(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）〜（４）
（１）２−ＤＨＡ−ホスファチジルコリンを含有する脂質混合物をリパーゼ処理する工程
（２）濃度９５ｖ／ｖ％以上の低級アルコール中にリパーゼ処理後の脂質混合物を溶解した溶液と強塩基イオン交換樹脂とを接触させて、脂質を強塩基イオン交換樹脂に吸着させる工程、
（３）強塩基イオン交換樹脂に吸着した脂質を濃度９０ｖ／ｖ％以下の低級アルコールを用いて溶出する工程、及び
（４）溶出した脂質をシリカゲルクロマトグラフィーに供して、２−ＤＨＡ−リゾホスファチジルコリンを含む通過液を回収して脂質組成物を得る工程
を含む、リゾホスファチジルコリン含有量が組成物重量に対して７０重量％以上であり、かつＤＨＡ含有量が脂質組成物の脂肪酸重量に対して３５重量％以上である、２−ＤＨＡ−リゾホスファチジルコリン含有脂質組成物の製造方法。
【請求項２】
工程（２）が濃度９５ｖ／ｖ％以上の低級アルコールに溶解した脂質混合物の活性炭処理をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
工程（１）における２−ＤＨＡ−ホスファチジルコリンを含有する脂質混合物がイカ又はサケ由来の脂質混合物である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）がグリセリン骨格の２位に結合したリゾホスファチジルコリンを含有する脂質組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質は、構造中にリン酸エステル部位をもつ脂質の総称であり、両親媒性を有することから、生体において糖脂質やコレステロールと共に細胞膜の主要な構成成分として利用される。構成脂肪酸の一つが加水分解された形のリン脂質は特にリゾリン脂質と呼ばれ、生体において様々な生理活性を示す。また、リン脂質は乳化剤として工業的にも利用されている。
【０００３】
一方、ＤＨＡは、６個の不飽和結合を有する炭素数２２の多価不飽和脂肪酸の一種であり、記憶学習能力の向上、抗アレルギー、抗腫瘍などの優れた生理活性を有することが知られている。ヒトの体内では、リン脂質の構成脂肪酸としてＤＨＡ結合型リン脂質の形態で存在し、様々な生理機能を担っている。例えば、ＤＨＡがグリセリン骨格の２位に結合したリゾリン脂質（２−ＤＨＡ−リゾリン脂質）特に２−ＤＨＡ−リゾホスファチジルコリンは、脳へのＤＨＡ輸送能力や赤血球変形能に優れていることが報告されている。
【０００４】
以上から、２−ＤＨＡ−リゾリン脂質特に２−ＤＨＡ−リゾホスファチジルコリン又はこれを多く含む脂質組成物は、ＤＨＡの生理活性を伴った優れた乳化剤として、医薬分野及び食品分野において高い付加価値を有すると期待される。
【０００５】
２−ＤＨＡ−リゾリン脂質を含む脂質組成物を調製する方法としては、イワシ、サバ、サケなどの魚類又はイカなどのＤＨＡを多く含む水産資源から適当な有機溶媒例えばイソプロパノールなどを用いて、ＤＨＡがグリセリン骨格の２位に結合したリン脂質（２−ＤＨＡ−リン脂質）を含む脂質混合物を抽出し、これにリパーゼを作用させてリゾリン脂質へと変換させてから、溶媒分配を繰り返して２−ＤＨＡ−リゾリン脂質を含む脂質組成物を回収する方法が知られている（例えば特許文献１）。しかしながらかかる方法では、脂質組成物中のリゾリン脂質の含有量及びＤＨＡの含有量は高くなく、生理活性及び乳化能いずれにおいても満足できるものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平９−２０６０８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、２−ＤＨＡ−リゾリン脂質特に２−ＤＨＡ−リゾホスファチジルコリンを多く含む脂質組成物を調製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、溶媒分配に代わる脂質組成物の新たな調製方法を種々検討した結果、イオン交換樹脂とシルカゲルとを組み合わせて使用することで、２−ＤＨＡ−リゾホスファチジルコリンを多く含む乳化能に優れた脂質組成物を調製することができることを見いだし、下記の各発明を完成した。
【０００９】
１）以下の工程（１）〜（４）
（１）２−ＤＨＡ−ホスファチジルコリンを含有する脂質混合物をリパーゼ処理する工程
（２）濃度９５ｖ／ｖ％以上の低級アルコール中にリパーゼ処理後の脂質混合物を溶解した溶液と強塩基イオン交換樹脂とを接触させて、脂質を強塩基イオン交換樹脂に吸着させる工程、
（３）強塩基イオン交換樹脂に吸着した脂質を濃度９０ｖ／ｖ％以下の低級アルコールを用いて溶出する工程、及び
（４）溶出した脂質をシリカゲルクロマトグラフィーに供して、２−ＤＨＡ−リゾホスファチジルコリンを含む通過液を回収して脂質組成物を得る工程
を含む、リゾホスファチジルコリン含有量が組成物重量に対して７０重量％以上であり、かつＤＨＡ含有量が脂質組成物の脂肪酸重量に対して３５重量％以上である、２−ＤＨＡ−リゾホスファチジルコリン含有脂質組成物の製造方法。
２）工程（２）が濃度９５ｖ／ｖ％以上の低級アルコールに溶解した脂質混合物の活性炭処理をさらに含む、１）に記載の製造方法。
３）工程（１）における２−ＤＨＡ−ホスファチジルコリンを含有する脂質混合物がイカ又はサケ由来の脂質混合物である、１）又は２）に記載の製造方法。
４）リゾホスファチジルコリン含有量が組成物重量に対して７０重量％以上であり、かつＤＨＡ含有量が脂質組成物の脂肪酸重量に対して３５重量％以上である、２−ＤＨＡ−リゾホスファチジルコリン含有脂質組成物。
５）ホスファチジルエタノールアミン及びリゾホスファチジルエタノールアミンの含有量が組成物重量に対して２重量％以下である、４）に記載の脂質組成物。
６）コレステロール及び遊離脂肪酸の含有量が組成物重量に対して１０重量％以下である、４）又は５）に記載の脂質組成物。
７）４）から６）のいずれかに記載の脂質組成物を含む乳化剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の製造方法は、２−ＤＨＡ−ホスファチジルコリンを含有する脂質混合物から、ＤＨＡに基づく有益な生理活性及び優れた乳化能を有する付加価値の高い脂質組成物を、安価かつ大量に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の第１の態様は、以下の工程（１）〜（４）
（１）２−ＤＨＡ−ホスファチジルコリンを含有する脂質混合物をリパーゼ処理する工程
（２）濃度９５ｖ／ｖ％以上の低級アルコール中にリパーゼ処理後の脂質混合物を溶解した溶液と強塩基イオン交換樹脂とを接触させて、脂質を強塩基イオン交換樹脂に吸着させる工程、
（３）強塩基イオン交換樹脂に吸着した脂質を濃度９０ｖ／ｖ％以下の低級アルコールを用いて溶出する工程、及び
（４）溶出した脂質をシリカゲルクロマトグラフィーに供して、２−ＤＨＡ−リゾホスファチジルコリンを含む通過液を回収して脂質組成物を得る工程
を含む、リゾホスファチジルコリン含有量が組成物重量に対して７０重量％以上であり、かつＤＨＡ含有量が脂質組成物の脂肪酸重量に対して３５重量％以上である、２−ＤＨＡ−リゾホスファチジルコリン含有脂質組成物の製造方法に関する。
【００１２】
本発明の第一の態様は、２−ＤＨＡ−ホスファチジルコリンを含有する脂質混合物をリパーゼ処理する工程（１）を含む。
【００１３】
工程（１）において、２−ＤＨＡ−ホスファチジルコリンすなわちＤＨＡがグリセリン骨格の２位に結合したホスファチジルコリンを含む天然資源から回収される脂質混合物が、リパーゼ処理の対象物として利用される。その例としては、カツオ、マグロ、イワシ、サバ、サケなどの魚類の組織、ケンサキイカ、コウイカ、マイカ、スルメイカ、ホタルイカ、ヤリイカ等のイカ類の組織などのＤＨＡを含む水産資源から、適当な有機溶媒を用いた抽出等の手段によって回収することができる脂質混合物を挙げることができる。また、ＤＨＡ含有油を含む飼料を給餌した家禽が産む卵から、適当な有機溶媒を用いた抽出によって回収することができる脂質混合物も、本発明において利用可能である。
【００１４】
工程（１）において原料として用いられる脂質混合物中のホスファチジルコリン含有量は、混合物全体に対して１０重量％以上、好ましくは２０重量％以上、より好ましくは４０重量％以上である。また、脂質混合物中のＤＨＡ含有量は、混合物中の全脂肪酸重量に対して５重量％以上、好ましくは１０重量％以上、より好ましくは２０重量％以上、さらにより好ましくは３０重量％以上である。また、脂質混合物は、２−ＤＨＡ−ホスファチジルコリン以外のリン脂質、遊離脂肪酸、中性脂質その他の脂質、タンパク質、アミノ酸、核酸などを含んでいてもよく、また溶液又は懸濁液の状態であってもよい。
【００１５】
本発明においては、水産廃棄物である魚類の皮やアラ、イカ類の皮などから、好ましくはイカ類の皮又はサケの頭部から、最も好ましくはイカ類の皮から有機溶媒を用いた抽出によって回収される脂質混合物が利用される。有機溶媒の例としては、エタノール、ヘキサン、イソプロピルアルコール、酢酸エチル、アセトン、エーテル、クロロホルム、メタノール、ブタノール又はこれらの混合物等を挙げることができる。
【００１６】
天然資源から回収されるかかる脂質混合物中の２−ＤＨＡ−リン脂質は、リパーゼ処理によって２−ＤＨＡ−リゾリン脂質へと変換される。本発明において利用されるリパーゼは、グリセリド骨格のｓｎ−１位若しくはｓｎ−３位のエステル結合を加水分解する１，３位特異性リパーゼ、ｓｎ−１位を特異的に加水分解するホスホリパーゼＡ１若しくはこれと同様の特異性を有するリパーゼ、又は長鎖不飽和脂肪酸のエステル結合を加水分解する活性が低いリパーゼから選択される。そのようなリパーゼは当業者に周知であり、１，３位特異性リパーゼの例としては、リリパーゼＡ−１０Ｄ（ナガセケムテックス株式会社）、リポザイムＲＭＩＭ（ノボザイムズ）、リポザイムＴＬＩＭ（ノボザイムズ）、パラターゼ２００００Ｌ（ノボザイムズ）、リパーゼＡ「アマノ」６（天野エンザイム）、リパーゼＲ「アマノ」（天野エンザイム）、リパーゼＤＦ「アマノ」１５（天野エンザイム）などを、また長鎖不飽和脂肪酸のエステル結合を加水分解する活性が低いリパーゼの例としては、リパーゼＡＹ「アマノ」３０ＳＤ（天野エンザイム）、リパーゼＭＥＲ「アマノ」（天野エンザイム）、リパーゼＯＦ（名糖産業）などを、それぞれ挙げることができる。
【００１７】
水産資源からの２−ＤＨＡ−ホスファチジルコリンを含む脂質混合物の回収及びリパーゼ処理は、例えば特許文献１（特開平９−２０６０８８号公報）、特許文献２（特開２００３−９３０８６号公報）などに記載された条件又はそれを当業者の通常の実施能力の範囲内で改変した条件の下で行うことができる。
【００１８】
例示すれば、脂質混合物の回収は、フリーズドライ等によって粉末化した水産資源に１０倍量程度の濃度９５ｖ／ｖ％以上のアルコール溶液を加え、室温〜６０℃程度で数時間撹拌した後にアルコール溶液を回収することにより行うことができる。また、アルコールの入っていない水系で前記と同様な反応を行うこともできる。またリパーゼ処理は、脂肪酸が加水分解される条件であればいずれでも良いが、好ましくは反応温度は０〜５０℃、反応時間は１０分〜４８時間、反応液のｐＨは３〜８の範囲で適宜調節すればよい。リパーゼ処理は、加熱若しくは有機溶媒の添加などによって酵素を失活させることで、又はろ過により酵素を除去することで終了させることができる。
【００１９】
リパーゼ処理後の反応液は、そのまま、又は溶媒抽出やエバポレーターその他の機器を用いた濃縮処理等を行った後に、次の工程（２）において用いることができる。
【００２０】
本発明の第一の態様は、濃度９５ｖ／ｖ％以上の低級アルコール中にリパーゼ処理後の脂質混合物を溶解した溶液と、強塩基イオン交換樹脂とを接触させて、脂質を強塩基イオン交換樹脂に吸着させる工程（２）を含む。
【００２１】
工程（２）は、９５ｖ／ｖ％以上の低級アルコール中に工程（１）でリパーゼ処理した脂質混合物を溶解した溶液と強塩基イオン交換樹脂とを槽内で撹拌することで接触させるバッチ式工程であってもよいが、濃度９５ｖ／ｖ％以上の低級アルコールをカラム溶媒として強塩基イオン交換樹脂を充填させた適当なカラムに、９５ｖ／ｖ％以上の低級アルコール中に工程（１）でリパーゼ処理した脂質混合物を溶解した溶液を流通させて、２−ＤＨＡ−リゾリン脂質を含む脂質を強塩基性イオン交換樹脂に吸着させるカラムクロマトグラフィーであることが好ましい。
【００２２】
濃度９５ｖ／ｖ％以上の低級アルコールは、例えば、メタノール、エタノール及びイソプロパノールの各溶液を挙げることができるが、エタノール、特に工業用エタノール又は純エタノールと呼ばれる濃度９７ｖ／ｖ％のエタノールが好ましい。
【００２３】
工程（２）で利用可能な強塩基性イオン交換樹脂としては、官能基として四級アンモニウム基例えばトリメチルアンモニウム基を導入したＩ型強塩基性イオン交換樹脂やジメチルエタノールアンモニウム基を導入したＩＩ型強塩基性イオン交換樹脂などが利用可能である。そのような強塩基性イオン交換樹脂の具体例としては、ＰＡ３０６Ｓその他の強塩基性陰イオン交換樹脂「ダイヤイオン（商標）シリーズ」（三菱化学）、ＩＲＡ４００Ｊ、ＩＲＡ４０２ＢＬその他のＩ型強塩基性陰イオン交換樹脂（オルガノ）、ＩＲＡ４１０Ｊ、ＩＲＡ４１１その他のＩＩ型強塩基性陰イオン交換樹脂（オルガノ）、ＤＯＷＥＸ（商標）１×２その他のＩ型強塩基性陰イオン交換樹脂（ダウ・ケミカル社）等を挙げることができる。樹脂の使用量は、リパーゼ処理後の脂質混合物の量、及び溶液の量に応じて適宜決定すればよく、例えば脂質混合物の１〜２０倍量、好ましくは２〜１０倍量の樹脂が用いられる。
【００２４】
強塩基イオン交換樹脂への脂質の吸着が完了したら、樹脂は溶液から分離され、好ましくは、９５ｖ／ｖ％以上の低級アルコールを適宜流通させて望ましくない成分を洗い流した後、次の工程（３）に供される。
【００２５】
なお、工程（２）は、リパーゼ処理した脂質混合物を濃度９５ｖ／ｖ％以上の低級アルコールで溶解した溶液と強塩基性イオン交換樹脂とを接触させる前に、前記溶液を活性炭処理することをさらに含むことが好ましい。使用する活性炭の種類に特に制限はなく、また活性炭の量は脂質混合物１重量部あたり５〜２０重量部、好ましくは５〜１０重量部であればよい。
【００２６】
本発明の第一の態様は、強塩基イオン交換樹脂に吸着した脂質を濃度９０ｖ／ｖ％以下の低級アルコールを用いて溶出する工程（３）を含む。工程（３）は、脂質が吸着した強塩基イオン交換樹脂を濃度９０ｖ／ｖ％以下の低級アルコール中で撹拌するバッチ式工程であってもよく、工程（２）のイオン交換樹脂がカラムに充填されているときは、当該カラムに濃度９０ｖ／ｖ％以下の低級アルコールを流通させて強塩基イオン交換樹脂から脂質を溶出するカラムクロマトグラフィー工程であってもよい。好ましくは、工程（３）はカラムクロマトグラフィー工程である。
【００２７】
溶出のための低級アルコールは、濃度７５〜９０ｖ／ｖ％、好ましくは８０〜９０ｖ／ｖ％、より好ましくは８５〜９０ｖ／ｖ％の低級アルコール水溶液である。溶出の際、低級アルコール濃度を工程（２）における９５ｖ／ｖ％以上から上記溶出濃度に一度に切り替えてもよく、又は９５ｖ／ｖ％以上から連続的若しくは段階的に上記溶出濃度に変化させてもよい。
【００２８】
工程（３）がバッチ式工程である場合、溶出を複数回にわたって行い、それぞれで回収した溶出液をまとめて次の工程に供することが好ましい。また工程（３）がカラムクロマトグラフィーである場合、カラム容量の２〜５倍量に相当する低級アルコール溶液を流通させて、溶出液を回収することが好ましい。回収された溶出液は、そのまま、又はエバポレーターその他の機器を用いた濃縮処理等を行った後に、次の工程において用いることができる。
【００２９】
本発明の第一の態様は、工程（３）で溶出した脂質をシリカゲルクロマトグラフィーに供して、２−ＤＨＡ−リゾホスファチジルコリンを含む通過液を回収して脂質組成物を得る工程（４）を含む。
【００３０】
工程（４）は、工程（３）で溶出した脂質を含む溶出液をそのまま、又は溶出液から好ましくは濃縮若しくは乾固した脂質を再び低級アルコールで溶解した溶液を、適当なカラムに充填したシリカゲルに流通させ、カラムの通過液画分を２−ＤＨＡ−リゾホスファチジルコリンを含む脂質組成物として回収する、シリカゲルカラムクロマトグラフィーであることが好ましい。シリカゲルは特別なものを必要とせず、生化学用途で通常使用されるものであればよい。またシリカゲルの量は、カラムに流通させる脂質の量及び溶液量に応じて適宜決定すればよく、例えば脂質の１〜２０倍量、好ましくは２〜１０倍量のシリカゲルが用いられる。
【００３１】
工程（４）においてシリカゲルに流通させる低級アルコールの濃度は、工程（３）で脂質を溶出させるときに使用するときのそれと同じであればよい。また、脂質を含む工程（３）の溶出液又は脂質を溶解した低級アルコール溶液をシリカゲルカラムに供した後、低級アルコール溶液をさらに流通させて通過液を回収することが好ましい。
【００３２】
シリカゲルからの通過液は、リゾホスファチジルコリンの含有量が７０重量％以上であり、かつ脂質中の脂肪酸の３５重量％以上がＤＨＡであるという特徴を有する脂質を含む。この溶液は適当な方法によって濃縮又は乾固させることができ、そのような濃縮物又は乾固物も、上記の特徴を有する脂質組成物として利用することができる。
【００３３】
本発明の第一の態様にかかる方法を経て製造される脂質組成物は、リゾホスファチジルコリン含有量が組成物重量に対して７０重量％以上であり、かつＤＨＡ含有量が脂質組成物の脂肪酸重量に対して３５重量％以上であるという特徴を有する。なお、本明細書において、組成物中の脂肪酸とは、脂質組成物に含まれる遊離脂肪酸及び脂質とエステル結合した状態の脂肪酸の両方を指す語として用いられる。
【００３４】
第一の態様の方法により製造される脂質組成物は、７０重量％以上、好ましくは７５重量％以上、より好ましくは８０重量％以上のリゾホスファチジルコリンを含む一方、コレステロール及び遊離脂肪酸の含有量の合計が１０重量％以下、好ましくは５重量％以下であり、ホスファチジルエタノールアミン及びリゾホスファチジルエタノールアミンの含有量の合計が２重量％以下、好ましくは１重量％以下、より好ましくは後述する一般的なリン脂質分析方法での検出限界以下である。また、脂質組成物は、その中に含まれる脂肪酸の３５重量％以上、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは６０重量％以上、さらにより好ましくは７０重量％以上がＤＨＡであるという特徴を有する。
【００３５】
リン脂質及び脂肪酸の含有量は、それぞれ当業者に公知の分析方法によって測定することができる。リン脂質の分析方法としては例えばシリカゲル系カラムを用いた液体クロマトグラフィー法、ＴＬＣ法及びＴＬＣ−ＦＩＤ（薄層クロマトグラフ−水素炎イオン化検出）法が、脂肪酸の定量方法としては例えばガスクロマトグラフィー法が挙げられる。
【００３６】
さらに、イカ類の皮又はサケの頭部から有機溶媒を用いた抽出によって回収される脂質混合物のように、工程（１）において原料として用いられる脂質混合物がＥＰＡを含有する場合、第一の態様の方法により製造される脂質組成物もＥＰＡを含有し得る。例えば、脂質組成物の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィー法で分析したときの脂肪酸の総和を１００重量％としたとき、ＤＨＡが３５重量％以上及びＥＰＡが１０〜２０重量％程を占め、パルミチン酸又はオレイン酸などの飽和脂肪酸は少量しか検出されない。
【００３７】
ＥＰＡは多価不飽和脂肪酸の一種であり、心筋梗塞、虚血性心疾患、動脈硬化、脳梗塞、脳卒中、血栓症高脂血症などの予防又は改善効果を有すること知られている。本発明の第一の態様の方法により製造される脂質組成物は、ＤＨＡ及びＥＰＡを含む、特にＤＨＡを２−ＤＨＡ−リゾホスファチジルコリンとして含むことで、ＤＨＡ及びＥＰＡが有している様々な生理活性を発揮するものと期待される。
【００３８】
また、本発明の第一の態様にかかる方法を経て製造される脂質組成物は、２５℃における臨界ミセル濃度が１０−４ｗｔ％オーダーであるという高い乳化能を有する。
【００３９】
本発明の第一の態様にかかる方法を経て製造される脂質組成物は、そのまま本発明の第二の態様にかかる脂質組成物に相当する。すなわち、本発明の第二の態様にかかる脂質組成物は、典型的には上記第一の態様にかかる製造法によって製造することができる脂質組成物、特に水産資源由来の脂質組成物である。
【００４０】
本発明の第二の態様にかかる脂質組成物は、リン脂質特にリゾリン脂質が求められる分野での使用に適し、典型的には医薬分野又は健康食品を含む食品分野において、有効成分又は乳化剤として用いることができる。
【００４１】
医薬分野においては、高純度リゾリン脂質、特に２−ＤＨＡ−リゾホスファチジルコリンの適応が有効な疾患に対する治療剤又は治療用組成物の有効成分として利用することができる他、懸濁剤、注射用懸濁剤、リポソーム製剤、軟膏その他の製剤の調製における脂質又は乳化剤として、他の薬剤及び又は薬学的に許容される賦形剤等と併せて利用することができる。
【００４２】
食品分野においては、脂質としてそのまま食用とすることができる他、食品製造のための乳化剤として利用することもでき、また高純度リゾリン脂質、特に２−ＤＨＡ−リゾホスファチジルコリンの生理活性を期待した機能性食品における有効成分としても利用することができる。食品の種類や形態に特に制限はなく、飲料、調味料を含む一般的な加工食品などの他、栄養補助食品、サプリメントなどにも添加して利用することができる。また、本発明の脂質組成物の食品中の含有量は、食品の形態及び脂質組成物の使用目的を損なわない範囲で、適宜調節すればよい。
【００４３】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
＜実施例１  本発明のカラム法によるイカ由来リゾリン脂質の精製＞
１）イカからのリン脂質分抽出及びリパーゼ処理
北海道産スルメイカの粉砕乾燥イカミール１９１ｋｇを９００Ｌの抽出槽に入れた。５５℃に保温した５ｍ３の撹拌翼付きタンクに約１０００Ｌの９５％イソプロパノールを入れ、この中の溶媒を抽出槽に循環させながら、４時間、抽出を行った。抽出液を回収後、残渣のイカミールを２００Ｌのイソプロパノールで洗浄し、先ほどの抽出液と一緒にした。抽出液を減圧下で脱溶媒することで、約５０Ｌのリン脂質を含む濃縮液（推定粗リン脂質含量１５．４ｋｇ）を得た。
【００４５】
この抽出液のうち、１／３を酵素反応なしの試料として後の試験に使うため、エバポレーターで乾固させ、約４．６ｋｇの粗リン脂質を調製した。残りの２／３の濃縮液に、３．０ｋｇのＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ由来のリリパーゼＡ−１０Ｄ（ナガセケムテックス株式会社，トリアシルグリセロールのｓｎ−１，３位に作用するリパーゼであるが、リン脂質の１位に作用するホスフォリパーゼＡ１活性を保持する）及び１００Ｌの水を加え、３０℃で一晩撹拌することでリパーゼ処理を行った。酵素処理後の液を４０ｋｇのブタノールで抽出し、減圧下で脱溶媒し、乾固させることで、イカ由来の粗リゾリン脂質約１０．８ｋｇを得た。
【００４６】
２）リゾリン脂質の精製
ガラス製カラム（内径３０ｍｍ×長さ４００ｍｍ）に強塩基イオン交換樹脂（ダイヤイオンＰＡ３０６Ｓ）１２０ｍｌを、別のガラス製カラム（内径３０ｍｍ×長さ４００ｍｍ）にシリカゲル（ＡＧＣ  ＳＩ−Ｔｅｃｈ．ＫＫ．  Ｄ−５０−１２０Ａ）１００ｍｌを充填し、それぞれのカラムに９７％エタノール２００ｍｌを流した。
【００４７】
１）で得たイカ由来粗リゾリン脂質の５０．７０ｇを２６０ｍｌの９７％エタノールに溶解し、この溶液を最初に強塩基性イオン交換樹脂のカラムに流し、リゾリン脂質を樹脂に吸着させた。樹脂体積の２倍量の９７％エタノールで洗浄した後、樹脂体積の２倍量の８５％エタノールでリゾリン脂質を溶出した。溶出液を更にシリカゲル（ＡＧＣ  ＳＩ−Ｔｅｃｈ．ＫＫ．Ｄ−５０−１２０Ａ）に流し、通過液を回収、濃縮することで、本発明の脂質組成物であるリゾリン脂質精製物２２．１３ｇを得た。
【００４８】
＜実施例２  本発明のカラム法によるイカ由来リゾリン脂質の精製＞
ガラス製カラム（内径３０ｍｍ×長さ４００ｍｍ）に強塩基イオン交換樹脂（ダイヤイオンＰＡ３０６Ｓ）１００ｍｌを、別のガラス製カラム（内径３０ｍｍ×長さ４００ｍｍ）にシリカゲル（ＡＧＣ  ＳＩ−Ｔｅｃｈ．ＫＫ．  Ｄ−１００−６０Ａ）１００ｍｌを充填し、それぞれのカラムに９７％エタノール２００ｍｌを流した。
【００４９】
実施例１の１）で得たイカ由来の粗リゾリン脂質３０．６８ｇを２００ｍｌの９７％エタノールに溶解し、この溶液を最初に強塩基イオン交換樹脂カラムに流し、リゾリン脂質を樹脂に吸着させた。樹脂体積の２倍量の９７％エタノールで洗浄した後、樹脂体積の２倍量の８５％エタノールでリゾリン脂質を溶出した。溶出液を更にシリカゲル（ＡＧＣ  ＳＩ−Ｔｅｃｈ．ＫＫ．  Ｄ−１００−６０Ａ）カラムに流し、通過液を回収、濃縮することで、本発明の脂質組成物であるリゾリン脂質精製物１３．８１ｇを得た。
【００５０】
＜実施例３  本発明のカラム法によるイカ由来リゾリン脂質の精製＞
ガラス製カラム（内径９５ｍｍ×長さ６００ｍｍ）に強塩基イオン交換樹脂（ダイヤイオンＰＡ３０６Ｓ）３０００ｍｌを、別のガラス製カラム（内径９５ｍｍ×長さ６００ｍｍ）にシリカゲル（関東化学Ｋ．Ｋシリカゲル６０−４０−５０μｍ）２５００ｍｌを充填し、それぞれのカラムに９７％エタノール３０００ｍｌを流した。
【００５１】
実施例１の１）で得たイカ由来の粗リゾリン脂質１００２ｇを４０００ｍｌの９７％エタノールで溶解し、この溶液を最初に強塩基イオン交換樹脂カラムに流し、リゾリン脂質を樹脂に吸着させた。樹脂体積の２倍量の９７％エタノールで洗浄した後、樹脂体積の２倍量の８５％エタノールでリゾリン脂質を溶出した。溶出液を更にシリカゲル（関東化学Ｋ．Ｋシリカゲル６０−４０−５０μｍ）カラムに流し、通過液を回収、濃縮することで、本発明の脂質組成物であるリゾリン脂質精製物３５２．０ｇを得た。
【００５２】
＜実施例４  本発明のカラム法によるイカ由来リゾリン脂質の精製＞
実施例１の１）と同様の方法で得たイカ由来粗リゾリン脂質１２５ｋｇを４００Ｌの９７％エタノールに溶解させた後、５〜１０％量の活性炭を加えて室温で３０分間撹拌した。珪藻土プレコートしたフィルタープレスを用いてこの混合液をろ過して活性炭を取り除き、ろ液を回収した。
【００５３】
５００Ｌの強塩基イオン交換樹脂（ダイヤイオンＰＡ３０６Ｓ）を充填したカラムに回収したろ液を流し、リゾリン脂質を樹脂に吸着させた。樹脂体積の２倍量の９７％エタノールで洗浄した後、樹脂体積の２倍量の８５％エタノールでリゾリン脂質を溶出した。溶出液を更にシリカゲル（ＡＧＣ  ＳＩ−Ｔｅｃｈ．ＫＫ．  Ｄ−１００−６０Ａ）カラムに流し、通過液を回収、濃縮することで、本発明の脂質組成物であるリゾリン脂質精製物約５０ｋｇを得た。
【００５４】
＜比較例  溶媒分配法によるイカ由来リゾリン脂質の精製＞
実施例１の１）で得たイカ由来の粗リゾリン脂質３３５ｍｇにｎ−ヘキサン：エタノール：水（体積比で１０：１：１）８ｍｌを加えて分層し、ｎ−ヘキサン層を除去して１回分配とした。次にｎ−ヘキサンを３．５ｍｌ加えて分層し、ｎ−ヘキサン層を除去した。同様の工程をｎ−ヘキサン３ｍｌ、２．５ｍｌ、２ｍｌと繰り返し（液相の粘度が高くなり分層しない場合は少量のエタノールを添加）、５回分配した後に得られたエタノール・水層を回収、濃縮することで、溶媒分配法によるリゾリン脂質精製物を得た。
ここで、比較として、溶媒で１回又は３回分画したリゾリン脂質精製物も調製した。
【００５５】
＜試験例１  イカ由来リン脂質の脂肪酸組成及び脂質クラス組成＞
実施例及び比較例で得たイカ由来リゾリン脂質精製物、並びにその調製工程の各試料を２規定のメタノール性水酸化ナトリウム及び２規定のメタノール性塩化水素を用いてメチルエステル化した後、ガスクロマトグラフィー（カラム：ＧカラムＧ−３００、ＰＥＧ−２０Ｍ、４０ｍ×１．２ｍｍ、膜厚０．５μｍ、財団法人化学物質評価研究機構；装置名：ＧＣ−３５３、ジーエルサイエンス株式会社；カラム温度：１９０℃；インジェクション温度：２５０℃；検出器温度：２５０℃；キャリアガス：ヘリウム１０ｍｌ／ｍｉｎ；検出器：ＦＩＤ）により脂肪酸組成を分析した。
【００５６】
また、粗リン脂質（実施例１の１）の酵素処理前試料）及び粗リゾリン脂質（実施例１の１）の酵素処理後試料）をＴＬＣで展開し、ホスファチジルコリン（ＰＣ）又はリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）のスポットを掻き取り法で精製したＰＣ試料、ＬＰＣ試料についても、同様に脂肪酸組成の分析を行った。
【００５７】
結果を表１に重量％で示す。カラム法での精製により、多価不飽和脂肪酸の含有量は増加した。また、ＰＣ試料とＬＰＣ試料を比較したところ、酵素処理により多価不飽和脂肪酸、特にＤＨＡの含有量が２倍近くに増加していた。
【００５８】
【表１】
0006763521.tif 000002
＊１  リン脂質に結合している脂肪酸全ての合計値
＊２  遊離脂肪酸とリン脂質に結合している脂肪酸全てとの合計値
【００５９】
また、これらの試料の脂質クラス組成をイアトロスキャン（ＬＳＩメディエンス株式会社）を用いてＴＬＣ−ＦＩＤ法により分析した。試料を１％濃度となるようにクロロホルム：メタノール（２：１，ｖ／ｖ）に溶解後、５マイクロをクロマトロッドＳＩＩＩにスポットした。クロロホルム：メタノール：水＝４５：２０：２（ｖ／ｖ）で２回展開後（４５分×２回）、イアトロスキャン（検出器：ＦＩＤ）で分析した。得られたデーターは、Ｃ−Ｈ結合を有する炭素数に比例することから、その炭素数と平均分子量で補正し、重量％に換算した。
【００６０】
結果を表２に重量％で示す。従来法である溶媒分画法では、分画を５回繰り返してもホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）が残存したのに対し、本発明のカラム法では、ＰＥ及びＬＰＥは検出限界以下に、コレステロール＋脂肪酸の量も従来法の半分以下に減少し、ＬＰＣの比率は８０％超まで高められた。表中には実施例４のリゾリン脂質精製物の分析値が示されているが、実施例１〜３のリゾリン脂質精製物も同様の組成であった。
【００６１】
【表２】
0006763521.tif 000003
【００６２】
＜試験例２  イカ由来リゾリン脂質精製物の乳化安定性の評価＞
実施例４及び比較例で得たイカ由来リゾリン脂質精製物を乳化剤として用いて乳化液状ドレッシング様サラダ調味料を作成し、その乳化安定性を評価した。乳化剤の量が０．２５ｇ、総量が１．３ｇとなるように各乳化剤を水と混合した後、混合物を一晩放置して溶解させた。使用した乳化剤の種類及び水の配合量を表３に示す。総ＰＬ（リン脂質）含量は、イアトロスキャンで測定した。
【００６３】
【表３】
0006763521.tif 000004
【００６４】
この混合物に米酢１．５ｇと食塩０．２ｇを添加後、７ｇのチリ産養殖銀鮭ミール油（市販の銀鮭を凍結乾燥、破砕後、ヘキサン・イソプロパノール（２：１）で抽出して油分を回収し、脱酸したもの）を３回に分けて添加しながらホモゲナイズ（ホモジナイザー  ＶＨ−１０、シャフトジェネレーター  Ｓ１０Ｎ−１０Ｇ（いずれもアズワン株式会社））した。１１，４００ｒｐｍでのホモゲナイズにより乳化させた後，さらに２０，４５０ｒｐｍで３０秒間のホモゲナイズにより追加乳化させた。窒素ガス発生器で窒素置換後、室温で２時間放置し、さらに８０℃で１４日間放置し、乳化が壊れ始める時間と、乳化が完全に壊れる時間とを調べた。８０℃での加熱は、乳化を早く壊すための加速試験である。
【００６５】
結果を表４に示す。本発明のカラム法で精製したリゾリン脂質は、大豆由来の市販リゾレシチンを含む既存乳化剤、及び溶媒分画法による精製品よりも遥かに乳化安定性に優れていた。
【００６６】
【表４】
0006763521.tif 000005
【００６７】
＜試験例３  リゾリン脂質精製物の乳化特性の評価＞
実施例１の１）と同様の方法でサケ頭部からリン脂質を含む油分を調製して酵素処理を行い、ＬＰＣとＬＰＥを同程度に含むサケ由来の粗リゾリン脂質（うちＬＰＣの構成脂肪酸としてＤＨＡ５４．３重量％、ＥＰＡ１５．３重量％を含む）を得た。この粗リゾリン脂質を実施例１の２）及び実施例２〜４と同様にカラム法による精製に供し、主にＬＰＣからなるサケ由来リゾリン脂質精製物を得た。
【００６８】
このサケ由来粗リゾリン脂質及びリゾリン脂質精製物、並びに実施例４で得たイカ由来リゾリン脂質精製物の乳化特性を評価するため、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を、協和界面化学の表面張力計ＣＡＶＰ−Ａ３を用いて、吊板法により２５℃で測定した。ＣＭＣは、ミセル形成に必要な最低限の界面活性剤濃度であり、値が小さいほど界面活性剤としての能力が高いことを示す。
【００６９】
横軸に乳化剤濃度（重量％）、縦軸に表面張力（ｍＮ／ｍ）を取ったグラフの屈曲点をＣＭＣとして算出した。１つの乳化剤について屈曲点が複数ある場合、最も小さい屈曲点を評価に用いた。
【００７０】
結果を表５に示す。未精製のサケ由来粗リゾリン脂質のＣＭＣは既存乳化剤であるショ糖脂肪酸エステルのＣＭＣよりも１００倍以上大きい値を示した。一方、サケ由来リゾリン脂質精製物及びイカ由来リゾリン脂質精製物のＣＭＣはいずれもショ糖脂肪酸エステルのＣＭＣと同レベルであったことから、本発明のカラム法により得られたリゾリン脂質精製物はいずれも優れた乳化特性を示すことが確認された。
【表５】
0006763521.tif 000006