(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコサミノグリカン誘導体を製造する方法であって、
ａ）隣接ジオールをジアルデヒドに変換するのに効果的な条件下で、グリコサミノグリカンの、２−Ｏ−非硫酸化残基の１０％〜１００％を酸化する工程；及び
ｂ）前記酸化されたグリコサミノグリカンを、前記ジアルデヒドをカルボキシレート基に変換するのに効果的な条件下で酸化する工程；を含み、
ステップａ）において、過ヨウ素酸塩によって酸化が行われ、
前記グリコサミノグリカンが非分画ヘパリン又はＬＭＷＨから選択され、２−Ｏ−及び／又は２−Ｎ−脱硫酸化されており、
前記グリコサミノグリカン誘導体は、ヘパラナーゼを阻害する、
グリコサミノグリカン誘導体を製造する方法。
【請求項２】
隣接ＯＨ／ＮＨ２をジアルデヒドに変換するのに効果的な条件下で、グリコサミノグリカンの、２Ｎ−、３−Ｏ−非硫酸化残基を酸化する工程；を更に含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記グリコサミノグリカンの伝導度滴定によって判定される硫酸化度（ＳＯ３-／ＣＯＯ-）が０．８〜２．８である、
請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記グリコサミノグリカンの伝導度滴定によって判定される硫酸化度（ＳＯ３-／ＣＯＯ-）が０．９〜２．５である、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記グリコサミノグリカン誘導体のカルボキシル増分が１．２〜２．２である、
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ）において、グリコサミノグリカンの、２−Ｏ−非硫酸化残基の２５％〜１００％を酸化する、
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記グリコサミノグリカンの誘導体は、３，０００から２０，０００Ｄａの分子量を有する、
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記グリコサミノグリカンの誘導体は、３，５００から１２，０００Ｄａの分子量を有する、
請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の前記グリコサミノグリカンの誘導体の酵素的又は化学的部分解重合を行う、
オリゴ糖化合物を製造する方法。
【請求項１０】
前記グリコサミノグリカン誘導体、及び、前記オリゴ糖化合物は、薬剤として用いる、
請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤は、抗転移剤又は抗腫瘍薬である、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗腫瘍薬は、抗骨髄腫薬である、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
誘導体が下記の構造を備えることを特徴とする、グリコサミノグリカンのカルボキシル化誘導体であって、
前記カルボキシル化誘導体の出発物質であるグリコサミノグリカンは、ヘパリン、低分子量ヘパリン、及び、ヘパラン硫酸から選択される、
グリコサミノグリカンのカルボキシル化誘導体。
【化１】
0006784454.tif 000003
Ｒ１は、ＳＯ３-又はＡｃであり、
Ｒ２は、ＳＯ３-又はＨである。
【請求項１４】
下記の構造の少なくとも１つを更に備える、
請求項１３に記載のグリコサミノグリカンのカルボキシル化誘導体。
【化２】
0006784454.tif 000004
Ｒ２は、それぞれＳＯ３-又はＨであり、
Ｒ３は、ＳＯ３-である。
【請求項１５】
（ａ）前記へパリンは、２−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン、及び、２−Ｎ−脱硫酸化ヘパリン、及び／又は
（ｂ）前記低分子量ヘパリンは、２−Ｏ−脱硫酸化低分子量ヘパリン、及び、２−Ｎ−脱硫酸化低分子量ヘパリンである、
請求項１３又は請求項１４に記載のグリコサミノグリカンのカルボキシル化誘導体。
【請求項１６】
前記カルボキシル化誘導体の出発物質である前記グリコサミノグリカンは、伝導度滴定によって判定される硫酸化度（ＳＯ３-／ＣＯＯ-）が０．８〜２．８、又は、０．９〜２．５である、
請求項１３〜請求項１５のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカンのカルボキシル化誘導体。
【請求項１７】
グリコサミノグリカンの前記カルボキシル化誘導体は、伝導度滴定によって判定される硫酸化度（ＳＯ３-／ＣＯＯ-）が０．８２〜１．９２である、
請求項１３〜請求項１６のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカンのカルボキシル化誘導体。
【請求項１８】
前記誘導体は、（ａ）８，０００〜３０，０００Ｄａから選択される分子量、又は、（ｂ）３，０００〜２０，０００Ｄａから選択される分子量、又は、（ｃ）３，５００〜１２，０００Ｄａから選択される分子量を有する、
請求項１３〜請求項１７のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカンのカルボキシル化誘導体。
【請求項１９】
ヘパラナーゼの阻害から恩恵を得る適応症の治療において使用する、
請求項１３〜請求項１８のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカンのカルボキシル化誘導体。
【請求項２０】
抗転移薬又は抗腫瘍薬として使用する、
請求項１３〜請求項１８のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカンのカルボキシル化誘導体。
【請求項２１】
抗骨髄腫薬として使用する、
請求項１３〜請求項１８のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカンのカルボキシル化誘導体。
【請求項２２】
請求項１３〜請求項１８のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカンのカルボキシル化誘導体を含む、
医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパラナーゼ阻害活性及び抗腫瘍活性を有し、グリコサミノグリカン残基の少なくとも一部の２位置及び３位置にカルボキシレート基を持つグリコサミノグリカン誘導体並びにそれを調製する方法に関する。
【０００２】
本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、場合により化学的又は酵素的に改質された、天然又は合成のグリコサミノグリカンから出発して生成される。特に、前記グリコサミノグリカン誘導体は、グリコサミノグリカンの二段階の酸化によって得ることができる。好ましくは過ヨウ素酸塩による、第一の酸化（ａ）によって、グリコサミノグリカン残基の隣接ジオール及び場合により隣接ＯＨ／ＮＨ２がアルデヒドに変換され、第二の酸化（ｂ）により、前記ジアルデヒドがカルボキシレート基に変換される。本発明によると、第一の酸化ステップ（ａ）において、隣接ジオール及び場合により隣接ＯＨ／ＮＨ２をアルデヒドに変換するのに効果的な条件下で、グリコサミノグリカンの２−Ｏ−非硫酸化残基及び場合により２Ｎ−、３−Ｏ−非硫酸化残基の好ましくは１０％〜１００％、より好ましくは２５％〜１００％が酸化される。
【０００３】
第一の酸化は、好ましくは酸化可能残基の環のＣ２−Ｃ３結合の開裂を引き起こすものである。好ましくは、グリコサミノグリカンは天然又は合成のグリコサミノグリカンであり、場合により２−Ｏ−及び／又は２−Ｎ−脱硫酸化されており、硫酸化度（ＳＯ３−／ＣＯＯ−モル比）が０．８〜２．８、好ましくは０．９〜２．５である。本明細書において硫酸化度（ＳＯ３−／ＣＯＯ−モル比）は、Ｃａｓｕ  Ｂ．及びＧｅｎｎａｒｏ  Ｕ．が著した、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ３９（１９７５年）の１６８〜１７６ページによる伝導度滴定によって判定したものが意図されている。上記に開示する本発明の方法によって得ることができるジ／トリカルボキシル化グリコサミノグリカン誘導体が示すカルボキシル増分（carboxyl increment）は１．２〜２．２である。ただし、カルボキシル増分は、本明細書において定義する伝導度滴定によって判定されるジ／トリカルボキシル化誘導体の硫酸化度（ＳＯ３−／ＣＯＯ−モル比）に対する出発物質の硫酸化度（ＳＯ３−／ＣＯＯ−モル比）の比として計算される。より具体的には、出発物質のグリコサミノグリカンの硫酸化度は、第一の酸化ステップ（ａ）によって得られるグリコサミノグリカン中間体のサンプルに対して、ＮａＢＨ４による還元後に判定される。
【０００４】
好ましくは、本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、場合により化学的又は酵素的に改質された、任意の動物及び臓器提供者由来の天然ヘパリン、又は合成ヘパリンから出発して得られる。より好ましくは、出発物質は、非分画ヘパリン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ、分子量は３，５００〜８，０００Ｄａ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、又はこれらの誘導体である。最も好ましくは、場合により２−Ｏ−及び／又は２−Ｎ−脱硫酸化された非分画ヘパリン又はＬＭＷＨから得ることができるグリコサミノグリカン誘導体である。
【０００５】
本発明は更に、前記グリコサミノグリカン誘導体を調製する方法に関し、更には、場合により公知の確立された薬物又は治療と組み合わせた薬剤の活性原材料としてのその使用に関する。特に、本発明は、多発性骨髄腫及び他の新生組織形成（即ち、非上皮性悪性腫瘍、上皮性悪性腫瘍、血液悪性腫瘍）などであって、その転移型も含む病態の治療用薬剤として用いるための前記グリコサミノグリカン誘導体を対象とする。
【０００６】
更には、本発明は、ヘパラナーゼの阻害から恩恵を受ける任意の治療指標（即ち、糖尿病性腎症、炎症性腸疾患、大腸炎、関節炎、乾癬、敗血症、アテローム性動脈硬化症）における前記グリコサミノグリカン誘導体の使用に関する。本発明は更に、前記ジ／トリカルボキシル化グリコサミノグリカン誘導体を含む医薬組成物に関し、特に、ジ／トリカルボキシル化ヘパリン及び低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）の誘導体を活性剤として含む医薬組成物に関する。場合により、前記医薬組成物は、少なくとも１種の別の活性剤、好ましくは少なくとも１種の別の抗がん剤を更に含む。
【背景技術】
【０００７】
多発性骨髄腫は、二番目に多く見られる血液悪性腫瘍であり、米国における血液がん全体の１０％以上を占めている。毎年約２０，０００件の新たな症例が出ており、致死率は５０％を超えている（Ｇｒａｈａｍ−Ｒｏｗｅ  Ｄ．、２０１１、多発性骨髄腫の見通し（Multiple myeloma outlook）、Ｎａｔｕｒｅ  ４８０、ｓ３４〜ｓ３５）。
【０００８】
最近の数年間に、有望な治療法、例えばプロテアソーム阻害剤（ベルケイド）、ビスホスフォネート、サリドマイドなどの投与が開発されている。これらの薬剤の有効性は、少なくとも部分的には、骨髄腫腫瘍微環境に及ぼすその影響によるものである。
【０００９】
骨髄腫に対する前記薬剤の有効性は実証されたものの、骨髄腫及び他の腫瘍の治療のための新規の改良された薬物に対する必要性は依然として存在する。
【００１０】
ヘパラナーゼは、シンデカン−１などのＨＳ−プロテオグリカンのヘパラン硫酸（ＨＳ）を開裂し、それによりＨＳ結合型増殖因子を放出する、エンド−β−グルクロニダーゼである。
【００１１】
人体には、ＨＳを開裂可能な単一の優勢な機能性ヘパラナーゼ酵素が存在するように見受けられる。ヘパラナーゼは、ほとんどのヒトの腫瘍に発現し、その場合、腫瘍細胞の血管形成能及び転移能を大幅に増大させる。ヘパラナーゼレベルの上昇は、実際に多くの腫瘍型の進行及び転移と相関関係があった。例えば、高レベルのヘパラナーゼは、患者の術後生存期間の短縮と関連している。腫瘍転移におけるヘパラナーゼの直接的な役割は、Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ及びＳａｎｄｅｒｓｏｎの研究室で実証され、そこで我々の新規な阻害剤もテストされてきた。
【００１２】
ＨＳ結合型増殖因子の放出及び侵入性細胞による細胞外基質（ＥＣＭ）の分解を含む酵素機能に加え、ヘパラナーゼは、腫瘍挙動及びその微環境に影響を及ぼし得る非酵素機能も有する。Ｓａｎｄｅｒｓｏｎのグループは、骨髄腫におけるヘパラナーゼ及びシンデカン−１を対象とした研究の先駆者であり、ヘパラナーゼが骨髄腫において浸潤性腫瘍表現型の主要調節因子として作用することを立証した。これは、ＶＥＧＦ及びＭＭＰ−９の上方調節を促進することによって起こり、同時に腫瘍増殖、転移性及び溶骨性骨破壊を増進する。実際、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ヘパラナーゼが骨髄腫腫瘍の成長及び骨への自然転移を促進すること、ならびに腫瘍細胞によるヘパラナーゼの発現が、少なくとも部分的にはＲＡＮＫＬ発現の上方調節による、著しい骨溶解を助長することが実証されている。ヘパラナーゼの骨溶解促進効果は、骨が劣化すると骨結合型増殖因子が放出されることから、非常に重要となり得る。加えて、破骨細胞は、ＨＧＦなどの腫瘍増殖促進因子を放出する可能性がある。同時に、これらの因子は、腫瘍細胞のホーミングとその後の増殖を助けるニッシェの骨髄内における形成を助長し得る（Ｆｕｘ，Ｌ．他、２００９、「ヘパラナーゼ：細胞表面で活発（Heparanase : busy at the cell surface）」Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ、３４（１０）：５１１〜５１９；Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｒ．Ｄ．及びＹａｎｇ  Ｙ．、２００８、「シンデカン−１：骨髄腫微環境の動的な調節因子（Syndecan-1 : a dynamic regulator of the myeloma microenvironment）」Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２５：１４９〜５９；Ｉｌａｎ  Ｎ．他、２００６、「がん転移及び血管形成におけるヘパラナーゼの制御、機能及び臨床的意義（Regulation, function and clinical significance of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis）」Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、３８：２０１８〜２０３９）。従って、ヘパラナーゼの阻害は、骨髄腫治療の実現可能な目標であり、人体には酵素的に活性な単一のヘパラナーゼが存在するという事実、及び通常の組織においてその発現はまれであるという事実によって裏付けられる。更には、ヘパラナーゼノックアウトマウスは生存可能であって観察可能な障害を何ら示さないことが証明されている。このことは、ヘパラナーゼ阻害方策からは副作用がほとんどあるいは全く生じないことを示している（Ｃａｓｕ  Ｂ．、他  ２００８、非抗凝固性ヘパリン及びがんの阻害（Non-anticoagulant heparins and inhibition of cancer）、Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈａｅｍｏｓｔ  Ｔｈｒｏｍｂ．３６：１９５〜２０３；Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ  Ｉ．、他、２００７、ヘパラナーゼ：構造、生物学的機能、及びヘパラン硫酸のヘパリン由来模倣薬による阻害（Heparanase: structure, biological functions, and inhibition by heparin-derived mimetics of heparan sulfate）、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．１３：２０５７〜２０７３；Ｎａｇｇｉ  Ａ．、他  ２００５、選択的脱硫酸化、段階的Ｎ−アセチル化、及びグリコール分割によるヘパリンのヘパラナーゼ阻害活性の調節（Modulation of the Heparanase-inhibiting Activity of Heparin through Selective Desulfation, Graded N- Acetylation, and Glycol Splitting）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：１２１０３〜１２１１３）。
【００１３】
ヘパリンは、グリコサミノグリカンファミリーの線状多分散硫酸化多糖類であり、抗凝固活性及び抗血栓活性を有する。ヘパリンの単糖鎖は、交互に並んだウロン酸とＤ−グルコサミンからなる。主要な繰り返し単位は、２−Ｏ−硫酸化Ｌ−イズロン酸（ＩｄｏＡ２Ｓ）α（１→４）とＮ−、６−Ｏ−脱硫酸化Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ６Ｓ）である。微量成分は、非硫酸化Ｌ−イズロン酸及びＤ−グルクロン酸であり、更にＮ−アセチルＤ−グルコサミン及びＮ−、３−Ｏ−、６−Ｏ−三硫酸化Ｄ−グルコサミンである（Ｃａｓｕ  Ｂ．、２００５、ヘパリンの構造及び活性ドメイン（Structure and active domains of heparin）、出典：ヘパリン及びヘパラン硫酸の化学及び生物学（Chemistry and Biology of Heparin and Heparan Sulfate）、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．１〜２８；Ｃａｓｕ  Ｂ．及びＬｉｎｄａｈｌ  Ｕ、２００１、ヘパリン及びヘパラン硫酸の構造及び生物相互作用（Structure and biological interactions of heparin and heparan sulfate）、Ａｄｖ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、５７：１５９〜２０６）。ヘパリンは、構造的にＨＳに類似しており、効率的にヘパラナーゼを阻害できるが、ヘパラナーゼ阻害方策における高用量でのヘパリンの使用は、その抗凝固活性のために不可能である。
【００１４】
興味深いことに、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）は、ヘパリンよりも生物学的有用性が高く（more bioavailable）て抗凝固性が低く、おそらくは腫瘍の増殖及び転移に直接的に作用してがん患者を延命するようにみえる。それは、少なくともある程度は、ヘパラナーゼ酵素活性の阻害によると考えられる（Ｚａｃｈａｒｓｋｉ  Ｌ．Ｒ．、及びＬｅｅ，Ａ．Ｙ．２００８、抗がん治療としてのヘパリン（Heparin as an anticancer therapeutic）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  １７：１０２９〜１０３７）。
【００１５】
ヘパラナーゼの酵素活性の効果的な阻害剤は、先行技術においては、非抗凝固性ヘパリンによるヘパラナーゼ阻害を研究することによって選ばれており、そのほとんどは、グリコサミノグリカン残基の炭素２と３との間の結合の開裂（グリコール分割）によるグルコシド環の開環によって改質された非硫酸化ウロン酸残基を含んでいる。前記阻害剤は、元々存在する非硫酸化ウロン酸残基と段階的２−Ｏ−脱硫酸化によって生成される非硫酸化ウロン酸残基の両方のＯ−硫酸化パターン、Ｎ−アセチル化度、及びグリコール分割の点で異なっている（Ｎａｇｇｉ  Ａ．、２００５、「ヘパリン及びヘパリン誘導体による増殖因子の阻害及びヘパラナーゼ阻害を調節するための手段としてのグリコール分割（Glycol-splitting as a device for modulating inhibition of growth factors and heparanase inhibition by heparin and heparin derivative）」出典：ヘパリン及びヘパラン硫酸の化学及び生物学（Chemistry and Biology of Heparin and Heparan Sulfate）、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ４６１〜４８１；Ｙａｎｇ  Ｙ．他、２００７、「シンデカン−１ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、骨髄腫治療のための実行可能な目標である（The syndecan-1 heparan sulfate proteoglycan is a viable target for myeloma therapy）」Ｂｌｏｏｄ、１１０：２０４１〜２０４８）。
【００１６】
特に、「グリコール分割（ｇｓ）」という用語は、従来は、それぞれヒドロキシル基を持つ２つの隣接する炭素間の１つの結合の切断（グリコール分割）によって一部の単糖類残基の開環を生じる多糖類を意味している。第一世代のグリコール分割ヘパリン、すなわち、いわゆる「還元オキシヘパリン」（ＲＯヘパリン）は、時にはグリコール分割残基によって遮断される未改質多硫酸化ブロックからなり、これは、元の鎖に沿って存在し、まずジアルデヒドに酸化され次いでアルコールに還元された非硫酸化グルクロン酸／イズロン酸残基に対応していた（Ｎａｇｇｉ  Ａ．、２００５、「ヘパリン及びヘパリン誘導体による増殖因子の阻害及びヘパラナーゼ阻害を調節するための手段としてのグリコール分割（Glycol-splitting as a device for modulating inhibition of growth factors and heparanase inhibition by heparin and heparin derivative）」出典：ヘパリン及びヘパラン硫酸の化学及び生物学（Chemistry and Biology of Heparin and Heparan Sulfate）、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ４６１〜４８１）
【００１７】
ＷＯ０１／５５２２１は２−Ｏ−脱硫酸化度が全ウロン酸単位の６０％以下のグリコサミノグリカンを開示している。前記グリコサミノグリカンは抗凝固活性を持たず、ＦＧＦの阻害に基づく抗血管形成活性を示す。ヘパラナーゼの阻害については、活性は予測されていなかった。
【００１８】
ＵＳ２００８／００５１５６７は、抗凝固活性又は細胞外基からの増殖因子の放出をほとんどあるいは全くもたらさない、１００％Ｎ−アセチル化され２５％グリコール分割されたヘパリンに対応する化合物を開示している。前記化合物は、骨髄腫のサンダーソンモデルを含む実験動物モデルにおいて、ヘパラナーゼ、腫瘍増殖、血管形成及び炎症を阻害することが判明した；Ｙａｎｇ  Ｙ．他、２００７、「シンデカン−１  ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、骨髄腫治療のための実行可能な目標である（The syndecan-1 heparan sulfate proteoglycan is a viable target for myeloma therapy）」Ｂｌｏｏｄ  １１０：２０４１〜２０４８）。
【発明の概要】
【００１９】
それにも関わらず、ヘパラナーゼ親和性がより高く、選択性がより高く、生物学的有用性が改善され、骨髄腫及び他の腫瘍などのヘパラナーゼ関連病変の治療に適した改良された化合物を提供する必要性は依然として存在する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１：本発明の方法によって生成される優勢な構造である。（１）１つのウロン酸（イズロン酸及び／又はグルクロン酸）と１つのグルコサミン（２−Ｎ−アセチル化、２−Ｎ−非置換、及び／又は２−Ｎ−硫酸化）とを含むグリコサミノグリカンポリマーの二糖類単位であり、ヒドロキシル基（Ｒ３及びＲ４）はそれぞれ又は両方を硫酸基で置換（substituted）又は非置換（non-substituted）とすることができる。（２、３、４）２−非硫酸化ヘパリン残基の環の酸化的開裂とその後のトリ又はジカルボキシル化残基への更なる酸化によって生成される代表的構造（新規物質）である。
【００２１】
【図２】図２：ＭＳ検出によって得られるクロマトグラムの一例である。ウロン酸ジ又はトリカルボン酸塩残基を含有するオリゴ糖に対応するピークの存在は、分子量の測定値に起因し、グラフにおいてはそれぞれ符号「＋ｃａｒｂｏｘ２」又は「＋ｃａｒｂｏｘ３」で示してある。
【００２２】
【図３】図３：ＭＳ検出によって得られるクロマトグラムの一例である。ウロン酸ジ又はトリカルボン酸塩残基を含有するオリゴ糖に対応するピークの存在は、分子量の測定値に起因し、グラフにおいてはそれぞれ符号「＋ｃａｒｂｏｘ２」又は「＋ｃａｒｂｏｘ３」で示してある。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、ヘパラナーゼ阻害活性を有する、化学的に改質されたグリコサミノグリカン誘導体の新規クラスに関する。特に、本発明は、残基の少なくとも一部が３つ（又は分割残基がグルコサミンの場合は２つ）のカルボキシレート基を持つ分割残基であるカルボキシル化グリコサミノグリカン誘導体に関する。
【００２４】
本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、好ましくは「ジ／トリカルボキシル化ヘパリン」として設計された、ヘパラナーゼのヘパラン硫酸分解活性を強力に阻害するヘパリン誘導体である。ヘパリンに対してなされる化学的改質がＡＴＩＩＩの結合部位に含まれるグルクロン酸の残基を改質し、ヘパリン抗凝固活性を無効にして高用量の使用を可能とする。
【００２５】
本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、グリコサミノグリカンの隣接ジオール及び場合により隣接ＯＨ／ＮＨ２をアルデヒドに変換する効果的な条件下で、好ましくは過ヨウ素酸塩によりグリコサミノグリカンの２−非硫酸化残基を酸化し、続いて酸化されたグリコサミノグリカンを、前記ジアルデヒドをカルボキシレート基に変換する条件下で酸化することによって得ることができる。特に、本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、好ましくは硫酸化度（ＳＯ３−／ＣＯＯ−モル比）が０．８〜２．８、好ましくは０．９〜２．５のグリコサミノグリカンから出発して得ることができる。本明細書において硫酸化度（ＳＯ３−／ＣＯＯ−モル比）は、Ｃａｓｕ  Ｂ．及びＧｅｎｎａｒｏ  Ｕ．、１９７５、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ  ３９、１６８〜１７６による伝導度滴定によって判定したものが意図されている。
上記に開示する本発明の方法によって得ることができるジ／トリカルボキシル化グリコサミノグリカン誘導体が示すカルボキシル増分は、１．２〜２．２である。ただし、前記カルボキシル増分は、本明細書において定義する伝導度滴定によって判定されるジ／トリカルボキシル化誘導体の硫酸化度（ＳＯ３−／ＣＯＯ−モル比）に対する第一の酸化ステップ後の出発物質の硫酸化度（ＳＯ３−／ＣＯＯ−モル比）の比として計算される。より具体的には、第一の酸化ステップ後の出発物質の硫酸化度は、第一の酸化ステップ（ａ）によって得られるグリコサミノグリカン中間体のサンプルに対して、ＮａＢＨ４による還元後に判定される。
【００２６】
好ましくは、本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、天然又は合成の（化学的又は酵素的に得られた）グリコサミノグリカン、より好ましくは２−Ｏ−及び／又は２−Ｎ−脱硫酸化グリコサミノグリカンに由来する。好適な実施の形態において、前記天然又は合成のグリコサミノグリカンは、非分画ヘパリン、ＬＭＷＨ、又はヘパラン硫酸であって、場合により２−Ｏ−及び／又は２−Ｎ−脱硫酸化されている。
【００２７】
より好ましくは、グリコサミノグリカン誘導体は、２−Ｏ−及び場合により２−Ｎ−脱硫酸化された天然又は合成のヘパリン又はＬＭＷＨに由来する。
【００２８】
一例として、ヘパリン鎖は本来、約５％〜３５％の２−Ｏ−非硫酸化ウロン酸残基、０％〜５０％のＮ−アセチル化グルコサミン残基、及び約０％〜６％のＮ−非置換（Ｎ−硫酸化もＮ−アセチル化もされていない）グルコサミン残基を含むことができる。硫酸化度の違いはヘパリン源（動物種、臓器提供者）及び抽出手順の違いによる。グリコサミノグリカンの２−Ｏ−又は２Ｎ−非硫酸化残基はいずれも、３−Ｏ−硫酸塩置換基を持たず、開環（分割）を伴う酸化並びに隣接ジオール及びＯＨ／ＮＨ２のアルデヒドへの変換が可能である。場合により、出発物質であるグリコサミノグリカンの段階的な２−Ｏ−脱硫酸化によってグルコサミン／ウロン酸分割残基の比を調節できる。
【００２９】
本発明は更に、前記カルボキシル化グリコサミノグリカン誘導体を調製する方法に関し、更には、単一の活性原材料として、又は他の薬剤との組み合わせで、病態を治療するための薬剤の活性原材料としてのその使用に関する。前記病態としては、多発性骨髄腫及び他の腫瘍性疾患が挙げられ、その転移型も含まれる。更には、本発明は、ヘパラナーゼの阻害から恩恵を受ける任意の治療指標において用いるための前記カルボキシル化グリコサミノグリカン誘導体に関する。本発明は更に、前記カルボキシル化グリコサミノグリカン誘導体を、場合により少なくとも１種の更なる活性原材料と組み合わせて含有する医薬組成物に関する。
【００３０】
本発明のカルボキシル化グリコサミノグリカン誘導体を調製する方法は、好ましくは過ヨウ素酸塩により（又は同様の反応性を有する酸化試薬を用いて）、隣接ジオール及び場合により隣接ＯＨ／ＮＨ２をアルデヒドに変換するのに効果的な条件下で感受性の高いグリコサミノグリカンの非硫酸化残基を酸化すること、及び、それに続く、第一の酸化で得られたグリコサミノグリカンを、対応するアルデヒド基から２つの新しいカルボキシレート基を得るための条件下で酸化することを含む。
【００３１】
従って、本発明の方法は、隣接ジオール及び場合により隣接ＯＨ／ＮＨ２をアルデヒドに変換するのに効果的な条件下で、好ましくは過ヨウ素酸塩により、グリコサミノグリカンの２−Ｏ−及び場合により２−Ｎ−、３−Ｏ−非硫酸化残基の１０％〜１００％、好ましくは２５％〜１００％を酸化することを含み、次いで、酸化されたグリコサミノグリカンを、前記ジアルデヒドをカルボキシレート基に変換するのに効果的な条件下で酸化することを含む。
【００３２】
好ましくは、出発物質であるグリコサミノグリカンは、天然又は合成のグリコサミノグリカンであり、より好ましくは、ヘパリン、低分子量ヘパリン、又はヘパラン硫酸から選択され、最も好ましくは、２−Ｏ−及び場合により２−Ｎ−脱硫酸化されたヘパリン及びＬＭＷＨから選択される。
【００３３】
好ましくは、出発物質であるグリコサミノグリカンは、本明細書に定義する伝導度滴定による硫酸化度（ＳＯ３−／ＣＯＯ−）が０．８〜２．８、より好ましくは０．９〜２．５である。
【００３４】
本発明の方法の第一の酸化は、ｐＨが、好ましくは３〜１０、より好ましくは４．５〜８で実施される。好適な実施の形態において、本発明の方法の第一の酸化は、非硫酸化ウロン酸残基のＣ２−Ｃ３結合のみを開裂し、副反応を回避するために、３〜５のｐＨで実施される。別の好適な実施の形態では、本発明の方法の第一の酸化は、２−Ｏ−非硫酸化ウロン酸とＮ−非硫酸化グルコサミン残基の両方のＣ２−Ｃ３結合を開裂するために、５．５〜１０のｐＨで実施される。
【００３５】
好適な実施の形態において、第一の酸化は、２−Ｏ−非硫酸化ウロン酸と２−Ｎ−、３−Ｏ−非硫酸化グルコサミンの両方のＣ２とＣ３の間の結合を開裂する条件下で実行される。
【００３６】
場合により、本発明の方法は、解重合を低減させるために用いるキレート剤金属イオン封鎖剤であるＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）の存在下で、反応液をアルカリ化するためのＮａＨＣＯ３もしくはピリジンの存在下で、又はＮＴＡと共にＭｎＣｌ２の存在下またはＮＴＡなしでＭｎＣｌ２の存在下で実行される。更なるジアルデヒド酸化は、ＮａＣｌＯ２を用いて、又はＴＥＭＰＯ（２，２，６，６テトラメチル−１−ピペリジニル−オキシ）などの同等の酸化作用を有する薬剤を用いて選択的に実行される。
【００３７】
好ましくは、本発明のグリコサミノグリカン誘導体中のカルボキシル化ウロン酸残基は、グリコサミノグリカンの全カルボキシル化残基の全残基の２５％〜１００％、より好ましくは５０％〜１００％、最も好ましくは６０％〜９０％である。
【００３８】
上記方法によって得ることができるカルボキシル化グリコサミノグリカン誘導体は、方法条件及び採用された出発物質であるグリコサミノグリカンにもよるが、好ましくは分子量が８０００〜３０，０００Ｄａである。好適な実施の形態においては、より好ましくは、非分画ヘパリンを出発物質であるグリコサミノグリカンとして採用した場合、上記方法によって得ることができるカルボキシル化グリコサミノグリカン誘導体は、好ましくは分子量が３，０００〜２０，０００Ｄａ、好ましくは３，５００〜１２，０００Ｄａである。
【００３９】
本発明の方法によって得ることができる新規なグリコサミノグリカン誘導体は、それぞれが２つの追加カルボキシレート基を持つ分割残基の存在を特徴とするヘパリン様多糖類の新規クラスに相当する。ここで留意すべきは、天然のカルボキシレート基１つを持つ残基は、本発明の方法によってトリカルボキシル化残基に変換されることである。前記新規なジ／トリカルボキシル化グリコサミノグリカン誘導体は、意外にもｉｎ  ｖｉｔｒｏでは強力なヘパラナーゼ阻害剤であって、動物モデルでは骨髄腫を阻害することが証明されている。
【００４０】
２つ又は３つのカルボキシレート基を持つ残基を含むグリコサミノグリカン誘導体は、元のグリコサミノグリカンより硫酸化度も低く、それよりも少数のカルボキシル基を持つ類似体よりも好ましい薬物動態を示す。
【００４１】
本発明は更に、薬剤として用いるための上記方法によって得ることができる化合物に関する。
【００４２】
特に、本発明は、単独で、又は少なくとも１種の更なる活性原材料と組み合わせて抗腫瘍薬剤として、好ましくは抗骨髄腫薬剤として用いるための、上記方法によって得ることができる化合物に関する。
【００４３】
本発明に従って調製されるヘパリン及び低分子量ヘパリン誘導体は、多発性骨髄腫実験モデルでは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏの両方においてヘパラナーゼ活性の効果的な阻害を示している。
【実施例】
【００４４】
［化合物の調製］
伝導度滴定による硫酸化度（ＳＯ３−／ＣＯＯ−）が異なる非分画又は分画ヘパリンのサンプルを、公知の方法を修正して実行した過ヨウ素酸酸化（分割ジアルデヒド単位を生じる）に付した。公知の方法（Ｊａｓｅｊａ  Ｍ．他、１９８９、「アルカリ性溶液におけるヘパリンの新規な位置及び立体選択的な改質−核磁気共鳴分光学的証拠（Novel regio- and stereo-selective modifications of heparin in alkaline solution. Nuclear magnetic resonance spectroscopic evidence）」Ｃａｎａｄ  Ｊ  Ｃｈｅｍ、６７、１４４９〜１４５５；Ｒ．Ｎ．Ｒｅｊ及びＡ．Ｓ．Ｐｅｒｌｉｎ、１９９０、「ヘパリンのα−Ｌ−イズロン酸２−硫酸単位のα−Ｌ−ガラクチュロン酸単位への塩基触媒変換及び関連反応（Base-catalyzed conversion of the α-L-iduronic acid 2-sulfate unit of heparin into a unit of α-L-galacturonic acid and related reactions）」Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２００、２５、４３７〜４４７；Ｃａｓｕ  Ｂ．他、２００４、「抗血管形成活性を有する低硫酸化グリコール分割ヘパリン（Undersulfated and Glycol-Split Heparins Endowed with Antiangiogenic Activity）」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４７、８３８〜８４８）を修正したものに従い、非分画ヘパリン（ＵＦＨ）の段階的な２−Ｏ−脱硫酸化を実行した。塩基性条件下では、２−Ｏ−脱硫酸化（天然又は化学的に誘発）Ｌ−イズロン酸単位は２，３−エポキシ誘導体に変換され、最終的にはＬ−ガラクチュロン酸単位に変換される。ウロン酸単位及び場合によりグルコサミンに由来するジアルデヒドは、好ましくは短時間のうちに更にジカルボン酸塩へと酸化させる。
【００４５】
［Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験］
Ｂｉｓｉｏ他の以前の研究（Ｂｉｓｉｏ  Ａ．他、２００７「ヘパラナーゼによる開裂に対するヘパリン種の感受性に関する高性能液体クロマトグラフィー／質量分光研究（High-performance liquid chromatographic/mass spectrometric studies on the susceptibility of heparin specie to cleavage by heparanase）」Ｓｅｍ  Ｔｈｒｏｍｂ  ｈｅｍｏｓｔ  ３３  ４８８〜４９５）に基づき、イスラエルハイファ大学のＶｌｏｄａｖｓｋｙ教授のグループによってヘパラナーゼ阻害活性が、Ｈａｍｍｏｎｄ他が記載する方法（Ｈａｍｍｏｎｄ他、２０１０「動態解析及び阻害剤スクリーニングに適するヘパラナーゼ活性に関する比色分析の開発（Development of a colorimetric assay for heparanase activity suitable for kinetic analysis and inhibitor screening）」Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、３９６、１１２〜６）に従いｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定された。端的に言えば、ヘパラナーゼは、ヘパリンの抗トロンビン結合部位に構造的に対応する抗血栓剤である合成五糖類フォンダパリヌクスを開裂することができる。ヘパラナーゼの開裂の結果、三糖類と還元性二糖類が得られる。後者は、ヘパラナーゼ活性を評価するために容易に定量化できる。本実施例においては、分析溶液（１００μｌ）は、４０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０と、１００ｍＭフォンダパリヌクス（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）とを含み、阻害剤試料は含む場合と含まない場合がある。分析を開始するためヘパラナーゼを最終濃度１４０ｐＭまで添加した。容器を粘着テープで封止し、３７℃で２から２４時間培養した。１．６９ｍＭの４−［３−（４−ヨードフェニル）−１Ｈ−５テトラゾリオ］−ｌ，３−ベンゼンジスルホナート（ＷＳＴ−１，Ａｓｐｅｐ、オーストラリア  メルボルン）の０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液１００μｌの添加によって分析を停止した。容器を粘着テープで再度封止し、６０℃で６０分間生育させた。吸光度を５８４ｎｍ（Ｆｌｕｏｓｔａｒ、ＢＭＧ、Ｌａｂｔｅｃｈ）で測定した。各容器において、Ｄ−ガラクトースを還元糖標準として、同じ緩衝液と体積で２〜１００μＭの濃度範囲で構築した標準曲線を用意した。この分析は単一の開裂点を持つ均質な基質を有するため、酵素の反応速度及び生化学的パラメーターを確実に特徴付けることができる。ＩＣ５０値を判定した。上記の比色分析を用いて得られた結果を、硫酸塩で標識した細胞外基質（ＥＣＭ）を基質として用いて検証した。端的に言えば、ＥＣＭ基質は、培養した角膜内皮細胞によって堆積されるため、組成、生物学的機能、及びバリア性が内皮化基底膜に酷似している。硫酸塩標識ＥＣＭの調製とヘパラナーゼ分析のためのその使用についての詳細な情報は、Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ，Ｉ．、細胞生物学における現在のプロトコル（Current Protocols in Cell Biology）、Ｃｈａｐｔｅｒ  １０：Ｕｎｉｔ  １０．４、２００１に記載されている。分析は感度が高く、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件によく似ているが、その生物学的性状のため、生化学的パラメーターの観点からは半定量的であり、限界がある。
【００４６】
［Ｉｎ  ｖｉｖｏ試験］
ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗骨髄腫活性を、Ｙａｎｇ  Ｙ他（Ｙａｎｇ  Ｙ．他、２００７、「シンデカン−１ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、骨髄腫治療のため実現可能な目標である（The syndecan-1 heparan sulfate proteoglycan is a viable target for myeloma therapy）」Ｂｌｏｏｄ  １１０：２０４１〜２０４８）に記載の手順に実質的に従いテストした。端的に言えば、５から６週齢のＣＢ１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスをＡｒｌａｎ（インディアナ州インディアナポリス）又はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国）から得た。マウスをバーミンガムのアラバマ大学の動物施設に収容して監視した。実験手順及びプロトコルは全て、動物実験委員会の承認を得た。１×１０６ヘパラナーゼ発現ＣＡＧ骨髄腫細胞（高発現及び低発現）を各マウスの左脇腹に皮下注射した。腫瘍細胞の注射１０日後、Ａｌｚｅｔ浸透圧ポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州クパチーノ）をマウスの右脇腹に埋め込んだ。ポンプには、テスト化合物（新しいヘパリン誘導体）の溶液又は対照としてのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）が入れてあった。溶液は、１４日間連続して供給した。１４日後、動物を殺し、皮下腫瘍の湿重量と平均血清Κレベルを分析してログランク検定によって実験群内で比較した（ｐ＜０．０５が統計的に有意であると考えられる）。
【００４７】
一週間のルシフェラーゼ生物発光画像化が原発腫瘍に関する定量的なデータを提供し、軟質組織だけでなく骨内の転移も追跡する。とりわけ、ＳＣＩＤ−ｈｕモデルは、ＳＣＩＤマウスの皮下に移植したヒト胎児骨の小片にヒト腫瘍細胞が直接注射されるため、ヒト骨髄腫を綿密に再現するという点で独特である。
【００４８】
［ＮＭＲ分析の一般的手順］
スペクトルを２５℃にて、５−ｍｍ  ＴＣＩ凍結探針又は１０ｍｍ  ＢＢＯプローブを備えるＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ５００  分光計（ドイツ  カールスルーエ）で記録した。スペクトルにおけるピーク体積の積分は、標準的なＢｒｕｋｅｒ  ＴｏｐＳｐｉｎ２．０ソフトウエアを用いて行った。ジカルボキシル化ウロン酸残基の構造を、トリカルボン酸塩残基の存在を確認しその化学シフトの同定を可能とする二次元異核実験によって判定した。下記の表には、グルコサミン及び２−Ｏ−硫酸化イズロン酸のジカルボキシル化残基の１、４、５位置におけるプロトン及び炭素の特定された化学シフトが報告されている。
【表１】
0006784454.tif 000002
【００４９】
［カルボキシル基増分の計算のための基本手順］
ジカルボキシル化ヘパリン誘導体のウロン酸残基におけるカルボキシル基の増加を、伝導度滴定（Ｃａｓｕ  Ｂ．ａｎｄ  Ｇｅｎｎａｒｏ  Ｕ．、１９７５、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ  ３９、１６８〜１７６）によって評価した、出発物質（非分画ヘパリン又は少なくとも部分的に脱硫酸化されたヘパリン及びＬＭＷＨ）及びジカルボキシル化誘導体のモル比ＳＯ３−／ＣＯＯ−のそれぞれの値から出発して計算した。特に、出発物質の硫酸化度は、第一の酸化ステップ後にグリコサミノグリカン酸化中間体の還元されたサンプルに対して判定を行い（実施例４〜７参照）、一方、最終グリコサミノグリカンカルボキシル化誘導体の硫酸化度は、第二の酸化ステップ後に判定する（実施例８〜１１、１３〜１４参照）。
ＳＯ３−／ＣＯ２−＝Ａ（出発物質における比）                ＳＯ３−＝Ａ／ＣＯ２−
ＳＯ３−／ＣＯ２−＝Ｂ（ジカルボキシル化誘導体における比）  ＳＯ３−＝Ｂ／ＣＯ２−
硫酸基の数は二段階の酸化中に変化しないことを考えると、カルボキシル基の増加（ＣＯ２−（ジカルボキシル化誘導体）／ＣＯ２−（出発物質））は、個々のモル比Ａ及びＢの比に等しいと結論付けられる。
カルボキシル増分（Ｃ．Ｉ．）＝Ａ／Ｂ＝ＣＯ２−（ジカルボキシル化誘導体）／ＣＯ２−（出発物質）
【００５０】
「ヘパリン及びそのカルボキシル化誘導体の酵素的開裂、並びにＨＰＬＣ／ＭＳ分析］
基質（２〜３ｍｇ）を１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と１０ｍＭ酢酸カルシウムの１：１（ｖ／ｖ）混合物に溶解し、７．７ｍｇ／ｍｌ溶液を得た。酵素的開裂を実施するため、１００ｍＭ酢酸ナトリウムと１０ｍＭ酢酸カルシウム（１：１）の混合物１４４μｌ、及びヘパリナーゼ混合物（ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩ）（各リアーゼ１μｌ、２ｍＵ／μｌ酵素溶液）３μｌをヘパリン溶液１３μｌに添加した。反応混合物を３７℃（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｈａｋｅｒ  ＴＳ−１００、Ｂｉｏｓａｎ）で２４時間撹拌した。３％ＨＣＯＯＨ  ３μｌを添加して反応を停止させた。各サンプルを水で２倍に希釈し、ＩＰＲＰ−ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＴＯＦ（ｍｉｃｒＯＴＯＦ−Ｑ、Ｂｒｕｋｅｒ）で分析した。１０ｍＭ  ＤＢＡ−ＣＨ３ＣＯＯＨを用いたフェーズＡ（ｐＨ６．２５）及びＢ（ｐＨ７．９５）を用いるＣ１８  ｋｉｎｅｔｅｘ及びグラジエント（０’−１７％Ｂ、１５’−２０％Ｂ、５５’−４０％Ｂ、１００’５０％Ｂ、１１５’９０％Ｂ）を流量１００μＬ／ｍｉｎで使用した。
【００５１】
［実施例１（Ｇ７６６９）］
１Ｍ  ＮａＯＨ（３２ｍｌ）に入れたＵＦＨ（ロット番号Ｇ５８４２の２．５ｇ）のサンプルを６０℃で３０分間加熱した。室温での冷却及び２Ｎ  ＨＣｌでの中和後に、溶液を薄膜（カットオフ：３５００Ｄａ）に包んで室温で３日間、蒸留水に対して透析した。減圧下での濃縮と凍結乾燥により、１３Ｃ−ＮＭＲによって判定されるエポキシド基を持つ全ウロン酸残基１３％を有する中間体２．１５ｇ（収率＝８０％ｗ／ｗ）が得られた。次いで、サンプルを水（３２ｍｌ）に溶解し、エポキシ基を加水分解するために７０℃で２日間撹拌下に置いた。濃縮と凍結乾燥の結果、Ｇ７６６９が得られた。
【００５２】
［実施例２（Ｇ８６６１）］
１Ｎ  ＮａＯＨ２７ｍｌに入れたＵＦＨ（ロット番号Ｇ３３７８の２．１１ｇ）のサンプルを６０℃で３０分間撹拌した。中和、室温での冷却及び透析、濃縮、並びに凍結乾燥（実施例１に記載の通り）により、中間体Ｇ８６３７（１．５ｇ）が得られた。その１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルがエポキシ基の存在を示していることから、エポキシ基を加水分解するために、Ｇ８６３７（１．５ｇ）を水（３２ｍｌ）に溶解し、７０℃で２日間撹拌下に置いた。濃縮と凍結乾燥の結果、Ｇ８６６１が得られた（１．５ｇ）。
【００５３】
［実施例３（Ｇ８６９９）］
ＵＦＨ（ロット番号Ｇ３３７８の２．０１ｇ）のサンプルを実施例２に記載の通りに処理して中間エポキシ含有誘導体Ｇ８６３８を得た。Ｇ８６３８（１．４ｇ）のサンプルを水（３２ｍｌ）に溶解し、撹拌下に７０℃で２４時間加熱し、濃縮と凍結乾燥の結果、１．３ｇのＧ８６９９が得られた。
［非分画ヘパリン及び２−Ｏ−脱硫酸化誘導体の過ヨウ素酸酸化］
【００５４】
［実施例４（Ｇ７７３１）］
水（５２ｍｌ）に入れた実施例１のサンプルＧ７６６９（１．８ｇ、１３％２−Ｏ−脱硫酸化）から出発し、溶液を４℃で冷却し、暗闇で撹拌し、０．２Ｍ  ＮａＩＯ４を５２ｍｌ添加した。１６時間後、エチレングリコール（５．２ｍｌ）を添加して過剰の過ヨウ素酸塩をクエンチし、４℃で１時間置いた後、反応混合物を４℃で１６時間、透析によって脱塩した。減圧下での濃縮と凍結乾燥の結果、ジアルデヒドを持つＧ７７３１、収率＝８３％が得られた（１．５ｇ）。サンプルの少量をＮａＢＨ４で還元し、伝導度滴定によりＭＷ＝８，２４２Ｄａ及びＳＯ３−／ＣＯＯ−＝２．４６が計測された。
【００５５】
［実施例５（Ｇ８４２５）］
ＵＦＨ（０．２５ｇ、ロット番号Ｇ３３７８）のサンプルから出発して実施例４に記載の手順と同じ手順を踏み、ジアルデヒドを持つＧ８４２５（０．２４ｇ）、収率＝９６％ｗ／ｗを得た。
【００５６】
［実施例６（Ｇ８６７８）］
実施例２のＧ８６６１のサンプル（１．５ｇ）から出発して実施例４に記載の手順と同じ手順を実行し、ジアルデヒドを持つＧ８６７８（１．５ｇ）を得た。サンプルの少量をＮａＢＨ４で還元し、伝導度滴定によりＳＯ３−／ＣＯＯ−＝１．９６が計測された。
【００５７】
［実施例７（Ｇ８７１０）］
実施例３のＧ８６９９のサンプル（０．５６ｇ）から出発して実施例４に記載の手順と同じ手順を踏み、ジアルデヒドを持つＧ８７１０（０．５６ｇ）を得た。サンプルの少量をＮａＢＨ４で還元し、伝導度滴定によりＳＯ３−／ＣＯＯ−＝１．５１が計測された。
［ジアルデヒドウロン酸中間体の対応するジカルボン酸塩への酸化］
【００５８】
［実施例８（Ｇ７９２７）］
実施例４のＧ７７３１のサンプル（０．３ｇ）を水（２９ｍｌ）に溶解し、二口丸底フラスコにて０℃で冷却し、窒素雰囲気中で撹拌下にＮａＣｌＯ２（０．３６２ｇ）を含有する水溶液（６ｍｌ）で処理した。ｐＨ４．０に到達するまで氷酢酸（０．１１８ｍｌ）を滴加した後、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。室温で更に３時間撹拌下に置いた後、Ｎ２をフラクシングすることにより無色の溶液を得た。反応混合物を０．５Ｎ  ＮａＯＨで中和し、実施例４に記載するように透析によって脱塩した。濃縮と凍結乾燥により、
ＭＷ＝６，４５０Ｄａ；
ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝１．２３；
カルボキシル増分（Ｃ．Ｉ．）＝２を有する、
Ｇ７９２７（０．２２８ｇ）、収率＝７６％ｗ／ｗ、が得られた。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヘパラナーゼ阻害分析では、ＩＣ５０＝１０ｎｇ／ｍｌが得られた。
【００５９】
［実施例９（Ｇ８４３７）］
実施例８に記載の手順と同じ手順を踏んで本来ヘパリンの鎖（１８％）に存在する非硫酸化ウロン酸のみを酸化した実施例５のＧ８４２５のサンプル（０．２５ｇ）から出発し、反応混合物の中和前のＮ２フラクシングを１．５時間に短縮することで、
ＭＷ＝１２，１００Ｄａ；
ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝１．６２；
カルボキシル増分（Ｃ．Ｉ．）：１．４３を有する、
Ｇ８４３７（０．２１ｇ）を得た。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヘパラナーゼ阻害分析では、ＩＣ５０＝１０ｎｇ／ｍｌが得られた。
【００６０】
［実施例１０（Ｇ８７６７）］
実施例６のＧ８６７８のサンプル（１ｇ）から出発して実施例８に記載の手順を踏み、
ＭＷ＝８，８００Ｄａ；
ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝１．２７；
カルボキシル増分（Ｃ．Ｉ．）＝１．５５を有する、
Ｇ８７６７（１．０５ｇ）を得た。
ｉｎ  ｖｉｖｏの抗骨髄腫活性分析（６０ｍｇ／ｋｇ／日、１４日間）では、５２％の腫瘍阻害と２０％の血清Ｋ阻害が得られた。
【００６１】
［実施例１１（Ｇ８７３３）］
実施例７のＧ８７１０のサンプル（０．５６ｇ）から出発して実施例８に記載の手順と同じ手順を踏み、
ＭＷ＝５，５４０Ｄａ；
ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝０．９７；
カルボキシル増分（Ｃ．Ｉ．）＝１．５６．を有する、
Ｇ８７３３（０．４５３ｇ）、収率＝８０％ｗ／ｗ、を得た。
ｉｎ  ｖｉｖｏの抗骨髄腫活性分析（６０ｍｇ／ｋｇ／日、１４日間）では、５３％の腫瘍阻害が得られた。
【００６２】
［実施例１２（Ｇ９６８５）］
ＵＦＨ（ロット番号Ｇ３３７８）のサンプルから出発して実施例４に記載の手順を踏み、ジアルデヒド誘導体を得た。ジアルデヒド誘導体を亜塩素酸ナトリウムの存在下で更に酸化させ、実施例８の手順を踏み、カルボキシル化誘導体Ｇ９６８５、ＭＷ＝１１，７００Ｄａを得た。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヘパラナーゼ阻害分析では、ＩＣ５０＝１０ｎｇ／ｍｌが得られた。
ｉｎ  ｖｉｖｏの抗骨髄腫活性分析（６０ｍｇ／ｋｇ／日、１４日間）では、６８％の腫瘍阻害が得られた。
【００６３】
［実施例１３（Ｇ７８９７）］
実施例４のＧ７７３１のサンプル（０．３ｇ）を水（３ｍｌ）に溶解し、１．３６ｍｌのＮａＣｌＯ２でｐＨ８．２〜８．５まで処理しＨＣｌ  ４％で処理した。次いで、１ｍｇのＴＥＭＰＯを添加し、ｐＨをＮａＯＨ  １Ｍで２４時間７〜７．５に維持した。反応混合物を透析によって脱塩し、濃縮し、凍結乾燥すると、
ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝１．９２；
カルボキシル増分（Ｃ．Ｉ．）＝１．２８を有する、
Ｇ７８９７（０．１９０ｇ）、収率＝６３％ｗ／ｗ、が得られた。
【００６４】
［実施例１４（Ｇ９５８５）］
２−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン（Ｇ９４１６、ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝１．３９）のサンプルから出発して実施例４に記載の手順を踏み、ジアルデヒド誘導体Ｇ９５７７を得た。水（２１ｍｌ）に溶解したＧ９５７７のサンプル（０．２４２ｇ）を二口丸底フラスコにて０℃で冷却し、窒素雰囲気中での撹拌下でＮａＣｌＯ２（０．１２８ｇ）を含有する水溶液（１ｍｌ）で処理した。ｐＨ４．０に達するまで氷酢酸（０．０８４ｍｌ）を滴加した後、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。室温で更に３時間撹拌下に置いた後、Ｎ２のフラクシングにより無色の溶液が得られた。反応混合物を０．５Ｎ  ＮａＯＨで中和し、実施例４に記載するように透析によって脱塩した。濃縮と凍結乾燥により、
ＭＷ＝４，７００Ｄａ；
ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝０．８２；
カルボキシル増分（Ｃ．Ｉ．）＝１．６９を有する、
Ｇ９５８５（０．１４８ｇ）、収率＝６１％ｗ／ｗ、が得られた。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヘパラナーゼ阻害分析では、ＩＣ５０＝４４ｎｇ／ｍｌが得られた。
［第１の局面］
ヘパラナーゼを阻害するグリコサミノグリカン誘導体を調製する方法であって、
ａ）隣接ジオール及び場合により隣接ＯＨ／ＮＨ２をジアルデヒドに変換するのに効果的な条件下で、グリコサミノグリカンの２−Ｏ−、及び場合により２Ｎ−、３−Ｏ−非硫酸化残基の１０％〜１００％を酸化する工程；
ｂ）前記酸化されたグリコサミノグリカンを、前記ジアルデヒドをカルボキシレート基に変換するのに効果的な条件下で酸化する工程；を含む、
グリコサミノグリカン誘導体を調製する方法。
［第２の局面］
前記グリコサミノグリカンが天然又は合成のグリコサミノグリカンであり、
好ましくはヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸から選択され、場合により２−Ｏ−及び／又は２−Ｎ−脱硫酸化されており、
より好ましくは非分画ヘパリン又はＬＭＷＨから選択され、場合により２−Ｏ−及び／又は２−Ｎ−脱硫酸化されている、
第１の局面に記載の方法。
［第３の局面］
前記グリコサミノグリカンの本明細書において定義する伝導度滴定によって判定される硫酸化度（ＳＯ３−／ＣＯＯ−）が０．８〜２．８である、
第１の局面または第２の局面に記載の方法。
［第４の局面］
前記グリコサミノグリカンの本明細書において定義する伝導度滴定によって判定される硫酸化度（ＳＯ３−／ＣＯＯ−）が０．９〜２．５である、
第３の局面に記載の方法。
［第５の局面］
前記グリコサミノグリカン誘導体の本明細書において定義するカルボキシル増分が１．２〜２．２である、
第１の局面〜第４の局面のいずれか１項に記載の方法。
［第６の局面］
ステップａ）において、過ヨウ素酸塩によって酸化が行われる、
第１の局面〜第５の局面のいずれか１項に記載の方法。
［第７の局面］
ステップａ）において、グリコサミノグリカンの２−Ｏ−及び場合により２Ｎ−、３−Ｏ−非硫酸化残基の２５％〜１００％を酸化する、
第１の局面〜第６の局面のいずれか１項に記載の方法。
［第８の局面］
第１の局面〜第７の局面のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる、
化合物。
［第９の局面］
分子量が、３，０００から２０，０００Ｄａである、
第８の局面に記載の誘導体化合物。
［第１０の局面］
分子量が、３，５００から１２，０００Ｄａである、
第８の局面に記載の誘導体化合物。
［第１１の局面］
第８の局面〜第１０の局面のいずれか１項に記載の前記化合物の酵素的又は化学的解重合により得ることができる、
オリゴ糖化合物。
［第１２の局面］
薬剤として用いる、
第８の局面〜第１１の局面のいずれか１項に記載の化合物。
［第１３の局面］
抗転移または抗腫瘍薬として用いる、
第８の局面〜第１１の局面のいずれか１項に記載の化合物。
［第１４の局面］
抗骨髄腫薬として用いる、
第８の局面〜第１１の局面のいずれか１項に記載の化合物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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