(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種もしくはより多くの複合糖質に内包されたグリカンを精製する方法であって、前記方法は、
前記１種もしくはより多くの複合糖質を含むサンプルと、脱グリコシル化試薬とを反応させて、前記１種もしくはより多くの複合糖質に内包された前記グリカンを前記１種もしくはより多くの複合糖質から放出させる工程；
放出された前記グリカンを複数の磁性粒子と会合させる工程；
磁場を印加して、放出された前記グリカンと会合させた複数の前記磁性粒子を引き下ろす工程；
引き下ろされた前記磁性粒子から上清を除去して、前記脱グリコシル化試薬および脱グリコシル化された前記サンプルを除去する工程；ならびに
前記グリカンを前記磁性粒子から溶離する工程
を包含し、前記磁性粒子が、カルボキシル被覆磁性ビーズであり、前記１種もしくはより多くの複合糖質に内包された前記グリカンが、グリコシド結合を介して基礎の分子に共有結合した１種もしくはより多くの糖単位を含むものであり、前記基礎の分子が、前記１種もしくはより多くの複合糖質のアミノ酸残基または脂質残基である、方法。
【請求項２】
前記複合糖質は、糖タンパク質もしくは糖ペプチドもしくは抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複合糖質は、プロテオグリカン、スフィンゴ糖脂質、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン、糖脂質もしくはグリコサミノグリカン、融合糖タンパク質もしくは抗体−薬物結合体を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記脱グリコシル化試薬は、脱グリコシル化酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、および核磁気共鳴（ＮＭＲ）、ならびにこれらの組み合わせのうちの１つによって、溶離された前記グリカンを分析する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記脱グリコシル化試薬は、エンドグリコシダーゼを含み、前記エンドグリコシダーゼは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
１種もしくはより多くの複合糖質に内包されたグリカンを分析する方法であって、前記方法は、
前記１種もしくはより多くの複合糖質を含むサンプルと、脱グリコシル化試薬とを反応させて、前記１種もしくはより多くの複合糖質に内包されたグリカンを前記１種もしくはより多くの複合糖質から放出させる工程；
前記グリカンを複数の磁性粒子と会合させる工程；
磁場を印加して、前記グリカンと会合させた複数の前記磁性粒子を引き下ろす工程；
引き下ろされた前記磁性粒子から上清を除去して、前記脱グリコシル化試薬および脱グリコシル化された前記サンプルを除去する工程；
前記グリカンと標識試薬とを反応させて、標識されたグリカンを形成する工程；
標識された前記グリカンを分析する工程、
を包含し、前記磁性粒子が、カルボキシル被覆磁性ビーズであり、前記１種もしくはより多くの複合糖質に内包された前記グリカンが、グリコシド結合を介して基礎の分子に共有結合した１種もしくはより多くの糖単位を含むものであり、前記基礎の分子が、前記１種もしくはより多くの複合糖質のアミノ酸残基または脂質残基である、方法。
【請求項８】
前記複合糖質は、糖タンパク質もしくは糖ペプチドを含み、前記糖タンパク質もしくは前記糖ペプチドは、抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記グリカンは、アセトニトリルを添加することによって、複数の前記磁性粒子と会合させられる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記グリカンと前記標識試薬とを反応させる前に、前記グリカンを前記磁性粒子から溶離する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記グリカンは、前記標識試薬および酸触媒を含む混合物を添加することによって、前記磁性ビーズから溶離され、前記酸触媒は、酢酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記グリカンと前記標識試薬とを反応させて、標識されたグリカンを形成する工程は、還元剤を添加して、前記グリカンと前記標識試薬との反応を開始する工程を包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
標識された前記グリカンを精製する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
標識された前記グリカンを複数の前記磁性粒子と会合させる工程；
磁場を印加して、標識された前記グリカンと会合させた複数の前記磁性粒子を引き下ろす工程；
標識された前記グリカンと会合させた、前記引き下ろされた複数の磁性粒子から上清を除去して、過剰な標識試薬を除去する工程；ならびに
標識された前記グリカンを複数の前記磁性粒子から溶離する工程、
をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標識された前記グリカンは、水性媒体を添加することによって、複数の前記磁性粒子から溶離され、前記水性媒体は、水である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標識された前記グリカンは、キャピラリー電気泳動、キャピラリー電気泳動と蛍光検出、液体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーと蛍光検出、質量分析（ＭＳ）もしくは核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって分析される、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識試薬は、１−アミノピレン−３，６，８−トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）、８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）、２−アミノ安息香酸（２−ＡＢ）、および２−アントラニル酸（２−ＡＡ）のうちの１種を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
前記グリカンと標識試薬とを反応させる工程は、還元剤を添加する工程をさらに包含し、前記還元剤は、ＮａＢＨ３ＣＮを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
グリカンを精製するためのキットであって、前記キットは、
複数のカルボキシル被覆磁性粒子；
グリカンを複合糖質から放出するための脱グリコシル化試薬；および
前記グリカンを複数の前記カルボキシル被覆磁性粒子と会合させるための試薬であって、アセトニトリルを含む、試薬、
を含み、前記グリカンが、グリコシド結合を介して基礎の分子に共有結合した１種もしくはより多くの糖単位を含むものであり、前記基礎の分子が、前記複合糖質のアミノ酸残基または脂質残基である、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１４年４月３０日に出願された米国仮出願第６１／９８６７３６号および２０１５年４月２１日に出願された同第６２／１５０７２２号（これら両方の内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）からの優先権の利益を主張する。
【０００２】
（分野）
グリカンおよび／もしくは複合糖質を分析するための方法、システム、およびキットが、本明細書で開示される。いくつかの局面において、本教示は、公知の方法と比較して、実質的に短縮されたサンプル調製時間を示す自動化糖分析プロトコルを可能にし得る。
【０００３】
（導入）
タンパク質グリコシル化は、代表的には、オリゴサッカリドもしくはグリカンがタンパク質に付着される翻訳後修飾をいう。例えば、タンパク質折りたたみ、輸送、および細胞間相互作用に対するグリコシル化の重要性を考慮すれば、多くの研究ツールが、複合糖質およびこれと会合したグリカンを特徴付けおよび／または分析するために開発されてきた。このようなツールは、生体医科学、バイオ医薬品産業（例えば、バイオマーカー探索）において、および規制機関のタンパク質治療剤の効力／安全性評価において、重要になってきている。
【０００４】
キャピラリー電気泳動および親水性相互作用液体クロマトグラフィーという最も一般的な糖分析法が有効であり得るものの、これら方法は、広範囲のサンプル調製（糖タンパク質捕捉、Ｎ−グリカン放出、蛍光誘導体化、精製、および予備濃縮工程が挙げられる）を要し得る。しかし、これら課題を充足する現在使用されているプロトコルは、時間を浪費し、例えば、複数回の遠心分離および／もしくは真空−遠心分離工程を必要とし、それによって、スループットが低減し、そして自動化が困難におよび／もしくは高価になっている。
【０００５】
よって、グリカンの精製および／または複合糖質もしくはこれと会合したグリカンの分析のための効率的かつ有効な方法が未だに必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
本教示は、複合糖質もしくはグリカンの精製および／もしくは分析のための方法、システム、およびキットに、具体的には、完全自動化および／もしくは現在のプロトコルと比較して短縮したサンプル調製時間を可能にし得る、磁性ビーズベースのサンプル調製法に関する。いくつかの局面において、本明細書で記載される方法は、その後のキャピラリー電気泳動とレーザー励起蛍光検出（ＣＥ−ＬＩＦ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、または他の分析法（例えば、質量分析（ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ））のための、時間を浪費するサンプル調製工程（例えば、遠心分離もしくは真空−遠心分離）を含まない、糖タンパク質消化、Ｎ−グリカン放出、蛍光標識、およびグリカン精製のうちの１もしくはより多くを提供し得る。
【０００７】
種々の局面によれば、本出願人の教示のある種の実施形態は、グリカンを精製するための方法に関し、上記方法は、１種もしくはより多くの複合糖質（例えば、糖タンパク質、糖ペプチド、抗体、プロテオグリカン、スフィンゴ糖脂質、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸（ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、ヒアルロナン、糖脂質、グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓｅａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）、融合糖タンパク質、抗体−薬物結合体）を含むサンプルと、脱グリコシル化試薬（例えば、Ｎ結合型グリカンについてはエンドグリコシダーゼ、Ｏ結合型グリカンについてはβ脱離）とを反応させて、グリカンを上記複合糖質から放出させる工程、上記放出されたグリカンを複数の磁性粒子（例えば、カルボキシル被覆磁性ビーズ）と会合させる工程、磁場を印加して、上記放出されたグリカンと会合させた上記複数の磁性粒子を引き下ろす工程、上記引き下ろされた磁性粒子から上清を除去して、上記脱グリコシル化試薬（例えば、酵素）および上記脱グリコシル化されたサンプルを除去する工程、ならびに上記グリカンを上記磁性粒子から解離もしくは溶離する工程を包含する。いくつかの局面において、上記方法は、ＣＥ（例えば、ＬＩＦとともに、ＵＶ標識とともに）、ＬＣ（例えば、蛍光検出とともにもしくはＵＶ検出とともに）、ＭＳ、およびＮＭＲ、ならびにこれらの組み合わせのうちの１つによる分析のために、上記グリカンを調製し得る。いくつかの局面において、上記グリカンは、遠心分離も真空遠心分離工程もなしで、精製される。
【０００８】
種々の局面によれば、本出願人の教示のある種の実施形態は、１種もしくはより多くの複合糖質（例えば、糖タンパク質、糖ペプチド、抗体、プロテオグリカン、スフィンゴ糖脂質、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、ヒアルロナン、糖脂質、グリコサミノグリカン、融合糖タンパク質、抗体−薬物結合体）を分析するための方法に関し、上記方法は、１種もしくはより多くの複合糖質を含むサンプルと、脱グリコシル化試薬（例えば、エンドグリコシダーゼ）とを反応させて、グリカンを上記複合糖質から放出させる工程、および上記グリカンを複数の磁性粒子（例えば、カルボキシル被覆磁性ビーズ）と会合させる工程を包含する。磁場は、上記グリカンと会合させた上記複数の磁性粒子を引き下ろすために印加され得、その上清は、上記引き下ろされた磁性粒子から上記脱グリコシル化酵素および脱グリコシル化された結合体を除去するために、除去され得る。上記グリカンは、標識されたグリカン（これは、次いで、分析され得る（例えば、キャピラリー電気泳動とレーザー誘起蛍光検出もしくはＵＶ検出を介して））を形成するために、標識試薬と反応させられ得る。本教示の種々の局面によれば、上記標識されたグリカンは、遠心分離も真空遠心分離もなしで分析のために調製され得る。
【０００９】
上記方法は、上記グリカンの標識前もしくは標識後に、上記グリカンを上記磁性粒子から溶離する工程を包含し得る。いくつかの局面において、例えば、上記方法は、上記グリカンと上記標識試薬とを反応させる前に、上記グリカンを上記磁性粒子から溶離する工程を包含し得る。例えば、上記グリカンは、上記標識試薬および酸触媒（例えば、酢酸）を含む混合物を添加することによって、上記磁性粒子から溶離され得る。関連局面において、上記グリカンは、還元剤（例えば、ＮａＢＨ３ＣＮもしくはｐｉｃ−ＢＨ３）を添加して上記グリカンと上記標識試薬との反応を開始することによって、標識されたグリカンを形成するために、上記標識試薬と反応させられ得る。
【００１０】
いくつかの局面において、上記方法はまた、上記標識されたグリカンを上記複数の磁性粒子（例えば、磁性微粒子、ビーズ）と会合させる工程、磁場を印加して、上記標識されたグリカンと会合させた上記複数の磁性粒子を引き下ろす工程、上記標識されたグリカンと会合させた、上記引き下ろされた複数の磁性粒子から上清を除去して、過剰な標識試薬を除去する工程、ならびに上記標識されたグリカンを上記複数の磁性粒子から溶離する工程を包含し得る。例えば、上記標識されたグリカンは、アセトニトリルを添加することによって、上記複数の磁性粒子と会合させられ得、上記標識されたグリカンは、水性媒体（例えば、水）を添加することによって、上記複数の磁性ビーズから溶離され得る。
【００１１】
本教示の種々の局面によれば、上記脱グリコシル化試薬は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素を含み得、グリカンは、アセトニトリルを添加することによって、上記複数の磁性粒子と会合させられ得、上記標識試薬は、１−アミノピレン−３，６，８−トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）、８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）、２−アントラニル酸（２−ＡＡ）、２−アミノ安息香酸（２−ＡＢ）のうちの１つを含み得る（これらは、例えば、還元剤（例えば、ＮａＢＨ３ＣＮもしくはｐｉｃ−ＢＨ３）を添加することによって、上記グリカンと反応させられ得る）。
【００１２】
種々の局面によれば、本出願人の教示のある種の実施形態は、グリカンを精製するためのキットに関し、上記キットは、複数のカルボキシル被覆磁性粒子、サンプル内に含まれる複合糖質からグリカンを放出するための脱グリコシル化試薬（例えば、１種もしくはより多くのエンドグリコシダーゼ、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ヒドラジン）、および上記グリカンを上記複数のカルボキシル被覆磁性粒子と会合させるための試薬を含み得る。
【００１３】
いくつかの局面において、上記キットは、上記放出されたグリカンを標識するための、特に、上記放出されたグリカンを蛍光標識するための試薬をさらに含み得る。例えば、上記キットは、ＡＰＴＳ、ＡＮＴＳ、２−ＡＡ、２−ＡＢ、酸触媒（例えば、酢酸）、および還元剤（例えば、ＮａＢＨ３ＣＮもしくはｐｉｃ−ＢＨ３）のうちの１種もしくはより多くを含み得る。
【００１４】
いくつかの局面において、上記放出されたグリカンを上記複数のカルボキシル被覆磁性粒子と会合させるための試薬は、アセトニトリルを含む。
【００１５】
いくつかの局面において、上記方法は、上記サンプルと上記脱グリコシル化酵素とを反応させるときに、約３７℃に等しいかもしくはより高い（例えば、約５０℃に等しいかもしくはより高い）温度を維持する工程をさらに包含し得る。
【００１６】
種々の局面において、上記キットは、キャピラリー電気泳動（例えば、レーザー誘起蛍光検出とともに）、液体クロマトグラフィー、ＭＳ、もしくはＮＭＲを介して、上記標識されたグリカンを分析するための試薬をさらに包含し得る。例えば、上記キットは、上記標識されたグリカンのＣＥ−ＬＩＦ分析のための蛍光標識された内部標準（例えば、ＡＰＴＳ標識、ＡＮＴＳ標識、２−ＡＡ標識、もしくは２−ＡＢ標識されたマルトース）を含み得る。
【００１７】
種々の局面によれば、キャピラリー電気泳動を使用してグリカンを分離するための組成物が提供され、上記組成物は、酢酸リチウム緩衝液、ポリエチレンオキシド、エチレングリコールおよび線状ポリアクリルアミドを含む。
【００１８】
種々の実施形態において、上記酢酸リチウムは、上記組成物中、４〜５．５の間のｐＨにおいて、１０ｍＭ〜５０ｍＭの間の濃度にあり、上記ポリエチレンオキシドは、１００〜１０００ｋＤａの分子量を有しかつ上記組成物中、０．５％〜５％の間の濃度にあり、上記エチレングリコールは、上記組成物中、６０％未満の濃度にあり、そして／または上記線状ポリアクリルアミドは、分子量  約１０ｋＤａを有しかつ上記組成物中、０．５％〜５％の間の濃度にある。
【００１９】
種々の実施形態において、上記組成物は、上記組成物中、ｐＨ  約４．７５において、２５〜３０ｍＭの間の濃度の酢酸リチウム緩衝液；分子量  約９００ｋＤａを有しかつ上記組成物中、約１％の濃度のポリエチレンオキシド；上記組成物中、約２０％の濃度のエチレングリコール；分子量  約１０ｋＤａを有しかつ上記組成物中、約３％の濃度の線状ポリアクリルアミドを含み得る。
【００２０】
特定の実施形態においては、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
グリカンを精製する方法であって、前記方法は、
１種もしくはより多くの複合糖質を含むサンプルと、脱グリコシル化試薬とを反応させて、グリカンを前記複合糖質から放出させる工程；
放出された前記グリカンを複数の磁性粒子と会合させる工程；
磁場を印加して、放出された前記グリカンと会合させた複数の前記磁性粒子を引き下ろす工程；
引き下ろされた前記磁性粒子から上清を除去して、前記脱グリコシル化試薬および脱グリコシル化された前記サンプルを除去する工程；ならびに
前記グリカンを前記磁性粒子から溶離する工程
を包含する、方法。
（項目２）
前記磁性粒子は、カルボキシル被覆磁性ビーズである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記複合糖質は、糖タンパク質もしくは糖ペプチドもしくは抗体を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記複合糖質は、プロテオグリカン、スフィンゴ糖脂質、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン、糖脂質もしくはグリコサミノグリカン、融合糖タンパク質もしくは抗体−薬物結合体を含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記脱グリコシル化試薬は、脱グリコシル化酵素である、項目１に記載の方法。
（項目６）
ＣＥ、ＬＣ、ＭＳ、およびＮＭＲ、ならびにこれらの組み合わせのうちの１つによって溶離された前記グリカンを分析する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記脱グリコシル化試薬は、エンドグリコシダーゼを含み、必要に応じて、前記エンドグリコシダーゼは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆを含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
１種もしくはより多くの複合糖質を分析する方法であって、前記方法は、
１種もしくはより多くの複合糖質を含むサンプルと、脱グリコシル化試薬とを反応させて、グリカンを前記複合糖質から放出させる工程；
前記グリカンを複数の磁性粒子と会合させる工程；
磁場を印加して、前記グリカンと会合させた複数の前記磁性粒子を引き下ろす工程；
引き下ろされた前記磁性粒子から上清を除去して、前記脱グリコシル化試薬および脱グリコシル化された前記サンプルを除去する工程；
前記グリカンと標識試薬とを反応させて、標識されたグリカンを形成する工程；
標識された前記グリカンを分析する工程、
を包含する、方法。
（項目９）
前記磁性粒子は、カルボキシル被覆磁性ビーズである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記複合糖質は、糖タンパク質もしくは糖ペプチドを含み、必要に応じて、前記糖タンパク質もしくは前記糖ペプチドは、抗体である、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記グリカンは、アセトニトリルを添加することによって、複数の前記磁性粒子と会合させられる、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記グリカンと前記標識試薬とを反応させる前に、前記グリカンを前記磁性粒子から溶離する工程をさらに包含する、項目８に記載の方法。
（項目１３）
前記グリカンは、前記標識試薬および酸触媒を含む混合物を添加することによって、前記磁性ビーズから溶離され、必要に応じて、前記酸触媒は、酢酸である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記グリカンと前記標識試薬とを反応させて、標識されたグリカンを形成する工程は、還元剤を添加して、前記グリカンと前記標識試薬との反応を開始する工程を包含する、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
標識された前記グリカンを精製する工程をさらに包含する、項目８に記載の方法。
（項目１６）
標識された前記グリカンを複数の前記磁性粒子と会合させる工程；
磁場を印加して、標識された前記グリカンと会合させた複数の前記磁性粒子を引き下ろす工程；
標識された前記グリカンと会合させた、前記引き下ろされた複数の磁性粒子から上清を除去して、過剰な標識試薬を除去する工程；ならびに
標識された前記グリカンを複数の前記磁性粒子から溶離する工程、
をさらに包含する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
標識された前記グリカンは、水性媒体を添加することによって、複数の前記磁性粒子から溶離され、必要に応じて、前記水性媒体は、水である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
標識された前記グリカンは、キャピラリー電気泳動、キャピラリー電気泳動と蛍光検出、液体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーと蛍光検出、ＭＳもしくはＮＭＲによって分析される、項目８に記載の方法。
（項目１９）
前記標識試薬は、ＡＰＴＳ、ＡＮＴＳ、２−ＡＢ、および２−ＡＡのうちの１種を含む、項目８に記載の方法。
（項目２０）
前記グリカンと標識試薬とを反応させる工程は、還元剤を添加する工程をさらに包含し、必要に応じて、前記還元剤は、ＮａＢＨ３ＣＮを含む、項目８に記載の方法。
（項目２１）
グリカンを精製するためのキットであって、前記キットは、
複数のカルボキシル被覆磁性粒子；
グリカンを複合糖質から放出するための脱グリコシル化試薬；および
前記グリカンを複数の前記カルボキシル被覆磁性粒子と会合させるための試薬、
を含む、キット。
（項目２２）
酢酸リチウム緩衝液、ポリエチレンオキシド、エチレングリコールおよび線状ポリアクリルアミドを含む、キャピラリー電気泳動を使用してグリカンを分離するための組成物。
（項目２３）
前記組成物中、ｐＨ  約４．７５において、２５〜３０ｍＭの間の濃度の酢酸リチウム緩衝液；
前記組成物中、約１％の濃度の、分子量  約９００ｋＤａを有するポリエチレンオキシド；
前記組成物中、約２０％の濃度のエチレングリコール；
前記組成物中、約３％の濃度の、分子量  約１０ｋＤａを有する線状ポリアクリルアミド、
を含む、項目２２に記載の組成物。
本出願人の教示のこれらおよび他の特徴は、本明細書で示される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
当業者は、図面（以下に説明される）が例証目的に過ぎないことを理解する。図面は、本出願人の教示の範囲を限定するとは如何様にも意図されない。
【００２２】
【図１】図１は、本出願人の教示の種々の局面に従うＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化の間のインキュベーション持続時間および温度の効果を図示する。
【００２３】
【図２】図２Ａ〜Ｂは、本出願人の教示の種々の局面に従う標識インキュベーション温度および時間の脱グリコシル化に対する効果を示す。
【００２４】
【図３】図３Ａ〜Ｃは、従来のサンプルクリーンアップ法と比較して、本教示の種々の局面に従う例示的な磁性ビーズベースのクリーンアッププロトコルを使用する、種々のグリカン構造の例示的ピーク面積分布を図示する。
【００２５】
【図４】図４は、本教示の種々の局面に従うＮ−グリコシル化分析の例示的磁性ビーズベースのサンプル調製ワークフローを模式的に示す。
【００２６】
【図５】図５は、本出願人の教示の種々の局面に従うＡＰＴＳ標識効率に対する温度およびインキュベーション時間の効果を示す。
【００２７】
【図６】図６は、本出願人の教示の種々の局面に従う種々のインキュベーション温度での標識効率に対するＡＰＴＳ濃度の効果を示す。
【００２８】
【図７】図７は、本出願人の教示の種々の局面に従って使用される磁性ビーズ懸濁物の量の関数として再現性を示す。
【００２９】
【図８】図８は、本教示の種々の局面に従うＮ−グリコシル化分析の例示的磁性ビーズベースのサンプル調製ワークフローを模式的に示す。
【００３０】
【図９】図９は、本教示の種々の局面に従う、自動化液体取り扱いデバイスを利用する複数のＡＰＴＳ標識されたＩｇＧグリカンのＣＥ−ＬＩＦ分析から得られた結果を示す。
【００３１】
【図１０】図１０は、本教示の種々の局面に従う個々のグリカンおよびグリカンの混合物のＣＥ−ＬＩＦ分析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（詳細な説明）
【００３３】
明確さのために、以下の考察は、本出願人の教示の実施形態の種々の局面を解説すると同時に、省くことが都合がよいかもしくは適切である場合には常に、ある種の具体的な詳細を省くことは認識される。例えば、代替の実施形態における同様なもしくは類似の特徴の考察は、幾分省略され得る。周知の観念もしくは概念はまた、簡潔さのために、少しも詳細に考察されなくてもよい。当業者は、本出願人の教示のいくつかの実施形態が、全ての実施においてある種の具体的に記載される詳細を要しないことがあり、それが実施形態の完全な理解を提供するために本明細書で示されるに過ぎないことを認識する。同様に、その記載される実施形態が本開示の範囲から逸脱することなく、技術常識に従って変更もしくはバリエーションが可能であり得ることは、明らかである。以下の実施形態の詳細な説明は、本出願人の教示の範囲を限定するとはいかなる様式においても見做されないものとする。
【００３４】
本教示の種々の局面によれば、本明細書で記載される方法、システム、およびキットは、完全自動化を可能にし得るおよび／または現在のプロトコルと比較してサンプル調製時間を短縮し得る、複合糖質もしくはグリカンの精製および／もしくは分析において使用され得る。いくつかの局面において、本明細書で記載される方法は、時間を浪費するサンプル調製工程（例えば、遠心分離もしくは真空−遠心分離）を要さずに、その後の分析のための複合糖質消化および／もしくはグリカン放出、蛍光標識、ならびにグリカン精製のうちの１種もしくはより多くを提供し得る。ハイスループットグリコシル化プロファイリングおよびシーケンシングを可能にする完全自動化は、例えば、バイオ医薬品産業の現代のニーズ（例えば、生物治療剤（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）の開発、生体マーカー探索）を満たすために、およびタンパク質治療剤の規制機関の効力／安全性評価において、極めて重要であり得、これらは、ハイスループットおよび非常に再現性の高いグリコシル化スクリーニング法を要し得る。このニーズにも拘わらず、グリコシル化分析のための現在使用されているサンプル調製プロトコルの大きな不利益のうちの１つは、容易な自動化を欠いていることであり、上記現在使用されているサンプル調製プロトコルは、現在は遠心分離能力を有する高品質の（高価な）ロボットシステムを要する。
【００３５】
種々の局面によれば、本明細書で記載される例示的な磁性ビーズベースのサンプル調製は、いかなる遠心分離および／もしくは真空遠心分離工程をも要さず、数時間で行われ得、従って、例えば、グリカン放出および標識の間のより短いインキュベーション時間、サンプル調製のための液体取り扱いロボットの使用、ならびに／またはマルチキャピラリー法を利用し得る、迅速で完全に自動化可能な分析を可能にする。以下で記載されるように、上記例示的方法は、このようにして、従来の遠心分離ベースのサンプル調製プロトコルと比較して、加工処理時間、効率、再現性、および自動化の容易さを改善し得る。
【００３６】
一実施形態において、例えば、例示的方法は、一般に、以下の５つの個々の工程を包含するが、より多くのもしくはより少ない工程を包含する方法が、本教示の範囲内にあることは認識される：１）複合糖質（ｇｌｕｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の脱グリコシル化；２）グリカン捕捉；３）グリカン標識；４）クリーンアップ；および５）グリカン分析（例えば、ＣＥ、ＬＣ、ＭＳ、ＮＭＲによる）。
【００３７】
グリカンもしくは複合糖質を含むかまたは含むと疑われる任意のサンプルは、血液、血漿、血清、尿もしくは唾液のサンプルを含め、本教示に従って使用され得ることはさらに認識される。さらに、上記サンプルは、遊離グリカン（例えば、予め脱グリコシル化されたサンプル）および／もしくは複合糖質を含み得る。
【００３８】
本教示に従って分析され得る例示的な複合糖質としては、糖タンパク質（例えば、フェチュイン、ＲＮａｓｅ  Ｂ、および抗体（例えば、ＩｇＧ））（全て非限定的な例として）が挙げられる。利用され得る他の例示的な複合糖質としては、プロテオグリカン、スフィンゴ糖脂質、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、ヒアルロナン、糖脂質、グリコサミノグリカン、融合糖タンパク質、および抗体−薬物結合体が挙げられる。上記複合糖質と会合される上記グリカンは、一般に、例えば、グリコシド結合を介して基礎の分子に共有結合されている１種もしくはより多くの糖単位（例えば、グルコース、フコース、マンノース、キシロース、シアル酸、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）およびオリゴサッカリド）を含む。当業者によって認識されるように、上記グリカンは、種々の炭水化物単位、種々の結合および位置を有する分枝状もしくは非分枝状の鎖、ならびに／または種々の長さのオリゴサッカリドを含み得、これらは、Ｎ結合型グリコシル化（例えば、グリカンが、タンパク質のアスパラギン（Ａｓｎ）残基のアミド窒素に結合されている）、Ｏ結合型グリコシル化（例えば、グリカンがＯ−ＧａｌＮＡｃもしくはＯ−ＧｌｃＮＡｃのように、タンパク質中のアミノ酸残基の酸素原子に結合されている）、Ｃ結合型グリコシル化（例えば、マンノースがアミノ酸配列中のトリプトファン残基に付加されている）、およびホスホ−セリングリコシル化（例えば、グリカンがホスホセリン中のホスフェートを介して結合している）（全て非限定的例による）を介して基礎の分子に付着され得る。
【００３９】
脱グリコシル化
いくつかの局面において、複合糖質もしくはこれと会合したグリカンを分析するための方法は、グリコシド結合を壊して、上記グリカンを上記複合糖質から除去する脱グリコシル化工程を包含し得る。当該分野で公知であり、本教示に従って改変される任意の脱グリコシル化試薬が利用され得ることは、認識される。非限定的例によれば、本教示に従う方法およびシステムは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（例えば、Ｎ結合型オリゴサッカリドを上記糖タンパク質から除去するため）、ＰＮＧａｓｅ  Ａ、他のエンドグリコシダーゼ（例えば、Ｏ−グリコシダーゼ、エンドグリコシダーゼＨおよびエンドグリコシダーゼＦ）、およびエキソグリコシダーゼ（例えば、ノイラミニダーゼ）、化学薬剤（例えば、ヒドラジン）ならびにこれらの混合物を利用し得る。
【００４０】
以下で詳細に考察されるように、ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、その安定性、特異性および単純なサンプル調製条件に起因して、３７℃で一晩のインキュベーションにおいてＮ−グリカンの酵素による脱グリコシル化に従来から使用されるが、本出願人は、高温（例えば、３７℃より高い、約５０℃）で脱グリコシル化を行うことによって、有意に短縮された脱グリコシル化時間を達成した。実際に、その放出されたグリカンの最大ピーク強度は、５０℃において１時間のインキュベーション時間後に起こることが見出されたのに対して、上記Ｎ−脱グリコシル化プロセスは、従来の３７℃では有意によりゆっくりと進んだ。
【００４１】
本教示に鑑みて、グリカンを分析するための方法はまた、脱グリコシル化もしくは消化工程が必要とされないように、予め脱グリコシル化されたサンプル（例えば、タンパク質もしくは他の生体ポリマーから既に解離したグリカンを含むサンプル）またはグリカンのみ（例えば、グリカン標準）を含むサンプルに対して行われ得ることは、認識されるものとする。
【００４２】
グリカン捕捉
上記グリカンのうちの少なくとも一部がそこから放出されるように上記複合糖質が消化された後、その放出されたグリカンは、例えば、脱グリコシル化試薬（例えば、酵素）および任意の解離されたポリペプチドから分離され得る。本教示の種々の局面によれば、例えば、磁性粒子の懸濁物は、上記グリカンが上記磁性ビーズと会合した状態になり得るように、上記サンプルと混合され得る。いくつかの局面において、上記磁性粒子の懸濁物は、アセトニトリルを含み得、これは、上記放出されたグリカンの捕捉を促進し得る。会合の後、磁場が、上記グリカンと会合させた上記磁性粒子を引きつける（例えば、引き下ろす、分離する）ために上記混合物に印加され得、その結果、その会合しなかった脱グリコシル化試薬（例えば、酵素）および残りのポリペプチドを含む上清は、例えば、上記上清を流すかもしくは吸引することによって、除去され得る。
【００４３】
本出願人は、驚くべきことに、ポリマー被覆磁性粒子（例えば、カルボキシル被覆磁性ビーズ）の上記カルボキシレート改変表面が、上記放出されたグリカンもしくは複合糖質の捕捉において特に有効であり得ることを発見した。磁性ビーズの表面から延びる負に荷電したカルボキシル基および負に荷電したグリカン（例えば、シアル化されている）は互いに反発してグリカン捕捉を妨げると一般には考えられていたが、本出願人は、上記カルボキシル被覆磁性ビーズが、荷電したおよび／もしくは荷電していないグリカンの分割を有効にかつ効率的にもたらし得ることを見出した。このような結果は、特に、大部分のグリカンが比較的低分子量である（すなわち、その結果、上記グリカンは、反発力をより受けやすいはずである）ことに鑑みれば、直感に反している。特定の理論によって拘束されないが、結合緩衝液（例えば、アセトニトリル）は、グリカン捕捉に都合のよい環境を形成するために上記カルボキシル化されたビーズの周りでクラウディング試薬（ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）として作用すると考えられる。本出願人の知見によれば、本教示に従うグリカンの分離への磁性ビーズ技術の適用は行われて来なかったが、本教示に従う使用のためのこのようなカルボキシル被覆磁性ビーズの商業的な例は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．（Ｂｒｅａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｃｌｅａｎｓｅｑ磁性ビーズを含む。
【００４４】
グリカン標識
いくつかの糖分析法は、上記グリカンがさらなる分析および／もしくは検出を可能にするために標識されることを要する。例示によれば、ＣＥ−ＬＩＦを使用する上記グリカンの分析は、上記糖に適切な電荷およびＵＶ活性もしくは蛍光特性を提供するために、上記糖の化学的誘導体化を利用し得る。よって、いくつかの局面において、グリカン標識工程が行われ得る。いくつかの局面において、上記グリカンは、還元的アミノ化ベースの反応を介して、例えば、１−アミノピレン−３，６，８−トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）、８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）、２−アントラニル酸（２−ＡＡ）、２−アミノ安息香酸（２−ＡＢ）のうちの１種を使用して、１種もしくはより多くの還元剤、触媒、および色素の量を使用して（全て非限定的例による）、標識され得る。上記標識試薬との反応を開始するための例示的な還元剤としては、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）および２−ピコリン−ボラン（ｐｉｃ−ＢＨ３）もしくは他の還元剤が挙げられる。いくつかの局面において、上記還元剤もしくはその使用は、シアル酸喪失を低減するために最適化され得る。種々の色素濃度が標識効率を増大させるために使用され得るが、より効率的なクリーンアップ工程が同様に、過剰な色素除去を確実にするために必要とされ得ることもまた、認識される。
【００４５】
本出願人は、上記グリカンが上記磁性粒子と会合される間に、または例えば、上記磁性粒子から解離された（例えば、溶離された）後に、上記グリカンとの標識反応が起こり得ることを見出した。例えば、いくつかの局面において、上記標識試薬は、上記磁性粒子に酢酸（これは、上記グリカンを、これらの上記磁性粒子との会合から溶離するために有効であり得る）とともに添加され得る。溶離の後、上記還元剤は、次いで、上記標識試薬（例えば、色素）と上記グリカンとの反応を開始するために添加され得る。
【００４６】
クリーンアップおよびグリカン分析
いくつかの局面において、上記グリカンが標識された後、過剰な標識試薬（例えば、非結合体化ＡＰＴＳ）が、１回もしくはより多くのクリーンアップ工程を介して除去され得る。上記で考察されるように、例えば、遊離の標識されたグリカンは、アセトニトリルの添加を介して、上記磁性ビーズと会合させられ得る。上記会合の後、磁場は、上記過剰な標識試薬を含む上清が、例えば、上記上清を流すかもしくは吸引することによって除去され得るように、上記標識されたグリカンと会合させた上記磁性粒子を引きつけるために、上記混合物に印加され得る。いくつかの局面において、アセトニトリルは、上記磁性ビーズおよびこれと会合させた標識されたグリカンを洗浄するために、１回もしくはより多く添加され得る。
【００４７】
上記過剰な標識試薬が除去されると、上記標識されたグリカンは、上記磁性ビーズから（例えば、溶離液（例えば、水）を添加することによって）放出され得る。上記グリカンを会合させ、そして上記磁性粒子から放出するための試薬の種々の容積が、上記標識されたグリカンを完全に精製するために利用され得るが、精製およびサンプル喪失の程度が逆に関連し得、その結果、適切な精製を得るために必要な溶離液の量が、あり得るサンプル喪失を最小限にするために最適化され得ることは、認識される。
【００４８】
上記溶離液を添加して、上記標識されたグリカンを上記磁性粒子から放出した後に、磁場は、上記遊離の標識されたグリカンを含む溶離物から、上記磁性粒子を分離するために再び印加され得る。上記溶離物（例えば、上記引き下ろされた磁性粒子に対する上清）は、次いで、例えば、ＣＥ−ＬＩＦ、ＬＣ、ＭＳ、およびＮＭＲのうちの１種によるさらなる分析のために取り出され得る。
【００４９】
キャピラリー電気泳動ベースの分析（例えば、ＣＥ−ＬＩＦ）を使用して分析する場合、上記グリカンのＣＥでの分離は、上記グリカンの分離に適したゲル組成物を使用して行われ得る。適切なゲル組成物は、例えば、約１０ｍＭ〜５０ｍＭの濃度の酢酸リチウム緩衝液の使用を包含し得、ここで上記緩衝液は、約４〜５．５の間のｐＨにある。上記組成物は、約１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａの間のＭｖにおいて、約０．５％〜５％の間の濃度のポリエチレンオキシドをさらに含む。上記組成物はまた、約６０％未満の濃度のエチレングリコールを含み得る。上記組成物はまた、分子量  約１０ｋＤａを有しかつ０．５％〜５％の間の濃度の線状ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）を含み得る。
【００５０】
好ましくは、上記組成物は、ｐＨ  約４．７５において、２５〜３０ｍＭの間の濃度を有する酢酸リチウム緩衝液、１％の濃度のポリエチレンオキシド（Ｍｖ  約９００ｋＤａ）、約２０％の濃度のエチレングリコールおよび約３％の濃度の線状ポリアクリルアミド（ＭＷ  約１０ｋＤａ）を含み得る。上記組成物中の特に好ましい酢酸リチウム濃度は、約３０ｍＭである。
【実施例】
【００５１】
上記の教示は、ここで、以下の実施例を使用して示され、本教示を示すために（しかし限定するためではない）提供される。以下で記載されるように、ＣＥ−ＬＩＦベースのＮ−グリコシル化分析のための例示的な迅速かつハイスループットの磁性ビーズベースのサンプル調製ワークフローが提供され、ここで全ての調製工程は、単純な液体取り扱いロボットを使用して容易に自動化され得る。以下で記載される例示的なワークフローにおいて、遠心分離工程および一晩のインキュベーション（これらは、別の方法では、従来のグリカン調製法の一部である）が回避されることが注意される。
【００５２】
上記例示的なサンプル調製プロトコルを、複合型、シアル化型、および高マンノース型のグリコシル化を有する代表的な糖タンパク質標準を使用して示した。以下で考察されるように、全ての個々の調製工程（例えば、グリカン放出、蛍光標識およびＡＰＴＳクリーンアップ）を、上記磁性ビーズベースの方法のための加工処理時間および効率を低減するように最適化した。本教示に従って最適な結果を得るために、例えば、以下で記載される容積、濃度、および時間に対して調節が行われ得ることは、当業者によって認識されるものとする。
【００５３】
（化学物質）
水およびアセトニトリルは、Ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖ  ＨＰＬＣグレードであった。ＩｇＧ、フェチュイン、ＲＮａｓｅ  Ｂ、ヒト血清、酢酸、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）、２−ピコリン−ボラン（ｐｉｃ−ＢＨ３）を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から得た。１−アミノピレン−３，６，８−トリスルホネート（ＡＰＴＳ）、炭水化物分離ゲル（ＮＣＨＯ）、マルトオリゴサッカリドラダー、およびＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｃｌｅａｎｓｅｑ磁性ビーズは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．（Ｂｒｅａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）製であった。脱グリコシル化キット（１０μＬ  糖タンパク質溶液、１μＬ  １０×変性緩衝液、８μＬ  水、２．５μＬ  １０×Ｇ７緩衝液、２．５μＬ  １０％  ＮＰ４０、１μＬ  ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  （Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ）から購入した。
【００５４】
（キャピラリー電気泳動）
ＡＰＴＳ標識されたＮ−グリカンのキャピラリー電気泳動プロファイリングを、固体レーザー誘起蛍光検出器（励起４８８ｎｍ、放射５２０ｎｍ）を備えたＰＡ８００＋自動化ＣＥ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｓｃｉｅｘを通じて販売））において行った。全ての分離を、Ｎ−ＣＨＯ炭水化物分離ゲル緩衝液を充填した５０ｃｍ有効長（計６０ｃｍ）の中性被覆（ｎｅｕｔｒａｌ  ｃｏａｔｅｄ）された５０μｍ内径キャピラリーカラム（ともにＳｃｉｅｘから）で達成した。その印加された電場強度は、カソードは注入側に、アノードは検出側にして（逆極性）、５００Ｖ／ｃｍであった。サンプルを、１ｐｓｉ（６．８９ｋＰａ）の圧力によって５秒間で注入した。移動時間補正および定量目的のために、ＡＰＴＳ標識されたマルトース（Ｇ２）を、内部標準として各サンプルと一緒に注入した。Ｋａｒａｔ  ３２バージョン９．１ソフトウェアパッケージ（Ｓｃｉｅｘ）を、データ獲得および分析のために使用した。
【００５５】
（実施例１：グリカン放出のためのインキュベーション時間の最適化）
液体取り扱いロボットに好都合な開放系の９６ウェルプレート形式を利用して、複合糖質の脱グリコシル化に対する温度の効果を分析した。６０℃より高い温度でのエバポレーションは、タンパク質沈殿もしくは緩衝液エバポレーションを（特に、小容積（例えば、１０〜５０μＬ）では）引き起こし得たので、消化効率を、ＩｇＧおよびフェチュイン糖タンパク質標準の脱グリコシル化に関して、５０℃および３７℃において０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間および１６時間のインキュベーションを使用して比較した。各消化反応時点混合物は、７．７ｍＵ  ＰＮＧａｓｅ  Ｆを含み、製造業者のプロトコルに従って調製した。各消化ストラテジーで３つの放出を行い、各放出で３回の反復を行って、消化時間および温度につき、９つのデータ点を生成した。上記放出されたグリカンを、ＡＰＴＳ標識し、ＣＥ−ＬＩＦによって分析した。
【００５６】
上記２つのインキュベーションストラテジーの間でピーク分布に有意差は認められなかった（ピーク面積パーセンテージによって測定される場合）が、そのＲＦＵ値は、上記放出されたグリカンの量の変化を示した。ここで図１を参照すると、３７℃でのピーク強度は、５０℃と比較して有意によりゆっくりと増大し、ここでは約１時間のインキュベーション時間後に最大レベルに達した。一晩の消化と比較した面積パーセンテージの類似性は、放出される糖の量に大きな差異はあっても、同じグリコシル化パターンがより短いインキュベーションを使用して放出され得る（消化の偏りなし）ことを示唆する。温度が高いほどグリカン放出は上記反応を促進したので、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化を以下の工程において５０℃で１時間にわたって行った。
【００５７】
（ＡＰＴＳ標識最適化）
単純な液体取り扱いロボットおよび磁性ビーズベースの自動化に適応させながらも、一方でピーク強度および面積分布に関して従来の遠心分離ベースの方法の標識効率を達成するように標識の条件を、分析した。本教示の種々の局面によれば、一晩のインキュベーションおよび真空−遠心分離ベースのサンプル濃縮なしで、高い標識効率を達成した。
【００５８】
まず、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ２Ｇ２Ｓ１、ＦＡ２Ｇ２Ｓ２およびＦＡ２Ｇ２Ｓ１のモノシアログリカン標準およびビシアログリカン標準を、１５％  酢酸中の２０ｍＭ  ＡＰＴＳで、２時間にわたって、３７℃、５０℃、６５℃、および８０℃において、二連で標識した。これらグリカンの非シアル化相当物（Ａ２Ｇ２およびＦＡ２Ｇ２）もまた標識し、より高温での反応混合物に加える（ｓｐｉｋｉｎｇ）ために使用して、あり得る温度誘起性脱シアル化を同定した。図２Ａに示されるように、反応温度の上昇は、全てのシアル化グリカン標準に関する脱シアル化プロセスを有意に高めた。ビシアル化（ｂｉ−ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）標準は、より高いシアル酸喪失を示した。平均して、２％  シアル酸喪失を、５０℃において、１１％を６５℃において、および３３％を８０℃において認めた。このことは、シアル化構造がサンプルで予測される場合に、注意深く選択した誘導体化温度がグリカン標識の間に重要であり得ることを示唆する。
【００５９】
インキュベーション時間の効果もまた、３７℃で試験したところ、図２Ｂに示されるように、一晩のインキュベーションと２時間のインキュベーションとの間にいくらかの差異が認められた。上記一晩のインキュベーションで、上記モノシアル化構造は、３％  酸喪失を示し、上記ビシアル化構造は、６％  シアル酸喪失を示した。
【００６０】
合わせると、これら結果は、標識温度およびインキュベーション時間が、還元的アミノ化において重要であり得ることを示す。例えば、ＡＰＴＳ標識のためのインキュベーション時間が短いほど、シグナル強度が低下し得るが、図２Ｂは、一晩の標識がまた、シアル酸喪失を生じ得ることを示す。上記の知見に基づいて、この例示的プロセスの残りは、３７℃で２時間の標識インキュベーション時間を利用した。
【００６１】
上記のより短いインキュベーションのより低いシグナル強度を補償するために、還元的アミノ化反応に対する触媒濃度（酢酸）およびＡＰＴＳ濃度の効果を、表１（以下）に示されるように分析した。１５％、２０％および２５％の酢酸中の２０ｍＭ  ＡＰＴＳを使用して、モノシアル化およびビシアル化グリカン標準（Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ２Ｇ２Ｓ１、ＦＡ２Ｇ２Ｓ２およびＦＡ２Ｇ２Ｓ１）を、いかなるシアル化喪失をも回避しようとしながら標識した。ピーク面積パーセンテージの調査は、検出可能なシアル酸喪失がない一方で、表１（セクションＡ）に示されるように、増大した（２０％）酢酸濃度で有意により高いピーク強度が得られることを示した。
【００６２】
種々のＡＰＴＳ濃度の効果は、図２および表１（セクションＡ）の結果と組み合わせて、表１（セクション２）に示される。マルトオリゴサッカリドラダーを、２０％  酢酸中の２０ｍＭ、４０ｍＭおよび８０ｍＭのＡＰＴＳを使用して、３７℃で２時間にわたって三連で標識した。表１（セクションＢ）に示されるように、上記ＡＰＴＳ濃度を増大させると、標識効率が増大した。しかし、以下で記載される例示的な磁性ビーズベースの方法は、標識試薬を少なくとも２０μＬ利用したので、より高い標識効率が８０ｍＭ  ＡＰＴＳによって示されたにも拘わらず、４０ｍＭ  ＡＰＴＳのより大きな容積を利用した。
【００６３】
より高い色素濃度および触媒濃度を利用して、１００μｇ  ＩｇＧ、フェチュイン、およびＲＮａｓｅ  Ｂ糖タンパク質標準から放出されたグリカンを、２０％  酢酸中の４０ｍＭ  ＡＰＴＳを使用して、３７℃で２時間にわたって二連で標識し、２時間および一晩の元の標識ストラテジー（２０ｍＭ  ＡＰＴＳ、１５％  酢酸、図２Ｂ）と比較した。表１（セクションＣ）に示されるように、より高い色素濃度および触媒濃度の組み合わせは、いかなるシアル酸喪失もない元の２時間の標識と比較して、約２０％高い標識効率を生じたが、一晩の標識の効率より低かった（ここでは、シアル酸喪失が検出された）。まとめると、これら結果は、２０％  酢酸中の４０ｍＭ  ＡＰＴＳでの３７℃において２時間の標識が、標識効率を有効に増大させ得ると同時に、より少ないシアル酸喪失を生じ得ることを示した。
【表１】
0006764347.tif 000002
【００６４】
（磁性ビーズベースのサンプル調製）
上記で注意されるように、上記例示的プロトコルは、自動化に適応させながら、自動化を困難にする遠心分離工程を回避するために、サンプル調製に磁性ビーズを利用する。
【００６５】
この例示的プロトコルにおいて、カルボキシル被覆磁性ビーズを、上記複合糖質からのそれらの放出の後に（すなわち、グリカン放出後の精製）およびフルオロフォア標識した場合に（すなわち、ＡＰＴＳ標識後の精製）、複合型炭水化物を捕捉するために使用した。
【００６６】
上記ＡＰＴＳ反応混合物をきれいにする（すなわち、過剰な、結合体化されていないＡＰＴＳを除去する）ために、適切な精製を得ながらいかなるあり得るサンプル喪失をも最小限にするために必要な磁性ビーズ懸濁物の最小量を決定しようと試みた。ＡＰＴＳ標識されたｈＩｇＧ（複合型）、フェチュイン（高シアル化）およびＲＮａｓｅ  Ｂ（高マンノース型）のグリカンを、２００μＬ  磁性ビーズ懸濁物を使用して三連で精製した。結合および洗浄工程を、１５０μＬ  ８７．５％  アセトニトリルを使用することによって達成した一方で、その溶離工程を、２５μＬの水を使用して達成した。磁性ビーズ懸濁物および結合／溶離溶液が１５０μＬより多かったので、自動ピペッターによって容易に扱われ、同様に、標準的なピペットチップもしくはシリンジを使用する単純な液体取り扱いロボットが適応できた。上記溶離物を、いかなるさらなる加工処理もなしでＣＥ−ＬＩＦによって直接分析した。第２のおよび第３の溶離画分もまた分析して、上記第１の溶離の効率を評価した。上記クリーンアップ混合物を適切に懸濁し、２５μＬ  水を溶離のために使用する場合、上記ビーズ上に検出可能なサンプルは全く残っていないことを見出した（すなわち、上記第２および第３の溶離は、陰性の結果を与えた）。他方で、わずか１５μＬの水を上記第１の溶離において使用した場合、微量の残存するＡＰＴＳ標識されたグリカンが、その後の溶離において検出された。
【００６７】
重要なことには、文献中で報告された従来のサンプルクリーンアップ法と比較すると、この磁性ビーズベースのクリーンアッププロトコルを使用すると、ピーク面積分布には全く差異が認められなかった。このことは、上記ビーズに対して、上記種々のグリカン構造（中性、シアル化、高マンノース）に関して明らかな偏りはないことを示唆する。その一方で、上記遊離ＡＰＴＳの大部分が、図３Ａ〜Ｃに示されるように、上記クリーンアップの間に除去された。
【００６８】
類似のアプローチを利用して、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化後に放出されたグリカンを捕捉した。８７．５％  アセトニトリル溶液中の磁性ビーズを、その放出されたグリカンを結合させるために、インキュベーション工程後にＰＮＧａｓｅ  Ｆ反応混合物に添加した。しかし、この場合、上記遊離グリカンを、水性のＡＰＴＳ溶液（２０％  酢酸中４０ｍＭ）によって溶離し、続いて、還元剤（例えば、ＭｅＣＮ中の１Ｍ  ｐｉｃ−ＢＨ３、もしくはＴＨＦ中のＮａＢ３ＣＮ）を添加して、いかなる中間工程もなしに、上記標識反応を直ぐに開始した。繰り返すと、このアプローチは、非常に有効であると同時に、いかなる真空遠心分離ベースのサンプル予備濃縮も、上記消化反応混合物中の残存するポリペプチド鎖およびＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素を除去するいかなる他の精製工程も要しなかった。
【００６９】
（磁性ビーズベースのサンプル調製プロトコル）
上記の最適化に従って、そして図４に模式的に示されるように、以下の例示的な磁性ビーズベースのグリカンサンプル調製プロトコルを行った。
【００７０】
ここで図４を参照すると、上記例示的な磁性ビーズベースのグリカンサンプル調製プロトコルは、５０℃で１時間のＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化（工程Ａ）で開始した。次いで、工程Ｂに示されるように、上記例示的な方法は、８７．５％  最終アセトニトリル濃度において２００μＬ  磁性ビーズ懸濁物を使用して、残存するポリペプチド鎖および消化酵素からの、上記放出されたグリカンの磁性ビーズベースの分割を利用した。チューブを、次いで、磁石の上に置いた。その上清を除去した後、上記捕捉されたグリカンを、同じチューブの中で２１μＬの、２０％  酢酸中の４０ｍＭ  ＡＰＴＳを添加することによって上記ビーズから溶離し、還元的アミノ化反応を、７μＬ  還元剤（例えば、ＭｅＣＮ中の１Ｍ  ｐｉｃ−ＢＨ３もしくはＴＨＦ中のＮａＢ３ＣＮ）を添加して開始した（工程Ｃ）。３７℃での２時間のインキュベーション後、過剰な標識色素を、工程Ｂにおけるものと同じ磁性ビーズおよびアプローチを使用することによって工程Ｄにおいて除去した。上記上清を流した後、上記捕捉されたＡＰＴＳ標識グリカンを、２５μＬのＨＰＬＣ水を添加することによって上記ビーズから溶離し、磁石の上にチューブを置くことによって分割した（工程Ｅ）。上記溶離物／上清を取り出し、ＣＥ−ＬＩＦによって分析した（工程Ｆ）。
【００７１】
上記方法の信頼性および再現性を、上記例示的な磁性ビーズベースのプロトコルを利用して、６種のＩｇＧ、フェチュインおよびＲＮａｓｅ  Ｂサンプルを調製することによって示し、従来の一晩のインキュベーションおよび遠心分離ベースのプロトコル（Ｖａｒａｄｉ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｍｅ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｂｙ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．，  ２０１３．  ３４（１６）：  ｐ．  ２２８７−９４に記載されるものに類似）と比較した。３回の反復を使用したところ、各放出は、５４データセット／調製プラットフォームを生成した。全てのサンプルを、中性および僅かにシアル化（パネルＡ）、高マンノース（パネルＢ）ならびに高シアル化（パネルＣ）のグリカンの代表について分析した。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙペアワイズ比較を使用して、ピーク面積パーセンテージの差異を調査した。
【００７２】
表２は、より短いインキュベーションを使用したフェチュインのより高いシアル化レベルを除いて、上記プロトコル間の面積パーセンテージに有意差がなかったという点で、本教示の種々の局面に従う上記の最適化されたプロセスの効率を示す。完全な磁性ビーズベースのプロトコルを使用することによって、優れた再現性が認められた。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙペアワイズ比較を適用して、ピーク面積パーセンテージの差異を調査した。２８個のピークを積分して、有意（ｐ）レベルを、上記２つの方法の間で調べたところ、４個のピークのみが、有意差を示した（ｐ＜０．０５）。上記種々のピークのうちの全てが、高度にシアル化されたフェチュインのグリカンであり、標識最適化に関して以前の考察に類似して、上記一晩の方法は、還元的アミノ化の間により短いインキュベーション時間の重要性を示唆するより低いシアル化レベルを生じた。上記磁性ビーズベースのプロトコルによって生じたピーク１、２の有意により高い面積パーセンテージは、ピーク５、７のより低い値と相関する。このことは、高シアル化率（テトラシアル化およびトリシアル化）を有する種の脱シアル化が、低シアル化種（ビシアル化およびモノシアル化）の量を増大させたことを示唆する。
【表２】
0006764347.tif 000003
【００７３】
（実施例２：ＡＰＴＳ標識最適化）
単純な液体取り扱いロボットおよび磁性ビーズベースの自動化に適応させながらも、一方でピーク強度および面積分布に関して従来の遠心分離ベースの方法の標識効率を達成するための標識の条件を、分析した。本教示の種々の局面によれば、高い標識効率は、一晩のインキュベーションおよび真空−遠心分離ベースのサンプル濃縮なしで達成された。
【００７４】
ＡＰＴＳ標識のためのインキュベーション条件を、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間および１６時間のインキュベーション時間を使用して、３種のＩｇＧサンプル（１００μｇ／サンプル）および３種のフェチュインサンプル（１００μｇ／サンプル）から放出されたグリカンに関して、３７℃および５０℃において試験した。上記適用した標識条件は、以前に公開されたプロトコル、すなわち、２０ｍＭ  ＡＰＴＳを６μＬおよびＴＨＦ中の１Ｍ  ＮａＢＨ３ＣＮを２μＬと同じであった。上記のように、３種の複製物を、各放出で作製したところ、１つの標識条件あたり９つのデータ点を生成した。図５に示されるように、シアル化フェチュイングリカンのピーク面積の約２％減少が、５０℃で認められたが、消化最適化の間のように、ＲＦＵ値の増大もまた見出された。増大した強度が、５０℃での有意により高い強度とともに、より長いインキュベーション時間で検出された。この温度において、わずか４時間のインキュベーション時間が、上記３７℃での一晩の反応のものに類似のＲＦＵ値を与えた。
【００７５】
誘導体化時間をさらに短縮するために、２時間の反応において高いＲＦＵ値をなお得るために必要とされる最小限のＡＰＴＳ濃度を、決定した。マルトオリゴサッカリドラダーサンプルを、３７℃、５０℃、および６５℃において、２０ｍＭ、４０ｍＭおよび８０ｍＭのＡＰＴＳで標識し、続いて、ＣＥ−ＬＩＦを行った。ここで図６を参照すると、標識温度の効果は明らかに示される。なぜなら３７℃標識法が高いＡＰＴＳ濃度でわずかな増大を明らかにした一方で、５０℃および６５℃では、有意により高い値が検出されたからである。
【００７６】
これら結果は、標識温度が医薬品産業上重要な糖タンパク質（例えば、モノクローナル抗体）の分析において非常に重要であり得ることを示す。例えば、ＡＰＴＳ標識の間のより低いインキュベーション温度は、ＲＦＵ値を低下させ得るが、脱シアル化の低下が、シアル化グリカンを保護する一助となり得る。上記の知見に基づいて、この例示的プロセスの残りは、３７℃の標識インキュベーション温度を利用した。
【００７７】
（液体取り扱いロボットのための磁性ビーズベースのサンプル調製）
上記グリカンサンプル調製を容易な自動化に最適化するために、遠心分離工程（真空遠心分離を含む）を回避した。むしろ、本明細書で他の点で考察されるように、本出願人は、カルボキシル被覆磁性ビーズが、上記放出されたグリカンおよび標識されたグリカンの両方を捕捉するにあたって有効であり得ることを発見した。上記例示的なＡＰＴＳクリーンアッププロトコルを最適化して、十分な磁性ビーズを提供すると同時にサンプル喪失を最小限にした。ＡＰＴＳ標識されたフェチュインおよびＩｇＧのグリカンを、５μＬ、１０μＬ、２０μＬ、４０μＬ、８０μＬ、１６０μＬ、および２００μＬの磁性ビーズを使用して、三連で精製した。磁性ビーズベースのサンプル調製の容易な取り扱いの他に、磁性ビーズの使用の他の利点のうちの１つは、小容積（例えば、２０μＬ）でのそれらの適用可能性である。結合工程および洗浄工程を、１５０μＬ  ８７．５％  アセトニトリルで行ったが、溶離工程は、２５μＬの水しか利用しなかった。次いで、これを、ＣＥ−ＬＩＦによって直接分析した。第２および第３の溶離画分をまた評価して、上記第１の溶離の効率を決定した。上記第１の溶離を２５μＬで行って、適切に懸濁した場合、上記ビーズ上にサンプルは全く残らない、すなわち、上記第２および第３の溶離は、陰性であることが決定された。しかし、上記第１の溶離をわずか１５μＬで行った場合には、いくらか残っているサンプルが検出された。
【００７８】
磁性ビーズベースのクリーンアッププロトコルを使用すると、ピーク面積分布に差異は全く見出されず、上記ビーズに対して上記種々のグリカンに関する特定の偏りはないことが判明した。しかし、図７に示されるように、磁性ビーズの量に基づいて、上記クリーンアップしたサンプルの再現性には、有意差が認められた。ＲＦＵ値のＲＳＤ％を、三連の磁性ビーズベースのクリーンアップ工程から計算したところ、２００μＬの磁性ビーズの使用で最高の再現性が明らかになった。
【００７９】
同じ磁性ビーズベースのアプローチを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化工程後のグリカン捕捉のために同様に使用した。１時間のＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化工程後に、１１３μＬ  アセトニトリルを、上記反応混合物に添加した（最終濃度８７．５％）。８７．５％  アセトニトリルでの１回の洗浄工程後に、上記グリカンを、２１μＬの、２０％  酢酸水性溶液中４０ｍＭ  ＡＰＴＳによって溶離した。還元剤の添加は、遠心分離ベースのサンプル濃縮の必要性なしに、上記標識反応を開始した。
【００８０】
（磁性ビーズベースのサンプル調製プロトコル）
図８に模式的に示されるように、以下の例示的な磁性ビーズベースのグリカンサンプル調製プロトコルを行った。上記例示的な磁性ビーズベースのグリカンサンプル調製プロトコルは、５０℃で１時間のＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化で始まり、その放出されたグリカンを、上記放出されたグリカンを上記磁性ビーズと会合させるために、アセトニトリルを上記反応混合物に添加する（最終濃度８７．５％）ことによって捕捉した。上記ビーズを、磁石によって引き下ろし、上清を除去した。上記グリカンを、２１μＬの、２０％  酢酸水性溶液中の４０ｍＭ  ＡＰＴＳによって溶離した。上記ＡＰＴＳ標識反応を、７μＬの還元剤（ＴＨＦ中１Ｍ  ＮａＢＨ３ＣＮ）を添加することで開始し、３７℃で２時間インキュベートした。１５０μＬ  アセトニトリル（最終濃度８７．５％）を再び添加して、上記磁性ビーズで上記標識されたグリカンを捕捉した。その上清を除去し、上記ビーズおよびグリカンを、アセトニトリル（１５０μＬ、最終濃度８７．５％）で２回洗浄した。次いで、２５μＬのＨＰＬＣ水を添加して、上記標識されたグリカンを溶離し、上記標識されたグリカンを含む溶離物を、ＣＥ−ＬＩＦに供した。
【００８１】
上記のデータは、一晩の遠心分離ベースの消化／標識を利用する従来のグリカンサンプル調製プロトコルと比較した場合、本教示に従うプロセスが、約４時間で匹敵する結果を提供し得ることを示す。さらに、従来の方法におけるような、いかなる遠心分離および／もしくは真空遠心分離工程の必要性もなしに、完全自動化が、ハイスループットサンプル加工処理のために、例えば、９６ウェルプレートにおいて優れた収率および高い再現性とともに、単純な液体取り扱いロボットで可能にされ得る。
【００８２】
（自動化された磁性ビーズベースのサンプル調製）
上記教示内のサンプル調製法を、ハイスループットサンプル加工処理システムにおいて、エンドグリコシダーゼ消化、迅速なフルオロフォア標識およびクリーンアップを含む完全自動化プロトコルにおいて利用した。液体取り扱いロボット（Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸｐ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ，  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｂｒｅａ，  ＣＡ）を、キャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光（ＣＥ−ＬＩＦ）デバイス（ＰＡ  ８００  ｐｌｕｓ，  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｓｃｉｅｘ，  Ｂｒｅａ，  ＣＡを通じて販売））と一緒に利用した。
【００８３】
自動化ワークステーションを、９６ウェルプレートホルダー、磁石スタンド、１０００μＬおよび２５μＬのピペットチップ、４区分レザバ（ｑｕａｒｔｅｒ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）、サンプルおよび試薬バイアルとともに構成した。上記４区分レザバは、アセトニトリル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  ＭＯ）およびＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＣｌｅａｎＳｅｑ磁性ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｂｒｅａ，  ＣＡ）を含んだ。上記試薬バイアルは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化のための試薬（Ｐｒｏｚｙｍｅ，  ＣＡ）、２０％  酢酸中の８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホネート（ＡＴＰＳ）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｓｃｉｅｘ，  Ｂｒｅａ，  ＣＡを通じて販売））および１Ｍ  シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＴＨＦ中）を含んだ。エバポレーション誘起性容積喪失を低減するために、ピペットボックスのふたを使用して、上記４区分レザバを覆った。上記糖タンパク質サンプルを、Ｂｉｏｍｅｋボルテックスヒーターブロックでインキュベートした。よりよい再懸濁のために、余分なプレートを、上記サンプルプレートの下にあてがい、その場合、磁石を、側面に向けるのではなく上記サンプルプレートの下に配置した。このようにして、磁石は、上記磁性ビーズを上記バイアルの底へとプルダウンすることができ、迅速な吸引／分与とともに、上記ビーズは、容易に再懸濁可能であった。
【００８４】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆを使用する酵素による消化を、５０℃で１時間にわたって行い、続いて、８７．５％  アセトニトリル媒体中で上記磁性ビーズ上でのグリカン捕捉を行った。その結合した炭水化物のＡＰＴＳ標識を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加することによって、上記ビーズ上で、インサイチュで開始し、３７℃で２時間インキュベートした。上記酵素による消化の後、上記グリカンを、１００％  アセトニトリルを添加してアセトニトリルに関して８７．５％濃度を生じるようにすることによって、再捕捉する。上記ＡＰＴＳ標識反応を、２１μｌの、２０％  酢酸中４０ｍＭ  ＡＰＴＳおよび７μｌの、ＴＨＦ中の１Ｍ  シアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加することによって、３７℃で２時間にわたって上記ビーズ上で、インサイチュで開始する。次に、上記標識されたグリカンを、１００％  アセトニトリルを添加して、最終濃度８７．５％に到達させることによって、再び上記ビーズ上に再捕捉する。次いで、上記ビーズを、高効率色素除去のために、８７．５％  アセトニトリル媒体で反復して洗浄する。上記フルオロフォア標識されたグリカンを、２５μＬの水を添加することによって上記ビーズから溶離し、ＣＥ−ＬＩＦ（４８８ｎｍ励起、５２０ｎｍ放射）の準備をした。分離のために、１％  ポリエチレンオキシド（Ｍｖ  約９００，０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む２５ｍＭ  酢酸リチウム（ｐＨ  ４．７５）バックグラウンド電解質とともに、２０ｃｍ有効長のＮＣＨＯキャピラリー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｓｃｉｅｘを通じて販売））を使用した（計３０ｃｍ長、５０μｍ内径）。印加された電圧は、３０ｋＶであり、分離温度は、２０℃であった。上記サンプルを、３ｐｓｉによって６秒間加圧注入した。この組成は、短期間でのグリカンの迅速な分離を可能にすることが見出された。液体取り扱いプロトコル全体を、Ｂｉｏｍｅｋソフトウェアバージョン４．０を使用してプログラム化した。ＣＥ−ＬＩＦデータを獲得し、Ｋａｒａｔ  ３２ソフトウェアパッケージ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｓｃｉｅｘ，  Ｂｒｅａ，  ＣＡを通じて販売））によって分析した。
【００８５】
研究室自動化ワークステーションは、迅速なサンプル調製選択肢を提供し、天然の生物学的サンプルマトリクスに対するフロー誘起性剪断ひずみを低減し、汚染リスクを最小限にした。より高精度の液体取り扱いもしくは未知の供給源およびサンプルの量のために、伝導性ピペットチップが使用され得、これは、高精密液体取り扱いの能力がある。上記液体取り扱いシステムにおいて利用可能な台（ｄｅｃｋ）の空間量が大きいことに起因して、ＣＥ−ＬＩＦ分析のための緩衝液調製もまた、分離ふるい分けマトリクスの可溶化工程を含め、自動的に行った。
【００８６】
得られたフルオロフォア標識されたグリカンを、完全自動化調製プロセスのハイスループットに適応させるために、迅速分離のために最適化したＣＥ−ＬＩＦ分析に供した。液体取り扱いロボットから出てくる９６ウェルプレートから連続的に注入される上記ＡＰＴＳ標識されたＩｇＧグリカンの電気泳動図を、図９に示す。主要なＩｇＧグリカンのベースライン分離（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）を、３分未満で得た。この分離法は、数百ものサンプルの迅速分析が非常に重要である大規模プロセスのために（例えば、クローン選択において）容易に適用され得る。
【００８７】
上記自動化方法に関するより具体的な手順を、本明細書中で考察する。
【００８８】
２００μｌのＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｃｌｅａｎｓｅｑ磁性ビーズを、ビーズ再懸濁のための迅速な吸引および分与の後に、上記４区分レザバから上記サンプルプレートへと添加する。一般に、上記磁性粒子の添加は、上記プロセスの第２部の色素（標識）除去工程にあるが、上記ビーズを上記第１の工程において添加することは、サンプルのために上記プレートの９６全てのウェルを使用することを可能にする−サンプルおよびビーズ調製のために、別個のウェルを必要としない。この工程から上記色素（標識）クリーニング工程まで、上記ビーズを、磁石スタンドによって壁上に絶えず維持する。これを使用すると、ビーズ喪失の低減に起因して改善された結果がもたらされ得ることが見出された。
【００８９】
３０秒待機した後に、上清（貯蔵溶液）を除去する。上記液体の除去を、低い吸引速度で常にウェルの底から行う。この場合、最初の引き下ろしの間に磁石がプルダウンできなかった磁性ビーズは、上記液体面（ｌｉｑｕｉｄ  ｌｅｖｅｌ）が低下している間に捕らえられ得る。
【００９０】
ウェルあたり糖タンパク質サンプルの２０μＬを、サンプルラックもしくはレザバから上記サンプルプレートへと添加する（９６ウェルプレートに関しては、サンプルが合計約９６０μＬ）。このサンプル量の使用は、上記ビーズを液体で覆い、上記ビーズを乾燥から防止するために十分である。
【００９１】
１μＬの変性緩衝液（ＮＥＢ  １０×変性緩衝液）を、１サンプルあたり、試薬ラックから上記サンプルプレートに添加する（９６ウェルプレートに関しては、緩衝液が合計約９６μＬ）。各サンプルを、６５℃で１０分間、ボルテックスシェイカー上（１０００ｒｐｍ）でインキュベートする。
【００９２】
１０分間のインキュベーション工程と並行して、２．５μＬのＮＰ−４０（ＮＥＢ  １０％  ＮＰ−４０）、２．５μＬの反応緩衝液（ＮＥＢ  １０×Ｇ７反応緩衝液）、３μＬの水および１μＬのＰＮｇａｓｅ  Ｆ酵素（ＮＥＢ）を、１サンプルあたり、上記試薬プレートもしくはレザバ上で混合する（９６ウェルプレートに関しては、ＮＰ−４０および反応緩衝液が合計約２４０μＬ、ＰＮｇａｓｅ  Ｆ酵素が合計約９６μＬおよび水が約２８８μＬ）。これは、ここでは消化混合物である。上記インキュベーション工程と並行して酵素による消化のための試薬を混合すると、サンプル調製工程の間の時間の短縮が可能になる。その温度は、５０℃へとサーモスタットで下げられる。
【００９３】
１９μＬの消化混合物を、各ウェル（９６ウェルプレートに関しては、消化混合物が合計約１８２４μＬ）に添加する−総サンプル容積は、３０μＬである。この溶液の添加は、ボルテックス上で行われる−実験器具の動きは何ら必要ない。
【００９４】
サンプルを、ボルテックスシェイカー上（１０００ｒｐｍ）で、５０℃で６０分間インキュベートする。
【００９５】
１サンプルあたり２１０μＬの１００％  アセトニトリルを添加して、８７．５％  アセトニトリル最終濃度を得る（９６ウェルプレートに関しては、アセトニトリルが合計約２０．１６ｍＬ）。この溶液の添加を、ボルテックスユニット上で行って、上記ビーズが磁石に起因してウェルの壁に強く貼り付くのを防止する。上記添加の間に、種々のピペッティング技術が使用される。上記ピペットチップからこぼれるアセトニトリルに起因して、溶解の後でさらなる空気が吸引される。分与する場合、その空気は、上記サンプル面（ｓａｍｐｌｅ  ｌｅｖｅｌ）より上に送り出され、次いで、上記アセトニトリルは、チップをわきにどけている間に分与される。このピペッティング技術を使用することは、分離する層を作らずに水性サンプル中で上記有機溶液を混合するために十分である。
【００９６】
上記サンプルは、２０秒間、１６００ｒｐｍにおいて室温（２５℃）でボルテックスされる。
【００９７】
材料を、室温（２５℃）で２分間および４０秒インキュベートして、グリカン再捕捉を可能にする（合計のグリカン捕捉時間は、３分間である）。３分間のグリカン捕捉工程と並行して、７μＬの、ＴＨＦ中の１Ｍ  シアノ水素化ホウ素ナトリウムおよび２１μｌの２０ｍＭ  ＡＰＴＳを、試薬プレートもしくはレザバ上で混合する（９６ウェルプレートに関しては、１Ｍ  シアノ水素化ホウ素ナトリウムが合計約６７２μＬおよび２０ｍＭ  ＡＰＴＳが２．０１６ｍＬ）。これは、ここでは染色／標識溶液である。
【００９８】
上記サンプルプレートを、磁石スタンドに戻す。３０秒の小休止後、磁石で上記ビーズを捕捉している間に、その上清を除去する。上清の除去後、２８μＬの標識色素溶液を、１ウェルあたりに添加する（９６ウェルプレートに関しては、染色溶液が合計約２．６６８ｍＬ）。材料を、３７℃で２時間、ボルテックスシェイカー（１０００ｒｐｍ）上でインキュベートする。
【００９９】
１９６μＬの１００％  アセトニトリルを、１サンプルあたり、ボルテックスユニット上で添加して（９６ウェルプレートについては、アセトニトリルが約１８．８１６ｍＬ）、上記グリカンを上記ビーズに再結合させる。上記サンプルを、２０秒間、１６００ｒｐｍにおいて室温（２５℃）でボルテックスし、次いで、サンプルを、グリカン捕捉のために室温（２５℃）で２分間および４０秒間インキュベートする（合計のグリカン捕捉時間は、３分間である）。
【０１００】
上記サンプルプレートを、磁石スタンドに戻す。３０秒間小休止して、上記ビーズを磁石で捕捉した後、その上清を除去する。
【０１０１】
上記グリカン捕捉を、色素クリーニング工程におけるのと類似の原理を使用して、上記磁性ビーズを壁上に絶えず維持することによって行い得るが、効率は低い可能性がある。従って、上記ビーズの再懸濁は好ましい。有機媒体中では、アセトニトリルが使用される場合、上記ビーズは、上記ウェルの壁への強い誘引を示し、激しいボルテックス用いても、これらビーズを除去するのは困難である。また、上記ビーズは、８７．５％  アセトニトリルで反復して洗浄されるが、迅速なアセトニトリルエバポレーションに起因して、これは、時間と共に変化する濃度を生じる。
【０１０２】
良好な再懸濁物を得、濃度変化を回避するために、以下の手順が、３回反復して利用され得る。
ａ．２０μｌの水を添加。水性溶液において、上記ＣｌｅａｎＳｅｑビーズは、壁に結合する可能性が小さく、単純なボルテックス工程によって容易に再懸濁され得る。
ｂ．上記サンプルを、１０秒間、１６００ｒｐｍにおいて室温（２５℃）でボルテックス。
ｃ．１４０μｌの１００％  アセトニトリルを添加。この場合、１００％  アセトニトリルのみが上記プロトコルの間に使用されるので、それがエバポレートするとしても、濃度は同じままである。
ｄ．上記サンプルを、２０秒間、１６００ｒｐｍにおいて室温（２５℃）でボルテックス。
ｅ．グリカン再捕捉のために室温（２５℃）で２分間および４０秒間インキュベート（合計のグリカン捕捉時間は、２分間である）。
ｆ．上記サンプルプレートを、磁石スタンドに戻す。
ｇ．３０秒間の小休止後、磁石によって上記ビーズを捕捉している間に、その上清を除去する。
【０１０３】
上記サンプルを、２０μｌの水で、それを３０秒間、１６００ｒｐｍでボルテックスすることによって溶離し、次いで、上記サンプルプレートを、磁石スタンドに戻し、３０秒（ｓｏｕｎｄ）後、上記サンプルを、キャピラリー電気泳動を使用して分析する準備のできたユニバーサルバイアルに移す。
【０１０４】
個々のグリカン（ＦＡ２Ｇ２、Ａ２Ｇ２、ＦＡ２Ｇ１、Ａ２Ｇ１、ＦＡ２およびＡ２）および上記個々のグリカンの混合物の分析を、本教示内のＣＥ−ＬＩＦを使用して達成した。ＣＥを使用する分離を、ｐＨ４．７５において、３０ｍＭの濃度の酢酸リチウム緩衝液、１％の濃度のポリエチレンオキシド（Ｍｖ  約９００ｋＤａ）、約２０％の濃度のエチレングリコールおよび約３％の濃度の線状ポリアクリルアミド（ＭＷ  約１０ｋＤａ）を含むゲル組成物で行った。分析の結果を、図１０に示す。
【０１０５】
（参考文献）
本明細書で列挙される全ての参考文献は、それらの全体において参考として援用される。
【表３−１】
0006764347.tif 000004
【表３−２】
0006764347.tif 000005
【表３−３】
0006764347.tif 000006
【０１０６】
本明細書で使用される節の見出しは、構成目的に過ぎず、限定として解釈されないものとする。本出願人の教示は、種々の実施形態とともに記載される一方で、本出願人の教示がこのような実施形態に限定されるとは意図されない。対照的に、本出願人の教示は、当業者によって認識されるように、種々の変更、改変および均等物を包含する。
【図１】
0006764347.tif 000007
【図２】
0006764347.tif 000008
【図３】
0006764347.tif 000009
【図４】
0006764347.tif 000010
【図５】
0006764347.tif 000011
【図６】
0006764347.tif 000012
【図７】
0006764347.tif 000013
【図８】
0006764347.tif 000014
【図９】
0006764347.tif 000015
【図１０】
0006764347.tif 000016