(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の双極性障害の素因を診断し、診断の確定をし、又は決定するための方法であって、
前記対象から採取した脳脊髄液サンプルのイソクエン酸の量を測定することと、
前記イソクエン酸の量と双極性障害ではない対象から採取した対応するサンプルのイソクエン酸の対照量とを比較することとを含み、
前記イソクエン酸の対照量と比較した、イソクエン酸量の増加が、前記対象が前記双極性障害であり、又は前記双極性障害の素因を有することの指標となる、方法。
【請求項２】
請求項1に記載の方法であって、
前記対象から採取した脳脊髄液サンプルのシス−アコニット酸、
前記対象から採取した血清サンプルのピルビン酸、
前記対象から採取した血清サンプルのN-アセチルグルタミン酸、
前記対象から採取した血清サンプルの2-オキソグルタル酸、
前記対象から採取した血清サンプルのβ-アラニン、
前記対象から採取した血清サンプルのアルギニン、
前記対象から採取した血清サンプルのセリン、
前記対象から採取した血清サンプルの尿酸、及び、
前記対象から採取した血清サンプルのクエン酸からなる群から選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定することと、
前記少なくとも1つのバイオマーカーの量と前記双極性障害ではない対象から採取した対応するサンプルの前記少なくとも1つのバイオマーカーの対照量とを比較することとを更に含み、
前記少なくとも1つのバイオマーカーの対照量と比較した、シス−アコニット酸量の増加、ピルビン酸量の増加、N-アセチルグルタミン酸量の増加、2-オキソグルタル酸量の増加、β-アラニン量の低下、アルギニン量の低下、セリン量の低下、尿酸量の増加、及びクエン酸量の低下が、前記対象が前記双極性障害であり、又は前記双極性障害の素因を有することの指標となる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも1つのバイオマーカーが前記対象から採取した血清サンプルのセリンである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも1つのバイオマーカーが血清から採取した前記バイオマーカーである、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオマーカーの少なくとも4つを組み合わせて測定する、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
以下のバイオマーカー；
対象から採取した前記脳脊髄液サンプルのイソクエン酸、
対象から採取した前記脳脊髄液サンプルのシス−アコニット酸、
前記対象から採取した血清サンプルのセリン、
前記対象から採取した血清サンプルの尿酸、及び、
前記対象から採取した血清サンプルのクエン酸
を組み合わせて測定する、請求項2に記載の方法。
【請求項７】
以下のバイオマーカー；
対象から採取した前記脳脊髄液サンプルのイソクエン酸、
前記対象から採取した血清サンプルのピルビン酸、
前記対象から採取した血清サンプルのN-アセチルグルタミン酸、
前記対象から採取した血清サンプルの2-オキソグルタル酸、
前記対象から採取した血清サンプルのβ-アラニン、
前記対象から採取した血清サンプルのアルギニン、及び、
前記対象から採取した血清サンプルのセリン
を組み合わせて測定する、請求項2に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が少なくとも1つの双極性発作、少なくとも1つの躁発作、少なくとも1つの軽躁発作、少なくとも1つの鬱発作、又はそれらの任意の組合せを有している、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項９】
バイオマーカーに基づかない、前記双極性障害の第2の診断テストを行うことを更に含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項１０】
前記双極性障害が双極性障害I型、双極性障害II型、急速交代型双極性障害、特定不能の双極性障害、気分循環症、又はそれらの任意の組合せである、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象は少なくとも1つの双極性薬を投与されている対象である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも1つの双極性薬がリチウム、バルプロ酸、カルバマゼピン、オクスカルバゼピン、ラモトリギン、ルラシドン、ジバルプロエクス、若しくは任意のそれらの塩、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象は、前記少なくとも1つの双極性薬を前記測定及び比較の前、前記測定及び比較の後、又はその両方に投与されている対象である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
双極性障害を予防及び／又は治療するための化合物を同定する方法であって、
真核生物細胞と培養液中の試験化合物とを接触させることと、
前記培養液中のイソクエン酸の量を測定することと、
前記イソクエン酸の量と未処理の真核生物細胞の培養液中のイソクエン酸の対照量とを比較することとを含み、
前記イソクエン酸の対照量と比較した、イソクエン酸量の低下が、前記試験化合物が双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質であることの指標となる、方法。
【請求項１５】
請求項14に記載の方法であって、
前記培養液中のシス−アコニット酸、ピルビン酸、N-アセチルグルタミン酸、2-オキソグルタル酸、β-アラニン、アルギニン、セリン、尿酸、及びクエン酸からなる群から選択されるバイオマーカーの少なくとも1つの量を測定することと、
前記少なくとも1つのバイオマーカーの量と前記未処理の真核生物細胞の培養液中の前記少なくとも1つのバイオマーカーの対照量とを比較することとを更に含み、
前記少なくとも1つのバイオマーカーの前記対照量と比較した、シス−アコニット酸量の低下、ピルビン酸量の低下、N-アセチルグルタミン酸量の低下、2-オキソグルタル酸量の低下、β-アラニン量の増加、アルギニン量の増加、セリン量の増加、尿酸量の低下、及びクエン酸量の増加が、前記試験化合物が双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質であることの指標となる、方法。
【請求項１６】
前記細胞を遺伝的に操作し、イソクエン酸脱水素酵素の3α-サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現を減少させる、請求項14又は15に記載の方法。
【請求項１７】
対照発現レベルと比較して特定の少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを増減させる試験化合物を選択することと、
双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質として前記試験化合物を同定することとを更に含む、
請求項14又は15に記載の方法。
【請求項１８】
双極性障害を予防及び／又は治療するための化合物を同定する方法であって、
試験化合物を動物に投与することと、
前記動物から採取した脳脊髄液サンプルのイソクエン酸の量を測定することと、
前記イソクエン酸の量と未治療の動物から採取した対応するサンプルのイソクエン酸の対照量とを比較することとを含み、
前記イソクエン酸の対照量と比較した、イソクエン酸量の低下が、前記試験化合物が双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質であることの指標となる、方法。
【請求項１９】
請求項18に記載の方法であって、
前記動物から採取した脳脊髄液サンプルのシス−アコニット酸、
前記動物から採取した血清サンプルのピルビン酸、
前記動物から採取した血清サンプルのN-アセチルグルタミン酸、
前記動物から採取した血清サンプルの2-オキソグルタル酸、
前記動物から採取した血清サンプルのβ-アラニン、
前記動物から採取した血清サンプルのアルギニン、
前記動物から採取した血清サンプルのセリン、
前記動物から採取した血清サンプルの尿酸、及び、
前記動物から採取した血清サンプルのクエン酸からなる群から選択されるの少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定することと、
前記少なくとも1つのバイオマーカーの量と前記未治療の動物から採取した対応するサンプルの少なくとも1つのバイオマーカーの対照量とを比較することとを更に含み、
前記少なくとも1つのバイオマーカーの対照量と比較した、シス−アコニット酸量の低下、ピルビン酸量の低下、N-アセチルグルタミン酸量の低下、2-オキソグルタル酸量の低下、β-アラニン量の増加、アルギニン量の増加、セリン量の増加、尿酸量の低下、及びクエン酸量の増加が、前記試験化合物が双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質であることの指標となる、方法。
【請求項２０】
前記動物を遺伝的に操作し、イソクエン酸脱水素酵素の3α-サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現を減少させる、請求項18又は19に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、双極性障害の診断方法及び双極性障害を治療又は予防するための治療化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
双極性障害（BD）は、気分正常期をはさんだ、鬱及び躁の発作又は軽躁病を特徴とする主要な精神疾患である。典型的な発症年齢は後期青年期又は早期成人期であり、BDは、継続した観察及び多くの場合、生涯治療を含む大きな健康問題であり、医療制度及び社会に大きな経済的負担がかかる。最近のスウェーデン資源を利用した試験では、平均年間費用が28011ユーロ／年／患者と推定され、2009年のUS試験では、BDの直接及び間接的費用が1510億ドルと推定された。
【０００３】
多くの家族及び双子の試験ではBDに対する感受性に影響を与える遺伝的因子の重要性が示されているが、BDの正確な病因はよくわかっていない。BDは神経炎症性又は神経変性障害である可能性があり、再発には中毒性があり、他の不良な予後を防止するために早期検出の有用性が示されている。しかし、知見の蓄積により、ミトコンドリア機能障害がBDの病因に重要な役割を果たしていることが示唆されている。
【０００４】
メタボロミクスとは小分子代謝産物のプロファイリングであり、疾患に関連する特異的代謝表現型を特徴付ける可能性をもたらす。メタボロミクスは、生体の代謝変化を直接採取し、遺伝子レベル、転写物レベル、及びタンパク質レベル並びに翻訳後修飾の変化から情報を集積するという点から、他の「オミックス」技法に対して有利なものである。BD患者及び対照の検死脳サンプルのメタボロミクス解析が報告されている。脳サンプルにおける小分子、例えばアミノ酸の組織濃度は死後経過時間（PMI）に大きく影響されることが知られている。それゆえ、検死脳サンプルを使用するメタボロミクス解析は、バイオマーカーの決定に有用でない可能性がある。脳脊髄液（CSF）は、脳の代謝状態及び生化学的性質を反映するものとして、脳障害のインビボ（in vivo）試験における関連の高いサンプル基質である。それゆえ、患者及び対照のCSFのメタボロミクスプロファイルは、バイオマーカーとしての価値を有し得る、BDの病因に関連するタンパク質の違いを明らかにする可能性がある。
【０００５】
キャピラリー電気泳動飛行時間型質量分析（CE-TOFMS）は、現行の技術水準のメタボローム解析技法である。CE-TOFMS分析の利点として、極めて高い解像度、多用途性、及びサンプル中の帯電した低分子量化合物を実質的に全て、同時に定量する能力が挙げられる。この技法を用いた2つの試験では、自閉症スペクトラム障害の血漿中に4つの分子（アルギニン、タウリン、5-オキソプロリン、及び乳酸）の確固たる変化及び統合失調症の投薬患者の初期症状の血漿中に5つの分子（クレアチン、ベタイン、ノナン酸、安息香酸、及びぺリル酸）の大きな変化が示されている。しかし、BD患者のCSFサンプルにこの技法を用いた報告はない。
【０００６】
それにより、双極性障害を診断し、双極性障害に対する強力な効能を有する化合物を同定する方法が必要とされている。
【０００７】
以下の参考文献は引用することにより、本明細書の一部をなす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Belmaker,N. Eng. J. Med. 2004; 351(5):476-486.
【非特許文献２】Taylor,Nat. Rev. Neurol. 2009; 5(9):484-491.
【非特許文献３】Crumpら、JAMA Psychiatry. 2013; 70(9):931-939.
【非特許文献４】Kleine-Buddeら、Bipolar Disord. 2014; 16(4):337-353.
【非特許文献５】Ekmanら、Soc. Psychiatry Psychiatr. Epidemiol. 2013; 48(10):1601-1610.
【非特許文献６】Dilsaver,J. Affect. Disord. 2011; 129(1-3):79-83.
【非特許文献７】Craddockら、Lancet 2013; 381(9878):1654-1662.
【非特許文献８】Jakobssonら、Neuropsychopharmacology. 2014; 39(10):2349-2356.
【非特許文献９】Ekmanら、Acta Psychiatr. Scand. 2010; 122(6):507-515.
【非特許文献１０】Iwamotoら、Hum. Mol. Genet. 2005; 14(2):241-253.
【非特許文献１１】Kato,Trends Neurosci. 2008; 31(10): 495-503.
【非特許文献１２】Quirozら、Neuropsychopharmacology. 2008; 33(11):2551-2565.
【非特許文献１３】Konradiら、Neurobiol. Dis. 2012;45(1):37-47.
【非特許文献１４】Andreazzaら、Int. J. Neuropsychopharmacol. 2014; 17(7):1039-1052.
【非特許文献１５】deSousaら、Expert Opin. Ther. Targets. 2014;18(10):1131-1147.
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【非特許文献５８】Nilesら、Int. J. Neuropsychopharmacol. 2012; 15(9):1343-1350.
【発明の概要】
【０００９】
本発明の特徴は、対象における双極性障害の診断を可能にする方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の特徴は、対象の双極性障害の確定を可能にする方法を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる特徴は、対象が双極性障害の素因を有する決定を可能にする方法を提供することである。
【００１２】
本発明の更なる特徴は、最終的に双極性障害を治療又は予防するために使用することができる化合物を同定する方法を提供することである。
【００１３】
本発明の更なる特徴と利点とは、一部以下の本明細書に示されるであろうし、一部明細書から明らかであろうし、又は本発明の実施により知ることが可能である。本発明の目的とその他の利点とは、本明細書及び添付の特許請求の範囲に具体的に示される要素と組合せとによって、認識され、達成されるであろう。
【００１４】
これらの利点及び他の利点を達成するために、及び本発明の目的に従い、本明細書において具体化され、広く記載されるように、本発明は、対象の双極性障害の素因を診断し、診断の確定をし、及び／又は決定する方法に関し、以下を含み得る。以下のバイオマーカー、対象から採取した脳脊髄液サンプルのイソクエン酸、対象から採取した脳脊髄液サンプルのシス−アコニット酸、対象から採取した血清サンプルのピルビン酸、対象から採取した血清サンプルのN-アセチルグルタミン酸、対象から採取した血清サンプルの2-オキソグルタル酸、対象から採取した血清サンプルのβ-アラニン、対象から採取した血清サンプルのアルギニン、対象から採取した血清サンプルのセリン、対象から採取した血清サンプルの尿酸、及び対象から採取した血清サンプルのクエン酸の少なくとも1つの量を測定することができる。少なくとも1つのバイオマーカーの量と双極性障害ではない対象から採取した対応するサンプルの少なくとも1つのバイオマーカーの対照量とを比較することができる。少なくとも1つのバイオマーカーの対照量と比較した、イソクエン酸量の増加、シス−アコニット酸量の増加、ピルビン酸量の増加、N-アセチルグルタミン酸量の増加、2-オキソグルタル酸量の増加、β-アラニン量の低下、アルギニン量の低下、セリン量の低下、尿酸量の増加、及びクエン酸量の低下が、対象が双極性障害であり、又は双極性障害の素因を有することの指標となり得る。
【００１５】
本発明は更に、以下を含み得る、双極性障害を予防及び／又は治療する化合物を同定する方法に関する。真核生物細胞と試験化合物とを接触させることができる。イソクエン酸脱水素酵素の3α-サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現レベルを細胞内及び／又は細胞を含有する培養液中において測定することができる。発現レベルを、未処理の真核生物細胞の遺伝子の対照発現レベルと比較することができる。対照発現レベルと比較した少なくとも1つの遺伝子の発現レベルの増加は、試験化合物が双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質であることの指標となり得る。本方法はまた、対照発現レベルと比較して少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを低下させた試験化合物を選択し、双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質として試験化合物を同定することを含み得る。
【００１６】
本発明はまた、以下を含み得る、双極性障害を予防及び／又は治療する化合物を同定する方法に関する。試験化合物を、動物、例えば非ヒト動物に投与することができる。動物の前頭前皮質におけるイソクエン酸脱水素酵素の3α-サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現レベルを測定することができる。発現レベルを、未治療の動物の前頭前皮質の少なくとも1つの遺伝子の対照発現レベルと比較することができる。対照発現レベルと比較した少なくとも1つの遺伝子のレベルの増加は、試験化合物が双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質であることの指標となり得る。
【００１７】
本発明は更に、以下を含み得る、双極性障害を予防及び／又は治療する化合物を同定する方法に関する。真核生物細胞と培養液中の試験化合物とを接触させることができる。細胞及び／又は培養液において、以下のバイオマーカー、イソクエン酸、シス−アコニット酸、ピルビン酸、N-アセチルグルタミン酸、2-オキソグルタル酸、β-アラニン、アルギニン、セリン、尿酸、及びクエン酸の少なくとも1つの量を測定することができる。少なくとも1つのバイオマーカーの量を、未処理の真核生物細胞の培養液中の少なくとも1つのバイオマーカーの対照量と比較することができる。少なくとも1つのバイオマーカーの対照量と比較した、イソクエン酸量の低下、シス−アコニット酸量の低下、ピルビン酸量の低下、N-アセチルグルタミン酸量の低下、2-オキソグルタル酸量の低下、β-アラニン量の増加、アルギニン量の増加、セリン量の増加、尿酸量の低下、及びクエン酸量の増加は、試験化合物が双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質であることの指標となり得る。
【００１８】
本発明はまた、以下を含み得る、双極性障害を予防及び／又は治療する化合物を同定する方法に関する。試験化合物を動物、例えば非ヒト動物に投与することができる。以下のバイオマーカー：動物から採取した脳脊髄液サンプルのイソクエン酸、動物から採取した脳脊髄液サンプルのシス−アコニット酸、動物から採取した血清サンプルのピルビン酸、動物から採取した血清サンプルのN-アセチルグルタミン酸、動物から採取した血清サンプルの2-オキソグルタル酸、動物から採取した血清サンプルのβ-アラニン、動物から採取した血清サンプルのアルギニン、動物から採取した血清サンプルのセリン、動物から採取した血清サンプルの尿酸、及び動物から採取した血清サンプルのクエン酸の少なくとも1つの量を測定することができる。少なくとも1つのバイオマーカーの量を未治療の動物から採取した対応するサンプルの少なくとも1つのバイオマーカーの対照量と比較することができる。少なくとも1つのバイオマーカーの量と比較した、イソクエン酸量の低下、シス−アコニット酸量の低下、ピルビン酸量の低下、N-アセチルグルタミン酸量の低下、2-オキソグルタル酸量の低下、β-アラニン量の増加、アルギニン量の増加、セリン量の増加、尿酸量の低下、及びクエン酸量の増加は、試験化合物が双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質であることの指標となり得る。
【００１９】
上記の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方が例示的及び説明的なものに過ぎず、請求項に記載の本発明を更に説明することを意図すると理解されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ミトコンドリアマトリクス内及び細胞質ゾル中に生じるクエン酸回路のクエン酸及びイソクエン酸が強調された代謝経路の概略図である。
【図２】受信者操作特性（ROC）曲線及び曲線下面積（AUC）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は対象の双極性障害の素因を診断し、診断の確定をし、又は決定する方法に関し、以下を含み得る。以下のバイオマーカー：対象から採取した脳脊髄液サンプルのイソクエン酸、対象から採取した脳脊髄液サンプルのシス−アコニット酸、対象から採取した血清サンプルのピルビン酸、対象から採取した血清サンプルのN-アセチルグルタミン酸、対象から採取した血清サンプルの2-オキソグルタル酸、対象から採取した血清サンプルのβ-アラニン、対象から採取した血清サンプルのアルギニン、対象から採取した血清サンプルのセリン、対象から採取した血清サンプルの尿酸、及び対象から採取した血清サンプルのクエン酸の少なくとも1つの量を測定することができる。少なくとも1つのバイオマーカーの量を、双極性障害のない対象から採取した対応するサンプルの少なくとも1つのバイオマーカーの対照量と比較することができる。少なくとも1つのバイオマーカーの対照量と比較した、イソクエン酸量の増加、シス−アコニット酸量の増加、ピルビン酸量の増加、N-アセチルグルタミン酸量の増加、2-オキソグルタル酸量の増加、β-アラニン量の低下、アルギニン量の低下、セリン量の低下、尿酸量の増加、及びクエン酸量の低下は、対象が双極性障害又は双極性障害の素因を有することの指標となり得る。対象はヒト対象又は双極性障害の動物モデルであってよい。
【００２２】
記載のいずれかのバイオマーカーを単独又は組み合わせて使用することができ、場合により、1つ又は複数の記載されていない追加のバイオマーカーと組み合わせることができる。例えば、少なくとも1つのバイオマーカーは、対象から採取した脳脊髄液サンプルのイソクエン酸を含むことができる。イソクエン酸を単独又は記載の有無に関わらず1つ又は複数の追加のバイオマーカーと組み合わせて測定することができる。例えば、対象から採取した脳脊髄液サンプルのイソクエン酸及び血清サンプルのセリンをともに測定し、対照と、及び／又は互いに比較することができる。測定された2つ以上のバイオマーカーの比を算出し、対照の比と比較することができる。測定し、比較された少なくとも1つのバイオマーカーは、例えば、対象の脳脊髄液から採取したバイオマーカーの少なくとも1つ及び血清から採取したバイオマーカーの少なくとも1つとの組合せを含むことができる。バイオマーカーの任意の好適な組合せを、単独又は1つ若しくは複数の更なるバイオマーカーと組み合わせて測定することができる。組み合わせた少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10以上のバイオマーカーを測定し、対応する対照と比較することができる。例えば、以下のバイオマーカー：対象から採取した脳脊髄液サンプルのイソクエン酸、対象から採取した脳脊髄液サンプルのシス−アコニット酸、対象から採取した血清サンプルのセリン、対象から採取した血清サンプルの尿酸、及び対象から採取した血清サンプルのクエン酸を組み合わせて測定することができる。例えば、以下のバイオマーカー：対象から採取した血清サンプルのピルビン酸、対象から採取した血清サンプルのN-アセチルグルタミン酸、対象から採取した血清サンプルの2-オキソグルタル酸、対象から採取した血清サンプルのβ-アラニン、対象から採取した血清サンプルのアルギニン、及び対象から採取した血清サンプルのセリンを組み合わせて測定することができる。
【００２３】
本発明の方法は、既存のバイオマーカーのデータ、これまでに採取されたサンプルを使用することができ、及び／又は対象からサンプルを採取することを含むことができる。本方法は、直接的又は間接的にヒト対象に接触させることを含むことができる。本方法は、任意のヒト対象との直接的な接触を含まなくてよい。脳脊髄液を対象から採取することができ、血清を対象から採取することができ、又はその両方を採取することができる。1つ又は複数の精製工程を1つのサンプルに行った後に、存在する1つ又は複数のバイオマーカーの量を測定することができる。代替の方法として、精製することなく量を測定することができる。対照サンプル又はバイオマーカーの量は、1つ又は複数の対照となる対象を基準にすることができる。採取は任意の好適な時間に行うことができる。例えば、対象が気分正常、躁発作中、鬱発作中、及び／又は双極性発作の任意の点にあるとき、サンプルを採取することができる。2つ以上のサンプルを採取及び／又は測定することができる。多数の測定値を平均化した後に対照量と比較することができる。対照量はまた、平均値を基準にすることができる。平均は、例えば算術的平均値又は幾何学的平均値、中央値、及び／又は最頻値であってよい。対照量は特定の量又は範囲であってよい。本発明の方法によると、対照に対するバイオマーカーの増減は、約少なくとも0.001 %、0.01 %、0.1 %、0.5 %、1.0 %、2.0 %、3.0 %、4.0 %、5.0 %、10 %、15 %、20 %、25 %、40 %、50 %、60 %、75 %、90 %、若しくは100 %、又は0.001 %未満若しくは100 %超であり得る。少なくとも1つのバイオマーカーは、ある量の代謝産物及び／又は遺伝子の発現レベルを含むことができる。
【００２４】
試験した対象は、これまでに双極性障害又は他の精神的な病気と診断されている必要はない。或いは、対象はこれまでに及び／又は現在1つ又は複数の精神的な病気、例えば双極性障害と診断されていてもよい。対象は、少なくとも1つの双極性発作、少なくとも1つの躁発作、少なくとも1つの軽躁発作、少なくとも1つの鬱発作、又はそれらの任意の組合せを有し得る。バイオマーカーに基づいた試験を行う前に、同時に、及び／又はその後に、双極性障害の1つ又は複数の追加の診断試験を行うことができる。追加の試験はまた、バイオマーカーに基づいた試験であってよく、又はバイオマーカーに基づいていない診断試験であってよい。例えば、他の診断試験は面接に基づいた試験であってよい。臨床評価手段、例えば、Sachsら、Biol Psychiatry. 2003;53(1):1028-1042の記載に合わせて行われた、双極性障害の体系化された治療向上プログラム（Systematic Treatment Enhancement Program of Bipolar Disorder）（STEP-BD）のために開発された情動障害評価（ADE）を追加の診断試験として使用することができる。これまでに双極性障害と診断されていない対象は、双極性障害と診断されている少なくとも1人の生物学的家族の一員、例えば、父親、母親、女兄弟、男兄弟、祖母、祖父、息子、娘、及び／又は従兄弟が存在し得る。
【００２５】
試験される双極性障害は、任意の双極性障害又は双極性障害の組合せであってよい。例えば、双極性障害は、双極性障害I型、双極性障害II型、急速交代型双極性障害、特定不能の双極性障害、気分循環症、又はそれらの任意の組合せであってよい。双極性障害は、精神障害の診断と統計マニュアル（Diagnostic and Statistical Manual）（DSM）-IV又はVに定義された基準に基づいた双極性障害であり得る。双極性障害の重症度は、臨床全般印象（CGI）評価尺度及び機能の全体的評価（GAF）を用いて評価することができる。双極性障害I型は、少なくとも7日間続く躁若しくは混合発作、又は即時の入院治療を必要とするほどの重症である躁症状を特徴とすることができる。双極性障害I型はまた、典型的には少なくとも2週間続く鬱発作を含み得る。双極性障害II型は、鬱発作と軽躁発作とのパターンを特徴とし得るが、本格的な躁又は混合発作ではない。特定不能の双極性障害は、双極性障害I型及び／又はII型の1つ又は複数の症状を特徴とし得る。特定不能の双極性障害は、双極性障害I型及び／又はII型の基準を全て満たす必要はないが、正常な挙動範囲をなお逸脱している症状を有する。気分循環症又は気分循環障害は双極性障害の軽度の形態であり、双極性障害I型及び／又はII型の基準を全て満たす必要はない。気分循環症は、少なくとも2年間の軽躁病及び軽度の鬱の発作を特徴とし得る。急速交代型双極性障害は、1年以内の大鬱病、躁、軽躁病、又は混在状態の4つ以上の発作全てを特徴とし得る。双極性障害は、以下の症状：躁、軽躁病、鬱、多幸感、集中力の欠如、早口及び／又は大声の会話、多動、不眠症、短時間睡眠、誇大自己イメージ、過度の浪費、性行動亢進、物質乱用、又はそれらの任意の組合せの1つ又は複数を含み得る。
【００２６】
本方法を任意の治療計画と別個に、又は治療計画と組み合わせて行うことができる。本方法は、少なくとも1つの双極性薬を対象に投与することを含むことができる。薬は、少なくとも1つのバイオマーカーを採取、測定、及び／又は比較する前、間、及び／又は後に投与することができる。任意の好適な薬を使用することができる。双極性薬は、躁、鬱、又はその両方の少なくとも1つの症状を治療することができる。例えば、少なくとも1つの双極性薬は、リチウム、バルプロ酸、カルバマゼピン、オクスカルバゼピン、ラモトリギン、ルラシドン、ジバルプロエクス、若しくはそれらの任意の塩、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。双極性薬は、少なくとも1つの気分安定剤、少なくとも1つの抗鬱剤、少なくとも1つの抗精神病薬、少なくとも1つの抗発作薬、少なくとも1つの抗痙攣薬、少なくとも1つのベンゾジアゼピン、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。気分安定剤の例として、リチウム、ジバルプロエクスナトリウム、カルバマゼピン、バルプロ酸、ラモトリギン、オクスカルバゼピン、又はそれらの任意の組合せを挙げることができる。抗精神剤の例として、オランザピン、アリピプラゾール、リスペリドン、ジプラシドン、クロザピン、ルラシドン、又はそれらの任意の組合せを挙げることができる。抗発作薬及び抗痙攣薬剤の例として、カルバマゼピン、クロナゼパム、クロラゼプ酸二カリウム、ジアゼパム、エトスクシミド、エトトイン、フェルバメート、ホスフェニトイン、ガバペンチン、ラモトリギン、レベチラセタム、ロラゼパム、メフェニトイン、メホバルビタール、オキシカルバゼピン、ペントバルビタール、フェニトイン、プリミドン、チアガビン、トピラメート、トリメタジオン、バルプロ酸、又はそれらの任意の組合せを挙げることができる。抗鬱剤の例として、フルオキセチン、パロキセチン、セルトラリン、シタロプラム、エスシタロプラム、ブプロピオン、三環式化合物、四環式化合物、モノアミン酸化酵素阻害剤、又はそれらの任意の組合せを挙げることができる。ベンゾジアゼピンの例として、アルプラゾラム、クロルジアゼポキシド、クロラゼペート、ジアゼパム、エスタゾラム、フルラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、プラゼパム、クアゼパム、テマゼパム、トリアゾラム、又はそれらの任意の組合せを挙げることができる。任意の有効医薬成分の任意の塩又は塩の組合せを使用することができる。非薬物療法、例えば、電気ショック療法及び／又は脳深部刺激を、少なくとも1つの（調剤）薬剤治療に代わり又は加えて使用することができる。
【００２７】
本発明は更に、以下を含み得る、双極性障害を予防及び／又は治療する化合物又は化合物の組合せを同定する方法に関する。真核生物細胞と試験化合物とを接触させることができる。イソクエン酸脱水素酵素の3α-サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現レベルを、細胞及び／又は細胞を含有する培養液において測定することができる。発現レベルを未処理の真核生物細胞の遺伝子の対照発現レベルと比較することができる。対照発現レベルと比較した少なくとも1つの遺伝子の発現レベルの増加は、試験化合物が双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質であることの指標となり得る。本方法はまた、対照発現レベルと比較して少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを低下させた試験化合物を選択し、双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質として試験化合物を同定することを含むことができる。イソクエン酸脱水素酵素の3α-サブユニット遺伝子及び／又はイソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子の発現レベルに加えて、1つ又は複数の遺伝子の発現レベルも分析することができる。同定された化合物を対象に投与することができる。対象は、双極性障害又は双極性障害の素因があると診断され得る。次いで、診断試験を対象に行うことができる。例えば、対象由来のサンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定することができる。サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの量を少なくとも1つのマーカーの対照量と比較することができ、この場合少なくとも1つのバイオマーカーの量の増減が、双極性障害を治療又は予防したことの指標となる。
【００２８】
任意の好適な細胞型を、処理及び未処理（対照）細胞に使用することができる。真核生物細胞が典型的に1つ又は複数のミトコンドリアを含むため、真核生物細胞を使用することは有利である。しかし、通常ミトコンドリアを含有しない細胞の人工構築物、例えばイソクエン酸脱水素酵素の3α-サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方を発現するよう改変された細菌又は他の細胞を使用することができる。真核生物細胞の任意の種類又は組合せを使用することができる。例えば、真核生物細胞は、単細胞又は多細胞生物由来であってよい。真核生物細胞は、例えば酵母であってよい。真核生物細胞は、動物、例えば無脊椎動物又は脊椎動物由来であってよい。真核生物細胞は、1つ又は複数の種類の哺乳類動物細胞、例えば1つ又は複数の種類のマウス、ラット、ハムスター、霊長類、又はヒトの細胞を含むことができる。細胞は、任意の好適な組織又は組織の組合せ由来であってよい。細胞は、任意の好適な器官又は組織、例えば、脳又は中枢神経系由来であってよい。細胞は、脳、例えば海馬又は前頭前皮質、例えば背外側前頭前皮質の任意の部分（単数又は複数）由来であってよい。脳細胞の任意の種類又は組合せ、例えばニューロン、グリア細胞、又はその両方を使用することができる。細胞は、天然の状態から改変されなくてもよく、又は任意の好適な技法を用いて1つ又は複数の方法において改変、例えば遺伝的に改変されてもよい。細胞を遺伝的に操作し、例えばイソクエン酸脱水素酵素の3α-サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現を減少させることができる。1つ又は複数の遺伝子を改変させることができる。各遺伝子に対する1つ又は複数の対立遺伝子を使用することができる。細胞を不死化することができる。任意の好適な細胞株を使用することができる。正常及び／又は癌細胞株を使用することができる。
【００２９】
任意の動物又は動物の組合せを本発明の診断方法、スクリーニング方法、及び治療方法に使用することができる。動物は非ヒト動物であってよい。動物はマウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、ウサギ、モルモット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、サル、類人猿、アカゲザル、チンパンジー、ヒヒ、又はそれらの任意の組合せであってよい。動物はヒトであってよい。非ヒト動物は1つ又は複数の双極性障害のモデルであってよい。非ヒト動物を遺伝的に操作することができる。例えば、非ヒト動物を遺伝的に操作し、遺伝子を付加及び／又は遺伝子を修正することができる。1つの対立遺伝子を別のものと入れ替えることができる。1つの種由来の遺伝子を使用し、別の種の対応物（counterpart）又は相同な遺伝子を置き換えることができる。非ヒト動物を遺伝的に操作し、1つ又は複数のバイオマーカーのレベルを変更することができる。例えば非ヒト動物を遺伝的に操作し、1つ若しくは複数の代謝産物の量及び／又は1つ若しくは複数の遺伝子の発現レベルを変更することができる。相同組み換え及び／又は任意の他の好適な技法を使用することができる。
【００３０】
本発明のスクリーニング方法は、対照発現レベルと比較して少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを減少させる試験化合物を選択することを更に含むことができる。本発明のスクリーニング方法は、双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質として試験化合物を同定することを更に含むことができる。細胞又は動物を使用するスクリーニング方法を独立して又は組み合わせて使用することができる。続いて、例えば細胞アッセイを用いて候補物質として同定された試験化合物を動物において試験若しくは確認し、又はその逆も行うことができる。すなわち、試験化合物を、双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質として決定した後、動物に投与することができる。イソクエン酸脱水素酵素の3α-サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現レベルを、遺伝子の型は細胞が由来する動物と動物又はヒトとの間の種の差により異なり得ることを理解した上で、動物の前頭前皮質において測定することができる。遺伝子はなお対応物（counterparts）であってよく、場合により高い割合の同一性、例えば少なくとも75 %、85 %、90 %、95 %、又は98 %同一である。次いで、少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを、未治療の動物の前頭前皮質の少なくとも1つの遺伝子の対照発現レベルと比較することができ、この場合、対照発現レベルと比較した少なくとも1つの遺伝子のレベルの増加が、試験化合物が双極性障害治療剤であることの指標となる。細胞試験及び動物試験を組み合わせるとき、試験するバイオマーカー（単数又は複数）は異なっていてもよい。例えば、細胞アッセイは遺伝子発現に基づき、動物アッセイは少なくとも1つの代謝産物バイオマーカーに基づき、又はその逆もあってよい。特定の遺伝子又は対立遺伝子に応じて、スクリーニングの指標因子は発現の増減であり得る。
【００３１】
本発明のスクリーニング方法のいずれかを単一の試験化合物又は試験化合物の組合せを用いて実施することができる。例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又はそれ以上の試験化合物の組合せを使用することができる。1つ又は複数の試験化合物を、スクリーニングアッセイの一部として1つ又は複数の既知の双極性薬と組み合わせて使用することができる。試験化合物の組合せを、本発明のスクリーニングアッセイを用いて相乗効果について試験することができる。1つ又は複数の試験化合物と、1つ又は複数の既知の双極性薬との組合せを、本発明のスクリーニングアッセイを用いて相乗効果について試験することができる。相乗効果はいずれかの化合物を単独で使用する場合よりも大きい効果を指すことができる。相乗効果は添加剤を超えるものであってよく、例えば双極性障害を治療及び／又は予防する効果が試験化合物の個々の効果の合計を超えるものであってよい。試験化合物は、それ自体に双極性障害に対する効果はないが、このような化合物又は薬を組み合わせるとき、1つ若しくは複数の他の試験化合物又は1つ若しくは複数の既知の双極性薬の効能を向上させるものであってよい。
【００３２】
本発明はまた、以下を含み得る、双極性障害を予防及び／又は治療するための化合物又は化合物の組合せを同定する方法に関する。試験化合物を動物に投与することができる。イソクエン酸脱水素酵素の3α-サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現レベルを動物の前頭前皮質において測定することができる。発現レベルを、未治療の動物の前頭前皮質の少なくとも1つの遺伝子の対照発現レベルと比較することができる。対照発現レベルと比較した少なくとも1つの遺伝子のレベルの増加は、試験化合物が双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質であることの指標となり得る。動物を遺伝的に操作し、イソクエン酸脱水素酵素の3α-サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現を減少させることができる。本方法はまた、対照発現レベルと比較して少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを低下させる試験化合物を選択することを含むことができる。本方法は、双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質として試験化合物を同定することを更に含むことができる。
【００３３】
本発明は更に、以下を含み得る、双極性障害を予防及び／又は治療する化合物又は化合物の組合せを同定する方法に関する。真核生物細胞と培養液中の試験化合物とを接触させることができる。以下のバイオマーカー、イソクエン酸、シス−アコニット酸、ピルビン酸、N-アセチルグルタミン酸、2-オキソグルタル酸、β-アラニン、アルギニン、セリン、尿酸、及びクエン酸の少なくとも1つの量を細胞及び／又は培養液において測定することができる。少なくとも1つのバイオマーカーの量を未処理の真核生物細胞の培養液中の少なくとも1つのバイオマーカーの対照量と比較することができる。少なくとも1つのバイオマーカーの対照量と比較した、イソクエン酸量の低下、シス−アコニット酸量の低下、ピルビン酸量の低下、N-アセチルグルタミン酸量の低下、2-オキソグルタル酸量の低下、β-アラニン量の増加、アルギニン量の増加、セリン量の増加、尿酸量の低下、及びクエン酸量の増加は、試験化合物が双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質であることの指標となり得る。少なくとも1つのバイオマーカーはイソクエン酸を含むことができる。細胞を遺伝的に操作し、イソクエン酸脱水素酵素の3α−サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現を減少させることができる。本方法はまた、対照発現レベルと比較して特定の少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを増減させる試験化合物を選択することを含むことができる。本方法は、双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質として試験化合物を同定することを更に含むことができる。本発明の細胞ベースのアッセイは、細胞、細胞培養液、又はその両方からのサンプル採取を含むことができる。細胞を、個々の細胞、コロニー、組織、及び／又は器官として培養することができる。細胞及び細胞構築物は天然のものであってよく、及び／又は人工的に構築されたものであってよい。
【００３４】
本発明は、以下を含み得る、双極性障害を予防及び／又は治療するための化合物又は化合物の組合せを同定する方法に関する。試験化合物を動物に投与することができる。以下のバイオマーカー：動物から採取した脳脊髄液サンプルのイソクエン酸、動物から採取した脳脊髄液サンプルのシス−アコニット酸、動物から採取した血清サンプルのピルビン酸、動物から採取した血清サンプルのN-アセチルグルタミン酸、動物から採取した血清サンプルの2-オキソグルタル酸、動物から採取した血清サンプルのβ-アラニン、動物から採取した血清サンプルのアルギニン、動物から採取した血清サンプルのセリン、動物から採取した血清サンプルの尿酸、及び動物から採取した血清サンプルのクエン酸の少なくとも1つの量を測定することができる。少なくとも1つのバイオマーカーの量と未治療の動物から採取した対応するサンプルの少なくとも1つのバイオマーカーの対照量とを比較することができる。少なくとも1つのバイオマーカーの対照量と比較した、イソクエン酸量の低下、シス−アコニット酸量の低下、ピルビン酸量の低下、N-アセチルグルタミン酸量の低下、2-オキソグルタル酸量の低下、β-アラニン量の増加、アルギニン量の増加、セリン量の増加、尿酸量の低下、及びクエン酸量の増加が、試験化合物が双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質であることの指標となり得る。少なくとも1つのバイオマーカーはイソクエン酸を含むことができる。動物を遺伝的に操作し、イソクエン酸脱水素酵素の3α-サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現を減少させることができる。
【００３５】
本発明の方法は、任意の技法、装置、又はそれらの組合せを使用し、バイオマーカー、例えば、代謝産物及び／又は遺伝子発現を測定することができる。例えば、キャピラリー電気泳動飛行時間型質量分析（CE-TOFMS）及び／又は高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用し、代謝産物を測定することができる。代謝産物を、酵素結合免疫吸着法（ELISA）を用いて測定することができる。遺伝子発現を、例えばリアルタイム定量RT-PCR解析及び／又は遺伝子チップを用いることにより測定することができる。
【００３６】
本発明は本発明の1つ又は複数の方法を用いて双極性障害を予防及び／又は治療するために同定された化合物及び化合物の組合せを含む。化合物を1つ又は複数の追加の薬学的に許容される賦形剤とともに配合することができる。同定された化合物を対象に投与し、双極性障害を予防及び／又は治療することができる。双極性障害を予防又は治療することは、双極性障害の1つ又は複数の症状を除去及び／又は減弱させることを含むことができる。対象に同定された化合物を投与後、本発明の診断試験を行うことができる。本発明の方法は本発明の診断試験を行い、全般的な医薬化合物の効能を決定若しくは確定し、又は双極性障害を予防若しくは治療するときに特定の対象における医薬化合物の効能をサンプル採取し、若しくは追跡することができる。例えば、対象への双極性障害医薬の投与は、単回の測定においてサンプル採取し、又は1つ若しくは複数のバイオマーカーが経時的に増減するかどうかを決定するために経時的に追跡することができる。特定の医薬化合物が1つ又は複数のバイオマーカーを双極性障害に罹患していない対象のバイオマーカーのレベルに、又はレベルに向かって変更させない場合、代替の薬剤又は追加の薬剤を投与することができる。
【００３７】
本発明は、診断アッセイ又はスクリーニングアッセイに好適なキットを含む。例えば、キットは、本発明による1つ又は複数の方法を行うための説明書を含むことができる。キットは1つ又は複数の対照及び／又は対照データを含むことができる。キットは1つ又は複数の試験化合物又は候補化合物を含むことができる。キットは、双極性障害の治療又は予防時に使用する試験化合物をアッセイするときに使用する1つ又は複数の細胞型を含むことができる。キットはサンプルを保持及び／又は精製するための1つ又は複数の容器を含むことができる。キットは、1つ又は複数のバイオマーカーの検出及び定量を補助する1つ又は複数の試薬を含むことができる。例えば、キットは1つ又は複数の核酸を含有する、ELISA型アッセイ及び／又は遺伝子チップに好適なプレートを含むことができる。
【００３８】
本発明は、本発明の例示を目的とする以下の実施例により更に明確となる。
【００３９】
以下の実施例において、CE−TOFMSを用いて、気分安定型BD患者及び年齢を一致させた健常対照のCSFサンプルのメタボロミクスアッセイを行った。検死脳サンプルの遺伝子発現解析及びCSFメタボロミクスにより同定された物質に関連する遺伝子の遺伝子関連解析も行った。代謝産物に対する薬の効果を調べるため、リチウム（Li）又はバルプロ酸（VPA）を用いて長期間治療したラット由来のCSFサンプルのメタボロミクスによる特徴付けも行った。
【００４０】
ヒトサンプル由来のデータを平均値±標準偏差（SD）で表す。統計的解析はSASソフトウェアバージョン9.3（SASInstitute、ノースカロライナ州ケーリー）を用いて行った。対応のないt検定及びウィルコクソンの順位和検定を用いて対照群とBD群との間の代謝産物の解析が行った。ステップワイズ選択法を用いたロジスティック回帰モデルを多変量分析及び重回帰分析に使用した（Allenら、Technometrics. 1974; 16(1):125-127;及びMillerら、Chapman and Hall. 1974の記載に一致、それらの全体を引用することにより本明細書の一部をなす）。ホスマーレメショウ適合度検定を用いて、ロジスティック回帰モデルの内部検証を行い、0.1より大きいP値が良好に適合することを示し（Hunzikerら、Crit. Care Med. 2011;39(7):1670-1674の記載に一致、その全体を引用することにより本明細書の一部をなす）、性能をジャックナイフ法（測定値をn-1観測値から予測し、その予測された観測値を削除する性能評価法）により評価した（Wadeliusら、Blood. 2009;113(4):784-792の記載に一致、その全体を引用することにより本明細書の一部をなす）。マンホイットニーのU検定（両側）を使用し、対照群とBD群との間のACO遺伝子及びIDH遺伝子の発現レベルの変化を評価した。ラットデータを平均値±SDで表す。薬物治療の効果を決定するため、一元配置分散分析後、ポストホックダネットの検定を使用した。両側検定において、0.05未満のP値は統計的に有意であると考えられた。
【実施例１】
【００４１】
この実施例では脳脊髄液（CSF）の種々の代謝産物のレベルを使用し、ヒト患者における双極性障害（BD）の診断を予測することができることを例証する。例えば、イソクエン酸のレベルがBDと正の相関であることが認められた。
【００４２】
BD患者は、スウェーデン、ストックホルムの北ストックホルム精神科病院の双極性病棟の患者を登録した、セントゴラン双極性プロジェクトから動員された。精密検査及び診断評価は、それらの全体を引用することにより本明細書の一部をなす、Jakobssonら、Neuropsychopharmacology. 2014;39(10):2349-2356; Rydenら、J. Neural Transm. 2009;116(2):1667-1674;及びPaalssonら、Eur.Neuropsychopharmacol., 2015; 25(1):133-140の記載に合わせて行った。使用された主要な臨床評価手段は、双極性障害の体系化された治療向上プログラム（STEP-BD）のために開発された情動障害評価（ADE）（Sachsら、Biol. Psychiatry.2003;53(1):1028-1042の記載に一致、その全体を引用することにより本明細書の一部をなす）であった。全体の診断評価は、患者への面接、症例記録、及び可能な場合、近親者への面接を含む利用可能な情報源全てに基づいた。評価者間の先入観を取り除くため、入院時に利用可能な全ての情報に基づいた最良の推定診断決定は、双極性障害（BD）に特化した経験豊かな有資格の精神科医（n=2〜5）のコンセンサス委員会による診断症例会議にて行った。
【００４３】
全般的な選択基準は、1）18歳以上及び2）双極性スペクトラム障害（すなわち、I型、II型、及び特定不能）の精神障害の診断と統計マニュアル（DSM）-IV基準を満たすことであった。年齢、性別、生存期間中の躁／軽躁／鬱／発作合計の数、（最初の軽躁又は躁発作からの年数として定義された）疾病期間、体格指数（BMI）、及び精神障害発作の既往歴に関する情報が集められた。BDの重症度を臨床全般印象（CGI）評価尺度及び機能の全体的評価（GAF）を用いて評価した。倫理的な理由により、CSFサンプル採取時も患者は処方されている薬の摂取を継続した。
【００４４】
地域住民を対象とした対照をスウェーデン統計局（SCB）が無作為に選択し、郵送にて連絡した。予測回答率が1:7であるとして、登録した対象に対して7回の案内を送付した。送付された対照の14パーセントが案内に応じ、試験担当看護師による事前の電話でのスクリーニングを行い、重度の精神的衛生状態、神経学的疾患、及び物質乱用を除外した。適合者に1日包括的評価の予約を行い、このとき精神疾患簡易構造化面接法（M.I.N.I.）を用いて経験のある臨床医による精神医学面接を行い、精神障害を除外した（Sheehanら、J. Clin. Psychiatry. 1998;59(Suppl20):22-33の記載に一致、その全体を引用することにより本明細書の一部をなす）。物質乱用は、看護師による電話による面接時の飲酒習慣スクリーニングテスト（AUDIT）及び薬物使用習慣スクリーニングテスト（DUDIT）により、及び糖鎖欠損トランスフェリン（CDT）の血清レベルを決定することによりスクリーニングされた（Saundersら、Addiction. 1993; 88(6):791-804の記載に一致、その全体を引用することにより本明細書の一部をなす）。CDTにより明らかとなったアルコールの過剰摂取又は大量摂取を示す応答（週2回超、1回に付き時間当たり8を超える基準飲酒量）、及び／又は記憶喪失、及び／又は月に1回を超える制御不能により、このような個体を本試験から除外した。他の除外基準は、軽度片頭痛以外の神経学的病態、未治療の内分泌障害、妊娠、認知症、再発性鬱障害、及び重度のパーソナリティー障害の疑い（面接及びDSM用構造的臨床面接（SCID-II）スクリーンパーソナリティー評価に基づく）、及び第一度近親者における統合失調症又はBDの家族歴であった。
【００４５】
本試験は、ストックホルムの地域倫理委員会により承認され、最新のヘルシンキプロトコールに従い行った。全ての患者及び対照は、口頭及び書面にて承諾し、本試験に参加した。インフォームドコンセントは、気分正常期（すなわち、患者が鬱又は躁発作の基準を満たしていないときの期間中）に得られた。全ての患者からは、患者を登録した医師が決定したときに、完全なインフォームドコンセントが強制されることなく得ることができた。合計で54名の男性BD患者及び40名の男性健常対照が組み入れられた（表1）。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
参加者が気分正常であるときにCSFサンプル採取（腰椎穿刺）を行った。サンプル採取は、一晩絶食後の午前9:00〜10:00に行った。CSFを採取するため、くも膜下穿刺針をL3/L4又はL4/L5の隙間に挿入し、12mLのCSFの標準量をポリプロピレンチューブに採取し、勾配効果を回避するためゆっくり反転させ、1.0 mL〜1.6 mLの一定分量にてプロピレンチューブに分配した。一定分量のCSFサンプルを、スウェーデン、ストックホルムのカロリンスカ研究所のバイオバンクにて解析を待つ間-80℃にて保存した。同一の手法を対照に対して行った。サンプルを、メタボロミクス解析用に、ドライアイスにて凍結させてクーリエメールにて日本の千葉大学に送付するまで-80℃にて保存した。本試験は千葉大学医学研究科の研究倫理委員会により承認された。
【００４８】
健常対照及びBD患者のCSFサンプルのメタボロミクス解析がヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社（日本、山形）にてCE-TOFMSを用いて行った。本試験において、種々の経路（解糖系、ペントースリン酸経路、クエン酸回路、尿素回路、ポリアミン−クレアチン代謝経路、プリン代謝経路、グルタチオン代謝経路、ニコチンアミド代謝経路、コリン代謝経路、及び多様なアミノ酸代謝経路）からの主な116個の代謝化合物をメタボロミクス解析用に選択した（表2及び表3）。
【００４９】
【表２−１】
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【００５０】
【表２−２】
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【００５１】
【表２−３】
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【００５２】
【表２−４】
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【００５３】
【表３−１】
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【００５４】
【表３−２】
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【００５５】
CSFサンプルの容量（50 μL）を、内部標準物質を含有する450 μLのメタノールに添加し、混合させた。次いで、450 μLのクロロホルム及び200 μLのミリ−Q水を混合物に添加した。混合後、混合物を2300 ×g及び4℃にて5分間遠心分離させた。続いて、800 μLの上部の水性層を、ミリポア5-kDaのカットオフフィルタに通して9100 ×g及び4℃にて120分間遠心分離により濾過し、タンパク質を除去した。濾液を遠心分離により濃縮し、解析用に25 μLのミリ−Q水に再懸濁させた。
【００５６】
陽イオン化合物を、CE-TOFMSのポジティブモードにおいて（Agilent CE-TOFMSシステム器3号、溶解シリカ毛細管、内径50 μM×80 cm）、陰イオン化合物を、CE-MS/MS（Agilent CEシステム及びAgilent 6400トリプル四重極LC/MS器QqQ01号、溶解シリカ毛細管、内径50 μM×80 cm）のポジティブ及びネガティブモードにおいて、これまでに報告されている通りに測定した（Sogaら、Anal. Chem. 2000; 72(6):1236-1241;Sogaら、Anal Chem. 2002; 74(10):2233-2239; Sogaら、J. Proteome Res. 2003; 2(5):488-494、それらの全体を引用することにより本明細書の一部をなす）。CE-TOFMS及びCE-MS/MSにより検出されたピークを、自動集積ソフトウェア（MasterHands、慶応義塾大学、日本、鶴岡）（Sugimotoら、Metabolomics. 2009; 6(1):78-95、その全体を引用することにより本明細書の一部をなす）及びMassHunter Quantitative Analysis B.04.00、AgilentTechnologies、米国カルフォルニア州サンタクララ）を用いて抽出し、m/z、泳動時間（MT）、及びピーク面積を含むピークの情報を得た。TOFMSにより決定されたCE及びm/z値のMTに基づきHMT代謝産物データベースから推定の代謝産物を用いて、ピークを注釈付けした。ピークの注釈付けの許容差範囲は、MTに対して±0.5分及びm/zに対して±10 ppmにて構成された。さらに、代謝産物の濃度を内部標準物質の面積に対する各代謝産物のピーク面積を正規化することにより、及び3点補正により得られた標準曲線を使用することにより算出した。
【００５７】
このようにして40名の健常対照及び54名のBD患者由来のCSFサンプルのメタボロミクス解析が行った。年齢及びBMIにおいて健常対照とBD患者との間の差はなかった（表1）。表1はBD患者の患者背景（demographics）及び臨床的特徴を示す。116種の主要な代謝産物質を種々の経路において測定し、そのうち72種がCSFにおいて検出され、残りの44種は検出限界以下であった（表2及び表3）。健常対照とBD患者との有意差を示す物質を選択するために、まず対応のないt検定とウィルコクソンの順位和検定との両方が、健常対照とBD患者との間で行った。尿酸、フルクトース6-リン酸、リボース5-リン酸、CoA、2-オキソイソ吉草酸、乳酸（乳酸塩）、ピルビン酸（ピルビン酸塩）、クエン酸（クエン酸塩）、イソクエン酸（イソクエン酸塩）、シス−アコニット酸（シス−アコニット酸塩）、尿素、アラニン、及びトリプトファンを含む13種の化合物が有意に変化した（表4）。ピルビン酸、クエン酸、イソクエン酸、シス−アコニット酸は、クエン酸回路（クレブス回路としても知られている）の分子である（図1）。
【００５８】
【表４】
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【００５９】
多変量ロジスティック回帰分析を行い、13種の代謝産物とBDとの間の関連を評価した。ステップワイズ選択−排除法を使用し、有意水準を5 %に設定した。少なくとも1つのパラメータであるイソクエン酸は独立してBDと関連があった。ジャックナイフ法を用いた交差検証試験の後、モデルの感度は79.6 %であり、特異度は72.5 %であった。ホスマーレメショウ適合度統計（ロジスティック回帰モデルの内部検証）はDFが8の12.1450であり（P=0.1449）、モデルが良好に適合することが示された（表5）。
【００６０】
【表５】
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【００６１】
イソクエン酸がBD患者の臨床データ又は薬による影響を受けているかを検討するため、追加の重回帰分析を行った。イソクエン酸がロジスティック回帰後のBD患者のCSFにおいて有意に（P<0.0001）変化したことから、次の解析では、イソクエン酸に焦点を当てた。本試験の主要な所見は、BD患者のイソクエン酸のCSFレベルが薬に対して関連のない健常対照のものに比べ有意に高値であったことであった。これは、BD患者のイソクエン酸のCSFレベルの増加を示す最初の試験であると思われる。
【実施例２】
【００６２】
この実施例では、血清の種々の代謝産物のレベルを使用し、ヒト患者における双極性障害（BD）の診断の予測することができることを例証する。試験は他に明記されない限り実施例1に記載の通りに行った。
【００６３】
39名の健常対照及び54名のBD患者の血清サンプルのメタボロミクス解析を行った。年齢及びBMIにおいて、健常対照とBD患者との差はなかった（表6）。表6はBD患者の患者背景及び臨床的特徴を示す。種々の経路の116種の主要な代謝産物の物質を測定し、そのうちの82種が血清にて検出され、残りの34種が検出限界以下であった（表7及び表8）。健常対照とBD患者との有意な差を示す物質を選択するため、対応のないt検定とウィルコクソンの順位和検定との両方が、健常対照とBD患者との間で最初に行った。尿酸、CoA、グリセロール3-リン酸、ピルビン酸（ピルビン酸塩）、N-アセチルグルタミン酸、2-ヒドロキシグルタル酸、2-オキソグルタル酸、クエン酸（クエン酸塩）、シス−アコニット酸（シス−アコニット酸塩）、尿素、β-アラニン、セリン、トリプトファン、オルニチン、グルタミン酸（グルタミン酸塩）、及びアルギニンを含む18種の化合物が有意に変化した（表8）。
【００６４】
【表６】
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【００６５】
【表７−１】
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【００６６】
【表７−２】
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【００６７】
【表７−３】
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【００６８】
【表８】
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【００６９】
多変量ロジスティック回帰分析を行い、18種の代謝産物とBDとの間の関連を評価した。ステップワイズ選択−排除法を使用し、有意水準を5 %に設定した。ピルビン酸、N-アセチルグルタミン酸、2-オキソグルタル酸、β-アラニン、セリン、及びアルギニンの少なくとも6種の化合物が独立してBDと関連があった（表9）。ジャックナイフ法を用いた交差検証試験の後、モデルの感度は85.2 %であり、特異度は76.9 %であった。ホスマーレメショウ適合度統計値（ロジスティック回帰モデルの内部検証）はDFが8の3.6123（P=0.8903）であり、モデルが良好に適合することが示された。
【００７０】
【表９】
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【実施例３】
【００７１】
この実施例では、脳脊髄液（CSF）と血清との両方の種々の代謝産物のレベルを使用し、ヒト患者の双極性障害（BD）の診断を予測することができることを例証する。例えば、イソクエン酸のレベルは、BDの正の相関であることが認められた。この実施例は、実施例1及び実施例2の結果に基づくものである。
【００７２】
CSF及び血清サンプルのマーカーの併用の評価、つまり多変量ロジスティック回帰分析を行い、代謝産物とBDとの間の関連を評価した。ステップワイズ選択−排除法を使用し、有意水準を5 %に設定した。イソクエン酸（イソクエン酸塩；CSF）、シス−アコニット酸（CSF）、尿酸（血清）、クエン酸（血清）、及びセリン（血清）の少なくとも5種の化合物は独立して、BDと関連があった（表10）。ジャックナイフ法を用いた交差検証試験の後、モデルの感度は88.89 %であり、特異度は82.50 %であった。ホスマーレメショウ適合度統計値（ロジスティック回帰モデルの内部検証）はDFが8の13.7635（P=0.0881）であり、モデルが良好に適合することが示された。
【００７３】
【表１０】
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【実施例４】
【００７４】
この実施例では、イソクエン酸代謝産物の基質、生成物、及び／又は酵素をバイオマーカーとして、及び／又はスクリーニング用に使用することができることを例証する。この実施例はまた、イソクエン酸脱水素酵素3（IDH3）のサブユニットを治療剤並びにバイオマーカー及びスクリーニングツールとして使用することができることを例証する。
【００７５】
ACO1及びACO2は、それぞれ細胞質ゾル及びミトコンドリアマトリクスに局在する。ACO1は細胞質ゾルにおいてクエン酸及びイソクエン酸を相互変換し、細胞がIDH1によってイソクエン酸から生成されるNADPHの量の平衡を保つことができるようにさせる。ACO2は、クエン酸回路のシス−アコニット酸を介してクエン酸をイソクエン酸に触媒する酵素である。IDH1は細胞質ゾルに局在し、IDH2及びIDH3はミトコンドリアマトリクスに見られる。IDH1酵素及びIDH2酵素は、イソクエン酸をα-ケトグルタル酸（2-オキソグルタル酸（2-OG）としても知られる）に変換するレドックス反応を触媒し、その間にNADPをNADPHに還元し、CO2を放出する。ミトコンドリアIDH3酵素は、クエン酸回路の必須の構成要素であり、イソクエン酸のα-ケトグルタル酸への酸化を触媒し、NADからNADHに還元させる。ミトコンドリア膜の電子移動連鎖（ETC）は、レドックス反応を介した電子供与体から電子受容体へと電子を移動させる一連の複合体I〜Vである。
【００７６】
背外側前頭前皮質のIDH及びACO遺伝子の発現を検討した。ブロードマン領野由来の検死脳サンプル46例をスタンリー医学研究所から得た（Kimら、Schizophr Bull. 2009;35(6):1031-1033;及びKimら、Neuropsychopharmacology. 2010;35(2):473-482の記載に一致、それらの全体を引用することにより本明細書の一部をなす）。脳サンプルを35名のBD患者（男性17名、女性18名；年齢平均値±SD、45.3±10.5歳；PMI、37.9±18.3時間；脳内pH、6.4±0.3）、及び対照35名（男性26名、女性9名；年齢平均値±SD、44.2±7.6歳；PMI、29.4±12.9時間；脳内pH、6.6±0.3）から採取した。診断はDSM-IV基準に従い行った。年齢、PMI、及びサンプルpHにおいて、双極性障害群と対照群との間に有意な背景的な差はなかった。全てのBD患者は、疾患を治療するための治療剤の服用歴があった。
【００７７】
リアルタイム定量RT-PCR解析はヒトとラットとの両方のサンプルにおいて、ABI7900HT Fast Real-Time PCR System（AppliedBiosystems、カルフォルニア州フォスターシティ）を用いて行った。7つの遺伝子（ACO1、ACO2、IDH1、IDH2、IDH3A、IDH3B、IDH3G）用のTaqManプローブ及びプライマー並びにGAPDH（内部対照物質）（表11）は、TAQMAN（商標）遺伝子発現アッセイプロダクト（Applied Biosystems）のものであった。全てのリアルタイム定量RT-PCR反応は、標準曲線法に基づき3連で行った（Yamadaら、HumGenet. 2012;131(3):443-451の記載に一致、その全体を引用することにより本明細書の一部をなす）。
【００７８】
【表１１】
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【００７９】
イソクエン酸は、シス−アコニット酸を介しその酵素であるアコニターゼ（ACO：アコニット酸ヒドラターゼ）によってクエン酸から合成される（図1）。アコニターゼの2つのアイソザイム：クエン酸回路において機能するミトコンドリア酵素（m-アコニターゼ：ACO2）及び鉄代謝の制御の役割も果たす二機能性細胞質ゾル酵素（c-アコニターゼ／IRP1: ACO1）が哺乳類動物細胞に存在する。イソクエン酸脱水素酵素（IDH）は、イソクエン酸の酸化的脱炭酸を触媒し、α-ケトグルタル酸（2-オキソグルタル酸としても知られる）及びCO2を生成する（図1）。ヒトにおいて、IDHは3つの形態にて存在する。2つのアイソフォームであるIDH1及びIDH2は、癌において変異し、更に代謝及びグルコース感知（IDH1）並びに酸化呼吸の調節（IDH2）を含めてこの触媒プロセスを利用する。IDH3は主にクエン酸回路におけるアロステリックに調節された、酵素を律速する工程として機能し、この間にミトコンドリアにおいてNAD+がNADHに変換される。IDH3は2つのα-サブユニット（IDH3A）と、1つのβ-サブユニット（IDH3B）と、1つのγ-サブユニット（IDH3G）とを含むヘテロ四量体である（図1）。
【００８０】
BD患者（N＝35）及び対照（N=35）の背外側前頭前皮質におけるACO遺伝子及びIDH遺伝子のmRNAレベルを試験した。BD患者の背外側前頭前皮質のACO1（P＝0.5008）及びACO2（P＝0.6454）のmRNAレベルは対照のものと差はなかった。BD群のIDH3A（P＝0.0017）及びIDH3B（P＝0.0208）のmRNAレベルは、対照群のものに比べ有意に低いものであった（表12）。対照的に、IDH3G（P＝0.2287）、IDH1（P＝0.7302）、及びIDH2（P＝0.2858）のmRNAレベルは2群間において差はなかった（表12）。
【００８１】
【表１２】
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【００８２】
さらに、BD患者の背外側前頭前皮質のIDH3A遺伝子及びIDH3B遺伝子のmRNAレベルは、対照サンプルのものに比べ有意に低いものであった。
【００８３】
ミトコンドリアに局在するIDH3酵素は、酸化的リン酸化に使用されるNADHを生成するクエン酸回路の調節に中心的な役割を果たす（図1）。クエン酸回路において、NAD-依存性IDH3は、イソクエン酸のα-ケトグルタル酸への変換、つまり同時にNAD+をNADHに変化させる回路の必須の反応を触媒する。この工程及びクエン酸回路の他の工程において生成されたNADHを使用し、エネルギー源として細胞内で広く使用される分子であるアデノシン三リン酸（ATP）を生成する。ミトコンドリアの酸化的リン酸化は、主要なATP生成経路でもあり、これにより細胞のエネルギー消費全体の95%超を供給することができる。
【００８４】
本試験では特筆すべきことにBDの背外側前頭前皮質のIDH3A及びIDH3BのmRNAレベルの低下を認めた。この結果は、脳内のIDH3A及びIDH3Bの活性の低下がBDの病因に重要な役割を果たし得ることを示す。クエン酸回路のIDH3の中心的な役割に基づき（図1）、これらの実施例では、BDのミトコンドリア機能における異常性を例証している。これらの結果は、BDの病因においてIDH3A及びIDH3Bによるイソクエン酸の代謝の異常性における証拠を提供する。それゆえ、クエン酸回路のミトコンドリアIDH3は、BDの治療標的であるとして例証される。
【実施例５】
【００８５】
BD患者及び対照のIDH遺伝子及びACO遺伝子の遺伝関連解析を行った。この実施例では、イソクエン酸代謝の基質、生成物、及び／又は酵素を関連の代謝遺伝子の任意の具体的な一塩基多型（SNP）とは独立したバイオマーカー及び／又はスクリーニングツールとして使用することができることを例証する。
【００８６】
BD対象は3つの経路から集められた。BD例（N=1416）はスウェーデン双極性障害品質保証レジストリ（the Swedish National Quality Assurance Registry for Bipolar Disorder）（BipolaaR）を用いて識別した（Karantiら、J. Affect. Disord. 2014; 174:303-309;及びSellgrenら、Acta Psychiatr. Scand. 2011; 124(6):447-453の記載に一致、それらの全体を引用することにより本明細書の一部をなす）。追加の対象をスウェーデン北ストックホルム精神科病院の双極性障害外来病院から、BDについての医師からの照会に従い動員した（N=315）。使用された診断手段は、スウェーデンにおいて情動障害評価に適応するものであり（Rydenら、Acta Psychiatr Scand. 2009;120(3):239-246の記載に一致、その全体を引用することにより本明細書の一部をなす）、SCIDの情動モジュールを含む。更なる576例のBDをストックホルム群管轄地域から動員し、診断をDSM-IV基準に従い行った。対照となる対象も登録者を介して選択され、年齢、性別及び在住国をグループ単位で一致させ、精神医学的な診断をされた入院歴はなかった。全ての対象は18歳以上であり、参加に当たり書面によるインフォームドコンセントを得た。試験はまた、カロリンスカ研究所の倫理委員会により承認を得た。
【００８７】
カロリンスカ研究所にて標準的な方法を用いて、血液サンプルが得られ、DNAを全血から抽出した。サンプルは2つのアレイの内の1つ、サンプル1にはIllumina OmniExpress（Illumina, Inc.、米国カルフォルニア州サンディエゴ）又はサンプル2にはAffymetrix 6.0（Affymetrix、米国カルフォルニア州サンタクララ）を用いて遺伝子型を決定した。全ての遺伝子型決定をハーバード及びMITのブロード研究所にて行い、遺伝子型を、Birdsuiteアルゴリズムを用いて判定した（Kornら、Nat Genet. 2008; 40(10):1253-1260の記載に一致、その全体を引用することにより本明細書の一部をなす）。対象に対する品質対照除外評価基準として、遺伝子型判定率95 %未満、多次元尺度構成法を介した血統外れ値（ancestry outliers）；無作為に選択された、同系性の高い任意の対象組のメンバー（pi-hat値.20超）；及び疑似サンプル誤差又は混入があった。SNPはハーディーワインベルク平衡から著しく逸脱したもの（P<1×10-6）、マイナー対立遺伝子頻度が低いもの（1 %未満）、及びPLINKの「mishap」試験を用いた隣接するハプロタイプ背景から推察されたノンランダム遺伝子型欠損（P<1×10-10）を除外した。プレートベースの関連性がP<1×10-6であることは、他の全てのプレートに対する各プレートの対立遺伝子頻度の比較に基づき、ノンランダムプレート欠損の証拠として採用され、プレート毎を基本に除外された。品質管理工程の後、サンプル1は1415症例及び1271対照からなり、サンプル2は836症例及び2093対照が含まれた。
【００８８】
遺伝子型を、BEAGLE（Browningら、Am. J. Hum. Genet. 2007; 81(5):1084-1097の記載に一致）を用いてHapMap3の常染色体遺伝子型データに入力した（InternationalHapMap 3 Consortium、Altshulerら、Nature.2010;467(7311):52-58の記載に一致）。全ての関連の解析は、PLINKのロジスティック回帰を用いて行った（Purcellら、Am. J. Hum. Genet. 2007; 81(3):559-575の記載に一致）。多次元尺度構成法は設定した全データに対して行われ、それぞれの回収サンプルを、第1の4つの多次元尺度構成法の構成要素を共変量として用いて個別に解析し、集団の部分構造用に管理した。
【００８９】
ACO遺伝子及びIDH遺伝子の遺伝子関連解析は、BD患者（サンプルセット1：n=1415、サンプルセット2：n=836）及び対照（サンプルセット1：n=1271、サンプルセット2：n=2093）について行った。全てのマーカーに対する判定率は98 %超であり、ハーディーワインベルク平衡からの著しい逸脱は認められなかった。試験した全ての一塩基多型（SNP）を通して、ACO1遺伝子及びIDH2遺伝子内のいくつかのSNPには名義的有意性が得られ、多重検定の補正後に依然として有意なものはなかった（表13）。
【００９０】
【表１３−１】
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【００９１】
【表１３−２】
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【００９２】
【表１３−３】
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【００９３】
エピスタシス試験も直接の遺伝子型決定マーカーを用いてサンプル毎に個別にPLINKにおいて行った。IDH遺伝子及びACO遺伝子のセット内でのマーカー間の相互作用を試験し、サンプル1において272の試験及びサンプル2において152の試験を得た。エピスタシス試験は、2つのサンプルセットにおいて個別に行った。両方のサンプルセットにおける強制的な相互作用をACO1遺伝子及びIDH2遺伝子におけるマーカー間にて検出した（サンプルセット1：rs10970986及びrs2970357においてP=0.0065；サンプルセット2：rs13302577及びrs2970359においてP=0.0025）（表14）。
【００９４】
【表１４】
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【００９５】
イソクエン酸代謝の変更は、主要な遺伝的変化から生じないと思われ、これはACO遺伝子及びIDH遺伝子のSNPがスウェーデン人集団におけるBDと関連がなかったためであった。
【実施例６】
【００９６】
ラットCSFレベルにおけるリチウム（Li）及びバルプロ酸（VPA）の効果をこの実施例において試験した。この実施例では、本発明のバイオマーカーを、対象が既存の双極性障害薬を服用しているかに関係なく使用することができることを例証する。
【００９７】
イソクエン酸等の代謝産物に対する薬の効果を調べるために、Li又はVPAの長期間（4週間）の治療を受けたラットのCSFサンプルのメタボロミクス解析を行った。いくつかの経路からの116種の主要な代謝産物のCSF濃度を測定した。64種の物質がラットCSF内にて検出された。6週齢の雄のSprague-Dawleyラット（日本エスエルシー株式会社、日本、静岡）を本試験に用いた。全てのラットをケージ当たり3匹の群にて、23℃±2℃及び60 %±10 %の湿度、12／12時間の明／暗サイクル（午前7時に点灯）にて維持された部屋にて飼育した。ラットに飼料及び水を自由に摂取させた。動物の管理及び使用は、大塚製薬株式会社（日本、徳島）の動物実験委員会のガイドラインに従い行った。動物を、4週間（1日目〜28日目）の、飲料水を介して炭酸リチウムを摂取する処理群（Li；600 mg/L、和光純薬工業株式会社、日本、大阪）又はバルプロ酸ナトリウム塩を摂取する処理群（VPA：4 g/L、シグマ−アルドリッチ、日本、東京）、及びベヒクル（水）摂取の対照群の3群（n=5〜6）に分けた。飲料水を1週間に2回交換した。Li及びVPAの用量をこれまでに報告された用量に基づき選択した（Talabら、Eur J Pharmacol. 2010;647(1-3):171-177；及びNilesら、Int J Neuropsychopharmacol. 2012;15(9):1343-1350の記載に一致、それらの全体を引用することにより本明細書の一部をなす）。全ての動物をCSFサンプル採取後30日目に断頭し、脳領域（前頭前皮質及び海馬）を氷上にて迅速に切除した。ラットのCSFサンプルのメタボロミクス解析を本明細書に記載の通りに行った。
【００９８】
Li治療は、コハク酸及びアルギニノコハク酸のCSFレベルを有意に増加させた。一方、VPA治療は、トレオニン、グルタミン、アルギニン、トレプトファン、及びアルギノコハク酸のCSFレベルを有意に変化させた（表15）。したがって、ラットのイソクエン酸のCSFレベルは、長期間のLi治療又はVPA治療により変化しなかった。
【００９９】
【表１５−１】
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【０１００】
【表１５−２】
0006742591.tif 000025
【０１０１】
【表１５−３】
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【実施例７】
【０１０２】
ラット血清レベルに対するリチウム（Li）及びバルプロ酸（VPA）の効果を本実施例において検討した。本実施例では、本発明のバイオマーカーを、対象が既存の双極性障害薬を摂取しているかに関わらず使用することができることを例証する。
【０１０３】
ピルビン酸、N-アセチルグルタミン酸、2-オキソグルタル酸、β-アラニン、セリン、及びアルギニン等の6種の代謝産物に対する薬の効果を調べるために、長期間（4週間）のLi治療又はVPA治療を受けたラットの血清サンプルのメタボロミクス解析を行った。いくつかの経路からの116種の主要な代謝産物の血清濃度を測定した。73種の物質がラット血清において検出された。上記の6種の代謝産物のうち、Li治療は2-オキソグルタル酸の血清レベルを有意に増加させた。したがって、ラットのピルビン酸、N-アセチルグルタミン酸、β-アラニン、セリン、及びアルギニンの血清レベルは、長期間のLi治療又はVPA治療により変化しなかった（表16）。
【０１０４】
実施例6及び実施例7の結果に基づき、長期間（4週間）のLi治療又はVPA治療は、ラットのイソクエン酸のCSFレベル又はラット脳の前頭前皮質及び海馬のAco1、Aco2、Idh3a、及びIdh3bのmRNAの発現を変化させず、Li及びVPAは脳内のイソクエン酸の合成及び代謝に影響を与えなかったことを示唆した。それゆえ、これらの気分安定剤がBD患者のイソクエン酸のCSFレベルに影響を与えているとは考えにくい。
【０１０５】
【表１６−１】
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【０１０６】
【表１６−２】
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【０１０７】
【表１６−３】
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【０１０８】
【表１６−４】
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【実施例８】
【０１０９】
ラット脳のAco1遺伝子、Aco2遺伝子、Idh3a遺伝子、及びIdh3b遺伝子の発現に対するリチウム（Li）及びバルプロ酸（VPA）の効果を検討した。この実施例ではイソクエン酸代謝の基質、生成物、及び／又は酵素を、対象が既存の双極性障害薬を服用しているかに関わらず、バイオマーカーとして及び／又はスクリーニング用に使用することができることを例証する。この実施例ではまた、イソクエン酸脱水素酵素3（IDH3）のサブユニットを、対象が既存の双極性障害薬を服用しているかに関わらず、治療標的、並びにバイオマーカー及びスクリーニングツールとして使用することができることも例証する。
【０１１０】
前頭前皮質及び海馬を氷上で迅速に切除し、RNA単離、cDNA合成、及びポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅法に使用するまで、4℃にてRNA later（AppliedBiosystems）に保存した。全RNAを製造業者の説明書に従い、RNeasy Lipid Tissue Miniキット（QIAGEN）を用いて抽出した。RNAの収率及び完全性をNanodrop（NanoDrop Technologies）を用いて評価した。全RNAの逆転写がSUPERSCRIPT VILO cDNA合成キット（Invitrogen）を用いて行った。定量PCRにおいて、ラットIdh3A（Rn00586270_m1）、Idh3B（Rn00504589_g1）、Aco1（Rn00569045_m1）、Aco2（Rn00577876_m1）、及びGapdh（Rn01775763_g1）のcDNAを市販のTaqManアッセイ（Applied Biosystems）を用いてABI 7500 Fast Real-Time PCR system（AppliedBiosystems）にて増幅させた（表17）。反応を3連行った。全ての反応をGapdhに対して正規化し、対照と比較した相対的発現変化として表した。
【０１１１】
【表１７】
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【０１１２】
前頭前皮質及び海馬のAco1、Aco2、Idh3a、及びIdh3bのmRNAレベルは、Li治療又はVPA治療によって変化しなかった（表18）。これらの結果は、長期間のLi治療及びVPA治療がラットの前頭前皮質及び海馬のAco1、Aco2、Idh3a、及びIdh3bにおけるmRNAの発現に影響を与えなかったことを示す。
【０１１３】
【表１８】
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【０１１４】
本発明は、任意の順序及び／又は任意の組合せでの以下の態様／実施形態／特徴を包含する。
1.本発明は、対象の双極性障害の素因を診断し、診断の確定をし、又は決定する方法であって、
以下のバイオマーカー、
対象から採取した脳脊髄液サンプルのイソクエン酸、
対象から採取した脳脊髄液サンプルのシス−アコニット酸、
対象から採取した血清サンプルのピルビン酸、
対象から採取した血清サンプルのN-アセチルグルタミン酸、
対象から採取した血清サンプルの2-オキソグルタル酸、
対象から採取した血清サンプルのβ-アラニン、
対象から採取した血清サンプルのアルギニン、
対象から採取した血清サンプルのセリン、
対象から採取した血清サンプルの尿酸、及び、
対象から採取した血清サンプルのクエン酸の少なくとも1つの量を測定することと、
少なくとも1つのバイオマーカーの量と双極性障害ではない対象から採取した対応するサンプルの少なくとも1つのバイオマーカーの対照量とを比較することとを含み、
少なくとも1つのバイオマーカーの対照量と比較した、イソクエン酸量の増加、シス−アコニット酸量の増加、ピルビン酸量の増加、N-アセチルグルタミン酸量の増加、2-オキソグルタル酸量の増加、β-アラニン量の低下、アルギニン量の低下、セリン量の低下、尿酸量の増加、及びクエン酸量の低下が、対象が双極性障害であり、又は双極性障害の素因を有することの指標となる、方法に関する。
2.少なくとも1つのバイオマーカーが対象から採取した脳脊髄液サンプルのイソクエン酸を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
3.少なくとも1つのバイオマーカーが対象から採取した血清サンプルのセリンを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
4.少なくとも1つのバイオマーカーが脳脊髄液から採取したバイオマーカーの少なくとも1つと血清から採取したバイオマーカーの少なくとも1つとを組み合わせて含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
5.バイオマーカーの少なくとも2つを組み合わせて測定する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
6.バイオマーカーの少なくとも5つを組み合わせて測定する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
7.以下のバイオマーカー；
対象から採取した脳脊髄液サンプルのイソクエン酸、
対象から採取した脳脊髄液サンプルのシス−アコニット酸、
対象から採取した血清サンプルのセリン、
対象から採取した血清サンプルの尿酸、及び、
対象から採取した血清サンプルのクエン酸を組み合わせて測定する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
8.以下のバイオマーカー；
対象から採取した血清サンプルのピルビン酸、
対象から採取した血清サンプルのN-アセチルグルタミン酸、
対象から採取した血清サンプルの2-オキソグルタル酸、
対象から採取した血清サンプルのβ-アラニン、
対象から採取した血清サンプルのアルギニン、及び、
対象から採取した血清サンプルのセリンを組み合わせて測定する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
9.対象から脳脊髄液を採取すること、対象から血清を採取すること、又はその両方を更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
10.対象が気分正常であるときに採取が行われる、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
11.対象が少なくとも1つの双極性発作、少なくとも1つの躁発作、少なくとも1つの軽躁発作、少なくとも1つの鬱発作、又はそれらの任意の組合せを有している、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
12.バイオマーカーに基づかない、双極性障害の第2の診断テストを行うことを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
13.双極性障害が双極性障害I型、双極性障害II型、急速交代型双極性障害、特定不能の双極性障害、気分循環症、又はそれらの任意の組合せである、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
14.少なくとも1つの双極性薬を対象に投与することを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
15.少なくとも1つの双極性薬がリチウム、バルプロ酸、カルバマゼピン、オクスカルバゼピン、ラモトリギン、ルラシドン、ジバルプロエクス、若しくは任意のそれらの塩、又はそれらの任意の組合せを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
16.少なくとも1つの双極性薬を測定及び比較の前、測定及び比較の後、又はその両方に投与する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
17.本発明は更に、双極性障害を予防及び／又は治療するための化合物を同定する方法であって、
真核生物細胞と試験化合物とを接触させることと、
細胞内のイソクエン酸脱水素酵素の3α-サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現レベルを測定することと、
発現レベルと未処理の真核生物細胞の遺伝子の対照発現レベルとを比較することとを含み、対照発現レベルと比較して少なくとも1つの遺伝子の発現レベルの増加が、試験化合物が双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質であることの指標となる、方法に関する。
18.処理及び未処理の真核生物細胞が哺乳類動物の細胞である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
19.処理及び未処理の真核生物細胞がヒト細胞である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
20.処理及び未処理の真核生物細胞がニューロン、グリア細胞、又はその両方を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
21.処理及び未処理の真核生物細胞を遺伝的に操作し、イソクエン酸脱水素酵素の3α-サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現を減少させる、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
22.試験化合物が双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質であることを決定することと、
試験化合物を動物に投与することと、
動物の前頭前皮質における、イソクエン酸脱水素酵素の3α-サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現レベルを測定することと、
発現レベルと未治療の動物の前頭前皮質の少なくとも1つの遺伝子の対照発現レベルとを比較することとを更に含み、対照発現レベルと比較した少なくとも1つの遺伝子のレベルの増加が、試験化合物が双極性障害治療剤であることの指標となる、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
23.対照発現レベルと比較して少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを低下させた試験化合物を選択することと、
双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質として試験化合物を同定することとを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
24.同定した化合物を対象に投与することを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
25.対象が双極性障害又は双極性障害の素因を有すると診断されている、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
26.対象由来のサンプルの少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定することと、
サンプルの少なくとも1つのバイオマーカーの量と少なくとも1つのマーカーの対照量とを比較することとを更に含み、少なくとも1つのバイオマーカーの量の増減が、双極性障害を治療又は予防していることの指標となる、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
27. 本発明は更に、双極性障害を予防及び／又は治療するための化合物を同定する方法であって、
試験化合物を動物に投与することと、
動物の前頭前皮質におけるイソクエン酸脱水素酵素の3α-サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現レベルを測定することと、
発現レベルと未治療の動物の前頭前皮質の少なくとも1つの遺伝子の対照発現レベルとを比較することとを含み、対照発現レベルと比較した少なくとも1つの遺伝子のレベルの増加が、試験化合物が双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質であることの指標となる、方法に関する。
28.動物を遺伝的に操作し、イソクエン酸脱水素酵素の3α-サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現を減少させる、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
29.動物が非ヒト動物である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
30.対照発現レベルと比較して少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを減少させた試験化合物を選択することと、
双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質として試験化合物を同定することとを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
31.本発明は更に、双極性障害を予防及び／又は治療するための化合物を同定する方法であって、
真核生物細胞と培養液中の試験化合物とを接触させることと、
培養液中の以下のバイオマーカー、イソクエン酸、シス−アコニット酸、ピルビン酸、N-アセチルグルタミン酸、2-オキソグルタル酸、β-アラニン、アルギニン、セリン、尿酸、及びクエン酸の少なくとも1つの量を測定することと、
少なくとも1つのバイオマーカーの量と未処理の真核生物細胞の培養液中の少なくとも1つのバイオマーカーの対照量とを比較することとを含み、少なくとも1つのバイオマーカーの対照量と比較した、イソクエン酸量の低下、シス−アコニット酸量の低下、ピルビン酸量の低下、N-アセチルグルタミン酸量の低下、2-オキソグルタル酸量の低下、β-アラニン量の増加、アルギニン量の増加、セリン量の増加、尿酸量の低下、及びクエン酸量の増加が、試験化合物が双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質であることの指標となる、方法に関する。
32.少なくとも1つのバイオマーカーがイソクエン酸を含み、細胞を遺伝的に操作し、イソクエン酸脱水素酵素の3α -サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現を減少させる、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
33.対照発現レベルと比較して特定の少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを増減させる試験化合物を選択することと、
双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質として試験化合物を同定することとを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
34.本発明は、双極性障害を予防及び／又は治療するための化合物を同定する方法であって、
試験化合物を動物に投与することと、
以下のバイオマーカー、
動物から採取した脳脊髄液サンプルのイソクエン酸、
動物から採取した脳脊髄液サンプルのシス−アコニット酸、
動物から採取した血清サンプルのピルビン酸、
動物から採取した血清サンプルのN-アセチルグルタミン酸、
動物から採取した血清サンプルの2-オキソグルタル酸、
動物から採取した血清サンプルのβ-アラニン、
動物から採取した血清サンプルのアルギニン、
動物から採取した血清サンプルのセリン、
動物から採取した血清サンプルの尿酸、及び、
動物から採取した血清サンプルのクエン酸の少なくとも1つの量を測定することと、
少なくとも1つのバイオマーカーの量と未治療の動物から採取した対応するサンプルの少なくとも1つのバイオマーカーの対照量とを比較することとを含み、少なくとも1つのバイオマーカーの対照量と比較した、イソクエン酸量の低下、シス−アコニット酸量の低下、ピルビン酸量の低下、N-アセチルグルタミン酸量の低下、2-オキソグルタル酸量の低下、β-アラニン量の増加、アルギニン量の増加、セリン量の増加、尿酸量の低下、及びクエン酸量の増加が、試験化合物が双極性障害を予防及び／又は治療するための候補物質であることの指標となる、方法に関する。
35.少なくとも1つのバイオマーカーがイソクエン酸を含み、動物を遺伝的に操作し、イソクエン酸脱水素酵素の3α -サブユニット遺伝子、イソクエン酸脱水素酵素の3β-サブユニット遺伝子、又はその両方の発現を減少させる、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
【０１１５】
本発明は、文及び／又は段落に記載のような上記及び／又は下記のこれらの様々な特徴又は実施形態の任意の組合せを包含し得る。本明細書に開示される特徴の任意の組合せは本発明の一部とみなされ、組合せ特徴に関しては限定されないことが意図される。
【０１１６】
出願人は、本開示において全ての引用された参考文献の全内容を具体的に援用する。さらに、量、濃度、又は他の値若しくはパラメータが、範囲、好ましい範囲、又は好ましい上限値及び好ましい下限値の列挙のいずれかとして与えられる場合、これは、範囲が別々に開示されているかどうかにかかわらず、任意の上限範囲又は好ましい値と任意の下限範囲又は好ましい値の任意の対により形成される全ての範囲を具体的に開示しているものと理解される。本明細書において数値範囲が列挙される場合、特に明記されない限り、その範囲はその終点、及びその範囲内の全ての整数及び端数を包含することが意図される。本発明の範囲は範囲を規定する場合に列挙された具体的な値に限定されることは意図されない。
【０１１７】
本発明の他の実施形態は、本明細書の検討、及び本明細書に開示される本発明の実施により当業者にとって明らかとなるであろう。本明細書及び実施例は例示的なものにすぎず、本発明の真の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲及びその均等物により示されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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