(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子を含む測定試料を流すためのフローセルと、
前記フローセルに供給された測定試料中の粒子を検出するための粒子検出部と、
前記粒子検出部による検出結果に基づいて、検出条件を満たす粒子とその他の粒子とを選別するための粒子選別部と、
前記粒子選別部により選別された検出条件を満たす粒子を含む撮像用試料を前記フローセルに供給するための試料供給部と、
前記フローセルに供給された選別後の撮像用試料中の粒子を撮像するための粒子撮像部と、を備え
前記試料供給部は、
前記粒子選別部により選別された検出条件を満たす粒子を含む撮像用試料を貯留および濃縮するための中間貯留部と、
前記中間貯留部で濃縮された前記撮像用試料を前記粒子検出部の検出位置に対して前記フローセルの上流側に帰還させて前記フローセルに再び流入させるための帰還流路と、を備える、細胞検出装置。
【請求項２】
前記中間貯留部は、エルトリエータロータまたは遠心分離機あるいはフィルタを用いて撮像用試料を濃縮する、請求項１に記載の細胞検出装置。
【請求項３】
粒子を含む測定試料を流すためのフローセルと、
前記フローセルに供給された測定試料中の粒子を検出するための粒子検出部と、
前記粒子検出部による検出結果に基づいて、検出条件を満たす粒子とその他の粒子とを選別するための粒子選別部と、
前記粒子選別部により選別された検出条件を満たす粒子を含む撮像用試料を前記粒子検出部の検出位置に対して前記フローセルの上流側に帰還させて前記フローセルに再び流入させるための帰還流路を有する試料供給部と、
前記帰還流路を介して前記フローセルに供給された選別後の撮像用試料中の粒子を撮像するための粒子撮像部と、
前記フローセルを流れる測定試料の速度を変化させる速度変更部と、を備え、
前記速度変更部は、
前記フローセルに前記測定試料を流して前記粒子検出部により前記粒子を検出する場合、前記測定試料を第１速度で流し、
前記粒子選別部により選別された検出条件を満たす粒子を含む撮像用試料を前記フローセルに流して前記粒子撮像部により前記粒子を撮像する場合、前記撮像用試料を前記第１速度よりも低速の第２速度で流す、細胞検出装置。
【請求項４】
前記測定試料とともに流れるシース液を前記フローセルに供給するシース液供給部をさらに備え、
前記速度変更部は、前記フローセルに供給される前記シース液の流量を変化させることにより、前記フローセルを流れる前記測定試料の速度を変化させる、請求項３に記載の細胞検出装置。
【請求項５】
前記試料供給部は、前記粒子選別部による粒子の選別が完了した後に、前記粒子選別部により選別された検出条件を満たす粒子を含む撮像用試料を、前記帰還流路を介して前記フローセルに供給する、請求項１ないし４の何れか一項に記載の細胞検出装置。
【請求項６】
前記粒子検出部は、所定波長の光を検出位置に照射するための光源と、前記光の照射により前記測定試料から生じる光を受光する受光部と、を備える、請求項１ないし５の何れか一項に記載の細胞検出装置。
【請求項７】
前記受光部は、前記光の照射により前記測定試料から生じる散乱光を受光する第１検出器および前記光の照射により前記測定試料から生じる蛍光を受光する第２検出器を備える、請求項６に記載の細胞検出装置。
【請求項８】
前記粒子撮像部は、前記第１検出器からの検出信号に基づく撮像タイミングで、前記粒子に対する撮像を行う、請求項７に記載の細胞検出装置。
【請求項９】
前記フローセルの流路は、前記測定試料が流れる方向に垂直な第１方向の幅が前記第１方向に垂直な第２方向の幅よりも大きく設定され、
前記粒子撮像部は、前記第２方向から前記撮像用試料中の粒子の画像を撮像する、請求項１ないし８の何れか一項に記載の細胞検出装置。
【請求項１０】
前記粒子検出部は、所定波長の光を検出位置に照射するための光源と、前記光が照射された前記検出位置を撮像するカメラと、を備え、
前記カメラの撮像信号に基づいて前記粒子を検出する、請求項１ないし６の何れか一項に記載の細胞検出装置。
【請求項１１】
前記粒子検出部は、前記粒子選別部により選別された検出条件を満たす粒子を前記カメラにより撮像し、同一の前記粒子に対して前記粒子撮像部により取得される画像とは異なる他の画像を取得する、請求項１０に記載の細胞検出装置。
【請求項１２】
前記粒子検出部の前記カメラが前記粒子撮像部の撮像に共用され、
前記粒子撮像部として取得する前記粒子の画像と前記粒子検出部として取得する前記粒子の画像とを前記カメラの撮像画像上において分離させる光学ユニットをさらに備える、請求項１０または１１に記載の細胞検出装置。
【請求項１３】
前記粒子検出部の検出位置と前記粒子撮像部の撮像位置が、前記フローセルにおける前記測定試料の流れ方向において一致する、請求項１ないし１２の何れか一項に記載の細胞検出装置。
【請求項１４】
前記粒子選別部により選別された検出条件を満たす粒子が前記フローセルの前記粒子撮像部の撮像位置を通過するように整列させる粒子整列部をさらに備える、請求項１ないし１３の何れか一項に記載の細胞検出装置。
【請求項１５】
前記粒子整列部は、
前記フローセルに前記測定試料を流して前記粒子検出部により前記粒子を検出する場合には動作せず、
前記粒子選別部により選別された検出条件を満たす粒子を含む撮像用試料を、前記帰還流路を介して前記フローセルに流して前記粒子撮像部により前記粒子を撮像する場合に動作する、請求項１４に記載の細胞検出装置。
【請求項１６】
前記粒子選別部により選別された検出条件を満たす粒子を含む撮像用試料を回収する回収部をさらに備える、請求項１ないし１５の何れか一項に記載の細胞検出装置。
【請求項１７】
前記粒子撮像部により取得された画像に基づいて前記撮像用試料に被検細胞が含まれるか否かを判定する制御部を備え、
前記制御部は、前記被検細胞を含む前記撮像用試料を前記回収部に回収させる、請求項１６に記載の細胞検出装置。
【請求項１８】
前記試料供給部は、前記粒子選別部により選別された検出条件を満たす粒子を含む撮像用試料を、前記帰還流路を介して前記フローセルに複数回帰還させ、
前記制御部は、
第１の帰還において前記粒子撮像部により取得された画像に基づいて前記撮像用試料に第１被検細胞が含まれるか否かを判定し、前記第１被検細胞を含む前記撮像用試料を前記回収部に回収させ、
前記第１の帰還とは異なる第２の帰還において前記粒子撮像部により取得された画像に基づいて前記撮像用試料に前記第１被検細胞と異なる第２被検細胞が含まれるか否かを判定し、前記第２被検細胞を含む前記撮像用試料を前記回収部に回収させる、請求項１７に記載の細胞検出装置。
【請求項１９】
前記粒子撮像部により取得された画像を出力する出力部をさらに備える、請求項１ないし１８の何れか一項に記載の細胞検出装置。
【請求項２０】
被検細胞は、血中循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、または抗原特異的Ｔ細胞である、請求項１ないし１９の何れか一項に記載の細胞検出装置。
【請求項２１】
粒子を含む測定試料をフローセルに流す工程と、
前記フローセルに供給された測定試料中の粒子を検出位置において検出する工程と、
前記粒子の検出結果に基づいて、検出条件を満たす粒子とその他の粒子とを選別する工程と、
選別された検出条件を満たす粒子を含む撮像用試料を貯留および濃縮する工程と、
濃縮された前記撮像用試料を前記検出位置に対して前記フローセルの上流側に供給する工程と、
前記フローセルに供給された選別後の撮像用試料中の粒子を撮像する工程と、
を備える、細胞検出方法。
【請求項２２】
粒子を含む測定試料をフローセルに流す工程と、
前記フローセルに供給された測定試料中の粒子を検出位置において検出する工程と、
前記粒子の検出結果に基づいて、検出条件を満たす粒子とその他の粒子とを選別する工程と、
選別された検出条件を満たす粒子を含む撮像用試料を前記検出位置に対して前記フローセルの上流側に供給する工程と、
前記フローセルに供給された選別後の撮像用試料中の粒子を撮像する工程と、を備え、
前記フローセルに供給された粒子を検出する場合、前記測定試料を第１速度で流し、
前記撮像用試料中の粒子を撮像する場合、前記撮像用試料を前記第１速度よりも低速の第２速度で流す、細胞検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞検出装置および細胞検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フローサイトメータを用いた検体測定装置として、フローセルを流れる測定試料中の粒子を検出する粒子検出部およびフローセルを流れる測定試料中の粒子を撮像する撮像部を備えるものが知られている。たとえば、特許文献１に記載の検体測定装置は、細胞検出部の下流側に、細胞を撮像するための構成が配置される。検体測定装置は、フローセルを流れる測定試料中の細胞にレーザ光を照射し、細胞から発せられる信号をトリガーとしてＣＣＤカメラにより測定試料中の細胞を撮像する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭６３−９４１５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の構成では、粒子画像の品質を高めるためにフローセルを流れる粒子の速度を遅くすると、たとえば数１０万個の細胞の中に１つといった測定試料中にごく僅かに含まれる細胞の画像を取得したい場合には、多量の測定試料を測定する必要があるため、細胞画像の取得にかかる時間が非常に長くなるといった問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１の態様に係る細胞検出装置は、粒子を含む測定試料を流すためのフローセルと、フローセルに供給された測定試料中の粒子を検出するための粒子検出部と、粒子検出部による検出結果に基づいて、検出条件を満たす粒子とその他の粒子とを選別するための粒子選別部と、粒子選別部により選別された検出条件を満たす粒子を含む撮像用試料をフローセルに供給するための試料供給部と、フローセルに供給された選別後の撮像用試料中の粒子を撮像するための粒子撮像部と、を備え、試料供給部は、粒子選別部により選別された検出条件を満たす粒子を含む撮像用試料を貯留および濃縮するための中間貯留部と、中間貯留部で濃縮された撮像用試料を粒子検出部の検出位置に対してフローセルの上流側に帰還させてフローセルに再び流入させるための帰還流路と、を備える。
【０００６】
本発明の第２の態様に係る細胞検出装置は、粒子を含む測定試料を流すためのフローセルと、フローセルに供給された測定試料中の粒子を検出するための粒子検出部と、粒子検出部による検出結果に基づいて、検出条件を満たす粒子とその他の粒子とを選別するための粒子選別部と、粒子選別部により選別された検出条件を満たす粒子を含む撮像用試料を粒子検出部の検出位置に対してフローセルの上流側に帰還させてフローセルに再び流入させるための帰還流路を有する試料供給部と、帰還流路を介してフローセルに供給された選別後の撮像用試料中の粒子を撮像するための粒子撮像部と、フローセルを流れる測定試料の速度を変化させる速度変更部と、を備え、速度変更部は、フローセルに測定試料を流して粒子検出部により粒子を検出する場合、測定試料を第１速度で流し、粒子選別部により選別された検出条件を満たす粒子を含む撮像用試料を前記フローセルに流して粒子撮像部により前記粒子を撮像する場合、撮像用試料を第１速度よりも低速の第２速度で流す。
本発明の第３の態様に係る細胞検出方法は、粒子を含む測定試料をフローセルに流す工程と、フローセルに供給された測定試料中の粒子を検出位置において検出する工程と、粒子の検出結果に基づいて、検出条件を満たす粒子とその他の粒子とを選別する工程と、選別された検出条件を満たす粒子を貯留および濃縮する工程と、濃縮された撮像用試料を検出位置に対してフローセルの上流側に供給する工程と、フローセルに供給された選別後の撮像用試料中の粒子を撮像する工程と、を備える。
本発明の第４の態様に係る細胞検出方法は、粒子を含む測定試料をフローセルに流す工程と、フローセルに供給された測定試料中の粒子を検出位置において検出する工程と、粒子の検出結果に基づいて、検出条件を満たす粒子とその他の粒子とを選別する工程と、選別された検出条件を満たす粒子を含む撮像用試料を検出位置に対してフローセルの上流側に供給する工程と、フローセルに供給された選別後の撮像用試料中の粒子を撮像する工程と、を備え、フローセルに供給された粒子を検出する場合、測定試料を第１速度で流し、撮像用試料中の粒子を撮像する場合、撮像用試料を第１速度よりも低速の第２速度で流す。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、測定対象となる細胞の画像を効率良く取得できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、実施形態１に係る細胞検出装置の構成を示す模式図である。
【図２】図２は、実施形態１に係る粒子検出部および粒子撮像部の構成を示す模式図である。
【図３】図３は、実施形態１に係る細胞検出装置の構成を示すブロック図である。
【図４】図４は、実施形態１に係る細胞検出装置が行う処理を示すフローチャートである。
【図５】図５（ａ）、（ｂ）は、実施形態１に係る検出処理によって開始される処理を示すフローチャートである。
【図６】図６（ａ）は、実施形態１に係る撮像処理によって開始される処理を示すフローチャートであり、図６（ｂ）は、実施形態１に係る細胞検出装置が行う表示処理を示すフローチャートである。
【図７】図７（ａ）、（ｂ）は、実施形態１に係る出力部に表示される画面を示す図である。
【図８】図８は、実施形態２に係る粒子検出部および粒子撮像部の構成を示す模式図である。
【図９】図９（ａ）、（ｂ）は、実施形態２に係る出力部に表示される画面を示す図である。
【図１０】図１０は、実施形態３に係る粒子検出部および粒子撮像部の構成を示す模式図である。
【図１１】図１１は、実施形態３に係るカメラの受光面上の領域を示す模式図である。
【図１２】図１２は、実施形態４に係る粒子検出部および粒子撮像部の構成を示す模式図である。
【図１３】図１３は、実施形態４に係るカメラの受光面上の領域を示す模式図である。
【図１４】図１４（ａ）は、実施形態５に係る細胞検出装置の構成を示すブロック図であり、図１４（ｂ）は、実施形態５に係る細胞検出装置が行う処理を示すフローチャートである。
【図１５】図１５は、実施形態５に係る撮像処理によって開始される処理を示すフローチャートである。
【図１６】図１６（ａ）は、実施形態６に係る速度変更部の構成を示す模式図であり、図１６（ｂ）は、実施形態６に係る細胞検出装置が行う処理を示すフローチャートである。
【図１７】図１７は、実施形態６に係る撮像処理によって開始される処理を示すフローチャートである。
【図１８】図１８は、実施形態７に係る細胞検出装置が行う処理を示すフローチャートである。
【図１９】図１９（ａ）は、実施形態７に係る活性化ありと判定されたＣＥＣの画像を示す図であり、図１９（ｂ）は、実施形態７に係る活性化なしと判定されたＣＥＣの画像を示す図である。
【図２０】図２０（ａ）、（ｂ）は、実施形態７に係る出力部に表示される画面を示す図である。
【図２１】図２１は、実施形態８に係る細胞検出装置の構成を示す模式図である。
【図２２】図２２は、実施形態８に係る細胞検出装置が行う処理を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
＜実施形態１＞
実施形態１は、血液検体に含まれる血中循環腫瘍細胞を被検細胞として撮像するための装置に本発明を適用したものである。以下、血中循環腫瘍細胞を、ＣＴＣ（Circulating Tumor Cell）と称する。進行したがん細胞から由来するＣＴＣは血液やリンパ液の流れに乗って循環しており、離れた臓器に転移をする。血液中のＣＴＣは、乳がん、前立腺がん、大腸がん等の転移性のがん患者において、治療効果の判定および予後予測因子として有用性が認められている。ＣＴＣを測定することは、治療による効果の判定、無増悪生存率、全生存率等、予後の予測をしたい場合に有効である。血液中に循環しているＣＴＣは極微量であり、血液１０ｍＬ中に数個〜数十個程度となっている。
【００１０】
図１に示すように、細胞検出装置１０は、試料供給部１０ａと、フローセル１７と、シース液供給部１８と、速度変更部１９と、粒子検出部２０と、粒子選別部２１と、廃液貯留部２２と、粒子整列部２７と、粒子撮像部２８と、を備える。試料供給部１０ａは、ノズル１１と、供給流路１２と、バルブ１３と、シリンジ１４と、バルブ１５と、ジェットノズル１６と、帰還流路２３と、バルブ２４と、中間貯留部２５と、バルブ２６と、を備える。細胞検出装置１０が備えるバルブは、電磁的に開閉可能に構成されている。
【００１１】
試料供給部１０ａは、試料容器１０ｂに収容された測定試料をフローセル１７に供給し、粒子選別部２１による粒子の選別が完了した後に、粒子選別部２１により選別された検出条件を満たす粒子を含む測定試料をフローセル１７に供給する。粒子選別部２１により選別された検出条件を満たす粒子を含む測定試料を、以下「撮像用試料」と称する。
【００１２】
試料容器１０ｂは、粒子を含む測定試料を収容する。測定試料は、人から採取された末梢血である検体に、以下に示す試薬を混和して予め調製される。
・赤血球を溶血させる溶血剤
・白血球を検出するためのＣＤ４５の標識抗体を含む試薬
・１７番染色体上に結合するＣｈ１７プローブを含む試薬
・Ｈｅｒ２遺伝子上に結合するＨｅｒ２プローブを含む試薬
・色素Ａｌｅｘａ４８８で標識されたＣｈ１７プローブに結合する抗体を含む試薬
・色素ＰＥで標識されたＨｅｒ２プローブに結合する抗体を含む試薬
・核を染色する色素７ＡＡＤを含む試薬
【００１３】
検体に上記試薬が混和されると、溶血剤の作用によって赤血球が溶血される。白血球の表面に発現しているＣＤ４５抗原は、ＣＤ４５の標識抗体により標識される。１７番染色体は、色素Ａｌｅｘａ４８８で標識される。Ｈｅｒ２遺伝子は、色素ＰＥで標識される。核は、色素７ＡＡＤによって染色される。色素Ａｌｅｘａ４８８、ＰＥ、７ＡＡＤに対して、後述する光源１２１から出射される波長が４８８ｎｍの光が照射されると、異なる波長の蛍光が励起される。色素Ａｌｅｘａ４８８に代えて、色素ＦＩＴＣが用いられても良く、色素ＰＥに代えて、色素ＰＥ−Ｃｙ７が用いられても良い。
【００１４】
Ｃｈ１７プローブに結合する抗体を標識する色素と、Ｈｅｒ２プローブに結合する抗体を標識する色素と、核を染色する色素の励起波長が異なる場合、後述する光源１２１は、色素の励起波長に応じた複数の光を出射する光源に変更される。このような光源として、基板に複数の発光素子がマウントされたマルチ発光レーザが用いられ得る。あるいは、光源１２１が、複数の半導体レーザから出射されたレーザ光をダイクロイックミラーで結合する構成であっても良い。たとえば、色素Ａｌｅｘａ４８８と励起波長が異なる色素として、色素Ａｌｅｘａ６４７、色素ＨＯＥＣＨＳＴが挙げられる。色素Ａｌｅｘａ６４７は、Ｈｅｒ２遺伝子の標識に用いられ、色素ＨＯＥＣＨＳＴは、核の標識に用いられ得る。
【００１５】
細胞検出装置１０は、測定試料を自動的に調製するための試料調製部を備えても良い。この場合、試料調製部は、検体に上記試薬を混和して自動的に測定試料を調製する。
【００１６】
供給流路１２は、ノズル１１とジェットノズル１６を接続する流路である。供給流路１２には、バルブ１３、１５とシリンジ１４が配置されている。ジェットノズル１６の先端は、フローセル１７の入口１７１に挿入されている。シリンジ１４は、供給流路１２に陽圧および陰圧を加えることが可能に構成されている。シリンジ１４が陰圧駆動されることにより、試料容器１０ｂ内の測定試料が、ノズル１１から吸引されてシリンジ１４内に引き込まれる。シリンジ１４が陽圧駆動されることにより、シリンジ１４に引き込まれた測定試料が、ジェットノズル１６から吐出されフローセル１７に送り出される。
【００１７】
フローセル１７は、入口１７１と、廃棄出口１７２と、帰還出口１７３と、を備え、内部に流路１７ａ、１７ｂ、１７ｃを備える。流路１７ａは入口１７１に繋がっており、流路１７ｂは廃棄出口１７２に繋がっており、流路１７ｃは帰還出口１７３に繋がっている。フローセル１７は、透光性を有するガラスや合成樹脂によって構成される。図１には、便宜上、互いに直交するＸＹＺ軸が示されている。フローセル１７において、Ｘ軸負側がフローセル１７の上流側であり、Ｘ軸正側がフローセル１７の下流側である。流路１７ａ、１７ｂは、直線状に並ぶように形成されている。流路１７ｂは、流路１７ａの下流側に位置する。流路１７ｃは、流路１７ａと流路１７ｂとの間において、流路１７ａから分岐している。ジェットノズル１６から送り出された測定試料は、流路１７ａに流され、その後、流路１７ｂまたは流路１７ｃに流される。
【００１８】
シース液供給部１８は、シース液を貯留するとともに、速度変更部１９を介してフローセル１７の流路１７ａにシース液を供給する。シース液供給部１８には、後述する空圧源３６が接続されている。シース液供給部１８は、空圧源３６から陽圧が供給されることにより、シース液を速度変更部１９に送り出す。ジェットノズル１６から流路１７ａに送り出される測定試料は、シース液に包まれた状態で下流へと流される。これにより、測定試料に含まれる粒子は、一列に整列した状態で検出位置２０ａを通る。
【００１９】
速度変更部１９は、流路１９ａ、１９ｂと、バルブ１９ｃ、１９ｄと、オリフィス１９ｅと、を備える。流路１９ａ、１９ｂは、シース液供給部１８とフローセル１７とを繋ぐ流路において、並列に配置されている。流路１９ａには、バルブ１９ｃが配置されており、流路１９ｂには、バルブ１９ｄとオリフィス１９ｅが配置されている。流路１９ａ、１９ｂの断面の径は同じである。オリフィス１９ｅの断面の径は、流路１９ａ、１９ｂの断面の径よりも小さい。
【００２０】
バルブ１９ｃが開けられバルブ１９ｄが閉じられた状態のとき、シース液供給部１８から送り出されたシース液は、流路１９ａを通ってフローセル１７に供給される。他方、バルブ１９ｃが閉じられバルブ１９ｄが開けられた状態のとき、シース液供給部１８から送り出されたシース液は、流路１９ｂを通ってフローセル１７に供給される。シース液が流路１９ａ、１９ｂを通る場合にフローセル１７に供給されるシース液の単位時間当たりの流量を、それぞれＶ１、Ｖ２とすると、オリフィス１９ｅによって、Ｖ２はＶ１よりも小さくなる。
【００２１】
ジェットノズル１６から流路１７ａに供給される測定試料は、上述したように、シース液に包まれた状態で下流へと流される。したがって、流路１７ａを流れる測定試料は、フローセル１７に供給されるシース液の単位時間当たりの流量によって決められる。ここで、フローセル１７に供給されるシース液の単位時間当たりの流量がＶ１、Ｖ２のとき、流路１７ａを流れる測定試料の速度を、それぞれ、第１速度および第２速度とすると、Ｖ２はＶ１よりも小さいため、第２速度は第１速度よりも低速となる。このように、速度変更部１９は、フローセル１７に供給するシース液の流量を切り替えることにより、流路１７ａを流れる測定試料の速度を第１速度と第２速度に切り替えることができる。測定試料は、第１速度で流路１７ａに流され、撮像用試料は、第２速度で流路１７ａに流される。
【００２２】
粒子検出部２０は、流路１７ａを流れる粒子を検出する。具体的には、粒子検出部２０は、流路１７ａの検出位置２０ａに位置付けられた粒子に光を照射して、生じた前方散乱光および蛍光を検出する。粒子検出部２０の構成については、追って図２を参照して説明する。
【００２３】
粒子選別部２１は、粒子検出部２０による検出結果に基づいて、被検細胞の検出条件を満たす粒子とその他の粒子とを選別する。被検細胞の検出条件を満たさない粒子を含む測定試料は、流路１７ｂを介して廃液貯留部２２に送られ、被検細胞の検出条件を満たす粒子を含む測定試料は、流路１７ｃを介して帰還流路２３に送られる。
【００２４】
粒子選別部２１は、部材２１ａと、部材２１ａを流路１７ｂに突出させるための駆動部と、を備える。部材２１ａが流路１７ｂを開放する位置に位置付けられると、流路１７ａを流れる測定試料は流路１７ｂを経由して廃液貯留部２２へと送られる。廃液貯留部２２は、フローセル１７の廃棄出口１７２と繋がっており、不要となった測定試料を貯留する。他方、部材２１ａが流路１７ｂを塞ぐ位置に位置付けられると、流路１７ａを流れる測定試料は流路１７ｃを経由して帰還流路２３へと送られる。被検細胞の検出条件を満たす粒子が流路１７ａの分岐位置１７ｄに位置付けられると、粒子選別部２１が部材２１ａを駆動して流路１７ｂを塞ぐ。これにより、分岐位置１７ｄにある粒子は、流路１７ｃを経由して帰還流路２３へと送られる。
【００２５】
粒子選別部２１は、図１に示す構成に代えて、バブル発生器を備えても良い。この場合、粒子選別部２１は、バブル発生器から生じるバブルにより、Ｘ軸正方向に流れる粒子の進行方向を流路１７ｃの方向へと変化させる。また、粒子選別部２１は、図１に示す構成に代えて、圧電体と電極を有するピエゾアクチュエータや、圧電結晶基板と櫛形電極を有する超音波発生部を備えても良い。この場合、粒子選別部２１は、ピエゾアクチュエータや超音波発生部により発生させる超音波を粒子に付与し、Ｘ軸正方向に流れる粒子の進行方向を流路１７ｃの方向へ変化させる。
【００２６】
帰還流路２３は、フローセル１７の帰還出口１７３と、バルブ１３とシリンジ１４の間の供給流路１２と、を接続する。帰還流路２３には、バルブ２４、２６と中間貯留部２５が配置されている。帰還流路２３は、粒子検出部２０の検出位置２０ａを通過した測定試料を、検出位置２０ａに対してフローセル１７の上流側に帰還させて、撮像用試料としてフローセル１７に再び流入させる。
【００２７】
中間貯留部２５は、流路１７ｃから帰還流路２３に供給された撮像用試料を貯留する。また、中間貯留部２５は、貯留した撮像用試料を濃縮することができるように構成されている。中間貯留部２５は、エルトリエータローターや、遠心分離機により構成するのが好ましい。また、撮像用試料の濃縮にあたっては、フィルタ等を用いてもよい。
【００２８】
中間貯留部２５は、流路１７ｃから帰還流路２３に供給された撮像用試料をノズルを介して反応管に吐出し、反応管により撮像用試料を貯留しても良い。反応管に貯留した撮像用試料をフローセル１７に送る場合には、中間貯留部２５は、ノズルを介して反応管から撮像用試料を吸引する。そして、吸引された撮像用試料が、シリンジ１４によりフローセル１７に送られる。
【００２９】
試料容器１０ｂからフローセル１７に供給される測定試料はシース液と混ぜられるため、帰還流路２３を通って中間貯留部２５に送られた撮像用試料の濃度は低くなっている。たとえば、中間貯留部２５は、濃度が低くなった撮像用試料を濃縮して、試料容器１０ｂに収容される測定試料の濃度と同程度の濃度に戻す。このように、中間貯留部２５によれば、シース液により低くなった撮像用試料の濃度を高めることができる。中間貯留部２５により濃縮された撮像用試料は、測定試料の場合と同様にシリンジ１４が駆動されることにより、再度同一のジェットノズル１６に戻され、ジェットノズル１６からフローセル１７の流路１７ａに送り出される。
【００３０】
粒子整列部２７は、流路１７ａの側面に配されたピエゾアクチュエータ２７ａ、２７ｂを備える。ピエゾアクチュエータ２７ａ、２７ｂは、圧電体と電極を有する。粒子整列部２７は、粒子撮像部２８による撮像方向であるＺ軸方向と粒子の流れ方向であるＸ軸方向とに垂直なＹ軸方向において、ピエゾアクチュエータ２７ａ、２７ｂにより、流路１７ａの両側から流路１７ａを流れる粒子に超音波を付与する。これにより、ピエゾアクチュエータ２７ａ、２７ｂの間において、点線で示すように超音波定在波が形成される。超音波定在波の節は、流路１７ａの中心軸に位置付けられる。
【００３１】
帰還流路２３を介して流路１７ａに帰還された撮像用試料に含まれる粒子は、超音波が付与されることにより、流路１７ａの中心軸に沿って流れるように整列される。このように粒子が整列されると、粒子が、粒子撮像部２８による撮像位置である検出位置２０ａを精度良く通るようになる。よって、粒子撮像部２８がより精度の高い画像を撮像できる。
【００３２】
粒子整列部２７は、超音波定在波を形成可能であればよく、ピエゾアクチュエータ２７ａ、２７ｂに代えて、圧電結晶基板と櫛形電極を有する超音波発生部であっても良い。
【００３３】
粒子撮像部２８は、帰還流路２３を介してフローセル１７に供給された選別後の撮像用試料中の粒子を、検出位置２０ａにおいて撮像する。具体的には、粒子撮像部２８は、検出位置２０ａに位置付けられた粒子に光を照射して、生じた蛍光を撮像する。粒子撮像部２８の構成については、追って図２を参照して説明する。検出位置２０ａを通り過ぎた撮像用試料は、全て廃液貯留部２２へと送られる。こうして、細胞検出装置１０による処理が終了する。
【００３４】
実施形態１では、粒子検出部２０が粒子の検出を行う検出位置２０ａと、粒子撮像部２８が粒子の撮像を行う撮像位置とが、流路１７ａにおける測定試料の流れ方向において一致する。これにより、フローセル１７を小型化できる。小型化の必要がなければ、粒子撮像部２８は、検出位置２０ａとは異なる流路１７ａの位置において粒子を撮像しても良い。なお、粒子撮像部２８の設置位置はこれに限られず、流路１７ｂや流路１７ｃ等、分岐位置１７ｄの下流とすることもできる。
【００３５】
このように、測定試料に含まれる粒子は、検出位置２０ａを最初に通るときに、粒子検出部２０により検出される。粒子検出部２０による検出結果に基づいて、被検細胞の検出条件を満たす粒子のみが、帰還流路２３へ送られる。その後、帰還流路２３を介してフローセル１７に帰還された粒子は、検出位置２０ａを２回目に通るときに、粒子撮像部２８により撮像される。すなわち、粒子の検出は１巡目で行われ、粒子の撮像は２巡目で行われる。これにより、効率良く細胞画像を取得できる。
【００３６】
図２に示すように、粒子検出部２０は、光源１０１と、照射レンズ１０２と、対物レンズ１０３と、ダイクロイックミラー１０４、１０５と、集光レンズ１０６、１０７と、受光部１０８と、を備える。受光部１０８は、第１検出器１０８ａと第２検出器１０８ｂを備える。粒子撮像部２８は、光源１２１と、照射レンズ１２２と、ダイクロイックミラー１２３、１２４、１２５と、集光レンズ１２６、１２７、１２８と、カメラ１２９、１３０、１３１と、を備える。
【００３７】
図２には、図１のＸＹＺ軸に対応するＸＹＺ軸が示されている。測定試料が流れる方向に垂直な第１方向をＹ軸方向とし、第１方向と垂直な第２方向をＺ軸方向とする。流路１７ａは、第１方向の幅Ｗ１が、第２方向の幅Ｗ２よりも大きくなるよう構成されている。
【００３８】
光源１０１は、半導体レーザ光源である。光源１０１から出射される光は、波長λ１のレーザ光である。波長λ１は、赤色波長帯域の波長である。照射レンズ１０２は、光源１０１から出射された光を集光して、流路１７ａに照射させる。光源１０１から出射された光は、第２方向、すなわちＺ軸方向から流路１７ａに入射される。流路１７ａに入射する波長λ１の光は、検出位置２０ａに位置付けられた粒子に照射される。これにより、粒子から波長λ１の前方散乱光が生じ、ＣＤ４５の標識抗体から波長λ２の蛍光が生じる。
【００３９】
対物レンズ１０３は、波長λ１の前方散乱光および波長λ２の蛍光を集光し、後述する波長λ４、λ５、λ６の蛍光を集光する。ダイクロイックミラー１０４は、波長λ１の前方散乱光および波長λ２の蛍光を反射し、波長λ４、λ５、λ６の蛍光を透過する。ダイクロイックミラー１０５は、波長λ１の前方散乱光を反射し、波長λ２の蛍光を透過する。集光レンズ１０６は、波長λ１の前方散乱光を集光する。第１検出器１０８ａは、波長λ１の前方散乱光を受光する。第１検出器１０８ａは、フォトダイオードであり、受光した前方散乱光の強度に応じた電気信号を出力する。集光レンズ１０７は、波長λ２の蛍光を集光する。第２検出器１０８ｂは、波長λ２の蛍光を受光する。第２検出器１０８ｂはアバランシェフォトダイオードであり、受光した蛍光の強度に応じた電気信号を出力する。
【００４０】
光源１２１は、半導体レーザ光源である。光源１２１から出射される光は、波長λ３のレーザ光である。波長λ３は、約４８８ｎｍである。照射レンズ１２２は、光源１２１から出射された光を集光して、流路１７ａに照射させる。光源１２１から出射された光は、第１方向、すなわちＹ軸方向から流路１７ａに入射される。流路１７ａに入射する波長λ３の光は、検出位置２０ａに位置付けられた粒子に照射される。これにより、色素Ａｌｅｘａ４８８から波長λ４の蛍光が生じ、色素ＰＥから波長λ５の蛍光が生じ、色素７ＡＡＤから波長λ６の蛍光が生じる。
【００４１】
このように、光源１２１から出射された蛍光励起用の光が第１方向から流路１７ａに入射されると、効率的に蛍光を生じさせることができる。すなわち、流路１７ａを流れる粒子は、短辺方向においてふらつきにくい。このため、流路１７ａの短辺側から蛍光励起用の光を入射させる場合、蛍光励起用の光の広がりを小さく絞っても、蛍光励起用の光を検出位置２０ａの粒子に照射できる。よって、蛍光励起用の光を粒子に効率的に照射できるため、効率的に蛍光を生じさせることができる。
【００４２】
波長λ４、λ５、λ６の蛍光は、対物レンズ１０３により集光される。図２では、粒子撮像部２８は、対物レンズ１０３を粒子検出部２０と共用している。対物レンズ１０３により集光された波長λ４、λ５、λ６の蛍光は、ダイクロイックミラー１０４を透過する。ダイクロイックミラー１２３は、波長λ４の蛍光を反射し、波長λ５、λ６の蛍光を透過する。ダイクロイックミラー１２４は、波長λ５の蛍光を反射し、波長λ６の蛍光を透過する。ダイクロイックミラー１２５は、波長λ６の蛍光を反射する。ダイクロイックミラー１２５が反射ミラーに置き換えられても良い。
【００４３】
集光レンズ１２６、１２７、１２８は、それぞれ、波長λ４、λ５、λ６の蛍光を集光する。カメラ１２９、１３０、１３１は、それぞれ、波長λ４、λ５、λ６の蛍光を受光して、検出位置２０ａに位置付けられた粒子の画像情報を撮像信号として出力する。カメラ１２９、１３０、１３１は、ＴＤＩ（Time Delay Integration）カメラであっても良い。ＴＤＩカメラが用いられると、より精度の高い画像情報を取得できる。
【００４４】
ここで、カメラ１２９、１３０、１３１が粒子を撮像する方向は、Ｚ軸方向である。流路１７ａは、上述したように、撮像方向であるＺ軸方向の幅Ｗ２よりも、撮像方向と粒子の流れ方向とに垂直な方向であるＹ軸方向の幅Ｗ１が大きくなるよう構成されている。よって、Ｚ軸方向における粒子の位置がばらつきにくいため、撮像倍率を上げて被写界深度が短くなったとしても、粒子に対してピントが合いやすくなる。よって、粒子画像を精度良く取得できる。
【００４５】
図３に示すように、細胞検出装置１０は、図１に示した粒子検出部２０と、粒子選別部２１と、中間貯留部２５と、粒子整列部２７と、粒子撮像部２８と、を備える。さらに、細胞検出装置１０は、制御部３１と、記憶部３２と、入力部３３と、出力部３４と、駆動部３５と、空圧源３６と、を備える。制御部３１は、たとえばＣＰＵである。制御部３１は、細胞検出装置１０の各部から信号を受信して、細胞検出装置１０の各部を制御する。制御部３１は、記憶部３２に記憶されたプログラムに従って、各部を制御する。記憶部３２は、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ハードディスク等である。
【００４６】
制御部３１は、粒子検出部２０の第１検出器１０８ａおよび第２検出器１０８ｂから出力された信号波形のピーク値を取得することにより、粒子ごとに、波長λ１の前方散乱光の強度および波長λ２の蛍光の強度を取得する。制御部３１は、波長λ１の前方散乱光の強度および波長λ２の蛍光の強度を、粒子ごとに記憶部３２に記憶する。制御部３１は、粒子撮像部２８のカメラ１２９、１３０、１３１から出力された信号に基づいて粒子の画像を生成し、生成した画像を粒子ごとに記憶部３２に記憶する。
【００４７】
制御部３１は、入力部３３を介してオペレータからの指示を受け付け、粒子の画像等を出力部３４に表示させる。入力部３３は、マウスやキーボードであり、出力部３４は、液晶パネル等のディスプレイである。
【００４８】
駆動部３５は、図１に示すバルブを個別に駆動するための機構と、シリンジ１４を駆動するための機構と、ノズル１１を昇降させるための機構と、を含む。空圧源３６は、細胞検出装置１０の各部に陽圧および陰圧を供給する。
【００４９】
次に、細胞検出装置１０が行う処理について、図４〜図６（ａ）に示すフローチャートを参照して説明する。
【００５０】
図４に示すように、オペレータにより開始指示が入力されると、ステップＳ１において、制御部３１は検出処理を行う。具体的には、制御部３１は、後述する図５（ａ）、（ｂ）に示す処理を並行して開始する。これにより、試料容器１０ｂの測定試料がフローセル１７に供給され、この測定試料に含まれる粒子が、粒子検出部２０により検出される。被検細胞の検出条件を満たす粒子のみが、帰還流路２３に供給される。図５（ａ）、（ｂ）の処理が終了すると、制御部３１は、処理をステップＳ２に進める。
【００５１】
ステップＳ２において、制御部３１は濃縮処理を行う。これにより、中間貯留部２５に貯留された撮像用試料の濃縮が行われる。濃縮が行われた撮像用試料は、中間貯留部２５に貯留される。
【００５２】
ステップＳ３において、制御部３１は撮像処理を行う。具体的には、制御部３１は、後述する図６（ａ）に示す処理を開始する。これにより、中間貯留部２５により濃縮が行われた撮像用試料が、再度フローセル１７に供給される。再度フローセル１７に供給された撮像用試料に含まれる粒子が、粒子撮像部２８により撮像される。図６（ａ）の処理が終了し、フローセル１７に帰還された撮像用試料が全て廃液貯留部２２に送られると、図４に示す細胞検出装置１０の処理が終了する。
【００５３】
図５（ａ）に示すように、ステップＳ１０１において、制御部３１は、第１速度で測定試料をフローセル１７に流す。具体的には、制御部３１は、バルブ１９ｃを開けてバルブ１９ｄを閉じ、シース液供給部１８からフローセル１７にシース液を供給する。そして、制御部３１は、試料容器１０ｂ内の測定試料をジェットノズル１６から流路１７ａに送り出す。
【００５４】
ステップＳ１０２において、制御部３１は、粒子検出部２０による検出を開始する。具体的には、制御部３１は、光源１０１から検出位置２０ａに光を照射して、波長λ１の前方散乱光および波長λ２の蛍光をそれぞれ第１検出器１０８ａおよび第２検出器１０８ｂにより受光する。制御部３１は、検出位置２０ａの粒子について、波長λ１の前方散乱光の強度および波長λ２の蛍光の強度を取得する。
【００５５】
ステップＳ１０３において、制御部３１は、検出位置２０ａの粒子が、被検細胞の検出条件を満たす粒子であるか否かを判定する。具体的には、波長λ２の蛍光の強度が所定の閾値以下であり、かつ、波長λ１の前方散乱光の強度が所定の閾値以上である場合に、制御部３１は、検出位置２０ａの粒子が被検細胞の検出条件を満たす粒子であると判定する。これにより、波長λ２の蛍光の強度が所定の閾値より大きい粒子および波長λ１の前方散乱光の強度が所定の閾値より小さい粒子が除外される。粒子が被検細胞のＣＴＣである場合、粒子はＣＤ４５の標識抗体と結合しないため、波長λ２の蛍光の強度は所定の閾値以下となる。また、粒子が被検細胞のＣＴＣである場合、粒子のサイズが大きくなるため、波長λ１の前方散乱光の強度は所定の閾値以上となる。
【００５６】
このように、検出した粒子が白血球以外の粒子である場合、かつ、検出した粒子のサイズが大きい場合に、制御部３１は、検出した粒子が被検細胞である可能性が高いとして、ステップＳ１０３においてＹＥＳと判定する。
【００５７】
測定試料の調製において、赤血球を溶血するための溶血剤が用いられなくても良い。この場合であっても、赤血球はサイズが小さく、波長λ１の前方散乱光の強度は所定の閾値より小さくなることから、測定試料中の赤血球は除外されることとなる。
【００５８】
ステップＳ１０３でＹＥＳと判定すると、ステップＳ１０４において、制御部３１は、ステップＳ１０３において被検細胞の検出条件を満たすと判定した粒子が、検出位置２０ａを通過したタイミングを記憶する。ステップＳ１０５において、制御部３１は、試料容器１０ｂ内の測定試料が全てフローセル１７に供給され、全ての粒子が検出位置２０ａを通過したか否かを判定する。制御部３１は、全ての粒子が検出位置２０ａを通過するまで、ステップＳ１０３、Ｓ１０４の処理を繰り返す。全ての粒子が検出位置２０ａを通過すると、図５（ａ）の処理が終了する。
【００５９】
図５（ｂ）に示すように、ステップＳ２０１において、制御部３１は、分岐位置１７ｄに帰還対象の粒子が到達したか否かを判定する。具体的には、制御部３１は、図５（ａ）のステップＳ１０４で記憶したタイミングから所定の時間が経過している場合、図５（ａ）のステップＳ１０３で被検細胞の検出条件を満たすと判定した粒子が、分岐位置１７ｄに到達したと判定する。
【００６０】
分岐位置１７ｄに帰還対象の粒子が到達すると、ステップＳ２０２において、制御部３１は、所定時間だけ部材２１ａが流路１７ｂを塞ぐように粒子選別部２１を駆動する。これにより、被検細胞の検出条件を満たす粒子は、流路１７ｃを経由して帰還流路２３に送られる。図５（ｂ）の処理は、図５（ａ）の処理が終了した後、所定時間が経過するまで繰り返し行われる。こうして、測定試料に含まれる被検細胞の条件を満たす全ての粒子が、帰還流路２３に送られる。
【００６１】
被検細胞の検出条件を満たさない粒子が分岐位置１７ｄを通過する場合に、流路１７ｃが塞がれても良い。この場合、粒子選別部２１は、流路１７ｃを塞ぐ部材を備える。制御部３１は、ステップＳ２０２において、流路１７ｃを塞ぐ部材で流路１７ｃを塞ぎ、かつ、流路１７ｂから部材２１ａを退避させる。
【００６２】
図６（ａ）に示すように、ステップＳ３０１において、制御部３１は、中間貯留部２５によって濃縮された撮像用試料を、第１速度よりも遅い第２速度でフローセル１７に流す。具体的には、制御部３１は、バルブ１９ｃを閉めてバルブ１９ｄを開け、シース液供給部１８からフローセル１７にシース液を供給する。そして、制御部３１は、中間貯留部２５によって濃縮された撮像用試料をジェットノズル１６から流路１７ａに送り出す。
【００６３】
ステップＳ３０２において、制御部３１は、粒子整列部２７を駆動して、流路１７ａに対して超音波を付与する。これにより、流路１７ａを流れる粒子は、流路１７ａの中心軸に沿って流れる。ステップＳ３０３において、制御部３１は、図５（ａ）のステップＳ１０２と同様、粒子検出部２０による検出を開始する。
【００６４】
図５（ａ）の処理では、図６（ａ）の処理とは異なり、粒子整列部２７は駆動されない。これは、粒子整列部２７が駆動されなくても、測定試料が第１速度で流路１７ａに流されると、測定試料に含まれる粒子は流路１７ａの中心軸に位置付けられやすいためである。しかしながら、帰還された撮像用試料は、第１速度よりも低速な第２速度で流路１７ａに流されるため、粒子がふらつく可能性がある。よって、図６（ａ）の処理では、粒子整列部２７が駆動される。
【００６５】
ステップＳ３０４において、制御部３１は、第１検出器１０８ａが受光する前方散乱光の強度に基づいて、検出位置２０ａに粒子が位置付けられたか否かを判定する。具体的には、制御部３１は、前方散乱光の強度が所定の閾値を超えると、検出位置２０ａに粒子が位置付けられたと判定する。検出位置２０ａに粒子が位置付けられると、ステップＳ３０５において、制御部３１は、粒子撮像部２８により検出位置２０ａに位置付けられた粒子を撮像する。具体的には、制御部３１は、光源１２１から検出位置２０ａに光を照射して、波長λ３、λ４、λ５の蛍光をそれぞれカメラ１２９、１３０、１３１により受光する。制御部３１は、カメラ１２９、１３０、１３１が出力する撮像信号に基づいて、検出位置２０ａの粒子の画像を生成する。ステップＳ３０５において、複数の画像がカメラ１２９、１３０、１３１で撮像されても良く、また、動画が撮像されても良い。
【００６６】
ステップＳ３０６において、制御部３１は、中間貯留部２５によって濃縮された撮像用試料が全てフローセル１７に供給され、全ての粒子が検出位置２０ａを通過したか否かを判定する。制御部３１は、全ての粒子が検出位置２０ａを通過するまで、ステップＳ３０４、Ｓ３０５の処理を繰り返す。全ての粒子が検出位置２０ａを通過すると、図６（ａ）の処理が終了する。こうして、フローセル１７に帰還された撮像用試料に含まれる全ての粒子について、画像が取得される。
【００６７】
このように、１巡目で粒子がＣＴＣである可能性が高いか否かの判定が行われ、２巡目で粒子の撮像が行われるため、速度変更部１９により、１巡目における測定試料の速度を、２巡目における撮像用試料の速度よりも高速に設定できる。よって、細胞検出装置１０による処理のスループットを高めることができる。
【００６８】
オペレータは、図４〜図６（ａ）の処理が終了すると、入力部３３を介して細胞検出装置１０に対して結果の表示指示を入力する。
【００６９】
図６（ｂ）に示すように、ステップＳ４０１において、制御部３１は、オペレータにより結果の表示指示が入力されたか否かを判定する。ステップＳ４０１でＹＥＳと判定すると、ステップＳ４０２において、制御部３１は、図６（ａ）のステップＳ３０５において取得した全ての粒子の画像を解析して、核内に１７番染色体に基づく輝点とＨｅｒ２遺伝子に基づく輝点とを含む細胞を抽出する。さらに、ステップＳ４０２において、制御部３１は、抽出した細胞の画像を解析して、細胞ごとにＨｅｒ２遺伝子の増幅がある細胞かを判定し、Ｈｅｒ２遺伝子の増幅がある細胞をＣＴＣとして抽出する。ここで、制御部３１は、１７番染色体に基づく２個の輝点と、Ｈｅｒ２遺伝子に基づく３個以上の輝点とを核内に含む細胞を、Ｈｅｒ２遺伝子の増幅がある細胞、すなわちＣＴＣとして抽出する。
【００７０】
ステップＳ４０３において、制御部３１は、ステップＳ４０２の抽出結果に基づいて、輝点を含む細胞の数と、Ｈｅｒ２遺伝子の増幅がある細胞（ＣＴＣ）の数とを、出力部３４に表示する。ステップＳ４０４において、制御部３１は、ステップＳ４０２で抽出した輝点を含む細胞の画像を、出力部３４に表示する。
【００７１】
図７（ａ）、（ｂ）に示すように、ステップＳ４０３、Ｓ４０４において、出力部３４には画面４０が表示される。画面４０には、輝点を含む細胞の数と、Ｈｅｒ２遺伝子の増幅がある細胞（ＣＴＣ）の数と、輝点を含む細胞の画像が表示される。オペレータは、細胞数を参照することにより、Ｈｅｒ２遺伝子の増幅が発生しているか否かを知ることができるため、医師等が最適な治療薬を決定するための有用な情報を提供できる。
【００７２】
横方向に並ぶ４枚の画像は、同じ１つの粒子についての画像である。左から順に４枚の画像は、それぞれ、１７番染色体の遺伝子を標識する色素により生じた蛍光の画像４１と、Ｈｅｒ２遺伝子を標識する色素により生じた蛍光の画像４２と、核を染色する色素により生じた蛍光の画像４３と、画像４１〜４３をマージした画像４４と、を示している。画像４１〜４４は、階調の反転を行った後、グレースケールに変換したものである。
【００７３】
図７（ａ）に示す粒子の画像は、Ｈｅｒ２遺伝子の増幅がない細胞の画像であり、図７（ｂ）に示す粒子の画像は、Ｈｅｒ２遺伝子の増幅がある乳がん細胞の画像である。輝点を含む粒子の画像が複数ある場合、オペレータは、画面４０上で粒子の画像を切り替えて表示できる。さらに、Ｈｅｒ２遺伝子の増幅がある細胞の画像の表示と、Ｈｅｒ２遺伝子の増幅がない細胞の画像の表示とを個別に表示可能なボタン等を、画面４０上に別途設けても良い。
【００７４】
画像４１の輝点の数は、１７番染色体の遺伝子の数を表している。画像４２の輝点の数は、Ｈｅｒ２遺伝子の数を表している。画像４３の輝点は核を表している。これにより、オペレータは、実際に画像を参照することにより、核内に、１７番染色体の遺伝子とＨｅｒ２遺伝子とが存在するか否かを知ることができる。また、Ｈｅｒ２遺伝子の増幅がないと、図７（ａ）に示すように、画像４１、４２の輝点は２個になり、Ｈｅｒ２遺伝子の増幅があると、図７（ｂ）に示すように、画像４１の輝点は２個になり、画像４２の輝点は２個よりも多くなる。これにより、オペレータは、実際に画像を参照することにより、Ｈｅｒ２遺伝子の増幅が発生しているか否かを知ることができる。
【００７５】
なお、ＣＴＣに発現するＥｐＣＡＭ抗原に特異的であり、かつ、磁性流体粒子と結合した抗体により、ＥｐＣＡＭ抗原を発現したＣＴＣを磁気標識することもできる。このようにＣＴＣを磁気標識する場合、測定試料を収容したチャンバに磁気勾配を印加する。こうすると、磁気標識されたＣＴＣがチャンバの観察表面に整列するため、観察表面を観察することにより、ＣＴＣの有無を検出できる。しかしながら、ＣＴＣにはＥｐＣＡＭ抗原を発現していないものが存在する場合があり、この手法では、ＥｐＣＡＭ抗原を発現していないＣＴＣを見逃してしまうことがある。実施形態１によれば、粒子撮像部２８により撮像される画像に基づいてＨｅｒ２遺伝子の増幅の有無が判定され、ＣＴＣであるか否かが判定される。よって、実施形態１によれば、ＣＴＣを見逃してしまう可能性を低減させることができる。
【００７６】
＜実施形態２＞
図８に示すように、実施形態２では、実施形態１と比較して、粒子撮像部２８は、集光レンズ１４１とカメラ１４２をさらに備え、ダイクロイックミラー１０４、１２３〜１２５の機能が変更されている。細胞検出装置１０の他の構成は、実施形態１と同様である。
【００７７】
実施形態２のダイクロイックミラー１０４は、波長λ１の前方散乱光の半分を反射し半分を透過する。検出位置２０ａの粒子から生じた波長λ１の前方散乱光のうち、半分はダイクロイックミラー１０４により反射され、半分はダイクロイックミラー１０４を透過し、さらにダイクロイックミラー１２３〜１２５を透過する。集光レンズ１４１は、波長λ１の前方散乱光を集光する。カメラ１４２は、波長λ１の前方散乱光を受光して、検出位置２０ａに位置付けられた粒子の画像情報を撮像信号として出力する。制御部３１は、帰還流路２３からフローセル１７に撮像用試料を帰還させた場合に、第１検出器１０８ａが受光する前方散乱光の強度に基づいて検出位置２０ａに粒子が位置付けられたと判定すると、カメラ１４２が出力する撮像信号に基づいて明視野画像を生成する。
【００７８】
実施形態２では、図６（ｂ）のステップＳ４０３、Ｓ４０４において、出力部３４に、図９（ａ）、（ｂ）に示す画面４０が表示される。図９（ａ）、（ｂ）に示す画面４０には、図７（ａ）、（ｂ）に示す画像４１〜４４に加えて、明視野の画像４５が示されている。実施形態２では、オペレータは、画像４１〜４４に加えて画像４５も併せて参照することにより、細胞の種類等を確認できる。
【００７９】
＜実施形態３＞
図１０に示すように、実施形態３では、実施形態１と比較して、粒子検出部２０の構成が相違する。実施形態３では、波長λ１の前方散乱光と波長λ２の蛍光を検出する構成として、光学ユニット１５１と、集光レンズ１５２と、カメラ１５３が用いられる。細胞検出装置１０の他の構成は、実施形態１と同様である。
【００８０】
光学ユニット１５１は、２枚のダイクロイックミラーが組み合わせられた構成を有する。光学ユニット１５１の２枚のダイクロイックミラーは、波長λ１の前方散乱光および波長λ２の蛍光を、互いに僅かに異なる角度で反射し、後述するカメラ１５３の受光面１５３ａ上において分離させる。光学ユニット１５１は、波長λ４、λ５、λ６の蛍光を透過する。集光レンズ１５２は、波長λ１の前方散乱光および波長λ２の蛍光を集光する。カメラ１５３は、波長λ１の前方散乱光および波長λ２の蛍光を受光して、検出位置２０ａに位置付けられた粒子の画像情報を撮像信号として出力する。
【００８１】
図１１に示すように、カメラ１５３は、受光面１５３ａ上の領域１６１、１６２において、それぞれ、波長λ１の前方散乱光および波長λ２の蛍光を受光する。受光面１５３ａは、カメラ１５３に配されたＣＭＯＳイメージセンサ等の撮像素子の受光面である。受光面１５３ａに照射される光の位置は、粒子が流路１７ａを移動することに合わせて、矢印で示すように、それぞれ領域１６１、１６２内で移動する。このように、光学ユニット１５１により２つの光が受光面１５３ａ上において分離されるため、制御部３１は、カメラ１５３が出力する撮像信号から各光に対応する信号を抽出できる。
【００８２】
制御部３１は、波長λ１の前方散乱光の強度と波長λ２の蛍光の強度を取得する場合、領域１６１から出力される信号を加算して波長λ１の前方散乱光の強度を取得し、領域１６２から出力される信号を加算して波長λ２の蛍光の強度を取得する。制御部３１は、取得した各強度を、図５（ａ）のステップＳ１０３において粒子の検出の際に参照する。粒子の画像を取得する場合、制御部３１は、上記と同様にして前方散乱光の強度を取得し、取得した強度を、図６（ａ）のステップＳ３０４において粒子が検出位置２０ａに位置付けられたか否かの判定の際に参照する。このとき、同時に、制御部３１は、領域１６１からの撮像信号を処理して、粒子の明視野画像を生成する。制御部３１は、生成した明視野画像を、図９（ａ）、（ｂ）と同様に表示する。
【００８３】
明視野画像が出力部３４に表示されると、実施形態２と同様、オペレータは、明視野画像も併せて参照することにより、細胞の種類等を確認できる。粒子検出部２０は、カメラ１５３に代えて、波長λ１の前方散乱光および波長λ２の蛍光をそれぞれ個別に受光するカメラを備えても良い。
【００８４】
＜実施形態４＞
図１２に示すように、実施形態４では、実施形態３と比較して、ダイクロイックミラー１２３〜１２５と、集光レンズ１２６〜１２８と、カメラ１２９〜１３１とが省略され、光学ユニット１５１の構成が変更されている。カメラ１５３の受光面には、後述する領域１６３、１６４、１６５がさらに追加されている。細胞検出装置１０の他の構成は、実施形態３と同様である。
【００８５】
光学ユニット１５１は、５枚のダイクロイックミラーが組み合わせられた構成を有する。光学ユニット１５１の５枚のダイクロイックミラーは、波長λ１の前方散乱光および波長λ２、λ４〜λ６の蛍光を、互いに僅かに異なる角度で反射し、カメラ１５３の受光面１５３ａ上において分離させる。集光レンズ１５２は、波長λ１の前方散乱光および波長λ２、λ４〜λ６の蛍光を集光する。カメラ１５３は、波長λ１の前方散乱光および波長λ２、λ４〜λ６の蛍光を受光して、検出位置２０ａに位置付けられた粒子の画像情報を撮像信号として出力する。
【００８６】
図１３に示すように、カメラ１５３は、受光面１５３ａ上の領域１６１〜１６５において、それぞれ、波長λ１の前方散乱光および波長λ２、λ４〜λ６の蛍光を受光する。このように、光学ユニット１５１により５つの光が受光面１５３ａ上において分離されるため、制御部３１は、カメラ１５３が出力する撮像信号から各光に対応する信号を抽出できる。領域１６１、１６２からの信号に基づく処理は、実施形態３と同様である。制御部３１は、帰還流路２３からフローセル１７に撮像用試料を帰還させた場合に、検出位置２０ａに粒子が位置付けられたと判定すると、カメラ１５３が出力する撮像信号に基づいて、領域１６１に照射される前方散乱光に対応する明視野画像と、領域１６３〜１６５に照射される蛍光に対応する画像を生成する。
【００８７】
実施形態４では、実施形態３と比較して、粒子撮像部２８のカメラ１２９〜１３１が省略され、粒子検出部２０のカメラ１５３が粒子撮像部２８の撮像に共用されている。よって、実施形態３と比較して、細胞検出装置１０の構成を簡素化できる。
【００８８】
＜実施形態５＞
図１４（ａ）に示すように、実施形態５では、実施形態１と比較して、回収流路５１と、バルブ５２と、ダイヤフラムポンプ５３と、回収部５４と、が追加されている。細胞検出装置１０の他の構成は、実施形態１と同様である。
【００８９】
回収流路５１は、中間貯留部２５とバルブ２６の間の帰還流路２３と、回収部５４と、を接続する。回収流路５１には、バルブ５２とダイヤフラムポンプ５３が配置されている。ダイヤフラムポンプ５３は、回収流路５１に陽圧および陰圧を加えることが可能に構成されている。ダイヤフラムポンプ５３が陰圧駆動されることにより、中間貯留部２５に貯留されている濃縮された撮像用試料が、ダイヤフラムポンプ５３内に引き込まれる。ダイヤフラムポンプ５３が陽圧駆動されることにより、ダイヤフラムポンプ５３に引き込まれた撮像用試料が、回収部５４に送り出される。
【００９０】
図１４（ｂ）に示すように、実施形態５では、実施形態１と比較して、図４の処理において、ステップＳ３に代えて、ステップＳ１１、Ｓ１２が追加されている。
【００９１】
ステップＳ１１において、制御部３１は、撮像処理を行う。具体的には、制御部３１は、後述する図１５に示す処理と、図５（ｂ）に示す処理とを並行して開始する。これにより、中間貯留部２５により濃縮が行われた撮像用試料が、再度フローセル１７に供給される。そして、再度フローセル１７に供給された撮像用試料に含まれる粒子は、粒子撮像部２８により撮像される。撮像された画像に基づいてＣＴＣであると判定された粒子のみが、再度、帰還流路２３に送られて中間貯留部２５に貯留され、それ以外の粒子は廃液貯留部２２に送られる。ステップＳ１２において、制御部３１は、濃縮処理と回収処理を行う。これにより、中間貯留部２５に貯留された撮像用試料の濃縮が行われる。そして、濃縮が行われた撮像用試料は、回収部５４に送られ、回収部５４に回収される。ステップＳ１２において、濃縮が行われることなく、撮像用試料が回収部５４に回収されても良い。
【００９２】
図１５に示す処理では、図６（ａ）に示す処理と比較して、ステップＳ３０５の後段に、ステップＳ３１１、Ｓ３１２が追加されている。
【００９３】
ステップＳ３１１において、制御部３１は、ステップＳ３０５において生成した画像を解析して、この画像が示す粒子の判定を行う。具体的には、制御部３１は、画像が示す粒子が、１７番染色体に基づく２個の輝点と、Ｈｅｒ２遺伝子に基づく３個以上の輝点とを核内に含む細胞であるか否か、すなわちＣＴＣであるか否かを判定する。ステップＳ３１２において、制御部３１は、粒子がＣＴＣであると判定した場合に、この粒子が検出位置２０ａを通過したタイミングを記憶する。
【００９４】
ＣＴＣであると判定された粒子は、図５（ｂ）に示す処理において、粒子選別部２１により帰還流路２３に送られる。こうして、ＣＴＣであると判定された全ての粒子が帰還流路２３に送られ、これら粒子を含む撮像用試料が、中間貯留部２５により濃縮された後、回収部５４に回収される。このように、ＣＴＣであると判定された粒子が回収部５４に回収されると、オペレータは、ＣＴＣであると判定された粒子に対して、顕微鏡で観察する等の診断が可能となる。
【００９５】
制御部３１は、帰還流路２３により帰還され粒子撮像部２８により撮像された撮像用試料を、全て帰還流路２３に送る処理を行っても良い。この場合、粒子撮像部２８により撮像され帰還流路２３に送られた撮像用試料は、中間貯留部２５により濃縮された後、回収部５４に回収される。こうすると、オペレータは、撮像された全ての粒子を顕微鏡で確認できる。
【００９６】
＜実施形態６＞
図１６（ａ）に示すように、実施形態６では、実施形態１と比較して、速度変更部１９は、流路１９ｆと、バルブ１９ｇと、オリフィス１９ｈと、をさらに備える。細胞検出装置１０の他の構成は、実施形態１と同様である。
【００９７】
流路１９ｆは、シース液供給部１８とフローセル１７とを繋ぐ流路において、流路１９ａ、１９ｂと並列に配置されている。流路１９ｆには、バルブ１９ｇとオリフィス１９ｈが配置されている。流路１９ｆの断面の径は、流路１９ａ、１９ｂの断面の径と同じである。オリフィス１９ｈの断面の径は、流路１９ｆの断面の径よりも小さく、オリフィス１９ｅの断面の径よりも大きい。バルブ１９ｇのみが開けられた状態のとき、シース液供給部１８から送り出されたシース液は、流路１９ｆを通ってフローセル１７に供給される。
【００９８】
ここで、シース液が流路１９ｆを通る場合にフローセル１７に供給されるシース液の単位時間当たりの流量をＶ３とすると、オリフィス１９ｈによって、Ｖ３は、Ｖ１よりも小さく、Ｖ２よりも大きくなる。したがって、フローセル１７に供給されるシース液の単位時間当たりの流量がＶ１、Ｖ３、Ｖ２のとき、流路１７ａを流れる測定試料の速度を、それぞれ、第１速度、第２速度、第３速度とすると、第２速度は、第１速度よりも低速で、第３速度よりも高速となる。
【００９９】
図１６（ｂ）に示すように、実施形態６では、実施形態１と比較して、図４の処理において、ステップＳ３に代えて、ステップＳ２１〜Ｓ２３が追加されている。
【０１００】
ステップＳ２１において、制御部３１は、撮像処理を行う。具体的には、制御部３１は、図１５に示す処理と、図５（ｂ）に示す処理とを並行して開始する。これにより、中間貯留部２５により濃縮が行われた撮像用試料が、再度フローセル１７に供給される。そして、再度フローセル１７に供給された撮像用試料に含まれる粒子は、粒子撮像部２８により撮像される。撮像された画像に基づいてＣＴＣであると判定された粒子のみが、帰還流路２３に送られ、それ以外の粒子は廃液貯留部２２に送られる。
【０１０１】
ステップＳ２２において、制御部３１は、ＣＴＣであると判定された粒子のみを含む撮像用試料を、中間貯留部２５により濃縮する。ステップＳ２３において、制御部３１は、撮像処理を行う。具体的には、制御部３１は、図１７に示す処理を開始する。これにより、中間貯留部２５により濃縮された撮像用試料が、再度フローセル１７に供給される。そして、再度フローセル１７に供給された撮像用試料に含まれる粒子は、粒子撮像部２８により撮像される。ステップＳ２３において撮像された撮像用試料は、廃液貯留部２２に送られる。ステップＳ２３において撮像された撮像用試料が、図１４（ａ）に示すような回収部により回収されても良い。
【０１０２】
図１７に示す処理では、図６（ａ）に示す処理と比較して、ステップＳ３０１に代えて、ステップＳ３２１が追加されている。ステップＳ３２１において、制御部３１は、中間貯留部２５によって濃縮された撮像用試料を、第２速度よりも遅い第３速度でフローセル１７に流す。
【０１０３】
このように、２巡目においてＣＴＣであると判定された粒子が、３巡目においてさらに低速でフローセル１７に流されるため、ＣＴＣと判定された粒子のみを高い解像度で撮像できる。また、３巡目の撮像の前に、２巡目で高速にＣＴＣの判定が行われＣＴＣ以外の粒子が除外される。これにより、３巡目において低速で撮像を行っても全体の処理時間を短く維持できる。
【０１０４】
第３速度による撮像を行うか否かをオペレータが設定可能であっても良い。第３速度による撮像を行わない場合、第２速度で撮像が行われる。また、第２速度による撮像の解析結果に基づいて、制御部３１が、第３速度による撮像を行うか否かを決定する構成であっても良い。この構成において、制御部３１は、第３速度による撮像を行わないと決定した場合、図１６（ｂ）のステップＳ２２で濃縮した撮像用試料を、たとえば、実施形態５と同様、回収部５４に回収する処理を実行する。測定試料および撮像用試料をフローセル１７に流す速度は、４段階以上であっても良い。
【０１０５】
＜実施形態７＞
被検細胞は、ＣＴＣに限られない。病状の判定および投薬の確認においては、たとえば、血管内皮細胞（CEC：Circulating Endothelial Cell）、血管内皮前駆細胞（EPC：Endothelial Progenitor Cell）、間葉系幹細胞（MSC：Mesenchymal Stem Cell）、造血幹細胞（HSC：Hematopoietic Stem Cell）、または抗原特異的Ｔ細胞等を撮像および検出することも有効である。これらの細胞は、これらの細胞に発現する表面抗原に対して蛍光標識された抗体を特異的に結合させることにより検出され得る。被検細胞は、実施形態１と同様、粒子撮像部２８で撮像された撮像画像を解析することにより検出される。
【０１０６】
実施形態７では、さらに、被検細胞に含まれるシグナル分子の細胞内の状態を確認することで、被検細胞の活性化状態が判定される。シグナル分子は、その挙動により被検細胞の機能性を評価可能な分子とされ得る。蛍光標識された抗体をシグナル分子に特異的に結合させることにより、シグナル分子が検出される。検出されたシグナル分子の状態を確認することにより、被検細胞の活性化状態等が判定される。シグナル分子の検出および活性化状態等の判定は、粒子撮像部２８で撮像された撮像画像を解析することにより行われる。
【０１０７】
被検細胞およびシグナル分子の蛍光標識に用いる色素は、実施形態１に例示された色素を用いても良いし、他の色素を用いても良い。蛍光標識に用いる抗体および色素に応じて、測定試料の調製で用いる試薬が変更される。また、これらの色素を励起する光の波長は、実施形態１のように単一の波長でも良く、あるいは、異なる波長であっても良い。各色素に蛍光を励起させる波長が互いに異なる場合、たとえば、図２に示す光源１２１は、マルチ発光レーザとされる。
【０１０８】
実施形態７においても、実施形態１と同様、まずは、図５（ａ）、（ｂ）のフローチャートにより被検細胞の選別が行われる。
【０１０９】
被検細胞が、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞または間葉系幹細胞である場合、測定試料の調製において、所定の試薬が検体に混和される。ここで混和される試薬は、赤血球を溶血する試薬と、白血球を検出するためのＣＤ４５の標識抗体を含む試薬と、被検細胞に発現する表面抗原に特異的に結合し色素で蛍光標識された抗体を含む試薬と、シグナル分子に特異的に結合し色素で蛍光標識された抗体を含む試薬と、核を染色する試薬である。実施形態１と同様、赤血球を溶血する試薬は省略されても良い。
【０１１０】
図５（ａ）のステップＳ１０３において、制御部３１は、実施形態１と同様の処理を実行する。制御部３１は、蛍光の強度が所定の閾値以下であり、かつ、前方散乱光の強度が所定の閾値以上である場合に、検出位置２０ａの粒子は被検細胞、すなわち血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞または間葉系幹細胞である可能性が高いと判定する。粒子が被検細胞である場合、粒子はＣＤ４５の標識抗体と結合しないため、蛍光の強度は所定値以下となる。ステップＳ１０３において、制御部３１は、白血球以外の粒子であり、かつ、粒子のサイズが大きい場合に、粒子が被検細胞、すなわち血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞または間葉系幹細胞である可能性が高いと判定する。
【０１１１】
被検細胞が、造血幹細胞である場合、測定試料の調製において、所定の試薬が検体に混和される。ここで混和される試薬は、赤血球を溶血する試薬と、造血幹細胞から分化する全ての血球を検出するための標識抗体を含む試薬と、造血幹細胞に発現する表面抗原に特異的に結合し色素で蛍光標識された抗体を含む試薬と、造血幹細胞中のシグナル分子に特異的に結合し色素で蛍光標識された抗体を含む試薬と、核を染色する試薬である。造血幹細胞から分化する全ての血球を検出するための標識抗体を含む試薬は、一般に、Lineageマーカーと呼ばれている。ここでは、Lineageマーカーの各抗体が同一の色素で標識される。実施形態１と同様、赤血球を溶血する試薬は省略されても良い。
【０１１２】
図５（ａ）のステップＳ１０３において、制御部３１は、蛍光の強度が所定の閾値以下であり、かつ、前方散乱光の強度が所定の閾値以上である場合に、検出位置２０ａの粒子は被検細胞、すなわち造血幹細胞である可能性が高いと判定する。粒子が被検細胞である場合、粒子はLineageマーカーと結合しないため、蛍光の強度は所定値以下となる。また、造血幹細胞は、造血幹細胞から分化した他の全ての血球よりも大きい。したがって、ステップＳ１０３において、蛍光の強度が所定の閾値以下であり、かつ、前方散乱光の強度が所定の閾値以上である場合、検出位置２０ａの粒子は、造血幹細胞である可能性が高い。
【０１１３】
被検細胞が、抗原特異的Ｔ細胞である場合、測定試料の調製において、所定の試薬が検体に混和される。ここで混和される試薬は、赤血球を溶血する試薬と、LineageマーカーからＣＤ２、ＣＤ３の抗体を除いた試薬と、Ｔ細胞に発現する表面抗原に特異的に結合するＣＤ３の標識抗体を含む試薬と、Ｔ細胞のうち抗原特異的Ｔ細胞に発現する表面抗原に特異的に結合し色素で標識されたＭＨＣテトラマーを含む試薬と、抗原特異的Ｔ細胞中のシグナル分子に特異的に結合し色素で蛍光標識された抗体を含む試薬と、核を染色する試薬である。ここでは、LineageマーカーからＣＤ２、ＣＤ３を除いた抗体は同一の色素で標識される。実施形態１と同様、赤血球を溶血する試薬は省略されても良い。
【０１１４】
図５（ａ）のステップＳ１０３において、制御部３１は、蛍光の強度が所定の閾値以下である場合に、検出位置２０ａの粒子はＴ細胞である可能性が高いと判定する。粒子がＴ細胞である場合、粒子はLineageマーカーと結合しないため、蛍光の強度は所定値以下となる。したがって、ステップＳ１０４において、蛍光の強度が所定の閾値以下である場合、検出位置２０ａの粒子は、Ｔ細胞である可能性が高い。
【０１１５】
こうして、被検細胞である可能性が高いか否かの判定を行った粒子に対し、制御部３１は、図５（ｂ）の処理を実行する。これにより、被検細胞の可能性が高いと判定された粒子が、流路１７ｃを介して帰還流路２３へと送られる。そして、制御部３１は、中間貯留部２５による濃縮を行って撮像用試料を再びフローセル１７に供給し、図６（ａ）に示す処理を実行して、被検細胞である可能性が高い粒子を順次撮像する。
【０１１６】
以上の処理により、制御部３１は、被検細胞、すなわち、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞または抗原特異的Ｔ細胞である可能性が高い粒子の画像を生成する。生成される画像には、被検細胞に発現する表面抗原に特異的に結合する標識抗体の蛍光の画像と、被検細胞中のシグナル分子に特異的に結合する標識抗体の蛍光の画像とが含まれる。カメラ１２９〜１３１は、各標識抗体から生じる異なる波長の蛍光を受光して、蛍光ごとに画像情報を出力する。図８の構成の場合には、カメラ１４２からの撮像信号から、さらに粒子の明視野画像が生成される。
【０１１７】
撮像処理が終了すると、オペレータは、入力部３３を介して細胞検出装置１０に対して結果の表示指示を入力する。
【０１１８】
図１８に示すように、オペレータにより結果の表示指示が入力され、ステップＳ４１１でＹＥＳと判定すると、ステップＳ４１２において、制御部３１は、撮像した全ての粒子の画像を画像解析して、被検細胞を抽出する。
【０１１９】
被検細胞が血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、間葉系幹細胞または造血幹細胞である場合、制御部３１は、ステップＳ４１２において、被検細胞に発現する抗体と特異的に結合する標識色素の画像を粒子ごとに参照し、この画像に所定強度を超える蛍光の領域が含まれているか否かを判定する。画像に蛍光の領域が含まれている場合、制御部３１は、判定対象の粒子が被検細胞であると判定する。
【０１２０】
被検細胞が抗原特異的Ｔ細胞である場合、制御部３１は、ステップＳ４１２において、まず、Ｔ細胞に発現する抗体と特異的に結合するＣＤ３の標識色素の画像を粒子ごとに参照し、この画像に所定強度を超える蛍光の領域が含まれているか否かを判定する。画像に蛍光の領域が含まれている場合、制御部３１は、判定対象の粒子がＴ細胞であると判定する。さらに、制御部３１は、抗原特異的Ｔ細胞に発現する表面抗原に結合するＭＨＣテトラマーの標識色素の画像を、Ｔ細胞であると判定した粒子ごとに参照し、この画像に所定強度を超える蛍光の領域が含まれているか否かを判定する。画像に蛍光の領域が含まれている場合、制御部３１は、判定対象の粒子が抗原特異的Ｔ細胞であると判定する。
【０１２１】
さらに、ステップＳ４１３において、制御部３１は、抽出した被検細胞の画像を解析して、細胞ごとに活性化の有無を判定し、活性化がある被検細胞を抽出する。ここで、制御部３１は、シグナル分子に特異的に結合する標識色素の画像を参照し、細胞内におけるシグナル分子の状態を検出する。制御部３１は、検出したシグナル分子の状態に基づいて、被検細胞の活性化の有無を判定する。
【０１２２】
たとえば、被検細胞が血管内皮細胞（ＣＥＣ）である場合、シグナル分子はＮＦκＢとされ得る。ステップＳ４１３において、制御部３１は、シグナル分子であるＮＦκＢが核内に局在しているか否かにより、血管内皮細胞の活性化の有無を判定する。血管内皮細胞は、血管の内壁から剥離して血液中に流れ込む。血管内皮細胞の剥離は、炎症による刺激の他、圧迫等による圧力の変化によっても生じる。制御部３１は、これらの剥離原因のうち炎症による刺激によって生じた剥離を、シグナル分子であるＮＦκＢが核内に局在しているか否かによって判定する。制御部３１は、炎症による刺激によって剥離した血管内皮細胞を、活性化がある血管内皮細胞として抽出する。
【０１２３】
図１９（ａ）に示すように、炎症による刺激によって剥離した血管内皮細胞では、ＮＦκＢが核内に局在する傾向にある。図１９（ａ）の左図には、核の蛍光画像が示されている。図１９（ａ）の左図では、便宜上、核の輪郭を示す破線が付記されている。図１９（ａ）の右図には、シグナル分子であるＮＦκＢの蛍光画像が示され、さらに、左図の核に対応する領域が破線で示されている。図１９（ａ）の左図および右図では、それぞれ、黒に近づくほど核からの蛍光およびＮＦκＢからの蛍光の強度が高くなっている。図１９（ａ）の例では、シグナル分子であるＮＦκＢが核内に局在していることが分かる。
【０１２４】
図１９（ｂ）の例では、シグナル分子であるＮＦκＢが核内には局在していない。図１９（ｂ）の右図では、破線の領域が核の領域である。このように、炎症による刺激以外の刺激によって剥離した血管内皮細胞では、ＮＦκＢが核内に局在しない傾向にある。制御部３１は、シグナル分子の蛍光の画像を解析し、シグナル分子であるＮＦκＢが核内に局在しているか否かによって、血管内皮細胞の活性化の有無を判定する。
【０１２５】
被検細胞が血管内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞または抗原特異的Ｔ細胞である場合も、同様に、制御部３１は、シグナル分子の局在位置に基づいて、これら細胞の機能性を評価し、傷害等の要因により増加した細胞を活性化がある細胞として抽出する。たとえば、被検細胞が血管内皮前駆細胞または間葉系幹細胞である場合、制御部３１は、シグナル分子の局在位置に基づいて、これら細胞の修復能を評価し、修復能が高い細胞を活性化がある細胞として抽出する。
【０１２６】
なお、被検細胞の機能性の評価は、シグナル分子の局在位置に限らず、他の要素により行われても良い。機能性の評価に用いる要素に応じて、シグナル分子の種類も適宜変更され得る。
【０１２７】
図１８に戻り、ステップＳ４１４において、制御部３１は、ステップＳ４１２、Ｓ４１３において抽出した被検細胞の数と、活性化がある被検細胞の数とを出力部３４に表示する。ステップＳ４１５において、制御部３１は、被検細胞の画像を出力部３４に表示する。たとえば、被検細胞が血管内皮細胞（ＣＥＣ）である場合、ステップＳ４１４、Ｓ４１５において、出力部３４に図２０（ａ）、（ｂ）に示す画面６０が表示される。
【０１２８】
画面６０には、血管内皮細胞（ＣＥＣ）の数と、活性化がある血管内皮細胞（ＣＥＣ）の数と、血管内皮細胞（ＣＥＣ）の画像が表示される。オペレータは、血管内皮細胞（ＣＥＣ）の数を参照することにより、血液中で血管内皮細胞が増加しているか否かを知ることができる。また、活性化がある血管内皮細胞（ＣＥＣ）の数を参照することにより、活性化状態にある血管内皮細胞の割合を把握ことができる。これらの情報は、医師等の治療の指針を決定するための有用な情報となり得る。
【０１２９】
横方向に並ぶ２枚の画像は、同じ１つの粒子についての画像である。画像６１は、核に特異的に結合する標識抗体により生じた蛍光の画像であり、画像６２は、シグナル分子に特異的に結合する標識抗体により生じた蛍光の画像である。上記のように、シグナル分子は、血管内皮細胞に含まれるタンパク質であるＮＦκＢである。血管内皮細胞の検出には、血管内皮細胞に発現する抗原に特異的に結合するＣＤ１４６の標識抗体が用いられる。なお、画像６１、６２は、階調の反転を行った後、グレースケールに変換したものである。画像６１、６２とともに、明視野の画像がさらに画面６０に含まれても良い
【０１３０】
図２０（ａ）に示す粒子の画像は、活性化がある血管内皮細胞の画像であり、図２０（ｂ）に示す粒子の画像は、活性化がない血管内皮細胞の画像である。血管内皮細胞の粒子の画像が複数ある場合、オペレータは、画面６０上で粒子の画像を切り替えて表示できる。さらに、活性化がある血管内皮細胞の画像の表示と、活性化がない血管内皮細胞の画像の表示とを個別に表示可能なボタン等を、画面６０上に別途設けても良い。
【０１３１】
実施形態７では、ＣＴＣの他、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞または抗原特異的Ｔ細胞等の、病状の判定および投薬の確認において有用な細胞の画像が取得され、これら細胞の画像が、抽出された細胞の数とともに、オペレータの要求に応じて表示される。医師等は、表示された情報を、治療の指針の決定に役立てることができる。
【０１３２】
たとえば、心筋梗塞や脳梗塞に罹患した患者は、健常者に比べて血管内皮細胞の数が増加する。また、組織に損傷があると、健常者に比べて血管内皮前駆細胞および間葉系幹細胞の数が増加する。したがって、医師等は、これらの細胞の数を把握することにより、患者が心筋梗塞等の疾患に罹患している可能性や患者の組織に損傷が生じている可能性を把握できる。
【０１３３】
さらに、実施形態７では、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞または抗原特異的Ｔ細胞の活性化状態が、シグナル分子の挙動に基づいて検出され表示される。このように、被検細胞の活性化状態がさらに表示されることにより、被検細胞の検出結果の特異性がさらに高められ得る。
【０１３４】
たとえば、被検細胞が血管内皮細胞である場合、図２０（ａ）、（ｂ）に示すように、血管内皮細胞（ＣＥＣ）の数とともに活性化がある血管内皮細胞（ＣＥＣ）の数が表示される。これにより、医師等は、炎症による刺激によって剥離した血管内皮細胞の数を正確に把握でき、患者が心筋梗塞等の疾患に罹患している可能性をより的確に把握できる。また、最近では、特定の抗原に応答するＴ細胞が免疫療法に利用されている。たとえば、癌細胞に特異的に応答できるＴ細胞を血中に戻し、その効能をモニタリングすることが治療法として試行されつつある。実施形態７では、このモニタリングにおいて、抗原特異的Ｔ細胞の活性化状態をその細胞数および画像により、医師等に提示できる。これにより、医師等は、この免疫治療の効果を確認できる。
【０１３５】
＜実施形態８＞
実施形態８では、ＣＴＣと判定された粒子およびＣＥＣと判定された粒子が回収される。実施形態８では、測定試料の調製において、実施形態１と比較して、さらに実施形態７で示したＣＥＣを検出するための試薬が混和される。また、実施形態８では、光源１２１は、ＣＴＣとＣＥＣをそれぞれ撮像するための、２種類の波長の光を出射するよう構成されている。
【０１３６】
図２１に示すように、実施形態８では、実施形態１と比較して、フローセル１７は、回収出口１７４をさらに備え、内部に流路１７ｅをさらに備える。流路１７ｅは、流路１７ａと流路１７ｂとの間において流路１７ａから分岐し、回収出口１７４に繋がっている。粒子選別部２１は、部材２１ｂ、２１ｃをさらに備える。細胞検出装置１０は、回収流路７１と、バルブ７２と、中間貯留部７３と、バルブ７４、７５と、ダイヤフラムポンプ７６、７７と、回収部７８、７９と、をさらに備える。回収流路７１は、フローセル１７の回収出口１７４と繋がっている。細胞検出装置１０の他の構成は、実施形態１と同様である。
【０１３７】
粒子選別部２１は、部材２１ｂ、２１ｃをそれぞれ流路１７ｃ、１７ｅに突出させる。部材２１ａが流路１７ｂを開放する位置に位置付けられると、分岐位置１７ｄにある粒子は、流路１７ｂを経由して廃液貯留部２２に送られる。部材２１ｂが流路１７ｃを開放する位置に位置付けられ、部材２１ａ、２１ｃがそれぞれ流路１７ｂ、１７ｅを塞ぐ位置に位置付けられると、分岐位置１７ｄにある粒子は、流路１７ｃを経由して帰還流路２３に送られる。部材２１ｃが流路１７ｅを開放する位置に位置付けられ、部材２１ａ、２１ｂがそれぞれ流路１７ｂ、１７ｃを塞ぐ位置に位置付けられると、分岐位置１７ｄにある粒子は、流路１７ｅを経由して回収流路７１に送られる。
【０１３８】
図２２に示すように、オペレータにより開始指示が入力されると、ステップＳ３１において、制御部３１は検出処理を行う。これにより、試料容器１０ｂの測定試料がフローセル１７に供給され、この測定試料に含まれる粒子が、粒子検出部２０により検出される。受光部１０８が受光する前方散乱光と蛍光に基づいて、検出位置２０ａに位置付けられた粒子が、ＣＴＣまたはＣＥＣである可能性が高いか否かが判定される。具体的には、波長λ２の蛍光の強度が所定の閾値以下であり、かつ、波長λ１の前方散乱光の強度が所定の閾値以上である場合に、制御部３１は、検出位置２０ａの粒子がＣＴＣまたはＣＥＣである可能性が高い粒子と判定する。
【０１３９】
ＣＴＣまたはＣＥＣである可能性が高い粒子は、流路１７ｃを介して帰還流路２３に送られる。それ以外の粒子は、流路１７ｂを介して廃液貯留部２２に送られる。ステップＳ３２において、制御部３１は、帰還流路２３に送られた撮像用試料を中間貯留部２５により濃縮する。
【０１４０】
ステップＳ３３において、制御部３１は撮像処理を行う。これにより、中間貯留部２５により濃縮された撮像用試料が再度フローセル１７に供給され、この撮像用試料に含まれる粒子が、粒子撮像部２８により撮像される。このとき、光源１２１は、ＣＴＣを撮像するための波長の光を出射する。粒子撮像部２８により取得される蛍光画像に基づいて、粒子がＣＴＣであるか否かが判定される。ＣＴＣと判定された粒子は、流路１７ｅを介して回収流路７１に送られ、ＣＴＣでないと判定された粒子は、流路１７ｃを介して帰還流路２３に送られる。
【０１４１】
ステップＳ３４において、制御部３１は、回収流路７１に送られた撮像用試料に対して中間貯留部７３による濃縮処理を行い、中間貯留部７３によって濃縮された撮像用試料を回収部７８に回収する。これにより、ＣＴＣと判定された粒子が、回収部７８に回収される。一方、ステップＳ３５において、制御部３１は、帰還流路２３に送られた撮像用試料を中間貯留部２５により濃縮する。
【０１４２】
ステップＳ３６において、制御部３１は撮像処理を行う。これにより、中間貯留部２５により濃縮された撮像用試料が再度フローセル１７に供給され、この撮像用試料に含まれる粒子が、粒子撮像部２８により撮像される。このとき、光源１２１は、ＣＥＣを撮像するための波長の光を出射する。粒子撮像部２８により取得される蛍光画像に基づいて、粒子がＣＥＣであるか否かが判定される。ＣＥＣと判定された粒子は、流路１７ｅを介して回収流路７１に送られ、ＣＥＣでないと判定された粒子は、流路１７ｂを介して廃液貯留部２２に送られる。
【０１４３】
ステップＳ３７において、制御部３１は、回収流路７１に送られた撮像用試料に対して中間貯留部７３による濃縮処理を行い、中間貯留部７３によって濃縮された撮像用試料を回収部７９に回収する。これにより、ＣＥＣと判定された粒子が、回収部７９に回収される。
【０１４４】
実施形態８によれば、細胞検出装置１０による１回の動作により、ＣＴＣの画像およびＣＥＣの画像を取得することができ、さらにＣＴＣおよびＣＥＣを個別に回収できる。これにより、ＣＴＣの撮像および回収と、ＣＥＣの撮像および回収とを別々に行う場合に比べて、オペレータの手間を省略でき、処理にかかる時間を短縮できる。回収される粒子は、ＣＴＣおよびＣＥＣに限られず、ＥＰＣ等、さらに他の粒子であっても良い。
【符号の説明】
【０１４５】
１０  細胞検出装置
１０ａ  試料供給部
１７  フローセル
１７ａ  流路
１８  シース液供給部
１９  速度変更部
２０  粒子検出部
２０ａ  検出位置
２１  粒子選別部
２３  帰還流路
２５  中間貯留部
２７  粒子整列部
２８  粒子撮像部
３１  制御部
３４  出力部
５４、７８、７９  回収部
１０１  光源
１０８  受光部
１０８ａ  第１検出器
１０８ｂ  第２検出器
１５１  光学ユニット
１５３  カメラ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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