(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
診断対象である植物の紫紋羽病菌の感染状態を診断する方法であって、
（Ａ）前記植物の植物体における代謝産物であって紫紋羽病菌の感染によって植物体地上部での変動挙動を示す低分子化合物の含量の値又は当該含量に基づく値を指標とする工程、
を含むことを特徴とする、植物における紫紋羽病菌の感染診断方法であって、；
前記低分子化合物が、粘液酸及びプトレシンからなる群から選ばれた１以上のものであり、；
前記感染による植物体地上部での低分子化合物の変動挙動が、粘液酸では増加変動挙動を示し、プトレシンでは減少変動挙動を示す、；
前記植物における紫紋羽病菌の感染診断方法。
【請求項２】
前記植物が紫紋羽病菌の感染により紫紋羽病の罹病病徴を発現する植物である、請求項１に記載の紫紋羽病菌の感染診断方法。
【請求項３】
前記（Ａ）に記載の工程の後、
（Ｂ）診断対象植物における前記指標とする値を、（ｂ１）陰性対照である紫紋羽病菌に非感染の植物及び／又は陽性対照である紫紋羽病菌に感染した植物、における対応する値と比較して、（ｂ２）これらの値の間での実質的な差異の有無又は差異の度合いに基づいて紫紋羽病菌の感染状態を判定することを含む、
請求項１又は２に記載の紫紋羽病菌の感染診断方法。
【請求項４】
前記（Ｂ）に記載の工程における比較及び判定が多変量解析を利用して行うことを含むものである、請求項３に記載の紫紋羽病菌の感染診断方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法を行うことを特徴とする、植物における紫紋羽病の罹病状態を診断する方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の紫紋羽病菌の感染診断方法を行うために使用するキットであって、前記（Ａ）に記載の紫紋羽病菌の感染によって植物体地上部での変動挙動を示す低分子化合物の定量を可能とする試薬を構成物品として含んでなる、植物における紫紋羽病菌の感染診断用キットであり、；
前記キットが、粘液酸の定量を可能とする試薬、及び／又は、プトレシンの定量を可能とする試薬、を含むものである、；
前記植物における紫紋羽病菌の感染診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断対象である植物の紋羽病菌の感染状態を診断する技術に関する。詳しくは、紫紋羽病菌の感染診断に適用可能な技術であって簡易な手法にて紋羽病菌感染の早期診断を可能とする技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
紋羽病と総称される植物病は、農作物や植物生産に甚大な被害を与える植物病害である。紋羽病には紫紋羽病（violet root rot）と白紋羽病（white root rot）が存在するが、いずれも土壌伝染性を示す糸状菌が原因微生物であり、根表面を菌糸束や菌糸膜で覆って皮層組織内に侵入し根を腐敗させ、最終的に地上部を枯死させる病徴を示す（非特許文献１：中村仁 2009）。
【０００３】
紋羽病菌の防除においては感染植物の早期処置が重要であるところ、これらの病原菌はいずれも土壌を介して感染が広がる土壌伝染性病原菌であるため、圃場等の土壌中に存在する病原菌を完全に死滅させることは困難である。また、地下部である根で感染が進行するため病徴の発見が遅れる傾向があり、植物体地上部に病徴が確認された時には樹木そのものが枯死する場合が多い。更に紋羽病菌は一度感染したら完治はもとより治癒が難しい傾向があるため、圃場や栽培現場等の全体に感染被害が拡大しやすく植物栽培に甚大な被害を与える。特に果樹等の樹木においては難防除性の深刻な病害であり、確実な早期処置を実現するための感染植物体の早期診断技術の開発が望まれている。
【０００４】
ここで、紋羽病の被害が特に深刻である果樹に対しては、従来技術として紋羽病感染個体を判別するための様々な方法が試みられてきた。
生産現場において簡易に行われていた感染樹の識別方法としては、具体的に、 i）紫紋羽病菌では矮性樹の地際部を目視観察して病徴を発見する観察手法が行われている。しかし、感染植物体の中には、判別指標となる地際部での病徴発現することなく根部のみで感染が進行しているケースがあり、また樹勢が強い個体の場合は罹病樹の発見自体を見落とされるケースも見られる。また、当該方法は診断に適した時期が子実体の形成される秋季に限られており、更にある程度の感染段階が進まなければ目視診断ができない。この点、当該目視観察に頼った方法では原理的に早期診断が困難であり、紋羽病防除において重大な課題となる。
【０００５】
また、ii）両紋羽病の病徴発現が確認しやすい根部を直接調査することができれば、直接的な診断が可能となり感染樹の見落しを低減できる点で好適である。しかし、樹木の根部のサンプリングは非常に労力を要する作業であるため、栽培現場においては現実的な方法とは認められない。更に掘り起しによる植物体への損傷や影響が大きいため、その後の生育状況や収量等に影響がでる点でも現実的ではない。
【０００６】
また、iii）病原菌が特異的に産生する外来物質を指標として感染病原菌の存在を検出する診断手法が報告されている（特許文献１：特許第4907325号公報）。具体的に特許文献１に記載の方法では、樹木の幹や枝等から白紋羽病菌の産生物質であるサイトカラシンＥを検出することによって、果樹等の白紋羽病菌の感染程度を診断する方法が報告されている。しかし、サイトカラシンＥの検出によって診断できる対象の病原菌は「白紋羽病菌」だけであり、「紫紋羽病菌」の感染を検出することはできない。また、特許文献１にてサイトカラシンＥを検出した実施例では、明らかに感染が進行した感染木と枯死寸前の感染木の実験例しか記載されておらず、地上部にて病徴が発現していない感染木での感染診断が可能であるかは示されていない。
この点、根に感染した病原菌の二次代謝物を検出する手法によって植物体外観上の病徴が十分に発現していない段階での感染判定が可能かは不明である。また、植物体地上部で明らかな病徴が観察されてから診断判定をしても紋羽病早期防除を実現することはできない。更に、サイトカラシンＥはＨＰＬＣやＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析等の定量分析を前提とした手法であり使用する物標準物質自体も高価である。更に代替可能な簡易測定法もないため分析単価が高額になるという課題がある。
【０００７】
以上に示したように、紋羽病の防除技術として重要な紋羽病菌感染の早期診断を可能とする技術は確立されていない。また、特許文献１に係る技術は紫紋羽病菌には原理的に適用できない技術である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４９０７３２５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】中村仁，微生物遺伝資源利用マニュアル（２７），ＩＳＳＮ  １３４４−１１５９，独立行政法人農業生物資源研究所，２００９年１２月２５日発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記背景技術の事情に鑑みてなされたものでありその課題とする処は、紫紋羽病菌の感染診断に適用可能な技術であって簡易な手法にて紋羽病菌感染の早期診断を可能とする技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、第一段階として紋羽病菌感染と相関性を示す生育中の植物体の内因性の情報に着目し、植物自体の代謝産物組成の変動挙動情報を利用するという技術的思想に着想した。
ここで、植物が作り出す代謝産物の種類は２０万種以上とも言われており、更に植物自身の代謝経路全体の変化は複雑であるため、紋羽病の感染によってどのような代謝変動を前もって予想することは困難である。
代謝組成変動を検出する手法としては、ＮＭＲ分析等を利用した網羅的解析法であるメタボローム解析を挙げることができるが、そもそも紋羽病感染研究においてはデータマインニングの前提となる感染植物を用いた比較実験を行った報告例がない。また、メタボローム解析に必要なＮＭＲ装置は高分解能を必要とするため高額であり、当該手法を特に必要とする果樹等を対象とする分析委託業者等において、当該手法を導入することは現実的に難しい。さらに、装置からＮＭＲスペクトルを得た後に、判別に利用できるシグナルを抽出する必要があるが、この過程において高度な解析技術が必要であり適用できる機関や事業体が限定される。
【００１２】
そこで、本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、植物が一般的に産生する代謝産物のうち、分子量が数十〜数百程度の低分子化合物を対象とするＧＣ／ＭＳによる解析を行うことを着想した。そして、当該解析を行うことによって、人為的に紋羽病菌に感染させた植物体において統計的有意差を以て変動挙動を示す代謝産物が複数存在することを見出した。ここで、本発明者らが見出した代謝産物の変動挙動情報は、地上部での紋羽病の病徴発現の程度に関わらず地下部の病徴が確認される程度であれば十分に検出可能な変動挙動であった。更に、これらの低分子化合物は物質として一般的な低分子化合物であるため抽出や分析操作が容易であり、酵素反応や吸光度を利用した方法等の簡易な定量手段も存在していた。また、当該変動挙動は、植物体地上部において紋羽病菌の検出が可能な植物体の内因性の代謝変動情報であった。
本発明者らは、これら低分子化合物含量の変動に着目することによって簡易な手法により紋羽病の早期診断を実現可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は具体的には以下に記載の発明に関する。
［項１］
診断対象である植物の紋羽病菌の感染状態を診断する方法であって、
（Ａ）前記植物の植物体における代謝産物であって紋羽病菌の感染によって変動挙動を示す低分子化合物の含量の値又は当該含量に基づく値を指標とする、
ことを特徴とする、植物における紋羽病菌の感染診断方法。
［項２］
前記低分子化合物の含量の値又は当該含量に基づく値が植物体地上部における値である、項１に記載の紋羽病菌の感染診断方法。
［項３］
前記植物が紋羽病菌の感染により紋羽病の罹病病徴を発現する植物である、項１又は２のいずれかに記載の紋羽病菌の感染診断方法。
［項４］
前記紋羽病菌が紫紋羽病菌を含むものである、項１〜３のいずれかに記載の紋羽病菌の感染診断方法。
［項５］
前記低分子化合物が、粘液酸、カフェイン酸、プトレシン、４−アミノ酪酸、セリン、マレイン酸、及びこれらの誘導体であって同様の変動挙動を示す化合物からなる群から選ばれた１以上のものである、項１〜４のいずれかに記載の紋羽病菌の感染診断方法。
［項６］
前記低分子化合物が、粘液酸、カフェイン酸、プトレシン、４−アミノ酪酸、セリン、及びマレイン酸からなる群から選ばれた１以上のものである、項１〜５のいずれかに記載の紋羽病菌の感染診断方法。
［項７］
前記低分子化合物が粘液酸及び／又はプトレシンである、項１〜６のいずれかに記載の紋羽病菌の感染診断方法。
［項８］
前記（Ａ）に記載の工程の後、
（Ｂ）診断対象植物における前記指標とする値を、（ｂ１）陰性対照である紋羽病菌に非感染の植物及び／又は陽性対照である紋羽病菌に感染した植物、における対応する値と比較して、（ｂ２）これらの値の間での実質的な差異の有無又は差異の度合いに基づいて紋羽病菌感染状態を判定することを含む、
項１〜７のいずれかに記載の紋羽病菌の感染診断方法。
［項９］
前記（Ｂ）に記載の工程における比較及び判定が多変量解析を利用して行うことを含むものである、項８に記載の紋羽病菌の感染診断方法。
［項１０］
項１〜９のいずれかに記載の方法を行うことを特徴とする、植物における紋羽病の罹病状態を診断する方法。
［項１１］
項１〜９のいずれかに記載の紋羽病菌の感染診断方法を行うために使用するキットであって、前記（Ａ）に記載の紋羽病菌の感染によって変動挙動を示す低分子化合物の定量を可能とする試薬を構成物品として含んでなる、紋羽病菌の感染診断用キット。
［項１２］
前記試薬が、粘液酸、カフェイン酸、プトレシン、４−アミノ酪酸、セリン、又はマレイン酸の定量を可能とする試薬を含むものである、項１１に記載の紋羽病菌の感染診断用キット。
［項１３］
前記試薬が粘液酸又はプトレシンの定量を可能とする試薬を含むものである、項１１又は１２のいずれかに記載の紋羽病菌の感染診断用キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、紫紋羽病菌の感染診断に適用可能な技術であって簡易な手法にて紋羽病菌感染の早期診断を可能とする技術を提供する。例えば、本発明では地上部に病徴が発現してない一見健全に見える生育中の植物体の葉を採取して分析に供して、簡易に紋羽病菌感染の早期診断を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１に係る紫紋羽病菌接種及び栽培試験において、リンゴマルバ苗地上部の状態を撮影した写真像図である。図１Ａ：地上部の凋れ症状が現れる前の状態。図１Ｂ〜Ｄ：地上部に凋れ症状が現れた状態。
【００１６】
【図２】実施例１に係る紫紋羽病菌接種及び栽培試験において、リンゴマルバ苗の地下部の感染状態を撮影した写真像図である。図２Ａ：根の２割に感染座が確認された状態（ＩＦ値＝２）。図２Ｂ：根の５割に感染座が確認された状態（ＩＦ値＝５）。図２Ｃ：根の９割に感染座が確認された状態（ＩＦ値＝９）。図２Ｄ：根の１０割と主幹の地下部に感染座が確認された状態（ＩＦ値＝１５）。
【００１７】
【図３】実施例１に係る紫紋羽病菌接種及び栽培試験において、根に形成された感染座を実体顕微鏡にて観察した写真像である。
【００１８】
【図４】実施例３に係るクラスター分析において、階層クラスター樹形の結果を示す図である。図中の白丸の符号はＩＦ値が０の個体、灰色丸の符号はＩＦ値が５以下の個体、及び黒丸の符号はＩＦ値が５を超える個体をそれぞれ示す。
【００１９】
【図５】実施例４に係るクラスター分析において、階層クラスター樹形の結果を示す図である。図中の白丸符号は無処理区の個体、灰色丸は吸水制限処理区の個体、及び黒丸は菌接種処理区の個体をそれぞれ示す。黒丸符号下のＡ及びＢの略号は菌株Ａ及び菌株Ｂを接種した個体であることを示す。
【００２０】
【図６】実施例５に係る単一成分での感染判定試験において、各処理区での粘液酸含量を比較した結果図である。
【００２１】
【図７】実施例５に係る単一成分での感染判定試験において、各処理区でのプトレシン含量を比較した結果図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００２３】
［用語等の説明］
本明細書中「感染診断」とは、診断対象植物の植物体において紋羽病菌から受ける影響を指標値として数値化して評価し、植物体における紋羽病菌の感染状態を判定する行為を指す。ここで感染診断には、感染の有無を判定する定性的な診断だけでなく、感染の進行段階を判定する定量的な診断も含まれる。
本明細書中「対照植物」とは、診断対象植物からの指標値と比較するための対応値の情報を得るための植物を指す。本明細書に係る対照植物としては陰性対照植物と陽性対照植物が含まれる。
また、本明細書中「圃場」とは、農作物や果樹等を栽培する田畑及び農園等を指す用語である。本明細書では広義の意味として植物栽培を行う環境全般を指す用語として用いられる。
【００２４】
１．紋羽病菌の感染診断方法
本発明は、診断対象である植物の紋羽病菌の感染状態を診断する技術に関する。詳しくは、紫紋羽病菌の感染診断に適用可能な技術であって簡易な手法にて紋羽病菌感染の早期診断を可能とする技術に関する。
【００２５】
［感染診断対象］
対象植物
本発明に係る方法で診断対象となる植物は、紋羽病菌の感染により罹病して紋羽病の病徴を発現する植物である。即ち、本発明では紋羽病菌に感染して紋羽病の罹病病徴を発現する植物を診断対象とすることができる。
紋羽病菌は、紫紋羽病菌及び白紋羽病菌の両種ともに多犯性が強く、木本植物及び草本植物に属する幅広い植物種に感染し紋羽病の病徴を発現する。本発明に係る診断対象としては、生産現場等にて有用に診断結果を利用可能な植物については好適に適用することが可能である。特に好適には、従来技術では早期診断が困難である木本植物に対して有用に適用することが可能である。特に経済的被害が大きい果樹等に適用することが有用である。また、農作物の作物体である草本植物についても適用することが可能である。
【００２６】
ここで、紋羽病菌の感染診断対象となる植物を例示するが、本発明の適用範囲はこれらに限定されるものではない。
具体的には、紫紋羽病菌に感染する植物としては、日本植物病名目録には１００種以上の宿主植物が報告されている（日本植物病名目録，２０００年度版，日本植物病理学会発行）。例えば、リンゴ、クワ、ウルシ、チャ、サクラ、ナラ、カエデ、ツバキ、ツツジ、ヒサカキ、ユリノキ、サツマイモ、アスパラガス、ニンジン、アルファルファ等を挙げることができる。
また、白紋羽病菌に感染する植物としては、日本植物病名目録には、１３０種以上の宿主植物が報告されている（日本植物病名目録，２０００年度版，日本植物病理学会発行）。例えば、リンゴ、ナシ、ブドウ、ビワ、イチジク、キウイフルーツ、モモ、ウメ、オウトウ、アンズ、スモモ、カキ、カンキツ、クリ、クワ、チャ、サクラ、カシ、ナラ、ポプラ、カエデ、ツバキ、ツツジ、バラ、キク、オモト、シャクヤク等を挙げることができる。
【００２７】
紋羽病菌
本発明に係る方法で感染診断が可能な植物病害は紋羽病である。ここで、紋羽病とは紫紋羽病菌と白紋羽病菌が原因微生物となって引き起こされる植物病害の総称である。いずれも土壌伝染性を示す糸状菌が原因微生物であり、根表面を菌糸束や菌糸膜が伸長し、紫紋羽病菌においてはさらに感染座（侵入座）を形成して皮層組織内に侵入し根を腐敗させ、最終的に地上部を萎縮させて枯死させる病徴を示す（中村仁, 微生物遺伝資源利用マニュアル（27）, 2009）。
【００２８】
紫紋羽病菌と白紋羽病菌とは別種の菌類であるがいずれも土壌性糸状菌であり、「紋羽」や「root rot」という共通した名称が示すように、罹病した植物に発現される病徴に多くの共通点が見られる。特に地上部の萎凋等の外観病徴は酷似しており、地下部の根の病徴を確認しなければ両者の判別は困難である（中村仁, 微生物遺伝資源利用マニュアル（27）, 2009）。また、地下部においても根の細胞壁等を分解して根皮層侵入する感染様式及び機構も共通する（Perez‐Jimenez, J. Phytopathology 154, 257-266, 2006、渡辺恒雄ら, 植物土壌病害の事典, 1998）。更にいずれの菌も多犯性を示し感染対象である宿主植物が約１００種以上存在し、リンゴやナシ等の果樹において紫紋羽病菌と白紋羽病菌の両方に共通して感染する宿主植物が多く存在する。
これらの点が示すように、紫紋羽病菌と白紋羽病菌との宿主となる感染植物の種類や外形的変化である病徴（感染応答反応後に発現される外形形態）には多くの共通点が存在することから、宿主植物側の感染による応答反応には共通する機構が存在することが示唆される。
【００２９】
紫紋羽病（violet root rot）の原因微生物である紫紋羽病菌としては、ヘリコバシディウム属（Helicobasidium）に属するH. mompa、H. brebissonii（シノニム：H. purpureum）、H. longisporum等を挙げることができる。これらはいずれも紫紋羽病の病徴を発現する近縁種であり（中村仁, 微生物遺伝資源利用マニュアル（27）, 2009）、共通した感染機構を存在すると認められる。
白紋羽病（white root rot）の原因微生物である白紋羽病菌としては、ロゼリニア属（Rosellinia）に属するR. necatrix、R. compacta等を挙げることができる。白紋羽病菌としては通常はR. necatrixが知られているが、近年近縁種であるR. compactaが発見された（Takemoto et al., Mycologia 101, p84-94, 2009）。当該近縁種についても共通した感染機構が存在すると認められる。
【００３０】
分析試料
本発明に係る方法は、診断対象植物の植物体における代謝産物の含有量を測定するために、診断対象植物の植物体を分析試料に供する。ここで、分析試料に適した植物体の部位としては、紋羽病菌の感染によって代謝産物含量に変動挙動が生じる部位であれば、地上部及び地下部のいずれの組織又は器官を採用することも可能である。特に導管や篩管等の通導組織を備えた部位であることが好適である。また、地上部の器官や組織を用いることが好適であるが、地下部の根、地際部の茎や樹幹等を分析試料とすることも可能である。
【００３１】
本発明における分析試料として好適な態様としては、地下部を掘り起こすことなく採取が可能な地上部の組織又は器官を用いることが特に好適である。特には、茎、葉、又は芽等の器官やこれらを構成する組織を用いることが好適である。また、茎、葉、又は芽等の変形器官やこれらを構成する組織を用いることも可能である。
地上部におけるこのような器官や組織としては、例えば、頂芽、側芽、花芽、萼、花弁、雄蕊、葯、雌蕊、胚珠、種子、苞、果実、果肉、果皮、茎、枝、表皮組織、皮層組織、樹皮、形成層、通導組織、葉芽、葉、葉肉組織、クチクラ組織等の器官や組織を挙げることができるこれらに限定されない。
分析試料として更に好ましくは、葉を用いることが好適である。特に好ましくは、葉身部分のみを採取回収して用いることが好適である。
なお、本発明に係る方法の分析試料としては、上記組織や器官が２種以上混在する状態のものを用いることも可能である。
【００３２】
分析試料としてより好ましくは、診断対象植物の生育や果実生産等に実質的な影響を与えにくく且つ容易に採取が可能な葉や側枝を分析試料に供することが好適である。ここで、植物体の生育に「実質的に影響を与えにくい」とは、分析試料に供する植物体部位を診断対象の植物体本体から採取した場合であっても、所望とする生育状態や生産性に影響を生じにくいことをいう。例えば、成長した植物体から葉等の特定の部位を数か所採取する行為等がこれに該当する。
また、幼苗等の栽培においては一部の苗自体（植物体本体）を間引いて試料に供することも可能である。この態様においては、分析に供した植物体の感染状態の診断を通して、その環境の周囲で生育している他の苗の健全性を把握することが可能となる。
【００３３】
本発明に係る診断方法では、植物体の器官や組織を採取する時期としては季節や発達段階に制限されることなく採取して診断用の試料に供することが可能である。なお、好適な態様としては、本発明に係る診断に供する植物体の器官や組織としては、発達ステージや採取時期を揃えて採取することが好適である。発達ステージの違いや分化誘導等のシグナルに由来する代謝産物変動（ノイズ）をより低減できる点で好適だからである。例えば、葉を採取する場合であれば、発達ステージが成熟段階に達している成葉を用いることで、発達ステージの違いに由来する代謝産物の変動を低減できる傾向があり好適である。
本発明に係る診断において特に好適な態様としては、植物体全体から偏らないように複数の箇所から採取した試料を用いることが望ましい。採取する植物体の量としては、植物体の生育に実質的に影響がない程度を採取することが望ましい。例えば、葉を採取する場合であれば、好ましくは複数の葉を植物体の大きさに応じて採取部位が均一と見なされる程度の枚数の葉であって、植物体の生育に実質的に影響がない程度を植物体全体から偏らないように採取することが好適である。
【００３４】
本発明に係る診断対象である植物は、栽培等を行っている環境土壌にて一定期間生育した状態にある植物体であることが望ましい。例えば、移植又は植樹等から少なくとも６週間以上、好ましくは８週間以上が経過して当該環境土壌にて生育中であることが確認されている植物体であることが望ましい。
【００３５】
測定
本発明の診断方法では、採取した植物体を分析試料に供して代謝産物含量を測定する。ここで、分析による測定値の信頼性を考慮すると、診断対象である植物体１個体につき２検体以上、好ましくは３検体以上を分析に供することが望ましい。例えば、植物体全体から偏りのないように複数の器官等を採取したものを混合試料の検体とした場合、同様にして複数の混合試料を調製して複数検体を調製することが好適である。
【００３６】
本発明に係る代謝産物含量の測定においては、生育状態にある植物体から採取直後の試料を分析に用いるが好適である。また、採取した植物体の部分を構成する細胞が生存している数時間から数日程度の状態であれば分析試料に供することも可能ではあるが、代謝産物の分解劣化等の影響を避けるために保存処理を施して保存して、分析試料に供することが好適である。ここで、保存処理としては、通常の植物組織から有機化合物を抽出可能な保存処理であれば採用可能である。例えば、乾燥処理、凍結乾燥処理、冷凍保存処理、冷蔵保存処理等を採用することが可能である。
本発明では、試料からの代謝産物の抽出操作は常法により行うことが可能である。好ましくは、前処理として植物体に対して粉砕、破砕、粉末化、擂潰、磨砕等の処理を行うことが望ましい。抽出溶媒としては、特に制限はないが水溶性溶媒を用いることが好適である。また、クロロホルム等の有機溶媒を添加した溶媒を用いて油性成分を除去し水溶性画分を分取する操作を行うとより好適である。
【００３７】
本発明における代謝産物含量の測定は、上記試料を分析に供することにより測定することが可能である。ここで、本発明にて適用可能な分析手法としては、化合物の定量に利用される手法であって診断対象植物の代謝産物含量の変動挙動を検出可能な感度にて測定可能な手法であれば、如何なる手法を採用することが可能である。
例えば、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、又はキャピラリー電気泳動等を用いて分画し、これらに質量分析計、電気化学検出器、又はエバポレイト光散乱検出器等を接続して定量するクロマトグラフィーを利用した分析法を採用することが可能である。また、一次元の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、上記代謝産物に該当する化学シフトのピークについて、ピーク面積値から求めた外部標準検量線等から算出するＮＭＲ法を採用することも可能である。更に、酵素反応後に可視光及び／又はＵＶ域の吸光度等を定量する比色定量法等の簡易定量法を採用することも可能である。
特には、検出感度及び操作性の点を重視すると、実施例で示したような低分子化合物の分析に適した条件でのＧＣ／ＭＳ法等により行うことが好適である。また、操作性や分析コスト等を重視する場合には、比色定量法等の簡易定量法を採用することが好適である。
【００３８】
［指標とする値］
本発明に係る診断方法では、診断対象植物の植物体における代謝産物であって紋羽病菌の感染によって変動挙動を示す低分子化合物の含量値又は当該値に基づく値を指標とすることによって、紋羽病の感染診断を実現する方法である。
本発明に係る診断方法では、当該指標とする値を用いることによって、診断対象植物の生育中の植物体において紋羽病菌から受ける影響を可視化し数値化した値であるため、当該値を以て紋羽病の感染状態を判定し評価することが可能となる。
【００３９】
本発明に係る診断において指標とすることが可能な「代謝産物の含量の値」とは、試料である植物体に含まれる代謝産物の含有量を表す値である。乾燥重量あたりの量を採用することが好適であるが、多試料間比較が担保可能であれば生重量の値を採用することも可能である。
また、本発明に係る診断において指標とすることが可能な「当該含量に基づく値」とは、試料である植物体に含まれる代謝産物含量から算出された値であって、代謝産物含量の多寡を多試料間で比較可能な指標値とできる値を指す。具体的には、代謝産物含量の絶対値以外にも、内部標準や外部標準等によって試料間比較を可能とした相対値で表された値も含まれる。また、係数を乗じて算出した値や、定数を加減して算出した値も含まれる。更に、２以上の代謝産物含量値を指標とする場合には、同じ変動挙動を示す化合物含量との合計量、反対の変動挙動を示す化合物含量との比（増加変動代謝物と減少変動代謝物に分けて算出した比）、等の値を算出して指標とすることも可能である。
【００４０】
本発明に係る診断方法で用いる代謝産物含量とは、紋羽病菌に感染した植物体における感染応答機構によって変動挙動を示す代謝産物含量を指すものである。具体的には、紋羽病菌に非感染の植物体に比べて実質的な差異が検出される代謝産物含量を指すものである。
ここで、当該代謝産物含量の変動挙動は、紋羽病菌の感染によって植物が受ける影響について代謝産物組成の変動を反映した量的結果である。従って、当該代謝産物含量の変動度合いは、感染応答による植物体側の代謝産物の内因的な組成変動を反映した量的結果であると認められる。即ち、当該代謝産物含量の変動挙動の度合は、診断対象植物体における紋羽病菌の感染度合と相関する度合であると推定される。従って、当該代謝産物含量の変動挙動の度合いは、紋羽病菌の感染度合や罹病度合いが進行した植物体である程、変動挙動が大きくなる傾向にあるものと推定される。
なお、当該代謝産物含量の変動挙動は、紋羽病感染時の二次的病徴である根の吸水制限によって誘導される現象ではなく、紫紋羽病菌の感染によって誘導される感染応答機構に基づく現象である。この点は、後述した実施例にて実験結果として示されている。
【００４１】
代謝産物
本発明に係る診断方法においては、診断対象植物の植物体における代謝産物のうち紋羽病の感染によって変動挙動を示す低分子化合物を指標化合物として採用することができる。本明細書において低分子化合物とは分子量６００以下のものを指す。特には５０〜６００、好ましくは７０〜５１０、より好ましくは８０〜２２０程度のものが好適である。更に好ましくは上記に加えて水およびアルコールに対して可溶性であり、常温で液体もしくは個体の特性を持つものが試料抽出及び分析等の点で好適である。
本発明における紋羽病感染により変動挙動を示す代謝産物としては、具体的には、粘液酸、カフェイン酸、プトレシン、４−アミノ酪酸、セリン、マレイン酸、及びこれらの誘導体であって同様の変動挙動を示す化合物、からなる群から選ばれた１以上のものを挙げることができる。即ち、本発明に係る診断方法ではこれらを指標化合物として採用することができる。
これらの化合物は、紋羽病の感染によって変動挙動を示す代謝産物であり、紋羽病菌に非感染の植物体に対して統計的な有意差を以て含有量に差異が生じる化合物である。即ち、実質的な差異検出が可能な植物体の内因性の代謝産物である。また、これらの代謝産物含量の変動は、紋羽病菌の感染進行が進んだ植物体であるほど変動度合が大きくなる傾向にある。
また、これらの代謝産物はいずれも分子量８８〜２１１程度の低分子有機化合物であり簡易測定法も公知である。また、標準物質を利用して定量においても標準物質を安価にて入手することが可能である。そのため、本発明に係る診断法は分析単価を低コストにて実行することが可能となる。更にいずれの化合物も水溶性を示す化合物であるため、試料からの分析において水溶性溶媒での抽出で容易に分析を行うことが可能である。また、標準物質自体が安全な物質であるため標準物質として利用した際のハンドリングが容易である。
【００４２】
ここで、「粘液酸」（Galactaric acid）は、２，３，４，５−テトラヒドロキシアジピン酸、ムチン酸、ガラクタル酸とも呼ばれる化合物で、ＣＡＳ番号は５２６−９９−８、分子量は２１０．１４である。Ｄ−ガラクトースの末端のアルデヒド基と第一アルコール基がカルボキシル基に酸化された化合物である。
また、「カフェイン酸」（Caffeic acid）は、３，４−ジヒドロキシケイ皮酸、カフェ酸とも呼ばれる化合物で、ＣＡＳ番号は３３１−３９−５、分子量は１８０．１６である。ケイ皮酸のパラ位及びメタ位がヒドロキシ化された構造を持つ芳香族カルボン酸でフェニルプロパノイドの１種である。
また、「プトレシン」（Putrescine）は１，４−ジアミノブタン、テトラメチレンジアミンとも呼ばれる化合物で、ＣＡＳ番号は１１０−６０−１、分子量は８８．１５である。アミン類の一種である。
また、「４−アミノ酪酸」（4-Aminobutyric Acid）は、γ−アミノ酪酸、ＧＡＢＡとも呼ばれる化合物で、ＣＡＳ番号は５６−１２−２、分子量は１０３．１２である。アミノ酸の一種である。
また、「セリン」（L-Serine）は、Ｌ−２−アミノ−３−ヒドロキシプロピオン酸とも呼ばれる化合物で、ＣＡＳ番号は５６−４５−１、分子量は１０５．０９である。アミノ酸の一種である。
また、「マレイン酸」（Maleic Acid）は、ｃｉｓ−２−ブテン二酸とも呼ばれる化合物で、ＣＡＳ番号は１１０−１６−７、分子量は１１６．０７である。鎖状不飽和ジカルボン酸の一種である。
本発明では、これらの化合物の誘導体であって同様の変動挙動を示す化合物についても指標代謝産物とすることができる。ここで、誘導体としては、上記代謝産物と同様の基本骨格を有する化合物であって、官能基の導入、酸化、還元、原子の置き換えなど基本骨格を大幅に変えない程度の改変を有する化合物を指す。また、これらの塩化合物等も誘導体に含まれる。
【００４３】
本発明における紋羽病感染により変動挙動を示す代謝産物としては、より好ましくは粘液酸、カフェイン酸、プトレシン、４−アミノ酪酸、セリン、及びマレイン酸からなる群から選ばれた１以上のものを挙げることができる。
本発明における紋羽病感染により変動挙動を示す代謝産物としては、更に好ましくは、紋羽病菌の感染による含量の変動挙動の度合が大きく差異検出が容易である粘液酸及び／又はプトレシンを指標化合物とすることが好適である。ここで、粘液酸は紋羽病菌に感染した植物体では非感染の植物体と比べて増加変動挙動を示す代謝産物である。また、プトレシンは紋羽病菌に感染した植物体では非感染の植物体と比べて減少変動挙動を示す代謝産物である。
【００４４】
［比較及び判定］
本発明に係る診断方法では、上記にて測定又は算出した値を指標として、当該指標値を対象植物からの対応値と比較することによって、診断対象植物における紋羽病の感染状態を判定することが可能となる。従って、本発明に係る診断方法としては、 i）陰性対照である紋羽病菌に非感染の植物及び／又は陽性対照である紋羽病菌に感染した植物における対応する値との比較を行い、ii）これらの値の間での実質的な差異の有無又は差異の度合いに基づいて紋羽病菌感染状態を判定することを含む方法であることが好適である。
【００４５】
対照植物
本明細書中「対照植物」とは、診断対象植物からの指標値と比較するための対応値の情報を得るための植物を指す。本明細書における対照植物としては、陰性対照植物と陽性対照植物を用いることが可能である。ここで「陰性対照植物」とは、紋羽病菌に感染していない状態の植物体を指す。また「陽性対照植物」とは、紋羽病菌に感染状態にある植物体を指す。陽性対照植物としては任意の感染進行段階にある植物を用いることが可能である。
【００４６】
本発明に係る診断方法において好適な態様としては、紋羽病感染による影響に由来する代謝組成の変化のみを精度よく検出できる態様にて行うことが望ましい。そのため、診断対象である植物体からの指標値と対照植物体からの対応値との比較において、紋羽病菌からの影響以外の他の要因に由来する代謝物組成の変化を可能な限り低減させ、代謝産物組成の背景を比較する試料間にて均一又は実質的に均一にすることが望ましい。
【００４７】
本発明に係る診断方法で用いる対照植物としては、遺伝的背景が同じもの又は実質的に同じものを用いることが望ましい。そのため、対照植物としては診断対象植物が属する種類の同一又は近縁な品種系統に属する植物を用いることが望ましい。特には、診断対象植物が属する種類の同一の品種系統に属する植物を用いることが最適である。
本発明においては、対照植物として診断対象と遺伝的背景が大きく異なる品種系統のものを用いた場合、ノイズが大きくなり正確な比較を行うことが困難となる傾向がある点で留意が必要となる。しかし、対照植物体が診断対象植物体とある程度異なる遺伝的背景のものであっても、実質的に同じ代謝変動挙動を示すと認められる近縁種又は同一種で異なる品種系統からの植物体部位からの値であれば比較判定を行うことは可能である。この点、本発明に係る診断方法においては異なる種類や品種系統どうし比較し差異を検出する態様を除外するものではない。
【００４８】
本発明に係る診断方法においては、対照植物から得られた対応値としては、判定及び診断精度の向上を考慮すると診断対象作物体と同じ時期に近隣の圃場等の生育環境で栽培した植物体から同時期に得た情報であることが最適である。
また、本発明に係る診断方法で用いる対照植物からの対応値としては、診断対象植物と同じ生育段階と認められる植物体部位から測定又は算出した値であることが最適ではあるが、実質的に同じ生育段階と認められる植物体部位からの値であれば比較判定を行うことは十分に可能である。即ち、本発明に係る診断方法においては、異なる生育段階どうしの値の比較での差異を検出する態様を除外するものではない。
ここで「実質的に同じ生育段階」とは、現実の栽培現場等にて実際に必要とされる差異の検出精度を考慮すると、同じ日時に採取した植物体を必ずしも意味するものではなく、例えば葉を試料とする場合であれば、同一の品種・生育ステージの試料を用いて、かつ気象や土壌などの栽培環境が似通っていれば許容される。
【００４９】
本発明に係る診断方法においては、感染状態を判定するための基準値を予め設定しておき、当該基準値と比較して感染状態を判定することも可能である。当該態様においては、診断対象の植物体から採取した試料を代謝産物含量の分析に供するのみで、その植物体と比較可能な対応するデータと比較して差異の検出及び感染判定を行うことが可能である。
当該態様における判定基準となる値としては、既に生育した植物体から得ていた代謝産物含量の情報を利用することが可能である。即ち、陰性対照である非感染植物で測定した含量値に基づいて非感染植物であれば示すべき値を設定することが可能である。当該態様においては、「陰性対照である非感染の植物における対応する値」として予め設定した判定基準値を採用することが可能である。
また、当該態様における判定基準となる値としては、陽性対照である感染した植物で測定した含量値に基づいて感染植物であれば示すべき値を設定することが可能である。当該態様においては、「陽性対照である感染した植物における対応する値」として予め設定した判定基準値を採用することが可能である。
また、当該態様における基準値としては、圃場等での代謝産物含量のデータ情報を蓄積して診断対象植物との比較用のデータベースや判定表等を作成しておくことで、栽培環境での対照植物を同時栽培することなく、より簡易に診断を行う実施態様が可能となる。
【００５０】
［統計解析］
本発明に係る診断方法では、上記代謝産物含量に基づく指標値について、 i）陰性対照である紋羽病菌に非感染の植物及び／又は陽性対照である紋羽病菌に感染した植物における対応する値との比較を行い、ii）これらの値の間での実質的な差異の有無又は差異の度合いに基づいて紋羽病菌感染状態を判定することが可能である。
ここで、本発明に係る診断方法では、上記代謝産物含量に基づく指標値について、単独成分に基づく値のみ用いて感染診断することが可能となる。また好ましくは、２以上の複数成分を用いて１つの指標値を算出して感染診断を行うことによって判定精度を高めることが可能となる。当該態様としては、例えば増加変動挙動を示す値と減少変動挙動を示す値との比を算出して、当該比の値を指標値とすることができる。例えば、増加変動する粘液酸含量値と減少変動するプトレシン含量値との比を算出した値を指標値として採用することが可能である。
【００５１】
本発明に係る診断においては、実質的な「差異の有無」が検出されるか否かを判定することによって、植物体の感染状態の定性的な診断が可能となる。ここで、実質的な差異の有無の判定は、統計解析を行って指標値間の実質的な差異の有無を判定することが望ましい。また、本発明に係る診断においては、指標値間の「差異の度合」を数値化された値として算出することも可能である。本発明では、当該値を算出することによって感染の進行状態を定量的に診断することが可能となる。
【００５２】
単変量解析
本発明に係る診断においては、実質的な差異の検出を単変量解析によって行う場合においては、統計解析を行って診断対象植物からの指標値と対照植物からの対応値との間での有意差の存在の有無を以て、指標値間の実質的な差異の有無を判定することが好適である。単変量解析を行う統計解析としては、例えば、標準誤差、標準偏差、ｔ検定、Ｘ２検定、ＡＮＯＶＡ検定、Ｍａｎｎ−Ｗｉｈｔｎｅｙ  Ｕ検定、尤度比検定、Ｗａｌｄ検定などを挙げることができる。
【００５３】
ここで、単変量解析によって差異を検出して感染状態を診断する手法としては、陰性対照である紋羽病菌に非感染の植物からの値との比較を含む態様にて行うことが可能である。当該態様においては、 i）診断対象植物における当該指標とする値を、陰性対照である紋羽病菌に非感染の植物における対応する値と比較して、ii）これらの値の間で実質的な差異が検出される場合には前記診断対象植物が紋羽病菌に感染していると判定することが可能となる。また、これらの間で実質的な差異が検出されない場合には前記診断対象植物が紋羽病菌に感染していないと判定することが可能となる。
また、ここで検出された指標値間の差異の度合は、紋羽病の感染度合と相関する値であるため、当該差異の度合が大きい程、診断対象植物における感染状態が重度であると判定することが可能である。また、差異の度合が小さい程、感染状態が軽度であると判定することが可能である。
【００５４】
また、陽性対照である紋羽病菌に感染した植物からの値との比較を行う態様を採用することも可能である。当該態様においては、 i）診断対象植物における当該指標とする値を、陽性対照である紋羽病菌に感染した植物における対応する値と比較して、ii）これらの値の間で実質的な差異が検出されない場合には前記診断対象植物が紋羽病菌に感染していると判定することが可能となる。当該態様においては、これらの値の間で実質的な差異が検出された場合には、指標値の測定や算出に用いた代謝産物の種類等を考慮して個別具体的に判断することが必要となる。
例えば、感染によって増加変動を示す指標値を採用した場合であれば、陽性対照の値より値が大きい場合には前記診断対象植物が紋羽病菌に感染していると判定することが可能となる。また、陽性対照の値より値が小さい場合には前記診断対象植物が紋羽病菌に感染していない又は感染状態が軽度であると判定することが可能となる。
また、感染によって減少変動を示す指標値を採用した場合であれば、陽性対照の値より値が小さい場合には前記診断対象植物が紋羽病菌に感染していると判定することが可能となる。また、陽性対照の値より値が大きい場合には前記診断対象植物が紋羽病菌に感染していない又は感染状態が軽度であると判定することが可能となる。
【００５５】
多変量解析
本発明に係る診断においては、多変量解析を含むようにして比較及び判定工程を行う態様であると更に好適である。具体的には、上記指標値を２以上用いて多変量解析を行うことによって、指標値間の差異の判定の精度を向上させることができ好適である。更に好ましくは２〜６指標値、特に好ましくは３〜６指標値、一層好ましくは４〜６指標値、より一層好ましくは５〜６指標値、特に一層好ましくは６指標値を用いて多変量解析を行うことが望ましい。
また、多変量解析に用いる指標値としては、粘液酸含量を含む２以上を選択することが好適である。また、プトレシン含量を含む２以上を選択することも好適である。特に好ましくは、粘液酸含量及びプトレシン含量を含む２以上を選択することが好適である。なお、ここで、粘液酸含量とプトレシン含量としては、これらの含量に基づいて算出した値を採用することも可能である。
本発明に係る診断方法においては、多変量解析として既知の手法を採用して行うことができる。多変量解析としては、例えば、重回帰分析、判別分析、ロジスティック回帰分析、数量化Ｉ類分析、数量化ＩＩ類分析、主成分分析、因子分析、クラスター分析、コレスポンデンス分析、数量化ＩＩＩ類分析、多次元尺度構成法、決定木分析、ニューラルネットワーク分析等を挙げることができる。
【００５６】
ここで、多変量解析を行う態様においては、診断対象植物の試料を複数用いて陰性対照となる非感染植物からの対応値との関係を解析することによって、感染の有無に応じたグルーピングによる判別解析を行うことが可能となり好適である。更には、感染の進行度合の異なる植物体が含まれている場合には、それぞれの感染の進行度合に応じてグルーピングする多群解析を行うことも可能となり好適である。また、当該分析においては、陰性対照となる非感染植物と伴に陽性対照となる紫紋羽病に感染した植物からの対応値を加えることによって、更に精度の高い判定及び診断を行うことが可能となり好適である。
本発明において当該解析な可能な多変量解析法としては、例えばクラスター分析等を用いることが可能である。クラスター分析では階層クラスタリング樹形として判定結果を得ることができるため、感染の有無及び感染進行度合を更に精度良く判定することが可能となり好適である。
【００５７】
２．紋羽病菌の感染診断用キット
本発明においては、上記段落に記載した原理を利用した紋羽病に対する診断方法を行うために使用するキットを提供することが可能となる。
ここで、本発明に係る感染診断用キットとしては、上記段落１．に記載した診断原理を利用するための構成部材を含んでなるキットであって、紋羽病菌の感染によって変動挙動を示す低分子化合物の定量を可能とする構成物品に含む態様のキットであれば、如何なる形態のキットを採用することも可能である。
【００５８】
本発明に係る感染診断用キットとして好適には、上記段落１．に記載した紋羽病菌の感染によって変動挙動を示す低分子代謝産物の定量を可能とする試薬を構成物品として含んでなるキットであることが好適である。
具体的には、粘液酸、カフェイン酸、プトレシン、４−アミノ酪酸、セリン、マレイン酸、又はこれらの誘導体であって同様の変動挙動を示す化合物の定量を可能とする試薬を構成物品として含んでなる態様が好適である。より好ましくは、粘液酸、カフェイン酸、プトレシン、４−アミノ酪酸、セリン、又はマレイン酸の定量を可能とする試薬を構成物品として含んでなる態様が好適である。更に好ましくは、粘液酸又はプトレシンの定量を可能とする試薬を構成物品として含んでなる態様が好適である。
【００５９】
本発明に係る感染診断用キットの構成物品としては、上記した低分子代謝産物の定量可能とする試薬であれば如何なるものでも採用可能である。
i）例えば、本発明に係る感染診断用キットの態様例としては、クロマトグラフィー分析等での定量分析を前提としたキットの態様を採用して、上記した低分子代謝産物を標準化合物として含んでなる診断キットを挙げることができる。また、当該診断キットの構成物品としては、抽出や分析を補助する試薬や部材を併せて構成物品とすることが可能である。また、対照植物からの試料や抽出物や、クロマトグラフィー分析等の判定基準値となる対照植物からの数値データ等を含んでなるキットとすることも可能である。
【００６０】
ii）本発明に係る感染診断用キットの別の態様例としては、簡易測定法の原理を利用した定量分析を前提としたキットの態様を採用することができる。当該態様においては、上記した低分子代謝産物の定量を、酵素反応や吸光度を利用した比色定量法等の原理によって簡易定量を実現可能とする試薬であれば如何なる試薬を採用することが可能である。上記した低分子代謝産物の簡易測定法としては、公知技術及び新規技術の如何なる方法を使用することが可能である。
ここで、上記した低分子代謝産物の簡易測定方法として利用可能な方法としては特に制限はないが、一例としては次の公知技術を挙げることができる。
例えば粘液酸を定量可能とする方法としては、Mojzita et al. (2010) Appl. Env. Microbiol. 76: 169-175に記載の方法を挙げることができる。カフェイン酸を定量可能とする方法としては、H. Wang et al., (2004) Food Chemistry 87: 307-311に記載の方法を挙げることができる。プトレシンを定量可能とする方法としては、Redmond et al. (1979) J. Chromatography, 170: 479-481に記載の方法を挙げることができる。４−アミノ酪酸及びセリンを定量可能とする方法としては、Syu et al., (2008) J. Agric. Food Chem. 56: 7637-7643に記載の方法を挙げることができる。マレイン酸を定量可能とする方法としては、Andersson et al., (1983) Z. Lebensm Unters Forsch. 176: 440-443に記載の方法を挙げることができる。また、上記低分子代謝産物の誘導体であって同様の変動挙動を示す化合物を定量可能とする方法としては、当該誘導体を上記化合物に変換する公知の反応等の前処理を行うことによって、上記した定量方法を実行することが可能である。
【００６１】
また、当該感染診断用キットの構成物品としては、当該簡易測定法の原理を使用した態様においても、抽出や分析等を補助する試薬や部材を構成物品として含むキット態様とすることが可能である。また、対照植物からの試料や抽出物や比較及び判定における判定基準値となる対照植物からの数値データ等を含んでなるキットとすることも可能である。
【００６２】
３．本発明に係る感染診断技術の利点
本発明においては、上記した感染状態の判定原理を利用して診断対象植物における紋羽病菌感染状態の診断結果とすることが可能となる。これにより本発明では上記判定原理を利用することによって、植物における紋羽病菌の感染診断方法として実施することが可能となる。
【００６３】
本発明においては、紋羽病の感染の有無を定性的に判定した場合には「感染の有無」を判定した診断結果として提供することが可能となる。また、本発明において感染進行度合を指標値又は度合い等で表して定量的な判定を行った場合には、「感染の進行度合」を判定した診断結果として提供することが可能となる。
更に、本発明において定量的な感染状態の診断を行った場合には、紋羽病の罹病状態を指標値又は度合い等で可視化した値となるため、植物における紋羽病罹病診断方法として診断結果を提供することも可能となる。
【００６４】
本発明に係る診断方法は、従来技術である紋羽病菌由来の産生物質等を検出原理とする方法ではなく、紋羽病菌の感染によって植物側が起こす応答代謝変動を指標として検出することを原理とする方法である。そのため、本発明に係る診断方法は、発現病徴及び感染機構が共通する紋羽病菌の感染診断において広く適用可能な手法である。この点、本発明に係る診断方法は従来技術である白紋羽病菌の産生物質であるサイトカラシンＥを指標物質とする診断方法（特許第4907325号公報）とは異なり、紫紋羽病菌の感染診断に対して好適に適用可能な方法となる。
【００６５】
また、本発明に係る診断方法は、従来技術では困難であった紋羽病菌感染の早期診断を可能とする方法である。本発明に係る診断原理は、根及び皮層組織に存在する紋羽病菌の量を反映した反応度合いであると推定され、当該代謝産物含量の変動挙動は地上部での罹病病徴発現の有無に関わらずに検出される現象である。従って、本発明に係る感染診断方法では、地上部の外観に病斑や病徴が発現していない一見健全に見える植物体についても、地下部における紋羽病菌の感染状態の有無や感染進行程度を評価することが可能となる。また、当該検出原理として季節性等とも関係なく適用可能な方法である。
この点、本発明に係る診断方法は、施用時期の制限を受けずに早期診断を実現可能とする特徴を備えた発明である。当該特徴は紋羽病防除技術として活用する上で特に重要な特徴となる。
【００６６】
また、本発明に係る診断方法は、上記分析等の主要操作を利用する方法であり、植物体の地上部を分析試料に供するのみで実施可能な方法である。従って、本発明に係る診断方法は、地下部の掘り起し等の重労働の作業を行うことなく植物体の感染診断を可能とする方法である。また、本発明に係る診断方法においては、指標代謝産物が水溶性を示す低分子化合物であるため抽出操作が容易であり、更に標準物質も安価で簡易測定法も存在する。これらの点が示すように、本発明に係る診断方法は簡易な手法にて分析単価を低く抑えた感染診断技術を提供することが可能である。
【００６７】
以上に示したように本発明に係る紋羽病菌感染診断方法及びこれを利用した一連の技術は、植物栽培を伴う事業に甚大な被害を与える難防除性の紋羽病に対して、簡易な手法にて早期診断が可能であり且つ紫紋羽病を含む紋羽病診断に幅広く適用可能な技術として有効に利用されることが期待される。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。
【００６９】
［実施例１］『紋羽病菌接種による栽培試験』
紋羽病菌を人為的に接種した場合において、紋羽病の感染状態及び罹病病徴の発現状態を確認した。
【００７０】
（１）「地下部における病徴発現状態の観察」
オートクレーブしたリンゴ切枝上（長さ２．５ｃｍ×直径６〜８ｍｍ）で紫紋羽病菌（Helicobasidium mompa）に属する菌株を培養して菌叢を生育させ接種源とした。冷蔵保存していたリンゴマルバ苗の根部をプラントボックスに入るように切り詰め、主幹部の地下部に１本あたり５個の上記接種源を巻き付けてから植え付けた。その後、温室で通常管理にて栽培をした。接種１．５ヶ月後に地上部の状態を観察した。地上部に凋れや枯死症状が見られた個体は除き（図１Ｂ〜Ｄ）、地上部に凋れ症状が現れておらず、無接種樹と同様に地上部が健全に見える苗木をサンプルとして供試した（図１Ａ）。
【００７１】
地上部の観察の後、根を掘り起こして冷蔵して観察時まで保存した。観察は掘りおこし後８日以内に行った。根部は観察前に水洗し、感染座の形成状況により根部の被害程度を判定するため、感染座が形成された根の割合と場所に基づいて感染度合を表す値（ＩＦ値：infection cushion index）を算出した。根のうち感染座が形成された割合により１〜１０点を（例えば、１割の根に感染座が形成されていれば１点、１０割の根に形成された場合１０点）、さらに主幹地下部に感染座が形成された場合に５点を追加して判定した。紫紋羽病菌においては、根表面に菌糸が這うだけでは組織内に菌糸が侵入しないために感染とは見なせず、感染座の形成が感染成立の目安となる。根部の観察状態を撮影した写真像図を図２に示した。また、菌糸束被膜部を実体顕微鏡での観察した結果を図３に示した。図３において赤紫色の小粒点が感染座である。
その結果、地上部が一見健全に見える苗木（図１Ａの状態）であっても、地下部である根については感染が進行して様々な感染度合の個体（ＩＦ値：１〜１５）が存在することが明らかになった。
【００７２】
［実施例２］『低分子代謝産物マーカーの同定』
紋羽病菌の接種後に変動挙動を示す低分子代謝産物に着目し、紋羽病菌の感染との相関性を示す指標マーカーの探索を行った。
【００７３】
（１）「栽培及びＧＣ／ＭＳ分析」
温室で栽培中のリンゴマルバ苗に、実施例１に記載の方法と同様にして紋羽病菌株を接種して栽培を継続し（接種区）、１．５ヶ月後に枝の先端で展開している葉３〜４枚から葉身を採取した。ここで供試したサンプルは全て地上部に凋れ症状が現れる前の健全に見える苗木であった（図１Ａ）。また、葉の採取後には地下部を掘り起こし感染の証拠である根における感染座形成を確認した。
採取した葉身は−３０℃にて凍結保存後、ボールミルにより微粉砕した。葉中の低分子成分をメタノール：クロロホルム：水（３：１：１）溶液で抽出した後、抽出液に含まれる水と等量の水を添加し上層を減圧条件下で乾燥させた。得られた減圧乾固抽出物にメトキシルアミン−ピリジン溶液を添加して３７℃で９０分間反応させ、ＭＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド、ＣＡＳ．ＮＯ ２４５８９−７８−４）を添加して更に３７℃で３０分間反応させた。得られた溶液を試料に供してＧＣ／ＭＳ分析を行った。ＧＣ／ＭＳの分析条件は低分子化合物の検出に適した条件となるように表１に示す条件にて行った。
【００７４】
対照として、紫紋羽病菌を接種しないことを除いては上記と同様にしてリンゴマルバ苗の栽培を行って（非接種区：対照区）、葉抽出物に対するＧＣ／ＭＳ分析を行った。分析等の基本操作は上記と同様にして行った。
【００７５】
【表１】
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【００７６】
（２）「低分子代謝産物の同定」
対照と比較した変動挙動を示すｍ／ｚが示す化合物を同定するため、保持時間の内部標準試料であるアルカン標準物質をＧＣ／ＭＳ分析に供し、各アルカンピークの出現時間をもとに保持指標（ＲＩ）を算出した。上記（１）で分析した結果について標準化したピーク面積値を算出し、接種区と非接種区（対照区）との比較を行った。その結果、低分子代謝産物含量を示すｍ／ｚのピークエリア値のうち、紫紋羽病菌を接種しない非接種区（対照区）と比べて紫紋羽病菌を接種した接種区において特徴的な変動挙動を示すｍ／ｚピークが６つ見出された。
得られたピークについて、保持指標値を用いてｗｅｂにて公開されているライブラリー（http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/）を基にＭＳスペクトル及びＲＩ値が一致する化合物を同定した。同定の結果、紫紋羽病菌を接種により葉中含有量が変動挙動を示す低分子代謝産物は、粘液酸、カフェイン酸、プトレシン、４−アミノ酪酸、セリン、及びマレイン酸であることが明らかになった。
【００７７】
（３）「統計解析」
上記（２）で同定した化合物含量の変動挙動の有意性を検証するため統計解析を行った。詳しくは、上記６化合物のピークエリア値を説明変数とし感染の有無を目的変数として、ロジスティック曲線に当て嵌めたＸ２検定を行った。結果を表２に示した。ここで、表２における「ｍ／ｚ」は各代謝産物に対応する質量数、「Ｘ２」は当該検定にて算出したＸ２値、「ｐ」はＸ２値から算出された確率を示す。
【００７８】
検定の結果、紫紋羽病菌を接種したリンゴマルバ苗（接種区）における粘液酸、カフェイン酸、プトレシン、４−アミノ酪酸、セリン、及びマレイン酸を示す葉中における各代謝産物含量値は、紫紋羽病菌を接種しないリンゴマルバ苗（非接種区：対照）での値に対して、５％有意水準にて変動することが示された。
この結果から、葉中における粘液酸、カフェイン酸、プトレシン、４−アミノ酪酸、セリン、又はマレイン酸の含有量は、紋羽病菌の感染の有無と相関性を示す指標マーカーとなることが統計的有意水準を以て示された。また、上記代謝産物の変動挙動は、地下部を掘り起こすことなく葉を採取するのみで紋羽病菌の感染検出を可能とする指標となることが示された。
【００７９】
【表２】
0006755101.tif 000003
【００８０】
［実施例３］『多変量解析』
上記に実施例にて同定した低分子代謝産物含量について、多変量解析であるクラスター解析による紋羽病菌の感染判定を行った。
【００８１】
（１）「栽培及びＧＣ／ＭＳ分析」
温室で栽培中のリンゴマルバ苗に、表３に示す紫紋羽病菌株（菌株Ａ〜Ｅ）をそれぞれ接種して栽培を継続し（接種区）、１．５ヶ月後に枝の先端で展開している葉３〜４枚から葉身を採取した。栽培等の手順は実施例１に記載の方法と同様にして行った。植物の地上部の罹病発現状態は地上部の病徴が現れる前の苗木であった（図１Ａ）。また、葉の採取後には地下部を掘り起こし感染の証拠である根における感染座形成を確認した。
採取した葉身を試料に供してＧＣ／ＭＳ分析を行い、葉中の粘液酸、カフェイン酸、プトレシン、４−アミノ酪酸、セリン、及びマレイン酸含量を示すピークエリア値を算出した。基本的な実験操作等は実施例２に記載の方法と同様にして行った。
対照として、紫紋羽病菌を接種しないことを除いては上記と同様にしてリンゴマルバ苗の栽培を行って葉中の低分子代謝産物含量を示すピークエリア値を算出した。
【００８２】
（２）「クラスター解析」
上記（１）にて分析を行った計２４サンプルから算出した６代謝産物含量を示すピーク面積値について、各値を内部標準物質（リビトール）のピークエリア値で標準化して階層的クラスタリング手法により統計解析を行った。階層的クラスタリング手法としてはソフトウェアＪＭＰ１１．０（SAS Institute, Cary, NC）を利用してウォード法により行った。クラスター樹形の結果図を図４に示した。正常判定率等を算出した結果を表３に示した。
【００８３】
クラスター解析の結果、紫紋羽病菌接種した個体と非接種区の個体とは分離してクレード形成された階層クラスター樹形が得られることが示された。接種区と非接種区（対照）とがクレード分離した正常判定率は８３．３％であった。
更に、本実施例においては紫紋羽病菌の接種区に供した試料にはＩＦ値が１〜１５の範囲にある感染度合いの段階が異なる個体の試料が含まれていたが、ＩＦ値が５を超える個体（ＩＦ＞５）からの試料は更に深い階層でクレード化する傾向が示され、偽陰性個体（感染が見過ごされた個体）は皆無（０％）であった。なお、陰性クレードとして階層化されたクラスターにおいて偽陰性を示す２個体が含まれていたが、これらはいずれも感染座数が少ない個体であった。
【００８４】
以上の結果から、有意な代謝変動を示す代謝産物含量の値を用いて多変量解析であるクラスター解析を行うことによって、紋羽病感染の有無の判定を簡易に精度良く行うことが可能であることが示された。また、感染座数が多く感染段階が進行したのものほど精度の高い判定が可能であることが示された。更に、感染座数が少なく感染段階が初期の個体であっても、地上部の葉のみを試料検体とした簡易診断法としては十分な精度での感染判定が可能であることが示された。
【００８５】
また、本実施例においては紫紋羽病菌の接種区として５種類の異なる菌株を接種試験に用いたが、これらの菌株は菌株ごとに１つにクレード化して階層形成する傾向は認められず、樹形全体に分散したクラスター樹形構造となることが示された。この結果から、本実施例に係る代謝産物含量の変動挙動は菌株特異的に誘導される応答現象ではなく、紋羽病菌の感染及び罹病において共通して誘導される感染応答機構に基づく現象であることが示唆された。
【００８６】
【表３】
0006755101.tif 000004
【００８７】
［実施例４］『吸水制限処理による確認試験』
上記実施例で示された紋羽病感染による低分子代謝産物含量の応答変動が、紋羽病感染時に生じる吸水阻害に起因する現象でないことを検証した。
【００８８】
（１）「各処理及び栽培」
温室で栽培中のリンゴマルバ苗に、吸水制限処理として根切り処理を行った試験区（吸水制限区：比較試験）を新たに設けて、吸水制限処理をせずに紫紋羽病菌株を接種した試験区（接種区）と吸水制限処理をせずに紫紋羽病菌株を接種しない試験区（無処理区：対照）との比較試験を行った。接種区で用いた紫紋羽病菌株としては菌株Ａ及び菌株Ｂを用いた。各処理から２ヶ月後に枝の先端で展開している葉３〜４枚から葉身を採取した。葉の採取後にリンゴマルバ苗の地下部を掘り起こし感染座の有無を確認した。
【００８９】
（２）「ＧＣ／ＭＳ分析及びクラスター解析」
採取した葉身を試料に供してＧＣ／ＭＳ分析を行い、葉中の粘液酸、カフェイン酸、プトレシン、４−アミノ酪酸、セリン、及びマレイン酸含量を示すピークエリア値を算出した。基本的な実験操作等は実施例２に記載の方法と同様にして行った。
分析を行った計７２サンプルから算出した６代謝産物含量を示すピーク面積値について、各値を内部標準シグナルのピークエリア値で標準化して階層的クラスタリング手法により統計解析を行った。階層的クラスタリング手法は実施例３に記載の方法と同様にして行った。クラスター樹形の結果図を図５に示した。正常判定率等を算出した結果を表４に示した。
【００９０】
クラスター解析の結果、紫紋羽病菌を接種した個体は、吸水制限処理区及び無処理区の個体とは分離してクレード形成された階層クラスター樹形が得られることが示された。接種区がクレード分離した正常判定率は９５．８％と高い精度を示した。また、本実施例において設けた吸水制限処理区の個体は、クレード化して階層形成する傾向を示さず、無処理区と混ざって分散したクラスター樹形構造となることが示された。また、接種区個体のうち陰性判定クレードに混入して偽陰性を示したのは１個体（２．１％）であった。
【００９１】
以上の結果から、本実施例に係る代謝産物含量の変動挙動は、紋羽病感染時の二次的病徴である根の吸水制限によって誘導される現象ではなく、紋羽病菌の感染によって誘導される感染応答機構に基づく現象であることが示された。また、本実施例では上記実施例３よりも全体の正常判定率が向上して判定精度が向上しているが、分析及び解析に供した個体数が増加したことで代謝産物組成の特徴が誤判定なく検出されやすくなったためと考えられた。
なお、本実施例では菌接種区の菌株Ａと菌株Ｂを接種した個体群がそれぞれクレード化して階層クラスター構造を形成したが、本実施例では菌株Ａに対しての代謝産物がより大きく変動したことなど、菌株に対する応答性の違いが検出された結果と推測された。
【００９２】
【表４】
0006755101.tif 000005
【００９３】
［実施例５］『単一成分を指標とした感染判定』
上記に実施例にて同定した低分子代謝産物の１つのみの含有量を指標とした場合において、紋羽病感染の判定が可能かを検証した。
【００９４】
（１）「単一成分比較」
上記同定した低分子代謝産物のうち変動幅が特に大きい粘液酸とプトレシンに着目して、葉中含有量の比較を行った。比較分析に供した低分子代謝産物含有量は、実施例４で測定した菌株ＡのＧＣ／ＭＳ分析結果を用いて代謝産物のピークエリア値を内部標準シグナルのピークエリア値で標準化した。当該値を用いて無処理区（対照）を１とした相対含量値を算出した。粘液酸含量の比較結果を図６に示した。またプトレシン含量の比較結果を図７に示した。
【００９５】
その結果、紫紋羽病菌を接種した処理区では、紫紋羽病菌を接種しない処理区（無処理区、吸水制限区）と比べて、葉中の粘液酸含量が増加することが示された（図６）。粘液酸の増加変動挙動は、接種区に供した個体の最小値が無処理区に供した個体の最大値より大きい値を示していた。
また、紫紋羽病菌を接種した処理区では、紫紋羽病菌を接種しない処理区（無処理区、吸水制限区）と比べて、葉中のプトレシン含量が減少することが示された（図７）。菌接種によるプトレシン含量減少変動挙動は、接種区に供した個体の最大値が無処理区に供した個体の最小値より小さい値を示していた。
【００９６】
以上の結果から、紋羽病菌への感染変動挙動を示す低分子化合物含量の単一成分を指標とした場合であっても、更に簡易測定法によって紋羽病菌の感染判定が可能であることが示された。特に粘液酸とプトレシンを指標とすることによって明確な紋羽病菌の感染判定が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明は、果樹栽培、農作物生産、園芸植物栽培、緑地及び路地用植物栽培、及び花卉生産等の植物栽培分野において広く利用されることが期待される。特に本発明は、紋羽病の被害が甚大な果樹栽培の生産現場において有効に利用されることが期待される。
【符号の説明】
【００９８】
１．正常葉
２．黄化葉、萎凋葉
３．感染座形成根
４．感染座
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0006755101.tif 000010
【図６】
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【図７】
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