(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィー装置において、カラムへ試料を導入するための試料導入装置の、試料注入装置用流路切替バルブを備えた試料注入装置とカラム間に備える装置であって、試料バンドをカラムに送るための第１送液ポートと該第１送液ポートから送られた試料バンドを分割するための分割ポートを備えた、試料バンドを分割するための試料バンド分割装置。
【請求項２】
前記試料バンド分割装置は、試料バンドを軸方向に交差する方向で分割するための装置であることを特徴とする請求項１に記載の試料バンド分割装置。
【請求項３】
前記分割ポートは、移動相をカラムに送るための第２送液ポート又は／及び試料バンドの一部を排出するための第１排出ポートを備えて構成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の試料バンド分割装置。
【請求項４】
前記第１送液ポートと前記第２送液ポート又は前記第１排出ポートとの流路切替点からカラム入口までの流路の容量が、カラム空隙容量の１／１３．９以下であることを特徴とする請求項３に記載の試料バンド分割装置。
【請求項５】
前記第１送液ポート及び前記第２送液ポートは、試料バンド分割用流路切替バルブを用いて構成されていることを特徴とする請求項３又は４に記載の試料バンド分割装置。
【請求項６】
前記試料バンド分割用流路切替バルブは、三方バルブ、四方バルブ、六方バルブ、八方バルブ又は十方バルブであることを特徴とする請求項５に記載の試料バンド分割装置。
【請求項７】
前記第１送液ポートと前記分割ポートは、三方ジョイント又は四方ジョイントを用いて接続されていることを特徴とする請求項１から４のうちいずれか１項に記載の試料バンド分割装置。
【請求項８】
請求項１から７のうちいずれか１項に記載の試料バンド分割装置を備えたことを特徴とする試料導入装置。
【請求項９】
前記試料注入装置より上流に試料バンドの一部を排出するための第２排出ポートを備えたことを特徴とする請求項８に記載の試料導入装置。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の試料導入装置を備えたことを特徴とする液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１１】
内径４．６ｍｍ以下のカラムを備えることを特徴とする請求項１０に記載の液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１２】
ピークの溶出容量が１０．２ｍＬ以下であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１３】
液体クロマトグラフィーにおいて、流路の切り替えによって、試料注入装置用流路切替バルブを備えた試料注入装置からカラム前の流路において試料バンドを分割し、分割された前記試料バンドの少なくとも一部分をカラムに導入することを特徴とする試料導入方法。
【請求項１４】
試料バンドが、カラム入口又はカラム入口に最も近い流路切替点をまたいでいるときに、流路の切り替えを行い、試料バンドを分割することを特徴とする請求項１３に記載の試料導入方法。
【請求項１５】
試料バンドを試料バンドの軸方向に交差する方向で分割することを特徴とする請求項１３から１４のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。
【請求項１６】
分割された試料バンドの各部分の全てをカラムに導入することを特徴とする請求項１３から１５のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。
【請求項１７】
分割された試料バンドの一部分をカラムに導入することを特徴とする請求項１３から１５のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。
【請求項１８】
分割された試料バンドのうちカラムに導入した部分以外の部分を排出することを特徴とする請求項１７に記載の試料導入方法。
【請求項１９】
試料バンドの中間部分を含む後部分をカラムに導入せずに流路内に留置し、分割された試料バンドの前部分をカラムに導入、或いは流路から排出した後、前記流路内に留置された試料バンドの後部分を分割して、試料バンドの中間部分をカラムに導入することを特徴とする請求項１３に記載の試料導入方法。
【請求項２０】
ポンプ、試料注入装置用流路切替バルブを備えた試料注入装置、カラム、検出器の順に連結されて構成されるクロマトグラフ装置を用い、前記試料注入装置から注入された試料バンドの前部分がカラムに入り、試料バンドがカラム入り口をまたいでいる時、又は、流路上のカラム入口に最も近い流路切替点を試料バンドがまたいでいる時に、試料バンドをカラムに送る第１送液ポートからの移動相の送液を止め、カラム入口付近に設けた第２の送液ポートからの移動相の送液を開始し、試料バンドを分割して、前記試料バンドの前部分をカラムに導入し、試料バンドの後部分を前記試料注入装置からの接続配管内に留めることを特徴とする請求項１３から１５のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。
【請求項２１】
ポンプ、試料注入装置用流路切替バルブを備えた試料注入装置、カラム、検出器の順に連結されて構成されるクロマトグラフ装置を用い、前記試料注入装置から注入された試料バンドの前部分がカラムに入り、試料バンドがカラム入り口をまたいでいる時、又は、流路上のカラム入口に最も近い流路切替点を試料バンドがまたいでいる時に、試料バンドをカラムに送る第１送液ポートからの移動相の送液を止め又は当該送液を維持して、カラム入口付近に設けた第２の送液ポートからの移動相の送液を開始し、試料バンドを分割して、前記試料バンドの前部分をカラムに導入し、ベントバルブを開き、第１送液ポートからの移動相の送液を再開又は当該送液を維持して、試料バンドの後部分をカラム入口付近の流路に設けた第１排出ポートから排出することを特徴とする請求項１３から１５のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。
【請求項２２】
ポンプ、試料注入装置、カラム、検出器の順に連結されて構成されるクロマトグラフ装置を用い、試料注入装置とカラムとの間に第１排出ポートを作り、試料注入装置から注入された試料バンドの前部分がカラムに入り、試料バンドがカラム入り口をまたいでいる時、又は、流路上のカラム入口に最も近い流路切替点を試料バンドがまたいでいる時に、前記第１排出ポートを開け、試料バンド後部分を排出することを特徴とする請求項１３から１５のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。
【請求項２３】
ポンプ、試料注入装置用流路切替バルブを備えた試料注入装置、カラム、検出器の順に連結されて構成されるクロマトグラフ装置を用い、試料バンドをカラムに送る第１送液ポートからの移動相の送液を止め又は当該送液を維持して、カラム入口付近に設けた第２の送液ポートからの移動相の送液を開始し、前記試料注入装置から注入された試料バンドを第２送液ポートからの移動相の送液により分割して、ポンプと前記試料注入装置との間に、ジョイントとバルブを介して液体を排出するための第２排出ポートを設け、バルブの開閉により随時液体を排出出来る構造とし、試料バンドの分割後、第１送液ポート内に留置された試料バンド後部分を、第２送液ポートからの移動相の送液により、前記試料注入装置を通して押し戻して、前記試料注入装置より上流に設けた第２排出ポートから排出することを特徴とする請求項１３から１５のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。
【請求項２４】
ポンプ、試料注入装置用流路切替バルブを備えた試料注入装置、カラム、検出器の順に連結されて構成されるクロマトグラフ装置を用い、試料バンドをカラムに送る第１送液ポートからの移動相の送液を止め又は当該送液を維持して、カラム入口付近に設けた第２の送液ポートからの移動相の送液を開始し、前記試料注入装置から注入された試料バンドを第２送液ポートからの移動相の送液により分割し、試料バンドの後部分を第１送液ポート内に留置し、カラムに導入された試料バンド前部分に含まれる試料成分がカラムから溶出された後に、第１送液ポート内に留置された試料バンド後部分を、第１送液ポートからの移動相の送液を再開してカラムに導入することを特徴とする請求項１３から１５のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。
【請求項２５】
第１送液ポート内に留置された試料バンド後部分を更に分割し、少なくともその一部を第１送液ポートからの送液を再開してカラムに導入することを特徴とする請求項１３から１５のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。
【請求項２６】
ポンプ、試料注入装置用流路切替バルブを備えた試料注入装置、カラム、検出器の順に連結されて構成されるクロマトグラフ装置を用い、試料バンドをカラムに送る第１送液ポートからの移動相の送液を維持して、カラム入口付近に設けた第２の送液ポートからの移動相の送液を開始し、前記試料注入装置から注入された試料バンドを第２送液ポートからの移動相の送液により分割し、試料注入時から試料バンド分割までの（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）の比の範囲は、１０／０〜１／５であることを特徴とする請求項１３から１５のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィーに関し、より詳細には、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）或いは超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）について、高性能及び超高性能を与える条件下での操作方法、特に試料の導入方法に関し、更にはこれらの方法のために必要な試料導入装置に関する。
【０００２】
ここで、「高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）」は、最大４０ＭＰａの圧力下で実行される液体クロマトグラフィーを意味する。又、「超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）」は、４０ＭＰａより大きく１４０ＭＰａまでの圧力下で実行される液体クロマトグラフィーを意味する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＰＬＣ又はＵＨＰＬＣにおいて、分離の高速化、即ち、短時間に大きな理論段数を発生させて分離時間を短縮するためには、小さな充填剤が詰められたカラムを使用することが必要である。しかし、小さなカラム充填剤は、充填剤の間隙（移動相が通る流路）を小さくするので、送液に高い圧力を必要とする。そこで、圧力を低くするために短いカラムが用いられる。
【０００４】
又、小さな充填剤の間隙に高速で送液すると、液体と粒子壁との摩擦により熱が発生する。発生した熱はカラム管壁からカラムの外に放散されるが、カラム中心部は高温となり、カラム内に温度分布が生じる結果、移動相溶媒の粘度に基づく送液抵抗や、移動相−固定相間の溶質の分配係数が不均一となるので、同じ溶質でもカラム内の位置に依存して移動速度が不均一となる。これにより溶質のバンド幅が拡がり、カラムの分離性能が低下する。そこで、カラム内の温度平衡を迅速に達成し、カラムの分離性能を保つためには、カラムを細くすることが有効である。
【０００５】
以上の理由で、小さな充填剤は、カラムの高い性能を発揮するため、短く細いカラムに充填されることとなる。そして、小さな高性能カラムから溶出される溶質のバンドは、非常に小さな体積及び分散をもつ（非特許文献８）。
【０００６】
又、溶質を溶かして試料を作製する溶媒は、溶出力が強い溶媒、溶解力が大きい溶媒、或いは移動相と同じ組成の溶媒を用いることが多い。そして試料がカラムに注入されたとき、試料中の溶媒自身によって溶質がカラム内を進行するので、試料バンド幅が広がり、理論段数を低下させる。そこで、注入する試料の体積を減らすことは非常に重要であるが、試料のハンドリングの容易さと検出器の感度に基づいて、内径１．０〜４．６ｍｍのカラムを使用するとき、一般的に０．１〜２０μＬの試料が注入される。そして、試料がインジェクター等の試料注入装置からカラムまでの流路、例えば接続配管を流れる間に層流（配管の中心において速く、壁際で遅い放物線型のフロープロファイルの形）になることにより、又、unswept volumeの存在（滞留の効果）により、試料バンド幅が拡がる。
【０００７】
カラムよって分離された試料成分（溶質）それぞれがクロマトグラム上に現れるピークはガウス分布で近似される。ガウス分布の分散（σ２：標準偏差σの２乗）には加算性があり、あるＨＰＬＣ装置とカラムを用いて分離された溶質バンドの分散（全体の溶質バンドの分散、σtotal2）は、式１に示すように、カラム本体がもたらす溶質バンドの分散σcol2と、カラム外の流路等における溶質バンドの分散σextra2の合計として表される（非特許文献１）。
【０００８】
（式１）
σtotal2 =σcol2 +σextra2
【０００９】
カラム外における溶質バンドの分散σextra2は、式２に示すように、（１）試料注入装置（ｉｎｊ）と、試料注入装置からカラム入口に至る配管（ｔｕｂｅ１）における溶質バンドの分散（σinj2 +σtube12）、（２）カラム出口から検出器に至る配管（ｔｕｂｅ２）と検出器セル（ｄｅｔ）における溶質バンドの分散（σtube22 +σdet2）及び（３）検出器からの信号の平均化及びデータ処理装置が信号を取り込む時間間隔がもたらす溶質バンドの分散σdata2からなる。
【００１０】
（式２）
σextra2 =σinj2 +σtube12 +σtube22 +σdet2 +σdata2
【００１１】
実際にＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置において得られるピークの分散（全体の溶質バンドの分散、σtotal2）は、式２右辺に、カラムでの溶質バンドの分散（σcol2）を加えて、式３のように示される。
【００１２】
（式３）
σtotal2 =σinj2 +σtube12 +σcol2 +σtube22 +σdet2 +σdata2
【００１３】
カラムの理論段数（Ｎ）は、式４に示すように、溶質の保持時間（tR）（或いは保持体積（VR））と溶質バンドの分散を用いて計算される。ここでσtotal-t2は、観測された時間として計算された分散であり、σtotal-v2 は体積として計算された分散である。以下、ピーク半値幅（ピーク高さの１／２におけるピーク幅）＝２．３５σとして理論段数を計算した。
【００１４】
（式４）  N=（tR2/σtotal-t2）=（VR2/σtotal-v2）
【００１５】
式５に示す、σextra2が無い理想的な条件下でカラムが示すべき理論段数（Ncol）と比較して、式４に示す、実際にＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置にカラムを接続して得られる理論段数（Ｎ）は一般的に小さい。これは、式１、式２に示す、カラム外における溶質バンドの分散σextra2の寄与に基づくものである。
【００１６】
（式５）  Ncol=（tR2/σcol-t2）=（VR2/σcol-v2）
【００１７】
ここで、σextra2に上記（３）のσdata2を含める理由を以下に述べる。クロマトグラムは検出器シグナルを時間に対してプロットする。クロマトグラムがデータ処理装置に表示されるとき、検出器の出力の遅さと、データ処理装置のデータ取り込みの遅さも、時間を尺度とするピークの拡がり（分散）を与える。移動相液体が一定の流速で流れている場合には、時間を尺度とする溶質バンドの分散を、流速を用いて体積を尺度とする分散に変換し、表すことが出来る。
【００１８】
小さなカラムを用いるＨＰＬＣ分離やＵＨＰＬＣ分離において高性能を得るためには、カラム外における溶質バンドの分散σextra2を最小化することが必要である。σextra2の中で、上記（３）のσdata2は、検出器のレスポンス時間を短くして、データ処理装置のデータ取り込み間隔を短くすることにより最小化される。
【００１９】
又、上記（２）のσtube22 + σdet2は、カラム出口と検出器セルの接続配管内径を小さく、長さを短くし、検出器セル流路の内径と容量を小さくすることにより最小化される。
【００２０】
液体試料をＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置に注入する際、試料バンドが、オートサンプラー又はインジェクター等の試料注入装置から配管を通って分離カラムに至る流路で、層流（放物線型のフロープロファイル）及び、接続部品の角（隅）がもたらすunswept volumeによる滞留の効果により拡散する。上記（１）のσinj2 +σtube12も、試料注入装置からカラムまでの配管内径を小さく、長さを短くすることと、試料注入装置のサンプルループやサンプルニードルの内径を小さくし、試料が通るバルブのオリフィスを小さくすることにより最小化されるが、試料注入装置のサンプルループやサンプルニードル、バルブのオリフィスは、引圧或いは大気圧下で液体試料を再現性よく通す必要があるので、抵抗になりにくい、実用的な内径の大きさが必要である。
【００２１】
以上に示したような、カラム外での溶質バンドの分散σextra2は、カラムサイズが小さくなると相対的に大きな寄与となり、小さなカラムであるほど、カラムが本来もっている性能を発揮しにくくなる。一般に使用されているＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置では、カラム管の容量が２００μＬを下回る場合（例えば内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム（カラム管容量約１７３μＬ）や内径１．０ｍｍ、長さ２５ｃｍ（カラム管容量約１９６μＬ）のカラム或いはこれらより容量の小さいカラムの場合）、この傾向が顕著となる。
【００２２】
具体的には、ＵＨＰＬＣ装置においては、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムがしばしば使用され、多くの場合０．１〜２．０μＬの試料が注入される。そして、多くのＵＨＰＬＣ装置においては、カラム外での溶質バンドの分散σextra2により、保持係数ｋ＝約５を与える溶質について、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムでは約３０％、内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム（カラム管容量約３９μＬ）では約７０％以上の理論段数の低下が報告されている（非特許文献２）。
【００２３】
又、小さなカラムほど、全体の溶質バンドの分散σtotal2に対して、カラム外での溶質バンドの分散σextra2の占める割合が大きくなる傾向にあるが、この傾向は、クロマトグラム上で溶質の保持係数が小さいとき、更に顕著となる。ＵＨＰＬＣ装置において、保持係数ｋ＝約１を与える溶質については、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムにおいても約５０％の理論段数の低下が報告されている（非特許文献３）。内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムについては、σextra2はさらに大きな性能低下をもたらす（非特許文献８）。
【００２４】
又、ＵＨＰＬＣ装置のカラム外での溶質バンドの分散σextra2を減らすため、試料注入装置からカラムに至る流路配管を、装置に元々備え付けられていた配管（内径０．１２７ｍｍ、長さ５５ｃｍ）から、より長さが短い配管（内径０．１２７ｍｍ、長さ２５ｃｍ）に変更することで、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム、内径２．１ｍｍ、長さ１０ｃｍのカラムの性能向上を確認した例が報告されている（非特許文献５）。
【００２５】
ＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置の試料注入装置は、送液ポンプとカラムの間に設置されており、通常、試料を入れるインジェクションポート、試料を一時的に溜めて置くサンプルループを備え、インジェクションポートから入れられた試料が、送液ポンプとカラムの間の流路に組み入れられて、カラム内に導入されている。そして、流路に組み入れられた試料は、カラム入口までの流路を拡散しながら移動するので、その流路の容量が試料バンドの分散に大きく影響する。試料注入装置の一種であるオートサンプラーでは、容量５．０〜５０μＬのサンプルループが接続された流路切替バルブが搭載され、この流路切替バルブの出口からカラム入口までの接続には、外径１．６ｍｍ、内径０．１〜０．２５ｍｍ、長さ２０〜３０ｃｍの配管がよく使用される。耐圧があり、カラムの付け替えを繰り返しても破損しにくい外径１．６ｍｍのステンレス管の中では内径０．１ｍｍがもっとも内径が小さい。又、オートサンプラーとカラムオーブンが別々のユニットになっている場合等、流路切替バルブからカラム入口までは一定の長さの配管が必要になる。
【００２６】
カラム外での溶質バンドの分散σextra2は、カラムサイズが小さくなると相対的に大きな寄与となり、カラム性能を低下させる。内径が小さく、長さが短いカラムを用いて、カラムが本来もっている性能（理論段数）を得るためにはσextra2を最小化することが必要であるが、中でも、試料注入装置と、試料注入装置からカラム入口に至る配管については、最小化について上記のような実際の制限があるので、試料注入装置で注入されてから、カラム入り口に至る流路で拡散する試料バンドについては、これまで上記の方法、或いは、溶出力の小さな溶媒を用いて、カラム入口の固定相に試料を狭いバンドとして吸着させて濃縮する方法（非特許文献６、非特許文献７）以外に有効な解決法が見出されなかった。
【００２７】
一方、充填剤（固定相）量の少ない、キャピラリーガスクロマトグラフィー用カラムやキャピラリー液体クロマトグラフィー用カラムにおいては、試料の容量や、試料に含まれる溶質の重量がカラムにとって過負荷になる場合には、スプリット注入により、試料の容量或いは試料に含まれる溶質の重量をカラムが処理可能な程度に低減して、カラム性能を維持することが行われている（特許文献１、非特許文献４）。
【００２８】
このスプリット注入は、カラムにとって大き過ぎる量の試料から一部を採取し、即ち、流れる試料バンドの一部をカラム入口から取り入れ、大部分を放出して廃棄する形式で行われる。このスプリット注入法では、必然的に多くの試料を廃棄することとなる。又、このスプリット注入法は、試料の容量或いは試料に含まれる溶質の重量がカラムに対して過大である場合に行われ、カラムに対して試料が適切な量である場合に行われるものではない。
【００２９】
又、このスプリット注入は、ＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置では、試料注入装置からカラム入口に至る配管の途中で、流路を分岐する形で行われるために、溶質バンドの分散を減らすことは出来ない。
【００３０】
又一方で、ＨＰＬＣ装置において、第１送液ポートと別に、カラム入口に第２送液ポートを設けて、カラム中心への送液と、カラム周辺部への送液を区別する方法は、カラム内で起こる層流（放物線型を描くフロープロファイル）を制御する目的で提案されている（非特許文献９、非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３１】
【特許文献１】米国特許第３５１３６３６号明細書
【非特許文献】
【００３２】
【非特許文献１】A. Prus, C. Kempter, J. Gysler, T. Jira, Journal of Chromatography A, 1016, 129−141（2003）. Extracolumn band broadening in capillary liquid chromatography.
【非特許文献２】N. Wu, A. C. Bradley, Journal of Chromatography A, 1261, 113-120 （2012）. Effect of column dimension on observed column efficiency in very high pressure liquid chromatography
【非特許文献３】F. Gritti, C. A. Sanchez, T. Farkas, G. Guiochon, Journal of Chromatography A, 1217, 3000-3012 （2010）. Achieving the full performance of highly efficient columns by optimizing conventional benchmark high-performance liquid chromatography instruments.
【非特許文献４】N. Wu, J. A. Lippert, M. L Lee, Journal of Chromatography A, 911, 1-12 （2001）. Practical aspects of ultrahigh pressure capillary liquid chromatography.
【非特許文献５】F. Gritti, C. A. Sanchez, T. Farkas, G. Guiochon, Journal of Chromatography A, 1217, 7677-7689 （2010）. On the extra-column band-broadening contributions of modern, very high pressure liquid chromatographs using 2.1mmI.D. columns packed with sub-2 μm particles.
【非特許文献６】J. P. C. Vissers, A. H. de Ru, M. Ursem, J.-P. Chervet, Journal of Chromatography A, 746, 1-7 （1996）. Optimised injection techniques for micro and capillary liquid chromatography.
【非特許文献７】A. C. Sanchez, J. A. Anspach, T. Farkas, Journal of Chromatography A, 1228, 338-348 （2012） Performance optimizing injection sequence for minimizing injection band broadening contributions in high efficiency liquid chromatographic separations.
【非特許文献８】Y. Ma, A. W. Chassy, S. Miyazaki, M. Motokawa, K. Morisato, H. Uzu, M. Ohira, M. Furuno, K. Nakanishi, H. Minakuchi, K. Mriziq, T. Farkas, O. Fiehn, N. Tanaka, Journal of Chromatography A, 1383, 47-57（2015）. Efficiency of short, small-diameter columns for reversed-phase liquid chromatography under practical operating conditions.
【非特許文献９】T. J. N. Webber, E. H. McKerrell, Journal of Chromatography, 122, 243-258（1976）. Optimisation of liquid chromatographic performance on columns packed with microparticulate silicas.
【非特許文献１０】R. A. Shalliker, M. Camenzuli, L. Pereira, H. J. Ritchie, Journal of Chromatography A, 1262, 64-69（2012）. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a ‘virtual’ narrow bore column.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
上述のように、ＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置に注入された試料は、試料注入装置からカラムに至る配管中で大きな分散を生じる。小さな（内径が細く、長さが短い）カラムを用いる場合、カラムが本来もっている性能（理論段数）を得るために、カラム外における溶質バンドの分散を最小化することが必要であるが、カラムにとって適切な容量と溶質重量でありながら、試料注入装置からカラム入り口に至る流路で拡散する試料バンドについては、これまで、上記の従来技術、特に、溶出力の小さな溶媒を用いて、カラム入口の固定相に試料を狭いバンドとして吸着させて濃縮する方法以外に有効な解決法が見出されなかった。
【００３４】
又、試料注入装置とカラムの間に、濃縮カラムを入れたバルブを設けて、濃縮カラムに一旦試料を狭いバンドとして吸着させ、その後カラムに試料を導入する方法も用いられているが、試料中の溶質に合わせての濃縮が必要になり、濃縮を行ない難い条件では適用出来ない。
【００３５】
非特許文献４に記載のスプリット注入は、試料の容量や試料中の溶質重量がカラムに対して過大である場合に行われる。カラムに対して、試料がすでに適切な量である場合に行われるものではない。又、試料注入装置からカラム入口に至る配管の途中で、流路を分岐する形で行われるために、溶質バンドの分散を減らすことは出来ない。
【００３６】
更に、試料注入装置に付属のバルブの切り替えを繰り返して、試料を分割して狭いバンドにカットする方法もあるが、その後、試料バンドはカラムに至る配管中で大きな分散を生じることになる。
【００３７】
又、非特許文献９及び非特許文献１０の例は、第１送液ポートと別に、カラム入口に第２送液ポートを設けて、カラム中心への送液とカラム管内壁周辺部への送液を区別し、送液ポート間の速度比を一定に保ち、カラム全長にわたってカラム中心部とカラム管内壁周辺部との間の移動相溶媒の速度差の効果を減じることを目的としており、第２送液ポートからの送液を、第１送液ポートから導入される試料バンドの分割やカラム外での溶質の分散の低減のために使用する技術ではなかった。
【００３８】
そこで、本発明は、試料の容量や試料中の溶質重量がカラムに対して過大である場合だけでなく、カラムに対して適切な量であると考えられる試料についても、一層高いカラム性能を発現させるために、カラム外における溶質バンドの分散を低減することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３９】
上記課題を解決するための手段としての本発明は、液体クロマトグラフィーにおいて、分離カラムに試料を導入する際に、試料注入装置とカラムとの間の流路で試料バンドを切断して分割し、一度にカラムに入る試料バンドの分散を減ずることにより、カラムの分離性能を向上させる発明である。
【００４０】
クロマトグラフィー装置、とくに液体クロマトグラフィー装置に液体試料を注入する際、試料バンドが試料注入装置（オートサンプラー或いはインジェクター等）から流路を通ってカラムに至る過程で拡散して、試料バンドの拡がりを起こす。カラム入口までに拡がった試料バンドは、カラム性能を低下させる。カラム外におけるこのバンド拡がり（カラム外での溶質バンドの分散）がカラム性能を低下させる効果（カラム外効果）は、カラムサイズが小さくなると相対的に大きな寄与となり、小さなカラムを高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置や超高圧液体クロマトグラフィー（或いは超高性能液体クロマトグラフィー、ＵＨＰＬＣ）装置で使用すると、カラムが本来もっている性能を発現することが出来ない。本発明は、試料注入装置で注入され、配管中で拡散した試料バンドを、カラム入口で試料バンドの軸方向（流れる方向）に交差する方向で切断して分割して、一度にカラムに導入される試料バンドの体積及び分散を減少させることで、カラムの分離能力（理論段数）を向上させるものであり、ＨＰＬＣ装置及びＵＨＰＬＣ装置において、カラム外での溶質バンドの分散を減少させるという、重要な課題を解決するものである。
【００４１】
より具体的には、試料導入装置の試料注入装置とカラム間に備える装置であって、試料バンドを分割するための試料バンド分割装置である。
【００４２】
又、上記試料バンド分割装置であって、液体クロマトグラフィー装置において、カラムへ試料を導入するための試料導入装置の試料注入装置とカラム間に備える装置であって、試料バンドをカラムに送るための第１送液ポートと該第１送液ポートから送られた試料バンドを分割するための分割ポートを備えた、試料バンドを分割するための試料バンド分割装置である。
【００４３】
又、上記試料バンド分割装置において、試料バンド分割装置は、試料バンドを軸方向に交差する方向で分割するための装置であることを特徴とする試料バンド分割装置である。
【００４４】
又、上記試料バンド分割装置において、前記分割ポートは、移動相をカラムに送るための第２送液ポート又は／及び試料バンドの一部を排出する第１排出ポートを備えて構成されていることを特徴とする試料バンド分割装置である。
【００４５】
又、上記試料バンド分割装置において、前記第１送液ポートと前記第２送液ポート又は前記第１排出ポートとの流路切替点からカラム入口までの流路の容量が、カラム空隙容量の１／１３．９以下であることを特徴とする試料バンド分割装置である。
【００４６】
又、上記試料バンド分割装置において、前記第１送液ポートと前記第２送液ポート又は前記第１排出ポートとの流路切替点からカラム入口までの流路の容量が、カラム空隙容量の１／２１．１以下となることを特徴とする試料バンド分割装置である。
【００４７】
又、上記試料バンド分割装置において、前記第１送液ポートと前記第２送液ポート又は前記第１排出ポートとの流路切替点からカラム入口までの流路の容量が、カラム空隙容量の１／２１．９以下となることを特徴とする試料バンド分割装置である。
【００４８】
又、上記試料バンド分割装置において、前記第１送液ポートと前記第２送液ポート又は前記第１排出ポートとの流路切替点からカラム入口までの流路の容量が、カラム空隙容量の１／２５９以下となることを特徴とする試料バンド分割装置である。
【００４９】
又、上記試料バンド分割装置において、流路切替バルブを備えたことを特徴とする試料バンド分割装置である。
【００５０】
又、上記試料バンド分割装置において、前記流路切替バルブは、三方バルブ、四方バルブ、六方バルブ、八方バルブ又は十方バルブであることを特徴とする試料バンド分割装置である。
【００５１】
又、上記試料バンド分割装置において、三方又は四方ジョイントを備えたことを特徴とする試料バンド分割装置である。
【００５２】
更に、上記試料バンド分割装置を備えたことを特徴とする試料導入装置である。
【００５３】
又、上記試料導入装置において、前記試料注入装置より上流に試料バンドの一部を排出するための第２排出ポートを備えたことを特徴とする試料導入装置である。
【００５４】
更に、前記試料導入装置を備えたことを特徴とする液体クロマトグラフィー装置である。
【００５５】
又、上記液体クロマトグラフィー装置において、内径４．６ｍｍ以下のカラムを備えることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置である。
【００５６】
又、上記液体クロマトグラフィー装置において、ピークの溶出容量が１０．２ｍＬ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置である。
【００５７】
又、液体クロマトグラフィーにおいて、流路の切り替えによって、試料注入装置からカラム前の流路において試料バンドを分割し、分割された前記試料バンドの少なくとも一部分をカラムに導入することを特徴とする試料導入方法である。
【００５８】
又、上記試料導入方法において、試料バンドが、カラム入口又はカラム入口に最も近い流路切替点をまたいでいるときに、流路の切り替えを行い、試料バンドを分割することを特徴とする試料導入方法である。
【００５９】
又、上記試料導入方法において、分割された試料バンドのうち、一度にカラムに導入する試料バンドの一部分の容量は、カラム空隙容量の１／１３．９以下であることを特徴とする試料導入方法である。
【００６０】
又、上記試料導入方法において、試料バンドを試料バンドの軸方向に交差する方向で分割することを特徴とする試料導入方法である。
【００６１】
又、上記試料導入方法において、分割された試料バンドの各部分の全てをカラムに導入することを特徴とする試料導入方法である。
【００６２】
又、上記試料導入方法において、分割された試料バンドの一部分をカラムに導入することを特徴とする試料導入方法である。
【００６３】
又、上記試料導入方法において、分割された試料バンドの前部分をカラムに導入することを特徴とする試料導入方法である。
【００６４】
又、上記試料導入方法において、分割された試料バンドの中間部分をカラムに導入することを特徴とする試料導入方法である。
【００６５】
又、上記試料導入方法において、分割された試料バンドの後部分をカラムに導入することを特徴とする試料導入方法である。
【００６６】
又、上記試料導入方法において、分割された試料バンドのうちカラムに導入した部分以外の部分を排出することを特徴とする試料導入方法である。
【００６７】
又、上記試料導入方法において、試料バンドの中間部分を含む後部分をカラムに導入せずに流路内に留置し、分割された試料バンドの前部分をカラムに導入、或いは流路から排出した後、前記流路内に留置された試料バンドの後部分を分割して、試料バンドの中間部分をカラムに導入することを特徴とする試料導入方法である。
【００６８】
又、上記試料導入方法において、ポンプ、試料注入装置、カラム、検出器の順に連結されて構成されるクロマトグラフ装置を用い、試料注入装置から注入された試料バンドの前部分がカラムに入り、試料バンドがカラム入り口をまたいでいる時、又は、流路上のカラム入口に最も近い流路切替点を試料バンドがまたいでいる時に、試料バンドをカラムに送る第１送液ポートからの送液を止め、カラム入口付近に設けた第２の送液ポートからの送液を開始し、試料バンドを分割して、前記試料バンドの前部分をカラムに導入し、試料バンドの後部分を試料注入装置からの接続配管内に留めることを特徴とする試料導入方法である。
【００６９】
又、上記試料導入方法において、ポンプ、試料注入装置、カラム、検出器の順に連結されて構成されるクロマトグラフ装置を用い、試料注入装置から注入された試料バンドの前部分がカラムに入り、試料バンドがカラム入り口をまたいでいる時、又は、流路上のカラム入口に最も近い流路切替点を試料バンドがまたいでいる時に、試料バンドをカラムに送る第１送液ポートからの送液を止め又は当該送液を維持して、カラム入口付近に設けた第２の送液ポートからの送液を開始し、試料バンドを分割して、前記試料バンドの前部分をカラムに導入し、ベントバルブを開き、第１送液ポートからの送液を再開又は当該送液を維持して、試料バンドの後部分をカラム入口付近の流路に設けた第１排出ポートから排出することを特徴とする試料導入方法である。
【００７０】
又、上記試料導入方法において、ポンプ、試料注入装置、カラム、検出器の順に連結されて構成されるクロマトグラフ装置を用い、試料注入装置とカラムとの間に第１排出ポートを作り、試料注入装置から注入された試料バンドの前部分がカラムに入り、試料バンドがカラム入り口をまたいでいる時、又は、流路上のカラム入口に最も近い流路切替点を試料バンドがまたいでいる時に、前記第１排出ポートを開け、試料バンド後部分を排出することを特徴とする試料導入方法である。
【００７１】
又、上記試料導入方法において、注入された試料バンドを第２送液ポートからの送液により分割して、ポンプと試料注入装置との間に、ジョイントとバルブを介して液体を排出するための第２排出ポートを設け、バルブの開閉により随時液体を排出出来る構造とし、試料バンドの分割後、第１送液ポート内に留置された試料バンド後部分を、第２送液ポートからの送液により、試料注入装置を通して押し戻して、試料注入装置より上流に設けた第２排出ポートから排出することを特徴とする試料導入方法である。
【００７２】
又、上記試料導入方法において、注入された試料バンドを第２送液ポートからの送液により分割し、試料バンドの後部分を第１送液ポート内に留置し、カラムに導入された試料バンド前部分に含まれる試料成分がカラムから溶出された後に、第１送液ポート内に留置された試料バンド後部分を、第１送液ポートからの送液を再開してカラムに導入することを特徴とする試料導入方法である。
【００７３】
又、上記試料導入方法において、第１送液ポート内に留置された試料バンド後部分を更に分割し、少なくともその一部を第１送液ポートからの送液を再開してカラムに導入することを特徴とする試料導入方法である。
【００７４】
又、上記試料導入方法において、試料注入時から試料バンド分割までの（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）の比の範囲は、１０／０〜１／５であることを特徴とする試料導入方法である。
【発明の効果】
【００７５】
本発明によれば、液体クロマトグラフィーにおいて、試料注入装置から分離カラムまでの流路で拡がった試料バンドを、カラム入口で試料バンドの軸方向に交差する方向で分割して、カラムに導入される試料バンドの分散を減ずることにより、カラムの分離性能、即ち理論段数を向上させることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】試料導入装置の概要図
【図２】試料バンド分割方法一実施例工程図
【図３】試料バンド分割装置の実施形態を示す図
【図４】試料バンド分割装置の実施形態及び分割工程を示す図
【図５Ａ】試料バンド分割装置の実施例を示す図
【図５Ｂ】試料バンド分割装置の実施例を示す図
【図５Ｃ】試料バンド分割装置の実施例を示す図
【図５Ｄ】試料バンド分割装置の実施例を示す図
【図５Ｅ】試料バンド分割装置の実施例を示す図
【図６】ベント構造を有する試料導入装置の実施例を示す図
【図７】ベント構造を有する試料バンド分割装置の実施例を示す図
【図８Ａ】ベント構造を有する試料バンド分割装置の実施例を示す図
【図８Ｂ】ベント構造を有する試料バンド分割装置の実施例を示す図
【図８Ｃ】ベント構造を有する試料バンド分割装置の実施例を示す図
【図８Ｄ】ベント構造を有する試料バンド分割装置の実施例を示す図
【図８Ｅ】ベント構造を有する試料バンド分割装置の実施例を示す図
【図９】ベント構造を有する試料バンド分割装置の実施例を示す図
【図１０】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図１１】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図１２】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図１３】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図１４】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図１５】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図１６】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図１７】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図１８】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図１９】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図２０】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図２１】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図２２】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図２３】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図２４】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図２５】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図２６】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図２７】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図２８】本発明の試料バンド分割方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム
【図２９】試料バンド分割を行うまでの第１送液ポートからの送液容量とカラムへの導入率との相関を示すグラフ図
【発明を実施するための形態】
【００７７】
本発明は、ＨＰＬＣ及びＵＨＰＬＣを含む液体クロマトグラフィーにおいて、試料注入装置から注入された試料バンドについて起こる、カラム外における試料バンド拡がりのうちで、試料注入装置と、試料注入装置からカラム入口に至るまでの配管を含む流路において拡がった試料バンドを、カラム入り口前、詳しくは試料導入装置の試料注入装置とカラム間に備えた試料バンド分割装置において試料バンドの軸方向に交差する方向で切断して分割し、試料バンドの一部をカラムに導入することにより、式２の、試料注入装置（ｉｎｊ）と、試料注入装置からカラム入口に至る配管（ｔｕｂｅ１）における溶質バンドの分散、即ち（σinj2 +σtube12）を小さくして、カラム外における溶質バンドの分散（σextra2）を減少させ、式１及び式４における（σtotal2）、即ち、分離系全体での溶質バンドの分散を減じて、カラム性能（理論段数Ｎ、式４）を増大させる、即ち、実際にカラムがもたらす分離能力を向上させる試料バンド分割装置、試料バンド導入装置及び試料バンドを分割してカラムに導入する試料バンド導入方法である。
【００７８】
尚、液体クロマトグラフィーは、分析用及び分取用を含む。そして、試料注入装置から注入する試料の量は特に限定されないが、分析用ＨＰＬＣの場合、０．０１〜５μＬの微小容量の試料、分取用ＨＰＬＣにおいては、装置及びカラムのサイズに応じて適切な量を注入することが出来る。又、本発明方法を用い又は本発明の試料導入装置を設置するクロマトグラフィー装置は、ポンプ、試料注入装置、カラム、検出器の順に連結されて構成された公知の装置である。
【００７９】
又、本発明は、試料バンドがカラム入口に到達したとき、詳しくは、注入され、その後、拡がりを増した試料バンドの前部がカラムに進入したとき、即ち、カラム入り口を試料バンドがまたいでいるとき、或いは、カラム入口に最も近い流路切替点を試料バンドがまたいでいるときに、流路の切り替えによってその試料バンドを切断し、試料バンドの一部、例えば前部分と後部分（テール部分）に分割して、後部分は少なくとも一時はカラムに進入させず、試料バンドの前部分のみをカラムに進入させることにより、カラムに入る試料バンドの容量及び分散を減じることで、カラムの分離性能を向上させる方法及び装置である。尚、試料バンドが切断され分割された部分のうち進行方向前方の部分を前部分、進行方向後方の部分を後部分、前部分及び後部分以外の部分を中間部分という。
【００８０】
試料注入装置は、例えば６方切り替えバルブ、或いはそれに類するバルブを用いるインジェクター、オートインジェクター及びオートサンプラーを含み、一般的にＨＰＬＣやＵＨＰＬＣで使用されている公知のものを使用することが出来る。
【００８１】
カラム入口付近において試料バンドを切断して試料バンドを分割し、分割された試料バンドをカラムに導入する方法及び試料バンドを分割してカラムに導入する試料バンド分割装置、試料導入装置は以下に示す方法及び装置を採用することが出来る。
【００８２】
（１）試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法及び装置
試料注入装置からの配管（第１送液ポート）から試料がカラム入口に入りつつあるとき、配管とカラムとの継ぎ目（即ちカラム入口）で、第１送液ポートとは別ルート（第２送液ポート）から移動相溶媒を供給開始することにより試料バンドを二分割、又は三以上に分割する（図１及び図２）。このとき第１送液ポートからの移動相溶媒の供給を止めれば、試料バンドの前部分だけがカラムに入り、試料バンドの後部分は第１送液ポート中に留められる（図２（４）〜（６））。その後、第２送液ポートからの送液によりカラムに導入された試料バンド前部分中の成分の分離を行うことが出来る。図１は、第２送液ポートをもつ試料バンド分割装置を備えた試料導入装置の概要を示し、図３、図４及び図５は、試料バンド分割装置の実施形態と実施例を示している。尚、後述するように、試料バンドの後部分の分離分析が必要でない場合には、試料注入装置の上流或いは下流の適切な位置に排出ポート（ベント）を設けて、後部分を排出することが出来る（図６及び図７）。
【００８３】
（２）試料バンドの分割−後部分排出を伴う試料導入方法及び装置
試料注入装置からの配管とカラム入り口との接続部において、別ルートで移動相溶媒を供給する第２送液ポート、及び、バルブ操作によりその流路から液体を排出出来る第３のポート（第１排出ポート又は第２排出ポート）を設けて、試料バンド前部分がカラムに入りつつあるときに第２送液ポートからの送液の開始と第３のポートからの排出の開始を行うことにより、試料バンドを切断し試料バンドの後部分を流路から排出し、試料バンド前部分だけをカラムに導入することが出来る（図６及び図７）。
【００８４】
（３）試料バンドから後部分排出による試料分割を伴う試料導入方法及び装置
試料注入装置からの配管とカラム入り口との接続部において、バルブ操作によりその流路から液体を排出出来るポート（第１排出ポート）を設けて、試料バンドの前部分がカラムに入り、試料バンドの後部分（テール部分）が配管中に残っているときに第１排出ポートからの排出を行うことにより、試料バンドの後部分を流路から排出し、試料バンドの前部分だけをカラムに導入することが出来る（図８）。
【００８５】
又、これらの方法においては、試料バンド分割装置における試料バンド分割部にて、第２送液ポート又は／及び試料バンドの一部を排出する第１排出ポートで構成される分割ポートを用いて、試料注入装置から注入された試料バンドを試料バンドの軸方向（進行方向）に交差する方向で分割し、試料バンド前部分をカラムに導入して試料バンド後部分を排出すること、試料バンド前部分を排出して試料バンド後部分のみをカラムに導入すること、試料バンドの前部分及び後部分を排出して中間部分だけをカラムに導入すること、又は試料バンドの一部又は全部を連続して分割して、分割された部分を所定の間隔を持って連続してカラムに導入することが出来る。即ち、試料バンドを２以上に分割し、１以上の分割された部分をカラムに導入して、他の部分を排出することが出来る。
【００８６】
以上のような方法により、試料バンドの一部、例えば後部分（テール部分）を排出し、試料バンドの他部、例えば前部分だけをカラムに導入し、試料バンドの分散を減じてカラム性能を向上させることが可能である。カラムに入る試料バンドの分散を減ずることにより、クロマトグラムのピーク幅を減少させることが可能となる。
【００８７】
次に、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法について詳細に説明する。この方法の実施に際しては、液体クロマトグラフ装置であって、図１に示すように、試料バンドの分割を行う、試料バンド分割部１１を有する試料バンド分割装置１０をカラム１入口近傍に備えた試料導入装置９１を備えた液体クロマトグラフ装置が用いられる。試料導入装置９１は、送液ポンプ２１から試料注入装置２２及び接続配管２３を通じての試料バンド分割装置１０及びカラム１を備えて構成され、試料バンド分割装置１０は、第１送液ポート２０の他に、別に移動相溶媒を供給出来る第２送液ポート２９、及び、カラム１入り口への流路２８を備えて構成することが出来る。又、試料バンド分割装置は、図６に示すように、第２排出ポート６０１と一緒に試料導入装置に備えたり、図７に示すように、第１排出ポート６０を備えて構成してもよい。
【００８８】
図１に示すように、試料バンド分割部１１は、第１送液ポートと第２送液ポートの流路を切り替える流路切替点１２を備え、流路切替点１２近傍の第１送液ポート２０の先端部分、第２送液ポート２９の先端部分及びカラム１入り口への流路２８を備えて構成している。試料バンドの切断は、第１送液ポートの出口である流路切替点１２で送液を切り替えることで行われる。図１において第２送液ポート２９には第１送液ポート２０とは別ルートで、或いは、図示しない別の送液ポンプから移動相が供給される。尚、カラム１の先端部にはフィルター２５を設置してもよい。
【００８９】
図１に示すように、試料は試料注入装置２２から第１送液ポート２０を通じてカラム１へ供給される。第１送液ポート２０は、試料注入装置２２につながった接続配管２３と、カラム１の間に配置され、或いは、試料注入装置２２とカラム１の間に配置されることも出来る。接続配管２３と第１送液ポート２０、或いは第１送液ポート２０のみを通じて、移動相溶媒と試料がカラム１へ送られる構造である。
【００９０】
図２は試料導入装置９１及び試料バンド分割装置１０において、試料注入装置２２からカラム１への第１送液ポート２０内の試料バンド３の進行と、ポンプの稼働状況（＋＝ｏｎ、 ０＝ｏｆｆ、Ａが第１送液ポート２０から送液するための送液ポンプ２１、Ｂが第２送液ポート２９から送液するための送液ポンプ２９１）を示す送液工程図である。図２（１）〜（３）に示されるように、送液ポンプ２１の稼働により、試料バンド３が第１送液ポート２０内を進行し、図２（４）に示すように、試料バンド３が試料バンド分割部１１の流路切替点１２をまたいでいる時に、送液ポンプ２１を停止して第１送液ポート２０からの送液を止めて、同時に送液ポンプ２９１の稼働により、第２送液ポート２９から送液を開始すると、図２（５）〜（６）に示すように試料バンド３が試料バンド分割部１１において分割され、分割された試料バンド３の前部分３１がカラム入口からカラム１内に送りこまれ、試料バンド３の後部分３２は第１送液ポート２０内に留められる。
【００９１】
尚、送液ポンプ２１と送液ポンプ２９１の二台のポンプの送液状態を入れ替える代わりに、送液ポンプ２１の出口に流路切り替えバルブを設置し、ポンプの送液は続けたまま流路切り替えを行うことでも、第１送液ポート２０からの送液を止めて、同時に第２送液ポート２９からの送液を開始することも出来る。
【００９２】
尚、試料バンド３の分割は、試料注入装置から注入された試料バンド３の前部分がカラムに入った時、試料バンド３をカラム１に送る第１送液ポートからの送液を止め、カラム入口付近に設けた第２送液ポートからの送液を開始して行うこととしてもよい。又、試料注入前から第２送液ポート２９からの送液を第１送液ポート２０からの送液と同時に予め継続して行い、試料バンド分割時に第１送液ポート２０からの送液を停止して、第２送液ポート２９からの送液を継続する方法でも、又、試料注入前から第２送液ポート２９からの送液を第１送液ポート２０からの送液と同時に予め継続して行い、試料バンド分割時に第１送液ポート２０からの送液を停止して、第２送液ポート２９からの送液量（流速）を増加させる方法も採用出来る。
【００９３】
この後、第２送液ポート２９からの送液を続けると、カラム１に導入された試料バンド３の前部分３１は通常のクロマトグラフィー分離過程を経て分離溶出される。この導入法によれば、試料バンド３の軸方向（流れの方向）と直交する方向を含む交差する方向での分割により試料バンドをカラム１入口付近で前部分と後部分（テール部分）に分け、前部分のみをカラム１に導入し、カラム１に入る試料のバンド拡がり（分散）を非常に小さくすることが出来る。
【００９４】
カラム１に導入された試料バンド前部分３１の分離溶出終了後、送液ポンプ２１の再稼働により第１送液ポート２０からの送液を再開すれば、第１送液ポート２０に留置されていた試料バンドの後部分３２がカラム１に導入され、第２のクロマトグラフィー分離が行われる。この操作を繰り返すことにより、一度で注入された試料バンド３全体を２度、或いはそれ以上に分けてカラム１に導入し、それぞれの部分を分離溶出或いは分離分析することが出来る。
【００９５】
試料バンド前部分３１をカラム１に導入した後、試料バンド後部分３２について分離分析が必要でない場合には、図６に示すように、送液ポンプ２１と試料注入装置２２との間に第２排出ポート（ベント）６０１を設けて排出する構造、或いは図７に示すように、試料注入装置２２とカラム１との間に第１排出ポート６０を設けて排出する構造とすることにより、試料バンドの前部分をカラム１へ導入した後、試料バンド前部分の分離溶出開始前、分離溶出中、或いは分離溶出終了後に、試料バンドの後部分を排出ポートから排出することが可能である。これらの構造と操作法については後述する。
【００９６】
このような第２送液ポートからの送液による試料バンドの分割、カラムへの導入方法を実施するための試料バンド分割装置の一例として、図３に示すように、Ｔ字コネクター（３方ジョイント）４１と二重管４２を用いて、二重管４２の内管４２１を第１送液ポート、外管４２２を第２送液ポートとする試料バンド分割装置１０をもつ構造のクロマトグラフ装置を用いることが出来る。この試料バンド分割装置の構造は、一般に用いられているカラムについて、カラム入口の溶媒フィルター（フリット）直前で試料バンドを分割することを可能とする。二重管を用いて第１送液ポート及び第２送液ポートを構成することにより、一般的なカラムエンドジョイント（１つの接続管ポートをもつカラムエンドジョイント）をもつカラムについて本発明の試料導入方法を行うことが出来、複数の送液流路をもつような特殊な構造をもつカラムエンドジョイントを必要としないという利点がある。
【００９７】
図３においてＴ字コネクター４１は、一般的な外径１／１６インチ（外径１．６ｍｍ）チューブが接続出来るものである。二重管の内管４２１、即ち、第１送液ポート２０は、内径０．０５〜０．２５ｍｍ、外径０．１〜０．４ｍｍのステンレススチール管（長さ１０〜２５ｃｍ）であり、カラム１入口に接続される二重管の外管４２２、第２送液ポート２９は、内径０．４〜１．０ｍｍ、外径１．６ｍｍのステンレススチール管である。第１送液ポート２０と第２送液ポート２９の流路を切り替える流路切替点１２は二重管の外管４２２内に構成されている。又、第２送液ポートに送液するための枝管は内径０．１〜０．５ｍｍ、外径１．６ｍｍのステンレススチール管である。尚、接続管のサイズは、液体クロマトグラフ装置の規模と流量範囲により、上記の範囲にとらわれずに適切に調節される。各管の間及びＴ字コネクターやカラムエンドジョイントとの接続は適切なフェラルとオシネ或いはナットを用いて行う。
【００９８】
図３（Ａ）に示すように、二重管の内管４２１と外管４２２の末端はカラムエンドジョイント１７のオリフィス入口と同一平面上の構造である。又、二重管の内管がカラム１のフィルター２５や充填剤層を傷つけない限り、内管は外管より長くても（図３（Ｂ）、（Ｃ））、又少し短くてもよい。又、カラム内フィルター２５をつきぬけて、充填剤層１８に直接的に試料を導入出来る構成（図３（Ｄ））としてもよい。
【００９９】
図３に示すように、第１送液ポート２０として二重管の内管４２１、第２送液ポート２９として二重管の外管４２２を用いる場合、Ｔ字コネクターを使用して、内管４２１はＴ字コネクターを貫通し、外管４２２は一方の内管４２１の外側に位置してＴ字コネクターの一つのポートに接続される構造を用いて、二重管の内管、第１送液ポートからカラムに試料バンドが移動しつつあるとき、第１送液ポートからの送液を止めて、第２送液ポートからの送液に切り替えることにより、試料バンドを分割し、試料バンドの後部分を第１送液ポート内に留めて、試料バンドの前部分（先端部分）だけをカラムに導入する試料導入方法を採用することが出来る。
【０１００】
又、図４に示すように、ポンプからの送液流路を切り替えるための流路切り替えバルブ、例えば三方、四方、六方、八方又は十方切り替えバルブを用いて、試料注入装置２２とカラム１との間のカラム１入口に近い流路上に、第２送液ポート５２を作り、それを用いて流路切替点５０で試料バンドを切断し、試料バンドを前部分と後部分に分割し、ループ５３内に留置或いは別途送液ポンプを用いてループ洗浄用配管５７や５８から排出出来る機能をもつ構造でも、本発明の、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法を実施出来る。
【０１０１】
これらの例で示されるように、カラム１入口近くの流路切替点で試料バンドを分割することにより、試料注入装置と、試料注入装置からカラム入口に至る配管中で拡散した試料の分散を非常に小さく出来る。流路切替点からカラム入口までの流路の容量が大きいと、分割された試料バンドがカラムに導入されるまでに拡散することになるので、流路切替点からカラム入口までの流路の容量は小さい方がよく、溶質の分散に影響する他の要因が一定であれば、流路切替点からカラム入口までの流路の容量／カラムの空隙容量の比が小さい方が、本発明の試料導入方法の有効性が高い。
【０１０２】
以下に、本発明の試料導入方法の有効性を確認した実施例から、流路切替点からカラム入口までの容量／カラムの空隙容量の比を３例示す。
【０１０３】
実施例１〜９、１２、１３（図１０〜１８、２１、２２）では、同じ試料分割装置を使用しているので、流路切替点からカラム入口までの容量は同じである。この容量は、実施例４、図１３（Ｅ）の第２クロマトグラムのナフタレンの溶出容量０．６５μＬ（流量０．０５ｍＬ／ｍｉｎでの測定値、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ×０．０１３ｍｉｎ）から、ゼロデッドボリュームユニオン（ＺＤＵ、容量０．０２μＬ）とＺＤＵ出口から検出器セル入口までの容量（約０．５５μＬ）と検出器セルの容量６ｎＬを差し引いて、０．０７μＬと計算される。測定値により装置流路の容量を測る方法は、非特許文献２を参考としている。カラムの空隙容量については、ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍ、カラム管容量約３９．３μＬ）の空隙容量は、実施例３、図１２（Ａ）のウラシルの測定値（流量０．０５ｍＬ／ｍｉｎでの測定値、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ×０．４０ｍｉｎ）と、実施例４、図１３（Ｂ）のナフタレンの測定値（流量０．０５ｍＬ／ｍｉｎでの測定値、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ×０．０３７ｍｉｎ）の差として、２０．０−１．８５＝１８．１５μＬと計算され、更に、実施例４、図１３（Ｂ）で使用したＺＤＵの容量０．０２μＬを差し引いて、１８．１３μＬと計算され、空隙率は約４６．１％となる。
【０１０４】
尚、これらの計算では、カラムなしの場合では検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃでのクロマトグラムのピークトップの値を、カラムありの場合では検出器のレスポンスは０．０５秒、データ取り込み間隔は５０ｍＳｅｃでのクロマトグラムのピークトップの値を使用しており、本来のピーク形状や保持時間への寄与は少ないと思われるので、検出器のレスポンスとデータ取り込み間隔を計算に入れていない。これらの値から、流路切替点からカラム入口までの容量／カラムの空隙容量＝１／２５９となる。後述するように、実施例３では、従来の注入法と比べて、本発明の試料導入方法によって１．２〜２．８倍の理論段数が発生している。保持容量の小さなピークの方が理論段数の増加率が高く、特に、非保持（ｋ＝０）のウラシルのピークについては、２．８倍の理論段数が発生している。ウラシルのピークはカラムを素通りしているので、ウラシルのピークがカラムのみから溶出するのに必要な容量は、カラムの空隙容量（１８．１３μＬ）となる。
【０１０５】
一方で、実施例１４、１５（図２３、２４）では、図４に示す、ミクロ６方流路切り替えバルブを用いた試料分割装置を使用していて、ミクロ６方流路切り替えバルブからカラム入口までの配管は内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍを用いているので、流路切替点からカラム入口までの容量は少なくとも０．８６μＬ以上で、ミクロ６方流路切り替えバルブ内部の流路の容量（流路径０．２５ｍｍのバルブなので、ローターシールの溝の長さが５ｍｍで、０．２５μＬ程度）が加わった値になる。実施例１５、図２４（Ｆ）の第２〜第６クロマトグラムから得られたウラシルの溶出容量の平均値は２．４５μＬ（流量０．０５ｍＬ／ｍｉｎでの測定値、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ×０．０４９ｍｉｎ）であり、ＺＤＵ（容量０．０２μＬ）とＺＤＵ出口から検出器セル入口までの容量（約１．１２μＬ）と検出器セルの容量６ｎＬを差し引いて、１．３０４μＬと計算される。測定値により装置流路の容量を測る方法は、非特許文献２を参考としている。カラムの空隙容量については、ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍ、カラム管容量約３９．３μＬ）の空隙容量は、実施例１４、図２３（Ｄ）のウラシルの測定値（流量０．０５ｍＬ／ｍｉｎでの測定値、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ×０．５３ｍｉｎ）と、実施例１５、図２４（Ｄ）のウラシルの測定値（流量０．０５ｍＬ／ｍｉｎでの測定値、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ×０．１６７ｍｉｎ）の差として、２６．５−８．３５＝１８．１５μＬと計算され、更に、実施例１５、図２４（Ｄ）で使用したＺＤＵの容量０．０２μＬを差し引いて、１８．１３μＬと計算され、空隙率は約４６．１％となる。
【０１０６】
尚、これらの計算では、カラムなしの場合では検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃでのクロマトグラムのピークトップの値を、カラムありの場合では検出器のレスポンスは０．０５秒、データ取り込み間隔は５０ｍＳｅｃでのクロマトグラムのピークトップの値を使用しており、本来のピーク形状や保持時間への寄与は少ないと思われるので、検出器のレスポンスとデータ取り込み間隔を計算に入れていない。これらの値から、流路切替点からカラム入口までの容量／カラムの空隙容量＝１／１３．９となる。又、少なくとも０．８６μＬ／１８．１５μＬ＝１／２１．１以上である。後述するように、実施例１４、図２３（Ｄ）と（Ｅ）を比較すると、従来の注入法と比べて、本発明の試料導入方法によって１．０３〜３．０６倍の理論段数が発生している。保持容量の小さなピークの方が理論段数の増加率が高い。
【０１０７】
又一方で、実施例１６、１７（図２５、２６）では、図７（Ｂ）に示す、クロスを用いた試料バンド分割装置を使用していて、クロスからカラム入口までの配管は内径０．０３ｍｍ、長さ６ｃｍを用いているので、流路切り替え点からカラム入口までの容量は少なくとも０．０４２μＬ以上の値になる。カラムの空隙容量については、ＭｏｎｏＣａｐ  Ｃ１８（シリカモノリスカラム、内径０．１ｍｍ、長さ１５ｃｍ、カラム管容量約１．１８μＬ）の空隙容量は、実施例１６、図２５（Ａ）のチオ尿素の測定値（流量０．００２ｍＬ／ｍｉｎでの測定値、０．００２ｍＬ／ｍｉｎ×０．７７ｍｉｎ）と、実施例１７、図２６（Ａ）のナフタレンの測定値（流量０．００３ｍＬ／ｍｉｎでの測定値、０．００３ｍＬ／ｍｉｎ×０．１８ｍｉｎ）の差として、１．５４−０．５４＝１．００μＬと計算され、更に、実施例１７、図２６（Ａ）で使用したフューズドシリカキャピラリーチューブの容量０．０４２μＬと、フューズドシリカキャピラリーチューブ入口出口を接続するためのゼロデッドボリュームユニオンの容量（０．０２μＬ×２）を差し引いて、０．９１８μＬと計算され、空隙率は約７７．８％となる。
【０１０８】
尚、これらの計算では、カラムなしの場合では検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃでのクロマトグラムのピークトップの値を、カラムありの場合では検出器のレスポンスは０．０５秒、データ取り込み間隔は５０ｍＳｅｃでのクロマトグラムのピークトップの値を使用しており、本来のピーク形状や保持時間への寄与は少ないと思われるので、検出器のレスポンスとデータ取り込み間隔を計算に入れていない。これらの値から、流路切り替え点からカラム入口までの容量／カラムの空隙容量＝１／２１．９となる。後述するように、実施例１６では、従来の注入法と比べて、本発明の試料導入方法によって２．５〜５．０倍の理論段数が発生している。保持容量の小さなピークの方が理論段数の増加率が高い。
【０１０９】
以上のように、本発明の試料導入方法の有効性が確認された、流路切替点からカラム入口までの容量／カラムの空隙容量の比の中で、最も大きな値は１／１３．９であった。これより小さな値の比においては、本発明の試料導入方法の有効性が発揮されることとなる。
【０１１０】
試料バンド分割装置、試料バンド導入装置及び試料バンドの分割、導入方法の一例として、図４に、ミクロ６方流路切り替えバルブ５を流路切り替えバルブ配管として用いる試料バンド分割装置１０及び試料バンド導入装置９３の構造とそれを用いる試料バンドの分割、カラムへの導入の過程を示す。図４（Ａ）は、試料注入装置２２から流路切り替えバルブ５の流路に試料バンド３が入り始めた状態を示し、図４（Ｂ）は、試料バンド３がカラム１入り口に到達し、近接する流路切替点５０（送液ポート切替点）をまたいでいる状態を示す。図４（Ｃ）は、図４（Ｂ）から流路の切り替えにより試料バンド３が二分割された状態を示し、この状態から図４（Ｄ）に示すように、第２送液ポート５２からの送液により試料バンド前部分３１がカラム１に進入し、試料バンド前部分３１に含まれる成分が分離、溶出される。図４（Ｄ）の状態において、第１送液ポート５１及びループ５３に留置されている試料バンド後部分３２を排出することも可能であるが、試料バンド前部分３１の溶出終了後、図４（Ｅ）に示すように、第１送液ポート５１からの送液に切り替えることにより、留置されていた試料バンド後部分３２をカラム１に導入し、分離溶出することが可能である。
【０１１１】
又、図４（Ｄ）において試料バンド後部分３２が大きい場合には、試料バンド前部分３１の溶出終了後、流路を切り替えて第１送液ポート５１からの送液により、試料バンド後部分の一部をカラムへ導入し（図４（Ｅ））、再度図４（Ｄ）に戻し第２送液ポート５２からの送液により溶出することが出来る。その後、図４（Ｅ）〜４（Ｄ）の流路切り替えを繰り返すことにより、試料注入装置から一回で注入された試料を、多数回に分けてカラムに導入し、分離溶出することが出来る。
【０１１２】
本発明の試料導入方法において、第１送液ポートからの送液速度（流速）と、試料注入から試料バンドの分割、カラムへの導入を行うまでの時間を制御することにより、試料バンド全体からカラムに導入される部分の割合、即ち、試料導入率を調節出来る。試料バンドの分割、カラムへの導入を行うタイミングは、試料バンド先端がカラム入口或いは流路切替点に到達したときから、試料バンド後端がカラム入口或いは流路切替点に到達するまで、即ち、試料バンドがカラム入り口或いは流路切替点をまたいでいる間である。試料導入率は９６〜４％が可能で、９３〜１０％が好適である。
【０１１３】
又、本発明の試料導入方法において、試料注入時、第１送液ポートのみから送液を行っておくだけではなく、部分的に第２送液ポートから移動相溶媒の送液を行っておき、試料の分割、カラムへの導入時に第１送液ポートからの送液の停止と、第２送液ポートからの送液速度の増加を行うことでも、試料バンドのカラムへの導入率の制御を可能としている。尚、試料注入時から試料分割までの（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）の比の範囲は、１０／０〜１／９が可能である。
【０１１４】
又、試料注入時、部分的に第２送液ポートから移動相溶媒の送液を行っておき、（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）の比を調節することにより、カラムへの試料導入率の調整を容易にすることが出来る。又、カラム性能の低下をもたらすことなく、カラム性能を最大化する試料注入時から試料分割までの（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）の比と、カラムへの試料導入率を選ぶことが出来る。試料注入時から試料分割までの（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）の比は、１０／０〜３／７が好適である。
【０１１５】
試料バンド分割装置の一例として、カラムがインジェクターに直結されている場合にも、第１送液ポートを設けると共に、図５Ａに示すように、Ｔ字コネクターと二重管を用いて第２送液ポート５２を設けるか、或いは、図５Ｂに示すように、試料注入装置（インジェクター）の接続ポートにカラムを直結し、カラム入口に第２送液ポート５２を設けることにより、又或いは、図５Ｃに示すように、試料注入装置とカラム１との間にＴ字コネクターを配置して、枝管で第２送液ポート５２を設けることにより、上記記載及び図２と同様の原理と操作により、本発明の、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法を実施することが可能である。
【０１１６】
試料バンド分割装置の一例として、図５Ｄに示すように、カラムエンドジョイント１９内に第２送液ポート５２を作ることによってもカラム１入り口での試料バンドの分割、カラムへの導入は実施可能であるが、その場合には、第２送液ポート５２をもつ特殊な構造のエンドジョイントをもつカラムが必要である。
【０１１７】
試料導入装置の一例として、試料バンドの分割後の試料バンド３の後部分３２の分析が不要である場合、図６に示すように、試料注入装置２２の上流に第２排出ポート６０１を設けて、ベントバルブ６２の操作により、抵抗管６３を通じて、或いは抵抗管なしで、試料バンド３の前部分３１の分離溶出前、分離溶出中、或いは分離溶出後に、第２送液ポート２９からの送液によって試料バンド３の後部分３２を排出することが可能である。
【０１１８】
次に、試料バンドの分割−後部分排出を伴う試料導入方法について詳細に説明する。この方法の実施に際しては、液体クロマトグラフ装置であって、図６に示すように、第１送液ポート２０のほかに、別に移動相溶媒を供給出来る第２送液ポート２９、及び、カラム１入り口への流路２８を備え、試料バンドの切断、分割を行うカラム１入口の試料バンド分割装置１０と、通常の液体クロマトグラフにおける送液ポンプ２１から試料注入装置２２及び第１送液ポート２０に接続する接続配管２３を備えた試料導入装置９５を用いることが出来る。第１送液ポート２０と第２送液ポート２９の合流点が流路切替点１２となる。図６において第２送液ポート２９には第１送液ポート２０とは別ルートで、或いは、図示しない別の送液装置から移動相が供給される。又、上記のように、試料注入装置２２の上流に第２排出ポート６０１を設けている。
【０１１９】
そして、図７（Ａ）に示すように、図示しない試料注入装置から注入された試料バンドがカラム１入口に入りつつあるとき（もしくは流路切替点１２１をまたいでいるとき）に、第１送液ポート２０からの送液を止め又は送液を維持して、第２送液ポート２９からの送液により試料バンドを切断して、試料バンドを分割し、第１排出ポート６０からの試料バンド後部分（テール部分）の排出（ベント）を行うための試料バンド分割部をもつ構造の試料バンド分割装置１０１を用いることが出来る。
【０１２０】
図７（Ｂ）は、図示しない試料注入装置とカラム１との間に４方ジョイント７を配置して、第１送液ポート２０及びカラム１への接続ポートの他に、第２送液ポート２９及び第１排出ポート（ベントポート）６０を組み込む構造の試料バンド分割装置１０１である。この構成の場合、第１送液ポート２０、第２送液ポート２９及び第１排出ポート６０の接続部が流路切替点１２１となる。
【０１２１】
この様な構成の装置、方法を用いる場合には、試料バンドが４方ジョイント（クロス）７の流路が交差する中心部、即ち流路切替点１２１を通過中、言い換えればまたいでいる時に、又は試料バンドがカラム入り口をまたいでいる時、第１送液ポート２０からの送液を止めると共に又は送液を維持して、第２送液ポート２９からの送液を開始することにより試料バンドを切断し、分割して試料バンド前部分をカラム１へ導入し、試料バンド前部分の分離溶出開始前、分離溶出中、或いは分離溶出終了後に、ベントバルブを開き、第１送液ポートからの送液を再開又は送液を維持し、試料バンド後部分を第１排出ポート６０から排出（ベント）して、カラムに入る試料バンドの分散を減じることによりカラム性能を向上させることが可能である。尚、第１排出ポート６０には図示しない貯留管を設けて、第１排出ポート６０に送られた試料バンド後部分を排出ではなく、貯留管に留置することとしてもよい。
【０１２２】
特に、前方と後方（前部分と後部分）に拡がりをもつ試料バンドの場合、試料バンドの前部分をカラムに導入或いは系外に排出した後、試料注入装置からカラムへの接続管に留置された試料バンド後部分について、分割と留置の操作を行う、或いはその操作を繰り返すことにより、その試料バンド後部分を分割して、その試料バンド後部分のうち試料バンド中間部分だけをカラムに導入することにより、カラムに入る試料バンドの分散を減じて、カラムの分離性能を向上させることが出来る。
【０１２３】
このように、試料注入装置とカラム１との間に第２送液ポート２９とともに第１排出ポート６０を設けて、第２送液ポート２９からの送液の開始と試料バンド後部分の排出を行って試料バンドの分割と試料バンド前部分のカラムへの導入を行う場合の一例として、インジェクターとカラム１を４方ジョイント７に接続し、他の２つのポートを第２送液ポート２９と第１排出ポート６０として使用する。この場合には、試料バンドが４方ジョイントの中心をまたいでいる時に第２送液ポート２９からの送液を開始して、試料バンドの分割と試料バンド前部分のカラムへの導入を行い、試料バンド前部分に含まれる溶質の分離溶出開始前、分離溶出中、或いは分離溶出終了後に、試料バンド後部分を第１排出ポートから放出することが可能である。試料注入装置とカラムとの間に他の位置関係で第２送液ポート２９と第１排出ポート６０を設置することによって、上記同様に第２送液ポートからの送液の開始と第１排出ポートからの試料バンド後部分の排出を行って試料バンドの分割と試料バンド前部分のカラムへの導入を行うことが可能である。又、いずれの場合にも、第１排出ポートとベントバルブ６２との間に、図示しない貯留管を配置することにより、試料注入装置とカラムを結ぶ流路から排出された試料バンド後部分を一時的に貯留する構造とすることも可能である。
【０１２４】
尚、第１送液ポート及び第２送液ポートを用い、試料バンドが４方ジョイントの中心をまたいでいる時にも第１送液ポートからの送液を停止せずに、ベントバルブを開き、第２送液ポートからの送液を開始することで、試料バンドを分割し、試料バンド後部分を排出することとしてもよい。更に、試料バンド後部分の排出は、図６に示すような、試料注入装置上流の排出ポートからの排出も可能である。この場合、４方ジョイントだけでなく、図３に示すような、Ｔ字コネクターと二重管を用いた試料バンド分割部が使用可能である。
【０１２５】
図５Ｅは、カラムエンドジョイント内に設けた流路切替点に、第１送液ポート５１、第２送液ポート５２、第１排出ポート６０をつないだ試料バンド分割装置の実施例である。図７（Ａ）、図７（Ｂ）に示した試料バンド分割装置と同様に使用出来る。
【０１２６】
次に、試料バンドから後部分（テール部分）の排出による試料分割を伴う試料導入方法の一例について詳細に説明する。この方法の実施に際しては、液体クロマトグラフ装置であって、図８に示すように、試料バンドがカラム１入口に入りつつあるときに、カラム１入口の直前に設けた、バルブ６２の操作により開閉する第１排出ポート６０からの試料バンド後部分（テール部分）の排出（ベント）を行うための試料バンド分割部１１をもつ構造の試料バンド分割装置１０１を備えた液体クロマトグラフ装置を用いることが出来る。この試料バンド分割装置１０１は、第１排出ポート６０からの試料バンド後部分（テール部分）の排出により、第１送液ポート２０と第１排出ポート６０の接続部である流路切替点１３において、試料バンドを分割する。
【０１２７】
図８Ａは、第１送液ポート２０と連通したカラムポート７７にカラム１を接続すると共に、第１排出ポート６０を設けた構造の試料バンド分割装置１０１を示している。試料バンド分割装置１０１には第２送液ポートは設けずに、第１送液ポート２０と第１排出ポート６０を備えて構成している。図８Ｂにおいては、Ｔ字コネクター４１と二重管４２を用いて、図示しない試料注入装置の出口と試料バンド分割部１１とカラム１入口が一体となった構造を示し、図８Ｃは、第１送液ポート２０の外側にＴ字コネクター４１と二重管４２で第１排出ポート６０を設けて、いずれもカラム入口に非常に近い位置に試料バンド分割部１１を配置している。図８Ｄにおいては、試料注入装置とカラム１との間にＴ字コネクター４１を配置して、枝管を排出ポート６０としている。
【０１２８】
原理的には、図８Ａ〜図８Ｄのいずれにおいても試料注入装置とカラム１との間にＴ字コネクター（３方ジョイント）を配置して、第１送液ポート２０及びカラム１への接続ポートの他に、第１排出ポート（ベントポート）６０を組み込む構造である。又、試料バンド分割装置１０１は、図８Ｅに示すように、カラムエンドジョイント２８内に試料分割部１１を設け、即ち、第１送液ポート２０及び第１排出ポート６０の先端部分をカラムエンドジョイント２８内に設けて構成してもよい。
【０１２９】
図８Ａ〜図８Ｅの構成の場合には、試料バンド前部分が第１排出ポート６０の接続部、即ち流路切替点１３を通過し、試料バンド後部分（テール部分）が流路切替点１３より後にあるときに、ベントバルブ６２を開いて、試料バンド後部分を第１排出ポート６０から排出を行うことにより、試料バンドを切断し、分割して、試料バンド後部分をカラムに導入せず、カラムに入る試料バンドの分散を減じることによりカラム性能を向上させることが可能である。
【０１３０】
尚、注入された試料バンドがカラム入口に進入したとき、又は、流路切替点１３を試料バンドがまたいでいるときに、一時的にカラム１への送液速度（流速）を減じること、或いはその流速を変えないこと、或いはその流速を増やすことと共に、ベントバルブ６２を開いて第１排出ポート６０への流れを開始することにより、試料バンド後部分を、第１排出ポート６０とベントバルブ６２の間に設ける図示しない貯留管への留置或いは排出を行うことが出来る。留置された試料バンド後部分をカラムに導入する場合には、第１排出ポート６０からカラムに向かって送液出来る送液ポンプ等が別途必要になる。
【０１３１】
このように、試料注入装置とカラムとの間に第１排出ポート６０を設けて、試料バンド後部分の排出を行うことで、試料バンドの分割とカラムへの導入を行う場合の一例として、インジェクターとカラムを３方ジョイントに接続し、枝管を排出ポート６０として使用する。図８Ａ、図８Ｄの場合には試料バンドが流路分岐点１３をまたいでいるときにベントバルブ６２の操作により試料バンドの分割を行い、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｅの場合には試料バンドがカラム１入口をまたいでいるときにベントバルブ６２の操作により試料バンドの分割を行い、試料バンド後部分を第１排出ポート６０から排出することと、その後ベントバルブを閉じ、カラムへの送液を再開することで、試料バンド前部分のカラムへの導入と、分離溶出や分析を行うことが可能である。いずれの場合にも、第１排出ポート６０とベントバルブ６２との間に図示しない貯留管を配置することにより、試料注入装置とカラムをつなぐ流路から排出された試料バンド後部分を一時的に貯留する構造とすることも可能である。
【０１３２】
図９に示すように、Ｔ字コネクター７３或いは４方ジョイント７４を試料バンド分割部１１に用いる場合、図７（Ｂ）と図８（Ｄ）に対応する図９（Ａ）と図９（Ｂ）おいて、分析される試料バンド前部分の拡散と排出される試料バンド後部分が拡散によってカラム１への流路に再進入することを防止するために、試料バンドの分割とカラムへの導入を行うためのジョイント内部に入り込んだ、試料注入装置とカラムをつなぐ流路上の配管相互の間のギャップを０．５ｍｍ以下まで狭くした構造とすることが好ましい。その他の試料バンド分割部（図５Ｃ）の接続形式においても同様の構造が可能である。
【０１３３】
次に、第２送液ポートからの送液開始のタイミングと（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）の比について説明する。第２送液ポートからの送液を伴う試料バンドの分割方法において、第１送液ポートからの送液の停止と第２送液ポートからの送液の開始を同時に行うことにより、試料バンドの分割とカラムへの導入を行うことが出来るが、試料注入の前から、第２送液ポートからの送液を第１送液ポートからの流速に対して１〜９０％程度の流速の範囲で開始しておいても構わない。試料注入時にあらかじめ第２送液ポートからの送液を行うことは、試料バンドの分割とカラムへの導入時の第２送液ポート送液ポンプの加速を容易にするので、カラム性能を最大限に発現させる試料導入を可能とするため、ならびに、試料バンドのカラムへの導入率を調節するために有効である。
【０１３４】
このように、本発明は、従来キャピラリー液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーにおいて用いられてきたスプリット注入法と以下の点において異なっている。
１．本発明は、通常のＨＰＬＣ或いはＵＨＰＬＣにおいて標準的であり、現代の技術水準で充分に小さいと考えられている試料体積（０．０１〜５μＬ）の試料をさらに分割する。
２．本発明は、大量の試料溶液の流れから大部分をベント（放出）して一部をカラムに取り入れるのではなく、標準的な量の試料をその軸方向に交差する方向で分割して、一部（前部分）をカラムに送って分離溶出や分析を行うと同時に、分割された試料の一部（後部分）を試料注入装置とカラム間の流路に留置するか、系外に排出する。
３．本発明においては、試料注入装置とカラムの間の流路に留置された試料の後部分は、試料前部分の分離溶出終了後、分離溶出されるか、或いは、分離溶出前後に排出ポートから放出される。
４．従来のガスクロマトグラフィーにおいて用いられるスプリット注入においては、各溶質の間の挙動の差（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）が問題となるが、本発明の方法は、試料バンドの分割によって溶質間の挙動の差が起こるか起こらないかを、分割された試料バンド前部分と後部分を連続して分析出来るので、一回の試料の注入で調べることが可能である。
５．従来の試料注入法において、最高の性能を与える最小限の試料体積が与える溶質バンドでも試料注入装置からカラム入り口まで流れたときにはバンド拡がりを増加させているが、本発明は、これをカラム入り口で、さらに分割してカラムに導入することが出来る。
【実施例】
【０１３５】
以下、本発明の装置と操作法を具体化する方法を、実施例として比較例と共に説明する。以下の実施例は、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法、試料バンドの分割−後部分排出を伴う試料導入方法、及び試料バンドから後部分排出による試料分割を伴う試料導入方法についてそれぞれの例を示している。これらの実施例は、各方法において、カラムサイズ、試料注入容量、検出器セル容量、ならびに試料注入時から試料分割までの（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比などのいくつかの組み合わせにおいて本発明の試料導入方法が従来の試料注入方法に比べてカラムの理論段数を増加させる効果を示すものであり、又、カラムなしでの実施例は、試料注入容量、検出器セル容量、試料注入時から試料分割までの（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比のいくつかの組み合わせにおいて、注入された試料バンドがどのように拡がり、本発明の試料導入方法でどのように分割され、カラムに導入されるかを直接的に可視化するものである。尚、以下の例において、従来の試料注入方法（試料注入バルブの操作によって、試料ループ内の試料バンドを移動相の流路へ組み込むこと）を「従来の試料注入方法」もしくは「従来の試料注入法」もしくは「注入」と表現する。
【０１３６】
試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法については、試料注入容量０．１〜５．０μＬ、 カラム内径１．０〜４．６ｍｍ、カラム長さ５〜１５ｃｍ、検出器セル容量１μＬと６ｎＬ、ならびに、試料注入時から試料分割までの（（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比のいくつかの組み合わせにおける実施例を含む。図１０〜２８のクロマトグラム上のピークに付した数値は、ピーク半値幅（単位：ｍｉｎ）であり、ガウス分布の場合、そのピークの２．３５σ（σ：標準偏差）に相当する。この数値と保持時間（ｔＲ）からカラムの理論段数を計算することが出来（式４）、又、本発明に基づく試料導入方法によってバンド幅、即ち、ピーク分散（σ２）の低減が可能であることを直接的に理解出来る。表１は各実施例、比較例における試料バンドの分割方法、カラムサイズ、検出器セル容量、試料注入容量、各実施例相互の関連性を示したものである。
【０１３７】
【表１】
0006754225.tif 000002
【実施例１】
【０１３８】
試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法によるカラム性能向上の確認のため、従来の試料注入法（図１０（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図１０（Ｂ））におけるカラム性能の比較を行った。
【０１３９】
本発明の試料導入方法のうち試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法において、０．４μＬ注入された試料バンドが２分割されてカラムに導入され、試料バンド前部分からの第１のクロマトグラムにおける理論段数の向上と、第１送液ポートに留められた試料バンド後部分の与える第２のクロマトグラムが示される例である。
【０１４０】
試料注入装置としてＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（５μＬループ、内径０．２０ｍｍ、長さ１５．９ｃｍ）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を０．０５ ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は室温とした。尚、室温とは２４．５±０．５℃である（以下同じ）。検出には、検出セル容量１μＬ、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０５秒、データ取り込み間隔は５０ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径１．６ｍｍ、内径０．０６３５ｍｍ、長さ１５ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約０．４８μＬ）を使用した。試料には、試料Ｉ：ウラシル（Ｕ、０．１３ｍｇ／ｍＬ）、安息香酸メチル（ＭＢ、１．８ｍｇ／ｍＬ）、トルエン（Ｔ、２．６ｍｇ／ｍＬ）、 ナフタレン（Ｎ、０．７ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０１４１】
この例で用いた試料バンド分割装置の試料バンド分割部は、図３（Ａ）に示す構造であり、Ｔ字コネクターＵ−４２８（内径０．５ｍｍ、ＩＤＥＸ社）を使用し、二重管は、試料注入バルブ〜カラム入口の接続管（第１送液ポート送液用の内管）に外径０．２３６ｍｍ、内径０．１０８ｍｍ、長さ１０ｃｍのステンレススチール管（容量約０．９２μＬ）、 及び、第２送液ポート送液用の外管に外径１．６ｍｍ、内径０．５ｍｍ、長さ５ｃｍのステンレススチール管で構成した。Ｔ字コネクターの第２送液ポートへの送液用の接続管（枝管）は、外径１．６ｍｍ、内径０．２５ｍｍのステンレススチール管を使用した。
【０１４２】
図１０（Ａ）は、従来の試料注入法を用いて、試料Ｉを０．４μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１送液ポートから流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。
【０１４３】
尚、図１０〜２８において、各ピーク上の数値は５０％ピーク高さにおけるバンド幅（半値幅、単位：ｍｉｎ）を示す。この半値幅は、ガウス分布の場合２．３５σ（σ：標準偏差）に対応し、この値からピークの分散及びカラムの理論段数（Ｎ、式４）を計算出来る。ピークの分散（σ２、式１）を体積の次元で表す場合には、流速（ｍＬ／ｍｉｎ）を用いてσを体積の次元に変換する。
【０１４４】
図１０（Ｂ）は、図１０（Ａ）と同じ移動相条件下、試料Ｉを０．４μＬ注入し、注入から０．０３分後に第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）を開始して試料バンドを分割し、分割した試料バンドの前部分をカラムに導入して溶出分離を行い、試料注入から４．０分後、第２送液ポート送液を停止し、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）に戻し、第１送液ポートに留め置かれた試料バンド後部分をカラムに導入して分離溶出を行ったクロマトグラムである。
【０１４５】
図１０（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＭＢ、Ｔ及びＮについてそれぞれ、理論段数４５０、２５４０、４４００、及び５１１０段が得られている。これに対して、注入された試料の約６０％が試料バンドの分割により第１送液ポートに残され、約４０％がカラムに導入された図１０（Ｂ）の前半のクロマトグラム（第１クロマトグラム）においては、試料バンドの分割、試料バンド前部分のカラムへの導入によって各ピークのバンド幅が狭くなり、Ｕ、ＭＢ、Ｔ及びＮについてそれぞれ、理論段数９６０、４６４０、６１２０及び６７４０段が得られ、図１０（Ａ）と比べて１．２〜２．１倍程度の理論段数の発生を可能としている。
【０１４６】
図１０（Ｂ）の後半のクロマトグラム（第２クロマトグラム）に示すように、試料注入から４．０分後に第１送液ポートからの送液に戻したことにより、試料注入から０．０３分後における試料バンドの分割時から第１送液ポート管内に残されていた試料バンド後部分が、カラムに導入され、分離溶出されているが、図１０（Ｂ）第２クロマトグラムの４つのピークは、いずれも試料バンドの分割無しで溶出された図１０（Ａ）（比較例）における溶出ピークよりも小さなバンド幅及び分散を示している。即ち、軸方向に交差する方向で２分割されてカラムに導入された試料バンドはいずれも、分割しないで注入された場合と比べて高性能分離されている。
【実施例２】
【０１４７】
従来の試料注入法と、本発明の試料導入方法における試料バンドの拡がりと形状に関し、従来の試料注入法（図１１（Ａ））（比較例）に比べ、本発明の試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法（図１１（Ｂ））による試料バンド幅の減少を、カラム無しで実証した。
【０１４８】
本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法において、０．４μＬ注入された試料バンドが２分割されてゼロデッドボリュームユニオンに導入され、試料バンド前部分からの第１クロマトグラムと、第１送液ポート内に留められた試料バンド後部分の与える第２クロマトグラムが示される例である。尚、クロマトグラム上の各ピークは、接続管及び検出セルでのバンド拡がりを含んでいる。図１１（Ａ）、図１１（Ｂ）はそれぞれ、図１０（Ａ）、図１０（Ｂ）におけるカラム入り口での試料バンドの状態を表すものと考えることが出来る。
【０１４９】
試料注入装置としてＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（５μＬループ、内径０．２０ｍｍ、長さ１５．９ｃｍ）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムに代えてゼロデッドボリュームユニオン（Ｕ−４３５、内径０．２５ｍｍ、内部容量０．０２μＬ、ＩＤＥＸ社、以下ＺＤＵと表記）を用いた。図３（Ａ）に示す構造の、実施例１と同様の試料バンド分割部を使用した。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は０．０５ ｍＬ／ｍｉｎで送液し、温度条件は室温とした。検出には、検出セル容量１μＬ、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。ＺＤＵ出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径１．６ｍｍ、内径０．０６３５ｍｍ、長さ１５ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約０．４８μＬ）を使用した。試料には、試料ナフタレン：ナフタレン（Ｎ、０．１ｍｇ／ｍＬ）のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０１５０】
図１１（Ａ）は、 従来の試料注入法を用いて、試料ナフタレン０．４μＬを注入し、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）により溶出したクロマトグラムである。図１１（Ｂ）は、０．４μＬ注入した試料ナフタレンを、本発明の試料導入方法を用いて２分割し、ＺＤＵに導入し溶出したクロマトグラムである。試料注入から０．０３分後に第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）を停止し、第２送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）を開始して試料バンドを分割して前部分をＺＤＵに導入して溶出し（第１クロマトグラム）、０．２分後、第２送液ポートの送液を停止し、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）に戻し、第１送液ポート内に留められていた試料バンド後部分のＺＤＵへの導入と溶出を行っている（第２クロマトグラム）。
【０１５１】
図１１（Ｂ）第２クロマトグラムには、試料注入から０．０３分後の試料バンドの分割時に第１送液ポートの中に残された試料が溶出されており、ＺＤＵ入口付近で試料バンドが軸方向に交差する方向で２分割され、それぞれＺＤＵに導入されていることが直接的に示されている。図１１（Ａ）（比較例）のピークと比較して、図１１（Ｂ）の２つのクロマトグラムの各ピークは、いずれもバンド幅が減少している。
【０１５２】
実施例１、２とも試料注入後、試料バンドの分割の有無にかかわらず、各ピークはＵＶ検出器のセル（容量１μＬ）を通過しているので、図１０、図１１に示すクロマトグラム上の各ピークは、カラム出口やＺＤＵ出口から検出器セルへの接続管、及び検出器セルにおける溶質のバンドの分散を含んでいる。
【実施例３】
【０１５３】
試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法によるカラム性能向上の確認のため、従来の試料注入法（図１２（Ａ）、（Ｂ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図１２（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ））におけるカラム性能の比較を行った。
【０１５４】
本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法により、試料バンド前部分からの第１クロマトグラムにおける理論段数の向上と、第１送液ポート内に留められた試料バンド後部分の与える第２クロマトグラムが示される例である。
【０１５５】
試料注入装置としてＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（５μＬループ、内径０．２０ｍｍ、長さ１５．９ｃｍ）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を０．０５ ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は室温とした。検出には、検出セル容量６ｎＬ、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０５秒、データ取り込み間隔は５０ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１５ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２９μＬ）をＺＤＵ（容量０．０２μＬ）に接続し、更に外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１２ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２４μＬ）を接続して使用した。試料バンド分割装置には、図３（Ａ）に示す構造の、実施例１、２と同様の試料バンド分割部を使用した。試料には、試料Ｉ：ウラシル（Ｕ、０．１３ｍｇ／ｍＬ）、安息香酸メチル（ＭＢ、１．８ｍｇ／ｍＬ）、トルエン（Ｔ、２．６ｍｇ／ｍＬ）、 ナフタレン（Ｎ、０．７ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０１５６】
図１２（Ａ）、（Ｂ） は、従来の試料注入法を用いて、試料Ｉをそれぞれ、（Ａ）０．２μＬ、（Ｂ）０．１μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１送液ポートから流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。
【０１５７】
図１２（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）はそれぞれ、試料Ｉの０．４μＬ、０．２ μＬ、０．１μＬの注入から０．０３分後に第１送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）を開始して試料バンドを分割し、試料バンド前部分をカラムに導入して分離溶出し、試料注入から４．０分後から第１送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）を再開し、第２送液ポート送液を停止することで、試料Ｉをそれぞれ２分割してカラムに導入し、分離を行ったクロマトグラムである。
【０１５８】
図１２（Ａ）（比較例）ではＵ、ＭＢ、Ｔ及びＮについてそれぞれ、理論段数１２４０、４８７０、６３７０及び６９００段が得られている。
【０１５９】
これに対して、試料Ｉが０．４μＬ注入され、図３（Ａ）に示す構造の、実施例１、２と同様の試料バンド分割部を使用して約４０％がカラムに導入された図１２（Ｃ）第１クロマトグラムでは、Ｕ 、ＭＢ、Ｔ及びＮについてそれぞれ、理論段数３３３０、６８４０、７４８０及び７８００段が得られている。試料Ｉが０．２μＬ注入され、実施例１、２と同様の試料バンド分割部を使用して約４７％がカラムに導入された図１２（Ｄ）第１クロマトグラムでは、Ｕ 、ＭＢ、Ｔ及びＮについてそれぞれ、理論段数３５３０、８５６０、８１４０及び８４１０段が得られている。試料Ｉが０．１μＬ注入され、実施例１、２と同様の試料バンド分割部を使用して約４８％がカラムに導入された図１２（Ｅ）第１クロマトグラムでは、Ｕ 、ＭＢ、Ｔ及びＮについてそれぞれ、理論段数３３３０、８７２０、８１６０及び８６１０段が得られている。
【０１６０】
実施例３では従来の注入法と比較して、試料バンドの軸方向に交差する方向での分割、カラムへの導入によってクロマトグラムのピーク幅が狭くなり、表２に示すように、１．２〜２．８倍程度の理論段数の発生を可能としている。尚、注入容量が小さい場合には試料バンド幅も小さくなるので、試料注入から同一時間後での試料バンドの分割においては、第１送液ポートに残される試料の割合が減少している。ただし、図１２（Ｄ）、（Ｅ）で見られるように、試料の流路中での拡散が起こりにくい条件である、遅い流速（０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）では、０．２μＬや０．１μＬのように注入容量がある程度小さくなると、拡散後の試料バンド幅はほぼ変わらなくなるので、分割された試料バンドの前部分がカラムに導入される割合が変わらなくなる。
【０１６１】
【表２】
0006754225.tif 000003
【０１６２】
実施例３において、小さな容量のキャピラリーＵＶセル（６ｎＬ）を使用した場合には、実施例１で１μＬセルを使用した場合と比較して大きな理論段数が得られた。又、特に保持の小さな溶質（Ｕ、ＭＢ）については、試料バンドの分割、カラムへの導入によって、従来の注入法に比べて大きな理論段数の増加が認められた。これらの結果は、カラム出口から検出器セル入り口までの配管の容量（実施例１では約０．４８μＬ、実施例３では約０．５５μＬ）と、検出器セル容量（実施例１では１μＬ、実施例３では６ｎＬ）により、カラムから溶出された各溶質ピークが分散しにくい条件の方が、より大きな理論段数が得られることと、本発明の試料導入方法により、より大きく理論段数が増加することを示している。又、本発明の試料導入方法によりカラム外で溶質が分散する効果が低減され、クロマトグラム初期に現れる保持の小さな溶質のピークについても、カラム本来の性能に近い性能（理論段数）が得られたことを示している。
【実施例４】
【０１６３】
従来の試料注入法と、本発明の試料導入方法における試料バンドの拡がりと形状に関し、従来の試料注入法（図１３（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ））（比較例）に比べ、本発明の試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法（図１３（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ））による試料バンド幅の減少を、カラム無しで実証した。
【０１６４】
本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法において、０．４μＬ、０．２μＬ、０．１μＬ注入された試料バンドが分割されてＺＤＵに導入され、試料バンド前部分からの第１クロマトグラムと、第１送液ポートに留められた試料バンド後部分の与える第２クロマトグラムが示される例である。図１３（Ｂ）と（Ｃ）、図１３（Ｄ）と（Ｅ）と（Ｆ）はそれぞれ、図１２（Ａ）と（Ｂ）（従来の試料注入方法）と、図１２（Ｃ）と（Ｄ）と（Ｅ）（本発明の試料導入方法）におけるカラム入り口での試料バンドの状態を表すものと考えることが出来る。ただし、これらのクロマトグラムもＺＤＵ出口から検出器セルへの接続管、及び検出器セルにおける溶質バンドの分散を含んでいる。
【０１６５】
試料注入装置としてＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（５μＬループ、内径０．２０ｍｍ、長さ１５．９ｃｍ）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムに代えてゼロデッドボリュームユニオン（Ｕ−４３５、内径０．２５ｍｍ、内部容量０．０２μＬ、ＩＤＥＸ社、以下ＺＤＵと表記）を用いた。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は０．０５ ｍＬ／ｍｉｎで送液し、温度条件は室温とした。検出には、検出セル容量６ｎＬ、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。ＺＤＵ出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１５ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２９μＬ）をもう１つのＺＤＵ（容量０．０２μＬ）に接続し、更に外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１２ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２４μＬ）を接続して使用した。試料バンド分割装置には、図３（Ａ）に示す構造の、実施例１〜３と同様の試料バンド分割部を使用した。試料には、試料ナフタレン：ナフタレン（Ｎ、０．１ｍｇ／ｍＬ）のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０１６６】
図１３（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、バルブを用いる従来の試料注入法を用い、試料ナフタレンをそれぞれ０．４μＬ、０．２μＬ、０．１μＬ注入し、移動相としてアセトニトリル／水＝６０／４０を第１送液ポートから０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液し、溶出したクロマトグラムである。
【０１６７】
図１３（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）は、試料ナフタレンをそれぞれ０．４μＬ、０．２μＬ、０．１μＬ注入し、本発明の試料導入方法にて、試料バンドを分割してＺＤＵに導入し溶出したクロマトグラムである。試料注入から０．０３分後に第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）を停止し、第２送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）を開始して試料バンドを分割して前部分をＺＤＵに導入して溶出し（第１クロマトグラム）、試料注入から０．２分後、第２送液ポートの送液を停止し、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）に戻し、分割された試料バンド後部分のＺＤＵへの導入と溶出を行っている（第２クロマトグラム）。
【０１６８】
図１３（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）（比較例）において、ナフタレンのピークが大きなテーリングを示しているのに対して、図１３（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）においては、第１クロマトグラムのピークは幅が小さくなっており、図１３（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）のピークからテーリング部分を削ぎ取られた形をしている。試料注入装置からカラム入口までの配管に内径０．１０８ｍｍ、長さ１０ｃｍ（容量約０．９２μＬ）という、容量の小さな配管を用いた装置でさえ、従来の試料注入方法にて注入体積を減らしただけでは得られない狭い試料バンドが、本発明によるカラム（この場合はＺＤＵ）入口付近での試料バンドの軸方向に交差する方向での分割によって得られたことが示されている。図１３（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）の第１クロマトグラムにおけるナフタレンの半値幅（５０％ピーク高さ）はそれぞれ、図１３（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）のナフタレンのピーク幅と比較して、約１／２に減少している。又、図３（Ａ）に示す構造の、試料バンド分割部を持つ試料バンド分割装置を用いた結果、０．１μＬ（１００ｎＬ）という微量で注入された試料においても、カラム入口付近で試料バンドを分割、導入してカラム外で溶質が分散する効果を減らすことが出来ることを示している。
【０１６９】
実施例４、図１３（Ｂ）のナフタレンの溶出容量の測定値（流量０．０５ｍＬ／ｍｉｎでの測定値、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ×０．０３７ｍｉｎ）は、１．８５μＬであった。この値から、ＺＤＵ（容量０．０２μＬ）とＺＤＵ出口から検出器セル入口までの容量（約０．５５μＬ）と検出器セルの容量６ｎＬを差し引くと、１．２７４μＬとなった。このことから、流量０．０５ｍＬ／ｍｉｎで試料の分割を行うタイミングは、試料注入から０．０３ｍｉｎ後（０．０５ｍＬ／ｍｉｎ×０．０３ｍｉｎ＝１．５μＬ送液後）に設定した。この結果、図１３（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）（比較例）にてそれぞれ、０．４μＬ、０．２μＬ及び０．１μＬで注入され、溶出したナフタレンのピークの５０％ピーク高さにおけるｓｙｍｍｅｔｒｙ係数は、２．５、２．４及び２．１であったが、図１３（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）にてそれぞれ、０．４μＬ、０．２μＬ及び０．１μＬで注入され、本発明の試料導入方法にて分割され、ＺＤＵに導入（試料導入率はそれぞれ、約２９％、約４１％及び約４０％）されて溶出したナフタレンのピークの５０％ピーク高さにおけるｓｙｍｍｅｔｒｙ係数は、０．９９、０．９３及び１．０４となり、対称性の良いピークとなった。
【０１７０】
図１３（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）（比較例）では、溶出したピークはテーリングしていて、注入容量の大きいピークの方が、ピーク全体が後ろ側（保持時間が長くなる方）に拡がっている。このため、試料注入から０．０３ｍｉｎ後という一定時間後に試料の分割を行うと、０．４μＬ注入された場合（図１３（Ｄ））で、最も試料が分割された割合（１００％−２９％＝７１％）が大きくなった。
【０１７１】
図１３（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）（比較例）では、ナフタレンのピークの分散は、モーメント法（境界要素法）により、０．３４μＬ２、０．４２μＬ２及び０．４１μＬ２と計算された。これらに対して、図１３（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）では、０．０４μＬ２、０．０５μＬ２及び０．０７μＬ２と計算され、本発明の試料導入方法により、０．３〜０．４μＬ２も（約８０％以上も）溶質の分散が小さくなった。ＵＶ検出に容量の小さい６ｎＬのキャピラリーセルを用いて、ＺＤＵから検出器セルまでの流路の容量を小さくしたことで、溶質がカラム外（ＺＤＵ外）で分散する要素が小さくなった条件下では、本発明の試料導入方法は従来の試料注入方法に比べて、試料バンドの分散を８０％以上減少させるという非常に大きな効果をもつことが示された。実施例３、図１２（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）とカラム以外は同じ条件下でこれらの結果が得られたということは、図１２（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）において、内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍの小さなカラムが本来もっている性能に近い性能を発現させることが可能となった要因が、カラム入口付近で試料バンドの分散を減少させた効果と考えられる。尚、モーメント法にてピークの分散を計算する際は、各ピークに付された半値幅を用いていない。モーメント法でピークの分散を計算した理由は、対称性の悪いピークにおいては、よりピーク形状を反映した分散が算出出来るからである。対称性の良いピークでは、半値幅（単位：ｍｉｎ）に流速を乗じて、体積の単位に換えた後、この値を２．３５σとしてσを計算し、その二乗（σ２）を分散としても、モーメント法で計算した分散と値は近くなる。
【０１７２】
又、実施例３、図１２（Ａ）では、従来の試料注入法にて０．２μＬの試料が注入され、カラムで分離溶出された溶質Ｕ 、ＭＢ、Ｔ及びＮについての分散はそれぞれ、ピークの半値幅（単位：ｍｉｎ）から、０．３１μＬ２、０．９３μＬ２、２．０４μＬ２及び２．９６μＬ２と計算された（半値幅（単位：ｍｉｎ）に流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎを掛け、体積の単位に換えた後、この値を２．３５σとしてσを計算し、その二乗（σ２）を分散とした）。これらに対して、図１２（Ｄ）第１クロマトグラムでは、０．１１μＬ２、０．５５μＬ２、１．６６μＬ２及び２．５３μＬ２と計算され、本発明の試料導入方法により、溶質ピークの分散を０．３〜０．４μＬ２減少させ、溶質ピークの理論段数は従来の試料注入方法に比べて１．２〜２．８倍増大することが出来た。
【実施例５】
【０１７３】
本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法により、試料バンド前部分からの第１クロマトグラムにおける理論段数の向上と、第１送液ポート内に留められた試料バンド後部分の与える第２クロマトグラムが示される例である（図１４（Ｂ））。又、試料バンド前部分からの第１クロマトグラムにおける理論段数の向上と、第１送液ポート内に留められた試料バンド後部分をカラムに導入せず、図６に示す排出ポートから排出させる例である（図１４（Ｃ））。又、試料バンドを分割し、試料バンド後部分を第１送液ポート内に留置し、試料バンド前部分を分離溶出後、第１送液ポート送液と第２送液ポート送液を交互に繰り返すことで、試料バンド後部分を一定間隔で５回に分けてカラムへ導入、分離溶出し、それぞれのクロマトグラムでの分離性能向上が示される例である（図１４（Ｄ））。又、カラム性能の比較のため、バルブを用いる従来の試料注入法による例も示される（図１４（Ａ））（比較例）。
【０１７４】
試料注入装置としてＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（５μＬループ、内径０．２０ｍｍ、長さ１５．９ｃｍ）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１、第２送液ポート両方から、第１送液ポート流速（０．０９ｍＬ／ｍｉｎ）、第２送液ポート流速（０．０１ｍＬ／ｍｉｎ）、合計０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は室温とした。検出には、検出セル容量６ｎＬ、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０５秒、データ取り込み間隔は５０ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１５ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２９μＬ）をＺＤＵ（容量０．０２μＬ）に接続し、更に外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１２ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２４μＬ）を接続して使用した。試料バンド分割装置には、図３（Ａ）に示す構造の、実施例１〜４と同様の試料バンド分割部を使用した。又、図６に示すように試料注入装置２２の上流に第２排出ポート６０１を設けた、ベント排出機能を備えた試料導入装置を使用した。試料には、試料ＩＩ： チオウレア（ＴＵ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．１６ｍｇ／ｍＬ）、 ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．３ｍｇ／ｍＬ）、ナフタレン（Ｎ、０．３ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．４４ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．４６ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．６ｍｇ／ｍＬ） 混合物のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０１７５】
図１４（Ａ）（比較例）は、バルブを用いる従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを１μＬ注入して分離したクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１、第２送液ポート両方から、第１送液ポート流速（０．０９ｍＬ／ｍｉｎ）、第２送液ポート流速（０．０１ｍＬ／ｍｉｎ）、合計０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。
【０１７６】
図１４（Ｂ）は、図１４（Ａ）と同じ移動相条件下で、試料ＩＩを１μＬ注入し、０．０３分後に第１送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０９ｍＬ／ｍｉｎ）を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０１ｍＬ／ｍｉｎ）の流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎに増加することにより試料バンドを分割、前部分をカラムへ導入して分離溶出し、試料注入から６．０分後に第１送液ポート流速（０．０９ｍＬ／ｍｉｎ）、 第２送液ポート流速（０．０１ｍＬ／ｍｉｎ）、合計０．１ｍＬ／ｍｉｎの送液に戻して試料バンド後部分をカラムへ導入、分離溶出したクロマトグラムである。
【０１７７】
図１４（Ｃ）は、図１４（Ａ）と同じ移動相条件下で、試料ＩＩを１μＬ注入し、０．０３分後に第１送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０９ｍＬ／ｍｉｎ）を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０１ｍＬ／ｍｉｎ）の流速を０．１８７ｍＬ／ｍｉｎに増加して送液することにより試料バンドを分割、前部分をカラムへ導入して分離溶出を始めると共に、試料バンド後部分を図６のベントバルブ６２を開いて、第２排出ポート６０１から排出し、試料注入から１．０分後にベントバルブ６２を閉じ、第１送液ポート流速（０．０９ｍＬ／ｍｉｎ）、第２送液ポート流速（０．０１ｍＬ／ｍｉｎ）、合計０．１ ｍＬ／ｍｉｎの送液に戻して試料バンド前部分を分離溶出したクロマトグラムである。
【０１７８】
上記試料バンド後部分排出の詳細については、試料注入後０．０３〜１．０分の間、図６に示した試料バンド分割装置の、試料注入装置２２の上流に第２排出ポート６０１を備えて設置したベントバルブ６２を開き、抵抗管６３（内径０．０３ｍｍ、長さ３０ｃｍのフューズドシリカ管）の流路抵抗を通じて、試料バンド後部分を試料注入装置の上流へ押し戻して排出した（バック排出）。試料注入後０．０３〜１．０分の間、試料バンド前部分のカラムからの分離溶出のために必要な流速に、排出ポートからの試料バンド後部分の排出に必要な流速を加えて、第２送液ポート送液の流速は０．１８７ｍＬ／ｍｉｎとした。内径０．０３ｍｍ、長さ３０ｃｍのフューズドシリカ管は送液抵抗として機能し、ベントバルブを開くことによる急激な圧力低下を防ぐ。又、第２送液ポート流速の調整によって、排出操作がない場合（図１４（Ｂ））の第１クロマトグラムと同等の分離クロマトグラムを得ることを可能とした。又、排出ポートからの排出を伴う試料バンドの分割、カラムへの導入方法により、従来のバルブ注入方法による分離溶出（図１４（Ａ））と同等の時間で分離溶出が出来、且つ、カラム性能を向上出来ることが示された。
【０１７９】
図１４（Ｄ）は、図１４（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）と同じ移動相条件下、即ち、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１、第２送液ポート両方から、第１送液ポート流速（０．０９ｍＬ／ｍｉｎ）、第２送液ポート流速（０．０１ｍＬ／ｍｉｎ）、合計０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液しながら、試料ＩＩを３μＬ注入し、０．０２分後に第１送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０９ｍＬ／ｍｉｎ）を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０１ｍＬ／ｍｉｎ）を０．１ｍＬ／ｍｉｎに増加して試料バンドを分割、カラムへ導入して分離溶出し（図１４（Ｄ）第１クロマトグラム）、試料注入から６．０分後から０．０１分の間（６．００〜６．０１分の間）、第１送液ポート流速（０．０９ｍＬ／ｍｉｎ）、第２送液ポート流速（０．０１ｍＬ／ｍｉｎ）、合計０．１ｍＬ／ｍｉｎの送液とすることで、第１送液ポート内に留められた試料バンドから０．０１分間の送液分だけをカラムに導入し、試料注入から６．０１分後〜１２．００分後の間、第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液の流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとして、カラムに導入された試料を分離溶出している（図１４（Ｄ）第２クロマトグラム）。
【０１８０】
試料注入から１２．００分後〜１２．０１分後の間、第１送液ポート流速（０．０９ｍＬ／ｍｉｎ）、第２送液ポート流速（０．０１ｍＬ／ｍｉｎ）、合計０．１ｍＬ／ｍｉｎの送液を行い、第１送液ポート内に留められた試料バンドから０．０１分間の送液分だけをカラムに導入し、試料注入から１２．０１分後〜１８．００分後の間、第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液の流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとして、カラムに導入された試料を分離溶出し（図１４（Ｄ）第３クロマトグラム）、更に同様の操作で試料注入から１８．００分後〜１８．０１分後の間に４回目の試料バンドの導入を行い、試料注入から１８．０１分後〜２４．００分後の間、カラムに導入された試料を分離溶出し（図１４（Ｄ）第４クロマトグラム）、同２４．００分後〜２４．０１分後の間に５回目の試料バンドの導入を行い、同２４．０１分後〜３０．００分後の間、カラムに導入された試料を分離溶出し（図１４（Ｄ）第５クロマトグラム）、同３０．００分後からは第１送液ポート流速（０．０９ｍＬ／ｍｉｎ）、第２送液ポート流速（０．０１ｍＬ／ｍｉｎ）、合計０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液し、第１送液ポート内に残っていた試料バンド全量をカラムに導入し、分離溶出を行った（図１４（Ｄ）第６クロマトグラム）。
【０１８１】
このようにして、カラムに注入された試料バンド前部分の溶出終了後、送液ポンプの再稼働により第１送液ポートからの送液を再開し、第１送液ポート２０に残されていた試料バンドの中間部分及び後部分３２をカラム１に導入し、次のクロマトグラフィー分離溶出が行われ、この操作を繰り返す方法で、第１送液ポート内に留められた試料バンドから６分ごとに試料バンドの軸方向に交差する方向での分割とカラムへの導入を繰り返して分離溶出を行うことにより、大量に試料を注入し、大きなテールとして第１送液ポート内及びＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブのループ内に留められた試料バンド後部分について連続分析の可能性が示された。
【０１８２】
又、図１４（Ｄ）の結果は、試料バンド前部分及び後部分を排出して、試料バンド中間部分だけをカラムに導入することでも、従来の試料注入法に比べて、カラムの理論段数を増加することが可能であることを示している。例えば図１３にて、従来の試料注入法で注入された試料バンドはテーリングしているが、分割されてＺＤＵに導入された試料バンドは前部分、後部分共にピーク幅が小さくなっていることから、又、図１０（Ｂ）にて、分割されてカラムに導入された試料バンドの前部分、後部分がそれぞれ分離された第１クロマトグラム、第２クロマトグラムのピーク幅は、いずれも図１０（Ａ）にて同じ溶質由来のピーク幅よりも小さくなっていることから、本発明の試料導入方法を用いて、試料バンドの前部分をカラムに導入せず排出し、試料バンドの後部分のみをカラムに導入することによっても、試料バンド全体の分散を減じて、カラム性能を向上出来ることは自明である。
【０１８３】
図８に示すような、カラム入口手前に、排出ポートを伴うＴ字コネクターや４方ジョイントを配置する試料分割部を用いれば、試料バンドの前部分、或いは後部分を排出し、中間部分のみをカラムに導入することも可能となる。
【０１８４】
図１４（Ａ）（比較例）において、従来の試料注入方法で１μＬの試料ＩＩが注入され、分離溶出されたＴＵ、Ｎ及びＯｃＰｈについて（１、４、７番目のピークについて）それぞれ、理論段数５００、６６９０及び７９９０段が得られている。これに対して、１μＬ注入された試料ＩＩが分割され、前部分（注入された試料全体の約６５％）がカラムに導入され、分離溶出された図１４（Ｂ）の第１クロマトグラムでは、ＴＵ、Ｎ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、理論段数１９１０、９２４０及び８６２０段が得られている。又、１μＬ注入された試料ＩＩが分割され、前部分がカラムに導入され、分離溶出された図１４（Ｃ）の第１クロマトグラムでは、ＴＵ、Ｎ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、理論段数２１３０、９１４０及び８８７０段が得られた。試料バンド後部分の排出操作の有無にかかわらず、試料バンドを軸方向に交差する方向で分割、カラムへ導入することにより、従来の試料注入方法に比べて１．１〜４倍程度の理論段数の発生を可能としている。
【０１８５】
又、試料注入時に第１送液ポート、第２送液ポート両方から送液を行う条件下でも、第１送液ポートからの送液を停止し、第２送液ポートからの送液速度を増加させることにより試料バンドの分割、カラムへの導入が可能であること、ならびに、第１送液ポートと第２送液ポートの流速比（第１送液ポート流速／第２送液ポート流速）を９／１から０／１０に、次いで再度９／１に変化させても、カラム性能を損なうことなく、本発明の試料導入方法によりカラム性能を向上出来ることが示された。図１４（Ｂ）において、試料注入時から、第１送液ポートからの送液容量が２．７μＬの時点における試料バンドの分割、カラムへの導入率は約６５％となった。
【実施例６】
【０１８６】
試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法による性能向上の確認のため、バルブを用いる従来の試料注入法（図１５（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図１５（Ｂ）、（Ｃ））におけるカラム性能の比較を行った。
【０１８７】
本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法により、試料バンド前部分からの第１クロマトグラムにおける理論段数の向上と、第１送液ポート内に留められた試料バンド後部分の与える第２クロマトグラムが示される例である（図１５（Ｂ）、（Ｃ））。
【０１８８】
試料注入装置としてＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（５μＬループ、内径０．２０ｍｍ、長さ１５．９ｃｍ）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムＫｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８（充填剤径２．６μｍ、内径２．１ ｍｍ、長さ５ｃｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１、第２送液ポート両方から、合計０．２ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は室温とした。検出には、検出セル容量１μＬ、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０５秒、データ取り込み間隔は５０ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径１．６ｍｍ、内径０．０６３５ｍｍ、長さ１５ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約０．４８μＬ）を使用した。試料バンド分割装置には、図３（Ａ）に示す構造の、実施例１〜５と同様の試料バンド分割部を使用した。試料には、試料ＩＩ： チオウレア（ＴＵ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．１６ｍｇ／ｍＬ）、 ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．３ｍｇ／ｍＬ）、ナフタレン（Ｎ、０．３ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．４４ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．４６ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．６ｍｇ／ｍＬ） 混合物のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０１８９】
図１５（Ａ）は、従来の試料注入法にて試料ＩＩを１μＬ注入して分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１送液ポートから０．２ｍＬ／ｍｉｎで送液した。
【０１９０】
図１５（Ｂ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１送液ポートから０．２ｍＬ／ｍｉｎで送液し、試料ＩＩを１μＬ注入してから０．０２分後に第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．２ｍＬ／ｍｉｎ）を開始して試料バンドを分割、前部分をカラムへ導入して分離溶出を行い、試料注入から６．０分後、第２送液ポートの送液を停止し、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．２ｍＬ／ｍｉｎ）に戻し、試料バンド後部分のカラムへの導入、分離を行ったクロマトグラムである。
【０１９１】
図１５（Ｃ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１、第２送液ポート両方から、第１送液ポート流速（０．１９９ｍＬ／ｍｉｎ）、第２送液ポート流速（０．００１ｍＬ／ｍｉｎ）、合計０．２ｍＬ／ｍｉｎで送液し、試料ＩＩを１μＬ注入し、０．０２分後に第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液の流速を増加（０．２ｍＬ／ｍｉｎ）して試料バンドを分割、前部分をカラムへ導入して分離溶出を行い、試料注入から６．０分後、第１、第２送液ポート両方からの送液に戻し、第１送液ポート流速（０．１９９ｍＬ／ｍｉｎ）、第２送液ポート流速（０．００１ｍＬ／ｍｉｎ）、合計０．２ｍＬ／ｍｉｎで分離溶出を行ったクロマトグラムである。
【０１９２】
図１５（Ａ）（比較例）では、１、３、４番目のピークであるＴＵ（非保持）、ＢｕＰｈ（保持係数ｋ＝１．８）及びＮ（ｋ＝２．８）についてそれぞれ、理論段数３０３０、８５２０及び１０２００段が得られている。これに対して、図１５（Ｂ）の第１クロマトグラムでは、ＴＵ、ＢｕＰｈ及びＮについてそれぞれ、理論段数３７６０、９３４０及び１０９６０段が得られた。本発明の、軸方向に交差する方向で分割し、カラムへ導入する試料導入方法が、従来の試料注入方法と比較して１．０７〜１．２５倍程度の理論段数の発生を可能としている。クロマトグラム初期に溶出するピークに対する効果が大きい。
【０１９３】
試料注入時に第１、第２送液ポート両方から、第１送液ポート流速／第２送液ポート流速＝１９９／１の比で送液を行い、図１５（Ｂ）と同様に０．０２分後に試料バンドが分割、前部分がカラムに導入された図１５（Ｃ）の第１クロマトグラムにおいては、ＴＵ（非保持）、ＢｕＰｈ（保持係数ｋ＝１．８）及びＮ（ｋ＝２．８）についてそれぞれ、理論段数３８３０、９０７０及び１０９７０段が得られ、本発明の、軸方向に交差する方向で分割し、カラムへ導入する試料導入方法が、従来の試料注入方法と比較して１．０７〜１．２６倍程度の理論段数の発生を可能としている。試料注入時から試料バンドの分割までの間に、適切な範囲の流速で第２送液ポートからの送液を行うことは、本発明の試料導入方法の効果を得られる一形態であり、加えて、試料バンドの分割、前部分のカラムへの導入を行う際に、第２送液ポート送液速度の増加を容易とする効果がある。
【実施例７】
【０１９４】
試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法によるカラム性能向上の確認のため、バルブを用いる従来の試料注入法（図１６（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図１６（Ｂ））におけるカラム性能の比較を行った。
【０１９５】
本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法により、試料バンド前部分からの第１クロマトグラムにおける理論段数の向上と、第１送液ポート内に留められた試料バンド後部分の与える第２クロマトグラムが示される例である（図１６（Ｂ））。
【０１９６】
試料注入装置としてＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（５μＬループ、内径０．２０ｍｍ、長さ１５．９ｃｍ）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムＫｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８（充填剤径２．６μｍ、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は室温とした。検出には、検出セル容量６ｎＬ、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０５秒、データ取り込み間隔は５０ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１５ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２９μＬ）をＺＤＵ（容量０．０２μＬ）に接続し、更に外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１２ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２４μＬ）を接続して使用した。試料バンド分割装置には、図３（Ａ）に示す構造の、実施例１〜６と同様の試料バンド分割部を使用した。試料には、試料ＩＩ： チオウレア（ＴＵ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．１６ｍｇ／ｍＬ）、 ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．３ｍｇ／ｍＬ）、ナフタレン（Ｎ、０．３ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．４４ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．４６ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．６ｍｇ／ｍＬ） 混合物のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０１９７】
図１６（Ａ）は、従来の試料注入法にて試料ＩＩを１μＬ注入して分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１送液ポートから０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。
【０１９８】
図１６（Ｂ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１送液ポートから０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液し、試料ＩＩを１μＬ注入してから０．０１分後に第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．３ｍＬ／ｍｉｎ）を開始して試料バンドを分割、前部分をカラムへ導入して分離溶出し、試料注入から５．０分後、第２送液ポートからの送液を停止し、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．３ｍＬ／ｍｉｎ）に戻し、試料バンド後部分のカラムへの導入と、分離溶出を行ったクロマトグラムである。
【０１９９】
図１６（Ａ）（比較例）においては、１、３、４、７番目のピークであるＴＵ（非保持）、ＢｕＰｈ（保持係数ｋ＝１．８）、Ｎ（ｋ＝２．８）及びＯｃＰｈ（ｋ＝１０．９）についてそれぞれ、理論段数３３３０、９４９０、１１２２０及び１０８９０段が得られている。これに対して、試料バンドが軸方向に交差する方向で分割され、前部分がカラムへ導入された図１６（Ｂ）の第１クロマトグラムでは、ＴＵ（非保持）、ＢｕＰｈ（保持係数ｋ＝１．８）、Ｎ（ｋ＝２．８）及びＯｃＰｈ（ｋ＝１０．９）についてそれぞれ、理論段数６１３０、１１５３０、１２３２０及び１１５７０段が得られた。本発明の試料導入方法が、従来の試料注入方法と比較して１．０６〜１．８４倍程度の理論段数の発生を可能としている。クロマトグラム初期に溶出するピークに対する効果が大きい。
【０２００】
ここで、図１６（Ｂ）について、第１クロマトグラムのピーク面積／（第１＋第２クロマトグラムのピーク面積）を計算した試料導入率の結果が表３である。各ピーク（図１６（Ｂ）第１クロマトグラムの左から順にＴＵ、ＡｃＰｈ、ＢｕＰｈ、Ｎ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ、ＯｃＰｈ）について、分割された試料バンドがカラムに導入された割合は６５．２±０．８％の範囲内にあり、特定の溶質が本発明の試料導入方法により選別されて、他の溶質よりも多くカラムに導入されることは起こっていないとみなされる（溶質間の挙動の差、ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎは起こっていないとみなされる）。
【０２０１】
【表３】
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【実施例８】
【０２０２】
従来の試料注入法と、本発明の試料導入方法における試料バンドの拡がりと形状に関し、従来の試料注入法（図１７（Ａ）、（Ｂ））（比較例）に比べ、本発明の試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法（図１７（Ｃ））による試料バンド幅の減少をカラム無しで実証した。
【０２０３】
本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法により、試料バンド前部分からの第１クロマトグラムにおける理論段数の向上と、第１送液ポート内に留められた試料バンド後部分の与える第２クロマトグラムが示される例である（図１７（Ｃ））。図１７（Ａ）と（Ｃ）はそれぞれ、図１６（Ａ）（従来の試料注入方法）と、図１６（Ｂ）（本発明の試料導入方法）におけるカラム入り口での試料バンドの状態を表す。
【０２０４】
試料注入装置としてＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（５μＬループ、内径０．２０ｍｍ、長さ１５．９ｃｍ）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムに代えてゼロデッドボリュームユニオン（Ｕ−４３５、内径０．２５ｍｍ、内部容量０．０２μＬ、ＩＤＥＸ社、以下ＺＤＵと表記）を用いた。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は０．３ ｍＬ／ｍｉｎで送液し、温度条件は室温とした。検出には、検出セル容量６ｎＬ、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。ＺＤＵ出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１５ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２９μＬ）をもう１つのＺＤＵ（容量０．０２μＬ）に接続し、更に外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１２ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２４μＬ）を接続して使用した。試料バンド分割装置には、図３（Ａ）に示す構造の、実施例１〜７と同様の試料バンド分割部を使用した。試料には、試料ナフタレン：ナフタレン（Ｎ、０．１ｍｇ／ｍＬ）のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０２０５】
図１７（Ａ）、（Ｂ）は、従来の試料注入法を用い、試料ナフタレンをそれぞれ１．０μＬ、０．５μＬ注入し、移動相としてアセトニトリル／水＝６０／４０を第１送液ポートから０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液し、溶出したクロマトグラムである。
【０２０６】
図１７（Ｃ）は、試料ナフタレンを１．０μＬ注入し、試料バンドを２分割してＺＤＵに導入し溶出したクロマトグラムである。試料注入から０．０１分後に第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．３ｍＬ／ｍｉｎ）を停止し、第２送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．３ｍＬ／ｍｉｎ）を開始して試料バンドを分割して前部分をＺＤＵに導入して溶出し（第１クロマトグラム）、試料注入から０．２分後、第２送液ポートの送液を停止し、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．３ｍＬ／ｍｉｎ）に戻し、分割された試料バンド後部分の溶出を行っている（第２クロマトグラム）。
【０２０７】
図１７（Ａ）、（Ｂ）（比較例）において、ナフタレンのピークが大きなテーリングを示しているのに対して、図１７（Ｃ）では、第１クロマトグラムのピーク幅が小さくなっており、図１７（Ａ）のピークからテーリング部分を削ぎ取られた形をしている。従来の試料注入方法で注入体積を減らした（図１７（Ｂ））だけでは得られない狭い試料バンドが、本発明によるカラム（この場合はＺＤＵ）入口付近での試料の軸方向に交差する方向での分割、ＺＤＵへの導入によって得られたことが示されている。図１７（Ｃ）では、１μＬ注入された試料から、約６９％がＺＤＵに導入されて第１クロマトグラムに表れており、図１７（Ｂ）で従来の試料注入法にて０．５μＬの試料が注入された結果現れたピークに比べ、ＺＤＵに導入された試料容量は多いにも関わらず、幅の狭いピークを与えている。図１７（Ｄ）は、図１７（Ａ）、（Ｂ）及び図１７（Ｃ）第１クロマトグラムの重ね書きであり、図１７（Ｃ）第１クロマトグラムのピーク幅が最も狭くなっていることがはっきりと見て取れる。
【０２０８】
図１７（Ａ）、（Ｂ）（比較例）では、ナフタレンのピークの分散は、モーメント法により、１．４４μＬ２、 １．３３μＬ２と計算された。これらに対して、図１７（Ｃ）では、０．４３μＬ２と計算され、本発明の試料導入方法により、従来の試料注入方法に比べて約７０％も分散が小さくなった。実施例７、図１６（Ｂ）とカラム以外は同じ条件下でこの結果が得られたということは、図１６（Ｂ）にて、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍの小さなカラムが本来もっている性能に近い性能を発現させることが可能となった要因が、カラム入口付近で試料バンドの分散を減少させた効果と考えられる。尚、モーメント法にてピークの分散を計算する際は、各ピークに付された半値幅を用いていない。
【実施例９】
【０２０９】
試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法によるカラム性能向上の確認のため、バルブを用いる従来の試料注入法（図１８（Ａ）、（Ｇ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図１８（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｈ）、（Ｉ））におけるカラム性能の比較を行った。又、図１８（Ｂ）、（Ｃ）については、第１クロマトグラムのピーク面積／（第１＋第２クロマトグラムのピーク面積）を計算し、再現性を確認した。又、試料バンド後部分の排出のタイミングの効果、及び、本発明の試料導入方法に適用する、試料注入から試料バンドの分割を行うまでの（第１送液ポート送液速度）／（第２送液ポート送液速度）比と、試料注入から試料バンドの分割を行うまでの送液時間が、カラム性能に与える効果を確認した。
【０２１０】
図１８（Ｂ）、（Ｃ）は、本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法により、試料バンド前部分からの第１クロマトグラムにおける理論段数の向上と、第１送液ポート内に留められた試料バンド後部分の与える第２クロマトグラムが示される例である。試料注入時から試料バンド分割を行うまでの（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．６／１．２ｍＬ／ｍｉｎでの、本発明の試料導入方法の再現性が確認出来た。
【０２１１】
図１８（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）では、本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法において、試料バンド後部分の排出時間と、試料バンド後部分の排出後の（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比、及び送液時間がカラム性能に与える効果が確認出来た。試料注入時から試料バンド分割を行うまでの（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．６／１．２ｍＬ／ｍｉｎとした。図１８（Ｇ）では、バルブを用いる従来の試料注入法にて、試料注入時から分離溶出を終えるまでの（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比の効果（図１８（Ａ）との比較）が確認出来た。試料注入時から分離溶出を終えるまでの（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．３／１．５ｍＬ／ｍｉｎとした。
【０２１２】
図１８（Ｈ）、（Ｉ）では、本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法において、試料注入時から試料バンド分割を行うまでの（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比の効果（図１８（Ｂ）、（Ｃ）との比較）が確認出来た。試料注入時から試料バンド分割を行うまでの（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．３／１．５ｍＬ／ｍｉｎとした。
【０２１３】
試料注入装置としてＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（５μＬループ、内径０．２０ｍｍ、長さ１５．９ｃｍ）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径４．６ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１、第２送液ポート両方から、合計１．８ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は室温とした。検出には、検出セル容量１μＬ、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０５秒、データ取り込み間隔は５０ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径１．６ｍｍ、内径０．０６３５ｍｍ、長さ１５ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約０．４８μＬ）を使用した。試料バンド分割装置には、図３（Ａ）に示す構造の、実施例１〜８と同様の試料バンド分割部を使用した。又、図６に示すように試料注入装置２２の上流に第２排出ポート６０１を設けた、ベント排出機能を備えた試料導入装置を使用した。試料には、試料ＩＩ： チオウレア（ＴＵ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．１６ｍｇ／ｍＬ）、 ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．３ｍｇ／ｍＬ）、ナフタレン（Ｎ、０．３ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．４４ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．４６ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．６ｍｇ／ｍＬ） 混合物のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０２１４】
図１８（Ａ）は、従来の試料注入法にて試料ＩＩを２μＬ注入し、分離溶出したクロマトグラムであり、比較例である。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１、第２送液ポート両方から送液した（（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．６／１．２ｍＬ／ｍｉｎ、合計１．８ｍＬ／ｍｉｎ）。図１８（Ｂ）、（Ｃ） は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１、第２送液ポート両方から送液し（（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．６／１．２ｍＬ／ｍｉｎ、合計１．８ｍＬ／ｍｉｎ）、試料ＩＩを２μＬ注入し、試料注入から０．０１分後に第１送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．６ｍＬ／ｍｉｎ）を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、１．２ｍＬ／ｍｉｎ）の流速を１．８ ｍＬ／ｍｉｎに増加して試料バンドを分割、前部分をカラムへ導入し、分離溶出した。試料注入から９．０分後に、第１、第２送液ポート両方からの送液（（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．６／１．２ｍＬ／ｍｉｎ、合計１．８ｍＬ／ｍｉｎ）に戻して、第１送液ポート内に留められた試料バンド後部分を分離溶出したクロマトグラムである。
【０２１５】
図１８（Ａ）（比較例）では、１、２、３、４番目のピークであるＴＵ、ＡｃＰｈ、ＢｕＰｈ、Ｎについてそれぞれ、理論段数４５４０、９５１０、１００７０、１１２９０段が得られた。これと比較して、図１８（Ｂ）と（Ｃ）では、ＴＵ、ＡｃＰｈ、ＢｕＰｈ、Ｎについてそれぞれ、理論段数の平均値５９８０、１０９３０、１１４８０、１１４９０段が得られた。本発明の、試料を軸方向に交差する方向で分割し、カラムに導入する試料導入方法が、従来の試料注入方法と比較して、クロマトグラム初期に溶出するピークについて１．０２〜１．３０倍程度の理論段数の発生を可能としている。
【０２１６】
図１８（Ｂ）と（Ｃ）について、第１クロマトグラムのピーク面積／（第１＋第２クロマトグラムのピーク面積）を計算した試料導入率の結果が表４である。各ピーク（図１８（Ｂ）第１クロマトグラムの左から順にＴＵ、ＡｃＰｈ、ＢｕＰｈ、Ｎ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ、ＯｃＰｈ）についてそれぞれ、分割された試料バンドがカラムに導入された割合は９０．０±０．８％の範囲内にあり、本発明の試料導入方法の再現性が示された。又、特定の溶質が本発明の試料導入方法により選別されて、他の溶質よりも多くカラムに導入されることは起こっていない（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎは起こっていない）。
【０２１７】
【表４】
0006754225.tif 000005
【０２１８】
図１８（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）では、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１、第２送液ポート両方から送液し（（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．６／１．２ｍＬ／ｍｉｎ、合計１．８ｍＬ／ｍｉｎ）、試料ＩＩを２μＬ注入し、試料注入から０．０１分後に第１送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．６ｍＬ／ｍｉｎ）を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、１．２ｍＬ／ｍｉｎ）の流速を１．９ｍＬ／ｍｉｎに増加することにより、試料バンドを分割し、試料バンド前部分をカラムへ導入して分離溶出を始めると共に、試料バンド後部分を、図６に示した排出ポートのベントバルブを開き、試料注入から０．０１分後〜１．０分後の間、内径０．０３ｍｍ、長さ３０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管の抵抗を通じて、試料注入装置の上流から排出した（バック排出）。試料注入から１．０分後からの第１送液ポート送液、第２送液ポート送液、排出ポートのベントバルブの操作は、下記に示すように図１８（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）でそれぞれ異なっている。尚、試料注入から０．０１分後〜１．０分後の間、第２送液ポートからの流速を１．９ｍＬ／ｍｉｎとした理由は、カラムから試料バンド前部分を分離溶出するために必要な流速に、排出ポートからの試料バンド後部分の排出に必要な流速を加えたためである。
【０２１９】
図１８（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）では、試料注入から１．０分後から９．０分後まで、第１送液ポート送液、第２送液ポート送液、排出ポートのベントバルブの操作について、以下の操作を行っている。図１８（Ｄ）では、（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０／１．９ｍＬ／ｍｉｎを継続し、ベントバルブは開いたままとした。図１８（Ｅ）では、（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．６／１．２ｍＬ／ｍｉｎとし、ベントバルブは閉じた。図１８（Ｆ）では、（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝１．８／０ｍＬ／ｍｉｎとし、ベントバルブは閉じた。
【０２２０】
本発明の試料導入方法の有無、及び、試料注入時から試料バンド分割を行うまでと、試料を分割して前部分をカラムへ導入後の（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比と、排出操作の有無がカラム理論段数に与える効果を表５に示す。
【０２２１】
【表５】
0006754225.tif 000006
【０２２２】
図１８（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）いずれの場合にも、１、３、４番目のピークであるＴＵ、 ＢｕＰｈ、Ｎについて、図１８（Ａ）にて従来の試料注入法にて得られた理論段数と比較して１−２０％大きな理論段数が得られた。これらの結果は内径４．６ ｍｍのカラムについても本発明の、試料を軸方向に交差する方向で分割し、カラムに導入する試料導入方法がカラム理論段数の増加に有効であることを示すとともに、分割された試料バンド前部分がカラムに導入され、試料バンド後部分が排出された後の、（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比は、カラムに流れる合計の流速が同じであれば、カラム性能に対して大きく影響しない（カラム理論段数の差は４．２％以下）ことを示している。
【０２２３】
内径０．０３ｍｍ、長さ３０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管は、この例においても送液抵抗として機能し、ベントバルブを開く排出操作による急激な圧力低下を防ぐと同時に、第２送液ポート流速の調整によって、排出操作が無い場合と同等の分離クロマトグラムを得ることを可能とした。又、排出ポートの使用を伴う本発明の試料導入方法を行うことにより、従来の試料注入法に比べてカラム性能を向上させるとともに、従来の試料注入法による分析と同等の時間で分離溶出を行えることが示された。
【０２２４】
図１８（Ｇ）は、比較例であり、従来の試料注入法にて試料ＩＩを２μＬ注入し、分離溶出したクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１、第２送液ポート両方から送液した（（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．３／１．５ｍＬ／ｍｉｎ、合計１．８ｍＬ／ｍｉｎ）。
【０２２５】
図１８（Ｈ）、（Ｉ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１、第２送液ポート両方から送液し（（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．３／１．５ｍＬ／ｍｉｎ、合計１．８ｍＬ／ｍｉｎ）、試料ＩＩを従来の試料注入方法で２μＬ注入し、試料注入から０．０２分後に第１送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．３ｍＬ／ｍｉｎ）を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、１．５ｍＬ／ｍｉｎ）の流速を１．８ ｍＬ／ｍｉｎに増加して試料バンドを分割、前部分をカラムへ導入し、分離溶出した。試料注入から９．０分後に、第１、第２送液ポート両方からの送液（（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．３／１．５ｍＬ／ｍｉｎ、合計１．８ｍＬ／ｍｉｎ）に戻して、第１送液ポート内に留められた試料バンド後部分を分離溶出したクロマトグラムである。
【０２２６】
図１８（Ｇ）（比較例）では、１、２、３、４番目のピークであるＴＵ、ＡｃＰｈ、ＢｕＰｈ、Ｎについてそれぞれ、理論段数１８５０、６３００、８６９０、９１４０段が得られた。これと比較して、図１８（Ｈ）第１クロマトグラムと図１８（Ｉ）第１クロマトグラムでは、ＴＵ、ＡｃＰｈ、ＢｕＰｈ、Ｎについて、理論段数の平均値２８４０、７７００、９４５０、９７６０段が得られた。本発明の、試料を軸方向に交差する方向で分割し、カラムに導入する試料導入方法が、従来の試料注入方法と比較して、クロマトグラム初期に溶出するピークについて１．０２〜１．５０倍程度の理論段数の発生を可能としている。しかし、表５に示すように、図１８（Ｂ）と（Ｃ）の移動相送液条件（（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．６ ／１．２ｍＬ／ｍｉｎ、合計１．８ｍＬ／ｍｉｎ）の場合より低い理論段数が得られ、この結果から、試料注入時から試料バンド分割を行うまでの（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比の適切な選択が、より高い理論段数をもたらすことが示された。
【０２２７】
図１８（Ｈ）と（Ｉ）について、第１クロマトグラムのピーク面積／（第１＋第２クロマトグラムのピーク面積）を計算した試料導入率の結果が表６である。各ピーク（図１８（Ｈ）第１クロマトグラムの左から順にＴＵ、ＡｃＰｈ、ＢｕＰｈ、Ｎ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ、ＯｃＰｈ）についてそれぞれ、分割された試料バンドがカラムに導入された割合は９２．４±０．８％の範囲内にあり、本発明の試料導入方法の再現性が示された。又、特定の溶質が本発明の試料導入方法により選別されて、他の溶質よりも多くカラムに導入されることは起こっていない（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎは起こっていない）。
【０２２８】
【表６】
0006754225.tif 000007
【０２２９】
第１送液ポート流速が０．３ｍＬ／ｍｉｎのとき、０．０２分で試料バンドを分割し、カラムへ導入すると、注入された試料から約９２％が第１クロマトグラムとして分析された。第１クロマトグラムと第２クロマトグラムのピーク面積の比には再現性が見られた。又、表４に示すように、図１８（Ｂ）と（Ｃ）においては、第１送液ポート流速０．６ｍＬ／ｍｉｎのとき、０．０１分で試料バンドを分割し、カラムへ導入すると、注入された試料から約９０％が第１クロマトグラムとして分析された。第１クロマトグラムと第２クロマトグラムのピーク面積の比には再現性が見られた。これらの実施例の結果は、本発明の試料導入方法が、内径４．６ ｍｍ、長さ５ｃｍの大きなカラムについても、特にクロマトグラム初期のピークについて、従来の試料注入方法を用いた場合と比較して、５０％程度まで大きな理論段数を得られること、又、溶質間の挙動の差（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）を起こさないこと、ならびに本発明の試料導入方法の再現性を示している。
【０２３０】
実施例１〜実施例９の結果は、
１．試料バンドの分割と、試料前部分のカラムへの導入までの第１送液ポートからの送液容量、即ち、第１送液ポートの流速と、試料注入から試料バンドの分割と、試料前部分のカラムへの導入までの時間とに基づいて、第１回目の分離分析に供される試料バンド前部分が試料全体に占める割合（試料導入率）を制御出来ること。
２．大きなカラムについて大きな流速が必要な場合でも第１送液ポートの流速を小さくし、部分的に第２送液ポートからの送液を用いれば、全体及び第１送液ポートの流速を調整し、タイミングを考慮することにより試料バンドの分割と、試料前部分のカラムへの導入を適切に行えること。
３．試料注入時から試料バンド分割を行うまでの（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比が小さくなりすぎるとカラムの理論段数が低下するので、よりよい理論段数（より高性能）を与える流速比を選ぶことが適切であること。
並びに、
４．（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比がカラム性能に与える効果は試料注入時から試料バンド分割を行うまでに限られ、試料バンドの分割と、試料バンド前部分のカラムへの導入を行って、試料バンドの後部分を排出ポートから排出した後は、（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝１００／０〜０／１００の全範囲の流速比が同等の結果を与えること。
などを示している。
【実施例１０】
【０２３１】
本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法によるカラム性能向上の確認のため、バルブを用いる従来の試料注入法（図１９（Ａ））と本発明の試料導入方法（図１９（Ｂ））におけるカラム性能の比較を行った。本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法によって、試料バンド前部分の与える第１クロマトグラムにおける理論段数の向上が確認された。
【０２３２】
試料注入装置としてＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（５μＬループ、内径０．２０ｍｍ、長さ１５．９ｃｍ）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムＣｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ−１８ カラム（Ｃ１８修飾モノリス型シリカゲル、内径４．６ｍｍ、長さ１０ｃｍ、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１、第２送液ポート両方から、合計１．０ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は室温とした。検出には、検出セル容量１μＬ、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０５秒、データ取り込み間隔は５０ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径１．６ｍｍ、内径０．０６３５ｍｍ、長さ１５ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約０．４８μＬ）を使用した。試料バンド分割装置には、図３（Ａ）に示す構造の、試料バンド分割部を使用し、注入バルブ−カラム入口の接続管（第１送液ポート送液用の二重管の内管）は外径０．３６３ｍｍ、内径０．１８５ｍｍ、長さ１０ｃｍ（容量約２．７μＬ）のステンレススチール管とした。又、図６に示すように試料注入装置２２の上流に第２排出ポート６０１を設けた、ベント排出機能を備えた試料導入装置を使用した。試料には、試料ＩＩ： チオウレア（ＴＵ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．１６ｍｇ／ｍＬ）、 ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．３ｍｇ／ｍＬ）、ナフタレン（Ｎ、０．３ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．４４ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．４６ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．６ｍｇ／ｍＬ） 混合物のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０２３３】
図１９（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法にて試料ＩＩを５μＬ注入し、分離溶出したクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１、第２送液ポート両方から送液した（（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．３／０．７ｍＬ／ｍｉｎ、合計１．０ｍＬ／ｍｉｎ）。
【０２３４】
図１９（Ｂ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１、第２送液ポート両方から送液し（（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．３／０．７ｍＬ／ｍｉｎ、合計１．０ｍＬ／ｍｉｎ）、試料ＩＩを従来の試料注入方法で５μＬ注入し、試料注入から０．０３分後に第１送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．３ｍＬ／ｍｉｎ）を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．７ｍＬ／ｍｉｎ）の流速を１．０ｍＬ／ｍｉｎに増加することにより、試料バンドを分割し、試料バンド前部分をカラムへ導入して分離溶出を行い、試料注入から１２分後に、第２送液ポート流速は１．０ ｍＬ／ｍｉｎとしたまま、ベントバルブを開いて、第１送液ポート内に残されていた試料バンド後部分を排出した。
【０２３５】
図１９（Ａ）（比較例）では、１、３、４、７番目のピークであるＴＵ（非保持）、ＢｕＰｈ（保持係数ｋ＝１．１）、Ｎ（ｋ＝１．７）及びＯｃＰｈ（ｋ＝６．５）についてそれぞれ、理論段数７８５０、１２４５０、１３２８０及び１１９３０段が得られた。これと比較して、図１９（Ｂ）では、ＴＵ（非保持）、ＢｕＰｈ（保持係数ｋ＝１．１）、Ｎ（ｋ＝１．７）及びＯｃＰｈ（ｋ＝６．５）についてそれぞれ、理論段数９５５０、１３９００、１３６２０及び１１９４０段が得られた。本発明の、試料を軸方向に交差する方向で分割し、カラムに導入する試料導入方法が、従来の試料注入方法と比較して、クロマトグラム初期に溶出するＴＵ（非保持）、ＢｕＰｈ（保持係数ｋ＝１．１）、Ｎ（ｋ＝１．７）の３つのピークについて１．０３〜１．２２倍の理論段数の発生を可能としている。
【０２３６】
この例においては、移動相を第１、第２送液ポート両方から送液した（（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．３／０．７ｍＬ／ｍｉｎ、合計１．０ｍＬ／ｍｉｎ）。試料注入から試料バンドの分割までの間に、第２送液ポートから適切な範囲の流速で送液を行うことは、試料バンドのカラムへの導入率の調節を容易にし、又、試料バンドの分割とカラムへの導入時に第２送液ポート流速の増加を容易にする効果がある。
【０２３７】
又、図１９（Ａ）、（Ｂ）にて７番目のピークのＯｃＰｈの溶出容量は１０．２ｍＬであり、実施例にて本発明の試料導入方法の効果を確認したピークの溶出容量の中では最も大きな値であった。
【実施例１１】
【０２３８】
バルブを用いる従来の試料注入法と、本発明の試料導入方法における試料バンドの拡がりと形状に関し、従来の試料注入法（図２０（Ａ）、（Ｂ））（比較例）に比べ、本発明の試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法（図２０（Ｃ）、（Ｄ））による試料バンド幅の減少をカラム無しで実証した。
【０２３９】
本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法により、試料バンド前部分からの第１クロマトグラムにおける理論段数の向上と、第１送液ポート内に留められた試料バンド後部分の与える第２クロマトグラムが示される例である（図２０（Ｃ）、（Ｄ））。図２０（Ｂ）と（Ｄ）は、それぞれ、図１９（Ａ）（従来の試料注入方法）と、図１９（Ｂ）（本発明の試料導入方法）におけるカラム入り口での試料バンドの状態を表すものと考えることが出来る。
【０２４０】
試料注入装置としてＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（５μＬループ、内径０．２０ｍｍ、長さ１５．９ｃｍ）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムに代えてゼロデッドボリュームユニオン（Ｕ−４３５、内径０．２５ｍｍ、内部容量０．０２μＬ、ＩＤＥＸ社、以下ＺＤＵと表記）を用いた。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１、第２送液ポート両方から、合計１．０ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は室温とした。検出には、検出セル容量１μＬ、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径１．６ｍｍ、内径０．０６３５ｍｍ、長さ１５ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約０．４８μＬ）を使用した。試料バンド分割装置には、図３（Ａ）に示す構造の、試料バンド分割部を使用し、注入バルブ−カラム入口の接続管（第１送液ポート送液用の二重管の内管）は外径０．３６３ ｍｍ、内径０．１８５ ｍｍ、長さ１０ｃｍ（容量約２．７μＬ）のステンレススチール管とした。又、図６に示すように試料注入装置２２の上流に第２排出ポート６０１を設けた、ベント排出機能を備えたものを使用した。試料には、試料ナフタレン：ナフタレン（Ｎ、０．１ｍｇ／ｍＬ）のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０２４１】
図２０（Ａ）と（Ｂ）は、従来の試料注入法にて試料ＩＩをそれぞれ、２μＬと５μＬ注入し、分離溶出したクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１、第２送液ポート両方から送液した（（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．３／０．７ｍＬ／ｍｉｎ、合計１．０ｍＬ／ｍｉｎ）。図２０（Ｃ）と（Ｄ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１、第２送液ポート両方から送液し（（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．３／０．７ｍＬ／ｍｉｎ、合計１．０ｍＬ／ｍｉｎ）、試料ＩＩをそれぞれ、２μＬと５μＬ注入し、試料注入から０．０２分後に第１送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．３ｍＬ／ｍｉｎ）を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．７ｍＬ／ｍｉｎ）の流速を１．０ｍＬ／ｍｉｎに増加することにより、試料バンドを分割し、試料バンド前部分をＺＤＵへ導入して溶出を行い、試料注入から０．２分後に、（第１送液ポート流速）／（第２送液ポート流速）比＝０．３／０．７ｍＬ／ｍｉｎ、合計１．０ｍＬ／ｍｉｎに戻した。図２０（Ｅ）は図２０（Ａ）と図２０（Ｃ）の重ね書きであり、同様に図２０（Ｆ）は図２０（Ｂ）と図２０（Ｄ）の重ね書きである。
【０２４２】
図２０（Ａ）、（Ｂ）（比較例）では、ナフタレンのピークが大きなテーリングを示しているのに対して、図２０（Ｃ）、（Ｄ）では、第１クロマトグラムのピーク幅が小さくなっており、それぞれ、図２０（Ａ）、（Ｂ）のピークからテーリング部分を削ぎ取られた形をしている。カラム入口直前での試料バンドの軸方向に交差する方向での分割、ＺＤＵへの導入により、試料バンドの後部分（テール部分）が除かれたことが示されている。
【０２４３】
図２０（Ｄ）と図１９（Ｂ）では、試料の注入から試料バンド分割までの第１送液ポートからの送液容量は９μＬと６μＬで異なっている。しかしながら、この点と、カラム以外は同じ条件下でこの結果が得られたということは、図１９（Ｂ）のクロマトグラムにおいて、内径４．６ｍｍ、長さ１０ｃｍの大きなカラムでも、特にクロマトグラム初期のピークについて、カラムが本来もっている性能に近い性能を発現させることが出来た要因が、カラム入口付近で試料バンドの分散を減少させた効果と考えられる。
【０２４４】
図２０（Ａ）、（Ｂ）（比較例）では、ナフタレンのピークの分散は、モーメント法により、２２．６μＬ２、６０．１μＬ２と計算された。これらに対して、図２０（Ｃ）、（Ｄ）の第１クロマトグラムでは、１４．７μＬ２、２３．１μＬ２と計算され、図２０（Ｄ）第１クロマトグラムにおいては、図２０（Ｂ）と比較して、溶質バンドの分散は６０％以上減少した。これに対して、図２０（Ｃ）第１クロマトグラムにおいては、図２０（Ａ）と比較して、溶質のバンド分散の減少は約３５％にとどまった。これらの結果は、試料注入から試料の分割までに第１送液ポートから送液された移動相の容量が０．３ｍＬ／ｍｉｎ×０．０２ｍｉｎ＝０．００６ｍＬ＝６μＬという条件では、図２０（Ｃ）においては試料注入容量が２μＬであり、試料バンドの分割時にごく一部が第１送液ポートに留置されたのに対して、図２０（Ｄ）においては試料注入容量が５μＬであり、試料バンドの分割時により多くの部分が第１送液ポートに留置されたことに基づいている。尚、モーメント法にてピークの分散を計算する際は、各ピークに付された半値幅を用いていない。
【実施例１２】
【０２４５】
従来の試料注入法と、本発明の試料導入方法における試料バンドの拡がりと形状に関し、従来の試料注入法（図２１（Ａ））（比較例）に比べ、本発明の試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法（図２１（Ｂ）、（Ｃ））による試料バンド幅の減少をカラム無しで実証した。
【０２４６】
本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法において、１μＬ注入された試料バンドが、異なるタイミングで２分割されてＺＤＵに導入、溶出された様子が、試料バンド前部分が与える第１クロマトグラムと、第１送液ポート内に留められた試料バンド後部分の与える第２クロマトグラムとして示される例（図２１（Ｂ）、（Ｃ））、及び、試料の分割とＺＤＵへの導入のタイミングにおいて、試料バンドがＺＤＵ入口に到達しておらず第１クロマトグラムが得られない例（図２１（Ｄ））である。図２１（Ａ）と図２１（Ｃ）はそれぞれ、後述する実施例１３、 図２２（Ａ）（バルブを用いる従来の試料注入法）と、図２２（Ｂ）（本発明の試料導入方法）におけるカラム入り口での試料バンドの状態を表すと考えられる。
【０２４７】
試料注入装置としてＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（５μＬループ、内径０．２０ｍｍ、長さ１５．９ｃｍ）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムに代えてゼロデッドボリュームユニオン（Ｕ−４３５、内径０．２５ｍｍ、内部容量０．０２μＬ、ＩＤＥＸ社、以下ＺＤＵと表記）を用いた。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は室温とした。検出には、検出セル容量６ｎＬ、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。ＺＤＵ出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１５ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２９μＬ）をもう１つのＺＤＵ（容量０．０２μＬ）に接続し、更に外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１２ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２４μＬ）を接続して使用した。試料バンド分割装置には、図３（Ａ）に示す構造の、実施例１〜９と同様の試料バンド分割部を使用した。試料には、試料ナフタレン：ナフタレン（Ｎ、０．１ｍｇ／ｍＬ）のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０２４８】
図２１（Ａ）は、従来の試料注入法にて試料ナフタレンを１μＬ注入し、溶出したクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１送液ポートから０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。図２１（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１送液ポートから０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液し、試料ナフタレンを１μＬ注入し、試料注入からそれぞれ、０．０３分後、０．０２分後、０．０１分後に第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．１ｍＬ／ｍｉｎ）を開始して試料の分割とＺＤＵへの導入、溶出を行い、試料注入から０．２分後に第２送液ポートからの送液を停止し、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．１ｍＬ／ｍｉｎ）に戻し分離を行ったクロマトグラムである。
【０２４９】
図２１（Ａ）（比較例）において、ナフタレンのピークが大きなテーリングを示しているのに対して、図２１（Ｂ）、（Ｃ）において、第１クロマトグラムのピークは、図２１（Ａ）のピークからテーリング部分を削ぎ取られた形をしており、試料バンドの分割、ＺＤＵへの導入により、試料バンドの後部分が第１送液ポートに留置されたことが示されている。
【０２５０】
図２１（Ａ）（比較例）では、ナフタレンのピークの分散は、モーメント法により、０．９５μＬ２と計算された。これに対して、図２１（Ｂ）、（Ｃ）の第１クロマトグラムでは、０．２７μＬ２、０．１７μＬ２と計算され、本発明の、試料を軸方向に交差する方向で分割し、カラム（この場合はＺＤＵ）に導入する試料導入方法により、０．７〜０．８μＬ２ 小さくなった。ＵＶ検出に容量の小さい６ｎＬのキャピラリーセルを用いて、ＺＤＵから検出器セルまでの流路の容量を小さくしたことで、溶質がカラム外（ＺＤＵ外）で分散する要素が小さくなった条件下では、本発明の試料導入方法は従来の試料注入方法に比べて、試料バンドの分散を８０％減少させるという非常に大きな効果をもつことが示された。尚、モーメント法にてピークの分散を計算する際は、各ピークに付された半値幅を用いていない。
【０２５１】
実施例１２、図２１（Ａ）のナフタレンの溶出容量の測定値（流量０．１ｍＬ／ｍｉｎでの測定値、０．１ｍＬ／ｍｉｎ×０．０２５ｍｉｎ）は、２．５μＬであった。この値から、ＺＤＵ（容量０．０２μＬ）とＺＤＵ出口から検出器セル入口までの容量（約０．５５μＬ）と検出器セルの容量６ｎＬを差し引くと、１．９２４μＬとなった。図２１（Ｄ）では、試料注入から０．０１分後（第１送液ポートからの送液容量は０．１ｍＬ／ｍｉｎ×０．０１ｍｉｎ＝０．００１ｍＬ＝１μＬ後）に、試料の分割とＺＤＵへの導入を試みた場合、試料バンドの先端が第１送液ポート（二重管の内管）の出口、即ち流路切替点に到達しておらず、試料バンド全体が第１送液ポートとＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（インジェクター）のループ内に留められたため、第１クロマトグラムにピークは現れなかった。第１送液ポートからの送液再開にともなって、第２クロマトグラムのピークとして、試料バンド全体が溶出したことを示している。
【０２５２】
図２１（Ｂ）、（Ｃ）ではそれぞれ、試料注入から０．１ ｍＬ／ｍｉｎ×０．０３ｍｉｎ＝０．００３ｍＬ＝３μＬ、０．１ ｍＬ／ｍｉｎ×０．０２ｍｉｎ＝０．００２ｍＬ＝２μＬを送液した時点で試料の分割、ＺＤＵへの導入を行うと、図２１（Ｂ）では約７８％、図２１（Ｃ）では約４０％の試料がＺＤＵへ導入され、第１クロマトグラムのピークとして溶出した。図２１（Ａ）のピークの、５０％ピーク高さにおけるｓｙｍｍｅｔｒｙ係数は２．０であり、図２１（Ｂ）第１クロマトグラムのピークでは１．３２、図２１（Ｃ）第１クロマトグラムのピークでは１．０となった。これらの結果から、試料注入から、試料バンドの分割までの第１送液ポートからの送液容量を制御することにより、従来の方法で注入された一定容量の試料バンドから、異なる容量の試料バンドをカラムに導入することが出来ることが示された。
【実施例１３】
【０２５３】
試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法によるカラム性能向上の確認のため、バルブを用いる従来の試料注入法（図２２（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図２２（Ｂ））におけるカラム性能の比較を行った。
【０２５４】
本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法により、試料バンド前部分からの第１クロマトグラムにおける理論段数の向上と、第１送液ポート内に留められた試料バンド後部分の与える第２クロマトグラムが示される例である（図２２（Ｂ））。
【０２５５】
試料注入装置としてＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（５μＬループ、内径０．２０ｍｍ、長さ１５．９ｃｍ）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムＭｏｎｏｂｉｓ  Ｃ１８（Ｃ１８修飾モノリス型シリカゲル、内径１．０ｍｍ、長さ１５ｃｍ、京都モノテック社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は室温とした。検出には、検出セル容量６ｎＬ、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０５秒、データ取り込み間隔は５０ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１５ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２９μＬ）をＺＤＵ（容量０．０２μＬ）に接続し、更に外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１２ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２４μＬ）を接続して使用した。試料バンド分割装置には、図３（Ａ）に示す構造の、実施例１〜８、１２と同様の試料バンド分割部を使用した。試料には、試料ＩＩ： チオウレア（ＴＵ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．１６ｍｇ／ｍＬ）、 ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．３ｍｇ／ｍＬ）、ナフタレン（Ｎ、０．３ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．４４ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．４６ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．６ｍｇ／ｍＬ） 混合物のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０２５６】
図２２（Ａ）は、従来の試料注入法にて試料ＩＩを１μＬ注入して分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１送液ポートから０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。
【０２５７】
図２２（Ｂ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１送液ポートから０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液し、試料ＩＩを１μＬ注入してから０．０２分後に第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．１ｍＬ／ｍｉｎ）を開始して試料バンドを分割、前部分をカラムへ導入して分離溶出し、試料注入から１０分後、第２送液ポートからの送液を停止し、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．１ｍＬ／ｍｉｎ）に戻し、試料バンド後部分のカラムへの導入と、分離溶出を行ったクロマトグラムである。
【０２５８】
図２２（Ａ）（比較例）においては、１、３、４、７番目のピークであるＴＵ（非保持）、ＢｕＰｈ（保持係数ｋ＝１．４）、 Ｎ（ｋ＝２．３）及びＯｃＰｈ（ｋ＝９．４）についてそれぞれ、理論段数６０６０、１１９７０、 １５３６０ 及び１５９６０段が得られている。これに対して、試料バンドが分割され、前部分がカラムへ導入された図２２（Ｂ）の第１クロマトグラムでは、ＴＵ（非保持）、ＢｕＰｈ（保持係数ｋ＝１．４）、Ｎ（ｋ＝２．３）及びＯｃＰｈ（ｋ＝９．４）についてそれぞれ、理論段数１３３３０、１７１２０、１８８９０及び１７３５０段が得られた。本発明の、試料を軸方向に交差する方向で分割し、カラムに導入する試料導入方法が、従来の試料注入方法と比較して１．０９〜２．２０倍程度の理論段数の発生を可能としている。
【実施例１４】
【０２５９】
試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法によるカラム性能向上の確認のため、バルブを用いる従来の試料注入法（図２３（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図２３（Ｂ）、（Ｃ））におけるカラム性能の比較を行った。又、従来の試料注入法（図２３（Ｄ））に比べ、本発明の試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法を連続して行う例（図２３（Ｅ））による試料バンド幅の減少を確認した。
【０２６０】
本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置の方法により、試料バンド前部分からの第１クロマトグラムにおける理論段数の向上と、第１送液ポート内とミクロ６方切り替えバルブのループ内に留められた試料バンド後部分の与える第２クロマトグラムにおける理論段数の向上が示される例である（図２３（Ｂ）、（Ｃ））。これらの例とのカラム性能の比較のため、従来の試料注入法による例も示される（図２３（Ａ））。
【０２６１】
又、試料バンドを分割し、試料バンド後部分を第１送液ポート内とミクロ６方流路切り替えバルブのループ内に留置し、試料バンド前部分を分離溶出後、第１送液ポート送液と第２送液ポート送液を交互に繰り返すことで、試料バンド後部分を一定間隔で６回に分けてカラムへ導入、分離溶出し、それぞれのクロマトグラムでの分離性能向上が示される例である（図２３（Ｅ））。この例とのカラム性能の比較のため、従来の試料注入法による例も示される（図２３（Ｄ））（比較例）。
【０２６２】
試料注入装置としてＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（２μＬループ、内径０．１３ｍｍ、長さ１５．０ｃｍと５μＬループ、内径０．２０ｍｍ、長さ１５．９ｃｍを使い分けた。）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を０．１ｍＬ／ｍｉｎと０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０５秒、データ取り込み間隔は５０ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径１．６ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）をＺＤＵ（容量０．０２μＬ）に接続し、更に外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１２ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２４μＬ）を接続して使用した。試料バンド分割装置には、図４に示す構造の、試料バンド分割部を使用した。
【０２６３】
Ｒｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブとカラムの間に、流路切り替えのためのミクロ６方流路切り替えバルブ（Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨ、ＶＡＬＣＯ社）を図４に示す流路構成（第１送液ポート５１、第２送液ポート５２、流路切り替え点５０、ループ５３、カラム１）で組み込み、このバルブをＬＣ８００により操作して、試料バンドの分割とカラムへの導入を行った。
【０２６４】
Ｒｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブからＣ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブまでの配管には、外径１．６ｍｍ、内径０．１ｍｍ、長さ１０ｃｍのステンレススチール管（容量約０．７９μＬ）を使用し、ループ５３の容量は２μＬ（図２３（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）で使用）と５μＬ（図２３（Ｄ）、（Ｅ）で使用）とした。流路切り替え点５０からカラム入口までの配管は、外径１．６ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を使用した。Ｃ７２X−１６９６ＥＨバルブにつなぐその他の配管は、外径１．６ｍｍ、内径０．１ｍｍのステンレススチール管とした。
試料には、図２３（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）では、試料ＩＩ： チオウレア（ＴＵ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．１６ｍｇ／ｍＬ）、 ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．３ｍｇ／ｍＬ）、ナフタレン（Ｎ、０．３ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．４４ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．４６ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．６ｍｇ／ｍＬ） 混合物のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０２６５】
又、図２３（Ｄ）、（Ｅ）では、試料ＩＩＩ：ウラシル（０．００５ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。
【０２６６】
図２３（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）では、Ｒｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブのループ及びＣ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのループ容量は２μＬとした。図２３（Ｄ）、（Ｅ）では、Ｒｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブのループ及びＣ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのループ容量は５μＬとした。クロマトグラム上の各ピークに付した数値は、ピーク半値幅を示す。
【０２６７】
図２３（Ａ）は、従来の試料注入法にて試料ＩＩを０．２μＬ注入して分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１送液ポートから０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。
【０２６８】
図２３（Ｂ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１送液ポートから０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液し、試料ＩＩを０．２μＬ注入してから０．０４分後に図４に示すミクロ６方流路切り替えバルブ（Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブ）を操作して切り替え、第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．１ｍＬ／ｍｉｎ）を開始して試料バンドを分割、前部分をカラムへ導入して分離溶出し、試料注入から５．０分後、ミクロ６方流路切り替えバルブを操作して、試料注入時の流路に切り替えることで、第２送液ポートからの送液を停止し、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．１ｍＬ／ｍｉｎ）に戻し、第１送液ポート内とミクロ６方流路切り替えバルブのループ内に留置されていた試料バンド後部分のカラムへの導入と、分離溶出を行ったクロマトグラムである。
【０２６９】
図２３（Ｃ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１送液ポートから０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液し、試料ＩＩを０．２μＬ注入してから０．０５分後に図４に示すミクロ６方流路切り替えバルブ（Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブ）を操作して切り替え、第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．１ｍＬ／ｍｉｎ）を開始して試料バンドを分割、前部分をカラムへ導入して分離溶出し、試料注入から５．０分後、ミクロ６方流路切り替えバルブを操作して、試料注入時の流路に切り替えることで、第２送液ポートからの送液を停止し、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．１ｍＬ／ｍｉｎ）に戻し、第１送液ポート内とミクロ６方流路切り替えバルブのループ内に留置されていた試料バンド後部分のカラムへの導入と、分離溶出を行ったクロマトグラムである。
【０２７０】
図２３（Ｄ）は、従来の試料注入法にて試料ＩＩＩを０．５μＬ注入して分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１送液ポートから０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。
【０２７１】
図２３（Ｅ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１送液ポートから流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液し、試料ＩＩＩを５μＬ注入し、０．０９分後にミクロ６方流路切り替えバルブを操作することで、第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）に切り替えて試料バンドを分割、カラムへ導入して分離溶出し（図２３（Ｅ）第１クロマトグラム）、試料注入から１０．００分後から０．０２分の間（１０．００〜１０．０２分の間）、ミクロ６方流路切り替えバルブの操作により、第２送液ポート送液を停止、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）を行い、第１送液ポート内とミクロ６方流路切り替えバルブのループ内に留置されていた試料バンドから０．０２分間の送液分（容量１μＬ分）をカラムに導入し、試料注入から１０．０２分後にミクロ６方流路切り替えバルブを操作することで、第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）に切り替えて分離溶出した（図２３（Ｅ）第２クロマトグラム）。さらにその後１０分ごと、即ち試料注入から２０．００、３０．００、４０．００及び５０．００分後からそれぞれ０．０１分間ずつ、上記の要領でミクロ６方流路切り替えバルブの操作によって容量０．５μＬ分ずつの試料バンドをカラムに導入、分離溶出し、図２３（Ｅ）の第３〜第６クロマトグラムを得た。最後に試料注入後６０．００分後からミクロ６方流路切り替えバルブの操作によって、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）に切り替えて、第１送液ポート内とミクロ６方流路切り替えバルブのループ内に残っていた試料バンドをカラムに導入、分離溶出して図２３（Ｅ）の第７クロマトグラムを得た。
【０２７２】
図２３（Ａ）（比較例）においては、１、３、４、７番目のピークであるＴＵ、ＢｕＰｈ、Ｎ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、理論段数４４０、３５２０、５２２０及び７８８０段が得られた。これに対して、バルブを用いる送液ポートの切り替えによって、試料バンドが分割され、前部分がカラムへ導入された図２３（Ｂ）の第１クロマトグラムでは、ＴＵ、ＢｕＰｈ、Ｎ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、理論段数９００、５６６０、７１４０及び８５４０段が得られた。本発明の、試料を軸方向に交差する方向で分割し、カラムに導入する試料導入方法が、従来の試料注入方法と比較して１．０８〜２．００倍程度の理論段数の発生を可能としている。クロマトグラム初期のピークに対する効果が大きい。
【０２７３】
ミクロ６方流路切り替えバルブを用いる送液ポートの切り替えによって、試料バンドが分割され、前部分がカラムへ導入された図２３（Ｃ）の第１クロマトグラムでは、ＴＵ、ＢｕＰｈ、Ｎ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、理論段数６８０、４９００、６４１０及び８６４０段が得られた。本発明の試料導入方法が、従来の試料注入方法と比較して１．０７〜１．５０倍程度の理論段数の発生を可能としている。図２３（Ｂ）では、試料注入から０．０４分後での試料の分割、カラムヘの導入により４１％の試料導入率が得られたのに対して、図２３（Ｃ）では、試料注入から０．０５分後での試料の分割、カラムヘの導入により７３％の試料導入率が得られた。試料導入率が大きい場合、カラムに導入された試料バンドには、より大きな後部分（テール部分）が含まれるので、図２３（Ｂ）第１クロマトグラムと図２３（Ｃ）第１クロマトグラムでは、図２３（Ｂ）第１クロマトグラムの方が高い理論段数が得られている。
【０２７４】
図２３（Ｂ）、（Ｃ）では、分割された試料バンド後部分の与える第２クロマトグラムのピークの理論段数も、図２３（Ａ）に比べて大きい。図２３（Ａ）では、ＴＵ、ＢｕＰｈ、Ｎ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、理論段数４４０、３５２０、５２２０及び７８８０段が得られたのに対して、図２３（Ｂ）の第２クロマトグラムでは、ＴＵ、ＢｕＰｈ、Ｎ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、理論段数６４０、４７９０、６３２０及び８３３０段が得られた。又、図２３（Ｃ）の第２クロマトグラムでは、ＴＵ、ＢｕＰｈ、Ｎ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、理論段数７５０、５２８０、６７７０及び８４６０段が得られた。本発明の、試料を軸方向に交差する方向で分割し、カラムに導入する試料導入方法が、従来の試料注入方法と比較して、より高い理論段数の発生を可能としている。
【０２７５】
図２３（Ｄ）（比較例）では、２、５、７、９番目のピークであるＡｃＡｎ、ＢｕＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｐＰｈについてそれぞれ、理論段数９３０、３９１０、５１１０及び６６４０段が得られた。これに対して図２３（Ｅ）第３−第６クロマトグラムでは、ＡｃＡｎ、 ＢｕＰｈ、 ＶａＰｈ及びＨｐＰｈについてそれぞれ、理論段数の平均２８４０、６９５０、７２７０、６８６０段が得られた。本発明の、試料を軸方向に交差する方向で分割し、カラムに導入する試料導入方法が、従来の試料注入方法と比較して、１．０３〜３．０６倍の理論段数の発生を可能としている。ピークの５０％高さにおけるバンド幅（半値幅）で比較すると、図２３（Ｄ）と比べて図２３（Ｅ）第３−第６クロマトグラムでは、１．７〜４３％小さくなっている。
【０２７６】
尚、図４（Ｂ）に示す、第１送液ポートの流路切り替え点５０直前の、バルブのローターチャネル中に存在する試料バンド中間部分のごく一部は、ミクロ６方流路切り替えバルブの切り替えにともない、ローターの回転方向によって、試料バンド前部分或いは後部分に付随して動く。又、図４（Ｄ）に示すように、流路切り替えにより試料バンドが分割された後、試料バンド前部分の分離溶出中或いは溶出後に切り替えバルブのループ洗浄用配管５８を用いて、ループ内に留置された試料バンド後部分を排出することが可能である。
【実施例１５】
【０２７７】
従来の試料注入法と、本発明の試料導入方法における試料バンドの拡がりと形状に関し、従来の試料注入法（図２４（Ａ））（比較例）に比べ、本発明の試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法（図２４（Ｂ）、（Ｃ））による試料バンド幅の減少をカラム無しで実証した。又、従来の試料注入法（図２４（Ｄ）、（Ｅ））に比べ、本発明の試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法を連続して行う例（図２４（Ｆ））による試料バンド幅の減少をカラム無しで実証した。
【０２７８】
本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法により、試料バンド前部分からの第１クロマトグラムにおける理論段数の向上と、第１送液ポート内と切り替えバルブのループ内に留められた試料バンド後部分の与える第２クロマトグラムにおける理論段数の向上が示される例である（図２４（Ｂ）、（Ｃ））。これらの例との比較のため、従来の試料注入法による例も示される（図２４（Ａ））。又、試料バンドを分割し、試料バンド後部分を第１送液ポート内とミクロ６方流路切り替えバルブのループ内に留置し、試料バンド前部分を分離溶出後、第１送液ポート送液と第２送液ポート送液を交互に繰り返すことで、試料バンド後部分を一定間隔で６回に分けてＺＤＵへ導入、溶出し、それぞれのクロマトグラムでの分離性能向上が示される例である（図２４（Ｆ））。この例との比較のため、従来の試料注入法による例も示される（図２４（Ｄ）、（Ｅ））。図２４（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）はそれぞれ、実施例１４、 図２３（Ａ）（従来の試料注入法）と、図２３（Ｂ）、（Ｃ）（本発明の試料導入方法）におけるカラム入り口での試料バンドの状態を表す。又、図２４（Ｅ）、（Ｆ）はそれぞれ、実施例１４、 図２３（Ｄ）（従来の試料注入法）と、図２３（Ｅ）（本発明の試料導入方法）におけるカラム入り口での試料バンドの状態を表す。
【０２７９】
試料注入装置としてＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（２μＬループ、内径０．１３ｍｍ、長さ１５．０ｃｍと５μＬループ、内径０．２０ｍｍ、長さ１５．９ｃｍを使い分けた。）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムに代えてゼロデッドボリュームユニオン（Ｕ−４３５、内径０．２５ｍｍ、内部容量０．０２μＬ、ＩＤＥＸ社、以下ＺＤＵと表記）を用いた。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を０．１ｍＬ／ｍｉｎと０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。ＺＤＵ出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径１．６ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）をもう１つのＺＤＵ（容量０．０２μＬ）に接続し、更に外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１２ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２４μＬ）を接続して使用した。試料バンド分割装置には、図４に示す構造の、試料バンド分割部を使用した。
【０２８０】
Ｒｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブとカラムの間に、流路切り替えのためのミクロ６方流路切り替えバルブ（Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨ、ＶＡＬＣＯ社）を図４に示す流路構成（第１送液ポート５１、第２送液ポート５２、流路切り替え点５０、ループ５３、カラム１）で組み込み、このバルブをＬＣ８００により操作して、試料バンドの分割とＺＤＵへの導入を行った。Ｒｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブからＣ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブまでの配管には、外径１．６ｍｍ、内径０．１ｍｍ、長さ１０ｃｍのステンレススチール管（容量約０．７９μＬ）を使用し、ループ５３の容量は２μＬ（図２４（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）で使用）と５μＬ（図２４（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）で使用）とした。流路切り替え点５０からＺＤＵ入口までの配管は、外径１．６ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を使用した。Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブにつなぐその他の配管は、外径１．６ｍｍ、内径０．１ｍｍのステンレススチール管とした。試料には、試料ウラシル： ウラシル（０．０７ｍｇ／ｍＬ）のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。クロマトグラム上の各ピークに付した数値は、ｔＲ: 保持時間、ｔＷ: ピーク半値幅を示す。
【０２８１】
図２４（Ａ）は、従来の試料注入法にて試料ウラシルを０．２μＬ注入して溶出したクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１送液ポートから０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。
【０２８２】
図２４（Ｂ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１送液ポートから０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液し、試料ウラシルを０．２μＬ注入してから０．０４分後に図４に示すミクロ６方流路切り替えバルブ（Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブ）を操作して切り替え、第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．１ｍＬ／ｍｉｎ）を開始して試料バンドを分割、前部分をＺＤＵへ導入して分離溶出し、試料注入から０．５分後、ミクロ６方流路切り替えバルブを操作して、試料注入時の流路に切り替えることで、第２送液ポートからの送液を停止し、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．１ｍＬ／ｍｉｎ）に戻し、第１送液ポート内と流路切り替えバルブのループ内に留置されていた試料バンド後部分のＺＤＵへの導入と、分離溶出を行ったクロマトグラムである。
【０２８３】
図２４（Ｃ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１送液ポートから０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液し、試料ウラシルを０．２μＬ注入してから０．０５分後に図４に示すミクロ６方流路切り替えバルブ（Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブ）を操作して切り替え、第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．１ｍＬ／ｍｉｎ）を開始して試料バンドを分割、前部分をＺＤＵへ導入して分離溶出し、試料注入から０．５分後、ミクロ６方流路切り替えバルブを操作して、試料注入時の流路に切り替えることで、第２送液ポートからの送液を停止し、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．１ｍＬ／ｍｉｎ）に戻し、第１送液ポート内とミクロ６方流路切り替えバルブのループ内に留置されていた試料バンド後部分のＺＤＵへの導入と、分離溶出を行ったクロマトグラムである。
【０２８４】
図２４（Ｄ）は、従来の試料注入法にて試料ウラシルを０．５μＬ注入して分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１送液ポートから０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。図２４（Ｅ）は、従来の試料注入法にて試料ウラシルを５．０μＬ注入して分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１送液ポートから０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。
【０２８５】
図２４（Ｆ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１送液ポートから流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液し、試料ウラシルを５μＬ注入し、０．０９分後にミクロ６方流路切り替えバルブを操作することで、第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）に切り替えて試料バンドを分割、ＺＤＵへ導入して分離溶出し（図２４（Ｆ）第１クロマトグラム）、試料注入から０．５０分後から０．０２分の間（０．５０分後〜０．５２分後の間）、ミクロ６方流路切り替えバルブの操作により、第２送液ポート送液を停止、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）に戻し、第１送液ポート内とミクロ６方流路切り替えバルブのループ内に留置されていた試料バンドから０．０２分間の送液分（容量１μＬ分）をＺＤＵに導入し、試料注入から０．５２分後、ミクロ６方流路切り替えバルブを操作することで、第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）に切り替えて分離溶出した（図２４（Ｆ）第２クロマトグラム）。さらにその後０．５分ごと、即ち試料注入から１．０、１．５、２．０及び２．５分後からそれぞれ０．０１分間ずつ、上記の要領でミクロ６方流路切り替えバルブの操作によって容量０．５μＬずつの試料バンドをＺＤＵに導入、溶出し、図２４（Ｆ）の第３〜第６クロマトグラムを得た。最後に試料注入後３．０分後からミクロ６方流路切り替えバルブの操作によって、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）に切り替えて、第１送液ポート内とミクロ６方流路切り替えバルブのループ内に残っていた試料バンドを溶出して図２４（Ｆ）の第７クロマトグラムを得た。
【０２８６】
図２４（Ｂ）に示すように、試料注入から、試料バンドの軸方向に交差する方向での分割とＺＤＵへの導入までの第１送液ポートからの送液容量が４μＬの場合には、注入された試料全体の約４１％が導入され、第１クロマトグラムのピークとして現れた。図２４（Ａ）（比較例）のピークではモーメント法で計算した試料バンドの分散が１．６８μＬ２であったのに対して、図２４（Ｂ）第１クロマトグラムのピークでは、試料バンドの分散は０．６８μＬ２となり、図２４（Ａ）のピークに比べて約６０％減少した。尚、モーメント法にてピークの分散を計算する際は、各ピークに付された半値幅を用いていない。
【０２８７】
図２４（Ｃ）に示すように、試料注入から、試料バンドの軸方向に交差する方向での分割とＺＤＵへの導入までの第１送液ポートからの送液容量が５μＬの場合には、注入された試料全体の約７３％が導入され、第１クロマトグラムのピークとして現れた。図２４（Ｃ）第１クロマトグラムのピークでは、モーメント法で計算した試料バンドの分散は０．９７μＬ２となり、図２４（Ａ）のピークに比べて約４０％減少した。図２４（Ｂ）、（Ｃ）いずれの場合にも、第２クロマトグラムのピークにおいても、図２４（Ａ）のピークと比較して試料バンド幅の減少が見られ、その幅の大小は、図２３（Ａ）のピークと比較して、図２３（Ｂ）、（Ｃ）の第２クロマトグラムのピークにおけるピーク幅が減少した傾向と類似している。尚、モーメント法にてピークの分散を計算する際は、各ピークに付された半値幅を用いていない。
【０２８８】
図２４（Ｂ）、（Ｃ）では、第２クロマトグラムのピークの溶出容量は、０．１ｍＬ／ｍｉｎ×０．０３５ｍｉｎ＝０．００３５ｍＬ＝３．５μＬであった。この値からＺＤＵの容量（０．０２μＬ）、ＺＤＵから検出器入口までの配管の容量（１．１２μＬ）及び検出器セルの容量（６ｎＬ）を差し引くと２．３５４μＬとなり、図４に示した流路切替点５０からＺＤＵ入口までの容量の０．１ｍＬ／ｍｉｎでの測定値は２．３５４μＬとなった。又、図２４（Ａ）では、ピークの溶出容量は、０．１ｍＬ／ｍｉｎ×０．０６８ｍｉｎ＝０．００６８ｍＬ＝６．８μＬであった。この値からＺＤＵの容量（０．０２μＬ）、ＺＤＵから検出器入口までの配管の容量（１．１２μＬ）及び検出器セルの容量（６ｎＬ）を差し引くと５．６５４μＬとなり、更に上記の測定値２．３５４μＬを差し引くと、３．３μＬとなった。よって、容量０．２μＬの試料ウラシルを流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで溶出した条件では、インジェクターから流路切替点までの容量が３．３μＬ、流路切替点からＺＤＵ入口までの容量は２．３５４μＬとなった。この条件下では、図２４（Ｂ）、（Ｃ）にてそれぞれ、試料バンド分割までの第１送液ポートからの送液容量が４μＬ、５μＬであった場合、試料導入率は４１％、７３％となった。これらの試料導入率は、図２３（Ｂ）、（Ｃ）での試料導入率と一致している。
【０２８９】
図２４（Ｄ）では、ピークの溶出容量は、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ×０．１６７ｍｉｎ＝０．００８３５ｍＬ＝８．３５μＬであった。この値からＺＤＵの容量０．０２μＬを差し引くと、８．３３μＬとなる。５μＬループのインジェクターを用いた装置構成で、０．５μＬの試料を従来の試料注入法にて注入した場合では、ピーク溶出時間から計算されるカラム外（この実験においてはカラム外でなくＺＤＵ外）の容量は８．３３μＬであった。これに対して、試料バンド分割装置の流路切り替えバルブのループに留置された試料バンドから０．５μＬずつＺＤＵに導入された図２４（Ｆ）の第３〜第６クロマトグラムでは、試料バンドの導入から平均０．０４９分後に試料ウラシルが溶出されているので、ピークの溶出容量は、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ×０．０４９ｍｉｎ＝０．００２４５ｍＬ＝２．４５μＬであった。この値からＺＤＵの容量０．０２μＬを差し引くと、２．４３μＬとなる。本発明の試料導入方法により、カラム外（この実験においてはＺＤＵ外）の容量が測定値で５．９μＬも減少していることが確認出来た。又、２．４３μＬから更にＺＤＵから検出器入口までの配管の容量（１．１２μＬ）及び検出器セルの容量（６ｎＬ）を差し引くと１．３０４μＬとなり、図４に示した流路切替点５０からＺＤＵ入口までの容量の０．０５ｍＬ／ｍｉｎでの測定値は１．３０４μＬとなった。
【０２９０】
非特許文献３で開示されるように、通常のＵＨＰＬＣ機器において、非特許文献２と同様の方法で測定されたカラム外の容量は、流速０．１〜２．０ｍＬ／ｍｉｎにおいて１２〜１８μＬであり大きい。これらの装置にも、本発明の試料導入方法を適用すれば、カラム外の容量を小さくして、溶質の分散を非常に小さく出来る。
【０２９１】
図２４（Ｄ）、（Ｅ）（比較例）においてモーメント法で計算したウラシルのピークのバンドの分散はそれぞれ、１．００μＬ２、１．１６μＬ２であったのに対して、図２４（Ｆ）の第３〜第６クロマトグラムにおけるウラシルのピークのバンドの分散は平均０．２６μＬ２であった。図２４（Ｄ）、図２４（Ｆ）の第３〜第６クロマトグラムではいずれも、容量０．５μＬ分の試料がＺＤＵに注入或いは導入されているが、同じ容量であるにも関わらず、溶出されるピークの分散は大きく異なっている。本発明の、試料の軸方向に交差する方向での分割と、カラム（ここではＺＤＵ）への導入による効果である。尚、モーメント法にてピークの分散を計算する際は、各ピークに付された半値幅を用いていない。
【０２９２】
実施例１４及び実施例１５にて、図２３（Ｅ）及び図２４（Ｆ）に示した例により、本発明の試料導入方法が、元々１つの試料バンドを多数に分割して分析出来ることが確認出来たが、この例で使用した図４の流路切り替え点５０とカラム１の間に、図７に示す４方ジョイント等から成る試料バンド分割部や、図８に示すＴ字コネクター等から成る試料バンド分割部を設ければ、試料バンドの前部分をカラムに導入せずに排出し、試料バンドの中間部分の分析を速やかに行うことが出来る。
【０２９３】
実施例１４、１５にて、ミクロ６方流路切替バルブを用いた本発明の試料導入方法を示したが、３方流路切替バルブを用いて、第２送液ポートからの送液に別途送液ポンプを使用すれば、本発明の試料導入方法を実施出来る。又、４方流路切替バルブ、８方流路切替バルブ、１０方流路切替バルブを用いても、６方流路切替バルブと同様の流路構成とすることで、本発明の試料導入方法を実施出来る。
【実施例１６】
【０２９４】
従来の試料注入法と、本発明の試料導入方法における試料バンドの拡がりと形状に関し、従来の試料注入法（図２５（Ａ））（比較例）に比べ、本発明の試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法（図２５（Ｂ））と、本発明の試料バンドの分割−後部分排出による試料導入方法（図２５（Ｃ））によるカラムの理論段数の向上を確認した。    
【０２９５】
図２５（Ｂ）は、本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法において、試料バンドの分割、前部分のカラムへの導入により、試料バンド前部分からのクロマトグラムにおける理論段数の向上と、試料バンド後部分の排出を行った例である。試料バンド後部分の排出には、図６に示すような、試料注入装置（インジェクター）上流の排出ポートを使用した。
【０２９６】
図２５（Ｃ）は、本発明の試料導入方法のうち、試料バンドの分割−後部分排出を伴う試料導入方法において、試料バンドの分割、前部分のカラムへの導入により、試料バンド前部分からのクロマトグラムにおける理論段数の向上と、試料バンド後部分の排出を行った例である。試料バンド後部分の排出には、図７（Ｂ）に示す、インジェクターとカラムの間に置かれたクロスに接続した排出ポートを使用した。
【０２９７】
試料注入装置として Ｖａｌｃｏインジェクターバルブ（ＶＩＣＩ Ｃ４−０００４−０１、１０ｎＬ内部ループ）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムＭｏｎｏｃａｐ Ｃ１８（Ｃ１８修飾モノリス型シリカゲル、内径０．１ｍｍ、長さ１５ｃｍ、京都モノテック社）を用いた。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を０．００２ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は室温とした。検出には、検出セル容量６ｎＬ、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０５秒、データ取り込み間隔は５０ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１２ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２４μＬ）を接続して使用した。試料バンド分割装置には、図７（Ｂ）に示す構造の、試料バンド分割部を使用した。又、図６に示すように、試料注入装置の上流に排出ポートを別途設置した。
【０２９８】
図７（Ｂ）に示す試料バンド分割部の詳細は、上記Ｖａｌｃｏインジェクターバルブとクロス（４方ジョイント、Ｕ−４３０、内径０．５０ｍｍ、内部容量０．７２μＬ、ＩＤＥX社）を、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０３ｍｍ、長さ５ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．０３５μＬ）で接続し、クロスとカラム入口は外径０．３７５ｍｍ、内径０．０３ｍｍ、長さ６ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．０４２μＬ）で接続した。図９（Ａ）に示すように、クロスにつないだ上記両フューズドシリカキャピラリー接続管は、クロス内部に差し込む形で接続し、上記両接続管の間のギャップを０．２ｍｍとした。又、第２送液ポートと、排出ポート（ベントバルブと抵抗管（内径０．０３ｍｍ、長さ３０ｃｍ）を接続）をクロスに別ポートとしてもうけた。
【０２９９】
試料には、試料ＩＩ： チオウレア（ＴＵ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．１６ｍｇ／ｍＬ）、 ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．３ｍｇ／ｍＬ）、ナフタレン（Ｎ、０．３ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．４４ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．４６ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．６ｍｇ／ｍＬ） 混合物のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０３００】
図２５（Ａ） は、従来の試料注入法にて試料ＩＩを０．０１μＬ注入して分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１送液ポートから０．００２ｍＬ／ｍｉｎで送液した。
【０３０１】
図２５（Ｂ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１送液ポートから０．００２ｍＬ／ｍｉｎで送液し、試料ＩＩを０．０１μＬ注入してから０．１５分後に第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０２ｍＬ／ｍｉｎ）を開始して試料バンドを分割、前部分をカラムへ導入して分離溶出し、試料注入から５．０分後、第２送液ポートからの送液を停止し、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．００２ｍＬ／ｍｉｎ）に戻したクロマトグラムである。
【０３０２】
試料注入から０．１５分後から５．０分後までの間、図６に示すような、試料注入装置の上流の排出ポートにつながったベントバルブを開き、内径０．０３ｍｍ、長さ３０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管の抵抗を通じて試料バンド後部分の排出を行った。試料注入から０．１５分後から５．０分後までの間、第２送液ポートからの流速を０．０２ｍＬ／ｍｉｎとしたのは、試料バンド前部分をカラムで分離溶出するのに必要な流速に、試料バンド後部分を排出ポートから排出するのに必要な流速を加えたためである。尚、図７（Ｂ）に示す、クロスにつながった排出ポートの先のベントバルブは、閉じたままとした。
【０３０３】
図２５（Ｃ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１送液ポートから０．００２ｍＬ／ｍｉｎで送液し、試料ＩＩを０．０１μＬ注入してから０．１５分後に第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．０２ｍＬ／ｍｉｎ）を開始して試料バンドを分割、前部分をカラムへ導入して分離溶出し、試料注入から５．０分後、第２送液ポートからの送液を停止し、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．００２ｍＬ／ｍｉｎ）に戻したクロマトグラムである。
【０３０４】
試料注入から０．１５分後から５．０分後までの間、図７（Ｂ）に示す、クロスにつながった排出ポートの先のベントバルブを開き、内径０．０３ｍｍ、長さ３０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管の抵抗を通じて試料バンド後部分の排出を行った。試料注入から０．１５分後から５．０分後までの間、第２送液ポートからの流速を０．０２ｍＬ／ｍｉｎとしたのは、試料バンド前部分をカラムで分離溶出するのに必要な流速に、試料バンド後部分を排出ポートから排出するのに必要な流速を加えたためである。尚、図６に示すような、試料注入装置上流の排出ポートの先のベントバルブは、閉じたままとした。
【０３０５】
図２５（Ａ）（比較例）に示されるように、非常に小さなキャピラリーカラム（内径０．１ｍｍ、長さ１５ｃｍ）を用いた場合には、カラム外で溶質が分散する効果が非常に大きく現れ、４、６、７番目のピークであるＮ、ＨｐＰｈ、ＯｃＰｈについてそれぞれ、理論段数４１０、１１４０、１９６０段が得られた。これに対して、本発明の試料導入方法にて得られた、試料バンド前部分からの図２５（Ｂ）では、Ｎ、ＨｐＰｈ、ＯｃＰｈについてそれぞれ、理論段数２１９０、４３６０、５４３０段が得られた。図２５（Ｃ）では、Ｎ、ＨｐＰｈ、ＯｃＰｈについてそれぞれ、理論段数２３８０、４３００、５４４０段が得られ、従来の試料注入方法に比べ、本発明の、試料を軸方向に交差する方向で分割し、カラムに導入する試料導入方法では２．５〜５．０倍の理論段数を与えた。
【実施例１７】
【０３０６】
従来の試料注入法と、本発明の試料導入方法における試料バンドの拡がりと形状に関し、従来の試料注入法（図２６（Ａ））（比較例）に比べ、本発明の試料バンドの分割−後部分留置を伴う試料導入方法（図２６（Ｂ））と、本発明の試料バンドの分割−後部分排出を伴う試料導入方法（図２６（Ｃ））による試料バンド幅の減少を、カラム無しで実証した。
【０３０７】
図２６（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）はそれぞれ、図２５（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）での、カラム入り口での試料バンドの状態を表す。
【０３０８】
試料注入装置として Ｖａｌｃｏインジェクターバルブ（ＶＩＣＩ Ｃ４−０００４−０１、１０ｎＬ内部ループ）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムに代えて外径０．３７５ｍｍ、内径０．０３ ｍｍ、長さ６ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．０４２μＬ）の入口出口にゼロデッドボリュームユニオン（Ｕ−４３５、内径０．２５ ｍｍ、内部容量０．０２μＬ、ＩＤＥＸ社）を接続したものを用いた。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を０．００３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は室温とした。検出には、検出セル容量６ｎＬ、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラムの代わりのフューズドシリカキャピラリー管出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１２ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２４μＬ）を接続して使用した。試料バンド分割装置には、図７（Ｂ）に示す構造の、試料バンド分割部を使用した。又、図６に示すように、試料注入装置の上流に排出ポートを別途設置した。
【０３０９】
図７（Ｂ）に示す試料バンド分割部の詳細は、Ｖａｌｃｏインジェクターバルブとクロス（４方ジョイント、Ｕ−４３０、内径０．５０ｍｍ、内部容量０．７２μＬ、ＩＤＥＸ社）を、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０３ｍｍ、長さ５ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．０３５μＬ）で接続し、クロスとカラムの代わりのフューズドシリカキャピラリー管は外径０．３７５ｍｍ、内径０．０３ｍｍ、長さ６ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．０４２μＬ）で接続した。図９（Ａ）に示すように、クロスにつないだ上記両接続管は、クロス内部に差し込む形で接続し、上記両接続管の間のギャップを０．２ｍｍとした。又、第２送液ポートと、排出ポート（ベントバルブと抵抗管（内径０．０３ｍｍ、長さ３０ｃｍ）を接続）をクロスに別ポートとしてもうけた。試料には、試料ナフタレン：ナフタレン（Ｎ、０．１ｍｇ／ｍＬ）のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０３１０】
図２６（Ａ） は、従来の試料注入法にて試料ナフタレンを０．０１μＬ注入して溶出を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１送液ポートから０．００３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。
【０３１１】
図２６（Ｂ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１送液ポートから０．００３ｍＬ／ｍｉｎで送液し、試料ナフタレンを０．０１μＬ注入してから０．１分後に第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．００４ｍＬ／ｍｉｎ）を開始して試料バンドを分割、前部分をカラムの代わりのフューズドシリカキャピラリー管へ導入して溶出し、試料注入から１．０分後、第２送液ポートからの送液を停止し、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．００３ｍＬ／ｍｉｎ）に戻したクロマトグラムである。
【０３１２】
試料注入から０．１分後から１．０分後までの間、図６に示すような、試料注入装置の上流の排出ポートにつながったベントバルブを開き、内径０．０３ｍｍ、長さ３０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管の抵抗を通じて試料バンド後部分の排出を行った。試料注入から０．１分後から１．０分後までの間、第２送液ポートからの流速を０．００４ｍＬ／ｍｉｎとしたのは、試料バンド前部分をカラムの代わりのフューズドシリカキャピラリー管から溶出するのに必要な流速に、試料バンド後部分を排出ポートから排出するのに必要な流速を加えたためである。尚、図７（Ｂ）に示す、クロスにつながった排出ポートの先のベントバルブは、閉じたままとした。
【０３１３】
図２６（Ｃ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１送液ポートから０．００３ｍＬ／ｍｉｎで送液し、従来の試料注入法にて試料ナフタレンを０．０１μＬ注入してから０．１分後に第１送液ポート送液を停止、第２送液ポート送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．００４ｍＬ／ｍｉｎ）を開始して試料バンドを分割、前部分をカラムの代わりのフューズドシリカキャピラリー管へ導入して溶出し、試料注入から１．０分後、第２送液ポートからの送液を停止し、第１送液ポートからの送液（アセトニトリル／水＝６０／４０、０．００３ｍＬ／ｍｉｎ）に戻したクロマトグラムである。
【０３１４】
試料注入から０．１分後から１．０分後までの間、図７（Ｂ）に示す、クロスにつながった排出ポートの先のベントバルブを開き、内径０．０３ｍｍ、長さ３０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管の抵抗を通じて試料バンド後部分の排出を行った。試料注入から０．１分後から１．０分後までの間、第２送液ポートからの流速を０．００４ｍＬ／ｍｉｎとしたのは、試料バンド前部分をカラムの代わりのフューズドシリカキャピラリー管から溶出するのに必要な流速に、試料バンド後部分を排出ポートから排出するのに必要な流速を加えたためである。尚、図６に示すような、試料注入装置上流の排出ポートの先のベントバルブは、閉じたままとした。
【０３１５】
図２６（Ａ）（比較例）において、ナフタレンのピークが大きなテーリングを示しているのに対して、図２６（Ｂ）、（Ｃ）では、クロマトグラムのピーク幅が小さくなっており、図２６（Ａ）のピークからテーリング部分を削ぎ取られた形をしている。カラム入口直前での試料バンドの軸方向に交差する方向での分割、カラムの代わりのフューズドシリカキャピラリー管への導入により、試料バンドの後部分（テール部分）が除かれたことが示されている。
【０３１６】
図２６（Ａ）（比較例）では、ナフタレンのピークの分散は、モーメント法により、０．０９２μＬ２と計算された。これに対して、図２６（Ｂ）、（Ｃ）のナフタレンのピークの分散はそれぞれ、０．０２３μＬ２、０．０３０μＬ２と計算された。本発明の、試料を軸方向に交差する方向での分割と、カラム（ここではフューズドシリカキャピラリーチューブ）への試料導入方法により、０．０６−０．０７μＬ2も（約６０−７０％も）分散が小さくなった。図２６（Ｂ）、（Ｃ）にて、図２５（Ｂ）、（Ｃ）と、カラムと流速以外は同じ条件下でこれらの結果が得られたことから、図２５（Ｂ）、（Ｃ）のクロマトグラムにおいて、内径０．１ｍｍ、長さ１５ｃｍのカラムで、従来の試料注入法で得られたクロマトグラム（図２５（Ａ））よりも高い理論段数が得られた要因は、カラム入口付近で試料バンドの分散を減少させた効果である。尚、モーメント法にてピークの分散を計算する際は、各ピークに付された半値幅を用いていない。
【実施例１８】
【０３１７】
従来の試料注入法と、本発明の試料導入方法における試料バンドの拡がりと形状に関し、従来の試料注入法（図２７（Ａ））（比較例）に比べ、本発明の、カラム入口での試料バンド後部分の排出による試料分割を伴う試料導入方法（図２７（Ｂ））によるカラム性能の比較を行った。
【０３１８】
本発明の試料導入方法のうち、図８（Ｃ）に示す試料バンド分割部を用いた、試料バンド後部分の排出による試料分割を伴う試料導入方法によるカラム性能の向上、即ち理論段数の向上を示すクロマトグラムである（図２７（Ｂ））。
【０３１９】
試料注入装置としてＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（５μＬループ、内径０．２０ｍｍ、長さ１５．９ｃｍ）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いた。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は室温とした。検出には、検出セル容量６ｎＬ、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０５秒、データ取り込み間隔は５０ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ４５ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．８８μＬ）をＺＤＵ（容量０．０２μＬ）に接続し、更に外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１２ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２４μＬ）を接続して使用した。試料バンド分割装置には、図８（Ｃ）に示す構造の、試料バンド分割部を使用した。
【０３２０】
図８（Ｃ）に示す試料バンド分割部の詳細は、Ｔ字コネクター（三方ジョイント）にＵ−４２８（内径０．５ｍｍ、ＩＤＥＸ社）を使用し、二重管は、試料注入バルブ〜カラム入口の接続管（第１送液ポート送液用の内管）に外径０．２３６ｍｍ、内径０．１０８ｍｍ、長さ１０ｃｍのステンレススチール管（容量約０．９２μＬ）、及び、外管に外径１．６ｍｍ、内径０．５ｍｍ、長さ５ｃｍのステンレススチール管で構成した。Ｔ字コネクターの枝管には、外径１．６ｍｍ、内径０．２５ｍｍのステンレススチール管を使用した。枝管の先のベントバルブには、６方切り替えバルブ（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ７０００）を使用した。試料には、試料ＩＶ：（チオウレア（ＴＵ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ）、 アセトフェノン（ＡｃＰｈ）、 プロピオフェノン（ＰｒＰｈ）、 ブチロフェノン（ＢｕＰｈ）、ナフタレン（Ｎ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ）、 ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ） 混合物のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０３２１】
図２７（Ａ） は、従来の試料注入法にて試料ＩＶを０．２μＬ注入して分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１送液ポートから０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。
【０３２２】
図２７（Ｂ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１送液ポートから０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液し、試料ＩＶを０．２μＬ注入してから０．０３分後〜０．０４分後までベントバルブを開き、試料バンド後部分を排出した。又、試料注入から０．０３分後〜０．０４分後までの第１送液ポート流速は０．１９９ｍＬ／ｍｉｎとし、試料注入から０．０４分後以降は０．０５ｍＬ／ｍｉｎとした。試料注入から０．０３分後から０．０４分後までの間、第１送液ポートからの流速を０．１９９ｍＬ／ｍｉｎとしたのは、試料バンド前部分をカラムから溶出するのに必要な流速に、試料バンド後部分を排出ポートから排出するのに必要な流速を加えたためである。
【０３２３】
図２７（Ａ）（比較例）では、１、５、６、９番目のピークであるＴＵ、ＢｕＰｈ、Ｎ、ＯｃＰｈについてそれぞれ、理論段数１０９０、５８００、６４９０、６８２０段が得られた。これに対して、本発明の、試料を軸方向に交差する方向で分割し、カラムに導入する試料導入方法にて得られた試料バンド前部分からのクロマトグラムにおける理論段数は、図２７（Ｂ）のＴＵ、ＢｕＰｈ、Ｎ、ＯｃＰｈについてそれぞれ、４５８０、８６９０、８７８０、７３１０段となり、１．０７〜４倍のカラム性能向上を示した。これは実施例３において、同カラムを用いて、従来の試料注入法と本発明の試料導入方法を比べて得られた結果（図１２（Ａ）のＮが６９００段、図１２（Ｄ）のＮが８４１０段）に近い性能向上である。
【実施例１９】
【０３２４】
従来の試料注入法と、本発明の試料導入方法における試料バンドの拡がりと形状に関し、従来の試料注入法（図２８（Ａ））（比較例）に比べ、本発明の、カラム入口での試料バンドの後部分（テール部分）の排出による試料分割を伴う試料導入方法（図２８（Ｂ））による試料バンド幅が減少する効果を、カラム無しで実証した。
【０３２５】
試料注入装置としてＲｈｅｏｄｙｎｅ８１２５バルブ（５μＬループ、内径０．２０ｍｍ、長さ１５．９ｃｍ）を備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、カラムに代えてゼロデッドボリュームユニオン（Ｕ−４３５、内径０．２５ｍｍ、内部容量０．０２μＬ、ＩＤＥＸ社、以下ＺＤＵと表記）を用いた。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は室温とした。検出には、検出セル容量６ｎＬ、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、 ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器セル入り口までの接続管は、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ４５ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．８８μＬ）をもう１つのＺＤＵ（容量０．０２μＬ）に接続し、更に外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ１２ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．２４μＬ）を接続して使用した。試料バンド分割装置には、図８（Ｃ）に示す構造の、実施例１８にて使用した、試料バンド分割部を使用した。試料には、試料ウラシル：ウラシル（Ｕ、０．０７ｍｇ／ｍＬ）のアセトニトリル／水＝６０／４０溶液を使用した。
【０３２６】
図２８（Ａ） は、従来の試料注入法にて試料ウラシルを０．２μＬ注入して溶出したクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）は第１送液ポートから０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。
【０３２７】
図２８（Ｂ）は、移動相（アセトニトリル／水＝６０／４０）を第１送液ポートから０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液し、従来の試料注入法にて試料ウラシルを０．２μＬ注入してから０．０３分後〜０．０４分後までベントバルブを開き、試料バンド後部分を排出した。又、試料注入から０．０３分後〜０．０４分後までの第１送液ポート流速は０．１９９ｍＬ／ｍｉｎとし、試料注入から０．０４分後以降は０．０５ｍＬ／ｍｉｎとした。試料注入から０．０３分後から０．０４分後までの間、第１送液ポートからの流速を０．１９９ｍＬ／ｍｉｎとしたのは、試料バンド前部分をＺＤＵから溶出するのに必要な流速に、試料バンド後部分を排出ポートから排出するのに必要な流速を加えたためである。図２８（Ａ）と（Ｂ）は、それぞれ、図２７（Ａ）と（Ｂ）におけるカラム入り口での試料バンドの拡がりと形状を表す。
【０３２８】
図２８（Ａ）（比較例）において、ウラシルのバンドが大きなテーリングを示しているのに対して、図２８（Ｂ）に示すように、第１送液ポートからの送液容量１．５μＬ（流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎ×０．０３ｍｉｎ）の時点での試料の軸方向に交差する方向での分割により、注入した試料バンドの約７１％がＺＤＵに導入されたウラシルのバンドは大きなテーリングを示していない。図２８（Ａ）においてはモーメント法で計算した試料バンドの分散が０．９５μＬ２であったのに対して、図２８（Ｂ）においては０．２２μＬ２となり、試料バンドの分散を７０％以上減少させることが出来た。図２８（Ｂ）にて、図２７（Ｂ）とカラム以外は同じ条件下でこの結果が得られたということは、図２７（Ｂ）のクロマトグラムにおいて、内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムで、従来の試料注入法で得られたクロマトグラム（図２７（Ａ））よりも高い理論段数が得られた要因が、カラム入口付近で試料バンドの分散を減少させた効果である。尚、モーメント法にてピークの分散を計算する際は、各ピークに付された半値幅を用いていない。
【０３２９】
実施例１、３、５、６、７、９、１０、１３、１６（図１０、１２、１４、１５、１６、１８、１９、２２、２５）において検討した条件下で、従来の試料注入方法に比べて、本発明の試料導入方法によるカラム理論段数の増加倍率とカラムサイズ、検出器セル容量との関係は、表７の通りである。
【０３３０】
【表７】
0006754225.tif 000008
【０３３１】
カラムサイズが大きくなるにしたがって、試料バンドの分割、導入による理論段数増大の効果は小さくなっているが、小さなカラムを用いた場合、特にクロマトグラム初期のピークについて、カラムが潜在的にもっている高い性能（大きな理論段数）の発現を可能とするためには、カラム入り口で試料バンドを軸方向に交差する方向で切断し分割し、試料バンドの前部分のみをカラムに導入することが有効であり、本発明記載の試料バンド分割装置の構造とその操作が、カラムの理論段数の増大を可能とすることが示された。
【０３３２】
表８は、カラムの代わりにＺＤＵやフューズドシリカキャピラリー配管を接続して測定した実施例から、カラム外での溶質バンドの分散σextra2を計算した結果である。対称性の良いピークは半値幅から、対称性の悪いピークはモーメント法により算出した。本発明の試料導入方法により、従来の試料注入法に比べて、σextra2を３０〜８０％減らせることが示されている。σextra2は、注入された試料容量の増加にともなって増大するが、本発明の方法により、非常に狭いバンドとして、カラムに試料を導入することが可能となった。  
【０３３３】
試料バンドの分散は、低い流速で、試料分割までの時間を短くしたとき（低い試料導入率において）、最も小さくなる。このことから、カラム本来の溶質バンドの分散（σcol2、式１）が小さな、クロマトグラム初期に現れるピークについても、σextra2を減少させることにより、従来の試料注入法と比べて１．１〜５倍の理論段数を得ることが可能となった（表８）。
【０３３４】
又、本発明の試料導入方法の効果を最も有効に利用するためには、カラム出口から検出器に至る配管（ｔｕｂｅ２）と検出器セル（ｄｅｔ）における溶質バンドの分散（σtube2 + σdet2）を低く保つことが出来る、内径が小さく容量の小さな配管や検出器セルを用いることが適切である。
【０３３５】
【表８】
0006754225.tif 000009
【０３３６】
実施例１、３、５、６、７、９、１０、１３、１４（図１０、１２、１４、１５、１６、１８、１９、２２、２３）の結果は、試料注入時から試料バンド分割までの（第１送液ポート流速／第２送液ポート流速）の比は、１００／０だけではなく、９０／１０、１９９／１、１／２、１／５、３／７という様々な値であっても、本発明の試料導入方法により、従来の試料注入方法に比べてカラム性能が向上することを示している。
【０３３７】
又、実施例５（図１４）と実施例９（図１８）の結果は、試料バンド分割時にベントバルブを開いて第２送液ポート流速を増加させることにより、試料バンド後部分の流路からの排出と、試料バンド前部分のカラムでの分離溶出を同時に行えることを示している。又、試料バンド後部分を流路から排出した後に、ベントバルブを閉じて試料バンド前部分のカラムでの分離溶出を様々な（第１送液ポート流速／第２送液ポート流速）の比で継続出来ることを示している。
【０３３８】
又、実施例９（図１８）の結果は、試料注入時から試料バンド分割までの、（第１送液ポート流速／第２送液ポート流速）の比には、カラムの高い性能を発揮する比が存在することを示している。
【０３３９】
又、本発明の試料導入方法は、カラムに代えてＺＤＵを用いて行った実施例２、４、８、１１、１２（図１１、１３、１７、２０、２１）が示すように、試料注入装置から注入された試料バンドを明確に試料バンドの軸方向（進行方向）に交差する方向で分割し、試料バンドの前部分のみをカラムに導入し、カラムの高い性能を発揮することが出来る。又、試料注入装置とカラムの間にベントポートを備えた試料バンド分割装置を用いれば、試料バンド前部分を流路から排出し、試料バンド後部分のみをカラムに導入出来ること、或いは、実施例５、１４、１５（図１４、２３、２４）が示唆するように、試料バンド前部分及び後部分を流路から排出し、中間部分だけをカラムに導入出来ることが明らかである。
【０３４０】
以上の実施例から、本発明は、試料注入装置（インジェクター等）から注入された試料バンドが、接続管を通じて第１送液ポートからカラムに入りつつあるとき、即ち、カラム入口或いは流路切替点を試料バンドがまたいでいるときに、カラム入口に接続した第２送液ポートからの送液によりカラムに入った試料バンドを分割し、試料バンド前部分の分離溶出を行うと同時に、分割された残りの試料バンドの後部分（テール部分）を第１送液ポート管内に留める、又は押し戻して流路から排出する、又は流路から排出することにより、カラムに導入される試料バンドの拡がりを減じて、カラム性能の向上を可能とすることが明らかである。
【０３４１】
特に、通常液体クロマトグラフィーにおいて好適とされる０．０１〜５μＬの試料注入容量が与える試料バンドについて、カラム性能を向上させる方法として、開示された試料バンド分割装置の構造と送液流路の操作方法が有用であることが明らかである。そして、試料バンドの分割とカラムへの導入によるカラム性能の向上（理論段数の増加）が、試料導入率９３〜２９％の範囲にわたり達成されていることが明らかである。
【０３４２】
実施例１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１８、１９（図１０〜１８、２１、２２、２７、２８）の結果から、試料注入装置からカラム入口までの容量が１．２７４μＬの場合（実施例４、図１３（Ｂ）にて流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎ、試料容量０．２μＬで測定された）では、試料注入容量が０．０１〜５μＬの時、試料バンドの分割までの第１送液ポート送液容量は、１．５〜６μＬが適切であることが明らかである。又、表８に示すように、カラムの代わりにＺＤＵやフューズドシリカキャピラリー配管を用いた実施例においては、試料導入率２９〜９３％において、ＺＤＵ等に導入された試料バンドの分散（カラム外での溶質バンドの分散とみなせる）を従来の試料注入方法に比べて３０〜８０％減らすことが出来、このことから、本発明の試料導入方法により、実施例１、３、７、１０、１３、１４、１６、１８（図１０、１２、１６、１９、２２、２３、２５、２７）にて、カラムの理論段数を１．１〜５倍まで向上させることが出来た。
【０３４３】
又、本発明は注入された試料容量を非常に小さくしてカラムに導入することで、カラム性能（理論段数）の向上を達成出来ることが明らかである。そして、本発明では、現在の技術水準で十分に小さいと考えられている容量０．０１〜０．１μＬ（１０〜１００ｎＬ）の試料を、更にカラム入口で分割してカラムに導入出来ることが明らかである。
【０３４４】
図２９は、インジェクターで注入された試料の容量が１μＬのとき（実施例５、６、７、８、１２、１３（図１４、１５、１６、１７、２１、２２）、試料の分割を行うまでに第１送液ポートから送液された移動相の容量と、試料バンド前部分のカラムもしくはＺＤＵへの導入率との関係を示している。横軸が「試料バンド分割を行うまでの第１送液ポートからの送液容量（μＬ）」、縦軸が「カラムへの試料導入率」である。但し、試料バンドの分割までの送液容量が６μＬの場合、注入された試料の容量が２μＬ（実施例９、図１８）、試料バンドの分割までの送液容量が１．５μＬの場合、注入された試料の容量が０．４μＬ（実施例１、２、３、４（図１０、１１、１２、１３））のデータをプロットしている。
【０３４５】
一定の構成の試料バンド分割装置について図２９に例示する校正曲線を作成することにより、試料注入から試料バンドの分割までの第１送液ポートからの送液容量の選択と、その設定における試料バンドのカラムへの導入率を予測することが出来る。
【０３４６】
表９は、長さ５ｃｍ、空隙率５０％のカラムで、理論段数１００００段を得られる溶質バンドの分散（σcol2、式５）を、ｋ＝０〜１０の間のいくつかの保持係数（ｋ値）のピークについてシミュレーションした値を示している。比較するカラムサイズとカラム空隙容量が同じであれば、様々な流速で採取されたクロマトグラムのピークが、理論段数１００００段に近づいたかどうかを表９と比較することで判断出来る。長さ５ｃｍのカラムで理論段数１００００段を得るには、一般的に２μｍ以下の充填剤を詰める必要があるが、特にＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を従来の液体クロマトグラフィー装置で使用した場合には、オートサンプラーのサンプルループ容量が０．２μＬ、オートサンプラーの試料注入バルブからカラム入口まで接続管は内径０．０２５ｍｍ、長さ１０ｃｍ（容量約０．０４９μＬ）、カラム出口から検出器セル入り口まで接続管は内径０．０２５ｍｍ、長さ１０ｃｍ（容量約０．０４９μＬ）、検出器セルは内径約０．１５ｍｍ、長さ５ｃｍ（容量約０．０９μＬ）という、非常に試料が通る流路の容量が小さいミクロキャピラリーＨＰＬＣ装置（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ  ＥｘｐｒｅｓｓＬＣ−Ｕｌｔｒａ、ＡＢ  ＳＣＩＥＸ社）で流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎで使用しても、保持係数ｋ＝０では理論段数１７９０、ｋ＝２．２では７１３０、ｋ＝４．０では８５５０、ｋ＝９．０では８７２０を得るのが限界であった（非特許文献８）。カラムの空隙率は充填剤種や充填の仕方、カラム内の単体の種類等によって異なるが、表９では一般的な空隙率の値を記載している。
【０３４７】
又、表８にて示した、従来の注入法に比べ、本発明の試料導入方法により溶質の分散が減少した値を、表９で示した分散の値と比べると、本発明の試料導入方法により高い効果を得られるカラムサイズ及びピークの保持係数が確認出来る。例えば、表８の実施例４、図１３（Ｄ）では、分散が０．３μＬ２減少している。表９の内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムで保持係数ｋが８であっても分散が３．１１μＬ２なので、約１０％も分散が減れば、カラム性能へ大きな影響を与える。又、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムでは保持係数ｋが１では２．９９μＬ２なので、０．３μＬ２減少したらカラム性能への影響は大きいが、ｋが２では６．７３μＬ２と大きいため、０．３μＬ２減少してもカラム性能への影響はあまり大きくないと予想される。
【０３４８】
例えば、実施例３、図１２（Ａ）の、内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムの場合、溶質Ｕ、ＭＢ、Ｔ及びＮについて、半値幅から計算されるピーク分散は０．３１μＬ2、０．９３μＬ2、２．０４μＬ2及び２．９６μＬ2であった。同一の試料注入容量０．２μＬから、試料バンドの分割、カラムへの導入を行って得られた図１２（Ｄ）において、溶質Ｕ、ＭＢ、Ｔ及びＮについてのピーク分散は０．１１μＬ2、０．５５μＬ2、１．６６μＬ2及び２．５３μＬ2であった。これらのピークの分散の減少は、実施例４、図１３（Ｂ）と（Ｅ）に示されるように、試料バンドの分割、ＺＤＵへの導入によりピーク分散が０．３〜０．４μＬ2減少したことに基づくものであり、図１２（Ｄ）の各ピークの理論段数（ｋ（Ｕ）＝０で３５３０、ｋ（ＭＢ）＝２．５で８５６０、ｋ（Ｔ）＝４．９で８１４０、ｋ（Ｎ）＝６．４で８４１０）が図１２（Ａ）の各ピークの理論段数（ｋ（Ｕ）＝０で１２４０、ｋ（ＭＢ）＝２．５で４８７０、ｋ（Ｔ）＝４．９で６３７０、ｋ（Ｎ）＝６．４で６９００）に比べて１．２〜２．８倍に増加する結果となった（表２）。表９に示すカラム（Ｎ＝１００００）によるピーク分散（σcol2）では、例えば内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムでｋ＝６のピークの分散は１．８８μＬ2であるから、図１２（Ｄ）のＮ（ｋ＝６．４でピーク分散２．５３μＬ2）については、本発明の試料導入方法により、試料が通る流路の容量がミクロキャピラリーＨＰＬＣ装置よりも大きいＨＰＬＣ装置を使用しても、理論段数を６９００から８４１０に上げることが出来、ミクロキャピラリーＨＰＬＣ装置で得られたカラム性能（ｋ＝４．０で理論段数８５５０、ｋ＝９．０で８７２０）に近いカラム性能が発揮されたことが示された。又、図１２（Ｄ）のＵ（ｋ＝０でピーク分散０．１１μＬ2）、ＭＢ（ｋ＝２．５でピーク分散０．５５μＬ2）については、本発明の試料導入方法により、ＵＨＰＬＣ装置を使用しても、理論段数をそれぞれ１２４０から３５３０に、４８７０から８５６０に上げることが出来、ミクロキャピラリーＨＰＬＣ装置で得られたカラム性能（ｋ＝０で理論段数１７９０、ｋ＝２．２で７１３０）を超えるカラム性能が発揮されたことが示された。
【０３４９】
つまり、本発明の試料導入方法により、内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムについては、保持係数ｋの広い範囲で理論段数の増加が見込まれる。内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム、或いは内径３．０ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムにおいても、特にクロマトグラム初期に現れるピークについては、カラム性能の向上が期待される。
【０３５０】
【表９】
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【０３５１】
表１０は、空隙率４６％の内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム、空隙率５０％の内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム、及び、空隙率５０％の内径３．０ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムで、理論段数１００００段を得られる溶質バンドの半値幅（単位：ｍｉｎ）を、ｋ＝０〜１０の間のいくつかの保持係数（ｋ値）についてシミュレーションした値を示している。半値幅は流速の影響を受けるが、比較するカラムサイズとカラム空隙容量と流速が同じであれば、採取されたクロマトグラムのピークが、理論段数１００００段に近づいたかどうか（或いは高性能となったかどうか）を表１０と比較することで判断出来る。実施例の各ピークには、半値幅（単位：ｍｉｎ）をそれぞれ付与している。又、半値幅を付与していないピークについても、表１１〜１３に半値幅を記載している。
【０３５２】
【表１０】
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【０３５３】
表１１〜１３では、各実施例について、各ピークの半値幅を示している。
【表１１】
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【０３５４】
【表１２】
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【０３５５】
【表１３】
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【０３５６】
本発明の試料導入方法により、様々な内径の液体クロマトグラフィー用カラムにおいて、カラム外での溶質の分散を減ずることが出来、内径０．１ｍｍ、１．０ｍｍ、２．１ｍｍ、４．６ｍｍのカラムにおいて、カラム理論段数を増大させる効果が認められた。本発明により、ＵＨＰＬＣで必要とされる、細く短い、小さなカラムについて、とくにクロマトグラム初期に溶出するピークについて、カラム性能を向上させることが可能となった。実施例で用いたポンプや流路切り替えバルブ等の動作は、１／１００分単位で制御されているが、制御可能な時間間隔を例えば１／１０００分〜１／１００００分単位に短く出来れば、カラム性能を向上させるためにより好適な制御が出来ることは自明である。
【産業上の利用可能性】
【０３５７】
本発明によれば、液体クロマトグラフィーにおいて、カラムの分離性能、即ち理論段数を向上させることが可能となったので、物質の分析、分取効率が向上し、様々な分野の研究並びに応用において利用が可能である。
【符号の説明】
【０３５８】
１    カラム
１０  試料バンド分割装置
１１  試料バンド分割部
１２  流路切替点
２０  第１送液ポート
２１  送液ポンプ
２２  試料注入装置
２９  第２送液ポート
３    試料バンド
３１  試料バンドの前部分
３２  試料バンドの後部分
５    ６方バルブ
５０  流路切替点
５１  第１送液ポート
５２  第２送液ポート
６０  第１排出ポート
７    ４方ジョイント
９１  試料導入装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
0006754225.tif 000021
【図５Ｄ】
0006754225.tif 000022
【図５Ｅ】
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【図６】
0006754225.tif 000024
【図７】
0006754225.tif 000025
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
0006754225.tif 000027
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
0006754225.tif 000029
【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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