(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂ。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、以下の（１）から（７）に記載のアミノ酸の置換を１つ以上含むアミノ酸配列からなる改変型組換えＦｃγＲＩＩｂ
（１）配列番号１の６８番目のイソロイシンがバリンに置換
（２）配列番号１の８４番目のセリンがトレオニンに置換
（３）配列番号１の１２５番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（４）配列番号１の１５８番目のリジンがメチオニンに置換
（５）配列番号１の１６２番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（６）配列番号１の１８８番目のチロシンがアスパラギンに置換
（７）配列番号１の１９０番目のロイシンがセリンに置換
（ｂ）上記（ａ）の組換えＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列において、上記（１）から（７）に記載のアミノ酸の置換を除く領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧ結合性を有する改変型組換えＦｃγＲＩＩｂ。
【請求項２】
配列番号２から配列番号４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂ。
【請求項３】
請求項１または２のいずれかに記載の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる改変型組換えＦｃγＲＩＩｂを生産可能な形質転換体。
【請求項６】
宿主が大腸菌である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項５または請求項６に記載の形質転換体を培養することにより改変型組換えＦｃγＲＩＩｂを生産する工程、得られた培養物から生産された改変型組換えＦｃγＲＩＩｂを回収する工程の２つの工程を含む改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対し結合親和性を有するヒトＦｃγレセプター（以下、ＦｃγＲという）ＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）に由来した組換えＦｃγＲＩＩｂに関するものである。より詳しくは、進化分子工学的手法を用いて生産性を高めた改変型組換えＦｃγＲＩＩｂに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＦｃγＲは、抗原と免疫グロブリンＧ（以下、ＩｇＧという）の結合物であるＩｇＧ免疫複合体を結合して細胞内にシグナルを導入するレセプター群である（非特許文献１）。ＦｃγＲは、サブタイプに分類することができ、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）が報告されている（非特許文献１と２）。
【０００３】
ＩｇＧ免疫複合体とＦｃγＲの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域にＦｃγＲが結合することで起こる。個々のＦｃγＲ分子種は、ＩｇＧのＦｃ領域認識ドメインを有し、単一種の、あるいは同じサブタイプに属するＩｇＧを認識する。これによって個々の免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動員されるかが決定される（非特許文献１と２）。その中でもＦｃγＲＩＩｂは細胞の活性化を抑制するシグナル伝達を行い、細胞の活性化のシグナル伝達を行う他のＦｃγＲとは異なる（非特許文献１）。ＦｃγＲはＩｇＧ免疫複合体を結合後、活性化型ＦｃγＲと抑制性ＦｃγＲであるＦｃγＲＩＩｂとがバランスを取り合いながら、マクロファージやマスト細胞を調節する。
【０００４】
ヒトＦｃγＲＩＩｂ由来の組換えタンパク質（以下、組換えＦｃγＲＩＩｂという）は、診断、医療、結晶構造解析、さらには抗体の分離や濃縮に使用するためのクロマトグラフィー材料などへの応用の可能性がある（特許文献１から４）。大腸菌宿主を用いた組換えＦｃγＲＩＩｂの調製に関して、これまでにいくつかの研究が行われているが、特許文献１から４では、大腸菌宿主で封入体（不溶性）として発現させた組換えＦｃγＲＩＩｂを、再生（リフォールディング）させる調製方法が報告されている。しかしながら、リフォールディングは一般的に複雑な操作が必要で、操作に数日かかる場合もあり時間がかかる、リフォールディング効率が低いなどの課題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許４９１４５３５号公報
【特許文献２】特表２００５−５１５９８１号公報
【特許文献３】特開２０１１−１０５７１６号公報
【特許文献４】特開２０１２−１８８４５６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】高井俊行，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８−３２６，２００５
【非特許文献２】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７−４９２，１９９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、組換えＦｃγＲＩＩｂを発現時から可溶性として大量発現させることにより、リフォールディングを不必要として組換えＦｃγＲＩＩｂの製造効率を向上するために、大腸菌宿主での発現時から可溶性の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂおよびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らの鋭意検討により、組換えＦｃγＲＩＩｂを構成するアミノ酸のうちの特定のアミノ酸を他の特定のアミノ酸に置換することにより、大腸菌宿主での発現時から可溶性であり、結果として大腸菌宿主で効率的に生産可能な改変型組換えＦｃγＲＩＩｂを提供し得ることが見出され、本発明が完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、以下の（１）から（７）に記載のアミノ酸の置換を１つ以上含むアミノ酸配列からなる改変型組換えＦｃγＲＩＩｂ、または、（ｂ）前記（ａ）の組換えＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列において、前記（１）から（７）に記載のアミノ酸の置換に加え、さらに１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧ結合性を有する改変型組換えＦｃγＲＩＩｂ（以下、本願第１発明という）であり、本願第２発明は、本願第１発明の中で配列番号２から配列番号４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる組換えＦｃγＲＩＩｂである。
（１）配列番号１の６８番目のイソロイシンのバリンへの置換。
（２）配列番号１の８４番目のセリンのトレオニンへの置換。
（３）配列番号１の１２５番目のヒスチジンのアルギニンへの置換。
（４）配列番号１の１５８番目のリジンのメチオニンへの置換。
（５）配列番号１の１６２番目のアルギニンのヒスチジンへの置換。
（６）配列番号１の１８８番目のチロシンのアスパラギンへの置換。
（７）配列番号１の１９０番目のロイシンのセリンへの置換。
【００１０】
また本発明は、本願第１発明又は本願第２発明をコードするポリヌクレオチド（以下、本願第３発明という）であり、本願第３発明を含む発現ベクター（以下、本願第４発明という）であり、本願第４発明で宿主を形質転換して得られる改変型組換えＦｃγＲＩＩｂを生産可能な形質転換体（以下、本願第５発明という）である。本願第６発明は、本願第５発明の中で、本願第４発明で形質転換して得られた大腸菌である。
【００１１】
さらに本願発明は、本願第５発明又は本願第６発明の形質転換体を培養することにより改変型組換えＦｃγＲＩＩｂを生産する工程、得られた培養物から生産された改変型組換えＦｃγＲＩＩｂを回収する工程の２つの工程を含む、改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの製造方法（以下、本願第７発明という）である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
ヒトＦｃγＲＩＩｂは３１０個のアミノ酸からなり（ＵｎｉＰｒｏｔデータベース、アクセッションナンバーＰ３１９９４−１を参照）、Ｎ末端側から順に、４２個のアミノ酸からなるシグナルペプチド領域、１７５個のアミノ酸からなる細胞外領域、２３個のアミノ酸からなる細胞膜貫通領域、そして７０個のアミノ酸からなる細胞内領域から構成され、ＩｇＧは、該ヒトＦｃγＲＩＩｂの細胞外領域の部分に結合する。本願第１発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において所定のアミノ酸の置換を含むものであるが、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端側２９番目のトレオニンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸配列はヒトＦｃγＲＩＩｂの前記細胞外領域のアミノ酸配列に由来する配列である。すなわち、本願第１発明及び本願第２発明は、ヒトＦｃγＲＩＩｂの細胞外領域に由来するものである。
【００１３】
配列番号１のアミノ酸配列についてより詳細に説明すると、そのＮ末端側１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでのアミノ酸配列は大腸菌ペリプラズムへの分泌発現シグナル配列（ＭａｌＥシグナル配列）であり、２７番目のメチオニンから２８番目のグリシンまでアミノ酸配列はリンカー配列であり、２９番目のトレオニンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸配列は前述の通り、ヒトＦｃγＲＩＩｂの細胞外領域のアミノ酸配列に由来する部分であり、２０２番目のグリシンから２０３番目のグリシンまでのアミノ酸配列はリンカー配列であり、２０４番目のヒスチジンから２０９番目のヒスチジンまでのアミノ酸配列はポリヒスチジン配列である。
【００１４】
本願第１発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端側から、（１）６８番目のイソロイシンのバリンへの置換（以下、Ｉｌｅ６８Ｖａｌとする）、（２）８４番目のセリンのトレオニンへの置換（以下、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒとする）、（３）１２５番目のヒスチジンのアルギニンへの置換（以下、Ｈｉｓ１２５Ａｒｇとする）、（４）１５８番目のリジンのメチオニンへの置換（以下、Ｌｙｓ１５８Ｍｅｔとする）、（５）１６２番目のアルギニンのヒスチジンへの置換（以下、Ａｒｇ１６２Ｈｉｓとする）、（６）１８８番目のチロシンのアスパラギンへの置換（以下、Ｔｙｒ１８８Ａｓｎとする）または（７）１９０番目のロイシンのセリンへの置換（以下、Ｌｅｕ１９０Ｓｅｒとする）という７つの置換のうちの１つ以上の置換を含むアミノ酸配列からなる。本願第１発明の望ましい例として、本願第２発明、すなわち配列番号２（Ｔｙｒ１８８Ａｓｎを含む）、配列番号３（Ｉｌｅ６８Ｖａｌ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１５８Ｍｅｔ、Ａｒｇ１６２ＨｉｓおよびＴｙｒ１８８Ａｓｎを含む）または配列番号４（Ｉｌｅ６８Ｖａｌ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｈｉｓ１２５Ａｒｇ、Ｌｙｓ１５８Ｍｅｔ、Ａｒｇ１６２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１８８ＡｓｎおよびＬｅｕ１９０Ｓｅｒの全てを含む）を例示することができる。
【００１５】
上記したＩｌｅ６８Ｖａｌ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｈｉｓ１２５Ａｒｇ、Ｌｙｓ１５８Ｍｅｔ、Ａｒｇ１６２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１８８ＡｓｎおよびＬｅｕ１９０Ｓｅｒというアミノ酸の置換は、本願第１発明の製造において、形質転換体による生産性（発現量）を高める効果がある。そのため、本願第１発明の生産性は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性より高い。なお形質転換体による生産性をより高めるためには、本願第１発明は上記したアミノ酸の置換を複数、より望ましくはすべて有する。
【００１６】
本願第１発明および本願第２発明は、ＩｇＧ結合性を有する限り、上記（１）から（７）のアミノ酸の置換を除く領域中に（言い換えれば、上記（１）から（７）のアミノ酸の置換を保持しつつ、更に加えて）、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されていてもよい。ここで複数のアミノ酸とは、２〜１７０個のアミノ酸を意味し、望ましくは２〜５０個のアミノ酸を意味し、更に望ましくは２〜３０個のアミノ酸を意味する。例えば、配列番号１のアミノ酸配列における大腸菌ペリプラズムへの分泌発現シグナルであるＭａｌＥシグナル配列の部分をＰｅｌＢ、ＤｓｂＡまたはＴｏｒＴなどの他のシグナル配列（特開２０１１−０９７８９８号公報参照）に置換してもよい。また、例えば、配列番号１のアミノ酸配列におけるポリヒスチジン配列の部分を他の配列（例えばポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸などのオリゴペプチドなど）に置換してもよいし、該ポリヒスチジン配列の部分を欠失させてもよい。アミノ酸の欠失、置換または付加は、当業者に周知の遺伝子工学的な方法を用いて行うことができる。
【００１７】
以下、本願第３ないし第７発明について説明する。本願第３発明は、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法といったＤＮＡ増幅法を利用しヒトＦｃγＲＩＩｂのｃＤＮＡ等をもとに改変して合成する方法、ヒトＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列からポリヌクレオチド配列に変換し、該ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成し、それをさらにＤＮＡ増幅法を利用し改変して合成する方法、そして例えば配列番号２から配列番号４に記載のアミノ酸配列をポリヌクレオチド配列に変換し、該ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法等により得ることができる。これらの方法において、アミノ酸配列からポリヌクレオチド配列に変換する際には、本願第１発明または本願第２発明の生産に利用する微生物や細胞（宿主）におけるコドンの使用頻度を考慮することが望ましい。一例として、大腸菌を宿主として利用する場合、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないいわゆるレアコドンであるため、これらのコドン以外のコドンを選択して変換することが望ましい。ちなみに、コドンの使用頻度の解析は、例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅなどを利用することにより可能である。
【００１８】
ＤＮＡ増幅法を用いて本願第３発明のポリヌクレオチドを調製する際は、エラープローンＰＣＲ法を用いて変異を導入することができる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ２を０．０１から１０ｍＭ、望ましくは０．１から１ｍＭの濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことを例示できる。
【００１９】
本願第３発明のポリヌクレオチドとして、具体的に、配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを例示することができる。本願第３発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換するには、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いて形質転換しても良いが、例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドまたはプラスミドなどを基にした発現ベクター中の適切な位置に本願第３発明のポリヌクレオチドを挿入して本願第４発明の発現ベクターとし、それを用いて形質転換したほうが、安定した形質転換が実施できる点で望ましい。ここで、適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、および伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。また発現ベクターに本願第３発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で発現ベクターに挿入することが望ましい。
【００２０】
本願発明において使用する発現ベクターは、宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、例えば大腸菌を宿主とする場合、ｐＥＴ発現ベクター、ｐＵＣ発現ベクター、ｐＴｒｃ発現ベクター、ｐＣＤＦ発現ベクターおよびｐＢＢＲ発現ベクター等が例示できる。また本願発明において使用するプロモータとしては、例えば大腸菌を宿主とする場合、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等を例示できる。
【００２１】
本願第５発明の形質転換体は、前記方法により作製した本願第４発明の発現ベクターを用いて宿主を形質転換することで得ることができる。
【００２２】
本願発明において使用する宿主に特に制限はないが、遺伝子工学に関する実験が容易な点で大腸菌が望ましい。また本願第４発明の発現ベクターを用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよく、例えば、宿主として大腸菌（大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株等）を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等を使用することができる。なお、本願第５発明の形質転換体から適当な抽出方法または市販のキットなどを用いることで、本願第４発明の発現ベクターを抽出することができる。例えば宿主が大腸菌の場合には、アルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（商品名、キアゲン社製）等の市販の抽出キットを用いることが例示できる。
【００２３】
本願第７発明は、本願第５または本願第６発明の形質転換体を用いて本願第１または本願第２発明のＦｃγＲＩＩｂを製造する方法であり、形質転換体を培養することでＦｃγＲＩＩｂを生産する工程（以下、第１工程という）、得られた培養物からＦｃγＲＩＩｂを回収する工程（以下、第２工程という）の２つの工程を含む。なお本明細書において、培養物とは、培養された形質転換体の細胞自体や細胞分泌物のほか、培養に用いた培地等も含まれる。
【００２４】
本願第７発明における第１工程では、形質転換体をその培養に適した培地で培養すれば良い。例えば、宿主として大腸菌を用いた場合は、必要な栄養源を補ったＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地を使用することが望ましい例として例示できる。本願第４発明の発現ベクターが薬剤耐性遺伝子を含む場合、その遺伝子に対応した薬剤を培地に添加して第一工程を実施すれば、形質転換体の選択的増殖が可能となるため望ましい。例えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加することが例示できる。
【００２５】
培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加するが、さらに、本願第５発明の形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促すためにグリシンなどの試薬を添加しても良い。宿主が大腸菌である場合、添加するグリシン濃度はその増殖に影響を与えない範囲であれば良く、望ましくは培地に対して１０％（Ｗ／Ｖ）以下、より望ましくは０．１％から２％とすることが例示できる。培養温度は利用する宿主に関して一般的に知られた温度であれば良く、例えば宿主が大腸菌の場合、１０℃から４０℃、望ましくは２５℃から３５℃、より望ましくは３０℃前後であり、製造しようとする本願第１発明または第２発明のＦｃγＲＩＩｂの製造量等を勘案しつつ、適宜決定すれば良い。培地のｐＨは、利用する宿主に関して一般的に知られたｐＨ範囲とすれば良く、例えば宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４の範囲、望ましくはｐＨ７．０前後であり、製造しようとする本願第１発明または第２発明のＦｃγＲＩＩｂの製造量等を勘案しつつ、適宜決定すれば良い。
【００２６】
本願第４発明の発現ベクターに誘導性のプロモータを導入した場合は、ＦｃγＲＩＩｂが良好に製造可能な条件下で培地に誘導剤を添加してその発現を誘導すれば良い。望ましい誘導剤としてはｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を例示することができ、その添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲、望ましくは０．０１から０．５ｍＭの範囲である。ＩＰＴＧ添加による発現誘導は、利用する宿主に関して一般的に知られた条件で行なえば良く、例えば宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）が約０．１から１．０のときに適当量のＩＰＴＧを添加し、引き続き培養することで、本願第１発明または本願第２発明のＦｃγＲＩＩｂの発現を誘導することができる。
【００２７】
本願第７発明における第２工程では、第１工程で得られた培養物から一般的に知られた回収方法によってＦｃγＲＩＩｂを回収する。例えばＦｃγＲＩＩｂが培養液中に分泌生産される場合は細胞を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本願第１発明または本願第２発明のＦｃγＲＩＩｂを回収すれば良く、細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合は、遠心分離操作により細胞を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加するなどにより細胞を破砕し、細胞破砕液から回収すれば良い。
【００２８】
以上に説明したように、本願第７発明により、宿主の培養物から本願第１発明または本願第２発明のＦｃγＲＩＩｂを回収することができる。回収されたＦｃγＲＩＩｂについて、更に高純度化する場合は、一般的に知られた精製方法を用いれば良い。例えば、液体クロマトグラフィーを用いた分離精製を例示することができるが、その際にはイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を使用することが望ましく、特にこれらのクロマトグラフィーを複数種組み合わせて精製を行うことが望ましい。
【発明の効果】
【００２９】
本願発明によれば、大腸菌等の宿主での効率的な生産が可能な改変型組換えＦｃγＲＩＩｂ、およびその製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性を評価した図である。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明の実施の形態について、実施例を用いて詳細に説明するが、本実施例は本発明の一形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。
【００３２】
実施例１  ＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの作製
ヒトＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースにアクセッションナンバーＰ３１９９４−１として登録・公開）基にＤＮＡｗｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３頁，２００２年）を用いて、コドンを大腸菌型に変換し、配列番号８に示すヒトＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を設計した。
【００３３】
配列番号９から配列番号５０に示す４２種類のオリゴヌクレオチドを使用した二段階のＰＣＲにより、配列番号８に示すヒトＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを作製した。
【００３４】
一段階目のＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９４℃で５分の熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６２℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル繰り返した後、７２℃で７分処理後に４℃に冷却することで実施した。なお、表１のＤＮＡ  ｍｉｘとは、配列番号９から配列番号５０に示す４２種類のオリゴヌクレオチドをそれぞれ一定量サンプリングし混合した溶液を意味する。
【００３５】
【表１】
0006710451.tif 000002
二段階目のＰＣＲは、表２に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９４℃で５分の熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６５℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル繰り返した後、７２℃で７分処理後に４℃に冷却することで実施した。
【００３６】
【表２】
0006710451.tif 000003
二段階目のＰＣＲ産物を、アガロースゲルを用いて電気泳動後、目的のＰＣＲ産物を含むゲル部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することで精製した（以下、同様方法での精製をＤＮＡ断片精製と略記する）。精製したＰＣＲ産物の５’末端をリン酸化し（ＴａＫａＲａ  ＢＫＬ  Ｋｉｔ：タカラバイオ社）、制限酵素ＳｍａＩで消化したｐＵＣ１９プラスミドベクターにライゲーションにより連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＬＢ培地（１０ｇ／ＬのＴｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ＬのＹｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ＬのＮａＣｌ）で培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することでプラスミドベクターｐＵＣ−ＦｃγＲＩＩｂを調製した。
【００３７】
実施例２  組換えＦｃγＲＩＩｂの発現系構築
（１）ｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターの構築
鋳型ＤＮＡとして特開２０１２−１４７７７２号公報で開示されているプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７を、ＰＣＲプライマーとして配列番号５１および配列番号５２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をＭａｌＥ２１ｐ１と命名した。
【００３８】
【表３】
0006710451.tif 000004
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ＭａｌＥ２１ｐ１を制限酵素ＸｂａＩとＮｃｏＩで消化後、再度ＤＮＡ断片精製した。この制限酵素ＸｂａＩとＮｃｏＩで消化したＰＣＲ産物ＭａｌＥ２１ｐ１を、あらかじめ制限酵素ＸｂａＩとＮｃｏＩで消化したｐＥＴ２６ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）へライゲーションにより連結することでｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターを作製し、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することでｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターを調製した。
【００３９】
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる組換えＦｃγＲＩＩｂの発現ベクターｐＥＴ−ＦｃγＲＩＩｂとその形質転換体の構築
鋳型ＤＮＡとして実施例１に記載のプラスミドベクターｐＵＣ−ＦｃγＲＩＩｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号５３および配列番号５４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で５分の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返した後、７２℃で５分処理後に４℃に冷却することで実施した。得られたＰＣＲ産物をＦｃγＲＩＩｂ−ｐ１と命名した。
【００４０】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ＦｃγＲＩＩｂ−ｐ１を制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、再度ＤＮＡ断片精製した。この制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＰＣＲ産物ＦｃγＲＩＩｂ−ｐ１を、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターへライゲーションにより連結することで発現ベクターｐＥＴ−ＦｃγＲＩＩｂを作製し、これを用いて大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体を形質転換体ＦｃγＲＩＩｂと命名した。形質転換体ＦｃγＲＩＩｂを５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて抽出することで発現ベクターｐＥＴ−ＦｃγＲＩＩｂを調製した。
発現ベクターｐＥＴ−ＦｃγＲＩＩｂのうち、制限酵素ＸｂａＩ認識配列からＨｉｎｄＩＩＩ認識配列までのポリヌクレオチドの配列を配列番号５５に示す。
【００４１】
（３）形質転換体ＦｃγＲＩＩｂによる可溶性の組換えＦｃγＲＩＩｂの発現
形質転換体ＦｃγＲＩＩｂを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。前培養後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地に前培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で２２時間、好気的に振とう培養した。培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて可溶性タンパク質抽出液を調製した。調製した可溶性タンパク質抽出液中の組換えＦｃγＲＩＩｂの濃度を、以下に記すＥｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）−１により測定した。
【００４２】
ＥＬＩＳＡ−１による組換えＦｃγＲＩＩｂの濃度測定は、次のように行った。抗ＦｃγＲＩＩＢ／Ｃ抗体（Ａｎｔｉ−ＦｃγＲＩＩＢ／Ｃ，Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｎｏ（１９０７１０））（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号ＢＡＭ１８７５１）を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で１μｇ／ｍＬの濃度に調整後、それを９６穴マイクロプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、抗ＦｃγＲＩＩＢ／Ｃ抗体を固定化した（４℃で１８時間）。固定化終了後、各ウェルの溶液を捨て、ＴＢＳ−Ｂ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１３７ｍＭのＮａＣｌ，２．６８ｍＭのＫＣｌ，０．５パーセント（ｗ／ｖ）のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ，ｐＨ７．４）を各ウェルに添加し、ブロッキングを行った（３０℃で２時間）。洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で各ウェルを洗浄後、調製した可溶性タンパク質抽出液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で段階希釈し、それらをウェルに添加して固定化抗ＦｃγＲＩＩＢ／Ｃ抗体と反応させた（３０℃で１時間半）。反応終了後、洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄し、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈）を各ウェルに添加し、３０℃で１時間半反応させた。反応後、前記洗浄緩衝液で各ウェルの洗浄を行ない、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を各ウェルに添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。既知濃度の糖鎖付組換えＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ／ｃ，Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，Ｃａｒｒｉｅｒ−ｆｒｅｅ ＜ＦｃγＲＩＩＢ／Ｃ＞）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号１８７５−ＣＤ−０５０）のＥＬＩＳＡ−１の測定結果を基準として、測定吸光度から可溶性タンパク質抽出液中の組換えＦｃγＲＩＩｂの濃度を決定した。
【００４３】
その結果、形質転換体ＦｃγＲＩＩｂによる培養液あたりの可溶性の組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性は３．２ｍｇ／Ｌ−培養液であった。
【００４４】
実施例３  ランダム変異導入を利用した改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの作製
（１）ランダム変異導入ライブラリーの構築
エラープローンＰＣＲ法を用いて、組換えＦｃγＲＩＩｂをコードするポリヌクレオチドにランダムに変異を導入した。鋳型ＤＮＡとして発現ベクターｐＥＴ−ＦｃγＲＩＩｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号５１および配列番号５６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いた。エラープローンＰＣＲは、表４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で７分間熱処理することで実施した。得られたＰＣＲ産物をＥＰと命名した。
【００４５】
【表４】
0006710451.tif 000005
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ＥＰを、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、再度ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結し、これを用いて塩化カルシウム法により大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させることで、組換えＦｃγＲＩＩｂのランダム変異導入ライブラリーを作製した。
（２）生産性の向上した改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの１次スクリーニング
前記の組換えＦｃγＲＩＩｂのランダム変異導入ライブラリーの各コロニー（約１８００）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地４００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で好気的に一晩振とう培養した。培養後、２０μＬの培養液を６００μＬのＬＢ培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％のグリシン、および５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で好気的に２４時間振とう培養した。培養後、遠心操作により得られる培養上清を改変型組換えＦｃγＲＩＩｂサンプル溶液とした。次いで、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて５倍希釈した各改変型組換えＦｃγＲＩＩｂサンプル溶液について、それに含まれる可溶性の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの量を下記に示すＥＬＩＳＡ−２により評価した。
【００４６】
ＥＬＩＳＡ−２による可溶性の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの検出は、次のように行った。ＩｇＧ（化学及血清療法研究所）を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で１０μｇ／ｍＬの濃度に調整後、それを９６穴マイクロプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、ＩｇＧを固定化した（４℃で１８時間）。固定化終了後、各ウェルの溶液を捨て、ＴＢＳ−Ｂ緩衝液を各ウェルに添加し、ブロッキングを行った（３０℃で２時間）。洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄後、調製した改変型組換えＦｃγＲＩＩｂサンプル溶液をウェルに添加し、固定化ＩｇＧと反応させた（３０℃で１時間半）。反応終了後、洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄し、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈）を各ウェルに添加し、３０℃で１時間半反応させた。反応後、洗浄緩衝液で各ウェルの洗浄を行ない、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を各ウェルに添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４７】
このＥＬＩＳＡ−２による評価の結果から、組換えＦｃγＲＩＩｂと比較して生産性の向上した改変型組換えＦｃγＲＩＩｂを発現する形質転換体を選抜した。
【００４８】
（３）生産性の向上した改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの２次スクリーニング
１次スクリーニングで選抜した各形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。前培養後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地に前培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で２２時間、好気的に振とう培養した。培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて可溶性タンパク質抽出液を調製した。調製した可溶性タンパク質抽出液中の可溶性の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの濃度を、以下に記す改変型組換えＦｃγＲＩＩｂとＩｇＧの結合性を利用した測定法であるＥＬＩＳＡ−３により測定した。
【００４９】
ＥＬＩＳＡ−３による可溶性の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの濃度測定は、次のように行った。ＩｇＧ（化学及血清療法研究所）を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で１０μｇ／ｍＬの濃度に調整後、それを９６穴マイクロプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、ＩｇＧを固定化した（４℃で１８時間）。固定化終了後、各ウェルの溶液を捨て、ＴＢＳ−Ｂ緩衝液を各ウェルに添加し、ブロッキングを行った（３０℃で２時間）。洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄後、調製した可溶性タンパク質抽出液を５０ｍＭのグリシンを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で段階希釈し、それらをウェルに添加して、固定化ＩｇＧと反応させた（３０℃で１時間半）。反応終了後、洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄し、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）（５０ｍＭのグリシンを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈）を各ウェルに添加し、３０℃で１時間半反応させた。反応後、洗浄緩衝液で各ウェルの洗浄を行ない、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を各ウェルに添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。既知濃度の可溶性の組換えＦｃγＲＩＩｂのＥＬＩＳＡ−３の測定結果を基準として、測定吸光度から各可溶性タンパク質抽出液中の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの濃度を決定した。
【００５０】
各形質転換体による培養液あたりの可溶性の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性は、可溶性タンパク質抽出液中の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの濃度を基に算出した。同じ条件で実験を行った実施例２に記載の形質転換体ＦｃγＲＩＩｂによる培養液あたりの可溶性の組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性（３．２ｍｇ／Ｌ−培養液）より高い生産性を示した形質転換体を選択した。その結果、１０株の形質転換体が選択され、それらを形質転換体ｍ１、形質転換体ａ１３Ｇ４、形質転換体ａ１５Ｇ９、形質転換体ａ１７Ｄ５、形質転換体ａ１８Ｇ１、形質転換体ａ１Ｂ２、形質転換体ａ１５Ａ６、形質転換体ａ１Ｂ１、形質転換体ａ４Ｆ３、形質転換体ａ２Ｅ２と命名した。各形質転換体による培養液あたりの可溶性の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性は表５に示す。また、ＥＬＩＳＡ−３により測定可能であったことからこれらの形質転換体によって産生される改変型組換えＦｃγＲＩＩｂはいずれもＩｇＧ結合性を有することがわかる。
【００５１】
【表５】
0006710451.tif 000006
前記選択した各形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて抽出することで各発現ベクターを調製した。これらの発現ベクターのうち、改変型組換えＦｃγＲＩＩｂをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号５１または配列番号５６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかをシークエンス用プライマーとして使用した。
【００５２】
ポリヌクレオチドの配列解析の結果を基に各形質転換体により発現される改変型組換えＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列を決定した。その結果、形質転換体ｍ１と形質転換体ａ１３Ｇ４によって発現される改変型組換えＦｃγＲＩＩｂはともにＴｙｒ１８８Ａｓｎのアミノ酸の置換を、形質転換体ａ１５Ｇ９によって発現される改変型組換えＦｃγＲＩＩｂはＡｒｇ１６２Ｈｉｓのアミノ酸の置換を、形質転換体ａ１７Ｄ５と形質転換体ａ１８Ｇ１によって発現される改変型組換えＦｃγＲＩＩｂはともにＬｙｓ１５８Ｍｅｔのアミノ酸の置換を、形質転換体ａ１Ｂ２によって発現される改変型組換えＦｃγＲＩＩｂはＬｅｕ１９０Ｓｅｒのアミノ酸の置換を、形質転換体ａ１５Ａ６と形質転換体ａ１Ｂ１によって発現される改変型組換えＦｃγＲＩＩｂはともにＩｌｅ６８Ｖａｌのアミノ酸の置換を、形質転換体ａ４Ｆ３によって発現される改変型組換えＦｃγＲＩＩｂはＳｅｒ８４Ｔｈｒのアミノ酸の置換を、形質転換体ａ２Ｅ２によって発現される改変型組換えＦｃγＲＩＩｂはＨｉｓ１２５Ａｒｇのアミノ酸の置換をそれぞれ有していた（表５）。前記の各形質転換体による培養液あたりの可溶性の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性の評価結果から、これらのアミノ酸置換は可溶性の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性の向上に寄与したことが示唆された。
【００５３】
前記の各形質転換体による培養液あたりの可溶性の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性の評価結果において、培養液あたりの可溶性の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性が最も高かった形質転換体ｍ１により発現される改変型組換えＦｃγＲＩＩｂをＦｃγＲＩＩｂ−ｍ１と命名した。ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ１のアミノ酸配列を配列番号２に、当該アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５に、それぞれ示す。
【００５４】
配列番号２のアミノ酸配列の詳細を説明すると、配列番号２の１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでのアミノ酸配列は大腸菌ペリプラズムへの分泌発現シグナルであるＭａｌＥシグナル配列であり、２７番目のメチオニンから２８番目のグリシンまでアミノ酸配列はリンカー配列であり、２９番目のトレオニンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸配列は前記のヒトＦｃγＲＩＩｂの細胞外領域のアミノ酸配列に由来する配列であり、２０２番目のグリシンから２０３番目のグリシンまでのアミノ酸配列はリンカー配列であり、２０４番目のヒスチジンから２０９番目のヒスチジンまでのアミノ酸配列はポリヒスチジン配列である。配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１つのアミノ酸が置換（Ｔｙｒ１８８Ａｓｎ）されたアミノ酸配列である。
【００５５】
実施例４  ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５を発現する形質転換体の構築
実施例３で判明したアミノ酸の置換のうちの５つのアミノ酸の置換（Ｉｌｅ６８Ｖａｌ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１５８Ｍｅｔ、Ａｒｇ１６２ＨｉｓおよびＴｙｒ１８８Ａｓｎ）を有する改変型組換えＦｃγＲＩＩｂであるＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５を発現する形質転換体の作製を以下の方法で行った。
【００５６】
鋳型ＤＮＡとして実施例３において形質転換体ａ１Ｂ１から調製した発現ベクターを、ＰＣＲプライマーとして配列番号５１および配列番号５７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｐ１と命名した。
【００５７】
鋳型ＤＮＡとして実施例３において形質転換体ａ１７Ｄ５から調製した発現ベクターを、ＰＣＲプライマーとして配列番号５８および配列番号５９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｐ２と命名した。
【００５８】
鋳型ＤＮＡとして実施例３において形質転換体ｍ１から調製した発現ベクターを、ＰＣＲプライマーとして配列番号６０および配列番号５６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｐ３と命名した。
【００５９】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ｍ５ｐ１、ｍ５ｐ２およびｍ５ｐ３を混合後、表６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｐ４と命名した。
【００６０】
【表６】
0006710451.tif 000007
ＰＣＲ産物ｍ５ｐ４を鋳型ＤＮＡとし、配列番号５１および配列番号５６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をＤＮＡ断片精製することで、ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５をコードするポリヌクレオチドを得た。
【００６１】
ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結し、これを用いて大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体を形質転換体ｍ５と命名した。
【００６２】
ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴ−ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５は、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した形質転換体ｍ５からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて抽出することで調製した。発現ベクターｐＥＴ−ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５のうち、ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５をコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例３と同様の方法により行なった。発現ベクターｐＥＴ−ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６に、それぞれ示す。
【００６３】
配列番号３のアミノ酸配列の詳細を説明すると、配列番号３の１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでのアミノ酸配列は大腸菌ペリプラズムへの分泌発現シグナルであるＭａｌＥシグナル配列であり、２７番目のメチオニンから２８番目のグリシンまでアミノ酸配列はリンカー配列であり、２９番目のトレオニンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸配列は前記のヒトＦｃγＲＩＩｂの細胞外領域のアミノ酸配列に由来する配列であり、２０２番目のグリシンから２０３番目のグリシンまでのアミノ酸配列はリンカー配列であり、２０４番目のヒスチジンから２０９番目のヒスチジンまでのアミノ酸配列はポリヒスチジン配列である。配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において５つのアミノ酸が置換（Ｉｌｅ６８Ｖａｌ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１５８Ｍｅｔ、Ａｒｇ１６２ＨｉｓおよびＴｙｒ１８８Ａｓｎ）されたアミノ酸配列である。
【００６４】
実施例５  ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ７を発現する形質転換体の構築
実施例３で判明したアミノ酸の置換のうちの７つのアミノ酸の置換（Ｉｌｅ６８Ｖａｌ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｈｉｓ１２５Ａｒｇ、Ｌｙｓ１５８Ｍｅｔ、Ａｒｇ１６２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１８８ＡｓｎおよびＬｅｕ１９０Ｓｅｒ）を有する改変型組換えＦｃγＲＩＩｂであるＦｃγＲＩＩｂ−ｍ７を発現する形質転換体の作製を以下の方法で行った。
【００６５】
鋳型ＤＮＡとして実施例４のＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５をコードするポリヌクレオチドを、ＰＣＲプライマーとして配列番号５１および配列番号６１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７ｐ１と命名した。
【００６６】
鋳型ＤＮＡとして実施例４のＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５をコードするポリヌクレオチドを、ＰＣＲプライマーとして配列番号６２および配列番号６３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７ｐ２と命名した。
【００６７】
鋳型ＤＮＡとして実施例４のＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５をコードするポリヌクレオチドを、ＰＣＲプライマーとして配列番号６４および配列番号５６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７ｐ３と命名した。
【００６８】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ｍ７ｐ１、ｍ７ｐ２およびｍ７ｐ３を混合後、表６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７ｐ４と命名した。
【００６９】
ＰＣＲ産物ｍ７ｐ４を鋳型ＤＮＡとし、配列番号５１および配列番号５６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をＤＮＡ断片精製することで、ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ７をコードするポリヌクレオチドを得た。
【００７０】
ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ７をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結し、これを用いて大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体を形質転換体ｍ７と命名した。
【００７１】
ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ７をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴ−ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ７は、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した形質転換体ｍ７からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて抽出することで調製した。発現ベクターｐＥＴ−ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ７のうち、ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ７をコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例３と同様の方法により行なった。発現ベクターｐＥＴ−ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ７により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号７に、それぞれ示す。
【００７２】
配列番号４のアミノ酸配列の詳細を説明すると、配列番号４の１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでのアミノ酸配列は大腸菌ペリプラズムへの分泌発現シグナルであるＭａｌＥシグナル配列であり、２７番目のメチオニンから２８番目のグリシンまでアミノ酸配列はリンカー配列であり、２９番目のトレオニンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸配列は前記のヒトＦｃγＲＩＩｂの細胞外領域のアミノ酸配列に由来する配列であり、２０２番目のグリシンから２０３番目のグリシンまでのアミノ酸配列はリンカー配列であり、２０４番目のヒスチジンから２０９番目のヒスチジンまでのアミノ酸配列はポリヒスチジン配列である。配列番号４に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において７つのアミノ酸が置換（Ｉｌｅ６８Ｖａｌ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｈｉｓ１２５Ａｒｇ、Ｌｙｓ１５８Ｍｅｔ、Ａｒｇ１６２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１８８ＡｓｎおよびＬｅｕ１９０Ｓｅｒ）されたアミノ酸配列である。
【００７３】
実施例６  改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの評価
実施例２の形質転換体ＦｃγＲＩＩｂ、実施例３の形質転換体ｍ１、実施例４の形質転換体ｍ５、および実施例５の形質転換体ｍ７を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
【００７４】
それぞれの前培養液を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地に１％（ｖ／ｖ）接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧをそれぞれに添加し、引き続き２０℃で２２時間、好気的に振とう培養した。
【００７５】
培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてそれぞれの可溶性タンパク質抽出液を調製した。
【００７６】
形質転換体ＦｃγＲＩＩｂ、形質転換体ｍ１、形質転換体ｍ５および形質転換体ｍ７から調製した可溶性タンパク質抽出液中の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂ（それぞれ組換えＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ１、ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５およびＦｃγＲＩＩｂ−ｍ７）の濃度を、実施例３に記すＥＬＩＳＡ−３により測定した。
【００７７】
各形質転換体による培養液あたりの可溶性の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性は、可溶性タンパク質抽出液中の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの濃度を基に算出した。２連で測定を行なった結果、図１に示すように、各形質転換体による培養液あたりの可溶性の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性は、多い順に、形質転換体ｍ７（培養液あたりの可溶性のＦｃγＲＩＩｂ−ｍ７の生産性：１３５．１±２９．０ｍｇ／Ｌ−培養液）、形質転換体ｍ５（培養液あたりの可溶性のＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５の生産性：４７．６±２．４ｍｇ／Ｌ−培養液）、形質転換体ｍ１（培養液あたりの可溶性のＦｃγＲＩＩｂ−ｍ１の生産性：２０．５±４．０ｍｇ／Ｌ−培養液）であった。これらの各形質転換体による培養液あたりの可溶性の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性は、形質転換体ＦｃγＲＩＩｂによる培養液あたりの可溶性の組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性（２．５±０．３ｍｇ／Ｌ−培養液）より高かった。また、ＥＬＩＳＡ−３により測定可能であったことからＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５とＦｃγＲＩＩｂ−ｍ７がＩｇＧ結合性を有することがわかる。
【００７８】
このように、特定のアミノ酸の置換を有する改変型組換えＦｃγＲＩＩｂは、特定のアミノ酸の置換を有さない組換えＦｃγＲＩＩｂと比較して、その生産性が向上することがわかる。さらに、改変型組換えＦｃγＲＩＩｂが特定のアミノ酸の置換を多数有することで、その生産性がより向上することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の改変型組換えＦｃγＲＩＩｂは、効率的に生産可能であり、そのＩｇＧ結合性から、診断薬を含む医薬品、生化学試薬およびＩｇＧを精製するためのアフィニティークロマトグラフィー用のリガンドとして有用である。
【図１】
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【配列表】
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