(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）の複合体：
Ａｂ−（ＤＬ）ｐ  （Ｉ）
であって、式中：
Ａｂは、ＡＸＬに結合する抗体であり；
ＤＬは、以下
【化１】
0006671555.tif 000053
であり、式中：
Ｘは、単結合、−ＣＨ２−、及び−Ｃ２Ｈ４−からなる群より選択され；
ｎは、１〜８であり；
ｍは、０または１であり；
Ｒ７は、メチルまたはフェニルであり；
Ｃ２とＣ３の間に二重結合が存在する場合、Ｒ２は、以下からなる群より選択され：
（ｉａ）ハロ、ニトロ、シアノ、エーテル、カルボキシ、エステル、Ｃ１−７アルキル、Ｃ３−７ヘテロシクリル、及びビス−オキシ−Ｃ１−３アルキレンを含む群より選択される１つまたは複数の置換基により任意選択で置換された、Ｃ５−１０アリール基、ここで「アルキル」という用語は、以下のサブクラス、即ち、アルケニル、アルキニル及びシクロアルキルを包含し、ここで「シクロアルキル」という用語は、飽和もしくは不飽和単環式炭化水素化合物を包含する；
（ｉｂ）Ｃ１−５飽和脂肪族アルキル；
（ｉｃ）Ｃ３−６飽和シクロアルキル；
（ｉｄ）
【化２】
0006671555.tif 000054
、式中、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３はそれぞれ、独立して、Ｈ、Ｃ１−３飽和アルキル、Ｃ２−３アルケニル、Ｃ２−３アルキニル、及びシクロプロピルから選択され、ただし、前記Ｒ２基の炭素原子の合計数は、５以下であり；
（ｉｅ）
【化３】
0006671555.tif 000055
、式中、Ｒ２５ａ及びＲ２５ｂの一方は、Ｈであり、他方は、フェニル、このフェニルは、ハロ、メチル、メトキシから選択される基により任意選択で置換され；ピリジル；及びチオフェニルから選択され；ならびに
（ｉｆ）
【化４】
0006671555.tif 000056
、式中、Ｒ２４は、以下から選択され：Ｈ；Ｃ１−３飽和アルキル；Ｃ２−３アルケニル；Ｃ２−３アルキニル；シクロプロピル；フェニル、このフェニルは、ハロ、メチル、メトキシから選択される基により任意選択で置換され；ピリジル；及びチオフェニルから選択され；
Ｃ２とＣ３の間に単結合が存在する場合、Ｒ２は、
【化５】
0006671555.tif 000057
であり、式中、Ｒ２６ａ及びＲ２６ｂは、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃ１−４飽和アルキル、Ｃ２−３アルケニルから選択され、これらアルキル及びアルケニル基は、Ｃ１−４アルキルアミド及びＣ１−４アルキルエステルから選択される基により任意選択で置換され；あるいは、Ｒ２６ａ及びＲ２６ｂの一方がＨである場合、他方は、ニトリル及びＣ１−４アルキルエステルから選択され；
Ｃ２’とＣ３’の間に二重結合がある場合、Ｒ１２は、以下からなる群より選択され：
（ｉｉａ）ハロ、ニトロ、シアノ、エーテル、カルボキシ、エステル、Ｃ１−７アルキル、Ｃ３−７ヘテロシクリル、及びビス−オキシ−Ｃ１−３アルキレンを含む群より選択される１つまたは複数の置換基により任意選択で置換された、Ｃ５−１０アリール基、ここで「アルキル」という用語は、以下のサブクラス、即ち、アルケニル、アルキニル及びシクロアルキルを包含し、ここで「シクロアルキル」という用語は、飽和もしくは不飽和単環式炭化水素化合物を包含する；
（ｉｉｂ）Ｃ１−５飽和脂肪族アルキル；
（ｉｉｃ）Ｃ３−６飽和シクロアルキル；
（ｉｉｄ）
【化６】
0006671555.tif 000058
、式中、Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３はそれぞれ、独立して、Ｈ、Ｃ１−３飽和アルキル、Ｃ２−３アルケニル、Ｃ２−３アルキニル、及びシクロプロピルから選択され、ただし、前記Ｒ１２基の炭素原子の合計数は、５以下であり；
（ｉｉｅ）
【化７】
0006671555.tif 000059
、式中、Ｒ３５ａ及びＲ３５ｂの一方は、Ｈであり、他方は、フェニル、このフェニルは、ハロ、メチル、メトキシから選択される基により任意選択で置換され；ピリジル；及びチオフェニルから選択され；ならびに
（ｉｉｆ）
【化８】
0006671555.tif 000060
、式中、Ｒ２４は、Ｈ；Ｃ１−３飽和アルキル；Ｃ２−３アルケニル；Ｃ２−３アルキニル；シクロプロピル；フェニル、このフェニルは、ハロ、メチル、メトキシから選択される基により任意選択で置換され；ピリジル；及びチオフェニルから選択され；
Ｃ２’とＣ３’の間に単結合が存在する場合、Ｒ１２は、
【化９】
0006671555.tif 000061
であり、式中、Ｒ３６ａ及びＲ３６ｂは、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃ１−４飽和アルキル、Ｃ２−３アルケニルから選択され、これらアルキル及びアルケニル基は、Ｃ１−４アルキルアミド及びＣ１−４アルキルエステルから選択される基により任意選択で置換され；あるいは、Ｒ３６ａ及びＲ３６ｂの一方がＨである場合、他方は、ニトリル及びＣ１−４アルキルエステルから選択され；
ならびにｐは、１〜８である、
前記複合体。
【請求項２】
Ｘは、−ＣＨ２−である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
ｎは、１〜４である、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
ｎは、２である、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
Ｃ２とＣ３の間には二重結合が存在し、かつＲ２は、Ｃ１−５飽和脂肪族アルキル基である、請求項１から４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
Ｒ２は、メチル、エチル、またはプロピルである、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
Ｃ２とＣ３の間には二重結合が存在し、かつＲ２は、
（ａ）１つ〜３つの置換基を有するフェニルであって、前記置換基は、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、シアノ、ビス−オキシ−メチレン、メチルピペラジニル、モルホリノ、及びメチルチオフェニルから選択されてもよい、フェニル、又は
（ｂ）シクロプロピル、又は
（ｃ）以下の式の基：
【化１０】
0006671555.tif 000062
前記Ｒ２基の炭素原子の合計数は、３以下である、又は
（ｄ）以下の基：
【化１１】
0006671555.tif 000063
、又は
（ｅ）以下の式の基：
【化１２】
0006671555.tif 000064
Ｒ２４は、Ｈ及びメチルから選択される、
である、請求項１から４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８】
Ｃ２とＣ３の間には単結合が存在し、Ｒ２は、
【化１３】
0006671555.tif 000065
であり、かつ
（ａ）Ｒ２６ａ及びＲ２６ｂは、両方ともＨであるか、又は
（ｂ）Ｒ２６ａ及びＲ２６ｂは、両方ともメチルであるか、又は
（ｃ）Ｒ２６ａ及びＲ２６ｂの一方はＨであり、かつ他方は、Ｃ１−４飽和アルキル、Ｃ２−３アルケニルから選択され、これらアルキル及びアルケニル基は、任意選択で置換される、請求項１から４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９】
Ｃ２’とＣ３’の間には二重結合が存在し、かつＲ１２は、Ｃ１−５飽和脂肪族アルキル基である、請求項１から８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１０】
Ｒ１２は、メチル、エチル、またはプロピルである、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
Ｃ２’とＣ３’の間には二重結合が存在し、かつＲ１２は、
（ａ）１つ〜３つの置換基を有するフェニルであって、前記置換基は、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、シアノ、ビス−オキシ−メチレン、メチルピペラジニル、モルホリノ、及びメチルチオフェニルから選択されてもよいフェニル、又は
（ｂ）シクロプロピル、又は
（ｃ）以下の式の基：
【化１４】
0006671555.tif 000066
前記Ｒ１２基の炭素原子の合計数は、３以下である、又は
（ｄ）以下の基：
【化１５】
0006671555.tif 000067
、又は
（ｅ）以下の式の基：
【化１６】
0006671555.tif 000068
Ｒ３４は、Ｈ及びメチルから選択される、
である、請求項１から８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１２】
Ｃ２’とＣ３’の間には単結合が存在し、Ｒ１２は
【化１７】
0006671555.tif 000069
であり、かつ
（ａ）Ｒ３６ａ及びＲ３６ｂは、両方ともＨであるか、又は
（ｂ）Ｒ３６ａ及びＲ３６ｂは、両方ともメチルであるか、又は
（ｃ）Ｒ３６ａ及びＲ３６ｂの一方はＨであり、かつ他方は、Ｃ１−４飽和アルキル、Ｃ２−３アルケニルから選択され、これらアルキル及びアルケニル基は、任意選択で置換される、請求項１から８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１３】
前記抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を持つＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号６のアミノ酸配列を持つＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を持つＶＨ  ＣＤＲ１を含むＶＨドメインを含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１４】
前記抗体は、配列番号１の配列を有するＶＨドメインを含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１５】
前記抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を持つＶＬ  ＣＤＲ３、配列番号９のアミノ酸配列を持つＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を持つＶＬ  ＣＤＲ１を含むＶＬドメインを含む、請求項１から１４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１６】
前記抗体は、配列番号２の配列を有するＶＨドメインを含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１７】
前記抗体は、配列番号３または配列番号２４の配列を有する重鎖を含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１８】
前記抗体は、配列番号４の配列を有する軽鎖との対形成を含む、請求項１から１７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか１項に定義されるとおりの複合体の混合物を含む組成物であって、前記複合体の混合物中の抗体あたりの平均薬物担持数は、１〜４である、前記組成物。
【請求項２０】
治療に使用するための、請求項１から１８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２１】
対象における増殖性疾患の治療に使用するための、請求項１から１８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２２】
前記疾患は、がんである、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２３】
疾患またはがんが、ＡＸＬ＋ｖｅとＡＸＬ−ｖｅ細胞との両方を含む新生物の存在によって特徴づけられる、請求項２１または２２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２４】
（ｉ）対象において、ＡＸＬ＋ｖｅとＡＸＬ−ｖｅ細胞との両方を含む新生物の存在を同定することと、
（ｉｉ）前記対象に前記抗体薬物複合体を投与することと、
を含む、増殖性疾患を治療するための方法における使用のための請求項１から１８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２５】
請求項１から１８のいずれか１項に記載の複合体と、薬学上許容される希釈剤、キャリア、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２６】
さらに、治療上有効量の化学療法薬を含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年２月８日出願のＧＢ１７０２０２９．８及びＧＢ１７０２０３１．４、ならびに２０１７年１１月３０日出願のＧＢ１７１９９０６．８の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、抗体とのリンカーという形で易分解性保護基を有するピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）に関する。
【背景技術】
【０００３】
ピロロベンゾジアゼピン
ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）の中には、ＤＮＡの特定配列を認識して結合する能力を有するものがあり、好適な配列はＰｕＧＰｕである。最初のＰＢＤ抗腫瘍抗生物質であるアントラマイシンは、１９６５に発見された（Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＡＭ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ８７，  ５７９３−５７９５（１９６５）、Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＡＭ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ８７，  ５７９１−５７９３（１９６５））。それ以来、天然に存在するＰＢＤがいくつか報告されており、多様な類似体を合成する１０を超える合成経路が開発されている（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  １９９４，  ４３３−４６５（１９９４）；Ａｎｔｏｎｏｗ，  Ｄ．  ａｎｄ  Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，  Ｄ．Ｅ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ２０１１  １１１（４），  ２８１５−２８６４）。このファミリーに属するものとして、アベイマイシン（Ｈｏｃｈｌｏｗｓｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ４０，  １４５−１４８（１９８７））、チカマイシン（Ｋｏｎｉｓｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ３７，  ２００−２０６（１９８４）），  ＤＣ−８１（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｐａｔｅｎｔ  ５８−１８０  ４８７；Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔ．，  ２６，  ７６７−７７２（１９９０）；Ｂｏｓｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ４８，  ７５１−７５８（１９９２））、マゼトラマイシン（Ｋｕｍｉｎｏｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ３３，  ６６５−６６７（１９８０））、ネオトラマイシンＡ及びＢ（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ２９，  ９３−９６（１９７６））、ポロトラマイシン（Ｔｓｕｎａｋａｗａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ４１，  １３６６−１３７３（１９８８））、プロトラカルシン（Ｓｈｉｍｉｚｕ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ２９，  ２４９２−２５０３（１９８２）、Ｌａｎｇｌｅｙ  ａｎｄ  Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ５２，  ９１−９７（１９８７））、シバノミシン（ＤＣ−１０２）（Ｈａｒａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ４１，  ７０２−７０４（１９８８）；Ｉｔｏｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ４１，  １２８１−１２８４（１９８８））、シビロマイシン（Ｌｅｂｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＡＭ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １１０，  ２９９２−２９９３（１９８８））、ならびにトママイシン（Ａｒｉｍａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ２５，  ４３７−４４４（１９７２））が挙げられる。ＰＢＤは、以下の一般式のものである。
【化１】
0006671555.tif 000002
【０００４】
ＰＢＤは、その芳香環Ａ及びピロロ環Ｃの両方で、置換基の個数、種類、及び位置が異なるとともに、環Ｃの飽和度も異なる。環Ｂでは、Ｎ１０−Ｃ１１の位置が、イミン（Ｎ＝Ｃ）、カルビノールアミン（ＮＨ−ＣＨ（ＯＨ））、またはカルビノールアミンメチルエーテル（ＮＨ−ＣＨ（ＯＭｅ））のいずれかになっており、ここがＤＮＡアルキル化の原因となる求電子中心である。既知の天然産物は全て、キラルなＣ１１ａ位に（Ｓ）型配置を有し、このため、ＰＢＤを環Ｃから環Ａに向かって見たときに、これらは右巻きになっている。このことが、ＰＢＤに、Ｂ型ＤＮＡの副溝との螺旋性一致（ｉｓｏｈｅｌｉｃｉｔｙ）に適切な三次元形状を与え、その結果、結合部位でのぴったりとした一致をもたらす（Ｋｏｈｎ，  Ｉｎ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ＩＩＩ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．３−１１（１９７５）；Ｈｕｒｌｅｙ  ａｎｄ  Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，  Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．，  １９，  ２３０−２３７（１９８６））。副溝で付加体を形成するＰＢＤの能力により、ＰＢＤはＤＮＡプロセシングに干渉することができ、したがって、ＰＢＤを抗腫瘍剤として使用することが可能となる。
【０００５】
ピロロベンゾジアゼピン化合物の１種が、化合物１としてＧｒｅｇｓｏｎらにより（Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９９９，  ７９７−７９８）に、及び化合物４ａとしてＧｒｅｇｓｏｎらにより（Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２００１，  ４４，  １１６１−１１７４）に記載されている。この化合物は、ＳＧ２０００としても知られる、以下に示すものである：
【化２】
0006671555.tif 000003
。
【０００６】
ＷＯ２００７／０８５９３０は、抗体などの細胞結合剤と接続するためのリンカー基を有する二量体ＰＢＤ化合物を記載している。このリンカーは、二量体の単量体ＰＢＤ単位を連結する架橋に存在する。
【０００７】
抗体などの細胞結合剤と接続するためのリンカー基を有する二量体ＰＢＤ化合物は、ＷＯ２０１１／１３０６１３及びＷＯ２０１１／１３０６１６に記載されている。これらの化合物におけるリンカーは、Ｃ２位を介してＰＢＤ核に結合されており、一般に、リンカー基に酵素が作用することによって切断される。ＷＯ２０１１／１３０５９８では、これらの化合物におけるリンカーは、ＰＢＤ核の利用可能なＮ１０位のうちの１つに結合されており、一般に、リンカー基に酵素が作用することによって切断される。
【０００８】
抗体薬物複合体
がん、免疫不全、及び血管原性障害の患者の標的治療のための抗体療法が、確立されている（Ｃａｒｔｅｒ，  Ｐ．（２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：３４３−３５７）。がん治療における、細胞傷害剤または細胞分裂阻害剤、すなわち腫瘍細胞を殺傷または阻害する薬物を局所送達するための、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、すなわち免疫複合体の使用は、薬物部分を腫瘍に送達し、腫瘍の細胞内に蓄積させることを目的とするが、こうした薬剤を複合体化させずに全身投与すると、許容不能なレベルの毒性を正常細胞にもたらす可能性がある（Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｅｘｐｅｒｔ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ６（３）：２８１−２９１；Ｋｏｖｔｕｎ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６６（６）：３２１４−３１２１；Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６６（４）：２３２８−２３３７；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３（９）：１１３７−１１４５；Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｊ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５：５４３−５４９；Ｈａｍａｎｎ  Ｐ．（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｐａｔｅｎｔｓ  １５（９）：１０８７−１１０３；Ｐａｙｎｅ，  Ｇ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２；Ｔｒａｉｌ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ５２：３２８−３３７；Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５−６１４）。
【０００９】
そのため、最小限の毒性で最大限の効果が求められている。ＡＤＣを設計及び改良する努力は、薬物の作用機序、薬物結合、薬物／抗体比（担持数）、及び薬物放出特性だけでなく、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の選択性にも向けられている（Ｊｕｎｕｔｕｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８ｂ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ２６（８）：９２５−９３２；Ｄｏｒｎａｎ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１４（１３）：２７２１−２７２９；ＵＳ７５２１５４１；ＵＳ７７２３４８５；ＷＯ２００９／０５２２４９；ＭｃＤｏｎａｇｈ（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌ．  １９（７）：２９９−３０７；Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  １７：１１４−１２４；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６６（８）：１−８；Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １１：８４３−８５２；Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４８：１３４４−１３５８；Ｈａｍｂｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １０：７０６３−７０７０）。薬物部分は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、プロテアソーム、及び／またはトポイソメラーゼの阻害をはじめとする機構により、それらの細胞毒性及び細胞分裂阻害効果を付与することができる。細胞毒性薬によっては、巨大抗体またはタンパク質受容体リガンドと複合体形成した場合に、不活化または活性低下する傾向がある。
【００１０】
本発明者らは、特定のＰＢＤ二量体抗体複合体を開発した。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の第一の態様は、式（Ｉ）の複合体を提供し：
Ａｂ−（ＤＬ）ｐ  （Ｉ）
式中：
Ａｂは、ＡＸＬに結合する抗体であり；
ＤＬは、以下
【化３】
0006671555.tif 000004
であり、式中：
Ｘは、単結合、−ＣＨ２−、及び−Ｃ２Ｈ４−からなる群より選択され；
ｎは、１〜８であり；
ｍは、０または１であり；
Ｒ７は、メチルまたはフェニルいずれかであり；
Ｃ２とＣ３の間に二重結合がある場合、Ｒ２は、以下からなる群より選択され：
（ｉａ）Ｃ５−１０アリール基、この基は、以下からなる群より選択される１つまたは複数の置換基により任意選択で置換され：ハロ、ニトロ、シアノ、エーテル、カルボキシ、エステル、Ｃ１−７アルキル、Ｃ３−７ヘテロシクリル、及びビス−オキシ−Ｃ１−３アルキレン；
（ｉｂ）Ｃ１−５飽和脂肪族アルキル；
（ｉｃ）Ｃ３−６飽和シクロアルキル；
（ｉｄ）
【化４】
0006671555.tif 000005
、式中、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３はそれぞれ、独立して、Ｈ、Ｃ１−３飽和アルキル、Ｃ２−３アルケニル、Ｃ２−３アルキニル、及びシクロプロピルから選択され、ただし、Ｒ１２基の炭素原子の合計数は、５以下であり；
（ｉｅ）
【化５】
0006671555.tif 000006
、式中、Ｒ２５ａ及びＲ２５ｂのいずれか一方は、Ｈであり、他方は、以下から選択され：フェニル、このフェニルは、ハロ、メチル、メトキシから選択される基により任意選択で置換され；ピリジル；及びチオフェニル；ならびに
（ｉｆ）
【化６】
0006671555.tif 000007
、式中、Ｒ２４は、以下から選択され：Ｈ；Ｃ１−３飽和アルキル；Ｃ２−３アルケニル；Ｃ２−３アルキニル；シクロプロピル；フェニル、このフェニルは、ハロ、メチル、メトキシから選択される基により任意選択で置換され；ピリジル；及びチオフェニル；
Ｃ２とＣ３の間に単結合がある場合、Ｒ２は、以下
【化７】
0006671555.tif 000008
であり、式中、Ｒ２６ａ及びＲ２６ｂは、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃ１−４飽和アルキル、Ｃ２−３アルケニルから選択され、これらアルキル及びアルケニル基は、Ｃ１−４アルキルアミド及びＣ１−４アルキルエステルから選択される基により任意選択で置換され；あるいは、Ｒ２６ａ及びＲ２６ｂの一方がＨである場合、他方は、ニトリル及びＣ１−４アルキルエステルから選択され；
Ｃ２’とＣ３’の間に二重結合がある場合、Ｒ１２は、以下からなる群より選択され：
（ｉａ）Ｃ５−１０アリール基、この基は以下からなる群より選択される１つまたは複数の置換基により任意選択で置換され：ハロ、ニトロ、シアノ、エーテル、カルボキシ、エステル、Ｃ１−７アルキル、Ｃ３−７ヘテロシクリル、及びビス−オキシ−Ｃ１−３アルキレン；
（ｉｂ）Ｃ１−５飽和脂肪族アルキル；
（ｉｃ）Ｃ３−６飽和シクロアルキル；
（ｉｄ）
【化８】
0006671555.tif 000009
、式中、Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３はそれぞれ、独立して、Ｈ、Ｃ１−３飽和アルキル、Ｃ２−３アルケニル、Ｃ２−３アルキニル、及びシクロプロピルから選択され、ただし、Ｒ１２基の炭素原子の合計数は、５以下であり；
（ｉｅ）
【化９】
0006671555.tif 000010
、式中、Ｒ３５ａ及びＲ３５ｂの一方は、Ｈであり、他方は、以下から選択され：フェニル、このフェニルは、ハロ、メチル、メトキシから選択される基により任意選択で置換され；ピリジル；及びチオフェニル；ならびに
（ｉｆ）
【化１０】
0006671555.tif 000011
、式中、Ｒ２４は、以下から選択され：Ｈ；Ｃ１−３飽和アルキル；Ｃ２−３アルケニル；Ｃ２−３アルキニル；シクロプロピル；フェニル、このフェニルは、ハロ、メチル、メトキシから選択される基により任意選択で置換され；ピリジル；及びチオフェニル；
Ｃ２’とＣ３’の間に単結合が存在する場合、Ｒ１２は、以下
【化１１】
0006671555.tif 000012
であり、式中、Ｒ３６ａ及びＲ３６ｂは、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃ１−４飽和アルキル、Ｃ２−３アルケニルから選択され、これらアルキル及びアルケニル基は、Ｃ１−４アルキルアミド及びＣ１−４アルキルエステルから選択される基により任意選択で置換され；あるいは、Ｒ３６ａ及びＲ３６ｂの一方がＨである場合、他方は、ニトリル及びＣ１−４アルキルエステルから選択され；
ならびにｐは、１〜８である。
【００１２】
これらの複合体は、スルホンアミド部分を含有しない類似複合体に比べて、良好な活性、及び驚くべき忍容性を示すことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】複合体のＡＸＬに対する結合を示す；
【図２】複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す；
【図３】複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す；
【図４】複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す；
【図５】患者由来の異種移植片に対する複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す；
【図６】別の患者由来の異種移植片に対する複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す。
【００１４】
本発明は、以下に定義されるとおり、リンカーが、Ｎ１０位を通じてＰＢＤ部分の一方と抗体とを接続している、ＰＢＤ二量体を提供する。
【００１５】
本発明は、対象の好適な部位にＰＢＤ化合物を提供する用途に適している。本複合体は、リンカーのどの部分も保持しない活性ＰＢＤ化合物を放出することを可能にする。ＰＢＤ化合物の反応性に影響を及ぼす可能性がある残存基は存在しない。すなわち、式（Ｉ）の複合体は、化合物ＲｅｌＡを放出すると思われる：
【化１２】
0006671555.tif 000013
【００１６】
本発明のＰＢＤ二量体と抗体の間の特定結合は、好ましくは、細胞外で安定である。細胞中に輸送または送達する前、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、好ましくは、安定かつ未変化のままである、すなわち、抗体は、薬物部分と連結したままである。リンカーは、標的細胞の外では安定であり、細胞内ではある有効速度で切断される可能性がある。有効なリンカーは、以下のものになる：（ｉ）抗体の特異的結合性を維持する；（ｉｉ）複合体または薬物部分の細胞内送達を可能にする；（ｉｉｉ）複合体が、その標的部位に送達されるまたは輸送されるまで、安定かつ未変化のままである、すなわち切断されない；ならびに（ｉｖ）ＰＢＤ薬物部分の細胞毒性、細胞殺傷効果、または細胞分裂阻害効果を維持する。ＡＤＣの安定性は、標準的な分析技法、例えば、質量分析法、ＨＰＬＣ、及び分離／分析技法ＬＣ／ＭＳなどにより測定可能である。
【００１７】
式ＲｅｌＡの化合物の送達は、カテプシンなどの酵素が、リンカー基に、詳細にはバリン−アラニンジペプチド部分に作用することにより、式（Ｉ）の複合体の所望の活性化部位で達成される。
【００１８】
定義
置換基
「任意選択で置換された」という用語は、本明細書中使用される場合、無置換の可能性も、置換されている可能性もある親基に関する。
【００１９】
特に記載がない限り、「置換された」という用語は、本明細書中使用される場合、１つまたは複数の置換基を有する親基に関する。「置換基」という用語は、本明細書中、従来の意味で使用され、親基と共有結合した、または妥当であれば、親基と融合した化学部分を示す。多種多様な置換基が周知であり、それらの形成及び様々な親基への導入の方法も周知である。
【００２０】
置換基の例を、以下でより詳細に説明する。
【００２１】
Ｃ１−１２アルキル：「Ｃ１−１２アルキル」という用語は、本明細書中使用される場合、１〜１２個の炭素原子を有する炭化水素化合物の炭素原子から水素原子を外すことにより得られる、一価部分に関し、炭化水素化合物は、脂肪族でも脂環式でも可能であり、飽和でも不飽和でも可能である（例えば、部分不飽和、完全不飽和など）。「Ｃ１−４アルキル」という用語は、本明細書中使用される場合、１〜４個の炭素原子を有する炭化水素化合物の炭素原子から水素原子を外すことにより得られる、一価部分に関し、炭化水素化合物は、脂肪族でも脂環式でも可能であり、飽和でも不飽和でも可能である（例えば、部分不飽和、完全不飽和など）。すなわち、「アルキル」という用語は、以下に説明される、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルなどのサブクラスを包含する。
【００２２】
飽和アルキル基の例として、メチル（Ｃ１）、エチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、及びヘプチル（Ｃ７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
飽和直鎖アルキル基の例として、メチル（Ｃ１）、エチル（Ｃ２）、ｎ−プロピル（Ｃ３）、ｎ−ブチル（Ｃ４）、ｎ−ペンチル（アミル）（Ｃ５）、ｎ−ヘキシル（Ｃ６）、及びｎ−ヘプチル（Ｃ７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
飽和分岐鎖アルキル基の例として、イソプロピル（Ｃ３）、イソブチル（Ｃ４）、ｓｅｃ−ブチル（Ｃ４）、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｃ４）、イソペンチル（Ｃ５）、及びネオペンチル（Ｃ５）が挙げられる。
【００２５】
Ｃ２−１２アルケニル：「Ｃ２−１２アルケニル」という用語は、本明細書中使用される場合、１つまたは複数の炭素炭素二重結合を有するアルキル基に関する。
【００２６】
不飽和アルケニル基の例として、エテニル（ビニル、−ＣＨ＝ＣＨ２）、１−プロペニル（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３）、２−プロペニル（アリル、−ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ２）、イソプロペニル（１−メチルビニル、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２）、ブテニル（Ｃ４）、ペンテニル（Ｃ５）、及びヘキセニル（Ｃ６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
Ｃ２−１２アルキニル：「Ｃ２−１２アルキニル」という用語は、本明細書中使用される場合、１つまたは複数の炭素炭素三重結合を有するアルキル基に関する。
【００２８】
不飽和アルキニル基の例としてエチニル（−Ｃ≡ＣＨ）及び２−プロピニル（プロパルギル、−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
Ｃ３−１２シクロアルキル：「Ｃ３−１２シクロアルキル」という用語は、本明細書中使用される場合、シクリル基でもあるアルキル基に関する；すなわち、環状炭化水素（炭素環式）化合物の脂環式環原子から水素原子を外すことにより得られる、一価部分であり、この部分は、３〜７個の環原子を含む３〜７個の炭素原子を有する。
【００３０】
シクロアルキル基の例として、以下に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない：
飽和単環式炭化水素化合物：
シクロプロパン（Ｃ３）、シクロブタン（Ｃ４）、シクロペンタン（Ｃ５）、シクロヘキサン（Ｃ６）、シクロヘプタン（Ｃ７）、メチルシクロプロパン（Ｃ４）、ジメチルシクロプロパン（Ｃ５）、メチルシクロブタン（Ｃ５）、ジメチルシクロブタン（Ｃ６）、メチルシクロペンタン（Ｃ６）、ジメチルシクロペンタン（Ｃ７）、及びメチルシクロヘキサン（Ｃ７）；
不飽和単環式炭化水素化合物：
シクロプロペン（Ｃ３）、シクロブテン（Ｃ４）、シクロペンテン（Ｃ５）、シクロヘキセン（Ｃ６）、メチルシクロプロペン（Ｃ４）、ジメチルシクロプロペン（Ｃ５）、メチルシクロブテン（Ｃ５）、ジメチルシクロブテン（Ｃ６）、メチルシクロペンテン（Ｃ６）、ジメチルシクロペンテン（Ｃ７）、及びメチルシクロヘキセン（Ｃ７）；ならびに
飽和多環式炭化水素化合物：
ノルカラン（Ｃ７）、ノルピナン（Ｃ７）、ノルボルナン（Ｃ７）。
【００３１】
Ｃ３−２０ヘテロシクリル：「Ｃ３−２０ヘテロシクリル」という用語は、本明細書中使用される場合、複素環化合物の環原子から水素原子を外すことにより得られる、一価部分に関し、この部分は、３〜２０個の環原子を有し、そのうちの１〜１０個は、環ヘテロ原子である。好ましくは、各環は、３〜７個の環原子を有し、そのうちの１〜４個は、環ヘテロ原子である。
【００３２】
この文脈において、接頭語（例えば、Ｃ３−２０、Ｃ３−７、Ｃ５−６、など）は、炭素原子であるかヘテロ原子であるかに関わらず、環原子の個数または環原子の個数範囲を示す。例えば、「Ｃ５−６ヘテロシクリル」という用語は、本明細書中使用される場合、５〜６個の環原子を有するヘテロシクリル基に関する。
【００３３】
単環式ヘテロシクリル基の例として、以下に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない：
Ｎ１：アジリジン（Ｃ３）、アゼチジン（Ｃ４）、ピロリジン（テトラヒドロピロール）（Ｃ５）、ピロリン（例えば、３−ピロリン、２，５−ジヒドロピロール）（Ｃ５）、２Ｈ−ピロールまたは３Ｈ−ピロール（イソピロール、イソアゾール）（Ｃ５）、ピペリジン（Ｃ６）、ジヒドロピリジン（Ｃ６）、テトラヒドロピリジン（Ｃ６）、アゼピン（Ｃ７）、
Ｏ１：オキシラン（Ｃ３）、オキセタン（Ｃ４）、オキソラン（テトラヒドロフラン）（Ｃ５）、オキソール（ジヒドロフラン）（Ｃ５）、オキサン（テトラヒドロピラン）（Ｃ６）、ジヒドロピラン（Ｃ６）、ピラン（Ｃ６）、オキセピン（Ｃ７）、
Ｓ１：チイラン（Ｃ３）、チエタン（Ｃ４）、チオラン（テトラヒドロチオフェン）（Ｃ５）、チアン（テトラヒドロチオピラン）（Ｃ６）、チエパン（Ｃ７）、
Ｏ２：ジオキソラン（Ｃ５）、ジオキサン（Ｃ６）、及びジオキセパン（Ｃ７）、
Ｏ３：トリオキサン（Ｃ６）、
Ｎ２：イミダゾリジン（Ｃ５）、ピラゾリシン（ジアゾリジン）（Ｃ５）、イミダゾリン（Ｃ５）、ピラゾリン（ジヒドロピラゾール）（Ｃ５）、ピペラジン（Ｃ６）、
Ｎ１Ｏ１：テトラヒドロオキサゾール（Ｃ５）、ジヒドロオキサゾール（Ｃ５）、テトラヒドロイソオキサゾール（Ｃ５）、ジヒドロイソオキサゾール（Ｃ５）、モルホリン（Ｃ６）、テトラヒドロオキサジン（Ｃ６）、ジヒドロオキサジン（Ｃ６）、オキサジン（Ｃ６）、
Ｎ１Ｓ１：チアゾリン（Ｃ５）、チアゾリジン（Ｃ５）、チオモルホリン（Ｃ６）、
Ｎ２Ｏ１：オキサジアジン（Ｃ６）、
Ｏ１Ｓ１：オキサチオール（Ｃ５）及びオキサチアン（チオキサン）（Ｃ６）、ならびに、
Ｎ１Ｏ１Ｓ１：オキサチアジン（Ｃ６）。
【００３４】
置換単環式ヘテロシクリル基の例として、環形状の単糖類、例えば、フラノース（Ｃ５）、例えば、アラビノフラノース、リキソフラノース、リボフラノース、及びキシロフラノース、ならびにピラノース（Ｃ６）、例えば、アロピラノース、アルトロピラノース、グルコピラノース、マンノピラノース、グロピラノース、イドピラノース、ガラクトピラノース、及びタロピラノースに由来するものが挙げられる。
【００３５】
Ｃ５−２０アリール：「Ｃ５−２０アリール」という用語は、本明細書中使用される場合、芳香族化合物の、芳香環原子から水素原子を外すことにより得られる、一価部分に関し、この部分は、３〜２０個の環原子を有する。「Ｃ５−７アリール」という用語は、本明細書中使用される場合、芳香族化合物の、芳香環原子から水素原子を外すことにより得られる、一価部分に関し、この部分は、５〜７個の環原子を有する。「Ｃ５−１０アリール」という用語は、本明細書中使用される場合、芳香族化合物の、芳香環原子から水素原子を外すことにより得られる、一価部分に関し、この部分は、５〜１０個の環原子を有する。好ましくは、各環は、５〜７個の環原子を有する。
【００３６】
この文脈において、接頭語（例えば、Ｃ３−２０、Ｃ５−７、Ｃ５−６、Ｃ５−１０、など）は、炭素原子であるかヘテロ原子であるかに関わらず、環原子の個数または環原子の個数範囲を示す。例えば、「Ｃ５−６アリール」という用語は、本明細書中使用される場合、５〜６個の環原子を有するアリール基に関する。
【００３７】
環原子は、「カルボアリール基」でそうであるように、全て炭素原子であることが可能である。
カルボアリール基の例として、ベンゼン（すなわち、フェニル）（Ｃ６）、ナフタレン（Ｃ１０）、アズレン（Ｃ１０）、アントラセン（Ｃ１４）、フェナントレン（Ｃ１４）、ナフタセン（Ｃ１８）、及びピレン（Ｃ１６）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
縮合環を含み、そのうち少なくとも１つが芳香環であるアリール基の例として、インダン（例えば、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン）（Ｃ９）、インデン（Ｃ９）、イソインデン（Ｃ９）、テトラリン（１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン（Ｃ１０）、アセナフテン（Ｃ１２）、フルオレン（Ｃ１３）、フェナレン（Ｃ１３）、アセフェナントレン（Ｃ１５）、及びアセアントレン（Ｃ１６）に由来する基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
あるいは、環原子は、「ヘテロアリール基」でそうであるように、１つまたは複数のヘテロ原子を含むことが可能である。単環式ヘテロアリール基の例として、以下に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない：
Ｎ１：ピロール（アゾール）（Ｃ５）、ピリジン（アジン）（Ｃ６）、
Ｏ１：フラン（オキソール）（Ｃ５）、
Ｓ１：チオフェン（チオール）（Ｃ５）、
Ｎ１Ｏ１：オキサゾール（Ｃ５）、イソオキサゾール（Ｃ５）、イソオキサジン（Ｃ６）、
Ｎ２Ｏ１：オキサジアゾール（フラザン）（Ｃ５）、
Ｎ３Ｏ１：オキサトリアゾール（Ｃ５）、
Ｎ１Ｓ１：チアゾール（Ｃ５）、イソチアゾール（Ｃ５）、
Ｎ２：イミダゾール（１，３−ジアゾール）（Ｃ５）、ピラゾール（１，２−ジアゾール）（Ｃ５）、ピリダジン（１，２−ジアジン）（Ｃ６）、ピリミジン（１，３−ジアジン）（Ｃ６）（例えば、シトシン、チミン、ウラシル）、ピラジン（１，４−ジアジン）（Ｃ６）、
Ｎ３：トリアゾール（Ｃ５）、トリアジン（Ｃ６）、及び、
Ｎ４：テトラゾール（Ｃ５）。
【００４０】
縮合環を含むヘテロアリールの例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
Ｃ９（２つの縮合環を含む）として、ベンゾフラン（Ｏ１）、イソベンゾフラン（Ｏ１）、インドール（Ｎ１）、イソインドール（Ｎ１）、インドリジン（Ｎ１）、インドリン（Ｎ１）、イソインドリン（Ｎ１）、プリン（Ｎ４）（例えば、アデニン、グアニン）、ベンズイミダゾール（Ｎ２）、インダゾール（Ｎ２）、ベンゾオキサゾール（Ｎ１Ｏ１）、ベンゾイソオキサゾール（Ｎ１Ｏ１）、ベンゾジオキソール（Ｏ２）、ベンゾフラザン（Ｎ２Ｏ１）、ベンゾトリアゾール（Ｎ３）、ベンゾチオフラン（Ｓ１）、ベンゾチアゾール（Ｎ１Ｓ１）、ベンゾチアジアゾール（Ｎ２Ｓ）に由来するもの；
Ｃ１０（２つの縮合環を含む）として、クロメン（Ｏ１）、イソクロメン（Ｏ１）、クロマン（Ｏ１）、イソクロマン（Ｏ１）、ベンゾジオキサン（Ｏ２）、キノリン（Ｎ１）、イソキノリン（Ｎ１）、キノリジン（Ｎ１）、ベンゾオキサジン（Ｎ１Ｏ１）、ベンゾジアジン（Ｎ２）、ピリドピリジン（Ｎ２）、キノキサリン（Ｎ２）、キナゾリン（Ｎ２）、シンノリン（Ｎ２）、フタラジン（Ｎ２）、ナフチリジン（Ｎ２）、プテリジン（Ｎ４）に由来するもの；
Ｃ１１（２つの縮合環を含む）として、ベンゾジアゼピン（Ｎ２）に由来するもの；
Ｃ１３（３つの縮合環を含む）として、カルバゾール（Ｎ１）、ジベンゾフラン（Ｏ１）、ジベンゾチオフェン（Ｓ１）、カルボリン（Ｎ２）、ペリミジン（Ｎ２）、ピリドインドール（Ｎ２）に由来するもの；ならびに
Ｃ１４（３つの縮合環を含む）として、アクリジン（Ｎ１）、キサンテン（Ｏ１）、チオキサンテン（Ｓ１）、オキサントレン（Ｏ２）、フェノキサチイン（Ｏ１Ｓ１）、フェナジン（Ｎ２）、フェノキサジン（Ｎ１Ｏ１）、フェノチアジン（Ｎ１Ｓ１）、チアントレン（Ｓ２）、フェナントリジン（Ｎ１）、フェナントロリン（Ｎ２）、フェナジン（Ｎ２）に由来するもの。
【００４１】
上記の基は、単独であるか別の置換基の一部であるかに関わらず、それら自身を、それら自身及び以下に列挙されるさらなる置換基から選択される１つまたは複数の基で、任意選択で置換することが可能である。
【００４２】
ハロ：−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、及び−Ｉ。
【００４３】
ヒドロキシ：−ＯＨ。
【００４４】
エーテル：−ＯＲ、式中、Ｒは、エーテル置換基、例えば、Ｃ１−７アルキル基（Ｃ１−７アルコキシ基、とも称する、以下で説明）、Ｃ３−２０ヘテロシクリル基（Ｃ３−２０ヘテロシクリルオキシ基とも称する）、またはＣ５−２０アリール基（Ｃ５−２０アリールオキシ基とも称する）、好ましくはＣ１−７アルキル基である。
【００４５】
アルコキシ：−ＯＲ、式中、Ｒは、アルキル基、例えば、Ｃ１−７アルキル基である。Ｃ１−７アルコキシ基の例として、−ＯＭｅ（メトキシ）、−ＯＥｔ（エトキシ）、−Ｏ（ｎＰｒ）（ｎ−プロポキシ）、−Ｏ（ｉＰｒ）（イソプロポキシ）、−Ｏ（ｎＢｕ）（ｎ−ブトキシ）、−Ｏ（ｓＢｕ）（ｓｅｃ−ブトキシ）、−Ｏ（ｉＢｕ）（イソブトキシ）、及び−Ｏ（ｔＢｕ）（ｔｅｒｔ−ブトキシ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
カルボキシ（カルボン酸）：−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ。
【００４７】
エステル（カルボキシラート、カルボン酸エステル、オキシカルボニル）：−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、式中、Ｒは、エステル置換基、例えば、Ｃ１−７アルキル基、Ｃ３−２０ヘテロシクリル基、またはＣ５−２０アリール基、好ましくは、Ｃ１−７アルキル基である。エステル基の例として、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ３、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（ＣＨ３）３、及び−Ｃ（＝Ｏ）ＯＰｈが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
アミノ：−ＮＲ１Ｒ２、式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、アミノ置換基、例えば、水素、Ｃ１−７アルキル基（Ｃ１−７アルキルアミノまたはジ−Ｃ１−７アルキルアミノとも称する）、Ｃ３−２０ヘテロシクリル基、またはＣ５−２０アリール基、好ましくはＨまたはＣ１−７アルキル基であるか、あるいは、「環状」アミノ基の場合、Ｒ１及びＲ２は、それらが結合した窒素原子と一緒になって、４〜８個の環原子を有する複素環を形成する。アミノ基は、第一級（−ＮＨ２）、第二級（−ＮＨＲ１）、または第三級（−ＮＨＲ１Ｒ２）が可能であり、カチオン形の場合、第四級（−＋ＮＲ１Ｒ２Ｒ３）も可能である。アミノ基の例として、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−ＮＨＣ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、及び−ＮＨＰｈが挙げられるが、これらに限定されない。環状アミノ基の例として、アジリジノ、アゼチジノ、ピロリジノ、ピペリジノ、ピペラジノ、モルホリノ、及びチオモルホリノが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
アミド（カルバモイル、カルバミル、アミノカルボニル、カルボキサミド）：−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１Ｒ２、式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、アミノ基について定義されるとおりのアミノ置換基である。アミド基の例として、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ３、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ３、及び−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、ならびにＲ１及びＲ２が、それらが結合した窒素原子と一緒になって複素環構造を形成しているアミド基、例えばピペリジノカルボニル、モルホリノカルボニル、チオモルホリノカルボニル、及びピペラジノカルボニルのような基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
ニトロ：−ＮＯ２。
【００５１】
アジド：−Ｎ３。
【００５２】
シアノ（ニトリル、カルボニトリル）：−ＣＮ。
【００５３】
抗体
１つの態様において、抗体は、ＡＸＬに結合する抗体である。
【００５４】
１Ｈ１２
実施形態によっては、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を持つＶＨ  ＣＤＲ３を有するＶＨドメインを含む。実施形態によっては、ＶＨドメインは、さらに、配列番号６のアミノ酸配列を持つＶＨ  ＣＤＲ２、及び／または配列番号５のアミノ酸配列を持つＶＨ  ＣＤＲ１を含む。実施形態によっては、抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を持つＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を持つＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列を持つＶＨ  ＣＤＲ３を有するＶＨドメインを含む。好適な実施形態において、抗体は、配列番号１に記載の配列を有するＶＨドメインを含む。
【００５５】
抗体は、さらに、ＶＬドメインを含むことができる。実施形態によっては、抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を持つＶＬ  ＣＤＲ３を有するＶＬドメインを含む。実施形態によっては、ＶＬドメインは、さらに、配列番号９のアミノ酸配列を持つＶＬ  ＣＤＲ２、及び／または配列番号８のアミノ酸配列を持つＶＬ  ＣＤＲ１を含む。実施形態によっては、抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を持つＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列を持つＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸配列を持つＶＬ  ＣＤＲ３を有するＶＬドメインを含む。好適な実施形態において、抗体は、配列番号２に記載の配列を有するＶＬドメインを含む。
【００５６】
好適な実施形態において、抗体は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。好ましくは、ＶＨは、配列番号１の配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号２の配列を含む。
【００５７】
ＶＨ及びＶＬドメイン（複数可）は、ＡＸＬに結合する抗体抗原結合部位を形成するように、対形成することができる。
【００５８】
実施形態によっては、抗体は、ＶＨドメイン及びこれと対形成したＶＬドメインを含む無傷抗体であり、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、配列番号１及びこれと対形成した配列番号２の配列を有する。
【００５９】
実施形態によっては、抗体は、配列番号３の配列を有する重鎖及びこれと対形成した配列番号４の配列を有する軽鎖を含む。実施形態によっては、抗体は、２つの配列番号３の配列を有する重鎖、及びそれぞれと対形成した配列番号４の配列を有する軽鎖を含む、無傷抗体である。
【００６０】
実施形態によっては、抗体は、配列番号２４の配列を有する重鎖及びこれと対形成した配列番号４の配列を有する軽鎖を含む。実施形態によっては、抗体は、２つの配列番号２４の配列を有する重鎖、及びそれぞれと対形成した配列番号４の配列を有する軽鎖を含む、無傷抗体である。
【００６１】
１つの態様において、抗体は、本明細書中記載されるとおりの抗体を、以下に記載されるとおりに修飾したもの（またはさらに修飾したもの）である。実施形態によっては、抗体は、本明細書中記載される抗体のヒト化、脱免疫化または表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）形態である。
【００６２】
５Ｆ１１
実施形態によっては、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を持つＶＨ  ＣＤＲ３を有するＶＨドメインを含む。実施形態によっては、ＶＨドメインは、さらに、配列番号１４のアミノ酸配列を持つＶＨ  ＣＤＲ２、及び／または配列番号１３のアミノ酸配列を持つＶＨ  ＣＤＲ１を含む。実施形態によっては、抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を持つＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を持つＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号１５のアミノ酸配列を持つＶＨ  ＣＤＲ３を有するＶＨドメインを含む。
【００６３】
実施形態によっては、抗体は、配列番号１１に記載の配列を有するＶＨドメインを含む。実施形態によっては、抗体は、配列番号１９に記載の配列を有するＶＨドメインを含む。実施形態によっては、抗体は、配列番号２０に記載の配列を有するＶＨドメインを含む。実施形態によっては、抗体は、配列番号２１に記載の配列を有するＶＨドメインを含む。
【００６４】
抗体は、さらに、ＶＬドメインを含むことができる。実施形態によっては、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を持つＶＬ  ＣＤＲ３を有するＶＬドメインを含む。実施形態によっては、ＶＬドメインは、さらに、配列番号１７のアミノ酸配列を持つＶＬ  ＣＤＲ２、及び／または配列番号１６のアミノ酸配列を持つＶＬ  ＣＤＲ１を含む。実施形態によっては、抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を持つＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を持つＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を持つＶＬ  ＣＤＲ３を有するＶＬドメインを含む。
【００６５】
実施形態によっては、抗体は、配列番号２２に記載の配列を有するＶＬドメインを含む。
【００６６】
好適な実施形態において、抗体は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。実施形態によっては、ＶＨは、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含み、ＶＬドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【００６７】
実施形態によっては、抗体は、配列番号１９の配列を有するＶＨドメイン、及び配列番号２２の配列を有するＶＬドメインを含む。実施形態によっては、抗体は、配列番号２０の配列を有するＶＨドメイン、及び配列番号２２の配列を有するＶＬドメインを含む。実施形態によっては、抗体は、配列番号２１の配列を有するＶＨドメイン、及び配列番号２２の配列を有するＶＬドメインを含む。
【００６８】
ＶＨ及びＶＬドメイン（複数可）は、ＡＸＬに結合する抗体抗原結合部位を形成するように、対形成することができる。
【００６９】
実施形態によっては、抗体は、ＶＨドメイン及びこれと対形成したＶＬドメインを含む無傷抗体である。
【００７０】
１つの態様において、抗体は、本明細書中記載される抗体を、以下に記載されるとおりに修飾したもの（またはさらに修飾したもの）である。実施形態によっては、抗体は、本明細書中記載される抗体のヒト化、脱免疫化または表面再構成形態である。
【００７１】
用語
「抗体」という用語は、本明細書中、最も広義の意味で用いられ、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、無傷抗体、及び抗体断片を包含するが、ただし、それらが所望の生物活性を示す、例えば、ＡＸＬに結合する能力を持つ限りにおいてである。抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または他の種由来抗体が可能である。抗体とは、免疫系により産生される、特定の抗原を認識してそれに結合することができるタンパク質である。（Ｊａｎｅｗａｙ，  Ｃ．，  Ｔｒａｖｅｒｓ，  Ｐ．，  Ｗａｌｐｏｒｔ，  Ｍ．，  Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。標的抗原は、一般に、複数の抗体のＣＤＲで認識される多数の結合部位（エピトープとも呼ばれる）を有する。異なるエピトープに特異的に結合する抗体は、それぞれ異なる構造を有する。すなわち、１つの抗原は、１つより多い対応する抗体を有する可能性がある。抗体として、全長免疫グロブリン分子または全長免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、関心対象の標的の抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位またはその一部分を有する分子が挙げられ、そのような標的として、がん細胞または自己免疫疾患に関連した自己免疫抗体を産生する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。免疫グロブリンは、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラス、あるいはアロタイプ（例えば、ヒトＧ１ｍ１、Ｇ１ｍ２、Ｇ１ｍ３、非Ｇ１ｍ１［これは、Ｇ１ｍ１以外の任意のアロタイプである］、Ｇ１ｍ１７、Ｇ２ｍ２３、Ｇ３ｍ２１、Ｇ３ｍ２８、Ｇ３ｍ１１、Ｇ３ｍ５、Ｇ３ｍ１３、Ｇ３ｍ１４、Ｇ３ｍ１０、Ｇ３ｍ１５、Ｇ３ｍ１６、Ｇ３ｍ６、Ｇ３ｍ２４、Ｇ３ｍ２６、Ｇ３ｍ２７、Ａ２ｍ１、Ａ２ｍ２、Ｋｍ１、Ｋｍ２、及びＫｍ３）の免疫グロブリン分子が可能である。免疫グロブリンは、任意の種由来のものが可能であり、ヒト、マウス、またはウサギ起原が挙げられる。
【００７２】
本明細書中使用される場合、「ＡＸＬに結合する」は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＣＡＡ７６８４７、バージョン番号ＣＡＡ７６８４７．１  ＧＩ：３３３６８４２、記録更新日時：Ｊａｎ  ７，  ２０１１  ０２：３０ＰＭ）などの非特異的パートナーに対してよりも高い親和性でＡＸＬに結合する抗体を意味するのに使用される。実施形態によっては、抗体は、生理的条件で測定した場合に、抗体のＢＳＡに対する結合定数（Ｋａ）より少なくとも２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１０４、１０５、または１０６倍高い結合定数でＡＸＬに結合する。本発明の抗体は、高い親和性でＣＤ２２に結合することができる。例えば、実施形態によっては、抗体は、約１０−６Ｍ以下、例えば、１×１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３、または１０−１４のＫＤでＣＤ２２に結合することができる。
【００７３】
ＡＸＬは、受容体型チロシンキナーゼのヒトＴＡＭファミリーの一員である。実施形態によっては、ＡＸＬポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＨ３２２２９、バージョン番号ＡＡＨ３２２２９．１  ＧＩ：２１６１９００４、記録更新日時：Ｍａｒｃｈ  ６，  ２０１２  ０１：１８  ＰＭ（配列番号９）に該当する。１つの実施形態において、ＡＸＬポリペプチドをコードする核酸は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ７６１２５、バージョン番号Ｍ７６１２５．１    ＧＩ：２９２８６９、記録更新日時：Ｊｕｎ  ２３，  ２０１０  ０８：５３  ＡＭに該当する。実施形態によっては、ＡＸＬポリペプチドは、配列番号２３の配列を有する。
【００７４】
「抗体断片」は、全長抗体の一部分、一般には全長抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びｓｃＦｖ断片；二重特異性抗体；線状抗体；Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、及び上記のもののいずれかの、がん細胞抗原、ウイルス抗原、または微生物抗原に免疫特異的に結合するエピトープ結合断片、単鎖抗体分子；ならびに、抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。
【００７５】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書中使用される場合、実質的に同種の抗体の集団、すなわち集団を構成する個々の抗体が、自然発生する可能性のある変異を除いて同一であり、そのような変異が存在したとしても少数である集団から得られる抗体を示す。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単独の抗原部位に向けられている。そのうえさらに、ポリクローナル抗体製剤が、異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含むのとは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単独の決定基に向けられている。モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、他の抗体が混入することなく合成できるという利点を有する。「モノクローナル」という修飾語は、抗体が、実質的に同種の抗体集団から得られたものであるという特徴を示すものであって、抗体の産生が何か特定の方法による必要があることを意図しない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５に初めて記載されたハイブリドーマ方法により作製することも可能であるし、組換えＤＮＡ法（ＵＳ４８１６５６７を参照）により作製することも可能である。モノクローナル抗体は、また、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８１−５９７に記載された技法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することも可能であるし、完全ヒト免疫グロブリン系を保有する遺伝子導入マウスから単離することも可能である（Ｌｏｎｂｅｒｇ（２００８）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ２０（４）：４５０−４５９）。
【００７６】
本明細書中のモノクローナル抗体として、具体的には「キメラ」抗体が挙げられる。「キメラ」抗体では、所望の生物活性を示す限りにおいて、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定種由来の抗体、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一または相同であるが、鎖（複数可）の残りの部分は、別の種由来の抗体、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体の断片の相当する配列と同一または相同である（ＵＳ４８１６５６７；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５）。キメラ抗体として、「霊長類化」抗体が挙げられ、この抗体は、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザルまたは類人猿）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒトの定常部配列を含む。
【００７７】
「無傷抗体」は、本明細書中、ＶＬドメイン及びＶＨドメイン、ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む抗体である。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えばヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異型が可能である。無傷抗体は、１つ以上の「エフェクター機能」を有することができ、エフェクター機能とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異型Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を示す。抗体エフェクター機能の例として、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞毒性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；ならびにＢ細胞受容体及びＢＣＲなど細胞表面受容体の下方制御が挙げられる。
【００７８】
無傷抗体は、その抗体の重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に従って、異なる「クラス」に割り振ることができる。無傷抗体には、５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのクラスのいくつかは、さらに「サブクラス」（アイソタイプ）に分割することができる（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２）。異なる抗体クラスにそれぞれ応じた重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。それぞれのクラスの免疫グロブリンについてのサブユニット構造及び三次元立体配置は、周知である
【００７９】
抗体の修飾
本明細書中開示される抗体は、修飾可能である。例えば、ヒト対象に対するそれらの免疫原性を低下させるためである。修飾は、当業者によく知られた多数の技法のいずれかを用いて達成可能である。そのような技法のいくつかを、以下でより詳細に説明する。
【００８０】
ヒト化
非ヒト抗体または抗体断片のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性を低下させる技法として、「ヒト化」と呼ばれるものが挙げられる。
【００８１】
「ヒト化抗体」は、ヒト抗体の修飾された可変領域の少なくとも一部分を含むポリペプチドを示し、この可変領域の一部分、好ましくは無傷ヒト可変ドメインより実質的に小さい一部分が、非ヒト種由来の相当する配列で置換されており、かつこの修飾された可変領域は、別のタンパク質の少なくとも別の部分、好ましくはヒト抗体の定常部と連結している。「ヒト化抗体」という表現は、１つまたは複数の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）アミノ酸残基及び／または１つまたは複数のフレームワーク領域（「ＦＷ」または「ＦＲ」）アミノ酸残基が齧歯類または他の非ヒト抗体の類似部位由来アミノ酸残基で置換されているヒト抗体を含む。「ヒト化抗体」という表現は、実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するＦＲ及び実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む免疫グロブリンアミノ酸配列変異型またはその断片も含む。
【００８２】
「ヒト化」型の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。すなわち、見方を変えると、ヒト化抗体とは、ヒト配列の代わりに非ヒト（例えばマウス）抗体から選択された配列も含有するヒト抗体である。ヒト化抗体は、保存的アミノ酸置換、すなわち抗体の結合及び／または生物学的活性を大きく変えることのない同種または異なる種由来の非天然の残基を含むことができる。そのような抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。
【００８３】
様々なヒト化技法が存在し、そのような技法として、「ＣＤＲグラフト法」、「選択誘導法」、「脱免疫化」、「表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（「ベニヤ修飾（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」としても知られる）」、「複合抗体」、「ヒトストリング含有量最適化（Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｒｉｎｇ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ）」、及びフレームワーク混合が挙げられる。
【００８４】
ＣＤＲグラフト法
この技法では、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の性質を有する、マウス、ラット、ラクダ、ウシ、ヤギ、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である（実際には、非ヒトＣＤＲが、ヒトフレームワークに「移植」されている）。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、相当する非ヒト残基で置換されている（これは、例えば、特定のＦＲ残基が抗原結合に対して大きな効果を有する場合などにそうなる可能性がある）。
【００８５】
そのうえさらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、導入されるＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含むことができる。こうした修飾を行うことで、抗体の性能をさらに洗練させて最大化することができる。したがって、一般に、ヒト化抗体は、全てまたは全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、及び全てまたは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである可変領域を、全部で少なくとも１つ、及び１つの態様において２つ含むことになる。ヒト化抗体はまた、随意に、ヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）の少なくとも一部分または全部を含むことができる。
【００８６】
選択誘導法
この方法は、特定のエピトープに対して特異的な所定の非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬドメインをヒトＶＨまたはＶＬライブラリーと組み合わせることからなり、特異的ヒトＶドメインは、関心対象の抗原に対して選択される。次いで、この選択されたヒトＶＨを、ＶＬライブラリーと組み合わせて、完全なヒトＶＨ×ＶＬの組み合わせを作成する。この方法は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｎ．Ｙ．）  １２，（１９９４）８９９−９０３に記載されている。
【００８７】
複合抗体
この方法では、ヒト抗体由来のアミノ酸配列の２つ以上のセグメントを、最終抗体分子内にひとまとめにする。最終抗体分子は、複数のヒトＶＨ及びＶＬ配列セグメントを、ヒトＴ細胞エピトープを制限または回避する組み合わせで、最終複合抗体Ｖ領域内にひとまとめにすることにより、構築される。必要な場合は、Ｔ細胞エピトープに寄与するまたはこれをコードするＶ領域セグメントを、Ｔ細胞エピトープを回避する代替セグメントに交換することにより、Ｔ細胞エピトープを制限または回避する。この方法は、ＵＳ２００８／０２０６２３９Ａ１に記載される。
【００８８】
脱免疫化
この方法は、ヒト（または他の二次種）Ｔ細胞エピトープを、治療用抗体（または他の分子）のＶ領域から除去することを含む。治療用抗体Ｖ領域配列を、例えば、ＭＨＣ結合モチーフのデータベース（ｗｗｗ．ｗｅｈｉ．ｅｄｕ．ａｕがホストである「モチーフ」データベースなど）と比較することで、ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフの存在について分析する。あるいは、ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフは、Ａｌｔｕｖｉａらにより記載される方法（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４９  ２４４−２５０（１９９５））などのコンピューターによるスレッド化法を用いて同定することができる。これらの方法では、Ｖ領域配列由来の連続重複ペプチドを、それらのＭＨＣクラスＩＩタンパク質との結合エネルギーについて試験する。次いで、このデータを、連続して存在するペプチドと関連する他の配列特性についての情報（両親媒性、ロスバードモチーフ（Ｒｏｔｈｂａｒｄ  ｍｏｔｉｆ）、ならびにカテプシンＢ及び他のプロセシング酵素による切断部位など）とまとめることができる。
【００８９】
いったん可能性のある二次種（例えば、ヒト）Ｔ細胞エピトープが同定されたら、１つまたは複数のアミノ酸を変更することで、それらを除去する。修飾されるアミノ酸は、通常、Ｔ細胞エピトープ自身内にあるが、タンパク質の一次または二次構造に関してエピトープと隣接するものの場合もある（したがって、一次構造では隣接していない場合がある）。最も典型的には、変更は、置換によるものであるが、状況によっては、アミノ酸の付加または削除の方が適切なこともある。
【００９０】
全ての変更は、組換えＤＮＡ技法により達成することができ、そのため、十分に確立された方法（部位特異的突然変異誘発など）を用いて組換え宿主で発現させることにより、最終分子を調製することができる。しかしながら、タンパク質化学反応または任意の他の分子変更手段の利用も可能である。
【００９１】
表面再構成
この方法は、以下を含む：
（ａ）非ヒト（例えば、齧歯類）抗体（またはその断片）の可変領域の三次元モデルを構築することにより、非ヒト抗体可変領域の高次立体構造を決定する；
（ｂ）十分な数の非ヒト及びヒト抗体の可変領域重鎖及び軽鎖でのＸ線結晶構造解析に基づく構造から、相対的到達性分布を用いて、配列アラインメントを作成して、アラインメント位置が、十分な数の非ヒト抗体重鎖及び軽鎖の９８％において同一である、重鎖及び軽鎖のフレームワーク位置の組を得る；
（ｃ）工程（ｂ）で作成したフレームワーク位置の組を用いて、ヒト化しようとする非ヒト抗体について、重鎖及び軽鎖の表面露出アミノ酸残基の組を定義する；
（ｄ）ヒト抗体アミノ酸配列から、工程（ｃ）で定義した表面露出アミノ酸残基の組との相同性が最も高い重鎖及び軽鎖の表面露出アミノ酸残基の組を同定するが、このヒト抗体由来の重鎖及び軽鎖は、天然に対形成するかどうかは問わない；
（ｅ）ヒト化しようとする非ヒト抗体のアミノ酸配列において、工程（ｃ）で定義した重鎖及び軽鎖の表面露出アミノ酸残基の組を、工程（ｄ）で同定した重鎖及び軽鎖の表面露出アミノ酸残基の組と置換する；
（ｆ）工程（ｅ）で指定される置換から得られる非ヒト抗体の可変領域の三次元モデルを構築する；
（ｇ）工程（ａ）及び工程（ｆ）で構築した三次元モデルを比較することにより、ヒト化しようとする非ヒト抗体の相補性決定領域のいずれかの残基のいずれかの原子から５オングストローム内にあるいずれかのアミノ酸残基を、工程（ｃ）または工程（ｄ）で同定した組から同定する；ならびに
（ｈ）工程（ｇ）で同定したいずれかの残基を、ヒトアミノ酸残基から元々の非ヒトアミノ酸残基に交換し、それにより、表面露出アミノ酸残基の非ヒト抗体ヒト化の組を確定させる；ただし、工程（ａ）は、必ずしも最初に行う必要はないが、工程（ｇ）の前に行わなければならない。
【００９２】
超ヒト化
この方法は、非ヒト配列を、機能的ヒト生殖系列遺伝子レパートリーと比較する。これらのヒト遺伝子の中から、非ヒト配列と同一または密接に関連する標準構造をコードするものを選択する。選択したこれらのヒト遺伝子の中から、ＣＤＲ内で最も高い相同性を持つものをＦＲドナーとして選択する。最後に、非ヒトＣＤＲをこれらのヒトＦＲに移植する。この方法は、ＷＯ２００５／０７９４７９Ａ２に記載されている。
【００９３】
ヒトストリング含有量最適化
この方法は、非ヒト（例えば、マウス）配列を、ヒト生殖系列遺伝子のレパートリーと比較し、差異を、ヒトストリング含有量（ＨＳＣ）として点数付けする。ＨＳＣは、潜在的ＭＨＣ／Ｔ細胞エピトープのレベルで配列を定量する。次いで、標的配列を、全体的な相同性尺度を用いるのではなく、標的配列のＨＳＣを最大にするようにヒト化することで、複数の多様なヒト化変異型を作成する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ４４，（２００７）１９８６−１９９８に記載されている）。
【００９４】
フレームワーク混合
非ヒト抗体のＣＤＲを、全てが既知の重鎖及び軽鎖ヒト生殖系列遺伝子フレームワークを包含するｃＤＮＡプールと、インフレームで融合させる。次いで、ヒト化抗体を、例えば、ファージ提示型抗体ライブラリーをパニングすることで選択する。この方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６，  ４３−６０（２００５）に記載されている。
【００９５】
アジドを用いた抗体修飾
薬物リンカーと複合体形成させるための抗体は、３工程プロセスで調製することができる：
１）コアＮ−グリカンを有する抗体（Ａｂ）を、適切な発現系（例えば、ＣＨＯ細胞株）で発現させる。コアＮ−グリカンは、典型的には、Ｋａｂａｔ命名体系に従って重鎖のＡｓｎ−２９７で複合体形成する；
２）全てのグリカンアイソフォーム（複合型、ハイブリッド型、高マンノース型）を、エンドグリコシダーゼでトリミングして、核ＧｌｃＮＡｃを残す；及び
３）核ＧｌｃＮＡｃに、薬物リンカーと複合体形成させるためのアジド基を抱えたＮ−アセチルガラクトース残基を、酵素で転移させる。
【００９６】
上記プロセスの概要は、ｖａｎ  Ｇｅｅｌ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１５，  ２６，  ２２３３−２２４２；ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｃｏｎｊｃｈｅｍ．５ｂ００２２４に記載されている。あるいは、ワンポットプロセスを使用することができる。実施例参照。
【００９７】
実施形態
Ｘ
実施形態によっては、Ｘは、単結合である。
他の実施形態において、Ｘは、−ＣＨ２−である。
さらなる実施形態において、Ｘは、−Ｃ２Ｈ４−である。
【００９８】
実施形態によっては、ｎは、１〜４である。
【００９９】
これらの実施形態のあるものにおいて、ｎは、１である。
これらの実施形態の他のものにおいて、ｎは、２である。
これらの実施形態のさらなるものにおいて、ｎは、４である。
【０１００】
Ｒ７
１つの実施形態において、Ｒ７は、メチルである。
別の実施形態において、Ｒ７は、フェニルである。
【０１０１】
Ｒ２
Ｃ２とＣ３の間に二重結合がある場合、Ｒ２は、以下からなる群より選択される：
（ａ）Ｃ５−１０アリール基、この基は、以下からなる群より選択される１つまたは複数の置換基により任意選択で置換される：ハロ、ニトロ、シアノ、エーテル、Ｃ１−７アルキル、Ｃ３−７ヘテロシクリル、及びビス−オキシ−Ｃ１−３アルキレン；
（ｂ）Ｃ１−５飽和脂肪族アルキル；
（ｃ）Ｃ３−６飽和シクロアルキル；
（ｄ）
【化１３】
0006671555.tif 000014
、式中、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３はそれぞれ、独立して、Ｈ、Ｃ１−３飽和アルキル、Ｃ２−３アルケニル、Ｃ２−３アルキニル、及びシクロプロピルから選択され、ただし、Ｒ２基の炭素原子の合計数は、５以下である；
（ｅ）
【化１４】
0006671555.tif 000015
、式中、Ｒ２５ａ及びＲ２５ｂのいずれか一方は、Ｈであり、他方は、以下から選択され：フェニル、このフェニルは、ハロ、メチル、メトキシから選択される基により任意選択で置換される；ピリジル；及びチオフェニル；ならびに
（ｆ）
【化１５】
0006671555.tif 000016
、式中、Ｒ２４は、以下から選択され：Ｈ；Ｃ１−３飽和アルキル；Ｃ２−３アルケニル；Ｃ２−３アルキニル；シクロプロピル；フェニル、このフェニルは、ハロ、メチル、メトキシから選択される基により任意選択で置換される；ピリジル；及びチオフェニル。
【０１０２】
Ｒ２がＣ５−１０アリール基である場合、この基は、Ｃ５−７アリール基であることが可能である。Ｃ５−７アリール基は、フェニル基またはＣ５−７ヘテロアリール基、例えば、フラニル、チオフェニル、及びピリジルが可能である。実施形態によっては、Ｒ２は、好ましくは、フェニルである。他の実施形態において、Ｒ１２は、好ましくは、チオフェニル、例えば、チオフェン−２−イル及びチオフェン−３−イルである。
【０１０３】
Ｒ２がＣ５−１０アリール基である場合、この基は、Ｃ８−１０アリール、例えば、キノリニルまたはイソキノリニル基であることが可能である。キノリニルまたはイソキノリニル基は、任意の利用可能な環位を通じてＰＢＤ核と結合することができる。例えば、キノリニルは、キノリン−２−イル、キノリン−３−イル、キノリン−４−イル、キノリン−５−イル、キノリン−６−イル、キノリン−７−イル、及びキノリン−８−イルが可能である。これらのうち、キノリン−３−イル及びキノリン−６−イルが好ましい場合がある。イソキノリニルは、イソキノリン−１−イル、イソキノリン−３−イル、イソキノリン−４−イル、イソキノリン−５−イル、イソキノリン−６−イル、イソキノリン−７−イル、及びイソキノリン−８−イルが可能である。これらのうち、イソキノリン−３−イル及びイソキノリン−６−イルが好ましい場合がある。
【０１０４】
Ｒ２がＣ５−１０アリール基である場合、この基は、任意の個数の置換基を有することができる。この基は、好ましくは、１〜３つの置換基を有し、１つ及び２つであることがより好ましく、単一の置換基であることが特に好ましい。置換基は、任意の位置にあることができる。
【０１０５】
Ｒ２がＣ５−７アリール基である場合、単一の置換基は、好ましくは、化合物の残部との結合に隣接していない環原子上にある、すなわち、この置換基は、好ましくは、化合物の残部との結合に対してβ位またはγ位にある。したがって、Ｃ５−７アリール基がフェニルである場合、置換基は、好ましくは、メタ位またはパラ位にあり、より好ましくは、パラ位にある。
【０１０６】
Ｒ２がＣ８−１０アリール基、例えば、キノリニルまたはイソキノリニルである場合、この基は、キノリンまたはイソキノリン環の任意の位置に任意の個数の置換基を有することができる。実施形態によっては、この基は、１つ、２つ、または３つの置換基を有し、それらは、近位環及び遠位環の一方または両方（置換基が複数の場合）に存在することができる。
【０１０７】
Ｒ２がＣ５−１０アリール基の場合のＲ２置換基
Ｒ２がＣ５−１０アリール基の場合のＲ２置換基がハロである場合、これは、好ましくは、ＦまたはＣｌであり、より好ましくはＣｌである。
【０１０８】
Ｒ２がＣ５−１０アリール基の場合のＲ２置換基がエーテルである場合、これは、実施形態によっては、アルコキシ基、例えば、Ｃ１−７アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ）であることが可能であり、または実施形態によっては、Ｃ５−７アリールオキシ基（例えば、フェノキシ、ピリジルオキシ、フラニルオキシ）であることが可能である。アルコキシ基は、それ自身が、置換、例えばアミノ基（例えば、ジメチルアミノ）によりさらに置換可能である。
【０１０９】
Ｒ２がＣ５−１０アリール基の場合のＲ２置換基がＣ１−７アルキルである場合、これは、好ましくは、Ｃ１−４アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル）が可能である。
【０１１０】
Ｒ２がＣ５−１０アリール基の場合のＲ２置換基がＣ３−７ヘテロシクリルである場合、これは、実施形態によっては、Ｃ６窒素含有ヘテロシクリル基、例えば、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジニル、ピペラジニルが可能である。これらの基は、窒素原子を介して、ＰＢＤ部分の残部と結合することができる。これらの基は、例えば、Ｃ１−４アルキル基でさらに置換可能である。Ｃ６窒素含有ヘテロシクリル基がピペラジニルである場合、このさらなる置換基は、第二の窒素環原子上にあることが可能である。
【０１１１】
Ｒ２がＣ５−１０アリール基の場合のＲ２置換基がビス−オキシ−Ｃ１−３アルキレンである場合、これは、好ましくは、ビス−オキシ−メチレンまたはビス−オキシ−エチレンである。
【０１１２】
Ｒ２がＣ５−１０アリール基の場合のＲ２置換基がエステルである場合、これは、好ましくは、メチルエステルまたはエチルエステルである。
【０１１３】
Ｒ２がＣ５−１０アリール基である場合の特に好適な置換基として、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、シアノ、ビス−オキシ−メチレン、メチルピペラジニル、モルホリノ、及びメチルチオフェニルが挙げられる。Ｒ２に特に好適な他の置換基は、ジメチルアミノプロピルオキシ及びカルボキシである。
【０１１４】
Ｒ２がＣ５−１０アリール基である場合の特に好適な置換Ｒ２基として、４−メトキシフェニル、３−メトキシフェニル、４−エトキシフェニル、３−エトキシフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、３，４−ビスオキシメチレン−フェニル、４−メチルチオフェニル、４−シアノフェニル、４−フェノキシフェニル、キノリン−３−イル及びキノリン−６−イル、イソキノリン−３−イル及びイソキノリン−６−イル、２−チエニル、２−フラニル、メトキシナフチル、ならびにナフチルが挙げられるが、これらに限定されない。別の可能な置換Ｒ２基は、４−ニトロフェニルである。特に関心が持たれるＲ２基として、４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル及び３，４−ビスオキシメチレン−フェニルが挙げられる。
【０１１５】
Ｒ２がＣ１−５飽和脂肪族アルキルである場合、Ｒ２は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはペンチルが可能である。実施形態によっては、Ｒ２は、メチル、エチル、またはプロピル（ｎ−ペンチルまたはイソプロピル）が可能である。これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｒ２は、メチルが可能である。他の実施形態において、Ｒ２は、ブチルまたはペンチルが可能であり、それらは、直鎖の場合も分岐鎖の場合もある。
【０１１６】
Ｒ２がＣ３−６飽和シクロアルキルである場合、Ｒ２は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、またはシクロヘキシルが可能である。実施形態によっては、Ｒ２は、シクロプロピルが可能である。
【０１１７】
Ｒ２が
【化１６】
0006671555.tif 000017
である場合、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３はそれぞれ、独立して、Ｈ、Ｃ１−３飽和アルキル、Ｃ２−３アルケニル、Ｃ２−３アルキニル、及びシクロプロピルから選択され、ただし、Ｒ２基の炭素原子の合計数は、５以下である。実施形態によっては、Ｒ２基の炭素原子の合計数は、４以下、または３以下である。
【０１１８】
実施形態によっては、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３の１つはＨであり、その他の２つの基は、Ｈ、Ｃ１−３飽和アルキル、Ｃ２−３アルケニル、Ｃ２−３アルキニル、及びシクロプロピルから選択される。
【０１１９】
他の実施形態において、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３のうち２つはＨであり、その他の１つの基は、Ｈ、Ｃ１−３飽和アルキル、Ｃ２−３アルケニル、Ｃ２−３アルキニル、及びシクロプロピルから選択される。
【０１２０】
実施形態によっては、Ｈではない基は、メチル及びエチルから選択される。これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｈではない基は、メチルである。
【０１２１】
実施形態によっては、Ｒ２１は、Ｈである。
【０１２２】
実施形態によっては、Ｒ２２は、Ｈである。
【０１２３】
実施形態によっては、Ｒ２３は、Ｈである。
【０１２４】
実施形態によっては、Ｒ２１及びＲ２２は、Ｈである。
【０１２５】
実施形態によっては、Ｒ２１及びＲ２３は、Ｈである。
【０１２６】
実施形態によっては、Ｒ２２及びＲ２３は、Ｈである。
【０１２７】
特に関心が持たれるＲ２基は、以下のものである：
【化１７】
0006671555.tif 000018
。
【０１２８】
Ｒ２が
【化１８】
0006671555.tif 000019
である場合、Ｒ２５ａ及びＲ２５ｂの一方は、Ｈであり、他方は、以下から選択される：フェニル、このフェニルは、ハロ、メチル、メトキシから選択される基により任意選択で置換される；ピリジル；及びチオフェニル。実施形態によっては、Ｈではない基は、任意選択で置換されたフェニルである。フェニルの任意選択置換基が、ハロである場合、これは、好ましくは、フルオロである。実施形態によっては、フェニル基は、無置換である。
【０１２９】
Ｒ２が
【化１９】
0006671555.tif 000020
である場合、Ｒ２４は、以下から選択される：Ｈ；Ｃ１−３飽和アルキル；Ｃ２−３アルケニル；Ｃ２−３アルキニル；シクロプロピル；フェニル、このフェニルは、ハロ、メチル、メトキシから選択される基により任意選択で置換される；ピリジル；及びチオフェニル。フェニルの任意選択置換基が、ハロである場合、これは、好ましくは、フルオロである。実施形態によっては、フェニル基は、無置換である。実施形態によっては、Ｒ２４は、Ｈ、メチル、エチル、エテニル、及びエチニルから選択される。これらの実施形態のあるものにおいて、Ｒ２４は、Ｈ及びメチルから選択される。
【０１３０】
Ｃ２とＣ３の間に単結合がある場合、
Ｒ２は、
【化２０】
0006671555.tif 000021
であり、式中、Ｒ２６ａ及びＲ２６ｂは、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃ１−４飽和アルキル、Ｃ２−３アルケニル、これらアルキル及びアルケニル基は、Ｃ１−４アルキルアミド及びＣ１−４アルキルエステルから選択される基により任意選択で置換される、から選択されるか、または、Ｒ２６ａ及びＲ２６ｂの一方がＨである場合に、他方は、ニトリル及びＣ１−４アルキルエステルから選択される。
【０１３１】
実施形態によっては、Ｒ２６ａ及びＲ２６ｂは、両方ともＨであることが好ましい。
【０１３２】
他の実施形態において、Ｒ２６ａ及びＲ２６ｂは、両方ともメチルであることが好ましい。
【０１３３】
さらなる実施形態において、好ましくは、Ｒ２６ａ及びＲ２６ｂの一方はＨであり、かつ他方は、Ｃ１−４飽和アルキル、Ｃ２−３アルケニルから選択され、これらアルキル及びアルケニル基は、任意選択で置換される。これらさらなる実施形態において、Ｈではない基は、メチル及びエチルから選択されることがさらに好ましい場合がある。
【０１３４】
Ｒ１２
Ｒ２に関する上記の優先事項は、Ｒ１２にも等しく当てはまる。
【０１３５】
本発明の１つの実施形態において、ＤＬは以下のものである。
【化２１】
0006671555.tif 000022
【０１３６】
薬物担持数
薬物担持数は、抗体、例えば抗体あたりのＰＢＤ薬物の平均数である。
【０１３７】
複合体形成反応からＡＤＣを調製する場合の抗体あたりの薬物の平均数は、従来手段、例えば、ＵＶ、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、質量分析法、ＥＬＩＳＡアッセイ、及び電気泳動などにより特性決定可能である。ｐに関してＡＤＣの量的分布を求めることも可能である。ＥＬＩＳＡにより、ＡＤＣの特定製剤におけるｐの平均値を求めることができる（Ｈａｍｂｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １０：７０６３−７０７０；Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １１：８４３−８５２）。しかしながら、ｐ（薬物）値の分布を、抗体抗原結合及びＥＬＩＳＡの検出限界により識別することはできない。同じく、抗体薬物複合体を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイは、薬物部分が抗体のどこに結合しているのか、例えば重鎖または軽鎖断片なのか、あるいは特定のアミノ酸残基なのかを明らかにはしない。場合によっては、ｐがある特定の値である均一なＡＤＣを、薬物担持数が異なるＡＤＣから分離、精製、及び特性決定することは、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動などの手段により達成できる。そのような技法は、他の型の複合体にも応用可能である。
【０１３８】
本発明の抗体薬物複合体の場合、ｐは、抗体上の結合部位の個数、すなわち、アジド基の個数により制限される。例えば、抗体は、薬物リンカーを結合させることが可能なアジド基を１つまたは２つのみ有する場合がある。
【０１３９】
典型的には、複合体形成反応中に、理論上最大値よりも少ない個数の薬物部分が、抗体と複合体形成する。ＡＤＣの担持数（薬物／抗体比）は、複数の異なる様式で制御することができ、そのような様式として、以下が挙げられる：（ｉ）抗体に対する薬物リンカー中間体（Ｄ−Ｌ）またはリンカー試薬のモル過剰量を制限する及び（ｉｉ）複合体形成反応時間及び温度を制限する。
【０１４０】
抗体の複数の求核または求電子基が薬物−リンカー中間体と反応する、またはリンカー試薬と反応し続いて薬物部分試薬と反応する場合、得られる生成物は、抗体と結合した薬物部分が、例えば、１つ、２つ、３つなどの分布を有するＡＤＣ化合物の混合物となる。ポリマー逆相（ＰＬＲＰ）及び疎水的相互作用（ＨＩＣ）などの液体クロマトグラフィー法は、混合物中の化合物を薬物担持数値で分離することができる。単一の薬物担持数値（ｐ）を持つＡＤＣの製剤を単離することが可能であるが、しかしながら、こうした単一の薬物担持数値のＡＤＣでもなお、異種混合物である場合がある。なぜなら、薬物部分は、リンカーを介して、抗体の異なる部位で結合している可能性があるからである。
【０１４１】
したがって、本発明の抗体薬物複合体組成物は、抗体薬物複合体化合物の混合物を含み、この混合物において、抗体は１つまたは複数のＰＢＤ薬物部分を有し、薬物部分は、様々なアミノ酸残基で抗体と結合している可能性がある。
【０１４２】
１つの実施形態において、１抗体あたりの二量体ピロロベンゾジアゼピン基の平均数は、１〜８の範囲である。実施形態によっては、この範囲は、１〜４、１〜４、２〜４、及び１〜３から選択される。
【０１４３】
実施形態によっては、１抗体あたり１つまたは２つの二量体ピロロベンゾジアゼピン基が存在する。
【０１４４】
包含される他の形態
特に記載がない限り、これら置換基の周知のイオン、塩、溶媒和物、及び保護形も、上記に含まれる。例えば、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）についての言及は、アニオン（カルボキシラート）形（−ＣＯＯ−）、その塩または溶媒和物、ならびに通常の保護形も含む。同様に、アミノ基についての言及は、プロトン化形（−Ｎ＋ＨＲ１Ｒ２）、その塩または溶媒和物、例えば、塩酸塩、ならびにアミノ基の通常の保護形も含む。同様に、ヒドロキシル基についての言及は、アニオン形（−Ｏ−）、その塩または溶媒和物、ならびに通常の保護形も含む。
【０１４５】
塩
活性化合物の相当する塩、例えば、薬学上許容される塩を調製、精製、及び／または取り扱うことが、好都合であるまたは望ましい場合がある。薬学上許容される塩の例は、Ｂｅｒｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．，  ６６，  １−１９（１９７７）に記載される。
【０１４６】
例えば、化合物がアニオン性である、またはアニオンになることが可能な官能基（例えば、−ＣＯＯＨは、−ＣＯＯ−になることが可能）を有する場合、適切なカチオンで塩を形成することができる。適切な無機カチオンの例として、アルカリ金属イオン、例えば、Ｎａ＋及びＫ＋など、アルカリ土類カチオン、例えば、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋など、ならびに他のカチオン、例えばＡｌ＋３などが挙げられるが、これらに限定されない。適切な有機カチオンの例として、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ４＋）及び置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ３Ｒ＋、ＮＨ２Ｒ２＋、ＮＨＲ３＋、ＮＲ４＋）が挙げられるが、これらに限定されない。適切な置換アンモニウムイオンのいくつかの例として、以下に由来するものがある：エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、及びトロメタミン、ならびにアミノ酸、例えば、リシン及びアルギニンなど。一般的な第四級アンモニウムイオンの例として、Ｎ（ＣＨ３）４＋がある。
【０１４７】
化合物がカチオン性である、またはカチオンになることが可能な官能基（例えば、−ＮＨ２は、−ＮＨ３＋になることが可能）を有する場合、適切なアニオンで塩を形成することができる。適切な無機アニオンの例として、以下の無機酸に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、及び亜リン酸。
【０１４８】
適切な有機アニオンの例として、以下の有機酸に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない：２−アセチルオキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、ケイ皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボキン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、及び吉草酸。適切な有機アニオンポリマーの例として、以下の酸ポリマーに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない：タンニン酸、カルボキシメチルセルロース。
【０１４９】
溶媒和物
活性化合物の相当する溶媒和物を調製、精製、及び／または取り扱うことが、好都合であるまたは望ましい場合がある。「溶媒和物」という用語は、本明細書中、従来の意味で使用され、溶質（例えば、活性化合物、活性化合物の塩）と溶媒の複合体を示す。溶媒が水である場合、溶媒和物は、都合よく、水和物、例えば、一水和物、二水和物、三水和物などと称することができる。
【０１５０】
本発明は、溶媒がＰＢＤ部分のイミン結合にまたがって付加した化合物を含む。溶媒が水またはアルコール（ＲＡＯＨ、式中、ＲＡはＣ１−４アルキルである）場合のそのような化合物を下に示す：
【化２２】
0006671555.tif 000023
これらの形は、カルビノールアミン及びカルビノールアミンエーテル形のＰＢＤと呼ぶことが可能である（上記のＲ１０に関するセクションで記載のとおり）。これらの平衡のバランスは、化合物が見られるときの条件、ならびに部分自身の性質に依存する。
【０１５１】
これらの特定化合物は、例えば、凍結乾燥により、固体で単離することができる。
【０１５２】
異性体
本発明のある特定の化合物は、１つまたは複数の特定の幾何異性体、光学異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、エピ異性体、アトロプ異性体、立体異性体、互変異性体、配座異性体、またはアノマー異性体形で存在することが可能であり、そのような異性体形として、シス及びトランス形；Ｅ及びＺ形；ｃ、ｔ、及びｒ形；エンド及びエキソ形；Ｒ、Ｓ、及びメソ形；Ｄ及びＬ形；ｄ及びｌ形；（＋）及び（−）形；ケト、エノール、及びエノラート形；シン及びアンチ形；シンクリナル及びアンチクリナル形；α及びβ形；アキシャル及びエカトリアル形；舟、いす、ねじれ、封筒、及び半いす形；ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されず、本明細書中以下、まとめて「異性体」（または異性体形）と称する。
【０１５３】
「キラル」という用語は、自らの鏡像パートナーと重ね合せることができない性質を持つ分子を示し、一方「アキラル」という用語は、自らの鏡像パートナーと重ね合せることができる分子を示す。
【０１５４】
「立体異性体」という用語は、同一の化学組成を有するが、原子または基の空間配置に関して異なる化合物を示す。
【０１５５】
「ジアステレオマー」は、２つ以上の不斉中心を持ち、その分子が互いに相手の鏡像ではない立体異性体を示す。ジアステレオマーは、物性、例えば、融点、沸点、分光特性、及び反応性などが異なる。ジアステレオマーの混合物は、電気泳動及びクロマトグラフィーなどの高分解能分析手法で分離可能である。
【０１５６】
「鏡像異性体」は、互いに重ね合わせができない鏡像である化合物の２つの立体異性体を示す。
【０１５７】
本明細書中使用される立体化学の定義及び慣習は、概して、Ｓ．  Ｐ．  Ｐａｒｋｅｒ，  Ｅｄ．，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（１９８４）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ＮｅｗＹｏｒｋ；及びＥｌｉｅｌ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｎ，  Ｓ．，  ‘‘Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ’’，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９４に従う。本発明の化合物は、不斉中心またはキラル中心を有する場合があり、したがって、異なる立体異性体形で存在する場合がある。本発明の化合物は、ジアステレオマー、鏡像異性体、及びアトロプ異性体をはじめとする、しかしこれらに限らない全ての立体異性体形、ならびにラセミ混合物などのそれらの混合物が、本発明の一部をなすものとする。多くの有機化合物は、光学活性形で存在する、すなわち、それらは、平面偏光の面を回転させる能力を有する。光学活性化合物の記載では、接頭語Ｄ及びＬ、またはＲ及びＳを用いて、分子のキラル中心（複数可）についてその絶対配置を表す。接頭語ｄ及びｌまたは（＋）及び（−）は、その化合物による平面偏光の回転の方向を指定するために用いられ、（−）またはｌは、化合物が左旋性であることを意味する。（＋）またはｄが先頭に付いた化合物は、右旋性である。所定の化学構造について、これらの立体異性体は、それらが互いに相手の鏡像であることを除いて、同一である。特定の１種類の立体異性体を鏡像異性体と称する場合もあり、そのような異性体の混合物は、鏡像異性体混合物と呼ばれる場合が多い。鏡像異性体の５０：５０混合物は、ラセミ混合物またはラセミ体と称し、これは、化学反応またはプロセスにおいて立体選択性または立体特異性がなかった場合に生じる可能性がある。「ラセミ混合物」及び「ラセミ体」という用語は、２種の鏡像異性体種の等モル混合物を示し、これは光学活性がない。
【０１５８】
なお、以下の互変異性体形に関する記述を除き、「異性体」という用語が、本明細書中使用される場合、構造（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ）（または構造（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ））異性体（すなわち、原子の空間配置だけというのでなく、原子間の接続が異なる異性体）は、具体的に除外される。例えば、メトキシ基、−ＯＣＨ３についての記述は、その構造異性体であるヒドロキシメチル基、−ＣＨ２ＯＨについての記述であると見なされることはない。同様に、ｏｒｔｈｏ−クロロフェニルについての記述は、その構造異性体であるｍｅｔａ−クロロフェニルについての記述であると見なされることはない。しかしながら、あるクラスの構造についての記述は、そのクラスの範疇に入る構造異性体形を含むことが十分可能である（例えば、Ｃ１−７アルキルは、ｎ−プロピル及びｉｓｏ−プロピルを含み；ブチルは、ｎ−、ｉｓｏ−、ｓｅｃ−、及びｔｅｒｔ−ブチルを含み；メトキシフェニルは、ｏｒｔｈｏ−、ｍｅｔａ−、及びｐａｒａ−メトキシフェニルを含む）。
【０１５９】
上記の除外は、互変異性体形、例えば、ケト、エノール、及びエノラート形、例えば、以下の互変異性体対のような場合には関係しない：ケト／エノール（以下に図示する）、イミン／エナミン、アミド／イミノアルコール、アミジン／アミジン、ニトロソ／オキシム、チオケトン／エンチオール、Ｎ−ニトロソ／ヒドロキシアゾ、及びニトロ／ａｃｉ−ニトロ。
【化２３】
0006671555.tif 000024
【０１６０】
「互変異性体」または「互変異性体形」という用語は、低いエネルギー障壁を越えて相互変換可能な異なるエネルギーの構造異性体を示す。例えば、プロトン互変異性体（プロトトロピック互変異性体としても知られる）として、プロトンの移動を介した相互変換、例えば、ケト−エノール及びイミン−エナミン異性化が挙げられる。原子価互変異性体として、結合電子のあるものの再組織化による相互変換が挙げられる。
【０１６１】
なお、「異性体」という用語には、１つまたは複数の同位体置換を持つ化合物も、具体的に含まれる。例えば、Ｈは、任意の同位体形の可能性があり、そのような同位体形として、１Ｈ、２Ｈ（Ｄ）、及び３Ｈ（Ｔ）が挙げられる；Ｃは、任意の同位体形の可能性があり、そのような同位体形として、１２Ｃ、１３Ｃ、及び１４Ｃが挙げられる；Ｏは、任意の同位体形の可能性があり、そのような同位体形として、１６Ｏ及び１８Ｏが挙げられる；などである。
【０１６２】
本発明の化合物に組み込むことが可能な同位体の例として、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素、及び塩素の同位体が挙げられ、例えば、２Ｈ（重水素、Ｄ）、３Ｈ（トリチウム）、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、及び１２５Ｉなどであるが、これらに限定されない。本発明の化合物を様々な同位体で標識したもの、例えば、３Ｈ、１３Ｃ、及び１４Ｃなどの放射性同位元素が組み込まれているもの。そのような同位体標識した化合物は、代謝研究、反応速度研究、検出または画像化技法、例えば、薬物もしくは基質の組織分布アッセイを含むポジトロン断層撮影法（ＰＥＴ）または単光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）において、あるいは患者の放射線治療において、有用である可能性がある。重水素で標識または置換した本発明の治療化合物は、分布、代謝、及び排泄（ＡＤＭＥ）に関連して、ＤＭＰＫ（薬物代謝及び薬物動態学）特性が改善されている可能性がある。重水素などより重い同位体への置換は、代謝安定性がより高まることに由来するある特定の治療上の利点、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長または投薬必要量の減少など、をもたらす可能性がある。１８Ｆ標識した化合物は、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ検査で有用である可能性がある。同位体標識した本発明の化合物及びそのプロドラッグは、一般に、非同位体標識試薬を容易に入手可能な同位体標識試薬に置き換えて、以下に記載されるスキームまたは実施例及び調製で開示される手順を行うことにより、調製可能である。さらに、より重い同位体、特に重水素（すなわち、２ＨまたはＤ）に置き換えることは、代謝安定性がより高まることに由来するある特定の治療上の利点、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長または投薬必要量の減少または治療指標の改善など、をもたらす可能性がある。この文脈における重水素は、置換基と見なされる。そのような重い同位体、特に重水素の濃度は、同位体濃縮係数により定義することが可能である。本発明の化合物において、特定の同位体として具体的に指定されていない任意の原子は、その原子の任意の安定同位体を表すことを意味する。
【０１６３】
特に記載がない限り、特定化合物についての記述は、こうした異性体形を全て、それらの（完全または部分）ラセミ混合物及び他の混合物も含めて、包含する。こうした異性体形の調製方法（例えば、不斉合成）及び分離方法（例えば、分別結晶化及びクロマトグラフィー手段）は、当該分野で既知であるか、本明細書中教示される方法もしくは既知の方法を、既知の様式で適用することにより容易に得られる。
【０１６４】
生物活性
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイ
一般に、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の細胞毒性または細胞分裂阻害活性は、以下により測定される：受容体タンパク質を有する哺乳類細胞を、細胞培地中で、ＡＤＣの抗体と接触させる；細胞を、約６時間〜約５日間の期間、培養する；そして、細胞生存度を測定する。細胞に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、生存度（増殖）、細胞毒性、及び本発明のＡＤＣのアポトーシス誘導（カスパーゼ活性）を測定する。
【０１６５】
抗体薬物複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ力価は、細胞増殖アッセイにより測定可能である。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙは、市販されているアッセイであり（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、甲虫目ルシフェラーゼの組換え発現に基づく均一アッセイ方法である（米国特許第５５８３０２４号、同第５６７４７１３号、及び同第５７００６７０号）。この細胞増殖アッセイは、代謝活性細胞の指標である存在するＡＴＰの定量に基づき、培養物中の生存細胞の個数を特定する（Ｃｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  １６０：８１−８８；ＵＳ６６０２６７７）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイは、９６ウェル形式で行われるので、自動高処理スクリーニング系（ＨＴＳ）で行うことが可能である（Ｃｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ６：３９８−４０４）。均一アッセイ手順は、血清添加した培地で培養された細胞に、単一試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬）を直接加えることを含む。細胞洗浄、培地除去、及び複数のピペット工程を、必要としない。この系は、試薬を加え混合してから１０分後には、３８４ウェル形式でわずか１５細胞／ウェルでも検出することができる。細胞は、ＡＤＣで連続処理されている場合もあるし、処理された後ＡＤＣから分離される場合もある。一般に、手短に、すなわち３時間処理された細胞は、連続処理された細胞と同じ力価効果を示した。
【０１６６】
均一「添加混合測定」様式は、細胞溶解及び存在するＡＴＰ量に比例した発光シグナルの発生をもたらす。ＡＴＰの量は、培養物中に存在する細胞数と直接比例する。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイは、ルシフェラーゼ反応により生成する「グロー型」発光シグナルを生成し、このシグナルは、細胞型及び使用した培地に応じて、一般に５時間を超える半減期を有する。生存細胞数は、相対発光単位（ＲＬＵ）に反映される。基質である甲虫ルシフェリンは、組換えホタルルシフェラーゼにより酸化的脱カルボン酸化され、これと同時にＡＴＰをＡＭＰに変換し、光子を生成する。
【０１６７】
抗体薬物複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ力価は、細胞毒性アッセイにより測定することもできる。培養した付着細胞を、ＰＢＳで洗い、トリプシンで脱離させ、１０％ＦＣＳを含有する完全培地に希釈し、遠心し、新たな培地に再懸濁させ、血球計算器で計数する。懸濁液培養物は、直接計数する。計数に適した単分散細胞懸濁液は、繰り返し吸引により撹拌して細胞塊を壊す必要がある場合がある。
【０１６８】
細胞懸濁液を、所望の播種密度に希釈し、黒色９６ウェルプレートに分注する（１ウェルあたり１００μｌ）。付着細胞株のプレートは、一晩インキュベートして、付着させる。懸濁細胞培養物は、播種の日に使用することができる。
【０１６９】
ＡＤＣ貯蔵原液（２０μｇ／ｍｌ）（１ｍｌ）は、適切な細胞培地で作成する。ＡＤＣ原液の系列１０倍希釈は、１５ｍｌ遠心管で、系列的に１００μｌを細胞培地９００μｌに移すことにより作成する。
【０１７０】
９６ウェル黒色プレート中、４つの複製ウェルのそれぞれに各ＡＤＣ希釈濃度（１００μｌ）を分注する。そこにはあらかじめ細胞懸濁液（１００μｌ）が播種してあり、その結果、最終体積は２００μｌになる。対照ウェルには、細胞培地（１００μｌ）を入れる。
【０１７１】
細胞株の倍加時間が３０時間より長い場合、ＡＤＣインキュベーションは５日間とし、それ以外は、４日間のインキュベーションを行う。
【０１７２】
インキュベーション期間終了時、アラマーブルーアッセイで細胞生存度を評価する。アラマーブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、プレート全体にわたって分注し（１ウェルあたり２０μｌ）、４時間インキュベートする。アラマーブルー蛍光を、Ｖａｒｉｏｓｋａｎフラッシュプレートリーダーで、励起５７０ｎｍ、発光５８５ｎｍで測定する。対照ウェルの平均蛍光に対するＡＤＣ処理ウェルの平均蛍光から、細胞生存パーセンテージを計算する。
【０１７３】
用途
本発明の複合体は、標的部位にＰＢＤ化合物を提供するために用いることができる。
【０１７４】
標的部位は、好ましくは、増殖細胞集団である。抗体は、増殖細胞集団に存在する抗原に対する抗体である。
【０１７５】
１つの実施形態において、抗原は、非増殖性細胞集団に、存在しない、または存在しても、増殖細胞集団、例えば、腫瘍細胞集団に存在する抗原の量に比べて低下したレベルである。
【０１７６】
標的部位で、リンカーは、化合物ＲｅｌＡを放出するように、切断される可能性がある。すなわち、複合体は、標的部位に化合物ＲｅｌＡを選択的に提供するために用いることができる。
【０１７７】
リンカーは、標的部位に存在する酵素により切断可能である。
【０１７８】
標的部位は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏの場合がある。
【０１７９】
本発明の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）化合物として、抗がん活性に関する有用性を持つものが挙げられる。詳細には、本化合物として、ＰＢＤ薬物部分、すなわち毒素と、複合体形成した、すなわち、リンカーにより毒素と共有結合した抗体が挙げられる。ＰＢＤ薬物が抗体と複合体形成していない場合、その薬物は、細胞毒性効果を有する。すなわち、ＰＢＤ薬物部分の生物活性は、抗体と複合体形成することにより調節される。本発明の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、有効量の細胞毒性剤を腫瘍組織に選択的に送達し、それにより、より高い選択性を、すなわちより低い有効量を達成することが可能である。
【０１８０】
すなわち、１つの態様において、本発明は、治療に使用するための、本明細書中記載されるとおりの複合体化合物を提供する。
【０１８１】
さらなる態様において、同じく提供されるのは、増殖性疾患の治療に使用するための、本明細書中記載されるとおりの複合体化合物である。本発明の第二の態様は、増殖性疾患の治療用医薬の製造における複合体化合物の使用を提供する。
【０１８２】
当業者なら、候補の複合体が任意の特定細胞型について増殖性症状を治療するかどうかを、容易に決定することができる。例えば、特定化合物により提供される活性を査定するのに都合良く用いることができるアッセイを、以下の実施例で記載する。
【０１８３】
「増殖性疾患」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏであるかｉｎ  ｖｉｖｏであるかに関わらず、望ましくない過剰なまたは異常細胞の望ましくないまたは制御不能な細胞増殖、例えば、腫瘍性または過形成増殖に関する。
【０１８４】
増殖性症状の例として、良性、前悪性、及び悪性細胞増殖が挙げられるがこれらに限定されず、そのような細胞増殖として、新生物及び腫瘍（例えば、組織球腫、神経膠腫、星細胞腫、骨腫）、がん（例えば、肺癌、小細胞肺癌、消化器癌、腸癌、結腸癌、乳癌、卵巣癌、食道癌、前立腺癌、精巣癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、脳癌、肉腫、骨肉腫、カポジ肉腫、黒色腫）、リンパ腫、白血病、乾癬、骨疾患、線維増殖性障害（例えば、結合組織のもの）、及び粥状動脈硬化が挙げられるがこれらに限定されない。特に関心が持たれるがんとして、白血病及び卵巣癌が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１８５】
任意の型の細胞を処置することが可能であり、そのような細胞として、肺、消化管（例えば、腸、結腸を含む）、乳房（乳腺）、卵巣、前立腺、肝臓（肝性）、腎臓（腎性）、膀胱、膵臓、脳、及び皮膚が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１８６】
特に関心が持たれる障害として、がんが挙げられるがこれらに限定されず、がんとして、転移性がん及び転移性がん細胞、例えば、血液またはリンパなどの体液で循環しているところが見つかる可能性がある、循環腫瘍細胞などが挙げられる。特に関心が持たれるがんとして、以下が挙げられる：乳癌、肺癌、胃癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌、及び前立腺癌、ならびにリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ＮＨＬ）、及び白血病（特に、急性骨髄性白血病、ＡＭＬ）。
【０１８７】
関心が持たれる他の障害として、Ａｘｌが過剰発現する任意の症状、またはＡｘｌ拮抗作用が臨床的有用性をもたらすことになる任意の症状が挙げられる。そのような症状として、免疫不全、心血管障害、血栓症、糖尿病、免疫チェックポイント障害、線維性障害（線維症）、または増殖性疾患、例えば、がん、詳細には転移性癌が挙げられる。さらに、Ａｘｌは、上皮起源の多くのがんにおいて役割を果たすことが知られている。
【０１８８】
関心が持たれる線維性障害として、斜視、強皮症、ケロイド、腎性全身性線維症、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、全身性硬化症、心線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、他の型の肝線維症、原発性胆汁性肝硬変、腎線維症、がん、及びアテローム性動脈硬化が挙げられる。これらの疾患において、組織における線維症の慢性的な進行は、罹患臓器の構造における著しい変化をもたらし、続いて臓器機能の欠陥を引き起こす。臓器への持続的な消耗のこの過程の結果として、線維症を含む多くの疾患はしばしば進行性の状態にあり、そして長期の予後不良を有する（Ｒｏｃｋｅｙ，  Ｄ．Ｃ．，  Ｂｅｌｌ，  Ｐ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｈｉｌｌ，  Ｊ．Ａ．（２０１５），  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｍｅｄ．，  Ｖｏｌ．  ３７２，  ｐｐ．  １１３８−１１４９を参照）。
【０１８９】
本発明の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、様々な疾患または障害、例えば、腫瘍抗原の過剰発現を特徴とするものの治療に使用される場合があることが企図される。症状または過剰増殖障害の例として、良性または悪性腫瘍；白血病、血液系悪性腫瘍、及びリンパ系悪性腫瘍が挙げられる。他のものとして、神経性障害、グリア細胞障害、星状細胞障害、視床下部障害、腺性障害、マクロファージ障害、上皮障害、間質性障害、胞胚腔障害、炎症性障害、血管原性障害、及び自己免疫障害を含む免疫障害が挙げられる。
【０１９０】
一般に、治療対象となる疾患または障害は、がんなどの過剰増殖疾患である。本明細書中、治療対象となるがんの例として、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病またはリンパ系悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。こうしたがんのより詳細な例として、扁平細胞癌（例えば、扁平上皮癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌を含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ）または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、膵癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎性癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝性癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頚部癌が挙げられる。
【０１９１】
治療にＡＤＣ化合物を使用する場合がある自己免疫疾患として、リウマチ障害（例えば、関節リウマチ、シェーグレン症候群、強皮症、ＳＬＥ及びループス腎炎などのループス、多発性筋炎／皮膚筋炎、低温型グロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群、及び乾癬性関節炎など）、変形性関節炎、自己免疫性消化管及び肝臓障害（例えば、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病など）、自己免疫性胃炎及び悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ならびにセリアック病など）、血管炎（例えば、チャーグ・ストラウス血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、及び多発性動脈炎をはじめとするＡＮＣＡ関連血管炎など）、自己免疫性神経障害（例えば、多発性硬化症、眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び自己免疫性多発ニューロパチーなど）、腎性障害（例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、及びベルジェ病など）、自己免疫性皮膚障害（例えば、乾癬、蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）、蕁麻疹（ｈｉｖｅｓ）、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、及び皮膚エリテマトーデスなど）、血液障害（例えば、血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後紫斑病、及び自己免疫性溶血性貧血など）、粥状動脈硬化、ぶどう膜炎、自己免疫性聴覚障害（例えば、内耳疾患及び難聴など）、ベーチェット病、レイノー病、臓器移植、ならびに自己免疫性内分泌障害（例えば、糖尿病関連自己免疫疾患、例えば、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、アジソン病、及び自己免疫性甲状腺疾患（例えば、グレーブス病及び甲状腺炎）など）が挙げられる。そのような疾患のより好ましいものとして、例えば、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、ループス、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーブス病、ＩＤＤＭ、悪性貧血、甲状腺炎、及び糸球体腎炎が挙げられる。
【０１９２】
治療方法
本発明の複合体は、治療方法において使用可能である。同じく提供されるのは、治療方法であり、本方法は、治療を必要としている対象に、治療上有効量の本発明の複合体化合物を投与することを含む。「治療上有効量」という用語は、患者に対して有益性を示すのに十分な量である。そのような有益性は、少なくとも１種の症候の少なくとも寛解である場合がある。投与される実際量、ならびに投与の速度及び時間経過は、治療されるものの性質及び重篤度に依存することになる。治療の処方、例えば、投薬量の決定は、一般開業医及び他の医療医師の担当範囲に含まれる。
【０１９３】
本発明の化合物は、単独で投与することも、他の治療と併用することも可能であり、併用する場合は、治療対象となる症状に応じて同時または順次いずれかである。治療及び療法の例として、化学療法（例えば、化学療法剤などの薬物をはじめとする活性作用剤の投与）；手術；及び放射線療法が挙げられるが、これらに限定されない
【０１９４】
「化学療法薬」とは、作用機序に関わらず、がんの治療に有用な化学合成物質である。化学療法薬のクラスとして、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルキル化剤、代謝拮抗剤、紡錘体毒植物アルカロイド、細胞毒性／抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、抗体、光増感剤、及びキナーゼ阻害剤。化学療法薬として、「標的治療」及び従来の化学療法に使用される化合物が挙げられる。
【０１９５】
化学療法薬の例として、以下が挙げられる：エルロチニブ（タルセバ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（タキソテール（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ＣＡＳ  Ｎｏ．５１−２１−８）、ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標）、Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ  Ｎｏ．３９１２１０−１０−９、Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（ｃｉｓ−ジアミン、ジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ  Ｎｏ．１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ  Ｎｏ．４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（タキソール（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペンタアザビシクロ［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキサミド、ＣＡＳ  Ｎｏ．８５６２２−９３−１、テモダール（ＴＥＭＯＤＡＲ）（登録商標）、テモダール（ＴＥＭＯＤＡＬ）（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブタ−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン、ノルバデックス（登録商標）、ＩＳＴＵＢＡＬ（登録商標）、ＶＡＬＯＤＥＸ（登録商標））、及びドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標））、Ａｋｔｉ−１／２、ＨＰＰＤ、及びラパマイシン。
化学療法薬のさらなる例として、以下が挙げられる：オキサリプラチン（エロキサチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ）（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（スニチニブ（登録商標）、ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（フェマーラ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、イマチニブメシル酸塩（グリベック（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（ＭＥＫ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、ＷＯ２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（ＭＥＫ阻害剤、ＡＺＤ６２４４、Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｓｅｍａｆｏｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（フェソロデックス（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ロイコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス、ラパミューン（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）、ロナファルニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ（商標）、ＳＣＨ６６３３６、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ネクサバール（登録商標）、ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（カンプトサール（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ）（登録商標）、ＣＰＴ−１１、Ｐｆｉｚｅｒ）、チピファルニブ（ザルネストラ（ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ）（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、アブラキサン（商標）（クレモホールを含まない）、すなわちパクリタキセルのアルブミン改変ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ、ＺＤ６４７４、ザクティマ（ＺＡＣＴＩＭＡ）（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（トーリセル（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンホスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標）、Ｔｅｌｉｋ）、チオテパ及びシクロホスファミド（シトキサン（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなど；アジリジン、例えば、ｂｅｎｚｏｄｏｐａ、カルボコン、ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ、及びｕｒｅｄｏｐａなど；エチレンイミン及びメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロメラミンなど；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ；ＣＣ−１０６５（その合成類似体であるアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシンを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ディオカルマイシン（合成類似体である、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなど；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質など（例えば、カリチアマイシン、カリチアマイシンガンマ１Ｉ、カリチアマイシンオメガＩ１（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔｌ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．（１９９４）３３：１８３−１８６）；ジネマイシン、ジネマイシンＡ；ビスホスホナート、例えば、クロドロネートなど；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団など）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアザ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、ネモルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣなど、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝産物、例えば、メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなど；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど；アンドロゲン、例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；抗副腎皮質薬、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えば、フォリン酸など；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルニチン；エリプチニウム酢酸塩（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポシロン��エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシノイド、例えば、マイタンシン及びアンサミトシンなど；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテンセン（特に、Ｔ−２トキシン、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類似体、例えば、シスプラチン及びカルボプラチンなど；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン（ナベルビン（登録商標））；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；カペシタビン（ゼローダ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸など；ならびに上記のいずれかのものの薬学上許容される塩、酸、及び誘導体。
【０１９６】
同じく「化学療法薬」の定義に含まれるのは、以下のものである：（ｉ）腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン薬及び選択的エストロゲン受容体修飾薬（ＳＥＲＭ）など、そのような抗ホルモン剤として、例えば、タモキシフェン（ノルバデックス（登録商標）；タモキシフェンクエン酸塩を含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びフェアストン（登録商標）（トレミフェンクエン酸塩）などが挙げられる；（ｉｉ）副腎でのエストロゲン産生を調節する酵素、アロマターゼを阻害する、アロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、アロマシン（登録商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、ホルメスタン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ボロゾール）、フェマーラ（登録商標）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、及びアリミデックス（登録商標）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）など；（ｉｉｉ）抗アンドロゲン剤、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなど；ならびに、トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；（ｉｖ）タンパク質キナーゼ阻害剤、例えば、ＭＥＫ阻害剤（ＷＯ  ２００７／０４４５１５）；（ｖ）脂質キナーゼ阻害剤；（ｖｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異所細胞増殖に関係付けられるシグナル伝達経路における遺伝子発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、及びＨ−Ｒａｓ、例えば、オブリメルセン（ゲナセンス（登録商標）、Ｇｅｎｔａ  Ｉｎｃ．）など；（ｖｉｉ）リボザイム、例えば、ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標））など、及びＨＥＲ２発現阻害剤；（ｖｉｉｉ）ワクチン、例えば、遺伝子治療ワクチン、例えば、アロベクチン（登録商標）、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）など；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；トポイソメラーゼ１阻害剤、例えば、ルルトテカン（登録商標）など；アバレリックス（登録商標）ｒｍＲＨ；（ｉｘ）血管新生阻害剤、例えば、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ならびに上記のいずれかのものの薬学上許容される塩、酸、及び誘導体。
同じく「化学療法薬」の定義に含まれるのは、治療用抗体、例えば、アレムツズマブ（キャンパス）、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；セツキシマブ（アービタックス（登録商標）、Ｉｍｃｌｏｎｅ）；パニツムマブ（ベクティビックス（登録商標）、Ａｍｇｅｎ）、リツキシマブ（リツキサン（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、オファツムマブ（アーゼラ（登録商標）、ＧＳＫ）、ペルツズマブ（パージェタ（商標）、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標）、２Ｃ４、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トシツモマブ（ベキサール、Ｃｏｒｉｘｉａ）、及び抗体薬物複合体である、ゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）などである。
【０１９７】
本発明の複合体と組み合わせて化学療法薬としての治療可能性を持つヒト化モノクローナル抗体として、以下が挙げられる：アレムツズマブ、アポリズマブ、アセリズマブ（ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）、アトリズマブ、バピノイズマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブメルタンシン（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、カンツズマブメルタンシン、セデリズマブ、セルトリズマブペゴール、シドフシツズマブ（ｃｉｄｆｕｓｉｔｕｚｕｍａｂ）、シドツズマブ（ｃｉｄｔｕｚｕｍａｂ）、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、ラベツズマブ、リンツズマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、モダビズマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、ノロビズマブ（ｎｏｌｏｖｉｚｕｍａｂ）、ヌマビズマブ（ｎｕｍａｖｉｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パスコリズマブ、ペクフシツズマブ（ｐｅｃｆｕｓｉｔｕｚｕｍａｂ）、ペクツズマブ（ｐｅｃｔｕｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ラリビズマブ（ｒａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、ラニビズマブ、レスリズマブ、レスリズマブ、レシビズマブ（ｒｅｓｙｖｉｚｕｍａｂ）、ロベリズマブ、ルプリズマブ、シブロツマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シプリズマブ、ソンツズマズ（ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、テフィバズマブ、トシリズマブ、トラリズマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブセルモロイキン（ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ  ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）、ツクシツズマブ、オマリズマブ、ウルトキサズマブ、及びビジリズマブ。
【０１９８】
本発明による、及び本発明に従った使用のための医薬組成物は、活性成分、すなわち複合体化合物の他に、薬学上許容される賦形剤、キャリア、緩衝剤、安定化剤、または当業者に周知の他の材料を含むことができる。そのような材料は、無毒でなければならず、また、活性成分の効力に干渉してはならない。キャリアまたは他の材料の正確な性質は、投与経路に依存することになり、投与経路は、経口または注射、例えば、皮膚、皮下、もしくは静脈内注射による場合がある。
【０１９９】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、または液剤の形状をしている場合がある。錠剤は、固形キャリアまたはアジュバントを含むことができる。液状医薬組成物は、一般に、水、石油、動物油もしくは植物油、鉱物油、または合成油などの液状キャリアを含む。生理食塩水溶液、ブドウ糖もしくは他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含ませることができる。カプセル剤は、ゼラチンなどの固形キャリアを含むことができる。
【０２００】
静脈内、皮膚、もしくは皮下注射、または患部への注射用の場合、活性成分は、非経口で許容可能な水性液剤の形状をとることになり、この液剤は、パイロジェンを含まず、かつ適切なｐＨ、等張性、及び安定性を有する。当業者なら、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを用いて、適切な液剤を調製することが十分可能である。保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び／または他の添加剤を、必要に応じて含ませることができる。
【０２０１】
配合物
複合体化合物は、単独で使用する（例えば、投与する）ことが可能であるものの、それを組成物または配合物として存在させることが望ましい場合が多い。
【０２０２】
１つの実施形態において、組成物は、本明細書中記載されるとおりの複合体化合物、及び薬学上許容されるキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物（例えば、配合物、製剤、薬剤）である。
【０２０３】
１つの実施形態において、組成物は、本明細書中記載されるとおりの複合体化合物の少なくとも１種を、当業者に周知の１種または複数の他の薬学上許容される成分とともに含む医薬組成物であり、薬学上許容される成分として、薬学上許容されるキャリア、希釈剤、賦形剤、アジュバント、充填剤、緩衝剤、保存剤、抗酸化剤、潤滑剤、安定化剤、可溶化剤、界面活性剤（例えば、湿潤剤）、マスキング剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
１つの実施形態において、組成物は、さらに、他の活性作用剤、例えば、他の治療薬または予防薬を含む。
【０２０５】
適切なキャリア、希釈剤、賦形剤などは、標準的な医薬書で見つけることができる。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （ｅｄｓ．  Ｍ．  Ａｓｈ  ａｎｄ  Ｉ．  Ａｓｈ），  ２００１（Ｓｙｎａｐｓｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｅｎｄｉｃｏｔｔ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ），  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐｕｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ２０００；及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９４を参照。
【０２０６】
本発明の別の態様は、医薬組成物の作成方法に関し、本方法は、少なくとも１種の［１１Ｃ］−放射標識した本明細書中記載されるとおりの複合体または複合体様化合物を、当業者に周知の１種または複数の薬学上許容される成分、例えば、キャリア、希釈剤、賦形剤などと一緒に混合することを含む。別個の単位（例えば、錠剤など）として配合される場合、各単位は、予め定められた量（投薬量）の活性化合物を含有する。
【０２０７】
「薬学上許容される」という用語は、本明細書中使用される場合、妥当な医学的判断の範囲内で、問題の対象（例えば、ヒト）の組織と接触する使用に適しており、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わず、合理的なベネフィット／リスクに釣り合う、化合物、成分、材料、組成物、剤形などに関する。各キャリア、希釈剤、賦形剤などは、配合物の他の成分と適合性があるという意味において「許容可能」でもなければならない。
【０２０８】
配合物は、薬学分野で周知の任意の方法により調製することができる。そのような方法は、活性化合物を、１種または複数の補助成分を構成するキャリアと会合させる工程を含む。一般に、配合物は、活性化合物とキャリア（例えば、液状キャリア、微粉砕固形キャリアなど）を均一かつ密接に会合させ、その後、必要であれば製品へと成型することにより、調製される。
【０２０９】
配合物は、迅速または緩徐な放出；即時、遅延、または徐放性；あるいはそれらの組み合わせを提供するように調製することができる。
【０２１０】
非経口投与（例えば、注射による）に適した配合物として、水性または非水性の、等張性で、パイロジェンを含まない、滅菌液体（例えば、液剤、懸濁剤）が挙げられ、この液体に、活性成分は、溶解している、懸濁している、またはそれ以外で提供されている（例えば、リポソームまたは他の微粒子に入れられて）。そのような液体は、追加で、他の薬学上許容される成分、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定化剤、静菌剤、懸濁化剤、増粘剤、及び配合物を予定されるレシピエントの血液（または他の関連体液）と等張性にする溶質などを含有することができる。賦形剤の例として、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などが挙げられる。そのような配合物用の適切な等張性キャリアの例として、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、または乳酸リンゲル注射液が挙げられる。典型的には、液体中の活性成分の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、例えば約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌである。配合物は、単位用量または複数用量で密閉された容器、例えば、アンプル及びバイアル中に入れられている場合があり、また、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓｅｄ））状態で貯蔵されていて、使用直前に滅菌液状キャリア、例えば水を加えるだけでよい場合がある。即時注射液剤及び懸濁剤は、滅菌散剤、顆粒、及び錠剤から調製することができる。
【０２１１】
投薬量
当業者には当然のことながら、複合体化合物、及び複合体化合物を含む組成物の適切な投薬量は、患者ごとに異なる可能性がある。最適な投薬量の決定は、一般に、治療効果のレベルとあらゆるリスクまたは危険な副作用との兼ね合いが関与することになる。選択される投薬量レベルは、様々な要因に依存することになり、そのような要因として、特定化合物の活性、投与経路、投与時間、化合物の排泄速度、治療期間、併用される他の薬物、化合物、及び／または材料、症状の重篤度、ならびに患者の種族、性別、年齢、体重、状態、全身の健康状態、及び以前の治療歴が挙げられるが、これらに限定されない。化合物の量及び投与経路は、最終的に、医師、獣医師、または臨床医の判断に任されることになるが、一般に、投薬量は、実質的に有害なまたは危険な副作用を引き起こすことなく所望の効果を達成する局所濃度を作用部位で達成するように選択されることになる。
【０２１２】
投与は、一つの用量で実現可能であり、その用量は治療課程を通じて連続的または断続的（例えば、適切な間隔を開けた分割用量）である。投与の最も効果的な手段及び投薬量を決定する方法は、当業者に周知であり、治療に使用される配合物、治療目的、治療される標的細胞（複数可）、及び治療される対象に合わせて変化することになる。一回または複数投与は、担当医師、獣医師、または臨床医により選択された用量レベル及びパターンに合わせて行うことができる。
【０２１３】
一般に、活性化合物の適切な用量は、１日あたり、対象の体重１キログラムあたり、約１００ｎｇ〜約２５ｍｇ（より典型的には、約１μｇ〜約１０ｍｇ）の範囲にある。活性化合物が、塩、エステル、アミド、プロドラッグなどである場合、投与される量は、親化合物に基づいて計算され、そのため使用される実際の重量は、比例して増加する。
【０２１４】
１つの実施形態において、活性化合物は、以下の投薬レジメに従ってヒト患者に投与される：約１００ｍｇ、１日３回。
【０２１５】
１つの実施形態において、活性化合物は、以下の投薬レジメに従ってヒト患者に投与される：約１５０ｍｇ、１日２回。
【０２１６】
１つの実施形態において、活性化合物は、以下の投薬レジメに従ってヒト患者に投与される：約２００ｍｇ、１日２回。
【０２１７】
しかしながら、１つの実施形態において、複合体化合物は、以下の投薬レジメに従ってヒト患者に投与される：約５０または約７５ｍｇ、１日３回または４回。
【０２１８】
１つの実施形態において、複合体化合物は、以下の投薬レジメに従ってヒト患者に投与される：約１００または約１２５ｍｇ、１日２回。
【０２１９】
上記の投薬量は、複合体（ＰＢＤ部分及び抗体と接続するリンカーを含む）または提供される有効量のＰＢＤ化合物に適用することができ、例えば、化合物の量は、リンカー切断後に放出可能な量である。
【０２２０】
疾患の予防または治療の場合、本発明のＡＤＣの適切な投薬量は、上記で定義されるとおりの治療予定の疾患の種類、疾患の重篤度及び過程、分子が予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、以前の治療、患者の病歴及び抗体に対する反応、ならびに担当医師の判断に依存することになる。分子は、患者に、一回で、または一連の治療にわたって、適切に投与される。疾患の種類及び重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の分子が、例えば、一回でまたは複数の分離した投与によるのか、または持続点滴によるのかに関わらず、患者に投与する最初の投薬量候補である。典型的な１日投薬量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲またはそれ以上になる可能性がある。患者に投与する予定のＡＤＣ投薬量の例は、約０．１〜約１０ｍｇ／患者体重ｋｇの範囲にある。数日間またはそれより長期にわたる繰り返し投与の場合、状態に応じて、治療は、所望の疾患症候の抑制が生じるまで継続される。投薬レジメンの例は、最初の負荷投与を約４ｍｇ／ｋｇで投与し、続いてＡＤＣの追加用量を毎週、２週間、または３週間投与するコースを含む。他の投薬レジメンが有用な場合もある。この治療の進行は、従来の技法及びアッセイにより容易にモニタリングされる。
【０２２１】
治療
「治療」という用語は、症状の治療の文脈において本明細書中使用される場合、ヒトであるか動物であるか（例えば、獣医学用途において）に関わらず、概して、ある所望の治療効果、例えば、症状の増悪の阻害などが達成される治療及び療法に関し、この用語は、増悪の速度の低下、増悪の速度の停止、症状の退行、症状の寛解、及び症状の治癒を含む。予防的手段としての治療（すなわち、予防、防止）も含まれる。
【０２２２】
「治療上有効量」という用語は、本明細書中使用される場合、所望の治療レジメンに従って投与した場合に、ある所望の治療効果を生じるのに有効であり、合理的なベネフィット／リスクに見合った、活性化合物、または活性化合物を含む材料、組成物、もしくは剤型の量に関する。
【０２２３】
同様に、「予防上有効量」という用語は、本明細書中使用される場合、所望の治療レジメンに従って投与した場合に、ある所望の予防効果を生じるのに有効であり、合理的なベネフィット／リスクに見合った、活性化合物、または活性化合物を含む材料、組成物、もしくは剤型の量に関する。
【０２２４】
薬物複合体の調製
本発明の抗体薬物複合体は、以下の薬物リンカー：
【化２４】
0006671555.tif 000025
を、例えば、ｖａｎ  Ｇｅｅｌ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１５，  ２６，  ２２３３−２２４２；ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｃｏｎｊｃｈｅｍ．５ｂ００２２４に記載されるとおりの方法により、アジド含有抗体と複合体形成させることにより、調製することができる。適切な方法として、例えば、水性条件下、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、及びＤＭＡから選択される任意選択の共溶媒を用いる銅を含まない複合体形成が挙げられるが、これに限定されない。
【０２２５】
薬物リンカーは、実施例に従って、適切な修飾を行って合成することができ、例えば、リンカーの合成については、ＷＯ２０１６／０５３１０７を参照し、及びＰＢＤ二量体については、例えば以下の文献を参照する：ＷＯ２０１１／１３０５９８、ＷＯ２０１３／０５５９８７、ＷＯ２０１４／０５７０７４。
【０２２６】
対象／患者
対象／患者は、動物、哺乳類、有胎盤哺乳類、有袋類（例えば、カンガルー、マーモット）、単孔類（例えば、カモノハシ）、齧歯類（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス）、マウス類（例えば、マウス）、ウサギ類（例えば、ウサギ）、鳥類（例えば、トリ）、イヌ類（例えば、イヌ）、ネコ類（例えば、ネコ）、ウマ類（例えば、ウマ）、ブタ類（例えば、ブタ）、ヒツジ類（例えば、ヒツジ）、ウシ類（例えば、ウシ）、霊長類、真猿類（例えば、サルまたは類人猿）、サル類（例えば、マーモセット、ヒヒ）、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）、またはヒトの場合がある。
【０２２７】
そのうえさらに、対象／患者は、その発育形態のいずれの場合もあり、例えば、胎児の場合もある。１つの好適な実施形態において、対象／患者は、ヒトである。
【実施例】
【０２２８】
中間体３の合成
【化２５】
0006671555.tif 000026
Ｎ２雰囲気下、ＢＣＮアルコール（０．３８４ｇ、２．５５ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（２５ｍＬ）に溶解させた溶液を、０℃に冷却し、そこに、イソシアン酸クロロスルホニル（ＣＳＩ）を滴下して加えた（０．２５５ｍＬ、４１５ｍｇ、２．９３ｍｍｏｌ、１．１５当量）。１５分撹拌後、Ｅｔ３Ｎを滴下して加え（１．４２ｍＬ、１．０３ｇ、１０．２ｍｍｏｌ、４当量）、さらに１０分間撹拌を続けた。次に、２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）酢酸（１．０ｇ、６．１ｍｍｏｌ、２．４当量）をＨ２Ｏ（５ｍＬ）に溶解させた溶液を加え、反応混合物を、室温で２時間撹拌した。この後、ＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）及びＨ２Ｏ（１００ｍＬ）を加え、層を分離させた。分液漏斗に入れた水層に、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）を加え、１ＮのＨＣｌでｐＨを４に調整してから、層を分離させた。水層を、ＣＨ２Ｃｌ２で２回抽出し（２×１００ｍＬ）、有機層をまとめて、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮した。残渣を、シリカのフラスコカラムクロマトグラフィーでＣＨ２Ｃｌ２から２０％ＭｅＯＨ含有ＣＨ２Ｃｌ２の勾配で溶出させて精製し、無色粘着ワックス状物として、中間体３を０．４２ｇ（１．０ｍｍｏｌ、３９％）得た。
【０２２９】
薬物リンカーの合成
【化２６】
0006671555.tif 000027
【化２７】
0006671555.tif 000028
化合物１は、ＷＯ２０１４／０５７０７４に記載されるとおりに合成可能である−化合物２２を参照。
【０２３０】
（ａ）テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、４．８ｍｇ、４．１５μｍｏｌ）を計量し、不活性雰囲気下におく。ピロリジン（５．０μＬ、４．３ｍｇ、６０μｍｏｌ）をＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解させた溶液全体にＮ２を吹き込むことにより、溶液を脱気する。化合物１（２７ｍｇ、２４μｍｏｌ）をＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解させた溶液全体にＮ２を吹き込むことにより、溶液を脱気する。溶液全体にＮ２を吹き込み続けながら、脱気したピロリジン溶液を加える。計量したＰｄ（ＰＰｈ３）４をＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解させ、この溶液のうち０．９ｍＬを加える。５０分間Ｎ２を吹き込んだ後、ＤＣＭ（２５ｍＬ）を加え、混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２５ｍＬ）で洗う。分離後、水層を、ＤＣＭ（２×２５ｍＬ）で抽出する。有機層をまとめて、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮する。残渣を、ＲＰ−ＨＰＬＣ（３０−９０％ＭｅＣＮ（０．１％ギ酸）含有Ｈ２Ｏ（０．１％ギ酸）により精製する。画分をまとめて、ＳＰＥ（ＨＣＯ３−）カラムに通し、濃縮する。ＭｅＣＮ（５０ｍＬ）を加えた後、混合物を再び濃縮する。得られる残渣２を、次の工程に用いる。
【０２３１】
反応物の変換は、ＬＣＭＳ分析を通じてモニタリングすることができる。カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  Ｃ１８  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｐｅｅｄ（ＩＳ）カラム、１３０Å、３．５μｍ（４．６ｍｍ×２０ｍｍ）。移動相Ａ：水（０．１％ギ酸）、移動相Ｂ（０．１％ギ酸）。ＰＤＡ及びＥＳＩ＋で検出。試料は、反応混合物をＭｅＣＮで希釈することにより調製可能である。
【０２３２】
（ｂ）上記残渣２をＣＨＣｌ３（５ｍＬ）に溶解させた溶液に、中間体３（１５ｍｇ、３６μｍｏｌ、ｍｗ４１８ｇ／モル）をＣＨＣｌ３（０．８ｍＬ）に溶解させた溶液を加える。得られる混合物を、固形ＥＤＣ・ＨＣｌ（４．７ｍｇ、２５μｍｏｌ）に加え、ＣＨＣｌ３（５ｍＬ）を加え、混合物を３０分間撹拌した。ＤＣＭ（３０ｍＬ）を加え、得られる混合物を、水（３０ｍＬ）で洗う。分離後、水相をＤＣＭ（３０ｍＬ）で抽出する。有機層をまとめて、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮する。残渣を、ＲＰ−ＨＰＬＣ（３０−９０％ＭｅＣＮ（酸を含まず）含有Ｈ２Ｏ（０．０１％ギ酸））により精製する。ＨＰＬＣ収集管を５％（ＮＨ４）ＨＣＯ３水溶液で満たしておいてから、収集する。ＨＰＬＣ画分をまとめて、ＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で抽出する。有機層をまとめて、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮する。生成物４を、わずかに黄色／白色油状物として得る（２１ｍｇ、１６μｍｏｌ、ｍｗ１３２３ｇ／モル、２工程全体で６７％）。
【０２３３】
反応物の変換は、ＬＣＭＳ分析によりモニタリングすることができる。カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  Ｃ１８  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｐｅｅｄ（ＩＳ）カラム、１３０Å、３．５μｍ（４．６ｍｍ×２０ｍｍ）。移動相Ａ：水（０．１％ギ酸）、移動相Ｂ（０．１％ギ酸）。ＰＤＡ及びＥＳＩ＋で検出。
【０２３４】
抗体修飾
反応条件
ワンポットグリカン再構築のための反応条件は以下の通りである：
１５ｍｇ／ｍｌの抗体（約０．１ｍＭ）
０．１５ｍｇ／ｍＬのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＥｎｄｏＳＨ（１％ｗ／ｗ）
１．１３ｍｇ／ｍＬのＨｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（７．５％ｗ／ｗ）ガラクトース−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃＴ）酵素
２．５ｍＭの６−Ｎ３ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ（ＩｇＧに対して２５当量）
１０ｍＭのＭｎＣｌ２
２５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ  ｐｈ８．０
１５０ｍＭのＮａＣｌ
３０°Ｃで１６時間インキュベートする
【０２３５】
これはＡＸＬとＢ１２で実施した。
【０２３６】
手順
この例は２５ｍｇ規模であり、必要に応じて変更することができる。個々の成分は順番に添加され、混合される。
１０６．５μＬの２５ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ（１６６７μＬの最終体積を得るため）
１ｍＬの、２５ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ中２５ｍｇ／ｍＬの抗体
７１．４μＬの、２５ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０中３．５ｍｇ／ｍＬのＥｎｄｏＳＨ
３８９μＬの、２５ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０中４．８２  ｍｇ／ｍＬのＨｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ
１６．７μＬの、ＭＱ中１ＭのＭｎＣｌ２
８３．４μＬの、ＭＱ中０．１Ｍの６−Ｎ３ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ
【０２３７】
この混合は３０℃で約１６時間である。修飾されたガラクトース残基の完了は、試料をＭＳ分析にかけることによって評価することができる。タンパク質Ａ親和性精製後、生成物の試料を少量ＤＴＴで還元し、続いてＭＳ分析にかけることができる。転移反応が成功していた場合の典型的な質量スペクトルは、修飾ガラクトースが核ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換Ａｂに転移することから生じる主要生成物（全重鎖の９０％）１種類、及び修飾ガラクトースが核ＧｌｃＮＡｃ（フコースを持たない）置換Ａｂに転移することから生じる少量生成物（全重鎖の±１０％）を示す。
【０２３８】
精製手順
緩衝液
結合／洗浄緩衝液（ＴＢＳ  ｐＨ７．５）：
２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ  ｐｈ７．５
１５０ｍＭのＮａＣｌ
エンドトキシン除去のための洗浄緩衝液（ＴＢＳ  ｐＨ７．５＋Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）：
２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．５
１５０ｍＭのＮａＣｌ
０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
溶出緩衝液：
０．１Ｍのグリシン  ｐＨ２．７
ＣＩＰ緩衝液：
０．５ＭのＮａＯＨ
【０２３９】
手順
１．試料を添加する前にカラムを清浄化するために、以下の緩衝液でＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ  ５ｍＬカラムを洗浄する（５ｍＬ／分）：
少なくとも５カラム体積（ＣＶ）のＴＢＳ  ｐＨ７．５でカラムを洗浄する
１５ＣＶの０．５ＭのＮａＯＨでカラムを洗浄する
５ＣＶのＴＢＳ  ｐＨ  ７．５でカラムを洗浄する
５ＣＶのグリシンｐＨ２．７でカラムを洗浄する
中性ｐＨが得られるまで、ＴＢＳ  ｐＨ７．５でカラムを洗浄する
２．  遠心分離（４０００ｇで５分間）または濾過（０．２２または０．４５μｍのフィルター）で反応混合物から沈殿物を除去する
３．  ２ｍＬ／分で試料を添加し、５ｍＬ／分で以下の工程を実施する：
少なくとも２０ＣＶのＴＢＳ＝０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で洗浄する
少なくとも２０ＣＶのＴＢＳで洗浄する
０．１Ｍのグリシンｐｈ２．７で溶出する
４．  １／５体積の１ＭのＴｒｉｃ−ＨＣｌ  ｐｈ８．０を添加して混合することによって、画分をすぐに中性化する
５．  ４℃で３回の５０体積以上のＰＢＳ  ｐＨ７．４に対して試料を透析する（１時間以上を３回）
６．  スピンフィルター装置を使用してサンプルを約２０ｍｇ／ｍＬに濃縮する
【０２４０】
化合物４と修飾抗体との複合体形成によるＣｏｎｊＡ及びＣｏｎｊＢの生成
反応条件
１５ｍｇ／ｍｌのアジド修飾抗体（０．１ＭのＩｇＧ）
０．５ｍＭの化合物４（ＩｇＧに対して５当量＝アジドあたり２．５当量）
１０％のＤＭＦまたは２５％のプロピレンジコール
ＰＢＳ  ｐＨ７．４
【０２４１】
手順
１．  ９体積の、ＰＢＳ  ｐＨ７中１６．６７ｍｇ／ｍｌのアジド修飾抗体を添加する
２．  １体積の、ＤＭＦ中５ｍＭの化合物４を添加してすぐに混合する
３．  一晩インキュベートする
４．  ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＭＳで変換を測定する
【表１】
0006671555.tif 000029
【０２４２】
ＡＤＣの精製
試料調製
カラムに添加する前に以下の要件を満たすべきである：
５％以下の有機溶媒
ＣＶの３％以下の総試料体積（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬに対して７２０μＬ以下、及びＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨｉＬｏａｄ  ２６／６００に対して１０ｍｌ以下）
沈殿物が存在しない
【０２４３】
上記の要件は、次の手順で達成することができる。
１．  ５％以下の最終有機溶媒濃度になるようにｐＨ７．４のＰＢＳでサンプルを希釈する
２．  体積がＣＶの３％を超える場合、サンプルをＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心フィルター（ＭＷＣＯ  １０ｋＤａ）を使用して濃縮する
３．  遠心分離（卓上型遠心分離機で、１３０００ｒｐｍで１０分間）によって潜在的沈殿物を除去する
【０２４４】
精製
精製は、Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ−１０でＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬカラム（ＣＶ＝２３ｍｌ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。以下の洗浄工程を０．５ｍｌ／分の流速で実施する：
１ＣＶの水でカラムを洗浄する
１ＣＶの０．５ＭのＮａＯＨでカラムを洗浄する
中性ｐＨが得られるまで、カラムをＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ，Ｄ８５３７）で平衡化する。
試料を０．５ｍｌ／分のＰＢＳ  ｐＨ７．４と共に注入し、１ｍｌの画分を集める（総実行＝１．５ＣＶ）。単量体画分をプールし、３回の１Ｌの配合物緩衝液（３０ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのソルビトール、０．０２％（ｗ／ｖ）のｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ  ６．０）に対して４℃で透析する。試料を、０．２２μｍフィルターを使用して濾過滅菌し、液体窒素を使用して急速冷凍し、そして−８０℃で保存する。
【０２４５】
ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ消化試料の質量スペクトル分析は、共役Ｆｃ／２断片に対応する１つの主要生成物（観察質量２５６９１Ｄａ、総Ｆｃ／２断片の約９０％）を示した。還元試料のＲＰ−ＨＰＬＣ分析は１．９８の平均ＤＡＲを示した。
【０２４６】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性
Ｈ１２９９細胞をＡＴＣＣから取得した（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−５８０３）。Ｈ１２９９培地は、１０％のＧｉｂｃｏ  ＦＢＳを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）であった。細胞を加湿インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。細胞懸濁液を、９６ウェル平底プレート中に分注した（ウェルあたり１０４細胞）。ＡＤＣ原液の８×１０倍希釈液のセットを、細胞培地中で調製した。各ＡＤＣ希釈液（ウェルあたり５０μｌ）を、９６ウェルプレートの細胞懸濁液の入った４つの複製ウェルに分注した。対照ウェルは、培地のみを同体積で添加することによって調製した。９６時間インキュベートした後、細胞生存率を、製造業者の取扱説明書に従って、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシ−フェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ５４２１）により測定した。吸光度は４９０ｎｍで測定した。細胞生存率（％）は、４つの対照ウェルにおける平均吸光度（１００％）と比較した４つのＡＤＣ処理ウェルにおける平均吸光度から計算した。３回の反復実験の平均データから用量反応曲線を作成し、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を使用して可変勾配を有するシグモイド用量反応曲線にデータをフィッティングすることによってＥＣ５０値を決定した。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示す。
【０２４７】
ＣｏｎｊＡのＥＣ５０は、０．０５５４μｇ／ｍＬであることがわかった。
【０２４８】
抗原結合試験
ＭａｘｉｓｏｒｐプレートをヒトＡｘｌ抗原（５０ｎｇ／ウェル；ＰＢＳ中バッチ）で一晩＋４℃でコーティングした。非反応性部位をＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ緩衝液（＋４℃または室温で一晩）でブロックした。ＡＤＣ原液の８×３倍または５倍希釈液のセットを試料緩衝液／ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０中で調製した。各ＡＤＣ希釈液（６０μＬ／ウェル）をコーティングされたプレートの４つの複製ウェルに分注した。対照ウェルを、同体積の試料緩衝液／ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０を添加することによって調製した。抗ヒトカッパＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体を二次抗体として使用した（１：５０００、１時間、室温）。ＨＲＰは、１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ基質溶液（７５μＬ／ウェル；室温で５分間）で検出した。基質反応を０．６ＭのＨＣｌ（７５μＬ／ウェル）で停止させた。吸光度は、４５０ｎｍのペルオキシダーゼプログラムを用いてＥｎｖｉｓｉｏｎにおいて４５０ｎｍで測定した。抗原結合曲線は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いた３回の反復実験の平均データから作成した。得られた結果を図１に示すが、図中：▲はＣｏｎｊＡである。エラーバーは平均値の標準偏差（ＳＥＭ）を示す。ＣｏｎｊＡはプレート上にコーティングされたＡＸＬの細胞外ドメインに高い親和性で結合した。
【０２４９】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１
５×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞をメスの無胸腺ヌードマウスに皮下移植した。腫瘍体積が８８〜１７２ｍｍ３に達したときに、ビヒクルまたは試験試料を用いたＡＤＣ投与を開始した。ＣｏｎｊＡを尾静脈注射により１ｍｇ／ｋｇの用量レベルで１回静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。投薬体積は１０ｍＬ／ｋｇ体重であり、各動物個体の体重に合わせて増量した。各動物を、腫瘍体積が終了体積１５００ｍｍ３に到達した時点で、または試験の終了日、いずれか先に訪れた時点で安楽死させた。試験期間中、動物の体重、あらゆる有害な徴候、処置に関連した副作用および臨床的徴候をモニターした。群の平均腫瘍体積の計算のために、以下の規則を適用した：動物が腫瘍サイズのために試験を終了したとき、その動物について記録された最終腫瘍体積をその後時点での平均体積を計算するために用いたデータと共に含めた。ある群の動物の５０％未満のみが試験に残っているとき、腫瘍体積および体重の値は、群平均腫瘍体積／体重を計算するためには使用されなかった。Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）をグラフ表示および統計分析に使用した。得られた結果を図２に示すが、図中、▲はＣｏｎｊＡであり、
（外１）
0006671555.tif 000030
はビヒクル単独である。エラーバーはＳＥＭを示す。
【０２５０】
１ｍｇ／ｋｇのＣｏｎｊＡの単回投与は、投与後６０日で１０／１０マウスが無腫瘍であり、腫瘍増殖を強く阻害した。
【０２５１】
ラット毒性試験
方法
ＣｏｎｊＡ１を、単回静脈内用量のラット忍容性試験で評価した。オスｓｐｒａｇｕｅ−ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝３／群）に、１日目、ＣｏｎｊＡについて３及び６ｍｇ／ｋｇで投与し、投与後２１日目に死体解剖した。体重及び摂食量は、頻繁にモニタリングし、臨床病理学用に生存中サンプリング（８日目及び２１日目に採血）及び薬物動態学用に繰り返しサンプリングを行った。死体解剖では、選択した臓器について、目視で観察し、重量を測定し、組織病理学検査が可能であれば保存した。
【０２５２】
ＣｏｎｊＡは、３及び６ｍｇ／ｋｇで臨床上十分に忍容性があった。体重増加は、３及び６ｍｇ／ｋｇ群でそれぞれ１１および２１％減少し、摂食量の減少と一致した。８日目には、主に６ｍｇ／ｋｇ投与群でいくつかの血液学パラメータが減少し（網状赤血球（−７６％）、ヘモグロビン（−２９％）、白血球（−６６％）、及び血小板（−３７％））、２１日目までに回復のいくつかの証拠を示した。剖検では、胸腺重量の減少がすべての動物で観察された。したがって、ＣｏｎｊＡの最大忍容用量（ＭＴＤ）は６ｍｇ／ｋｇであった。
【０２５３】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験−ＳＮ１２Ｃ
メス重症複合免疫不全マウス（Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ（登録商標）、ＣＢ１７／Ｉｃｒ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＩｃｒＩｃｏＣｒｌ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）は、試験１日目において、１０週齢であり、体重（ＢＷ）範囲は１８．０〜２１．６ｇであった。腫瘍移植当日、５×１０６のＳＮ１２Ｃ細胞（５０％マトリゲル（登録商標）マトリクス（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））含有リン酸緩衝生理食塩水に加えた細胞懸濁液０．１ｍＬ）を、各試験マウスの右側腹部に皮下移植した。ＳＮ１２Ｃは、高レベルのＡＸＬ発現（細胞あたり約８８，０００コピー）を有するヒト腎細胞癌由来の異種移植モデルである。
【０２５４】
腫瘍増殖は、平均寸法が標的範囲の１００〜１５０ｍｍ３に接近していくところをモニタリングした。腫瘍は、ノギスを用いて二次元で測定し、以下の式に従って体積を計算した：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝ｗ２×１／２
式中、腫瘍のｗ＝幅、及び１＝長さ（ｍｍ）である。腫瘍の重さは、１ｍｇが腫瘍体積１ｍｍ３に等しいという仮定を用いて推定可能である。
【０２５５】
腫瘍移植から２５日後を試験の１日目に指定し、この日、動物を、５つの群に分けた（ｎ＝８）。個々の腫瘍体積は１０８〜１７２ｍｍ３であり、群平均の腫瘍体積は１２０〜１２３ｍｍ３であった。全ての処置はｉ．ｖ．投与した。試験の１日目に単回注射で外側尾静脈に投与した。投薬体積は、体重２０グラムあたり０．２ｍＬ（１０ｍＬ／ｋｇ）であり、各動物個体の体重に比例した。腫瘍は、ノギスを用いて週に２回測定し、各動物を、腫瘍が終了体積２０００ｍｍ３に到達した時点で、または試験の終了日、いずれか先に訪れた時点で安楽死させた。試験は、６０日目に終了した。１ｍｇ／ｋｇの用量で、ＣｏｎｊＡは、６０日目の試験終了時に７／８の完全応答者（ＣＲ）および６／８の無腫瘍生存者（ＴＦＳ）をもたらした。
【０２５６】
得られた結果を図３に示すが、図中：
（外２）
0006671555.tif 000031
はビヒクル単独であり；
（外３）
0006671555.tif 000032
は１ｍｇ／ｋｇで投与されたＣｏｎｊＢであり；
（外４）
0006671555.tif 000033
は０．３ｍｇ／ｋｇで投与されたＣｏｎｊＡであり；
（外５）
0006671555.tif 000034
は０．６ｍｇ／ｋｇで投与されたＣｏｎｊＡであり；
（外６）
0006671555.tif 000035
は１ｍｇ／ｋｇで投与されたＣｏｎｊＡである。
エラーバーはＳＥＭを示す。
【０２５７】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験−Ｋａｒｐａｓ２９９（ＡＸＬ−陰性）
メス重症複合免疫不全マウス（Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ（登録商標）、ＣＢ１７／Ｉｃｒ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＩｃｒＩｃｏＣｒｌ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）は、試験１日目において、９週齢であり、体重（ＢＷ）範囲は１７．０〜２２．５ｇであった。腫瘍移植当日、１×１０７  Ｋａｒｐａｓ−２９９細胞（ＰＢＳ中０．１ｍＬの細胞懸濁液）を、各試験マウスの右側腹部に皮下移植した。
【０２５８】
腫瘍増殖は、平均寸法が標的範囲の１００〜１５０ｍｍ３に接近していくところをモニタリングした。腫瘍は、ノギスを用いて二次元で測定し、以下の式に従って体積を計算した：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝ｗ２×１／２
式中、腫瘍のｗ＝幅、及び１＝長さ（ｍｍ）である。腫瘍の重さは、１ｍｇが腫瘍体積１ｍｍ３に等しいという仮定を用いて推定可能である。
【０２５９】
腫瘍移植から１０日後を試験の１日目に指定し、この日、動物を、４つの群に分けた。個々の腫瘍体積は１０８〜１２６ｍｍ３であり、群平均の腫瘍体積は１１３〜１１７ｍｍ３であった。試験１日目、全ての処置を、外側尾静脈から、単回注射で静脈内投与した。投薬体積は、各動物個体の体重に比例して、体重２０グラムあたり０．２ｍＬ（１０ｍＬ／ｋｇ）であった。腫瘍は、ノギスを用いて週に２回測定し、各動物を、腫瘍が終了体積２０００ｍｍ３に到達した時点で、または試験の終了日、いずれか先に訪れた時点で安楽死させた。試験は、２９日目に終了した。
【０２６０】
得られた結果を図４に示すが、図中：
（外７）
0006671555.tif 000036
はビヒクル単独であり；
（外８）
0006671555.tif 000037
は１ｍｇ／ｋｇで投与されたＣｏｎｊＡである。
エラーバーはＳＥＭを示す。
【０２６１】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験−膵臓癌患者由来の異種移植（ＰＤＸ）  ＰＡＸＦ  １６５７モデル
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒからのメスｎｕ／ｎｕマウス（ＮＵ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ）は、０日目において、少なくとも８週齢であり、体重（ＢＷ）範囲は２２．０〜３０．０ｇであった。移植当日、腫瘍断片をヌードマウス内の異種移植から得た。ドナーマウスから取り出したのち、腫瘍を断片（３〜４ｍｍ辺長）に切断し、１０％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＰＢＳ中に入れた。レシピエント動物をイソフルランの吸入により麻酔し、片側または両側の腹部に、腫瘍移植片を皮下移植した。
【０２６２】
動物及び腫瘍移植片は、それらの移植体積が、十分な数の動物において標的範囲の５０〜２５０ｍｍ３に接近していくところをモニタリングした。腫瘍は、ノギスを用いて二次元で測定し、以下の式に従って体積を計算した：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝ｗ２×１／２
式中、ｗ＝腫瘍の幅、及び１＝腫瘍の長さ（ｍｍ）である。
【０２６３】
無作為化の日を実験の０日目とした。実験１日目に、皮下ＰＡＸＦ  １６５７異種移植片を有するメスのｎｕ／ｎｕマウス（群平均腫瘍体積１０９．０〜１１０．１ｍｍ３）を群に分け（群あたりｎ＝８）、投与を開始した。投薬体積は、各動物個体の体重に比例して、体重２０グラムあたり０．１ｍＬ（５ｍＬ／ｋｇ）であった。１日目に、全ての処置を、単回注射で静脈内（ｉ．ｖ．）投与した（ｑｄ×１）。腫瘍は、ノギスを用いて週に２回測定し、各動物を、腫瘍が終了体積２０００ｍｍ３に到達した時点で、または試験の終了日、いずれか先に訪れた時点で安楽死させた。試験は、４２日目に終了した。ＣｏｎｊＡの各単回投与（０．３、０．６および１ｍｇ／ｋｇ）は、試験終了時に腫瘍の完全な根絶をもたらした。
【０２６４】
得られた結果を図５に示すが、図中：
（外９）
0006671555.tif 000038
はビヒクル単独であり；
（外１０）
0006671555.tif 000039
は１ｍｇ／ｋｇで投与されたＣｏｎｊＢであり；
（外１１）
0006671555.tif 000040
は０．３ｍｇ／ｋｇで投与されたＣｏｎｊＡであり；
（外１２）
0006671555.tif 000041
は０．６ｍｇ／ｋｇで投与されたＣｏｎｊＡであり；
（外１３）
0006671555.tif 000042
は１ｍｇ／ｋｇで投与されたＣｏｎｊＡである。
エラーバーはＳＥＭを示す。垂直の点線は投与の開始を示す（１日目）。
【０２６５】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験−食道癌患者由来の異種移植（ＰＤＸ）  ＥＳ０１９５モデル
Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＡｎｉＫｅｅｐｅｒ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．からのメスのＢａｌｂ／ｃヌードマウスは、試験開始時に、５〜６週齢であり、体重範囲は２０．２〜２４．６ｇであった。移植断片（氷冷無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中直径２〜３ｍｍ）を２４匹のメスＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右側腹部に皮下播種した。
【０２６６】
全ての動物を、３つの異なる試験群に無作為に割り当てた。０日目にＳｔｕｄｙ  Ｌｏｇソフトウェアのマルチタスク法を用いて無作為化を行った。無作為化時の各群の平均腫瘍体積（ｍｍ３）＋ＳＤは以下の通りであった：約１４１ｍｍ３±４７ｍｍ３）。
【０２６７】
１日目に、全ての処置を、単回注射で静脈内（ｉ．ｖ．）投与した（ｑｄ×１）。試験期間中、体重を週に２回測定した。腫瘍は、週に２回測定した。試験は、投与開始後５１日目に終了した。
【０２６８】
得られた結果を図６に示すが、図中：
（外１４）
0006671555.tif 000043
はビヒクル単独であり；
（外１５）
0006671555.tif 000044
は１ｍｇ／ｋｇで投与されたＣｏｎｊＡであり；
（外１６）
0006671555.tif 000045
は１ｍｇ／ｋｇで投与されたＣｏｎｊＢであり；
エラーバーはＳＥＭを示す。垂直の点線は投与の開始を示す（１日目）。
【０２６９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイスタンダー活性試験
ＳＮ１２ＣおよびＫａｒｐａｓ−２９９細胞株におけるＣｏｎｊＡおよびアイソタイプ対照ＡＤＣ、ＣｏｎｊＢのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を比較した。Ｋａｒｐａｓ−２９９はＡＸＬ陰性であり、ＳＮ１２ＣはＡＸＬ陽性である。接着性ＳＮ１２Ｃ細胞をトリプシン処理し、１ｍｌの増殖培地に再懸濁し、穏やかに混合してから細胞密度を決定するため計数した。懸濁Ｋａｒｐａｓ２９９細胞を前処理なしで計数した。細胞密度は、ＬＵＮＡ−ＩＩ（商標）自動細胞計数器を用いてトリパンブルー排除アッセイにより複製して決定した。ＳＮ１２Ｃ細胞懸濁液を細胞特異的増殖培地で１×１０４細胞／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルを滅菌白色９６ウェル平底マイクロプレートに分注し、一晩インキュベートして細胞を接着させた。Ｋａｒｐａｓ２９９細胞をＡＤＣ適用と同一の日に播種した。
【０２７０】
２０μｇ／ｍｌの出発ＡＤＣ濃度を用い、滅菌９６ウェルポリプロピレンプレートにおいて細胞特異的増殖培地で希釈して、フィルター滅菌したＡＤＣの連続希釈液を１：１０の比率で行い、繰り返して８回連続希釈液を作製した。ＡＤＣ希釈液（原液を含む）を、１００μｌの播種細胞懸濁液を含む標識付き白色９６ウェル平底プレートの２つの複製ウェルに、１００μｌ／ウェルで分注した。培地対照ウェルについては、１００μｌの細胞増殖培地を２つの複製ウェルに分注し、細胞株対照ウェルについては、１００μｌの増殖培地を１００μｌの細胞懸濁液（予め分注されている）上に２つの複製ウェルに分注した。全てのプレートを３７℃のＣＯ２ガス（５％）インキュベーター中で５日間インキュベートした。アッセイは、両方の細胞株について同一の細胞播種密度およびインキュベーション時間を使用して実施した。１×１０３細胞／ウェルをそれぞれ５日間インキュベートした（これらの条件は、この試験のために以前に最適化されている）。
【０２７１】
５日間のインキュベーション期間の後、プレートを６００Ｇ（２０℃）で５分間遠心分離した後、１００μｌの播種したＫａｒｐａｓ−２９９細胞（以前に分注された）を含む新たに調製した白色９６ウェル平底プレートに１００μｌ／ウェルを慎重に移した。全てのプレートを３７℃のＣＯ２ガス（５％）インキュベーター中で５日間インキュベートした。インキュベーション期間の後、プレートを６００Ｇ（２０℃）で５分間遠心分離した後、１００μｌ／ウェルを慎重に取り出して廃棄し、細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイを用いてウェル中の残りの培地で測定した。プレートを、ルミネセンスプロトコールを用いてＥｎｖｉｓｉｏｎ上で読み、データをＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析した。
【０２７２】
【表２】
0006671555.tif 000046
【０２７３】
配列
配列番号１［１Ｈ１２  ＶＨ、ＣＤＲは下線部］
（外１７）
0006671555.tif 000047
【０２７４】
配列番号２［１Ｈ１２  ＶＬ、ＣＤＲは下線部］
（外１８）
0006671555.tif 000048
【０２７５】
配列番号３［１Ｈ１２重鎖］
（外１９）
0006671555.tif 000049
Ｎ＊はＡｓｎ２９７を示す。
【０２７６】
配列番号４［１Ｈ１２軽鎖］
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＳＡＳＳＳＶＳＳＧＮＦＨＷＹＱＱＫＰＧＬＡＰＲＬＬＩＹＲＴＳＮＬＡＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＷＳＧＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２７７】
配列番号５［１Ｈ１２  ＶＨ  ＣＤＲ１］
ＳＹＧＭＳ
【０２７８】
配列番号６［１Ｈ１２  ＶＨ  ＣＤＲ２］
ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ
【０２７９】
配列番号７［１Ｈ１２  ＶＨ  ＣＤＲ３］
ＨＰＩＹＹＴＹＤＤＴＭＤＹ
【０２８０】
配列番号８［１Ｈ１２  ＶＬ  ＣＤＲ１］
ＳＡＳＳＳＶＳＳＧＮＦＨ
【０２８１】
配列番号９［１Ｈ１２  ＶＬ  ＣＤＲ２］
ＲＴＳＮＬＡＳ
【０２８２】
配列番号１０［１Ｈ１２  ＶＬ  ＣＤＲ３］
ＱＱＷＳＧＹＰＷＴ
【０２８３】
配列番号１１［マウス５Ｆ１１  ＶＨ、ＣＤＲは下線部］
（外２０）
0006671555.tif 000050
【０２８４】
配列番号１２［マウス５Ｆ１１  ＶＬ、ＣＤＲは下線部］
（外２１）
0006671555.tif 000051
【０２８５】
配列番号１３［５Ｆ１１  ＶＨ  ＣＤＲ１］
ＲＹＷＭＳ
【０２８６】
配列番号１４［５Ｆ１１  ＶＨ  ＣＤＲ２］
ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤ
【０２８７】
配列番号１５［５Ｆ１１  ＶＨ  ＣＤＲ３］
ＰＹＹＹＧＰＦＡＹ
【０２８８】
配列番号１６［５Ｆ１１  ＶＬ  ＣＤＲ１］
ＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨ
【０２８９】
配列番号１７［５Ｆ１１  ＶＬ  ＣＤＲ２］
ＲＡＳＮＬＥＡ
【０２９０】
配列番号１８［５Ｆ１１  ＶＬ  ＣＤＲ３］
ＱＱＳＲＥＹＰＲＴ
【０２９１】
配列番号１９［５Ｆ１１  ＲＨＡ］
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤＲＦＡＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＰＹＹＹＧＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ
【０２９２】
配列番号２０［５Ｆ１１  ＲＨＢ］
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＰＹＹＹＧＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ
【０２９３】
配列番号２１［５Ｆ１１  ＲＨＣ］
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＰＹＹＹＧＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ
【０２９４】
配列番号２２［５Ｆ１１  ＲＫＡ］
ＥＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＡＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＱＱＳＲＥＹＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【０２９５】
配列番号２３［ヒトＡｘｌ］
ＭＡＷＲＣＰＲＭＧＲＶＰＬＡＷＣＬＡＬＣＧＷＡＣＭＡＰＲＧＴＱＡＥＥＳＰＦＶＧＮＰＧＮＩＴＧＡＲＧＬＴＧＴＬＲＣＱＬＱＶＱＧＥＰＰＥＶＨＷＬＲＤＧＱＩＬＥＬＡＤＳＴＱＴＱＶＰＬＧＥＤＥＱＤＤＷＩＶＶＳＱＬＲＩＴＳＬＱＬＳＤＴＧＱＹＱＣＬＶＦＬＧＨＱＴＦＶＳＱＰＧＹＶＧＬＥＧＬＰＹＦＬＥＥＰＥＤＲＴＶＡＡＮＴＰＦＮＬＳＣＱＡＱＧＰＰＥＰＶＤＬＬＷＬＱＤＡＶＰＬＡＴＡＰＧＨＧＰＱＲＳＬＨＶＰＧＬＮＫＴＳＳＦＳＣＥＡＨＮＡＫＧＶＴＴＳＲＴＡＴＩＴＶＬＰＱＱＰＲＮＬＨＬＶＳＲＱＰＴＥＬＥＶＡＷＴＰＧＬＳＧＩＹＰＬＴＨＣＴＬＱＡＶＬＳＤＤＧＭＧＩＱＡＧＥＰＤＰＰＥＥＰＬＴＳＱＡＳＶＰＰＨＱＬＲＬＧＳＬＨＰＨＴＰＹＨＩＲＶＡＣＴＳＳＱＧＰＳＳＷＴＨＷＬＰＶＥＴＰＥＧＶＰＬＧＰＰＥＮＩＳＡＴＲＮＧＳＱＡＦＶＨＷＱＥＰＲＡＰＬＱＧＴＬＬＧＹＲＬＡＹＱＧＱＤＴＰＥＶＬＭＤＩＧＬＲＱＥＶＴＬＥＬＱＧＤＧＳＶＳＮＬＴＶＣＶＡＡＹＴＡＡＧＤＧＰＷＳＬＰＶＰＬＥＡＷＲＰＧＱＡＱＰＶＨＱＬＶＫＥＰＳＴＰＡＦＳＷＰＷＷＹＶＬＬＧＡＶＶＡＡＡＣＶＬＩＬＡＬＦＬＶＨＲＲＫＫＥＴＲＹＧＥＶＦＥＰＴＶＥＲＧＥＬＶＶＲＹＲＶＲＫＳＹＳＲＲＴＴＥＡＴＬＮＳＬＧＩＳＥＥＬＫＥＫＬＲＤＶＭＶＤＲＨＫＶＡＬＧＫＴＬＧＥＧＥＦＧＡＶＭＥＧＱＬＮＱＤＤＳＩＬＫＶＡＶＫＴＭＫＩＡＩＣＴＲＳＥＬＥＤＦＬＳＥＡＶＣＭＫＥＦＤＨＰＮＶＭＲＬＩＧＶＣＦＱＧＳＥＲＥＳＦＰＡＰＶＶＩＬＰＦＭＫＨＧＤＬＨＳＦＬＬＹＳＲＬＧＤＱＰＶＹＬＰＴＱＭＬＶＫＦＭＡＤＩＡＳＧＭＥＹＬＳＴＫＲＦＩＨＲＤＬＡＡＲＮＣＭＬＮＥＮＭＳＶＣＶＡＤＦＧＬＳＫＫＩＹＮＧＤＹＹＲＱＧＲＩＡＫＭＰＶＫＷＩＡＩＥＳＬＡＤＲＶＹＴＳＫＳＤＶＷＳＦＧＶＴＭＷＥＩＡＴＲＧＱＴＰＹＰＧＶＥＮＳＥＩＹＤＹＬＲＲＧＮＲＬＫＱＰＡＤＣＬＤＧＬＹＡＬＭＳＲＣＷＥＬＮＰＱＤＲＰＳＦＴＥＬＲＥＤＬＥＮＴＬＫＡＬＰＰＡＱＥＰＤＥＩＬＹＶＮＭＤＥＧＧＧＹＰＥＰＰＧＡＡＧＧＡＤＰＰＴＱＰＤＰＫＤＳＣＳＣＬＴＡＡＥＶＨＰＡＧＲＹＶＬＣＰＳＴＴＰＳＰＡＱＰＡＤＲＧＳＰＡＡＰＧＱＥＤＧＡ
【０２９６】
配列番号２４［１Ｈ１２重鎖］
（外２２）
0006671555.tif 000052
Ｎ＊はＡｓｎ２９７を示す。
【図１】
0006671555.tif 000070
【図２】
0006671555.tif 000071
【図３】
0006671555.tif 000072
【図４】
0006671555.tif 000073
【図５】
0006671555.tif 000074
【図６】
0006671555.tif 000075
【配列表】
0006671555000001.app