(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なるデングウイルス血清型と反応性である抗体により認識されるエピトープ、または
ｉｉ）デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なるデングウイルス血清型由来のタンパク質ドメイン
を導入するアミノ酸置換を含むデングウイルスＥ糖タンパク質主鎖を含むキメラデングウイルスＥ糖タンパク質であって、前記キメラデングウイルスＥ糖タンパク質が、
アミノ酸配列：
【化１】
0006671364.tif 000052
【化２】
0006671364.tif 000053
【化３】
0006671364.tif 000054
または、
【化４】
0006671364.tif 000055
を含む、キメラデングウイルスＥ糖タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項３】
請求項１に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質または請求項２に記載のフラビウイルス粒子またはＶＬＰをコードする単離された核酸分子。
【請求項４】
請求項２に記載のフラビウイルス粒子を含むフラビウイルス粒子の集団。
【請求項５】
請求項１に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質、請求項２に記載のフラビウイルス粒子及び／またはＶＬＰ、請求項３に記載の核酸分子、または請求項４に記載の集団を、薬学的に許容される担体中に含む組成物。
【請求項６】
ｉ）対象にワクチン接種してデングウイルスに対する免疫応答を生じさせる、
ｉｉ）対象においてデングウイルス感染を処置する、
ｉｉｉ）対象においてデングウイルス感染に関連した障害を防止する、または
ｉｖ）デングウイルス感染の影響から対象を保護する
方法における使用のための、請求項１に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質、請求項２に記載のフラビウイルス粒子、請求項２に記載のＶＬＰ、請求項３に記載の核酸分子、請求項４に記載の集団、及び／または請求項５に記載のいずれかの組成物、あるいはそれらの組み合わせ。
【請求項７】
対象由来の生物学的試料においてデングウイルスに対する中和抗体の存在を同定する方法であって、
ａ）請求項１に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質が投与された対象由来の生物学的試料を、前記Ｅ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、および
ｂ）ステップ（ａ）における中和を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルスに対する中和抗体の存在を同定するステップ
を含み、
ｉ）前記中和抗体が、デングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体であり、前記Ｅ糖タンパク質が、配列番号５を含むＥ糖タンパク質である、または
ｉｉ）前記中和抗体が、デングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体であり、前記Ｅ糖タンパク質が、配列番号６を含むＥ糖タンパク質である、または
ｉｉｉ）前記中和抗体が、デングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体であり、前記Ｅ糖タンパク質が、配列番号３または配列番号４を含むＥ糖タンパク質である、
方法。
【請求項８】
対象においてデングウイルスに対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
ａ）請求項１に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物が投与された対象由来の生物学的試料を、前記Ｅ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、
ｂ）前記生物学的試料が、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびに
ｃ）前記生物学的試料が、（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、前記対象においてデングウイルスに対する中和抗体を誘導するものとして前記免疫原性組成物を同定するステップ
を含み、
ｉ）前記中和抗体が、デングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体であり、前記Ｅ糖タンパク質が、配列番号５を含むＥ糖タンパク質である、または
ｉｉ）前記中和抗体が、デングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体であり、前記Ｅ糖タンパク質が、配列番号６を含むＥ糖タンパク質である、または
ｉｉｉ）前記中和抗体が、デングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体であり、前記Ｅ糖タンパク質が、配列番号３または配列番号４を含むＥ糖タンパク質である、
方法。
【請求項９】
試料においてデングウイルスに対する中和抗体を検出する方法であって、
ａ）前記試料を、請求項１に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体を形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
ｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記試料においてデングウイルスに対する抗体を検出するステップ
を含み、
ｉ）前記中和抗体が、デングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体であり、前記Ｅ糖タンパク質が、配列番号５を含むＥ糖タンパク質である、または
ｉｉ）前記中和抗体が、デングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体であり、前記Ｅ糖タンパク質が、配列番号６を含むＥ糖タンパク質である、または
ｉｉｉ）前記中和抗体が、デングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体であり、前記Ｅ糖タンパク質が、配列番号３または配列番号４を含むＥ糖タンパク質である、
方法。
【請求項１０】
前記試料が、請求項１に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物が投与された対象由来の生物学的試料であり、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルスに対する中和抗体を同定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
対象においてデングウイルスに対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
ａ）請求項１に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物が投与された対象由来の生物学的試料を、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
ｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象においてデングウイルスに対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップ
を含み、
ｉ）前記中和抗体が、デングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体であり、前記Ｅ糖タンパク質が、配列番号５を含むＥ糖タンパク質である、または
ｉｉ）前記中和抗体が、デングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体であり、前記Ｅ糖タンパク質が、配列番号６を含むＥ糖タンパク質である、または
ｉｉｉ）前記中和抗体が、デングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体であり、前記Ｅ糖タンパク質が、配列番号３または配列番号４を含むＥ糖タンパク質である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の言明
この出願は、２０１４年１１月２日に出願された米国仮出願第６２／０７４，０５３号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）による恩典を主張し、その仮出願の全内容は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】
政府支援の言明
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与された認可番号ＡＩ  ０５７１５７、ＡＩ  ０９７５６０、ＡＩ  １０７７３１、およびＡＩ  １０９７６１による政府支援で行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、単一の供給源由来の複数のデングウイルス血清型に対する中和抗体を誘導するデングウイルスワクチンを対象とする。
【背景技術】
【０００４】
デングウイルス（ＤＥＮＶ）は、かつてないほどの速さで広がっている蚊媒介性フラビウイルスであり、５０を超える国において、重大な健康的および経済的負荷に発展している。全ての４つのＤＥＮＶ血清型から保護する現在のＤＥＮＶワクチンは、それぞれがその血清型に対する保護を与えることを意図された、４つのウイルスまたは４つの組換えタンパク質の「四価」製剤として送達されなければならない。バランスのとれた抗体応答を達成するための四価カクテルにおける血清型の正しい混合は知られておらず、最も進歩した四価の弱毒化キメラ生ウイルスが、タイにおいて大きな第２Ｂ相試験で臨床的に有意義な保護を提供することに最近、失敗したことにより、浮き彫りにされた（Ｓａｂｃｈａｒｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。１つまたは複数のウイルス血清型がその他の血清型を打ち負かすというウイルス干渉が失敗に寄与すると考えられている。
【０００５】
本発明は、単一の供給源由来の複数のデングウイルス血清型に対する中和抗体を誘導するキメラデングウイルスを提供することにより、当技術分野における前の欠点を克服する。
【発明の概要】
【０００６】
一態様において、本発明は、デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なるデングウイルス血清型と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含むデングウイルスＥ糖タンパク質主鎖を含むキメラデングウイルスＥ糖タンパク質であって、デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖がデングウイルス血清型４由来であり、抗体がデングウイルス血清型３と反応性である、キメラデングウイルスＥ糖タンパク質を提供する。
【０００７】
さらなる態様において、本発明は、デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なるデングウイルス血清型由来のタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含むデングウイルスＥ糖タンパク質主鎖を含むキメラデングウイルスＥ糖タンパク質であって、デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖がデングウイルス血清型４由来であり、タンパク質ドメインがデングウイルス血清型２由来である、キメラデングウイルスＥ糖タンパク質を提供する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なるデングウイルス血清型と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含むデングウイルスＥ糖タンパク質主鎖を含むキメラデングウイルスＥ糖タンパク質であって、前記デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖がデングウイルス血清型２由来であり、抗体がデングウイルス血清型１と反応性である、キメラデングウイルスＥ糖タンパク質を提供する。
【０００９】
対象（例えば、それを必要としている対象）においてデングウイルスに対する免疫応答を生じさせる方法であって、対象に、有効量の、この発明のＥ糖タンパク質、この発明のフラビウイルス粒子、この発明のＶＬＰ、この発明の核酸分子、この発明の集団、および／またはこの発明の組成物、ならびにそれらの任意の組み合わせを投与することを含む方法もまたここに提供される。
【００１０】
追加として、対象（例えば、それを必要としている対象）においてデングウイルス感染を処置する方法であって、対象に、有効量の、この発明のＥ糖タンパク質、この発明のフラビウイルス粒子、この発明のＶＬＰ、この発明の核酸分子、この発明の集団、および／またはこの発明の組成物、ならびにそれらの任意の組み合わせを投与することを含む方法がここに提供される。
【００１１】
さらに、対象（例えば、それを必要としている対象）においてデングウイルス感染に関連した障害を防止する方法であって、対象に、有効量の、この発明のＥ糖タンパク質、この発明のフラビウイルス粒子、この発明のＶＬＰ、この発明の核酸分子、この発明の集団、および／またはこの発明の組成物、ならびにそれらの任意の組み合わせを投与することを含む方法がここに提供される。
【００１２】
追加の態様として、本発明は、デングウイルス感染の影響から対象を保護する方法であって、対象に、有効量の、この発明のＥ糖タンパク質、この発明のフラビウイルス粒子、この発明のＶＬＰ、この発明の核酸分子、この発明の集団、および／またはこの発明の組成物、ならびにそれらの任意の組み合わせを投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、対象由来の生物学的試料において特定的デングウイルス血清型またはその組み合わせ（例えば、４／３、４／２、２／１）に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、ａ）この発明の特定のＥ糖タンパク質を含む組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ｂ）対象由来の生物学的試料を、上記の特定のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、およびｃ）ステップ（ｂ）における中和を検出し、それにより、対象由来の生物学的試料において特定的デングウイルス血清型またはその組み合わせに対する中和抗体の存在を同定するステップを含む方法を提供する。
【００１４】
本発明は、追加として、対象由来の生物学的試料において特定的デングウイルス血清型またはその組み合わせ（例えば、４／３、４／２、２／１）に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、ａ）この発明の特定のＥ糖タンパク質を投与されている対象由来の生物学的試料を、Ｅ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、およびｂ）ステップ（ａ）における中和を検出し、それにより、対象由来の生物学的試料において特定的デングウイルス血清型またはその組み合わせに対する中和抗体の存在を同定するステップを含む方法を提供する。
【００１５】
他の実施形態において、本発明は、対象において特定的デングウイルス血清型またはその組み合わせ（例えば、４／３、４／２、２／１）に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、ａ）この発明の特定のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ｂ）対象由来の生物学的試料を、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、ｃ）生物学的試料が、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、およびｄ）生物学的試料が、（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、免疫原性組成物を、対象において特定的デングウイルス血清型またはその組み合わせに対する中和抗体を誘導するものとして同定するステップを含む方法を提供する。
【００１６】
対象において特定的デングウイルス血清型またはその組み合わせ（例えば、４／３、４／２、２／１）に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、ａ）この発明の特定のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、Ｅ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、ｂ）生物学的試料が、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、およびｃ）生物学的試料が、（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、免疫原性組成物を、対象において特定的デングウイルス血清型またはその組み合わせに対する中和抗体を誘導するものとして同定するステップを含む方法が本明細書においてさらに提供される。
【００１７】
本発明はまた、試料において特定的デングウイルス血清型またはその組み合わせに対する抗体を検出する方法であって、ａ）試料をこの発明の特定のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、およびｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、試料において特定的デングウイルス血清型またはその組み合わせに対する抗体を検出するステップを含む方法を提供する。
【００１８】
追加として、対象由来の生物学的試料において特定的デングウイルス血清型またはその組み合わせに対する抗体を同定する方法であって、ａ）この発明の特定のＥ糖タンパク質を含む組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ｂ）対象由来の生物学的試料を（ａ）のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、およびｃ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を同定するステップを含む方法がここに提供される。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、対象由来の生物学的試料において特定的デングウイルス血清型またはその組み合わせに対する抗体を同定する方法であって、ａ）この発明の特定のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、Ｅ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、およびｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を同定するステップを含む方法を提供する。
【００２０】
本発明は、追加として、対象において特定的デングウイルス血清型またはその組み合わせに対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、ａ）この発明の特定のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、Ｅ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、およびｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、対象において特定的デングウイルス血清型またはその組み合わせに対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップを含む方法を提供する。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態は、対象において特定的デングウイルス血清型またはその組み合わせに対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、ａ）特定のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ｂ）対象由来の生物学的試料を（ａ）のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、およびｃ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、対象において特定的デングウイルス血清型またはその組み合わせに対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップを含む方法である。
【００２２】
この発明のＥ糖タンパク質を含むデングウイルス粒子、フラビウイルス粒子、および／またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）が、追加としてここに提供される。
【００２３】
この発明のＥ糖タンパク質をコードする単離された核酸分子、加えて、この発明のデングウイルス粒子、フラビウイルス粒子、またはＶＬＰをコードする単離された核酸分子もまたここに提供される。
【００２４】
本発明はまた、この発明のＥ糖タンパク質を薬学的に許容される担体中に含む組成物を提供し、この発明の核酸分子、この発明のベクター、この発明の粒子、および／またはこの発明の集団を薬学的に許容される担体中に含む組成物もまた提供する。
【００２５】
本発明はさらに、対象においてデングウイルスに対する免疫応答を生じさせるための薬物の製造における使用のための、デングウイルス感染の処置を、それを必要としている対象において行うための、対象においてデングウイルス感染を防止するための、および／またはデングウイルス感染の影響から対象を保護するための、単独での、または任意の組み合わせでの、この発明のＥ糖タンパク質、この発明のデングウイルス粒子、この発明のフラビウイルス粒子、この発明のＶＬＰ、この発明の核酸分子、この発明のベクター、この発明の集団、および／またはこの発明の組成物を提供する。
【００２６】
対象においてデングウイルスに対する免疫応答を生じさせること、デングウイルス感染の処置を、それを必要としている対象において行うこと、対象においてデングウイルス感染を防止すること、および／またはデングウイルス感染の影響から対象を保護することに用いるための、単独での、または任意の組み合わせでの、この発明のＥ糖タンパク質、この発明のデングウイルス粒子、この発明のフラビウイルス粒子、この発明のＶＬＰ、この発明の核酸分子、この発明のベクター、この発明の集団、および／またはこの発明の組成物の使用もまたここに提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＤＥＮＶ３および４の感染性ｃＤＮＡクローンの設計ならびに組換えＤＥＮＶ４／３ウイルスの作製を示す図である。（Ａ）サブゲノム断片を作製するために用いられる制限エンドヌクレアーゼを含む、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４感染性クローン設計のゲノム概略図。サブゲノム断片のサイズは、細菌の不安定性および毒性を回避するために切断されるＤＥＮＶゲノムにおける位置を示す。（Ｂ）ＤＥＮＶ４  Ｍ１２、Ｍ１４、およびＭ１６、それぞれを作製するためのＤＥＮＶ３配列の移植によりＤＥＮＶ４  Ｅタンパク質において変化したアミノ酸。アミノ酸番号は、ＤＥＮＶ４のＥタンパク質の開始地点からの残基を表す。ＤＥＮＶ４  Ｍ１２（Ｃ；緑色残基）、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４（Ｄ；緑色＋シアン色残基）、およびＤＥＮＶ４  Ｍ１６（Ｅ；緑色＋シアン色＋オレンジ色残基）へ転移されるＡＡが示されている、ＤＥＮＶ３  Ｅタンパク質二量体のリボン構造。色は、（Ｂ）における強調されたＡＡ残基に対応する。
【図２】哺乳類細胞におけるｒＤＥＮＶ４／３の成長特性を示す図である。（Ａ）ＤＥＮＶ３、ＤＥＮＶ４、ＤＥＮＶ４  Ｍ１２、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４、およびＤＥＮＶ４  Ｍ１６をＣ６／３６細胞において、最大の細胞病理が観察されるまで（典型的には、接種から４日後）増殖させ、ベロ−８１細胞における力価測定のために収集した。感染力価は、ｆｆｕ／ｍｌ細胞培養上清として表されている。（Ｂ）ベロ−８１細胞におけるＷＴウイルスおよびｒＤＥＮＶウイルスの感染巣サイズおよび形態。
【図３】節足動物細胞におけるｒＤＥＮＶ４／３の成長特性を示す図である。（Ａ）ＭＯＩ＝０．０１でＣ６／３６細胞において接種されたＤＥＮＶ３、ＤＥＮＶ４、ＤＥＮＶ４  Ｍ１２、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４、およびＤＥＮＶ４  Ｍ１６の多段階成長曲線分析。細胞培養上清を、記載されているように、Ｃ６／３６細胞において力価測定した。（Ｂ）Ｃ６／３６細胞におけるＷＴおよびｒＤＥＮＶの感染巣サイズおよび形態。
【図４】ｒＤＥＮＶ４／３におけるｈｍＡｂ  ５Ｊ７の結合および中和を示す図である。（Ａ）ＤＥＮＶ３、ＤＥＮＶ４、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４、およびＤＥＮＶ４  Ｍ１６におけるＤＥＮＶ３特異的ｈｍＡｂ  ５Ｊ７についてのＥＬＩＳＡ  ＯＤ値。５Ｊ７は、ＤＥＮＶ４  Ｍ１２と結合せず、ＷＴ  ＤＥＮＶ４と同一の曲線を示した（データ未呈示）。ＤＥＮＶ３、ＤＥＮＶ４、ＤＥＮＶ４  Ｍ１２、Ｍ１４、およびＭ１６についてのベロ−８１（Ｂ）およびＵ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ（Ｃ）における中和アッセイ。データは、ウイルス感染力の５０％を中和するのに必要とされるμｇ／ｍｌとして示されている。
【図５】ポリクローナルＤＥＮＶ３血清中和を示す図である。（Ａ〜Ｄ）一次ＤＥＮＶ３感染から回復したヒトドナーから収集された血清を、ベロ−８１細胞においてＤＥＮＶ３、ＤＥＮＶ４、ＤＥＮＶ４  Ｍ１２、およびＤＥＮＶ４  Ｍ１４に対してアッセイして、ＤＥＮＶ３体液性免疫応答に対する感受性を評価した。（Ｅ〜Ｇ）一次ＤＥＮＶ３感染から回復したヒトドナーから収集された血清を、Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞においてＤＥＮＶ３、ＤＥＮＶ４、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４、およびＤＥＮＶ４  Ｍ１６に対してアッセイして、ＤＥＮＶ３体液性免疫応答に対する感受性を評価した。
【図６】ポリクローナルＤＥＮＶ４血清中和を示す図である。（Ａ）一次ＤＥＮＶ４感染から回復したヒトドナーから収集された血清を、ベロ−８１細胞においてＤＥＮＶ３、ＤＥＮＶ４、ＤＥＮＶ４  Ｍ１２、およびＤＥＮＶ４  Ｍ１４に対してアッセイして、ＤＥＮＶ４体液性免疫応答に対する感受性を評価した。（Ｂ〜Ｄ）一次ＤＥＮＶ４感染から回復したヒトドナーから収集された血清を、Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞においてＤＥＮＶ３、ＤＥＮＶ４、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４、およびＤＥＮＶ４  Ｍ１６に対してアッセイして、ＤＥＮＶ４体液性免疫応答に対する感受性を評価した。
【図７】ヘテロタイプ血清中和を示す図である。（Ａ、Ｂ）一次ＤＥＮＶ１感染から回復したヒトドナーから収集された血清を、ベロ−８１細胞においてＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ３、ＤＥＮＶ４  Ｍ１２、およびＤＥＮＶ４  Ｍ１４に対してアッセイして、非特異的体液性免疫応答に対する感受性を評価した。（Ｃ、Ｄ）一次ＤＥＮＶ２感染から回復したヒトドナーから収集された血清を、ベロ−８１細胞においてＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３、ＤＥＮＶ４  Ｍ１２、およびＤＥＮＶ４  Ｍ１４に対してアッセイして、ＤＥＮＶ４体液性免疫応答に対する感受性を評価した。
【図８】ＤＥＮＶ１および２の感染性ｃＤＮＡクローンの設計ならびに組換えＤＥＮＶ２／１ウイルスの作製を示す図である。（Ａ）サブゲノム断片を作製するために用いられる制限エンドヌクレアーゼを含む、ＤＥＮＶ１およびＤＥＮＶ２感染性クローン設計のゲノム概略図。サブゲノム断片のサイズは、細菌の不安定性および毒性を回避するために切断されたＤＥＮＶゲノムにおける位置を示す。（Ｂ）ＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅを作製するためのＤＥＮＶ１配列の移植によりＤＥＮＶ２  Ｅタンパク質において変化したアミノ酸。アミノ酸番号は、ＤＥＮＶ２のＥタンパク質の開始地点からの残基を表す。（Ｃ）ＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅへ転移されるＡＡを有するＤＥＮＶ２  Ｅタンパク質二量体のリボン構造。
【図９】ｒＤＥＮＶ２／１の成長特性を示す図である。ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、およびＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅを、Ｃ６／３６細胞上で、最大細胞病理が観察されるまで（典型的には、接種から４日後）増殖させ、ベロ−８１細胞（Ａ）またはＣ６／３６細胞（Ｂ）における力価測定のために収集した。感染力価は、ｆｆｕ／ｍｌ細胞培養上清として表されている。（Ｃ）Ｃ６／３６細胞にＭＯＩ＝０．０１で接種されたＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、およびＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅの多段階成長曲線分析。細胞培養上清を、記載されているように、Ｃ６／３６細胞において力価測定した。（Ｄ）Ｃ６／３６細胞におけるＷＴウイルスおよびＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅウイルスの感染巣サイズおよび形態。
【図１０】ｒＤＥＮＶ２／１におけるｈｍＡｂ  １Ｆ４の結合および中和を示す図である。（Ａ）ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、およびＤＥＮＶ２−１Ｆ４ＥにおけるＤＥＮＶ１特異的ｈｍＡｂ  １Ｆ４についてのＥＬＩＳＡ  ＯＤ値。ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、およびＤＥＮＶ２−１Ｆ４ＥについてのＣ６／３６（Ｂ）およびＵ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ（Ｃ）における中和アッセイ。データは、ウイルス感染力の５０％を中和するのに必要とされるμｇ／ｍｌとして表されている。
【図１１】ポリクローナルＤＥＮＶ１およびＤＥＮＶ２血清中和を示す図である。（ＡおよびＢ）一次ＤＥＮＶ１感染から回復したヒトドナーから収集された血清を、Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞においてＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、およびＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅに対してアッセイして、ＤＥＮＶ１体液性免疫応答に対する感受性を評価した。（Ｃ〜Ｅ）一次ＤＥＮＶ２感染から回復したヒトドナーから収集された血清を、Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞においてＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、およびＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅに対してアッセイして、ＤＥＮＶ２体液性免疫応答に対する感受性を評価した。
【図１２】マウス生存を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６背景におけるインターフェロンα／β／γ欠損マウスに、３．３×１０６ｆｆｕ  ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、またはＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅを腹腔内に接種した。マウスを、５６日間、体重減少および臨床的病気についてモニターした。
【図１３】ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２ウイルスの設計および構築を示す図である。（Ａ）ＤＥＮＶ２およびＤＥＮＶ４の直鎖状エンベロープドメインＩＩＩ（ＥＤＩＩＩ）配列（全Ｅ配列の残基２９６〜３９５（合計９９ａａ））のアミノ酸アラインメント。ＤＥＮＶ２とＤＥＮＶ４の間で異なる残基は灰色で強調されている。ＤＥＮＶ３由来のＥＤＩＩＩを含有する組換えＤＥＮＶ４ウイルス、ｒＤＥＮＶ４／２は、ＤＥＮＶ４由来の異なる残基を、明るい灰色で強調された、ＤＥＮＶ２由来の残基と置き換えている。（Ｂ）ＤＥＮＶ２  Ｅタンパク質二量体のカートーン型（左）および空間充填型（右）結晶構造モデル。交換された残基は色づけされている。（Ｃ）ＤＥＮＶゲノムを操作するための逆遺伝学系、上＝ＤＥＮＶ２、下＝ＤＥＮＶ４。ＤＥＮＶゲノムは４つのプラスミドカセットへ分割され、そのプラスミドカセットは、個々に突然変異させ、合わせてライゲーションし、細胞へ電気穿孔して、組換えウイルスを生じることができる。ＤＥＮＶ４−Ａカセットは、エンベロープ遺伝子を含有し、ＥＤＩＩＩは灰色で強調されている。ＤＥＮＶ４主鎖においてＥＤＩＩＩ残基をＤＥＮＶ２由来のそれらで置き換えることにより、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２ウイルスが生じる。
【図１４】ＤＥＮＶおよびＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２ビリオンは類似した成熟プロフィールを有することを示す図である。ウイルスをＣ６／３６細胞において成長させ、培養上清を収集し、遠心分離していかなる細胞片も除去した。試料を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流し、ブロットを、抗Ｅ抗体（４Ｇ２）および抗ＰｒＭ抗体（２Ｈ１２および５Ｌ２０）で探索した。ＤＥＮＶ２は実質的レベルのＰｒＭが存在し、不完全なフューリンプロセシングまたはＰｒＭ解離のいずれかを示している。ＰｒＭバンドは、ＤＥＮＶ４試料またはＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２試料のいずれにおいても検出できない。
【図１５】ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は親ウイルスと比較してベロ細胞において２ｌｏｇの成長減弱を生じることを示す図である。（Ａ）ベロ−８１細胞を、ＭＯＩ＝０．０１で感染させた。ウイルス上清を２４時間ごとに収集し、その後、ベロ−８１細胞において力価測定した。（Ｂ）ＤＥＮＶはベロ−８１細胞において感染巣を形成する（ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ４、およびＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２をそれぞれ、感染から５日後、４日後、および６日後、固定した）。ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２病巣は、どちらの親ウイルスよりも小さい。
【図１６】ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２はＣ６／３６細胞において成長減弱を生じないことを示す図である。（Ａ）Ｃ６／３６細胞を、ＭＯＩ＝０．０１で感染させた。ウイルス上清を２４時間ごとに収集し、その後、Ｃ６／３６細胞において力価測定した。（Ｂ）ＤＥＮＶはＣ６／３６細胞において感染巣を形成する（ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ４、およびＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２をそれぞれ、感染から４日後、３日後、および５日後、固定した）。さらに何日間かの成長で、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２病巣は親ウイルスに匹敵するサイズに達する。
【図１７】型特異的ＤＥＮＶ２ヒトＭＡｂによるＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２の結合および中和の転移を示す図である。（Ａ）四次エピトープと結合する強中和性ＤＶ２  ＭＡｂであるヒトＭＡｂ  ２Ｄ２２の概要の表。（Ｂ）以前に作製された２Ｄ２２エスケープ突然変異体は、ＥＤＩＩＩに位置する１つのエスケープ突然変異、Ｒ３２３Ｇを生じた。（Ｃ）ＥＬＩＳＡアッセイにより、親ＤＶ４のレベルより上であるが、ＤＶ２レベルには達していない、２Ｄ２２のＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２との転移された部分的結合が、示されている。（Ｄ）交差反応性対照抗体２Ｊ２０のＥＬＩＳＡ結合は、存在し、かつウイルスの構造的完全性を維持したウイルスが同等レベルであることを示している。（Ｅ）ベロ−８１に基づいた病巣低下中和試験（ＦＲＮＴ）を、２Ｄ２２を用いて実施し、ＦＲＮＴ５０（感染の５０％を中和するのに必要とされる抗体の濃度）値を計算した。（Ｆ）Ｕ９３７＋ＤＣ−ＳＩＧＮに基づいた中和アッセイ（Ｎｅｕｔ）を、２Ｄ２２を用いて実施し、Ｎｅｕｔ５０値を計算した。両方のアッセイ（Ｅ、Ｆ）において、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は、２Ｄ２２による中和を、ＤＶ２より高いレベルで獲得した。ＤＶ４は、いずれのアッセイにおいても、２Ｄ２２の最高濃度で中和されなかった。
【図１８】ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２が、多くの追加のＤＶ２型特異的ＭＡｂによる中和を獲得したことを示す図である。（Ａ、Ｂ、Ｅ）エスケープ突然変異体または（表２からの）アラニンスキャニング突然変異残基、それぞれ、ＤＶＣ３．７について残基３８２、ＤＶＣ１０．１６について残基３１１、ならびにＤＶＣ１３．６について残基１０１および１０８が示されている、ＤＥＮＶ  Ｅタンパク質二量体結晶構造。（Ｃ、Ｄ、Ｆ〜Ｉ）各ＭＡｂについてのベロ−８１  ＦＲＮＴアッセイ。３Ｆ９を例外として、示されたＭＡｂによるＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２中和が、親ＤＶ２ウイルスのレベルの同等以上のレベルで転移された。３Ｆ９は、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２と結合しない（ＥＬＩＳＡ結合データは未呈示）。
【図１９】ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２はＤＶ４型特異的ＥＤＩＩＩ  ＭＡｂにより中和されないことを示す図である。（Ａ）（表２からの）アラニンスキャニング突然変異残基が残基３３１および３６１に示されている、ＤＥＮＶ  Ｅタンパク質二量体結晶構造。（Ｂ）ベロ−８１  ＦＲＮＴアッセイにより、ＤＶ−Ｅ８８は、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２もＤＶ２も中和する能力がないが、親ＤＶ４を中和することができることが示されている。
【図２０】ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は、ポリクローナルＤＥＮＶ２免疫血清による中和を獲得したことを示す図である。（Ａ〜Ｌ）ベロ−８１  ＦＲＮＴアッセイにより、ＤＶ２中和のレベルに匹敵する、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２に対するポリクローナル免疫血清中和の獲得が示されており、ＥＤＩＩＩのＤＶ２からＤＶ４への転移が、ＤＥＮＶ２中和の大部分を転移するのに十分であることを示している。＊＝ＦＲＮＴ５０＜２０
【図２１】ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は、ポリクローナルＤＥＮＶ４免疫血清による中和を維持したことを示す図である。（Ａ〜Ｆ）ベロ−８１  ＦＲＮＴアッセイにより、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２が大部分の中和を維持することが示され、ＤＶ２由来のＥＤＩＩＩの転移が、ＤＶ４中和エピトープを破壊しないことを示している。＊＝ＦＲＮＴ５０＜２０
【図２２】ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２はＤＶ２血清中和を獲得し、かつＤＶ４血清中和を保存することを示す図である。（Ａ）図１９に提示されたＤＶ２ポリクローナル中和データの概要。（Ｂ）図２０に提示されたＤＶ４ポリクローナル中和データの概要。ＦＲＮＴ５０＜２０を有する試料は１９の血清希釈係数にグラフ化されている。
【図２３】ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は、ヘテロタイプのポリクローナル免疫血清による中和を獲得しないことを示す図である。ベロ−８１  ＦＲＮＴアッセイにより、親ＤＶ２またはＤＶ４中和価のいずれよりも上の、ヘテロタイプの（Ａ）ＤＥＮＶ１または（Ｂ）ＤＥＮＶ３ポリクローナル免疫血清による中和の獲得はないことが示されている。ＦＲＮＴ５０＜２０を有する試料は１９の血清希釈係数にグラフ化されている。
【図２４】ｒＤＥＮＶ４／２ウイルスの設計および構築を示す図である。（Ａ）ＤＥＮＶ２（右）由来の残基を、ＤＥＮＶ４主鎖へ移動させて、組換えＤＥＮＶ４／２ウイルス（ｒＤＥＮＶ４／２）を生じさせることができる。（Ｂ）ＤＥＮＶゲノムを操作するための逆遺伝学系。上＝ＤＥＮＶ２、下＝ＤＥＮＶ４。ＤＥＮＶゲノムは４つのプラスミドカセットへ分割され、そのプラスミドカセットは、個々に突然変異させ、合わせてライゲーションし、細胞へ電気穿孔して、組換えウイルスを生じることができる。ＤＥＮＶ４−Ａカセットは、変異が生じているエンベロープ遺伝子を含有する。ＤＥＮＶ４残基をＤＥＮＶ２由来のそれらと置き換えることにより、全体的にＤＥＮＶ４遺伝子主鎖上に構築されたｒＤＥＮＶ４／２ウイルスが生じる。
【図２５】ＲＴ-ＰＣＲによる血清型同定のための新しい方法およびＤＥＮＶ４主鎖組換えウイルスの確認を示す図である。（Ａ）血清型特異的ＲＴ-ＰＣＲのためのＲＴ−ＰＣＲプライマーの設計。プライマーは、高度に保存された３’末端ＮＳ１遺伝子を標的にする共通のセンスオリゴヌクレオチドを利用する。血清型特異的アンチセンスプライマーは、高度に多様なＮＳ２Ａ遺伝子を標的にする。（Ｂ）ウイルスをＣ６／３６細胞において成長させ、培養上清を収集し、遠心分離して、いかなる細胞片も除去した。ウイルスＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｍｐウイルスＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて単離した。ＰＣＲを３５サイクル、実行し、ＰＣＲ産物を１．５％超高純度アガロースゲル上で分析した。対照ＲＮＡ（ＤＶ１／ＤＶ２／ＤＶ３／ＤＶ４）および水を、陽性および陰性対照として流した。予想される産物サイズ：ＤＶ１＝２０５ｂｐ、ＤＶ２＝５３９ｂｐ、ＤＶ３＝４５５ｂｐ、ＤＶ４＝４０１ｂｐ。
【図２６】制限断片長多型はｒＤＥＮＶ４／２を親ＤＥＮＶ４から識別することを示す図である。（Ａ）ｒＤＥＮＶ４／２（下部）を親ＤＥＮＶ４（上部）から識別するために設計された制限断片長多型（ＲＦＬＰ）。ｒＤＥＮＶ４／２を作製するためにＤＥＮＶ４  Ｅゲノムへ導入された変異（アスタリスクとして表されている）は、ＤＥＮＶ４に存在するＸｍｎＩ制限酵素部位を破壊する。（Ｂ）ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＸｍｎＩで消化する。消化産物を、１．５％超高純度アガロースゲル上で分析した。予想される産物サイズ：消化されていない完全長＝１０３１ｂｐ、消化された産物＝９３１ｂｐおよび１１３ｂｐ。
【図２７】ＤＥＮＶ４およびｒＤＥＮＶ４／２ビリオンは類似した成熟プロフィールを有することを示す図である。ウイルスをＣ６／３６細胞において成長させ、培養上清を収集し、遠心分離していかなる細胞片も除去した。試料を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流し、ブロットを、抗Ｅ抗体（４Ｇ２）および抗ＰｒＭ抗体（２Ｈ１２および５Ｌ２０）で探索した。ＤＥＮＶ２は実質的レベルのＰｒＭが存在し、不完全なフューリンプロセシングまたはＰｒＭ解離のいずれかを示している。ＰｒＭバンドは、ＤＥＮＶ４試料またはｒＤＥＮＶ４／２試料のいずれにおいても検出されない。
【図２８】ｒＤＥＮＶ４／２は、親ウイルスと比較してベロ細胞において２ｌｏｇの成長減弱を生じることを示す図である。（Ａ）ベロ−８１細胞を、ＭＯＩ＝０．０１で感染させた。ウイルス上清を２４時間ごとに収集し、その後、ベロ−８１細胞において力価測定した。（Ｂ）ＤＥＮＶはベロ−８１細胞において感染巣を形成する（ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ４、およびｒＤＥＮＶ４／２をそれぞれ、感染から５日後、４日後、および６日後、固定した）。ｒＤＥＮＶ４／２病巣は、どちらの親ウイルスよりも小さい。
【図２９】ｒＤＥＮＶ４／２はＣ６／３６細胞において成長減弱を生じず、親ウイルスと比較して類似した感染巣を形成することを示す図である。（Ａ）Ｃ６／３６細胞を、ＭＯＩ＝０．０１で感染させた。ウイルス上清を２４時間ごとに収集し、その後、Ｃ６／３６細胞において力価測定した。（Ｂ）ＤＥＮＶはＣ６／３６細胞において感染巣を形成する（ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ４、およびｒＤＥＮＶ４／２をそれぞれ、感染から４日後、３日後、および５日後、固定した）。さらに何日間かの成長で、ｒＤＥＮＶ４／２病巣は親ウイルスに匹敵するサイズに達する。
【図３０】型特異的ＤＥＮＶ２ヒトＭＡｂによるｒＤＥＮＶ４／２の結合および中和の転移を示す図である。（Ａ）四次エピトープと結合する強中和性ＤＶ２  ＭＡｂであるヒトＭＡｂ  ２Ｄ２２の概要の表。（Ｂ）ＥＬＩＳＡアッセイにより、親ＤＶ４のレベルより上であるが、ＤＶ２レベルには達していない、２Ｄ２２のｒＤＥＮＶ４／２との、転移された部分的結合が、示されている。（Ｃ）交差反応性対照抗体２Ｊ２０のＥＬＩＳＡ結合は、存在し、かつウイルス完全性を維持したウイルスが同等レベルであることを示している。（Ｄ）ベロ−８１に基づいた病巣低下中和試験（ＦＲＮＴ）を、２Ｄ２２を用いて実施し、ＦＲＮＴ５０（感染の５０％を中和するのに必要とされる抗体の濃度）値を計算した。（Ｅ）Ｕ９３７＋ＤＣ−ＳＩＧＮに基づいた中和アッセイ（Ｎｅｕｔ）を、２Ｄ２２を用いて実施し、Ｎｅｕｔ５０値を計算した。両方のアッセイ（Ｄ、Ｅ）において、ｒＤＥＮＶ４／２は、２Ｄ２２による中和を、ＤＶ２より高いレベルで獲得した。ＤＶ４は、いずれのアッセイにおいても、２Ｄ２２の最高濃度で中和されなかった。
【図３１】ｒＤＥＮＶ４／２は、ＤＥＮＶ４ポリクローナル血清による中和を保存しながら、ＤＥＮＶ２ポリクローナル免疫血清による中和を獲得することを示す図である。ベロ−８１  ＦＲＮＴアッセイにより、（Ａ）ｒＤＥＮＶ４／２が、親ＤＥＮＶ２に匹敵するレベルでＤＥＮＶ２ポリクローナル免疫血清による中和を獲得することが示されている。（Ｂ）ｒＤＥＮＶ４／２は、ＤＥＮＶ４ポリクローナル免疫血清による中和の喪失を示さない。ｒＤＥＮＶ４／２は、親のＤＥＮＶ２またはＤＥＮＶ４中和価のいずれよりも上の、ヘテロタイプの（Ｃ）ＤＥＮＶ１および（Ｄ）ＤＥＮＶ３ポリクローナル免疫血清による中和の獲得を示していない。自然感染または実験的ワクチン接種のいずれかを有する個体由来の血清は、示されているようにコードされている。ＦＲＮＴ５０＜２０を有する試料は１９の血清希釈係数にグラフ化されている。
【図３２Ａ】組換えＤＥＮＶ４／２配列のアラインメントを示す図である。野生型ＤＥＮＶ２、組換えＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２、および野生型ＤＥＮＶ４のアミノ酸配列が、コンセンサス配列およびアミノ酸保存パーセンテージと共に示されている。
【図３２Ｂ】組換えＤＥＮＶ２／１配列のアラインメントを示す図である。野生型ＤＥＮＶ１、組換えＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅ、および野生型ＤＥＮＶ２のアミノ酸配列が、コンセンサス配列およびアミノ酸保存パーセンテージと共に示されている。
【図３２Ｃ】組換えＤＥＮＶ４／３配列のアラインメントを示す図である。野生型ＤＥＮＶ３、組換えＤＥＮＶ４  Ｍ１２、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４、ＤＥＮＶ４  Ｍ１６、および野生型ＤＥＮＶ４のアミノ酸配列が、コンセンサス配列およびアミノ酸保存パーセンテージと共に示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、１つまたは複数のＤＥＮＶ血清型を定義する１つまたは複数のエピトープ領域を、異なるＤＥＶＮ血清型のタンパク質主鎖へ転移させて、複数の血清型についての抗体標的を含有するキメラ分子が生成され得、それにより、単一の供給源または４つ未満の供給源由来の２つ、３つ、または４つの異なるＤＥＮＶ血清型に対する中和抗体を誘導することができる多価（例えば、二価、三価、または四価）のワクチンとして機能するという予期せぬ発見に基づいている。したがって、本発明は、デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なる１つ、または複数のデングウイルス血清型と反応性であるそれぞれの抗体により認識される１つまたは複数のエピトープを導入するアミノ酸置換を含むキメラデングウイルスＥ糖タンパク質主鎖の構築のためのプラットフォームを提供する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、そのデングウイルスＥ糖タンパク質主鎖は、デングウイルス血清型１由来である。いくつかの実施形態において、デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖は、デングウイルス血清型２、デングウイルス血清型３、またはデングウイルス血清型４由来であり得る。
【００３０】
いくつかの実施形態において、デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なるデングウイルス血清型と反応性である抗体は、デングウイルス血清型１、デングウイルス血清型２、デングウイルス血清型３、またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のそれぞれのデングウイルス血清型由来の１つまたは複数のデングウイルスタンパク質ドメインは、異なるデングウイルス血清型のデングウイルスＥ糖タンパク質主鎖へ導入することができる。
【００３２】
デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖についての第１のデングウイルス血清型、ならびに第２、第３、および／または第４のデングウイルス血清型、それぞれにおいて同定されているようなデングウイルスエピトープまたはデングウイルスタンパク質ドメインの任意の組み合わせが、第１のデングウイルス血清型、ならびに第２、第３、および／または第４のデングウイルス血清型が異なる（すなわち、第２、第３、および／もしくは第４の血清型が、第１のデングウイルス血清型と同じ血清型ではなく、ならびに／または第２、第３、および／もしくは第４のデングウイルス血清型がお互いに異なる）という条件で、用いることができることは理解されるであろう。
【００３３】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なるデングウイルス血清型と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含むデングウイルスＥ糖タンパク質主鎖を含むキメラデングウイルスＥ糖タンパク質であって、デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖がデングウイルス血清型４由来であり、抗体がデングウイルス血清型３と反応性である、キメラデングウイルスＥ糖タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体５Ｊ７であり、いくつかの実施形態において、Ｅ糖タンパク質は、アミノ酸配列：
【化１】
0006671364.tif 000002
を含み得、それから本質的になり得、またはそれからなり得、前記アミノ酸配列が、以下のアミノ酸置換：
Ｔ４９Ｅ、Ｋ５１Ｔ、Ｅ５２Ｑ、Ｖ５３Ｌ、Ｌ５５Ｔ、Ｔ５８Ｋ、Ｙ５９Ｌ、Ｓ１２２Ｌ、Ｇ１２３Ｅ、Ｋ１２４Ｐ、Ｔ１２６Ｅ、Ｎ１２８Ｋ、Ｌ１２９Ｖ、Ｉ１３２Ｙ、Ｍ１９９Ｌ、Ｋ２００Ｔ、Ｔ２０５Ａ、Ｌ２０７Ｍ、Ｋ２１０Ｒ、Ｌ２１４Ｆ、Ａ２２２Ｓ、Ｖ２７０Ｉ、Ｄ２７１Ｑ、Ｓ２７２Ｎ、Ｇ２７３Ｓ、Ｄ２７４Ｇ、Ｎ２７６Ｔ、Ｈ２７７Ｓ、およびＭ２７８Ｉ
の全部を含み、または全部ではない任意の組み合わせで含み、前記アミノ酸配列が、以下のアミノ酸置換：Ａ７１Ｄ、Ｔ１４８Ｑ、Ｄ２２５Ｔ、Ｖ２２９Ｐ、Ｄ３０７Ｋ、Ｋ３２１Ｑ、およびＶ３６２Ｐのうちの１つまたは複数を任意の組み合わせでさらに含み得る。
【００３４】
いくつかの実施形態において、４／３デングウイルス糖タンパク質として上で記載されたキメラデングウイルスＥ糖タンパク質は、アミノ酸配列：
【化２】
0006671364.tif 000003
またはアミノ酸配列：
【化３】
0006671364.tif 000004
またはアミノ酸配列：
【化４】
0006671364.tif 000005
を含み得、それから本質的になり得、またはそれからなり得る。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本発明は、デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なるデングウイルス血清型由来のタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含むデングウイルスＥ糖タンパク質主鎖を含むキメラデングウイルスＥ糖タンパク質であって、デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖がデングウイルス血清型４由来であり、タンパク質ドメインがデングウイルス血清型２由来である、キメラデングウイルスＥ糖タンパク質を提供する。
【００３６】
いくつかの実施形態において、デングウイルス血清型４のデングウイルスＥ糖タンパク質主鎖が、デングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、抗体はモノクローナル抗体２Ｄ２２である。
【００３７】
いくつかの実施形態において、タンパク質ドメインはＥ糖タンパク質ドメインＩＩＩであり、いくつかの実施形態において、４／２として上で記載されたキメラデングウイルスＥ糖タンパク質は、アミノ酸配列：
【化５】
0006671364.tif 000006
を含み得、それから本質的になり得、またはそれからなり得る。
【００３８】
いくつかの実施形態において、キメラデングウイルスＥ糖タンパク質は、アミノ酸配列：
【化６】
0006671364.tif 000007
を含み得、前記アミノ酸配列が、以下のアミノ酸置換：
Ｔ３００Ｓ、Ｓ３０３Ｔ、Ｓ３０７Ｋ、Ｄ３０９Ｖ、Ｍ３１２Ｉ、Ｔ３２０Ｉ、Ｖ３２２Ｉ、Ｋ３２３Ｒ、Ｋ３２５Ｑ、Ａ３２９Ｄ、Ａ３３１Ｓ、Ｖ３３５Ｉ、Ｉ３３７Ｆ、Ｒ３４０Ｔ、Ｖ３４２Ｌ、Ｎ３４３Ｅ、Ｅ３４５Ｒ、Ｋ３４６Ｈ、Ｖ３４８Ｌ、Ｖ３５１Ｌ、Ｓ３５３Ｔ、Ｓ３５４Ｖ、Ｔ３５５Ｎ、Ｌ３５７Ｉ、Ａ３５８Ｖ、Ｅ３５９Ｔ、Ｎ３６０Ｅ、Ｔ３６１Ｋ、Ｎ３６２Ｄ、Ｖ３６４Ｐ、Ｔ３６５Ｖ、Ｌ３６９Ａ、Ｖ３７９Ｉ、Ｇ３８３Ｅ、Ｎ３８４Ｐ、Ｓ３８５Ｇ、Ａ３８６Ｑ、Ｔ３８８Ｋ、Ｈ３９０ＮおよびＲ３９３Ｋ
の全部を含み、または全部ではない任意の組み合わせで含む。
【００３９】
この発明のさらなる実施形態は、相互交換ウイルス、すなわち、デングウイルス血清型４由来のデングウイルスタンパク質ドメイン（例えば、ドメインＩＩＩ）を導入するアミノ酸置換を有するデングウイルス血清型２のデングウイルスＥ糖タンパク質を含む。デングウイルス血清型主鎖、および異なるデングウイルス血清型由来の置換デングウイルスタンパク質ドメインの任意の他の組み合わせがこの発明の実施形態として含まれ、例えば、組み合わせ１／２、１／３、１／４、１／２／３、１／２／４、１／３／４、１／２／３／４、２／１、２／３、２／４、２／１／３、２／１／４、２／３／４、２／１／３／４、３／１、３／２、３／４、３／１／２、３／１／４、３／２／４、３／１／２／４、４／１、４／２、４／３、４／１／３、４／１／２、４／３／２、または４／３／２／１（各組み合わせの１番目の数は主鎖の血清型を定義し、各組み合わせの２番目、３番目、または４番目の数は、主鎖へ導入されているエピトープまたはドメインの血清型を定義する）が挙げられる。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態は、デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なるデングウイルス血清型と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含むデングウイルスＥ糖タンパク質主鎖を含むキメラデングウイルスＥ糖タンパク質であって、デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖がデングウイルス血清型２由来であり、抗体がデングウイルス血清型１と反応性である、キメラデングウイルスＥ糖タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、抗体はモノクローナル抗体１Ｆ４であり、いくつかの実施形態において、キメラデングウイルスＥ糖タンパク質は、アミノ酸配列：
【化７】
0006671364.tif 000008
を含み、それから本質的になり、またはそれからなる。
【００４１】
この発明のいくつかの実施形態において、キメラＥ糖タンパク質は、モノクローナル抗体５Ｈ２と反応性であるデングウイルス血清型４由来のエピトープを導入するために、任意の組み合わせでの、以下のアミノ酸置換：残基１５５におけるＡ、残基１６０におけるＶ、残基１６１におけるＴ、残基１６２におけるＡ、残基１６３におけるＭ、残基１６８におけるＳ、残基１７０におけるＳ、残基１７１におけるＶ、残基１７３におけるＶ、残基１７４におけるＫ、残基１７６におけるＰ、残基１７７におけるＤ、残基１８０におけるＥ、残基２９１におけるＫ、および残基２９３におけるＲのうちの１個または複数（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個全部）を含む、デングウイルス血清型１、デングウイルス血清型２、またはデングウイルス血清型３のデングウイルスＥ糖タンパク質主鎖を含み得る。アミノ酸ナンバリングは、ここに提供されたＷＴ＿ＤＥＮＶ４のアミノ酸配列に基づいている。
【００４２】
本発明は、ここに提供された配列表セクションにおいて、本明細書に記載された組成物および方法に用いることができる、この発明のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質の追加の非限定的例を提供する。
【００４３】
本発明はまた、例えば、対象においてデングウイルスに対する免疫応答を生じさせる方法であって、対象に、有効量の、この発明のＥ糖タンパク質、この発明のフラビウイルス粒子、この発明のＶＬＰ、この発明の核酸分子、この発明の集団、および／またはこの発明の組成物、ならびにそれらの任意の組み合わせを投与することを含む方法を含めた様々な治療的方法を提供する。
【００４４】
対象においてデングウイルス感染を処置する方法であって、対象に、有効量の、この発明のＥ糖タンパク質、この発明のフラビウイルス粒子、この発明のＶＬＰ、この発明の核酸分子、この発明の集団、および／またはこの発明の組成物、ならびにそれらの任意の組み合わせを投与することを含む方法が、追加としてここに提供される。
【００４５】
さらなる実施形態において、本発明は、対象においてデングウイルス感染に関連した障害を防止する方法であって、対象に、有効量の、この発明のＥ糖タンパク質、この発明のフラビウイルス粒子、この発明のＶＬＰ、この発明の核酸分子、この発明の集団、および／またはこの発明の組成物、ならびにそれらの任意の組み合わせを投与することを含む方法を提供する。
【００４６】
デングウイルス感染の影響から対象を保護する方法であって、対象に、有効量の、この発明のＥ糖タンパク質、この発明のフラビウイルス粒子、この発明のＶＬＰ、この発明の核酸分子、この発明の集団、および／またはこの発明の組成物、ならびにそれらの任意の組み合わせを投与することを含む方法もまたここに提供される。
【００４７】
本発明はまた、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、例えば、ａ）デングウイルス血清型３と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型３のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ｂ）対象由来の生物学的試料を、上記のステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、ならびにｃ）ステップ（ｂ）における中和を検出し、それにより、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体の存在を同定するステップを含む方法を含めた様々な診断方法を提供する。
【００４８】
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ｂ）対象由来の生物学的試料を、上記のステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、ならびにｃ）ステップ（ｂ）における中和を検出し、それにより、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体の存在を同定するステップを含む方法が本明細書にさらに提供される。
【００４９】
本発明はまた、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型１と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型１のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ｂ）対象由来の生物学的試料を、上記のステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、ならびにｃ）ステップ（ｂ）における中和を検出し、それにより、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体の存在を同定するステップを含む方法を提供する。
【００５０】
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型３と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型３のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ならびにｂ）ステップ（ａ）における中和を検出し、それにより、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体の存在を同定するステップを含む方法もまたここに提供される。
【００５１】
さらに、本発明は、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ならびにｂ）ステップ（ａ）における中和を検出し、それにより、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体の存在を同定するステップを含む方法を提供する。
【００５２】
追加の実施形態において、本発明は、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型１と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型１のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ならびにｂ）ステップ（ａ）における中和を検出し、それにより、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体の存在を同定するステップを含む方法を提供する。
【００５３】
本発明はさらに、対象においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型３と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型３のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ｂ）対象由来の生物学的試料を、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、ｃ）生物学的試料が、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびにｄ）生物学的試料が、（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、対象においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体を誘導するものとして免疫原性組成物を同定するステップを含む方法を提供する。
【００５４】
さらに、本発明は、対象においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ｂ）対象由来の生物学的試料を、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、ｃ）生物学的試料が、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびにｄ）生物学的試料が、（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、対象においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体を誘導するものとして免疫原性組成物を同定するステップを含む方法を提供する。
【００５５】
本発明はさらに、対象においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型１と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型１のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ｂ）対象由来の生物学的試料を、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、ｃ）生物学的試料が、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびにｄ）生物学的試料が、（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、対象においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体を誘導するものとして免疫原性組成物を同定するステップを含む方法を提供する。
【００５６】
追加の実施形態において、本発明は、対象においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型３と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物、および／またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型３のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、Ｅ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、ｂ）生物学的試料が、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびにｃ）生物学的試料が、（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、対象においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体を誘導するものとして免疫原性組成物を同定するステップを含む方法を提供する。
【００５７】
追加として、本発明は、対象においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物、および／またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、Ｅ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、ｂ）生物学的試料が、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびにｃ）生物学的試料が、（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、対象においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体を誘導するものとして免疫原性組成物を同定するステップを含む方法を提供する。
【００５８】
追加として、対象においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型１と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物、および／またはデングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型１のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、Ｅ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、ｂ）生物学的試料が、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびにｃ）生物学的試料が、（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、対象においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体を誘導するものとして免疫原性組成物を同定するステップを含む方法がここに提供される。
【００５９】
本発明はさらに、試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を検出する方法であって、ａ）デングウイルス血清型３と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型３のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物と試料を、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびにｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を検出するステップを含む方法を提供する。
【００６０】
本発明はまた、試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する抗体を検出する方法であって、ａ）デングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物と試料を、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびにｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する抗体を検出するステップを含む方法を提供する。
【００６１】
試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する抗体を検出する方法であって、ａ）デングウイルス血清型１と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型１のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物と試料を、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびにｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する抗体を検出するステップを含む方法もまたここに提供される。
【００６２】
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型３と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型３のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ｂ）対象由来の生物学的試料を（ａ）のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびにｃ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を同定するステップを含む方法がさらにここに提供される。
【００６３】
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する抗体を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ｂ）対象由来の生物学的試料を（ａ）のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびにｃ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する抗体を同定するステップを含む方法が、追加としてここに提供される。
【００６４】
なおさらなる実施形態において、本発明は、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する抗体を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型１と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型１のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ｂ）対象由来の生物学的試料を（ａ）のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびにｃ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する抗体を同定するステップを含む方法を提供する。
【００６５】
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型３と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物、および／またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型３のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、Ｅ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびにｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を同定するステップを含む方法が、追加としてここに提供される。
【００６６】
本発明はさらに、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する抗体を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物、および／またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、Ｅ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびにｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する抗体を同定するステップを含む方法を提供する。
【００６７】
本発明はさらに、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する抗体を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型１と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物、および／またはデングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型１のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、Ｅ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびにｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する抗体を同定するステップを含む方法を提供する。
【００６８】
本発明はさらに、対象においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型３と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物、および／またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型３のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、Ｅ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびにｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、対象においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップを含む方法を提供する。
【００６９】
対象においてデングウイルス血清型２および／または４に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、ａ）請求項６〜８のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、Ｅ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびにｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、対象においてデングウイルス血清型２および／または４に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップを含む方法がさらにここに提供される。
【００７０】
対象においてデングウイルス血清型１および／または２に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型１と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物、および／またはデングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型１のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、Ｅ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびにｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、対象においてデングウイルス血清型１および／または２に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップを含む方法もまたここに提供される。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態において、対象においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型３と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型３のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型３のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ｂ）対象由来の生物学的試料を（ａ）のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびにｃ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、対象においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップを含む方法が提供される。
【００７２】
本発明は、対象においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型４のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型４のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ｂ）対象由来の生物学的試料を（ａ）のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびにｃ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、対象においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップを含む方法を、追加として提供する。
【００７３】
対象においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、ａ）デングウイルス血清型１と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型１のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型２のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物、および／またはデングウイルス血清型２のデングウイルスタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含む血清型１のＥ糖タンパク質主鎖を含むＥ糖タンパク質を含む組成物を、対象に、Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、ｂ）対象由来の生物学的試料を（ａ）のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびにｃ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、対象においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップを含む方法もまた、ここに提供される。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本発明は、移植されたエピトープまたはドメインに対して産生される抗体の量を決定する方法を提供する。例えば、５Ｊ７領域を標的にするＤＥＮＶ３抗体は、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４の中和を親ＤＥＮＶ４の中和と比較することにより測定することができ、ＤＥＮＶ３抗体が、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４の一部を中和することができるが、親ＤＥＮＶ４を中和することができないと予想される。
【００７５】
本発明はまた、この発明のキメラＥ糖タンパク質を含むデングウイルス粒子、フラビウイルス粒子、およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。本発明のデングウイルスＥ糖タンパク質は、無傷のウイルス粒子（例えば、死滅した、もしくは生きた弱毒化ウイルス粒子、または組換えデングウイルスベクター）またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）（それらは、任意で、無傷のデングウイルス粒子またはデングウイルスＶＬＰであってもよい）内に存在し得る。
【００７６】
この発明のＥ糖タンパク質をコードする単離された核酸分子、この発明のデングウイルス粒子、フラビウイルス粒子、またはＶＬＰをコードする単離された核酸分子、この発明の核酸分子を含むベクター、ならびにこの発明のデングウイルス粒子および／またはフラビウイルス粒子を含むデングウイルス粒子および／またはフラビウイルス粒子の集団もまた、提供される。
【００７７】
この発明のＥ糖タンパク質を薬学的に許容される担体中に含む組成物、この発明の核酸分子を薬学的に許容される担体中に含む組成物、この発明のウイルス粒子を含む組成物、この発明の集団を薬学的に許容される担体中に含む組成物、およびこの発明のＶＬＰを薬学的に許容される担体中に含む組成物がさらにここに提供される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、この発明のキメラの作製は、デングウイルスエピトープおよび／またはデングウイルスタンパク質ドメインの部分として同定されるアミノ酸置換の一部（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個など）または全部を、デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖またはフラビウイルスＥ糖タンパク質主鎖へ導入することにより行うことができる。デングウイルスエピトープまたはデングウイルスタンパク質ドメインの部分として同定されるあらゆるアミノ酸が、この発明のキメラタンパク質を作製するために置換されることを必要とされるとは限らない。例えば、いくつかの実施形態において、デングウイルスエピトープまたはデングウイルスドメインの部分として同定される連続したアミノ酸配列の一方の末端における約１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸のさらなる置換および／または置換の排除が、この発明のキメラの作製において含まれ得る。望ましい高次構造的エピトープまたはドメインを生じるのに必要な置換の数は、本明細書における教示に従い、かつ当技術分野においてよく知られたプロトコールに従って、当業者により容易に決定することができる。本明細書に示されるアミノ酸配列に提供されるアミノ酸残基ナンバリングは、ここに提供されているように、それぞれのＤＥＮＶ血清型のそれぞれの非改変型（例えば、野生型）Ｅ糖タンパク質アミノ酸配列に基づいている。しかしながら、他のデングウイルスＥ糖タンパク質アミノ酸配列または他のフラビウイルスＥ糖タンパク質アミノ酸配列における等価のアミノ酸位置が、この発明のキメラタンパク質の作製において容易に同定および使用され得ることは当業者により容易に理解されるだろう。
【００７９】
いくつかの実施形態において、本発明は、１つまたは複数のデングウイルスエピトープを、デングウイルスではないフラビウイルス由来のフラビウイルスＥ糖タンパク質へ導入するためにアミノ酸置換が生じている、キメラフラビウイルスＥ糖タンパク質を提供する。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖ではないフラビウイルスＥ糖タンパク質主鎖を含むキメラＥ糖タンパク質を含むフラビウイルスＥ糖タンパク質であって、フラビウイルスＥ糖タンパク質主鎖が、デングウイルスと反応性であるそれぞれの抗体により認識される１つまたは複数のエピトープを導入するアミノ酸置換を含む、フラビウイルスＥ糖タンパク質を提供する。
【００８０】
用いることができるフラビウイルスの非限定的例には、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースアクセッション番号ＪＸ５０３５２９）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースアクセッション番号Ｕ１４１６３）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースアクセッション番号ＤＱ２１１６５２）、および現在知られた、または後で同定される任意の他のフラビウイルスが挙げられる。
【００８１】
デングウイルスワクチンを作製しようとする多くの試みが、結果として、自然感染またはワクチンへのその後の曝露で病態の可能性を増加させ得る、非中和抗体の産生を生じることは、当技術分野において知られている。操作されたエピトープを提供するための別のアプローチは、別のフラビウイルス粒子またはＶＬＰへ組み込まれたデングウイルスＥタンパク質の全部または一部を送達することである。代表的な実施形態において、異種性フラビウイルスは、ウエストナイルウイルスまたは黄熱病ウイルスである。Ｅタンパク質の部分は、例えば、デングウイルスＥタンパク質および／または他のデングウイルス構造タンパク質に存在する中和していないエピトープに対する非中和デングウイルス抗体の産生を低下させるために、異種性フラビウイルス主鎖のＥタンパク質へ移植することができる。
【００８２】
したがって、キメラフラビウイルスまたはキメラフラビウイルスＶＬＰは、キメラフラビウイルスまたはフラビウイルスＶＬＰに存在していないデングウイルスＥタンパク質の他の部分および／または他の構造タンパク質に対する非中和抗体の産生を低下させながら、四次デングウイルスエピトープを適切な高次構造で提示することができる。
【００８３】
本発明のいくつかの実施形態において、フラビウイルスＥ糖タンパク質またはデングウイルスＥ糖タンパク質の個々のエピトープおよび高次構造的エピトープが、合成主鎖または支持構造上に、合成主鎖または支持構造内のエピトープが、Ｅ糖タンパク質、ウイルス粒子、またはＶＬＰの構造内のエピトープの高次構造および配置を模倣するように、提示され得る。
【００８４】
本発明のなおさらなる実施形態において、本発明は、本発明のＥ糖タンパク質の個々のエピトープおよび高次構造的エピトープを模倣するペプチドミモトープ（Ｍｅｌｏｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  １３，  ３５２−３５９を参照）を提供する。ミモトープは当技術分野において知られた任意の技術を用いて同定され得、その技術には、表面刺激、ランダムペプチドライブラリーまたはファージディスプレイライブラリー、加えて、本発明のＥ糖タンパク質の個々のエピトープおよび高次構造的エピトープに対する抗体が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８５】
本発明はさらに、本発明のデングウイルスペプチド、デングウイルスタンパク質ドメイン、デングウイルスポリペプチド、またはフラビウイルスポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、単離された核酸分子）を提供する。
【００８６】
本発明はさらに、本発明のキメラフラビウイルス粒子またはキメラフラビウイルス様粒子（ＶＬＰ）（例えば、フラビウイルス粒子のウイルスコート）をコードする核酸分子（例えば、単離された核酸分子）を提供する。
【００８７】
本発明の核酸分子を含む核酸ベクターもまた提供される。
【００８８】
この発明の、ベクター、核酸分子、デングウイルスタンパク質、デングウイルスペプチド、デングウイルスタンパク質ドメイン、フラビウイルスタンパク質、フラビウイルスペプチド、フラビウイルスタンパク質ドメイン、キメラデングウイルス粒子、キメラデングウイルスＶＬＰ、キメラフラビウイルスＶＬＰ、および／またはキメラフラビウイルス粒子を単独で、または任意の組み合わせで含む細胞（例えば、単離された細胞）もまた提供される。
【００８９】
本発明はまた、本発明の、細胞、ベクター，核酸分子、デングウイルスタンパク質、キメラデングウイルスＶＬＰ、キメラデングウイルス粒子、キメラフラビウイルスＶＬＰ、および／またはキメラフラビウイルス粒子を単独で、または任意の組み合わせで含む免疫原性組成物を提供する。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は一価である。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、デングウイルス血清型ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３、および／またはＤＥＮ４の任意の組み合わせについての多価（例えば、二価、三価、または四価）である。この発明のデングウイルスキメラＥ糖タンパク質は、対象に単独で、または任意の組み合わせで投与することができ、その組み合わせには、プライムおよびブーストの、当技術分野において知られているそのような免疫化プロトコールによる任意の組み合わせが挙げられる。この発明のデングウイルスキメラＥ糖タンパク質は、１／２、１／３、１／４、１／２／３、１／２／４、１／３／４、１／２／３／４、２／１、２／３、２／４、２／１／３、２／１／４、２／３／４、２／１／３／４、３／１、３／２、３／４、３／１／２、３／１／４、３／２／４、３／１／２／４、４／１、４／２、４／３、４／１／３、４／１／２、４／３／２、または４／３／２／１（各組み合わせの１番目の数は主鎖の血清型を定義し、各組み合わせの２番目、３番目、または４番目の数は、主鎖へ導入されているエピトープまたはドメインの血清型を定義する）であり得る。いくつかの実施形態において、全ての４つのデングウイルス血清型を代表する抗原の投与を生じるプライム／ブーストの組み合わせが用いられる。そのようなプライム／ブーストレジメンは、この結果を達成し得る任意の順序での抗原の任意の組み合わせの投与を含み得る。プライム／ブーストプロトコールの非限定的例には、それぞれ、０日目におけるプライム、および３ヶ月目と６ヶ月目におけるブースト、または６ヶ月目と１年目におけるブーストが挙げられる。このプロトコールはまた、３ヶ月目、６ヶ月目、または１年目のいずれかにおける１回のみのブーストを含むように改変することもできる。
【００９０】
本発明は、対象においてデングウイルスに対する免疫応答を生じさせる方法であって、対象に、有効量の、本発明のデングウイルスタンパク質、キメラデングウイルス粒子、キメラデングウイルスＶＬＰ、キメラフラビウイルスＶＬＰ、キメラフラビウイルス粒子、核酸分子、ベクター、細胞、および／または免疫原性組成物を単独で、または任意の組み合わせで投与することを含む方法を包含する。
【００９１】
いくつかの実施形態において、本発明は、有利には、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３、およびＤＥＮ４血清型のうちの１つ、２つ、３つ、または４つ全部に対する免疫応答を誘導するように実行することができる。いくつかの実施形態において、この発明のデングウイルスキメラＥ糖タンパク質および／またはこの発明のデングウイルスキメラＥ糖タンパク質をコードする核酸分子が、全ての４つのＤＥＮＶ血清型に対する免疫応答（例えば、測定されることになっているデング免疫のパラメータが、全ての４つのＤＥＶＮ血清型についてほとんど等価である、バランスのとれた免疫応答）を誘導するために、単独で、または任意の組み合わせおよび／もしくは順序で、対象に投与することができる。有効かつ安全な多価デングワクチンが、血清型間の干渉という問題のために設計するのに課題を抱えていることは当技術分野おいてよく知られている。例えば、免疫応答は、標的血清型の一部のみに対して主に向けられ得る。その後、全ての血清型に対する応答を達成するように試みるために、複数のワクチン接種が必要とされる；しかしながら、デングウイルスの場合、このアプローチは、既存の抗体を有する対象への反復投与が、デング出血熱などのより重篤な合併症および／または疾患をもたらし得るため、危険であり得る。
【００９２】
本発明のなおさらなる態様は、デングウイルス感染を処置する方法であって、対象に、有効量の、この発明のデングウイルスタンパク質、デングウイルスタンパク質ドメイン、デングウイルスペプチド、キメラデングウイルス粒子、キメラデングウイルスＶＬＰ、キメラフラビウイルスＶＬＰ、キメラフラビウイルス粒子、核酸分子、ベクター、細胞、および／または免疫原性組成物を単独で、または任意の組み合わせで、もしくは組み合わせの任意の順序で投与することを含む方法である。
【００９３】
本発明のなおさらなる態様は、デングウイルス感染を防止する方法であって、対象に、有効量の、この発明のデングウイルスタンパク質、デングウイルスタンパク質ドメイン、デングウイルスペプチド、キメラデングウイルス粒子、キメラデングウイルスＶＬＰ、キメラフラビウイルスＶＬＰ、キメラフラビウイルス粒子、核酸分子、ベクター、細胞、および／または免疫原性組成物を単独で、または任意の組み合わせで、もしくは組み合わせの任意の順序で投与することを含む方法である。
【００９４】
本発明のなおさらなる態様は、デングウイルス感染の影響から対象を保護する方法であって、対象に、有効量の、この発明のデングウイルスタンパク質、デングウイルスタンパク質ドメイン、デングウイルスペプチド、キメラデングウイルス粒子、キメラデングウイルスＶＬＰ、キメラフラビウイルスＶＬＰ、キメラフラビウイルス粒子、核酸分子、ベクター、細胞、および／または免疫原性組成物を単独で、または任意の組み合わせで、もしくは組み合わせの任意の順序で投与することを含む方法である。
【００９５】
「デングウイルス感染の影響から対象を保護すること」とは、対象が、デングウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害を発症しないこと、あるいは、対象がデングウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害を発症した場合には、この発明のデングウイルスタンパク質、デングウイルスタンパク質ドメイン、デングウイルスペプチド、キメラデングウイルス粒子、キメラデングウイルスＶＬＰ、キメラフラビウイルスＶＬＰ、キメラフラビウイルス粒子、核酸分子、ベクター、細胞、および／または免疫原性組成物の投与の非存在下でデングウイルスによる感染で対象が経験するだろうものと比較して、対象において、疾患もしくは障害の重症度がより低く、ならびに／または症状が減少し、および／もしくは重症度が低いことを意味する。
【００９６】
デングウイルスの４つの血清型（ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、およびＤＥＮＶ−４）がある。各血清型内には、いくつかの異なる菌株または遺伝子型がある。この発明のデングウイルスエピトープおよびタンパク質ドメインは、現在知られた、または後で同定される、全ての血清型、菌株、および遺伝子型を含む、任意のデングウイルス由来であり得る。
【００９７】
本発明の実施形態において、デングウイルスは、ＵＮＣ１０１７株（ＤＥＮ１）、ウエストパシフィック（Ｗｅｓｔ  Ｐａｃｉｆｉｃ）７４株（ＤＥＮ１）、Ｓ１６８０３株（ＤＥＮ２）、ＵＮＣ２００５株（ＤＥＮ２）、Ｓ１６８０３株（ＤＥＮ２）、ＵＮＣ３００１株（ＤＥＮ３）、ＵＮＣ３０４３（１９８４年フィリピンから採取されたＤＥＮ３株０５９．ＡＰ−２）、ＵＮＣ３００９株（ＤＥＮ３、Ｄ２８６３、スリランカ、１９８９）、ＵＮＣ３０６６（１９７７年プエルトリコから採取されたＤＥＮ３、１３４２株）、ＣＨ５３４８９株（ＤＥＮ３）、ＵＮＣ４０１９株（ＤＥＮ４）、またはＴＶＰ−３６０（ＤＥＮ４）である。
【００９８】
本発明の実施形態において、デングウイルスポリペプチド（例えば、Ｅタンパク質）の「免疫学的活性断片」は、少なくとも約６個、８個、１０個、１２個、１５個、２０個、３０個、５０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個もしくはそれ以上のアミノ酸、任意で、連続したアミノ酸、および／または約４９５個未満、４７５個未満、４５０個未満、４２５個未満、４００個未満、３５０個未満、３００個未満、２５０個未満、２００個未満、１５０個未満、１００個未満、７５個未満、もしくは５０個未満のアミノ酸、任意で、連続したアミノ酸、加えて、下限が上限より少ない限り、前述の任意の組み合わせを含み、それらから本質的になり、またはそれらからなり、「免疫学的活性断片」は、宿主においてデングウイルスに対する免疫応答（例えば、天然抗原と反応するＩｇＧおよび／またはＩｇＡ）、任意で、防御免疫応答を誘導し、本明細書に記載された四次デングウイルスエピトープと特異的に結合する抗体（例えば、中和抗体）の産生を誘導する。
【００９９】
本明細書に用いられる場合、用語「エピトープ」は、適切な高次構造で存在する場合、抗体（例えば、Ｂ細胞エピトープ）またはＴ細胞受容体（例えば、Ｔ細胞エピトープ）に対して反応部位を提供する、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の特定的組み合わせを意味する。
【０１００】
Ｂ細胞エピトープを含む所定のポリペプチドの部分は、当技術分野において知られているエピトープマッピング技術（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ６６，  Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｅｄ．，  １９９６，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．参照）のいくつでも用いて、同定することができる。例えば、直鎖状エピトープは、例えば、多数のペプチド（そのペプチドは、タンパク質分子の部分に対応している）を固体支持体上で同時に合成し、ペプチドが支持体にまだ付着したまま、ペプチドを抗体と反応させることにより、決定することができる。そのような技術は当技術分野において知られており、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；  Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２；  Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３：７０９−７１５に記載されている。
【０１０１】
同様に、高次構造的エピトープは、例えば、Ｘ線結晶解析および２次元核磁気共鳴などのアミノ酸の空間的高次構造を決定することにより容易に同定することができる。タンパク質の抗原性領域もまた、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐから入手できるＯｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを用いて計算されるものなど、標準の抗原性およびヒドロパシーのプロットを用いて同定することができる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロフィールを決定するためにＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ  ｍｅｔｈｏｄ  （Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  （１９８１）  ７８：３８２４−３８２８）およびハイドロパシープロットのためにＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術（Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９８２）  １５７：１０５−１３２）を用いる。
【０１０２】
一般的に、対象の細胞性免疫系を刺激することに関与するＴ細胞エピトープは、約８〜２５個のアミノ酸の短いペプチドである。Ｔ細胞エピトープを同定する一般的な方法は、重複合成ペプチドを用いて、例えば、酵素結合イムノスポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）を用いて、関心対象となる抗原に対して免疫性である動物由来のＴ細胞によって認識されるこれらのペプチドのプール、または個々のペプチドを分析することである。これらの重複ペプチドはまた、サイトカイン放出もしくは分泌の刺激などの他のアッセイに用いることができ、またはそのペプチドを含有する主要組織適合性（ＭＨＣ）四量体を構築することにより評価することができる。そのような免疫原的活性断片はまた、関心対象となる抗原由来の様々な断片による刺激に応答してリンパ球増殖を刺激するそれらの能力に基づいて同定することができる。
【０１０３】
本発明は、予防、治療、および／または診断を目的として実施することができる。加えて、本発明は、診断もしくは研究目的などの任意の目的のために、または別の対象への移入による受動免疫のために、抗体を産生するように実施することができる。
【０１０４】
本発明はさらに、この発明の１つまたは複数の組成物を含むキットを提供する。この発明のキットが、当技術分野においてよく知られているように、適切なバッファーおよび／または希釈剤および／または他の溶液、ならびにそのキットを用いるための説明書と共にキットの試薬（例えば、抗体、抗原、核酸）を保持する１つまたは複数の入れ物および／または容器を含み得ることは、当業者によりよく理解されている。そのようなキットはさらに、当技術分野においてよく知られているように、アジュバントおよび／または他の免疫刺激剤もしくは免疫調節剤を含み得る。
【０１０５】
本発明の組成物およびキットはまた、他の薬用作用物質、薬学的作用物質、担体、希釈剤、免疫刺激性サイトカインなどを含み得る。そのような剤形を調製する実際の方法は、当業者に知られており、または明らかであろう。
【０１０６】
対象への投与は、当技術分野において知られた任意の経路により得る。非限定的例として、投与の経路は、吸入（例えば、経口的および／または経鼻的吸入）、経口、頬側（例えば、舌下）、直腸、膣、（気道への投与を含む）局所的、眼内、経皮、非経口による（例えば、筋肉内［骨格筋への投与］）、静脈内、動脈内、腹腔内など）、（足蹠への投与を含む）皮下、皮内、胸膜内、脳内、および／またはくも膜下腔内の経路により得る。
【０１０７】
本発明のエピトープ、ポリペプチド、ＶＬＰ、およびウイルスベクターは、それ自体で、またはそれをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を送達することにより、送達することができる。
【０１０８】
免疫調節性ケモカインおよびサイトカイン（好ましくは、ＣＴＬ誘導性サイトカイン）などの免疫調節性化合物を対象へ同時に投与することができる。
【０１０９】
サイトカインは、当技術分野において知られた任意の方法により投与され得る。外因性サイトカインは、対象へ投与され得、または代替として、サイトカインをコードする核酸が、適切なベクターを用いて対象へ送達され得、サイトカインがインビボで産生され得る。特定の実施形態において、ウイルスアジュバントがサイトカインを発現する。
【０１１０】
本発明の実施形態において、本発明の組成物の複数回用量（例えば、２回、３回、またはそれ以上）を、検出可能な病原性（デングショック症候群／デング出血熱）なしに投与することができる。
【０１１１】
本発明の実施形態において、本発明の多価ワクチンは、免疫干渉を生じず、例えば、提示された全ての抗原に対して、バランスのとれた免疫応答が誘導される。本発明の実施形態において、バランスのとれた応答は、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、およびＤＥＮＶ−４に対する防御免疫を生じる。
【０１１２】
本発明の実施形態において、多価ワクチンは、抗デングの母親由来抗体が存在する対象へ投与することができる。
【０１１３】
本発明が異なる形で具体化することができ、かつ本明細書に示された実施形態に限定されると解釈されるべきではないことは、理解されているはずである。むしろ、これらの実施形態は、この開示が徹底的かつ完全であり、かつ本発明の範囲を当業者に完全に伝えるだろうように、提供される。
【０１１４】
他に規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者により一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。本明細書において本発明の説明に用いられる用語法は、特定の実施形態のみを記載することを目的とし、本発明を限定することを意図するものではない。
【０１１５】
本明細書で用いられる場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、または「その（ｔｈｅ）」は、１つまたは複数を意味し得る。例えば、「１つの（ａ）」細胞は、単一細胞または複数の細胞を意味し得る。
【０１１６】
また本明細書で用いられる場合、「および／または」は、関連して列挙された項目の１つまたは複数のありとあらゆる可能な組み合わせ、加えて、離接的接続詞（「または（ｏｒ）」）において解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、かつ包含する。
【０１１７】
用量の量（例えば、脂肪酸の量）などの測定可能な値を指す時、本明細書で用いられる場合、用語「約」は、特定化された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらに±０．１％の変動を包含することを意味する。
【０１１８】
本明細書で用いられる場合、移行句「から本質的になること」とは、特許請求の範囲の範囲が、特許請求の範囲に列挙された特定化材料またはステップ、および主張された発明の基本的かつ新規の特徴に実質的には影響しないものを包含すると解釈されるべきであることを意味する。Ｉｎ  ｒｅ  Ｈｅｒｚ，  ５３７  Ｆ．２ｄ  ５４９，  ５５１−５２，  １９０  Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ．  ４６１，  ４６３  （ＣＣＰＡ  １９７６）（原文における強調）参照；ＭＰＥＰ  §  ２１１１．０３もまた参照。したがって、この発明の特許請求の範囲において用いられる時の用語「から本質的になること」は、「を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と等価であると解釈されることを意図するものではない。
【０１１９】
本明細書で用いられる場合、用語「核酸」は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば、化学合成された）ＤＮＡ、およびＲＮＡとＤＮＡのキメラを含む、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を包含する。核酸は二本鎖または一本鎖であり得る。核酸は、ヌクレオチド類似体または誘導体（例えば、イノシン、またはホスホロチオエートヌクレオチド）を用いて合成され得る。そのようなヌクレオチドは、例えば、塩基対形成能力の変化、またはヌクレアーゼに対する抵抗性の増加を有する核酸を調製するために、用いることができる。
【０１２０】
本明細書で用いられる場合、用語「ポリペプチド」は、他に指示がない限り、ペプチドおよび（融合タンパク質を含む）タンパク質の両方を包含する。
【０１２１】
「融合タンパク質」は、天然では一緒に融合しては見出されない２つ（またはそれ以上の）異なるポリペプチドをコードする２つの異種性ヌクレオチド配列またはその断片が、正しい翻訳リーディングフレームで一緒に融合している場合に産生されるポリペプチドである。
【０１２２】
「組換え」核酸、ポリヌクレオチド、またはヌクレオチド配列は、遺伝子工学技術によって作製されるものである。
【０１２３】
「組換え」ポリペプチドは、組換え核酸、ポリペプチド、またはヌクレオチド配列から産生される。
【０１２４】
本明細書で用いられる場合、「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離された核酸」または「単離されたヌクレオチド配列」）は、天然に存在する生物体またはウイルスの他のコンポーネントの少なくとも一部、例えば、そのポリヌクレオチドに付随して一般的に見出される細胞もしくはウイルスの構造コンポーネントまたは他のポリペプチドもしくは核酸から少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。必ずではないが、任意で、「単離された」ポリヌクレオチドは、出発材料と比較して、より高い濃度（例えば、少なくとも約２倍、３倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、１００００倍、またはそれ以上の濃度）で存在する（すなわち、濃縮されている）。それぞれの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上純粋である。
【０１２５】
「単離された」ポリペプチドは、天然に存在する生物体またはウイルスの他のコンポーネントの少なくとも一部、例えば、そのポリペプチドに付随して一般的に見出される細胞もしくはウイルスの構造コンポーネントまたは他のポリペプチドもしくは核酸から少なくとも部分的に分離されているポリペプチドを意味する。必ずではないが、任意で、「単離された」ポリペプチドは、出発材料と比較して、より高い濃度（例えば、少なくとも約２倍、３倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、１００００倍、またはそれ以上の濃度）で存在する（すなわち、濃縮されている）。それぞれの実施形態において、単離されたポリペプチドは、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上純粋である。
【０１２６】
さらに、「単離された」細胞は、それが天然で、通常、付随している他のコンポーネントから部分的に、または完全に分離されている細胞である。例えば、単離された細胞は、培地中の細胞、および／または薬学的に許容される担体中の細胞であり得る。
【０１２７】
用語「免疫原」および「抗原」は、本明細書で交換可能に用いられ、細胞性および／または体液性免疫応答が向けられる任意の（ポリペプチドを含む）化合物を意味する。特定の実施形態において、免疫原または抗原は、デングウイルス感染の影響に対する防御免疫応答を誘導することができる。
【０１２８】
本明細書で用いられる場合、「有効量」は、治療的なおよび／または有益な効果であり得る所望の効果を生じるのに十分である、本発明のベクター、核酸、エピトープ、ポリペプチド、細胞、粒子、ＶＬＰ、組成物、または製剤の量を指す。有効量は、対象の年齢、全身状態、処置されることになっている状態の重症度、投与される特定の作用物質、処置の期間、任意の併用処置の性質、用いられる薬学的に許容される担体、および当業者の知識および専門知識の範囲内の同様の因子によって変わる。必要に応じて、任意の個々の場合における「有効量」は、関連のあるテキストおよび文献を参照することにより、ならびに／または日常的実験を用いることにより、当業者により決定することができる。
【０１２９】
本明細書で用いられる場合、用語「免疫原性量」または「有効免疫用量」は、他に指示がない限り、非免疫化対象の生来の免疫より大きい（任意で、防御応答であり得る）免疫応答を、処置される対象において誘導するのに十分な量または用量を意味する。任意の特定の状況における免疫原性量または有効免疫用量は、当技術分野において知られた方法を用いて日常的に決定することができる。
【０１３０】
用語「ワクチン」、「ワクチン接種」、および「免疫化」は当技術分野においてよく理解されており、本明細書で交換可能に用いられる。例えば、ワクチン、ワクチン接種、または免疫化という用語は、免疫原に対する対象の免疫反応（例えば、能動免疫応答をもたらすことによる）、ならびにそれにしたがって、感染に抵抗し、それを克服し、および／またはそれから回復するその対象の能力（すなわち、防御免疫応答）を増加させる方法または組成物であると理解することができる。
【０１３１】
用語「処置する」、「処置すること」、または「の処置」（およびそれの文法的語尾変化）とは、対象の状態の重症度が、低下し、少なくとも部分的に改善し、もしくは寛解すること、ならびに／あるいは少なくとも１つの臨床症状のいくらかの軽減、緩和、もしくは減少が達成され、および／または疾患もしくは障害の進行の遅延があることを意味する。それぞれの実施形態において、用語「処置する」、「処置すること」、または「の処置」（およびそれの文法的語尾変化）は、臨床疾患の他の徴候の有無に関わらず、ウイルス血症の重症度の低下、および／またはウイルス血症の進行の遅延を指す。
【０１３２】
本明細書で用いられる場合、「処置有効」量は、対象を（本明細書で定義されているように）処置するのに十分である量である。いくらかの利益が対象にもたらされる限り、治療的効果が完全または治癒的である必要はないことを当業者は理解しているだろう。
【０１３３】
用語「防止する」、「防止すること」、または「の防止」（およびその文法的語尾変化）は、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発生および／もしくは進行の防止および／もしくは遅延、ならびに／または本発明の方法の非存在下で起こるであろうものと比較して、疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発生および／もしくは進行の重症度の低下を指す。代表的な実施形態において、用語「防止する」、「防止すること」、または「の防止」（およびその文法的語尾変化）は、臨床疾患の他の徴候の有無に関わらず、対象におけるウイルス血症の発生および／または進行の防止および／または遅延を指す。防止は、完全、例えば、疾患、障害、および／または臨床症状の全部の欠如であり得る。防止はまた、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の出現、ならびに／または発生および／もしくは進行の重症度が、本発明の非存在下で起こるであろうものより低いような部分的であり得る。
【０１３４】
本明細書で用いられる場合、「防止有効」量は、対象において疾患、障害、および／または臨床症状を（本明細書で定義されているように）防止するのに十分である量である。いくらかの利益が対象にもたらされる限り、防止のレベルが完全である必要はないことを当業者は理解しているだろう。
【０１３５】
本発明の方法によりデングウイルス感染を処置および／または防止する効力は、当業者によりよく知られているように、対象の症状および／または臨床的パラメータ（例えば、ウイルス血症）の変化により示されるような臨床的向上を検出することにより決定することができる。
【０１３６】
他に指示がない限り、用語「保護する」、「保護すること」、「保護」、および「防御的」（およびその文法的語尾変化）は、デングウイルスの菌株、遺伝子型、または血清型の１つに対するものであろうと、複数に対するものであろうと、対象においてデングウイルス感染を防止する方法と処置する方法の両方を包含する。
【０１３７】
本明細書で用いられる場合、用語「防御」免疫応答または「防御」免疫は、免疫応答が、それが疾患、または感染の任意の他の徴候の発生率および／または重症度および／または持続期間を防止し、または低下させる点において、対象にいくらかの利益を与えることを示す。例えば、代表的な実施形態において、防御免疫応答または防御免疫は、臨床疾患を伴う、伴わないに関わらず、ウイルス血症の低下を生じる。あるいは、防御免疫応答または防御免疫は、既存の疾患の治療的処置において有用であり得る。
【０１３８】
「能動免疫応答」または「能動免疫」は、免疫原との遭遇後の宿主組織および細胞の関与により特徴づけられる。それは、リンパ細網組織における免疫担当細胞の分化および増殖を含み、それが、抗体の合成、もしくは細胞性反応の発生、または両方をもたらす。Ｈｅｒｂｅｒｔ  Ｂ．  Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ，  Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  ｉｎ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：  ＢＡＳＩＣ  ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ  １１７  （Ｊｏｓｅｐｈ  Ａ．  Ｂｅｌｌａｎｔｉ  ｅｄ．，  １９８５）。別の言い方をすれば、能動免疫応答は、感染またはワクチン接種による免疫原への曝露後、宿主により開始される。能動免疫は、受動免疫と対照をなし、受動免疫は、「能動免疫された宿主由来のあらかじめ形成された物質（抗体、トランスファー因子、胸腺移植片、インターロイキン２）の非免疫宿主への移入」を通して獲得される。同上。
【０１３９】
本発明の「対象」には、デングウイルスに感染しやすい任意の動物が挙げられる。そのような対象は、一般的に、哺乳類の対象（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、霊長類などの実験動物）、農業用もしくは商業用動物（例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ロバ、ヒツジなど）、または家庭用動物（例えば、ネコ、イヌ、フェレットなど）である。特定の実施形態において、対象は、霊長類の対象、非ヒト霊長類の対象（例えば、チンパンジー、ヒヒ、サル、ゴリラなど）、またはヒトである。本発明の対象は、デングウイルスによる感染のリスクがあることが知られた、または考えられる対象であり得る。あるいは、本発明による対象にはまた、デングウイルスに感染していること、またはデングウイルス感染についての処置を必要としていることを以前には知られても、もしくは疑われもしていない対象も挙げることができる。
【０１４０】
対象は、防御免疫応答を誘発するため、またはその対象において抗体の産生を誘発するためなどの任意の目的のために処置され得、その抗体は、収集されて、研究目的もしくは診断目的などの他の目的に、または他の対象に投与して、そこに受動免疫を生じさせるために用いることができる。
【０１４１】
対象には、新生児、若年、成熟、および老齢の対象を含む任意の年齢の男性および／または女性が挙げられる。ヒト対象に関して、代表的な実施形態において、対象は、乳児（生後約１２ヶ月未満、１０ヶ月未満、９ヶ月未満、８ヶ月未満、７ヶ月未満、６ヶ月未満、またはそれ未満）、幼児（例えば、少なくとも生後約１２ヶ月、１８ヶ月、もしくは２４ヶ月、および／または約３６ヶ月未満、３０ヶ月未満、もしくは２４ヶ月未満）、または小児（例えば、少なくとも約１歳、２歳、３歳、４歳、もしくは５歳、および／または約１４歳未満、１２歳未満、１０歳未満、８歳未満、７歳未満、６歳未満、５歳未満、もしくは４歳未満）であり得る。本発明の実施形態において、対象は、生後約０ヶ月から３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１５ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３０ヶ月、３６ヶ月、４８ヶ月、もしくは６０ヶ月まで、約３ヶ月から６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１５ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３０ヶ月、３６ヶ月、４８ヶ月、もしくは６０ヶ月まで、約６ヶ月から９ヶ月、１２ヶ月、１５ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３０ヶ月、３６ヶ月、４８ヶ月、もしくは６０ヶ月まで、約９ヶ月から１２ヶ月、１５ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３０ヶ月、３６ヶ月、４８ヶ月、もしくは６０ヶ月まで、約１２ヶ月から１８ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月、４８ヶ月、もしくは６０ヶ月まで、約１８ヶ月から２４ヶ月、３０ヶ月、３６ヶ月、４８ヶ月、もしくは６０ヶ月まで、または約２４ヶ月から３０ヶ月、３６ヶ月、４８ヶ月、もしくは６０ヶ月までであるヒト対象である。
【０１４２】
本発明の実施形態において、対象は、デングウイルスに対する母親由来抗体を有する。
【０１４３】
本発明の方法を「必要としている対象」は、デングウイルスに感染していることが知られた、もしくは感染しているのではないかと疑われる対象、または感染するリスクがある対象であり得る。
【０１４４】
本発明のデングウイルスのエピトープ、ポリペプチド、キメラフラビウイルスＶＬＰもしくはキメラフラビウイルス粒子、核酸、ベクター、細胞、または組成物、および薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤（例えば、免疫原性製剤）もまた提供され、知られた技術に従って、薬学的担体において、投与のために製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（最新版）を参照。本発明の実施形態による薬学的組成物の製造において、本発明の組成物は、典型的には、とりわけ、薬学的に許容される担体と混合される。「薬学的に許容される担体」とは、薬学的組成物における他の成分と適合性があり、その上、対象に対して危害（harmful）を加えず、有害（deleterious）でもない担体を意味する。担体は、固体もしくは液体、または両方であり得、好ましくは、本発明の組成物と共に、単位用量製剤、例えば、錠剤として製剤化され、その単位用量製剤は、約０．０１重量％または０．５重量％から約９５重量％または９９重量％までの組成物を含有し得る。薬学的組成物は、薬学のよく知られた技術のいずれかにより調製され、その技術には、任意で１つまたは複数の補助的成分を含む、コンポーネントを混合することが挙げられるが、それに限定されない。ある特定の実施形態において、薬学的に許容される担体は、無菌であり、担体を含む薬学的組成物についての規制ガイドラインに従って、ヒト対象への投与に適しているとみなされる。
【０１４５】
さらに、本発明による組成物の塩、担体、賦形剤、または希釈剤などの「薬学的に許容される」コンポーネントは、（ｉ）それが、意図された目的に適さない組成物を与えることなく、本発明の組成物と組み合わせることができる点において、組成物の他の成分と適合性であり、かつ（ｉｉ）過度の有害な副作用（例えば、毒性、刺激作用、およびアレルギー応答）なしに、ここに提供されているような対象に用いるのに適しているコンポーネントである。副作用は、それらのリスクが、その組成物によりもたらされる利益より上回る場合、「過度」である。薬学的に許容されるコンポーネントの非限定的例には、リン酸緩衝食塩水、水、油／水型乳濁液、マイクロエマルジョンなどの乳濁液、および様々な型の湿潤剤などの標準薬学的担体のいずれかが挙げられる。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、１つまたは複数のアジュバントをさらに含み得る。本発明のアジュバントは、アミノ酸配列の形、および／またはアジュバントをコードする核酸の形をとり得る。核酸の形をとる場合、アジュバントは、本発明のポリペプチドもしくは断片もしくはエピトープをコードする核酸の構成要素、および／または本発明のポリペプチドもしくは断片もしくはエピトープをコードする核酸を含む組成物の別個の構成要素であり得る。本発明によれば、アジュバントはまた、アジュバントとして機能するペプチド、タンパク質断片、もしくはタンパク質全体であるアミノ酸配列であり得、および／またはアジュバントは、アジュバントとして機能するペプチド、タンパク質断片、もしくはタンパク質全体をコードする核酸であり得る。本明細書で用いられる場合、「アジュバント」は、対象において免疫応答を増強し、向上させ、または別なふうに調節するために、本発明の組成物と組み合わせることができる任意の免疫調節物質であり得る物質を表す。
【０１４７】
さらなる実施形態において、アジュバントは、免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＧＭ／ＣＳＦ、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、インターフェロン−γ、インターロイキン−４、腫瘍壊死因子−α、インターロイキン−１、造血因子ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、Ｂ７．１共刺激分子およびＢ７．２共刺激分子が挙げられるが、それらに限定されない）、リン酸緩衝食塩水中、５パーセント（重量／体積）スクアレン（ＤＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、２．５パーセントＰｌｕｒｏｎｉｃ、Ｌ１２１ポリマー（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、および０．２パーセント  ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｓｉｇｍａ）で構成されるＳＹＮＴＥＸアジュバント製剤１（ＳＡＦ−１）であり得るが、それらに限定されない。適切なアジュバントにはまた、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）、リン酸アルミニウム、またはアルガンムリン（algannmulin）などのアルミニウム塩が挙げられるが、カルシウム、鉄、もしくは亜鉛の塩でもよく、あるいは、アシル化チロシン、またはアシル化糖、陽イオン性もしくは陰イオン性に誘導体化された多糖、またはポリホスファゼンの不溶性懸濁液であり得る。
【０１４８】
他のアジュバントは当技術分野においてよく知られており、それには、非限定的に、ＭＦ  ５９、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２（Ｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４（６）：７６６−７５  （２００５））、ＱＳ−２１、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれる、ＣＧＰ  １１６３７）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる、ＣＧＰ  １９８３５Ａ）、およびＲＩＢＩ（２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ  ８０乳濁液中に、細菌から抽出された３つのコンポーネント、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有する）が挙げられる。
【０１４９】
追加のアジュバントには、例えば、アルミニウム塩とのモノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）の組み合わせを挙げることができる。増強されたアジュバント系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組み合わせ、特に、国際公開第９４／００１５３号に開示されているようなＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせ、または国際公開第９６／３３７３９号に開示されているような、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチされている、より反応源性が低い組成物を含む。水中油型乳濁液においてＱＳ２１  ３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤は、国際公開第９５／１７２１０号に記載されている。加えて、本発明の核酸組成物は、抗原をコードするヌクレオチド配列、およびＣｐＧ配列などのアジュバント機能を提供するヌクレオチド配列を含むことによりアジュバントを含むことができる。そのようなＣｐＧ配列またはモチーフは当技術分野においてよく知られている。
【０１５０】
例えば、免疫刺激性サイトカインなどの、本発明と共に用いられるアジュバントは、対象への本発明の組成物の投与の前に、投与と同時に、ならびに／または投与前および／もしくは投与後の２、３時間、数時間、および／もしくは１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、および／もしくは１０日以内に投与することができる。
【０１５１】
さらに、免疫刺激性サイトカインなどのアジュバントの任意の組み合わせは、本発明の免疫原性組成物の投与前、投与後、および／または投与と同時に対象へ併用投与することができる。例えば、免疫刺激性サイトカインの組み合わせは、ＧＭ／ＣＳＦ、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、インターフェロン−γ、インターロイキン−４、腫瘍壊死因子−α、インターロイキン−１、造血因子ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、Ｂ７．１共刺激分子およびＢ７．２共刺激分子などの２つ以上の免疫刺激性サイトカインからなり得る。アジュバントまたはアジュバントの組み合わせの有効性は、本明細書に記載されているように、および当技術分野において知られているように、標準手順を用いて、アジュバントまたはアジュバントの組み合わせと共に、またはなしで、対象へのこの発明の組成物の投与に応答して生じた免疫応答を測定することにより決定することができる。
【０１５２】
本発明の実施形態において、アジュバントは、例えば、米国特許第７，８６２，８２９号に記載されているようにアルファウイルスアジュバントを含む。
【０１５３】
ブースト用量を、数日間、数週間、数か月間、または数年間の時間経過にわたってさらに投与することができる。慢性感染において、最初の高用量、続いてブースト用量が有利であり得る。
【０１５４】
本発明の薬学的製剤は、任意で、他の薬用作用物質、薬学的作用物質、安定化剤、バッファー、担体、希釈剤、塩、等張化剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなどを含むことができる。
【０１５５】
注射について、担体は、典型的には，液体である。投与の他の方法について、担体は、固体または液体のいずれでもよい。吸入投与について、担体は呼吸用であり、典型的には、固体粒子または液体粒子の形をとる。
【０１５６】
本発明の組成物は、知られた技術に従って、薬学的担体中に、投与のために製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （９ｔｈ  Ｅｄ．  １９９５）を参照。本発明による薬学的組成物の製造において、ＶＬＰは、典型的には、とりわけ、許容される担体と混合される。担体は、固体もしくは液体、または両方であり得、任意で、単位用量製剤、例えば、錠剤として化合物と製剤化される。様々な薬学的に許容される水性担体を用いることができ、例えば、水、緩衝用水、０．９％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸、発熱物質を含まない水、発熱物質を含まないリン酸緩衝食塩水、静菌水、またはＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）などである。これらの組成物は、通常の技術により滅菌することができる。本発明の製剤は、薬学のよく知られた技術のいずれかにより調製することができる。
【０１５７】
薬学的製剤は、そのまま用いるために、または凍結乾燥されて、パッケージングすることができ、凍結乾燥された調製物は、一般的に、投与前に無菌水溶液と混合される。組成物はさらに、単位用量または複数回用量の容器内、例えば、密封アンプルおよびバイアル内に、パッケージングすることができる。
【０１５８】
薬学的製剤は、薬学の通常の技術による当技術分野において知られた任意の方法により、投与のために製剤化することができる。例えば、組成物は、鼻腔内に、吸入（例えば、経口吸入）により、経口的に、頬側に（例えば、舌下に）、直腸性に、経腟的に、局所的に、くも膜下腔内に、眼内に、経皮的に、非経口投与により（例えば、筋肉内［例えば、骨格筋］、静脈内、皮下、皮内、胸膜内、脳内、および動脈内、くも膜下腔内）、または局所的に（例えば、気道表面を含む皮膚表面と粘膜表面の両方に）、投与されるように製剤化することができる。
【０１５９】
鼻腔内または吸入の投与について、薬学的製剤は、エアロゾル（この用語は、液体エアロゾルと乾燥粉末エアロゾルの両方を含む）として製剤化することができる。例えば、薬学的製剤は、界面活性剤および噴霧剤と共に微粉化された形で提供することができる。組成物の典型的なパーセンテージは、０．０１〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％である。界面活性剤は、一般的に、無毒であり、噴霧剤中に溶ける。そのような作用物質の代表は、脂肪族多価アルコールまたはそれの環状無水物との、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸（olesteric acid）、およびオレイン酸などの６個から２２個までの炭素原子を含有する脂肪酸のエステルまたは部分的エステルである。混合された、または天然のグリセリドなどの混合されたエステルが用いられ得る。界面活性剤は、組成物の０．１〜２０重量％、好ましくは０．２５〜５重量％である。組成物のその残りは通常、噴霧剤である。鼻腔内送達用のレシチンのように、担体もまた、必要に応じて、含むことができる。当業者に知られているように、圧力駆動型エアロゾル噴霧器または超音波噴霧器を用いるなどの任意の適切な手段によって液体粒子のエアロゾルを生じさせることができる。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号参照。同様に、固体粒子のエアロゾルを、薬学分野で知られた技術により、任意の固体粒子薬物エアロゾル発生装置で生じさせることができる。鼻腔内投与はまた、鼻腔表面への液滴投与によることができる。
【０１６０】
注射製剤は、液体の溶液もしくは懸濁液、注射前の液体中の溶解もしくは懸濁に適した固形として、または乳濁液としてのいずれかの通常の形で調製することができる。あるいは、全身的様式よりむしろ局所的様式に、例えば、デポーまたは徐放性製剤において、薬学的製剤を投与することができる。
【０１６１】
即時的注射溶液および懸濁液は、前に記載された種類の無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。例えば、密封容器内の単位剤形での本発明の注射可能の安定な無菌製剤を提供することができる。製剤は、凍結乾燥物の形で提供することができ、その凍結乾燥物を、対象への注射に適した液体組成物を形成するように、適切な薬学的に許容される担体で復元することができる。単位剤形は、約１μｇから約１０グラムまでの製剤であり得る。製剤が、実質的に不水溶性である場合、薬学的に許容されている十分な量の乳化剤が、水性担体において製剤を乳化するのに十分な量で含まれ得る。１つのそのような有用な乳化剤はホスファチジルコリンである。
【０１６２】
経口投与に適した薬学的製剤は、カプセル剤、カシェ剤、ロゼンジ、もしくは錠剤などの別々の単位で、粉末もしくは顆粒として、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型乳濁液として提供することができる。経口送達は、動物の腸における消化酵素による分解に耐える能力がある担体へ本発明の化合物を複合体化させることにより実施することができる。そのような担体の例には、当技術分野において知られているように、プラスチックのカプセル剤または錠剤が挙げられる。そのような製剤は、そのタンパク質と適切な担体（上で言及されているように１つまたは複数の補助的成分を含有してもよい）を会合させるステップを含む、薬学の任意の適切な方法により調製される。一般的に、薬学的製剤は、化合物を液体担体もしくは微粉化された固体担体、または両方と均一かつ密接に混合し、その後、必要にならば、生じた混合物を成形することにより調製される。例えば、錠剤は、任意で１つまたは複数の補助的成分と共に、粉末または顆粒を圧縮または成型することにより調製することができる。圧縮化錠剤は、適切な機械において、任意で結合剤、潤滑剤、不活性な希釈剤、および／または表面活性剤／分散剤と混合された粉末または顆粒などの自由流動性の形をとる製剤を圧縮することにより調製される。成型化錠剤は、適切な機械において、不活性な液体結合剤で湿った粉末タンパク質を成型することにより作製される。
【０１６３】
頬側（舌下）投与に適した薬学的製剤には、香味づけた基剤、通常にはスクロース、およびアラビアゴムまたはトラガカントゴム中に化合物を含むロゼンジ、ならびにゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性な基剤中のトローチ剤が挙げられる。
【０１６４】
非経口投与に適した薬学的製剤は、無菌水性および非水性注射液を含み得、その調製物は、好ましくは、意図されたレシピエントの血液と等張である。これらの調製物は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および（組成物を、意図されたレシピエントの血液と等張にする）溶質を含有することができる。水性および非水性の無菌の懸濁液、溶液、および乳濁液は、懸濁剤および増粘剤を含むことができる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール性／水性溶液、食塩水および緩衝媒体を含む、乳濁液または懸濁液が挙げられる。非経口媒介物には、塩化ナトリウム溶液、リンゲル液デキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が挙げられる。静脈内媒介物には、流動性栄養補充液、電解質補充液（例えば、リンゲル液デキストロースに基づいたものなど）などが挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなどの保存剤および他の添加剤もまた、存在し得る。
【０１６５】
直腸投与に適した薬学的製剤は、任意で、単位用量坐剤として提供される。これらは、活性物質を、例えば、カカオバターなどの１つまたは複数の通常の固体担体と混合し、その後、生じた混合物を成形することにより調製することができる。
【０１６６】
皮膚への局所投与に適した薬学的製剤は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、またはオイルの形をとる。用いることができる担体には、石油ゼリー、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮吸収促進剤、およびそれらの２つ以上の組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、例えば、局所送達は、本発明の薬学的製剤を、皮膚を通過する能力がある親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と混合することにより実施することができる。
【０１６７】
経皮投与に適した薬学的製剤は、対象の表皮と密接に接触して、長期間、留まるのに適応した別々のパッチの形をとり得る。経皮投与に適した製剤はまた、イオン泳動により送達することができ（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：３１８  （１９８６）参照）、典型的には、化合物の緩衝水溶液の形をとる。適切な製剤は、クエン酸バッファーもしくはビス／トリスバッファー（ｐＨ６）、またはエタノール／水を含むことができ、０．１Ｍから０．２Ｍまでの活性成分を含有することができる。
【０１６８】
本発明の実施形態において、この発明のウイルス粒子の用量は、約１０３〜約１０８のプラーク形成単位／フォーカス形成単位（ＰＦＵ／ＦＦＵ）の範囲であり得る。この発明の実施形態において、この発明のＶＬＰの用量は、約５００マイクログラム〜約５ミリグラムの範囲であり得る。この発明の実施形態において、この発明のタンパク質の用量は、約１００〜約１０４マイクログラム＋／−アジュバントの範囲であり得る。
【０１６９】
さらに、組成物は、リポソーム製剤として製剤化することができる。用いられる脂質層は、任意の便利な組成であり得、コレステロールを含有することも、またはコレステロールを含まないこともいずれでもあり得る。生成されるリポソームは、例えば、標準超音波処理およびホモジナイゼーション技術の使用によって、サイズを減少させることができる。
【０１７０】
リポソーム製剤は、水などの薬学的に許容される担体で復元されて、リポソーム懸濁液を再生することができる凍結乾燥物を生じるように、凍結乾燥することができる。
【０１７１】
本発明の免疫原性組成物は、任意で、無菌であり得、さらに、密閉された病原体不透過性容器内で提供することができる。
【実施例】
【０１７２】
［実施例１］
デング３とデング４の間の複雑な四次血清型特異的中和抗体エピトープの移植が、ポリクローナル中和応答の決定基を明らかにする
デングウイルス（ＤＥＮＶ）は、世界中で最も重大なヒトアルボウイルス疾患であり、毎年、３億人以上の感染者がいる。しかしながら、ＤＥＮＶ感染に対するヒト免疫応答の決定基はほとんど不明のままである。したがって、本発明者らは、ヒトにおけるＤＥＮＶ感染に対する抗体（Ａｂ）応答を特徴づけるためのツールを開発することに着手した。逆遺伝学を用いて、本発明者らは、Ａｂ−ウイルス相互作用を研究することを可能にする全ての４つのＤＥＮＶ血清型についての感染性クローン（ＩＣ）を開発した。モノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）のパネルの特徴づけにより、ＤＥＮＶ３の強い型特異的中和Ａｂが同定された。構造情報に基づくアプローチを用いて、中和のエスケープをもたらす突然変異を含むエンベロープ（Ｅ）タンパク質ドメインＩ／ＩＩ（ＥＤＩ／ＩＩ）ヒンジ領域の１２Å領域を同定し、ヒトにおけるこのエピトープのポリクローナル免疫応答への寄与を評価するために、ＤＥＮＶ４からＤＥＮＶ３へ移植した（ｒＤＥＮＶ３／４）。興味深いことに、このｒＤＥＮＶ３／４は、ＤＥＮＶ３血清に対して抵抗性になると同時に、ヒトＤＥＮＶ４免疫血清による中和に対する完全な感受性を獲得し、このＥＤＩ／ＩＩヒンジ領域が、型特異的中和応答の主要な決定基を含有することを示している。ＤＥＮＶ４への相互移植を行った時、ｍＡｂ結合は、保持されず、中和プロフィールの有意なシフトはなく、レシピエントＤＥＮＶ血清型における隣接残基が、ビリオン表面上のエピトープ提示において役割を果たすことを示している。ＤＥＮＶ３からＤＥＮＶ４への５個のアミノ酸残基の追加は、ｍＡｂ結合および中和を回復させることができたが、ポリクローナル血清中和はほとんど変化しないままであった。最後に、本発明者らは、複数のＥ二量体に及ぶ残基を含む複雑な四次エピトープをＤＥＮＶ４へ移動させた（ｒＤＥＮＶ４／３）。このＤＥＮＶ４／３は、生存可能であり、高い感染力価へと成長し、ＤＥＮＶ３免疫血清に対する感受性を示し、同時に、ＤＥＮＶ４に対する中和応答は、ほとんど変化しないままであった。これらの結果は、合理的に設計されたＤＥＮＶワクチンプラットフォームの未来開発を導くことができる型特異的中和応答の決定基への洞察を与えている。
【０１７３】
「実施例２」
デング３およびデング４の両方の型特異的中和決定基を捕獲する組換えデング４ウイルスの開発および特徴づけ
組換えＤＥＮＶ４作製のための逆遺伝学プラットフォームの開発
本発明者らは、組換えＤＥＮＶ３（ｒＤＥＮＶ３）の産生のための逆遺伝学系の作製および特徴づけを前に記載している（図１、パネルＡ）。同様の技術を利用して、本発明者らは、１９８９年にスリランカで単離され、かつジェノグループ（genogroup）Ｉに属するＤＥＮＶ４の臨床分離株についてのｃＤＮＡ感染性クローン（ＩＣ）系を開発している。大腸菌における細菌プラスミド増幅中の不安定性および毒性を回避するために、ＤＥＮＶ４ゲノムを４個の異なる断片へサブクローニングした（図１、パネルＡ）。ＤＥＮＶ４ゲノムにおけるヌクレオチド（ＮＴ）位置３２１６（ＰｆｌＭＩ；認識配列：ＣＣＡＡＡＣＡＧＴＧＧ、配列番号７）、位置５４８２（ＤｒａＩＩＩ；ＣＡＣＣＡＧＧＴＧ）、および位置８８５５（ＰｆｌＭＩ；ＣＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧ、配列番号８）での天然に存在するクラスＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を利用して、ゲノムｃＤＮＡを分割した。さらに、その細菌ベクター内で、かつＴ７プロモーター配列の上流のＥｃｏＲＶ部位を用いて、ゲノムの５’末端を生じさせ、一方、ベクターにおけるＢｓｍＢＩ部位を３’ゲノム末端のために用いた（図１、パネルＡ）。ゲノムｃＤＮＡ断片を含有するプラスミドの細菌増幅後、プラスミドを、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化し、アガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、５’キャップ類似体を含有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼで転写した。その後、インビトロで転写されたＲＮＡを、ベロ−８１細胞またはＢＨＫ−２１細胞のいずれかへ電気穿孔した。細胞を４〜６日間、培養し、その時点で上清を収集し、遠心分離により清澄化し、さらに４日間、Ｃ６／３６（ヒトスジシマカ（Aedes albopictus））細胞上へ継代した。再び、上清を収集し、清澄化し、作業用ウイルスストックとして用いるために力価測定した。ｒＤＥＮＶ４は、親の天然分離株のと同一の表現型性質（成長速度、ピーク感染力価、および感染巣形態／サイズ）を示した。
【０１７４】
型特異的中和ＤＥＮＶ３  ｍＡｂエピトープのＤＥＮＶ４への移植
前の研究は、ＤＥＮＶ３に特異的な、強く型特異的なヒトモノクローナル抗体（ｈｍＡｂ）（５Ｊ７）を同定した。しかしながら、これらの研究は、このｈｍＡｂからのＤＥＮＶ３中和のエスケープをもたらす単一の点突然変異を同定しただけだった。このｈｍＡｂエピトープをさらに特徴づけるために、本発明者らは、本発明者らの新規の逆遺伝学プラットフォームを用いて、このエピトープを含むアミノ酸（ＡＡ）残基をＤＥＮＶ３からＤＥＮＶ４へ移植しようとした。公開されたエスケープ突然変異と未公開のエスケープ突然変異の両方をガイドとして用いて、エンベロープドメインＩ／ＩＩ（ＥＤＩ／ＩＩ）ヒンジ領域を含む約１２オングストローム周径を、ＤＥＮＶ３  Ｅタンパク質結晶構造上に、抗体エピトープ：パラトープ結合領域のフットプリントに近づけるように重ねた。ＤＥＮＶ３とＤＥＮＶ４の間のＡＡおよびＮＴアラインメント後、血清型間バリアントＡＡを同定し、ＤＥＮＶ３からＤＥＮＶ４への移植用に選択した。ＤＥＮＶ４  ＩＣにおけるＮＴ配列を、ＤＥＮＶ３に適合するＡＡ変化を促進するように改変し、これらの変化を捕獲するサブゲノムｃＤＮＡを合成した（ＢｉｏＢａｓｉｃ；Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）。ｒＤＥＮＶを上記のように作製し、回収されたウイルスを表現型特徴づけのために用いた。エピトープ移植の成功の可能性を最大限にするために、３個の異なるｒＤＥＮＶを作製し、それぞれが、連続的追加のＤＥＮＶ３残基を含有し、したがって、より大きい理論上のエピトープフットプリントを移植する。これらのｒＤＥＮＶは、ＤＥＮＶ４  Ｍ１２、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４、およびＤＥＮＶ４  Ｍ１６と名付けられており、増加性サイズのＤＥＮＶ３配列がそれぞれ、移植されている（図１、パネルＢ〜Ｃ）。注目すべきことには、ＤＥＮＶ４  Ｍ１６へのＤＥＮＶ３移植は、５Ｊ７の仮説上の複雑な四次エピトープを含み、本発明者らの知る限りでは、この手のエピトープが初めて、異なるウイルス間で移植されていることを表している。
【０１７５】
ｒＤＥＮＶ４／３ウイルスは生存可能であり、インビトロで明確な適応度特性を示す
ｒＤＥＮＶ４／３ウイルス（ＤＥＮＶ４  Ｍ１２、Ｍ１４、およびＭ１６）の３つ全ては、エレクトロポレーションおよびその後のＣ６／３６細胞上での継代後、回収に成功した。Ｃ６／３６細胞からの（およびベロ−８１細胞上での病巣形成アッセイにより測定された）ピーク感染力価は、親のＷＴ  ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４  ＩＣのそれに匹敵することが見出された（図２、パネルＡ）。ＤＥＮＶ４  Ｍ１２およびＭ１４は、ＷＴ  ＤＥＮＶ３のと類似したピーク力価を示し、それらの全部が、この系においてＷＴ  ＤＥＮＶ４のそれよりおよそ１ｌｏｇ１０の低下である。しかしながら、ＤＥＮＶ４  Ｍ１６は、より減弱した成長表現型を示し、ピーク力価は、約２×１０６ｆｆｕ／ｍｌ（ＷＴ  ＤＥＮＶ３の約５０分の１、ＷＴ  ＤＥＮＶ４の約３００分の１）に達した（図２、パネルＡ）。それに応じて、感染巣サイズもまた、ｒＤＥＮＶにおいて、それらのＷＴ親と比較して小さかった。ＤＥＮＶ４  Ｍ１２およびＭ１４病巣は、ＷＴより小さいが、それでも、ＤＥＮＶ４  Ｍ１６より有意に大きく、ＤＥＮＶ４  Ｍ１６は、ベロ−８１細胞上に非常に小さいピンポイント病巣を形成している（図２、パネルＢ）。
【０１７６】
同様の適応度分析を、Ｃ６／３６蚊細胞上で行った。多段階成長曲線（ＭＯＩ＝０．０１）を、ＤＥＮＶ４  Ｍ１２、Ｍ１４、Ｍ１６、ならびに親ＷＴ  ＤＥＮＶ３および親ＷＴ  ＤＥＮＶ４上で実施した（図３、パネルＡ）。一般的に、初期時点（＜９６接種後時間（ｈｐｉ））において有意な適応度欠損は見られないが、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４は、１４４ｈｐｉにおけるバーストを示す前に、９６ｈｐｉおよび１２０ｈｐｉにおいてＷＴより遅れた。さらに、ＤＥＮＶ４  Ｍ１６は、１２０ｈｐｉ以降、成長速度の減少を示し、感染力価は、他の株より約２ｌｏｇ１０の低下であった。各場合において、細胞の健康がこの減弱の一因となっている可能性があり、それゆえに、さらなる調査が必要とされる。しかしながら、これらのデータは、感染における少なくとも初期時点において、ｒＤＥＮＶが、ＷＴ  ＤＥＮＶと比較して、節足動物細胞において有意な成長減弱を示さないことを示している。興味深いことに、ベロ細胞とは対照的に、ＤＥＮＶ４  Ｍ１２、Ｍ１４、Ｍ１６の感染巣（図３、パネルＢ）は、ＷＴ  ＤＥＮＶ３もしくは４と比較して、またはお互いに、サイズまたは形態の実質的違いを示していない。これは、成長曲線データとよく相関しており、ｒＤＥＮＶ減弱の決定因子が、一般的に、ベロ−８１細胞および／または哺乳類細胞に特異的な細胞型であり得ることを示唆している。これらのデータは、ＤＥＮＶ３の移植された領域を含有するｒＤＥＮＶ４ウイルスが、生存可能であり、かつさらなる特徴づけのための適切な成長特性を示すことを示している。
【０１７７】
ｒＤＥＮＶ４／３はｈｍＡｂ  ５Ｊ７に対する様々な程度の反応性を示す
３つのｒＤＥＮＶにおける、ｈｍＡｂ  ５Ｊ７に対するエピトープがＤＥＮＶ３からＤＥＮＶ４へ移植されたレベルを決定するためにアッセイを実施した。ＤＥＮＶ３特異的ｈｍＡｂ  ５Ｊ７の、ＷＴウイルスおよびｒＤＥＮＶウイルスの両方との結合を評価するためにＥＬＩＳＡを行った。これらにより、５Ｊ７はＷＴ  ＤＥＮＶ３と結合したが、ＷＴ  ＤＥＮＶ４と結合せず、前のデータと一致することが明らかにされた。興味深いことに、５Ｊ７は、ＤＥＮＶ４  Ｍ１２を全く結合することができなかったが、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４およびＭ１６の両方は、ＷＴ  ＤＥＮＶ３のレベルに近く、またはそれを超えるレベルで５Ｊ７結合を促進するのにＤＥＮＶ３エピトープを十分、提示した（図４、パネルＡ）。これらのデータは、わずか４個のＡＡ（ＤＥＮＶ４  Ｍ１２とＭ１４の間での移植されたＡＡにおける違い）が、５Ｊ７のＤＥＮＶ４  Ｍ１４との結合を与えるのに関与したことを示している。これらの結合研究への推論として、ウイルス中和アッセイを、５Ｊ７を用いて実施し、ｒＤＥＮＶ４パネルの中和に対する感受性を評価した。ＥＬＩＳＡ結合データと一致して、ＤＥＮＶ４  Ｍ１２は、５Ｊ７で中和され得ず、一方、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４およびＭ１６の両方は、５Ｊ７により、ＷＴ  ＤＥＮＶ３のＡｂ濃度に匹敵するＡｂ濃度で中和された（図４ＢおよびＣ）。意義深いことには、これらの結果は、高度に異なる（成熟対未成熟）ウイルス粒子について中和感受性を獲得していると考えられた２つの異なる細胞株（ベロ−８１、およびＤＣ−ＳＩＧＮを発現するＵ９３７）において、（ＤＥＮＶ４  Ｍ１４について）一貫性があり、これらのｒＤＥＮＶの粒子成熟状態が５Ｊ７中和に影響を及ぼし得ないことを示している。
【０１７８】
ｒＤＥＮＶ４／３はポリクローナル血清中和に対する二価感受性を有する
本発明者らのｒＤＥＮＶ４／３パネルの、ポリクローナル抗体中和に対する感受性を評価するために、一次ＤＥＮＶ感染後の回復期患者から収集されたドナー血清を、病巣低下アッセイ（ベロ−８１）およびフローサイトメトリに基づいたアッセイ（Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ）に用いた。ＥＬＩＳＡ結合アッセイおよび５Ｊ７  ｈｍＡｂ中和アッセイと同様に、ＤＥＮＶ４  Ｍ１２は、ベロ細胞においてＤＥＮＶ３特異的血清による中和に対する感受性の増加を示さなかった（図５、パネルＤ）。しかしながら、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４は、ベロ細胞において、ＷＴ  ＤＥＮＶ３のとほとんど同一で、かつＷＴ  ＤＥＮＶ４のより有意に高い中和表現型を示し（図５、パネルＡ〜Ｃ）、このｒＤＥＮＶ４／３ウイルスが、ヒトにおける自然ＤＥＮＶ３感染により生じたポリクローナル抗体応答による中和に対する感受性を獲得したことを示している。さらに、この表現型は、Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞において確認され、ＤＥＮＶ４  Ｍ１６に広げられ（図５、パネルＥ〜Ｇ）、その場合、どちらのｒＤＥＮＶについても、ＤＥＮＶ３抗血清によるポリクローナル中和は、ＷＴ  ＤＥＮＶ３に匹敵したが、ＷＴ  ＤＥＮＶ４は、最低の血清希釈度（１：２０）においてさえも中和されなかった。ベロ細胞におけるＤＥＮＶ４  Ｍ１６の小さい病巣表現型のために、この細胞型における中和アッセイは技術的に困難であり、それゆえに、このｒＤＥＮＶについての中和データは、Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮに制限され、そのフローサイトメトリに基づいたアッセイは、減弱したウイルスにおいてさえも容易に実施されるからである。まとめると、これらのデータは、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４およびＭ１６は、ＤＥＮＶ３型特異的中和のポリクローナル決定基を捕獲しており、中和感受性において二価を示すことを示している。
【０１７９】
本発明者らのｒＤＥＮＶのＤＥＮＶ３ポリクローナル中和に対する感受性の獲得に加えて、本発明者らは、ＤＥＮＶ４  Ｍ１２、Ｍ１４、およびＭ１６のＤＥＮＶ４中和感受性の保持および／または喪失を決定することに関心をもった。この目的を達成するために、回復期の一次ＤＥＮＶ４患者から収集された血清を用いて、ベロ（図６、パネルＡ）およびＵ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ（図６、パネルＢ〜Ｄ）において中和アッセイを実施した。ＤＥＮＶ４  Ｍ１２は、ベロ細胞においてＷＴ  ＤＥＮＶ４よりわずかに低い中和価を示したが（図６、パネルＡ）、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４およびＭ１６は、どちらの細胞型においても、ＷＴ  ＤＥＮＶ４と等しく、またはそれを超える中和価を有した（図６、パネルＡ〜Ｄ）。この重要な所見は、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４についての型特異的中和の決定基が、Ｅ糖タンパク質上の別々のエレメントであること、ならびにその２つの決定基ＡＡ配列が、お互いを変化させることなく、組み合わせられ得ることを示唆している。それゆえに、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４およびＭ１６は、両方のワクチン診断学のための重要な試薬として、または新しく、および／もしくは向上したワクチン候補の開発を導くために利用される可能性がある。
【０１８０】
ｒＤＥＮＶ４／３ポリクローナル中和感受性は特異的である
ｒＤＥＮＶ４／３ウイルスのパネルが、非特異的様式での中和に対するそれらの感受性を増加させるように改変されている可能性を排除するために、回復期のヒト患者から収集された一次ＤＥＮＶ１およびＤＥＮＶ２血清での中和アッセイを実施した。一次ＤＥＮＶ１血清は、高レベルで中和されたＷＴ  ＤＥＮＶ１とは正反対に、ベロ細胞においてＤＥＮＶ４  Ｍ１２またはＭ１４のいずれも全く中和できなかった（図７、パネルＡ〜Ｂ）。さらに、ＤＥＮＶ２血清もまた、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４を中和できなかったが、試験された１つの試料は、ＷＴ  ＤＥＮＶ２のよりはるかに低いレベルではあるが、ＤＥＮＶ４  Ｍ１２を中和した（図７、パネルＣ〜Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ＤＥＮＶ４背景におけるＤＥＮＶ３中和感受性の獲得はＤＥＮＶ３特異的であり、ｒＤＥＮＶパネルをヘテロタイプの血清による中和に対して感受性をより高くさせる全体的な構造変化の結果ではないことを示している。
【０１８１】
［実施例３］
デング１およびデング２の両方の型特異的中和決定基を捕獲する組換えデング２ウイルスの開発および特徴づけ
組換えＤＥＮＶ１およびＤＥＮＶ２作製のための逆遺伝学プラットフォームの開発
本発明者らは、組換えＤＥＮＶ３（ｒＤＥＮＶ３）の産生のための逆遺伝学系の作製および特徴づけを前に記載している。同様の技術を利用して、本発明者らは、２００７年のニカラグアにおけるエピデミックから単離されたＤＥＮＶ２の臨床分離株（Ｖ１２１０）と共に、ＤＥＮＶ１  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｐａｃｉｆｉｃ  １９７４（ＷｅｓｔＰａｃ７４）についてのｃＤＮＡ感染性クローン（ＩＣ）系を開発している。大腸菌における細菌プラスミド増幅中の不安定性および毒性を回避するために、両方のゲノムを４個の異なる断片へサブクローニングした（図８、パネルＡ）。ＤＥＮＶ１ゲノムにおけるヌクレオチド（ＮＴ）位置２０５２（ＰｆｌＭＩ；認識配列：ＣＣＡＣＣＴＴＴＴＧＧ、配列番号９）、４２１５（ＰｆｌＭＩ；ＣＣＡＣＴＡＧＣＴＧＧ、配列番号１０）、および８５６３（ＰｆｌＭＩ；ＣＣＡＡＡＣＣＡＴＧＧ、配列番号１１）での天然に存在するクラスＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を利用して、ゲノムｃＤＮＡを分割した。さらに、その細菌ベクター内で、かつＴ７プロモーター配列の上流のＥｃｏＲＶ部位を用いて、ゲノムの５’末端を生じさせ、一方、ベクターにおけるＳａｐＩ部位を３’ゲノム末端のために用いた（図８、パネルＡ）。ＤＥＮＶ２について、第１のゲノム分割は、位置２３４０（断片Ａとベクターの間のＤｒａＩＩＩ；認識配列：ＣＡＣＴＧＴＧＴＧ）で生じた。ゲノム配列を保存するために、ＤｒａＩＩＩ部位（ＣＡＣｎｎｎＧＴＧ）を、Ａ断片の３’末端に利用し、一方、ＡｌｗＮＩ（ＣＡＧｎｎｎＣＴＧ）部位を、Ｂ断片の５’末端に用いた。認識部位のベクター領域（かつＤＥＮＶゲノム配列ではない）におけるエンドヌクレアーゼ認識配列を突然変異させることにより、これらの２つの制限エンドヌクレアーゼ消化物のライゲーションされた生成物は、消化を促進するためのＤＥＮＶゲノムへの突然変異の導入なしに、天然ＤＥＮＶ２ゲノム配列を保存する。ＮＴ４６６２（ＤｒａＩＩＩ；ＣＡＣＧＴＧＧＴＧ）、および７４１４（ＤｒａＩＩＩ；ＣＡＣＡＣＴＧＴＧ）における追加のゲノム接合部を利用して、ゲノムｃＤＮＡを分割した。さらに、その細菌ベクター内で、かつＴ７プロモーター配列の上流のＳｐｅＩ部位を用いて、ゲノムの５’末端を生じさせ、一方、ベクターにおけるＥｃｉＩ部位を３’ゲノム末端のために用いた（図８、パネルＡ）。ゲノムｃＤＮＡ断片を含有するプラスミドの細菌増幅後、プラスミドを、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化し、アガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、５’キャップ類似体を含有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼで転写した。その後、インビトロで転写されたＲＮＡを、ベロ−８１細胞またはＢＨＫ−２１細胞のいずれかへ電気穿孔した。細胞を４〜６日間、培養し、その時点で上清を収集し、遠心分離により清澄化し、さらに４日間、Ｃ６／３６（ヒトスジシマカ）細胞上へ継代した。再び、上清を収集し、清澄化し、作業用ウイルスストックとして用いるために力価測定した。ｒＤＥＮＶ１およびｒＤＥＮＶ２は、親の天然分離株のと同一の表現型性質（成長速度、ピーク感染力価、および感染巣形態／サイズ）を示した（データ未呈示）。
【０１８２】
強中和性ＤＥＮＶ１  ｍＡｂエピトープのＤＥＮＶ２  ＩＣへの移植
前の研究は、ＤＥＮＶ１に特異的な、強く型特異的なヒトモノクローナル抗体（ｈｍＡｂ）（１Ｆ４）を同定した。ＤＥＮＶ１と結合したこのｈｍＡｂの結晶構造、および同定された接触アミノ酸（ＡＡ）残基を利用して、本発明者らは、本発明者らの新規の逆遺伝学プラットフォームを用いて、このエピトープを含むＡＡ残基をＤＥＮＶ１からＤＥＮＶ２へ移植しようとした。ＤＥＮＶ１とＤＥＮＶ２の間のＡＡおよびＮＴアラインメント後、血清型間バリアントＡＡを同定し、ＤＥＮＶ１からＤＥＮＶ２への移植のために選択した。ＤＥＮＶ２  ＩＣにおけるＮＴ配列を、ＤＥＮＶ１に適合するＡＡ変化を促進するように改変し（図８、パネルＢ〜Ｃ）、これらの変化を捕獲するサブゲノムｃＤＮＡを合成した（ＢｉｏＢａｓｉｃ；Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）。ｒＤＥＮＶを上記のように作製し、回収されたウイルスを表現型特徴づけに用いた。このｒＤＥＮＶは、ＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅと名付けられている（図８、パネルＢ〜Ｃ）。
【０１８３】
ｒＤＥＮＶ２／１ウイルスは、生存可能であり、インビトロで明確な適応度特性を示す
ｒＤＥＮＶ２／１は、エレクトロポレーションおよびその後のＣ６／３６細胞上での継代後、回収に成功した。Ｃ６／３６細胞からのピーク感染力価が測定され、Ｃ６／３６細胞における親のＷＴ  ＤＥＮＶ１およびＤＥＮＶ２  ＩＣのそれに匹敵することを見出されたが（図９、パネルＢ）、ベロ細胞において非常に減弱していた（およそ３ｌｏｇ１０）（図９、パネルＡ）。適応度分析を、Ｃ６／３６蚊細胞上で、多段階成長曲線（ＭＯＩ＝０．０１）を用いて行った（図９、パネルＣ）。一般的に、初期時点（＜９６接種後時間（ｈｐｉ））では、有意な適応度欠損は見られなかった。ＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅは、９６ｈｐｉにおける力価の降下を示したが、これは、１２０ｈｐｉ以降、力価はＷＴ  ＤＥＮＶ１および２と等価であったため、その場限りの遅れであった（図９、パネルＣ）。細胞の健康が、このその場限りの減弱した時点において影響を及ぼしている可能性があり、それゆえに、さらなる調査が必要とされる。しかしながら、これらのデータは、ＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅが、ＷＴ  ＤＥＮＶ１および２と比較して、節足動物細胞において有意な成長減弱を示さないことを示している。成長速度データに応じて、ＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅ（図９、パネルＤ）は、ＷＴ  ＤＥＮＶ１および２と比較して、感染巣のサイズまたは形態の実質的違いを示していない。これらのデータは、ＤＥＮＶ１の移植された領域を含有するｒＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅが生存可能であり、さらなる特徴づけのための適切な成長特性を示すことを示している。
【０１８４】
ｈｍＡｂ  １Ｆ４はｒＤＥＮＶ２／１と結合する
ＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅにおける、ｈｍＡｂ  １Ｆ４に対するエピトープがＤＥＮＶ１からＤＥＮＶ２へ移植されたレベルを決定するためにアッセイを実施した。ＤＥＮＶ１特異的ｈｍＡｂ  １Ｆ４の、ＷＴウイルスおよびｒＤＥＮＶウイルスの両方との結合を評価するためにＥＬＩＳＡを行った。これらにより、１Ｆ４はＷＴ  ＤＥＮＶ１と結合したが、ＷＴ  ＤＥＮＶ２と結合せず、前のデータと一致することが明らかにされた。興味深いことに、１Ｆ４は、ＷＴ  ＤＥＮＶ１に匹敵するレベルでＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅと結合した（図１０、パネルＡ）。これらのデータは、ＤＥＮＶ１と結合した１Ｆ４の結晶構造において同定された残基が、ＤＥＮＶ１とＤＥＮＶ２の間で、モノクローナルＡｂ結合を移植するのに十分であることを示している。これらの結合研究への推論として、ウイルス中和アッセイを、１Ｆ４およびＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅを用いて実施した。ＥＬＩＳＡ結合データと一致して、ＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅは、ＷＴ  ＤＥＮＶ１のＡｂ濃度に匹敵するＡｂ濃度での１Ｆ４により中和された（図１０、パネルＢ〜Ｃ）。意義深いことには、これらの結果は、２つの異なる細胞株（Ｃ６／３６、およびＤＣ−ＳＩＧＮを発現するＵ９３７）において、一貫性がある。
【０１８５】
ｒＤＥＮＶ２／１はポリクローナル血清中和に対する二価感受性を有する
本発明者らのｒＤＥＮＶ２／１ウイルスの、ポリクローナル抗体中和に対する感受性を評価するために、一次ＤＥＮＶ１感染後の回復期患者から収集されたドナー血清を、フローサイトメトリに基づいた（Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ）アッセイに用いた。ベロ細胞におけるＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅの小さい病巣表現型のために、この細胞型における中和アッセイは技術的に困難であり、それゆえに、このｒＤＥＮＶについての中和データは、Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮに制限され、そのフローサイトメトリに基づいたアッセイは、減弱したウイルスにおいてさえも容易に実施されるからである。ＥＬＩＳＡ結合アッセイおよび１Ｆ４  ｈｍＡｂ中和アッセイと同様に、ＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅは、Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞において、ＷＴ  ＤＥＮＶ１とほぼ同一で、かつＷＴ  ＤＥＮＶ２より有意に高い、中和表現型を示し（図１１、パネルＡ〜Ｂ）、このｒＤＥＮＶ２／１ウイルスが、ヒトにおける自然ＤＥＮＶ１感染により生じたポリクローナル抗体応答による中和に対する感受性を獲得していることを示している。ｈｍＡｂ  １Ｆ４データと共にこれらのデータは、ＤＥＮＶ２−１Ｆ４ＥがＤＥＮＶ１型特異的中和のポリクローナル決定基を獲得し、中和感受性において二価性を示すことを示している。
【０１８６】
本発明者らのｒＤＥＮＶのＤＥＮＶ１ポリクローナル中和に対する感受性の獲得に加えて、本発明者らは、ＤＥＮＶ２−１Ｆ４ＥのＤＥＮＶ２中和感受性の保持および／または喪失を決定することに関心をもった。この目的を達成するために、回復期の一次ＤＥＮＶ２患者から収集された血清を用いて、Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮにおいて中和アッセイを実施した（図１１、パネルＣ〜Ｅ）。意義深いことには、ＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅは、全ての場合において、ＷＴ  ＤＥＮＶ２と等しく、またはそれを超える中和価を有した。この所見は、ＤＥＮＶ１およびＤＥＮＶ２についての型特異的中和の決定基が、Ｅ糖タンパク質上の別々のエレメントであること、ならびにその２つの決定基ＡＡ配列が、お互いを変化させることなく、組み合わせられ得ることを示唆している。それゆえに、ＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅは、両方のワクチン診断学のための重要な試薬として、または新しく、および／もしくは向上したワクチン候補の開発を導くために利用される可能性がある。
【０１８７】
ｒＤＥＮＶ２／１は、ＤＥＮＶ発病のマウスモデルにおいて減弱する
本発明者らのキメラｒＤＥＮＶの減弱のレベルを評価するために、本発明者らは、ＤＥＮＶ疾患の免疫不全マウスモデルにおいて、ＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅの死亡率をそれの親のＷＴ  ＤＥＮＶ１およびＤＥＮＶ１と比較した。インターフェロンα／β受容体およびインターフェロンγ受容体の両方が欠損したＣ５７ＢＬ／６に、３．３×１０６ｆｆｕ（Ｃ６／３６力価）のＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、またはＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅを腹腔内に接種した。マウスの体重を計り、研究の終了まで５６ｄｐｉの間、マウスをモニターした。図１２に示されているように、ＷＴ  ＤＥＮＶ１およびＤＥＮＶ２を接種されたマウスは、８０％より高い死亡率を示したが、等価用量のＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅを受けたマウスのいずれも、感染に屈せず（ｐ＝０．００７６）、このｒＤＥＮＶについての高程度の減弱を示している。これらのデータは、二価ウイルスを作製するためのＤＥＮＶのキメラ化が、ワクチン開発に適し得るインビボ弱毒のレベルを導入することを示している。
【０１８８】
［実施例４］
血清型２中和ヒト抗体応答をマッピングするためのキメラ組換えデングウイルスの使用
デングウイルス（ＤＥＮＶ；ＤＶ）は、世界中で最も重大なヒトアルボウイルス病原体であり、毎年、推定３億９千万人の感染者と９千６百万人の症候性症例がある。世界人口のほぼ半分が、疾患のリスクがあり、まだなお、デング疾患を処置または防止する認可されたワクチンまたは治療用物質がない。デング感染は、デング熱（激しい骨および関節の痛みによって特徴づけられる自己限定的発熱性疾患）、または不適切な凝固、血管漏出、および最も重篤な例においては、典型的には致死的である多臓器不全によって強調されるデング出血熱およびデングショック症候群として知られたより重篤な形として現れ得る。デングウイルスは、４つの異なる血清型として存在し、１つの血清型による感染は、その後の他のものによる感染からの保護を与えない。それどころか、単一のデング血清型に対する免疫は、別の血清型による感染で重篤な疾患のリスクの増加と関連しており、ワクチン設計にとって、困惑させる因子となっている。伝統的なワクチン接種ストラテジーは、各血清型に対して等価の免疫応答を誘発するために４つの異なるウイルスのカクテルを利用しているが、これまで、相変わらずこの目標を達成することには至っていない。それゆえに、デング感染に対する複雑な免疫応答の我々の理解を助けるための診断ツール、および新しいワクチン設計を導き、かつ作製するための新しいテクノロジーの切羽詰まった必要性がある。この発明報告は、複数の血清型に対するヒト抗体応答を特徴づけるために、およびまた、単一のウイルス接種菌液の状況内で、複数の血清型に対する免疫応答を誘発する能力がある新しい多価ワクチン候補を作製するために用いることができる、異種性血清型の重要な抗原性コンポーネントを含有する新規の組換えキメラデングウイルスのパネルの作製を記載する。本発明者らは、抗原移植のこのストラテジーが、他のヒトおよび動物病原体についての複数のワクチンプラットフォームに適合し、重要なことには、デングウイルスワクチン開発の大きなブレークスルーを表すと考えている。
【０１８９】
ｒＤＥＮＶ４／２ウイルスの作製
ＤＥＮＶ２とＤＥＮＶ４の間で異なるアミノ酸残基を同定するために、エンベロープドメインＩＩＩ（ＥＤＩＩＩ）領域のアミノ酸配列（アミノ酸位置２９６〜３９５）をアラインメントした（図１３、パネルＡ）。ＤＥＮＶ２とＤＥＮＶ４の間で異なる残基は、強調されており、合計４０個であり、ＤＥＮＶ４由来のそれらの残基は、できる限り最少のヌクレオチド変化を生じさせることにより、ＤＥＮＶ２由来のそれらと置き換えられた。４０個の異にするアミノ酸は、ＥＤＩＩＩ全体に及び、そのドメインの表面露出残基、内部残基、および端の残基を含み、おそらく、他の単量体および二量体と相互作用する（図１３、パネルＢ）。組換えウイルスの作製は、親の野生型ウイルスを生み出すために用いられる４断片のクローニングストラテジーを利用する。ＤＥＮＶ−４Ａプラスミドカセットは、エンベロープ糖タンパク質を含有し、ＥＤＩＩＩは灰色で強調されている（図１３、パネルＣ）。組換えＤＥＮＶ−４Ａと共にＤＥＮＶ−４Ｂ、Ｃ、およびＤのプラスミドカセットを用いて、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２ウイルスが生じ得る。組換えウイルスへ導入された４０個のアミノ酸変化のうち、そのアミノ酸の１４個が、電荷の変化を導入する（表１）。６個の残基は、負電荷を増加させ、８個の残基は、より多い正電荷を導入する。
【０１９０】
組換えウイルスは親ＤＥＮＶ４と類似した成熟プロフィールを有する
ウイルスに存在するＥタンパク質およびｐｒＭタンパク質の比を測定するために、ウイルスにおいてイムノブロッティングを実施した（図１４）。ＤＥＮＶ２は、Ｅに対して高レベルのｐｒＭを示し、不完全なフューリンプロセシングまたはｐｒＭ解離のいずれかによる、高度に未成熟のウイルスを示している。ＤＥＮＶ４およびＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２のどちらも、検出可能なｐｒＭを有さず、これらのウイルスが高度に成熟であることを示唆している。しかしながら、ＤＥＮＶ２とその２つのＤＥＮＶ４主鎖型ウイルスとの間で検出されるＥタンパク質の量における有意な差のため、本発明者らは、これらのビリオンの表面上にいくつかのｐｒＭの存在を除外することができない。
【０１９１】
組換えウイルスはベロ細胞において減弱するが、蚊細胞においては減弱しない
多段階成長曲線を用いる実験により、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は、ＤＥＮＶ２およびＤＥＮＶ４の両方の親ウイルスと比較して、ベロ細胞において２ｌｏｇ１０の成長減弱を有する（図１５、パネルＡ）。ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は、ベロ細胞において、両方の親ウイルス間の中間の形態を有する感染巣を形成する（図１５、パネルＢ）。ベロ細胞における追加の１〜２日間の感染にも関わらず、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２病巣は、親ウイルス病巣のサイズに達していない。
【０１９２】
ベロ細胞における成長減弱にも関わらず、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は、Ｃ６／３６細胞において減弱を示さない（図１６、パネルＡ）。ベロ細胞において観察されたように、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２  Ｃ６／３６感染巣は、両方の親ウイルス間の中間の形態を示す。追加の１〜２日間の感染で、これらの病巣は、両方の野生型ウイルスに匹敵するサイズに達する。
【０１９３】
ＤＥＮＶ２  ＥＤＩＩＩの移植は、２Ｄ２２結合および中和を移すのに十分である
２Ｄ２２は、ＤＥＮＶ２に非常に型特異的であるヒトモノクローナル抗体（ＭＡｂ）である（図１７、パネルＡ）。以前、ベロ細胞において２Ｄ２２の存在下でＤＥＮＶ２を継代することにより、エスケープ突然変異体を作製した。このエスケープ突然変異体は、ＥＤＩＩＩの中央に１つの点突然変異、Ｒ３２３Ｇを有し（図１７、パネルＢ）、ＤＥＮＶ  Ｅのこの領域が、２Ｄ２２エピトープ内に含まれ得ることを示している。ＥＬＩＳＡ結合により、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２が、ＤＶ４レベルより上だが、ＤＶ２レベルには達しない、２Ｄ２２との部分的結合を獲得していることが示されている（図１７、パネルＣ）。交差反応性ＤＥＮＶ  ｍＡｂである、２Ｊ２０との結合（図１７、パネルＤ）は、同等レベルのウイルスが結合アッセイにおいて存在し、しかもＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２形態が維持されていることを示している。
【０１９４】
２Ｄ２２による中和を、２つの細胞型および２つのアッセイを用いて分析した。ベロ−８１細胞を、２Ｄ２２の存在下で感染させ、５０％の病巣を中和するのに必要とされる抗体の量（ＦＲＮＴ５０）を計算した。ＤＥＮＶ２は、５０％のウイルスを中和するのに約０．１ｎｇ／ｕｌの２Ｄ２２を必要とするが、ＤＥＮＶ４は、用いられた抗体の最高濃度、５ｎｇ／ｕｌにおいて中和されない（図１７、パネルＥ）。ＥＤＩＩＩの移植は、約０．０１ｎｇ／ｕｌ  ＦＲＮＴ５０値からわかるように、２Ｄ２２による中和に対する感受性を移すのに十分である。これらの結果は、抗体の存在下で感染した細胞の数の低下により中和を測定する、Ｕ９３７＋ＤＣ−ＳＩＧＮフローサイトメトリに基づいた中和アッセイを用いて確認されている（図１７、パネルＦ）。これらのデータは、２Ｄ２２が、それのエピトープの部分としてＥＤＩＩＩを含有することをさらに示唆している。
【０１９５】
ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は、追加のＤＥＮＶ２  ＭＡｂによる中和に対する感受性を獲得している
６個の追加のＤＥＮＶ２  ＭＡｂのパネルを用いて、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２をさらに特徴づけた（表２）。これらのＭＡｂの多くは、組換えＥＤＩＩＩ（ｒＥＤＩＩＩ）と結合せず、それには、２Ｄ２２が挙げられ、それはそれのエピトープの部分としてＥＤＩＩＩを含有することを本発明者らは示している（図１７）。ｒＥＤＩＩＩ単独との結合の欠如を説明するのに、２Ｄ２２が、Ｅ単量体全体、Ｅ二量体、または完全なウイルス構造においてのみ存在する複雑なエピトープを用いるということはあり得る。このパネルにおける他のＭＡｂが同じ要求性を有することはあり得る。エスケープ突然変異体を作製することによる、またはアラニンスキャニング突然変異を通してのいずれかで決定される、結合に重要な残基などの追加の情報が、その表に含まれる。
【０１９６】
ＤＶＣ３．７について、ＥＤＩＩＩの側面の隆線に位置する１つの点突然変異Ｖ３８２Ｇを生じさせた（図１８、パネルＡ）。ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は、ＤＥＮＶ２と類似して、ＤＶＣ３．７による中和に感受性があるが、親のＤＥＮＶ４は感受性がない（図１８、パネルＣ）。ＤＶＣ１０．１６について、ＥＤＩＩＩのＡ鎖に位置する１つの点突然変異Ｅ３１１Ｋを生じさせた（図１８、パネルＢ）。ＤＶＣ３．７に関して見られたように、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は、ＤＥＮＶ２中和に必要とされるレベルより下の、ＤＶＣ１０．１６による中和を、親のＤＥＮＶ４から獲得している。アラニンスキャニング変異導入法により、ＤＶＣ１３．６結合に必要され得る、ＥＤＩＩにおける融合ループの位置１０１および１０８が明らかにされた（図１８、パネルＥ）。ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２はＤＶＣ１３．６によって中和される（図１８、パネルＦ）。これらのデータは、ＤＶＣ１３．６  ＤＥＮＶ２エピトープが、ＥＤＩＩＩからＥＤＩＩの融合ループ領域へと及び得ることを示唆している。２つの追加のＭＡｂは、ＤＥＮＶ２と同様にＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２を中和し、ＤＥＮＶ４を中和しない（図１８、パネルＧ〜Ｈ）。驚くべきことに、ｒＥＤＩＩＩと結合する３Ｆ９（表２）は、移植されたドメインにも関わらず、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２と結合もせず、中和もしない（図１８、パネルＩ）。これは、３Ｆ９のエピトープがＥＤＩＩＩを必要とするが、おそらく、ＤＥＮＶ２にのみ存在し、かつＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２に存在しない、ＥＤＩＩＩの外側の追加の残基を必要とすることを示唆している。
【０１９７】
ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は、ＤＥＮＶ４  ＥＤＩＩＩ特異的ＭＡｂによる中和を喪失している
ＤＶ４−Ｅ８８はマウスＤＶ４型特異的ＭＡｂであり、知られたＥＤＩＩＩエピトープ、ならびにエスケープ突然変異体を通して位置づけられた、特異的残基３３１および３６１に関わる（表２、および図１９、パネルＡ）。予想された通り、ＤＶ４−Ｅ８８はＤＶ４を中和するが、ＤＶ２を中和しない。ＤＥＮＶ４のＥＤＩＩＩがＤＥＮＶ２由来のそれと置き換えられたため、ＤＶ４−Ｅ８８によるＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２中和は喪失した。
【０１９８】
ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は、ＤＥＮＶ２ポリクローナル免疫血清による中和を獲得している
ポリクローナル免疫血清に存在する抗体が、ＥＤＩＩＩを認識するかどうかを試験するために、１２個のＤＥＮＶ２ポリクローナル免疫血清を、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２に対して試験した（図２０、パネルＡ〜Ｌ）。ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は、ＤＥＮＶ２に匹敵する、ＤＥＮＶ２血清による中和に対する感受性を獲得している。ＤＥＮＶ４は、試験された最高濃度における血清のいずれによっても中和されない。異なる血清での中和価の範囲（約５０から約３，０００までの範囲）に関わらず、平均ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２中和価は、ＤＥＮＶ２より高い（図２２、パネルＡ）。
【０１９９】
ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は、ＤＥＮＶ４ポリクローナル免疫血清による中和を保存する
ＤＥＮＶ４ポリクローナル免疫血清は、ＤＥＮＶ４の中和価と類似した中和価で、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２を中和する（図２１、パネルＡ〜Ｆ）。これらのデータは、主要なＤＥＮＶ４中和エピトープがＤＥＮＶ２と異なり、ＤＥＮＶ２  ＥＤＩＩＩがＤＥＮＶ４へ導入された場合、破壊されないことを示唆している。ＤＥＮＶ２ポリクローナル免疫血清に関して見られたように、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２平均中和価は、ＤＥＮＶ４の中和価に匹敵する（図２２、パネルＢ）。
【０２００】
ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は、ヘテロタイプのポリクローナル免疫血清による中和を獲得していない
ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２がヘテロタイプのＤＥＮＶ１またはＤＥＮＶ３ポリクローナル免疫血清によって中和されるかどうかを試験するために、同じＦＲＮＴアッセイを、回復期のＤＥＮＶ１およびＤＥＮＶ３ドナー由来の血清を用いて実施した。いくつかの場合において、ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は、親のＤＥＮＶ４中和価のレベルより上の中和に対するわずかな感受性を獲得しているが、それは、ＤＥＮＶ２中和のレベルを超えず、いずれの場合でも、ホモタイプの中和より実質的に低い（図２３、パネルＡ〜Ｂ）。
【０２０１】
ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２は、主要なＤＥＮＶ２型特異的中和エピトープを、ＥＤＩＩＩを含有する四次エピトープであると同定するように思われる。この組換えウイルスは、ＤＥＮＶ４血清に対する感受性を喪失することなく、ＤＥＮＶ２ポリクローナル免疫血清による中和を獲得しており、ＤＥＮＶ４が異なる中和エピトープを有することを示唆している。このウイルスは、ＤＥＮＶ２抗体またはＤＥＮＶ４抗体のいずれについても探索する診断ツールとして用いることができる。特に、異種性ＤＥＮＶ４背景におけるＤＥＮＶ２  ＥＤＩＩＩの孤立のため、自然感染した、またはワクチン接種された個体由来のＥＤＩＩＩ特異的Ａｂの相対的存在量をアッセイすることができる。これは、ＤＥＮＶ２のＥＤＩＩＩが、感染後の型特異的中和応答にとって重大な意味をもつと思われるという本発明者らの所見を考慮すると、意義深い。このウイルスは、ＤＥＮＶ２とＤＥＮＶ４の両方からのドメインを含有し、ＤＥＮＶ２抗体およびＤＥＮＶ４抗体の両方による中和に対して感受性があり、このウイルスが、両方の血清型に対する抗体応答を誘発する能力がある二価ワクチンとして有用であり得ることを示唆している。さらに、四価ワクチン製剤は、ＤＥＮＶ１／３またはＤＥＮＶ３／１組換えウイルスと合わせて用いられる場合には、達成可能であり得、デングワクチン分野における意義深い進歩を示している。
【０２０２】
ウイルス構築
組換えウイルスを、４断片クローニングストラテジーを用いて構築し、同じストラテジーを、野生型ＤＥＮＶ感染性クローンを作製するのに用いる。ＤＥＮＶ−４ゲノムを、４つの別々のＤＮＡプラスミドへサブクローニングする。Ｔ７プロモーターを、Ａ断片の５’末端へ導入し、固有のＩＩS型制限部位を、各断片の５’末端および３’末端へ導入する。これらの制限部位は、プラスミドが、正しい方向でのみ組み立てられてＤＥＮＶゲノム配列を生じるであろうことを確実にする。
【０２０３】
ＤＥＮＶ４  Ａ断片におけるヌクレオチドを、ＤＥＮＶ２アミノ酸をコードするヌクレオチドで置き換えることにより、ＤＥＮＶ２由来のＥＤＩＩＩ残基をＤＥＮＶ４へ導入した。ＤＥＮＶ２由来のヌクレオチドを有する新しいＡ断片を合成し、ｐＵＣ−５７プラスミド（ＢｉｏＢａｓｉｃ）へ挿入した。ＤＥＮＶ４  Ｂ、Ｃ、およびＤプラスミドに加えて、新しいＡプラスミドを大腸菌において成長させ、精製し、対応するＩＩS型制限酵素で消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションして、完全長ｃＤＮＡデングウイルスゲノムが生成された。ｃＤＮＡを、Ｔ７ポリメラーゼを用いて転写した。組換えＲＮＡをＢＨＫ−２１細胞へ電気穿孔し、生存ウイルスを含有する細胞培養上清を採取した。その後、ウイルスを、Ｃ６／３６細胞において２回、継代し、遠心分離して細胞片を除去し、−８０℃で保存した。
【０２０４】
細胞
蚊ヒトスジシマカＣ６／３６細胞を、ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培地中、３２℃で成長させた。ベロ−８１細胞をＤＭＥＭ中、３７℃で維持した。レトロウイルス形質導入によりＤＣ−ＳＩＧＮを安定的に発現するヒト単球リンパ腫細胞株Ｕ９３７（Ｕ９３７＋ＤＣ−ＳＩＧＮ）を、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃で維持し、５０ｍＭ  β−メルカプトエタノールを追加した。培地にＦＢＳ（ベロ−８１細胞およびＵ９３７＋ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞について１０％、Ｃ６／３６について５％）を追加し、感染培地を作製するために、ＦＢＳを２％まで低下させた。全ての培地に、さらに、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを追加した。Ｕ９３７＋ＤＣ−ＳＩＧＮに、さらに、０．１ｍＭ非必須アミノ酸および２ｍＭグルタミンを追加した。全ての細胞を５％ＣＯ２中、インキュベートした。
【０２０５】
結合性ＥＬＩＳＡ
（ＥＬＩＳＡによって前に力価測定されているような）等量のウイルスを、抗Ｅ抗体を用いて捕獲した。一次抗体２Ｄ２２および２Ｊ２０を４倍希釈して、希釈系列の作製を開始した。アルカリフォスファターゼ連結型二次抗体を用いて、一次抗体のＰ−ニトロフェニルリン酸基質との結合を検出し、反応の色変化を、分光光度法を用いて定量化した。
【０２０６】
ＤＥＮＶ免疫血清
ヒトＤＥＮＶ免疫血清を、以前の自然ＤＥＮＶ感染が確認された個体から収集した。追加のヒト免疫血清を、ＤＥＮＶワクチンを与えられた個体から収集した。非ヒト霊長類免疫血清を、ＤＥＮＶ感染後、収集した。
【０２０７】
ウイルス力価測定および病巣低下中和試験（ＦＲＮＴ）
感染の１日前、２４ウェルプレートに、５×１０４個のベロ−８１細胞または１×１０５個のＣ６／３６細胞のいずれかを播種した。感染の前に成長培地を除去した。ウイルスストックを１０倍の段階希釈し、その後、３７℃で１時間、インキュベートすることによりウイルス力価測定を実施した。インキュベーション後、ウイルス希釈溶液を、細胞へ、３７℃で１時間、加え、その後、２％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを追加したＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中の１ｍｌ  １％メチルセルロースでオーバーレイした。３７℃での３〜６日間のインキュベーション後、オーバーレイを除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、８０％メタノール中に固定した。プレートを、ＰＢＳ中に作製された５％インスタントミルクでブロッキングし、その後、抗Ｅ  ＭＡｂ  ４Ｇ２および抗ＰｒＭ  ＭＡｂ  ２Ｈ２（どちらもブロッキングバッファー中、１：５００に希釈されている）とインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、ブロッキングバッファー中１：２５００に希釈されたＨＲＰコンジュゲート型ヤギ抗マウスＡｂ（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、病巣を、ＴｒｕｅＢｌｕｅ  ＨＲＰ基質（ＫＰＬ）で発色させ、病巣をカウントした。
【０２０８】
ＦＲＮＴアッセイについて、ＭＡｂまたは血清のいずれかを、４倍希釈し、約４０ＦＦＵウイルスと混合し、その後、３７℃で１時間、インキュベートした。インキュベーション後、ウイルスおよびＭＡｂ／血清希釈溶液を細胞へ、３７℃で１時間、加え、その後、オーバーレイを加え、上記のように処理した。
【０２０９】
成長曲線
ベロ細胞またはＣ６／３６細胞のいずれかを、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。２４時間ごとに、培養上清を採取し、遠心分離して細胞片を除去した。試料を、使用するまで、−８０℃で凍結させた。新鮮な培地に毎日、交換した。ウイルスを、上記のようなそれらを増殖する細胞型において力価測定した。
【０２１０】
Ｕ９３７＋ＤＣ−ＳＩＧＮ中和アッセイ
ＦＲＮＴアッセイにおいて行ったように、ウイルスを、Ｕ９３７＋ＤＣ−ＳＩＧＮ感染培地中に希釈し、４倍希釈系列のＭＡｂと混合した。ウイルスおよびＭＡｂ混合物を３７℃で１時間、インキュベートした。その後、ウイルスおよびＭＡｂ混合物を、９６ウェル丸底プレートのウェルあたり５×１０４個のＵ９３７＋ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞に加え、３７℃で２時間、インキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離し、感染培地で２回、洗浄し、その後、成長培地中に再び、懸濁させた。感染から１日後、細胞を遠心分離して収集し、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。その後、細胞を透過処理し、１％正常マウス血清中でブロッキングした。細胞を、Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で直接的に標識された抗Ｅ  ２Ｈ２の１：４００希釈溶液で染色した。陽染性細胞のパーセンテージを、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメータ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で測定した。
【０２１１】
イムノブロッティング
ウイルスストックをＰＢＳ中で希釈し、４×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と混合し、５０℃で１０分間、加熱した。試料を、１２％  ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に流し、ＰＶＤＦ膜に転写し、ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ中の５％インスタントミルクにおいて、４℃で一晩、ブロッキングした。膜を、ブロッキングバッファー中、０．５ｕｇ／ｍｌ抗Ｅ  ４Ｇ２、０．５ｕｇ／ｍｌ抗ＰｒＭ  ２Ｈ１２および５Ｌ２０で、３７℃、２時間、探索した。洗浄後、ＨＲＰコンジュゲート型抗マウスおよび抗ヒト二次抗体をブロッキングバッファー中、１：１０，０００希釈し、室温で１時間、インキュベートした。膜を化学発光基質に曝露し、フィルム上に顕出させた。
【０２１２】
［実施例５］
血清型２中和ヒト抗体応答をマッピングするためのキメラ組換えデングウイルスの使用
４つのデングウイルス（ＤＥＮＶ）血清型（ＤＥＮＶ１〜４）の１つでの一次感染は、感染した血清型を中和する抗体を生じるが、他の血清型を中和する抗体は生じない。本発明者らのグループは、自然ＤＥＮＶ感染に曝露した人々からの、血清型特異的な、強く中和するモノクローナル抗体（ｈＭＡｂ）の単離を以前、報告している。本発明者らは、これらのｈＭＡｂが、無傷ウイルス粒子上でのみ発現している複雑な四次構造エピトープと結合することを実証している。最近、本発明者らは、これらの複雑なエピトープが血清型の間で移植されている生存可能な組換えＤＥＮＶを作製することが可能であることを報告した。ＤＥＮＶ３／４キメラを用いることにより、本発明者らは、エンベロープ（Ｅ）タンパク質のドメインＩ／ＩＩの間のヒンジ領域が、血清型３および４を中和する型特異的抗体の主要な標的であるエピトープを含有することを観察した。最新の研究において、本発明者らは、同様のアプローチを用いて、中和ｈＭＡｂおよび一次ＤＥＮＶ２ヒト免疫血清により認識されるＤＥＮＶ２の部位を位置づけている。本発明者らの研究により、血清型３および４について以前に定義されたＥＤＩ／ＩＩヒンジ領域エピトープとは異なる新規な四次構造依存性ＤＥＮＶ２エピトープの同定がもたらされた。重要なことには、本発明者らは、機能の獲得と喪失の研究を用いて、ＤＥＮＶ１〜４  Ｅ糖タンパク質における異なる位置が、固有の長続きする中和エピトープをコードし、そのエピトープが血清型の間で移植可能であることを実証している。ＤＥＮＶ２エピトープの位置、ならびに自然感染およびワクチンに曝露された人々における中和抗体についての標的としてのそれの相対的重要性を調べた。
【０２１３】
ｒＤＥＮＶ４／２ウイルスの設計および構築
ＤＥＮＶ２（右）由来の残基を、ＤＥＮＶ４主鎖へ移動させて、組換えＤＥＮＶ４／２ウイルス（ｒＤＥＮＶ４／２、図２４、パネルＡ）を作製した。ＤＥＮＶゲノムを操作するための逆遺伝学系を用いた（図２４、パネルＢ）。上＝ＤＥＮＶ２、下＝ＤＥＮＶ４。ＤＥＮＶゲノムを、個々に突然変異させることができる４つのプラスミドカセットへ分割し、共にライゲーションし、細胞へ電気穿孔し、組換えウイルスが生じる。ＤＥＮＶ４−Ａカセットは、突然変異が生じるエンベロープ遺伝子を含有する。そのＤＥＮＶ４残基をＤＥＮＶ２由来のそれらと置き換えることにより、ＤＥＮＶ遺伝子主鎖上に全体的に構築されたｒＤＥＮＶ４／２ウイルスが生じる。
【０２１４】
ＲＴ−ＰＣＲによる血清型同定のための新しい方法およびＤＥＮＶ４主鎖組換えウイルスの確認
血清型特異的ＲＴ−ＰＣＲのためにＲＴ−ＰＣＲプライマーを設計した（図２５、パネルＡ）。利用されるプライマーは、高度に保存された３’末端ＮＳ１遺伝子を標的にする共通センスオリゴヌクレオチド、および高度に多様なＮＳ２Ａ遺伝子を標的にする血清型特異的アンチセンスプライマーを含んだ。ウイルスをＣ６／３６細胞中で成長させ、培養上清を収集し、遠心分離して、いかなる細胞片も除去した。ウイルスＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｍｐウイルスＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて単離した。ＰＣＲを３５サイクル、実行し、ＰＣＲ産物を、１．５％超高純度アガロースゲル上で分析した。対照ＲＮＡ（ＤＶ１／ＤＶ２／ＤＶ３／ＤＶ４）および水を、陽性および陰性対照として流した（図２５、パネルＢ）。予想される産物サイズ：ＤＶ１＝２０５ｂｐ、ＤＶ２＝５３９ｂｐ、ＤＶ３＝４５５ｂｐ、ＤＶ４＝４０１ｂｐ。
【０２１５】
制限断片長多型はｒＤＥＮＶ４／２を親ＤＥＮＶ４から識別する
ｒＤＥＮＶ４／２（下）を親ＤＥＮＶ４（上）から識別するために、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析を用いた。ｒＤＥＮＶ４／２を作製するためにＤＥＮＶ４  Ｅゲノムへ導入された突然変異（アスタリスクで表されている）は、ＤＥＮＶ４に存在するＸｍｎＩ制限酵素部位を破壊している（図２６、パネルＡ）。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＸｍｎＩで消化した。消化産物を１．５％超高純度アガロースゲル上で分析した（図２６、パネルＢ）。予想される産物サイズ：消化されていない完全長＝１０３１ｂｐ、消化産物＝９３１ｂｐおよび１１３ｂｐ。
【０２１６】
ＤＥＮＶ４およびｒＤＥＮＶ４／２ビリオンは類似した成熟プロフィールを有する
ウイルスをＣ６／３６細胞中で成長させ、培養上清を収集し、遠心分離して、いかなる細胞片も除去した。試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流し、ブロットを抗Ｅ抗体（４Ｇ２）および抗ＰｒＭ抗体（２Ｈ１２および５Ｌ２０）で探索した（図２７）。ＤＥＮＶ２は、実質的なレベルのＰｒＭが存在し、不完全なフューリンプロセシングまたはＰｒＭ解離のいずれかを示している。ＰｒＭバンドは、ＤＥＮＶ４またはｒＤＥＮＶ４／２のいずれの試料においても検出されない。
【０２１７】
ｒＤＥＮＶ４／２は、ベロ細胞において親ウイルスと比較して２ｌｏｇの成長減弱を示す
ベロ−８１細胞を、ＭＯＩ＝０．０１で、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ４、およびｒＤＥＮＶ４／２に感染させた。ウイルス上清を２４時間ごとに収集し、続いて、ベロ−８１細胞において力価測定した（図２８、パネルＡ）。ＤＥＮＶは、ベロ−８１細胞において感染巣を形成する。ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ４、およびｒＤＥＮＶ４／２をそれぞれ、感染から５日後、４日後、および６日後に固定した（図２８、パネルＢ）。ｒＤＥＮＶ４／２は、両方の親ウイルスより小さい病巣を示した。
【０２１８】
ｒＤＥＮＶ４／２は、Ｃ６／３６細胞において成長減弱を示さず、親ウイルスと類似した感染巣を形成する
Ｃ６／３６細胞を、ＭＯＩ＝０．０１で、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ４、およびｒＤＥＮＶ４／２に感染させた。ウイルス上清を２４時間ごとに収集し、続いて、Ｃ６／３６細胞において力価測定した（図２９、パネルＡ）。ＤＥＮＶは、Ｃ６／３６細胞において感染巣を形成する。ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ４、およびｒＤＥＮＶ４／２をそれぞれ、感染から４日後、３日後、および５日後に固定した（図２９、パネルＢ）。さらに何日間かの成長で、ｒＤＥＮＶ４／２病巣は、親ウイルスに匹敵するサイズに達する。
【０２１９】
図３０．型特異的ＤＥＮＶ２ヒトＭＡｂによるｒＤＥＮＶ４／２の結合および中和の転移
四次エピトープと結合する、強中和性ＤＶ２  ＭＡｂである、ヒトＭＡｂ  ２Ｄ２２の結合の概要は、図３０、パネルＡに示されている。２Ｄ２２は、ＤＥＮＶ２を中和することに対して高い特異性を示す。ＥＬＩＳＡアッセイにより、親ＤＶ４のレベルより上であるが、ＤＶ２レベルまでではない、２Ｄ２２のｒＤＥＮＶ４／２への部分的結合の転移が示されている（図３０、パネルＢ）。交差反応性対照抗体の２Ｊ２０のＥＬＩＳＡ結合は、存在する同等レベルのウイルス、およびウイルス完全性の維持を示した（図３０、パネルＣ）。ベロ−８１に基づいた病巣低下中和試験（ＦＲＮＴ）を、２Ｄ２２を用いて実施し、ＦＲＮＴ５０（感染の５０％を中和するのに必要とされる抗体の濃度）値を計算した（図３０、パネルＤ）。Ｕ９３７＋ＤＣ−ＳＩＧＮに基づいた中和アッセイ（Ｎｅｕｔ）を、２Ｄ２２を用いて実施し、Ｎｅｕｔ５０値を計算した（図３０、パネルＥ）。両方のアッセイにおいて（図３０、パネルＤ〜Ｅ）、ｒＤＥＮＶ４／２は、２Ｄ２２による中和を、ＤＶ２より高いレベルで獲得した。ＤＶ４は、いずれのアッセイにおいても、最高濃度の２Ｄ２２で中和されなかった。
【０２２０】
ｒＤＥＮＶ４／２は、ＤＥＮＶ４ポリクローナル血清による中和を保存しながら、ＤＥＮＶ２ポリクローナル免疫血清による中和を獲得する
ベロ−８１  ＦＲNTアッセイにより、ｒＤＥＮＶ４／２が、親ＤＥＮＶ２に匹敵するレベルで、ＤＥＮＶ２ポリクローナル免疫血清による中和を獲得したことが示された（図３１、パネルＡ）。ｒＤＥＮＶ４／２は、ＤＥＮＶ４ポリクローナル免疫血清による中和の喪失は示さなかった（図３１、パネルＢ）。ｒＤＥＮＶ４／２は、親ＤＥＮＶ２またはＤＥＮＶ４の中和価のいずれよりも上のヘテロタイプのＤＥＮＶ１ポリクローナル免疫血清（図３１、パネルＣ）およびＤＥＮＶ３ポリクローナル免疫血清（図３１、パネルＤ）による中和の獲得は示さなかった。自然感染または実験的ワクチン接種のいずれかを有する個体由来の血清は、示された通り、コード化されている。ＦＲＮＴ５０＜２０を有する試料は、１９の血清希釈係数にグラフ化されている。
【０２２１】
この研究において、２つのＤＥＮＶ血清型（ＤＥＮＶ２およびＤＥＮＶ４）由来のエンベロープ残基で構成された組換えＤＥＮＶウイルスが作製され、このウイルスを特徴づけることにおいて、いくつかの鍵となる所見が同定されており、その所見は、１つのＤＥＮＶ血清型から別の血清型へ領域を移植することによる生存可能な組換えウイルスを作製することができること；ｒＤＥＮＶ４／２成長は、哺乳類細胞において減弱するが、昆虫細胞において減弱しないこと；ｒＤＥＮＶ４／２は検出可能なＰｒＭタンパク質が存在せず、それが、完全にプロセシングされ、高度に成熟していることを示していること；２つの異なる細胞型および中和アッセイにおいてヒトＤＥＮＶ２型特異的ＭＡｂ  ２Ｄ２２による結合および中和が転移されたこと；ｒＤＥＮＶ４／２は、ＤＥＮＶ４ポリクローナル免疫血清による中和を喪失することなく、ＤＥＮＶ２ポリクローナル免疫血清による中和を獲得すること；ｒＤＥＮＶ４／２はヘテロタイプのポリクローナル免疫血清による中和を獲得していないこと；ならびにｒＤＥＮＶ４／２は、ＤＥＮＶ２およびＤＥＮＶ４の両方に対する防御抗体応答を誘発し得る二価ワクチンとして開発され得ることである。
【０２２２】
［実施例６］
組換えＤＥＮＶの野生型ＤＥＮＶ配列とのアミノ酸アラインメント
ＤＶ４−ＥＤＩＩＩ−ＤＶ２の野生型ＤＥＮＶ４およびＤＥＮＶ２とのアミノ酸配列アラインメントは図３２Ａに示されている。ＤＥＮＶ２−１Ｆ４Ｅの野生型ＤＥＮＶ２およびＤＥＮＶ１とのアミノ酸配列アラインメントは図３２Ｂに示されている。最後に、ＤＥＮＶ４  Ｍ１２、ＤＥＮＶ４  Ｍ１４、およびＤＥＮＶ４  Ｍ１６の野生型ＤＥＮＶ４およびＤＥＮＶ３とのアミノ酸アラインメントは図３２Ｂに示されている。
【０２２３】
前述は、本発明の例証となるものであり、それを限定するものとして解釈されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲、加えて、それに含まれ得る特許請求の範囲の等価物により、定義される。
【０２２４】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その参考文献が示されている文および／または段落に関連した教示として完全に引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０２２５】
【表１】
0006671364.tif 000009
【０２２６】
【表２】
0006671364.tif 000010
【０２２７】
配列
【化８】
0006671364.tif 000011
【０２２８】
【化９】
0006671364.tif 000012
【０２２９】
【化１０】
0006671364.tif 000013
【０２３０】
【化１１】
0006671364.tif 000014
【０２３１】
【化１２】
0006671364.tif 000015
【０２３２】
【化１３】
0006671364.tif 000016
【０２３３】
【化１４】
0006671364.tif 000017
【０２３４】
【化１５】
0006671364.tif 000018
【０２３５】
【化１６】
0006671364.tif 000019
【０２３６】
【化１７】
0006671364.tif 000020
【０２３７】
【化１８】
0006671364.tif 000021
【０２３８】
【化１９】
0006671364.tif 000022
【０２３９】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ１のより小さい領域がＤＥＮＶ２へ移植されている２つのウイルスが生み出され得る：
１．Ｎ５２Ｑ、Ｖ５５Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ｖ１３９Ｉ
２．Ａ１６８Ｓ、Ｐ１６９Ｓ、Ａ１８０Ｔ、Ｌ１８１Ｖ、Ｌ１８３Ｍ（＃１に列挙されたものに加えて）
【０２４０】
【化２０】
0006671364.tif 000023
【０２４１】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ１のより小さい領域がＤＥＮＶ２へ移植されている２つのウイルスが生み出され得る：
１．Ｎ５２Ｅ、Ｐ５３Ｖ、Ｖ５５Ｌ、Ｓ１３８Ｔ
２．Ａ１６８Ｓ、Ａ１８０Ｅ（＃１に列挙されたものに加えて）
【０２４２】
【化２１】
0006671364.tif 000024
【０２４３】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ３のより大きい領域がＤＥＮＶ１へ移植されているウイルスが生み出され得る（ＤＥＮＶ１−３Ｍ１６と名付けられている）：
１．Ｓ２２５Ｔ、Ｅ２２９Ｐ、Ｅ３０７Ｋ
【０２４４】
【化２２】
0006671364.tif 000025
【０２４５】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ３のより大きい領域がＤＥＮＶ２へ移植されている２つのウイルスが生み出され得る（ＤＥＮＶ２−Ｍ１４（＃１）およびＤＥＮＶ２−Ｍ１６（＃２）と名付けられている）：
１．Ｋ１２２Ｌ、Ｋ１２３Ｅ、Ｐ１３２Ｙ
２．Ｅ７１Ｄ、Ｅ１４８Ｑ、Ｄ２２５Ｔ、Ｓ２２９Ｐ、Ｖ３０７Ｋ（＃１に列挙されたものに加えて）
【０２４６】
【化２３】
0006671364.tif 000026
【０２４７】
【化２４】
0006671364.tif 000027
【０２４８】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ２のより大きい領域がＤＥＮＶ４へ移植されている２つのウイルスが生み出され得る：
１．Ｙ８１Ｓ、Ｋ８３Ｓ、Ｖ２４２Ｎ、Ｒ２４７Ｋ
２．Ｉ６８Ｔ、Ａ７１Ｅ、Ｔ７２Ｓ、Ｒ９３Ｋ、Ｒ９４Ｈ、Ｄ９５Ｓ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１１３Ｉ（＃１に列挙されたものに加えて）
【０２４９】
【化２５】
0006671364.tif 000028
【０２５０】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ２のより大きい領域がＤＥＮＶ１へ移植されている２つのウイルスが生み出され得る：
１．Ｉ６８Ｔ、Ｄ７１Ｅ、Ａ８０Ｐ、Ｔ８１Ｓ、Ｖ８３Ｎ、Ｔ２４２Ｎ、Ａ２４３Ｐ、Ｅ２４９Ｄ
２．Ｒ９３Ｋ、Ｒ９４Ｈ、Ｔ９５Ｓ、Ｆ９６Ｍ、Ｓ１１２Ｇ、Ｌ１１３Ｉ、Ｉ１１４Ｖ（＃１に列挙されたものに加えて）
【０２５１】
【化２６】
0006671364.tif 000029
【０２５２】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ２のより大きい領域がＤＥＮＶ３へ移植されている２つのウイルスが生み出され得る：
１．Ｄ７１Ｅ、Ａ８０Ｐ、Ｖ８１Ｓ、Ｐ８３Ｎ、Ａ２４３Ｐ、Ｅ２４９Ｄ
２．Ｉ６８Ｔ、Ｔ９５Ｓ、Ｙ９６Ｍ、Ｓ１１２Ｇ、Ｌ１１３Ｉ（＃１に列挙されたものに加えて）
【０２５３】
【化２７】
0006671364.tif 000030
【０２５４】
注：ＡＡ  ＃５０は、ＶまたはＡであり得、ＡＡ  ＃５２はＱまたはＮであり得、ＡＡ  ＃５５はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃２７２はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７５はＴまたはＧであり得、ＡＡ  ＃２７６はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７７はＴまたはＬであり得る。
【０２５５】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ１および／またはＤＥＮＶ３のより大きい領域がＤＥＮＶ２へ移植されているウイルスが生み出され得る：
１．Ｑ５２Ｎ、Ｔ５５Ｖ、Ｔ１３８Ｓ、Ｉ１３９Ｖ
２．Ｓ１６８Ａ、Ｓ１６９Ｐ、Ｔ１８０Ａ、Ｖ１８１Ｌ、Ｍ１８３Ｌ（＃１に列挙されたものに加えて）
３．Ｋ１２２Ｌ、Ｋ１２３Ｅ、Ｐ１３２Ｙ
４．Ｅ７１Ｄ、Ｅ１４８Ｑ、Ｄ２２５Ｔ、Ｓ２２７Ｐ、Ｖ３０７Ｋ（＃３に列挙されたものに加えて）
５．１、２、３、４、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ（すなわち、１＋３、１＋４、２＋３、２＋４）
【０２５６】
【化２８】
0006671364.tif 000031
【０２５７】
注：ＡＡ  ＃１６０はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１６３はＴまたはＭであり得、ＡＡ  ＃１６８はＳまたはＡであり得、ＡＡ  ＃１７０はＴまたはＳであり得、ＡＡ  ＃１７１はＳまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１７３はＶまたはＩであり得、ＡＡ  ＃１７４はＱまたはＫであり得、ＡＡ  ＃１７６はＰまたはＴであり得、ＡＡ  ＃１８０はＥまたはＡであり得る。
【０２５８】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ１のより大きい領域がＤＥＮＶ２へ移植されているウイルスが生み出され得る：
１．Ｑ５２Ｎ、Ｔ５５Ｖ、Ｔ１３８Ｓ、Ｉ１３９Ｖ
２．Ｓ１６８Ａ、Ｓ１６９Ｐ、Ｔ１８０Ａ、Ｖ１８１Ｌ、Ｍ１８３Ｌ（＃１に列挙されたものに加えて）
【０２５９】
【化２９】
0006671364.tif 000032
【０２６０】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ３のより大きい領域がＤＥＮＶ２へ移植されている２つのウイルスが生み出され得る：
１．Ｋ１２２Ｌ、Ｋ１２３Ｅ、Ｐ１３２Ｙ
２．Ｅ７１Ｄ、Ｅ１４８Ｑ、Ｄ２２５Ｔ、Ｓ２２９Ｐ、Ｖ３０７Ｋ（＃１に列挙されたものに加えて）
【０２６１】
【化３０】
0006671364.tif 000033
【０２６２】
注：ＡＡ  ＃５０はＶまたはＡであり得、ＡＡ  ＃５２はＱまたはＮであり得、ＡＡ  ＃５５はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１６０はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１６３はＴまたはＭであり得、ＡＡ  ＃１６８はＳまたはＡであり得、ＡＡ  ＃１７０はＴまたはＳであり得、ＡＡ  ＃１７１はＳまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１７３はＶまたはＩであり得、ＡＡ  ＃１７４はＱまたはＫであり得、ＡＡ  ＃１７６はＰまたはＴであり得、ＡＡ  ＃１８０はＥまたはＡであり得、ＡＡ  ＃２７２はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７５はＴまたはＧであり得、ＡＡ  ＃２７６はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７７はＴまたはＬであり得る。
【０２６３】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ１および／またはＤＥＮＶ３のより大きい領域がＤＥＮＶ２へ移植されているウイルスが生み出され得る：
１．Ｑ５２Ｎ、Ｔ５５Ｖ、Ｔ１３８Ｓ、Ｉ１３９Ｖ
２．Ｓ１６８Ａ、Ｓ１６９Ｐ、Ｔ１８０Ａ、Ｖ１８１Ｌ、Ｍ１８３Ｌ（＃１に列挙されたものに加えて）
３．Ｋ１２２Ｌ、Ｋ１２３Ｅ、Ｐ１３２Ｙ
４．Ｅ７１Ｄ、Ｅ１４８Ｑ、Ｄ２２５Ｔ、Ｓ２２７Ｐ、Ｖ３０７Ｋ  （＃３に列挙されたものに加えて）
５．１、２、３、４、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
【０２６４】
【化３１】
0006671364.tif 000034
【０２６５】
注：ＡＡ  ＃５０はＶまたはＡであり得、ＡＡ  ＃５２はＱまたはＮであり得、ＡＡ  ＃５５はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃２７２はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７５はＴまたはＧであり得、ＡＡ  ＃２７６はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７７はＴまたはＬであり得る。
【０２６６】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ３のより大きい領域がＤＥＮＶ１へ移植されているウイルスが生み出され得る：
１．Ｖ１２２Ｌ、Ｔ１２３Ｅ、Ｋ１２４Ｐ、Ｌ２１４Ｆ
２．Ｓ２２５Ｔ、Ｅ２２９Ｐ、Ｅ３０７Ｋ（＃１に列挙されたものに加えて）
【０２６７】
【化３２】
0006671364.tif 000035
【０２６８】
注：ＡＡ  ＃５０はＶまたはＡであり得、ＡＡ  ＃５２はＱまたはＮであり得、ＡＡ  ＃５５はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃２７２はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７５はＴまたはＧであり得、ＡＡ  ＃２７６はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７７はＴまたはＬであり得る。
【０２６９】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ２および／またはＤＥＮＶ３のより大きい領域がＤＥＮＶ１へ移植されているウイルスが生み出され得る：
１．Ｉ６８Ｔ、Ｄ７１Ｅ、Ａ８０Ｐ、Ｔ８１Ｓ、Ｖ８３Ｎ、Ｔ２４２Ｎ、Ａ２４３Ｐ、Ｅ２４９Ｄ
２．Ｒ９３Ｋ、Ｒ９４Ｈ、Ｔ９５Ｓ、Ｆ９６Ｍ、Ｓ１１２Ｇ、Ｌ１１３Ｉ、Ｉ１１４Ｖ（＃１に列挙されたものに加えて）
３．Ｖ１２２Ｌ、Ｔ１２３Ｅ、Ｋ１２４Ｐ、Ｌ２１４Ｆ
４．Ｓ２２５Ｔ、Ｅ２２９Ｐ、Ｅ３０７Ｋ（＃３に列挙されたものに加えて）
５．１、２、３、４、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
【０２７０】
【化３３】
0006671364.tif 000036
【０２７１】
注：ＡＡ  ＃１６０はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１６３はＴまたはＭであり得、ＡＡ  ＃１６８はＳまたはＡであり得、ＡＡ  ＃１７０はＴまたはＳであり得、ＡＡ  ＃１７１はＳまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１７３はＶまたはＩであり得、ＡＡ  ＃１７４はＱまたはＫであり得、ＡＡ  ＃１７６はＰまたはＴであり得、ＡＡ  ＃１８０はＥまたはＡであり得る。
【０２７２】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ２のより大きい領域がＤＥＮＶ１へ移植されている２つのウイルスが生み出され得る：
１．Ｉ６８Ｔ、Ｄ７１Ｅ、Ａ８０Ｐ、Ｔ８１Ｓ、Ｖ８３Ｎ、Ｔ２４２Ｎ、Ａ２４３Ｐ、Ｅ２４９Ｄ
２．Ｒ９３Ｋ、Ｒ９４Ｈ、Ｔ９５Ｓ、Ｆ９６Ｍ、Ｓ１１２Ｇ、Ｌ１１３Ｉ、Ｉ１１４Ｖ（＃１に列挙されたものに加えて）
【０２７３】
【化３４】
0006671364.tif 000037
【０２７４】
注：ＡＡ  ＃５０はＶまたはＡであり得、ＡＡ  ＃５２はＱまたはＮであり得、ＡＡ  ＃５５はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１６０はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１６３はＴまたはＭであり得、ＡＡ  ＃１６８はＳまたはＡであり得、ＡＡ  ＃１７０はＴまたはＳであり得、ＡＡ  ＃１７１はＳまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１７３はＶまたはＩであり得、ＡＡ  ＃１７４はＱまたはＫであり得、ＡＡ  ＃１７６はＰまたはＴであり得、ＡＡ  ＃１８０はＥまたはＡであり得、ＡＡ  ＃２７２はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７５はＴまたはＧであり得、ＡＡ  ＃２７６はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７７はＴまたはＬであり得る。
【０２７５】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ２および／またはＤＥＮＶ３のより大きい領域がＤＥＮＶ１へ移植されている２つのウイルスが生み出され得る：
１．Ｉ６８Ｔ、Ｄ７１Ｅ、Ａ８０Ｐ、Ｔ８１Ｓ、Ｖ８３Ｎ、Ｔ２４２Ｎ、Ａ２４３Ｐ、Ｅ２４９Ｄ
２．Ｒ９３Ｋ、Ｒ９４Ｈ、Ｔ９５Ｓ、Ｆ９６Ｍ、Ｓ１１２Ｇ、Ｌ１１３Ｉ、Ｉ１１４Ｖ（＃１に列挙されたものに加えて）
３．Ｖ１２２Ｌ、Ｔ１２３Ｅ、Ｋ１２４Ｐ、Ｌ２１４Ｆ
４．Ｓ２２５Ｔ、Ｅ２２９Ｐ、Ｅ３０７Ｋ（＃３に列挙されたものに加えて）
５．１、２、３、４、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
【０２７６】
【化３５】
0006671364.tif 000038
【０２７７】
注：ＡＡ  ＃５０はＶまたはＡであり得、ＡＡ  ＃５２はＱまたはＮであり得、ＡＡ  ＃５５はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１６０はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１６３はＴまたはＭであり得、ＡＡ  ＃１６８はＳまたはＡであり得、ＡＡ  ＃１７０はＴまたはＳであり得、ＡＡ  ＃１７１はＳまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１７３はＶまたはＩであり得、ＡＡ  ＃１７４はＱまたはＫであり得、ＡＡ  ＃１７６はＰまたはＴであり得、ＡＡ  ＃１８０はＥまたはＡであり得，ＡＡ  ＃２７２はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７５はＴまたはＧであり得、ＡＡ  ＃２７６はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７７はＴまたはＬであり得る。
【０２７８】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ１のより大きい領域がＤＥＮＶ３へ移植されているウイルスが生み出され得る：
１．Ｓ１６９Ｐ、Ｔ１８０Ａ
２．Ｑ５２Ｎ、Ｌ５３Ｐ、Ｔ５５Ｖ（＃１に列挙されたものに加えて）
【０２７９】
【化３６】
0006671364.tif 000039
【０２８０】
注：ＡＡ  ＃５０はＶまたはＡであり得、ＡＡ  ＃５２はＱまたはＮであり得、ＡＡ  ＃５５はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃２７２はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７５はＴまたはＧであり得、ＡＡ  ＃２７６はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７７はＴまたはＬであり得る。
【０２８１】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ２および／またはＤＥＮＶ１のより大きい領域がＤＥＮＶ３へ移植されている２つのウイルスが生み出され得る：
１．Ｄ７１Ｅ、Ａ８０Ｐ、Ｖ８１Ｓ、Ｐ８３Ｎ、Ａ２４３Ｐ、Ｅ２４９Ｄ
２．Ｉ６８Ｔ、Ｔ９５Ｓ、Ｙ９６Ｍ、Ｓ１１２Ｇ、Ｌ１１３Ｉ（＃１に列挙されたものに加えて）
３．Ｓ１６９Ｐ、Ｔ１８０Ａ
４．Ｑ５２Ｎ、Ｌ５３Ｐ、Ｔ５５Ｖ（＃３に列挙されたものに加えて）
５．１、２、３、４、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
【０２８２】
【化３７】
0006671364.tif 000040
【０２８３】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ２のより大きい領域がＤＥＮＶ３へ移植されている２つのウイルスが生み出され得る：
１．Ｄ７１Ｅ、Ａ８０Ｐ、Ｖ８１Ｓ、Ｐ８３Ｎ、Ａ２４３Ｐ、Ｅ２４９Ｄ
２．Ｉ６８Ｔ、Ｔ９５Ｓ、Ｙ９６Ｍ、Ｓ１１２Ｇ、Ｌ１１３Ｉ（＃１に列挙されたものに加えて）
【０２８４】
【化３８】
0006671364.tif 000041
【０２８５】
注：ＡＡ  ＃５０はＶまたはＡであり得、ＡＡ  ＃５２はＱまたはＮであり得、ＡＡ  ＃５５はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１６０はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１６３はＴまたはＭであり得、ＡＡ  ＃１６８はＳまたはＡであり得、ＡＡ  ＃１７０はＴまたはＳであり得、ＡＡ  ＃１７１はＳまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１７３はＶまたはＩであり得、ＡＡ  ＃１７４はＱまたはＫであり得、ＡＡ  ＃１７６はＰまたはＴであり得、ＡＡ  ＃１８０はＥまたはＡであり得、ＡＡ  ＃２７２はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７５はＴまたはＧであり得、ＡＡ  ＃２７６はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７７はＴまたはＬであり得る。
【０２８６】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ２および／またはＤＥＮＶ１のより大きい領域がＤＥＮＶ３へ移植されている２つのウイルスが生み出され得る：
１．Ｄ７１Ｅ、Ａ８０Ｐ、Ｖ８１Ｓ、Ｐ８３Ｎ、Ａ２４３Ｐ、Ｅ２４９Ｄ
２．Ｉ６８Ｔ、Ｔ９５Ｓ、Ｙ９６Ｍ、Ｓ１１２Ｇ、Ｌ１１３Ｉ（＃１に列挙されたものに加えて）
３．Ｓ１６９Ｐ、Ｔ１８０Ａ
４．Ｑ５２Ｎ、Ｌ５３Ｐ、Ｔ５５Ｖ（＃３に列挙されたものに加えて）
５．１、２、３、４、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
【０２８７】
【化３９】
0006671364.tif 000042
【０２８８】
注：ＡＡ  ＃５０はＶまたはＡであり得、ＡＡ  ＃５２はＱまたはＮであり得、ＡＡ  ＃５５はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１６０はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１６３はＴまたはＭであり得、ＡＡ  ＃１６８はＳまたはＡであり得、ＡＡ  ＃１７０はＴまたはＳであり得、ＡＡ  ＃１７１はＳまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１７３はＶまたはＩであり得、ＡＡ  ＃１７４はＱまたはＫであり得、ＡＡ  ＃１７６はＰまたはＴであり得、ＡＡ  ＃１８０はＥまたはＡであり得、ＡＡ  ＃２７２はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７５はＴまたはＧであり得、ＡＡ  ＃２７６はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７７はＴまたはＬであり得る。
【０２８９】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ１および／またはＤＥＮＶ３のより大きい領域がＤＥＮＶ４へ移植されているウイルスが生み出され得る：
１．Ｔ４９Ｅ、Ｓ１２２Ｌ、Ｇ１２３Ｅ、Ｉ１３２Ｙ
２．Ａ７１Ｄ、Ｔ１４８Ｑ、Ｄ２２５Ｔ、Ｖ２２９Ｐ、Ｄ３０７Ｋ、Ｋ３２１Ｑ、Ｖ３６２Ｐ（＃１に列挙されたものに加えて）
３．Ｓ１６８Ａ、Ｅ１８０Ａ
４．Ｅ５２Ｎ、Ｖ５３Ｐ、Ｌ５５Ｖ、Ｔ１３８Ｓ（＃３に列挙されたものに加えて）
５．１、２、３、４、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
【０２９０】
【化４０】
0006671364.tif 000043
【０２９１】
注：ＡＡ  ＃１６０はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１６３はＴまたはＭであり得、ＡＡ  ＃１６８はＳまたはＡであり得、ＡＡ  ＃１７０はＴまたはＳであり得、ＡＡ  ＃１７１はＳまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１７３はＶまたはＩであり得、ＡＡ  ＃１７４はＱまたはＫであり得、ＡＡ  ＃１７６はＰまたはＴであり得、ＡＡ  ＃１８０はＥまたはＡであり得る。
【０２９２】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ１および／またはＤＥＮＶ２のより大きい領域がＤＥＮＶ４へ移植されている２つのウイルスが生み出され得る：
１．Ｙ８１Ｓ、Ｋ８３Ｓ、Ｖ２４２Ｎ、Ｒ２４７Ｋ
２．Ｉ６８Ｔ、Ａ７１Ｅ、Ｔ７２Ｓ、Ｒ９３Ｋ、Ｒ９４Ｈ、Ｄ９５Ｓ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１１３Ｉ（＃１に列挙されたものに加えて）
３．Ｓ１６８Ａ、Ｅ１８０Ａ
４．Ｅ５２Ｎ、Ｖ５３Ｐ、Ｌ５５Ｖ、Ｔ１３８Ｓ（＃３に列挙されたものに加えて）
５．１、２、３、４、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
【０２９３】
【化４１】
0006671364.tif 000044
【０２９４】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ２および／またはＤＥＮＶ３のより大きい領域がＤＥＮＶ４へ移植されている２つのウイルスが生み出され得る：
１．Ｙ８１Ｓ、Ｋ８３Ｓ、Ｖ２４２Ｎ、Ｒ２４７Ｋ
２．Ｉ６８Ｔ、Ａ７１Ｅ、Ｔ７２Ｓ、Ｒ９３Ｋ、Ｒ９４Ｈ、Ｄ９５Ｓ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１１３Ｉ（＃１に列挙されたものに加えて）
３．Ｔ４９Ｅ、Ｓ１２２Ｌ、Ｇ１２３Ｅ、Ｉ１３２Ｙ
４．Ａ７１Ｄ、Ｔ１４８Ｑ、Ｄ２２５Ｔ、Ｖ２２９Ｐ、Ｄ３０７Ｋ、Ｋ３２１Ｑ、Ｖ３６２Ｐ（＃３に列挙されたものに加えて）
５．１、２、３、４、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
【０２９５】
【化４２】
0006671364.tif 000045
【０２９６】
注：ＡＡ  ＃５０はＶまたはＡであり得、ＡＡ  ＃５２はＱまたはＮであり得、ＡＡ  ＃５５はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１６０はＴまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１６３はＴまたはＭであり得、ＡＡ  ＃１６８はＳまたはＡであり得、ＡＡ  ＃１７０はＴまたはＳであり得、ＡＡ  ＃１７１はＳまたはＶであり得、ＡＡ  ＃１７３はＶまたはＩであり得、ＡＡ  ＃１７４はＱまたはＫであり得、ＡＡ  ＃１７６はＰまたはＴであり得、ＡＡ  ＃１８０はＥまたはＡであり得、ＡＡ  ＃２７２はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７５はＴまたはＧであり得、ＡＡ  ＃２７６はＴまたはＮであり得、ＡＡ  ＃２７７はＴまたはＬであり得る。
【０２９７】
以下の変化もまた起こされて、ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、および／またはＤＥＮＶ３のより大きい領域がＤＥＮＶ４へ移植されている２つのウイルスが生み出され得る：
１．Ｙ８１Ｓ、Ｋ８３Ｓ、Ｖ２４２Ｎ、Ｒ２４７Ｋ
２．Ｉ６８Ｔ、Ａ７１Ｅ、Ｔ７２Ｓ、Ｒ９３Ｋ、Ｒ９４Ｈ、Ｄ９５Ｓ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１１３Ｉ（＃１に列挙されたものに加えて）
３．Ｔ４９Ｅ、Ｓ１２２Ｌ、Ｇ１２３Ｅ、Ｉ１３２Ｙ
４．Ａ７１Ｄ、Ｔ１４８Ｑ、Ｄ２２５Ｔ、Ｖ２２９Ｐ、Ｄ３０７Ｋ、Ｋ３２１Ｑ、Ｖ３６２Ｐ（＃３に列挙されたものに加えて）
５．Ｓ１６８Ａ、Ｅ１８０Ａ
６．Ｅ５２Ｎ、Ｖ５３Ｐ、Ｌ５５Ｖ、Ｔ１３８Ｓ
７．１、２、３、４、５、６および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
出願時の特許請求の範囲は以下の通りである。
［請求項１］
デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なるデングウイルス血清型と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含むデングウイルスＥ糖タンパク質主鎖を含むキメラデングウイルスＥ糖タンパク質であって、前記デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖がデングウイルス血清型４由来であり、前記抗体がデングウイルス血清型３と反応性である、キメラデングウイルスＥ糖タンパク質。
［請求項２］
前記抗体がモノクローナル抗体５Ｊ７である、請求項１に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質。
［請求項３］
アミノ酸配列：
【化４３】
0006671364.tif 000046
を含み、前記アミノ酸配列が以下のアミノ酸置換：
Ｔ４９Ｅ、Ｋ５１Ｔ、Ｅ５２Ｑ、Ｖ５３Ｌ、Ｌ５５Ｔ、Ｔ５８Ｋ、Ｙ５９Ｌ、Ｓ１２２Ｌ、Ｇ１２３Ｅ、Ｋ１２４Ｐ、Ｔ１２６Ｅ、Ｎ１２８Ｋ、Ｌ１２９Ｖ、Ｉ１３２Ｙ、Ｍ１９９Ｌ、Ｋ２００Ｔ、Ｔ２０５Ａ、Ｌ２０７Ｍ、Ｋ２１０Ｒ、Ｌ２１４Ｆ、Ａ２２２Ｓ、Ｖ２７０Ｉ、Ｄ２７１Ｑ、Ｓ２７２Ｎ、Ｇ２７３Ｓ、Ｄ２７４Ｇ、Ｎ２７６Ｔ、Ｈ２７７Ｓ、およびＭ２７８Ｉ
を含み、前記アミノ酸配列が以下のアミノ酸置換：Ａ７１Ｄ、Ｔ１４８Ｑ、Ｄ２２５Ｔ、Ｖ２２９Ｐ、Ｄ３０７Ｋ、Ｋ３２１Ｑ、およびＶ３６２Ｐのうちの１つまたは複数を任意の組み合わせでさらに含む、請求項１に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質。
［請求項４］
アミノ酸配列：
【化４４】
0006671364.tif 000047
を含む、請求項１に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質。
［請求項５］
アミノ酸配列：
【化４５】
0006671364.tif 000048
を含む、請求項１に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質。
［請求項６］
デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なるデングウイルス血清型由来のタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含むデングウイルスＥ糖タンパク質主鎖を含むキメラデングウイルスＥ糖タンパク質であって、前記デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖がデングウイルス血清型４由来であり、前記タンパク質ドメインがデングウイルス血清型２由来である、キメラデングウイルスＥ糖タンパク質。
［請求項７］
前記タンパク質ドメインがＥ糖タンパク質ドメインＩＩＩである、請求項６に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質。
［請求項８］
アミノ酸配列：
【化４６】
0006671364.tif 000049
を含み、前記アミノ酸配列が、以下のアミノ酸置換：
Ｔ３００Ｓ、Ｓ３０３Ｔ、Ｓ３０７Ｋ、Ｄ３０９Ｖ、Ｍ３１２Ｉ、Ｔ３２０Ｉ、Ｖ３２２Ｉ、Ｋ３２３Ｒ、Ｋ３２５Ｑ、Ａ３２９Ｄ、Ａ３３１Ｓ、Ｖ３３５Ｉ、Ｉ３３７Ｆ、Ｒ３４０Ｔ、Ｖ３４２Ｌ、Ｎ３４３Ｅ、Ｅ３４５Ｒ、Ｋ３４６Ｈ、Ｖ３４８Ｌ、Ｖ３５１Ｌ、Ｓ３５３Ｔ、Ｓ３５４Ｖ、Ｔ３５５Ｎ、Ｌ３５７Ｉ、Ａ３５８Ｖ、Ｅ３５９Ｔ、Ｎ３６０Ｅ、Ｔ３６１Ｋ、Ｎ３６２Ｄ、Ｖ３６４Ｐ、Ｔ３６５Ｖ、Ｌ３６９Ａ、Ｖ３７９Ｉ、Ｇ３８３Ｅ、Ｎ３８４Ｐ、Ｓ３８５Ｇ、Ａ３８６Ｑ、Ｔ３８８Ｋ、Ｈ３９０Ｎ、Ｒ３９３Ｋ
を含む、請求項６に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質。
［請求項９］
アミノ酸配列：
【化４７】
0006671364.tif 000050
を含む、請求項６に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質。
［請求項１０］
デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なるデングウイルス血清型と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含むデングウイルスＥ糖タンパク質主鎖を含むキメラデングウイルスＥ糖タンパク質であって、前記デングウイルスＥ糖タンパク質主鎖がデングウイルス血清型２由来であり、前記抗体がデングウイルス血清型１と反応性である、キメラデングウイルスＥ糖タンパク質。
［請求項１１］
前記抗体がモノクローナル抗体１Ｆ４である、請求項１０に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質。
［請求項１２］
アミノ酸配列：
【化４８】
0006671364.tif 000051
を含む、請求項１０に記載のキメラデングウイルスＥ糖タンパク質。
［請求項１３］
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
［請求項１４］
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質をコードする単離された核酸分子。
［請求項１５］
請求項１３に記載のフラビウイルス粒子またはＶＬＰをコードする単離された核酸分子。
［請求項１６］
請求項１３に記載のフラビウイルス粒子を含むフラビウイルス粒子の集団。
［請求項１７］
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を薬学的に許容される担体中に含む組成物。
［請求項１８］
請求項１４または１５に記載の核酸分子を薬学的に許容される担体中に含む組成物。
［請求項１９］
請求項１６に記載の集団を薬学的に許容される担体中に含む組成物。
［請求項２０］
請求項１３に記載のフラビウイルス粒子および／またはＶＬＰを薬学的に許容される担体中に含む組成物。
［請求項２１］
対象においてデングウイルスに対する免疫応答を生じさせる方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質、請求項１３に記載のフラビウイルス粒子、請求項１３に記載のＶＬＰ、請求項１４〜１５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１６に記載の集団、および／または請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の組成物、ならびにそれらの任意の組み合わせを投与することを含む方法。
［請求項２２］
対象においてデングウイルス感染を処置する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質、請求項１３に記載のフラビウイルス粒子、請求項１３に記載のＶＬＰ、請求項１４〜１５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１６に記載の集団、および／または請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の組成物、ならびにそれらの任意の組み合わせを投与することを含む方法。
［請求項２３］
対象においてデングウイルス感染に関連した障害を防止する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質、請求項１３に記載のフラビウイルス粒子、請求項１３に記載のＶＬＰ、請求項１４〜１５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１６に記載の集団、および／または請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の組成物、ならびにそれらの任意の組み合わせを投与することを含む方法。
［請求項２４］
デングウイルス感染の影響から対象を保護する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質、請求項１３に記載のフラビウイルス粒子、請求項１３に記載のＶＬＰ、請求項１４〜１５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１６に記載の集団、および／または請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の組成物、ならびにそれらの任意の組み合わせを投与することを含む方法。
［請求項２５］
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む組成物を、前記対象に、前記Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
ｂ）前記対象由来の生物学的試料を、上記のステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、および
ｃ）ステップ（ｂ）における中和を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体の存在を同定するステップ
を含む方法。
［請求項２６］
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、
ａ）請求項６〜９のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む組成物を、前記対象に、前記Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
ｂ）前記対象由来の生物学的試料を、上記のステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、および
ｃ）ステップ（ｂ）における中和を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体の存在を同定するステップ
を含む方法。
［請求項２７］
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、
ａ）請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む組成物を、前記対象に、前記Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
ｂ）前記対象由来の生物学的試料を、上記のステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、および
ｃ）ステップ（ｂ）における中和を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体の存在を同定する、ステップ
を含む方法。
［請求項２８］
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記Ｅ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、および
ｂ）ステップ（ａ）における中和を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体の存在を同定する、ステップ
を含む方法。
［請求項２９］
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、
ａ）請求項６〜９のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記Ｅ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、および
ｂ）ステップ（ａ）における中和を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体の存在を同定する、ステップ
を含む方法。
［請求項３０］
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、
ａ）請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記Ｅ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、および
ｂ）ステップ（ａ）における中和を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体の存在を同定する、ステップ
を含む方法。
［請求項３１］
対象においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を、対象に、前記Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
ｂ）前記対象由来の生物学的試料を、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、
ｃ）前記生物学的試料が、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびに
ｄ）前記生物学的試料が、（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、前記対象においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体を誘導するものとして前記免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
［請求項３２］
対象においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
ａ）請求項６〜９のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を、対象に、前記Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
ｂ）前記対象由来の生物学的試料を、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、
ｃ）前記生物学的試料が、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびに
ｄ）前記生物学的試料が、（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、前記対象においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体を誘導するものとして前記免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
［請求項３３］
対象においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
ａ）請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を、対象に、前記Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
ｂ）前記対象由来の生物学的試料を、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、
ｃ）前記生物学的試料が、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびに
ｄ）前記生物学的試料が、（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、前記対象においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体を誘導するものとして前記免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
［請求項３４］
対象においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記Ｅ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、
ｂ）前記生物学的試料が、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびに
ｃ）前記生物学的試料が、（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、前記対象においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体を誘導するものとして前記免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
［請求項３５］
対象においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
ａ）請求項６〜９のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記Ｅ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、
ｂ）前記生物学的試料が、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびに
ｃ）前記生物学的試料が、（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、前記対象においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体を誘導するものとして前記免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
［請求項３６］
対象においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
ａ）請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記Ｅ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、
ｂ）前記生物学的試料が、ステップ（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびに
ｃ）前記生物学的試料が、（ａ）のＥ糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、前記対象においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体を誘導するものとして前記免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
［請求項３７］
試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を検出する方法であって、
ａ）前記試料を請求項１〜５のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
ｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を検出するステップ
を含む方法。
［請求項３８］
試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する抗体を検出する方法であって、
ａ）前記試料を請求項６〜９のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
ｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を検出するステップ
を含む方法。
［請求項３９］
試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する抗体を検出する方法であって、
ａ）前記試料を請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
ｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する抗体を検出するステップ
を含む方法。
［請求項４０］
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を同定する方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む組成物を、前記対象に、前記Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
ｂ）前記対象由来の生物学的試料を（ａ）のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
ｃ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を同定するステップ
を含む方法。
［請求項４１］
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する抗体を同定する方法であって、
ａ）請求項６〜９のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む組成物を、前記対象に、前記Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
ｂ）前記対象由来の生物学的試料を（ａ）のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
ｃ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する抗体を同定するステップ
を含む方法。
［請求項４２］
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する抗体を同定する方法であって、
ａ）請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む組成物を、前記対象に、前記Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
ｂ）前記対象由来の生物学的試料を（ａ）のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
ｃ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する抗体を同定するステップ
を含む方法。
［請求項４３］
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を同定する方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記Ｅ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
ｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を同定するステップ
を含む方法。
［請求項４４］
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する抗体を同定する方法であって、
ａ）請求項６〜９のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記Ｅ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
ｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型２および／または４に対する抗体を同定するステップ
を含む方法。
［請求項４５］
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する抗体を同定する方法であって、
ａ）請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記Ｅ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
ｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型１および／または２に対する抗体を同定するステップ
を含む方法。
［請求項４６］
対象においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記Ｅ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
ｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象においてデングウイルス血清型３および／または４に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
［請求項４７］
対象においてデングウイルス血清型２および／または４に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
ａ）請求項６〜９のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記Ｅ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
ｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象においてデングウイルス血清型２および／または４に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
［請求項４８］
対象においてデングウイルス血清型１および／または２に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
ａ）請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記Ｅ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
ｂ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象においてデングウイルス血清型１および／または２に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
［請求項４９］
対象においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を、対象に、前記Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
ｂ）前記対象由来の生物学的試料を（ａ）のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
ｃ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象においてデングウイルス血清型３および／または４に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
［請求項５０］
対象においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
ａ）請求項６〜９のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を、対象に、前記Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
ｂ）前記対象由来の生物学的試料を（ａ）のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
ｃ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象においてデングウイルス血清型２および／または４に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
［請求項５１］
対象においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
ａ）請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＥ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を、対象に、前記Ｅ糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
ｂ）前記対象由来の生物学的試料を（ａ）のＥ糖タンパク質と、抗原／抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
ｃ）抗原／抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象においてデングウイルス血清型１および／または２に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
【図１−１】
0006671364.tif 000056
【図１−２】
0006671364.tif 000057
【図２】
0006671364.tif 000058
【図３】
0006671364.tif 000059
【図４】
0006671364.tif 000060
【図５】
0006671364.tif 000061
【図６】
0006671364.tif 000062
【図７】
0006671364.tif 000063
【図８】
0006671364.tif 000064
【図９】
0006671364.tif 000065
【図１０】
0006671364.tif 000066
【図１１】
0006671364.tif 000067
【図１２】
0006671364.tif 000068
【図１３】
0006671364.tif 000069
【図１４】
0006671364.tif 000070
【図１５】
0006671364.tif 000071
【図１６】
0006671364.tif 000072
【図１７】
0006671364.tif 000073
【図１８】
0006671364.tif 000074
【図１９】
0006671364.tif 000075
【図２０】
0006671364.tif 000076
【図２１】
0006671364.tif 000077
【図２２】
0006671364.tif 000078
【図２３】
0006671364.tif 000079
【図２４】
0006671364.tif 000080
【図２５】
0006671364.tif 000081
【図２６】
0006671364.tif 000082
【図２７】
0006671364.tif 000083
【図２８】
0006671364.tif 000084
【図２９】
0006671364.tif 000085
【図３０】
0006671364.tif 000086
【図３１】
0006671364.tif 000087
【図３２Ａ】
0006671364.tif 000088
【図３２Ｂ】
0006671364.tif 000089
【図３２Ｃ−１】
0006671364.tif 000090
【図３２Ｃ−２】
0006671364.tif 000091
【配列表】
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