(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｏｂ１に特異的に結合するＴ細胞レセプターのＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドに作用的に連結されたプロモーターを含む核酸分子であって、該核酸分子は、
ａ）ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）ＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、
を含み、
ここで、
ｉ）該ＴＣＲαポリペプチドの該ＣＤＲ３領域は配列番号１のアミノ酸配列を含み、かつ該ＴＣＲβポリペプチドの該ＣＤＲ３領域は配列番号４のアミノ酸配列を含む、または
ｉｉ）該ＴＣＲαポリペプチドの該ＣＤＲ３領域は配列番号２５のアミノ酸配列を含み、かつ該ＴＣＲβポリペプチドの該ＣＤＲ３領域は配列番号２８のアミノ酸配列を含む、
ここで該ＴＣＲαポリペプチドおよびＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域は一緒に、Ｂｏｂ１に特異的に結合する、核酸分子。
【請求項２】
前記Ｔ細胞レセプターの前記ＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＡＰＡＰＴＡＶＶＬまたはアミノ酸配列ＹＡＬＮＨＴＬＳＶを含むＢｏｂ１ポリペプチドに特異的に結合する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
ｉ）前記第１のポリヌクレオチドは配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオチド配列またはその誘導体を含み、かつ前記第２のポリヌクレオチドは配列番号５もしくは配列番号６のヌクレオチド配列またはその誘導体を含むか、または
ｉｉ）前記第１のポリヌクレオチドは配列番号２６もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列またはその誘導体を含み、かつ前記第２のポリヌクレオチドは配列番号２９もしくは配列番号３０のヌクレオチド配列またはその誘導体を含む、
請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
ｉ）前記第１のポリペプチドは配列番号７のアミノ酸配列を含み、かつ前記第２のポリペプチドは配列番号１０のアミノ酸配列を含む、または
ｉｉ）前記第１のポリペプチドは配列番号３１のアミノ酸配列を含み、かつ前記第２のポリペプチドは配列番号３４のアミノ酸配列を含む、
請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項５】
ｉ）前記第１のポリヌクレオチドは配列番号８もしくは配列番号９のヌクレオチド配列を含み、かつ前記第２のポリヌクレオチドは配列番号１１もしくは配列番号１２のヌクレオチド配列を含むか、または
ｉｉ）前記第１のポリヌクレオチドは配列番号３２もしくは配列番号３３のヌクレオチド配列を含み、かつ前記第２のポリヌクレオチドは配列番号３５もしくは配列番号３６のヌクレオチド配列を含む、
請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか１項に記載の核酸分子を含む、プラスミドベクターまたはウイルスベクター。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項７に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の改変された細胞および薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸分子および薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において免疫応答を高めるのに使用するための、請求項９または１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するのに使用するための、請求項９または１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
改変された細胞を含む請求項１１または１２に記載の薬学的組成物であって、前記改変された細胞は、自家Ｔ細胞または同種異系Ｔ細胞である、薬学的組成物。
【請求項１４】
細胞においてＢｏｂ１に特異的に結合するＴ細胞レセプターを発現させるための方法であって、該方法は、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸分子と細胞とを、該核酸分子が該細胞に組み込まれる条件下で接触させ、それによって、該細胞が該Ｔ細胞レセプターを該組み込まれた核酸分子から発現すること、を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
Mirjam  H.M.  Heemskerkらが発明者として名前が挙げられている「T  Cell  Receptors  Directed  Against  Bob1  and  Uses  Thereof」との名称の２０１５年１１月３日に出願された米国仮特許出願第６２／０７４，５３４号、およびMirjam  H.M.  Heemskerkらが発明者として名前が挙げられている「T  Cell  Receptors  Directed  Against  Bob1  and  Uses  Thereof」との名称の２０１５年２月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／１１５，７３７号への優先権が主張され、これらは、その全体が参照され、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（分野）
本技術は、部分的に、Ｂｏｂ１抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物および方法に関する。Ｂｏｂ１抗原に対する免疫応答を誘導することによって過剰増殖性疾患を処置するための方法もまた提供される；上記免疫応答は、Ｂｏｂ１ポリペプチドフラグメントを使用して、またはＢｏｂ１に対して指向されるＴ細胞レセプターを使用してＢｏｂ１発現細胞を特異的に標的化することによって、誘導され得る。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
Ｔ細胞の活性化は、病原微生物（例えば、ウイルス、細菌および寄生生物）、外来タンパク質および環境内の有害な化学物質に対する防御免疫において、ならびにがんおよび他の過剰増殖性疾患に対する免疫としても、重要なステップである。Ｔ細胞は、その表面上に、細胞表面上に提示された抗原を認識するレセプター（すなわち、Ｔ細胞レセプター）を発現する。正常な免疫応答の間、ＭＨＣ抗原提示の状況において、これらの抗原がＴ細胞レセプターに結合することにより、細胞内の変化が惹起され、Ｔ細胞の活性化に至る。
【０００４】
養子Ｔ細胞療法は、抗原特異的免疫応答を提供することによって過剰増殖性疾患（腫瘍が挙げられる）を処置するために使用されてきた。１つの方法は、抗原に結合する細胞外ドメインを有する抗原特異的タンパク質を発現する遺伝子改変されたＴ細胞の使用を要する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
遺伝子ＰＯＵ２ＡＦ１によってコードされる細胞内転写因子、Ｂ細胞Ｏｃｔ結合タンパク質１（Ｂｏｂ１）は、Ｂ細胞悪性腫瘍および多発性骨髄腫のＴＣＲベースの免疫療法の適切な標的として同定された。このＢｏｂ１ポリペプチドは、免疫原、または免疫療法の標的として使用され得る。原発性Ｂ細胞悪性腫瘍および多発性骨髄腫を認識するＢｏｂ１特異的Ｔ細胞クローンを、同定した。Ｂｏｂ１特異的ＴＣＲを使用するＴＣＲ遺伝子移入アプローチは、疾患の中でも、Ｂ細胞悪性腫瘍または多発性骨髄腫を有する患者のための新規な処置様式をもたらし得る。
【０００６】
Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプターをコードする核酸、ならびにＢｏｂ１抗原を認識するＴ細胞レセプターを発現する細胞を含む組成物および方法が、本明細書で提供される。上記細胞はまた、安全機構（例えば、誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドなどの）を付加するさらなるポリペプチドを発現し得る。
【０００７】
ある種の実施形態は、以下の説明、実施例、特許請求の範囲および図面の中でさらに記載される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
Ｂｏｂ１に特異的に結合するＴ細胞レセプターのＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドに作用的に連結されたプロモーターを含む核酸分子であって、該核酸分子は、
ａ．ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ．ＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、
を含み、ここで該ＴＣＲαポリペプチドおよびＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域は一緒に、Ｂｏｂ１に特異的に結合する、核酸分子。
（項目２）
ａ．前記第１のポリヌクレオチドは、ＴＣＲαポリペプチドのＶＪ領域を含む第１のポリペプチドをコードし；そして
ｂ．前記第２のポリヌクレオチドは、ＴＣＲβポリペプチドのＶＤＪ領域を含む第２のポリペプチドをコードする、
項目１に記載の核酸分子。
（項目３）
前記第１のポリペプチドは、前記ＴＣＲαポリペプチドの定常領域をさらに含み、前記第２のポリペプチドは、前記ＴＣＲβポリペプチドの定常領域をさらに含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目４）
前記核酸分子は、Ｔ細胞レセプターをコードする、項目１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目５）
前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＡＰＡＰＴＡＶＶＬを含むＢｏｂ１ポリペプチドに特異的に結合する、項目１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目６）
前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＹＡＬＮＨＴＬＳＶを含むＢｏｂ１ポリペプチドに特異的に結合する、項目１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目７）
前記第１のまたは第２のポリペプチドの定常領域は、異種の定常領域である、項目３〜６のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目８）
前記第１のおよび第２のポリペプチドの定常領域は、マウスＴＣＲ定常領域に由来する、項目３〜７のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目９）
前記第１のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１０）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目９に記載の核酸分子。
（項目１１）
前記第２のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む、項目１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１２）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５もしくは配列番号６のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目１１に記載の核酸分子。
（項目１３）
前記第１のポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１４）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号８もしくは配列番号９のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目１３に記載の核酸分子。
（項目１５）
前記第２のポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、項目１〜８または１３〜１４のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１６）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号１１もしくは配列番号１２のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目１５に記載の核酸分子。
（項目１７）
前記第１のポリペプチドは、配列番号１３または１４のアミノ酸配列を含む、項目１〜８のいずれか１項に記載核酸分子。
（項目１８）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号１５、１６、または１８のヌクレオチド配列を含む、項目１７に記載の核酸分子。
（項目１９）
前記第２のポリペプチドは、配列番号１９または２０のアミノ酸配列を含む、項目１〜８または１７〜１８のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目２０）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２１、２２、または２４のヌクレオチド配列を含む、項目１９に記載の核酸分子。
（項目２１）
前記第１のポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目２２）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２６もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目２１に記載の核酸分子。
（項目２３）
前記第２のポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、項目１〜８または２１〜２２のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目２４）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２９もしくは配列番号３０のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目２３に記載の核酸分子。
（項目２５）
前記第１のポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目２６）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３２もしくは配列番号３３のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目２５に記載の核酸分子。
（項目２７）
前記第２のポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、項目１〜８または２５〜２６のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目２８）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号３５もしくは配列番号３６のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目２７に記載の核酸分子。
（項目２９）
前記第１のポリペプチドは、配列番号３７または３８のアミノ酸配列を含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目３０）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３９、４０、４１、または４２のヌクレオチド配列を含む、項目２９に記載の核酸分子。
（項目３１）
前記第２のポリペプチドは、配列番号４３または４４のアミノ酸配列を含む、項目１〜８または２９〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目３２）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号４５、４６、４７、または４８のヌクレオチド配列を含む、項目３１に記載の核酸分子。
（項目３３）
多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目３４）
ＴＣＲαまたはＴＣＲβをコードするポリヌクレオチドと前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該ポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、項目３３に記載の核酸分子。
（項目３５）
前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域である、項目３３または３４のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目３６）
前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域を含む、項目３３〜３５のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目３７）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、項目３６に記載の核酸分子。
（項目３８）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、項目３６に記載の核酸分子。
（項目３９）
前記多量体リガンド結合領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓを含む、項目３３〜３８のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目４０）
前記多量体リガンド結合領域は、配列番号５２のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはその機能的フラグメント、または配列番号７１のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはその機能的フラグメントを含む、項目３３〜３９のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目４１）
前記多量体リガンド結合領域は、残基３６がバリンであるＦｖポリペプチドバリアントをさらに含む、項目３５〜３７のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目４２）
前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、項目３４〜４１のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目４３）
前記多量体リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、項目３３〜４２のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目４４）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列を有するか、または配列番号５７のヌクレオチド配列によってコードされる、項目３３〜４３のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目４５）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表３の中のカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、項目３３〜４３のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目４６）
ａ）項目１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子；ならびに
ｂ）多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子、
を含む組成物。
（項目４７）
前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域である、項目４６に記載の組成物。
（項目４８）
前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域を含む、項目４６〜４７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目４９）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、項目４８に記載の組成物。
（項目５０）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、項目４８に記載の組成物。
（項目５１）
前記多量体リガンド結合領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓを含む、項目４６〜５０のいずれか１項に記載の組成物。
（項目５２）
前記多量体リガンド結合領域は、配列番号５２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメント、または配列番号７１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメントを含む、項目４６〜５１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目５３）
前記多量体リガンド結合領域は、残基３６がバリンであるＦｖポリペプチドバリアントを含む、項目４６〜５１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目５４）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列を有するか、または配列番号５７のヌクレオチド配列によってコードされる、項目４６〜５３のいずれか１項に記載の組成物。
（項目５５）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表３の中のカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、項目４６〜５３のいずれか１項に記載の組成物。
（項目５６）
項目１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
（項目５７）
前記ベクターは、プラスミドベクターである、項目５６に記載のベクター。
（項目５８）
前記ベクターは、ウイルスベクターである、項目５６に記載のベクター。
（項目５９）
前記ベクターは、レトロウイルスベクターである、項目５６に記載のベクター。
（項目６０）
前記ベクターは、レンチウイルスベクターである、項目５６に記載のベクター。
（項目６１）
項目１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子、または項目５６〜６０のいずれか１項に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
（項目６２）
前記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに含む、項目６１に記載の改変された細胞。
（項目６３）
項目３３〜４５のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
（項目６４）
前記ベクターは、プラスミドベクターである、項目６３に記載のベクター。
（項目６５）
前記ベクターは、ウイルスベクターである、項目６３に記載のベクター。
（項目６６）
前記ベクターは、レトロウイルスベクターである、項目６３に記載のベクター。
（項目６７）
前記ベクターは、レンチウイルスベクターである、項目６３に記載のベクター。
（項目６８）
項目３３〜４５のいずれか１項に記載の核酸分子または項目６３〜６７のいずれか１項に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
（項目６９）
前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域である、項目６２または６８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目７０）
前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域を含む、項目６２または６８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目７１）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、項目７０に記載の改変された細胞。
（項目７２）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、項目７０に記載の改変された細胞。
（項目７３）
前記多量体リガンド結合領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓを含む、項目６２または６８〜７２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目７４）
前記多量体リガンド結合領域は、配列番号５２のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはその機能的フラグメント、または配列番号７１のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはその機能的フラグメントを含む、項目６２または６８〜７２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目７５）
前記多量体リガンド結合領域は、残基３６がバリンであるＦｖポリペプチドバリアントを含む、項目６２または６８〜７２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目７６）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列を有するか、または配列番号５７のヌクレオチド配列によってコードされる、項目６２または６８〜７５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目７７）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表３の中のカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、項目６２または６８〜７５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目７８）
項目１〜４５のいずれか１項に記載の核酸分子、項目５６〜６０もしくは６３〜６７のいずれか１項に記載のベクター、または項目４７〜５５のいずれか１項に記載の組成物でトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
（項目７９）
項目６１〜６２または６８〜７８のいずれか１項に記載の改変された細胞および薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目８０）
項目１〜４５のいずれか１項に記載の核酸または項目５６〜６０もしくは６３〜６７のいずれか１項に記載のベクターおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目８１）
過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において免疫応答を高めるための方法であって、該方法は、治療有効量の項目６１〜６２または６８〜７８のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に投与することを包含する方法。
（項目８２）
前記被験体は、少なくとも１個の腫瘍を有する、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記少なくとも１個の腫瘍のサイズは、前記薬学的組成物の投与後に減少している、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記被験体は、Ｂ細胞悪性腫瘍または多発性骨髄腫と診断されている、項目８１〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目８５）
被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、項目６１〜６２または６８〜７８のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に投与することを包含する方法。
（項目８６）
前記標的細胞は、腫瘍細胞である、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記標的細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍、原発性Ｂ細胞悪性腫瘍、または多発性骨髄腫の細胞である、項目８５または８６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８８）
前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記改変された細胞の投与後に減少している、項目８５〜８７のいずれか１項に記載の方法。
（項目８９）
前記改変された細胞を投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、該改変された細胞を投与した後に該被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、および該第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増大または減少を決定することを包含する、項目８５〜８８のいずれか１項に記載の方法。
（項目９０）
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増大している、項目８９に記載の方法。
（項目９２）
前記改変された細胞のさらなる用量は、前記被験体に投与される、項目８５〜９１のいずれか１項に記載の方法。
（項目９３）
前記標的細胞は、Ｂｏｂ１を発現する、項目８５〜９２のいずれか１項に記載の方法。
（項目９４）
被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、有効量の項目６１〜６２または６８〜７８のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に投与することを包含する、方法。
（項目９５）
標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、有効量の項目６１〜６２または６８〜７８のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に投与することを包含する方法。
（項目９６）
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
前記標的抗原は、Ｂｏｂ１である、項目９５に記載の方法。
（項目９８）
前記改変された細胞のさらなる用量を前記被験体に投与することをさらに包含し、ここで前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、項目８１〜９７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９９）
被験体における状態または疾患の有無またはステージを同定すること；および
該被験体において同定された状態または疾患の有無またはステージに基づいて、項目６１〜６２または６８〜７８のいずれか１項に記載の改変された細胞を投与するか、該改変された細胞のその後の投与量を維持するか、または該患者へ投与される該改変された細胞のその後の投与量を調整する指示を伝えること、
をさらに包含する、項目８１〜９７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１００）
前記状態は、白血病である、項目８１〜９９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０１）
前記被験体は、多発性骨髄腫またはＢ細胞悪性腫瘍と診断されている、項目８１〜９９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０２）
前記Ｂ細胞悪性腫瘍は、リンパ腫である、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
前記改変された細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む、項目８１〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０４）
前記被験体への前記改変された細胞の投与後に、前記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを該被験体に投与することをさらに包含する、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記多量体リガンドの投与後に、前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度は、該多量体リガンドを投与する前に該被験体から得られるサンプル中の該キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度と比較して、該多量体リガンドを投与した後の該被験体から得られるサンプル中で減少している、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、５０％減少している、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、７５％減少している、項目１０５に記載の方法。
（項目１０８）
前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、９０％減少している、項目１０５に記載の方法。
（項目１０９）
前記被験体が、該被験体への前記改変された細胞の投与後に負の症候を経験していることを決定すること、および前記リガンドを投与して、該負の症候を減少または緩和することを包含する、項目１０４〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１０）
前記リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、項目１０４〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１１）
前記改変された細胞は、自家Ｔ細胞である、項目１〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１２）
前記改変された細胞は、同種異系Ｔ細胞である、項目８１〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１３）
前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、項目８１〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１４）
前記改変された細胞は、エキソビボでトランスフェクトまたは形質導入される、項目８１〜１１０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１１５）
細胞においてＢｏｂ１に特異的に結合するＴ細胞レセプターを発現させるための方法であって、該方法は、項目１〜４５のいずれか１項に記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させ、それによって、該細胞が該Ｔ細胞レセプターを該組み込まれた核酸から発現すること、を包含する方法。
（項目１１６）
前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、項目１１５に記載の方法。
（項目１１７）
前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、項目１１５に記載の方法。
（項目１１８）
Ｂｏｂ１の免疫原性ペプチドエピトープ。
（項目１１９）
前記免疫原性ペプチドエピトープは、表１のＢｏｂ１ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含む、項目１１８に記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
（項目１２０）
前記免疫原性ペプチドエピトープは、アミノ酸配列ＡＰＡＰＴＡＶＶＬを有するポリペプチドを含む、項目１１８に記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
（項目１２１）
前記免疫原性ペプチドエピトープは、アミノ酸配列ＹＡＬＮＨＴＬＳを有するポリペプチドを含む、項目１１８に記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
（項目１２２）
前記免疫原性エピトープは、２０以下のアミノ酸を有する、項目１１８〜１２１のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
（項目１２３）
前記免疫原性エピトープは、１０以下のアミノ酸を有する、項目１１８〜１２１のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
（項目１２４）
前記免疫原性エピトープは、１２以下のアミノ酸を有する、項目１１８〜１２１のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
（項目１２５）
前記免疫原性エピトープは、１４以下のアミノ酸を有する、項目１１８〜１２１のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
（項目１２６）
前記免疫原性エピトープは、１６以下のアミノ酸を有する、項目１１８〜１２１のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
（項目１２７）
前記免疫原性エピトープは、１８以下のアミノ酸を有する、項目１１８〜１２１のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
（項目１２８）
前記免疫原性エピトープは、２０以下のアミノ酸を有する、項目１１８〜１２１のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
（項目１２９）
項目１１８〜１２８のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸。
（項目１３０）
前記ポリヌクレオチドは、前記免疫原性エピトープの発現を指向できるプロモーター配列に作用的に連結される、項目１２８に記載の核酸。
（項目１３１）
項目１２９または１３０のいずれか１項に記載の核酸を含む、ベクター。
（項目１３２）
プラスミド、酵母、ポックスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、およびシンドビスウイルスからなる群より選択される、項目１３１に記載のベクター。
（項目１３３）
前記ベクターは、ＭＰ７１レトロウイルスベクターである、項目１３１に記載のウイルス。
（項目１３４）
項目１１８〜１２８のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む核酸で形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞。
（項目１３５）
項目１２８〜１３２のいずれか１項に記載の核酸またはベクターを含む、項目１３４に記載の改変された細胞。
（項目１３６）
前記細胞は、ヒト細胞である、項目１３４または１３５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１３７）
前記細胞は、抗原提示細胞または腫瘍細胞である、項目１３４〜１３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１３８）
項目１３４〜１３７のいずれか１項に記載の改変された細胞、および薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目１３９）
項目１２９〜１３０のいずれか１項に記載の核酸、または項目１３１〜１３３のいずれか１項に記載のベクター、および薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目１４０）
項目１１８〜１２８のいずれか１項に記載の免疫原性エピトープ、および薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目１４１）
アジュバントをさらに含む、項目１４０に記載の薬学的組成物。
（項目１４２）
過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において免疫応答を高めるための方法であって、該方法は、治療有効量の項目１３８〜１４１のいずれか１項に記載の薬学的組成物を該被験体に投与することを包含する、方法。
（項目１４３）
前記被験体は、少なくとも１個の腫瘍を有する、項目１４２に記載の方法。
（項目１４４）
前記少なくとも１個の腫瘍のサイズは、前記薬学的組成物の投与後に減少している、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
前記被験体は、Ｂ細胞悪性腫瘍または多発性骨髄腫と診断されている、項目１４２〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４６）
前記Ｂ細胞悪性腫瘍は、リンパ腫である、項目１４５に記載の方法。
（項目１４７）
前記被験体に樹状細胞を含む組成物を投与することを包含し、ここで該樹状細胞は、それらの表面にＢｏｂ１ポリペプチド抗原の少なくとも１個の免疫原性ＨＬＡエピトープを呈示する、項目１４２〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４８）
被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、項目１３８〜１４０のいずれか１項に記載の薬学的組成物を該被験体に投与することを包含する、方法。
（項目１４９）
前記標的細胞は、腫瘍細胞である、項目１４８に記載の方法。
（項目１５０）
前記標的細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍、原発性Ｂ細胞悪性腫瘍、または多発性骨髄腫の細胞である、項目１４８〜１４９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５１）
前記被験体中の標的細胞の数または濃度は、前記薬学的組成物の投与後に減少している、項目１４８〜１５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５２）
前記薬学的組成物の投与前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、該薬学的組成物の投与後に該被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、および該第１のサンプルにおける標的細胞の数または濃度と比較して、該第２のサンプルにおける標的細胞の数または濃度の増大または減少を決定することを包含する、項目１４８〜１５１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５３）
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度に比較して減少している、項目１５２に記載の方法。
（項目１５４）
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増大している、項目１５２に記載の方法。
（項目１５５）
前記薬学的組成物のさらなる用量は、前記被験体に投与される、項目１４８〜１５４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５６）
被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、該被験体に、有効量の項目１３８〜１４０のいずれか１項に記載の薬学的組成物を投与することを包含する、方法。
（項目１５７）
標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、有効量の項目１３８〜１４０のいずれか１項に記載の薬学的組成物を投与することを包含する、方法。
（項目１５８）
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、項目１５７に記載の方法。
（項目１５９）
前記標的抗原は、Ｂｏｂ１である、項目１５７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図面は、本技術のある種の実施形態を例証するのであって、限定ではない。例証の明瞭性および容易さのために、図面は、縮尺どおりには作成されておらず、場合によっては、種々の局面が、特定の実施形態の理解を促進するために誇張または拡大されて示され得る。
【０００９】
【図１】図１Ａは、養子Ｔ細胞療法の模式図を提供し、図１Ｂは、腫瘍に対して指向される養子Ｔ細胞療法の一例の模式図を提供する。
【００１０】
【図２】図２は、Ｔ細胞クローンライブラリーを生成するために使用される方法の模式的図示および例を提供する。
【００１１】
【図３】図３は、造血悪性細胞および非悪性細胞サブセット、ならびに健常非造血細胞のマイクロアレイ分析である。
【００１２】
【図４】図４Ａは、単一細胞ソートしたテトラマー陽性Ｔ細胞クローンのハイスループットスクリーニングの棒グラフであり、図４Ｂは、円グラフである。
【００１３】
【図５】図５Ａは、Ｂｏｂ１特異的Ｔ細胞クローンのアビディティーが変動し得ることを示す線グラフであり、図５Ｂは、棒グラフである。
【００１４】
【図６】図６は、クローン３Ｃ１０によるＢ細胞悪性腫瘍の認識の棒グラフである。
【００１５】
【図７】図７Ａは、Ｂｏｂ１反応性クローン４Ｇ１１が原発性Ｂ細胞悪性腫瘍を効率的に認識することを示す定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す棒グラフであり、図７Ｂは、棒グラフであり、図７Ｃは、マイクロアレイ分析である。
【００１６】
【図８】図８Ａは、ＰＯＵ２ＡＦ１／Ｂｏｂ１クローン３Ｃ１０  ＡＶ１３−１＊０１  ＴＣＲαポリペプチドのアミノ酸配列を含む模式図を提供する。図８Ｂは、ＰＯＵ２ＡＦ１／Ｂｏｂ１クローン３Ｃ１０  ＢＶ１２−４＊０１  ＴＣＲβポリペプチドのアミノ酸配列を含む模式図を提供する。
【００１７】
【図９】図９Ａは、ＰＯＵ２ＡＦ１／Ｂｏｂ１クローン４Ｇ１１  ＴＲＡＶ１３−１＊０１  ＴＣＲαポリペプチドのアミノ酸配列を含む模式図を提供する。図９Ｂは、ＰＯＵ２ＡＦ１／Ｂｏｂ１クローン４Ｇ１１  ＴＲＢＶ４−１＊−１  ＴＣＲβポリペプチドのアミノ酸配列を含む模式図を提供する。
【００１８】
【図１０】図１０Ａは、４つのＦＡＣｓプロットを提供し、図１０Ｂは、末梢血由来のＢｏｂ１−ＴＣＲ形質導入したＣＤ８＋  Ｔ細胞がＢｏｂ１特異的認識パターンを有することを示す２つの棒グラフを提供する。
【００１９】
【図１１Ａ】図１１Ａおよび１１Ｂは、Ｂｏｂ１−ＴＣＲを発現するために使用され得るレトロウイルスベクターの一例の配列を提供する。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび１１Ｂは、Ｂｏｂ１−ＴＣＲを発現するために使用され得るレトロウイルスベクターの一例の配列を提供する。
【００２０】
【図１２】図１２Ａは、マーカー遺伝子ＮＧＦ−Ｒの発現およびＭＡＣＳ単離を介する富化後で、形質導入されたＴ細胞の４つのＦＡＣＳプロットを提供する。象限の中の数字は、細胞のパーセンテージを示す。ＦＡＣＳプロットは、二項指数関数軸（ｂｉｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ａｘｅｓ）で示す。図１２Ｂは、Ｔ細胞クローン４Ｇ１１または精製された形質導入ＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋  Ｔ細胞と、種々のＨＬＡ−Ｂ７陽性細胞株との１８時間の共培養の後に評価したＩＦＮ−γ濃度の３つの棒グラフを提供する。
【００２１】
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｔ細胞クローン４Ｇ１１、または精製ＴＣＲ形質導入もしくはモック形質導入ＣＤ８＋  Ｔ細胞とのインキュベーション後に、フローサイトメトリーによって評価された、生きている標的細胞の生存パーセンテージの棒グラフを提供する。
【００２２】
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、刺激細胞または陰性コントロール細胞との５日間の共培養後のＴＣＲ形質導入（実線）またはモック形質導入（灰色の領域）ＣＤ８＋  Ｔ細胞のヒストグラムを提供する。
【００２３】
【図１５】図１５は、切断可能な２Ａリンカーで連結されたＢｏｂ１  ＴＣＲおよび誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするｐＢＰ０９５４−ｐＳＦＧ−ｉＣ９．Ｔ２Ａ−Ｂｏｂ−１プラスミドのプラスミドマップである。このプラスミドは、改変された短縮型カスパーゼ−９ポリペプチド（Ｎ４０５Ｑ）を含む。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（詳細な説明）
養子Ｔ細胞療法は、抗原特異的免疫応答を提供することによって、過剰増殖性疾患（腫瘍が挙げられる）を処置するために使用されてきた。１つの方法は、抗原に結合する細胞外ドメインを有する抗原特異的タンパク質を発現する遺伝子改変されたＴ細胞の使用を要する。組換えＴ細胞レセプターは、Ｔ細胞に対する特異性を提供するために使用されてきた。他の方法では、特定の抗原に特異的な異種のＴ細胞レセプターが、抗原特異的免疫応答を提供するためにＴ細胞において発現されてきた。養子Ｔ細胞療法の方法は、図１中に模式図として提供される。
【００２５】
養子Ｔ細胞療法の方法は、しばしば標的化された細胞外抗原を有する。例えば、ＣＤ１９（Ｂ細胞悪性腫瘍の表面上の細胞外抗原）は、Ｔ細胞療法の標的であった。ＣＤ１９特異的抗原レセプター形質導入Ｔ細胞を使用して提供されるこの養子Ｔ細胞療法はしばしば、Ｂ細胞悪性腫瘍がＣＤ１９抗原の発現を喪失する場合にそれほど有効でない可能性がある。従って、例えば、Ｔ細胞がＣＤ２０、またはＣＤ１９を認識するように操作される場合、ＣＤ２０およびＣＤ１９発現が喪失される、またはこれら分子が他の悪性腫瘍（例えば、多発性骨髄腫）上では存在しないことで、それらの適用は制限される。
【００２６】
細胞内転写因子Ｂｏｂ１（遺伝子ＰＯＵ２ＡＦ１によってコードされる）は、免疫療法の適切な標的であることがいまや見出されている。Ｂｏｂ１は、ＣＤ１９＋  Ｂ細胞、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、および多発性骨髄腫（ＭＭ）において高度に発現され、非Ｂ細胞系統（ＣＤ３４＋  造血前駆細胞（ＨＰＣ）、Ｔ細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトおよび消化管が挙げられる）には存在しない。
【００２７】
Ｂｏｂ１は、細胞内に局在するが、ＨＬＡ呈示Ｂｏｂ１由来ポリペプチドは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の細胞表面にアクセス可能であり、従って、Ｔ細胞によって認識され得る。ＨＬＡ呈示されたリガンドーム（ｌｉｇａｎｄｏｍｅ）（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，  ２０１３；１２：１８２９）から、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（ＨＬＡ−Ａ２）、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２（ＨＬＡ−Ｂ７）、および他のＨＬＡクラスＩ分子において呈示される天然にプロセシングされたＢｏｂ１由来ポリペプチドが、同定された（表１および表２）。自己抗原（例えば、Ｂｏｂ１）に対する自己反応性は、自己ＨＬＡ中の自己抗原を認識する高アビディティーＴ細胞を枯渇させることによって防止されるので、同種異系ＨＬＡにおいて呈示されるこれらポリペプチドの免疫原性が、活用された。６名の異なるＨＬＡ−Ａ２／Ｂ７陰性健常ドナー由来の合計３×１０９  末梢血単核細胞から、ＨＬＡ−Ａ２もしくはＨＬＡ−Ｂ７に結合したＢｏｂ１由来ポリペプチドから構成されるポリペプチド−ＭＨＣ−テトラマーに結合する１０００を超えるＣＤ８＋  Ｔ細胞を、単離し、クローンとして増やした（図２）。このＴ細胞クローンを、Ｂｏｂ１由来ポリペプチドを負荷しないかまたはパルスしたＨＬＡ−Ａ２またはＢ７のいずれかを発現するＢｏｂ１陰性Ｋ５６２細胞での刺激によって、厳密なポリペプチド特異性について試験した。これは、Ｂｏｂ１に対して非常に特異的な１５のＴ細胞クローンの選択をもたらした。最高のアビディティーのＴ細胞クローンを同定するために、Ｔ細胞クローンを、滴定した量のＢｏｂ１由来ポリペプチドを負荷した刺激細胞の、およびＢｏｂ１発現ＨＬＡ−Ａ２／Ｂ７陽性ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の認識を試験することによって、ポリペプチド感受性に関して比較した。
【００２８】
Ｔ細胞クローン４Ｇ１１を、ＨＬＡ−Ｂ７において呈示されたＢｏｂ１由来ポリペプチドＢｏｂ１４４に対して高感受性および特異性であることから選択し、Ｔ細胞クローン３Ｃ１０は、ＨＬＡ−Ａ２に結合したポリペプチドＢｏｂ１２４５を特異的に認識した。Ｂｏｂ１依存性認識は、さもなければＢｏｂ１発現を欠く細胞株へとＢｏｂ１を形質導入することによって示された。有害毒性がこれらＴ細胞クローンによって引き起こされ得るかどうかを調査するために、それらの反応性を、Ｂｏｂ１陰性刺激者細胞の広い一団に対して試験したところ、摸倣炎症刺激条件（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下ですら、ＨＬＡ−Ｂ７陽性ＣＤ３４＋  ＨＰＣ、Ｔ細胞、単球、未成熟および成熟樹状細胞、ならびに線維芽細胞の認識がないことを示した。厳密なＨＬＡ−Ｂ７拘束認識を、広範な、一般的なおよび稀なＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子を発現するスティミュレーター一団に対して試験した場合に、クローン４Ｇ１１について観察した。これらデータは、オフターゲットの毒性の可能性が殆どない安全な反応性プロフィールを例証する。それらの臨床適用可能性を試験するために、クローン４Ｇ１１および３Ｃ１０を、種々の原発性Ｂ細胞悪性腫瘍の認識に関して試験した。クローン４Ｇ１１は、ＨＬＡ−Ｂ７陽性原発性ＡＬＬ、ＣＬＬおよびマントル細胞リンパ腫を効率的に認識した一方で、クローン３Ｃ１０は、より低い程度ではあったが、ＨＬＡ−Ａ２陽性原発性Ｂ細胞悪性腫瘍を認識した。さらに、クローン４Ｇ１１に関して、精製された原発性ＨＬＡ−Ｂ７陽性多発性骨髄腫の再現性のある強い認識を示すことができた。従って、Ｔ細胞クローン４Ｇ１１のＴＣＲは、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を多発性骨髄腫患者に投与することによって、免疫療法のために使用され得る。４Ｇ１１のＴＣＲの形質導入が、Ｂｏｂ１反応性をレシピエント細胞に付与するかどうかを試験するために；このＴＣＲを、レトロウイルスベクターへとクローニングした。ＨＬＡ−Ｂ７陽性Ｂｏｂ１発現標的細胞に対する非常に特異的な反応性を、ＴＣＲ形質導入レシピエントＴ細胞に組み込む（ｉｎｓｔａｌｌ）ことができた。
【００２９】
まとめると、遺伝子ＰＯＵ２ＡＦ１によってコードされる細胞内転写因子Ｂｏｂ１は、Ｂ細胞悪性腫瘍および多発性骨髄腫のＴＣＲベースの免疫療法に適した標的として同定された。Ｂｏｂ１特異的Ｔ細胞クローン４Ｇ１１は、原発性Ｂ細胞白血病および多発性骨髄腫を効率的に認識した。Ｂｏｂ１特異的ＴＣＲを使用するＴＣＲ遺伝子移入アプローチは、Ｂ細胞悪性腫瘍または多発性骨髄腫を有する患者にとっての新規な処置様式をもたらし得る。
【００３０】
従って、ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；およびＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、Ｂｏｂ１に特異的に結合するＴ細胞レセプターのＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドに作用的に（operatively）連結されたプロモーターを含む核酸分子がいくつかの実施形態において提供され、ここで上記ＴＣＲαポリペプチドおよびＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域は一緒に、Ｂｏｂ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＡＰＡＰＴＡＶＶＬまたはアミノ酸配列ＹＡＬＮＨＴＬＳＶを含むＢｏｂ１ポリペプチドに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、上記第１のポリペプチドは、配列番号１または配列番号２５のアミノ酸配列を含み、上記第２のポリペプチドは、配列番号４または配列番号２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含みかつ上記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５もしくは配列番号６のヌクレオチド配列またはその誘導体を含むか；あるいは上記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２６もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含みかつ上記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２９もしくは配列番号３０のヌクレオチド配列またはその誘導体を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、Ｂｏｂ１に特異的に結合するＴ細胞レセプターのＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子は、ＴＣＲαポリペプチドのＶＪ領域を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；およびＴＣＲβポリペプチドのＶＤＪ領域を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、上記第１のポリペプチドは、ＴＣＲαポリペプチドの定常領域をさらに含み、上記第２のポリペプチドは、ＴＣＲβポリペプチドの定常領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記核酸分子は、Ｔ細胞レセプターをコードする。いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＡＰＡＰＴＡＶＶＬを含むＢｏｂ１ポリペプチドに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、上記第１のまたは第２のポリペプチドの定常領域は、異種の定常領域である。いくつかの実施形態において、上記第１のおよび第２のポリペプチドの定常領域は、マウスＴＣＲ定常領域に由来する。いくつかの実施形態において、上記第１のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、上記第２のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５もしくは配列番号６のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、上記第１のポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第１のポリヌクレオチドは、配列番号８もしくは配列番号９のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、上記第２のポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第２のポリヌクレオチドは、配列番号１１もしくは配列番号１２のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、上記第１のポリペプチドは、配列番号１３または１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第１のポリヌクレオチドは、配列番号１５、１６、または１８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第２のポリペプチドは、配列番号１９または２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２１、２２、または２４のヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＹＡＬＮＨＴＬＳＶを含むＢｏｂ１ポリペプチドに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、上記第１のポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２６もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、上記第２のポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２９もしくは配列番号３０のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、上記第１のポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３２もしくは配列番号３３のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、上記第２のポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第２のポリヌクレオチドは、配列番号３５もしくは配列番号３６のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、上記第１のポリペプチドは、配列番号３７または３８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３９、４０、４１、または４２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第２のポリペプチドは、配列番号４３または４４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第２のポリヌクレオチドは、配列番号４５、４６、４７、または４８のヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、上記核酸分子は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記核酸分子を含むプラスミドまたはウイルスベクターが提供される。
【００３４】
いくつかの実施形態において、上記核酸分子、上記プラスミド、または上記ウイルスベクターでトランスフェクトまたは形質導入された改変された細胞が、提供される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに含む。上記改変された細胞および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物がまた、提供される。上記核酸および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物がまた、提供される。いくつかの実施形態において、過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において免疫応答を高めるための方法が提供され、上記方法は、治療有効量の上記改変された細胞を上記被験体に投与することを包含する。いくつかの実施形態において、被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法が提供され、上記方法は、上記改変された細胞を上記被験体に投与することを包含する。いくつかの実施形態において、上記被験体における標的細胞の数または濃度は、上記改変された細胞の投与後に減少している。いくつかの実施形態において、上記改変された細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記被験体への上記改変された細胞の投与後に、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを上記被験体に投与することをさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記多量体リガンドの投与後に、上記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度は、上記多量体リガンドを投与する前に上記被験体から得られるサンプル中の上記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度と比較して、上記多量体リガンドを投与した後に上記被験体から得られるサンプル中で減少している。
【００３５】
細胞においてＢｏｂ１に特異的に結合するＴ細胞レセプターを発現するための方法がまた提供され、上記方法は、上記核酸と細胞とを、上記核酸が上記細胞に組み込まれる条件下で接触させ、それによって、上記細胞が上記Ｔ細胞レセプターを上記組み込まれた核酸から発現することを包含する。
【００３６】
Ｂｏｂ１の免疫原性ペプチドエピトープがまた、提供される。いくつかの実施形態において、上記免疫原性ペプチドエピトープは、表１のＢｏｂ１ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、上記免疫原性ペプチドエピトープは、アミノ酸配列ＡＰＡＰＴＡＶＶＬを有するか、またはアミノ酸配列ＹＡＬＮＨＴＬＳを有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、上記免疫原性ペプチドエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む核酸で形質導入またはトランスフェクトされた改変された細胞が提供される。細胞においてＢｏｂ１免疫原性ペプチドエピトープを発現するための方法がまた提供され、上記方法は、上記核酸と細胞とを、上記核酸が上記細胞に組み込まれる条件下で接触させ、それによって、上記細胞がＢｏｂ１免疫原性エピトープを上記組み込まれた核酸から発現することを包含する。
【００３７】
いくつかの実施形態において、過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において免疫応答を高めるための方法が提供され、上記方法は、治療有効量の上記免疫原性ペプチドエピトープを上記被験体に投与することを包含する。いくつかの実施形態において、被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法が提供され、上記方法は、治療有効量の上記免疫原性ペプチドエピトープを上記被験体に投与することを包含する。いくつかの実施形態において、被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法が提供され、上記方法は、上記被験体に有効量の上記免疫原性ペプチドエピトープを投与することを包含する。
【００３８】
本明細書中で使用されるとき、請求項および／または明細書において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに使用されるときの単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つの」を意味し得るが、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」および「１つもしくは１つより多くの」の意味とも一致する。なおもさらに、用語「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、相互交換可能であり、当業者は、これらの用語がオープンエンドな（ｏｐｅｎ  ｅｎｄｅｄ）用語であると認識している。
【００３９】
本明細書中で使用される用語「同種異系」は、宿主細胞とドナー細胞との間で抗原的に異なるＨＬＡ遺伝子座またはＭＨＣ遺伝子座のことを指す。
【００４０】
したがって、同じ種から移植される細胞または組織は、抗原的に異なり得る。同系マウスは、１つ以上の遺伝子座が異なり得（コンジェニック）、同種異系マウスは、同じバックグラウンドを有し得る。
【００４１】
本明細書中で使用される用語「抗原」は、免疫応答を引き起こす分子として定義される。この免疫応答は、抗体の産生もしくは特定の免疫適格細胞の活性化またはその両方を含み得る。抗原は、生物、タンパク質／抗原のサブユニット、殺滅されたまたは不活性化されたホールセルまたは溶解産物に由来し得る。例示的な生物としては、ヘリコバクター、カンピロバクター、クロストリジウム、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｉ、プラスモディウム、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、パピローマウイルス、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ、大腸菌、麻疹ウイルス、ロタウイルス、赤痢菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａが挙げられるが、これらに限定されない。ゆえに、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が、抗原として働き得る。さらに、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。病原性ゲノム、または免疫応答を誘発するタンパク質に対する遺伝子もしくは遺伝子のフラグメントのヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡは、抗原の合成をもたらす。さらに、本方法は、遺伝子またはゲノムの核酸配列全体の使用に限定されない。本組成物および方法は、１つより多くの遺伝子またはゲノムの部分的核酸配列の使用、およびこれら核酸配列が所望の免疫応答を誘起する種々の組み合わせで配置されることを含むが、これらに限定されない。
【００４２】
用語「抗原提示細胞」は、少なくとも１つの抗原または抗原性フラグメントをその細胞表面上に（または細胞表面に）ディスプレイするか、獲得するかまたは提示することができる種々の細胞のいずれかである。一般に、用語「細胞」は、抗原または抗原性組成物に対する免疫応答（すなわち、免疫系のＴ細胞またはＢ細胞のアームからの免疫応答）の強化を助けるという目標を達成する任意の細胞であり得る。例えば、Ｋｕｂｙ，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｐ．４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｎｙ（参照により本明細書中に援用される）において論じられ、ある特定の実施形態において本明細書中で使用されるように、正常にまたはクラスＩＩ主要組織適合分子もしくは主要組織適合複合体とともに免疫細胞に抗原をディスプレイするかまたは提示する細胞が、「抗原提示細胞」である。ある特定の態様において、細胞（例えば、ＡＰＣ細胞）は、別の細胞、例えば、組換え細胞または所望の抗原を発現している腫瘍細胞と融合され得る。２つまたはそれを超える細胞の融合物を調製するための方法は、例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．６５−６６，７１−７４（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３，Ｂｕｒｄｅｎ  ＆  Ｖｏｎ  Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｅｌｓｅｖｉｅｗ，ｐｐ．７５−８３，１９８４；  Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５；Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９，１９７６，Ｇｅｆｔｅｒら、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．，３：２３１−２３６，１９７７（これらの各々は参照により本明細書中に援用される）において論じられている。場合によっては、細胞が抗原をディスプレイするかまたは提示する免疫細胞は、ＣＤ４＋ＴＨ細胞である。ＡＰＣ上または他の免疫細胞上に発現されるさらなる分子は、免疫応答の強化を助け得るか、または改善し得る。分泌分子または可溶性分子、例えば、サイトカインおよびアジュバントもまた、抗原に対する免疫応答を助け得るかまたは高め得る。様々な例が、本明細書中で論じられる。
【００４３】
「抗原認識部分」は、抗原に結合する任意のポリペプチドまたはそのフラグメント、例えば、天然に由来するかまたは合成の抗体フラグメント可変ドメインであり得る。抗原認識部分の例としては、抗体由来のポリペプチド（例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメントのような）；Ｔ細胞レセプター由来のポリペプチド（例えば、ＴＣＲ可変ドメインのような）；シグナル伝達ドメインに人工的に融合され得る分泌因子（例えば、サイトカイン、成長因子）（例えば、「ザイトカイン」）、および細胞外の同種（ｃｏｇｎａｔｅ）タンパク質に結合する任意のリガンドまたはレセプターフラグメント（例えば、ＣＤ２７、ＮＫＧ２Ｄ）が挙げられるが、これらに限定されない。コンビナトリアルライブラリーはまた、腫瘍関連標的に高親和性で結合するペプチドを同定するために使用され得る。
【００４４】
用語「自己の」は、細胞、核酸、タンパク質、ポリペプチドなどであって、これが後に個体に投与されるその同じ個体に由来するものを意味する。本方法の改変された細胞は、例えば、自己細胞（例えば、自己Ｔ細胞のような）であり得る。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「がん」は、そのユニークな特質である正常なコントロールの喪失が、制御されない成長、分化の欠如、局所的な組織浸潤および転移をもたらす、細胞の過剰増殖として定義される。例としては、メラノーマ、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺がん、肝細胞癌、白血病、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、歯肉がん、舌がん、神経芽細胞腫、頭部がん、頚部がん、乳がん、膵がん、前立腺がん、腎がん、骨がん、精巣がん、卵巣がん、中皮腫、子宮頸がん、消化器がん、リンパ腫、脳がん、結腸がん、肉腫または膀胱がんが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書中で使用される用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、交換可能に使用され得る。これらの用語のすべてには、任意およびすべてのその後の世代のそれらの子孫も含まれる。故意または偶然の変異に起因して、すべての子孫が同一でない可能性があることが理解される。
【００４７】
本明細書中で使用されるとき、用語「ｃＤＮＡ」は、鋳型としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を使用して調製されたＤＮＡのことを指すと意図されている。ゲノムＤＮＡ、またはゲノムＲＮＡ鋳型、プロセシングされていないＲＮＡ鋳型もしくは部分的にプロセシングされたＲＮＡ鋳型から重合されたＤＮＡに対立するものとしてｃＤＮＡを使用することの利点は、ｃＤＮＡが、主に、対応するタンパク質のコード配列を含む点である。完全または部分的なゲノム配列が使用されるときがあり、例えば、最適な発現のために非コード領域を必要とする場合、またはイントロンなどの非コード領域がアンチセンスストラテジーにおいて標的化される場合が存在する。
【００４８】
本明細書中で使用されるとき、用語「発現構築物」または「導入遺伝子」は、遺伝子産物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝的構築物として定義され、ここで、核酸コード配列の一部または全部が転写されることが可能であり、該構築物は、ベクターに挿入され得る。転写産物は、タンパク質に翻訳されるが、必ずしも翻訳されるわけではない。ある特定の実施形態において、発現は、遺伝子の転写とｍＲＮＡから遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の実施形態において、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写だけを含む。用語「治療的な構築物」は、発現構築物または導入遺伝子のことを指すためにも使用され得る。発現構築物または導入遺伝子は、例えば、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害（例えば、がん）を処置する治療として、使用され得、ゆえに、発現構築物または導入遺伝子は、治療的な構築物または予防的な構築物である。
【００４９】
本明細書中で使用されるとき、用語「発現ベクター」は、転写されることが可能な遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターのことを指す。場合によっては、ＲＮＡ分子は、その後、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。他の場合、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの生成では、これらの配列は、翻訳されない。発現ベクターは、種々の調節配列を含み得、それらの調節配列は、特定の宿主生物において、作用的に連結されたコード配列を転写するためおよびおそらく翻訳するために必要な核酸配列のことを指す。ベクターおよび発現ベクターは、転写および翻訳を支配する調節配列に加えて、同様に他の機能を果たす核酸配列を含み得、それらは、下で論じられる。
【００５０】
本明細書中で使用されるとき、用語「エキソビボ」は、身体の「外側」のことを指す。用語「エキソビボ」および「インビトロ」は、本明細書中で交換可能に使用され得る。
【００５１】
Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、抗原性分子に特異的に結合する免疫タンパク質である。ＴＣＲは、Ｔ細胞の表面上に存在する２つの異なるポリペプチドから構成される。それらは、主要組織適合遺伝子複合体分子に結合した抗原を認識またはこれに特異的に結合する；その抗原に結合すると、Ｔ細胞は活性化される。ＴＣＲは、αおよびβポリペプチド、または鎖を含み得る。このαおよびβポリペプチドは、２つの細胞外ドメイン、可変ドメインおよび定常ドメインを含む。このαおよびβポリペプチドの可変ドメインは、３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する；ＣＤＲ３は、エピトープの認識を担う主なＣＤＲであると考えられる。上記αポリペプチドは、ＶＪ組み換えによって生成されるＶおよびＪ領域を含み、上記βポリペプチドは、ＶＤＪ組み換えによって生成されるＶ、Ｄ、およびＪ領域を含む。上記ＶＪ領域およびＶＤＪ領域の交差（ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ）は、ＣＤＲ３領域に相当する。ＴＣＲはしばしば、国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）ＴＣＲ命名法（ＩＭＧＴ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ｗｗｗ．  ＩＭＧＴ．ｏｒｇ；  Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，  Ｖ．ら，ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢ、ＩＭＧＴ（登録商標）  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３４，  Ｄ７８１−Ｄ７８４  （２００６）．  ＰＭＩＤ：  １６３８１９７９；Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ，  ＬｅＦｒａｎｃ  ａｎｄ  ＬｅＦｒａｎｃ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ＩＳＢＮ    ０−１２−４４１３５２−８）を使用して命名される。
【００５２】
「特異的に結合する」とは、Ｔ細胞レセプターに関する場合、あるいは本明細書中の組換えＴ細胞レセプター、核酸フラグメント、バリアント、もしくはアナログ、または改変された細胞（例えば、Ｂｏｂ１  Ｔ細胞レセプター、およびＢｏｂ１を発現する改変された細胞を指す場合、Ｔ細胞レセプターもしくはそのフラグメントが、Ｂｏｂ１抗原を認識するかまたはこれに選択的に結合することを意味する。ある種の条件下では（例えば、イムノアッセイ、例えば、本明細書で論じられるイムノアッセイでは）、上記Ｔ細胞レセプターはＢｏｂ１に結合し、他のポリペプチドには有意な量で結合しない。従って、上記Ｔ細胞レセプターは、コントロール抗原性ポリペプチドに対するより少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍高い親和性でＢｏｂ  １に結合する。この結合はまた、Ｂｏｂ１  ＴＣＲを発現する改変されたＴ細胞の状況において間接的に決定され得る。例えば、本明細書で論じられるアッセイなどのアッセイにおいて、上記改変されたＴ細胞は、多発性骨髄腫細胞株および少なくとも１つの悪性Ｂ細胞株（例えば、ＡＬＬ、ＣＬＬおよびマントル細胞リンパ腫細胞株など）に対して特異的に反応性である。従って、上記改変されたＢｏｂ１発現Ｔ細胞は、多発性骨髄腫細胞株または悪性Ｂ細胞株ではないコントロール細胞株に対するその反応性と比較した場合、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍高い反応性で多発性骨髄腫細胞株または悪性Ｂ細胞株に結合する。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「機能的に等価な」とは、例えば、Ｔ細胞レセプターに関する場合、またはＴ細胞レセプター核酸フラグメント、バリアント、もしくはアナログを指す場合、抗原もしくは細胞に対する免疫応答を刺激するＴ細胞レセプターもしくはＴ細胞レセプターポリペプチドをコードする核酸を指す。Ｔ細胞レセプターポリペプチドの「機能的に等価な」または「機能的フラグメント」とは、例えば、Ｔ細胞レセプタードメイン（例えば、定常領域）を欠いているが、Ｔ細胞に代表的な免疫応答を刺激し得るＴ細胞レセプターを指す。機能的に等価なＴ細胞レセプターフラグメントは、例えば、抗原に特異的に結合し得るかまたは抗原を認識し得、そして認識すると、Ｔリンパ球を活性化し得る。用語「機能的に等価な」が、他の核酸またはポリペプチド（例えば、カスパーゼ−９もしくは短縮型カスパーゼ−９など）に適用される場合、その用語は、本明細書中の方法の参照ポリペプチドと同じまたは類似の活性を有するフラグメント、バリアントなどのことを指す。例えば、腫瘍抗原ポリペプチド、例えば、ＰＳＭＡなどの機能的フラグメントは、抗原性であり得、特定の腫瘍抗原を認識する抗体を産生させ得る。リガンド結合領域の機能的フラグメント、例えば、Ｆｖｌｓは、適切なリガンドに結合するのに十分なリガンド結合領域ポリペプチドの部分を含む。「機能的に等価な」とは、例えば、細胞外ドメインを欠いているが、Ｔ細胞において発現されたとき、Ｔ細胞媒介性の腫瘍殺滅応答を増幅することができる、共刺激ポリペプチドのことを指す。
【００５４】
用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖に起因する疾患として定義される。例示的な過剰増殖性疾患としては、がんまたは自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。他の過剰増殖性疾患としては、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症または炎症性腸疾患が挙げられ得る。
【００５５】
本明細書中で使用されるとき、用語「遺伝子」は、機能的なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする単位として定義される。理解されるように、この機能的な用語には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質および変異体を発現するかまたは発現するように適合された、より小さい操作された遺伝子セグメントが含まれる。
【００５６】
用語「免疫原性組成物」または「免疫原」は、免疫応答を引き起こすことができる物質のことを指す。免疫原の例としては、例えば、抗原、自己免疫疾患の誘導において役割を果たす自己抗原、およびがん細胞上に発現された腫瘍関連抗原が挙げられる。
【００５７】
本明細書中で使用される用語「免疫無防備状態」は、免疫系が衰えているかまたは弱くなっている被験体として定義される。免疫無防備状態の状態は、免疫系の欠損もしくは機能不全または感染および／もしくは疾患への感受性を高める他の要因に起因し得る。そのような分類は、評価に対して概念的基礎を与えるが、免疫無防備状態の個体は、一方の群または他方の群に完全に当てはまらないことが多い。身体の防御機構における２つ以上の欠損が、影響され得る。例えば、ＨＩＶによって引き起こされる特定のＴリンパ球欠損を有する個体は、抗ウイルス治療のために使用される薬物によって引き起こされる好中球減少症も有し得るか、または皮膚および粘膜の完全性が破られたために免疫無防備状態であり得る。免疫無防備状態の状況は、留置中心ライン（ｉｎｄｗｅｌｌｉｎｇ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｌｉｎｅｓ）もしくは静脈内薬物乱用に起因する他のタイプの機能障害に起因し得るか；または続発性悪性疾患、栄養失調によって引き起こされ得るか、または他の感染病原体（例えば、結核）もしくは性行為感染症、例えば、梅毒もしくは肝炎に感染していることに起因し得る。
【００５８】
本明細書中で使用されるとき、用語「薬学的または薬理学的に許容され得る」は、動物またはヒトに投与されたとき、有害（ａｄｖｅｒｓｅ）反応、アレルギー反応または他の有害（ｕｎｔｏｗａｒｄ）反応をもたらさない分子実体および組成物のことを指す。
【００５９】
本明細書中で使用されるとき、「薬学的に許容され得るキャリア」は、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒質または作用物質が、本明細書中に提示されるベクターまたは細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、被験体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、被験体は、ヒトである。
【００６０】
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書中で使用される核酸およびポリヌクレオチドは、相互交換可能である。核酸は、モノマーの「ヌクレオチド」に加水分解され得るポリヌクレオチドである。モノマーのヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書中で使用されるとき、ポリヌクレオチドには、当該分野において利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が含まれるが、これらに限定されず、そのような手段としては、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術およびＰＣＲＴＭなどを使用する組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、ならびに合成手段が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの変異を含み、当該分野で周知の方法によるヌクレオチドまたはヌクレオシドの変異を含むが、これらに限定されない。核酸は、１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。  
【００６１】
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、通常、規定の配列を有する、アミノ酸残基の鎖として定義される。本明細書中で使用されるとき、ポリペプチドという用語は、タンパク質という用語と相互交換可能であり得る。
【００６２】
本明細書中で使用されるとき、用語「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。
【００６３】
本明細書中で使用されるとき、用語「免疫応答を制御する」、「免疫応答を調節する」または「免疫応答をコントロールする」とは、免疫応答を改変できることを指す。例えば、組成物は、免疫応答を増強することおよび／または活性化することができる。なおもさらに、組成物は、免疫応答を阻害することもできる。制御の形態は、組成物とともに使用されるリガンドによって決定される。例えば、化学物質の二量体アナログが、共刺激性ポリペプチドの二量体化をもたらし、Ｔ細胞活性化をもたらすが、しかしながら、その化学物質のモノマーアナログは、共刺激ポリペプチドの二量体化をもたらさず、Ｔ細胞を活性化しない。
【００６４】
用語「トランスフェクション」および「形質導入」は、相互交換可能であり、外来性ＤＮＡ配列が真核生物宿主細胞に導入されるプロセスのことを指す。トランスフェクション（または形質導入）は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃送達、レトロウイルス感染、リポフェクション、スーパーフェクション（ｓｕｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ）などを含むいくつかの手段のうちのいずれか１つによって達成され得る。
【００６５】
本明細書中で使用されるとき、用語「同系」とは、同一の遺伝子型、または組織移植が可能であるのに十分密接な関係がある遺伝子型、または免疫学的に適合性の遺伝子型を有する細胞、組織または動物のことを指す。例えば、同じ近交系の一卵性双生児または動物。同系および同遺伝子系は、交換可能に使用され得る。
【００６６】
用語「患者」または「被験体」は、相互交換可能であり、本明細書中で使用されるとき、生物または動物；哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジまたは他の非ヒト哺乳動物を含む）；非哺乳動物（例えば、非哺乳動物の脊椎動物、例えば、鳥類（例えば、ニワトリまたはアヒル）または魚類、および非哺乳動物の無脊椎動物を含む）を含むが、これらに限定されない。
【００６７】
本明細書中で使用されるとき、用語「ワクチン」とは、動物に投与することができる形態で存在する、本明細書中に提示される組成物を含む製剤のことを指す。代表的には、ワクチンは、組成物が懸濁されるかまたは溶解される従来の食塩水または緩衝水溶液媒質を含む。この形態において、組成物は、ある状態を予防するか、回復させるか、または別途処置するために都合よく使用され得る。ワクチンは、被験体に導入されたとき、抗体、サイトカインおよび／または他の細胞応答の産生を含むがこれらに限定されない免疫応答を引き起こすことができる。
【００６８】
本明細書中で使用されるとき、用語「転写支配下」または「作用的に連結された」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現をコントロールする核酸に対して正しい位置および方向で存在することとして定義される。
【００６９】
本明細書中で使用されるとき、用語「処置」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置される」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、予防法および／または治療のことを指す。その用語は、例えば、がん性の固形腫瘍などの固形腫瘍に関して使用されるとき、固形腫瘍またはがんに対する被験体の抵抗性を高める予防的処置による予防のことを指す。いくつかの例において、被験体は、がんを予防するために処置され得、ここで、そのがんは、家族性であるか、または遺伝的に関連する。その用語は、例えば、感染症に関して使用されるとき、病原体による感染に対する被験体の抵抗性を高める予防的処置、すなわち換言すれば、その被験体が病原体に感染する可能性もしくはその感染症に起因し得る疾病の徴候を示す可能性を低下させる予防的処置、ならびに感染症と闘うための、例えば、感染症を弱めるためもしくは排除するための、または悪化するのを防ぐための、その被験体が感染した後の処置のことを指す。
【００７０】
本明細書で提供される方法は、例えば、腫瘍抗原の上昇した発現が存在する疾患、障害、または状態を処置するために使用され得る。
【００７１】
本明細書中で使用されるとき、用語「ワクチン」とは、動物に投与することができる形態で存在する、本明細書中に提示される組成物を含む製剤のことを指す。代表的には、ワクチンは、組成物が懸濁されるかまたは溶解される従来の食塩水または緩衝水溶液媒質を含む。この形態において、組成物は、ある状態を予防するか、回復させるか、または別途処置するために都合よく使用され得る。ワクチンは、被験体に導入されたとき、抗体の産生、サイトカインの産生および／または他の細胞応答の産生を含むがこれらに限定されない免疫応答を引き起こすことができる。
【００７２】
血液疾患：本明細書中で使用される用語「血液疾患」、「血液疾患」および／または「血液の疾患」は、血液およびその成分（血液細胞、ヘモグロビン、血液タンパク質を含むが、これらに限定されない）の産生、凝固のメカニズム、血液の産生、血液タンパク質の産生などおよびそれらの組み合わせに影響する状態のことを指す。血液疾患の非限定的な例としては、貧血、白血病、リンパ腫、血液学的新生物、アルブミン血症（ａｌｂｕｍｉｎｅｍｉａｓ）、血友病などが挙げられる。
【００７３】
骨髄疾患：本明細書中で使用される用語「骨髄疾患」は、血液細胞および血小板の産生の減少をもたらす状態のことを指す。いくつかの骨髄疾患では、正常な骨髄の構造が、感染症（例えば、結核）または悪性疾患によって取って代わられ得、その後、血液細胞および血小板の産生の減少に至り得る。骨髄疾患の非限定的な例としては、白血病、細菌感染症（例えば、結核）、放射線宿酔または放射線中毒、汎血球減少症（ａｐｎｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、貧血、多発性骨髄腫などが挙げられる。
【００７４】
Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞：ＣＤ３＋Ｔ細胞（Ｔリンパ球とも称される）は、リンパ球と称される白血球の一群に属する。リンパ球は、一般に、細胞性免疫に関わる。「Ｔ細胞」における「Ｔ」とは、胸腺に由来する細胞またはその成熟が胸腺に影響される細胞のことを指す。Ｔ細胞は、Ｔ細胞レセプターとして知られる細胞表面タンパク質の存在によって、他のリンパ球のタイプ（例えば、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）と区別され得る。本明細書中で使用される用語「活性化Ｔ細胞」は、クラスＩおよびＩＩ主要組織適合性（ＭＨＣ）マーカーにおいて提示された抗原決定基の認識によって免疫応答（例えば、活性化Ｔ細胞のクローン性増殖）をもたらすように刺激されたＴ細胞のことを指す。Ｔ細胞は、抗原決定基、サイトカインおよび／またはリンフォカインならびに分化クラスター細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８などおよびそれらの組み合わせ）の存在によって活性化される。差次的なタンパク質のクラスターを発現する細胞は、しばしば、Ｔ細胞表面上のそのタンパク質の発現について「陽性」であると言われる（例えば、ＣＤ３またはＣＤ４の発現について陽性の細胞は、ＣＤ３＋またはＣＤ４＋と称される）。ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８タンパク質は、Ｔ細胞におけるシグナル伝達に直接的および／または間接的に関わり得る細胞表面レセプターまたはコレセプターである。
【００７５】
末梢血：本明細書中で使用される用語「末梢血」は、血液の循環プールから得られるかまたは調製され、リンパ系、脾臓、肝臓もしくは骨髄内に隔絶されない、血液の細胞成分（例えば、赤血球、白血球および血小板）のことを指す。
【００７６】
臍帯血：臍帯血は、末梢血、およびリンパ系、脾臓、肝臓または骨髄内に隔絶された血液とは異なる。交換可能に使用され得る用語「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｂｌｏｏｄ）」、「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｂｌｏｏｄ）」または「臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）」は、胎盤および出産後のつながったままの臍帯に残存する血液のことを指す。臍帯血は、造血細胞をはじめとした幹細胞を含むことが多い。
【００７７】
例えば、細胞の場合におけるような「得られるかまたは調製される」は、細胞または細胞培養物が、その供給源から単離されること、精製されることまたは部分的に精製されることを意味し、ここで、その供給源は、例えば、臍帯血、骨髄または末梢血であり得る。これらの用語は、元の供給源または細胞培養物が培養され、細胞が複製される場合、および子孫細胞がその元の供給源に由来する場合にも適用され得る。
【００７８】
あるパーセントの細胞が殺滅される場合におけるような「殺滅する（ｋｉｌｌ）」または「殺滅する（ｋｉｌｌｉｎｇ）」は、アポトーシスを計測するための公知の任意の方法を用いて計測されるときの、アポトーシスによる細胞の死を意味する。その用語は、細胞剥離のことも指し得る。
【００７９】
ドナーＴ細胞：ここで使用される用語「ドナーＴ細胞」は、同種異系の幹細胞移植の後に抗ウイルス免疫および／または抗腫瘍免疫をもたらすためにレシピエントにしばしば投与されるＴ細胞のことを指す。ドナーＴ細胞は、骨髄移植片拒絶反応を阻害するためおよび同種異系生着（ａｌｌｏｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）の成功を増加させるために利用されることが多いが、しかしながら、同じドナーＴ細胞は、宿主抗原に対する同種異系攻撃反応（ａｌｌｏａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を引き起こし得、それはその後、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）をもたらし得る。ある特定の活性化ドナーＴ細胞は、他の活性化Ｔ細胞よりも高いまたは低いＧｖＨＤ反応を引き起こし得る。ドナーＴ細胞は、レシピエントの腫瘍細胞に対しても反応性であり得、有益な移植片対腫瘍効果を引き起こす。
【００８０】
機能保存的バリアントは、タンパク質または酵素の全体的な立体構造および機能を変化させずに所与のアミノ酸残基が変更されたタンパク質または酵素であり、それには、あるアミノ酸を、極性または非極性の性質、サイズ、形状および電荷を含む類似の特性を有するアミノ酸で置き換えることが含まれるが、これらに限定されない。一般に公知の遺伝的にコードされないアミノ酸の多くに対する保存的アミノ酸置換は、当該分野で周知である。他のコードされないアミノ酸に対する保存的置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸の特性と比べたときの物理的特性に基づいて決定され得る。
【００８１】
保存アミノ酸と示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において異なり得、機能が類似した任意の２つのタンパク質の間のタンパク質配列またはアミノ酸配列の類似性のパーセントは、変動し得、アラインメントスキームに従って決定されるとき、例えば、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％であり得る。本明細書中で言及されるとき、「配列類似性」は、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が関係する程度を意味する。２つの配列間の類似性の程度は、配列同一性および／または保存のパーセントに基づき得る。本明細書中の「配列同一性」は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が不変である程度を意味する。「配列アラインメント」は、類似性の程度を評価する目的のために最大の同一性（およびアミノ酸配列の場合、保存）レベルを達成するように２つ以上の配列を並べるプロセスを意味する。配列をアラインメントするためおよび類似性／同一性を評価するための数多くの方法（例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ法ならびにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡなど）が、当該分野で公知である。これらのプログラムのうちのいずれかを使用するとき、好ましい設定は、最も高い配列類似性をもたらす設定である。
【００８２】
間葉系ストローマ細胞：本明細書中で使用される用語「間葉系ストローマ細胞」または「骨髄由来間葉系ストローマ細胞」は、エキソビボ、インビトロおよびインビボにおいて脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨芽細胞に分化し得、標準的な培養条件においてプラスチック培養皿に接着する単核骨髄細胞の一部としてさらに定義され得る、多分化能幹細胞のことを指し、造血系マーカーが陰性であり、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５が陽性である。
【００８３】
胚性幹細胞：本明細書中で使用される用語「胚性幹細胞」は、５０〜１５０個の細胞の初期胚である、胚盤胞の内部細胞塊に由来する、多能性幹細胞のことを指す。胚性幹細胞は、それ自体を無限に再生する能力、ならびに３つの一次胚葉である外胚葉、内胚葉および中胚葉のすべての誘導体に分化する能力を特徴とする。多能性細胞は、すべての細胞型を生み出せるが、多分化能細胞（例えば、成体幹細胞）は、限られた数の細胞型しか生み出せないという点で、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）は、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）と区別される。
【００８４】
誘導性多能性幹細胞：本明細書中で使用される用語「誘導性多能性幹細胞」または「人工多能性幹細胞」は、胚性幹細胞などの、すべての細胞型ではないが多くの細胞型に分化できる細胞を作製するように、遺伝的操作（例えば、後に多能性を活性化する遺伝子の発現）、生物学的操作（例えば、ウイルスまたはレトロウイルスによる処理）および／または化学的操作（例えば、小分子、ペプチドなど）によって「再プログラムされた」または誘導された、成体の細胞または分化細胞のことを指す。誘導性多能性幹細胞は、それらが、中間に分化したまたは最終分化した状況（例えば、皮膚細胞、骨細胞、線維芽細胞など）を達成し、次いで、脱分化するように誘導され、それにより、多分化能細胞または多能性細胞を作製する能力の一部または全部を回復するという点で胚性幹細胞と区別される。
【００８５】
ＣＤ３４＋細胞：本明細書中で使用される用語「ＣＤ３４＋細胞」は、その細胞表面上にＣＤ３４タンパク質を発現している細胞のことを指す。本明細書中で使用される「ＣＤ３４」は、細胞間接着因子としてしばしば働き、リンパ節にＴ細胞が入ることに関与し、「分化クラスター」遺伝子ファミリーのメンバーである、細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）のことを指す。ＣＤ３４は、骨髄、細胞外マトリックスに、またはストローマ細胞に直接、幹細胞が付着することも媒介し得る。ＣＤ３４＋細胞は、臍帯および骨髄において造血細胞として、間葉系幹細胞のサブセット、内皮前駆体細胞、リンパ管（胸膜のリンパ管を除く）ではなく血管の内皮細胞、マスト細胞、皮膚の真皮の間質におよび付属器周辺における樹状細胞の部分集団（ＸＩＩＩａ因子が陰性である）、ならびにある特定の軟部組織の腫瘍（例えば、胞状軟部肉腫、プレＢ急性リンパ芽球性白血病（Ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ＡＭＬ−Ｍ７、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、巨細胞線維芽腫、顆粒球性肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、髄膜（ｍｅｎｇｉｎｇｅａｌ）血管周囲細胞腫、髄膜腫、神経線維腫、神経鞘腫および甲状腺乳頭癌）における細胞に見られることが多い。
【００８６】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、標的化された様式（ｍａｎｏｒ）で、腫瘍に浸潤し、腫瘍細胞を殺滅する、様々なレセプターを有するＴ細胞のことを指す。本願の方法を使用してＴＩＬの活性を制御することは、腫瘍細胞の排除のより直接的なコントロールを可能にし得る。
【００８７】
遺伝子発現ベクター：本文書全体を通じて交換可能に使用され得る、本明細書中で使用される用語「遺伝子発現ベクター」、「核酸発現ベクター」または「発現ベクター」は、宿主細胞内で複製され得、単数または複数の遺伝子を宿主細胞に導入するために利用され得る、核酸分子（例えば、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、人工染色体、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ））のことを広く指す。発現ベクター上に導入された遺伝子は、内在性遺伝子（例えば、宿主細胞または宿主生物に通常見られる遺伝子）または異種遺伝子（例えば、ゲノムに通常見られない遺伝子または宿主細胞もしくは宿主生物の染色体外核酸上の遺伝子）であり得る。発現ベクターによって細胞に導入される遺伝子は、天然の遺伝子、または改変されたもしくは操作された遺伝子であり得る。遺伝子発現ベクターは、発現ベクター上に保有された単数または複数の遺伝子の効率的な転写を促進し得るかまたは増強し得る、エンハンサー配列、プロモーター領域および／またはターミネーター配列として時折、機能し得る、５’および３’非翻訳制御配列を含むようにも操作され得る。遺伝子発現ベクターは時折、特定の細胞型、細胞位置または組織タイプにおける複製および／または発現の機能性（例えば、転写および翻訳）について操作される。発現ベクターは時折、宿主細胞またはレシピエント細胞においてベクターを維持するための選択マーカーを含む。
【００８８】
発生的に制御されるプロモーター：本明細書中で使用される用語「発生的に制御されるプロモーター」は、発生のプログラムまたは経路によってコントロールされるか、開始されるか、または影響されるある特定の条件下で発現される遺伝子を転写するＲＮＡポリメラーゼに対する最初の結合部位として作用するプロモーターのことを指す。発生的に制御されるプロモーターは、発生のプログラムまたは経路の一部である遺伝子の転写に影響し得る転写のアクチベーターまたはリプレッサーに結合するためのさらなる調節領域をプロモーター領域にまたはプロモーター領域付近に有することが多い。発生的に制御されるプロモーターは、時折、遺伝子産物が細胞の発生分化に影響する遺伝子の転写に関与する。
【００８９】
発生的に分化した細胞：本明細書中で使用される用語「発生的に分化した細胞」は、発生的に制御される特定の遺伝子の発現を伴うことが多く、特定の機能を果たすために、その細胞がそれほど特殊化されていない形態からより特殊化された形態に発展するプロセスを経た細胞のことを指す。発生的に分化した細胞の非限定的な例は、肝臓細胞、肺細胞、皮膚細胞、神経細胞、血液細胞などである。発生分化の変化は、通常、遺伝子発現の変化（例えば、遺伝子発現のパターンの変化）、遺伝子の再編成（例えば、サイレンシングされるかまたは発現される遺伝子をそれぞれ隠すかまたは曝すリモデリングまたはクロマチン）を含み、時々、ＤＮＡ配列の変化（例えば、免疫多様性の分化）を含む。発生中の細胞分化は、遺伝子制御ネットワークの結果として理解され得る。制御遺伝子およびそのシス制御のモジュールは、インプット（例えば、発生の経路またはプログラムの上流で発現されるタンパク質）を受け取り、そのネットワークの別の箇所でアウトプットをもたらす、遺伝子制御ネットワークにおける分岐点（ｎｏｄｅ）である（例えば、発現された遺伝子産物は、その発生の経路またはプログラムの下流の他の遺伝子に対して作用する）。
【００９０】
いくつかの実施形態において、核酸は、ウイルスベクター内に含まれている。ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、細胞は、エキソビボにおいてウイルスベクターと接触され、いくつかの実施形態において、細胞は、インビボにおいてウイルスベクターと接触されることが理解される。
【００９１】
ある特定の実施形態において、細胞は、抗原とも接触される。しばしば、細胞は、エキソビボにおいて抗原と接触される。時折、細胞は、インビボにおいて抗原と接触される。いくつかの実施形態において、細胞は、被験体内に存在し、免疫応答が、抗原に対してもたらされる。時折、免疫応答は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答である。時折、免疫応答は、腫瘍抗原に対してもたらされる。ある特定の実施形態において、細胞は、アジュバントの添加なしに活性化される。
【００９２】
いくつかの実施形態において、細胞は、エキソビボにおいて核酸を形質導入され、皮内投与によって被験体に投与される。いくつかの実施形態において、細胞は、エキソビボにおいて核酸を形質導入され、皮下投与によって被験体に投与される。時折、その細胞は、エキソビボにおいて核酸を形質導入される。時折、その細胞は、インビボにおいて核酸を形質導入される。
【００９３】
いくつかの実施形態における細胞は、時折、エキソビボにおいて抗原と接触される。ある特定の実施形態において、細胞は、被験体内に存在し、免疫応答、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答が、その抗原に対してもたらされる。ある特定の実施形態において、免疫応答が、腫瘍抗原（例えば、ＰＳＭＡ）に対してもたらされる。いくつかの実施形態において、核酸は、エキソビボにおいて調製され、例えば、皮内投与または皮下投与によって、被験体に投与される。時折、細胞は、エキソビボまたはインビボにおいて核酸を形質導入されるかまたはトランスフェクトされる。
【００９４】
いくつかの実施形態において、核酸は、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。あるいは、核酸は、キメラタンパク質のタンパク質コード領域を含む、エキソビボにおいて転写されるＲＮＡを含む。
【００９５】
固形腫瘍の「腫瘍サイズを減少させる」または「腫瘍の成長を阻害する」とは、標準的なガイドライン、例えば、例えば、固形がんの治療効果判定のためのガイドライン（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ）（ＲＥＣＩＳＴ）基準に従う、処置に対する応答または疾患の安定化のことを意味する。例えば、これは、固形腫瘍の直径の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の減少、または腫瘍、循環腫瘍細胞もしくは腫瘍マーカーの数の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の減少を含み得る。腫瘍のサイズは、例えば、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、例えば、ＣＴ−ＭＲＩ、胸部Ｘ線（肺の腫瘍の場合）または分子イメージング、例えば、ＰＥＴスキャン、例えば、阻害剤がＴＲＯＦＥＸＴＭ／ＭＩＰ−１０７２／１０９５である場合など、例えば、ヨウ素１２３で標識されたＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡリガンドを投与した後のＰＥＴスキャン、または分子イメージング、例えば、ＳＰＥＣＴ、またはＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡ抗体、例えば、１１１−イリジウムで標識されたＰＳＭＡ抗体であるカプロマブ（ｃａｐｒｏｍａｄ）ペンデチド（ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ）などを用いるＰＥＴスキャンをはじめとした任意の方法によって解析され得る。
【００９６】
「腫瘍の血管新生を減少させるか、遅延させるかまたは阻害する」とは、処置前の腫瘍の血管新生の量と比べたときの、腫瘍の血管新生の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の減少または新しい血管構造の出現の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の減少のことを意味する。その減少は、１つの腫瘍について言及していることもあるし、１つより多い腫瘍における血管新生の合計または平均でもあり得る。腫瘍の血管新生を測定する方法としては、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲＩ、例えば、ＣＴ−ＭＲＩ、または分子イメージング、例えば、ＳＰＥＣＴもしくはＰＥＴスキャン、例えば、阻害剤がＴＲＯＦＥＸＴＭ／ＭＩＰ−１０７２／１０９５である場合など、例えば、ヨウ素１２３で標識されたＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡリガンドの投与後のＰＥＴスキャンなど、またはＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡ抗体、例えば、１１１−イリジウムで標識されたＰＳＭＡ抗体であるカプロマブペンデチド（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ）などを用いるＰＥＴスキャンが挙げられる。
【００９７】
例えば、腫瘍が、前立腺に存在するものであるか、または前立腺における腫瘍に由来するかもしくは前立腺における腫瘍から転移したものであるか、またはＰＳＡを産生するものであるとき、その腫瘍は、前立腺がんの腫瘍などと分類されるかまたは器官の一部として命名される。例えば、腫瘍が、被験体の前立腺における腫瘍と同じまたは同様の染色体切断点を有すると決定されるとき、その腫瘍は、前立腺における腫瘍から転移したものである。
【００９８】
血液悪性腫瘍に関して、「血液悪性腫瘍を減少させるか、遅延させるかまたは阻害する」とは、処置前の悪性細胞の量または濃度と比較したとき、例えば被験体から得られるサンプル中で測定される場合に、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の悪性細胞の量または濃度の減少、遅延または阻害のことを意味する。悪性細胞もしくは腫瘍負荷の量または濃度を測定するための方法としては、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびゲノムワイドシーケンシングが挙げられる。
【００９９】
血液腫瘍に関して、「腫瘍負荷を減少させるか、遅延させるかまたは阻害する」とは、処置前の腫瘍細胞の量または濃度と比較したとき、例えば被験体から得られるサンプル中で測定される場合に、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の腫瘍細胞の量または濃度の減少、遅延または阻害のことを意味する。腫瘍細胞の量または濃度を測定するための方法としては、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびゲノムワイドシーケンシングが挙げられる。
【０１００】
（発現構築物の操作）
本発明のＴＣＲまたはキメラポリペプチドを発現する発現構築物は、ＴＣＲまたはポリペプチドコード領域およびプロモーター配列（全て作用的に連結される）を含む。一般に、用語「作動可能に連結される（operably  linked）」とは、プロモーター配列が第２の配列に機能的に連結されており、ここで上記プロモーター配列が、上記第２の配列に相当するＤＮＡの転写を開始および媒介することを示すことを意味する。
【０１０１】
ある種の例において、ＴＣＲまたは他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、上記第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同じベクター（例えば、ウイルスベクターもしくはプラスミドベクターなどの）の中に含まれる。この第２のポリペプチドは、例えば、カスパーゼポリペプチド（本明細書で論じられるとおり）またはマーカーポリペプチドであり得る。これらの例において、上記構築物は、切断可能な２Ａポリペプチドによって連結された、２個のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸に作動可能に連結された１個のプロモーターとともにデザインされ得る。この例において、上記第１のおよび第２のポリペプチドは、翻訳の間に分断され、ＴＣＲおよびさらなるポリペプチドを生じる。他の例において、この２個のポリペプチドは、同じベクターから別個に発現され得、ここで上記ポリペプチドのうちの一方をコードするポリヌクレオチドを含む各核酸は、別個のプロモーターに作動可能に連結される。さらに他の例において、１個のプロモーターは、２個のポリヌクレオチドに作動可能に連結され、２個の別個のＲＮＡ転写物、および従って２個のポリペプチドの生成を指向する；一例において、上記プロモーターは、２方向性であり得、そのコード領域は、５’−３’の反対方向にあり得る。従って、本明細書で論じる発現構築物は、少なくとも１個、または少なくとも２個のプロモーターを含み得る。
【０１０２】
さらに他の例において、２個のポリペプチド（例えば、ＴＣＲおよびカスパーゼポリペプチドなど）は、２個の別個のベクターを使用して細胞において発現され得る。上記細胞は、ベクターで共トランスフェクトもしくは共形質転換され得るか、または上記ベクターは、異なる時点で上記細胞に導入され得る。
【０１０３】
上記ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端までそれらの順序において変動し得る。種々のドメインの順序は、最適な発現および活性を得るために、例えば、本明細書で論じる方法などの方法を使用してアッセイされ得る。
【０１０４】
選択マーカー
ある特定の実施形態において、発現構築物は、その発現構築物にマーカーを含めることによってその発現がインビトロまたはインビボにおいて識別される核酸構築物を含む。そのようなマーカーは、その発現構築物を含む細胞の容易な識別を可能にする識別可能な変化を細胞にもたらし得る。通常、薬物選択マーカーを含めることが、クローニングおよび形質転換体の選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）などの酵素が使用される。免疫学的表面マーカーを含む細胞外の非シグナル伝達ドメインまたは様々なタンパク質（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＬＮＧＦＲ）もまた使用され得、それにより、磁性抗体または蛍光抗体によって媒介される選別のための直接的方法が可能になる。使用される選択マーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要であると考えられない。選択マーカーのさらなる例としては、例えば、レポーター（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ベータ−ｇａｌまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））が挙げられる。ある特定の実施形態において、マーカータンパク質、例えば、ＣＤ１９などは、例えば、免疫磁気選択などにおいて、移入するための細胞の選択のために使用される。本明細書中で論じられるように、ＣＤ１９マーカーは、抗ＣＤ１９抗体、すなわち、例えば、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、ＴＣＲまたは他の抗原認識部分と区別される。
【０１０５】
ある種の実施形態において、上記マーカーポリペプチドは、誘導性キメラシグナル伝達分子に連結される。例えば、上記マーカーポリペプチドは、ポリペプチド配列（例えば、切断可能な２Ａ様配列など）を介して、誘導性キメラシグナル伝達分子に連結され得る。上記マーカーポリペプチドは、例えば、ＣＤ１９、ΔＣＤ１９であり得るか、または例えば、上記誘導性キメラシグナル伝達分子の活性に影響を与えないように選択された異種タンパク質であり得る。
【０１０６】
２Ａ様配列または「ペプチド結合スキッピング」２Ａ配列は、例えば、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ由来のものを含む、例えば、多くの異なるウイルスに由来する。これらの配列は、時折、「ペプチドスキッピング配列」としても知られる。このタイプの配列が、分断されるように意図された２つのペプチドの間のシストロン内に配置されるとき、リボソームは、ペプチド結合をスキップするとみられ、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａの配列の場合、カルボキシ末端「Ｐ−Ｇ−Ｐ」におけるＧｌｙアミノ酸とＰｒｏアミノ酸との間の結合が省略される。この配列が使用されるとき、２Ａ配列の５’側でコードされるペプチドは、カルボキシ末端において、Ｇｌｙ残基および２Ａ配列内の任意の上流残基を含むさらなるアミノ酸で終わることがある。２Ａ配列の３’側でコードされるペプチドは、アミノ末端において、Ｐｒｏ残基および２Ａ配列の後ろの任意の下流残基を含むさらなるアミノ酸で終わることがある。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、細胞をソーティングする一助とするために、発現ベクターの中に含まれ得る。例えば、ＣＤ３４最小エピトープは、ベクターの中に組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＴＣＲを発現させるために使用される発現ベクターは、１６アミノ酸のＣＤ３４最小エピトープをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。本明細書中の例において提供されるある特定の実施形態などのいくつかの実施形態において、ＣＤ３４最小エピトープは、ＣＤ８ストークのアミノ末端位置において組み込まれる。
【０１０８】
リガンド結合領域
リガンド結合領域は、本明細書で論じられるキメラポリペプチドの中に、例えば、誘導性カスパーゼポリペプチドの一部として含まれ得る。発現構築物のリガンド結合（「二量体化」）ドメインは、天然または非天然のリガンド、例えば、非天然の合成リガンドを使用して誘導を可能にし得る任意の好都合なドメインであり得る。多量体化領域、、またはリガンド結合ドメインは、構築物の性質およびリガンドの選択に応じて、細胞膜に対して内側または外側であり得る。上に示された細胞質領域と会合されるリガンド結合タンパク質を含むレセプターをはじめとした多種多様のリガンド結合タンパク質が公知である。本明細書中で使用されるとき、用語「リガンド結合ドメインは、用語「レセプター」と相互交換可能であり得る。リガンド（例えば、小さい有機リガンド）が公知であるかまたは容易に生成され得るリガンド結合タンパク質が、特に興味深い。これらのリガンド結合ドメインまたはレセプターには、ＦＫＢＰおよびシクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、上に示された他のレセプターなど、ならびに抗体から得ることができる「非天然の」レセプター、特に、重鎖または軽鎖サブユニット、その変異された配列、確率論的手順、コンビナトリアル合成などによって得られるランダムアミノ酸配列が含まれる。ある特定の実施形態において、リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域、ステロイドレセプターリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域およびテトラサイクリンレセプターリガンド結合領域からなる群より選択される。しばしば、リガンド結合領域は、ＦｖＦｖｌｓ配列を含む。時折、Ｆｖ’Ｆｖｌｓ配列は、さらなるＦｖ’配列をさらに含む。例としては、例えば、Ｋｏｐｙｔｅｋ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：３１３−３２１（２０００）およびＧｅｓｔｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍ．＆  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １０：６６７−６７５（２００７）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  Ｔ（２００６）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  ６７：４４０−２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，ｓ．ら、ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ，２００７））において論じられているものが挙げられる。
【０１０９】
おおむね、リガンド結合ドメインまたはレセプタードメインは、天然のドメインまたはその切断された活性な一部として、少なくとも約５０アミノ酸、および約３５０アミノ酸未満、通常、２００アミノ酸未満であり得る。結合ドメインは、例えば、低分子（ウイルスベクターでの効率的なトランスフェクションを可能にする＜２５ｋＤａ）であり得、モノマーであり得、非免疫原性であり得、二量体化のために形成され得る、合成的に入手可能な細胞透過性の無毒性リガンドを有し得る。
【０１１０】
レセプタードメインは、発現構築物のデザインおよび適切なリガンドの利用可能性に応じて、細胞内または細胞外であり得る。疎水性リガンドの場合、結合ドメインは、膜のいずれの側であってもよいが、親水性リガンド、特に、タンパク質リガンドの場合、リガンドを結合にとって利用可能な形態で内部移行させるための輸送系が存在しない場合、結合ドメインは、通常、細胞膜に対して外側であり得る。細胞内レセプターの場合、構築物は、レセプタードメイン配列の５’または３’においてシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインをコードし得るか、またはレセプタードメイン配列の５’に脂質付着シグナル配列を有し得る。レセプタードメインが、シグナルペプチドと膜貫通ドメインとの間に存在する場合、レセプタードメインは、細胞外であり得る。
【０１１１】
レセプターをコードする発現構築物の一部は、種々の理由のために変異誘発に供され得る。変異誘発されたタンパク質は、より高い結合親和性を提供し得、天然に存在するレセプターと変異誘発されたレセプターとのリガンドによる区別を可能にし得、レセプター−リガンド対などをデザインする機会を提供し得る。レセプターの変更は、結合部位におけるコンビナトリアル法を使用したランダム変異誘発と知られているアミノ酸の変更を含み得、ここで、結合部位に関連するアミノ酸または立体構造変化に関連する他のアミノ酸に対するコドンが、特定のアミノ酸に対するコドン（複数可）を公知の変化によってまたはランダムに変更し、得られるタンパク質を適切な原核生物宿主において発現し、次いで、得られたタンパク質を結合についてスクリーニングすることによって、変異誘発に供され得る。
【０１１２】
抗体および抗体サブユニット、例えば、重鎖もしくは軽鎖、特にフラグメント、より詳細には、可変領域の全部もしくは一部、または高親和性結合をもたらす重鎖と軽鎖との融合物が、結合ドメインとして使用され得る。企図される抗体には、免疫応答を引き起こさず、一般に末梢（すなわち、ＣＮＳ／脳領域の外側）では発現されない細胞外ドメインなどの異所的に発現されたヒト生成物であるものが含まれる。そのような例としては、低親和性神経成長因子レセプター（ＬＮＧＦＲ）および胚表面タンパク質（すなわち、癌胎児抗原）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
なおもさらに、抗体は、生理的に許容され得るハプテン分子、および結合親和性についてスクリーニングされる個別の抗体サブユニットに対して調製され得る。そのサブユニットをコードするｃＤＮＡは、単離され、定常領域、可変領域の一部の欠失、可変領域の変異誘発などによって改変されることにより、リガンドに対して適切な親和性を有する結合タンパク質ドメインを得ることができる。このように、ほとんどの生理的に許容され得る任意のハプテン化合物が、リガンドとして使用され得るか、またはリガンドに対するエピトープを提供するために使用され得る。抗体単位の代わりに、結合ドメインが公知であって、結合のための有用なリガンドが存在する、天然のレセプターが使用され得る。
【０１１４】
オリゴマー化
形質導入されるシグナルは、通常、キメラタンパク質分子のリガンド媒介性のオリゴマー化によって、すなわち、リガンドが結合した後のオリゴマー化の結果として、生じ得るが、他の結合事象、例えば、アロステリックな活性化が、シグナルを惹起するために使用され得る。キメラタンパク質の構築物は、様々なドメインの順序および個々のドメインの反復の数に関して、変動し得る。
【０１１５】
カスパーゼ−９ポリペプチドを多量体化する場合、キメラ誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドのリガンド結合ドメイン／レセプタードメインに対するリガンドは、通常、少なくとも２つの結合部位を有し、それらの結合部位の各々がリガンドレセプタードメインに結合することができるという意味において、多量体であり得る。「多量体リガンド結合領域」とは、多量体リガンドに結合するリガンド結合領域のことを意味する。用語「多量体リガンド」には、二量体のリガンドが含まれる。二量体のリガンドは、リガンドレセプタードメインに結合することができる２つの結合部位を有し得る。望ましくは、対象のリガンドは、二量体またはそれより高次のオリゴマー、通常、約四量体以下の、小さい合成有機分子であり得、個々の分子は、代表的には、少なくとも約１５０Ｄａおよび約５ｋＤａ未満、通常、約３ｋＤａ未満であり得る。合成リガンドとレセプターとの種々の対が、使用され得る。例えば、天然のレセプターを含む実施形態において、二量体のＦＫ５０６は、ＦＫＢＰ１２レセプターとともに使用され得、二量体化されたシクロスポリンＡは、シクロフィリンレセプターとともに使用され得、二量体化されたエストロゲンは、エストロゲンレセプターとともに使用され得、二量体化された糖質コルチコイドは、糖質コルチコイドレセプターとともに使用され得、二量体化されたテトラサイクリンは、テトラサイクリンレセプターとともに使用され得、二量体化されたビタミンＤは、ビタミンＤレセプターとともに使用され得るなど。あるいは、それより高次のリガンド、例えば、三量体が、使用され得る。非天然のレセプター、例えば、抗体サブユニット、改変された抗体サブユニット、可動性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む一本鎖抗体、または改変されたレセプターならびにその変異された配列などを含む実施形態の場合、多種多様な化合物のうちのいずれかが使用され得る。これらのリガンド単位の有意な特色は、各結合部位が、高親和性でレセプターに結合することができる点、およびそれらのリガンド単位が、化学的に二量体化されることができる点である。また、リガンドが、機能的なレベルで血清に溶解することができ、なおもほとんどの用途のために原形質膜を横断して拡散することができるように、それらのリガンドの疎水性／親水性のバランスをとる方法も利用可能である。
【０１１６】
ある特定の実施形態において、本方法は、条件的にコントロールされるタンパク質またはポリペプチドを生成するために、化学的に誘導される二量体化（ＣＩＤ）の手法を利用する。この手法は、誘導可能であることに加えて、不安定な二量体化剤の分解またはモノマーの競合的阻害剤の投与に起因して、可逆的である。
【０１１７】
ＣＩＤシステムは、合成二価リガンドを使用して、リガンド結合ドメインに融合されたシグナル伝達分子を迅速に架橋する。このシステムは、細胞表面タンパク質（Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３．２６２：ｐ．１０１９−１０２４；Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｄ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １９９６，６：８３９−８４７；Ｂｌａｕ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９７，９４：３０７６−３０８１）またはサイトゾルタンパク質（Ｌｕｏ，Ｚ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８３：１８１−１８５；ＭａｃＣｏｒｋｌｅ，Ｒ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９８，９５：３６５５−３６６０）のオリゴマー化および活性化、転写を調節するＤＮＡエレメントへの転写因子のリクルートメント（Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８２：８２２−８２６；Ｒｉｖｅｒａ，Ｖ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９６，２：１０２８−１０３２）またはシグナル伝達を刺激する原形質膜へのシグナル伝達分子のリクルートメント（Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９５，９２：９８０５−９８０９；Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９５，９５：９８１０−９８１４）を引き起こすために使用されている。
【０１１８】
ＣＩＤシステムは、表面レセプターの凝集が、下流のシグナル伝達カスケードを効率的に活性化するという概念に基づく。最も単純な実施形態において、ＣＩＤシステムは、脂質透過性免疫抑制薬ＦＫ５０６の二量体アナログを使用し、その二量体アナログは、その正常な生物活性を失っているが、ＦＫ５０６結合タンパク質であるＦＫＢＰ１２に遺伝的に融合された分子を架橋する能力を獲得している。１つ以上のＦＫＢＰおよびミリストイル化配列を、標的レセプターの細胞質シグナル伝達ドメインに融合することによって、二量体化薬物に依存的であるがリガンドおよび外部ドメインに非依存的な様式でシグナル伝達を刺激することができる。これにより、時間的なコントロール、モノマー薬物アナログを使用して可逆性、および高い特異性を備えたシステムが提供される。第３世代のＡＰ２０１８７／ＡＰ１９０３  ＣＩＤの、それらの結合ドメインであるＦＫＢＰ１２に対する高親和性は、インビボにおいて、内在性のＦＫＢＰ１２による非特異的な副作用を誘導することなく、組換えレセプターの特異的な活性化を可能にする。二量体化薬物に結合する、アミノ酸の置換および欠失を有するＦＫＢＰ１２バリアント（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６）もまた使用され得る。さらに、合成リガンドは、プロテアーゼ分解に対して抵抗性であり、それにより、インビボにおけるレセプターの活性化において、送達されるほとんどのタンパク質剤よりも効率的になる。
【０１１９】
使用されるリガンドは、リガンド結合ドメインの２つ以上に結合することができる。キメラタンパク質は、２つ以上のリガンド結合ドメインを含むとき、２つ以上のリガンドに結合することができる場合がある。そのリガンドは、代表的には、非タンパク質または化学物質である。例示的なリガンドとしては、二量体のＦＫ５０６（例えば、ＦＫ１０１２）が挙げられるが、これに限定されない。
【０１２０】
他のリガンド結合領域は、例えば、二量体の領域、またはゆらぎ置換によって改変されたリガンド結合領域、例えば、ＦＫＢＰ１２（Ｖ３６）などであり得る：Ｆ３６がＶに置換されたヒト１２ｋＤａ  ＦＫ５０６結合タンパク質、完全に成熟したコード配列（アミノ酸１〜１０７）は、合成二量体化薬物ＡＰ１９０３に対する結合部位を提供する（Ｊｅｍａｌ，Ａ．ら、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃ．５８，７１−９６（２００８）；Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ．ａｎｄ  Ｋｅｌｌｙ，Ｗ．Ｋ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １１，１５６６−７２（１９９３））。上記タンパク質の２つのタンデムなコピーは、より高次のオリゴマーが、ＡＰ１９０３による架橋の際に誘導されるようにその構築物においても使用され得る。
【０１２１】
Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰ：Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、Ｆ３６Ｖ−ＦＫＢＰのコドンゆらぎバージョンである。それは、  Ｆ３６Ｖ−ＦＫＰＢと同一のポリペプチド配列をコードするが、ヌクレオチドレベルでは６２％の相同性しか有しない。Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、レトロウイルスベクターにおける組換えを減少させるようにデザインされた（Ｓｃｈｅｌｌｈａｍｍｅｒ，Ｐ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５７，１７３１−５（１９９７））。Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、ＰＣＲアセンブリ手順によって構築された。その導入遺伝子は、１コピーのＦ３６Ｖ−ＦＫＢＰに直接連結された１コピーのＦ３６Ｖ’−ＦＫＢＰを含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、リガンドは、小分子である。選択されたリガンド結合領域に対する適切なリガンドが、選択され得る。しばしば、リガンドは、二量体であり、時折、リガンドは、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６アナログである。ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ１９０３（ＣＡＳ索引名：２−ピペリジンカルボン酸、１−［（２Ｓ）−１−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ブチル］−、１，２−エタンジイルビス［イミノ（２−オキソ−２，１−エタンジイル）オキシ−３，１−フェニレン［（１Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピリデン］］エステル、［２Ｓ−［１（Ｒ＊），２Ｒ＊［Ｓ＊［Ｓ＊［１（Ｒ＊），２Ｒ＊］］］］］−（９Ｃｌ）ＣＡＳ登録番号：１９５５１４−６３−７；分子式：Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４Ｏ２０  分子量：１４１１．６５）である。ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ２０１８７である。ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ２０１８７アナログ、例えば、ＡＰ１５１０などである。いくつかの実施形態において、ある特定のアナログは、ＦＫＢＰ１２に対して適切であり得、ある特定のアナログは、ＦＫＢＰ１２の変異体（Ｖ３６）バージョンに対して適切であり得る。ある特定の実施形態において、１つのリガンド結合領域が、キメラタンパク質に含められる。他の実施形態において、２つ以上のリガンド結合領域が、含められる。例えば、リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２である場合、これらの領域の２つが含められる場合、一方は、例えば、ゆらぎバージョンであり得る。
【０１２３】
企図される他の二量体化システムとしては、クーママイシン／ＤＮＡジャイレースＢシステムが挙げられる。クーママイシンによって誘導される二量体化は、改変されたＲａｆタンパク質を活性化し、ＭＡＰキナーゼカスケードを刺激する。Ｆａｒｒａｒら、１９９６を参照のこと。
【０１２４】
ＡＰ１９０３  ＡＰＩは、Ａｌｐｈｏｒａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．によって製造されており、ＡＰ１９０３  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、ＡＡＩ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐによって作製されている。それは、非イオン性可溶化剤Ｓｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５（２５０ｍｇ／ｍＬ，ＢＡＳＦ）の２５％溶液中のＡＰ１９０３の５ｍｇ／ｍＬ溶液として製剤化されている。室温において、この製剤は、透明の溶液である。冷蔵されると、この製剤は、長期の貯蔵において可逆的な相転移を起こし、乳白色の溶液になる。室温に再度温めると、この相転移は、元に戻る。１本分は、１０ｍＬのガラスバイアルにおける８ｍＬである（バイアル１本あたり合計約４０ｍｇのＡＰ１９０３  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。
【０１２５】
使用するために、ＡＰ１９０３は、投与前に、室温に温め、希釈される。ＡＰ１９０３を投与する必要性、ならびに改変されたＴＣＲ発現Ｔ細胞のアポトーシスを誘導するためにカスパーゼ−９を活性化する必要性を決定する際、患者には、例えば、非ＤＥＨＰで非エチレンオキシドの滅菌された注入セットを使用して、２時間にわたるＩＶ注入によって、単一の固定された用量のＡＰ１９０３  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（０．４ｍｇ／ｋｇ）が投与され得る。ＡＰ１９０３の用量は、すべての患者に対して個別に計算され、体重が≧１０％変動しない限り、再計算されない。計算された用量は、注入前に０．９％生理食塩水において１００ｍＬに希釈される。
【０１２６】
すべての試験薬が、２℃〜８℃の温度で維持され、過剰な光および熱から保護され、アクセスが制限された鍵が掛かった区域で保管される。
【０１２７】
ＡＰ１９０３の以前の第Ｉ相研究では、２４人の健常志願者を、２時間にわたって、ＩＶ注入される０．０１、０．０５、０．１、０．５および１．０ｍｇ／ｋｇという用量レベルにおいて、単一用量のＡＰ１９０３  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎで処置した。ＡＰ１９０３血漿レベルは、用量に正比例し、平均Ｃｍａｘ値は、０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量の範囲にわたって、およそ１０〜１２７５ｎｇ／ｍＬの範囲だった。最初の注入期間の後、血中濃度は、急速な分布相を示し、血漿レベルは、投与の０．５、２および１０時間後にそれぞれ最高濃度のおよそ１８、７および１％に減少した。ＡＰ１９０３  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、すべての用量レベルにおいて安全であり、耐容性がよいことが示され、好ましい薬物動態プロファイルを示した。Ｉｕｌｉｕｃｃｉ  ＪＤら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：８７０−９，２００１。
【０１２８】
使用されるＡＰ１９０３  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎの固定された用量は、例えば、２時間にわたって静脈内に注入される０．４ｍｇ／ｋｇであり得る。細胞の効率的なシグナル伝達のためにインビトロにおいて必要とされるＡＰ１９０３の量は、約１０〜１００ｎＭ（ＭＷ：１４１２Ｄａ）である。これは、１４〜１４０μｇ／Ｌまたは約０．０１４〜０．１４ｍｇ／ｋｇ（１．４〜１４０μｇ／ｋｇ）に等しい。投与量は、用途に応じて変動することがあり、ある特定の例では、０．１〜１０ｎＭの範囲内、または５０〜１５０ｎＭ、１０〜２００ｎＭ、７５〜１２５ｎＭ、１００〜５００ｎＭ、１００〜６００ｎＭ、１００〜７００ｎＭ、１００〜８００ｎＭもしくは１００〜９００ｎＭの範囲内であり得る。１ｍｇ／ｋｇまでの用量が、上記のＡＰ１９０３の第Ｉ相研究において耐容性がよかった。
【０１２９】
膜標的化
膜標的化配列は、細胞表面膜へのキメラタンパク質の輸送を提供し、ここで、同じ配列または他の配列が、細胞表面膜へのキメラタンパク質の結合をコードし得る。細胞膜と会合した分子は、膜会合を容易にするある特定の領域を含み、そのような領域は、キメラタンパク質分子に組み込まれることにより、膜標的化分子をもたらし得る。例えば、いくつかのタンパク質は、アシル化される配列をＮ末端またはＣ末端に含み、これらのアシル部分は、膜会合を容易にする。そのような配列は、アシルトランスフェラーゼによって認識され、特定の配列モチーフに一致することが多い。ある特定のアシル化モチーフは、単一のアシル部分（その後に、陰イオン性脂質頭部基との会合を改善するいくつかの正に帯電した残基（例えば、ヒトｃ−Ｓｒｃ：Ｍ−Ｇ−Ｓ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ）が続くことが多い）によって修飾されることができ、他のものは、複数のアシル部分によって修飾されることができる。例えば、タンパク質チロシンキナーゼＳｒｃのＮ末端配列は、単一のミリストイル部分を含み得る。二重アシル化領域は、ある特定のタンパク質キナーゼ（例えば、Ｓｒｃファミリーメンバーのサブセット（例えば、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ）およびＧタンパク質アルファサブユニット）のＮ末端領域内に配置されている。そのような二重アシル化領域は、そのようなタンパク質の最初の１８アミノ酸の中に配置されることが多く、それは、配列モチーフＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓに一致し、ここで、Ｍｅｔは、切断され、Ｇｌｙは、Ｎ−アシル化され、Ｃｙｓ残基のうちの１つは、Ｓ−アシル化される。Ｇｌｙは、ミリストイル化されることが多く、Ｃｙｓは、パルミトイル化され得る。配列モチーフＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ（いわゆる「ＣＡＡＸボックス」）に一致するアシル化領域は、Ｇタンパク質ガンマサブユニットのＣ末端由来のＣ１５またはＣ１０イソプレニル部分によって修飾され得、他のタンパク質（例えば、ワールドワイドウェブアドレスｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ＤｉｓｐｌａｙＩｐｒｏＥｎｔｒｙ？ａｃ＝ＩＰＲ００１２３０）もまた使用され得る。これらのおよび他のアシル化モチーフとしては、例えば、Ｇａｕｔｈｉｅｒ−Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  １５：２２０５−２２１７（２００４）；Ｇｌａｂａｔｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３：６９７−７００（１９９４）およびＺｌａｋｉｎｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１０：６７３−６７９（１９９７）において論じられているものが挙げられ、そのモチーフは、膜局在化を誘導するためにキメラ分子に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、アシル化モチーフを含むタンパク質由来の天然の配列が、キメラタンパク質に組み込まれる。例えば、いくつかの実施形態において、Ｌｃｋ、ＦｙｎもしくはＹｅｓまたはＧタンパク質アルファサブユニットのＮ末端部分（例えば、そのようなタンパク質由来の最初の２５個のＮ末端アミノ酸またはそれより少ないアミノ酸（例えば、随意の変異を有する、その天然の配列の約５〜約２０アミノ酸、約１０〜約１９アミノ酸または約１５〜約１９アミノ���））が、キメラタンパク質のＮ末端の中に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、ＣＡＡＸボックスモチーフ配列を含むＧタンパク質ガンマサブユニット由来の約２５アミノ酸以下のＣ末端配列（例えば、随意の変異を有する、天然の配列の約５〜約２０アミノ酸、約１０〜約１８アミノ酸または約１５〜約１８アミノ酸）が、キメラタンパク質のＣ末端に連結され得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、アシル部分は、＋１から＋６というｌｏｇ  ｐ値を有し、時折、＋３から＋４．５というｌｏｇ  ｐ値を有する。Ｌｏｇ  ｐ値は、疎水性の尺度であり、オクタノール／水の分配研究に由来することが多く、ここで、より高い疎水性を有する分子は、より高い頻度でオクタノールに分配し、より高いｌｏｇ  ｐ値を有すると特徴付けられる。Ｌｏｇ  ｐ値は、いくつかの親油性分子に対して公表されており、ｌｏｇ  ｐ値は、公知の分配プロセスを使用して計算され得る（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．７１，Ｉｓｓｕｅ  ６，ｐａｇｅ  ５９９、エントリー４４９３は、４．２というｌｏｇ  ｐ値を有するラウリン酸を示している）。任意のアシル部分が、上で論じられたペプチド組成物に連結され得、公知の方法および本明細書中以後に論じられる方法を用いて抗菌活性について試験され得る。アシル部分は、時折、例えば、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ４−Ｃ１２シクロアルキルアルキル（ｃｙｃｌａｌｋｙｌａｌｋｙｌ）、アリール、置換アリールまたはアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキルである。任意のアシル含有部分は、時折、脂肪酸であり、脂肪酸部分の例は、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）、オクチル（Ｃ８）、ノニル（Ｃ９）、デシル（Ｃ１０）、ウンデシル（Ｃ１１）、ラウリル（Ｃ１２）、ミリスチル（Ｃ１４）、パルミチル（Ｃ１６）、ステアリル（Ｃ１８）、アラキジル（Ｃ２０）、ベヘニル（Ｃ２２）およびリグノセリル部分（Ｃ２４）であり、各部分は、０、１、２、３、４、５、６、７または８つの不飽和（すなわち、二重結合）を含み得る。アシル部分は、時折、脂質分子（例えば、ホスファチジル脂質（例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴミエリン（ｓｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）、スフィンゴシン、セラミド、ガングリオシド、セレブロシド））またはそれらの改変バージョンである。ある特定の実施形態において、１、２、３、４もしくは５個またはそれより多くのアシル部分が、膜会合領域に連結される。宿主において機能性であり、キメラタンパク質の他のドメインのうちの１つと会合されていることもあるし会合されていないこともある、任意の膜標的化配列が、使用され得る。いくつかの実施形態において、そのような配列としては、ミリストイル化標的化配列、パルミトイル化標的化配列、プレニル化配列（すなわち、ファルネシル化、ゲラニル−ゲラニル化、ＣＡＡＸボックス）、タンパク質間相互作用モチーフ、またはレセプター由来の膜貫通配列（シグナルペプチドを利用する）が挙げられるが、これらに限定されない。例としては、例えば、ｔｅｎ  Ｋｌｏｏｓｔｅｒ  ＪＰら、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ（２００７）９９，１−１２，Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１：９３６−４０，１０９８（２００３）において論じられているものが挙げられる。
【０１３１】
様々な膜におけるタンパク質の保持を高め得るさらなるタンパク質ドメインが存在する。例えば、約１２０アミノ酸のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインが、代表的には細胞内のシグナル伝達に関与する２００個を超えるヒトタンパク質において見られる。ＰＨドメインは、膜内の様々なホスファチジルイノシトール（ＰＩ）脂質（例えば、ＰＩ（３，４，５）−Ｐ３、ＰＩ（３，４）−Ｐ２、ＰＩ（４，５）−Ｐ２）に結合し得るので、種々の膜コンパートメントまたは細胞内コンパートメントにタンパク質をリクルートする際に鍵となる役割を果たし得る。しばしば、ＰＩ脂質のリン酸化状態は、例えば、ＰＩ−３キナーゼまたはＰＴＥＮによって制御されるので、膜とＰＨドメインとの相互作用は、アシル脂質による相互作用ほど安定でない。
【０１３２】
調節領域
１．プロモーター
目的のポリヌクレオチド配列の発現をコントロールするために使用される特定のプロモーターは、標的化された細胞においてそのポリヌクレオチドの発現を指示することができる限り、重要であると考えられない。したがって、ヒト細胞が標的化される場合、ポリヌクレオチド配列コード領域は、例えば、ヒト細胞において発現されることができるプロモーターに隣接しておよびそのプロモーターの支配下に配置され得る。一般的に言えば、そのようなプロモーターは、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターを含み得る。
【０１３３】
様々な実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列、β−アクチン、ラットインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素が、目的のコード配列の高レベル発現を得るために使用され得る。発現レベルが所与の目的にとって十分であるならば、目的のコード配列の発現を達成すると当該分野で周知である他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用も同様に企図される。周知の特性を有するプロモーターを使用することによって、トランスフェクション後または形質転換後の目的のタンパク質の発現のレベルおよびパターンが、最適化され得る。
【０１３４】
特異的な生理学的シグナルまたは合成シグナルに応答して制御されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘導性発現を可能にし得る。例えば、１つの導入遺伝子の発現、またはマルチシストロニックなベクターが使用されるときは複数の導入遺伝子の発現が、ベクターが生成される細胞にとって有毒である場合、それらの導入遺伝子のうちの１つ以上の発現を妨げるかまたは減少させることが望ましい。産生細胞株にとって有毒である導入遺伝子の例は、アポトーシス促進遺伝子およびサイトカイン遺伝子である。いくつかの誘導性プロモーターシステムが、導入遺伝子産物が有毒である場合のウイルスベクターの作製に利用可能である（より誘導性のプロモーターを付加する）。
【０１３５】
エクジソンシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は、１つのそのようなシステムである。このシステムは、哺乳動物細胞において目的の遺伝子の制御された発現を可能にするようにデザインされる。そのシステムは、導入遺伝子の基底レベルの発現ではなく２００倍超の誘導能を実質的に可能にする厳しく制御された発現機構からなる。そのシステムは、ショウジョウバエのヘテロ二量体エクジソンレセプターに基づき、エクジソンまたはムリステロンＡなどのアナログが、そのレセプターに結合すると、そのレセプターは、プロモーターを活性化して、下流の導入遺伝子の発現をオンにし、高レベルのｍＲＮＡ転写産物がもたらされる。このシステムでは、ヘテロ二量体レセプターの両方のモノマーが、１つのベクターから構成的に発現されるのに対し、目的の遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは、別のプラスミド上に存在する。ゆえに、このタイプのシステムを目的の遺伝子トランスファーベクターに遺伝子操作して導入することが、有用であり得る。次いで、産生細胞株において目的の遺伝子を含むプラスミドとレセプターモノマーを含むプラスミドとをコトランスフェクションすることにより、潜在的に有毒な導入遺伝子を発現させずに、遺伝子トランスファーベクターの作製が可能になり得る。適切な時点において、導入遺伝子の発現が、エクジソンまたはムリステロンＡによって活性化され得る。
【０１３６】
有用であり得る別の誘導性システムは、もともとはＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄによって開発された（Ｇｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１，１９９２；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９，１９９５）、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭまたはＴｅｔ−ＯｎＴＭシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）である。このシステムもまた、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体（例えば、ドキシサイクリン）に応答して高レベルの遺伝子発現を制御することが可能である。Ｔｅｔ−ＯｎＴＭシステムでは、ドキシサイクリンの存在下において遺伝子発現がオンになるのに対し、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムでは、ドキシサイクリンの非存在下において遺伝子発現がオンになる。これらのシステムは、大腸菌のテトラサイクリン抵抗性オペロンに由来する２つの制御エレメントに基づく。テトラサイクリンリプレッサーが結合するテトラサイクリンオペレーター配列、およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質。目的の遺伝子は、プラスミドの中に存在するテトラサイクリン応答性エレメントを有するプロモーターの後ろでプラスミド中にクローニングされる。第２のプラスミドは、テトラサイクリンによってコントロールされるトランス活性化因子と呼ばれる制御エレメントを含み、その制御エレメントは、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムでは、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６ドメインおよび野生型テトラサイクリン（ｔｅｒｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）リプレッサーから構成される。したがって、ドキシサイクリンの非存在下において、転写は、恒常的にオンである。Ｔｅｔ−ＯｎＴＭシステムでは、テトラサイクリンリプレッサーは、野生型でなく、ドキシサイクリンの存在下において転写を活性化する。遺伝子治療ベクターを作製する場合、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下において産生細胞が生育され得、潜在的に有毒な導入遺伝子の発現を妨げ得るように、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムが使用され得るが、そのベクターが患者に導入されると、遺伝子発現は恒常的にオンになり得る。
【０１３７】
いくつかの状況において、遺伝子治療ベクターにおける導入遺伝子の発現を制御することが望ましい。例えば、様々な活性強度を有する種々のウイルスプロモーターが、所望の発現レベルに応じて使用される。哺乳動物細胞では、ＣＭＶ前初期プロモーターが、強力な転写活性化をもたらすために使用されることが多い。ＣＭＶプロモーターは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら、１９９７．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−４８において概説されている。導入遺伝子の低い発現レベルが望まれるとき、それほど強力でないＣＭＶプロモーターの改変バージョンもまた、使用されている。造血細胞における導入遺伝子の発現が望まれるとき、ＭＬＶまたはＭＭＴＶ由来のＬＴＲなどのレトロウイルスプロモーターが使用されることが多い。所望の効果に応じて使用される他のウイルスプロモーターとしては、ＳＶ４０、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２  ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ２ＡまたはＭＬＰ領域由来のもの）、ＡＡＶ  ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫおよびトリ肉腫ウイルスが挙げられる。
【０１３８】
同様に、組織特異的プロモーターは、標的化されていない組織に対する潜在的な毒性または望ましくない効果を減少させるように、特定の組織または細胞において転写をもたらすために使用される。これらのプロモーターは、ＣＭＶプロモーターなどのより強力なプロモーターと比べて低い発現をもたらし得るが、より限定された発現および免疫原性ももたらし得る（Ｂｏｊａｋ，Ａ．ら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１９７５−７９；Ｃａｚｅａｕｘ．，Ｎ．ら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：３３２２−３１）。例えば、組織特異的プロモーター（例えば、ＰＳＡ関連プロモーター）または前立腺特異的腺性カリクレインまたは筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子が、必要に応じて使用され得る。
【０１３９】
組織特異的プロモーターまたは分化特異的プロモーターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｂ２９／ＣＤ７９ｂ（Ｂ細胞）；ＣＤ１４（単球性細胞）；ＣＤ４３（白血球および血小板）；ＣＤ４５（造血細胞）；ＣＤ６８（マクロファージ）；デスミン（筋肉）；エラスターゼ−１（膵腺房細胞）；エンドグリン（内皮細胞）；フィブロネクチン（分化中の細胞、治癒中の組織）；およびＦｌｔ−１（内皮細胞）；ＧＦＡＰ（アストロサイト）。
【０１４０】
ある特定の適応症では、遺伝子治療ベクターを投与した後の特定の時点において転写を活性化することが望ましい。これは、ホルモンまたはサイトカインによって制御可能であるようなプロモーターを用いて行われる。使用され得るサイトカイン応答性プロモーターおよび炎症性タンパク質応答性プロモーターとしては、ＫキニノーゲンおよびＴキニノーゲン（Ｋａｇｅｙａｍａら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，２３４５−２３５１）、ｃ−ｆｏｓ、ＴＮＦ−α、Ｃ反応性タンパク質（Ａｒｃｏｎｅら（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６（８），３１９５−３２０７）、ハプトグロビン（Ｏｌｉｖｉｅｒｏら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．，６，１９０５−１９１２）、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰα、ＩＬ−１、ＩＬ−６（Ｐｏｌｉ  ａｎｄ  Ｃｏｒｔｅｓｅ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２０２−８２０６）、補体Ｃ３（Ｗｉｌｓｏｎら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６１８１−６１９１）、ＩＬ−８、α−１酸性糖タンパク質（Ｐｒｏｗｓｅ  ａｎｄ  Ｂａｕｍａｎｎ，（１９８８）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，８，４２−５１）、α−１抗トリプシン、リポタンパク質リパーゼ（Ｚｅｃｈｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２３９４−２４０１，１９８８）、アンジオテンシノーゲン（Ｒｏｎら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２８８７−２８９５）、フィブリノゲン、ｃ−ｊｕｎ（ホルボールエステル、ＴＮＦ−α、ＵＶ照射、レチノイン酸および過酸化水素によって誘導可能）、コラゲナーゼ（ホルボールエステルおよびレチノイン酸によって誘導される）、メタロチオネイン（重金属および糖質コルチコイド誘導性）、ストロメライシン（ホルボールエステル、インターロイキン−１およびＥＧＦによって誘導可能）、α−２マクログロブリンおよびα−１抗キモトリプシンが挙げられる。他のプロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＭＶ）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、エプスタイン・バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビンおよびクレアチンが挙げられる。
【０１４１】
上記プロモーターのいずれか単独または別のプロモーターとの併用が、所望の作用に応じて有用であり得ることが想定される。プロモーターおよび他の制御エレメントは、それらが所望の細胞または組織において機能的であるように選択される。さらに、このプロモーターのリストは、網羅的または限定的であると解釈されるべきでなく；他のプロモーターが、本明細書中に開示されるプロモーターおよび方法とともに使用される。
【０１４２】
２．エンハンサー
エンハンサーは、同じＤＮＡ分子上の離れた位置に配置されたプロモーターからの転写を増加させる遺伝的エレメントである。初期の例としては、コード配列に隣接し、かついくつかのイントロンの中に存在する、免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプターに関連するエンハンサーが挙げられる。多くのウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０およびレトロウイルスＬＴＲ）は、エンハンサーの活性と密接に関連し、単一エレメントのように扱われることが多い。エンハンサーは、ほぼプロモーターのように組織化される。すなわち、エンハンサーは、多くの個々のエレメントから構成され、その各々が、１つ以上の転写性タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターとの基本的な区別は、操作上のものである。エンハンサー領域は概して、少し離れて、しばしば向きに関係なく、転写を刺激する；これは、プロモーター領域またはその成分エレメントには必ずしも当てはまらない。他方で、プロモーターは、特定の部位において特定の向きでＲＮＡ合成の開始を指示する１つ以上のエレメントを有するのに対し、エンハンサーは、これらの特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば重複し、近接することから、しばしば非常によく似たモジュール構成を有するようである。エンハンサーのサブセットには、転写活性を増加させ得るだけでなく、ゲノムにインテグレートされたとき、隣接する配列から転写性エレメントを（インスレーターエレメントとともに）隔離するのを助け得る、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）が含まれる。
【０１４３】
任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  ＥＰＤＢのように）が、遺伝子の発現を駆動するために使用され得るが、多くは、特定の組織タイプまたは組織のサブセットに発現を限定し得る（例えば、Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９：７７６−８８に概説されている）。例としては、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビン、筋肉クレアチンキナーゼ由来のエンハンサー、ならびにウイルスＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶ由来の配列が挙げられるが、これらに限定されない。適切なエンハンサーが、特定の用途に対して選択され得る。適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝的発現構築物として提供される場合、真核細胞は、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質内転写を支持し得る。
【０１４４】
３．ポリアデニル化シグナル
ｃＤＮＡインサートが使用される場合、遺伝子転写産物の適切なポリアデニル化をもたらすためにポリアデニル化シグナルを含めることが通常望ましい。ポリアデニル化シグナルの性質は、本方法の実施の成功にとって重大であるとは考えられておらず、任意のそのような配列（例えば、ヒトまたはウシの成長ホルモンおよびＳＶ４０のポリアデニル化シグナルならびにＬＴＲポリアデニル化シグナル）が、使用される。１つの非限定的な例は、ｐＣＥＰ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に存在するＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。ターミネーターもまた、発現カセットのエレメントとして企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを高めるため、およびそのカセットから他の配列への読み過ごしを最小限にするために役立ち得る。終止シグナル配列またはポリ（Ａ）シグナル配列は、例えば、ｍＲＮＡの３’末端における保存配列（ＡＡＵＡＡＡ）から約１１〜３０ヌクレオチド下流に位置し得る（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ら、１９９３．ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：７７７−８３；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８）。
【０１４５】
４．開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳に必要とされることがある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接する配列を含む。ＡＴＧ開始コドンをはじめとした外来性翻訳調節シグナルが、提供される必要があり得る。開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠とインフレームで配置される。外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然または合成であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって上昇し得る。
【０１４６】
ある特定の実施形態において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用は、多重遺伝子すなわちポリシストロニックなメッセージを作製するために使用される。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回することができ、内部部位において翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：３２０−３２５，１９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメントが、論じられており（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、ならびに哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳも論じられている（Ｍａｃｅｊａｋ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４，１９９１）。ＩＲＥＳエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに連結され得る。各々がＩＲＥＳによって分断されている複数のオープンリーディングフレームが、共に転写され得、ポリシストロニックなメッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の遺伝子が、単一のメッセージを転写するために単一のプロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現され得る（米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号（各々が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。
【０１４７】
配列の最適化
タンパク質産生は、導入遺伝子におけるコドンを最適化することによっても増加され得る。タンパク質産生を増加させるために、種特異的コドンの変更が用いられ得る。また、コドンが最適化されることにより、最適化されたＲＮＡが生成され得、それにより、より効率的な翻訳がもたらされ得る。ＲＮＡに組み込まれるコドンを最適化することによって、不安定性を引き起こす二次構造をもたらすエレメント、例えばリボソーム結合を阻害し得るｍＲＮＡ二次構造、またはｍＲＮＡの核外輸送を阻害し得るクリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）配列などのエレメントが、除去され得る（Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８；Ｙａｎ．，Ｊ．ら、２００７．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：４１１−２１；Ｃｈｅｕｎｇ，Ｙ．Ｋ．ら、２００４．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：６２９−３８；Ｎａｒｕｍ．，Ｄ．Ｌ．ら、２００１．６９：７２５０−５５；Ｙａｄａｖａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｏｃｋｅｎｈｏｕｓｅ，Ｃ．Ｆ．，２００３．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：４９６２−６９；Ｓｍｉｔｈ．，Ｊ．Ｍ．ら、２００４．ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ２０：１３３５−４７；Ｚｈｏｕ，Ｗ．ら、２００２．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８８：１２７−５１；Ｗｕ，Ｘ．ら、２００４．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１３：８９−９６；Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ら、２００６．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４９：６９−７８；Ｄｅｍｌ，Ｌ．Ａ．ら、２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０９９−１１００１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｒ．Ｍ．ら、１９９７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４８９２−４９０３；Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｄ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：４５３１−４０；ｚｕｒ  Ｍｅｇｅｄｅ，Ｊ．ら、２０００．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２６２８−２６３５）。
【０１４８】
リーダー配列
リーダー配列は、ｍＲＮＡの安定性を高めるためおよびより効率的な翻訳をもたらすために付加され得る。リーダー配列は、通常、ｍＲＮＡを小胞体に標的化することに関与する。例としては、自身の切断を遅延させる、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）に対するシグナル配列、およびＩｇＥ遺伝子リーダー配列が挙げられる（Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８；Ｌｉ，Ｖ．ら、２０００．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７２：４１７−２８；Ｘｕ，Ｚ．Ｌ．ら、２００１．Ｇｅｎｅ  ２７２：１４９−５６；Ｍａｌｉｎ，Ａ．Ｓ．ら、２０００．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．２：１６７７−８５；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．ら、２００５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：１１２−１２５；Ｙａｎｇ．，Ｊ．Ｓ．ら、２００２．Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：１３７９−８４；Ｋｕｍａｒ．，Ｓ．ら、２００６．ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２５：３８３−９２；Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：４５３１−４０）。ＩｇＥリーダーは、小胞体への挿入を高めるために使用され得る（Ｔｅｐｌｅｒ，Ｉら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５９１２）。
【０１４９】
導入遺伝子の発現は、発現を最適化するための適切な方法を選択することによって、最適化され得るおよび／またはコントロールされ得る。これらの方法は、例えば、プロモーター、送達方法および遺伝子配列を最適化する工程を含む（例えば、Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ．ら、２００８．ＰＬｏＳ．ＯＮＥ  ３  ｅ２５１７；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８に提示されているような）。
【０１５０】
核酸
本明細書中で使用される「核酸」は、一般に、核酸塩基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその誘導体もしくはアナログの分子（１本、２本またはそれより多くの鎖）のことを指す。核酸塩基には、例えば、ＤＮＡ（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」またはシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」またはＣ）に見られる天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基が含まれる。用語「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を包含し、その各々は、用語「核酸」の亜属として包含される。核酸は、少なくとも、多くとも、または約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０もしくは１０００ヌクレオチド長、またはこの中の導き出せる任意の範囲の長さであり得る。
【０１５１】
本明細書中に提供される核酸は、別の核酸に対して同一または相補的である領域を有し得る。その相補的または同一である領域は、少なくとも５つ連続した残基であり得ることが企図されるが、その領域は、少なくとも、多くとも、または約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００個連続したヌクレオチドであることが特に企図される。
【０１５２】
本明細書中で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすることができる」は、二本鎖分子もしくは三本鎖分子、または部分的な二本鎖もしくは三本鎖の性質を有する分子を形成することを意味すると理解される。本明細書中で使用される用語「アニールする」は、「ハイブリダイズする」と同義である。用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすることができる」は、用語「ストリンジェントな条件（複数可）」または「高ストリンジェンシー」および用語「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件（複数可）」を包含する。
【０１５３】
本明細書中で使用されるとき、「ストリンジェントな条件（複数可）」または「高ストリンジェンシー」は、相補的な配列（複数可）を含む１つ以上の核酸鎖の間のまたはその１つ以上の核酸鎖内のハイブリダイゼーションを可能にするが、ランダム配列のハイブリダイゼーションを妨げる条件である。ストリンジェントな条件は、核酸と標的鎖との間のミスマッチを、たとえあったにしてもほとんど許容しない。そのような条件は、公知であり、高選択性が要求される用途のために使用されることが多い。非限定的な用途としては、核酸（例えば、遺伝子またはその核酸セグメント）の単離、または少なくとも１つの特異的なｍＲＮＡ転写産物もしくはその核酸セグメントの検出などが挙げられる。
【０１５４】
ストリンジェントな条件は、約４２℃〜約７０℃の温度における約０．０２Ｍ〜約０．５Ｍ  ＮａＣｌによって提供されるような、低塩および／または高温の条件を含み得る。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、特定の核酸（複数可）の長さ、標的配列（複数可）の長さおよび核酸塩基含有量、核酸（複数可）の電荷組成、ならびにハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたは他の溶媒（複数可）の存在または濃度によって部分的に決定されることが理解される。
【０１５５】
ハイブリダイゼーションのためのこれらの範囲、組成および条件は、単なる非限定的な例という目的で言及されていること、特定のハイブリダイゼーション反応に対する所望のストリンジェンシーは、１つ以上のポジティブコントロールまたはネガティブコントロールとの比較によって経験的に決定されることが多いことが理解される。想定される用途に応じて、標的配列に対する様々な程度の核酸選択性を達成するために、様々なハイブリダイゼーション条件が使用され得る。非限定的な例では、ストリンジェントな条件下において核酸にハイブリダイズしない関係する標的核酸の同定または単離は、低温および／または高イオン強度におけるハイブリダイゼーションによって達成され得る。そのような条件は、「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と呼ばれ、低ストリンジェンシーの非限定的な例としては、約２０℃〜約５０℃の温度範囲における約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍ  ＮａＣｌで行われるハイブリダイゼーションが挙げられる。低または高ストリンジェンシー条件は、特定の用途に適合させるためにさらに改変され得る。
【０１５６】
「機能保存的バリアント」は、タンパク質または酵素の全体的な立体構造および機能を変化させずに所与のアミノ酸残基が変更されたタンパク質または酵素であり、それには、あるアミノ酸を、極性または非極性の性質、サイズ、形状および電荷を含む類似の特性を有するアミノ酸で置き換えたものが含まれるが、これらに限定されない。一般に公知の遺伝的にコードされないアミノ酸の多くに対する保存的アミノ酸置換は、当該分野で周知である。他のコードされないアミノ酸に対する保存的置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸の特性と比べたときの物理的特性に基づいて決定され得る。
【０１５７】
核酸修飾
下記で論じられる修飾のいずれかが、核酸に適用され得る。修飾の例としては、ＲＮＡもしくはＤＮＡの骨格、糖または塩基、およびそれらの様々な組み合わせに対する変更が挙げられる。核酸における任意の好適な数の骨格結合、糖および／または塩基が、修飾され得る（例えば、独立して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、最大１００％）。修飾されていないヌクレオシドは、β−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に結合された塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルのうちのいずれか１つである。
【０１５８】
修飾塩基は、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基である。修飾塩基の非限定的な例としては、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピンなどが挙げられる。修飾塩基の他の非限定的な例としては、ニトロピロリル（例えば、３−ニトロピロリル）、ニトロインドリル（例えば、４−、５−、６−ニトロインドリル）、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルなどが挙げられる。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、例えば、核酸（nucleid  acid）は、リン酸骨格修飾を有する修飾された核酸分子を含み得る。骨格修飾の非限定的な例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタールおよび／またはアルキルシリル修飾が挙げられる。ある特定の場合において、ヌクレオシドに天然に存在するリボース糖部分は、ヘキソース糖、多環式ヘテロアルキル環またはシクロヘキセニル基で置き換えられる。ある特定の場合において、ヘキソース糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースまたはそれらの誘導体である。ヘキソースは、Ｄ−ヘキソース、グルコースまたはマンノースであり得る。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル基は、環内に１つの酸素原子を含む二環式環であり得る。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル基は、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［３．２．１］オクタンまたはビシクロ［３．３．１］ノナンである。
【０１６０】
ニトロピロリル核酸塩基およびニトロインドリル核酸塩基は、ユニバーサル塩基として公知の化合物のクラスのメンバーである。ユニバーサル塩基は、オリゴヌクレオチド二重鎖の融解挙動または活性に実質的に影響せずに４つの天然に存在する塩基のいずれかを置き換え得る化合物である。天然に存在する核酸塩基に関連する安定化する水素結合相互作用とは対照的に、３−ニトロピロリル核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド二重鎖は、スタッキング相互作用によって単独で安定化され得る。ニトロピロリル核酸塩基との有意な水素結合相互作用が無いことにより、特定の相補性塩基に対する特異性は不必要になる。さらに、４−、５−および６−ニトロインドリルは、４つの天然塩基に対して非常に低い特異性しか示さない。１−（２’−Ｏ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロインドールを調製するための手順は、Ｇａｕｂｅｒｔ，Ｇ．；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００４，４５，５６２９に論じられている。他のユニバーサル塩基としては、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニルおよびそれらの構造的誘導体が挙げられる。
【０１６１】
ジフルオロトリルは、ユニバーサル塩基として機能する非天然の核酸塩基である。ジフルオロトリルは、天然の核酸塩基チミンの同配体である。しかしながら、チミンとは異なり、ジフルオロトリルは、天然塩基のいずれに対しても、顕著な選択性を示さない。ユニバーサル塩基として機能する他の芳香族化合物は、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾールおよび４−メチルベンゾイミダゾールである。さらに、比較的疎水性のイソカルボスチリリル誘導体である３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリルおよび３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリルは、天然塩基だけを含むオリゴヌクレオチド配列と比べてオリゴヌクレオチド二重鎖の不安定化をわずかにしか引き起こさないユニバーサル塩基である。他の非天然の核酸塩基としては、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルおよびそれらの構造的誘導体が挙げられる。ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾールおよび上で言及された他の非天然塩基の合成手順を含むより詳細な考察については、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：７２３８−７２４２（１９９４）を参照のこと。
【０１６２】
さらに、化学的置換基、例えば、架橋剤が、反応物に対して安定性または不可逆性をさらに付加するために使用され得る。架橋剤の非限定的な例としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル（ジスクシンイミジルエステル、例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）を含む）、二官能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの作用物質が挙げられる。
【０１６３】
ヌクレオチドアナログは、「ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）」核酸も含み得る。ある特定の組成物は、内因性の核酸を特定の構造に本質的に「繋ぎ止める」または「ロックする」ために使用され得る。配列を繋ぎ止めることは、核酸複合体の解離を防ぐために役立ち、ゆえに、複製を防ぎ得るだけでなく、内在性配列の標識、修飾および／またはクローニングも可能にし得る。ロックされた構造は、遺伝子発現を制御し得る（すなわち、転写または複製を阻害し得るかまたは増強し得る）か、または内在性の核酸配列を標識するためもしくはその他の方法で修飾するために使用され得る安定した構造として使用され得るか、またはその内在性配列を単離するために、すなわちクローニングのために使用され得る。
【０１６４】
核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡだけを含む分子に必ずしも限定されず、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。非ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのパーセントは、１％〜１００％（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５％）であり得る。
【０１６５】
核酸の調製
いくつかの実施形態において、例えば、アッセイにおけるコントロールまたは標準物質として、または治療薬として使用するための核酸が、提供される。核酸は、当該分野で公知の任意の手法（例えば、化学合成、酵素的生成または生物学的生成など）によって作製され得る。核酸は、生物学的サンプルから回収され得るかまたは単離され得る。核酸は、組換えであり得るか、または天然であり得るかもしくは細胞にとって内因性であり得る（細胞のゲノムから産生され得る）。生物学的サンプルは、小さい核酸分子の回収率を高めるような方法で処理され得ることが企図される。一般に、方法は、グアニジニウムおよび界面活性剤を有する溶液で細胞を溶解する工程を含み得る。
【０１６６】
核酸合成はまた、標準的な方法に従って行われ得る。合成核酸（例えば、合成オリゴヌクレオチド）の非限定的な例としては、ホスホトリエステル、ホスファイトもしくはホスホルアミダイト化学を使用するインビトロ化学合成および固相法によってまたはデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体を介して作製された核酸が挙げられる。様々な異なるオリゴヌクレオチド合成機構が、他の箇所に開示されている。
【０１６７】
核酸は、公知の手法を用いて単離され得る。特定の実施形態において、小さい核酸分子を単離するためおよび／またはＲＮＡ分子を単離するための方法が、使用され得る。クロマトグラフィーは、タンパク質または他の核酸から核酸を分離するためまたは単離するために使用されるプロセスである。そのような方法は、ゲルマトリックスを用いる電気泳動、フィルターカラム、アルコール沈殿および／または他のクロマトグラフィーを含み得る。細胞からの核酸が、使用されるかまたは評価される場合、方法は、一般に、特定のＲＮＡ集団を単離するためのプロセスを実行する前に、細胞をカオトロピック（例えば、グアニジニウムイソチオシアネート）および／または界面活性剤（例えば、Ｎ−ラウロイルサルコシン）で溶解する工程を含む。
【０１６８】
方法は、核酸を単離するための有機溶媒および／またはアルコールの使用を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞溶解産物に加えられるアルコールの量は、約５５％〜６０％というアルコール濃度に達する。種々のアルコールを使用できるが、エタノールがうまく機能する。固体支持体は、任意の構造であってよく、それには、電気陰性基を有する無機物またはポリマー支持体を含み得る、ビーズ、フィルターおよびカラムが含まれる。ガラス繊維のフィルターまたはカラムは、そのような単離手順にとって有効である。
【０１６９】
核酸単離プロセスは、時折、ａ）サンプル中の細胞を、グアニジニウムを含む溶解液で溶解する工程（ここで、少なくとも約１Ｍグアニジニウムの濃度を有する溶解産物が生成される）；ｂ）その溶解産物から核酸分子を、フェノールを含む抽出液を用いて抽出する工程；ｃ）その溶解産物にアルコール溶液を加えることにより、溶解産物／アルコール混合物を形成する工程（ここで、その混合物中のアルコールの濃度は、約３５％〜約７０％である）；ｄ）その溶解産物／アルコール混合物を固体支持体に適用する工程；ｅ）イオン性溶液を用いてその固体支持体から核酸分子を溶出する工程；およびｆ）その核酸分子を捕捉する工程を含み得る。サンプルは、乾燥され得、その後の操作にとって適切な液体および体積で再懸濁され得る。
【０１７０】
遺伝子移入の方法
細胞内での導入遺伝子発現の効果を媒介するために、発現構築物を細胞に移行させる必要があり得る。そのような移行は、ウイルスによる遺伝子移入方法またはウイルスによらない遺伝子移入方法を使用し得る。この項では、遺伝子移入の方法および組成物の考察が提供される。
【０１７１】
発現ベクターを含む形質転換された細胞は、その細胞に発現ベクターを導入することによって作製される。本方法とともに使用するための細胞小器官、細胞、組織または生物の形質転換のためのポリヌクレオチド送達に適した方法は、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を細胞小器官、細胞、組織または生物に導入し得る実質的に任意の方法を含む。
【０１７２】
宿主細胞は、ベクターに対するレシピエントとして使用され得るし、使用されてきた。宿主細胞は、所望の結果が、ベクターの複製であるかまたはベクターによってコードされるポリヌクレオチド配列の一部もしくは全部の発現であるかに応じて、原核生物または真核生物に由来し得る。数多くの細胞株および細胞培養物が、宿主細胞として使用するために利用可能であり、それらは、生存している培養物および遺伝物質に対する保管所としての機能を果たす組織であるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）を通じて入手することができる。具体的な実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、またはナチュラルキラーＴ細胞である。
【０１７３】
適切な宿主は、決定され得る。一般に、これは、ベクターの骨格および所望の結果に基づく。例えば、プラスミドまたはコスミドは、多くのベクターの複製のために、原核生物宿主細胞に導入され得る。ベクターの複製および／または発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞としては、ＤＨ５α、ＪＭ１０９およびＫＣ８、ならびにいくつかの商業的に入手可能な細菌宿主（例えば、ＳＵＲＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ＣｅｌｌｓおよびＳＯＬＯＰＡＣＫ  Ｇｏｌｄ  Ｃｅｌｌｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標），Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））が挙げられる。あるいは、大腸菌ＬＥ３９２などの細菌細胞が、ファージウイルスに対する宿主細胞として使用され得る。宿主細胞として使用され得る真核細胞としては、酵母、昆虫および哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの複製および／または発現のための哺乳動物真核生物宿主細胞の例としては、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＳａｏｓおよびＰＣ１２が挙げられるが、これらに限定されない。酵母株の例としては、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７４】
核酸ワクチンは、例えば、非ウイルスＤＮＡベクター、「裸の」ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにウイルスベクターを含み得る。細胞をこれらのワクチンで形質転換する方法およびこれらのワクチンに含まれる遺伝子の発現を最適化するための方法は公知であり、それらの方法も本明細書中で論じられる。
【０１７５】
核酸またはウイルスベクターを移入する方法の例
細胞、例えば、Ｔ細胞をトランスフェクトするためもしくは形質転換するため、または本方法のヌクレオチド配列もしくは組成物を投与するために、任意の適切な方法が使用され得る。ある特定の例が、本明細書中に提示され、それらの例としてはさらに、カチオン性ポリマー、脂質様分子およびある特定の市販品、例えば、ＩＮ−ＶＩＶＯ−ＪＥＴ  ＰＥＩなどを使用した送達などの方法が挙げられる。
【０１７６】
１．エキソビボ形質転換
生物から取り出された血管細胞および血管組織をエキソビボの環境においてトランスフェクトするために、様々な方法が利用可能である。例えば、イヌ内皮細胞は、インビトロにおけるレトロウイルス遺伝子移入によって遺伝的に変更され、イヌに移植された（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４−１３４６，１９８９）。別の例では、ユカタンミニブタ内皮細胞を、インビトロにおいてレトロウイルスでトランスフェクトし、ダブルバルーンカテーテルを使用して動脈に移植した（Ｎａｂｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４（４９１０）：１３４２−１３４４，１９８９）。したがって、細胞または組織が、取り出され、本明細書中に提示されるポリヌクレオチドを使用してエキソビボにおいてトランスフェクトされ得ることが企図される。特定の態様において、移植された細胞または組織は、生物の中に配置され得る。例えば、Ｔ細胞は、動物から得られ得、上記細胞は、発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換され得、次いで、その動物へと投与して戻され得る。
【０１７７】
２．注射
ある特定の実施形態において、細胞または核酸ベクターもしくはウイルスベクターは、１つ以上の注射（すなわち、針による注射）、例えば、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、前立腺内（ｉｎｔｒａｐｒｏｔａｔｉｃ）、腫瘍内、腹腔内（intrintraperitoneal）などを介して、細胞小器官、細胞、組織または生物に送達され得る。注射の方法としては、例えば、食塩水溶液を含む組成物の注射が挙げられる。さらなる実施形態は、直接マイクロインジェクションによるポリヌクレオチドの導入を含む。使用される発現ベクターの量は、抗原の性質、ならびに使用される細胞小器官、細胞、組織または生物に応じて変動し得る。
【０１７８】
皮内注射、結節内注射またはリンパ管内注射は、ＤＣ投与のより一般的に使用される方法の一部である。皮内注射は、血流への吸収が低速度であるがリンパ系への取り込みが迅速であることを特徴とする。真皮に多数のランゲルハンス樹状細胞が存在することにより、インタクトな抗原ならびにプロセシングされた抗原が流入領域リンパ節に輸送され得る。これを正しく行うためには、適切な部位の準備が必要である（すなわち、適切な針の留置を観察するために、毛を刈り込む）。結節内注射は、リンパ系組織への抗原の直接的な送達を可能にする。リンパ管内注射は、ＤＣの直接投与を可能にする。
【０１７９】
３．エレクトロポレーション
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションを介して細胞小器官、細胞、組織または生物に導入される。エレクトロポレーションは、細胞およびＤＮＡの懸濁液を高圧放電に曝露することを含む。この方法のいくつかの変法では、ある特定の細胞壁分解酵素（例えば、ペクチン分解酵素）を使用して、標的レシピエント細胞を、未処理の細胞よりもエレクトロポレーションによる形質転換に対してより感受性にする（参照により本明細書中に援用される米国特許第５，３８４，２５３号）。
【０１８０】
エレクトロポレーションを使用した真核細胞のトランスフェクションは、かなり成功している。この様式で、マウスプレＢリンパ球がヒトκ免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされ（Ｐｏｔｔｅｒら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，７１６１−７１６５）、ラット肝細胞がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６，７１６−７１８）。
【０１８１】
インビボにおけるワクチン用エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）、すなわちｅＶａｃは、単純な注射法を介して臨床で実行されている。腫瘍抗原をコードするＤＮＡベクターが、患者の皮内に注射される。次いで、電極によって皮内の空間に電気的パルスが適用されることにより、そこに局在化している細胞、特に、常在の皮膚樹状細胞が、ＤＮＡベクターを取り込み、コードされる腫瘍抗原を発現するようになる。次いで、局所炎症によって活性化された、腫瘍抗原を発現しているこれらの樹状細胞が、リンパ節に遊走し、腫瘍抗原を提示し、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞をプライムし得る。核酸が、エレクトロポレーションによって細胞に送達され得る場合、その核酸は、例えば、限定されないが、核酸の注射または他の任意の投与手段の後で、エレクトロポレーションを使用して投与されるとき、電気穿孔的に（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ）投与される。
【０１８２】
エレクトロポレーションの方法は、例えば、Ｓａｒｄｅｓａｉ，Ｎ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２３：４２１−９（２０１１）およびＦｅｒｒａｒｏ，Ｂ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ７：１２０−１２７（２０１１）（これらの全体が本明細書中で参照により援用される）に論じられている。
【０１８３】
４．リン酸カルシウム
他の実施形態では、リン酸カルシウム沈殿を用いて、ポリヌクレオチドが細胞に導入される。この手法を用いて、ヒトＫＢ細胞が、アデノウイルス５ＤＮＡでトランスフェクトされた（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４６７）。また、この様式において、マウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞が、ネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされ（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７（８）：２７４５−２７５２，１９８７）、ラット肝細胞が、種々のマーカー遺伝子でトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：６８９−６９５，１９９０）。
【０１８４】
５．ＤＥＡＥ−デキストラン
別の実施形態では、ＤＥＡＥ−デキストランの後にポリエチレングリコールを使用して、ポリヌクレオチドが細胞に送達される。この様式において、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入された（Ｇｏｐａｌ，Ｔ．Ｖ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８５  Ｍａｙ；５（５）：１１８８−９０）。
【０１８５】
６．音波処理負荷（Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｌｏａｄｉｎｇ）
さらなる実施形態は、直接音波負荷（ｄｉｒｅｃｔ  ｓｏｎｉｃ  ｌｏａｄｉｎｇ）によるポリヌクレオチドの導入を含む。ＬＴＫ線維芽細胞が、音波処理負荷によってチミジンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，８４６３−８４６７）。
【０１８６】
７．リポソーム媒介性トランスフェクション
さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、脂質複合体、例えば、リポソームなどの中に閉じ込められ得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側の水性媒質を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒質によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると、自発的に形成する。それらの脂質成分は、自己再配列を起こした後、閉鎖構造を形成し、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｈａｗａｔ，（１９９１）Ｉｎ：Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ．ｐｐ．８７−１０４）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体化されたポリヌクレオチドも企図される。
【０１８７】
８．レセプター媒介性トランスフェクション
なおもさらに、ポリヌクレオチドは、レセプター媒介性送達ビヒクルを介して標的細胞に送達され得る。これらは、標的細胞において生じているレセプター媒介性エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。様々なレセプターの細胞型特異的分布に照らして、この送達方法は、別の特異性の程度を付加する。
【０１８８】
ある特定のレセプター媒介性遺伝子標的化ビヒクルは、細胞レセプター特異的リガンドおよびポリヌクレオチド結合剤を含む。他のものは、送達されるべきポリヌクレオチドに作動可能に付着された細胞レセプター特異的リガンドを含む。いくつかのリガンドは、レセプター媒介性遺伝子移入のために使用され（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，４４２９−４４３２；Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７（９）：３４１０−３４１４，１９９０；Ｐｅｒａｌｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４０８６−４０９０，１９９４；Ｍｙｅｒｓ，ＥＰＯ  ０２７３０８５）、これにより、この手法の実施可能性が確立される。別の哺乳動物細胞型における特異的送達も論じられている（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，１２：１５９−１６７，１９９３；参照により本明細書中に援用される）。ある特定の態様では、標的細胞の集団上に特異的に発現されるレセプターに対応するリガンドが、選択される。
【０１８９】
他の実施形態において、細胞特異的ポリヌクレオチド標的化ビヒクルのポリヌクレオチド送達ビヒクル成分は、リポソームとともに特異的結合リガンドを含み得る。送達されるべきポリヌクレオチド（複数可）は、そのリポソーム内に収容され、特異的結合リガンドは、リポソーム膜に機能的に組み込まれる。このようにして、そのリポソームは、標的細胞のレセプター（複数可）に特異的に結合し、細胞にその内容物を送達し得る。そのようなシステムは、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）が、ＥＧＦレセプターのアップレギュレーションを示す細胞へのポリヌクレオチドのレセプター媒介性送達において使用されるシステムを使用して機能的であると示された。
【０１９０】
なおもさらなる実施形態において、標的化された送達ビヒクルのポリヌクレオチド送達ビヒクル成分は、リポソーム自体であり得、そのリポソームは、例えば、細胞特異的結合を指示する１つ以上の脂質または糖タンパク質を含み得る。例えば、ガラクトース末端のアシアロガングリオシドであるラクトシル−セラミドが、リポソームに組み込まれ、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加が観察された（Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９，１５７−１７６）。組織特異的な形質転換構築物が、類似の様式で標的細胞に特異的に送達され得ることが企図される。
【０１９１】
９．微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）
微粒子銃法は、ポリヌクレオチドを少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織または生物に導入するために使用され得る（米国特許第５，５５０，３１８号；米国特許第５，５３８，８８０号；米国特許第５，６１０，０４２号；およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９６９９；これらの各々は、参照により本明細書中に援用される）。この方法は、ＤＮＡをコーティングした微小発射体が高速度に加速して、それらが細胞膜を貫通し、細胞を殺滅せずにそれらの細胞に入ることを可能にする能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３）。当該分野で公知の多種多様の微粒子銃法が存在し、それらの多くは、本方法に適用可能である。
【０１９２】
この微粒子銃では、１つ以上の粒子が、少なくとも１つのポリヌクレオチドでコーティングされ、推進力によって細胞に送達され得る。小粒子を加速するためのいくつかのデバイスが、開発された。１つのそのようなデバイスは、電流を発生させ、その後その電流が輸送力を提供する高圧放電に依存する（Ｙａｎｇら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，９５６８−９５７２）。使用される微小発射体は、生物学的に不活性な物質（例えば、タングステンまたは金の粒子またはビーズ）からなった。例示的な粒子としては、タングステン、白金、およびある特定の例では、金から構成された粒子（例えば、ナノ粒子を含む）が挙げられる。場合によっては、金属粒子上へのＤＮＡ沈殿が、微粒子銃を使用したレシピエント細胞へのＤＮＡ送達に必要としないことが企図される。しかしながら、粒子は、ＤＮＡでコーティングされるのではなく、ＤＮＡを含み得ることが企図される。ＤＮＡをコーティングした粒子は、粒子銃を介したＤＮＡ送達のレベルを上昇させ得るが、本質的に必要ない。
【０１９３】
（１０．トランスポゾン媒介性移入）
トランスポゾン媒介性移入法はまた、例えば、ｐｉｇｇｙ／Ｂａｃ遺伝子移入システムを使用して、用いられ得る。Ｓａｔｏ，  Ｍ．ら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．  ２０１４  Ｏｃｔ  ２４．  ｄｏｉ：  １０．１００２／ｂｉｏｔ．２０１４００２８３．  ［印刷物に先駆けた電子出版］。
【０１９４】
ウイルスベクター媒介性移入方法の例
被験体内の単数または複数の細胞がヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子を発現し得るようにそのヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列を含む組成物をその細胞またはその被験体に投与するのに適した任意のウイルスベクターが、本方法において使用され得る。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、細胞への遺伝子移入を媒介するウイルス粒子に組み込まれる。代表的には、そのウイルスは、単純に、適切な宿主細胞に生理学的条件下で曝露されることにより、ウイルスの取り込みが可能になり得る。本方法は、下記で論じられるように、種々のウイルスベクターを使用して都合よく使用される。
【０１９５】
１．アデノウイルス
アデノウイルスは、その中程度のサイズのＤＮＡゲノム、操作の容易性、高力価、広範囲な標的細胞および高感染力を理由に、遺伝子トランスファーベクターとして使用するのに特に適している。およそ３６ｋｂのウイルスゲノムは、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシス作用性エレメントを含む１００〜２００塩基対（ｂｐ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）が境を接している。異なる転写単位を含む、ゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分割される。
【０１９６】
Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の制御に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現により、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質が合成される。これらのタンパク質は、ＤＮＡの複製、後期遺伝子の発現および宿主細胞の切り離しに関与する（Ｒｅｎａｎ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ  Ｏｎｃｏｌ．，１９，１９７−２１８）。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５）の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によってもたらされる単一の一次転写産物の有意なプロセシングの後にだけ、発現される。ＭＬＰ（１６．８マップ単位に位置する）は、感染の後期において特に有効であり、このプロモーターからもたらされたすべてのｍＲＮＡは、それらを翻訳にとって有用にする５’トリパータイトリーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ）（ＴＬ）配列を有する。
【０１９７】
アデノウイルスが遺伝子治療に対して最適化されるために、大きなＤＮＡセグメントを含むことができるように運搬能を最大にする必要がある。ある特定のアデノウイルス産物に関連する毒性および免疫学的反応を減少させることも非常に望ましい。これらの２つの目標は、アデノウイルス遺伝子の除去が両方の目的にかなうという点で、ある程度重なり合っている。本方法の実施によって、治療的な構築物を比較的容易にマニピュレートする能力を保持しつつ、これらの両方の目標を達成することができる。
【０１９８】
ウイルスＤＮＡの複製に必要とされるシスエレメントがすべて、直鎖状のウイルスゲノムのいずれかの末端の末端逆位反復配列（ＩＴＲ）（１００〜２００ｂｐ）に局在化するので、ＤＮＡの大きな置き換えが可能である。ＩＴＲを含むプラスミドは、非欠陥アデノウイルスの存在下において複製し得る（Ｈａｙ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９８４  Ｊｕｎ  ５；１７５（４）：４９３−５１０）。ゆえに、これらのエレメントをアデノウイルスベクターに含めることにより、複製が可能になり得る。
【０１９９】
さらに、ウイルス封入のためのパッケージングシグナルは、ウイルスゲノムの左端の１９４〜３８５ｂｐ（０．５〜１．１マップ単位）に局在する（Ｈｅａｒｉｎｇら、Ｊ．（１９８７）Ｖｉｒｏｌ．，６７，２５５５−２５５８）。このシグナルは、左端に近いが付着末端配列の外側の特異的配列が、頭部構造へのＤＮＡの挿入に必要とされるタンパク質への結合を媒介する、バクテリオファージラムダＤＮＡにおけるタンパク質認識部位を模倣している。ＡｄのＥ１置換ベクターは、ウイルスゲノムの左端の４５０ｂｐ（０〜１．２５マップ単位）フラグメントが２９３細胞においてパッケージングを指示し得ることを実証した（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ，１０１：１９５−２０２，１９９１）。
【０２００】
以前に、アデノウイルスゲノムのある特定の領域が、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、コードされている遺伝子が発現され得ることが示された。これらの細胞株は、その細胞株によってコードされる、アデノウイルス機能を欠いたアデノウイルスベクターの複製を支持することができる。「補助」ベクター、例えば、野生型ウイルスまたは条件欠陥性変異体による複製欠損性アデノウイルスベクターの補完の報告も存在する。
【０２０１】
複製欠損性アデノウイルスベクターは、ヘルパーウイルスによってトランスで補完され得る。しかしながら、複製機能を提供するのに必要なヘルパーウイルスが存在するせいで、いずれの調製物も汚染され得るので、この知見だけでは、複製欠損性ベクターの単離が可能にならない。したがって、複製欠損性ベクターの複製および／またはパッケージングに特異性を付加し得るさらなるエレメントが必要だった。そのエレメントは、アデノウイルスのパッケージング機能に由来する。
【０２０２】
アデノウイルスに対するパッケージングシグナルは、従来のアデノウイルスマップの左端に存在することが示されている（Ｔｉｂｂｅｔｔｓら（１９７７）Ｃｅｌｌ，１２，２４３−２４９）。後の研究から、ゲノムのＥ１Ａ（１９４〜３５８ｂｐ）領域に欠失を有する変異体が、初期（Ｅ１Ａ）機能を補完した細胞株においてさえ不十分にしか成長しないことが示された（Ｈｅａｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６７，８０９−８２２）。代償的な（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｎｇ）アデノウイルスＤＮＡ（０〜３５３ｂｐ）が、その変異体の右端に組み換えられたとき、そのウイルスは、正常にパッケージングされた。さらなる変異解析から、Ａｄ５ゲノムの左端に、短い反復性の位置依存性エレメントが同定された。その反復は、ゲノムのいずれかの末端に存在する場合、効率的なパッケージングには１コピーで十分であるが、Ａｄ５  ＤＮＡ分子の内側に向かって移動した場合は、そうではないことが見出された（Ｈｅａｒｉｎｇら、Ｊ．（１９８７）Ｖｉｒｏｌ．，６７，２５５５−２５５８）。
【０２０３】
パッケージングシグナルの変異バージョンを使用することによって、様々な効率でパッケージングされるヘルパーウイルスを作製することが可能である。代表的には、変異は、点変異または欠失である。パッケージングが低効率であるヘルパーウイルスをヘルパー細胞内で生育させるとき、そのウイルスは、野生型ウイルスと比べて低い速度であったとしてもパッケージングされ、それにより、ヘルパーの繁殖が可能となる。しかしながら、これらのヘルパーウイルスを、野生型パッケージングシグナルを含むウイルスとともに細胞内で生育させるとき、その野生型パッケージングシグナルは、変異バージョンよりも優先的に認識される。パッケージング因子の量が限られていることを考慮すると、野生型シグナルを含むウイルスは、ヘルパーと比べて選択的にパッケージングされる。優先性が十分大きい場合、均質に近い系統（stock）が達成され得る。
【０２０４】
特定の組織または種に対するＡＤＶ構築物の向性を改善するために、レセプター結合ファイバー配列は、しばしばアデノウイルス分離株の間で置換され得る。例えば、アデノウイルス５において見出されたコクサッキー−アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）リガンドは、アデノウイルス３５由来のＣＤ４６結合ファイバー配列の代わりに用いられ、ヒト造血細胞に対する結合親和性が大幅に改善されたウイルスが作製され得る。得られた「シュードタイプ化された」ウイルスであるＡｄ５ｆ３５は、いくつかの臨床的に開発されたウイルス分離株の基礎となった。さらに、例えばＴ細胞などの標的細胞に対してウイルスを再標的化することを可能にするファイバーを改変する様々な生化学的方法が存在する。方法は、二機能性抗体（一方の末端はＣＡＲリガンドに結合し、もう一方の末端は標的配列に結合する）の使用、およびカスタマイズされたアビジンベースのキメラリガンドとの会合を可能にするファイバーの代謝性のビオチン化を含む。あるいは、リガンド（例えば、抗ＣＤ２０５）をヘテロ二機能性リンカー（例えば、ＰＥＧ含有）によってアデノウイルス粒子に付着することができる。
【０２０５】
２．レトロウイルス
レトロウイルスは、そのＲＮＡを逆転写のプロセスによって感染細胞において二本鎖ＤＮＡに変換する能力を特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ，（１９９０）Ｉｎ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４３７−１５００）。次いで、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞染色体内に安定に組み込み、ウイルスタンパク質の合成を指示する。その組み込みにより、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、３つの遺伝子、それぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含む。ｐｓｉと呼ばれる、ｇａｇ遺伝子から上流に見られる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルとして機能する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列が、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムへの組み込みにも必要である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。したがって、例えば、本技術は、例えば、細胞を形質導入するために使用されるポリヌクレオチドがその細胞のゲノムに組み込まれた細胞を含む。
【０２０６】
レトロウイルスベクターを構築するために、プロモーターをコードする核酸を、ウイルスゲノム内のある特定のウイルス配列の位置に挿入することにより、複製欠損であるウイルスが作製される。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲおよびｐｓｉ成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ，３３，１５３−１５９）。レトロウイルスのＬＴＲ配列およびｐｓｉ配列とともにヒトｃＤＮＡを含む組換えプラスミドをこの細胞株に導入するとき（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、そのｐｓｉ配列は、その組換えプラスミドのＲＮＡ転写産物をウイルス粒子内にパッケージングさせ、次いでそれを培養培地中に分泌させる（Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．Ｒ．，（１９８８）Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．）．Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ；Ｔｅｍｉｎら（１９８６）Ｉｎ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４９−１８８；Ｍａｎｎら、１９８３）。組換えレトロウイルスを含む培地を捕集し、必要に応じて濃縮し、遺伝子移入のために使用する。レトロウイルスベクターは、幅広い種類の細胞型に感染することができる。しかしながら、多くのタイプのレトロウイルスの組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら（１９７５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７，２４２−２４８）。
【０２０７】
レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするようにデザインされたアプローチは、ウイルスエンベロープへのガラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づいて最近開発された。アシアロ糖タンパク質レセプターを介した肝細胞などの細胞の特異的感染を可能にし得るこの修飾が望まれる場合がある。
【０２０８】
組換えレトロウイルスの標的化に対する異なるアプローチがデザインされており、そのアプローチは、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特異的な細胞レセプターに対するビオチン化抗体を使用した。それらの抗体は、ストレプトアビジンを使用することによってビオチン成分を介して結合された（Ｒｏｕｘら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９０７９−９０８３）。主要組織適合遺伝子複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を使用して、それらの表面抗原を有する種々のヒト細胞がインビトロにおいてエコトロピックウイルスに感染することが実証された（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
【０２０９】
（３．レンチウイルス）
本方法において使用されるレンチウイルスベクターは、任意の適切なレンチウイルスに由来し得る。レンチウイルスベクターは、霊長類および非霊長類両方の群を含むレトロウイルスベクターの１タイプである。レンチウイルスベクターの例は、例えば、Ｃｏｆｆｉｎら  （１９９７）  「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｅｄｓ：  Ｊ  Ｍ  Ｃｏｆｆｉｎ，  Ｓ  Ｍ  Ｈｕｇｈｅｓ，  Ｈ  Ｅ  Ｖａｒｍｕｓ  ｐｐ  ７５８−７６３）において論じられる。霊長類レンチウイルスの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（ヒト自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因因子）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）。非霊長類レンチウイルス群としては、プロトタイプ「スローウイルス」ビスナ／マエディーウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ならびにネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が挙げられる。レンチウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染し得る（Ｌｅｗｉｓら  （１９９２）；  Ｌｅｗｉｓ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｍａｎ  （１９９４））。
【０２１０】
レンチウイルスベクターは、本明細書で使用される場合、少なくとも１個の構成要素部分を含むベクターであり、ここでこの構成要素部分は、このベクターが細胞に感染し、遺伝子を発現するか、または複製され、レンチウイルスに由来し得ることによる生物学的機構に関与する。
【０２１１】
レトロウイルスゲノムおよびレンチウイルスゲノムの基本的構造は、５’  ＬＴＲおよび３’  ＬＴＲ（その間またはその内部に、ゲノムをパッケージし得るようにパッケージングシグナルを配置する）、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノムならびにパッケージング構成要素をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子への組み込みを可能にする組み込み部位などの多くの共通する特徴を共有する。レンチウイルスはまた、ＨＩＶにおけるｒｅｖおよびＲＲＥ配列などのさらなる特徴を含み、これらは、その組み込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写物を、感染した標的細胞の核から細胞質へと効率的に輸送することを可能にする。
【０２１２】
上記プロウイルスでは、ウイルス遺伝子は両方の末端で、長末端反復（ＬＴＲ）といわれる領域に挟まれている。このＬＴＲは、プロウイルス組み込みおよび転写を担う、ＬＴＲはまた、エンハンサー−プロモーター配列として働き、ウイルス遺伝子の発現をコントロールし得る。
【０２１３】
上記ＬＴＲ自体は、Ｕ３、ＲおよびＵ５といわれる３個のエレメントに分けられ得る同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に特有の配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両方の末端で反復される配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に特有の配列に由来する。この３個のエレメントのサイズは、異なるウイルス間でかなり変動し得る。
【０２１４】
本明細書で論じられるレンチウイルスベクターの例において、複製に必須の１またはこれより多くのタンパク質コード領域のうちの少なくとも一部は、上記ウイルスから除去され得る。このことは、ウイルスベクターを複製欠損にする。ウイルスゲノムの一部はまた、標的非分裂宿主細胞を形質導入し得るおよび／またはそのゲノムを宿主ゲノムへと組み込み得るＮＯＩを含むベクターを生成するために、ＮＯＩによって置き換えられ得る。
【０２１５】
一実施形態において、上記レトロウイルスベクターは、ＷＯ  ２００７／０７１９９４、ＷＯ  ２００７／０７２０５６、米国特許第９，１６９，４９１号、米国特許第８，０８４，２４９号、または米国特許第７，５３１，６４８号で論じられるとおりの非組み込みベクターである。いくつかの例において、上記レンチウイルスベクターは、自己不活性化レトロウイルスベクターであり、ここで転写エンハンサー、または３’  ＬＴＲのＵ３領域中のエンハンサーおよびプロモーターは、欠失されている（例えば、Ｙｕら．  （１９８６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８３：３１９４−３１９８；  Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｔｅｍｉｎ  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８４：１１９７−１２０１；  Ｈａｗｌｅｙら  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８４：２４０６−２４１０；  Ｙｅｅら  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９１：９５６４−９５６８を参照のこと）。
【０２１６】
宿主細胞／パッケージング細胞内でウイルスゲノムを生成するために使用されるレンチウイルスプラスミドベクターはまた、宿主細胞／パッケージング細胞中のゲノムの転写を指向するためにレンチウイルスゲノムに作動可能に連結された転写制御コントロール配列を含む。これら制御配列は、その転写されたレンチウイルス配列、すなわち、５’  Ｕ３領域と会合した天然の配列であり得るか、またはそれらは、異種プロモーター（例えば、別のウイルスプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター）であり得る。
【０２１７】
４．アデノ随伴ウイルス
ＡＡＶは、約４７００塩基対の直鎖状の一本鎖ＤＮＡを使用する。末端逆位反復配列は、ゲノムに隣接している。２つの遺伝子が、ゲノム内に存在し、いくつかの異なる遺伝子産物を生じる。第１に、ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ−１、ＶＰ−２およびＶＰ−３と命名された３つの異なるビリオンタンパク質（ＶＰ）を生成する。第２に、ｒｅｐ遺伝子は、４つの非構造タンパク質（ＮＳ）をコードする。これらのｒｅｐ遺伝子産物の１つ以上は、ＡＡＶ転写のトランス活性化に関与する。
【０２１８】
ＡＡＶにおける３つのプロモーターは、ゲノム内のそれらの位置によって、マップ単位で命名されている。これらは、左から右へ、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０である。転写によって、６つの転写産物が生じ、２つは、３つの各プロモーターにおいて開始され、各対の一方がスプライシングされる。マップ単位４２〜４６に由来するスプライス部位は、各転写産物にとって同じである。４つの非構造タンパク質は、より長い転写産物に由来するとみられ、３つのビリオンタンパク質のすべてが、最も小さい転写産物から生じる。
【０２１９】
ＡＡＶは、ヒトにおけるいかなる病的状態にも関連しない。興味深いことに、効率的な複製のために、ＡＡＶは、単純ヘルペスウイルスＩおよびＩＩ、サイトメガロウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ならびに当然のことながらアデノウイルスなどのウイルスからの「補助」機能を必要とする。それらのヘルパーのうち最も特徴付けられたものは、アデノウイルスであり、このウイルスに対する多くの「初期」機能は、ＡＡＶの複製を支援すると示された。ＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質の低レベルの発現は、ＡＡＶ構造発現を抑制すると考えられており、ヘルパーウイルス感染は、この阻止を取り消すと考えられている。
【０２２０】
ＡＡＶベクターの末端反復配列は、ＡＡＶまたは改変されたＡＡＶゲノムを含むｐ２０１などのプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化によって（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：３０９６−３１０１（１９８７））またはＡＡＶの公開配列に基づく末端反復配列の化学的合成もしくは酵素的合成を含むがこれらに限定されない他の方法によって得ることができる。それは、例えば、機能、すなわち安定した部位特異的な組み込みを可能にするために必要とされるＡＡＶ  ＩＴＲの最小の配列または一部を、欠失分析によって決定することができる。また、安定した部位特異的な組み込みを指示する末端反復配列の能力を維持しつつ、配列のどの軽微な改変が許容され得るかを決定することもできる。
【０２２１】
ＡＡＶベースのベクターは、インビトロにおいて遺伝子送達するための安全で有効なビヒクルであることが証明されており、これらのベクターは、開発されており、エキソビボとインビボの両方における潜在的な遺伝子治療において広範囲に適用するために前臨床段階および臨床段階において試験されている（Ｃａｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｆｌｏｔｔｅ，（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０；７９−９０；Ｃｈａｔｔｅｉｊｅｅら（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０，７９−９０；Ｆｅｒｒａｒｉら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，３２２７−３２３４；Ｆｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，５２０−５３２；Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６１３−１０６１７，（１９９３）；Ｇｏｏｄｍａｎら（１９９４），Ｂｌｏｏｄ，８４，１４９２−１５００；Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９４）Ｎａｔ’ｌ  Ｇｅｎｅｔ．，８，１４８−１５３；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．１９９６  Ｄｅｃ；６２（６）：１６６９−７６；Ｋｅｓｓｌｅｒら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１４０８２−１４０８７；Ｋｏｅｂｅｒｌら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１４２６−１４３１；Ｍｉｚｕｋａｍｉら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１７，１２４−１３０）。
【０２２２】
肺におけるＡＡＶ媒介性の効率的な遺伝子移入および遺伝子発現は、嚢胞性線維症の処置のための臨床試験に至っている（Ｃａｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｆｌｏｔｔｅ，１９９５；Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６１３−１０６１７，（１９９３））。同様に、骨格筋へのジストロフィン遺伝子のＡＡＶ媒介性の遺伝子送達による筋ジストロフィーの処置、脳へのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子送達によるパーキンソン病の処置、肝臓への第ＩＸ因子遺伝子送達による血友病Ｂの処置、および潜在的に、心臓への血管内皮成長因子遺伝子による心筋梗塞の処置の見込みは、これらの器官におけるＡＡＶ媒介性の導入遺伝子発現が高度に効率的であると最近示されたので、有望であるとみられる（Ｆｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，５２０−５３２；Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３；Ｋａｐｌｉｔｔら、１９９４；１９９６；Ｋｏｅｂｅｒｌら、１９９７；ＭｃＣｏｗｎら（１９９６）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，７１３，９９−１０７；Ｐｉｎｇら（１９９６）Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，３，２２５−２２８；Ｘｉａｏら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，８０９８−８１０８）。
【０２２３】
５．他のウイルスベクター
他のウイルスベクターも、本発明の方法および組成物において発現構築物として用いられる。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，（１９８８）Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，ｐｐ．４６７−４９２；Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，（１９８６）Ｉｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｐｐ．１１７−１４８；Ｃｏｕｐａｒら、Ｇｅｎｅ，６８：１−１０，１９８８）カナリアポックスウイルスおよびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが使用される。これらのウイルスは、様々な哺乳動物細胞への遺伝子移入において使用するためのいくつかの特徴を提供する。
【０２２４】
いったん、構築物が細胞内に送達されたら、導入遺伝子をコードする核酸は、種々の部位に位置づけられ、発現される。ある実施形態おいて、導入遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれる。この組み込みは、相同組換えを介して同種の（ｃｏｇｎａｔｅ）位置および向きである（遺伝子置換）かまたはランダムで非特異的な位置に組み込まれる（遺伝子増強）。なおもさらなる実施形態において、核酸は、ＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして細胞において安定に維持される。そのような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期と無関係のまたはそれと同期した維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物がどのように細胞に送達され、その核酸が細胞のどこにとどまるかは、使用される発現構築物のタイプに依存する。
（Ｔ細胞を操作するための方法、および改変されたＴ細胞の評価）
Ｔ細胞を操作するための方法および改変されたＴ細胞の評価の例は、本明細書で提供される。
【０２２５】
（レトロウイルスおよびレンチウイルス構築物）
（レトロウイルス形質導入）
レトロウイルスの一過性の生成のために、２９３Ｔ細胞を、キメラポリペプチド構築物で、ｇａｇ−ｐｏｌおよびＲＤ  １１４エンベロープをコードするプラスミドとともに、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を使用してトランスフェクトする。ウイルスを、トランスフェクションの４８〜７２時間後に採取し、急速凍結し、使用するまで−８０℃で貯蔵する。レンチウイルスの一過性の生成のために、２９３Ｔ細胞を、上記構築物で、プラスミドｐＬＰ１（ｇａｇ／ｐｏｌ）、ｐＬＰ２（ｒｅｖ）およびｐＬＰ／ＶＳＶＧ（ＶＳＶＧ  ｅｎｖ）とともにＧｅｎｅＪｕｉｃｅを使用してトランスフェクトする。ウイルスを、トランスフェクションの４８〜７２時間後に採取し、急速凍結し、使用するまで−８０℃で貯蔵する。大規模なレトロウイルス生成のために、一過性ＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルス上清を用いた複数回の形質導入によって、安定なＦＬＹＲＤ１８由来レトロウイルス産生株を生成する。導入遺伝子発現が最も高いＦＬＹＲＤ１８細胞を、単一細胞ソーティングし、最も高いウイルス力価をもたらすクローンを増やし、リンパ球形質導入のためのウイルスを生成するために使用する。このクローンの導入遺伝子発現、機能およびレトロウイルス力価は、８週間超にわたる連続培養中、維持される。組織培養用の処理が行われていない２４ウェルプレートを、３７℃において１時間または４℃において一晩、７μｇ／ｍｌ  Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）でコーティングする。それらのウェルを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで、３７℃において３０分間、プレートを１．５ｍｌの上清とともにインキュベートすることによって、レトロウイルス上清でコーティングする。続いて、Ｔ細胞芽球を、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２が補充されたウイルス上清中、１ウェルあたり５×１０５細胞をプレーティングする。６０時間の期間にわたって形質導入を行う。形質導入後、細胞を収集し、フローサイトメトリーによってＣＤ１９またはＧＦＰの発現について表現型分析を行う。形質導入後、細胞を収集し、フローサイトメトリーによってＣＤ１９またはＧＦＰの発現について表現型分析を行う。
【０２２６】
（形質導入されたＴ細胞の細胞傷害性）
形質導入された各Ｔ細胞株の細胞傷害活性は、以前に提示されたような標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて評価される。Ｔ細胞に上記レトロウイルスまたはレンチウイルスを形質導入し、それを、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）によって刺激された自家リンパ球（ＰＨＡ芽球）、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３またはＤＵ１４５およびＡ５４９がん細胞株、ならびにヒトＰＳＭＡを発現するトランスジェニックＡ５４９（Ａ５４９−ＰＳＭＡ）を含む、Ｃｒ５１で標識された標的細胞と比較する。完全培地または１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中でインキュベートされた標的細胞をそれぞれ自発的なおよび最大の５１Ｃｒ放出を決定するために使用する。三連のウェルの特異的溶解の平均パーセンテージを、１００×（実験による放出−自発的な放出）／（最大放出−自発的な放出）として計算した。クロム放出アッセイに加えて、共培養実験を行う。ここでは、細胞株ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、ＤＵ１４５、Ａ５４９およびＡ５４９−ＰＳＭＡを、蛍光性ｍＯｒａｎｇｅを発現するように形質導入し、標的細胞として使用する。ｍＯｒａｎｇｅを発現している腫瘍細胞を、完全培地中、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）の存在下において、形質導入されていないＴ細胞または改変されたＴ細胞とともに、腫瘍細胞とＴ細胞とが１：１０という比で共培養する。２４時間後、Ｔ細胞を１００ｎＭ  ＡＰ１９０３で刺激する。７２時間後、細胞を捕集し、カウントし、Ｔ細胞を検出するためにＣＤ３で標識し、ｍＯｒａｎｇｅ腫瘍細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩ；ＢＤ）によって解析する。
【０２２７】
（形質導入されたＴ細胞の表現型分析および活性化状態）
形質導入されたＴ細胞の細胞表面の表現型を、以下のモノクローナル抗体を使用して調べる：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲ。１００ｎＭ  ＡＰ１９０３を用いておよび用いずに、表現型分析を行う。適切なアイソタイプマッチコントロールを各実験において使用し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を用いて細胞を解析する。抗Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を使用して、キメラポリペプチドの発現を評価する。
【０２２８】
（形質導入されたＴ細胞のサイトカイン産生の解析）
１００ｎＭ  ＡＰ１９０３による刺激の前および後（２４時間）のＴ細胞培養上清中のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）の濃度を、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインサイトメトリビーズアレイ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して測定する。培養上清中の誘導されたサイトカイン産生を、製造者の指示に従って酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって検証する。
【０２２９】
（形質導入されたＴ細胞の増殖）
ＡＰ１９０３によって誘導される活性化の増殖効果を、ＡＰ１９０３に曝露した後の、形質導入されたＴ細胞および形質導入されていないＴ細胞の細胞成長を測定することによって評価する。Ｔ細胞を、３７℃において１０分間、１０μＭカルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識する。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ  ＤＣ培地に再懸濁する。その後、１×１０６個のＣＦＳＥで標識された改変Ｔ細胞または形質導入されていないＴ細胞を、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ  ＤＣ培地のみにおいて培養するか、または１００ｎＭ  ＡＰ１９０３で刺激する。５日後、細胞を収集し、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５およびＣＤ１９−ＰＥで標識し、ＣＦＳＥ希釈についてフローサイトメトリーによって解析する。
【０２３０】
可溶性免疫グロブリンが、形質導入されたＴリンパ球の増殖および拡大に影響するかを評価するために、いかなる外来性サイトカインも加えずに、健常ドナーから得られるヒト血漿の段階希釈物または精製されたヒト免疫グロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の段階希釈物とともに細胞を１×１０５細胞／ウェルで培養する。７２時間後、それらの細胞を、１μＣｉ（０．０３７ＭＢｑ）メチル−３［Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）でパルスし、さらに１５時間培養する。次いで、それらの細胞を、フィルター上に収集し、乾燥させ、１分当たりのカウント数を、β−シンチレーションカウンター（ＴｒｉＣａｒｂ  ２５００  ＴＲ；Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，ＣＴ）において測定する。これらの実験は、三連で行う。他の実験では、コントロールおよび改変されたＴリンパ球を、培地のみ、または血漿もしくは精製された免疫グロブリンの段階希釈物を１日おきに加えた培地を用いて培養する。次いで、トリパンブルー排除を用いて細胞を２日おきにカウントする。
【０２３１】
（エキソビボでのＴ細胞の活性化およびヒト被験体への投与）
ヒト治療のためにさらなるキメラポリペプチド（例えば、本明細書で論じるキメラカスパーゼ−９ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい改変されたＴ細胞（例えば、Ｂｏｂ１改変Ｔ細胞）を使用する方法が、本実施例で呈示される。
【０２３２】
材料および方法
遺伝子改変されたＴ細胞の大規模産生
Ｔ細胞は、標準的な方法を用いて健常志願者から生成される。簡潔には、健常ドナーまたはがん患者由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、可溶性αＣＤ３およびαＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して、増殖および形質導入のために活性化する。ＰＢＭＣを、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充されたＣｅｌｌｇｅｎｉｘ  ＤＣ培地に、１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、０．２μｇ／ｍｌ  αＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ  αＣＤ２８可溶性抗体で刺激する。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２において４日間培養する。４日目に、ＩＬ−２を含む１ｍｌの新鮮培地を加える。７日目に、形質導入に向けて、細胞を収集し、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ  ＤＣ培地に再懸濁する。
【０２３３】
（プラスミドおよびレトロウイルス）
本実施例の組成物および方法は、本明細書で論じるとおりのＢｏｂ１をコードするレンチウイルスベクターを含むように改変され得る。ＳＦＧプラスミドは、切断可能な２Ａ様配列を介して短縮型ヒトＣＤ１９に連結された誘導性キメラポリペプチドからなる。この誘導性キメラポリペプチドは、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーを介してヒトキメラポリペプチドに接続された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＨ００２  ８１８）からなる。上記Ｆ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤（homodimerizer）、ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３へのＦＫＢＰ１２の結合親和性を増大させる。上記２Ａ様配列、「Ｔ２Ａ」は、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸のペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残基との間での＞９９％の切断を媒介して、誘導性キメラポリペプチドのＣ末端に１９個の追加のアミノ酸およびＣＤ１９のＮ末端に１つの追加のプロリン残基をもたらす。ＣＤ１９は、細胞質内ドメインを２４２アミノ酸から１９アミノ酸に短縮し、リン酸化に対する潜在的な部位である保存されたすべてのチロシン残基を除去する、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）で短縮される、完全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００１７７０）からなる。
【０２３４】
テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ−Ｖ）偽型レトロウイルスを産生する安定したＰＧ１３クローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ＃ＳＤ３４４４；ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をＳＦＧプラスミドで一過性にトランスフェクトすることによって、作製する。これは、Ｅｃｏ偽型レトロウイルスを産生する。そのＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、Ｅｃｏ偽型レトロウイルスで３回形質導入することにより、細胞１つあたり複数のＳＦＧプラスミドプロウイルス組み込み体を含む産生株（producer  line）を生成する。単一細胞クローニングを行い、最も高い力価をもたらしたＰＧ１３クローンを、増やし、ベクター生成のために使用する。
【０２３５】
レトロウイルス形質導入
Ｔ細胞の活性化および増殖のための培養培地は、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充された無血清Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ  ＤＣ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）である。レトロウイルスベクターで形質導入する前の７日間にわたって、Ｔ細胞を可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって活性化する。必要であれば、ΔＣＤ１９の免疫磁気選択を形質導入後の４日目に行い；陽性画分をさらに２日間にわたって増殖させ、凍結保存する。
【０２３６】
（遺伝子改変され、同種枯渇された細胞のスケールアップ産生）
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップでは、１０ｍｌの抗ＣＤ３  ０．５μｇ／ｍｌおよび抗ＣＤ２８  ０．２μｇ／ｍｌまたは１０ｍｌのフィブロネクチン７μｇ／ｍｌで４℃において一晩コーティングされた、組織培養用に処理されていないＴ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を使用する。細胞付着性を増大させるためにコロナ処理されたフッ化エチレンプロピレンバッグ（２ＰＦ−００７２ＡＣ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）も使用する。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８をコーティングしたフラスコに、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２が補充された培地中、１×１０６細胞／ｍｌ播種する。レトロウイルス形質導入のために、レトロネクチンをコーティングしたフラスコまたはバッグを、１０ｍｌのレトロウイルス含有上清で２〜３時間、一度負荷する。活性化Ｔ細胞を、３：１の比の、レトロウイルスベクター含有新鮮培地および１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２が補充されたＴ細胞培養培地中、１×１０６細胞／ｍｌ播種する。細胞を、翌朝収集し、組織培養用に処理されたＴ７５またはＴ１７５フラスコ内、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２が補充された培養培地中で、約５×１０５細胞／ｍｌ〜８×１０５細胞／ｍｌの播種密度で増やす。
【０２３７】
（ＣＤ１９免疫磁気選択）
本実施例では、改変された細胞は、ＣＤ１９マーカータンパク質を発現する；改変された細胞を、ＣＤ１９以外のマーカーを使用して、または他の方法によって選択し得ることは、理解される。ＣＤ１９に対する免疫磁気選択は、一例では、形質導入の４日後に行われ得る。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体に結合体化された常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）で標識し、小規模実験ではＭＳまたはＬＳカラムにおいて、および大規模実験ではＣｌｉｎｉＭａｃｓ  Ｐｌｕｓ自動選択デバイスにおいて、選択する。ＣＤ１９によって選択された細胞を、さらに４日間増やし、形質導入後の８日目に凍結保存する。これらの細胞は、「遺伝子改変細胞」と称される。
【０２３８】
免疫表現型分析および五量体解析
フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、以下の抗体を使用して行う：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６およびＣＤ６２Ｌ。ＣＤ１９−ＰＥ（クローン４Ｇ７；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）は、最適な染色をもたらすと見出されており、その後のすべての解析において使用された。形質導入されていないコントロールを、ＣＤ１９に対するネガティブゲートを設定するために使用する。
【０２３９】
統計解析
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して、サンプル間の差の統計的有意性を決定する。すべてのデータを平均±１標準偏差として表す。
【０２４０】
疾患を処置するための方法
本方法は、疾患を処置するかまたは予防する方法も包含し、ここで、例えば注入による細胞の投与が、有益であり得る。
【０２４１】
細胞、例えば、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、または前駆体細胞など、例えば、造血幹細胞、間葉系ストローマ細胞、幹細胞、多能性幹細胞および胚性幹細胞などが、細胞治療のために使用され得る。それらの細胞は、ドナーに由来し得るか、または患者から得られた細胞であり得る。それらの細胞は、例えば、病的な細胞の機能を置き換えるための、例えば、再生において使用され得る。それらの細胞は、生物学的作用物質が、特定の微小環境、例えば、病的な骨髄または転移性の沈着物（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｄｅｐｏｓｉｔ）などに送達され得るように、異種遺伝子を発現するようにも改変され得る。間葉系ストローマ細胞は、例えば、免疫抑制活性を提供するためにも使用されており、移植片対宿主病および自己免疫障害の処置において使用され得る。本願において提供される細胞は、細胞治療後に治療用細胞の活性が増加されるか、または減少される必要がある状況において価値のあるものであり得る安全スイッチを含む。例えば、Ｔ細胞レセプター（例えば、Ｂｏｂ１標的化ＴＣＲ）を発現するＴ細胞が患者に提供される場合、場合によっては、またはオフターゲット毒性などの有害事象が存在し得る。リガンドの投与を終了すると、治療用Ｔ細胞は非活性化状態に戻り、無毒性の低い発現レベルで残存し得る。または、例えば、その治療用細胞は、腫瘍細胞または腫瘍サイズを減少させるように働き得、もはや必要とされなくなることがある。この状況では、リガンドの投与は、終了してもよく、治療用細胞は、もはや活性化されない。最初の治療後に腫瘍細胞が再発する（ｒｅｔｕｒｎ）かまたは腫瘍サイズが増加する場合、ＴＣＲを発現しているＴ細胞をさらに活性化させ、患者を再処置するために、リガンドが再度投与され得る。
【０２４２】
「治療用細胞」とは、細胞治療のために使用される細胞、すなわち、状態または疾患を処置するためまたは予防するために被験体に投与される細胞のことを意味する。
【０２４３】
用語「単位用量」は、それが接種材料に関するとき、哺乳動物に対する単位投与量（ｕｎｉｔａｒｙ  ｄｏｓａｇｅｓ）として好適な物理的に分離した単位のことを指し、各単位は、必要とされる希釈剤とともに、所望の免疫刺激効果をもたらすと計算された所定の量の薬学的組成物を含む。接種材料の単位用量に対する詳述は、薬学的組成物のユニークな特色および達成されるべき特定の免疫学的効果によって規定され、それらに依存する。
【０２４４】
本明細書中に提示される多量体リガンドなどの薬学的組成物の有効量は、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９７％超または８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％もしくは１０％未満の治療用細胞が殺滅されるような、カスパーゼ−９を発現する細胞Ｔ細胞においてアポトーシスを誘導するこの選択された結果を達成する量であり得る。この用語は、「十分な量」とも同義である。薬学的組成物が改変Ｔ細胞である場合の有効量は、所望の治療的応答（例えば、リガンド誘導物質が投与される前の時点と比べて、腫瘍サイズの減少、腫瘍細胞のレベルの低下、または白血病細胞のレベルの低下）を達成する量でもあり得る。
【０２４５】
任意の特定の適用のための有効量は、処置されている疾患もしくは状態、投与されている特定の組成物、被験体のサイズ、および／または上記疾患もしくは状態の重症度などの要因に依存して変動し得る。本明細書で示される特定の組成物の有効量は、過度の実験を要することなしに経験的に決定され得る。
【０２４６】
用語「接触される」および「曝露される」は、細胞、組織または生物に適用されるとき、薬学的組成物および／もしくは別の作用物質、例えば、化学療法剤または放射線治療薬などが、標的細胞、組織もしくは生物に送達されるプロセス、または標的細胞、組織もしくは生物のすぐ近位に配置されるプロセスを記述するために本明細書中で使用される。細胞の殺滅または静止を達成するために、薬学的組成物および／またはさらなる作用物質（複数可）が、細胞（複数可）を殺滅するのに有効または細胞の分裂を防ぐのに有効な合計量で１つ以上の細胞に送達される。
【０２４７】
薬学的組成物の投与は、数分から数週間の範囲の間隔だけ、他の作用物質（複数可）より先に行われ得る、他の作用物質（複数可）と同時であり得る、および／または他の作用物質（複数可）の後に行われ得る。薬学的組成物および他の作用物質（複数可）が別々に細胞、組織または生物に適用される実施形態では、その薬学的組成物および作用物質（複数可）がなおも、都合よく組み合わされた効果をその細胞、組織または生物に対して発揮することができ得るように、各送達の時点の間に有効時間が満了しないことが通常、保証され得る。例えば、そういった場合には、２、３、４つまたはそれより多くの様式を用いて、細胞、組織または生物を実質的に同時に（すなわち、約１分未満以内に）薬学的組成物と接触させ得ることが企図される。他の態様では、１つ以上の作用物質が、発現ベクターを投与する前および／または投与した後に、実質的に同時、約１分以内から、約２４時間、約７日間、約１〜約８週間またはそれより長くまで、およびそれらの中の任意の導き出せる範囲で投与され得る。なおもさらに、本明細書中に提示される薬学的組成物と１つ以上の作用物質との様々な併用レジメンが、使用され得る。
【０２４８】
最適化されたおよび個別化された治療的処置
改変された細胞の投与量および投与スケジュールは、処置される疾患または状態のレベルを決定することによって最適化され得る。例えば、任意の残存している固形腫瘍のサイズ、または標的化される細胞、例えば、患者の中に残存している、腫瘍細胞または白血病細胞などのレベルが、決定され得る。
【０２４９】
例えば、患者が臨床的に関連するレベルの腫瘍細胞を有するか、または最初の治療の後に固形腫瘍を有するという決定は、改変されたＴ細胞を投与する必要があり得るという指示を臨床医に提供する。別の例では、改変された細胞で処置した後に、患者が、低下したレベルの腫瘍細胞または減少した腫瘍サイズを有するという決定は、追加の用量の改変された細胞が必要ないと臨床医に指示し得る。同様に、改変された細胞で処置した後、患者が、疾患もしくは状態の症状を示し続けているかまたは症状の再発に苦しんでいるという決定は、少なくとも１つのさらなる用量の改変された細胞を投与する必要があり得ると臨床医に指示し得る。
【０２５０】
用語「投与量」は、投与の用量と投与の頻度（例えば、次の投与のタイミングなど）の両方を含むことが意味される。用語「投与量レベル」とは、被験体の体重との関係から投与される改変された細胞の量のことを指す。
【０２５１】
ある特定の実施形態において、上記細胞は、動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類における細胞である。被験体は、例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類であり得る。上記被験体は、例えば、ヒト、例えば、感染症に罹患している患者、および／または免疫無防備状態であるかもしくは過剰増殖性疾患に罹患している被験体であり得る。
【０２５２】
従って、例えば、ある種の実施形態において、上記方法は、改変された細胞もしくは核酸の投与後の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数と比較して、被験体における腫瘍サイズ増大および／または腫瘍細胞数の増大の有無を決定すること、ならびに腫瘍サイズの増大および／または腫瘍細胞数の増大の存在が決定されるという事象において、上記被験体に上記改変された細胞もしくは核酸のさらなる用量を投与することを包含する。上記方法はまた、改変された細胞または核酸の投与後の白血病細胞のレベルと比較して、例えば、被験体における白血病細胞の増大の有無を決定すること、ならびに上記被験体における白血病細胞の増大の存在が決定されるという事象において、上記被験体に上記改変された細胞または核酸のさらなる用量を投与することを包含する。これらの実施形態において、例えば、上記患者は、本明細書で提供される方法に従って、治療用細胞または核酸で最初に処置される。最初の処置後に、例えば、腫瘍のサイズ、腫瘍細胞数、または白血病細胞の数は、その最初の処置前のときと比較して減少し得る。この最初の処置後のある時間では、上記患者は再び試験されるか、または上記患者は、疾患症候に関して継続してモニターされ得る。例えば、腫瘍のサイズ、腫瘍細胞数、または白血病細胞数が、その最初の処置直後のときと比較して増大していることが決定される場合、上記改変された細胞または核酸は、さらなる用量のために投与され得る。Ｂｏｂ１標的化Ｔ細胞レセプターを発現する治療用細胞が患者の中に残っていることに注意しながら、このモニタリングおよび処置スケジュールは、継続され得る。
【０２５３】
他の実施形態において、改変された細胞または核酸（ここで上記改変された細胞または核酸は、誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する）の投与後に、改変された細胞またはインビボで改変された細胞の数を減少させる必要がある事象において、多量体リガンドは、上記患者に投与され得る。これらの実施形態において、上記方法は、負の症候または状態（例えば、移植片対宿主病、またはオフターゲット毒性）の有無を決定すること、およびある用量の上記多量体リガンドを投与することを包含する。上記方法は、上記症候または状態をモニターすることおよび上記症候または状態が持続する事象において、上記多量体リガンドのさらなる用量を投与することをさらに包含し得る。Ｂｏｂ１標的化ＴＣＲを発現する治療用細胞が上記患者に残っている間は、このモニタリングおよび処置スケジュールは継続され得る。
【０２５４】
その後の薬物の用量、例えば、その後の、改変された細胞または核酸の用量、および／またはその後の薬物投与量などを調整するまたは維持する指示は、任意の好都合な様式で提供され得る。指示は、いくつかの実施形態において、表形式で（例えば、物理的媒体または電子媒体において）提供され得る。例えば、腫瘍細胞のサイズ、またはサンプル中の腫瘍細胞の数もしくはレベルが、表に提供され得、臨床医は、疾患のステージのリストまたは表とその症状を比較し得る。次いで、その臨床医は、その表から、その後の薬物用量（drug  dose）に対する指示を確認し得る。ある特定の実施形態において、指示は、それらの症状がコンピュータに提供された後（例えば、コンピュータ上のメモリに入れられた後）、コンピュータによって提示され得る（例えば、表示され得る）。例えば、この情報は、コンピュータに提供され得（例えば、ユーザーによってコンピュータメモリに入れられ得るか、またはコンピュータネットワーク内のリモートデバイスを介してコンピュータに送信され得）、コンピュータ内のソフトウェアが、その後の薬物用量を調整するかもしくは維持するための指示を生成し得、および／またはその後の薬物用量の量（subsequent  drug  dose  amount）を提供し得る。
【０２５５】
その後の用量が、指示に基づいて決定されたら、臨床医は、決定されたその後の用量を投与し得るか、または別の人もしくは実体に対してその用量を調整する指示（instruction）を提供し得る。本明細書中で使用される用語「臨床医」は、意思決定者のことを指し、ある特定の実施形態において、臨床医は、医療専門家である。意思決定者は、いくつかの実施形態において、コンピュータまたは表示されたコンピュータプログラムのアウトプットであり得、そのコンピュータによって表示される指示またはその後の薬物用量に基づいて、保健サービス提供者が行動し得る。意思決定者は、その後の用量を直接投与し得る（例えば、その後の用量を被験体に注入し得る）か、または遠隔的に投与し得る（例えば、ポンプパラメータが、意思決定者によって遠隔的に変更され得る）。
【０２５６】
本明細書中に提示されるような方法は、有効量の活性化された細胞、核酸またはそれをコードする発現構築物の送達を含むが、これらに限定されない。活性化された細胞、核酸または発現構築物の「有効量」は、一般に、述べられた所望の結果を検出可能におよび繰り返し達成するのに十分な量、例えば、疾患またはその症状を回復させるか、減少させるか、最小にするか、またはその程度を限定するのに十分な量として定義される。疾患の排除、根絶または治癒を含む他のより厳密な定義が、適用され得る。いくつかの実施形態において、処置の有効性を評価するためおよび毒性をコントロールするためにバイオマーカー、または腫瘍サイズもしくは腫瘍抗原発現などの他の疾患症状をモニターすることが存在し得る。
【０２５７】
さらなる実施形態において、発現構築物および／または発現ベクターは、細胞を活性化する組成物または物質として利用され得る。「細胞を活性化する」または「細胞の活性を増強する」そのような組成物とは、細胞に関連する１つまたはそれを超える活性を刺激する能力のことを指す。例えば、本方法の発現構築物またはベクターなどの組成物は、細胞上の共刺激分子のアップレギュレーションを刺激し得るか、細胞におけるＮＦ−κＢの核移行を誘導し得るか、細胞におけるｔｏｌｌ様レセプター、またはサイトカインもしくはケモカインを含む他の活性を活性化し得る。
【０２５８】
発現構築物、発現ベクターおよび／または形質導入された細胞は、例えば、より弱い抗原（例えば、高度に精製された抗原または組換え抗原）の免疫原性を高めること、免疫応答に必要な抗原の量を減少させること、防御免疫をもたらすのに必要な免疫化の頻度を減少させること、免疫応答が低下しているかまたは弱まっている被験体（例えば、新生児、高齢および免疫無防備状態の個体）におけるワクチンの効力を改善すること、および粘膜免疫などの標的組織における免疫を増強することによって、ワクチンの有効性を高め得るかもしくはワクチンの有効性に寄与し得るか、または特定のサイトカインプロファイルを誘発することによって細胞媒介性免疫もしくは体液性免疫を促進し得る。
【０２５９】
ある特定の実施形態において、細胞は、抗原とも接触される。しばしば、細胞は、エキソビボにおいて抗原と接触される。時折、細胞は、インビボにおいて抗原と接触される。いくつかの実施形態において、細胞は、被験体内に存在し、免疫応答が、抗原に対してもたらされる。時折、その免疫応答は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答である。時折、その免疫応答は、腫瘍抗原に対してもたらされる。ある特定の実施形態において、その細胞は、アジュバントの添加なしに活性化される。
【０２６０】
ある種の実施形態において、上記細胞は、エキソビボで、上記核酸で形質導入され、静脈内投与によって上記被験体へと投与される。他の実施形態において、上記細胞は、皮内投与を使用して投与される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、エキソビボで、上記核酸で形質導入され、皮下投与によって上記被験体に投与される。ときおり、上記細胞は、エキソビボで、上記核酸で形質導入される。ときおり、上記細胞は、インビボで、上記核酸で形質導入される。
【０２６１】
ある特定の実施形態において、上記細胞は、エキソビボで、上記核酸で形質導入され、皮内投与によって上記被験体へと投与され、ときおり上記細胞は、エキソビボで、上記核酸で形質導入され、皮下投与によって上記被験体へと投与される。抗原は、腫瘍抗原であり得、流入領域リンパ節への細胞の遊走によってＣＴＬ免疫応答が誘導され得る。腫瘍抗原は、宿主において免疫応答を引き起こす任意の抗原、例えば、ペプチドまたはポリペプチドなどである。腫瘍抗原は、新生物腫瘍細胞に関連する腫瘍関連抗原であり得る。
【０２６２】
いくつかの実施形態において、免疫無防備状態の個体または被験体は、免疫応答が低下したまたは弱まった被験体である。そのような個体には、化学療法または免疫系を弱める他の任意の治療を受けた被験体、移植レシピエント、現在、免疫抑制剤を摂取している被験体、高齢化している個体、またはＴ細胞が減少しているおよび／もしくは損なわれている任意の個体も含まれ得る。本方法は、免疫無防備状態の被験体におけるＴ細胞の量および／または活性を高めるために利用され得ることが企図される。
【０２６３】
抗原
Ｔ細胞レセプターは、標的抗原に結合する。インビトロまたはエキソビボでＴ細胞活性化をアッセイする場合、標的抗原は、種々の供給源から得られ得るかまたは単離され得る。標的抗原は、本明細書中で使用されるとき、抗原または抗原上の免疫学的エピトープであり、それは、哺乳動物における、免疫認識および疾患を引き起こす作用因子（agent）または疾患状態の最終的な排除またはコントロールにおいてきわめて重大である。その免疫認識は、細胞性および／または体液性であり得る。細胞内の病原体およびがんの場合、免疫認識は、例えば、Ｔリンパ球応答であり得る。
【０２６４】
標的抗原は、例えば、病原性の微生物、例えば、ＨＩＶ（Ｋｏｒｂｅｒら編  ＨＩＶ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎ．Ｍｅｘ．１９７７）、インフルエンザ、単純ヘルペス、ヒトパピローマウイルス（米国特許第５，７１９，０５４号）、Ｂ型肝炎（米国特許第５，７８０，０３６号）、Ｃ型肝炎（米国特許第５，７０９，９９５号）、ＥＢＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などを含むウイルスに由来し得るかまたはそれらから単離され得る。標的抗原は、病原菌、例えば、クラミジア（米国特許第５，８６９，６０８号）、マイコバクテリア、レジオネラ、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ）、Ａ群連鎖球菌、サルモネラ、リステリア、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（米国特許第５，９５５，５９６号）など）に由来し得るかまたはそれらから単離され得る。
【０２６５】
標的抗原は、例えば、アスペルギルス、侵襲性カンジダ（米国特許第５，６４５，９９２）、ノカルジア、ヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）、クリプトスポリジウムなどを含む病原性の酵母に由来し得るかまたはそれらから単離され得る。
【０２６６】
標的抗原は、例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、トリパノソーマ、リーシュマニア（米国特許第５，９６５，２４２号）、マラリア原虫（米国特許第５，５８９，３４３号）およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉを含むがこれらに限定されない、病原性の原生動物および病原性の寄生生物に由来し得るかまたはそれらから単離され得る。
【０２６７】
標的抗原には、新生物発生前または過形成の状態に関連する抗原が含まれる。標的抗原はまた、がんに関連し得るか、またはがんの原因となり得る。そのような標的抗原は、例えば、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または組織特異的抗原、それらのエピトープおよびそれらのエピトープアゴニストであり得る。そのような標的抗原としては、癌胎児抗原（ＣＥＡ）およびそのエピトープ、例えば、ＣＡＰ−１、ＣＡＰ−１−６Ｄなど（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２９５４０）、ＭＡＲＴ−１（Ｋａｗａｋａｒｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４７−３５２，１９９４）、ＭＡＧＥ−１（米国特許第５，７５０，３９５号）、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ（米国特許第５，６４８，２２６号）、ＧＰ−１００（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：６４５８−６４６２，１９９２）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、点変異したｒａｓがん遺伝子、正常なおよび点変異したｐ５３がん遺伝子（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：３５５１−３５５５，１９９４）、ＰＳＭＡ（Ｉｓｒａｅｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２２７−２３０，１９９３）、チロシナーゼ（Ｋｗｏｎら、ＰＮＡＳ  ８４：７４７３−７４７７，１９８７）ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）（Ｃｏｈｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１８：２８０７−２８０８，１９９０；米国特許第５，８４０，８３９号）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Ｃｈｅｎら、ＰＮＡＳ  ９４：１９１４−１９１８，１９９７）、ＴＲＰ−２（Ｊａｃｋｓｏｎら、ＥＭＢＯＪ，１１：５２７−５３５，１９９２）、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ／ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２（米国特許第５，５５０，２１４号）、ＢＲＣ−Ｉ、ＢＲＣ−ＩＩ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、ＴＡＡおよび組織特異的抗原の改変物、ＴＡＡのスプライスバリアント、エピトープアゴニストなどが挙げられるがこれらに限定されない。他のＴＡＡは、当該分野で公知の方法、例えば、米国特許第４，５１４，５０６号に開示されている方法によって同定され、単離され、クローニングされ得る。標的抗原は、１つまたはそれを超える成長因子および各々のスプライスバリアントも含み得る。
【０２６８】
ある抗原は、非がん細胞よりもがん細胞において、頻繁に発現され得る。その抗原は、改変された細胞を、前立腺特異的膜抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）またはそのフラグメントと接触させた結果、生じ得る。
【０２６９】
前立腺抗原（ＰＡ００１）は、ＰＳＭＡ抗原の細胞外の一部からなる組換えタンパク質である。ＰＳＭＡは、ニューロペプチダーゼ活性および葉酸加水分解酵素活性を有する約１００ｋＤａ（グリコシル化前は８４ｋＤａであり、二量体としては約１８０ｋＤａ）のタイプＩＩ膜タンパク質であるが、ＰＳＭＡの真の機能は、現在のところ不明である。Ｃａｒｔｅｒ  ＲＥら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９３：７４９−５３，１９９６；Ｉｓｒａｅｌｉ  ＲＳら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２２７−３０，１９９３；Ｐｉｎｔｏ  ＪＴら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２：１４４５−５１，１９９６。
【０２７０】
上記細胞は、例えば、未分画の腫瘍溶解産物、ＭＨＣから溶出したペプチド、腫瘍由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ（ペプチドまたはタンパク質））を未熟なＤＣにパルスすること、またはバルク腫瘍ｍＲＮＡ、すなわちＴＡＡをコードするｍＲＮＡでＤＣをトランスフェクトすること（Ｇｉｌｂｏａ，Ｅ．＆  Ｖｉｅｗｅｇ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １９９，２５１−６３（２００４）；Ｇｉｌｂｏａ，Ｅ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ４，４０１−１１（２００４）に概説）をはじめとした様々な方法によって、腫瘍抗原、例えば、ＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡポリペプチドと接触され得る。
【０２７１】
ＤＮＡゲノムを含む生物の場合、標的抗原またはその目的の免疫学的エピトープをコードする遺伝子は、そのゲノムＤＮＡから単離される。ＲＮＡゲノムを有する生物の場合、所望の遺伝子は、そのゲノムのｃＤＮＡコピーから単離され得る。そのゲノムの制限酵素地図が入手可能である場合、目的の遺伝子を含むＤＮＡフラグメントは、日常的な方法による制限エンドヌクレアーゼ消化によって切断される。所望の遺伝子が以前にクローニングされていた場合、それらの遺伝子は、入手可能なクローンから容易に得られることがある。あるいは、その遺伝子のＤＮＡ配列が既知である場合、その遺伝子は、デオキシリボ核酸を合成するための任意の従来の手法によって合成することができる。
【０２７２】
目的の抗原をコードする遺伝子は、例えば、その遺伝子を細菌宿主にクローニングすることによって、増幅され得る。この目的のために、様々な原核生物のクローニングベクターが使用され得る。例は、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣおよびｐＥＭＢＬである。
【０２７３】
少なくとも１つの標的抗原またはその免疫学的エピトープをコードする遺伝子は、標準的な手法によるウイルスを用いた組換えのためにデザインされたプラスミドベクターに挿入するために調製され得る。一般に、クローニングされた遺伝子は、制限酵素消化によって原核生物クローニングベクターから切り取られ得る。ほとんどの場合、切り取られたフラグメントは、その遺伝子のコード領域全体を含む。クローニングされた遺伝子を有するＤＮＡフラグメントは、例えば、ウイルスを用いた組換えのために使用されるＤＮＡベクターの挿入部位と適合するフラグメントの末端を作製するために、必要に応じて改変され得、次いで、精製された後、そのベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断部位（クローニング部位）に挿入される。
【０２７４】
細胞、例えば、例えば、樹状細胞の、抗原（例えば、Ｂｏｂ１エピトープポリペプチドのような）による抗原負荷は、例えば、例えば、細胞、例えば、樹状細胞または前駆体細胞を抗原と接触させることによって、例えば、細胞を抗原とともにインキュベートすることによって、達成され得る。負荷は、例えば、抗原をコードするＤＮＡ（裸のものまたはプラスミドベクター内のもの）またはＲＮＡをインキュベートする；または抗原を発現している組換え細菌またはウイルス（例えば、ワクシニア、水痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクター）とともにインキュベートすることによっても達成され得る。負荷の前に、抗原は、Ｔ細胞を助ける免疫学的パートナー（例えば、キャリア分子）に共有結合的に結合体化されてもよい。あるいは、樹状細胞は、別々にまたはポリペプチドの存在下において、結合体化されていない免疫学的パートナーでパルスされ得る。細胞またはＭＨＣ分子由来の抗原は、酸溶出または他の方法によって得ることができる（Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  Ｌら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９６．１８３：８７−９７を参照のこと）。それらの細胞は、それらの細胞が抗原で負荷される前、負荷された後、または負荷されるのと同時に、本方法に従って、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を形質導入され得るかまたはトランスフェクトされ得る。特定の実施形態において、抗原負荷は、形質導入またはトランスフェクションの後に行われる。
【０２７５】
さらなる実施形態において、形質導入された細胞は、腫瘍細胞ｍＲＮＡでトランスフェクトされる。形質導入され、トランスフェクトされた細胞は、動物に投与されて、細胞傷害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞の抗腫瘍抗原免疫応答をもたらし、その細胞は、二量体のＦＫ５０６および二量体のＦＫ５０６アナログによって制御される。腫瘍細胞ｍＲＮＡは、例えば、前立腺腫瘍細胞由来のｍＲＮＡであり得る。
【０２７６】
いくつかの実施形態において、形質導入された細胞は、腫瘍細胞溶解産物でパルスすることによって負荷され得る。パルスされ、形質導入された細胞は、動物に投与されて、細胞傷害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞の抗腫瘍抗原免疫応答をもたらし、その細胞は、二量体のＦＫ５０６および二量体のＦＫ５０６アナログを用いて制御される。その腫瘍細胞溶解産物は、例えば、前立腺腫瘍細胞溶解産物であり得る。
【０２７７】
免疫細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球応答
Ｔリンパ球は、本明細書中で論じられる発現ベクターを含む細胞との接触によって活性化され得、ここで、その細胞は、抗原でチャレンジされているか、トランスフェクトされているか、パルスされているか、または電気融合されている。
【０２７８】
Ｔ細胞は、その膜上にユニークな抗原結合レセプター（Ｔ細胞レセプター）を発現し、そのレセプターは、他の細胞の表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と会合している抗原のみを認識することができる。Ｔ細胞にはいくつかの集団、例えば、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞がある。ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞は、第一に、それぞれ、膜結合糖タンパク質ＣＤ４およびＣＤ８のディスプレイによって区別される。ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージおよび他の免疫系細胞の活性化にとってきわめて重大な様々なリンフォカインを分泌する。対照的に、抗原−ＭＨＣ複合体を認識するナイーブＣＤ８Ｔ細胞は、増殖し、細胞傷害性ＣＤ８Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。ＣＴＬは、細胞溶解をもたらす物質を産生することによって、抗原をディスプレイしている体内の細胞（例えば、ウイルスに感染した細胞および腫瘍細胞）を排除する。
【０２７９】
ＣＴＬの活性は、例えば、本明細書中で論じられる方法によって評価され得る。例えば、ＣＴＬは、単離されたばかりの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において評価され得るか、ＰＢＭＣから確立された、フィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）によって刺激され、ＩＬ−２によって増殖した細胞株において評価され得るか（Ｂｅｒｎａｒｄら、ＡＩＤＳ，１２（１６）：２１２５−２１３９，１９９８）、または予め免疫された被験体から単離され、抗原を含むアデノウイルスベクターに感染したＤＣで６日間にわたって再刺激されたＴ細胞によって、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出マイクロ毒性アッセイを用いて評価され得る。１つのタイプのアッセイは、クローン化Ｔ細胞を用いる。クローン化Ｔ細胞は、再指向化（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）細胞傷害性アッセイにおいてパーフォリン依存性の殺滅とＦａｓリガンド依存性の殺滅の両方を媒介する能力について試験された（Ｓｉｍｐｓｏｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１５（４）：８４９−８５５，１９９８）。クローン化細胞傷害性Ｔリンパ球は、Ｆａｓ依存性殺滅とパーフォリン依存性殺滅の両方を示した。最近になって、新しい蛍光増幅システムを利用するインビトロデヒドロゲナーゼ放出アッセイが開発された（Ｐａｇｅ，Ｂ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９８  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；１８（４Ａ）：２３１３−６）。このアプローチは、高感度であり、迅速であり、再現性があり、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に対して有益に使用され得る。このアプローチは、細胞膜の完全性を用いる、大規模な細胞傷害性試験のためにさらに容易に自動化され得るので、考慮に入れられる。細胞媒介性の細胞傷害性を検出するために開発された別の蛍光測定アッセイでは、使用されるフルオロフォアは、無毒性分子のＡｌａｍａｒＢｌｕｅである（Ｎｏｃｉａｒｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１３（２）：１５７−１６７，１９９８）。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅは、ミトコンドリアの還元が生じ、それによってＡｌａｍａｒＢｌｕｅの蛍光強度の劇的な増加（すなわち、量子収量の増加）がもたらされるまで、蛍光消光される（すなわち、低量子収量）。このアッセイは、極めて高感度であり、特異的であると報告されており、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイよりも有意に少ない数のエフェクター細胞しか必要としない。
【０２８０】
本方法によって誘導され得る他の免疫細胞としては、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）が挙げられる。ＮＫは、抗原特異的レセプターを欠き、自然免疫系の一部である、リンパ系細胞である。代表的には、感染した細胞は、通常、細胞表面ＭＨＣに結合した外来粒子によって警告されたＴ細胞によって破壊される。しかしながら、ウイルスに感染した細胞は、抗体によって認識されるウイルスタンパク質を発現することによって感染をシグナル伝達する。これらの細胞は、ＮＫによって殺滅され得る。腫瘍細胞では、その腫瘍細胞が、ＭＨＣ  Ｉ分子の発現を失っている場合、それは、ＮＫに感受性であり得る。
【０２８１】
患者に投与するための製剤および経路
臨床適用が企図される場合、薬学的組成物（発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、形質導入された細胞、活性化Ｔ細胞、形質導入されたＴ細胞、および負荷されたＴ細胞）を、意図される用途にとって適切な形態で調製する必要があり得る。一般に、これは、発熱物質ならびにヒトまたは動物にとって有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴い得る。
【０２８２】
多量体リガンド、例えば、ＡＰ１９０３などは、例えば、約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ被験体体重、０．１〜２ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．０５〜１．０ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．２〜４ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．３〜３ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．３〜２ｍｇ／ｋｇ被験体体重または約０．３〜１ｍｇ／ｋｇ被験体体重、例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重の用量で送達され得る。いくつかの実施形態において、リガンドは、１用量あたり０．４ｍｇ／ｋｇ、例えば、５ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される。リガンドを、例えば、バイアル１本あたり約０．２５ｍｌ〜約１０ｍｌ、例えば、約０．２５、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０ｍｌ、例えば、約２ｍｌの体積で含むバイアルまたは他の容器が提供され得る。
【０２８３】
送達ベクターを安定にするためおよび標的細胞による取り込みを可能にするために適切な塩および緩衝剤を使用することが一般に望ましい場合がある。緩衝剤は、組換え細胞が患者に導入されるときにも使用され得る。水性組成物は、薬学的に許容され得るキャリアまたは水性媒質に溶解されたまたは分散された、細胞に対して有効量のベクターを含む。そのような組成物は、接種材料とも称される。句「薬学的にまたは薬理学的に許容され得る」とは、動物またはヒトに投与されたとき、有害（ａｄｖｅｒｓｅ）反応、アレルギー反応または他の有害（ｕｎｔｏｗａｒｄ）反応をもたらさない分子実体および組成物のことを指す。薬学的に許容され得るキャリアは、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、公知である。任意の従来の媒質または作用物質が、ベクターまたは細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る。
【０２８４】
活性な組成物は、従来の医薬品を含み得る。これらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の通常の経路を介し得る。これには、例えば、経口、経鼻、頬側、直腸、膣または局所的が含まれる。あるいは、投与は、同所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射による投与であり得る。そのような組成物は、通常、本明細書中で論じられる薬学的に許容され得る組成物として投与され得る。
【０２８５】
注射可能な使用に適した薬学的な形態としては、滅菌された水溶液または分散液、および滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌された粉末が挙げられる。すべての場合において、その形態は、滅菌されており、容易に注射できる程度に流動性である。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護される。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散液の場合、必要とされる粒径を維持すること、および界面活性物質を使用することによって、維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。ある特定の例では、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムが、含められ得る。注射可能な組成物の持続性の吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において使用することによってもたらされ得る。
【０２８６】
経口投与の場合、組成物は、賦形剤とともに組み込まれ得、摂取不可能なうがい薬および歯磨剤の形態で使用され得る。必要とされる量で活性成分をホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などの適切な溶媒に組み込んでいるうがい薬が、調製され得る。あるいは、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含む殺菌洗浄液に組み込まれ得る。活性成分は、例えば、ゲル、ペースト、粉末およびスラリーを含む、歯磨剤にも分散され得る。活性成分は、例えば、水、結合剤、研磨剤、香味料、起泡剤および湿潤剤を含み得るペースト歯磨剤に治療有効量で加えられ得る。
【０２８７】
組成物は、中性または塩の形態で製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩としては、例えば、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸など、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とともに形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基とともに形成される塩は、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄など、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基からも得ることができる。
【０２８８】
製剤化されると、溶液は、投与製剤（ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に適合した様式で、および治療的に有効であるような量で、投与され得る。それらの製剤は、種々の剤形（例えば、注射可能な液剤、薬物放出カプセル剤など）で容易に投与される。例えば、水性液剤での非経口投与の場合、その液剤は、必要であれば適切に緩衝され得、最初に、液体希釈剤が、十分な食塩水またはグルコースで等張性にされ得る。これらの特定の水性液剤は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。この文脈では、滅菌された水性媒質が使用され得る。例えば、１投与量が、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、１０００ｍｌの皮下注入液に加えられ得るか、または提案される注入部位に注射され得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１０３５−１０３８および１５７０−１５８０頁を参照のこと）。処置されている被験体の状態に応じて、投与量のいくつかのバリエーションが必然的に生じる。いずれにしても、投与に関与する者が、個々の被験体に対する適切な用量を決定し得る。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの基準が要求するような、無菌性、発熱性ならびに一般的な安全性および純度の基準を満たし得る。
【０２８９】
投与スケジュールは、患者にふさわしいように決定され得、例えば、核酸が０週目に投与された後、二量体化の化学誘導物質の投与による誘導が行われ、それに続いて、さらなる誘導物質が、有効な治療結果を得るのに必要なとき、または例えば、その後、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０間隔で、例えば、合計２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００週間わたって、投与される投薬スケジュールを含み得る。
【０２９０】
投与スケジュールは、患者にふさわしいように決定され得、例えば、核酸を形質導入されたＴ細胞または他の細胞が０週目に投与された後、二量体化化学誘導物質の投与による誘導が行われ、それに続いて、さらなる誘導物質が、有効な治療結果を得るのに必要なとき、または例えば、その後、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０週間の間隔で、例えば、合計２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００週間にわたって、投与される投薬スケジュールを含み得る。
【０２９１】
必要であれば、上記方法は、処置において使用されるより多くの細胞を得るためにさらなる白血球アフェレーシスをさらに含み得る。
【０２９２】
（疾患を処置するための方法）
本方法はまた、過剰増殖性疾患によって引き起こされる疾患の処置または防止の方法を包含する。
【０２９３】
薬学的組成物（形質導入されたＴ細胞、発現ベクター、発現構築物など）を使用して処置され得るかまたは予防され得る新生物発生前または過形成の状態としては、結腸ポリープ、クローン病、潰瘍性大腸炎、乳房病変などのような新生物発生前または過形成の状態が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９４】
薬学的組成物を使用して処置され得る、固形腫瘍を含むがんとしては、原発性または転移性メラノーマ、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵がん、結腸がん、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、ＮＰＣ、膀胱がん、子宮頸がんなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９５】
本明細書中に提示されるＴ細胞活性化システムおよび他の治療的細胞活性化システムを使用して処置され得る、固形腫瘍を含む他の過剰増殖性疾患としては、関節リウマチ、炎症性腸疾患、変形性関節症、平滑筋腫、アデノーマ、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、新生物発生前の病変（例えば、腺腫様過形成および前立腺上皮内新形成）、上皮内癌、口腔毛状白斑症または乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９６】
処置方法において、薬学的組成物（発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、形質導入された細胞、および活性化Ｔ細胞、形質導入されたＴ細胞および負荷されたＴ細胞）の投与は、「予防的」または「治療的」な目的であり得る。薬学的組成物は、予防的に提供されるとき、任意の症候よりも先に提供される。薬学的組成物の予防的投与は、その後の任意の感染または疾患を予防するためまたは回復させるために役立つ。薬学的組成物は、治療的に提供されるとき、感染または疾患の症候の発生時または発生後に提供される。したがって、本明細書中に提示される組成物は、疾患を引き起こす作用因子もしくは疾患状態への予想される曝露の前または感染もしくは疾患の開始後に提供され得る。したがって、本明細書中で論じられる核酸および細胞を用いる、固形腫瘍（例えば、がんに見出される固形腫瘍、または例えば前立腺がんであるがこれに限定されない）の予防的処置のための方法が、本明細書中に提供される。例えば、被験体において腫瘍を予防的に防止するかまたはそのサイズを減少するための方法が提供され、上記方法は、本明細書で論じられる核酸または細胞を投与し、それによって上記核酸または細胞が、被験体において腫瘍を防止するかまたはそのサイズを減少するために有効な量で投与される工程を包含する。
【０２９７】
任意の組織または器官由来の固形腫瘍が、本方法を用いて処置され得るが、例えば、その固形腫瘍としては、血管構造において、例えば、ＰＳＡ、例えばＰＳＭＡを発現している任意の腫瘍、例えば、肺、骨、肝臓、前立腺または脳、ならびにまた、例えば、乳房、卵巣、腸、精巣、結腸、膵臓、腎臓、膀胱、神経内分泌系、軟部組織、骨性腫瘤（ｂｏｎｅｙ  ｍａｓｓ）およびリンパ系に存在する固形腫瘍が挙げられる。処置され得る他の固形腫瘍としては、例えば、神経膠芽腫および悪性骨髄腫が挙げられる。
【０２９８】
用語「単位用量」は、それが接種材料に関するとき、哺乳動物に対する単位投与量として好適な物理的に分離した単位のことを指し、各単位は、必要とされる希釈剤と共同して、所望の免疫原性効果をもたらすと計算された所定の量の薬学的組成物を含む。接種材料の単位用量についての規格（specification）は、薬学的組成物のユニークな特色および達成されるべき特定の免疫学的効果によって規定され、その特色に依存する。
【０２９９】
薬学的組成物の有効量は、免疫応答を増強するこの選択された結果を達成する量であり、そのような量は、決定され得る。例えば、免疫系不全を処置するための有効量は、免疫系の活性化を引き起こし、抗原に曝露されたときに抗原特異的な免疫応答を発生させるために必要な量であり得る。この用語は、「十分な量」とも同義である。
【０３００】
任意の特定の適用のための有効量は、処置されている疾患もしくは状態、投与されている特定の組成物、被験体のサイズ、および／または上記疾患もしくは状態の重症度などの要因に依存して変動し得る。本明細書で示される特定の組成物の有効量は、過度の実験を要することなしに経験的に決定され得る。従って、例えば、一実施形態において、上記形質導入されたＴ細胞または他の細胞は、例えば、免疫応答を誘導するのに有効な量で、または例えば、腫瘍サイズを減少させるかもしくは腫瘍血管構造の量を減少させるのに有効な量で、被験体に投与される。
【０３０１】
Ａ．（遺伝子に基づく治療）
ある種の実施形態において、細胞には、Ｔ細胞において組換えＴＣＲポリペプチド（例えば、Ｂｏｂ１  ＴＣＲポリペプチド）を提供し得る発現構築物が提供される。その中で使用される発現ベクターおよび遺伝的エレメントの長い考察は、この節へと参考として援用される。ある種の例において、発現ベクターは、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、およびレトロウイルス）であり得る。別の例において、上記ベクターは、リソソームによって被包された発現ベクターであり得る。
【０３０２】
遺伝子送達は、インビボとエキソビボの両方の状況において行われ得る。ウイルスベクターの場合、一般に、ウイルスベクターストックが調製され得る。エキソビボおよびインビボにおけるウイルスベクター媒介性の遺伝子送達の例は、本願において提示される。インビボで送達する場合、ウイルスの種類および達成可能な力価に応じて、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０４、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０５、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０６、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０７、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０８、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０９、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０１０、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０１１または１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０１２個の感染性粒子が患者に送達され得る。類似の数字は、相対的な取り込み効率を比較することによって、リポソーム製剤または他の非ウイルス製剤に対して外挿され得る。薬学的に許容され得る組成物としての製剤は、下記で論じられる。多量体リガンド、例えば、ＡＰ１９０３などは、例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９または１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重の用量で送達され得る。
【０３０３】
Ｂ．（細胞ベースの治療）
企図される別の治療は、例えば、形質導入されたＴ細胞の投与などの操作されたＴ細胞の投与である。上記Ｔ細胞は、インビトロにおいて操作され得る。薬学的に許容され得る組成物としての製剤は、本明細書中で論じられる。
【０３０４】
細胞に基づく治療では、操作された細胞は、例えば、標的抗原核酸をコードするレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターで形質導入され得るか；標的抗原核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）もしくはタンパク質でトランスフェクトされ得るか；細胞溶解産物、タンパク質もしくは核酸でパルスされ得るか；または細胞と電気的に融合され得る。それらの細胞、タンパク質、細胞溶解産物または核酸は、腫瘍細胞などの細胞、または他の病原微生物、例えば、ウイルス、細菌、原生動物などに由来し得る。
【０３０５】
Ｃ．併用療法
本明細書中に提示される発現ベクターの有効性を高めるために、これらの組成物および方法をその疾患の処置において有効な作用物質と組み合わせることが、望ましい場合がある。
【０３０６】
ある特定の実施形態において、抗がん剤が、本方法と組み合わせて使用され得る。「抗がん」剤は、例えば、１つ以上のがん細胞を殺滅すること、１つ以上のがん細胞においてアポトーシスを誘導すること、１つ以上のがん細胞の成長速度を低下させること、転移の発生率もしくは数を減少させること、腫瘍のサイズを減少させること、腫瘍の成長を阻害すること、腫瘍もしくは１つ以上のがん細胞への血液の供給を減少させること、１つ以上のがん細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進すること、がんの進行を予防するかもしくは阻害すること、またはがんを有する被験体の寿命を延長することによって、被験体におけるがんに悪影響を与えることができる。抗がん剤としては、例えば、化学療法剤（化学療法）、放射線治療剤（放射線治療）、外科手技（手術）、免疫治療剤（免疫療法）、遺伝的治療剤（遺伝子治療）、ホルモン治療、他の生物学的薬剤（生物療法）および／または代替療法が挙げられる。
【０３０７】
さらなる実施形態では、感染症を処置するためおよび／または予防するために、抗生物質が薬学的組成物と組み合わせて使用され得る。そのような抗生物質としては、アミカシン、アミノグリコシド類（例えば、ゲンタマイシン）、アモキシシリン、アンホテリシンＢ、アンピシリン、アンチモン類（ａｎｔｉｍｏｎｉａｌｓ）、アトバコン、スチボグルコン酸ナトリウム、アジスロマイシン、カプレオマイシン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフトリアキソン、クロラムフェニコール、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、クロファジミン、サイクロセリン、ダプソン、ドキシサイクリン、エタンブトール、エチオナミド、フルコナゾール、フルオロキノロン類、イソニアジド、イトラコナゾール、カナマイシン、ケトコナゾール、ミノサイクリン、オフロキサシン）、パラ−アミノサリチル酸、ペンタミジン、ポリミキシン、ディフェンシン類（ｄｅｆｉｎｓｉｎｓ）、プロチオナミド、ピラジナミド、ピリメタミン、スルファジアジン、キノロン類（例えば、シプロフロキサシン）、リファブチン、リファンピン、スパルフロキサシン、ストレプトマイシン、スルホンアミド類、テトラサイクリン類、チアセタゾン、トリメトプリム（ｔｒｉｍｅｔｈａｐｒｉｍ）−スルファメトキサゾール、バイオマイシンまたはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０８】
より一般的には、そのような薬剤は、がん細胞および／もしくは微生物を殺滅するためまたはがん細胞および／もしくは微生物の増殖を阻害するために有効な発現ベクターとともに、合計量で提供され得る。このプロセスは、細胞（複数可）を薬剤（複数可）および薬学的組成物と同時にまたはある時間内に接触させる工程を含み得、ここで、細胞、組織または生物への薬学的組成物と薬剤との別個の投与によって、所望の治療的な利益がもたらされる。これは、薬学的組成物と１つ以上の薬剤の両方を含む単一の組成物または薬理学的製剤と細胞、組織もしくは生物を接触させることによって、または２つ以上の別々の組成物もしくは製剤（ここで、一方の組成物は薬学的組成物を含み、他方は１つ以上の薬剤を含む）と細胞を接触させることによって達成され得る。
【０３０９】
用語「接触される」および「曝露される」は、細胞、組織または生物に適用されるとき、薬学的組成物および／もしくは別の作用物質、例えば、化学療法剤または放射線治療薬などが標的細胞、組織もしくは生物に送達されるプロセスを記述するために本明細書中で使用されるか、または標的細胞、組織もしくは生物のすぐ近位に配置されるプロセスを記述するために本明細書中で使用される。細胞の殺滅または静止を達成するために、薬学的組成物および／またはさらなる作用物質（複数可）が、細胞（複数可）を殺滅するのに有効または細胞の分裂を防ぐのに有効な合計量で１つ以上の細胞に送達される。
【０３１０】
薬学的組成物の投与は、数分から数週間の範囲の間隔だけ、他の作用物質（複数可）より先に行われ得る、他の作用物質（複数可）と同時であり得る、および／または他の作用物質（複数可）の後に行われ得る。薬学的組成物および他の作用物質（複数可）が別々に細胞、組織または生物に適用される実施形態では、その薬学的組成物および作用物質（複数可）がなおも、都合よく組み合わされた効果をその細胞、組織または生物に対して発揮することができ得るように、各送達の時点の間に有効時間が満了しないことが通常、保証され得る。例えば、そういった場合には、２、３、４つまたはそれより多くの様式を用いて、細胞、組織または生物を実質的に同時に（すなわち、約１分未満以内に）薬学的組成物と接触させ得ることが企図される。他の態様において、１つ以上の作用物質が、発現ベクターを投与する前および／または投与した後に、実質的に同時、約１分以内から、約２４時間、約７日間、約１〜約８週間またはそれより長くまで、およびそれらの中の任意の導き出せる範囲で投与され得る。なおもさらに、本明細書中に提示される薬学的組成物と１つ以上の作用物質との様々な併用レジメンが、使用され得る。
【０３１１】
いくつかの実施形態において、上記化学療法剤は、リンパ球枯渇化学療法剤であり得る。他の実施形態において、化学療法剤は、タキソテール（ドセタキセル）または別のタキサン、例えば、カバジタキセル（ｃａｂａｚｉｔａｘｅｌ）などであり得る。化学療法剤は、細胞および誘導物質による処置の前、処置中または処置の後に投与され得る。例えば、化学療法剤は、第１の用量の活性化された核酸を投与する約１年前、１１、１０、９、８、７、６、５もしくは４ヶ月前、または１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２，１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２週間前もしくは１週間前に、投与され得る。または、例えば、化学療法剤は、第１の用量の細胞または誘導物質を投与した約１週間後、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８週間後、または４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１ヶ月後、または１年後に投与され得る。
【０３１２】
化学療法剤の投与は、２つ以上の化学療法剤の投与を含み得る。例えば、シスプラチンは、タキソテールまたは他のタキサン、例えば、カバジタキセルなどに加えて投与され得る。
【０３１３】
本明細書で示されるとおりの方法は、限定なしに、活性化された細胞、核酸、またはこれをコードする発現構築物の有効量の送達を含む。薬学的組成物の「有効量」は、一般に、検出可能にかつ反復して、述べられる所望の結果を達成するために、例えば、上記疾患またはその症候を回復するか、減少するか、最小にするか、またはその程度を制限するために、十分な量として定義される。疾患の排除、根絶または治癒を含む他のより厳密な定義が、適用されることもある。いくつかの実施形態において、処置の有効性を評価するためおよび毒性をコントロールするためにバイオマーカーをモニターすることが存在してもよい。
【０３１４】
改変された細胞の有効量は、個々の患者を考慮して、医師によって決定され得る。考慮されるべき因子としては、例えば、疾患もしくは状態の程度、腫瘍サイズ、感染症の程度、転移、年齢、および体重が挙げられ得る。投与量および投与回数は、医師、または他の臨床医によって、疾患もしくは状態の症候について患者をモニターすることによって、および以前の投与量への応答に関しては、例えば、腫瘍サイズ、または腫瘍抗原のレベルもしくは濃度をモニターすることによって、決定され得る。ある特定の例では、改変された細胞は、１０４〜１０９個の改変された細胞／ｋｇ  体重、１０５〜１０６個、１０９〜１０１１個、または１０１０〜１０１１個の改変された細胞／ｋｇ  体重の投与量で、投与され得る。
【実施例】
【０３１５】
以下に示される実施例は、ある種の実施形態を例証するのであって、本技術を限定しない。
【０３１６】
（実施例１：材料および方法）
（ｐＭＨＣ−テトラマーを使用する、Ｂｏｂ１特異的Ｔ細胞クローンの単離）
Ｂｏｂ１ペプチドを含むｐＭＨＣ−テトラマーに結合するＴ細胞を、（１）において提供されるプロトコルに本質的に従って、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２陰性健常個体に由来する凍結保存したＰＢＭＣから単離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＰＥ標識ｐＭＨＣ−テトラマーとともに１時間、４℃でインキュベートした。細胞を２回洗浄し、抗ＰＥ磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）とインキュベートした。ＰＥ標識細胞を、製造業者の指示に従って、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）でＭＡＣＳによって単離した。Ｂｏｂ１特異的Ｔ細胞クローンを得るために、その陽性画分を、Ｂｏｂ１ペプチドを含むＰＥ標識ｐＭＨＣ−テトラマーおよびＣＤ８に対する抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｃａｌｔａｇ，  Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，  ＵＫ）をＣＤ４、ＣＤ１４、およびＣＤ１９に対する抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）と組み合わせて染色することによってソートした。細胞を、ＰＥ標識ｐＭＨＣ−テトラマーとともに１時間、４℃で最初に染色し、その後抗体をさらに１５分間、４℃において添加した。単一のｐＭＨＣ−テトラマー＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、１００μｌ  Ｔ細胞培地（０．８μｇ／ｍｌ  ＰＨＡを補充）中に５×１０４の照射同種異系ＰＢＭＣを含む９６ウェル丸底培養プレートへとソートした。細胞ソーティングを、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）で行った。拡大の２週間後に、そのクローンを、刺激後のＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γ生成を測定することによって、ペプチド特異的反応性についてスクリーニングした。
【０３１７】
（機能分析）
刺激細胞を、種々のペプチド濃度で３０分間、３７℃においてペプチドでパルスした。レスポンダーＴ細胞およびペプチドでパルスしたかもしくは負荷されていない刺激細胞を、種々のレスポンダー  対  スティミュレーター比で共インキュベートした。１８時間の共インキュベーション後に、上清を採取し、ＩＦＮ−γ生成を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ，  Ｓａｎｑｕｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって測定した。さらに、レスポンダーＴ細胞を、種々の原発性Ｂ細胞悪性腫瘍ならびに種々の造血および非造血細胞サブセットで刺激した。原発性ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ｂ＊０７０２陽性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ならびに多発性骨髄腫（ＭＭ）を、診断時点でＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＢ＊０７：０２陽性患者の凍結保存されたＰＢＭＣ由来のそれらの悪性表現型に基づいてＦＡＣＳソーティングし、高度に精製された集団（＞９９％）を、刺激アッセイで使用した。初代造血細胞サブセットを、製造業者の指示に従って、抗ＣＤ４、抗ＣＤ１４、および抗ＣＤ１９もしくは抗ＣＤ３４磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＢ＊０７：０２陽性の健常ドナーの凍結保存されたＰＢＭＣから精製した。単離された細胞の純度を、ＦＡＣＳ分析を使用して評価し、細胞を、純度が９５％を超えた場合に、実験においてのみ使用した。未熟および成熟樹状細胞（ＤＣ）を、以前に記載されるように（２）、単離されたＣＤ１４＋細胞集団からインビトロで分化させた。活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、Ｔ細胞培地（０．８μｇ／ｍｌ  フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ，  Ｒｅｍｅｌ，  Ｌｅｎｅｘａ，  ＫＳ，  ＵＳＡ）を補充）中１０日間、精製ＣＤ４＋  Ｔ細胞を照射した（３５Ｇｙ）ＰＢＭＣで、１：５の比で刺激することによって生成した。活性化ＣＤ１９＋  Ｂ細胞を、ＣＤ４０Ｌ形質導入した照射（７０Ｇｙ）マウス線維芽細胞上で、ＩＭＤＭ（２ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４  （Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，  Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）および１０％  ヒト血清を補充）中で７日間、ＣＤ１９＋細胞を共培養することによって生成した。ＨＬＡ−Ａ２を発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２−Ａ２）は、以前に記載された（３）。ＨＬＡ−Ｂ７を発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２−Ｂ７）を、ＨＬＡ−Ｂ７でのレトロウイルス形質導入によって生成した。線維芽細胞を単離し、以前に記載されるように（２）培養した。線維芽細胞を、２００  ＩＵ／ｍｌ  ＩＦＮ−γの存在下または非存在下で４日間培養した。
【０３１８】
（Ｂｏｂ１をコードするかまたはＢｏｂ１−ＴＣＲをコードするレトロウイルスベクターの構築およびレトロウイルス上清の生成）
Ｂｏｂ１タンパク質をコードするＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子を、コドン最適化し（ＧｅｎｅＡｒｔ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＧＦ−Ｒと組み合わせてＭＰ７１レトロウイルス骨格上に発現させた（Ｒｕｇｇｉｅｒｉ  Ｌら，  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １９９７；８：  １６１１−１６２３を参照のこと）。
【０３１９】
Ｂｏｂ１特異的Ｔ細胞クローンから、ｍＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡを、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ定常領域特異的オリゴを使用して合成した。テンプレートの切り替えによって、オリゴを、各５’  ｃＤＮＡ末端に固定し、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ転写物のその後のＴＣＲ  Ｖ−遺伝子非依存性増幅を可能にした。単一Ｔ細胞クローンのＰＣＲ生成物を、バーコードをつけ、プールし、全長読み取りを、単一のＰａｃＢｉｏ  ＮＧＳを実行して生成した。コドン最適化したシステイン改変Ｂｏｂ１−ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖の配列を、２Ａ配列によって連結されたＭＰ７１レトロウイルス構築物へとクローニングし、短縮型神経増殖因子レセプター（ＮＧＦ−Ｒ）へと内部リボソーム侵入部位配列（ＩＲＥＳ配列）によって連結したところ、ＴＣＲαβ鎖およびＮＧＦ−Ｒの両方の調和した化学量論的な発現が生じた。Ｂｏｂ１−ＴＣＲのシステイン改変を、それぞれ、４８位および５７位でのＴＣＲαおよびβ鎖の定常ドメインにシステイン残基を導入することによって行った。Ｂｏｂ１−ＴＣＲのコドン最適化（ＣＯ）は、ＧＥＮＥＳＣＲＩＰＴ（登録商標）によって行った。ＨＡ１−ＴＣＲをコードする同じＭＰ７１レトロウイルスベクター骨格を、本発明者らの近年の臨床研究において使用する（４）。
【０３２０】
レトロウイルス生成のために、Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ａ細胞を、Ｔ２５フラスコ中、４×１０４  細胞／ｃｍ２でプレーティングした。２４時間後、細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、４μｇ  レトロウイルスベクター  ＤＮＡおよび２μｇ  Ｍ５７ベクターＤＮＡでトランスフェクトした。レトロウイルス粒子を含む上清を、トランスフェクションの４８時間および７２時間後に採取し、−８０℃で貯蔵した。
【０３２１】
形質導入のために、レトロウイルス上清を、３０μｇ／ｍｌ  レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ，  Ｓｈｉｇａ，  Ｊａｐａｎ）でコーティングし２％  ヒト血清アルブミン（Ｓａｎｑｕｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）でブロッキングした、２４ウェルの組織培養用の処理が行われていないプレートに負荷した。ウイルス上清を、２，０００ｇで２０分間、４℃において遠沈した。１×１０５〜３×１０５  細胞を、レトロウイルス上清に添加し、１８時間インキュベートした。高純度バルクＢｏｂ１形質導入Ｋ５６２−Ａ２およびＫ５６２−Ｂ７細胞集団を、ＮＧＦ−Ｒに対する抗体で染色した細胞をソーティングすることによって得た。Ｂｏｂ１−ＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、さらなるソーティングなしに、テトラマー染色および機能的活性について分析した。
【０３２２】
（細胞株）
多発性骨髄腫細胞株ＵＭ９およびＵ２６６、Ｂ−ＬＣＬ−ＪＹ、ならびに２種のＡＬＬ細胞株ＡＬＬ−ＢＶおよびＡＬＬ−ＶＧを、本明細書で論じられるとおり、改変された細胞が、サイトカイン分泌アッセイおよび細胞傷害性アッセイにおいてＢｏｂ１に対して反応するかどうかを決定するために使用し得る。
【０３２３】
細胞を、１０％  ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含む完全ＩＭＤＭ（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）中で、３７℃で５％  二酸化炭素（ＣＯ２）を含む加湿雰囲気において維持する。Ｂｏｂ１−ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞およびＰＨＡ芽細胞を、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ  ＤＣ（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）培地（１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）を補充）中で維持する。
【０３２４】
（Ｔ細胞の活性化）
拡大および形質導入のためのＴ細胞の活性化を、可溶性αＣＤ３およびαＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ）を使用して行う。ＰＢＭＣを、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ  ＤＣ培地（１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）を補充）中、１×１０６  細胞／ｍｌで再懸濁し、０．２μｇ／ｍｌ  αＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ  αＣＤ２８可溶性抗体で刺激する。次いで、細胞を３７℃、５％  ＣＯ２で４日間培養する。４日目に、ＩＬ−２を含む新鮮培地１ｍｌを添加する。７日目に、細胞を採取し、形質導入のためにＣｅｌｌｇｅｎｉｘ  ＤＣ培地中で再懸濁する。
【０３２５】
（参考文献リスト）
【化１】
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【０３２６】
（実施例２：同種異系ＨＬＡレパートリーからの高親和性Ｂｏｂ１特異的ＴＣＲの単離）
非多型的腫瘍関連抗原または組織特異的自己抗原に対して特異的な高アビディティーＴ細胞の単離は、自己寛容性が原因で困難である。自己ＨＬＡによって呈示される自己抗原に対して高アビディティーを示すＴ細胞は、自己免疫を防止するために胸腺発生の間の負の選択によって排除される。寛容性誘導は、自己ＨＬＡによる所定の自己ポリペプチドの呈示を要するので、任意のポリペプチドは、外来ＨＬＡ分子の状況において呈示される場合には、潜在的免疫原である。一般的ＨＬＡ分子および細胞タイプ拘束または腫瘍特異的発現を有するタンパク質に由来するポリペプチドの複合体は、従って、多くの個体によって共有される有用な治療標的であり得る。本実施例は、同種異系ＨＬＡレパートリーからの抗原特異的Ｔ細胞の単離を可能にするストラテジーを提供する。
【０３２７】
Ｂｏｂ１遺伝子座（ＰＯＵ２ＡＦ１）は、成長および生存の利益を提供する、多発性骨髄腫における増幅の標的である。悪性の増殖に必須の遺伝子の標的化は、エスケープバリアント（ｅｓｃａｐｅ  ｖａｒｉａｎｔ）の発生を防止し得る。Ｂ細胞特異的抗原を標的化する治療上関連性のある高親和性ＴＣＲを同定するために、以下の実施例においてプロトコルを開発する。Ｂｏｂ１−ＴＣＲの使用は、多発性骨髄腫、ならびに他の悪性Ｂ細胞悪性腫瘍を標的化する免疫療法の適用を広げ得る。
【０３２８】
４種の異なるＨＬＡタイプのＥＢＶ−ＬＣＬに由来するＨＬＡポリペプチド溶離データベースに存在する１５，０００の溶離したポリペプチドのセットを、近年確立されたマイクロアレイ発現分析システムとマッチさせて、細胞外および細胞内両方のタンパク質に由来する一連の真性のＢ細胞特異的エピトープを生成し、上位１８個の高親和性ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＢ＊０７：０２結合候補をさらなる評価のために選択した。図３において、１つの代表的細胞外タンパク質（ＣＤ１９）および１つの細胞内タンパク質（Ｂｏｂ１）のマイクロアレイ分析を示す。高度に精製された造血悪性および非悪性細胞サブセット、ならびに健常非造血細胞のマイクロアレイ分析。図３（左）  転写因子Ｂｏｂ１をコードするＰＯＵ２ＡＦ１遺伝子のＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨＴ−１２発現アレイ。図３（右）  ＣＤ１９のＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨＴ−１２発現アレイ。
【０３２９】
Ｂ細胞特異的エピトープのセットは、Ｂｏｂ１に由来する４個のエピトープ、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２に結合する３個のエピトープ、およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１に結合する１個のエピトープを含んだ（表１）。
【表１−１】
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【表１−２】
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【０３３０】
ポリペプチドのセットを、ＵＶ媒介性交換技術（ＵＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によってＨＬＡ−テトラマーの生成のために最初に使用した。６名の異なるＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＢ＊０７：０２陰性健常ドナーに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（０．５〜１×１０９  細胞）を、ＨＬＡ−テトラマーの混合物とともにインキュベートし、磁性活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によって、ＨＬＡ−テトラマー陽性Ｔ細胞を単離した。その後、１ウェルあたり単一の細胞を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によりＨＬＡ−テトラマー陽性Ｔ細胞をソーティングすることによって、数千ものＴ細胞クローンを生成した。
【０３３１】
ハイスループット法によって、およそ５０００の拡大しているＴ細胞クローンを、Ａ２結合ポリペプチド混合物を負荷しないかまたは負荷したＫ５６２−Ａ２で、およびＢ７結合ポリペプチド混合物を負荷しないかまたは負荷したＫ５６２−Ｂ７で全てのＴ細胞クローンを刺激することによって、Ｂ細胞特異的ポリペプチド反応性に関して分析した。ポリペプチドを負荷したＫ５６２−Ａ２またはポリペプチドを負荷したＫ５６２−Ｂ７いずれかに対して反応性でありかつ負荷しないＫ５６２−Ａ２／Ｂ７に対して反応性でない、ポリペプチド特異的反応性パターンを示した全てのＴ細胞クローンを、選択して凍結した（図４Ａ）。５０００個の拡大しているＴ細胞クローンのうち、およそ３５０個のクローンは、ポリペプチド特異的認識パターンを示し、これら選択したＨＬＡ−テトラマー陽性Ｔ細胞クローンのＴＣＲレパートリーにおいて高い多様性を示した。他の４６５０個のＴ細胞クローンは、非反応性であるか、またはＫ５６２−Ａ２もしくはＫ５６２−Ｂ７いずれかのポリペプチド非依存性認識を示すかのいずれかであった（図４Ｂ）。３５０個の同種異系ＨＬＡ拘束Ｔ細胞クローンのプール内では、ポリペプチド特異的Ｔ細胞クローンを、ほぼ全てのＢ系統特異的ポリペプチドに対して同定した。１つの特異的ポリペプチドに対する異なるＴ細胞クローンの数は、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２結合ポリペプチドのうちの１個に対して特異的な２個のＴ細胞クローンから、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合ポリペプチドに対して特異的な２１７個のＴ細胞クローンまでの範囲に及んだ。
【０３３２】
Ｔ細胞クローンのプール内で、細胞内で発現される転写因子Ｂｏｂ１（これは、遺伝子ＰＯＵ２ＡＦ１によってコードされる）に由来する２個の異なるエピトープに対して指向される高アビディティーＴ細胞クローンを同定した。４名の異なる健常個体に由来し、多様なＴＣＲαβレパートリーを有するＴ細胞クローンを、Ｂｏｂ１ポリペプチドの滴定した濃度を負荷したＫ５６２−Ａ２に対して試験した。Ｂｏｂ１のＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープＹＡＬＮＨＴＬＳＶに対して指向される変動性のアビディティーを有するＴ細胞クローンを、同定した（図５Ａ）。全７個のＢｏｂ１テトラマー陽性Ｔ細胞クローンを、Ｂｏｂ１ポリペプチドを負荷しないかまたは負荷したＫ５６２−Ａ２、Ｋ５６２−Ｂ７、および３個のＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性ＥＢＶ−ＬＣＬ（ＪＹ−ＥＢＶ、ＨＨＣ−ＥＢＶ、およびＡＬＹ−ＥＢＶ）に対して試験した。高アビディティークローン３Ｃ１０および７Ｄ１は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の状況においてＢｏｂ１を内因的に呈示するＥＢＶ−ＬＣＬに対して特異的反応性を発揮した。クローン３Ｃ１０は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の状況においてＢｏｂ１ポリペプチドを内因的にプロセシングしかつ呈示した３個のＥＢＶ−ＬＣＬに対して最高の反応性を発揮した（図５Ｂ）。このＴ細胞クローンを、異なる原発性ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性Ｂ細胞悪性腫瘍（急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）ならびに多発性骨髄腫（ＭＭ）を含む）に対して試験した。図６は、クローン３Ｃ１０によるＢ細胞悪性腫瘍の認識を示す。ＨＬＡ−Ａ２拘束Ｂｏｂ１特異的Ｔ細胞クローン３Ｃ１０を、異なる原発性ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、および多発性骨髄腫（ＭＭ）、ならびに陽性コントロールとしてＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性ＥＢＶ−ＬＣＬ、ならびに陰性コントロールとしてＢｏｂ１に関して陰性のＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性Ｋ５６２に対して試験した。刺激の１８時間後に、ＩＦＮ−γの生成を測定した。Ｂ細胞悪性腫瘍をそれらの悪性表現型に基づいてＦＡＣＳソーティングし、高度精製集団（＞９９％）を刺激アッセイにおいて使用した。これら結果は、これらＴ細胞クローンのアビディティーが、これら原発性悪性細胞に対して反応性を示すために非常に十分高かったことを示す。
【０３３３】
次に、３個の異なるＴ細胞クローンを、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２において呈示されるＢｏｂ１ポリペプチドＡＰＡＰＴＡＶＶＬに対して特異的であるＴＣＲ  Ｖβの差異に基づいて単離した。図７は、Ｂｏｂ１反応性クローンが種々の原発性Ｂ細胞悪性腫瘍を、厳密なＢ細胞特異的認識パターンとともに効率的に認識するかどうかを評価する。Ａ）高アビディティーＢｏｂ１特異的Ｔ細胞クローン（４Ｇ１１）を、原発性ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２陽性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、および多発性骨髄腫、ならびに陽性コントロールとしてＥＢＶ−ＬＣＬに対して試験し、刺激の１８時間後に、ＩＦＮ−γの生成を測定した。Ｂ細胞悪性腫瘍を、それらの悪性表現型に基づいてＦＡＣＳでソーティングし（ＦＡＣｓｏｒｔｅｄ）、高度精製集団（＞９９％）を、刺激アッセイにおいて使用した。Ｂ）この４Ｇ１１クローンを、精製ＣＤ３＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１９＋、およびＣＤ３４＋細胞サブセット、ならびに２名の異なるＨＬＡ−Ａ＊０２陽性健常個体に由来する未成熟および成熟ＤＣへと分化される活性化ＣＤ３＋細胞およびＣＤ１４＋細胞に対して試験した。線維芽細胞を、ＩＦＮ−γ処置ありまたはなしで分析した。Ｃ）定量的ＲＴ−ＰＣＲを、Ｂに示されるものと同じ細胞集団に対して行った。これら細胞サブセットは全て、最小限の３名の異なる健常個体に由来する。これら３個のＴ細胞クローンのうち、クローン４Ｇ１１は、ポリペプチド滴定およびＨＬＡ−Ｂ＊０７０２陽性ＥＢＶ−ＬＣＬの認識によって示される、高アビディティーのＢｏｂ１特異的反応性プロフィールを示した。さらに、クローン４Ｇ１１は、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２陽性原発性ＣＬＬ、ＡＬＬ、ＭＣＬならびにＭＭに対して高い反応性を発揮した（図７Ａ）。全ての異なる悪性細胞集団を、それらの悪性表現型に基づいてソートして、Ｂ細胞による汚染がＴ細胞始動の原因となることを排除した。Ｂｏｂ１特異的Ｔ細胞クローンの安全プロフィールを調査するために、クローン４Ｇ１１を、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２陽性の健常造血および非造血細胞サブセットに対して試験した。図７Ｂに示されるように、クローン４Ｇ１１は、健常非Ｂ細胞系統（活性化および非活性化Ｔ細胞、単球、ＤＣならびにＣＤ３４＋造血幹細胞を含む）に対して反応性ではない。線維芽細胞に対する反応性は、炎症刺激条件下では、さらに存在しなかった（図７Ｂ）。クローン４Ｇ１１の認識パターンは、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定されるＢｏｂ１遺伝子発現に厳密に従った（図７Ｃ）。
【０３３４】
他のＨＬＡ対立遺伝子に結合するＢｏｂ１エピトープを、さらなる溶離実験を行うことによって同定する。それらエピトープを、質量分析パターンとそれぞれの合成ポリペプチドとを比較することによって確認する（表２）。
【表２】
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【０３３５】
（実施例３：Ｂｏｂ１  ＴＣＲのクローニング）
３Ｃ１０および４Ｇ１１クローンによって発現されるＴ細胞レセプターを配列決定した。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の状況において呈示されるＢｏｂ１ポリペプチドに対して特異的な最高のアビディティーのＴ細胞クローン３Ｃ１０に由来するＴＣＲの配列を、図８に示す。ＡＶ１３−１＊０１は、完全なＴＣＲαポリペプチドを表す。ＢＶ１２−４＊０１は、完全なＴＣＲβポリペプチドを表す。高アビディティーのＢｏｂ１特異的ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２拘束Ｔ細胞クローンに由来するＴＣＲの配列を、図９に示す。ＴＲＡＶ１３−１＊０１は、完全なＴＣＲαポリペプチドを表す。ＴＲＢＶ４−１＊−１は、完全なＴＣＲβポリペプチドを表す。
【０３３６】
Ｔ細胞クローニング実験は、ＨＬＡ−Ｂ７拘束Ｔ細胞クローン４Ｇ１１が原発性Ｂ細胞悪性腫瘍に対して最も強い反応性を発揮することを示したので、４Ｇ１１のＢｏｂ１特異的ＨＬＡ−Ｂ７拘束ＴＣＲをコードするレトロウイルスベクターを構築し、これを使用して、末梢血Ｔ細胞を形質導入した。図１０において、コドン最適化システイン改変Ｂｏｂ１特異的ＴＣＲの遺伝子移入は、形質導入されたＣＤ８＋  Ｔ細胞の特異的Ｂｏｂ１テトラマー染色（図１０Ａ）を示し、加えて、形質導入されたＴ細胞は、Ｂｏｂ１ポリペプチド特異的認識パターンを発揮する（図１０Ｂ）。図１０。末梢血に由来する上記Ｂｏｂ１−ＴＣＲ形質導入されたＣＤ８＋  Ｔ細胞は、Ｂｏｂ１特異的認識パターンを有する。Ａ）末梢Ｔ細胞を、短縮型ＮＧＦＲと組み合わせてＢｏｂ１−ＴＣＲをコードするレトロウイルス上清またはコントロールとして短縮型ＮＧＦＲのみをコードするレトロウイルス上清（モック）で形質導入した、８日間後、このＴ細胞を、抗ＮＧＦＲ、抗ＣＤ８およびＢｏｂ１−テトラマーまたはｐｐ６５コントロールテトラマーのいずれかで染色した。上記ＣＤ８＋  Ｔ細胞をゲート制御し、ドットプロットで示す。Ｂ）形質導入されたＴ細胞を、ＨＬＡ−Ｂ７で形質導入されたＫ５６２（Ｋ５６２−Ｂ７）およびＢｏｂ１ポリペプチド負荷Ｋ５６２−Ｂ７に対して試験した。さらに、この形質導入されたＴ細胞を、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２陽性ＥＢＶ−ＬＣＬ（ＪＹ−ＥＢＶ、ＨＨＣ−ＥＢＶ、およびＡＬＹ−ＥＢＶ）に対して試験し、これらから、その異なるＢｏｂ１ポリペプチドを溶離した。図１１ａおよび１１ｂは、レトロウイルス（ＭＰ７１）マルチクローニング部位ベクターの一例の配列（配列番号４９）を提供する。このＢｏｂ１  ＴＣＲコードＤＮＡは、およそヌクレオチド１１０６から１１３０までに挿入され得る。
【０３３７】
（実施例４：Ｂｏｂ１配列の例）
Ｂｏｂ１  ＴＣＲクローンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列が、本明細書で提供される
【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【０３３８】
（実施例５：ＴＣＲ遺伝子移入は、Ｂｏｂ１反応性をレシピエントＴ細胞に組み込み、原発性悪性腫瘍の効率的溶解を誘導する）
クローン４Ｇ１１のＴＣＲ（ＴＣＲ−４Ｇ１１）を、遺伝子移入によってＢｏｂ１反応性をレシピエント細胞に組み込む能力について試験した。ＴＣＲ−４Ｇ１１を配列決定し、コドン最適化し、ジスルフィド結合で改変して、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖の優先的対合を増大させ、マーカー遺伝子としてＮＧＦ−Ｒを発現するＭＰ７１ベクターへとクローニングした。ＮＧＦ−Ｒの発現を、ＮＧＦ−Ｒ発現細胞のＭＡＣＳガイドによる単離によって、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を高純度へと富化するために使用した。ＨＬＡ−Ｂ７ｐｏｓ  健常個体に由来するレトロウイルスで形質導入されたＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ｐＭＨＣ−テトラマーＢｏｂ１４４：Ｂ７を結合するそれらの能力によって示される、細胞表面上にＴＣＲ−４Ｇ１１を発現した（図１２ａ）。ｐＭＨＣ−テトラマーでのより強力な染色は、より高いＮＧＦ−Ｒ発現と相関した。これは、導入されたＴＣＲのより高い量を発現する細胞がｐＭＨＣ−テトラマーをより効率的に結合することを示唆していた。テトラマー結合は、モック形質導入されたＴ細胞に関しては観察されなかった。ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＮＧＦ−Ｒの発現によって示されるように形質導入できたが、Ｂｏｂ１４４：Ｂ７テトラマーへの結合は観察されなかった（図１２ａ）。ＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、Ｂｏｂ１発現ＨＬＡ−Ｂ７ｐｏｓ  刺激細胞（例えば、多発性骨髄腫細胞株ＵＭ９およびＵ２６６、Ｂ−ＬＣＬ−ＪＹ、ならびに２種のＡＬＬ細胞株ＡＬＬ−ＢＶおよびＡＬＬ−ＶＧ）を容易に認識した。これは、Ｔ細胞クローン４Ｇ１１の反応性プロフィールを再現する（図１２ｂ）。対照的に、ＴＣＲ形質導入ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、これら細胞株のうちのいずれも認識しなかった。モック形質導入ＣＤ８＋  Ｔ細胞に関する認識は観察されなかった。これは、認識がＴＣＲ−４Ｇ１１の導入に起因することを示した。
【０３３９】
図１２。ＴＣＲ−４Ｇ１１の移入は、レシピエントＣＤ８＋  Ｔ細胞に対するＢｏｂ１反応性を組み込む。ＣＤ４＋  およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ｂ７ｐｏｓ健常個体から単離し、レトロウイルス上清で形質導入して、ＴＣＲ−４Ｇ１１をＮＧＦ−Ｒと一緒に発現させた。ＮＧＦ−Ｒマーカー遺伝子のみを含む空のベクターでの形質導入（モック）を、コントロールとして供した。図１２Ａに関して、マーカー遺伝子ＮＧＦ−Ｒの発現およびＭＡＣＳ単離を介する負荷後の、形質導入されたＴ細胞のＦＡＣＳプロット。単離されたＣＤ８＋（上の行）またはＣＤ４＋（下の行）のＴ細胞を、ｐＭＨＣ−テトラマーＢｏｂ１４４：Ｂ７およびＮＧＦ−Ｒに対する抗体で染色した。象限の中の数字は、細胞のパーセンテージを示す。ＦＡＣＳプロットは、二項指数関数軸とともに示される。図１２Ｂに関して、Ｔ細胞クローン４Ｇ１１または精製された形質導入ＣＤ８＋  またはＣＤ４＋  Ｔ細胞を、種々のＨＬＡ−Ｂ７ｐｏｓ  細胞株と共に共インキュベートした。細胞株は、Ｂｏｂ１を発現するために形質導入されたＫ５６２−Ｂ７（Ｋ５６２−Ｂ７  ＋  Ｂｏｂ１）、２種の多発性骨髄腫細胞株ＵＭ９およびＵ２６６、Ｂ−ＬＣＬ−ＪＹ、ならびに２種のＡＬＬ細胞株ＡＬＬ−ＢＶおよびＡＬＬ−ＶＧを含んだ。ＩＦＮ−γ濃度を、共培養の１８時間後に評価した。
【０３４０】
さらに、ＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、原発性ＨＬＡ−Ｂ７ｐｏｓ  悪性細胞サンプルを効率的に溶解した（図１３ａ）。完全またはほぼ完全な溶解は、等しいエフェクター  対  標的比において、標的細胞がエフェクター細胞の３倍を超えた場合ですら、原発性ＡＬＬおよびＭＣＬサンプル、ならびに多発性骨髄腫細胞株に関して観察された。ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞による効率的溶解はまた、試験した原発性ＣＬＬサンプルならびに２種のＡＬＬ細胞株のうちの２種の両方について観察できた。さらに、両方の精製ＨＬＡ−Ｂ７陽性原発性多発性骨髄腫サンプルは、低いエフェクター  対  標的比でもＴＣＲ形質導入Ｔ細胞によって容易に溶解された。モック形質導入Ｔ細胞については、全ての場合で溶解は観察されなかった。これは、溶解がＴＣＲ−４Ｇ１１の導入に起因することを示した。健常Ｂ細胞におけるＢｏｂ１発現はまた、自家ＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋  Ｔ細胞によるそれらの溶解をもたらした（図１３ｂ）。Ｂｏｂ１陰性Ｋ５６２−Ｂ７細胞株は溶解されなかった（図１３ａ）ので、溶解は特異的であった。さらに、ＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、自家活性化Ｔ細胞またはＣＤ１４＋  単球を溶解しなかった。これは、安全な反応性プロフィールを示す（図１３ｂ）。
【０３４１】
図１３。ＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、原発性Ｂ細胞悪性腫瘍および多発性骨髄腫を効率的に溶解する。図１３Ａおよび１３Ｂに関して、Ｔ細胞クローン４Ｇ１１または精製されたＴＣＲ形質導入もしくはモック形質導入ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ｂ７ｐｏｓ  標的細胞に対するそれらの溶解能力について試験した。ＰＫＨ標識標的細胞を、種々のエフェクター：標的比で、エフェクターＴ細胞とともに共培養した。共培養の１８時間後、生きている標的細胞の数を、フローサイトメトリーによって評価し、％生存を計算した。図１３Ａ：悪性細胞サンプルは、多発性骨髄腫細胞株ＵＭ９、原発性多発性骨髄腫（ＭＭ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ芽球性（ＡＬＬ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含んだ。コントロールは、Ｂｏｂ１陰性細胞株Ｋ５６２−Ｂ７を含んだ。図１３Ｂ：健常造血細胞は、形質導入されたＴ細胞と同じ起源であり（自家の状況）、ＰＨＡ活性化Ｔ細胞、ＣＤ１４＋  単球、ＣＤ１９＋  初代Ｂ細胞およびＣＤ４０Ｌ活性化Ｂ細胞を含んだ。
【０３４２】
ＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＡＬＬ、ＣＬＬ、ＭＣＬ、多発性骨髄腫細胞株および自家活性化Ｂ細胞を含む種々のＨＬＡ−Ｂ７ｐｏｓ  Ｂｏｂ１発現一次サンプルで刺激すると増殖した（図１４ａ、ｂ）。対照的に、抗原陰性細胞株Ｋ５６２−Ｂ７または自家活性化Ｔ細胞での刺激は、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の増殖をもたらさなかった。
【０３４３】
図１４。ＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、抗原に遭遇すると増殖する。図１４Ａおよび１４Ｂに関して、ＰＫＨ標識形質導入ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、照射したＨＬＡ−Ｂ７ｐｏｓ  刺激細胞と共培養した。ヒストグラムは、５日間の共培養後のＴＣＲ形質導入（実線）またはモック形質導入（灰色領域）のＣＤ８＋  Ｔ細胞を示す。図１４Ａ：  刺激細胞は、細胞株ＵＭ９および原発性ＡＬＬ、ＣＬＬおよびＭＣＬを含んだ。陰性コントロールは、刺激細胞の非存在下での培養（スティミュレーターなし）またはＢｏｂ１陰性Ｋ５６２−Ｂ７細胞との共培養を含んだ。陽性コントロールは、ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ細胞アクチベータービーズ（ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ）の存在下での刺激を含んだ。図１４Ｂ：自家ＣＤ４０Ｌ刺激Ｂ細胞またはＰＨＡ活性化Ｔ細胞を、刺激細胞として使用した。
【０３４４】
マウスモデルは、インビボでＢｏｂ１−ＴＣＲを発現する改変されたＴ細胞をさらにアッセイするために使用され得る。ルシフェラーゼ陽性ＭＭ細胞株ＵＭ９細胞がマウスの関節へと注射され得るヒト化多発性骨髄腫（ＭＭ）マウスモデルにおいて、Ｂｏｂ１−ＴＣＲ改変されたＴ細胞の効力をモニターし得る。また、ヒト間葉系ストロマ細胞（ＭＳＣ）をコーティングした３個の２〜３ｍｍの二相性リン酸カルシウム粒子（biphasic  calcium  phosphate  particle）からなるハイブリッド足場を移植し、Ｌｕｃ＋  ＭＭ細胞株ＵＭ９またはＵ２６６を負荷したＲＡＧ２−／−γＣ−／−マウスは、Ｔ細胞の効力をモニターするために使用され得る（Ｇｒｏｅｎ  ＲＷら，  Ｂｌｏｏｄ  ２０１２；１２０：ｅ９−ｅ１６）。
【０３４５】
まとめると、ＴＣＲ−４Ｇ１１のＴＣＲ遺伝子移入は、Ｂｏｂ１反応性をレシピエントＣＤ８＋  Ｔ細胞に組み込んだ。ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞は、非Ｂ細胞を残しながら低いエフェクター−対−標的比で原発性ＡＬＬ、ＣＬＬ、ＭＣＬおよび多発性骨髄腫を効率的に溶解した。さらに、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞は、抗原に遭遇すると容易に増殖した。
【０３４６】
（実施例６：自殺遺伝子の付加−−改変された細胞の選択的アポトーシス）
Ｂｏｂ１標的化ＴＣＲを発現する改変された細胞は、患者が負の効果を経験する場合または処置を減少させるかもしくは中止する必要性がある場合に、細胞のうちのいくらかまたは全てを除去する機構と共に提供され得る。いくつかの例において、上記自殺遺伝子機構は、治療を迅速に終了する選択肢が必要である場合に、標的に対するが臓器以外にも示す毒性（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ，  ｏｆｆ−ｏｒｇａｎ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）のレベルを低減するために提供される。
【０３４７】
改変された細胞において発現され得るキメラポリペプチドの例は、本実施例において提供される。いくつかの例において、上記改変された細胞は、キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびＢｏｂ１  ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む。他の例では、上記核酸は、キメラカスパーゼ−９ポリペプチドおよびＢｏｂ１  ＴＣＲの両方をコードするポリヌクレオチドを含む；誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドは、ペプチド結合のスキッピングに起因して、翻訳中にＢｏｂ１  ＴＣＲポリペプチドから分断される（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，  ＭＬ  ２００１，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８２：１０１３−２５を参照のこと）。キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞の選択的アポトーシスを誘導するための方法は、米国特許第９，０８９，５２０号（標題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」、２０１５年７月２８日発行）において論じられる；Ｔ細胞におけるキメラカスパーゼ−９ポリペプチドおよび別のポリペプチドの共発現のための方法は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１５８２９（ＷＯ２０１５／１２３５２７として２０１５年８月２０日に公開、標題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｐｏｌｙｐｅｐｕｔｉｄｅ」）において論じる。これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される。Ｂｏｂ１  ＴＣＲ構築物において使用され得るさらなるキメラカスパーゼ−９ポリペプチドとしてはまた、例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２２００４（ＷＯ２０１４／１６４３４８として２０１５年３月５日に公開、標題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃａｓｐａｓｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」）において、および国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１９１８６（ＷＯ２０１５／１３４８７７として２０１５年９月１１日に公開、標題「Ｃａｓｐａｓｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」において論じられるものが挙げられる。これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される。本明細書で提供される例は、被験体へのキメラカスパーゼ−９ポリペプチドを発現する改変されたＴ細胞の投与、およびＣＩＤ（ＡＰ１９０３（リミズシド（rimiducid））もしくはＡＰ２０１８７）の投与による被験体における移植片対宿主病の発生後の改変されたＴ細胞の同種枯渇（allodepletion）を論じる。この方法は、本明細書で論じられるＢｏｂ１  ＴＣＲ改変された細胞における使用のために適合され得る。
【０３４８】
（ベクター構築および発現の確認）
ヒトＴ細胞において安定してかつ効率的に発現され得る安全スイッチは、本明細書で示される。ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６などの）に融合された改変されたヒトカスパーゼ−９活性を含む、治療剤としての使用に適した発現ベクターを、構築した。このカスパーゼ−９／ＦＫ５０６ハイブリッド活性は、小分子医薬を使用して二量体化され得る。カスパーゼ−９活性の全長、短縮型および改変バージョンを、リガンド結合ドメインまたは多量体化領域に融合し、蛍光マーカーＧＦＰの発現をも可能にするレトロウイルスベクターＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＲＰへと挿入した。
【０３４９】
全長の誘導性カスパーゼ−９分子（Ｆ’−Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９）は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーで、カスパーゼ分子の小サブユニットおよび大サブユニットに連結された、２個、３個、またはこれより多くのＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ−例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６バリアント）を含む。全長の誘導性カスパーゼ−９（Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９．Ｉ．ＧＦＰ）は、全長カスパーゼ−９を有し、Ｆ３６Ｖ変異を含む２個の１２ｋＤａ  ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＨ００２  ８１８）に連結されたカスパーゼ補充ドメイン（caspase  recruitment  domain）（ＣＡＲＤ；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００１  ２２９）をも含む。上記ＦＫＢＰ（Ｆ’）のうちの１個もしくはこれより多くのアミノ酸配列は、レトロウイルスにおいて発現される場合に相同組換えを防止するために、コドン揺らぎがあった（例えば、各アミノ酸コドンの３番目のヌクレオチドが、本来コードされるアミノ酸を維持するサイレント変異によって変化されていた）。Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９Ｃ３Ｓは、その活性化部位を破壊する２８７位でのシステインからセリンへの変異を含む。構築物Ｆ’Ｆ−Ｃａｓｐ９、Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９、およびＦ’−Ｃａｓｐ９において、カスパーゼ活性化ドメイン（ＣＡＲＤ）、１個のＦＫＢＰ、または両方のいずれかを、それぞれ、欠失さた。全ての構築物を、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントとしてＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰへとクローニングした。
【０３５０】
トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞での予測されるサイズの誘導性カスパーゼ−９構築物とマーカー遺伝子ＧＦＰとの共発現は、全長および短縮型のカスパーゼ分子の両方に存在するアミノ酸残基２９９〜３１８に特異的なカスパーゼ−９抗体、ならびにＧＦＰ特異的抗体を使用するウェスタンブロットによって示された。
【０３５１】
最初のスクリーニングは、形質導入された細胞が導入遺伝子の基底活性によって排除されることに恐らく起因して、全長ｉＣａｓｐ９がＴ細胞において高レベルで安定して維持できないことを示した。上記ＣＡＲＤドメインは、アポトーシス性プロテアーゼ活性化因子１（Ａｐａｆ−１）とのシトクロムＣおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）駆動性相互作用によって、カスパーゼ−９分子の生理学的二量体化に関与する。ＣＩＤを使用して、自殺スイッチの二量体化および活性化を誘導することから、ＣＡＲＤドメインの機能は、この状況では不要であり、ＣＡＲＤドメインの除去を、基底活性を減少させるための方法として調査した。
【０３５２】
（ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子を使用して、半合致（haploidentical）幹細胞移植後に同種枯渇されたＴ細胞の安全性を改善する）
半合致幹細胞移植後に同種枯渇されたＴ細胞の安全性を改善するための発現構築物および発現構築物を使用するための方法が、本実施例において示される。類似の方法が、同種枯渇されていない細胞においてカスパーゼ−９発現構築物を発現させるために使用され得る。これら方法はまた、Ｂｏｂ１  ＴＣＲ発現細胞においてキメラカスパーゼ−９ポリペプチドを発現するために使用され得る。ｉＣａｓｐ９および選択マーカー（短縮型ＣＤ１９）をコードするレトロウイルスベクターを、ドナーＴ細胞のための安全スイッチとして作製した。（抗ＣＤ２５免疫毒素を使用する）同種枯渇後ですら、ドナーＴ細胞は、効率的に形質導入、拡大、およびその後、ＣＤ１９免疫磁性選択によって＞９０％純度へと富化できた。その操作された細胞は、抗ウイルス特異性および機能性を保持し、制御性の表現型および機能を有するサブセットを含んだ。小分子二量体化剤でのｉＣａｓｐ９の活性化は、＞９０％のアポトーシスを迅速に生じた。導入遺伝子発現は静止期Ｔ細胞においてダウンレギュレートされたが、ｉＣａｓｐ９は、発現が活性化（同種反応性）Ｔ細胞において迅速にアップレギュレートされたので、効率的自殺遺伝子を保持した。
【０３５３】
（材料および方法）
（同種枯渇されたＴ細胞の生成）
同種枯渇された細胞を、以前に示されたように健常志願者から生成した。簡潔には、健常ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、無血清培地（ＡＩＭ  Ｖ；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）中で４０：１のレスポンダー  対  スティミュレーター比において、照射レシピエントエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）とともに共培養した。７２時間後、ＣＤ２５を発現する活性化Ｔ細胞は、ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ免疫毒素中での一晩のインキュベーションによって共培養物から枯渇された。同種枯渇を、残っているＣＤ３＋ＣＤ２５＋集団が＜１％であり、３Ｈ−チミジン組み込みによる残りの増殖が＜１０％である場合に適切であるとみなした。
【０３５４】
（プラスミドおよびレトロウイルス）
ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９は、切断可能な２Ａ様配列を介して短縮型ヒトＣＤ１９へと連結された誘導性カスパーゼ−９（ｉＣａｓｐ９）からなる。ｉＣａｓｐ９は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーを介してヒトカスパーゼ−９（ＣＡＳＰ９；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１２２９）へと接続された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＨ００２  ８１８）からなる。このＦ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３へのＦＫＢＰ１２の結合親和性を増大させる。カスパーゼ補充ドメイン（ＣＡＲＤ）を、ヒトカスパーゼ−９配列から欠失させた。なぜならその生理学的機能は、ＦＫＢＰ１２によって置き換えられており、その除去は、導入遺伝子の発現および機能を増大させるからである。この２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸のペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残基との間での＞９９％の切断を媒介して、ｉＣａｓｐ９のＣ末端に１９個の追加のアミノ酸およびＣＤ１９のＮ末端に１つの追加のプロリン残基をもたらす。ＣＤ１９は、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）で短縮された全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７７０）からなり、これは、２４２から１９個のアミノ酸までの細胞質内ドメインを短縮し、リン酸化の潜在的部位である保存された全てのチロシン残基を除去する。
【０３５５】
テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ−Ｖ）偽型レトロウイルスを生成する安定なＰＧ１３クローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ製品＃ＳＤ３４４４；  ＡＴＣＣ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）をＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９で一過性にトランスフェクトすることによって作製した。これは、Ｅｃｏ偽型レトロウイルスを生成した。ＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、Ｅｃｏ偽型化もしくはレトロウイルスで３回形質導入して、１細胞あたり複数のＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９プロウイルス組み込み体を含むプロデューサー株を生成した。単一細胞クローニングを行い、最高力価を生じたＰＧ１３クローンを増やし、ベクター生成のために使用した。
【０３５６】
（レトロウイルス形質導入）
Ｔ細胞活性化および拡大のための培養培地は、４５％  ＲＰＭＩ  １６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ，  Ｌｏｇａｎ，  ＵＴ）、４５％  クリック（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，  ＣＡ）および１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；  Ｈｙｃｌｏｎｅ）からなった。同種枯渇された細胞を、レトロウイルスベクターでの形質導入前に、４８時間にわたって固定化抗ＣＤ３（ＯＫＴ３；  Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，  ＮＪ）によって活性化した。選択的同種枯渇を、ドナーＰＢＭＣとレシピエントＥＢＶ−ＬＣＬとを共培養することによって行って、同種反応性細胞を活性化した：活性化した細胞は、ＣＤ２５を発現し、その後、抗ＣＤ２５免疫毒素によって排除した。この同種枯渇された細胞を、ＯＫＴ３によって活性化し、レトロウイルスベクターで４８時間後に形質導入した。免疫磁性選択を、形質導入の４日目に行った；陽性画分を、さらに４日間増やし、凍結保存した。
【０３５７】
小規模実験では、組織培養用の処理が行われていない２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）を、ＯＫＴ３  １μｇ／ｍｌで２〜４時間、３７℃においてコーティングした。同種枯渇された細胞を、１×１０６  細胞／ウェルで添加した。２４時間で、１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；  Ｃｈｉｒｏｎ，  Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，  ＣＡ）を添加した。レトロウイルス形質導入を、活性化の４８時間後に行った。組織培養用の処理が行われていない２４ウェルプレートを、３．５μｇ／ｃｍ２  組換えフィブロネクチンフラグメント（ＣＨ−２９６；  Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ；  Ｔａｋａｒａ  Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）でコーティングし、そのウェルに、０．５ｍｌ／ウェルにおいてレトロウイルスベクター含有上清を、３０分間、３７℃において２回負荷した。その後、ＯＫＴ３活性化細胞を、３：１の比の新鮮なレトロウイルスベクター含有上清およびＴ細胞培養培地（１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を補充）中で、５×１０５  細胞／ウェルにおいてプレーティングした。細胞を２〜３日後に採取し、５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下で増やした。同様の方法（本明細書で論じられるとおり）は、Ｂｏｂ１  ＴＣＲおよびキメラカスパーゼ−９ポリペプチドのレンチウイルス発現のために使用され得る。
【０３５８】
（遺伝子改変同種枯渇細胞のスケールアップ生成）
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップは、組織培養用の処理が行われていないＴ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ，  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  ＮＹ）を使用し、これを、一晩４℃において、１０ｍｌのＯＫＴ３  １μｇ／ｍｌまたは１０ｍｌのフィブロネクチン  ７μｇ／ｍｌでコーティングした。増大した細胞接着のためのコロナ放電処理したフッ化エチレンプロピレンバッグ（２ＰＦ−００７２ＡＣ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）も使用した。同種枯渇された細胞を、１×１０６  細胞／ｍｌでＯＫＴ３コーティングフラスコの中に播種した。１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を翌日添加した。レトロウイルス形質導入のために、レトロネクチンコーティングフラスコまたはバッグに、１０ｍｌのレトロウイルス含有上清を２〜３時間にわたって１回負荷した。ＯＫＴ３活性化Ｔ細胞を、３：１の比の新鮮なレトロウイルスベクター含有培地およびＴ細胞培養培地（１００  Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を補充）中、１×１０６  細胞／ｍｌで播種した。翌朝に細胞を採取し、約５０〜１００Ｕ／ｍｌの間のＩＬ−２で補充した培養培地中、約５×１０５  細胞／ｍｌ〜８×１０５  細胞／ｍｌの間の播種密度で組織培養用に処理したＴ７５またはＴ１７５フラスコの中で増やした。
【０３５９】
（ＣＤ１９免疫磁性選択）
ＣＤ１９をマーカーとして使用した；他の適切なマーカーは、免疫磁性選択のために使用され得る。ＣＤ１９に関する免疫磁性選択を、形質導入の４日後に行った。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体に結合体化した常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ）で標識し、小規模実験ではＭＳもしくはＬＳカラム上で、および大規模実験ではＣｌｉｎｉＭａｃｓ  Ｐｌｕｓ自動化選択デバイスで選択した。ＣＤ１９選択した細胞を、さらに４日間増やし、形質導入後の８日目に凍結保存した。これらの細胞を、「遺伝子改変同種枯渇細胞」とよんだ。
【０３６０】
（免疫表現型決定およびペンタマー分析）
フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア；  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、以下の抗体を使用して行った：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６およびＣＤ６２Ｌ。ＣＤ１９−ＰＥ（Ｃｌｏｎｅ  ４Ｇ７；  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）は、最適な染色を与えることが見出されたので、その後の全ての実験において使用した。非形質導入コントロールを使用して、ＣＤ１９に関する陰性ゲートを設定した。ＨＬＡ−ペンタマー、ＨＬＡ−Ｂ８−ＲＡＫＦＫＱＬＬ（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ，  Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，  ＶＡ）を使用して、ＥＢＶ溶解抗原（ＢＺＬＦ１）のエピトープを認識するＴ細胞を検出した。ＨＬＡ−Ａ２−ＮＬＶＰＭＶＡＴＶペンタマーを使用して、ＣＭＶ−ｐｐ６５抗原のエピトープを認識するＴ細胞を検出した。
【０３６１】
（二量体化の化学的誘導物質、ＡＰ２０１８７でのアポトーシスの誘導）
自殺遺伝子機能性を、小分子合成ホモ二量体化剤、ＡＰ２０１８７（Ａｒｉａｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）をＣＤ１９免疫磁性選択の翌日に１０ｎＭ  終濃度で添加することによって評価した。ＡＰ１９０３も使用され得る。細胞を、２４時間でアネキシンＶおよび７−アミノアクチノマイシン（７−ＡＡＤ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。アネキシンＶおよび７−ＡＡＤの両方に関して陰性の細胞を、生存しているとみなし、アネキシンＶ陽性の細胞をアポトーシスとみなし、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤの両方に陽性の細胞を壊死とみなした。二量体化によって誘導されるパーセンテージ殺滅を、以下のとおり、ベースラインの生存率に関して較正した：パーセンテージ殺滅＝１００％−（ＡＰ２０１８７処理細胞の％生存率÷非処理細胞の％生存率）。
【０３６２】
（長期培養および再活性化後の導入遺伝子発現の評価）
細胞を、形質導入の２２日後まで、５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を含むＴ細胞培地中で維持した。細胞の一部を、１μｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３および１μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ２８（Ｃｌｏｎｅ  ＣＤ２８．２，  ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）で４８〜７２時間コーティングした２４ウェルプレートにおいて再活性化した。再活性化細胞および非再活性化細胞の両方でのＣＤ１９発現および自殺遺伝子機能を、形質導入後の２４日目または２５日目に測定した。
【０３６３】
いくつかの実験では、細胞をまた、形質導入後３週間培養し、１：１レスポンダー：スティミュレーター比において、３０Ｇ照射同種異系ＰＢＭＣで刺激した。共培養の４日後、細胞の一部を、１０ｎＭ  ＡＰ２０１８７で処理した。殺滅を、２４時間でのアネキシンＶ／７−ＡＡＤ染色によって測定し、傍観者（bystander）ウイルス特異的Ｔ細胞に対する二量体化剤の効果を、ＡＰ２０１８７処理細胞および未処理細胞においてペンタマー分析によって評価した。
【０３６４】
自殺遺伝子改変Ｔ細胞の免疫学的応答能を維持するための最適な培養条件を、安全スイッチ、選択マーカーおよび細胞タイプの各組み合わせに関して決定して定義しなければならない。なぜなら表現型、レパートリーおよび機能性は、全て、ポリクローナルＴ細胞活性化のために使用される刺激、形質導入細胞の選択のための方法、および培養の継続時間によって影響を受け得るからである。
【０３６５】
（半合致幹細胞移植後の誘導性カスパーゼ−９自殺遺伝子で形質導入した同種枯渇Ｔ細胞のフェーズＩ臨床試験）
この例は、代替の自殺遺伝子ストラテジーを使用するフェーズ１臨床試験の結果を示す。簡潔には、ドナー末梢血単核細胞を、レシピエントの照射ＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞とともに（４０：１）７２時間共培養し、ＣＤ２５免疫毒素で同種枯渇させ、次いで、ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子および選択マーカー（ΔＣＤ１９）を有するレトロウイルス上清で形質導入した；ΔＣＤ１９は、免疫磁性選択を介して＞９０％純度への富化を可能にした。
【０３６６】
キメラカスパーゼ−９コード核酸を含むＴ細胞療法生成物の生成のためのプロトコルの一例は、本明細書で提供される。この例は、本明細書で論じられるとおり、Ｂｏｂ１ベクターの使用のために改変され得る。ある種の実施形態において、自家Ｔ細胞は、このアプローチのために使用され得る（または同種ＳＣＴ後のＴ細胞（ドナー起源であるが寛容化した）もしくはドナーＴ細胞）。この例は、同種枯渇された細胞の使用を論じるが、本明細書で論じられるとおり、同種枯渇されたドナーＴ細胞または同種枯渇されていないドナーＴ細胞のいずれかが使用されてもよい。Ｂｏｂ１ベクターを含む改変された細胞は、キメラカスパーゼ−９コード核酸、または他のポリペプチドコード核酸（例えば、本明細書で論じられるキメラ刺激ポリペプチド）をさらに含み得る。
【０３６７】
いくつかの組成物および方法において、上記Ｂｏｂ１特異的ＴＣＲは、Ｔ細胞においてキメラカスパーゼ−９ポリペプチドとともに発現され得るので、Ｂｏｂ１  ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む核酸、およびキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む改変されたＴ細胞が提供される。上記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび上記Ｂｏｂ１  ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドは、同じベクターにおいてシスで、または別個のベクターにおいてトランスで、のいずれかで細胞へとトランスフェクトまたは形質導入され得る。従って、上記２種のポリペプチドは、２種の核酸（例えば、２種のプラスミドまたは２種のウイルスなどの）を使用して発現され得、上記Ｔ細胞は、例えば、２回トランスフェクトされ得るか、または特定の実施形態では、上記２種の核酸は、共トランスフェクトされ得る。他の実施形態において、この２種のポリペプチドは、１つの核酸において（例えば、同じプラスミドまたはウイルスにおいてなど）発現され得る。この核酸は、２種の別個のプロモーター（一方は、ＴＣＲのため、および一方は、キメラカスパーゼ−９ポリペプチドのため）を使用して、２種のポリペプチドを発現し得る。あるいは、他の実施形態において、上記２種のポリペプチドは、同じプロモーターを使用して発現され得る。この実施形態において、上記２種のポリペプチドは、切断可能なポリペプチド（例えば、２Ａ配列などの）によって分断され得る。
【０３６８】
（原材料）
末梢血の２４０ｍｌまで（２回の収集にて）を、確立されたプロトコルに従って移植ドナーから得た。場合によっては、ドナーおよびレシピエントのサイズに依存して、白血球フェレーシス（leukopheresis）を行って、十分なＴ細胞を単離した。１０〜３０ｃｃの血液をまた、レシピエントから採血し、刺激細胞として使用されるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球細胞株を生成するために使用した。場合によっては、医療履歴および／または低いＢ細胞数の徴候に依存して、ＬＣＬを、適切な第１度近親者（例えば、親、きょうだい、もしくは子孫）の末梢血単核細胞を使用して生成した。
【０３６９】
（同種枯渇された細胞の生成）
同種枯渇された細胞を、本明細書で示されるように移植ドナーから生成した。健常ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、無血清培地（ＡＩＭ  Ｖ；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）中４０：１のレスポンダー対スティミュレーター比において、照射したレシピエントのエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）とともに共培養した。７２時間後、ＣＤ２５を発現する活性化Ｔ細胞を、ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ免疫毒素中での一晩のインキュベーションによって、共培養物から枯渇させた。同種枯渇を、その残りのＣＤ３＋ＣＤ２５＋集団が＜１％であり、３Ｈ−チミジン組み込みによる残りの増殖が＜１０％であった場合に、適切であるとみなす。
【０３７０】
これら例において論じられる方法については、患者から得られる自家Ｔ細胞もまた使用され得る。
【０３７１】
（レトロウイルス生成）
レトロウイルスプロデューサー株クローンを、ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９構築物のために生成した。このプロデューサーのマスター細胞バンクもまた、生成した。このマスター細胞バンクの試験を行って、複製能のあるレトロウイルスの生成およびマイコプラズマ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶなどによる感染を除外した。このプロデューサー株を、コンフルエントになるまで成長させ、上清を採取し、濾過し、アリコートに分け、急速凍結し、−８０℃で貯蔵した。さらなる試験を、レトロウイルス上清の全てのバッチに対して行って、プロトコルに従って、複製能のあるレトロウイルス（Replication  Competent  Retrovirus）（ＲＣＲ）を除外し、分析証明書を発行した。
【０３７２】
（同種枯渇された細胞の形質導入）
同種枯渇されたＴリンパ球を、フィブロネクチンを使用して形質導入した。プレートまたはバッグを、組換えフィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６（ＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎＴＭ，  Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ，  Ｏｔｓｕ，  Ｊａｐａｎ）でコーティングした。ウイルスを、コーティングしたプレートまたはバッグの中でプロデューサー上清をインキュベートすることによってレトロネクチンに付着させた。次いで、細胞を、ウイルスコーティングしたプレートまたはバッグに移した。形質導入後、プロトコルに従って、同種枯渇されたＴ細胞を、これらにＩＬ−２を１週間に２回供給して増やして、十分な細胞数に到達させた。
【０３７３】
（ＣＤ１９免疫磁性選択）
ＣＤ１９に関する免疫磁性選択を、形質導入の４日後に行った。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体に結合体化した常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ）で標識し、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ  Ｐｌｕｓ自動化選択デバイスで選択する。臨床での注入に必要とされる細胞数に依存して、細胞を、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ選択後に凍結保存するか、またはＩＬ−２でさらに増やして形質導入後の６日目または８日目に凍結保存するかのいずれかを行った。
【０３７４】
（凍結）
細胞のアリコートを、ＦＤＡによる最終リリース試験のために必要とされるとおりの形質導入効率、同一性、表現型および微生物学的培養を試験するために取り出した。この細胞を、プロトコルに従って投与する前に、凍結保存した。
【０３７５】
（研究薬物）
（ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ）
ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡは、ヘテロ−−二官能性架橋剤［Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−ｄ−（２−ピリジルチオ）トルエン］（ＳＭＰＴ）を介して化学的に脱グリコシル化したリシンＡ鎖（ｄｇＡ）に結合体化されたマウスＩｇＧ１  抗ＣＤ２５（ＩＬ−２レセプターα鎖）である。ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡを、０．５ｍｇ／ｍｌで滅菌溶液として製剤化する。
【０３７６】
（合成ホモ二量体化剤ＡＰ１９０３）
作用機構：ＡＰ１９０３誘導可能細胞死は、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）由来の薬物結合ドメインに融合されたヒト（カスパーゼ−９プロテイン）レセプター（これは、アポトーシス細胞死をシグナル伝達する）の細胞内部分を含むキメラタンパク質を発現させることによって達成される。このキメラタンパク質は、ＦＫＢＰドメインを架橋し、カスパーゼシグナル伝達およびアポトーシスを開始するＡＰ１９０３の投与まで細胞内で静止したままである。
【０３７７】
毒物学：ＡＰ１９０３は、ＦＤＡによって治験薬（ＩＮＤ）として評価されており、フェーズＩ臨床安全性研究を成功裡に終えた。ＡＰ１９０３を０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ  用量範囲にわたって投与した場合に、重大な有害作用は注記されなかった。
【０３７８】
薬理学／薬物動態：患者に、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を、２時間注入として（０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ用量範囲にわたって１０ｎｇ／ｍＬの血漿濃度を示し、投与後０．５時間および２時間において最大の１８％および７％へと低下する血漿レベルを伴う公開されたＰＫデータに基づいて）与えた（例えば、Ｉｕｌｉｕｃｃｉ，  Ｊ．Ｄ．ら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００１，  ４１：  ８７０−９を参照のこと）。
【０３７９】
ヒトにおける副作用プロファイル：志願者でのフェーズ１研究の間には、重篤な有害事象は起こらなかった。有害事象の発生率は、各処置後に非常に低く、全ての有害事象は、重症度が軽度であった。唯一の有害事象は、おそらくＡＰ１９０３に関連していると考えられた。これは、１．０ｍｇ／ｋｇ  ＡＰ１９０３投与量で１名の志願者について「顔面紅潮」として示された血管拡張というエピソードであった。この事象は、注入の開始後３分で起こり、３２分の継続後に解決した。この研究の間に報告された全ての他の有害事象は、研究者によって研究薬物には関連しないかまたは関連性がありそうもないと考えられた。これらの事象は、胸痛、インフルエンザ様症状（ｆｌｕ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、口臭、頭痛、注射部位疼痛、血管拡張、増大した咳嗽、鼻炎、発疹、歯肉出血、および斑状出血を含んだ。
【０３８０】
グレード１  ＧｖＨＤを発症している患者を、２時間注入として、０．４ｍｇ／ｋｇ  ＡＰ１９０３で処置した。グレード１  ＧｖＨＤを発症している患者へのＡＰ１９０３の投与プロトコルを、以下のとおり確立した。同種枯渇されたＴ細胞の注入後にＧｖＨＤを発症している患者を生検して診断を確定し、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を２時間の注入として与える。グレードＩ  ＧｖＨＤを有する患者は、他の治療を最初に何も受けなかったが、彼らがＧｖＨＤの進行を示した場合、従来のＧｖＨＤ治療を、制度上のガイドラインに従って施した。グレード２〜４  ＧｖＨＤを発症している患者に、制度上のガイドラインに従って、ＡＰ１９０３二量体化薬物に加えて、標準的な全身免疫抑制治療を施した。
【０３８１】
調製および注入の指示：注射用ＡＰ１９０３を、３ｍｌ  バイアル中、５ｍｇ／ｍｌの濃度の２．３３ｍｌの濃縮溶液（すなわち、１０．６６ｍｇ／バイアル）として得る。投与前に、その計算した用量を、注入用０．９％  ノーマルセーライン中で１００ｍＬへと希釈した。１００ｍｌ容積中の注射用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を、非ＤＥＨＰ、非エチレンオキシド滅菌注入セットおよび注入ポンプを使用して、２時間かけてＩＶ注入を介して投与した。
【０３８２】
ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子発現構築物（例えば、ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ΔＣＤ１９）は、切断可能な２Ａ様配列を介して短縮型ヒトＣＤ１９（ΔＣＤ１９）へと連結した誘導性カスパーゼ−９（ｉＣａｓｐ９）からなる。ｉＣａｓｐ９は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーを介してヒトカスパーゼ−９（ＣＡＳＰ９；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１２２９）へと接続されたＦ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＨ００２  ８１８）を含む。このＦ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３に対するＦＫＢＰ１２の結合親和性を増大させ得る。このカスパーゼ補充ドメイン（ＣＡＲＤ）は、ヒトカスパーゼ−９配列から欠失されており、その生理学的機能は、ＦＫＢＰ１２によって置き換えられている。ＣＡＲＤをＦＫＢＰ１２で置き換えると、導入遺伝子発現および機能が増大する。上記２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ  Ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の１８アミノ酸のペプチドをコードし、それはグリシンと末端プロリン残基との間で＞９９％切断を媒介し、ｉＣａｓｐ９のＣ末端において１７個の追加のアミノ酸およびＣＤ１９のＮ末端において１個の追加のプロリン残基をもたらす。ΔＣＤ１９は、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）で短縮された全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７７０）からなり、これは、２４２から１９個のアミノ酸までの細胞質内ドメインを短縮し、リン酸化の潜在的部位である保存された全てのチロシン残基を除去する。
【０３８３】
（インビボ研究）
３名の患者に、ハプロ−ＣＤ３４＋幹細胞移植（ＳＣＴ）後に、約１×１０６〜約３×１０６  細胞／ｋｇの間の用量レベルでｉＣａｓｐ９＋  Ｔ細胞を与えた。
【０３８４】
注入したＴ細胞を、１７０±５の最大倍数拡大（maximum  fold  expansion）（注入後２９±９日目）とともに、注入後７日目ほどの早さで、フローサイトメトリー（ＣＤ３＋  ΔＣＤ１９＋）またはｑＰＣＲによってインビボで検出した。２名の患者は、グレードＩ／ＩＩ  ａＧｖＨＤを発症し、ＡＰ１９０３投与は、注入の３０分以内に、ＣＤ３＋  ΔＣＤ１９＋細胞の＞９０％除去（２４時間以内にさらなる対数減少を伴う）、および２４時間以内の皮膚および肝臓のａＧｖＨＤの消散を引き起こし、ｉＣａｓｐ９導入遺伝子がインビボで機能することを示した。
【０３８５】
エキソビボ実験は、このデータを確認した。さらに、残っている同種枯渇されたＴ細胞は、拡大でき、ウイルス（ＣＭＶ）および真菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に対して反応性であった（ＩＦＮ−γ生成）。これらのインビボ研究は、二量体化薬物の単一用量が、ＧｖＨＤを引き起こすＴ細胞の部分集団を減少または排除し得るが、ウイルス特異的ＣＴＬ（これは、次いで、再拡大し得る）を残し得ることを見出した。
【０３８６】
（免疫再構築）
患者細胞および試薬の利用可能性に依存して、免疫再構築研究（免疫表現型決定、Ｔ細胞およびＢ細胞機能）は、移植後一連の間隔で得られ得る。ｉカスパーゼ形質導入同種枯渇Ｔ細胞から生じる免疫再構築を測定するいくつかのパラメーターを分析する。この分析は、全リンパ球数、Ｔ細胞およびＣＤ１９  Ｂ細胞の数の反復測定、ならびにＴ細胞サブセット（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、α／βおよびγ／δＴ細胞レセプター）のＦＡＣＳ分析を含む。患者Ｔ細胞の利用可能性に依存して、Ｔ調節性細胞マーカー（例えば、ＣＤ４１ＣＤ２５１ＦｏｘＰ３）もまた分析する。可能な場合には、注入の４時間後、１ヶ月間毎週、毎月×９ヶ月間、および次に１年でおよび２年で、およそ１０〜６０ｍｌの患者血液を採取する。採取される血液量は、レシピエントのサイズに依存し、いずれの１回の血液採取時にも（臨床上のケアおよび研究評価のために血液が採取されることを考慮して）全体で１〜２ｃｃ／ｋｇを超えない。
【０３８７】
（より低い基底活性およびリガンドの最小損失のＩＣ５０を有する改変カスパーゼ−９ポリペプチド）
基底シグナル伝達（アゴニストまたは活性化剤の非存在下でのシグナル伝達）は、多くの生体分子に一般的である。例えば、それは、複数のサブファミリーに由来する６０を超える野生型Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）［１］、キナーゼ（例えば、ＥＲＫおよびａｂｌ）［２］、表面免疫グロブリン［３］、およびプロテアーゼにおいて観察されている。基底シグナル伝達は、胚性幹細胞多能性の維持、Ｂ細胞発生および分化［４〜６］、Ｔ細胞分化［２，  ７］、胸腺細胞発生［８］、エンドサイトーシスおよび薬物寛容性［９］、自己免疫［１０］から、植物生長および発生［１１］まで、非常に種々の生物学的事象に寄与すると仮定されている。その生物学的重要性は常に完全に理解されているわけでも明らかでもないが、欠陥のある基底シグナル伝達は、重大な結果をもたらし得る。欠陥のある基底Ｇタンパク質シグナル伝達は、網膜色素変性、色盲、腎性尿崩症、家族性ＡＣＴＨ不応症（ｆａｍｉｌｉａｌ  ＡＣＴＨ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、および家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症［１２，  １３］）などの疾患をもたらした。
【０３８８】
野生型イニシエーターカスパーゼ−９のホモ二量体化がエネルギー的にたとえ不利であり、野生型イニシエーターカスパーゼ−９を溶液中で大部分をモノマーにしても［１４〜１６］、プロセシングされていないカスパーゼ−９の低レベルの本来の基底活性［１５，１７］は、Ａｐａｆ−１ベースの「アポプトソーム」（その天然のアロステリック調節因子［６］）の存在下で増強される。さらに、超生理学的発現レベルおよび／または共局在は、近位にあることで駆動される二量体化（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ−ｄｒｉｖｅｎ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）をもたらし得、さらには、基底活性化を増強し得る。本出願の改変された細胞は、より低い基底シグナル伝達活性を有するキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。より低い基底シグナル伝達を有するカスパーゼ−９変異体の例は、以下の表に提供される。より低い基底シグナル伝達を有するカスパーゼ−９変異体を含むポリヌクレオチドは、本明細書中での細胞治療に使用される改変された細胞において発現され得る。これらの例では、その改変された細胞は、より低い基底シグナル伝達キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む安全スイッチを含み得る。本明細書中のＢｏｂ１  ＴＣＲを含む改変された細胞の投与後の有害事象という事象では、カスパーゼ−９活性は、患者に二量体化剤を投与することによって誘導され得る、こうして、アポトーシスおよび改変された細胞のうちのいくらかまたは全てのクリアランスを誘導し得る。いくつかの例では、投与される二量体化剤の量は、改変された細胞のうちの最高量、少なくとも８０％または９０％を除去するようにデザインされた量として決定され得る。他の例では、投与される二量体化剤の量は、負の症候または状態を緩和すると同時に患者において治療用の改変された細胞の十分な量を残しておくために、治療を継続するために、改変された細胞の一部のみを除去するようにデザインされた量として決定され得る。キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを使用してアポトーシスを誘導するための方法は、Ｍａｌｃｏｌｍ  Ｋ．  ＢｒｅｎｎｅｒらによるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３７３８１（標題、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、２０１１年５月２０日出願）およびＭａｌｃｏｌｍ  Ｋ．  Ｂｒｅｎｎｅｒらによる米国特許出願第１３／１１２，７３９号（標題、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、２０１１年５月２０日出願、現米国特許第９，０８９，５２０号）において論じられる。改変された基底活性を有するキメラカスパーゼポリペプチドは、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２２００４（ＷＯ２０１４／１６４３４８として２０１５年３月５日公開、標題、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃａｓｐａｓｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」）および国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１９１８６（ＷＯ２０１５／１３４８７７として２０１５年９月１１日に公開、標題「Ｃａｓｐａｓｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈ��ｒｅｏｆ」）において論じられる。治療用の改変された細胞の部分的アポトーシスを誘導するための方法は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１４／０４０９６４（ＷＯ２０１４／１９７６３８として２０１４年１２月１１日公開、Ｋｅｖｉｎ  Ｓｌａｗｉｎらによる、標題、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｐａｒｔｉａｌ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｓｐａｓｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）において論じられる。これらの特許出願および刊行物は、それらの全体において本明細書に全て参考として援用される。
【表３−１】
0006718444.tif 000016
【表３−２】
0006718444.tif 000017
【０３８９】
プラスミドの一例、ｐＢＰ０９５４−ｐＳＦＧ−ｉＣ９．Ｔ２Ａ−Ｂｏｂ−１が図１５に提供され、このプラスミドは、Ｂｏｂ１  ＴＣＲおよび誘導性キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む本出願の核酸を発現するために使用され得る。この例では、上記短縮型カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｎ４０５Ｑ変異を含む；他の短縮型カスパーゼ−９ポリペプチド（例えば、本明細書で提供される短縮型カスパーゼ−９ポリペプチド、例えば、配列番号５８、１０８、１１０、１１２、または１１６のアミノ酸配列を有するもの、例えば、配列番号５７、１０７、１０９、１１１、または１１５のヌクレオチド配列によってコードされるもの）は、上記プラスミドにおいて使用されるＮ４０５Ｑカスパーゼ−９ポリペプチドコードポリヌクレオチドの代わりに使用され得る。また、ポリペプチドの順序は、２Ａポリペプチド切断可能リンカーコードポリヌクレオチドによって分断される場合、変動し得ることは、理解される。この例では、上記誘導性キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｂｏｂ１  ＴＣＲβポリペプチドに隣接して位置し、２ＡポリペプチドコードポリヌクレオチドによってＢｏｂ１  ＴＣＲβポリペプチドから分断される。他の実施形態において、上記誘導性キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｂｏｂ１  ＴＣＲαポリペプチドに隣接して位置し得、２ＡポリペプチドコードポリヌクレオチドによってＢｏｂ１  ＴＣＲαポリペプチドから分断され得る。さらに他の実施形態において、上記誘導性キメラカスパーゼ０９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｂｏｂ１  ＴＣＲαおよびＢｏｂ１  ＴＣＲβポリペプチドとの間に位置し得、誘導性カスパーゼ−９コードポリヌクレオチドのいずれかの側で、２個のポリヌクレオチド（各々、２Ａポリペプチドをコードする）によって分断される。適切なポリヌクレオチドリンカー配列（例えば、本明細書で提供されるもの）はまた、本明細書で論じられるポリヌクレオチドのうちのいずれかの直ぐ隣に位置し得る。
（引用される、あるいは本実施例にさらなる裏付けを提供する参考文献）
【化１２−１】
0006718444.tif 000018
【化１２−２】
0006718444.tif 000019
【化１２−３】
0006718444.tif 000020
【０３９０】
キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを発現するために使用され得る配列の例としては、以下の配列が挙げられる。本明細書中の配列は、本明細書で論じられるとおりの適切な発現ベクターに含めるために選択され得る。
【化１３】
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【化１４】
0006718444.tif 000022
【化１５】
0006718444.tif 000023
【化１６】
0006718444.tif 000024
【０３９１】
（実施例７：誘導性キメラ共刺激ポリペプチドの付加）
Ｔ細胞レセプターシグナル伝達は、二量体化の化学誘導物質（ＣＩＤ）を、ＣＩＤに結合する多量体化領域を含むキメラ共刺激ポリペプチドと組み合わせて使用して誘導し得る。Ｔ細胞を、誘導性キメラ共刺激ポリペプチド（これは、１個、２個、または３個のＦＫＢＰフラグメントで連結された）を発現するように操作した。上記細胞は、キメラレセプターを発現し、ＣＩＤ依存性Ｔ細胞活性化を示した（Ｓｐｅｎｃｅｒ，  Ｄ．  Ｍ．ら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９３．  ２６２：  ｐ．  １０１９−１０２４）。抗原認識領域（例えば、キメラ抗原レセプターまたはＴ細胞におけるＴＣＲなど）を有するポリペプチドの共発現のための方法および組成物は、例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２６７３４（ＷＯ２０１４／１５１９６０として２０１４年９月２５日に公開、標題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ」）および国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１５８２９（ＷＯ２０１５／１２３５２７として２０１５年８月２０日に公開、標題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」）において論じられる。これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【０３９２】
（実施例８：特定の核酸およびアミノ酸配列の例）
以下のさらなる配列は、本明細書で提供されるＢｏｂ１  ＴＣＲおよびキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする発現ベクターのデザインにおいて使用され得る。
【化１７】
0006718444.tif 000025
【化１８】
0006718444.tif 000026
【化１９】
0006718444.tif 000027
【化２０】
0006718444.tif 000028
【化２１】
0006718444.tif 000029
【化２２】
0006718444.tif 000030
【化２３】
0006718444.tif 000031
【化２４】
0006718444.tif 000032
【化２５】
0006718444.tif 000033
【化２６】
0006718444.tif 000034
【化２７】
0006718444.tif 000035
【化２８】
0006718444.tif 000036
【化２９】
0006718444.tif 000037
【化３０】
0006718444.tif 000038
【化３１】
0006718444.tif 000039
【化３２】
0006718444.tif 000040
【０３９３】
（実施例９：さらなる参考文献）
以下の参考文献は、本実施例において引用されるか、またはさらなる一般的情報を提供する。
【化３３−１】
0006718444.tif 000041
【化３３−２】
0006718444.tif 000042
【化３３−３】
0006718444.tif 000043
【化３３−４】
0006718444.tif 000044
【０３９４】
（実施例１０：代表的実施形態）
本技術のある種の実施形態の例が、これ以降に提供される。
【０３９５】
Ａ１．Ｂｏｂ１を認識するＴ細胞レセプターのＣＤＲ３領域をコードする核酸分子であって、該核酸分子は、
ａ．ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；および
ｂ．ＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、
を含む核酸分子。
【０３９６】
Ａ２．  
ａ．前記第１のポリヌクレオチドは、ＴＣＲαポリペプチドのＶＪ領域を含む第１のポリペプチドをコードし；そして
ｂ．前記第２のポリヌクレオチドは、ＴＣＲβポリペプチドのＶＤＪ領域を含む第２のポリペプチドをコードする、
実施形態Ａ１に記載の核酸分子。
【０３９７】
Ａ３．前記第１のポリペプチドは、前記ＴＣＲαポリペプチドの定常領域をさらに含み、前記第２のポリペプチドは、前記ＴＣＲβポリペプチドの定常領域をさらに含む、実施形態Ａ１に記載の核酸分子。
【０３９８】
Ａ４．前記核酸分子は、Ｔ細胞レセプターをコードする、実施形態Ａ１〜Ａ３のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０３９９】
Ａ５．前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＡＰＡＰＴＡＶＶＬを含むＢｏｂ１ポリペプチドを認識する、実施形態Ａ１〜Ａ４のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４００】
Ａ６．前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＹＡＬＮＨＴＬＳＶを含むＢｏｂ１ポリペプチドを認識する、実施形態Ａ１〜Ａ４のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４０１】
Ａ７．前記第１のまたは第２のポリペプチドの定常領域は、異種の定常領域である、実施形態Ａ３〜Ａ６のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４０２】
Ａ８．前記第１のおよび第２のポリペプチドの定常領域は、マウスＴＣＲ定常領域に由来する、実施形態Ａ３〜Ａ７のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４０３】
Ａ９．前記第１のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４０４】
Ａ１０．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ９に記載の核酸分子。
【０４０５】
Ａ１１．前記第２のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ１０のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４０６】
Ａ１２．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５もしくは配列番号６のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ１１に記載の核酸分子。
【０４０７】
Ａ１３．前記第１のポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４０８】
Ａ１４．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号８もしくは配列番号９のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ１３に記載の核酸分子。
【０４０９】
Ａ１５．前記第２のポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ８またはＡ１３〜Ａ１４のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４１０】
Ａ１６．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号１１もしくは配列番号１２のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ１５に記載の核酸分子。
【０４１１】
Ａ１７．前記第１のポリペプチドは、配列番号１３または１４のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４１２】
Ａ１８．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号１５、１６、または１８のヌクレオチド配列を含む、実施形態Ａ１７に記載の核酸分子。
【０４１３】
Ａ１９．前記第２のポリペプチドは、配列番号１９または２０のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ８またはＡ１７〜Ａ１８のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４１４】
Ａ２０．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２１、２２、または２４のヌクレオチド配列を含む、実施形態Ａ１９に記載の核酸分子。
【０４１５】
Ａ２１．前記第１のポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４１６】
Ａ２２．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２６もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ２１に記載の核酸分子。
【０４１７】
Ａ２３．前記第２のポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ８またはＡ２１〜Ａ２２のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４１８】
Ａ２４．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２９もしくは配列番号３０のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態２３に記載の核酸分子。
【０４１９】
Ａ２５．前記第１のポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４２０】
Ａ２６．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３２もしくは配列番号３３のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ２５に記載の核酸分子。
【０４２１】
Ａ２７．前記第２のポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ８またはＡ２５〜Ａ２６のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４２２】
Ａ２８．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号３５もしくは配列番号３６のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ２７に記載の核酸分子。
【０４２３】
Ａ２９．前記第１のポリペプチドは、配列番号３７または３８のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４２４】
Ａ３０．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３９、４０、４１、または４２のヌクレオチド配列を含む、実施形態Ａ２９に記載の核酸分子。
【０４２５】
Ａ３１．前記第２のポリペプチドは、配列番号４３または４４のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ８またはＡ２９〜Ａ３０のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４２６】
Ａ３２．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号４５、４６、４７、または４８のヌクレオチド配列を含む、実施形態Ａ３１に記載の核酸分子。
【０４２７】
Ｂ１．多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ３２のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４２８】
Ｂ２．ＴＣＲαまたはＴＣＲβをコードするポリヌクレオチドと前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該ポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、実施形態Ｂ１に記載の核酸分子。
【０４２９】
Ｂ３．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ領域である、実施形態Ｂ１またはＢ２のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４３０】
Ｂ４．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｂ１またはＢ２のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４３１】
Ｂ５．前記多量体リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｂ１〜Ｂ４のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４３２】
Ｂ６．前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表３の中のカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ｂ１〜Ｂ５のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０４３３】
Ｃ１．被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、実施形態Ａ１〜Ｂ６のいずれか１つに記載の核酸を含む改変された細胞を該被験体に投与することを包含する方法。
【０４３４】
Ｃ２．前記標的細胞は、腫瘍細胞である、実施形態Ｃ１に記載の方法。
【０４３５】
Ｃ３．前記標的細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍、原発性Ｂ細胞悪性腫瘍、または多発性骨髄腫の細胞である、実施形態Ｃ１またはＣ２のいずれか１つに記載の方法。
【０４３６】
Ｃ４．前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記改変された細胞の投与後に減少している、実施形態Ｃ１〜Ｃ３のいずれか１つに記載の方法。
【０４３７】
Ｃ５．前記改変された細胞を投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、該改変された細胞の投与後に該被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、および該第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増大または減少を決定することを包含する、実施形態Ｃ１〜Ｃ４のいずれか１つに記載の方法。
【０４３８】
Ｃ６．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、実施形態Ｃ５に記載の方法。
【０４３９】
Ｃ７．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増大している、実施形態Ｃ５に記載の方法。
【０４４０】
Ｃ８．前記改変された細胞のさらなる用量は、前記被験体に投与される、実施形態Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の方法。
【０４４１】
Ｃ９．前記標的細胞は、Ｂｏｂ１を発現する、実施形態Ｃ１〜Ｃ８のいずれか１つに記載の方法。
【０４４２】
Ｃ１０．前記被験体は、少なくとも１個の腫瘍を有する、実施形態Ｃ１〜Ｃ８のいずれか１つに記載の方法。
【０４４３】
Ｃ１１．前記少なくとも１個の腫瘍のサイズは、薬学的組成物の投与後に減少している、実施形態Ｃ１０に記載の方法。
【０４４４】
Ｃ１２．前記被験体は、Ｂ細胞悪性腫瘍または多発性骨髄腫と診断されている、実施形態Ｃ１〜Ｃ１１のいずれか１つに記載の方法。
【０４４５】
Ｃ１３．前記Ｂ細胞悪性腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫である、実施形態Ｃ１２に記載の方法。
【０４４６】
Ｃ１４．前記Ｂ細胞リンパ腫は、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、および大細胞型Ｂ細胞リンパ腫からなる群より選択される、実施形態Ｃ１３に記載の方法。
【０４４７】
Ｄ１．Ｂｏｂ１に特異的に結合するＴ細胞レセプターのＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドに作用的に連結されたプロモーターを含む核酸分子であって、該核酸分子は、
ａ．ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；および
ｂ．ＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、
を含み、ここで該ＴＣＲαポリペプチドおよびＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域は一緒に、Ｂｏｂ１に特異的に結合する、核酸分子。
【０４４８】
Ｄ２．前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＡＰＡＰＴＡＶＶＬまたはアミノ酸配列ＹＡＬＮＨＴＬＳＶを含むＢｏｂ１ポリペプチドに特異的に結合する、実施形態Ｄ１に記載の核酸分子。
【０４４９】
Ｄ３．前記第１のポリペプチドは、配列番号１または配列番号２５のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチドは、配列番号４または配列番号２８のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｄ１に記載の核酸分子。
【０４５０】
Ｄ４．
ａ）前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含み、前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５もしくは配列番号６のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含むか；あるいは
ｂ）前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２６もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含み、前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２９もしくは配列番号３０のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、
実施形態Ｄ１に記載の核酸分子。
【０４５１】
Ｄ５．多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｄ１に記載の核酸分子。
【０４５２】
Ｄ６．実施形態Ｄ１に記載の核酸分子を含む、プラスミドまたはウイルスベクター。
【０４５３】
Ｄ７．実施形態Ｄ１に記載の核酸分子でトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
【０４５４】
Ｄ８．前記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに含む、実施形態Ｄ７に記載の改変された細胞。
【０４５５】
Ｄ９．実施形態Ｄ５に記載の核酸分子でトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
【０４５６】
Ｄ１０．実施形態Ｄ７に記載の改変された細胞および薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
【０４５７】
Ｄ１１．実施形態Ｄ１に記載の核酸および薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
【０４５８】
Ｄ１２．   過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において免疫応答を高めるための方法であって、該方法は、治療有効量の実施形態Ｄ７に記載の改変された細胞を該被験体に投与することを包含する方法。
【０４５９】
Ｄ１３．被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、実施形態Ｄ７に記載の改変された細胞を該被験体に投与することを包含する方法。
【０４６０】
Ｄ１４．前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記改変された細胞の投与後に減少している、実施形態Ｄ１３に記載の方法。
【０４６１】
Ｄ１５．前記改変された細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、実施形態Ｄ１３に記載の方法。
【０４６２】
Ｄ１６．前記被験体への前記改変された細胞の投与後に、前記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを該被験体に投与することをさらに包含する、実施形態Ｄ１５に記載の方法。
【０４６３】
Ｄ１７．前記多量体リガンドの投与後に、前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度は、該多量体リガンドを投与する前に該被験体から得られるサンプル中の該キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度と比較して、該多量体リガンドを投与した後に該被験体から得られるサンプル中で減少している、実施形態Ｄ１６に記載の方法。
【０４６４】
Ｄ１８．細胞においてＢｏｂ１に特異的に結合するＴ細胞レセプターを発現するための方法であって、該方法は、実施形態１に記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させ、それによって、該細胞が該Ｔ細胞レセプターを該組み込まれた核酸から発現することを包含する、方法。
【０４６５】
Ｄ１９．Ｂｏｂ１の免疫原性ペプチドエピトープ。
【０４６６】
Ｄ２０．前記免疫原性ペプチドエピトープは、表１のＢｏｂ１ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含む、実施形態Ｄ１９に記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
【０４６７】
Ｄ２１．前記免疫原性ペプチドエピトープは、アミノ酸配列ＡＰＡＰＴＡＶＶＬを有するかまたはアミノ酸配列ＹＡＬＮＨＴＬＳを有するポリペプチドを含む、実施形態Ｄ１９に記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
【０４６８】
Ｄ２２．実施形態Ｄ１９に記載の免疫原性ペプチドエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む核酸で形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞。
【０４６９】
Ｄ２３．   過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において免疫応答を高めるための方法であって、該方法は、治療有効量の実施形態Ｄ１９に記載の免疫原性ペプチドエピトープを該被験体に投与することを包含する方法。
【０４７０】
Ｄ２４．被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、治療有効量の実施形態Ｄ１９に記載の免疫原性ペプチドエピトープを該被験体に投与することを包含する方法。
【０４７１】
Ｄ２５．被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、有効量の実施形態Ｄ１９に記載の免疫原性ペプチドエピトープを該被験体に投与することを包含する方法。
【０４７２】
Ｅ１．実施形態Ａ１〜Ｂ６５のいずれか１つに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【０４７３】
Ｅ２．実施形態Ａ１〜Ａ３２のいずれか１つに記載の核酸分子または実施形態Ｅ１に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、細胞。
【０４７４】
Ｅ２．１．前記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに含む、実施形態Ｅ２に記載の細胞。
【０４７５】
Ｅ２．２．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ領域である、実施形態Ｅ２．１に記載の細胞。
【０４７６】
Ｅ２．３．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｅ２．１またはＥ２．２のいずれか１つに記載の細胞。
【０４７７】
Ｅ２．４．前記多量体リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｅ２．１〜Ｅ２．３のいずれか１つに記載の細胞。
【０４７８】
Ｅ２．５．前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表３の中のカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ｅ２．１〜Ｅ２．４のいずれか１つに記載の細胞。
【０４７９】
Ｅ３．実施形態Ｂ１〜Ｂ６のいずれか１つに記載の核酸分子でトランスフェクトまたは形質導入された、細胞。
【０４８０】
Ｅ４．実施形態Ｃ１〜Ｃ５のいずれか１つに記載の核酸分子でトランスフェクトまたは形質導入された、細胞。
【０４８１】
Ｅ５．実施形態Ｄ１〜Ｄ５のいずれか１つに記載の核酸分子でトランスフェクトまたは形質導入された、細胞。
【０４８２】
Ｅ６．前記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに含む、実施形態Ｅ４またはＥ５のいずれか１つに記載の細胞。
【０４８３】
Ｆ１．Ｂｏｂ１の免疫原性ペプチドエピトープ。
【０４８４】
Ｆ２．前記免疫原性ペプチドエピトープは、表１のＢｏｂ１ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含む、実施形態Ｆ１に記載の免疫原性エピトープ。
【０４８５】
Ｆ３．前記免疫原性ペプチドエピトープは、アミノ酸配列ＡＰＡＰＴＡＶＶＬを有するポリペプチドを含む、実施形態Ｆ１に記載の免疫原性エピトープ。
【０４８６】
Ｆ４．前記免疫原性ペプチドエピトープは、アミノ酸配列ＹＡＬＮＨＴＬＳＶを有するポリペプチドを含む、実施形態Ｆ１に記載の免疫原性エピトープ。
【０４８７】
Ｆ５．留保。
【０４８８】
Ｆ６．前記免疫原性エピトープは、２０以下のアミノ酸を有する、実施形態Ｆ１〜Ｆ５のいずれか１つに記載の免疫原性エピトープ。
【０４８９】
Ｆ７．前記免疫原性エピトープは、１０以下のアミノ酸を有する、実施形態Ｆ１〜Ｆ５のいずれか１つに記載の免疫原性エピトープ。
【０４９０】
Ｆ７．１．前記免疫原性エピトープは、１２以下のアミノ酸を有する、実施形態Ｆ１〜Ｆ５のいずれか１つに記載の免疫原性エピトープ。
【０４９１】
Ｆ７．２．前記免疫原性エピトープは、１４以下のアミノ酸を有する、実施形態Ｆ１〜Ｆ５のいずれか１つに記載の免疫原性エピトープ。
【０４９２】
Ｆ７．３．前記免疫原性エピトープは、１６以下のアミノ酸を有する、実施形態Ｆ１〜Ｆ５のいずれか１つに記載の免疫原性エピトープ。
【０４９３】
Ｆ７．４．前記免疫原性エピトープは、１８以下のアミノ酸を有する、実施形態Ｆ１〜Ｆ５のいずれか１つに記載の免疫原性エピトープ。
【０４９４】
Ｆ７．５．前記免疫原性エピトープは、２０以下のアミノ酸を有する、実施形態Ｆ１〜Ｆ５のいずれか１つに記載の免疫原性エピトープ。
【０４９５】
Ｆ８．実施形態Ｆ１〜Ｆ７のいずれか１つに記載の免疫原性エピトープをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸。
【０４９６】
Ｆ９．前記ポリヌクレオチドは、前記免疫原性エピトープの発現を指向し得るプロモーター配列に作用的に連結される、実施形態Ｆ８に記載の核酸。
【０４９７】
Ｆ１０．実施形態Ｆ９に記載の核酸を含む、ベクター。
【０４９８】
Ｆ１１．プラスミド、酵母、ポックスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、およびシンドビスウイルスからなる群より選択される、実施形態Ｆ１０に記載のベクター。
【０４９９】
Ｆ１２．前記ベクターは、ＭＰ７１レトロウイルスベクターである、実施形態Ｆ１０に記載のベクター。
【０５００】
Ｆ１３．実施形態Ｆ１〜Ｆ７のいずれか１つに記載の免疫原性エピトープを含む、単離された細胞。
【０５０１】
Ｆ１３．１．実施形態Ｆ８〜Ｆ１２のいずれか１つに記載の核酸またはベクターを含む、実施形態Ｆ１３に記載の単離された細胞。
【０５０２】
Ｆ１４．前記細胞は、ヒト細胞である、実施形態Ｆ１３またはＦ１３．１のいずれか１つに記載の単離された細胞。
【０５０３】
Ｆ１５．前記細胞は、抗原提示細胞または腫瘍細胞である、実施形態Ｆ１３、Ｆ１３．１、またはＦ１４のいずれか１つに記載の単離された細胞。
【０５０４】
Ｆ１６．実施形態Ｆ１３〜Ｆ１５のいずれか１つに記載の単離された細胞、および薬学的に許容され得るキャリアを含む、組成物。
【０５０５】
Ｆ１７．実施形態Ｆ８〜Ｆ９のいずれか１つに記載の核酸、または実施形態Ｆ１０〜Ｆ１２のいずれか１つに記載のベクター、および薬学的に許容され得るキャリアを含む、組成物。
【０５０６】
Ｆ１８．実施形態Ｆ１〜Ｆ７のいずれか１つに記載の免疫原性エピトープおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む、組成物。
【０５０７】
Ｆ１９．アジュバントをさらに含む、実施形態Ｆ１８に記載の組成物。
【０５０８】
Ｆ２０．過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において免疫応答を高めるための方法であって、該方法は、治療有効量の実施形態Ｆ１６〜Ｆ１９のいずれか１つに記載の組成物を該被験体に投与することを包含する方法。
【０５０９】
Ｆ２１．前記被験体は、少なくとも１個の腫瘍を有する、実施形態Ｆ２０に記載の方法。
【０５１０】
Ｆ２２．前記少なくとも１個の腫瘍のサイズは、前記薬学的組成物の投与後に減少している、実施形態Ｆ２１に記載の方法。
【０５１１】
Ｆ２３．前記被験体は、Ｂ細胞悪性腫瘍または多発性骨髄腫と診断されている、実施形態Ｆ２０〜Ｆ２２のいずれか１つに記載の方法。
【０５１２】
Ｆ２３．５．前記Ｂ細胞悪性腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫である、実施形態Ｆ２３に記載の方法。
【０５１３】
Ｆ２３．６．前記Ｂ細胞リンパ腫は、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、および大細胞型Ｂ細胞リンパ腫からなる群より選択される、実施形態Ｆ２３．５に記載の方法。
【０５１４】
Ｆ２４．前記被験体に樹状細胞を含む組成物を投与することを包含し、ここで該樹状細胞は、それらの表面にＢｏｂ１ポリペプチド抗原の少なくとも１個の免疫原性ＨＬＡエピトープを呈示する、実施形態Ｆ２０〜Ｆ２３のいずれか１つに記載の方法。
【０５１５】
Ｆ２５．被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、実施形態Ｆ１６〜Ｆ１９のいずれか１つに記載の薬学的組成物を該被験体に投与することを包含する、方法。
【０５１６】
Ｆ２６．前記標的細胞は、腫瘍細胞である、実施形態Ｆ２５に記載の方法。
【０５１７】
Ｆ２７．前記標的細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍、原発性Ｂ細胞悪性腫瘍、または多発性骨髄腫の細胞である。実施形態Ｆ２５またはＦ２６のいずれか１つに記載の方法。
【０５１８】
Ｆ２８．前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記薬学的組成物の投与後に減少している、実施形態Ｆ２５〜Ｆ２７のいずれか１つに記載の方法。
【０５１９】
Ｆ２９．前記薬学的組成物を投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、該薬学的組成物の投与後に該被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、および該第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増大または減少を決定することを包含する、実施形態Ｆ２５〜Ｆ２８のいずれか１つに記載の方法。
【０５２０】
Ｆ３０．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、実施形態Ｆ２９に記載の方法。
【０５２１】
Ｆ３１．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増大している、実施形態Ｆ２９に記載の方法。
【０５２２】
Ｆ３２．前記薬学的組成物のさらなる用量は、前記被験体に投与される、実施形態Ｆ２５〜Ｆ３１のいずれか１つに記載の方法。
【０５２３】
Ｆ３３．   被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、該被験体に有効量の実施形態Ｆ１６〜Ｆ１９のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを包含する方法。
【０５２４】
Ｆ３４．標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に有効量の実施形態Ｆ１６〜Ｆ１９のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを包含する方法。
【０５２５】
Ｆ３５．前記標的抗原は、腫瘍抗原である、実施形態Ｆ３４に記載の方法。
【０５２６】
Ｇ１．Ｂｏｂ１に特異的に結合するＴ細胞レセプターのＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドに作用的に連結されたプロモーターを含む核酸分子であって、該核酸分子は、
ａ．ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；および
ｂ．ＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、
を含み、ここで該ＴＣＲαポリペプチドおよびＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域は一緒に、Ｂｏｂ１に特異的に結合する、核酸分子。
【０５２７】
Ｇ２．  
ａ．前記第１のポリヌクレオチドは、ＴＣＲαポリペプチドのＶＪ領域を含む第１のポリペプチドをコードし；そして
ｂ．前記第２のポリヌクレオチドは、ＴＣＲβポリペプチドのＶＤＪ領域を含む第２のポリペプチドをコードする、
実施形態Ｇ１に記載の核酸分子。
【０５２８】
Ｇ３．前記第１のポリペプチドは、前記ＴＣＲαポリペプチドの定常領域をさらに含み、前記第２のポリペプチドは、前記ＴＣＲβポリペプチドの定常領域をさらに含む、実施形態Ｇ１に記載の核酸分子。
【０５２９】
Ｇ４．前記核酸分子は、Ｔ細胞レセプターをコードする、実施形態Ｇ１〜Ｇ３のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５３０】
Ｇ５．前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＡＰＡＰＴＡＶＶＬを含むＢｏｂ１ポリペプチドに特異的に結合する、実施形態Ｇ１〜Ｇ４のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５３１】
Ｇ６．前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＹＡＬＮＨＴＬＳＶを含むＢｏｂ１ポリペプチドに特異的に結合する、実施形態Ｇ１〜Ｇ４のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５３２】
Ｇ７．前記第１のまたは第２のポリペプチドの定常領域は、異種の定常領域である、実施形態Ｇ３〜Ｇ６のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５３３】
Ｇ８．前記第１のおよび第２のポリペプチドの定常領域は、マウスＴＣＲ定常領域に由来する、実施形態Ｇ３〜Ｇ７のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５３４】
Ｇ９．前記第１のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ８のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５３５】
Ｇ１０．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ｇ９に記載の核酸分子。
【０５３６】
Ｇ１１．前記第２のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ１０のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５３７】
Ｇ１２．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５もしくは配列番号６のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ｇ１１に記載の核酸分子。
【０５３８】
Ｇ１３．前記第１のポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ８のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５３９】
Ｇ１４．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号８もしくは配列番号９のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ｇ１３に記載の核酸分子。
【０５４０】
Ｇ１５．前記第２のポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ８またはＧ１３〜Ｇ１４のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５４１】
Ｇ１６．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号１１もしくは配列番号１２のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ｇ１５に記載の核酸分子。
【０５４２】
Ｇ１７．前記第１のポリペプチドは、配列番号１３または１４のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ８のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５４３】
Ｇ１８．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号１５、１６、または１８のヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｇ１７に記載の核酸分子。
【０５４４】
Ｇ１９．前記第２のポリペプチドは、配列番号１９または２０のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ８またはＧ１７〜Ｇ１８のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５４５】
Ｇ２０．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２１、２２、または２４のヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｇ１９に記載の核酸分子。
【０５４６】
Ｇ２１．前記第１のポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ８のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５４７】
Ｇ２２．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２６もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ｇ２１に記載の核酸分子。
【０５４８】
Ｇ２３．前記第２のポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ８またはＧ２１〜Ｇ２２のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５４９】
Ｇ２４．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２９もしくは配列番号３０のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ｇ２３に記載の核酸分子。
【０５５０】
Ｇ２５．前記第１のポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ８のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５５１】
Ｇ２６．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３２もしくは配列番号３３のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ｇ２５に記載の核酸分子。
【０５５２】
Ｇ２７．前記第２のポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ８またはＧ２５〜Ｇ２６のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５５３】
Ｇ２８．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号３５もしくは配列番号３６のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ｇ２７に記載の核酸分子。
【０５５４】
Ｇ２９．前記第１のポリペプチドは、配列番号３７または３８のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ８のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５５５】
Ｇ３０．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３９、４０、４１、または４２のヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｇ２９に記載の核酸分子。
【０５５６】
Ｇ３１．前記第２のポリペプチドは、配列番号４３または４４のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ８またはＧ２９〜Ｇ３０のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５５７】
Ｇ３２．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号４５、４６、４７、または４８のヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｇ３１に記載の核酸分子。
【０５５８】
Ｇ３３．多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ３２のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５５９】
Ｇ３４．ＴＣＲαまたはＴＣＲβをコードするポリヌクレオチドと前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該ポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、実施形態Ｇ３３に記載の核酸分子。
【０５６０】
Ｇ３５．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域である、実施形態Ｇ３３またはＧ３４のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５６１】
Ｇ３６．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域を含む、実施形態Ｇ３３〜Ｇ３５のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５６２】
Ｇ３７．前記ＦＫＢＰ１２領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、実施形態Ｇ３６に記載の核酸分子。
【０５６３】
Ｇ３８．前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｇ３６に記載の核酸分子。
【０５６４】
Ｇ３９．前記多量体リガンド結合領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓを含む、実施形態Ｇ３３〜Ｇ３８のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５６５】
Ｇ４０．前記多量体リガンド結合領域は、配列番号５２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメント、または配列番号７１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｇ３３〜Ｇ３９のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５６６】
Ｇ４１．前記多量体リガンド結合領域は、残基３６がバリンであるＦｖポリペプチドバリアントをさらに含む、実施形態Ｇ３５〜Ｇ３７のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５６７】
Ｇ４２．前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、実施形態Ｇ３４〜Ｇ４１のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５６８】
Ｇ４３．前記多量体リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｇ３３〜Ｇ４２のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５６９】
Ｇ４４．前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列を有するか、または配列番号５７のヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態Ｇ３３〜Ｇ４３のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５７０】
Ｇ４５．前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表３の中のカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ｇ３３〜Ｇ４３のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０５７１】
Ｇ４６．
ａ）実施形態Ｇ１〜Ｇ３２のいずれか１つに記載の核酸分子；および
ｂ）多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子、
を含む組成物。
【０５７２】
Ｇ４７．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域である、実施形態Ｇ４６に記載の組成物。
【０５７３】
Ｇ４８．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域を含む、実施形態Ｇ４６〜Ｇ４７のいずれか１つに記載の組成物。
【０５７４】
Ｇ４９．前記ＦＫＢＰ１２領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、実施形態Ｇ４８に記載の組成物。
【０５７５】
Ｇ５０．前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｇ４８に記載の組成物。
【０５７６】
Ｇ５１．前記多量体リガンド結合領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓを含む、実施形態Ｇ４６〜Ｇ５０のいずれか１つに記載の組成物。
【０５７７】
Ｇ５２．前記多量体リガンド結合領域は、配列番号５２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメント、または配列番号７１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｇ４６〜Ｇ５１のいずれか１つに記載の組成物。
【０５７８】
Ｇ５３．前記多量体リガンド結合領域は、残基３６がバリンであるＦｖポリペプチドバリアントを含む、実施形態Ｇ４６〜Ｇ５１のいずれか１つに記載の組成物。
【０５７９】
Ｇ５４．前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列を有するか、または配列番号５７のヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態Ｇ４６〜Ｇ５３のいずれか１つに記載の組成物。
【０５８０】
Ｇ５５．前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表３の中のカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ｇ４６〜Ｇ５３のいずれか１つに記載の組成物。
【０５８１】
Ｇ５６．実施形態Ｇ１〜Ｇ３２のいずれか１つに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【０５８２】
Ｇ５７．前記ベクターは、プラスミドベクターである、実施形態Ｇ５６に記載のベクター。
【０５８３】
Ｇ５８．前記ベクターは、ウイルスベクターである、実施形態Ｇ５６に記載のベクター。
【０５８４】
Ｇ５９．前記ベクターは、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｇ５６に記載のベクター。
【０５８５】
Ｇ６０．前記ベクターは、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｇ５６に記載のベクター。
【０５８６】
Ｇ６１．実施形態Ｇ１〜Ｇ３２のいずれか１つに記載の核酸分子または実施形態Ｇ５６〜Ｇ６０のいずれか１つに記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
【０５８７】
Ｇ６２．前記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに含む、実施形態Ｇ６１に記載の改変された細胞。
【０５８８】
Ｇ６３．実施形態Ｇ３３〜Ｇ４５のいずれか１つに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【０５８９】
Ｇ６４．前記ベクターは、プラスミドベクターである、実施形態Ｇ６３に記載のベクター。．
【０５９０】
Ｇ６５．前記ベクターは、ウイルスベクターである、実施形態Ｇ６３に記載のベクター。
【０５９１】
Ｇ６６．前記ベクターは、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｇ６３に記載のベクター。
【０５９２】
Ｇ６７．前記ベクターは、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｇ６３に記載のベクター。
【０５９３】
Ｇ６８．実施形態Ｇ３３〜Ｇ４５のいずれか１つに記載の核酸分子または実施形態Ｇ６３〜Ｇ６７のいずれか１つに記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
【０５９４】
Ｇ６９．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域である、実施形態Ｇ６２またはＧ６８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５９５】
Ｇ７０．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域を含む、実施形態Ｇ６２またはＧ６８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５９６】
Ｇ７１．前記ＦＫＢＰ１２領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、実施形態Ｇ７０に記載の改変された細胞。
【０５９７】
Ｇ７２．前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｇ７０に記載の改変された細胞。
【０５９８】
Ｇ７３．前記多量体リガンド結合領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓを含む、実施形態Ｇ６２またはＧ６８〜Ｇ７２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５９９】
Ｇ７４．前記多量体リガンド結合領域は、配列番号５２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメント、または配列番号７１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｇ６２またはＧ６８〜Ｇ７２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０６００】
Ｇ７５．前記多量体リガンド結合領域は、残基３６がバリンであるＦｖポリペプチドバリアントを含む、実施形態Ｇ６２またはＧ６８〜Ｇ７２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０６０１】
Ｇ７６．前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列を有するか、または配列番号５７のヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態Ｇ６２またはＧ６８〜Ｇ７５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０６０２】
Ｇ７７．前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表３の中のカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ｇ６２またはＧ６８〜Ｇ７５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０６０３】
Ｇ７８．実施形態Ｇ１〜Ｇ４５のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態Ｇ５６〜Ｇ６０もしくはＧ６３〜Ｇ６７のいずれか１つに記載のベクター、または実施形態Ｇ４７〜Ｇ５５のいずれか１つに記載の組成物でトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
【０６０４】
Ｇ７９．実施形態Ｇ６１〜Ｇ６２またはＧ６８〜Ｇ７８のいずれか１つに記載の改変された細胞および薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
【０６０５】
Ｇ８０．実施形態Ｇ１〜Ｇ４５のいずれか１つに記載の核酸または実施形態Ｇ５６〜Ｇ６０もしくはＧ６３〜Ｇ６７のいずれか１つに記載のベクターおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
【０６０６】
Ｇ８１．   過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において免疫応答を高めるための方法であって、該方法は、治療有効量の実施形態Ｇ６１〜Ｇ６２またはＧ６８〜Ｇ７８のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に投与することを包含する方法。
【０６０７】
Ｇ８２．前記被験体は、少なくとも１個の腫瘍を有する、実施形態Ｇ８１に記載の方法。
【０６０８】
Ｇ８３．前記少なくとも１個の腫瘍のサイズは、前記薬学的組成物の投与後に減少している、実施形態Ｇ８２に記載の方法。
【０６０９】
Ｇ８４．前記被験体は、Ｂ細胞悪性腫瘍または多発性骨髄腫と診断されている、実施形態Ｇ８１〜Ｇ８３のいずれか１つに記載の方法。
【０６１０】
Ｇ８５．被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、実施形態Ｇ６１〜Ｇ６２またはＧ６８〜Ｇ７８のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に投与することを包含する方法。
【０６１１】
Ｇ８６．前記標的細胞は、腫瘍細胞である、実施形態Ｇ８５に記載の方法。
【０６１２】
Ｇ８７．前記標的細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍、原発性Ｂ細胞悪性腫瘍、または多発性骨髄腫の細胞である、実施形態Ｇ８５またはＧ８６のいずれか１つに記載の方法。
【０６１３】
Ｇ８８．前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記改変された細胞の投与後に減少している、実施形態Ｇ８５〜Ｇ８７のいずれか１つに記載の方法。
【０６１４】
Ｇ８９．前記改変された細胞を投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、該改変された細胞の投与後に該被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、および該第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増大または減少を決定することを包含する、実施形態Ｇ８５〜Ｇ８８のいずれか１つに記載の方法。
【０６１５】
Ｇ９０．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、施形態Ｇ８９に記載の方法。
【０６１６】
Ｇ９１．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増大している、実施形態Ｇ８９に記載の方法。
【０６１７】
Ｇ９２．前記改変された細胞のさらなる用量は、前記被験体に投与される、実施形態Ｇ８５〜Ｇ９１のいずれか１つに記載の方法。
【０６１８】
Ｇ９３．前記標的細胞は、Ｂｏｂ１を発現する、実施形態Ｇ８５〜Ｇ９２のいずれか１つに記載の方法。
【０６１９】
Ｇ９４．   被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、該被験体に、有効量の実施形態Ｇ６１〜Ｇ６２またはＧ６８〜Ｇ７８のいずれか１つに記載の改変された細胞を投与することを包含する方法。
【０６２０】
Ｇ９５．標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、有効量の実施形態Ｇ６１〜Ｇ６２またはＧ６８〜Ｇ７８のいずれか１つに記載の改変された細胞を投与することを包含する方法。
【０６２１】
Ｇ９６．前記標的抗原は、腫瘍抗原である、実施形態Ｇ９５に記載の方法。
【０６２２】
Ｇ９７．前記標的抗原は、Ｂｏｂ１である、実施形態Ｇ９５に記載の方法。
【０６２３】
Ｇ９８．前記改変された細胞のさらなる用量を投与することをさらに包含し、ここで前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、実施形態Ｇ８１〜Ｇ９７のいずれか１つに記載の方法。
【０６２４】
Ｇ９９．
被験体における状態または疾患の有無またはステージを同定すること；および
該被験体において同定された状態または疾患の有無またはステージに基づいて実施形態Ｇ６１〜Ｇ６２またはＧ６８〜Ｇ７８のいずれか１つに記載の改変された細胞を投与するか、該改変された細胞のその後の投与量を維持するか、または該患者に投与される該改変された細胞のその後の投与量を調整する指示を伝えること、
をさらに包含する、実施形態Ｇ８１〜Ｇ９７のいずれか１つに記載の方法。
【０６２５】
Ｇ１００．前記状態は、白血病である、実施形態Ｇ８１〜Ｇ９９のいずれか１つに記載の方法。
【０６２６】
Ｇ１０１．前記被験体は、多発性骨髄腫またはＢ細胞悪性腫瘍と診断されている、実施形態Ｇ８１〜Ｇ９９のいずれか１つに記載の方法。
【０６２７】
Ｇ１０２．前記Ｂ細胞悪性腫瘍は、リンパ腫である、実施形態Ｇ１０１に記載の方法。
【０６２８】
Ｇ１０３．前記改変された細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む、実施形態Ｇ８１〜Ｇ１０２のいずれか１つに記載の方法。
【０６２９】
Ｇ１０４．前記被験体への前記改変された細胞の投与後に、前記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを該被験体に投与することをさらに包含する、実施形態Ｇ１０３に記載の方法。
【０６３０】
Ｇ１０５．前記多量体リガンドの投与後に、前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度は、該多量体リガンドの投与前に前記被験体から得られるサンプル中の該キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度と比較して、該多量体リガンドの投与後の該被験体から得られるサンプル中で減少している、実施形態Ｇ１０４に記載の方法。
【０６３１】
Ｇ１０６．前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、５０％減少している、実施形態Ｇ１０５に記載の方法。
【０６３２】
Ｇ１０７．前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、７５％減少している、実施形態Ｇ１０５に記載の方法。
【０６３３】
Ｇ１０８．前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、９０％減少している、実施形態Ｇ１０５に記載の方法。
【０６３４】
Ｇ１０９．前記被験体が、該被験体への前記改変された細胞の投与後に、負の症候を経験していることを決定すること、および該負の症候を減少または改善するために前記リガンドを投与することを包含する、実施形態Ｇ１０４〜Ｇ１０８のいずれか１つに記載の方法。
【０６３５】
Ｇ１１０．前記リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｇ１０４〜Ｇ１０９のいずれか１つに記載の方法。
【０６３６】
Ｇ１１１．前記改変された細胞は、自家Ｔ細胞である、実施形態Ｇ８１〜Ｇ１１０のいずれか１つに記載の方法。
【０６３７】
Ｇ１１２．前記改変された細胞は、同種異系Ｔ細胞である、実施形態Ｇ８１〜Ｇ１１０のいずれか１つに記載の方法。
【０６３８】
Ｇ１１３．前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、実施形態Ｇ８１〜Ｇ１１０のいずれか１つに記載の方法。
【０６３９】
Ｇ１１４．前記改変された細胞は、エキソビボでトランスフェクトまたは形質導入される、実施形態Ｇ８１〜Ｇ１１０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０６４０】
Ｇ１１５．細胞においてＢｏｂ１に特異的に結合するＴ細胞レセプターを発現するための方法であって、該方法は、実施形態Ｇ１〜Ｇ４５のいずれか１つに記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させ、それによって、該細胞が該Ｔ細胞レセプターを該組み込まれた核酸から発現することを包含する、方法。
【０６４１】
Ｇ１１６．前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、実施形態Ｇ１１５に記載の方法。
【０６４２】
Ｇ１１７．前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、実施形態Ｇ１１５に記載の方法。
【０６４３】
Ｇ１１８．Ｂｏｂ１の免疫原性ペプチドエピトープ。
【０６４４】
Ｇ１１９．前記免疫原性ペプチドエピトープは、表１のＢｏｂ１ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含む、実施形態Ｇ１１８に記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
【０６４５】
Ｇ１２０．前記免疫原性ペプチドエピトープは、アミノ酸配列ＡＰＡＰＴＡＶＶＬを有するポリペプチドを含む、実施形態Ｇ１１８に記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
【０６４６】
Ｇ１２１．前記免疫原性ペプチドエピトープは、アミノ酸配列ＹＡＬＮＨＴＬＳを有するポリペプチドを含む、実施形態Ｇ１１８に記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
【０６４７】
Ｇ１２２．前記免疫原性エピトープは、２０以下のアミノ酸を有する、実施形態Ｇ１１８〜Ｇ１２１のいずれか１つに記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
【０６４８】
Ｇ１２３．前記免疫原性エピトープは、１０以下のアミノ酸を有する、実施形態Ｇ１１８〜Ｇ１２１のいずれか１つに記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
【０６４９】
Ｇ１２４．前記免疫原性エピトープは、１２以下のアミノ酸を有する、実施形態Ｇ１１８〜Ｇ１２１のいずれか１つに記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
【０６５０】
Ｇ１２５．前記免疫原性エピトープは、１４以下のアミノ酸を有する、実施形態Ｇ１１８〜Ｇ１２１のいずれか１つに記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
【０６５１】
Ｇ１２６．前記免疫原性エピトープは、１６以下のアミノ酸を有する、実施形態Ｇ１１８〜Ｇ１２１のいずれか１つに記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
【０６５２】
Ｇ１２７．前記免疫原性エピトープは、１８以下のアミノ酸を有する、実施形態Ｇ１１８〜Ｇ１２１のいずれか１つに記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
【０６５３】
Ｇ１２８．前記免疫原性エピトープは、２０以下のアミノ酸を有する、実施形態Ｇ１１８〜Ｇ１２１のいずれか１つに記載の免疫原性ペプチドエピトープ。
【０６５４】
Ｇ１２９．実施形態Ｇ１１８〜Ｇ１２８のいずれか１つに記載の免疫原性ペプチドエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸。
【０６５５】
Ｇ１３０．前記ポリヌクレオチドは、前記免疫原性エピトープの発現を指向し得るプロモーター配列に作用的に連結される、実施形態Ｇ１２８に記載の核酸。
【０６５６】
Ｇ１３１．実施形態Ｇ１２９またはＧ１３０のいずれか１つに記載の核酸を含む、ベクター。
【０６５７】
Ｇ１３２．プラスミド、酵母、ポックスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、およびシンドビスウイルスからなる群より選択される、実施形態Ｇ１３１に記載のベクター。
【０６５８】
Ｇ１３３．前記ベクターは、ＭＰ７１レトロウイルスベクターである、実施形態Ｇ１３１に記載のベクター。
【０６５９】
Ｇ１３４．実施形態Ｇ１１８〜Ｇ１２８のいずれか１つに記載の免疫原性ペプチドエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む核酸で形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞。
【０６６０】
Ｇ１３５．実施形態Ｇ１２８〜Ｇ１３２のいずれか１つに記載の核酸またはベクターを含む、実施形態Ｇ１３４に記載の改変された細胞。
【０６６１】
Ｇ１３６．前記細胞は、ヒト細胞である、実施形態Ｇ１３４またはＧ１３５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０６６２】
Ｇ１３７．前記細胞は、抗原提示細胞または腫瘍細胞である、実施形態Ｇ１３４〜Ｇ１３６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０６６３】
Ｇ１３８．実施形態Ｇ１３４〜Ｇ１３７のいずれか１つに記載の改変された細胞および薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
【０６６４】
Ｇ１３９．実施形態Ｇ１２９〜Ｇ１３０のいずれか１つに記載の核酸、または実施形態Ｇ１３１〜Ｇ１３３のいずれか１つに記載のベクター、および薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
【０６６５】
Ｇ１４０．実施形態Ｇ１１８〜Ｇ１２８のいずれか１つに記載の免疫原性エピトープおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
【０６６６】
Ｇ１４１．アジュバントをさらに含む、実施形態１４０に記載の薬学的組成物。
【０６６７】
Ｇ１４２． 過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において免疫応答を高めるための方法であって、該方法は、治療有効量の実施形態Ｇ１３８〜Ｇ１４１のいずれか１つに記載の薬学的組成物を該被験体に投与することを包含する方法。
【０６６８】
Ｇ１４３．前記被験体は、少なくとも１個の腫瘍を有する、実施形態Ｇ１４２に記載の方法。
【０６６９】
Ｇ１４４．前記少なくとも１個の腫瘍のサイズは、前記薬学的組成物の投与後に減少している、実施形態Ｇ１４３に記載の方法。
【０６７０】
Ｇ１４５．前記被験体は、Ｂ細胞悪性腫瘍または多発性骨髄腫と診断されている、実施形態Ｇ１４２〜Ｇ１４４のいずれか１つに記載の方法。
【０６７１】
Ｇ１４６．前記Ｂ細胞悪性腫瘍は、リンパ腫である、実施形態Ｇ１４５に記載の方法。
【０６７２】
Ｇ１４７．前記被験体に、樹状細胞を含む組成物を投与することを包含し、ここで該樹状細胞は、それらの表面上にＢｏｂ１ポリペプチド抗原の少なくとも１つの免疫原性ＨＬＡエピトープを呈示する、実施形態Ｇ１４２〜Ｇ１４６のいずれか１つに記載の方法。
【０６７３】
Ｇ１４８． 被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、実施形態Ｇ１３８〜Ｇ１４０のいずれか１つに記載の薬学的組成物を該被験体に投与することを包含する方法。
【０６７４】
Ｇ１４９．前記標的細胞は、腫瘍細胞である、実施形態Ｇ１４８に記載の方法。
【０６７５】
Ｇ１５０．前記標的細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍、原発性Ｂ細胞悪性腫瘍、または多発性骨髄腫の細胞である、実施形態Ｇ１４８〜Ｇ１４９のいずれか１つに記載の方法。
【０６７６】
Ｇ１５１．前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記薬学的組成物の投与後に減少している、実施形態Ｇ１４８〜Ｇ１５０のいずれか１つに記載の方法。
【０６７７】
Ｇ１５２．前記薬学的組成物を投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、該薬学的組成物を投与した後に該被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、および該第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増大または減少を決定することを包含する、実施形態Ｇ１４８〜Ｇ１５１のいずれか１つに記載の方法。
【０６７８】
Ｇ１５３．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、実施形態Ｇ１５２に記載の方法。
【０６７９】
Ｇ１５４．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増大している、実施形態Ｇ１５２に記載の方法。
【０６８０】
Ｇ１５５．前記薬学的組成物のさらなる用量は、前記被験体に投与される、実施形態Ｇ１４８〜Ｇ１５４のいずれか１つに記載の方法。
【０６８１】
Ｇ１５６． 被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、該被験体に、有効量の実施形態Ｇ１３８〜Ｇ１４０のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを包含する方法。
【０６８２】
Ｇ１５７． 標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、有効量の実施形態Ｇ１３８〜Ｇ１４０のいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを包含する方法。
【０６８３】
Ｇ１５８．前記標的抗原は、腫瘍抗原である、実施形態Ｇ１５７に記載の方法。
【０６８４】
Ｇ１５９．前記標的抗原は、Ｂｏｂ１である、実施形態Ｇ１５７に記載の方法。
【０６８５】
本明細書で言及される各特許、特許出願、刊行物および文書の全体は、これによって本明細書に参考として援用される。上記特許、特許出願、刊行物および文書の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であるということを許容するものでもなく、これら刊行物または文書の内容または日付に関するいかなる許容をも構成しない。それらの引用は、関連する開示の検索を示すものではない。文書の日付（複数可）または内容に関する全ての陳述は、入手可能な情報に基づき、それらの精度または正確さに関する許容ではない。
【０６８６】
本技術の基本的な態様から逸脱することなく、前述のものに対して改変が行われ得る。本技術は、１つ以上の特定の実施形態に照らして実質的に詳細に説明されてきたが、当業者は、本願において具体的に開示された実施形態に対して変更が行われ得るが、これらの改変および改善が本技術の範囲内および精神内であることを認識する。
【０６８７】
本明細書中に例証的に記載された技術は、本明細書中に具体的に開示されていない任意のエレメント（複数可）の非存在下において、適切に実施され得る。したがって、例えば、本明細書中の各場合において、用語「〜を含む」、「〜から本質的になる」および「〜からなる」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えられてもよい。使用されてきた用語および表現は、限定の用語ではなく説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用は、示されたおよび記載された特徴またはそれらの一部のいかなる等価物も排除せず、特許請求される本技術の範囲内で様々な改変が可能である。エレメントのうちの１つまたはエレメントのうちの２つ以上が記載されていることが文脈から明らかでない限り、用語「ａ」または「ａｎ」は、それが修飾するエレメントのうちの１つまたは複数のことを指し得る（例えば、「試薬（ａ  ｒｅａｇｅｎｔ）」は、１つ以上の試薬を意味し得る）。本明細書中で使用される用語「約」は、基となるパラメータの１０％以内の値（すなわち、プラスまたはマイナス１０％）のことを指し、一続きの値の始めに用語「約」を使用することにより、それらの値の各々が修飾される（すなわち、「約１、２および３」は、約１、約２および約３のことを指す）。例えば、「約１００グラム」という重量は、９０グラム〜１１０グラムの重量を含み得る。さらに、値のリストが、本明細書中に記載されるとき（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）、そのリストには、それらのすべての中間値および分数値（例えば、５４％、８５．４％）が含まれる。したがって、本技術は、代表的な実施形態および随意の特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書中に開示された概念の改変およびバリエーションが、当業者によって用いられることがあり、そのような改変およびバリエーションは、本技術の範囲内であるとみなされると理解されるべきである。
【０６８８】
本技術のある種の実施形態は、以下の特許請求の範囲に示される。
【図１】
0006718444.tif 000045
【図２】
0006718444.tif 000046
【図３】
0006718444.tif 000047
【図４】
0006718444.tif 000048
【図５】
0006718444.tif 000049
【図６】
0006718444.tif 000050
【図７】
0006718444.tif 000051
【図８】
0006718444.tif 000052
【図９】
0006718444.tif 000053
【図１０】
0006718444.tif 000054
【図１１Ａ】
0006718444.tif 000055
【図１１Ｂ】
0006718444.tif 000056
【図１２】
0006718444.tif 000057
【図１３】
0006718444.tif 000058
【図１４】
0006718444.tif 000059
【図１５】
0006718444.tif 000060
【配列表】
0006718444000001.app