(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポトーシスの誘発後に照射された初期アポトーシス状態にある単核細胞を含む、照射及びプールされた単核アポトーシス細胞集団であって、
前記アポトーシス細胞集団の分析が、前記細胞の少なくとも８５％がアネキシンＶ陽性であることと、前記細胞の１５％未満がヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性であることとを示し、
前記プールされたアポトーシス細胞集団が、複数のドナーから採取されてプールされた個別の単核細胞集団を含み、
前記プールされたアポトーシス細胞集団が、照射されていない細胞集団と比較して、
（ａ）減少された数の非静止非アポトーシス細胞、
（ｂ）任意の生きた非アポトーシス細胞の抑制された細胞活性化、
（ｃ）任意の生きた非アポトーシス細胞の低減された増殖、
またはそれらの任意の組み合わせを含む、照射及びプールされた単核アポトーシス細胞集団。
【請求項２】
前記個別の単核細胞集団が、アポトーシスの誘発前またはアポトーシスの誘発後にプールされた、請求項１に記載の照射及びプールされた単核アポトーシス細胞集団。
【請求項３】
前記個別の単核細胞集団が、前記照射の前または前記照射の後にプールされた、請求項１または２に記載の照射及びプールされた単核アポトーシス細胞集団。
【請求項４】
前記個別の単核細胞集団が、レシピエント対象に関してＨＬＡ適合またはＨＬＡ不適合の供給源に由来する同種異系細胞を含み、前記個別の単核細胞集団が、リンパ球、単球、樹状細胞、及びナチュラルキラー細胞からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の照射及びプールされた単核アポトーシス細胞集団。
【請求項５】
前記個別の単核細胞集団が、２〜２５単位の血液中に存在する細胞から取得され、前記血液が、献血に由来する白血球（ＷＢＣ）画分を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の照射及びプールされた単核アポトーシス細胞集団。
【請求項６】
前記照射が、ガンマ線照射またはＵＶ照射を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の照射及びプールされた単核アポトーシス細胞集団。
【請求項７】
前記照射されたアポトーシス細胞集団が、照射されていない細胞集団と比較して、減少した割合の、集団当たりの非静止非アポトーシス細胞を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の照射及びプールされた単核アポトーシス細胞集団。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の照射及びプールされた単核アポトーシス細胞集団を含む、薬学的組成物。
【請求項９】
照射及びプールされた単核アポトーシス細胞集団を含む薬学的組成物を生成するための方法であって、前記アポトーシス細胞集団が、アポトーシスの誘発後に照射された初期アポトーシス状態にある単核細胞を含み、前記アポトーシス細胞集団の分析が、前記細胞の少なくとも８５％がアネキシンＶ陽性であることと、前記細胞の１５％未満がヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性であることとを示し、前記アポトーシス細胞集団が、複数のドナーから採取されてプールされた個別の単核細胞集団を含み、
（ａ）末梢血液から個別の単核濃縮細胞集団を取得するステップであって、前記単核濃縮細胞集団が単一のドナーまたは複数のドナーから取得される、該ステップと、
（ｂ）前記単核濃縮細胞集団を、抗凝固剤を含む凍結媒体中で凍結させるステップと、
（ｃ）前記単核濃縮細胞集団を解凍するステップと、
（ｄ）前記単核濃縮細胞集団を、１０〜１００μｇ／ｍＬの最終濃度のメチルプレドニゾロンと抗凝固剤とを含むアポトーシスを誘発するインキュベーション媒体中でインキュベートするステップと、
（ｅ）前記単核濃縮アポトーシス細胞集団を、投与媒体中に再懸濁させるステップと、
（ｆ）前記単核濃縮アポトーシス細胞集団を不活性化するステップであって、前記ステップ（ｄ）または（ｅ）のステップの後に行われる、該ステップと、
（ｇ）前記単核濃縮細胞集団をプールするステップであって、前記ステップ（ａ）〜（ｆ）のいずれかのステップの後に行われる、該ステップと、を含み、
照射およびプールされた単核初期アポトーシス細胞集団を含む薬学的組成物を生成する、方法。
【請求項１０】
前記単核濃縮細胞集団を取得する前記ステップ（ａ）が、白血球除去によって複数の個別のドナーから白血球（ＷＢＣ）画分を取得することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記単核濃縮細胞集団を取得する前記ステップ（ａ）が、複数の個別のドナーから白血球（ＷＢＣ）画分を取得することを含み、
前記白血球（ＷＢＣ）画分が、血液バンクから取得されたＷＢＣ画分を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記白血球（ＷＢＣ）画分が、
（ａ）リンパ球、単球、樹状細胞、及びナチュラルキラー細胞からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型を含むか、
（ｂ）２〜２５単位の血液から収集されているか、または
それらの任意の組み合わせを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記単核濃縮細胞集団を取得する前記ステップ（ａ）が、前記個別の単核濃縮細胞集団のＨＬＡ適合性によって制限されない、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
アポトーシス誘発媒体における前記インキュベートが、２〜１２時間である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記単核濃縮アポトーシス細胞集団を不活性化する前記ステップ（ｆ）が、前記単核濃縮アポトーシス細胞集団に照射することを含む、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記照射が、
（ａ）ガンマ線照射もしくはＵＶ照射、
（ｂ）２５〜３０グレイ単位（Ｇｙ）、または
それらの組み合わせを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
免疫疾患、自己免疫疾患、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、サイトカインストーム、癌、または炎症性疾患の発生の治療、予防、改善、阻害、または低減を必要とする対象においてそれを行うための薬物の調製における、請求項１〜７のいずれか一項に記載の照射およびプールされた単核アポトーシス細胞集団、または請求項８に記載の薬学的組成物、または請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法によって調製された薬学的組成物の使用。
【請求項１８】
前記免疫疾患が、ＧＶＨＤ、関節炎、痛風、または炎症性腸疾患を含む群から選択されるか、
前記ＣＲＳもしくはサイトカインストームが、感染の結果であるか、または
前記対象が、造血器悪性腫瘍を罹患しているか、敗血症を罹患しているか、移植片対腫瘍もしくは移植片対白血病（ＧＶＬ）効果を保持しているか、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受けているか、もしくは固形臓器移植を受けている、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記ＨＳＣＴが、同種異系ＨＳＣＴであり、前記薬学的組成物が、複数の同種異系ドナーであって、前記対象または前記ドナーに対してＨＬＡ適合ではない同種異系ドナーから取得された細胞を含む、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記薬学的組成物が、前記移植の最大２４時間前、前記移植と同時、または前記移植の１５日間後までに投与される、請求項１８または１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記薬学的組成物が、静脈注射によって投与される、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、プール及び濃縮された単核アポトーシス細胞集団を含む細胞調製物、ならびに該細胞調製物を調製する方法に関する。さらに、対象における免疫疾患、炎症性疾患、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、サイトカインストーム、または自己免疫疾患を治療するためのこれらのプールされた細胞調製物の使用が、本明細書に説明される。
【背景技術】
【０００２】
病理学的免疫応答を特徴とする疾患としては、著しい死亡率及び疾病率に関連付けられる多くの疾患、特に、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の自己免疫疾患、及び移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）等の移植関連疾患が挙げられる。自己免疫疾患は概して、２つの一般的な種類、すなわち、全身性自己免疫疾患（例えば、ＳＬＥ及び強皮症）及び多発性硬化症等の臓器特異的自己免疫疾患、ならびに糖尿病に分けられ得る。
【０００３】
免疫抑制薬は、移植された臓器及び組織（例えば、骨髄、心臓、腎臓、肝臓）の拒絶の治療または予防、自己免疫疾患または自己免疫起源である可能性が最も高い疾患（例えば、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、クローン病、ベーチェット病、天疱瘡、ブドウ膜炎、及び潰瘍性結腸炎）の治療、いくつかの他の非自己免疫炎症性疾患（例えば、長期的なアレルギー性喘息管理）及び移植関連疾患（例えば、ＧＶＨＤ）の治療に使用されてきた。しかしながら、免疫抑制薬治療は、多くの合併症を導くことがあり、病理学的免疫反応に対応する改善された方法が必要である。
【０００４】
同種異系骨髄移植（ａｌｌｏＢＭＴ）において、患者の体内へのドナー髄の注入は、２つの免疫系からの細胞の相互作用を伴う。同種異系移植物を受ける患者のための調整レジメンは、免疫系を抑制することによって、ドナー幹細胞が患者内に生着することを可能にする。ドナーの免疫細胞が患者の体内に確立されると、それらは、任意の残留癌細胞を含む患者自身の組織及び細胞を異種または外来性であると認識し得る。免疫系は次に、肝臓、消化管、または皮膚等の特定の臓器に損傷を与える場合があり、この効果は、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）として知られている。
【０００５】
今日現在、ＧＶＨＤ予防薬は、カルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）、シクロスポリンまたはタクロリムス、及びメトトレキサートか、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）か、またはシロリムスかのいずれかを含む、免疫抑制薬の組み合わせを含む。しかしながら、急性ＧＶＨＤは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合同胞に由来する移植物を受けるＢＭＴ患者の３５％〜７０％において依然生じており、非血縁ドナー移植物のレシピエントにおいてはより頻繁に生じている。
【０００６】
カルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）は急性ＧＶＨＤを部分的に阻害するが、これらは、Ｔ細胞の発達を阻害することによって免疫再構築を損ない、疾患の再発の危険性を増加させ得る。したがって、同種異系ＢＭＴを受けている血液悪性腫瘍患者は、ＣＮＩの使用を最小にし、ＧＶＨＤを予防し、有益な移植片対腫瘍効果を含む機能的な免疫系を保持するであろうＧＶＨＤ予防薬を必要とする。
【０００７】
アポトーシス細胞は、樹状細胞及びマクロファージに対する免疫耐性を直接的または間接的に誘発することが可能な免疫変調細胞である。多くの動物実験が、遺伝的適合性とは独立した免疫変調効果を実証している。示唆的に、非遺伝的適合マウスに由来するアポトーシス細胞は、遺伝的適合マウス（同系）に由来するものと同程度に効果的であった。患者またはドナーから収集した末梢細胞（白血球除去）から高い寛容原性潜在力を有する（免疫耐性を有する）安定したアポトーシス細胞を作成するためのプロセスが、高度に再現可能である、非遺伝的適合アポトーシス血液サンプルを組み合わせる能力は、対象において免疫体制を誘発するための独特で費用対効果の高い供給源を提供し得る。
【０００８】
また、非適合白血球（ＷＢＣ）の使用は、２つの潜在的な問題を生じさせる。１つ目は、（細胞死のプロセスにおける）アポトーシス細胞に対する可能な免疫応答である。２つ目は、アポトーシス集団を作成するために誘発されるＷＢＣの必ずしも全てがアポトーシス性になるとは限らないため、アポトーシス細胞のプール内に残る生きた細胞の画分からの応答である。したがって、投与されるアポトーシスＷＢＣの画分は、いくらかの生きた細胞を含有することになる。生きた細胞は、レシピエントにＧＶＨＤを生じさせる場合がある。
【０００９】
現在、１日当たり約１，０００単位の血液が、多くはＭａｇｅｎ  Ｄａｖｉｄ  Ａｄｏｍ（ＭＤＡ）を通じてイスラエル内で加工されている。ＷＢＣ画分は、加工されないか、または研究用の軟膜として加工されるかのいずれかである。このＷＢＣ画分をバッグ内に受容することが可能であり、該バッグ中には、ほぼ２×１０７個の白血球が存在し、そのうち約０．７×１０７個が、アポトーシス細胞生成に好ましい単核細胞である。現在の推定によると、生成効率はおよそ５０％である。
【００１０】
自己免疫及び炎症性疾患ならびに移植関連疾患を含む、免疫障害を治療または予防するための組成物及び方法に関する満たされていない必要がある。例えば、ＧＶＨＤは、推定発生率が３０％〜７０％であり、依然として成功的な同種異系血液または髄移植に対する主な障壁であり、ＧＶＨＤの予防法に関する最適なアプローチは未だ確立されていない。具体的には、安全で、確実で、再現可能で、効果的な様式でＧＶＨＤを予防または改善する組成物及び方法を取得することが不可欠である。
【００１１】
本明細書において下記に説明される細胞調製物及びその組成物は、複数の個別の血液ドナーまたは個別の献血から取得されたプールされたアポトーシス細胞を含む普遍的な生成物を提供することによって、この必要に応える。さらに、本プールされたアポトーシス細胞調製物は、自己免疫及び炎症性疾患、移植関連疾患及び状態、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、サイトカインストーム、ならびに不妊症を含む免疫障害を治療するために使用され得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一態様では、初期アポトーシス状態にある単核細胞を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物が本明細書に開示され、該プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、プールされた個別の単核細胞集団を含み、該プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、
減少された割合の非静止非アポトーシス細胞、
任意の生きた非アポトーシス細胞の抑制された細胞活性化、もしくは
任意の生きた非アポトーシス細胞の低減された増殖、
またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００１３】
関連する態様では、該プールされた個別の単核細胞集団は、該個別の単核細胞集団のアポトーシスの誘発前またはアポトーシスの誘発後にプールされた個別の単核細胞集団を含む。別の態様では、プールされた個別の単核細胞集団は、該個別の単核細胞集団のＨＬＡマーカーのＨＬＡ適合性とは独立してプールされた集団を含む。別の態様では、取得されたプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、約２〜２５単位の血液中に存在する細胞から取得された単核細胞集団を含む。別の態様では、血液は、献血に由来する白血球（ＷＢＣ）画分を含む。別の態様では、個別の単核細胞集団は、リンパ球、単球、樹状細胞、及びナチュラルキラー細胞からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型を含む。さらなる態様では、個別の単核細胞集団は、レシピエント対象に関してＨＬＡ適合またはＨＬＡ不適合の供給源に由来する同種異系細胞を含む。
【００１４】
関連する態様では、プールされた個別の単核細胞集団は、不活性なＴ細胞受容体を含むかまたは免疫活性が低減された細胞を含む。別の態様では、プールされた個別の単核細胞集団は、照射された細胞集団を含む。別の態様では、照射は、ガンマ線照射またはＵＶ照射を含む。別の態様では、プールされた個別の単核細胞集団は、該照射の前または該照射の後にプールされた集団を含む。別の態様では、照射された細胞集団は、照射されていない細胞集団と比較して、減少された割合の、集団当たりの非静止非アポトーシス細胞を含む。
【００１５】
一態様では、本明細書に開示される細胞調製物を含む薬学的組成物が、本明細書に説明される。
【００１６】
一態様では、初期アポトーシス状態にあるプールされた個別の単核細胞集団を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物を含む薬学的組成物を生成するための方法が、本明細書に開示され、該方法は、
（ａ）末梢血液の個別の単核濃縮細胞集団を取得するステップと、
（ｂ）該単核濃縮細胞集団を、抗凝固剤を含む凍結媒体中で凍結させるステップと、
（ｃ）該単核濃縮細胞集団を解凍するステップと、
（ｄ）該単核濃縮細胞集団を、約１０〜１００μｇ／ｍＬの最終濃度のメチルプレドニゾロンと抗凝固剤とを含むアポトーシスを誘発するインキュベーション媒体中でインキュベートするステップと、
（ｅ）該アポトーシス細胞集団を、投与媒体中に再懸濁させるステップと、
（ｆ）該単核濃縮集団を不活性化するステップであって、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのステップの後に生じる、不活性化するステップと、
（ｇ）該単核濃縮集団をプールするステップであって、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのステップの後に生じる、プールするステップと、を含み、
該方法は、初期アポトーシス状態にあるプールされた個別の単核細胞集団を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物を含む薬学的組成物を生成する。
【００１７】
関連する態様では、不活性化するステップは、該プールされた単核アポトーシス細胞調製物中で、非静止非アポトーシス細胞の割合を減少させること、任意の生きた非アポトーシス細胞の細胞活性化を抑制すること、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の増殖を低減すること、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の態様では、該個別の単核濃縮細胞集団の取得は、白血球除去によって複数の個別のドナーから白血球（ＷＢＣ）画分を取得することを含む。別の態様では、白血球（ＷＢＣ）画分は、血液バンクから取得されたＷＢＣ画分を含む。別の態様では、白血球（ＷＢＣ）画分は、リンパ球、単球、樹状細胞、及びナチュラルキラー細胞からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型を含む。別の態様では、白血球（ＷＢＣ）画分は、約２〜２５単位の血液から収集されている。別の態様では、該単核濃縮細胞集団の取得は、該個別の単核濃縮細胞集団のＨＬＡ適合性によって制限されない。別の態様では、インキュベートは、約２〜１２時間である。別の態様では、個別の単核濃縮細胞集団は、レシピエント対象に関してＨＬＡ適合またはＨＬＡ不適合の供給源に由来する同種異系細胞を含む。
【００１８】
関連する態様では、（ｆ）該単核濃縮集団を不活性化するステップは、該個別の集団における免疫応答を抑制もしくは排除すること、該個別の集団間の交差反応性を抑制もしくは排除すること、または該個別の集団におけるＴ細胞受容体活性を低減もしくは排除することを含み、該プールされた単核アポトーシス細胞調製物を含む該生成される薬学的組成物は、該細胞調製物中の、減少された割合の生きた非アポトーシス細胞、任意の生きた非アポトーシス細胞の抑制された細胞活性化、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の低減された増殖、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の態様では、該単核濃縮集団の不活性化は、該単核濃縮集団を照射することを含む。別の態様では、照射は、ガンマ線照射またはＵＶ照射を含む。別の態様では、照射は、約２５〜３０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。
【００１９】
一態様では、免疫疾患、自己免疫疾患、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、サイトカインストーム、または炎症性疾患の発生の治療、予防、改善、阻害、または低減を必要とする対象においてそれを行う方法が本明細書に開示され、該方法は、該対象に、本明細書に説明されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物、または本明細書に説明される組成物、または本明細書に説明される方法によって調製される組成物を含む薬学的組成物を投与することを含む。一態様では、免疫疾患は、ＧＶＨＤ、関節炎、痛風、または炎症性腸疾患を含む群から選択される。別の態様では、対象は、造血器悪性腫瘍を罹患しているか、移植片対腫瘍もしくは移植片対白血病（ＧＶＬ）効果を保持しているか、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受けているか、または固形臓器移植を受けている。別の態様では、ＨＳＣＴは、同種異系ＨＳＣＴであり、該薬学的組成物は、複数の同種異系ドナーであって、該対象または該ドナーに対してＨＬＡ適合ではない同種異系ドナーから取得された細胞を含む。別の態様では、薬学的組成物の投与は、該移植の最大２４時間前もしくは該移植と同時に実行されるか、または該移植の１５日間後まで投与される。さらなる態様では、薬学的組成物は、静脈注射によって投与される。
【００２０】
本明細書に開示されると見なされる主題は、本明細書の結論部分において具体的に指摘され、かつ明確に特許請求される。しかしながら、運営組織及び方法は、その目的、特徴、及び利点と共に、添付の図面を読むときに、以下の詳細な説明を参照することによって最も良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】生存に対する、複数の個別のドナー（青）に由来する単一のアポトーシス細胞調製物注射の明確な効果（ｐ＜０．０１）を示すグラフを提示する。提示されるグラフは、単一用量の複数の個別のドナーに由来する照射されたプールされたアポトーシス細胞調製物で治療されたＧｖＨＤマウスモデルにおけるカプラン・マイヤー生存曲線である。
【図２】比較された２つの群の体重損失のパーセンテージに対する、複数の個別のドナー（青）に由来する単一のアポトーシス細胞調製物注射の明確な効果（ｐ＜０．０１）を示すグラフを提示する。
【図３】誘発ＧｖＨＤのマウスモデルを使用した、生存率に対する単一ドナーアポトーシス細胞調製物及び複数ドナーアポトーシス細胞調製物の単一用量の投与＋／−照射の比較を示すグラフを提示する。
【図４Ａ】ＨＬＡ−ＤＲの発現によって測定された、アポトーシス細胞との相互作用後の樹状細胞（ＤＣ）の成熟の阻害を示す効力試験の結果を提示する。新鮮な最終生成物ＡのＨＬＡ  ＤＲ平均蛍光（ｔ０）。
【図４Ｂ】ＬＡ−ＤＲの発現によって測定された、アポトーシス細胞との相互作用後の樹状細胞（ＤＣ）の成熟の阻害を示す効力試験の結果を提示する。２〜８℃で２４時間後の最終生成物ＡのＨＬＡ  ＤＲ平均蛍光。
【図５Ａ】ＣＤ８６の発現によって測定された、アポトーシス細胞との相互作用後の樹状細胞（ＤＣ）の成熟の阻害を示す効力試験の結果を提示する。新鮮な最終生成物ＡのＣＤ８６平均蛍光（ｔ０）。
【図５Ｂ】ＣＤ８６の発現によって測定された、アポトーシス細胞との相互作用後の樹状細胞（ＤＣ）の成熟の阻害を示す効力試験の結果を提示する。２〜８℃で２４時間後最終生成物ＡのＣＤ８６平均蛍光。
【００２２】
例証の単純さ及び明瞭さのために、図中に示される要素は必ずしも縮尺通りに描かれているわけではないことが理解されるであろう。例えば、要素のうちのいくつかの寸法は、明瞭さのために他の要素に対して拡大されている場合がある。さらに、適切であると見なされる場合、参照番号は、対応するまたは類似の要素を示すために図間で反復され得る。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本出願は、２０１５年４月２１日出願の米国特許仮出願第６２／１５０，３０５号の利益を主張する。
【００２４】
以下の詳細な説明では、本明細書の開示の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が記載される。しかしながら、本細胞調製物、本細胞調製物を作製する方法、及びこれらの細胞調製物を使用する方法は、これらの具体的な詳細を伴わずに実践され得ることが、当業者によって理解されるであろう。他の例では、周知の方法、手順、及び構成要素は、本明細書に提示される開示を曖昧にしないように、詳細に説明されてはいない。
【００２５】
本開示は、一実施形態において、初期アポトーシス状態にある単核細胞を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物を提供し、該プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、プールされた個別の単核細胞集団を含み、該プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、減少された割合の生きた非アポトーシス細胞、任意の生きた非アポトーシス細胞の抑制された細胞活性化、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の低減された増殖、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞は、照射されている。別の実施形態では、本開示は、いくつかの実施形態では献血から取得された白血球画分（ＷＢＣ）を使用する、プールされた単核アポトーシス細胞調製物を提供する。このＷＢＣ画分は、血液バンクにて廃棄されるか、または研究における使用のために標的とされることが多い。
【００２６】
一実施形態では、細胞調製物は、不活性化される。別の実施形態では、不活性化は、照射を含む。別の実施形態では、不活性化は、Ｔ細胞受容体の不活性化を含む。別の実施形態では、不活性化は、Ｔ細胞受容体の編集を含む。別の実施形態では、不活性化は、該調製物における免疫応答を抑制または排除することを含む。別の実施形態では、不活性化は、調製物中に含まれる複数の個別の集団間の交差反応性を抑制または排除することを含む。他の実施形態では、不活性化は、調製物中に含まれる複数の個別の集団間のＴ細胞受容体活性を低減または排除することを含む。別の実施形態では、不活性化された細胞調製物は、減少された割合の生きた非アポトーシス細胞、任意の生きた非アポトーシス細胞の抑制された細胞活性化、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の低減された増殖、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の実施形態では、不活性化された細胞調製物は、照射されていない細胞調製物と比較して、低減された数の非静止非アポトーシス細胞を含む。
【００２７】
別の実施形態では、照射は、ガンマ線照射またはＵＶ照射を含む。また別の実施形態では、照射された調製物は、照射されていない細胞調製物と比較して、低減された数の非静止非アポトーシス細胞を有する。
【００２８】
別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞は、Ｔ細胞受容体の不活性化を受けている。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞は、Ｔ細胞受容体の編集を受けている。
【００２９】
一実施形態では、プールされた血液は、レシピエントに関してＨＬＡ適合またはＨＬＡ不適合の供給源に由来する第三者（３ｒｄ  ｐａｒｔｙ）血液を含む。
【００３０】
一実施形態では、本開示は、初期アポトーシス状態にあるプールされた個別の単核細胞集団を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物を含む薬学的組成物の生成の方法を提供し、該組成物は、減少された割合の生きた非アポトーシス細胞、任意の生きた非アポトーシス細胞の抑制された細胞活性化を有する調製物、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の低減された増殖を有する調製物、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の実施形態では、本方法は、初期アポトーシス状態にあるプールされた個別の単核細胞集団を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物を含む薬学的組成物を提供し、該組成物は、減少された割合の非静止非アポトーシス細胞を含む。
【００３１】
別の実施形態では、本開示は、免疫疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、サイトカインストーム、または不妊症の発生の治療、予防、改善、阻害、または低減を必要とする対象においてそれを行うための、本明細書に説明される初期アポトーシス状態にある単核細胞を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物の使用の方法を提供する。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物が本明細書に開示され、特定の実施形態において、かかる細胞調製物の使用は、例えばＨＬＡ分類による、ドナーとレシピエントとの適合を必要としない。
【００３２】
プールされた単核アポトーシス細胞調製物
【００３３】
一実施形態では、本開示は、初期アポトーシス状態にある単核細胞を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物を提供し、該プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、プールされた個別の単核細胞集団を含み、該プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、
減少された割合の非静止非アポトーシス細胞、
任意の生きた非アポトーシス細胞の抑制された細胞活性化、もしくは
任意の生きた非アポトーシス細胞の低減された増殖、
またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００３４】
別の実施形態では、初期アポトーシス状態にある単核細胞を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、プールされた個別の単核細胞集団を含み、該プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、低減された数の非静止非アポトーシス細胞を含む。
【００３５】
当業者は、「プールされる」という用語は、一実施形態では、複数の個別のドナーから収集され、調製され、場合によりその後の使用のために保管された血液であって、その複数の個別のドナーの血液から取得された単核濃縮細胞集団が、例えば、末梢血液の個別の単核濃縮細胞集団を取得した後の任意の調製ステップの後またはそれと同時に組み合わされる、血液を包含することを理解するであろう。代替的に、別の実施形態では、プールは、該単核濃縮細胞集団の凍結の後またはそれと同時に生じる。別の実施形態では、プールは、該単核濃縮細胞集団の解凍の後またはそれと同時に生じる。別の実施形態では、プールは、アポトーシスを誘発するためのインキュベーションの後またはそれと同時に生じる。また別の実施形態では、プールは、細胞のアポトーシス集団の再懸濁の後またはそれと同時に生じる。別の実施形態では、プールは、単核細胞集団の不活性化ステップの後またはそれと同時に生じる。
【００３６】
単核濃縮細胞集団の組み合わされたプールの加工は、次に、本明細書に説明されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物を生成するように継続され得る。
【００３７】
別の実施形態では、当業者は、「プールされる」という用語は、個別のドナーから収集され、アポトーシス細胞調製物として個別に調製され、場合により保管された血液であって、該調製物は、アポトーシス調製物の再懸濁時に「プールされる」、血液を包含することを認識するであろう。別の実施形態では、個別のドナーから収集された血液の調製は、同時で並行している。別の実施形態では、個別のドナーから収集された血液の調製は、同時ではない。
【００３８】
別の実施形態では、細胞は、下記の調製の方法に説明される、アポトーシスが誘発されるインキュベーションステップの直前にプールされる。別の実施形態では、細胞は、下記の調製の方法に説明される通り、再懸濁のステップにおいてインキュベーションステップの後にプールされる。別の実施形態では、細胞は、照射ステップの直前にプールされる。別の実施形態では、細胞は、不活性化ステップの後にプールされる。別の実施形態では、細胞は、照射ステップの後にプールされる。別の実施形態では、細胞は、下記の調製の方法に説明される任意のステップにおいてプールされる。また別の実施形態では、本明細書に説明されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、該個別の単核細胞集団のアポトーシスの誘発前またはアポトーシスの誘発後にプールされた個別の単核細胞集団を含む。
【００３９】
別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、単核アポトーシス細胞の容易に利用可能な供給が、対象において免疫疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、またはサイトカインストームの発生を治療、予防、改善、阻害、または低減するための使用に利用可能であり得ることを確実にする。
【００４０】
一実施形態では、プールされたアポトーシス細胞調製物は、約２〜２５単位の血液中に存在する細胞から取得される。別の実施形態では、該プールされたアポトーシス細胞調製物は、約２〜５、２〜１０、２〜１５、２〜２０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、６〜１３、または６〜２５単位の血液中に存在する細胞を含む。別の実施形態では、該プールされたアポトーシス細胞調製物は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５単位の血液中に存在する細胞を含む。必要とされる単位血液の数はまた、血液からのＷＢＣ回収の効率にも依存する。例えば、低効率ＷＢＣ回収は、さらなる必要な単位につながり、それに対して高効率ＷＢＣ回収は、より少ない必要な単位につながる。いくつかの実施形態では、各単位は、血液のバッグである。別の実施形態では、プールされたアポトーシス細胞調製物は、少なくとも２５単位の血液、少なくとも５０単位の血液、または少なくとも１００単位の血液中に存在する細胞を含む。
【００４１】
一実施形態では、単位血液は、献血に由来する白血球（ＷＢＣ）画分を含む。別の実施形態では、献血は、血液センターまたは血液バンクに由来し得る。別の実施形態では、献血は、プールされたアポトーシス細胞調製物の調製時に集められた病院内のドナーに由来し得る。別の実施形態では、複数の個別のドナーに由来するＷＢＣを含む単位血液は、本明細書に開示される目的のために作られた独立した血液バンクに保存及び維持される。別の実施形態では、複数の個別のドナーに由来するＷＢＣを含む単位血液を供給することが可能であるように本明細書に開示される目的のために開発された血液バンクは、白血球除去単位を含む。
【００４２】
一実施形態では、プールされたＷＢＣの単位は、ＨＬＡ適合性によって制限されない。したがって、結果として得られるプールされたアポトーシス細胞調製物は、ＨＬＡ適合性によって制限されない細胞集団を含む。したがって、特定の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、同種異系細胞を含む。
【００４３】
ヒト対象のハロタイプ整合は、治療的移植の文脈で当該技術分野において日常的に実践されており、通常ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子の整合を含むが、ＨＬＡ適合性によって制限されないプールされたＷＢＣから取得される、本明細書に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物の利点は、容易に利用可能なＷＢＣ供給源、及びＷＢＣの取得の低減された費用である。
【００４４】
一実施形態では、プールされた血液は、ＨＬＡ適合性とは独立した複数の個別のドナーに由来する血液を含む。別の実施形態では、プールされた血液は、レシピエントに関するＨＬＡ適合性が考慮された複数の個別のドナーに由来する血液を含む。例えば、１つのＨＬＡ対立遺伝子、２つのＨＬＡ対立遺伝子、３つのＨＬＡ対立遺伝子、４つのＨＬＡ対立遺伝子、５つのＨＬＡ対立遺伝子、６つのＨＬＡ対立遺伝子、または７つのＨＬＡ対立遺伝子が、ドナーとレシピエントとの間で適合している場合。別の実施形態では、複数の個別のドナーは、部分的に適合しており、例えば、ドナーの一部は、ＨＬＡ適合しており、この場合、本明細書に開示される通り、１つのＨＬＡ対立遺伝子、２つのＨＬＡ対立遺伝子、３つのＨＬＡ対立遺伝子、４つのＨＬＡ対立遺伝子、５つのＨＬＡ対立遺伝子、６つのＨＬＡ対立遺伝子、または７つのＨＬＡ対立遺伝子がドナーの一部とレシピエントとの間で適合している。
【００４５】
一実施形態では、本明細書に説明されるプールされた個別の単核細胞集団を含む細胞調製物は、個別の単核細胞集団のＨＬＡマーカーのいずれのＨＬＡ適合性とも独立してプールされた集団を含む。別の実施形態では、本明細書に説明されるプールされた個別の単核細胞集団を含む細胞調製物は、レシピエント対象に関してＨＬＡ適合またはＨＬＡ不適合の供給源に由来する同種異系細胞を含む。
【００４６】
下記の実施例において取り上げられている１つの疑問は、本明細書に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物に対する実験動物（例えばＧｖＨＤのマウスモデル）の応答である。特定の実施形態では、いくつかの生存非アポトーシス細胞（場合によりアポトーシス耐性細胞）は、下記に説明されるアポトーシスステップ誘発ステップの後も残り得る。
【００４７】
一実施形態では、生存非アポトーシス細胞は、アネキシンＶ陰性及びヨウ化プロピジウム陰性である生きた細胞を含む。当業者は、「生存非アポトーシス細胞」という用語は、「非静止非アポトーシス細胞」と互換的に使用され得ることを理解するであろう。したがって、当業者は、非静止非アポトーシス細胞がアネキシンＶ陰性及びヨウ化プロピジウム陰性であることを理解するであろう。
【００４８】
これらの生存非アポトーシス細胞は、急速に増殖するか、または活性化されることが可能であり得る。移植の場合、プールされた単核アポトーシス細胞調製物の細胞は、新しい移植物と共に投与され得る。いくつかの実施形態では、複数の個別のドナーから取得されたプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、宿主に対して活性化されてもよく、さらに互いに対して活性化されてもよい。特定の実施形態では、投与される生存非アポトーシス細胞の約１０〜２０％が、生着され、機能的となり得る。
【００４９】
一実施形態では、本明細書に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、不活性化された細胞調製物を含む。別の実施形態では、不活性化された細胞調製物は、不活性なＴ細胞受容体を含む細胞を含む。別の実施形態では、不活性化された細胞調製物は、低減された免疫応答を含む細胞を含む。別の実施形態では、不活性化された細胞調製物は、不活性なＴ細胞受容体または低減された免疫応答を含む細胞を含む。別の実施形態では、不活性化された細胞調製物は、抑制または排除された該集団間の交差反応性を有する複数の個別の単核集団を含む。別の実施形態では、不活性化された細胞調製物は、低減または排除されたＴ細胞受容体活性を有する複数の個別の単核集団を含む。別の実施形態では、不活性化された細胞調製物は、低減された数の静止非アポトーシス細胞を含む。別の実施形態では、不活性化された細胞調製物は、低減または排除された免疫応答を含む。別の実施形態では、不活性化された細胞調製物は、低減または排除された互いに対する交差反応性を有するプールされた個別の単核集団を含む。別の実施形態では、プールされた個別の単核細胞集団を含む不活性化された細胞調製物は、照射された細胞集団を含む。
【００５０】
一実施形態では、本明細書に開示される照射された細胞調製物または細胞集団は、照射されていない細胞調製物または集団と比較して、抑制された細胞活性化及び低減された増殖を有する。別の実施形態では、照射は、ガンマ線照射またはＵＶ照射を含む。別の実施形態では、照射された細胞調製物または集団は、照射されていない細胞調製物と比較して、減少された割合の非静止非アポトーシス細胞を有する。別の実施形態では、照射された細胞調製物または集団は、照射されていない細胞調製物と比較して、低減された数の非静止非アポトーシス細胞を有する。別の実施形態では、照射された細胞調製物は、低減または排除された互いに対する交差反応性を有するプールされた個別の単核集団を含む。
【００５１】
別の実施形態では、照射は、約１５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約２０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約２５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約３０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約３５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約４０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約４５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約５０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約５５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約６０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約６５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、最大２５００Ｇｙを含む。別の実施形態では、照射は、約１５〜２５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約２５〜３０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約３０〜４０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約４０〜５０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約５０〜６５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。
【００５２】
別の実施形態では、照射されたプールされたアポトーシス細胞調製物は、照射されていないプールされたアポトーシス細胞調製物と同一または類似のアポトーシスプロフィール、安定性、及び有効性を維持する。別の実施形態では、照射されたプールされたアポトーシス細胞調製物は、同一または類似の細胞型分布プロフィールを維持する。
【００５３】
また別の実施形態では、本明細書に説明されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、該個別の単核細胞集団の不活性化前または不活性化後にプールされた個別の単核細胞集団を含む。別の実施形態では、本明細書に説明されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、該個別の単核細胞集団の照射前または照射後にプールされた個別の単核細胞集団を含む。
【００５４】
一実施形態では、本明細書に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、最大２４時間安定である。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、少なくとも２４時間安定である。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、２４時間超安定である。また別の実施形態では、本明細書に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、最大３６時間安定である。また別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、少なくとも３６時間安定である。さらなる実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、３６時間超安定である。別の実施形態では、本明細書に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、最大４８時間安定である。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、少なくとも４８時間安定である。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、４８時間超安定である。
【００５５】
当業者は、「安定である」という用語は、初期アポトーシス細胞の割合（％）が、例えば、一実施形態では照射後等、不活性化後に低減されない調製物を包含することを理解するであろう。一実施形態では、本明細書に開示される細胞調製物中の初期アポトーシス細胞の割合（％）は、約１％超は低減されない。別の実施形態では、本明細書に開示される細胞調製物中の初期アポトーシス細胞の割合（％）は、約２％超は低減されない。別の実施形態では、本明細書に開示される細胞調製物中の初期アポトーシス細胞の割合（％）は、約３％超は低減されない。別の実施形態では、本明細書に開示される細胞調製物中の初期アポトーシス細胞の割合（％）は、約４％超は低減されない。別の実施形態では、本明細書に開示される細胞調製物中の初期アポトーシス細胞の割合（％）は、約５％超は低減されない。別の実施形態では、本明細書に開示される細胞調製物中の初期アポトーシス細胞の割合（％）は、約６％超は低減されない。別の実施形態では、本明細書に開示される細胞調製物中の初期アポトーシス細胞の割合（％）は、約７％超は低減されない。別の実施形態では、本明細書に開示される細胞調製物中の初期アポトーシス細胞の割合（％）は、約８％超は低減されない。別の実施形態では、本明細書に開示される細胞調製物中の初期アポトーシス細胞の割合（％）は、約９％超は低減されない。別の実施形態では、本明細書に開示される細胞調製物中の初期アポトーシス細胞の割合（％）は、約１０％超は低減されない。別の実施形態では、本明細書に開示される細胞調製物中の初期アポトーシス細胞の割合（％）は、約２０％超は低減されない。
【００５６】
一実施形態では、照射ステップを含む、プールされた細胞調製物を生成する方法は、細胞の調製物が照射ステップを含まなくてもよい単一適合ドナーから取得されたアポトーシス調製物において見られる、初期アポトーシス性の免疫変調及び安定性特性を保存する。別の実施形態では、本明細書に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）応答を生じさせない。
【００５７】
細胞調製物の照射は、当該技術分野において安全であると見なされる。照射手順は、ＷＢＣに対する反応を予防するために、献血に対して現在日常的に実施されている。
【００５８】
別の実施形態では、本明細書に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物中のアポトーシス細胞の割合は、１００％に近く、それによって、細胞調製物中の生きた非アポトーシス細胞の画分を低減する。一実施形態では、アポトーシス細胞の割合は、少なくとも２０％である。別の実施形態では、アポトーシス細胞の割合は、少なくとも３０％である。別の実施形態では、アポトーシス細胞の割合は、少なくとも４０％である。別の実施形態では、アポトーシス細胞の割合は、少なくとも５０％である。また別の実施形態では、アポトーシス細胞の割合は、少なくとも６０％である。また別の実施形態では、アポトーシス細胞の割合は、少なくとも７０％である。さらなる実施形態では、アポトーシス細胞の割合は、少なくとも８０％である。別の実施形態では、アポトーシス細胞の割合は、少なくとも９０％である。また別の実施形態では、アポトーシス細胞の割合は、少なくとも９９％である。したがって、低減された、または存在しない、または静止した、または活性化不可能な、生きた非アポトーシス細胞の画分を含む細胞調製物は、一実施形態において、レシピエントにＧＶＨＤを生じさせないプールされた単核アポトーシス細胞調製物を提供し得る。
【００５９】
代替的に、別の実施形態では、生きた非アポトーシスＷＢＣのパーセンテージは、例えば標的化沈殿によって、生きた細胞集団を特異的に除去することによって低減される。別の実施形態では、生きた非アポトーシス細胞の割合は、ホスファチジルセリンに結合する磁気ビーズを使用して低減され得る。別の実施形態では、生きた非アポトーシス細胞の割合は、非アポトーシス細胞の細胞表面上のマーカーに結合するが、アポトーシス細胞には結合しない磁気ビーズを使用して低減され得る。または逆に、アポトーシス細胞は、アポトーシス細胞の細胞表面上のマーカーに結合するが、非アポトーシス細胞には結合しない磁気ビーズを使用して、さらなる調製物のために選択されてもよい。また別の実施形態では、生きた非アポトーシスＷＢＣのパーセンテージは、超音波の使用によって低減される。
【００６０】
一実施形態では、アポトーシス細胞は、プールされた第三者ドナーに由来する。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、プールされた第四者ドナーに由来する。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、プールされた第五者ドナーに由来する。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、プールされた第Ｎ者ドナーに由来し、Ｎは、例えば個別のドナーまたは個別の単位血液等の、所与のプールされた細胞調製物中の供給源の数を表す。例えば、プールされた細胞調製物が１０の個別の供給源ドナーに由来する単核細胞を含む場合、Ｎは、１０である。
【００６１】
一実施形態では、プールされた細胞調製物は、リンパ球、単球、樹状細胞、及びナチュラルキラー細胞からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型を含む。別の実施形態では、プールされた細胞調製物は、単核細胞の濃縮集団を含む。一実施形態では、プールされた単核細胞は、リンパ球、単球、樹状細胞、及びナチュラルキラー細胞からなる群から選択される細胞型を含む単核濃縮細胞調製物である。別の実施形態では、単核濃縮細胞調製物は、１５％以下、代替的に１０％以下、典型的には５％以下の、顆粒球（すなわち、好中球、好塩基球、及び好酸球）としても知られる多形核白血球を含む。別の実施形態では、プールされた単核細胞調製物は、顆粒球を欠く。
【００６２】
別の実施形態では、プールされた単核濃縮細胞調製物は、１５％以下、代替的に１０％以下、典型的には５％以下のＣＤ１５ｈｉｇｈ発現細胞を含む。一実施形態では、プールされたアポトーシス細胞調製物は、１５％未満のＣＤ１５ｈｉｇｈ発現細胞を含む。
【００６３】
一実施形態では、プールされた単核濃縮細胞調製物は、少なくとも６０％の単核細胞、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％の単核細胞、代替的に少なくとも９０％の単核細胞、または少なくとも９５％の単核細胞を含み、各々の可能性は、別個の実施形態である。一実施形態では、プールされた単核濃縮細胞調製物は、少なくとも８５％の単核細胞を含む。
【００６４】
一実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、増加された多核細胞（ＰＭＮ）を有する細胞調製物を、高い単核細胞を有する細胞調製物とプールすることを含む。
【００６５】
当業者は、「単核細胞」という用語は、１つの分葉核を有する白血球を包含し得ることを理解するであろう。別の実施形態では、本明細書に開示されるプールされたアポトーシス細胞調製物は、５％未満の多形核白血球を含む。
【００６６】
薬学的組成物及びそれらの調製
【００６７】
単一の適合ドナーに由来するアポトーシス細胞を調製する方法及びそれらの使用は、国際公開第ＷＯ２０１４／０８７４０８号（例えば、実施例１１〜１５を参照）及び国際出願第ＰＣＴ／ＩＬ２０１６／０５０１９４号（例えば、実施例１〜２を参照）に詳述されており、それらはその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６８】
当業者は、本明細書に開示されるとき、「組成物」及び「薬学的組成物」という用語は全ての同じ意味及び質を有して互換的に使用され、また一実施形態では、上記に詳述される通りプールされた単核アポトーシス細胞調製物を含む組成物を包含し得ることを理解するであろう。一実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に開示されるプールされた細胞調製物を含む組成物を包含し、抗凝固剤をさらに含む。当業者は、「組成物」という用語は、細胞調製物を、例えばそれを必要とする患者等のレシピエント対象に投与するために使用される最終懸濁媒体中に再懸濁された、本明細書に開示されるプールされた細胞調製物を含む組成物を包含し得ることを理解するであろう。当業者は、「最終懸濁媒体」及び「投与媒体」という用語は、本明細書で使用されるとき、互換的に使用され、また本明細書に開示されるプールされた細胞調製物をレシピエント対象に投与するために使用される媒体を包含し得ることをさらに理解するであろう。
【００６９】
一実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物は、初期アポトーシス状態にある単核細胞を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物を含み、該プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、プールされた個別の単核細胞集団を含み、該プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、減少された割合の生きた非アポトーシス細胞、任意の生きた非アポトーシス細胞の抑制された細胞活性化、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の低減された増殖、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物を含む。
【００７０】
別の実施形態では、組成物中で、該プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、例えば、照射された調製物、または該個別の細胞集団が照射されている調製物等の本明細書に開示される不活性化調製物を含む。別の実施形態では、組成物は、抗凝固剤をさらに含む。
【００７１】
一実施形態では、初期アポトーシス状態にあるプールされた個別の単核細胞集団を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物を含む薬学的組成物を生成するための方法が、本明細書に開示され、該方法は、
（ａ）末梢血液の個別の単核濃縮細胞集団を取得するステップと、
（ｂ）該単核濃縮細胞集団を、抗凝固剤を含む凍結媒体中で凍結させるステップと、
（ｃ）該単核濃縮細胞集団を解凍するステップと、
（ｄ）該単核濃縮細胞集団を、約１０〜１００μｇ／ｍＬの最終濃度のメチルプレドニゾロンと抗凝固剤とを含むアポトーシスを誘発するインキュベーション媒体中でインキュベートするステップと、
（ｅ）該アポトーシス細胞集団を、投与媒体中に再懸濁させるステップと、
（ｆ）該単核濃縮集団を不活性化するステップであって、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのステップの後に生じる、不活性化するステップと、
（ｇ）該単核濃縮集団をプールするステップであって、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのステップの後に生じる、プールするステップと、を含み、
該方法は、初期アポトーシス状態にあるプールされた個別の単核細胞集団を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物を含む薬学的組成物を生成する。
【００７２】
一実施形態では、不活性化するステップ（ｆ）は、該プールされた単核アポトーシス細胞調製物中で、非静止非アポトーシス細胞の割合を減少させること、任意の生きた非アポトーシス細胞の細胞活性化を抑制すること、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の増殖を低減すること、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００７３】
一実施形態では、単核濃縮細胞集団の取得は、白血球除去によって複数の個別のドナーから白血球（ＷＢＣ）画分を取得することを含む。別の実施形態では、単核濃縮細胞集団の取得は、血液バンクから取得されたＷＢＣ画分を含む白血球（ＷＢＣ）画分を取得することを含む。別の実施形態では、収集されるＷＢＣは、それらが取得される供給源に基づいて、即時使用可能であり得る。
【００７４】
当業者は、「白血球除去」という用語は、白血球がドナーの血液から分離されるアフェレーシス手順を包含し得ることを理解するであろう。一実施形態では、ドナーの血液は、白血球除去を受け、したがって、単核濃縮細胞組成物は、本生成方法に従って取得される。当該技術分野において知られる通り、収集された細胞の凝固を予防するために、白血球除去中に少なくとも１つの抗凝固剤の使用が必要とされることが留意されるべきである。
【００７５】
一実施形態では、白血球除去手順は、本生成方法に従う単核濃縮細胞組成物の収集を可能にするように構成される。一実施形態では、白血球除去によって取得された細胞収集物は、少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、または８０％の単核細胞を含む。一実施形態では、細胞ドナーに由来する血漿は、本生成方法に従う単核濃縮細胞組成物の取得と並行して収集される。一実施形態では、細胞ドナーに由来する約３００〜６００ｍｌの血漿が、本生成方法に従う単核濃縮細胞組成物の取得と並行して収集される。一実施形態では、本生成方法に従う単核濃縮細胞組成物の取得と並行して収集された血漿は、凍結及び／またはインキュベーション媒体の一部として使用される。
【００７６】
一実施形態では、単核濃縮細胞調製物は細胞収集時に少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、または少なくとも８０％の単核細胞を含むが、本生成方法の後の最終薬学的組成物は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％の単核細胞を含むことが留意されるべきである。別の実施形態では、単核濃縮細胞調製物は、細胞収集時に、本明細書に開示される方法を使用して生成される最終生成物よりも低い割合の単核細胞を含む。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、最初の単核濃縮細胞調製物、例えば、白血球除去によって収集された調製物よりも高い割合の単核細胞を含む。
【００７７】
特定の実施形態によると、組成物の生成に使用される単核濃縮細胞調製物は、少なくとも５０％の単核細胞を細胞収集時に含む。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物の生成に使用される単核濃縮細胞調製物は、約４０〜６０％の単核細胞を細胞収集時に含む。特定の実施形態によると、本開示は、薬学的組成物を生成するための方法を提供し、本方法は、ドナーの末梢血液から単核濃縮細胞調製物を取得することを含み、該単核濃縮細胞調製物は、少なくとも５０％の単核細胞を含む。別の実施形態では、薬学的組成物を生成するための方法であって、本方法は、ドナーの末梢血液から単核濃縮細胞調製物を取得することを含み、該単核濃縮細胞調製物は、約４０〜６０％の単核細胞を含む。特定の実施形態によると、本開示は、薬学的組成物を生成するための方法を提供し、本方法は、少なくとも４０％、５０％、または６０％の単核細胞を含む単核濃縮細胞調製物を凍結させることを含む。
【００７８】
一実施形態では、単位血液は、０．３５×１０７個の細胞を含む。別の実施形態では、１×１０６〜１×１０７個の細胞が取得される。別の実施形態では、取得された細胞は、本明細書に開示される調製物において即時使用可能である。別の実施形態では、白血球（ＷＢＣ）画分は、約２〜２５単位の血液から収集される。別の実施形態では、白血球（ＷＢＣ）画分は、約１〜２５０単位の血液から収集される。別の実施形態では、白血球（ＷＢＣ）画分は、約１〜５００単位の血液から収集される。別の実施形態では、白血球（ＷＢＣ）画分は、約１〜１０００単位の血液から収集される。別の実施形態では、白血球（ＷＢＣ）画分は、約１〜２０００単位の血液から収集される。
【００７９】
別の実施形態では、２〜２５単位の血液が、本明細書の組成物の調製のために一日に収集され得る。別の実施形態では、１〜２５０単位の血液が、本明細書の組成物の調製のために一日に収集され得る。別の実施形態では、１〜５００単位の血液が、本明細書の組成物の調製のために一日に収集され得る。別の実施形態では、５００〜１０００単位の血液が、本明細書の組成物の調製のために一日に収集され得る。また別の実施形態では、５００〜２０００単位の血液が、本明細書の組成物の調製のために一日に収集され得る。別の実施形態では、１０００単位の血液が、本明細書の組成物の調製のために一日に収集され得る。
【００８０】
一実施形態では、３５００億個のプールされた血液細胞が、本明細書に説明される組成物の調製のために取得される。別の実施形態では、１０００億〜５０００億プールされた血液細胞が、本明細書に説明される組成物の調製のために取得される。別の実施形態では、約１０００億、約２０００億、約３０００億、約４０００億、約５０００億、約６０００億、約７０００億、約８０００億、または約９０００億個の細胞が、本明細書に説明される組成物の調製のために取得される。
【００８１】
一実施形態では、本明細書に説明される組成物の投薬量は、対象１キロ当たり３５００万〜７０００万個のプールされた単核アポトーシス細胞を含む。したがって、３５００億個の細胞のプールから開始して、８０〜１５０投薬単位が一度に調製され得る。一実施形態では、平均して１０単位のプールされた血液が、単一治療用量を生成する。この計算は、生成効率等の可能な改善は考慮に入れず、現在の白血球除去の生成に基づいている。
【００８２】
一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、反復投薬に使用され得る。
【００８３】
一実施形態では、本明細書に開示される調製の方法は、約２〜２５単位の血液から収集された白血球（ＷＢＣ）画分を含むプールされた単核濃縮細胞集団を調製することを含む。別の実施形態では、白血球（ＷＢＣ）画分は、約１３〜２５単位の血液から収集されている。また別の実施形態では、白血球（ＷＢＣ）画分は、約１０単位の血液から収集されている。別の実施形態では、該ＷＢＣ画分は、約２〜５、２〜１０、２〜１５、２〜２０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、６〜１３、または６〜２５単位の血液から収集されている。別の実施形態では、該ＷＢＣ画分は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５単位の血液から収集されている。必要とされる単位血液の数はまた、血液からのＷＢＣ回収の効率にも依存する。例えば、低効率ＷＢＣ回収は、さらなる必要な単位につながり、それに対して高効率ＷＢＣ回収は、より少ない必要な単位につながる。いくつかの実施形態では、各単位は、血液のバッグである。別の実施形態では、プールされたアポトーシス細胞調製物は、少なくとも２５単位の血液、少なくとも５０単位の血液、または少なくとも１００単位の血液中に存在する細胞を含む。またさらなる実施形態では、プールされた単核濃縮アポトーシス細胞集団の調製物は、調製を実施する当業者によって決定される可能な限り多くの単位のＷＢＣを含む。
【００８４】
一実施形態では、組成物を生成する方法は、ＨＬＡ適合性とは独立して収集されたＷＢＣ画分を含む。別の実施形態では、該ＷＢＣ画分は、白血球除去によって複数の個別のドナーから取得される。別の実施形態では、白血球（ＷＢＣ）画分は、血液バンクから取得される。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物を生成する方法は、該個別の単核濃縮細胞集団のＨＬＡ適合性によって制限されない該単核濃縮細胞集団を取得することを含む。
【００８５】
一実施形態では、薬学的組成物中のヘパリンは、０．００１Ｕ／ｍｌ〜３Ｕ／ｍｌ、典型的には０．０１ｍｌ〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度で存在する。別の実施形態では、薬学的組成物中のヘパリンは、０．００５Ｕ／ｍｌ〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度で存在する。他の実施形態によると、薬学的組成物中のヘパリンは、０．０１Ｕ／ｍｌ〜１Ｕ／ｍｌの濃度で存在する。一実施形態では、薬学的組成物中のＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａは、０．０１体積／体積％〜６体積／体積％の濃度で存在する。他の実施形態によると、薬学的組成物中のＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａは、０．０５体積／体積％〜５体積／体積％の濃度で存在する。他の実施形態によると、薬学的組成物中のＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａは、０．０１体積／体積％〜１０体積／体積％の濃度で存在する。さらに、単核アポトーシス細胞を含む組成物及びその調製物は、本明細書に完全に組み込まれるＷＯ２０１４／０８７４０８に説明されている。
【００８６】
一実施形態では、薬学的組成物は、残留メチルプレドニゾロンをさらに含む。一実施形態では、薬学的組成物は、３０μｇ／ｍｌを超えない濃度でメチルプレドニゾロンをさらに含む。一実施形態では、薬学的組成物は、抗凝固剤をさらに含む。一実施形態では、抗凝固剤は、ヘパリン、ＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００８７】
一実施形態では、本明細書に開示される細胞調製物中の高パーセンテージの単核細胞は、本明細書に説明される通り、多段階の製造プロトコル（単位血液の白血球除去及びプール、冷凍保存及びメチルプレドニゾロンによるインキュベーションを使用する初期アポトーシス誘発、ならびに種々の洗浄ステップを含む）に従って達成されることが理解されるべきである。
【００８８】
当業者は、「初期アポトーシス」という用語は、一実施形態では、細胞の少なくとも８５％が生存したままであり（アネキシンＶ陽性）、１５％未満がヨウ化プロピジウム（ＰＩ）アッセイによって死滅したかまたは瀕死であると見なされる（ＰＩ陰性）細胞のアポトーシス集団を指すことを理解するであろう。別の実施形態では、「初期アポトーシス」は、細胞の少なくとも８５％が生存したままであり、細胞の１５％未満がＣＤ１５ｈｉｇｈを発現する細胞集団を指す。
【００８９】
当業者は、「初期アポトーシス状態」という用語は、アポトーシスの初期の兆候を示し、アポトーシスの後期の兆候を有さない細胞を包含し得ることを理解するであろう。細胞におけるアポトーシスの初期の兆候の例としては、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の露出及びミトコンドリア膜電位の損失が挙げられる。後期の事象の例としては、細胞内へのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の侵入、及び最終的なＤＮＡ切断が挙げられる。細胞が「初期アポトーシス」状態にあることを立証するために、一実施形態では、アネキシンＶ及びＰＩ染色によるＰＳ露出検出が使用され、アネキシンＶで染色されるがＰＩでは染色されない細胞は、「初期アポトーシス細胞」と見なされる。別の実施形態では、アネキシンＶ  ＦＩＴＣ及びＰＩの両方によって染色される細胞は、「後期アポトーシス細胞」と見なされる。別の実施形態では、アネキシンＶ及びＰＩのどちらに関しても染色しない細胞は、非アポトーシス生存細胞（生きた細胞）と見なされる。
【００９０】
一実施形態では、アポトーシス細胞は、初期アポトーシス状態にある細胞を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、該細胞の少なくとも９０％が初期アポトーシス状態にある細胞を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、該細胞の少なくとも８０％が初期アポトーシス状態にある細胞を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、該細胞の少なくとも７０％が初期アポトーシス状態にある細胞を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、該細胞の少なくとも６０％が初期アポトーシス状態にある細胞を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、該細胞の少なくとも５０％が初期アポトーシス状態にある細胞を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、該細胞の少なくとも４０％が初期アポトーシス状態にある細胞を含む。
【００９１】
一実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物を生成する方法は、リンパ球、単球、樹状細胞、及びナチュラルキラー細胞からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型を含む白血球（ＷＢＣ）画分を含む。
【００９２】
一実施形態では、単核濃縮細胞調製物は、限定されるものではないが、多形核白血球及び好中球等の低濃度の非単核を含む。一実施形態では、プールされた単核濃縮細胞調製物は、顆粒球を欠く。一実施形態では、顆粒球は、生成方法の種々のステップの間に崩壊する。一実施形態では、組成物は、１５％以下、代替的に１０％以下、典型的には５％以下の顆粒球を含む。
【００９３】
一実施形態では、顆粒球は、生成方法の凍結及び解凍ステップの後に著しい程度まで崩壊する。一実施形態では、顆粒球は、生成方法の凍結及び解凍ステップの後に著しい程度まで崩壊し、凍結及び／または解凍ステップ後の洗浄ステップ中に調製物から洗浄される。
【００９４】
一実施形態では、崩壊した顆粒球は、生成方法の種々の洗浄ステップの間に細胞調製物から洗浄される。一実施形態では、組成物は、１５％以下、場合により１０％以下、典型的には５％以下の多形核白血球を含む。
【００９５】
一実施形態では、組成物は、５％以下の多形核白血球を含む。一実施形態では、組成物は、１５％以下、代替的に１０％以下、典型的には５％以下のＣＤ１５ｈｉｇｈ発現細胞を含む。
【００９６】
一実施形態では、組成物は、５％以下のＣＤ１５ｈｉｇｈ発現細胞を含む。
【００９７】
当業者は、「ＣＤ１５ｈｉｇｈ」発現細胞という用語は顆粒球を包含し得ることを理解するであろう。
【００９８】
アポトーシスの初期の特徴は、血漿膜の形態学的変化である。この変化は、細胞膜の内層から外層への膜リン脂質ホスファチジルセリン（ＰＳ）の転位を含む。カルシウムイオンの存在下で、アネキシンＶは、ＰＳに関する高い特異性及び親和性を有する。したがって、露出したＰＳを有する細胞へのアネキシンＶの結合は、初期の細胞アポトーシスを検出するための高感度の方法を提供する。
【００９９】
したがって、一実施形態では、細胞の「初期アポトーシス状態」または「初期アポトーシス細胞」は、本明細書で使用されるとき、無傷の細胞膜を依然有しているが、ＤＮＡ切断を受け始め、ホスファチジルセリンの転位を受け始めている細胞集団を指す。本明細書で使用されるとき、初期アポトーシス細胞、または初期アポトーシス状態にある細胞は、アネキシンＶを使用して陽性に染色され、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で陰性に染色される細胞である。初期アポトーシスの検出のための方法は、例えばフローサイトメトリーによるアネキシンＶ陽性及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性の初期アポトーシス細胞の検出等、当該技術分野において既知である。本明細書に開示される組成物を生成する方法の一実施形態において、照射のステップは、細胞調製物の初期アポトーシス的表現型（すなわち、％ＰＳ陽性及びＰＩ陰性）を著しく喧嘩させない。
【０１００】
一実施形態では、後期アポトーシス状態にある細胞は、フローサイトメトリーを使用して証明され得るように、アネキシンＶを使用した陽性染色及びＰＩを使用した陽性染色によって検出され得る。ＰＩは、非透過性膜であり、したがって、後期アポトーシスまたはネクローシス細胞等の細胞膜の無傷性が損なわれている細胞にのみ入り得ることが留意されるべきである。一実施形態では、ネクローシス細胞は、フローサイトメトリーを使用して証明され得るように、ＰＩに関して強い染色を示す。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、細胞調製物は、懸濁液中に細胞を含む。
【０１０２】
当業者は、細胞の「生存性」という用語は、ネクローシス、初期アポトーシス、または後期アポトーシスを受けていない細胞を包含し得ることを理解するであろう。したがって、「生存細胞」という用語は、本明細書で使用されるとき、ネクローシスを受けていない細胞、または初期もしくは後期アポトーシス状態にない細胞を指す。一実施形態では、「生存細胞」という用語は、無傷の血漿膜を有する細胞を指す。細胞生存性を決定するためのアッセイは、フローサイトメトリーによって検出され得るヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色の使用等、当該技術分野において既知である。したがって、一実施形態では、生存細胞は、ヨウ化プロピジウムの摂取を示さず、ホスファチジルセリンを発現しない細胞である。ネクローシスは、光学、蛍光、もしくは電子顕微鏡法技術を使用することによって、または染料トリパンブルーの取り込みを介して、さらに特定され得る。
【０１０３】
アポトーシスは、ネクローシスとは区別される細胞死プロセスであり、例えば、正常な細胞及び組織の発達、病原体に感染した細胞のＴリンパ球殺傷、ならびに変異的に損傷した細胞の自己排除の間に生じる、プログラムされ、秩序立てられた細胞の生理学的排除である。アポトーシス細胞は、細胞質及び核における明白な形態学的変化、等間隔の部位におけるクロマチン切断、ならびにヌクレオソーム間の部位におけるゲノムＤＮＡのエンドヌクレアーゼ的切断を特徴とする。細胞アポトーシスを決定するためのアッセイは、アネキシンＶの使用等、当該技術分野において既知である。一方、ネクローシスは、限定されるものではないが、典型的には、致死的な細胞傷害後の酵素の制御されていない進行性の分解作用によって引き起こされる、細胞死の本質的に病的な前炎症性プロセスである。ネクローシス細胞は、典型的には、ミトコンドリアの膨張、核凝集、細胞溶解、膜の完全性の損失、及び最終的な細胞死を特徴とする。
【０１０４】
一実施形態では、細胞調製物は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の生存細胞、または少なくとも９７％の生存細胞を含む。
【０１０５】
追加的な実施形態では、細胞調製物中の高パーセンテージの生存細胞は、調製後、少なくとも２４時間残る。一実施形態では、ネクローシス細胞及び／または後期アポトーシス状態にある細胞は、崩壊し、したがって生成方法の洗浄ステップ中に最終細胞調製物から実質的に排除される。
【０１０６】
本明細書に説明される一実施形態では、ＧＶＨＤ等の自己免疫疾患における治療免疫耐性を誘発するために、細胞調製物中の治療用単核濃縮細胞は、同種異系個体から取得される。別の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して調製されたプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、レシピエント対象に関してＨＬＡ適合またはＨＬＡ不適合の供給源に由来する同種異系細胞を含む。別の実施形態では、同種異系細胞は、レシピエント対象に関してＨＬＡ適合の供給源を含む。別の実施形態では、同種異系細胞は、レシピエント対象に関してＨＬＡ不適合の供給源を含む。
【０１０７】
一実施形態では、薬学的組成物は、プールされた細胞調製物を含み、抗凝固剤をさらに含む。
【０１０８】
当業者は、「プールされた細胞調製物」、「細胞調製物」、「プールされた単核アポトーシス細胞調製物」、「単核濃縮アポトーシス細胞調製物」、及び「単核アポトーシス細胞調製物」という用語は、一実施形態では、全ての同じ意味及び質を有して互換的に使用されることを理解するであろう。
【０１０９】
一実施形態では、薬学的組成物は、細胞調製物を含み、残留メチルプレドニゾロンをさらに含む。他の実施形態によると、薬学的組成物は、細胞調製物を含み、抗凝固剤及び残留メチルプレドニゾロンをさらに含む。一実施形態では、残留メチルプレドニゾロンは、本生成方法の使用後に組成物中に残留しているメチルプレドニゾロンを指す。
【０１１０】
一実施形態では、組成物は、抗凝固剤を含む。当該技術分野において知られる通り、本明細書で使用されるとき、抗凝固剤は、血液凝固を予防するまたは減少させる物質を指す。一実施形態では、抗凝固剤は、ヘパリンである。他の実施形態によると、抗凝固剤は、酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）、ｆｏｒｍｕｌａ  Ａである。一実施形態では、抗凝固剤は、ＡＣＤ  ｆｏｒｍｕｌａ  Ａとヘパリンとを含む組成物である。一実施形態では、抗凝固剤は、約１０Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含有するＡＣＤ  ｆｏｒｍｕｌａ  Ａである。一実施形態では、抗凝固剤は、ヘパリン、ＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態では、組成物中の抗凝固剤の存在は、組成物の生成プロセスの凍結及び／またはインキュベーション及び／または洗浄段階中の抗凝固剤の添加に起因する。一実施形態では、組成物の生成中の抗凝固剤の存在は、本明細書に説明されるアポトーシス誘発に悪影響を及ぼさない。
【０１１１】
一実施形態では、組成物は、ヘパリンを含む。一実施形態では、ヘパリンは、硫酸化ヘテロ多糖類ヘパリン、非分画ヘパリン（ＵＦＨ）、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。他の実施形態によると、ヘパリンは、限定されるものではないが、フォンダパリヌクス（Ｆｏｎｄａｐａｒｉｎａｕｘ）等の合成ヘパリンである。
【０１１２】
一実施形態では、組成物は、０．００１Ｕ／ｍｌ〜３Ｕ／ｍｌ、代替的に０．００５Ｕ／ｍｌ〜２．５Ｕ／ｍｌ、典型的には０．０１Ｕ／ｍｌ〜１Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含む。他の実施形態によると、組成物は、０．００１〜２．５Ｕ／ｍｌ、代替的に０．００１〜１Ｕ／ｍｌ、場合により０．００１〜０．５Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含む。
【０１１３】
他の実施形態によると、組成物は、０．００５〜１Ｕ／ｍｌ、代替的に０．００５〜０．６Ｕ／ｍｌ、場合により０．００５〜０．５Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含む。他の実施形態によると、組成物は、０．０１〜３Ｕ／ｍｌ、代替的に０．０１〜２Ｕ／ｍｌ、または０．０１〜０．６Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含む。一実施形態では、組成物は、０．０１〜０．５Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含む。一実施形態では、組成物は、０．０５Ｕ／ｍｌ〜０．２５Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含む。特定の実施形態によると、組成物は、０．０１Ｕ／ｍｌ〜０．６Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含む。
【０１１４】
一実施形態では、組成物は、最大３Ｕ／ｍｌのヘパリン、典型的には最大２．５Ｕ／ｍｌのヘパリン、場合により最大１Ｕ／ｍｌのヘパリン、代替的に最大０．５Ｕ／ｍｌのヘパリンを含む。一実施形態では、組成物は、少なくとも０．００１Ｕ／ｍｌのヘパリン、代替的に少なくとも０．００５Ｕ／ｍｌのヘパリン、場合により少なくとも０．０１のヘパリンを含む。一実施形態では、組成物は、最大３００Ｕ、代替的に最大１５０Ｕ、場合により最大７５Ｕのヘパリンを含む。特定の実施形態によると、組成物は、最大１８０Ｕのヘパリンを含む。
【０１１５】
一実施形態では、組成物中に含まれるヘパリンは、細胞調製物と患者への細胞調製物の投与に使用される最終懸濁媒体とを含む組成物中のヘパリンを指す。一実施形態では、組成物中に含まれるＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａは、細胞調製物と患者への細胞調製物の投与に使用される最終懸濁媒体とを含む組成物中のヘパリンを指す。
【０１１６】
一実施形態では、組成物は、０．５〜５００Ｕのヘパリン、場合により０．５〜５００Ｕのヘパリン、代替的に７〜１８０Ｕのヘパリンを含む。
【０１１７】
一実施形態では、組成物は、ＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａを含む。一実施形態では、ＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａは、クエン酸、デキストロース、及びクエン酸ナトリウムを含む。一実施形態では、ＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａは、０．７３ｇｒ／ｌ００ｍｌの濃度の無水クエン酸、２．４５ｇｒ／ｌ００ｍｌの濃度のデキストロース一水和物、及び２．２０ｇｒ／ｌ００ｍｌの濃度のクエン酸ナトリウム二水和物を含む。
【０１１８】
一実施形態では、組成物は、０．０１〜１０体積／体積、代替的に０．０５〜６体積／体積、場合により０．１体積／体積％〜５体積／体積％の濃度でＡＣＤ  ｆｏｒｍｕｌａ  Ａを含む。他の実施形態によると、組成物は、０．０５〜１０体積／体積、場合により０．０５〜６体積／体積、代替的に０．０５〜５体積／体積の濃度でＡＣＤ  ｆｏｒｍｕｌａ  Ａを含む。
【０１１９】
代替的実施形態によると、組成物は、０．１〜１０体積／体積、代替的に０．１％〜６％、場合により０．１体積／体積％〜５体積／体積％の濃度でＡＣＤ  ｆｏｒｍｕｌａ  Ａを含む。一実施形態では、組成物は、０．５体積／体積％〜２．５体積／体積％の濃度でＡＣＤ  ｆｏｒｍｕｌａ  Ａを含む。特定の実施形態によると、組成物は、０．０５〜６体積／体積、典型的には０．１体積／体積％〜６体積／体積％の濃度でＡＣＤ  ｆｏｒｍｕｌａ  Ａを含む。
【０１２０】
一実施形態では、組成物は、最大１５ｍｌ、代替的に最大９ｍｌ、場合により最大７．５ｍｌのＡＣＤ  ｆｏｒｍｕｌａ  Ａを含む。特定の実施形態によると、組成物は、最大１８ｍｌのＡＣＤ  ｆｏｒｍｕｌａ  Ａを含む。
【０１２１】
一実施形態では、組成物は、０．０５〜４０ｍｌのＡＣＤ  ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ、場合により０．１〜２５ｍｌのＡＣＤ  ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ、代替的に０．７〜１８ｍｌのＡＣＤ  ｆｏｒｍｕｌａ  Ａを含む。
【０１２２】
一実施形態では、組成物は、メチルプレドニゾロンをさらに含む。一実施形態では、組成物中の残留メチルプレドニゾロンの存在は、細胞調製物の生成プロセスのインキュベーション段階中のメチルプレドニゾロンの使用に起因する。一実施形態では、メチルプレドニゾロンは、細胞を初期アポトーシス状態に入るように誘発する手順の一部として、細胞調製物の生成中に使用される。
【０１２３】
一実施形態では、組成物は、０．５〜３０μｇ／ｍｌ、場合により１〜２５μｇ／ｍｌ、典型的には３〜２２μｇ／ｍｌの濃度でメチルプレドニゾロンをさらに含む。一実施形態では、組成物は、３．７〜２１．９μｇ／ｍｌの濃度でメチルプレドニゾロンを含む。
【０１２４】
一実施形態では、組成物は、３０μｇ／ｍｌを超えない濃度でメチルプレドニゾロンをさらに含む。一実施形態では、組成物は、３０μｇ／ｍｌを超えない、場合により２５μｇ／ｍｌを超えない、典型的には２１．９μｇ／ｍｌを超えない濃度でメチルプレドニゾロンをさらに含む。
【０１２５】
一実施形態では、組成物は、０．５〜６０μｇ／ｍｌ、場合により１．１２〜６０μｇ／ｍｌの濃度でメチルプレドニゾロンをさらに含む。一実施形態では、組成物は、６０μｇ／ｍｌを超えない濃度でメチルプレドニゾロンをさらに含む。
【０１２６】
一実施形態では、組成物は、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、場合により少なくとも１μｇ／ｍｌ、代替的に少なくとも３μｇ／ｍｌのメチルプレドニゾロンを含む。一実施形態では、組成物は、少なくとも３．５μｇ／ｍｌのメチルプレドニゾロンを含む。一実施形態では、組成物は、少なくとも３．７μｇ／ｍｌのメチルプレドニゾロンを含む。
【０１２７】
一実施形態では、組成物は、０．１〜２５ｍｇのメチルプレドニゾロン、場合により０．４〜２０ｍｇのメチルプレドニゾロン、代替的に０．６７〜１８ｍｇのメチルプレドニゾロンをさらに含む。一実施形態では、組成物は、２５ｍｇ、典型的には２０ｍｇ、代替的に１８ｍｇを超えない量のメチルプレドニゾロンをさらに含む。特定の実施形態によると、組成物は、１５ｍｇを超えない量のメチルプレドニゾロンをさらに含む。
【０１２８】
一実施形態では、薬学的組成物中のヘパリンは、０．００５Ｕ／ｍｌ〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度で存在する。他の実施形態によると、薬学的組成物中のＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａは、０．０１体積／体積％〜１０体積／体積％、代替的に０．０５体積／体積％〜５体積／体積％の濃度で存在する。
【０１２９】
特定の実施形態では、薬学的組成物は、体重１ｋｇ当たり約３０×１０６〜３００×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり１００×１０６〜３００×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり代替的に約１２０×１０６〜２５０×１０６個の細胞の投薬量で投与される。別の実施形態では、本明細書に開示される投薬量は、対象の体重１キログラム当たり約３０×１０６、３５×１０６、４０×１０６、４５×１０６、５０×１０６、５５×１０６、６０×１０６、６５×１０６、７０×１０６、または７５×１０６個の、プールされた単核アポトーシス細胞調製物に由来する細胞を含む。
【０１３０】
特定の実施形態では、薬学的組成物は、体重１ｋｇ当たり約３５×１０６個の細胞の投薬量で投与される。一実施形態では、薬学的組成物は、体重１ｋｇ当たり約１４０×１０６〜２１０×１０６個の細胞の投薬量で投与される。実施形態によると、薬学的組成物は、体重１ｋｇ当たり約１４０×１０６個の細胞の投薬量で投与される。別の実施形態によると、薬学的組成物は、体重１ｋｇ当たり約２１０×１０６個の細胞の投薬量で投与される。別の実施形態によると、薬学的組成物は、体重１ｋｇ当たり約３５×１０６〜２１０×１０６個の細胞の投薬量で投与される。別の実施形態によると、薬学的組成物は、体重１ｋｇ当たり約２５０×１０６個の細胞の投薬量で投与される。他の実施形態では、薬学的組成物は、体重１ｋｇ当たり約５×１０６個の細胞の投薬量で投与される。該低投薬量は、関節炎を治療するための関節への局所注射等の本明細書に開示される組成物の局所注射に好適であることが理解されるべきである。
【０１３１】
一実施形態では、治療用のプールされた単核濃縮細胞調製物は、対象に、静脈内経路を介して全身に投与される。代替的に、治療用の単核濃縮細胞は、限定されるものではないが、非経口、腹腔内、関節内、筋肉内、及び皮下経路を含む種々の他の経路に従って態様に投与されてもよい。別の実施形態では、治療用の単核濃縮細胞は、対処に、限定されるものではないが、生理食塩水、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等の好適な生理的緩衝液中に懸濁されて投与される。さらに、懸濁媒体は、細胞の生存性の維持を助ける補助物質をさらに含み得る。別の実施形態では、懸濁媒体は、細胞の初期アポトーシス状態の維持を助ける補助物質を含む。
【０１３２】
一実施形態では、本生成方法に従って取得された単核濃縮細胞組成物は、凍結媒体中で凍結を受ける。
【０１３３】
一実施形態では、凍結は、漸進的である。一実施形態では、収集後、細胞は、凍結されるまで室温に維持される。一実施形態では、細胞調製物は、細胞収集の後かつ凍結の前に、洗浄媒体中で少なくとも１つの洗浄ステップを受ける。
【０１３４】
当業者は、「細胞の取得」及び「細胞収集」という用語は、互換的に使用されることを理解するであろう。一実施形態では、細胞調製物の細胞は、収集の３〜６時間以内に凍結される。一実施形態では、細胞調製物は、細胞収集の最大６時間以内に凍結される。一実施形態では、細胞調製物の細胞は、収集の１、２、３、４、５、６、７、８時間以内に凍結される。他の実施形態によると、細胞調製物の細胞は、収集の８、１２、２４、４８、７２時間以内に凍結される。他の実施形態によると、収集後、細胞は、凍結されるまで２〜８℃に維持される。
【０１３５】
一実施形態では、本生成方法に従う凍結は、細胞調製物を約−１８℃〜−２５℃で凍結させた後、細胞調製物を約−８０℃で凍結させ、最後に細胞調製物を解凍まで液体窒素中で凍結させることを含む。一実施形態では、本生成方法に従う凍結は、細胞調製物を約−１８℃〜−２５℃で少なくとも２時間凍結させることと、細胞調製物を約−８０℃で少なくとも２時間凍結させることと、最後に細胞調製物を解凍まで液体窒素中で凍結させることとを含む。一実施形態では、細胞は、解凍前に少なくとも８、１０、または１２時間液体窒素中に保たれる。一実施形態では、細胞調製物の細胞は、解凍、及びアポトーシスを誘発するインキュベーション媒体によるインキュベーションまで、液体窒素中に保たれる。一実施形態では、細胞調製物の細胞は、造血幹細胞移植の日まで液体窒素中に保たれる。非限定的な例によると、細胞収集及び凍結から最終組成物の調製までの時間は、１〜５０日間、代替的に６〜３０日間であり得る。代替的実施形態によると、細胞調製物は、例えば少なくとも数カ月間等、より長期間液体窒素中に保たれてもよい。
【０１３６】
一実施形態では、本生成方法に従う凍結は、細胞調製物を約−１８℃〜−２５℃で少なくとも０．５、１、２、４時間凍結させることを含む。一実施形態では、本生成方法に従う凍結は、細胞調製物を約−１８℃〜−２５℃で約２時間凍結させることを含む。一実施形態では、本生成方法に従う凍結は、細胞調製物を約−８０℃で少なくとも０．５、１、２、４、１２時間凍結させることを含む。
【０１３７】
一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２０カ月間、凍結されたままであり得る。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、少なくとも０．５、１、２、３、４、５年間、凍結されたままであり得る。特定の実施形態によると、単核濃縮細胞組成物は、少なくとも２０カ月間、凍結されたままであり得る。
【０１３８】
一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、少なくとも８、１０、１２、１８、２４時間凍結される。特定の実施形態によると、単核濃縮細胞組成物の凍結は、少なくとも８時間の期間である。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、少なくとも約１０時間凍結される。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、少なくとも約１２時間凍結される。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、約１２時間凍結される。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物の総凍結時間（約−１８℃〜−２５℃、約−８０℃、及び液体窒素中）は、少なくとも８、１０、１２、１８、２４時間である。
【０１３９】
一実施形態では、凍結は、単核濃縮細胞組成物の細胞において初期アポトーシス状態を少なくとも部分的に誘発する。一実施形態では、凍結媒体は、Ｌ−グルタミン、Ｈｅｐｅｓ、Ｈｅｓ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び血漿を含むＲＰＭＩ  １６４０媒体を含む。一実施形態では、凍結媒体は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５％のＨｅｓ、１０％のジメチルスルホキシド、及び２０体積／体積％の血漿を含むＲＰＭＩ  １６４０媒体を含む。
【０１４０】
一実施形態では、凍結媒体は、抗凝固剤を含む。特定の実施形態によると、凍結媒体、インキュベーション媒体、及び洗浄媒体を含む、本生成方法中に使用される媒体のうちの少なくともいくつかは、抗凝固剤を含む。特定の実施形態によると、本生成方法中に使用される、抗凝固剤を含む全ての媒体は、同一濃度の抗凝固剤を含む。一実施形態では、抗凝固剤は、細胞組成物の最終懸濁媒体には添加されない。
【０１４１】
一実施形態では、少なくとも凍結媒体への抗凝固剤の添加は、細胞調製物の収率を改善する。他の実施形態によると、凍結媒体への抗凝固剤の添加は、高トリグリセリドレベルの存在下で細胞調製物の収率を改善する。本明細書で使用されるとき、細胞調製物の収率の改善は、凍結された細胞のうちの生存細胞のパーセンテージ、生存細胞のうちの初期状態のアポトーシス細胞のパーセンテージ、及びそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つの改善に関する。
【０１４２】
一実施形態では、凍結媒体への抗凝固剤の添加は、薬学的組成物の異なる調製物間の高く安定した収率に貢献する。好ましい実施形態によると、少なくとも凍結媒体及びインキュベーション媒体への抗凝固剤の添加は、使用される細胞収集プロトコルに関わらず、薬学的組成物の異なる調製物間の高く安定した収率をもたらす。
【０１４３】
一実施形態では、凍結媒体は、ヘパリン、ＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固剤を含む。一実施形態では、凍結媒体中に使用される抗凝固剤は、１０Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含有するＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａである。一実施形態では、凍結媒体は、１０Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含む５体積／体積％のＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ溶液を含む。
【０１４４】
一実施形態では、凍結媒体は、ヘパリンを含む。一実施形態では、凍結媒体中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度である。一実施形態では、凍結媒体中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌ、場合により０．３〜０．７Ｕ／ｍｌ、典型的には約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。特定の実施形態によると、凍結媒体中のヘパリンは、約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。
【０１４５】
一実施形態では、凍結媒体は、ＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａを含む。一実施形態では、凍結媒体中のＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａは、１体積／体積％〜１５体積／体積％の濃度である。一実施形態では、凍結媒体中のＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａは、１体積／体積％〜１５体積／体積％、場合により４体積／体積％〜７体積／体積％、典型的には約５体積／体積％の濃度である。一実施形態では、凍結媒体中のＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａは、約５体積／体積％の濃度である。
【０１４６】
一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、細胞収集の後、かつ凍結媒体中に再懸濁され、凍結される前に、少なくとも１つの洗浄ステップを受ける。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、凍結及び解凍の後に少なくとも１つの洗浄ステップを受ける。一実施形態では、洗浄ステップは、単核濃縮細胞組成物の遠心分離、その後の上清抽出、及び洗浄媒体中での再懸濁を含む。
【０１４７】
一実施形態では、細胞収集は、単核濃縮細胞組成物の取得を指す。一実施形態では、本生成方法中に実施される洗浄ステップは、洗浄媒体中で実施される。特定の実施形態によると、本生成方法のインキュベーションステップまでに実施される洗浄ステップは、洗浄媒体中で実施される。一実施形態では、洗浄媒体は、Ｌ−グルタミン及びＨｅｐｅｓを補充したＲＰＭＩ  １６４０媒体を含む。一実施形態では、洗浄媒体は、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓを補充したＲＰＭＩ  １６４０媒体を含む。
【０１４８】
一実施形態では、洗浄媒体は、抗凝固剤を含む。一実施形態では、洗浄媒体は、ヘパリン、ＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固剤を含む。一実施形態では、洗浄媒体中の抗凝固剤の濃度は、凍結媒体中のものと同一の濃度である。一実施形態では、洗浄媒体中の抗凝固剤の濃度は、インキュベーション媒体中のものと同一の濃度である。一実施形態では、洗浄媒体中に使用される抗凝固剤は、１０Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含有するＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａである。
【０１４９】
一実施形態では、洗浄媒体は、ヘパリンを含む。一実施形態では、洗浄媒体中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度である。一実施形態では、洗浄媒体中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌ、場合により０．３〜０．７Ｕ／ｍｌ、典型的には約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。特定の実施形態によると、洗浄媒体中のヘパリンは、約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。
【０１５０】
一実施形態では、洗浄媒体は、ＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａを含む。一実施形態では、洗浄媒体中のＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａは、１体積／体積％〜１５体積／体積％の濃度である。一実施形態では、洗浄媒体中のＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａは、１体積／体積％〜１５体積／体積％、場合により４体積／体積％〜７体積／体積％、典型的には約５体積／体積の濃度である。一実施形態では、洗浄媒体中のＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａは、約５体積／体積％の濃度である。
【０１５１】
一実施形態では、プールされた単核濃縮細胞組成物は、対象への組成物の意図される投与の数時間前に解凍される。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、約３３℃〜３９℃で解凍される。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、約３０〜２４０秒間、好ましくは４０〜１８０秒間、最も好ましくは５０〜１２０秒間解凍される。
【０１５２】
一実施形態では、プールされた単核濃縮細胞組成物は、組成物の意図される投与の少なくとも１０時間前、代替的に組成物の意図される投与の少なくとも２０、３０、４０、または５０時間前に解凍される。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、組成物の意図される投与の少なくとも１５〜２４時間前に解凍される。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、組成物の意図される投与の少なくとも約２４時間前に解凍される。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、組成物の意図される投与の少なくとも２０時間前に解凍される。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、組成物の意図される投与の３０時間前に解凍される。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、組成物の意図される投与の少なくとも２４時間前に解凍される。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、解凍の前及び／または後に洗浄媒体中で少なくとも１つの洗浄ステップを受ける。
【０１５３】
一実施形態では、プールされた単核濃縮細胞組成物は、インキュベーション媒体中でインキュベートされた後、凍結及び解凍される。一実施形態では、解凍とインキュベーションとの間に少なくとも１つの洗浄ステップが存在する。本明細書で使用されるとき、「インキュベーション媒体」及び「アポトーシスを誘発するインキュベーション媒体」という用語は、互換的に使用される。一実施形態では、インキュベーション媒体は、Ｌ−グルタミン、Ｈｅｐｅｓメチルプレドニゾロン、及び血漿を補充したＲＰＭＩ  １６４０媒体を含む。一実施形態では、洗浄媒体は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、及び１０体積／体積％の血漿を含む。一実施形態では、インキュベーション媒体中の血漿は、細胞調製物の細胞が取得されるドナーと同じドナーから取得される。一実施形態では、血漿は、インキュベーションの日にインキュベーション媒体に添加される。一実施形態では、インキュベーションは、３７℃で実施される。
【０１５４】
一実施形態では、インキュベーション媒体は、メチルプレドニゾロンを含む。一実施形態では、インキュベーション媒体内のメチルプレドニゾロンは、単核濃縮細胞組成物中の細胞が初期アポトーシス状態に入るようにさらに誘発する。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物中の細胞は、メチルプレドニゾロンの存在下で、凍結及びインキュベートの両方によって初期アポトーシス状態に入るように誘発される。一実施形態では、本生成方法は、ネクローシスの誘発を実質的に伴わずに初期アポトーシス状態の誘発を有利に可能にし、細胞は、調製後約２４時間、その初期アポトーシス状態にて安定したままである。
【０１５５】
一実施形態では、インキュベーション媒体は、約１０〜１００μｇ／ｍｌの濃度でメチルプレドニゾロンを含む。一実施形態では、インキュベーション媒体は、約４０〜６０μｇ／ｍｌ、代替的に約４５〜５５μｇ／ｍｌの濃度でメチルプレドニゾロンを含む。一実施形態では、インキュベーション媒体は、５０μｇ／ｍｌの濃度でメチルプレドニゾロンを含む。
【０１５６】
一実施形態では、インキュベーションは、約２〜１２時間、場合により４〜８時間、典型的には約５〜７時間である。一実施形態では、インキュベーションは、約６時間である。一実施形態では、インキュベーションは、少なくとも６時間である。好ましい実施形態によると、インキュベーションは、６時間である。
【０１５７】
一実施形態では、インキュベーション媒体は、抗凝固剤を含む。一実施形態では、インキュベーション媒体への抗凝固剤の添加は、細胞調製物の収率を改善する。一実施形態では、インキュベーション媒体中の抗凝固剤は、凍結媒体中のものと同一の濃度である。一実施形態では、インキュベーション媒体は、ヘパリン、ＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固剤を含む。一実施形態では、インキュベーション媒体中に使用される抗凝固剤は、１０Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含有するＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａである。
【０１５８】
一実施形態では、インキュベーション媒体は、ヘパリンを含む。一実施形態では、インキュベーション媒体中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度である。一実施形態では、インキュベーション媒体中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌ、場合により０．３〜０．７Ｕ／ｍｌ、典型的には約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。特定の実施形態によると、インキュベーション媒体中のヘパリンは、約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。
【０１５９】
一実施形態では、インキュベーション媒体は、ＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａを含む。一実施形態では、インキュベーション媒体中のＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａは、１体積／体積％〜１５体積／体積％の濃度である。一実施形態では、インキュベーション媒体中のＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａは、１体積／体積％〜１５体積／体積％、場合により４体積／体積％〜７体積／体積％、典型的には約５体積／体積％の濃度である。一実施形態では、インキュベーション媒体中のＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａは、約５体積／体積％の濃度である。
【０１６０】
一実施形態では、凍結媒体及びインキュベーション媒体の両方が、抗凝固剤を含む。一実施形態では、インキュベーション媒体及び凍結媒体の両方への抗凝固剤の添加は、例えば、限定されるものではないが、細胞収集中に添加される抗凝固剤のタイミング及び／または種類等の細胞収集条件に関わらず、組成物の異なる調製物間の高く安定した細胞収率をもたらす。一実施形態では、インキュベーション媒体及び凍結媒体の両方への抗凝固剤の添加は、白血球除去中に添加される抗凝固剤のタイミング及び／または種類に関わらず、細胞調製物の高く安定した収率をもたらす。
【０１６１】
一実施形態では、高トリグリセリドレベルを有するドナーの血液は、プールされた単核濃縮調製物から除外される。一実施形態では、「高トリグリセリドレベル」という用語は、同じ性別及び年齢の健康な対象の正常なレベルを上回るトリグリセリドレベルを指す。一実施形態では、「高トリグリセリドレベル」という用語は、約１．７ミリモル／リットルを上回るトリグリセリドレベルを指す。
【０１６２】
当業者は、高く安定した収率は、対象に投与されたときに治療効率を実証するであろう用量の調製物を可能にするのに十分に高い組成物の細胞収率を指すことを理解するであろう。一実施形態では、治療効率は、対象において免疫疾患、自己免疫疾患、または炎症性疾患を治療、予防、または改善する能力を指す。一実施形態では、高く安定した細胞収率は、初めに凍結された細胞のうち、少なくとも３０％、場合により少なくとも４０％、典型的には少なくとも５０％の組成物中の細胞の細胞収率である。
【０１６３】
一実施形態では、インキュベーション媒体及び／または凍結媒体への抗凝固剤の添加は、ドナーの血液中のトリグリセリドレベルに関わらず、組成物中の高く安定した細胞収率をもたらす。一実施形態では、インキュベーション媒体及び／または凍結媒体への抗凝固剤の添加は、正常な、または高いトリグリセリドレベルを有するドナーの血液から取得されるとき、組成物における高く安定した細胞収率をもたらす。一実施形態では、少なくともインキュベーション媒体への抗凝固剤の添加は、ドナーの血液中のトリグリセリドレベルに関わらず、組成物における高く安定した細胞収率をもたらす。一実施形態では、凍結媒体及びインキュベーション媒体への抗凝固剤の添加は、ドナーの血液中のトリグリセリドレベルに関わらず、組成物における高く安定した細胞収率をもたらす。
【０１６４】
一実施形態では、凍結媒体及び／またはインキュベーション媒体及び／または洗浄媒体は、少なくとも０．１Ｕ／ｍｌ、場合により少なくとも０．３Ｕ／ｍｌ、典型的には少なくとも０．５Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含む。一実施形態では、凍結媒体及び／またはインキュベーション媒体及び／または洗浄媒体は、少なくとも１体積／体積％、場合により少なくとも３体積／体積％、典型的には少なくとも５体積／体積％の濃度でＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａを含む。
【０１６５】
一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、本生成方法の各段階の間に少なくとも１つの洗浄ステップを受ける。一実施形態では、抗凝固剤は、本生成方法全体を通じて、洗浄ステップ中に洗浄媒体に添加される。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、インキュベーションの後に少なくとも１つの洗浄ステップを受ける。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、ＰＢＳを使用して、インキュベーションの後に少なくとも１つの洗浄ステップを受ける。一実施形態では、抗凝固剤は、投与媒体中での細胞調製物の再懸濁の前の最終洗浄ステップへは添加されない。一実施形態では、抗凝固剤は、投与媒体中での細胞調製物の再懸濁の前の最終洗浄ステップで使用されるＰＢＳには添加されない。特定の実施形態によると、抗凝固剤は、投与媒体には添加されない。
【０１６６】
一実施形態では、インキュベート中の細胞の濃度は、約５×ｌ０６細胞／ｍｌである。
【０１６７】
一実施形態では、プールされた単核濃縮細胞組成物は、凍結、解凍、及びインキュベートの後に投与媒体中に懸濁され、それによって薬学的組成物をもたらす。一実施形態では、投与媒体は、好適な生理的緩衝液を含む。好適な生理的緩衝液の非限定的な例は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｈｐａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）等である。一実施形態では、投与媒体は、ＰＢＳを含む。一実施形態では、投与媒体は、細胞の依存性の維持を助ける補助物質を含む。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、投与の前に濾過される。一実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、少なくとも２００μπιのフィルタを使用して投与の前に濾過される。
【０１６８】
一実施形態では、プールされた単核濃縮細胞組成物は、結果として得られる細胞調製物の最終体積が１００〜１０００ｍｌ、場合により２００〜８００ｍｌ、典型的には３００〜６００ｍｌであるように、投与媒体中に再懸濁される。
【０１６９】
一実施形態では、薬学的組成物を生成するための方法は、上記に説明されるプールされた単核濃縮細胞組成物を取得することをさらに含む。
【０１７０】
一実施形態では、本開示は、細胞調製物を提供し、該細胞調製物は、本生成方法によって生成される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、１００％の同種異系細胞を含む。別の実施形態では、組成物は、１００％未満の同種異系細胞を含む。
【０１７１】
一実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物を生成するための方法の、該単核濃縮集団を不活性化することを含むステップ（ｆ）は、該個別の集団における免疫応答を抑制もしくは排除すること、該個別の集団間の交差反応性を抑制もしくは排除すること、または該個別の集団におけるＴ細胞受容体活性を低減もしくは排除することを含み、該プールされた単核アポトーシス細胞調製物を含む該生成される薬学的組成物は、該細胞調製物の、減少された割合の非静止非アポトーシス細胞、任意の生きた非アポトーシス細胞の抑制された細胞活性化、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の低減された増殖、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１７２】
一実施形態では、細胞調製物を調製する方法は、照射ステップを含む。別の実施形態では、プールされたアポトーシス細胞調製物を調製する方法は、該細胞調製物中に存在する非アポトーシス細胞の活性化または増殖を抑制することを含む。いくつかの実施形態では、該抑制は、細胞調製物を照射することを含む。
【０１７３】
一実施形態では、（ｆ）該再懸濁された細胞集団中で、非静止非アポトーシス細胞の割合を減少させること、任意の生きた非アポトーシス細胞の細胞活性化を抑制すること、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の増殖を低減すること、またはそれらの任意の組み合わせを含む、「不活性化する」ステップは、細胞調製物を照射するステップを含む。別の実施形態では、該単核濃縮集団の不活性化は、該単核濃縮集団を照射することを含む。別の実施形態では、照射ステップは、該調製物の投与時に、例えば、ＧＶＨＤ等を引き起こし得る細胞の割合を効果的に低減する。別の実施形態では、照射ステップは、照射されていない細胞調製物と比較して、非静止非アポトーシス細胞の実際の数を低減する。別の実施形態では、照射ステップは、照射されていない細胞調製物と比較して、非静止非アポトーシス細胞の割合を低減する。
【０１７４】
別の実施形態では、照射を含む薬学的組成物を生成するための方法は、ガンマ線照射またはＵＶ照射を含む。別の実施形態では、照射を含む薬学的組成物を生成するための方法は、約１５グレイ単位（Ｇｙ）照射を含む。別の態様では、照射は、約２０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約２５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約３０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約３５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約４０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約４５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約５０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約５５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約６０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の態様では、照射は、約６５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、最大２５００Ｇｙを含む。別の実施形態では、照射は、約１５〜２５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約２５〜３０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約３０〜４０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約４０〜５０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約５０〜６５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。
【０１７５】
一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、凍結され、次に医療センターで解凍され、対象に投与され得る。別の実施形態では、白血球除去によって収集されたプールされた単核細胞は、凍結され、使用時前に液体窒素中に保管されてもよく、そのプールされた単核細胞は、医療センターで解凍され、本明細書に説明される通り初期アポトーシスが誘発された後、対象へ投与するために細胞懸濁液組成物が調製される。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、「即時使用可能な」形態であってもよく、約２〜８℃で冷蔵され、２４時間以内は使用のために安定である。
【０１７６】
プールされた単核アポトーシス細胞調製物の使用
【０１７７】
一実施形態では、本開示は、免疫疾患、自己免疫疾患、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、サイトカインストーム、または炎症性疾患の発生の治療、予防、改善、阻害、または低減を必要とする対象においてそれを行う方法であって、該対象に、上記に詳細に説明されるような発生を治療、予防、改善、阻害、または低減するプールされた単核アポトーシス細胞調製物を含む薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、プールされた単核アポトーシス細胞調製物の投与後に効率的に排出される。
【０１７８】
当業者は、「治療」または「治療する」という用語は、本明細書において上記に説明される標的とされた病理学的状態または障害を予防または軽減することを目的とする、疾患または状態の改善を含む治療的治療及び予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）尺度の両方を包含することを理解するであろう。したがって、一実施形態では、治療することは、疾患、障害、もしくは状態に関連する症状に直接影響を及ぼすか、もしくはそれらを治癒、抑制、阻害、予防すること、それらの重症度を低減すること、それらの発症を遅らせること、それらを低減すること、またはそれらの組み合わせを含み得る。したがって、一実施形態では、「治療する」は、とりわけ、進行を遅らせること、寛解を促進こと、寛解を誘発すること、寛解を増大させること、回収を速めること、代替的な治療薬の有効性を増加させることもしくはそれに対する耐性を減少させること、またはそれらの組み合わせを指す。一実施形態では、「予防する」は、とりわけ、症状の発症を遅延させること、疾患の再発を予防すること、再発エピソードの数もしくは頻度を減少させること、症候性エピソード間の潜伏期間を増加させること、またはそれらの組み合わせを指す。一実施形態では、「抑制する」または「阻害する」は、とりわけ、症状の重症度を低減すること、急性エピソードの重症度を低減すること、症状の数を低減すること、疾患関連症状の発生を低減すること、症状の潜伏期間を低減すること、症状を改善すること、二次的な症状を低減すること、二次感染を低減すること、患者の生存を延長すること、またはそれらの組み合わせを指す。
【０１７９】
一実施形態では、本明細書に開示される使用の方法の対象は、ヒト成人である。別の実施形態では、本明細書に開示される使用の方法の対象は、ヒト小児である。別の実施形態では、使用の方法の対象は、ヒト乳幼児である。
【０１８０】
一実施形態では、本明細書に開示される方法によって治療される免疫疾患は、ＧｖＨＤ、関節炎疾患、痛風、または炎症性腸疾患を含む群から選択される。
【０１８１】
一実施形態では、本明細書に開示される方法に従う濃縮されたプールされた単核細胞調製物における初期アポトーシスの誘発は、アポトーシス性の非ＨＬＡ適合同種異系ドナー細胞の臨床グレード集団を提供し、それは、骨髄から取得された細胞と共に注入されたときに、移植に関連付けられる重要な因子に影響を及ぼし、血液悪性腫瘍を有する対象においてＧＶＨＤの発生を効果的に低減した。
【０１８２】
ＧｖＨＤ
【０１８３】
具体的には、移植後１００日目で、グレードＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤの発生は、調製されたアポトーシスドナー細胞で治療されたＨＳＣ移植レシピエントにおいて低減され得、非再発生存率は、有意に増加された。初期アポトーシス細胞調製物の使用の詳細は、本明細書に完全に組み込まれるＷＯ２０１４／０８７４０８に開示されている。
【０１８４】
さらに、別の実施形態では、本方法に従って調製されたアポトーシスドナー細胞の注入は、ＨＳＣの生着までの時間の低減、及びＨＳＣ移植レシピエントにおける肝毒性の発生の著しい低減に効果的である。
【０１８５】
一実施形態では、本開示は、ＨＳＣＴを受けている対象においてＧＶＨＤの発生を治療、予防、改善、阻害、または低減する方法であって、該対象に薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、対象において不妊症を治療する方法を提供する。
【０１８６】
一実施形態では、本開示は、ＨＳＣＴを受けている対象においてＧＶＨＤの発生を予防、改善、阻害、または低減する方法であって、該対象に薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＨＳＣＴを受けている対象におけるＧＶＨＤの発生を治療、予防、改善、阻害、または低減する方法であって、該対象に、本明細書において上記に詳細に説明される通り本明細書において詳細に説明されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその薬学的組成物を含む薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＨＳＣＴを受けている対象においてＧＶＨＤの発生を治療、改善、阻害、または低減する、その発生を改善、阻害、または低減する方法であって、該対象に、本明細書において上記に詳細に開示される薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【０１８７】
一実施形態では、本開示は、ＨＳＣＴを受けている対象においてＧＶＨＤの発生を治療、予防、改善、阻害、または低減する方法であって、該対象に、上記に詳細に開示されるプールされた単核濃縮細胞を含む細胞調製物を含む薬学的組成物を投与することを含み、該薬学的組成物が、ヘパリン、ＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固剤を含む、方法を提供する。
【０１８８】
一実施形態では、本開示は、ＨＳＣＴを受けている対象においてＧＶＨＤの発生を治療、予防、改善、阻害、または低減する方法であって、該対象に、本明細書において上記に詳細に開示される通り本明細書において詳細に説明されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその薬学的組成物を含む薬学的組成物を投与することを含み、該薬学的組成物が、ヘパリン、ＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ、及びそれらの組み合わせから選択される抗凝固剤を含む、方法を提供する。
【０１８９】
一実施形態では、本開示は、ＨＳＣＴを受けている対象においてＧＶＨＤの発生を治療、予防、改善、阻害、または低減する方法であって、該対象に、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核濃縮細胞を含む細胞調製物を含む薬学的組成物を投与することを含み、該調製物が、３０μｇ／ｍｌを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを含む、方法を提供する。一実施形態では、の発生を治療、予防、改善、阻害、または低減すること。
【０１９０】
一実施形態では、の発生を治療、予防、改善、阻害、または低減すること、一実施形態では、本明細書において詳細に説明されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその薬学的組成物の発生を治療、予防、改善、阻害、または低減すること。
【０１９１】
一実施形態では、の発生を治療、予防、改善、阻害、または低減すること、一実施形態では、の発生を治療、予防、改善、阻害、または低減すること、一実施形態では、本開示は、ＨＳＣＴを受けている対象におけるＧＶＨＤの発生の治療、予防、改善、阻害、または低減の発生の治療、予防、改善、阻害、または低減における使用のための薬学的組成物を提供する。別の実施形態では、該ＨＳＣＴは、同種異系ＨＳＣＴを含み、該薬学的組成物は、該レシピエント対象に対してＨＬＡ適合ではない複数の同種異系ドナーから取得された細胞を含み、互いに対してＨＬＡ適合である該複数の同種異系ドナーに由来する細胞は含まない。
【０１９２】
一実施形態では、ＧＶＨＤは、高グレードＧＶＨＤである。特定の実施形態によると、高グレードＧＶＨＤは、グレードＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤである。別の特定の実施形態によると、高グレードＧＶＨＤは、グレードＩＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤである。実施形態によると、薬学的組成物は、高グレードＧＶＨＤからグレードＩのＧＶＨＤへの移行を誘発する。
【０１９３】
別の実施形態によると、ＧＶＨＤは、急性ＧＶＨＤである。また別の実施形態によると、ＧＶＨＤは、慢性ＧＶＨＤである。別の実施形態によると、薬学的組成物を投与された対象は、移植片対腫瘍（ＧＶＴＳ）または移植片対白血病（ＧＶＬ）効果を保持する。
【０１９４】
一実施形態では、ＧＶＨＤは、対象の肝臓におけるＧＶＨＤである。同種異系ＨＳＣＴレシピエントにおける肝機能障害は、予備レジメン及び他の薬に由来する毒性、感染、静脈閉塞性疾患（ＶＯＤ）、ならびに肝臓の急性及び慢性移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を含む多様な因子に起因し得る。
【０１９５】
別の実施形態によると、薬学的組成物は、ＧＶＨＤに関連付けられる肝毒性を低減する。一実施形態では、細胞調製物は、ＧＶＨＤに関連付けられる肝毒性を低減する。肝毒性の一般的な症状及び合併症としては、リンパ節炎、発熱、増加された赤血球沈降速度、高ビリルビンレベル、及び発熱性好中球減少症が挙げられる。
【０１９６】
免疫疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、及びサイトカインストーム
【０１９７】
一実施形態では、本開示は、免疫疾患または自己免疫疾患またはサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または炎症性疾患、またはサイトカインストームの発生の予防、改善、阻害、または低減を必要とする対象においてそれを行う方法であって、該対象に、本明細書において上記に詳細に開示される細胞調製物を含む薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、本開示は、免疫疾患または自己免疫疾患またはサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または炎症性疾患またはサイトカインストームの発生の治療、予防、改善、阻害、または低減を必要とする対象においてそれを行う方法であって、該対象に、本明細書において上記に詳細に説明される薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１９８】
一実施形態では、本開示は、免疫疾患または自己免疫疾患またはサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または炎症性疾患またはサイトカインストームの発症の治療、予防、改善、阻害、または低減を必要とする対象におけるその実施における使用のためのプールされた細胞調製物を提供する。一実施形態では、本開示は、免疫疾患または自己免疫疾患またはサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または炎症性疾患またはサイトカインストームの発生の治療、予防、改善、阻害、または低減を必要とする対象におけるその実施における使用のための薬学的組成物を提供する。
【０１９９】
一実施形態では、免疫疾患は、ＧＶＨＤである。一実施形態では、本開示は、ＧＶＨＤの発生の治療、予防、改善、阻害、または低減を必要とする対象におけるその実施における使用のための薬学的組成物を提供する。
【０２００】
一実施形態では、本開示は、造血器悪性腫瘍の発生を治療、予防、改善、阻害、または低減する方法であって、それを必要とする対象に薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。実施形態によると、対象は、造血器悪性腫瘍を罹患している。
【０２０１】
本明細書で使用されるとき、「造血器悪性腫瘍」という用語は、血液細胞の制御されていない異常な成長を特徴とする任意の血液細胞癌を指す。「造血器悪性腫瘍」という用語は、限定されるものではないが、白血病、骨髄異形成症候群、リンパ腫、及び多発性骨髄腫（形質細胞疾患）を含む。「白血病」という用語は、循環血液中の白血球数の対応する増加を伴うまたは伴わない身体組織中の白血球数の異常な増加を特徴とする、造血臓器の疾患（例えば、急性リンパ芽球性白血病、ＡＬＬ；急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病、ＡＭＬ；慢性骨髄性白血病、ＣＭＬ等）を指す。「骨髄異形成症候群」という用語は、骨髄が、前白血病プロセスを示唆する定性的及び定量的変化を示すが、必ずしも急性白血病として終わるわけではない慢性経過を有する状態を指す。「リンパ腫」という用語は、ＢまたはＴリンパ球から得られるリンパ芽球の悪性腫瘍（例えば、ホジキンリンパ腫、ＨＬ；非ホジキンリンパ腫、ＮＨＬ等）を指す。「形質細胞疾患」という用語は、形質細胞増殖（例えば、多発性骨髄腫、ＭＭ；形質細胞白血病、ＰＣＬ等）に起因する形質細胞増加症を指す。
【０２０２】
例示的な実施形態によると、該造血器悪性腫瘍は、ＭＤＳ、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病（ＡＭＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群から選択される。
【０２０３】
Ｔリンパ球等の特定の種類のドナー血液細胞の注入はまた、移植片対白血病効果を刺激し得る。この効果は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を有する患者に最も良く観察されている。ＣＭＬでは、移植後に再発した患者の７５パーセントが、再び寛解に入る。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）等の他の障害に関しては、この効果はより顕著ではなく、ＡＭＬ及びＭＤＳにおいては、およそ２０パーセントの患者が寛解に入る。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する患者に関しては、移植片対白血病効果の効果は明確ではないが、少数の患者は、少なくとも一時的にこの効果から恩恵を受けていることが報告されている。
【０２０４】
換言すると、プールされたドナー免疫細胞は、残留白血病細胞、リンパ腫細胞、または癌細胞を異種として認識し、それらを破壊し得る。遡及的研究は、急性または慢性ＧＶＨＤを発症する患者は、ＧＶＨＤを発症しない患者よりも低い疾患再発率を有することを実証している。この発見は、移植片対腫瘍効果の間接的な現れである。
【０２０５】
「調整処置」という用語は、放射線、免疫血清、化学療法、及び／または免疫抑制剤を含む種々の調整レジメンによる、移植前の移植レシピエントの予備的処置を指す。移植調整は、骨髄移植の前に極めて一般的である。
【０２０６】
当業者は、「対象」、「患者」、「レシピエント」、及び「それを必要とする対象」という用語は、互換的に使用され得、薬学的組成物の投与を必要とする対象を包含し得ることを理解するであろう。
【０２０７】
一実施形態では、薬学的組成物は、ＨＳＣＴを受けた、または受ける予定である対象に投与される。一実施形態では、それを必要とする対象は、ＨＳＣＴを受けている対象である。一実施形態では、それを必要とする対象に移植される造血幹細胞（ＨＳＣ）及び薬学的組成物の細胞は、同一のドナーから取得される。
【０２０８】
別の実施形態によると、薬学的組成物の投与は、ＨＳＣＴの最大２４時間前に実行される。一実施形態では、薬学的組成物の投与は、ＨＳＣＴの約２４〜３０時間前に実行される。また別の実施形態によると、薬学的組成物の投与は、ＨＳＣＴと同時に実行される。一実施形態では、薬学的組成物の投与は、ＨＳＣＴ後、最大１５日間後実行される。追加的な実施形態によると、ＨＳＣＴに使用されるＨＳＣは、同種異系ＨＳＣである。非限定的な例によると、ＨＳＣＴに使用されるＨＳＣは、骨髄、末梢血液、または臍帯血から取得され得る。別の実施形態によると、薬学的組成物は、単一用量で投与される。
【０２０９】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、クローン病及び潰瘍性結腸炎として示される、消化管における粘膜免疫系の異常調節を伴う慢性腸炎を特徴とする。本明細書で使用されるとき、ＩＢＤという用語は、クローン病、潰瘍性結腸炎、またはそれらの組み合わせを指す。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）等の腸管微生物叢及び危険信号の両方を含む遺伝因子及び環境因子は全て、腸炎を誘発することが示されている。ＴＮＦａ及びＩＦＮｙ遮断ならびに抗ＩＬ−Ιβ戦略、ならびに抗生物質治療は、大腸炎の誘発を改善することを可能であり、固有層におけるマクロファージ及び樹状細胞の核因子カッパＢ（ＮＦ−κΒ）及びインフラマソーム阻害に関する役割を示唆している。
【０２１０】
一実施形態では、プールされたアポトーシス細胞組成物は、インビトロ及びインビボの両方でＮＬＲＰ３インフラマソームを陰性調節し、造血細胞中のＮＬＲＰ３インフラマソームを介して誘発される前炎症性応答を下方調節することが可能である。
【０２１１】
一実施形態では、本開示は、ＩＢＤの発生の治療、予防、改善、阻害、または低減を必要とする対象においてそれを行う方法であって、該対象に薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＩＢＤの発生の治療、予防、改善、阻害、または低減を必要とする対象におけるその実施における使用のための薬学的組成物を提供する。
【０２１２】
一実施形態では、本開示は、ＩＢＤの発生の治療、予防、改善、阻害、または低減を必要とする対象においてそれを行う方法であって、該対象に、本明細書に説明されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその薬学的組成物を含み、１５％以下の多形核白血球を含む薬学的組成物を投与することを含み、該薬学的組成物が、ヘパリン、ＡＣＤ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固剤を含む、方法を提供する。
【０２１３】
一実施形態では、本開示は、ＩＢＤの発生の治療、予防、改善、阻害、または低減を必要とする対象においてそれを行う方法であって、該対象に、本明細書に詳細に説明されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその薬学的組成物を含む薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０２１４】
一実施形態では、免疫疾患の発生を治療、予防、改善、阻害、または低減する方法は、固形臓器移植を受けている対象に本明細書に開示される組成物を投与することを含む。一実施形態では、臓器は、肺、心臓、腎臓、膵臓、肝臓、皮膚、及び小腸からなる群から選択される。別の実施形態では、固形臓器は、β細胞を含む。別の実施形態では、固形臓器は、四肢である。
【０２１５】
一実施形態では、薬学的組成物の投与は、該移植の最大２４時間前に実行される。別の実施形態では、薬学的組成物の投与は、移植と同時に実行される。また別の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、該移植の１５日間後まで投与される。別の実施形態では、投与は、単回投与を含む。また別の実施形態では、投与は、本明細書に開示される組成物による反復投薬を含む。別の実施形態では、反復投薬は、増加された効果を示す。
【０２１６】
一実施形態では、本明細書に開示される組成物の投与に対する免疫原性応答が、モニタリングされる。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物の投与は、例えば、投与及び該対象の治療に悪影響を及ぼす抗体が生成される等の負の免疫応答に応答して中断される。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物の投与に対する免疫応答は、中和抗体に関してモニタリングされる。
【０２１７】
一実施形態では、本明細書に開示される組成物で治療される炎症性疾患は、関節炎である。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物で治療される炎症性疾患は、痛風である。また別の実施形態では、炎症性疾患は、炎症性腸疾患である。
【０２１８】
一実施形態では、本明細書に開示される組成物で治療される炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性結腸炎、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０２１９】
サイトカインストーム及びサイトカイン放出症候群
【０２２０】
一実施形態では、本明細書に説明される方法は、本明細書において詳細に説明されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物を提供して、対象において生じ得る毒性サイトカイン放出または「サイトカイン放出症候群」（ＣＲＳ）または「重度のサイトカイン放出症候群」（ｓＣＲＳ）または「サイトカインストーム」を減少させることを含む。別の実施形態では、ＣＲＳ、ｓＣＲＳ、またはサイトカインストームは、免疫細胞の投与の結果として生じる。別の実施形態では、ＣＲＳ、ｓＣＲＳ、またはサイトカインストームは、免疫細胞とは別の刺激、状態、または症候群の結果である（下記参照）。別の実施形態では、サイトカインストーム、サイトカインカスケード、または高サイトカイン血症は、サイトカイン放出症候群のより重度の形態である。
【０２２１】
当業者は、毒性サイトカイン放出または毒性サイトカインレベルの減少は、対象における毒性サイトカインレベルの生成を減少もしくは阻害すること、または対象におけるサイトカイン放出症候群もしくはサイトカインストームの発生を阻害もしくは低減することを含むことを理解するであろう。別の実施形態では、毒性サイトカインレベルは、ＣＲＳまたはサイトカインストーム中に低減される。別の実施形態では、毒性サイトカインレベルの生成の減少または阻害は、ＣＲＳまたはサイトカインストームを治療することを含む。別の実施形態では、毒性サイトカインレベルの生成の減少または阻害は、ＣＲＳまたはサイトカインストームを予防することを含む。別の実施形態では、毒性サイトカインレベルの生成の減少または阻害は、ＣＲＳまたはサイトカインストームを緩和することを含む。別の実施形態では、毒性サイトカインレベルの生成の減少または阻害は、ＣＲＳまたはサイトカインストームを改善することを含む。別の実施形態では、毒性サイトカインは、前炎症性サイトカインを含む。別の実施形態では、前炎症性サイトカインは、ＩＬ−６を含む。別の実施形態では、前炎症性サイトカインは、ＩＬ−１βを含む。別の実施形態では、前炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−αを含む。別の実施形態では、前炎症性サイトカインは、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、もしくはＴＮＦ−α、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０２２２】
一実施形態では、サイトカイン放出症候群は、いくつかの炎症性サイトカインの上昇したレベル、ならびに低血圧、高熱、及び震え等の対象における有害な身体的反応を特徴とする。別の実施形態では、炎症性サイトカインは、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、及びＴＮＦ−αを含む。別の実施形態では、ＣＲＳは、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、もしくはＴＮＦ−α、またはそれらの任意の組み合わせの上昇したレベルを特徴とする。別の実施形態では、ＣＲＳは、ＩＬ−８、もしくはＩＬ−１３、またはそれらの任意の組み合わせの上昇したレベルを特徴とする。別の実施形態では、サイトカインストームは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、フラックタルカイン（ｆｒａｃｋｔａｌｋｉｎｅ）、またはそれらの組み合わせもしくはそれらのサブセットの増加を特徴とする。また別の実施形態では、ＩＬ−６は、ＣＲＳまたはサイトカインストームのマーカーを含む。別の実施形態では、ＩＦＮ−γは、ＣＲＳまたはサイトカインストームのマーカーを含む。別の実施形態では、より大きい腫瘍負荷を有する患者は、サイトカイン放出症候群のより高い発生及び重症度を有する。
【０２２３】
別の実施形態では、ヒト及びマウスにおけるＣＲＳまたはサイトカインストームにおいて増加されるサイトカインは、下記の表１及び２に列挙されるサイトカインの任意の組み合わせを含み得る。
【０２２４】
【表１】
0006803339.tif 000002
【０２２５】
一実施形態では、表１のサイトカインＦｌｔ−３Ｌ、フラクタルカイン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１３は、ＣＲＳまたはサイトカインストームにおいて顕著であると見なされる別の実施形態では、表１のＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−１、及びＩＬ−１Ｒαは、ＣＲＳまたはサイトカインストームにおいて重要であると考えられる。別の実施形態では、Ｍ−ＣＳＦは、未知の重要性を有する。別の実施形態では、表１に列挙される任意のサイトカイン、またはそれらの組み合わせは、ＣＲＳまたはサイトカインストームのマーカーとして使用され得る。
【０２２６】
【表２】
0006803339.tif 000003
【０２２７】
一実施形態では、表２のＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、及びＴＮＦ−αは、ＣＲＳまたはサイトカインストームにおいて顕著であると見なされる。別の実施形態では、表２のＩＬ−２７、ＭＣＰ−３、ＰＧＥ２、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−αＲ１、及びＭＩＧは、ＣＲＳまたはサイトカインストームにおいて重要であると考えられる。別の実施形態では、ＩＬ−２３及びＩＬ−２５は、未知の重要性を有する。別の実施形態では、表２に列挙される任意のサイトカイン、またはそれらの組み合わせは、ＣＲＳまたはサイトカインストームのマーカーとして使用され得る。
【０２２８】
当業者は、「サイトカイン」という用語は、サイトカイン（例えば、インターフェロンγ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍ネクローシス因子α）、ケモカイン（例えば、ＭＩＰ  １α、ＭＩＰ  １β、ＲＡＮＴＥＳ）、ならびに活性酸素種及び酸化窒素等の他の好適な炎症メディエーターを包含し得ることを理解するであろう。
【０２２９】
一実施形態では、特定のサイトカインの増加された放出は、顕著であるか、重要であるか、未知の重要性を有しているかに関わらず、その特定のサイトカインがサイトカインストームの一部であることを先験的に意味するものではない。一実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの増加は、サイトカインストームまたはＣＲＳの結果ではない。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、増加したレベルの特定のサイトカインまたはサイトカイン群の供給源であり得る。
【０２３０】
別の実施形態では、サイトカイン放出症候群は、以下の症状のうちの任意のものまたは全てを特徴とする：悪寒を伴うまたは伴わない発熱、不快感、倦怠感、食欲不振、筋肉痛、関節痛、吐き気、嘔吐、頭痛、皮膚発疹、吐き気、嘔吐、下痢、多呼吸、低酸素血症、心管性頻脈（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、脈圧拡大、低血圧、増加した心拍出量（初期）、潜在的に減退した心拍出量（後期）、上昇したＤ二量体、出血を伴うまたは伴わない低フィブリノゲン血症、高窒素血漿、肝臓高トランスアミナーゼ血症（Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｔｒａｎｓａｍｉｎｉｔｉｓ）、高ビリルビン血症、頭痛、精神状態の変化、混乱、せん妄、喚語困難または明らかな失語、幻覚、振戦、ディスメトリア、歩行変動、発作。別の実施形態では、サイトカインストームは、ＩＬ−２放出及びリンパ増殖を特徴とする。別の実施形態では、サイトカインストームは、ＣＡＲ  Ｔ細胞によって放出されるサイトカインの増加を特徴とする。別の実施形態では、サイトカインストームは、ＣＡＲ  Ｔ細胞以外の細胞によって放出されるサイトカインの増加を特徴とする。
【０２３１】
別の実施形態では、サイトカインストームは、心機能障害、成人呼吸促迫症候群、神経毒性、腎及び／または肝不全、ならびに播種性血管内凝固を含む、生命に関わり得る合併症につながる。
【０２３２】
当業者は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの特徴は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの要因の数日〜数週間後に生じると推定されることを理解するであろう。一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの要因である。別の実施形態では、ＣＲＳまたはサイトカインストームの要因は、ＣＡＲ  Ｔ細胞ではない。
【０２３３】
一実施形態では、サイトカインストームの指標としてのサイトカインレベルまたは濃度の測定は、サイトカインレベルまたは濃度の倍増加、パーセント（％）増加、純増加、または変化率として表され得る。別の実施形態では、特定のレベルまたは濃度を上回る絶対サイトカインレベルまたは濃度は、サイトカインストームを受けているか、またはサイトカインストームを経験しようとしている対象の兆候であり得る。別の実施形態では、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を受けていない対照対象において正常に見られるレベルまたは濃度等、特定のレベルまたは濃度の絶対サイトカインレベルまたは濃度は、ＣＡＲ  Ｔ細胞を受けている対象におけるサイトカインストームの発生を阻害または低減するための方法の兆候であり得る。
【０２３４】
当業者は、「サイトカインレベル」という用語は、濃度の尺度、倍変化の尺度、パーセント（％）変化の尺度、または速度変化の尺度を包含し得ることを理解するであろう。さらに、血液、唾液、血清、尿、及び血漿中のサイトカインを測定するための方法は、当該技術分野において周知である。
【０２３５】
一実施形態では、サイトカインストームはいくつかの炎症性サイトカインの上昇に関連付けられるという認識にも関わらず、ＩＬ−６レベルは、サイトカインストームの一般的尺度及び／またはサイトカインストームの治療の効果の一般的尺度として使用され得る。当業者は、他のサイトカインがサイトカインストームのマーカーとして使用されてもよく、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＢ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、もしくはＩＮＦ−γ、または任意の上記の組み合わせのいずれかが、ＣＲＳまたはサイトカインストームのマーカーとして使用されてもよいことを理解するであろう。さらに、このサイトカインを測定するためのアッセイ方法は、当該技術分野において周知である。当業者は、サイトカインストームに影響を及ぼす方法は、同様にサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）に影響を及ぼし得ることを理解するであろう。
【０２３６】
一実施形態では、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験している対象においてサイトカイン生成を減少させるまたは阻害する方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験しやすい対象においてサイトカイン生成を減少させるまたは阻害する方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験している対象においてサイトカイン生成を減少させるまたは阻害する方法であって、表１及び／または２に列挙される任意のサイトカインまたはサイトカイン群の生成が減少または阻害される方法が、本明細書に開示される。別の実施形態では、サイトカインＩＬ−６生成が、減少または阻害される。別の実施形態では、サイトカインＩＬ−β１生成が、減少または阻害される。別の実施形態では、サイトカインＩＬ−８生成が、減少または阻害される。別の実施形態では、サイトカインＩＬ−１３生成が、減少または阻害される。別の実施形態では、サイトカインＴＮＦ−α生成が、減少または阻害される。別の実施形態では、サイトカインＩＬ−６生成、ＩＬ−１β生成、もしくはＴＮＦ−α生成、またはそれらの任意の組み合わせが、減少または阻害される。
【０２３７】
一実施形態では、サイトカイン放出症候群は、等級付けられる。別の実施形態では、グレード１は、症状は致命的ではなく、例えば、発熱、吐き気、倦怠感、頭痛、筋肉痛、不快感等の対症治療のみを必要とするサイトカイン放出症候群を説明する。別の実施形態では、グレード２の症状は、酸素、低血圧用の流体または昇圧剤等の中程度の介入を必要とし、それに応答する。別の実施形態では、グレード３の症状は、積極的な介入を必要とし、それに応答する。別の実施形態では、グレード４の症状は、致命的な症状であり、人工呼吸器を必要とし、患者は臓器毒性を示す。
【０２３８】
別の実施形態では、サイトカインストームは、ＩＬ−６及びインターフェロンγの放出を特徴とする。別の実施形態では、サイトカインストームは、ＩＬ−６の放出を特徴とする。別の実施形態では、サイトカインストームは、インターフェロンγの放出を特徴とする。別の実施形態では、サイトカインストームは、表１及び２に列挙される任意のサイトカインまたはそれらの組み合わせの放出を特徴とする。別の実施形態では、サイトカインストームは、当該技術分野において既知である任意のサイトカインまたはそれらの組み合わせの放出を特徴とする。
【０２３９】
一実施形態では、症状の発症は、注入開始の数分〜数時間後に開始する。別の実施形態では、症状は、ピークサイトカインレベルと同時に生じる。
【０２４０】
一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞癌療法を受けている対象においてサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生を阻害または低減する方法は、本明細書に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその薬学的組成物を投与することを含む。
【０２４１】
一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞癌療法を受けている対象においてサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生を治療、予防、改善、阻害、または低減する方法は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の有効性に影響を及ぼさない。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞癌療法を受けている対象においてＣＲＳまたはサイトカインストームの発生を治療、予防、改善、阻害、または低減する方法は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の有効性を約５％超は低減しない。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞癌療法を受けている対象においてＣＲＳまたはサイトカインストームの発生を治療、予防、改善、阻害、または低減する方法は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の有効性を約１０％超は低減しない。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞癌療法を受けている対象においてＣＲＳまたはサイトカインストームの発生を治療、予防、改善、阻害、または低減する方法は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の有効性を約１５％超は低減しない。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞癌療法を受けている対象においてＣＲＳまたはサイトカインストームの発生を治療、予防、改善、阻害、または低減する方法は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の有効性を約２０％超は低減しない。
【０２４２】
ＣＡＲを発現するように修飾された免疫細胞の活性が実質的に変化しないままであるかを決定するために、細胞毒性を定量化する任意の適切な方法が使用され得る。例えば、細胞毒性は、実施例に説明される細胞毒性アッセイ等の細胞培養に基づいたアッセイを使用して定量化され得る。細胞毒性アッセイは、死滅した細胞のＤＮＡを選択的に染色する染料を用い得る。他の場合では、細胞集団内の生きた細胞及び死滅した細胞の相対数を測定する蛍光及び発光アッセイが、使用され得る。かかるアッセイに関して、プロテアーゼ活性は、細胞の生存性及び細胞の毒性に関するマーカーとして働き、標識された細胞透過性ペプチドは、サンプル中の生存細胞の数に比例する蛍光信号を生み出す。種々の細胞毒性アッセイ用のキットが、Ｐｒｏｍｅｇａ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ等の製造者から市販されている。別の実施形態では、細胞毒性の尺度は、定性的であり得る。別の実施形態では、細胞毒性の尺度は、定量的であり得る。さらなる実施形態では、細胞毒性の尺度は、細胞毒性サイトカインの発現の変化に関連し得る。
【０２４３】
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法に関連付けられるサイトカイン放出
【０２４４】
一実施形態では、サイトカイン放出は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法等の免疫療法の投与の数日間〜２週間後に発生する。一実施形態では、低血圧及び他の症状が、サイトカイン放出後に、すなわち数日間〜数週間後に続く。したがって、一実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物は、予防薬として免疫療法と同時に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜３日間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７日間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０日間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４日間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜１４日間後に対象に投与される。
【０２４５】
別の実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物は、免疫療法の投与の２〜３時間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７時間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０時間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４時間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜１４時間後に対象に投与される。
【０２４６】
代替的実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物は、予防薬として免疫療法の前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１日間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜３日間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７日間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０日間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４日間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜１４日間前に対象に投与される。
【０２４７】
別の実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物は、免疫療法の投与の２〜３時間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７時間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０時間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４時間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜１４時間前に対象に投与される。
【０２４８】
別の実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物は、サイトカイン放出症候群が生じた後に治療的に投与され得る。一実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、サイトカイン放出症候群の開始につながるか、またはそれを立証するサイトカイン放出が検出された後に、投与され得る。一実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、増加したサイトカインレベル、またはサイトカイン放出症候群を終わらせ、その後遺症を回避し得る。
【０２４９】
別の実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物は、複数の時点で治療的に投与され得る。別の実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物の投与は、本明細書に説明される少なくとも２つの時点における。別の実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物の投与は、本明細書に説明される少なくとも３つの時点における。別の実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物の投与は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの前、及びサイトカイン放出症候群が生じた後、ならびにそれらの任意の組み合わせである。
【０２５０】
一実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）療法と、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物とは、一緒に投与される。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、アポトーシス細胞療法または上清の後に投与される。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、アポトーシス細胞療法または上清の前に投与される。この態様によると、一実施形態では、アポトーシス細胞療法または上清は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法のおよそ２〜３週間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞療法または上清は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法のおよそ６〜７週間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞療法または上清は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法のおよそ９週間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞療法は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の最大数カ月間後に投与される。
【０２５１】
したがって、一実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物は、予防薬として免疫療法と同時に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜３日間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７日間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０日間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４日間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜１４日間後に対象に投与される。
【０２５２】
別の実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物は、免疫療法の投与の２〜３時間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７時間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０時間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４時間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜１４時間後に対象に投与される。
【０２５３】
代替的実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物は、予防薬として免疫療法の前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１日間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜３日間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７日間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０日間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４日間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜１４日間前に対象に投与される。
【０２５４】
別の実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物は、免疫療法の投与の２〜３時間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７時間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０時間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４時間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜１４時間前に対象に投与される。
【０２５５】
別の実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物は、サイトカイン放出症候群が生じた後に治療的に投与され得る。一実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物は、サイトカイン放出症候群の開始につながるか、またはそれを立証するサイトカイン放出が検出された後に、投与され得る。一実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、増加したサイトカインレベル、またはサイトカイン放出症候群を終わらせ、その後遺症を回避し得る。
【０２５６】
別の実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物は、複数の時点で治療的に投与され得る。別の実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物の投与は、本明細書に説明される少なくとも２つの時点における。別の実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物の投与は、本明細書に説明される少なくとも３つの時点における。別の実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物の投与は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの前、及びサイトカイン放出症候群が生じた後、ならびにそれらの任意の組み合わせである。
【０２５７】
一実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）療法と、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物とは、一緒に投与される。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物の後に投与される。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物の前に投与される。この態様によると、一実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法のおよそ２〜３週間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞療法または上清は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法のおよそ６〜７週間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞療法または上清は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法のおよそ９週間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞療法は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の最大数カ月間後に投与される。
【０２５８】
一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、対象に対して異種である。一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、１人以上のドナーから取得される。一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、１人以上の骨髄ドナーから取得される。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、１つ以上の血液バンク寄付から取得される。一実施形態では、ドナーは、適合ドナーである。一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、普遍的な同種異系ＣＡＲ  Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、同系ＣＡＲ  Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、不適合の第三者ドナーに由来する。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、プールされた第三者ドナーのＴ細胞に由来する。一実施形態では、ドナーは、骨髄ドナーである。別の実施形態では、ドナーは、血液バンクドナーである。一実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法のＣＡＲ  Ｔ細胞は、１つ以上のＭＨＣ非制限的腫瘍指向性キメラ受容体を含む。一実施形態では、非自己Ｔ細胞は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０１５６７９４号に説明されるもの等の、自己免疫反応を予防または最小化するような当該技術分野において既知であるプロトコルに従って、操作または投与され得る。
【０２５９】
別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、対象に対して自己由来である。一実施形態では、患者自身の細胞が使用される。この実施形態では、患者自身の細胞が使用される場合、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、プールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物の後に投与される。
【０２６０】
一実施形態では、調製物は、例えば、患者の身体の特定の領域への直接的な調製物の注射を介して、全身的な様式というよりもむしろ局所的に投与される。別の実施形態では、特定の領域は、腫瘍または癌を含む。
【０２６１】
特定の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、ＣＡＲ  Ｔ細胞とプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物とを含む本明細書に開示される組成物を投与することを含む。
【０２６２】
非ＣＡＲ  Ｔ細胞用途に関連付けられるサイトカイン放出
【０２６３】
一実施形態では、サイトカイン放出症候群もしくはサイトカインストームを経験しているか、またはサイトカイン放出症候群もしくはサイトカインストームを発症しやすい対象において、サイトカイン生成を減少させる阻害する方法であって、該対象に、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物を含む組成物を投与するステップを含み、該投与が、該対象におけるサイトカイン生成を減少させるまたは阻害する方法が、本明細書に開示される。別の実施形態では、サイトカイン生成の減少または阻害は、サイトカイン放出症候群もしくはサイトカインストームを経験しているか、またはサイトカイン放出症候群もしくはサイトカインストームを発症しやすく、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物を投与されていない対象と比較される。別の実施形態では、サイトカイン生成を減少させるまたは阻害する方法は、前炎症性サイトカインの生成を減少させるまたは阻害する。別の実施形態では、サイトカイン生成を減少させるまたは阻害する方法は、少なくとも１つの前炎症性サイトカインの生成を減少させるまたは阻害する。別の実施形態では、サイトカイン生成を減少させるまたは阻害する方法は、少なくともサイトカインＩＬ−６の生成を減少させるまたは阻害する。別の実施形態では、サイトカイン生成を減少させるまたは阻害する方法は、少なくともサイトカインＩＬ−１βの生成を減少させるまたは阻害する。別の実施形態では、サイトカイン生成を減少させるまたは阻害する方法は、少なくともサイトカインＴＮＦ−αの生成を減少させるまたは阻害する。別の実施形態では、本明細書に開示されるサイトカイン生成を減少させるまたは阻害するための方法は、該対象において、サイトカイン放出症候群もしくはサイトカインストームを経験しているか、またはサイトカイン放出症候群もしくはサイトカインストームを発症しやすく、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物を投与されていない対象と比較してサイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１β、もしくはＴＮＦ−α、または任意の組み合わせの生成の低減または阻害をもたらす。
【０２６４】
癌または腫瘍もまた、前炎症性サイトカインを含むサイトカインの絶対レベルに影響を及ぼし得る。対象における腫瘍負荷のレベルは、サイトカインレベル、特にｐｒｏ０炎症性サイトカインに影響を及ぼし得る。当業者は、「減少させるまたは阻害する」という語句またはその文法的変異形は、サイトカイン生成の倍減少もしくは阻害、またはサイトカイン生成の純減少もしくは阻害、またはパーセント（％）減少もしくは阻害を含み得るか、あるいはサイトカイン生成の減少または阻害の変化率を包含し得ることを理解するであろう。
【０２６５】
別の実施形態では、サイトカイン放出症候群もしくはサイトカインストームを経験しているか、またはサイトカイン放出症候群もしくはサイトカインストームを発症しやすい対象においてサイトカイン生成を減少または阻害する方法であって、該対象に、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物を投与するステップを含む方法が、本明細書に開示される。
【０２６６】
別の実施形態では、サイトカイン放出症候群もしくはサイトカインストームを経験しているか、またはサイトカイン放出症候群もしくはサイトカインストームを発症しやすい対象においてサイトカイン生成を減少または阻害する方法であって、該対象に、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物を投与するステップを含む方法が、本明細書に開示される。
【０２６７】
一実施形態では、感染が、対象においてサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを引き起こす。一実施形態では、感染は、インフルエンザ感染である。一実施形態では、インフルエンザ感染は、Ｈ１Ｎ１である。別の実施形態では、インフルエンザ感染は、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザである。別の実施形態では、感染は、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）である。別の実施形態では、対象は、エプスタイン・バーウイルス関連血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）を有する。別の実施形態では、感染は、敗血症である。一実施形態では、敗血症は、グラム陰性である。別の実施形態では、感染は、マラリアである。別の実施形態では、感染は、エボラウイルス感染である。別の実施形態では、感染は、天然痘ウイルスである。別の実施形態では、感染は、全身性グラム陰性細菌感染である。別の実施形態では、感染は、ヤーリッシュ・ヘルクスハイマー症候群である。
【０２６８】
一実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）である。別の実施形態では、ＨＬＨは、散発性ＨＬＨである。別の実施形態では、ＨＬＨは、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）である。別の実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、ＭＡＳである。
【０２６９】
一実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、慢性関節炎である。別の実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、スチル病としても知られる全身性若年性特発性関節炎（ｓＪＩＡ）である。
【０２７０】
一実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、クリオピリン関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ）である。別の実施形態では、ＣＡＰＳは、家族性寒冷蕁麻疹症（ＦＣＵ）としても知られる家族性寒冷自己炎症症候群（ＦＣＡＳ）を含む。別の実施形態では、ＣＡＰＳは、マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）を含む。別の実施形態では、ＣＡＰＳは、慢性幼児神経学的皮膚及び関節（ＣＩＮＣＡ）症候群を含む。また別の実施形態では、ＣＡＰＳは、ＦＣＡＳ、ＦＣＵ、ＭＷＳ、もしくはＣＩＮＣＡ症候群、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、ＦＣＡＳである。別の実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、ＦＣＵである。別の実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、ＭＷＳである。別の実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、ＣＩＮＣＡ症候群である。また別の実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、ＦＣＡＳ、ＦＣＵ、ＭＷＳ、もしくはＣＩＮＣＡ症候群、またはそれらの任意の組み合わせである。
【０２７１】
別の実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、ＣＩＡＳＩ遺伝子としても知られるＮＬＲＰ３遺伝子内に遺伝性またはデノボ機能獲得型変異を含むクライオピリノパチー（ｃｒｙｏｐｙｒｉｎｏｐａｔｈｙ）である。
【０２７２】
一実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、遺伝性自己炎症性障害である。
【０２７３】
一実施形態では、炎症性サイトカインの放出の要因は、リポ多糖（ＬＰＳ）、グラム陽性毒素、真菌毒素、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、またはＲＩＧ−１遺伝子発現の変調である。
【０２７４】
別の実施形態では、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験している対象は、感染性疾患を有さない。一実施形態では、対象は、急性膵炎を有する。別の実施形態では、対象は組織傷害を有し、それは一実施形態では、重度の火傷または外傷である。別の実施形態では、対象は、急性呼吸促迫症候群を有する。別の実施形態では、対象は、薬剤の使用に続発するサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを有する。別の実施形態では、対象は、毒素吸入に続発するサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを有する。
【０２７５】
別の実施形態では、対象は、免疫療法の受容に続発するサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを有し、該免疫療法は、一実施形態では、超作動性ＣＤ２８特異性モノクローナル抗体（ＣＤ２８ＳＡ）による免疫療法である。一実施形態では、ＣＤ２８ＳＡは、ＴＧＮ１４１２である。別の実施形態では、免疫療法は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法である。別の実施形態では、免疫療法は、樹状細胞療法である。
【０２７６】
別の実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物は、薬学的組成物の投与の結果としてもたらされるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを制御するために使用され得る。
【０２７７】
別の実施形態では、本明細書において上記に詳細に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物またはその組成物は、抗体の投与の結果としてもたらされるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを制御するために使用され得る。一実施形態では、抗体は、モノクローナルである。別の実施形態では、抗体は、ポリクローナルである。一実施形態では、抗体は、リツキシマブである。別の実施形態では、抗体は、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３（ムロモナブ−ＣＤ３）である。別の実施形態では、抗体は、アレムツズマブ、トシツズマブ（ｔｏｓｉｔｕｚｕｍａｂ）、ＣＰ−８７０，８９３、ＬＯ−ＣＤ２ａ／ＢＴＩ−３２２、またはＴＧＮ１４１２である。
【０２７８】
別の実施形態では、炎症性サイトカイン生成の制御が有益であり得る疾患の例としては、癌、アレルギー、任意の種類の感染、毒素性ショック症候群、敗血症、任意の種類の自己免疫疾患、関節炎、クローン病、狼瘡、乾癬、または顕著な特徴が対象において有害効果を引き起こす毒性サイトカイン放出である任意の他の疾患が挙げられる。
【０２７９】
以下の実施例は、実施形態をより完全に例証するために提示される。しかしながら、それらは決して、広い範囲を限定するものと見なされるべきではない。
【実施例】
【０２８０】
実施例１：単一供給源初期アポトーシス細胞の生成
【０２８１】
同胞ＨＬＡ適合ドナーに由来する単核濃縮細胞画分から生成されたアポトーシス細胞を含有する初期アポトーシス細胞生成物は、ＷＯ２０１４／０８７４０８に詳細に説明されており、例えば、実施例の章を参照されたく、このＷＯ２０１４／０８７４０８出願は本明細書に完全に組み込まれる。ドナーの適格性基準は、以下のものを含んだ：成人男性または女性ドナー、１８〜６５歳；ドナー及びレシピエントは、ＨＬＡ  Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤＲ遺伝子座において少なくとも７／８ＨＬＡ適合を有していなくてはならない；４０ｋｇ超；ＨＳＣＴの提供に加えて、初期アポトーシス細胞の生産のために造血血液単核細胞を提供する意思。適格ドナーは、地域のＳＯＰに従って白血球除去手順（Ｃｏｂｅ（登録商標）ＳｐｅｃｔｒａＴＭ，Ｇａｍｂｒｏ  ＢＣＴ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＣＯ，ＵＳＡ）を使用して末梢血液単核細胞を採取するために、およそ−１９日目に診療所を再来した。
【０２８２】
およそ２．５時間の白血球除去中に、７Ｌの血液を処理し、単核細胞を、室温で移送用パック内に収集した。ドナーからの濃縮単核細胞画分の推定収率は、推定体積１００〜１４０ｍｌ中１．０×１０１０個の細胞であった。白血球除去から得られた細胞収集中の単核細胞画分の平均パーセンテージは、８８±８％（６５〜９６％の範囲）であった。細胞収率は、ドナーの変動性に応じて変動した。
【０２８３】
ＨＬＡ適合ドナーに由来する収集した単核濃縮細胞画分を、細胞の凍結及び解凍、その後のメチルプレドニゾロンによるインキュベーション（詳細は下記）を含む多段階手順を通じて初期アポトーシスを誘発するための一連のプロセスに供した。初期アポトーシス最終細胞懸濁液は、少なくとも４０％の初期アポトーシス細胞を含有した。注入用の細胞懸濁液を、現行の良好製造手順（ｃＧＭＰ）下で製造した。注入は、ＨＳＣＴの２４〜３０時間前かつ調製の完了の８時間以内に実施した。細胞は、投与するまで２〜８℃で保管した。
【０２８４】
メチルプレドニゾロンによるインキュベーション
【０２８５】
初期アポトーシス細胞生成物の調製中、濃縮単核細胞画分を、５０μｇ／ｍＬのメチルプレドニゾロンを含むアポトーシス誘発媒体中で６時間インキュベートした。アポトーシス誘発の終了時に、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させた。品質制御サンプルの収集後の初期アポトーシス細胞生成物の最終体積は、３００ｍｌであった。初期アポトーシス細胞最終生成物の上清中のメチルプレドニゾロンの残留量は、３回の実行から調製した最終生成物において決定した。メチルプレドニゾロンレベルを、逆相液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して決定した。アッセイは、Ｓｐｅｃｔｒｏｌａｂ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌによって適格であると見なされ、実施された。初期アポトーシス細胞最終生成物中の残留メチルプレドニゾロンのレベルは、下記の表３に提示される。
【０２８６】
【表３】
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【０２８７】
最終生成物中の残留メチルプレドニゾロン濃度の範囲は、初期アポトーシス細胞生成物の最低細胞用量において３．７ｍｇ／Ｌ、最高細胞用量において２１．９ｍｇ／Ｌであった。最終用量中の総メチルプレドニゾロンの範囲は、初期アポトーシス性の用量に相関して１．１１〜６．５７ｍｇであった。結果は、最高コホートを含む初期アポトーシス細胞生成物中に存在するメチルプレドニゾロンの量は、骨髄移植中に一般的な治療プロトコルの一部として患者が受けるメチルプレドニゾロンの用量に対してごく僅かであることを実証した。
【０２８８】
製造プロセスの説明
【０２８９】
健全な適格ドナーからの濃縮単核細胞画分及び血漿の収集を、アフェレーシス機及び滅菌した使い捨てキットを介して、アフェレーシスセンターにて実施した。細胞を細胞収集バッグに、及び自己血漿を血漿収集バッグに収集した。ドナーからの濃縮単核細胞画分の推定収率は、２５０〜３５０ｍＬ中におよそ１．５×１０１０個の細胞であると期待された。アフェレーシス中、およそ４００〜６００ｍＬのドナー自己血漿も収集した。収集した細胞及び血漿は、さらなる処理まで室温で保管し、収集の完了から平均３〜６時間以内に冷凍保存用に調製する。
【０２９０】
凍結手順：
【０２９１】
細胞：
【０２９２】
凍結媒体をバッグ内に調製し、凍結手順をｃＧＭＰ条件下でクローズドシステムにて実施した。
【０２９３】
細胞凍結用の媒体をアフェレーシスの日に新鮮に調製し、それは事前に予冷され、以下の配合で構成された：
【０２９４】
ミックス１：ｐＨ７．４の注射用プラズマライトＡ（ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ）、５％のヒト血清アルブミン、及び１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを植菌した５％の抗凝固剤クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ溶液。
【０２９５】
ミックス２：ｐＨ７．４の注射用プラズマライトＡ、１０％のＤＭＳＯ、及び１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを植菌した５％のＡＣＤ  ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ溶液。
【０２９６】
白血球除去手順の完了後、細胞を、１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを植菌した５％のＡＣＤ  ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ溶液を補充した、予冷したｐＨ７．４の注射用プラズマライトＡで洗浄した。洗浄後、上清を除去し、ミックス１を用いて細胞ペレットを再懸濁させた。次に、細胞を計数し、生存性を分析した。
【０２９７】
【表４】
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【０２９８】
細胞計数に従って、収集した細胞の総数を算出した。細胞凍結バッグの数を、５０〜６５×１０６細胞／ｍｌの濃度に従って決定した。次に、ミックス１を、最終凍結体積の５０％の体積まで細胞にさらに添加する。次に、細胞を凍結バッグに移し、ミックス２を、最終凍結体積の５０％の体積まで各バッグに添加した。
【０２９９】
各凍結バッグを、予冷した凍結カセット内に配置し、−１８−（−２５）°Ｃの冷凍庫に２時間移した。−１８−（−２５）℃にて２時間の後、カセットを−８０℃の冷凍庫にさらに２時間移した。−８０℃にて２時間の後、カセットを、製造用に必要となるまで長期の保管のために液体窒素冷凍庫に移した。
【０３００】
血漿：
【０３０１】
血漿を、５０ｍｌのアリコートに分割し、１５０ｍｌの移送用パック容器（「血漿凍結バッグ」と指定される）で保管した。
【０３０２】
等分の完了後、全ての血漿凍結バッグを−８０℃の冷凍庫に２時間移した。−８０℃にて２時間の後、血漿凍結バッグを、−１８−（−２５）℃の冷凍庫にて長期の保管に移した。
【０３０３】
アポトーシス細胞（初期アポトーシス）の製造
【０３０４】
プロセスは、ｃＧＭＰ条件下でクローズドシステムにて実施した。
【０３０５】
製造プロセス
【０３０６】
媒体の調製：
【０３０７】
製造プロセスは、全てバッグ内で作製される３つの媒体を含む：
（１）解凍洗浄媒体
（２）誘発溶液
（３）乳酸加リンゲル溶液
【０３０８】
解凍洗浄媒体は、解凍後の細胞の洗浄に使用した。解凍洗浄媒体の最終製剤は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、及び１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを植菌した５％のＡＣＤ  ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ溶液を補充した、ＲＰＭＩ  １６４０であった。誘発溶液は、アポトーシス誘発に使用し、その製剤は、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１０％の自己血漿、５０μｇ／ｍｌのメチルプレドニゾロン、及び１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを植菌した５％のＡＣＤ  ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ溶液を補充した、ＲＰＭＩ  １６４０である。
【０３０９】
媒体は、使用前に予熱した。
【０３１０】
解凍及びアポトーシス誘発：
【０３１１】
凍結した細胞濃縮物を含有する凍結バッグを、液体窒素保管冷凍庫から移し、３５〜３８０℃の循環水浴中に浸した。細胞濃縮物を、およそ１２０秒間、穏やかに混合しながら完全に解凍した。次に、細胞凍結バッグを水浴から除去し、７０％のイソプロパノールで濯ぐことによって消毒し、拭いて乾燥させた。
【０３１２】
解凍した凍結バッグを、予熱した解凍洗浄媒体バッグに接続し、解凍した細胞を、重量流によって移送用パックに移した。このプロセスを、さらなる凍結バッグの各々に繰り返した。
【０３１３】
懸濁させた解凍した細胞を、２９０×ｇで１０分間、２５℃にて遠心分離した。その終了時に、洗浄した細胞を遠心分離機から慎重に除去し、上清を除去した。
【０３１４】
洗浄した細胞を、予熱した誘発溶液で再懸濁させ、均質な懸濁液が形成されるまで穏やかに混合した。
【０３１５】
次に、細胞を計数し、生存性を分析した。
【０３１６】
【表５】
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【０３１７】
細胞計数及び適格対象に必要とされる細胞の用量に基づいて、各バッグの体積が製造者によって決定された体積の範囲内に維持されるように、適切な数の細胞培養バッグを調製した。細胞を、誘発溶液を用いておよそ５×１０６細胞／ｍｌの最終濃度にし、次に細胞を、必要とされるだけ多くの細胞培養バッグに均等に分配した。
【０３１８】
誘発溶液と共に細胞を含有する細胞培養バッグを、３７℃、５％ＣＯ２にて、６時間インキュベートした。
【０３１９】
体積低減及び最終生成物の最終製剤化：
【０３２０】
体積低減及び投与緩衝液（乳酸加リンゲル溶液）への媒体交換を、ＬＯＶＯ細胞処理システムを使用して自動で実施した。
【０３２１】
ＬＯＶＯ計器に、滅菌した使い捨てキットを装填した。投与緩衝液及び細胞培養バッグを、キットに滅菌接続した。アポトーシス細胞を含有する細胞培養バッグを、５：１の低減率を使用してＬＯＶＯを介して処理し、一方、冷たい乳酸加リンゲル溶液を用いて、最終製剤化を４５０〜５００ｍｌの最終体積に送達バッグ内へ直接実施した。
【０３２２】
放出及び放出後試験のためのサンプルの収集
【０３２３】
最終生成物送達バッグの内容物を、均質な混合物を確実にするように適正に混合した。下記の表６に詳述される通り、およそ１０％を放出試験のために除去した。
【０３２４】
【表６】
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【０３２５】
最終生成物のデータは、表７に提示される。
【０３２６】
【表７】
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【０３２７】
注入用の放出生成物：
【０３２８】
最終生成物が放出試験を通過した後、最終初期アポトーシス細胞生成物を２〜８℃で保管し、患者への投与のために臨床センターに輸送した。生成物は、２００ミクロン以上のフィルタを用いた注入セットを使用して投与する。予備段階の安定性データに基づくと、最終初期アポトーシス細胞生成物に関する有効時間は、調製の時間から４８時間であった。
【０３２９】
実施例２：ＧｖＨＤ白血病／リンパ腫モデルにおけるプールされたアポトーシス細胞調製物の使用
【０３３０】
以下の予備研究において、ＧｖＨＤ白血病／リンパ腫モデルにおける同一の注入の効果を調査した。骨髄移植（ＢＭＴ）を受けているマウスにおける急性ＧｖＨＤの予防に関して、照射された複数ドナー由来単一アポトーシス細胞注入（プールされた単核の照射されたアポトーシス細胞調製物）の安全性及び有効性を調査した。このモデルでは、ＢＭＴは、照射されたマウスを救済した（８０〜１００％）。
【０３３１】
移植片対白血病（ＧｖＬ）効果はＧＶＨＤの重症度と相関していることが見出されているため、高グレードのａＧＶＨＤを潜在的に回避する全ての成功的治療において、この効果の可能性のある損失に関する疑問が生じる。
【０３３２】
方法
【０３３３】
アポトーシス細胞を、本実験では調製を４ドナーから同時に行ったことを除いて、上記の実施例１の通りに調製した。４ドナーからの調製の後、細胞調製物を、最終ステップ（照射前）にて組み合わせ、直後に照射し、照射の直後に注射した。照射は、２５Ｇｙであった。
【０３３４】
結果
【０３３５】
図１及び２に提示される２つのグラフは、生存及び体重損失の両方に対する、複数の個別のドナー（３個組）に由来するアポトーシス細胞の単一注射の明確な効果（ｐ＜０．０１）を示す。図１は、複数の個別のドナーに由来する単一用量の照射されたアポトーシス細胞で治療したＧｖＨＤマウスモデルにおけるカプラン・マイヤー生存曲線であり、生存は有意に改善された。図２は、比較された２つの群の体重損失のパーセンテージであり、これは図１の発見に従い、それと相関する。
【０３３６】
要約すると、複数ドナー由来の照射されたアポトーシス細胞の単一注入は、ＧｖＨＤのマウスモデルにおいて余命を成功裏に及び有意に改善した。
【０３３７】
実施例３：複数の個別のドナーに由来するアポトーシス細胞に関する安定性基準
【０３３８】
この研究の目的は、複数の個別のドナーに由来するアポトーシス細胞に関する安定性基準を、照射されていないＨＬＡ適合アポトーシス細胞に対する比較可能性研究を用いて開発することである（Ｍｅｖｏｒａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２０（１）：５８−６５；Ｍｅｖｏｒａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２１（２）：Ｓ３３９−Ｓ３４０）。
【０３３９】
アポトーシス細胞最終生成物調製物を、２〜８℃で８、２４、４８、及び６０時間保管した後、各時点でサンプリングしながら、細胞数、生存性、アポトーシス的表現型、及び効力に関して評定する。アポトーシス細胞最終生成物のロットを、標準操作手順（ＳＯＰ）（実施例１、実施例５）及びバッチ記録（ＢＲ、すなわち、特定の製造手順）に従って調製する。効力評定については、初期アポトーシス細胞調製物最終生成物ロットのサンプルを、未成熟樹状細胞（時点０〜２４時間）または単球（時点０〜６）においてリポ多糖（ＬＰＳ）によって誘発されたＭＨＣ−ＩＩ発現の上方調節の阻害に関して試験し、ＳＯＰに従って実施し、ＢＲに記録する。これらの一連の試験を、それぞれ、複数の個別のドナー及び単一のドナーを起源とする調製物中のプールされた及びプールされていない生成物において実施する。
【０３４０】
さらに、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ１４（単球）、ＣＤ１５ｈｉｇｈ（顆粒球）、及びＣＤ５６（ＮＫ細胞）のフローサイトメトリー分析を記録する。これらの研究の目的は、狭い範囲の結果との一貫性を実証することである。予備段階の結果は、これらの目標と一致しており、ＳＯＰからの逸脱は見られず、技術的問題は報告されない。しかしながら、効果的な治療の範囲及び安定性を結論付けるために、さらなる研究が必要とされる。予備段階の結果は、これらの全てのパラメータにおいて同値を示している（実施例６、表３）。さらに、単一ドナーの安定性研究は、少なくとも４８時間の期間を通して安定性を示した（実施例５、細胞調製物）。
【０３４１】
実施例４：急性移植片対宿主疾患の予防薬としての複数ドナー由来の照射されたアポトーシス細胞の安全性及び有効性
【０３４２】
目的：同種異系ｈｌａ適合造血幹細胞移植を受けているヒト白血球抗原適合の血縁及び非血縁患者の造血器悪性腫瘍における移植片対宿主疾患の予防のための、複数の不適合ドナーに由来する照射されたアポトーシス細胞の単一用量投与の安全性、忍容性、及び予備段階の有効性を評定する、フェーズ１／２ａ、多施設、非盲検研究
【０３４３】
第一目的：複数ドナー由来の照射されたアポトーシス細胞治療の安全性及び忍容性を決定すること。
【０３４４】
第二目的：造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受ける予定の造血器悪性腫瘍患者における急性ＧＶＨＤ（ａＧＶＨＤ）に関する予防尺度としての、複数の個別のドナーに由来する照射されたアポトーシス細胞の有効性を決定すること。この研究の目的のために、ＨＳＣＴは、骨髄移植（ＢＭＴ）または末梢血液幹細胞移植（ＰＢＳＣＴ）のいずれかであり得る。
【０３４５】
治療指標： ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合の血縁及び非血縁患者内の造血器悪性腫瘍における移植後の移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）
【０３４６】
研究設計：これは、完全な骨髄機能廃絶または強度低減骨髄機能廃絶調整レジメンに従ってＨＬＡ適合の血縁または非血縁ドナーに由来するＨＳＣＴ（骨髄移植または末梢血液幹細胞移植のいずれか）を受ける予定である造血器悪性腫瘍と診断された患者における、非盲検研究、多施設、フェーズ−１／２ａ研究である。
【０３４７】
調整レジメンの開始前のレシピエント患者によるインフォームドコンセントへの署名、ドナースクリーニング期間、及び細胞収集の後に、適格レシピエント患者を、いずれかのＨＳＣＴ移植の１２〜３６時間前に静脈（ＩＶ）注射を受けるために割り当てる（予防的治療及び血縁対非血縁移植物ドナーによって１：１の比率に分類する）。
【０３４８】
調査アーム：リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中、複数の個別のドナーの照射された初期アポトーシス細胞／ｋｇ体重からの１４０×１０６±２０％細胞／ｋｇの単一用量
【０３４９】
全患者はまた、機関の標準治療（ＳＯＣ）免疫抑制レジメンによって治療する：骨髄除去に関してはシクロスポリン／メトトレキサートまたはタクロリムス／メトトレキサート、及び強度低減に関してはミコフェノレート（ｍｙｃｏｆｅｎｏｌａｔｅ）／シクロスポリンまたはミコフェノレート／タクロリヌス（ｔａｃｒｏｌｉｎｕｓ）。患者は、医学上の指示により入院する。
【０３５０】
患者は、二次有効性エンドポイントに関して１８０日間、ならびに一次安全性及び三次有効性エンドポイントに関して１年間追跡される。この研究に参加する患者の訪問回数は、それらの状態にある患者に関して慣習的であるものに相当する。ドナーに関しては、スクリーニング期間中のアフェレーシス手順のための、研究に特有の訪問である。
【０３５１】
これらの患者は、多くの潜在的な医学的状態を有し、またａＧＶＨＤと両立し得る症状を経験する場合があるため、ＧｖＨＤ予防のためにアポトーシス細胞を使用する先行するフェーズ１−２ａ研究からの基礎データは存在するものの、毒性がアポトーシス細胞に関連しているか否かを完全に決定することは困難であり得る（Ｍｅｖｏｒａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２０（１）：５８−６５、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｏｎｏｒ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｅａｒｌｙ  Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ａｓ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ  ｆｏｒ  Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ  ＨＬＡ−Ｍａｔｃｈｅｄ  Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ．ＢＢＭＴ  ２０（１）５８−６５）。
【０３５２】
データ安全性モニタリング委員会（ＤＳＭＢ）を、安全性に関する懸念が事前に生じていないと仮定し、予定された中間分析（１８０日間）の時点を含めＤＳＭＢ検証に指定される通りに開く。
【０３５３】
研究手順：
【０３５４】
本研究は、スクリーニング、治療、及び追跡調査期間で構成される。
【０３５５】
１．スクリーニング期間（−６０日目〜−２日目）
【０３５６】
潜在的レシピエント患者は、全ての研究に関連する手順の遂行の前にインフォームドコンセントへ署名する。認可前の標準的な評価は、スクリーニング期間中にドナーのための移植センターによって実施し、通常は以下のものを含む：人口統計データ、病歴、ＨＬＡ適合状態の検証（非適合が必要とされる）、身体検査、身長及び体重、生命兆候、妊娠検査（全女性）、血液学、血液化学、感染性疾患スクリーニング、ＥＣＧ、ならびに尿検査。
【０３５７】
レシピエント（研究患者）は、スクリーニング期間中に以下の評価を受ける：人口統計データ、病歴、カルノフスキーパフォーマンスステータス、ＨＬＡ適合の検証、身体検査、身長及び体重、生命兆候、妊娠検査（全女性）、ＥＣＧ、肺機能検査、血液学、血液化学、凝固マーカー、感染性疾患スクリーニング、ならびに尿検査。
【０３５８】
最初のスクリーニング評定の後、レシピエントが研究への参加に適格である場合、レシピエント患者は、調整レジメンの初日に割り当てられ、１４０×１０６±２０％細胞／ｋｇの複数ドナーアポトーシス細胞の単一ＩＶ注入を受ける。アポトーシス細胞の注入の前またはその日に完了するべき調整レジメンは、研究の−１日目に予定する。
【０３５９】
アポトーシス細胞の投薬量を各レシピエント患者に関して算出し、それに従って推定されるアフェレーシス収集数及びドナー数を決定する。
【０３６０】
末梢幹細胞移植物ドナーについて：−６日目〜−１日目に、ドナーは、前駆細胞を動員するために１日１回のＧ−ＣＳＦ注射を１回以上受け、０日目に、移植用のドナー造血血液幹細胞を生成するためにアフェレーシスを受ける。骨髄移植用の造血血液幹細胞の調製物は、施設の標準的慣行に従って熟練した医療スタッフにより実施する。ＨＳＣＴ用の造血血液幹細胞は、操作しないか、または投与前にＴ細胞を除去する。
【０３６１】
骨髄移植物ドナーについて：骨髄を、施設の標準的慣行によって採取及び調製し、それ以外には操作しない。
【０３６２】
２．治療日（−１日目）
【０３６３】
−１日目（ＨＳＣＴの１２〜３６時間前）に、適格患者は、いずれかの１４０×１０６±２０％細胞／ｋｇの複数の個別のドナー由来の照射された初期アポトーシス細胞の単一ＩＶ注入を受ける。生命兆候を、注入中は毎時間、その後、最初の２４時間は４時間毎にモニタリングする。治療に関連するＡＥを、注入後即座に評価する。
【０３６４】
０日目に、患者は、地方機関のガイドラインに従って造血幹細胞移植を受ける。
【０３６５】
３．短期追跡調査期間（０日目〜１８０日目）
【０３６６】
患者は、以下の一次エンドポイント安全性及び忍容性ならびに二次及び三次エンドポイントの評価に関して研究の１８０日目まで追跡される：ａＧＶＨＤグレードＩＩ〜ＩＶの累積発生率（Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａらの任意のグレード及び高グレードのａＧＶＨＤの累積発生率に基づく「修正されたＧｌｕｃｋｓｂｅｒｇ」コンセンサス、すなわちグレードＩＩ〜ＩＶのａＧＶＨＤの発症までの時間）、ＧＶＨＤの任意の全身治療、及びｃＧＶＨＤの発症。
【０３６７】
短期追跡調査訪問は、移植のための入院中は毎日（通常少なくとも−１〜＋１４日目以上）であり、退院後の最初の７週間は毎週訪問し、＋７、＋１４、＋２１、＋２８、＋３５、４２日目、次いで６０、１００、１４０、及び１８０日目である。訪問ウィンドウは、毎週の訪問（最初の７週間）については±５日間、最大１８０日間のその後の追跡調査期間中は隔週またはそれ以上について±５日間である。
【０３６８】
血液サンプルを、１、３、７、＋７、＋２８、＋４２、６０、１００、１４０、及び１８０日目に取得し、生着、免疫回復、血漿及び血清バイオマーカー（「Ｍｉｃｈｉｇａｎ」）、ならびに細胞下位集団を記録するために調査する。
【０３６９】
４．長期追跡調査期間（１８１日目〜３６５日目／１年間）
【０３７０】
患者は、以下のより長期の二次エンドポイントに関してＨＳＣＴ後１年間追跡される：非再発性死亡率及び全生存率（ＯＳ）、再発、無白血病生存率（ＬＦＳ）、ならびに慢性ＧＶＨＤ。少なくとも２回の長期追跡調査訪問があり、最後の訪問はＨＳＣＴの１２±１カ月間後である。
【０３７１】
研究期間：各参加患者に関して、研究期間は、以下の通り最大１４カ月間である：
Ａ．スクリーニング  最大６０日間（２ヶ月間）
Ｂ．治療            １日間
Ｃ．追跡調査        以下からなる３６５日間（１２ヶ月間）
Ｄ．短期            １８０日間
Ｅ．長期            ＋１８０日間
【０３７２】
研究集団：血液悪性腫瘍と診断され、施設の標準的慣行によって骨髄機能廃絶または強度低減調整レジメンのいずれかに従い少なくとも１５名の非血縁ドナーによるＨＳＣＴ（骨髄移植または末梢血液幹細胞移植のいずれか）を受ける予定である合計２５人の患者を本研究に含め、歴史的対照と比較する。
【０３７３】
包含／除外基準：
【０３７４】
レシピエント患者除外基準
【０３７５】
１．患者、年齢＞１８歳、以下の悪性腫瘍のための同種異系ＨＳＣＴに適格である：
Ａ．完全寛解（任意の寛解）またはそれ以上にあるが、骨髄の形態により＜５％の芽球を有する急性骨髄性白血病または未分化白血病または混合型白血病。
Ｂ．完全寛解にある急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）であり、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）から進展している場合（急性骨髄性白血病の診断の少なくとも３カ月間前にＭＤＳの記録された診断が存在しなければならない）。または真性赤血球増加症もしくは本態性血小板増加症から進展している場合。
Ｃ．骨髄の形態により＜５％の芽球を有する、完全寛解（任意の寛解）にある急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）。
Ｄ．慢性期または加速期にある慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）。
Ｅ．骨髄異形成症候群−多血球系異形成を伴う不応性血球減少（ＲＣＭＤ）、ＲＡ（不応性貧血）、環状鉄芽球を伴うＲＡ（ＲＡＲＳ；全て＜５％芽球）、過剰な芽球を伴うＲＡ（ＲＡＥＢ；５〜２０％芽球）。
【０３７６】
移植物ドナー及びレシピエント患者は、ＨＬＡ  Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＱ、及びＤＲ遺伝子座において少なくとも８／８ＨＬＡ適合を有していなければならず、かつ抗原または対立遺伝子不適合を有していてはならない。しかしながら、アポトーシス細胞形成用の白血球のドナー（複数可）は、ＨＬＡ適合性に制限されない。
【０３７７】
スクリーニング訪問時点に少なくとも７０％のパフォーマンスステータススコア（成人ではカルノフスキー、１６歳未満のレシピエントではランスキー）。
【０３７８】
調整開始後４週間以内に、成人において＞４０％の左心室駆出分画；以前にアントラサイクリン曝露または心疾患の病歴がある場合、ＭＵＧＡスキャンまたは心臓エコーを要する。
【０３７９】
＞６０％の予測を伴うＤＬＣＯ1、ＦＥＶ１（努力呼気肺活量）、及びＦＶＣ（努力肺活量）による肺機能検査。
【０３８０】
室内気に対する少なくとも９０％の酸素飽和度。
【０３８１】
患者は、下記に定義される通り適正な臓器機能を有していなければならない：
Ａ．ＡＳＴ（ＳＧＯＴ）／ＡＬＴ（ＳＧＰＴ）＜３ｘ正常上限（ＵＬＮ）。
Ｂ．血清クレアチニン＜２．０ｍｇ／ｄＬ（成人、＞１６歳）、または＜０．８（１〜２歳）、＜１（３〜４歳）、＜１．２（５〜９歳）、＜１．６（１０〜１３歳）、及び１．８（１４〜１５歳）。
Ｃ．血清ビリルビン＜３ｍｇ／ｄＬ、但しジルベール病または溶血に起因する場合を除く。
【０３８２】
患者、または未成年者の場合には保護者による、本研究への自主的な参加に関する書面によるインフォームドコンセントへの署名。
【０３８３】
研究要件に従う能力。
【０３８４】
（−１日目から）４週間の間、女性及び男性のどちらも以下に同意しなければならない。
Ａ．ＢＭＴに関連する制限がある場合、最初の１カ月間以上は適切な避妊法を使用するか、または避妊手術を受けていること。
Ｂ．妊娠の可能性に関わらず、陰性の妊娠検査を有すること。
【０３８５】
レシピエント患者除外基準
【０３８６】
包含基準に指定されていない、ＨＳＣＴに適格である全ての疾患。
【０３８７】
スクリーニング訪問の３０日間以内の介入性治験への参加。
【０３８８】
進行性のまたは不良に制御された悪性腫瘍を有する。
【０３８９】
ＢＭＴ計画が、Ｔ細胞欠失同種移植片を含む場合。
【０３９０】
ＢＭＴ計画が、移植後のＧＶＨＤの予防のために免疫抑制レジメンまたは高用量シクロホスファミド療法の一部として抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）またはアレムツズマブを含む場合。
【０３９１】
スクリーニング訪問の２週間以内の敗血症、低酸素血症を伴う肺炎、持続性菌血症、または髄膜炎を含む、制御されていない感染。（１一酸化炭素肺拡散能）
【０３９２】
現在既知であるＨＢＶまたはＨＣＶを伴う活動性の急性または慢性感染。
【０３９３】
既知のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染。
【０３９４】
人工呼吸器による補助を必要とする、重度または症候性の拘束性もしくは閉塞性肺疾患または呼吸不全を有する患者。
【０３９５】
本研究への参加に支障をきたし得る、他の併発した重度の及び／または制御されていない医学的状態を有する患者（すなわち、活動性感染、制御されていない糖尿病、制御されていない高血圧、鬱血性心不全、不安定狭心症、心室性不整脈、活動性虚血性心疾患、６カ月間以内の心筋梗塞、慢性の肝疾患または腎疾患、活動性上部消化管潰瘍）。
【０３９６】
治験生成物の効果の評定を妨げやすい任意の慢性または急性状態。
【０３９７】
調査者の意見により、本研究の遂行を妨げやすい任意の形態の物質乱用（薬物またはアルコール乱用を含む）、精神障害、または任意の慢性状態。
【０３９８】
臓器同種移植、または幹細胞移植（同種異系のみ）の以前の履歴。
【０３９９】
妊娠の可能性のある女性における授乳。
【０４００】
本研究中に従わないまたは非協力的である可能性のある患者。
【０４０１】
治験生成物の経路及び剤形
【０４０２】
アポトーシス細胞を、ＨＳＣＴの１２〜３６時間前に、１４０×１０６＋２０％細胞／ｋｇの照射された複数ドナー由来のアポトーシス細胞生成物のＩＶ注入として投与する。
【０４０３】
アポトーシス細胞は、複数の個別のドナー由来のアポトーシス細胞で構成された細胞ベースの治療薬である。生成物は、少なくとも４０％の初期アポトーシス細胞を有する懸濁液体の形態の同種異系ドナー単核濃縮細胞を含有する。懸濁液は、ＧＭＰ規制に従ってＰＢＳ溶液と共に複数の個別のドナーから調製し、注入まで２〜８℃で保管しなければならない。最終生成物は、不透明な移送用パック内で３００〜６００ｍＬの総体積であり、調製後に２５Ｇｙで照射する。治験生成物は、製造プロセスの完了の４８時間以内に患者に投与されるべきである。
【０４０４】
安全性の結果／有効性エンドポイント／結果尺度
【０４０５】
一次：
【０４０６】
安全性及び忍容性エンドポイントは、生着までの時間、ならびに１８０日目及び３６０日目（１年間）における有害事象、併用薬、及び安全性実験室（ｓａｆｅｔｙ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を決定するための身体検査を含む。さらに、照射されたプールされたアポトーシス細胞調製物は、インビトロ及びインビボの細胞増殖の欠落ならびにインビボの活性化の欠落を示すことが期待される。かかる結果は、プールされたアポトーシス細胞調製物を使用に安全であると認める。
【０４０７】
二次：
Ａ．１８０日目における、（Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）に基づく「修正されたＧｌｕｃｋｓｂｅｒｇ」コンセンサスを使用したグレードＩＩ〜ＩＶのａＧＶＨＤの累積発生率
Ｂ．１年間の非再発性死亡率及び全生存率（ＯＳ）
Ｃ．１年間の再発
Ｄ．１年間の無白血病生存率（ＬＦＳ）
Ｅ．最初の１８０日間以内のａＧＶＨＤの最大グレード
Ｆ．グレードＩＩＩ〜ＩＶのａＧＶＨＤの累積発生率
Ｇ．１８０日目及び３６０日目（１年間）における、（Ｊａｇａｓｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）に従う慢性ＧＶＨＤの発生。
Ｈ．２０日目〜１８０日目における、ａＧｖＨＤの治療のためのコルチコステロイド（使用または非使用及び累積投薬量の両方）を含む任意の「全身治療」
Ｉ．＋２８、１００、１８０、及び３６０日目（１年間）における、Ｔ、Ｂ、ＮＫ、及び単球に関連する免疫再構築及び機能
Ｊ．８０日目〜１年間における主要な感染率（肺浸潤物、ＣＭＶ再活性化、及び入院を要する任意の他の感染を含む）。
【０４０８】
三次／探索的：
Ａ．入院日数の、危険性がある日数の合計または生存し入院していない日数の合計に対する割合。または、移植後の最初の退院までの入院日数の合計。
Ｂ．臓器特異的ＧＶＨＤ
Ｃ．１８０日目におけるＴ  ｒｅｇ、ＣＤ４  Ｔｃｏｎ、ＣＤ８、ＮＫ及びＢ細胞のレベル
【０４０９】
統計的分析：
【０４１０】
研究結果を、相当のベースライン特徴を有する個体を用いた歴史的対照と比較する。
【０４１１】
記述統計学を使用して、結果尺度及びベースライン特徴を要約する。この分析では、欠測データを補完することなく、全ての利用可能なデータを提示する。対象は、離脱または研究完了または死亡の時点まで利用可能なデータとなる。平均、中央値、標準偏差、最小値、及び最大値等の記述統計学を使用して、連続型変数を要約する。アポトーシス細胞注入を受ける全ての対象が、安全性分析に含まれる。ＨＳＣＴも受ける対象は、有効性分析に含まれる。この研究は探索的な性質であるため、臨時の分析が計画される。
【０４１２】
サンプルサイズの検討
【０４１３】
合計２５名の患者が含まれ、少なくとも１５名の適合非血縁患者が登録される。アポトーシス細胞（活性）を全てに付与し、ＧＶＨＤ予防レジメン、及び血縁対非血縁移植物ドナーについて分類する。
【０４１４】
集団分析の定義
【０４１５】
全ての有効性分析は、包括解析（ＩＴＴ）集団にて遂行し、適当な歴史的対照と比較する。安全性集団は、研究薬の投薬を受ける全ての患者と定義する。
【０４１６】
統計的方法
【０４１７】
患者、疾患、及び移植物の特徴を、必要に応じて頻度及びパーセンテージまたは中央値（範囲）を使用して記述する。
【０４１８】
安全性分析
【０４１９】
記述統計学を使用して、研究治療の注入とＨＳＣＴ処置との間（２４〜３０時間ウィンドウ）に報告されたＡＥに着目し、安全性の結果を要約する。ＤＳＭＢの考察の結果として、サンプルサイズ調整を含むいかなる変更も研究の遂行において開始しない。したがって、中間分析の結果として第１種の過誤全体において罰則調整は必要としない。
【０４２０】
二次エンドポイント分析
【０４２１】
グレードＩＩ〜ＩＶのａＧＶＨＤを、ａＧＶＨＤ前の死亡を競合事象として累積発生率推定器を使用して記述する。
【０４２２】
好中球及び血小板回収、グレードＩＩＩ〜ＩＶのａＧＶＨＤ、慢性ＧＶＨＤ、感染、再発、ならびに移植物関連死亡率を、ＴＲＭに関しては再発を競合事象として、他の全てに関しては死亡を競合事象として累積発生率を使用して記述する。全生存率及び無白血病生存率を、カプラン・マイヤー推定器を使用して記述する。最初の１８０日間以内の最大グレードのａＧＶＨＤ、及び１８０日目におけるステロイドの必要性を、それぞれ、マンホイットニーＵ検定及びカイ二乗検定を使用し、頻度及びパーセンテージを使用して記述する。各細胞サブセット及びＴＲＥＧの免疫回復を、中央値及び範囲マンホイットニー検定をお使用して各時点で記述する。
【０４２３】
実施例５：ＧｖＨＤ白血病／リンパ腫モデルにおけるプールされたアポトーシス細胞調製物対単一ドナーアポトーシス細胞調製物の比較
【０４２４】
目的：ＧｖＨＤのマウスモデルにおけるＧｖＨＤの重症度に対する、単一ドナーから取得されたヒト初期アポトーシス細胞の有益な臨床効果を、存在する場合、ＧｖＨＤのマウスモデルにおけるＧｖＨＤの重症度に対する、複数の個別のドナーから取得されたヒト初期アポトーシス細胞の臨床効果と比較することであり、ここでは、複数の個別のドナーは、ＨＬＡ不適合異種ドナーを表した。
【０４２５】
上記の実施例２は、複数の個別のドナーからプールされた照射されたアポトーシス細胞の有益な効果を示している。当業者は、不適合細胞の複数の供給源は細胞の抗原性の多様性を増加させ得、したがって臨床効果の劇的な低減が予測されるであろうと認識し得るため、図１及び図２に示される結果は、驚くべきものであった。予期せぬことに、ＧｖＨＤの重症度の低減、またしたがって死亡までの日数の延長に対する初期アポトーシス細胞の既知の有益な効果は、プールされた不適合初期アポトーシス細胞（図１）によっても緩和され、これは、プールされた複数の不適合供給源細胞に起因する増加された抗原性を有するであろうと推測される。
【０４２６】
さらなる目的は、照射された初期アポトーシス細胞の使用と、照射されていない期アポトーシス細胞の使用との間に差があるかを理解することであった。
【０４２７】
当業者は、不適合の照射された細胞は、ＡＰＣメカニズムによって認識される通り、及びそれらが注入されている宿主のＴ細胞によって認識される通り、その抗原プロフィールを維持することを理解するであろう。したがって、細胞の異種不適合集団をプールする際の懸念として、プールされている個別の集団間の交差反応性、プールされた集団の混合細胞リンパ球反応、細胞を低減もしくは排除し得るプールされた集団間のＴ細胞免疫反応、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられた。
【０４２８】
方法
【０４２９】
マウスモデル：不適合ＧＶＨＤモデルにおいて、雌の７〜９週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）を、レシピエントとして使用し、雌の８〜９週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）を、ドナーとして使用した。レシピエントを、骨髄及び脾細胞移植の２４時間前に８５０ｃＧｙで全身に照射した。ドナー骨髄細胞を、骨髄再構築に使用した。骨髄細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０によって大腿骨及び脛骨から抽出した。赤血球を溶解し、次に、細胞を洗浄し、ＰＢＳで再懸濁させた。トリパンブルー染料排除を証して、生存性を評価した（＞９０％生存性）。ドナー脾細胞を、ＧＶＨＤの誘発に使用した。脾臓を除去し、均質化し、単一細胞懸濁液を取得した。赤血球を溶解し、脾細胞をＰＢＳで再懸濁させた。トリパンブルー染料を使用して、少なくとも９０％の生存細胞を評価した。
【０４３０】
初期アポトーシス細胞：実施例１と同様に、健全なドナーから、単核濃縮細胞画分アフェレーシスによりアポトーシス細胞を生成した。手短に述べると：
【０４３１】
単核細胞（ＭＮＣ）の濃縮画分を、白血球除去手順によって健全な適格ドナーから取得した。細胞を、１２リットルの血液及び４００〜６００ｍｌの自己血漿から、Ｓｐｅｃｔｒａ  ＯＰＴＩＡ（登録商標）アフェレーシスシステムによって収集した。ドナーからの濃縮単核細胞画分の推定収率は、およそ１．２〜１．５×１０１０個の細胞であると期待された。白血球除去手順の前に、ドナーを試験し、下記のウイルスベクターに対して陰性であることを確認する：
１．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、１及び２型、
２．Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、
３．Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、
４．サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、
５．梅毒トレポネーマ（梅毒）、
６．ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、Ｉ及びＩＩ型
【０４３２】
細胞収集後、細胞をＲＰＭＩで洗浄し、以下の通り凍結させた。凍結製剤は、ｐＨ７．４の注射用プラズマライトＡ、１０％のＤＭＳＯ、５％のヒト血清アルブミン、及び１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを植菌した５％の抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液で構成された。
【０４３３】
凍結媒体をバッグ内に調製し、凍結手順をｃＧＭＰ条件下でクローズドシステムにて実施した。
【０４３４】
白血球除去手順の完了後、濃縮ＭＮＣ画分をプラズマライトＡで洗浄し、氷冷した凍結媒体で５０〜６５×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁させた。次に、細胞を凍結バッグに移し、バッグを予冷したアルミニウムカセットに移し、即座にカセットを−１８−（−２５）℃に２時間に移した。
【０４３５】
２時間後、カセットを、−８０℃にさらに２時間移し、次に液体窒素（＞−１３５℃）中で長期保管した。
【０４３６】
自己血漿を、５０ｇｒアリコートに分割した。血漿アリコートを、−８０℃に２時間移し、次に−１８−（−２５）℃で長期保管した。
【０４３７】
アポトーシス誘発のために、細胞を解凍し、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び１０Ｕ／ｍｌヘパリンを有する５％の抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液を含有する予熱したＲＰＭＩ１６４０で洗浄した。上清抽出後、細胞を、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのＬ−グルタミンを補充し、１０％の自己血漿と、５０μｇ／ｍｌのメチルプレドニゾロンと、１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを植菌した５％の抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液とを添加したＲＰＭＩ  １６４０中で、５×１０６／ｍｌの最終濃度に再懸濁させた。次に、細胞を細胞培養バッグに移し、加湿したインキュベータにて３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートして、アポトーシスを安定させた。
【０４３８】
インキュベーション後、細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させた。
【０４３９】
初期アポトーシス細胞生成物を、１つの単一ドナーまたは組み合わせた１０個の異なる個別のドナーから生成し、異なる個別のドナーの場合、細胞は照射の直前に組み合わせた。複数ドナー生成物中の成分間、例えば、生きた非アポトーシス細胞間等で干渉が生じ得るため、初期アポトーシス細胞生成物をさらに分割し、インビボで試験するための初期アポトーシス細胞のサンプルを、投与の前に２５００ｃＧｙで照射し（下記のサンプルＦ）、投与まで２〜８℃で保管した。下記の実施例６の表３は、アネキシンＶ陽性／ヨウ化プロピジウム陰性の比率及び初期アポトーシス細胞生成物の細胞表面マーカーの詳細を提示しており、マウスに投与されたアポトーシス細胞の一貫性が維持されていることを立証する。最終生成物は、２〜８℃で４８時間安定していた。
【０４４０】
移植の日に、マウスは、以下の実験設計に従って、５×１０６個の骨髄細胞、３×１０６個の脾細胞、及び３０×１０６個の単一または複数ドナー初期アポトーシス細胞生成物を受けた：
Ａ．照射対照
Ｂ．再構築対照−照射＋骨髄移植（ＢＭ）
Ｃ．ＧＶＨＤ対照−照射＋骨髄及び脾細胞移植
Ｄ．単一ドナー、照射−照射＋骨髄及び脾細胞移植＋単一ドナーに由来する照射された初期アポトーシス細胞生成物
Ｅ．単一ドナー、非照射−照射＋骨髄及び脾細胞移植＋単一ドナーに由来する照射されていない初期アポトーシス細胞生成物
Ｆ．複数ドナー、照射−照射＋骨髄及び脾細胞移植＋複数ドナーに由来する照射された初期アポトーシス細胞生成物
Ｇ．複数ドナー、非照射−照射＋骨髄及び脾細胞移植＋複数の個別のドナーに由来する照射されていない初期アポトーシス細胞生成物
【０４４１】
モニタリング−移植したマウスにタグ付けをし、生存をモニタリングした。体重を、実験の最初の２週間は２日毎に、その後は毎日評価した。開始体重からの３５％の損失を一次エンドポイントとして決定し、マウスを屠殺し、それに従って生存曲線を更新した。体重の結果は、実施例３、図２に見られるものに匹敵した。
【０４４２】
ＧＶＨＤの重症度を、以下の５つの臨床パラメータを含む既知の採点システム（Ｃｏｏｋｅ  ＫＲ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｉ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｍｉｎｏｒ  Ｈ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ．Ｂｌｏｏｄ．１９９６；８：３２３０−３２３９）を使用して評価した：体重損失、姿勢（背中の丸まり）、活性、毛皮の手触り、及び皮膚の完全性。マウスを、各基準に関して評定し、０〜２に等級付けした。５つの臨床的スコアの総和によって、臨床的指標値を生み出した（指標数は、ＧＶＨＤの重症度に伴い増加する）。
【０４４３】
結果
【０４４４】
異なるマウス集団の生存率が、図３にグラフ表示される。照射のみの対照マウスは、骨髄再構築を受けなかったマウスから予測される通り、８〜１２日目に死亡した（ｎ＝１３）。ＧＶＨＤ対照マウス（骨髄及び脾臓を受けた）の大多数は、６〜２７日目に死亡した。１匹のマウスは死亡しなかった（ｎ＝１８）。骨髄再構築対照群（ＢＭ）では、７匹のマウスのうち３匹が６〜８日目に死亡した。残りのマウスにおいては、ドナー骨髄によって骨髄が再構築され、マウスは生存したままであった（＞５０日間）。
【０４４５】
単一ドナーの照射されていないマウスは、１５〜３６日目に死亡した。したがって、先に示された通り、単一ドナーの照射されていない初期アポトーシス細胞は有益な効果を有し、生存は延長された（ｐ＜０．０１）。
【０４４６】
単一ドナー由来の照射されたマウスは、７〜３５日目に死亡し、１匹のマウスは無疾患生存に留まった（＞５０日間）。これは、単一ドナーの照射されたアポトーシス細胞もまた、ＧＶＨＤに関して有益な効果を提供したことを実証している。したがって、照射は、初期アポトーシス細胞の免疫変調効果を損なわなかった。全て、ＧＶＨＤマウスモデルにける生存に対してＧＶＨＤ対照と比較して有益な効果を有した（ｐ＜０．０１）。
【０４４７】
照射されていない複数ドナー治療は、ＧＶＨＤ対照と比較して有益な効果を提供しなかった（ｎ＝１１）。生存パターンは、ＧＶＨＤ対照に類似しており、マウスは、６〜２８日目に死亡した（ｐ＝ＮＳ−有意差無し）。驚くべきことに、また照射されていないアポトーシス細胞とは対照的に、照射された複数の個別のドナー由来のアポトーシス細胞（治療Ｆ）（ｎ＝１０）は、ＧＶＨＤ対照と比較して、単一ドナー治療に類似した有益な効果を有した。ＧＶＨＤの症状は、その後により顕著に現れ、マウスは、１８〜３４日目に死亡した（ｐ＜０．０１）。
【０４４８】
照射された複数の個別のドナー（ｎ＝１０）、照射された単一ドナー（ｎ＝１０）、及び照射されていない単一ドナー治療（ｎ＝１０）は、類似の生存パターンを有しており、これらの３つの治療群間で、生存に対する効果の有意な差は観察されなかった。
【０４４９】
実験は、ＧＶＨＤを誘発されたマウスにおけるアポトーシス細胞注入の明確な効果を示唆した。照射された複数の個別のドナー、ならびに照射された及び照射されていない単一ドナーのアポトーシス細胞の治療に関して、顕著な延長された生存の効果が存在した。
【０４５０】
複数ドナー治療は、照射されない場合にマウスの生存を延長しなかったが、マウスへの投与前のアポトーシス細胞生成物の照射は、結果を改善し、治療は、単一ドナー治療に近い生存パターンを有した。
【０４５１】
上述の通り、図３は、複数の不適合ドナーから取得された照射されていないアポトーシス細胞は、（１）単一の不適合ドナーから取得された照射されていないアポトーシス細胞、（２）単一の不適合ドナーから取得された照射されたアポトーシス細胞、及び（３）複数の不適合ドナーから取得された照射されたアポトーシス細胞と比較して、ＧｖＨＤの低減及び死亡率（％生存）に対して有意により低い正の臨床効果を有することを示している。さらに、３つ全て（照射されていない初期アポトーシス細胞、単一ドナー：照射された初期アポトーシス細胞、単一ドナー；及び照射された初期アポトーシス細胞、複数の個別のドナー）は、類似の効果を有する。
【０４５２】
このデータは、複数の個別のドナーから取得された照射されていないアポトーシス細胞の抗原性は、複数の個別のドナーから取得された照射されたアポトーシス細胞の抗原性に類似であることが予測されるため、驚くべきものであり、なぜ、両方ともが移植された骨髄に対する類似の敵対的な抗原反応を有さないのであろうか、またなぜ、両方ともがＧｖＨＤ及び死亡率を低減することが可能ではないのであろうか？
【０４５３】
ここで、抗原性が主要な問題であるならば、単一ドナーから取得された照射されていないアポトーシス細胞と単一ドナーから取得された照射されたアポトーシス細胞との臨床効果に差が見られることが期待された。しかしながら、データはこの差を示していない。
【０４５４】
１つの可能性は、複数の個別のドナーから調製された照射されていないプールされたアポトーシス細胞調製物の有効性の欠落が、プールされた調製物中に存在する個別の単核集団間の交差相互作用からもたらされたということである。照射された細胞はその抗原性を維持しているため、これらの相互作用は、宿主に対する抗原性に直接起因しているようには見えないが、有効性は、照射されていない細胞とは顕著に異なった。したがって、照射を受けているプールされた初期アポトーシス細胞調製物間の交差相互作用は、予期せぬことに排除され、宿主は細胞の投与に良好に応答したと考えられる。
【０４５５】
示される通り、照射されたプールされたドナーは、単一の照射されていないドナーと本質的に同一の効果を有した。
【０４５６】
実施例６：最終アポトーシス細胞生成物における照射の効果
アポトーシス細胞は、それらの固有の免疫変調及び抗炎症特性のため、新規の治療戦略においてますます使用されるようになっている。初期アポトーシス細胞調製物は、２０〜４０％もの生存細胞（ＰＳ露出の欠落及びＰＩ無浸入；アネキシンＶ陰性及びヨウ化プロピジウム陰性によって測定する）を含有してもよく、その一部は、輸液中に使用された後にアポトーシス性となり得るが、一部は生存したままとなる。適合ドナーからの骨髄移植の場合、レシピエントは実際の移植物においてより多くの生存細胞を既に受けているため、生存細胞は臨床的問題を示さない。しかしながら、第三者輸液（または、プールされた単核アポトーシス細胞調製物で表され得る通り、第四者以上）の場合、生存細胞を含むアポトーシス細胞集団の使用は、第２のＧｖＨＤ誘発因子を導入し得る。さらに、初期アポトーシス細胞の免疫変調潜在力における照射の意義は、現在のところ評価されていない。当業者は、初期アポトーシス細胞集団の追加の照射が、細胞をより後期のアポトーシスまたはネクローシスへと進行させ得ることを考慮し得る。これは、臨床用途に関して特に適切な疑問であると考えられるため、下記に提示される実験は、この問題に対処するように設計されており、少なくとも１つの目標は、機能的なアポトーシス細胞の生体安全性を改善することであった。
【０４５７】
したがって、目的は、アポトーシス細胞の効力が、移植された細胞の生着よりもむしろバイスタンダー効果に依存し得る、多数の兆候のためのアポトーシス細胞の臨床利用を促進することであった。
【０４５８】
目的：初期アポトーシス細胞に対する照射の効果を調査することであり、ここでは、照射はアポトーシスの誘発後に生じる。
【０４５９】
方法（手短に記す）：実施例５に従って細胞を収集し、本質的に実施例５に説明される通りに初期アポトーシス細胞を調製した。
【０４６０】
３つの別個の初期アポトーシス細胞バッチを、異なる日に調製した（収集物４０４−１、００４４−１、及び００４３−１）。
【０４６１】
各最終生成物を、３つの群に分けた：
【０４６２】
未治療
【０４６３】
２５００ｒａｄ
【０４６４】
４０００ｒａｄ
【０４６５】
照射後、初期アポトーシス細胞を、細胞計数、アネキシンＶ陽性−ＰＩ陰性染色、細胞表面マーカー（異なる細胞型集団の％）、及び効力（樹状細胞（ＤＣ））に関して即座に試験した（ｔ０）。ｔ０における調査の後、初期アポトーシス細胞を２〜８℃で２４時間保管し、同じ試験パネルを使用して次の日に調査した（ｔ２４ｈ）（細胞計数、アネキシンＶ陽性−ＰＩ陰性染色、ならびに細胞表面マーカー及び効力）。
【０４６６】
これまでに、放出後効力アッセイが開発されており、これは耐性を誘発するドナー単核初期アポトーシス細胞（初期アポトーシス細胞）の能力を評価する（Ｍｅｖｏｒａｃｈ  ｅｔ  ａｌ，ＢＢＭＴ  ２０１４  ｉｂｉｄ）。このアッセイは、ＬＰＳへの曝露後のｉＤＣ膜上のＭＨＣクラスＩＩ分子（ＨＬＡ−ＤＲ）及び副刺激分子（ＣＤ８６）の発現のフローサイトメトリー評定の使用に基づく。これまでに繰り返し示されている通り、寛容原性ＤＣは、アポトーシス細胞との相互作用時に生産され得（Ｖｅｒｂｏｖｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００２，Ｋｒｉｓｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００６）、ＬＰＳで処置されたＤＣの成熟の阻害（ＤＲ及びＣＤ８６発現の阻害）は、用量依存性様式で生じる。
【０４６７】
初期アポトーシス細胞臨床研究のフェーズ１／２ａ中に、放出後効力アッセイを各初期アポトーシス細胞バッチに関して遂行して、耐性を誘発する各バッチの能力を評定した（全体の結果ｎ＝１３）（結果は図１に示される、Ｍｅｖｏｒａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２０（１）：５８−６５）。
【０４６８】
未知の非血縁の健康なドナーから収集された新鮮な軟膜からの各初期アポトーシス細胞バッチに関して、ＤＣを生産し、異なる比率で初期アポトーシス細胞と組み合わせた（それぞれ、１：２、１：４、及び１：８のＤＣ：初期アポトーシス細胞）。初期アポトーシス細胞によるインキュベーション及びＬＰＳへの曝露の後、ＤＣ：初期アポトーシス細胞の１つ以上の比率におけるＨＬＡ  ＤＲまたはＣＤ８６のいずれかのＤＣ膜発現の下方調節に基づいて、効力を決定した。１３のアッセイ全てにおいて、初期アポトーシス細胞は寛容原性効果を実証しており、これは、最も高いＤＣ：初期アポトーシス細胞比の調製物において、両マーカーに関して用量依存性様式で見られた。
【０４６９】
単球取得した未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）を、健康なドナーの末梢血液ＰＢＭＣから生産し、１％の自己血漿、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ−４の存在下で培養した。次に、ｉＤＣを、新鮮に調製した最終生成物か、または２〜８℃で２４時間保管した最終生成物かのいずれかのアポトーシス細胞と共に、１；２、１；４、及び１；８の比率で２時間予備インキュベートした。２つの最終生成物を、同時に調査して、保管がアポトーシス細胞の効力に影響を及ぼすかを判定した。インキュベーションの後、ＬＰＳを指定のウェルに添加し、それをさらに２４時間放置した。インキュベーションの終了時に、ｉＤＣＳを収集し、洗浄し、ＤＣ兆候及びＨＬＡ−ＤＲまたはＣＤ８６の両方で染色して、発現の変化を決定した。フローサイトメータを使用して細胞を分析し、ＦＣＳ−ｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、ＤＣ兆候陽性細胞ゲートから分析を実施して、ＤＣのみの分析を確実にした。
【０４７０】
図４Ａ〜Ｂ及び図５Ａ〜Ｂは、照射されていない単一ドナー細胞と比較した照射されたプールされたアポトーシス細胞の効力試験を示す。
【０４７１】
結果：
【０４７２】
単一ドナー調製物
【０４７３】
表８は、照射されていない、及び照射されたアポトーシス細胞の、以下の比較結果を提示する；２４時間における平均細胞損失（％）；０時間及び２４時間におけるアネキシン陽性（＋）ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性（−）％（初期アポトーシス細胞の％）；０時間及び２４時間におけるアネキシン陽性（＋）ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性（＋）％（後期アポトーシス細胞の％）；０時間及び２４時間における細胞表面抗原ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞）、ＣＤ１４（単球）、及びＣＤ１５ｈｉｇｈ（顆粒球）の存在。
【０４７４】
【表８】
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【０４７５】
表８の結果は、照射されていないアポトーシス細胞及び照射されたアポトーシス細胞の両方が、初期（２及び３行目）及び後期（４及び５行目）のアポトーシス細胞に相当するパーセンテージを有していたことを示す。したがって、２５または４０Ｇｙの照射は、この高レベルのガンマ線照射の前に誘発されたアポトーシスまたはネクローシスプロセスを加速しなかった。さらに、細胞型に関して、照射された細胞集団と対照の照射されていない集団との間に一貫性があった。
【０４７６】
図４Ａ〜４Ｂ（ＨＬＡ−ＤＲ発現）及び図５Ａ〜５Ｂ（ＣＤ８６発現）に提示される効力アッセイの結果は、照射されていないアポトーシス細胞と比較して、新鮮な（図４Ａ、図５Ａ）及び２４時間保管された（図４Ｂ、図５Ｂ）照射されたアポトーシス細胞の免疫変調能力に変化がなかったことを示す。
【０４７７】
図４Ａ〜Ｂ及び図５Ａ〜Ｂの両方において、成熟剤ＬＰＳへの曝露後にＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８６発現の両方において明確な情報調節が存在する。両方の共刺激マーカーの有意な（ｐ＜０．０１）用量依存性下方調節が、単一ドナーまたは照射されたプールされたドナーから新鮮に調製した両方のアポトーシス細胞の存在下で観察された。さらに、用量依存性下方調節は、２〜８℃で２４時間保管されたアポトーシス細胞の存在下で両マーカーにおいて維持され、２４時間の保管後の最終生成物の安定性及び効力を示している。
【０４７８】
樹状細胞に対する効果。アポトーシス細胞の免疫変調能力を試験するために、放出後効力アッセイを使用した（Ｍｅｖｏｒａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）ＢＢＭＴ，ｉｂｉｄ）。樹状細胞の免疫変調アッセイにおいて、変化は観察されなかった。（データは示されていない）
【０４７９】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に対する効果。免疫変調効果をさらに試験するために、標準化ＭＬＲアッセイを確立した。ここで、刺激因子及び応答細胞の共培養、すなわちＭＬＲは、強く確実な増殖をもたらした。照射されていないアポトーシス細胞をＭＬＲに添加すると、リンパ球増殖は、有意に５倍超低減し、増殖の細胞阻害を明白に実証している。照射されたアポトーシス細胞によって媒介されたＭＬＲにおけるリンパ球増殖の阻害は、完全に相当した。（データは示されていない）
【０４８０】
次のステップは、完全不適合マウスモデルにおいて照射された及び照射されていないアポトーシス細胞をインビボで評定することであった。図１〜２に示される通り、照射された及び照射されていない初期アポトーシス細胞調製物は、相当なインビボの有益な効果を有した。
【０４８１】
単一ドナー調製物の結論：
【０４８２】
結論として、２５Ｇｙまたは４０Ｇｙの照射は、アポトーシス細胞の集団において、アポトーシスまたは誘発されたネクローシスを有意に加速しなかった。意義深いことに、これらの集団は、インビトロ及びインビボの両方でアポトーシス細胞の免疫変調効果を維持した。
【０４８３】
複数ドナー調製物
【０４８４】
次に、単一ドナーの第三者調製物にて観察された現象が複数の第三者ドナーに関しても当てはまることを検証するために、実験を実施した。予期せぬことに、プールされた個別のドナーのアポトーシス細胞調製物を使用したときに、単一不適合ドナーの有益な効果は失われた（図３）。各ドナーの有益な効果は別々に維持されているため、これはＧｖＨＤに起因するものではない（試験結果は示されていない）。１つの可能性は、初期アポトーシス細胞調製物の有益な効果が、個別のドナー細胞のそれらの間の相互作用によって失われたということである。さらに、異なるドナーのこの可能な相互作用がガンマ線照射によって回避され得るかを調査した。
【０４８５】
図３に示される通り、単一ドナーの有益な効果は、ガンマ線照射後に完全に復活しており、照射された複数ドナー調製物及び単一ドナー調製物（照射されたまたは照射されていない）は、類似の生存パターンを有した。
【０４８６】
結論：
【０４８７】
驚くべきことに、照射（及び、場合によりＴ細胞受容体の阻害を導く任意の方法）は、Ｔ細胞の望ましくない増殖及び活性化を回避するだけでなく、複数ドナーの第三者アポトーシス細胞の調製物を使用したときに免疫変調の有益な効果を可能にすることが、今回初めて示された。
【０４８８】
本明細書において特定の特徴が例証及び説明されているが、当業者は、多数の修正、置換、変更、及び同等物を思い付くであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、かかる修正及び変更を本明細書の開示の真の精神に入るように包含することが意図されることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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