(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Lactococcus lactis subsp.lactis JCM5805である乳酸菌株生菌体又は死菌体を有効成分として含む、ワクチンである抗原と併用される、該抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖及び該抗原に特異的な抗体産生の増強用組成物。
【請求項２】
ワクチンである抗原を投与する被験体に、事前に経口摂取させ、該抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖及び該抗原に特異的な抗体の産生を増強する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
抗原が感染症の原因となる細菌、ウイルス若しくはリケッチアに特異的な抗原、又はがん特異的抗原である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
７〜20日間、１日１〜３回経口摂取させる請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物、及び抗原を含む、該抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖及び該抗原に特異的な抗体の産生を増強するためのキット。
【請求項６】
感染症の予防又は治療に用いられる、請求項５記載のキット。
【請求項７】
がんの予防又は治療に用いられる、請求項５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、事前に経口摂取することで、例えば皮下注射など別経路で投与した抗原に対する特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）及び特異的な抗体の産生を増強させる乳酸菌、又は乳酸菌含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザなど毎年多くのウイルスを原因とする感染症が流行しており、その予防及び重症化を防ぐ手段として弱毒化したウイルスやウイルス由来断片などの抗原を生体内に投与することで抗原特異的な免疫反応を惹起させるワクチンが開発されてきた。また、近年では予防の観点からがん抗原や認知症抗原を含むワクチンも開発されている。しかし、このようなワクチンに実効性を持たせるためには、抗原単独の投与では効果が十分に発揮されることが難しく、アジュバントと呼ばれる抗原性を増強させる物質を同時に投与することが必要とされる。一方で、アジュバントについては、長年その副作用の問題から安全性が不安視されており、世界中で安全かつ高効率なアジュバント開発競争が行われている。これまでに免疫賦活作用を有する乳酸菌が数多く知られており、安全性上の懸念がほとんどないことから多くの飲食物に応用されている。その中には、抗原に対する特異的な抗体量を増加させる乳酸菌としてLactobacillus plantarum Strain AYA（特許文献１を参照）、Lactobacillus pentosus ONRIC b0240（特許文献２を参照）、Lactobacillus balgaricus OLL1073R-1（非特許文献１を参照）などが知られている。現在世界で流通しているワクチンの期待効果には２つがあり、ひとつはB細胞を介した抗原特異的な抗体の誘導であり、もうひとつは抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の誘導である。前者は生体に侵入した感染源・抗原の除去、後者は感染細胞・抗原発現細胞の生体からの除去を担っているため、両者が協調して作用することが重要である。しかしながら、経口摂取によってウイルス感染防御に最重要とされる抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）と抗原特異的な抗体量の二者を同時に増強させるといった乳酸菌に関する報告はない。以上のことから、経口摂取によって有効性と安全性を兼ね備えた抗原性を増強させる物質及び方法が必要とされてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開2010-47485号公報
【特許文献２】特開2010-222329号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】日本食品免疫学会2013年度大会要旨集、「1073R-1乳酸菌で発酵したヨーグルトの摂取がインフルエンザ特異的抗体価に与える影響」、p.30、ポスター番号P-14
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、乳酸菌又は乳酸菌の培養物若しくは処理物又はそれらを含有する組成物の経口摂取による、皮下注射などの別経路で投与した抗原に対する免疫反応を増強させる効果を有する、組成物及び飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、特定の乳酸菌株がプラズマサイトイド樹状細胞のインターフェロン産生を誘導することを見出していた（国際公開第2012/091081号）。本発明者はさらにそれらの乳酸菌の免疫活性促進効果について検討を行った。
【０００７】
その結果、乳酸菌の経口摂取が、別経路で投与した抗原に対する免疫反応、具体的には抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）及び抗原特異的な抗体の産生を増加させることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖及び抗体の産生を増強させる、Lactococcus lactis subsp.lactisである乳酸菌株又はその培養物若しくは処理物を含む、細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖及び抗体の産生を増強するための経口摂取用組成物。
[２]  Lactococcus lactis subsp.lactisである乳酸菌株がLactococcus lactis JCM5805である、[１]の経口摂取用組成物。
[３]  医薬組成物である、[１]又は[２]の経口摂取用組成物。
[４]  飲食品である、[１]又は[２]の経口摂取用組成物。
[５]  ワクチンアジュバントである、[１]〜[４]のいずれかの経口摂取用組成物。
[６]  細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖及び抗体の産生を増強させる、Lactococcus lactis subsp.lactisである乳酸菌株又はその培養物若しくは処理物を含む、ワクチンである抗原と併用される、該抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖及び該抗原に特異的な抗体の産生を増強するための、[１]〜[５]のいずれかの経口摂取用組成物。
[７]  ワクチンである抗原を投与する被験体に、事前に経口摂取させ、該抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖及び該抗原に特異的な抗体の産生を増強する、[６]の経口摂取用組成物。
[８]  抗原が感染症の原因となる細菌、ウイルス若しくはリケッチアに特異的な抗原、又はがん特異的抗原である、[６]又は[７]の経口摂取用組成物。
[９]  ７〜20日間、１日１〜３回経口摂取させる[１]〜[８]のいずれかの経口摂取用組成物。
[１０]  [１]〜[９]のいずれかの経口摂取用組成物、及び抗原を含む、該抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖及び該抗原に特異的な抗体の産生を増強するためのキット。
[１１]  感染症の予防又は治療に用いられる、[１０]のキット。
[１２]  がんの予防又は治療に用いられる、[１０]のキット。
【発明の効果】
【０００９】
特定の乳酸菌株又は該乳酸菌株の培養物若しくは処理物を含む組成物を被験体に経口摂取させ、その後抗原を該被験体に投与することで、被験体において抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）及び抗原特異的な抗体の産生を増加させる効果を持つ。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】マウスへの抗原投与スケジュールを示す図である。
【図２】Lactococcus lactis JCM5805株を抗原投与前に経口摂取させた場合の、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の割合の増加を示す図である。
【図３】Lactococcus lactis JCM5805株を抗原投与前に経口摂取させた場合の、抗原特異的抗体量の増加を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明は、ヒトを含む動物の抗原に対する特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(ＣＴＬ：cytotoxic T lymphocyte）（キラーＴ細胞とも呼ぶ)及び抗体産生を増強させる方法であり、特定の乳酸菌株又は乳酸菌の培養物若しくは処理物を含む組成物を経口摂取させることを含む。該特定の乳酸菌株は、経口摂取により、抗原に対する特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）及び抗体産生を増強させる乳酸菌株である。
【００１３】
抗原に対する特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）及び抗体産生を増強させる特定の乳酸菌株は、球菌であるLactococcus lactis subsp.lactis（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス）であり、例えば、Lactococcus lactis subsp.lactis JCM5805、Lactococcus lactis subsp.lactis JCM20101が含まれる。該乳酸菌株は、理化学研究所  バイオリソースセンター(日本国  茨城県つくば市高野台３丁目１番地の１）American type culture collection （米国）から入手することができる。本発明の特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）及び抗体産生を増強させる方法においては、上記乳酸菌株と同等の菌株を用いることができる。ここで、同等の菌株とは、上記の菌株から由来している菌株又は上記の菌株が由来する菌株若しくはその菌株の子孫菌株をいう。同等の菌株は他の菌株保存機関に保存されている場合もある。
【００１４】
上記の乳酸菌は、胃液や腸液に対する耐性が高く、例えば、強い酸耐性を有しており、生存したまま腸管に到達し得る乳酸菌である。上記のLactococcus lactis JCM5805は経口摂取した場合にも、生体に対して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）及び抗体産生を増強させる作用を発揮し得る。
【００１５】
本発明において、乳酸菌の培養物とは、生菌体、死菌体、生菌体又は死菌体の破砕物、生菌体又は死菌体の凍結乾燥物、該凍結乾燥物の破砕物、培養液、培養液抽出物等をいい、乳酸菌の一部や乳酸菌の処理物も含む。乳酸菌の処理物には、例えば乳酸菌を酵素処理、熱処理等によって処理したもの、あるいは該処理したものをエタノール沈殿させ回収したものが含まれる。
【００１６】
本発明は、上記乳酸菌株又は乳酸菌の培養物若しくは処理物を含む、ヒトを含む動物の抗原に対する特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）及び抗体産生を増強させるための組成物も包含する。該組成物は医薬品や飲食品を含む。
【００１７】
本発明の乳酸菌株又は乳酸菌の培養物若しくは処理物を含む組成物を被験体に事前に経口摂取させた後、該被験体に感染症の原因となる微生物に特異的な抗原やがん特異的抗原である抗原をワクチンとして投与する。好ましくは抗原投与後も前記組成物を一定期間経口摂取させる。この結果、投与した抗原に対して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）が増殖し、かつ抗原に特異的な抗体産生が上昇し、投与した抗原に対する免疫防御が成立する。すなわち、本発明の乳酸菌株又は乳酸菌の培養物若しくは処理物を含む組成物は、ワクチン療法と組合せて用いることができる。また、本発明の乳酸菌株又は乳酸菌の培養物若しくは処理物を含む組成物は、特定の抗原に対する免疫防御を成立させるためのワクチンのアジュバントして用いることができる。前記乳酸菌株又は乳酸菌の培養物若しくは処理物を含む組成物は、ワクチンとして抗原を投与する予定の被験体にあらかじめ経口摂取される。
【００１８】
乳酸菌又は乳酸菌の培養物若しくは処理物を含む組成物の、抗原投与前の経口摂取の期間及び頻度は限定されないが、２〜30日間、好ましくは７〜20日間、さらに好ましくは10〜16日間である。摂取の頻度は１日１〜３回、毎日あるいは２〜３日に１回である。
【００１９】
経口摂取量は、投与する患者の年齢、体重、性別、疾患の相違、症状の程度により適宜決定することができ、１日１回又は数回に分けて投与すればよく、１回乳酸菌数にして1×109〜1×1012細胞に相当する量の乳酸菌又は乳酸菌の培養物若しくは処理物を含む組成物を経口摂取すればよい。あるいは、乳酸菌体の重量換算で１回1〜1000mgを経口摂取すればよい。
【００２０】
該組成物の形態は特に限定されず、例えば、粉末、顆粒、錠剤、シロップ、懸濁剤などが挙げられる。該組成物は、経口で投与される。該組成物は、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、着色剤等を含んでいても良い。賦形剤としてはブドウ糖、乳糖、コーンスターチ、ソルビット等が、崩壊剤としてはデンプン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン末、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリン等が、結合剤としてはジメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等が、滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油等がそれぞれ挙げられる。
【００２１】
また、乳酸菌又は乳酸菌の培養物若しくは処理物を含む組成物は、該組成物を含む飲食品であってもよい。該飲食品をヒトを含む動物の抗原に対する特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）及び抗体産生を増強させるための飲食品として用いることができる。対象となる飲食品として、乳・乳製品；飲料；調味料；酒類；農産・林産加工食品；菓子・パン類；穀粉・麺類；水産加工品；畜産加工品；油脂・油脂加工品；調理冷凍食品；レトルト食品；インスタント食品；食品素材などが挙げられる。この中でも、ヨーグルト、チーズ等の発酵乳製品や乳酸菌飲料に用いることができる。発酵飲食品として用いる場合、乳酸菌を発酵飲食品に死菌として所要量添加するほか、乳酸菌スターターとして用いて発酵飲食品を製造することもできる。
【００２２】
本発明の飲食品は、健康飲食品、特定保健用飲食品、栄養機能飲食品、健康補助飲食品等を含む。ここで、特定保健用飲食品とは、食生活において特定の保健の目的で摂取をし、その摂取により当該保健の目的が期待できる旨の表示をする飲食品をいう。これらの飲食品には、例えば、体の免疫機能を増強する、体の免疫機能を賦活する、風邪をひきにくくする、インフルエンザウイルス、ノロウイルスあるいはロタウイルス等のウイルスに感染しにくくする、発がん予防に効果を有する等の表示が付されていてもよい。
【００２３】
ワクチンとして投与する抗原としては、感染症の原因となる微生物である、ウイルス、細菌、リケッチア等の特異的抗原が挙げられる。感染症の原因となるウイルス、細菌、リケッチアとして、インフルエンザウイルス、肺炎双球菌、狂犬病ウイルス、コレラ菌、ジフテリア菌、百日咳菌、破傷風菌、ポリオウイルス、日本脳炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、炭疽菌、髄膜炎菌、チフス菌、ダニ媒介脳炎ウイルス等が挙げられる。
【００２４】
上記抗原は、生ワクチンとして投与しても、不活化ワクチンとして投与してもよい。また、ウイルス、細菌、リケッチア等の一部を投与してもよく、例えば、毒素（トキソイド）等が挙げられる。抗原の分子量が小さい抗原か、又はタンパク質を含まない抗原であるハプテンである場合、他のタンパク質と融合させて投与してもよい。また、複数の抗原を混合ワクチンとして投与してもよい。
【００２５】
上記のウイルス、細菌、リケッチア等の抗原を投与した場合、投与したウイルス、細菌、リケッチアに対する特異的細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖が増強され、さらにウイルス、細菌、リケッチアに対する特異的抗体の産生が増強され、細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）によりウイルス、細菌、リケッチアに感染した細胞が攻撃され、さらに抗体によりウイルス、細菌、リケッチアを攻撃する。すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）による細胞性免疫と抗体による液性免疫の両方の免疫機構により排除される。
【００２６】
さらに、本発明の乳酸菌株又は乳酸菌の培養物若しくは処理物を含む組成物はがんの免疫治療に用いることもできる。がん免疫療法として、がんワクチンが用いられているが、がんワクチンは細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）によりがんの攻撃のみを誘導する。本発明の乳酸菌株又は乳酸菌の培養物若しくは処理物を含む組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖を増強するため、がんワクチン治療と組合せて用いることができる。すなわち、がん特異的抗原をがんワクチンとして投与すればよい。がん特異的抗原は、がん細胞に特異的に発現し、強い免疫原性を有する抗原である。がん特異的抗原はがん種特異的に発現し、本発明で用いるがん特異的抗原として、例えば、大腸がんや消化器がんにおけるがん胎児性抗原(CEA）、悪性黒色腫（メラノーマ）におけるMAGE（Melanoma antigen)、乳がんにおけるHER2/neu、前立腺がんにおけるヒト前立腺がん特異的抗原（PSA)、ヒト前立腺酸性フォスファーターゼ（PAP)及びPSMA(prostate specific membrane antigen)、白血病や各種がんにおけるWT1ペプチド、肝細胞がんにおけるグリピカン3（GPC3）、各種がんにおけるMUC1(Mucin 1)、hTERT(human telomerase reverse transcriptase)、AKAP-4（A-kinase anchor protein-4）、Survivin（baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing 5）、NY-ESO-1（New York esophageal squamous cell carcinoma 1）等が挙げられる。
【００２７】
がん特異的抗原を投与した場合、がん特異的抗原に対する特異的細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖が増強され、がん特異的抗原を発現したがん細胞を攻撃する。すなわち、がん細胞は細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）による細胞性免疫により排除され、がんの予防又は治療を達成することができる。
【００２８】
本発明の方法により、癌特異抗原を選択することにより、胃癌、肺癌、肝癌、肛門・直腸癌、結腸癌、膵癌、食道癌、子宮癌、乳癌、リンパ腫・白血病、脳・神経腫瘍、皮膚癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫等の予防又は治療を行うことができる。
【００２９】
また、がん特異的抗原を投与した後に、生体より細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）を採取し、in vitro で培養し、さらに増殖させた後に、生体に戻してもよい。
【００３０】
抗原の投与ルートは限定されないが、乳酸菌株又は乳酸菌の培養物若しくは処理物を含む組成物とは異なる経路で投与する。すなわち、経口投与以外の腹腔内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉注射、経皮投与、直腸投与、経鼻投与等により行えばよい。
【００３１】
その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、１回あたり、0.001mg〜100mgの抗原を皮下注射、静脈注射、腹腔内注射、筋肉注射等によって投与すればよい。抗原の投与は、乳酸菌株又は乳酸菌の培養物若しくは処理物を含む組成物の経口摂取を継続して行った後に、１回投与しても効果があるが、さらに、数回投与してもよい。
【００３２】
本発明の抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖及び抗原特異的な抗体の産生を増強させる乳酸菌株又はその培養物若しくは処理物を含む、細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖及び抗体の産生を増強するための組成物は、上記の抗原と併用されるという点で、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖及び抗原特異的な抗体の産生を増強させる乳酸菌株又はその培養物若しくは処理物を含む、抗原と併用される組成物である。抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖及び抗原特異的な抗体の産生を増強させる乳酸菌株又はその培養物若しくは処理物を含む、細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖及び抗体の産生を増強するための組成物は、前記抗原と別々に投与される。
【００３３】
本発明は、抗原に対する特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）及び抗体産生を増強させる乳酸菌株又は乳酸菌の培養物若しくは処理物を含む組成物と上記の抗原を含む該抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖及び該抗原に特異的な抗体の産生を増強するためのキットも包含する。該キットは、細菌、ウイルス又はリケッチアの感染症の予防又は治療のために用いられ、さらにがんの予防又は治療のために用いられる。
【００３４】
該キットは、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖及び抗原特異的な抗体の産生を増強させる、乳酸菌株又はその培養物若しくは処理物と上記抗原を含む。該キットは、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖及び抗原特異的な抗体の産生を増強させる、乳酸菌株又はその培養物若しくは処理物と上記抗原を組合せてなり、別々に投与される組成物でもある。
【００３５】
動物の抗原に対する特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）及び抗体産生を増強させる乳酸菌株又は乳酸菌の培養物若しくは処理物を含む組成物を事前に経口摂取させ、その後抗原を投与した被験体における抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の増殖の増強は、テトラマー法により確認することができ、抗原特異的な抗体の産生の増強は、ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）等の免疫学的測定法により確認することができる。
【実施例】
【００３６】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３７】
マウス
6週齢メスのC57BL/6Jマウス（チャールズリバー社）を使用した。1週間馴化させた後、体重を基にコントロール群（n=8）とJCM5805群（n=8）の2群にマウスを群分けした。コントロール群には標準食であるAIN-93Gを摂取させ、JCM5805群にはLactococcus lactis JCM5805株加熱死菌体を1 mg/day/mouse含んだAIN-93Gを摂取させた。温度25 ± 1 ℃、湿度60 ± 15%、明暗周期12時間に保たれた無菌環境の室内で1ケージあたり1匹のマウスを飼育した。
【００３８】
抗原の投与方法
JCM5805株を14日間混餌投与した後、抗原の注入を行った。抗原注入後もJCM5805株の摂取は解剖時まで継続的に行われた。抗原にはInfluenza PA Peptide（MBL社製）を使用した。10 mg/ml H-2DbInfluenza PA Peptide（MBL社製）を1μl、10 mg/ml I-Ab HBc Helper Peptide（MBL社製）を12μl、Complete Freund’s Adjuvant（SIGMA社製）を100μl、PBS を87μl混合した後にエマルジョン化したもの200μlをマウス腹腔内へ投与した。抗原投与12日後にマウスを安楽殺し、脾臓及び血液を回収した。
抗原投与スケジュールを図１に示す。
【００３９】
抗原特異的なCD8+ T細胞の検出
回収した脾臓から細胞調製液を作製し、1個体あたり1 × 106 cellsの脾臓細胞調製液を用いた。細胞の染色には、CD8-FITC（KT15）（MBL社製）、H-2DbInfluenza PA Tetramer-PE（MBL社製）、7-AAD（BD Pharmingen社製）、CD4-APC（RM4-5）（eBioscience社製）、CD3e-APC-Cy7（145-2C11）（BD Pharmingen社製）を使用した。測定にはFACS Cant II（BD Biosciences社製）を用い、解析にはFCS Express Software （De Novo Software社製）を用いた。7-AAD- CD3+ CD8+の細胞をCD8+ T細胞と定義し、CD8+ T細胞の内Influenza PA Tetramer+ （Tet+)の割合、すなわち抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の割合を解析した。
【００４０】
結果を図２に示す。図２に示すように、抗原投与前にJCM5805株を経口摂取しておくことで、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）の割合が増加した。
【００４１】
血中における抗原特異的な抗体量の検出
回収した血液1 mlを遠心（4 ℃、30分、2000 rpm）し、上清（血漿）を回収した。血漿中の抗原特異的Whole IgGの検出にはELISA法を用いた。H-2Db Influenza PA Peptide（MBL社製）を終濃度100μg/mlになるように0.05 M Sodium Bicarbonate（pH 9.6）で調製した後、調製した抗原100μlを96 wellプレートに添加、4 ℃、over nightでインキュベートした。PBS-T（0.05% Tween20含有PBS）で3回洗浄を行い、Assay Diluent buffer（50 mM Tris、0.14 M NaCl、1% BSA、0.05% Tween20）200μlを添加後、室温で2時間インキュベートした。PBS-Tで3回洗浄を行い、100倍希釈した血漿100μlを添加し、室温で2時間インキュベートした。PBS-Tで3回洗浄を行い、Assay Diluent で1000倍希釈したHRP標識二次抗体（Bethyl社製）100μlを添加し、室温で2時間インキュベートした。PBS-Tで5回洗浄を行い、TMB substrate（eBioscience社製）100μlを添加し、室温で15分インキュベートした。Stop buffer（1 M H3PO4）100μlを添加し、プレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。
【００４２】
結果を図３に示す。図３に示すように、抗原投与前にJCM5805株を経口摂取しておくことで、抗原特異的抗体量が増加した。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の特定の乳酸菌株を抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）及び抗原特異的な抗体の産生を増加させる効果を持つ組成物又は飲食品として用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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