(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的物の濃度を決定する方法であって、
標的物の局所的な濃度を示す個別の局所的な測定値のデータ点を含むアッセイデータを、アッセイアセンブリの複数のアッセイ領域のそれぞれにて得るステップであって、前記アッセイ領域は、前記アッセイアセンブリを流れる試料が順番に各アッセイ領域を流れるように直列に連結され、各アッセイ領域は、その表面に固定化されている複数のプローブ物を含み、前記試料が前記アッセイ領域の１つから次のものまで流れる際に前記標的物の濃度が減少するように、前記プローブ物は前記試料中の前記標的物に結合するように配置されているステップと；
前記アッセイデータをパラメータ化された関数でモデル化するステップと；
１つ以上のパラメータの少なくとも１つに基づいて試料中の標的物の濃度を示す値を決定するステップと、を含み、
前記パラメータ化された関数がロジスティック関数であり、前記パラメータ化された関数が下記数式に比例することを特徴とする方法。
【数１】
0006755251.tif 000021
（式中、ＤＰｍａｘおよびＳｈａｐｅは前記アッセイアセンブリに特有の固定パラメータであり、ＤＰｍａｘはアッセイ領域から検出できる局所的な測定値の最大振幅を示し、Ｓｈａｐｅは１つのアッセイ領域から次のものまで試料が流れる際に標的物の濃度が減少した量または割合を示し、Ｏｆｆｓｅｔは試料中の標的物の濃度に依存するパラメータであり、ＤＺｉは、順番における個別のアッセイ領域ｉの位置を示す。）
【請求項２】
前記パラメータ化された関数が試料中の標的物の濃度の範囲について得られたアッセイデータセットから得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
較正関数を用いて、１つ以上のパラメータの少なくとも１つに基づいて値を決定するステップを含み、前記較正関数が、所与の値を超える試料中の標的物の濃度での使用のための第１の関数と、所与の値未満の試料中の標的物の濃度での使用のための第２の関数と、を含むことを特徴とする請求項１乃至２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
各局所的な測定値が、個別のアッセイ領域の表面での屈折率の変動を示す請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記個別のアッセイ領域の表面での前記屈折率の変動が、前記個別のアッセイ領域を流れる増幅器溶液によって増幅され、結合した標的物と増幅器が相互作用した際に前記個別のアッセイ領域での前記屈折率の変動が増幅するように、前記アッセイ領域の表面に結合した標的物と相互作用するように前記増幅器溶液が配置されていることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
各局所的な測定値が、増幅前シグナルと増幅後シグナルとの差を含み、前記試料と前記個別のアッセイ領域との相互作用後に、かつ前記増幅器溶液と個別のアッセイ領域に結合した標的物との相互作用前に、増幅前シグナルが検出され、前記個別のアッセイ領域に結合した標的物と前記増幅器溶液との相互作用後に、増幅後シグナルが検出されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アッセイデータをモデル化するステップが、調整項を用いて前記試料のバルク屈折率を算定するステップを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記調整項は、前記試料と前記アッセイ領域との相互作用の前に検出されたベースラインシグナルと、前記増幅前シグナルとの差に基づいて決定されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
各局所的な測定値が、前記増幅器溶液が前記個別のアッセイ領域と相互作用する比率を示すことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記順番におけるアッセイ領域の位置を示す量が、前記アッセイ領域の位置の上流のプローブ物の量を示す請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
試料中の標的物の濃度を決定するためのシステムであって、
アッセイアセンブリの複数のアッセイ領域のそれぞれでの標的物の局所的な濃度を示す個別の局所的な測定値のデータ点を含むアッセイデータを得、
前記アッセイデータをパラメータ化された関数でモデル化し、
１つ以上のパラメータの少なくとも１つに基づいて試料中の標的物の濃度を示す値を決定するように配置された処理装置を含み、
ここで、前記アッセイ領域は、前記アッセイアセンブリを流れる試料が各アッセイ領域を順番に流れるように直列に連結されており、
各アッセイ領域はその表面に固定化されている複数のプローブ物を含み、前記プローブ物は、前記試料が前記アッセイ領域の１つから次のものまで流れる際に前記標的物の濃度が減少するように、前記標的物に結合するように配置されており、
前記パラメータ化された関数がロジスティック関数であり、前記パラメータ化された関数が下記数式に比例することを特徴とするシステム。
【数２】
0006755251.tif 000022
（式中、ＤＰｍａｘおよびＳｈａｐｅは前記アッセイアセンブリに特有の固定パラメータであり、ＤＰｍａｘはアッセイ領域から検出できる局所的な測定値の最大振幅を示し、Ｓｈａｐｅは１つのアッセイ領域から次のものまで試料が流れる際に標的物の濃度が減少した量または割合を示し、Ｏｆｆｓｅｔは試料中の標的物の濃度に依存するパラメータであり、ＤＺｉは、順番における個別のアッセイ領域ｉの位置を示す。）
【請求項１２】
前記システムは、アッセイアセンブリを流れる試料が各アッセイ領域を順番に流れるように直列に連結された複数のアッセイ領域を含み、各アッセイ領域はその表面に固定化されている複数のプローブ物を含み、前記プローブ物は、前記試料が前記アッセイ領域の１つから次のものまで流れる際に標的物の濃度が減少するように標的物に結合するように配置されているアッセイアセンブリと；
各アッセイ領域で局所的な測定を実施して、前記複数のアッセイ領域のそれぞれでの前記標的物の局所的な濃度を示す個別の局所的な測定値のデータ点を含むアッセイデータを得るように配置された少なくとも１つの検出器と、をさらに含み；
前記処理装置が、前記少なくとも１つの検出器からアッセイデータを得るように配置されている請求項１１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、試料中の標的物の濃度を決定する、例えば、生物学的試料中の標的抗原または標的抗体の濃度を決定する方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
イムノアッセイを使用して、試料中に存在する標的物、例えば抗原の濃度を定量的に決定することできる。マイクロ流体イムノアッセイの場合、試料が導入されるマイクロ流体チャンバーを含む配置を使用し得る。そのようなチャンバーは、チャンバーの表面上に固定化した複数のプローブ物、例えば抗体を含み、試料が表面を通過する際に、試料中の抗原がチャンバー内の抗体に結合するようになっている。抗体−抗原結合の量は、例えば、蛍光または表面プラズモン共鳴測定（ＳＰＲ）を用いて検出し得、定量し得、試料中の標的物の濃度はこの量から決定できる。
【０００３】
既存のイムノアッセイに固有の制約、例えばプローブ密度または検出感度により、既知のマイクロ流体イムノアッセイによって検出できる試料中の標的物の濃度の範囲が制限される。いずれか１つのアッセイについて、検出および定量化は、標的濃度と検出シグナルとの関係の感知できる（理想的には直線状の）範囲でのみ機能する。この範囲より下では、ノイズに対するシグナルの比率が低すぎ、この範囲を超えるとアッセイが飽和する。いずれにしても、測定したシグナルは、試料濃度から独立したものとなる。
【発明の概要】
【０００４】
これらの問題を対処し、濃度が定量できるダイナミックレンジを拡張する標的濃度の決定方法およびシステムを提供することが望まれている。
【０００５】
第１の態様では、試料中の標的物の試料濃度を決定する、例えば、血液試料または他の生物学的試料中の標的抗原または標的抗体の濃度を決定する方法が提供される。該方法は、アッセイアセンブリを用いるアッセイからのアッセイアセンブリの複数のアッセイ領域のそれぞれに固定化されている標的物の局所的な濃度を示す個別の局所的な測定値のデータ点を含むアッセイデータを得るステップを含む。アッセイ領域は、アッセイアセンブリを流れる試料が各アッセイ領域を順番に流れるように直列に連結される。各アッセイ領域はアッセイ領域の表面に固定化されている複数のプローブ物を含み、試料がアッセイ領域の１つから次のものまで流れる際に標的物の濃度が減少するように、プローブ物は試料中の標的物に結合するように配置されている。アッセイデータは、順番における個別のアッセイ領域の位置を示す量に対する局所的な測定値のパラメータ化された関数でモデル化され、ここで、１つ以上のパラメータは試料濃度に依存する。試料濃度を示す値は１つ以上のパラメータの少なくとも１つに基づいて決定される。
【０００６】
複数の連続的に連結されたアッセイ領域から得られた減少データを用いて、標的−プローブ結合に関する情報を、１つのアッセイ領域から次のものまで濃度が低下する際に異なる標的物の濃度で得ることができる。したがって、単一のアッセイ領域を含むシステムと比較して、より大きい範囲の標的物の試料濃度を決定できる。複数のアッセイ領域からの測定結果の量に対する関数でデータをモデル化することによって、ノイズに対する全体のシグナルの割合を改善し得るようにデータが組み合わせられる。
【０００７】
データのモデル化は、例えば、当分野で周知のように、パラメータ化された関数の値とデータ点との間の矛盾を捕捉する対応する総和関数を減少させるか、または最小化することによって、パラメータ化された関数をデータ点に合わせるように、１つ以上のパラメータを調節することを含み得ることが理解される。そのような既知の技術の例は、一般に、非線形回帰、勾配降下および最小二乗最適化である。
【０００８】
一部の実施形態では、パラメータ化された関数が、オフセット量によって相殺される順番におけるアッセイ領域の位置を示す量に対する局所的な測定値の関数であるように、１つ以上のパラメータの１つは、順番におけるアッセイ領域の位置を示す量を相殺するオフセット量を示す変数パラメータである。言い換えれば、アッセイ領域の位置ｉを順番に示す量をＤＺｉで表した場合パラメータ化された関数は（ＤＺｉ＋Ｏｆｆｓｅｔ）（「Ｏｆｆｓｅｔ」はオフセット量）の関数である。
【０００９】
パラメータ化された関数は、個別の試料濃度についてそれぞれ得られた複数のアッセイデータセットから導かれてもよく、該試料濃度は、試料濃度のある範囲をカバーする。
【００１０】
パラメータ化された関数は、限定ではなく、理解を助ける例として、アッセイアセンブリのシステム特性における標的物の濃度の減少を定めるマスター減少曲線を表すものとして考えられ得、該システムは、順番における１つの概念上のアッセイ領域から順番における次の概念上のアッセイ領域まで、標的物の濃度が減少するように配置された複数の概念上のアッセイ領域を含む。概念上のアッセイ領域の数は、アッセイアセンブリ中のアッセイ領域の数より大きい。マスター減少曲線をアッセイデータセットに合わせることは、アッセイアセンブリのアッセイ領域が試料濃度に対応する概念上のアッセイ領域のセットに位置づけられるように、アッセイ領域をオフセット量で概念上相殺することと考えることができる。
【００１１】
パラメータ化された関数はロジスティック関数であり得る。一部の場合では、ｎ次多項式関数またはスプラインを使用してもよく、またはいずれの他の適した関数形式を使用してもよい。パラメータ化された関数は、例えば、ルックアップテーブル内でデータ入力の間にデータ点を作成するように補間を使用して、マスター減少曲線を表すためのルックアップテーブルを含み得る。
【００１２】
一部の実施形態では、オフセット量は、アッセイアセンブリのアッセイ領域ごとに、個別の局所的な測定値とパラメータ化された関数の対応する値との間の差異を最小限にすることによって決定される。例えば、オフセット量は、最小二乗近似またはいずれの他の適した近似を用いて決定し得る。
【００１３】
一部の実施形態では、オフセット量「Ｏｆｆｓｅｔ」は、以下の関数を最小にすることによって決定される。
【数１】
0006755251.tif 000002
式中、ＤＰ（ＤＺｉ）は、個別のアッセイ領域ｉでの局所的な測定値であり、ｆはパラメータ化された関数の対応する値である。前述したように、ＤＺｉは順番におけるアッセイ領域の位置を示す量である。いずれの適したコスト関数の最小化も実施して、パラメータ化された関数のアッセイデータへの最良の適合を得てもよい。例えば、カイ二乗最小化法を使用し得る。他の最小化アプローチは、局所的な測定値に重み付けを適用することであり得る。例えば、より低い重み付けがノイズ閾値に近い測定値に与えられ得る。例えば、順番内で前のアッセイ領域により高い重み付けが与えられ得る。
【００１４】
一部の実施形態では、１つ以上のパラメータが、所与のアッセイアセンブリの１つ以上の固定パラメータ特性を含み得る。例えば、１つの固定パラメータが、以下、時折ＤＰｍａｘと称される、アッセイ領域から検出できる局所的な測定値の最大振幅を示し得る。例えば、別の固定パラメータが、以下、時折Ｓｈａｐｅと称される、１つのアッセイ領域から次のものまで試料が流れる際に標的物の濃度が減少した量または割合を示し得る。これらのパラメータが、アッセイアセンブリ（または実質的に同一の条件下で製造したバッチまたはアッセイアセンブリ）の特性であり、アッセイされた試料の組成の関数として実質的に変動しないという意味で固定されたと言及されることが理解されるだろう。各アッセイアセンブリは、一部の実施形態では１回のみ使用され、それ故に同じ製造バッチからバッチを特徴付けるように個別のアッセイアセンブリを用いて実験が実施されることが理解されるだろう。決定した固定パラメータは、既知の試料濃度または標的物の試料と共にバッチの他のアセンブリを用いる検証実験で、バッチの代表であるとして検証し得る。
【００１５】
ＤＰｍａｘおよびＳｈａｐｅの値は、アッセイアセンブリについて決定され得、固定され得る。
【００１６】
１つ以上の固定パラメータは、実験データを用いて、例えば、複数の実験ｊのそれぞれでのアッセイアセンブリにおけるアッセイ領域ｉごとに、個別の局所的な測定値とパラメータ化された関数の対応する値との間の差異を最小化することによって決定し得、ここで、各実験は、所与の濃度の標的物を有する試料を用いて実施され、濃度は濃度のある範囲に及ぶ。例えば、オフセット量は、最小二乗近似またはいずれの他の適した近似を用いて決定し得る。
【００１７】
１つの例では、１つ以上の固定パラメータまたは定数λのセットを、以下の関数を最小化することで決定し得る。
【数２】
0006755251.tif 000003
ここで、ｍ回の実験からのデータが使用され、実験ごとに、ｎ個のアッセイ領域を含むアッセイアセンブリが使用される。固定パラメータに加えて、「Ｏｆｆｓｅｔ」の値も、複数の実験ｊのそれぞれについて決定できる。このデータを用いて、実験ごとにＯｆｆｓｅｔと試料の標的物の開始濃度Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｊとの関係は、Ｏｆｆｓｅｔの対応する値についての濃度値を与える較正関数として定義し得る。例えば、較正関数は、{Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｊ，Ｏｆｆｓｅｔｊ}のデータ点に合わせることができる。さらに以下で説明するように、較正関数を使用して、１つ以上の変数パラメータの少なくとも１つ、特に上記例でのＯｆｆｓｅｔを基準として標的物の試料濃度を決定し得る。
【００１８】
パラメータ化された関数はロジスティック関数であり得る。
【００１９】
一部の実施形態では、パラメータ化された関数は、
【数３】
0006755251.tif 000004
に比例する。式中、ＤＰｍａｘは、アッセイ領域から検出できる局所的な測定値の最大振幅を示し、Ｓｈａｐｅは、試料が１つのアッセイ領域から次のものまで流れる際に標的物の濃度が減少する割合を示し、Ｏｆｆｓｅｔは、データ適合によって決定される変数パラメータであり、ＤＺｉは、順番における個別のアッセイ領域ｉの位置を示す。
【００２０】
一部の実施形態では、各アッセイ領域の中心で検出が実施され、したがって、ＤＺｉは、アッセイ領域ごとに正の半整数値、すなわち０．５、１．５、２．５等を取り得る。これは、第１の測定値が取られる位置の前に、減少量が第１のアッセイ領域にて発生するからである。ＤＺｉは整数値、またはいずれの他の適した値を取り得る。一部の実施形態では、整数および半整数値の混合を使用し得る。一部の実施形態では、順番における位置を示す量は、対応する測定値が取られる位置であるアッセイ領域の上流に存在するプローブ物（標的物と相互作用可能なもの）の量を示す。これらの実施形態では、１つのアッセイ領域から次のものまでの量の変化が一定でなくてもよく、プローブ物の量または該当する２つのアッセイ領域間の標的物を結合する容量に依存してもよい。
【００２１】
パラメータ化された関数は、Ｏｆｆｓｅｔの値を調節することによって、得られたアッセイデータに合わせ得る。これは、例として、アッセイデータをマスター減少曲線に位置づけるものとして考えることができる。試料中の標的物の濃度を示す値は、Ｏｆｆｓｅｔの値を較正関数と共に用いて決定し得る。
【００２２】
上記式（１）によって与えられたパラメータ化関数では、アッセイアセンブリは、ＤＰｍａｘおよびＳｈａｐｅを決定することによって特徴付けられる。より多くの複合モデル、例えば後述する４ＰＬおよび５ＰＬ関数は、システムを説明するのにより正確であり得るが、そのような複合モデルでは、追加の適合パラメータが使用される。
【００２３】
試料濃度を示す値を決定し得、例えば較正関数を用いて計算し得る。較正関数はロジスティック関数、指数関数、またはいずれの他の適した関数であり得る。一部の実施形態では、較正関数は、所与の値を超える標的物の試料濃度で使用するための第１の関数と、所与の値未満の標的物の試料濃度で使用するための第２の関数とを含む。特定の実施形態では、第１の関数はＯｆｆｓｅｔの関数であり、第２の関数は、
【数４】
0006755251.tif 000005
の関数であるような、ＤＺｉ＝０での概念上減少していない応答の関数である。標的物の試料濃度を示す値を決定するステップは、試料濃度自体を計算するステップまた試料濃度のいずれの変換も計算するステップを含み得る。同様に、試料濃度を示す値を決定するステップは、局所的な測定値を直接またはそれらのいずれの変換もモデル化するステップを含み得る。
【００２４】
試料濃度の決定は反復プロセスであり得る。例えば、第１のステップを最初に適用し得、続いてより精密な結果をもたらし得る第２のステップを適用し得る。具体的には、一部の実施形態では、第１の関数を第１のステップで使用して、濃度を示す値を決定する。値が閾値未満である場合、第２のステップは第２の較正関数を用いて値を再計算する。一部の実施形態では、順序が逆転し、第１のステップからの（第２の関数からの）値が閾値を超える場合、第１の関数を第２のステップで使用する。
【００２５】
一部の実施形態では、較正関数は、下記等式（２）で示すような４パラメータロジスティック（４ＰＬ）非線形回帰モデルである。
【数５】
0006755251.tif 000006
式中、ａ、ｂ、ｃおよびｄは固定パラメータであり、ｘ＝Ｏｆｆｓｅｔ（または他の適合パラメータ）である。
【００２６】
一部の実施形態では、較正関数は、下記等式（３）に示すような５パラメータロジスティック（５ＰＬ）非線形回帰モデルである。
【数６】
0006755251.tif 000007
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｇは固定パラメータであり、ｘ＝Ｏｆｆｓｅｔ（または他の適合パラメータ）を満たす。
【００２７】
上述したように、４ＰＬおよび５ＰＬ関数も、パラメータ化された関数として使用できる。その場合、例えばｘ＝ＤＺｉ＋Ｏｆｆｓｅｔである。
【００２８】
一部の実施形態では、各局所的な測定値は、標的−プローブ結合による個別のアッセイ領域の表面での屈折率の変動を示す。例えば、局所的な測定値は、検出領域での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）挙動の変化に対応し得る。そのような変化は、ＳＰＲ吸収のピークの変化、例えばピークが生じる散乱角の値によって検出され得る。例えば波長または相を基準とした他のＳＰＲ検出パラダイムも、一部の実施形態で当然使用し得る。ＳＰＲ測定値を用いて、１つのアッセイ領域から次のものまでの標的物の局所的な濃度の０．５ｎＭの変化が検出され得る。代替として、個別のアッセイ領域の表面での標的−プローブ結合の量を定量的に検出するためのいずれの他の適した手段も使用し得、例えば、蛍光または吸収検出（例えばＵＶ吸収）および／または標的物に結合した標識（蛍光のものまたは他のもの）の検出を使用し得る。
【００２９】
一部の実施形態では、個別のアッセイ領域の表面での屈折率の変動は、増幅器溶液を用いて増幅し得る。増幅器が結合した標的物と相互作用した際に個別のアッセイ領域での屈折率の変動が増幅するように、増幅器溶液は、アッセイ領域の表面に結合した標的物と相互作用するように用意される。増幅器溶液は、アッセイ領域の表面に順番に結合した標的物に結合するように用意されたものを含み得、例えば標的物に結合して標的特異的増幅をもたらすように官能化された金ナノ粒子、他の適したナノ粒子、二次抗体、およびビーズを使用し得る。増幅器溶液は、個別のアッセイ領域の表面での屈折率の変動を２〜２０倍、例えば５〜１０倍、例えば１０倍増幅し得る。
【００３０】
標的物および／またはプローブ物は、分子または他の適したもの、例えばタンパク質、ＤＮＡ、ペプチド、酵素、ウイルス、細菌、細胞等であり得る。試料は、血液試料またはいずれの他の液体の生物学的（または他の）試料であり得る。
【００３１】
一部の実施形態では、各局所的な測定値は、試料のアッセイ領域との相互作用の前に検出されたベースラインシグナルと、個別のアッセイ領域に結合した標的物と増幅器溶液との相互作用の後に検出された増幅後シグナルとの間の差を含む。例えば、増幅後シグナルは、個別のアッセイ領域を緩衝液で洗浄した後に検出し得る。
【００３２】
一部の実施形態では、各局所的な測定値は、増幅前シグナルと増幅後シグナルとの差を含む。試料と個別のアッセイ領域との相互作用後に、増幅器溶液と個別のアッセイ領域に結合した標的物との相互作用前に増幅前シグナルが検出される。増幅器溶液と個別のアッセイ領域に結合した標的物との相互作用後に、増幅後シグナルが検出される。増幅前シグナルは試料のバルク試料屈折率からの寄与を含み得る。増幅器の適用に続く洗浄ステップで、非結合増幅器および試料を緩衝液で実質的に洗い流した後に、増幅後シグナルを得てもよい。そのような実施形態では、局所的な測定値のパラメータ化された関数は、増幅前シグナルに影響を与えるが増幅後シグナルに影響を与えない試料のバルク試料屈折率を算定するための調整項を含み得る。調整項は、１つ以上の変数パラメータの一部としてデータ点に合わせてもよく、例えば一部の実施形態ではＯｆｆｓｅｔと共に同時に合わせてもよい。他の実施形態では、試料のアッセイ領域との相互作用前に検出されたベースラインシグナルと、増幅前シグナルとの差に基づいて調整項を決定し得る。そのような実施形態では、この項を合わせる必要はないが、調整項は、局所的な測定値（増幅前と増幅後のシグナルの差）から単に引くことができる。
【００３３】
増幅前シグナルと増幅後シグナルとの差を含む局所的な測定値を使用することには、局所的な測定値がより短い期間でもたらされ、それ故に比較されるシグナルにおけるいずれのドリフトの効果も低減されるという利点がある。増幅前シグナルへのバルク試料屈折率の寄与を算定する実施形態は、バルク試料屈折率の変化が算定される場合、増幅前の別個の洗浄ステップの必要性を好都合になくす。
【００３４】
一部の実施形態では、増幅器溶液の濃度は、アッセイアセンブリ（すなわちすべてアッセイ領域）を増幅器で飽和させる程度のものである。
【００３５】
一部の実施形態では、増幅器溶液の濃度は、アッセイアセンブリを増幅器で飽和させない程度のものである。そのような実施形態では、局所的な測定値は、標的試料中の濃度並びに増幅器溶液の濃度に依存する。それ故に、試料濃度と増幅器自体の両方からの減少効果が合わせられる。これらの２つの異なる減少プロセスは、パラメータ化された関数で特徴づけられてもよく、例えば、パラメータ化された関数は、増幅器または追加の項の減少を明らかにするための追加のパラメータを含有する。代替として、または追加して、「Ｓｈａｐｅ」パラメータは、試料濃度および増幅器濃度の両方を変動させるベクトルであり得る。一部の実施形態では、Ｓｈａｐｅは、増幅器の変動濃度を捕捉するための位置／上流の結合容量を示す量の関数であり得る。一部の実施形態では、増幅器の濃度の効果は、アッセイアセンブリ中に存在するプローブ物の密度の効果と同種であると考えることができる。したがって、例えば、ＤＺｉの値は、後に詳細に説明するように、アッセイアセンブリの相対結合容量を考慮するようにＤＺｉをどのように調整するかと同様に、増幅器濃度を明らかにするように調整し得る。
【００３６】
増幅器を非飽和条件で使用することは、増幅器の量の減少が必要となり、それ故にコストが低減するという利点がある。
【００３７】
一部の実施形態では、アッセイ領域は、標的物に対して同じ結合容量を有する。
【００３８】
一部の実施形態では、アッセイ領域は標的物に対して異なる結合容量を有する。一部の実施形態では、ＤＺｉは、アッセイアセンブリの位置ｉの上流のプローブ物の量を示す。
【００３９】
アッセイ領域は、マイクロ流体回路で連結し得る。一部の実施形態では、アッセイ領域間の回路は、標的物に対する結合容量としてである。
【００４０】
順番における個別のアッセイ領域を囲む隣接したチャンバーにチャンバーの対の間の導管によって連結されたチャンバーそれぞれに、アッセイ領域はそれぞれ位置し得る。各アッセイ領域は、チャンバーの一部を占め得、ここで、局所的な測定値は、それぞれの部分でもたらされる。代替として、アッセイ領域は、チャンバー全体を占め得る。一部の実施形態では、例えば近接している官能化された表面の一部として、複数のアッセイ領域が単一のチャンバー内で設けられ、該アッセイ領域は、単に測定が行われる位置によって定められる。
【００４１】
各局所的な測定値は、増幅器溶液が個別のアッセイ領域と相互作用する割合を示し得、例えば定められた点での測定シグナルの変化の割合として測定される。
【００４２】
各局所的な測定値は、個別のアッセイ領域への増幅器溶液の導入から閾値シグナル振幅、例えば最大シグナル振幅の検出までにかかった時間を示す測定値を含み得る。
【００４３】
一部の実施形態では、アッセイデータの入手は、局所的な測定の実施を含み得る。代替として、アッセイデータは第３者から得てもよい。
【００４４】
第２の態様では、試料中の標的物の試料濃度を決定するためのシステムが提供される。該システムは、アッセイアセンブリを用いるアッセイからのアッセイアセンブリの複数のアッセイ領域のそれぞれに固定化されている標的物の局所的な濃度を示す個別の局所的な測定値のデータ点を含むアッセイデータ得るように配置された処理装置を含み、アッセイ領域は、アッセイアセンブリを流れる試料が順番に各アッセイ領域を流れるように直列に連結され、各アッセイ領域はアッセイ領域の表面に固定化されている複数のプローブ物を含み、プローブ物は、試料がアッセイ領域の１つから次のものまで流れる際に標的物の濃度が減少するように、標的物に結合するように配置される。また、処理装置は、順番における個別のアッセイ領域の位置を示す量に対する局所的な測定値のパラメータ化された関数で、アッセイデータをモデル化するように配置され、ここで、１つ以上のパラメータは試料濃度に依存する。処理装置は、さらに、１つ以上のパラメータの少なくとも１つに基づいて試料濃度を示す値を決定するように配置される。
【００４５】
第３の態様では試料中の標的物の試料濃度を決定する方法が提供される。該方法は、アッセイアセンブリを用いるアッセイから試料をアッセイアセンブリに導入するステップを含み、アッセイアセンブリは複数のアッセイ領域を含み、アッセイ領域は、アッセイアセンブリを流れる試料が順番に各アッセイ領域を流れるように直列に連結され、各アッセイ領域はアッセイ領域の表面に固定化されている複数のプローブ物を含み、プローブ物は、試料がアッセイ領域の１つから次のものまで流れる際に標的物の濃度が減少するように、標的物に結合するように配置される。試料はアッセイアセンブリに流され、局所的な測定が各アッセイ領域で実施されて、アッセイアセンブリの複数のアッセイ領域のそれぞれに固定化されている標的物の局所的な濃度を示す個別の局所的な測定値のデータ点を含むアッセイデータが得られる。アッセイデータは、順番におけるアッセイ領域の位置を示す量に対する局所的な測定値のパラメータ化された関数でモデル化され、ここで、１つ以上のパラメータは試料濃度に依存する。試料濃度を示す値は１つ以上のパラメータの少なくとも１つに基づいて決定される。
【００４６】
さらなる態様では、試料中の標的物の試料濃度を決定するためのシステムが提供される。該システムは、アッセイアセンブリを流れる試料が順番に各アッセイ領域を流れるように直列に連結された複数のアッセイ領域を含むアッセイアセンブリを含み、ここで、各アッセイ領域は、アッセイ領域の表面に固定化されている複数のプローブ物を含み、プローブ物は、試料がアッセイ領域の１つから次のものまで流れる際に標的物の濃度が減少するように、標的物に結合するように配置される。該システムは、各アッセイ領域で局所的な測定を実施して複数のアッセイ領域のそれぞれに固定化されている標的物の局所的な濃度を示す個別の局所的な測定値のデータ点を含むアッセイデータを得るように配置された少なくとも１つの検出器をさらに含む。該システムは、順番におけるアッセイ領域の位置を示す量に対する局所的な測定値のパラメータ化された関数でアッセイデータをモデル化するように配置された処理装置をさらに含み、ここで、１つ以上のパラメータは試料濃度に依存する。また、処理装置は、１つ以上のパラメータの少なくとも１つに基づいて試料濃度を示す値を決定するように配置される。
【００４７】
一部の実施形態では、複数のアッセイ領域で、例えば検出器およびアッセイ領域の１つを残りのものに対して動かすことによって局所的な測定を実施するための単一の検出器が設けられる。代替として、アッセイ領域ごとに検出器を設けられ得る。
【００４８】
さらなる態様では、試料中の標的物の試料濃度を決定する方法が提供される。該方法は、アッセイアセンブリのアッセイ領域に固定化されている標的物の局所的な濃度を示す局所的な測定値を含むアッセイデータを、アッセイアセンブリを用いるアッセイから得るステップを備え、ここで、アッセイ領域はアッセイ領域の表面に固定化されている複数のプローブ物を含み、プローブ物は標的物に結合するように配置されている。増幅器溶液とアッセイ領域の表面に結合した標的物との相互作用の後に増幅した変動のような、アッセイ領域の表面での屈折率の変動を示すシグナルに局所的な測定値は基づいている。局所的な測定値は、増幅前シグナルと増幅後シグナルとの差を含み、ここで、増幅前シグナルは、試料とアッセイ領域との相互作用の後に、かつ増幅器溶液とアッセイ領域に結合した標的物との相互作用の前に検出され、増幅後シグナルは、増幅器溶液とアッセイ領域に結合した標的物との相互作用の後に、かつアッセイ領域を緩衝液で洗浄した後に検出される。該方法は、試料のバルク試料屈折率を考慮するように、調整項を用いて局所的な測定値を調整するステップと、調整した局所的な測定値を用いて試料濃度を示す値を決定するステップとをさらに含む。
【００４９】
一部の実施形態では、調整項は、試料とアッセイ領域との相互作用の前に検出されたベースラインシグナルと、増幅前シグナルとの差に基づいて決定される。ここで、上記の試料のバルクのバルク試料屈折率の寄与に対する補償に関する特徴が同等に適用可能である。
【００５０】
さらなる態様では、試料中の標的物の試料濃度を決定するためのアッセイアセンブリが提供される。該アッセイアセンブリは、アッセイアセンブリを流れる試料が各アッセイ領域を順番に流れるように連続的に接続された複数のアッセイ領域を含む。各アッセイアセンブリは、複数のアッセイ領域におけるアッセイ領域の対ごとに入口と出口とを含み、アッセイアセンブリを流れる試料が、複数のアッセイ領域におけるアッセイ領域の対ごとに、連結部分を介して第１のアッセイ領域から第２のアッセイ領域まで流れるように、第１のアッセイ領域の出口は、連結部分によって第２のアッセイ領域の入口に連結されている。さらに、各アッセイ領域は、アッセイ領域の表面に固定化されている複数のプローブ物を含み、プローブ物は、試料がアッセイ領域の１つから次のものまで流れる際に標的物の濃度が検出可能に減少するように、標的物に結合するように配置される。
【００５１】
試料がアッセイアセンブリを通過する際、試料の流れは、拡散または他の混合効果を実質的に無視できるような層流であり得る。そのような場合、チャンバー表面に隣接した試料の一部内の標的物のみ、プローブ物との結合に利用できるだろう。試料が、試料の層流により、１つのチャンバーから次のチャンバーまで拡散を制限するのに十分に速く通過する場合、試料の同じ部分が各チャンバーの表面に隣接し、試料の同じ部分に存在する標的物のみが結合に利用可能である。それ故に、試料が１つのチャンバーから次のチャンバーまで流れる際に、各表面に隣接した試料の一部における標的物の濃度が減少する。減少は、試料のバルク中の標的のほんの一部のみであり得る一方で、拡散が制限された層流により、標的物の減少は濃度の有意な検出可能な変化を表す。
【００５２】
さらなる態様では、上記のアッセイアセンブリを含むマイクロ流体デバイスが提供される。
【００５３】
上記の特徴のそれぞれは、説明した各態様に適用し得ることが理解される。簡潔に表現するために、すべての可能な組み合わせが本明細書で詳細に説明されていない。
【００５４】
ほんの一例として、具体的な実施形態を添付の図面を参照しながら以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】アッセイアセンブリを含むデバイスの略図である。
【図２】図２ａは、図１のアッセイアセンブリのアッセイ領域における標的−プローブ結合の断面の略図である。図２ｂは、図１のアッセイアセンブリのアッセイ領域における増幅器−標的結合の断面の略図である。
【図３】試料中の標的物の濃度を決定するためのシステムの略図である。
【図４】減少マスター曲線のグラフである。
【図５】実験データを用いた図４の減少曲線のグラフである。
【図６】試料中の標的物の濃度を決定する方法を示すフローチャートである。
【図７】経時的な応答振幅の変動を示し、局所的な測定値Δ３１、Δ３２およびΔ２１を示すセンサーグラムである。
【図８】経時的な応答振幅の変動を示し、局所的な測定値Ｇａｍｐを示すセンサーグラムである。
【図９】経時的な応答振幅の変動を示し、局所的な測定値Δｔを示すセンサーグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
図１を参照すると、遠心力または「ラボオンディスク（ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｄｉｓｃ）」マイクロ流体デバイス２が軸４まわりの回転のために配置されている。典型的には、マイクロ流体デバイス２は、外径が１２０ｍｍ、厚さが〜１．２ｍｍであり、ディスクの中心の穴の寸法が直径１５ｍｍであるマイクロ流体ポリカーボネートディスクである。ディスクは、薄膜ポリマーによって一緒になって結合される２つの０．６ｍｍディスクを含む。図１に示され、以下に説明するマイクロ流体の特徴は、ディスクおよび薄膜の１つで定められる。２つのディスクの他方は、後述するように金でコーティングした回析格子が設けられているＳＰＲ領域を含む。ディスク２は、複数のチャンバーにおけるチャンバーのそれぞれの対が管１０で連結されるように直列に配置されている複数のチャンバー８を有するアッセイアセンブリ６を含む。チャンバーは、ＳＰＲ領域と並ぶ。試料、例えば血液または他の液体が、アッセイアセンブリ６に、一連の第１のチャンバー８の入口を形成する流入管１４を介して導入され、試料が、一連の最後のチャンバー８の出口を形成する放水管１２を介してアッセイアセンブリから離れる。各チャンバー８は０．０２ｍｍの深さであり、ディスクの中心から５０ｍｍの距離に配置されている。各チャンバーは、典型的には容積が約５０ｎｌであり、アッセイアセンブリおよびデバイスは、約１００μｌの液体がアッセイアセンブリを約５〜６分で流れることができるように配置されている。
【００５７】
図２ａを参照すると、単一のチャンバー８が記載されている。チャンバー８は、試料が連結管１０（または一連の第１のチャンバーの場合、流入管１４）からチャンバー８に入り得る入口１６と、連結管１０（または一連の最後のチャンバーの場合、放水管１２）を介して試料がチャンバー８から離れ得る出口１８とを含む。試料がチャンバーを通過する際、試料は、入口１６から出口１８までのチャンバーを図２ａ中の矢印「Ｆ」で示される方向で流れる。
【００５８】
チャンバー８は、高さが１００ｎｍであり、周期が１６００ｎｍである正弦波形状の格子（図示せず）を含む表面２０を有する。表面２０は、金でコーティングされており、金表面上に固定化されているプローブ物２２の単層を有する。標的物２４を含む試料がチャンバー８を流れる際に、試料中の特定の標的物２４がチャンバー表面２０のプローブ物２２に結合するように、各プローブ物２２は、チャンバー８を通過した試料中に存在し得る特定の対応する標的物２４に特異的に結合する能力を有する。
【００５９】
試料がアッセイアセンブリを通過する際、試料の流れは、拡散または他の混合効果がアッセイアセンブリを通じて実質的に無視できる程度十分な速度の層流である。したがって、チャンバー表面２０に隣接した試料の一部における標的物２４のみ、プローブ物２２との結合に利用可能である。試料が１つのチャンバー８から次のチャンバーまで通過する際、試料の層流により、試料の同じ部分が各チャンバー８の表面２０に隣接し、それ故に試料の同じ部分に存在する標的物２４のみ結合に利用可能である。このように、各表面２０に隣接した試料の一部における標的物２４の濃度が、試料が１つのチャンバー８から次のチャンバーまで流れる際に減少する。
【００６０】
薄層のみのプローブ物が結合に利用可能であることにより、１つのチャンバーから次のチャンバーまでのプローブ物に結合した標的物の濃度変化が、ＳＰＲ法を用いて検出可能である。例えば、表面２０に隣接した液体層の濃度の検出可能な変化は、チャンバー８中の１つの点から次のチャンバー８中の対応する点まで、０．５ｎＭであり得る。
【００６１】
図３を参照すると、試料中の標的物２４の濃度を決定するためのシステム２６が記載されている。システム２６は、上記のアッセイアセンブリ６を含むマイクロ流体デバイス２を含む。光源２８が設けられ、チャンバー８の表面２０の検出域３０に放射光が入射するように位置合わせされている。典型的には、光源２８は偏光単色光源、例えばダイオードレーザーである。使用時には、検出域３０への入射光線が表面２０から反射され、反射した光線が検出器３２によって検出される。検出器３２は、時間に対する角度の関数として反射した光線の光度を測定するように配置されている。
【００６２】
システムは、試料を含む種々の液体をデバイス２に導入し、定められた順序でアッセイアセンブリ６を流れるように、制御器の制御下でデバイス２を回転して、デバイス２内の液体の流れを駆動するための駆動装置をさらに含む。駆動装置は、明確とするために図３中に図示していないが、液体の流れをどのように制御し得るかについての更なる詳細は、国際公開第２０１１／１２２９７２号および国際公開第２０１２／１３１５５６号で見ることができ、これらの内容を参照によって本明細書に組み込む。
【００６３】
使用時には、結合した標的物または結合した標的−増幅器複合体（下記参照）の存在による検出領域３０の表面２０での屈折率の変化は、表面２０の共振挙動の変化、具体的には表面プラズモン共鳴挙動の変化を引き起こす。これは、時間の関数として反射した光にて光度の最小値が生じる角度の変化を検出することによって検出できる。チャンバー８の表面２０におけるプローブ物２２への標的物２４の結合は、表面２０での屈折率の変化を引き起こす。したがって、チャンバー８の表面２０における標的−プローブ結合の量を、チャンバーの表面２０での屈折率の変化を検出することで、例えば表面プラズモン共鳴が生じる角度の変化を検出することで定量的に決定できる。一部の実施形態では、表面プラズモン効果を決定するための別のアプローチを使用し得る。ＳＰＲ測定法の例は、Ｊｉｒｉ  Ｈｏｍｏｌａ，“Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉｅｓ”，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０８，ｐａｇｅｓ  ４６２−  ４９３  （２００８）に記載されており、この文献の内容を参照によって本明細書に組み込む。
【００６４】
試料が１つのチャンバー８から次のチャンバーまで流れる際の標的物２４の局所的な濃度の減少は、図４に示されるマスター減少曲線３５の一部を、その一部を定める試料の開始濃度によって確立すると考えることができる。マスター減少曲線３５は、順番におけるチャンバー８の位置の上流のプローブ物の量を示す量に対する、個別のチャンバー８の表面２０での標的物２４の濃度を示す局所的な測定値の変動を特徴付ける。
【００６５】
マスター減少曲線３５は、標的物の濃度が非常に高い試料が導入される限定されない数の概念上のチャンバー（それ故に検出域）を有する仮説上のシステムを考慮することによって概念的に理解され得る。試料がアッセイアセンブリに導入された際、順番における最初のチャンバーが標的物で飽和され、それ故に局所的な測定値の最大振幅ＤＰｍａｘで測定シグナルが飽和する。試料が試料チャンバーを順番に流れる際標的物の量が逐次減少し、各チャンバーでの局所的な測定値の振幅が低減する。試料が更なるチャンバーを流れる際、標的物の量がさらに減少し、局所的な測定値の振幅が最小振幅ＤＰｍｉｎに達する。その後、残りの概念上のチャンバーについての局所的な測定値は、この最小振幅でほぼ一定である。
【００６６】
マスター減少曲線３５は、試料の異なる開始標的物濃度で、一定の減少特性を有するアッセイアセンブリを用いて実施した複数の実験からの実験上のまたは仮説上のデータを考慮することによって理解され得る。減少特性は、とりわけ、流体の特徴を含む因子、例えばアッセイアセンブリ６を通る試料の流速、チャンバー８の高さおよび幅、および検出回路の長さ；認識層の特徴、例えばプローブ物２２の密度、標的物２４に対するプローブ物２２の結合活性および親和性；並びに標的物２４の特徴、例えば拡散係数によって決定される。実験を実施するのに使用されるアッセイアセンブリは、典型的には５〜１０個のチャンバーを有し、したがって、得られた減少データが、上述したように、マスター減少曲線の部分のみを代表する。
【００６７】
図５を参照すると、マスター減少曲線は、既知の開始濃度の範囲で実施した実際の実験または概念上の実験からのデータを組み合わせた曲線としてさらに理解され得る。得られたデータは、一緒に「縫合」されてマスター減少曲線を形成するものとして考えられ得る。別の実験での特定のチャンバーが同じまたは類似の局所的な標的濃度を有するという実験データのセットが「重複する」場合、データセットは、滑らかな線が得られるまでｘ軸に沿って概念上「シフト」され得る。
【００６８】
図５に示した例では、マスター減少曲線は、４つの実験（ｉ）〜（ｉｖ）に由来する組み合わせた減少曲線として考えられ得る。各実験は、５つのチャンバーを含むアッセイアセンブリを用いて実施され、それ故に５つのデータ点を含むデータセットが各実験から得られる。実験（ｉ）で使用した標的物の開始濃度は、（ｉｉ）で使用したものより高く、（ｉｉ）で使用したものは、（ｉｉｉ）で使用したものより高く、（ｉｉｉ）で使用したものは（ｉｖ）で使用したものより高い。各実験の開始濃度の情報を用いて、データセットを一緒に「縫合」してマスター減少曲線を形成することができる。
【００６９】
マスター減少曲線はパラメータ化された関数で表される。具体的な実施形態では、関数はロジスティック関数である。
【００７０】
パラメータ化された関数は、チャンバー８の順番内の位置、それ故に検出域または領域を示す量、より具体的には、順番におけるチャンバー８の位置ｉの上流のプローブ物の量ＤＺｉに対する個別のチャンバーで生じた局所的な測定値の振幅ＤＰをモデル化する。一部の実施形態では、位置および量の数量は本質的に同じであり、一部のスケーリングのために保存する。各チャンバーでの量が一定ではない他の実施形態では、以下に説明するように、関係がより複雑であり得る。
【００７１】
ＤＺｉの値の例を下記表１、２、３および４に示し、表中、「＃ＤＺ」は順番におけるチャンバーの位置（それ故に検出域）であり、「ＤＺ容量」は標的物に結合するためのチャンバーの相対容量であり、「ＤＺｉ」は、順番におけるチャンバーの位置ｉ（当然順番内の位置の指標でもある）の上流のプローブ物の量を示す値である。ＤＺｉは、パラメータ化した関数で使用される。表１〜４に示される例のそれぞれにおいて、各チャンバーの中心で検出が行われる。表１は、チャンバーがそれぞれ標的物を結合するための同じ相対容量（例えば標的物を結合するための上記プローブ物の同じ量）を有する場合を示す。この例では、使用したＤＺｉの値は０．５、１．５、２．５、３．５および４．５である（０．５オフセットが検出領域の上流の各チャンバーにおいて生じる結合を表すものである）。
【表１】
0006755251.tif 000008
【００７２】
表２は、チャンバーの相対容量が１つのチャンバーから次のチャンバーまで倍になる場合を示す。チャンバーの相対容量におけるこの違いは、使用したＤＺｉの値で説明される。
【表２】
0006755251.tif 000009
【００７３】
表３は、１番目、４番目および５番目のチャンバーが１の相対容量を有し、２番目および３番目のチャンバーが２の相対容量を有する場合を示す。この場合もやはり、相対容量におけるこの違いは、ＤＺｉの調整によって説明される。
【表３】
0006755251.tif 000010
【００７４】
チャンバーは、マイクロ流体回路で連結され得る。一部の実施形態では、チャンバーは、標的物に対する結合能力を有するチャンバーの間のマイクロ流体回路で連結される。表４は、アッセイ領域が１の相対結合容量を有し、チャンバー間の回路が、０．５の相対容量を有する場合を示す。回路では検出は実施されない。この場合、ＤＺｉは、システムの相対容量を算定するように、表４に従って調整される。
【表４】
0006755251.tif 000011
【００７５】
アッセイアセンブリおよびその減少特性、ＤＰｍａｘおよびＳｈａｐｅに関し、所与のアッセイアセンブリおよびアッセイについて一定である定数をパラメータ化された関数は含む。また、試料の開始濃度を示す、試料中の標的物２４の濃度に依存するパラメータＯｆｆｓｅｔも関数は含む。パラメータＯｆｆｓｅｔは、パラメータ化した関数を実施した実験それぞれでのデータ点に合わせることによって決定される。
【００７６】
上記の概念上のおよび例証の説明では、Ｏｆｆｓｅｔは、マスター減少曲線上の実際のチャンバー／検出領域でのデータ点の位置を決定する。
【００７７】
図４を参照すると、Ｏｆｆｓｅｔは、マスター減少曲線がｘ軸に沿ってシフトした程度を示す値と理解できる。例えば、標的濃度が低い試料では、順番中の第１のチャンバーで得られる局所的な測定値は、相応に低い測定値ＤＰ１である。マスター減少曲線をこの実験データに合わせるには、局所的な測定値ＤＰ１が第１のチャンバーｉ＝１を示すＤＺｉの値に対応するようにシフトしなければならない。これは、図４中、ＤＺ１＝０．５で示される。マスター減少曲線がシフトしなければならない量であり、得られたアッセイデータを合わせるために、方向が試料の標的濃度に依存するだろう。したがって、Ｏｆｆｓｅｔの値は、パラメータ化した関数、およびそれ故にマスター減少曲線を、アッセイアセンブリにおける各チャンバーで得られる個別の局所的な測定値に合わせることによって決定される。
【００７８】
パラメータ化した関数は、下記等式（５）で表される。
【数７】
0006755251.tif 000012
【００７９】
図４について上述したように、ＤＰｍａｘは、アッセイアセンブリの第１のチャンバー８で得ることができ、実験を通じて一定のままである局所的な測定値の最大振幅である。パラメータＳｈａｐｅは、試料が１つのチャンバーから次のチャンバーまで流れる際に、チャンバー表面での標的物の濃度が減少する割合を示す。この値は、アッセイアセンブリの減少特性に依存し、所与のアッセイアセンブリおよびアッセイのための実験を通じて一定のままであり、ｅｘｐは、典型的にはオイラー数ｅであるが、いずれの他の適した基数も他のパラメータで対応する調整を行って使用し得る。
【００８０】
上記で説明したように、ＤＺｉは、順番におけるそれぞれのチャンバーの位置ｉの上流のプローブ物の量を示す値に対応する。図２ａを参照すると、各チャンバー８での検出域３０が、チャンバー表面２０の中心の一部である。  したがって、この配置では、チャンバーごとに、ＤＺｉは、正の半整数値、すなわち０．５、１．５、２．５、３．５等をとり得る。代替として、ＤＺｉは、整数値、またはアッセイアセンブリにおけるチャンバーの位置の上流のプローブ物の量を示すいずれの他の適した値をとり得る。
【００８１】
ＳｈａｐｅおよびＤＰｍａｘの定数は、実験を実施して試料濃度を決定する前にアッセイアセンブリのバッチを特徴付けることによって決定される。各アッセイアセンブリは、１回のみ使用され、それ故にアセンブリのバッチを特徴付けるための実験が、同じ製造バッチからの個別のアッセイアセンブリを使用して、マイクロ流体装置２のバッチを特徴付けることで実施される。ＳｈａｐｅおよびＤＰｍａｘの決定した値は、既知の試料濃度の試料または標的物を有するバッチの他のアセンブリを用いる検証実験によって、バッチを表すものとして検証される。次に、決定した値は、例えば、包装で示してデバイス２を積むか、またはバーコードまたはこの情報を運ぶための他の適した手段を用いて、値を示すようにデバイス２自体をマーキングすることによって、マイクロ流体装置２と関連付けられる。包装および／またはディスクは、この情報を直接運び得るか、またはネットワーク、例えばインターネットを通じたアクセスのためにこの情報が保存される遠隔位置へのリンクを運び得る。
【００８２】
これらの値は、アッセイアセンブリについて、すべての個別の局所的な測定値にわたって一定である。λでまとめて表されるＤＰｍａｘおよびＳｈａｐｅは、既知の標的物の開始濃度（所定の濃度の範囲にわたる濃度）をそれぞれ有し、複数のアッセイ領域ｉを有するアッセイアセンブリを用いてそれぞれ実施される複数の実験ｊから得られた既知の実験データを用いて決定される。ＤＰｍａｘおよびＳｈａｐｅは、下記の総和を最小化することによって決定される：
【数８】
0006755251.tif 000013
式中、ＤＰ（ＤＺｉ）は、アッセイ領域ｉでの局所的な測定値であり、ｆは、定数λを有するパラメータ化された関数の対応する値である。ｍ回の実験からのデータが使用され、各実験は、ｎ個のアッセイ領域を有するアッセイアセンブリを用いて実施されたものである。一部の実施形態では、ＳｈａｐｅおよびＤＰｍａｘのパラメータは、いずれの適した最適化法、例えば最小二乗法、勾配降下法、回帰法またはカイ二乗最小化法を用いて決定される。上記総和（６）から、「Ｏｆｆｓｅｔ」も複数の実験ｊごとに決定され、それ故に、「Ｏｆｆｓｅｔ」と標的物の開始濃度との間の関係が決定される。複数の実験ｊごとのＯｆｆｓｅｔｊと濃度Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｊとの間のこのような関係は、較正関数を適合させるのに使用できるデータ点{Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｊ，Ｏｆｆｓｅｔｊ}を定める。さらに以下に説明するように、この較正関数を用いて、Ｏｆｆｓｅｔの値に基づいて試料濃度を決定する。
【００８３】
特徴付けられた（決定したλについての値）バッチからのアセンブリを用いて、試料中の標的物の未知の濃度を見出すためのアッセイ実験が実施される。Ｏｆｆｓｅｔの値は、試料の開始濃度の指標を提供するために、所与の実験からのアッセイデータに適合される。疑いを避けるために、本明細書で「開始濃度」とは、試験される試料中の標的物の濃度を指すものとして理解すべきである。パラメータ化された関数は、下記の総和を最小化することによって決定されるアッセイデータおよびＯｆｆｓｅｔの値に適合され得る：
【数９】
0006755251.tif 000014
式中、ＤＰ（ＤＺｉ）は、アッセイ領域ｉでの局所的な測定値であり、ｆはパラメータ化された関数の対応する値である。このようなコスト関数またはいずれの適したコスト関数の最小化は、パラメータ化された関数のアッセイデータへの最良の適合を得るように実施できる。一部の実施形態では、最小二乗回帰の最小化法が、カイ二乗試験を用いて使用され、有効である。
【００８４】
Ｏｆｆｓｅｔの値が、パラメータ化された関数を得られた実験データに適合させることによって決定されると、試料の開始標的濃度を示す値が較正関数を用いて決定できる。
【００８５】
較正関数は、第１の関数および第２の関数を含む。第１の関数ｆ１が、標的濃度が高いことが知られている試料についての標的濃度を決定するのに使用され、「Ｏｆｆｓｅｔ」の関数であり、例えばｆｉは、上記のデータ点{Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｊ，Ｏｆｆｓｅｔｊ}へ適した関数を適合させることによって見出し得る。第２の関数ｆ２が、標的濃度が低いことが知られている試料についての標的濃度を決定するのに使用され、システムによって得られる減少していない測定値の関数、言い換えれば、ＤＺｉ＝０の場合の仮説上の局所的な測定値の関数である。したがって、第２の関数は、下記式（８）の関数である：
【数１０】
0006755251.tif 000015
【００８６】
一部の実施形態では、第１および第２の関数は、下記等式（９ａ）および（９ｂ）によって示されるような指数関数の形態で表される。
【数１１】
0006755251.tif 000016
【数１２】
0006755251.tif 000017
【００８７】
ＤＰ（ＤＺｉ＝０）はＤＺｉ＝０の場合の局所的な測定値の振幅である。パラメータＸ１,２、Ｙ１,２およびＺ１,２は、実験データへ上記と同様に適合させることによって得られる。
【００８８】
一部の実施形態では、試料濃度の決定は反復プロセスである。例えば、第１のステップを最初に適用した後、より精密な結果をもたらす第２のステップを適用してもよい。具体的には、一部の実施形態では、第１の関数を第１のステップで使用して、濃度を示す値を決定する。値が閾値未満である場合、第２のステップは第２の較正関数を用いて値を再計算する。一部の実施形態では、順序を逆にし、第１のステップからの（第２の関数からの）値が閾値を超える場合、第１の関数を第２のステップで使用する。
【００８９】
代替として、一部の実施形態では較正関数は、Ｏｆｆｓｅｔを試料の標的濃度に関連付ける単一の関数である。
【００９０】
一部の実施形態では、Ｏｆｆｓｅｔに対する試料濃度の較正曲線は、ロジスティック関数、例えば４ＰＬ非線形回帰モデルである。４ＰＬモデルの場合、試料濃度は、（Ｏｆｆｓｅｔ、ａ、ｂ、ｃ、ｄ）の関数であり、ここで、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、最小化法、例えばカイ二乗最小化法、および上記の実験データを用いて得ることが可能なモデルのパラメータである。
【００９１】
試料中の標的物の濃度を決定する方法の概略を図６を参照して説明する。第１のステップ３６では、アッセイデータが得られる。得られたアッセイデータは複数のデータ点を含み、各データ点は、個別のチャンバー８で実施した局所的な測定に対応する。局所的な測定値は、チャンバーそれぞれの表面での屈折率の変化の検出に関連し、個別のチャンバー８の表面２０での標的物２４の濃度を示す。アッセイデータは、上記のように、第２のステップ３８でパラメータ化された関数によってモデル化され、パラメータ化された関数は、試料中の標的物の濃度に依存するパラメータＯｆｆｓｅｔを含む。その後、試料中の標的物の濃度を示す値が、上記の第１および第２の較正関数を用いて、「Ｏｆｆｓｅｔ」に基づいて第３のステップ４０で決定される。ステップ３８の前のいくつかの点で、例えばデバイス２をシステム２６に搭載する場合、上記のように、パラメータλが、例えば手入力で、またはこの情報を持つバーコードなどのタグを読むことでシステムにロードされることが理解される。
【００９２】
上記および図３に示されるシステム２６を用いて、アッセイデータを得る。最初に、緩衝液がアッセイアセンブリ６にベースラインとして流され、続いて試験される試料、増幅器溶液、最後に第２の緩衝液を有する洗浄液が流される。図７を参照すると、個別のチャンバー８それぞれについて、検出されたシグナルの振幅、例えば表面プラズモン共鳴が発生する角度の変化が、チャンバー表面２０での屈折率の変化の大きさに正比例して増加するようなチャンバー表面２０での屈折率の変化が検出器３２によって検出できる。
【００９３】
個別のチャンバー８ごとに、緩衝液がチャンバー８を流れると、ベースライン測定値４２が検出領域３０のために測定される。その後、ある量の標的物２４を含む試料がチャンバー８に導入される。標的物２４がチャンバーの表面２０でプローブ物２２に結合する際、表面２０での屈折率が変化し、結果として、検出領域３０についての測定したシグナルの振幅の増加４４ａがある。一部の場合では、一部の標的−プローブ結合は可逆であり、それ故に検出領域３０について測定したシグナルの振幅の減少４４ｂが定常状態に達するまで生じ得る。そのような減少は、試料中の標的物２４の濃度が非常に高い場合には見ることができない。
【００９４】
図２ｂおよび図７を参照すると、続いて、増幅器溶液がチャンバー８に流される。増幅器溶液中の活性成分２５が標的物２４に結合し、次にプローブ物２２に結合する。結合した標的物が増幅器で飽和する程十分に高い濃度の増幅器がチャンバー８に流される。
【００９５】
これは、チャンバー８の表面２０での屈折率へのさらなる変化をもたらし、結果として検出領域３０について測定したシグナルの振幅の増加４６ａがある。標的−プローブ結合と同様に、一部の場合では、一部の増幅器−標的結合が可逆であり、それ故に検出領域３０について測定したシグナルの振幅の減少４６ｂが定常状態に達するまで生じ得る。そのような減少は、増幅器中の活性成分の濃度が非常に高い場合には見ることができない。
【００９６】
最後に第２の緩衝液がチャンバー８に流されて、いずれの残存する非結合の試料または増幅器も洗い流す。結果として、検出領域３０について測定したシグナルの振幅は一定のまま４８である。局所的な測定値は、多くの適した測定値のいずれかであってもよく、それらの一部は下記の実施形態でより詳細に説明される。
【００９７】
代替として、アッセイデータをいずれの他の適した手段によって得てもよく、また事前に実行したアッセイから得てもよく、場合により第三者によって実行されたアッセイから得てもよい。
【００９８】
アッセイデータを得たら、それをパラメータ化された関数でモデル化し、「Ｏｆｆｓｅｔ」の値を上記のように決定する。アッセイアセンブリの定数ＤＰｍａｘおよびＳｈａｐｅの特徴は、上記の方法を用いて事前に決定され、マイクロ流体デバイス自体に、例えばバーコードを用いてマーキングされている。パラメータ化された関数は、個別のチャンバー８それぞれで実施した局所的な測定値を量ＤＺに対してモデル化する。測定したデータのパラメータ化された関数への適合の質は、例えば、カイ二乗最小化法を用いて、またはいずれの他の適した手段を用いて、適合のためにピアソンの係数を計算することによって評価される。適合の質は、それが閾値を満たすのに十分に良好でない場合にはデータが処分されるように所定の閾値と比較される。
【００９９】
Ｏｆｆｓｅｔの値を、パラメータ化された関数を得られたアッセイデータに適合させることによって決定したら、試料の標的濃度を示す値を上述したように較正関数を用いて決定できる。
【０１００】
実施形態１
第１の実施形態では、局所的な測定が、図７で検出点１として示されるＢ１で試料がチャンバー８に流される前に得られたベースライン応答の振幅を検出し、図７で検出点３として示されるＢ３で第２の緩衝剤がチャンバー８を流れた後の応答の振幅を検出し、２つの応答の間の差Δ３１＝Ｂ３−Ｂ１を決定することによって、アッセイアセンブリ中の個別のチャンバー８それぞれで実施される。
【０１０１】
したがって、個別の局所的な測定値それぞれについてのパラメータ化された関数は、下記等式（１０）によって与えられる。
【数１３】
0006755251.tif 000018
【０１０２】
式中、ＤＰｍａｘ_ａｍｐは、増幅器とチャンバー８との相互作用の後のチャンバー８での局所的な測定値の最大振幅である。この場合、チャンバー中のバルク溶液が緩衝液である（すなわち各測定でのバルク溶液が同じ屈折率を有する）場合に測定Ｂ１およびＢ３が行われることから、ＤＺｉがより大きくなると、ＤＰはゼロになる傾向があり、それ故にマスター曲線／パラメータ化した関数の振幅ＤＰｍｉｎはゼロである。
【０１０３】
実施形態２
実施形態１で説明したアプローチでの潜在的な欠点は、例えば温度の変動、システムの振動等により、比較されるシグナルのドリフトが存在し得ることである。表面プラズモン共鳴の例では、シグナルは検出表面近くの局所的な屈折率に依存する。したがって、そのようなシグナルは、（ｉ）特定の密度で標的物がプローブに結合しているプローブ／標的層；（ｉｉ）周囲の液体；（ｉｉｉ）チャンバーの表面に存在する金属、例えば金からの寄与を含む。これらの３つの寄与の屈折率は、温度に依存し、それ故に、温度のドリフトが、検出されたシグナルのドリフトを引き起こす。類似のドリフト効果が、システムの機械的振動によって生じる。
【０１０４】
これは図７に示されている。このドリフトの結果として、システムのノイズレベルがより高くなり、結果として、検出能力が低下する。これを克服するために、以下に説明するように、局所的な測定値Δ３２がΔ３１の代わりに使用できる。
【０１０５】
局所的な測定Δ３２が、アッセイアセンブリ中の個別のチャンバー８のそれぞれで実施される。Δ３２は、図７中の検出点２として示される、試料とチャンバー表面２０との相互作用後に、かつ表面に結合した標的物と増幅器との相互作用前に、応答の振幅Ｂ２を検出することによって測定される。その後、図７中の検出点３として示される、チャンバー８内への第２の緩衝剤の導入後の応答の振幅Ｂ３が検出され、２つの応答の差、Δ３２＝Ｂ３−Ｂ２が決定される。
【０１０６】
このようなΔ３２の測定には、測定がより短い期間にわたって行われ（Ｂ２とＢ３との間の時間がＢ１とＢ３との間の時間より短いため）、それ故にドリフトの効果が低減されるという利点がある。
【０１０７】
Ｂ２を検出する際にはチャンバー８内のバルク材料が試料である一方で、Ｂ３を検出する際にはチャンバー８内のバルク材料が緩衝液である。試料および緩衝液は、それぞれ異なる屈折率を有し、それ故に局所的な測定値Δ３２は、Ｂ２とＢ３との間の試料から緩衝液までのバルク材料における変化によって生じた寄与を含む。したがって、Δ３２は、下記等式（１１）によって表すことができる。
【数１４】
0006755251.tif 000019
式中、ｆ（Ｏｆｆｓｅｔ）は、パラメータ化された関数／マスター曲線であり、Δｂｕｌｋは試料の屈折率による寄与である。
【０１０８】
試料が血液である場合、例えば、Ｂ２とＢ３との間のバルク溶液における差異による屈折率の変化Δｂｕｌｋは、ヒトそれぞれで変わり、したがって未知の量である。
【０１０９】
Δｂｕｌｋは、関数（１１）を実験データに適合させる、すなわち、同じ時間でのＯｆｆｓｅｔおよびΔｂｕｌｋを調整することによって、更なる変数パラメータとして得ることができる。代替として、図７を参照すると、Δ２１が以下に説明するように測定でき、Δｂｕｌｋへの近似（増幅していない標的−プローブ結合の効果を無視する）として使用できる。Δ２１は、ベースライン応答の振幅Ｂ１を検出し、緩衝液がアッセイアセンブリを流れたら、試料とチャンバー表面２０との相互作用後、かつ表面に結合した標的物と増幅器との相互作用前の応答の振幅Ｂ２を検出し、Ｂ１とＢ２との差、すなわちΔ２１＝Ｂ２−Ｂ１を決定することによって測定される。測定値Δ２１は、下記等式（１２）に従って推考できる。
【数１５】
0006755251.tif 000020
式中、Δｕｎａｍｐｌｉｆｌｅｄ＿ｂｉｎｄｉｎｇは、チャンバーの表面への標的物の結合が増幅していないことによる寄与である。バルクからのシグナルへの寄与が、チャンバーの表面への標的物の結合が増幅していないことからの寄与よりはるかに大きいため、測定値Δ２１は、Δｂｕｌｋにほぼ等しいと考えることができる。したがって、一部の実施形態では、Δ３２−Δ２１が局所的な測定値として使用でき、すなわち局所的な測定値がΔ３２−Δ２１＝ｆ（Ｏｆｆｓｅｔ）としてモデル化される。当然、それは、モデルΔ３２＝Δ２１＋ｆ（Ｏｆｆｓｅｔ）と同等であり、これは一部の実施形態では代わりに使用される。
【０１１０】
実施形態３
別の実施形態では、増幅器がチャンバー８の表面２０を流れる際に検出器３２によって検出された応答シグナルの振幅の変化Ｇａｍｐが、局所的な測定値として使用される。この測定値は、増幅器中の活性成分が個別のチャンバー８に結合した標的物２４と結合する割合を反映する。
【０１１１】
また、図４に示され、上述したマスター減少曲線も、局所的な測定値がＧａｍｐであり、対応するモデルがＧａｍｐ＝ｆ（Ｏｆｆｓｅｔ）（ｆは上記のように定義される）であるこのような場合に、たとえそのパラメータが適合されている、例えば、ＤＰｍａｘが、飽和したチャンバー８での概念上の最大変化率であるとしても適用される。
【０１１２】
図８に示した例では、Ｇａｍｐは、センサーグラム上の点４で示される時間ｔ１での曲線の勾配に相当する。当然、いずれの他の適した、例えば増幅、頻度依存性の測定も採り得る。
【０１１３】
実施形態４
さらに別の実施形態では、個別のチャンバー内への増幅器の導入から応答シグナルの閾値振幅またはシグナルの特徴（例えば最大）の検出までにかかった時間が測定される。１／Δｔを局所的な測定値として用いることによって、図４に示され、上述したマスター減少曲線も適用され、実験データが１／Δｔ＝ｆ（Ｏｆｆｓｅｔ）（ｆは上記の通り定義される）として、たとえそのパラメータが調整されている、例えばＤＰｍａｘが、飽和させたチャンバー８での１／Δｔの概念上の最大値（Δｔの最小）であるとしてもモデル化できる。
【０１１４】
当然、いずれの他の適した時間依存性の測定も採り得る。
【０１１５】
上記と同じシステムおよび方法を用い、いずれの適した局所的な測定行うことで、増幅器中の活性成分の濃度がアッセイアセンブリを飽和させるほど十分に高いものではない場合、局所的な測定値は、増幅器が１つのチャンバーから次のチャンバーまで流れる際に減少するであろうこの活性成分濃度にも依存する。したがって、パラメータ化された関数は、この依存性を算定するように調整される。例えば、パラメータ化された関数は、活性成分濃度の減少を算定するための追加のパラメータを含み得る。代替として、または加えて、「Ｓｈａｐｅ」パラメータは、試料濃度および増幅器濃度の両方によって変化するベクトルであり得る。一部の実施形態では、増幅器の濃度の効果は、第１の近似としてアッセイアセンブリ中に存在するプローブ物の密度の効果と同種と考えることができる。したがって、例えば、ＤＺｉの値は、上記で詳細に説明した、アッセイアセンブリの相対結合容量を考慮するようにＤＺｉを調整する方法と同様に、増幅器濃度を算定するように調整され得る。
【０１１６】
一般に、増幅器濃度が飽和しない場合、２つの減少効果、すなわち１）標的物の減少；２）増幅器の減少が生じる。（２）は、各検出領域での標的物の濃度に依存する。全体の効果はこれらの２つの効果の組み合わせに依存する。各効果は、一部の実施形態では、独立して評価され、高次関数を用いて、両方の効果を組み合わせる。代替として、両方の効果は、適した高次関数および／または減少特性を適合させるためのより多くのパラメータを有する関数（例えば４ＰＬまたは５ＰＬ関数）を用いて容易に捕捉され得る。
【０１１７】
増幅器が飽和濃度で提供されるか否かは、使用した局所的な測定値から独立しており、飽和していない増幅器濃度が、上記の実施形態で特定したいずれの局所的な測定、または実際にはいずれの他の局所的な測定とともに使用し得ることが理解される。
【０１１８】
当然ながら、具体的な実施形態について上記の通り説明したが、これらは例示に過ぎず、当業者であれば多くの改変および変化を成し、そのような改変および変化は添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。例えば、上記の説明は、表面プラズモン共鳴の変化の検出の観点から述べられたものであるが、表面２０での標的−プローブ結合の量を定量的に検出するためのいずれの他の適した手段も使用し得、例えば、標的物２４のＵＶ吸収蛍光および／または標的物２４に結合した標識の検出を使用し得ることが理解される。一部の実施形態では、複数の検出域が単一チャンバーに設けられ、例えば官能化された表面のストリップに沿って間隔をおいた、シグナルが測定される検出領域が設けられる。
【図１】
0006755251.tif 000023
【図２ａ】
0006755251.tif 000024
【図２ｂ】
0006755251.tif 000025
【図３】
0006755251.tif 000026
【図４】
0006755251.tif 000027
【図５】
0006755251.tif 000028
【図６】
0006755251.tif 000029
【図７】
0006755251.tif 000030
【図８】
0006755251.tif 000031
【図９】
0006755251.tif 000032