(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞分割法であって、
複数の細胞に係る入力画像からバイナリマスクを生成する工程であって、前記バイナリマスクは背景から前景の細胞を分離するものである工程と、
前記バイナリマスクの各細胞領域を、単一細胞領域、小クラスター領域及び大クラスター領域に分類する工程と、
前記小クラスター領域のそれぞれに対して、当該小クラスター領域の輪郭形状に基づく分割を行う工程と、
前記大クラスター領域のそれぞれに対して、当該大クラスター領域中のテクスチャに基づく分割を行う工程と、
細胞境界を含む画像を出力する工程と、
からなる方法。
【請求項２】
閾値処理、Ｋ平均クラスター化とそれに続く閾値処理、又は機械学習法により前記バイナリマスクを生成する工程、
を備える請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バイナリマスク中の各閉輪郭について、当該輪郭中に存在する各陥凹点を検出し、陥凹点の数に基づいて輪郭面積に対する包部面積の比を算出する工程と、
各閉輪郭を前記単一細胞領域、前記小クラスター領域又は前記大クラスター領域のいずれか１つに分類する工程と、
を備える請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バイナリマスク中に陥凹点を含まない細胞クラスターを不適合とする工程、
を備える請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記小クラスター領域に分類された各閉輪郭について分散画像を生成する工程を備えており、当該工程は、
エッジ分散画像を生成する工程と、
欠陥数が１を超える場合は、最も見込みある欠陥ペアを見つけ出す工程とからなり、
当該最も見込みある欠陥ペアを見つけ出す工程は、
各欠陥ペア間のユークリッド距離を求める工程と、
欠陥がどちらも同じ側にある場合は、当該欠陥ペアを無効ペアと同定する工程と、
欠陥が反対側にある場合は、ペアとなる欠陥間の距離が最も短い欠陥ペアを、２つ又はそれ以上の細胞に対応する最も見込みある欠陥ペアと同定する工程と、
からなる請求項３に記載の方法。
【請求項６】
１つだけ残された欠陥、又は輪郭の同じ側にあり有効ペアを同定できずに残された欠陥に対して、欠陥ペアの第２の欠陥を導入する工程であって、前記第２の欠陥は、境界上であって、第１の欠陥点と当該第１の欠陥の包線への投影によって形成される直線上の点である工程と、
第１の欠陥点と第２の欠陥点の間のパスに、最短パスアルゴリズムを適用する工程と、を備えており、
当該最短パスアルゴリズムを適用する工程は、
注目領域を抽出する工程と、
前記注目領域の向きを縦向きにする工程と、
前記注目領域を始点から横断して、推定されるパスの次の点を見つけ出す工程と、
前記パスのコストが最小となる、パスの次の推定点を選択する工程であって、当該パスは、（ｐ１、ｐ２・・・ｐｉ・・・ｐｍ）と定義され、ｐ１は常に欠陥点であり、第２の欠陥はパスＰの最終点であり、ｐｉはパスＰのｉ番目のレイヤーの点である工程と、
からなる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記パスのコストがコスト関数として定義され、当該コスト関数は以下の通りである請求項６に記載の方法。
【数１】
0006710135.tif 000013
式中、Ｃ０は目的項、Ｃ１は制約項を表し、Ｃ１は、現在の点（ｐｉ）から次の点（ｐｉ＋１）が列としてどの程度離れているかを決定する。
【数２】
0006710135.tif 000014
式中、Ｃ０は、ｉ番目のレイヤーの分散画像の輝度値及び前の点のコスト値から算出され、点ｐｉ＋１は、最小コストに基づき選択され、既存のパスＰに追加される。  
【請求項８】
大クラスター領域中のテクスチャに基づく前記分割が、汎用ラプラシアンガウシアン（ｇＬｏＧ）フィルター処理に基づく分割であり、
当該ｇＬｏＧフィルター処理に基づく分割は、
前記バイナリマスクから抽出したグレー画像を入力して、細胞核の細胞分割境界を生成する工程と、
前記細胞核の細胞分割境界を、１つ又はそれ以上のスケール及び方向のｇＬｏＧフィルターでフィルター処理する工程と、
フィルター処理された前記細胞核の細胞分割境界から、距離マップを用いて応答曲面を生成する工程と、
前記応答曲面から極大を検出して、複数のシード点を生成する工程と、
前記複数のシード点のそれぞれに対して、解像度アルゴリズムを適用する工程と、
からなる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
細胞数を生成する工程を備えており、
当該細胞数は、
前記単一細胞領域については、前記バイナリマスクにおける全結合要素に基づく全細胞数であり、
前記小クラスター領域については、前記バイナリマスクに分割境界を重ね合わせた画像に対してモルフォロジー収縮／膨張を行って個々の細胞を分離した、結合要素の数であり、
前記大クラスター領域については、極大クラスター化アルゴリズムにおける大クラスターラベルの総数である、
請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
細胞分割のためのコンピュータ読取り可能なコードを格納するコンピュータプログラムであって、前記プログラムはコンピュータにより実行可能であって、当該コンピュータに、
複数の細胞に係る入力画像からバイナリマスクを生成する工程であって、前記バイナリマスクは背景から前景の細胞を分離する工程と、
前記バイナリマスクの各細胞領域を、単一細胞領域、小クラスター領域及び大クラスター領域に分類する工程と、
前記小クラスター領域のそれぞれに対して、当該小クラスター領域の輪郭形状に基づく分割を行う工程と、
前記大クラスター領域のそれぞれに対して、当該大クラスター領域中のテクスチャに基づく分割を行う工程と、
細胞境界を含む画像を出力する工程と、
を実行させるコンピュータプログラム。
【請求項１１】
閾値処理、Ｋ平均クラスター化とそれに続く閾値処理、又は機械学習法により前記バイナリマスクを生成する工程、
を備える請求項１０に記載のコンピュータプログラム。
【請求項１２】
前記バイナリマスク中の各閉輪郭について、当該輪郭中に存在する各陥凹点を検出し、陥凹点の数に基づいて輪郭面積に対する包部面積の比を算出する工程と、
各閉輪郭を前記単一細胞領域、前記小クラスター領域又は前記大クラスター領域のいずれか１つに分類する工程と、
前記バイナリマスク中に陥凹点を含まない細胞クラスターを不適合とする工程と、
前記小クラスター領域に分類された各閉輪郭について分散画像を生成する工程と、を備えており、
前記分散画像を生成する工程は、
エッジ分散画像を生成する工程と、
欠陥数が１を超える場合は、最も見込みある欠陥ペアを見つけ出す工程とからなり、
当該最も見込みある欠陥ペアを見つけ出す工程は、
各欠陥ペア間のユークリッド距離を求める工程と、
欠陥がどちらも同じ側にある場合は、当該欠陥ペアを無効ペアと同定する工程と、
欠陥が反対側にある場合は、ペアとなる欠陥間の距離が最も短い欠陥ペアを、２つ又はそれ以上の細胞に対応する最も見込みある欠陥ペアと同定する工程と、
からなる請求項１０に記載のコンピュータプログラム。
【請求項１３】
１つだけ残された欠陥、又は輪郭の同じ側にあり有効ペアを同定できずに残された欠陥に対して、欠陥ペアの第２の欠陥を導入する工程であって、前記第２の欠陥は、境界上であって、第１の欠陥点と当該第１の欠陥の包線への投影によって形成される直線上の点である工程と、
第１の欠陥点と第２の欠陥点の間のパスに、最短パスアルゴリズムを適用する工程と、を備えており、
当該最短パスアルゴリズムを適用する工程は、
注目領域を抽出する工程と、
前記注目領域の向きを縦向きにする工程と、
前記注目領域を始点から横断して、推定されるパスの次の点を見つけ出す工程と、
前記パスのコストが最小となる、パスの次の推定点を選択する工程であって、当該パスは、（ｐ１、ｐ２・・・ｐｉ・・・ｐｍ）と定義され、ｐ１は常に欠陥点であり、第２の欠陥はパスＰの最終点であり、ｐｉはパスＰのｉ番目のレイヤーの点である工程と、
からなる請求項１２に記載のコンピュータプログラム。
【請求項１４】
前記パスのコストがコスト関数として定義され、当該コスト関数は以下の通りである請求項１３に記載のコンピュータプログラム。
【数３】
0006710135.tif 000015
式中、Ｃ０は目的項、Ｃ１は制約項を表し、Ｃ１は、現在の点（ｐｉ）から次の点（ｐｉ＋１）が列としてどの程度離れているかを決定する。
【数４】
0006710135.tif 000016
式中、Ｃ０は、ｉ番目のレイヤーの分散画像の輝度値及び前の点のコスト値から算出され、点ｐｉ＋１は、最小コストに基づき選択され、既存のパスＰに追加される。  
【請求項１５】
大クラスター領域中のテクスチャに基づく前記分割が、汎用ラプラシアンガウシアン（ｇＬｏＧ）フィルター処理に基づく分割であり、
当該ｇＬｏＧフィルター処理に基づく分割は、
前記バイナリマスクから抽出したグレー画像を入力して、細胞核の細胞分割境界を生成する工程と、
前記細胞核の細胞分割境界を、１つ又はそれ以上のスケール及び方向のｇＬｏＧフィルターでフィルター処理する工程と、
フィルター処理された前記細胞核の細胞分割境界から、距離マップを用いて応答曲面を生成する工程と、
前記応答曲面から極大を検出して、複数のシード点を生成する工程と、
前記複数のシード点のそれぞれに対して、解像度アルゴリズムを適用する工程と、
からなる請求項１０に記載のコンピュータプログラム。
【請求項１６】
細胞数を生成する工程を備えており、
当該細胞数は、
前記単一細胞領域については、前記バイナリマスクにおける全結合要素に基づく全細胞数であり、
前記小クラスター領域については、前記バイナリマスクに分割境界を重ね合わせた画像に対してモルフォロジー収縮／膨張を行って個々の細胞を分離した、結合要素の数であり、
前記大クラスター領域については、極大クラスター化アルゴリズムにおける大クラスターラベルの総数である、
請求項１０に記載のコンピュータプログラム。
【請求項１７】
細胞分割システムであって、
複数の細胞に係る入力画像を生成する入力モジュールと、
前記複数の細胞に係る入力画像を処理して、当該入力画像の細胞数を生成する少なくとも１つのモジュールと、
出力画像について細胞数を表示するディスプレイとからなり、
前記少なくとも１つのモジュールはプロセッサを備えており、
当該プロセッサは、
複数の細胞に係る入力画像からバイナリマスクを生成し、前記バイナリマスクは背景から前景の細胞を分離し、
前記バイナリマスクの各細胞領域を、単一細胞領域、小クラスター領域及び大クラスター領域に分類し、
前記小クラスター領域のそれぞれに対して、当該小クラスター領域の輪郭形状に基づく分割を行い、
前記大クラスター領域のそれぞれに対して、当該大クラスター領域中のテクスチャに基づく分割を行い、
細胞境界を含む画像を出力するものであり、
前記細胞数は、
前記単一細胞領域については、前記バイナリマスクにおける全結合要素に基づく全細胞数であり、
前記小クラスター領域については、前記バイナリマスクに分割境界を重ね合わせた画像にモルフォロジー収縮／膨張を行って個々の細胞を分離した、結合要素の数であり、
前記大クラスター領域については、極大クラスター化アルゴリズムにおける大クラスターラベルの総数である、
細胞分割システム。
【請求項１８】
前記プロセッサは、
閾値処理、Ｋ平均クラスター化とそれに続く閾値処理、又は機械学習法により前記バイナリマスクを生成し、
前記バイナリマスク中の各閉輪郭について、当該輪郭中に存在する各陥凹点を検出し、陥凹点の数に基づいて輪郭面積に対する包部面積の比を算出し、
各閉輪郭を前記単一細胞領域、前記小クラスター領域又は前記大クラスター領域のいずれか１つに分類し、
前記バイナリマスク中に陥凹点を含まない細胞クラスターを不適合とし、
前記小クラスター領域に分類された各閉輪郭について分散画像を生成するものであり、
前記分散画像の生成は、
エッジ分散画像を生成する工程と、
欠陥数が１を超える場合は、最も見込みある欠陥ペアを見つけ出す工程とからなり、
当該最も見込みある欠陥ペアを見つけ出す工程は、
各欠陥ペア間のユークリッド距離を求める工程と、
欠陥がどちらも同じ側にある場合は、当該欠陥ペアを無効ペアと同定する工程と、
欠陥が反対側にある場合は、ペアとなる欠陥間の距離が最も短い欠陥ペアを、２つ又はそれ以上の細胞に対応する最も見込みある欠陥ペアと同定する工程と、
からなる請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記プロセッサは、
１つだけ残された欠陥、又は輪郭の同じ側にあり有効ペアを同定できずに残された欠陥に対して、欠陥ペアの第２の欠陥を導入し、
第１の欠陥点と第２の欠陥点の間のパスに、最短パスアルゴリズムを適用するものであり、
前記第２の欠陥は、境界上であって、第１の欠陥点と当該第１の欠陥の包線への投影によって形成される直線上の点であり、
当該最短パスアルゴリズムの適用は、
注目領域を抽出する工程と、
前記注目領域の向きを縦向きにする工程と、
前記注目領域を始点から横断して、推定されるパスの次の点を見つけ出す工程と、
前記パスのコストが最小となる、パスの次の推定点を選択する工程であって、当該パスは、（ｐ１、ｐ２・・・ｐｉ・・・ｐｍ）と定義され、ｐ１は常に欠陥点であり、第２の欠陥はパスＰの最終点であり、ｐｉはパスＰのｉ番目のレイヤーの点である工程とからなり、
前記パスのコストがコスト関数として定義され、当該コスト関数は以下の通りである請求項１８に記載のシステム。
【数５】
0006710135.tif 000017
式中、Ｃ０は目的項、Ｃ１は制約項を表し、Ｃ１は、現在の点（ｐｉ）から次の点（ｐｉ＋１）が列としてどの程度離れているかを決定する。
【数６】
0006710135.tif 000018
式中、Ｃ０は、ｉ番目のレイヤーの分散画像の輝度値及び前の点のコスト値から算出され、点ｐｉ＋１は、最小コストに基づき選択され、既存のパスＰに追加される。  
【請求項２０】
大クラスター領域中のテクスチャに基づく前記分割が、汎用ラプラシアンガウシアン（ｇＬｏＧ）フィルター処理に基づく分割であり、
当該ｇＬｏＧフィルター処理に基づく分割は、
前記バイナリマスクから抽出したグレー画像を入力して、細胞核の細胞分割境界を生成する工程と、
前記細胞核の細胞分割境界を、１つ又はそれ以上のスケール及び方向のｇＬｏＧフィルターでフィルター処理する工程と、
フィルター処理された前記細胞核の細胞分割境界から、距離マップを用いて応答曲面を生成する工程と、
前記応答曲面から極大を検出して、複数のシード点を生成する工程と、
前記複数のシード点のそれぞれに対して、解像度アルゴリズムを適用する工程と、
からなる請求項１７に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞画像の自動分析方法及びシステムに関し、特に、細胞画像を単一細胞、小クラスター及び大クラスターに分類することができ、細胞画像から細胞境界を抽出することができる、顕微細胞画像の自動細胞分割方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物医学画像の分野では、画像解析における非常に重要な工程として、接触している細胞核の分割（ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）が挙げられる。細胞分割を行う方法及びシステムは存在するものの、それらは、細胞が様々な集合形態をとる場合の解決策となるものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記の問題を鑑みると、例えば、まず顕微細胞画像を単一細胞、小クラスター及びそれを超える大クラスターに分類し、次いで小クラスター及び大クラスターを例えば異なる方法により分割する、顕微細胞画像の細胞分割システム及び方法があれば望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
例示的実施態様により細胞分割法が開示される。当該方法は、
複数の細胞に係る入力画像からバイナリマスクを生成する工程であって、前記バイナリマスクは背景から前景の細胞を分離するものである工程と、
前記バイナリマスクの各細胞領域を、単一細胞領域、小クラスター領域及び大クラスター領域に分類する工程と、
前記小クラスター領域のそれぞれに対して、当該小クラスター領域の輪郭形状に基づく分割を行う工程と、
前記大クラスター領域のそれぞれに対して、当該大クラスター領域中のテクスチャに基づく分割を行う工程と、
細胞境界を含む画像を出力する工程とからなる。
【０００５】
例示的実施態様により、細胞分割のためのコンピュータ読取り可能なコードを格納するコンピュータプログラムが開示される。当該プログラムはコンピュータにより実行可能であって、当該コンピュータに、
複数の細胞に係る入力画像からバイナリマスクを生成する工程であって、前記バイナリマスクは背景から前景の細胞を分離する工程と、
前記バイナリマスクの各細胞領域を、単一細胞領域、小クラスター領域及び大クラスター領域に分類する工程と、
前記小クラスター領域のそれぞれに対して、当該小クラスター領域の輪郭形状に基づく分割を行う工程と、
前記大クラスター領域のそれぞれに対して、当該大クラスター領域中のテクスチャに基づく分割を行う工程と、
細胞境界を含む画像を出力する工程とを実行させる。
【０００６】
例示的実施態様により細胞分割システムが開示される。当該システムは、
複数の細胞に係る入力画像を生成する入力モジュールと、
前記複数の細胞に係る入力画像を処理して、当該入力画像の細胞数を生成する少なくとも１つのモジュールと、
出力画像について細胞数を表示するディスプレイとからなる。
前記少なくとも１つのモジュールはプロセッサを備えており、当該プロセッサは、
複数の細胞に係る入力画像からバイナリマスクを生成し、前記バイナリマスクは背景から前景の細胞を分離し、
前記バイナリマスクの各細胞領域を、単一細胞領域、小クラスター領域及び大クラスター領域に分類し、
前記小クラスター領域のそれぞれに対して、当該小クラスター領域の輪郭形状に基づく分割を行い、
前記大クラスター領域のそれぞれに対して、当該大クラスター領域中のテクスチャに基づく分割を行い、
細胞境界を含む画像を出力するものである。
前記細胞数は、
前記単一細胞領域については、前記バイナリマスクにおける全結合要素に基づく全細胞数であり、
前記小クラスター領域については、前記バイナリマスクに分割境界を重ね合わせた画像にモルフォロジー収縮／膨張を行って個々の細胞を分離した、結合要素の数であり、
前記大クラスター領域については、極大クラスター化アルゴリズムにおける大クラスターラベルの総数である。
【０００７】
当然ながら、上記の概要及び以下の詳細な説明は、いずれも例示及び説明のためのものあって、請求の範囲に記載される発明のさらなる説明を意図するものである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】例示的実施形態に従って分析及び処理することのできる、種々の細胞タイプを示す図である。
【図２】例示的実施形態に係る自動細胞分割システムの略図である。
【図３Ａ】例示的実施形態に従って入力されたサンプルを示す図である。
【図３Ｂ】例示的実施形態に従って生成されたマスクを示す図である。
【図４】例示的実施形態に係る細胞カテゴリー分類システムのブロック図である。
【図５】例示的実施形態に係る陥凹点の検出結果の一例に、手書きでハイライトした単細胞、小クラスター及び大クラスターの領域を重ねた図である。
【図６】細胞領域カテゴリー分類の出力の一例を示す図である。
【図７】例示的実施形態に係る境界及び分散に基づく分割のフローチャートである。
【図８Ａ】例示的実施形態に係る元画像を示す図である。
【図８Ｂ】例示的実施形態に係る対応する分散画像を示す図である。
【図９Ａ】有効ペアを示す図であり、例示的実施形態に係る有効ペアと無効ペアを区別する方法を示している。
【図９Ｂ】無効ペアを示す図であり、例示的実施形態に係る有効ペアと無効ペアを区別する方法を示している。
【図１０】例示的実施形態に係る最も見込みのある欠陥ペア、見込みの低い欠陥ペア及び無効な欠陥ペアを示す図である。
【図１１】例示的実施形態に係る第２の欠陥を発見して有効ペアを形成するシステム及び方法を示す図である。
【図１２】注目領域（ＲＯＩ）の抽出及び回転の一例を示す図である。
【図１３】境界−分散分割の例示的サンプル又は結果を示す図である。
【図１４】例示的実施形態に係る汎用ラプラシアンガウシアン（ｇＬｏＧ）フィルター処理に基づく分割を示すフローチャートである。
【図１５Ａ】応答曲面の一例を画像として示す図である。
【図１５Ｂ】応答曲面の一例を表面プロットを示す図である。
【図１６】例示的実施形態に係る極大クラスター化の中間結果を示す図である。
【図１７】分割された細胞境界の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ここで、本発明の好ましい実施形態について詳細に述べるが、それらの例は添付の図面に記載されている。図面及び明細書において、同一または同様の部分には、可能な限り同一の参照番号を用いている。
【００１０】
例示的実施形態によれば、他の多くの方法とは異なり、単一の画像中に存在する様々な大きさの細胞に好適な、例えば、細胞の大きさ（小型又は大型）に影響されない、細胞境界を抽出することができるシステム及び方法が開示される。図１は、本明細書に開示されるシステム及び方法に従って解析及び処理することのできる様々な種類の細胞画像を示す図である。
【００１１】
図２は、例示的実施形態に係る細胞分割システム２００のブロック図を示す。図２に示すように、システム２００は、入力モジュール２１０、前処理モジュール２１４、カテゴリー分類モジュール２２０、分割モジュール２３０及び出力モジュール２４０を含みうる。例示的実施形態によれば、入力２１２は、例えば細胞画像、例えば顕微鏡から得た、コントラストをストレッチした細胞画像であってよい。例示的実施形態によれば、分割モジュール２３０は、境界及び分散に基づく分割モジュール２３２及びＬｏＧ（Ｌａｐｌａｃｉａｎ  ｏｆ  Ｇａｕｓｓｉａｎ）フィルター処理に基づく分割モジュール２３４を含みうる。出力２４０は、細胞境界２４２を含む出力画像及び／又は細胞数２４４を含みうる。
【００１２】
例示的実施形態によれば、入力モジュール２１０、前処理モジュール２１４、カテゴリー分類モジュール２２０、分割モジュール２３０及び出力モジュール２４０は、メモリ、プロセッサ、オペレーティング・システム及び／又はソフトウェア及び／又は任意のグラフィカル・ユーザー・インターフェース（ＧＵＩ）及び／又はディスプレイを有する、１つ又はそれ以上のコンピュータ又は処理装置を含みうる。例示的実施形態によれば、例えば、各モジュール２１０、２１４、２２０、２３０、２４０は、１つのコンピュータ装置、例えば独立型コンピュータに組み合わせることができ、あるいは、それぞれメモリ、プロセッサ、オペレーティング・システム及び／又はソフトウェア、並びにグラフィカル・ユーザー・インターフェース（ＧＵＩ）又はディスプレイを有する１つ又はそれ以上のコンピュータ装置に含まれていてもよい。例えば、グラフィカル・ユーザー・インターフェースは、本明細書に開示される細胞画像及び／又は細胞数の表示に用いることができる。
【００１３】
（前処理モジュール）
例示的実施形態によれば、前処理モジュール２１４は、入力された細胞画像にバイナリマスク２１６を行うことができ、これにより背景から前景の細胞を分離される。例示的実施形態によれば、生成されるマスク（つまりバイナリマスク）は、様々な方法、例えば閾値処理、Ｋ平均法とそれに続く閾値処理、及び／又は機械学習法を用いて生成することができる。図３Ａ及び３ｂは、入力画像２１２と、前処理モジュール２１４を用いて生成された対応するマスク２１６とを示す図である。
【００１４】
（カテゴリー分類）
例示的実施形態によれば、カテゴリー分類モジュール２２０は、入力マスク２１６を用いて、細胞領域要素２２２を以下の３つのカテゴリーのうちの１つに分類する。
１．単一細胞２２４
２．小クラスター領域２２６
３．大クラスター領域２２８
【００１５】
図４は、例示的実施形態に係る細胞カテゴリー分類システム４００のブロック図である。図４に示すように、マスク画像２１６中に存在する各閉輪郭について、カテゴリー分類モジュール２２０は、輪郭４１０に存在する全ての陥凹点を検出し、陥凹点数及び輪郭面積４２０に対する包部（ｈｕｌｌ）面積の比に基づいて、マスク画像が単一細胞２２４、小クラスター領域２２６又は大クラスター領域２２８であるかどうかを判定する。
【００１６】
例示的実施形態によれば、例えば、陥凹点は、以下のアルゴリズムに基づいて検出することができる。
・全てのｎ番目の点を輪郭から選択することにより輪郭を近似する。ｎ値は、輪郭境界に存在するノイズ量に基づいて求めることができる。
・Ｙ及びＺに隣接する各Ｘ点について、ベクトルＸＹ及びＸＺの外積を算出する。
・（外積（ＸＹ，ＸＺ）＜０）且つ（角度（ＸＹ，ＸＺ）＜閾値）である場合、Ｘは陥凹点である。
・陥凹点が検出されれば、例えば、例示的実施形態によれば、包線（ｈｕｌｌ）からの深さ又は距離や２つの推定陥凹点間の最短距離等の１つ又はそれ以上の制約を追加することができる。
【００１７】
図５は、上記の陥凹点検出からの出力５００の一例を示す図であり、輪郭５１０、輪郭の凸包５２０及び検出された陥凹点５３０が表示されている。更に、図５に示すように、出力５００は、単一細胞２２４、小クラスター領域２２６及び大クラスター領域２２８を含んでいてもよい。
【００１８】
例示的実施形態によれば、凸包及び陥凹点が検出されれば、例えば、以下の３つの特徴（図４）に基づいて、輪郭を、図６に示すように単一細胞２２４、小クラスター領域２２６及び大クラスター領域２２８に分離することができる。
・輪郭中の陥凹点数４２０
・輪郭面積／包線面積の比４３０
・細胞のレイアウト又は直線配列４４０（これには、マスク内の陥凹点情報を検出できない密集したクラスターを不適格とすることが含まれる。）
【００１９】
（分割）
（小クラスターの境界及び分散に基づく分割）
例示的実施形態によれば、小クラスター領域２２６を分割するためには、境界形状情報及び画像輝度から得られる分散画像を用いた方法が開示される。図７は、例示的実施形態に係る境界及び分散に基づく分割のフローチャート７００である。
【００２０】
（分散画像）
例示的実施形態によれば、ステップ７１０において、入力されたコントラストをストレッチした画像７０２は、分割モジュール２３２によって受け取られ、入力画像７０２から分散画像が生成される。例示的実施形態によれば、エッジ分散画像を用いる理由は、この画像では、実際の画像を用いる場合と比べてエッジが顕著であり、そのため正しい最短パスを発見できる可能性がより高いためである。エッジ分散は、局所においてエッジの強度を評価するための手段である。
【００２１】
例示的実施形態によれば、以下のフィルターをエッジ分散画像の生成に用いることができる：
【数１】
0006710135.tif 000002
式中、Ｎは３ｘ３の近傍系、ＩｃはＮの中心ピクセルの輝度、ＩｉはＮのピクセルｉの輝度、ｗはピクセルｉと中心ピクセルｃとの距離の逆数を表す。図８Ａ及び８Ｂは、それぞれ入力画像８１０及びそれに対応する分散画像８２０の一例である。
【００２２】
（最も見込みある欠陥ペアの検索）
欠陥の数が１を超える場合、分割境界となる最も見込みある欠陥ペアを見つけることができる。例示的実施形態によれば、ステップ７２０において、各欠陥ペアのユークリッド距離を求め、ステップ７３０において、最も距離の短いペアを同定する。
【００２３】
更に、ペアを形成する前に、ステップ７２４において、欠陥がどちらも輪郭の「同じ側」にあるかどうかを確認する試験を行うことができる。例えば、図９Ａ及び９Ｂは、それぞれ欠陥の有効ペア９１０及び欠陥の無効ペア９２０を示す図であって、有効ペアと無効ペアを区別する方法を示しており、どのようにして複数の欠陥から最も見込みあるペアを見つけ出すことのできるかを示している。例示的実施形態によれば、例えば、有効ペア（図９Ｂ）では、欠陥及びその包線への投影からの各ベクトルが、逆方向に向いている。一方、無効ペア（図９Ａ）では、各ベクトルが同じ方向に向いている。ステップ７５０において、欠陥が最短パスではないことが判明した場合、当該ペアの２点は、リストから削除することができる。
【００２４】
例えば、図１０に示すように、距離（Ｄ２、Ｄ３）は、距離（Ｄ１、Ｄ３）よりも短いが、（Ｄ２、Ｄ３）は「無効」な欠陥ペアであるため、ペアとして選択されない。ステップ７３０において、ペア（Ｄ１、Ｄ３）及びペア（Ｄ１、Ｄ２）からは、例えば、最も見込みあるペアとしてペア（Ｄ１、Ｄ３）が選択される。これは、そのユークリッド距離が、ペア（Ｄ１、Ｄ３）及びペア（Ｄ１、Ｄ２）のうちで最も短いからである。
【００２５】
（第２の欠陥点の導入）
例示的実施形態によれば、ステップ７４０において、ペアとなる第２の欠陥を導入して、２つの欠陥間の最短パスを求めることができる。
・欠陥が１つだけ残る１１１０、１１２０（例えば、図１１のケース１１．１及びケース１１．２）；又は
・全ての欠陥が輪郭の「同じ」側に存在し、有効ペアが存在しない１１３０（例えば、図１１のケース１１．３）
【００２６】
例示的実施形態によれば、第２の欠陥は、境界（輪郭境界又は分割境界）上であって、欠陥点及びその包線への投影により作られる直線上の点である。図１１は、第２の欠陥を見つける方法の例示的実施形態を示す。例えばケース１１．１の場合、１つの境界欠陥Ｄ２を輪郭境界上に導入することができ、ペア（Ｄ１、Ｄ２）を形成する。あるいは、例えばケース１１．２の場合、１つの欠陥Ｄ４を分割境界に導入することができ、ペア（Ｄ３、Ｄ４）を形成する。ケース１１．３の場合、複数の欠陥Ｄ３、Ｄ４を導入することができ、それぞれペア（Ｄ１、Ｄ３）及びペア（Ｄ２、Ｄ４）を形成する。
【００２７】
（２つの欠陥間の最短パスの検索）
例示的実施形態によれば、有効な欠陥ペアが見つかれば、最短パスアルゴリズムを用いて２つの欠陥間のパス７２０を求めることができ、これは２つの欠陥間の実際のエッジに一致する。
【００２８】
例示的実施形態によれば、図１２に示すように、注目領域（ＲＯＩ）を画像の分散画像から抽出して、最短パスを求めることができる。注目領域（ＲＯＩ）は、注目領域の向きが縦向きとなり、最短パスの始点（欠陥の１つ）が矩形の中心となるように回転させることができる。
【００２９】
図１２は、注目領域（ＲＯＩ）の抽出及び回転の一例を示す図である。ＲＯＩが抽出されれば、始点から最短パスアルゴリズムを開始し、次のレイヤー（この場合、次の列）に横断して、推定されるパスの次の点を見つけ出す。次のレイヤーからは、パスのコストが最小となるのであればどの点でもパスの次の点として選択することができる。
【００３０】
パスＰは、一連の点の配列（ｐ１、ｐ２・・・ｐｉ・・・ｐｍ）として定義することができ、ｐ１は常に欠陥点である。更に、ある欠陥から別の欠陥へ到達する完全なパスが望ましいことから、第２の欠陥は、パスＰの最終点である。ｐｉは、パスＰのｉ番目レイヤーの点である。
【００３１】
コスト関数は、以下のように定義することができる。
【数２】
0006710135.tif 000003
式中、Ｃ０は目的項、Ｃ１は制約項を表し、例えば、Ｃ１は、現在の点（ｐｉ）から次の点（ｐｉ＋１）が列としてどの程度離れていてもよいかを決定する。
【数３】
0006710135.tif 000004
Ｃ０は、ｉ番目のレイヤーの分散画像の輝度値及び前の点のコスト値から算出される。点ｐｉ＋１は、最低コストに基づき選択することができ、既存のパスＰに追加される。
【００３２】
図１３は、元画像１３１０を分割結果１３２０と比較した境界−分散分割の結果、並びに、最も見込みある欠陥ペアおよび当該欠陥ペア間の最短パスの検索により生成された結果の一例を示す図である。
【００３３】
更に、境界によって細胞が分割されることから、マスクに分割境界を重ね合わせた画像に収縮処理（ｅｒｏｓｉｏｎ）を行うことができ、これにより個々の細胞が分離されて、結合要素の数から細胞数を得ることができる。
【００３４】
（ＬｏＧ（Ｌａｐｌａｃｉａｎ  ｏｆ  Ｇａｕｓｓｉａｎ）フィルターに基づく大クラスターの分割）
例示的実施形態によれば、マスク画像から大クラスター領域２２８が検出されれば、当該大クラスター領域２２８は、大クラスター用の分割モジュールに送られる。大クラスター領域の細胞分割には、テクスチャに基づく分割、例えば汎用ラプラシアンガウシアン（ｇＬｏＧ）等のｂｌｏｂ検出法を用いることができる。
【００３５】
（複数のスケールによるＬｏＧフィルター処理）
例示的実施形態によれば、ｇＬｏＧフィルター処理に基づく分割を図１４に示す。例示的実施形態によれば、ステップ１４１０において、細胞分割境界は、細胞核のみが処理に供され、且つ背景が存在しないように、入力マスクを用いて入力グレースケール画像を抽出することによって求めることができ、これを画像ＩＮと呼ぶ。
【００３６】
ステップ１４２０において、画像ＩＮを、複数のスケール及び方向によるラプラシアンガウシアン（ＬｏＧ）フィルター処理を用いて処理する。ＬｏＧフィルターは、以下のように定義することができる。
【数４】
0006710135.tif 000005
式中、σはスケール値又はフィルターサイズ、Ｇ（ｘ，ｙ；σ）はサイズσ及び０平均のガウシアンフィルターを表す。複数のスケールσについて、入力画像ＩＮをフィルター処理する。更に、複数のスケール値σに対する応答を平均化するには、
【数５】
0006710135.tif 000006
式中、σ = [σmin, … , σmax]である。
このフィルターにより、半径ｒ＝σ＊√２のピーク応答を生成することができる。
【００３７】
しかし、上記のＬｏＧは、回転対称性しかないため、例えばsをｘ及びｙ座標で同一に設定しても、上記の等式は、一般的な楕円形の細胞核の検出には限定的である。よって、例示的実施形態によれば、一般的な楕円形の細胞核を検出するには、上記（２）式のＬＯＧ（Ｘ，Ｙ；σ）をＧＬＯＧ（Ｘ，Ｙ；σＸ，σＹ，θ）で置き換えた、汎用ラプラシアンガウシアン（ＧＬＯＧ）フィルターを用いることができる。
【００３８】
ガウスカーネルの一般形は、次のように表すことができる。
【数６】
0006710135.tif 000007
式中、Ｃは正規化係数、ｘ０及びｙ０はカーネルの中心を表し、ａ、ｂ及びｃはカーネルの形状及び方向を示す係数を表し、以下のようにσｘ、σｙ及びθの平均から求めることができる。
【数７】
0006710135.tif 000008
【００３９】
例示的実施形態によれば、単純化すると、ｘ０及びｙ０は零とすることができる。したがって、５Ｄガウスカーネルは、以下のようになる。
【数８】
0006710135.tif 000009
【００４０】
例示的実施形態によれば、汎用ラプラシアンガウシアン（ｇＬｏＧ）は、以下のように表すことができる。
【数９】
0006710135.tif 000010
【００４１】
複数のスケール及び方向に対する応答を平均化するには、上記（２）式を一般形で表すことができる。
【数１０】
0006710135.tif 000011
式中、σx ∈ [σxmin, … , σxmax]、σy ∈ [σymin, … , σymax]、及びθ ∈ [0, 45°, 90°, 135°]である。
【００４２】
（応答曲面）
異なるスケールにより複数回フィルター処理された画像が得られれば、ステップ１４３０において、距離マップＤＮを制約係数として用いて、これらのフィルター処理の結果を以下の等式により表される単一画像にまとめることにより、単一の応答曲面を得ることができる。したがって、汎用ＬｏＧに対する応答は、以下のように表すことができる。
【数１１】
0006710135.tif 000012
式中、σx∈ [σxmin, σxmax]、σy ∈ [σymin, σymax]、θ = [0, … , 135°] であり、以下のとおりである。
σxmax = max {σxmin, min{σxmax, 2DN(x, y)}}      （６）
σymax = max {σymin, min{σymax, 2DN(x, y)}}      （７）
【００４３】
図１５Ａ及び１５Ｂは、ステップ１４３０による応答曲面の一例を、画像１５１０及び曲面プロット１５２０として示す図である。
【００４４】
（シード検出）
ステップ１４４０において、応答曲面ＲＮから極大を検出して初期シードを生成することができ、これらは核の中心であるか、又は少なくとも核の中心らしいものである。初期シードの位置を、極大に基づくクラスター化アルゴリズムへと送り、より正確な細胞境界を得るために細胞ピクセルのクラスター化をリファイン（ｒｅｆｉｎｅ）することができる。
【００４５】
（極大のクラスター化）
例示的実施形態によれば、ステップ１４５０において、入力グレースケール画像に極大のクラスター化を行い、クラスターの中心又はシード点となるピクセルを確実に指定する一助とすることができる。
【００４６】
解像度パラメータｒは、各ピクセルの周囲に、最も近接し且つ最も一致するシード点を探索するための２ｒ×２ｒの領域を定義する。極大クラスター化アルゴリズムは、以下のステップとして説明することができる。
（ｉ）各シード点について、その周囲２ｒ×２ｒのピクセルとクラスター中心（シード点）との輝度差が閾値未満である場合は、当該ピクセルにシード点と同一のクラスターラベルを付す。
（ｉｉ）以下の場合は、２つのクラスターを１つのクラスターに結合する。
・２つのシード点間の距離が、解像度パラメータｒ未満である場合。
・２つのシード点の輝度差が閾値未満である場合。
（ｉｉｉ）併合したクラスターには同一のクラスターラベルを付し、どちらのシード点からも極大となる新たなシード点を求める。
ｉｖ．シード点が変更される場合は、ステップ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を繰り返す。
【００４７】
例示的実施形態によれば、局所的な極大のクラスター化の後、ステップ１４６０において、不要な余分のシードを除去し、ピクセルに適切なクラスターラベルを付す。中間結果の例を図１６に示す。図１６に示すように、前段階からの極大（ピーク）１６１０、初期クラスターラベル１６２０、中間状態の更新クラスターラベル１６３０及びクラスター化後のピーク変更１６４０である。
【００４８】
クラスター境界は細胞境界であるから、細胞分割の結果を、例えば図１７に見ることができる。図１７に示すように、プロセスには、以下の段階が含まれうる：入力１７１０、マスク１７２０、エッジ分割１７３０、クラスター化前のピーク１７４０、クラスター化後のピーク１７５０。
【００４９】
（細胞数の出力）
（単一細胞画像における細胞の計数）
単一細胞画像（又は単一細胞領域）については、例示的実施形態によれば、細胞の総数は、バイナリマスクから、結合要素の総数に基づいて得ることができる。
【００５０】
（小クラスター領域における細胞の計数）
小クラスター領域の輪郭形状に基づく分割法、例えば小クラスター領域用の境界−分散に基づく分割法を用いることができ、細胞は分割境界によって明確に分離される。例示的実施形態によれば、マスクに分割境界を重ね合わせた画像に対してモルフォロジー収縮／膨張（ｅｒｏｓｉｏｎ／ｄｉｌａｔｉｏｎ）を行い、個々の細胞を分離することで、結合要素の数から細胞数を得ることができる。
【００５１】
（大クラスター領域の計数のためのＬｏＧフィルター処理に基づく分割）
ＬｏＧフィルター処理により、細胞の大クラスター中の細胞核が検出され、検出された核は、さらにウォーターシェッド分割法やレベルセット分割法等の何らかの領域分割法のシードとして用いることができ、これによりクラスターが個々の細胞に分離されて、結合要素の数から細胞数を得ることができる。
【００５２】
ラベルされたクラスターの総数から、全細胞の数を得ることができる。よって、例示的実施形態によれば、
細胞数
＝単一細胞マスクにおける、結合要素ラベルの総数
＋改良小クラスターマスクにおける、結合要素ラベルの総数
＋極大クラスター化アルゴリズムにおける、クラスターラベルの総数、となる。
式中、改良小クラスターマスク＝モルフォロジー（小クラスターマスク＋分割境界）である。
【００５３】
例示的実施形態によれば、細胞分割のためのコンピュータ読み取り可能なコードを格納するコンピュータプログラムを収めた、非一時的なコンピュータ読み取り可能な媒体が開示され、前記プログラムはコンピュータにより実行可能であり、
当該コンピューターに、
複数の細胞に係る入力画像からバイナリマスクを生成することであって、前記バイナリマスクは背景から前景の細胞を分離することと、
前記バイナリマスクの各細胞領域を、単一細胞領域、小クラスター領域及び大クラスター領域に分類することと、
前記小クラスター領域のそれぞれに、当該小クラスター領域の輪郭形状に基づく分割を行うことと、
前記大クラスター領域のそれぞれに、当該大クラスター領域中のテクスチャに基づく分割を行うことと、
細胞境界を含む画像を出力すること、
を有するプロセスを実行させるプログラムである。
【００５４】
コンピュータ読取り可能な記録媒体は、磁気的記録媒体、光磁気記録媒体又は将来開発されるその他のあらゆる記録媒体であってよく、これらはすべて同じようにして本発明に適用可能であると考えてよい。一次及び二次複製品並びにその他を含め、このような媒体の複製は、疑義なく上記媒体と等価であるとみなされる。さらに、本発明の実施形態がソフトウェアとハードウェアの組み合わせであった場合でも、本発明の概念から逸脱するものでは全く無い。本発明は、そのソフトウェア部分が事前に記録媒体に書き込まれており、動作の際に必要に応じて読み取られることで実施されてもよい。
【００５５】
本発明の範囲又は精神から逸脱しない限り、本発明の構造に様々な改良及び変更を加えうることは、当業者にとって明白であろう。以上より、以下のクレーム及びその均等の範囲内である限り、本発明には、本発明の改良例や変形例も包含されるものとする。
【図１】
0006710135.tif 000019
【図２】
0006710135.tif 000020
【図３Ａ】
0006710135.tif 000021
【図３Ｂ】
0006710135.tif 000022
【図４】
0006710135.tif 000023
【図５】
0006710135.tif 000024
【図６】
0006710135.tif 000025
【図７】
0006710135.tif 000026
【図８Ａ】
0006710135.tif 000027
【図８Ｂ】
0006710135.tif 000028
【図９Ａ】
0006710135.tif 000029
【図９Ｂ】
0006710135.tif 000030
【図１０】
0006710135.tif 000031
【図１１】
0006710135.tif 000032
【図１２】
0006710135.tif 000033
【図１３】
0006710135.tif 000034
【図１４】
0006710135.tif 000035
【図１５Ａ】
0006710135.tif 000036
【図１５Ｂ】
0006710135.tif 000037
【図１６】
0006710135.tif 000038
【図１７】
0006710135.tif 000039