(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高度に血管性の腫瘍の、前記腫瘍の微小血管塞栓形成を引き起こすことによる処置に使用するための組成物であって、
一酸化窒素（ＮＯ）阻害剤；および
担体ビヒクルであって、前記担体ビヒクルがナノ粒子であり、前記ナノ粒子がポリマーソームである、担体ビヒクル
を含み、
前記ＮＯ阻害剤は、少なくとも１種のＮＯ結合分子を含み、
ＮＯ結合は、１０ｍｍＨｇ未満の酸素圧でのみ可能にされ、
前記少なくとも１種のＮＯ結合分子が、無修飾ヒトミオグロビン、別の生物種由来の無修飾ミオグロビン、およびヒトまたは別の生物種由来の化学的または遺伝的に修飾されたミオグロビンの１種または複数から選択され、
前記少なくとも１種のＮＯ結合分子に、酸素が予め装填され、そして、
前記ＮＯ阻害剤は、前記担体ビヒクル内に被包されている、組成物。
【請求項２】
前記ＮＯ結合が、５ｍｍＨｇ未満の酸素圧でのみ可能にされる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物がさらに、前記ポリマーソーム内に前記少なくとも１種のＮＯ結合分子と共被包されたＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）阻害剤および抗酸化剤の少なくとも１種を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物がさらに、前記ポリマーソーム内に前記少なくとも１種のＮＯ結合分子と共被包された化学療法剤および血管新生阻害剤の少なくとも１種を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ＮＯ阻害剤が、前記ポリマーソームの水性コア内にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ＮＯ阻害剤が、前記ポリマーソームの膜状部分内にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリマーソームが、単層状または多層状ポリマーソームである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリマーソームが、複数の生分解性ポリマーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリマーソームが、直径２００ナノメートル未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリマーソームが、直径１００ナノメートル未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリマーソームが、前記ＮＯ阻害剤を少なくとも１種の他の放射線感受性化剤または化学療法剤とともに共被包する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
受動拡散を介して、または前記ポリマーソームと別個の標的化分子のコンジュゲーションから構成される標的化モダリティーを介して目的の部位で蓄積するように構成された、複数のポリマーソームをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記複数のポリマーソームの少なくとも一部が生分解性ポリマーソームであり、前記複数のポリマーソームの少なくとも一部が生体適合性ポリマーソームである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記生体適合性ポリマーソームが、ポリ（エチレンオキシド）またはポリ（エチレングリコール）から部分的に構成される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記生分解性ポリマーソームが、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（ε−カプロラクトン）の少なくとも１種のブロックコポリマーから構成される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記生分解性ポリマーソームが、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（γ−メチルε−カプロラクトン）の少なくとも１種のブロックコポリマーから構成される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記生分解性ポリマーソームが、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（トリメチルカーボネート）の少なくとも１種のブロックコポリマーから構成される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記生分解性ポリマーソームが、純粋なまたはブレンドのマルチブロックコポリマーであり、前記コポリマーが、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、およびポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）、ポリ（乳酸）、ポリ（メチルε−カプロラクトン）の少なくとも１種を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
前記生分解性ポリマーソームが、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣのいずれか１種から形成される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記高度に血管性の腫瘍が、腎細胞癌（ＲＣＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）、および多発性骨髄腫（ＭＭ）からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物が、体循環中に前記組成物を導入することによって前記腫瘍に送達され、前記組成物が前記腫瘍内に蓄積する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも１種のＮＯ結合分子が、Ｏ２およびＮＯを競合的に結合させる少なくとも１種のＮＯ結合分子を含み、
前記少なくとも１種のＮＯ結合分子が体循環中に導入され、そして
前記少なくとも１種のＮＯ結合分子は、前記腫瘍内に前記ポリマーソームが蓄積すると脱酸素化された状態になり、それによって前記腫瘍の微小血管系中のＮＯの選択的スカベンジングを可能にする、
請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記腫瘍内への前記ポリマーソームの蓄積が、前記ポリマーソーム内へのＮＯの拡散を可能にし、前記ＮＯの選択的スカベンジングが、前記被包された少なくとも１種のＮＯ結合分子の脱酸素化によって少なくとも部分的に実施される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記腫瘍微小血管系中の正常なＮＯ活性の選択的阻止は、前記腫瘍血管系中の血管収縮および血小板凝集を引き起こす、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記腫瘍血管系中の持続性の流体力学的圧力は、前記血小板凝集の破裂および前記腫瘍内への出血を引き起こす、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記腫瘍内への出血は、腫瘍血管系の血栓形成および腫瘍組織の壊死を引き起こす、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物がさらに、前記ポリマーソーム内に前記少なくとも１種のＮＯ結合分子とともに共被包された血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）阻害剤の少なくとも１種を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１に記載の組成物を含む医薬組成物；ならびに
ＮＯ阻害剤を静脈内に、吸入を介して、局部的に、直腸を通じて、腟を通じて、経皮的に、皮下に、腹腔内に、髄腔内に、筋肉内に、または経口投与するための手段
を含む、高度に血管性の腫瘍の、前記腫瘍の微小血管塞栓形成を引き起こすことによる処置に使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１２年１２月２０日に出願された「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ｔｏ  Ｔｕｍｏｒｓ」との表題の米国特許出願第１３／５０８，２７１号の一部継続出願であり、これは、２０１２年１月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２０６８０を国内段階に移行したものである。ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２０６８０は、２０１１年１月７日に出願された「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ」との表題の米国仮特許出願第６１／４３０，６２８号および２０１１年１月２５日に出願された「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ」との表題の米国仮特許出願第６１／４３５，８８６号に対する優先権の利益を主張する。上記出願の全ては、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
本願は、酸素の腫瘍内分圧を増大させ、侵襲性の分子挙動および転移能を実証する腫瘍細胞の自然選択を緩和し、放射線および化学療法の効果を増強するために高親和性酸素結合剤を合成し、それを腫瘍に送達するための組成物および方法に関する。本願はまた、腫瘍特異的止血を誘導する血管作用性化合物を生成および送達するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
毎年、およそ１２０万人の米国人が固形腫瘍悪性腫瘍と診断され、処置のために５５０億ドル超の総ヘルスケアコストをもたらしている１、２。これらの患者の５０％超が、かれらの処置計画の一部として放射線療法（ＸＲＴ）を受ける３〜５。放射フィールド内の局所的な腫瘍再発は、最終的な療法を受けている患者における処置失敗の主原因として関係付けられることが多い４〜７。ＸＲＴの悪性細胞を根絶する能力は、ＤＮＡ損傷の媒介に関与する強力な放射線感受性化剤であるＯ２の腫瘍内含有量に決定的に依存する８〜１０。腫瘍内Ｏ２レベルは、単一フラクションのイオン化放射線療法で処置されている同じタイプの腫瘍の中での応答の最も重要な決定要因の１つである４、５、１１。実験的研究は、正常レベルのＯ２を有するものより２〜３倍単一フラクションのイオン化放射線に対して耐性であることを示唆する５、１０、１２、１３。ＸＲＴは、細胞傷害性である高レベルの局在的な反応性酸素種（ＲＯＳ）を生成するが、腫瘍低酸素は、基本的な内因性ＲＯＳを促進し１４、それは、低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）の安定化をもたらし、より侵襲性の腫瘍形成性表現型に至る３、５、８、１５〜１７。頭部がん、頸部がん、および子宮頸がんを有する患者における腫瘍の処置前のＯ２レベルの予後的意義に対する調査は、２．５〜１０ｍｍＨｇ未満の酸素圧（ｐＯ２）レベルとしてこれらの研究において典型的には指定される低酸素の悪化は、放射線および化学療法の両方の耐性、手術後の局所的な腫瘍制御の低下、ならびに生存期間のより低い割合に関連することをさらに実証した４、５、１８〜２８。
【０００４】
低酸素は、５０年超にわたって固形腫瘍の処置失敗の原因として認識されているが、それを克服するための取り組みは、一般に成功していない４、５、８、２９〜３５。いくつかの戦略が、固形腫瘍の放射線感受性および放射線治癒性を増強するために設計されている。最もよく研究された低酸素変更方法は、Ｏ２の作用を模倣するが、よりゆっくりと代謝される電子親和性放射線感受性化剤を使用している。過去３０年の間、ニトロイミダゾール化合物が、頭部、頸部、子宮頸部、および肺の癌におけるＸＲＴの補助剤として広範に評価されている３６〜４３。これらの研究のほとんどは、失望させる局所的な制御および生存転帰を報告しているが３６〜３８、４０、４１、４３、有効性および安全性を最大にする、ならびにより新しいクラスの作用物質を開発する取り組みが進行中である４４〜４７。代替戦略の大部分は、ＸＲＴ投与に依存しない直接の細胞傷害効果を付与するバルクアルキル化化合物の使用に依拠している。マイトマイシンＣ、チラパザミン、ポルフィロマイシンなどを評価する臨床試験は、様々ながんの局所領域制御および原因特異的生存の統計的かつ臨床的に有意な改善を示したが、投薬の繰り返しに比例して著しい毒性という代償を払うことが多い３０〜３２、４８〜７３。
【０００５】
腫瘍低酸素を克服するための最も直接的で最も毒性が少ない経路は、腫瘍内ｐＯ２を増大させることである。高圧酸素の投与が最初に試みられたが、臨床的に使用されておらず、その理由は、それが、一貫性のない応答、法外に高いコスト、不便さ、および投与関連安全性問題を示すためである４、５、８、１０、７４。より最近の戦略は、カルボゲンの投与４５、７５〜８２、輸血、合成ヘモグロビンベース酸素担体、またはペルフルオロカーボンエマルジョン５、８３、８４、および組換えヒトエリスロポエチン５、８５〜８９、アロステリックエフェクター（ＲＳＲ１３）、もしくは血管新生阻害剤９０〜９２の注射を含んでいる。これらの戦略のすべては、高圧酸素負荷への依存、製剤不安定性、低酸素腫瘍領域（３ｍｍＨｇ未満）内で見つかるものよりはるかに高いｐＯ２値（２０〜４０ｍｍＨｇ）で起こるヘモグロビン結合酸素の放出、および／または相対的に一定の組織酸素化レベルを維持するために血液フローを変更する血管内調節機構に起因して最小限の臨床的成功を収めている５、８、８３、９１。
【０００６】
さらに、血管新生が腫瘍増殖に要求され、転移が必要であるので、このようなプロセスは、がん進行の制御において重要なポイントでもある。過去３５年にわたって、腫瘍特異的血管新生の分子的基盤を標的にするように開発されたいくつかの療法は、抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）療法およびラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）阻害剤を含む。しかし、これらの療法は、血管新生を部分的に阻害するだけであり、したがってほとんどのがんにおいてわずかな効果しかもたらさない。
本開示で参照した刊行物のリストを続ける。これらのそれぞれは、これらのそれぞれの開示の該当する部分について参照により組み込まれている。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
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【化３２】
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【化３３】
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【化３４】
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【化３５】
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【化３６】
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【化３７】
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【化３８】
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【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】American Cancer Society, Cancer Facts and Figures 2010
【非特許文献２】Care Core National, Radiation Therapy Management 2010
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
様々な実施形態は、腫瘍内にナノ粒子媒介微小血管塞栓形成（ＮＭＥ）を引き起こす方法であって、一酸化窒素（ＮＯ）作用剤（affecting  agent）を腫瘍に送達することを含む、方法を含む。一部の実施形態では、ＮＯ作用剤を腫瘍に送達することは、体循環内にＮＯ作用剤を導入することを含み、ＮＯ作用剤は、体循環中のＮＯの正常な活性に影響せず、腫瘍内のＮＯ作用剤の蓄積は、腫瘍微小血管系の保持および浸透性の増強に少なくとも部分的に基づく。
【０００９】
一部の実施形態では、ＮＯ作用剤は、担体粒子内に被包されたＮＯ結合分子であり、ＮＯの正常な活性を選択的に阻止することは、腫瘍微小血管系中でＮＯを選択的にスカベンジングすることを含む。一部の実施形態では、担体粒子は、ナノ粒子および微粒子からなる群より選択され、担体粒子は、リン脂質、合成ポリマー、ポリペプチド、およびポリ核酸の少なくとも１種を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、ポリマーソーム（polymersome）である。
【００１０】
一部の実施形態では、ＮＯ結合分子は、酸素（Ｏ２）およびＮＯを競合的に結合させ、体循環内にＮＯ作用剤を導入することは、体循環内に酸素化されたＮＯ結合分子を導入することを含み、ＮＯ結合分子は、腫瘍内に担体粒子が蓄積すると脱酸素化された状態になり、それによって腫瘍微小血管系中のＮＯの選択的スカベンジングを可能にする。
【００１１】
一部の実施形態では、腫瘍内にＮＯ作用剤が蓄積すると、担体粒子内へのＮＯの拡散が可能になり、そこでＮＯの選択的スカベンジングが、被包されたＮＯ結合分子の脱酸素化によって少なくとも部分的に実施される。一部の実施形態では、ＮＯ作用剤は、表面会合ＮＯ結合分子をさらに含み、そこでＮＯの選択的スカベンジングが、表面会合ＮＯ結合分子の脱酸素化によって少なくとも部分的に実施される。一部の実施形態では、ＮＯ結合分子は、１０ｍｍＨｇ未満の圧力でのみ酸素を放出する。
【００１２】
一部の実施形態では、ＮＯ結合分子は、無修飾ヒトミオグロビン、別の生物種由来の無修飾ミオグロビン、およびヒトまたは別の生物種由来の化学的または遺伝的に修飾されたミオグロビンの１種または複数から選択される。一部の実施形態では、腫瘍血管系中の正常なＮＯ活性の選択的阻止は、腫瘍血管系中の血管収縮および血小板凝集を引き起こす。一部の実施形態では、腫瘍血管系中の持続性の流体力学的圧力は、血小板凝集の破裂および腫瘍内への出血を引き起こす。一部の実施形態では、腫瘍内への出血は、腫瘍血管系の血栓形成および腫瘍組織の壊死を引き起こす。
【００１３】
一部の実施形態では、表面会合ＮＯ結合分子は、表面結合ミオグロビンを含む。一部の実施形態では、ＮＯ作用剤を腫瘍に送達することは、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）阻害剤、および放射線療法の少なくとも１種と併せてＮＯ作用剤を投与することを含む。一部の実施形態では、ＮＯ作用剤は、担体粒子内にＮＯ結合分子と共被包された（co-encapsulated）化学療法剤および血管新生阻害剤の少なくとも１種をさらに含む。一部の実施形態では、ＮＯ作用剤は、ＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）阻害剤および抗酸化剤の少なくとも１種を含む。
【００１４】
さらなる実施形態における組成物は、一酸化窒素（ＮＯ）阻害剤および担体ビヒクルを含み、ここでＮＯ阻害剤は、担体ビヒクルが体循環内にあるときＮＯ活性は影響されず、循環から腫瘍内に担体ビヒクルが血管外遊出した後にＮＯ活性が阻害されるように、担体ビヒクルとともに化学的または非共有結合的に組み込まれている。一部の実施形態では、ＮＯ活性の阻害は、ＮＯの結合を伴い、ＮＯ結合は、５ｍｍＨｇ未満の酸素圧でのみ可能になる。
【００１５】
一部の実施形態では、担体ビヒクルは、合成ポリマーベシクルであり、ＮＯ阻害剤は、ポリマーベシクルの水性コア内にある。他の実施形態では、担体ビヒクルは、合成ポリマーベシクルを含み、ＮＯ阻害剤は、ポリマーベシクルの膜状部分内にある。一部の実施形態では、担体ビヒクルは、合成ポリマーベシクルであり、ＮＯ阻害剤は、ポリマーベシクルの外表面に付着されている。他の実施形態では、担体ビヒクルは、単層状または多層状ポリマーソームである。
【００１６】
一部の実施形態の組成物では、担体ビヒクルは、複数の生分解性ポリマーを含む。他の実施形態では、複数の生分解性ポリマーは、ナノ粒子を形成する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、直径２００ナノメートル未満であり、他の実施形態では、ナノ粒子は、直径１００ナノメートル未満である。
【００１７】
一部の実施形態では、担体ビヒクルは、少なくとも１種の他の放射線感受性化剤または化学療法剤とともにＮＯ阻害剤を共被包する。他の実施形態では、担体ビヒクルは、ミセル、固体ナノ粒子、ポリマーソーム、およびリポソーム（lipsome）の少なくとも１種から選択される。さらなる実施形態の組成物では、担体ビヒクルは、ナノ粒子であり、組成物は、受動拡散を介して、またはナノ粒子と別個の標的化分子のコンジュゲーションから構成される標的化モダリティーを介して目的の部位で蓄積するように構成された複数のナノ粒子をさらに含む。一部の実施形態では、複数のナノ粒子の少なくとも一部は、生分解性ポリマーベシクルであり、複数のポリマーベシクルの少なくとも一部は、生体適合性ポリマーベシクルである。一部の実施形態の組成物では、生体適合性ポリマーベシクルは、ポリ（エチレンオキシド）またはポリ（エチレングリコール）を含む。他の実施形態の組成物では、生分解性ポリマーベシクルは、ポリ（ε−カプロラクトン）を含む。他の実施形態の組成物では、生分解性ポリマーベシクルは、ポリ（γ−メチルε−カプロラクトン）を含む。他の実施形態の組成物では、生分解性ポリマーベシクルは、ポリ（トリメチルカーボネート）を含む。
【００１８】
一部の実施形態の組成物では、生分解性ポリマーベシクルは、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（ε−カプロラクトン）の少なくとも１種のブロックコポリマーを含む。他の実施形態の組成物では、生分解性ポリマーベシクルは、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（γ−メチルε−カプロラクトン）の少なくとも１種のブロックコポリマーを含む。他の実施形態の組成物では、生分解性ポリマーベシクルは、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（トリメチルカーボネート）の少なくとも１種のブロックコポリマーを含む。他の実施形態の組成物では、生分解性ポリマーベシクルは、純粋なまたはブレンドのマルチブロックコポリマーであり、コポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、およびポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）、ポリ（乳酸）、ポリ（メチルε−カプロラクトン）の少なくとも１種を含む。
【００１９】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなす添付の図面は、本発明の例となる態様を例証するものであり、上で示した概要および以下に示す詳細な説明と共に、本発明の特色を説明する役目を果たす。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
腫瘍中に微小血管塞栓形成を引き起こす方法であって、
一酸化窒素（ＮＯ）作用剤を腫瘍に送達することを含み、前記ＮＯ作用剤は、前記腫瘍の微小血管系中のＮＯの正常な活性を選択的に阻止し、前記腫瘍への微小血管の流れが停止される、方法。
（項目２）
前記ＮＯ作用剤を前記腫瘍に送達することが、前記ＮＯ作用剤を体循環内に導入することを含み、
前記ＮＯ作用剤が、前記腫瘍微小血管系の保持および浸透性の増強に少なくとも部分的に基づいて前記腫瘍内に蓄積し、
前記ＮＯ作用剤が、体循環中のＮＯの正常な活性に影響しない、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＮＯ作用剤が、鉄結合分子を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ＮＯ作用剤が、担体粒子内に被包されたＮＯ結合分子を含み、ＮＯの正常な活性を選択的に阻止することが、前記腫瘍微小血管系中のＮＯを選択的にスカベンジングすることを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ＮＯ結合分子が、酸素（Ｏ２）およびＮＯに競合的に結合し、
前記ＮＯ作用剤を体循環内に導入することが、酸素化されたＮＯ結合分子を体循環内に導入することを含み、
前記ＮＯ結合分子が、前記腫瘍中に前記担体粒子が蓄積すると脱酸素化された状態になり、それによって前記腫瘍微小血管系中のＮＯの選択的スカベンジングを可能にする、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記腫瘍中の前記ＮＯ作用剤の蓄積が、前記担体粒子中へのＮＯの拡散を可能にし、ＮＯの前記選択的スカベンジングが、被包された前記ＮＯ結合分子の脱酸素化によって少なくとも部分的に実施される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ＮＯ作用剤が、表面会合ＮＯ結合分子をさらに含み、ＮＯの前記選択的スカベンジングが、前記表面会合ＮＯ結合分子の脱酸素化によって少なくとも部分的に実施される、項目５に記載の方法。
（項目８）
酸素化された前記ＮＯ結合分子が、１０ｍｍＨｇ未満の圧力でのみ酸素を放出する、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記ＮＯ結合分子が、無修飾ヒトミオグロビン、別の生物種由来の無修飾ミオグロビン、およびヒトまたは別の生物種由来の化学的または遺伝的に修飾されたミオグロビンの１種または複数から選択される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記担体粒子が、ナノ粒子および微粒子からなる群より選択され、前記担体粒子が、リン脂質、合成ポリマー、ポリペプチド、およびポリ核酸の少なくとも１種を含む、項目４に記載の方法。
（項目１１）
前記ナノ粒子が、ポリマーソームを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記腫瘍血管系中の正常なＮＯ活性の前記選択的阻止が、前記腫瘍血管系中で血管収縮および血小板凝集を引き起こす、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記腫瘍血管系中の持続性の流体力学的圧力が、前記血小板凝集の破裂および前記腫瘍内への出血を引き起こす、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記腫瘍内への前記出血が、腫瘍血管系の血栓形成および腫瘍組織の壊死を引き起こす、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記表面会合ＮＯ結合分子が、表面結合ミオグロビンを含む、項目４に記載の方法。
（項目１６）
前記ＮＯ作用剤を前記腫瘍に送達することが、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）阻害剤、および放射線療法の少なくとも１つと併せて前記ＮＯ作用剤を投与することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記ＮＯ作用剤が、前記担体粒子内に前記ＮＯ結合分子と共被包された化学療法剤および血管新生阻害剤の少なくとも１種をさらに含む、項目４に記載の方法。
（項目１８）
前記ＮＯ作用剤が、ＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）阻害剤および抗酸化剤の少なくとも１種を含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
一酸化窒素（ＮＯ）阻害剤；および
担体ビヒクル
を含む組成物であって、前記ＮＯ阻害剤は、前記担体ビヒクルが体循環内にあるときＮＯ活性は影響されず、循環から腫瘍内に前記担体ビヒクルが血管外遊出した後にＮＯ活性が阻害されるように、前記担体ビヒクルと化学的または非共有結合的に組み込まれている、組成物。
（項目２０）
ＮＯ活性の前記阻害が、ＮＯの結合を含み、前記ＮＯ結合が、５ｍｍＨｇ未満の酸素圧でのみ可能にされる、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記ＮＯ作用剤が、無修飾ヒトミオグロビン、別の生物種由来の無修飾ミオグロビン、およびヒトまたは別の生物種由来の化学的または遺伝的に修飾されたミオグロビンの１種または複数から選択されるＮＯ結合分子を含む、項目１９に記載の組成物。
（項目２２）
前記担体ビヒクルが、合成ポリマーベシクルを含み、前記ＮＯ作用剤が、前記ポリマーベシクルの水性コア内にある、項目１９に記載の組成物。
（項目２３）
前記担体ビヒクルが、合成ポリマーベシクルを含み、前記ＮＯ作用剤が、前記ポリマーベシクルの膜状部分内にある、項目１９に記載の組成物。
（項目２４）
前記担体ビヒクルが、合成ポリマーベシクルを含み、前記ＮＯ作用剤が、前記ポリマーベシクルの外表面に付着されている、項目１９に記載の組成物。
（項目２５）
前記担体ビヒクルが、単層状または多層状ポリマーソームである、項目１９に記載の組成物。
（項目２６）
前記担体ビヒクルが、複数の生分解性ポリマーを含む、項目１９に記載の組成物。
（項目２７）
前記複数の生分解性ポリマーが、ナノ粒子を形成する、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
前記ナノ粒子が、直径２００ナノメートル未満である、項目２７に記載の組成物。
（項目２９）
前記ナノ粒子が、直径１００ナノメートル未満である、項目２７に記載の組成物。
（項目３０）
前記担体ビヒクルが、前記ＮＯ作用剤を少なくとも１種の他の放射線感受性化剤または化学療法剤とともに共被包する、項目１９に記載の組成物。
（項目３１）
前記担体ビヒクルが、ミセル、固体ナノ粒子、ポリマーソーム、およびリポソームベース担体ベシクルの少なくとも１種から選択される、項目１９に記載の組成物。
（項目３２）
受動拡散を介して、または前記ナノ粒子と別個の標的化分子のコンジュゲーションから構成される標的化モダリティーを介して目的の部位で蓄積するように構成された、複数のナノ粒子をさらに含む、項目３１に記載の組成物。
（項目３３）
前記複数のナノ粒子の少なくとも一部が生分解性ポリマーベシクルであり、前記複数のポリマーベシクルの少なくとも一部が生体適合性ポリマーベシクルである、項目３２に記載の組成物。
（項目３４）
前記生体適合性ポリマーベシクルが、ポリ（エチレンオキシド）またはポリ（エチレングリコール）から部分的に構成される、項目３３に記載の組成物。
（項目３５）
前記生分解性ポリマーベシクルが、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（ε−カプロラクトン）の少なくとも１種のブロックコポリマーから構成される、項目３３に記載の組成物。
（項目３６）
前記生分解性ポリマーベシクルが、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（γ−メチルε−カプロラクトン）の少なくとも１種のブロックコポリマーから構成される、項目３３に記載の組成物。
（項目３７）
前記生分解性ポリマーベシクルが、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（トリメチルカーボネート）の少なくとも１種のブロックコポリマーから構成される、項目３３に記載の組成物。
（項目３８）
前記生分解性ポリマーベシクルが、純粋なまたはブレンドのマルチブロックコポリマーであり、前記コポリマーが、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、およびポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）、ポリ（乳酸）、ポリ（メチルε−カプロラクトン）の少なくとも１種を含む、項目３３に記載の組成物。
（項目３９）
一酸化窒素（ＮＯ）作用剤を含む医薬組成物であって、前記ＮＯ作用剤は、複数のポリマーおよびＮＯ阻害分子を含む、医薬組成物；ならびに
ＮＯ阻害剤を静脈内に、吸入を介して、局部的に、直腸を通じて、腟を通じて、経皮的に、皮下に、腹腔内に、髄腔内に、筋肉内に、または経口投与するための手段
を含む、キット。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ヘモグロビンの酸素解離曲線を例証するグラフである。
【００２１】
【図２】図２は、ヘモグロビン、および様々な実施形態に従って組織中の酸素レベルを操作するのに使用することのできる例となる薬剤の酸素解離曲線を例証するグラフである。
【００２２】
【図３】図３は、ヘモグロビンおよびミオグロビンの酸素解離曲線を例証するグラフである。
【００２３】
【図４】図４Ａは、様々な実施形態において生分解性の細胞性酸素担体の成分となりうる生分解性ポリマーを例証する図である。図４Ｂは、様々な実施形態において生分解性の細胞性酸素担体の成分として使用することのできる水溶性近赤外フルオロフォア「◇」および水溶性酸素結合性タンパク質「○」を例証する図である。図４Ｃは、ナノスケールのポリマーソーム被包ミオグロビン（ＰＥＭ）の合成、および様々な実施形態に従ってナノスケールＰＥＭを得るのに使用される加工手順（熱、音波処理、および押出し）を例証する図である。図４Ｄは、実施形態ポリマーソームの被包概略図を例証する図である。図４Ｅは、ＰＥＭの極低温透過型電子顕微鏡写真および共焦点顕微鏡写真である。
【００２４】
【図５】図５は、ウィンドウチャンバー腫瘍についての（Ａ）明視野、（Ｂ）酸素％での酸素張力、および（Ｃ）機能しうる血管系を例証する一組の写真である。
【００２５】
【図６−１】図６Ａは、ベシクルの膜コア厚さを２２．５±２．３ナノメートルとして示す、脱イオン水中のＰＥＯ（２Ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２Ｋ）ベースポリマーソーム（５ｍｇ／ｍｌ）の極低温透過型電子顕微鏡写真である。図６Ｂは、１４日にわたり蛍光光度法によって測定した、直径２００ｎｍのＰＥＯ（２Ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２Ｋ）ベースポリマーソーム内に負荷されたドキソルビシンの、様々な生理学的条件（ｐＨ５．５および７．４、Ｔ＝３７℃）下における累積ｉｎ  ｓｉｔｕ放出を例証するグラフである。
【００２６】
【図６−２】図６Ａは、ベシクルの膜コア厚さを２２．５±２．３ナノメートルとして示す、脱イオン水中のＰＥＯ（２Ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２Ｋ）ベースポリマーソーム（５ｍｇ／ｍｌ）の極低温透過型電子顕微鏡写真である。図６Ｂは、１４日にわたり蛍光光度法によって測定した、直径２００ｎｍのＰＥＯ（２Ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２Ｋ）ベースポリマーソーム内に負荷されたドキソルビシンの、様々な生理学的条件（ｐＨ５．５および７．４、Ｔ＝３７℃）下における累積ｉｎ  ｓｉｔｕ放出を例証するグラフである。
【００２７】
【図７−１】図７Ａは、腫瘍における実施形態担体の蓄積を例証する、被包オリゴ（ポリフィリン）ベース近赤外（ＮＩＲ）フルオロフォア（ＮＩＲＦ）のｉｎ  ｖｉｖｏ視像である。図７Ｂは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、リポソーム被包ＤＯＸ、およびポリマーソーム被包ＤＯＸによって阻害されるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍成長のグラフである。
【００２８】
【図７−２】図７Ａは、腫瘍における実施形態担体の蓄積を例証する、被包オリゴ（ポリフィリン）ベース近赤外（ＮＩＲ）フルオロフォア（ＮＩＲＦ）のｉｎ  ｖｉｖｏ視像である。図７Ｂは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、リポソーム被包ＤＯＸ、およびポリマーソーム被包ＤＯＸによって阻害されるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍成長のグラフである。
【００２９】
【図８−１】図８Ａは、４種のポリマーソームで被包されたウシおよびヒトＨｂ製剤の、直径２００ｎｍのポリカーボネート膜から押し出した後のヘモグロビン（Ｈｂ）被包効率を例証する棒グラフである。図８Ｂは、赤血球、ヘモグロビン、および４種のポリマーソームで被包されたヘモグロビン製剤の、２００ｎｍのポリカーボネート膜から押し出した後のＰ５０（ｍｍＨｇ）を例証する棒グラフである。
【００３０】
【図８−２】図８Ａは、４種のポリマーソームで被包されたウシおよびヒトＨｂ製剤の、直径２００ｎｍのポリカーボネート膜から押し出した後のヘモグロビン（Ｈｂ）被包効率を例証する棒グラフである。図８Ｂは、赤血球、ヘモグロビン、および４種のポリマーソームで被包されたヘモグロビン製剤の、２００ｎｍのポリカーボネート膜から押し出した後のＰ５０（ｍｍＨｇ）を例証する棒グラフである。
【００３１】
【図９】図９は、ミオグロビンベース酸素担体（ＭＢＯＣ）を調製および送達する実施形態方法を例証する工程流れ図である。
【００３２】
【図１０】図１０は、少なくとも１種の生体適合性ポリマーと少なくとも１種の生分解性ポリマーとを含むポリマーソームを調製する実施形態方法を例証する工程流れ図である。
【００３３】
【図１１】図１１は、ＰＥＭを生成するための最適化されたステップを例証する略図である。
【００３４】
【図１２】図１２は、図１１の方法によって形成されたＰＥＭ懸濁液におけるミオグロビン濃度およびミオグロビンのポリマーに対する重量百分率を数量化する一組の棒グラフである。
【００３５】
【図１３−１】図１３Ａは、ミオグロビンがポリマーソームの表面上と水性の空洞中の両方で会合しているＰＥＭ（すなわち、ＰＥＭ−ＳＥ）、ミオグロビンがポリマーソームの水性の空洞中でのみ会合しているＰＥＭ（すなわち、ＰＥＭ−Ｅ）、および遊離ミオグロビンの酸素飽和度を、酸素の分圧の関数として例証するグラフである。図１３Ｂは、被包されていないおよび表面に会合しているすべてのミオグロビンがタンパク質分解によって除去されており、残存するミオグロビンが１．５ｍｇ／ｍＬのＮａ２Ｓ２Ｏ４の存在下でオキシミオグロビンに還元されているＰＥＭからの酸素の解離についての動力学的時間経過を例証するグラフである。図１３Ｃは、被包されていないおよび表面に会合しているすべてのミオグロビンがタンパク質分解によって除去されており、残存するミオグロビンがオキシミオグロビンに還元されているＰＥＭの、ＮＯを媒介とする脱酸素化についての動力学的時間経過を例証するグラフである。
【００３６】
【図１３−２】図１３Ａは、ミオグロビンがポリマーソームの表面上と水性の空洞中の両方で会合しているＰＥＭ（すなわち、ＰＥＭ−ＳＥ）、ミオグロビンがポリマーソームの水性の空洞中でのみ会合しているＰＥＭ（すなわち、ＰＥＭ−Ｅ）、および遊離ミオグロビンの酸素飽和度を、酸素の分圧の関数として例証するグラフである。図１３Ｂは、被包されていないおよび表面に会合しているすべてのミオグロビンがタンパク質分解によって除去されており、残存するミオグロビンが１．５ｍｇ／ｍＬのＮａ２Ｓ２Ｏ４の存在下でオキシミオグロビンに還元されているＰＥＭからの酸素の解離についての動力学的時間経過を例証するグラフである。図１３Ｃは、被包されていないおよび表面に会合しているすべてのミオグロビンがタンパク質分解によって除去されており、残存するミオグロビンがオキシミオグロビンに還元されているＰＥＭの、ＮＯを媒介とする脱酸素化についての動力学的時間経過を例証するグラフである。
【００３７】
【図１３−３】図１３Ａは、ミオグロビンがポリマーソームの表面上と水性の空洞中の両方で会合しているＰＥＭ（すなわち、ＰＥＭ−ＳＥ）、ミオグロビンがポリマーソームの水性の空洞中でのみ会合しているＰＥＭ（すなわち、ＰＥＭ−Ｅ）、および遊離ミオグロビンの酸素飽和度を、酸素の分圧の関数として例証するグラフである。図１３Ｂは、被包されていないおよび表面に会合しているすべてのミオグロビンがタンパク質分解によって除去されており、残存するミオグロビンが１．５ｍｇ／ｍＬのＮａ２Ｓ２Ｏ４の存在下でオキシミオグロビンに還元されているＰＥＭからの酸素の解離についての動力学的時間経過を例証するグラフである。図１３Ｃは、被包されていないおよび表面に会合しているすべてのミオグロビンがタンパク質分解によって除去されており、残存するミオグロビンがオキシミオグロビンに還元されているＰＥＭの、ＮＯを媒介とする脱酸素化についての動力学的時間経過を例証するグラフである。
【００３８】
【図１４】図１４は、様々なＰＥＭ製剤についての酸素解離（Ｋｏｆｆ，Ｏ２）およびＮＯを媒介とする脱酸素化（Ｋｏｘ，ＮＯ）の動力学的速度定数を、遊離（被包されていない）ミオグロビン（Ｍｂ）と比較して示す表である。
【００３９】
【図１５−１】図１５Ａは、ＮＩＲミオグロビン、空のポリマーソーム、およびＰＥＭの、静脈内注射後の４時点での体内分布についての一組のｉｎ  ｖｉｖｏ視像である。図１５Ｂは、ＮＩＲミオグロビン、空のポリマーソーム、およびＰＥＭの腫瘍蓄積を、時間の関数として例証するグラフである。図１５Ｃは、ＮＩＲミオグロビンおよびＰＥＭの血漿ミオグロビン濃度を、時間の関数として例証するグラフである。
【００４０】
【図１５−２】図１５Ａは、ＮＩＲミオグロビン、空のポリマーソーム、およびＰＥＭの、静脈内注射後の４時点での体内分布についての一組のｉｎ  ｖｉｖｏ視像である。図１５Ｂは、ＮＩＲミオグロビン、空のポリマーソーム、およびＰＥＭの腫瘍蓄積を、時間の関数として例証するグラフである。図１５Ｃは、ＮＩＲミオグロビンおよびＰＥＭの血漿ミオグロビン濃度を、時間の関数として例証するグラフである。
【００４１】
【図１５−３】図１５Ａは、ＮＩＲミオグロビン、空のポリマーソーム、およびＰＥＭの、静脈内注射後の４時点での体内分布についての一組のｉｎ  ｖｉｖｏ視像である。図１５Ｂは、ＮＩＲミオグロビン、空のポリマーソーム、およびＰＥＭの腫瘍蓄積を、時間の関数として例証するグラフである。図１５Ｃは、ＮＩＲミオグロビンおよびＰＥＭの血漿ミオグロビン濃度を、時間の関数として例証するグラフである。
【００４２】
【図１６】図１６は、同系正所性４Ｔ１乳房腫瘍のＰＥＭ処置を示す一組の像である。
【００４３】
【図１７】図１７は、図１６に示すＰＥＭ処置腫瘍ならびにＮＩＲミオグロビンおよび空のポリマーソームで処置した腫瘍について、腫瘍内の合計ヘモグロビン濃度を時間の関数として例証するグラフである。
【００４４】
【図１８−１】図１８Ａは、ＰＥＭで処置した後の一定期間にわたる腫瘍および周囲の正常組織の一組の明視野像である。図１８Ｂは、ＰＥＭを投与してから２４時間後の図１８Ａの腫瘍の一組の像である。
【００４５】
【図１８−２】図１８Ａは、ＰＥＭで処置した後の一定期間にわたる腫瘍および周囲の正常組織の一組の明視野像である。図１８Ｂは、ＰＥＭを投与してから２４時間後の図１８Ａの腫瘍の一組の像である。
【００４６】
【図１９−１】図１９Ａは、ＰＥＭおよび空のポリマーソームでの処置の前および処置後４時間前後の腫瘍におけるヘモグロビン飽和度（％）を示す一組の像である。図１９Ｂは、ＰＥＭおよび空のポリマーソームでの処置の前および処置後４時間前後の腫瘍における流速（μｍ／ｓ）を示す一組の像である。
【００４７】
【図１９−２】図１９Ａは、ＰＥＭおよび空のポリマーソームでの処置の前および処置後４時間前後の腫瘍におけるヘモグロビン飽和度（％）を示す一組の像である。図１９Ｂは、ＰＥＭおよび空のポリマーソームでの処置の前および処置後４時間前後の腫瘍における流速（μｍ／ｓ）を示す一組の像である。
【００４８】
【図２０】図２０は、ＮＩＲミオグロビン対照およびＰＥＭ処置動物についての、切除された腫瘍の一組の代表的な蛍光像ならびにヘマトキシリンおよびエオシン像である。
【００４９】
【図２１】図２１は、ＰＥＭ処置動物についての血清化学パネルの結果を例証する表である。
【００５０】
【図２２−１】図２２Ａおよび２２Ｂは、ＰＥＭおよび空のポリマーソームで処置した腫瘍マウスから切除された肝臓の、一組ずつのヘマトキシリンおよびエオシン像である。図２２Ｃは、ＰＥＭで処置したマウスにおける同種移植ＲＥＮＣＡ腫瘍を示す一組の像である。図２２Ｄは、空のポリマーソームで処置したマウスにおける同種移植ＲＥＮＣＡ腫瘍を示す一組の像である。図２２Ｅおよび２２Ｆは、それぞれ、ＰＥＭおよび空のポリマーソームで処置したマウスから切除された腫瘍の、一組ずつの代表的な蛍光像ならびにヘマトキシリンおよびエオシン像である。
【００５１】
【図２２−２】図２２Ａおよび２２Ｂは、ＰＥＭおよび空のポリマーソームで処置した腫瘍マウスから切除された肝臓の、一組ずつのヘマトキシリンおよびエオシン像である。図２２Ｃは、ＰＥＭで処置したマウスにおける同種移植ＲＥＮＣＡ腫瘍を示す一組の像である。図２２Ｄは、空のポリマーソームで処置したマウスにおける同種移植ＲＥＮＣＡ腫瘍を示す一組の像である。図２２Ｅおよび２２Ｆは、それぞれ、ＰＥＭおよび空のポリマーソームで処置したマウスから切除された腫瘍の、一組ずつの代表的な蛍光像ならびにヘマトキシリンおよびエオシン像である。
【００５２】
【図２３】図２３Ａは、ＰＥＭの安全な投与レベルおよびスケジュールを決定するため研究パラメーターを例証する表である。図２３Ｂは、ウィンドウチャンバーで可視化される腫瘍特異的なナノ粒子媒介微小血管塞栓形成（ＮＭＥ）を誘導するＰＥＭの最小有効用量を決定するための研究パラメーターを例証する表である。
【００５３】
【図２４】図２４Ａは、ＲＣＣのファーストライン療法として腫瘍成長を阻害するのに最適なＰＥＭ投与スケジュールおよびＶＥＧＦ受容体ＴＫＩとの治療の組合せを決定するための研究パラメーターを例証する表である。図２４Ｂは、ＲＣＣのセカンドライン療法として腫瘍成長を阻害するのに最適なＰＥＭ投与スケジュールおよびｍＴＯＲ阻害剤との治療の組合せを決定するための研究パラメーターを例証する表である。
【００５４】
【図２５】図２５は、ＲＣＣの対症療法として腫瘍成長を阻害するのに最適な、放射線療法とのＰＥＭ投与スケジュールを決定するための研究パラメーターを例証する表である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明は、本開示の一部を形成する添付の図面および実施例に関連して採用された以下の詳細な説明を参照することによってより容易に理解することができる。様々な実施形態は、本明細書に記載し、かつ／または示す具体的な組成物、方法、用途、デバイス、条件、またはパラメーターに限定されず、本明細書で使用する専門用語は、単なる例として特定の実施形態を記述する目的のためであり、限定的であるように意図されていないことが理解されるべきである。
【００５６】
別個の実施形態という状況で明確にするために本明細書に記載されるある特定の特徴は、単一の実施形態で組合せて提供することもできることが認識されるべきである。反対に、単一の実施形態という状況で簡潔さのために記載されている様々な特徴は、別個に、または任意のサブコンビネーションで提供することもできる。さらに、範囲で述べた値への言及は、その範囲内のありとあらゆる値を含む。
【００５７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容により別段に明らかに指示されていない限り、複数形の指示対象を含む。
【００５８】
単語「約」は、測定可能な値、例えば、量、一時的な持続時間などを参照するとき本明細書で使用され、指定した値の±２０％、±１０％、±５％、±１％、または±０．１％の変動を、このような変動が開示した方法を実施するのに適切であるとき、包含することを意味する。
【００５９】
単語「例示的な」は、「例、事例、または実例として機能を果たすこと」を意味するように本明細書で使用される。「例示的な」として本明細書に記載される任意のインプリメンテーションは、他のインプリメンテーションに対して好適または有利であると必ずしも解釈されない。
【００６０】
単語「複数」は、１つを超えるを意味するように本明細書で使用される。値の範囲が表現されているとき、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、値が、先行詞「約」を使用することによって近似として表現されているとき、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されることになる。すべての範囲は、両端を含み、組み合わせられる。
【００６１】
用語「対象」および「患者」は、ヒト患者を指すのに本明細書で互換的に使用され、一方、用語「対象」は、任意の動物を指す場合がある。様々な実施形態では、対象は、哺乳動物、非ヒト動物、イヌ、および／または脊椎動物であり得ることが理解されるべきである。
【００６２】
用語「モノマー単位」は、モノマーの１つとして同じまたは同様の数の原子を含有するポリマー分子の単位を意味するように本明細書で使用される。モノマー単位は、本明細書では、単一タイプ（均質）または様々なタイプ（不均質）のものであり得る。
【００６３】
用語「ポリマー」は、接続されたモノマー分子を含む巨大分子というその通常の意味に従って使用される。
【００６４】
用語「両親媒性サブスタンス」は、極性（水溶性）基および疎水性（水不溶性）基の両方を含有するサブスタンスを意味するように本明細書で使用される。
【００６５】
用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ送達」は、局部的、経皮、坐剤（直腸、膣）、ペッサリー（膣）、静脈内、口腔、皮下、腹腔内、髄腔内、筋肉内、頭蓋内、吸入、口腔などの投与経路による生物製剤の送達を指すのに本明細書で使用される。
【００６６】
用語「有効量」は、特定の生物学的な結果、例えば、それだけに限らないが、本明細書に開示、記載、または例示した生物学的な結果などを実現するのに有効な化合物、材料、または組成物の量を指すのに本明細書で使用される。このような結果として、それだけに限らないが、当技術分野で適当な任意の手段によって判定される場合、本明細書に述べられる疾患状態のいずれかと関連した症状の有効な低減を挙げることができる。
【００６７】
用語「膜」は、３次元空間内で２次元表面を画定し、したがって少なくとも局所的な意味で１つの空間を別の空間から分離する分子の空間的に明確なコレクションを意味するように本明細書で使用される。
【００６８】
用語「医薬活性剤」は、認め得るほどに、それが導入される生物系を変化させ、またはそれに影響する任意のタンパク質、ペプチド、糖、サッカリド、ヌクレオシド、無機化合物、脂質、核酸、小合成化学化合物、または有機化合物を指すのに本明細書で使用される。
【００６９】
用語「薬物送達」は、ヒトまたは動物において治療効果を実現するために医薬化合物を投与する方法またはプロセスを指すのに本明細書で使用される。
【００７０】
用語「ビヒクル」は、固有の治療上の利益を有さないが、薬物送達の目的で医薬活性剤と組み合わされるとき、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達のその機構またはモード、生成物の有効性および安全性を改善する利益のためのその濃度、生物学的利用能、吸収、分布、および排除、ならびに患者の利便性およびコンプライアンスを含むが、それに限定されない医薬活性剤の特性の改変をもたらす作用物質を指すのに本明細書で使用される。
【００７１】
用語「担体」は、薬物送達の目的で医薬活性剤を組み込むのに使用される送達ビヒクルを記述するのに本明細書で使用される。
【００７２】
用語「酸素結合剤」または「酸素結合化合物」は、酸素を結合させ、貯蔵し、放出する任意の分子または巨大分子を指すのに本明細書で使用される。
【００７３】
用語「アロステリックエフェクター」は、酸素担体への酸素結合、または酸素担体からの酸素放出の速度または量をモジュレートする分子を指すのに本明細書で使用される。
【００７４】
用語「高酸素親和性」剤または「高酸素親和性化合物」は、酸素を結合させ、貯蔵するが、自然のヒトヘモグロビンが通常酸素を放出するレベル未満である酸素の分圧でのみそれを放出する任意の分子または巨大分子を指すのに本明細書で使用される。高酸素親和性剤には、酸素結合化合物が含まれる。高酸素親和性剤として、天然のアロステリックモジュレーター、一酸化炭素、または強い還元剤もしくは酸化剤とのそれらの相互作用の有無にかかわらず、ヒト成人または胎児ヘモグロビンのもの未満である酸素のＰ５０を有する酸素結合化合物を挙げることができる。
【００７５】
用語「酸素結合担体」または「酸素担体」は、単一または複数の酸素結合剤を組み込む合成または部分的に合成のビヒクルから構成される担体を指すのに本明細書で使用される。
【００７６】
用語「ホモポリマー」は、１つのモノマー種のポリマーに由来するポリマーを指すのに本明細書で使用される。
【００７７】
用語「コポリマー」は、ただ１種のモノマーが使用されるホモポリマーとは対照的に、２種（またはそれ超）のモノマー種のポリマーに由来するポリマーを指すのに本明細書で使用される。コポリマーは、少なくとも２つのタイプの構成要素単位（また構造単位）からなるので、コポリマーは、どのようにこれらの単位が鎖に沿って配列されているかに基づいて分類され得る。
【００７８】
用語「ブロックコポリマー」は、共有結合によって連結された２種またはそれ超のホモポリマーサブユニットを含むコポリマーを指すのに本明細書で使用され、ホモポリマーサブユニットの合体は、ジャンクションブロックとして公知の中間非繰り返しサブユニットを必要とし得る。２種または３種の明確なブロックを有するブロックコポリマーは、それぞれ「ジブロックコポリマー」および「トリブロックコポリマー」と本明細書で呼ばれる。
【００７９】
用語「面積歪み」は、外部の力または張力を印加する前の粒子の元の表面積によって除された前記外部の力または張力下の粒子の表面積の変化を指すのに本明細書で使用される（「Ａ」で表され、％として表現される）。
【００８０】
用語「臨界溶解張力」または「Ｔｃ」は、マイクロピペット吸引によって測定され、ミリニュートン／メートル（ｍＮ／ｍ）として表現される外部の力に付されるとき、粒子が破裂する張力を指すのに本明細書で使用される。
【００８１】
用語「臨界面積歪み」または「Ａｃ」は、臨界溶解張力で酸素担体またはポリマーソームによって実現される面積歪みを指すのに本明細書で使用される。
【００８２】
用語「負荷比」は、酸素結合担体の測定値を指すのに本明細書で使用され、不活性ビヒクルの乾燥重量によって除された酸素担体内の酸素結合剤の重量として定義され得る。
【００８３】
用語「ミオグロビン負荷容量」は、ミオグロビンベース酸素担体の測定値を指すのに本明細書で使用され、担体の総重量によって除された酸素担体内のミオグロビンの重量として定義され得る。用語「ミオグロビン負荷効率」は、ミオグロビンベース酸素担体の測定値を指すのに本明細書で使用され、被包前の溶液中の元のミオグロビンの重量によって除された担体懸濁液内に被包され、かつ／または組み込まれているミオグロビンの重量として定義され得る（％として表現される）。
【００８４】
用語「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の別々の量を指すのに本明細書で使用される。
【００８５】
Ｐ５０は、酸素結合化合物が酸素で５０％飽和した状態になる酸素の分圧（ｐＯ２）であることが理解されるべきである。Ｐ５０が低下するにつれて、酸素親和性が増大し、逆の場合も同様である。正常な成人ヘモグロビンＡは、２６．５ｍｍＨｇのＰ５０を有し、一方、胎児ヘモグロビンＦは、２０ｍｍＨｇのＰ５０を有し、鎌状赤血球性貧血ヘモグロビンＳは、３４ｍｍＨｇのＰ５０を有する。
【００８６】
様々な実施形態は、腫瘍内ｐＯ２を増大させ、腫瘍の侵襲性の分子表現型を妨げ、腫瘍に向けられる放射線および化学療法の有効性を増大させるために、腫瘍に高酸素親和性剤（例えば、ミオグロビンなどの分子およびタンパク質）を送達するナノ粒子ベース治療剤担体を提供する。
【００８７】
一般に、放射線処置は、同時の放射線療法とともにより多くの酸素ベースフリーラジカルを生成するために腫瘍の酸素濃度を増大させることによって、または腫瘍特異的部位に別の非Ｏ２依存性放射性感受性化剤を送達することによって強化することができる。腫瘍の酸素濃度を操作するための従来法は、この増大した酸素容量を腫瘍に最終的に送達するために酸素の全身レベルを増大させることに頼っている。天然ヘモグロビン（Ｈｂ）を使用して人工血液代替品を送達する１つのこのような方法は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１１年４月１９日に出願された「Biodegradable  Nanoparticles  as  Novel  Hemoglobin-Based  Oxygen  Carriers  and  Methods  of  Using  the  Same」という表題の米国特許出願第１３／０９０，０７６号に開示されている。
【００８８】
ヘモグロビンは、ヒト赤血球中の酸素輸送タンパク質である。ヘモグロビンの構造は、酸素への結合を効率的にし、ヒト組織／血流中の結合酸素をアンロードすることを効率的にする。ヘモグロビンは、非共有結合によって一緒に保持されて、より大きい４サブユニット（四量体）ヘモグロビン分子を形成する２対のグロビン二量体からなる。四量体ヘモグロビンの酸素結合能は、ヘム基と呼ばれる非タンパク質単位の存在に依存する（すなわち、ヘモグロビン１分子は、４個の酸素分子と結合することができる）。
【００８９】
図１は、ヘモグロビンの酸素解離曲線を例示する。酸素のヘモグロビンへの協調的な結合は、天然ヘモグロビンにＳ字形状酸素解離曲線を与え、酸素がｐＯ２の狭い生理的範囲内で（４０〜１００ｍｍＨｇ）結合および放出されることを可能にする。腫瘍の酸素レベルを操作するための従来法は、天然ヘモグロビンと同様の酸素解離曲線を有するヘモグロビンまたは作用物質（タンパク質、分子など）を使用することを試みている。他の方法は、ヘモグロビン酸素解離曲線の右にシフトした酸素解離曲線を有する作用物質（すなわち、ヘモグロビンより酸素に対して低い親和性を有する作用物質）を使用することを試みている。
【００９０】
図２は、ヘモグロビン、および腫瘍中の酸素レベルを操作するのに使用することができる２種の他の例示的作用物質（例えば、作用物質Ａ、作用物質Ｂ）の酸素解離曲線を例示する。具体的には、図２は、例示的な作用物質（作用物質Ａ、作用物質Ｂ）は、ヘモグロビン酸素解離曲線の右にシフトした酸素解離曲線を有し、それにより、例示的な作用物質によって送達される酸素の量が増大することを例示する。
【００９１】
図３は、ヘモグロビンおよびミオグロビン、筋組織中の酸素レベルの調節に関与するユビキタスタンパク質の酸素解離曲線を例示する。図３は、ミオグロビンの酸素解離曲線は、Ｓ字形状ヘモグロビン酸素解離曲線の左にある非常に低いＰ５０を有する矩形双曲線であることを示す（すなわち、ミオグロビンは、ヘモグロビンよりはるかに高い酸素に対する親和性を有する）。すなわち、図２を参照して上記に論じた例示的な作用物質（例えば、作用物質Ａ、作用物質Ｂ）と対照的に、ミオグロビンは、ヘモグロビン酸素解離曲線の左にシフトした酸素解離曲線を有する。これは、ヘモグロビン（約２０〜５０ｍｍＨｇの酸素に対する親和性を有する）と異なり、ミオグロビンは、酸素と非常に強く結合し、非常に低い酸素圧（２〜３ｍｍＨｇ）でのみそれを放出するという事実に部分的に起因する。様々な実施形態は、同様のレベルの酸素圧（２〜５ｍｍＨｇ）が固形腫瘍の中心に存在し、この同じレベル（２〜５ｍｍＨｇ）が、放射線療法の有効性がその最大値の５０パーセント未満に降下するレベルであることが示されているという事実から恩恵を受ける。
【００９２】
様々な実施形態は、天然ミオグロビンと同様の酸素親和性を有する高酸素親和性剤（例えば、ミオグロビン、修飾ヘモグロビン、合成タンパク質）を固形腫瘍に送達して放射線療法の有効性を改善するための組成物および方法を提供する。固形腫瘍の中心の酸素圧は、酸素がミオグロビンから放出される酸素圧（２〜３ｍｍＨｇ）と同様であるので、高酸素親和性剤の使用は、酸素が、作用物質が腫瘍周囲または腫瘍内に位置するまで作用物質から放出されないことを保証する。
【００９３】
上述したように、固形腫瘍の中心の酸素圧は、酸素がミオグロビンから放出される酸素圧（２〜３ｍｍＨｇ）と同様である。やはり上述したように、放射線処置の有効性は、腫瘍の酸素レベルを増大させることによって改善することができ、酸素レベルを操作するための従来法は、酸素の全身レベルを増大させることに頼っている。例えば、酸素を腫瘍に送達するための既存の方法は、腫瘍への血液フローの量を増大させ、血液中の溶解酸素の量を増大させ、またはヘモグロビンの全体的な血中濃度を増大させることを伴い得る。従来法は、これが腫瘍酸素送達の増大につながり得ることを期待して血液の酸素運搬能を増大させるために、天然赤血球と同様の酸素に対する親和性を有する作用物質（例えば、ヒトもしくは異種（xenotic）ヘモグロビンの誘導体、および／または天然ヒトヘモグロビンと同じまたはそれより低い酸素に対する親和性を有する他の作用物質）を使用することによってこれを実現する。これらの慣例的な処置方法とは対照的に、様々な実施形態は、天然ヒトヘモグロビンのものよりはるかに高い酸素に対する親和性を有し、天然ミオグロビンのものと同様の酸素解離曲線を有する作用物質を利用することによって酸素を腫瘍組織に送達する物質の組成物および方法を記述する。固形腫瘍の中心の酸素の分圧は、酸素がミオグロビンから放出される酸素圧（２〜３ｍｍＨｇ）と同様であるので、酸素は、高酸素親和性剤が腫瘍周囲または腫瘍内に存在するまで放出されない。
【００９４】
高酸素親和性剤（例えば、ミオグロビン、ミオグロビンと同様の酸素親和性を有する他の合成タンパク質など）を固形腫瘍に送達すると、放射線療法の有効性を改善することができるが、腫瘍への適切な局在化を実現するために、大量の高酸素親和性剤が血流中に注射されなければならない。血流中に大量のこのようなタンパク質を注射することは、危険であり、その理由は、注射される作用物質（例えば、ミオグロビン）は、腎毒性であり得、かつ／または高血圧の切迫または緊急事態を引き起こし得る（通常血管緊張を制御する血管拡張剤一酸化窒素の隔離を介して）ためである。例えば、ミオグロビンの場合では、このような現象は、心発作を有し、マラソンを走り、他の激しい運動に携わっており、かつ／またはコカインなどの様々な薬物を使用する人々において一般に観察される。このような人々においては、筋肉が非常に急速に分解し始め、それによって大量のミオグロビンを血流中に放出する場合がある。この追加のミオグロビンは、体のフィルター装置（すなわち、腎臓糸球体）に捕捉されたタンパク質をもたらし、かつ／または横紋筋融解症として公知の生命を危うくする状態を引き起こし得る。血流中の大量のミオグロビンはまた、血圧を増大させ、臓器損傷をもたらし得る。これは、血流中で、ミオグロビンおよび他の遊離酸素結合タンパク質が、血管緊張および血液フローのメディエーターである一酸化窒素（ＮＯ）を隔離するためである。したがって、ミオグロビンが血流中にあふれているとき、それは、血管壁から一酸化窒素を抽出し、血管を収縮させるように作用する。これは、全血圧を増大させ、場合により高血圧の危機に至り得、主要臓器、例えば、腎臓、心臓、および脳などに損傷を与える。これらおよび他の理由で、ミオグロビンなどの酸素結合タンパク質をその自由形状で血流中に直接注射することは危険である。
【００９５】
これらおよび他の問題に対処するために、様々な実施形態は、高親和性酸素結合剤を担体ビヒクル（例えば、ナノ粒子シェル）中に被包することができ、担体ビヒクルは、被包された作用物質を、血液循環中にある間、血流中に放出され、または生物学的コンポーネント（例えば、タンパク質、細胞、および血管壁）と相互作用することから保護することになる。様々な実施形態は、特許請求の範囲内にそのように明白に列挙されていない限り、必ずしもナノ粒子被包または任意の特定の担体ビヒクルに限定されないことが留意されるべきである。一部の実施形態では、不活性な担体は、高親和性酸素結合剤自体のＰＥＧ化された、または重合されたバージョンであり得る。
【００９６】
様々な実施形態では、高親和性酸素結合剤は、腫瘍領域周囲でのこれらの蓄積を可能にし、かつ／または低酸素圧を受けている腫瘍を標的化することができる特性を有する担体ビヒクル中に被包され得る。担体ビヒクルは、高親和性酸素結合剤が被包されたままでありながら酸素がビヒクル内から低酸素圧の領域（腫瘍の中心に存在するような）に拡散するような特性も有し得る。高酸素親和性剤は、送達された作用物質が作用物質の酸素分圧勾配特性に起因して放射線の有効性を増大させるのに要求される酸素圧で酸素を放出することを可能にする方式で腫瘍に送達され得る。
【００９７】
様々な実施形態では、高酸素親和性剤は、生分解性ポリマー（例えば、ポリマーソーム、ナノ粒子など）から構成されるビヒクル中に被包され得る。高酸素親和性剤（例えば、酸素結合タンパク質および／または分子）を生分解性ポリマービヒクル中に被包すると、作用物質が血液および組織と接触することから保護され、それによってビヒクルが低酸素腫瘍組織内に位置されるまで高い内部酸素濃度を維持しながら毒性が低減される。一実施形態では、作用物質を、これらが担体ビヒクルの水性内部内に高度に濃縮されるように被包することができる。作用物質は、担体ビヒクル（例えば、ナノ粒子シェル）が、被包されたタンパク質が血管壁と相互作用することを遮蔽し、一酸化窒素がナノ粒子中に吸収され、かつ／または被包された酸素結合タンパク質および／もしくは分子に結合することを阻止するように被包することができる。作用物質は、最も低酸素の腫瘍（すなわち、組織のポケットが高親和性酸素運搬剤のＰ５０未満である酸素圧を有する不均質腫瘍）内で見つかるものなどの、酸素に対して非常に高い親和性を有し（例えば、酸素に対して低いＰ５０を有するタンパク質）、かつ／または酸素が最低酸素圧でのみタンパク質および／もしくは分子から非結合になるような酸素結合特性を有するタンパク質および／または分子を含み得る。作用物質は、酸素が１０ミリメートル水銀（ｍｍＨｇ）未満の酸素圧で放出されるタンパク質および／または分子を含み得る。
【００９８】
様々な実施形態では、高親和性酸素結合剤は、無修飾ヒトミオグロビン、別の生物種に由来の無修飾ミオグロビン、ヒトもしくは別の生物種由来の化学的もしくは遺伝的に修飾されたミオグロビン、別の生物種由来の無修飾ヘモグロビン、または小分子、金属−キレーター錯体、または肺に見つかるような生理的な酸素結合圧で酸素と強く結合し、低酸素腫瘍中に見つかるような最低酸素圧でのみそれを放出する（すなわち、１０ｍｍＨｇ未満もしくはそれに等しい酸素に対するＰ５０を有する分子）ペプチド、タンパク質、核酸、もしくは多糖を含めた生物因子であり得る。様々な実施形態では、不活性な担体ビヒクルは、リポソーム、ポリマーソーム、ミセル、修飾リポタンパク質、固体ナノ粒子、固体ミクロンサイズ粒子、脂質もしくはペルフルオロカーボンエマルジョン、デンドリマー、ウイルス、またはウイルス様粒子の任意の１種または複数であり得る。他の実施形態では、不活性な担体ビヒクルは、１種または複数の高親和性酸素結合剤のＰＥＧ化または重合されたバージョンであり得る。好適な実施形態では、ヒトミオグロビンは、ナノ粒子、ポリマーベシクル、および／またはポリマーソーム内に被包することができる。様々な実施形態では、ナノ粒子、ポリマーベシクル、および／またはポリマーソームは、いくつかの異なる生分解性材料の１種から構築することができる。
【００９９】
上述したように、一実施形態では、高親和性酸素結合剤は、ミオグロビンを含み得る。ミオグロビン（Ｍｂ）は、骨格筋および心筋（特に、低発生率の悪性腫瘍を伴った２つの組織）中のＯ２輸送およびフリーラジカルスカベンジングにおいてよく特徴付けられた役割を果たす細胞質ヘムタンパク質である９３、９４。ミオグロビンの酸素関連機能は、多重であり、少なくとも３つの異なる活性を含む。第１に、ミオグロビンは、ヘモグロビン（Ｍｂ）のものよりはるかに高いＯ２親和性を有する酸素リザーバーとして作用する（Ｐ５０−Ｍｂ＝２．７５対Ｐ５０−Ｈｂ＝２５〜５０ｍｍＨｇ）。したがって、ミオグロビンは、好気性条件でＯ２と結合し、腫瘍中に見つかるような低酸素条件下でそれを放出する９５。第２に、ミオグロビンは、細胞質ｐＯ２が低レベルに降下する際にその酸素をアンロードすることによって細胞内Ｏ２を緩衝することができ、連続的な酸化的リン酸化を促進する９６。第３に、ミオグロビンは、助長されたＯ２拡散として公知のプロセスにおいて担体として働くことによって単純なＯ２送達を補足する９７。
【０１００】
ミオグロビンは、腫瘍低酸素のモジュレーターであることが最近示された９８、９９。マウス異種移植ヒト肺腫瘍中のミオグロビン遺伝子移入は、腫瘍進行におけるＯ２およびＲＯＳの役割を研究するのに有効なモデルを提供した。低ｐＯ２下での酸化的リン酸化を可能にすることによって、ミオグロビンは、低酸素条件下でのベースラインＲＯＳ形成をさらに阻止し、腫瘍形成性応答を軽減する９８、９９。がんのこれらのマウスモデルにおいて、ミオグロビン発現は、腫瘍インプランテーションの遅延をもたらし、異種移植片の成長を低減させ、最小限のＨＩＦ−１レベルを生じさせた９８。血管新生および浸潤も強く阻害された９８。これらの効果は、Ｏ２を結合させることができないが、フリーラジカルをスカベンジングすることができるミオグロビンの点突然変異型を使用しても観察されなかった９８。総合すると、これらのデータは、低酸素が、単に調節不全増殖に関連した付帯徴候ではなく、腫瘍進行を推進する主要な要因でもあることを示唆する。これらは、ミオグロビンの多面発現性機能が複数の様式でがん生物学に影響することも示唆する。
【０１０１】
ミオグロビンは、腫瘍低酸素をモジュレートすることが示されたが、Ｏ２治療剤としてのその臨床的有用性は、そのフリー血管内注入に関連した２つの主要な支障：１）内皮由来一酸化窒素（ＮＯ）の捕捉に起因する動物における血管収縮、高血圧、血液フローの低減、および血管損傷；ならびに２）横紋筋融解症に見られる腎毒性を克服することを必要とする。様々な実施形態では、酸素担体としてミオグロビンを使用する限定事項は、ミオグロビンを適切なポリマービヒクル（例えば、ポリマーソーム）内に被包して、その腫瘍特異的送達を改善し、その全身曝露を軽減することによって克服することができる。
【０１０２】
ポリマーソーム３８、３９は、ナノメートル寸法（直径５０〜３００ｎｍ）で形成され、細胞性酸素担体としていくつかの好都合な特性を示す合成ポリマーベシクルである。例えば、ポリマーソームは、自己組織化によって生成することができ、その水性コア中にヘモグロビン（Ｈｂ）およびミオグロビン（Ｍｂ）などの親水性化合物を被包することができる二重層および多層ベシクルのクラスに属する４０、４１。さらに、ポリマーソームは、完全に生分解性のＦＤＡ承認コンポーネントから設計され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは急性ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性を示さないいくつかの選択肢を提供する。
【０１０３】
ポリマーソームは、これらを有効なミオグロビンベース酸素担体ＭＢＯＣにする、リポソームおよび他のナノ粒子ベース送達ビヒクルに対していくつかの優れた特性を示す。例えば、これらのコンポーネントコポリマーブロックの構造に応じて、ポリマーソーム膜は、リポソーム（３〜４ｎｍ）のものより著しく厚くなり得（約９〜２２ｎｍ）、リポソームより５〜５０倍機械的に強靭にし、少なくとも１０倍水に対して低透過性にする４６、４７。１．２〜３．７ｋＤａの範囲のポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）ブラシを有するポリマーソームの循環半減期は、同様のサイズのポリ（エチレングリコール）ベースリポソーム（ＰＥＧ−リポソーム（lyposome））のものと類似し（約２４〜４８時間）、複合ビルディングブロックとして様々なコポリマーを使用することによってさらに具体的に適応させることができる４８。ポリマーソームは、ｉｎ  ｓｉｔｕで数カ月間、およびよく混合された準生理学的条件下で血漿中で数日間、ベシクルサイズおよび形態のいずれの変化も受けることなく安定であることが示された４０、４８。これらは、最大で６０℃まで面内熱転移を示さない３７、４８。さらに、ドキソルビシンを被包しているＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬおよびポリ（エチレン−オキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）−（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ−）ベースポリマーソーム製剤に対する早期の動物研究は、急性毒性も亜急性毒性を示さなかった。最後に、ポリマーソームの生成および貯蔵は、経済的である。ポリマーソームは、高価な製造後精製プロセスを必要とすることなく、大規模で容易に生成および貯蔵することができる。
【０１０４】
最も有望な生分解性ポリマーソーム被包ミオグロビン（ＰＥＭ）製剤は、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、およびポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）を含むが、それらによって限定されない様々な疎水性脂肪族ポリ（アンヒドリド）、ポリ（核酸）、ポリ（エステル）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ペプチド）、ポリ（ホスファゼン）、およびポリ（サッカリド）にカップリングした、ＰＥＧと化学的に同義である親水性生体適合性ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）からなるブロックコポリマーから構成されると仮定されている。１００％ＰＥＧ化された表面から構成されるポリマーソームは、改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学的安定性、強化されたｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的利用能、および延長された血液循環半減期を有する４２、４３。例えば、ポリマーソームの膜部分を構成する脂肪族ポリエステルは、人体中などの生理的条件下でこれらのエステル連結の加水分解によって分解される。その生分解性特質のために、脂肪族ポリエステルは、薬物送達デバイス、生体吸収性縫合糸、癒着障壁におけるインプラント可能な生体材料として、および組織工学を介した傷害修復の足場として使用するのに大きな関心を受けている４４、４５。
【０１０５】
他の生分解性脂肪族ポリエステルと比較して、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）およびその誘導体は、１）低分子薬物への高浸透性；２）分解の際の中性ｐＨ環境の維持；３）他のポリマーとのブレンド形成における容易性；ならびに４）ＰＬＡ、ＰＧＡ、およびＰＬＧＡと比較して遅い浸食動力学によって与えられる長期間送達の適性を含めたいくつかの有利な特性を有する４５。ポリマーソーム被包ミオグロビン（ＰＥＭ）製剤中の膜形成シェルとしてのε−カプロラクトン（またはγ−メチルε−カプロラクトンなどの誘導体）の利用は、得られる細胞性ミオグロビンベース酸素担体（ＭＢＯＣ）が安全で完全なｉｎ  ｖｉｖｏ分解を有することを約束する。
【０１０６】
生分解性ポリマーソームのコンポーネントは、図４Ａに示した生分解性ポリマー、ならびに図４Ｂに示した水溶性近赤外フルオロフォアおよび水溶性酸素結合タンパク質を含み得る。図４Ｃは、加熱、超音波処理、および押出を含む、様々な実施形態におけるナノスケールＰＥＭの合成に関与する処理手順を例示する。一実施形態のＰＥＭが、図４Ｄに概略的に、かつ図４Ｅ中の低温透過型電子顕微鏡写真および共焦点顕微鏡写真に示されている。完全に生分解性かつ生体吸収性のポリマーソームは、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬの両親媒性ジブロックコポリマーの水性水和後の自己組織化を介して生成されることが以前に実証されている３９。コンポーネントビルディングブロックの分子量が様々である２０超のＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬコポリマーが、安定な二重層ポリマーソームの生成について以前に試験されている。しかし、ＰＥＯブロックが１〜５ｋＤａであり、重量によってポリマー塊の１０〜２０％であったＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬのジブロックコポリマーのみが、直径２００ｎｍの孔カットオフ膜に通して押出した後に２００ｎｍ未満の平均粒径および９〜２２ｎｍの膜厚を有する安定な単分散ポリマーソームの一貫したかなりの収率を実証した。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬポリマーソームは、硫酸アンモニウム勾配を使用して抗新生物薬ドキソルビシン（ＤＯＸ）を装填することができることが引き続いて示された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性、分解の機構、およびＤＯＸ装填ＰＥＯ（２ｋＤａ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋＤａ）ポリマーソームからの薬物放出の速度が、１４日にわたってｐＨの関数として評価された。放出の動力学は、中性および酸性ｐＨ条件（３７℃で５．５および７．４）下で変動したが、初期のバースト放出相（最初の８時間内に初期ペイロードの約２０％）が、両方のｐＨ条件で観察され、その後、より制御されたｐＨ依存性放出が数日間にわたって続いた。７．４のｐＨで、動力学的放出研究は、被包された分子は、インタクトなポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）膜を横断する薬物の受動拡散によってポリマーソームを最初に脱出し（１〜４日目）、引き続いてＰＣＬの加水分解性マトリックス分解によって脱出する（５〜１４日目）ことを示唆する。しかし、５．５のｐＨで、放出の支配的機構は、短時間および長時間の両方で、ＰＣＬ膜の酸触媒加水分解であると思われる。特に、これらの完全に生分解性のポリマーソームは、これらの放出の半減期（τ１／２）（ｐＨ７．４で２週間）よりはるかに短い循環の半減期（τ１／２）（２４〜４８時間）を有する。
【０１０７】
図５は、（Ａ）腫瘍血管系の明視野顕微鏡写真、（Ｂ）腫瘍柔組織中の酸素圧の分布（％酸素での）、および（Ｃ）（Ａ）および（Ｂ）のオーバーレイを例示し、ｉｎ  ｖｉｖｏウィンドウチャンバー腫瘍モデル系を利用して機能的な酸素送達を実証する。この実例では、腫瘍は、パネルＡの中央−左の相対的に暗い領域である。酸素飽和（Ｃ）は、その明るさが全Ｏ２含有量によってモジュレートされているカラースケールで示されている（したがって、十分に血管新生した領域は、明るく見える）。腫瘍領域は、酸素圧の中心ピーク、および高度に低酸素である周辺（上および右）領域を伴って非常に不均質の酸素濃度（Ｂ）を示す。複合マップは、腫瘍全体にわたって血管新生に起因して周囲の正常組織とかなりのコントラストを示し、それを曇って明るく見せている。図５の例示した実施例において明白であるように、Ｏ２含有量（様々なポイントで酸素の分圧によって測定した場合）は、腫瘍柔組織全体にわたって不均質であるが、最低酸素圧（１０ｍｍＨｇ未満のｐＯ２によって境界を定めた最も暗いエリア）を腫瘍の中心範囲内に見つけることができる。腫瘍が、ＨＩＦ−１シグナル伝達カスケードをアップレギュレートする傾向があり、より侵襲性の腫瘍形成性表現型に至るのは、これらの低ｐＯ２負荷状態エリア内であり、この表現型は、放射線および化学療法に対して耐性であり、他の場所に転移するより高い傾向を有する。したがって、不均質腫瘍内に見つかる最低酸素圧を増大させることは、それが治療目的になるとき、全体的な腫瘍ｐＯ２を増大させることと同じぐらい重要であり得る。
【０１０８】
図６Ａは、ＰＥＯブロックが１〜５ｋＤａであり、重量によってポリマー塊の１０〜２０％であったポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ）のジブロックコポリマーのみが、直径２００ｎｍの孔カットオフ膜に通して押出した後に２００ｎｍ未満の平均粒径および９〜２２ｎｍの膜厚を有する安定な単分散ポリマーソームの一貫したかなりの収率を実証したことを例示する。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬポリマーソームは、硫酸アンモニウム勾配を使用して抗新生物薬ドキソルビシン（ＤＯＸ）を装填することができることが引き続いて示された。
【０１０９】
図６Ｂは、１４日にわたってｐＨの関数として評価されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性、分解の機構、およびＤＯＸ装填ＰＥＯ（２ｋＤａ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋＤａ）ポリマーソームからの薬物放出の速度を例示する。図６Ｂは、放出の動力学は、中性および酸性ｐＨ条件（３７℃で５．５および７．４）下で変動したが、初期のバースト放出相（最初の８時間内に初期ペイロードの約２０％）が、両方のｐＨ条件で観察され、その後、より制御されたｐＨ依存性放出が数日間にわたって続いたことを示す。７．４のｐＨで、動力学的放出研究は、被包された分子は、インタクトなＰＣＬ膜を横断する薬物の受動拡散によってポリマーソームを最初に脱出し（１〜４日目）、引き続いてＰＣＬの加水分解性マトリックス分解によって脱出する（５〜１４日目）ことを示す。しかし、５．５のｐＨで、放出の支配的機構は、短時間および長時間の両方で、ＰＣＬ膜の酸触媒加水分解である。特に、これらの完全に生分解性のポリマーソームは、これらの放出のｔ１／２半減期（ｐＨ７．４で２週間）よりはるかに短い循環のｔ１／２半減期（２４〜４８時間）を有する。したがって、ポリマーソームは、相対的にインタクトに血流中を循環することを予期することができ、低酸素腫瘍中に見つかるようなより低いｐＨ環境に曝露されたときのみ加速された様式でこれらの被包された内容物を放出することになる。
【０１１０】
図７Ａは、ポリマーソームの膜シェル内に組み込まれているオリゴ（ポルフィリン）ベース近赤外（ＮＩＲ）フルオロフォア（ＮＩＲＦ）のｉｎ  ｖｉｖｏ光学イメージングによって実証した腫瘍中の一実施形態の担体（ポリマーソーム）の蓄積を例示する。この図は、ポリマーソームが、漏出性腫瘍微小血管系に関連した浸透および保持の増強効果（ＥＰＲ）に起因して受動的標的化モダリティーによって腫瘍周囲に蓄積し得ることを例示する。ポリマーソーム蓄積のさらなる増大は、腫瘍部位でポリマーソームの濃度を増強する標的化分子を含めることによって支援され得る。
【０１１１】
図７Ｂは、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、リポソーム被包ＤＯＸ、およびポリマーソーム被包ＤＯＸによって阻害されたｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖（ｌｏｇ（ｍｍ３）での腫瘍サイズとして表した）の折れ線グラフである。この図は、ポリマーソームは、腫瘍周囲に蓄積することができるだけでなく（図７Ａに見られるように）、十分な量で、かつ血管内安定性を保存して蓄積することができ、その結果、腫瘍生物学を変化させるように腫瘍部位でこれらの封入剤ペイロードを有効に放出することを可能にすることを例示する。異なる生分解性送達ビヒクル（例えば、ポリマーソーム対リポソーム対遊離薬物）を比較するとき、これらの成果を実現するポリマーソームの優れた能力が明白である。
【０１１２】
図８Ａは、直径２００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出した後、４種のポリマーソーム被包ウシおよびヒトＨｂ製剤のヘモグロビン（Ｈｂ）被包効率を例示する。具体的には、図８Ａは、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−１（１．６５ＫＤａ）、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−２（１５ＫＤａ）、ＰＥＯ−ｂ−ＰＬＡ−１（１０ｋＤａ）、およびＰＥＯ−ｂ−ＰＬＡ−２（２．４５ＫＤａ）のヘモグロビン被包効率を例示する。上記に論じたように、様々な実施形態は、１．１未満の多分散指数および５０％超のヘモグロビン被包効率を伴って１００〜１２５ｎｍの間の平均半径を有する構築物を生成するための方法論を提供する。
【０１１３】
図８Ｂは、赤血球、ヘモグロビン、ならびに直径２００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出した４種のポリマーソーム被包ヘモグロビン製剤（ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−１（１．６５ＫＤａ）、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−２（１５ＫＤａ）、ＰＥＯ−ｂ−ＰＬＡ−１（１０ｋＤａ）、およびＰＥＯ−ｂ−ＰＬＡ−２（２．４５ＫＤａ））のＰ５０（ｍｍＨｇ）を例示する。上述したように、様々な実施形態は、１０ｍｍ水銀未満のＰ５０、および同様のヘモグロビン負荷濃度でリポソーム被包ヘモグロビン分散物（ＬＥＨ）について測定したものより少なくとも１桁小さいＮＯ結合速度定数を有するＰＥＭ構築物を生成するための方法論を提供する。
【０１１４】
上記に論じたように、ポリマーは、化学的にコンジュゲートしたモノマー分子を含む巨大分子であり、モノマー単位は、単一タイプ（均質）または様々なタイプ（不均質）である。ポリマーの物理的挙動は、全分子量、ポリマーの組成（例えば、異なるモノマーの相対濃度）、各モノマー単位の化学的素性、および溶媒とのその相互作用、およびポリマーのアーキテクチャ（それが単鎖であるか、分岐鎖からなるか）を含めたいくつかの要因によって指示され得る。例えば、エチレングリコール（ethylene  gylcol）（ＥＧ）のポリマーであるポリエチレングリコール（polyethylene  gylcol）（ＰＥＧ）では、その鎖長は、リン脂質に共有結合しているとき、リポソームの循環寿命を最適化し、３４〜１１４のおおよその範囲内で共有結合的に連結したモノマー（ＥＧ３４〜ＥＧ１１４）であることが公知である。好適な実施形態は、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）（ＰＥＧと関連しているポリマー）、および水および他の水性媒体中で直径が最大で数ミクロンまでのポリマーソームの自己組織化を推進するいくつかの疎水性ブロックの１つの親水性コポリマーを含む。
【０１１５】
上記に論じたように、両親媒性サブスタンスは、極性（水溶性）基および疎水性（水不溶性）基の両方を含有するものである。水中で安定な膜を形成するために、両親媒性物質の潜在的な最低必要分子量は、メタノールＨＯＣＨ３のものを超えなければならず、メタノールは、一端が極性（ＨＯ−）であり、他端が疎水性（−ＣＨ３）である最小カノニカル両親媒性物質である。安定な層状相の形成は、投影面積が両親媒性物質の疎水性部分の最大寸法によって除された体積におよそ等しい親水性基を有する両親媒性物質を必要とする。
【０１１６】
一部の実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、その複数のポリマーの１つとしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を含まない。一部の実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレンオキシド（polyethyelene  oxide）（ＰＥＯ）である少なくとも１種の親水性ポリマーを含む。一部の実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＯポリマーは、分子量が約５キロダルトン（ｋＤａ）〜約５０ｋＤａの分子量内で変動し得る。
【０１１７】
最も一般的なラメラ形成両親媒性物質は、２０から５０％の間の親水性体積分率を有し得る。一部の実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームの親水性体積分率は、最大で約２０％である。一部の実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームの親水性体積分率は、最大で約１９％である。一部の実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームの親水性体積分率は、最大で約１８％である。一部の実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームの親水性体積分率は、最大で約１７％である。一部の実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームの親水性体積分率は、最大で約１６％である。一部の実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームの親水性体積分率は、最大で約１５％である。一部の実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームの親水性体積分率は、２０％未満である。一部の実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームの親水性体積分率は、約１％〜約２０％である。両親媒性および超両親媒性分子の自己組織化する能力は、水溶液中に合成超両親媒性物質を懸濁させ、任意の基本的な光学顕微鏡、低温透過型電子顕微鏡下での単純な観察結果によって、または光の散乱によって判断される層状およびベシクル構造を調べることによって、過度の実験を用いることなく概ね評価することができることに留意されるべきである。
【０１１８】
組成物の有効量は、限定することなく、対象の種、品種、サイズ、高さ、重量、年齢、全体的な健康、製剤のタイプ、投与のモードもしくは方式、処置されている特定の状態のタイプおよび／もしくは重症度、または類似体のその受容体への会合によって誘導される分子経路の活性をモジュレートする必要性を含めた任意の数の変数に依存し得る。適切な有効量は、慣例的な最適化技法、ならびに専門家の熟練した、および情報に基づく判断、ならびに当業者に明白な他の要因を使用して当業者によって日常的に判断することができる。
【０１１９】
様々な実施形態の酸素担体の治療有効用量は、患者または対象の生理学的に平均、中央値、または最低の組織酸素化の生物活性と比較して部分的または完全な生物活性をもたらし得る。様々な実施形態の酸素担体の治療有効用量は、対象が処置されている疾患、障害、または病気と関連した症状の完全または部分的な寛解をもたらし得る。
【０１２０】
様々な実施形態の酸素担体は、発症を遅延させ、対象が処置されている疾患、障害、または病気と関連した１つまたは複数の症状を対象が発生させる機会を下げることができる。一部の実施形態では、有効量は、低いまたは乏しい組織酸素化から生じる結果を処置または防止するのに要求される化合物の量である。様々な実施形態によれば、低いまたは乏しい組織酸素化によって引き起こされ、またはそれに寄与する状態の治療的処置に使用される活性化合物（複数可）の有効量は、投与の方式、患者の年齢、体重、および全身的な健康に応じて変動する。
【０１２１】
可溶性両親媒性物質、タンパク質、リガンド、アロステリックエフェクター、酸素結合化合物は、膜に結合し、かつ／または膜内に入り込むことができる。このような膜はまた、溶質に対して半透性であり、その厚さ（ｄ）においてサブ微視的であり、自己組織化または指向性組織化のプロセスから生じなければならない。膜は、温度およびそれが形成される両親媒性物質の化学的性質に応じて流体または固体の特性を有し得る。一部の温度で、膜は、流体（測定可能な粘度を有する）であり得、またはそれは、弾性および曲げ剛性を有する固体様であり得る。膜は、その機械的な変形によってエネルギーを貯蔵することができ、またはそれは、膜貫通電位を維持することによって電気エネルギーを貯蔵することができる。いくつかの条件下で、膜は、互いに接着し、合体する（融合する）ことができる。
【０１２２】
様々な実施形態では、ミオグロビンは、酸素結合化合物として使用され得る。一部の実施形態では、酸素結合化合物は、ミオグロビンと同様である酸素結合特性を有するタンパク質である。一部の実施形態では、酸素結合化合物は、遺伝的もしくは化学的に修飾されたミオグロビン、またはヒトミオグロビンと同様である気体結合特性を有する別の種から単離された酸素結合タンパク質である。一部の実施形態では、酸素結合化合物は、タンパク質、小分子、ポリペプチド、核酸分子、金属−キレーター錯体、またはこれらの任意の組合せから選択される。一部の実施形態では、酸素結合化合物は、タンパク質である。一部の実施形態では、酸素結合化合物は、ポリペプチドである。一部の実施形態では、酸素結合化合物は、遺伝的または化学的に修飾されたヘム基を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、酸素結合化合物は、ヘム基を含む小分子である。
【０１２３】
一部の実施形態では、酸素担体は、対象を処置し、または対象の血液が十分なレベルの酸素を組織に運搬もしくは放出しない疾患もしくは障害を罹患することから対象を防止するために有効量の酸素を輸送する。一部の実施形態では、酸素担体は、それを必要とする対象におけるがんの蔓延を処置または防止するための有効量の酸素を含む。一部の実施形態では、酸素担体は、それを必要とする対象における創傷治癒を促進するための有効量の酸素を含む。
【０１２４】
一部の実施形態では、アロステリックエフェクターは、２，３−ビスホスホグリセレートまたはそれに由来する異性体である。２，３−ビスホスホグリセレートなどのアロステリックエフェクターは、様々な実施形態の酸素担体またはポリマーソームから対象内で脱酸素化されている組織または細胞への酸素のオフロードを増大させ得る。
【０１２５】
上述したように、臨界溶解張力（Ｔｃ）は、マイクロピペット吸引によって測定され、ミリニュートン／メートル（ｍＮ／ｍ）として表現される場合、外部の力に付すとき粒子が破裂する張力である。酸素担体またはポリマーソームの臨界溶解張力の変化は、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームにミオグロビン、別の酸素結合化合物、または１種もしくは複数の酸素結合化合物の混合物を装填する前後に測定することができる。
【０１２６】
様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、２０％以下の臨界溶解張力の変化を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、１９％以下の臨界溶解張力の変化を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、１８％以下の臨界溶解張力の変化を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、１７％以下の臨界溶解張力の変化を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、１６％以下の臨界溶解張力の変化を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、１５％以下の臨界溶解張力の変化を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、１４％以下の臨界溶解張力の変化を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、１３％以下の臨界溶解張力の変化を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、１２％以下の臨界溶解張力の変化を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、１１％以下の臨界溶解張力の変化を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、１０％以下の臨界溶解張力の変化を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約５％〜約１０％の臨界溶解張力の変化を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１０％〜約１５％の臨界溶解張力の変化を有し得る。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１５％〜約２０％の臨界溶解張力の変化を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１％〜約５％の臨界溶解張力の変化を有する。
【０１２７】
上述したように、臨界面積歪み（Ａｃ）は、臨界溶解張力で酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームによって実現される面積歪みである。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２０％〜約５０％の臨界面積歪みを有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２０％〜約２５％の臨界面積歪みを有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２５％〜約３０％の臨界面積歪みを有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約３０％〜約３５％の臨界面積歪みを有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約３５％〜約４０％の臨界面積歪みを有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約４０％〜約４５％の臨界面積歪みを有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約４５％〜約５０％の臨界面積歪みを有する。
【０１２８】
上述したように、「ミオグロビン負荷容量」は、ミオグロビン（myglobin）ベース酸素担体の測定値であり、担体の総重量によって除された酸素担体内のミオグロビンの重量として定義される。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約５超のミオグロビン負荷容量を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、１０超のミオグロビン負荷容量を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、１５超のミオグロビン負荷容量を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、２０超のミオグロビン負荷容量を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、２５超のミオグロビン負荷容量を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、２６超のミオグロビン負荷容量を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、２７超のミオグロビン負荷容量を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、２８超のミオグロビン負荷容量を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、２９超のミオグロビン負荷容量を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、３０超のミオグロビン負荷容量を有する。
【０１２９】
上述したように、「ミオグロビン負荷効率」は、ミオグロビンベース酸素担体の基本的な測定値であり、被包前の溶液中の元のミオグロビンの重量によって除された担体懸濁液内に被包され、かつ／または組み込まれているミオグロビンの重量として定義される（％として表現される）。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１０％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１１％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１２％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１３％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１４％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１５％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１６％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１７％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１８％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１９％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２０％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２１％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２２％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２３％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２４％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２５％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２６％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２７％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２８％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２９％超のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約３０％超のミオグロビン負荷効率を有する。
【０１３０】
様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１０％〜約３５％のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１５％〜約３５％のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１８％〜約３５％のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２０％〜約３５％のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２２％〜約３５％のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２４％〜約３５％のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２６％〜約３５％のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２８％〜約３５％のミオグロビン負荷効率を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約３０％〜約３５％のミオグロビン負荷効率を有する。
【０１３１】
様々な実施形態では、対象は、哺乳動物であり得る。様々な実施形態では、対象は、非ヒト動物であり得る。様々な実施形態では、対象は、イヌであり得る。様々な実施形態では、対象は、脊椎動物であり得る。
【０１３２】
様々な実施形態は、ポリマーソームなどのナノ粒子中に被包された酸素結合化合物から構成される酸素担体を作製、貯蔵、および投与するための組成物および方法を含む。様々な実施形態では、酸素結合化合物は、ミオグロビンから構成され得る。様々な実施形態では、酸素結合化合物は、ヒトまたは動物ヘモグロビンから構成され得る。様々な実施形態では、酸素結合化合物は、遺伝的または化学的に変更された形態のヒトまたは動物ヘモグロビンから構成され得る。様々な実施形態では、酸素結合化合物は、ヒトミオグロビンのものと同様の酸素親和性（Ｐ５０、協同性係数ｎ）を有するペプチド、タンパク質、または核酸に由来し得る。様々な実施形態では、酸素結合化合物は、ヒトミオグロビンのものと同様の酸素親和性（Ｐ５０、協同性係数ｎ）を有する小分子または金属−キレーター錯体に由来し得る。様々な実施形態では、酸素結合化合物は、ヒトミオグロビンのものと同様の酸素親和性（Ｐ５０、協同性係数ｎ）を有する核酸または多糖に由来し得る。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、酸素結合化合物の混合物から構成され得る。
【０１３３】
様々な実施形態は、ポリマーソームなどのビヒクル中に被包された酸素結合化合物から構成される酸素担体を作製、貯蔵、および投与するための組成物および方法を含む。様々な実施形態では、酸素担体は、ミオグロビンを含み得る。様々な実施形態では、酸素担体は、遺伝的または化学的に変更された形態のヒトまたは動物ヘモグロビンを含み得る。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、酸素結合化合物の混合物を含み得る。
【０１３４】
一部の実施形態は、酸素担体としてのポリマーソーム被包ミオグロビン（ＰＥＭ）を開発するための組成物および方法をさらに含み得る。様々な実施形態では、ＰＥＭは、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ）、およびポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（γ−メチルε−カプロラクトン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬ）の関連ジブロックコポリマーから構成されるポリマーソームを含み得る。ＰＥＯは、ポリマーソームに改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学的安定性、強化されたｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的利用能、および延長された血液循環半減期をもたらし得る。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬはともに、これらのエステル連結の加水分解を介してポリマーソーム膜の完全で安全なｉｎ  ｖｉｖｏ生分解をもたらすことができる。様々な実施形態では、生分解性ポリマーソーム被包ミオグロビン（ＰＥＭ）分散物は、約１．５〜２ｋＤａのＰＥＯブロックサイズ、および約１０〜２０重量％のブロック画分を有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬのジブロックコポリマーから構成され得る。様々な実施形態では、生分解性ポリマーソーム被包ミオグロビン（ＰＥＭ）分散物は、約８ｋＤａ〜２３ｋＤａのＰＣＬブロックサイズ、および約５０〜８５パーセントのブロック重量分率を有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬのジブロックコポリマーから構成され得る。他の実施形態では、ＰＥＭ分散物は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬのジブロックコポリマーから構成され得る。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬポリマーソームは、好適な細胞性ミオグロビンベース酸素担体（ＭＢＯＣ）であり得、調整可能な酸素結合能、均一で適切に小さいサイズ分布、ヒト血液様粘度、および膨張特性、ならびに大量生産の容易さ、および手頃な貯蔵を含めた有効な酸素送達のためのすべての要求される特性を有する。
【０１３５】
一実施形態では、超分子自己組織化手法を使用して、自己の二重層膜内に高量子収率オリゴ（ポルフィリン）ベース近赤外（ＮＩＲ）フルオロフォア（ＮＩＲＦ）を組み込む単分散単層ポリマーソーム（５０〜３００ｎｍの直径）を調製することができる１２４、１３０、１６４〜１６７。これらの明るいＮＩＲ−発光性ポリマーソームは、超高感度ｉｎ  ｖｉｖｏ光学イメージングに要求される光物理的特性および生体適合性を有し得る１１１、１２４、１６４、１６８。担腫瘍マウスのイメージング研究は、非標的化ポリマーソームが、漏出性の腫瘍微小血管系に関連した浸透性および保持の増強（ＥＰＲ）効果に起因して、血管内注射後に腫瘍中に蓄積することができることを示した。定量的蛍光分析は、２倍超大きい腫瘍蓄積が容易に実現されることを示した（図７Ａ）１６４。腫瘍特異的蓄積は、標的化リガンド、例えば、小分子、ペプチド、タンパク質（例えば、抗体）、および核酸などへの化学的コンジュゲーションによりポリマーソーム表面を修飾することによってさらに増強され得る１１１、１２７、１６４。
【０１３６】
一部の実施形態は、以下の標準的な特性を常に満たすＰＥＭ分散物を合成するための操作方法を含む：（ｉ）１．１未満の多分散指数を有する１００〜２００ｎｍの間の平均半径；（ｉｉ）５０ｍｏｌ％超のＭｂ被包効率；（ｉｉｉ）２超の被包Ｍｂ：ポリマーの重量比；（ｉｖ）５％未満の溶液メトＭｂレベル；（ｖ）３〜４ｃＰの間の懸濁液粘度；（ｖｉ）２〜３ｍｍＨｇの間のＰ５０；ならびに（ｖｉｉ）同様のウェイトパーボリュームの分布での遊離Ｍｂについて測定したものと少なくとも１桁小さいＮＯ結合速度定数；（ｖｉｉｉ）Ｍｂ  ８０〜１８０ｍｇ／溶液１ｍＬの間の最終懸濁液濃度；ならびに（ｉｘ）インタクトな形態、５ｎｍ未満の平均粒径の変化、および変更されないＭｂ濃度（０．５ｇ／ｄＬ未満の変化）、および変化しないメトＭｂレベル（２％未満の変化）によって判定した場合の異なる貯蔵および流量条件下での優れた安定性。
【０１３７】
様々な実施形態のＰＥＭは、これらの粒径、変形能、および濃度の組合せが異なり得る。これらのパラメーターのそれぞれは、１粒子当たりのＭｂの量、粒子安定性、および腫瘍部位で蓄積する粒子の数に独立に影響し得る。平均粒径が１００ｎｍまたは２００ｎｍであるＰＥＭを形成することができる。ポリマーソームは、直径２５０ｎｍ未満である他のナノ粒子のように、ＥＰＲ効果に起因して固形腫瘍中に累加し得る１１１、１１４、１６４。２００ｎｍの平均粒径を有するポリマーソームは、１粒子当たりにより多くのＭｂを送達することができるが、直径約１００ｎｍであるものは、より長い血液循環半減期を示すことができ（ＲＥＳによる最終クリアランスの前）１０２、１１１、１１４、１３６、１７２、血漿チャネルを横行することによって腫瘍蓄積の増強を実証することができる１７３（ＲＢＣを除外する小微小血管）。
【０１３８】
一実施形態のＰＥＭを、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍送達を最大にし得る粒子安定性対変形能の究極のバランスを判定するために、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（γ−メチルε−カプロラクトン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬ）、および／またはポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（トリメチルカーボネート）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣ）ジブロックコポリマーから構築することができる。ＰＭＣＬは、ＰＣＬの誘導体として、エステル連結の非酵素的加水分解を介して分解する完全に生体吸収性のポリマーソームを同様に形成する１７４。しかし、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬは、超安定な固体ベシクル膜を生じ得る一方、ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＴＭＣは、より変形しやすいポリマーソーム、蛇行状の腫瘍血管を通るＰＥＭ通過に役立ち得る特性を生じさせ得る。
【０１３９】
様々な実施形態は、ポリマーソームナノ粒子、または様々なサイズを有する他の酸素担体を含み得る。様々な実施形態では、ポリマーソームまたは酸素担体は、おおよそ球形を伴い、約５０ｎｍ〜約１μｍの直径を有する。様々な実施形態では、ポリマーソームまたは酸素担体は、約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍの直径を有する。様々な実施形態では、ポリマーソームまたは酸素担体は、約１００ｎｍ〜約２００ｎｍの直径を有する。様々な実施形態では、ポリマーソームまたは酸素担体は、約２００ｎｍ〜約３００ｎｍの直径を有する。様々な実施形態では、ポリマーソームまたは酸素担体は、約３００ｎｍ〜約４００ｎｍの直径を有する。様々な実施形態では、ポリマーソームまたは酸素担体は、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍの直径を有する。様々な実施形態では、ポリマーソームまたは酸素担体は、約５００ｎｍ〜約６００ｎｍの直径を有する。様々な実施形態では、ポリマーソームまたは酸素担体は、約６００ｎｍ〜約７００ｎｍの直径を有する。様々な実施形態では、ポリマーソームまたは酸素担体は、約７００ｎｍ〜約８００ｎｍの直径を有する。様々な実施形態では、ポリマーソームまたは酸素担体は、約８００ｎｍ〜約９００ｎｍの直径を有する。様々な実施形態では、ポリマーソームまたは酸素担体は、約９００ｎｍ〜約１μｍの直径を有する。
【０１４０】
様々な実施形態では、酸素担体は、約５ｎｍ〜約１００ｎｍの直径を有するナノ粒子からなる。様々な実施形態では、酸素担体は、約５ｎｍ〜約１０ｎｍの直径を有する。様々な実施形態では、酸素担体は、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの直径を有する。様々な実施形態では、酸素担体は、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍの直径を有する。様々な実施形態では、酸素担体は、約１００ｎｍ〜約３００ｎｍの直径を有する。様々な実施形態では、酸素担体は、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍの直径を有する。様々な実施形態では、酸素担体は、約５００ｎｍ〜約１μｍの直径を有する。
【０１４１】
さらなる実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、様々な膜厚を含み得る。膜の厚さは、酸素担体またはポリマーソームの調製に使用されるポリマーの分子量およびポリマーのタイプに依存し得る。様々な実施形態では、膜は、単一、二重、三重、四重、またはそれ超の層のポリマーであり得る。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約５ｎｍ〜約３５ｎｍのポリマー膜厚を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約５ｎｍ〜約１０ｎｍの膜厚を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１０ｎｍ〜約１５ｎｍの膜厚を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約１５ｎｍ〜約２０ｎｍの膜厚を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２０ｎｍ〜約２５ｎｍの膜厚を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約２５ｎｍ〜約３０ｎｍの膜厚を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、約３０ｎｍ〜約３５ｎｍの膜厚を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、厚さが約５ｎｍ以下であるポリマー膜を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、厚さが約１０ｎｍ以下であるポリマー膜を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、厚さが約１５ｎｍ以下であるポリマー膜を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、厚さが約２０ｎｍ以下であるポリマー膜を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、厚さが約２５ｎｍ以下であるポリマー膜を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、厚さが約３０ｎｍ以下であるポリマー膜を有する。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、厚さが約３５ｎｍ以下であるポリマー膜を有する。
【０１４２】
図９は、ＭＢＯＣの調製および送達のための方法９００を例示する。ステップ９０２では、ミオグロビンベース酸素担体（ＭＢＯＣ）が水溶液中で自己組織化される。ステップ９０４では、ミオグロビンベース酸素担体が、化学修飾を介して安定化される。ステップ９０６では、得られた構築物が凍結乾燥される。ステップ９０８では、得られた構築物が乾相貯蔵を介して貯蔵される。ステップ９１０では、ポイントオブケア溶液再水和。ステップ９１２では、その元のミオグロビンを保持する生分解性ＭＢＯＣがｉｎ  ｖｉｖｏで送達される。非限定的な例として、ポリマーソーム被包Ｍｂは、このようなＭＢＯＣ調製法を介して調製および生成され得る。ステップ９１４では、例えば、ＭＢＯＣおよび／または高酸素親和性剤を患者に投与し、イオン化放射線を腫瘍に投与することによって、処置を施すことができる。
【０１４３】
図１０は、少なくとも１種の生体適合性ポリマーおよび少なくとも１種の生分解性ポリマーを含むポリマーソームを調製するための方法１０００を例示する。図１０は、方法ステップの高レベル全体像を提供し、各ステップの詳細は、以下でさらに提供されていることに留意されるべきである。ステップ１００２では、複数のポリマーを有する有機溶液を調製することができる。ステップ１００４では、複数のポリマーを含む有機溶媒を、プラスチック、ポリテトラフルオロエチレン（すなわち、Ｔｅｆｌｏｎ（商標））（本明細書で「ＰＴＦＥ」）、またはガラス表面に曝露することができる。ステップ１００６では、有機溶液をプラスチック、ＰＴＦＥ、またはガラス表面上で脱水してポリマーのフィルムを作製することができる。ステップ１００８では、ポリマーのフィルムを水溶液中に再水和することができる。ステップ１０１０では、ポリマーを、化学修飾を介して水溶液中で架橋することができる。
【０１４４】
様々な実施形態のＰＥＭのポリマーソームは、親水性または疎水性ブロック内に重合性基を含むように合成されるコポリマーを含み得る。重合性生分解性ポリマーを利用して、自己の水性の内部にＭｂおよび水溶性開始剤を共組込みするポリマーソームを、または代わりに自己の水性空洞にＭｂ、および自己の疎水性膜に水不溶性開始剤を区分化することによってポリマーソームを形成することができる。
【０１４５】
様々な実施形態は、少なくとも１種の生体適合性ポリマーおよび少なくとも１種の生分解性ポリマーを含むポリマーソームを調製するための方法であって、（ａ）複数のポリマーを含む有機溶媒を調製し、複数のポリマーを含む有機溶媒をプラスチック、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）（別名Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））、またはガラス表面に曝露することと；（ｂ）プラスチック、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、またはガラス表面上の有機溶媒を脱水してポリマーのフィルムを作製することと；（ｃ）ポリマーのフィルムを水溶液中で再水和することと；（ｄ）化学修飾を介して水溶液中でポリマーを架橋することを含む、方法をさらに含み得る。
【０１４６】
様々な実施形態の組成物は、その内容全体が参照により組み込まれているO’Neilら、Langmuir、２００９年、２５巻（１６号）、９０２５〜９０２９頁に記載されている直接水和法によって作製することができる。簡単に言えば、様々な実施形態のポリマーソームを以下の方法を使用して作製および被包することができる：製剤を調製するために、合計２０ｍｇのポリマーを秤量して、１．５ｍＬの遠心管に入れ、９５℃で２０分間加熱し、混合することができる。試料を室温に冷却した後（最低１５分）、タンパク質溶液１０μＬを添加し、各添加後に混合しながら、ｐＨ７．４の１０ｍｍｏｌリン酸緩衝液（ＰＢＳ）２０、７０、９００μＬで希釈することができる。対照として、ポリマーソームを、ＰＢＳ（各添加後に混合しながらＰＢＳ１０、２０、７０、８９０μＬ）で希釈して形成し、最後にポリマーソームの形成後にタンパク質溶液１０μＬを添加することができる。このように、被包効率および装填量を、減算によって計算することができる。すべての試料を三連で準備した。被包効率は、調査下の最適なポリマーに蛍光標識し、架橋して生成した検量線から定量化することができる。
【０１４７】
さらなる実施形態では、方法、ポリマーソーム調製は、ベシクル粒子の大規模分画を伴い得る。簡単に言えば、ジブロックコポリマー合計１．２５ｇを、ｐＨ７．３の１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ＰＢ）２５ｍＬで再水和することができる。ＰＢ中でのジブロックコポリマーの溶解性が低いので、水性ポリマー混合物を室温で８〜１０時間超音波処理して（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ４５０、ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）、原料コポリマー溶液を得ることができる。次いで原料コポリマー溶液を精製Ｍｂ（２５０〜３００ｇ／Ｌ）２５ｍＬと混合して、Ｍｂコポリマー混合物中１２．５ｍｇ／ｍＬのコポリマー濃度を得ることができる。空のポリマーソームを、精製Ｍｂ溶液の代わりにＰＢで原料コポリマー溶液を希釈することによって調製して１２．５ｍｇ／ｍＬのコポリマー濃度を得てもよい。体積１ｍＬの手動押出法について、Ｍｂ−コポリマー／コポリマー混合物を、直径１００ｎｍまたは２００ｎｍのポリカーボネート膜（Ａｖａｎｔｉ  ＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）に通して２０回押出することができる。しかし、大規模中空糸（ＨＦ）押出法（図４および５）について、Ｍｂ−コポリマー／コポリマー混合物を、０．２μｍのＨＦ膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）に通して押出することができる。両押出法について、押出したＰＥＭ分散物を、１：１０００の体積／体積（ｖ／ｖ）（押出ＰＥＭ／ＰＢ）比で、４℃にてＰＢ中で３００ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）透析バッグ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）を使用して一晩透析して、ベシクル分散物から被包されていないＭｂを除去することができる。１８アングルＤａｗｎ  Ｈｅｌｅｏｓマルチアングル静的光散乱測光器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）に直列にカップリングしたＥｃｌｉｐｓｅ非対称フローフィールドフロー分留装置（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用して、空のポリマーソームおよびＰＥＭ粒子のサイズ分布を測定することができる。光散乱測光器は、６５８ｎｍのレーザー波長で作動する３０ｍＷ  ＧａＡｓレーザーが備わっている。光散乱スペクトルを、ＡＳＴＲＡソフトウェアパッケージ（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用して分析して、粒径分布を計算することができる。溶出緩衝液は、ｐＨ７．３の１０ｍＭ  ＰＢからなっていた。
【０１４８】
直径範囲が上記に与えられているが、ポリマーソームが押出されるポリカーボネート膜の最終直径が、その懸濁液中のポリマーソームの究極のサイズ分布（直径）を画定することになることに留意されるべきである。
【０１４９】
ＰＥＭ中のＭｂ被包：ＰＥＭ粒子内部に被包されたＭｂの量を測定するために、透析したＰＥＭ分散物を、ＰＢ中の０．５％ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して最初に溶解させた。溶解したＰＥＭ試料を１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を分析のために収集することができる。ＰＥＭ粒子を溶解させた後に得られる被包Ｍｂの濃度（ｍｇ／ｍＬ）を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によりＢｒａｄｆｏｒｄ法を使用して測定することができる。
【０１５０】
開始剤によって助長された重合性基の２つまたはそれ超の反応の結果として、安定化されたＰＥＭ分散物を、ポリマーソーム膜を形成するコポリマーの鎖同士間の共有結合の形成を介して生成することができる。これらの安定化されたＰＥＭ構築物を、形成されたポリマーソーム構造を破壊し、または被包されたＭｂを喪失することなく十分確立した凍結乾燥プロトコールを介してさらに乾燥させることができる。様々な実施形態では、ポリマーソームは、水溶液で投与される。凍結乾燥されている場合、様々な実施形態では、ポリマーソームは、適切な水溶液で再構成され、対象に投与される。凍結乾燥した生分解性ＰＥＭは、ポリマーまたはＭｂの分解を伴うことなく様々な期間にわたって４℃でデシケーター（Ｏ２を含まない）中に貯蔵することができ、その理由は、乾燥した懸濁液は、無水フリーラジカル、プロトンなどを含まないためである。ポリマーソームは、送達する前にポイントオブケアで再水和することができる。
【０１５１】
安定化されたポリマーソームを生成するために、重合性単位を、合成後にコポリマーの親水性または疎水性末端に化学的に連結してもよい。マルチブロックコポリマー鎖同士間の１つまたは複数の架橋を、様々な実施形態の重合性単位と親水性または疎水性ポリマーとの間で形成することができる。これらの架橋は、複数の重合性基を有する組成物をマルチブロックコポリマーの鎖に導入することによって適切に形成され得るが、様々な場合では、マルチブロックコポリマー自体が複数の重合性基を含む。様々な実施形態では、複数の重合性基は、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、ビニル、ビニルスルホン単位、またはこれらの組合せから選択される。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、組成物の総重量の約０重量（ｗｔ）％〜約５ｗｔ％の重合性基を含む。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、組成物の総重量の約５ｗｔ％〜約１０ｗｔ％の重合性基を含む。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、組成物の総重量の約１０ｗｔ％〜約２０ｗｔ％の重合性基を含む。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、組成物の総重量の約２０ｗｔ％〜約３０ｗｔ％の重合性基を含む。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、組成物の総重量の約３０ｗｔ％〜約４０ｗｔ％の重合性基を含む。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、組成物の総重量の約４０ｗｔ％〜約５０ｗｔ％の重合性基を含む。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、組成物の総重量の約５０ｗｔ％〜約６０ｗｔ％の重合性基を含む。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、組成物の総重量の約６０ｗｔ％〜約７０ｗｔ％の重合性基を含む。様々な実施形態では、酸素担体またはポリマーソームは、組成物の総重量の約７０ｗｔ％〜最大で約８０ｗｔ％の重合性基を含む。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子および／またはポリマーソームは、組成物の総重量の約８０ｗｔ％〜最大で約９０ｗｔ％の重合性基を含む。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子および／またはポリマーソームは、組成物の総重量の約９０ｗｔ％〜最大で約９５ｗｔ％の重合性基を含む。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子および／またはポリマーソームは、組成物の総重量の約９５ｗｔ％〜最大で約１００ｗｔ％の重合性基を含む。膜の鎖同士間の架橋は、開始剤による重合反応の活性化を介して実現され、ポリマーソーム組成物の剛性の増強をもたらす。ある特定の実施形態では、重合性基は、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（アクリル酸）などのいずれかからなるコポリマーの親水性ブロックにコンジュゲートされてもよい。他の実施形態では、重合性基は、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（γ−メチルε−カプロラクトン）、ポリ（トリメチルカーボネート）、ポリ（メンチド（menthide））、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（メチルグリコリド）、ポリ（ジ���チルシロキサン）、ポリ（イソブチレン）、ポリ（スチレン）、ポリ（エチレン）、ポリ（プロピレンオキシド）などのいずれかからなるコポリマーの疎水性ブロックにコンジュゲートされてもよい。開始剤は、熱、光、ｐＨ、溶液イオン強度、オスモル濃度、圧力などを生じさせ／それと反応する分子であり得る。様々な実施形態では、開始剤は、光反応性であり得、紫外光への曝露を介して酸素担体またはポリマーソームのポリマーを架橋することができる。
【０１５２】
様々な実施形態の組成物は、有機溶媒を使用することなく調製することができる。様々な実施形態の組成物は、疎水性ブロック末端においてアクリレート部分で修飾されたポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（γ−メチルε−カプロラクトン）、および／またはポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（トリメチルカーボネート）コポリマーを含むポリマーソームを含み得る。様々な実施形態では、酸素担体、ナノ粒子、および／またはポリマーソームは、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）などのＵＶ開始剤を使用して疎水性ブロック末端とジアクリレートとの間に形成された架橋ポリマーを含み得る。様々な実施形態では、ＤＭＰＡは、ポリマーソームアセンブリーの間にポリマーソーム中で区切られ、一方、Ｍｂは、担体の内部水性コンパートメントを占有する。
【０１５３】
様々な実施形態の組成物は、分解半減期が増大したポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体も含み得る。酸素担体およびポリマーソームの循環時間は、肝臓および脾臓の単核食作用系（ＭＰＳ）、または排泄による急速なクリアランスのために数時間（または最大で１日）に一般に制限され得る。臨床研究により、球状担体の循環時間は、一般に、ラットに対してヒトにおいて３倍延長され得ることが示された。ＰＥＧ−リポソームの臨床的に使用されている薬物製剤について提案されているように、長い循環寿命を有する酸素担体およびポリマーソームは、がん細胞、低酸素化組織、または回復期創傷への薬物曝露を増大させ、それによって一般に「曲線下面積」と薬物送達において呼ばれる時間積分用量を増大させることができる。さらに、小さい溶質およびミセルが急速にエクスパンドしている腫瘍の漏出性血管に浸透することを可能にする浸透および保持の増強効果は、酸素担体およびポリマーソームを腫瘍間質内に輸送することも可能にし得る。酸素担体およびポリマーソームの持続性の循環は、多くの実用的応用を有し、その理由は、これらのビヒクルは、がん細胞、低いもしくは乏しい酸素化された組織、または回復期創傷への薬物の曝露を増大させることができるためである。
【０１５４】
様々な実施形態の組成物は、循環半減期が増大したポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含み得る。様々な実施形態では、組成物は、約１２時間〜約３６時間の循環半減期、および約３８〜約６０時間の分解半減期を有するように設計されたある特定のパーセント質量組成のポリマーを有する。
【０１５５】
様々な実施形態では、組成物は、酸素担体またはポリマーソームの分解半減期より約１２時間少ない循環半減期を有するように設計されたある特定のパーセント質量組成のポリマーを有する。分解のこの遅延は、投与経路および／または標的化される微小区画、酸素担体もしくはポリマーソームのサイズ、またはポリマーソームもしくは酸素担体が本明細書に開示の疾患状態もしくは障害を処置もしくは防止するためにその内容物を展開する細胞下微小環境に応じて変動し得る。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、酸素担体またはポリマーソームの分解半減期より約１１時間少ない循環半減期を有する。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、酸素担体またはポリマーソームの分解半減期より約１０時間少ない循環半減期を有する。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、酸素担体またはポリマーソームの分解半減期より約９時間少ない循環半減期を有する。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、酸素担体またはポリマーソームの分解半減期より約８時間少ない循環半減期を有する。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、酸素担体またはポリマーソームの分解半減期より約７時間少ない循環半減期を有する。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、酸素担体またはポリマーソームの分解半減期より約６時間少ない循環半減期を有する。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、酸素担体またはポリマーソームの分解半減期より約５時間少ない循環半減期を有する。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、酸素担体またはポリマーソームの分解半減期より約４時間少ない循環半減期を有する。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、酸素担体またはポリマーソームの分解半減期より約３時間少ない循環半減期を有する。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、酸素担体またはポリマーソームの分解半減期より約２時間少ない循環半減期を有する。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、酸素担体またはポリマーソームの分解半減期より約１時間少ない循環半減期を有する。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、酸素担体またはポリマーソームの分解半減期より約１４時間少ない循環半減期を有する。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、酸素担体またはポリマーソームの分解半減期より約１時間〜約２０時間少ない循環半減期を有する。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、約３６時間の循環半減期、および約４８時間超の分解半減期を有するように設計されたある特定のパーセント質量組成のポリマーを有する。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、約２４時間〜約３６時間の循環半減期、および約３８〜約６０時間の分解半減期を有するように設計されたある特定のパーセント質量組成のポリマーを有する。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、約２８時間〜約３６時間の循環半減期、および約３８〜約６０時間の分解半減期を有するように設計されたある特定のパーセント質量組成のポリマーを有する。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、約３０時間〜約３６時間の循環半減期、および約３８〜約６０時間の分解半減期を有するように設計されたある特定のパーセント質量組成のポリマーを有する。様々な実施形態では、ポリマーソーム、ナノ粒子、または酸素担体を含む組成物は、約３６時間以下の循環半減期、および約３８〜約６０時間の分解半減期を有するように設計されたある特定のパーセント質量組成のポリマーを有する。
【０１５６】
様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より６時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より６時間から２４時間の間で長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より２４時間超長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約６時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約７時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約８時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約９時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約１０時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約１１時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約１２時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約１３時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約１４時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約１５時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約１６時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約１７時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約１８時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約１９時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約２０時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約２１時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約２２時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約２３時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約２４時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約３６時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約４８時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約６０時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より約７２時間長い。様々な実施形態では、分解半減期は、循環半減期より９６時間超長い。
【０１５７】
様々な実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達は、静脈内、吸入、経粘膜（例えば、頬側）、または経皮的投与経路によって実現される。所与の宿主の投与量は、例えば、対象標本の示差的活性の慣例的な比較、および公知の適切な、慣例的な薬理学的プロトコールによって慣例的な考察を使用して判定することができる。
【０１５８】
一実施形態では、酸素化の改善および腫瘍低酸素の緩和に対するＭｂ用量の効果を試験するために、異なる最終濃度のＰＥＭを使用することができる。Ｍｂ  ９０または１８０ｍｇ／ｍＬを含有するＰＥＭ  １００μＬを注射すると２０ｇのマウスを仮定してそれぞれ４５０または９００ｍｇ／ｋｇの注射用量のＭｂがもたらされ得る。これらの用量は、１５ｇ／ｄＬの血中濃度、血液４５０ｍＬ／ユニット、および７０ｋｇのヒトを仮定して、全血０．５および１ユニット中に見つかる総ヘモグロビン注射用量に対応する。より大きいＰＥＭ用量は、Ｍｂ腫瘍送達を増強する可能性が高くなり得るが、遊離Ｍｂ（ＰＥＭ分解中に放出される）の量の増大は、局所的なＮＯ取込み、微小灌流の低下、および効果的でない酸素化ももたらし得る１７５。好適な実施形態では、関連したポリマー濃度および対象の注射用量は、１０〜３５の間の範囲の被包Ｍｂ：ポリマーの最終重量比を仮定して、２．５〜１８ｍｇ／ｍＬおよび１２．５〜９０ｍｇ／ｋｇの間の範囲となり得、これらはともに、様々なポリマーソーム組成物からの亜急性または急性ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性を実証しなかった以前の動物研究の範囲内に十分入る１１１、１２２、１６４、１６８、１７１。
【０１５９】
様々な実施形態の医薬組成物は、酸素結合剤と不活性ビヒクルの異なる「装填量比」を有する酸素担体であり得る。様々な実施形態では、医薬組成物は、酸素結合剤５ｍｇ未満／不活性ビヒクル１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、酸素結合剤約５〜約４０ｍｇ／不活性ビヒクル１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、酸素結合剤約１０〜約４０ｍｇ／ポリマー不活性ビヒクル１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、酸素結合剤約２０〜約４０ｍｇ／不活性ビヒクル１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、酸素結合剤約３０〜約４０ｍｇ／不活性ビヒクル１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、酸素結合剤約３５〜約４０ｍｇ／不活性ビヒクル１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、酸素結合剤約２５〜約４０ｍｇ／不活性ビヒクル１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、酸素結合剤約２５〜約３５ｍｇ／不活性ビヒクル１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、酸素結合剤約２５〜約３０ｍｇ／不活性ビヒクル１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、酸素結合剤約２０〜約２５ｍｇ／不活性ビヒクル１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、酸素結合剤約１０〜約１５ｍｇ／不活性ビヒクル１ｍｇを含む。
【０１６０】
様々な実施形態では、医薬組成物は、Ｍｂ約５〜約３５ｍｇ／ポリマー１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、Ｍｂ約１０〜約３５ｍｇ／ポリマー１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、Ｍｂ約２０〜約３５ｍｇ／ポリマー１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、Ｍｂ約３０〜約３５ｍｇ／ポリマー１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、Ｍｂ約２５〜約３５ｍｇ／ポリマー１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、Ｍｂ約２５〜約３０ｍｇ／ポリマー１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、Ｍｂ約２０〜約２５ｍｇ／ポリマー１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、Ｍｂ約１０〜約１５ｍｇ／ポリマー１ｍｇを含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、Ｍｂ約５〜約１０ｍｇ／ポリマー１ｍｇを含む。様々な実施形態では、Ｍｂ投与量は、同じ重量のＭｂによって置き換えられてもよい。
【０１６１】
様々な実施形態では、医薬組成物は、液体製剤であり、投与量は、組成物約１ユニット〜酸素担体懸濁液約５０ユニットであり得、懸濁液のユニットは、Ｍｂ約４０ｇ〜Ｍｂ約８５ｇを含む。
【０１６２】
一実施形態では、高酸素親和性剤／化合物は、２５ｍｍＨｇ未満である酸素のＰ５０を有する。一実施形態では、高酸素親和性剤／化合物は、２０ｍｍＨｇ未満である酸素のＰ５０を有する。一実施形態では、高酸素親和性剤／化合物は、１５ｍｍＨｇ未満である酸素のＰ５０を有する。一実施形態では、高酸素親和性剤／化合物は、１０ｍｍＨｇ未満である酸素のＰ５０を有する。一実施形態では、高酸素親和性剤／化合物は、５ｍｍＨｇ未満である酸素のＰ５０を有する。
【０１６３】
様々な実施形態では、医薬組成物を含む液体製剤のユニットは、Ｍｂ約４１グラムを含む。様々な実施形態では、医薬組成物を含む液体製剤のユニットは、Ｍｂ約４５グラムを含む。様々な実施形態では、医薬組成物を含む液体製剤のユニットは、Ｍｂ約５０グラムを含む。様々な実施形態では、医薬組成物を含む液体製剤のユニットは、Ｍｂ約５５グラムを含む。様々な実施形態では、医薬組成物を含む液体製剤のユニットは、Ｍｂ約６０グラムを含む。様々な実施形態では、医薬組成物を含む液体製剤のユニットは、Ｍｂ約６５グラムを含む。様々な実施形態では、医薬組成物を含む液体製剤のユニットは、Ｍｇ約７０グラムを含む。様々な実施形態では、医薬組成物を含む液体製剤のユニットは、Ｍｂ約７５グラムを含む。様々な実施形態では、医薬組成物を含む液体製剤のユニットは、Ｍｂ約８０グラムを含む。様々な実施形態では、医薬組成物を含む液体製剤のユニットは、Ｍｂ約８５グラムを含む。
【０１６４】
一般に、様々な実施形態による医薬組成物は、溶液内に懸濁され、ユニットで投与される一用量の酸素結合タンパク質を含み得、ユニットは、酸素結合タンパク質８１グラムに等しい。対象が手術を受け、または失血を経験する場合、医薬組成物は、以下の投薬レジメンに従って対象に投与することができ、血液は、液体製剤のユニットで置き換えられる。様々な実施形態では、医薬組成物は、酸素結合タンパク質約４０ｇ／投与される溶液１ユニット〜酸素結合タンパク質約８１ｇ／投与される溶液１ユニットを含む。
【表１−１】
0006764864.tif 000040
【表１−２】
0006764864.tif 000041
【０１６５】
様々な実施形態では、医薬組成物は、Ｍｂ約４０ｇ／投与される溶液１ユニット〜Ｍｂ約８０ｇ／投与される溶液１ユニットの用量を含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、Ｍｂ約５０ｇ／投与される溶液１ユニット〜Ｍｂ約８０ｇ／投与される溶液１ユニットの用量を含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、Ｍｂ約６０ｇ／投与される溶液１ユニット〜Ｍｂ約８０ｇ／投与される溶液１ユニットの用量を含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、Ｍｂ約７０ｇ／投与される溶液１ユニット〜Ｍｂ約８０ｇ／投与される溶液１ユニットの用量を含む。様々な実施形態では、医薬組成物は、Ｍｂ約６０ｇ／投与される溶液１ユニット〜Ｍｂ約７０ｇ／投与される溶液１ユニットの用量を含む。
【０１６６】
様々な実施形態の医薬組成物の用量は、対象１ｋｇ当たりに投与されるポリマーソームのグラムで測定されてもよい。様々な実施形態では、投与される全用量は、対象１ｋｇ当たりポリマー約１２．５ｍｇ〜ポリマー約９０ｍｇを含む。様々な実施形態では、投与される全用量は、対象１ｋｇ当たりポリマー約１５ｍｇ〜ポリマー約９０ｍｇを含む。様々な実施形態では、投与される全用量は、対象１ｋｇ当たりポリマー約２５ｍｇ〜ポリマー約９０ｍｇを含む。様々な実施形態では、投与される全用量は、対象１ｋｇ当たりポリマー約３５ｍｇ〜ポリマー約９０ｍｇを含む。様々な実施形態では、投与される全用量は、対象１ｋｇ当たりポリマー約４５ｍｇ〜ポリマー約９０ｍｇを含む。様々な実施形態では、投与される全用量は、対象１ｋｇ当たりポリマー約５５ｍｇ〜ポリマー約９０ｍｇを含む。様々な実施形態では、投与される全用量は、対象１ｋｇ当たりポリマー約６５ｍｇ〜ポリマー約９０ｍｇを含む。様々な実施形態では、投与される全用量は、対象１ｋｇ当たりポリマー約７５ｍｇ〜ポリマー約９０ｍｇを含む。様々な実施形態では、投与される全用量は、対象１ｋｇ当たりポリマー約８０ｍｇ〜ポリマー約９０ｍｇを含む。様々な実施形態では、投与される全用量は、対象１ｋｇ当たりポリマー約８５ｍｇ〜ポリマー約９０ｍｇを含む。
【０１６７】
様々な実施形態では、医薬組成物は、２，３−ビスホスホグリセレートなどのアロステリックエフェクターを含む液体製剤であり、製剤は、約１〜約１００ｍｍｏｌ／製剤１Ｌを含む。様々な実施形態では、製剤は、製剤１Ｌ当たり約１〜約１００ｍｍｏｌの２，３−ビスホスホグリセレートの異性体を含む。様々な実施形態では、製剤は、製剤１Ｌ当たり約１〜約１０ｍｍｏｌの２，３−ビスホスホグリセレートの異性体を含む。様々な実施形態では、製剤は、製剤１Ｌ当たり約５ｍｍｏｌの２，３−ビスホスホグリセレートまたはそれに由来する異性体を含む。様々な実施形態では、製剤は、製剤１ユニット（４５０ｍＬ）当たり約２．２５ｍｍｏｌの２，３−ビスホスホグリセレートまたはそれに由来する異性体を含む。
【０１６８】
医薬組成物は、滅菌した、注射可能な、水性の、または油性の懸濁液または溶液の形態で調製、梱包、または販売することができる。この懸濁液または溶液は、公知の技術に従って製剤化することができ、活性成分に加えて、追加の成分、例えば、本明細書に記載の分散剤、湿潤剤、または懸濁剤などを含み得る。このような滅菌した注射製剤は、無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒、例えば、水または１，３ブタンジオールなどを使用して調製することができる。他の許容される希釈剤および溶媒としては、それだけに限らないが、リンガー液、等張性塩化ナトリウム溶液、および合成モノまたはジグリセリドなどの固定油がある。有用である他の非経口投与可能製剤としては、微結晶性形態で、リポソーム調製物で、または生分解性ポリマーシステムのコンポーネントとして活性成分を含むものがある。持続放出またはインプランテーションのための組成物は、薬学的に許容されるポリマーまたは疎水性材料、例えば、エマルジョン、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、または難溶性塩などを含み得る。本明細書に記載の製剤は、肺送達および呼吸器系または肺のがんの処置にも有用であり、様々な実施形態の医薬組成物の鼻腔内送達にも有用である。鼻腔内投与に適したこのような製剤は、活性成分を含み、約０．２〜５００マイクロメートルの平均粒子を有する粗い粉末であり、鼻孔付近に保持された粉末の容器からの鼻腔を通る急速吸入によって投与される。
【０１６９】
様々な実施形態の医薬組成物は、約０．１ｇ／ｋｇ／日〜約１００ｇ／ｋｇ／日の用量を送達するように投与することができ、グラム測定値は、医薬組成物中のＭｂおよびポリマーの総重量に等しい。様々な実施形態では、投与量は、約０．１〜１ｇ／ｋｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、約０．５ｇ／ｋｇ／日〜約１．０ｇ／ｋｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、約１．０ｇ／ｋｇ／日〜約１．５ｇ／ｋｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、約１．５ｇ／ｋｇ／日〜約２．０ｇ／ｋｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、約２．５ｇ／ｋｇ／日〜約３．０ｇ／ｋｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、１．０、２．０、５．０、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｇ／ｋｇ／日であり、グラム測定値は、医薬組成物中のＭｂおよびポリマーの総重量に等しい。一実施形態では、一用量の投与は、ｉｎ  ｖｉｖｏで分析されるとき、哺乳動物の病変もしくはがん患部組織、または腫瘍中で１μＭから１０μＭの間で、薬物、タンパク質、活性剤などの治療上有効な濃度をもたらし得る。
【０１７０】
一実施形態では、医薬組成物、特に予防目的で使用されるものは、さらに、薬学的に許容されるアジュバント、充填剤などをさらに含むことができる。適当な薬学的に許容される担体は、当技術分野で周知である。典型的な担体の例としては、生理食塩水、緩衝食塩水、および他の塩、脂質、および界面活性剤がある。酸素担体またはポリマーソームは、凍結乾燥され、粉末の形態で投与されてもよい。本明細書に開示の任意のタンパク質コンポーネントを変性させない適切な対策を取って、調製物を、本明細書に論じた酸素担体またはポリマーソームと有害に反応しない助剤、例えば、滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液などを用いて安定化し、必要に応じてそれと混合することができる。これらはまた、望まれる場合、他の生物学的活性剤、例えば、アンチセンスＤＮＡまたはｍＲＮＡと組み合わせることができる。
【０１７１】
様々な実施形態の医薬組成物は、バルクで、単一単位用量として、または複数の単一単位用量として調製、梱包、または販売することができる。活性成分の量は一般に、当技術分野で公知であるはずであるように、対象に投与される活性成分の投与量、またはこのような投与量の好都合な画分、例えば、このような投与量の２分の１または３分の１に等しい。
【０１７２】
様々な実施形態の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体、および任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の素性、サイズ、および状態に応じて、さらに、組成物が投与される経路に応じて変動し得る。例として、組成物は、約０．１％〜約１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【０１７３】
本明細書に記載の組成物および方法は、がん、または貧血を含むが、必ずしもそれに限らない任意の血液障害を防止または処置するのに有用であり得、血液障害は、対象における組織の低いまたは乏しい酸素化を引き起こす。様々な実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、放射線療法と併せてがんの処置において使用され得る。
【０１７４】
本明細書に記載の組成物および方法は、それだけに限らないが、乳がん、肉腫および他の新生物、膀胱がん、大腸がん、肺がん、膵がん、胃がん、子宮頸がん、卵巣がん、脳腫瘍、様々な白血病およびリンパ腫を含めたいくつかのタイプのがんによって代表される、白血病、リンパ腫、髄膜腫、唾液腺の混合腫瘍、腺腫、癌、腺癌、肉腫、未分化胚細胞腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、メラノーマ、および皮腫を含めたがんの汎発を防止し、またはがんの化学療法および／もしくは放射線量を改善するのに有用であり得る。機能的ｐ５３の発現にかかわらず、任意の他のヒト腫瘍細胞が本明細書に論じた方法による処置または防止の影響を受けることが予期されるが、乳腺細胞および乳腺腫瘍に対して特に強調される。様々な実施形態は、処置の方法であって、治療有効量の薬物、タンパク質、活性剤など、または様々な実施形態によるこれらを含むベクターが、このような処置を必要とする患者に投与され得る、処置の方法も包含し得る。様々な実施形態は、これらの例にもっぱら限定されると解釈されるべきでなく、その理由は、現在のところ未知である他のがん関連疾患は、分かると、様々な実施形態の方法を使用してやはり処置可能であり得るためである。
【０１７５】
様々な実施形態で提供される方法と併せてやはり有用であるのは、別個にまたは組み合わせて、化学療法、光線療法、抗血管新生剤、または照射療法であり得、これらは、ここで論じた処置の増強の前、同時、または後に使用され得るが、細胞が本方法によって感作された後に最も有効に使用されることになる。本明細書では、語句「化学療法剤」は、それだけに限らないが、アドリアマイシン、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン、コルヒチン、タキソール、シスプラチナム、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびメトトレキセートなどの作用物質を含む、腫瘍細胞に選択的に影響する化学療法処置で使用される任意の化学剤または薬物を意味する。他のこのような作用物質も当技術分野で周知である。
【０１７６】
様々な実施形態は、それを必要とする対象における創傷治癒を刺激するための方法であって、様々な実施形態の酸素担体またはポリマーソームを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を含み得る。一部の実施形態は、哺乳動物における疾患、疾病、または状態を処置または防止するための方法を含み得る。様々な実施形態では、様々な実施形態の組成物は、イヌの貧血に使用される場合がある。様々な実施形態では、様々な実施形態の組成物は、鉄欠乏症と関連した症状を処置または防止するのに有用であり得る。一部の実施形態は、高血圧に感受性の、それの徴候を示す、またはそれを発生させるリスクが上昇している患者における組織の血液障害または低酸素化を処置するための方法を提供することができる。
【０１７７】
様々な実施形態は、酸素担体またはポリマーソームを含む上述の組成物または医薬組成物のいずれかを含むキットであって、酸素担体またはポリマーソームは、少なくとも１種の生体適合性ポリマーおよび少なくとも１種の生分解性ポリマーを含む、キットも含み得る。様々な実施形態によれば、製剤は、キットの一部として供給される場合がある。キットは、酸素担体またはポリマーソームを含む医薬組成物を含み得る。別の実施形態では、キットは、水性再水和混合物とともに凍結乾燥した酸素担体またはポリマーソームを含み得る。別の実施形態では、酸素担体またはポリマーソームは、１つの容器中にあり得、一方、再水和混合物は、第２の容器中にある。再水和混合物は、乾燥形態で供給される場合があり、それに、口、静脈穿刺、注射、または送達の任意の他のモードによる投与の前に、水が添加されて、再水和溶液を形成することができる。様々な実施形態では、キットは、組成物を投与するための運搬具、管類、カテーテル、シリンジ、針、および／または上記のいずれかの組合せなどをさらに含み得る。
【０１７８】
ナノ粒子は、上記に論じたように放射線および化学療法の有効性を増大せるために、腫瘍内ｐＯ２を増大させるのに使用することができるが、一部の実施形態では、様々なナノ粒子製剤を、代替の機構による腫瘍低減のために設計することができる。このような代替の機構の一詳細は、「ナノ粒子媒介微小血管塞栓形成」（ＮＭＥ）というユニークなプロセスである。ＮＭＥプロセスでは、ナノ粒子は、分子血管新生標的の発現に頼らない方式で血液供給源を遮断するために、腫瘍に血管作用性物質を選択的に送達するのに使用することができる。
【０１７９】
現在の腫瘍塞栓形成の試みは一般に、訓練された介入放射線医によって実施され、肝細胞癌（ＨＣＣ）の、または他の原発性悪性腫瘍からの肝臓支配的転移の経カテーテル動脈化学塞栓療法（ＴＡＣＥ）を伴う技法を伴う。このような技法は、典型的には、患者の半分超において直接の腫瘍壊死を誘導するが、使用される注入剤は、腫瘍内の分岐血管の間でのみ分布し、側副微小血管循環から除外され得る。したがって、ＴＡＣＥは、一時的な、対症の、局部的な処置にとって高度に有効であるが、転移性疾患を有する患者の腫瘍のすべてのエリアを処置するために全身性に投与することができない。さらに、ＴＡＣＥは、自己制限的な塞栓後症候群（痛み、発熱、および倦怠感）、化学性肝炎、ならびに壊死および肝実質細胞および塞栓形成した腫瘍細胞からのサイトカインの放出に起因する類白血病反応とも関連し得る。さらに、腫瘍塞栓形成の慣例的な作用物質は、典型的には、化学療法と混載されるポリマー微粒子である。このような作用物質は、全身投与に適用できず、その理由は、これらのサイズおよび毒性ペイロードが、重要臓器（例えば、肝臓、心臓、肺、腎臓など）の血管床に重度の損傷を促進するためである。
【０１８０】
ＨＢＯＣの血管作用は一般に、修飾鉄含有ヘモグロビンの血管の内皮への浸潤に少なくとも部分的に帰され、一酸化窒素（ＮＯ）の消費をもたらす。様々な実施形態の処置技法は、ナノ粒子、例えば、ポリマーソームの水性空洞内にミオグロビンなどの一酸化炭素を結合させることができる分子（「ＮＯ結合分子」）を被包することを伴い得る。このような被包されたＮＯ結合分子は、酸素を結合させることについて高親和性も有し、腫瘍酸素化に関して上記に論じられているもの（例えば、ＰＥＭ）と同じであっても、または異なっていてもよい。上記に論じたように、ＮＯは、血管拡張を促進するパラクリンシグナル伝達因子であり、一方、ＮＯ枯渇は、血管収縮をもたらす。他の技法は、他の機構によって正常なＮＯ活性を阻害することができる分子を被包することを伴い得る。一般に、ＮＯ結合分子および他のＮＯ活性阻害剤は、「ＮＯ阻害」または「ＮＯ作用」分子と本明細書で呼ばれる場合がある。一般に、ＮＯ結合分子は、Ｏ２を結合させることもでき、したがって用語「ＮＯ結合」分子は、ＮＯおよびＯ結合分子を指すのに本明細書で使用される場合がある。
【０１８１】
様々な実施形態では、被包されたＮＯ結合分子は、腫瘍中にナノ粒子を蓄積した後にのみ続いて起こる局所的血管作用によるＮＭＥ効果によって腫瘍に影響し得る。このような蓄積は、活性腫瘍血管新生由来の浸透性および保持の増強（「ＥＰＲ」）に起因し得る。一般に、ＥＰＲ効果は、分子が正常組織内に蓄積するより多く腫瘍組織内に蓄積する傾向を記述する特性であり、それは、活性腫瘍増殖によって刺激された急速な血管新生における異常な血管の作製に基づき得る。このような異常な血管系は、機能障害性であり得、「漏出性」血管系と本明細書で呼ばれる場合がある。さらに、腫瘍組織は、通常、有効なリンパ排水を欠き、それは、漏出性血管系と一緒に、異常な分子および流体輸送、すなわち、ＥＰＲ効果に導き得る。
【０１８２】
ＮＭＥの結果は、最終的な微小血管閉塞および腫瘍壊死であり得るが、いずれの全身性血管作用も伴わない。したがって、様々な実施形態のナノ粒子は、腎細胞癌（ＲＣＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）、および多発性骨髄腫（ＭＭ）を含めた最も高度に血管性の腫瘍の処置に対して特定の有用性を有し得る。特定の理論に束縛されることを望むことなく、ミオグロビンまたは別のＮＯ結合分子を含有するナノ粒子を体循環内に導入すると、粒子がＥＰＲ効果を介して血管外遊出し、または腫瘍微小血管系内に留まった状態になるまで、ＮＯの結合を選択的に遅延させることによって腫瘍中のＮＭＥを選択的に誘導することができる。様々な例示的手順では、ミオグロビンなどのＮＯ結合分子をポリマーソームなどのナノ粒子中に被包することができる。一部の実施形態では、追加の造影剤および／または治療用分子も、腫瘍に対する相補的活性を促進するなどのためにナノ粒子内に被包することができる。ＮＯ結合分子は、ナノ粒子による受動的蓄積および／または能動的標的化を介して腫瘍に送達され得る。送達されると、ＮＯ結合分子は、腫瘍組織中にＮＭＥを誘導することができる。
【０１８３】
特定の理論に束縛されることを望むことなく、ＮＭＥは、以前に調査されたポリマーソーム被包製剤および他のＨＢＯＣに対するいくつかの特異的な性質、特性、および調整に基づき得る。遊離ＮＯ結合分子と比較して、被包ＮＯ結合分子によってＮＯを隔離すると、時間および／または量を著しく遅延させることができ、それによって腫瘍組織特異性を可能にする。このような遅延は、ＮＯ結合分子の物理的および／または化学的特性（すなわち、ＮＯおよび／または他の分子に対する結合親和性など）ならびにナノ粒子の物理的および／または化学的特性（すなわち、サイズ、タイプ、膜など）に基づき得る。ＮＯ隔離時間に影響するこれらの特性の様々な限定されない理論を以下で論じる。
【０１８４】
第１に、ＮＭＥ効果は、ナノ粒子のＮＯとの相互作用に起因し得る。具体的には、一部の実施形態では、ナノ粒子中に被包される分子は、酸素およびＮＯの両方を競合的に結合させる酸素担体（例えば、ミオグロビン）であり得る。これらの被包分子は、酸素を予め装填している場合があり、したがって、酸素が放出されるまでＮＯを結合させることができない。一部の実施形態の酸素担体は、酸素結合に対して特に高い親和性を有する場合もあり、ＮＯ結合は、脱酸素化後にのみ起こるので、体循環中にある間、ＮＯ隔離に対する追加の障壁をもたらす。一部の実施形態では、このような脱酸素化は、被包酸素担体が腫瘍組織中に蓄積することができるようになってのみ起こり得る。
【０１８５】
一例示的実施形態では、被包酸素担体は、ＰＥＭであり得る。上記に論じたように、ミオグロビンは、酸素に対して高親和性（低Ｐ５０）を有し、それにより、循環内の天然赤血球中に見つかるヘモグロビンよりはるかに大きい程度にミオグロビンが酸素を結合させ、保持することを可能にする。ミオグロビン上でＮＯが結合する特異的分子部位（すなわち、鉄ポルフィリン（iron  prophyrin））は、生理学的条件下で酸素によって占有されている。ナノ粒子が体循環中にあるとき見られるこのような生理学的条件では、したがって被包ミログロビンは、有意な量のＮＯを結合させることができない。
【０１８６】
第２に、腫瘍特異的ＮＭＥ効果も、ナノ粒子内またはナノ粒子上に組み込んでいることに起因する環境からのＮＯ結合分子の隔離に起因し得る。例えば、酸素担体を被包するナノ粒子がポリマーソームである実施形態では、これらの合成ポリマー膜は、リポソームなどの他の天然ベシクルのものより著しく厚い場合がある。このような厚い膜は、低酸素腫瘍に到達するまでポリマーソームの水性空洞内へのＮＯを含めた極性ガス分子の拡散に対する追加の障壁を提供し得る。上記に論じたように、他の作用物質を、腫瘍に対する相補的活性をもたらすために、ナノ粒子内に共被包することができる。このような追加の作用物質の例として、限定することなく、追加の化学療法剤または生物学的薬剤を挙げることができ、これらは、血管新生（すなわち、新しい血管の増殖を促す腫瘍によって生成される分子シグナルのプロセス）を阻害し、それによってＮＭＥ効果を増強する。
【０１８７】
一部の実施形態では、ＮＯ結合分子を組み込む分子をナノ粒子の表面に付着させることができ、それは、特定の臓器への標的化または特異的細胞による取り込みを可能にし得る。一部の実施形態では、ナノ粒子は、ポリマーソームである。一部の実施形態では、表面分子は、表面結合ミオグロビンであり得、それは、被包ミオグロビンに加えて、またはその代わりに使用され得る。
【０１８８】
提案されるＮＭＥ機構：
【０１８９】
その投与の後（例えば、腹腔内または静脈内注射を介して）、ナノ粒子は、上記に論じたＥＰＲ効果に起因して腫瘍中に蓄積することができる。循環中のナノ粒子は、正常な血管の内皮タイトジャンクションを貫通することができない場合があり、これらは、漏出性血管系の結果として腫瘍組織中に選択的に血管外遊出することができ、その中でこれらは、捕捉された状態になり、蓄積し、それは、有効なリンパ排水の欠如によって助けられる場合がある。
【０１９０】
腫瘍中の平衡状態酸素圧は、正常組織のものよりはるかに低い場合があるので、腫瘍組織中に蓄積される被包ＮＯ結合分子に結合した酸素は、そのとき、ナノ粒子から解離および拡散する。様々な実施形態では、ナノ粒子からの酸素解離は、腫瘍中の酸素の分圧が被包ＮＯ結合分子の平衡結合圧力（すなわち、５０％飽和に要求される酸素の分圧）未満に降下するとき起こり得る。平衡結合圧力は、様々な実施形態では、具体的なＮＯ結合分子の特性／組成に基づく。
【０１９１】
次いで被包ＮＯ結合分子の脱酸素化により、その分子がナノ粒子内に受動的に拡散したＮＯを結合させることが可能になり得、それは、血管内皮からのＮＯの枯渇に起因して血管収縮をもたらし得る。内皮ＮＯ枯渇に起因するこのような血管収縮の下流の結果として、腫瘍微小血管系の損傷、その後の血小板接着、活性化、および血餅形成（すなわち、血栓形成）をもたらす凝集を挙げることができる。最終的に、腫瘍微小血管系の凝固は、周囲腫瘍組織中の局所的な止血（すなわち、血液フローの減速／停止）をもたらすことができ、それによって腫瘍毛細血管中に持続性の流体力学的圧力を作製する。結果として、新しく形成された血餅は、破裂し、腫瘍のボディ内への出血（bleeding）（すなわち、出血（hemorrhage））を引き起こし得る。出血の後で、腫瘍毛細血管床の完全な血栓形成は、進行して、赤血球のさらなる送達を含めた腫瘍へのすべての血液フローを停止することができる。このようにして、ＮＭＥ効果は、腫瘍細胞の壊死に至り得る。
【０１９２】
ＮＯ結合分子の代替案：
【０１９３】
様々な実施形態では、ＮＯ阻害に影響する他の分子を、ＮＯ結合分子を結合させる酸素担体に加えて、またはその代わりにナノ粒子中に被包することができる。このような作用物質として、ＮＯ生成を阻害する化合物（例えば、ＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）阻害剤）、ＮＯラジカルをスカベンジングする化合物、市販のＮＯ結合試薬を挙げることができる。
【０１９４】
ＮＯは、３種の異なるＮＯＳによって酵素的に生成される。神経細胞ＮＯＳ（ｎＮＯＳ）および内皮ＮＯＳ（ｅＮＯＳ）は、それぞれ神経伝達および血管緊張などの恒常性プロセスにとって重要な構成酵素であり、誘導性ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）は、通常発現されないが、むしろ炎症に応答して新規に合成される。したがって、ｎＮＯＳ阻害剤、ｅＮＯＳ阻害剤、およびｉＮＯＳ阻害剤を被包する様々な実施形態のナノ粒子を作製することができる。さらに、ＮＯＳ酵素は、Ｌ−アルギニンからＮＯを作るので、競合性Ｌ−アルギニン類似体は、ＮＯＳ酵素がＮＯを生成することを防止することができ、一部の実施形態のナノ粒子中に被包される場合もある。これらの被包される類似体として、それだけに限らないが、ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）、Νω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＮＡ）、およびＮＧ−ニトロアルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）を挙げることができる。
【０１９５】
ＮＯ−スカベンジング化合物を様々な実施形態のナノ粒子製剤中に被包および使用することができる。このような化合物として、それだけに限らないが、ニトロニルニトロキシド（例えば、カルボキシ−ＰＴＩＯ）、ジチオカルバメート誘導体、化学的に修飾されたヒト由来ヘモグロビンコンジュゲートピリドキサール化ヘモグロビンポリオキシエチレン（ＰＨＰ）などを挙げることができる。ＮＯラジカルに特異的である追加のＮＯスカベンジング化合物が、様々な実施形態で使用するために将来開発され得る。
【０１９６】
さらに、市販のＮＯ結合試薬を、様々な実施形態のナノ粒子製剤で使用するのにナノ粒子中に被包することができる。このような試薬は、他の目的／処置のためにある程度のＮＯ隔離を誘導することが示されているものであり得る。このようなＮＯ結合試薬の例として、敗血症ショック、２型糖尿病、関節炎および他の炎症疾患、ならびに鎌状赤血球性貧血を処置するために、Ｍｅｄｉｎｏｘ，Ｉｎｃ．によって開発された小分子ＮＯ阻害剤および低分子量一酸化炭素代謝産物化合物を挙げることができる。
【０１９７】
ポリマーソームの代替案：
【０１９８】
様々な実施形態では、ポリマーソーム以外のナノ粒子製剤を、ポリマーソームの代わりに、またはそれに加えて使用してＮＯ結合またはＮＯ作用分子を被包することができる。さらに、様々な市販の無細胞ＨＢＯＣを、被包ＮＯ結合分子の開発に対してさらに、または代替案として使用することができる。これらの市販のＨＢＯＣは、限定することなく、重合ヘモグロビン生成物（例えば、Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡによるＰｏｌｙＨｅｍｅ（商標）、Ｂｉｏｐｕｒｅ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡによるＨｅｍｏｐｕｒｅ（商標）およびＯｘｙｇｌｏｂｉｎ（商標））、不活性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、５ｋＤａ超の分子量を有する））を用いた表面改質に基づいてより大きい全体の粒子を有し得る共役ヘモグロビン生成物（例えば、Ｓａｎｇａｒｔ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡによるＨｅｍｏｓｐａｎ（商標））、ならびに／または架橋ヘモグロビン生成物（例えば、ＢａｘｔｅｒによるＨｅｍｏＡｓｓｉｓｔ（商標）、ＳｏｍａｔｏｇｅｎによるＯｐｔｒｏ（商標）など）であり得る。しかし、これらは、これらのヘム基中の鉄の酸化状態を自己調節する能力を欠いているので、ＨＢＯＣ中の鉄は、第一鉄状態から第二鉄状態に自由に変換することができ、正常な量超のメトヘモグロビンを作製する。
【０１９９】
さらに、一部の実施形態では、酸素担体／ＮＯ結合またはＮＯ作用分子を被包する微粒子および／またはナノ粒子は、免疫認識を媒介する表面糖タンパク質、核酸、または小分子によって修飾されてもよい。一例では、ＣＤ１７２ａ受容体のエンゲージメントを介して単核食作用系（ＭＰＳ）（主に肝臓および脾臓）を媒介するＣＤ４７を、ナノ粒子表面上にコンジュゲートさせることができる。
【０２００】
上記に論じたナノ粒子製剤の代わりにＮＯ阻害／ＮＯ作用分子を被包するのに使用され得る様々な他の市販ナノ粒子として、限定することなく、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（すなわち、ナノ粒子−アルブミン結合パクリタキセル）、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）（すなわち、リポソームによって被包されたドキソルビシン）、および／またはがん療法のために具体的に開発された様々な他のナノ粒子を挙げることができる。
【０２０１】
ＮＭＥの具体的な用途：
【０２０２】
様々な実施形態では、ＮＭＥを引き起こすための被包されたＮＯ阻害／ＮＯ効果分子（例えば、ＰＥＭ）の使用は、高度に血管新生した腫瘍、例えば、そのすべてが不満足な処置選択肢を有するがんであるＲＣＣ、ＨＣＣ、ＧＢＭ、およびＭＭなどに特に有用であり得る。一部の実施形態では、ＰＥＭは、乏しい処置選択肢を有する血管性腫瘍、例えば、卵巣がん、非小細胞肺がん、乳がん、および大腸がんなどを含めた多くのまたはすべての固形腫瘍に対して有効であり得る。様々な実施形態では、ＮＭＥを引き起こすための被包ＮＯ作用分子の使用は、放射線および／または化学療法を強化するための腫瘍酸素化に関して上述されているＰＥＭ構築物を使用することができる。
【０２０３】
血管新生の調節解除は、ＲＣＣ腫瘍などの高度に血管新生した腫瘍の発生における主要な病態生理学的要因である。特に、慣例的なまたは明らかな細胞ＲＣＣは、腎がんの最も一般的な組織学的サブタイプであり、フォンヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）腫瘍抑制遺伝子の、メチル化による突然変異またはサイレンシングに続発する体細胞喪失によって特徴付けられる。これらのＶＨＬ異常は、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）を含む複数の血管新生促進分子を増幅する転写因子のアップレギュレーションに至る。
【０２０４】
したがって、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、例えば、スニチニブ、パゾパニブ、およびソラフェニブなどがＲＣＣのフロントライン処置として出現してきた。さらに、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）阻害剤、例えば、テムシロリムスおよびエベロリムスなどは、ＶＥＧＦＲ  ＴＫＩ−耐性疾患の発生後の無増悪生存期間を増大させることにおける利益を実証した。組合せ療法は、さらなる改善をもたらさず、副作用を大いに増大させただけである。
【０２０５】
最初に、高度に血管性の腫瘍のための新規治療モダリティーとしてのＰＥＭの有効性および安全性を、ＲＣＣのマウスモデルにおいて単剤としての治療的使用を示し、最適な用量レベルおよび投薬スケジュールを開発することによって実証することができる。次いで、ＶＥＧＦＲ指向療法（ファーストライン療法）との相乗的組合せにおける、かつ／またはＶＥＧＦＲ  ＴＫＩ耐性疾患（セカンドライン療法）の場合におけるＰＥＭの有効性および安全性を示すことができる。ＰＥＭはまた、放射線療法（ＸＲＴ）を用いた、および用いない新規対症処置として有用性を有し得、対症的腎摘除の（またはその代わりに）転帰を改善する。したがって、ＰＥＭの確立した抗血管新生療法および／またはＸＲＴとの有効な組合せを、ＲＣＣのマウスモデルを使用して様々な実施形態において示すことができる。
【０２０６】
特に、ＰＥＭは、以下の様々な異なるがん、作用物質クラス、および作用物質族（name）との相乗的な組合せで使用することができる。
【０２０７】
上記に論じたように、一部の実施形態のナノ粒子は、単一ナノ粒子内に複数の作用物質を共組込みするのに使用することもできる。例えば、実施形態のＰＥＭ構築物に、ＮＯ結合分子、およびＮＯに影響する分子（例えば、ＮＯＳ阻害剤、ＶＥＧＦＲ  ＴＫＩ、およびｍＴＯＲ阻害剤）の任意の２種またはそれ超を装填し、それによって最大の抗血管新生活性および腫瘍増殖の阻害をもたらすことができる。さらに、ＰＥＭ誘導ＮＭＥは、抗血管新生療法（例えば、ＶＥＧＦＲ  ＴＫＩまたはｍＴＯＲ阻害剤）と相乗的である可能性が高く、処置未経験の患者集団、度重なる処置を受けた患者集団、およびプアリスク患者集団において同様の有効性を実証することができる。
【０２０８】
様々な実施形態を、それだけに限らないが、以下の実施例で例示することができる。
【実施例】
【０２０９】
（実施例Ｉ）
【０２１０】
物理化学的特性が様々である生分解性ＰＥＭ分散物を構築するための方法および材料：
【０２１１】
約１．５〜４ｋＤａのＰＥＯブロックサイズを有し、ＰＥＯブロック率が約１０〜２０重量％であるポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ）を利用して、生分解性ＰＥＭ分散物を形成する。分子量、疎水性対親水性ブロック率、および得られるポリマーソーム膜−コア厚さが様々であるポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（γ−メチルε−カプロラクトン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬ）およびポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（トリメチルカルボネート）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣ）コポリマーをさらに組み込んで、ゆっくりと生分解性になるだけでなく、独特な変形性を有し、脆弱化した毛細血管床での通行が赤外線によって可能になる、ＰＥＭ構築物を生成する。ＰＣＬの誘導体としてのＰＭＣＬは、そのエステル結合が非酵素的に切断されて分解する、同様に完全に生体再吸収性のポリマーである。ＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣおよび／またはＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬから構成されたポリマーソームは、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬから構成されたポリマーソームに比べて、より低い温度で自発的に、より高い収率で形成し、また変形性および粘弾性のより高い膜を有する。こうしたポリマーソームはまた、ＰＥＯ−ｂ−ＰＧＡ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＬＡ、またはＰＥＯ−ｂ−ＰＬＧＡから形成されたベシクルよりはるかにゆっくりと、同様に分解する。そのため、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬから得られたＰＥＭ分散物は、文献で主張されている生分解性の細胞性ＭＢＯＣに比べて、より高いＭｂ被包効率、より小さい平均粒径、およびより低いメトミオグロビン生成レベルを実証する。
【０２１２】
ＰＥＭ分散物の合成：
【０２１３】
ＰＥＭ分散物を合成するには、精製ヒトＭｂをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）から購入して、出発材料として使用することができる。ＰＥＯ分子量が１ｋＤａ〜４ｋＤａの範囲であるＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬ、およびＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣコポリマーでは、安定した高い収率のポリマーソームが得られることが、かねてより示されている５３。例えば、ＰＥＯが２ｋＤａの分子量を有し、ＰＭＣＬが９．４ｋＤａの分子量を有することがある。ポリマーの初期量（試料当たり５ｍｇ〜２０ｍｇ）、ならびにポリマーソーム形成に使用する初期Ｍｂ濃度（１００ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌ）を変化させることにより、Ｍｂ被包度の異なるＰＥＭ分散物が生成される。
【０２１４】
ＰＥＭ分散物は、次の３つの異なる方法を使用して形成される。１）「薄膜再水和」（溶解したポリマーの有機溶液をＴｅｆｌｏｎフィルムに付着させ、フィルムを真空オーブンで終夜乾燥させて、すべての有機溶媒を除去し、ポリマーの乾燥薄膜を精製Ｍｂの水溶液に浸漬し、引き続いて、熱しながら高周波音波処理にかけ、最後に、一連の異なる孔径の膜から押し出して、所望のナノメートルＰＥＭ分散物を得るものである）、２）「直接水和」１１６，１１７（乾燥ポリマーを１：１のモル比で等重量のＰＥＧ５００ＤＭＥと混合し、３０分間９５℃に加熱し、激しく混合し、２０分かけて室温に冷ましてから、Ｍｂ溶液を加え、次いでその後さらに激しく混合し、音波処理し、一連の異なる孔径の膜から押し出して、所望のナノメートルＰＥＭ分散物を得、最後に、サイズ排除カラムに流すことによりＰＥＧ５００を分離する）、および３）薄膜直接水和（乾燥ポリマーを１：１のモル比で等重量のＰＥＧ５００ＤＭＥと混合してからＴｅｆｌｏｎに付着させた後、次いでこのフィルムを終夜乾燥させ、３０分間９５℃に加熱し、激しく混合し、２０分かけて室温に冷ましてから、Ｍｂ溶液を加え、さらに激しく混合し、音波処理し、一連の異なる孔径の膜から押し出して、所望のナノメートルＰＥＭ分散物を得、最後に、サイズ排除カラムに流すことによりＰＥＧ５００を分離する）。
【０２１５】
こうした方法ではそれぞれ、膜押出しによって、効果的に制御することのできる高収率の安定したポリマーソームが産生されて、直径が平均サイズで１００ｎｍから１μｍまで様々となる、ＰＥＭの単層単分散懸濁液が得られる。薄膜再水和では、ＰＥＭサイズ分布が非常に狭くなり、また被包に利用可能なコア体積がより大きいためＭｂ被包％が比較的高くなりうるとはいえ１１６、Ｍｂおよび結果として生じるＰＥＭ分散物の安定性は、明白に低くなる場合があり１６３、こうした結果は、ポリマーソームの所与のポリマー組成物の生成に必要な水和および最適音波処理温度が、遊離Ｍｂの変性温度に近くなることがあるせいであるといえる（例えば、薄膜再水和によるＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬベースＰＥＭ分散物の生成には６０℃が使用される）。ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣポリマーソームは、室温（周囲ｐＯ２中）での直接または薄膜直接水和によって形成され、より高いＭｂ被包効率で、より高収率のＰＥＭが可能になることが予想される。ＮＩＲ画像処理研究を同時に行うために、オリゴ（ポリフィリン）ベースＮＩＲＦを、乾燥させたポリマーと（１：４０のモル比で）、Ｍｂ水溶液に曝露する前に混ぜ合わせることで１６６、ＮＩＲ発光性ＰＥＭ構築物を生成することもできる。被包されないＭｂは、透析、限外濾過、および／またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、すべてのＰＥＭ分散物から分離される。
【０２１６】
（実施例ＩＩ）
【０２１７】
ＰＥＭ分散物の物理化学的特性の特徴付け：
【０２１８】
ＰＥＭ生成を検証するために、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、各Ｍｂ／ポリマー製剤を粒度分布について特徴付ける。ＰＥＭ構造および形態は、極低温透過型電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）を使用して、直接可視化する。様々なＰＥＭ分散物の粘性は、微量粘度計を使用して測定する。Ｍｂ被包％の測定には、２つの独立した方法を使用する。１つ目の方法では、界面活性剤（例えば、ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を用いてＰＥＭ分散物を最初に溶解させ、得られる可溶化液のＵＶ吸光度を測定して、Ｍｂの質量、引き続いてもとのＰＥＭ組成物のＭｂ被包％を決定する１６２。この計算は、比較的簡単明瞭ではあるが、合計Ｍｂ分散物体積をもとに一部が仮定されることで、被包％が高く見積もられ過ぎることもある。そのため、示差干渉屈折計とつないだ非対称電界中流体分離装置（asymmetric  field-flow  fractionator）を使用して、溶出する非被包Ｍｂの濃度を測定し、これから被包％を決定する１６２、１７６。これらの測定値から、様々なＰＥＭ分散物中のＭｂ：ポリマーの最終重量比をさらに計算する。ＰＥＭ分散物それぞれにおけるメトＭｂ％は、十分に確立されているシアノメトＭｂアッセイに類似した方法によって決定する１６２、１６３。
【０２１９】
（実施例ＩＩＩ）
【０２２０】
生分解性ＰＥＭ分散物の酸素運搬特性の特徴付け：
【０２２１】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬベースのＰＥＭ分散物の酸素結合特性を、確立された技術を使用して測定する。平衡酸素結合特性ならびにポリマーソーム膜を介した酸素の拡散動力学を、入念に特徴付ける。これらの測定を活用して、こうした様々なＰＥＭ分散物の酸素透過性および酸素−膜拡散係数を決定する。こうした非常に基本的なパラメーターは、好結果の細胞性ＭＢＯＣの最適な設計にとって重要である。様々なＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬおよびＰＥＯ−ｂＰＭＣＬベースＰＥＭ分散物の一酸化窒素（ＮＯ）結合プロファイルも、さらに決定する。細胞性ＭＢＯＣは、内皮由来ＮＯを捕捉するため、動物において血管収縮、高血圧、血流量減少、および血管損傷を誘発することが予想できる。しかし、ポリマーソーム、リポソーム、ミセルなどのナノ粒子に被包されたＭｂは、同様に「血管作動性」になるとは予想されず、自然のＲＢＣのＭｂと似たように、リポソームおよびポリマーソーム膜が、Ｍｂを周囲の血管環境から効果的に隔離することで、ＮＯ結合を効果的に阻止するはずである。ＰＥＭ分散物は、そのより厚い膜とより低い透過性のおかげで、ＮＯスカベンジングに対してより強い抵抗性を示す可能性が高くなる。最後に、長い持続時間にわたる生理学的条件下でのその安定性および完全性を試験するために、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬベースＰＥＭ分散物について別の測定を行う。
【０２２２】
実験：
【０２２３】
酸素結合特性の特徴付け：
【０２２４】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬ、およびＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣベースＰＥＭ分散物のＰ５０などの平衡酸素結合特性を、Ｈｅｍｏｘ−ａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定する５１、５２。一連のＭｂ負荷濃度を使用することに加えて、イノシトール６リン酸などのアロステリックエフェクターをポリマーソームの水相に加えることにより、こうした特性の、ＰＥＭ分散物の組成に対する依存性を判定する。これは、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬ、およびＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣベースＰＥＭ構築物が、低い酸素化条件にありながらも正常な酸素化を経て組織に酸素を送達するのに適当であるかを判定するために特に重要である。遊離Ｍｂ溶液のＰ５０およびｎ値と、ＦＤＡが獣医学的使用について唯一承認している酸素治療薬であるＯｘｙｇｌｏｂｉｎ（登録商標）（Ｂｉｏｐｕｒｅ  Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ケンブリッジ）のその値に関して、これらの実験の結果を比較する。
【０２２５】
これらの平衡測定に加えて、異なるＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬ、およびＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣベースＰＥＭ分散物についての、ＰＥＭ膜を介した酸素拡散およびＭｂへの結合／Ｍｂの放出の動力学を、高感度酸素微小電極を使用して決定する。Ｏ２取込みにおける拡散および結合の役割を明確にするために、様々なＰＥＭの測定値を、遊離Ｍｂおよび空ポリマーソーム分散物（Ｍｂなし）からの測定値と比較する。こうした実験の結果を、拡散−反応輸送モデルを活用して分析して、異なるポリマーソーム膜の酸素透過性を判定し、様々なジブロックコポリマー膜の拡散特性と、ＰＥＭ製剤の実測による酸素結合特性の間の相関関係を推測する。
【０２２６】
ＮＯ結合特性の特徴付け：
【０２２７】
酸素化および脱酸素化条件下でのＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬ、およびＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣベースＰＥＭ分散物のＮＯ結合を、ストップトフロー分光法を使用して、体系的に研究する１７７，１７８。ＮＯ含有溶液とすばやく混合した様々な酸素化または脱酸素化ＰＥＭ分散物を急速吸光度走査にかけることにより、結合の時間経過を測定する。Ｍｂ負荷濃度、ＰＥＭ分散物濃度、およびＰＥＭサイズの範囲によって、こうした実験の結果が変わることが予想される。同様に、ＰＥＭ、遊離Ｍｂ、および空ポリマーソームを比較する実験をＮＯ微小電極を使用して行うことにより、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬ、およびＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣベースＰＥＭ構築物によるＮＯ取込みにおけるＮＯ拡散および結合の役割をさらに特徴付ける。こうした包括的な研究を通して、異なる条件下でのＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬ、およびＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣベースＰＥＭ分散物のＮＯ結合速度定数を確立し、溶液中の遊離Ｍｂ、リポソームで被包されたＭｂ（ＬＥＭ）、およびＯｘｙｇｌｏｂｉｎ（登録商標）についての結果と比較する。
【０２２８】
ＰＥＭ分散物の安定性および完全性の特徴付け：
【０２２９】
様々なＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬ、およびＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣベースＰＥＭ分散物の安定性を試験するために、これらを食塩水中および血漿中において、４℃および３７℃で数日間保管し、ＰＥＭ形態およびサイズ分布の変化を、それぞれｃｒｙｏ−ＴＥＭおよびＤＬＳを使用して評価する。同様に、様々な溶液条件下（例えば、温度、ｐＨ、ｐＯ２、およびｐＮＯ）、様々な時点でのＭｂ濃度、メトＭｂレベル、ＮＯ取込み、および生分解性ＰＥＭからのＭｂ放出のｉｎ  ｓｉｔｕ変化も、本明細書に記載の技術を使用して試験する。こうした研究では、電子吸収分光法、ならびにメチル化、ＮＯ結合型、および酸素化Ｍｂについての既知の消衰係数に基づく濃度計算を利用する１７９〜１８８。
【０２３０】
微量ピペット吸引を使用する臨界溶解張力（critical  lysis  tension）、臨界面積歪み（critical  areal  strain）の測定：
【０２３１】
Ｍｂを被包するポリマーソームの微量ピペット吸引は、先行参照文献に記載の手順と類似の手順に従う。簡潔に述べると、ホウケイ酸ガラス管材料でできた微量ピペット（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｄｉｍｍｏｃｋ、ニュージャージー州Ｍｉｌｖｉｌｌｅ）を、針／ピペットプラー（モデル７３０、Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州Ｔｕｊｕｎｇａ）を使用して準備し、ガラスビーズを使用して微細加工して、先端の縁を滑らかで平らにする。微量ピペットの内径は、１ｕｍ〜６ｕｍの範囲であり、コンピューター画像処理ソフトウェアを使用して測定される。ピペットを使用して、Ｍｂ負荷および非負荷ポリマーソームを拾い上げ、その膜に張力をかける。微量ピペットをＰＢＳ溶液で満たし、マノメーター、Ｖａｌｉｄｙｎｅ圧力変換器（モデルＤＰ１５−３２およびＤＰ１０３−１４、Ｖａｌｉｄｙｎｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州ノースリッジ）、デジタル圧力表示器、マイクロマニピュレーター（モデルＷＲ−６、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ、日本国東京）、およびＭｅｌｌｅｓＧｒｉｏｔミリマニピュレーター（ｘ，ｙ，ｚ進路制御）が備え付けられたＺｅｉｓｓ倒立顕微鏡の側に取り付けられた吸引場所に接続する。吸い上げ圧力は、マノメーターに接続されたシリンジで適用する。実験は、ポリマーソームを弛緩させるために、モル浸透圧濃度が３１０〜３２０ｍＯｓｍであるＰＢＳ溶液中で実施する（内部ベシクル溶液は通常、２９０〜３００ｍＯｓｍのスクロースとした）。溶液のモル浸透圧濃度は、浸透圧計を使用して測定する。スクロースとＰＢＳは、異なる密度および屈折率を有するため、ポリマーソームは、溶液中に沈降し、位相差またはＤＩＣ光学装置で容易に認識できる。
【０２３２】
（実施例ＩＶ）
【０２３３】
乾燥貯蔵、ポイントオブケア再水和、およびｉｎ  ｖｉｖｏ送達の可能なＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬ、およびＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣベースＰＥＭ分散物の開発：
【０２３４】
ポリマー合成：
【０２３５】
アクリレート修飾されたジブロックコポリマー（例えば、アクリル修飾されたＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬベースポリマーとみなされるＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−アクリル）を、オクタン酸第一スズを触媒として使用する標準手順に従って合成する。例えば、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−アクリルは、数平均分子量が１４ｋＤａ（ＰＣＬおよびＰＥＯブロックについて、それぞれ１２および２ｋＤａ）であることが分かっている。これらは、ＮＭＲピークを、およそ３．４ｐｐｍにあるＰＥＯ上の末端メトキシ基に合わせて調整することにより決定するポリマーの多分散性は、１．５未満である。ＰＣＬブロックのＯＨ末端がアクリル化されても、２回目の精製後のポリマーサイズまたは分布に有意な変化は生じない。アクリル化効率は、９９％であることが分かった。
【０２３６】
ＰＥＭ分散物の形成：
【０２３７】
アクリル修飾されたポリマーからなるＰＥＭ分散物（例えば、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−アクリルベースＰＥＭ分散物）を合成するために、純粋なヒトＭｂを出発材料として使用する。純粋なヒトＭｂは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）から購入することができる。ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−アクリルポリマーおよび２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）を、１：１のモル比で塩化メチレンに溶解させ、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）に付着させ、有機溶媒を蒸発させることにより、ざらついたＴｅｆｌｏｎ（登録商標）上で乾燥させる。アクリル修飾されたポリマーの量（例えば、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−アクリルポリマー、試料当たり５ｍｇ〜２０ｍｇ）ならびにポリマーソーム形成に使用する最初のＭｂ水溶液濃度（１００ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌ）を様々に変えて、その膜においてＤＭＰＡが区画化されており、Ｍｂ水溶液被包度の異なるＰＥＭ分散物を生成する。ＰＥＭ分散物は、十分に確立されている３つの方法：１）薄膜再水和、２）直接水和、および３）薄膜直接水和を使用して形成する（実施例Ｉを参照されたい）。こうした方法ではそれぞれ、膜押出しによって、効果的に制御することのできる高収率の安定したポリマーソームが産生されて、直径が平均サイズで１００ｎｍから１μｍまで様々となる、ＰＥＭの単層単分散懸濁液が得られる。薄膜再水和では、ＰＥＭサイズ分布が非常に狭くなり、また被包に利用可能なコア体積がより大きいためＭｂ被包％がより高くなる可能性もあるとはいえ１１６、Ｍｂおよび結果として生じるＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬベースＰＥＭ分散物の安定性は、明白に低くなる場合があり１６３、こうした結果は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬの水和温度が遊離Ｍｂの変性温度に近いせいであるといえる。ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣポリマーソームは、室温（周囲ｐＯ２中）での直接水和または薄膜直接水和によって形成され、より高いＭｂ被包効率で、より高収率のＰＥＭが可能になることが予想される。ＮＩＲ画像処理研究を同時に行うために、オリゴ（ポリフィリン）ベースＮＩＲＦを、乾燥させたポリマーと（１：４０のモル比で）、Ｍｂ水溶液に曝露する前に混ぜ合わせることで１６６、ＮＩＲ放射ＰＥＭ構築物を生成する。被包されないＭｂは、透析、限外濾過、またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、すべてのＰＥＭ分散物から分離される。
【０２３８】
形成後のＰＥＭ膜の安定化：
【０２３９】
組み立てがなされたなら、ＰＥＭ分散物の膜を構成するアクリル修飾されたポリマーソーム（例えば、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−アクリル）は、ＵＶ光に露出し、それによって、ポリマーソーム膜に組み込まれた光開始剤ＤＭＰＡの活性化によってアクリル基をラジカル重合させることで、架橋することができる。この手法では、生分解性ブロック（例えば、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−アクリルのＰＣＬ鎖）の加水分解が妨げられず、分解されたモノマー（例えば、オリゴ−カプロラクトン単位）、ＰＥＯ、および動力学的な鎖のポリ（アクリル酸）が分解生成物として生じる。ポリマーソームの水性コア内にＮＡＣまたはメチレンブルーをＭｂと共に被包することにより、Ｍｂは、メトＭｂ形成という光誘導性の分解から保護される。ＰＥＭ分散物を構成する、ＤＭＰＡが組み込まれたアクリル修飾ポリマー（例えば、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−アクリル）を、視準レンズ付きのＯｍｎｉＣｕｒｅ  Ｓｅｒｉｅｓ  １０００スポット硬化ランプ（Ｅｘｆｏ、カナダ国オンタリオ；３６５ｎｍ、５５ｍＷ／ｃｍ２）から発せられるＵＶ光を使用して１０〜３０分間露出することにより、ベシクルの膜の重合を進行させる。凍結乾燥および乾燥相貯蔵：
【０２４０】
凍結乾燥は、ＵＶ光露出後のアクリル修飾ＰＥＭ分散物（例えば、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬアクリルＰＥＭ）を泡立ちが止むまで液体窒素に浸すことにより凍結乾燥して進行させる。次いで、凍結したＰＥＭ分散物を、卓上凍結乾燥装置（ＦｒｅｅＺｏｎｅ  ４．５Ｌ  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌａｂｃｏｎｃｏ、ミズーリ州カンザスシティー；モデル７７５００）に、試料が乾燥するまで２４時間載せておく。次いで、乾燥した崩れたＰＥＭ分散物を、デシケーターに入れてアルゴンガス中で貯蔵し、４℃に置く。
【０２４１】
ポイントオブケア水和：
【０２４２】
乾燥させたアクリル修飾ＰＥＭ分散物をデシケーターから取り出し、バイアルに入れる。もとの同じ体積の水溶液を試料に元通り加えて、ベシクルを水和させる。１０分間穏やかにボルテックス撹拌することにより、ポリマーソーム再水和をさらに促進して、ベシクルを完全に再懸濁させる。ＤＬＳによって無傷のポリマーソームを検証し、ベシクルの凝集が最小限に抑えられており、ミセルへと破壊されていないことが示される。Ｍｂ保持は、ＰＥＭ分散物を水性サイズ排除カラムに流し、流出バンドのアリコートを採取してＵＶ−ｖｉｓ分析にかけることにより検証する。溶出アリコートのＤＬＳによってさらに検証したとき、ポリマーソームに対応するバンドだけが、ＵＶ−ｖｉｓ分光法によって評価したとき、Ｍｂを含有する。保持されたＭｂの安定性は、ＵＶ−ｖｉｓスペクトルが、メトＭｂの発生または別のいずれかのＭｂ崩壊生成物に対応するバンドを示さないことによってさらに検証される。
【０２４３】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬ、およびＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣベース分子標的ＰＥＭ分散物の開発：
【０２４４】
十分に確立された化学コンジュゲーション法によって、ポリマーソーム表面を様々な生物学的リガンドで修飾すると、特異的な多重結合活性の生物学的接着性が付与される。同様の方法を採用して、とりわけ、創傷治癒、および低酸素組織に対する放射線療法の有効性の向上を促進することのできる、分子および細胞標的ポリマーソーム被包ＰＥＭ分散物を生成することができる。生物学的リガンドは、カルボジイミド−ポリビニルスルホンを媒介とする水相反応によって、こうしたナノ粒子にコンジュゲートされる。リガンドによるポリマーソーム表面被覆の度合いは、異なる濃度のリガンド、および異なる官能化対非官能化比率のポリマーを含有する混合物から合成されているＰＥＭ分散物を使用することにより、体系的に様々にされる（ポリマーソームの合計表面積の１％〜１０％超）。ポリマーソーム表面のペプチドコンジュゲーションを検証した後、得られるＰＥＭ製剤の組換え分子標的／受容体への動力学的結合を、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲ）測定によって特徴付け、遊離生物学的リガンドについて記載したのと同様にして用量依存曲線を分析する。こうした研究によって、ＰＥＭ分散物と分子標的の相互作用の動力学的パラメーター（オン速度、ｋｏｎ、およびオフ速度、ｋｏｆｆ）、ならびにポリマーソームへのそのコンジュゲーションの影響を受けるリガンドの親和性の変化（解離定数、Ｋ）が明らかになる。
【０２４５】
実験：
【０２４６】
確立された化学修飾手順を使用して、生分解性ポリマー（例えば、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマー）のＰＥＯ末端をカルボキシル基で官能化し、１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって反応を検証する。ＰＥＭ分散物を作製し、標準の分離法を使用して、官能化および非官能化コポリマーが様々に組み合わさったものから精製して、数か月間安定である単層ベシクルの単分散懸濁液を得る。動的光散乱（ＤＬＳ）によってＰＥＭサイズ分布を決定する。逆相高速液体クロマトグラフィーおよびＭＡＬＤＩ質量分析によって、リガンド同一性および純度を確認する。ポリマーソーム表面上でのカルボキシル末端を有するＰＥＯ基へのリガンドコンジュゲーションを、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を媒介とする水系反応において実施する。リガンドコンジュゲーションの程度を、マイクロＢＣＡアッセイを使用して決定する。得られた標的化ＰＥＭ分散物を、極低温透過型電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）によって広範に画像処理して、リガンドコンジュゲーション後のその安定性を検証する。そのサイズ分布をＤＬＳによって再び測定する。リガンドコンジュゲーションの度合いを、フローサイトメトリーを使用して検証する。バイオセンサー計器Ｂｉａｃｏｒｅ  ＸおよびＢｉａｃｏｒｅ  ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＧ、スウェーデン国ウプサラ）において２５℃でＳＰＲ測定を実施する。精製された組換えリガンド標的（例えば、タンパク質受容体）を市販品として購入し、センサー表面上のデキストランヒドロゲルに付着させることにより固定する。標的化ＰＥＭ構築物を様々な濃度で注入し、その結合をリアルタイムでモニターする。受容体／ＰＥＭ結合についての動力学的速度定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）および平衡結合定数（ＫＤ）を、センサーグラムの動力学的分析から推定する。標的化リガンドなしのＰＥＭまたは無関係のリガンドにコンジュゲートされたＰＥＭを対照として使用する。
【０２４７】
別のリガンドコンジュゲーション化学を用いることもできる。例えば、ジブロックポリマーを化学的に官能化し、選択したリガンド（有機相溶解性を有する小分子、ペプチド）とコンジュゲートしてからＰＥＭ分散物を形成する有機相反応が可能であり、この有機カップリング法では、ＰＥＯ末端が、競合する加水分解のためにその修飾された表面反応性基の多くを失わせかねない水溶液に曝露される前に、確実にリガンドとコンジュゲートされる。また、リガンド表面コンジュゲーションの度合いを様々にする代替法として、ＰＥＯおよびＰＣＬブロックサイズが様々であるＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬコポリマーで構成されたＰＥＭ分散物が作製される。この手法では、ポリマーソーム表面へのリガンドコンジュゲーションの動力学に加えて所与のＰＥＭ製剤についてのリガンド表面被覆の度合いが制御される。標的化ＰＥＭ製剤は、ＳＰＲ測定の際、センサー表面に非特異的に結合し、それによって、その再生およびシグナル対バックグラウンド比に影響を及ぼす可能性がある。信頼性のある測定を行うことができない場合、ナノ粒子結合研究のための他の確立された技術である、ＥＬＩＳＡまたは等温滴定熱量測定を使用して、リガンドにコンジュゲートされたＰＥＭの結合特性も研究する。
【０２４８】
ＰＥＭによるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍酸素化モジュレーション：
【０２４９】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣ、および／またはこれらポリマーをアクリル修飾したバージョンから形成されたＰＥＭ分散物について、異物移植腫瘍保持マウスに尾静脈注射後にｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍酸素化を変更する能力を試験する。粒径、変形性、および濃度が、効果的なＭｂ送達ならびにその結果としての腫瘍酸素化に及ぼす共依存的な影響についても分析する。リアルタイムでの動力学的Ｏ２輸送を空間的に分析することのできるハイパースペクトル光学画像処理システムを使用して、所与のＰＥＭ構築物が平均および最小腫瘍酸素圧（ｐＯ２）を変更する効力を評価する１５１、１５４、１５６、１５８。平均ｐＯ２は、以前に研究されており、他の技術によって容易に測定されるが、空間的に分布した最小腫瘍ｐＯ２はおそらく、腫瘍形成を推進し、腫瘍が有効な治療をかわす助けとなるがん幹細胞ニッチをもたらす最大の原因である１５１、１５４、１５５、１８９。ハイパースペクトル光学画像処理システムでは、動力学的ｐＯ２のリアルタイムでの空間マッピングが可能になり、低腫瘍ｐＯ２区域のＰＥＭモジュレーションの度合いの可視化および定量化に使用される。加えて、穏やかな局在化腫瘍加熱によって、長くとも数時間で固形腫瘍中の血管孔径が増して、ナノ粒子管外遊出が促進される１９０、１９１。そのため、局在化腫瘍温熱療法により、ＰＥＭによるＯ２送達をさらに増加させることができる。最後に、ＰＥＭに関連したミオグロビン尿およびこれがクレアチニンクリアランス（ＣＣｒ）に及ぼす影響をモニターして、処置後の急性腎毒性を評価する。
【０２５０】
動物の保管、取り扱い、およびＰＥＭ注射：
【０２５１】
マウスを購入し、適切な動物施設に収容する。処置のおよそ１週間前に、各動物に、背側皮膚折り畳みウィンドウチャンバーを外科的に埋め込む。外科的手順の際、マウスの背部または側腹部に１０，０００個の４Ｔ１乳癌細胞を注射する。これらの細胞は、ＲＦＰを構成的に発現するように操作されており、ＧＦＰ発現は、ＨＩＦ−１活性に応じて誘導される１９２。腫瘍をおよそ１週間成長させ、この時点で腫瘍は、低酸素性になるのに十分な大きさであり、ＨＩＦ−１活性を有する１５８。１００μＬのＰＥＭ懸濁液を上述のとおりに調製し、ｔ＝０およびｔ＝２４ｈの時点で尾静脈から注射する。こうした実験パラメーターによって、およそ２４時間でピークに達すると予想される、血管周囲空間に蓄積されたＰＥＭの効果の評価が可能になる。温熱療法研究については、特別な収容ユニットを使用して、ウィンドウチャンバー／腫瘍温度を様々に変化させる１９０、１９１。
【０２５２】
ＰＥＭによる動力学的腫瘍酸素モジュレーションの可視化および定量化：
【０２５３】
上で指定した時点においてハイパースペクトル画像処理を使用して、腫瘍ｐＯ２の修飾に対する様々なＰＥＭ構築物の効果を評価する。温度は、３４〜４２℃の間に調整する１９０、１９１。Ｍｂ吸収のハイパースペクトル画像処理を使用して、Ｍｂ  Ｏ２飽和度を定量化する１５８一方、ホウ素ナノ粒子蛍光および燐光の比率計測評価を使用して、絶対腫瘍ｐＯ２を定量化する１５３。ＨＩＦ−１活性も、ＧＦＰ発光の測定によって評価する。これにより、血管および組織両方の酸素化と、腫瘍低酸素表現型の存在の定量化が、個々に、また同時に可能になる。
【０２５４】
（実施例Ｖ）
【０２５５】
上で論じたとおり、生物学的に活性のある酸素担体を高濃度で示す、様々な実施形態ナノ粒子は、ヒト乳がんの動物モデルの循環に注射されたとき、腫瘍中に蓄積しうる。こうした動物の腫瘍内で、ナノ粒子は、がん細胞の広範にわたる血管流遮断、出血、および壊死をもたらしうるが、正常組織に対する明らかな毒性の副作用はもたらさない。
【０２５６】
以下で論述する特定の例となる実施形態では、次の一般的手技をネズミモデルに使用してよい。
【０２５７】
治療薬投与の際の麻酔：
【０２５８】
麻酔は、画像処理については、イソフルラン（isofluorane）（ノーズコーンから１．５〜２．５％）を使用して行うことができる。外科的手順については、ケタミン／キシラジン（１００／１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を使用することができる。動物は、麻酔が適正な深さかどうか、足指つねり応答および呼吸数によってモニターすることができる。循環水式加熱パッドを使用して、動物の適正な体温を維持することもできる。保湿軟膏を動物の目にあてがってもよい。
【０２５９】
動物へのＰＥＭ注射：
【０２６０】
ＰＥＭおよび空のポリマーソーム（すなわち、陰性対照）は、無菌の優良試験所基準（ＧＬＰ）条件下で、ＵＳＰ０．９％ＮａＣｌ中に調製することができる。各注入物の粘性、ｐＨ、およびモル浸透圧濃度を測定し、血液の標準の生理学的範囲内（例えば、４〜５ｋＰａ、ｐＨ７．４、２９０ｍＯｓｍ）にあることを検証する。蓄積後の誘発された腫瘍特異的ＮＭＥへの化合物の臨床適用が予想され、高めの用量では全身の血管作用の潜在的可能性が懸念されるため、ゆっくりとした静脈内（ＩＶ）注射を５〜１０分かけて使用することができる。優先的には翼状針を使用することができるが、静脈内カニューレを表在静脈の適所にテープで留めてもよく（短期）、または使用前のある時期に外科的に配置してもよい（より長期または多数回の注射、例えば、３サイクルの毎週の適用に）。初回注入は、１０ｍｌ／ｋｇの体積、１ｍｌ／ｋｇ／分の速度で試みることができるが、正確なＰＥＭ濃度を決めないまま、これらの数字を増やしてもよい。著しい苦痛または肺病変の発症を回避するために、５ｍＬ／ｋｇ／分で注入される２０ｍＬ／ｋｇの最大体積を設定することができる。
【０２６１】
採血：
【０２６２】
（以下の毒性評価のように）様々な用量およびスケジュールのＰＥＭで処置される動物の毒物動態学研究には、頻繁な採血が必要となる場合もある。麻酔薬の必要なしに循環血液体積の７．５％を取り去ることが可能であるため、外側足根（伏在）静脈採血を優先的に使用することができる。マウスが関与する研究については、０．１ｍＬの採血になるといえる（２５ｇのマウスの合計血液体積は１．８ｍＬである）。伏在静脈は、足根関節の外側面にあり、毛を剃り、その区域をアルコールで拭いた後に容易に位置を探し当てることができる。動物をプラスチック管などの適切な抑制物に入れ、作業者は、後肢を伸ばすことができる。静脈は、関節に軽く圧力をかけて浮き上がらせることができ、溶血なしに十分に急速な血液回収を可能にする最小ゲージの針（例えば、マウスには２５〜２７ゲージ）を使用して、血管に穴を開ける。小さい体積については、単純な穿刺によって、穿刺部位において直ちに血液の滴が形成され、ミクロヘマトクリット管を使用して、標準体積を収集することができる。血液を収集してしまった後、部位にかかる圧力は、さらなる出血を止めるのに十分となりうる。痂皮を除去すると、連続的な試料採取を可能にすることができる。毎週を超えない頻度で行われる採血については、取り去られる１採取当たりの最大体積を、循環体積の１０％（マウスでは０．２ｍＬ）に設定することができる。３週間毎を超えない頻度で行われる採血については、取り去られる１採取当たりの最大体積を、循環体積の２０％（マウスでは０．４ｍＬ）に設定することができる。屠殺時の終末採血については、全身麻酔下で心臓穿刺を用いてよい。
【０２６３】
毒性評価：
【０２６４】
評価を行うことのできる動力学的パラメーターおよびエンドポイントとしては、臨床徴候（最初の６時間は毎時、次いで３日間は１２時間毎、その後は毎週）、体重および変化（１週間に２〜３回）、摂食量（１週間に２〜３回）、簡易機能観察総合評価（１週間に２〜３回）、眼科的評価（１週間に２〜３回）、血清学プロファイル（（毎週）行われる血液学、凝血、臨床化学、尿検査）、毒物動態学的パラメーター（最初の６時間は毎時、次いで３日間は１２時間毎、その後は毎週）、肉眼的剖検所見（３サイクルが完了してからの屠殺後）、臓器重量（屠殺後）、および組織病理学的検査（屠殺後）が挙げられる。
【０２６５】
ウィンドウチャンバー外科手術：
【０２６６】
動物は、１００／１０ｍｇ／ｋｇのケタミン／キシラジンで麻酔してよい。Ｅｘｉｄｉｎｅ溶液を使用して動物の皮膚を消毒し、７０％のエタノールで洗い流してよい。無菌領域において、動物の背側皮膚を金属のＣ形枠に縫合することができ、次いでチタン金属枠を外科的に挿入し、適所に縫合することができる。皮膚の１２ｍｍの円形切片を切除してよい。次いで、２０マイクロリットルのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させたおよそ１０，０００個のＲＣＣ細胞を、この時点では目に見える、下にある皮膚の裏面に注射することができる。次にカバーガラス窓を挿入し、ばね押しの金属環で適所に固定することができる。その後Ｃ形枠は取り除いてもよく、動物を麻酔から回復させることができる。加熱したワックスパッドを使用して、手順の間を通じて温度を維持することができる。疼痛緩和に必要となるため、外科手術後直ちに、次いで外科手術後８〜１２時間の時点で、ブプレノルフィンを皮下注射することができる。
【０２６７】
ＮＭＥを画像処理する：
【０２６８】
スカベンジング系が活発である動物をイソフルランを使用して麻酔し（ノーズコーンから１．５〜２．５％）、画像処理台の適切な場所に置いてよい。バシトラシン／ネオマイシン／ポリミキシンＢ（ＢＮＰ）懸濁液を局所的に適用してよく、ヘモグロビン飽和度および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（ＨＩＦ−１）蛍光を３０分まで画像処理して、ベースライン酸素化レベルを確立することができる。画像処理は、蛍光顕微鏡（例えば、Ｚｅｉｓｓ）を使用して行うことができる。４２℃の温熱療法処置を１時間施してよく、その後、動物にＰＥＭ懸濁液（例えば、１００μＬ）を尾静脈注射してよい。画像処理は、１時間継続してよく、２回目のＰＥＭ用量を２４時間の時点で送達して、追跡画像処理セッションを、処置後２４および４８時間の時点で実施することができる。各時点についての合計画像処理および処置時間は、２時間未満でよい。
【０２６９】
スニチニブの投与：
【０２７０】
スニチニブマレイン酸塩（ＶＥＧＦＲ  ＴＫＩ）は、購入することができる（例えば、ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（日本国）から、ＵＳＰ９９％）。経口製剤は、Ｃｒｅｍｅｐｈｏｒ  ＥＬ／エタノール（５０：５０）溶液中に、４倍濃縮（例えば、２０ｇのマウスには３．２ｍｇ）によって、調製することができる。この４倍濃縮の原液は、毎日新たに調製してよい。最終の投与溶液は、使用当日に、無内毒素蒸留水で通常濃度に希釈することにより生成し、ボルテックス撹拌によって混合してから直ちに、経口投与によって、１日４０ｍｇ／ｋｇ（２０ｇのマウスには０．８ｍｇ）で投与することができる。
【０２７１】
ルシフェラーゼ画像処理による腫瘍成長のモニタリング：
【０２７２】
ルシフェラーゼを構成的に発現するように操作されている７８６−Ｏ細胞を利用して、同所性に異種移植されたＲＣＣ腫瘍保持動物を生成することができる。ルシフェラーゼ画像処理を使用すると、腫瘍サイズをモニターし、転移を追跡することができる。処置の初日から出発して、１週間に２回〜３回、腫瘍ルシフェラーゼ強度および体重を記録してよい。腫瘍体積は、ルシフェラーゼからの合計放射輝度を腫瘍体積と関係付ける予備的な検量線から決定することができ、動物は、画像処理にかけ、次いで屠殺して、腫瘍体積を直接測定することができる。
【０２７３】
ＶＥＧＦＲ  ＴＫＩ抵抗性疾患の確立：
【０２７４】
同所性に異種移植されたＲＣＣ腫瘍保持動物を作製し、経口スニチニブ（１日当たり４０ｍｇ／ｋｇ）で毎日処置することができ、処置は、腫瘍が１００ｍｍ３に達したときに開始し、その初期サイズの１．５倍に成長するまで継続してよい。次いで、テムシロリムス使用および／もしくは不使用でのＰＥＭ、または対照ナノ粒子のさらなる治療投与を実施することができる。
【０２７５】
ＰＥＭ製剤の潜在的な毒性、投与量、および動力学的測定値
【０２７６】
様々な実施形態研究において、対照（すなわち、ポリマーソームのみまたはミオグロビンのみ）に対してＰＥＭが注射されたマウスからの包括的な血清化学パネルおよび肝臓組織学を行うことができる。ＲＣＣのＮＭＥを誘導するのに必要なＰＥＭの最小有効用量（ＭＥＤ）を突き止めることもできる。別の治療研究では、用量制限毒性（ＤＬＴ）が見出されなければ、安全な投与のためのその最大用量を、ＳＴＤ１０（１０％の動物における重度毒性用量）またはＭＴＤ７５（７５％の動物において体重減少が１５〜２０％未満にしかならない、最大耐用量）のいずれかとして設定することができる。
【０２７７】
ＰＥＭ構築物を開発する：
【０２７８】
様々な実施形態において、ミオグロビン被包効率が５０％より高く、被包ミオグロビンのポリマーに対する重量比が５ｗｔ％より高く、溶液メトミオグロビンレベルが総ミオグロビンの５％未満となっており、懸濁液粘度が３〜４ｃＰの間であり、Ｐ５０が遊離ミオグロビンと類似しており、ＮＯ結合速度定数が、遊離ミオグロビンについて測定されたものより１桁小さい、ＰＥＭ構築物を開発することができる。このようなＰＥＭ構築物は、生体適合性のポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）コポリマーを使用して開発することができる。さらに、このようなＰＥＭ構築物は、いくつかの生分解性コポリマーのいずれかを使用して開発することもできる。ミオグロビンの被包は、薄膜再水和、薄膜直接再水和、電気穿孔、および直接再水和を含む方法を使用して実現することができる。
【０２７９】
特に、改良された直接水和法を用いると、ミオグロビン負荷およびミオグロビン被包効率を最大にすることができる。温度、混合比、音波処理力／時間、およびミオグロビン還元を含めたいくつかの変数を変化させて、ＰＥＭ製剤におけるミオグロビン負荷を最適化することができる。図１１および１２は、一部の実施形態によるＰＥＭ製剤の生成および測定のステップを例証するものである。図１１に示すとおり、同等の量のＯＢ１８およびＰＥＧポリマー（Ｍｗ＝５００Ｄａ、「ＰＥＧ５００」）を９５℃で１時間加熱した後、十分に混合し、試料を室温（ＲＴ）に冷却することができる。１０ｍｇの還元ミオグロビンの溶液（１０ｍＭのｐＨ７．４  ＰＢＳ中１５０ｍｇ／ｍＬのメトミオグロビン（メトＭｂ））を加え、１ｗｔ％の亜ジチオン酸ナトリウムを加えて還元することができる。混合物を撹拌し、室温で０．５時間音波処理することができ、滴定されたアリコート（１０、２０、５０、および最終１００ｎｌ）の還元Ｍｂ溶液を加えてポリマー懸濁液をさらに希釈し、各希釈ステップ後に十分な音波処理にかけることができる。試料を４℃の無菌ＰＢＳ緩衝液に対してさらに透析し、得られたＰＥＭ製剤を動的光散乱（ＤＬＳ）によって特徴付けて、サイズを決定することができる。試料を極低温透過型電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）にかけて、形態を検証することができる。
【０２８０】
図１２の一組のグラフに示すとおり、試料をさらにＵＶ−ｖｉｓ分光測定にかけて、最終ＰＥＭ構築物におけるＭｂの最終濃度およびＭｂのポリマーに対する重量百分率（ｗｔ％Ｍｂ／ポリマー）を算出することができる。機能性Ｍｂの試料濃度は、誘導結合プラズマ発光分光分析法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）を使用してＰＥＭ懸濁液中の鉄含有量を測定することにより別個に検証することもでき、ＵＶ−Ｖｉｓデータと十分に相関する（ｗｔ％  Ｍｂ／ポリマー＝ＵＶ−Ｖｉｓで６％、ＩＣＰ−ＯＥＳで８％）。粒径は、ポリマー組成および分子量を選択することで、直径１００〜２００ｎｍの間に揃えることができる。
【０２８１】
ポリマーソームの外表面と内表面は、親水性ポリマー（ＰＥＧ）で構成されているため、ミオグロビンは、水性の空洞内に被包され、ポリマーソームの表面に結合しうる。純粋なＰＥＭを得るには、プロナーゼ（すなわち、タンパク質を個々のアミノ酸に消化する、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓから単離された様々なプロテイナーゼの混合物）を使用するタンパク質分解によって、表面に会合したミオグロビンを除去することができる。プロナーゼは、ポリマーソーム二層膜を越えることができないため、これを使用して、被包されたＭｂに影響を与えないまま、表面に会合したすべてのミオグロビンを消化することができる。簡潔に述べると、ＰＥＭ試料にプロナーゼ溶液を加えて、最終酵素濃度を４ｗｔ％としてよい。溶液を室温で少なくとも２時間さらに混合し、遠心分離し、透析して、酵素を除去することができる。引き続いて、ＰＥＭ懸濁液中の保持されたＭｂを定量化し、３ｗｔ％Ｍｂ／ポリマー（ＵＶ−Ｖｉｓによる）〜５ｗｔ％Ｍｂ／ポリマー（ＩＣＰ−ＯＥＳによる）の間であることが分かった。
【０２８２】
直接水和を利用すると、生分解性のＰＥＯ−ｂ−ポリ（カプロラクトン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ）およびＰＥＯ−ｂ−ポリ（ＰＣＬ／トリメチレンカーボネート）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＴＭＣ）コポリマーから生成される小さいＰＥＭ組成物（すなわち、直径１００〜１５０ｎｍ前後）を得ることもできる。ミオグロビン／ポリマーｗｔ％ならびにミオグロビン被包効率は、生体適合性および生分解性ＰＥＭ製剤の両方で同様となりうる。
【０２８３】
ミオグロビン中の鉄は、大気条件に曝露されると酸化してＦｅ３＋になる。したがって、Ｏ２／ＮＯ結合を可能にするために、亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）などの様々な薬剤を使用して、メトミオグロビンを化学的に還元することができる。還元ミオグロビンを使用することで、メトミオグロビンの利用によって実現可能な程度より、ＰＥＭの生成が効率的になり、収率も高くなりうる。メトミオグロビンは、ＰＥＭ生成より前に（１ｗｔ％のＮａ２Ｓ２Ｏ４によって）オキシミオグロビンに還元することができるが、大部分のＰＥＭは、長期貯蔵後に、メトミオグロビンに再酸化しかねない。したがって、ＰＥＭを再び還元してオキシミオグロビンに戻した直後に、注入することができる。様々な実施形態において、このような再還元は、希薄量のＮａ２Ｓ２Ｏ４中で音波処理してから透析することからなる方法によって行うことができ、音波処理力および時間の影響を調べ、最適化することができる。さらなる酸化を回避するために、還元型ＰＥＭは、動物研究に直ちに使用してよい。
【０２８４】
気体の平衡結合：
【０２８５】
ＰＥＭおよび遊離Ｍｂ分散物の酸素平衡結合曲線は、Ｈｅｍｏｘ（商標）アナライザーを使用して生理的温度（３７℃）で測定することができる。簡潔に述べると、試料は、圧縮空気を使用して１４７ｍｍＨｇのｐＯ２に飽和させ、次いで圧縮窒素流を使用して脱酸素化してよい。酸素化および脱酸素化された試料のＵＶ−Ｖｉｓ吸光度測定値を、二波長分光法によるｐＯ２の関数として記録することができる。酸素−ＰＥＭ／ミオグロビン平衡曲線は、４パラメーター（Ａ０、Ａ∞、Ｐ５０、ｎ）Ｈｉｌｌモデルに適合させることができる。
【化３９】
0006764864.tif 000042
式中、Ａ０およびＡ∞は、それぞれ０ｍｍＨｇおよび完全Ｏ２飽和での吸光度を表す。ｐＯ２は、Ｏ２の分圧を表し、Ｐ５０は、ＰＥＭ／Ｍｂが５０％酸素飽和である場合のＯ２の分圧を表す。最後に、「ｎ」は、ＰＥＭ／Ｍｂの協同性係数を表す。例となる研究において、タンパク質分解の前（ＰＥＭ−ＳＥ）および後（ＰＥＭ−Ｅ）のＰＥＭについてのＰ５０は、それぞれ７．９および１７．１ｍｍＨｇになることが分かり、両方とも、遊離ＭｂのＰ５０（約２ｍｍＨｇ）より有意に高かった。これらの結果を図１３Ａに示すが、図１３Ａは、ミオグロビンがポリマーソームの表面上と水性の空洞中の両方で会合しているＰＥＭ（すなわち、ＰＥＭ−ＳＥ）、ミオグロビンがポリマーソームの水性の空洞中でのみ会合しているＰＥＭ（すなわち、ＰＥＭ−Ｅ）、および遊離ミオグロビンの酸素飽和度を、酸素の分圧の関数として例証する。遊離ミオグロビンより低いＰＥＭのＯ２親和性（より高いＰ５０）は、ポリマーソーム膜の遮蔽効果に起因するといえ、この効果はさらに、ＰＥＭへのＯ２結合の動力学を遅らせることも分かった。
【０２８６】
様々な実施形態において、様々な気体リガンド（Ｏ２およびＮＯ）のＰＥＭおよび遊離ミオグロビンに対する結合／放出の動力学的測定は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ  ＳＸ−２０微小体積ストップトフロー分光光度計を使用して行うことができる。動力学曲線の例となる測定値を一次指数式に当てはめて、仮の速度定数を回帰推定し、仮の速度定数は、ＮＯの場合では一次になり、Ｏ２解離についてはゼロ次になることが分かった。異なるＮＯ濃度での動力学的時間経過を測定することにより、見かけの一次速度定数をＮＯ濃度に対してプロットし、適合した線の傾きから、ＮＯ脱酸素化についての二次速度定数を得た。図１３Ｂは、被包されていないおよび表面に会合しているすべてのミオグロビンがタンパク質分解によって除去されており、残存するミオグロビンが１．５ｍｇ／ｍＬのＮａ２Ｓ２Ｏ４の存在下でオキシミオグロビンに還元されているＰＥＭのＯ２解離時間経過を示す。
【０２８７】
図１４は、様々なＰＥＭ製剤についての酸素解離（Ｋｏｆｆ，Ｏ２）およびＮＯを媒介とする脱酸素化（Ｋｏｘ，ＮＯ）の動力学的速度定数を、遊離（被包されていない）ミオグロビン（Ｍｂ）と比較して示す表である。
【０２８８】
図１３Ｃは、被包されていないおよび表面に会合しているすべてのミオグロビンがタンパク質分解によって除去されており、残存するミオグロビンがオキシミオグロビンに還元されているＰＥＭの、ＮＯを媒介とする脱酸素化についての動力学的時間経過を示す。脱酸素化反応からの吸光度を、０．１ＭのｐＨ７．４リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中、２０℃にて、４３７．５ｎｍで観測した。ＰＥＭのＮＯ脱酸素化時間経過は、酸素化されたＰＥＭ（７．５μＭヘム）と適切な希釈度のＮＯ保存溶液を速やかに混合した後の４２０ｎｍおよび２０℃での吸光度変化をもとに取得した。
【０２８９】
様々な実施形態において、ＰＥＭ−ＳＥおよびＰＥＭ−Ｅの酸素解離定数（Ｋｏｆｆ，Ｏ２）およびＮＯ脱酸素化定数（Ｋｏｘ，ＮＯ）は、遊離ミオグロビンの定数より有意に小さくなりうる。このような差は、環境中でＰＥＭと気体リガンドの間の障壁として効果的に働き、それによってＯ２解離、ＮＯ脱酸素化、およびこうした気体のＰＥＭへの平衡結合を遅らせることのできる、厚いポリマーソーム膜の遮蔽効果のためであるといえる。遮蔽効果は、表面会合と被包両方のミオグロビンを有するポリマーソーム（ＰＥＭ−ＳＥ）における気体リガンドの動力学的および平衡結合に、プロナーゼで処理して非特異的に結合した表面ミオグロビンが除去されているＰＥＭ製剤（ＰＥＭ−Ｅ）に比べて差が認められたこととも一致する。表面に会合しているミオグロビンは、曝露された気体と急速に反応することがあり、したがって、ＰＥＭ−ＳＥは、ＰＥＭ−Ｅより高いｋｏｆｆ，Ｏ２を示しうる。全体として、ＰＥＭは、ＲＢＣに結合したヘモグロビンより高く、遊離ミオグロビンより低いＯ２親和性を示しうる。遊離（被包されていない）ミオグロビン（Ｍｂ）と比較した、様々なＰＥＭ製剤についての酸素解離（Ｋｏｆｆ，Ｏ２）およびＮＯを媒介とする脱酸素化（Ｋｏｘ，ＮＯ）の動力学的速度定数の例は、図１４の表に示す。
【０２９０】
様々な実施形態において、陰性対照は、近赤外（ＮＩＲ）ミオグロビンを使用して調製してもよい。例えば、近赤外フルオロフォア（ＩＲＤｙｅ８００ｃｗ  ＮＨＳ）を、ウマ骨格ミオグロビン上のリシンに共有結合を介して取り付けて、対照ＮＩＲミオグロビンを形成することができる。マウスモデルにおいて、３０Ｇ針を使用して尾静脈にカテーテルを挿入することができ、ヘパリン添加食塩水、空のポリマーソーム（第１の対照）、ＮＩＲミオグロビン（第２の対照）、およびＰＥＭ懸濁液を、静脈内（ＩＶ）注射によって投与してよい。注射した後、カテーテルをヘパリン添加食塩水でフラッシュして、正確な投与を確実にすることができる。
【０２９１】
例となる研究の結果
【０２９２】
例となる研究において、０．５×１０６〜１×１０６個の４Ｔ１マウス乳癌細胞を、ｂａｌｂ／ｃマウスの乳房脂肪パッドに注射した。腫瘍が直径５ｍｍより大きくなったなら、マウスを無作為化し、尾静脈カテーテルを通してＰＥＭ（５０ｍｇ／ｍＬのポリマー懸濁液に対応する２．５ｍｇ／ｍＬのＭｂを１００μＬ）、空のポリマーソーム（同等のポリマー用量）、およびＮＩＲ−Ｍｂ（同等のミオグロビン用量）で処置した（１群当たりｎ＝５）。ＮＩＲ−ＭｂおよびＰＥＭは、上で論じたプロトコールに従って、処置の前に、そのオキシミオグロビン形態に還元した。マウスは、（体内分布／薬動学的研究のために）２４時間の時点または（腫瘍有効性研究に続く組織学および毒性学評価のため）に６〜９日の時点で屠殺した。どちらの場合でも、低酸素の染色にはＥＦ−５を、潅流にはＨｏｅｃｈｓｔ溶液を使用した。腫瘍を屠殺時に採取した。免疫蛍光法（ＩＦ）を実施して、腫瘍全域のＥＦ−５およびＨｏｅｃｈｓｔ分布を画像処理した。同じ腫瘍切片を、免疫組織学的（ＩＨＣ）分析のためにヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）でも染色した。血液を屠殺時に心臓穿刺によって採取し、血漿を単離し、後の分析のために−８０℃で保管した。
【０２９３】
図１５Ａは、静脈内注射後の時点のＮＩＲ−Ｍｂ、空のポリマーソーム、およびＰＥＭの体内分布、腫瘍蓄積、および薬動学を示す。空のポリマーソームおよびＰＥＭ構築物は、蛍光ＮＩＲ色素（ＰＺｎ３）が組み込まれて、粒子体内分布のｉｎ  ｖｉｖｏ光学画像処理、ならびに蛍光シグナルの定量化による血漿濃度の薬動学的決定が可能になっており、蛍光シグナルは、引き続いて、初期蛍光値と比較し、投与前にＩＣＰ−ＯＥＳによって決定されたＭｂ濃度と相互に関係付けた。図１５Ｂに、空のポリマーソーム、ＰＥＭ、およびＮＩＲミオグロビンのそうした血漿濃度を時間の関数として示し、図１５Ｃに、相互に関係付けられたミオグロビン濃度を時間の関数として示す。図１５Ａ〜１５Ｃに例証されるとおり、ＰＥＭの取込みおよび薬動学は、空のポリマーソームのそれと似通っていると思われ、急速な分布期、緩慢なクリアランス期、およびおよそ１５時間の全般的な血漿半減期が実証された。他方、ＮＩＲ−Ｍｂは、遊離Ｍｂの既知の体内分布およびクリアランスから予想されるとおり、極めて急速な血漿クリアランス（腎臓を経由して膀胱へ）を示した。
【０２９４】
すべての体内分布研究について、ポリマーソーム、ＮＩＲ−Ｍｂ、およびＰＥＭのＮＩＲ画像処理は、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＸＧＩ−８ガス麻酔システムを備えたＭＳ（登録商標）Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＡｅＸ＝７４５ｎｍ、Ａｅｍ＝８１０〜８７５ｎｍ）を用いて行った。蛍光画像は、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（登録商標）４．２ソフトウェアを用い、目的の範囲（ＲＯＩ）の放射効率を測定することにより分析した。放射効率（［光子／秒］／［μＷ／ｃｍ２］）は、不均一な励起および曝露時間の差について補正して、試料間の測定に整合性をもたらしている。
【０２９５】
薬動学的研究については、（５．５ｍｍのランセット、Ｇｏｌｄｅｎｒｏｄを使用して）マウスの顎下静脈から１５〜１００μＬの血液試料を採取し、ヘパリン処理された毛細管（Ｋｉｍｂｌｅ）に直接収集した。毛細管を３〜５分間遠心分離し、ＭＳ（登録商標）Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して直ちに画像処理した。各毛細管中の血漿の合計放射効率を、寸法の一致した目的の範囲において測定した。既知の濃度のＰＺｎ３負荷発光性ポリマーソームの溶液を未処置血漿に加え、毛細管からの蛍光を測定することにより最初に決定された検量線をもとに、ＰＥＭおよび空のポリマーソームの血漿濃度を算出した。薬動学的結果を、時間に対するＰＥＭおよび空のポリマーソームの血漿濃度としてプロットした。時間に対するミオグロビン濃度は、注射後にすべてのミオグロビンがＰＥＭと会合したままであると仮定して、それぞれＰＥＭのＰＺｎ３蛍光およびＮＩＲ−ＭｂのＩＲＤｙｅ８００蛍光をもとに推定した。
【０２９６】
ＰＥＭ投与に対する正所性腫瘍応答：
【０２９７】
図１６に示すとおり、およそ３〜６時間以内に、５例のうち５例の腫瘍が、（周囲の正常組織で見られるような）その初期のピンク色から濃赤色または黒色に変化し始めた。こうした結果は、（Ｚｅｎａｌｕｘ，Ｉｎｃ．によるＺｅｎａｓｃｏｐｅから）光学分光法によって評価されるＲＢＣ結合型ヘモグロビン（Ｈｂ）の蓄積と対応する。分光法の結果は、図１７に示し、ＰＥＭ、空のポリマーソーム、およびＮＩＲミオグロビン製剤について、合計ヘモグロビン濃度を時間の関数として提供している。特定の理論に囚われるつもりはないが、この現象は、ＰＥＭが引き起こした腫瘍血管閉塞およびナノ粒子媒介微小血管塞栓形成（ＮＭＥ）によるものであるといえる。ＰＥＭによって誘導されるＮＭＥは、肝臓、脾臓、またはＰＥＭ体内分布の他の正常組織では見られておらず、したがって、腫瘍特異的であることが示される。
【０２９８】
微小血管レベルでのＰＥＭ活性の高解像ウィンドウチャンバー研究：
【０２９９】
以前に記載したとおり、背側皮膚フラップウィンドウチャンバーを使用して、腫瘍微細環境を画像処理した。ウィンドウチャンバー研究を実施するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを剪毛し、外科手術前にＮａｉｒを適用した。外科手術の際、１〜１．５×１０５個の４Ｔ１細胞を筋膜に注射した。外科手術から７〜９日で、ウィンドウ内に腫瘍が見えるようになった。次いで、マウスに、尾静脈カテーテルから、空のポリマーソームまたはＰＥＭに対応する５０ｍｇ／ｍＬのポリマー懸濁液１５０〜２００μＬによる処置を施した。マウスをノーズコーンからイソフルランで麻酔し、ウィンドウを顕微鏡の台に固定した。処置の注射の前および最中、ならびに実験中の４８時間までの様々な時点において、画像処理を実施した。
【０３００】
空のポリマーソームおよびＰＥＭ構築物について、その膜内のＰＺｎ３フルオロフォアからのＮＩＲ発光の蛍光画像処理を使用して、ウィンドウチャンバー内で画像処理した。明視野像も、一定期間にわたり収集した。ハイパースペクトル画像処理を使用して、血液におけるＨｂ吸光スペクトルをもとにヘモグロビン濃度および酸素飽和度を求めた。明視野照明と共に、同調可能な液晶フィルターを使用して、５００〜６２０ｎｍにかけて像を収集した。ＭａｔＬａｂを使用して各画素のスペクトル逆重畳積分を実施して、酸素化ヘモグロビン飽和度の画像を作製した。腫瘍の血行力学的特性も研究した。ウィンドウチャンバーにおける血流の映像を、ヘモグロビンが高い吸収を有する５６０ｎｍに設定した同調可能なフィルターを用いて撮影した。画素単位での相互相関を映像に適用し、ＭａｔＬａｂを使用して分析して、腫瘍血管内の流速マップを作製した。
【０３０１】
図１８Ａは、ＰＥＭおよび空のポリマーソームで処置している間の典型的なマウス腫瘍を示す。血管閉塞は、ＰＥＭを投与してから１時間以内に明白になり、時間と共により激しくなる。４時間の時点までに、腫瘍範囲の黒ずみが顕著になり、４８時間まで激しさは増し続ける。
【０３０２】
図１８Ｂは、ＰＥＭを投与してから２４時間後の、図１８Ａに示す腫瘍の明視野像（左）およびＰＺｎ３を使用している近赤外（ＮＩＲ）蛍光像（右）を示し、ＮＩＲ蛍光は、腫瘍内のＰＥＭの局在に対応する。
【０３０３】
図１９Ａおよび１９Ｂは、それぞれ、代表的な腫瘍についてのヘモグロビン飽和度および血流速度マップを示す。これらのマップそれぞれには、ＰＥＭおよび空のポリマーソーム（対照）での処置の前および後の代表的な腫瘍を示している。ＰＥＭ処置の結果、処置後の酸素化ヘモグロビン飽和度が実質的に低下するだけでなく、血流の減少も著しくなり、血流減少は、時間と共に激しさがより顕著になる。こうした結果は、空のポリマーソーム処置では見られない。
【０３０４】
切除された腫瘍の結果がＰＥＭによって誘導されるＮＭＥを実証する：
【０３０５】
図２０は、切除された腫瘍の代表的な免疫組織化学（ＩＨＣ）ならびにヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）像を、ＮＩＲミオグロビン対照およびＰＥＭ処置動物について例証する。ＰＥＭ処置動物では、腫瘍切片の過半を占める、広々と強調された壊死の区域に加えて、腫瘍のＮＭＥに対応する、潅流された血管のほぼ完全な遮断が存在する。こうした効果は、空のポリマーソームの投与では見られなかった。
【０３０６】
図２１は、次の処置：ＮＩＲミオグロビン（対照）、空のポリマーソーム（対照）、およびＰＥＭのそれぞれを注射した一組の腫瘍保持マウス（処置当たりｎ＝５マウス）について行った血清化学パネルの結果を提供する。個々の値の多少の上昇が群全体に分布していたものの、ＰＥＭまたは対照処置に関係なく、いずれかのパラメーターについて一貫したレベルの上昇はなかった。
【０３０７】
肝臓は、ポリマーソーム／ＰＥＭ蓄積の主要な臓器であり、したがって、正常組織に対する、対応する微小血管損傷があるかを判定するために、肝臓の組織学を実施することができる。例となる研究において、各処置懸濁液は、注入前にＮａ２Ｓ２Ｏ４と混合して、オキシミオグロビンを再生させることができる。動物に、この（ＰＥＭとＮａ２Ｓ２Ｏ４の）溶液混合物での直接の注射、ならびに透析されたＰＥＭ懸濁液（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４が除去されている）での注射の両方を施して、増強効果があるかを判定した。ＰＥＭおよび空のポリマーソーム（対照）で処置した、正所性に４Ｔ１が異種移植されたマウスからの肝臓も、Ｈ＆Ｅ染色および顕微鏡検査のため、（処置から６〜９日後、腫瘍注射から１４〜１７日後）屠殺後に切除した。各処置懸濁液を、同じく注入前にＮａ２Ｓ２Ｏ４と混合して、オキシミオグロビンを再生させた。動物に、この溶液混合物（ＰＥＭとＮａ２Ｓ２Ｏ４）での直接の注射、ならびに透析されたＰＥＭ懸濁液（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４が除去されている）での注射の両方を施して、増強効果があるかを判定した。図２２Ａおよび２２Ｂは、ＰＥＭおよび空のポリマーソームで処置した腫瘍マウスから切除された肝臓の、それぞれ２０倍の倍率および４０倍の倍率のＨ＆Ｅ像である。これらのＨ＆Ｅ像に示されるとおり、任意の製剤から肝毒性が認められ、ここでも、ＰＥＭによって誘導されるＮＭＥの腫瘍特異性が確認された。
【０３０８】
（実施例ＶＩ）
【０３０９】
ＰＥＭの作用（すなわち、腫瘍に対するそのＮＭＥ効果）の、提唱されている機序に基づけば、ＰＥＭは、最も高度に血管化した腫瘍のファーストライン療法として特に有効となりうる。例となる標的は、化学療法抵抗性であるが、血管新生を阻害するがん治療薬には応答性である、明細胞ＲＣＣ（ＣＣ−ＲＣＣ）としてよい。様々な実施形態において、ＲＣＣのマウスモデルを使用して、ＲＣＣ腫瘍の選択的なＮＭＥの促進およびその成長の阻害におけるＰＥＭの有効性を試験してもよい。
【０３１０】
様々な研究において、免疫無防備状態のマウス（ＮＣｒ  ｎｕ／ｎｕ）におけるヒトＲＣＣ腫瘍細胞の異所性および正所性異種移植片および／またはマウスＲＣＣ腫瘍細胞の同種移植片を使用して、ＲＣＣのマウスモデルを生成することができる。上で論じたとおり、ＰＥＭは、１０〜１５ｍｇ／ｋｇのＭｂ（２００〜３００ｍｇ／ｋｇのポリマーに対応する）で１回の投与後に、腫瘍特異的ＮＭＥを誘導することができる。ＲＣＣに対するその有効性を確立するために、最小限の毒性で最大の効果を実現する最適な用量レベルを決定することができる。
【０３１１】
図２２Ｃは、ＰＥＭで処置する少し前および処置からおよそ２８時間後のマウスＲＣＣ腫瘍を示す。その初期の（周囲の正常組織で見られるような）淡色から暗色への色の変化は、（Ｚｅｎａｌｕｘ，Ｉｎｃ．によるＺｅｎａｓｃｏｐｅから）光学分光法によって評価されるＲＢＣ結合型ヘモグロビン（Ｈｂ）の蓄積に対応しうる。比較として、図２２Ｄは、空のポリマーソームでの処置の少し前および処置からおよそ２８時間後のマウスＲＣＣ腫瘍を示す。図２２Ｄの腫瘍において認められる色の変化は、図２２Ｃにおける変化より有意に少ない。特定の理論に囚われるつもりはないが、こうした結果は、ＰＥＭによって誘導されるＮＭＥが、ＲＣＣ腫瘍などの、乳房腫瘍以外のマウス腫瘍でも起こることを示すといえる。
【０３１２】
図２２Ｅおよび２２Ｆは、それぞれ、ＰＥＭおよび空のポリマーソームで処置したＲＣＣのマウスモデルから切除された腫瘍の、代表的なＩＨＣおよびＨ＆Ｅ像を例証する。ＰＥＭで処置した動物には、図２２Ｅに示される、腫瘍切片の過半を占める、広々と強調された壊死の区域が存在する。空のポリマーソーム処置の図２２Ｆでは、このような区域が同様には示されない。
【０３１３】
ＰＥＭのグラムスケール調製物をＧＬＰ条件下で生成し、用量漸増研究を行って、単一薬剤としてのその治療領域を決定することができる。図２３Ａの表には、任意のＤＬＴを決定するための研究のパラメーターを提供し、図２３Ｂの表には、ＰＥＭがＲＣＣのＮＭＥを促進するＭＥＤを決定するための研究のパラメーターを提供する。ＤＬＴが見出されなければ、安全な投与のためのＰＥＭの最大用量は、ＳＴＤ１０（１０％の動物における重度毒性用量）またはＭＴＤ７５（７５％の動物において体重減少が１５〜２０％未満にしかならない、最大耐用量）として設定することができる。
【０３１４】
生分解性ＰＥＭ分散物は、精製ヒトミオグロビンと、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）およびＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＭＣＬ（９．４ｋ）からなるジブロックコポリマーを使用して形成することができる。ＰＥＭの形成は、上で論じたとおりの改良された直接再水和プロトコールによって行ってよい。ｉｎ  ｖｉｖｏ光学画像処理研究のために、同じく上で論じたとおり、ＰＺｎ３フルオロフォアを混ぜ合わせることで、ＮＩＲ発光性ＰＥＭ構築物を生成することができる。各ＰＥＭバッチについて、粒径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定することができ、粘度は、微量粘度計を使用して測定することができ、酸素およびＮＯ結合、ミオグロビン濃度、ミオグロビン／ポリマーの最終ｗｔ％、およびメトミオグロビンのｗｔ％は、確立された方法に従って決定することができる。メトミオグロビンレベル、ＮＯ取込み、および生分解性ＰＥＭ製剤からのミオグロビン放出のｉｎ  ｓｉｔｕ変化を、様々な溶液条件（例えば、温度、ｐＨ、ｐＯ２、およびｐＮＯ）下、様々な時点で試験して、製品の安定性を検証することができる。次の動力学的パラメーターおよびエンドポイントを評価することができる：臨床徴候（最初の２４時間は毎時、次いで３日間は１２時間毎、その後は毎週）、体重および変化（１週間に２〜３回）、摂食量（１週間に２〜３回）、簡易機能観察総合評価（２〜３回／週）、眼科的評価（１週間に２〜３回）、血清学プロファイル（（毎週行われる）血液学、凝血、臨床化学、尿検査）、毒物動態学パラメーター（最初の２４時間は毎時の採血、次いで３日間は１２時間毎、その後は毎週、肉眼的剖検所見（３サイクルの処置が完了してからの屠殺後）、臓器重量（屠殺後）、および組織病理学的検査（屠殺後）。
【０３１５】
ＮＣｒ  ｎｕ／ｎｕマウスにおける異所性および正所性ＲＣＣ異種移植片の生成：
【０３１６】
ヒトＲＣＣ細胞系である７８６−０（ＶＨＬ−／−）を、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手し、１０％の熱不活化ウシ胎児血清で補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）において、３７℃、ＣＯ２５％で管理し、増殖させることができる。異所性ＲＣＣ異種移植片モデルについては、雌の無胸腺ＮＣｒ  ｎｕ／ｎｕマウスの皮下に、７８６−０細胞の１ｍｍ３の腫瘍断片を埋め込むことができる。正所性ＲＣＣ異種移植片モデルについては、腎被膜を切開し、鞘被膜のすぐ下にドナー断片を置くことにより、雄の無胸腺ＮＣｒ  ｎｕ／ｎｕマウスに同様の腫瘍断片体積で埋め込むことができる。
【０３１７】
ＭＥＤによるＮＭＥ誘導の判定：
【０３１８】
ウィンドウチャンバーは、異所性に異種移植されたＲＣＣ腫瘍保持動物に外科的に埋め込んでよい。ＰＥＭ懸濁液は、上で論じたとおりに調製し、腫瘍が直径４〜６ｍｍに達したとき、尾静脈から注射してよい。ヘモグロビン吸収のハイパースペクトル画像処理を使用して、ヘモグロビン酸素飽和度を定量化することができ、ＧＦＰ発光の測定によって、ＨＩＦ−１活性を評価することができる。ＰＥＭの位置を決定するために、ｔ＝０、２、４、６、２４、４８、および７２時間の時点で、ＰＥＭの各尾静脈注射の前後にｉｎ  ｖｉｖｏ光学画像処理を行うことができ、その際、動物は、１〜２．５％のイソフルランを使用して麻酔し、加温パッド上で管理してよい。
【０３１９】
従来の抗血管新生および免疫ベース療法とは対照的に、ＮＭＥの機序は、腫瘍による特定の分子標的の発現を頼みとしていないことから、ＰＥＭが、より満遍なく有効な、ＲＣＣのファーストライン療法になることが分かるといえる。様々な実施形態において、ＰＥＭを、ＶＥＧＦＲ  ＴＫＩであるスニチニブと共に、またスニチニブなしで、異なる投与レベルおよびスケジュールで投与して、未処置ＲＣＣに対して最大の活性を実現する治療の組合せを決定することができる。処置によって、腫瘍成長阻害の持続時間がスニチニブ単独の１．５倍より長くなり、関連するＤＬＴが認められない場合、ＰＥＭの前臨床有効性が確立されたといえる。
【０３２０】
さらに、ＮＭＥは、ＶＥＧＦＲ  ＴＫＩとは異なる作用機序で働くので、ＰＥＭによって、こうした薬剤で見られる腫瘍応答が増強される場合もある。そのため、ＲＣＣのネズミモデルにおいて、ＰＥＭを単独の薬剤として、およびスニチニブとの組合せとしての両方で投与したとき、異なる２つの用量レベルおよび２通りの投与スケジュールの治療効果を観察することができる。図２４Ａに、腫瘍成長阻害が最大となり、かつ処置を受ける動物への重篤な毒性のないファーストライン療法における、ＰＥＭ用量レベル、スケジュール、および処置（すなわち、単独の薬剤またはスニチニブと併用のいずれか）の単一の組合せを開発するための研究のパラメーターを提供する。
【０３２１】
ＰＥＭの投与スケジュールおよび組合せに呼応した腫瘍成長阻害の決定：
【０３２２】
ルシフェラーゼを構成的に発現するように操作されている７８６−０細胞を利用して、同所性に異種移植されたＲＣＣ腫瘍保持動物を生成することができる。その後ルシフェラーゼ画像処理を使用すると、腫瘍サイズをモニターし、転移を追跡することができる。処置の初日から出発して、１週間に２回〜３回、ルシフェラーゼ強度および体重を記録してよい。予備的な検量線を作成して、合計腫瘍放射輝度を、屠殺時に直接測定することのできる腫瘍体積と関係付けることができる。腫瘍が１００ｍｍ３に達したときに処置を開始してよく、治療有効性は、対照群に対する腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）のパーセントとして測定することができる。ＴＧＩは、以下の式２によって算出することができる。
ＴＧＩ＝（１−Ｔ／Ｃ）×１００  （式２）
式中、ＴおよびＣは、それぞれ、処置（Ｔ）および対照（Ｃ）群における最後の治療日の平均腫瘍質量を表す。５０％を超えていることに加え、（ｔ検定によって評価したとき）ＴがＣより有意に小さいＴＧＩは、有効であるとみなしてよい。エラーバーは、平均値の標準誤差として算出してよい。動物の全般的な健康状態は、腫瘍サイズが５倍に増えてしまう、腫瘍の体積が５００ｍｍ３に達する、または有意な動物の苦痛の徴候（例えば、体質量の１５％を超える減少）が観察されるまで、毎日モニターしてよい。ＰＥＭとスニチニブのすべての組合せについて毒性パラメーターを決定してよい。処置の終わりに、すべての腫瘍を除去し、表面顕微鏡写真を撮影してよい。次いで、腫瘍を１０％のホルマリンで固定し、パラフィンに包埋して、以下のとおりのＩＨＣ分析にかけることができる。データは、変換後に正常であると仮定され、統計学的有意性の検定にはｔ検定を使用してよい。対照平均の標準偏差を５０％と仮定すると、５０％超のＴＧＩの検出力が確実に８０％を上回るようにするのに、１群当たり最低１０匹の動物が必要となる場合がある。多重比較は、偽発見率について補正することができる。
【０３２３】
腫瘍血管新生の阻害、細胞増殖、アポトーシスの程度、およびＨＩＦ−１シグナル伝達のＩＨＣ分析：
【０３２４】
腫瘍血管新生の阻害は、ＣＤ３１およびａＳＭＡのレベル、Ｋｉ−６７染色による細胞増殖、末端デオキシヌクレオチド転移酵素を媒介とするニック末端標識による腫瘍アポトーシスの程度、およびＨｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１  Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔによる腫瘍低酸素を、以前より確立されているプロトコールに従って測定することにより評価してよい。
【０３２５】
単独の薬剤として、またはＶＥＧＦＲ  ＴＫＩスニチニブとの組合せとしての、ファーストライン療法としてのＰＥＭの前臨床有効性および安全性は、処置によって、ＴＧＩの持続時間がスニチニブ単独の１．５倍より長くなり、ＤＬＴが認められない場合、確立されたといえる。
【０３２６】
他の実施形態において、セカンドライン療法としての（すなわち、ＶＥＧＦＲ  ＴＫＩ抵抗性ＲＣＣにおける）ＰＥＭの有効性を判定することができる。ＰＥＭを、ｍＴＯＲ阻害剤であるテムシロリムスと共に、またはテムシロリムスなしで、異なる投与レベルおよびスケジュールで投与して、ＶＧＦＲ  ＴＫＩ抵抗性ＲＣＣに対して最も有効な治療の組合せを決定することができる。
【０３２７】
現在、ｍＴＯＲ阻害剤によって、ＶＥＧＦＲ  ＴＫＩ抵抗性ＲＣＣに対してほどほどの奏効率が実現されているが、ｍＴＯＲ阻害剤は、限られた期間しか活性でない。ＮＭＥが腫瘍選択性であるため、ＰＥＭは、明白な全身毒性がないことと相まって、この度重なる処置を受けた患者集団に特に適したものとなりうる。図２４Ｂに、ＰＥＭを単独の薬剤として、およびテムシロリムスとの組合せとしての両方で、セカンドライン療法として投与したときの、異なる用量レベルおよび投与スケジュールの治療効果を決定するための研究のパラメーターを提供する。
【０３２８】
様々な実施形態において、同所性に異種移植されたＲＣＣ腫瘍保持動物を生成し、スニチニブ（１日当たり４０ｍｇを経口投与する）で処置することができ、処置は、腫瘍が１００ｍｍ３に達したときに開始し、その初期サイズの１．５倍に成長するまで継続してよい。この時点において、セカンドライン療法のために動物を無作為化し、上で論じたとおりにモニターしてよい。単独の薬剤またはｍＴＯＲ阻害剤テムシロリムスとの組合せとしての、ＰＥＭの前臨床有効性および安全性は、処置によって、ＴＧＩの持続時間がテムシロリムス単独の１．５倍より長くなり、ＤＬＴが認められない場合、確立されたといえる。
【０３２９】
様々な実施形態において、ＰＥＭを、ＲＣＣの対症治療としてのＸＲＴと組み合わせることの利点を判定することができる。ＰＥＭをＸＲＴ後に投与して、ＲＣＣの局所コントロールを長引かせるその能力を評価することができる。
【０３３０】
現在、腎摘出後の対症的な放射線療法は、リスクの高い患者において、局所コントロールを向上させるのに使用されているが、全生存期間の利点がない。こうした患者は、遠隔転移を生じる傾向が強く、これが生存期間が確保されない理由といえる。したがって、ＰＥＭを使用して、ＲＣＣの対症治療としてのＸＲＴを補うことができる。図２５に、腫瘍成長阻害が最大となり、１か月間１週間間隔で測定したとき新たな転移の数が減少する、対症治療における単独のＰＥＭ用量レベルおよびスケジュールを決定するための研究のパラメーターを提供する。同所性に異種移植されたＲＣＣ腫瘍保持動物を上で論じたとおりに確立し、（ＰＸｉ  Ｘ−Ｒａｄ  ２２５Ｃｘ常用電圧画像誘導照射装置によって）腎床（renal  bed）に向けて３Ｇｙ×５の分けられた線量で毎日処置することができる。ＰＥＭ投与の後、１か月間１週間間隔で腫瘍成長を評価することができ、屠殺時に、転移の数を決定することができる。ＰＥＭとＸＲＴを組み合わせる利点は、投与の結果、ＴＧＩが５０％を超え、転移の数が処置後１か月までにＸＲＴのみを受けた動物と比べて２５％減少している場合、確立されたといえる。
【０３３１】
様々な実施形態において、ＰＥＭのスケールアップを、接線フロー濾過装置によって、確立された技術に従って実現してもよい。動物研究については、最初の５つの初期用量レベル内でＭＴＤ７５が確立されない場合、追加の２つのＰＥＭ用量レベルを選択してよい（例えば、２００および５００ｍｇ／ｋｇのミオグロビン）。７８６−０細胞に加えて、Ａ４９８、７６９−Ｐ、Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２、ＳＷ８３９、ＡＣＨＮ、Ｇ４０１および／またはＳＫ−ＮＥＰ−１細胞系（すべてＡＴＣＣから入手可能）を、ＲＣＣのマウスモデルの生成に使用してもよい。さらに、ＮＣｒ  ｎｕ／ｎｕマウスの腫瘍が有効に成長または応答しない場合、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを利用して、腫瘍異種移植片を生成してもよい。別法として、腎臓近位尿細管細胞において構成的活性型のＨＩＦ−１ａを発現させる、腎臓のがんのトランスジェニックモデル（すなわち、「ＴＲＡＣＫ」マウス）を用いてもよい。スニチニブの後のテムシロリムス処置で、動物に、陽性対照（テムシロリムスのみ）動物について評価されるような過度の毒性が現れた場合、異なる投与量のテムシロリムスおよび／または別法としてエベロリムスで調べることができる。さらに、腫瘍成長が処置に不応である場合、代替線量（例えば、３０Ｇｙ）またはＸＲＴモード（すなわち、ＳＢＲＴ）を用いてもよい。
【０３３２】
前述の開示では、実例となる態様および／または実施形態について論じており、添付の特許請求の範囲によって規定される、記載の態様および／または実施形態の範囲から逸脱することなく、本発明において様々な変更および改変を行ってよいことを留意すべきである。さらに、記載の態様および／または実施形態の要素は、単数形で記載または請求がなされる場合もあるとはいえ、単数に限ることを明確に述べない限り、複数が意図されている。加えて、いずれかの態様および／または実施形態の全部または一部は、別段記載しない限り、他のいずれかの態様および／または実施形態の全部または一部と一緒に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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