(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも１つの結合部位を含む結合タンパク質であって、結合部位は、ターゲット細胞に関連する抗原に結合する結合タンパク質と、
ｂ）ＩＬ−１５ポリペプチドであって、ＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９２、９４、９５、９７、９８、１１４、及び／又は１１５位に対応する１つ以上の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことにより、配列番号：１（Uniprotナンバー：Ｐ４０９３３−１）の野生型ＩＬ−１５の親和性と比較して、ＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有するＩＬ−１５ポリペプチドとを含み、
結合タンパク質が、抗体、二価の抗体フラグメント、一価の抗体フラグメント、又は抗体様結合性を有するタンパク質性結合分子からなる群より選択される、
融合タンパク質。
【請求項２】
ターゲット細胞が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び／又は自己免疫疾患に関連する抗原を発現している、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ＴＡＡが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤｗ５２、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ−３、ＣＤ１３５）、ｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＳＦ１Ｒ、（ＣＤ１１５）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＰＤＧＦＲ−α（ＣＤ１４０ａ）、ＰＤＧＦＲ−β（ＣＤ１４０ｂ）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、Ｍｕｃ−１、ＥＧＦＲ、ｄｅ２−７−ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、葉酸遮断タンパク質、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＩＬ３Ｒ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、カーボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ガン胎児抗原（ＣＥＡ）、ＥｐＣＡＭ、ＣＤＣＰ１、デルリン１、テネシン、ｆｒｉｚｚｌｅｄ１〜１０、血管抗原ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ１）、ＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ４、ＣＤ３０９）、エンドグリン、ＣＬＥＣ１４、Ｔｅｍ１−８、Ｔｉｅ２、メソセリン、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）、ガン抗原７２−４（ＣＡ７２−４）、インターロイキン１３レセプター  アルファ−２サブユニット、ＩＬ１３Ｒα２、Ｉｇカッパ軽鎖（κ）、ＧＤ３−ガングリオシド（ＧＤ３）、ＧＤ２−ガングリオシド（ＧＤ２）、ＧＤ２及びＧＤ３のアセチル化変異体、ＣＤ１７１、ＮＣＡＭ、アルファ葉酸レセプター（αＦＲ）、ルイス（Ｙ）、胎児アセチルコリンレセプター（ＦＡＲ）、トリ赤芽血症ウイルスのガン遺伝子ホモログ３（ＥＲＢＢ３）、トリ赤芽血症ウイルスのガン遺伝子ホモログ４（ＥＲＢＢ４）、トリ赤芽血症ウイルスのガン遺伝子ホモログ２（ＥＲＢＢ２）、肝細胞増殖因子レセプター（ＨＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ）、クローディン１８．２、クローディン３、クローディン４、クローディン１、クローディン１２、クローディン２、クローディン５、クローディン８、クローディン７、クローディン６、膜結合ＣＥＡ、Ｒｏｂｏ４、ＣＤ１３８、テネシン、ならびにフィブロネクチンのエクストラドメインＢからなる群より選択される、請求項２記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ターゲット細胞が、自己免疫疾患に関連する抗原を発現しており、同抗原が、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ５２及びＴＮＦＲ、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ４０からなる群より選択される、請求項２記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ターゲット細胞が、腫瘍／ガン細胞及び／又はＢ細胞である、請求項１〜４のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ＩＬ−１５ポリペプチドが、配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９４、９７、９８、１１４、及び／又は１１５位に対応する１つ以上の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項７】
少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｌ９２Ｄ、Ｅ９４Ｋ、Ｌ９５Ｄ、Ｖ９７Ｄ、Ｉ９８Ｄ、Ｌ１１４Ｄ、Ｌ１１４Ｅ、Ｉ１１５Ｄ、Ｉ１１５Ｅからなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＩＬ−１５ポリペプチドが、ＩＬ−１５Ｒαに結合しない、請求項１〜７のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ＩＬ−１５ポリペプチドが、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγに結合する、請求項１〜８のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ＩＬ−１５ポリペプチドが、全長ＩＬ−１５タンパク質又はそのフラグメントもしくは変異体であり、同フラグメント又は変異体が、配列番号：１の野生型ＩＬ−１５の親和性と比較して、ＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有する、請求項１〜９のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
ＩＬ−１５ポリペプチドが、少なくとも、配列番号：４に示されたアミノ酸配列を含み、同アミノ酸配列は、配列番号：４に示されたアミノ酸配列の４４、４６、４７、４９、５０、６６、及び／又は６７位に対応する１つ以上の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜９のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
融合タンパク質が、リンカーを更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγを発現しているエフェクター細胞のターゲット細胞限定活性化に使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγを発現しているエフェクター細胞により媒介されるターゲット細胞限定ターゲット細胞殺傷に使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
ＮＫ細胞及びＴ細胞の細胞溶解活性を、非改変結合タンパク質の細胞溶解活性と比較して、向上させるのに使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
疾患の処置に使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
疾患が、増殖性疾患又は自己免疫疾患である、請求項１６記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項１８】
処置の副作用が低減される、請求項１６〜１７のいずれか一項記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか一項記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれか一項記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項２１】
ベクターに含まれる、請求項２０記載の核酸分子。
【請求項２２】
請求項２０記載の核酸分子又は請求項２１記載のベクターを含む、ホスト細胞。
【請求項２３】
融合タンパク質の発現のために、融合タンパク質の発現を可能にする条件下において、融合タンパク質をコードする核酸を使用することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項記載の融合タンパク質を製造するための方法。
【請求項２４】
請求項１〜１２のいずれか一項記載の融合タンパク質を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［背景］
本発明は、結合タンパク質と、ＩＬ１５Ｒαに対する低下した親和性を有するインターロイキン１５ポリペプチドとを含む融合タンパク質及びその使用、このような融合タンパク質を含む医薬組成物、ならびに、このような融合タンパク質を製造するための方法に関する。
【０００２】
［発明の分野］
第２世代のキメラ又はヒト化モノクローナル抗体、例えば、リツキサン及びハーセプチンはそれぞれ、悪性リンパ腫及びＨｅｒ２陽性乳ガンを有する患者の処置を相当改善してきた。しかしながら、一般的には、第２世代抗体の治療活性は限られたものであり、最適化された抗体に基づく試薬の開発についての喫緊の医療的ニーズが存在している（例えば、Beck A, Wurch T, Bailly C, Corvaia N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 2010; 10:345-352を参照のこと）。
【０００３】
Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）陽性免疫エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞をリクルートする能力は、大部分の抗体の治療活性に重要であると考えられている。このため、抗体最適化に使用される戦略の多くは、向上した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性をもたらすＦｃ部分の改善に焦点が当てられている。原理的には、これは、現在の臨床使用における大部分の抗腫瘍抗体に含有されるグリコシル化パターン及び／又はＩｇＧＩ−Ｆｃ部分のＣＨ２ドメインにおけるアミノ酸配列を遺伝子操作することにより達成することができる（Shinkawa T, Nakamura K, Yamane N, et al. (2003) 「The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity.」 J Biol Chem.278:3466-3473；Lazar GA, Dang W, Karki S, Vafa 0, Peng JS, Hyun L, Chan C, Chung HS, Eivazi A, Yoder SC, Vielmetter J, Carmichael DF, Hayes RJ, Dahiyat BI. (2006) 「Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function.」 Proc Natl Acad Sci USA 103:4005-4010）。
【０００４】
両戦略は、Ｆｃ最適化された第３世代抗体の開発のために、製薬業界において使用されてきた（Oflazoglu E, Audoly LP (2010) 「Evolution of anti-CD20 monoclonal antibody therapeutics in oncology.」 MAbs 2:14-19）。Roche（Basel, Switzerland）は、Glycart（Schlieren, Switzerland）と共同で、グリコ操作ＣＤ２０抗体ＧＡ１０１（オビヌツズマブ）を開発した。慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を患う患者についての最近の大規模臨床試験において、この抗体は、リツキサンより優れていた（Goede V et al. (2014) 「Obinutuzumab plus Chlorambucil in Patients with CLL and Coexisting Conditions.」 N Engl J Med 370:1101-1110）。
【０００５】
Xencor（Monrovia, CA USA）により開発された、リンパ腫関連抗原であるＣＤ１９及びＣＤ３０に対する２つの他の抗体（ＸｍＡｂ５５７４及びＸｍＡｂ２５１３）は、アミノ酸交換Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ（ＳＤＩＥ改変）を有する。ＧＡ１０１と同様に、これらの抗体は、顕著に向上したＡＤＣＣを発揮することが報告され（Horton et al. (2008) 「Potent in vitro and in vivo activity of an Fc-engineered anti-CD19 monoclonal antibody against lymphoma and leukemia.」 Cancer Res; 68:8049-8057；Foyil KV, Bartlett NL (2010) 「Anti-CD30 Antibodies for Hodgkin lymphoma.」 Curr Hematol Malig Rep 5:140-147）、現在、臨床試験で評価されている。
【０００６】
サイトカインであるＩＬ−２及びＩＬ−１５が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＴ細胞両方の細胞溶解活性を向上させることが十分確立されている。両サイトカインは、異なるα鎖により完成される共通のβγレセプターを使用する。α鎖の差動的発現により、サイトカインの生体活性が主に決定される。両方とも、ＮＫ細胞及びＴ細胞を刺激することができる。ただし、ＩＬ−２は、Ｔレギュラトリー細胞（Ｔ  ｒｅｇ）を刺激するが、ＩＬ−１５は、例えば、ＣＤ８＋メモリＴ細胞の増殖を促進し、Ｔ  ｒｅｇを阻害すると考えられる（Ring et al. (2012) 「Mechanistic and structural insight into the functional dichotomy between IL-2 and IL-15」 Nat Immunol; 13:1187-1195；Waldmann (2006) 「The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design」 Nat Rev Immunol; 6:595-601；Perna et al.  (2013) 「Interleukin 15 provides relief to CTLs from regulatory T cell-mediated inhibition: implications for adoptive T cell-based therapies for lymphoma」 Clin Cancer Res; 19:106-117）
【０００７】
今日まで、ＩＬ−２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＬ−１５は、免疫サイトカインの構築に使用されてきた（Kaspar M, Trachsel E, Neri D (2007) 「The antibody-mediated targeted delivery of interleukin-15 and GM-CSF to the tumor neovasculature inhibits tumor growth and metastasis.」 Cancer Res. 15;67(10):4940-8）。これらの免疫サイトカインは、サイトカイン活性に焦点を当てるのを可能にするために構築され、意図されているサイトカインと抗体との融合タンパク質である。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏ用途において、腫瘍に特異的に結合する抗体の割合は、１％を下回っている。加えて、従来の融合タンパク質の活性は、その特異的な結合性に依存しない。その結果として、各サイトカインレセプターを発現している免疫細胞に対するターゲット以外への結合により及ぼされるこのような融合タンパク質の副作用は相当なものであり、安全に適用可能な容量が制限されてしまう。例えば、List and Neri (2013) 「Immunocytokines: a review of molecules in clinical development for cancer therapy」. Clin Pharmacol; 5:29-45、Gillies et al. (1992) 「Antibody-targeted interleukin 2 stimulates T cell killing of autologous tumor cells」, Proc Natl Acad Sci USA; 89:1428-1432、Albertini et al. (2012) 「Phase II trial of hu14.18-11.2 for patients with metastatic melanoma」. Cancer Immunol lmmunother; 61:2261-2271、又はRibas et al. (2009) 「Phase 1/11 open-label study of the biologic effects of the interleukin-2 immunocytokine EMD 273063 (hu14.18-IL2) in patients with metastatic malignant melanoma」 J Transl Med; 7:68を参照のこと。
【０００８】
原理的には、ＩＬ−１５の特定の作用メカニズムが、この問題に対する解決策を提供する可能性がある。ＩＬ−２とは対照的に、ＩＬ−１５は、そのレセプターをトランスにトリガーする。すなわち、単球及び樹状細胞上に発現されたレセプターのα鎖は、ＮＫ細胞及びＴ細胞上のβ／γレセプターをトランスに刺激する。理論的には、これは、抗体のターゲット細胞への特異的な結合後にのみＩＬ−１５レセプターのβγ複合体（ＩＬ１５Ｒβγ）をトリガーするターゲット細胞限定融合タンパク質、例えば、免疫サイトカインの構築に最適な状況である。ただし、この目的では、ＩＬ−１５のそのレセプターのα鎖への結合が防止される必要がある。
【０００９】
原理的には、その防止は、ＩＬ−１５及び可溶性リコンビナントＩＬ１５Ｒα又はそのフラグメントの結合タンパク質複合体又は融合タンパク質への結合により達成することができる（Bessard A et al. (2009) 「High antitumor activity of RLI, an interleukin-15 (IL-15)-IL-15 receptor alpha fusion protein, in metastatic melanoma and colorectal cancer.」 Mol Cancer Ther; 8:2736-2745；Vincent M et al. (2013) 「Tumor targeting of the IL-15 superagonist RLI by an anti-GD2 antibody strongly enhances its antitumor potency.」 Int J Cancer; 133:757-765；Kermer V et al. (2012) 「An antibody fusion protein for cancer immunotherapy mimicking IL-15 trans-presentation at the tumor site.」 Mol Cancer Ther.; 11:1279-1288）。しかしながら、驚くべきことに、ＩＬ−１５及びＩＬ−１５ＲαＦｃの融合タンパク質又は複合体は、サイトカイン単独より効果的であり、ＩＬ−１５スーパーアゴニストと呼ばれている。このため、このようなタンパク質は、この細胞をターゲットする結合タンパク質に結合させた後に、ターゲット細胞限定活性を発揮することを予測することができない。
【００１０】
この理由に則して、ＩＬ−１５スーパーアゴニストの活性は、Ｆｃ架橋によっては更に向上することはない（Rubinsteinet al.  「Converting IL-15 to a superagonist by binding to soluble IL-15Rα.」 Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103:9166-9171）。このため、このようなスーパーアゴニストを含有する免疫サイトカインの活性が、上記概説された意味において、ターゲット細胞限定的であろう可能性は極めて低い。
【００１１】
まとめると、ターゲット細胞特異的な方法で作用することができ、及び／又は、副作用を引き起こさず、及び／又は、安全な用量で投与することができる融合タンパク質を提供するニーズが未だに存在する。この課題は、特許請求の範囲に反映され、説明に記載され、本願の実施例及び図面に例示された実施態様により解決される。
【発明の概要】
【００１２】
上記のように、本発明は、
ａ）少なくとも１つの結合部位を含む結合タンパク質であって、結合部位は、ターゲット細胞に関連する抗原に結合する結合タンパク質と、
ｂ）ＩＬ−１５ポリペプチドであって、ＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１２、１１３、１１４、１１５、及び／又は１１６位に対応する１つ以上の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、これにより、配列番号：１（Uniprotナンバー：Ｐ４０９３３−１）の野生型ＩＬ−１５の親和性と比較して、ＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有するＩＬ−１５ポリペプチドとを含む、
、融合タンパク質に関する。
【００１３】
加えて、本発明は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγを発現しているエフェクター細胞のターゲット細胞限定活性化に使用するための、本発明の融合タンパク質に関する。
【００１４】
さらに、本発明は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγを発現しているエフェクター細胞により媒介されるターゲット細胞限定ターゲット細胞殺傷に使用するための、本発明の融合タンパク質に関する。
【００１５】
また、本発明は、ＮＫ細胞及びＴ細胞、好ましくは、ＮＫ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解活性を、本明細書で記載された非改変結合タンパク質の細胞溶解能と比較して、向上させるのに使用するための、本発明の融合タンパク質に関する。
【００１６】
加えて、本発明は、疾患の処置に使用するための、本発明の融合タンパク質に関する。
【００１７】
また、本発明は、本発明の融合タンパク質を含む、医薬組成物に関する。
【００１８】
加えて、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする、核酸分子に関する。
【００１９】
さらに、本発明は、本発明の核酸分子、又は、本発明の核酸分子を含むベクターを含む、ホスト細胞に関する。
【００２０】
加えて、本発明は、融合タンパク質の発現のために、融合タンパク質の発現を可能にする条件下において、融合タンパク質をコードする核酸を使用することを含む、本発明の融合タンパク質を製造するための方法に関する。
【００２１】
また、本発明は、本発明の融合タンパク質を含む、キットに関する。
【００２２】
本発明のこれらの態様は、下記説明、図面、及び非限定的な実施例を参照して、より完全に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１．本発明の例示的な融合タンパク質によるＩＬ−１５Ｒβγレセプターのターゲット細胞限定刺激。本発明の融合タンパク質は、（ｉ）例えば、腫瘍細胞上のターゲット抗原に対する、例えば、インタクトな二量体抗体分子であることができる結合タンパク質を含む（図１Ａ）。このようなターゲット抗原は、例えば、ＣＤ１９又はＰＳＭＡであることができる。本発明の融合タンパク質は、（ｉｉ）配列番号：１の野生型ＩＬ−１５の親和性と比較してＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有する、及び／又は、ＩＬ−１５Ｒαにもはや結合することができないＩＬ−１５ポリペプチドを更に含む。したがって、本発明のこのような融合タンパク質は、２つの結合特異性、すなわち、ａ）ターゲット抗原、例えば、ＣＤ１９又はＰＳＭＡと、ｂ）ＩＬ−１５Ｒβγとを有する。ただし、本発明の結合タンパク質は、例えば、ＣＤ１９に結合する１つの結合部位と、例えば、ＣＤ３に結合する第２の結合部位とを有する二重特異性タンパク質、例えば、二重特異性一本鎖Ｆｖフラグメントであることもできる。このような二重特異性タンパク質は、そのＮ末端又はＣ末端のいずれかにおいて、配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１２、１１３、１１４、１１５、及び／又は１１６位に対応する１つ以上の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＩＬ−１５ポリペプチドと融合させ、３つの結合部位を有する分子をもたらすことができる。図１Ａに示された本発明の融合タンパク質の例示に戻って、同融合タンパク質は、結合分子として、定常ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する抗体分子を含有する。このような結合タンパク質は、その非改変対照物と比較して、向上した抗体依存的細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を発揮するように、更に改変させることができる。図１Ａに、すなわち、ＣＨ２ドメインのいわゆるＳＤＩＥ改変を含ませることにより、このような改変結合タンパク質をどのようにして得ることができるかについての一例を示す。この変異は、抗体分子のＡＤＣＣ活性を向上させることが公知である。上記されたように、結合タンパク質部分に加えて、本発明の融合タンパク質は、配列番号：１の野生型ＩＬ−１５の親和性と比較して、ＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有するか、又は、同親和性を何ら有さない、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む。また、このようなＩＬ−１５ポリペプチドは、図１Ａにも模式的に示される。ＩＬ−１５ポリペプチドは、結合タンパク質に（ペプチド性又は非ペプチド性の）リンカーを介して付着することができる。あるいは、ＩＬ−１５ポリペプチドは、結合タンパク質に直接融合させることもできる。加えて、本発明の融合タンパク質において、少なくとも１つ（すなわち、１つ、２つ、又はそれ以上、例えば、３つもの）ＩＬ−１５ポリペプチドが、結合タンパク質に融合される。図１Ａの例示において、融合タンパク質は、２つの変異ＩＬ−１５ポリペプチドを含有する。同ＩＬ−１５ポリペプチドはそれぞれ、結合タンパク質として使用される抗体分子の重鎖のＣＨ３ドメインに融合される。本発明の融合タンパク質により、ＩＬ−１５−βγレセプターのターゲット細胞限定活性化が可能となる。ＩＬ−１５がその機能を発揮するのがその理由である。生理学的条件下において、ＩＬ−１５は、２つのターゲットに結合する。同ターゲットは、種々の細胞上で発現される（トランス提示）。第一に、野生型ＩＬ−１５は、高い親和性で、例えば、単球及び樹状細胞上で発現されるＩＬ１５Ｒαレセプターに結合する。第二に、ついで、ＩＬ１５Ｒαは、（トランスで）結合したＩＬ−１５を、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγを発現している反対側の細胞に提示する。生理学的条件下では、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγレセプターは、例えば、メモリＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、又はＮＫ細胞上で発現される（図１Ｂ）。これは、ターゲット細胞の不存在下において、βγレセプターを、本発明の融合タンパク質によって活性化することができないことを意味する。α鎖によるトランス提示が生じ得ないためである（図１Ｃ）。図１Ｂ及び図１Ｃに、本発明の融合タンパク質の機能を例示的に示す。結合タンパク質は、ターゲット細胞に結合する。そのＩＬ−１５ポリペプチド部分により、ついで、本発明の融合タンパク質は、βγレセプター陽性細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＮＫ細胞に同時に結合することができ（上記を参照のこと）、これらの細胞を活性化させることができる。これは、ＩＬ−５Ｒαを介したＩＬ−１５の提示を模倣している。これは、そのレセプターのβγ複合体に対するＩＬ−１５のトランス提示が、ＩＬ−１５レセプターのα部分を発現している細胞ではなく、ターゲット細胞により達成されるためである。ＩＬ−１５Ｒαに対する内因親和性は、本発明の融合タンパク質において低下する。このため、ターゲット細胞が存在しない場合には、ＩＬ−１５Ｒα媒介提示は生じない。その結果として、βγレセプター陽性エフェクター細胞は活性化されない。
【図２】図２．種々のＩＬ−１５ポリペプチドを含む種々の融合タンパク質のＩＬ−１５Ｒαに対する結合性（Ａ）及び細胞溶解活性（Ｂ）。（Ａ）：ＣＤ１９陽性ＮＡＬＭ１６細胞を、示された濃度の別個の融合タンパク質と共にインキュベーションし、リコンビナントＨｉｓタグ付きＩＬ−１５Ｒα−ＦＣ融合タンパク質、ビオチンラベル抗Ｈｉｓ抗体、最後に、ストレプトアビジンＰＥコンジュゲートにより染色した。ついで、細胞を、フローサイトメトリーにより分析した。特に、融合タンパク質ＣＤ１９−ＩＬ１５ｗｔ（ｗｔ＝野生型）は、野生型ヒトＩＬ−１５（ｈＩＬ−１５）に融合した、Ｆｃ最適化ヒトＩｇＧ１定常領域（本明細書で記載されたＳＤＩＥ変異）を有するＣＤ１９抗体４Ｇ７を含んだ。そしてここで、ｈＩＬ−１５は、ＣＨ３ドメインに、２つのアミノ酸リンカー、すなわち、グリシン−セリンリンカー（本明細書において、「短いリンカー」とも呼ばれる）を介して、直接結合している。この融合タンパク質は、対照として機能した。更に試験された融合タンパク質は、αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ、αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｖ４９Ｄ、又はαＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｉ５０Ｄと呼ばれ、Ｆｃ最適化（ＳＤＩＥ）ヒトＩｇＧ１定常領域（本明細書で記載されたＳＤＩＥ変異）を有する４Ｇ７抗体を含んだ。ＩＬ−１５ポリペプチドは、示された位置において変異していた。これらの位置は、図５に示されたように、配列番号：２及び配列番号：４に示された位置に相当する。さらに、これらのアミノ酸位置は、配列番号：１に関するアミノ酸置換Ｅ９４Ｋ（Ｅ４６Ｋについて）、Ｖ９７Ｄ（Ｖ４９Ｄについて）、及びＩ９８Ｄ（Ｉ５０Ｄについて）に相当する（本明細書においてもより詳細に記載）。これら全ての融合タンパク質において、ｈＩＬ−１５は、２つのアミノ酸グリシン−セリンリンカーを介して、ＣＨ３ドメインに直接結合している。種々のアミノ酸置換を含むＩＬ−１５ポリペプチドがＩＬ−１５Ｒαに結合するその能力を残していたかどうかを分析するために、Ｈｉｓタグ付きＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ−融合タンパク質（R&D systems）を、培養物に加えた。このため、融合タンパク質のＩＬ−１５ポリペプチド部分がＩＬ−１５Ｒαに結合するその能力を残していた場合、加えられたＨｉｓタグ付きＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ−融合タンパク質は、（融合タンパク質を介して）ＮＡＬＭ１６細胞に結合するであろう。このため、ビオチンラベル抗Ｈｉｓ抗体（Qiagen）及びストレプトアビジンＰＥコンジュゲート（Life technologies）の添加に基づいて、検出可能なシグナルが生成されるであろう。このシグナルを、フローサイトメトリーにより測定した（平均蛍光強度；ＭＦＩ；図２Ａのｙ軸）。図２Ａに、αＣＤ１９−ＩＬ１５−ｗｔ（４Ｇ７−ＩＬ１５−ｗｔ；ｗｔ＝野生型）融合タンパク質（対照）について検出されたＭＦＩが、３００MFI付近であることを示す。通常、ＩＬ−１５は、ＩＬＲ−１５αに結合するために、このシグナルは、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαへの結合についての証拠を提供する。αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｖ４９Ｄ（４Ｇ７−ＩＬ１５−Ｖ４９Ｄ）融合タンパク質は、対照と比較した場合、同様のシグナルを示した。これにより、この融合タンパク質は、わずかに低い親和性ではあるがＩＬＲαに結合することが示される。融合タンパク質αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ（４Ｇ７−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ）及びαＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｉ５０Ｄ（４Ｇ７−ＩＬ１５−Ｉ５０Ｄ）は、１５０付近のＭＦＩシグナルを示した。このことは、ＩＬ−１５Ｒαに対する結合が、強力に減少させられる（又は更に、存在しなくなる）ことを示す。図２Ａ中の破線は、バックグラウンド染色、すなわち、（ＩＬ１５含有融合タンパク質を含まない）ラベル検出抗体による細胞の染色を示す。このため、アミノ酸置換Ｅ４６Ｋ及びＩ５０Ｄを含むＩＬ−１５ポリペプチドは、結合タンパク質を含む融合タンパク質内で使用された場合、ＩＬＲ−１５α結合を強力に減少させ、又は更に、無くしたことを示した。図２Ｂにおいて、ＮＡＬＭ１６細胞を、図２Ａに示された実験にも使用された各融合タンパク質及び健康なボランティアの抹消血単核球（ＰＢＭＣ）と共にインキュベーションした。２日後、増殖を、３Ｈ−チミジン取込みアッセイ法を使用して評価した。融合タンパク質及びＰＢＭＣの不存在下での増殖を、増殖の阻害が０％である１００％増殖と定義した。通常、このようなＰＢＭＣ細胞は、リンパ球、単球、及びマクロファージを含む、リンパ球の一部、特に、ＮＫ細胞は、Ｆｃγレセプターと、ＩＬ−１５が結合することができる（上記を参照のこと）ＩＬ−２／ＩＬ−１５レセプターのβ及び共通のγ鎖を発現する。このため、融合タンパク質の両者（ＮＡＬＭ１６細胞はＣＤ１９結合タンパク質（４Ｇ７：ＣＤ１９特異的抗体）を介して、ＮＫ細胞はＩＬ１５を介して）への結合に基づいて、ＮＡＬＭ１６細胞を殺傷することができる。ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒβγヘの結合は、ＮＫ細胞を活性化し、抗体媒介殺傷を向上させる。図２Ａに示された実験に関して、別個の融合タンパク質の細胞溶解活性を分析した。図２Ｂから分かるように、αＣＤ１９−ＩＬ１５−ｗｔ（４Ｇ７−ＩＬ１５−ｗｔ、そしてここで、４Ｇ７は、ＳＤＩＥ改変を有するＦｃ最適化４Ｇ７抗体である）及びαＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ（４Ｇ７−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ、そしてここで、４Ｇ７は、ＳＤＩＥ改変を有するＦｃ最適化４Ｇ７抗体である）の融合タンパク質は両方とも、約８０〜８５％の阻害を生じさせた。αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｖ４９Ｄ（４Ｇ７−ＩＬ１５−Ｖ４９Ｄ、そしてここで、４Ｇ７は、ＳＤＩＥ改変を有するＦｃ最適化４Ｇ７抗体である）のタンパク質は、同様のレベルに達したが、より低い濃度ではほとんど有効ではなかった。αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｉ５０Ｄ（４Ｇ７−ＩＬ１５−Ｉ５０Ｄ、そしてここで、４Ｇ７は、ＳＤＩＥ改変を有するＦｃ最適化４Ｇ７抗体である）の融合タンパク質及び融合したＩＬ−１５タンパク質を含まない非改変ＣＤ１９−ＳＤＩＥ（４Ｇ７−ＳＤＩＥ）抗体は、増殖の約６０％の阻害をもたらした。このため、変異ＩＬ−１５を有する融合タンパク質群から、ＩＬ−１５ポリペプチド中にＥ４６Ｋアミノ酸置換を含有する融合タンパク質は、ＣＤ１９発現ターゲット細胞に対する最も高い細胞溶解活性を示したため、その後の実験に使用した。図２に示されたデータからのまとめ：評価された３つの変異ＩＬ−１５ポリペプチドの内の２つＥ４６Ｋ及びＩ５０��は、ＣＤ１９ターゲット融合タンパク質内で使用した場合、ＩＬ−１５Ｒα結合性を欠いていた（Ａ）。Ｅ４６Ｋアミノ酸置換を含有する融合タンパク質は、ＣＤ１９発現ターゲット細胞に対する最も高い細胞溶解活性を有した（Ｂ）。
【図３】図３．ＮＫ９２細胞（図３Ａ）及びＰＢＭＣ（図３Ｂ）において種々の融合タンパク質により誘引された増殖。図２に示された実験は、短いリンカーを含有する融合タンパク質により行われたが、図３で表わされた実験は、長いリンカー（Ｌ）を含有する融合タンパク質を更に使用した。長いリンカーを有する融合タンパク質は、２０個のアミノ酸長のアミノ鎖ストレッチ（４−グリシン  １−セリン）４を含む。短いリンカーを含む融合タンパク質において、ｈＩＬ−１５は、短いグリシン−セリンリンカーを介して、ＣＨ３ドメインに直接結合している。長いリンカー又は短いリンカーを含有する融合タンパク質を、ＮＫ９２細胞（図３Ａ）又はＰＢＭＣ（図３Ｂ）細胞と共に、２日間インキュベーションした。ついで、細胞を、３Ｈチミジンでパルスし、３日目にフィルタマット上に収集し、液体シンチレーションカウンターでカウントした。図３Ａにおいて、ＮＫ９２細胞を、種々の濃度の別個の融合タンパク質と共に、示されたようにインキュベーションした（図３Ａ中のｘ軸及び図の凡例）。ＮＫ９２細胞は、ナチュラルキラーリンパ腫細胞であり、αＣＤ１９結合タンパク質が結合するＣＤ１９を発現しない（Gong et al. (1994) 「Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells」 Leukemia; 8(4):652-8）。このため、この細胞培養物は、ターゲット細胞を欠いている。ｙ軸（図３Ａ）に示されたように、３Ｈ−チミジンカウントにより増殖を測定することにより、エフェクター細胞における増殖を誘引する融合タンパク質の能力を、概ね評価する。αＣＤ１９−ＩＬ１５−ｗｔ（４Ｇ７−ＩＬ１５ｗｔ；短いリンカーを含有、そしてここで、４Ｇ７は、ＳＤＩＥ改変を有するＦｃ最適化４Ｇ７抗体である）及びαＣＤ１９−ＩＬ１５−ｗｔ−Ｌ（４Ｇ７−ＩＬ１５ｗｔ−Ｌ；長いリンカーを含有、そしてここで、４Ｇ７は、ＳＤＩＥ改変を有するＦｃ最適化４Ｇ７抗体である）により、約２５０００の３Ｈチミジンカウントがもたらされた。ただし、長いリンカーを有するタンパク質は、より低い濃度で、かなり活性であった。これにより、短いリンカーは、ＩＬ−１５の活性に影響を及ぼすことが示される。同様に、本発明の融合タンパク質のＩＬ−１５ポリペプチドを含有する融合タンパク質は、野生型ＩＬ−１５タンパク質を含有する融合タンパク質よりほとんど活性でなかった。このため、Ｅ４６Ｋ変異は、予想通りに、ＩＬ−１５活性を減少させる。これらの融合タンパク質が、ＩＬ−１５Ｒαにより提示することができないためである。加えて、ＩＬ−１５活性は、短いリンカーによる融合により更に減少される。また、同様の結果が、図３Ｂに示された実験において得られた。ここでは、ＰＢＭＣ細胞を、種々の濃度の別個の融合タンパク質と共に、示されたようにインキュベーションした（図３Ｂ中のｘ軸及び図の凡例）。一部のＰＢＭＣ（例えば、Ｂ細胞）も、ＣＤ１９を発現する。ＣＤ１９は、αＣＤ１９（ここでは、４Ｇ７）結合タンパク質により検出される。特に、ＰＢＭＣ培養物は、一部の有力なエフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞等も含む。図３Ａにおけるのと同様に、増殖を、ｙ軸（図３Ｂ）に示されたように、３Ｈ−チミジンカウントにより決定した。これらの実験において、αＣＤ１９−ＩＬ１５−ｗｔ（４Ｇ７−ＩＬ１５ｗｔ；短いリンカー）及びαＣＤ１９−ＩＬ１５−ｗｔ−Ｌ（４Ｇ７−ＩＬ１５ｗｔ−Ｌ；長いリンカー及び野生型（ｗｔ）ＩＬ−１５を含有）それぞれにより、約６０００及び１２０００の３Ｈチミジンカウントがもたらされた。再度、αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ（４Ｇ７−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ、そしてここで、４Ｇ７は、ＳＤＩＥ改変を有するＦｃ最適化４Ｇ７抗体である）により、より少ない程度の増殖が提供された（約４５００カウント ３Ｈチミジン）、一方、融合タンパク質αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ（４Ｇ７−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ；長いリンカーを含有、そしてここで、４Ｇ７は、ＳＤＩＥ改変を有するＦｃ最適化４Ｇ７抗体である）により、野生型ＩＬ−１５融合タンパク質に類似する増殖の検出がもたらされた（約８５００カウント；図３Ｂ）。このため、この実験では、αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ（４Ｇ７−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ）により、αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ（４Ｇ７−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ）融合タンパク質より高い、細胞の増殖／活性化が誘引された。これにより、ＮＫ９２細胞について得られた結果が確認される。図３に示されたデータからのまとめ：（ｉ）アミノ酸置換Ｅ４６Ｋを含むＩＬ−１５を有する融合タンパク質は、野生型ＩＬ−１５を含む融合タンパク質より活性が低い。及び、（ｉｉ）長いリンカー（Ｌ）を有する融合タンパク質は、短いリンカーを有する融合タンパク質より活性である。このため、長いリンカーを含有する融合タンパク質を、その後の実験に使用した。
【図４Ａ】図４．ＰＢＭＣ培養物中での種々の融合タンパク質によるターゲット細胞限定ＮＫ細胞活性化（図４Ａ）及びＢ細胞殺傷（図４Ｂ）。生成された融合タンパク質のターゲット細胞限定を評価するために、正常なＰＢＭＣを、野生型ＩＬ−１５及び、ＣＤ１９抗原及び前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）それぞれに関連するＢ細胞をターゲットする種々の融合タンパク質に含まれ、野生型ＩＬ−１５よりＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有するＩＬ−１５ポリペプチドと共にインキュベーションした。Ｂ細胞がＰＢＭＣ培養物中に存在するため、ＣＤ１９は、この環境において、関連するターゲット抗原として機能する。一方、ＰＳＭＡは機能性せず、このため関連しない。ＰＢＭＣを、示された融合タンパク質（０．１μg/ml）と共に、３日間インキュベーションし、ついで、フローサイトメトリーにより分析した。図４Ａにおいて、ＮＫ細胞活性化及びＢ細胞殺傷を、ＣＤ６９を発現しているＣＤ５６陽性細胞（ＣＤ５６＋／ＣＤ６９＋ダブルポジティブ細胞）数を測定することにより評価した。ＣＤ６９は、活性化されたＮＫ細胞により発現される。一方、ＣＤ５６は、停止しているＮＫ細胞によっても発現される。ダブルポジティブ細胞（ＣＤ５６＋／ＣＤ６９＋）を選択することにより、活性化されたＮＫ細胞のみを測定する。図４Ａにおいて、細胞数を、ｙ軸に提供し、利用された種々の融合タンパク質を、ｘ軸に示す。対照ＰＢＭＣ培養物（「ＰＢＭＣのみ」）では、約１２０００個の細胞が、ＣＤ５６を発現し（ＣＤ５６＋）、約１０００個が、ＣＤ５６及びＣＤ６９について、ダブルポジティブ（ＣＤ５６＋／ＣＤ６９＋）であった。ＣＤ１９をターゲットし、ＳＤＩＥ変異を含む４Ｇ７結合タンパク質（αＣＤ１９−ＳＤＩＥ）の添加により、活性化されたＮＫ細胞数がわずかに増大した（αＣＤ１９−ＳＤＩＥ：ＳＤＩＥ改変を有するＦｃ最適化４Ｇ７抗体、それに付着したＩＬ−１５ポリペプチドを有さない）。対照的に、ＰＢＭＣ培養物内で活性化されたＮＫ細胞数は、αＣＤ１９−ＳＤＩＥ−ＩＬ１５ｗｔ−Ｌ融合タンパク質（４Ｇ７−ＩＬ１５ｗｔ−Ｌ、長いリンカーを含有、そしてここで、４Ｇ７は、ＳＤＩＥ改変を有するＦｃ最適化４Ｇ７抗体である）の添加の結果として、大きく増大した。活性化されたＮＫ細胞数において、顕著ではないが、それでもかなりの増大が、αＣＤ１９−ＳＤＩＥ−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質（４Ｇ７−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ、長いリンカーを含有、そしてここで、４Ｇ７は、ＳＤＩＥ改変を有するＦｃ最適化４Ｇ７抗体である）によっても観察された。ＰＳＭＡをターゲットする融合タンパク質について、さらに実験を行った。ＰＳＭＡは、ＰＢＭＣ細胞により発現されない。ここでは、αＰＳＭＡ−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質の添加（長いリンカーを含有）は、細胞の組成を明らかには変化させなかった。対照的に、αＰＳＭＡ−ＩＬ１５ｗｔ融合タンパク質（長いリンカーを含有）の添加は、ＣＤ５６陽性細胞プール内の活性化されたＮＫ細胞数を顕著に増大させた。これらの結果から、本発明のＩＬ−１５ポリペプチドを含有する融合タンパク質によるＮＫ細胞活性化は、ターゲット細胞限定的である、すなわち、結合���ンパク質は、ＣＤ１９をターゲットし、ＰＳＭＡをターゲットせず、ＮＫ細胞を活性化し、Ｂ細胞を殺傷すると、まとめることができる。野生型ＩＬ−１５を含む融合タンパク質の添加に基づいて、ＮＫ細胞のターゲット細胞限定活性化は、明らかに顕著ではない。これは、野生型ＩＬ−１５がＩＬ−１５Ｒαによりトランス提示され、融合タンパク質のターゲット細胞への結合を必要としないためである。図４Ｂにおいて、ＮＫ細胞活性化及びＢ細胞殺傷を、ＣＤ２０＋Ｂ細胞数を測定することにより評価した。ＣＤ２０は、Ｂ細胞により専ら発現される。この実験では、融合タンパク質を何ら加えずＰＢＭＣ細胞のみを含有する細胞培養物を、対照として機能させた。ここでは、約１２０００個のＣＤ２０陽性（ＣＤ２０＋）Ｂ細胞をカウントした。αＣＤ１９−ＳＤＩＥ対照の添加により、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞の（約４０００個の細胞への）減少がもたらされた。特に、αＣＤ１９−ＳＤＩＥ−ＩＬ１５ｗｔ−Ｌ（長いリンカーを含む）及びαＣＤ１９−ＳＤＩＥ−ＩＬ−１５Ｅ４６Ｋ−Ｌ（長いリンカーを含む）融合タンパク質により、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞の最も大きい減少がもたらされた（約２０００個の細胞）。対照的に、ＰＳＭＡ−ＩＬ−１５ｗｔ融合タンパク質の添加により、約６０００個の細胞への減少が示された。特に、ＰＳＭＡ−ＩＬ−１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質は、「ＰＢＭＣのみ」の対照と比較して、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞数を変化させなかった。このため、結合タンパク質−ＩＬ−１５ポリペプチド融合タンパク質によるＣＤ２０＋細胞数の減少（Ｂ細胞枯渇）は、Ｆｃ最適化ＣＤ１９抗体（αＣＤ１９ＳＤＩＥ）単独による減少より、顕著であった（図４Ｂ）。さらに、ＰＳＭＡ指向融合タンパク質は、ＩＬ−１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質がＣＤ２０陽性Ｂ細胞において何ら効果を示さなかったことを示した。このため、ターゲット細胞限定Ｂ細胞殺傷は、ＩＬ−１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質を使用して最も顕著である。一方、野生型ＩＬ−１５を含む融合タンパク質は、ほとんど顕著でないか、又は更に、存在しない、Ｂ細胞のターゲット細胞限定殺傷を示した（図４Ｂ）。図４Ｃにおいて、ＮＫ細胞活性化を、Ｂ細胞枯渇ＰＢＭＣ培養物において評価した。Ｂ細胞を、ＣＤ１９ MicroBeads（Miltenyi Biotec）を使用する磁気細胞分取（ＭＡＣＳ）により枯渇させた。図４Ａ及び図４Ｂにおけるように、細胞数の決定のために、等量のＢＤ陰性ビーズ（BD Biociencesからの陰性ビーズ）を、各サンプルに加えた。フローサイトメトリー測定中に、同じ数のＢＤ陰性ビーズを、全てのサンプルについて取得した。これにより、１つの実験からの種々のサンプル間での細胞の定量及び細胞数の直接比較が可能であった。これらの実験から、ＮＫ細胞活性化は、Ｅ４６Ｋ変異ＩＬ−１５ポリペプチドを含有する融合タンパク質の存在下において、顕著に低下し、ＰＳＭＡをターゲットする対応タンパク質のレベルにほぼ達した。これは、ターゲット抗原ＣＤ１９を有する細胞が枯渇していたためである。野生型ＩＬ−１５を含有する融合タンパク質の活性は、ほとんど影響を受けなかった。図４に表わされたデータからのまとめ：ａ．本発明のＩＬ−１５ポリペプチドを含有する融合タンパク質によるＮＫ細胞活性化は、ターゲット細胞限定的である。すなわち、ＣＤ１９をターゲットするが、ＰＳＭＡをターゲットしないタンパク質は、ＮＫ細胞を活性化し、Ｂ細胞を殺傷する。変異ＩＬ−１５ポリペプチドを含むＣＤ１９ターゲット融合タンパク質によるＮＫ細胞活性化は、Ｂ細胞がＰＢＭＣから枯渇された場合、減少した（図４Ｃ）。ｂ．野生型ＩＬ−１５を含有する両融合タンパク質によるＮＫ細胞活性化は、ターゲット細胞限定的ではない。すなわち、両融合タンパク質は、ＮＫ細胞活性化及びターゲットされた抗原に無関係な少なくとも幾らかのＢ細胞殺傷を誘引する。ｃ．本発明の融合タンパク質によるＢ細胞枯渇は、Ｆｃ最適化ＣＤ１９抗体（４Ｇ７ＳＤＩＥ）単独による枯渇より顕著である（図４Ｂ）。
【図４Ｂ】図４．ＰＢＭＣ培養物中での種々の融合タンパク質によるターゲット細胞限定ＮＫ細胞活性化（図４Ａ）及びＢ細胞殺傷（図４Ｂ）。生成された融合タンパク質のターゲット細胞限定を評価するために、正常なＰＢＭＣを、野生型ＩＬ−１５及び、ＣＤ１９抗原及び前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）それぞれに関連するＢ細胞をターゲットする種々の融合タンパク質に含まれ、野生型ＩＬ−１５よりＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有するＩＬ−１５ポリペプチドと共にインキュベーションした。Ｂ細胞がＰＢＭＣ培養物中に存在するため、ＣＤ１９は、この環境において、関連するターゲット抗原として機能する。一方、ＰＳＭＡは機能性せず、このため関連しない。ＰＢＭＣを、示された融合タンパク質（０．１μg/ml）と共に、３日間インキュベーションし、ついで、フローサイトメトリーにより分析した。図４Ａにおいて、ＮＫ細胞活性化及びＢ細胞殺傷を、ＣＤ６９を発現しているＣＤ５６陽性細胞（ＣＤ５６＋／ＣＤ６９＋ダブルポジティブ細胞）数を測定することにより評価した。ＣＤ６９は、活性化されたＮＫ細胞により発現される。一方、ＣＤ５６は、停止しているＮＫ細胞によっても発現される。ダブルポジティブ細胞（ＣＤ５６＋／ＣＤ６９＋）を選択することにより、活性化されたＮＫ細胞のみを測定する。図４Ａにおいて、細胞数を、ｙ軸に提供し、利用された種々の融合タンパク質を、ｘ軸に示す。対照ＰＢＭＣ培養物（「ＰＢＭＣのみ」）では、約１２０００個の細胞が、ＣＤ５６を発現し（ＣＤ５６＋）、約１０００個が、ＣＤ５６及びＣＤ６９について、ダブルポジティブ（ＣＤ５６＋／ＣＤ６９＋）であった。ＣＤ１９をターゲットし、ＳＤＩＥ変異を含む４Ｇ７結合タンパク質（αＣＤ１９−ＳＤＩＥ）の添加により、活性化されたＮＫ細胞数がわずかに増大した（αＣＤ１９−ＳＤＩＥ：ＳＤＩＥ改変を有するＦｃ最適化４Ｇ７抗体、それに付着したＩＬ−１５ポリペプチドを有さない）。対照的に、ＰＢＭＣ培養物内で活性化されたＮＫ細胞数は、αＣＤ１９−ＳＤＩＥ−ＩＬ１５ｗｔ−Ｌ融合タンパク質（４Ｇ７−ＩＬ１５ｗｔ−Ｌ、長いリンカーを含有、そしてここで、４Ｇ７は、ＳＤＩＥ改変を有するＦｃ最適化４Ｇ７抗体である）の添加の結果として、大きく増大した。活性化されたＮＫ細胞数において、顕著ではないが、それでもかなりの増大が、αＣＤ１９−ＳＤＩＥ−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質（４Ｇ７−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ、長いリンカーを含有、そしてここで、４Ｇ７は、ＳＤＩＥ改変を有するＦｃ最適化４Ｇ７抗体である）によっても観察された。ＰＳＭＡをターゲットする融合タンパク質について、さらに実験を行った。ＰＳＭＡは、ＰＢＭＣ細胞により発現されない。ここでは、αＰＳＭＡ−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質の添加（長いリンカーを含有）は、細胞の組成を明らかには変化させなかった。対照的に、αＰＳＭＡ−ＩＬ１５ｗｔ融合タンパク質（長いリンカーを含有）の添加は、ＣＤ５６陽性細胞プール内の活性化されたＮＫ細胞数を顕著に増大させた。これらの結果から、本発明のＩＬ−１５ポリペプチドを含有する融合タンパク質によるＮＫ細胞活性化は、ターゲット細胞限定的である、すなわち、結合���ンパク質は、ＣＤ１９をターゲットし、ＰＳＭＡをターゲットせず、ＮＫ細胞を活性化し、Ｂ細胞を殺傷すると、まとめることができる。野生型ＩＬ−１５を含む融合タンパク質の添加に基づいて、ＮＫ細胞のターゲット細胞限定活性化は、明らかに顕著ではない。これは、野生型ＩＬ−１５がＩＬ−１５Ｒαによりトランス提示され、融合タンパク質のターゲット細胞への結合を必要としないためである。図４Ｂにおいて、ＮＫ細胞活性化及びＢ細胞殺傷を、ＣＤ２０＋Ｂ細胞数を測定することにより評価した。ＣＤ２０は、Ｂ細胞により専ら発現される。この実験では、融合タンパク質を何ら加えずＰＢＭＣ細胞のみを含有する細胞培養物を、対照として機能させた。ここでは、約１２０００個のＣＤ２０陽性（ＣＤ２０＋）Ｂ細胞をカウントした。αＣＤ１９−ＳＤＩＥ対照の添加により、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞の（約４０００個の細胞への）減少がもたらされた。特に、αＣＤ１９−ＳＤＩＥ−ＩＬ１５ｗｔ−Ｌ（長いリンカーを含む）及びαＣＤ１９−ＳＤＩＥ−ＩＬ−１５Ｅ４６Ｋ−Ｌ（長いリンカーを含む）融合タンパク質により、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞の最も大きい減少がもたらされた（約２０００個の細胞）。対照的に、ＰＳＭＡ−ＩＬ−１５ｗｔ融合タンパク質の添加により、約６０００個の細胞への減少が示された。特に、ＰＳＭＡ−ＩＬ−１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質は、「ＰＢＭＣのみ」の対照と比較して、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞数を変化させなかった。このため、結合タンパク質−ＩＬ−１５ポリペプチド融合タンパク質によるＣＤ２０＋細胞数の減少（Ｂ細胞枯渇）は、Ｆｃ最適化ＣＤ１９抗体（αＣＤ１９ＳＤＩＥ）単独による減少より、顕著であった（図４Ｂ）。さらに、ＰＳＭＡ指向融合タンパク質は、ＩＬ−１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質がＣＤ２０陽性Ｂ細胞において何ら効果を示さなかったことを示した。このため、ターゲット細胞限定Ｂ細胞殺傷は、ＩＬ−１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質を使用して最も顕著である。一方、野生型ＩＬ−１５を含む融合タンパク質は、ほとんど顕著でないか、又は更に、存在しない、Ｂ細胞のターゲット細胞限定殺傷を示した（図４Ｂ）。図４Ｃにおいて、ＮＫ細胞活性化を、Ｂ細胞枯渇ＰＢＭＣ培養物において評価した。Ｂ細胞を、ＣＤ１９ MicroBeads（Miltenyi Biotec）を使用する磁気細胞分取（ＭＡＣＳ）により枯渇させた。図４Ａ及び図４Ｂにおけるように、細胞数の決定のために、等量のＢＤ陰性ビーズ（BD Biociencesからの陰性ビーズ）を、各サンプルに加えた。フローサイトメトリー測定中に、同じ数のＢＤ陰性ビーズを、全てのサンプルについて取得した。これにより、１つの実験からの種々のサンプル間での細胞の定量及び細胞数の直接比較が可能であった。これらの実験から、ＮＫ細胞活性化は、Ｅ４６Ｋ変異ＩＬ−１５ポリペプチドを含有する融合タンパク質の存在下において、顕著に低下し、ＰＳＭＡをターゲットする対応タンパク質のレベルにほぼ達した。これは、ターゲット抗原ＣＤ１９を有する細胞が枯渇していたためである。野生型ＩＬ−１５を含有する融合タンパク質の活性は、ほとんど影響を受けなかった。図４に表わされたデータからのまとめ：ａ．本発明のＩＬ−１５ポリペプチドを含有する融合タンパク質によるＮＫ細胞活性化は、ターゲット細胞限定的である。すなわち、ＣＤ１９をターゲットするが、ＰＳＭＡをターゲットしないタンパク質は、ＮＫ細胞を活性化し、Ｂ細胞を殺傷する。変異ＩＬ−１５ポリペプチドを含むＣＤ１９ターゲット融合タンパク質によるＮＫ細胞活性化は、Ｂ細胞がＰＢＭＣから枯渇された場合、減少した（図４Ｃ）。ｂ．野生型ＩＬ−１５を含有する両融合タンパク質によるＮＫ細胞活性化は、ターゲット細胞限定的ではない。すなわち、両融合タンパク質は、ＮＫ細胞活性化及びターゲットされた抗原に無関係な少なくとも幾らかのＢ細胞殺傷を誘引する。ｃ．本発明の融合タンパク質によるＢ細胞枯渇は、Ｆｃ最適化ＣＤ１９抗体（４Ｇ７ＳＤＩＥ）単独による枯渇より顕著である（図４Ｂ）。
【図４Ｃ】図４．ＰＢＭＣ培養物中での種々の融合タンパク質によるターゲット細胞限定ＮＫ細胞活性化（図４Ａ）及びＢ細胞殺傷（図４Ｂ）。生成された融合タンパク質のターゲット細胞限定を評価するために、正常なＰＢＭＣを、野生型ＩＬ−１５及び、ＣＤ１９抗原及び前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）それぞれに関連するＢ細胞をターゲットする種々の融合タンパク質に含まれ、野生型ＩＬ−１５よりＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有するＩＬ−１５ポリペプチドと共にインキュベーションした。Ｂ細胞がＰＢＭＣ培養物中に存在するため、ＣＤ１９は、この環境において、関連するターゲット抗原として機能する。一方、ＰＳＭＡは機能性せず、このため関連しない。ＰＢＭＣを、示された融合タンパク質（０．１μg/ml）と共に、３日間インキュベーションし、ついで、フローサイトメトリーにより分析した。図４Ａにおいて、ＮＫ細胞活性化及びＢ細胞殺傷を、ＣＤ６９を発現しているＣＤ５６陽性細胞（ＣＤ５６＋／ＣＤ６９＋ダブルポジティブ細胞）数を測定することにより評価した。ＣＤ６９は、活性化されたＮＫ細胞により発現される。一方、ＣＤ５６は、停止しているＮＫ細胞によっても発現される。ダブルポジティブ細胞（ＣＤ５６＋／ＣＤ６９＋）を選択することにより、活性化されたＮＫ細胞のみを測定する。図４Ａにおいて、細胞数を、ｙ軸に提供し、利用された種々の融合タンパク質を、ｘ軸に示す。対照ＰＢＭＣ培養物（「ＰＢＭＣのみ」）では、約１２０００個の細胞が、ＣＤ５６を発現し（ＣＤ５６＋）、約１０００個が、ＣＤ５６及びＣＤ６９について、ダブルポジティブ（ＣＤ５６＋／ＣＤ６９＋）であった。ＣＤ１９をターゲットし、ＳＤＩＥ変異を含む４Ｇ７結合タンパク質（αＣＤ１９−ＳＤＩＥ）の添加により、活性化されたＮＫ細胞数がわずかに増大した（αＣＤ１９−ＳＤＩＥ：ＳＤＩＥ改変を有するＦｃ最適化４Ｇ７抗体、それに付着したＩＬ−１５ポリペプチドを有さない）。対照的に、ＰＢＭＣ培養物内で活性化されたＮＫ細胞数は、αＣＤ１９−ＳＤＩＥ−ＩＬ１５ｗｔ−Ｌ融合タンパク質（４Ｇ７−ＩＬ１５ｗｔ−Ｌ、長いリンカーを含有、そしてここで、４Ｇ７は、ＳＤＩＥ改変を有するＦｃ最適化４Ｇ７抗体である）の添加の結果として、大きく増大した。活性化されたＮＫ細胞数において、顕著ではないが、それでもかなりの増大が、αＣＤ１９−ＳＤＩＥ−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質（４Ｇ７−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ、長いリンカーを含有、そしてここで、４Ｇ７は、ＳＤＩＥ改変を有するＦｃ最適化４Ｇ７抗体である）によっても観察された。ＰＳＭＡをターゲットする融合タンパク質について、さらに実験を行った。ＰＳＭＡは、ＰＢＭＣ細胞により発現されない。ここでは、αＰＳＭＡ−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質の添加（長いリンカーを含有）は、細胞の組成を明らかには変化させなかった。対照的に、αＰＳＭＡ−ＩＬ１５ｗｔ融合タンパク質（長いリンカーを含有）の添加は、ＣＤ５６陽性細胞プール内の活性化されたＮＫ細胞数を顕著に増大させた。これらの結果から、本発明のＩＬ−１５ポリペプチドを含有する融合タンパク質によるＮＫ細胞活性化は、ターゲット細胞限定的である、すなわち、結合���ンパク質は、ＣＤ１９をターゲットし、ＰＳＭＡをターゲットせず、ＮＫ細胞を活性化し、Ｂ細胞を殺傷すると、まとめることができる。野生型ＩＬ−１５を含む融合タンパク質の添加に基づいて、ＮＫ細胞のターゲット細胞限定活性化は、明らかに顕著ではない。これは、野生型ＩＬ−１５がＩＬ−１５Ｒαによりトランス提示され、融合タンパク質のターゲット細胞への結合を必要としないためである。図４Ｂにおいて、ＮＫ細胞活性化及びＢ細胞殺傷を、ＣＤ２０＋Ｂ細胞数を測定することにより評価した。ＣＤ２０は、Ｂ細胞により専ら発現される。この実験では、融合タンパク質を何ら加えずＰＢＭＣ細胞のみを含有する細胞培養物を、対照として機能させた。ここでは、約１２０００個のＣＤ２０陽性（ＣＤ２０＋）Ｂ細胞をカウントした。αＣＤ１９−ＳＤＩＥ対照の添加により、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞の（約４０００個の細胞への）減少がもたらされた。特に、αＣＤ１９−ＳＤＩＥ−ＩＬ１５ｗｔ−Ｌ（長いリンカーを含む）及びαＣＤ１９−ＳＤＩＥ−ＩＬ−１５Ｅ４６Ｋ−Ｌ（長いリンカーを含む）融合タンパク質により、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞の最も大きい減少がもたらされた（約２０００個の細胞）。対照的に、ＰＳＭＡ−ＩＬ−１５ｗｔ融合タンパク質の添加により、約６０００個の細胞への減少が示された。特に、ＰＳＭＡ−ＩＬ−１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質は、「ＰＢＭＣのみ」の対照と比較して、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞数を変化させなかった。このため、結合タンパク質−ＩＬ−１５ポリペプチド融合タンパク質によるＣＤ２０＋細胞数の減少（Ｂ細胞枯渇）は、Ｆｃ最適化ＣＤ１９抗体（αＣＤ１９ＳＤＩＥ）単独による減少より、顕著であった（図４Ｂ）。さらに、ＰＳＭＡ指向融合タンパク質は、ＩＬ−１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質がＣＤ２０陽性Ｂ細胞において何ら効果を示さなかったことを示した。このため、ターゲット細胞限定Ｂ細胞殺傷は、ＩＬ−１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質を使用して最も顕著である。一方、野生型ＩＬ−１５を含む融合タンパク質は、ほとんど顕著でないか、又は更に、存在しない、Ｂ細胞のターゲット細胞限定殺傷を示した（図４Ｂ）。図４Ｃにおいて、ＮＫ細胞活性化を、Ｂ細胞枯渇ＰＢＭＣ培養物において評価した。Ｂ細胞を、ＣＤ１９ MicroBeads（Miltenyi Biotec）を使用する磁気細胞分取（ＭＡＣＳ）により枯渇させた。図４Ａ及び図４Ｂにおけるように、細胞数の決定のために、等量のＢＤ陰性ビーズ（BD Biociencesからの陰性ビーズ）を、各サンプルに加えた。フローサイトメトリー測定中に、同じ数のＢＤ陰性ビーズを、全てのサンプルについて取得した。これにより、１つの実験からの種々のサンプル間での細胞の定量及び細胞数の直接比較が可能であった。これらの実験から、ＮＫ細胞活性化は、Ｅ４６Ｋ変異ＩＬ−１５ポリペプチドを含有する融合タンパク質の存在下において、顕著に低下し、ＰＳＭＡをターゲットする対応タンパク質のレベルにほぼ達した。これは、ターゲット抗原ＣＤ１９を有する細胞が枯渇していたためである。野生型ＩＬ−１５を含有する融合タンパク質の活性は、ほとんど影響を受けなかった。図４に表わされたデータからのまとめ：ａ．本発明のＩＬ−１５ポリペプチドを含有する融合タンパク質によるＮＫ細胞活性化は、ターゲット細胞限定的である。すなわち、ＣＤ１９をターゲットするが、ＰＳＭＡをターゲットしないタンパク質は、ＮＫ細胞を活性化し、Ｂ細胞を殺傷する。変異ＩＬ−１５ポリペプチドを含むＣＤ１９ターゲット融合タンパク質によるＮＫ細胞活性化は、Ｂ細胞がＰＢＭＣから枯渇された場合、減少した（図４Ｃ）。ｂ．野生型ＩＬ−１５を含有する両融合タンパク質によるＮＫ細胞活性化は、ターゲット細胞限定的ではない。すなわち、両融合タンパク質は、ＮＫ細胞活性化及びターゲットされた抗原に無関係な少なくとも幾らかのＢ細胞殺傷を誘引する。ｃ．本発明の融合タンパク質によるＢ細胞枯渇は、Ｆｃ最適化ＣＤ１９抗体（４Ｇ７ＳＤＩＥ）単独による枯渇より顕著である（図４Ｂ）。
【図５−１】図５．種々の配列の表示。野生型ｈＩＬ−１５の配列は、配列番号：１に示される。下線が引かれたこの配列の最初の４８個のアミノ酸は、長さが４８個のアミノ酸シグナルペプチドを含む。同シグナルペプチドは、ｈＩＬ−１５の分泌中に開裂され、ＩＬ−１５融合タンパク質の一部ではない。配列番号：１中、野生型ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαへの結合に重要な対応するアミノ酸（図５に示されたように、配列番号：２、３、及び配列番号：４に示す）を、灰色に強調している。配列番号：１において、灰色に強調された部分は、Ring et al. (2012)（Ring et al. (2012) 「Mechanistic and structural insight into the functional dichotomy between IL-2 and IL-15」 Nat Immunol; 13:1187-1195）に記載されたように、βγ受容体結合に重要なアミノ酸である。特に、βγ受容体結合に重要なアミノ酸は、配列番号：１のアミノ酸位置５５、５６、５８、５９、１０９、１１３、１１６、１１７、１５６、１５７、１６０に対応するアミノ酸である。ＩＬ１５Ｒα又はβγ受容体結合に重要なアミノ酸位置を、以下の表１及び表２にも示す。また、抗ＣＤ１９抗体４Ｇ７のシングル重鎖可変ドメイン（配列番号：５）、抗ＣＤ１９抗体４Ｇ７のシングル軽鎖可変ドメイン（配列番号：６）、抗ＦＬＴ３抗体ＢＶ１０のシングル重鎖可変ドメイン（配列番号：７）、抗ＦＬＴ３抗体ＢＶ１０のシングル軽鎖可変ドメイン（配列番号：８）、抗ＦＬＴ３抗体４Ｇ８のシングル重鎖可変ドメイン（配列番号：９）、抗ＦＬＴ３抗体４Ｇ８のシングル軽鎖可変ドメイン（配列番号：１０）、抗ＰＳＭＡ抗体Ｊ５９１のシングル重鎖可変ドメイン（配列番号：１１）、抗ＰＳＭＡ抗体Ｊ５９１のシングル軽鎖可変ドメイン（配列番号：１２）、抗エンドグリン抗体Ｋｒｏ２３のシングル重鎖可変ドメイン（配列番号：２５）、抗エンドグリン抗体Ｋｒｏ２３のシングル軽鎖可変ドメイン（配列番号：２６）のアミノ酸配列も示される。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図５−２】図５．種々の配列の表示。野生型ｈＩＬ−１５の配列は、配列番号：１に示される。下線が引かれたこの配列の最初の４８個のアミノ酸は、長さが４８個のアミノ酸シグナルペプチドを含む。同シグナルペプチドは、ｈＩＬ−１５の分泌中に開裂され、ＩＬ−１５融合タンパク質の一部ではない。配列番号：１中、野生型ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαへの結合に重要な対応するアミノ酸（図５に示されたように、配列番号：２、３、及び配列番号：４に示す）を、灰色に強調している。配列番号：１において、灰色に強調された部分は、Ring et al. (2012)（Ring et al. (2012) 「Mechanistic and structural insight into the functional dichotomy between IL-2 and IL-15」 Nat Immunol; 13:1187-1195）に記載されたように、βγ受容体結合に重要なアミノ酸である。特に、βγ受容体結合に重要なアミノ酸は、配列番号：１のアミノ酸位置５５、５６、５８、５９、１０９、１１３、１１６、１１７、１５６、１５７、１６０に対応するアミノ酸である。ＩＬ１５Ｒα又はβγ受容体結合に重要なアミノ酸位置を、以下の表１及び表２にも示す。また、抗ＣＤ１９抗体４Ｇ７のシングル重鎖可変ドメイン（配列番号：５）、抗ＣＤ１９抗体４Ｇ７のシングル軽鎖可変ドメイン（配列番号：６）、抗ＦＬＴ３抗体ＢＶ１０のシングル重鎖可変ドメイン（配列番号：７）、抗ＦＬＴ３抗体ＢＶ１０のシングル軽鎖可変ドメイン（配列番号：８）、抗ＦＬＴ３抗体４Ｇ８のシングル重鎖可変ドメイン（配列番号：９）、抗ＦＬＴ３抗体４Ｇ８のシングル軽鎖可変ドメイン（配列番号：１０）、抗ＰＳＭＡ抗体Ｊ５９１のシングル重鎖可変ドメイン（配列番号：１１）、抗ＰＳＭＡ抗体Ｊ５９１のシングル軽鎖可変ドメイン（配列番号：１２）、抗エンドグリン抗体Ｋｒｏ２３のシングル重鎖可変ドメイン（配列番号：２５）、抗エンドグリン抗体Ｋｒｏ２３のシングル軽鎖可変ドメイン（配列番号：２６）のアミノ酸配列も示される。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【図６】図６．ＳＤＩＥ改変を含む抗エンドグリンＩｇＧ１（Ｋｒｏ２３）重鎖とＩＬ１５変異体との融合タンパク質（配列番号：２７）及び抗エンドグリンＩｇＧ１（Ｋｒｏ２３）の軽鎖（配列番号：２８）の表示。配列番号：２７の表示において、ＶＨ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。続けて、ＣＨ１領域は、強調されていない。ヒンジ領域は、再度、灰色で強調されており、イタリック体により表わされている。一方、それに続くＣＨ２領域は、再度、強調されていない。その後のＣＨ３領域は、灰色で強調されており、ボールド体により表わされている。続くリンカー配列は、強調されていない。最後の部分は、ＩＬ１５変異体（ＩＬ１５ｍｕｔ）であり、再度、灰色で強調されており、ボールドのイタリック体により表わされている。そしてここで、ＩＬ１５変異体の変異アミノ酸に下線が引かれている。この変異は、配列番号：４のＥ４６Ｋ変異に相当する。配列番号：２６において、ＶＬ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。一方、ＣＬ領域は、強調されていない。
【図７−１】図７．ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖と野生型ＩＬ１５とのグリシン−セリンリンカー（短いリンカー）による融合タンパク質（配列番号：２９）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｅ４６Ｋ変異体との短いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３０）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｖ４９Ｄ変異体との短いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３１）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｉ５０Ｄ変異体との短いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３２）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖と野生型ＩＬ１５との（グリシン４−セリン１）４リンカー（長いリンカー）による融合タンパク質（配列番号：３３）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｅ４６Ｋ変異体との長いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３４）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｖ４９Ｄ変異体との長いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３５）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｉ５０Ｄ変異体との長いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３６）、さらに、抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）軽鎖（配列番号：３７）の表示。配列番号：３０〜３７の表示において、ＶＨ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。続けて、ＣＨ１領域は、強調されていない。ヒンジ領域は、再度、灰色で強調されており、イタリック体により表わされている。一方、それに続くＣＨ２領域は、再度、強調されていない。その後のＣＨ３領域は、灰色で強調されており、ボールド体により表わされている。続くリンカー配列は、強調されていない。最後の部分は、ＩＬ１５変異体（ＩＬ１５ｍｕｔ）であり、再度、灰色で強調されており、ボールドのイタリック体により表わされている。そしてここで、ＩＬ−１５変異体を含む融合タンパク質における変異アミノ酸に下線が引かれている。これらの変異は、配列番号４のＥ４６Ｋ（配列番号：３０及び３４）、Ｖ４９Ｄ（配列番号：３１及び３５）、又はＩ５０Ｄ（配列番号：３２及び３６）変異それぞれに相当する。配列番号：３７において、ＶＬ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。一方、ＣＬ領域は、強調されていない。
【図７−２】図７．ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖と野生型ＩＬ１５とのグリシン−セリンリンカー（短いリンカー）による融合タンパク質（配列番号：２９）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｅ４６Ｋ変異体との短いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３０）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｖ４９Ｄ変異体との短いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３１）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｉ５０Ｄ変異体との短いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３２）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖と野生型ＩＬ１５との（グリシン４−セリン１）４リンカー（長いリンカー）による融合タンパク質（配列番号：３３）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｅ４６Ｋ変異体との長いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３４）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｖ４９Ｄ変異体との長いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３５）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｉ５０Ｄ変異体との長いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３６）、さらに、抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）軽鎖（配列番号：３７）の表示。配列番号：３０〜３７の表示において、ＶＨ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。続けて、ＣＨ１領域は、強調されていない。ヒンジ領域は、再度、灰色で強調されており、イタリック体により表わされている。一方、それに続くＣＨ２領域は、再度、強調されていない。その後のＣＨ３領域は、灰色で強調されており、ボールド体により表わされている。続くリンカー配列は、強調されていない。最後の部分は、ＩＬ１５変異体（ＩＬ１５ｍｕｔ）であり、再度、灰色で強調されており、ボールドのイタリック体により表わされている。そしてここで、ＩＬ−１５変異体を含む融合タンパク質における変異アミノ酸に下線が引かれている。これらの変異は、配列番号４のＥ４６Ｋ（配列番号：３０及び３４）、Ｖ４９Ｄ（配列番号：３１及び３５）、又はＩ５０Ｄ（配列番号：３２及び３６）変異それぞれに相当する。配列番号：３７において、ＶＬ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。一方、ＣＬ領域は、強調されていない。
【図７−３】図７．ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖と野生型ＩＬ１５とのグリシン−セリンリンカー（短いリンカー）による融合タンパク質（配列番号：２９）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｅ４６Ｋ変異体との短いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３０）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｖ４９Ｄ変異体との短いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３１）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｉ５０Ｄ変異体との短いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３２）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖と野生型ＩＬ１５との（グリシン４−セリン１）４リンカー（長いリンカー）による融合タンパク質（配列番号：３３）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｅ４６Ｋ変異体との長いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３４）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｖ４９Ｄ変異体との長いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３５）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｉ５０Ｄ変異体との長いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３６）、さらに、抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）軽鎖（配列番号：３７）の表示。配列番号：３０〜３７の表示において、ＶＨ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。続けて、ＣＨ１領域は、強調されていない。ヒンジ領域は、再度、灰色で強調されており、イタリック体により表わされている。一方、それに続くＣＨ２領域は、再度、強調されていない。その後のＣＨ３領域は、灰色で強調されており、ボールド体により表わされている。続くリンカー配列は、強調されていない。最後の部分は、ＩＬ１５変異体（ＩＬ１５ｍｕｔ）であり、再度、灰色で強調されており、ボールドのイタリック体により表わされている。そしてここで、ＩＬ−１５変異体を含む融合タンパク質における変異アミノ酸に下線が引かれている。これらの変異は、配列番号４のＥ４６Ｋ（配列番号：３０及び３４）、Ｖ４９Ｄ（配列番号：３１及び３５）、又はＩ５０Ｄ（配列番号：３２及び３６）変異それぞれに相当する。配列番号：３７において、ＶＬ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。一方、ＣＬ領域は、強調されていない。
【図７−４】図７．ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖と野生型ＩＬ１５とのグリシン−セリンリンカー（短いリンカー）による融合タンパク質（配列番号：２９）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｅ４６Ｋ変異体との短いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３０）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｖ４９Ｄ変異体との短いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３１）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｉ５０Ｄ変異体との短いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３２）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖と野生型ＩＬ１５との（グリシン４−セリン１）４リンカー（長いリンカー）による融合タンパク質（配列番号：３３）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｅ４６Ｋ変異体との長いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３４）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｖ４９Ｄ変異体との長いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３５）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｉ５０Ｄ変異体との長いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３６）、さらに、抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）軽鎖（配列番号：３７）の表示。配列番号：３０〜３７の表示において、ＶＨ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。続けて、ＣＨ１領域は、強調されていない。ヒンジ領域は、再度、灰色で強調されており、イタリック体により表わされている。一方、それに続くＣＨ２領域は、再度、強調されていない。その後のＣＨ３領域は、灰色で強調されており、ボールド体により表わされている。続くリンカー配列は、強調されていない。最後の部分は、ＩＬ１５変異体（ＩＬ１５ｍｕｔ）であり、再度、灰色で強調されており、ボールドのイタリック体により表わされている。そしてここで、ＩＬ−１５変異体を含む融合タンパク質における変異アミノ酸に下線が引かれている。これらの変異は、配列番号４のＥ４６Ｋ（配列番号：３０及び３４）、Ｖ４９Ｄ（配列番号：３１及び３５）、又はＩ５０Ｄ（配列番号：３２及び３６）変異それぞれに相当する。配列番号：３７において、ＶＬ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。一方、ＣＬ領域は、強調されていない。
【図７−５】図７．ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖と野生型ＩＬ１５とのグリシン−セリンリンカー（短いリンカー）による融合タンパク質（配列番号：２９）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｅ４６Ｋ変異体との短いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３０）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｖ４９Ｄ変異体との短いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３１）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｉ５０Ｄ変異体との短いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３２）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖と野生型ＩＬ１５との（グリシン４−セリン１）４リンカー（長いリンカー）による融合タンパク質（配列番号：３３）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｅ４６Ｋ変異体との長いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３４）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｖ４９Ｄ変異体との長いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３５）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）重鎖とＩＬ１５  Ｉ５０Ｄ変異体との長いリンカーによる融合タンパク質（配列番号：３６）、さらに、抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１（４Ｇ７）軽鎖（配列番号：３７）の表示。配列番号：３０〜３７の表示において、ＶＨ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。続けて、ＣＨ１領域は、強調されていない。ヒンジ領域は、再度、灰色で強調されており、イタリック体により表わされている。一方、それに続くＣＨ２領域は、再度、強調されていない。その後のＣＨ３領域は、灰色で強調されており、ボールド体により表わされている。続くリンカー配列は、強調されていない。最後の部分は、ＩＬ１５変異体（ＩＬ１５ｍｕｔ）であり、再度、灰色で強調されており、ボールドのイタリック体により表わされている。そしてここで、ＩＬ−１５変異体を含む融合タンパク質における変異アミノ酸に下線が引かれている。これらの変異は、配列番号４のＥ４６Ｋ（配列番号：３０及び３４）、Ｖ４９Ｄ（配列番号：３１及び３５）、又はＩ５０Ｄ（配列番号：３２及び３６）変異それぞれに相当する。配列番号：３７において、ＶＬ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。一方、ＣＬ領域は、強調されていない。
【図８】図８．ＳＤＩＥ改変を含む抗ＦＬＴ３  ＩｇＧ１（ＢＶ１０）重鎖とＩＬ１５変異体との融合タンパク質（配列番号：３８）、さらに、抗ＦＬＴ３  ＩｇＧ１（ＢＶ１０）軽鎖（配列番号：３９）の表示。配列番号：３８の表示において、ＶＨ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。続けて、ＣＨ１領域は、強調されていない。ヒンジ領域は、再度、灰色で強調されており、イタリック体により表わされている。一方、それに続くＣＨ２領域は、再度、強調されていない。その後のＣＨ３領域は、灰色で強調されており、ボールド体により表わされている。続くリンカー配列は、強調されていない。最後の部分は、ＩＬ１５変異体（ＩＬ１５ｍｕｔ）であり、再度、灰色で強調されており、ボールドのイタリック体により表わされている。そしてここで、ＩＬ１５変異体の変異アミノ酸に下線が引かれている。この変異は、配列番号：４のＥ４６Ｋ変異に相当する。配列番号：３９において、ＶＬ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。一方、ＣＬ領域は、強調されていない。
【図９】図９．ＳＤＩＥ改変を含む抗ＦＬＴ３  ＩｇＧ１（４Ｇ８）重鎖とＩＬ１５変異体との融合タンパク質（配列番号：４０）、さらに、抗ＦＬＴ３  ＩｇＧ１（４Ｇ８）軽鎖（配列番号：４１）の表示。配列番号：４０の表示において、ＶＨ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。続けて、ＣＨ１領域は、強調されていない。ヒンジ領域は、再度、灰色で強調されており、イタリック体により表わされている。一方、それに続くＣＨ２領域は、再度、強調されていない。その後のＣＨ３領域は、灰色で強調されており、ボールド体により表わされている。続くリンカー配列は、強調されていない。最後の部分は、ＩＬ１５変異体（ＩＬ１５ｍｕｔ）であり、再度、灰色で強調されており、ボールドのイタリック体により表わされている。そしてここで、ＩＬ１５変異体の変異アミノ酸に下線が引かれている。この変異は、配列番号：４のＥ４６Ｋ変異に相当する。配列番号：４１において、ＶＬ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。一方、ＣＬ領域は、強調されていない。
【図１０−１】図１０．ＳＤＩＥ改変を含む抗ＰＳＭＡ  ＩｇＧ１（Ｊ５９１）重鎖と野生型ＩＬ１５との融合タンパク質（配列番号：４２）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＰＳＭＡ  ＩｇＧ１（Ｊ５９１）重鎖とＩＬ１５  Ｅ４６Ｋ変異体との融合タンパク質（配列番号：４３）、さらに、抗ＰＳＭＡ  ＩｇＧ１（Ｊ５９１）軽鎖（配列番号：４４）の表示。配列番号：４２及び４３の表示において、ＶＨ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。続けて、ＣＨ１領域は、強調されていない。ヒンジ領域は、再度、灰色で強調されており、イタリック体により表わされている。一方、それに続くＣＨ２領域は、再度、強調されていない。その後のＣＨ３領域は、灰色で強調されており、ボールド体により表わされている。続くリンカー配列は、強調されていない。最後の部分は、ＩＬ１５変異体（ＩＬ１５ｍｕｔ）であり、再度、灰色で強調されており、ボールドのイタリック体により表わされている。そしてここで、ＩＬ−１５変異体を含む融合タンパク質における変異アミノ酸に下線が引かれている。これらの変異は、配列番号：４のＥ４６Ｋ（配列番号：４３）変異に相当する。配列番号：４４において、ＶＬ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。一方、ＣＬ領域は、強調されていない。
【図１０−２】図１０．ＳＤＩＥ改変を含む抗ＰＳＭＡ  ＩｇＧ１（Ｊ５９１）重鎖と野生型ＩＬ１５との融合タンパク質（配列番号：４２）、ＳＤＩＥ改変を含む抗ＰＳＭＡ  ＩｇＧ１（Ｊ５９１）重鎖とＩＬ１５  Ｅ４６Ｋ変異体との融合タンパク質（配列番号：４３）、さらに、抗ＰＳＭＡ  ＩｇＧ１（Ｊ５９１）軽鎖（配列番号：４４）の表示。配列番号：４２及び４３の表示において、ＶＨ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。続けて、ＣＨ１領域は、強調されていない。ヒンジ領域は、再度、灰色で強調されており、イタリック体により表わされている。一方、それに続くＣＨ２領域は、再度、強調されていない。その後のＣＨ３領域は、灰色で強調されており、ボールド体により表わされている。続くリンカー配列は、強調されていない。最後の部分は、ＩＬ１５変異体（ＩＬ１５ｍｕｔ）であり、再度、灰色で強調されており、ボールドのイタリック体により表わされている。そしてここで、ＩＬ−１５変異体を含む融合タンパク質における変異アミノ酸に下線が引かれている。これらの変異は、配列番号：４のＥ４６Ｋ（配列番号：４３）変異に相当する。配列番号：４４において、ＶＬ領域は、灰色で強調されている。その中で、ＣＤＲに下線が引かれている。一方、ＣＬ領域は、強調されていない。
【００２４】
［詳細な説明］
【表１】
0006757338.tif 000002
【００２５】
【表２】
0006757338.tif 000003
【００２６】
配列番号：４のアミノ酸配列は、配列番号：１のフラグメントであり、同フラグメント中において、ＩＬ−１５Ｒα及びＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγ結合に重要なアミノ酸位置は、図５でも強調されている。
【００２７】
本願は、（これらのターゲット細胞の）ターゲット細胞限定殺傷することができる融合タンパク質を提供する。そしてここで、これらの融合タンパク質は、２「種類の機能的な部分」、すなわち、第１の部分として、（本明細書で詳細に記載された）結合タンパク質と、第２の部分として、ＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性、好ましくは、配列番号：１（UniProtアクセッションナンバー：Ｐ４０９３３）の野生型ＩＬ−１５の親和性と比較して、ヒトＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有するＩＬ−１５ポリペプチド、好ましくは、ヒトＩＬ−１５ポリペプチドとを含有する。本発明者らは、このようなＩＬ−１５ポリペプチドが配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１２、１１３、１１４、１１５、及び／又は１１６位に対応する１つ以上の位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを、見出した。この文脈において、「ＩＬ−１５Ｒα」という用語は、インターロイキン１５レセプター  アルファサブユニットを指すのに、その通常の意味で使用されることが留意される。同サブユニットは、高い親和性でＩＬ−１５に結合するインターロイキン１５レセプターのサブユニットを意味し、ＩＬ−１５レセプターの２つの他のサブユニットＣＤ１２２及びＣＤ１３２とは独立している（ＩＬ−１５レセプターは、ＩＬ−２に対するレセプターを共有している）。「ＩＬ−１５Ｒα」のアミノ酸配列は、多くの種について公知であり、ヒト「ＩＬ−１５Ｒα」の配列は、UniProtアクセッションナンバーＱ１３２６１で登録されている。
【００２８】
また、「ＩＬ−１５」又は「ＩＬ１５」という用語は、インターロイキン１５を指すのに、その通常の意味で使用される。「ＩＬ−１５」のアミノ酸配列は、多くの種について公知である。ヒト「ＩＬ−１５」の配列は、アイソフォームＩＬ１５−Ｓ４８ＡＡとして、UniProtアクセッションナンバーＰ４０９３３及びGeneBankアクセッションナンバーＤＱ８９３７０９それぞれで登録されており、配列番号：１に示される。
【００２９】
原理的には、このようなＩＬ−１５ポリペプチドを含む融合タンパク質において、ターゲット結合タンパク質は、ＩＬ−１５レセプターのα鎖の機能を置き換えることにより、例えば、腫瘍細胞上に発現されるそのターゲット抗原への結合タンパク質の結合性により決まる、βγ鎖のターゲット細胞限定刺激をもたらす。このため、オフターゲット作用が減少し、例えば、十分なＮＫ及びＴ細胞活性化を達成することができる、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるより高い用量の適用が可能となる。活性化されると、例えば、ＮＫ細胞を、例えば、本発明の融合タンパク質（図１）に含まれるＦｃ最適化ターゲット結合タンパク質により、効果的にリクルートすることができる。
【００３０】
本発明の融合タンパク質は、ＩＬ−１５と可溶性リコンビナントＩＬ−１５Ｒα又はそのフラグメントとの公知の複合体又は融合タンパク質を上回る、有益な代替物である。これに関しては、例えば、Bessard et al. (2009) 「High antitumor activity of RLI, an interleukin-15 (IL-15)-IL-15 receptor alpha fusion protein, in metastatic melanoma and colorectal cancer」 Mol Cancer Ther; 8:2736-2745、Vincent et al. (2013) 「Tumor targeting of the IL-15 superagonist RLI by an anti-GD2 antibody strongly enhances its antitumor potency.」 Int J Cancer; 133:757-765、又はKermer et al. (2012) 「An antibody fusion protein for cancer immunotherapy mimicking IL-15 trans-presentation at the tumor site」 Mol Cancer Ther; 11:1279-1288)を参照のこと。これらの参考文献に記載されたリコンビナントＩＬ−１５Ｒα又はそのフラグメントは全て、いわゆる、「ｓｕｓｈｉドメイン」を含む。同ドメインは、ＩＬ−１５ＲαへのＩＬ−１５の結合に重要である（Wei et al.  (2001) 「The Sushi Domain of Soluble IL-15 Receptor α Is Essential for Binding IL-15 and Inhibiting Inflammatory and Allogenic Responses In Vitro and In Vivo」 The Journal of Immunology; vol. 167, no. 1, p. 277-282を参照のこと）。ＩＬ−１５のみを含む構築物については、同構築物は、ＩＬ−１５αＲ及びＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγの両方への結合を介してのみ機能することが明らかである。理論に拘束されるものではないが、２つのレセプター（α及びβγ）へのこの二重依存性により、これらの野生型ＩＬ−１５構築物の作用が、ほとんどターゲット細胞特異的でなくなると考えられる。また、このことは、本願の実施例において、本発明の融合タンパク質が野生型ＩＬ−１５を含む融合タンパク質より非常にターゲット限定的な方法で作用するのが示されたことによっても証明される。
【００３１】
また、ＩＬ−１５とＩＬ−１５ＲαＦｃとの融合タンパク質又は複合体は、サイトカイン単独より、メモリ表現型ＣＤ８＋細胞及びＮＫ細胞の増殖を刺激するのに効果的であることも示されている。したがって、それらの融合タンパク質は、「ＩＬ−１５スーパーアゴニスト」と呼ばれている。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体の予期せぬスーパーアゴニスト機能のために、その作用が、例えば、腫瘍関連抗原をターゲットする抗体への融合により、ターゲット細胞限定的になることは、全くありそうもない。「ＩＬ−１５スーパーアゴニスト」の活性は、Ｆｃ架橋によって更に向上されることはない（Rubinstein et al. (2006) supports this notion. 「Converting IL-15 to a superagonist by binding to soluble IL-15Rα」 Proc Natl Acad Sci USA; 103:9166-9171）。対照的に、ここで記載された、結合タンパク質と変異ＩＬ−１５変異体とを含む本融合タンパク質は、それらがターゲット細胞に結合タンパク質に結合する限りにおいて、顕著に低下したＩＬ−１５活性を示す。
【００３２】
特に、本発明は、
ａ）少なくとも１つの結合部位を含む結合タンパク質であって、結合部位は、ターゲット細胞に関連する抗原に結合する結合タンパク質と、
ｂ）ＩＬ−１５ポリペプチドであって、ＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１２、１１３、１１４、１１５、及び／又は１１６位に対応する１つ以上の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、これにより、配列番号：１（Uniprotナンバー：Ｐ４０９３３−１）の野生型ＩＬ−１５の親和性と比較して、ＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有するＩＬ−１５ポリペプチドとを含む、融合タンパク質に関する。
【００３３】
本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、ターゲット細胞に関連する抗原に結合することができる任意のタンパク質であることができる。結合タンパク質は、抗体分子、例えば、インタクトな抗体、二価の抗体フラグメント、又は一価の抗体フラグメントであることができる。あるいは、結合タンパク質は、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子であることができる。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「抗体分子」は、全長抗体、リコンビナント抗体分子、又は完全にヒトの抗体分子であることができる。全長抗体は、任意の天然の抗体である。また、「抗体」という用語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）の種々のクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）及びサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２等）も含む。このような全長抗体は、種々の動物、例えば、種々の哺乳類種等から単離することができる。「リコンビナント抗体分子」は、その遺伝子がクローニングされ、ホスト細胞又は生物中において、遺伝子操作の周知の方法を使用して、組換え的に生成される、抗体分子を意味する。典型的には、リコンビナント抗体分子は、天然には見出されないアミノ酸配列を含むように遺伝子改変されている。このため、リコンビナント抗体分子は、キメラ抗体分子又はヒト化抗体分子であることができる。好ましい実施態様では、融合タンパク質は、本明細書で記載された免疫グロブリンの重鎖と本明細書で記載されたＩＬ−１５変異体とを含む。同重鎖と同ＩＬ−１５変異体とは、本明細書で記載されたリンカーを介して結合させることができる。この配置において、免疫グロブリン部分は、ＩＬ−１５変異体のＮ末端に位置するのが好ましい。このような融合タンパク質において、抗体分子の軽鎖は、任意の通常の抗体又は抗体フラグメントにおけるのと同様に、抗体重鎖と対合している（この点で、図１Ａも参照のこと）。
【００３５】
本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、「抗体フラグメント」であることもできる。このような抗体フラグメントは、（抗原）結合部位を形成する抗体のそれらの部分を少なくとも含む。このような抗体フラグメントの実例は、名称を少しだけ挙げると、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆｖフラグメント、シングルドメイン抗体、例えば、ＶＨＨ（ラクダ科）抗体等、ｄｉ−ｓｃＦｖｓ、フラグメント抗原結合領域（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ディアボディ、ドメイン抗体（Holt LJ, Herring C, Jespers LS, Woolven BP, Tomlinson IM. Domain antibodies: proteins for therapy. Trends Biotechnol. 2003 Nov; 21(11):484-90）、又は、国際公開公報第２０１３／０９２００１号に記載され、ＣＨ２ドメインを介してＦａｂフラグメントに結合している一本鎖Ｆｖフラグメントを含む二重特異性「Ｆａｂｓｃ」抗体分子である。
【００３６】
上記で示されたように、本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、抗体又は異なる特異性を有する２つの結合部位を含む二価抗体フラグメントであることができる。例えば、一つの特異性は、腫瘍関連抗原、例えば、ＦＬＴ３、ＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、又はＣＤ４４ｖ６（以下も参照のこと）、及び、エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞に存在するレセプター、例えば、ＣＤ３又はＣＤ１６に対するものである。このような二価の抗体フラグメントに使用することができるフォーマットの非限定的な例は、国際公開公報第２０１３／０９２００１号に記載された、（Ｆａｂ）２’−フラグメント、二重特異性一本鎖Ｆｖフラグメント、ｂｓＦｃ−１／２−二量体、又はｂｓＦｃ−ＣＨ３−１／２二量体を含む。また、例えば、Lamerisa et al. (2014) 「Bispecific antibody platforms for cancer immunotherapy」 Crit Rev Oncol Hematol. S1040-8428(14)00135-8、Kontermann (2012) 「Dual targeting strategies with bispecific antibodies」 Landes Bioscience mAbs Vol. 4, Issue 2 182-197に記載された二重特異性（又は三重特異性）抗体分子を利用することもできる。あるいは、本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、二価のタンパク質性人工結合分子、例えば、リポカリン突然変異タンパク質であることもできる。リポカリン突然変異タンパク質は、「デュオカリン」としても公知である。
【００３７】
ただし、本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、１つの結合部位のみを有することができる、すなわち、一価であることができる。一価の結合タンパク質の例は、一価の抗体フラグメント、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子を含むが、これらに限定されない。このような一価の抗体フラグメントの例は、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、又はｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【００３８】
上記で説明されたように、本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、代替的に、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子であることができる。結合タンパク質として使用することができる抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子の実例は、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づく突然変異タンパク質（その商品名「Anticalin（登録商標）」でも公知の例示的なリポカリン突然変異タンパク質は、例えば、国際公開公報第９９／１６８７３号、同第００／７５３０８号、同第０３／０２９４７１号、同第０３／０２９４６２号、同第０３／０２９４６３号、同第２００５／０１９２５４号、同第２００５／０１９２５５号、同第２００５／０１９２５６号、同第２００６／５６４６４号、もしくは同第２００８／０１５２３９、又は、Skerra, A. (2001) Rev. Mol. Biotechnol. 74, 257-275のレビュー文献に記載されている）、グルボディ、アンキリン足場に基づくタンパク質、結晶性足場に基づくタンパク質、アドネクチン、アビマー、ＥＧＦ様ドメイン、クリングルドメイン、Ｉ型フィブロネクチンドメイン、ＩＩ型フィブロネクチンドメイン、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン、ＰＡＮドメイン、Ｇ１ａドメイン、ＳＲＣＲドメイン、クーニッツ／ボバイン膵臓トリプシン阻害ドメイン、テンダミスタット、ｋａｚａｌ型セリンプロテアーゼ阻害ドメイン、トレフォイル（Ｐ型）ドメイン、フォンビルブランド因子Ｃ型ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、ＣＵＢドメイン、チログロブリンＩ型リピート、ＬＤＬレセプタークラスＡドメイン、Ｓｕｓｈｉドメイン（補体調節タンパク質（ＣＣＰ）モジュール）、Ｌｉｎｋドメイン、トロンボスポンジンＩ型ドメイン、免疫グロブリンドメイン、又は免疫グロブリン様ドメイン（例えば、ドメイン抗体又はラクダ重鎖抗体）、Ｃ型レクチンドメイン、ＭＡＭドメイン、フォンビルブランド因子Ａ型ドメイン、ソマトメジンＢドメイン、ＷＡＰ型４ジスルフィドコアドメイン、Ｆ５／８  Ｃ型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、ＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、ラミニン型ＥＧＦ様ドメイン、Ｃ２ドメイン、「Ｋａｐｐａｂｏｄｉｅｓ」（ＩＩＩ  ＣＲ１、Gonzales JN, Houtz EK, Ludwig JR, Melcher ED, Hale JE, Pourmand R, Keivens VM, Myers L, Beidler K, Stuart P, Cheng S, Radhakrishnan R. Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions. Protein Eng. 1997 Aug;10(8):949-57）、「ミニボディ」（Ｍａｒｔｉｎ  Ｆ１、Toniatti C, Salvati AL, Venturini S, Ciliberto G, Cortese R, Sollazzo M. The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6. EMBO J. 1994 Nov 15;13(22):5303-9）、「Ｊａｎｕｓｉｎｓ」（Traunecker A, Lanzavecchia A, Karjalainen K. Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells. EMBO J. 1991 Dec;10(12):3655-9、及び、Traunecker A, Lanzavecchia A, Karjalainen K. Janusin: new molecular design for bispecific reagents. Int J Cancer Suppl. 1992;7:51-2）、ナノボディ、アドネクチン、テトラアネクチン、ミクロボディ、アフィリン、アフィボディ、又はアンキリン、クリスタリン、ノッチン、ユビキチン、ジンクフィンガータンパク質、自己蛍光タンパク質、アンキリン又はアンキリンリピートタンパク質、又はロイシンリッチリピートタンパク質、アビマー（Silverman J1, Liu Q, Bakker A, To W, Duguay A, Alba BM, Smith R, Rivas A, Li P, Le H, Whitehorn E, Moore KW, Swimmer C, Perlroth V, Vogt M, Kolkman J, Stemmer WP. Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains. Nat Biotechnol. 2005 Dec;23(12):1556-61. Epub 2005 Nov 20）；及びSilverman et al.（Silverman J, Liu Q, Bakker A, To W, Duguay A, Alba BM, Smith R, Rivas A, Li P, Le H, Whitehorn E, Moore KW, Swimmer C, Perlroth V, Vogt M, Kolkman J, Stemmer WP. Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains. Nat Biotechnol. 2005 Dec;23(12):1556-61. Epub 2005 Nov 20）にも記載されたヒトレセプタードメインのファミリーのエキソンシャッフリングにより進化された多価アビマータンパク質を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明の融合タンパク質における「結合タンパク質」という用語は、非タンパク質性アプタマーも含む。このようなアプタマーは、特定のターゲット分子に結合するオリゴ核酸である。これらのアプタマーは、通常、それらを大きなランダム配列プールから選択することにより作製されるが、天然のアプタマーも存在する。より具体的には、アプタマーは、ＤＮＡ又はＲＮＡアプタマーとして分類することができる。それらは、（通常短い）鎖のオリゴヌクレオチドからなる。したがって、上記されたタンパク質性アプタマーは、タンパク質部分に加えて、オリゴヌクレオチド部分も含むことができる。
【００４０】
このため、本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子であることができる。同タンパク質性結合分子は、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づく突然変異タンパク質、グルボディ、アンキリン足場に基づくタンパク質、結晶性足場に基づくタンパク質、アドネクチン、又はアビマーからなる群より選択される。
【００４１】
結合タンパク質により結合される（レセプター）タンパク質は、本明細書で記載されたターゲット細胞に関連する任意の抗原であることができる。本発明によるこの文脈において、結合タンパク質のターゲットとして本明細書で選択されたレセプタータンパク質のリガンドも、（ターゲット）タンパク質であることが想定される。同レセプタータンパク質は、本明細書で記載されたターゲット細胞に関連する。ターゲット細胞に関連するレセプタータンパク質に結合するこのような天然又はリコンビナントリガンドについての例は、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ−３）、レセプター型チロシン−タンパク質キナーゼＦＬＴ３、又は胎児肝臓キナーゼ−２（Ｆｌｋ２）としても公知のＣＤ１３５である。ＣＤ１３５は、サイトカインＦｌｔ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）についてのレセプターである。このため、ＦＬＴ３Ｌも、ＦＬＴ−３に結合する結合タンパク質として使用することができる。一方、ＦＬＴ−３レセプターも、ＦＬＴ−３Ｌに結合する結合タンパク質として使用することができる。
【００４２】
ここから、本発明の融合タンパク質の生理学的作用に切り替えて、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）陽性免疫エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞をリクルートする能力は、本発明の融合タンパク質の治療活性に重要であると見られる。融合タンパク質は、結合タンパク質（融合タンパク質の「部分ａ」）として、例えば、定常ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する抗体分子を、この目的で使用することができるが、融合タンパク質の結合タンパク質の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を向上させるのに使用することができる種々の戦略が、当業者に公知であることが留意される（Beck et al. (2010)及びNatsume et al. (2009)（Beck A et al. (2010) 「Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies.」 Nat Rev Immunol; 10:345-352；Natsume A, Niwa R, Satoh M. 「Improving effector functions of antibodies for cancer treatment: Enhancing ADCC and CDC」 Drug Des Devel Ther. 2009;3:7-16）に例示的にまとめられる）。ただし、Ｆｃレセプター陽性免疫エフェクター細胞をリクルートする能力は、結合タンパク質が抗体／免疫グロブリンに基づく融合タンパク質に限定されることを意味するものではない。むしろ、例えば、結合タンパク質として、ＡＤＣＣ活性を提供する（ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含むことができる）Ｆｃポリペプチドの一部と融合した他のタンパク質性分子、例えば、リポカリン突然変異タンパク質を使用することも可能である。次に、Ｆｃポリペプチドは、本明細書で記載された変異ＩＬ−１５ポリペプチドと融合される。このような融合タンパク質において、Ｆｃ部分／ポリペプチドは、「ＡＤＣＣ活性」提供部分だけでなく、同時に、結合タンパク質と変異ＩＬ−１５ポリペプチドとの間のリンカーとしても機能する。
【００４３】
このため、本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、非改変の結合タンパク質と比較して、向上した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有するように改変することができる。ＡＤＣＣ活性は、周知の試験、例えば、aCella（商標）-TOX、ＧＡＰＤＨ放出アッセイ法等により測定することができる。aCella（商標）-TOXは、例えば、Promega又はInterchimから得ることができる。あるいは、ＡＤＣＣは、本明細書における実施例に記載されたようにも測定することもできる。このため、本発明の融合タンパク質における改変結合タンパク質は、（同じであるが）改変を含まない非改変結合タンパク質と比較した場合、向上したＡＤＣＣ活性を有することができる。例えば、実施例中に本明細書で記載された改変４Ｇ７抗体は、そのＦｃ部分にＳＤＩＥ改変を含まない「正常な」４Ｇ７抗体より、向上したＡＤＣＣ活性を有する。
【００４４】
本発明の融合タンパク質の細胞殺傷活性を改善するための１つの戦略は、例えば、従来のキメラ化及び「ＳＤＩＥ変異」を含有するＦｃ最適化抗体分子の使用であることができる。後者の抗体は、顕著に向上した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することが公知である（Lazar et al. (2006) 「Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function.」 Proc Nat Acad Sci USA 2006; 103:4005-4010；Horton et al. (2008) 「Potent in vitro and in vivo activity of an Fc-engineered anti-CD19 monoclonal antibody against lymphoma and leukemia」Cancer Res; 68:8049-8057；Foyil and Bartlett (2010) 「Anti-CD30 Antibodies for Hodgkin lymphoma」Curr Hematol Malig Rep; 5:140-147）。
【００４５】
したがって、本発明の融合タンパク質の改変結合タンパク質は、Ｆｃ最適化させることができる。この改変は、非改変結合タンパク質のＡＤＣＣ活性と比較して、向上した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性をもたらす。改変結合タンパク質は、例えば、インタクトな抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント、ｂｓＦｃ−１／２二量体、又はｂｓＦｃ−ＣＨ３−１／２二量体であることができる。後者の２つの抗体フォーマットは、国際公開公報第２０１３／０９２００１号に記載されている。
【００４６】
特に、Ｆｃ最適化は、アミノ酸置換を含むことができる。同アミノ酸置換は、Ｆ２４３Ｌ及び／又はＤ２７０Ｅ及び／又はＲ２９２Ｐ及び／又はＳ２９８Ａ及び／又はＳ２９８Ｎ及び／又はＹ３００Ｌ及び／又は３０５Ｉ及び／又はＡ３３０Ｖ及び／又はＡ３３０Ｌ及び／又はＩ３３２Ｅ及び／又はＥ３３３Ａ及び／又はＫ３３４Ａ及び／又はＰ３９６Ｌ及び／又はＳ２３９Ｄからなる群より選択される。そしてここで、位置ナンバリングは、ＥＵインデックスによる。使用されるアミノ酸のナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリング［ＥＵインデックス］による配列位置に対応する。Ｆｃ最適化改変結合タンパク質は、Hofmann et al. (2012) 「Generation, selection and preclinical characterization of an Fc-optimized FLT3 antibody for the treatment of myeloid leukemia」 Leukemia; 26:1228-1237に記載された「ＳＤＩＥ」変異を含むこともできる。このため、Ｆｃ最適化は、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅを含むアミノ酸置換を含むことができる。そしてここで、位置ナンバリングは、ＥＵインデックスによる。また、Ｆｃ最適化は、アミノ酸置換Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌを含むこともできる。そしてここで、位置ナンバリングは、ＥＵインデックスによる。また、Ｆｃ最適化は、アミノ酸置換Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、及びＹ３００Ｌを含むこともできる。そしてここで、位置ナンバリングは、ＥＵインデックスによる。
【００４７】
また、示されたアミノ酸置換は、示されたアミノ酸位置に対応することも想定される。このことは、例えば、Ｆｃドメインを含む抗体フラグメント又は結合タンパク質において、示されたアミノ酸の位置ナンバリングが異なる場合があるが、それでも、以下でもより詳細に記載された類似する隣接アミノ酸を有する場合がある。
【００４８】
上記で説明されたように、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）陽性免疫エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞をリクルートする能力は、ほとんどの抗体の治療活性に重要であると考えられている。非改変結合タンパク質と比較して、向上した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する改変結合タンパク質を得るための別の戦略は、改変結合タンパク質のグリコシル化パターンの遺伝子操作により達成される。
【００４９】
このため、対応する抗体分子が結合タンパク質として使用される場合、本発明の融合タンパク質におけるこのような改変結合タンパク質は、非改変結合タンパク質のＦｃ結合オリゴ糖のグリコシル化パターンとは異なる、Ｆｃ結合オリゴ糖のグリコシル化パターンを有することができる。特に、改変結合タンパク質は、非改変結合タンパク質より少なくフコシル化されている。改変結合タンパク質は、フコシル化されていないこともできる。例えば、改変結合タンパク質のＦｃ結合オリゴ糖は、非改変結合タンパク質のＦｃ結合オリゴ糖より、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％少なくフコシル化されていることができる。一般的には、タンパク質のフコシル化は、当業者に公知の技術により測定することができる。例えば、Life TechnologiesからのClick-iT（登録商標）フコースアルキン、又は、欧州特許第２４８３６９３号に記載された方法を使用することができる。
【００５０】
本発明の融合タンパク質における改変結合タンパク質は、Ｆｃ最適化及び、非改変結合タンパク質のＦｃ結合オリゴ糖のグリコシル化パターンとは異なるＦｃ結合オリゴ糖のグリコシル化パターンの両方を含むこともできる。
【００５１】
このため、原理的には、本発明の結合タンパク質の向上したＡＤＣＣは、グリコシル化パターン及び／又は現在臨床使用されているほとんどの抗腫瘍抗体に含有されるＩｇＧ−Ｆｃ部分におけるＣＨ２ドメインのアミノ酸配列の遺伝子操作により達成することができる（Shinkawa et al. (2003) 「The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity」 J Biol Chem; 278:3466-3473；Lazar et al. (2006) 「Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function」 Proc Nat Acad Sci USA; 103:4005-4010）。
【００５２】
両戦略は、Ｆｃ最適化された第３世代抗体の開発のために、製薬業界において以前から使用されてきた（Oflazoglu & Audoly (2010) 「Evolution of anti-CD20 monoclonal antibody therapeutics in oncology.」 MAbs 2:14-19）。Roche（Basel, Switzerland）は、Glycart（Schlieren, Switzerland）と共同で、グリコ操作ＣＤ２０抗体ＧＡ１０１（オビヌツズマブ）を開発した。慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を患う患者についての最近の大規模臨床試験において、この抗体は、リツキサンより優れていた（Goede et al. (2014) 「Obinutuzumab plus Chlorambucil in Patients with CLL and Coexisting Conditions.」 N Engt J Med 370:1101-1110）。Xencor（Monrovia, CA USA）により開発された、抗原ＣＤ１９及びＣＤ３０に関連するリンパ腫に対する２つの他の抗体（ＸｍＡｂ５５７４及びＸｍＡｂ２５１３）は、アミノ酸交換Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ（ＳＤＩＥ改変）を有する。ＧＡ１０１と同様に、これらの抗体は、顕著なＡＤＣＣを発揮することが報告され（Horton et al. (2008) 「Potent in vitro and in vivo activity of an Fc-engineered anti-CD19 monoclonal antibody against lymphoma and leukemia.」 Cancer Res; 68:8049-8057；Foyil, Bartlett NL (2010) 「Anti-CD30 Antibodies for Hodgkin lymphoma.」 Curr Hematol Malig Rep 5:140-147）、現在、臨床試験で評価されている。このような市販の結合タンパク質は、ベルツズマブ（抗ＣＤ２０抗体）、オクレリズマブ（抗ＣＤ２０）、オクラツズマブ（抗ＣＤ２０抗体）、オビヌツズマブ（抗ＣＤ２０抗体）、ＸｍＡｂ５５７４（抗ＣＤ１９抗体）、及びＸｍＡｂ２５１３（抗ＣＤ２０抗体）を含む。
【００５３】
原理的には、任意の市販の結合タンパク質を、本発明の融合タンパク質に使用することができる。本発明の融合タンパク質に使用することができる更なる例示的、かつ、純粋に例示となる結合タンパク質は、リツキシマブ（抗ＣＤ２０抗体）、イブリツモマブ（抗ＣＤ２０抗体）、チウキセタン（抗ＣＤ２０抗体）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０抗体）、オファツムマブ（抗ＣＤ２０抗体）、ブレンツキシマブベドチン（抗ＣＤ３０抗体）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３抗体）、オゾガマイシン（抗ＣＤ３３抗体）、ＩＧＮ１０１（抗ＥｐＣＡＭ抗体）、アデカツムマブ（抗ＥｐＣＡＭ抗体）、ラベツズマブ（抗ＣＥＡ抗体）、ミネツモマブ（抗ＴＡＧ−７２抗体）、Ｊ５９１（抗ＰＳＭＡ抗体）、ｈｕ３Ｓ１９３（抗ルイスＹ抗体）、ＩｇＮ３１１（抗ルイスＹ抗体）、ＩＭ−２Ｃ６（抗ＶＥＧＦ抗体）、ＣＤＰ７９１（抗ＶＥＧＦ抗体）、ブレバシズマブ（抗ＶＥＧＦ抗体）、トラスツズマブ（抗ＥＲＢＢ２抗体）、ペルツズマブ（抗ＥＲＢＢ２抗体）、ＭＭ−１２１（抗ＥＲＢＢ３抗体）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ抗体）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ抗体）、ニモツズマブ（抗ＥＧＦＲ抗体）、８０６（抗ＥＧＦＲ抗体）、シブロツズマブ（抗ＦＡＰ抗体）、Ｆ１９（抗ＦＡＰ抗体）、及び８１Ｃ６（抗テネシン抗体）を含む。本発明により、市販の結合タンパク質が、その非改変対照物と比較して、向上したＡＤＣＣ活性を有するように改変することができることが、更に企図される。
【００５４】
上記で言及されたように、本明細書で記載されたターゲット細胞に関連する抗原に結合する１つの結合部位を有し、一方で、二重特異性結合タンパク質の第２の結合部位がエフェクター細胞又はターゲット細胞に関連する抗原に結合する、二重特異性結合タンパク質も想定される。エフェクター細胞に関連する抗原は、例えば、ＣＤ３又はＣＤ１６を含むことができる。
【００５５】
種々の二重特異性抗体及び二価抗体フラグメントが、臨床環境において以前から使用されている。本発明の融合タンパク質に使用することもできるこのような二重特異性抗体及び二価抗体フラグメントの例は、ＢｉＭＡｂ（抗ＣＤ１６×抗ＣＤ３０二重特異性モノクローナル抗体）、ＨＲＳ−３／Ａ９（抗ＣＤ１６×抗ＣＤ３０抗体）、カツマキソマブ（ｒｅｍｏｖａｂ、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３）、エルツマキソマブ（抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３）、ＳＨＲ−１（抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９）、ブリナツモマブ、ＣＢＡ−ＣＥＡＣＤ３（ＣＤ３×ＣＥＡ）、ＢＩＳ−１（抗ＥＧＰ−２×抗ＣＤ３）、ＭＴ−１１０（抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３）、ＥＧＦＲＢｉ（抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲ  ＢｉＡｂ）、ＣＤ２０Ｂｉ（抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０  ＢｉＡｂ）、ＭＧＤ００６（抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３）、ＦＢＴＡ０５（抗ＣＤ２０×抗ＣＤ３）、ＭＧＤ００７（抗ｇｐＡ３３×抗ＣＤ３）、ＭＯＲ２０９／ＥＳ４１４（抗ＰＳＭＡ×抗ＣＤ３）、ＢＡＹ２０１０１１２（抗ＰＳＭＡ×抗ＣＤ３）、トリオマブ抗体、例えば、抗ＣＤ３×抗ＥｐＣＡＭトリオマブ及びＥＧＦＲ×ＣＤ３  ｂｓＦａｂ２（Jung et al. Int J Cancer 「Local immunotherapy of glioma patients with a combination of 2 bispecific antibody fragments and resting autologous lymphocytes: evidence for in situ T-cell activation and therapeutic efficacy.」 Jan 15;91(2):225-30, 2001）を含む。１つの特定の例では、二重特異性抗体分子は、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する。このような二重特異性ＣＤ３×ＣＤ１９抗体分子の例は、国際公開公報第９９／５４４４０号及び同第２００４／１０６３８１号に記載された、それらの一本鎖抗体分子を含む。このような市販の結合タンパク質を、それらが本明細書で記載された非改変結合タンパク質と比較して向上したＡＤＣＣ活性を示すように、改変することもできる。
【００５６】
ここで、本明細書で記載された任意のこのような結合タンパク質（抗体分子又は抗体様特性を有するタンパク質性結合タンパク質、例えば、「Anticalin（登録商標）」）と本明細書で使用される変異ＩＬ−１５ポリペプチドとの融合を行うことは、タンパク質の発現及び精製の分野における当業者の知識の範囲内であることが留意される。典型的には、この目的で、発現に基づいて、結合タンパク質のＣ末端又はＮ末端のいずれかに変異ＩＬ−１５ポリペプチドを融合させることができる核酸が生成される。本発明の融合タンパク質における両部分の機能性を維持しながら、変異ＩＬ−１５ポリペプチドが結合タンパク質にどのようにして融合させるかを（経験的に）決定することは、当業者の知識の範囲内である。
【００５７】
１つの具体的な実施態様では、本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、配列番号：５（４Ｇ７における重鎖の可変ドメイン配列）に対して、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、４Ｇ７抗体の結合部位を含むことが、更に想定される。本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、追加的に又は代替的に、配列番号：６（４Ｇ７における軽鎖の可変ドメイン配列）に対して、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、４Ｇ７抗体の結合部位も含むことができる。また、これらの結合タンパク質は、本明細書で記載された非改変結合タンパク質と比較して、向上したＡＤＣＣ活性を示すように改変することもできる。
【００５８】
また、本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、配列番号：７（ＢＶ１０における重鎖の可変ドメイン配列）に対して、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、ＢＶ１０抗体の結合部位を含むことも想定される。本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、追加的に又は代替的に、配列番号：８（ＢＶ１０における軽鎖の可変ドメイン配列）対して、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、ＢＶ１０抗体の結合部位も含むことができる。また、これらの結合タンパク質は、本明細書で記載された非改変結合タンパク質と比較して、向上したＡＤＣＣ活性を示すように改変することもできる。
【００５９】
また、本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、配列番号：９（４Ｇ８における重鎖の可変ドメイン配列）に対して、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、４Ｇ８抗体の結合部位を含むことも想定される。本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、追加的に又は代替的に、配列番号：１０（４Ｇ８における軽鎖の可変ドメイン配列）対して、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、４Ｇ８抗体の結合部位も含むことができる。また、これらの結合タンパク質は、本明細書で記載された非改変結合タンパク質と比較して、向上したＡＤＣＣ活性を示すように改変することもできる。
【００６０】
本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、配列番号：１１（Ｊ５９１における重鎖の可変ドメイン配列）に対して、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、Ｊ５９１抗体の結合部位を含むことが、更に想定される。本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、追加的に又は代替的に、配列番号：１２（Ｊ５９１における軽鎖の可変ドメイン配列）対して、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、Ｊ５９１抗体の結合部位も含むことができる。Ｊ５９１抗体は、米国特許第６，１０７，０９０号に記載されており、アクセッションナンバーＡＴＣＣ  ＨＢ−１２１２６で登録もされている。また、これらの結合タンパク質は、本明細書で記載された非改変結合タンパク質と比較して、向上したＡＤＣＣ活性を示すように改変することもできる。上記で言及されたように、本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、少なくとも１つの結合部位を含む。ただし、結合タンパク質は、２つ以上（例えば、３つ又は４つ）の結合部位を含むこともできる。
【００６１】
本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、配列番号：２５（Ｋ−ｒｏ２３における重鎖の可変ドメイン配列）に対して、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、Ｋ−ｒｏ２３抗体の結合部位を含むことが、更に想定される。本発明の融合タンパク質における結合タンパク質は、追加的に又は代替的に、配列番号：２６（Ｋ−ｒｏ２３における軽鎖の可変ドメイン配列）対して、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、Ｋ−ｒｏ２３抗体の結合部位も含むことができる。また、これらの結合タンパク質は、本明細書で記載された非改変結合タンパク質と比較して、向上したＡＤＣＣ活性を示すように改変することもできる。
【００６２】
本発明の融合タンパク質における結合タンパク質の結合部位は、ターゲット細胞に関連する抗原に結合する。ターゲット細胞は、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び／又は自己免疫疾患に関連する抗原を発現することができる。このようなＴＡＡの非限定的な例は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤｗ５２、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ−３、ＣＤ１３５）、ｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＳＦ１Ｒ、（ＣＤ１１５）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＰＤＧＦＲ−α（ＣＤ１４０ａ）、ＰＤＧＦＲ−β（ＣＤ１４０ｂ）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、Ｍｕｃ−１、ＥＧＦＲ、ｄｅ２−７−ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、葉酸遮断タンパク質、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＩＬ３Ｒ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、カーボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ガン胎児抗原（ＣＥＡ）、ＥｐＣＡＭ、ＣＤＣＰ１、デルリン１、テネシン、ｆｒｉｚｚｌｅｄ１−１０、血管抗原ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ１）、ＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ４、ＣＤ３０９）、エンドグリン、ＣＬＥＣ１４、Ｔｅｍ１−８、Ｔｉｅ２、メソセリン、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）、ガン抗原７２−４（ＣＡ７２−４）、インターロイキン１３レセプター  アルファ−２サブユニット、ＩＬ１３Ｒα２、Ｉｇカッパ軽鎖（κ）、ＧＤ３−ガングリオシド（ＧＤ３）、ＧＤ２−ガングリオシド（ＧＤ２）、ＧＤ２及びＧＤ３のアセチル化変異体、ＣＤ１７１、ＮＣＡＭ、アルファ葉酸レセプター（αＦＲ）、ルイス（Ｙ）、胎児アセチルコリンレセプター（ＦＡＲ）、トリ赤芽血症ウイルスのガン遺伝子ホモログ３（ＥＲＢＢ３）、トリ赤芽血症ウイルスのガン遺伝子ホモログ４（ＥＲＢＢ４）、トリ赤芽血症ウイルスのガン遺伝子ホモログ２（ＥＲＢＢ２）、肝細胞増殖因子レセプター（ＨＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ）、クローディン１８．２、クローディン３、クローディン４、クローディン１、クローディン１２、クローディン２、クローディン５、クローディン８、クローディン７、クローディン６、膜結合ＣＥＡ、Ｒｏｂｏ４、及びＣＤ１３８を含む。
【００６３】
自己免疫疾患に関連する例示的な抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ５２、及びＴＮＦＲ、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ４０を含む。ターゲット細胞は、腫瘍／ガン細胞及び／又はＢ細胞であることができる。
【００６４】
本発明の融合タンパク質は、変異ＩＬ−１５ポリペプチドも含む。そしてここで、ＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１２、１１３、１１４、１１５、及び／又は１１６位に対応する１つ以上の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。このような変異により、配列番号：１（Uniprotナンバー：Ｐ４０９３３−１）の野生型ＩＬ−１５の親和性と比較して、ＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有する、ＩＬ−１５ポリペプチドがもたらされる。また、ＩＬ−１５ポリペプチドは、ＩＬ−１５Ｒαに全く結合しないこともできる。本発明により、ＩＬ−１５ポリペプチドは、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγに結合することができることが、更に想定される。ただし、原理的には、配列番号：１の野生型ＩＬ−１５の親和性と比較して、ＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有するＩＬ−１５ポリペプチドをもたらす任意のアミノ酸置換／欠失が、本発明により企図される。
【００６５】
本発明に基づいて使用される場合、「位置」という用語は、本明細書で示されたアミノ酸配列内でのアミノ酸の位置を意味する。本明細書で使用する場合、「対応する」という用語も、位置が先のアミノ酸のナンバーによってのみ決定されないことを含む。置換することができる本発明に基づく所定のアミノ酸の位置は、例えば、（変異又はフラグメントの）ＩＬ−１５ポリペプチドにおけるどこかでの、欠失又は更なるヌクレオチドにより変化する場合がある。同様に、置換することができる本発明に基づく所定のアミノ酸の位置は、例えば、（変異、フラグメント、又は野生型の）ＩＬ−１５ポリペプチドにおけるどこかでの、アミノ酸の欠失又は付加により変化する場合がある。
【００６６】
このため、本発明で使用する場合、「対応する位置」は、アミノ酸が示された位置と異なる場合があるが、それでも、類似する隣接アミノ酸を有する場合があることが理解される。交換され、欠失され、又は付加することができるアミノ酸も、「対応する位置」という用語に含まれる。具体的には、参照配列（サブジェクト配列）、例えば、配列番号：１を、対象となるアミノ酸配列（クエリ配列）とアライメントする場合、当業者は、例えば、本明細書で特定されたアミノ酸位置（すなわち、配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９３及び／又は１１２位に対応する位置）を探す際に、配列番号：４の配列（又は、このタンパク質をコードする対応する核酸配列それぞれ）について、対象となる配列を調査することができる。
【００６７】
より具体的には、前記位置のアミノ酸「Ｌ」又は「Ｅ」がそれぞれ、置換の対象である。例えば、前記「Ｌ」又は「Ｅ」が、別のアミノ酸により置き換えられる。例えば、前記位置の「Ｌ」は、「Ｌ」以外のアミノ酸により置換される。また、例えば、前記位置の「Ｅ」は、「Ｅ」以外のアミノ酸により置換される。
【００６８】
所定の（変異、フラグメントの）ＩＬ−１５ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基が、配列番号：１のアミノ酸配列における特定の位置に対応するかどうかを決定するために、当業者であれば、当技術分野において周知の手段及び方法、例えば、手作業又はコンピュータプログラム、例えば、BLAST2.0を使用することによるアライメントを使用することができる。BLAST2.0は、Basic Local Alignment Search ToolもしくはClustalW、又は、配列アライメントを生成するのに適した任意の他の適切なプログラムを表わす。
【００６９】
本発明の融合タンパク質におけるＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号：１に示されたＩＬ−１５ポリペプチドに対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有することができる。
【００７０】
本発明において使用する場合、「配列同一性」又は「同一性」という用語は、場合により、本発明のＩＬ−１５ポリペプチドにおける配列と当該配列との（ホモロジー）アライメントに従って、これら２つの配列のより長い方における残基数に関して、対で同一の残基の割合を意味する。特定は、同一の残基数を残基総数で割り、結果に１００を掛けることにより測定される。典型的には、本明細書で特定されたＩＬ−１５ポリペプチド配列の配列同一性は、配列番号：１に示されたタンパク質配列におけるアミノ酸と同一の候補配列（対象となる配列）におけるアミノ酸の割合として定義される。
【００７１】
配列同一性は、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列をアライメントし、必要に応じて、ギャップを導入した後に、配列同一性の一部として保存的置換を何ら考慮することなく、決定することができる。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアライメントは、当業者の範囲内にある種々の方法において、例えば、公衆に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えば、BLAST、ALIGN、又はMegalign（DNASTAR）ソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、アライメントを測定するのに適したパラメータを決定することができる。同パラメータは、比較される配列の全長にわたる最大アライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む。例えば、BLAST2.0（Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1997), 3389-3402；Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993), 290-300；Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410；http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHomeも参照のこと)を、ローカル配列アライメントを検索するのに使用することができる。
【００７２】
ＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９３、９４、９７、９８、９９、１００、１１４、及び／又は１１５位に対応する１つ以上の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むこともできる。ＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９４、９７、９９、及び／又は１００位に対応する１つ以上の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むこともできる。ＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９４、９７、及び／又は９８位に対応する１つ以上の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むこともできる。ＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９４及び／又は９８位に対応する１つ以上の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むこともできる。
【００７３】
アミノ酸置換は、この位置でのアミノ酸の変化をもたらす、任意のアミノ酸置換であることができる。一実施態様において、アミノ酸は、酸性アミノ酸、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、又は、塩基性アミノ酸、例えば、リシンにより置換される。本発明により、配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９４位に対応するアミノ酸は、塩基性アミノ酸により置換されることも想定される。塩基性アミノ酸は、例えば、アルギニン、リシン、又はヒスチジン、好ましくは、リシンからなる群より選択することができる。
【００７４】
本発明により、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｌ４４Ｄ、Ｅ４６Ｋ、Ｌ４７Ｄ、Ｖ４９Ｄ、Ｉ５０Ｄ、Ｌ６６Ｄ、Ｌ６６Ｅ、Ｉ６７Ｄ、及びＩ６７Ｅからなる群より選択される。これらのアミノ酸置換のナンバリングは、配列番号：２、配列番号：３、及び配列番号：４のポリペプチド配列（図５）に対応する。このため、これらのアミノ酸置換は、配列番号：１に関するアミノ酸置換Ｌ９２Ｄ、Ｅ９４Ｋ、Ｌ９５Ｄ、Ｖ９７Ｄ、Ｉ９８Ｄ、Ｌ１１４Ｄ、Ｌ１１４Ｅ、Ｉ１１５Ｄ、及びＩ１１５Ｅに対応する。以下の表３及び表４を参照のこと。
【００７５】
【表３】
0006757338.tif 000004
【００７６】
【表４】
0006757338.tif 000005
【００７７】
少なくとも１つのアミノ酸置換は、図５に示された配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸位置の対応において、Ｅ４６Ｋ、Ｖ４９Ｄ、及び／又はＩ５０Ｄからなる群より選択することもできる。少なくとも１つのアミノ酸置換は、図５に示された配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸位置の対応において、Ｅ４６Ｋ及び／又はＩ５０Ｄからなる群より選択することもできる。少なくとも１つのアミノ酸置換は、図５に示された配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸位置の対応において、Ｅ４６Ｋからなる群より更に選択することもできる。
【００７８】
少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号：１のアミノ酸位置の対応において、Ｅ９４Ｋ、Ｖ９７Ｄ、及び／又はＩ９８Ｄからなる群より選択することもできる。少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号：１のアミノ酸位置の対応において、Ｅ９４Ｋ及び／又はＩ９８Ｄからなる群より選択することもできる。少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号：１のアミノ酸位置の対応において、Ｅ９４Ｋからなる群より更に選択することができる。
【００７９】
本発明の融合タンパク質におけるＩＬ−１５ポリペプチドは、全長ＩＬ−１５タンパク質又はその任意のフラグメントもしくは変異体であることができ、そしてここで、フラグメント及び又は変異体は、配列番号：１の野生型ＩＬ−１５の親和性と比較して、ＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有する。本発明により、フラグメント又は変異体は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγに対する結合能を更に有することができることが、更に想定される。
【００８０】
このため、Ｉｌ−１５ポリペプチド及びその変異体又はフラグメントは、２つの機能を有する、一方では、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγに結合することができ、一方では（及び同時に）、配列番号：１の野生型ＩＬ−１５の親和性と比較して、ＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有する。
【００８１】
ＩＬ−１５ポリペプチドフラグメントは、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγに結合し、一方では（及び同時に）、配列番号：１の野生型ＩＬ−１５の親和性と比較して、ＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有する、ＩＬ−１５ポリペプチドの任意のフラグメントであることができる。フラグメントは、本発明の融合タンパク質のＩＬ−１５ポリペプチドより少ないアミノ酸を含むことができる。このようなフラグメントは、配列番号：１に関するアミノ酸欠失を含むこともできる。ＩＬ−１５ポリペプチドフラグメントは、１６２個未満のアミノ酸長、例えば、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、又は更に、５０個未満のアミノ酸長を有することができる。例示的なフラグメントは、配列番号：４に示されたアミノ酸配列からなる、又は、同配列を少なくとも含む、ＩＬ−１５ポリペプチドであることができる。同ＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号：４に示されたアミノ酸配列の４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、６０、６１、６２、６３、及び／又は６４位に対応する１つ以上の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。このようなＩＬ−１５フラグメントは、当然、（配列番号：４における各配列位置に対応する）配列番号：１、２、又は３に関して、本明細書で記載されたアミノ酸置換を含むことができる。ＩＬ−１５ポリペプチドフラグメントは、配列番号：１のβγレセプター結合に重要なアミノ酸を、少なくとも含むこともできる。例えば、ＩＬ−１５ポリペプチドフラグメントは、配列番号：１のアミノ酸位置５５、５６、５８、５９、１１６、１１７、１５６、１５７、１６０を含むアミノ酸配列を有することができる。
【００８２】
ＩＬ−１５ポリペプチド変異体は、本発明の融合タンパク質におけるＩＬ−１５ポリペプチドに関して、更なるアミノ酸置換又は挿入を含むことができる。このため、ＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号：１に示されたＩＬ−１５ポリペプチドに対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有することができる。
【００８３】
一般的には、「親和性」という用語は、エピトープと結合タンパク質の結合部位との間の相互作用強度を意味する。所定の結合タンパク質／ＩＬ−１５ポリペプチドの親和性を決定するための方法は、当業者に周知である。変異ＩＬ−１５ポリペプチドの結合親和性は、複数の方法、例えば、蛍光滴定、競合的ＥＬＩＳＡ、又は表面プラズモン共鳴（BIAcore（商標））により測定することができる。ＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有するＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号：１の野生型ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαに対する親和性と比較して、ＩＬ−１５Ｒαに対するより低い親和性を有する。本発明により、本発明の融合タンパク質におけるＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号：１の野生型ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαに対する親和性より、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％低い、ＩＬ−１５Ｒαに対する親和性を有することも想定される。
【００８４】
本明細書で記載された結合タンパク質及びＩＬ−１５ポリペプチドについて、結合親和性が１０−７M超である場合、結合は、特異的であると考えられる。特に、結合親和性が約１０−８〜１０−１１M（ＫＤ）又は約１０−９〜１０−１１M以上である場合、結合は、特異的であると考えられる。このため、第１の結合部位及び／又は第２の結合部位を有する結合タンパク質とＩＬ−１５ポリペプチドとは、ピコモル濃度（１０−１２MのＫＤを有する）においても、本発明に包含される。
【００８５】
ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγを、本発明の薬学的使用によるエフェクター細胞により発現することができることも、本発明により想定される。このことは、エフェクター細胞がＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγを発現することができることを意味する。例示定なエフェクター細胞は、ＮＫ細胞又はＴ細胞、例えば、ＣＤ８＋細胞、ガンマデルタＴ細胞、又はＮＫ  Ｔ細胞を含む。エフェクター細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＮＫ細胞であることもできる。
【００８６】
本発明の融合タンパク質における結合タンパク質及びＩＬ−１５ポリペプチドは、リンカーを更に含むことができる。このことは、リンカーが存在しない場合があること、及び、ＩＬ−１５ポリペプチドが結合タンパク質に直接結合する場合があることも意味する。ただし、リンカーは、結合タンパク質とＩＬ−１５ポリペプチドとを結合するのに存在することもできる。
【００８７】
後者の場合、リンカーは、原理的に、結合タンパク質及びＩＬ−１５ポリペプチドのあらゆる箇所に、通常、融合タンパク質の一方の部分のＣ末端と他方の部分のＮ末端との間に付着することができる。適切なリンカーは、当技術分野において公知であり、例えば、Chen et al. (2013) 「Fusion protein linkers: property, design and functionality」 Adv Drug Deliv Rev; 65(10):1357-69に記載されている。したがって、リンカーは、当技術分野において公知の任意のリンカーであることができる。
【００８８】
リンカーは、例えば、活性化された側鎖基、例えば、アミノ、チオール、又はヒドロキシル基を介して、両パートナーに結合する直鎖又は分岐の炭化水素系部分であることができる。リンカーは、環状部分を含むこともできる。リンカー部分が炭化水素系部分である場合、リンカーの主鎖は、炭素原子のみを含むことができるが、ヘテロ原子、例えば、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、又は硫黄（Ｓ）原子を含有することもできる。リンカーは、例えば、Ｃ１〜Ｃ２０炭素原子鎖又はポリエーテル系鎖、例えば、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）−繰返し単位を含むポリエチレングリコール系鎖を含む。炭化水素系リンカーの典型的な実施態様では、結合部分は、１〜約１５０、１〜約１００、１〜約７５、１〜約５０、又は１〜約４０、又は１〜約３０、又は１〜約２０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び１９個を含む主鎖原子を含むことができる。例えば、リンカーは、
【化１】
0006757338.tif 000006
［式中、ｎは、０〜２０又は１〜１０又は１〜５の整数であるか、あるいは、ｎは、３である。このため、例えば、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０であることができる］
を含むことができる。
【００８９】
ただし、リンカーは、リンカーが本融合タンパク質の一方又は両方の部分の機能と干渉しない限り、任意の適切な長さのペプチドリンカーであることもできる。リンカーは、２つ以上、５つ以上、１０個以上、１５個以上、又は２０個以上のアミノ酸残基を含むことができる。ペプチドリンカーは、任意のアミノ酸残基を含むことができる。一実施態様において、ペプチドリンカーは、小型又は極性アミノ酸、例えば、Ｇｌｙ及びＳｅｒを豊富に含んでいることができるが、柔軟性を維持するための更なるアミノ酸、例えば、Ｔｈｒ及びＡｌａ、ならびに、安定性を改善するための極性アミノ酸、例えば、Ｌｙｓ及びＧｌｕを含有することができる。例示となる柔軟なリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは、１〜７の数字であることができる）（配列番号：１３）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号：１４）、及びＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号：１５）、（Ｇｌｙ）８（配列番号：１６）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号：１７）、（Ｇｌｙ）６（配列番号：１８）を含むが、これらに限定されない。
【００９０】
例示となる剛直なリンカーは、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（式中、ｎは、１〜７の数字であることができる）（配列番号：１９）、（ＸＰ）ｎ（式中、ｎは、１〜１３の数字であることができ、Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、又はＧｌｕ、（Ａｌａ−Ｐｒｏ）７を指定することができる（配列番号：２０）、又は、−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−もしくは−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−の繰返しを含有する３３個の残基のペプチドを含むが、これらに限定されない。例示となるｉｎ  ｖｉｖｏ開裂性リンカーは、例えば、ＬＥＡＧＣＫＮＦＦＰＲＳＦＴＳＣＧＳＬＥ（配列番号：２１）、Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｔ（配列番号：２２）、ＣＲＲＲＲＲＲＥＡＥＡＣ（配列番号：２３）を含む。
【００９１】
一実施態様において、本発明の融合タンパク質は、リンカーを含み、同リンカーは、グリシン及びセリンを含む。リンカーは、例えば、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（（４−グリシン  １−セリン）４；配列番号：２４）を含むことができる。例えば、「グリシン−セリン」リンカーのＮ末端及び／又はＣ末端のいずれかには、ＩＬ−１５ポリペプチド及び／又は結合タンパク質間に配列される、更なるアミノ酸を含有させることが可能である。これらの更なるアミノ酸は、例えば、本発明の融合タンパク質を生成するのに使用されるクローニング戦略のために存在させる場合がある。１つのこのような実例において、「グリシン−セリン」リンカー、例えば、（ＧＧＧＧＳ）４リンカーは、更なるＮ末端セリンを有することができる（例えば、図６に示された融合タンパク質を参照のこと）。
【００９２】
ただし、リンカーは、結合タンパク質及びＩＬ−１５ポリペプチドの１つ以上の実際の結合部位には付着しないであろう。例えば、リンカーは、多くの場合、抗体又は抗体フラグメントのＣＤＲ３領域に付着しないであろう。
【００９３】
抗体系結合タンパク質について、リンカーは、例えば、抗体分子（結合タンパク質）のＦａｂ部分又はＦｃ部分に付着することができる。とりわけ、リンカーは、本発明の融合タンパク質における結合タンパク質のＣＨ３、ＣＨ２、又はＣＨ１ドメインに付着することができる。このため、リンカーは、結合タンパク質における最外部である領域に付着することもできる。このことは、例えば、リンカーが、例えば、ＣＨ３欠失結合タンパク質におけるＣＨ２ドメインに、又は、ＣＨ２／ＣＨ３欠失結合タンパク質におけるＣＨ１に付着することができる。２つのリンカーが、結合タンパク質、例えば、抗体の２つのＣＨ３領域に付着していることも、本発明により想定される。これにより、各ＣＨ３ドメインは、付着した１つのリンカーを有する。ただし、リンカーは、所定の結合タンパク質の一方のみのＣＨ３領域に付着することもできる。一実施態様において、ＩＬ−１５ポリペプチドは、結合タンパク質のＣＨ３ドメインに、リンカーを介して結合している。
【００９４】
ただし、例えば、結合タンパク質が抗体のＶＨ及びＶＬ鎖のみからなる場合には、リンカーは、２つの鎖を連結しているヒンジ領域に付着していることもできる。二重特異性結合タンパク質、例えば、ＢｉＴＥ構築物、例えば、ブリナツモマブ等の場合には、リンカーは、２種類の結合部位を連結しているリンカーに付着することもできる。
【００９５】
本明細書で指摘されたように、典型的には、リンカーは、本明細書で記載された結合タンパク質のＦｃドメインに付着している。特に、典型的には、このようなドメインを含まない結合タンパク質に、ＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３ドメインを融合させることが付加的に可能である。例えば、これは、本明細書で記載された抗体様結合性を有するタンパク質性結合分子について、又は、本明細書で記載された免疫レセプターもしくはそのリガンドについて行うことができる。例えば、このようなＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３ドメインは、リポカリン分子に、例えば、タンパク質性結合分子をコードする配列に対してこれらのドメインをクローニングすることにより融合させることができる。このような場合、例えば、１つのリンカー又は２つ以上のリンカーが、これらのＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３ドメインに付着することもできる。
【００９６】
１つの例示的な実施態様では、本発明の融合タンパク質は、抗原として、エンドグリン（ＣＤ１０５）に結合することができ、このため、エンドグリン結合する結合タンパク質を含むことができる。結合タンパク質は、例えば、抗体分子又はリポカリン突然変異タンパク質であることができる。エンドグリンは、内皮細胞において過剰発現しており、血管新生に必須のタンパク質であるため、腫瘍成長、ガン細胞の生存及び身体内の他の場所への転移に重要なタンパク質である。エンドグリンは、血管新生内皮細胞上に、高密度で選択的に発現され、低酸素誘引因子−１ａ（ＨＩＦ−１ａ）の誘引による低酸素によりアップレギュレーションされる。エンドグリン発現は、ＶＥＧＦ経路の阻害後に、腫瘍内皮細胞においてもアップレギュレーションされる。固体腫瘍を有する患者において、エンドグリン免疫組織化学により評価された高い腫瘍微小血管密度が、乏しい予後に関連している。本発明の融合タンパク質に使用することができる例示的なエンドグリン結合抗体は、Ｋ−ｒｏ２３である。Ｋ−ｒｏ２３は、Schwartz, K, doctoral thesis, 2013, Eberhard Karls University, Tubingen, Germany, 「Generierung, praklinische Charakterisierung und Optimierung monoklonaler Antikorper zur anti-angiogenetischen Therapie solider Tumoren」に記載されている。本発明の融合タンパク質に使用することができる別の例示的なエンドグリン結合抗体は、ＴＲＣ０５と呼ばれる抗体である。同抗体の可変ドメインは、Seon et al., (2011), Endoglin targeted cancer therapy, Curr Drug Deliv, 8(1):135-143に記載されている。抗体ＴＲＣ１０５は、現在、多発性個体腫瘍型の処置用の臨床試験において研究されおり、第１相及び第２相臨床試験が完了している。したがって、本発明の融合タンパク質は、好ましくは、Ｋ−ｒｏ２３又はＴＲＣ１０５の抗体結合部位を含むことができる。この抗体結合部位は、配列番号：２７に対して、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９８％、好ましくは、少なくとも９９％、好ましくは、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、又は好ましくは、同アミノ酸配列からなることができる。前記融合タンパク質は、配列番号：２８に対して、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９８％、好ましくは、少なくとも９９％、好ましくは、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、又は好ましくは、同アミノ酸配列からなるＩｇＧ軽鎖に更に付着することができ、好ましくは、同軽鎖に共有結合することができる。
【００９７】
本発明の融合タンパク質に含まれる結合部位についての別の好ましい結合パートナーは、フィブロネクチン、好ましくは、フィブロネクチンのエクストラドメイン−Ｂである。エクストラドメイン−Ｂ含有フィブロネクチン（ＥＤＢ−ＦＮ）は、細胞接着及び遊走を媒介する高分子量糖タンパク質である。ＥＤＢ−ＦＮの発現は、数多くのガン関連生物学的プロセス、例えば、腫瘍形成、血管新生、表皮から中皮への転移（ＥＭＴ）に関連する。このため、本発明の融合タンパク質の好ましい実施態様は、フィブロネクチン、好ましくは、フィブロネクチンのエクストラドメイン−Ｂに特異的に結合する抗体分子と、本明細書で記載されたＩＬ−１５変異体とを含むことができる。別の好ましい実施態様では、結合パートナーは、国際公開公報第２０１１／０６９９９２号に記載され、フィブロネクチンのエクストラドメインＢに結合するリポカリン突然変異タンパク質であることができる。
【００９８】
本発明の融合タンパク質に含まれる結合部位についての更に好ましい結合パートナーは、テナシン、好ましくは、種々のアイソマーのテナシンＣである。テナシンＣ（ＴＮ−Ｃ）は、ヒトにおいて、ＴＮＣ遺伝子によりコードされる糖タンパク質である。テナシンＣは、数多くの種類のガン、例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、膀胱ガン、及びグリオブラストーマに関与する。グリオブラストーマ細胞において、テナシン−Ｃ発現は、ガンの予後及び腫瘍進行に関して、非常に臨床的及び機能的有意差を提供する。このため、本発明の融合タンパク質の好ましい実施態様は、テナシン、好ましくは、テナシンｃに特異的に結合する抗体分子と、本明細書で記載されたＩＬ−１５変異体とを含むことができる。
【００９９】
本発明の融合タンパク質に含まれる更に好ましい結合パートナーは、炭水化物抗原、例えば、ガングリオシドＧＤ２及びＧＤ３、ならびにそのアセチル化変異体である。このような抗原は、大部分のガンの細胞表面上で発現されており、正常組織でのその発現は、多く場合、制限されている。ＧＤ２抗体及びそれから得られる免疫サイトカインは、神経芽細胞種を有する小児の処置に成功して使用されてきた（例えば、Navid et al, Immune Therapies for Neuroblastoma, Cancer Biol Ther. 2009 May; 8(10): 874-882を参照のこと。同文献では、抗ＧＤ２抗体、例えば、マウスモノクローナル抗ＧＤ２抗体３Ｆ８又はキメラ抗体Ｃｈ１４．１８及び免疫サイトカインｃｈ１４．１８−ＩＬ−２（抗体１４．１８のＦｃ部分は、ＩＬ−２に結合した）についての臨床試験の結果が報告されている）。
【０１００】
また、本発明は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγを発現しているエフェクター細胞のターゲット細胞限定活性化に使用するための、本発明の融合タンパク質に関する。「ターゲット細胞限定エフェクター細胞活性化」という用語は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγ発現エフェクター細胞がターゲット細胞の存在下において活性化されることを意味する。この活性化は、本発明の融合タンパク質により達成される。一方、本発明の融合タンパク質は、本明細書で記載されたＩＬ−１５ポリペプチドを含む。同ＩＬ−１５ポリペプチドは、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγ発現エフェクター細胞に結合する。加えて、本発明の融合タンパク質は、ターゲット細胞に関連する抗原に結合する少なくとも１つの結合部位を含む結合タンパク質を含む。このため、理論に拘束されるものではないが、エフェクター細胞とターゲット細胞とを互いに近づけることにより、エフェクター細胞は、その機能、例えば、ターゲット細胞特異的な方法でターゲット細胞殺傷を媒介することができる。このため、本発明は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγを発現しているエフェクター細胞により媒介されるターゲット細胞限定ターゲット細胞殺傷に使用するための、本発明の融合タンパク質にも関する。例えば、本発明の融合タンパク質は、本明細書で記載された向上したＡＤＣＣ活性を有さない非改変結合タンパク質を含む融合タンパク質の細胞溶解活性と比較して、ＮＫ細胞及びＴ細胞、好ましくは、ＮＫ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解活性を向上させるのに使用することができる。
【０１０１】
また、本発明は、疾患の処置に使用するための、本発明の融合タンパク質に関する。この処置は、エフェクター細胞の結合に基づく任意の処置であることができる。さらに、この用語は、エフェクター細胞の結合による特異的なターゲット細胞関連抗原に対する任意の治療を意味する。例えば、疾患の処置は、増殖性疾患又は自己免疫疾患の処置であることができる。
【０１０２】
増殖性疾患の例示的かつ非限定的な例は、副腎ガン、肛門ガン、胆管ガン、膀胱ガン、骨ガン、脳及び脊髄腫瘍、乳ガン、キャッスルマン病、子宮頚ガン、結腸ガン、子宮内膜ガン、食道ガン、ユーイング腫瘍、眼ガン、胆嚢ガン、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓ガン、喉頭部及び下咽頭ガン、白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、肝臓ガン、肺ガン、非小細胞肺ガン、小細胞肺ガン、肺カルチノイド、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔ガン、上咽頭ガン、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び口咽頭ガン、骨肉腫、卵巣ガン、膵臓ガン、陰茎ガン、下垂体腫瘍、前立腺ガン、直腸ガン、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺ガン、肉腫、皮膚ガン、基底細胞及び扁平上皮細胞ガン、メラノーマ、メルケル細胞ガン、小腸ガン、胃ガン、精巣ガン、胸腺ガン、甲状腺ガン、子宮肉腫、膣ガン、外陰ガン、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、又はウィルムス腫瘍を含む。増殖性疾患は、白血病又はリンパ腫であることもできる。
【０１０３】
自己免疫疾患の非限定的な例は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グッドパスチャー症候群、サルコイドーシス、強皮症、関節リウマチ、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、強皮症、皮膚筋炎、乾癬、白斑症、円形脱毛症、Ｉ型糖尿病、自己免疫性膵炎、橋本甲状腺炎、アジソン病、多発性硬化症、重症筋無力症、結節性多発動脈炎、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、抗リン脂質抗体症候群、悪性貧血、胃腸疾患、セリアック病、炎症性腸疾患、自己免疫性肝炎、又は原発性胆汁性肝硬変を含む。
【０１０４】
本発明の融合タンパク質について、一般的には、ヒトの患者へのＩＬ−１５の適用後に観察される副作用を減少させることを意図している（Conlon et al. (2015) 「Redistribution, hyperproliferation, activation of natural killer cells and CD8 T cells, and cytokine production during first-in-human clinical trial of recombinant human interleukin-15 in patients with cancer.」 J Clin Oncol. 33(1):74-82）。特に、これらの「副作用」は、患者に有益でないネガティブな副作用である。理論に拘束されるものではないが、このようなネガティブな副作用は、非特異的な（ターゲット細胞特異的でないことを意味する）エフェクター細胞活性化によると考えられる。このため、本発明の融合タンパク質は、エフェクター細胞のターゲット細胞限定活性化を提供するために、これらの副作用を、減らし、又は更に、減少させることができる。
【０１０５】
したがって、エフェクター細胞の「非特異的エフェクター細胞活性化」又は「オフターゲット活性化」は、本明細書で記載された結合タンパク質のターゲット細胞に関連する抗原への結合に関連しないエフェクター細胞の任意の活性化であることができる。このため、例えば、オフターゲットエフェクター細胞活性化は、ターゲット細胞非依存性エフェクター細胞活性化であることができる。一実施態様において、非特異的エフェクター細胞活性化は、ターゲット細胞の不存在下におけるエフェクター細胞の活性化を含む。
【０１０６】
副作用の実例は、輸注反応、体温上昇／発熱、呼吸困難、循環系の問題、免疫原性、過敏症反応、免疫サプレッション、感染、貧血、自己免疫性悪性貧血、白血球減少症、血小板減少症、汎血球減少症、血球減少症、心不全の悪化、腫瘍溶解、サイトカイン放出症候群、甲状腺障害、心毒性、局所的な皮膚反応、肝臓トランスアミナーゼの上昇、低血圧、血清病、皮膚粘膜反応、肝炎再活動化、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、腎毒性、心不整脈を含む。
【０１０７】
本発明の融合タンパク質は、本発明の融合タンパク質の結合タンパク質と、配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１２、１１３、１１４、１１５、及び／又は１１６位に対応する１つ以上の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含まないＩＬ−１５ポリペプチドとを含む融合タンパク質に使用される用量と比較して、投与される融合タンパク質の用量を増大させるのに使用することもできる。
【０１０８】
再度、本願の背景にある合理的根拠は、本発明の融合タンパク質のターゲット細胞限定的な作用モードである。融合分子の活性がよりターゲット限定的であるほど、予測される副作用がより小さくなるため、投与量をより多くすることができる。このため、本発明の融合タンパク質は、本明細書で記載された結合タンパク質と（例えば、配列番号：１の）野生型ＩＬ−１５ポリペプチドとを含む融合タンパク質に使用される用量と比較して、投与される本発明の融合タンパク質の用量を増大させるような方法で、処置に使用することができる。
【０１０９】
投与される本発明の融合タンパク質の「用量」は、所望の予防的効果又は治療的応答を達成するのに、広い範囲内で変動させることができる。例えば、用量は、選択されたターゲットに対する結合タンパク質の親和性、及び、結合タンパク質／ＩＬ−１５ポリペプチドとターゲット抗原との間の複合体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期により決まるであろう。さらに、最適な用量は、本発明の融合タンパク質の生体分布、投与方式、処置される疾患／障害の重症度、及び、対象／患者の健康状態により決まるであろう。例えば、局所投与用の軟膏に使用される場合、高濃度の本発明の融合タンパク質を使用することができる。
【０１１０】
任意の適切な用量の本発明の融合タンパク質を使用することができる。例えば、本発明の融合タンパク質の適切な用量を経験的に決定することは、当業者の知識の範囲内である。例示的な実施態様では、本融合タンパク質は、患者の体重１kgあたりに約０．３mg、体重１kgあたりに約０．５mg、体重１kgあたりに約１mg、体重１kgあたりに約２mg、最高２０mg/kgの用量、又は、更に高い用量で使用することができる。この用量は、最高２０mg/m2/日、１５mg/m2/日、１０mg/m2/日、７．５mg/m2/日、６mg/m2/日、４mg/m2/日以下であることもできる。
【０１１１】
また、本発明は、本発明の融合タンパク質と、場合により、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む、医薬組成物に関する。したがって、本発明の融合タンパク質は、薬学的に許容し得る成分と、確立された調製法（Gennaro, A.L. and Gennaro, A.R. (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA）とを使用して、組成物に配合することができる。医薬組成物を調製するために、薬学的に不活性な無機又は有機の賦形剤を使用することができる。例えば、丸剤、粉末剤、ゼラチンカプセル剤、又は坐剤を調製するために、例えば、ラクトース、タルク、ステアリン酸及びその塩、脂肪、ロウ、固体状又は液状のポリオール、天然油及び硬化油を使用することができる。液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル混合物、又は、使用前に液剤又はエアロゾル混合物に再構成するための粉末剤の製造に適した賦形剤は、水、アルコール、グリセロール、ポリオール、及びそれらの適切な混合物、ならびに、植物油を含む。
【０１１２】
本医薬組成物は、添加剤、例えば、充填材、バインダー、湿潤剤、滑剤、安定剤、保存剤、乳化剤、及び更に、溶媒、もしくは溶解剤、又は、貯蔵効果を達成するための作用物質等を含有することもできる。後者は、融合タンパク質が遅効性もしくは持続性放出、又は、ターゲット送達システム、例えば、リポソーム及びマイクロカプセルに包含させることができる。
【０１１３】
この製剤は、細菌保持フィルタによるろ過を含めた数多くの手段により、又は、滅菌水もしくは他の無菌媒体中に使用直前に溶解させ、又は、分散させることができる無菌の固体組成物の形態で滅菌剤を包含させることにより、滅菌することができる。本発明の融合タンパク質についての数多くの可能性のある用途が、医学に存在している。
【０１１４】
また、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。本核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができ、ゲノム又は合成起源のものであることができ、一本鎖又は二本鎖であることができる。核酸の例は、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとのコポリマー、オリゴヌクレオチド等を含む。各核酸は、非天然ヌクレオチド類似物を更に含有することができ、及び／又は、親和性タグ又はラベルに結合させることができる。同タグ又はラベルを、例えば、本融合タンパク質に含ませることもできる。このような親和性タグは、ｈｉｓタグ、ｆｌａｇタグ、ｓｔｒｅｐタグ、ＨＡタグ、カルモデュリンタグ、又はＧＦＰタグであることができる。また、本発明の核酸分子は、例えば、ベクターに含ませることができる。また、本発明は、本発明の核酸分子又は本明細書で記載されたベクターを含む、ホスト細胞に関する。
【０１１５】
また、本発明は、融合タンパク質の発現のために、融合タンパク質の発現を可能にする条件下において、融合タンパク質をコードする核酸を使用することを含む、本発明の融合タンパク質を製造するための方法に関する。一実施態様において、本融合タンパク質は、ホスト細胞により、又は、細胞フリー系において発現される。
【０１１６】
また、本発明は、治療的に有効量の本発明の融合タンパク質を、対象に投与することを含む、疾患を処置する方法に関する。疾患は、例えば、本明細書で記載された増殖性又は自己免疫疾患であることができる。
【０１１７】
「投与」という用語は、治療的に有効な用量の融合タンパク質を、対象に投与することを意味する。「投与すること」という用語も、融合タンパク質を生物の組織内に包含させる方法に関する。種々の経路の投与が可能である。本発明の融合タンパク質又は医薬組成物を、例えば、種々の方法、例えば、（好ましくはタンパク質性）薬剤について治療的に有効な任意の非経口又は非経口以外（経腸又は局所）経路により投与することができる。非経口投与法は、例えば、注射液、注入液、又はチンキの形態における、例えば、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、くも膜下腔内、鼻内、心房内、腹腔内、又は静脈内への注射及び注入技術を含む。非経口以外の送達方式は、例えば、丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤、又は懸濁剤の形態における、例えば、経腸送達方式、例えば、経口送達、又は、例えば、坐剤の形態での直腸にである。ただし、非経口送達が好ましい。局所投与経路は、皮膚上又は吸入投与を含む。肺薬剤送達、すなわち、（鼻内投与にも使用することができる）エアロゾルの吸入又は気管内点滴のいずれかについての概観は、Patton et al.（2004）、例えば、（J.S. Patton et al. The lungs as a portal of entry for systemic drug delivery. Proc. Amer. Thoracic Soc. 2004 Vol. 1 pages 338-344）に提供される。一般的には、本発明の融合タンパク質及び医薬組成物は、必要に応じて、本明細書で記載された従来の無毒性の薬学的に許容し得る賦形剤又は担体、添加剤及び媒体を含有する製剤において投与することができる。
【０１１８】
特に、「治療的」又は「治療効果」という用語は、異常な状態を引き起こし又は同状態に関与している因子の阻害又は活性化を意味する。例えば、治療効果は、エフェクター細胞により媒介されるターゲット細胞の殺傷であることができる。このため、このような治療効果を、例えば、本発明の融合タンパク質又は医薬組成物の投与前の対象と比較して、本発明の融合タンパク質又は医薬組成物を受けた対象における、例えば、腫瘍サイズの減少又はＢ細胞量の減少を測定することにより、測定することができる。
【０１１９】
本発明の融合タンパク質又は医薬組成物を、他の治療との同時処置に使用することもできる。このような同時処置は、好ましくは、医薬の形態における、本発明の融合タンパク質又は医薬組成物の、疾患、例えば、増殖性又は自己免疫疾患を患う対象への投与と、別の医薬／薬剤の投与とを含むことができる。このような更なる薬剤の例は、化学療法、放射線療法に使用される薬剤、血管新生阻害剤、又はガンワクチンである。このような更なる薬剤の更なる例は、甲状腺補充、ビタミン、例えば、Ｂ１２、又はインスリン注入、免疫サプレッション、例えば、コルチゾール、ナタリズマブ、又はインフリキシマブである。
【０１２０】
本発明の融合タンパク質又は医薬組成物を、対象に投与することもできる。「対象」という用語は、ヒト又は動物を意味することもできる。対象は、ガン又は自己免疫疾患を患っている対象であることもできる。対象は、脊椎動物、より好ましくは、哺乳類であることができる、哺乳類は、家畜動物、競技動物、ペット、霊長類、マウス、及びラットを含むが、これらに限定されない。好ましくは、哺乳類は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、マウス、ラット等であり、特に好ましくは、人間である。このため、一実施態様において、対象は、脊椎動物、好ましくは、人間である。
【０１２１】
また、本発明は、疾患を有する対象を処置するための医薬の製造における、本発明の融合タンパク質又は本発明の医薬組成物の使用に関する。
【０１２２】
また、本発明は、本発明の融合タンパク質を含む、キットに関する。このようなキットは、
ａ）１つ以上のバッファー、
ｂ）１つ以上のプロトコール
を更に含むことができる。
【０１２３】
適切なバファーは、本発明の融合タンパク質又は医薬組成物を保存することができ、又は、本発明の融合タンパク質又は医薬組成物を対象に直接投与することができる、バッファーを含む。後者の場合、このようなバッファーは、無毒性の生理学的許容し得るバッファーである。
【０１２４】
また、本発明は、治療における非特異的なターゲット細胞活性化を減少させるための方法であって、治療が、本発明の融合タンパク質を対象に投与することを含む、方法に関する。
【０１２５】
加えて、本発明は、治療における副作用を減少させるための方法であって、治療が、本発明の融合タンパク質を対象に投与することを含む、方法に関する。副作用の実例は、輸注反応、体温上昇／発熱、呼吸困難、循環系の問題、免疫原性、過敏症反応、免疫サプレッション、感染、貧血、白血球減少症、血小板減少症、心不全の悪化、腫瘍溶解、サイトカイン放出症候群、甲状腺障害、心毒性、局所的な皮膚反応、甲状腺障害、肝臓トランスアミナーゼの上昇、低血圧、血清病、皮膚粘膜反応、肝炎再活動化、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、腎毒性、心不整脈の内の少なくとも１つを含む。
【０１２６】
また、本発明は、治療における融合タンパク質の用量を増大させる方法にも関し、該治療は対象に本発明の融合タンパク質を投与することを含む。
【０１２７】
また、本発明は、治療における融合タンパク質の用量を増大させるための方法であって、治療が、本発明の融合タンパク質を対象に投与することを含む、方法に関する。
【０１２８】
本発明は、下記項により更に特徴付けられる。
【０１２９】
１．  ａ）少なくとも１つの結合部位を含む結合タンパク質であって、結合部位は、ターゲット細胞に関連する抗原に結合する結合タンパク質と、
ｂ）ＩＬ−１５ポリペプチドであって、ＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１２、１１３、１１４、１１５、及び／又は１１６位に対応する１つ以上の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことにより、配列番号：１（Uniprotナンバー：Ｐ４０９３３−１）の野生型ＩＬ−１５の親和性と比較して、ＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有するＩＬ−１５ポリペプチドとを含む、
融合タンパク質。
【０１３０】
２．  結合タンパク質が、抗体、二価の抗体フラグメント、一価の抗体フラグメント、又は抗体様結合性を有するタンパク質性結合分子からなる群より選択される、項１記載の融合タンパク質。
【０１３１】
３．  二価の抗体フラグメントが、（Ｆａｂ）２’フラグメント、二価の一本鎖Ｆｖフラグメント、ｂｓＦｃ−１／２−二量体、又はｂｓＦｃ−ＣＨ３−１／２二量体である、項２記載の融合タンパク質。
【０１３２】
４．  一価の抗体フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、又はｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントからなる群より選択される、項２記載の融合タンパク質。
【０１３３】
５．  抗体様結合性を有するタンパク質性結合分子が、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づく突然変異タンパク質、グルボディ（glubody）、アンキリン足場に基づくタンパク質、結晶性足場に基づくタンパク質、アドネクチン、アビマー、又は（リコンビナント）レセプタータンパク質からなる群より選択される、項２記載の融合タンパク質。
【０１３４】
６．  結合タンパク質が、非改変結合タンパク質と比較して、向上した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有するように改変されている、項２〜４のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１３５】
７．  改変結合タンパク質が、Ｆｃ最適化されている、項６記載の融合タンパク質。
【０１３６】
８．  改変結合タンパク質が、抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント、ｂｓＦｃ−１／２二量体、又はｂｓＦｃ−ＣＨ３−１／２二量体である、項７記載の融合タンパク質。
【０１３７】
９．  Ｆｃ最適化が、アミノ酸置換を含み、同アミノ酸置換が、Ｆ２４３Ｌ及び／又はＤ２７０Ｅ及び／又はＲ２９２Ｐ及び／又はＳ２９８Ａ及び／又はＳ２９８Ｎ及び／又はＹ３００Ｌ及び／又は３０５Ｉ及び／又はＡ３３０Ｖ及び／又はＡ３３０Ｌ及び／又はＩ３３２Ｅ及び／又はＥ３３３Ａ及び／又はＫ３３４Ａ及び／又はＰ３９６Ｌ及び／又はＳ２３９Ｄ、好ましくは、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅからなる群より選択され、そしてここで、位置ナンバリングが、ＥＵインデックスによる、項７又は８記載の融合タンパク質。
【０１３８】
１０．  改変結合タンパク質が、非改変結合タンパク質のＦｃ結合オリゴ糖のグリコシル化パターンとは異なる、Ｆｃ結合オリゴ糖のグリコシル化パターンを有する、項６記載の融合タンパク質。
【０１３９】
１１．  改変結合タンパク質が、非改変結合タンパク質より少なくフコシル化されている、項１０記載の融合タンパク質。
【０１４０】
１２．  改変結合タンパク質が、フコシル化されていない、項１１記載の融合タンパク質。
【０１４１】
１３．  結合タンパク質が、４Ｇ７抗体の結合部位を含み、同結合部位が、配列番号：５（４Ｇ７の重鎖の可変ドメイン配列）に対して、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、項２〜４、６〜１２のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１４２】
１４．  結合タンパク質が、４Ｇ７抗体の結合部位を含み、同結合部位が、配列番号：６（４Ｇ７の軽鎖の可変ドメイン配列）に対して、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、項２〜４、６〜１３のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１４３】
１５．  ターゲット細胞が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び／又は自己免疫疾患に関連する抗原を発現している、項１〜１４のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１４４】
１６．  ＴＡＡが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤｗ５２、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ−３、ＣＤ１３５）、ｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＳＦ１Ｒ、（ＣＤ１１５）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＰＤＧＦＲ−α（ＣＤ１４０ａ）、ＰＤＧＦＲ−β（ＣＤ１４０ｂ）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、Ｍｕｃ−１、ＥＧＦＲ、ｄｅ２−７−ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、葉酸遮断タンパク質、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＩＬ３Ｒ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、カーボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ガン胎児抗原（ＣＥＡ）、ＥｐＣＡＭ、ＣＤＣＰ１、デルリン１、テネシン、ｆｒｉｚｚｌｅｄ１〜１０、血管抗原ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ１）、ＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ４、ＣＤ３０９）、エンドグリン、ＣＬＥＣ１４、Ｔｅｍ１−８、Ｔｉｅ２、メソセリン、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）、ガン抗原７２−４（ＣＡ７２−４）、インターロイキン１３レセプター  アルファ−２サブユニット、ＩＬ１３Ｒα２、Ｉｇ  カッパ軽鎖（κ）、ＧＤ３−ガングリオシド（ＧＤ３）、ＧＤ２−ガングリオシド（ＧＤ２）、ＧＤ２及びＧＤ３のアセチル化変異体、ＣＤ１７１、ＮＣＡＭ、アルファ葉酸レセプター（αＦＲ）、ルイス（Ｙ）、胎児アセチルコリンレセプター（ＦＡＲ）、トリ赤芽血症ウイルスのガン遺伝子ホモログ３（ＥＲＢＢ３）、トリ赤芽血症ウイルスのガン遺伝子ホモログ４（ＥＲＢＢ４）、トリ赤芽血症ウイルスのガン遺伝子ホモログ２（ＥＲＢＢ２）、肝細胞増殖因子レセプター（ＨＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ）、クローディン１８．２、クローディン３、クローディン４、クローディン１、クローディン１２、クローディン２、クローディン５、クローディン８、クローディン７、クローディン６、膜結合ＣＥＡ、Ｒｏｂｏ４、ＣＤ１３８、テネシン、ならびにフィブロネクチンのエクストラドメインＢからなる群より選択される、項１５記載の融合タンパク質。
【０１４５】
１７．  ターゲット細胞が、自己免疫疾患に関連する抗原を発現しており、同抗原が、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ５２及びＴＮＦＲ、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ４０からなる群より選択される、項１５記載の融合タンパク質。
【０１４６】
１８．  ターゲット細胞が、腫瘍／ガン細胞及び／又はＢ細胞である、項１〜１７のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１４７】
１９．  ＩＬ−１５ポリペプチドが、配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９３、９４、９７、９８、９９、１００、１１４、及び／又は１１５位に対応する１つ以上の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、項１〜１８のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１４８】
２０．  ＩＬ−１５ポリペプチドが、配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９４、９７、９９、及び／又は１００位に対応する１つ以上の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、項１９記載の融合タンパク質。
【０１４９】
２１．  ９４位に対応するアミノ酸が、塩基性アミノ酸により置換されている、項１９又は２０記載の融合タンパク質。
【０１５０】
２２．  塩基性アミノ酸が、アルギニン、リシン、及びヒスチジンからなる群より選択される、項２１記載の融合タンパク質。
【０１５１】
２３．  少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｌ９２Ｄ、Ｅ９４Ｋ、Ｌ９５Ｄ、Ｖ９７Ｄ、Ｉ９８Ｄ、Ｌ１１４Ｄ、Ｌ１１４Ｅ、Ｉ１１５Ｄ、Ｉ１１５Ｅ、及び／又は、好ましくは、Ｅ９４Ｋ、Ｖ９７Ｄ、及び／又はＩ９８Ｄ、最も好ましくは、Ｅ９４Ｋからなる群より選択される、項１〜１８のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１５２】
２４．  ＩＬ−１５ポリペプチドが、ＩＬ−１５Ｒαに結合しない、項１〜２３のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１５３】
２５．  ＩＬ−１５ポリペプチドが、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγに結合する、項１〜２４のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１５４】
２６．  ＩＬ−１５ポリペプチドが、全長ＩＬ−１５タンパク質又はそのフラグメントもしくは変異体であり、同フラグメント又は変異体が、配列番号：１の野生型ＩＬ−１５の親和性と比較して、ＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有する、項１〜２５のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１５５】
２７．  フラグメント又は変異体が、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγに対する結合能を更に有する、項２６記載の融合タンパク質。
【０１５６】
２８．  ＩＬ−１５ポリペプチドが、少なくとも、配列番号：４に示されたアミノ酸配列を含み、同アミノ酸配列は、配列番号：４に示されたアミノ酸配列の４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、６４、６５、６６、６７、及び／又は６８位に対応する１つ以上の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、項１〜２７のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１５７】
２９．  ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγが、エフェクター細胞により発現される、項２５記載の融合タンパク質。
【０１５８】
３０．  エフェクター細胞が、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγを発現する、項２９記載の融合タンパク質。
【０１５９】
３１．  エフェクター細胞が、ＮＫ細胞又はＴ細胞、好ましくは、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、又はＮＫ  Ｔ細胞である、項３０記載の融合タンパク質。
【０１６０】
３２．  融合タンパク質が、リンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを更に含む、項１〜３１のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１６１】
３３．  リンカーが、グリシン及びセリンを含む、項３２記載の融合タンパク質。
【０１６２】
３４．  リンカーが、２個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、又は２０個以上のアミノ酸を含み、好ましくは、リンカーが、２０個のアミノ酸を含む、項３２又は３３記載の融合タンパク質。
【０１６３】
３５．  リンカーが、アミノ酸配列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS（（４−グリシン  １−セリン）４）を含む、項３３又は３４記載の融合タンパク質。
【０１６４】
３６．  ＩＬ−１５ポリペプチドが、結合タンパク質のＣＨ３ドメインに、リンカーを介して結合している、項３２〜３５のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１６５】
３７．  ターゲット細胞に関連する抗原が、エンドグリンである、項１〜３６のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１６６】
３８．  融合タンパク質が、配列番号：２７に対して、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項３７記載の融合タンパク質。
【０１６７】
３９．  融合タンパク質が、配列番号：２８に対して、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＩｇＧ軽鎖に共有結合している、項３８記載の融合タンパク質。
【０１６８】
４０．  ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγを発現しているエフェクター細胞のターゲット細胞限定活性化に使用するための、項１〜３９のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１６９】
４１．  ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγを発現しているエフェクター細胞により媒介されるターゲット細胞限定ターゲット細胞殺傷に使用するための、項１〜３９のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１７０】
４２．  ＮＫ細胞及びＴ細胞、好ましくは、ＮＫ細胞、ガンマデルタＴ細胞、又はＮＫ  Ｔ細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解活性を、項６で定義された非改変結合タンパク質の細胞溶解活性と比較して、向上させるのに使用するための、項１〜３９のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１７１】
４３．  疾患の処置に使用するための、項１〜３９のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【０１７２】
４４．  疾患が、増殖性疾患又は自己免疫疾患である、項４３記載の使用のための融合タンパク質。
【０１７３】
４５．  増殖性疾患が、副腎ガン、肛門ガン、胆管ガン、膀胱ガン、骨ガン、脳及び脊髄腫瘍、乳ガン、キャッスルマン病、子宮頚ガン、結腸ガン、子宮内膜ガン、食道ガン、ユーイング腫瘍、眼ガン、胆嚢ガン、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓ガン、喉頭部及び下咽頭ガン、白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、肝臓ガン、肺ガン、非小細胞肺ガン、小細胞肺ガン、肺カルチノイド、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔ガン、上咽頭ガン、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び口咽頭ガン、骨肉腫、卵巣ガン、膵臓ガン、陰茎ガン、下垂体腫瘍、前立腺ガン、直腸ガン、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺ガン、肉腫、皮膚ガン、基底細胞及び扁平上皮細胞ガン、メラノーマ、メルケル細胞ガン、小腸ガン、胃ガン、精巣ガン、胸腺ガン、甲状腺ガン、子宮肉腫、膣ガン、外陰ガン、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、又はウィルムス腫瘍からなる群より選択される、項４４記載の使用のための融合タンパク質。
【０１７４】
４６．  自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グッドパスチャー症候群、サルコイドーシス、強皮症、関節リウマチ、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、強皮症、皮膚筋炎、乾癬、白斑症、円形脱毛症、Ｉ型糖尿病、自己免疫性膵炎、橋本甲状腺炎、アジソン病、多発性硬化症、重症筋無力症、結節性多発動脈炎、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、抗リン脂質抗体症候群、悪性貧血、胃腸疾患、セリアック病、炎症性腸疾患、自己免疫性肝炎、又は原発性胆汁性肝硬変からなる群より選択される、項４４記載の使用のための融合タンパク質。
【０１７５】
４７．  処置の副作用が低減される、項４３〜４６のいずれか一項記載の使用のための融合タンパク質。
【０１７６】
４８．  副作用が、輸注反応、体温上昇／発熱、呼吸困難、循環系の問題、免疫原性、過敏症反応、免疫サプレッション、感染、貧血、自己免疫性悪性貧血、白血球減少症、血小板減少症、汎血球減少症、血球減少症、心不全の悪化、腫瘍溶解、サイトカイン放出症候群、甲状腺障害、心毒性、局所的な皮膚反応、肝臓トランスアミナーゼの上昇、低血圧、血清病、皮膚粘膜反応、肝炎再活動化、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、腎毒性、心不整脈の内の少なくとも１つを含む、項４７記載の使用のための融合タンパク質。
【０１７７】
４９．  処置において、投与される融合タンパク質の用量が、項１〜３６のいずれか一項記載の融合タンパク質の結合タンパク質、及び、配列番号：１に示されたアミノ酸配列の９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１２、１１３、１１４、１１５、及び／又は１１６位に対応する１つ以上の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含まないＩＬ−１５ポリペプチドを含む融合タンパク質に使用される用量と比較して増大する、項４３〜４８のいずれか一項記載の使用のための融合タンパク質。
【０１７８】
５０．  項１〜３９のいずれか一項記載の融合タンパク質を含む、
医薬組成物。
【０１７９】
５１．  項１〜３９のいずれか一項記載の融合タンパク質をコードする、
核酸分子。
【０１８０】
５２．  ベクターに含まれる、項５１記載の核酸分子。
【０１８１】
５３．  項５１記載の核酸分子又は項５２記載のベクターを含む、
ホスト細胞。
【０１８２】
５４．  融合タンパク質の発現のために、融合タンパク質の発現を可能にする条件下において、融合タンパク質をコードする核酸を使用することを含む、
項１〜３９のいずれか一項記載の融合タンパク質を製造するための方法。
【０１８３】
５５．  融合タンパク質が、ホスト細胞により、又は、細胞フリー系において発現される、項５４記載の方法。
【０１８４】
５６．  治療的に有効量の、項１〜３９のいずれか一項記載の融合タンパク質を、対象に投与することを含む、
疾患を処置する方法。
【０１８５】
５７．  疾患が、増殖性又は自己免疫疾患である、項５６記載の方法。
【０１８６】
５８．  疾患を有する対象を処置するための医薬の製造における、項１〜３９のいずれか一項記載の融合タンパク質又は項５０記載の医薬組成物の使用。
【０１８７】
５９．  対象が、脊椎動物、好ましくは、人間である、項５６記載の方法又は項５８記載の使用。
【０１８８】
６０．  項１〜３９のいずれか一項記載の融合タンパク質を含む、
キット。
【０１８９】
６１．  キットが、
ａ）１つ以上のバッファー、
ｂ）１つ以上のプロトコール
を更に含む、項６０記載のキット。
【０１９０】
６２．  治療における非特異的なターゲット細胞活性化を減少させるための方法であって、
治療が、項１〜３９のいずれか一項記載の融合タンパク質を対象に投与することを含む、
方法。
【０１９１】
６３．  治療における副作用を減少させるための方法であって、
治療が、項１〜３９のいずれか一項記載の融合タンパク質を対象に投与することを含む、
方法。
【０１９２】
６４．  副作用が、輸注反応、体温上昇／発熱、呼吸困難、循環系の問題、免疫原性、過敏症反応、免疫サプレッション、感染、貧血、白血球減少症、血小板減少症、心不全の悪化、腫瘍溶解、サイトカイン放出症候群、甲状腺障害、心毒性、局所的な皮膚反応、甲状腺障害、肝臓トランスアミナーゼの上昇、低血圧、血清病、皮膚粘膜反応、肝炎再活動化、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、腎毒性、心不整脈の内の少なくとも１つを含む、項６３記載の方法。
【０１９３】
６５．  治療における融合タンパク質の用量を増大させるための方法であって、
治療が、項１〜３９のいずれか一項記載の融合タンパク質を対象に投与することを含む、
方法。
【実施例】
【０１９４】
本発明は、以下の非限定的な実施例により更に例示される。
【０１９５】
実施例１：融合タンパク質の生成
Ｆｃ最適化ＳＤＩＥ改変抗体の構築は、Hofmann et al. (2012) 「Generation, selection and preclinical characterization of an Fc-optimized FLT3 antibody for the treatment of myeloid leukemia」 Leukemia 26:1228-1237に記載されている。ヒトＩＬ−１５配列を含有するプラスミドを、DKFZ Genomics and Proteomics Core facility（ベクター：ｐＥＮＴＲ２２１、ｈＩＬ−１５GeneBankアクセッションナンバー：ＤＱ８９３７０９、配列番号：１にも示す）から得た。特に、この配列の最初の４８個のアミノ酸は、長さ４８個のアミノ酸シグナルペプチドを含む。同シグナルペプチドは、ｈＩＬ−１５の分泌中に開裂され、ＩＬ−１５融合タンパク質の一部ではない。ＢｓｐＥＩ及びＳｐｅＩの制限部位を、ＰＣＲにより、ＩＬ−１５配列の５’及び３’端に加えた。その後、同配列を、ｐＪｅｔ１．２  ｂｌｕｎｔベクター内にクローニングした。第１の工程において、ＩＬ−１５配列内のＢｓｐＥＩ制限部位を、変異誘発ＰＣＲを使用して除去した。第２の工程において、３種類のＩＬ−１５ポリペプチドを、変異誘発ＰＣＲにより生成した（Ｅ４６Ｋ、Ｖ４９Ｄ、及びＩ５０Ｄ、これらの変異は、配列番号：１に関するアミノ酸置換Ｅ９４Ｋ、Ｖ９７Ｄ、及びＩ９８Ｄに相当する。本明細書で記載された表３も参照のこと）。４種類のＩＬ−１５ポリペプチドを、ＢｓｐＥＩ及びＳｐｅＩ制限部位により、４Ｇ７（抗ＣＤ１９／αＣＤ１９）についての可変ドメイン及びＦｃ最適化ヒトＩｇＧ１定常領域を含有する発現ベクター内に導入した。すなわち、定常ドメインは、アミノ酸交換Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ（ＥＵナンバリング）を有する。これらの構築物において、ｈＩＬ−１５は、グリシン−セリン（短いリンカー）を介して、ＣＨ３ドメインに直接連結している（図１）。
【０１９６】
ＰＳＭＡ−ＩＬ−１５ｗｔ及びＰＳＭＡ−ＩＬ−１５−Ｅ４６Ｋ構築物を、Ｊ５９１（抗ＰＳＭＡ）についての配列を含有する発現ベクターに基づいて生成した。長いリンカーを有する構築物を、下記のようにして生成した。長さ２０個のアミノ酸の長いリンカー（４−グリシン  １−セリン）４をコードする配列＋ＩＬ−１５配列の最初の３９個のヌクレオチドを、Eurofins Genomics, Ebersberg, Germanyにおいて、ＤＮＡフラグメント（５’ＢｓｐＥＩ及び３’ＢｇｌＩＩ制限部位を含有）として合成した。ＩＬ−１５配列は、ＢｇｌＩＩ制限部位を、ヌクレオチド位置３９に含有する。このため、（４Ｇ−１Ｓ）４リンカーを、ＢｓｐＥＩ及びＢｇｌＩＩにより、種々のＩＬ−１５を含有する発現ベクター内にライゲーションした。同様に、エンドグリン−ＩＬ−１５ｗｔ及びエンドグリンＩＬ−１５−Ｅ４６Ｋ構築物を、Ｋ−ｒｏ２３（キメラ抗エンドグリン抗体）についての配列を含有する発現ベクター使用して生成した。
【０１９７】
全ての重鎖プラスミドを、適切な軽鎖ベクターと共に、ＳＰ２／０細胞内にトランスフェクションした。１つの抗体を生成するクローンを増殖させ、抗体を、上清からプロテインＡによる親和性クロマトグラフィーにより精製した。
【０１９８】
実施例２：ＩＬ−１５Ｒαに対する結合性
ＣＤ１９陽性ＮＡＬＭ１６細胞を、種々の濃度の別個の融合タンパク質と共にインキュベーションし、リンコンビナントＨｉｓタグ付きＩＬ−１５Ｒ−α−Ｆｃ−融合タンパク質（R&D systems）、ビオチンラベル抗Ｈｉｓ抗体（Qiagen）、及び最後に、ストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲート（Life technologies）により染色した。ついで、細胞を、フローサイトメトリー（BD FACS Calibur）により分析した。最も適した融合タンパク質を選択するために、ＣＤ１９陽性ＮＡＬＭ１６細胞を、示された濃度の別個の融合タンパク質（図２Ａ及び図２Ｂのｙ軸）と共にインキュベーションした。
【０１９９】
融合タンパク質αＣＤ１９−ＩＬ１５ｗｔは、野生型ヒトＩＬ−１５に融合した、Ｆｃ最適化ヒトＩｇＧ１定常領域（上記されたＳＤＩＥ変異）を有する４Ｇ７抗体（抗ＣＤ１９抗体）を含んだ。そしてここで、ｈＩＬ−１５は、グリシン−セリン（短いリンカー）を介して、ＣＨ３ドメインに直接結合している。この融合タンパク質を、対照として機能させた。Ｆｃ最適化（ＳＤＩＥ）ヒトＩｇＧ１定常領域を有する４Ｇ７抗体を含んだ、αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ（４Ｇ７−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ）、αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｖ４９Ｄ（４Ｇ７−ＩＬ１５−Ｖ４９Ｄ）、又はαＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｉ５０Ｄ（４Ｇ７−ＩＬ１５−Ｉ５０Ｄ）と名付けた融合タンパク質を更に試験した。このＩＬ−１５ポリペプチドは、示されたアミノ酸置換をそれぞれ含んだ。これらのアミノ酸置換は、配列番号：２（図５に示す）のナンバリングに対応している。これら全ての融合タンパク質において、ｈＩＬ−１５は、グリシン−セリン（短いリンカー）を介して、ＣＨ３ドメインに直接結合している。
【０２００】
ＣＤ１９結合タンパク質（ここでは、４Ｇ７抗体）がＣＤ１９に対するために、同タンパク質は、このアッセイ法において、ＮＡＬＭ１６細胞に結合するであろう。融合タンパク質のＩＬ−１５ポリペプチドがＩＬ−１５Ｒαに結合するその能力を残していたかを理解するために、Ｈｉｓタグ付きＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ−融合タンパク質（R&D systems）を、培養物に加えた。このため、融合タンパク質のＩＬ−１５ポリペプチドがＩＬ−１５Ｒαに結合するその能力を残していた場合、加えられたＨｉｓタグ付きＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ−融合タンパク質は、融合タンパク質を介して、ＮＡＬＭ１６細胞に結合したままであろう。このため、ビオチンラベル抗Ｈｉｓ抗体（Qiagen）及びストレプトアビジンＰＥ−コンジュゲート（Life technologies）の添加に基づいて、検出可能なシグナルが生じるであろう。このシグナルを、平均蛍光強度（ＭＦＩ；図２Ａのｙ軸）により測定した。
【０２０１】
図２Ａに、αＣＤ１９−ＩＬ１５−ｗｔ（４Ｇ７−ＩＬ−１５−ｗｔ）融合タンパク質について検出されたＭＦＩは、約３００MFIであることを示す。ＩＬ−１５は通常、ＩＬＲ−１５Ｒαに結合するため、このシグナルにより、ＩＬ−１５のＩＬＲ−１５αへの結合の証拠が提供される。αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｖ４９Ｄ（４Ｇ７−ＩＬ１５−Ｖ４９Ｄ）融合タンパク質では、対照と同程度に顕著には生じなかった。このことにより、この融合タンパク質は、αＣＤ１９−ＩＬ−１５−ｗｔ融合タンパク質と比較してわずかに低下して、ＩＬＲ−１５αに結合したことが示される。対照的に、融合タンパク質αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ及びαＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｉ５０Ｄは、約１５０のＭＦＩシグナルを示した。このことは、αＣＤ１９−ＩＬ−１５−ｗｔ融合タンパク質と比較して、ＩＬＲ−１５αに対する結合性が強力に減少している（又は更に存在しない）ことを示している。このため、評価された３つの内の２つのＩＬ−１５ポリペプチドＥ４６Ｋ及びＩ５０Ｄは、本発明の融合タンパク質内で使用された場合、ＩＬ−１５Ｒαに対する結合性を減少させ／欠いていた（図２Ａ）。
【０２０２】
実施例３：種々のＩＬ−１５ポリペプチドを含有する種々の融合タンパク質の細胞溶解活性
次の実験において、実施例２で試験された融合タンパク質の細胞溶解アッセイを分析した。この分析を達成するために、ＮＡＬＭ１６細胞を、各融合タンパク質とインキュベーションした。加えて、健康なボランティアの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、この培養物に加えた。通常、このようなＰＢＭＣ細胞は、リンパ球、単球、及びマクロファージを含む。一部のリンパ球、例えば、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はＮＫ  Ｔ細胞等は、（ＩＬ−１５α鎖に加えて）ＩＬ−１５が結合することができる、ＩＬ−２／ＩＬ−１５レセプターのβ及び共通のγ鎖を発現している。このため、融合タンパク質のαＣＤ１９（４Ｇ７）結合タンパク質を介した両ＮＡＬＭ１６細胞への結合、及び、融合タンパク質のＩＬ−１５ポリペプチドを介したβγ陽性細胞への結合に基づいて、ＮＡＬＭ１６（ＣＤ１９発現）ターゲット細胞を殺傷することができる。
【０２０３】
細胞溶解活性を分析するために、ＮＡＬＭ１６ターゲット細胞の増殖を、３Ｈ−チミジン取込みアッセイ法を使用して、２日後に評価した。これに関して、融合タンパク質及びＰＢＭＣの不存在下での増殖を、１００％増殖と定義した。この増殖は、増殖の０％阻害を意味する。このため、検出された増殖の阻害量が多いほど、このアッセイ法において、より少ない増殖が起こっている。同様に、増殖量が少ないほど、融合タンパク質の細胞溶解活性が高い。
【０２０４】
図２Ｂから分かるように、αＣＤ１９−ＩＬ１５−ｗｔ及びαＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｖ４９Ｄ融合タンパク質は両方とも、約８０〜８５％を示した。一方、変異タンパク質の場合には、同等の活性を達成するのに、より高い濃度を必要とした。αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｉ５０Ｄ融合タンパク質では、それに融合したＩＬ−１５部分を有さない親αＣＤ１９−ＳＤＩＥ（４Ｇ７ＳＤＩＥ）抗体により得られた阻害と比較して、約６０％の増殖阻害がもたらされた。特に、αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ融合タンパク質は、野生型タンパク質と共に、増殖の最も高い阻害を提供した（図２Ｂ）。このため、Ｅ４６Ｋアミノ酸置換を有するＩＬ−１５ポリペプチドを含有する融合タンパク質は、ＣＤ１９発現ターゲット細胞に対する全ての変異タンパク質の中で、最も高い細胞溶解活性を示したため、その後の実験に使用した。
【０２０５】
実施例４：ＮＫ９２細胞及びＰＢＭＣ細胞において種々の融合タンパク質により誘引された増殖
長いリンカー（Ｌ）対短いリンカーの重要性を試験するために、ＩＬ１５応答性細胞の増殖を、実施例３で記載された３Ｈ−チミジン取込みアッセイ法を使用して評価した。応答性細胞は、ＮＫ９２細胞（図３Ａ）又はＰＢＭＣ（図３Ｂ）のいずれかとした。短いリンカーを含む融合タンパク質において、ｈＩＬ−１５は、グリシン−セリン（短いリンカー）を介して、ＣＨ３ドメインに直接結合している。長いリンカーを有する融合タンパク質は、２０個のアミノ酸の長いリンカー（４−グリシン  １−セリン）４を含み、このリンカーにより、ｈＩＬ−１５がＣＨ３ドメインに直接結合している。
【０２０６】
長い又は短いリンカーを含有する融合タンパク質を、ＮＫ９２細胞（図３Ａ）又はＰＢＭＣ（図３Ｂ）細胞と共に、２日間インキュベーションした。ついで、細胞を、３Ｈ−チミジンでパルスし、３日目にフィルタマット上で収集し、液体シンチレーションカウンターでカウントした。
【０２０７】
図３Ａにおいて、ＮＫ９２細胞を、種々の濃度の別箇の融合タンパク質と共に、示されたように（ｘ軸及び図中の凡例）インキュベーションした。ＮＫ９２細胞は、ナチュラルキラーリンパ腫細胞であり、αＣＤ１９（４Ｇ７）結合タンパク質が結合するＣＤ１９を発現しない（Gong et al. (1994) 「Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells」 Leukemia; 8(4):652-8）。このため、この細胞培養物は、ターゲット細胞を含んでいない。ｙ軸に示された増殖３Ｈ−チミジンカウントを測定することにより（図３Ａ）、エフェクター細胞の増殖を誘引する融合タンパク質の能力を、概ね評価した。
【０２０８】
αＣＤ１９−ＩＬ１５ｗｔ及びαＣＤ１９−ＩＬ１５ｗｔ−Ｌ（長いリンカーを含有）は、約２５０００ ３Ｈ−チミジンカウントをもたらした。一方、変異タンパク質の場合には、同等の活性を達成するのに、より高い濃度が必要である。αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋにより、細胞培養物中におけるより少ない量の増殖が提供された（約５０００カウント ３Ｈ−チミジン）。特に、融合タンパク質αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ（長いリンカーを含有）は、約２００００カウントの増殖を誘引した（図３Ａ）。このため、融合タンパク質αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌは、αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ融合タンパク質より高い増殖／活性化を誘引した。
【０２０９】
同様の結果が、図３Ｂにおいても得られた。ここでは、ＰＢＭＣ細胞を、種々の濃度の別箇の融合タンパク質と共に、示されたように（図３Ｂ中のｘ軸及び図中の凡例）インキュベーションした。一部のＰＢＭＣ（例えば、Ｂ細胞）も、ＣＤ１９を発現する。ＣＤ１９は、４Ｇ７結合タンパク質により検出される。特に、ＰＢＭＣ培養物は、一部の強力なエフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞等も含む。図３Ａにおけるのと同様に、増殖を、ｙ軸に示されたように、３Ｈ−チミジンカウントにより決定した（図３Ｂ）。
【０２１０】
これらの実験において、αＣＤ１９−ＩＬ１５ｗｔ及びαＣＤ１９−ＩＬ１５ｗｔ−Ｌ（長いリンカーを含有し、野生型（ｗｔ）ＩＬ−１５である）はそれぞれ、約６０００及び１２０００ ３Ｈ−チミジンカウントをもたらした。再度、αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋにより、より少ない程度の増殖が提供された（約４５００カウント ３Ｈ−チミジン）。一方、融合タンパク質αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ（長いリンカーを含有）は、ＩＬ−１５野生型融合タンパク質に類似する増殖の検出をもたらした（約８５００カウント；図３Ｂ）。このため、この実験では、αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌは、αＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ融合タンパク質より高い、細胞の増殖／活性化を誘引した。
【０２１１】
実施例５：ターゲット細胞限定ＮＫ細胞活性化及びターゲット細胞殺傷
生成された融合タンパク質のターゲット細胞限定活性を評価するために、正常なＰＢＭＣを、Ｂ細胞関連ＣＤ１９抗原及び前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）をターゲットする融合タンパク質に含まれる野生型ＩＬ−１５及び変異ＩＬ−１５ポリペプチドと共にインキュベーションした。Ｂ細胞が、ＰＢＭＣ培養物中に存在するため、ＣＤ１９は、この環境において、関連するターゲット抗原として機能する。一方、ＰＳＭＡは機能せず、このため、関係がない。ＰＢＭＣを、示された融合タンパク質（０．１μg/ml）と、３日間インキュベーションし、ついで、フローサイトメトリーにより分析した。
【０２１２】
図４Ａにおいて、ＮＫ細胞活性化を、ＣＤ６９を発現しているＣＤ５６陽性細胞（ＣＤ５６＋／ＣＤ６９＋ダブルポジティブ細胞）数を測定することにより評価した。ＣＤ６９は、活性化されたＴ細胞及びＢ細胞により発現され、マクロファージ及びＮＫ細胞を活性化させる。一方、ＣＤ５６は、ＮＫ細胞によってのみ発現される。ダブルポジティブ細胞（ＣＤ５６＋／ＣＤ６９＋）を選択することにより、活性化されたＮＫ細胞のみを測定する。
【０２１３】
図４Ａにおいて、細胞数は、ｙ軸に提供される。利用された種々の融合タンパク質は、ｘ軸に示される。対照のＰＢＭＣ培養物（「ＰＢＭＣのみ」）において、約１５０００個の細胞が、ＣＤ５６を発現し（ＣＤ５６＋）、約１０００個が、ＣＤ５６及びＣＤ６９についてダブルポジティブであった（ＣＤ５６＋／ＣＤ６９＋）。αＣＤ１９−ＳＤＩＥ（ＳＤＩＥ変異を含む４Ｇ７抗体；４Ｇ７−ＳＤＩＥ）の添加により、細胞組成がわずかにのみ変化した（約２５００個の活性化ＮＫ細胞）。対照的に、ＰＢＭＣ培養物内の活性化ＮＫ細胞数は、αＣＤ１９−ＳＤＩＥ−ＩＬ１５ｗｔ−Ｌ融合タンパク質の添加の結果として、約２０，０００個の活性化ＮＫ細胞に、大幅に増大した。活性化ＮＫ細胞数において、ほとんど目立たないが、それでも顕著な増大（約１２，０００個）が、αＣＤ１９−ＳＤＩＥ−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ構築物により観察された。
【０２１４】
更なる実験を、ＰＳＭＡをターゲットする融合タンパク質について行った。ＰＳＭＡは、ＰＢＭＣ細胞により発現されない。ここでは、ＰＳＭＡ−ＩＬ−１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質の添加により、ＮＫ細胞は活性化されなかった。対照的に、ＰＳＭＡ−ＩＬ−１５ｗｔ構築物の添加により、ＣＤ５６陽性細胞プール内の活性化ＮＫ細胞数も、顕著に増大した。これらの結果から、ＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有するＩＬ−１５ポリペプチドを含有する構築物によるＮＫ細胞活性化は、ターゲット細胞限定的である、すなわち、ＣＤ１９をターゲットするが、ＰＳＭＡをターゲットしない融合タンパク質は、ＮＫ細胞を活性化し、Ｂ細胞を殺傷すると、まとめることができる。対照的に、野生型ＩＬ−１５を含む（ＩＬ−１５Ｒαに対して正常な親和性を有する）融合タンパク質の添加に基づいて、ＮＫ細胞の細胞限定的活性化は、ほとんど目立たず、又は更に存在しない。これは、野生型ＩＬ−１５がαＩＬ１５Ｒαによりトランス提示されるため、その能力を発揮するのに、ターゲット細胞結合を必要としないためである。
【０２１５】
図４Ｂにおいて、Ｂ細胞殺傷を、ＣＤ２０＋Ｂ細胞数を測定することにより評価した。ＣＤ２０は、Ｂ細胞において専ら発現される。このため、細胞培養物中に存在するＢ細胞が少ないほど、αＣＤ１９結合タンパク質（４Ｇ７；抗ＣＤ１９抗体）を含む融合タンパク質のＢ細胞殺傷がより効果的である。
【０２１６】
この実験においても、ＰＢＭＣのみを含有し、融合タンパク質を何ら加えなかった細胞培養物を、対象として機能させた。ここでは、約１２０００個のＣＤ２０陽性（ＣＤ２０＋）Ｂ細胞をカウントした。αＣＤ１９−ＳＤＩＥ対照の添加により、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞の減少がもたらされた（約５０００個の細胞）。特に、αＣＤ１９−１５ｗｔ−Ｌ及びαＣＤ１９−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質により、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞の最大の減少がもたらされた（約２０００個の細胞）。対照的に、ＰＳＭＡ−ＩＬ１５ｗｔ融合タンパク質の添加により、約６０００個の細胞への減少が示された。特に、ＰＳＭＡ−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質によっては、「ＰＢＭＣのみ」対照と比較して、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞数は変化しなかった。
【０２１７】
このため、結合タンパク質／ＩＬ−１５融合タンパク質によるＣＤ２０＋細胞数の減少（Ｂ細胞枯渇）は、Ｆｃ最適化ＣＤ１９抗体（αＣＤ１９−ＳＤＩＥ；４Ｇ７ＳＤＩＥ）単独により達成された減少より顕著であった（図４Ｂ）。さらに、ＰＳＭＡに対する融合タンパク質であるＰＳＭＡ−ＩＬ１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌは、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞に対して何ら効果を有さなかった。ＰＳＭＡ  ＩＬ１５−ｗｔ融合タンパク質は、中程度の効果を有した。このため、ターゲット細胞限定Ｂ細胞殺傷は、ＩＬ−１５−Ｅ４６Ｋ−Ｌ融合タンパク質を使用した場合、最も顕著であった。一方、野生型ＩＬ−１５を含む融合タンパク質は、ほとんど目立たないか、又は更に存在しない、Ｂ細胞のターゲット細胞限定殺傷を示した（図４Ｂ）。
【０２１８】
図４Ｃにおいて、ＮＫ細胞活性化を、Ｂ細胞枯渇ＰＢＭＣ培養物において評価した。Ｂ細胞を、CD19MicroBads（Miltenyi Biotec）を使用する磁気細胞分離装置（ＭＡＣＳ）により枯渇させた。図４Ｂに示されたように、細胞数の決定のために、等量のＢＤ陰性ビーズ（BD Biociencesからの陰性ビーズ）を、各サンプルに加えた。フローサイトメトリー測定中に、同じ数のＢＤ陰性ビーズを、全てのサンプルについて取得した。これにより、１つの実験からの種々のサンプル間での細胞の定量及び細胞数の直接比較が可能であった。ＣＤ６９は、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞、活性化マクロファージ、ならびにＮＫ細胞により発現され、ＣＤ５６は、ＮＫ細胞によってのみ発現されるため、Ｂ細胞の枯渇により、これらの細胞プールは、Ｔ細胞及びＮＫ細胞に限定される。ＣＤ１９発現細胞がこれらの実験において枯渇されるため、変異ＩＬ−１５を含有するＣＤ１９ターゲット融合タンパク質の活性は強力に低下するが、野生型タンパク質を含有する融合タンパク質では低下しない。
【０２１９】
まとめ：野生型ＩＬ−１５（配列番号：１）のＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有するＩＬ−１５ポリペプチドを含む融合タンパク質によるＮＫ細胞活性化は、ターゲット細胞限定的である。すなわち、ＣＤ１９をターゲットするが、ＰＳＭＡをターゲットしないタンパク質は、ＮＫ細胞を活性化し、Ｂ細胞を殺傷する。その結果として、ＣＤ１９ターゲット融合タンパク質によるＮＫ細胞活性化は、Ｂ細胞がＰＢＭＣから枯渇された場合、低下した（図４Ｃ）。
ａ．野生型ＩＬ−１５を含有する両融合タンパク質によるＮＫ細胞活性化は、ターゲット細胞限定的ではない。すなわち、両融合タンパク質は、ＮＫ細胞活性化を誘引し、ターゲットされた抗原に無関係のＢ細胞を少なくともいくらか殺傷する。
ｂ．（野生型ＩＬ−１５よりＩＬ−１５Ｒαに対する低下した親和性を有する）結合タンパク質／ＩＬ−１５融合タンパク質によるＢ細胞枯渇は、Ｆｃ最適化ＣＤ１９抗体（αＣＤ１９−ＳＥＩＤ）単独による枯渇より顕著である（図４Ｂ）。
【０２２０】
特に断りない限り、説明及び特許請求の範囲を含む本明細書で使用された下記用語は、以下で与えられた定義を有する。
【０２２１】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、明確に他の方法で示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。このため、例えば、「試薬（ａ  ｒｅａｇｅｎｔ）」への言及は、１つ以上のこのような種々の試薬を含む。「方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、本明細書で記載された方法について修正し、又は、置換することができる、当業者に公知の同等の工程及び方法への言及を含む。
【０２２２】
当業者であれば、過度の思考錯誤をすることなく、本明細書で記載された本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識し、又は、確認することができるであろう。このような均等物は、本発明に包含されることを意図している。
【０２２３】
特に断りない限り、一連の要素に先立つ「少なくとも」という用語は、一連における全ての要素を意味すると理解されたい。当業者であれば、過度の思考錯誤をすることなく、本明細書で記載された方法及び使用の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識し、又は、確認することができるであろう。このような均等物は、本発明に包含されることを意図している。
【０２２４】
複数の文献が、本開示の文章全体を通して引用される。（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造仕様書、説明書等を含めた）本明細書で引用された文献はそれぞれ、前記又は下記であるかに関わらず、その内容全体が参照により組み入れられる。参照により組み入れられる情報が本明細書を否定し、又は、本明細書と矛盾する程度において、本明細書が、任意のこのような情報に対して優先されるであろう。本明細書において、本発明が、従来の発明によるこのような開示に新規性があると認めると、解釈されるべきではない。
【０２２５】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲全体を通して、特に断りない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、及び、変形例、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記述された整数もしくは工程、又は、整数もしくは工程の群の包含を意味するが、任意の他の整数もしくは工程、又は、整数もしくは工程の群の除外を意味しないと理解されるであろう。本明細書で使用する場合、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語により置き換えることができ、又は場合により、本明細書で使用する場合、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」という用語により置き換えることができる。
【０２２６】
本明細書で使用する場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲の要素において特定されなかった、任意の要素、工程、又は成分を除外する。本明細書で使用する場合、「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲の基礎的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を除外しない。本明細書における各例において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、他の２つの用語のいずれかにより置き換えることができる。
【０２２７】
本明細書で使用する場合、複数の言及された要素間の「及び／又は」という結合用語は、個々の選択肢及び組み合わせられた選択肢の両方を包含すると理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」により連結されている場合、第１の選択肢は、第２の要素を含まない第１の要素の適用性を意味する。第２の選択肢は、第１の要素を含まない第２の要素の適用性を意味する。第３の選択肢は、第１の要素と第２の要素とを組み合わせた適用性を意味する。これらの選択肢のいずれか１つが、その意味の範囲内にあり、したがって、本明細書で使用される「及び／又は」という用語の要求を満たすと理解される。２つ以上の選択肢の同時適用性も、その意味の範囲内にあり、したがって、本明細書で使用される「及び／又は」という用語の要求を満たすと理解される。
【０２２８】
本明細書で使用する場合、「約」という語は、当業者により決定された特定の値についての、許容し得る誤差範囲内にある値を意味する。同許容範囲は、一部において、その値がどのようにして測定され、又は、決定されるかにより、すなわち、測定系の限界により決まるであろう。例えば、「約」は、当技術分野における実務に関して、１以内又は１を超える標準偏差を意味することができる。また、「約」という用語は、当該量又は値が指定された値、又は、その値に近似する幾らかの他の値であることができることを示すのにも使用される。この表現は、類似する値が本発明の同等の結果又は効果を促進することを伝えることを意図している。この文脈において、「約」は、最大１０％の上下範囲を意味することができる。「約」という語は、一部の実施態様では、特定の値の上下範囲、すなわち、その値の上下最大５％、例えば、最大２％、最大１％、又は最大０．５％を意味する。一実施形態において、「約」は、所定の値の上下最大０．１％の範囲を意味する。
【０２２９】
参考文献の列記
【表５】
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0006757338.tif 000010
0006757338.tif 000011
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【配列表】
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