(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一対の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体であって、
ａ）標的核酸配列に結合する少なくとも１つの核酸認識モイエティー、
ｂ）少なくとも１つのエフェクター部分モイエティー、及び
ｃ）少なくとも１つの選択的反応性モイエティー
から成る第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体、及び
ａ）標的核酸配列に結合する少なくとも１つの核酸認識モイエティーであって、前記配列は、第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の核酸認識モイエティーが結合する配列に隣接する、前記核酸認識モイエティー、
ｂ）少なくとも１つのエフェクター部分モイエティー、及び
ｃ）少なくとも１つの選択的反応性モイエティー
から成る第２の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体
（ここで、第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の選択的反応性モイエティーは、第２の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の選択的反応性モイエティーと反応することができ、
第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の選択的反応性モイエティーと第２の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の選択的反応性モイエティーとの反応により、第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の選択的反応性モイエティーと第２の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の選択的反応性モイエティーとの間に共有結合が形成され、
第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体のエフェクター部分モイエティーと第２の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体のエフェクター部分モイエティーは、活性エフェクター分子を産生し、
当該選択的反応性モイエティーは、アジド、シクロオクチン、ノルボルネン、ホスフィン、ジアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィン、ホスフィノチオール、ホスフィノフェノール、シクロオクテン、及びテトラジンから成るグループから選ばれるバイオオーソゴナルモイエティーであり、当該エフェクター部分モイエティーの分子サイズは、２０ｋＤａ未満である。）
から成る、前記一対の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体。
【請求項２】
各標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の核酸認識モイエティーが、核酸結合オリゴマーである、請求項１に記載の一対の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体。
【請求項３】
各標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の当該核酸認識モイエティーが、当該標的核酸配列に相補的形成をする核酸オリゴマーである、請求項１に記載の一対の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体。
【請求項４】
各標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の当該選択的反応性モイエティーが、生物学的に不活性である、請求項１に記載の一対の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体。
【請求項５】
各標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の当該選択的反応性モイエティーが、当該核酸認識モイエティーに結合されている、請求項１に記載の一対の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体。
【請求項６】
当該活性エフェクター分子が、酵素活性、遺伝子／タンパク質発現、分子シグナル伝達、及び分子相互作用の少なくとも１つを調節する、請求項１に記載の一対の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体。
【請求項７】
当該活性エフェクター分子が、当該エフェクター部分モイエティーの活性と比較して標的活性を所有する、請求項１に記載の一対の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体。
【請求項８】
当該核酸認識モイエティーと当該選択的反応性モイエティーの間、及び当該選択的反応性モイエティーと当該エフェクター部分モイエティーの間の、いずれかの間でケミカルリンカーからさらに成る、請求項１に記載の一対の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体。
【請求項９】
当該ケミカルリンカーが、当該標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の溶解性、疎水性、電荷、細胞透過性、毒性、生体内分布、及び安定性の少なくとも１つを改善する、請求項８に記載の一対の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体。
【請求項１０】
当該ケミカルリンカーが、柔軟性モイエティー、切断部位、及び化学修飾部位の少なくとも１つである、請求項８に記載の一対の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体。
【請求項１１】
当該標的核酸配列が、癌固有の核酸配列、ウイルス核酸配列、微生物固有の核酸配列、異なった発現を示す遺伝子、疾患固有の核酸配列、及びそれらのフラグメント、部分または核酸遺伝子生成物から選ばれる、請求項１に記載の一対の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体。
【請求項１２】
活性エフェクター分子が、抗体または抗体フラグメントまたはＴ細胞受容体に対するリガンドである、請求項１に記載の一対の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体。
【請求項１３】
オリゴマーが、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート変性ヌクレオチド、２−Ｏ−アルキル化ＲＮＡヌクレオチド、ハロゲン化ヌクレオチド、ロック化核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸類似体（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓ）、プソイドウリジンヌクレオチド、キサンチンヌクレオチド、ヒポキサンチンヌクレオチド、２−デオキシイノシンヌクレオチド、他の塩基対形成が可能な
核酸類似体、及びそれらの組み合わせからなるグループから選ばれる、請求項２または３に記載の一対の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体。
【請求項１４】
各標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の当該核酸認識モイエティーが、オンコ遺伝子、突然変異遺伝子、オンコウイルス遺伝子、ウイルス核酸配列、微生物核酸配列、異なる発現を示す遺伝子、及びそれらのフラグメント、部分、または核酸遺伝子生成物から成るグループから選ばれる標的核酸配列に結合する、請求項１に記載の一対の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体。
【請求項１５】
当該エフェクター部分モイエティーが、ペプチド、ペプチド模倣構造の非活性部分、薬剤の非活性部分、及び他の生理活性化合物から成るグループから選ばれる、請求項１に記載の一対の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体。
【請求項１６】
当該核酸認識モイエティー、当該選択的反応性モイエティー、及び当該エフェクター部分モイエティーの１つまたは複数が、ケミカルリンカーにより官能化される、請求項１に記載の一対の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体。
【請求項１７】
テンプレート化アセンブリ反応体の合成法であって、以下から成る前記合成法：
標的核酸配列に結合することができる少なくとも１つの核酸認識モイエティーを生成すること、
相応する選択的反応性モイエティーに結合することができる少なくとも１つの選択的反応性モイエティーを生成すること、
活性エフェクター分子を産生するために、相応するエフェクター部分モイエティーに結合することができる少なくとも１つのエフェクター部分モイエティーを生成すること、及び
当該核酸認識モイエティーを当該エフェクター部分モイエティーに結合し、当該エフェクター部分モイエティーを当該選択的反応性モイエティーに結合すること、
ここで、当該選択的反応性モイエティーは、アジド、シクロオクチン、ノルボルネン、ホスフィン、ジアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィン、ホスフィノチオール、ホスフィノフェノール、シクロオクテン、及びテトラジンから成るグループから選ばれるバイオオーソゴナルモイエティーであり、当該エフェクター部分モイエティーの分子サイズは、２０ｋＤａ未満である。
【請求項１８】
当該活性エフェクター分子を産生するために、当該核酸認識モイエティー、選択的反応性モイエティー、及び当該エフェクター部分モイエティーの処理能力を決定するステップからさらに成る、請求項１７に記載の前記方法。
【請求項１９】
活性エフェクター分子の合成法であって、以下から成る前記方法：
以下から成る第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体を生成すること；
ａ）標的サンプル内の標的核酸配列に結合する少なくとも１つの核酸認識モイエティー、
ｂ）少なくとも１つの選択的反応性モイエティー、及び
ｃ）少なくとも１つのエフェクター部分モイエティー；
以下から成る第２の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体を生成すること；
ａ）標的核酸配列に結合する少なくとも１つの核酸認識モイエティーであって、前記配列は、第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の核酸認識モイエティーが結合する配列に隣接する、前記核酸認識モイエティー、
ｂ）少なくとも１つのエフェクター部分モイエティー、及び
ｃ）少なくとも１つの選択的反応性モイエティー；
（ここで、第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の選択的反応性モイエ
ティーは、第２の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の選択的反応性モイエティーと反応することができる。）
当該標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体が、それぞれの標的核酸配列に接触して、第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の選択的反応性モイエティーと第２の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の選択的反応性モイエティーとの間に共有結合を形成すること、及び
第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体のエフェクター部分モイエティーと第２の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体のエフェクター部分モイエティーから活性エフェクター分子を産生すること；
ここで、当該選択的反応性モイエティーは、アジド、シクロオクチン、ノルボルネン、ホスフィン、ジアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィン、ホスフィノチオール、ホスフィノフェノール、シクロオクテン、及びテトラジンから成るグループから選ばれるバイオオーソゴナルモイエティーであり、当該エフェクター部分モイエティーの分子サイズは、２０ｋＤａ未満である。
【請求項２０】
当該活性エフェクター分子が、当該エフェクター部分モイエティーの活性と比較して標的活性を所有する、請求項１９に記載の前記方法。
【請求項２１】
少なくとも２つの標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体を病原性細胞に送達する方法に用いるための組成物であって、当該組成物は治療に効果的な量の
以下：
ａ）当該標的病原性細胞内の標的核酸配列に結合する少なくとも１つの核酸認識モイエティー、
ｂ）少なくとも１つの選択的反応性モイエティー、及び
ｃ）少なくとも１つのエフェクター部分モイエティー
から成る第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体、及び
以下：
ａ）標的核酸配列に結合する少なくとも１つの核酸認識モイエティーであって、前記配列は、第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の核酸認識モイエティーが結合する配列に隣接する、前記核酸認識モイエティー、
ｂ）少なくとも１つのエフェクター部分モイエティー、及び
ｃ）少なくとも１つの選択的反応性モイエティー
から成る第２の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体
（ここで、第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の選択的反応性モイエティーは、第２の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の選択的反応性モイエティーと反応することができ、
第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の選択的反応性モイエティーと第２の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の選択的反応性モイエティーとの反応により、第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の選択的反応性モイエティーと第２の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の選択的反応性モイエティーとの間に共有結合が形成され、
第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体のエフェクター部分モイエティーと第２の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体のエフェクター部分モイエティーは、当該病原性細胞において、少なくとも１つの活性エフェクター分子を産生する。）
から成り、
当該方法は前記標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の治療に効果的な量を、当該病原性細胞に投与することから成り、そして、
当該選択的反応性モイエティーは、アジド、シクロオクチン、ノルボルネン、ホスフィン、ジアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィン、ホスフィノチオール、ホスフィノフェノール、シクロオクテン、及びテトラジンから成るグループから選ばれるバイオオー
ソゴナルモイエティーであり、当該エフェクター部分モイエティーの分子サイズは、２０ｋＤａ未満である、前記組成物。
【請求項２２】
当該標的核酸配列の有無が、当該標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の投与前に検出される、請求項２１に記載の前記組成物。
【請求項２３】
当該病原性細胞のプログラム化された細胞死、当該病原性細胞のアポトーシス、当該病原性細胞の非特異的なまたはプログラム化された壊死、当該病原性細胞の溶解、及び当該病原性細胞の増殖阻害の少なくとも１つが誘発される、請求項２１に記載の前記組成物。
【請求項２４】
第１の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の標的核酸配列と第２の標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の標的核酸配列が、同じ遺伝子転写内、または異なる遺伝子転写内で見出せる、請求項２１に記載の前記組成物。
【請求項２５】
当該テンプレート化アセンブリ反応体のエフェクター部分モイエティーが、２つまたはそれ以上の活性エフェクター分子を産生できる、２つまたはそれ以上のエフェクター部分モイエティーのセットから成る、請求項２１に記載の前記組成物。
【請求項２６】
２つまたはそれ以上のエフェクター活性が誘発される、請求項２５に記載の前記組成物。
【請求項２７】
当該病原性細胞が、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、微生物感染細胞、及び疾患を誘発するまたは疾患を変調する分子であって、炎症、アレルギーまたは自己免疫性病理を起こす分子を産生する細胞から成るグループから選ばれる、請求項２１に記載の前記組成物。
【請求項２８】
当該病原性細胞が、ウイルス感染細胞であり及び当該ウイルス感染細胞のプログラム化された細胞死、当該ウイルス感染細胞のアポトーシス、当該ウイルス感染細胞の非特異的なまたはプログラム化された壊死、当該ウイルス感染細胞の溶解、ウイルス感染の阻害、及びウイルス複製の阻害の少なくとも１つが誘発される、請求項２１に記載の前記組成物。
【請求項２９】
当該病原性細胞が腫瘍細胞であり及び当該腫瘍細胞のプログラム化された細胞死、当該腫瘍細胞のアポトーシス、当該腫瘍細胞の非特異的またはプログラム化された壊死、当該腫瘍細胞の溶解、当該腫瘍細胞増殖の阻害、当該腫瘍細胞における腫瘍遺伝子発現の阻害、及び当該腫瘍細胞における遺伝子発現の改変の少なくとも１つが誘発される、請求項２１に記載の前記組成物。
【請求項３０】
当該病原性細胞が微生物感染細胞であり及び当該微生物感染細胞のプログラム化された細胞死、当該微生物感染細胞のアポトーシス、当該微生物感染細胞の非特異的なまたはプログラム化された壊死、当該微生物感染細胞の溶解、微生物感染の阻害、及び微生物複製の阻害の少なくとも１つが誘発される、請求項２１に記載の前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テンプレート化アセンブリの方法及び核酸に特異的なヘテロ化合物を含有するテンプレート化アセンブリ反応体の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品開発の目標は、ウイルスに感染した細胞、腫瘍細胞、自己免疫反応を産生する細胞、及びその他の調節不全または機能不全の細胞などの病原性細胞への、強力な生物学的治療介入である。病原性細胞に立ち向かう能力のある強力な生物学的治療介入の例として、トキシン、アポトーシス促進薬及び病原性細胞を排除するために、免疫細胞の働きを変える免疫療法のアプローチを包含する。残念なことに、それら医薬品の開発は、隣接する正常細胞または患者の健康全般への高い毒性リスクのために極めて困難である。
【０００３】
正常細胞への毒性を軽減しつつ病原性細胞への強力な介入の送達を可能にすることを明らかにした方法は、病原性細胞に特異的な分子マーカーに対して、その介入を差し向けることによる治療の標的化である。標的治療は、限られたケースにおいて並外れた臨床結果を示しながらも、標的治療のためのアクセス可能なマーカーが不在のために、現在それら治療の適用には限定がある。多くの病原性細胞の型に対応したタンパク質マーカーを見出すことは非常に困難であり、及び多くの場合は不可能である。
【０００４】
ごく最近になって、病原性細胞に特異的な核酸標的を標的化した治療法が開発された。ｓｉＲＮＡなどの、既存の核酸標的化の治療は、潜在的な危険遺伝子の調節発現を抑制することができるが、強力な細胞毒性または細胞増殖抑制性の介入を送達しないので、したがって、危険細胞それ自身の排除には特に効果的ではない。
【０００５】
このような理由から、既存の生物学的治療介入の脆弱な効能及び／または重篤な副作用に対処する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、標的化されるテンプレート化アセンブリ反応体の作成及び使用に対応した方法及び物質を示す。１つの態様において、標的化されるテンプレート化アセンブリ反応体は、標的核酸配列に結合した少なくとも１つの核酸認識モイエティー、その核酸認識モイエティーに結合した少なくとも１つの選択的反応性モイエティー及び少なくとも１つのエフェクター部分モイエティーを含有でき、ここで、当該エフェクター部分モイエティーと当該選択的反応性モイエティーが、活性エフェクター構造を産生するために結合できる。他の態様において、標的化されるテンプレート化アセンブリ反応体は、少なくとも１つの核酸認識モイエティー、少なくとも１つのバイオオーソゴナルモイエティー及び少なくとも１つのエフェクター部分モイエティーを含有できる。また、活性エフェクター構造を産生するために、標的核酸配列を結合することができる少なくとも１つの核酸認識モイエティーを生成することにより、相応する選択的反応性モイエティーを結合することができる少なくとも１つの選択的反応性モイエティーを生成することにより、及び相応するエフェクター部分モイエティーを結合することができる少なくとも１つのエフェクター部分モイエティーを生成することにより、標的化されるテンプレート化アセンブリ反応体を合成する方法を開示する。活性エフェクター構造の合成法はまた、少なくとも２つのテンプレート化アセンブリ反応体の生成、当該標的化されるテンプレート化アセンブリ反応体の標的核酸配列への接触、及び活性エフェクター構造の産生を包含する。少なくとも２つの標的化されるテンプレート化アセンブリ反応体を病原性細胞に送達する方法もまた、本明細書に含まれる。当該方法は、病原性細胞に、当該標的化されるテンプレート化アセンブリ反応体の治療に効果的な量を投与し、及びその病原性細胞に、少なくとも１つの活性エフェクター構造を産生することを包含できる。
【０００７】
いくつかの実施形態において、当該標的化されるテンプレート化アセンブリ組成物を開示する。当該核酸認識モイエティーは、標的核酸配列と相補的な形成ができる核酸結合オリゴマー及び核酸オリゴマーであり得る。そのようなオリゴマーの例として、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート変性ヌクレオチド、２−Ｏ−アルキル化ＲＮＡヌクレオチド、ハロゲン化ヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸類似体（モルホリノ類）、プソイドウリジンヌクレオチド、キサンチンヌクレオチド、ヒポキサンチンヌクレオチド、２−デオキシイノシンヌクレオチド、他の塩基対形成可能な核酸類似体、及びそれらの組み合わせから成る群から選ばれるオリゴマーを包含できる。当該核酸結合のモイエティーは、オンコ遺伝子、突然変異遺伝子、オンコウイルス遺伝子、ウイルス核酸配列、微生物核酸配列、異なる発現を示す遺伝子、及びそれらのフラグメント、一部分または核酸遺伝子生成物から成る群から選ばれる標的核酸配列を結合できる。
【０００８】
いくつかの実施形態において、当該選択的反応性モイエティーは、当該核酸認識モイエティーに結合する。当該選択的反応性モイエティーは、当該核酸認識モイエティーに結合され得る。当該選択的反応性モイエティーは、バイオオーソゴナル反応性分子などのように、生物学的に導入され得る。選択的反応性モイエティーの例として、アジド、シクロオクチン、ニトロン、ノルボルネン、オキサノルボナジエン、ホスフィン、ジアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィン、ホスフィノチオール、ホスフィノフェノール、シクロオクテン、ニトリル酸化物、チオエステル、テトラジン、イソニトリル、テトラゾール、クアドリシクラン、及びそれらの誘導体を包含できる。当該エフェクター部分モイエティーはまた、当該活性エフェクター構造を産生するために、選択的反応性モイエティーと結合する第１エフェクター部分モイエティー、及びその第１エフェクター部分モイエティーと結合する第２エフェクター部分モイエティーを包含できる。当該エフェクター部分モイエティーはまた、当該活性エフェクター構造を産生するために、当該選択的反応性モイエティーと相互作用を持つケミカルリンカーを包含できる。当該エフェクター部分モイエティーは、ペプチド、ペプチド模倣構造の非活性部分、薬剤の非活性部分、または２０ｋＤａ未満の他の生物活性化合物であり得る。
【０００９】
いくつかの実施形態において、活性エフェクター構造を開示する。当該活性エフェクターは、少なくとも１つの選択的反応性モイエティー構造と当該選択的反応性モイエティーに結合した少なくとも１つのエフェクター部分モイエティーとの反応生成物を包含できる。当該活性エフェクター構造は、その反応生成物に結合した少なくとも１つの核酸認識モイエティーを包含できる。当該活性エフェクターは、酵素活性、標的遺伝子の調節発現などの遺伝子／タンパク質発現、分子シグナル伝達、及び分子間相互作用及び／または当該エフェクター部分モイエティーの活性と比較して標的される活性の保有の少なくとも１つを調節できる。当該活性エフェクターは、免疫反応、プログラム化された細胞死、アポトーシス、プログラム化された非固有またはプログラム化された壊死、溶解、増殖阻害、ウイルス感染の阻害、ウイルス複製の阻害、オンコ遺伝子発現の阻害、遺伝子発現の改質、微生物感染症の阻害、及び微生物複製の阻害の少なくとも１つを誘発できる。ある実施形態において、当該活性エフェクター構造は、抗体である。
【００１０】
当該ケミカルリンカーは、当該核酸認識モイエティーと当該選択的反応性モイエティーの間に、及び／または当該選択的反応性モイエティーと当該エフェクター部分モイエティーとの間に、及び／または柔軟性モイエティー、開裂サイト、及び／または化学修飾サイトとして位置することができる。当該ケミカルリンカーは、当該核酸認識モイエティー、当該バイオオーソゴナルモイエティー、及び／または当該エフェクター部分モイエティーを、溶解性、疎水性、電荷、細胞透過性、毒性、生体内分布、及び当該標的化されるテンプレート化アセンブリ組成物の安定性の少なくとも１つの改善によって、官能化できる。ケミカルリンカーの例として、アルキル基、アルケニル基、アミド、エステル、チオエステル、ケトン、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エチレングリコール、シクロアルキル基、ベンジル基、複素環基、マレイミジル基、ヒドラゾン、ウレタン、アゾール、イミン、ハロアルキル、カルバミン酸塩、及びそれらの組み合わせを包含できる。当該標的核酸配列は、癌固有の核酸配列、ウイルス核酸配列、微生物固有の核酸配列、異なる発現を示す遺伝子、疾患固有の核酸配列、及びそれらのフラグメント、部分またはその核酸遺伝子生成物を包含できる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、テンプレート化アセンブリ反応体の合成法及び活性エフェクター構造の合成法を開示する。当該方法は、当該核酸認識モイエティー、選択的反応性モイエティー、及び当該エフェクター部分モイエティーの、当該活性エフェクター構造を産生する処理能力をさらに包含できる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、少なくとも２つの標的化されるテンプレート化アセンブリ反応体を病原性細胞に送達する方法を開示する。当該方法はまた、当該標的化されるテンプレート化アセンブリ反応体の投与に先立って、当該標的核酸配列の有無の検出を包含できる。他の実施形態において、当該方法は、当該病原性細胞のプログラム化された細胞死、当該病原性細胞のアポトーシス、当該病原性細胞の非特定のまたはプログラム化された壊死、当該病原性細胞の溶解、及び当該病原性細胞の増殖阻害の少なくとも１つを誘発することを包含する。
【００１３】
当該投与組成物は、テンプレート化アセンブリ反応体の２つまたはそれ以上のセットを含むことができ、ここでテンプレート化アセンブリ反応体のセットは、標的化されるテンプレート化アセンブリ反応体及び相応する標的化されるテンプレート化アセンブリ反応体を含む。当該セットは、２つまたはそれ以上の標的核酸配列を結合できる核酸認識モイエティーの２つまたはそれ以上のセットを包含することができる。２つまたはそれ以上の標的核酸配列は、同一の遺伝子転写内に、または個別及び分離した転写において見出されてよい。同一細胞の転写内での個別の核酸標的配列の認識に対応したテンプレート化アセンブリ反応体の２つまたはそれ以上のセットは、テンプレートが示す方法で同じエフェクター生成物を追加複製するために反応する同一のエフェクター部分構造を、個別に持ち込んでよい。
【００１４】
いくつかの実施形態において、個別及び分離の核酸標的配列を認識する相応するテンプレート化アセンブリ反応体の２つまたはそれ以上のセットは、テンプレートが示す方法でエフェクター生成物を形成するために反応する同一のエフェクター部分構造を持ち込んでよい。
【００１５】
いくつかの実施形態において、同一の細胞核酸標的配列を認識する相応するテンプレート化アセンブリ反応体の２つまたはそれ以上のセットは、テンプレートが示す方法で個別のエフェクター生成物を形成するために反応する個別のエフェクター部分構造を持ち込んでよい。テンプレート化アセンブリ反応体の２つまたはそれ以上のセットは、２つまたはそれ以上の活性エフェクター構造を産生できるエフェクター部分モイエティーを含有できる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、個別及び分離の核酸標的配列を認識する相応したテンプレート化アセンブリ反応体の２つまたはそれ以上のセットは、テンプレートが示す方法で個別のエフェクター生成物を形成するために反応する個別のエフェクター部分構造を持ち込んでよい。エフェクター部分モイエティーの２つまたはそれ以上のセットが当該組成物に含有される実施形態において、２つまたはそれ以上の活性エフェクター構造は、２つまたはそれ以上のエフェクター活性を誘発するために産生されてよい。
【００１７】
当該病原性細胞は、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、及び微生物に感染した細胞、またはアレルギー、アナフィラキシーまたは自己免疫疾患、または病気を媒介するサイトカインを誘導する抗体を生産する細胞などの、病気につながる分子を産生する細胞であり得る。当該病原性細胞がウイルス感染細胞である実施形態において、当該方法はさらに、当該ウイルス感染細胞のプログラム化された細胞死、当該ウイルス感染細胞のアポトーシス、当該ウイルス感染細胞の非固有またはプログラム化された壊死、当該ウイルス感染細胞の溶解、当該ウイルス感染の阻害、及びウイルス複製の阻害の、少なくとも１つを誘発することを包含できる。当該病原性細胞が腫瘍細胞である実施形態において、当該方法はさらに、当該腫瘍細胞のプログラム化された細胞死、当該腫瘍細胞のアポトーシス、当該腫瘍細胞の非固有またはプログラム化された壊死、当該腫瘍細胞の溶解、当該腫瘍細胞増殖の阻害、当該腫瘍細胞におけるオンコ遺伝子発現の阻害、当該腫瘍細胞における遺伝子発現の改質の、少なくとも１つを誘発することを包含できる。当該病原性細胞が微生物感染細胞である実施形態において、当該方法はさらに、当該微生物感染細胞のプログラム化された細胞死、当該微生物感染細胞のアポトーシス、当該微生物感染細胞の非固有またはプログラム化された壊死、当該微生物感染細胞の溶解、微生物感染の阻害、及び微生物複製の阻害の、少なくとも１つを誘発することを包含できる。当該病原性細胞が病気を媒介する分子を産生する実施形態において、当該方法は、当該病気誘発細胞のプログラム化された細胞死、当該病気誘発細胞のアポトーシス、当該病気誘発細胞の壊死、当該病気誘発細胞の溶解、及び病気を媒介する分子の産生の阻害の、少なくとも１つを誘発することを包含できる。
【００１８】
本開示における上記に記載の特徴、利点、対象を明確にし、詳細に理解できるよう添付の図面が本明細書に含まれる。これらの図面は明細書の一部を成す。しかしながら、添付の図面は本開示の実施様態を示すものであって、本開示の特許請求の範囲を制限すると考えられるべきではないことに留意するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】２つの個別の化合物を含有するテンプレート化アセンブリ反応体の実施形態の図解である。図１Ａは、標的核酸テンプレート上の２つの核酸認識モイエティー間の相互作用を示し、個別のエフェクター部分モイエティー（Ａ及びＢ）及び個別の選択的反応性モイエティー（１及び２）を示している。
【図１Ｂ】２つまたはそれ以上の個別の化合物を含有するテンプレート化アセンブリの他の実施形態の図解である。図１Ｂは、３つのエフェクター部分構造（Ａ、Ｂ、Ｃ）及び２つの個別の選択的反応性モイエティー（１及び２）を使用した、３者のアセンブリを示す。1つの核酸認識モイエティーの末端５′は、選択的反応性モイエティー２で複修飾されたエフェクター部分モイエティーＢに結合しており、３者反応化合物の形成を促している。
【図１Ｃ】ケミカルリンカーにより接合されたテンプレート化アセンブリ反応体によるテンプレート化アセンブリの他の実施形態の図解である。図１Ｃは、単分子配置を介したテンプレート化アセンブリを示し、ここで、単一核酸認識モイエティーの５′及び３′末端は、選択的反応性モイエティーで修飾されており、及び後者は、特定の核酸標的の存在時にのみ、特異的に並列になる。
【図２Ａ】特定の標的ＲＮＡ分子（任意の一般的な標的核酸を代表する）を含有し、及び５′と３′にバイオオーソゴナル反応性モイエティーを持つ２つのテンプレート化アセンブリ反応体が参入する細胞標的コンパートメントの図解である。当該テンプレート化アセンブリ反応体は、標的ＲＮＡへのアクセスのために当該標的コンパートメントに共に送達される。
【図２Ｂ】当該バイオオーソゴナル反応性モイエティーが、並列的に反応する、標的ＲＮＡ上での各テンプレート化アセンブリ反応体の相補的形成を示す。Ｎ′は、各テンプレート化アセンブリ反応体の各核酸塩基Ｎに対応する標的ＲＮＡらせん構造の中の相補的な核酸塩基を示す。
【図２Ｃ】テンプレート化アセンブリ連結反応生成物、及びアセンブリ化エフェクター構造の例を示す。１）非トレースレスの連結、２）トレースレス連結、及び３）キャリアー核酸からの化学的または酵素的な分解後のトレースレス連結及びエフェクターフリー構造。
【図３】テンプレート化アセンブリ反応体の合成ステップのフロー図である。
【図４】核酸テンプレート化アセンブリを利用し所望の生物活性を生成する方法のフローチャートを示す。四角囲みは、実行者の部分において活動が要求されるステップを表し、楕円は、投与後、自発的に起きるステップを表す。
【図５】当該対象部位内の標的の局所化及び局所化された標的への当該標的化されたテンプレート化アセンブリ生成体の特異性を描いた図解である。
【図６】治療前−腫瘍細胞の選択的排除に対する治療使用例の図解である。
【図７】治療中の相補的形成−腫瘍細胞の選択的排除に対する治療使用例の図解である。
【図８】標的細胞中に産生されたエフェクター構造を表し、及び細胞毒性のＴリンパ球、治療用抗体、細胞内受容体、直接的細胞間相互作用などのアポトーシスを誘発する異なる機構を介した作用の図解である。
【図９】反応体Ａ及びＢの複数の反応体を持つ標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体の図解である。複数の核酸認識モイエティーは、活性エフェクター構造を生成するために、標的配列と相補的形成を行い及び反応体との結合を可能にする。
【図１０】対象部位サンプルにおけるテンプレート化アセンブリ反応体の診断的評価の略図による解説である。
【図１１】多様な温度での相補的形成において、核酸テンプレート化アセンブリによって産生され、テンプレート化後に残されたわずかな非−連結反応生成物を含む連結反応生成物を示すゲルである。
【図１２】治療した腫瘍細胞による抗原に特異的な免疫エフェクター細胞の刺激におけるＩＬ−２放出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
特定の例示的な実施形態は、本明細書に開示する化合物の構造、機能、製造及び使用、そして方法の原則についての全体的理解を提供するために記述する。それら実施形態の１つまたは複数の実施例を、添付図に図解する。本明細書に具体的に記載され、そして添付図に図解される当該化合物及び方法は、非限定的で例示的な実施形態であり、及び本開示の範囲が、当該請求項によってのみ定義されることは、当業者には理解されよう。１つの例示的な実施形態に関連して図解されまたは記述される当該特徴は、他の実施形態の特徴と組み合わされてよい。そのような修正および変更は、本開示の範囲内に含まれることを意図している。
【００２１】
従来型の標的治療は、標的抗原の可能性、病原性遺伝子の調節発現を低下させる能力または病原性細胞自身を除去する効率によって限定される。対照的に、本開示の方法及び化合物は、それら治療に関連する最も一般的な落とし穴の多くを避ける。当該病原性細胞における遺伝子テンプレートに特化した標的化、本開示の方法及び化合物は、的外れの毒性を避けそして病原体に固有の反応性を高める。本開示は、免疫療法のプロトコルとは異なって、望ましい結果を仲立ちすることができる新規分子を産生する、当該病原性細胞に固有のトランスクリプトームの利用を開示する。当該細胞は、正常細胞に対する毒性の誘発を伴わずに、自己破壊によってまたは他の細胞による免疫療法の破壊などの指定された治療介入に対して、適切に標的化される。
【００２２】
核酸テンプレート化アセンブリ
本開示は、特定の核酸配列の存在下で、他の生物学的物質の存在下においてさえも、選択的な所望の化学構造の産生を可能にする。本開示は、標的核酸上での２つまたはそれ以上の反応体のテンプレート化アセンブリを記述し、ここで、標的核酸が存在する場所で、活性エフェクター生成物を生成する。核酸テンプレート化アセンブリは、標的核酸が存在する場所で、相応する反応体の局所的な有効濃度を増加することによって、反応速度を改善する。本明細書で公にする開示は、当該標的核酸が存在する場所でのみ活性エフェクター構造を産生することによって、癌や免疫系障害などの病気の標的治療を可能にする。
【００２３】
核酸テンプレート化アセンブリの基本的スキームを、以下に描写する。
【化１】
0006710157.tif 000002
【００２４】
核酸テンプレート化アセンブリは、２つまたはそれ以上のテンプレート化反応体を近接に持ち込み、テンプレート化アセンブリ連結反応生成物を産出する。本明細書で使用する用語「テンプレート化アセンブリ連結反応生成物」とは、当該生成物構造または１つまたは複数の核酸テンプレート化アセンブリ反応体の相互作用、結合または反応によって形成される構造を指す。テンプレート化アセンブリ連結反応生成物は、所望の生物学的活性を産生できる活性エフェクター生成物を含有する。テンプレート化アセンブリ連結反応生成物の形成は、相補的形成及びアニーリングなどの標的核酸との結合相互作用を介し、位置−及び／または向きに固有の方法で組み立てられた、個別のテンプレート化アセンブリ反応体によって促される。テンプレート化アセンブリ反応の部分を担うために、単一の標的アセンブリ上に同時に来たテンプレート化アセンブリ反応体を、本開示では、「相応する反応体のセット」または「相応するテンプレート化アセンブリ反応体のセット」と呼ぶ。「相応するテンプレート化アセンブリ反応体のセット」は、核酸標的テンプレートの近接する空間部に、配列特異な方法で結合し、容易に互いに他と反応し、活性エフェクター構造を含むテンプレート化アセンブリ連結反応生成物を産生する。
【００２５】
テンプレート化アセンブリ反応体は、相応する反応体に、近接する空間部分で当該標的テンプレートとの配列特異の結合を指示する核酸認識モイエティーを含有できる。テンプレート化アセンブリ反応体は、相応する反応体のセットの選択的反応性モイエティーが、互いに他との反応に容易に参加できるが、当該病原性細胞または生物学的サンプル中の他の化合物とは容易に反応できない選択的反応性モイエティーを含有できる。生体細胞などの複雑な環境で起こる反応を許容しない他のテンプレート化アセンブリシステムとは異なり、選択的反応性モイエティーの利用は、生体細胞を含む高度に複雑な化学環境において起こる核酸テンプレート化アセンブリを許容できる。テンプレート化アセンブリ反応体はまた、エフェクター部分モイエティーを含有でき、相応する反応体のセットが、標的テンプレート化反応に参加し、活性エフェクター生成物が生成される。エフェクター部分モイエティーは、当該核酸認識モイエティー及び当該選択的反応性モイエティーのいくつかまたは全てを含有して良い。テンプレート化アセンブリ反応体は、ケミカルリンカーまたはアクセサリグループを随意に含有して良く、当該反応体の合成を促し、その化学的または生物学的特徴を改善し、及び／またはその反応体に追加の機能を導入して良い。
【００２６】
本明細書に開示する当該テンプレート化アセンブリ方法の実利的な利点の例は、当該分子の内因的モジュール性である。例えば、もし特定の強力なエフェクター分子を、当該エフェクター部分モイエティーのアセンブリの結果として、その完全エフェクター分子に産生することができるならば、同一エフェクター分子を、多様な異なる核酸標的上にテンプレートを介して産生できる。この方法は、選択的反応性基に結合した同一エフェクター部分構造を、異なる核酸認識モイエティーに結合させ、指定した標的核酸への結合で、当該選択的反応性基を隣接の空間に持ち込むことによって、達成できる。こうした手段によって、当該完全エフェクター分子を、同一の最終的生物学的効果を産生する核酸標的に結合することによって、アセンブリできる。さらに、複数の異なる転写を、同一細胞内に標的化でき、単一の特定標的の転写を失う可能性、または接近不可能な方向を獲得したことによるテンプレート化の不良を防ぐ。したがって、同一エフェクター生成物分子を、同一標的細胞内の異なる核酸標的上に合成できる。同様な方法で、標的細胞内に産生される任意の目標エフェクター機構に対する耐性の可能性を避けるために、異なるエフェクター生成物を同一転写上にアセンブリできる。こうように、病原性細胞内で多様な標的転写を識別することによって、細胞排除に対応する同一エフェクターアセンブリの使用が、または同一転写上での異なるエフェクター生成物のアセンブリが可能になる。このようなモジュール方式の利点は、既存の生物学的治療介入には見られないテンプレート化アセンブリ技術に対する適応性の提供である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、相応するテンプレート化アセンブリ反応体のセットは、図１Ａ及び図１Ｂに示すように、２つまたはそれ以上の別々な化合物であるテンプレート化アセンブリ反応体から成る。他の実施形態において、図１Ｃに示すように、相応するテンプレート化アセンブリ反応体のセットは、当該相応する反応体が物理的に接合できても、標的テンプレートが、テンプレート化アセンブリ反応に対応してその近傍にそれら反応体を持ち込むまでは空間的な分離を保つような方法で、ケミカルリンカーにより接合されて良い。
【００２８】
本開示は一般的に、少なくとも１つの核酸認識モイエティー、少なくとも１つの選択的反応性モイエティー、及び少なくとも１つのエフェクター部分モイエティーから成るテンプレート化アセンブリ反応体の方法及び組成物を記述する。
【００２９】
本開示はさらに、標的核酸テンプレートの存在下で活性エフェクター構造を生成するための相応するテンプレート化アセンブリ反応体のセットの投与方法を記述する。要求される生物学的活性を産生できる活性エフェクター構造の例を記述する。
【００３０】
一般的なアプローチを、図２Ａに描写し及びテンプレート化アセンブリ生成物の例を、図２Ｂ及び２Ｃに描写する。当該方法及び組成物のさらに詳細を、以下の項で記述する。
【００３１】
核酸テンプレート化アセンブリ反応体の設計及び合成
標的細胞に要求される活性の選択性を生成するためには、以下のテンプレート化アセンブリ反応体化合物を合成する必要がある。ａ）標的核酸の存在下で、要求の活性を生成する活性エフェクター生成物を産生する、ｂ）標的核酸の不在下では、当該活性エフェクター生成物または相当量の活性を産生しない、ｃ）自然な生体分子の下での非産生的な副作用によって、劣化しない。これらの特徴を持つテンプレート化アセンブリ反応体化合物は、以下のステップを実施することにより合成でき、このステップの順序は、特定のケースに合わせて変更して良い。
・病原性細胞またはサンプル物質中の適切な標的核酸テンプレートを特定すること。
・病原性細胞またはサンプル物質に要求される効果を産生できる、適切な活性エフェクター構造を決定すること。
・テンプレート戦略を決定すること。
・当該標的核酸テンプレートと結合できる核酸認識モイエティーを設計し及び合成すること。
・当該適切な活性エフェクター構造の産生と両立し得る選択的反応性モイエティーを設計し及び合成すること。
・当該適切な活性エフェクター構造の産生と両立し得るエフェクター部分モイエティーを設計し及び合成すること。
・当該完全な核酸テンプレート化アセンブリ反応体を合成すること。
【００３２】
図３は、テンプレート化アセンブリ反応体の合成プロセスのステップのフローチャートを描写している。これら各ステップの詳細は、以下の項に記述する。
【００３３】
標的核酸
少なくともいくつか配列情報が利用可能で、直接または間接に核酸認識モエティーを結合させるのに適している核酸テンプレート化アセンブリに対しては、いかなる核酸も、標的核酸になり得る。核酸認識モイエティー単位のいくつかの非限定的な例には、オリゴヌクレオチ、ペプチド核酸オリゴマー、及びモルホリノオリゴマーを包含できる。標的核酸配列のいくつかの非限定的な例には、ｍＲＮＡ、ゲノムまたはオルガネラＤＮＡ、エピゾームまたはプラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、または任意の他の生物学的または人工的核酸配列を包含できる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、当該標的核酸は、標的コンパートメントには存在できるが、非標的コンパートメントには存在できない。本実施形態の例として、病原性または疾患細胞に存在する核酸配列を含むが、健康細胞に存在する核酸配列を含まない。本明細書で使用する用語「病原性細胞」は、ウイルスに感染した細胞、腫瘍細胞、及び微生物に感染した細胞などの病気または異常症状を引き起こしまたは促進する能力がある細胞を指すことができる。
【００３５】
標的核酸を含有するサンプルの任意の細胞、ウイルス、空間領域、溶解物、または他の二次コンパートメントは、当該標的核酸を提供できる。当該標的核酸を含有する標的コンパートメントには、非限定的に、病原性細胞、癌細胞、ウイルス、ウイルスまたは他の病原体に感染した宿主細胞、または適応または先天性免疫系、移植拒絶反応、またはアレルギー反応の細胞などの自己免疫疾患に関わっている免疫系の細胞を包含できる。１つの実施形態において、標的核酸は、ウイルスまたはウイルスに感染した細胞に存在できるが、健康細胞には存在できない。ウイルスのいくつかの非限定的例には、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、または逆転写ウイルスを包含できる。１つの実施形態において、標的核酸は、腫瘍または癌細胞に存在できるが、健康細胞には存在できない。癌のいくつかの非限定的な例として、ヒトパピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトＴリンパ球好性ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなどの、オンコウイルスにより引き起こされるものを包含できる。他の実施形態において、標的核酸は、感染病原体または微生物、または感染病原体または微生物に感染した細胞中に存在できるが、健康な細胞には存在しない。感染病原体または微生物のいくつかの非限定的な例として、ウイルス、細菌、真菌、原生生物、プリオン、または真核生物の寄生虫を包含できる。
【００３６】
当該標的核酸配列は、オンコ遺伝子、突然変異遺伝子、オンコウイルス遺伝子、ウイルス核酸配列、微生物核酸配列、異なる発現を示す遺伝子、及びそれらの核酸遺伝子生成物などの、遺伝子のフラグメント、一部分または遺伝子部分であり得る。
【００３７】
ウイルス固有の標的核酸のいくつかの非限定的な例として、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、または逆転写ウイルスに存在する配列を包含できる。癌固有の核酸のいくつかの非限定的な例として、ヒトパピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトＴリンパ球好性ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスを非限定的に包含する、オンコウイルスから誘導される配列を包含できる。癌固有の標的核酸の例として、変異ｒａｓ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＡＢＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、またはＳＲＣ遺伝子などの変異オンコ遺伝子、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰ７３、ＭＤＭ１、ＭＤＭ２、ＡＴＭ、ＲＢ１、ＲＢＬ１、ＲＢＬ２、ＰＴＥＮ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＷＴ１、ＩＲＦ１、ＣＤＫ２ＡＰ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＴＲＩＭ３、ＢＲＣＡ１、またはＢＲＣＡ２の遺伝子などの変異癌抑制遺伝子及び癌細胞に発現した遺伝子を包含でき、ここで当該遺伝子は、変異または遺伝的に変更されていなくても良いが、がん胎児性抗原のように、投与時におけるサンプルの健康細胞には発現しない。
【００３８】
いくつか実施形態において、当該標的核酸は、当該標的コンパートメントにおいて、当該非標的コンパートメントと比べて異なる量または濃度で存在できる。例としては、非限定的に、ｍｙｃ、テロメラーゼ、ＨＥＲ２、またはサイクリン依存キナーゼなどの、健康細胞よりは癌細胞に異なるレベルで発癌する遺伝子を包含できる。１つの実施形態において、当該標的核酸配列は、非標的コンパートメントに対して標的ウイルスに少なくとも１．５倍の変異発現している遺伝子であり得る。それらのいくつかの例として、非限定的に、標的ＲＮＡ分子が、免疫グロブリンイプシロン重鎖配列を含有するために、タイプＩアレルギー反応の介在に関連した遺伝子、プロインスリン由来ペプチド及びαまたはβの変動領域配列を含有し、糖尿病誘発ＣＤ８＋Ｔ細胞から誘導されるクローン固有ｍＲＮＡｓのような特定主要組織適合（ＭＨＣ）タンパク質の文脈において自己抗原を認識する固有Ｔ細胞受容体（ＴＣＲｓ）などの、Ｔ細胞のサブセットに発現した遺伝子、及び非限定的にＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１、ＩＦＮ−γ、ＯＳＭ、及びＬＩＦを含み、それらの産生が、炎症反応の増悪を介在した副作用を持つサイトカインを包含できる。
【００３９】
いくつかの実施形態において、標的核酸は、標的コンパートメント及び非標的コンパートメントの許容可能なサブグループに存在するが、非標的コンパートメントの異なるまたは明確に異なるサブグループには存在しない。非限定的ないくつかの例として、癌精巣抗原、サバイビン、前立腺特異抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン及び他の癌胎児蛋白質などの、癌細胞に発現した遺伝子及び健康細胞のクラス限定の遺伝子を包含できる。また、重篤な疾患に直面している健康でない生命体にとって、多数の組織及び臓器は、本質的なものでない。例えば、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１及びｇｐ１００などのメラニン細胞抗原は、正常なメラニン細胞と同様に、多数の悪性黒色腫に発現し、それら抗原を標的にした治療は、腫瘍と正常のメラニン細胞の両方を破壊する可能性があり、白斑を引き起こすが、主要な腫瘍の縮小に至らない可能性がある。同様に、生殖器は、外科的に除去され、精巣、卵巣、子宮などは、乳房及び前立腺などの関連臓器と同様に、それら組織に腫瘍が発生した時には、標的となり得て、そしてそれら臓器内の正常組織の破壊は、治療の許容範囲内の帰結とされる。さらに、甲状腺ホルモンやインスリンなどのホルモンを産生するいくつかの細胞が、関連タンパク質と置き換えられ、それら臓器の腫瘍の存在時に生存しているかもしれない正常組織が潜在的な標的として許容されている。
【００４０】
標的核酸はまた、従来特定されていない新規配列を包含できる。１つの実施形態において、１つまたは複数のサンプルは、そのサンプルの遺伝子構造を決定するために、次世代シーケンス、全トランスクリプトーム（ＲＮＡ−ｓｅｑ）または全ゲノムシーケンス、マイクロアレイプロファイリング、遺伝子発現の複数解析（ＳＡＧＥ）などの配列分析によって評価できる。標的核酸配列は、標的コンパートメントに存在し、非標的コンパートメントには存在せず、または非標的コンパートメントとの比較で、標的コンパートメントに異なる量または濃度で存在するので、特定が可能である。本方法によって特定される配列は、標的核酸として使用できる。
【００４１】
エフェクター構造の決定
当該エフェクター構造は、当該サンプルに要求される作用を駆動させるトリガーである。要求されるエフェクター活性のいくつかの例として、非限定的に、免疫反応、プログラムされた細胞死、アポトーシス、非固有またはプログラム化された壊死、溶解、増殖阻害、ウイルス感染の阻害、ウイルス複製の阻害、オンコ遺伝子発現の阻害、遺伝子発現の改質、微生物感染の阻害、及び微生物の複製の阻害、そしてそれらの生物学的活性の組み合わせを誘発することを包含できる。他の実施形態において、当該エフェクター構造は、当該病原性細胞の場所で免疫反応を誘発するために、または当該病原性細胞の場所に、治療ペイロードを負荷している抗体による抗体直接療法を局在化するために、抗体に対するリガンドとしての役割を果たし得る。他の実施形態において、当該エフェクター構造は、標的遺伝子の発現を調節できる。他の実施形態において、当該エフェクター構造は、酵素活性、遺伝子／タンパク質発現、分子シグナル伝達、及び分子間相互作用を制御できる。
【００４２】
エフェクター構造は、テンプレート化アセンブリ反応体の組み合わせ、またはテンプレート化アセンブリ反応体の部分的組み合わせの生成物であり、サンプルに要求される活性を産生する。当該活性エフェクター構造は、標的活性または個別の当該エフェクター部分モイエティーのどちらかまたは両方と比較して活性の向上したレベルを保有できる。１つの実施形態において、当該活性エフェクター構造は、当該個別のモイエティーより、個別の当該エフェクター部分モイエティーのどちらかまたは両方と比較して、新規のまたは大幅に異なる活性を保有できる。
【００４３】
エフェクター構造の多様な配置が、核酸テンプレート化アセンブリによって産生されて良い。任意の活性生成物は、相応する選択的反応性基の反応によって組み合わされた比較的不活性な前駆体のテンプレート化アセンブリによって、そのような構造が産生される限りはエフェクター構造の役割を果たして良い。従って、本明細書に記載のアミド結合、トリアゾール連結、ホスフィン酸化物の連結、または他のバイオオーソゴナル連結反応生成物の形成によって、離れた部分で再構築される任意の化合物は、活性エフェクター構造の役割を果たしてよい。さらに、そのような化合物は、事実上、任意のアクセス可能な核酸テンプレート上で組み立てることができ、したがって、非常に多様なサンプルのセットにおいてアセンブリを可能にする。
【００４４】
エフェクター構造の一般的形態には、非限定的に、以下を含む。
【００４５】
【化２】
0006710157.tif 000003
非トレースレスのバイオオーソゴナル反応により創出されるアミド連結エフェクター構造
【００４６】
【化３】
0006710157.tif 000004
アジド−アルキンのバイオオーソゴナル反応により産生されるトリアゾール連結エフェクター構造
【００４７】
【化４】
0006710157.tif 000005
非トレースレスのシュタウディンガー連結バイオオーソゴナル反応によって産生されるホスフィン酸化物連結のエフェクター構造
【００４８】
活性エフェクター構造はまた、タンパク質、標準または非標準アミノ酸、ペプチド模倣構造、及び当該エフェクター構造の相互作用または組み込みを可能にしまたは要求する薬剤またはその他の生理活性化合物を含むペプチドを包含できる。
【００４９】
いくつかの実施形態において、エフェクター構造は、その生成物の残余部に当該エフェクター構造をつないでいる結合を切断することによって、当該テンプレート化アセンブリ生成物の他のモイエティーから解き放たれてよい。切断は、当該結合の加水分解によって、または当該サンプルに内因性のタンパク質または他の化合物による酵素的切断によって、達成されて良い。それらの切断可能な結合の非限定的な例として、エステル類、チオエステル類、イミン類、ヒドラゾン類、細胞プロテアーゼの切断モチーフまたは細胞酵素の基質を包含する。切断基は、合成の間に、それらの組み込みによってテンプレート化アセンブリ反応体モイエティー、リンカー、またはアクセサリー基に導入して良く、または連結反応の間に生成してよい。１つの実施形態において、所望の活性のトリガーとなる当該エフェクター構造に対して、当該エフェクター構造のポスト連結切断または原位置での他の化学修飾が要求されて良い。
【００５０】
エフェクター構造は、標的コンパートメント内で（例えば、細胞内で）、標的コンパートメントの表面で（例えば、その細胞表面）、その標的コンパートメントの近傍において（例えば、当該エフェクター構造が、当該細胞から活性状態で転送される、当該細胞から流れ出る、細胞死で放出される）、または拡散または当該サンプルの離れた領域に運ばれるなどの作用によって、活性のトリガーであって良い。いくつかの実施形態において、当該テンプレート化アセンブリ生成物に標的グループを組み込むことによって、エフェクター構造は、その活性部位が標的となり得る。いくつかの非限定的な標的グループの例として、小胞体輸送シグナル、ゴルジ体輸送シグナル、核輸送シグナル、ミトコンドリア輸送シグナル、ユビキチン化モチーフ、他のプロテアソーム標的モチーフ、またはグリコシルホスファチジルイノシトール・アンカーモチーフを包含できる。標的グループは、合成の間にテンプレート化アセンブリ反応体モイエティー、ケミカルリンカー、またはアクセサリー群へのそれらの組み込みによって導入されて良く、その連結反応の間に生成されて良い。
【００５１】
いくつか実施形態において、当該エフェクター構造は、標的コンパートメントの表面に存在できる。他の実施形態において、当該エフェクター構造は、主要組織適合遺伝子複合体分子に結合したリガンドとしての細胞の表面に存在できる。
【００５２】
いくつか実施形態において、当該エフェクターは、内因性ペプチド等、及びそれらの類似体、または抗体のようなエフェクター構造がトリガーとなった作用因子に対して標的となる完全合成構造であり得る。標的核酸の有用性で、活性エフェクターの産生が制約され得て、したがって、低レベルでも活性を発揮するエフェクター構造をもつのが望ましいであろう。
【００５３】
当該エフェクター構造はまた、非常に多様なサンプルのセットにおいて、アクセス可能な核酸転写産物上でのテンプレート化によって産生でき、及びエフェクター構造の組み合わせは、同じ転写産物上、または細胞などのように、サンプルと同時に存在できる異なる転写産物上で産生できる。従って、単一のエフェクター構造を、同じサンプル内の異なるテンプレート上でアセンブリでき、または複数のエフェクター構造を、同一のテンプレート上で、または同一サンプル内の複数のテンプレート上にアセンブリでき、特定のエフェクター分子の多数の複製を、及びエフェクター分子の多数の多様な配列を、同じサンプル内の利用可能なテンプレート上に産生できる。
【００５４】
標的核酸の局所化のための化学マーカーとしてのエフェクター構造
いくつか実施形態において、同一サンプル内の標的コンパートメントの位置を指示するために、エフェクター構造固有の抗体を利用できる。それらの実施形態において、相応するテンプレート化アセンブリ反応体を、レポーター抗体と同時に投与できる。エフェクター構造は、標的コンパートメントに産生され、標的コンパートメントでレポーター抗体と結合し及び蓄積を引き起す。当該標的コンパートメントの位置は、当該抗体のレポーター機能によって決定される。図５に、標的コンパートメントの局所化の一般的スキームを図解する。局在化されて良い標的コンパートメントには、非限定的に、癌細胞、腫瘍、ウイルスまたは他の感染因子によって感染した細胞、またはそのサンプルの全ての細胞には発現していない関心部に特定の核酸配列を発現している細胞における任意の細胞またはグループを包含する。図６及び図７に、腫瘍細胞の選択的排除に対する治療的用法の一般的スキームを、治療前（図６）及び治療中の相補的形成（図７）で図解する。
【００５５】
生体細胞に所望の活性を産生するエフェクター構造
特定の細胞集団は、エフェクター構造の生成を介して調節でき、最終的には、指定された細胞の標的コンパートメントの破壊または改造をもたらす。エフェクター構造が生成する活性を、望ましくない細胞標的コンパートメントを削除するように設計して良い。図８に、細胞毒性Ｔリンパ球、治療用抗体、細胞内受容体及び直接細胞間相互作用などのアポトーシスを誘発するために異なるメカニズムを採り入れた当該エフェクター構造を図解する。
【００５６】
細胞毒性及びプロアポトーシスのエフェクター構造
いくつか実施形態において、標的細胞の殺傷または増殖阻害は、細胞傷害性、殺菌または殺ウイルスエフェクター構造との直接的な相互作用によって誘発できる。当技術分野で公知の多数の有害分子が産生できる。１つの実施形態において、トレースレスのバイオオーソゴナル反応ケミストリーでは、有害ペプチドを産生する。有害ペプチドのいくつかの例として、非限定的に、蜂メリチン、コノトキシン、カテリシジン、ディフェンシン、プロテグリン、ＮＫ−ライシンを包含できる。
【００５７】
いくつか実施形態において、標的細胞の殺傷または増殖阻害は、プロアポトーシスエフェクター構造によって誘発できる。例えば、トレースレスのバイオオーソゴナルケミストリーを用いて産生したエフェクターペプチドは、非限定的に、プリオンタンパク質のフラグメント１０６−１２６（ＰｒＰ  １０６−１２６）、Ｂａｘ  １０６−１３４を含むカスパーゼ連鎖反応に関連したＢａｘ由来の最小ポロペプチド、及びプロアポトーシスペプチド（ＫＬＡＫＬＡＫ）２を含むプロアポトーシスペプチドを包含して良い。
【００５８】
血栓形成のエフェクター構造
いくつか実施形態において、産生された当該エフェクター分子は、タンパク質の凝固カスケードの多様な組成物の活性化、またはタンパク質の活性化、または血小板の活性化及び／または凝集、または病原性細胞を含む領域が、腫瘍または他の病原性細胞への血液供給を制約するために選択的に血栓形成でき、生物学的な活性プロセスの原因となり得る血管内皮細胞障害を誘発することにおいて、血栓を形成できる。これらエフェクターのタイプは、標的病原性細胞その周辺で、凝固、または凝固抑制、または血小板活性化抑制及び凝集を誘発できる。
【００５９】
免疫活性化エフェクター構造
いくつか実施形態において、エフェクター構造は、免疫系に関連した分子、経路、または細胞の活性化により、標的細胞またはウイルスの殺傷または増殖阻害を仲介できる。エフェクター構造は、自然免疫系、獲得免疫系、及び／またはその両方を関与させる。
【００６０】
自然免疫系を活性化するエフェクター構造
いくつか実施形態において、エフェクター構造は、自然免疫系の刺激により、細胞またはウイルスの殺傷または増殖阻害を仲介できる。１つの実施形態において、エフェクター構造は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）、及びそれらの合成類似体を包含できる。
【００６１】
いくつか実施形態において、補体系を活性化するエフェクター構造によって、自然免疫系を関与させることができる。補体系活性エフェクター構造の非限定的な例として、補体蛋白質Ｃ３のＣ３ａフラグメントがあり得る。
【００６２】
いくつか実施形態において、エフェクター構造は、蟻酸化ペプチド受容体のアゴニストであり得る。１つの実施形態において、当該蟻酸化トリペプチドホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅは、トレースレスのバイオオーソゴナルケミストリーを使用して産生できる。トレースレス・テンプレート化アセンブリ反応体を使用したｆＭＬＦペプチドの生成における具体的なスキームの例を、以下に含む。
【００６３】
【化５】
0006710157.tif 000006
【００６４】
いくつか実施形態において、ペプチドＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−（Ｄ−Ｍｅｔ）などの蟻酸化ペプチド受容体の小ペプチドアゴニストを、産生できる。
【００６５】
いくつか実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の自然または合成リガンドを有するエフェクター構造を産生できる。１つの非限定的な例として、エフェクター構造は、ＴＬＲアゴニストとして知られる熱衝撃蛋白質（ｈｓｐ）のペプチドフラグメントを含有できる。
【００６６】
いくつか実施形態において、トレースレスのバイオオーソゴナルケミストリーは、炎症反応を活性化するＮＯＤ２受容体のムラミルジペプチドアゴニストを産生するために使用して良い。
【００６７】
獲得免疫系を活性化するエフェクター構造
いくつか実施形態において、エフェクター構造は、当該獲得免疫系の分子または細胞を活性化することにより、細胞またはウイルスの殺傷または増殖阻害を仲介できる。当該獲得免疫系に固有の分子または細胞は、特別に多様な構造を認識するように設計できるので、当該エフェクター構造が本質的に活性であり、または内因性タンパク質に結合しなくてはならないという制約を取り除く。
【００６８】
当該システムがモジュール性を有するため、同一のエフェクター構造を、任意の標的核酸の存在下で産生できるので、当該獲得免疫系の単一に設計された分子または細胞を、任意の標的コンパートメントまたは標的核酸の治療に利用できる。この点は、当技術分野の現状に対する優位性であり、時間、難易度及びコストを有効に使い、どんな新規標的の治療に対しても、新規分子または細胞が設計されるはずである。
【００６９】
いくつか実施形態において、エフェクター構造は、抗体または抗体フラグメント（非限定的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、及びｓｃＦｖを包含する）に対するリガンドであり得る。トレースレスのバイオオーソゴナルのアプローチは、ペプチドまたは既存の抗体により結合している他のペプチドを産生するために使用でき、または任意の選択的感応性のまたはバイオオーソゴナルのアプローチにより創出されるエフェクター構造を認識するために、抗体を開発できる。
【００７０】
テンプレート化アセンブリ反応体との組み合わせにおける治療介入に対して、人工的に製造された抗体を、エフェクター構造トリガー物質として投与できる。本明細書で使用する用語「エフェクター構造トリガー物質」は、エフェクター構造に結合し必要な活性を発揮することができる外因的に産生された化合物または細胞を指す。当該物質は、テンプレート化アセンブリ反応体の投与前、投与中、または投与後にサンプルに投入できる。非限定的な例として、レポーター抗体がある。１つの実施形態において、非修飾抗体を、治療効果に介在させるために利用できる。他の実施形態において、エフェクター構造固有抗体を、当該治療効果を高めるために設計され添付されたペイロードを使って製造できる。治療用抗体ペイロードの非限定的ないくつかの例として、細胞毒素、放射性同位元素、放射線治療と組み合わせて使用される放射線増感剤、活性薬に対する共投与プロドラッグの転換酵素、または他の抗体指向療法を包含できる。
【００７１】
いくつか実施形態において、対象部位内に標的コンパートメントを局所化している抗体を、インビボのエフェクター構造の検出に使用して良い。
【００７２】
いくつか実施形態において、エフェクター構造は、Ｔ細胞を活性化できる。Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合しているエフェクター構造によって達成できる。１つの実施形態において、エフェクター構造は、主要組織適合遺伝子複合体分子（ＭＨＣ）に結合された標的細胞の表面に存在でき、Ｔ細胞受容体の結合を促進する。エフェクター構造は、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスII分子に結合されて良い。例示的な実施形態において、エフェクター構造は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合されている。ＴＣＲを結合する構造は、従来のペプチド抗原、または特定の変動（Ｖ）領域を発現する広範なＴ細胞のサブセットに結合する「スーパー抗原」であり得る。特定の抗原と相互作用を持つために選ばれるＴＣＲとは対照的に、スーパー抗原は、異なる抗原−ＭＨＣ複合体に結合できる受容体を有する多数のＴ細胞集団を活性化でき、及び炎症性メディエーターのカスケードを始動するための強い炎症反応を誘発できる。このように、スーパー抗原またはスーパー抗原模倣病原性細胞を、多数のＴ細胞を病原性細胞に集め、及びそのような細胞の破壊または増殖の制約を引き起こすことができる活性エフェクター構造として産生できる。
【００７３】
ＭＨＣクラスＩ分子に結合されている天然リガンドは、通常は８から１０個のアミノ酸の長さのペプチドであるが、他の長さも許容される。ＭＨＣクラスII分子に結合されている天然リガンドは、通常は１５から２４個のアミノ酸の長さのペプチドであるが、他の長さも許容される。エフェクター構造は、トレースレスのバイオオーソゴナルケミストリーを使用して産生できる。ＭＨＣリガンドとして公知のペプチドは、エフェクター構造として利用でき、または新規ペプチドを産生できる。ＭＨＣ分子へのペプチド結合を評価する試験は、当技術分野では公知であり、及びＭＨＣ結合に対するエフェクター構造候補の評価に使用して良い。
【００７４】
ＭＨＣ分子は、非ペプチド構造及びペプチド模倣体を結合することが知られている。非トレースレスのバイオオーソゴナルでのテンプレート化アセンブリのアプローチを、Ｔ細胞受容体の活性化のためのペプチド模倣ＭＨＣが結合する抗体の創出に利用して良い。１つの実施形態において、当該ペプチド模倣体は、６から４０個のアミノ酸または非標準アミノ酸のペプチドであり得て、ここで１から４個のアミノ酸残基は、以下のような非トレースレスのバイオオーソゴナル連結反応構造に置き換えられる。
1mＲ−［バイオオーソゴナル連結反応構造］−Ｒ2n
ここで、Ｒ１及びＲ２は、共有結合の標準または非標準アミノ酸であり、ｍ＝０から４０、ｎ＝０から４０、及びｍ＋ｎ＝２から３９である。いくつか実施形態において、ｍ＋ｎ＝３から１１であり、ＭＨＣクラスＩへの結合に適した構造を
産生する。
【００７５】
設計足場のような、主要抗原腫瘍ＭＡＲＴ−１を使用したエフェクター構造のいくつかの例として、以下を包含できる。
【００７６】
【化６】
0006710157.tif 000007
シュタウディンガー連結反応ケミストリーに基づくペプチド模倣エフェクター構造の例
【００７７】
【化７】
0006710157.tif 000008
アジド−アルキン連結反応ケミストリーに基づくペプチド模倣エフェクター構造の例
【００７８】
【化８】
0006710157.tif 000009
アジド−シクロオクチルアルキン連結反応ケミストリーに基づくペプチド模倣エフェクター構造の例
【００７９】
ペプチド模倣エフェクター構造は、ＭＨＣ及びＴ細胞受容体（前述の例に示す）と結合することが知られる天然リガンドに基づいて設計されてよい。あるいは、ペプチド模倣エフェクター構造は、まったく新規の構造でも良く、及び新規のＴ細胞クローンまたはキメラ抗体ＴＣＲ（Ｔボディ）は、エフェクター構造トリガー物質として使用するために開発されてよい。このアプローチは、活性を増進する一方で、治療中に望ましくない副作用を低減する、高度に非自己、非交差反応性エフェクター構造を使用する利点がある。
【００８０】
いくつか実施形態において、天然ペプチドまたはペプチド模倣ＭＨＣが結合するエフェクター構造は、養子Ｔ細胞療法と併用して利用でき、ここで、当該養子Ｔ細胞は、エフェクター構造トリガー物質としての役割を果たす。養子Ｔ細胞療法は、患者に、治療上望ましい免疫反応を行うことができる外因性Ｔ細胞を提供する。しかしながら、同種異系Ｔ細胞は、拒絶反応、または移植片対宿主疾患リスクのいずれかの問題を潜在的に引き起こす可能性がある。
【００８１】
最近開発された技術は、多様な応用治療に対して自己Ｔ細胞の使用を可能にし、宿主遺伝子不適合が避けられる。臨床的に関連するＴ細胞サブセット（ＴＣＲｓに特異なクローン由来細胞を含む）は、インビトロで交換可能であり及び自家患者に戻すことができる。標的抗原に対して特異性が判っているＴＣＲｓの発現（腫瘍上で発現することが知られている物など）を可能にするベクター、または同等に必要な特異性を持つ人工的に作られたキメラ抗原受容体と共に、インビトロで移入された自己Ｔ細胞を用いて、大きな選択性が達成できる。
【００８２】
一旦、活性エフェクター構造が選択されると、当該テンプレート化アセンブリ反応体に組み込むための、適切な選択的反応性モイエティー及びエフェクター部分モイエティーが設計できる。それらモイエティーは、テンプレート化アセンブリ反応が起きた時に、それらモイエティーが、当該活性エフェクターモイエティーを再構築できるように設計される。
【００８３】
核酸テンプレート化戦略の決定
適切な核酸標的配列が特定され及び活性エフェクター生成物が決定されると、相応するテンプレート化アセンブリ反応体のセットの設計戦略が生み出される。相応するテンプレート化アセンブリ反応体のセットが、以下のように選択される。
ａ）当該反応体のセットは、それらの核酸認識モイエティーの相補的形成部位により決定される適切な隣接空間位置に、当該標的核酸テンプレートを結合する。
ｂ）当該テンプレート化アセンブリ反応体の選択的反応性モイエティーは、当該エフェクター部分モイエティーからの当該活性エフェクター生成物の形成を促進する方法で、互いに反応できる。
【００８４】
以下の項では、互いに独立したモイエティーの設計と合成、及びテンプレート化アセンブリ反応体全体の合成のためのプロセスを記述する。テンプレート化アセンブリ反応体に組み込まれてよいオプションのケミカルリンカーまたはアクセサリグループもまた記述する。
【００８５】
核酸認識モイエティーの設計と合成
核酸テンプレート化アセンブリ反応体は、少なくとも１つの核酸認識モイエティーを含有する。当該核酸認識モイエティーは、特定の標的配列を認識し及びＷａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対による相互作用を介した配列特異の方法で標的核酸と相互作用する当該組成物を標的化している成分である。当該核酸認識モイエティーは、当該標的核酸と結合でき、または当該標的核酸への結合を促進する。１つの実施形態において、当該核酸認識モイエティーは、当該標的核酸と直接結合する。
【００８６】
本明細書で使用する表現「核酸認識モイエティー」は、標的核酸への配列に特異的な結合を促進する化合物を指す。当該核酸認識モイエティーの主要な機能は、テンプレート化アセンブリの場所として当該標的分子を使用することである。この方法は、相補的形成がしばしば、標的分子を直接的に阻止または阻害するために最適化されている多数の現行技術とは異なる。
【００８７】
いくつか実施形態において、当該核酸認識モイエティーは、標的核酸に結合する。この結合は、当該核酸認識モイエティーと当該標的核酸の直接的な相補的形成を通して、または、リンカーなどの、当該核酸認識モイエティーと当該標的核酸の両者に結合する中間体を通して間接的に、成し得る。表現「標的核酸配列」及び「標的核酸」は互換的に使用され、及び核酸テンプレート化アセンブリに対してテンプレートとして作用することを意図した単位また核酸の配列を指す。
【００８８】
当該核酸認識モイエティーには、核酸または核酸類似体などの塩基対形成単位のオリゴマーを包含して良い。当該オリゴマーは、いくつかのまたは全ての単位が、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対の相互作用を形成することのできる塩基である複数の単位から作られて良く、二重または多重構造での標的核酸への配列特異の結合を許容する。
【００８９】
当該オリゴマー配列は、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート変性ヌクレオチド、２−Ｏ−アルキル化ＲＮＡヌクレオチド、ハロゲン化ヌクレオチド、ロック化核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸類似体（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓ）、プソイドウリジンヌクレオチド、キサンチンヌクレオチド、ヒポキサンチンヌクレオチド、２−デオキシイノシンヌクレオチド、他の塩基対形成可能な核酸類似体、またはそれらの組み合わせであって良い。１つの実施形態において、当該核酸認識モイエティーは、核酸及びｍＲＮＡ標的への相補的生成体を包含する。
【００９０】
当該オリゴマーは、特定単位を組み込み、特定単位と相互作用し、または特定単位と結合して良い。例えば、生体細胞または溶解液中などにおいて、標準ＤＮＡまたはＲＮＡを分解するヌクレアーゼの存在下で、当該核酸認識モイエティーを使用する場合、当該オリゴマーにヌクレアーゼ耐性塩基を組み込みことが望まれるであろう。いくつかの非限定例として、ホスホロチオエート塩基、２−Ｏ−アルキル化または２−ハロゲン化ＲＮＡ塩基、ロック化核酸、ペプチド核酸、少なくともこれらの１つを含むモルホリノまたはキメラを包含できる。リボヌクレアーゼＨ活性に依存するアンチセンスプローブとは異なり、当該オリゴマーの内部塩基は、標的ＲＮＡ転写産物のリボヌクレアーゼＨの加水分解を誘発する必要はない。したがって、当該核酸認識モイエティーのいかなる位置においても、リボヌクレアーゼＨ誘発塩基の要求はない。
【００９１】
核酸認識モイエティーにおける塩基配列は、標的核酸上の相補的形成部位に対して相補的であり得て、当該標的核酸への当該核酸認識モイエティーの配列特異の結合を許容する。１つの実施形態において、当該相補的形成部位は、非標的核酸における存在として公知の配列に類似していない配列であるように選択される。他の実施形態において、当該相補的形成部位は、当該標的核酸内に見出せる１つまたは複数の突然変異を含有し、核酸認識モイエティーが、突然変異を含まない非標的核酸とではなく、当該標的核酸と特異的に結合することを許容する。さらに他の実施形態において、当該核酸認識モイエティーは、標的核酸との必要な結合相互作用における可能な改善と共に、茎ループ構造として設計されて良い。
【００９２】
当該標的核酸上の結合サイトは、約５から約１００の塩基の長さ範囲のどの位置でも良い。１つの実施形態において、当該標的核酸上の当該結合サイトは、約５から約５０の塩基の長さ範囲にあり得る。他の実施形態において、当該標的核酸上の当該結合サイトは、約５から約４０の塩基の長さ範囲にあり得る。さらに他の実施形態において、当該標的核酸上の当該結合サイトは、約１０から約３０の塩基の長さ範囲にあり得る。
【００９３】
同様に、当該核酸認識モイエティーは、当該標的核酸に結合可能なオリゴマーを含有できる。当該オリゴマーは、約５から約１００の塩基の長さ範囲のどの位置でも良い。１つの実施形態において、当該オリゴマーは、約５から約５０の塩基の長さ範囲にあり得る。他の実施形態において、当該オリゴマーは、約５から約４０の塩基の長さ範囲にあり得る。さらに他の実施形態において、当該オリゴマーは、約１０から約３０の塩基の長さ範囲にあり得る。
【００９４】
当該核酸認識モイエティーはまた、当該標的核酸配列との必要な相互作用を提供するために最適化される。当該核酸認識モイエティーが結合する当該標的核酸の長さは、当該標的核酸の相補配列の化学的性質に基づいて選定され得る。そのような性質は、当該相補配列の融解温度及びアニーリング温度を包含できる。当該融解温度Ｔm、は、指定された核酸配列の全ての分子の５０％が二本鎖に相補的形成を行い、５０％は一本鎖として存在する摂氏温度として定義される。当該アニーリング温度は、その融解温度より一般に５℃低い。
【００９５】
当該標的核酸の相補配列のＴm値は、当該テンプレート化アセンブリ反応体が使用される温度条件の低温側で約１０℃から高温側で約４０℃の範囲であり得る。例えば、仮にテンプレート化アセンブリ反応体が３７℃で使用されるなら、当該核酸認識モイエティーは、２７℃から７７℃のＴm期待値で設計されて良い。１つの実施形態において、当該テンプレート化アセンブリ反応体は、おおよそ３７℃で使用可能であり、及び当該核酸認識モイエティーで使用される相補配列のＴm値は、約３７℃から約５２℃の範囲で設計される。
【００９６】
いくつか実施形態において、核酸認識モイエティーは、当該標的核酸を結合するためのＴm値が、類似の非標的核酸を結合させるためのＴm値と実質的に異なるように設計され得る。例えば、当該核酸認識モイエティーは、標的核酸上にそれを結合する相補的形成部が、突然変異部を含むように設計して良い。例示的な実施形態において、当該標的核酸に結合している当該核酸認識モイエティーのＴm値は、当該テンプレート化アセンブリ反応体が使用される温度でまたはその上の温度であるが、一方、当該非標的核酸に結合している当該核酸認識モイエティーのＴm値は、当該テンプレート化アセンブリ反応体が使用される温度より低い。当該核酸認識モイエティーは、突然変異標的配列に結合するが、非標的、非突然変異配列には結合しない。
【００９７】
相応するテンプレート化アセンブリ反応体のセット要員の当該核酸認識モイエティーの結合または相補的形成部は、同じ標的核酸上にあり得る。１つの実施形態において、当該結合または相補的形成部は、同じ標的核酸上にあり得て、しかし当該標的核酸上で約０から約１００の塩基分だけ離れて見出され得る。他の実施形態において、当該結合または相補的形成部は、当該標的核酸上で約０から約３０の塩基分だけ離され得る。他の実施形態において、当該結合または相補的形成部は、同じ標的核酸上に３０塩基分を超えて離され得るが、当該標的核酸の二次または三次構造形成を介した隣接に近づけて持ち込まれ得る。１つの実施形態において、当該結合または相補的形成部は、１００塩基分を超えて離され得て、及び当該標的核酸の二次または三次構造形成を介した隣接に近づけて持ち込まれ得る。
【００９８】
オリゴマーは、当技術分野で公知の複数の方法で合成されて良い。ヌクレオチドに基づくオリゴマーは、溶液中でまたはホスホロアミダイトケミストリーを用いた固相上で合成されて良い。ペプチド核酸はまた、溶液中でまたは当技術分野で公知の方法を用いた固相上で合成されて良い。多数のモルホリノ合成法が使用されるであろう。前述の任意のタイプのオリゴマーはまた、様々な商業的供給源で完全に合成されて入手されて良い。
【００９９】
アミン類、ヒドラジド類、チオール類、カルボン酸類、イソシアン酸塩類、アルデヒド類の非限定的な官能基を導入するために、市販の誘導体塩基が組み込まれて良く、それらは、完全なテンプレート化アセンブリ反応体の合成を促進するための生体共役反応ケミストリーの標準的な技術を用いて、他のモイエティー上の活性官能基と共役させて良い。
【０１００】
選択的反応性モイエティーの設計及び合成
核酸テンプレート化アセンブリ反応体組成物はまた、少なくとも１つの選択的反応性モイエティーを含有する。当該選択的反応性モイエティーは、相応する選択的反応性モイエティーとの化学反応または物理的相互作用を介するなどで、核酸認識生成物の形成を可能にする。当該選択的反応性モイエティーは、当該核酸認識モイエティーと相互作用または結合ができる。当該選択的反応性モイエティーはまた、当該エフェクター部分モイエティーと相互作用または結合ができる。本明細書で使用する用語「結合（ｂｉｎｄ）」、「結合する（ｂｉｎｄｓ）」、「結合している（ｂｉｎｄｉｎｇ）」、及び「結合された（ｂｏｕｎｄ）」は、１つが他に隣接する二つの分子間の安定した相互作用を指す。当該用語は、化学結合（直接的な結合または中間体構造を介した結合のいずれか）などの物理的な相互作用、及び静電気引力、水素結合、及びファンデルワールス／分散力などの非物理的相互作用及び吸引力を包含する。
【０１０１】
選択的反応性モイエティーは、生物学的に不活性にできる。特に、当該選択的反応性モイエティーは、相応する選択的反応性モイエティーとは容易に相互作用できるが、天然の生体分子とは容易に相互作用しない。このことは、当該核酸テンプレート化アセンブリ生成物は、相応するテンプレート化アセンブリ反応体が、標的核酸上でアセンブリされる時に形成されることを保証することである。このことはまた、当該核酸テンプレート化アセンブリ反応体を、アセンブリが起きている環境中に存在する他の分子上の官能基との反応が起きて、意図した生成物の形成を妨げることから保護することである。選択的反応性モイエティーの例として、バイオオーソゴナル反応モイエティーを包含する。バイオオーソゴナル反応モイエティーは、相応するバイオオーソゴナル反応モイエティーと化学的に反応するが、他の生体分子とは容易に化学反応しない。
【０１０２】
当該選択的反応性モイエティーは、細胞、ウイルス、組織、腫瘍、ライセート、他の生物学的構造、または当該標的核酸を含有する、または非標的コンパートメントと比較して異なる量の標的核酸を含有するサンプル内の空間領域などの複雑な標的コンパートメントに起きるテンプレート化反応に対するメカニズムを提供する。選択的反応性モイエティーは、相応する選択的反応性モイエティーと反応できるが、普通の生物学的分子とは通常の条件下では反応しない。他の反応性物質とは異なり、当該選択的反応性モイエティーの選択性は、その生成物または反応体のアセンブリ前での当該反応性グループの切断を防ぐ。
【０１０３】
選択的反応性モイエティーの例として、バイオオーソゴナル反応モイエティーを包含できる。当該バイオオーソゴナル反応モイエティーは、アジドとアルキン間での「クリック」反応、アジドとホスフィン間でのトレースレスまたは非トレースレスのシュタウディンガー反応、及びチオエステルとチオール間の自然な化学連結反応を受けることができるそれらのグループを包含する。さらに、当該バイオオーソゴナルモイエティーは、任意のアジド、シクロオクチン、ニトロン、ノルボルネン、オキサノルボルナジエン、ホスフィン、ジアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィン、ホスフィノチオール、ホスフィノフェノール、シクロオクテン、ニトリル酸化物、チオエステル、テトラジン、イソニトリル、テトラゾール、クワドリシクラン、及びそれらの誘導体であり得る。相応するテンプレート化アセンブリ反応体セットの要員の選択的反応性モイエティーは、活性エフェクター構造を産生するために互いに反応するように選択される。
【０１０４】
複数の選択的反応性モイエティーは、本明細書に開示される方法及び組成物で使用でき、非限定的ないくつかの例を以下に含める。
【０１０５】
アジド−アルキン「クリックケミストリー」
クリックケミストリーは、通常の条件下における一般的な生体分子とのアジド反応またはアルキン反応のどちらでもなく、高度に選択的である。Ｒ−Ｎ3形成のアジド及びＲ−Ｃ≡ＣＨ形成の末端アルキンまたはＲ−Ｃ≡Ｃ−Ｒ形成の内部アルキンは、互いに容易に反応し、１，２，３−トリアゾールの形でヒュスゲン付加環化反応生成物を産生する。
【０１０６】
【化９】
0006710157.tif 000010
【０１０７】
アジド塩基化されたテンプレート化アセンブリ反応体は、Ｒ−Ｎ3のサブ構造を有し、ここで、Ｒは、ケミカルリンカー、核酸認識モイエティー、またはエフェクター部分モイエティーである。アジド及びアジド誘導体は、市販の試薬から容易に調合される。
【０１０８】
アジドはまた、当該エフェクター部分モイエティーの合成の間に、エフェクター部分モイエティーに導入できる。１つの実施形態において、アジド基は、標準的なペプチド合成法を使用した当該エフェクター部分モイエティーペプチドの合成の間に、市販のアジド誘導体標準アミノ酸またはアミノ酸類似  体の組み込みによって、ペプチドから成るエフェクター部分モイエティーに導入される。アミノ酸は、当該α−アミノ基をアジドで置き換えることで誘  導体となり得て、その形成体の構造を以下に提供する。
【化１０】
0006710157.tif 000011
ここで、Ｒは、標準的なアミノ酸または非標準的なアミノ酸類似体の側鎖である。
【０１０９】
市販の生成物に、アミノ酸側鎖としてのアジド官能性を導入でき、以下の生成物構造となる。
【化１１】
0006710157.tif 000012
ここで、Ａは、標準的なアミノ酸または非標準的なアミノ酸類似体の側鎖における任意の原子及びその置換基である。
【０１１０】
アジドは、ジアド交換法により、当該ペプチド上のアミノ基をジアドに変換することによって合成後にエフェクター部分モイエティーペプチドに導入して良い。生体共役ケミストリーは、市販のアジド誘導体を、適切な反応基を含有するケミカルリンカー、核酸認識モイエティー、またはエフェクター部分モイエティーに接合するために使用できる。
【０１１１】
標準的なアルキンは、アジド組み込みに類似の方法でテンプレート化アセンブリ反応体に組み込むことができる。アルキン官能性のヌクレオチド類似体は市販されおり、核酸認識モイエティーの合成時に直接組み込めるアルキン基がある。同様に、アルキン誘導アミノ酸類似体は、標準的ペプチド合成法によりエフェクター部分モイエティーに組み込まれてよい。さらに、生体共役ケミストリーと互換性である多官能アルキンは、適切な官能性または側基を介した他のモイエティーへのアルキンの組み込みを促進するために使用して良い。
【０１１２】
アジド活性化アルキン「クリックケミストリー」
標準的なアジド−アルキンケミストリー反応は、通常は銅（Ｉ）のような触媒を必要とする。触媒濃度における銅（Ｉ）は、多数の生態系に対して毒性であり、標準的なアジド−アルキンケミストリー反応は、生体細胞での使用に限界がある。活性アルキンを基にした銅を使用しないクリックケミストリー系は、毒性触媒を回避する。
【０１１３】
活性アルキンはしばしば、シクロオクチンの形態をとり、ここでそのシクロオクチン基への組み込みは、当該アルキンに環のひずみを持ち込む。
【０１１４】
【化１２】
0006710157.tif 000013
【０１１５】
ヘテロ原子または置換基は、当該シクロオクチン環の多様な場所に導入して良く、当該アルキンの反応性を変えまたはその化合物にその他の化学的特徴としての選択肢を与えるであろう。当該環上の多様な場所は、当該シクロオクチンの核酸テンプレート化アセンブリモイエティーまたはリンカーへの連結にとっての結合点としての役割を担うであろう。
【０１１６】
複数のシクロオクチンは、市販されており、標準的な生体共役ケミストリーのプロトコルでの使用に対して適切な多数の誘導体製品を包含する。市販のシクロオクチン誘導ヌクレオチドは、核酸認識モイエティーの合成の間に、当該選択的反応性モイエティーの簡便な組み込みの促進を助けることができる。
【０１１７】
【化１３】
0006710157.tif 000014
【０１１８】
シクロオクチン−アジドベースのバイオオーソゴナルケミストリーは、以下の一般構造のテンプレート化アセンブリ生成物を産生する。
【０１１９】
【化１４】
0006710157.tif 000015
【０１２０】
アジド−ホスフィン・シュタウディンガーケミストリー
シュタウディンガー還元はまた、Ｎ2損失のアジドとホスフィンまたはホスファイト間の迅速な反応に基づいており、バイオオーソゴナル反応を代表する。シュタウディンガー連結反応は、シュタウディンガー反応においてその反応体間で二重結合が形成され、核酸テンプレート化アセンブリにおける使用に適している。シュタウディンガー連結反応の非トレースレス及びトレースレスの両形態は、それらの反応において形成される生成物の化学構造における多様なオプションを許容する。
【０１２１】
非トレースレス・シュタウディンガー連結反応
標準的なシュタウディンガー連結反応は、アジドとトリフェニルホスフィンなどのフェニル置換ホスフィンとの非トレースレス反応であり、ここで当該ホスフィン上の求電子捕捉置換基、メチルエステルなど、は、当該反応のアザイリド中間体と再配置し、ホスフィンオキシドが結合した連結反応生成物を生成する。テンプレート化アセンブリ反応体Ａ及びＢにより形成されたシュタウディンガー連結反応生成物の例として、以下の構造を有して良い。
【０１２２】
【化１５】
0006710157.tif 000016
【０１２３】
求電子捕捉を持ち込むフェニル置換ホスフィンはまた、容易に合成できる。誘導体製品が市販されており及びテンプレート化アセンブリ反応体への組み込みに適している。
【０１２４】
【化１６】
0006710157.tif 000017
【０１２５】
トレースレス・シュタウディンガー連結反応
いくつか実施形態において、トレースレス・シュタウディンガー連結反応に対応できるホスフィンは、選択的反応性モイエティーとして利用されてよい。トレースレス反応において、当該ホスフィンは、当該アザイリド中間体の再配置の間に、脱離基としての役割を持ち、自然なアミド結合の形成において典型的な連結を作る。トレースレス・シュタウディンガー連結反応に対応できる化合物は一般に、チオエステル誘導ホスフィンまたはエステル誘導ホスフィンの形態をとる。
【０１２６】
【化１７】
0006710157.tif 000018
トレースレス・シュタウディンガー連結反応に対応するエステル誘導ホスフィン
【０１２７】
【化１８】
0006710157.tif 000019
トレースレス・シュタウディンガー連結反応に対応するチオエステル誘導ホスフィン
【０１２８】
ケミカルリンカーまたはアクセサリグループは随意で、置換基として上記構造のＲ基に付加して良く、核酸認識モイエティーまたは、当該反応体への追加官能性の導入に対応した付加点を与える。
【０１２９】
トレースレス・ホスフィノフェノール・シュタウディンガー連結反応
当該非トレースレス・シュタウディンガー・ホスフィノフェノール化合物との比較において、トレースレスホスフィノフェノール上の求電子捕捉エステルの配向性は、フェノール基に対して相対的に逆向きになる。このことは、アジドとの反応において、トレースレス・シュタウディンガー連結反応が起きることを可能にし、ホスフィンオキシドを含まない生成物に自然なアミド結合を生み出す。
【０１３０】
【化１９】
0006710157.tif 000020
【０１３１】
当該トレースレス・シュタウディンガー連結反応は、もし、第三級アミンなどの適切な親水性基を、当該フェニルホスフィンに付加するならば、有機共溶媒を含まない水溶媒中で行われてよい。Ｗｅｉｓｂｏｒｄ及びＭａｒｘ（２０１０）が、水溶性ホスフィノフェノールの調合について記述した論文によれば、水溶性ホスフィノフェノールの調合には、ジシクロヘキシルジカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＮ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などのカルボジイミド及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）などのエステル活性化剤を使用する緩慢なシュテークリヒ（Ｓｔｅｇｌｉｃｈ）のエステル化を介して、カルボン酸（エプチドのＣ末端など）を含有する所望のエフェクター部分モイエティーを使用して良い。このアプローチは、以下の形態のテンプレート化アセンブリ反応体の合成を促進する。
【０１３２】
【化２０】
0006710157.tif 000021
水溶性ホスフィノフェノールに基づくトレースレス・テンプレート化アセンブリ反応体構造
【０１３３】
トレースレス・ホスフィノメタンチオール・シュタウディンガー連結反応
ホスフィノメタンチオールは、トレースレス・シュタウディンガー連結反応を仲介するホスフィノフェノールに対しての代替物を代表する。一般に、ホスフィノメタンチオールは、トレースレス・シュタウディンガー反応の仲介において、ホスフィノフェノールに比べて有利な反応速度を有する。米国特許出願（Ｕ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ２０１０／００４８８６６）及びＴａｍら（２００７）に係る論文では、以下の形態の水溶性ホスフィノメタンチオールの調合を記述している。
【０１３４】
【化２１】
0006710157.tif 000022
【０１３５】
これらの化合物は、活性化エステルの形態において、トレースレス・バイオオーソゴナル反応性基としての使用に適したチオエステルを形成するために、ペプチド及び他のペイロードと共に使用されてよい。
【０１３６】
【化２２】
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水溶性ホスフィノメタンチオール・トレースレス・シュタウディンガー・バイオオーソゴナルケミストリーに基づく、テンプレート化アセンブリ反応体構造
【０１３７】
天然の化学連結反応
天然の化学連結反応は、チオエステルとチオ及びアミンを有する化合物との反応に基づくバイオオーソゴナルなアプローチである。古典的な天然の化学連結反応は、以下に示すように、Ｃ末端チオエステルを有するペプチドと、Ｎ末端システインを有する他のペプチドとの間の反応である。
【０１３８】
【化２３】
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【０１３９】
天然の化学連結反応は、内部システイン残渣、またはもし非標準のアミノ酸が使われるならば、他のチオ含有残渣を含むペプチドまたはペプチド模倣体を生成するトレースレス反応を仲介する目的で利用されてよい。
【０１４０】
Ｎ末端システインは、標準的なアミノ酸合成法によって組み込まれて良い。末端チオエステルは、本技術分野で公知の複数の方法で生成されて良く、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などの試薬を使用するチオールとの活性エステルの縮合、または「セフティーキャッチ」型支持レジンの使用を介したペプチド合成中での導入を包含する。
【０１４１】
他の選択的反応性モイエティー
任意の適切なバイオオーソゴナル反応ケミストリーは、複雑な生体環境において高度な選択方法で反応を効率的に仲介するかぎりにおいて、テンプレート化アセンブリ反応体の合成に利用して良い。最近開発された非限定例として、適切と思われる代替可能なバイオオーソゴナルケミストリーは、テトラジンと多様なノルボルネン、トランス−シクロオクテンなどのアルキン間の反応であり、水溶液中でバイオオーソゴナル反応を効率的に仲介する。
【０１４２】
ケミカルリンカーまたはアクセサリグループは随意に、上記構造に置換基として付加して良く、核酸認識モイエティーまたはエフェクター部分モイエティーに対する、または当該反応体に追加の官能性を導入するための、付加点を提供する。
【０１４３】
エフェクター部分モイエティーの設計及び合成
核酸テンプレート化アセンブリ反応体はさらに、少なくとも１つのエフェクター部分モイエティーを含有する。当該エフェクター部分モイエティーは、活性エフェクター構造の一部分であり、相応するテンプレート化アセンブリ反応体のセットが、テンプレート化反応に参加する際に、当該テンプレート化アセンブリ連結反応生成物に必要な活性エフェクター構造を産生するために、それらエフェクター部分モイエティーが組み合わされる。したがって、当該エフェクター部分モイエティーは、当該活性エフェクター構造の化学構造に寄与する。当該エフェクター部分モイエティーは、当該テンプレート化アセンブリ反応体の明確な一部分であり得て、または当該核酸認識モイエティーの一部または全部及び／または選択的反応性モイエティーの一部または全部を含有して良い。用語「活性エフェクター構造」及び「エフェクター構造」は、本明細書では互換的に使用され及び要求される効力のトリガーであるテンプレート化アセンブリ生成物の活性部分を指す。
【０１４４】
当該エフェクター部分モイエティーは、標的化される活性または当該活性エフェクター構造に関連するあるレベルの活性を所有しない。いくつかの例において、当該エフェクター部分構造は、当該活性エフェクター構造と比較して実質的に不活性である。いくつか実施形態において、個別のエフェクター部分モイエティーは、個別の活性を持ち得るが、エフェクター部分モイエティー同士の結合は、個別では有しない活性を創出する。例えば、２つの異なる抗体（エフェクター部分構造に各々結合する）を結合する二価のエフェクター構造は、当該核酸テンプレート化アセンブリ診断評価アッセイに関連して実施例１に記載の、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出に対して適切なエフェクターを作る。
【０１４５】
いくつか実施形態において、単一のエフェクター部分モイエティーは、当該テンプレート化アセンブリ反応体の一部として存在して良い。しかしながら、単一のエフェクター部分モイエティーだけでは、活性エフェクター構造を産生しない。エフェクター部分モイエティーは、当該核酸認識モイエティーと当該選択的反応性モイエティーの間に位置するか、または当該選択的反応性モイエティーに付加され、そのために当該選択的反応性モイエティーが、当該エフェクター部分モイエティーと当該核酸認識モイエティーとの間になる、またはその両方である。
【０１４６】
いくつか実施形態において、１つ以上のエフェクター部分モイエティーが、単一のテンプレート化アセンブリ反応体の一部分として存在して良い。当該核酸テンプレート化アセンブリ反応体のアセンブリは、１つのエフェクター部分モイエティーが別のエフェクター部分モイエティーに結合することを許容し、当該活性エフェクター構造の産生をもたらす。１つ以上のエフェクター部分モイエティーは、当該選択的反応性モイエティーに付加されてよく、そのために当該選択的反応性モイエティーは、当該エフェクター部分モイエティーと当該核酸認識モイエティーとの間になる。１つの実施形態において、当該エフェクター部分モイエティーは、当該選択的反応性モイエティーに結合できるケミカルリンカーを含有する。
【０１４７】
いくつか実施形態において、複数のテンプレート化アセンブリ反応体は、当該活性エフェクター構造を産生するために存在して良い。１つ以上の核酸テンプレート化アセンブリ反応体は、図９及び図１Ｂに示すように、互いに近接してアセンブリされ、及び位置付けられる。隣接するテンプレート化アセンブリ反応体上の当該選択的反応性モイエティーは、バイオオーソゴナル反応などの化学反応を介して結合し、及び当該エフェクター部分モイエティーは、当該活性エフェクター構造の産生を許容するように位置付けられる。
【０１４８】
核酸テンプレート化アセンブリ反応体の効率及び反応体をサンプルの標的コンパートメントに送達する効率の両方が、一般的にはその反応体のサイズの増加に伴って減少する。いくつか実施形態において、１つまたは複数のエフェクター部分モイエティーは、活性エフェクター構造を産生している間は、サイズが最小であるように選ばれる。１つの実施形態において、エフェクター部分モイエティーの当該分子サイズは、約２０ｋＤａ未満である。他の実施形態において、エフェクター部分モイエティーの当該分子サイズは、約１０ｋＤａ未満である。
【０１４９】
当該エフェクター部分モイエティーは、産生された当該エフェクター構造が、その反応が起こった後で当該テンプレート化アセンブリ連結反応生成物から切断されるために、テンプレート化アセンブリ反応体上の他のモイエティーと共役することができる。切断は、結合の加水分解で、または酵素または細胞内の他の分子による触媒化で起こり得る。切断した結合の非限定的な例として、エステル、チオエステル、イミン、ヒドラゾン、細胞プロテアーゼの切断モチーフ、または細胞酵素の基質を包含する。
【０１５０】
トレースレス・バイオオーソゴナル反応基が、当該エフェクター構造に自然なアミド結合を形成する実施形態において、当該エフェクター部分モイエティーには、活性ペプチドの非活性部分、または非ペプチド薬の非活性部分またはアミド結合を介して相応する部分に再構築され得る内因性の生理活性化合物を含んでよい。
【０１５１】
非トレースレス・バイオオーソゴナル反応基が、ホスフィンオキシド、トリアゾール、または他のバイオオーソゴナルライゲーション残基を組み込む実施形態において、エフェクター部分モイエティーは、ペプチド模倣薬構造の非活性部分、または薬剤あるいは生物活性化合物の非活性部分を含んでよい。これらの実施形態においては、バイオオーソゴナル反応から連結された残基がエフェクター構造に統合され得る。
【０１５２】
エフェクター部分モイエティーの多様な性質のために、合成には多様な方法が要求される。１つの実施形態において、ペプチドが使用され、及びエフェクター部分モイエティーが、標準的なメリフィールド固相合成法を使用して合成される。他のエフェクター部分モイエティーの合成アプローチは、特定モイエティーの具体的な化学構造によって決定される。
【０１５３】
ケミカルリンカー
ケミカルリンカーは、当該テンプレート化アセンブリ反応体に組み込まれて良い。当該ケミカルリンカーは、どのモイエティーの間に含まれても良い。ケミカルリンカーは、追加の官能性を導入し、または合成を促進するために、２つまたはそれ以上のモイエティーを任意で結合して良い。当該ケミカルリンカーは、いずれかのモイエティー間での結合になり得る。いくつか実施形態において、当該ケミカルリンカーは、いずれかの当該核酸認識モイエティーと当該選択的反応性モイエティー間に、及び当該選択的反応性モイエティーと当該エフェクター部分モイエティー間に存在し得る。１つの実施形態において、当該エフェクター部分モイエティーは、当該活性エフェクター構造を産生するために、当該選択的反応性モイエティーと相互作用できるケミカルリンカーを含有する。当該結合は、化学結合（直接的な結合または中間体構造を介した結合のいずれか）などの物理的相互作用、または静電気引力、水素結合、及びファンデルワールス／分散力などの非物理的相互作用または吸引力を包含できる。
【０１５４】
当該ケミカルリンカーは、当該モイエティーの空間的な分離の促進を助け、互いに他に対して当該モイエティーの柔軟性を高め、当該テンプレート化アセンブリ反応体に切断部分または修飾部分を導入し、当該テンプレート化アセンブリ反応体の合成を促進し、テンプレート化アセンブリ反応体の物理的または官能的性質（溶解性、疎水性、電荷、細胞透過性、毒性、生体内分布、または安定性など）を改善し、または上記のいずれの組み合わせをも助ける。１つの実施形態において、当該ケミカルリンカーは、生体共役ケミストリーを介した当該テンプレート化アセンブリ反応体モイエティーの接合を促進するクロスリンカーから誘導される。本明細書で使用する「生体共役ケミストリー」は、緩慢な条件下で普通の官能基を共に連結し、複数モイエティー化合物の分子構築を促進する化学合成戦略及び試薬を指す。緩慢な反応条件であるために、生体共役ケミストリーのアプローチは、核酸、ペプチド、または多糖類などの生体分子の連結に好適であり得る。非限定的ないくつかの例として、１つまたは複数の以下の結合鎖を包含できる。すなわち、アルキル基、アルケニル基、アミド類、エステル類、チオエステル類、ケトン類、エーテル類、チオエーテル類、ジスルフィド類、エチレングリコール、シクロアルキル基、ベンジル基、複素環基、マレイミジル基、ヒドラゾン類、ウレタン類、アゾール類、イミン類、ハロアルキル基、カルバミン酸塩類、またはそれらのいずれかの組み合わせ。
【０１５５】
モイエティー間のケミカルリンカーに加えて、追加の官能性を任意で、それらモイエティーへのアクセサリグループの追加によって、テンプレート化アセンブリ反応体に導入して良い。アクセサリグループの非限定的ないくつかの例として、テンプレート化アセンブリ反応体または連結反応生成物の場所を追跡するためのケミカルタグまたは発光体の付加を、または細胞透過性ペプチド、または安定化ポリエチレングリコール基などのテンプレート化アセンブリ反応体の標的コンパートメントへの送達を改善する物質の付加を包含できる。適切なモイエティー上におけるアクセサリー基の付加点の非限定的な実施例を本明細書に記載する。１つの実施形態において、当該核酸認識モイエティー、当該選択的反応性モイエティー、及び当該エフェクター部分モイエティーのいずれか１つ以上を、ケミカルリンカーによって官能化できる。
【０１５６】
テンプレート化アセンブリ反応体の当該核酸認識モイエティーは、当該核酸認識モイエティー、または当該核酸認識モイエティーの内部のいずれかの末端で、ケミカルリンカー、エフェクター部分モイエティー、またはバイオオーソゴナル反応性モイエティーに付加されて良い。１つの実施形態において、当該付加点は、核酸認識モイエティーオリゴマーの1末端であり得て、相補的形成の立体障害を回避するために、直接的にまたはケミカルリンカーを介して当該オリゴマーの末端単位に付加され得る。他の実施形態において、当該付加点は、当該オリゴマーのバックボーンや塩基部分などの相補的形成に干渉しない、当該核酸認識モイエティーの内部点であり得る。例えば、グアニン塩基のＮ−７位は、塩基対に参加しないので付加点としての役割を担う。上記付加点は、当該テンプレート化アセンブリ反応体に官能性を付与するためのアクセサリグループの付加に対して適切な位置であろう。
【０１５７】
標的テンプレート化アセンブリ反応体の合成
当該テンプレート化アセンブリ組成物の合成法には、標的核酸配列を結合できる少なくとも１つの核酸認識モイエティーの生成、当該核酸認識モイエティーを結合できる少なくとも１つの選択的反応性モイエティーの生成、及びエフェクター部分モイエティーの生成を包含する。それらモイエティーは、完全なテンプレート化アセンブリ反応体を産生するために、生体共役ケミストリーなどの当技術分野で公知の方法を使用して共に結合される。異なるテンプレート化アセンブリ反応体のモイエティーは、異なる構成で結合または付加されて良く、当該テンプレート化アセンブリ反応体が、適切な活性を保持するように提供されて良い。１つの実施形態において、相応する反応体における当該核酸認識モイエティーへの他のモイエティーの付加点は、当該選択的反応性モイエティーが、当該相応する反応体の標的核酸との相補的生成において、近接近空間に持ち込まれるように設計され得る。例えば、２つの相応する核酸認識モイエティーが、標的核酸と相補的形成をした場合、１つの核酸認識モイエティーの末端単位は、他の核酸認識モイエティーの末端単位と近接近になるであろう。それらの末端単位は、図９に描写されるように、この実施形態における追加のモイエティーに対する付加点としての役割を果たす。
【０１５８】
当該テンプレート化アセンブリ反応体を合成するために、当該モイエティーを結合させる３つの一般的なアプローチが採用されて良い。１）官能性モイエティーを、合成時に、１つのモイエティーの他のモイエティーへの直接組み込みによって結合させる。例えば、アルキン官能化ヌクレオチドは、固相ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチド合成中に、核酸認識モイエティーに組み込んでよい。アジド及びアルキン官能化アミノ酸はまた、市販されており、固相メリフィールドペプチド合成中にエフェクター部分構造ペプチドに組み込まれて良く、または同様のケミストリーを使用した核酸認識モイエティーにおけるペプチド核酸に組み込まれてよい。２）１つの事前に合成したモイエティーに含まれる官能基は、原位置で追加モイエティーを創出するために、化学的に変換されてよい。例えば、核酸認識モイエティーまたはエフェクター部分モイエティーに含まれる第一級アミンは、ジアゾ転移によってアジドに変換されて良い。３）個別の事前合成モイエティーは、当該モイエティー上に適切な官能基を共有結合させるために、生体共役ケミストリーの技術を使用して結合されてよい。それら官能基は、モイエティー上に自然に存在して良く、またはモイエティーの合成中に、誘導基の組み込みによって導入されて良い。
【０１５９】
相応するテンプレート化アセンブリ反応体のエフェクター生成物の診断評価を選択的に生み出すための、核酸テンプレート化アセンブリ反応体の使用
相応するテンプレート化アセンブリ反応体のセットおよびその対象部位の診断テスト評価が採用される。この評価は、テンプレート化アセンブリ反応体の特定のセットが、目的の対象部位に対してエフェクター構造を産生する能力があるかどうかを決定する役割を担うであろう。もし当該テンプレート化アセンブリ反応体がこれまで利用されていない、または現行のサンプルが従来のサンプルと大幅に異なるなど、当該サンプルが、従来のサンプルより低いレベルの標的核酸を含有している場合には、この方法が有用であろう。当該診断テスト評価はまた、サンプル中の標的核酸の有無、またはサンプル中の標的核酸の存在量を検出できる。当該診断テスト評価は、核酸標的が、テンプレート化アセンブリ反応に接続可能かどうかを決定し、サンプル中の核酸標的のおおよその二次構造に対応した情報を与える。１つの実施形態において、当該核酸認識モイエティー、選択的反応性モイエティー、及び当該エフェクター部分モイエティーの、当該活性エフェクター構造を産生する処理能力を決定できる。
【０１６０】
当該診断評価アッセイには、当該相応するテンプレート化アセンブリ反応体の、1つまたは複数サンプルへの接触を包含できる。図１０を参照のこと。もし当該エフェクター構造により産生された活性が、インビトロで簡易に読み出し可能であれば、テンプレート化アセンブリ反応体は、インビトロでサンプルに投与して良く、及び当該エフェクター構造により産生された活性をモニターされて良い。もしエフェクター構造の活性のインビトロ検出が不可能、簡便でない、またはコスト高であれば、サンドイッチ酵素結合免疫吸着法に類似した代替の読み出しが実行されて良い。
【０１６１】
インビトロのサンドイッチ診断評価アッセイを行うために、以下のステップを実施できる。インビトロアッセイのために、1つまたは複数のサンプルを対象から得る。任意で、標的コンパートメントサンプル（腫瘍生検など）及びネガティブ対照としての非標的コンパートメント（健康組織のサンプルなど）を得る。サンプルを、核酸放出のために適切な緩衝液に溶解し、当該アッセイの使いやすさを改善しまたはその感度を高める。テンプレート化アセンブリ反応体を、当該サンプルまたは溶解液に投与する。標的核酸が存在する場合は、テンプレート化アセンブリ連結反応生成物が形成される。連結反応生成物を、固定された捕獲分子によって結合する。この分子を、マイクロプレートウェルなどの容器、またはアッセイ媒体と混合したアガロースビードまたは磁性体ビードなどで基板上に固定する。サンプル物質または非連結反応体を除去し及び固定された複合物を洗浄する。当該テンプレート化アセンブリ連結反応生成物の接合部分を特定する検出分子を、当該固定複合物と共に培養し、及び適切な検出の読み出しを行う。１つの実施形態において、当該検出分子、捕獲分子、またはその両方の特異性から、当該テンプレート化アセンブリ反応が起こる前には、いかなるテンプレート化アセンブリ反応体上においても存在しない、当該テンプレート化アセンブリ連結反応生成物上での構造を選択的に検出し、したがって、当該テンプレート化アセンブリ連結反応生成物の捕獲及び／または検出が可能になる。例えば、図１０に示すように、当該捕獲分子の特異性が、出発物質であるテンプレート化アセンブリ反応体には存在しないエフェクター生成物構造を選択的に検出し、テンプレート化連結反応生成物のみを捕獲し及び検出できることを保証する。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、当該検出分子の特異性は、１つのテンプレート化アセンブリ反応体上の１構造を選択的に検出でき、及び当該捕獲分子の特異性は、異なるテンプレート化アセンブリ反応体上の１構造を選択的に検出できることであり、テンプレート化アセンブリ連結反応生成物が両構造を含有しているとしても検出できる。図２Ｃに描写されるような、単一化合物上に含まれるテンプレート化アセンブリ反応体のセットは、この実施形態と互換性がないであろう。
【０１６３】
投与
相応するテンプレート化アセンブリ反応体のセットの投与は、そのサンプルの性質によって変えて良い。１つの実施形態は、適切な容器またはチャンバー内での、標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体のサンプルへの投入を包含できる。他の実施形態において、当該サンプルは、すでに標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体を含んでいる容器に投入できる。さらに他の実施形態において、当該標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体を、インビボまたは原位置でアセンブリできる。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、当該標的テンプレート化アセンブリ反応体を、インビボのテンプレート化アセンブリに投与できる。当該標的テンプレート化アセンブリ反応体のサンプルへの投与を容易にするために、調合したテンプレート化アセンブリ反応体を、任意の適切な緩衝液または処方物中に、任意の適切な送達剤を組み込んで、及びサンプルと接触させ、投与して良い。標的テンプレートが無くても、高濃度では物質生成反応が起こるので、濃縮形態のテンプレート化アセンブリ反応体は、その反応性の相手から分離して扱って良い。表１は、多様な選択的反応性モイエティーから成る裸の（送達剤を含まない）テンプレート化アセンブリ反応体の許容最大濃度に対応したガイドラインの詳細である。仮に、テンプレート化アセンブリ反応体が、これら閾値以上の濃度で接触するならば、望ましくない非テンプレート化のバックグランド反応が、予想される。
【０１６５】
【表１】
0006710157.tif 000025
【０１６６】
他のテンプレート化アセンブリ反応体の閾値濃度は、ここに開示の当該テンプレート化アセンブリ診断評価アッセイを利用して経験的に決定されるであろう。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、非テンプレート化反応の可能性は、１つの反応体を最初に投入し、次いで少し時間をおいて当該相応するテンプレート化アセンブリ反応体を投入するというような、相応するテンプレート化アセンブリ反応体のセットの投入によって軽減されるであろう。この遅延時間は、この系における当該テンプレート化アセンブリ反応体の持続性に応じて、１分から数日の範囲で調整して良い。
【０１６８】
カチオン性脂質、ポリエチレンイミン、デキストラン塩基化形質転換体、または当技術分野で公知の他物質などの形質転換試薬などの特定の送達剤は、当該テンプレート化アセンブリ反応体の濃縮を引き起こすであろう。これら環境下では、テンプレート化アセンブリ反応体は、当該相応する活性テンプレート化アセンブリ反応体から分離されて調合され、別々にサンプルに投入される。テンプレート化アセンブリ反応体を、いずれの追加送達剤の添加も無い適切な緩衝剤中に溶解して、裸のまま投与して良い。
【０１６９】
当該テンプレート化アセンブリ反応体は、適切な送達剤と処方した後に投与して良い。適切な送達剤は、当該テンプレート化アセンブリ反応体の安定性、生体利用効率、生体内分布、細胞透過性、または望ましい薬理的特性、またはそれら特性の組み合わせを高める。当技術分野で公知の送達剤として、非限定的に、ポリカチオン形質転換試薬、ポリエチレンイミンおよびその誘導体、ＤＥＡＥ−デキストラン、他の形質転換試薬、塩、イオン、緩衝液、可溶化剤、様々なウイルスベクター、リポソーム、標的リポソーム、ナノ粒子、キャリアー高分子、エンドソームかく乱物質、透過剤、脂質、ステロイド、界面活性剤、分散剤、安定化剤、またはそれらの任意の組み合わせを包含する。
【０１７０】
テンプレート化アセンブリ反応体の標的コンパートメントへの送達はまた、アクセサリグループのテンプレート化アセンブリ反応体への共有結合によって高められて良い。送達を高めるアクセサリグループとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの化合物の安定性及び生体内分布を高めるとして公知の化合物、及び非限定的に、当技術分野で公知のコレステロール誘導体、当技術分野で公知のエンドソーム中断薬、及びポリアルギニンまたはポリリジンなどのポリカチオン、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質由来のペプチド、トランスポータン、及びアンテナペディアタンパク質（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）由来のペプチドなどの細胞透過性ペプチドを含むテンプレート化アセンブリ反応体の細胞透過性を高める化合物を包含して良い。
【０１７１】
エフェクター生成物をトリガーする物質の投与には、抗体または他のエフェクター生成物検出分子、またはエフェクター生成物検出細胞などを包含して良い。当該投与は、当該テンプレート化アセンブリの手順の一部になり得る。当該物質は、テンプレート化アセンブリ反応体の投与前、投与中、または投与後に、及び当該薬剤に適したいずれかの方法で投与されてよい。１つの実施形態において、当該エフェクター生成物トリガー物質は、薬剤結合を形成及びそれが可能になるや否やエフェクター構造によって活性のトリガーを促進するために、当該テンプレート化アセンブリ反応体の投与前に投与される。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、相応する反応体の複数のセットを、平行して投与して良い。反応体のこれらセットは、単一の標的核酸上の複数の相補的形成部に、または異なる標的核酸に、またはそれらの組み合わせに結合される。反応体の当該異なるセットは、同じエフェクター構造を産生し、したがって、その産生を促進することでそのようなエフェクター構造により生み出される活性レベルを高め、または反応体の当該異なるセットは、異なるエフェクター構造を産生し、したがって、同じサンプルに多価活性を産生し、またはその組み合わせを産生する。相応する反応体の複数のセットを、平行して投与する場合、同じバイオオーソゴナル反応基（または、異なるバイオオーソゴナルケミストリーが、反応体の異なるセットに採用される場合、互いに反応しない基）を有する相応する反応体の異なるセットを、高濃度であっても、互いには反応しないので、一緒に投与して良い。例えば、もし、アジド−アルキンバイオオーソゴナル反応系が、相応する反応体の各セットに採用された場合、当該サンプル中へ当該アジド体を十分に希釈後に、全ての当該アジド含有反応体が処方され及び一緒に投与されて良く、及び全ての当該アルキン含有反応体が処方され及び一緒に投与されて良い。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、投与される当該組成物は、２つまたはそれ以上の標的核酸配列を結合できる核酸認識モイエティーを含む、２つまたはそれ以上の相応するテンプレート化アセンブリ反応体のセットを含有できる。２つまたはそれ以上の標的核酸配列は、同じ遺伝子転写内で、あるいは個別の及び分離した転写内で見出して良い。同じ細胞転写内の異なる核酸標的配列を認識する、２つまたはそれ以上の相応するテンプレート化アセンブリ反応体のセットは、独立して、直接テンプレート化法において、同じエフェクター生成物の追加複製を形成するように反応する同じエフェクター部分構造を持ち込む。当該個別の核酸認識モイエティーは、当該選択的反応性モイエティーに結合する。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、投与される当該組成物は、２つまたはそれ以上の活性エフェクター構造を産生するために、互いに選択的反応性モイエティーに結合している２つまたはそれ以上のエフェクター部分モイエティーを含有できる。２つまたはそれ以上の活性エフェクター構造の産生は、免疫反応、プログラム化された細胞死、アポトーシス、壊死、溶解、増殖阻害、ウイルス感染の阻害、ウイルス複製の阻害、オンコ遺伝子発現の阻害、遺伝子発現の変更、微生物感染の阻害、及び微生物の複製の阻害、そしてこれらの生物学的活性の組み合わせなどを包含する、２つまたはそれ以上のエフェクター活性を生み出すことができる。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、投与される当該組成物は、２つまたはそれ以上の標的核酸配列を結合できる相補的形成モイエティーを含む２つまたはそれ以上の相応するテンプレート化アセンブリ反応体のセットを含有できる。２つまたはそれ以上の標的核酸配列は、同じ遺伝子転写内で、あるいは個別の及び分離した転写内で見出して良い。同一の細胞転写内で異なる核酸標的配列を認識する、２つまたはそれ以上の相応するテンプレート化アセンブリ反応体のセットは、独立して、直接テンプレート化法において、同じエフェクター生成物の追加複製を形成するように反応する、同じまたは異なるエフェクター部分構造を持ち込む。２つまたはそれ以上のエフェクター部分モイエティーの包含は、免疫反応、プログラム化された細胞死、アポトーシス、非固有またはプログラム化された壊死、溶解、増殖阻害、ウイルス感染の阻害、ウイルス複製の阻害、オンコ遺伝子発現の阻害、遺伝子発現の変更、微生物感染の阻害、及び微生物複製の阻害、そしてそれら生物学的活動の組み合わせなどを含む２つまたはそれ以上のエフェクター活性を生成するために、２つまたはそれ以上の活性エフェクター構造を産生できる。
【０１７６】
標的核酸配列の存在量は、テンプレート化アセンブリにより産生される活性エフェクター構造の量を制限する。１つの実施形態において、標的コンパートメント当たり、少なくとも標的核酸の５複製が平均値である。投入される組成物の投与量及び濃度は、当該標的核酸の利用可能性を考慮して決めることができる。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、組成物を病原性細胞に送達する方法を開示する。当該方法は、相応するテンプレート化アセンブリ反応体組成物のセットまたは複数セットの治療に効果的な量を病原性細胞に投与すること、当該テンプレート化アセンブリ反応体組成物を当該標的核酸配列に結合すること、及び活性エフェクター生成物を産生することを包含できる。当該組成物は、当該標的病原性細胞内の標的核酸配列を結合する少なくとも１つの核酸認識モイエティー、当該核酸認識モイエティーに結合された少なくとも１つの選択的反応性モイエティー、及び少なくとも１つのエフェクター部分モイエティーを包含できる。１つの実施形態において、当該方法はまた、当該標的テンプレート化アセンブリ反応体組成物の投与前に、当該標的核酸配列の有無を検出することを包含できる。
【０１７８】
医薬組成物は、経口、局所、全身（例えば、経皮、経鼻、または坐剤により）、または非経口的（例えば、筋肉内、皮下、または静脈内注射）経路の１つにより投与されて良い。組成物は、錠剤、丸薬、カプセル、半固体、粉末、徐放性製剤、溶液、懸濁液、エリキシル剤、エアロゾル、またはその他の適切な組成物の形態をとって良く、及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた少なくとも１つの化合物から成って良い。適切な賦形剤は、当業者には良く知られており、及びそれらは、そしてその組成物を処方する方法は、次のレミントンのような標準的な参照に見出せるであろう。Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ。適切な液体担体は、特に注射剤に対しては、水、生理食塩水溶液、ブドウ糖水溶液、及びグリコールを包含する。
【０１７９】
注射に適した医薬組成物には、無菌水溶液（水溶性）または分散液及び無菌の注射液または分散液の即時調整に対応した無菌粉末を含めて良い。全ての場合において、当該組成物は、滅菌され、容易に注射針を通過する範囲の流体であらねばばらない。製造及び貯蔵条件に適しており及びバクテリア及びカビなどの微生物の汚染活動に対して保護されねばならない。当該担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び植物油を含む溶液または分散溶媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要な粒子径の維持管理によって及び界面活性剤の使用によって維持される。微生物作用の防止は、多様な抗菌及び抗カビ剤によって達成できる。多くの場合、当該組成物中に、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなど多価アルコール、塩化ナトリウムの等張剤を含めることができる。当該注射用組成物の長期吸収は、おおまかには、アルミニウムモノステアレート及びゼラチンなどの遅延剤を当該組成物に含有させることによってもたらすことができる。
【０１８０】
無菌の注射剤は、必要に応じて、上記列挙した成分を含む適切な溶液中に、当該テンプレート化アセンブリ反応体の必要量を含有する組成物を組み合わせることによって調合できる。一般的に、塩基性の分散溶媒及び前述で列記したものの中から必要な他の成分を含有する無菌の搬送体に、当該組成物を組み合わせることによって、分散液が調合される。
【０１８１】
前述のように、当該テンプレート化アセンブリ反応体を含有する組成物が、適切に保護されている場合、当該組成物は、例えば、不活性希釈剤または吸収性食用キャリアーと共に、経口投与に対して処方が可能である。当該組成物及び他の成分は、ハードまたはソフトシェルのゼラチンカプセルに、錠剤に圧縮封入して、または対象の治療食に直接組みこんで包むことができる。治療的な経口投与に対して、当該組成物を、賦形剤と組み合わせて及び、摂取錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェーハなどの形態で使用することができる。当該組成物の量及び製剤は、もちろん、変動可能である。そのような治療に有用な組成物中のテンプレート化アセンブリ反応体の量は、適切な投与量が得られるように決められる。
【０１８２】
投与の容易性及び投与量の均一性のために、投薬単位形態に組成物を処方することは好都合である。本明細書で使用する投薬単位形態は、治療対象に対する単一投与量として適した、物理的に独立した単位を指す。各投与量には、必要な医薬担体を併用して、活性エフェクター生成物の量を産生するように計算された当該テンプレート化アセンブリ反応体を、事前に決定した量で含有する。当該新規の投与単位形態の仕様は、当該標的テンプレート化アセンブリ組成物に固有の特徴、及び達成される具体的な治療効果に依存する。投与量は、通常用量及び当該成分の投与方法を参照して決定される。
【０１８３】
用語「薬学的に許容される」を本明細書で使用する場合、生物学的でない場合には許容されない物質を指す。例えば、用語「薬学的に許容される担体」は、組成物に組み込まれ得て及び許容されない生物学的作用を起こさずに、または当該組成物の他の成分と許容されない方法で相互作用すること無しに患者に投与できる物質を指す。そのような薬学的に許容される物質は通常、毒性及び製造試験に要求される標準に適合しており、及び米国食品医薬品局によって適切な不活性成分として特定されている物質を包含する。
【０１８４】
用語「薬学的に許容される塩」とは、哺乳類などの患者への投与が許容される塩基または酸から調合される塩を意味する（例えば、目的の投与形態に対して、許容できる哺乳類の安全性を有する塩）。しかしながら、本明細書に含まれる塩で、患者への投与を意図していない当該テンプレート化アセンブリ反応体の塩などは、薬学的に許容される塩である必要が無いことは、理解されよう。薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機または有機塩基及び薬学的に許容される無機または有機酸から誘導できる。さらに、テンプレート化アセンブリ反応体が、アミンのような塩基性モイエティー、及びカルボン酸のような酸性モイエティーの両方を含有する場合、両性イオンが形成され及び本明細書に使用する用語「塩」として包含される。薬学的に許容される無機の塩基から誘導される塩には、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン、亜マンガン、カリウム、ナトリウム、及び亜鉛塩などを包含できる。薬学的に許容される有機の塩基から誘導される塩には、置換アミン、環状アミン類、自然発生するアミンなど、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン及びそれに類するものを含む第一級、第二級及び第三級アミンの塩を包含できる。薬学的に許容される無機酸から誘導される塩には、ホウ酸、炭酸、ハロゲン化水素酸（臭化水素、塩酸、フッ化水素、ヨウ化水素）、硝酸、リン酸、スルファミン酸及び硫酸の塩を包含できる。薬学的に許容される有機酸から誘導される塩には、脂肪族ヒドロキシ酸（例えば、クエン酸、グルコン酸、グリコール酸、乳酸、ラクトビオン酸、リンゴ酸、及び酒石酸）、脂肪族モノカルボン酸（例えば、酢酸、酪酸、ギ酸、プロピオン酸及びトリフルオロ酢酸酸）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、芳香族カルボン酸（例えば、安息香酸、ｐ−クロロ安息香酸、ジフェニル酢酸、ゲンチシン酸、馬尿酸、及びトリフェニル酢酸）、芳香族ヒドロキシ酸（例えば、ｏ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、１−ヒドロキシナフタレン−２−カルボン酸及び３−ヒドロキシナフタレン−２−カルボン酸）、アスコルビン酸、ジカルボン酸（例えば、フマル酸、マレイン酸、シュウ酸及びコハク酸）、グルクロン酸、マンデル酸、粘液酸、ニコチン酸、オロチン酸、パモン酸、パントテン酸、スルホン酸（例えば、ベンゼンスルホン酸、カンファースルホン酸、エジシル酸、エタンスルホン酸、イセチオン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２，６−ジスルホン酸及びｐ−トルエンスルホン酸）、キシナホ酸、及びそれらに類する塩を包含できる。
【０１８５】
上記実施形態に基づく開示のさらなる特徴及び利点は、当業者には評価されるであろう。したがって、本開示は、具体的に示され及び記述される内容に限定されず、以下に明記する実施例により限定されない。本明細書で引用される全ての出版物及び参照は、その全体を援用によって本明細書に明確に組み入れる。本明細書及び添付の請求項で使用する単数形用語「ひとつの（ａ）」、「ひとつの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、その文脈が明確に指示しない限り、複数の参照を包含する。本開示に使用する用語は、当業者によって一般的に認められた標準的な定義に従う。さらなる説明が必要な場合について、いくつかの用語を以下に説明する。
【０１８６】
用語「活性エフェクター構造」及び「エフェクター構造」は、本明細書において互換的に使用し及び必要とされる効力のトリガーとなるテンプレート化アセンブリ生成物の活性部分を指す。
【０１８７】
本明細書で使用する用語「塩基」は、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合相互作用を介して、他の相応する塩基と結合対を形成するプリンまたはピリミジン基を含有する分子、または人工的な類似体を指す。塩基はさらに、オリゴマーのようなポリマーに複数の塩基を一緒に共有結合させる基を包含する。非限定例として、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチド核酸残基、またはモルホリノ残基を包含する。
【０１８８】
本明細書で使用する用語「結合（ｂｉｎｄ）」「結合する（ｂｉｎｄｓ）」「結合している（ｂｉｎｄｉｎｇ）」及び「結合した（ｂｏｕｎｄ）」は、互いに接近している２つの分子間の安定な相互作用を指す。当該用語は、化学結合（直接的な結合または中間体構造を介した結合のいずれか）などの物理的相互作用、及び静電気引力、水素結合、及びファンデルワールス／分散力などの非物理的相互作用および引力を包含する。
【０１８９】
本明細書で使用する用語「生体共役ケミストリー」は、緩慢な条件下で普通の官能基を共に連結し、複数モイエティー化合物のモジュール構造を促す、化学合成の戦略及び試薬を指す。
【０１９０】
本明細書で使用する用語「ケミカルリンカー」は、異なる化合物上で、１つのテンプレート化アセンブリ反応体と他のテンプレート化アセンブリ反応体と結合させまたは１つのモイエティーを他のモイエティーと結合させる分子をさす。リンカーは、直鎖のまたは分岐鎖の共有結合分子鎖から成って良い。
【０１９１】
本明細書で使用する用語「非トレースレス・バイオオーソゴナルケミストリー」は、当該選択的反応性モイエティーの構造の一部または全部が当該生成物構造に保持されるように、選択的反応性モイエティーを巻き込む反応を指す。
【０１９２】
本明細書で使用する用語「エフェクター部分モイエティー」は、核酸テンプレート化アセンブリによって形成される生成物において、当該エフェクター構造の化学構造に寄与するテンプレート化アセンブリ反応体の一部分を指す。エフェクター部分モイエティーは、当該反応体の異なる部分であって良く、または当該核酸認識モイエティー及び／または当該選択的反応性モイエティーの一部または全部を含んで良くまたはそれらから成って良い。
【０１９３】
本明細書で使用する用語「エフェクター構造トリガー物質」は、エフェクター構造に結合することにより要求される活性を始動できる体外で産生された化合物または細胞を指す。
【０１９４】
本明細書で使用する表現「核酸認識モイエティー」は、標的核酸への配列特異の結合を促す化合物を指す。
【０１９５】
本明細書で使用する表現「核酸テンプレート化アセンブリ」は、標的核酸上の生成物の構造または複数構造の合成を指し、当該標的核酸に結合された近接でアセンブリされているテンプレート化アセンブリ反応体により産生形成が促進され得る。
【０１９６】
本明細書で使用する用語「オリゴマー」は、複数単位から成る分子を指し、ここで当該単位のいくつかまたは全てが、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ相互作用を形成することができる塩基であり、二重または多重構造の核酸への配列特異の結合を許容する。非限定例として、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸のオリゴマー、及びモルホリノオリゴマーを包含する。
【０１９７】
本明細書で使用する用語「病原性細胞」は、ウイルス感染の細胞、腫瘍細胞、及び微生物感染の細胞、または非限定的に、アレルギー、アナフィラキシー、炎症及び自己免疫を含む疾患を誘発しまたは媒介する分子を産生する細胞などの、病気または異常症状を引き起こしまたは促進することができる細胞を指す。
【０１９８】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される」は、生物学的でない場合は許容されない物質で、化合物に組み込むことができ、及び当該組成物の他成分を伴う許容されない方法での、許容されない生理学的作用または相互作用を起こすことが無く、患者に投与できる物質を指す。
【０１９９】
用語「薬学的に許容される塩」は、哺乳類などの患者への投与が許容される塩基または酸から調合される塩を意味する（例えば、目的の投与量の形態に対して許容される哺乳類への安全性を有する塩）。
【０２００】
本明細書で使用する用語「塩」は、薬学的に許容される無機酸及び無機塩基から誘導される塩であり、薬学的に許容される有機酸及び有機塩基から誘導される塩であり、それらの誘導体であり、そしてそれらの変異体である。
【０２０１】
本明細書で使用する用語「サンプル」は、テンプレート化アセンブリ反応体が投与される任意の系を指し、そこで核酸テンプレート化アセンブリが起こる。非限定例として、生体細胞、固定または保持された細胞、全生物、組織、腫瘍、溶解液、またはインビトロアッセイの系を包含する。
【０２０２】
用語「選択的反応性モイエティー」は、隣接するテンプレート化アセンブリ上で、相応するテンプレート化アセンブリ反応体による化学反応を介して、生成物の形成が可能なテンプレート化アセンブリ反応体の一部を指す。例えば、選択的反応性モイエティーは、相応する選択的反応性モイエティーと容易に反応することができるが、天然の生体分子とは容易に反応しない。
【０２０３】
本明細書における表現「相応する反応体のセット」または「相応するテンプレート化アセンブリ反応体」は、テンプレート化アセンブリ反応においてその一部である単一の標的テンプレート上に共存するテンプレート化アセンブリ反応体を指す。
【０２０４】
本明細書で使用する用語「スーパー抗原」は、Ｔ細胞の広範囲なサブセットに結合し、特異な可変領域（Ｖ）を発現する抗原である。
【０２０５】
本明細書で使用する表現「トレースレス・バイオオーソゴナルケミストリー」は、自然発生の結合に選択的反応性モイエティーを引き込む反応であり、例えばアミドは、当該生成物構造から当該選択的反応性モイエティーの一部または全部を除去することにより形成される。
【０２０６】
本明細書で使用する用語「標的コンパートメント」は、細胞、ウイルス、組織、腫瘍、ライセート、他の生物学的構造、空間領域、または標的核酸を含むサンプル、または非標的コンパートメントと比較して異なる量の標的核酸を含むサンプルを指す。
【０２０７】
表現「標的核酸配列」及び「標的核酸」は互換的に使用し、核酸テンプレート化アセンブリにおいてテンプレートとして作用することを意図した単位または核酸の配列を指す。
【０２０８】
本明細書で使用する用語「テンプレート化アセンブリ連結反応生成物」は、１つまたは複数の核酸テンプレート化アセンブリ反応体の相互作用、結合または反応によって形成される、当該生成物の構造または複数構造を指す。
【０２０９】
本明細書で使用する用語「テンプレート化アセンブリ反応体」は、配列特異な方法で標的核酸テンプレートに結合し及び核酸テンプレート化アセンブリ中の生成物形成に参加する当該核酸認識モイエティーを指す。
【０２１０】
さらに本明細書には、化学修飾及び同じ生物学的活性の保持または欠損、及び／またはテンプレート化アセンブリ反応体として作用する能力、またはテンプレート化アセンブリ反応体にふさわしい機能における塩、水和物、それらの溶媒和物、または他の分子などの「誘導体」または「類似体」を包含する。
【実施例】
【０２１１】
実施例１：核酸認識モイエティーの効力の評価
核酸認識モイエティー間の関係、Ｔm値、サンプル環境温度、及び反応効率を決定するために、様々な温度で、アジド−シクロオクチンに基づく相応する反応体のセットが、核酸テンプレート化連結反応に参画する能力を評価した。生成物をゲル電気泳動法及びＥＬＩＳＡ様式サンドイッチアッセイで評価した。当該標的核酸テンプレートは、腫瘍関連ウイルスの転写ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７からの配列を示していた。
【０２１２】
テンプレート化アセンブリ反応体の核酸認識モイエティーを、変成オリゴデオキシヌクレオチドから構成した。オリゴヌクレオチドの配列及び予測Ｔm値を表２に示す。
【０２１３】
【表２】
0006710157.tif 000026
【０２１４】
オリゴ−１．１は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８９３４８．１の４１５位から４７０位の配列を表し、Ｃａｓｋｉ細胞株から単離されたヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）に対応した参照配列である。ＨＰＶは、ヒトの子宮頸がんにほぼ１００％見出される。当該配列のこの位置は、Ｅ６／Ｅ７からであり、ほとんど全てのＨＰＶ誘発子宮頸がんに発現する。オリゴ−１．２は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８９３４８．１の４４７位から４６１位の逆相補体の配列を表す。この配列は、オリゴ−１．１に対して相補的形成をする能力がある。この配列は、５′末端にカルボキシ蛍光色素（フルオレセイン）及び３′末端にアジドを含有する。
【０２１５】
オリゴ−１．３は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８９３４８．１の４３１−４４６位からの逆相補体の配列を表す。この配列は、オリゴ−１．２の相補的形成部に隣接するオリゴ−１．１に相補的形成をする能力がある。この配列は、５′末端に第一級アミン及び３′末端にビオチンを含有する。
【０２１６】
合成時に、オリゴ−１．２上に当該バイオオーソゴナルアジド基を組み込んだ。オリゴ−１．３を、ジベンジルシクロオクチン−スルホ−ＮＨＳエステル（ＤＢＣＯ−ＮＨＳ）で官能化し、クリックケミストリーツールから取得した。ＤＢＣＯ−ＮＨＳをＤＭＳＯに溶解し、１００ｍＭの量を産生した。等倍のＰＢＳ緩衝液（リン酸生理食塩緩衝液）（１３７ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．４）を使用して、１ｍＭのオリゴ−２溶液を調合した。ＤＢＣＯの２０倍モル量を、オリゴ−１．２の１００ｎモルと混合し、及び室温で４時間培養した。この反応物を、ｐＨ８．０で１Ｍのトリス−ＨＣｌで抑制して、最終的にトリス−ＨＣｌが１００ｍＭの濃度になるようにした。生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５カラムに通して精製し、及び酢酸ナトリウムを使用した標準的な方法でエタノール沈殿物を得た。
【０２１７】
４０ｐモルのオリゴ−１．１及び４０ｐモルのオリゴ−１．２を３９ｕＬの等倍ＰＢＳ中で最初に混合して、標準ＰＣＲ管中で、核酸テンプレート化連結反応生成物を調合した。この溶液を、１５分間実験温度を保持するようにプログラム化したサーマルサイクラー中で平衡化した後、オリゴ−１．３−ＤＢＣＯ共役物の４０ｐモルを添加した。反応を５分間培養した後、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で反応を抑制した。テンプレート化を省略した室温での反応を、ネガティブコントロールとして含めた。オリゴ−１．２及びオリゴ−１．３の高濃度での培養により生成した連結反応生成物を、ポジティブコントロールとして含めた。実験室での連結反物を、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃（オリゴＴm値以内）、４５℃（＞オリゴＴm値）で培養した。最終反応を抑制した直後に、各生成物及びコントロールの２０ｕＬを、１５％変性ＰＡＧＥゲル上で、２０Ｗで３時間走らせた。図１１に示すように、当該ゲルを、ＳＹＢＲゴールド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｅｓ）で染めた。
【０２１８】
さらに、サンプル（２０ｕＬ）の残りをＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイで評価し、ストレプトアジピンのプレート上で、当該連結反応生成物のビオチン化末端を捉え及び抗ＦＡＭペルオキシダーゼ抗体で当該生成物をＦＡＭ標識化した末端を検出した（これらグループの両方を所有している反応体ではなく、連結反応生成物が発生するシグナルのみ）。４５０ｎｍにけるＴＭＢベースの発色吸光度の検出を表３に提供した。
【０２１９】
【表３】
0006710157.tif 000027
【０２２０】
シクロオクチンに基づくテンプレート化アセンブリ反応体は、反応体のＴm計算値よりわずかに高い反応温度において、効率的なテンプレート依存の生成物形成を示す。サンドイッチ様式ＥＬＩＳＡの読み出し結果は、ゲル電気泳動の結果と良く相関している。
【０２２１】
実施例２：単一塩基変異体の識別及び標的存在量の識別
シクロオクチンのクリック及び非トレースレス・シュタウディンガー基を持つ相応する反応体の以下の能力について評価した。
オンコ遺伝子配列における単一塩基変異体の識別
標的存在量レベルの識別
複雑な生物学的物質（腫瘍細胞ライセート）を含有するインビトロシステムで、その性能を評価した。
【０２２２】
標的テンプレート：単一塩基変異実験及び存在量の識別のために、Ｈ−ｒａｓ腫瘍遺伝子配列に対して当該テンプレート化アセンブリ反応体を標的化し、特にＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２５８７６．１の１６７位に表されるＴ変異に対してＧを標的化した。配列を表４に示す。オリゴ−２．１以下に、１３７位から１８６位の当該配列の標的フラグメントを表し、太字でその変異位置を示した。オリゴ−２．２はこの標的フラグメントの野生型を表す。オリゴ−２．３は突然変異標的フラグメントの混合物型である。
【０２２３】
【表４】
0006710157.tif 000028
【０２２４】
反応バッファーに対応した複合ライセート：各評価反応に対応して、ＨｅＬａ細胞ライセートから成る対象物質に、適切なオリゴ標的を混ぜた。１ｘ１０6ＨｅＬａ細胞を、２５０ｕＬの溶解緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ−４０、１％のデオキシコール酸ナトリウム、０，１％のＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤、膵臓リボヌクレアーゼ阻害剤）に溶解し、混合し、及び堆積物をペレット化し、ＨｅＬａ細胞ライセートを調合した。ＨｅＬａ細胞は、実験的なＨ−ｒａｓ変異に対してはネガティブである一方、核酸テンプレート化アセンブリ反応体に対しては、複合した生化学的環境を与える。
【０２２５】
テンプレート化アセンブリ反応体の合成：表５に示すように、当該Ｈ−ｒａｓ反応体に対する核酸認識モイエティーのテンプレート化アセンブリは、オリゴデオキシヌクレオチドから構成される。
【０２２６】
【表５】
0006710157.tif 000029
【０２２７】
バイオオーソゴナル反応基の付加を促進するために、オリゴ−２．５にアミン基を組み込んだ。検出に対応して、当該エフェクター部分基としてのオリゴヌクレオチドにＤＩＧ（ジゴキシゲニン）及びビオチンを組み込んだ。
【０２２８】
オリゴ−２．４は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２５８７６．１上の１７３から１６３位に相補的形成部を有する。オリゴ−２．５は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２５８７６．１上の１６１から１５１位に相補的形成部を有する。オリゴ−２．４は、調査中のＨ−ｒａｓ変異の部分を含有する。これは、標的テンプレートオリゴ−２．１に対して完全な相補形であり及び標的テンプレートオリゴ−２．２との単一塩基の不一致を有する。
【０２２９】
バイオオーソゴナル反応基を、反応性５′アミノ基を使用してオリゴ−２．５と共役させた。ＤＢＣＯ  ＮＨＳを、実施例１に記載の方法でオリゴ−２．５と共役させた。非トレースレス・シュタウディンガーホスフィン基を、スルホ−ＮＨＳ−ホスフィン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造者の推奨するプロトコルに従い、オリゴ−２．５と共役させ、当該ホスフィン共役生成物を産生した。
【０２３０】
【化２４】
0006710157.tif 000030
【０２３１】
変異Ｈ−ｒａｓに特異的な２つの相応するテンプレート化アセンブリ反応体のセットを次のように産生した：アジド−シクロオクチンＨ−ｒａｓ、オリゴ−２．４及びオリゴ−２．５−ＤＢＣＯ共役体及びアジド−ホスフィンＨ−ｒａｓ、オリゴ−２．４及びオリゴ−２．５−ホスフィン共役体。
【０２３２】
不一致識別の評価：当該オリゴヌクレオチド標的のオリゴ−２．１（Ｈ−ｒａｓ変異体）、オリゴ−２．２（Ｈ−ｒａｓ野生型）、及びオリゴ−２．３（混合物のコントロール）の各々におけるテンプレート化能力に対して、各テンプレート化アセンブリ反応体のセットを評価した。各々の反応体オリゴヌクレオチドの４０ｐモル及びテンプレート化標的オリゴヌクレオチドの４０ｐモルを、ＨｅＬａ細胞の３９ｕＬに３７℃で添加し及び混合した。反応を３７℃で５分間培養し、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で抑制した。
【０２３３】
テンプレート化アセンブリ生成物形成の度合いをＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイで評価し、ストレプトアビジンプレート上で、当該連結反応生成物のビオチン標識末端を捕捉し及び当該生成物のＤＩＧ標識末端を、抗ＤＩＧペルオキシダーゼ抗体で検出した（これらグループの両方を所有している反応体ではなく、連結反応生成物が発生するシグナルのみ）。４５０ｎｍでのＴＭＢベースの発色吸光度検出で、結果を読み出した。各反応体の３回の平均値を表す、取集した吸収値を、表６に表す。
【０２３４】
【表６】
0006710157.tif 000031
【０２３５】
シクロオクチンに基づく及び非トレースレス・シュタウディンガー反応に基づく両テンプレート化アセンブリでは、複合反応環境における標的テンプテート上での単一塩基の不一致を認識できる。
【０２３６】
標的テンプテートの相対存在量の検出評価：複合反応混合物における完全一致の標的テンプレートの相対存在量の検出能力を、アジド−シクロオクチンＨ−ｒａｓテンプレート化アセンブリ反応体で評価した。オリゴ−２．４の４０ｐモル及び標的テンプレートオリゴ−２．１の変動量を、ＨｅＬａ細胞ライセートの３９ｕＬに３７℃で添加し及び２０分間培養した。次いでオリゴ−２．５−ＤＢＣＯ共役体の４０ｐモルを加え、及び反応を３７℃で５分間培養し、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で反応を抑制した。連結反応生成物の検出に、ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイを用いた。各反応体の３回の平均を表す、取集した吸光度を、表７に表す。
【０２３７】
【表７】
0006710157.tif 000032
【０２３８】
テンプレート化を制約した条件下での、テンプレート化アセンブリの生成物形成の度合いは、複合反応混合物に存在するテンプレートの量と相関している。
【０２３９】
実施例３：生体細胞におけるアジド−シクロオクチン核酸テンプレート化アセンブリ
生体細胞の腫瘍関連標的上での非トレースレス・核酸テンプレート化アセンブリの評価のために、ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７遺伝子に特異の相応する反応体のセットをＣａｓｋｉ細胞に転写した。テンプレート化アセンブリ連結反応生成物が、ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７配列を欠いた関連細胞株よりＣａｓｋｉ細胞に優先的に形成されていること確認するために、サンドイッチ酵素検出を使用した。
【０２４０】
当該細胞または細胞培養液中の核酸分解酵素による分解を防ぐために、核酸認識モイエティーのテンプレート化アセンブリ反応体を、２−Ｏ−メチル変性オリゴリボヌクレオチドとして調合した。オリゴリボヌクレオチド配列を表８に提示する。
【０２４１】
【表８】
0006710157.tif 000033
【０２４２】
オリゴ−３．１は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８９３４８．１の４４７位から４６１位からの配列を表し、Ｃａｓｋｉ細胞株から単離されるヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）に対応する参照配列である。ＨＰＶは、ヒト子宮頸がんにほぼ１００％見出せる。当該配列のこの位置は、遺伝子Ｅ６／Ｅ７にあり、そのｍＲＮＡは、ほとんど全てのＨＰＶ誘発子宮頸がんにおいて発現する。
【０２４３】
オリゴ−３．２は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８９３４８．１の４３１−４４６位からの逆相補体の配列を表す。
【０２４４】
オリゴリボヌクレオチド合成中に、５′末端のＦＡＭ−ホスホロアミダイトの組み込みと３′アミンのＮＨＳ−アジドの共役により、オリゴ−３．１のＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）検出基及びアジドバイオオーソゴナルモイエティーを組み込んだ。
【０２４５】
当該バイオオーソゴナル反応基への共役を促すために、５′アミノ官能基でオリゴ−３．２を合成した。クリックケミストリーツールから得たジベンジルシクロオクチン−スルホ−ＮＨＳエステル（ＤＢＣＯ−ＮＨＳ）で、当該アミン基においてオリゴ−３．２を共役させた。ＤＢＣＯ−ＮＨＳをＤＭＳＯに溶解し、１００ｍＭの生成物を産生させた。オリゴ−３．２の１ｍＭ溶液を、等倍のＰＢＳ緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ，３ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．４）中で調合した。ＤＢＣＯの２０倍モルを、オリゴ−３．２の１００ｎモルと混合し及び室温で４時間培養した。次いで、ｐＨ８．０の１Ｍのトリス−ＨＣｌで反応を抑制し、最終的に１００ｍＭ濃度のトリスを得た。生成物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５カラムに通して精製し及び酢酸ナトリウムを使用した標準的な方法でエタノール沈降物を得た。このエタノール沈降物は、容易には形成しなかった。このサンプルをドライアイス−エタノール浴にて−７８℃で２４時間養生し、完全に沈降させた。ＨＰＬＣによる精製で、当該オリゴ−３．２−ＤＢＣＯ共役生成物を得た。
【０２４６】
Ｃａｓｋｉ細胞株及びＨｅＬａ細胞株を、１０％の加熱不活性化ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で培養した。各実験条件に対して、１ｘ１０6個の細胞を２４時間Ｔ−２５フラスコに留めて、核酸導入（トランスフェクション）を行った。各細胞株のフラスコでは、両テンプレート化アセンブリ反応体（実験用）でのトランスフェクションが起こり、及びＣａｓｋｉフラスコは、同様に単離した当該反応体の各々でトランスフェクションされた（ネガティブコントロール）。
【０２４７】
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の指示に従って、当該トランスフェクション試薬として使用した。トランスフェクションの直前に、細胞フラスコを等倍のＰＢＳで洗浄し及びＯｐｔｉｍｅｍの無血清培地を増殖培地として加えた。オリゴ−３．１及びオリゴ−３．２−ＤＢＣＯの共役体を、等倍のＰＢＳ中で、１００ｕＭの濃度に再懸濁した。各実験フラスコに対し、１．１ｕＬのオリゴ−３．１を、２７５ｕＬのＯｐｔｉｍｅｍの無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。それとは別に、１１ｕＬのリポフェクタミン２０００を、２７５ｕＬのＯｐｔｉｍｅｍの無血清培地で１５分間培養した。次いで、当該オリゴ−３．１溶液と当該リポフェクタミン溶液を混合し及び２０分間培養した。次いで、５００ｕＬのオリゴ−３．１−リポフェクタミンのトランスフェクション溶液を、実験フラスコに押し出した。当該オリゴ−３．２−ＤＢＣＯ共役体のために、前述のトランスフェクションのプロセスを繰り返し、当該相応する反応体の押し出しの３０分後に、当該オリゴ−３．２−ＤＢＣＯ−リポフェクタミンのトランスフェクション溶液をフラスコに押し出した。４時間後、当該無血清培地を取り除き及びＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで置き換えた。
【０２４８】
２４時間後、トランスフェクション細胞を等倍のＰＢＳで３回洗浄し及びその基質から細胞を除去するためにトリプシンで簡潔に処置した。細胞を遠心分離でペレットとし、そのペレットを等倍のＰＢＳで２回洗浄した。ペレットを次のプロセスまで冷凍保存した。
【０２４９】
連結されたテンプレート化アセンブリ生成物を検出するために、サンドイッチ様式の回収及び検出技術を使用した。細胞ペレットを、５００ｕＬのＲＩＰＡ緩衝液（ｐＨ７．４の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ  ｘ−１００、１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮａ3ＶＯ4、１μｇ／ｍｌのロイペプチン）に溶解し、及び残物を取り除くために遠心分離した。３００μＬの透明ライセートを、ストエプトマイシンをコートしたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに入れ及び３時間の振とう培養を行った。製造者の指示に従い、そのウェルを３回洗浄し、及びＴＢＳＴ中での抗ＦＡＭ西洋ワサビペルオキシダーゼ共役抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｅｓ））の５０００分の１希釈液をそのウェルに添加し、及び室温で３時間の振とう培養を行った。その抗体溶液を取り去り、ウェルを３回洗浄し、及び製造者の指示に従い、ウルトラＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ基質キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でシグナルを発生させた。トランスフェクトサンプルの吸光度を表９に提示する。
【０２５０】
【表９】
0006710157.tif 000034
【０２５１】
両テンプレート化アセンブリ反応体でトランスフェクトされたＣａｓｋｉ細胞は、当該検出アッセイにおいて、連結反応生成物に対応した適切なポジティブなシグナルが生み出され、核酸テンプレート化アセンブリが、標的細胞において、選択的に起きたことを確認した。
【０２５２】
実施例４．生体細胞における非内因性ペプチドのトレースレス・シュタウディンガー連結反応を介した合成
生体細胞で、トレースレス・シュタウディンガー連結反応に基づく核酸テンプレート化アセンブリを、標的核酸としてＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７  ｍＲＮＡを使用して実施し及びエフェクター構造としてのＦＬＡＧペプチドのエピトープを創出した。
【０２５３】
細胞中のＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７標的ｍＲＮＡ配列の存在の下、当該ＦＬＡＧペプチドエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）の産生を許容するテンプレート化アセンブリ反応体を合成した。ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７の当該相補的形成部を、実施例３のものと同様になるように選んだ。トレースレスのホスフィノメタンチオールのバイオオーソゴナル反応ケミストリーを利用した。当該ＦＬＡＧエピトープの第四Ｎ末端残基は、エフェクター構造の検出に使用する抗体の結合に対して鍵となる残渣であると報告されているので（Ｒｏｏｓｌｉｄ  ｅｔ  ａｌ．２００６）、非連結反応体の検出を防ぐために、この第四残基領域を破壊するような当該エフェクター部分モイエティーを選んだ。
【０２５４】
テンプレート化アセンブリ反応体４Ａの、核酸認識モイエティー、バイオオーソゴナル反応性モイエティー、及びエフェクター部分モイエティーを個別に合成し、生体共役ケミストリー法を介して共役化した。
【０２５５】
核酸認識モイエティー４Ａにヌクレアーゼ抵抗を与えるために、２−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドで構成し、他のモイエティーへの共役を与えるために３′チオールで官能化した。ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７  ｍＲＮＡ上の相補的形成部は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８９３４８の４４７位から４６１位であった。オリゴリボヌクレオチド配列を表１０に提示する。
【０２５６】
【表１０】
0006710157.tif 000035
【０２５７】
オリゴ−４．１及びオリゴ−４．２にある全てのヌクレオチドは、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであった。合成時に、３′チオール修飾を導入した。
【０２５８】
水溶性ホスフィノメタンチオール、ビス（ｍ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルフェニル）ホスフィノメタンチオールは、テンプレート化アセンブリ反応体４Ａのバイオオーソゴナル反応性モイエティーとしての役割を果した。
【０２５９】
【化２５】
0006710157.tif 000036
【０２６０】
当該生成物を（Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，２００９．１７（３）：ｐ．１０５５−６３）に記述のように合成し、最終収率は５％であった。
【０２６１】
反応体４Ａのエフェクター部分モイエティーを、アスパラギン酸−チロシンジペプチド（ＤＹ）で構成した。このペプチドの当該バイオオーソゴナル反応基との共役を促すため、（Ｂｌａｎｃｏ−Ｃａｎｏｓａ，Ｄａｗｓｏｎ  ２００８）に記述のように、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから市販されているジアミノベンゾイル−リンカーであるＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＡＭレジン上で合成した。標準的な方法を使用したこのレジン上での当該ＤＹペプチドの合成後に、当該リンカーを、記述のように、ｐ−ニトロフェニルクロロギ酸エステル、次いでＤＩＰＥＡで活性化した。標準的なＴＦＡ／Ｈ2Ｏ／ＴＩＳ切断を使用し、当該リンカーから当該ペプチドを取り除き、チオエステル形成を介したバイオオーソゴナル反応基４Ａとのカップリングに適したＣ−末端Ｎ−アシル尿素を産生した。
【０２６２】
【化２６】
0006710157.tif 000037
【０２６３】
１．０ｍｇ（２．２ｕモル）のアシル尿素活性化ＤＹジペプチドのエフェクター部分モイエティー４Ａを、１．２ｍｇ（３．３ｕモル）のバイオオーソゴナル反応基Ａを、合計で１ｍＬのチオエステル連結反応緩衝液（０．２Ｍのリン酸塩緩衝液、６ＭのグアニジンＨＣｌ、０．２Ｍの４−メルカプトフェニル酢酸、０．０２ＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．０）中で反応させ、及び室温で４時間培養した。この生成物をＨＰＬＣで精製し、１．０ｍｇのチオエステル生成物を産出した（収率７３％）。当該１．０ｍｇのチオエステル生成物を、１０モル当量の２官能性クロスリンカーＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）と、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中において室温で２時間反応させた。生成物をＨＰＬＣで精製し、１．１ｍｇ（１．３ｕモル）のマレイミド負荷の中間体生成物を産出した。この生成物を、２６０ｕＬのＤＭＦで再懸濁した。この再懸濁液（１０ｎモル）の２ｕＬを、４８ｕＬの等倍ＰＢＳ中の等モル量のチオール脱保護化オリゴ−４．１に添加し、及び室温で２時間培養した。この生成物をＨＰＬＣで精製した。ＭＡＬＤＩ質量分析によるこの生成物のｍ／ｚは、５９８４．３（予測値５９７７．２１）であった。
【０２６４】
【化２７】
0006710157.tif 000038
【０２６５】
当該バイオオーソゴナル反応性モイエティーの反応体４Ｂを、合成時に、当該エフェクター部分モイエティーの部分として組み込んだ。核酸認識モイエティー４Ｂを、個別に合成し、次いでその他のモイエティーに、生体共役ケミストリー法を介して共役させた。
【０２６６】
核酸認識モイエティー４Ｂを、２−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドで構成しヌクレアーゼ抵抗を与え、５′アミンで官能化して他のモイエティーとの共役を与え、及び３′ビオチンで官能化して生成物の単離及び検出を促した。ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７  ｍＲＮＡ上の当該相補的形成部は、オリゴ−４．１に対してはＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８９３４８の４４７位から４６１位であり、オリゴ−４．２に対してはＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８９３４８の４３１位から４４６位であった。
【０２６７】
当該エフェクター部分モイエティーの反応体４Ｂには、反応体４Ａが与えない当該ＦＬＡＧペプチドの残りの部分を最構築する必要がある。したがって、反応体４Ｂは、ＫＤＤＤＤＫのペプチド配列を含有する。天然のペプチド結合を産生するために、反応体４Ａ上で、当該トレースレス・ホスフィンバイオオーソゴナル反応性モイエティーと反応するためには、当該Ｎ末端基は、α−アジドアミノ酸でなければならず、当該Ｎ末端リシンを、（Ｓ）−２−アジド−６−（Ｂｏｃアミノ）ヘキサン酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）として組み込んだ。さらに、当該チオールを介した核酸認識モイエティー４Ａへの共役を促すために、Ｃ末端システインを含有した。このように、標準ペプチド合成を利用して、Ｎ3−ＫＤＤＤＤＫＣの形態であるモイエティーを産生した。このペプチドをＨＰＬＣで精製した。ＭＡＬＤＩ質量分析によるこの生成物のｍ／ｚは、８６４．２１（予測値８６３．３１）であった。当該２官能性クロスリンカーＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、核酸認識モイエティー４Ｂの第一級アミン基をバイオオーソゴナルエフェクター部分モイエティー４Ｂのチオールと共役させた。最初に、１００ｕＬの等倍ＰＢＳ中の２０ｎモルのオリゴ−４．２を、２ｕＬのＤＭＦに溶解した２０モル当量のＳＭＣＣと混合した。その反応を室温で２時間継続して、次いでその生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５カラム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に通して精製した。この精製物を、等倍ＰＢＳ中の２０ｎモル（０．０２ｍｇ）のアジド−ペプチド生成物との反応に即座に使用した。この反応を室温で３時間継続し、次いでＨＰＬＣで精製した。ＭＡＬＤＩ質量分析によるこの生成物のｍ／ｚは、６６１１．９４（予測値６６０７．３１）であった。
【０２６８】
【化２８】
0006710157.tif 000039
【０２６９】
トランスフェクションせずに、１つの反応体を生み出したことを以外は、トランスフェクション条件及び手順は、実施例３のものと同様であった。追加細胞株で、ＨＰＶのいかなる歪をも抱いていないＣ３３Ａ子宮頸がん細胞を、追加のネガティブコントロールとして加えた。トランスフェクションフラスコの組み立てを、表１１に記載する。
【０２７０】
【表１１】
0006710157.tif 000040
【０２７１】
加えた検出抗体が、モノクローナル抗ＦＬＡＧRＭ２ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の１０，０００分の１希釈であったこと以外は、ストレプトアビジンコーティングのＥＬＩＳＡ用プレートのウェル中でのサンドイッチ様式アッセイを伴う細胞収穫及び検出を、実施例３と全く同様に実施した。各細胞株における当該ＦＬＡＧエピトープ連結反応生成物の検出で得られた吸光度を、表１２に示す。
【０２７２】
【表１２】
0006710157.tif 000041
【０２７３】
標的核酸配列を内部に持つ細胞におけるトレースレス核酸テンプレート化アセンブリにより、ＦＬＡＧペプチドのエピトープ生成物を優先的に形成する。
【０２７４】
実施例５．腫瘍細胞における非内因性ペプチド抗原のトレースレス・シュタウディンガー反応に基づく核酸テンプレート化アセンブリによる抗原特異の免疫細胞の刺激
生体の腫瘍細胞において、当該標的核酸としてＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７  ｍＲＮＡを使用し、トレースレス・シュタウディンガー反応に基づく核酸テンプレート化アセンブリを実施し、及びエフェクター構造としての当該ＥＬＡペプチドエピトープ（アミノ酸配列：ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）を創出した。このペプチドエピトープは、本研究に利用するいかなる腫瘍細胞株にも、天然には存在しない。当該ＥＬＡペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２分子と結合し、及び当文脈内において、ＥＬＡ−ＨＬＡ複合体特異のＴ細胞によって認識される腫瘍細胞表面に表れる。当研究において、ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７  ＲＮＡを内部に持つ腫瘍細胞のテンプレート化アセンブリ反応体での治療は、ＥＬＡ抗原特異的免疫細胞の選択的な刺激を誘発した。
【０２７５】
細胞中のＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７標的ｍＲＮＡ配列の存在下で、当該ＥＬＡペプチドエピトープ（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）の産生を許容するテンプレート化アセンブリ反応体を合成した。ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７の当該相補的形成部を、実施例３及び４のそれらと同じになるように選択した。
【０２７６】
トレースレス・ホスフィノメタンチオール・バイオオーソゴナル反応ケミストリーを利用した。細胞プロテアーゼが、当該連結反応生成物を加工し、及び当該エフェクターペプチドをＭＨＣ分子に負荷することを促すために、Ｌｅ  Ｇｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７［１］に記述されるように、当該エフェクター構造ペプチドを、追加アミノ酸のどちらかの端に位置づけ、その結果、プロテアソームの切断が起こる前に当該連結反応生成物に産生された当該ペプチドは、ＤＲＷＥＫＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶＫＹＫＬＫＣであった（これは、テンプレート化アセンブリ反応体の合成を促すＣ末端システインを含有する）。
【０２７７】
異なるアミノ酸のバイオオーソゴナル反応基との共役が、当該テンプレート化アセンブリのプロセスに大きな影響を与えるかどうかを決定するために、当該エフェクター構造ペプチドの、当該相応する反応体間への配分のみを変えた、テンプレート化アセンブリ反応体の異なる２セットを用意した。このうちの１セットにおいては、テンプレート化アセンブリ反応体５Ａが、ＤＲＷＥＫＥＬＡＧＩを有するエフェクター部分ペプチドを含有し、一方テンプレート化アセンブリ反応体５Ｂが、ＧＩＬＴＶＫＹＫＬＫＣを有するエフェクター部分ペプチドを含有していた。他のセットにおいては、テンプレート化アセンブリ反応体５αが、ＤＲＷＥＫＥＬＡＧを有するエフェクター部分ペプチドを含有し、一方テンプレート化アセンブリ反応体５βが、ＩＧＩＬＴＶＫＹＫＬＫＣを有するエフェクター部分ペプチドを含有していた。核酸認識モイエティーに使用した当該オリゴリボヌクレオチド及び当該バイオオーソゴナル反応基は、２セット間で一致していた。
【０２７８】
テンプレート化アセンブリ反応体５Ａ及び５αの合成
テンプレート化アセンブリ反応体５Ａ及び５αの核酸認識モイエティー、バイオオーソゴナル反応モイエティー、及びエフェクター部分モイエティーを、個別に合成し、次いで生体共役ケミストリー法を介して共役させた。
【０２７９】
核酸認識モイエティー５Ａ／αを、２′−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドで構成し、ヌクレアーゼ耐性を付与し、３′チオールで官能化して、他のモイエティーとの共役を与えた。ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７  ｍＲＮＡ上の当該相補的形成部は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８９３４８の４４７位から４６１位であった。オリゴリボヌクレオチド配列を、表１３に提示する。
【０２８０】
【表１３】
0006710157.tif 000042
【０２８１】
オリゴ−５．１及びオリゴ−５．２の全てのヌクレオチドは、２′−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであった。この合成時に、当該３′チオール修飾を導入した。
【０２８２】
実施例４で使用したものと同じ水溶性ホスフィノメタンチオール、ビス（ｍ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルフェニル）ホスフィノメタンチオールは、テンプレート化アセンブリ反応体５Ａ及び５αの当該バイオオーソゴナル反応モイエティーとしての役割を果たした。再び、Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００９［２］に記述されるように、当生成物を合成した。
【０２８３】
反応体５Ａの当該エフェクター部分モイエティーを、ＤＲＷＥＫＥＬＡＧＩを有するペプチドで構成し、一方、反応体５αの当該エフェクター部分モイエティーを、ＤＲＷＥＫＥＬＡＧを有するペプチドで構成した。実施例４にあるように、それらのペプチドを、ジアミノベンゾイルリンカーＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＡＭレジン［３］上で合成し、当該バイオオーソゴナル反応基への共役を促した。標準的な方法を使用したこのレジン上でのそれらペプチドの合成後に、記述のように、このリンカーをｐ−ニトロフェニルクロロギ酸エステル次いでＤＩＰＥＡで活性化した。標準的なＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ切断を使用して当該リンカーから、当該ペプチドを取り去り、チオエステル形成を介したバイオオーソゴナル反応基５Ａ／αとのカップリングに適切なＣ末端Ｎ−アシル尿素を産出した。ＤＲＷＥＫＥＬＡＧＩペプチドのエフェクター部分モイエティー５Ａ及びＤＲＷＥＫＥＬＡＧペプチドのエフェクター部分モイエティー５αの両者に対応して、２．０ｍｇ（〜１．４μモル）のアシル尿素活性化ペプチドを、１．２ｍｇ（３．３μモル）のバイオオーソゴナル反応基５Ａ／αと、合計で１ｍＬのチオエステル連結反応緩衝液（０．２Ｍのリン酸塩緩衝液、６ＭのグアニジンＨＣｌ、０．２Ｍの４−メルカプトフェニル酢酸、０．０２ＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．０）中で反応させ、及び室温で４時間培養した。この生成物をＨＰＬＣで精製し、２．１ｍｇの各チオエステル生成物を産出した。２．０ｍｇの各チオエステル生成物を、１０モル当量の当該２官能性クロスリンカーＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）と、１０％のＮ，Ｎジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ｐＨ６．５の５０ｍＭのリン酸塩緩衝液中で（当該Ｎ末端アミンへの共役を制約するために）、室温で２時間反応させた。生成物をＨＰＬＣで精製し、当該マレイミド負荷の中間体を産出した。この物質の２０ｎモルを、４８μＬの等倍ＰＢＳ中の等モル量のチオール脱保護化オリゴ−５．１に添加し、及び室温で４時間培養した。その生成物をＨＰＬＣで精製した。テンプレート化アセンブリ反応体５Ａに対する、ＭＡＬＤＩ質量分析によるこの生成物のｍ／ｚは、６９０７．７（予測値６８９７．２９）であった。テンプレート化アセンブリ反応体５αに対する、ＭＡＬＤＩ質量分析によるこの生成物のｍ／ｚは、６７９６．６（予測値６７８４．２１）であった。
【０２８４】
テンプレート化アセンブリ反応体５Ｂ及び５βの合成
実施例４に示すように、反応体５Ｂ及び５βの当該バイオオーソゴナル反応性モイエティーを、当該エフェクター部分モイエティーの部分として、合成時に組み込んだ。核酸認識モイエティー５Ｂ／βを、個別に合成し、次いで生体共役ケミストリー法を介して、その他のモイエティーと共役させた。
【０２８５】
核酸認識モイエティー５Ｂ／βを、２′−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドで構成してヌクレアーゼ耐性を与え、５′アミンで官能化して他のモイエティーとの共役を与えた。オリゴ−５．２に対応するＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７  ｍＲＮＡ上の当該相補的形成部は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８９３４８の４３１位から４４６位であった。
【０２８６】
反応体５Ｂの当該エフェクター部分モイエティーには、反応体５Ａが与えない当該ＥＬＡペプチドの残余部を再構成する。したがって、それは、当該ペプチド配列ＧＩＬＴＶＫＹＫＬＫＣを含有する。同様に、反応体５βの当該エフェクター部分モイエティーは、当該ペプチド配列ＩＧＩＬＴＶＫＹＫＬＫＣから成る。当該Ｎ末端基は、反応体５Ａまたは５α上の当該トレースレス・ホスフィンバイオオーソゴナル反応性モイエティーと反応するために、α−アジドアミノ酸でなければならず、天然のペプチド結合を与える。このようにエフェクター部分モイエティー５Ｂに対して、当該Ｎ末端グリシンを、２−アジド酢酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）として組み込んだ。エフェクター部分モイエティー５βに対しては、２−アジドイソロイシンが市販されておらず、そのため当該ペプチドのＮ末端における標準イソロイシンアミノ酸を、Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２［４］に記載のように、ジアド転換試薬であるイミダゾール−１−スルホニルアジド塩酸塩で処理することにより、当該２−アジド形成体に転換した。当該アジド基に加えて、Ｃ末端システインを、各ペプチドに含ませ、当該チオールを介して核酸認識モイエティー５Ｂ／βへの共役を促した。このように、標準ペプチド合成を利用して、テンプレート化アセンブリ反応体５Ｂに対してはＮ３−ＧＩＬＴＶＫＹＫＬＫＣ形成モイエティーを、テンプレート化アセンブリ反応体５βに対してはＮ3−ＩＧＩＬＴＶＫＹＫＬＫＣ形成モイエティーを産生した。これらのペプチドはＨＰＬＣで精製した。
【０２８７】
当該２官能性クロスリンカーＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、核酸認識モイエティー５Ｂ／βの当該第一級アミン基を、バイオオーソゴナル−エフェクター部分モイエティー５Ｂ及び５βの当該チオールと共役させた。各エフェクター部分モイエティーに対して、１００ｕＬの等倍ＰＢＳ中の３０ｎモルのオリゴ−５．２を、２ｕＬのＤＭＦに溶解した２０モル当量のＳＭＣＣと混合した。その反応を室温で２時間持続し、次いでその生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５カラム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に通して精製した。当該活性化オリゴリボヌクレオチドを、即座に等倍ＰＢＳ中の３０ｎモルのアジド−ペプチド生成物との反応に使用した。この反応を室温で４時間持続し、次いでＨＰＬＣで精製した。テンプレート化アセンブリ反応体５Ｂに対するＭＡＬＤＩ質量分析で、生成物のｍ／ｚは、７１４９．６（予測値７１３８．２０）であった。テンプレート化アセンブリ反応体５βに対するＭＡＬＤＩ質量分析で、生成物のｍ／ｚは、７２４９．１（予測値７２５１．２８）であった。
【０２８８】
テンプレート化アセンブリ反応体セット５Ａ／５Ｂ、及び５α／５βを使用した腫瘍細胞の治療
テンプレート化アセンブリ反応体５Ａ及び５Ｂ、さらにそれとは別に５α及び５βが、ポジティブ腫瘍細胞に対するペプチド抗原特異の免疫細胞反応を選択的に生み出す能力を、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７  ＲＮＡ陽性及び陰性腫瘍細胞株で評価した。この反応のアッセイは以下の通りである。
１．腫瘍細胞株をテンプレート化アセンブリ反応体で処置し、ＨＰＶ陽性腫瘍に、ＥＬＡエフェクター構造ペプチド抗原を形成するようにさせ、タンパク質の分解を進め、及びその表面に現れるようにＨＬＡ分子に負荷させる。
２．ＨＬＡにある当該ＥＬＡペプチドを特異的に認識するＴ細胞を、処置した腫瘍細胞と共培養し、結果としてペプチド抗原が存在するかどうかでＴ細胞の刺激に至る。
３．  Ｔ細胞の刺激レベルを、ＩＬ−２サイトカイン放出アッセイで決定する。
【０２８９】
腫瘍細胞株
これらテンプレート化アセンブリ化合物によって創出される当該ＥＬＡペプチド抗原エフェクター構造を、ＨＬＡ分子の対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ２に結合したため、これら試験で使用する全ての腫瘍細胞株は、ＨＬＡ−Ａ２陽性であった。Ｃａｓｋｉ細胞は、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７  ＲＮＡ陽性細胞株としての役割を果たし、一方ＨＰＶ陰性のＣ３３Ａ及びＵ２６６細胞は、ネガティブコントロールとしての役割を果たした。実施例５で利用した当該腫瘍細胞株を、表１４にまとめる。
【０２９０】
【表１４】
0006710157.tif 000043
【０２９１】
化合物投与
これらのアッセイに対して、腫瘍細胞株を、合計で１５０ｕＬのＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  １６４０  （ＲＰＭＩ−１６４０）培地において、ウェルあたり５ｘ１０4細胞を播種した９６ウェルプレートで培養した。細胞がウェルに播種されたその日に、テンプレート化アセンブリ反応体またはコントロールのＥＬＡペプチドで、細胞を処置した。テンプレート化アセンブリ反応体を、ウェルあたり０．１ナノモル及び０．５ナノモルの投与量で試験した。コントロールのＥＬＡペプチドを、それらと同じ投与量、及びより低いウェルあたり０．０２ナノモルの投与で試験した。テンプレート化アセンブリ化合物を、それらウェルに添加する前に、等倍ＰＢＳに溶解し、希釈した。化合物を、裸で−トランスフェクション試薬を行わずにまたはキャリアーを使用しないで、等倍ＰＢＳ中に投入した。複数のテンプレート化アセンブリ反応体の投与スキームを評価し、テンプレート化のバックグランドレベルでそれらの効果を以下のように評価した。
１．同時投与：テンプレート化アセンブリ反応体５Ｂを添加し、及びウェルに分散させ、次いで５分以内に、テンプレート化アセンブリ反応体５Ａを添加した。
２．時間差投与：テンプレート化アセンブリ反応体５Ｂを添加し及び細胞で４時間培養し、次いで培地を取り除いた。細胞を新鮮な培地に受け、及びテンプレート化アセンブリ反応体５Ａを添加した。
３．時間後投与：テンプレート化アセンブリ反応体５Ｂを添加し及び細胞で４時間培養し、次いで培地を取り除いた。細胞を新鮮な培地に受けた。この培地交換の２時間後、テンプレート化アセンブリ反応体５Ａを添加した。
各条件のセットを、３回のウェルで試験した。
【０２９２】
Ｔ細胞投与及び刺激アッセイ
Ｈａｇｇｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１２［５］に記載のように、ＨＬＡ−Ａ２に結合したＥＬＡを特異的に認識するクローン化されたＴ細胞受容体で形質転換したＪｕｒｋａｔ細胞から、ＥＬＡ特異のＴ細胞を確立した。当該第二テンプレート化アセンブリ反応体またはＥＬＡコントロールペプチドの投与直後に、５ｘ１０4のそれら細胞を試験ウェルに添加した。同じくＨａｇｇｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１２［５］に記載のように、処置した腫瘍細胞及びＴ細胞を３７℃で２０時間の共培養後、Ｔ細胞の抗原特異刺激を、ＥＬＩＳＡに基づくＩＬ−２サイトカイン放出アッセイにより評価した。当該試験の評価条件を表１５にまとめる。
【０２９３】
【表１５】
0006710157.tif 000044
【０２９４】
結果：処置後の腫瘍細胞による抗原特異的免疫エフェクター細胞の刺激
図１２は、試験した各条件で観察されたＩＬ−２放出をグラフ化する。その結果から、複数の結論が引き出せるであろう。
１．テンプレート化アセンブリ反応体での処理は、標的ＲＮＡを内包している腫瘍細胞に対して、選択的で強いＴ細胞反応を引き出す。
２．当該２つの反応体に対応する異なる投与スキームは、当該反応の選択性の度合いに影響を与えるであろう。このケースの場合、時間後投与は、ネガティブコントロールに非常に低バックグラウンドを実現することにより選択性を向上させる。
３．この実施例において、テンプレート化アセンブリ反応体の２つのセットは、各ケースにおいて当該バイオオーソゴナル基と共役した異なるアミノ酸を有するにもかかわらず、非常に類似して機能した。
【０２９５】
当該結果は、腫瘍関連ＲＮＡの存在下で、ペプチド抗原を創出するように設計された核酸テンプレート化アセンブリ化合物は、抗原特異の免疫細胞との共役において、腫瘍細胞への選択的反応を生み出すために使用されて良い、ということを表す。抗原特異の免疫細胞は、標的ＲＮＡを内包する処置後の腫瘍細胞の存在下で、選択的に刺激される。核酸テンプレート化アセンブリ化合物は、腫瘍細胞に対するＲＮＡ選択的な免疫細胞反応を引き出す能力がある。
【０２９６】
上記の実施形態に基づく本開示のさらなる特徴及び利点を、当業者は受け入れるであろう。したがって、本開示は、当該添付の請求項により指示される以外に、具体的に示され及び記述された内容によって限定されるものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0006710157.tif 000057
【図１０】
0006710157.tif 000058
【図１１】
0006710157.tif 000059
【図１２】
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【配列表】
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