか、またはその３０％、２０％もしくは１０％の範囲の長さであってよい。核酸は、本明細書に記載されるイムノグロブリン可変ドメイン配列をコードする領域に対応し得る。
【００６３】
「単離した組成物」は、単離した組成物を得ることができる天然試料の少なくとも一つの成分の少なくとも９０％が除去された組成物を指す。人工的にもしくは天然で産生された組成物は、関心対象の種もしくは種の集団が、少なくとも５、１０、２５、５０、７５、８０、９０、９２、９５、９８もしくは９９重量％で純粋である場合、「少なくとも」特定の度合いで純粋である「組成物」であり得る。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、用語「インビトロ」は、人為的環境、例えば多細胞生物内ではなく、例えば試験管もしくは反応容器において、細胞培養等において起こる事象を指す。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、用語「インビボ」は、ヒトもしくは非ヒトの動物のような多細胞生物内で起こる事象を指す。
【００６６】
「単離した組成物」は、単離した組成物を得ることができる天然試料の少なくとも一つの成分の少なくとも９０％が除去された組成物を指す。人工的にもしくは天然で産生された組成物は、関心対象の種もしくは種の集団が、少なくとも５、１０、２５、５０、７５、８０、９０、９２、９５、９８もしくは９９重量％純粋である場合、「少なくとも」特定の度合いで純粋である「組成物」であり得る。
【００６７】
「単離した」タンパク質は、単離したタンパク質を得ることができる天然試料の少なくとも一つの成分の少なくとも９０％が除去されたタンパク質を指す。タンパク質は、対象の種もしくは種の集団が、少なくとも５、１０、２５、５０、７５、８０、９０、９２、９５、９８もしくは９９重量％で純粋である場合、「少なくとも」特定の度合いで純粋であり得る。
【００６８】
用語「カリクレイン」（例えば血漿カリクレイン）は、セリンプロテアーゼファミリーのサブグループであるペプチダーゼ（タンパク質のペプチド結合を切断する酵素）を指す。血漿カリクレインは、キニノーゲンを切断して強力な炎症誘発性ペプチドであるキニンを産生する。
【００６９】
用語「カリクレイン阻害剤」は、カリクレインを阻害する任意の剤もしくは分子を指す。例えば、ＤＸ−８８（本明細書において「ＰＥＰ−１」とも呼ばれる）は、血漿カリクレイン（ＮＰ＿０００８８３）の強力（Ｋｉ＜１ｎＭ）かつ特異的な阻害剤である（例えばＷＯ９５／２１６０１もしくはＷＯ２００３／１０３４７５を参照）。
【００７０】
本明細書において使用されるとき、用語「ＤＸ−２９２２」は、用語「Ｘ１０１−Ａ０１」と交換可能に使用される。この抗体の他の変異型を以下に記載する。
【表１】
0006757252.tif 000002
【００７１】
本明細書において使用されるとき、用語「ＤＸ−２９３０」は、用語「Ｘ１２４−Ｇ０１」と交換可能に使用される。この抗体の他の変異型を以下に記載する。
【表２】
0006757252.tif 000003
【００７２】
用語「調節剤」は、調節を起こすことが可能であり得る、ポリペプチド、核酸、巨大分子、複合体、分子、小分子、化合物、種など（天然もしくは非天然）、または、細菌、植物、酵母もしくは動物の細胞もしくは組織のような生物学的物質から作製される抽出物を指す。調節剤は、アッセイに含めることにより、機能特性、生物学的活性もしくはプロセス、またはそれらの組み合わせの、（直接もしくは間接の）阻害剤もしくは活性化剤としての潜在的活性（例えば、アゴニスト、部分アンタゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト、抗菌剤、細菌感染もしくは増殖の阻害剤など）について評価され得る。そのようなアッセイにおいて、多くの調節剤が一度にスクリーニングされ得る。調節剤の活性は、公知、未知、もしくは部分的に公知であり得る。
【００７３】
「非必須」アミノ酸残基は、例えば抗体のような結合剤の野生型配列から生物学的活性を消失させることなく、もしくはより好ましくは生物学的活性を実質的に変化させることなく変更できる残基であり、一方で「必須」アミノ酸残基は、活性の大幅な喪失を生じる。
【００７４】
該方法によって治療される「患者」、「対象」もしくは「宿主」（これらの用語は交換可能に使用される）は、ヒトもしくは非ヒトの動物のいずれかを意味し得る。ある実施態様において、対象は、カリクレイン媒介障害、例えばブラジキニン媒介障害、例えば遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）の危険性があるか、もしくはそれに罹患している。ある実施態様において、対象は、非ヒスタミン依存性特発性血管性浮腫、関節リウマチ、クローン病、狼瘡、アルツハイマー病、敗血症性ショック、熱傷損傷、脳虚血／再潅流傷害、脳浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、黄斑浮腫、血管炎、動脈または静脈の血栓症、補助人工心臓もしくはステントに関連する血栓症、血栓症を伴うヘパリン起因性血小板減少、血栓塞栓症、不安定狭心症を伴う冠動脈性心疾患、浮腫、眼疾患、痛風、腸疾患、口腔粘膜炎、神経因性疼痛、炎症性疼痛、脊柱管狭窄症変性脊椎疾患、術後イレウス、大動脈瘤、変形性関節症、遺伝性血管浮腫、肺塞栓症、脳卒中、頭部外傷もしくは腫瘍周囲脳浮腫、敗血症、急性中大脳動脈（ＭＣＡ）虚血事象（脳卒中）、再狭窄（例えば血管形成術後）、全身性エリテマトーデス腎炎、自己免疫疾患、炎症性疾患、心血管疾患、神経疾患、タンパク質ミスフォールディングに関連する疾患、血管新生に関連する疾患、高血圧性腎症および糖尿病性腎症、アレルギーおよび呼吸器疾患（例えば、アナフィラキシー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、持続性鼻炎）および組織損傷（例えば、熱傷もしくは化学的損傷）の危険性を有するかもしくはそれに罹患している。
【００７５】
用語「プレカリクレイン」および「プレ血漿カリクレイン」は本明細書において交換可能に使用され、プレカリクレインとしても知られる活性血漿カリクレインの酵素前駆体形態を指す。
【００７６】
対象における疾患の「予防」もしくはそれを「予防する」という用語は、疾患の少なくとも一つの症状が予防されるように、対象に例えば薬剤の投与のような薬物治療を施すことを指し、すなわち、宿主が望ましくない状態を発症するのを防ぐために、望ましくない状態（例えば疾患もしくは宿主動物の他の望ましくない状態）の臨床症状発現より前に投与することを指す。疾患を「予防する」は、「予防」もしくは「予防的治療」とも呼ばれ得る。
【００７７】
本明細書において使用されるとき、用語「実質的に同一」（もしくは「実質的に相同」）は、第一および第二のアミノ酸もしくは核酸配列が、類似の活性、例えば結合活性、結合選択性もしくは生物学的活性を有する（もしくは有するタンパク質をコードする）ように、第二のアミノ酸もしくは核酸配列と同一もしくは同等の（例えば、類似の側鎖を有する、例えば保存的アミノ酸置換）アミノ酸残基もしくは核酸の十分数を含む、第一のアミノ酸もしくは核酸配列を指すものとして本明細書において使用される。抗体の場合、第二の抗体は、同じ抗原に対して同じ特異性を持ち、かつ同じ抗原に対して少なくとも５０％、少なくとも２５％もしくは少なくとも１０％の親和性を持つ。
【００７８】
本明細書に開示される配列と類似もしくは相同である配列は、本願の部分でもある。ある実施態様において、配列の同一性は、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上であり得る。
【００７９】
さらに、核酸セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件（例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件）で相補鎖に結合するとき、実質的な同一性が存在する。核酸は、全細胞に、細胞溶解物に、または部分精製もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る、
【００８０】
バイオポリマーのモチーフ配列は、変異アミノ酸であり得る位置を含み得る。例えば、そのような文脈における記号「Ｘ」は他に特定されない限り任意のアミノ酸（例えば２０種の天然アミノ酸の任意のもの）を指し、例えば、任意の非システインアミノ酸を指す。他に許容されるアミノ酸はまた、例えば括弧およびスラッシュを用いて表記することができる。例えば、「Ａ／Ｗ／Ｆ／Ｎ／Ｑ」は、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、アスパラギンおよびグルタミンがその特定の位置において許容されることを意味する。
【００８１】
統計学的有意性は、任意の当技術分野に公知の方法によって測定され得る。例示的な統計学的検定には、スチューデントのｔ検定、マン・ホイットニーのＵノンパラメトリック検定およびウィルコクソンのノンパラメトリック検定が挙げられる。ある統計的に有意な関係は、０．０５もしくは０．０２未満のＰ値を持つ。用語「誘導する」、「阻害する」、「増強する」、「上昇する」、「増加する」、「減少する」などは、例えば二つの状態の間の、区別可能な定性的もしくは定量的な差を指し、二つの状態の間に差があること、例えば統計学的有意差があることを意味し得る。
【００８２】
本明細書で使用されるとき、「試料」は、対象からの組織、例えば血液、血漿もしくはタンパク質を含む組成物を指す。試料は、対象から採取された、最初の未処理の試料と、例えば部分精製もしくは保存の形態のような、その後に処理されたものとの両方を含む。例示的な試料は、血液、血漿、涙液、もしくは粘液を含む。
【００８３】
「治療的有効量」は、好ましくは、例えば血漿カリクレイン活性のような測定可能なパラメータを、無処置の対象と比較して、統計学的に有意な程度に、または少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも約８０％調節する。例えば疾患関連パラメータのような測定可能なパラメータを調節する化合物の能力は、ヒトの障害および状態における有効性を予測する動物モデル系において評価できる。代替的に、組成物のこの性質は、インビトロのパラメータを調節する化合物の能力を試験することによって評価できる。
【００８４】
対象における疾患（もしくは状態）の「治療」または疾患を持つ対象の「治療」は、疾患の少なくとも一つの症状が治癒、緩和もしくは減少するように、例えば薬物投与のような薬物治療を対象に施すことを指す。
【００８５】
対象における疾患を「予防する」という用語は、疾患の少なくとも一つの症状が予防されるように、対象に例えば薬剤の投与のような薬物治療を施すことを指し、すなわち、宿主が望ましくない状態になることを防ぐために、望ましくない状態（例えば疾患もしくは宿主動物の他の望ましくない状態）の臨床症状発現より前に投与することを指す。疾患を「予防する」は、「予防」もしくは「予防的治療」とも呼ばれる。
【００８６】
「予防的有効量」は、所望の予防の結果を達成するのに有効な、用量および必要な期間の量を指す。典型的には、疾患の前、もしくは疾患の初期段階において予防的な用量が対象に用いられるため、予防的有効量は、治療的有効量よりも低いであろう。
【００８７】
アルファベットもしくは数字の見出しを含む見出しは、単に理解と読解の容易さのためのものであり、別段の表示がない限り、時間的な順序もしくは好ましさの階層を課すものではない。
【００８８】
接触系バイオマーカー
血漿カリクレインは、大部分がその基質である高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）に結合している、プレカリクレインと呼ばれる不活性の酵素前駆体として循環する。刺激に応答して、第ＸＩＩ因子は活性化して第ＸＩＩａ因子となる。第ＸＩＩａ因子は、プレカリクレインを切断して、活性血漿カリクレインを形成する（図１）。循環中のプレカリクレインのおよそ７５〜９０％が、ＨＭＷＫのドメイン６との非活性部位相互作用を通じてＨＭＷＫに結合する。遊離のおよびＨＭＷＫに結合した活性ｐＫａｌは切断型ＨＭＷＫおよびブラジキニンを産生する。血漿カリクレイン活性化のバイオマーカーを表２に示す。バイオマーカーの適合性は、ＨＡＥの急性発作の存在および非存在におけるその濃度を追跡することによって実証できる。これらのバイオマーカーの濃度はまた、ブラジキニン媒介浮腫の発作時もしくはｐＫａｌ活性に媒介される他の疾患の際に変動し得る。
【００８９】
以下の表２は、ｐＫａｌもしくはブラジキニン媒介障害について対象を評価するための表２および本明細書のいずれかに記載した方法によって評価できるマーカーを提供する。表２は、ｐＫａｌもしくはブラジキニン媒介障害に関連するマーカーの濃度の変化の方向を示す。
【００９０】
バイオマーカーのアッセイ
本明細書に開示されるバイオマーカーの濃度（例えば量）、もしくは本明細書に開示されるバイオマーカーの濃度の変化は、本明細書に記載されるアッセイおよび／もしくは当技術分野に公知のアッセイを用いて評価することができる。バイオマーカーの濃度を評価するのに利用できるアッセイには、例えばイムノアッセイ、例えばウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、電気化学発光に基づく検出アッセイおよび関連する技術が挙げられる。質量分析に基づくアプローチを使用することもできる。発色基質に依存するアッセイもまた利用できる。
【００９１】
ある実施態様において、電気化学発光検出アッセイもしくは電気化学発光とパターン化アレイ技術の組み合わせに依存するアッセイ（例えばＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  （ＭＳＤ）のＥＣＬもしくはＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹ技術アッセイ）が使用される。
【００９２】
（ｉ）プレカリクレイン
プレカリクレインの濃度は、プレカリクレインに関する既存のアッセイ、例えばイムノアッセイ、例えばプレカリクレインＥＬＩＳＡを用いて評価できる。例えば、プレカリクレインＥＬＩＳＡキットは、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍより市販されている（カタログ番号ＡＢＩＮ８５８０７３）。プレカリクレインに結合する抗体は当技術分野において公知であり、例えばイムノアッセイにおいて、プレカリクレインの検出のために利用できる。例えば、マウスモノクローナル抗ヒトプレカリクレイン抗体が作製されている。例えばＶｅｌｏｓｏ，Ｄ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１９８７、７０（４）：１０５３〜１０６２を参照できる。ヒツジ抗ヒトプレカリクレイン抗体は、ＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（ＧｅｎＷａｙＩＤ：ＧＷＢ−５８ＡＣ７９）より市販されている。
【００９３】
ある実施態様において、試料のアリコート中のｐＫａｌの濃度を決定する。次に、試料のアリコート中の全てのプレカリクレインをｐＫａｌに変換して、ｐＫａｌの濃度を測定する。第二の濃度から第一の濃度を差し引くことでプレカリクレインの量がもたらされる。濃度の決定は、酵素活性によって行うことができる。
【００９４】
（ｉｉ）活性血漿カリクレイン
活性血漿カリクレイン（活性化ｐＫａｌ）は、例えばイムノアッセイを用いて検出できる。イムノアッセイは、例えばＤＸ−２９３０もしくはＤＸ−２９２２のような、活性血漿カリクレインにのみ結合する抗体を使用することができる。一実施態様において、アッセイは、活性ｐＫａｌと、捕捉試薬、例えばカリクレイン阻害剤、例えばＤＸ−８８と配列が類似であるポリペプチド、例えばＤＸ−８８と１個、２個もしくは５個未満のアミノ酸残基が異なるポリペプチド、例えばＥＰＩＫＡＬ−２との結合に依存する。
【００９５】
ある実施態様において、捕捉試薬を基質上で提供し、試料と接触させ、そして捕捉試薬に結合した量を、例えば抗ｐＫａｌ抗体によって決定する。ある実施態様において、接触活性化のレベルを低減させるために、例えば、一つの容器から他の容器への移動のような試料の試料操作を最小限にする。ある実施態様において、捕捉試薬は、同じデバイス、例えば採取容器、例えば試料、例えば血液を対象から採取するために用いられる採血管に入れられる。
【００９６】
本開示において、ｐＫａｌ活性を決定するためのエクスビボ活性化アッセイ（例えばマイクロプレートに基づいたｐＫａｌ活性アッセイ）もまた提供され、該方法は、（ｉ）対象からの血漿試料を提供すること、（ｉｉ）ｐＫａｌによる切断後に検出可能なシグナルを放出できる標識に結合しているｐＫａｌ基質の存在下で、ｐＫａｌ系活性化剤と共に血漿試料をインキュベートすること、および（ｉｉｉ）検出可能なシグナルの濃度に基づいてｐＫａｌの活性を測定することを含む。ある例において、活性化剤は、第ＸＩＩａ因子である。ある例において、血漿試料は、活性化剤、ｐＫａｌ基質およびｐＫａｌ阻害剤候補と共にインキュベートされる。ある例において、該方法は、ｐＫａｌ阻害剤候補の活性を評価することをさらに含み、ｐＫａｌ阻害剤候補の非存在下でのｐＫａｌ活性のレベルと比較してｐＫａｌ阻害剤候補の存在下でのｐＫａｌ活性のレベルが低減すれば、該阻害剤候補が有効であることを示す。
【００９７】
【表３】
0006757252.tif 000004
0006757252.tif 000005
【００９８】
該方法は、対象がｐＫａｌに関連する疾患を有するかまたはその危険性があるかを評価することをさらに含んでもよく、既定値（例えば、健康な対象もしくは健康な対象集団からの試料におけるｐＫａｌ活性のレベル）と比較してｐＫａｌ活性のレベルが上昇すれば、対象が該疾患を有するかその危険性があることを示す。
【００９９】
該方法は、ｐＫａｌに関連する疾患の治療のような、治療の有効性を評価することをさらに含み得る。複数の生物学的試料（例えば血漿試料）を、ＨＡＥのようなｐＫａｌ関連疾患を持ち、そしてｐＫａｌ阻害剤のような治療剤によって治療されている患者から、治療の前、治療の過程の最中、および／もしくは治療の後に得ることができる。それらの生物学的試料中のｐＫａｌ活性のレベルもしくはｐＫａｌ活性の指標であるバイオマーカーは、本明細書に開示されるアッセイ法の任意のものを用いて測定できる。治療前と比較してｐＫａｌ活性レベルが低減すればもしくはｐＫａｌ活性の指標であるバイオマーカーの一つもしくはそれ以上のレベルが低減すれば、または、治療の過程にわたってのｐＫａｌ活性／バイオマーカーのレベルが低減すれば、治療が有効であることを示す。
【０１００】
（ｉｉｉ）α２Ｍ−ｐＫａｌ複合体
血漿カリクレインα２マクログロブリン複合体（α２Ｍ−ｐＫａｌ複合体）は、例えばイムノアッセイを用いて検出できる。例えば、サンドイッチに基づくＥＬＩＳＡアッセイが、実施例２に記載されるように開発されている。定量的サンドイッチＥＬＩＳＡはまた、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１９９１、７７（１２）：２６６０−２６６７およびＷａｃｈｔｆｏｇｅｌ，Ｙ．Ｔ．ら、１９８９、Ｂｌｏｏｄ、７３：４６８〜４７１において報告される。免疫固定化酵素アッセイは、Ｈａｒｐｅｌ，Ｐ．Ｃ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９８５、２６０（７）：４２５７〜４２６３において報告される。例えば、ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．ｃｏｍにおいて入手可能であり、そのプロトコールがｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．ｃｏｍ／ｍｅｔｈｏｄｓ／ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ＿ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ＿ｍｅｔｈｏｄｓ＿ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ−ｌｉｋｅ．ｈｔｍにおいて提供される、発色基質Ｓ−２３０２を用いる発色基質アッセイもまた利用できる。
【０１０１】
（ｉｖ）Ｃ１ＩＮＨ−ｐＫａｌ複合体
Ｃ１ＩＮＨ−ｐＫａｌ複合体は、例えばイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ法、例えば実施例３に記載される方法を用いて検出できる。例えば、抗ｐＫａｌ抗体（例えばマウスｍＡｂ  １３Ｇ１１）が捕捉抗体であり、Ｃ１ＩＮＨに対する抗体が検出抗体として使用されるサンドイッチＥＬＩＳＡ、またはＣ１ＩＮＨに対する抗体が捕捉抗体として使用され、抗ｐＫａｌ抗体（例えばマウスｍＡｂ  １３Ｇ１１）が検出抗体であるサンドイッチＥＬＩＳＡが利用できる。Ｃ１ＩＮＨに対する抗体は当技術分野において公知である。例えば、ヒトＣ１阻害因子に対するマウスモノクローナル抗体はＡＢＢＩＯＴＥＣから入手可能である（カタログ番号２５０１２２）。ヒトＣ１阻害因子に対する他のマウスモノクローナル抗体（４Ｇ１２）は、ｐｉｅｒｃｅ−ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ｃｏｍから入手可能である（製品番号ＬＦ−ＭＡ０１３６）。ヤギ抗ヒトＣ１阻害因子抗体は、Ｑｕｉｄｅｌより入手可能である（カタログ番号Ａ３００）。Ｃ１ＩＮＨ−ｐＫａｌ複合体の検出のための他のＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイは、Ｗａｃｈｔｆｏｇｅｌ，Ｙ．Ｔ．ら、１９８９、Ｂｌｏｏｄ、７３：４６８〜４７１において使用された。
【０１０２】
（ｖ）インタクトＨＭＷＫ
インタクト高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）は、例えば、凝集法もしくは例えばラジオイムノアッセイのような免疫学的方法を用いてアッセイできる（例えばＫｅｒｂｉｒｉｏｕ−Ｎａｂｉａｓ，Ｄ．Ｍ．、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ、１９８４、５６（２）：２７３４〜２７８６を参照できる）。ヒトＨＭＷＫ軽鎖に対するモノクローナル抗体は公知である（例えば、Ｒｅｄｄｉｇａｒｉ，Ｓ．Ｒ．およびＫａｐｌａｎ，Ａ．Ｐ．、Ｂｌｏｏｄ、１９９９、７４：６９５〜７０２を参照できる）。発色基質に基づくＨＭＷＫのアッセイもまた使用できる（例えば、Ｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ｆ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ、１９８７、４８（６）：６８５〜７００；Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ，Ｍ．Ｊ．らＴｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ、２００４、１１４（２）：９１−９６を参照できる）。
【０１０３】
ＨＭＷＫをコードするヒトの遺伝子は、キニノーゲン１（ＫＮＧ１）である。ＫＮＧ１は、転写され、そして選択的にスプライシングされて、ＨＭＷＫもしくは低分子量キニノーゲン（ＬＭＷＫ）のいずれかをコードするｍＲＮＡを形成する。ＨＭＷＫの例示的なタンパク質配列を以下に提供する：
＞ｇｉ｜１５６２３１０３７｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００１０９５８８６．１｜  キニノーゲン−１アイソフォーム１前駆体［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ］
ＭＫＬＩＴＩＬＦＬＣＳＲＬＬＬＳＬＴＱＥＳＱＳＥＥＩＤＣＮＤＫＤＬＦＫＡＶＤＡＡＬＫＫＹＮＳＱＮＱＳＮＮＱＦＶＬＹＲＩＴＥＡＴＫＴＶＧＳＤＴＦＹＳＦＫＹＥＩＫＥＧＤＣＰＶＱＳＧＫＴＷＱＤＣＥＹＫＤＡＡＫＡＡＴＧＥＣＴＡＴＶＧＫＲＳＳＴＫＦＳＶＡＴＱＴＣＱＩＴＰＡＥＧＰＶＶＴＡＱＹＤＣＬＧＣＶＨＰＩＳＴＱＳＰＤＬＥＰＩＬＲＨＧＩＱＹＦＮＮＮＴＱＨＳＳＬＦＭＬＮＥＶＫＲＡＱＲＱＶＶＡＧＬＮＦＲＩＴＹＳＩＶＱＴＮＣＳＫＥＮＦＬＦＬＴＰＤＣＫＳＬＷＮＧＤＴＧＥＣＴＤＮＡＹＩＤＩＱＬＲＩＡＳＦＳＱＮＣＤＩＹＰＧＫＤＦＶＱＰＰＴＫＩＣＶＧＣＰＲＤＩＰＴＮＳＰＥＬＥＥＴＬＴＨＴＩＴＫＬＮＡＥＮＮＡＴＦＹＦＫＩＤＮＶＫＫＡＲＶＱＶＶＡＧＫＫＹＦＩＤＦＶＡＲＥＴＴＣＳＫＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴＫＫＬＧＱＳＬＤＣＮＡＥＶＹＶＶＰＷＥＫＫＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫＲＰＰＧＦＳＰＦＲＳＳＲＩＧＥＩＫＥＥＴＴＶＳＰＰＨＴＳＭＡＰＡＱＤＥＥＲＤＳＧＫＥＱＧＨＴＲＲＨＤＷＧＨＥＫＱＲＫＨＮＬＧＨＧＨＫＨＥＲＤＱＧＨＧＨＱＲＧＨＧＬＧＨＧＨＥＱＱＨＧＬＧＨＧＨＫＦＫＬＤＤＤＬＥＨＱＧＧＨＶＬＤＨＧＨＫＨＫＨＧＨＧＨＧＫＨＫＮＫＧＫＫＮＧＫＨＮＧＷＫＴＥＨＬＡＳＳＳＥＤＳＴＴＰＳＡＱＴＱＥＫＴＥＧＰＴＰＩＰＳＬＡＫＰＧＶＴＶＴＦＳＤＦＱＤＳＤＬＩＡＴＭＭＰＰＩＳＰＡＰＩＱＳＤＤＤＷＩＰＤＩＱＩＤＰＮＧＬＳＦＮＰＩＳＤＦＰＤＴＴＳＰＫＣＰＧＲＰＷＫＳＶＳＥＩＮＰＴＴＱＭＫＥＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列識別番号５）
【０１０４】
（ｖｉ）切断型ＨＭＷＫ
切断型高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）は、本明細書において「切断型キニノーゲン」とも呼ばれ、例えば、例えばウェスタンブロットのような実施例１に記載されるような方法を用いてアッセイできる。例えばマウスｍＡｂクローン１１Ｈ０５のような、切断型ＨＭＷＫに結合する抗体を使用できる。さらに、切断型ＨＭＷＫは、質量分析を用いて評価してもよい。切断型ＨＭＷＫの濃度を評価するためのイムノブロット技術は、当技術分野に公知である（例えば、Ｂｕｈｌｅｒ  Ｒ．ら、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ、１９９５、６（３）：２２３〜２３２を参照できる）。
【０１０５】
切断型キニノーゲンの重鎖および軽鎖の例示的な配列を以下に提する。
＞  切断型キニノーゲン−１重鎖
ＱＥＳＱＳＥＥＩＤＣＮＤＫＤＬＦＫＡＶＤＡＡＬＫＫＹＮＳＱＮＱＳＮＮＱＦＶＬＹＲＩＴＥＡＴＫＴＶＧＳＤＴＦＹＳＦＫＹＥＩＫＥＧＤＣＰＶＱＳＧＫＴＷＱＤＣＥＹＫＤＡＡＫＡＡＴＧＥＣＴＡＴＶＧＫＲＳＳＴＫＦＳＶＡＴＱＴＣＱＩＴＰＡＥＧＰＶＶＴＡＱＹＤＣＬＧＣＶＨＰＩＳＴＱＳＰＤＬＥＰＩＬＲＨＧＩＱＹＦＮＮＮＴＱＨＳＳＬＦＭＬＮＥＶＫＲＡＱＲＱＶＶＡＧＬＮＦＲＩＴＹＳＩＶＱＴＮＣＳＫＥＮＦＬＦＬＴＰＤＣＫＳＬＷＮＧＤＴＧＥＣＴＤＮＡＹＩＤＩＱＬＲＩＡＳＦＳＱＮＣＤＩＹＰＧＫＤＦＶＱＰＰＴＫＩＣＶＧＣＰＲＤＩＰＴＮＳＰＥＬＥＥＴＬＴＨＴＩＴＫＬＮＡＥＮＮＡＴＦＹＦＫＩＤＮＶＫＫＡＲＶＱＶＶＡＧＫＫＹＦＩＤＦＶＡＲＥＴＴＣＳＫＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴＫＫＬＧＱＳＬＤＣＮＡＥＶＹＶＶＰＷＥＫＫＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫ  （配列識別番号６）
＞  切断型キニノーゲン−１軽鎖
ＳＳＲＩＧＥＩＫＥＥＴＴＶＳＰＰＨＴＳＭＡＰＡＱＤＥＥＲＤＳＧＫＥＱＧＨＴＲＲＨＤＷＧＨＥＫＱＲＫＨＮＬＧＨＧＨＫＨＥＲＤＱＧＨＧＨＱＲＧＨＧＬＧＨＧＨＥＱＱＨＧＬＧＨＧＨＫＦＫＬＤＤＤＬＥＨＱＧＧＨＶＬＤＨＧＨＫＨＫＨＧＨＧＨＧＫＨＫＮＫＧＫＫＮＧＫＨＮＧＷＫＴＥＨＬＡＳＳＳＥＤＳＴＴＰＳＡＱＴＱＥＫＴＥＧＰＴＰＩＰＳＬＡＫＰＧＶＴＶＴＦＳＤＦＱＤＳＤＬＩＡＴＭＭＰＰＩＳＰＡＰＩＱＳＤＤＤＷＩＰＤＩＱＩＤＰＮＧＬＳＦＮＰＩＳＤＦＰＤＴＴＳＰＫＣＰＧＲＰＷＫＳＶＳＥＩＮＰＴＴＱＭＫＥＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ  （配列識別番号７）
【０１０６】
ある実施態様において、本開示はエクスビボ活性化方法を提供する。そのような方法は、（ｉ）対象より得た血漿試料を血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）系の活性化剤（例えば第ＸＩＩａ因子）と共にインキュベートすること、（ｉｉ）インキュベーションの前後の血漿試料において、インタクト高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、切断型ＨＭＷＫ、またはその両方の濃度を測定すること、ならびに（ｉｉｉ）活性化後の試料中のインタクトＨＭＷＫの減少を決定することを含む。ある例において、インタクトＨＭＷＫおよび切断型ＨＭＷＫの濃度は、ウェスタンブロット解析、例えば、Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ（登録商標）、ウェスタンブロット解析によって測定される。Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）アッセイは、当技術分野において公知である（例えば、Ｒｕｓｔａｎｄｉら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２０１２、９月；３３（１７）：２７９０〜２７９７を参照できる）。Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）製品はまた、市販されている（例えば、カリフォルニア州のＳａｎｔａ  ＣｌａｒａのＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ（登録商標）を参照できる）。
【０１０７】
本明細書に記載されるエクスビボ活性化方法を用いて、血漿活性化の阻害におけるｐＫａｌ阻害剤候補の活性を評価できる。より具体的には、血漿試料を、ｐＫａｌ阻害剤候補の存在下で、活性化剤と共にインキュベートできる。阻害剤候補の存在下で活性レベルが低減する場合、該候補が、血漿活性化の阻害に有効であることを示す。
【０１０８】
他の実施態様において、本開示は、内因性の切断型ＨＭＷＫを測定する方法を提供する。そのような方法は、（ｉ）対象からの血漿試料を提供すること、および（ｉｉ）血漿試料中の切断型ＨＭＷＫの濃度を測定することを含み得る。ある例において、切断型ＨＭＷＫの濃度は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅウェスタンブロット解析によって測定される。
【０１０９】
内因性の切断型ＨＭＷＫアッセイは、ｐＫａｌ系に関連する疾患、例えば本明細書に記載される疾患を有するかもしくは有する疑いのある対象を同定するのに適用できる。ある例において、血漿試料は、ｐＫａｌ系に関連する疾患を有するかもしくは有する疑いのある対象から得られる。対象における内因性の切断型ＨＭＷＫが、健康な対象の内因性の切断型ＨＭＷＫと比較して上昇する場合、該対象が該疾患を有するかもしくは有する疑いがあることを示す。
【０１１０】
代替的にもしくはさらに、内因性の切断型ＨＭＷＫアッセイは、ｐＫａｌ系に関連する疾患の治療の有効性を評価するのに使用できる。その場合、血漿試料は、疾患を有し、かつｐＫａｌ阻害剤によって治療されている対象より得られる。治療後、治療前と比較して切断型ＨＭＷＫの濃度の低減が観察される場合、ｐＫａｌ阻害剤が有効であることを示す。
【０１１１】
さらに代替的にもしくは追加的に、該アッセイは、対象がｐＫａｌに関連する疾患を有するかもしくはその危険性があるかを評価するためにも利用でき、既定の値（例えば、健康な対象もしくは健康な対象の集団からの試料中の切断型ＨＭＷＫの濃度）と比較して切断型ＨＭＷＫの濃度が上昇すれば、該対象が該疾患を有するかもしくはその危険性があることを示す。
【０１１２】
該方法はまた、ｐＫａｌに関連する疾患の治療のような治療の有効性を評価することを含み得る。複数の生物学的試料（例えば血漿試料）を、ＨＡＥのようなｐＫａｌ関連疾患を有し、かつｐＫａｌ阻害剤のような治療剤によって治療されている患者から、治療の前、治療の過程の最中、および／もしくは治療の後において得ることができる。それらの生物学的試料中のインタクトＨＭＷＫおよび／もしくは切断型ＨＭＷＫの濃度は、本明細書に開示される方法の任意のものを用いて測定できる。治療前と比較して切断型ＨＭＷＫの濃度が低減すれば、または治療過程にわたって切断型ＨＭＷＫの濃度が低減すれば、治療が有効であることを示す。
【０１１３】
抗体
抗体および抗原結合断片を、提供される方法において使用できる。ある実施態様において、捕捉剤は、抗体もしくは抗原結合断片であるかもしくはそれらを含む。ある実施態様において、検出剤は、抗体もしくは抗原結合断片であるかもしくはそれらを含む。ある実施態様において、ｐＫａｌ媒介もしくはブラジキニン媒介の障害の治療のための治療組成物は、抗体もしくは抗原結合断片であるかもしくはそれらを含む。
【０１１４】
本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、少なくとも一つのイムノグロブリン可変ドメインもしくはイムノグロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を指す。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）、および軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）を含み得る。他の例において、抗体は、２個の重（Ｈ）鎖可変領域と２個の軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。用語「抗体」は、抗体の抗原結合断片（例えば、一本鎖抗体、ＦａｂおよびｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ‘）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（ｄｅ  Ｗｉｌｄｔら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６、２６（３）、６２９〜６３９））ならびに完全な抗体を包含する。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにそれらのサブタイプ）の構造的特徴を持ち得る。抗体は任意の源由来であってよいが、霊長類（ヒトおよび非ヒトの霊長類）および霊長類化のものが好ましい。
【０１１５】
ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存されたフレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれる領域が介在する「相補性決定領域（「ＣＤＲ」）」と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は正確に定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら（１９８７）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照。ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋもまた参照できる。）。Ｋａｂａｔの定義が本明細書において使用される。それぞれのＶＨおよびＶｌは、典型的には３個のＣＤＲと４個のＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置される。
【０１１６】
抗体のＶＨ鎖もしくはＶＬ鎖はそれぞれ、重鎖定常領域もしくは軽鎖定常領域のすべてもしくは部分を含んでもよく、従ってイムノグロブリン重鎖もしくはイムノグロブリン軽鎖をそれぞれ形成する。一実施態様において、抗体は２個のイムノグロブリン重鎖と２個のイムノグロブリン軽鎖とのテトラマーであり、ここで、イムノグロブリン重鎖とイムノグロブリン軽鎖とは、例えばジスルフィド結合によって相互結合されている。ＩｇＧにおいて、重鎖定常領域は、３個のイムノグロブリンドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域はＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系のさまざまな細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主の組織もしくは因子への抗体の結合を媒介する。イムノグロブリンの軽鎖は、κもしくはλのタイプであってよい。一実施態様において、抗体はグリコシル化されている。抗体は、抗体依存性細胞傷害性および／もしくは補体依存性細胞障害性について機能的であり得る。
【０１１７】
抗体の一つもしくはそれ以上の領域はヒトもしくは事実上ヒトのものであり得る。例えば、可変領域の一つもしくはそれ以上は、ヒトもしくは事実上ヒトのものであり得る。例えば、ＣＤＲの一つもしくはそれ以上はヒトの、例えばＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３であり得る。軽鎖ＣＤＲのそれぞれはヒトのものであり得る。ＨＣ  ＣＤＲ３はヒトのものであり得る。フレームワーク領域の一つもしくはそれ以上は、ヒトの、例えばＨＣもしくはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４であり得る。例えば、Ｆｃ領域はヒトのものであり得る。一実施態様において、フレームワーク領域の全てはヒトのものであり、例えばヒトの体細胞、例えばイムノグロブリンを産生する造血細胞もしくは非造血細胞によって産生される抗体のフレームワークの配列を持つ。一実施態様において、ヒトの配列は、例えば生殖細胞系列の核酸によってコードされる、生殖細胞系列の配列である。一実施態様において、選択されたＦａｂのフレームワーク（ＦＲ）の残基を、特にヒトの生殖細胞系列の遺伝子のような、最も類似する霊長類の生殖細胞系列の遺伝子において対応する残基のアミノ酸型に変換することができる。定常領域の一つもしくはそれ以上は、ヒトもしくは事実上ヒトのものであってよい。例えば、イムノグロブリン可変ドメイン、定常領域、定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬ１）もしくは抗体全体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％もしくは１００％は、ヒトもしくは事実上ヒトのものであり得る。
【０１１８】
抗体のすべてもしくは部分は、イムノグロブリン遺伝子もしくはその断片によってコードされ得る。例示的なヒトイムノグロブリン遺伝子には、κ、λ、α（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、εおよびμの定常領域遺伝子ならびに多くのイムノグロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。全長のイムノグロブリン「軽鎖」（約２５ｋＤａもしくはアミノ酸約２１４個）は、ＮＨ２末端における可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）、ならびに、ＣＯＯＨ末端におけるκもしくはλ定常領域遺伝子によってコードされる。全長のイムノグロブリン「重鎖」（約５０ｋＤａもしくはアミノ酸約４４６個）は、同様に、可変領域遺伝子（アミノ酸約１１６個）および例えば（アミノ酸約３３０個をコードする）γのような他の上述の定常領域遺伝子の一つによってコードされる。ヒトＨＣの長さは、ＨＣ  ＣＤＲ３がアミノ酸残基約３個からアミノ酸残基３５個超まで変化するために、大幅に変化する。
【０１１９】
全長抗体の「抗原結合断片」という用語は、関心対象の標的との特異的結合能を保持する全長抗体の一つもしくはそれ以上の断片を指す。全長抗体の「抗原結合断片」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって結合する２個のＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ‘）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４〜５４６）、ならびに（ｖｉ）機能性を保持する、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、ＶＬおよびＶＨであるＦｖ断片の２個のドメインは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらを、組換え技術を用いて合成リンカーによって結合して、ＶＬおよびＶＨ領域が対を形成して一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製することができる（例えば米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第４，９４６，７７８号および米国特許第４，８８１，１７５号、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３〜４２６およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９〜５８８３を参照）。
【０１２０】
抗体断片は、当業者に公知の従来技術を含む任意の好適な技術を用いて得ることができる。用語「単一特異的抗体」は、例えばエピトープのような特定の標的に対して単一の結合特異性および結合親和性を示す抗体を指す。この用語は「モノクローナル抗体」もしくは「モノクローナル抗体組成物」を含み、それらは、本明細書において、抗体がどのように生成されたかに関わらず、単一の分子組成の抗体もしくはその断片の調製を指すのに用いられる。
【０１２１】
本明細書で使用されるとき、「ヒト化」イムノグロブリン可変領域は、イムノグロブリン可変領域が正常ヒトにおいて免疫原性応答を引き起こさないために十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含むように改変されたイムノグロブリン可変領域である。「ヒト化」イムノグロブリンの記載は、例えば、米国特許第６，４０７，２１３号および米国特許第５，６９３，７６２号を含む。
【０１２２】
阻害定数（Ｋｉ）は、阻害効力の尺度を提供し、それは、酵素活性を半減させるのに必要な阻害剤の濃度であり、酵素もしくは基質の濃度に依存しない。見かけのＫｉ（Ｋｉ，ａｐｐ）を、異なる濃度の阻害剤（例えば阻害的結合タンパク質）が反応の度合い（例えば酵素活性）に及ぼす阻害効果を測定することによって、異なる基質濃度で得て、阻害剤の濃度の関数としての擬１次速度定数の変化をモリソン式（数１）に適合させることで見かけのＫｉ値の推定値を得る。Ｋｉは、Ｋｉ，ａｐｐ対基質濃度のプロットの線形回帰分析から引き出されるＹ切片から得られる。
【数１】
0006757252.tif 000006
【０１２３】
遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）
ある実施態様において、血漿カリクレイン活性を含む疾患もしくは病状は遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）である。遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）はまた、「クインケ浮腫」、Ｃ１エステラーゼ阻害因子欠乏症、Ｃ１阻害因子欠乏症、および遺伝性血管神経性浮腫（ＨＡＮＥ）としても知られる。ＨＡＥは、重度の腫脹（血管性浮腫）の再発性エピソードを特徴とし、これは例えば四肢、顔、生殖器、消化管、気道に影響を与え得る。ＨＡＥの症状は、例えば腕、脚、唇、目、舌、および／もしくは喉の腫脹；喉の腫脹もしくは突然の嗄声を伴い得る気道閉塞；明らかな原因のない腹部痙攣の繰り返しエピソード；ならびに／または重度であり得て、腹部痙攣、嘔吐、脱水、下痢、疼痛、および／もしくはショックにつながり得る、腸の腫脹を含む。ＨＡＥに罹患する人の約３分の１が、発作中に辺縁紅斑と呼ばれるかゆみのない発疹を発症する。
【０１２４】
気道の腫脹は生命を脅かし、一部の患者に死を引き起こし得る。死亡率は１５〜３３％と推定される。ＨＡＥによる救急診療は、年間約１５，０００〜３０，０００例である。
【０１２５】
外傷もしくはストレス、例えば、歯科処置、病気（例えば、風邪やインフルエンザのようなウイルス性疾患）、月経、および外科手術は、血管浮腫の発作を誘発し得る。ＨＡＥの急性発作を防ぐために、患者は以前に発作を引き起こした特定の刺激を避けようとし得る。しかしながら、多くの場合、発作は既知のトリガーがなくとも起こる。典型的には、ＨＡＥ症状は、小児期に最初に現れ、そして思春期に悪化する。平均的には、無処置の個人は１〜２週間ごとに発作を起こし、ほとんどのエピソードは、約３〜４日間持続する（ｇｈｒ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ／ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ−ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ）。発作の頻度および期間は、遺伝性血管浮腫を持つ人々の間で大幅に変化し、同じ家族間の人々の間ですら大幅に変化する。
【０１２６】
Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型として知られる３つの型のＨＡＥが存在する。ＨＡＥは、５０，０００人中１人に罹患し、Ｉ型が症例の約８５％を占め、ＩＩ型が症例の約１５％を占め、そして、ＩＩＩ型は非常にまれである。ＩＩＩ型はごく最近に記載された型であり、当初は女性にのみ起こると考えられていたが、罹患した男性のいる家族が特定されている。
【０１２７】
ＨＡＥは、常染色体優性パターンで遺伝し、そのため罹患した人が、罹患した１人親から変異を受け継ぎ得る。該遺伝子における新規の変異もまた起こり得て、従って、ＨＡＥは、その家族に該障害の病歴を持たない人々においてもまた起こり得る。症例の２０〜２５％が新規の自然突然変異により生じると推定されている。
【０１２８】
ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子の変異は、Ｉ型およびＩＩ型の遺伝性血管浮腫を引き起こす。ＳＲＰＩＮＧ１遺伝子は、炎症の制御に重要であるＣ１阻害因子タンパク質の産生の指示を提供する。Ｃ１阻害因子は、炎症を促進する特定のタンパク質の活性を遮断する。Ｉ型遺伝性血管浮腫を引き起こす変異によって、血液中のＣ１阻害因子の濃度が低減する。対照的に、ＩＩ型を引き起こす変異によって、異常に機能するＣ１阻害因子が産生される。機能性のＣ１阻害因子の適切な濃度がないため、過剰量のブラジキニンが産生される。ブラジキニンは、血管壁を通しての体液の体組織への滲出を増加させることによって炎症を促進する。体組織に体液の過剰な蓄積は、Ｉ型およびＩＩ型遺伝性血管浮腫を有する人に見られる腫脹のエピソードを引き起こす。
【０１２９】
Ｆ１２遺伝子の変異は、ＩＩＩ型遺伝性血管浮腫のいくつかの症例に関連する。Ｆ１２遺伝子は、血液凝固第ＸＩＩ因子の産生の指示を提供する。血液凝固（凝固）における重要な役割に加えて、第ＸＩＩ因子はまた、炎症の重要な刺激因子であり、ブラジキニンの産生に関係している。Ｆ１２遺伝子のある変異は、活性が増加した第ＸＩＩ因子の産生をもたらす。結果として、より多くのブラジキニンが産生され、そして血管壁はより滲出性となり、これによって腫脹のエピソードが起こる。ＩＩＩ型遺伝性血管浮腫の他の症例の原因はいまだ不明である。いまだ同定されていない遺伝子の一つもしくはそれ以上の変異が、これらの症例の障害の原因であり得る。
【０１３０】
ＨＡＥは、アレルギーもしくは他の医学的状態により生じる他の型の血管性浮腫と類似性を示し得るが、原因および治療は大幅に異なる。遺伝性血管浮腫がアレルギーと誤診断されると、それは最も一般的に、抗ヒスタミン薬、ステロイド、および／もしくはエピネフリンで治療され、エピネフリンは、生命を脅かす反応のために使用することができるものの、これらは典型的にＨＡＥにおいて無効である。誤診断はまた、腹部腫脹を有する患者では不要な試験開腹という結果となり、何人かのＨＡＥ患者では、腹痛は、間違って心因性と診断されている。
【０１３１】
Ｃ１阻害因子療法、ならびにＨＡＥの他の治療は、Ｋａｐｌａｎ，Ａ．Ｐ．、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１０、１２６（５）：９１８〜９２５に記載される。
【０１３２】
ＨＡＥ発作の急性期治療は、可能な限り迅速に浮腫の進行を停止するために提供される。１つの急性期治療は、ドナー血液からのＣ１阻害因子濃縮物の静脈内投与であるが、この治療は、多くの国において利用可能ではない。Ｃ１阻害因子濃縮物が利用可能ではない緊急事態においては、同様にＣ１阻害因子を含む新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）を、代替として使用できる。
【０１３３】
ヒト血液由来の精製Ｃ１阻害因子は、１９７９年より欧州において使用されてきた。いくつかのＣ１阻害因子治療は、現在米国において利用可能であり、２つのＣ１阻害因子製品が現在カナダにおいて利用可能である。低温殺菌のＢｅｒｉｎｅｒｔ  Ｐ（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）は、２００９年に急性発作のためにＦ．Ｄ．Ａに承認された。ナノ濾過のＣｉｎｒｙｚｅ（ＶｉｒｏＰｈａｒｍａ）は、２００８年に予防のためにＦ．Ｄ．Ａに承認された。Ｒｈｕｃｉｎ  （Ｐｈａｒｍｉｎｇ）は、開発中の組換えＣ１阻害因子であり、ヒト血液由来病原体による感染症伝播の危険性を持たない。
【０１３４】
急性ＨＡＥ発作の治療はまた、疼痛緩和剤の投薬および／もしくは静脈内輸液を含み得る。
【０１３５】
他の治療モダリティは、Ｃ１阻害因子の合成を刺激するか、またはＣ１阻害因子の消費を低減させることができる。ダナゾールのようなアンドロゲン薬は、Ｃ１阻害因子の産生を刺激することによって、発作の頻度および重篤度を低減できる。
【０１３６】
ヘリコバクターピロリ菌は、腹部発作を引き起こし得る。ｈ．  ｐｙｌｏｒｉを治療するための抗生剤は腹部発作を減少するであろう。
【０１３７】
より新しい治療は接触カスケードを標的とする。エカランチド（ＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）、ＤＸ−８８、Ｄｙａｘ）は、血漿カリクレインを阻害し、米国において承認されている。イカチバント（ＦＩＲＡＺＹＲ（登録商標）、Ｓｈｉｒｅ）はブラジキニンＢ２受容体を阻害し、欧州および米国において承認されている。
【０１３８】
ＨＡＥの診断は、例えば家族の病歴および／もしくは血液検査に依存し得る。Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型ＨＡＥに関連する検査所見は、例えばＫａｐｌａｎ，Ａ．Ｐ．、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１０、１２６（５）：９１８〜９２５に記載される。Ｉ型ＨＡＥでは、Ｃ１阻害因子の濃度は、Ｃ４の濃度と同様に減少し、一方でＣ１ｑの濃度は正常である。ＩＩ型ＨＡＥではにおいて、Ｃ１阻害因子の濃度は正常かもしくは上昇するが、Ｃ１阻害因子の機能は異常である。Ｃ４濃度は減少し、Ｃ１ｑ濃度は正常である。ＩＩＩ型では、Ｃ１阻害因子、Ｃ４およびＣ１ｑの濃度はすべて正常であり得る。
【０１３９】
ＨＡＥの症状は、例えば、患者、臨床医、または家族の構成員が記入するアンケートのようなアンケートを用いて評価され得る。そのようなアンケートは当技術分野において公知であり、例えば、視覚的アナログスケールを含む。例えば、ＭｃＭｉｌｌａｎ，Ｃ．Ｖ．ら、Ｐａｔｉｅｎｔ．２０１２；５（２）：１１３〜１２６を参照できる。
【０１４０】
他のｐＫａｌ媒介もしくはブラジキニン媒介の障害
他の例示的な血漿カリクレイン活性に関連する疾患もしくは症状は、非ヒスタミン依存性特発性血管性浮腫、関節リウマチ、クローン病、狼瘡、アルツハイマー病、敗血症性ショック、熱傷損傷、脳虚血／再潅流傷害、脳浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、黄斑浮腫、血管炎、動脈もしくは静脈の血栓症、補助人工心臓もしくはステントに関連する血栓症、血栓症を伴うヘパリン起因性血小板減少、血栓塞栓症、不安定狭心症を伴う冠動脈性心疾患、浮腫、眼疾患、痛風、腸疾患、口腔粘膜炎、神経因性疼痛、炎症性疼痛、脊柱管狭窄症変性脊椎疾患、術後イレウス、大動脈瘤、変形性関節症、遺伝性血管浮腫、肺塞栓症、脳卒中、頭部外傷もしくは腫瘍周囲脳浮腫、敗血症、急性中大脳動脈（ＭＣＡ）虚血事象（脳卒中）、再狭窄（例えば血管形成術後）、全身性エリテマトーデス腎炎、自己免疫疾患、炎症性疾患、心血管疾患、神経疾患、タンパク質ミスフォールディングに関連する疾患、血管新生に関連する疾患、高血圧性腎症および糖尿病性腎症、アレルギーおよび呼吸器疾患（例えば、アナフィラキシー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、持続性鼻炎）および組織損傷（例えば、熱傷もしくは化学的損傷）を含む。
【０１４１】
治療
本明細書に記載される方法のようなアッセイ方法を用いて同定されるｐＫａｌ媒介もしくはブラジキニン媒介障害の危険性があるかもしくはそれに罹患している対象は、任意の好適な治療剤によって治療され得る。ある実施態様において、提供される方法は、例えばバイオマーカー検出のような提供されるアッセイの結果に基づいて、対象のために治療を選択することを含む。
【０１４２】
ある実施態様において、該方法は、例えばバイオマーカー検出のようなアッセイの結果に基づいて対象に投与するために、治療剤、例えば本明細書に記載されるようなカリクレイン結合剤、例えば本明細書に記載されるようなブラジキニンＢ２受容体アンタゴニスト、例えば本明細書に記載されるようなＣ１−ＩＮＨ補充剤を選択もしくは投与することの一つもしくはその両方を含む。
【０１４３】
ある実施態様において、血漿カリクレイン結合のタンパク質もしくはポリペプチドが対象に投与される。ある実施態様において、該カリクレイン結合剤は、例えばペプチド、小分子阻害剤、カリクレイン抗体もしくはその断片のようなカリクレイン阻害剤である。ある実施態様において、ブラジキニンＢ２受容体のアンタゴニストが対象に投与される。ある実施態様において、Ｃ１−ＩＮＨ補充治療剤が対象に投与される。
【０１４４】
治療剤、例えばカリクレイン阻害剤、例えばブラジキニンＢ２受容体アンタゴニスト、例えばＣ１−ＩＮＨ補充剤は、血漿カリクレインおよび／もしくはブラジキニン活性を含む疾患もしくは症状の治療のために併用療法の一部として他の治療と共に投与され得る。例えば、カリクレイン阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストもしくはＣ１−ＩＮＨ補充剤の一つもしくはそれ以上との、例えば、カリクレイン阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストもしくはＣ１−ＩＮＨ補充剤の一つもしくはそれ以上および他の治療との併用療法は、複数の異なる形態において供給され得る。第一の剤は、他の治療を投与する前もしくはその後に投与され得る。ある状況において、該第一の剤および他の治療（例えば治療剤）は、同時に投与されるか、もしくは時間的に近接して（例えば、同一の治療セッションのような注射の間が短い時間間隔で）投与される。第一の剤および他の治療はまた、より広い時間間隔で投与され得る。
【０１４５】
血漿カリクレイン結合剤
血漿カリクレイン結合剤（例えば結合タンパク質、例えばポリペプチド、例えば阻害ポリペプチド、例えば抗体、例えば阻害抗体、もしくは他の結合剤、例えば小分子）は、例えば血漿カリクレイン活性を含む疾患および症状のようなさまざまな疾患および症状のための有用な治療剤である。例えば、ある実施態様において、血漿カリクレイン活性を含む該疾患もしくは症状は、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）である。ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質もしくはポリペプチドは、ｐＫａｌ媒介もしくはブラジキニン媒介の障害の危険性があるかもしくはそれに罹患している対象に投与される。
【０１４６】
組織および血漿のカリクレインのいずれかのカリクレインの、有用なタンパク質阻害剤の数多くはＫｕｎｉｔｚドメインを含む。本明細書において使用されるとき、「Ｋｕｎｉｔｚドメイン」は、少なくとも５１個のアミノ酸を持ち、少なくとも２個の、好ましくは３個のジスルフィドを含む、ポリペプチドドメインである。１番目と６番目のシステイン、２番目と４番目の、および３番目と５番目のシステインがジスルフィド結合を形成するように（例えば、５８個のアミノ酸を持つＫｕｎｉｔｚドメインにおいて、システインは、以下に提供されるＢＰＴＩ相同配列の番号に従って５、１４、３０、３８、５１および５５番目のアミノ酸に対応する位置に存在し得て、そしてジスルフィドは、５番目と５５番目、１４番目と３８番目、および３０番目と５１番目の位置のシステイン間で形成できる）、または２個のジスルフィド結合が存在する場合にはそれらはそれらのシステインの対応するサブセット間で形成するように、該ドメインは折りたたまれる。それぞれのシステイン間の間隔は、以下に提供されるＢＰＴＩ配列の付番に従って、５から５５、１４から３８および３０から５１番目に対応する位置の間隔のアミノ酸７、５、４、３、２、１もしくは０個以内にあり得る。ＢＰＴＩ配列は、任意の一般的なＫｕｎｉｔｚドメイン中の具体的な位置を参照するための基準として使用できる。関心対象であるＫｕｎｉｔｚドメインのＢＰＴＩとの比較は、整列されるシステインの数が最大化されるような最適アラインメントを同定することによって実施される。
【０１４７】
ＢＰＴＩのＫｕｎｉｔｚドメインの３Ｄ構造（高解像度）は公知である。Ｘ線構造の一つは、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに「６ＰＴＩ」として寄託されている。いくつかのＢＰＴＩ相同体の３Ｄ構造（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔら（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３（７）：５９１〜５９８；Ｈｙｎｅｓら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９：１００１８〜１００２２）は公知である。少なくとも８１個のＫｕｎｉｔｚドメイン配列が公知である。公知であるヒトの相同体には、組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）としても知られるＬＡＣＩの３個のＫｕｎｉｔｚドメイン（Ｗｕｎら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１３）：６００１〜６００４；Ｇｉｒａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３３８：５１８〜５２０；Ｎｏｖｏｔｎｙら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４（３１）：１８８３２〜１８８３７）、インターαトリプシンンヒビターの２個のＫｕｎｉｔｚドメイン、ＡＰＰ−Ｉ（Ｋｉｄｏら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３（３４）：１８１０４〜１８１０７）、コラーゲン由来のＫｕｎｉｔｚドメイン、ＴＦＰＩ−２の３個のＫｕｎｉｔｚドメイン（Ｓｐｒｅｃｈｅｒら（１９９４）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９１：３３５３−３３５７）、肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子タイプＩのＫｕｎｉｔｚドメイン、肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子タイプＩＩのＫｕｎｉｔｚドメイン、米国特許公開第２００４−０１５２６３３に記載されるＫｕｎｉｔｚドメインが挙げられる。ＬＡＣＩは、３個のＫｕｎｉｔｚドメインを含む分子量３９ｋＤａのヒト血清ホスホグリコタンパク質である（表１におけるアミノ酸配列）。
【０１４８】
【表４】
0006757252.tif 000007
0006757252.tif 000008
【０１４９】
上述のＫｕｎｉｔｚドメインは、ＬＡＣＩ−Ｋ１（５０〜１０７番目の残基）、ＬＡＣＩ−Ｋ２（１２１〜１７８番目の残基）、およびＬＡＣＩ−Ｋ３（２１３〜２７０番目の残基）と呼ばれる。ＬＡＣＩのｃＤＮＡ配列は、Ｗｕｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８、２６３（１３）：６００１〜６００４）により報告される。Ｇｉｒａｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ、１９８９、３３８：５１８〜５２０）は３個のＫｕｎｉｔｚドメインのそれぞれのＰ１残基が改変された変異研究を報告する。ＬＡＣＩ−Ｋ１は、第ＶＩＩａ因子（Ｆ．ＶＩＩａ）が組織因子と複合体を形成するとき、第ＶＩＩａ因子（Ｆ．ＶＩＩａ）を阻害し、ＬＡＣＩ−Ｋ２は第Ｘａ因子を阻害する。
【０１５０】
例示的なＫｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質には、以下が挙げられ、かっこ内にＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴアクセッション番号を示す。
Ａ４＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０５０６７）、Ａ４＿ＭＡＣＦＡ（Ｐ５３６０１）、Ａ４＿ＭＡＣＭＵ（Ｐ２９２１６）、Ａ４＿ＭＯＵＳＥ（Ｐ１２０２３）、Ａ４＿ＲＡＴ（Ｐ０８５９２）、Ａ４＿ＳＡＩＳＣ（Ｑ９５２４１）、ＡＭＢＰ＿ＰＬＥＰＬ（Ｐ３６９９２）、ＡＰＰ２＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ０６４８１）、ＡＰＰ２＿ＲＡＴ（Ｐ１５９４３）、ＡＸＰ１＿ＡＮＴＡＦ（Ｐ８１５４７）、ＡＸＰ２＿ＡＮＴＡＦ（Ｐ８１５４８）、ＢＰＴ１＿ＢＯＶＩＮ（Ｐ００９７４）、ＢＰＴ２＿ＢＯＶＩＮ（Ｐ０４８１５）、ＣＡ１７＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ０２３８８）、ＣＡ３６＿ＣＨＩＣＫ（Ｐ１５９８９）、ＣＡ３６＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ１２１１１）、ＣＲＰＴ＿ＢＯＯＭＩ（Ｐ８１１６２）、ＥＬＡＣ＿ＭＡＣＥＵ（Ｏ６２８４５）、ＥＬＡＣ＿ＴＲＩＶＵ（Ｑ２９１４３）、ＥＰＰＩ＿ＨＵＭＡＮ（Ｏ９５９２５）、ＥＰＰＩ＿ＭＯＵＳＥ（Ｑ９ＤＡ０１）、ＨＴＩＢ＿ＭＡＮＳＥ（Ｐ２６２２７）、ＩＢＰ＿ＣＡＲＣＲ（Ｐ００９９３）、ＩＢＰＣ＿ＢＯＶＩＮ（Ｐ００９７６）、ＩＢＰＩ＿ＴＡＣＴＲ（Ｐ１６０４４）、ＩＢＰＳ＿ＢＯＶＩＮ（Ｐ００９７５）、ＩＣＳ３＿ＢＯＭＭＯ（Ｐ０７４８１）、ＩＭＡＰ＿ＤＲＯＦＵ（Ｐ１１４２４）、ＩＰ５２＿ＡＮＥＳＵ（Ｐ１０２８０）、ＩＳＣ１＿ＢＯＭＭＯ（Ｐ１０８３１）、ＩＳＣ２＿ＢＯＭＭＯ（Ｐ１０８３２）、ＩＳＨ１＿ＳＴＯＨＥ（Ｐ３１７１３）、ＩＳＨ２＿ＳＴＯＨＥ（Ｐ８１１２９）、ＩＳＩＫ＿ＨＥＬＰＯ（Ｐ００９９４）、ＩＳＰ２＿ＧＡＬＭＥ（Ｐ８１９０６）、ＩＶＢ１＿ＢＵＮＦＡ（Ｐ２５６６０）、ＩＶＢ１＿ＢＵＮＭＵ（Ｐ００９８７）、ＩＶＢ１＿ＶＩＰＡＡ（Ｐ００９９１）、ＩＶＢ２＿ＢＵＮＭＵ（Ｐ００９８９）、ＩＶＢ２＿ＤＡＢＲＵ（Ｐ００９９０）、ＩＶＢ２＿ＨＥＭＨＡ（Ｐ００９８５）、ＩＶＢ２＿ＮＡＪＮＩ（Ｐ００９８６）、ＩＶＢ３＿ＶＩＰＡＡ（Ｐ００９９２）、ＩＶＢＢ＿ＤＥＮＰＯ（Ｐ００９８３）、ＩＶＢＣ＿ＮＡＪＮＡ（Ｐ１９８５９）、ＩＶＢＣ＿ＯＰＨＨＡ（Ｐ８２９６６）、ＩＶＢＥ＿ＤＥＮＰＯ（Ｐ００９８４）、ＩＶＢＩ＿ＤＥＮＡＮ（Ｐ００９８０）、ＩＶＢＩ＿ＤＥＮＰＯ（Ｐ００９７９）、ＩＶＢＫ＿ＤＥＮＡＮ（Ｐ００９８２）、ＩＶＢＫ＿ＤＥＮＰＯ（Ｐ００９８１）、ＩＶＢＴ＿ＥＲＩＭＡ（Ｐ２４５４１）、ＩＶＢＴ＿ＮＡＪＮＡ（Ｐ２０２２９）、ＭＣＰＩ＿ＭＥＬＣＰ（Ｐ８２９６８）、ＳＢＰＩ＿ＳＡＲＢＵ（Ｐ２６２２８）、ＳＰＴ３＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ４９２２３）、ＴＫＤ１＿ＢＯＶＩＮ（Ｑ２８２０１）、ＴＫＤ１＿ＳＨＥＥＰ（Ｑ２９４２８）、ＴＸＣＡ＿ＤＥＮＡＮ（Ｐ８１６５８）、ＵＰＴＩ＿ＰＩＧ（Ｑ２９１００）、ＡＭＢＰ＿ＢＯＶＩＮ（Ｐ００９７８）、ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０２７６０）、ＡＭＢＰ＿ＭＥＲＵＮ（Ｑ６２５７７）、ＡＭＢＰ＿ＭＥＳＡＵ（Ｑ６０５５９）、ＡＭＢＰ＿ＭＯＵＳＥ（Ｑ０７４５６）、ＡＭＢＰ＿ＰＩＧ（Ｐ０４３６６）、ＡＭＢＰ＿ＲＡＴ（Ｑ６４２４０）、ＩＡＴＲ＿ＨＯＲＳＥ（Ｐ０４３６５）、ＩＡＴＲ＿ＳＨＥＥＰ（Ｐ１３３７１）、ＳＰＴ１＿ＨＵＭＡＮ（Ｏ４３２７８）、ＳＰＴ１＿ＭＯＵＳＥ（Ｑ９Ｒ０９７）、ＳＰＴ２＿ＨＵＭＡＮ（Ｏ４３２９１）、ＳＰＴ２＿ＭＯＵＳＥ（Ｑ９ＷＵ０３）、ＴＦＰ２＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ４８３０７）、ＴＦＰ２＿ＭＯＵＳＥ（Ｏ３５５３６）、ＴＦＰＩ＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ１０６４６）、ＴＦＰＩ＿ＭＡＣＭＵ（Ｑ２８８６４）、ＴＦＰＩ＿ＭＯＵＳＥ（Ｏ５４８１９）、ＴＦＰＩ＿ＲＡＢＩＴ（Ｐ１９７６１）、ＴＦＰＩ＿ＲＡＴ（Ｑ０２４４５）、ＹＮ８１＿ＣＡＥＥＬ（Ｑ０３６１０）
【０１５１】
配列データベースからＫｕｎｉｔｚドメインを同定するためにさまざまな方法が使用できる。例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインの公知のアミノ酸配列、コンセンサス配列もしくはモチーフ（例えばＰｒｏＳｉｔｅモチーフ）を、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ベテスダ、ＭＤ）に対して、例えばＢＬＡＳＴを用いて；ＨＭＭ（隠れマルコフモデル）のＰｆａｍデータベースに対して（例えばＰｆａｍ検索に関するデフォールトのパラメータを用いて）；ＳＭＡＲＴデータベースに対して；もしくはＰｒｏＤｏｍデータベースに対して、検索できる。例えば、Ｐｆａｍリリース９のＰｆａｍアクセッション番号ＰＦ０００１４は、数多くのＫｕｎｉｔｚドメインとＫｕｎｉｔｚドメイン同定のためのＨＭＭを提供する。Ｐｆａｍデータベースの説明は、Ｓｏｎｈａｍｍｅｒら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２８（３）：４０５〜４２０に見出すことができ、ＨＭＭの詳細な説明は、例えば、Ｇｒｉｂｓｋｏｖら（１９９０）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６〜１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４３５５〜４３５８；Ｋｒｏｇｈら（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：１５０１〜１５３１；およびＳｔｕｌｔｚら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２：３０５〜３１４に見出すことができる。ＨＭＭのＳＭＡＲＴデータベース（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、ＥＭＢＬ、ハイデルベルク、ＤＥ）は、Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：５８５７およびＳｃｈｕｌｔｚら（２０００）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ２８：２３１に記載される通りである。ＳＭＡＲＴデータベースは、ＨＭＭｅｒ２サーチプログラム（Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎら（１９９８）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）の隠れマルコフモデルによるプロファイリングによって同定されるドメインを含む。データベースはまた、アノテートされ、モニターされる。ＰｒｏＤｏｍタンパク質ドメインデータベースは、相同なドメインの自動編集物からなる（Ｃｏｒｐｅｔら（１９９９）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２６３〜２６７）。ＰｒｏＤｏｍの現在のバージョンは、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ３８およびＴＲＥＭＢＬのタンパク質データベースの再帰的ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴサーチ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２；Ｇｏｕｚｙら（１９９９）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２３：３３３〜３４０）を用いて構築される。データベースはそれぞれのドメインのコンセンサス配列を自動的に生成する。Ｐｒｏｓｉｔｅは、モチーフとしてＫｕｎｉｔｚドメインを列挙し、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質を同��する。例えばＦａｌｑｕｅｔらＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：２３５〜２３８（２００２）を参照できる。
【０１５２】
Ｋｕｎｉｔｚドメインは、主として２個のループ領域（「結合ループ」）中のアミノ酸を用いて標的プロテアーゼと相互作用する。第一のループ領域は、ＢＰＴＩの１３〜２０番目のアミノ酸に対応するおよその残基の間にある。第二のループ領域は、ＢＰＴＩの３１〜３９番目のアミノ酸に対応するおよその残基の間にある。Ｋｕｎｉｔｚドメインの例示的なライブラリは、第一および／もしくは第二のループ領域中の一つもしくはそれ以上のアミノ酸の位置が多様である。カリクレインと相互作用するＫｕｎｉｔｚドメインをスクリーニングするとき、もしくは親和性が改善された変異体に関して選択するとき、変化させるのに特に有用な位置は、ＢＰＴＩの配列に関して、１３、１５、１６、１７、１８、１９、３１、３２、３４および３９番目の位置を含む。これらの位置の少なくともいくつかは、標的のプロテアーゼと密接に接触すると予測される。例えば、三次元構造において上述の位置と近傍の位置のような他の位置を変化させることもまた有用である。
【０１５３】
Ｋｕｎｉｔｚドメインの「フレームワーク領域」は、Ｋｕｎｉｔｚドメインの一部であるが、第一および第二の結合ループ領域中の残基、すなわち、ＢＰＴＩの１３〜２０番目およびＢＰＴＩの３１〜３９番目のアミノ酸に対応するおよその残基を明確に排除する残基として定義される。逆に、結合ループ中にない残基は、広範囲のアミノ酸置換を許容し得る（例えば、保存的および／もしくは非保存的置換）。
【０１５４】
一実施態様において、これらのＫｕｎｉｔｚドメインは、ヒトリポタンパク質関連凝固阻害因子（ＬＡＣＩ）タンパク質のＫｕｎｉｔｚドメイン１を含むループ構造の変異体型である。ＬＡＣＩは、Ｋｕｎｉｔｚドメインの典型である３個の明確な内部ペプチドループ構造を含む（Ｇｉｒａｒｄ，Ｔ．ら、１９８９．Ｎａｔｕｒｅ、３３８：５１８〜５２０）。本明細書に記載される、ＬＡＣＩのＫｕｎｉｔｚドメイン１の変異体は、スクリーンされ、単離されており、そして増強された親和性と特異性でカリクレインに結合する（例えば、米国特許第５，７９５，８６５号および米国特許第６，０５７，２８７号を参照できる）。これらの方法は、例えば血漿カリクレインのようなカリクレインと相互作用する他のＫｕｎｉｔｚドメインを得るために、他のＫｕｎｉｔｚドメインフレームワークにもまた適用できる。カリクレインの機能の有用な調節剤は、カリクレイン結合および阻害アッセイを用いて決定されるように、典型的にカリクレインと結合および／もしくはカリクレインを阻害する。
【０１５５】
ある態様において、カリクレイン結合剤（例えば結合タンパク質、例えばポリペプチド、例えば阻害ポリペプチド、例えば抗体、例えば阻害抗体、もしくは他の結合剤、例えば小分子）は、活性型の血漿カリクレインに結合する。ある実施態様において、カリクレイン結合剤は、例えば、ヒト血漿カリクレインおよび／もしくはマウスカリクレインのような血漿カリクレインに結合し、かつ阻害する。
【０１５６】
血漿カリクレイン結合タンパク質は全長（例えばＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、（例えばＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）であってもよく、または抗原結合断片（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）２もしくはｓｃＦｖ断片）のみを含んでいてもよい。結合タンパク質は、２個の重鎖イムノグロブリンおよび２個の軽鎖イムノグロブリンを含み得るか、もしくは一本鎖抗体であり得る。血漿カリクレイン結合タンパク質は、ヒト化、ＣＤＲグラフト化、キメラ、脱免疫化、もしくはインビトロ産生の抗体のような組換えタンパク質であってもよく、任意選択で、ヒト生殖細胞系列のイムノグロブリン配列由来の定常領域を含んでいてもよい。ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質はモノクローナル抗体である。
【０１５７】
ある実施態様において、カリクレイン結合タンパク質は、例えばヒト血漿カリクレインおよび／もしくはマウスカリクレインのような血漿カリクレインに結合し、かつ阻害する。例示的な血漿カリクレイン結合タンパク質は、米国特許出願公開第２０１２０２１７５６号に開示され、そのすべての内容は参照により本明細書に組み入れられる。ある実施態様において、カリクレイン結合タンパク質は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書においてＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書においてＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４からなる群より選択される抗体の軽鎖および／もしくは重鎖を持つ抗体（例えばヒト抗体）である。ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書においてＤＸ−２９２２とも呼ばれる）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書においてＤＸ−２９３０とも呼ばれる）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４と競合するかまたはそれと同じエピトープに結合する。ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質はＤＸ−２９３０である。ＵＳ２０１１０２００６１１およびＵＳ２０１２０２０１７５６を参照でき、それらは本明細書における参照により組み入れられる。
【０１５８】
ある態様においてカリクレイン結合ポリペプチド（例えば阻害ポリペプチド）は、血漿カリクレインの活性型に結合する。例示的なポリペプチドの血漿カリクレイン剤は、米国特許第５，７９５，８６５号、米国特許第５，９９４，１２５号、米国特許第６，０５７，２８７号、米国特許第６，３３３，４０２号、米国特許第７，６２８，９８３および号、米国特許第８，２８３，３２１号、米国特許第７，０６４，１０７号、米国特許第７，２７６，４８０号、米国特許第７，８５１，４４２号、米国特許第８，１２４，５８６号、米国特許第７，８１１，９９１および米国特許出願公開第２０１１００８６８０１号に開示され、これらのそれぞれのすべての内容は参照により本明細書に組み入れられる。ある実施態様において、カリクレイン結合ポリペプチドは、ＤＸ−８８である（非天然に産生されたカリクレイン阻害剤であり、ＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）（エカランチド）としても知られる。配列識別番号３）。ある実施態様において、カリクレイン阻害剤は、配列識別番号３の３〜６０番目のアミノ酸のアミノ酸約５８個の配列を含むかもしくはそれからなるか、または配列識別番号３のアミノ酸６０個の配列を持つＤＸ−８８ポリペプチドである。Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列識別番号３）
【０１５９】
ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、ＥＰＩＫＡＬ−２（配列識別番号４）であり、これは５８残基のアミノ酸配列（配列識別番号３の３〜６０番目の残基に相当）を持ち、３４番目の残基でＩｌｅからＳｅｒへのアミノ酸置換および３９番目の残基でＧｌｕからＧｌｙへのアミノ酸置換を持つ天然に存在しないカリクレイン阻害剤である。ＥＰＩＫＡＬ−２の配列を以下に示す：
ＥｐｉＫａｌ２：  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ（配列識別番号４）
【０１６０】
ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、本明細書に記載される結合タンパク質に対して、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有し得る。ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、本明細書に記載される結合タンパク質に対して、ＨＣおよび／もしくはＬＣフレームワーク領域（例えばＨＣおよび／もしくはＬＣ  ＦＲ１、２、３および／もしくは４）において約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有し得る。ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、本明細書に記載される結合タンパク質に対して、ＨＣおよび／もしくはＬＣ  ＣＤＲ（例えばＨＣおよび／もしくはＬＣ  ＣＤＲ１、２および／もしくは３）において約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有し得る。ある実施態様において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、本明細書に記載される結合タンパク質に対して、定常領域（例えばＣＤ１、ＣＨ２、ＣＨ３および／もしくはＣＬ１）において約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有し得る。
【０１６１】
ある態様において、小分子は、血漿カリクレインの活性型に結合する。
【０１６２】
ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニスト
ある実施態様において、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストが対象に投与される。例示的なブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストはイカチバント（ＦＩＲＡＺＹＲ（登録商標））であり、それはブラジキニンＢ２受容体への天然のブラジキニンの結合を阻止するアミノ酸１０個を含むペプチド模倣薬剤である。
【０１６３】
Ｃ１−ＩＮＨ補充剤
ある実施態様において、Ｃ１−ＩＮＨ補充剤が対象に投与される。例示的なＣ１−ＩＮＨ補充剤は、公的に入手可能であり、例えば、精製ヒト低温殺菌ナノ濾過Ｃ１−ＩＮＨ濃縮物であるＢｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）が挙げられる。
【実施例】
【０１６４】
実施例１：切断型キニノーゲン
接触系の分析に基づくと、切断型キニノーゲンは、接触系活性化を測定する好適なバイオマーカーである。切断型キニノーゲンは、ＨＡＥ発作時、肝硬変において、ならびに敗血症における接触系活性化の結果として上昇することがこれまでに示されている。抗体のファージディスプレイライブラリを、インタクトキニノーゲンの枯渇と組み合わせて、切断型キニノーゲンに対してパニングした。並行して、マウスを切断型キニノーゲンによって免疫して、そしてハイブリドーマ細胞株からモノクローナル抗体を得た。その両方の試みにより、切断型キニノーゲンとインタクトキニノーゲンの両方に結合する数多くの異なるモノクローナル抗体が得られたが、切断型キニノーゲンにのみ結合する抗体はまったく得られなかった。
【０１６５】
数多くの抗体をウェスタンブロット解析における好適性に関してスクリーニングして、図２に示されるマウスｍＡｂ（クローン１１Ｈ０５）を含むいくつかの抗体を良好に機能すると同定した。このアッセイがヒト血漿試料において切断型キニノーゲンを検出できることは明らかである。さらに、図２のデータは、接触活性化およびキニノーゲン切断を防止するのに、ガラス管での血漿回収で十分であることを確証する。
【０１６６】
質量分析に基づいたアプローチもまた、患者の血漿における切断型キニノーゲンを検出するのに利用できる。このアプローチにおいて、患者の試料由来キニノーゲンを免疫吸着し、溶出させたキニノーゲンをタンパク分解消化し、そしてペプチド断片をＬＣ−ＭＣによって分析する。
【０１６７】
実施例２：Ｃ１ＩＮＨ−ｐＫａｌおよびα２Ｍ−ｐＫａｌの免疫アッセイ
これらの複合体の検出のために、ＥＬＩＳＡに基づく免疫アッセイが開発されている。サンドイッチに基づくＥＬＩＳＡアッセイは、以前記載されていたものと類似であり、Ｋａｕｆｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ  ７７、２６６０〜２６６７、およびＷａｃｈｔｆｏｇｅｌ、Ｂｌｏｏｄ  ７３、４６８〜４７１を参照できる。
【０１６８】
実施例３：Ｃ１ＩＮＨ−ｐＫａｌアッセイ
Ｃ１ＩＮＨ−ｐＫａｌ複合体の検出のためのＥＬＩＳＡが開発されている。このサンドイッチアッセイはｐＫａｌおよびＣ１ＩＮＨに対する抗体を、捕捉試薬もしくは検試薬のいずれかとして用いる。このアッセイの開発の第一のステップは、Ｃ１ＩＮＨ−ｐＫａｌ複合体の調製である。この共有結合の複合体を、Ｃ１ＩＮＨに対して２〜４倍モル過剰のｐＫａｌをインキュベートすることによって調製した。次に、複合体を、図３に示されるように、陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｃａｐｔｏ  Ｓ樹脂）を用いて精製した。該複合体を、２８０ｎｍにおいて計算されたモル吸光係数（１２１、７４０Ｍ−１ｃｍ−１）を用いて定量した。Ｃ１ＩＮＨ−ｐＫａｌを測定するために類似のアッセイを用いた以前の報告は、吸光係数について報告しなかった。疾患の際にどれほど多くのｐＫａｌが活性化されるかを決定するためのアッセイでは薬剤の用量の情報を提供するので、濃度の正確な決定は重要である。
【０１６９】
ＥＬＩＳＡによるＣ１ＩＮＨ−ｐＫａｌの検出のための２つのアッセイフォーマットを調べた。第一のフォーマットは、抗ｐＫａｌ抗体（マウスｍＡｂ１３Ｇ１１）を捕捉試薬として、かつＣ１ＩＮＨに対する抗体を検出抗体として用い、ＨＲＰ−標識化二次抗体によってシグナルを産生させる（図４）。このアッセイは、一桁のナノモル範囲もしくはそれ以下における、定量下限を有する。抗Ｃ１ＩＮＨが捕捉抗体であり、抗ｐＫａｌ（１３Ｇ１１）が検出抗体である、反対のアッセイフォーマットもまた調べた（図５）。このアッセイフォーマットは、同様の定量下限を有する。２つのアッセイフォーマットを持つことにより、Ｃ１ＩＮＨ−ｐＫａｌおよびα２Ｍ−ｐＫａｌに対する多重アッセイに対するさらなる選択肢を提供する。
【０１７０】
実施例４：α２Ｍ−ｐＫａｌ複合体アッセイ
α２Ｍ−ｐＫａｌ複合体の検出のためにＥＬＩＳＡを開発した。このサンドイッチアッセイは、ｐＫａｌおよびα２Ｍに対する抗体を、捕捉試薬もしくは検出試薬のいずれかとして用いる。このアッセイの開発の第一のステップは、α２Ｍ−ｐＫａｌ複合体の調製である。この共有結合の複合体を、α２Ｍに対して２〜４倍モル過剰のｐＫａｌをインキュベートすることによって調製した。次に、該複合体を、図６に示されるように、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。α２Ｍは、テトラマーまでのオリゴマー分布として存在する〜１８０ｋＤａのサブユニットからなる。ｐＫａｌと相互作用すると、α２Ｍのそれぞれのモノマーは、ｐＫａｌ上のリジンアミンによるα２Ｍ中のチオエステル結合の加水分解により共有アミド結合を形成する傾向がある。結果として、定量を複雑にする架橋種の分布が予測され得る。複合体の活性を測定し、そして標準曲線を用いて濃度に変換することによってα２Ｍ−ｐＫａｌ複合体を定量化する方法を誘導した（図７）。α２Ｍと標的プロテアーゼとの共有結合複合体は、小分子の合成ペプチド基質に向かう活性部位を妨害しないということが文献において周知であるので、この定量方法は可能である。
【０１７１】
Ｃ１ＩＮＨ−ｐＫａｌアッセイについても、ＥＬＩＳＡによるα２Ｍ−ｐＫａｌの検出のための２つのアッセイフォーマットを調べた。第一のフォーマットは、抗ｐＫａｌ抗体（マウスｍＡｂ１３Ｇ１１）を捕捉試薬として、かつα２Ｍに対する抗体を検出抗体として用い、ＨＲＰ−標識化二次抗体によってシグナルを産生させる（図８）。このアッセイフォーマットは、一桁のナノモル範囲もしくはそれ以下の定量下限を有する。抗α２Ｍが捕捉抗体であり、抗ｐＫａｌ（１３Ｇ１１）が検出抗体である、反対のアッセイフォーマットもまた調べた（図９）。このアッセイフォーマットは、同様の定量下限を有する。本発明者らはＣ１ＩＮＨ−ｐＫａｌおよびα２Ｍ−ｐＫａｌの多重アッセイを求めていることから、２つのアッセイフォーマットを持つことはさらなる選択肢を提供する。
【０１７２】
実施例５：活性化血漿におけるα２Ｍ−ｐＫａｌおよびＣ１ＩＮＨ−ｐＫａｌの検出
ＥＬＩＳＡを用いて、接触活性化を誘導すると知られるカオリンもしくは硫酸デキストランのような試薬で処理された正常ヒト血漿におけるｐＫａｌ活性化を検出した。図１０に示されるように、該アッセイは、硫酸デキストランによるインビトロ活性化後に血漿中で形成される複合体を検出することができる。
【０１７３】
実施例６：インタクト、および切断型キニノーゲン
ウェスタンブロットを用いて、発作中に得られ、抗プロテアーゼカクテルを含むクエン酸加採血管中に採取した患者由来の血漿が、インタクトキニノーゲン（すなわち１本鎖）の量の減少を示すことを示した（図１１）。切断型キニノーゲン（すなわち２本鎖）の増加が観察された（データは示されない）。
【０１７４】
実施例７：例示的なアッセイおよびアッセイのデータ
（ｉ）ＨＭＷＫエクスビボ活性化
ＨＭＷＫエクスビボ活性化アッセイを用いて、接触活性化に対するｐＫａｌ阻害剤候補の阻害活性を評価することができる。要約すると、第ＸＩＩａ因子（例えば５ｎＭ）を用いて、正常ヒト血漿における接触系活性化を刺激するか、もしくはＨＡＥ発作試料を模倣して１本鎖ＨＭＷＫの濃度をおよそ１０〜５０％低減し、これをＳｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＳＢＨＤ）もしくはウェスタンブロット（ＴＧＡ）において検出することができる。接触活性化の低減が、ＤＸ−２９３０処置試料において観察された。
【０１７５】
図１７に示されるように、最低濃度（例えば９〜２７ｎＭ）のＤＸ−２９３０による阻害活性が、本明細書に記載されるＨＭＷＫエクスビボ活性化アッセイにおいて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎもしくは従来のウェスタンブロット解析を用いて、検出された。この試験に使用したアッセイ条件は、５％血漿中で９〜２７ｎＭのＤＸ−２９３０の活性を検出できた。以下の表２もまた参照できる。
【表５】
0006757252.tif 000009
【０１７６】
ＤＸ−２９３０の用量を漸増させた第ＸＩＩａ因子活性化血漿の生データを図１８に提供した。以下の表３もまた参照できる。
【表６】
0006757252.tif 000010
0006757252.tif 000011
【０１７７】
１本鎖ＨＭＷＫの低減を、第ＸＩＩａ因子による３０分間の活性化の後のさまざまなヒトの未希釈血漿試料において試験した。結果を図２２〜２６に示す。以下の表４〜８もまた参照できる。
【表７】
0006757252.tif 000012
【表８】
0006757252.tif 000013
【表９】
0006757252.tif 000014
【表１０】
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【表１１】
0006757252.tif 000016
【０１７８】
図２７に示されるように、第ＸＩＩａ因子の活性化によって、血漿試料中の１本鎖ＨＭＷＫが濃度依存的に低減した。
【０１７９】
（ｉｉ）内因性の切断型キニノーゲン
このアッセイにおいて、血漿試料中の切断型キニノーゲンの濃度を測定するためにＳＣＡＴチューブの血漿を、Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＳＢＨＤ）およびＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ（ＴＧＡ）によって分析した。切断型ＨＭＷＫは、正常ヒト血漿と比較して、基礎状態のおよび発作時のＨＡＥ試料において上昇していることが見出された。切断型ＨＭＷＫは、ＤＸ−２９３０で処置したＨＡＥ患者、ならびにＤＸ−２９３０で処置した健康なボランティアにおいて低減すると予想される。
【０１８０】
図２８に示されるように、基礎謡所のＨＡＥ患者の試料における２本鎖ＨＭＷＫ（切断型ＨＭＷＫ）濃度は、ＨＡＥ発作時の患者の濃度よりも低いことが見出された。ＤＸ−２９３０で処置した患者における切断型ＨＭＷＫ濃度は、正常患者の濃度と同様であると予想される。
【０１８１】
図２９は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅウェスタンブロット解析と従来のウェスタンブロット解析とによって決定定された、基礎状態のＨＡＥ患者とＨＡＥ発作時の患者における切断型ＨＭＷＫの濃度を示す。
【０１８２】
内因性の切断型ＨＭＷＫを、４人の個体において試験した。結果を図３０に示す。クエン酸加採血管で採取した正常ヒト血漿試料中に少量の切断型ＨＭＷＫが見出された。
【０１８３】
（ｉｉｉ）ｐＫａｌ活性測定のためのエクスビボアッセイ
正常ヒト血漿における接触系活性化を評価するためもしくはＨＡＥ発作試料を模倣するため（１本鎖ＨＭＷＫの１０〜５０％の低減を目的として）、および接触系活性化に対するｐＫａｌ阻害剤の阻害活性を評価するために、酵素に基づくこのアッセイを開発した。接触活性の低減が、ＤＸ−２９３０で処置した対象において観察された。このアッセイは、処置した対象（例えばサルもしくはヒトの患者）におけるＤＸ−２９３０生物活性のようなｐＫａｌ阻害剤を評価するのに有用である。
【０１８４】
このアッセイの例を図１２に図解する。要約すると、血漿試料を、９６穴マイクロプレートに入れた。例示的なｐＫａｌ阻害剤であるＤＸ−２９３０、例示的な接触系活性化剤である第ＸＩＩａ因子を、血漿試料に添加した。混合物を、好適な期間（例えば２分間）、ｐＫａｌの標識されたペプチド基質の存在下において氷上でインキュベートして、トウモロコシトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）を混合物に添加して活性化反応を停止させた。混合物を、必要に応じて希釈して、、蛍光ペプチド基質の濃度を測定することによって、タンパク質分解活性を決定した。
【０１８５】
図１２に示されるように、ＤＸ−２９３０で処置したサルは、接触活性化レベルの低減（ｐＫａｌ活性の低減）を示した。
【０１８６】
（ｉｖ）切断型ＨＭＷＫの決定のためのウェスタンブロット解析
切断型ＨＭＷＫの濃度を、ＬｉＣｏｒ検出を伴い得るウェスタンブロット解析によって測定した。以下の実施例８も参照できる。必要に応じて、クエン酸もしくは抗プロテアーゼカクテルを、このアッセイにおいて抗凝固剤として使用した。ＨＡＥ試料では正常血漿と比較して切断型ＨＭＷＫの増加が観察された。このアッセイは、処置した対象（例えばサルもしくはヒトの患者）におけるＤＸ−２９３０生物活性のようなｐＫａｌ阻害剤を評価するのに有用である。
【０１８７】
抗プロテアーゼ阻害剤カクテル中のＨＡＥ患者より採取した血漿試料を、ＬｉＣｏｒ検出を伴うウェスタンブロット解析を用いて試験して、結果を図１４に示した。図１５に示されるように、インタクトキニノーゲンは、以前に報告されたように、１０％から５０％に減少した（ＬｉＣｏｒ検出を伴うウェスタンブロット解析）。ＤＸ−２９３０で処置したカニクイザルは、ｐＫａｌ活性化（カオリンもしくは硫酸デキストランによる）のレベルの濃度依存的な低減を示した（図１６）。以下の表９もまた参照できる。
【表１２】
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【０１８８】
３０分間の活性化の後のさまざまな血漿試料中のヒトＨＭＷＫを、本明細書に記載されるウェスタンブロット解析により決定してれ、図１９に示した。還元試料は、ゲル添加の前に５分間煮沸した。試料を２０倍に希釈して、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で、１５０ｖで９０分間泳動させた。ゲル上のタンパク質を、ｉＢｌｏｔを用いてメンブレンに７分間転写した。マウス抗ヒトキニノーゲン（１：１，０００希釈）を使用した。ブロットの露出時間は５秒間であった。
【０１８９】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎを、血漿活性化の検出において従来のウェスタンブロット解析と比較した。図２０および２１に示されるように、前者（右パネル）は、後者（左パネル）よりも高感度である。
【０１９０】
実施例８：バイオマーカーとしてのｐＫａｌのエクスビボ活性化
血漿中でのプレカリクレインから血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）へのエクスビボ活性化は、例えば、ＤＸ−２９３０のようなｐＫａｌの治療阻害剤の生物活性の証拠を提供するための薬力学的（ＰＤ）バイオマーカーとして、および、疾患試料における活性化ｐＫａｌの検出のためとしての両方に利用できる。
【０１９１】
第一の実験において、ＤＸ−２９３０（５ｍｇ／ｋｇ）の1回ＳＣ注射を行ったカニクイザルから血漿を得て、そして１０ｎＭの第ＸＩＩａ因子により活性化し、活性ｐＫａｌを生成させて、これを、合成基質（Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）を用いてモニターした。基質の添加前に第ＸＩＩａ因子の活性化を停止するために、トウモロコシトリプシン阻害剤を添加した。投与されたカニクイザルからの血漿試料において観察されるパーセント阻害は、モル当量のＤＸ−２９３０もしくはエカランチドのいずれかを添加した調製された血漿試料の阻害とマッチした（図３１）。ＤＸ−２９３０の血漿中濃度は、第ＸＩＩａ因子のエクスビボ添加によって生じるｐＫａｌのおよそ８０％を阻害する薬剤レベル（〜２６５ｎＭ）に到達したことは明らかである。図３１はまた、同量のｐＫａｌ阻害が当量濃度のエカランチドによって観察されたことを示す。対照的に、当量濃度のＣ１−ＩＮＨを血漿に添加しても、このエクスビボ活性化アッセイにおいて第ＸＩＩａ因子によって活性化されたｐＫａｌを阻害しなかった。
【０１９２】
第二の実験において、異なる用量のＤＸ−２９３０の５週間のＳＣ注射を行ったカニクイザルより血漿を得て、異なる用量のＤＸ−２９３０の1回ＳＣ注射を行ったフェーズ１ａ臨床試験のヒト（ｎ＝６）よりクエン酸加血漿を得た。血漿試料を、第ＸＩＩａ因子により活性化して、生じるｐＫａｌ活性を、合成基質（Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）を用いて測定した。基質の添加前に第ＸＩＩａ因子の活性化を停止するために、トウモロコシトリプシン阻害剤を添加した。パーセント阻害を、それぞれの個体からの投与前の血漿中に存在するｐＫａｌ活性をベースラインとして用いて決定した。図３２は、、ＤＸ−２９３０の用量が増加するにつれて、ヒトおよびサルの血漿試料の両方において、パーセント阻害が増加したことを示す。
【０１９３】
２つの実験からの結果は、エクスビボ活性化アッセイがｐＫａｌの治療阻害剤の生物活性のためのＰＤバイオマーカーとして有用であることを示す。
【０１９４】
実施例９：ＤＸ−２９３０フェーズ１Ａ試験の血漿試料におけるｐＫａｌ活性のエクスビボ阻害
ＤＸ−２９３０を皮下投与されたヒト対象由来の血漿におけるＤＸ−２９３０のエクスビボ阻害（生物活性）を、この試験において調べた。
【０１９５】
物質
・ＤＸ−２９３０  （１０６．７  ｍｇ／ｍｌ  ＝  ７３２  μＭ）
・ヒト第ＸＩＩａ因子  ‐  ＥＲＬ  ＨＦＸＩＩａ  ２７９０Ｐ  （１．７２  ｍｇ／ｍｌ  ＝  ２５．３  μＭ）
・トウモロコシトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）  ‐  ＥＲＬ  ＣＴＩ  ３６０  （１．５４  ｍｇ／ｍｌ  ＝  １２３  μＭ）
・ペプチド基質  ＝  ＰＦＲ−ＡＭＣ、Ｓｉｇｍａ  カタログ番号９９２７３、ロット０３７Ｋ１２０７．
・アッセイ緩衝液＝  ２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．５、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％  ＰＥＧ−８０００
・Ｃｏｒｎｉｎｇ  ９６穴白色ポリスチレンマイクロプレート  カタログ番号３７８９
・Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ２プレートリーダー
・ＤＸ−２９３０フェーズ１Ａ試験において採取したクエン酸加血漿
【０１９６】
方法
１：４０希釈した血漿を、１０ｎＭの第ＸＩＩａ因子の添加により、２分間室温で活性化した。第ＸＩＩａ因子を、１００ｎＭのＣＴＩの添加によりクエンチさせて、血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）のタンパク分解活性を、試料の血漿をさらに１：１０希釈して１０μＭの蛍光ペプチド基質ＰＦＲ−ＡＭＣを添加することにより評価した。それぞれの血漿試料を、ｐＫａｌ活性の割合として報告し、これを、それぞれの個体に関する投与前の対照に基づいて「％阻害」へと変換した。
【０１９７】
結果
クエン酸加血漿試料を、ＤＸ−２９３０フェーズ１ａ試験において健康な対象から得て、血漿中のエクスビボ生物活性アッセイを用いて分析した。用量群３（１．０ｍｇ／ｋｇＤＸ−２９３０）および用量群４（３．０ｍｇ／ｋｇＤＸ−２９３０）において、ｐＫａｌ活性の有意な阻害が観察され、それぞれ、およそ１９％および３６％のｐＫａｌ活性の最大阻害を達成した（図３３）。群３および群４において達成された阻害は持続し、およそ２０日間という見かけの半減期と一致した。用量群１（０．１ｍｇ／ｋｇＤＸ−２９３０）および用量群２（０．３ｍｇ／ｋｇＤＸ−２９３０）におけるｐＫａｌ活性の阻害は有意ではなかった。
【０１９８】
これらの結果は、エクスビボ活性化アッセイがｐＫａｌの治療阻害剤の生物活性に関するＰＤバイオマーカーとして有用であることを示す。
【０１９９】
図１０：ウェスタンブロット解析によるフェーズ１ａ試験の試料におけるＤＸ−２９３０生物活性の分析
ＤＸ−２９３０により処置されたヒト対象の血漿中のＤＸ−２９３０の生物活性を、本明細書に記載されるウェスタンブロット解析を用いて調べた。
【０２００】
ＤＸ−２９３０もしくはプラセボの投与後、１日目（ＤＸ−２９３０もしくはプラセボ投与前）、５日目もしくは２８日目に得たクエン酸加血漿試料を用いて、ウェスタンブロット解析を行った。試料を、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）を検出する抗体、ＤＸ−２９３０によって阻害される標的酵素である活性血漿カリクレインの基質を用いるウェスタンブロットによって分析した。血漿カリクレインはＨＭＷＫに作用し、炎症促進性ペプチドであるブラジキニンと、ウェスタンブロット解析により検出されるＨＭＷＫの切断型として知られている２本鎖とを産生する。活性化血液凝固第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ）により処置されたおよびそれに未処置の血漿試料をウェスタンブロット解析により分析した。第ＸＩＩａ因子は、血漿中の不活性のプレカリクレインを活性化血漿カリクレインに変換する。
【０２０１】
この試験から得られた結果は、３ｍｇ／ｋｇＤＸ−２９３０（群４）を投与した対象由来の第ＸＩＩａ因子処置試料が、それらの対象からの投与前の試料と比較して、５日目（ｐ＝０．００１１）および２８日目（ｐ＝０．００２８）において、統計的により低い２本鎖ＨＭＤＫ（切断型ＨＭＷＫ）の割合を示したことを示す。これは、内因性の基質（ＨＭＷＫ）の血漿カリクレイン媒介タンパク分解に対するＤＸ−２９３０の生物活性の証拠である（図３４）。群４において観察される２本鎖ＨＭＷＫの割合の低減は、他の用量群もしくはプラセボ処置群において観察されるものよりもより低い傾向にあった。
【０２０２】
さらに、第ＸＩＩａ因子で処置されず、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、もしくは３ｍｇ／ｋｇのＤＸ−２９３０を投与された対象は、プラセボもしくは０．１ｍｇ／ｋｇ用量において観察されたものよりもより低い割合の２本鎖ＨＭＷＫを示した（図３５）。
【０２０３】
まとめると、これらの結果は、ウェスタンブロット解析がｐＫａｌの治療阻害剤の生物活性に関するＰＤバイオマーカーとして有用であることをさらに実証する。
【０２０４】
均等物および範囲
当業者は、単なるルーチンの実験を用いて、本明細書に記載される本開示の具体的な実施態様に対する多くの均等物を、認識するかまたは解明するであろう。本願の開示の範囲は、上述の説明に限定されないと意図され、むしろ添付の特許請求の範囲に説明される。
【０２０５】
特許請求の範囲において、「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」のような冠詞は、文脈より明らかに反対のものもしくは他のものを示されていない限り、一つもしくは一つ以上を意味することができる。群の一つもしくはそれ以上の構成要素の間の「ｏｒ」を含む特許請求の範囲もしくは説明は、文脈から明らかに反対のものもしくは他のものを示されていない限り、与えられた産物もしくはプロセスにおいて、群の構成要素の一つもしくは一つ以上、または全てが、存在し、使用され、もしくはその他で関連している場合に満たされるとみなされる。本開示は、群の正確に一つの構成要素が、与えられた産物もしくはプロセスにおいて存在し、使用されもしくはその他で関連している実施態様を含む。本開示は、群の一つ以上または群の全ての構成要素が、与えられた産物もしくはプロセスにおいて存在し、使用されもしくはその他で関連している実施態様を含む。
【０２０６】
さらに、本開示は、列挙された請求項の一つもしくはそれ以上からの、一つもしくはそれ以上の限定、要素、項および記述用語が他の請求項に導入されるすべての変更、組み合わせ、および置換を包含する。例えば、他の請求項に従属する任意の請求項は、同じ基本の請求項に従属する任意の他の請求項に見出される一つもしくはそれ以上の限定を含むよう修飾することができる。要素が、例えばマーカッシュ群形式での列挙として存在するとき、それぞれの要素のサブグループもまた開示され、そして任意の要素を、該群より除去できる。一般的に、本開示もしくは本開示の態様が特定の要素および／もしくは特徴を含むとして示されるとき、本開示の特定の実施態様もしくは本開示の態様は、そのような要素および／もしくは特徴からかるか、もしくは本質的にそれらからなるということは理解されるべきである。単純化のため、そのような実施態様は、本明細書においてこのとおりの言葉で具体的に説明されていない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、制限がないことを意図し、さらなる要素もしくはステップを含むことを許容する。範囲が与えられるとき、端点は含まれる。さらに、文脈および当業者の理解から他が示されることもしくは他が明確である場合を除き、範囲として表される値は、文脈が明確に他を指示するのでない限り、範囲の下限の単位の１０分の１までの、本開示の他の実施態様中に述べられる範囲中の任意の具体的な値もしくはサブ範囲をとることができる。
【０２０７】
本願はさまざまな発行された特許、公開された特許出願、雑誌記事および他の刊行物を参照し、そのすべては参照により本明細書に組み入れられる。組み入れられた参考文献の任意のものと本明細書の間で矛盾が存在する場合、本明細書が優先する。さらに、従来技術の範囲内にある本開示の任意の特定の実施態様は、請求項の任意の一つもしくはそれ以上から明確に除外され得る。そのような実施態様は当業者に公知であるとみなされるため、それらは、本明細書に除外が明確に説明されない場合でも、除外できる。本開示の任意の特定の実施態様は、従来技術の存在に関連するか否かによらず、任意の理由により任意の請求項から除外できる。
【０２０８】
当業者は、単なるルーチンの実験を用いて、本明細書に記載される具体的な実施態様の多くの均等物を理解するかもしくは確認することができるであろう。本明細書に記載される本実施態様の範囲は、上述の記載に限定されないことが意図され、それはむしろ添付の特許請求の範囲に説明される。当業者は、以下の特許請求の範囲に記載されるような本開示の精神もしくは範囲から離れずに、本説明に対してさまざまな変更および修正を行ってもよいことを認識するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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