(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤添加後の細胞間脂質被験体及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体について示差走査熱量測定を行うことによって、前記薬剤添加後の細胞間脂質被験体と前記薬剤未添加の細胞間脂質被験体との間での前記細胞間脂質の微細構造の薬剤添加前後における変化を評価する方法であり、
前記薬剤添加後の細胞間脂質被験体及び前記薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピークを、非線形最小二乗法により、それぞれ複数の小ピークに分割する、ピーク分割工程と、
前記薬剤添加後の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の前記複数の小ピークと、前記薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の前記複数の小ピークとを比較する、薬剤添加前後比較工程を含み、
前記薬剤添加前後比較工程において、
前記薬剤添加後の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の前記ピークの面積が、前記薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の前記ピークの面積と比較して、大きく、
且つ
前記細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の前記複数の小ピークのうち、直方晶による部分と六方晶による部分との合計に対する直方晶による部分の割合が第１番目に大きいものを第１直方晶主体小ピークとしたときに、前記薬剤添加後の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の前記第１直方晶主体小ピークの面積が、前記薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の前記第１直方晶主体小ピークの面積と比較して、大きい
場合、前記薬剤により前記細胞間脂質被験体のバリア能が向上したと評価する、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法を用いることを特徴とする、薬剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
細胞間脂質サンプル及び細胞間脂質コントロールについて示差走査熱量測定を行うことによって、前記細胞間脂質サンプルにおける細胞間脂質の充填構造における直方晶と六方晶との比率を評価する方法であり、
前記細胞間脂質サンプル及び前記細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定のピークを、非線形最小二乗法により、それぞれ複数の小ピークに分割する、ピーク分割工程と、
前記細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定の前記複数の小ピークと、前記細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定の前記複数の小ピークとを比較する、サンプル−コントロール比較工程と
を含み、
前記サンプル−コントロール比較工程において、
前記細胞間脂質コントロールとして、前記細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定の前記複数の小ピークの面積と比較して小さい示差走査熱量測定の前記複数の小ピークの面積を有するものを選択し、
前記細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定の前記複数の小ピークの面積から、前記細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定の前記複数の小ピークの面積を、減じて得られる前記複数の小ピークの面積を、前記細胞間脂質サンプルにおける六方晶に由来する前記複数の小ピークの面積とみなす、
方法。
【請求項４】
前記細胞間脂質コントロールとして、直方晶と六方晶との比率が８０：２０〜１００：０であるものを選択し、
前記細胞間脂質サンプルにおける直方晶と六方晶との比率は、前記細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定の前記複数の小ピークの面積と、前記細胞間脂質サンプルにおける六方晶に由来する前記複数の小ピークの面積との比率であるとみなす、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞間脂質コントロールの直方晶と六方晶との比率は、広角Ｘ線散乱測定により予め評価する、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞間脂質コントロールを、前記細胞間脂質サンプルに薬剤を与えたものとする、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞間脂質が、脂肪酸、コレステロール、セラミド類の混合物を含む、細胞間脂質モデルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記混合物における混合比が、パルミチン酸：コレステロール：セラミドＡＳ(セラミド５)＝４５〜７５：０〜２５：１０〜５０である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞間脂質サンプル及び細胞間脂質コントロールについて示差走査熱量測定を行うことによって、前記細胞間脂質サンプルにおける細胞間脂質の充填構造における直方晶と六方晶との比率を評価する方法であり、
前記細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定の前記ピークと、前記細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定の前記ピークとを比較する、サンプル−コントロール比較工程と
を含み、
前記サンプル−コントロール比較工程において、
前記細胞間脂質コントロールとして、前記細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定の前記ピークの面積と比較して小さい示差走査熱量測定の前記ピークの面積を有するものを選択し、
前記細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定の前記ピークの面積から、前記細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定の前記ピークの面積を、減じて得られる前記ピークの面積を、前記細胞間脂質サンプルにおける六方晶に由来する前記ピークの面積とみなす、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞間脂質の微細構造を簡便に評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体表面にある細胞間脂質は、細胞どうしを繋ぎとめることで、脂質バリアを構築している。例えば、皮膚表面の角層における角質細胞間脂質は、バリア能により、外部からの異物の侵入を防止すると共に、皮膚内部に水分を維持する役割を担っている。
【０００３】
細胞間脂質の微細構造に関する情報は、生体の診断や薬剤の開発の分野において大きな意義を有しており、細胞間脂質の微細構造を評価する方法が盛んに研究されている。
例えば、特許文献１では、示差走査熱量測定を用いて、角質細胞間脂質の構造の破壊を評価する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−２３７０９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、示差走査熱量測定を用いた上記従来の方法では、細胞間脂質のラメラ構造や充填構造等の微細構造について評価することができていないという問題があった。
【０００６】
そこで、本発明は、細胞間脂質の微細構造を簡便に評価することが可能な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
細胞間脂質の微細構造を評価する方法としては、様々な手法があるが、その代表例として、Ｘ線回折（ＸＲＤ）測定、より詳細には、小角・広角Ｘ線散乱（ＳＷＡＸＳ）測定が挙げられる。小角Ｘ線散乱測定では、主として細胞間脂質のラメラ構造に関する情報が得られ、広角Ｘ線散乱測定では、主として細胞間脂質の充填構造に関する情報が得られるとされている。
【０００８】
図１（ａ）に、ある対象の示差走査熱量測定の結果を模式的に示し、図１（ｂ）に、（ａ）に示す示差走査熱量測定のピークを非線形最小二乗法によるカーブフィッティングにより分割した３つの小ピーク（Ａ）〜（Ｃ）を模式的に示す。図中、「×」は小ピーク（Ａ）〜（Ｃ）のピークトップを示し、それぞれのピークトップの位置における温度をＳ１〜Ｓ３で示す。
図２（ａ）に、ある対象の小角Ｘ線散乱測定の結果を示し、図２（ｂ）に、ある対象の広角Ｘ線散乱測定の結果を示す。
図２（ａ）中、「×」は、ピーク（Ｘ）〜（Ｚ）のピーク位置（それぞれ、０．２７ｎｍ-1、０．２３ｎｍ-1、０．２２ｎｍ-1）を示し、それぞれの位置における温度Ｔ１〜Ｔ３は相転移温度を示す。
図２（ｂ）中、「×」は、２５℃における、ピーク（Ｖ）、（Ｗ）のピーク位置（それぞれ、２．４ｎｍ-1、２．７ｎｍ-1）を示す。なお、２．４ｎｍ-1のピーク（Ｖ）は、六方晶及び斜方晶に由来するもの、２．７ｎｍ-1のピーク（Ｗ）は、斜方晶に由来するものである。また、ピーク（Ｖ）の散乱強度を（Ｓｖ）、ピーク（Ｗ）の散乱強度を（Ｓｗ）としたときに、斜方晶の斜方晶と六方晶との合計に対する割合（％）は、［Ｓｗ／｛（Ｓｖ−２×Ｓｗ）／３＋Ｓｗ｝］×１００で算出される。
【０００９】
これまでに、示差走査熱量測定のピークの面積と、小角Ｘ線散乱測定の回折ピークの強度の積分値とは、相関を有する、具体的には、前者が増加・減少するに従って後者も増加・減少する、ことが知られており、これに基づいて、示差走査熱量測定のピークの面積からラメラ構造の絶対量（斜方晶と六方晶との合計の絶対量）を評価することができることが知られている（図１（ａ）、図２（ａ）参照）。
【００１０】
今回、発明者らは、対象の示差走査熱量測定のピークを非線形最小二乗法によるカーブフィッティングにより複数の小ピークに分割するという新規な手法を試みたところ、この分割された小ピーク（Ａ）〜（Ｃ）のピーク位置におけるそれぞれの温度（図１（ｂ）中、Ｓ１〜Ｓ３にて示す）と、対象の温度走査小角Ｘ線散乱測定による回折ピーク（Ｘ）〜（Ｚ）のピーク位置における温度（図２（ａ）中、Ｔ１〜Ｔ３にて示す）とが、相関を有する、具体的には、上記温度Ｓ１〜Ｓ３が、それぞれＴ１〜Ｔ３と極めて近い値である、ことを見出した（図１（ｂ）、図２（ａ）参照）。
この発見により、示差走査熱量測定のピークから、ラメラ構造の全体量等といった微細構造の概要に留まらず、斜方晶と六方晶との比率等といった微細構造の詳細にまで至る情報が得られる可能性が示された。
【００１１】
その後、発明者らの研究により、特に、対象の温度走査小角Ｘ線散乱測定による回折ピーク（Ｙ）は、脂肪酸、コレステロール、セラミド類から構成されるラメラ構造に由来するものであると推測されるようになった。
【００１２】
そこで、発明者らは、示差走査熱量測定のピークから、例えば、広角Ｘ線散乱測定から得られる情報である、細胞間脂質の微細構造（例えば、斜方晶と六方晶との比率等）に関する情報が得られる可能性があることに想到し、本発明を完成させるに至った（図１（ｂ）、図２（ｂ）参照）。
【００１３】
本発明の要旨は以下の通りである。
なお、本願明細書において、「斜方晶」と「直方晶」とは同義である。
本発明の方法の一態様では、薬剤添加後の細胞間脂質被験体及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体について示差走査熱量測定を行うことによって、前記薬剤添加後の細胞間脂質被験体と前記薬剤未添加の細胞間脂質被験体との間での前記細胞間脂質の微細構造の薬剤添加前後における変化を評価する。
本発明の方法は、前記薬剤添加後の細胞間脂質被験体及び前記薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピークを、非線形最小二乗法により、それぞれ複数の小ピークに分割する、ピーク分割工程を含む。本発明の方法は、前記薬剤添加後の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の前記複数の小ピークと、前記薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の前記複数の小ピークとを比較する、薬剤添加前後比較工程を含む。
本発明の方法では、前記薬剤添加前後比較工程において、前記薬剤添加後の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の前記ピークの面積が、前記薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の前記ピークの面積と比較して、大きく、且つ前記細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の前記複数の小ピークのうち、直方晶による部分と六方晶による部分との合計に対する直方晶による部分の割合が第１番目に大きいものを第１直方晶主体小ピークとしたときに、前記薬剤添加後の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の前記第１直方晶主体小ピークの面積が、前記薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の前記第１直方晶主体小ピークの面積と比較して、大きい場合、前記薬剤により前記細胞間脂質被験体のバリア能が向上したと評価してよい。
【００１４】
本発明の方法の更なる態様は、上記本発明の方法の一態様の方法を用いる、薬剤のスクリーニング方法である。
【００１５】
本発明の方法の別の態様では、細胞間脂質サンプル及び細胞間脂質コントロールについて示差走査熱量測定を行うことによって、前記細胞間脂質サンプルにおける細胞間脂質の充填構造における直方晶と六方晶との比率を評価する。
本発明の方法は、前記細胞間脂質サンプル及び前記細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定のピークを、非線形最小二乗法により、それぞれ複数の小ピークに分割する、ピーク分割工程を含む。本発明の方法は、前記細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定の前記複数の小ピークと、前記細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定の前記複数の小ピークとを比較する、サンプル−コントロール比較工程を含む。
本発明の方法では、前記サンプル−コントロール比較工程において、前記細胞間脂質コントロールとして、前記細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定の前記複数の小ピークの面積と比較して小さい示差走査熱量測定の前記複数の小ピークの面積を有するものを選択し、前記細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定の前記複数の小ピークの面積から、前記細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定の前記複数の小ピークの面積を、減じて得られる前記複数の小ピークの面積を、前記細胞間脂質サンプルにおける六方晶に由来する前記複数の小ピークの面積とみなしてよい。
本発明の方法の別の態様では、前記細胞間脂質が、脂肪酸、コレステロール、セラミド類の混合物を含む、細胞間脂質モデルであることが好ましい。
【００１６】
本発明の方法では、パルミチン酸、コレステロール、セラミドＡＳ（セラミド５）の混合物からなる、細胞間脂質モデルであることが更に好ましい。本発明の方法では、前記混合物における混合比が、パルミチン酸：コレステロール：セラミドＡＳ（セラミド５）＝４５〜７５：０〜２５：１０〜５０であることが好ましく、パルミチン酸：コレステロール：セラミドＡＳ（セラミド５）＝５５〜６５：１０〜１５：２０〜４０であることが特に好ましい。
【００１７】
本発明の方法の更なる態様は、細胞間脂質サンプル及び細胞間脂質コントロールについて示差走査熱量測定を行うことによって、前記細胞間脂質サンプルにおける細胞間脂質の充填構造における直方晶と六方晶との比率を評価する。
本発明の方法では、前記細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定の前記ピークと、前記細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定の前記ピークとを比較する、サンプル−コントロール比較工程を含む。本発明の方法では、前記サンプル−コントロール比較工程において、前記細胞間脂質コントロールとして、前記細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定の前記ピークの面積と比較して小さい示差走査熱量測定の前記ピークの面積を有するものを選択し、前記細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定の前記ピークの面積から、前記細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定の前記ピークの面積を、減じて得られる前記ピークの面積を、前記細胞間脂質サンプルにおける六方晶に由来する前記ピークの面積とみなしてよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の方法によれば、細胞間脂質の微細構造の詳細を簡便に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】（ａ）は、ある対象の示差走査熱量測定の結果を模式的に示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示す示差走査熱量測定のピークを非線形最小二乗法によるカーブフィッティングにより分割した３つの小ピーク（Ａ）〜（Ｃ）を模式的に示す図である。図中、「×」は小ピーク（Ａ）〜（Ｃ）のピークトップを示し、それぞれのピークトップの位置における温度をＳ１〜Ｓ３で示す。
【図２】（ａ）は、ある対象の小角Ｘ線散乱測定の結果を示す図であり、（ｂ）は、ある対象の広角Ｘ線散乱測定の結果を示図である。（ａ）中、「×」はピーク（Ｘ）〜（Ｚ）のピーク位置（それぞれ、０．２７ｎｍ-1、０．２３ｎｍ-1、０．２２ｎｍ-1）を示し、それぞれの位置における温度Ｔ１〜Ｔ３は相転移温度を示す。（ｂ）中、「×」は、２５℃における、ピーク（Ｖ）、（Ｗ）のピーク位置（それぞれ、２．４ｎｍ-1、２．７ｎｍ-1）を示す。
【図３】本発明の実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法を示す概略図である。
【図４】本発明の第一実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法を示す概略図である。
【図５】第一実施形態の方法の一例である実施例の方法における、細胞間脂質サンプル（細胞間脂質モデル）、及び細胞間脂質コントロール（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）の示差走査熱量測定の結果を、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つの小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して示す図である。
【図６】第一実施形態の方法の好適な形態において、細胞間脂質サンプル（細胞間脂質モデル）のピーク及び／又は複数の小ピークと、細胞間脂質コントロール（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）のピーク及び／又は複数の小ピークとを、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つの小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して比較した結果を示す図である。
【図７】第一実施形態の方法の一例である実施例の方法における、細胞間脂質コントロール（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）について、微細構造の詳細を既知とするための広角Ｘ線散乱測定の結果を示す図である。なお、細胞間脂質サンプルについては広角Ｘ線散乱測定を行っていない。
【図８】第一実施形態の方法のより好適な形態において、細胞間脂質サンプル（細胞間脂質モデル）のピーク及び／又は複数の小ピークと、細胞間脂質コントロール（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）のピーク及び／又は複数の小ピークとを、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つ小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して比較した結果を示す図である。
【図９】第一実施形態の方法のより好適な形態により得られる結果の概略を示す図である。
【図１０】第一実施形態の方法の一例である実施例の方法における、細胞間脂質サンプル（細胞間脂質モデル）について、微細構造の詳細を確認するための広角Ｘ線散乱測定の結果を示す図である。
【図１１】本発明の第二実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法を示す概略図である。
【図１２】第二実施形態の方法の一例である実施例の方法における、薬剤添加後の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）、及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデル）の示差走査熱量測定の結果を、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つ小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して示す図である。
【図１３】第二実施形態の方法の好適な形態において、薬剤添加後の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）のピーク及び／又は複数の小ピークと、薬剤未添加の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデル）のピーク及び／又は複数の小ピークとを、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つの小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して比較した結果を示す図である。
【図１４】第二実施形態の方法の一例である実施例の方法における、バリア能を向上させるのに適した薬剤（Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン）添加後の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデル）について、微細構造の詳細を確認するための広角Ｘ線散乱測定の結果を示す図である。
【図１５】バリア能を向上させるのに適した薬剤（Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン）添加前後の角層シートについての広角Ｘ線散乱測定の結果を斜方晶及び六方晶の散乱強度について示す図である。
【図１６】バリア能を向上させるのに適した薬剤（Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン）添加前後の角層シートについての広角Ｘ線散乱測定の結果を斜方晶と六方晶との比率について示す図である。
【図１７】第二実施形態の方法の一例である実施例の方法における、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン以外のアミノ酸添加後の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデル）について、微細構造の詳細を確認するための広角Ｘ線散乱測定の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、図面を参照して、本発明の細胞間脂質の微細構造を評価する方法の実施形態について詳細に例示説明する。
【００２１】
本発明の実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法（以下、「本実施形態の方法」ともいう。）は、示差走査熱量測定（以下、「ＤＳＣ測定」ともいう）によるものである。
【００２２】
本実施形態の方法では、ＤＳＣ測定の結果とＸＲＤ測定の結果との間の関係性についての前述の知見に基づいて、興味の対象について小角・広角Ｘ線散乱（ＳＷＡＸＳ）測定を行うことを必須とすることなく、興味の対象について示差走査熱量測定を行うことによって、細胞間脂質の微細構造を評価することができ、ひいては、多数の興味の対象について簡便に細胞間脂質の微細構造を評価することを可能にする。
【００２３】
また、本実施形態の方法によれば、細胞間脂質の微細構造の詳細を評価することが可能となる。
更に、本実施形態の方法によれば、細胞間脂質の微細構造を薬剤の添加前後における変化を評価することが可能となる。これにより、細胞間脂質の充填構造に影響を与える化粧料・薬剤をスクリーニングすることができ、細胞間脂質の充填構造を緩める成分であるか、充填構造を密にする成分であるかを評価することができる。ひいては、角層のバリアをコントロールすること、化粧料に配合される有効成分の経皮吸収を高めることも可能となる。また、有効成分を投与した後のステップにおいて充填構造を密にする成分を使用することによって、角層における経皮水分蒸散量を低く保ち、皮膚の恒常性を維持することも可能となる。
【００２４】
本実施形態の方法を適用することが可能な細胞間脂質としては、皮膚の角質、毛髪内部の細胞膜複合体（ＣＭＣ（Ｃｅｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ））部分、更に詳細には、キューティクルＣＭＣ（ＣＵ−ＣＵ）、キューティクル−コルテックス間ＣＭＣ（ＣＵ−ＣＯ）、コルテックス−コルテックス間ＣＭＣ（ＣＯ−ＣＯ）、これらのモデル系（後述）等が挙げられ、特に、脂質濃度が高い状態で示差走査熱量測定を行うことができ、ピーク検出が容易であるため、モデル系が好ましい。
【００２５】
そして、本実施形態の方法では、複数の対象について示差走査熱量測定を行うことが好ましい。対象を複数とすることによって、示差走査熱量測定の結果を対象間で比較することができ、細胞間脂質の微細構造について詳細な知見を得ることが可能となる。
ここで、複数の対象とは２つ以上の対象をいい、対象は３つ以上であることが好ましい。
【００２６】
図３に、本発明の実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法の概略図を示す。
【００２７】
本実施形態の方法は、まず、複数の対象（図３では、対象Ａ及び対象Ｂ）について示差走査熱量測定を行う（ＤＳＣ測定工程）。
【００２８】
本実施形態の方法は、次いで、複数の対象の示差走査熱量測定のピークを、非線形最小二乗法により、それぞれ複数の小ピークに分割する（ピーク分割工程）。
ここで、複数の小ピークとは２つ以上の小ピークをいい、小ピークは３つ以上であることが好ましい。
この工程は、例えば、コンピュータ等の計算機器を用いて行ってよい。
非線形最小二乗法において、ピーク形状に対するカーブフィッティングに用いられる関数としては、例えば、ガウス関数、ローレンツ関数、これら２つを畳み込んだフォークト関数等が挙げられ、特に、ガウス関数、ローレンツ関数とすることが好ましい。
ピーク解析用ソフトとしては、例えば、Ｏｒｉｇｉｎ等が挙げられる。
該解析ソフトに搭載されるアルゴリズムとしては、例えば、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭＡ）等が挙げられる。
【００２９】
本実施形態の方法は、続いて、複数の対象のうちの一方の示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークと、これらのピークに対応する、複数の対象のうちの他方の示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークとを比較する（比較工程）。
この工程は、ピーク及び／又は複数の小ピークどうしで、その面積やピーク位置等を比較してよい。
【００３０】
ここで、前述の複数の対象としては、特に限定されないが、比較検討され得るものが好ましく、例えば、細胞間脂質サンプル及び細胞間脂質コントロール、薬剤添加後の細胞間脂質被験体及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体、美肌から採取した角層及び荒れ肌から採取した角層、健常毛髪及びダメージ毛髪等が挙げられる。
【００３１】
これらの複数の対象では、他方を一方に薬剤を与えたものとしてもよい。
なお、薬剤とは、細胞間脂質の微細構造（ラメラ構造、充填構造）に変化を与え得るものをいい、通常、化粧料等に配合する成分等であれば特に限定されるものではなく、例えば、美白成分や抗肌荒れ成分、保湿成分等の有効成分等が挙げられる。
【００３２】
（第一実施形態）
図４に、本発明の第一実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法の概略図を示す。
本発明の第一実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法（以下、「第一実施形態の方法」ともいう。）は、前述の複数の対象を、細胞間脂質サンプル及び細胞間脂質コントロールとし、細胞間脂質サンプルにおける細胞間脂質の微細構造の詳細を評価するものである。
なお、細胞間脂質サンプルとは、微細構造の詳細を評価する対象となる細胞間脂質を指し、細胞間脂質コントロールとは、該細胞間脂質サンプルに対する比較対象となる細胞間脂質を指す。
【００３３】
ここで、第一実施形態の方法の一例である実施例の方法（後述）では、細胞間脂質の微細構造の詳細を、細胞間脂質の充填構造における斜方晶と六方晶との比率としている。
【００３４】
また、この実施例の方法では、細胞間脂質サンプルを細胞間脂質モデルとして、細胞間脂質コントロールを該細胞間脂質モデルに薬剤（エタノール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール（１，３−ＢＧ）、これらの混合物）を添加したものとしている。
【００３５】
第一実施形態の方法では、まず、細胞間脂質サンプル及び細胞間脂質コントロールについて示差走査熱量測定を行う（ＤＳＣ測定工程）。
【００３６】
次いで、細胞間脂質サンプル及び細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定のピークを、非線形最小二乗法により、それぞれ複数の小ピークに分割する（ピーク分割工程）。
ここに示す例では、細胞間脂質モデル及び細胞間脂質モデルに薬剤を添加したもののＤＳＣピークを、第１ピーク、中間ピーク、第２ピークの３つの小ピークに分割している（図４参照）。
【００３７】
図５に、第一実施形態の方法の一例である実施例の方法における、細胞間脂質サンプル（細胞間脂質モデル）、及び細胞間脂質コントロール（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）の示差走査熱量測定の結果を、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つの小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して示す。
【００３８】
第一実施形態の方法では、続いて、細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークと、細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークとを比較する（サンプル−コントロール比較工程）。
ここに示す例では、細胞間脂質モデルのＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる第１ピーク、中間ピーク、第２ピークと、該細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもののＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる第１ピーク、中間ピーク、第２ピークのそれぞれとを比較している（図６、図８参照）。
【００３９】
特に、第一実施形態の方法の好適な形態では、前述のサンプル−コントロール比較工程において下記の通りとしてよい。
【００４０】
図６に、第一実施形態の方法の好適な形態において、細胞間脂質サンプル（細胞間脂質モデル）のピーク及び／又は複数の小ピークと、細胞間脂質コントロール（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）のピーク及び／又は複数の小ピークとを、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つ小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して比較した結果を示す。
【００４１】
この好適な形態では、まず、細胞間脂質コントロールとして、細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークの面積と比較して小さい示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークの面積を有するものを選択する。
ここに示す例では、細胞間脂質モデルに薬剤（エタノール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール（１，３−ＢＧ）、これらの混合物）を添加した細胞間脂質モデルの全てのＤＳＣピークの面積が、細胞間脂質モデルのＤＳＣピークの面積と比較して小さくなっている（図６参照）。これに基づいて、細胞間脂質コントロールとして、上記薬剤を添加した細胞間脂質モデルの全てを選択している。
【００４２】
そして、この好適な形態では、細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークの面積から、細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークの面積を、減じて得られるピーク及び／又は複数の小ピークの面積を、細胞間脂質サンプルにおける六方晶に由来するピーク及び／又は複数の小ピークの面積とみなす。
ここに示す例では、細胞間脂質モデルの第１ピーク、中間ピーク、第２ピークのそれぞれの面積から、細胞間脂質モデルに各薬剤を添加した細胞間脂質モデルの第１ピーク、中間ピーク、第２ピークのそれぞれの面積を減じて得られる小ピークの面積、すなわち、図６中に破線にて示した部分に係るピークの面積を、細胞間脂質モデルにおける六方晶に由来するピークの面積とみなしている。
【００４３】
上記の第一実施形態の方法の好適な形態は、細胞間脂質においてラメラ構造が失われるとき、斜方晶に優先して六方晶が失われていく、すなわち、斜方晶の絶対量は大きく変動せず、場合によっては維持されながら、六方晶の絶対量が減少する、という発明者らの知見に基づくものである。上記知見は、言い換えれば、ある対象が別の対象と比較してそのラメラ構造が少ないとき、当該ある対象では、斜方晶よりもむしろ六方晶が少ない、すなわち、斜方晶の絶対量は上記の別の対象と比較してほぼ同じでありながら、斜方晶の絶対量は上記の別の対象と比較して少ない、ということも意味する。
【００４４】
ここで、第一実施形態の方法では、評価の精度を高める観点から、細胞間脂質コントロールについて、微細構造の詳細が既知である、この場合、充填構造における斜方晶と六方晶との比率が既知であることが好ましい場合がある。
充填構造における斜方晶と六方晶との比率は、前述の小角・広角Ｘ線散乱（ＳＷＡＸＳ）測定等の公知の手法により、既知とすることができる。
【００４５】
図７に、第一実施形態の方法の一例である実施例の方法における、細胞間脂質コントロール（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）について、微細構造の詳細を既知とするための広角Ｘ線散乱測定の結果を示す。なお、細胞間脂質サンプルについては広角Ｘ線散乱測定を行っていない。
【００４６】
また、第一実施形態の方法のより好適な形態では、前述の第一実施形態の方法の好適な形態において下記の通りとしてよい。
【００４７】
図８に、第一実施形態の方法のより好適な形態において、細胞間脂質サンプル（細胞間脂質モデル）のピーク及び／又は複数の小ピークと、細胞間脂質コントロール（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）のピーク及び／又は複数の小ピークとを、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つ小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して比較した結果を示す。
【００４８】
このより好適な形態では、まず、細胞間脂質コントロールとして、斜方晶と六方晶との比率が８０：２０〜１００：０であるものを選択する。
ここに示す例では、細胞間脂質コントロールとして、斜方晶と六方晶との比率が９０：１０である、細胞間脂質モデルにグリセリンを添加した細胞間脂質モデルを選択している。
【００４９】
そして、このより好適な形態では、細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークの面積は、（実質的に）細胞間脂質サンプルにおける斜方晶に由来するピーク及び／又は複数の小ピークの面積とみなすことができることに基づいて、細胞間脂質サンプルにおける斜方晶と六方晶との比率は、細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークの面積と、細胞間脂質サンプルにおける六方晶に由来するピーク及び／又は複数の小ピークの面積との比率であるとみなす。
ここに示す例では、グリセリンを添加した細胞間脂質モデルのＤＳＣピークの面積が、細胞間脂質モデルに斜方晶に由来するピークの面積とみなすことができることに基づいて、細胞間脂質モデルにおける斜方晶と六方晶との比率は、グリセリンを添加した細胞間脂質モデルのＤＳＣピークの面積、すなわち、図８中に黒色にて示した部分に係るピークの面積と、細胞間脂質モデルのＤＳＣピークの面積から、グリセリンを添加した細胞間脂質モデルのＤＳＣピークの面積を減じて得られる小ピークの面積、すなわち、図８中に破線にて示した部分に係るピークの面積との比率であるとみなしている。
【００５０】
なお、ここに示す例では、細胞間脂質モデルのみならず、細胞間脂質モデルにグリセリン以外の薬剤を添加したものも、細胞間脂質サンプルとして、同様に、斜方晶と六方晶との比率を求めている（図８参照）。
【００５１】
上記の第一実施形態の方法のより好適な形態は、細胞間脂質コントロールとして、充填構造が実質的に全て斜方晶であるものを選択する点に特徴を有している。
【００５２】
図９に、第一実施形態の方法のより好適な形態により得られる結果の概略を示す。
ここに示す例では、図９中に囲み線にて示す通り、細胞間脂質モデルにおける斜方晶と六方晶との比率を求めることができる。
【００５３】
（第二実施形態）
図１１に、本発明の第二実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法の概略図を示す。
本発明の第二実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法（以下、「第二実施形態の方法」ともいう。）は、複数の対象を、薬剤添加後の細胞間脂質被験体及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体とし、薬剤添加後の細胞間脂質被験体と薬剤未添加の細胞間脂質被験体との間での細胞間脂質の微細構造の薬剤添加前後における変化を評価するものである。
なお、細胞間脂質被験体とは、微細構造の薬剤添加前後における変化を評価する対象となる細胞間脂質を指す。
【００５４】
ここで、第二実施形態の方法の一例である実施例の方法（後述）では、薬剤として、前述の第一実施形態の方法でも用いたエタノール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール（１，３−ＢＧ）、これらの混合物、及びＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンとしている。
【００５５】
第二実施形態の方法では、まず、薬剤添加後の細胞間脂質被験体及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体について示差走査熱量測定を行う（ＤＳＣ測定工程）。
【００５６】
第二実施形態の方法では、次いで、薬剤添加後の細胞間脂質被験体及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピークを、非線形最小二乗法により、それぞれ複数の小ピークに分割する（ピーク分割工程）。
ここに示す例では、薬剤添加後の細胞間脂質被験体及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体のＤＳＣピークを、第１ピーク、中間ピーク、第２ピークに分割している（図１１参照）。
【００５７】
図１２に、第二実施形態の方法の一例である実施例の方法における、薬剤添加後の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）、及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデル）の示差走査熱量測定の結果を、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つ小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して示す。
【００５８】
第二実施形態の方法では、続いて、薬剤添加後の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークと、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークとを比較する（薬剤添加前後比較工程）。
ここに示す例では、薬剤未添加の細胞間脂質被験体のＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる第１ピーク、中間ピーク、第２ピークと、薬剤添加後の細胞間脂質被験体のＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる第１ピーク、中間ピーク、第２ピークのそれぞれとを比較している（図１３参照）。
【００５９】
特に、第二実施形態の方法の好適な形態では、薬剤により細胞間脂質被験体のバリア能が向上したかどうかを評価することを目的として、前述の薬剤添加前後比較工程において、下記の通りとしてよい。
【００６０】
より詳細には、薬剤添加前後比較工程において、下記（Ａ）及び（Ｂ）の条件を満たす場合に、薬剤により細胞間脂質被験体のバリア能が向上したと評価する。
（Ａ）薬剤添加後の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピークの面積が、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピークの面積と比較して、大きい。
（Ｂ）細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の複数の小ピークのうち、斜方晶による部分と六方晶による部分との合計における斜方晶による部分の割合が第１番目に大きいものを第１斜方晶主体小ピークとしたときに、薬剤添加後の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の第１斜方晶主体小ピークの面積が、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の第１斜方晶主体小ピークの面積と比較して、大きい。
【００６１】
ここで、上記（Ａ）の点は、ＤＳＣピークの面積とラメラ構造の絶対量との間に相関があるという公知の事実（例えば、Ｎｅｔｓｕ  Ｓｏｋｕｔｅｉ  ３４  （４）  １５９−１６６参照）に基づくものである。
上記（Ａ）の条件を満たす場合には、薬剤添加後に細胞間脂質被験体におけるラメラ構造の絶対量が増大したことを意味する。
【００６２】
また、上記（Ｂ）の点は、示差走査熱量測定のピーク全体における斜方晶と六方晶との比率と、示差走査熱量測定のピークを分割して得られる各小ピークにおける斜方晶と六方晶との比率は、必ずしも一致するものではなく、ピーク全体における斜方晶と六方晶との比率と比較して大きい比率を有する小ピーク、及びピーク全体における斜方晶と六方晶との比率と比較して小さい比率を有する小ピークが存在するという、発明者らの新たな知見に基づくものである。
【００６３】
そして、上記（Ｂ）の点における第１斜方晶主体小ピークは、薬剤未添加の細胞間脂質被験体について公知の手法を用いることによって、定めてよく、例えば、薬剤未添加の細胞間脂質被験体を細胞間脂質サンプルとし、グリセリンを添加した細胞間脂質被験体を細胞間脂質コントロールとして、前述の第一実施形態の方法のより好適な形態を用いることによって、定めることができる。
すなわち、まず、図１３に示す通り、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の複数の小ピークにおける斜方晶による部分と六方晶による部分との比率を、それぞれ、薬剤添加後の細胞間脂質被験体の複数の小ピークにおける斜方晶による部分の面積と、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の複数の小ピークの面積から、薬剤添加後の細胞間脂質被験体の複数の小ピークにおける斜方晶による部分の面積を減じて得られる小ピークの面積との比率とみなす。
ここに示す例では、薬剤未添加の細胞間脂質モデルの第１ピーク、中間ピーク、第２ピークにおける斜方晶による部分と六方晶による部分との比率を、それぞれ、グリセリンを添加した細胞間脂質モデルの第１ピーク、中間ピーク、第２ピークにおける斜方晶による部分の面積（図１３中、黒色にて示す）と、薬剤未添加の細胞間脂質モデルの第１ピーク、中間ピーク、第２ピークの面積から、グリセリンを添加した細胞間脂質モデルの第１ピーク、中間ピーク、第２ピークにおける斜方晶による部分の面積を減じて得られる第１ピーク、中間ピーク、第２ピークの面積（図１３中、破線にて示す）との比率とみなす。
次いで、細胞間脂質被験体における上記の複数の小ピークのうち斜方晶による部分と六方晶による部分との合計における斜方晶による部分の割合が第１番目に大きいものを第１斜方晶主体小ピークと定める。
ここに示す例では、細胞間脂質モデルの第１ピーク、中間ピーク、第２ピークのうち斜方晶による部分と六方晶による部分との合計における斜方晶による部分の割合が第１番目に大きい中間ピークを第１斜方晶主体小ピークと定めている。
【００６４】
ここに示す例での第二実施形態の方法の好適な形態では、図１３に示す通り、
（Ａ）について、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンを添加した細胞間脂質モデルの示差走査熱量測定のピークの面積が、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピークの面積と比較して、大きくなっている。
また、図１３に示す通り、
（Ｂ）について、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンを添加した細胞間脂質モデルの示差走査熱量測定の第１ピーク、中間ピーク、第２ピークのうち斜方晶と六方晶との合計における斜方晶による部分の割合が第１番目に大きい中間ピークが、斜方晶主体小ピークとなり、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン添加後の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の中間ピークの面積が、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の中間ピークの面積と比較して、大きくなっている。
上記の通り、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンを添加した細胞間脂質モデルは、（Ａ）及び（Ｂ）の条件を満たすため、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンにより細胞間脂質被験体のバリア能が向上したと評価している。そして、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンを細胞間脂質被験体のバリア能を向上させるのに適した薬剤と評価することができる。
【００６５】
なお、第二実施形態の方法の好適な形態では、前述の薬剤添加前後比較工程において、前述の（Ａ）又は（Ｂ）（（Ａ）及び（Ｂ）のいずれか一方）を満たさない場合に、薬剤により細胞間脂質被験体のバリア能が向上しないと評価してもよい。
【００６６】
ここに示す例では、図１３に示す通り、
グリセリンを添加した細胞間脂質モデルの示差走査熱量測定のピークの面積が、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピークの面積と比較して、小さくなっており、前述の（Ａ）を満たしていない。よって、グリセリンにより細胞間脂質被験体のバリア能が向上しないと評価している。そして、グリセリンを細胞間脂質被験体のバリア能を向上させるのに適しない薬剤と評価することができる。
また、グリセリンの場合と同様に、エタノール、１，３−ブチレングリコール（１，３−ＢＧ）、これらとグリセリンとの混合物についても、前述の（Ａ）を満たしておらず、これらの薬剤を細胞間脂質被験体のバリア能を向上させるのに適しない薬剤と評価することができる。
【００６７】
また、第二実施形態の方法の好適な形態では、前述の（Ｂ）の条件を下記の（Ｂ’）の条件としてもよい。
（Ｂ’）細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の複数の小ピークのうち、斜方晶による部分と六方晶による部分との合計における斜方晶による部分の割合が、細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピーク全体における斜方晶と六方晶との合計における斜方晶による部分の割合と比較して大きいものを斜方晶主体小ピークとしたときに、薬剤添加後の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の斜方晶主体小ピークの面積が、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の斜方晶主体小ピークの面積と比較して、大きい。
ここで、斜方晶主体小ピークは、１つでも複数でもよい。
また、斜方晶主体小ピークにおける斜方晶による部分と六方晶による部分との合計における斜方晶による部分の割合は、用いる細胞間脂質被験体に依存して定められる。
例えば、ピーク全体における上記割合が２８％であり、３つの小ピークにおける上記割合が４５％、３０％、２５％である場合には、４５％の割合を有する小ピーク及び３０％の割合を有する小ピークを、斜方晶主体小ピークとしてよい。
上記比率としては、例えば、０：１００〜５０：５０としてもよく、また、５０：５０〜１００：０としてもよく、７０：３０〜１００：０としてもよい。
【００６８】
上記本発明の第二実施形態の方法は、細胞間脂質被験体のバリア能を向上させるのに適切した又は適しない薬剤をスクリーニングするために用いることができる。すなわち、本発明は、本発明の第二実施形態の方法を用いる、薬剤のスクリーニング方法を提供することもできる。
【００６９】
本発明の実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法において好適に用いられる細胞間脂質モデルとしては、斜方晶と六方晶とを形成させる観点から、脂肪酸、コレステロール、セラミド類の混合物を含むものが好ましく、該混合物からなるものが更に好ましい。
【００７０】
細胞間脂質モデルに用いられる脂肪酸としては、炭素数１４〜２２の飽和又は不飽和脂肪酸が好ましく、炭素数１６〜１８のものが更に好ましい。より具体的には、脂肪酸としては、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸が好ましい。脂肪酸として、これらの塩を用いてもよい。
【００７１】
細胞間脂質モデルに用いられるセラミド類とは、スフィンゴイド類と脂肪酸とがアミド結合した構造を基本構造として有する化合物（以下、「基本セラミド」とも称する）、上記基本セラミドの誘導体（以下、「セラミド誘導体」とも称する）、上記基本セラミド及びその誘導体を模倣して合成された類縁体（以下、「セラミド類似体」とも称する）、スフィンゴイド類を指す。
本発明におけるセラミド類は、合成物、天然物（例えば、植物抽出物）等の由来を問わない。
【００７２】
−−基本セラミド−−
基本セラミドが有する基本構造としては、下記式（Ｓ１）に示す構造が挙げられる。
【化１】
0006692673.tif 000002
なお、上記式（Ｓ１）に示す基本セラミドのうち、セラミド１〜セラミド１０は、特に、ヒトの角質層に含まれるセラミド（肌セラミド）である。
また、実際には、ヒトやそれ以外の動物等に由来するセラミドの中には、上記式（Ｓ１）中に示されるスフィンゴイド類及び脂肪酸のアルキル鎖長に関して様々な変形例が存在する。上記基本セラミドには、アルキル鎖長以外について上記式（Ｓ１）中に示す化合物と同じ骨格を有する化合物も含まれるものとする。
更に、上記基本セラミドとしては、天然型（Ｄ（−）体）の光学活性体を用いても、非天然型（Ｌ（＋）体）の光学活性体を用いても、更に、天然型と非天然型との混合物を用いてもよい。上記基本セラミドの構造中の複数の不斉炭素についての相対立体配置は、天然型の立体配置のものでも、それ以外の非天然型の立体配置のものでもよく、また、これらの混合物によるものでもよい。
【００７３】
セラミド類に含まれるスフィンゴイド類部分としては、天然型スフィンゴシン及びその類縁体が挙げられる。天然型スフィンゴシンとしては、具体的には、スフィンゴシン、スフジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、６−ヒドロキシスフィンゴシン（以上、上記式（Ｓ１）に示す）、スフィンガジエニン、デヒドロスフィンゴシン、デヒドロフィトスフィンゴシン、並びにこれらのＮ−アルキル化体（例えばＮ−メチル化体）及びアセチル化体等の誘導体等が挙げられ、スフィンゴシンが好ましい。
セラミド類に含まれる脂肪酸部分としては、炭素数１４〜３４の、ヒドロキシル基を有しない飽和又は不飽和脂肪酸、α−ヒドロキシ脂肪酸、ω−ヒドロキシ脂肪酸、及びこれらの誘導体等が挙げられ、炭素数１４〜３４のα−ヒドロキシ脂肪酸が好ましい。
セラミド類に含まれるスフィンゴイド類部分及び脂肪酸部分は、合成物、天然物（例えば、植物抽出物）等の由来を問わない。
【００７４】
−−セラミド誘導体−−
セラミド誘導体としては、糖類により分子内で修飾されたセラミド化合物（以下、「糖セラミド」とも称する）等が挙げられる。糖セラミドに用いられる糖類としては、例えば、グルコース、ガラクトース等の単糖類；ラクトース、マルトース等の二糖類；これらの単糖類や二糖類がグルコシド結合により高分子化されているオリゴ糖類や多糖類等が挙げられる。また、別のセラミド誘導体として、上記糖セラミドにおいて、糖類の糖単位に含まれるヒドロキシル基が他の官能基で置換されている糖類類縁体により分子内で修飾されたセラミド化合物（以下、「糖セラミド類縁体」とも称する）も挙げられる。糖セラミド類縁体に用いられる糖類類縁体としては、例えば、グルコサミン、グルクロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン等が挙げられる。
糖セラミド及び糖セラミド類縁体における糖単位の数は、組成物中における分散安定性の観点から、１〜５であることが好ましく、１又は２（糖セラミドの場合、糖類がそれぞれ、グルコース又はラクトース）であることがより好ましく、１であることが特に好ましい。
糖セラミド及び糖セラミド類縁体は、化学的合成により入手してもよく、市販品の購入により入手してもよい。
糖セラミドの市販品としては、例えば、岡安商店社製の（商品名）「植物スフィンゴ液ＦＲ１」が挙げられる。
【００７５】
−−セラミド類似体−−
セラミド類似体としては、例えば、下記式（Ｓ２）に示すセラミド化合物が挙げられる。
【００７６】
【化２】
0006692673.tif 000003
【００７７】
−−スフィンゴイド類−−
更に、本発明におけるセラミド類には、スフィンゴイド類も含まれる。スフィンゴイド類として、前述のセラミド類に含まれるスフィンゴイド類部分に用いられるものが挙げられる。
本発明に好適に用いられるフィトスフィンゴシンの具体例としては、例えば、Ｅｖｏｎｉｋ  Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ  ＧｍｂＨ社製の（商品名）「Ｐｈｙｔｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ」が挙げられる。
【００７８】
上記セラミド類として例示されたものは、１種単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００７９】
細胞間脂質モデルに用いられるセラミド類としては、天然の細胞間脂質における存在比率が比較的大きい、セラミドＡＳ（セラミド５）、セラミドＮＳ（セラミド２）、セラミドＥＯＳ（セラミド１）が好ましい。これらの中でも、更にバリア能の高い長周期ラメラ構造を形成する傾向がある、セラミドＥＯＳ（セラミド１）が好ましく、天然の細胞間脂質における存在比率が特に大きい、セラミドＡＳ（セラミド５）、セラミドＮＳ（セラミド２）が好ましい。
【００８０】
細胞間脂質モデルとして、脂肪酸、コレステロール、セラミド類の混合物を用いた場合、各成分の混合比は、この順に、４５〜７５：０〜２５：１０〜５０であることが好ましく、５５〜６５：１０〜１５：２０〜４０であることが更に好ましい。
特に、細胞間脂質モデルとして、パルミチン酸、コレステロール、セラミドＡＳ（セラミド５）の混合物を用いた場合、各成分の混合比は、５９．６：１３．９：２６．５であることが特に好ましい。
【実施例】
【００８１】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００８２】
本実施例では、パルミチン酸：コレステロール：セラミドＡＳ（セラミド５）＝５９．６：１３．９：２６．５の混合物からなり、斜方晶と六方晶との比率が３１：６９であることを確認している、細胞間脂質モデルを用いた。
【００８３】
また、本実施例では、細胞間脂質サンプルに対する細胞間脂質コントロール、及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体に対する薬剤添加後の細胞間脂質被験体を調製するために、下記の薬剤を用いた。
・エタノール（日本アルコール社製）
・グリセリン（阪本薬品工業社製）
・１，３−ブチレングリコール（ダイセル社製）
・Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン（日生化学工業所社製）
【００８４】
そして、本実施例における対象を、下記の通り調製した。
細胞間脂質モデル溶液２００ｍＬ（脂質濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を準備した（以下、この場合の対象を「Ｂｌａｎｋ」ともいう。）。
また、上記細胞間脂質モデル溶液が２００ｍＬとなるように薬剤溶液を加え、相転移温度以上とし、これに超音波処理を行い、続いて、３５℃の恒温槽で２４時間保管した。そして、この溶液の水分を除去することによって、薬剤を添加した細胞間脂質モデルの薄膜を得た。
上記操作中の薬剤溶液としては、エタノール１０％水溶液２５．１２ｍＬ（以下、この場合の対象を「エタノール」ともいう。）、グリセリン１０％水溶液１６ｍＬ（以下、この場合の対象を「グリセリン」ともいう。）、１，３−ブチレングリコール１０％水溶液（以下、この場合の対象を「１，３−ＢＧ」ともいう。）、２０ｍＬ。更に、エタノール５％水溶液１２．５６ｍＬ、グリセリン１０％水溶液２５．１２ｍＬ、１，３−ブチレングリコール１０％水溶液２０ｍＬの混合溶液（以下、この場合の対象を「混合」ともいう。）、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン１０％水溶液２０ｍＬ（以下、この場合の対象を「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン」ともいう。）を用いた。
【００８５】
実施例で用いた分析方法について以下に説明する。
【００８６】
（１）示差走査熱量測定
示差走査熱量計（セイコーインスツルメンツ（株）社製、ＤＳＣ６２００）を用いて、温度範囲：５〜９５℃、昇温速度：３℃／分の条件にて行った。
示差走査熱量測定のピークの解析用ソフトとして、ＬｉｇｈｔＳｔｏｎｅ社製、Ｏｒｉｇｉｎを用いた。
【００８７】
（２）小角・広角Ｘ線散乱（ＳＷＡＸＳ）測定
ＳＰｒｉｎｇ−８／ＢＬ４０Ｂ２を用いて、温度走査：２５〜８５℃、昇温速度：０．８３℃／分の条件にて行い、２．５℃ごとにデータを取得した。
【００８８】
下記の手順に従って、本発明の細胞間脂質の微細構造を評価する方法を実施した。
・上記調製した、「Ｂｌａｎｋ」、「エタノール」、「グリセリン」、「１，３−ＢＧ」、「混合」の５つの対象について、（１）に従って示差走査熱量測定を行った（図５参照）。
【００８９】
・第一に、「Ｂｌａｎｋ」を細胞間脂質サンプルとして、細胞間脂質サンプルにおける細胞間脂質の微細構造の詳細（充填構造における斜方晶と六方晶との比率）を評価することを試みた。
【００９０】
・次に、５つの対象のＤＳＣピークを、それぞれ、（１）に従って小ピークに分割したところ、第１ピーク、中間ピーク、第２ピークの３つの小ピークに分割された（図５参照）。
・ここで、５つの対象のうち「Ｂｌａｎｋ」を除く４つの対象については、（２）に従って広角Ｘ線散乱測定を行った（図７参照）。その結果、図７に示す通り、「エタノール」、「グリセリン」、「１，３−ＢＧ」、「混合」における斜方晶と六方晶との比率は、それぞれ、６５：３５、９０：１０、７０：３０、９０：１０であることがわかった。
・続いて、「Ｂｌａｎｋ」のＤＳＣピークの面積と比較して小さいＤＳＣピークの面積を有し、また、斜方晶と六方晶との比率が８０：２０〜１００：０である「グリセリン」を細胞間脂質コントロールとして選択した。
そして、「Ｂｌａｎｋ」のＤＳＣピークの面積から、「グリセリン」のＤＳＣピークの面積を減じて得られるピークの面積（図８中に破線にて示す）を、「Ｂｌａｎｋ」における六方晶に由来するピークの面積とみなしたうえで、「Ｂｌａｎｋ」における斜方晶と六方晶との比率は、「グリセリン」のＤＳＣピークの面積（図８中に黒色にて示す）と、「Ｂｌａｎｋ」のＤＳＣピークの面積から、「グリセリン」のＤＳＣピークの面積を減じて得られるピークの面積との比率であるとみなした。
その結果、図９に示す通り、「Ｂｌａｎｋ」における斜方晶と六方晶との比率は、３５：６５であると評価した（図９中に囲み線にて示す）。なお、「エタノール」、「１，３−ＢＧ」、「混合」における斜方晶と六方晶との比率についても、同様に、６５：３５、７０：３０、１００：０であると評価した。
【００９１】
・ここで、「Ｂｌａｎｋ」についても、確認のため、（２）に従って広角Ｘ線散乱測定を行った（図１０参照）。
図１０に、第一実施形態の方法の一例である実施例の方法における、細胞間脂質サンプル（細胞間脂質モデル）について、微細構造の詳細を確認するための広角Ｘ線散乱測定の結果を示す。
その結果、図１０に示す通り、「Ｂｌａｎｋ」における斜方晶と六方晶との比率は、３１：６９であることがわかった。
【００９２】
以上より、本実施例の方法により得られた、細胞間脂質サンプルにおける細胞間脂質の微細構造の詳細（充填構造における斜方晶と六方晶との比率）の評価が、微細構造の詳細の分析において確立された方法である広角Ｘ線散乱測定による評価と高い相関を有することが実証された。
【００９３】
・第二に、「Ｂｌａｎｋ」を薬剤未添加の細胞間脂質被験体として、「Ｂｌａｎｋ」を除く５つの対象を薬剤添加後の細胞間脂質被験体として、細胞間脂質の微細構造の薬剤添加前後における変化を評価することを試みた。
【００９４】
・ここで、上記調製した、「Ｂｌａｎｋ」、「エタノール」、「グリセリン」、「１，３−ＢＧ」、「混合」に加えて、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン」についても、（１）に従って示差走査熱量測定を行った（図１２参照）。
また、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン」のＤＳＣピークを、それぞれ、（１）に従って小ピークに分割したところ、第１ピーク、中間ピーク、第２ピークの３つの小ピークに分割された（図１２参照）。
【００９５】
・ここで、「Ｂｌａｎｋ」の第１ピーク、中間ピーク、第２ピークにおける斜方晶による部分と六方晶による部分との比率は、前述の通り、図８に示す通り、それぞれ、３５：６５、５５：４５、２０：８０であると評価している。この結果より、この系においては、中間ピークを、第１斜方晶主体小ピークとした。
【００９６】
・このとき、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン」のＤＳＣピークの面積が、「Ｂｌａｎｋ」のＤＳＣピークの面積と比較して、大きく、且つ、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン」の中間ピークの面積が、「Ｂｌａｎｋ」の中間ピークの面積と比較して、大きい、ことを見出した。
これにより、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの添加により細胞間脂質モデルのバリア能が向上したと評価した（図１３参照）。
【００９７】
・ここで、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン」についても、確認のため、（２）に従って広角Ｘ線散乱測定を行った（図１４参照）。
図１４に、第二実施形態の方法の一例である実施例の方法における、バリア能を向上させるのに適した薬剤（Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン）添加後の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデル）について、微細構造の詳細を確認するための広角Ｘ線散乱測定の結果を示す。
その結果、図１４に示す通り、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン」における斜方晶と六方晶との比率は、５０：５０であり、「Ｂｌａｎｋ」におけるそれ（３１：６９）と比較して大きくなっていることがわかった。
【００９８】
以上より、本実施例の方法により得られた、細胞間脂質の微細構造の薬剤添加前後における変化（薬剤による細胞間脂質ルのバリア能の向上）の評価が、微細構造の詳細の分析において確立された方法である広角Ｘ線散乱測定による評価と高い相関を有することが実証された。
【００９９】
本発明者らは、図１４に示される「Ｂｌａｎｋ」及び「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン」のＤＳＣピークの面積及び斜方晶と六方晶との比率に着目して、細胞間脂質においてラメラ構造（斜方晶及び六方晶）が増加するとき、斜方晶と六方晶との比率を少なくとも維持する（ときに斜方晶割合を増大させる）傾向がある、という新たな知見を得た。
【０１００】
続いて、本発明者らは、上記知見を深めるため、また、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンによる細胞間脂質のバリア能の向上の効果を確認するため、細胞間脂質モデルの代わりに角層シートを用いて、薬剤添加前後の角層シートについて広角Ｘ線散乱測定を行った。
角層シートとして、ヒト胸部の皮膚より剥離した皮膚をトリプシン処理した角層シート（ＢＩＯＰＲＥＤＩＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（フランス）製）を用いた。
また、薬剤としては、前述のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンとその対照としての水とを用いた。
ここでは、図１５に示すように、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン添加前の角層シート、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン添加後の角層シート（添加１．５時間後、添加後２４時間後）について広角Ｘ線散乱測定を行った）。水（精製水）についても同様とした。
【０１０１】
具体的な実験項を以下の通りとした。
ヒト胸部の皮膚より剥離した皮膚をトリプシン処理した角層シート（ＢＩＯＰＲＥＤＩＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（フランス）製）（以下、単に「角層シート」ともいう。）を用意した。
角層シートから３×３ｍｍ2のサイズのシートを５枚切り出し、これらを積層させて、広角Ｘ線散乱測定の試料とした。
薬剤溶液としてＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン（ＮＡＧ）２％水溶液を用い、対照液として精製水を用いた。
【０１０２】
準備した角層シートの試料をＳＷＡＸＳ測定用のワッシャーに挟み込んだ。
ここで、下記条件において、小角・広角Ｘ線散乱（ＳＷＡＸＳ）測定を行った（以下、同じ）；測定装置：ＳＰｒｉｎｇ−８ビームラインＢＬ４０Ｂ２、露光時間：１８０秒／回、測定温度３２℃、単回照射、Ｘ線波長：０．０８３ｎｍ（１５ｋｅＶ）、カメラ長：５３９．２８１（ｍｍ）、検出器：イメージングプレート。散乱像を取得した後、円環平均を計算し、１次元散乱プロファイルデータを得た。得られた回折ピークをガウス関数にフィッティングすることにより解析を行った。
試料のワッシャー中央部からＮＡＧ２％水溶液を２０μＬ添加し、室温（２０℃）で保管した。保管中、試料に薬剤溶液中の薬剤を吸収させつつ、水分を薬剤溶液から揮発させた。
添加１．５時間後、角層シートの試料は湿潤状態であった。このとき、再び広角Ｘ線散乱測定を行った。
添加２４時間後、角層シートの試料は乾燥状態であった。ここで、更に広角Ｘ線散乱測定を行った。
【０１０３】
図１５に、バリア能を向上させるのに適した薬剤（Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン）添加前後の角層シートについての広角Ｘ線散乱測定の結果を斜方晶及び六方晶の散乱強度について示す。
【０１０４】
図１６に、バリア能を向上させるのに適した薬剤（Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン）添加前後の角層シートについての広角Ｘ線散乱測定の結果を斜方晶と六方晶との比率について示す。
【０１０５】
図１５に示す通り、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの添加により角層シートにおいてラメラ構造（斜方晶及び六方晶）が増加することが確認された。
【０１０６】
また、図１６に示す通り、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン添加前の角層シートにおける斜方晶と六方晶との比率は、６０：４０であり、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン添加１．５時間後の角層シートにおける斜方晶と六方晶との比率は、５６：４４であり、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン添加２４時間後の角層シートにおける斜方晶と六方晶との比率は、５７：４３であった。
なお、対照である水（精製水）の場合、斜方晶と六方晶との比率は、添加前において５５：４５であり、添加１．５時間後において５３：４７であり、添加２４時間後において５１：４９であった。
この結果から、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの添加により角層シートにおいて斜方晶と六方晶との比率は維持されることが確認された。
【０１０７】
また、薬剤として、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン以外のアミノ酸を用いて、細胞間脂質の微細構造の薬剤添加前後における変化を評価することも試みた。
【０１０８】
薬剤添加後の細胞間脂質被験体を調製するために用いた、細胞間脂質モデル溶液（脂質濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン１０％水溶液としては、前述の通りとした。
Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン以外のアミノ酸として、フェニルアラニン（純正化学株式会社製）、チロシン（純正化学株式会社製）、トリプトファン（純正化学株式会社製）、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸（日本プロテイン株式会社製）、グリシン（純正化学株式会社製）、グルタミン（純正化学株式会社製）、アスパラギン酸（純正化学株式会社製）を用いた。そして、薬剤溶液として、それぞれのアミノ酸の溶解度を考慮して、できるだけ高い濃度を設定し、フェニルアラニン１％水溶液、チロシン０．０１％水溶液、トリプトファン１％水溶液、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸２％水溶液、グリシン１５％水溶液、グルタミン４％水溶液、アスパラギン酸０．１％水溶液を、それぞれ２０ｍＬずつ準備した（以下、それぞれの場合の対象を、「フェニルアラニン」、「チロシン」、「トリプトファン」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸」、「グリシン」、「グルタミン」、「アスパラギン酸」ともいう。）。
【０１０９】
ここで、上記調製した、「Ｂｌａｎｋ」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン」、「フェニルアラニン」、「チロシン」、「トリプトファン」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸」、「グリシン」、「グルタミン」、「アスパラギン酸」についても、（１）に従って示差走査熱量測定を行った（図１７参照）。
また、各アミノ酸溶液を添加した対象のＤＳＣピークを、それぞれ、（１）に従って小ピークに分割したところ、第１ピーク、中間ピーク、第２ピークの３つの小ピークに分割された（図１７参照）。
【０１１０】
前述の通り、「Ｂｌａｎｋ」の第１ピーク、中間ピーク、第２ピークにおける斜方晶による部分と六方晶による部分との比率は、前述の通り、図８に示す通り、それぞれ、３５：６５、５５：４５、２０：８０であると評価している。この結果より、この系においては、中間ピークを、第１斜方晶主体小ピークとした。
【０１１１】
このとき、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン」のＤＳＣピークの面積が、「Ｂｌａｎｋ」のＤＳＣピークの面積と比較して大きいこととは対照的に、「フェニルアラニン」、「チロシン」、「トリプトファン」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸」、「グリシン」、「グルタミン」、「アスパラギン酸」のＤＳＣピークの面積が、「Ｂｌａｎｋ」のＤＳＣピークの面積と比較して小さいことを見出した（図１７参照）。
これにより、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンを添加した場合とは対照的に、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸、グリシン、グルタミン、アスパラギン酸の添加によっては、細胞間脂質モデルのバリア能を向上させる効果は見受けられないと評価した。（図１７参照）。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明の方法によれば、細胞間脂質の微細構造を簡便に評価すること、詳細には、細胞間脂質の微細構造の詳細を評価すること、細胞間脂質の微細構造薬剤の添加前後における変化を評価することができる。
本発明の方法は、細胞間脂質の充填構造に影響を与える薬剤をスクリーニングすることができる。その薬剤を用いることにより、角層のバリアをコントロールすること、化粧料や皮膚外用剤等の外用剤に配合される薬剤の経皮吸収を高めること、角層における経皮水分蒸散量を低く保ち、皮膚の恒常性を維持することを可能にする点において、産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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