(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識および結合部分を含むプローブであって、結合部分は、ポリミキシンの疎水性尾部の少なくとも一部が除去されているトランケートされたポリミキシン部分であり、標識は、７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）である、プローブ。
【請求項２】
ポリミキシン部分がポリミキシンＢ１から誘導されており、６−メチルオクタン酸基が除去されている、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
ポリミキシン部分がポリミキシンＢ２から誘導されており、６−メチルオクタン酸基が除去されている、請求項１に記載のプローブ。
【請求項４】
標的領域において細菌および／または真菌を検出する方法であって、
（１）細菌および／または真菌を蛍光標識するように適合されており、完全長ユビキシジン（配列番号１）などのユビキシジン部分を含む少なくとも１つの第１の結合部分および少なくとも１つの第１のフルオロフォアを含む、第１のプローブを準備するステップと、
（２）第１のプローブを標的領域に送達するステップと、
（３）適した波長の光を標的領域に照射して、第１のプローブを励起するステップと、
（４）標的領域において細菌および／または真菌が第１のプローブによって標識されたかどうかを判定するステップと、
（５）グラム陰性菌のみを標識するように適合されており、ポリミキシンの疎水性尾部の少なくとも一部が除去されているトランケートされたポリミキシン部分である第２の結合部分および第２のフルオロフォアを含む、第２のプローブを準備するステップと、
（６）第２のプローブを標的領域に送達するステップと、
（７）適した波長の光を標的領域に照射して、第２のプローブを励起するステップと、
（８）標的領域において第２のプローブが細菌を標識したかどうかを判定するステップと
を含み、標的領域において第１のプローブにより標識された種は、細菌および／または真菌と同定され、標的領域において第２のプローブにより標識された細菌は、グラム陰性菌またはグラム陽性菌と同定され、第１および第２のプローブは、哺乳動物細胞を蛍光標識しないように適合されている、方法。
【請求項５】
標的領域が、細胞培養物、生検サンプルなどの組織サンプル、体液サンプルなどの液体サンプルの一部またはカテーテルもしくはインプラントなどの医療器具の一部であり、方法がインビトロで行われてもよく、
細菌および／または真菌が標的領域に存在するかどうか、およびいずれかの細菌がグラム陰性であるか、またはグラム陽性であるかを判定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第１および／または第２のフルオロフォアが、近赤外または赤外領域のスペクトルで光を発し、
フルオロフォアが、光音響イメージングにより検出可能である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
第１および／または第２のフルオロフォアの蛍光の強度／量子収率が第１および／または第２のフルオロフォアの周囲環境に依存し、第１および／または第２のフルオロフォアの蛍光の量子収率または強度が、細胞膜内などの疎水性環境においてより高く、第１および／または第２のフルオロフォアが、独立して、７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、マラカイトグリーン、スチリルベースの染料、カスケードイエロー、プロダン（別名１−プロパノン、１−（６−（ジメチルアミノ）−２−ナフタレニル）、ダンシル（別名５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホニル）、Ｄａｐｏｘｙｌ、ＰｙＭＰＯ（別名１−（３−（スクシンイミジルオキシカルボニル）ベンジル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウム、ピレンおよびジエチルアミノクマリンである、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
複数のプローブ要素内のプローブ要素のうち１つまたは複数のフルオロフォアが、より長い蛍光寿命を有し、フルオロフォアのより長い蛍光寿命が、バックグラウンドの自家蛍光を上回ってプローブの検出を可能にし、フルオロフォアが、アザジオキサトリアングレン（ＡＤＯＴＡ）もしくはジアザオキサトリアングレン（ＤＡＯＴＡ）である、請求項４から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
蛍光下において標的領域を観察して、標的領域において同定されたいずれかの感染体（細菌または真菌）の形態を判定するステップを含み、
蛍光下において標的領域を観察して、標的領域内の細菌または真菌を同定するステップを含み、第１および第２のプローブが、それらの細菌または真菌の正体を判定するために使用される、請求項４から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
第１および／または第２の結合部分が真菌糸と結合してもよい、請求項５から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の結合部分が、アミノ酸２９から４１のユビキシジンフラグメント（ＵＢＩ２９〜４１、配列番号２）であり、または
結合部分が、元のメチオニンアミノ酸に対するノルロイシンアミノ酸の置換を含むＵＢＩ２９〜４１（ＵＢＩ２９〜４１Ｎｌｅ、配列番号３）である、請求項４から１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子プローブの分野に関し、より詳細には、細菌および真菌などの微生物の検出のための分子プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中で感染症の負担が増大しており、正確な診断が、正確な治療を提供することに対する土台であり続けている。
【０００３】
病院内の患者、広範には医療を受けている患者は、感染症のリスクがある。院内感染症（ＨＡＩ）は、さらに一般的になってきており、そのような感染症に速やかに、正確に反応する能力がより重要になりつつある。重症な患者の免疫系は少なくとも部分的に損なわれていることが多く、そのため患者は特に院内感染症（ＨＡＩ）にかかりやすくなる。
【０００４】
救命医療において人工呼吸されている患者およびすべての免疫不全患者は特に院内感染症（ＨＡＩ）にかかりやすく、最も甚大な被害をもたらす院内感染症（ＨＡＩ）のうちの１つは、依然として人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）である。ＶＡＰは依然として正確に診断するのが難しいことで知られており、不適切な治療が患者にとって有害であることも示されている。それゆえに、ＶＡＰは、高い死亡率、著しい罹患率を有し、医療資源にとって負担であり続けている。診断に関して、発熱、酸素依存の増加および頻脈の臨床徴候が依然として炎症または急性肺傷害を見つける非特異的な手段であるが、肺生検が依然として最も認められた手段であり、これは、侵襲的で、検査の固有の侵襲的な性質によりめったに利用されない検査である。気管支肺胞洗浄などの他の方法が依然として議論の余地があると同時に、非培養法はいかなる顕著な影響または強い確証も得られていない。したがって、速やかな医療決断が行われるのを可能にし、適切な療法により患者の転帰を向上させる、正確で適時のＶＡＰの診断を可能にする代替的なアプローチが必要とされる。
【０００５】
現在、臨床医は、いつ抗菌治療を開始するか、および開始するか否か、使用する薬剤の選択ならびに治療を開始した場合、いつ療法を徐々に減らすのかに関して著しい不確実さに直面している。これらの問題は、抗生物質療法の遅れおよび不十分さと、臨床転帰の悪さとの間に関連性が証明されたため、有効な抗生物質管理に対して障害となる。
【０００６】
分子イメージング技術は、微生物の特異的なトレーサーの使用を可能にし、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）などのイメージング様式と組み合わされた場合、無菌部位から感染部位を視覚的に示す能力を有する可能性がある。しかしながら、このアプローチは、ポイントオブケア診断検査が必要とされると予想される集中治療コホートなどの一部の患者群には適用できず、放射性薬剤の投与が問題となり、制限される場合がある。これらの技術はまた放射線を伴い、病院外の環境でのイメージングに容易に適用できない。
【０００７】
当該技術分野における代替的なアプローチは、内視鏡の使用により患者の標的領域の直接的な可視化を可能にする光プローブの適用である。Ｖｉｓｅｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．名義のＷＯ２００３／０７９０１５は、変化した代謝活動に関して正常組織および患部組織を同定し、特徴づけるための光学イメージングプローブについて開示している。
【０００８】
本出願人名義のＷＯ２０１２／１３６９５８は、特定の細胞タイプに染料が内在化すると蛍光の増加によりインビボで細胞を視覚化することが可能な分岐染料（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｄｙｅ）について開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、患者の状態が感染症によるものであるかどうか、そうである場合、その感染症が細菌性または真菌性であるかどうかのその場（インサイチュ）でのポイントオブケア判定を可能にする炎症の原因を判定する改良された方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、迅速で正確なポイントオブケア診断に適した改良されたイメージング／感知方法を提供することである。
【００１１】
本発明の第１の態様によると、標的領域において細菌および／または真菌を検出する方法であって、
（１）細菌および／または真菌を標識するように適合されている第１のプローブを準備するステップと、
（２）第１のプローブを標的領域に送達するステップと、
（３）適した波長の光を標的領域に照射して、第１のプローブを励起するステップと、
（４）標的領域において細菌および／または真菌が第１のプローブによって標識されたかどうかを判定するステップと
を含み、標的領域において第１のプローブによって細菌が標識されたと判定された場合、
（５）グラム陰性菌またはグラム陽性菌のみを標識するように適合されている第２のプローブを準備するステップと、
（６）第２のプローブを標的領域に送達するステップと、
（７）適した波長の光を標的領域に照射して、第２のプローブを励起するステップと、
（８）標的領域において第２のプローブが細菌を標識したかどうかを判定するステップと
をさらに含み、標的において第２のプローブにより標識された細菌は、グラム陰性菌またはグラム陽性菌と同定される、方法が提供される。
【００１２】
細菌が第１のプローブによって標識されない場合、標的領域内に細菌が存在せず、ステップ（５）から（８）を行う必要はない。標的領域において細菌が第１のプローブによって標識された場合、ステップ（５）から（８）の実施は、その細菌がグラム陰性であるか、またはグラム陽性であるかを判定する。
【００１３】
例えば、第２のプローブがグラム陰性菌を標識するように適合されている場合、ステップ（４）において第１のプローブによって標識されたと判定され、その後、ステップ（８）において第２のプローブによって標識されたと判定される細菌は、グラム陰性菌である。ステップ（４）において第１のプローブによって標識されたと判定され、その後、第２のプローブによって標識されなかったと判定される（ステップ（８））細菌は、グラム陽性菌である。
【００１４】
したがって、本発明の方法は、標的領域における細菌の存在、および細菌が標的領域に存在する場合、その細菌がグラム陰性であるか、またはグラム陽性であるかの判定を可能にする。さらに、本方法は、標的領域における真菌の存在の判定を可能にする。
【００１５】
標的領域がグラム陰性菌およびグラム陽性菌を含む実施形態において、第１のプローブは、標的領域のすべての細菌を標識することになり、第２のプローブは、グラム陽性菌またはグラム陰性菌のいずれかを標識して、それにより直接的（それらを標識化することによって）または間接的（それらを標識化せずに）のいずれかで両グラム細菌を同定することになる。
【００１６】
好ましくは、標的領域は、患者内の組織の一部であってもよく、本方法は、インビボで行われてもよい。例えば、標的領域は、患者の肺の一部であってもよく、本方法は、プローブを標的領域に送達し、光を標的領域に送達し、標的領域から蛍光を検出するために気管支鏡のワーキングチャネルを使用して行われてもよい。あるいは、プローブを標的領域に送達し、光を標的領域に送達し、標的領域から蛍光を検出するために別個の器具が使用されてもよい。
【００１７】
例えば、ファイバー共焦点蛍光顕微鏡（ｆｉｂｅｒ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（ＦＣＦＭ）などの発光顕微鏡（ｏｐｔｉｃａｌ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（ＯＥＭ）を使用して患者の組織から蛍光が検出されてもよい。
【００１８】
標的領域は、患者の皮膚上、関節中、循環器系中、これらに限定されないが消化器系もしくは生殖器系などの上皮内層またはヒトの手術中の手技によってアクセス可能な任意の領域であってもよく、プローブは、例えば、内視鏡を介してまたは直接的な噴霧によって送達および／または観察されてもよい。
【００１９】
あるいは、標的領域は、細胞培養物、生検サンプルなどの組織サンプルまたは体液サンプルなどの液体サンプルの一部であってもよく、本方法はインビトロで行われてもよい。
【００２０】
標的領域が患者の組織の一部である実施形態において、患者はヒト患者であることが好ましい。しかしながら、患者は、例えば、ウマ、ヒツジ、ウシまたはげっ歯類などの非ヒト動物であってもよい。
【００２１】
救命医療または集中治療などの医療の多くの領域において、例えば、肺の炎症が無菌性、細菌性または真菌性であるか、および細菌性の場合、その細菌がグラム陽性であるか、もしくはグラム陰性であるか、または両方が混ざったものであるかを同定する必要がある。しかしながら、安全に動かすことができない患者、特に、人工呼吸されている患者の炎症を検査するためにＰＥＴスキャンなどの標準的な方法を使用することは一般に不可能である。したがって、臨床医は、炎症の原因を、自信を持って診断するためおよび治療の適切な補正方針を指示するための十分な情報を有していない場合が多い。例えば、炎症が無菌性である場合、患者に抗生物質を投与することは、助けにならず、有害な副作用がある可能性もある。また、細菌がグラム陰性であり、グラム陽性菌に対してのみ有効な抗生物質が患者に与えられた場合または逆もまた同様に、抗生物質は細菌を排除せず、不都合で有害な副作用がある可能性もある。
【００２２】
本発明の方法は、臨床医によってその場（インサイチュ）でポイントオブケアにおいて行うことができ、患者の肺または肺の一部内などの標的領域に細菌および／または真菌が存在するかどうか、およびいずれかの細菌がグラム陰性であるか、またはグラム陽性であるかを判定する。したがって、本発明の方法は、有利にも臨床医が炎症の原因を、自信を持って判定するため、および例えば、適切な抗生物質または抗真菌薬を患者に与えることなど治療の最良の方針を判断するために必要な情報を臨床医に提供する。
【００２３】
標的領域において細菌が検出され、適切な抗生物質が患者に投与された場合、本方法は、抗生物質の効果を判定するために行われてもよい。例えば、標的領域における細菌の数の減少または細菌の不在は、治療の方針が細菌感染を効果的に排除していることを一般に示す。同様に、標的領域において真菌が検出され、適切な抗真菌剤が患者に投与された場合、本方法は、抗真菌薬の効果を判定するために行われてもよい。
【００２４】
第１のプローブは、少なくとも１つの第１のプローブ要素を含むことが好ましい。第１のプローブは、少なくとも２つの第１のプローブ要素を含んでもよい。第１のプローブは、少なくとも３つの第１のプローブ要素を含んでもよい。
【００２５】
そのまたは各々の第１のプローブ要素は、第１の標識および第１の結合部分を含んでもよい。
【００２６】
第２のプローブは、少なくとも１つの第２のプローブ要素を含むことが好ましい。第２のプローブは、少なくとも２つの第２のプローブ要素を含んでもよい。第２のプローブは、少なくとも３つの第２のプローブ要素を含んでもよい。
【００２７】
そのまたは各々の第２のプローブ要素は、第２の標識および第２の結合部分を含んでもよい。
【００２８】
第１および／または第２の標識はフルオロフォアであってもよく、第１および／または第２のプローブは細菌および／または真菌を蛍光標識するように適合されていてもよい。
【００２９】
第１および／または第２の標識は、放射性標識であってもよい。放射性標識は、放射性ヌクレオチドを含んでもよい。放射性標識は、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、１１Ｃ、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅもしくは８６Ｚｒのうちの１つまたは複数を含んでもよい。
【００３０】
第１および／または第２の標識は、磁気共鳴標識またはコアであってもよい。磁気共鳴標識またはコアは、例えば、Ｆｅ、ＭｎまたはＧｄであってもよい。
【００３１】
第１および第２のプローブは、二次標識を含んでもよい。例えば、第１のプローブは、フルオロフォアおよび放射性標識を含んでもよく、または第１のプローブは、フルオロフォアおよび二次フルオロフォアなどを含んでもよい。さらなるバリエーションおよび組合せが当業者には認識されると予想される。
【００３２】
好ましくは、第１のプローブは第１のフルオロフォアを含み、第２のプローブは第２のフルオロフォアを含む。第１および／または第２のフルオロフォアは、任意の適したフルオレセインなどのフルオロフォアまたはフルオレセインなどのその誘導体、シアニンベースのフルオロフォア、ローダミンベースのフルオロフォアもしくはホウ素ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）ベースのフルオロフォアであってもよい。
【００３３】
第１および／または第２のフルオロフォアは、赤、近赤外または赤外領域のスペクトルで光を発してもよい。例えば、第１および／または第２のフルオロフォアは、Ｃｙ７または類似のフルオロフォアであってもよい。赤外線は、大部分の組織を通過することができ、全身または体の大きな部分をイメージングすることを可能にする。さらに、赤外線の吸収が、光音響イメージングにより検出可能な熱膨張につながる場合もあり、それにより存在する感染体を間接的に検出することができる。
【００３４】
好ましくは、第１および／または第２のフルオロフォアは、第１および／または第２のフルオロフォアの蛍光の強度／量子収率が第１および／または第２のフルオロフォアの周囲環境に依存するような環境感受性フルオロフォアである。例えば、遊離の水性環境における第１および／または第２のフルオロフォアの量子収率または強度は、第１および／または第２のフルオロフォアが細胞膜内などの疎水性環境にある場合と異なる可能性もある。好ましくは、第１および／または第２のフルオロフォアの蛍光の量子収率または強度は、細胞膜内などの疎水性環境においてより高い。それゆえに、第１および／または第２のフルオロフォアによって発される蛍光の強度は、例えば、第１および／または第２のプローブ要素が細菌の細胞膜内で結合している場合などの、第１および／または第２のフルオロフォアが細胞膜内にある場合に増加する。したがって、第１および／または第２のフルオロフォアは、本発明の方法において細胞膜を介して細胞を蛍光標識するために使用されるときに特に有効な可能性もある。
【００３５】
例えば、第１および／または第２のフルオロフォアは、７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、マラカイトグリーン、スチリルベースの染料、カスケードイエロー（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ）、プロダン（別名１−プロパノン、１−（６−（ジメチルアミノ）−２−ナフタレニル）、ダンシル（別名５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホニル）、Ｄａｐｏｘｙｌ、ＰｙＭＰＯ（別名１−（３−（スクシンイミジルオキシカルボニル）ベンジル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウム、ピレンおよびジエチルアミノクマリン、またはそれらの誘導体もしくはバリアントであってもよい。
【００３６】
第１および／または第２のフルオロフォアは、ＮＢＤ部分であることが好ましい。ＮＢＤは、本発明のプローブに特に適したフルオロフォアであることを本発明者らが発見し、プローブが細菌または少なくとも一部の真菌と結合したときの強い蛍光および低いバックグラウンドの蛍光をもたらし、試験された他のフルオロフォアと比較して細菌および少なくとも一部の真菌をはっきりと確実に標識することを可能にする。
【００３７】
複数のプローブ要素内のプローブ要素のうち１つまたは複数のフルオロフォアは、長い蛍光寿命を有してもよく、フルオロフォアの長い蛍光寿命は、バックグラウンドの自家蛍光を上回ってプローブの検出を可能にする。例えば、使用中、フルオロフォアの蛍光は、フルオロフォアからの蛍光がバックグラウンドの蛍光と容易に区別できるように標的領域のバックグラウンドの自家蛍光よりも有意に長い寿命を有してもよい。
【００３８】
例えば、フルオロフォアは、アザジオキサトリアングレニウム（ａｚａｄｉｏｘａｔｒｉａｎｇｕｌｅｎｅ）（ＡＤＯＴＡ）染料もしくはジアザオキサトリアングレニウム（ｄｉａｚａｏｘａｔｒｉａｎｇｕｌｅｎｅ）（ＤＡＯＴＡ）またはそれらの誘導体である。
【００３９】
第１および／または第２のフルオロフォアからの蛍光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）または相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）素子などの検出素子に向けられている第１および／または第２のフルオロフォアから発せられる蛍光によって直接イメージングされてもよい。第１および／または第２のフルオロフォアからの蛍光は、間接的にイメージングされてもよい。例えば、蛍光は、光音響イメージングを使用することによって音波に変換されてもよい。光音響イメージングは、標的領域の高分解能イメージが生成されるのを可能にすることもできる。第１および／または第２のフルオロフォアが近赤外または赤外領域の波長（約７００ｎｍ〜１ｍｍ）で光を発する実施形態において、患者の全身または実質的に全身をイメージングすることができる。あるいは、第１および／または第２のフルオロフォアが可視領域の波長（約３９０ｎｍ〜７００ｎｍ）で光を発する実施形態において、患者の特定の標的領域をイメージングすることができ、光は、例えば、光ファイバーにより標的領域に送達されてもよく、標的領域から受け取られてもよい。
【００４０】
本方法は、光超音波（ｐｈｏｔｏａｃｃｏｕｓｔｉｃ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）を使用して標的領域を観察して、標的領域において検出された感染体（細菌または真菌）の正体を判定するステップを含んでもよい。本方法は、光音響器具を使用して標的領域を観察して、標的領域内の微生物を同定するステップを含んでもよく、第１および第２のプローブは、直接的な蛍光検出を使用して、それらの微生物の正体を判定するために使用されてもよい。
【００４１】
本方法は、白色光または蛍光下において標的領域を観察して、標的領域において同定されたいずれかの感染体（細菌または真菌）の形態を判定するステップを含んでもよい。本方法は、白色光または蛍光下において標的領域を観察して、標的領域内の微生物を同定するステップを含んでもよく、第１および第２のプローブは、それらの微生物の正体を判定するために使用されてもよい。
【００４２】
例えば、細菌が白色光もしくは蛍光または自家蛍光によって同定された場合、ステップ（５）から（８）の実施は、その細菌がグラム陰性であるか、またはグラム陽性であるかを判定することがさらに想定される。
【００４３】
第１の結合部分は、少なくとも一部の細菌と選択的に結合するが、例えば、哺乳動物細胞などの動物細胞とは結合しないか、または極めて弱くしか結合しない場合もある。それゆえに、第１の結合部分は、第１の細菌結合部分であってもよい。第１の細菌結合部分は、実質的にすべての細菌と結合するが、動物細胞とは結合しないか、または極めて弱くしか結合しない場合もある。
【００４４】
第２の結合部分は、少なくとも一部の細菌と選択的に結合するが、例えば、哺乳動物細胞などの動物細胞とは結合しないか、または極めて弱くしか結合しない場合もある。それゆえに、第２の結合部分は、第２の細菌結合部分であってもよい。第２の細菌結合部分は、実質的にグラム陰性菌と選択的に結合するが、グラム陽性菌もしくは哺乳動物細胞などの動物細胞とは結合しないか、または極めて弱くしか結合しない場合もある。第２の細菌結合部分は、実質的にグラム陽性菌と選択的に結合するが、グラム陰性菌もしくは哺乳動物細胞などの動物細胞とは結合しないか、または極めて弱くしか結合しない場合もある。
【００４５】
第１および／または第２の結合部分は、真菌と選択的に結合するが、例えば、哺乳動物細胞などの動物細胞とは結合しない場合もある。それゆえに、第１および／または第２の結合部分は、第１および／または第２の真菌結合部分であってもよく、真菌糸と結合してもよい。
【００４６】
第１および／または第２の結合部分は、少なくとも一部の細菌および少なくとも一部の真菌と選択的に結合するが、哺乳動物細胞などの動物細胞とは結合しい場合もある。それゆえに、第１および／または第２のプローブは、標的領域において真菌および／または少なくとも一部の細菌の検出を可能にすることができる。例えば、結合部分は、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの真菌糸と結合するように適合されていてもよい。
【００４７】
第１の結合部分は、完全長ユビキシジン（ｕｂｉｑｕｉｃｉｄｉｎ）（配列番号１）などのユビキシジン部分またはそのフラグメントもしくはバリアントであってもよい。ユビキシジン部分は、哺乳動物細胞よりも細菌と選択的に結合することができるのが好ましい。第１の結合部分は、ユビキシジンの少なくとも１０個の連続したアミノ酸または少なくとも１２個の連続したアミノ酸を含むユビキシジンのフラグメントであってもよい。例えば、第１の結合部分は、アミノ酸２９から４１のユビキシジンフラグメントであってもよい（ＵＢＩ２９〜４１、配列番号２）。第１の結合部分は、１つまたは複数の置換を含むユビキシジン部分であってもよい。そのまたは各々の置換は、保存的置換であってもよく、ユビキシジン部分の細菌結合性への影響がほとんどないか、または好ましくはまったくない。そのまたは各々の置換は、分解または酸化に対するユビキシジン部分の安定性の増加をもたらす可能性がある。例えば、結合部分は、元のメチオニンアミノ酸に対するノルロイシンアミノ酸の置換を含むＵＢＩ２９〜４１であってもよい（ＵＢＩ２９〜４１Ｎｌｅ、配列番号３）。
【００４８】
ユビキシジンは、気管上皮細胞、腸粘膜およびマクロファージに存在する哺乳動物の抗菌性ペプチドである。ユビキシジンは、細菌などの原核生物の細胞膜と特異的に結合するが、哺乳動物細胞とは結合しない。
【００４９】
第２の結合部分は、グラム陽性菌と選択的に結合するが、実質的にグラム陰性菌とは結合しない場合もある。好ましくは、第２の結合部分は、グラム陰性菌と選択的に結合するが、実質的にグラム陽性菌とは結合しない。それゆえに、第２の結合部分がグラム陰性菌と選択的に結合する実施形態において、第２のプローブは、グラム陰性菌を含まない標的領域にランダムに分散させられてもよく、且つ標的領域に存在するあらゆるグラム陰性菌の細胞膜に局在させ、それによりグラム陰性菌を標識してもよい。したがって、第２のプローブは、標的領域におけるグラム陰性菌の存在または不在を選択的に示すように適合されていてもよい。
【００５０】
例えば、第２の結合部分は、完全長ポリミキシン（配列番号４）などのポリミキシン部分またはそのフラグメントもしくはバリアントであってもよい。ポリミキシンはグラム陰性菌と選択的に結合するため、ポリミキシン部分を含む細菌結合部分は、選択的にそれぞれのプローブ要素をグラム陰性細菌のみと結合させることになり、それにより標的領域内のあらゆるグラム陰性細菌の検出を可能にする。第２の結合部分は、ポリミキシンの少なくとも６個の連続したアミノ酸または少なくとも８個の連続したアミノ酸を含むポリミキシンのフラグメントであってもよい。第２の結合部分は、１つまたは複数の置換を含むポリミキシン部分であってもよい。そのまたは各々の置換は、保存的置換であってもよく、ポリミキシン部分のグラム陰性菌結合性に対する影響がほとんどないか、好ましくはまったくない。そのまたは各々の置換は、分解または酸化に対するポリミキシン部分の安定性の増加をもたらす可能性がある。
【００５１】
第１のフルオロフォアと第２のフルオロフォアが同じ実施形態において（例えば、第１のフルオロフォアがＮＢＤであり、第２のフルオロフォアがＮＢＤである）、本方法は、第２のプローブが標的領域と接触させられる前に、標的領域を洗浄するステップまたは別の方法で標的領域から第１のプローブを取り除くステップを含んでもよい。したがって、標的領域の細菌がグラム陰性であるか、またはグラム陽性であるかを判定するときに、第１のプローブによる標的領域の汚染が予防されるか、または少なくとも最小限にされる。
【００５２】
第１のフルオロフォアと第２のフルオロフォアは、異なってもよい。第１のフルオロフォアと第２のフルオロフォアが異なる実施形態において、好ましくは、第１のフルオロフォアは、第２のフルオロフォアの発光ピークとは有意に異なる発光ピークを有する。（すなわち、第１のフルオロフォアの蛍光は第２のフルオロフォアの蛍光と異なる波長であるため、第１のフルオロフォアからの蛍光と第２のフルオロフォアからの蛍光を選択的に検出することが可能である）。例えば、第１のフルオロフォアはＮＢＤであってもよく、第２のフルオロフォアはＴＡＭＲＡであってもよい。
【００５３】
第１のフルオロフォアが第２のフルオロフォアと異なる実施形態において、第２のプローブを標的領域に送達するステップが、第１のプローブを標的領域に送達するステップと同時に行われてもよく、細菌が第１のプローブによって標識されたかどうか、およびその細菌が同時に第２のプローブによって標識されたかどうかを判定できるように、第１および第２のフルオロフォアを励起するのに適した波長または適した複数の波長の光を標的領域に照射してもよい。よって、細菌および／または真菌を検出し、検出されたいずれかの細菌が単一の手順でグラム陰性であるか、またはグラム陽性であるかを判定することが可能である。
【００５４】
好ましくは、フルオロフォアの蛍光は、バックグラウンドまたは、存在する場合には、標的領域における自家蛍光を上回って直接または間接的に検出可能である。標的領域内に元々ある細胞または組織の自家蛍光は、第１のプローブのフルオロフォアよりも短い蛍光寿命を有してもよい。標的領域内に元々ある細胞または組織の自家蛍光は、プローブのフルオロフォアのものより速い速度で経時的に減少してもよい。それゆえに、標的領域において観察される経時的によりゆっくりと減少する蛍光は、第１のプローブを示す可能性があり、標的領域において観察される経時的により速く減少する蛍光が自家蛍光を示す可能性がある。例えば、フルオロフォアは、アザジオキサトリアングレン（ＡＤＯＴＡ）もしくはジアザオキサトリアングレン（ＤＡＯＴＡ）またはそれらの誘導体であってもよい。
【００５５】
第１および／または第２のプローブが少なくとも２つのプローブ要素を含む実施形態において、第１および／または第２のプローブはコアを含んでもよく、少なくとも２つのプローブ要素のそれぞれがコアに接続されてもよい。
【００５６】
「コア」という用語は、単一のユニットを形成するために複数のプローブ要素をつなぐ共有部分を指す。それゆえに、コアは、単原子であってもよく、あるいは官能基、飽和もしくは不飽和炭化水素鎖またはポリグリゴール（直鎖、分岐もしくは環式）、ペプチド配列またはポリマーを含んでいてもよい。
【００５７】
一般に、少なくとも２つのプローブ要素のうちのそれぞれのプローブ要素は、フルオロフォアおよび結合部分を含む。例えば、３つの第１のプローブ要素を含む第１のプローブは、３つの第１のフルオロフォアおよび３つの第１の結合部分を含む。
【００５８】
少なくとも２つのフルオロフォアを含む第１および／または第２のプローブは、プローブ１つ当たりがより明るく、それにより同じシグナルをより少ないプローブから得られると予想することができる。したがって、細菌を確実に検出できるようにするために、標的領域に適用される必要がある第１および／または第２のプローブはより少ない量であることが予想され得る。
【００５９】
しかしながら、少なくとも一部の実施形態において、少なくとも２つのフルオロフォアが自己消光する場合もあり、例えば第１のフルオロフォアが第２のフルオロフォアによって吸収されたエネルギーを熱として非放射的に消散する。したがって、少なくとも２つのフルオロフォアを含む第１または第２のプローブは、蛍光性である場合も、またはそうでない場合もあり、実際、自己消光のために蛍光が不十分であると当業者に予想され得る。
【００６０】
驚くべきことに、本発明者らは、複数のフルオロフォアを含むプローブにおいて自己消光する少なくともいくつかのフルオロフォアは、疎水性環境にある場合、自己消光することができないことを発見した。例えば、複数のＮＢＤフルオロフォアを含む第１のプローブは、水性環境ではほとんど蛍光を示さないが、細胞膜内に少なくとも部分的に組み込まれた場合、明るく蛍光を発する。
【００６１】
当該技術分野において公知の光プローブは、一般に厳しい条件のためにプローブの分解もしくは酸化および／またはプロテアーゼの破壊を引き起こす可能性があるインビボの標的領域において十分に保持されず、結果として、プローブは、標的の確実な検出を可能にするそれらの標的と結合した状態を保つことができない。例えば、サーファクタント濃度が高い肺内のイメージングに使用される光プローブは、一般にそれらの標的を検出させることができない。肺内のさらなる問題としては、そのなかの循環体液によってプローブが「洗い流されること」が挙げられる。
【００６２】
驚くべきことに、本発明者らは、複数のを含む第１および／または第２のプローブが当該技術分野において公知のプローブよりも酸化、分解およびプロテアーゼ活性に対してより安定であり、そのようなプローブは、肺で見られる条件などの厳しい条件であっても本発明の方法を使用してインビボにおいて細菌を確実に検出可能にすることを発見した。
【００６３】
第１および／または第２のプローブは、切断可能なリンカーによって少なくとも１つの第１および／または第２のプローブ要素と連結されたクエンチャーを含んでもよい。そのまたは各々の第１および／または第２のフルオロフォアは、少なくとも１つの第１および／または第２のプローブ要素が切断可能なリンカーによりクエンチャーと連結されている場合、クエンチャーによって実質的に蛍光消光されることもあり、少なくとも１つの第１および／または第２のプローブ要素は、切断可能なリンカーが切断されるとクエンチャーから分離される。
【００６４】
好ましくは、切断可能なリンカーは、酵素切断可能なペプチド配列を含み、切断酵素が酵素切断可能なペプチド配列を切断するときに、リンカーが切断される。
【００６５】
したがって、酵素切断可能なペプチド配列の切断は、一般にリンカーの切断に相当し、これにより第１および／または第２のプローブの少なくとも１つのプローブ要素からクエンチャーが切断される。それゆえに、切断可能なリンカーが酵素切断可能なペプチド配列を含む実施形態において、「リンカーの切断」という用語は、別に指定されない限り、酵素切断可能なペプチド配列の切断を指す。
【００６６】
当該技術分野において公知の光プローブは、一般に常時蛍光性であり（いわゆる「常時オン」のフルオロフォア）、判定されるのがプローブの位置であるか、あるいはプローブの環境が変化したときにプローブがその蛍光を変化させるかのいずれかであり、ここでこの環境の変化は、クエンチャーからの除去もしくは分離（例えば、プローブに基づく蛍光共鳴エネルギー移動、すなわちＦＲＥＴの場合）または細胞に内在化することである。
【００６７】
しかしながら、第１および／または第２のプローブが１つのフルオロフォアを含むか、または自己消光しない少なくとも２つのフルオロフォアを含む実施形態において、クエンチャーおよび切断可能なリンカーを含む第１および／または第２のプローブは、切断可能なリンカーが切断酵素などの切断因子によって切断されたかどうかにより、それらの蛍光を有利に変化させ、観察されたときの第１および／または第２のプローブの位置が細菌および／または真菌の存在を示すことができる。したがって、本発明の方法は、当該技術分野において公知の光プローブを使用する方法よりも具体的で詳細な情報を提供することができる。
【００６８】
第１のプローブがクエンチャーおよび切断可能なリンカーを含む実施形態において、本発明の方法は、（ａ）第１のプローブの蛍光の増加または第１のプローブの蛍光の色の変化によって示される切断因子が存在するかどうか、（ｂ）第１のプローブによる細菌および／または真菌の標識によって示される細菌および／または真菌が存在するかどうか、ならびに細菌が存在した場合、（ｃ）第２のプローブによって標識されたか否かに応じてその細菌がグラム陰性であるか、またはグラム陽性であるかを判定することができる。
【００６９】
切断因子は、標的領域内に元々ある細胞によって産生または発現されてもよい。切断因子は、標的領域に移動した、患者により産生された、例えば、好中球などの付加的な細胞によって産生または発現されてもよい。切断因子は、例えば、細菌または真菌などの標的領域の感染細胞によって産生または発現されてもよい。
【００７０】
切断因子は切断酵素であることが好ましい。切断酵素はエラスターゼであり、酵素切断可能なペプチド配列の切断はエラスターゼの存在を示す。一般に、エラスターゼは好中球エラスターゼであり、エラスターゼは好中球によって産生または発現される。一般に、エラスターゼは、タンパク質分解的な切断が可能な活性型の酵素である。好中球は、一般に病態生理学的なまたは正常な機能の一部のいずれかの炎症反応を起こしている体内の部位を標的とする。したがって、患者内の標的領域における好中球の存在は、標的領域内の組織または組織の一部が炎症を起こしていることを示す。患者がヒトである実施形態において、切断酵素はヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）であることが好ましい。よって、リンカーの切断の結果として生じる第１および／または第２のフルオロフォアの蛍光または蛍光の増加は好中球エラスターゼの存在を示し、それにより、標的領域における好中球の存在を示すため、標的領域内の組織の炎症を示す。したがって、本発明の方法は、標的領域内の組織が炎症を起こしているかどうかを判定するように適合されている。
【００７１】
したがって、有利にも、本発明の方法は、（ａ）組織が炎症を起こしているかどうか、（ｂ）細菌および／または真菌が存在するかどうか、および（ｃ）存在するいずれかの細菌がグラム陽性であるか、もしくはグラム陰性であるかを判定する方法であり、これはインビボまたはインビトロで行われてもよい。したがって、本方法は、医療専門家が炎症を取り除くための適切な治療を決定することを可能にする情報を提供することができる。
【００７２】
好ましくは、切断可能なリンカーは、クエンチャーがそのまたは各々の第１および／または第２のフルオロフォアを消光するだけ、そのまたは各々の第１および／または第２のフルオロフォアに十分に近いような寸法にされる。一般に、クエンチャーは、そのまたは各々の第１および／または第２のフルオロフォアから１０ｎｍ未満で離れている。好ましくは、クエンチャーは、そのまたは各々の第１および／または第２のフルオロフォアから５ｎｍ未満で離れている。
【００７３】
一般に、酵素切断可能なペプチドリンカーは、切断酵素のある切断部位であるかまたは特定の切断部位であるペプチド配列である。好ましくは、切断酵素のそのまたは各々の切断部位は、複数のアミノ酸を含む。切断酵素がエラスターゼである実施形態において、好ましくは、酵素切断可能なペプチド配列は、アミノ酸配列Ａ−Ａ−Ｐ−Ｖ（すなわち、アラニン−アラニン−プロリン−バリンもしくはＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）またはＥ−Ｅ−Ｉ−Ｎｌｅ−Ｒ−Ｒを含む。酵素切断可能なペプチド配列は、例えば、ｘＡＡＰＶｙ、ｘＡＡＰＶもしくはＡＡＰＶｙなどの位置ｘおよび／またはｙの配列ＡＡＰＶのいずれかの側に１つまたは複数の追加のアミノ酸を含んでもよい。
【００７４】
あるいは、切断酵素は、ＭＭＰ−９などのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）であってもよく、酵素切断可能なペプチド配列は、Ｇ−Ｐ−Ｋ−Ｇ−Ｌ−Ｋ−Ｇを含んでもよい。切断酵素は、プロテイナーゼ３であってもよく、酵素切断可能なペプチド配列は、Ｖ−Ａ−Ｄ−Ｃ−Ａ−Ｄ−Ｙを含んでもよい。切断酵素は、カテプシンＧであってもよく、酵素切断可能なペプチド配列は、Ａ−Ａ−Ｐ−ＦまたはＦ−Ｖ−Ｔ−Ｇｎｆ−Ｓ−Ｗを含んでもよい（ここで、Ｇｎｆ＝４−グアニジン−Ｌ−フェニルアラニン）。切断酵素は、カスパーゼであってもよく、酵素切断可能なペプチド配列は、Ｄ−Ｅ−Ｖ−Ｄを含んでもよい。
【００７５】
代替的実施形態において、切断可能なリンカーは、微生物の存在により生成するスーパーオキシド（Ｏ２−）もしくは過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）などの反応性酸素種または活性化好中球などの炎症プロセスによって切断されてもよい。したがって、反応性酸素種が切断因子であってもよい。例えば、リンカーは、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、２０１４、８７４ページＲｏｇｅｒ  Ｙ．Ｔｓｉｅｎに記載されているものなどの変性されたボロン酸ベースのリンカーであってもよい。
【００７６】
第１および／または第２のプローブがクエンチャーを含む実施形態において、そのまたは各々の第１および／または第２のプローブ要素の、そのまたは各々の第１および／または第２のフルオロフォアは、適したクエンチャーとＦＲＥＴ対を形成することができる任意のフルオロフォアであってもよい。一般に、フルオロフォアとクエンチャーは、確実にフルオロフォアからクエンチャーへのエネルギーの移動のための適切な励起および発光スペクトルを有するように対として選択される（すなわち、それらはＦＲＥＴ対を形成する）。例えば、一般的なフルオロフォア／クエンチャー対としては、Ｃｙ３／Ｃｙ５、Ｃｙ３／ＱＳＹ２１、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、フルオレセイン／メチルレッド、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）／黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などが挙げられる。ＦＲＥＴ対のさらなる例は、当業者が容易に同定することができる。
【００７７】
クエンチャーは、ダーククエンチャーであってもよい。ダーククエンチャーは、励起されたフルオロフォアからエネルギーを受け取り、そのエネルギーを非放射的に、一般に、例えば、熱または音響エネルギーとして消散することができる部分である。したがって、フルオロフォア／クエンチャー対が十分に近くにあり、フルオロフォアの励起スペクトル内の波長の光が照射されると、クエンチャーは、非放射的な様式でフルオロフォアが光から吸収したエネルギーを消散し、蛍光が観察されない。このように、ダーククエンチャーは、フルオロフォアの蛍光を抑制する。
【００７８】
クエンチャーがダーククエンチャーである実施形態において、クエンチャーは、例えば、メチルレッド、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ＤＡＢＳＹＬ）、Ｉｏｗａ  ｂｌａｃｋ  ＦＱもしくはＩｏｗａ  ｂｌａｃｋ  ＲＱ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．アイオワ州、米国）、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２またはＢＨＱ３であってもよい。
【００７９】
クエンチャーは、蛍光クエンチャーであってもよい。蛍光クエンチャーは、励起されたフルオロフォアからエネルギーを受け取り、そのエネルギーを放射することができる部分である。したがって、蛍光クエンチャーは一般にフルオロフォアであり、エネルギーを受け取ったフルオロフォアによって放射される光とは異なる波長でクエンチャーが光を発する。このように、蛍光の色の変化は、クエンチャーのフルオロフォアに対する相対的な近接を示す。
【００８０】
クエンチャーが蛍光クエンチャーである実施形態において、クエンチャーは、例えば、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）などのローダミンもしくはその誘導体、フルオレセインもしくはその誘導体、シアニンフルオロフォアまたはＢＯＤＩＰＹフルオロフォアであってもよい。
【００８１】
クエンチャーが蛍光クエンチャーである実施形態において、クエンチャーは、好中球を標識するように適合されていてもよい。したがって、切断酵素が好中球によって産生される実施形態において、本発明の方法は、エラスターゼなどの切断酵素の存在を判定するよう、好中球の存在を判定するよう、存在する可能性のあるいずれかの細菌および／または真菌を標識するよう、および細菌がグラム陽性であるか、またはグラム陰性であるかを判定するように適合されていてもよい。
【００８２】
例えば、切断酵素がＨＮＥである実施形態において、蛍光クエンチャーは、細菌の存在によって、または例えば、カルシウムイオノフォアなどの刺激によって活性化される好中球によるエンドサイトーシスにより取り込まれてもよい。それゆえに、蛍光クエンチャーは、標的領域内の好中球を選択的に標識することができる。本発明者らは、ＴＡＭＲＡなどの蛍光クエンチャーが、好中球により選択的に取り込まれるが、細菌によって、および単球などの他の炎症細胞によっては取り込まれないか、または最大でもはるかに少ない程度で取り込まれることを観察した。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、この観察された蛍光クエンチャーの取り込みの差は、好中球などの極めて食細胞のより高いエンドサイトーシスおよび飲作用による可能性があると推測する。
【００８３】
そのまたは各々の第１および／または第２のプローブ要素の、そのまたは各々の第１および／または第２のフルオロフォアがＮＢＤである実施形態において、クエンチャーは、ＮＢＤからのエネルギーを受け取ってＮＢＤとＦＲＥＴ対を形成することができる部分であることが好ましい。クエンチャーは、メチルレッドもしくはテトラメチルローダミンまたはその誘導体であることが好ましい。例えば、クエンチャーは、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）であってもよい。さらに適したフルオロフォア／クエンチャー対は、当業者が決定することができる。
【００８４】
好ましくは、本方法が、標的領域の組織が炎症を起こしているかどうか、および組織の炎症が無菌性または感染性であるかどうかを判定する方法である実施形態において、第１のプローブはクエンチャーおよび切断可能なリンカーを含む。それゆえに、本方法は、第２のプローブが標的領域に送達される前に、炎症およびその炎症が感染性である／標的領域に存在する細菌および／または真菌によって引き起こされたかどうかを検出することができる。
【００８５】
第１および／または第２のプローブがクエンチャーおよび切断可能なリンカーを含む実施形態において、第１および／または第２のプローブの結合部分は、リンカーから遠位端のプローブ要素であってもよい。あるいは、細菌結合部分は、リンカーと隣接するプローブ要素の近位端にあってもよい。フルオロフォアは、結合部分を介してリンカーに連結されてもよい。フルオロフォアは、リンカーに直接連結されてもよい。
【００８６】
結合部分は、切断可能なリンカーの切断の前に細菌および／または真菌と結合してもよい。あるいは、結合部分は、切断可能なリンカーの切断後に細菌および／または真菌と結合してもよい。
【００８７】
第１および／または第２のプローブが少なくとも２つのプローブ要素、コア、クエンチャーおよび切断可能なリンカーを含む実施形態において、コアは、各プローブ要素をリンカーと連結する。それゆえに、切断可能なリンカーが切断される（例えば、リンカーの酵素切断可能なペプチド配列が切断酵素によって切断される）とき、プローブは、クエンチャーと少なくとも２つのプローブ要素およびコアとに分割され、少なくとも２つのプローブ要素は、コアに連結されたままである。
【００８８】
一般に、少なくとも２つのプローブ要素を含む第１および／または第２のプローブの提供は、少なくとも２つのフルオロフォアおよび少なくとも２つの結合部分を含むプローブに相当する。
【００８９】
本発明の第２の態様によると、本発明の第１の態様の方法に使用するための標識および結合部分を含むプローブが提供される。
【００９０】
標識はフルオロフォアであってもよく、プローブは細菌および／または真菌を蛍光標識するように適合されていてもよい。
【００９１】
標識は、放射性標識であってもよい。放射性標識は、放射性ヌクレオチドを含んでもよい。放射性標識は、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、１１Ｃ、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅまたは８６Ｚｒのうちの１つまたは複数を含んでもよい。
【００９２】
標識は、磁気共鳴標識またはコアであってもよい。磁気共鳴標識またはコアは、例えば、Ｆｅ、ＭｎまたはＧｄであってもよい。
【００９３】
プローブは、二次標識を含んでもよい。例えば、プローブは、フルオロフォアおよび放射性標識を含んでもよく、またはプローブは、フルオロフォアおよび二次フルオロフォアなどを含んでもよい。さらなるバリエーションおよび組合せが当業者には認識されると予想される。
【００９４】
フルオロフォアは、環境感受性フルオロフォアであることが好ましい。フルオロフォアは、ＮＢＤであることが好ましい。
【００９５】
好ましくは、結合部分は、完全長ユビキシジン（配列番号１）などのユビキシジン部分またはそのフラグメントもしくはバリアントである。好ましくは、ユビキシジン部分は、完全長ユビキシジンのアミノ酸２９から４１を含むユビキシジンフラグメントである（ＵＢＩ２９〜４１、配列番号２）。ユビキシジン部分は、アミノ酸置換を含むことが好ましい。ユビキシジン部分は、ユビキシジン部分のメチオニン残基のノルロイシンへのアミノ酸置換を含むことが好ましい（ＵＢＩＮｌｅ、配列番号３）。
【００９６】
フルオロフォアは、結合部分に直接連結されてもよい。あるいは、フルオロフォアは、スペーサーによって結合部分に連結されてもよい。スペーサーは、炭化水素鎖、エーテル、ポリマー、ポリエチルグリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｇｌｙｃｏｌ）（ＰＥＧ）、ポリグリコールまたは類似物であってもよい。スペーサーは、ペプチドであってもよい。スペーサーがペプチドである実施形態において、ペプチドは、１〜１０アミノ酸長、１〜２０アミノ酸長または１〜３０アミノ酸長であってもよい。
【００９７】
プローブは、コアおよびコアに連結された複数の結合部分を含むことが好ましい。プローブは、少なくとも３つの結合部分を含むことが好ましい。
【００９８】
例えば、好ましい実施形態において、プローブは、コア、３つのフルオロフォアおよび３つの結合部分を含み、３つの結合部分のそれぞれがＵＢＩＮｌｅを含み、３つのフルオロフォアのそれぞれがＮＢＤである。
【００９９】
本発明の第３の態様によると、標識ならびにそれぞれグラム陰性菌またはグラム陽性菌と結合するように、および動物細胞またはグラム陽性菌もしくはグラム陰性菌とは実質的に結合しないように適合されている結合部分を含む、本発明の第１の態様の方法に使用するためのプローブが提供される。
【０１００】
標識はフルオロフォアであってもよく、プローブは細菌および／または真菌を蛍光標識するように適合されていてもよい。
【０１０１】
標識は、放射性標識であってもよい。放射性標識は、放射性ヌクレオチドを含んでもよい。放射性標識は、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、１１Ｃ、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅまたは８６Ｚｒのうちの１つまたは複数を含んでもよい。
【０１０２】
標識は、磁気共鳴標識またはコアであってもよい。磁気共鳴標識またはコアは、例えば、Ｆｅ、ＭｎまたはＧｄであってもよい。
【０１０３】
プローブは、二次標識を含んでもよい。例えば、プローブは、フルオロフォアおよび放射性標識を含んでもよく、またはプローブは、フルオロフォアおよび二次フルオロフォアなどを含んでもよい。さらなるバリエーションおよび組合せが当業者には認識されると予想される。
【０１０４】
フルオロフォアは、環境感受性フルオロフォアであることが好ましい。フルオロフォアは、ＮＢＤであることが好ましい。
【０１０５】
好ましくは、結合部分は、グラム陰性菌と結合するが、動物細胞またはグラム陽性菌とは実質的に結合しないように適合されている。
【０１０６】
好ましくは、結合部分は、完全長ポリミキシン（配列番号４）などのポリミキシン部分またはそのフラグメントもしくはバリアントである。ポリミキシン部分は、一般にポリミキシンの炭化水素尾部の少なくとも一部が除去された切断型ポリミキシンである。例えば、ポリミキシン部分はポリミキシンＢ１から誘導されてもよく、６−メチルオクタン酸基が除去されてもよく、またはポリミキシンはポリミキシンＢ２から誘導されてもよく、６−メチルヘプタン酸が除去されていてもよい。
【０１０７】
フルオロフォアは、結合部分に直接連結されてもよい。あるいは、フルオロフォアは、リンカーによって結合部分に連結されてもよい。リンカーは、飽和もしくは不飽和炭化水素鎖、エーテル、ポリマー、ポリエチルグリコール（ＰＥＧ）、ポリグリコール、ポリエーテルまたは類似物であってもよい。リンカーは、ペプチドであってもよい。リンカーがペプチドである実施形態において、ペプチドは、１〜１０アミノ酸長、１〜２０アミノ酸長または１〜３０アミノ酸長であってもよい。
【０１０８】
好適な実施形態において、プローブは、ポリミキシン部分およびＮＢＤを含む。
【０１０９】
好ましくは、第２の態様のプローブは、第１の態様の方法の第１のプローブとして使用されるのに適しており、第３の態様のプローブは、第１の態様の方法の第２のプローブとして使用されるのに適している。
【０１１０】
したがって、本発明は、第４の態様において、本発明の第２の態様のプローブの使用および本発明の第１の態様の方法における第３の態様のプローブに範囲を広げる。
【０１１１】
好ましい実施形態において、第２の態様のプローブは、コアならびに３つの結合部分および３つのＮＢＤフルオロフォアを含み、３つの結合部分のそれぞれがＵＢＩＮｌｅを含み、第３の態様のプローブはポリミキシン部分およびＮＢＤを含む。
【０１１２】
本発明の第１の態様の好ましいおよび任意の特徴は、第２、第３および第４の態様のプローブの好ましいおよび任意の特徴である。
【０１１３】
本発明の実施形態をここで、添付の図面を参照して非限定例により次に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】本発明の例の方法を示すフローチャートである。
【図２Ａ】エラスターゼに依存した細菌の標識化スキームを示す図である。細菌結合構成要素にあるフルオロフォアがダーククエンチャーによって消光され、このことは、細菌との結合時に蛍光が観察されないことを意味する。エラスターゼに特異的な配列ＡＡＰＶの切断により細菌結合構成要素（ＰＶ−ＮＢＤ−ＵＢＩ）がダーククエンチャーのメチルレッド（ＭＲ）から遊離される。
【図２Ｂ】インビトロにおけるエラスターゼに依存した細菌の標識化のイメージである。ＦＭ−４６４（赤）で対比染色され、単離ヒト好中球とともにコインキュベートされたメチシリン感受性ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＳＳＡ）は、好中球の存在下で細菌の標識化（緑）を実証し、これは、エラスターゼ阻害剤の存在下では阻害される。
【図３Ａ】エラスターゼに依存した細菌の標識スキームを示す図である。細菌結合構成要素にあるフルオロフォアがより長い波長の異なるフルオロフォアによって消光され、このことは、細菌への結合時に蛍光が観察されないことを意味する。エラスターゼに特異的な配列ＡＡＰＶの切断により、細菌結合構成要素（ＰＶ−ＮＢＤ−ＵＢＩ）がクエンチャー（ＴＡＭＲＡ）から遊離される。ＴＡＭＲＡは、エンドサイトーシスの取り込みにより活性化好中球の存在をレポートする。
【図３Ｂ】インビトロにおけるエラスターゼに依存した細菌の標識化のイメージである。ＰＫＨ  ６６０（紫色）で対比染色したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｅｒｉｇｉｎｏｓａ（ＰＡ）は、ＴＡＭＲＡ−ＡＡＰＶ−ＮＢＤ−ＰＭＸとともにインキュベートされ、活性化されていない好中球の存在下では標識化を示さず（上段パネル）、エラスターゼに依存的な様式で細菌の標識化（緑で示した）を示し、エラスターゼ非依存的な様式で活性化好中球の標識化（赤で示した）を示した。
【図３Ｃ】切断後のＴＡＭＲＡのエラスターゼに依存的な蛍光の増加のグラフ図である。ＴＡＭＲＡ−ＡＡＰＶ−ＮＢＤ−ＰＭＸと比較してＴＡＭＲＡ−ＡＡ（切断された化合物）の蛍光がエラスターゼに依存的な様式で増加するという予想外の結果を実証ための分光光度計データおよびエラスターゼ阻害剤により阻害された（励起５２５、蛍光５８０）。
【図４】フルオロフォアの選択は標識された細菌をイメージングする能力に影響を及ぼし、ＮＢＤ構築物がフルオレセイン（ＦＡＭ）を上回る改善されたシグナル対ノイズを有することを示すイメージである。Ａ）ＦＭ−４６４で対比染色された細菌（ＭＳＳＡ）（赤で示した）およびＦＡＭ−ＵＢＩまたはＮＢＤ−ＵＢＩとともにインキュベートされた細菌（ＭＳＳＡ）は、ＮＢＤが改善されたシグナル対ノイズ比を示し、これが大半の細菌の検出を可能にする（緑で示した）。これを、凝集した細菌の小さな部分集合を検出したＦＡＭ−ＵＢＩと比較した。Ｂ）ＮＢＤ−ＵＢＩはまた、哺乳動物細胞（白の矢印）よりも細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対して特異性を示す。
【図５】ＦＡＭ−ＰＭＸが、インビトロにおいて細菌を検出するのに十分なシグナル対ノイズをもたらさないことを示すイメージである。Ａ）ＦＭ−４６４で対比染色されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡ）（赤）およびＡ５４９細胞（紫色のヒト肺上皮細胞）とともにインキュベートされたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡ）は、バックグラウンドを上回る細菌の標識化は見られず、上皮細胞の標識化もなかったことを示している。Ｂ）核対比染色剤Ｓｙｔｏ  ８２（赤）を伴うＮＢＤ−ＰＭＸ（緑）は、細菌の標識化を可能にし、哺乳動物細胞（紫色）を上回る標識化の選択性を保持する。
【図６】プローブの発光スペクトルが疎水性環境における蛍光の増加を裏づけるグラフ図である。Ａ）４８８ｎｍの波長で励起された場合のＰＢＳまたはＤＭＳＯ（疎水性環境）の存在下におけるＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ（５μＭ）およびＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ（１５μＭ）に対して示される発光スペクトル。Ｂ）４８８ｎｍの波長で励起された場合のＰＢＳまたはＤＭＳＯ（疎水性環境）の存在下におけるＮＢＤ−ＰＭＸ（１０μＭ）に対して示される発光スペクトル。両プローブの蛍光は、細菌細胞膜標的への結合時に存在すると予想される疎水条件下において大幅に増加する。
【図７】ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄが、インビトロにおいて哺乳動物細胞よりも細菌を選択的に標識することを示す図である。Ａ）蛍光包括的細胞ＤＮＡ染料（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｇｅｎｅｒｉｃ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ  ｄｙｅ）Ｓｙｔｏ−８２（赤）で対比染色された、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ（５μＭ、緑）を用いレーザー走査型共焦点顕微鏡によってイメージングされた臨床的に関連する細菌パネルの例のイメージ。Ｂ）ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ  ５μＭ（最適濃度）標識細菌パネルの定量化。パネルのすべての細菌は、ＭＳＳＡおよびＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ  １０μＭ（最適濃度）と比較して明るい。Ｃ）未染色細菌（赤）、ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ  １５μＭ（青）およびＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ  ５μＭで標識された細菌（オレンジ）に関するフローサイトメトリーのデータ。Ｄ）Ｓｙｔｏ−８２で対比染色されたＭＳＳＡおよびＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ（５μＭ、緑）ならびにヒト好中球（赤い矢印）を示す統合図。Ｅ）Ａ５４９細胞（赤い矢印）は哺乳動物細胞を標識しないことを実証している。代表的なイメージを示し、すべての実験に関してｎ≧３である。
【図８】ＮＢＤ−ＰＭＸが、インビトロにおいてグラム陰性菌を選択的に標識することを示す図である。ＮＢＤ−ＰＭＸを用いレーザー走査型共焦点顕微鏡によってイメージングされた細菌パネルの例のイメージ。Ａ）ＮＢＤ−ＰＭＸ  １μＭ（緑）を用いた、Ｓｙｔｏ−８２（赤）で対比染色された細菌パネル。グラム陽性菌（赤枠で境界を示した）は、グラム陰性菌と比較して最小限の標識化である／標識化がないことを示している。Ｂ）白い棒のグラム陽性菌および黒い棒のグラム陰性菌に関するＮＢＤ−ＰＭＸ  １μＭによる細菌パネルの定量化は、グラム陽性菌と比較してグラム陰性菌の高強度の選択的な標識化を示している。すべてのグラム陰性は、すべてのグラム陽性よりも統計学的に有意な増加を示した。Ｃ）ＮＢＤ−ＰＭＸによる細菌の標識化のフローサイトメトリー評価は、未染色細菌（赤）およびＮＢＤ−ＰＭＸ（青）標識細菌を示している。グラム陽性菌の著しい標識化はない（赤枠で境界を示した）。Ｄ）Ｓｙｔｏ−８２で対比染色されたＭＳＳＡおよびＮＢＤ−ＰＭＸ  １μＭ（緑）ならびにヒト好中球（赤い矢印）を示す統合図。Ｅ）Ａ５４９細胞（赤い矢印）は哺乳動物細胞を標識しないことを示している（図４から転載）。代表的なイメージを示し、すべての実験に関してｎ≧３である。
【図９】細菌感染症のエクスビボモデル図である。Ａ）ヒツジ肺を採取し、人工呼吸し、３７℃の周囲温度の新生児用保育器に入れた。肺区画にＰＢＳ（対照）または細菌を気管支鏡により注入した。その後、プローブを注入し、区画を４８８ｎｍレーザースキャニングユニット（ＬＳＵ）を使用したファイバー共焦点蛍光顕微鏡（ＦＣＦＭ）によりイメージングした。Ｂ）エクスビボのヒツジモデルは注入後５時間生菌を示した。細菌（ＭＳＳＡ）をヒツジ肺の区画に注入し、１、３および５時間の時点で洗浄し（ｎ＝３）、ＣＦＵ／ｍｌに応じて平板培養し、１６時間のインキュベーション後に計数した。
【図１０】遠位肺の細菌の代表的なＦＣＦＭイメージが特有の点状のパターンを示していることを示す図である。Ａ）ＰＫＨ標識黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、カルセイン標識黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＧＦＰ発現菌株の注入により、区画がＦＣＦＭを使用してイメージングされると蛍光の点状のパターンが生成されている。これらのイメージは、次のその場（インサイチュ）での標識化実験のための陽性対照を形成するために使用された。代表的なイメージを示し、すべての実験に対してｎ＝３である。Ｂ）ＰＫＨ染料はバイスタンダー細胞を染色しない。共焦点イメージは、Ｓｙｔｏ−８２（赤）ならびにＰＫＨ６６０（紫色）で対比染色された細菌（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））との共培養物中の上皮細胞を示している。バイスタンダー哺乳動物細胞（赤い矢印）は標識された細菌から浸出したＳｙｔｏ−８２で標識されたが、ＰＫＨ６６０の移動はない。
【図１１】ＮＢＤ−ＵＢＩがヒツジ肺にいる細菌を標識できないことを示すイメージである。細菌を対比染色し、スペクトル的に異なるイメージングシステムによりイメージングすることによって確認されるヒツジ肺にいる細菌の一貫した標識化はなかった。Ａ）ＰＫＨ６６０標識ＭＳＳＡを注入後１時間の時点の肺区画。Ｂ）６６０ｎｍでイメージングされた対照区画（ＰＢＳを注入し細菌がいない）。Ｃ）１０μＭのＮＢＤ−ＵＢＩ注入後に４８８ｎｍでイメージングされた同じ区画。ただし、パネルＤに紫色で示されている対比染色されたＰＫＨ６６０標識クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（グラム陰性）を用い、ＮＢＤ−ＰＭＸが添加された同じ実験は同じ点状のシグナルを示している。
【図１２】ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄが、遠位のヒツジ肺においてその場（インサイチュ）で細菌を検出することを示すイメージである。ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄの代表的なＦＣＦＭイメージは、対照区画に点状のシグナルが見られないのに対し、細菌を注入された区画ではバックグラウンドの蛍光を上回って上記図１０に記載されている特有の点状のシグナルが見られることを示している。さらに、アガロースビーズ単独では蛍光を示さない（対照ビーズ）が、ビーズが細菌でコーティングされた場合、ヒツジ肺においてその場（インサイチュ）で標識されるとシグナルが見られる。代表的なイメージを示し、すべての実験に関してｎ≧３である。
【図１３】ＮＢＤ−ＰＭＸが、ヒツジ肺にいるグラム陰性菌をその場（インサイチュ）で選択的に標識することを示すイメージである。Ａ）対照区画およびグラム陽性区画は点状のシグナルを示していないのに対し、グラム陰性注入区画は陽性対照と同一のシグナルを示している。Ｂ）各区画の洗浄液中菌数（ｌａｖａｇｅ  ｃｏｕｎｔ）は、細菌の存在を確認する区画間の菌数に大幅な差がないことを示している。Ｃ）アガロースビーズ単独では蛍光を示さないが、ビーズが細菌でコーティングされた場合、ヒツジ肺においてその場（インサイチュ）で標識されるとシグナルが見られる。代表的なイメージを示し、すべての実験に関してｎ≧３。
【図１４】ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸが、「洗い流すこと」に対して耐性があり、ヒツジ肺にいる細菌の検出を可能にすることを示すイメージである。ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄまたはＮＢＤ−ＰＭＸのいずれかで前標識された細菌は、ヒツジ肺に注入されたときＦＣＦＭによって容易に可視化された。しかしながら、直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅで前標識された細菌が注入された場合、点状のシグナルは見られなかった。肺への注入の前の細菌懸濁液をイメージングすること（左側パネル）およびＦＣＦＭによりイメージングすること（右側パネル）によって標識化が確認された。懸濁液中のＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ標識細菌に関する低いＳＮＲに留意する。代表的なイメージを示し、各実験に関してｎ＝３である。
【図１５】ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄが、洗浄が行われるとき蛍光を保持することを示すグラフ図である。Ａ）細菌パネルは、レーザー走査型共焦点顕微鏡によってＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄの持続的な存在下で（黒色）およびその後のＰＢＳ洗浄（白色）にイメージングされた。定量化は、プローブの持続的な存在下でＭＳＳＡを伴う直線的なＮＢＤ−ＵＢＩを上回る蛍光の保持を示す（赤線）。３つのランダムな視野を用いてｎ≧３が各実験に関して評価された。Ｂ）プローブの持続的な存在下で（黒色）またはその後のＰＢＳ洗浄（白色）にＮＢＤ−ＰＭＸを用いてイメージングされた細菌パネルは、すべてのグラム陰性菌がプローブの持続的な存在下で、グラム陽性菌を伴うＮＢＤ−ＰＭＸよりも高い蛍光の保持を示している。３つのランダムな視野を用いてｎ≧３が各実験に関して評価された。
【図１６】ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄが、ＡＬＩ  ＢＡＬＦ中で安定であることを示すグラフ図である。質量分析ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、３０分間コインキュベートされた場合の、生理食塩水の存在下におけるＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅの安定性（矢印は１９４９の質量で見られる補正ピークを示す）およびＡＬＩ洗浄液の存在下における分解（質量１９４９でピークが見られないが、矢印は予測できる分解化合物を示す）を実証した。それに反して、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄは、ＦＴＭＳによって評価すると依然として安定したままである（示されるデータは理論上のプロットを表し、実験に基づくピークを示すプロットは化合物の存在を示すことに相当する）。ＮＢＤ−ＰＭＸは、ＡＬＩ  ＢＡＬＦ中で安定である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、３０分間コインキュベートされた場合の生理食塩水またはＡＬＩ洗浄液の存在下におけるＮＢＤ−ＰＭＸの安定性を実証した（矢印は、１２９１〜１２９３の質量で見られる補正ピークを示す）。
【図１７】ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄが、ヒツジ洗浄液中の細菌に対して等モルの等価の直線的なものよりも高い蛍光を保持することを示す図である。Ａ）ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ（１５μＭ）およびＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ（５μＭ）を用いてヒツジ洗浄液の存在下または不在下においてレーザー走査型共焦点顕微鏡によってイメージングされたＭＳＳＡ。両ＮＢＤ−ＵＢＩ化合物はヒツジ洗浄液中で蛍光が減少したが、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄはより高い蛍光強度を保持している。Ｂ）対照的に、ＮＢＤ−ＰＭＸ（１μＭ）を用いてヒツジ洗浄液の存在下または不在下においてイメージングされたＰＡ３２８４は、蛍光強度の著しい減少は示していない。代表的なイメージを示し、ｎ＝３である。
【図１８】ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸは、サーファクタントが豊富な環境において細菌を首尾よくイメージングすることを示す図である。細菌の蛍光強度の比：サーファクタント蛍光強度は、共焦点顕微鏡イメージから数量化される。等モルのＮＢＤ濃度に対して、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸは、ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅよりも有意に高い細菌の強度：サーファクタント強度を有する。
【図１９】イメージ処理アルゴリズムは、ＦＣＦＭデータからの「ポジティブ」および「ネガティブ」画像を視覚的に示すイメージである。Ａ）ポジティブまたはネガティブと考えられる画像に関する未処理データ。Ｂ）前処理なし、スポット検出の効果がない。その後のバックグラウンドノイズの推定Ｃ）、ハイパスフィルタリングＤ）および適切なしきい値処理Ｅ）、現行のアルゴリズムはネガティブ画像にある最小限の点状のシグナルを検出するＦ）。
【図２０】全ＦＣＦＭビデオの自動イメージ処理（最大３５００画像）は細菌の検出を実証するグラフ図である。１画像当たり８０スポットのしきい値処理および１０％の任意のカットオフを用いたＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄのビデオの解析は、ラプラシアガウシアン（ＬｏＧ）およびガウシアン差分（ＤｏＧ）ポジティブ画像の組合せを使用した細菌の客観的検出を可能にする。１画像当たり８０スポットのしきい値処理および１０％の任意のカットオフを用いたＮＢＤ−ＰＭＸのビデオの解析は、ＬｏＧおよびＤｏＧポジティブ画像の組合せを使用してグラム状態の客観的検出を可能にする。ｎ＝３の肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を除いて、すべての分析に対してｎ＝４である。対照と比較される場合の統計分析。
【図２１】ヒト肺組織自家蛍光の存在下で検出された細菌を示す図である。Ａ）ＰＡ３２８４が含まれるヒト肺組織のＦＣＦＭイメージは、エラスチン自家蛍光を示し、細菌のシグナルを示さない（左）。さらに、ＮＢＤ−ＰＭＸとともにコインキュベートされたＰＡ３２８４を含むヒト肺組織は細菌のシグナルを示す（右）。Ｂ）ライブ共焦点顕微鏡イメージ（統合図）は、核酸対比染色（赤）のＮＢＤ−ＰＭＸ標識化なしとの統合イメージを示している。ＮＢＤ−ＰＭＸで標識され、バックグラウンドの蛍光を上回る右パネルの細菌は、はっきりと見ることができる。Ｃ）４８８ｎｍでのレーザー励起および時間分解単一光子計数分光計（ｔｉｍｅ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）によって測定されたＮＢＤの蛍光寿命は、肺の元々ある細胞の自家蛍光の蛍光寿命よりも大幅に長く、これは、インビボにおいてプローブを同定し、感知およびイメージングのシグナル対ノイズを増加させるために使用することができる。
【図２２】ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄまたはＮＢＤ−ＰＭＸは１００μＭまで溶血が見られなかったことを示す図である。溶血アッセイ（ｎ＝３）は、濃度１００μＭまで溶血が起こらないことを示している。陽性対照は０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘとし、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘに対して１００％溶血になるよう値が補正された。
【図２３】Ａ）ＮＢＤ−ＰＭＸはマウスの２週間で１回の注入モデルで臓器毒性を示さないことを示すイメージである。ＮＢＤ−ＰＭＸに関する代表的な組織構造イメージ（×１００）を４８時間および１４日の時点でＰＢＳ対照動物と比較した。どの群においても対照との差が見られなかった（顧問組織病理学者により盲検的にスコア化された）。Ｂ）ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄは、マウスの２週間で１回の注入モデルで臓器毒性を示していない。ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄに関する代表的な組織構造イメージ（×１００）を４８時間および１４日の時点でＰＢＳ対照動物と比較した。どの群においても対照との差が見られなかった（顧問組織病理学者により盲検的にスコア化された）。
【図２４】蛍光寿命イメージングが、肺組織を細菌と容易に区別することを示すイメージである。左パネルは、肺および肺組織にいる細菌（点）の４８８ｎｍ励起での共焦点を示す。ＦＬＩＭ（右パネル）は、肺組織（緑）および細菌（青）のイメージングにおいてはっきりとした相違を示す。イメージングは、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびヒト肺組織の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を使用して行った。
【発明を実施するための形態】
【０１１５】
本発明の各種実施形態の作製および使用について以下に詳細に述べるが、本発明は、多種多様の特定の状況において具現化することができる多くの適用可能な発明性のある概念を提供するものと認識されるべきである。本明細書において述べられている特定の実施形態は、本発明を作製および使用するための特定の方法を単に説明するためのものであり、本発明の範囲の限界を定めるものではない。
【０１１６】
本発明の理解を容易にするために、多くの用語が以下に定義される。本明細書において定義される用語は、本発明に関連した領域の当業者が一般的に理解するとおりの意味を有する。「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」などの用語は、単数の要素を指すだけでなく、特定の例が説明のために使用され得る一般的なクラスも含むことが意図される。本明細書中の術語は、本発明の特定の実施形態を説明するために使用されるが、それらの使用は、特許請求の範囲において境界を明らかにしている場合を除いて本発明の境界を定めるものではない。
【０１１７】
以下の本発明例の実施形態の説明において、ポリミキシン部分を含む結合部分は符号「ＰＭＸ」と示され、ユビキシジン部分を含む結合部分は符号「ＵＢＩ」と示される。例えば、ＮＢＤおよび変性されたユビキシジンフラグメントＵＢＩＮｌｅを含む複数のプローブ要素を含む本発明の実施形態（「デンドロンプローブ」）は、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄと言及される。
【０１１８】
第１の例の方法
本発明の例において、詳細な方法を次に記載する。これは、本発明の例の実施形態であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１９】
マイクロドーズの５００μＬの第１のプローブ（１０μｇのプローブを含む）を、気管支鏡を使用して患者の肺内の標的領域に送達する。第１のプローブは、３つのユビキシジンフラグメント（ＵＢＩＮｌｅ、結合部分として働く）および３つのＮＢＤフルオロフォアを含み、ゆえに患者の肺内の自然状態の細胞ではなく細菌および／または真菌と特異的に結合するように適合されている。
【０１２０】
適した波長の光（例えば、ＮＢＤの励起極大前後、４８８ｎｍ）を気管支鏡内の光ファイバーにより標的領域に送達する。標的領域からの光が気管支鏡内の第２の光ファイバーによって集められ、共焦点光学配置または広視野配置により電荷結合素子（ＣＣＤ）に入射する。ＣＣＤによって生成された標的領域のイメージを分析し、細菌および／または真菌が第１のプローブによって標識されたかどうかを判定する。
【０１２１】
細菌および／または真菌がはっきりと視認された（すなわち、第１のプローブによって標識された）場合、標的領域に細菌および／または真菌が存在すると判定し、その結果、臨床医は抗生物質および／または抗真菌薬が患者に投与されるべきと判断することができる。
【０１２２】
細菌がはっきりと視認された場合、必要とされる抗生物質の種類を決定するために、さらなる検査が必要とされる。
【０１２３】
第１のプローブを洗い流すために大量に生理食塩緩衝液を標的領域に瞬時に送達する。標的領域の蛍光のレベルがバックグラウンドレベルに達したら、マイクロドーズの５００μＬの第２のプローブ（１０μｇのプローブを含む）を標的領域に送達する。第２のプローブは、ポリミキシン部分（ＰＭＸ）（結合部分として働く）およびＮＢＤフルオロフォアを含み、ゆえにグラム陽性菌または患者の肺内の自然状態の細胞ではなく、グラム陰性菌と特異的に選択的に結合するように適合されている。
【０１２４】
再び、適した波長の光（例えば、ＮＢＤの励起極大前後、４８８ｎｍ）を気管支鏡内の光ファイバーにより標的領域に送達する。標的領域からの光が気管支鏡内の第２の光ファイバーによって集められ、共焦点光学配置または広視野配置により電荷結合素子（ＣＣＤ）に入射する。ＣＣＤによって生成された標的領域のイメージを分析し、細菌が第２のプローブによって標識されたかどうかを判定する。当業者は、例えば、ＣＭＯＳ検出器などの任意の適した検出器を使用できることを認識していると予想される。本方法は、ＣＣＤ検出器の使用に限定されない。
【０１２５】
細菌がはっきりと視認された（すなわち、第２のプローブによって標識された）場合、細菌がグラム陰性菌であると判定され、その結果、臨床医は、グラム陰性菌に対する抗生物質が投与されるべきであると判断することができる。細菌がはっきりと視認されなかった場合、細菌がグラム陽性であると判定され、その結果、臨床医は、グラム陽性菌に対する抗生物質が投与されるべきであると判断することができる。
【０１２６】
したがって、臨床医は、患者の肺のいかなる炎症の原因も、無菌性炎症であるか、または感染体の混合物が原因であるかを自信を持って判定することができる。その結果、気管支鏡は、人工呼吸器を介して患者の肺に送り込むことができるため、臨床医は患者を著しく動かす必要なく、または患者が使用している場合もあるいかなる人工呼吸器も除去する必要なく採用すべき措置の適切な方針を決定することができる。
【０１２７】
第２の例の方法
代替的方法において、ＴＡＭＲＡ部分（蛍光クエンチャーとして働く）を含むマイクロドーズの５００μＬの第１のプローブ（２０μｇのプローブを含む）、ペプチド配列ＡＡＰＶを含むリンカー、ＮＢＤフルオロフォアおよびユビキシジン（ｕｂｕｑｕｉｃｉｄｉｎ）部分（ＵＢＩＮｌｅ、結合部分として働く）を患者の肺の標的領域に送達し、第１の例の方法に従って照射した。
【０１２８】
ＴＡＭＲＡのみの蛍光は、標的領域にＨＮＥが存在しないため、標的領域内の組織は炎症を起こしていないことを示す。ＮＢＤによる細菌および／または真菌の標識化を伴わないＴＡＭＲＡおよびＮＢＤの蛍光は、ＨＮＥの存在を示す（ＨＮＥによってリンカーが切断されて、ＮＢＤが蛍光を発するのを可能にする）。ＴＡＭＲＡによるヒト好中球の蛍光標識化は標的領域内のヒト好中球の存在を示し、ＮＢＤによる細菌および／または真菌の蛍光標識化は標的領域内の細菌および／または真菌を示す。
【０１２９】
したがって、本方法は、無菌性炎症、細菌性炎症および真菌性炎症を含む炎症を検出することを可能にする。
【０１３０】
細菌が検出された場合、第１の例の方法の第２のプローブを使用して、その細菌がグラム陰性であるか、またはグラム陽性であるかを判定することができ、それにより、炎症があるかどうか、炎症が細菌および／または真菌によって引き起こされたかどうか、および炎症が細菌によって引き起こされた場合、その細菌がグラム陰性であるか、またはグラム陽性であるかを判定することを可能にする。
【０１３１】
第３の例の方法
第３の例において、第１または第２の例の方法のいずれかに従ってマイクロドーズの第１のプローブおよびポリミキシン部分およびマラカイトグリーンフルオロフォアを含むマイクロドーズの第２のプローブを同時に送達してもよい。あるいは、第２のプローブは、例えば、ｃｙ３またはｃｙ５などのシアニン染料を含んでもよい。
【０１３２】
したがって、第１のプローブ、第２のプローブおよび第２の例の方法の第１のプローブが使用される場合は、蛍光クエンチャー（ＴＡＭＲＡ）の蛍光を細菌および／または真菌の存在と同時に分析することができ、細菌が検出された場合、その細菌がグラム陰性であるか、またはグラム陽性であるかを同時に判定することができる。
【実施例１】
【０１３３】
本発明の方法に使用される適切なプローブの特徴づけ
エラスターゼ感受性プローブの第１の実施例（図２Ａにおいて模式的に示されている）は、ペプチド配列ＡＡＰＶ（リンカーとして働く）により７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）およびユビキシジンフラグメントＵＢＩ２９〜４１（プローブ要素としてともに働く）と連結されたメチルレッド（ダーククエンチャーとして働く）を含む。それゆえに、ＮＢＤ蛍光は、メチルレッドにより消光され、蛍光シグナルが観察されないことになり（すなわち、メチルレッドとＮＢＤがＦＲＥＴ対として働いている）、ゆえに、プローブはＵＢＩ２９〜４１により標的領域に存在する可能性があるいかなる細菌と結合しても、しなくても、共焦点顕微鏡を使用してシグナルは観察されない。
【０１３４】
炎症組織においてなどプローブがヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）の存在下にある場合、ＨＮＥはリンカーのペプチド配列を切断して、それによりメチルレッドクエンチャーからプローブ要素を遊離させる。それに応じて、ＮＢＤフルオロフォアはもはや消光されず、蛍光シグナルを生成する。さらに、ＮＢＤの環境感受性のため、ＮＢＤが細胞膜内などの疎水性環境にある場合、生成されるシグナルは大幅に増幅される。
【０１３５】
図２Ｂは、細菌および好中球の共培養物とともにインキュベートしたプローブを含むサンプルに関する共焦点イメージを示す。これらのイメージは、好中球由来のＨＮＥによって切断され、細菌を標識するプローブの能力を裏づける。エラスターゼ阻害剤であるシベレスタットを培地に添加したとき、プローブは依然として切断されないままである（よって、ＮＢＤはメチルレッドにより消光されている）ため標識化は観察されなかった。
【実施例２】
【０１３６】
第２の実施例において、プローブは、ペプチド配列ＡＡＰＶ（リンカーとして働く）によりＮＢＤおよびポリミキシン（プローブ要素として働く）と連結されたカルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ、蛍光クエンチャーとして働く）を含む。それゆえに、ＮＢＤ蛍光はＴＡＭＲＡにより消光されて、ＴＡＭＲＡからの蛍光シグナルが生じる（すなわち、ＴＡＭＲＡは、ＮＢＤが吸収したエネルギーを受け取って、それ自体が蛍光を発しており、ＴＡＭＲＡとＮＢＤはＦＲＥＴ対として働いている）。それゆえ、存在する可能性があるいかなる細菌とポリミキシンが結合していようが、してなかろうが、ＴＡＭＲＡからのシグナルのみが観察される。
【０１３７】
プローブがエラスターゼによって切断されたら、ＮＢＤの蛍光のため細菌はプローブ要素によって標識される（図３Ａ）のに対し、好中球は活性化されるとＴＡＭＲＡ部分によって標識される（図３Ｂ）。さらに、本発明者らは、切断されたＴＡＭＲＡ化合物の蛍光がエラスターゼに依存的な様式で増加し、シベレスタットなどのエラスターゼ阻害剤（「Ｓ」、図３Ｃ）により阻害されることを実証している。
【０１３８】
細菌のレポートのために、本発明者らは、細菌のプローブ要素のみを含み、メチオニンをノルロイシンで置換したプローブ「ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ」を合成した。このプローブは、別の「常時オン」のフルオロフォアであるフルオレセイン（ＦＡＭ）を有する同じ細菌検出部分と比較され、レポートされたＮＢＤに対してライブベンチトップ共焦点顕微鏡により改善されたシグナル対ノイズを示した（図４）。さらに、標識化は、一般に細菌に特異的であり、細胞膜に特異的ではないことが確認された。例えば、図４は、単離ヒト好中球がＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅプローブによって標識されなかった一方で、細菌はＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅプローブによって標識されたことを示している。
【０１３９】
ＰＭＸ細菌検出部分に対して同じことが観察されると予想されることを確認するために、本発明者らは、ＮＢＤ−ＰＭＸおよびＦＡＭ−ＰＭＸを構築し、これはＮＢＤ−ＰＭＸに関してＦＡＭ−ＰＭＸよりも改善されたシグナル対ノイズを示し、この構築物は哺乳動物細胞に対しても特異的であることを確認している（図５）。
【０１４０】
「分岐／デンドロン」または「多価」プローブ
本発明のさらなる例において、コアおよびコアに連結された３つのプローブ要素を含むプローブ（「三分岐」プローブ）であって、各プローブ要素がＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ部分を含むプローブを調製した（ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ）。
【０１４１】
本発明者らのペプチド部分と結合したときにＮＢＤがその特徴を保持する蛍光レポーターを確認するために、本発明者らは、化合物の蛍光を、疎水性環境（ＤＭＳＯ）を模倣する条件において測定した。直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸは４８８ｎｍにおいて励起され（Ｂｉｏｔｅｋ蛍光プレートリーダー）、プローブがジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下（疎水性環境）にあるとき、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と比較して蛍光の著しい増加を示し（図６）、このことは、環境感受性蛍光レポートを裏づけている。驚くべきことに、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄは、等モル濃度のＮＢＤを使用する場合、１プローブ当たり３コピーのＮＢＤがあるという事実にもかかわらず、直線的なものと同じ蛍光の増加を示した。
【０１４２】
ＶＡＰの原因病原体の７０％超に相当する細菌のパネル（Ｃｈａｓｔｒｅ  Ｊら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２００２年４月１日；１６５（７）：８６７〜９０３ページ）（グラム陰性：緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（２つの菌株）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ。グラム陽性：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＳＳＡ）および肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））（下記表３の菌株リスト）をＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄで標識した。標識化は、多様な強度で観察された（図７ＡおよびＢ）。それにもかかわらず、すべての細菌が直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅで標識したＭＳＳＡよりも明るく（図７Ｂ）、フローサイトメトリーによりＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄは直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅよりも標識化の増加を示した（図７Ｃ）。さらに、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄは、ヒト好中球またはＡ５４９細胞を標識せず、このことは原核生物に対する選択性を裏づけている。（図７ＤおよびＥ）。
【０１４３】
細菌とともにインキュベートしたＮＢＤ−ＰＭＸは、共焦点分析においてグラム陰性菌（緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対してグラム陽性菌（ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡおよび肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））よりも有意に高い蛍光を示し（ｐ＜０．０５）（図８ＡおよびＢ）、これがフローサイトメトリーによって確認された（図７Ｃ）。さらに、ヒト好中球またはＡ５４９細胞の標識化はなかった。（図８ＤおよびＥ）。
【０１４４】
ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸを、細菌感染症のエクスビボのヒツジモデルにおいてその場（インサイチュ）での特異性および感受性に関して評価した（図９）。このモデルにおいて、ＰＫＨ蛍光色素標識した細菌の遠位のヒツジ肺への注入、およびＦＣＦＭでのイメージングは、それぞれの視野において点状の蛍光の特徴的で特有のパターンを明らかにする（図１０Ａ）。本発明者らは、肺に注入し、ＦＣＦＭでイメージングしたカルセイン標識細菌および緑蛍光タンパク質発現黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に関して同一のパターンを確認した（図１０Ａ）。このパターンは、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸで「前標識した」細菌を肺区画に注入することによって同様に再現される。
【０１４５】
モデルおよび陽性対照のこの完全な特徴づけに続いて、本発明者らは、ＰＢＳまたはＶＡＰ関連細菌をエクスビボ肺モデル内の異なる区画に注入し、続いてプローブのマイクロドーズ送達を行った。本発明者らは、直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅは、インビトロでの能力にもかかわらずその場（インサイチュ）で細菌を標識することができないことを実証した（図１１）。これらの実験に対して、このアッセイを対比染色したグラム陰性菌（クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））を用いて繰り返し、これがＮＢＤ−ＰＭＸによる標識化を実証した（図１１）。しかしながら、細菌を注入した区画では、本発明者らは、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄを注入したとき「陽性対照」（緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））で見られたのと同じシグナルを実証したが、ＰＢＳ対照を用いると最小限のシグナル／シグナルがないことを実証し、このことは、その場（インサイチュ）で細菌を標識する能力およびＦＣＦＭシステムを使用してイメージングする能力を裏づけている（図１２）。
【０１４６】
グラム陰性菌緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（実験室株ＰＡ０１および臨床ＶＡＰ分離株Ｊ３２８４）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および大腸菌を注入した区画において、本発明者らは、ＮＢＤ−ＰＭＸを注入したときに「陽性対照」においてと同じシグナルを実証したが、ＰＢＳまたはグラム陽性菌ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡおよび肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を注入した区画ではシグナルがないことを実証した（図１３）。これらの実験において、本発明者らは、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸを用いてイメージングされたすべての区画において気管支肺胞洗浄（区画間でＣＦＵ／ｍｌに差がないことを実証する）によっておよび６６０ｎｍでレーザースキャニングユニット（ＬＳＵ）によりイメージングされた対比染色した細菌により、等しい密度のグラム陽性菌およびグラム陰性菌を確認した。
【０１４７】
その場（インサイチュ）での細菌の検出をさらに実証するためおよび細菌凝集体をイメージングするプローブの能力を評価するため、本発明者らは、細菌をアガロースビーズに埋め込み、その後、それを肺に注入した。マイクロドーズのプローブ注入およびＦＣＦＭイメージングは、細菌ビーズがはっきりと排他的に検出されるのに対し、対照ビーズ（細菌を伴わないビーズ）は検出されないことを示した（図１２および１３）。
【０１４８】
遠位肺において、送達直後にプローブの著しい急速な消失がある可能性がある。よって、これらの条件下でプローブによる細菌標識化が依然とし持続していることが重要である。ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ標識細菌は、ＮＢＤ−ＰＭＸに対して見られるようにプローブを「洗い流す」ときに標識化を保持する。ヒツジ肺に注入されたとき、ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅで前標識した細菌はＦＣＦＭによって検出できないのに対し、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄまたはＮＢＤ−ＰＭＸで前標識した細菌は容易に可視化される（図１４）。したがって、「洗い流すこと」に対するこの耐性は、プローブと細菌の親和性の代替の指標に相当し、これは、遠位肺のその場（インサイチュ）での標識化に対する絶対要件のようである。現在、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸの両方が洗い流すことに対して耐性がある一方で、その他の構造的バリアントの大半は耐性がない。したがって、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸの両方で標識した細菌は、遠位肺において起こるプローブの消失時に十分な強度の蛍光を保持する（図１５）。
【０１４９】
第二に、本発明者らは、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）によって急性肺傷害（ＡＬＩ）の患者からの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中のプローブの安定性を評価した。ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸをＢＡＬＦとともに３０分間インキュベートした（図１６）。ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸは安定性を示し、ピークは生理食塩水およびＢＡＬＦとインキュベートしたサンプルの両方において容易に同定される、完全なプローブの予測される理論上のスペクトルと厳密に対応している。分解産物の予測されるスペクトルも見られなかった。それに反して、ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅの分解産物は洗浄液中で不安定性を示すことが確認された。したがって、「炎症を起こした」極めて酵素的に活性な遠位肺環境の状況においてプローブの安定性および機能の保持は、インビボにおける有用性の重要な決定要因である。これは、ヒツジ洗浄液の存在下でイメージングすることによって確認し、これは、ヒツジ洗浄液においてイメージングされると、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄが直線的な化合物よりも高い蛍光強度を示し、ＮＢＤ−ＰＭＸに関しては強度の低減を示さなかった（図１７）。
【０１５０】
大量のサーファクタントの存在下で細菌を優先的に検出するプローブの能力を調査するために、肺サーファクタント成分を使用してインビトロにおいて実験を行った。ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸに組み込まれる蛍光レポーター（ＮＢＤ）の性質は、サーファクタントが「豊富な」疎水性環境における蛍光活性化の可能性を示唆した。緩衝生理食塩水中のサーファクタント成分の懸濁液を調製し（２０ｍｇ／ｍｌ、６５％ジパルミトイルホスファチジルコリン、３０％ホスファチジルグリセロール、５％パルミチン酸さらに展着剤として１ｍｇ／ｍｌチロキサポール）、Ａ５４９上皮細胞単層とともにおよびそれを伴わずにインキュベートした。上皮細胞表面をコーティングするように見えるサーファクタント成分の粒子は蛍光性であり、このことは、この疎水性溶液中でＮＢＤの蛍光が増加することを示唆している。本発明者らは、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸはともに肺サーファクタント成分よりも細菌の標識化に対して選択性があることを明確に実証する。等モル濃度において、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄは、サーファクタント成分の存在下で直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅよりも著しく改善された細菌の選択性を有する（図１８）。ＮＢＤによる疎水性環境における蛍光の増加に依存したメカニズムにもかかわらず、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸの両方が、遠位肺において細菌をイメージングするその能力に従って精製されたサーファクタント成分よりも細菌に対して優先的に蛍光を増加させる。肺におけるサーファクタント成分の比較分布および相対的存在量はわかっていないが、もっぱらこれがプローブ注入時に観察されるバックグラウンドの蛍光をもたらし、プローブが分解に対して十分に耐性があり、洗い流したときに標識化を保持する場合には、サーファクタントの存在下でインビトロで標識化を保持することが、首尾よくイメージングするためにプローブに必要とされる可能性が高い。
【０１５１】
本発明者らは、プローブ／ＦＣＦＭプラットフォームによって生成された大きなデータセットの高速なリアルタイム客観分析を実施するためのカスタムメイドのイメージ分析／処理戦略を開発し始めた。明確な細菌の検出およびそのグラム状態の描写が、これらのイメージ処理アルゴリズムをリアルタイムで用いることによって達成されると予想される。単一の画像分析に基づく処理アルゴリズムを全ビデオシーケンス（最大３５００画像）に適用し、この初期の段階でも本発明者らは、細菌の存在およびグラム状態を明確に視覚的に示すことができる。これらのシグナルおよびイメージ処理アルゴリズムは、臨床適用のための準備を整えて速やかに繰り返され、本発明者らは、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸデータセットのさらなる最適化に組み込まれるべき機械学習の重要な要素を予想する。
【０１５２】
図１９は、モデルを開発するために初めに選択した１つのポジティブ画像および１つのネガティブ画像に対する、蛍光顕微鏡イメージの明るいスポットを検出するために対物レンズのコンピューターによる手法において一般的に使用される２つのイメージ処理アルゴリズム（ラプラシアンガウシアン（ＬｏＧ）およびガウシアン差分（ＤｏＧ））に基づく段階的な処理を示す。ＬｏＧまたはＤｏＧフィルターによりたたみ込むことによってイメージにあるスポットを強調する。イメージにあるノイズの影響を取り除くことによって精度を向上させるために前処理が必要である。まず、イメージを小さなウィンドウに分割し（１画像当たり１００）、その後、ピクセル強度の標準偏差を算出することによってバックグラウンドノイズを推定する。低周波数ノイズを減少するためにハイパスフィルタリングが使用される。３×標準偏差での得られたイメージのしきい値処理は、バックグラウンドノイズを除去し、より高いピクセル強度値のみを維持する。最後に、ＬｏＧまたはＤｏＧによりスポットが検出される。
【０１５３】
本発明者らは、全ＦＣＦＭイメージのビデオ（最大３５００画像）を分析するために上記の方法を用いたした。ポジティブ画像を示すために１画像当たり８０スポットの初期の閾値限界を用いて、本発明者らは、１ビデオ当たりのポジティブ画像のパーセンテージを求め、はい／いいえの二値結果のためのしきい値として２０％の任意の「カットオフ」を設定した。これは、それぞれＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸを使用して明確な細菌の検出およびグラム状態を示す（図２０）。
【０１５４】
確実に化合物が正常なヒト肺の自家蛍光を上回って細菌を標識するように、細菌をヒト肺組織とともにインキュベートし、ＦＣＦＭを使用してベンチトップ共焦点によりイメージングし（図２１）、これは、一旦標識されると、自家蛍光のレベルを上回って細菌を検出することができることを実証している。
【０１５５】
本発明者らは、プローブによる遠位肺のその場（インサイチュ）での標識化の多くの決定要因を同定した。これらは、なぜ直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅプローブに関する有望なインビトロのデータが、ヒツジ肺において再現性のあるその場（インサイチュ）での標識化に変換されなかったかを明らかにする。構造的バリアントを合成し、評価して、構造活性相関を探った。最初の目標は、分解に対する耐性を向上させ、シグナル対ノイズを向上させることであった。安定性（ｄ−アミノ酸／ｎ−メチルの挿入もしくは限定されたｄ−アミノ酸バリアントを含むバリアントなど）または標識化強度（化合物の環化）などの１つの機能面を大幅に改善した特定の改変は、遠位肺にいる細菌の再現性のある視覚化を可能にできなかった。本発明者らは、ＡＬＩ  ＢＡＬＦ中における安定性、３７℃においてライブベンチトップ共焦点イメージングを使用した細菌のインビトロでの標識化およびヒツジ肺におけるその場（インサイチュ）での標識化に関してＵＢＩ類似体を広範囲にわたって評価した。
【０１５６】
これまでのところ、多くの構造的改変に対する取り組みがなされており、それらは、概して２つのグループに分けられる。
【０１５７】
（ａ）さまざまな環境感受性フルオロフォアを調べるか、またはＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅペイロードを増加させることによってシグナル対ノイズ比を増加させる。
【０１５８】
本発明者らはまた、それぞれのＵＢＩフラグメントに関して２つのＮＢＤフルオロフォアを含むことの有用性を評価し、これを、安定性を向上させるために設計されたＮ−メチル化アミノ酸バリアントとともにも評価した。本発明者らは、より低いレベルの細菌の検出またはより低いプローブ有効濃度での検出を可能にする可能性があるより高いシグナル対ノイズ比をもたらすことを目的として、マラカイトグリーンおよびスチリルベースの染料を含む一連の代替的な環境感受性フルオロフォアを評価した。
【０１５９】
（ｂ）タンパク質分解に対する耐性を向上させる。
【０１６０】
本発明者らは、親ＮＢＤ−ＵＢＩ化合物のＭＡＬＤＩ分析によってタンパク質分解を受けやすい部位と特定された選択位置にＤ−アミノ酸およびＮ−メチル化アミノ酸を組み込んだバリアントを含む多くの化合物を評価した。アミノ酸成分を変えることなく分解を低減するために、本発明者らは、ペプチド配列の末端からの分解をブロックすべくアミノ末端および／またはカルボキシ末端にＰＥＧ単位を含むバリアントを合成した。本発明者らはまた、ブロッキングＰＥＧ単位を含むか、または含まない、Ｄ−アミノ酸および配列の逆位を有するＤ−アミノ酸からすべてが成るバリアントを合成し、評価した。さらに、ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅの環式バリアントならびにＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅの環式バリアントのＭＡＬＤＩ分析によってタンパク質切断を受けやすいままだと特定された選択位置にＮ−メチル化アミノ酸を組み込んだこの化合物のさらなるバリアントも評価した。
【０１６１】
【化１】
0006754531.tif 000002
【０１６２】
すべての化合物を生物学的評価した。安定性に関して、本発明者らは、０．９％のＮａＣｌ（生理食塩水）または急性肺傷害の患者からプールした洗浄液の存在下でそれぞれの化合物を評価し、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法（ＭＡＬＤＩ）またはフーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）によって分析した。インビトロでの標識化を、化合物の存在下で細菌を用いてベンチトップ共焦点のものにより評価し、標識化を細菌の標識化の基準対照として機能するＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅと比較した。必要に応じて、本発明者らはまた、単離ヒト好中球およびヒト初代細胞株（Ａ５４９ヒト肺腺癌細胞株）に対する化合物の標識化も評価した。エクスビボおよびインビボでのヒツジ肺実験に関して、対照肺区画（２ｍｌのＰＢＳを注入した）または細菌区画（２ｍｌの２光学密度の細菌を注入した）において、それぞれの化合物を評価した。細菌注入後、その化合物を目的とする区画に投与し、これをプローブベースの共焦点レーザー顕微内視鏡（ｅｎｄｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（ＦＣＦＭ）によってイメージングした。
【０１６３】
さまざまなＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅバリアントの評価により、本発明者は肺環境においてプローブの機能に影響を及ぼすさまざまな機構的要因をより明確に理解し、具体的には、当該技術分野の教示がＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄが自己消光することを示唆するが、ＵＢＩバリアントのうちＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄのみが肺における細菌をイメージングすることの理由を明らかにした。
【０１６４】
代替的なフルオロフォアは、本出願のＮＢＤより劣っていた。マラカイトグリーンバリアントは細菌に対してはるかに低い標識化強度をもたらし、スチリル染料化合物は細菌に対して増加した標識化強度を示したが、これらの化合物は哺乳動物細胞を上回る選択性が低下した。これは、ユビキシジン部分のターゲティングに打ち勝って脂溶性膜に入るそれらの染料自体の傾向による可能性が最も高い。それゆえに、スチリル染料バリアントは、エクスビボの肺においてオフターゲットの標識化が大幅に増加し、細菌のシグナルは観察されなかったことを呈示した。
【０１６５】
Ｄ−アミノ酸バリアントならびにペプチド配列の末端にＰＥＧブロッキング基を有するバリアントは、インビトロにおいて低減された標識化を示し、エクスビボにおいて標識化が示されなかった。向上した安定性にもかかわらず、インビトロにおいて機能を保持した直線的なＵＢＩバリアントのうちどれも肺にいる細菌をイメージングすることができなかった。本発明者らは、プローブの洗い流される特性がプローブを肺で首尾よくイメージングするために使用可能か否かに影響を与えるという証拠を得、これは、親和性および／または続いて起こる細菌細胞膜への挿入の性質に関連する可能性が最も高い。プローブ溶液の除去時の標識化の保持を、共焦点によってインビトロで調査した。すべての直線的なＵＢＩバリアントによる標識化は、洗い流したときに完全に失われた。これは、流体消散の結果として細菌の周りのプローブ濃度が低下すると、肺では標識化が速やかに失われることを示唆する。細菌をこれらの直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ化合物で前標識し、注入前の細菌懸濁液をイメージングすることによって上首尾の標識化を確認した。これらの懸濁液をエクスビボの肺に注入した後、ＦＣＦＭによりその区画をイメージングしても、細菌のシグナルが検出されなかった（注入カテーテルから同じ区画へのＦＣＦＭファイバー通路の挿入への切り換えに特有の時間遅延がある）。しかしながら、インビトロで共焦点のものによって評価した場合に洗い流したときに標識化が失われなかったポリミキシン−ＮＢＤ（ＮＢＤ−ＰＭＸ）で前標識した細菌を注入すると、細菌のシグナルが検出された。ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ構築物は、等モル濃度で増加した細菌のシグナルをもたらすだけでなく、洗い流したときに標識化を保持した。予測されるとおり、これらの化合物で前標識した細菌をエクスビボの肺に注入すると細菌が首尾よくイメージングされた。
【０１６６】
前に記載したとおり、本発明者らは、合成サーファクタント中のＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅの環式バリアントを評価し、蛍光細菌はサーファクタント標識化のバックグラウンドを上回って同定可能であった（ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸに対して見られるとおり）。その結果、ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅの環式バリアントおよびＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄはともに、同様の洗い流す行為、標識化の強度およびサーファクタント成分の存在下における標識化の保持を共有するが、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄだけが肺において細菌をイメージングすることができる。よって、分解がこの化合物の限定要因である可能性があると仮定した。ＭＡＬＤＩ分析は、環式ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅが、直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ化合物とは異なる箇所で選択的に分解することを特定した。ゆえに、こうした部位にＮ−メチルアミノ酸を組み込んだ。しかしながら、これらのバリアントは、もはやＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅの環式バリアントに見られた増加した標識化の強度を示さず、洗い流したときに標識化も保持しなかった。主な分解の部位だと仮定した位置に１つのＮ−メチルアルギニンの挿入を有するバリアントは、元のＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅの環式バリアントと比較して標識化が低減したが、直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅと比較して依然としてより高い強度を示した。このバリアントは、洗い流したときの標識化の保持が改善されたが、保持された標識化は、ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅの環式バリアントのものより低く、この化合物は、エクスビボの肺において細菌をイメージングしなかった。
【０１６７】
ＮＢＤ−ＰＭＸおよびＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄを溶血アッセイによって直接赤血球毒性（ｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）に関して評価し、１００μＭまで赤血球溶血が起こらないことが示された（図２２）。化合物を、げっ歯類の単回投与で毒性に関して評価し、これは気管内毒性評価である。マウスに１００μｇ／２５ｇマウス（１００μｇが７５ｋｇのヒトに送達されるとするヒト用量の３０００倍）のＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄもしくはＮＢＤ−ＰＭＸまたはＰＢＳ対照を１回気管内投与した。その後、４８時間および１４日の時点でマウスを安楽死させた（１群当たりｎ＝３）。データは、ＮＢＤ−ＰＭＸ（表１および図２３）またはＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ（表２および図２３）に毒性がないことを示している。
【０１６８】
【表１】
0006754531.tif 000003
【０１６９】
【表２】
0006754531.tif 000004
【０１７０】
プローブの合成方法
ユビキシジンベースのエラスターゼプローブの合成（「メチルレッド（ＭＲ）−ＡＡＰＶ−ＮＢＤ−ＵＢＩ２９〜４１」および「ＴＡＭＲＡ−ＡＡＰＶ−ＮＢＤ−ＵＢＩ２９〜４１」）
ＭＲ−ＡＡＰＶ−Ｋ（ＮＢＤ）−ＰＥＧ−ＯＨ（ＡＬ３−７４）フラグメントを、標準的なアミノ酸カップリングサイクル（室温で２×３０分）で約０．１ｍＭの試薬濃度のペプチドグレードＤＭＦ中でＤＩＣおよびオキシマを用いてＦｍｏｃ法を使用して固相上で合成した。Ｆｍｏｃ脱保護工程は、２０％ピペリジン／ＤＭＦ中で行った（２×３０分）。各工程の間に、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭおよびＭｅＯＨで洗浄した。
【０１７１】
２ｇのクロロトリチルポリスチレン樹脂（約０．３ｍｍｏｌ／ｇロード）を無水ＤＣＭ（２ｍＬ）中のＦｍｏｃ−ＰＥＧ−ＯＨ（３当量）およびＤＩＰＥＡ（６当量）で３時間処理した。洗浄およびＦｍｏｃ脱保護後、Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶＫ（Ｄｄｅ）配列を、上記のとおりＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを使用して合成した。配列が完成した後、その樹脂の半分を用いて合成を続け（０．３ｍｍｏｌスケール）、Ｄｄｅ保護基をＮＭＰ／ＤＣＭ中のＮＨ２ＯＨ／イミダゾールで直角に取り除いた（２×９０分）。その樹脂を、ＤＭＦ中のＮＤＢ−Ｃｌ（３当量）およびＤＩＰＥＡ（６当量）で処理した（２×４５分）。Ｆｍｏｃ脱保護後、０．１５ｍｍｏｌスケールで合成を続け、上記のとおりＮ末端にメチルレッドを連結した。洗浄後、そのフラグメントを、ＴＦＡ−ＴＩＳ−Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）で樹脂から切り取り（３０分間）、冷えたエーテルで沈殿させてＡＬ３−７４を得た（ＥＳＩ−ＭＳ１０４４．４および１０６６．４）。
【０１７２】
【化２】
0006754531.tif 000005
【０１７３】
上記のＦｍｏｃ法を使用してＲｉｎｋ−ａｍｉｄｅ  ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂（１ｍｍｏｌ／ｇロード）上にＵｂｉ２９〜４１配列を合成した。次に、無水ＤＭＦ（０．６ｍＬ）中のＡＬ３−７４（０．０５５ｍｍｏｌ）をＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂ＡＬ３−６８（０．０３ｍｍｏｌ）上のＵｂｉ２９〜４１に添加し、続いてＨＢＴＵ（０．０５５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。その反応混合物を、光を防いで一晩振盪した。ろ過後、その樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭおよびＭｅＯＨで洗浄した。その樹脂をＤＣＭで膨張させ、プローブを、ＴＦＡ／チオアニソール／ＥＤＴ／アニソール（９０：５：３：２）を用いて脱保護し、樹脂から切り取った（３時間）。粗製物を冷えたエーテルで沈殿させ、遠心分離によって回収した。生成物ＡＬ３−７９を４９０ｎｍで検出および溶離液として０．１％ギ酸を含むＨ２Ｏ−ＡＣＮの勾配で分取ＨＰＬＣによって精製した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ２７１９．４、＞９５％ＨＰＬＣ純度。
【０１７４】
ＴＡＭＲＡ−ＡＡＰＶ−ＮＢＤ−ＵＢＩ２９〜４１  ＡＬ３−８８（Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ  ＭＳ  ２８８１．５、＞９５％ＨＰＬＣ純度）を、フラグメントＴＡＭＲＡ−ＡＡＰＶ−Ｋ（ＮＢＤ）−ＰＥＧ−ＯＨ（ＡＬ３−７５）が樹脂ＡＬ３−６８上のＵＢＩベースのペプチドのＮ末端側に連結されたことを除いて同様の手法で合成した。
【０１７５】
【化３】
0006754531.tif 000006
【０１７６】
ポリミキシンベースのＮｅＢａｃ−プローブ（ＡＬ３−１２４）の合成
【０１７７】
【化４】
0006754531.tif 000007
【０１７８】
Ｔａｍｒａ−ＡＡＰＶ−Ｋ（ＭＲ）−ＰＥＧ−ＯＨ  ３Ａフラグメントを、標準的なアミノ酸連結サイクル（室温で２×３０分）で約０．１ｍＭの試薬濃度のペプチドグレードＤＭＦ中でＤＩＣおよびオキシマを用いてＦｍｏｃ法を使用して固相上で合成した。Ｆｍｏｃ脱保護工程は、２０％ピペリジン／ＤＭＦ中で行った（２×３０分）。各工程の間に、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭおよびＭｅＯＨで洗浄した。
【０１７９】
５００ｍｇのクロロトリチルポリスチレン樹脂（約０．３ｍｍｏｌ／ｇのロード）を、無水ＤＣＭ（２ｍＬ）中のＦｍｏｃ−ＰＥＧ−ＯＨ（３当量）およびＤＩＰＥＡ（６当量）で３時間処理した。洗浄およびＦｍｏｃ脱保護後、Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶＫ（Ｄｄｅ）−配列を上記のとおりＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを使用して合成した。配列が完成した後、Ｄｄｅ保護基をＮＭＰ／ＤＣＭ中のＮＨ２ＯＨ／イミダゾールで直角に取り除いた（２×９０分）。その樹脂を、ＤＭＦ中のＮＤＢ−Ｃｌ（３当量）およびＤＩＰＥＡ（６当量）で処理した（２×４５分）。Ｆｍｏｃ脱保護後、５（６）−カルボキシＴａｍｒａを上記のとおりＮ末端側に連結した。洗浄後、そのフラグメントを、ＴＦＡ−ＴＩＳ−Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）で樹脂から切り取り（３０分間）、エーテルで沈殿させた。３Ａ  ＥＳＩ−ＭＳ  １０４４．４および１０６６．４。
【０１８０】
次に、無水ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の３Ａ（０．０１１ｍｍｏｌ）にＨＳＰｙＵ（０．０１１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．０３３ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で１時間撹拌した。切断され選択的にＢｏｃ保護されたポリミキシン（テトラ−Ｂｏｃポリミキシン化合物Ｃ−以下参照）（１５ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、０．５ｍＬのＤＭＦ中）およびＤＩＰＥＡ（０．０３３ｍｍｏｌ）を添加し、その反応混合物を、光を防いで一晩撹拌した。ＤＭＦを蒸発させ、粗製物を１ｍＬのＴＦＡ−ＤＣＭ（１：１）に溶解させ、９０分間撹拌した。ＴＦＡ−ＤＣＭを蒸発させ、粗製物を冷えたエーテルで沈殿させ、遠心分離によって回収した。その生成物を、４９０ｎｍで検出および溶離液として０．１％ギ酸を含むＨ２Ｏ−ＡＣＮの勾配で分取ＨＰＬＣによって精製した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ２１５１．６および２１７３．６、１００％ＨＰＬＣ純度。
【０１８１】
ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄの合成
モノマー（５）の合成
モノマー（５）を、スキーム１に示されるとおり６つの工程１で合成した。アクリロニトリルへの１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのヒドロキシ基の１，４付加に続く、アミノ基保護（Ｂｏｃ）によってモノマー（５）を調製した。ＰｔＯ２／Ｈ２を用いたニトリル基の水素化分解により（３）を得、これをＤｄｅＯＨで処理してトリス−Ｄｄｅ保護アミン（４）を得た。Ｂｏｃ保護基の除去後、Ｋｎｏｌｋｅｒ２の手順に従ってイソシアネート（５）を調製した。
【０１８２】
【化５】
0006754531.tif 000008
【０１８３】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂（６）
４−［（２，４−ジメトキシフェニル）−（Ｆｍｏｃ−アミノ）メチル］フェノキシ酢酸（Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅリンカー）をＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂（ＬＶ＝１ｍｍｏｌ／ｇ）に付着させた。このようにＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−ａｍｉｄｅリンカー（０．２ｍｍｏｌ、１当量）をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解させ、エチルオキシミノシアノアセタート（オキシマ）（０．２ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、その混合物を５分間撹拌した。その後、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（０．２ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、得られた混合物をさらに２分間撹拌した。その溶液をＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂（０．１ｍｍｏｌ、１．０ｍｍｏｌ／ｇ、１当量）に添加し、０．５時間振盪した。得られた樹脂を、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）、ＤＣＭ（３×５ｍＬ）およびＭｅＯＨ（３×５ｍＬ）で洗浄した。カップリング反応を定量的なニンヒドリン試験３により監視した。
【０１８４】
【化６】
0006754531.tif 000009
【０１８５】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ型リンカーを用いて誘導体化されたＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂上にプローブを合成した（スキーム２）。リンカー（６）にモノマー（５）をロードして、トリ分岐スカフォールド（７）を得た。Ｄｄｅ基の除去後（ＤＭＦ中２％ヒドラジン）、適切なＦｍｏｃ−アミノ酸を連続的に連結した後、４−ＰＥＧ−７−ニトロベンゾフラザンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＢＤ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）を結合させ、ＴＦＡ／ＴＩＳ／ＤＣＭ（９０／５／５）を使用して樹脂から切断した。
【０１８６】
Ｆｍｏｃ脱保護のための一般的な手順
（ＤＣＭ中で予め膨張させた）樹脂にＤＭＦ中２０％ピペリジン（５ｍＬ）を添加し、その反応混合物を１０分間振盪した。溶液を排出し、その樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。この手順を２回繰り返した。カップリング反応を定量的なニンヒドリン試験３により監視した。
【０１８７】
（７）を得るためのイソシアネートカップリング
ＤＣＭ（１０ｍＬ）中で予め膨張させた樹脂（０．３０ｍｍｏｌ）にイソシアネート（６）（９２０ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．２ｍＬ、０．９３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ／ＤＭＦの混合物（１：１、５ｍＬ）溶液を添加し、その混合物を一晩振盪し、その反応を定量的なニンヒドリン試験によって監視した。溶液を排出し、その樹脂をＤＭＦ（３×２０ｍＬ）、ＤＣＭ（３×２０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（３×２０ｍＬ）ならびにエーテル（３×２０ｍＬ）で洗浄した。（３×２０ｍＬ）。カップリング反応を定量的なニンヒドリン試験３により監視した。
【０１８８】
ＰＥＧカップリング  −  ８−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−アミノ）−３，６−ジオキサオクタン酸（Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＯＨ）カップリング
ＤＭＦ（３ｍＬ）中のＦｍｏｃ−ＰＥＧ−ＯＨ（３．０ｍｍｏｌ、１０当量）溶液およびオキシマ（３．０ｍｍｏｌ、１０当量）を添加し、その混合物を５分間撹拌した。その後、ＤＩＣ（３．０ｍｍｏｌ、１０当量）を添加し、得られた混合物をさらに２分間撹拌した。その溶液をＤＣＭ中で予め膨張させた樹脂（７）に添加し、その反応混合物を０．５時間振盪した。溶液を排出し、その樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。カップリング反応を定量的なニンヒドリン試験３により監視した。
【０１８９】
ペプチド合成
ペプチド配列：Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
適切なＦｍｏｃ−アミノ酸（３．０ｍｍｏｌ、１０当量）（Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ）およびオキシマ（３．０ｍｍｏｌ、１０当量）の溶液を添加し、その混合物を５分間撹拌した。その後、ＤＩＣ（３．０ｍｍｏｌ、１０当量）を添加し、得られた混合物をさらに２分間撹拌した。その溶液をＤＣＭ中で予め膨張させた樹脂に添加し、その反応混合物を０．５時間振盪した。溶液を排出し、その樹脂をＤＭＦ（３×２０ｍＬ）、ＤＣＭ（３×２０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（３×２０ｍＬ）で洗浄した。カップリング反応を定量的なニンヒドリン試験３によって監視した。
【０１９０】
７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ）カップリング
ＮＢＤ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（３．０ｍｍｏｌ、１０当量）のＤＭＦ中（３ｍＬ）溶液にＤＩＰＥＡ（３．０ｍｍｏｌ、１０当量）を添加した。得られた溶液をＤＣＭ中で予め膨張させた樹脂（１当量）に添加し、その反応混合物を０．５時間振盪した。溶液を排出し、その樹脂をＤＭＦ（×３）、ＤＣＭ（×３）およびＭｅＯＨ（×３）で洗浄した。カップリング反応を定量的なニンヒドリン試験３により監視した。
【０１９１】
レポーターＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄのＴＦＡ切断および精製
ＤＣＭ中で予め膨張させた樹脂（４５ｍｇ）をＴＦＡ／ＴＩＳ／ＤＣＭ（９０／５／５、３００μＬ）の切断カクテルで２．５時間処理した。溶液を排出し、その樹脂を切断カクテルで洗浄し、溶液を真空中で除去した。その粗製材料を最低量の切断カクテル（５０μＬ）に溶解させ、氷冷エーテル（７．５ｍＬ）に添加した。沈殿した固体（２２ｍｇ）を遠心分離によって回収し、デカンテーションによって溶媒を除去し、沈殿物を冷えたエーテル（３×５ｍＬ）で洗浄した。その後、沈殿物を分取逆相ＨＰＬＣによって精製し、必要とされる画分をプールし、凍結乾燥してＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄを得た。
【０１９２】
【化７】
0006754531.tif 000010
【０１９３】
ＮＢＤ−ＰＭＸの合成
前駆体ポリミキシンＢスルファートから４つの工程でＮＢＤ−ＰＭＸプローブを合成した（スキーム６）。このプローブは新規のものであり、その中間体を適度な変更を伴い報告された方法１を使用して合成した。フルオロフォアをＮＢＤ−ｐｅｇのＮＨＳエステルとテトラ−ｂｏｃポリミキシン化合物Ｃとの間のアミドカップリングとして組み込む。ＴＦＡ切断およびＨＰＬＣ精製後にＮＢＤ−ＰＭＸを得る。
【０１９４】
【化８】
0006754531.tif 000011
【０１９５】
化合物Ｂの調製
ポリミキシンＢスルファート（１０ｇ、７．７ｍｍｏｌ、１当量）をｐＨ６．５の脱イオン化水（２００ｍＬ）に溶解させた（ｐＨを調節するためにＨＣｌ水溶液を使用）。パパイン（１．５ｇ）を水（２５ｍＬ）（同じｐＨ）に溶解させた。その溶液を混合し、トルエン（０．５ｍＬ）を添加し、その混合物を６５℃で一晩穏やかに撹拌した。その後、その混合物を５分間沸騰水中で撹拌し、形成された沈殿物（変性したパパイン）を遠心分離およびろ過によって除去した。ろ液を真空中で濃縮し、フリーズドライして粗生成物Ｂを定量的収率で得た。この工程をさらにいかなる精製も行うことなく次の工程に進めた。ＭＳ  ｍ／ｚ  ９６３．２（１００％、［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【０１９６】
化合物Ｃの調製：
粗製物Ｂ（５．５ｇ、５．７ｍｍｏｌ、１当量）をＨ２Ｏ：ジオキサン：Ｅｔ３Ｎ（１５０ｍＬ、１：１：１）の混合物に溶解し、Ｂｏｃ−ＯＮ（４．５２ｇ、１７．１ｍｍｏｌ、３当量）を添加した。その溶液を室温で２０分間撹拌した後、メタノール性アンモニア（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ  ａｍｍｏｎｉａ）（２０ｍＬ、２Ｍのアンモニア、ＭｅＯＨ中）でクエンチした。反応をＥＬＳＤによって追跡した。溶媒を蒸発させ、得られた混合物をシリカゲルクロマトグラフィーカラム（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ、１５：８５）に供して、白色固体Ｂ（１．７ｇ、２２％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  １３６３．７（１００％、［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【０１９７】
Ｎ−（４−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−７−イル）アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＮＢＤ−ＰＥＧ２−ＯＨ）：２
ＤＩＥＡ（８５０μｌ、５．００ｍｍｏｌ）および固体８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＮＨ２−ＰＥＧ２−ＯＨ）（３９２ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ、１当量）をゆっくりと１時間かけて０℃のＮＢＤ−Ｃｌ（４０１ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ）のメタノール（２０ｍＬ）中溶液に添加した。その反応混合物を一晩室温で撹拌した。溶媒を蒸発させ、残っている材料をシリカによる溶離液としてＤＣＭ／ＭｅＯＨ（８：２）を用いたクロマトグラフィーによって精製して、暗赤色の油状物としてＮＢＤ−ＰＥＧ２−ＯＨ（４００ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ、５１％）を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO): δ 10.9 (s, 1H; COOH), 8.49 (d, J = 8.5 Hz, 1H; CH NBD), 7.1 (s, 1H, NH), 6.23 (d, J = 8.5 Hz, 1H; CH NBD), 4.25 (s, 2H), 3.93 (t, J = 5.3 Hz, 2H; CH2), 3.80 (s, 4H), 3.72 (t, J = 6.8 Hz, 2H; CH2) ppm;ＭＳ  （ＥＳＩ−）：ｍ／ｚ  Ｃ１２Ｈ１４Ｎ４Ｏ７に対する計算値［Ｍ−Ｈ］：３２５．１；実測値：３２５．２。
【０１９８】
Ｎ−（４−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−７−イル）アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸、スクシンイミジルエステル（ＮＢＤ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）：
ＮＢＤ−ＰＥＧ−ＯＨ（２．４ｇ、７．４ｍｍｏｌ、１当量）の無水ＤＣＭ（５００ｍＬ）中溶液にＥＤＣ．ＨＣｌ（１．５６ｇ、８．１８ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＤＩＰＥＡ（１．３６ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を１０分間撹拌した後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．９４ｇ、８．１８ｍｍｏｌ）を添加し、１６時間撹拌させた。その反応混合物をＤＣＭ（２５０ｍＬ）で希釈し、５％クエン酸水溶液（２×２００ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液およびブラインで処理した。有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、真空中で還元して、暗褐色の固体として生成物を得た（１．０ｇ、定量的）。この粗製物をさらに精製することなく次の工程に使用した。
【０１９９】
化合物Ｆの調製：
ＮＢＤ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（４６６ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、１当量）、ＤＩＰＥＡ（３８４μＬ、２．２ｍｍｏｌ、２当量）およびアミンＣ（１．５ｇ、１．１ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ中（１５０ｍＬ）溶液を室温で１時間撹拌し、光を防いだ。反応の完了後（ＴＬＣ）、揮発性物質を真空下で除去した。粗製混合物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９０：１０）によって精製して、暗いオレンジ／褐色の固体（１．２ｇ、６５％）を得た。ＨＰＬＣ（２５４ｎｍおよび４９５ｎｍ）Ｒｔ＝７．８０分；ｍ／ｚ  １６７１．７（２５％、［Ｍ＋Ｈ］＋）；１６９３．９（６５％、［Ｍ＋Ｎａ］＋）。
【０２００】
ＮＢＤ−ＰＭＸプローブの調製：
Ｂｏｃ保護ポリミキシンＦ（１５０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）の２０％ＴＦＡ／ＤＣＭ中（２ｍＬ）溶液を室温で４５分間勢いよく撹拌し、光を防いだ。その反応混合物を真空中で蒸発させ、生じたものをエーテルに溶解させた。遠心分離後にエーテル層をデカントした（３×２ｍＬ）。生じた黄色／褐色の固体（４０ｍｇ、定量的）を真空下で乾燥した。その粗生成物を添加剤として０．１％ギ酸を含む勾配溶媒系としてＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏにおいて分取ＨＰＬＣによって精製した。分取ＨＰＬＣから回収された画分をフリーズドライして、赤色／オレンジ色の固体（３０ｍｇ、ＨＰＬＣからの回収率２６％）を得た。
【０２０１】
特徴づけ：分析的ＨＰＬＣのために、ダイオードアレイ検出器とともにＰｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＳＢ−Ｃ１８、２．７μｍ、４．６×５０ｍｍカラムを使用した。分取ＨＰＬＣ法について：１ｍＬ／分の流速およびＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ／ＨＣＯＯＨ（９５／５／０．０５）からＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ／ＨＣＯＯＨ（５／９５／０．０５）のＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ１８逆相カラム（５ｃｍ×４．６ｍｍ、５μｍ）で６分間にわたって溶出し、９５％ＭｅＯＨで４分間保持し、２５４および４９５ｎｍでＥＬＳＤによって検出した。ＨＰＬＣ（４９５ｎｍ）：Ｒｔ＝４．１分；ＭＳ  ｍ／ｚ  １２７１．７（９５％、［Ｍ＋Ｈ］＋）；１２９３．７（１００％、［Ｍ＋Ｎａ］＋）；ＦＴＭＳ  計算値６３６．３２８２（［Ｍ＋２Ｈ］／２）＋，実測値６３６．３３４４。
吸収／発光：４６７ｎｍ／５３９ｎｍ。
溶解度：水に完全に溶解できる。
安定性：室温で１週間を超えて安定。
保存：不活性雰囲気下、−２０℃で保存した。光を防ぐ。
【０２０２】
生物学的方法
細菌増殖：アッセイに使用される細菌には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡ０１−参照菌株およびＪ３２８４−ＶＡＰ患者からの臨床分離株）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＳＳＡ）を含む）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が含まれる。
【０２０３】
【表３】
0006754531.tif 000012
【０２０４】
すべての細菌を寒天ブロス、チョコレート寒天または血液寒天プレートで増殖させ、４℃で保存した。アッセイのために、１つのコロニーの細菌を、接種ループを使用して取り、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ中の１０ｍｌの液体ブロスに添加した。これを３７℃のインキュベーターに１６時間移した（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に関しては５％ＣＯ２を補充した）。培養物は一晩培養物（固定相）として使用されるか、またはこれらの培養物から一部の培養物が使用され（１：１００）、サンプルを対数増殖中期（ｍｉｄ  ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）に入るまで増殖させた（５９５ｎｍで分光光度計により０．５〜０．６光学密度（ＯＤ）の読取り）。その後、その培養物を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ペレットをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させた。３回の洗浄後、これを、共焦点アッセイのために０．５ＯＤ５９５ｎｍ、フローサイトメトリーのために０．１ＯＤ５９５ｎｍまたはヒツジのエクスビボ肺実験のために２ＯＤ５９５ｎｍに再構成した（別に明記されない限り）。
【０２０５】
細菌の計数：サンプル（調製された細菌またはヒツジ肺区画の洗浄液）を短時間ボルテックスし、その後、希釈液を８回の希釈まで段階希釈（１：１０）を行った。ブロス／血液寒天プレートを、四分割のそれぞれに５×２０ｕｌ滴を含む四分割にした。これらを３７℃で１６時間インキュベートし（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に関しては５％ＣＯ２を補充した）、プレートを、１ミリリットル当たりコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）として報告されるデータを用いて計数した。
【０２０６】
サーファクタント成分合成：サーファクタント、５μｇの１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）および２．５μｇのＬ−α−ホスファチジル−ＤＬ−グリセロールナトリウム塩（卵黄レシチン由来；ＰＧ）を５００μｌのクロロホルムに溶解させ、窒素下で蒸発させて、丸底フラスコ中で薄い脂質膜にした。撹拌（７５０ｒｐｍ）しながらこの脂質膜を４８℃のＰＢＳを用いて１時間再水和して、多重膜ベシクル（ＭＬＶ）を形成した。これを、共焦点実験に使用するために１：４希釈した。
【０２０７】
アガロース細菌ビーズ：細菌を４００ｍｌのＴＳＢ中で対数増殖中期まで増殖させ、遠心分離によってペレットにし、２ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。これを、１８ｍｌの融解したトリプシン大豆寒天（５０℃）と混合し、予め５０℃に温めたボルテックスしている鉱油＋０．０１％Ｓｐａｎ  ８０に速やかに注入した。その後、これを、ボルテックスを続けながら速やかに４℃に冷却して、ビーズを固まらせた。細菌寒天ビーズを遠心分離によってペレットにし（２０分、３０００ｇ）、ＰＢＳ中の０．５％デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）中で（２０分、３０００ｇ）、続いてＰＢＳ中の０．２５％ＳＤＣ中で洗浄し（２０分、３０００ｇ）、ＰＢＳ（１０分、３０００ｇ）中および３×ＰＢＳ（５分間、２００ｇ）中で洗浄した。注入のためにＰＢＳに５０％ｖ／ｖでビーズを再懸濁させた。
【０２０８】
好中球の抽出：好中球を、健康なヒト志願者のデキストラン沈殿の末梢性血から単離した後、不連続のプラズマ−パーコール勾配により遠心分離した。
【０２０９】
Ａ５４９培養物：Ａ５４９細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍＬ  ペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において８０％集密化するまで増殖させた。トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を分散させ、カバーガラスまたは８ウェル共焦点イメージングチャンバー上に植え付け、ＤＭＥＭの存在下で集密化するまで増殖させた。
【０２１０】
共焦点分析：細菌を調製し、３７℃および３５０ｒｐｍで２０分間、振盪ヒート・ブロックにおいてＳｙｔｏ  ８２核酸染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、米国）で対比染色した。その細胞を、密閉ＰＯＣミニチャンバーまたは８ウェル共焦点チャンバー中において必要とされる濃度のプローブとともにコインキュベートした。必要な場合、ＰＯＣチャンバーのためのカバーガラスをフィブロネクチン（好中球実験に対して）またはポリ−ｄ−リシン（細菌および細胞株に対して）でコーティングし、細胞とともに１時間、３７℃でインキュベートして、細菌接種前に接着させた。分析はＩｍａｇｅＪによって行った。簡単にいえば、Ｓｙｔｏチャネルは、自動的にしきい値が決められ（Ｈｕａｎｇ）、これからＲＯＩが生成された。このＲＯＩ内のプローブチャネルに対する平均蛍光強度を数量化した。提示されたデータは、３つの別々の視野の平均を表す。
【０２１１】
フローサイトメトリー：細菌を調製し、３７℃および３５０ｒｐｍで２０分間、振盪付きヒートブロックにおいてＳｙｔｏ  ８２核酸染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、米国）で対比染色した。細菌をＰＢＳ×３中で洗浄し、プローブ（５０μｌ）を５０ｕｌのＯＤ５９５  １ｏｄ細菌に添加した。これを５００ｕＬに希釈し、ＦＬ−１およびＦＬ−２チャネルを使用したＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを使用して１０，０００イベントで分析した。ＦＬ−２チャネルに関してゲートした後、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析を行った。
【０２１２】
肺の採取およびｐＣＬＥ手順：選別を予定した過剰な家畜の雌ヒツジのコホートから、１匹の雌ヒツジを特定し、過量の麻酔薬により最後に安楽死させた。死亡を確かめ、気管を確認し、その場（インサイチュ）でクランプした。その後、胸腔にアクセスし、肺を周辺の組織および臓器から外し、心臓／肺を塊の状態で取り出した。右の肺動脈を確認し、カニューレを挿入し、１０００ｍｌの０．９％ＮａＣｌで灌流した。左心室の充満を確認したら切開を行って自由排水させ、左心房からの排液が透明になるまで灌流を続けた。その後、肺をＱｕｅｅｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに移し、クランプを外した直後に気管に８．０気管内チューブを挿管した。肺を３７℃の周囲温度および６５％の湿度の新生児用保育器に入れ、Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ（Ｂｒｅａｓ  Ｖｉｖｏ  ＰＶ  ４０３）を使用して人工呼吸した。最大限の実質リクルートメントを助け、１リットル超の一回換気量を達成するよう人工呼吸器の設定を調節した。最適な人工呼吸の１時間後、気管支鏡を始め、個々の区画を同定し、２ｍｌの細菌またはＰＢＳ対照を注入した。注入後、個別のシース（ＥＲＢＥ）を導入し、プローブを注入した。その後、ｐＣＬＥファイバーを、ワーキングチャネルを下行させ、その区画をイメージングした。ＢＡＬＦのために、気管支鏡を押し込み、２０ｍｌの０．９％ＮａＣｌを注入し、４０〜５０％の洗浄液収率で注意深く引き抜いた。対照区画は、解剖学的に区別しおよび／または対側肺にあるものとした。気管支鏡は、イメージングするそれぞれの区画間で浄化した。
【０２１３】
溶血アッセイ：新たに抜き、抗凝固処理したヒト血液から赤血球を単離し、２０体積％でＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁させた。９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、１００μｌの赤血球懸濁液を１００μｌのＮＬＬＰのＰＢＳ溶液（１：２段階希釈によって調製）または陰性対照の場合は１００μｌのＰＢＳに添加した。１００パーセント溶血ウェルは、１００μｌの０．２体積％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１００μｌの赤血球懸濁液を含んでいた。そのプレートを３７℃で１時間インキュベートした後、各ウェルを１５０μｌのＰＢＳで希釈した。その後、そのプレートを１，２００ｇで１５分間遠心分離し、各ウェルから１００μｌの上清を新しいマイクロタイタープレートに移し、Ａ３５０を測定した。溶血の割合を（Ａ−Ａ０）／（Ａｔｏｔａｌ−Ａ０）×１００として求め、この場合、Ａは試験ウェルの吸光度であり、Ａ０は陰性対照の吸光度であり、Ａｔｏｔａｌは１００％溶血ウェルの吸光度であり、すべてＢｉｏｔｅｋプレートリーダーによる３５０ｎｍにおけるものである。
【０２１４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：プローブを生理食塩水またはＡＬＩの患者からプールしたＢＡＬＦに添加し、３０分間インキュベートした。ＺｉｐＴｉｐ（Ｃ−１８、０．２μＬ）を５μＬのＭｅＣＮ（添加剤として０．１％ＴＦＡを含む）、続いて２０μＬのＨ２Ｏで洗浄した。ＺｉｐＴｉｐをサンプルにロードし、洗浄し、５μＬの８０％ＭｅＣＮ水溶液（添加剤として０．１％ＴＦＡを含む）に溶出させた。そのサンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ（商標）ＳＴＲ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州））によって分析した。
【０２１５】
統計分析：別に明記されていない限り、すべての実験を少なくとも３回実施し、結果を平均±ＳＥＭとして表した。データを独立ｔ−検定またはＡＮＯＶＡによって解析し、有意性をｐ＜０．０５として判定した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）。
【０２１６】
参考文献
1.  M. Ternon, J. J. Diaz-Mochon, A. Belsom, M. Bradley, Tetrahedron, 2004, 60, 8721
2.  H. J. Knoelker, T. Braxmeier, G. Schlechtingen, Angew. Chem. Int. Ed., 1995, 34, 2497
3.  E. Kaiser, R. L. Colescott, C. D. Bossinger and P. I. Cook, Analytical Biochemistry, 1970, 34, 595-598.
【０２１７】
関連する配列の一覧
配列番号1
ユビキシジン(完全)
0006754531.tif 000013
配列番号2
ユビキシジン(UBI29-41)
0006754531.tif 000014
配列番号3
ユビキシジン(UBINle)
0006754531.tif 000015
配列番号4
ポリミキシン
0006754531.tif 000016
配列番号5
ポリミキシンB1
0006754531.tif 000017
配列番号6
ポリミキシンB2
0006754531.tif 000018
0006754531.tif 000019
【図１】
0006754531.tif 000020
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
0006754531.tif 000023
【図３Ｂ】
0006754531.tif 000024
【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0006754531.tif 000028
【図７Ａ】
0006754531.tif 000029
【図７Ｂ】
0006754531.tif 000030
【図７Ｃ】
0006754531.tif 000031
【図７Ｄ】
0006754531.tif 000032
【図７Ｅ】
0006754531.tif 000033
【図８Ａ】
0006754531.tif 000034
【図８Ｂ】
0006754531.tif 000035
【図８Ｃ】
0006754531.tif 000036
【図８Ｄ】
0006754531.tif 000037
【図８Ｅ】
0006754531.tif 000038
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
0006754531.tif 000045
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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