(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを生産するための方法であって、該方法は：
Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、および該被験体のＭＨＣ型の情報を解析装置に入力するステップ；
Ｂ）該解析装置に、該疾患組織に特異的な変異に関する情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析させるステップ；ならびに
Ｃ）該エピトープの情報に基づいてペプチドを生産するステップ
を包含し、
該Ｂ）ステップは、該疾患組織に特異的な変異を参照情報データベースに基づきアノテーションを該解析装置に行わせ候補変異を同定するステップを含み、その後、該候補変異の核酸情報をアミノ酸情報に変換して野生型（ＷＴ）ペプチドおよび変異型（ＭＴ）ペプチドを生産し、その後該ＭＨＣ型と、該ＷＴペプチドおよび該ＭＴペプチドとを用いて該解析装置にエピトープ探索を行わせた上で、エピトープの順位付けを行って該解析装置にエピトープリストを出力させることを包含し、
該順位付けは、該変異の優先順位付け、遺伝子発現の有無およびペプチドの優先順位付けからなる群より選択される少なくとも１つの要素を考慮して行われ、
該順位付けは、ＨＬＡ−ペプチド間のＩＣ５０の値、ヒットが見出されるエピトープ探索プログラムの数、ヒットが見出される変異探索ソフトウエアの数の順に適用することでソートされる、方法。
【請求項２】
前記疾患組織に特異的な変異は、前記被験体のゲノムリードおよびその変異に関する情報に基づいて導出されることを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ゲノムリードは、エキソームリードを包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は、それぞれ、前記被験体の正常な試料および前記被験体の前記疾患に罹患した試料から得られ、該ゲノムリードおよびその変異に関する情報をマッピングした後前記疾患組織に特異的な変異を探索し、前記疾患組織に特異的な変異を同定する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記Ａ）ステップは、さらに前記被験体のＲＮＡリードの情報を前記解析装置に入力することを包含し、前記Ｂ）ステップは該解析装置に該ＲＮＡリードの情報にも基づいて前記変異に関するエピトープを解析させることを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡリードは疾患組織のＲＮＡリードを含み、該疾患組織のＲＮＡリードをマッピングして変異を探索し、および／または発現量を導出するステップをさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡリードの情報は正常組織のＲＮＡリードを含み、該正常組織のＲＮＡリードをマッピングして体細胞変異を探索し、および／または発現量を導出し、前記疾患組織のＲＮＡリードに基づいて導出された発現量と比較するステップをさらに包含する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＨＣ型は、前記被験体のゲノムリードから導出される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｂ）ステップは、以下：
Ｂ−１）前記解析装置に前記疾患組織に特異的な変異に対して、既存のデータベースに基づくアノテーションおよび核酸アミノ酸変換を行わせて、野生型ペプチドおよび疾患特異的変異ペプチドの情報を導出するステップ；
Ｂ−２）前記ＭＨＣ型、該野生型ペプチドおよび該疾患特異的変異ペプチドを用いて、公知のデータベースを用いて該解析装置に該疾患に特異的なエピトープ探索を行わせるステップ；ならびに
Ｂ−３）該解析装置に、得られたエピトープのペプチド配列、ＭＨＣ情報（遺伝子型および該エピトープのＭＨＣへの親和性）ならびに変異情報（染色体、位置、変異パターン（野生型／変異型）、信頼性、優先度、および該当遺伝子（遺伝子名、発現量））からスコアを算出させ、優先すべきエピトープの順位付けを行うステップ
から選択される少なくとも１つのステップを包含し、
前記Ｃ）ステップは、
Ｃ−１）該順位付けに基づきペプチドを生産するステップを包含する、
請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は同じ被験体から得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は異なる被験体から得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は、正常組織および前記疾患の組織から得られる、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ゲノムリードのマッピングはｂｗａ（商標）、ｂｏｗｔｉｅ（商標）、またはｎｏｖｏａｌｉｇｎ（商標）、あるいはそれらの組合せを用いて行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記ゲノムリードの変異の探索は、ＭｕＴｅｃｔ（商標）、ＶａｒＳｃａｎ（商標）またはlofreq（商標）あるいはそれらの組合せを含む変異探索プログラムを用いて行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記アノテーションは、ｒｅｆＧｅｎｅ（商標）、ｅｎｓＥｍｂｌ（商標）から選択される遺伝子構造データベース、および／またはdbSNP（商標）、cosmic（商標）、1000  genomes（商標）、およびwhole  exome  features（商標）からなる群より選択される変異既知情報のデータベースを用い、ANNOVAR（商標）およびsnpEff（商標）からなる群より選択されるプログラムを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡリードのマッピングは、TopHat（商標）およびＳＴＡＲ（商標）からなる群より選択されるプログラムを用いて行われる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＮＡの変異の探索は、ＭｕＴｅｃｔ（商標）、ＶａｒＳｃａｎ（商標）、GATK（登録商標）およびsamtools（商標）からなる群より選択される変異探索プログラムを用いて行われる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１８】
前記RNAの発現量の導出は、CuffLinks（商標）およびＥｒａｎｇｅ（商標）からなる群より選択される変異探索プログラムを用いて行われる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＭＨＣ型の導出はHLAminer（商標）、Athlates（商標）、Sting  HLA（商標）、HLA  caller（商標）、OptiType（商標）、およびomixon（商標）からなる群より選択されるソフトウエアを用いて行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験体はヒトであり、前記ＭＨＣはＨＬＡである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記エピトープ探索は、NetMHCpan（商標）、NetHMC（商標）、NetMHCcons（商標）、およびPickPocket（商標）からなる群より選択されるエピトープ探索プログラムを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記変異の優先順位付けは、ヒットが見出される変異探索プログラムの数の多少およびＲＮＡレベルでの変異の証拠の有無からなる群より選択される少なくとも１つの要素が考慮される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記遺伝子発現の有無は、前記ＲＮＡリードをマッピングし算出されたfpkmもしくはrpkmの値が正であるか否かで判断される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチドの優先順位付けは、ヒットが見出されるエピトープ探索プログラムの数の多少、ヒットが見出される変異探索ソフトウエアの数の多少およびＨＬＡ−ペプチド間のＩＣ５０＜５００ｎＭの値からなる群より選択される少なくとも１つの要素が考慮される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記疾患は腫瘍または自己免疫疾患である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ステップＡ）は、
Ａ−１）前記解析装置に前記被験体のゲノムの配列決定を行って該被験体のゲノムリードおよびその変異に関する情報を得、該ゲノムリードおよびその変異に関する情報をマッピングした後前記疾患組織に特異的な変異を探索させ、前記疾患組織に特異的な変異を得るステップ、
Ａ−２）該解析装置に該被験体のＲＮＡの配列決定を行って該被験体のＲＮＡリードの情報を得、該疾患組織のＲＮＡリードをマッピングして変異を探索させ、および／または発現量を導出させ、必要に応じて正常組織のＲＮＡリードをマッピングして体細胞変異を探索させ、および／または発現量を導出させ、該疾患組織のＲＮＡリードに基づいて導出された発現量と比較するステップ、および
Ａ−３）該解析装置に必要に応じて該被験体のゲノムリードを用いて該被験体のＭＨＣタイピングを行わせて該被験体のＭＨＣ型の情報を得るステップ
からなる群より選択される少なくとも１つを行うことを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定する方法であって、
Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、および該被験体のＭＨＣ型の情報を解析装置に入力するステップ；および
Ｂ）該解析装置に該疾患組織に特異的な変異に関する情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析させるステップを包含し、
該Ｂ）ステップは、該疾患組織に特異的な変異を参照情報データベースに基づきアノテーションを該解析装置に行わせ候補変異を同定するステップを含み、その後、該候補変異の核酸情報をアミノ酸情報に変換して野生型（ＷＴ）ペプチドおよび変異型（ＭＴ）ペプチドを生産し、その後該ＭＨＣ型と、該ＷＴペプチドおよび該ＭＴペプチドとを用いて該解析装置にエピトープ探索を行わせた上で、エピトープの順位付けを行って該解析装置にエピトープリストを出力させることを包含し、
該順位付けは、該変異の優先順位付け、遺伝子発現の有無およびペプチドの優先順位付けからなる群より選択される少なくとも１つの要素を考慮して行われ、
該順位付けは、ＨＬＡ−ペプチド間のＩＣ５０の値、ヒットが見出されるエピトープ探索プログラムの数、ヒットが見出される変異探索ソフトウエアの数の順に適用することでソートされる、方法。
【請求項２８】
被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを生産する装置であって、該装置は：
Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のＲＮＡリードの情報および該被験体のＭＨＣ型の情報を入力する情報入力ユニット；
Ｂ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該ｍＲＮＡ配列情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析するエピトープ解析ユニット；ならびに
Ｃ）該エピトープの情報に基づいてペプチドを生産するペプチド生産ユニット
を包含し、
該ユニットＢにおいて、該疾患組織に特異的な変異を参照情報データベースに基づきアノテーションを行って候補変異が同定され、その後、該候補変異の核酸情報をアミノ酸情報に変換して野生型（ＷＴ）ペプチドおよび変異型（ＭＴ）ペプチドが生産され、その後該ＭＨＣ型と、該ＷＴペプチドおよび該ＭＴペプチドとを用いてエピトープ探索を行った上で、エピトープの順位付けを行ってエピトープリストが出力され、
該順位付けは、該変異の優先順位付け、遺伝子発現の有無およびペプチドの優先順位付けからなる群より選択される少なくとも１つの要素を考慮して行われ、
該順位付けは、ＨＬＡ−ペプチド間のＩＣ５０の値、ヒットが見出されるエピトープ探索プログラムの数、ヒットが見出される変異探索ソフトウエアの数の順に適用することでソートされる、装置。
【請求項２９】
前記ユニットＡは、前記被験体のゲノムを配列決定する手段、前記被験体の疾患組織に特異的な変異を決定する手段、前記被験体のＲＮＡの配列決定手段および前記被験体のＭＨＣタイピングの手段の少なくとも１つを含む、請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定する装置であって、
Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のＲＮＡリードの情報および該被験体のＭＨＣ型の情報を入力する情報入力ユニット；ならびに
Ｂ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該ｍＲＮＡ配列情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析し、その結果を該疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドとして出力するエピトープ解析ユニット
を包含し、
該ユニットＢにおいて、該疾患組織に特異的な変異を参照情報データベースに基づきアノテーションを行って候補変異が同定され、その後、該候補変異の核酸情報をアミノ酸情報に変換して野生型（ＷＴ）ペプチドおよび変異型（ＭＴ）ペプチドが生産され、その後該ＭＨＣ型と、該ＷＴペプチドおよび該ＭＴペプチドとを用いてエピトープ探索を行った上で、エピトープの順位付けを行ってエピトープリストが出力され、
該順位付けは、該変異の優先順位付け、遺伝子発現の有無およびペプチドの優先順位付けからなる群より選択される少なくとも１つの要素を考慮して行われ、
該順位付けは、ＨＬＡ−ペプチド間のＩＣ５０の値、ヒットが見出されるエピトープ探索プログラムの数、ヒットが見出される変異探索ソフトウエアの数の順に適用することでソートされる、装置。
【請求項３１】
前記ユニットＡは、前記被験体のゲノムを配列決定する手段、前記被験体の疾患組織に特異的な変異を決定する手段、前記被験体のＲＮＡの配列決定手段および前記被験体のＭＨＣタイピングの手段の少なくとも１つを含む、請求項３０に記載の装置。
【請求項３２】
被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定するための方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のＲＮＡリードの情報および該被験体のＭＨＣ型の情報を入力するステップ；ならびに
Ｂ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該ｍＲＮＡ配列情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析し、その結果を該疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドとして出力するステップ
を包含し、
該Ｂ）ステップは、該疾患組織に特異的な変異を参照情報データベースに基づきアノテーションを行って候補変異を同定するステップを含み、その後、該候補変異の核酸情報をアミノ酸情報に変換して野生型（ＷＴ）ペプチドおよび変異型（ＭＴ）ペプチドを生産し、その後該ＭＨＣ型と、該ＷＴペプチドおよび該ＭＴペプチドとを用いてエピトープ探索を行った上で、エピトープの順位付けを行ってエピトープリストを出力することを包含し、
該順位付けは、該変異の優先順位付け、遺伝子発現の有無およびペプチドの優先順位付けからなる群より選択される少なくとも１つの要素を考慮して行われ、
該順位付けは、ＨＬＡ−ペプチド間のＩＣ５０の値、ヒットが見出されるエピトープ探索プログラムの数、ヒットが見出される変異探索ソフトウエアの数の順に適用することでソートされる、プログラム。
【請求項３３】
被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定するための方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを格納したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のＲＮＡリードの情報および該被験体のＭＨＣ型の情報を入力するステップ；ならびに
Ｂ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該ｍＲＮＡ配列情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析し、その結果を該疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドとして出力するステップ
を包含し、
該Ｂ）ステップは、該疾患組織に特異的な変異を参照情報データベースに基づきアノテーションを行って候補変異を同定するステップを含み、その後、該候補変異の核酸情報をアミノ酸情報に変換して野生型（ＷＴ）ペプチドおよび変異型（ＭＴ）ペプチドを生産し、その後該ＭＨＣ型と、該ＷＴペプチドおよび該ＭＴペプチドとを用いてエピトープ探索を行った上で、エピトープの順位付けを行ってエピトープリストを出力することを包含し、
該順位付けは、該変異の優先順位付け、遺伝子発現の有無およびペプチドの優先順位付けからなる群より選択される少なくとも１つの要素を考慮して行われ、
該順位付けは、ＨＬＡ−ペプチド間のＩＣ５０の値、ヒットが見出されるエピトープ探索プログラムの数、ヒットが見出される変異探索ソフトウエアの数の順に適用することでソートされる、記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法のための診断、モニタリングおよび治療剤の設計および製造に関する。より詳細には、ゲノム（例えば、エキソーム）、ｍＲＮＡの情報、ＭＨＣの情報その他生体情報に基づいて、エピトープを解析し、その結果に基づいて免疫療法に有用なペプチドを設計する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の医学、生物学の発展、特に次世代シーケンサ（ＮＧＳ）の急速な進歩に伴いがん細胞の全ゲノム解析も比較的容易となり、細胞がん化に関連する遺伝子変化も各個人のレベルで解析することが可能となっている。それに伴い変異遺伝子の機能を制御する分子標的治療薬を用いた個別化治療が臨床医学分野では一般化されつつあるが、変異遺伝子産物（ネオ抗原）を標的とした特異的がん免疫療法に関しては十分には検討されていない（非特許文献１）。【０００３】
変異遺伝子については、ｍｕｔａｎｏｍｅ解析と呼ばれる、網羅的な変異体のデータベースに基づく解析もなされている。ｍｕｔａｎｏｍｅ解析では、タンパク質に様々なアミノ酸置換変異を網羅的に導入し、各変異体の構造と機能を測定することにより、配列・構造・機能のデータベースを構築し、このデータベースを解析し、配列情報のみからタンパク質の構造・機能を予測する方法を開発することが目的とされている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Schumacher  TN,  et  al.,  (2015)  Science,  348(6230),  69-74,  doi:  10.1126/science.aaa4971,  PMID:25838375
【非特許文献２】Castle  JC,  et  al.,  (2012)  Cancer  Res.,  72(5),  1081-1089,  doi:  10.1158/0008-5472.CAN-11-3722.  Epub  2012  Jan  11.,  PMID:22237626
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意検討した結果、被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを生産するための方法を開発した。ここでは、被験体のゲノムリード（例えば、エキソームリード）およびその変異に関する情報、必要に応じて該被験体のＲＮＡ配列の情報および該被験体のＭＨＣ型の情報を入手し、ゲノムリード（例えば、エキソームリード）および該変異に関する情報、任意の該ＲＮＡ配列情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析し、必要に応じてエピトープの情報に基づいてペプチドを生産することによって達成される。【０００６】
したがって、例えば、本発明は以下を提供する。
（１）被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを生産するための方法であって、該方法は：
Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、および該被験体のＭＨＣ型の情報を解析装置に入力するステップ；
Ｂ）該解析装置に、該疾患組織に特異的な変異に関する情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析させるステップ；ならびに
Ｃ）該エピトープの情報に基づいてペプチドを生産するステップ
を包含する、方法。
（２）前記Ｂ）ステップは、前記疾患組織に特異的な変異を参照情報データベースに基づきアノテーションを前記解析装置に行わせ候補変異を同定するステップを含み、その後、該候補変異の核酸情報をアミノ酸情報に変換して野生型（ＷＴ）ペプチドおよび変異型（ＭＴ）ペプチドを生産し、その後前記ＭＨＣ型と、該ＷＴペプチドおよび該ＭＴペプチドとを用いて該解析装置にエピトープ探索を行わせた上で、エピトープの順位付けを行って該解析装置にエピトープリストを出力させることを包含する、上記項目に記載の方法。
（３）前記疾患組織に特異的な変異は、前記被験体のゲノムリードおよびその変異に関する情報に基づいて導出されることを包含する、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（４）前記ゲノムリードは、エキソームリードを包含する、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（５）前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は、それぞれ、前記被験体の正常な試料および前記被験体の前記疾患に罹患した試料から得られ、該ゲノムリードおよびその変異に関する情報をマッピングした後前記疾患組織に特異的な変異を探索し、前記疾患組織に特異的な変異を同定する、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（６）前記Ａ）ステップは、さらに前記被験体のＲＮＡリードの情報を前記解析装置に入力することを包含し、前記Ｂ）ステップは該解析装置に該ＲＮＡリードの情報にも基づいて前記変異に関するエピトープを解析させることを包含する、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（７）前記ＲＮＡリードは疾患組織のＲＮＡリードを含み、該疾患組織のＲＮＡリードをマッピングして変異を探索し、および／または発現量を導出するステップをさらに包含する、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（８）前記ＲＮＡリードの情報は正常組織のＲＮＡリードを含み、該正常組織のＲＮＡリードをマッピングして体細胞変異を探索し、および／または発現量を導出し、前記疾患組織のＲＮＡリードに基づいて導出された発現量と比較するステップをさらに包含する、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（９）前記ＭＨＣ型は、前記被験体のゲノムリードから導出される、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（１０）前記Ｂ）ステップは、以下：
Ｂ−１）前記解析装置に前記疾患組織に特異的な変異に対して、既存のデータベースに基づくアノテーションおよび核酸アミノ酸変換を行わせて、野生型ペプチドおよび疾患特異的変異ペプチドの情報を導出するステップ；
Ｂ−２）前記ＭＨＣ型、該野生型ペプチドおよび該疾患特異的変異ペプチドを用いて、公知のデータベースを用いて該解析装置に該疾患に特異的なエピトープ探索を行わせるステップ；ならびに
Ｂ−３）該解析装置に、得られたエピトープのペプチド配列、ＭＨＣ情報（遺伝子型および親和性）ならびに変異情報（染色体、位置、変異パターン（野生型／変異型）、信頼性、優先度、および該当遺伝子（遺伝子名、発現量））からスコアを算出させ、優先すべきエピトープの順位付けを行うステップ
から選択される少なくとも１つのステップを包含し、
前記Ｃ）ステップは、
Ｃ−１）該順位付けに基づきペプチドを生産するステップを包含する、
上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（１１）前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は同じ被験体から得られる、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（１２）前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は異なる被験体から得られる、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（１３）前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は、正常組織および前記疾患の組織から得られる、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（１４）前記ゲノムリードのマッピングはｂｗａ、ｂｏｗｔｉｅ、またはｎｏｖｏａｌｉｇｎ、あるいはそれらの組合せを用いて行われる、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（１５）前記ゲノムリードの変異の探索は、ＭｕＴｅｃｔ、ＶａｒＳｃａｎまたはlofreqあるいはそれらの組合せを含む変異探索プログラムを用いて行われる、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（１６）前記アノテーションは、ｒｅｆＧｅｎｅ、ｅｎｓＥｍｂｌから選択される遺伝子構造データベース、および／またはdbSNP、cosmic、1000  genomes、およびwhole  exome  featuresからなる群より選択される変異既知情報のデータベースを用い、ANNOVARおよびsnpEffからなる群より選択されるプログラムを用いて行われる、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（１７）前記RNAリードのマッピングは、TopHatおよびＳＴＡＲからなる群より選択されるプログラムを用いて行われる、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（１８）前記RNAの変異の探索は、ＭｕＴｅｃｔ、ＶａｒＳｃａｎ、GATKおよびsamtoolsからなる群より選択される変異探索プログラムを用いて行われる、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（１９）前記RNAの発現量の導出は、CuffLinksおよびＥｒａｎｇｅからなる群より選択される変異探索プログラムを用いて行われる、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（２０）前記MHCタイピングはHLAminer、Athlates、Sting  HLA、HLA  caller、OptiType、およびomixonからなる群より選択されるソフトウエアを用いて行われる、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（２１）前記被験体はヒトであり、前記ＭＨＣはＨＬＡである、上記項目のいずれか１項のいずれか１項に記載の方法。
（２２）前記エピトープ探索は、NetMHCpan、NetHMC、NetMHCcons,およびPickPocketからなる群より選択されるエピトープ探索プログラムを用いて行われる、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（２３）前記順位付けは、前記変異の優先順位付け、遺伝子発現の有無およびペプチドの優先順位付けからなる群より選択される少なくとも１つの要素を考慮して行われる、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（２４）前記変異の優先順位付けは、ヒットが見出される変異探索プログラムの数の多少およびＲＮＡレベルでの変異の証拠の有無からなる群より選択される少なくとも１つの要素が考慮される、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（２５）前記遺伝子発現の有無は、前記ＲＮＡリードをマッピングし算出されたfpkmもしくはrpkmの値が正であるか否かで判断される、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（２６）前記ペプチドの優先順位付けは、ヒットが見出されるエピトープ探索プログラムの数の多少、ヒットが見出される変異探索ソフトウエアの数の多少およびＨＬＡ−ペプチド間のＩＣ５０＜５００ｎＭの値からなる群より選択される少なくとも１つの要素が考慮される、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（２７）前記順位付けは、ＨＬＡ−ペプチド間のＩＣ５０の値、ヒットが見出されるエピトープ探索プログラムの数、ヒットが見出される変異探索ソフトウエアの数の順に適用することでソートされる、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（２８）前記疾患は腫瘍または自己免疫疾患である、上記項目のいずれか１項のいずれか１項に記載の方法。
（２９）前記ステップＡ）は、
Ａ−１）前記解析装置に前記被験体のゲノムの配列決定を行って該被験体のゲノムリードおよびその変異に関する情報を得、該ゲノムリードおよびその変異に関する情報をマッピングした後前記疾患組織に特異的な変異を探索させ、前記疾患組織に特異的な変異を得るステップ、
Ａ−２）該解析装置に該被験体のＲＮＡの配列決定を行って該被験体のＲＮＡリードの情報を得、該疾患組織のＲＮＡリードをマッピングして変異を探索させ、および／または発現量を導出させ、必要に応じて正常組織のＲＮＡリードをマッピングして体細胞変異を探索させ、および／または発現量を導出させ、該疾患組織のＲＮＡリードに基づいて導出された発現量と比較するステップ、および
Ａ−３）該解析装置に必要に応じて該被験体のゲノムリードを用いて該被験体のＭＨＣタイピングを行わせて該被験体のＭＨＣ型の情報を得るステップ
からなる群より選択される少なくとも１つを行うことを包含する、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（３０）被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定する方法であって、
Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、および該被験体のＭＨＣ型の情報を解析装置に入力するステップ；および
Ｂ）該解析装置に該疾患組織に特異的な変異に関する情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析させるステップを包含する、方法。
（３１）上記項目のいずれか１項または複数に記載の特徴をさらに有する、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（３２）被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを生産する装置であって、該装置は：
Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のＲＮＡリードの情報および該被験体のＭＨＣ型の情報を入力する情報入力ユニット；
Ｂ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該ｍＲＮＡ配列情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析するエピトープ解析ユニット；ならびに
Ｃ）該エピトープの情報に基づいてペプチドを生産するペプチド生産ユニットを包含する、装置。
（３３）前記ユニットＢにおいて、上記項目のいずれか１項または複数に規定される手順がなされる、上記項目に記載の装置。
（３４）前記ユニットＡは、前記被験体のゲノムを配列決定する手段、前記被験体の疾患組織に特異的な変異を決定する手段、前記被験体のＲＮＡの配列決定手段および前記被験体のＭＨＣタイピングの手段の少なくとも１つを含む、上記項目のいずれか１項に記載の装置。
（３５）被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定する装置であって、
Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のＲＮＡリードの情報および該被験体のＭＨＣ型の情報を入力する情報入力ユニット；ならびに
Ｂ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該ｍＲＮＡ配列情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析し、その結果を該疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドとして出力するエピトープ解析ユニットを包含する、装置。
（３６）前記ユニットＢにおいて、上記項目のいずれか１項または複数に規定される手順がなされる、上記項目のいずれか１項に記載の装置。
（３７）前記ユニットＡは、前記被験体のゲノムを配列決定する手段、前記被験体の疾患組織に特異的な変異を決定する手段、前記被験体のＲＮＡの配列決定手段および前記被験体のＭＨＣタイピングの手段の少なくとも１つを含む、上記項目のいずれか１項に記載の装置。
（３８）被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定するための方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のＲＮＡリードの情報および該被験体のＭＨＣ型の情報を入力するステップ；ならびに
Ｂ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該ｍＲＮＡ配列情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析し、その結果を該疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドとして出力するステップを包含する、プログラム。
（３９）上記項目のいずれか１項または複数に記載の特徴をさらに有する、上記項目に記載のプログラム。
（４０）被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定するための方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを格納したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のＲＮＡリードの情報および該被験体のＭＨＣ型の情報を入力するステップ；ならびに
Ｂ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該ｍＲＮＡ配列情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析し、その結果を該疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドとして出力するステップを包含する、記録媒体。
（４１）上記項目のいずれか１項または複数に記載の特徴をさらに有する、上記項目に記載の記録媒体。【０００７】
本発明において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、種々の疾患、例えば、がん等についてより有効な免疫療法や免疫モニタリングが得られる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明のコンセプトを示す。
【図２】図２は、解析フロー模式図を示す。中央の点線は、本発明において中心的なフローを示す。点線外の領域は任意の追加的解析ステップを示す。
【図３】図３は、分析フローにおける開始画面を示す。ここでは、腫瘍由来エキソーム、正常組織由来エキソーム、腫瘍由来ＲＮＡ配列、正常組織由来ＲＮＡ配列の選択、スレッド数の選択、リードのトリミング条件、低品質（ＬＱ）領域のトリミング、分析の条件等を選択できるようになっている。例えば、分析条件では、マッピングアルゴリズム等のアルゴリズムの種類およびその条件の選択および設定ができるようになっている。
【図４】図４は、分析の条件設定の画面を表すものである。エキソームマッピングおよび変異検索の条件、ＲＮＡマッピングおよびその発現分析、変異検出、変異のアノテーション、ＨＬＡタイピング、エピトープ予測（決定）に用いるソフトウエアおよび条件の選択および設定ができるようになっている。
【図５】図５は、出力結果の例を示す。
【図６】図６は、実施例１の実験結果を示す。左から順にインターフェロンγのＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（サンプルＮｏ．１４、３３、４１）、細胞内インターフェロンγの染色を示す。
【図７】図７は、本発明のシステムのブロック図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。従って、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１１】
本明細書において「ゲノム」とは当該分野で使用される通常の意味で用いられ、ある生物がもつすべての染色体の集合をいう。
【００１２】
本明細書において「エキソーム」（exome）とは当該分野で使用される通常の意味で用いられ、ゲノムのエキソンを網羅的に解析することおよび解析されたものを示す。したがって、エキソームはゲノムの一部に該当するものを網羅的に解析することに関する。
【００１３】
本明細書において「ゲノムリード」および「エキソームリード」とは、それぞれゲノムおよびエキソームについて、核酸配列を読み取ったもの（ｒｅａｄ）をいう。通常は塩基配列の残基（アデニン、シトシン、グアニン、チミン（ＤＮＡの場合）、ウラシル（ＲＮＡの場合））に基づく配列情報により特定される。
【００１４】
本明細書において、「ｍＲＮＡ」とは、ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡの省略形であり、当該分野で使用される通常の意味で用いられ、蛋白質に翻訳され得る塩基配列情報と構造を持ったＲＮＡをいう。
【００１５】
本明細書において「ＲＮＡリード」とは、ｍＲＮＡについて、核酸配列を読み取ったもの（ｒｅａｄ）をいう。通常は配列情報により特定される。
【００１６】
本明細書において、「マッピング」とは、ある集合の個々の構成要素に対して、別の集合の要素を規則に従って機械的に対応付けを行ったり割り当てたりすることを意味し、本発明において、「ゲノムマッピング」とは、ある核酸配列または遺伝子のゲノムまたは染色体上の位置を同定することをいう。また「ｍＲＮＡマッピング」とは、ｍＲＮＡリードをゲノムにマッピングすることをいい、リードが大量にマッピングされるところと、何もマッピングされないところが交互に繰り返され、これがそれぞれエキソン、イントロンに該当すると分析することができる。ｍＲＮＡマッピングでは、変異を検索できることの他、頻度を算出することによって発現量を導出することができる。
【００１７】
本明細書において「ＭＨＣタイピング」または「ＨＬＡタイピング」とは、ヒト白血球抗原の型を特定することをいう。「ＭＨＣ」とは、主要組織適合遺伝子複合体：ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ、主要組織適合抗原複合体とも呼ばれる）のことであり、ヒトの場合、ヒト白血球型抗原（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）である。ＭＨＣタイピングまたはＨＬＡタイピングは、既存のデータベースまたは既存の個人の情報から入手することができ、あるいは、種々の手法でタイピングすることができ、そのような方法としては、例えば、血清学的検査、配列特異的オリゴヌクレオチド［ＳＳＯ］、配列特異的プライマー［ＳＳＰ］、ＣＥ配列ベースタイピング［ＳＢＴ］などを挙げることができる。あるいは次世代シーケンス手法を用いる場合は、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａの次世代シーケンサを用いる手法を用いる場合、そこで提供されるタイピング手法によって解析することができる。
【００１８】
本明細書において「データベース」とは、遺伝子に関する任意のデータベースをいい、特に本発明では、疾患の変異に関する情報を含むものが用いられ得る。このようなデータベースとしては、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ、ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ，ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）データベース、ＧｅｎＢａｎｋ（米国生物工学情報センター、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）データベース、ＥＮＡ（ＥＭＢＬ（欧州分子生物学研究所）、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎａ）データベース、ＩＭＧＴ（ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，  ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）データベース、等を挙げることができるがこれに限定されない。
【００１９】
本明細書において「アノテーション」とは、あるデータに対して関連する情報（メタデータ）を注釈として付与することをいう。バイオインフォマティクスの分野では、遺伝子関連等の生体に関する情報（例えば、配列情報）に別の生体に関する情報（遺伝子機能等）を関連付け注釈として付与することをいう。本発明の方法においては、探索された変異について、参照情報データベース（ＤＢ）を用いて情報を追加することができる。追加される情報としては、位置（エキソン、イントロン、制御領域、遺伝子間領域など）、アミノ酸変異を伴うかどうか、変異に関連する既知の情報（疾患関連性、人種別頻度など）等を挙げることができるがこれらに限定されない。使用され得るデータベースの例としては、遺伝子構造のデータベース（ｒｅｆＧｅｎｅ、ｅｎｓＥｍｂｌなど）、変異の既知情報のデータベース（ｄｂＳＮＰ、ｃｏｓｍｉｃ、１０００  ｇｅｎｏｍｅｓ、ｗｈｏｌｅ  ｅｘｏｍｅ  ｆｅａｔｕｒｅｓなど）などを挙げることができる。ＡＮＮＯＶＡＲ、ｓｎｐＥｆｆなどのアノテーションを行うソフトウエアを用いることができ、典型的には、ＡＮＮＯＶＡＲが用いられるがそれに限定されない。
【００２０】
本明細書において「アサイン」とは、ある配列（例えば、核酸配列、タンパク質配列等）に、特定の遺伝子名、機能、特徴領域（例えば、ドメインや結合領域など）等情報を割り当てることをいう。具体的には、ある配列に特定の情報を入力またはリンクさせる等により達成することができる。
【００２１】
本明細書において「核酸アミノ酸変換」（ＮＮ−ＡＡ変換とも略される。）とは、核酸配列の情報をコドン変換に基づいてアミノ酸配列に変換することをいう。本発明では、アミノ酸変化を伴う変異について、変化前（ＷＴ）、変化後（ＭＴ）のペプチドを導出することができる。単純な文字列変換であり、通常のプログラミングで組むことができるほか、標準のソフトウエアでは付随する機能であることが多い。
【００２２】
本明細書において「疾患特異的ペプチド」とは、ある被験体がある疾患に罹患した場合に正常な被験体よりも頻度が増加する（好ましくは特異的に出現する）ペプチドをいう。例えば、疾患ががんである場合は、疾患特異的ペプチドはがん特異的ペプチドと呼ばれ、抗がん剤として使用され得る。
【００２３】
当該分野では、遺伝子変異由来の抗原（ネオ抗原）を標的とした個別化免疫療法が注目されている。特にがん分野では、従来使用されるがん抗原が免疫原性が低いことから、特異的がん免疫療法の臨床効果は必ずしも良好とはいえなかった。そこで、免疫系からは“非自己”として認識されるために高アビディティ（ｈｉｇｈ  ａｖｉｄｉｔｙ）な抗原特異的Ｔ細胞が効率よく誘導されるネオ抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）を用いて、がん悪性化に関与する変異遺伝子（Ｄｒｉｖｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を標的とすればがん細胞での抗原喪失による免疫監視機構からの逃避も起こりにくいと考えられている。ここで、Ｄｒｉｖｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎに由来するＴ細胞抗原エピトープ等を同定することで、有効な治療法をできることが提唱されており（Yamada  T,  Azuma  K,  Muta  E,  Kim  J,  Sugawara  S,  Zhang  GL,  et  al.  (2013)  PLoS  ONE  8(11):  e78389.  doi:10.1371/journal.pone.0078389）、一部臨床試験も行われている。しかしながら、従来は、個別にペプチド配列を同定する等で対応されており、十分な解析はなされていない。
【００２４】
本明細書において「被験体（者）」とは、本発明の診断または検出、あるいは治療等の対象をいう。
【００２５】
本明細書においてここで、「被験試料」または単に「試料」とは、目的とする被験体（生体）、細胞またはそれに由来する物質であって遺伝子発現を可能にするものを含むと考えられる試料であればよい。
【００２６】
本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。本明細書において「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体またはリンパ球レセプターが結合する抗原分子中の部位をいう。エピトープの情報を用いてペプチドを生産する（例えば、化学合成または微生物による生産）ことで、免疫療法、例えばがん免疫療法やがん免疫モニタリングに利用することができる。例えば、このようなペプチドをネオ抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）として用いることで、抗腫瘍効果を発揮させた抗がん剤として用いることができる。
【００２７】
本明細書において「診断」とは、被験体における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「早期診断」、「予測診断」、「事前診断」等を含む。本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「予測診断、事前診断もしくは診断」を「支援」すると称することがある。本明細書において「モニタリング」とは、がん免疫等の疾患に対する免疫療法等に関して用いられる場合、その免疫療法等の医薬等の被験者に対する反応の評価を行うことをいう。モニタリングのためには任意の手法が用いられるが、１つの代表的な例としては酵素免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイが用いられる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ワクチン、医薬品、生物学的製剤に対する被験者の反応や有効性を評価するために利用することができる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特定のタンパク質を分泌する個別細胞の検出・列挙において、最も精度の高い細胞アッセイの一つである。酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）をベースにしたものであり、当初、特定の抗体分泌細胞の分析のために開発されたが、サイトカインなど他のエフェクタ分子を生成・分泌する細胞の頻度を測定するためにも用いられる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは従来のＥＬＩＳＡアッセイと比較した場合、分析したサイトカイン／因子によって２００倍〜４００倍高い精度を発揮し、最大数十万分の一という低頻度でサイトカイン分泌細胞を検出することができる。また、抗原に反応して放出されるサイトカインは単一細胞にマッピングできるため、Ｔ細胞のレスポンダーの頻度を算出することができる。ＥＬＩＳＰＯＴはまた、誘発された免疫反応の種類とされるサイトカイン反応のタイプも示すことができる。
【００２８】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、溶液ではなく細胞を測定対象にしている点でELISAとは異なるが、それ以外は類似する点が多い。
【００２９】
以下簡単に手順を説明すると、被験細胞を特異的捕捉用抗体でコートされたウェル表面上で培養する。細胞を除去した後、分泌された分子をＥＬＩＳＡの要領で検出する。沈殿基質を用いることにより、分泌細胞が位置していた場所にスポットが形成される。従ってＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、溶液中の物質の濃度の代わりに、分泌細胞の頻度を測定することになる。さらに、各スポットのサイズや発色強度が、その位置にあった細胞から分泌されたサイトカインの量を表すことになる。ＥＬＩＳＰＯＴ技術が特異的免疫応答の解析に利用される場合は、Ｔ細胞が、抗原攻撃後の活性化プロセスの一部として、サイトカインの産生を開始するという現象を利用する。ある抗原に応答する能力がある全ての細胞は、対応するサイトカインを分泌するため、この方法で同定することができる。したがって、任意の細胞で利用可能であるが、主な利用分野としては、感染症、癌、ワクチン開発研究において、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）と免疫的に関与するＣＤ８＋Ｔ細胞で産生されるＩＦＮ−γを検出する利用法が、頻繁に用いられる。
【００３０】
本明細書において「治療」（ｔｈｅｒａｐｙ）とは、ある疾患または障害（例えば、がん）について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいい、患者の疾患、もしくは疾患に伴う1つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。事前に診断を行って適切な治療を行うことは「コンパニオン治療」といい、そのための診断薬を「コンパニオン診断薬」ということがある。本明細書において「処置」（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、ｔｒｅａｔ）とは、ある疾患または障害またはそのリスクがある被験体に対して何らかの処理または手当を行うことをいう。広義には「治療」および「予防」を包含する。
【００３１】
本明細書において「治療薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、がん等の疾患など）を治療できるあらゆる薬剤をいい、本発明が提供するような阻害剤（例えば、抗体）をいう。本発明の一実施形態において「治療薬」は、有効成分と、薬理学的に許容される1つもしくはそれ以上の担体とを含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、例えば有効成分と上記担体とを混合し、製剤学の技術分野において知られる任意の方法により製造できる。また治療薬は、治療のために用いられる物であれば使用形態は限定されず、有効成分単独であってもよいし、有効成分と任意の成分との混合物であってもよい。また上記担体の形状は特に限定されず、例えば、固体または液体（例えば、緩衝液）であってもよい。
【００３２】
本明細書において「予防」とは、ある疾患または障害（例えば、がん）について、そのような状態になる前に、そのような状態にならないようにすることをいう。本発明の薬剤を用いて、診断を行い、必要に応じて本発明の薬剤を用いて例えば、がん等の予防をするか、あるいは予防のための対策を講じることができる。
【００３３】
本明細書において「予防薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、がん等の疾患など）を予防できるあらゆる薬剤をいう。
【００３４】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではagentに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、cDNA、ゲノムDNAのようなDNA、mRNAのようなRNAを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性（例えば、70％以上の配列同一性）をもって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００３５】
本発明で使用され得る診断薬、治療薬、予防薬等の医薬等としての処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載され、あるいは他の文献に記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、使用すべき量を決定することができる。
【００３６】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
【００３７】
（免疫療法ペプチドを特定および生産する方法）
１つの局面において、本発明は、被験体における疾患の処置（治療および予防を含む）、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定する方法を提供する。この方法は、Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、および該被験体のＭＨＣ型の情報を解析装置に入力するステップ；Ｂ）該解析装置に、該疾患組織に特異的な変異に関する情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析させるステップ；ならびにＣ）該エピトープの情報に基づいてペプチドを生産するステップを包含する。本発明で使用される「解析装置」は、解析すべき情報の入力を受け、解析し、通信などによって他のユニットと連絡を取り、結果を出力する機能などを有し得、（免疫療法解析装置・システム、および解析プログラム）においても詳述されており、その任意の実施形態を採用することができ、各種ユニットはこの解析装置を構成し得る。解析装置の模式的図は図７に示されており、（システム構成）において詳述されている。
【００３８】
１つの実施形態では、本発明の方法は、Ａ）該被験体のゲノムリード（例えば、エキソームリード）およびその変異に関する情報、必要に応じて該被験体のＲＮＡ配列の情報および該被験体のＭＨＣ型の情報を解析装置に入力するステップ；ならびにＢ）該ゲノムリードおよび該変異に関する情報、必要に応じて該ＲＮＡ配列情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析装置に解析させ、その結果を該疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドとして解析装置に出力させるステップを包含してもよい。
【００３９】
別の局面において、本発明は、被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを生産するための方法を提供する。この方法は、Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、および該被験体のＭＨＣ型の情報を解析装置に入力するステップ；およびＢ）解析装置に該疾患組織に特異的な変異に関する情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析させるステップを包含する。
【００４０】
１つの実施形態では、本発明の方法は、Ａ）該被験体のゲノムリード（例えば、エキソームリード）およびその変異に関する情報、必要に応じて該被験体のＲＮＡリードの情報および該被験体のＭＨＣ型の情報を解析装置に入力するステップ；Ｂ）解析装置に該ゲノムリードおよび該変異に関する情報、必要に応じて該ＲＮＡ配列の情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析させるステップ；ならびにＣ）該エピトープの情報に基づいてペプチドを生産するステップを包含してもよい。
【００４１】
本発明の方法において、上記解析をすることで、体細胞変異（somatic  mutation）に起因する疾患（例えば、がん）について特異的なエピトープに関する情報を入手することができ、それにより、免疫療法や免疫モニタリング等の治療、診断を行うことができる。このような例としては、例えば、個別遺伝子変異（固有抗原）を標的とした免疫応答が存在し、抗腫瘍効果が得られることに基づくネオ抗原（Neoantigen）の手法や、これを網羅的に解析するmutanomeに応用することができる。本発明が対象としうる他の疾患としては、例えば、自己反応性T細胞による自己免疫疾患を挙げることができ、この場合、多くの自己免疫疾患でT細胞の異常が病因と関連している根拠は示されているため、これらの情報を活用することができる。本発明は、特定の疾患を起こす特異的T細胞を同定分離すること、また、その認識分子（病因抗原）も決定も容易に行うことができるため応用され得る。例えば、自己反応性T細胞としては、関節リウマチ・１型糖尿病・多発性硬化症は未知の関節の抗原に対して特異的T細胞が起こす疾患であるため、対象疾患として挙げることができる。自己免疫疾患においては、自己免疫でT細胞に認識される自己抗原を同定して、自己反応性Ｔ細胞の活性化を抑制したり、活性化そのものを阻害したりすることによって発症を抑制することにある。本来は自己に対して成立している免疫寛容の破綻が自己免疫の誘導に関わると考えられるが、自己免疫を誘導する抗原側の体細胞変異の有無を網羅的に検討・探索することにより、本発明は、既知のみならず未知の病因抗原（エピトープ）の同定することができ、これにより疾患処置や予防を行うことができる。本発明はまた、自己免疫疾患の病因抗原の有無が診断・予防に応用され得、また、病因抗原を標的とした治療薬の開発にも応用することができる。
【００４２】
１つの実施形態では、本発明で実施されるＢ）ステップは、解析装置に前記疾患組織に特異的な変異を参照情報データベースに基づきアノテーションを行わせ候補変異を同定するステップを含み、その後、候補変異の核酸情報をアミノ酸情報に変換して野生型（ＷＴ）ペプチドおよび変異型（ＭＴ）ペプチドを生産し、その後ＭＨＣ型（ヒトの場合ＨＬＡ型）と、ＷＴペプチドおよびＭＴペプチドとを用いて解析装置にエピトープ探索を行った上で、エピトープの順位付けを行って解析装置にエピトープリストを出力させることを包含する。
【００４３】
特定の実施形態では、疾患組織に特異的な変異は、前記被験体のゲノムリードおよびその変異に関する情報に基づいて導出される。
【００４４】
１つの実施形態において、前記ゲノムリードは、正常組織に由来するゲノムリードと疾患組織（例えば、腫瘍等）に由来するゲノムリードとを含むことができる。したがって、本発明で使用され得るゲノムリードとしては、疾患組織（例えば、腫瘍）もしくは正常組織のゲノムＤＮＡ配列を読んだリードが挙げられる。ゲノムリードの入手方法としては、例えば、全ゲノム配列決定法、エキソーム配列決定法を挙げることができるがこれらに限定されない。したがって、ゲノムリードおよびその変異に関する情報は、それぞれ、前記被験体の正常な試料および前記被験体の前記疾患に罹患した試料から得られ、該ゲノムリードおよびその変異に関する情報をマッピングした後前記疾患組織に特異的な変異を探索し、前記疾患組織に特異的な変異を同定する。使用され得る使用機器としては任意の次世代シーケンサ（例えば、Illumina、Roche  454等）、あるいはキャピラリーシーケンサ等を挙げることができるがこれらに限定されず、核酸配列（遺伝子配列）を読むことができる限り任意の手法を用いることができることが理解される。特に典型的にはエキソーム配列が使用される。
【００４５】
１つの実施形態において、本発明が利用するゲノムリードは、エキソームリードを包含する。エキソームはゲノムの主要な部分を構成するエキソンの網羅的な解析または解析した結果に関するものであり、理論に束縛されることを望まないが、エキソームリードを調査対象とすることで、実際に機能するタンパク質とより密接な関連を有する情報を調査対象とすることができ、解析精度を挙げることができると考えられる。
【００４６】
１つの実施形態では、本発明の方法は、被験体のＲＮＡリードの情報を利用する。したがって、特定の実施形態では、前記Ａ）ステップは、さらに前記被験体のＲＮＡリードの情報を解析装置に入力することを包含し、前記Ｂ）ステップは解析装置に該ＲＮＡリードの情報にも基づいて前記変異に関するエピトープを解析させることを包含する。具体的な実施形態では、ＲＮＡリードは疾患組織のＲＮＡリードを含み、該疾患組織のＲＮＡリードをマッピングして変異を探索し、および／または発現量を導出するステップをさらに包含する。好ましい実施形態は、本発明で使用されるＲＮＡリードの情報は正常組織のＲＮＡリードを含み、該正常組織のＲＮＡリードをマッピングして体細胞変異を探索し、および／または発現量を導出し、前記疾患組織のＲＮＡリードに基づいて導出された発現量と比較するステップをさらに包含する。理論に束縛されることを望まないが、被験体のＲＮＡリード、すなわちｍＲＮＡについて、核酸配列を読み取ったもの（ｒｅａｄ）の情報を含めて利用することにより、得られるエピトープのヒットにおける精度が飛躍的に増加し、実施例において示されているように、３０％程度のヒット率（例示的な例として、インターフェロンγ分泌アッセイによる。）が得られた。したがって、従来では得られなかった格別顕著なレベルのヒット率を達成し得ることが判明している。本発明で使用され得るＲＮＡリードとしては、疾患組織（例えば、腫瘍）および／または正常組織のＲＮＡ配列を読んだリードを挙げることができる。このようなＲＮＡ配列の配列決定には、次世代シーケンサによるＲＮＡ−Ｓｅｑの手法の他、キャピラリーシーケンサによるＥＳＴ解析を行うことができるがこれらに限定されず、ＲＮＡ配列を読むことができる限り任意の手法を用いることができることが理解される。次世代シーケンサによるＲＮＡ−Ｓｅｑが代表的である。
【００４７】
本発明で実施され得るＭＨＣ（ＨＬＡ）タイピングとしては、任意のタイピング手法を用いることができる。例えば、ゲノムリードよりソフトウエアを用いてタイピングすることが可能である。また、Luminex法など、検体より直接タイピングするアッセイ系を用いることができる。
【００４８】
さらなる特定の実施形態では、解析するステップであるＢ）ステップは、解析装置に野生型ペプチドおよび疾患特異的変異ペプチドの情報を導出させるステップ；解析装置に該疾患に特異的なエピトープ探索を行わせるステップ；ならびに解析装置に得られたエピトープのスコアを算出させ、優先すべきエピトープの順位付けを行わせるステップから選択される少なくとも１つのステップを包含する。ある好ましい実施形態では、解析装置に疾患に特異的な変異を同定させるステップ、および疾患に特異的な変異を参照情報データベースに基づき解析装置にアノテーションを行わせ候補変異を同定するステップを含み、その後、候補変異の核酸情報をアミノ酸情報に変換して野生型（ＷＴ）ペプチドおよび変異型（ＭＴ）ペプチドのデータを生成し、その後ＭＨＣ型（ヒトの場合ＨＬＡ型）と、ＷＴペプチドおよびＭＴペプチドのデータとを用いてエピトープ探索を行った上で、エピトープの順位付けを行ってエピトープリストを出力することを包含する。
【００４９】
好ましい実施形態では、本発明の方法はＢ−１）解析装置に前記疾患組織に特異的な変異に対して、既存のデータベースに基づくアノテーションおよび核酸アミノ酸変換を行わせて、野生型ペプチドおよび疾患特異的変異ペプチドの情報を導出するステップ；Ｂ−２）解析装置に前記ＭＨＣ型、該野生型ペプチドおよび該疾患特異的変異ペプチドを用いて、公知のデータベースを用いて該疾患に特異的なエピトープ探索を行わせるステップ；ならびにＢ−３）解析装置に得られたエピトープのペプチド配列、ＭＨＣ情報（遺伝子型および親和性）ならびに変異情報（染色体、位置、変異パターン（野生型／変異型）、信頼性、優先度、および該当遺伝子（遺伝子名、発現量））からスコアを算出させ、優先すべきエピトープの順位付けを行うステップから選択される少なくとも１つのステップの１つ以上の特徴を有する。
【００５０】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、上記Ｂ−１）〜Ｂ−３）に加え、必要に応じ、解析装置に以下の少なくとも１つのステップを行わせることを含む：前記被験体の正常な試料および前記被験体の前記疾患に罹患した試料からそれぞれ前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報を得、該ゲノムリードおよびその変異に関する情報をマッピング（アラインメント）した後前記変異を探索し、該疾患に特異的な変異を同定すること、必要に応じて、前記ＲＮＡリードの情報について該疾患に特異的な配列を同定し、これをマッピングし変異を探索し、および／または発現量を導出すること、また必要に応じて、該正常および該疾患に特異的な異常に関する情報からＭＨＣタイピングを行ってＭＨＣ型を同定すること。
【００５１】
より詳細に説明すると、Ｂ）ステップではまずＢ−１）として解析装置に前記疾患組織に特異的な変異に対して、既存のデータベースに基づくアノテーションおよび核酸アミノ酸変換を行わせて、野生型ペプチドおよび疾患特異的変異ペプチドの情報を導出するステップを含む。ここで、使用される疾患に特異的な変異は、すでに存在するデータを利用してもよく、以下の導出ステップを行ってもよい。導出ステップでは、前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は、それぞれ、前記被験体の正常な試料および前記被験体の前記疾患に罹患した試料から得られ、該ゲノムリードおよびその変異に関する情報をマッピング（アラインメント）した後前記変異を探索し、該疾患に特異的な変異を同定し、該疾患に特異的な変異に対して、既存のデータベースに基づいてアノテーションを行い核酸アミノ酸変換を行って、野生型ペプチドおよび疾患特異的変異ペプチドの情報を導出する。これらの野生型ペプチドおよび疾患特異的変異ペプチドの情報を分析することにより、体細胞変異の探索を行うことができる。導出ステップは、ゲノムリードないしエキソームリードを入力とする場合の追加フローということができる。
【００５２】
ここで、本発明において実施され得るゲノムマッピングは、ゲノムリードをゲノム配列にマッピングすることをいう。好ましくは、事前にリードのクリーンアップを実施することが有利であり得る。
【００５３】
本発明で使用され得るリードのクリーンアップの手法は、任意の手法を用いることができるが、代表的には、ゲノムリード（例えば、エキソームリード）および／またはＲＮＡリードより、解析に不適な領域を削除すること、例えば、配列決定（シーケンス）用アダプタ配列の除去すること；低クオリティ領域の除去；コンタミネーションの除去などを挙げることができる。コンタミネーションの除去は、リードの一部をトリミングするのではなく、不適切なリードをリードセットより除去することによって実現される。例えばヒトゲノム解析に先立って、細菌やウイルス由来の配列を除去することができる。
【００５４】
配列決定（シーケンス）用アダプタ配列の除去の手法は、当該分野で公知の任意の手法を使用することができるが、代表的には、適切な長さ、例えば12bp以上（或いは、10bp以上、11bp以上、または13bp以上、14bp以上等を挙げることができる。）にわたって、ミスマッチ率10%以下でアダプタ配列と一致する領域がみつかったら、その領域を除去すること等を挙げることができる。ミスマッチ率は、適宜変更することができ、例えば、１％以下、２％以下、３％以下、４％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下等でもよい。
【００５５】
低クオリティ領域の除去としては、当該分野で公知の任意の手法を使用することができるが、代表的には、適切な長さ、例えば、10bpの平均クオリティ値が所定の値、例えば12以下であるような領域がリード両端よりみつかったら、その領域を除去することなどを挙げることができる。
【００５６】
本明細書において「平均クオリティ値」とは、遺伝子解析ソフトウエアにおいてその解析の品質を示す値をいい、使用するソフトウエア（例えば、配列決定ソフトウエア等）において適宜設定されている。本明細書において使用される「クオリティ値」とは、各種シーケンサより出力されるリード上の各塩基の信頼度を定量化した値（塩基のエラー率がＸの場合、−ｌｏｇ１０（Ｘ）×１０で定義される）である。シーケンサごとに各塩基のエラー率は異なり、機種ごとに独自のロジックでエラー率をクオリティ値として評価している。評価を行うのはシーケンサを制御するフロントエンド計算機およびその上で稼働するソフトウエアであるため、通常使用されるソフトウエア（例えば、配列決定ソフトウエア）では適宜設定されている。ここで、「平均クオリティ値」は、そのクオリティ値を定められた長さの領域で算術平均した値である。
【００５７】
平均クオリティ値を調査する場合の平均長さについては、上記以外でもよく、例えば、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、１１ｂｐ、１２ｂｐ、１３ｂｐ、１４ｂｐ、１５ｂｐ等、あるいはそれより長い長さを挙げることができる。平均クオリティ値としては、１０以下、１１以下、１２以下、１３以下、１４以下、１５以下等を挙げることができる。
【００５８】
ゲノムマッピングで使用され得るソフトウエアとしては、ｂｗａ、ｂｏｗｔｉｅ、ｎｏｖｏａｌｉｇｎ等を挙げることができ、代表的にはｂｗａを用いることができる。ｂｗａおよびｂｏｗｔｉｅは公開され自由にダウンロードされ得るソフトウエアであり、ｎｏｖｏａｌｉｇｎもまた市販されるソフトウエアであり当業者に利用可能である。
【００５９】
本発明における体細胞変異探索は、疾患組織（例えば、腫瘍組織）と正常組織を比較し、前者のみにみつかる変異を探索することをいう。このような探索もまた、ソフトウエアにて実現することができ、例えば、使用され得るソフトウエアとしては、muTect、VarScan、  lofreq等の変異探索プログラムを挙げることができ、典型的にはmuTectを用いることができる。これらのソフトウエアは併用することができる。２種類以上（2種類、3種類等）のソフトウエアを併用することにより信頼性を向上させることができる。
【００６０】
Ｂ−１）において行われるアノテーションにおいて、探索された変異について、参照情報データベースを用いて情報を追加することができる。ここでは、位置(エキソン、イントロン、制御領域、遺伝子間領域など)、アミノ酸変異を伴うかどうか、変異に関連する既知の情報(疾患関連性、人種別頻度など)などの情報を追加することができる。使用されるデータベースの例としては、例えば、遺伝子構造のものとして、ｒｅｆＧｅｎｅ、ｅｎｓＥｍｂｌなどを挙げることができるがこれらに限定されない。また、変異の既知情報については、dbSNP、cosmic、1000  genomes、whole  exome  featuresなどを挙げることができるがこれらに限定されない。使用され得るソフトウエアとしては、ANNOVAR、snpEffなどを挙げることができるがこれらに限定されず、好ましくは、ANNOVARが用いられる。なお、さらに使用されるデータベースとしてhg19がある。ｈｇ１９はヒトゲノム配列データベースであり、マッピングの参照配列としてバックグラウンドとして通常使用され得る。
【００６１】
Ｂ）ステップはまた、必要に応じて、前記ＲＮＡリードの情報について該疾患に特異的な配列を同定し、これをマッピングし変異を探索し、および／または発現量を導出するステップを包含し得る。ＲＮＡリードの情報を含めることにより、より精確性を上昇させることができる。
【００６２】
ｍＲＮＡのマッピングは、ＲＮＡリードを、エキソン−イントロン構造を考慮しながらゲノム配列にマッピングすることによって実現することができる。ゲノムリードと同様事前にリードをクリーンアップする場合もあり、そのようなクリーンアップ技術はゲノムリードと同様の物を用いることができる。ｍＲＮＡマッピングはソフトウエアにより実現することができ、使用され得るソフトウエアとしては、例えば、TopHat、STARなどを挙げることができ、典型的にはＴｏｐＨａｔが用いられる。
【００６３】
ＲＮＡリードについてもゲノムリードと同様、正常組織および疾患組織（腫瘍等）のリードを解析することが出来る。これらについてはｍＲＮＡマッピングを行い、変異探索を行うことができる。変異探索はゲノムリードと同様に体細胞変異の探索を行うことができるほか、疾患組織（例えば、腫瘍）については、変異探索を行うことができる。このような疾患組織の変異探索は、単一検体にみられる変異の探索を行うものであり、使用され得る代表的なソフトウエアとしては、muTect、VarScan、GATK、samtoolsなどを挙げることができ、典型的にはGATKが用いられ得る。
【００６４】
ＲＮＡリードについては、さらに特徴的なこととして、発現量を導出でき、これを解析に反映することができる点がある。発現量の導出および発現量の比較は、mRNAマッピング結果を、各遺伝子の発現量に変換することによって実現することができる。ここで、各遺伝子座にマップされたリードの多寡を発現量とみなすことで分析をすることができる。通常はFPKMまたはRPKM  (Fragments/Reads  Per  Kilobase  of  exon  per  Million  mapped  reads)  を単位とするがこれに限定されない。検体間で発現量を比較そして、検体間で発現量を比較することができる。使用され得る代表的なソフトウエアとしては、CuffLinks、Erangeなどの変異探索プログラムを挙げることができ、例えば、典型的にはCuffLinksが使用されるがこれに限定されない。
【００６５】
疾患組織のＲＮＡリードを併用する場合は、疾患組織（例えば、腫瘍組織）のＲＮＡリードのｍＲＮＡマッピングを行い、変異探索および発現量導出を行い、これらの変異および発現量の情報をエピトープ一覧の優先順位付けに用いることができる。
【００６６】
正常組織のＲＮＡリードを併用する場合は、正常組織のＲＮＡリードのｍＲＮＡマッピングを行い、体細胞変異探索および発現量導出を行い、これらの情報をエピトープ一覧の優先順位付けに用いることができ、さらに疾患組織のＲＮＡリードをも併用する場合、体細胞変異の情報と、疾患組織由来のＲＮＡリードから導出された発現量と、正常組織のＲＮＡリードから導出された発現量とを比較して疾患組織と正常組織との発現量の相違情報をもエピトープ一覧の優先順位付けに用いることができる。
【００６７】
Ｂ）ステップはまた、必要に応じて、解析装置に該正常および該疾患に特異的な異常に関する情報からＭＨＣタイピングを行わせてＭＨＣ型を同定するステップを包含し得る。ここで。ＭＨＣタイピング（ヒトの場合はＨＬＡタイピングとなる）は、ゲノムリードよりＨＬＡ型を判定することができるが、別アッセイ系でタイピングした結果を使用することもできる。ソフトウエアを使用する場合は、例えば、HLAminer、Athlates、Sting  HLA、HLA  caller、OptiType、omixonなどのソフトウエアを用いることができ、典型的には、典型的にはomixon  (ヒト)、HLA  caller  (マウス)が用いられる。
【００６８】
Ｂ）ステップはまた、Ｂ−２）解析装置に該ＭＨＣ型、該野生型ペプチドおよび該疾患特異的変異ペプチドを用いて、公知のデータベースを用いて該疾患に特異的なエピトープ探索を行わせるステップを包含し得る。ここで、特異的なエピトープ探索は、指定HLA型に親和性のある部分ペプチドを、指定ペプチドより探索することができる。使用され得るソフトウエアとしては、例えば、NetMHCpan、NetHMC、NetMHCcons、PickPocketなどを挙げることができるがそれらに限定されない。好ましくは、ＮｅｔＭＨＣｐａｎが用いられる。併用して信頼性を向上させることも可能であり、参照データベースを切り替えることでヒトのほか、マウス、ラット、アカゲザル、チンパンジーなどでも実施することができる。
【００６９】
Ｂ）ステップはまた、Ｂ−３）解析装置に得られたエピトープのペプチド配列、ＭＨＣ情報（遺伝子型および親和性）ならびに変異情報（染色体、位置、変異パターン（野生型／変異型）、信頼性、優先度、および該当遺伝子（遺伝子名、発現量））からスコアを算出させ、優先すべきエピトープの順位付けを行うステップを包含し得る。
【００７０】
Ｂ−３）において好ましい実施形態ではさらなる特徴として、解析装置において、ＭＨＣ情報（ＨＬＡ情報）に親和性のある部分ペプチドを探索後、それらがアミノ酸変異位置を含むか否か確認し、前者のみを保存することで、無駄な結果を排除して効率化を図ることを挙げることができる。これにより、効率化が達成され、および／または解析結果の精度の向上が達成されている。
【００７１】
エピトープの選択基準としては、変異の優先順位付け、遺伝子発現の有無、ペプチドの優先順位付けなどを挙げることができる。
【００７２】
好ましい実施形態では、エピトープ選択の際の基準として、変異の優先順位付けを行うことが挙げられる。変異の優先順位付けを行う際には、例えば、複数の変異探索ソフトウエアで見出されること、および／またはＲＮＡリード由来である証拠があることを優先順位の上位に付すことなどを挙げることができるが、それらに限定されない。あるいは、遺伝子発現があることを優先順位の上位に付すことも考慮してよい。遺伝子発現の有無は、ＲＮＡリードの結果について、RNAリードをマップし算出されたfpkmもしくはrpkmの値が正であるか否かで判断することができる。ＲＮＡリードの結果を活用することにより、実施例で示されるように精確性の向上に寄与することが判明している。あるいは、ペプチドの優先順位付けを行うことができる。ここで、ペプチドの優先順位付けのためには、複数のエピトープ探索ソフトウエアで見つかるかどうかを挙げることができる。また、ペプチドの優先順位付けは、ＨＬＡ−ペプチド間のＩＣ５０の値のレベル等を参酌して決定することができ、例えば、ＩＣ５０＜５００ｎＭであること、好ましくは、ＩＣ５０＜４００ｎＭであること、ＩＣ５０＜３００ｎＭであること、ＩＣ５０＜２００ｎＭであること、ＩＣ５０＜１００ｎＭであること、ＩＣ５０＜９０ｎＭであること、ＩＣ５０＜８０ｎＭであること、ＩＣ５０＜７０ｎＭであること、ＩＣ５０＜６０ｎＭであること、ＩＣ５０＜５０ｎＭであることなどを挙げることができるが、これらに限定されず、閾値としてはこれらの中間の値（例えば、実施例で採用されるＩＣ５０＜５４ｎＭ等）も、検索結果を見て適宜変動し採用することができる。
【００７３】
好ましい実施形態では、ペプチドの優先順位付けは、ヒットが見出されるエピトープ探索プログラムの数の多少、ヒットが見出される変異探索ソフトウエアの数の多少およびＨＬＡ−ペプチド間のＩＣ５０＜５００ｎＭの値からなる群より選択される少なくとも１つの要素が考慮される。さらに好ましくは、順位付けは、ＨＬＡ−ペプチド間のＩＣ５０の値、ヒットが見出されるエピトープ探索プログラムの数、ヒットが見出される変異探索ソフトウエアの数の順に適用することでソートされる。理論の束縛されることを望まないが、このソート法で驚くべき精度の高い抗原ペプチドを同定することができる。
【００７４】
別の実施形態では、本発明において、前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は同じ被験体から得られる。同じ被験体から情報を得ることにより、同一人における変化を考慮し解析をすることができる。ここで好ましくは、ゲノムリードおよびその変異に関する情報は、正常組織および前記疾患の組織から得られる。
【００７５】
別の実施形態では、本発明において、前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は異なる被験体から得られる。好ましくは、異なる被験体に正常被験体を含めることで、疾患の疑いのある被験体との対比をはっきりと行うことができる。これらの相違はゲノムマッピングを行った後、体細胞変異の探索を行い、疾患特異的な変異（例えば、がんであれば腫瘍特異変異）として同定することができる。
【００７６】
このように得られた疾患特異的変異については、いったん変異が得られたならば解析装置に適宜参照情報データベース（ＤＢ）を用いてアノテーションを行わせ、候補の変異を同定し、アミノ酸情報に変換することができる。このように変換されたアミノ酸配列の候補に基づき野生型ペプチドと変異ペプチドとを生成することができる。
【００７７】
本発明におけるアノテーションは、探索された変異について、参照情報ＤＢを用いて情報を追加することをいう。追加され得る情報としては、例えば、位置(エキソン、イントロン、制御領域、遺伝子間領域など)、アミノ酸変異を伴うかどうか、変異に関連する既知の情報(疾患関連性、人種別頻度など)などを挙げることができるがこれらに限定されない。アノテーションに使用され得るデータベースの例としては、遺伝子構造の調査のためには、refGene、ensEmblなどを挙げることができ、変異の既知情報には、dbSNP、cosmic、1000  genomes、whole  exome  featuresなどを使用することができる。全体としては、ANNOVAR、snpEffなどを使用することができ、ANNOVARを用いることが典型的であるがこれに限定されない。
【００７８】
本発明の方法では、核酸アミノ酸変換（ＮＡ−ＡＡ変換）が行われるが、これは、通常のコドンコードを変換することで実現される。単純な文字列変換によって達成されるため格別のソフトウエアを使用する必要はない。本発明では、アミノ酸への変換後、アミノ酸変化を伴う変異について、変化前(野生型＝WT)、変化後(変異型＝MT)のペプチドを導出することができる。これにより、アミノ酸レベルで変動がない変異を除去することができる。
【００７９】
次に、野生型ペプチドおよび変異ペプチドに基づいて、ＨＬＡ型の情報に照らし、エピトープ探索を行うことができる。エピトープ探索は指定ＨＬＡ型に親和性のある部分ペプチドを、指定ペプチドより探索することができる。使用され得るソフトウエアとしては、NetMHCpan、NetHMC、NetMHCcons、PickPocketなどを挙げることができるがこれらに限定されない。典型的には、NetMHCpanが用いられる。また、2種類以上を併用して信頼性を向上させることができる。さらに、典型的にはヒト、霊長類、げっ歯類等の哺乳動物のデータベースを用いて実現され得るが、例示的に実施されたヒトの例に代えて、参照データベースを切り替えることで  マウス、ラット、アカケザル、チンパンジー等も実現することができる。
【００８０】
本発明の方法において、ペプチドの生産を行う場合は、ペプチドの配列情報が与えられることから、その配列情報に基づき実施し得る任意の生産方法、例えば、化学合成、微生物による生産、またはより大きなペプチドの切断（例えば、酵素的な切断）等によって生産することができる。ペプチド合成（化学合成）による合成が好ましい。大量生産および／または精度の点からこれらが好ましい合成方法である。
【００８１】
動物でもヒトと同じような手法で本発明を実施することができる。以下にその例を記載する。
１．全ての系統（ｓｙｎｇｅｎｉｃ）のマウスを対象にして、自然発症、化学発症、放射線発症に由来する腫瘍（癌、肉腫、白血病）に対してネオ抗原の探索が可能である。
２．担癌マウスの癌部位からの組織採取、正常マウスにおいて腫瘍部位と同一臓器・組織の採取を行う。この際には、担癌マウス個体では、腫瘍部位と非腫瘍部位（例えば、大腸癌の際には、腫瘍部位と非腫瘍部位）。マウスは同一系統の場合は、正常組織は正常マウスから採取できる。
３．採取された組織・臓器からＤＮＡおよびＲＮＡを抽出し、エキソームｓｅｑおよびＲＮＡｓｅｑ解析を行う。
４．系統毎にＭＨＣ（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ；  主要組織適合遺伝子複合体）は分かっているため、本発明で使用され得るｍｕｔａｎｏｍｅを探索し、更にはＭＨＣ（マウスではＨ−２）上に提示されるネオ抗原を同定する。
５．ネオ抗原の選択に関しては、実施例で例示されるヒト腫瘍で記載している方法論と同一のものを例示することができる。
６．同定されたネオ抗原に対しては、ペプチドを人工的に合成し、同系マウスの脾臓細胞に添加培養して、培養後のＩＦＮγ産生誘導を活性の指標とすることができる。
７．また、ネオ抗原で刺激し培養した脾臓細胞を用いて、腫瘍に対する細胞障害性を測定する。
８．試験管内での検討から、探索されたネオ抗原が腫瘍に対してＴ細胞の機能的な誘導を起こす事が明確になった場合には以下を行う。
９．すなわち、候補となったネオ抗原を用いたｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を検討する。
１０．ｉｎ  ｖｉｖｏ効果としては、担癌マウス（ネオ抗原探索に使用した腫瘍を移植したマウス）にネオ抗原を直接投与する。また、樹状細胞療法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで同系マウス由来の樹状細胞を刺激培養し、その樹状細胞を担癌マウスに投与する）を用いて治療することができる。
【００８２】
（免疫療法解析装置・システム、および解析プログラム）
別の局面において、本発明は、被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを生産する装置またはシステムを提供する。この装置またはシステムは、Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のＲＮＡリードの情報および該被験体のＭＨＣ型の情報を入力する情報入力ユニット；Ｂ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該ｍＲＮＡ配列情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析するエピトープ解析ユニット；ならびにＣ）該エピトープの情報に基づいてペプチドを生産するペプチド生産ユニットを備える。ここで使用される情報入力ユニット、解析ユニットおよび合成ユニットは、（免疫療法ペプチドを特定および生産する方法）において説明される任意の特徴を備えることができる。本発明において使用される「解析装置」は、情報入力ユニットとエピトープ解析ユニットとを含みうる。さらに、本発明の解析装置は、このほかの機能を有する少なくとも１つのさらなるユニットを含んでいてもよく。これらのユニットは以下に説明される。
【００８３】
別の局面において、被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定する装置またはシステムを提供する。この装置またはシステムは、Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のＲＮＡリードの情報および該被験体のＭＨＣ型の情報を入力する情報入力ユニット；ならびにＢ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該ｍＲＮＡ配列情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析し、その結果を該疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドとして出力するエピトープ解析ユニットを包含する。ここで使用される情報入力ユニット、および解析ユニットは、（免疫療法ペプチドを特定および生産する方法）において説明される任意の特徴を備えることができる。
【００８４】
さらに別の局面において、本発明は、被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定するための方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを提供する。このプログラムが実行する方法は、Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のＲＮＡリードの情報および該被験体のＭＨＣ型の情報を入力するステップ；ならびにＢ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該ｍＲＮＡ配列情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析し、その結果を該疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドとして出力するステップを包含する。プログラムは、記録媒体に格納されていてもよく、伝送媒体によって伝送されてもよい。ここで実行される方法は、（免疫療法ペプチドを特定および生産する方法）において説明される任意の特徴を備えることができる。
【００８５】
したがって、本発明は、被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定するための方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを格納する記録媒体を提供する。ここで格納されるプログラムが実行する方法は、Ａ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のＲＮＡリードの情報および該被験体のＭＨＣ型の情報を入力するステップ；ならびにＢ）該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該ｍＲＮＡ配列情報、該ＭＨＣ型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析し、その結果を該疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドとして出力するステップを包含する。記録媒体は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、またはハードディスク（ＨＤＤ）、磁気ディスク（ＤＶＤ等）、ＵＳＢメモリ等のフラッシュメモリなどの外部記憶装置であり得る。ここで実行される方法は、（免疫療法ペプチドを特定および生産する方法）において説明される任意の特徴を備えることができる。
【００８６】
例えば、１つの実施形態では、ユニットＡ（情報入力ユニット）は、被験体のゲノムを配列決定する手段、前記被験体のＲＮＡの配列決定手段および前記被験体のＭＨＣタイピングの手段の少なくとも１つを含み得る。また、プログラムが実行するＡ）ステップは、Ａ−１）該被験体のゲノムの配列決定を行って該被験体のゲノムリードおよびその変異に関する情報を得、該ゲノムリードおよびその変異に関する情報をマッピングした後前記疾患組織に特異的な変異を探索し、前記疾患組織に特異的な変異を得るステップ、Ａ−２）該被験体のＲＮＡの配列決定を行って該被験体のＲＮＡリードの情報を得、該疾患組織のＲＮＡリードをマッピングして変異を探索し、および／または発現量を導出し、必要に応じて正常組織のＲＮＡリードをマッピングして体細胞変異を探索し、および／または発現量を導出し、前記疾患組織のＲＮＡリードに基づいて導出された発現量と比較するステップ、およびＡ−３）必要に応じて該被験体のゲノムリードを用いて該被験体のＭＨＣタイピングを行って該被験体のＭＨＣ型の情報を得るステップからなる群より選択される少なくとも１つを行うことを包含する。
【００８７】
ユニットＢ（解析ユニット）は、種々の機能を有し得る。また、プログラムが実行するＢ）ステップは、種々の機能を実行する。解析ユニットで行われるステップまたは解析ステップは、図１に示されるコンセプトを実現する事項をコンピュータに実装する任意のステップを含みうるものであり、さらに図２に示される解析フローの任意のステップを実現する事項をコンピュータに実装する任意のステップを含みうる。
【００８８】
特に、ユニットＢまたはプログラムが実行するＢ）ステップでは、疾患組織に特異的な変異を入力または同定するステップ、および疾患に特異的な変異を参照情報データベースに基づきアノテーションを行い候補変異を同定するステップが実証され、その後、候補変異の核酸情報をアミノ酸情報に変換して野生型（ＷＴ）ペプチドおよび変異型（ＭＴ）ペプチドのデータを生成し、その後ＭＨＣ型（ヒトの場合ＨＬＡ型）と、ＷＴペプチドおよびＭＴペプチドのデータとを用いてエピトープ探索を行った上で、エピトープの順位付けを行ってエピトープリストを出力することが実装されることが好ましい。
【００８９】
疾患に特異的な変異は、すでに存在するデータを利用してもよく、システムに対してＢ−１）疾患組織に特異的な変異に対して、既存のデータベースに基づいてアノテーションを行い核酸アミノ酸変換を行って、野生型ペプチドおよび疾患特異的変異ペプチドの情報を導出するステップを実施させてもよく、本発明のプログラムではこのようなステップが実施される。Ｂ−１）ステップの詳細については、（免疫療法ペプチドを特定および生産する方法）に説明されている。
【００９０】
好ましくは、疾患組織に特異的な変異は被験体のゲノムリードおよびその変異に関する情報に基づいて導出される。ここで、ゲノムリードおよびその変異に関する情報は、それぞれ、前記被験体の正常な試料および前記被験体の前記疾患に罹患した試料から得られ、該ゲノムリードおよびその変異に関する情報をマッピングした後前記疾患組織に特異的な変異を探索し、前記疾患組織に特異的な変異を同定する。
【００９１】
好ましくは、本発明の装置またはシステムは、ＲＮＡリードの情報の解析を実装させてもよい。この場合、本発明の装置またはシステムに、必要に応じて、前記ＲＮＡリードの情報について該疾患に特異的な配列を同定し、これをマッピングし変異を探索し、および／または発現量を導出するステップを実装させることができ、本発明のプログラムではこのようなステップが実施され得る。ＲＮＡリードの情報を含めることにより、より精確性を上昇させることができる。ＲＮＡリードの情報取得ステップの詳細については、（免疫療法ペプチドを特定および生産する方法）に説明されている。
【００９２】
本発明の装置またはシステムでは、ＭＨＣ型（またはＨＬＡ型）としては既知の情報を用いてもよく、これを同定するステップを実装してもよい。したがって、本発明の装置またはシステムは、必要に応じて、該正常および該疾患に特異的な異常に関する情報からＭＨＣタイピングを行ってＭＨＣ型を同定するステップを実装し得、本発明のプログラムではこのようなステップが実施され得る。ＭＨＣ型同定ステップの詳細については、（免疫療法ペプチドを特定および生産する方法）に説明されている。
【００９３】
本発明の装置またはシステムは、Ｂ−２）該ＭＨＣ型、該野生型ペプチドおよび該疾患特異的変異ペプチドを用いて、公知のデータベースを用いて該疾患に特異的なエピトープ探索を行うステップを実装してもよく、本発明のプログラムではこのようなステップが実施され得る。これにより、エピトープの探索がなされる。Ｂ−２）ステップの詳細については、（免疫療法ペプチドを特定および生産する方法）に説明されている。
【００９４】
本発明の装置またはシステムは、エピトープの順位付けを行うステップを実装し得、本発明のプログラムではこのようなステップが実施される。したがって、本発明の装置またはシステムは、Ｂ−３）得られたエピトープのペプチド配列、ＭＨＣ情報（遺伝子型および親和性）ならびに変異情報（染色体、位置、変異パターン（野生型／変異型）、信頼性、優先度、および該当遺伝子（遺伝子名、発現量））からスコアを算出し、優先すべきエピトープの順位付けを行うステップを実装し得、本発明のプログラムではこのようなステップが実施され得る。Ｂ−３）ステップの詳細については、（免疫療法ペプチドを特定および生産する方法）に説明されている。
【００９５】
本発明の装置またはシステムがペプチドの生産を行う場合は、エピトープの情報に基づいてペプチドを生産するペプチド生産ユニットを備えていてもよい。このようなペプチド生産ユニットは、ペプチドの配列情報が与えられることから、その配列情報に基づき実施し得る任意の生産方法、例えば、化学合成、微生物による生産、またはより大きなペプチドの切断（例えば、酵素的な切断）等による生産を実現する任意のユニットを備え得る。
【００９６】
本発明のプログラムは、ペプチドの生産を実施するプログラムと組み合わされてもよく、あるいは、本発明のプログラムの一部としてペプチドの生産を実行するステップを実現するプログラムが組み込まれていてもよい。
【００９７】
（システム構成）
次に、図７のブロック図を参照して、本発明のシステムまたは装置の構成を説明する。なお、本図においては、単一のシステムで実現した場合を示しているが、これらは複数のユニットやコンポーネントから構成されていてもよい。
【００９８】
本発明のシステムは、コンピュータシステムに内蔵されたＣＰＵ０１にシステムバス２０を介してＲＡＭ０３、ＲＯＭやＨＤＤ、磁気ディスク、ＵＳＢメモリ等のフラッシュメモリなどの外部記憶装置０５及び入出力インターフェース（Ｉ／Ｆ）２５が接続されて構成される。入出力Ｉ／Ｆ２５には、キーボードやマウスなどの入力装置０９、ディスプレイなどの出力装置０７、及びモデムなどの通信デバイス１１がそれぞれ接続されている。外部記憶装置０５は、情報データベース格納部３０とプログラム格納部４０とを備えている。何れも、外部記憶装置０５内に確保された一定の記憶領域である。
【００９９】
このようなハードウェア構成において、入力装置０９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１１等を介してコマンドを受信することで、この記憶装置０５にインストールされたソフトウエアプログラムがＣＰＵ０１によってＲＡＭ０３上に呼び出されて展開され実行されることで、ＯＳ（オペレーションシステム）と協働してこの発明の機能を奏するようになっている。
【０１００】
データベース格納部３０には、参照データベースや入力配列セットあるいは生成したゲノムリードデータ、ＲＮＡリードデータ、ＭＨＣ（ＨＬＡ）型のデータ、特異的変異データ等のデータや、各種ステップを実行するソフトウエア、場合によってはデータベースも確認されており、もしくは通信デバイス１１等を介して取得した情報が随時書き込まれ、更新される。必要に応じて各入力配列セット中の各々の配列、参照データベースの各遺伝子情報ＩＤ等の情報を各マスタテーブルで管理することにより、蓄積対象となるサンプルに帰属する情報を、各マスタテーブルにおいて定義されたＩＤにより管理することが可能となる。
【０１０１】
データベース格納部３０には、入力エントリー情報として、正常組織、疾患組織（例えばがん組織）の被験体に関する情報（ＩＤ等を含む）、試料の情報、配列分析（リード）の情報、各種変異に関する情報、マッピングの情報、アノテーションの情報、核酸・アミノ酸変換の情報、発現量の情報、その比較の情報、野生ペプチド、変異ペプチド、ＭＨＣ（ＨＬＡ）型の情報等が試料ＩＤに関連付けて格納される。ここで、分析結果は、本発明の処理によって処理して得られる情報である。
【０１０２】
また、プログラム格納部４０に格納されるコンピュータプログラムは、コンピュータを、エピトープ探索やエピトープ優先順位付け等の処理を含む、本発明のプログラムまたは本発明の装置若しくはシステムとして構成するものである。これらの各機能は、それぞれが独立したコンピュータプログラムやそのモジュール、ルーチンなどであり、上記ＣＰＵ０１によって実行されることでコンピュータを各システムや装置として構成させるものである。
【０１０３】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook  J.  et  al.(1989).Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harborおよびその3rd  Ed.(2001);  Ausubel,  F.  M.(1987).Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Ausubel,F.M.(1989).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Innis,  M.  A.  (1990).  PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications,  Academic  Press;  Ausubel,  F.  M.  (1992).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Ausubel,  F.  M.(1995).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Innis,  M.  A.  et  al.(1995).  PCR  Strategies,  Academic  Press;  Ausubel,  F.  M.  (1999).  Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Wiley,  and  annual  updates;  Sninsky,  J.  J.  et  al.(1999).PCR  Applications:  Protocols  for  Functional  Genomics,  Academic  Press,  Gait,  M.  J.  (1985).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Gait,  M.  J.  (1990).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Eckstein,  F.(1991).  Oligonucleotides  and  Analogues:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Adams,  R.  L.  et  al.(1992).The  Biochemistry  of  the  Nucleic  Acids,  Chapman  &  Hall;  Shabarova,  Z.  et  al.(1994).  Advanced  Organic  Chemistry  of  Nucleic  Acids,  Weinheim;  Blackburn,  G.  M.  et  al.(1996).  Nucleic  Acids  in  Chemistry  and  Biology,  Oxford  University  Press;  Hermanson,  G.  T.  (I996).  Bioconjugate  Techniques,  Academic  Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されている。これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１０４】
バイオインフォマティクスで汎用される技術常識の文献としては、例えば、Gibas  C.  et  al.  (2001).  Developing  Bioinformatics  Computer  Skills,  O’Reilly;  Mount  D.  W.,  (2004).  Bioinformatics:  Sequence  and  Genome  Analysis,  CSHL  Press;  Pevzner  P.  et  al.  (2011).  Bioinformatics  for  Biologist,  Cambridge  University  Press;  菅野純夫、他  (2012)  細胞工学別冊「次世代シークエンサー目的別アドバンストメソッド」秀潤社をあげることができる。これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１０５】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１０６】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１０７】
（実施例１：変異ペプチド選別と免疫原性の確認〜ヒト被験体の腫瘍の場合）
（解析）
図２に例示されるフローに基づき変異ペプチド選別を行った。【０１０８】
具体的には以下のとおりである。
（１）被験体群は以下を用いた。
対象患者：６５歳日本人男性の肺ガン患者
本実施例を実施する前に、Ｌｕｍｉｎｅｘ法でタイピングして以下のＨＬＡ型が同定されている。
ＨＬＡタイプ：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１，  ２４：０２
（２）正常組織および腫瘍組織よりＤＮＡ抽出し、イルミナ社シーケンサＨｉＳｅｑ２０００により、ＴｒｕＳｅｑ  ＰＥキットを用いてエキソームシーケンスした。使用機器はイルミナ社シーケンサＨｉＳｅｑ２０００で、使用ソフトウエアは同シーケンサの制御ソフトウエアを使用した。【０１０９】
（エキソームリードマッピング）
次に、正常組織および腫瘍組織由来のエキソームリードを、各々、bwaを用いて以下のパラメータでマップした。
algorithm:  mem
read  mode:  paired  end
minimum  seed  length:  19
band  width:  100
off  diagonal  dropoff:  100
match  score  :  1
mismatch  penalty:  4
gap  open  penalty:  6
gap  extension  penalty:  1
clipping  penalty:  5
unpaired  read  penalty:  9。【０１１０】
（体細胞変異探索）
次に、正常組織および腫瘍組織由来のエキソームリードのマップ結果を基に、muTect、VarScan、lofreqを用いて、腫瘍組織特異的な体細胞変異を探索した。【０１１１】
以上の解析の実現フローを図３〜５に示す。図３は、分析フローにおける開始画面を示す。ここでは、腫瘍由来エキソーム、正常組織由来エキソーム、腫瘍由来ＲＮＡ配列、正常組織由来ＲＮＡ配列の選択、スレッド数の選択、リードのトリミング条件、低品質（ＬＱ）領域のトリミング、分析の条件等を選択できるようになっている。例えば、分析条件では、マッピングアルゴリズム等のアルゴリズムの種類およびその条件の選択および設定ができるようになっている。図４は、分析の条件設定の画面を表すものである。エキソームマッピングおよび変異検索の条件、ＲＮＡマッピングおよびその発現分析、変異検出、変異のアノテーション、ＨＬＡタイピング、エピトープ予測（決定）に用いるソフトウエアおよび条件の選択および設定ができるようになっている。図５は、出力結果の例である。その結果、腫瘍特異的変異を計数し、１６７３個見出された。【０１１２】
（３）次に、ＲＮＡリード（正常組織）およびＲＮＡリード（腫瘍組織）を取得した。腫瘍組織よりRNA抽出し、イルミナ社シーケンサHiSeq2000により、TruSeq  RNA  LibraryキットおよびTruSeq  PEキットを用いてRNAの配列決定を行った。得られたRNAリードを、TopHatを用いて以下のパラメータでマップした。
segment  length:  16
maximum  mismatch:  2
expected  mate  pair  inner  distance:  50
standard  deviation  of  mate  pair  inner  distance:  20。
（４）次に、ｍＲＮＡマッピングの結果得られたデータを変異探索（または体細胞変異探索）および発現量導出を行った。腫瘍組織由来RNAリードのマップ結果を基に、muTect、VarScanを用いて変異を探索した。また、CuffLinksを用いて遺伝子発現量を算出した。
（５）（４）で得られたＲＮＡリードに基づく結果について変異があるものを合わせて解析した。
（６）（２）で得られた腫瘍特異的変異について、遺伝子構造情報のデータベースとしてrefGeneおよびensEmblを用いて変異のアノテーションを実行し候補変異を特定した。特定された候補変異について核酸−アミノ酸返還を行って野生型（ＷＴ）ペプチドおよび変異（ＭＴ）ペプチドを画定した。
（７）また、次にエキソームリードからomixonを用いてHLAタイピングを実施した。
（８）（６）で得られたＷＴペプチドとＭＴペプチドとに加えＨＬＡ型の情報を合わせてエピトープ解析を行った。その結果を、以下の表に示す。表中ＭＴ配列中にあるハイフンはその間のまたは端部のアミノ酸が正常アミノ酸と比較して変異していることを示す。【０１１３】
表中の項目は以下を示す。
HLA  allele：ＨＬＡ対立遺伝子
WT  peptide  sequence：野生型ペプチド配列
MT  peptide  sequence：変異型ペプチド配列
Consensus  percentile  rank：コンセンサスの百分位数ランク
ANN  IC50  :  artificial  neural  network法により算出されたIC50  (NetMHCpanにおける最適値)
ANN  rank  :  それをランク値に変換した値
SMM  IC50  :  stabilized  matrix法により算出されたIC50  (算出できない場合はna)
SMM  rank  :  それをランク値に変換した値
comblib  sydney2008  score  :  sydney2008法により算出されたIC50  (算出できない場合はna)
comblib  sydney2008  rank  :  それをランク値に変換した値
mutation  information：変異情報
chromosome：染色体
start  position：開始位置
end  position：終了位置
gene  name：遺伝子名
accession：アクセッション番号
exon  ID：エキソン番号
position  on  transcript：転写物における位置
WT  NA:野生型における核酸
MT  NA:変異型における核酸
start  pos.  on  peptide：ペプチド上の開始位置
mutation  pos.  on  peptide：ペプチド上の変異位置
end  pos.  on  peptide：ペプチド上の終了位置
WT  AA：野生型アミノ酸
MT  AA：変異型アミノ酸
upstream  AA：上流アミノ酸
downstream  AA：下流アミノ酸
log  likelihood：対数尤度
read  depth：読み深さ
num  of  WT  on  tumor  :  腫瘍組織において、その位置をカバーするWT(変異の無い)リードの数
num  of  MT  on  tumor  :  同上、MT(変異)リードの数
QV  sum  of  WT  on  tumor  :  腫瘍組織において、その位置をカバーするWTリードのクオリティ値(QV)の総和
QV  sum  of  MT  on  tumor  :  同上、MTリードのQVの総和
num  of  WT  on  normal  :  正常組織において、その位置をカバーするWTリードの数
num  of  MT  on  normal  :  同上、MTリードの数
QV  sum  of  WT  on  normal  :  正常組織において、その位置をカバーするWTリードのQVの総和
QV  sum  of  MT  on  normal  :  同上、MTリードのQVの総和
found  in  RNA  :  その変異がRNAでもみつかったか否かのフラグ
found  by  :  その変異をコールしたソフトを列挙
all  AA  changes  :  アミノ酸置換パターンを、遺伝子名、遺伝子座のアクセッション、核酸変異パターン、アミノ酸変異パターンで記述
cytoband  :  その位置を染色体バンドの記述形式で示したもの
dbSNP  138  :  その変異がdbSNP  release.138に登録されている場合は、そのID
cosmic  70  :  その変異がcosmid  release.70に登録されている場合は、そのID
TSS  :  その変異が乗る遺伝子のTSS(Transcription  Start  Site)のID
gene  location  on  genome  :  その変異の位置、chromosome、start  position、end  positionを連結しただけ
gene  expression  (FPKM)  :  遺伝子発現量(fragments  per  kirobase  of  exon  per  million  mapped  reads)
95%  conf  low  :  FPKMの95%信頼区間の下限
95%  conf  high  :  同上、上限
status  :  発現量算出結果が有効(OK)か、低精度(LOWQUAL)か【０１１４】
【表１−１】
0006710004.tif 000002
【０１１５】
【表１−２】
0006710004.tif 000003
【０１１６】
【表１−３】
0006710004.tif 000004
【０１１７】
【表１−４】
0006710004.tif 000005
【０１１８】
【表１−５】
0006710004.tif 000006
【０１１９】
（解析結果）
解析した結果を以下に示す。【０１２０】
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１，２４：０２の個体を使用して解析し見出された腫瘍特異的変異は１６７３箇所見出された。このうち、ＲＮＡリード上にも変異があった件を同定したところ、４１個に絞られた。さらにアミノ酸変化を伴う変異があったものに絞ったところ２５個に絞られた。これをペプチドの数で計数したところ４４ペプチドが同定された（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１）。すなわち、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１とＩＣ５０≦５４ｎＭのアフィニティ（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を持つペプチドが４４見出されたことになる。なお、なお、次のステップでは、HLA-A＊02:01を保有する健常人末梢血を使用したため、（ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２では無く）ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１とのアフィニティ（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を持つペプチドのみを選択した。【０１２１】
（ペプチド合成）
これらの４４ペプチドをペプチド合成機にて合成した。本実施例では、以下にその手順を示す。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（東京、日本）に外注したものを使用した。【０１２２】
（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１試料）
被験体資料（腫瘍患者）と同一のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を保有する健常人の末梢血を用いた。これに対して製造されたペプチドを用いて反応性の実験を行った。【０１２３】
なお、試料としては、同一のＨＬＡ型（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１）を保有する健常人の血液（末梢血）もしくはがん患者の血液そのものを使用することもでき、目的からは、同一のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を保有する方の血液を使うこともできる。【０１２４】
（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）
実施したアッセイは、インターフェロンγＥＬＩＳＰＯＴおよび細胞内インターフェロンγ染色を行った。インターフェロンγＥＬＩＳＰＯＴには、MABTECH  anti-human  IFN-γ  mAb  1-D1K、purified（3420-3-250）を捕捉抗体（Capture  antibody）として使用し、MILLIPORE  MultiScreen  HTS  96-well  Filtration  Plateを使用した。【０１２５】
手短に示すと以下のとおりである。
（１）サイトカイン（ここでは、インターフェロン−γ）特異的モノクローナル抗体（MABTECH  anti-human  IFN-γ  mAb  1-D1K,  purified  （3420-3-250））を固層表面に固定化した。ここでは、MILLIPORE  MultiScreen  HTS  96-well  Filtration  Plateを使用した。
（２）  洗浄後に1x10＊5個の細胞を16時間刺激培養した。分泌されたサイトカインであるインターフェロン−γは、産生細胞の周辺にある捕捉用抗体（Detection  antibody  ；MABTECH  anti-human  IFN-γ  mAb  7-B6-1,  biotinylated（3420-6-250））と結合させた。洗浄により細胞を除去した後、検出用の抗インターフェロンγ抗体を添加した。【０１２６】
ビオチン標識検出抗体の場合は、酵素標識ストレプトアビジン（MABTECH  Streptavidin-HRP(3310-9)）を添加した。
（３）次に、BD  ELISPOT  AEC  Substrate  Set（551951）で発色させた。この方法により、インターフェロンγ（サイトカイン）産生細胞が位置した場所に相当するスポットを見ることができる。得られたスポットは、カールツァイス  KS  ELISPOT（ミネルバテック社）でスポット数をカウントし、陽性細胞の頻度を記録した。【０１２７】
（細胞内インターフェロンγ染色）
また、得られたサンプルについて、細胞内インターフェロンγ染色を行った。5x10５個のリンパ球を200μlの培地中で4時間刺激培養した。刺激にはネオ抗原（neoantigen）ペプチド、コントロールペプチドを終濃度1μg/mlになるように添加した。未刺激のコントロールも調製した。刺激中BioLegend  Brefeldin  A  Solution(1,000X)を終濃度5.0μg/mlになるように加えた。培養終了後細胞を回収し、Fixable  Viability  Dye  eFluor780(eBioscience  65-0865-18),FITC  標識抗CD4抗体（BD  PharmingenＴＭ557307）、ECD標識抗CD8抗体（BECKMAN  COULTER  41116015）、PerCP・CY5.5標識抗CD3抗体（Biolegend  300430）で4℃30分染色した。【０１２８】
Intraprep  permeabilization  reagent(Immunotech,  Marseille,  France)で15分細胞を処理した。PE標識抗IL−2抗体（BD  PharmingenＴＭ559334）、Alexa700標識抗TNFα抗体（BD  PharmingenＴＭ557996）、Pacific  Blue標識抗IFN-γ抗体（Biolegend  502522）で15分間染色した。【０１２９】
0.5％PFA入のPBSに懸濁した後、Galliosフローサイトメーター（BECKMAN  COULTER）で測定した。細胞内フローサイトメトリーのソーティングには、ＣＤ８陽性細胞を用いて、インターフェロンγの産生の解析を行った。【０１３０】
（インターフェロンγ産生に関する結果）
インターフェロンγ産生の解析結果を図６に示す。また、各種ペプチドについてインターフェロンγ産生が認められた変異ペプチドを以下にまとめる。表中変更のあるアミノ酸には下線を付した。【０１３１】
【表２】
0006710004.tif 000007
【０１３２】
表中のＭＴは変異型を示しＷＴは野生型を示す。ｐｅｐＩＤは実施例におけるサンプル番号である。ＩＣ５０は、ＨＬＡ−ペプチド結合の阻害濃度を示す。上記表中＋＋は３／３でインターフェロンγ産生が認められたものであり、＋は１／３〜２／３でインターフェロンγ産生が認められたものを指す。【０１３３】
以上から、今般見出された４４例のうち３０％近くの１２例において、ＥＬＩＳＰＯＴまたは細胞内インターフェロン産生について陽性の反応が出たことが明らかになった。【０１３４】
30％近くもの例で有用であり得るがん免疫ペプチドの候補が見出されたことは従来技術ではなく、顕著な効果であるといえる。【０１３５】
（実施例２：変異ペプチド選別と免疫原性の確認〜マウスの場合）
本実施例では、マウスを用いた場合でも実施することができる。【０１３６】
その手順を以下に示す。
１．全ての系統（ｓｙｎｇｅｎｉｃ）のマウスを対象にして、自然発症、化学発症、放射線発症に由来する腫瘍（癌、肉腫、白血病）に対してネオ抗原の探索が可能である。ここでは、マウス系統：Ｃ５７ＢＬ／６（ＭＨＣ  Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ．  Ｈ２ｂ  ）を用いて行う。腫瘍としては、腫瘍：Ｂ１６メラノーマ細胞を用いる。
２．担癌マウスの癌部位からの組織採取、正常マウスにおいて腫瘍部位と同一臓器・組織の採取を行う。この際には、担癌マウス個体では、腫瘍部位と非腫瘍部位（例えば、大腸癌の際には、腫瘍部位と非腫瘍部位と言う意味）。マウスは同一系統の場合は、正常組織は正常マウスから採取する。
３．採取された組織・臓器からＤＮＡおよびＲＮＡを抽出し、エキソームｓｅｑおよびＲＮＡｓｅｑ解析を行う。
４．系統毎にＭＨＣ（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ；  主要組織適合遺伝子複合体）は分かっているため、ｍｕｔａｎｏｍｅを探索し、更にはＭＨＣ（マウスではＨ−２）上に提示されるネオ抗原を同定する。
５．ネオ抗原の選択に関しては、実施例１でヒト腫瘍で記載している方法論と同一のものを使用する。具体的には、Ｂ１６メラノーマ細胞と同系のＣ５７ＢＬ／６マウスから正常皮膚を採取し、それぞれＤＮＡとＲＮＡを抽出し、エキソームｓｅｑ・ＲＮＡｓｅｑを行い、実施例１のネオ抗原探索ソフトにて候補ペプチドを同定する。
６．同定されたネオ抗原に対しては、ペプチドを人工的に合成し、同系マウスの脾臓細胞に添加培養して、培養後のＩＦＮγ産生誘導を活性の指標とする。
７．また、ネオ抗原で刺激し培養した脾臓細胞を用いて、腫瘍に対する細胞障害性を測定する。
８．試験管内での検討から、探索されたネオ抗原が腫瘍に対してＴ細胞の機能的な誘導を起こす事が明確にする。
９．候補となったネオ抗原を用いたｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を検討する。
１０．ｉｎ  ｖｉｖｏ効果としては、担癌マウス（ネオ抗原探索に使用した腫瘍を移植したマウス）にネオ抗原を直接投与する。また、樹状細胞療法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで同系マウス由来の樹状細胞を刺激培養し、その樹状細胞を担癌マウスに投与する）を用いて治療することができる。【０１３７】
効果判定は以下のようにして行う。
１．Ｃ５７Ｂｌ／６マウス由来脾臓細胞を用いたＥｌｉｓｐｏｔアッセイと細胞障害性を確認後にｉｎ  ｖｉｖｏでの効果判定を行う。
２．Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６メラノーマ細胞を皮下に移植し（１×１０６）、また、同数のＢ１６メラノーマ細胞を静脈内投与する。
３．Ｂ１６皮下投与後に、ネオ抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）の治療効果に関しては、腫瘍の大きさと生存率を指標とする。【０１３８】
以上のようにして、マウスでも同様に抗原ペプチドを同定し治療させることができる。【０１３９】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は日本国特許出願特願２０１６−５０８６１（２０１６年３月１５日出願）に対して優先権主張を行うものであり、その内容は本明細書においてその全体が参照として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
精確度の高い免疫療法用のペプチドの特定技術が提供され、より精度の高い治療、モニタリング、予防が可能となり、医薬品産業、臨床応用場面において特に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１４１】
配列番号１〜１２は実施例１で行ったＷＴペプチドとＭＴペプチドとに加えＨＬＡ型の情報を合わせてエピトープ解析結果において表示されるアミノ酸配列である。配列番号１、４、７、１０は1つ目のサンプル（HLA-C*03:03）で表示される配列であり、配列番号２、５、８および１１は２つ目のサンプル（HLA-C*03:03）で表示される配列であり、配列番号３、６、９、および１２は３つ目のサンプル（HLA-C*14:02）で表示される配列である。配列番号１〜３は、野生型アミノ酸配列、配列番号４〜６は変異型アミノ酸配列、配列番号７〜９は上流のアミノ酸配列および配列番号１０〜１２は下流のアミノ酸配列を示す。配列番号１３〜３６は、表２で示される実際のヒットのペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号１３〜２４は変異型アミノ酸配列であり、順にＰｅｐＩＤ１４、２１、４１、３６、７、４３、３０、３３、４２、２７、１２、１８を示す。配列番号２５〜３６は野生型アミノ酸配列であり、順にＰｅｐＩＤ１４、２１、４１、３６、７、４３、３０、３３、４２、２７、１２、１８を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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