(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の導入遺伝子と一方向で、第２の導入遺伝子と逆方向で、作動可能に連結された双方向性マウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）プロモーターを含んでなる、組換えアデノウイルス。
【請求項２】
前記プロモーターの３’および前記第１の導入遺伝子の５’に位置するイントロンと、前記プロモーターの３’および前記第２の導入遺伝子の５’に位置するイントロンとをさらに含んでなる、請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３】
前記アデノウイルスがＥ１領域に欠失を有する、請求項１または２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４】
前記第１および第２の導入遺伝子が異なり、それらの少なくとも１つが抗原をコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５】
前記アデノウイルスがヒトアデノウイルス血清型３５またはヒトアデノウイルス血清型２６である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６】
遺伝的に安定な組換えアデノウイルスを製造する方法であって、
前記アデノウイルスは、標的細胞に感染したときにそれぞれ強力に発現される第１および第２の導入遺伝子を含み、
前記方法は、
ａ）第１の導入遺伝子と一方向で、第２の導入遺伝子と逆方向で作動可能に連結された双方向性マウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）プロモーターを含むコンストラクトを調製するステップと；
ｂ）前記コンストラクトを前記組換えアデノウイルスのゲノム内へ組み込むステップと
を含む、方法。
【請求項７】
前記コンストラクトが、前記プロモーターの３’および前記第１の導入遺伝子の５’に位置するイントロンと、前記プロモーターの３’および前記第２の導入遺伝子の５’に位置するイントロンとをさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組換えアデノウイルスが、そのゲノムのＥ１領域に欠失を有する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１および第２の導入遺伝子が異なり、それらの少なくとも１つが抗原をコードする、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換えアデノウイルスが、ヒトアデノウイルス血清型３５またはヒトアデノウイルス血清型２６である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクターを細胞に提供するステップを含んでなる、細胞内で少なくとも２つの導入遺伝子を発現させる試験管内または生体外での方法。
【請求項１２】
少なくとも２つの抗原に対する免疫応答を誘導する方法で用いるための医薬組成物であって、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクターを含み、
前記方法は、前記組換えアデノウイルスベクターを対象に投与するステップを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスのゲノムを含んでなる、組換えＤＮＡ分子。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスと、薬学的に許容できる担体または賦形剤とを含んでなる医薬組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所の契約番号ＨＨＳＮ２７２２００８０００５６Ｃによる政府の支援により行われた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、ワクチン接種および遺伝子治療における用途のための医薬分野および遺伝子送達分野に関する。より特には、本発明は、２つの導入遺伝子の発現のための双方向性プロモーターを有する、組換えアデノウイルスおよび組換えアデノウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００３】
組換えヒトおよび動物アデノウイルは、遺伝子治療およびワクチン接種におけるそれらの用途のために、広範に使用されている。これらの用途では、アデノウイルスベクターは、宿主細胞内に導入される目的遺伝子または遺伝子群のためのキャリアとして使用される。例えば、アデノウイルスベクターは、所望の抗原をコードする遺伝子またはその一部を発現させて、免疫応答を惹起するために使用され得る。
【０００４】
第１世代アデノウイルスベクターは、典型的に１つの導入遺伝子のみを含んだ。これらの第１世代ベクターのための多数のストラテジーが、公開されている。公開されたストラテジーは、様々な異なるアデノウイルスベクターの使用を報告しており、導入遺伝子発現カセットが、例えば、Ｅ１領域、Ｅ３領域、またはＥ４と右ＩＴＲの間などのアデノウイルスの異なる領域に、配置され得ることを示している。
【０００５】
しかし、ワクチンの目的では、保護および広いカバー範囲を達成するために、２つ以上の抗原、または異なる株からの同じ抗原が必要であることが多い。したがって、場合によっては、１つのアデノウイルスベクターから少なくとも２つの抗原を発現させることが望ましい。１つのアデノウイルスベクター中に２つの抗原をコードするための様々なアプローチが、記載されている。
【０００６】
最初の２抗原アプローチでは、１つの抗原発現カセットがＥ１領域に配置され、第２の抗原発現カセットがＥ３領域に配置された（例えば、（Ｖｏｇｅｌｓら，２００７））。異なる２抗原アプローチでは、１つの抗原発現カセットがＥ１中に配置され、もう１つがＥ４と右ＩＴＲの間に配置された（例えば、（Ｈｏｌｍａｎら，２００７；Ｐｈａｍら，２００９；Ｓｃｈｅｐｐ−Ｂｅｒｇｌｉｎｄら，２００７））。さらに別の２抗原アプローチでは、組換えによる遺伝的不安定性を防止するために、２つの異なるプロモーター配列を使用して、２つの抗原発現カセットが頭−尾様式でＥ１領域に配置された（例えば、（Ｂｅｌｏｕｓｏｖａら，２００６；Ｈａｒｒｏら，２００９））。
【０００７】
例えば、レンチウイルスベクターなどの異なるウイルスベクターについて、様々なその他の２抗原アプローチが公開されている。例としては、２つのタンパク質に翻訳される単一転写物を生じさせるための、双方向性プロモーターの使用、またはプラス鎖ＲＮＡウイルス（例えば、ＥＭＣＶに由来する）の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の使用が挙げられる（例えば、（Ａｍｅｎｄｏｌａ，Ｖｅｎｎｅｒｉ，Ｂｉｆｆｉ，Ｖｉｇｎａ，＆  Ｎａｌｄｉｎｉ，２００５；Ｎａ  ＆  Ｆａｎ，２０１０））。その他の例としては、２つのタンパク質に切断されるポリタンパク質を生成するための、宿主細胞スプライシング機構の利用、または口蹄疫２Ａ配列などのプラス鎖ＲＮＡウイルスに由来する「切断」ペプチドまたはその他のウイルスに由来する同等物の使用が挙げられる。公開された報告によると、これらのストラテジーは全て等しく有用であり成功する。
【０００８】
２つの抗原が１つのアデノウイルスベクター中にコードされる場合、多価ベクターが製造可能であり、ワクチンの目的のために有用でもあるように、一価ベクターのいくつかの特徴が維持されるべきである。重要な特徴としては、規模拡大中の遺伝的安定性、大規模におけるベクターの生産性、双方の抗原の高レベル発現、および双方の抗原の免疫原性が挙げられる。しかし、公表されたストラテジーの大多数で、ベクターの遺伝的安定性およびその他の特徴は、系統的に分析されていない。
【０００９】
本明細書に記載されるのは、単一組換えアデノウイルスを用いて２つの抗原を発現するための先行技術に記載されるアプローチが、以下をもたらすことを示す実験結果である：ａ）組換えアデノウイルスの規模拡大過程における遺伝的安定性の低下（ヘルパー細胞株における連続継代により模倣され得る）；ｂ）組換えアデノウイルスの生産性の低下（ベクターを大きな精製バッチに規模拡大する可能性を低下させる）；ｃ）抗原の発現の減少；および／またはｄ）抗原の内の１つまたは複数の免疫原性の低下（マウスモデルにおける）。これらは、先行技術に記載されているような２つの抗原を発現するための組換えアデノウイルスの大規模使用を支持しない、明らかな不都合である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、遺伝的に安定しており、その中で双方の抗原の免疫原性が維持されるような様式で２つの抗原を発現する、組換えアデノウイルスを提供する必要性が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）ベクターおよびｒＡｄベクターを製造および使用する方法を提供する。ｒＡｄおよびｒＡｄベクターは、第１の導入遺伝子が一方向で双方向性マウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）プロモーターと作動可能に連結され、第２の導入遺伝子が別の方向で双方向性ｍＣＭＶプロモーターと作動可能に連結された、２つの導入遺伝子を含んでなる。本発明のｒＡｄは遺伝的に安定しており、継代１３（ｐ１３）に至るまでＰＣＲ分析によって欠失バンドが検出されず、したがって単一導入遺伝子のみを有するｒＡｄに匹敵する遺伝的安定性を提供する。さらに、どちらの導入遺伝子も、導入遺伝子発現のＦＡＣＳ分析、およびＴ細胞応答およびＢ細胞応答に関する発現抗原の免疫原性のＥＬＩＳＰＯＴおよびＥＬＩＳＡ分析に基づいて、強力に発現される。したがって、双方向性プロモーターを有する本発明のｒＡｄは、遺伝子治療およびワクチン用途で使用するのに適すると判定された。
【００１２】
一般的かつ好ましい実施形態が、添付の独立請求項および従属請求項によってそれぞれ定義され、簡潔さのために参照により本明細書に援用される。本発明の様々な態様のその他の好ましい実施形態、特徴、および利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、第１の導入遺伝子と一方向で、第２の導入遺伝子と逆方向で、作動可能に連結された双方向性マウスＣＭＶ（ｍＣＭＶ）プロモーターを含んでなる、組換えアデノウイルスを提供する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、第１の導入遺伝子と一方向で、第２の導入遺伝子と逆方向で、作動可能に連結された双方向性ｍＣＭＶプロモーターを含んでなる、コンストラクトを調製するステップと、前記コンストラクトを組換えアデノウイルスのゲノム内に組み込むステップとを含んでなる、第１および第２の導入遺伝子を含んでなる組換えアデノウイルスを製造する方法もまた提供する。
【００１５】
特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、プロモーターの３’および第１の導入遺伝子の５’に位置するイントロンと、プロモーターの３’および第２の導入遺伝子の５’に位置するイントロンとをさらに含んでなる。
【００１６】
特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ｅ１領域に欠失を有し、特定の実施形態では、このＥ１領域に双方向性ｍＣＭＶプロモーターおよび第１および第２の導入遺伝子および任意選択的にイントロンを含んでなる。
【００１７】
特定の実施形態では、第１および第２の導入遺伝子は異なり、それらの少なくとも１つは抗原をコードする。特定の実施形態では、どちらも異なる抗原をコードする。
【００１８】
特定の実施形態では、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型３５またはヒトアデノウイルス血清型２６である。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、本発明による組換えアデノウイルスベクターを有する細胞を提供するステップを含んでなる、細胞内で少なくとも２つの導入遺伝子を発現する方法もまた提供する。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、本発明による組換えアデノウイルスベクターを対象に投与するステップを含んでなる、少なくとも２つの抗原に対する免疫応答を誘導する方法もまた提供する。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、本発明による組換えアデノウイルスのゲノムを含んでなる、組換えＤＮＡ分子もまた提供する。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、本発明による組換えアデノウイルスおよび薬学的に許容できる担体または賦形剤を含んでなる医薬組成物もまた提供する。特定の実施形態では、医薬組成物はワクチンである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】単一導入遺伝子をコードする一価ｒＡｄの設計および試験。（Ａ）Ｅ１領域の単一遺伝子発現カセットとΨパッケージングシグナルとを有する、ｒＡｄの遺伝子設計の概略図。（Ｂ）ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）パッケージング細胞内で継代されたウイルスのＰＣＲ分析による、小規模遺伝的安定性試験の略図。継代ｐ１３は、工程の詳細次第で商業規模を３継代超える。（Ｃ）ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＥＢＯＶ、ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶ、ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ、およびｒＡｄ２６．Ｅ１．ＥＢＯＶの４つの異なるウイルスのＥ１同一性ＰＣＲ分析の結果が示される。番号１〜５は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内でｐ１３に継代された、５つの異なるプラーク（ウイルス集団）に由来するＤＮＡを表す。Ｐ＋は、ＰＣＲバンドの予想サイズを示す陽性プラスミド対照であり、Ｐ−は、抗原なしの発現カセットのサイズを示す陰性プラスミド対照である。Ｈ２ＯはＰＣＲの水対照であり、Ｍは分子量マーカーである。
【図２】二価Ｅ１−Ｅ３  ｒＡｄの設計および試験。（Ａ）左のＩＴＲの下流のＥ１領域に遺伝子１を有する発現カセットと、Ｅ３領域に遺伝子２を有する第二の発現カセットとを有する、ｒＡｄの遺伝子設計の模式図。（Ａ）に示されるように、ｒＡｄ３５ベクターは、Ｅ３領域で逆方向であった。（Ｂ）ｒＡｄ３５二価ベクターであるｒＡｄ３５．Ｅ１．ＥＢＯＶ−Ｅ３．ＳＥＢＯＶについて、継代５（ｐ５）、継代１０（ｐ１０）、および継代１５（ｐ１５）のＥ１およびＥ３導入遺伝子領域のＰＣＲ分析の結果が示される。番号１〜５は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内で継代された、５つの異なるプラーク（ウイルス集団）に由来するＤＮＡを表す。Ｐ＋は、ＰＣＲバンドの予想サイズを示す陽性プラスミド対照であり、Ｐ−は、抗原なしの発現カセットのサイズを示す陰性プラスミド対照である。Ｈ２ＯはＰＣＲの水対照であり、Ｍは分子量マーカーである。星印は、陽性対照と、異なる試験されたプラークとの双方に存在する、非特異的ＰＣＲバンドを示す。矢頭は、完全にまたは部分的に抗原または発現カセットを欠失させたウイルスゲノムから増幅されたＰＣＲ産物に相当する、欠失バンドを示す。
【図３】Ｅ１中にバイシストロニック発現カセットを有する、二価ｒＡｄの設計および試験。（Ａ）ｅＧＦＰおよびルシフェラーゼ、ルシフェラーゼおよびｅＧＦＰ、またはＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶをそれぞれ含んでなる、遺伝子１および遺伝子２をコードする、ｒＡｄ二価ベクターに対するＦ２Ａアプローチを用いた、バイシストロニックベクターの概略設計。双方の抗原、遺伝子１および遺伝子２は、１つのｍＲＮＡ上のＥ１領域でコードされ、発現はｈＣＭＶによって駆動される。Ｆ２Ａ（フューリン２Ａ）部分は、フューリン認識部位をコードし、ピコルナウイルス口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に由来する２Ａペプチドは、遺伝子１および遺伝子２によってコードされたタンパク質産物の分離をもたらす。Ｆ２Ａ部分のアミノ酸配列は、以前記載された通りである（（ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ，Ｌｕｋｅ，Ｂｒｏｗｎ，＆  Ｒｙａｎ，２０１０；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，２００１））（Ｂ）継代１３（ｐ１３）における、Ｅ１−Ｆ２Ａ設計を有する異なる二価ｒＡｄ３５の導入遺伝子領域のＰＣＲ分析の結果が示される。番号１〜５は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内でｐ１３に継代された、５つの異なるプラーク（ウイルス集団）に由来するＤＮＡを表す。Ｐ＋は、ＰＣＲバンドの予想サイズを示す陽性プラスミド対照であり、Ｈ２ＯはＰＣＲの水対照であり、Ｍは分子量マーカーである。星印は、陽性対照と、異なる試験されるプラークとの双方に存在する、非特異的ＰＣＲバンドを示す。矢頭は、完全にまたは部分的に抗原または発現カセットを欠失させたウイルスゲノムから増幅されたＰＣＲ産物に相当する、欠失バンドを示す。（Ｃ）Ｅ１中にバイシストロニック発現カセットを有する二価ｒＡｄ３５ベクター、および同一タンパク質を発現する一価ベクターによる、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶタンパク質の発現を比較するためのウエスタンブロットが示される。Ａ５４９細胞を１０００、２５００、および５０００ＶＰ／細胞で、ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶ、ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ、またはｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶに感染させて、４８ｈｐｉで採取し、溶解産物は、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶに特異的な一次抗体を使用して、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶタンパク質の発現について試験された。（Ｄ）二価ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶ、および一価ベクターであるｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶとの混合物を比較するための、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶタンパク質の表面発現を分析するためのＦＡＣＳ染色による結果の折れ線グラフが示される。Ａ５４９細胞を１１１、３３３、および１０００ＶＰ／細胞で、ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶに、またはｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶとの混合物に感染させた。発現は４８ｈｐｉで分析され、％陽性細胞がＶＰ／細胞に対してプロットされた。（Ｅ）二価ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶによる、または一価ベクターであるｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶとの混合物による、免疫化後８週目のマウスの免疫原性を評価するためのＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果が示される。ｒＡｄ３５．ｅｍｐｙは陰性対��である。ＥＬＩＳＰＯＴデータは、スポット形成単位（ＳＦＵ）／１０６脾細胞としてプロットされ、異なるベクターによるＳＥＢＯＶおよびＭＡＲＶ特異的Ｔ細胞応答に対応する。（Ｆ）二価ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶによって、または一価ベクターであるｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶ（ＭＡＲＶ＋ＳＥＢＯＶ）との混合物によって発現される、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ糖タンパク質に対する抗体応答（体液性応答、Ｂ細胞応答）を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイの結果が示される。ｒＡｄ３５．ｅｍｐｙは、陰性対照である。ＥＬＩＳＡデータは、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）／ｍｌとして対数目盛りで提示される。ＥＬＩＳＰＯＴおよびＥＬＩＳＡの双方のアッセイ（ＥおよびＦ）のために、１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群が、１×１０９ＶＰのｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶで、または１×１０９ＶＰのｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶおよび１×１０９ＶＰのｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶで、筋肉内（ＩＭ）免疫化された。合計２×１０９ＶＰの単一インサート組合せを投与された群の可能なアジュバント効果を考慮して、１×１０９ＶＰのＡｄ３５．ｅｍｐｔｙベクターが、ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶと共に同時注射された。陰性対照として、５匹のマウスの２つの群に、合計２×１０９ＶＰのＡｄ３５．ｅｍｔｐｙが投与された。ワクチン接種に先だって、マウスは採血もされて未感作血清が作製された（データ未掲載）。
【図３ａ】（前記と同じ。）
【図４】Ｅ１−Ｅ１設計による二価ｒＡｄ３５ベクターの設計および試験。（Ａ）Ｅ１−Ｅ１アプローチを用いた二価ベクターの概略設計：Ｅ１領域は、頭尾構造の２つの完全な発現カセットを含み、その中では、遺伝子１の発現がヒトＣＭＶプロモーターによって駆動され、遺伝子２の発現は、その異種配列とヒトＣＭＶプロモーターに対する同等の効力との理由から選択されたｍＣＡＧプロモーターによって駆動される。遺伝子１および遺伝子２を有する２つの発現カセットは、異種ポリアデニル化シグナルｐＡ１およびｐＡ２をそれぞれ保有する。（Ｂ）ｒＡｄ３５．Ｅ１．ｍＣＡＧ．Ｌｕｃ−ｈＣＭＶ．ｅＧＦＰおよびｒＡｄ３５．Ｅ１．ｍＣＡＧ．ＭＡＲＶ−ｈＣＭＶ．ＳＥＢＯＶの導入遺伝子領域のＰＣＲ分析の結果が示される。番号１〜５は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内でｐ１３に継代された、５つの異なるプラーク（ウイルス集団）に由来するＤＮＡを表す。Ｐ＋は、ＰＣＲバンドの予想サイズを示す陽性プラスミド対照であり、Ｐ−は、抗原なしの発現カセットのサイズを示す陰性プラスミド対照である。Ｈ２ＯはＰＣＲの水対照であり、Ｍは分子量マーカーである。星印はＰＣＲ背景バンドを示し、矢頭は欠失バンドを示す。（Ｃ）二価ｒＡｄ３５．Ｅ１．ｍＣＡＧ−ＭＡＲＶ．ｈＣＭＶ−ＳＥＢＯＶによる、および一価ベクターであるｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶまたはｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶによる発現を比較するためのウエスタンブロットが示される。Ａ５４９細胞は１０００、２５００、および５０００ＶＰ／細胞で、ｒＡｄ３５．Ｅ１．ｍＣＡＧ−ＭＡＲＶ．ｈＣＭＶ−ＳＥＢＯＶ、ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ、またはｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶに感染させて、４８ｈｐｉで採取し、溶解産物は、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶに特異的な一次抗体を使用して、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶタンパク質の発現について試験された。（Ｄ）二価ｒＡｄ３５．Ｅ１．ｍＣＡＧ−ＭＡＲＶ．ｈＣＭＶ−ＳＥＢＯＶからの、および一価ベクターであるｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶとの混合物からの発現を比較するための、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶタンパク質の表面発現を分析するためのＦＡＣＳ染色による結果の折れ線グラフが示される。Ａ５４９細胞を１１１、３３３、および１０００ＶＰ／細胞で、ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶに、またはｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶとの混合物に感染させた。ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶの表面感染細胞の存在が４８ｈｐｉで分析され、％陽性細胞がＶＰ／細胞に対してプロットされた。（Ｅ）二価ｒＡｄ３５．Ｅ１．ｍＣＡＧ−ＭＡＲＶ．ｈＣＭＶ−ＳＥＢＯＶによる、または一価ベクターであるｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶとの混合物による、免疫化後８週目のマウスの免疫原性を評価するためのＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果が示される。Ａｄ３５．ｅｍｐｔｙは陰性対照である。ＥＬＩＳＰＯＴデータは、スポット形成単位（ＳＦＵ）／１０６脾細胞としてプロットされ、異なるベクターによるＳＥＢＯＶおよびＭＡＲＶ特異的Ｔ細胞応答に対応する。（Ｆ）二価ｒＡｄ３５．Ｅ１．ｍＣＡＧ−ＭＡＲＶ．ｈＣＭＶ−ＳＥＢＯＶによって、または一価ベクターであるｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶとの混合物によって発現される、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ糖タンパク質に対する抗体応答（体液性応答）を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイの結果が示される。Ａｄ３５．ｅｍｐｙベクターは陰性対照である。ＥＬＩＳＡデータは、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）／ｍｌとして対数目盛りで提示される。ＥＬＩＳＰＯＴおよびＥＬＩＳＡの双方のアッセイ（ＥおよびＦ）のために、１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群が、１×１０９ＶＰのｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶで、または１×１０９ＶＰのｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶおよび１×１０９ＶＰのｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶで、筋肉内（ＩＭ）免疫化された。合計２×１０９ＶＰの単一インサート組合せを投与された群の可能なアジュバント効果を考慮して、１×１０９ＶＰのＡｄ３５．ｅｍｐｔｙベクターが、ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶと共に同時注射された。陰性対照として、５匹のマウスの２つの群に、合計２×１０９ＶＰのＡｄ３５．ｅｍｔｐｙが投与された。ワクチン接種に先だって、マウスは採血もされて未感作血清が作製された（データ未掲載）。
【図４ａ】（前記と同じ。）
【図５】３つの異なる双方向性プロモーターであるＰｂｉｄｉｒ１、Ｐｂｉｄｉｒ２、およびＰｂｉｄｉｒ３を有するｅＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を発現する二価Ｅ１  ｒＡｄ３５ベクターの設計および試験。（Ａ）Ｅ１中の双方向性発現カセットの概略設計：Ｅ１領域は、双方向性プロモーターであるＰｂｉｄｉｒ１、Ｐｂｉｄｉｒ２、またはＰｂｉｄｉｒ３の内の１つによって駆動される発現カセットを含む。発現カセット内では、遺伝子１は５’側に逆方向で、遺伝子２は３’側に順方向で配置される。（Ｂ）遺伝子１および遺伝子２の位置で交換されたＬｕｃおよびｅＧＦＰを含む３つの異なる双方向性プロモーター変異体を有するＥ１  ｒＡｄＡｐｔ３５ベクターで一過性に形質移入された、ＨＥＫ２９３細胞内のルシフェラーゼおよびｅＧＦＰ発現レベルの棒グラフが示される。個々に（ｐＡｄＡｐｔ３５．ｅＧＦＰまたはＡｄＡｐｔ３５．Ｌｕｃ）または組み合わせで（ｐＡｄＡｐｔ３５．ｅＧＦＰ＋ＡｄＡｐｔ３５．Ｌｕｃ）使用される場合は、一価ベクターに由来するルシフェラーゼおよびｅＧＦＰの発現レベルもまた対照として含まれる。ｅＧＦＰの発現レベルは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示され、ルシフェラーゼ発現レベルは相対光単位（ＲＬＵ）として示される。（Ｃ）ＬｕｃおよびｅＧＦＰが遺伝子１および遺伝子２の位置で交換されている、選択されたＰｂｉｄｉｒ３双方向性プロモーターを有するＥ１  ｒＡｄ３５ベクターに感染させた、Ａ５４９細胞内のルシフェラーゼまたはｅＧＦＰの発現レベルの棒グラフが示される。導入遺伝子がない空のｒＡｄ３５ベクター（ｒＡｄ３５．ｅｍｐｔｙ）、および個々に使用された一価ベクター（ｒＡｄ３５．ｅＧＦＰまたはｒＡｄ３５．Ｌｕｃ）に由来する、ルシフェラーゼおよびｅＧＦＰの発現レベルもまた対照として含まれる。Ａ５４９細胞を１０００ＶＰ／細胞で感染させ、発現は４８ｈｐｉで判定された。ｅＧＦＰの発現レベルは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示され、ルシフェラーゼ発現レベルは相対光単位（ＲＬＵ）として示される。（Ｄ）５’側のイントロン２および３’側のイントロン１の２つのイントロンで挟まれたｍＣＭＶ  ＩＥ１／ＩＥ２を有する、Ｐｂｉｄｉｒ３双方向性プロモーターの略図である。
【図５ａ】（前記と同じ。）
【図６】異なる機能性断片について注釈された、ｍＣＭＶ  ＩＥ１／ＩＥ２双方向性プロモーター配列の配列である。方向および特定の機能性断片が、ｍＣＭＶ  ＩＥ１／ＩＥ２由来プロモーター配列、両方向のＭＩＥ２およびＭＩＥ１エンハンサー、ＴＡＴＡボックス、およびヒトＡｐｏＥ１由来イントロン配列とキメライントロン配列とで挟まれた転写開始部位（ＴＳＳ）の配列上に重ねられた矢印で示される。
【図６ａ】（前記と同じ。）
【図７】Ｅ１双方向性設計による、二価ｒＡｄ３５ベクターの設計および試験。（Ａ）ｒＡｄ３５  Ｅ１双方向性二価ベクターの概略設計：Ｅ１領域は、双方向性発現カセットを含み、その中では、双方の抗原が、異種ポリアデニル化シグナルｐＡ１およびｐＡ２を用いた双方向性マウスＣＭＶプロモーター制御下で発現される。（Ｂ）３つの異なるｒＡｄ３５．Ｅ１．双方向性ベクター（ｒＡｄ３５．Ｅ１．ｅＧＦＰ−ｍＣＭＶ−Ｌｕｃ、（ｒＡｄ３５．Ｅ１．Ｌｕｃ−ｍＣＭＶ−ｅＧＦＰ、およびｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶの導入遺伝子領域のＰＣＲ分析の結果が示される。番号１〜５は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内でｐ１３に継代された、５つの異なるプラーク（ウイルス集団）に由来するＤＮＡを表す。Ｐ＋は、ＰＣＲバンドの予想サイズを示す陽性プラスミド対照であり、Ｐ−は、抗原なしの発現カセットのサイズを示す陰性プラスミド対照である。Ｈ２ＯはＰＣＲの水対照であり、Ｍは分子量マーカーである。ｒＡｄ３５Ｅ１−双方向性二価ベクターについて、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内でｐ１３に継代された５つの異なるプラーク（ウイルス集団）に由来するウイルスＤＮＡ中に欠失バンドは検出されなかった。（Ｃ）二価ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶによる、および一価ベクターであるｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶおよびｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶによる、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ発現を比較するためのウエスタンブロットが示される。Ａ５４９細胞を１０００、２５００、および５０００ＶＰ／細胞で、表示されるベクターに感染させて、４８ｈｐｉで採取し、溶解産物は、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ特異的一次抗体を使用して、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶタンパク質の発現について試験された。（Ｄ）二価ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶからの、および一価ベクターであるｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶとの混合物からの発現を比較するための、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶタンパク質の表面発現を分析するためのＦＡＣＳ染色による結果の折れ線グラフが示される。Ａ５４９細胞を１１１、３３３、および１０００ＶＰ／細胞で、表示されるベクターに感染させた。感染細胞の表面におけるＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶの存在は、ＦＡＣＳ染色によって４８ｈｐｉで分析され、陽性細胞％が示される。（Ｅ）二価ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶによる、または２つの一価ベクターであるｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶとの混合物による、免疫化後８週目のマウスの免疫原性を評価するためのＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果が示される。Ａｄ３５．ｅｍｐｙは、陰性対照である。ＥＬＩＳＰＯＴデータは、スポット形成単位（ＳＦＵ）／１０６脾細胞としてプロットされ、異なるベクターによるＳＥＢＯＶおよびＭＡＲＶ特異的Ｔ細胞応答に対応する。（Ｆ）二価ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶによる、または２つの一価ベクターであるｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶとの混合物による、免疫化後８週目のマウスのＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ糖タンパク質に対する抗体応答（体液性応答���を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイの結果が示される。Ａｄ３５．ｅｍｐｙは、陰性対照である。ＥＬＩＳＡデータは、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）／ｍｌとして対数目盛りで提示される。ＥＬＩＳＰＯＴおよびＥＬＩＳＡの双方のアッセイ（ＥおよびＦ）のために、１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群が、１×１０９ＶＰのｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶで、または１×１０９ＶＰのｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶおよび１×１０９ＶＰのｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶで、筋肉内（ＩＭ）免疫化された。合計２×１０９ＶＰの単一インサート組合せを投与された群の可能なアジュバント効果を考慮して、１×１０９ＶＰのＡｄ３５．ｅｍｐｔｙベクターが、ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶと共に同時注射された。陰性対照として、５匹のマウスの２つの群に、合計２×１０９ＶＰのＡｄ３５．ｅｍｐｔｙが投与された。ワクチン接種に先だって、マウスは採血もされて未感作血清が作製された（データ未掲載）。
【図７ａ】（前記と同じ。）
【図８】Ｅ１双方向性設計による二価ｒＡｄ２６ベクターの設計および試験。（Ａ）Ｅ１双方向性アプローチを用いた二価ｒＡｄ２６ベクターの概略設計。（Ｂ）二価ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶの導入遺伝子領域のＰＣＲ分析の結果が示される。番号１〜５は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内でｐ１３に継代された、５つの異なるプラーク（ウイルス集団）に由来するＤＮＡを表す。Ｐ＋は、ＰＣＲバンドの予想サイズを示す陽性プラスミド対照であり、Ｐ−は、抗原なしの発現カセットのサイズを示す陰性プラスミド対照である。Ｈ２ＯはＰＣＲの水対照であり、Ｍは分子量マーカーである。（Ｃ）二価ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶからの、および一価ベクターであるｒＡｄ２６．Ｅ１．ＳＥＢＯＶおよびｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶからのＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ発現を比較するためのウエスタンブロットが示される。Ａ５４９細胞を１００００、２５０００、および５００００ＶＰ／細胞で、表示されるベクターに感染させて、４８ｈｐｉで採取し、溶解産物は、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ特異的一次抗体を使用して、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶタンパク質の発現について試験された。（Ｄ）二価ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶからの、および一価ベクターであるｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶとの混合物からの発現を比較するための、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶタンパク質の表面発現を分析するためのＦＡＣＳ染色による結果の折れ線グラフが示される。Ａ５４９細胞を１００，０００、２００００、４０００、および８００ＶＰ／細胞で、表示されるベクターに感染させた。感染細胞の表面におけるＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶの存在は、ＦＡＣＳ染色によって４８ｈｐｉで分析された。陽性細胞の％が示される。（Ｅ）二価ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶによる、または２つの一価ベクターであるｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶとｒＡｄ２６．Ｅ１．ＳＥＢＯＶとの混合物による、免疫化後８週目のマウスの免疫原性を評価するためのＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果が示される。ｒＡｄ２６．ｅｍｐｔｙは、陰性対照である。ＥＬＩＳＰＯＴデータは、スポット形成単位（ＳＦＵ）／１０６脾細胞としてプロットされ、異なるベクターによるＳＥＢＯＶおよびＭＡＲＶ特異的Ｔ細胞応答に対応する。（Ｆ）二価ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶによる、または２つの一価ベクターであるｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶとｒＡｄ２６．Ｅ１．ＳＥＢＯＶとの混合物による、免疫化後８週目のマウスのＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ糖タンパク質に対する抗体応答（体液性応答）を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイの結果が示される。ｒＡｄ２６．ｅｍｐｙは、陰性対照である。ＥＬＩＳＡデータは、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）／ｍｌとして対数目盛りで提示される。ＥＬＩＳＰＯＴおよびＥＬＩＳＡの双方のアッセイ（ＥおよびＦ）のために、１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群が、１×１０９ＶＰのｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶで、または１×１０９ＶＰのｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶおよび１×１０９ＶＰのｒＡｄ２６．Ｅ１．ＳＥＢＯＶで、筋肉内（ＩＭ）免疫化された。合計２×１０９ＶＰの単一インサート組合せを投与された群の可能なアジュバント効果を考慮して、１×１０９ＶＰのＡｄ２６．ｅｍｐｔｙベクターが、ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶと共に同時注射された。陰性対照として、４匹のマウスの２つの群に、合計２×１０９ＶＰのｒＡｄ２６．ｅｍｐｔｙが投与された。ワクチン接種に先だって、マウスは採血されて未感作血清が作製された（データ未掲載）。
【図８ａ】（前記と同じ。）
【図８ｂ】（前記と同じ。）
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書に記載されるのは、１つの組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）から２つの導入遺伝子を発現するための先行技術に記載されるアプローチが、同一抗原を発現する単一導入遺伝子を有するｒＡｄと比較して、ｒＡｄの遺伝的不安定性および／または導入遺伝子発現の低下をもたらすことを示す実験結果である。これらの問題を解決するためのいくつかの異なる新たなストラテジーを試験した後に、双方向性マウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）プロモーターの調節下に置かれた２つの導入遺伝子を有するｒＡｄベクターを使用した新規解決策が特定された。本発明のｒＡｄは、先行技術に記載されている二価ｒＡｄに優る。双方向性ｍＣＭＶを有するｒＡｄは遺伝的に安定しており、継代１３（ｐ１３）に至るまでＰＣＲ分析によって欠失バンドが検出されず、したがって単一導入遺伝子のみを有するｒＡｄに匹敵する遺伝的安定性を提供する。さらに、どちらの導入遺伝子も、導入遺伝子発現のウエスタンブロットおよびＦＡＣＳ分析、およびＴ細胞応答およびＢ細胞応答に関する発現抗原の免疫原性のＥＬＩＳＰＯＴおよびＥＬＩＳＡ分析に基づいて、強力に発現される。したがって、双方向性プロモーターを有する本発明のｒＡｄは、遺伝子治療およびワクチン用途で使用するのに適すると判定された。
【００２５】
したがって本発明は、ｒＡｄおよびｒＡｄベクターと、ｒＡｄおよびｒＡｄベクターを製造して使用する方法とに関し、その中で、ｒＡｄおよびｒＡｄベクターは、双方向性ｍＣＭＶプロモーターおよび２つの導入遺伝子を含んでなり、その中で、第１の導入遺伝子は一方向で双方向性ｍＣＭＶプロモーターと作動可能に連結され、第２の導入遺伝子は別の方向で双方向性ｍＣＭＶプロモーターと作動可能に連結される。
【００２６】
本発明のｒＡｄは、大規模な量、またはバッチで製造され得る。ｒＡｄの「バッチ」は、単一製造容器内の単回製造工程において製造される組成物であり、または代案としては、それは単一容器（例えば、バイオリアクター、バッグ、フラスコ、ボトル、多回用量バイアル、単回投与バイアル、シリンジなど）内に存在する組成物中の複数のｒＡｄ粒子を指し得る。本発明によるｒＡｄのバッチは、または本発明によるｒＡｄを含んでなる組成物は、好ましくは、少なくとも１０７個のｒＡｄ粒子を含んでなり、特定の実施形態では、少なくとも１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８個以上のｒＡｄ粒子、最大で１０２０個のｒＡｄ粒子を含んでなる（例えば、単回製造工程において、大規模バイオリアクター内にて製造される）。Ａバッチまたは組成物は、ｒＡｄ以外のさらなる関連する成分を含んでなってもよく、または含まなくてもよい。
【００２７】
本明細書の用法では、組換えアデノウイルスの「組換え」という用語は、野生型アデノウイルスとは対照的に、人の手によって修飾されていることを意味し、例えば、それは、異種遺伝子、遺伝子群、またはその一部、および双方向ｍＣＭＶプロモーターを含んでなる。
【００２８】
本明細書中の配列は、当該技術分野で慣用されているように、５’から３’方向に提供される。
【００２９】
「アデノウイルスカプシドタンパク質」は、特定のアデノウイルスの血清型および／または向性の決定に関与する、アデノウイルスのカプシド上のタンパク質を指す。アデノウイルスカプシドタンパク質は、典型的に、繊維、ペントンおよび／またはヘキソンタンパク質を含む。本発明による特定の血清型の（または「それをベースとする」）ｒＡｄは、典型的にその特定の血清型の繊維、ペントンおよび／またはヘキソンタンパク質を含んでなり、好ましくはその特定の血清型の繊維、ペントンおよびヘキソンタンパク質を含んでなる。これらのタンパク質は、典型的に、ｒＡｄのゲノムによってコードされる。特定の血清型のｒＡｄは、任意選択的に、その他のアデノウイルス血清型に由来するその他のタンパク質を含んでなってもよく、および／またはそれらをコードしてもよい。
【００３０】
本明細書の用法では、ｒＡｄは、少なくとも配列が、野生型からの誘導によってアデノウイルス「をベースとする」。これは、出発原料として野生型ゲノムまたはその部分を使用した、分子クローニングによって達成され得る。野生型アデノウイルスゲノムの既知の配列を使用して、ＤＮＡ合成および／または分子クローニングの分野のビジネスを有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ，ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）による日常的手順を用いて実施され得るＤＮＡ合成によって、ゲノム（の一部）を新規に作製することもまた可能である。したがって、非限定的例として、Ａｄ３５のヘキソン、ペントン、および繊維を含んでなるｒＡｄが、Ａｄ３５をベースとするｒＡｄなどと見なされる。
【００３１】
本発明のベクターは、ｒＡｄベクターと称される。ｒＡｄベクターの調製は、当該技術分野で周知である。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明によるｒＡｄベクターは、例えば、Ｅ１ａ領域および／またはＥ１ｂ領域などのウイルス複製に必要なアデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能が欠損している。特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部が欠損している。特定の実施形態では、ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能、および非必須Ｅ３領域の少なくとも一部が欠損している。アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの２つ以上の領域のそれぞれにおいて、１つまたは複数の必須遺伝子機能が欠損していることを意味する「多重欠損」であり得る。例えば、前述のＥ１欠損またはＥ１欠損、Ｅ３欠損アデノウイルスベクターには、Ｅ４領域の少なくとも１つの必須遺伝子および／またはＥ２領域（例えば、Ｅ２Ａ領域および／またはＥ２Ｂ領域）の少なくとも１つの必須遺伝子がさらに欠損し得る。
【００３３】
アデノウイルスベクター、それらを構築する方法、およびそれらを増殖させる方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、米国特許第５，８３７，５１１号明細書、米国特許第５，８４６，７８２号明細書、米国特許第５，８５１，８０６号明細書、米国特許第５，９９４，１０６号明細書、米国特許第５，９９４，１２８号明細書、米国特許第５，９６５，５４１号明細書、米国特許第５，９８１，２２５号明細書、米国特許第６，０４０，１７４号明細書、米国特許第６，０２０，１９１号明細書、米国特許第６，１１３，９１３号明細書、および米国特許第８，９３２，６０７号明細書、およびＴｈｏｍａｓ  Ｓｈｅｎｋ，”Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，”Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６７  ａｎｄ  ６８，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら，ｅｄｓ．，３ｄ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）、および本明細書で言及されるその他の参考文献に記載される。典型的に、アデノウイルスベクターの構築は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｗａｔｓｏｎら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２ｄ  ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ（１９９２）、およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９５）、および本明細書で言及されるその他の参考文献に記載されるものなどの標準分子生物学的技術の使用を伴う。
【００３４】
本発明によるアデノウイルスは、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）に属し、好ましくはマストアデノウイルス属（Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）に属するものである。それはヒトアデノウイルスであり得るが、ウシアデノウイルス（例えば、ウシアデノウイルス３、ＢＡｄＶ３）、イヌアデノウイルス（例えば、ＣＡｄＶ２）、ブタアデノウイルス（例えば、ＰＡｄＶ３または５）、またはサルアデノウイルス（チンパンジーアデノウイルスまたはゴリラアデノウイルスなどのサルアデノウイルスおよび類人猿アデノウイルスをはじめとする）をはじめとするが、これに限定されるものではないその他の生物種に感染するアデノウイルスでもあり得る。好ましくは、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ、またはＡｄＨｕ；本発明では生物種の指示なしにＡｄに言及される場合にヒトアデノウイルスが意味され、例えば、簡略表記「Ａｄ５」は、ヒトアデノウイルス血清型５であるＨＡｄＶ５と同じものを意味する）、またはチンパンジーまたはゴリラアデノウイルスなどのサルアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ、またはＳＡｄＶ）である。
【００３５】
最も進んだ研究は、ヒトアデノウイルスを用いて実施されており、本発明の特定の態様によればヒトアデノウイルスが好ましい。特定の好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルスをベースとする。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型５、１１、２６、３４、３５、４８、４９または５０をベースとする。本発明の特に好ましい実施形態によれば、アデノウイルスは、血清型２６、３５の内の１つのヒトアデノウイルスである。これらの血清型の利点は、ヒト集団における低い血清陽性率および／または低い既存の中和抗体力価である。ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットおよび（Ａｂｂｉｎｋら，２００７）に記載される。Ａｄ２６の例示的ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ１５３４７４および国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットの配列番号１に見られる。ｒＡｄ３５ベクターの調製は、例えば、米国特許第７，２７０，８１１号明細書、国際公開第００／７００７１号パンフレット、および（Ｖｏｇｅｌｓら，２００３）に記載される。Ａｄ３５の例示的ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣ＿００００１９および国際公開第００／７００７１号パンフレットの図６に見られる。
【００３６】
サルアデノウイルスは、一般に、ヒト集団における低い血清陽性率および／または低い既存の中和抗体力価もまた有し、チンパンジーアデノウイルスベクターを使用した相当量の研究が報告されている（例えば、米国特許第６０８３７１６号明細書；国際公開第２００５／０７１０９３号パンフレット；国際公開第２０１０／０８６１８９号パンフレット；国際公開第２０１００８５９８４号パンフレット；（Ｂａｎｇａｒｉ  ＆  Ｍｉｔｔａｌ，２００６；Ｃｏｈｅｎら，２００２；Ｆａｒｉｎａら，２００１；Ｋｏｂｉｎｇｅｒら，２００６；Ｌａｓａｒｏ  ＆  Ｅｒｔｌ，２００９；Ｔａｔｓｉｓら，２００７）。したがって、その他の好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、例えば、チンパンジーアデノウイルスなどのサルアデノウイルスをベースとする。特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、サルアデノウイルス１、７、８、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７．１、２８．１、２９、３０、３１．１、３２、３３、３４、３５．１、３６、３７．２、３９、４０．１、４１．１、４２．１、４３、４４、４５、４６、４８、４９、５０またはＳＡ７Ｐ型をベースとする。
【００３７】
上記のヒトおよび非ヒトアデノウイルスの大多数の配列は公知であり、その他については日常的な手順を用いて得られ得る。
【００３８】
本発明による組換えアデノウイルスは、複製能を有してもよく、または複製欠損であってもよい。
【００３９】
特定の実施形態では、アデノウイルスは、例えばゲノムのＥ１領域に欠失を含むため、複製欠損である。「Ｅ１領域における欠失」は、野生型アデノウイルスと比較したこの領域における欠失を意味し、少なくともＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ  ５５ＫまたはＥ１Ｂ  ２１Ｋコード領域の内の１つの欠失、好ましくはＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ  ５５Ｋ、およびＥ１Ｂ２１Ｋコード領域の欠失を意味する。当業者に知られているように、アデノウイルスゲノムからの必須領域が欠失する場合、これらの領域によってコードされた機能は、好ましくは産生細胞によってトランスで提供されなければならず、すなわち、アデノウイルスから、Ｅ１、Ｅ２および／またはＥ４領域の一部または全体が欠失する場合、これらは、例えば、それらのゲノム内に組み込まれ、またはいわゆるヘルパーアデノウイルスまたはヘルパープラスミドなどの形態で、産生細胞内に存在しなくてはならない。アデノウイルスはまた、複製に不必要なＥ３領域に欠失を有してもよく、したがってこのような欠失は補完されなくてもよい。
【００４０】
使用され得る産生細胞（時に、当該技術分野でおよび本明細書で、「パッケージング細胞」または「相補細胞」または「宿主細胞」とも称される）は、その中で所望のアデノウイルスが増殖され得る任意の産生細胞であり得る。例えば、組換えアデノウイルスベクターの増殖は、アデノウイルスの欠陥を補完する産生細胞内で実施される。このような産生細胞は、好ましくはそれらのゲノム中に少なくともアデノウイルスＥ１配列を有し、それによりＥ１領域に欠失がある組換えアデノウイルスを補完できる。例えば、９１１またはＰＥＲ．Ｃ６細胞（米国特許第５，９９４，１２８号明細書を参照されたい）、Ｅ１形質転換羊膜細胞（欧州特許第１２３０３５４号明細書を参照されたい）、Ｅ１形質転換Ａ５４９細胞（例えば、国際公開第９８／３９４１１号パンフレット、米国特許第５，８９１，６９０号明細書を参照されたい）、ＧＨ３２９：ＨｅＬａ（Ｇａｏ，Ｅｎｇｄａｈｌ，＆  Ｗｉｌｓｏｎ，２０００）、２９３などのＥ１により不死化されたヒト網膜細胞などの任意のＥ１補完産生細胞が使用され得る。特定の実施形態では、産生細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞、または９１１細胞、またはＩＴ２９３ＳＦ細胞などである。
【００４１】
亜群ＣまたはＥアデノウイルスに由来しないＥ１欠損アデノウイルスでは、非亜群ＣまたはＥアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード配列をＡｄ５などのアデノウイルス亜群ＣのＥ４−ｏｒｆ６で交換することが好ましい。これにより、例えば、２９３細胞またはＰＥＲ．Ｃ６細胞（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される（Ｈａｖｅｎｇａら，２００６）；国際公開第０３／１０４４６７号パンフレットを参照されたい）などのＡｄ５のＥ１遺伝子を発現する良く知られている相補的な細胞株における、このようなアデノウイルスの増殖が可能になる。
【００４２】
代案の実施形態では、アデノウイルスベクターに（例えば、Ａｄ５の）異種Ｅ４ｏｒｆ６領域を入れる必要はないが、その代わりに、Ｅ１欠損非サブグループＣまたはＥベクターが、例えば、Ａｄ５からのＥ１とＥ４ｏｒｆ６の双方を発現する２９３−ＯＲＦ６細胞株などのＥ１および適合性Ｅ４ｏｒｆ６の双方を発現する細胞株において増殖される（例えば、（Ｂｒｏｕｇｈ，Ｌｉｚｏｎｏｖａ，Ｈｓｕ，Ｋｕｌｅｓａ，＆  Ｋｏｖｅｓｄｉ，１９９６）が２９３−ＯＲＦ６細胞の生成について記載しており；（Ａｂｒａｈａｍｓｅｎら，１９９７；Ｎａｎら，２００３）がそれぞれこのような細胞株を使用したＥ１欠失非亜群Ｃアデノウイルスベクターの生成について記載しているのを参照されたい）。
【００４３】
代案としては、増殖させる血清型からのＥ１を発現する相補細胞が使用され得る（例えば、国際公開第００／７００７１号パンフレット、国際公開第０２／４０６６５号パンフレットを参照されたい）。
【００４４】
Ｅ１領域に欠失を有するＡｄ３５などの亜群Ｂアデノウイルスでは、例えば、ｐＩＸ開始コドンのすぐ上流の２４３ｂｐフラグメント（Ａｄ３５ゲノム中のＢｓｕ３６Ｉ制限部位によって５’末端で標識される）などの、ｐＩＸオープンリーディングフレームのすぐ上流の１６６ｂｐまたはこれを含んでなるフラグメントなど、アデノウイルスのＥ１Ｂ  ５５Ｋオープンリーディングフレームの３’末端を保持することが好ましいが、これはｐＩＸ遺伝子のプロモーターがこの領域に部分的に存在することから、アデノウイルスの安定性を高めるためである（例えば、参照により本明細書に援用される（Ｈａｖｅｎｇａら，２００６）；国際公開第２００４／００１０３２号パンフレットを参照されたい）。
【００４５】
本発明のアデノウイルスにおける「異種核酸」（本明細書では「導入遺伝子」とも称される）は、アデノウイルスに天然に存在しない核酸である。これは、例えば、標準分子生物学的技術によって、アデノウイルスに導入される。これは、特定の実施形態では、目的タンパク質またはその一部をコードしてもよい。これは、例えば、アデノウイルスベクターの欠失Ｅ１またはＥ３領域にクローン化され得る。本発明の好ましい実施形態では、双方向性ｍＣＭＶプロモーター制御下の２つの導入遺伝子を有する発現カセットが、アデノウイルスゲノムのＥ１領域に配置される。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列と作動可能に連結される。これは、例えば、導入遺伝子をコードする核酸をプロモーター制御下に置くことで実施され得る。導入遺伝子の発現のために、多数のプロモーターが使用され得て、当業者に知られている。
【００４６】
本明細書の用法では、「プロモーター」または「プロモーター領域」または「プロモーター要素」という用語は、同義的に使用されて、典型的にＤＮＡであるがこれに限定されるものではない、それ列が作動可能に結合している核酸配列の転写を調節する核酸配列断片を指す。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および、転写開始に十分な特異的配列を含む。さらに、プロモーター領域は、任意選択的に、このＲＮＡポリメラーゼの認識、結合、および転写開始活性を調節する配列を含み得る。これらの配列は、シス作用性であってもよく、またはトランス作用因子応答性であってもよい。プロモーターは、制御の性質次第で構成的または制御的であってもよい。本発明は、双方向性マウスＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ）を使用して、双方向性様式で２つの異なる導入遺伝子の直接転写を誘導する。
【００４７】
さらなる制御配列もまた、付加されてもよい。「制御配列」という用語は、本明細書中で「調節要素」と同義的に使用されて、典型的にＤＮＡであるが、これに限定されるものではない、それが作動可能に結合している核酸配列の転写を調節し、したがって転写調節因子の役割を果たす核酸断片を指す。制御配列は、転写タンパク質および／または転写因子、エンハンサーまたはリプレッサーの核酸結合ドメインなどによって認識される転写結合ドメインである、核酸配列を含んでなることが多い。例えば、制御配列は、テトラサイクリンオペロンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）の存在下で発現が阻害されるように、１つまたは複数のテトラサイクリンオペロンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）を含み得る。テトラサイクリンの不在下では、ｔｅｔＲタンパク質は、ｔｅｔＯ部位に結合して、ｔｅｔＯ部位と作動可能に連結された遺伝子の転写を抑制できる。しかし、テトラサイクリンの存在下では、ｔｅｔＲタンパク質の立体構造変化が、それがオペレーター配列に結合するのを妨げ、作動可能に連結された遺伝子の転写を可能にする。特定の実施形態では、本発明のｒＡｄは、その中でｔｅｔＲタンパク質が発現される産生細胞系において産生されたｒＡｄにおいて、１つまたは複数の導入遺伝子の発現が阻害されるように、任意選択的に、双方向性マウスＣＭＶプロモーターと作動可能に連結されたｔｅｔＯを含み得る。引き続いて、ｒＡｄが、ｔｅｔＲタンパク質を発現しない対象または細胞に導入されると、発現は阻害されない（例えば、国際公開第０７／０７３５１３号パンフレットを参照されたい）。特定のその他の実施形態では、本発明のｒＡｄは、任意選択的に、クマート遺伝子スイッチ系を含み得て、その中では、発現の制御が、プロモーター下流に配置されたオペレーター部位（ＣｕＯ）へのリプレッサー（ＣｙｍＲ）の結合によって媒介される（例えば、（Ｍｕｌｌｉｃｋら，２００６）を参照されたい）。
【００４８】
本明細書の用法では、「リプレッサー」という用語は、組換え発現ベクターの異種タンパク質産物の産生を阻害し、妨害し、遅延させおよび／または抑制する能力を有する実体（例えば、タンパク質またはその他の分子）を指す。例えば、発現カセットなどの、発現ベクターに沿った適切な位置で結合部位を干渉することによって。リプレッサーの例としては、ｔｅｔＲ、ＣｙｍＲ、ｌａｃリプレッサー、ｔｒｐリプレッサー、ｇａｌリプレッサー、λリプレッサー、および当該技術分野で公知のその他の適切なリプレッサーが挙げられる。
【００４９】
本発明の組換えアデノウイルスは、第１の導入遺伝子と一方向で、第２の導入遺伝子と逆方向で、作動可能に連結された双方向性マウスＣＭＶ（ｍＣＭＶ）プロモーターを含んでなる。双方向性ｍＣＭＶプロモーターについては、欧州特許第１６０１７７６号明細書で詳細に記載されており、ｍＣＭＶ前初期１プロモーター（ＩＥ１）を一方向で、ｍＣＭＶ前初期２プロモーター（ＩＥ２）を逆方向で含んでなる。それは、天然またはその他のエンハンサーなどのエンハンサーをさらに含んでなってもよい。双方向ｍＣＭＶプロモーターの天然エンハンサーは、主要前初期１（ＭＩＥ１）エンハンサーおよびＭＩＥ２エンハンサーを構成する。エンハンサーはまた、ｍＣＭＶ  ＩＥ領域に天然に存在しないその他のエンハンサーと交換されてもよく、および／またはその他の位置に配置されてもよい。好ましくは、第１の方向のプロモーターのエンハンサー配列と、他の方向のプロモーターは重ならない。プロモーターは、双方向性構造にあり、それは、当業者によって理解されるように、双方のプロモーター（すなわち、一緒になってｍＣＭＶ  ＩＥ双方向性プロモーターを構成するＩＥ１およびＩＥ２プロモーター）が、逆方向で、２つのプロモーターの中心からアデノウイルスゲノム末端に向けて外側に、発現を駆動することを意味する。したがって双方向性プロモーターは、アデノウイルスゲノムの第１の末端に向けて第１の導入遺伝子の発現を駆動し、およびアデノウイルスゲノムのもう一方の端に向けて第２の導入遺伝子の発現を駆動する。本発明のｒＡｄおよびｒＡｄベクターコンストラクトの概略図は、図５、７、および８に提供される。代表的な双方向性ｍＣＭＶプロモーターのアノテートされた配列は、図６に提供される。イントロン（配列番号１）をはじめとするｍＣＭＶ双方向性プロモーター配列、およびイントロン以外のｍＣＭＶプロモーター（配列番号２）について、代表的な配列が提供される。当業者は、ｍＣＭＶ  ＩＥ１およびＩＥ２プロモーターが活性プロモーター配列であり（例えば、欧州特許第１６０１７７６号明細書を参照されたい）、提供された配列で変異体が生成され得て、日常的方法によってプロモーター活性が試験され得ることを認識するであろう。典型的に、（イントロン配列が存在する場合はイントロン配列を除いて）示されるプロモーター配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列は、なおも機能活性を有し、したがって双方向性ｍＣＭＶプロモーターと見なされる。したがって、本発明の双方向性ｍＣＭＶプロモーターは、（イントロン配列が存在する場合は、イントロン配列の外部で）示されたプロモーター配列と、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。特定の実施形態では、双方向性ｍＣＭＶプロモーターは、本明細書で開示される配列と１００％同一である。
【００５０】
「作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結された」、または「作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結された」という用語は、本明細書で同義的に使用されて、核酸配列と、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳終結部位、およびその他のシグナル配列などのヌクレオチド制御配列との機能的関係を指し、２つ以上ＤＮＡ断片がそれらの意図される目的のために協力して機能するように共に連結することを示唆する。例えば、典型的にＤＮＡである核酸配列と、制御配列またはプロモーター領域との作動可能な連結は、ＤＮＡを特異的に認識し、それに結合し、それを転写するポリメラーゼによって、このようなＤＮＡの転写が制御配列またはプロモーターから開始されるような、ＤＮＡと制御配列またはプロモーターとの間の物理的および機能的関係を指す。発現および／または生体外転写を最適化するために、それが発現される細胞型における核酸またはＤＮＡの発現のための制御配列の修飾が必要なこともある。そのような修飾の望ましさまたは必要性は、経験的に判定されてもよい。
【００５１】
双方向性プロモーターのｍＣＭＶ  ＩＥ１部分は、双方向性プロモーターのｍＣＭＶ  ＩＥ２部分よりも強力な発現を提供し（ルシフェラーゼについて試験されるように、約１０倍の発現レベルの差）、したがってそれに対して最も高い発現が所望される導入遺伝子は、双方向性プロモーターのｍＣＭＶ  ＩＥ１部分の制御下に置かれ得る。しかし、双方向性プロモーターのどちらかの部分によって制御される発現によっても、導入遺伝子は強力に発現される。本明細書の用法では、「強力に発現される」または「強力な発現」は、ウエスタンブロットまたはＦＡＣＳ分析などの異なるタンパク質検出技術による測定で、ｈＣＭＶプロモーター制御下で単一抗原を発現する一価ｒＡｄからの発現と同等のまたはさらに良好でさえある発現を意味する。例えば、ＦＡＣＳ分析により判定される、本発明の双方向性ｍＣＭＶプロモーターからの双方の抗原の発現レベルは、好ましくはｈＣＭＶプロモーターを有する一価ｒＡｄからの抗原発現レベルの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％である。特定の実施形態では、双方向性ｍＣＭＶからの双方の抗原発現レベルは、ｈＣＭＶプロモーターを有する一価ｒＡｄからの抗原発現レベルの１００％である。さらに、ｈＣＭＶプロモーターの制御下で単一抗原を発現するｒＡｄから、有意なＴ細胞およびＢ細胞免疫応答を生じさせるのに発現が十分であることが公知である。そのため、本発明のｍＣＭＶ双方向性プロモーターによって発現される２つの導入遺伝子の強力な発現は、双方の導入遺伝子に対して顕著なＴ細胞およびＢ細胞免疫応答を生じさせることが予測される。例えば、２つの導入遺伝子が、対象に投与された際に免疫応答を惹起する抗原をコードする場合、強力な発現は双方の抗原に対して測定可能な免疫応答を生じさせ、免疫応答は、好ましくはｈＣＭＶプロモーター制御下で単一抗原を発現する単一導入遺伝子を有するｒＡｄによって生じる免疫応答と同一か、またはそれよりもさらに良好であろう。
【００５２】
「コード配列」、コードする配列、または「コードする」という用語は、本明細書で同義的に使用され、適切な制御配列と作動可能に連結されると、生体外または生体内で、転写され（ＤＮＡ）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡ）、核酸配列を指す。
【００５３】
例えば、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号明細書）などのポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子の後方に存在してもよい。好ましくは、各導入遺伝子はポリＡシグナルを有し、好ましくは、第１の導入遺伝子のポリＡシグナルは、第２の導入遺伝子のポリＡシグナルと異なる。一実施形態では、第１のポリＡシグナルはＳＶ４０ポリＡシグナルであり、第２のポリＡシグナルはウシ成長ホルモンポリＡシグナルである。
【００５４】
好ましい実施形態では、イントロンを含んでなる配列は、プロモーターの下流（３’）で第１の導入遺伝子の上流（５’）に位置し、イントロンを含んでなるさらなる配列は、プロモーターの下流で第２の導入遺伝子の上流に位置する。これらのイントロンは、同一であってもまたは異なっていてもよい。本明細書の用法では、イントロンは、技術分野で公知のような正常な機能と構造を有して、核酸中のポリヌクレオチド配列であり、それはタンパク質合成の情報をコードせず、スプライシングとして知られている過程によって、メッセンジャーＲＮＡの翻訳前に除去される。イントロンは、スプライス供与体部位（イントロンの５’末端、通常ＧＵ配列）およびスプライス受容体部位（イントロンの３’末端、通常ＧＡ配列）を含んでなる。イントロンを含んでなる本発明によるコンストラクトの構造の略図は、図５Ｄに提供される。イントロンを含むｍＣＭＶ双方向性プロモーター配列の代表的な配列は、配列番号１として提供される。イントロンを除くｍＣＭＶ双方向性プロモーター配列の代表的な配列は、配列番号２として提供される。本発明により、任意のイントロンが使用され得て、組換えアデノウイルス中の導入遺伝子のためにより多くのスペースが残されるように、ウイルスベクター中であまりにも多くのスペースを占有しないよう、比較的短いイントロンを使用することが好ましい。双方向性プロモーターの片側で第１のイントロンを、双方向性プロモーターのもう１つの側で第２の異なるイントロンを使用することが好ましく、すなわち、異なるイントロン配列が各導入遺伝子に先行する。特定の実施形態では、第１のイントロンはキメライントロンであり、例えば、配列番号３を有する。特定の実施形態では、さらなるイントロンはヒトＡｐｏＡ１イントロンであり、例えば、配列番号４を有する。当業者は、多くの異なるイントロンが入手可能であり、使用され得ることを認識する。イントロンは、特に生体内でタンパク質発現を増大させることが知られている。したがってイントロンが存在する場合の本発明の実施形態の利点は、導入遺伝子の高度発現であり、それは免疫原性にまたは遺伝子治療にとって非常に有用である。
【００５５】
本明細書に記載される実験で例示されるパラメータの内の１つは免疫原性であり、それはワクチン用途における抗原に関連する。しかし、導入遺伝子発現レベルが、免疫応答が第一の目的ではない導入遺伝子、例えば遺伝子治療目的で使用される導入遺伝子にも関連し得ることは、当業者には直ちに明らかになるであろう。したがって、本発明は、それに対して単一組換えアデノウイルスベクターからの発現が所望される、導入遺伝子の任意の組み合わせを用いて実施され得る。そのため、導入遺伝子の同一性は本発明の題材でなく、それは任意の導入遺伝子を含んでなるアデノウイルスに適している。適切な導入遺伝子は当業者に周知であり、例えば、遺伝子治療目的で治療効果を有するポリペプチドをコードする読み取り枠、またはワクチン接種目的でｒＡｄベクターが使用される場合にそれに対する免疫応答が所望されるポリペプチドをコードする読み取り枠などの、導入遺伝子読み取り枠を含んでもよい。特に好ましい異種核酸は、それに対して免疫応答を生じさせる必要がある抗原決定基をコードする、目的遺伝子である。このような抗原決定基もまた、典型的に抗原と称される。組換えアデノウイルスが、対象に投与されると、抗原に対して免疫応答が生じる。任意の所望の抗原は、アデノウイルスベクターによってコードされ得る。本発明による典型的な実施形態では、抗原は、疾患または病状を引き起こしてもよい生物に由来する、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である。そのため、さらに好ましい実施形態では、前記目的異種核酸は、免疫原性（または抗原性）決定因子をコードする。より好ましくは、前記免疫原性決定因子は、細菌、ウイルス、酵母または寄生生物に由来する抗原である。このような生物によって引き起こされる疾患は、一般に「感染症」と称される（したがって「感染する」生物に限定されないが、また宿主に侵入して疾患を引き起こすものも含む）。例えば、腫瘍抗原などのいわゆる「自己抗原」もまた最新技術の一部を形成し、本発明の組換えアデノウイルス中の異種核酸によってコードされてもよい。それから抗原決定基（または抗原）が取得される非限定的例は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）などのマラリアを引き起こす生物、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）などの結核を引き起こす生物、酵母、またはウイルスである。その他の好ましい実施形態では、フラビウイルス（例えば、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス）、エボラウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびマールブルグウイルスなどのウイルスに由来する抗原が、本発明による組成物で使用されてもよい。一実施形態では、前記抗原は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に由来するＣＳタンパク質またはその免疫原性部である（ＣＳをコードするアデノウイルスベクターの例については、例えば、本明細書で全てその内容全体が参照により援用される（Ｈａｖｅｎｇａら，２００６；Ｏｐｈｏｒｓｔら，２００６）；国際公開第号パンフレット２００４／０５５１８７を参照されたい）。別の実施形態では、抗原決定基は、Ａ��８５Ａ、Ａｇ８５Ｂおよび／またはＴＢ１０．４タンパク質またはそれらの免疫原性部分などのＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来する、１つの抗原のタンパク質、またはいくつかの抗原の融合タンパク質である（このようなＴＢワクチンウイルスの構築および製造については、例えば、参照により本明細書に援用される、国際公開第２００６／０５３８７１号パンフレットを参照されたい）。さらに別の実施形態では、前記抗原決定基は、エボラウイルスまたはマールブルグウイルスなどのフィロウイルスに由来するＧＰなどの、ウイルス糖タンパク質またはその免疫原性部分である（例えば、（Ｇｅｉｓｂｅｒｔら，２０１１；Ｓｕｌｌｉｖａｎら，２００６；Ｓｕｌｌｉｖａｎら，２００３）。なおもさらなる実施形態では、前記免疫原性決定因子は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、またはそれらの変異体などのＨＩＶタンパク質に由来する（アデノウイルスベースのＨＩＶワクチンの例については、例えば、国際公開第２００９／０２６１８３号パンフレット、国際公開第２０１０／０９６５６１号パンフレット、国際公開第２００６／１２００３４号パンフレット、国際公開第０２／２２０８０号パンフレット、国際公開第０１／０２６０７号パンフレットを参照されたい）。その他の実施形態では、前記抗原決定基は、インフルエンザウイルスに由来する、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ、またはＮＰタンパク質、またはこれらのいずれかの免疫原性部分である（例えば、（Ｈｕら，２０１１；Ｚｈｏｕら，２０１０）；（Ｖｅｍｕｌａ  ＆  Ｍｉｔｔａｌ，２０１０）による概説）。その他の実施形態では、抗原決定基は、麻疹ウイルスに由来する、ＨＡタンパク質またはその免疫原性部分である（例えば、国際公開第２００４／０３７２９４号パンフレット）。その他の実施形態では、抗原決定基は、狂犬病ウイルス糖タンパク質である（例えば、（Ｚｈｏｕ，Ｃｕｎ，Ｌｉ，Ｘｉａｎｇ，＆  Ｅｒｔｌ，２００６））。さらなる実施形態では、抗原は、例えば、ＲＳＶ  Ｆタンパク質（例えば、国際公開第２０１３／１３９９１１号パンフレットおよび国際公開第２０１３／１３９９１６号パンフレットを参照されたい）またはＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはその双方、またはその他のＲＳＶタンパク質など、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に由来する。その他の実施形態では、抗原は、ヒトパピローマウイルスまたはその他のウイルスなどの別のウイルスに由来する。組換えアデノウイルスは、同一生物に由来する２つの異なる抗原をコードしてもよい。組換えアデノウイルスはまた、例えば、第１の生物に由来する第１の抗原と、第２の生物に由来する第２の抗原などの異なる生物に由来する抗原の組み合わせをコードしてもよい。例えば、抗原およびＴｏｌｌ様−受容体（ＴＬＲ）作動薬、ＴＬＲ３作動薬など、ｄｓＲＮＡまたはその模倣剤など、抗原および例えばアジュバントを同一アデノウイルス中にコードすることもまた可能である（例えば、国際公開第２００７／１００９０８号パンフレット）。特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、それぞれ双方向性ｍＣＭＶプロモーターの制御下にある、２つの異なる抗原をコードする。その他の実施形態では、組換えアデノウイル���は、それぞれ双方向性ｍＣＭＶプロモーターの制御下にある、抗原および免疫修飾物質をコードする。特定の実施形態では、双方向性ｍＣＭＶプロモーターの制御下にある第１および第２の導入遺伝子以外に、さらなる異種配列または導入遺伝子が、組換えアデノウイルス中に存在してもよい。
【００５６】
本発明は、第１の導入遺伝子と一方向で、第２の導入遺伝子と逆方向で、作動可能に連結された双方向性ｍＣＭＶプロモーターを含んでなる、コンストラクトを調製するステップと、前記コンストラクトを組換えアデノウイルスのゲノム内に組み込むステップとを含んでなる、アデノウイルスが標的細胞に感染すると、それぞれ強力に発現される第１および第２の導入遺伝子を含んでなる、遺伝的に安定な組換えアデノウイルスを製造する方法もまた提供する。このようなコンストラクトの調製は、組換えアデノウイルス技術の分野において、当業者に知られており、慣例的に実施され、本明細書で例示されるように、標準分子クローニング方法の使用を包含する（例えば、（Ｈｏｌｔｅｒｍａｎら，２００４；Ｌｅｍｃｋｅｒｔら，２００６；Ｖｏｇｅｌｓら，２００３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら，ｅｄｓ，１９８７；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＭＪ，Ｈａｍｓ  ＢＤ，Ｔａｙｌｏｒ  ＧＲ，ｅｄｓ，１９９５を参照されたい）。双方向性ｍＣＭＶプロモーターは、上述されたような特性を有し、日常的方法によって得られ得る（例えば、欧州特許第１６０１７７６号明細書を参照されたい）。便宜のため、当業者は、プラスミド形態の導入遺伝子の容易な操作と導入のために、例えば、Ｅ１領域までのゲノムの左部分のための第１の部分、および第１の部分との再結合時に完全なアデノウイルスゲノムをもたらすゲノムの残部のための第２のより大きな部分などのより小型の断片にクローニングすることで、アデノウイルスゲノムを操作してもよい（例えば、国際公開第９９／５５１３２号パンフレットを参照されたい）。
【００５７】
本発明のｒＡｄは、先行技術で提供される２つの導入遺伝子を発現するための様々な代案のアプローチによって調製されるアデノウイルスとは異なり、２つの導入遺伝子を発現し得て、遺伝的に安定したままであるという利点を有する。したがって、双方向性ｍＣＭＶプロモーターは、２つの導入遺伝子を発現するアデノウイルスの遺伝的不安定性の問題を解決する。
【００５８】
遺伝的安定性を測定するために、例えば、ヘルパー細胞株ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）などの適切な細胞株において、ｒＡｄがレスキューされて継代される。ウイルスＤＮＡは、特定の継代数において単離され、以下の１つまたは複数によってｒＡｄゲノムの完全性が分析され得る：欠失バンドの存在または不在についてのＰＣＲ分析、制限断片の差異の存在または不在についてのｒＡｄゲノムの制限酵素消化、および／またはｒＡｄ配列中の変異体の存在または不在についてのｒＡｄゲノムまたはｒＡｄゲノムＰＣＲ産物の配列決定。本発明のｒＡｄに関して、「遺伝的に安定な」とは、２つの導入遺伝子を発現するｒＡｄが、大規模バッチ生産に適するように、（ｈＣＭＶプロモーター後方に）単一導入遺伝子を有する同等のｒＡｄと同じ遺伝的安定性を有するように、ヌクレオチド配列が、ｒＡｄの作製のために使用されるプラスミドから、その後のｒＡｄ生産段階まで変化しないことを意味する。例えば、発現カセット側方のプライマーを使用したＰＣＲ分析は、ｒＡｄまたは出発原料のより初期の継代数と比較して欠失断片（バンド）を示さず、および／またはＥ１、Ｅ３、およびＥ４領域のＰＣＲ産物の配列決定は、ヌクレオチド配列が変化しないことを裏付ける。遺伝的安定性は、単一製造ウイルスバッチの試験消化などのその他の試験法と比較して、この試験で完全に評価される。アッセイ感度は、以下の手段によって増大される：いくつかのウイルス集団（プラーク）が単離され、拡張継代に供される。拡張継代は、発現カセット側方のプライマーを用いたＰＣＲ分析と組み合わされて、他の方法を用いて見過ごされるかもしれない、ｒＡｄ集団中の小さな割合の欠失変異体の検出を可能にする。さらに、配列解析が実施されて、導入遺伝子のオープンリーディングフレーム中の停止コドンの導入などの点突然変異の発生が排除される。より具体的には、ウイルス変異は常に偶発事象を呈するので、１つのプラークは安定しており、別のものは欠失バンドを提示してもよい。したがって、遺伝的安定性を正しく評価するために、いくつかのウイルス集団（プラーク）が試験されなくてはならない。ベクターが親ベクターよりも効率的に自己複製できるようにする突然変異が生じた場合、これは変異体バージョンの増生をもたらし得て、それはこの研究で説明されているように拡張継代後に観察されることが多い。好ましくは、本発明のｒＡｄは、ウイルスが大規模生産活動中に十分に安定しているように、用いられる試験系において、少なくとも１０継代に至るまで、なおもより好ましくは少なくとも１３継代に至るまで遺伝的に安定している。
【００５９】
本発明の方法に従って製造された組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルスについて上に記載された実施形態に従って調製され得る。
【００６０】
本発明は、本発明による組換えアデノウイルスを細胞に提供するステップを含んでなる、少なくとも２つの導入遺伝子を発現する方法もまた提供する。組換えアデノウイルスを細胞に提供するステップは、アデノウイルスの対象への投与を通じて、または試験管内または生体外でのアデノウイルスの細胞への導入（例えば、感染）を通じて実施され得る。特定の実施形態では、本発明は、例えば、組換えアデノウイルスを対象に投与することによる、細胞内の少なくとも２つの導入遺伝子の発現において使用するための組換えアデノウイルスベクターを提供する。
【００６１】
本発明は、本発明による組換えアデノウイルスを対象に投与するステップを含んでなる、少なくとも２つの抗原に対する免疫応答を誘導する方法もまた提供する。本発明は、少なくとも２つの抗原に対する免疫応答の誘導において使用するための本発明による組換えアデノウイルスもまた提供する。
【００６２】
本発明は、本発明の組換えアデノウイルスのゲノムを含んでなる、組換えＤＮＡ分子もまた提供する。当業者は、これが、一緒になって本発明の単一組換えＤＮＡ分子を形成し得る、少なくとも２つの異なる組換えＤＮＡ分子の組み合わせであってもよいことを認識するであろう。そのような分子は、ゲノムを操作し、新規組換えアデノウイルスを作製する上で有用である。ゲノムは、許容細胞におけるアデノウイルス複製およびパッケージングに必要なタンパク質をコードする。
【００６３】
本開示における用法では、数値についての「約」という用語は、±１０％を意味する。
【００６４】
産生細胞は培養されて、細胞数およびウイルス数および／またはウイルス力価が増大される。細胞を培養することで、本発明による目的のウイルスの代謝および／または増殖および／または分裂および／または生成が可能になる。これは、当業者に周知のような方法によって達成され得て、例えば、適切な培養液中で細胞に栄養素を提供することが挙げられるが、これに限定されるものではない。適切な培養液は、当業者に周知であり、一般に、大量に商業的供給元から入手され得て、または標準プロトコルに従って特注製造され得る。培養は、例えば、バッチ、流加、連続系などを用いて、シャーレ、ローラーボトル内またはバイオリアクター内で実施され得る。細胞を培養するのに適した条件は、公知である（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）、およびＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ  ０−４７１−３４８８９−９を参照されたい）。
【００６５】
典型的に、アデノウイルスが培養中の適切な産生細胞に曝露されて、ウイルスの取り込みができるようにする。通常、最適撹拌は、約５０〜３００ｒｐｍ、典型的に、約１００〜２００、例えば、約１５０であり、典型的には、ＤＯは２０〜６０％、例えば、４０％であり、最適ｐＨは、６．７〜７．７であり、最適温度は、３０〜３９℃、例えば、３４〜３７°Ｃであり、最適ＭＯＩは、５〜１０００、例えば、約５０〜３００などである。典型的には、アデノウイルスは産生細胞に自然に感染し、産生細胞をｒＡｄ粒子と接触させることが、細胞を感染させるのに十分である。一般に、アデノウイルスの種ストックが培養物に添加されて感染が開始され、引き続いてアデノウイルスが産生細胞中で増殖する。これらは、全て当業者にとってルーチンである。
【００６６】
アデノウイルスの感染の後、ウイルスは細胞内で自己複製し、それにより増幅され、本明細書ではアデノウイルスの増殖と呼ばれる過程である。アデノウイルス感染は、最終的に感染細胞の溶解をもたらす。したがってアデノウイルスの溶解特性は、２つの異なるウイルス生産様式を可能にする。第１の様式は、細胞溶解前にウイルスを採取し、外的因子を用いて細胞を溶解する。第２の態式は、製造されたウイルスによる（ほぼ）完全な細胞溶解の後に、ウイルス上清を回収する（例えば、外的因子による宿主細胞の溶解なしのアデノウイルス採取を描写する、米国特許第６，４８５，９５８号明細を参照されたい）。アデノウイルスを採取するために、細胞を能動的に溶解するための外的因子を用いることが好ましい。
【００６７】
能動的細胞溶解のために使用され得る方法は当業者に公知であり、例えば、国際公開第９８／２２５８８号パンフレットのｐ．２８〜３５で考察されている。この点において有用な方法は、例えば、凍結解凍、固体剪断、高張および／または低張溶解、液体剪断、超音波処理、高圧押出、洗剤溶解、上記の組み合わせなどである。本発明の一実施形態では、細胞は、少なくとも１つの界面活性剤を使用して溶解される。溶解のための洗剤の使用は、簡単な方法であって容易に規模が拡大縮小できるという利点を有する。
【００６８】
使用され得る洗剤およびそれらが使用される様式は、一般に当業者に公知である。いくつかの例が、例えば、国際公開第９８／２２５８８号パンフレットのｐ．２９〜３３で考察される。洗剤としては、アニオン性、カチオン性、両性イオン、および非イオン性洗剤が挙げられる。洗剤の濃度は、例えば約０．１％〜５％（ｗ／ｗ）の範囲内で変化させてもよい。一実施形態では、使用される洗剤はトリトンＸ−１００である。
【００６９】
ヌクレアーゼが用いられて、混入している、すなわち、主に産生細胞に由来する、核酸が除去されてもよい。本発明で使用するのに適した例示的ヌクレアーゼとしては、ベンゾナーゼ（登録商標）、プルモザイム（登録商標）、または当該技術分野内で一般に使用される任意のその他のＤＮａｓｅおよび／またはＲＮａｓｅが挙げられる。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼはベンゾナーゼ（登録商標）であり、それは特定のヌクレオチド間の内部リン酸ジエステル結合の加水分解によって核酸を迅速に加水分解し、それにより細胞溶解産物の粘度を低下させる。ベンゾナーゼ（登録商標）は、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡから商業的に入手され得る（コードＷ２１４９５０）。その中でヌクレアーゼが使用される濃度は、好ましくは１〜１００単位／ｍｌの範囲内である。代案としては、またはヌクレアーゼ処理に加えて、臭化ドミフェンなどの選択的沈殿剤を使用して、アデノウイルス精製中に、宿主細胞ＤＮＡをアデノウイルス調製物から選択的に沈殿させることもまた可能である（例えば、米国特許第７，３２６，５５５号明細書；（Ｇｏｅｒｋｅ，Ｔｏ，Ｌｅｅ，Ｓａｇａｒ，＆  Ｋｏｎｚ，２００５）；国際公開第２０１１／０４５３７８号パンフレット；国際公開第２０１１／０４５３８１号パンフレットを参照されたい）。
【００７０】
産生細胞の培養物からアデノウイルスを採取する方法は、国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレットに広範に記載されている。
【００７１】
特定の実施形態では、採取されたアデノウイルスはさらに精製される。アデノウイルスの精製は、例えば、参照により本明細書に援用される、国際公開第０５／０８０５５６号パンフレットに記載されるような浄化、限外濾過、透析濾過またはクロマトグラフィーによる分離を含んでなる数段階で実施され得る。浄化は、細胞破片および他の不純物を細胞溶解物から除去する濾過工程によって実施してもよい。限外濾過が使用されて、ウイルス溶液が濃縮される。ウルトラフィルターを用いる透析濾過、または緩衝液交換は、塩類、糖類などの除去および交換方法である。当業者は、各精製工程のための最適条件を見つける方法を理解している。また、その内容全体が参照により本明細書に援用される国際公開第９８／２２５８８号パンフレットは、アデノウイルスベクターを製造および精製する方法を記載する。方法は、宿主細胞を増殖させるステップと、宿主細胞をアデノウイルスに感染させるステップと、宿主細胞を採取して溶解させるステップと、粗溶解産物を濃縮するステップと、粗溶解産物の緩衝液を交換するステップと、溶解産物をヌクレアーゼで処理するステップと、クロマトグラフィーを用いてウイルスをさらに精製するステップとを含んでなる。
【００７２】
好ましくは、精製は、例えば国際公開第９８／２２５８８号パンフレットのｐ．６１〜７０で考察されるような少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を用いる。クロマトグラフィー工程が方法に含まれる、アデノウイルスのさらなる精製のための多くの方法が記載されている。当業者はこれらの方法を承知しており、クロマトグラフィー工程を用いる正確なやり方を変化させて、方法を最適化させ得る。例えば、アニオン交換クロマトグラフィー工程によってアデノウイルスを精製することが可能であり、例えば、国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレットを参照されたい。その他の多くのアデノウイルス精製方法が記載されており、当業者の到達範囲内である。さらにアデノウイルスを製造および精製する方法が、例えば、全て参照により本明細書に援用される、国際公開第００／３２７５４号パンフレット、国際公開第０４／０２０９７１号パンフレット、米国特許第５，８３７，５２０号明細書、米国特許第６，２６１，８２３号明細書、および国際公開第２００６／１０８７０７号パンフレットで開示される。
【００７３】
ヒトに投与するために、本発明は、ｒＡｄと、薬学的に許容できる担体または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物を用いてもよい。本文脈上、「薬学的に許容可能な」という用語は、使用される用量および濃度では、それらが投与される対象において、いかなる望まれないまたは有害な効果も引き起こさない、担体または賦形剤を意味する。このような薬学的に許容可能な担体および賦形剤は、当該技術分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照されたい）。精製されたｒＡｄは、好ましくは滅菌溶液として処方されて投与されるが、凍結乾燥製剤を利用することも可能である。滅菌溶液は、滅菌濾過または当技術分野でそれ自体が公知の他の方法によって調製される。溶液は、次に凍結乾燥されまたは医薬品投与容器に充填される。溶液のｐＨは、一般に、ｐＨ３．０〜９．５、例えば、ｐＨ５．０〜７．５の範囲である。ｒＡｄは、典型的に、適切な緩衝液を有する溶液中にあり、ｒＡｄの溶液は塩もまた含有してもよい。任意選択的に、アルブミンなどの安定剤が存在してもよい。特定の実施形態では、洗剤が添加される。特定の実施形態では、ｒＡｄは注射用製剤に処方されてもよい。これらの製剤は有効量のｒＡｄを含み、滅菌液体溶液、液体懸濁液または凍結乾燥バージョンのいずれかであり、任意選択的に、安定剤または賦形剤を含有する。アデノウイルスワクチンはまた、鼻腔内投与のためにエアロゾル化され得る（例えば、国際公開第２００９／１１７１３４号パンフレットを参照されたい）。
【００７４】
例えば、アデノウイルスは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｈｏｇａｎｓｏｎら，２００２）のためにも使用される緩衝液：２０ｍＭのトリスｐＨ８、２５ｍＭのＮａＣｌ、２．５％グリセロール中で保存されてもよい。ヒトへの投与に適する別の有用な調合緩衝液は、２０ｍＭのトリス、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０％ｗ／ｖのスクロース、０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０である。組換えアデノウイルスに適する別の調合緩衝液は、１０〜２５ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ５．９〜６．２、４〜６％（ｗ／ｗ）のヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）、７０〜１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１８〜０．０３５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート−８０、および任意選択的に０．３〜０．４５％（ｗ／ｗ）のエタノールを含んでなる。明らかに、その他の多くの緩衝液が使用され得て、例えば、欧州特許第０８５３６６０号明細書、米国特許第６，２２５，２８９号明細書、および国際公開第９９／４１４１６号パンフレット、国際公開第９９／１２５６８号パンフレット、国際公開第００／２９０２４号パンフレット、国際公開第０１／６６１３７号パンフレット、国際公開第０３／０４９７６３号パンフレット、国際公開第０３／０７８５９２号パンフレット、国際公開第０３／０６１７０８号パンフレットに見られるものをはじめとする、精製（アデノ）ウイルス製剤の保存および医薬品投与のためのいくつかの適切な配合の例が知られている。
【００７５】
特定の実施形態では、アデノウイルスを含んでなる組成物は、１つまたは複数のアジュバントをさらに含んでなる。アジュバントは、適用された抗原決定基に対する免疫応答をさらに増大させることが当技術分野で公知であり、アデノウイルスおよび適切なアジュバントを含んでなる薬学的組成物は、例えば、参照により本明細書に援用される、国際公開第２００７／１１０４０９号パンフレットで開示されている。「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書で同義的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１つまたは複数の物質と定義される。この文脈で、アジュバントは、本発明のアデノウイルスベクターに対する免疫応答を増強するために使用される。適切なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウム塩などのアルミニウム塩；ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルションをはじめとする油エマルション組成物（または水中油型組成物）（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照されたい）；例えば、ＱＳ２１および免疫賦活性錯体（ＩＳＣＯＭＳ）などのサポニン製剤（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照されたい）；その例が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴなどである、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰリボース化細菌毒素またはそれらの変異体などの細菌または微生物誘導体が挙げられる。例えば、Ｃ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）のオリゴマー化ドメインの目的抗原への融合物をコードする異種核酸（Ｏｇｕｎ，Ｄｕｍｏｎ−Ｓｅｉｇｎｏｖｅｒｔ，Ｍａｒｃｈａｎｄ，Ｈｏｌｄｅｒ，＆  Ｈｉｌｌ，２００８）、またはｄｓＲＮＡなどのＴＬＲ３作動薬などのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）作動薬をコードする異種核酸（（例えば、国際公開第２００７／１００９０８号パンフレットを参照されたい）などを使用して、ベクターでコードされたアジュバントを使用することも可能である。本発明によるこのようなｒＡｄは、例えば、双方向性プロモーターの片側の目的抗原と、双方向性プロモーターの別の側のＴＬＲ３作動薬とをコードしてもよい。このようなｒＡｄは、特に、例えば、経口投与などの粘膜経路を通じた投与に適している（例えば、国際公開第２００７／１００９０８号パンフレットを参照されたい）。特定の実施形態では、本発明の組成物は、用量当たり、例えば、０．０７５〜１．０ｍｇなどの０．０５〜５ｍｇの濃度のアルミニウム含有量で、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウムアルミニウム、またはそれらの組み合わせの形態のアルミニウムをアジュバントとして含んでなる。
【００７６】
その他の実施形態では、組成物は、アジュバントを含まない。
【００７７】
本発明による医薬組成物は、特定の実施形態では、ワクチンであってもよい。
【００７８】
アデノウイルス組成物は、例えば、ヒト対象などの対象に投与されてもよい。１回の投与の間に対象に提供されるアデノウイルスの総用量は、熟練した実務家に知られているように変化させ得て、一般に、１×１０７ウイルス粒子（ｖｐ）〜１×１０１２ｖｐ、好ましくは、１×１０８ｖｐ〜１×１０１１ｖｐ、例えば、３×１０８〜５×１０１０ｖｐ、例えば、１０９〜３×１０１０ｖｐである。
【００７９】
アデノウイルス組成物の投与は、標準的な投与経路を用いて実施され得る。非限定的実施形態としては、例えば、皮内や筋肉内などの注射、または皮下もしくは経皮、または例えば、鼻腔内や経口などの粘膜投与などによる非経口投与が挙げられる。一実施形態では、組成物は、例えば、腕の三角筋内、または腿の外側広筋内への筋肉内注射によって投与される。当業者は、ワクチン中の抗原に対する免疫応答を誘導するために、例えば、ワクチンなどの組成物を投与する様々な可能性を理解している。
【００８０】
対象は、本明細書の用法では、好ましくは、例えば、マウスなどの齧歯類、または非ヒト霊長類、またはヒトなどの哺乳類である。好ましくは、対象はヒト対象である。
【００８１】
１つまたは複数のアデノウイルスワクチンの１回または複数回の追加免疫投与を提供することもまた、可能である。追加免疫ワクチン接種が実施される場合、典型的には、このような追加免疫ワクチン接種は、組成物が対象に初めて投与された（このような場合、これは「プライミングワクチン接種」と称される）後、１週間〜１年間、好ましくは２週間〜４ヶ月間の時点で同一対象に投与される。代案の追加免疫措置では、プライミングまたは追加免疫ワクチン接種として、例えば異なる血清型の１つまたは複数のアデノウイルスなどの異なるベクター、またはＭＶＡ、ＤＮＡもしくはタンパク質などのその他のベクターを対象に投与することも可能である。
【００８２】
特許、公開出願、技術論文、および学術的論文をはじめとする様々な文献が明細書全体を通じて括弧内に引用され、それぞれの完全な引用は明細書の終わりにある。これらの引用される文献のそれぞれは、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
【００８３】
本発明のその他の実施形態、特徴、および利点は、以下の実施例を参照してさらに例示される。実施例は、本発明をどのようにも制限するものではない。それらは、発明を明確化する役割をのみを果たす。
【実施例】
【００８４】
さらなる説明なしに、当業者は、先行する説明および以下の説明に役立つ実施例を用いて、本発明を作製および利用し、特許請求される方法を実施し得ると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を具体的に指摘し、本開示の残りの部分をどのようにも制限すると解釈されるものではない。
【００８５】
［比較例］実施例１：一価複製不能ｒＡｄ３５およびｒＡｄ２６ベクターの調製および特性決定
フィロウイルス糖タンパク質を含むＥ１アダプタープラスミドの作成
マールブルグウイルス・アンゴラ（ＭＡＲＶ）（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｑ１ＰＤ５０）、エボラウイルス・ザイール株メインガ（ＥＢＯＶ）（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＡＡＮ３７５０７．１、Ｔ５４４Ｉ変異あり）、およびエボラウイルス・スーダン・グル（ＳＥＢＯＶ）（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＹＰ＿１３８５２３、Ｇ２Ｅあり）のフィロウイルス糖タンパク質をコードする遺伝子がヒト発現について遺伝子最適化され、制限酵素認識部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを使用して、ｐＡｄａｐｔ３５またはｐＡｄａｐｔ２６プラスミドにクローン化された（Ｖｏｇｅｌｓら  ２００７；Ａｂｂｉｎｋら，２００７）。コザック配列（５’ＧＣＣＡＣＣ３’）がＡＴＧ開始コドンの直前に含まれて、２つの停止コドン（５’ＴＧＡ  ＴＡＡ３’）がコード配列末端に付加された。本明細書に記載されるように、組換えアデノウイルスおよびベクターは、一般に、ｒＡｄまたはｒＡｄベクターと称され、より具体的には、ｒＡｄ３５またはｒＡｄ２６と称される。
【００８６】
細胞培養：
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｆａｌｌａｕｘら，１９９８）は、１０ｍＭのＭｇＣｌ２が添加された、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）添加ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持された。
【００８７】
アデノウイルスの作製、感染、および継代。
全てのアデノウイルスは、相同組換えによってＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内で作製され、以前記載されたように作製された（ｒＡｄ３５については（Ｈａｖｅｎｇａら，２００６）；ｒＡｄ２６については（Ａｂｂｉｎｋら，２００７））。簡単に述べると、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞は、製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって提供される使用説明に従ってリポフェクタミンを使用して、プラスミドをコードするｒＡｄベクターで形質移入された。フィロウイルス糖タンパク質導入遺伝子発現カセットを有するｒＡｄ３５ベクターのレスキューのために、ｐＡｄＡｐｔ３５プラスミドおよびｐＷＥ／Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３．５ｏｒｆ６コスミドが使用された一方で、ｒＡｄ２６ベクターのためには、ｐＡｄＡｐｔプラスミドおよびｐＷＥ．Ａｄ２６．ｄＥ３．５ｏｒｆ６．コスミドが使用された。細胞は、完全細胞変性効果（ＣＰＥ）の１日後に採取され、凍結融解されて、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離され、２０℃で保存された。次に、ウイルスはプラーク精製され、マルチウェル２４組織培養プレートの単一ウェル上で培養されたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）中で増幅された。さらなる増幅が、Ｔ２５組織培養フラスコを使用して培養されたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）において実施された。
【００８８】
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内のアデノウイルスベクターの遺伝的安定性試験。
図１Ｂに例示されるように、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内のいくつかの継代を含む生産工程における遺伝的安定性を確実にするために、ワクチンベクターの遺伝的安定性試験が実施された。組換えワクチンベクターの作製、プラーク精製、およびＴ２５形態への増殖は、上述されたようにして達成された。簡単に述べると、組換えウイルスは、Ｅ１相補細胞株ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）において、プラスミド形質移入によって作製されて、プラーク精製された。マルチウェル２４（ＭＷ２４）からＴ２５フラスコ（ｒＡｄ３５ｐ３／ｒＡｄ２６ｐ４）への規模拡大のために、５つのプラークが選択された。引き続いて、新たなＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞をウイルス継代数１３（ｒＡｄ３５ｐ１３／ｒＡｄ２６ｐ１３）まで、Ｔ２５形態で感染させた。ウイルスの増殖は、感染の２日後に完全細胞変性効果を与えると予定された、ｒＡｄ３５では５０、ｒＡｄ２６では９００の細胞当たりウイルス粒子比の範囲内にあることが遡及的に判定された、感染性容積を使用して実施された。ウイルスＤＮＡは、ｐ１３材料から単離され、ＰＣＲ分析によって、完全導入遺伝子発現カセットの存在について試験された。ワクチンベクターは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内で、継代数１３まで増殖された。増殖は、感染の２日後に完全なＣＰＥを与えるようなやり方で実施された。ｒＡｄ３５ウイルスが完全ＣＰＥの２日後に採取された一方で、ｒＡｄ２６ウイルスは完全ＣＰＥの１日後に採取された。ウイルスＤＮＡは、継代２、継代５、継代１０、および継代１３で単離され、導入遺伝子発現カセット側面に位置するプライマーを使用したＰＣＲ分析によって、欠失の不在が試験された。欠失変異体の欠如は、以下のパラメータによって定義された：ＰＣＲ産物のバンドサイズは、陽性対照（ウイルスレスキューのために使用されたプラスミドのＰＣＲ産物）に一致し、予測されたＰＣＲ産物を下回るバンドはない（追加的なバンドが非特異的なＰＣＲ産物であることが示されない限り、それらは陽性対照にも存在するので）。承認されたアッセイ：ＰＣＲ  Ｈ２Ｏ対照においてバンドがない。遺伝的安定性をさらに確認するために、発現カセット＋いくつかのプラーク隣接領域のＰＣＲ産物が配列決定された。
【００８９】
図１Ａに示されるような遺伝子設計を用いた一価ｒＡｄ．Ｅ１または単一挿入ベクターは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞などの産生細胞株における規模拡大のためのいくつかの増殖工程を伴う、大規模製造において、遺伝的に安定していることが知られている。臨床試験または商業規模材料の大規模生産に必要なこれらの増殖工程を模倣するために、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞における形質移入によってアデノウイルスベクターが作製され、プラーク精製によってウイルスクローンが単離された。ウイルス当たり５つのプラークが選択され、Ｔ２５フラスコ内に接種されたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内で、ウイルス集団が連続的に継代された。遺伝的安定性について１つのバッチのみを試験するのとは対照的に、５つのプラークをｐ１３まで並行して連続的に継代することにより、ｒＡｄゲノム安定性のより現実的な評価が可能になる。ｒＡｄベクターのゲノム安定性を評価するこの特定のアプローチは、いくつかの理由から有益である。第１に、ｒＡｄゲノムのいくつかのクローンを見ることで、１つのｒＡｄクローンのみを評価することと比較して、分解能が追加される。アッセイ能力は、いくつかのｒＡｄクローンをｐ１３まで、またはそれすら超えて連続的に継代することでさらに高められ、これは「１つ」のバッチの遺伝的安定性を単に見ることとは比較され得ない。後者は、主に、バッチが場合によっては、「低い」継代数で製造され得るという事実に起因する。最後ではあるが重要さに劣ることなく、Ｅ１発現カセット側方のプライマーを用いて、継代されたｒＡｄゲノムをＰＣＲで分析することにより、アッセイの感度が高まり、これはウイルスＤＮＡの制限酵素消化では見過ごされるかもしれない、ｒＡｄ集団内の小規模な欠失変異体の検出を可能にする。ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＥＢＯＶ、ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶ、ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ、およびｒＡｄ２６．Ｅ１．ＥＢＯＶは、全て、継代１３（ｐ１３）において安定していることが確認され、ＰＣＲ分析によって欠失バンドは判定されなかった（図１Ｃ）。全ての４つのウイルスについて、実際には１０のプラークが試験されたが、図１Ｃの各ウイルスでは、５つのみが示されることに留意されたい。一価ｒＡｄ３５．Ｅ１およびｒＡｄ２６．Ｅ１ベクターの遺伝的安定性結果は、二価アデノウイルスベクターの遺伝的安定性試験の基準点として使用された。
【００９０】
［比較例］実施例２：Ｅ１−Ｅ３ストラテジーを用いたｒＡｄ３５およびｒＡｄ２６二価ベクターの調製および特性決定
二価アデノウイルスベクターを作製する公開されたストラテジーの第１の実施例として、図２に示されるようなＥ１−Ｅ３ストラテジーが試験された。図２Ａは、ｒＡｄ３５およびｒＡｄ２６ベクターの双方について作製されたウイルスベクターの遺伝子設計を示し、その中では、１つの発現カセットがＥ１領域に配置され、追加的な発現カセットがＥ３領域に配置される。ｒＡｄ３５  Ｅ３カセットは、図２Ａに示されるように逆方向に生成された。Ｅ１およびＥ３カセットのどちらも同一のヒトＣＭＶプロモーターを保有するが、異種ポリアデニル化シグナルを有する（Ｖｏｇｅｌｓら，２００７）。第１のウイルスベクターとして、エボラウイルス・ザイール（ＥＢＯＶ）およびエボラウイルス・スーダン・グルー（ＳＥＢＯＶ）に由来するフィロウイルス糖タンパク質をコードするｒＡｄ３５．Ｅ１．ＥＢＯＶ−Ｅ３．ＳＥＢＯＶが、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞への形質移入によって調製され、プラーク精製されて、継代５（ｐ５）、継代１０（ｐ１０）、および継代１５（ｐ１５）における遺伝的安定性試験のために、ウイルス当たり５つのプラークが選択された。図２Ｂは、ｐ５、ｐ１０、およびＰ１５で実施された同一性ＰＣＲの結果を示す。欠失バンドは、Ｅ１／Ｅ３同一性ＰＣＲにおいて、ｐ１０の５つのプラークの内３つで検出される。ｐ１５では、全ての試験されたプラークのウイルス集団の大部分が、Ｅ３の発現カセットの部分欠損を示す。使用された抗原の、または特異的抗原組み合わせの効果を試験するために、いくつかのその他のＥ１−Ｅ３二価アデノウイルスベクターがレスキューされて、遺伝的安定性について試験された。表１は、全ての記載されたＥ１−Ｅ３二価アデノウイルスベクターがレスキューされ得たことを示すが、全ての試験されたベクターは、ＰＣＲ分析に基づいて遺伝的に不安定であった。合計すると、６つのｒＡｄ３５．Ｅ１−Ｅ３修飾ベクターが成功裏にレスキューされたが、Ｅ３同一性ＰＣＲによって試験されたように、全て遺伝的不安定性を示した。対照的に、Ｅ１およびＥ３またはフィロウイルス糖タンパク質およびｅＧＦＰ中にフィロウイルス糖タンパク質のどちらかを含有する２つの試験されたｒＡｄ２６Ｅ１．Ｅ３修飾ベクターは、増殖効率が極度に損なわれ、したがって増殖させるのが困難である。どちらのベクターも同一性ＰＣＲによって試験されると遺伝的不安定性を示した。この遺伝的不安定性は、２つのフィロウイルス糖タンパク質を発現する二価ベクター、および１つのフィロウイルス糖タンパク質とｅＧＦＰとを発現する二価ベクターについて観察された。したがって、観察された遺伝的不安定性は、毒性誘導性淘汰圧に起因するものではない。結論は、図２に示されるようなｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５におけるＥ１−Ｅ３逆転二価ストラテジーは、以前の文献が大規模生産に適していると示唆したにもかかわらず、二価アデノウイルスベクターの大規模生産には適していないということである。可能な説明は、以前の文献報告が限定的試験に基づいており、遺伝的安定性が本明細書に記載されているように徹底的かつ系統的に分析されていないことである。特に、遺伝的安定性を測定するために本研究で使用された発現カセット側方のプ���イマーを用いた拡張継代後のＰＣＲ分析は、アッセイの感度を高め、ｒＡｄゲノムの制限消化などの他の方法を用いて見過ごされるかもしれない、ｒＡｄ集団内の小規模な欠失変異体の検出を可能にすることに留意すべきである。ｒＡｄ５において異種プロモーターを使用する、最近報告されたＥ１−Ｅ３＿ｒｅｖｅｒｓｅストラテジーは、ベクターのレスキュー可能性に関する同様の結果を記載する（Ｓｍａｌｌら，２０１４）。彼らの結果は、異種プロモーターを有する発現カセットの時計回りの５’−３’方向への挿入が、レスキューできなかったことを示す。しかし、逆時計回りの３’−５’方向に挿入された同一発現カセットは、ＨＥＫ２９３細胞内でレスキューされ得るベクターをもたらした。いくつかのベクターの遺伝的安定性はまた、ＨＥＫ２９３細胞上における第１および第１０継代後のウイルスゲノムの制限酵素消化およびゲル電気泳動によっても示された。
【００９１】
［比較例］実施例３：Ｅ１にバイシストロニック発現カセットを有する二価ｒＡｄ３５ベクター調製および特性決定
Ｅ１−Ｆ２Ａストラテジー（図３Ａに示される）は、二価アデノウイルスベクターを作製するための第２のストラテジーとして試験された。この目的を達成するために、２つの遺伝子が、フューリン認識部位と口蹄疫ウイルス由来の自己切断２Ａペプチドとによって隔てられたヒトＣＭＶプロモーターの下流のＥ１領域にクローニングされて、リボソームスキッピングによって隔てられたｍＲＮＡ転写物の転写がもたらされた（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，２００１；Ｓｚｙｍｃｚａｋら，２００４）。３つの異なるウイルスｒＡｄ３５．Ｅ１．ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−Ｌｕｃ、ｒＡｄ３５．Ｅ１．Ｌｕｃ−Ｆ２Ａ−ｅＧＦＰ、およびｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶが作製され、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）内で継代１３まで増殖された。３つの異なるウイルスの５つのプラークがＰＥＲ．Ｃ６細胞内で増殖されて、遺伝的安定性についてＰＣＲ分析によって試験された。ウイルスは、継代１０において遺伝的に安定していたが（データ未掲載）、継代１３（ｐ１３）では、ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶのプラークの内２つが、非常にかすかな欠失バンドを示した（図３Ｂ）。欠失バンドは、高度に露出過度のアガロースゲル写真においてより明瞭に見られ、これらのウイルス集団の一部が、二価発現カセットをｐ１３までに部分的に欠失させたことが確認された。以前試験されたＥ１−Ｅ３二価ストラテジーと比較して、Ｅ１−Ｆ２Ａウイルスベクターは遺伝的に安定であり、継代１０に至るまで欠失バンドがなく、より効率的に増殖させ得た。
【００９２】
したがって、バイシストロニックＥ１−Ｆ２Ａ設計を有するウイルスのさらなる評価を可能にするために、特に、２つの導入遺伝子の発現レベルおよび免疫原性を評価するために、作製されたＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶウイルスのＴ２５材料を使用して、Ｔ１７５組織培養フラスコに接種した。Ｔ１７５粗溶解物の内３〜５ｍｌを使用して、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の７０％コンフルエント層を含有する２０×Ｔ１７５三重層組織培養フラスコに接種した。次に、ウイルスは二段階ＣｓＣｌ精製法を用いて精製され、精製ウイルスは８５℃でアリコート中に保存された。
【００９３】
さらに、ＴａＶ配列、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｓｉｇｎａ）（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｓｉｇｎａ）ウイルスに由来する２Ａ配列および発現ｅＧＦＰおよびルシフェラーゼ、ｒＡｄ３５．Ｅ１．ｅＧＦＰ−ＴａＶ−Ｌｕｃ、ｒＡｄ３５．Ｅ１．Ｌｕｃ−ＴａＶ−ｅＧＦＰを使用して、ウイルスベクターが作製された。ウエスタンブロットによる発現分析は、Ｆ２Ａコンストラクトについて観察されたのと同様の発現低下を示した。遺伝的安定性試験はまた、Ｆ２Ａコンストラクトと同等の結果も示した。このアプローチは、さらに追求されなかった。
【００９４】
遺伝子治療およびワクチン用途のどちらでも、コードされた導入遺伝子の強力な発現が必要条件であり、例えば、ワクチンが十分に免疫原性であるためには、Ｔ細胞および／またはＢ細胞を刺激するための導入遺伝子（抗原）の十分な発現が必要である。図１に提示されるような単一挿入ワクチンベクターは、いくつかの動物モデルおよびヒトにおいて高度に免疫原性であるため、これらの単一挿入ベクターは、生体外アッセイにおける強力な発現のための基準点として使用された。Ａ５４９細胞を細胞当たり１０００、２５００、および５０００ウイルス粒子（ＶＰ／細胞）で、ＣｓＣｌ精製ワクチンベクターに感染させた。導入遺伝子発現は、導入遺伝子特異的一次抗体を用いるウエスタンブロットによって分析された。図３Ｃは、ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶベクターが、ｒｒＡｄ３５．ＭＡＲＶまたはｒＡｄ３５．ＳＥＢＯＶのいずれかの同一ＶＰ／細胞と比較して、双方のコードされた導入遺伝子の導入遺伝子発現低下を駆動することを示す。
【００９５】
フィロウイルス糖タンパク質（ＧＰ）、ＭＡＲＶ、およびＳＥＢＯＶは、表面膜貫通タンパク質であるため、正しい翻訳後修飾および輸送は、免疫原性にとって重要であると考えられる。そのため、ｒＡｄ感染細胞の細胞表面における発現が、ＦＡＣＳ細胞表面発現アッセイで試験された。この目的を達成するために、Ａ５４９細胞をＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶの双方を発現する二価ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶに、および基準対照としての２つの一価ベクターであるｒＡｄ３５．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．ＳＥＢＯＶとの混合物に、感染させた。細胞を漸増量のウイルス（１１１、３３３、および１０００ＶＰ／細胞）に感染させて、感染後４８時間で採取し（４８ｈｐｉ）、各ＧＰに対して産生されたマウス血清を使用して、細胞表面のＧＰを染色した。抗マウスＡＰＣ結合二次抗体を使用して、ＦＡＣＳによる細胞の検出を容易にした。ＡＰＣ陽性細胞の％が計数された。図３Ｄに提示される結果は、ＧＰの正確なプロセッシングおよび輸送が維持されることを示すが、ＦＡＣＳ分析は、ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．ＳＥＢＯＶとの混合物と比較して、ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶの双方の導入遺伝子の発現が低下することもまた確認した。
【００９６】
二価ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶによる、コードされた導入遺伝子に対して誘導された免疫応答を分析するために、２つの一価ベクターであるｒＡｄ３５．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．ＳＥＢＯＶとの混合物を基準対照として用いて、精製ワクチンベクターでマウスが免疫化された。この試験では、１０匹のマウスの実験群に動物が分配された。ベクター当たり１×１０９ベクター粒子（ＶＰ）の単回用量が、筋肉内投与された。２つの単一挿入ベクターを注射された（したがって動物当たり２×１０９ＶＰを投与された）マウスにおける、可能なアジュバント効果を代償するために、ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶが注射された動物には、１×１０９ＶＰのＡｄ３５．ｅｍｐｔｙベクターもまた投与された（したがって全てのマウスには、動物当たり２×１０９の総ＶＰが投与された）。細胞性および体液性の免疫応答の読み取りは、免疫化の８週間後におけるＥＬＩＳＰＯＴおよびＥＬＩＳＡであった。
【００９７】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、脾臓内のＧＰタンパク質特異的ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の相対数を判定するために用いられ、いくつかの適応を加えて、本質的に（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃら，２０１０）に記載されるようにして、実施される。手短に述べると、ＥＬＩＳＰＯＴにおける刺激のために、フィロウイルス抗原当たり、エボラまたはマールブルグフィロウイルス糖タンパク質のどちらかに類似したペプチドを含有するコンセンサスプール；特定の糖タンパク質のＮ末端半分からの残りのペプチドを含有するプール１；特定のフィロウイルス糖タンパク質のＣ末端部分からの残りのペプチドを含有するペプチドであるプール２の３つの異なる１５量体ペプチド貯留が使用された。設計された重複ペプチドは、ｒＡｄベクターによってコードされる糖タンパク質と完全に一致した。１０６個の細胞当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）の数が計算された。
【００９８】
ＧＰ特異的抗体力価の判定のために、ＳＥＢＯＶまたはＭＡＲＶ糖タンパク質特異的マウス抗体ＥＬＩＳＡが使用された。ＥＬＩＳＡ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）が、ＰＢＳ（ｐＨ７．４  Ｇｉｂｃｏ）中の１０μｇ／ｍｌ  Ｌ−ＰＢＳ、レクチンによって、４℃で一晩（ＯＮ）被覆された。引き続いてプレートは、ブロック緩衝液を用いて室温で（ＲＴ）で２時間ブロックされ、ＨＥＫ２９３上清を含有するＰＢＳ希釈ＳＥＢＯＶおよびＭＡＲＶで被覆された。洗浄緩衝液で洗浄した後、希釈した参照標準血清および試験血清が、サンプル緩衝液と共にプレートに（二連で）添加され、室温で１時間インキュベートされた。陰性対照として、未感作マウス血清が採取される。プレートは洗浄緩衝液で再度洗浄され、サンプル緩衝液で希釈された抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰで被覆され、室温で１時間インキュベートされ、製造業者の推奨に従ってＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ）溶液を用いて展開された。１ＭのＨ２ＳＯ４との反応による酵素的停止後、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いてＯＤが４９２ｎｍで測定された。全ての分析は、Ｇｅｎ５ソフトウェアを用いて実施された。試験サンプル中の血清濃度は、以下の包含および排除基準で、ミリリットル当たりのＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ／ｍｌ）で報告された；各サンプルの二重反復試験間のＯＤ変動が＞２０％のサンプルは排除され、未感作血清の平均ＯＤは０．５を下回るべきであり、最終的に血清サンプル当たり少なくとも２回の希釈は、正確なＥＵ／ｍｌを得るためにＯＤが０．５を上回るべきである。
【００９９】
図３Ｅは、各一価ベクターの混合物である基準対照と比較して、ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶによって誘導される細胞性免疫応答を示す。免疫化の８週間後におけるＭＡＲＶに対する細胞性免疫応答はＥＬＩＳＰＯＴによって検出されたが、ＳＥＢＯＶ  ＥＬＩＳＰＯＴでは細胞性免疫応答は検出されなかった。図３Ｆは、ＥＬＩＳＡによって測定された体液性免疫応答を示す。ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶによって誘導される体液性免疫応答は、ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．ＳＥＢＯＶとの混合物によって誘導されるものと比較して低下した。
【０１００】
図３に提示される実験から、二価ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶ導入遺伝子を保有するｒＡｄ３５ベクターが生成され得て、継代１０に至るまで遺伝的に安定であり得ることが明らかであるが、コンストラクト内の１つでは、より高い継代数（ｐ１３）でいくつかの欠失バンドが認められた。さらに、二価ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶ−Ｆ２Ａ−ＳＥＢＯＶによって誘導される導入遺伝子発現および免疫原性は、一価ベクターであるｒＡｄ３５．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．ＳＥＢＯＶとの混合物と比較して、どちらも有意に低下した。したがって、二価に関するＥ１−Ｆ２Ａストラテジーは一価ベクター混合物に劣り、遺伝子治療またはワクチン用途における使用には最適ではないと判定された。
【０１０１】
［比較例］実施例４：Ｅ１中に頭−尾配置の２つの発現カセットを有するｒＡｄ３５二価ベクターの調製および特性決定
二価ｒＡｄベクターを作製する第３のストラテジーとして、２つの発現カセットをＥ１領域に頭−尾配置で挿入できるかどうかが試験された。設計の略図は、図４Ａに示される。２つの遺伝子は、異種プロモーターｍＣＡＧ（遺伝子１）およびｈＣＭＶ（遺伝子２）によって駆動されるＥ１領域にクローン化される。異なるベクター、すなわちｒＡｄ３５．ｍＣＡＧ．Ｌｕｃ−ｈＣＭＶ．ｅＧＦＰおよびｒＡｄ３５．ｍＣＡＧ．ＭＡＲＶ−ｈＣＭＶ．ＳＥＢＯＶが作製され、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）における継代１３までの増殖によって、発現カセットの遺伝的安定性について試験された。各ベクターについて、５つのプラークが試験された。ｒＡｄ３５．ｍＣＡＧ．Ｌｕｃ−ｈＣＭＶ．ｅＧＦＰのプラークの１つは、図４ＢのＰＣＲバンド（レーン２）によって示されるように不安定であることが判明した。対照的に、ｒＡｄ３５．ｍＣＡＧ．ＭＡＲＶ−ｈＣＭＶ．ＳＥＢＯＶは、試験されたいずれのプラークにおいても、このような欠失バンドを示さなかった。
【０１０２】
図４Ｃに示されるように、異種プロモーターによって駆動されるＥ１中に頭−尾導入遺伝子配置を有するｒＡｄからの導入遺伝子発現がウエスタンブロットによって試験され、発現が上述の基準単一挿入ベクターと比較された。Ａ５４９細胞は、１０００、２５００、および５０００（ＶＰ／細胞）で形質導入され、導入遺伝子産生は、抗原特異的一次抗体を用いたウエスタンブロットによって分析された。基準一価ベクターと比較した場合、二価ｒＡｄと同等レベルのＭＡＲＶ導入遺伝子発現があったが、ＳＥＢＯＶ発現のレベルがわずかに低下したことが観察された。
【０１０３】
糖タンパク質導入遺伝子の正確なプロセッシングおよび提示のさらなる調節として、各抗原特異的抗体を用いて、ベクターｒＡｄ３５．ｍＣＡＧ．ＭＡＲＶ−ｈＣＭＶ．ＳＥＢＯＶ形質導入Ａ５４９細胞（１１１、３３３、および１０００ＶＰ／細胞）のＦＡＣＳによる表面染色（陽性細胞の％）が実施された。単一挿入物基準対照であるｒＡｄ３５．ＳＥＢＯＶおよびｒＡｄ３５．ＭＡＲＶとの直接比較は、より高レベルの表面付着ＭＡＲＶを示し、ｒＡｄ３５．ｍＣＡＧ．ＭＡＲＶ−ｈＣＭＶ．ＳＥＢＯＶベクターによって、より低レベルの表面付着ＥＢＯＶが産生された（図４Ｄ）。
【０１０４】
ｒＡｄ３５．ｍＣＡＧ．ＭＡＲＶ−ｈＣＭＶ．ＳＥＢＯＶは、マウスにおける免疫原性についてさらに試験された。群当たり１０匹のマウスが、精製ワクチンベクターの単回用量（１×１０９）によって筋肉内免疫化され、２つの一価ベクターであるｒＡｄ３５．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．ＳＥＢＯＶとの混合物と直接比較された。体液性および細胞性免疫応答が、免疫化の８週間後にＥＬＩＳＰＯＴおよびＥＬＩＳＡによって分析された（図４Ｅ〜Ｆ）。検出されたＭＡＲＶ抗体力価は、対照動物よりもｒＡｄ３５．ｍＣＡＧ．ＭＡＲＶ−ｈＣＭＶ．ＳＥＢＯＶ免疫化マウスでより高かった。対照的に、ＳＥＢＯＶ特異的抗体レベルは、対照動物と比較してｒＡｄ３５．ｍＣＡＧ．ＭＡＲＶ−ｈＣＭＶ．ＳＥＢＯＶ免疫化マウスにおいて低下した。さらに、ｒＡｄ３５．ｍＣＡＧ．ＭＡＲＶ−ｈＣＭＶ．ＳＥＢＯＶによって誘導される、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ抗原の双方に対するＴ細胞応答は、各一価ベクターの混合物で免疫化された対照動物と比較して低下した。したがって、異種プロモーターによって駆動されるＥ１中の二価頭ー尾配置は、一価ベクターの混合物に劣り、したがって、二価頭ー尾配置は、遺伝子治療またはワクチン用途における使用には最適でないと判定された。
【０１０５】
実施例５：マウスＣＭＶＩＥ１／ＩＥ２双方向性プロモーターを保有するアデノウイルスベクター調製および特性決定。
最後に、選択された２つの遺伝子がＥ１領域に挿入され得る、多価ｒＡｄを作製する第４の選択肢が設計された。これまでに考察された設計とは対照的に、抗原は双方向性プロモーター（Ｐｂｉｄｉｒまたはｂｉｄｉｒ）によって駆動され、プロモーターの５’側に逆方向に、３’側に順方向に配置される。目的は、本明細書で均衡のとれた導入遺伝子発現と称される、双方のコードされた導入遺伝子の同様のレベルを発現する双方向性プロモーターを見出すことであったので、いくつかの異なる双方向性プロモーター設計が、導入遺伝子発現の効力および均衡について試験された（図５）。最初に、ＨＥＫ２９３細胞内のｐＡｄａｐｔ３５プラスミドの一過性形質移入と、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）およびｅＧＦＰ発現レベルの分析によって、ｂｉｄｉｒ１〜３と称される３つの異なる双方向性プロモーターが、効力および均衡について試験された。Ｐ  ｂｉｄｉｒ１、Ｐ  ｂｉｄｉｒ２、およびＰ  ｂｉｄｉｒ３の設計は無関係であり、強力な双方向性プロモーターを同定するために作製された。Ｐ  ｂｉｄｉｒ３が天然の双方向性マウスＣＭＶプロモーターをベースとしている一方で、Ｐ  ｂｉｄｉｒ１およびＰ  ｂｉｄｉｒ２は、１つのエンハンサー配列のみが存在する頭−頭配置にある、技術分野で公知の遍在的に強力なプロモーターを用いた、合成双方向性プロモーター設計である（Ａｍｅｎｄｏｌａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００５）。レポーター遺伝子であるｅＧＦＰおよびＬｕｃは、プロモーターの５’または３’側のどちらかに配置され（図５Ａに示される）、各レポーター遺伝子発現について比較された。各プロモーターおよびレポーター遺伝子の組み合わせについて記録された相対ｅＧＦＰ平均蛍光強度（ＭＦＩ）およびルシフェラーゼ相対光単位（ＲＬＵ）が、ＨＥＫ２９３細胞（一過性形質移入）およびＡ５４９細胞（ウイルス感染）において測定された。ルシフェラーゼ活性は、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ（商標）Ａｓｃｅｎｔマイクロプレート照度計内において、０．１％ＤＴＴ（１Ｍ）の存在下で、細胞溶解物中で測定された。ｅＧＦＰ蛍光は、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）内において、トリプシン処理、遠心分離、そして細胞ペレットをＰＢＳ／１％ＦＢＳ（非ウイルス物質）またはＣｅｌｌＦｉｘ（ウイルス物質）に再懸濁することにより、測定された。
【０１０６】
ＨＥＫ２９３細胞内の一過性レポーター遺伝子発現は、ｂｉｄｉｒ３プロモーターが最も強力かつ均衡のとれたプロモーターであることを例証する。ｂｉｄｉｒ１およびｂｉｄｉｒ２プロモーターと直接比較した場合、ＬｕｃおよびｅＧＦＰの最も均衡のとれた発現がｂｉｄｉｒ３プロモーターで認められた。効力に関しては、ｂｉｄｉｒ１プロモーターおよびｂｉｄｉｒ２プロモーターはどちらも、ｂｉｄｉｒ３プロモーターで記録されたレポーター遺伝子発現レベルを下回った（図５Ｂ）。
【０１０７】
ＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入によって得られた結果を確認するために、ｒＡｄ３５．ｅＧＦＰ−ｂｉｄｉｒ３−ＬｕｃおよびｒＡｄ３５．Ｌｕｃ−ｂｉｄｉｒ３−ｅＧＦＰアデノウイルスベクターが作製されて、１０００ＶＰ／細胞で感染させたＡ５４９細胞内でレポーター遺伝子の発現が試験された（図５Ｃ）。ｂｉｄｉｒ３二重挿入ベクターと各単一挿入対照の間の直接レポーターｅＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼ発現の比較は、プロモーター対する位置に関わりなく、同等のレベルのｅＧＦＰを示す。一方、ルシフェラーゼ遺伝子が、プロモーターの５’側と比較して３’側に位置する場合、ルシフェラーゼ発現はより高い。それでもなお、ｂｉｄｉｒ３二重挿入ベクターについて記録されたレポーター遺伝子発現レベルは、単一挿入ベクター対照について記録されたレベルを上回り、ｂｉｄｉｒ３がより強力なプロモーターであることが示唆される（図５Ｃ）。
【０１０８】
したがって、双方向性マウスＣＭＶプロモーターを有するｒＡｄは、２つの導入遺伝子ｅＧＦＰおよびＬｕｃの発現レベルに関して、以前に報告された二価ｒＡｄより優れていると判定された。さらに、ｂｉｄｉｒ３双方向性プロモーターを有するｒＡｄからの２つの導入遺伝子の発現もまた、試験された基準一価ベクターよりも優れていた。したがって、ｂｉｄｉｒ３双方向性プロモーターを有するｒＡｄは、導入遺伝子の発現レベルに関して、遺伝子治療またはワクチン用途で使用するのに適すると判定された。
【０１０９】
ｍＣＭＶ  ＩＥ１／ＩＥ２プロモーターの代表的な設計は図６に示され、配列および対応する注釈が、重ねられた矢印で示される。ｍＣＭＶ  ＩＥ１／ＩＥ２コア配列は、発現を両方向に駆動する２つのＭＩＥ１およびＭＩＥ２エンハンサー配列を含む。さらに、配列は、どちらもヒトＡｐｏＥ１およびキメライントロン配列で挟まれた、２つのＴＡＴＡボックスおよび２つの転写開始部位（ＴＳＳ）を含む（図５Ｄおよび６参照）。イントロン（ｂｉｄｉｒ３）を含むｍＣＭＶ双方向性プロモーター配列の代表的な配列は、配列番号１として提供され、イントロンを除くｍＣＭＶ双方向性プロモーター配列の代表的な配列は、配列番号２として提供される。
【０１１０】
実施例６：ｍＣＭＶ双方向性発現カセットを有するｒＡｄ３５二価ベクターの調製および特性決定
選択されたｍＣＭＶ双方向性プロモーターは、挿入された遺伝子の方向およびｒＡｄ３５ベクターゲノムにおける位置を示す、図７Ａに概略的に示される。異なるｒＡｄ３５ベクターが、ｐ１３に至るまでのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内の遺伝的安定性、抗原の発現レベル（全発現および表面発現）、およびマウスにおける免疫原性について試験された（図７）。
【０１１１】
異なるｒＡｄベクターもまた、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内のレスキュー可能性、およびｐ１３での遺伝的安定性について評価された。データは、表２に要約される。遺伝的安定性は、５つのプラークのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）におけるｐ１３に至るまでの継代によって、各ベクターについて評価された。全てのベクターは、ｐ１３で遺伝的に安定していることが分り、欠失バンドはなかった（図７Ｂ）。図７Ｂのデータは、ｒＡｄ３５．ｅＧＦＰ−ｍＣＭＶ−Ｌｕｃ、ｒＡｄ３５．Ｌｕｃ−ｍＣＭＶ−ｅＧＦＰ、およびｒＡｄ３５．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶの３つのベクターの代表的なセットであり、ウイルスＤＮＡは継代１３（ｐ１３）で単離され、ＰＣＲはＥ１発現カセット側方のプライマーを使用して実施された。
【０１１２】
引き続いて、ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶの発現レベルが、抗ＭＡＲＶおよび抗ＳＥＢＯＶ抗体を用いて、全発現（ウエスタンブロット、図７Ｃ）および表面発現（ＦＡＣＳ、図７Ｄ）の双方について評価された。ＳＥＢＯＶおよびＭＡＲＶの全発現レベルを評価するために、Ａ５４９を１０００、２５００、および５０００ＶＰ／細胞で感染させて、単一挿入ベクターであるｒＡｄ３５．Ｅ１ＭＡＲＶまたはｒＡｄ３５．ＳＥＢＯＶと直接比較した。ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶとｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶの間に、ＭＡＲＶの全タンパク質レベルの明らかな差は観察されなかった。対照的に、ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶから発現されたＳＥＢＯＶについて検出されたタンパク質レベルは、単一挿入対照ｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶを超えた（図７Ｃ）。細胞表面の抗原ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶの発現は、Ａ５４９細胞を１１１、３３３、および１０００ＶＰ／細胞で、ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶに、またはｒＡｄ３５．Ｅ１ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．Ｅ１ＳＥＢＯＶとの混合物に感染させ、ＦＡＣＳ内で感染後４８時間（４８ｈｐｉ）のＭＡＲＶまたはＳＥＢＯＶ陽性細胞（％）を分析することで試験された。一価ベクターの対照混合物と比較して、ＦＡＣＳ内における抗ＭＡＲＶ染色および抗ＳＥＢＯＶ染色はどちらも、ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶで陽性細胞のより高い百分率を示した（図７Ｄ）。
【０１１３】
次に、ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶ（２×１０９ＶＰ）の免疫原性が、誘導されたＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ特異的Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答を調べることで、それぞれの単一挿入対照であるｒＡｄ３５．Ｅ１．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．Ｅ１．ＳＥＢＯＶとの混合物（２×１０９ＶＰ）と直接比較された（それぞれ図７ＥおよびＦ）。図７ＥのＥＬＩＳＰＯＴ結果は、免疫化の８週間後のマウス脾細胞内の１０６（ＳＦＵ／１０６）当たりのスポット形成単位における、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ陽性Ｔ細胞画分を表す。ＳＥＢＯＶ誘導Ｔ細胞応答は、単一挿入ベクターであるｒＡｄ３５．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．ＳＥＢＯＶとの混合物よりも、ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶで免疫化されたマウス群でより高かった（図７Ｅ）。二重挿入Ａｄ３５．ＭＡＲＶＡ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶで免疫化されたマウス群のＭＡＲＶ誘導Ｔ細胞応答は、ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．ＳＥＢＯＶとの混合物に劣らなかった（図７Ｅ）。対応するＳＥＢＯＶおよびＭＡＲＶ特異的Ｂ細胞応答がＥＬＩＳＡ中で測定され、ｍｌ当たりのＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ／ｍｌ）として表された。ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ特異的Ｂ細胞応答はどちらも、ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶとｒＡｄ３５．ＳＥＢＯＶとの単一挿入混合物と比較して、二重挿入ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶで免疫化されたマウス群でより高かった（図７Ｆ）。
【０１１４】
したがって、ｒＡｄ３５．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶについて上に提示された結果によれば、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶを発現する双方向性マウスＣＭＶプロモーターを有するｒＡｄ３５は、遺伝的安定性、２つの導入遺伝子の発現レベル、および免疫原性に関して、以前報告された二価ｒＡｄより優れていると判定された。さらに、双方向性マウスＣＭＶプロモーターを有するｒＡｄ３５は、双方の抗原に対する顕著なＴ細胞応答およびＢ細胞免疫応答を生じるための双方の導入遺伝子の十分な発現レベルを提供すると判定された。したがって、双方向性マウスＣＭＶプロモーターを有するｒＡｄ３５は、遺伝的安定性、導入遺伝子の発現レベル、および発現抗原の免疫原性に関して、遺伝子治療およびワクチン用途で使用するのに適していると判定された。
【０１１５】
実施例７：ｍＣＭＶ双方向性発現カセットを使用したｒＡｄ２６二価ベクターの調製および特性決定
ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ抗原（ＭＡＲＶ．ｍＣＭＶ．ＳＥＢＯＶ）を含有する二価の双方向性プロモーター発現カセットが、遺伝的安定性、２つの抗原の発現レベル（全および表面）、およびマウスにおけるコードされた抗原に対する免疫原性について、ｒＡｄ２６において広範に試験された。ｒＡｄ２６の全体的な設計は、発現カセットがＥ１領域に配置され、各抗原が中央に配置された双方向性ｍＣＭＶプロモーター（図８Ａ）によって制御されるｒＡｄ３５設計に従う。遺伝的安定性試験のために、ｒＡｄ２６．ＭＡＲＶ．ｍＣＭＶ．ＳＥＢＯＶは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）において１３継代（ｐ１３）に至るまで継代された。ウイルスＤＮＡはｐ１３で単離され、双方向性導入遺伝子発現カセット側方のプライマーを用いて、ＰＣＲによってＥ１における潜在的欠失について分析された（図８Ｂ）。試験されたプラークにおいて欠失バンドは検出されず、ｒＡｄ２６．ＭＡＲＶ．ｍＣＭＶ．ＳＥＢＯＶの良好な遺伝的安定性プロファイルが示唆された。さらに、ｐ１３プラークのＰＣＲ産物が配列決定され、配列決定は、変異および停止コドンの不在を確認した。したがって、ＰＣＲ分析および配列決定に基づいて、ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶは遺伝的に安定している。
【０１１６】
ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ．ｍＣＭＶ．ＳＥＢＯＶ中でコードされたＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ抗原の全タンパク質発現レベルは、Ａ５４９細胞を１００００、２５０００、および５００００ＶＰ／細胞で感染させ、細胞を４８ｈｐｉで溶解し、ウエスタンブロットにおいて抗ＭＡＲＶまたは抗ＳＥＢＯＶ抗体で染色することで評価された（図８Ｃ）。二重挿入ベクターからのタンパク質発現は、単一挿入ベクターであるｒＡｄ２６．Ｅ１．ＳＥＢＯＶおよびｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶと直接比較された。抗ＭＡＲＶによる染色は、ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶと比較した場合、二重挿入ベクターｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ．ｍＣＭＶ．ＳＥＢＯＶに感染させた細胞におけるＭＡＲＶ発現の低下を示した。一方、単一挿入対照ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶと比較した場合、ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ．ｍＣＭＶ．ＳＥＢＯＶに感染させた細胞では、ＳＥＢＯＶの量の増大が検出された（図８Ｃ）。
【０１１７】
ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ抗原の表面発現は、Ａ５４９細胞を１０００００、２００００、４０００、および８００ＶＰ／細胞で感染させ、感染後４８時間（４８ｈｐｉ）で抗ＭＡＲＶまたは抗ＳＥＢＯＶで染色し、ＦＡＣＳによってＭＡＲＶまたはＳＥＢＯＶパーセント（％）陽性細胞を分析することで評価された（図４Ｄ）。Ａ５４９溶解物中に観察されたＭＡＲＶ発現の差は、ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ．ｍＣＭＶ．ＳＥＢＯＶに感染させたＡ５４９細胞のＦＡＣＳ分析では検出されなかった。ここでは、全タンパク質発現についてウエスタンブロットで見られたものとは対照的に、ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ．ｍＣＭＶ．ＳＥＢＯＶおよびｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶに感染した細胞の表面に、等量のＭＡＲＶが検出された（図８Ｄ）。さらに、ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ．ｍＣＭＶ．ＳＥＢＯＶおよびｒＡｄ２６．Ｅ１．ＳＥＢＯＶに感染させた細胞内の表面発現ＳＥＢＯＶの量の間に、差は観察されなかった。細胞表面のＳＥＢＯＶ発現に関するＦＡＣＳの結果は、ウエスタンブロットにおける全タンパク質染色と一致した（図８ＣおよびＤ）。
【０１１８】
ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ．ｍＣＭＶ．ＳＥＢＯＶの免疫原性効力は、ＥＬＩＳＰＯＴおよびＥＬＩＳＡアッセイをそれぞれ用いて、ＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ特異的Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答を誘導する、二価ベクターの能力と、単一挿入ベクター混合物の能力とを比較することで評価された。双方のアッセイでは、群当たり１２匹のマウスが、１×１０９ＶＰのｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶで、または１×１０９ＶＰのｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶと１×１０９ＶＰのｒＡｄ２６．Ｅ１．ＳＥＢＯＶとの混合物で、筋肉内（ＩＭ）免疫化された。合計２×１０９ＶＰの単一インサート組合せを投与された群の可能なアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）効果を考慮して、１×１０９ＶＰのＡｄ２６．ｅｍｐｔｙベクターが、ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶと共に同時注射された。陰性対照として、５匹のマウスの２つの群に、合計２×１０９ＶＰのＡｄ２６．ｅｍｔｐｙが投与された。ワクチン接種に先だって、マウスは採血もされて未感作血清が作製された（データ未掲載）。ＥＬＩＳＰＯＴおよびＥＬＩＳＡアッセイ結果は、それぞれ、図８ＥおよびＦとして示される。
【０１１９】
ＥＬＩＳＰＯＴによってスポット形成単位／１０６個の脾細胞（ＳＦＵ／１０６）で測定されたＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ特異的Ｔ細胞応答は、二重挿入ベクターと単一挿入ベクター混合物との間にいくらかの差を示したが、その差は、２×１０９ＶＰのより低用量でのみ有意であった。２×１０９ＶＰのｒＡｄ２６．Ｅ１．ＳＥＢＯＶとｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲとの混合物のより低用量で免疫化されたマウス群では、同一用量のｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ．ｍＣＭＶ．ＳＥＢＯＶと比較して、ＭＡＲＶ特異的（ｐ＜０．０１）およびＳＥＢＯＶ特異的（ｐ＜０．０５）Ｔ細胞応答が有意に高かった。しかし、これらの差は、より高い２×１０１０ＶＰ用量のベクターで免疫化されたマウスにおけるＭＡＲＶまたはＳＥＢＯＶ特異的Ｔ細胞応答では、観察されなかった。さらに、二重挿入ベクターは、双方の抗原に対して強力なＴ細胞応答を提供した（図８Ｅ）。
【０１２０】
ＥＬＩＳＡデータに基づいて、単一挿入ベクター混合物と比較して、二重挿入ベクターのＢ細胞応答にもいくらかの差があったが、差はＭＡＲＶでのみ見られた。ＳＥＢＯＶについては、異なるベクターのいずれかの用量で免疫化されたマウスにおけるＳＥＢＯＶ抗体のレベルに、有意差はなかった（図８Ｆ）。ＭＡＲＶ特異的Ｂ細胞応答では、同一用量の二重挿入ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ．ｍＣＭＶ．ＳＥＢＯＶと比較して、ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＳＥＢＯＶとｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶとの単一挿入物を含有する混合物のいずれかの用量で免疫化されたマウスで、有意により高い（ｐ＜０．０１）ＩｇＧレベル（ｍｌ当たりＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ／ｍｌ））があった（図８Ｆ）。しかしここでもまた、ＥＬＩＳＡは、二重挿入ベクターが強力なＢ細胞応答を提供することを示した。
【０１２１】
したがって、導入遺伝子の表面発現のＦＡＣＳ分析、および免疫原性を測定するためのＥＬＩＳＰＯＴおよびＥＬＩＳＡアッセイからのデータによれば、二重挿入ベクターｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ．ｍＣＭＶ．ＳＥＢＯＶは、強力な発現、そしてＭＡＲＶおよびＳＥＢＯＶ抗原の双方に対する強力なＴ細胞およびＢ細胞免疫応答を提供すると判定された。単一挿入ベクター混合物と比較して、二重挿入ベクターを有する抗原にいくらかの差が検出されたが、ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ．ｍＣＭＶ．ＳＥＢＯＶは２つの導入遺伝子の表面発現を高レベルで提供し、強力なＴ細胞およびＢ細胞応答を誘導した。さらに、ＰＣＲ分析および配列決定に基づいて、ｒＡｄ２６．Ｅ１．ＭＡＲＶ−ｍＣＭＶ−ＳＥＢＯＶは遺伝的に安定していた。したがって、双方向性マウスＣＭＶプロモーターを有するｒＡｄ３５と同様に、双方向性マウスＣＭＶプロモーターを有するｒＡｄ２６は、遺伝的安定性、導入遺伝子発現、および発現抗原の免疫原性ついて、遺伝子治療およびワクチン用途で使用するのに適していると判定された。
【０１２２】
結論
上述のように、異なるフィロウイルス糖タンパク質、ならびにレポーター遺伝子（ｅＧＦＰおよびルシフェラーゼ）を含有する、多数のｍＣＭＶ双方向性プロモーターベクター、ｒＡｄ３５およびｒＡｄ２６が、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内の遺伝的安定性、導入遺伝子タンパク質の発現（全および表面）、およびＴ細胞応答およびＢ細胞応答の双方に関する抗原の免疫原性について試験された。試験されたベクターの数、各ベクターについて５つ以上のプラークが試験されたこと、ならびにＥ１発現カセットＰＣＲ分析の遺伝的安定性に対する感度を考慮すると、双方向性ｍＣＭＶプロモーターを有する本発明のｒＡｄは、ｐ１３で欠失バンドがなく、遺伝的に安定していると判定された。さらに、導入遺伝子発現のＦＡＣＳ分析、およびＴ細胞応答およびＢ細胞応答に関する発現抗原の免疫原性のＥＬＩＳＰＯＴおよびＥＬＩＳＡ分析に基づいて、双方向性プロモーターを有する本発明のｒＡｄは、遺伝子治療およびワクチン用途で使用するのに適すると判定された。したがって、ｍＣＭＶ双方向性プロモーターを有する本発明のｒＡｄは、当該技術分野で以前に記載された二価ｒＡｄベクターと比較して、顕著な改善を提供する。
【０１２３】
【表１】
0006735288.tif 000002
【０１２４】
【表２】
0006735288.tif 000003
以下の態様を包含し得る。
［１］  第１の導入遺伝子と一方向で、第２の導入遺伝子と逆方向で、作動可能に連結された双方向性マウスＣＭＶ（ｍＣＭＶ）プロモーターを含んでなる、組換えアデノウイルス。
［２］  前記プロモーターの３’および前記第１の導入遺伝子の５’に位置するイントロンと、前記プロモーターの３’および前記第２の導入遺伝子の５’に位置するイントロンとをさらに含んでなる、上記［１］に記載の組換えアデノウイルス。
［３］  前記アデノウイルスがＥ１領域に欠失を有する、上記［１］〜［２］のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
［４］  前記第１および第２の導入遺伝子が異なり、それらの少なくとも１つが抗原をコードする、上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
［５］  前記アデノウイルスがヒトアデノウイルス血清型３５またはヒトアデノウイルス血清型２６である、上記［１］〜［４］のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
［６］  ａ）第１の導入遺伝子と一方向で、第２の導入遺伝子と逆方向で作動可能に連結された双方向性ｍＣＭＶプロモーターを含んでなるコンストラクトを調製するステップと；
ｂ）前記コンストラクトを前記組換えアデノウイルスのゲノム内へ組み込むステップと
を含んでなる、前記アデノウイルスが標的細胞に感染すると、それぞれ強力に発現される第１および第２の導入遺伝子を含んでなる、遺伝的に安定な組換えアデノウイルスを製造する方法。
［７］  前記コンストラクトが、前記プロモーターの３’および前記第１の導入遺伝子の５’に位置するイントロンと、前記プロモーターの３’および前記第２の導入遺伝子の５’に位置するイントロンとをさらに含んでなる、上記［６］に記載の方法。
［８］  前記組換えアデノウイルスが、そのゲノムのＥ１領域に欠失を有する、上記［６］または［７］に記載の方法。
［９］  前記第１および第２の導入遺伝子が異なり、それらの少なくとも１つが抗原をコードする、上記［６］〜［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］  前記組換えアデノウイルスが、ヒトアデノウイルス血清型３５またはヒトアデノウイルス血清型２６である、上記［６］〜［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］  上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクターを細胞に提供するステップを含んでなる、細胞内で少なくとも２つの導入遺伝子を発現させる方法。
［１２］  上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクターを対象に投与するステップを含んでなる、少なくとも２つの抗原に対する免疫応答を誘導する方法。
［１３］  上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスのゲノムを含んでなる、組換えＤＮＡ分子。
［１４］  上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスと、薬学的に許容できる担体または賦形剤とを含んでなる医薬組成物。
【０１２５】
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ＷＯ２００７１００９０８Ａ２（９／７／２００７）．“ＣＨＩＭＥＲＩＣ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＡＬ  ＶＥＣＴＯＲＳ”．ＴＵＣＫＥＲ，Ｓｅａｎ，Ｎ．
ＷＯ２００７１０４７９２Ａ２（９／２０／２００７）．“ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳＥＳ  ＢＡＳＥＤ  ＯＮ  ＳＥＲＯＴＹＰＥ  ２６  ＡＮＤ  ４８，ＡＮＤ  ＵＳＥ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＢＡＲＯＵＣＨ，Ｄａｎ  Ｈ．；ＨＡＶＥＮＧＡ，Ｍｅｎｚｏ  Ｊａｎｓ  Ｅｍｋｏ
ＷＯ２００７１１０４０９Ａ１（１０／４／２００７）．“ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＣＯＭＰＲＩＳＩＮＧ  Ａ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＡＮＤ  ＡＮ  ＡＤＪＵＶＡＮＴ”．ＨＡＶＥＮＧＡ，Ｍｅｎｚｏ  Ｊａｎｓ  Ｅｍｋｏ；ＲＡＤＯＳＥＶＩＣ，Ｋａｔａｒｉｎａ
ＷＯ２００９０２６１８３Ａ１（２／２６／２００９）．“ＵＳＥ  ＯＦ  ＣＨＩＭＥＲＩＣ  ＨＩＶ／ＳＩＶ  ＧＡＧ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＴＯ  ＯＰＴＩＭＩＺＥ  ＶＡＣＣＩＮＥ−ＩＮＤＵＣＥＤ  Ｔ  ＣＥＬＬ  ＲＥＳＰＯＮＳＥＳ  ＡＧＡＩＮＳＴ  ＨＩＶ  ＧＡＧ”．ＮＡＢＥＬ，Ｇａｒｙ，Ｊ．；ＹＡＮＧ，Ｚｈｉ−Ｙｏｎｇ；ＳＨＩ，Ｗｅｉ；ＢＡＲＯＵＣＨ，Ｄａｎ，Ｈ．
ＷＯ２００９１１７１３４Ａ２（９／２４／２００９）．“ＡＥＲＯＳＯＬＩＺＥＤ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＥ”．ＲＯＥＤＥＲＥＲ，Ｍａｒｉｏ；ＲＡＯ，Ｓｒｉｎｉｖａｓ；ＮＡＢＥＬ，Ｇａｒｙ，Ｊ．；ＡＮＤＲＥＷＳ，Ｃｈａｒｌａ，Ａｎｎｅ
ＷＯ２０１００８５９８４Ａ１（８／５／２０１０）．“ＳＩＭＩＡＮ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ−ＡＮＤ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤ−ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ，ＶＥＣＴＯＲＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＳＡＭＥ，ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＣＯＬＬＯＣＡ，Ｓｔｅｆａｎｏ；ＮＩＣＯＳＩＡ，Ａｌｆｒｅｄｏ；ＣＯＲＴＥＳＥ，Ｒｉｃｃａｒｄｏ；ＡＭＭＥＮＤＯＬＡ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ；ＡＭＢＲＯＳＩＯ，Ｍａｒｉａ
ＷＯ２０１００８６１８９Ａ２（８／５／２０１０）．“ＳＩＭＩＡＮ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ−ＡＮＤ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤ−ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ，ＶＥＣＴＯＲＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＳＡＭＥ，ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＣＯＬＬＯＣＡ，Ｓｔｅｆａｎｏ；ＮＩＣＯＳＩＡ，Ａｌｆｒｅｄｏ；ＣＯＲＴＥＳＥ，Ｒｉｃｃａｒｄｏ；ＡＭＭＥＮＤＯＬＡ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ；ＡＭＢＲＯＳＩＯ，Ｍａｒｉａ
ＷＯ２０１００９６５６１Ａ１（８／２６／２０１０）．“ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＨＩＶ／ＳＩＶ  ＧＡＧ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＮＡＢＥＬ，Ｇａｒｙ  Ｊ．；ＹＡＮＧ，Ｚｈｉ−ｙｏｎｇ；ＳＨＩ，Ｗｅｉ；ＢＡＲＯＵＣＨ，Ｄａｎ  Ｈ．
ＷＯ２０１１０４５３７８Ａ１（４／２１／２０１１）．“ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＰＡＲＴＩＣＬＥＳ”．ＤＥ  ＶＯＣＨＴ，Ｍａｒｃｅｌ，Ｌｅｏ；ＶＥＥＮＳＴＲＡ，Ｍａｒｌｏｅｓ
ＷＯ２０１１０４５３８１Ａ１（４／２１／２０１１）．“ＰＲＯＣＥＳＳ  ＦＯＲ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＦＲＯＭ  ＨＩＧＨ  ＣＥＬＬ  ＤＥＮＳＩＴＹ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ”．ＤＥ  ＶＯＣＨＴ，Ｍａｒｃｅｌ，Ｌｅｏ；ＶＥＥＮＳＴＲＡ，Ｍａｒｌｏｅｓ
ＷＯ２０１３１３９９１１Ａ１（９／２６／２０１３）．“ＶＡＣＣＩＮＥ  ＡＧＡＩＮＳＴ  ＲＳＶ”．ＲＡＤＯＳＥＶＩＣ，Ｋａｔａｒｉｎａ；ＣＵＳＴＥＲＳ，Ｊｅｒｏｍｅ  Ｈ．Ｈ．Ｖ．；ＶＥＬＬＩＮＧＡ，Ｊｏｒｔ；ＷＩＤＪＯＪＯＡＴＭＯＤＪＯ，Ｍｙｒａ  Ｎ．
ＷＯ２０１３１３９９１６Ａ１（９／２６／２０１３）．“ＶＡＣＣＩＮＥ  ＡＧＡＩＮＳＴ  ＲＳＶ”．ＲＡＤＯＳＥＶＩＣ，Ｋａｔａｒｉｎａ；ＣＵＳＴＥＲＳ，Ｊｅｒｏｍｅ  Ｈ．Ｈ．Ｖ．；ＶＥＬＬＩＮＧＡ，Ｊｏｒｔ；ＷＩＤＪＯＪＯＡＴＭＯＤＪＯ，Ｍｙｒａ，Ｎ．
【０１２８】
その他の参考文献：
書籍
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【０１２９】
学術誌
Ａｂｂｉｎｋ，Ｐ．，Ｌｅｍｃｋｅｒｔ，Ａ．Ａ．，Ｅｗａｌｄ，Ｂ．Ａ．，Ｌｙｎｃｈ，Ｄ．Ｍ．，Ｄｅｎｈｏｌｔｚ，Ｍ．，Ｓｍｉｔｓ，Ｓ．，．．．Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．（２００７）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｅｒｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉｘ  ｒａｒｅ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ  Ｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，８１（９），４６５４−４６６３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２６９６−０６
Ａｂｒａｈａｍｓｅｎ，Ｋ．，Ｋｏｎｇ，Ｈ．Ｌ．，Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ，Ａ．，Ｂｒｏｕｇｈ，Ｄ．，Ｌｉｚｏｎｏｖａ，Ａ．，Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．，＆  Ｆａｌｃｋ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｅ．（１９９７）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ７ａ  Ｅ１Ａ−ｖｅｃｔｏｒ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７１（１１），８９４６−８９５１．
Ａｍｅｎｄｏｌａ，Ｍ．，Ｖｅｎｎｅｒｉ，Ｍ．Ａ．，Ｂｉｆｆｉ，Ａ．，Ｖｉｇｎａ，Ｅ．，＆  Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．（２００５）．Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｄｕａｌ−ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３（１），１０８−１１６．
Ｂａｎｇａｒｉ，Ｄ．Ｓ．，＆  Ｍｉｔｔａｌ，Ｓ．Ｋ．（２００６）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２４（７），８４９−８６２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２００５．０８．１０１
Ｂｅｌｏｕｓｏｖａ，Ｎ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｒ．，Ｚｉｎｎ，Ｋ．，Ｒｈｏｄｅｓ−Ｓｅｌｓｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｋｏｔｏｖ，Ａ．，Ｋｏｔｏｖａ，Ｏ．，．．．Ａｌｖａｒｅｚ，Ｒ．Ｄ．（２００６）．Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｅｖｅｎｔｓ  ｅｎｃｏｕｎｔｅｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｇｒａｄｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７０（５），１４８８−１４９３．
Ｂｒｏｕｇｈ，Ｄ．Ｅ．，Ｌｉｚｏｎｏｖａ，Ａ．，Ｈｓｕ，Ｃ．，Ｋｕｌｅｓａ，Ｖ．Ａ．，＆  Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉ．（１９９６）．Ａ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ  Ｅ１  ａｎｄ  Ｅ４．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７０（９），６４９７−６５０１．
Ｃｏｈｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｘｉａｎｇ，Ｚ．Ｑ．，Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，＆  Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２００２）．Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ＣＶ−６８  ａｄａｐｔｅｄ  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８３（Ｐｔ  １），１５１−１５５．
ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ，Ｐ．，Ｌｕｋｅ，Ｇ．Ａ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｄ．，＆  Ｒｙａｎ，Ｍ．Ｄ．（２０１０）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ２Ａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ’ｃｌｅａｖａｇｅ’  ｏｆ  ｃｅｒｔａｉｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｅａｒｉｎｇ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ，５（２），２１３−２２３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｏｔ．２００９００１３４
Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｍ．Ｌ．，Ｈｕｇｈｅｓ，Ｌ．Ｅ．，Ｌｕｋｅ，Ｇ．，Ｍｅｎｄｏｚａ，Ｈ．，ｔｅｎ  Ｄａｍ，Ｅ．，Ｇａｎｉ，Ｄ．，＆  Ｒｙａｎ，Ｍ．Ｄ．（２００１）．Ｔｈｅ  ’ｃｌｅａｖａｇｅ’  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ２Ａ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ’２Ａ−ｌｉｋｅ’  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８２（Ｐｔ  ５），１０２７−１０４１．
Ｆａｌｌａｕｘ，Ｆ．Ｊ．，Ｂｏｕｔ，Ａ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｌｄｅ，Ｉ．，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｗｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｊ．，Ｈｅｈｉｒ，Ｋ．Ｍ．，Ｋｅｅｇａｎ，Ｊ．，．．．Ｈｏｅｂｅｎ，Ｒ．Ｃ．（１９９８）．Ｎｅｗ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎ  １−ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，９（１３），１９０９−１９１７．
Ｆａｒｉｎａ，Ｓ．Ｆ．，Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，Ｘｉａｎｇ，Ｚ．Ｑ．，Ｒｕｘ，Ｊ．Ｊ．，Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｒ．Ｍ．，Ａｌｖｉｒａ，Ｍ．Ｒ．，．．．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２００１）．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７５（２３），１１６０３−１１６１３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７５．２３．１１６０３−１１６１３．２００１
Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，Ｅｎｇｄａｈｌ，Ｒ．Ｋ．，＆  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０００）．Ａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｙｉｅｌｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ１−ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１１（１），２１３−２１９．ｄｏｉ：１０．１０８９／１０４３０３４００５００１６２８３
Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｔ．Ｗ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｍ．，Ｈｅｎｓｌｅｙ，Ｌ．，Ａｓｉｅｄｕ，Ｃ．，Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｊ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｄ．，．．．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｎ．Ｊ．（２０１１）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２６（Ａｄ２６）ａｎｄ  Ａｄ３５  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂｙｐａｓｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  Ａｄ５  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，８５（９），４２２２−４２３３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２４０７−１０
Ｇｏｅｒｋｅ，Ａ．Ｒ．，Ｔｏ，Ｂ．Ｃ．，Ｌｅｅ，Ａ．Ｌ．，Ｓａｇａｒ，Ｓ．Ｌ．，＆  Ｋｏｎｚ，Ｊ．Ｏ．（２００５）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，９１（１），１２−２１．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．２０４０６
Ｈａｒｒｏ，Ｃ．Ｄ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｍ．Ｎ．，Ｌａｌｌｙ，Ｍ．Ａ．，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．Ｄ．，Ｅｄｕｐｕｇａｎｔｉ，Ｓ．，Ｇｏｅｐｆｅｒｔ，Ｐ．Ａ．，．．．Ｍｅｈｒｏｔｒａ，Ｄ．Ｖ．（２００９）．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｎｅａｒ−ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ＨＩＶ  ｔｙｐｅ  １  ｃｌａｄｅ  Ｂ  ｇａｇ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔｓ．ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，２５（１），１０３−１１４．
Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．，Ｖｏｇｅｌｓ，Ｒ．，Ｚｕｉｊｄｇｅｅｓｔ，Ｄ．，Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ，Ｋ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．，Ｓｉｅｕｗｅｒｔｓ，Ｍ．，．．．Ｇｏｕｄｓｍｉｔ，Ｊ．（２００６）．Ｎｏｖｅｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｂ−ｇｒｏｕｐ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｈｉｇｈ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｙｉｅｌｄ  ｉｎ  ＰＥＲ．Ｃ６  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８７（Ｐｔ  ８），２１３５−２１４３．
Ｈｏｇａｎｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．，Ｍａ，Ｊ．Ｃ．，Ａｓａｔｏ，Ｌ．，Ｏｎｇ，Ｍ．，Ｐｒｉｎｔｚ，Ｍ．Ａ．，Ｈｕｙｇｈｅ，Ｂ．Ｇ．，．．．Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｍ．Ｊ．（２００２）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｓｔａｂｌｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｊ．，１（１），４３−４８．
Ｈｏｌｍａｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｄ．，Ｒａｖｉｐｒａｋａｓｈ，Ｋ．，Ｒａｊａ，Ｎ．Ｕ．，Ｌｕｏ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，．．．Ｄｏｎｇ，Ｊ．Ｙ．（２００７）．Ｔｗｏ  ｃｏｍｐｌｅｘ，ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔｈａｔ  ｔｏｇｅｔｈｅｒ  ｉｎｄｕｃｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ａｌｌ  ｆｏｕｒ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４（２），１８２−１８９．
Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ，Ｌ．，Ｖｏｇｅｌｓ，Ｒ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｕｇｔ，Ｒ．，Ｓｉｅｕｗｅｒｔｓ，Ｍ．，Ｇｒｉｍｂｅｒｇｅｎ，Ｊ．，Ｋａｓｐｅｒｓ，Ｊ．，．．．Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．（２００４）．Ｎｏｖｅｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １１（Ａｄ１１）ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｌｏｗ  ｓｅｒｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  Ａｄ５．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７８（２３），１３２０７−１３２１５．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７８．２３．１３２０７−１３２１５．２００４
Ｈｕ，Ｘ．，Ｍｅｎｇ，Ｗ．，Ｄｏｎｇ，Ｚ．，Ｐａｎ，Ｗ．，Ｓｕｎ，Ｃ．，＆  Ｃｈｅｎ，Ｌ．（２０１１）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＨＡ）ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｈ５  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ，１５５（１），１５６−１６２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｕｓｒｅｓ．２０１０．０９．０１４
Ｋｏｂｉｎｇｅｒ，Ｇ．Ｐ．，Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｈ．，Ｚｈｉ，Ｙ．，Ｓｃｈｕｍｅｒ，Ｇ．，Ｇａｏ，Ｇ．，Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｆ．，．．．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２００６）．Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｚａｉｒｅ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３４６（２），３９４−４０１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｏｌ．２００５．１０．０４２
Ｌａｓａｒｏ，Ｍ．Ｏ．，＆  Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（２００９）．Ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｏｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１７（８），１３３３−１３３９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２００９．１３０
Ｌｅｍｃｋｅｒｔ，Ａ．Ａ．，Ｇｒｉｍｂｅｒｇｅｎ，Ｊ．，Ｓｍｉｔｓ，Ｓ．，Ｈａｒｔｋｏｏｒｎ，Ｅ．，Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ，Ｌ．，Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｂ．，．．．Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．Ｊ．（２００６）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ４９：ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ｏｎ  ＰＥＲ．Ｃ６  ｃｅｌｌｓ，ｔｒｏｐｉｓｍ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８７（Ｐｔ  １０），２８９１−２８９９．ｄｏｉ：１０．１０９９／ｖｉｒ．０．８２０７９−０
Ｍｕｌｌｉｃｋ，Ａ．，Ｘｕ，Ｙ．，Ｗａｒｒｅｎ，Ｒ．，Ｋｏｕｔｒｏｕｍａｎｉｓ，Ｍ．，Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ，Ｃ．，Ｂｒｏｕｓｓａｕ，Ｓ．，．．．Ｍａｓｓｉｅ，Ｂ．（２００６）．Ｔｈｅ  ｃｕｍａｔｅ  ｇｅｎｅ−ｓｗｉｔｃｈ：ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，６，４３．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−６−４３
Ｎａ，Ｍ．，＆  Ｆａｎ，Ｘ．（２０１０）．Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ａｄ５Ｆ３５  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｄｕａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ，３８（６），４４６−４５２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｘｐｈｅｍ．２０１０．０３．００７
Ｎａｎ，Ｘ．，Ｐｅｎｇ，Ｂ．，Ｈａｈｎ，Ｔ．Ｗ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｅ．，Ｌｉｚｏｎｏｖａ，Ａ．，Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉ．，＆  Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ，Ｍ．（２００３）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  Ａｄ７  ｃｏｓｍｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｄ７ｄｅｌｔａＥ１ｄｅｌｔａＥ３ＨＩＶ（ＭＮ）ｅｎｖ／ｒｅｖ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１０（４），３２６−３３６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｇｔ．３３０１９０３
Ｏｇｕｎ，Ｓ．Ａ．，Ｄｕｍｏｎ−Ｓｅｉｇｎｏｖｅｒｔ，Ｌ．，Ｍａｒｃｈａｎｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｈｏｌｄｅｒ，Ａ．Ａ．，＆  Ｈｉｌｌ，Ｆ．（２００８）．Ｔｈｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｃ４−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ４ｂｐ）ａｃｔｓ  ａｓ  ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  １９−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｆｕｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｃ４ｂｐ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，７６（８），３８１７−３８２３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＩＡＩ．０１３６９−０７
Ｏｐｈｏｒｓｔ，Ｏ．Ｊ．，Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ，Ｋ．，Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．Ｊ．，Ｐａｕ，Ｍ．Ｇ．，Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ，Ｌ．，Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｂ．，．．．Ｔｓｕｊｉ，Ｍ．（２００６）．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ３５−ｂａｓｅｄ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，７４（１），３１３−３２０．
Ｐｈａｍ，Ｌ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｇａｂｒｉｅｌａ  Ｒｏｓａｌｅｓ，Ａ．，Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｓ．Ｋ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｋ．Ｒ．，Ｐｅｎｇ，Ｋ．Ｗ．，＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．（２００９）．Ｃｏｎｃｏｒｄａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｅ１，Ｅ３  ａｎｄ  Ｅ４  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ，１１（３），１９７−２０６．
Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ，Ｋ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ａ．，Ｌｅｍｃｋｅｒｔ，Ａ．Ａ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ，Ｍ．，Ｇｉｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．，Ｗａｒｎａｒ，Ｃ．，．．．Ｇｏｕｄｓｍｉｔ，Ｊ．（２０１０）．Ｔｈｅ  Ｔｈ１  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｂｏｏｓｔｅｄ  ｂｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ３５  ａｎｄ  ２６  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｉｎｓｅｒｔ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７（１１），１６８７−１６９４．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＣＶＩ．００３１１−１０
Ｓｃｈｅｐｐ−Ｂｅｒｇｌｉｎｄ，Ｊ．，Ｌｕｏ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｄ．，Ｗｉｃｋｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｒａｊａ，Ｎ．Ｕ．，Ｈｏｅｌ，Ｂ．Ｄ．，．．．Ｄｏｎｇ，Ｊ．Ｙ．（２００７）．Ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ  Ｃ，ＰｒｅＭ，Ｅ，ａｎｄ  ＮＳ１  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｂｏｔｈ  ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４（９），１１１７−１１２６．
Ｓｍａｌｌ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｕｒｕｐａｔｉ，Ｒ．Ｋ．，Ｚｈｏｕ，Ｘ．，Ｂｉａｎ，Ａ．，Ｃｈｉ，Ｅ．，Ｌｉ，Ｙ．，．．．Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（２０１４）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ１−ａｎｄ  Ｅ３−ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２５（４），３２８−３３８．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１３．２１６
Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｎ．Ｊ．，Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｔ．Ｗ．，Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｊ．Ｂ．，Ｓｈｅｄｌｏｃｋ，Ｄ．Ｊ．，Ｘｕ，Ｌ．，Ｌａｍｏｒｅａｕｘ，Ｌ．，．．．Ｎａｂｅｌ，Ｇ．Ｊ．（２００６）．Ｉｍｍｕｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｎｇｌｅ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＧＰｓ．ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ，３（６），ｅ１７７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｍｅｄ．００３０１７７
Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｎ．Ｊ．，Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｔ．Ｗ．，Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｊ．Ｂ．，Ｘｕ，Ｌ．，Ｙａｎｇ，Ｚ．Ｙ．，Ｒｏｅｄｅｒｅｒ，Ｍ．，．．．Ｎａｂｅｌ，Ｇ．Ｊ．（２００３）．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４２４（６９４９），６８１−６８４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０１８７６
Ｓｚｙｍｃｚａｋ，Ａ．Ｌ．，Ｗｏｒｋｍａｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｖｉｇｎａｌｉ，Ｋ．Ｍ．，Ｄｉｌｉｏｇｌｏｕ，Ｓ．，Ｖａｎｉｎ，Ｅ．Ｆ．，＆  Ｖｉｇｎａｌｉ，Ｄ．Ａ．（２００４）．Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉ−ｇｅｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ’ｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖｉｎｇ’  ２Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２（５），５８９−５９４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ９５７
Ｔａｔｓｉｓ，Ｎ．，Ｂｌｅｊｅｒ，Ａ．，Ｌａｓａｒｏ，Ｍ．Ｏ．，Ｈｅｎｓｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．，Ｃｕｎ，Ａ．，Ｔｅｓｅｍａ，Ｌ．，．．．Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（２００７）．Ａ  ＣＤ４６−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｓ  ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｒｒｉｅｒ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１５（３），６０８−６１７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｍｔ．６３０００７８
Ｖｅｍｕｌａ，Ｓ．Ｖ．，＆  Ｍｉｔｔａｌ，Ｓ．Ｋ．（２０１０）．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ａ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ，１０（１０），１４６９−１４８７．ｄｏｉ：１０．１５１７／１４７１２５９８．２０１０．５１９３３２
Ｖｏｇｅｌｓ，Ｒ．，Ｚｕｉｊｄｇｅｅｓｔ，Ｄ．，ｖａｎ  Ｍｅｅｒｅｎｄｏｎｋ，Ｍ．，Ｃｏｍｐａｎｊｅｎ，Ａ．，Ｇｉｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．，Ｓｉｊｔｓｍａ，Ｊ．，．．．Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．Ｊ．（２００７）．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｉｎ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３５  ｖｅｃｔｏｒ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８８（Ｐｔ  １１），２９１５−２９２４．
Ｖｏｇｅｌｓ，Ｒ．，Ｚｕｉｊｄｇｅｅｓｔ，Ｄ．，ｖａｎ  Ｒｉｊｎｓｏｅｖｅｒ，Ｒ．，Ｈａｒｔｋｏｏｒｎ，Ｅ．，Ｄａｍｅｎ，Ｉ．，ｄｅ  Ｂｅｔｈｕｎｅ，Ｍ．Ｐ．，．．．Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．（２００３）．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３５  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｙｐａｓｓ  ｏｆ  ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７７（１５），８２６３−８２７１．
Ｚｈｏｕ，Ｄ．，Ｃｕｎ，Ａ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｘｉａｎｇ，Ｚ．，＆  Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（２００６）．Ａ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ−ｏｒｉｇｉｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａｎ  ｏｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１４（５），６６２−６７２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２００６．０３．０２７
Ｚｈｏｕ，Ｄ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｌ．，Ｌａｓａｒｏ，Ｍ．Ｏ．，Ｌａｔｉｍｅｒ，Ｂ．Ｐ．，Ｐａｒｚｙｃｈ，Ｅ．Ｍ．，Ｂｉａｎ，Ａ．，．．．Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（２０１０）．Ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ−２  ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｌｅｔｈａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１８（１２），２１８２−２１８９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１０．２０２
【図１】
0006735288.tif 000004
【図２】
0006735288.tif 000005
【図３】
0006735288.tif 000006
【図３ａ】
0006735288.tif 000007
【図４】
0006735288.tif 000008
【図４ａ】
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【図５】
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【図５ａ】
0006735288.tif 000011
【図６】
0006735288.tif 000012
【図６ａ】
0006735288.tif 000013
【図７】
0006735288.tif 000014
【図７ａ】
0006735288.tif 000015
【図８】
0006735288.tif 000016
【図８ａ】
0006735288.tif 000017
【図８ｂ】
0006735288.tif 000018
【配列表】
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