(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＺＨ２由来ペプチドであって、ヒト白血球抗原ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルに結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるペプチドであり、前記ペプチドが、配列番号：５に示すアミノ酸配列からなることを特徴とするペプチドを含む、前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物であって、前記ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａが、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ３１及びＨＬＡ−Ａ３３からなる群から選択されるＨＬＡ−Ａである、医薬組成物。
【請求項２】
癌ワクチンである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者より採取された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を請求項１に記載のペプチドと接触させる工程を含む、前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導方法。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドを含むことを特徴とする前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤。
【請求項５】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者に由来する抗原提示能を有する細胞に請求項１に記載のペプチドを取り込ませる工程を含む、ＥＺＨ２由来ペプチド又はその誘導体とＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルとの複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製する方法。
【請求項６】
ＥＺＨ２由来ペプチド又はその誘導体とＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルとの複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するための抗原提示細胞調製剤であって、請求項１に記載のペプチドを含むことを特徴とする抗原提示細胞調製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者の処置又は予防に有用な癌ワクチン療法に有用なＥＺＨ２由来ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は老年期男性に多い癌である。前立腺癌にはアンドロゲン除去療法が一過性に奏功するが、去勢抵抗性又は骨転移性前立腺癌として再発した場合に有効な治療法はない。このような患者にとって特異的免疫療法は有望な選択肢となりうる。これまで前立腺癌患者に対する特異的免疫療法に利用可能な癌抗原ペプチドは多く同定されている。しかしながらＨＬＡ（human leukocyte antigen：以下、ヒト白血球抗原ともいう）−Ａ２及び−Ａ２４アレル（allele：以下、対立遺伝子ともいう）の頻度が世界的に高いことから、従来の癌抗原ペプチドはＨＬＡ−Ａ２又は−Ａ２４アレルが陽性（陽性を、「＋」と表記することもある）の患者に対するものがほとんどであった。
【０００３】
ＨＬＡクラスＩアレルには、その構造的相同性及びペプチド結合モチーフ解析に基づきＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３、−Ｂ７及び−４４スーパータイプアレルが提唱されている。それらのうちＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルはコーカサス人の３８％、中国人の５３％、日本人の４６％、並びに北米アフリカ系アメリカ人及びヒスパニックの４３％に認められる。それにも関わらずＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者の治療に使用できる癌抗原ペプチドワクチンは限られている（例えば、特許文献１で開示された前立腺関連蛋白由来ペプチド、特許文献２で開示されたＳＡＲＴ３由来ペプチド及び特許文献３で開示されたＬｃｋ由来ぺプチド等）。
【０００４】
一方、ＨＬＡ−Ａ２又は−Ａ２４分子を持った癌患者のための、ペプチドに基づいた抗癌ワクチンに用いることができるＥＺＨ２由来ペプチドの報告例が、特許文献４及び非特許文献１等に見られる。
【０００５】
しかしながら、ＥＺＨ２由来ペプチドをＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋前立腺癌患者のためのワクチンに用いられた例はない。
【０００６】
前記ペプチドワクチンによるワクチン療法の経験から、個々の患者の免疫状態の多様性と治療ターゲットである癌の多様性によって免疫応答（例えば、ＣＴＬ反応など）が多彩であること、一旦有効であった症例も免疫逃避あるいは寛容により無効となることが明らかとなった。このようなエビデンスを鑑みると、１つの決まった抗原をターゲットにするのではなく、前立腺癌の発生、分化、増殖に立脚した複数の分子をターゲットにし、それぞれ異なった性質の癌を担癌した宿主に合ったテーラーメイドワクチン療法が必要と思われる。
【０００７】
したがって、前立腺癌患者に対する癌ワクチン療法に有用なペプチドの開発が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００７／０００９３５号
【特許文献２】国際公開第２００８／００７７１１号
【特許文献３】国際公開第２００９／０２２６５２号
【特許文献４】特開２００５−１７０７９９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ogata R, et al. “Identification of Polycomb Group Protein Enhancer of Zeste Homolog2 (EZH2)-Derived Peptides Immunogenic in HLA-A24+ Prostate Cancer Patients.” Prostate 2004; 60:273-281.
【非特許文献２】Itoh Y, et al., “New peptides of the polycomb group protein enhancer of zeste homolog 2 with the potential to induce cancer-reactive cytotoxic T lymphocytes in human leukocyte antigen-A2+ prostate cancer patients.” Oncol Rep 2007;18:1231-1237.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は前記課題を解決するためになされたもので、前立腺癌患者に対する癌ワクチン療法に有用なペプチドを提供することを目的とする。また、本発明は、特異的細胞性免疫を誘導することができ、前立腺細胞癌の予防又は治療に有用な医薬組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤及びそれを用いた前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するためになされた本発明は、ＥＺＨ２（enhancer of zeste homolog 2：以後、ｚｅｓｔａ同族体エンハンサー２ともいう）由来ペプチドであって、ヒト白血球抗原ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルに結合でき、かつ細胞性免疫に認識され得るペプチドを提供することである。具体的には、本発明は、以下に示される：
＜１＞本発明は、ＥＺＨ２由来の部分ペプチドであって、ヒト白血球抗原ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルに結合でき、かつ細胞性免疫に認識され得る前立腺癌抗原ペプチド、又は同等の性質を有するその誘導体である。
【００１２】
＜２＞本発明は、（ａ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチド、又は（ｂ）配列番号５に示すアミノ酸配列において１又は２個のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加が導入されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等の性質を有するペプチドである＜１＞に記載のペプチドである。
【００１３】
＜３＞本発明は、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属するＨＬＡ−Ａが、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ３１及びＨＬＡ−Ａ３３からなる群から選択されるＨＬＡ−Ａである、＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドである。
【００１４】
＜４＞本発明のために、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載のペプチドをコードする塩基配列からなる核酸分子を用いてもよい。
【００１５】
＜５＞本発明のために、＜４＞に記載の核酸分子を含有するベクターを用いてもよい。
【００１６】
＜６＞本発明は、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載のペプチド、及び＜５＞に記載のベクターの少なくともいずれか１つを含む、前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物であってもよい。
【００１７】
＜７＞本発明は、癌ワクチンである＜６＞に記載の医薬組成物である。
【００１８】
＜８＞本発明は、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者より採取された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載のペプチドと接触させる工程を含む、前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導方法である。
【００１９】
＜９＞本発明は、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載のペプチドを含む、前立腺癌反応性の細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤である。
【００２０】
＜１０＞本発明は、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者に由来する抗原提示能を有する細胞に＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載のペプチドを取り込ませる工程、又は＜５＞に記載のベクターを導入する工程を含む、ＥＺＨ２由来ペプチド又はその誘導体とＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルとの複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製する方法である。
【００２１】
＜１１＞本発明は、ＥＺＨ２由来ペプチド又はその誘導体とＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルとの複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するための抗原提示細胞調製剤であって、
＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載のペプチド、及び＜５＞に記載のベクターの少なくとも１つを含む、抗原提示細胞調製剤であってもよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者に対するペプチド基盤免疫療法、特に前立腺癌ワクチン療法の選択肢が広がった。本発明により、現在までいくつかの癌ワクチン候補ペプチドが同定されているＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者の治療において癌増殖に関与するとされるＥＺＨ２をターゲットに加えることにより更なる治療効果の向上に寄与することが期待される。
【００２３】
本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルに結合できそれにより癌患者とりわけＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者の細胞性免疫に認識されるので、癌疾患とりわけ前立腺癌の治療や予防に有用である。このペプチドによれば、ＨＬＡ拘束性に前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる。このペプチドは、生体に存するＥＺＨ２に由来し又はその骨格に基づいて改変し又は誘導されたもので、生体内での所望のバインドサイトに結合し作用効果を発現するものであるから、副作用が少なくて信頼性が高く、安全である。
【００２４】
このペプチドの配列を利用し、それをコードする核酸分子及びそれのベクターを作製して、ペプチドを生体外で製造したり生体内で産生したりするのに用いることができる。
【００２５】
また、このぺプチドやそれをコードする核酸分子を利用して、前立腺癌の予防用又は治療用の医薬製剤、例えば前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞への誘導剤、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の抗原提示細胞への誘導剤、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌の治療薬又は予防薬、癌ワクチンとして、癌治療、とりわけＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌治療に供することができる。
【００２６】
さらにこのペプチドとヒトＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルとの複合体を細胞表面に提示した抗原提示細胞又は前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞が含有された前立腺癌予防用又は治療用の生物製剤を調製したりして、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者の治療に役立てることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】（ａ）は、ＬＮＣａＰ細胞（androgen-sensitive human prostate adenocarcinoma cells：以下、アンドロゲン依存性前立腺癌細胞ともいう）におけるＥＺＨ２タンパク質の発現を示すゲル泳動図である。（ｂ）は、３つのＬＮＣａＰトランスフェクタントが、ＨＬＡ−Ａ１１、−Ａ３１、又は−Ａ３３分子のそれらの表面発現に対して、フローサイトメトリー（以下、流動細胞計測法ともいう）によって検査された図である。
【図２】本発明を適用するＥＺＨ２由来ペプチドでＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋前立腺癌患者からの抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激し、それにより誘導されたペプチド反応性ＣＴＬが前立腺由来癌細胞株に対して細胞傷害活性を示すことができるかを調べた図である。
【図３】本発明を適用する配列番号５のＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドにて刺激したＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋前立腺癌細胞に由来するＰＢＭＣの、ＬＮＣａＰ−Ａ１１、−Ａ３１及び−Ａ３３に対する細胞傷害活性が、ＨＩＶペプチドパルスに比して、ＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドでパルスした非標識のＣ１Ｒ−Ａ１１、−Ａ３１及び−Ａ３３細胞の添加によって有意に抑制されたことを示す図である（Ｃ１Ｒ：ＨＬＡヒトＢ細胞株であり、ＨＬＡアレルのみを発現する細胞株を指す）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの形態に限定されるものではない。
【００２９】
（ペプチド）
本発明のペプチドは、ＥＺＨ２由来の部分ペプチドであって、ヒト白血球抗原ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルに結合でき、かつ細胞性免疫に認識され得る前立腺癌抗原ペプチド、又は同等の性質を有するその誘導体ペプチドである。具体的には、下記（ａ）及び（ｂ）のいずれかである。
（ａ）ＥＺＨ２７３３−７４１（配列番号：５）に示すアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）ＥＺＨ２７３３−７４１（配列番号：５）で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【００３０】
本発明において、「ペプチドがＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルに結合できる」とは、ペプチドがＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルと複合体を形成し細胞表面に提示され得ることをいう。一般に、ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、ＨＬＡの型に依存する規則性あるアミノ酸配列を有することが知られており、前記規則性あるアミノ酸配列は、結合モチーフと呼ばれる。前記ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルに対し、ペプチドが結合できるか否かは、例えば、ウエブサイト（Bioinformatics and Molecular Analysis Section、 Computational Bioscience and Engineering Laboratory、 Division of Computer Research & Technology、NIH）などのコンピューター解析により予測することができる。
【００３１】
本発明において、「細胞性免疫に認識される」とは、ペプチドが特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬともいう）に認識される、即ち、ペプチド特異的ＣＴＬを誘導することができることをいう。ペプチド特異的ＣＴＬを誘導することができるか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペプチドで刺激した末梢血単核細胞（以下、ＰＢＭＣともいう）が、該ペプチドをパルスした抗原提示細胞に反応してインターフェロン（以下、ＩＦＮと略すこともある）−γなどのサイトカインを産生するか否かを測定することにより確認する方法などが挙げられる。前記サイトカインを測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay：以下、酵素免疫吸着測定法ともいう）などで測定することができる。また、誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５１Ｃｒ遊離試験により確認する方法などが挙げられる。
【００３２】
前記（ａ）ＥＺＨ２７３３−７４１（配列番号５）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ＥＺＨ２由来ペプチドであり、前記ＥＺＨ２における７３３番目から７４１番目のアミノ酸配列に相当する。
【００３３】
前記（ｂ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドとしては、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルに結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるペプチドであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３４】
前記欠失、置換、及び付加の位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記置換としては、ペプチドの性質を変化させない点で、同族アミノ酸の間で置換することが好ましい。前記同族アミノ酸は、例えば、極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸などの観点で選択することができる。
【００３５】
前記欠失、置換、及び付加は、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルの結合モチーフである点で、ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から第２番目のアミノ酸がアラニン、セリン、イソロイシン、バリン、トレオニン、メチオニン、又はロイシンであり、Ｎ末端から第９番目のアミノ酸がリシン又はアルギニンとなるように行うことが好ましい。
【００３６】
前記ペプチドを構成するアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよいし、アミノ酸アナログであってもよい。前記アミノ酸アナログとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アミノ酸のＮ−アシル化物、Ｏ−アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物などが挙げられる。
【００３７】
また、前記ペプチドは、本発明の効果を損なわない限り、その構成アミノ酸又はカルボキシル基などが修飾されていてもよい。前記修飾としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｎ末端や遊離のアミノ基にホルミル基、アセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル基等を結合するものや、Ｃ末端や遊離のカルボキシル基にメチル基、エチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基等を結合するものなどが挙げられる。
【００３８】
前記ペプチドは、細胞性免疫と液性免疫の両方に認識されるペプチドは、免疫原性が高くＣＴＬ誘導能に優れると期待される点で、液性免疫にも認識されることが好ましい。本発明において、「液性免疫に認識される」とは、ペプチドに特異的なＩｇＧが生体内に存在する、即ち、ペプチド特異的ＩｇＧが血漿から検出されることをいう。血漿中の特異的ＩｇＧを測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥＬＩＳＡ法などで測定することができる。
【００３９】
前記ペプチドの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００４０】
本発明のペプチドは、そのアミノ酸配列を含むポリペプチドが細胞内で断片化されることで生じるものであってもよい。前記ポリペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４１】
前記ペプチドは、癌増殖に関与するとされるＥＺＨ２由来ペプチドであり、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルに結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるので、例えば、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者の癌ワクチン療法に好適に用いることができる。
【００４２】
（核酸分子）
本発明の核酸分子としては、前記ペプチドをコードする塩基配列からなるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４３】
前記核酸分子は、例えば、後述するベクターに好適に利用可能である。
【００４４】
（ベクター）
本発明のベクターは、本発明の核酸分子を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の要素を含む。前記ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミド、ウイルスベクターなどが挙げられる。前記ウイルスベクターの具体例としては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどが挙げられる。
【００４５】
前記ベクターの調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して調製することができる。
【００４６】
前記ベクターは、抗原提示細胞に導入されると本発明のペプチドを発現する。そして、前記抗原提示細胞は、前記ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルとの複合体を細胞表面に提示する。前記抗原提示細胞は、ペプチド特異的に前立腺癌細胞を傷害するＣＴＬを効率的に増殖させることができる。
【００４７】
前記ベクターは、後述する前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物、抗原提示細胞調製剤に好適に利用可能である。
【００４８】
（前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物）
本発明の前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物は、本発明のペプチド、及び本発明のベクターの少なくともいずれかを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００４９】
前記前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物における前記ペプチド、及び前記ベクターの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５０】
前記前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物は、前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくともいずれかからなるものであってもよい。前記ペプチド、及び前記ベクターは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、前記ペプチド、及び前記ベクターのそれぞれについても、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００５１】
前記前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物における前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬上許容され得る担体などが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記担体の具体例としては、セルロース、重合アミノ酸、アルブミンなどが挙げられる。
【００５２】
前記前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５３】
前記前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物は、他の成分を有効成分とする医薬組成物と併せた態様で使用されてもよい。また、前記前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００５４】
前立腺癌患者のＣＴＬは、様々な癌抗原ペプチドを認識する細胞の集合であるため、前記前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物は、例えば、Ｌｃｋ由来ペプチド（特許文献３）及び／又はＳＡＲＴ３由来ペプチド(特許文献２)と組み合わせて使用してもよい。
【００５５】
前記前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物の剤形としては、特に制限はなく、公知の剤形を適宜選択することができ、例えば、固形剤、半固形剤、液剤などが挙げられる。これらの剤形の前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物は、常法に従い製造することができる。
【００５６】
前記前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物は、癌ワクチンとして使用することが好ましい。
【００５７】
前記前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物の投与方法、投与量、投与時期、投与間隔、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５８】
前記前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物は、免疫応答が効果的に成立するように、従来からワクチン投与に用いられることが知られているアジュバントとともに投与することが好ましく、投与方法としては、例えば、皮内投与、皮下投与などが挙げられる。
【００５９】
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象の個体の疾患の状態、年齢、体重、体質、他の成分を有効成分とする医薬組成物の投与の有無などを考慮して適宜選択することができる。前記前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物が前記ペプチドを含む場合の投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペプチド量として、０．０００１ｍｇ〜１，０００ｍｇなどが挙げられる。
【００６０】
前記前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物が前記ベクター含む場合の投与量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ量として、０．１μｇ〜１００ｍｇなどが挙げられる。投与方法としては、静脈注射、皮下投与、皮内投与などが挙げられる。
【００６１】
前記投与時期、及び投与間隔としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、数週から数ヶ月に１回、１年間〜３年間継続して投与するなどが挙げられる。
【００６２】
前記投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒトが挙げられる。
【００６３】
（前立腺癌の予防又は治療方法）
前記ペプチド、及び前記ベクターは、個体に投与することにより、個体における前立腺癌の発症を予防したり、前立腺癌を患っている個体を治療したりすることができる。したがって、本発明は、前立腺癌を予防又は治療するための方法であって、個体に、前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくともいずれかを投与することを特徴とする、前立腺癌の予防又は治療方法にも関する。
【００６４】
また、前記前立腺癌の予防又は治療方法は、後述する前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法により誘導した前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を個体に戻したり、後述する抗原提示細胞の調製方法により調製した抗原提示細胞を個体に戻したりすることにより行ってもよい。
【００６５】
（前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法）
本発明の前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法は、接触工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００６６】
＜接触工程＞
前記接触工程は、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者より採取された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を本発明のペプチドと接触させる工程である。前記接触工程により、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌細胞を傷害する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導することができる。
【００６７】
前記細胞傷害性Ｔ細胞が「前立腺癌反応性」であるとは、前記細胞傷害性Ｔ細胞が、前立腺癌細胞上の癌抗原ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を認識し、その細胞を傷害する能力を有することをいう。
【００６８】
前記ペプチドは、前記ペプチドのみからなるものを使用してもよいし、後述する前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤を使用してもよい。
【００６９】
前記接触の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者より採取された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記ペプチドの存在下で培養する方法などが挙げられる。
【００７０】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７１】
前記前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法で得られた前立腺反応性細胞傷害性Ｔ細胞は、例えば、末梢血単核細胞を採取した個体の体内に戻して前立腺癌細胞を傷害する養子免疫療法に好適に用いることができる。
【００７２】
（前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤）
本発明の前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤は、本発明のペプチドを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。前記ペプチドは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤における前記ペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記前立腺癌反応性傷害性Ｔ細胞誘導剤は、前記ペプチドのみからなるものであってもよい。
【００７３】
前記前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上述した前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物のその他の成分の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７４】
前記前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤は、上述した前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法に好適に用いることができる。
【００７５】
（前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導用キット）
本発明の前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導用キットは、本発明の前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の要素を含む。前記その他の要素としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地、緩衝液などが挙げられる。前記その他の要素は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導用キットは、上述した前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法に好適に用いることができる。
【００７６】
（抗原提示細胞の調製方法）
本発明の抗原提示細胞は、導入工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００７７】
前記導入工程は、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者より採取された抗原提示能を有する細胞に本発明のペプチド、及び本発明のベクターの少なくともいずれかを導入する工程である。前記導入工程により、エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルとの複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製することができる。前記抗原提示細胞は、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌細胞を傷害する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得る。
【００７８】
前記ペプチドは、前記ペプチドのみからなるものを使用してもよいし、後述する抗原提示細胞調製剤を使用してもよい。前記ベクターは、前記ベクターのみからなるものを使用してもよいし、後述する抗原提示細胞調製剤を使用してもよい。前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくともいずれかを前記抗原提示能を有する細胞導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７９】
前記抗原提示細胞は、例えば、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者由来の抗原提示能を有する細胞を前記ペプチドと共に培養することにより得られる。また、例えば、前記ベクターをＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者由来の抗原提示能を有する細胞に導入し、前記ペプチドを発現させることにより得られる。
【００８０】
前記抗原提示能を有する細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、樹状細胞などが挙げられる。前記樹状細胞の調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、患者より採取した末梢血単核細胞から培養プレートに接着する細胞を分離し、その細胞をＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下で約１週間培養する方法などが挙げられる。
【００８１】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００８２】
前記抗原提示細胞の調製方法で得られた抗原提示細胞は、例えば、末梢血単核細胞を採取した個体の体内に戻し、体内での前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を促進するために好適に用いることができる。
【００８３】
（抗原提示細胞調製剤）
本発明の抗原提示細胞調製剤は、エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルとの複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するための抗原提示細胞調製剤であって、本発明のペプチド、及び本発明のベクターの少なくともいずれかを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００８４】
前記ペプチド、及び前記ベクターは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、前記ペプチド、及び前記ベクターのそれぞれについても、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記抗原提示細胞調製剤における前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記抗原提示細胞調製剤は、前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくともいずれかのみからなるものであってもよい。
【００８５】
前記抗原提示細胞調製剤におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上述した前立腺癌の予防又は治療用医薬組成物のその他の成分の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記抗原提示細胞調製剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００８６】
前記抗原提示細胞調製剤は、上述した抗原提示細胞の調製方法に好適に用いることができる。
【００８７】
（抗原提示細胞調製用キット）
本発明の抗原提示細胞調製用キットは、エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルとの複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するための抗原提示細胞調製用キットであって、本発明の前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の要素を含む。
【００８８】
前記その他の要素としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地、緩衝液などが挙げられる。前記その他の要素は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００８９】
前記抗原提示細胞調製用キットは、上述した抗原提示細胞の調製方法に好適に用いることができる。
【実施例】
【００９０】
以下、本発明の試験例を説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。
【００９１】
＜材料及び方法＞
＜患者＞  末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）は、書面のインフォームドコンセントを提供した前立腺癌患者及び健康なドナー（ＨＤ：Healthy Donor）から得られた。被検者はＨＬＡ−Ａ１１＋、−Ａ３１＋又は−Ａ３３＋患者を含んでいた；ＨＬＡ−Ａ３＋又は−Ａ６８＋患者からのＰＢＭＣは、日本人の個体群中でそれらの極端に低い頻度（それぞれに１．６及び０．５％）のために利用可能ではなかった［Aizawa M. The Proceedings of the 3rd Asia-Oceania histocompatibility workshop conference. Oxford University Press 1986; 1090-1103］。どの参加者もヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に感染していなかった。３０ミリリッターの末梢血が得られた。そして、ＰＢＭＣがフィコール−コンレイ密度グラディエント遠心分離によって調製された。サンプルはすべて使用まで凍結保存された。近畿大学の倫理検討委員会は研究プロトコール（承認Ｎｏ．１９−１０）を承認した。
【００９２】
＜細胞株＞
Ｃ１Ｒ−Ａ１１、Ｃ１Ｒ−Ａ３１及びＣ１Ｒ−Ａ３３は、ＨＬＡ−Ａ１１：０１（Ａ３１：０１）（Ａ３３：０３遺伝子）で強固にそれぞれにトランスフェクトされたＣ１Ｒリンパ腫亜系である。これらの亜系上のＨＬＡ−Ａ１１、−Ａ３１及び−Ａ３３分子の発現が報告されている［Takedatsu H, Shichijo S, Katagiri K, Sawamizu H, Sata M, Itoh K: Identification of peptide vaccine candidates sharing among HLA-A3+, -A11+, -A31+, -A33+ cancer patients. Clin Cancer Res 2004; 10: 1112-1120］。ＬＮＣａＰ−Ａ１１、ＬＮＣａＰ−Ａ３１及びＬＮＣａＰ−Ａ３３は、ＨＬＡ−Ａ１１、−Ａ３１、−Ａ３３分子の各々を発現するＬＮＣａＰ亜系である［Minami T, Matsueda S, Takedatsu H, Tanaka M, Noguchi M, Uemura H, Itoh K, Harada M: “Identification of SART3-derived peptides having the potential to induce cancer-reactive cytotoxic T lymphocytes from prostate cancer patients with HLA-A3 supertype alleles.” Cancer Immunol Immuother 2007; 56: 689-698］。これらの細胞株はすべて１０％のＦＣＳでＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持された。ＰｒＥＣは、Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国、から購入された前立腺正常上皮細胞株である。
【００９３】
＜ペプチド＞
ＥＺＨ２から派生した全てのペプチドは、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルに結合するモチーフに基づいて調製された［Parker KC, Bednarek MA, Coligan JE. “Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains.” J Immunol 1994; 152: 163-175］。簡単に言えば、ペプチドを結合するスコアはＢＩＭＡＳ（Bioinformatics and Molecular Analysis Section, Computational Bioscience and Engineering Laboratory, Division of Computer Research & Technology, NIH, bimas.cit.nih.gov）から得られるようなＨＬＡクラスＩ分子からの解離の予測された半減期に基づいて計算され、そしてＥＺＨ２由来の５つのペプチド（配列番号：１〜５）が選択された。それらを以下に示す：
【００９４】
【表１】
0006784964.tif 000002
【００９５】
また、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルに結合するコントロールに用いたペプチドのアミノ酸配列を以下に示す：
【００９６】
【表２】
0006784964.tif 000003
【００９７】
全てのペプチドは、（ユーロフィンジェノミクス株式会社、Ｔｏｋｙｏ、日本）から購入され、服量１０ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに溶解された。
【００９８】
＜ＰＢＭＣからのペプチドに特有のＣＴＬの誘導＞
ペプチドに特有のＣＴＬの検出のためのアッセイはいくつかの修正を伴って以前に報告された方法によって行なわれた［Hida N, Maeda Y, Katagiri K, Takasu H, Harada M, Itoh K: “A simple culture protocol to detect peptide-specific cytotoxic T lymphocyte precursors in the circulation.” Cancer Immunol Immunother 2002;51:219-228］。ＰＢＭＣ（５個×１０４細胞／ウエル）は、培地１００μＬ中、Ｕ底型９６穴ウエルサブカルチャープレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で、各ペプチド１０μｇ／ｍｌで培養された。培地は、４５％のＲＰＭＩ１６４０、４５％のＡＩＭ−Ｖ媒体（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、アメリカ）、１０％のＦＣＳ及びＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（×１００希釈、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）から構成されていた。８つのウエルが各ペプチドに用いられた。翌日に、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含有している培地１００μＬが添加された。８日目に、培地１００μＬが除去され、対応するペプチド（１０μｇ／ｍｌ）を含有している新鮮な培地が補充され、及び９日目には、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含有している培地１００μＬが添加された。培養の１７日目に、新鮮な培地で置換された。そして、培養細胞は１つのウエルから４つのウエルへ分離された：対応するペプチドパルスＣ１Ｒ−Ａ１１、Ｃ１Ｒ−Ａ３１、又はＣ１Ｒ−Ａ３３細胞を持った刺激のための２つのウエル及び他の２つのウエルが、コントロールのＨＩＶのペプチドパルスＣ１Ｒ−Ａ１１、Ｃ１Ｒ−Ａ３１又はＣ１Ｒ−Ａ３３細胞を持った刺激に用いられた。１８時間の培養の後、上澄みが収集され、及びＩＦＮ−γのレベルがＥＬＩＳＡによって決定された。ペプチドに特有のＣＴＬの誘導は以下の２つの基準が満たされたときにだけ陽性と判断された：
（ｉ）対応するペプチドで刺激された２つのウエル中のＩＦＮ−γレベルの両方共が、≧５０ｐｇ／ｍｌであって、且つ、（ｉｉ）対応するペプチドで刺激された２つのウエル中のＩＦＮ−γレベルの両方共が、コントロールのＨＩＶペプチドで刺激された２つのウエルにおけるＩＮＦ−γレベルの中間値より１．２倍以上多かった場合である。
【００９９】
＜フローサイトメトリック分析＞
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルの発現を検討するために、ＬＮＣａＰトランスフェクタントが、抗−ＨＬＡ−Ａ１１  ｍＡｂ（Ｃａｔ．ｎｏ．０２８４ＨＡ；Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｃ．、Ｃａｎｏｇａ、ＣＡ、アメリカ）、抗−ＨＬＡ−Ａ３１  ｍＡｂ（Ｃａｔ．ｎｏ．０２７３ＨＡ；Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ）、及び抗−ＨＬＡ−Ａ３３  ｍＡｂ（Ｃａｔ．ｎｏ．０６１２ＨＡ；Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ）のいずれかで染色され、引き続き、ＦＩＴＣ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、アメリカ）で染色された。
【０１００】
＜免疫ブロット法アッセイ＞
細胞はプロテアーゼ阻害剤混合液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）でＭ−ＰＥＲ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、アメリカ）中に溶解された。タンパク濃度はＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｒａｄｆｏｒｄキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定された。ＮｕＰＡＧＥジェル（４〜１２％又は１２％；ライフ・テクノロジーズ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、アメリカ）が、タンパク質分離に用いられた。そして、タンパク質はｉＢｌｏｔトランスファー方式（ライフ・テクノロジーズ）を用いて、ＰＶＤＦ膜（ライフ・テクノロジーズ）の上に固定された。膜は、ＢｌｏｃｋｅｒＢＳＡ溶液（１×）（Ｐｉｅｒｃｅ）を含有しているＴＢＳＴ（０．１％のトゥイーン２０でトリス塩基塩性）を用いて、３０分間ブロックされた。一次抗体での培養は４℃でＢｌｏｃｋｅｒＢＳＡ（１×）を含有しているＴＢＳＴを用いて一夜行なわれた。以下の一次抗体を用いた：抗ＥＺＨ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、アメリカ）及び抗−β−アクチン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、アメリカ）抗体。洗浄の後、膜は、アルカリホスファターゼ共役二次抗体で、室温で３０分間培養された。タンパク質帯域は、ＣＤＰ星状体化学発光を用いて視覚化され、ＬＡＳ−４０００（ＦｕｊｉＦｉｌｍ、Ｔｏｋｙｏ、日本）で撮影された。
【０１０１】
＜細胞毒性試験＞
標準６時間の５１Ｃｒ遊離試験によってＣＴＬの細胞毒性を試験するために、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ペプチドに刺激されたＰＢＭＣから以下のようにマイナスで精製された：ペプチドで刺激されたＰＢＭＣが、抗ＣＤ５６  ｍＡｂ（ｍＩｇＧ１：ＤＩＡＣＬＯＮＥ、Ｂｅｓａｎｃｏｖ  Ｃｅｄｅｘ、フランス）で最初に染色され、次いで、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ抗ＣＤ１９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＤｙｎａｂｅａｄｓ抗ＣＤ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色された。Ｄｙｎａｂｅａｄｓに結合した細胞は磁化されマイナスで除去された。ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞の消耗の後、ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは実験（データは示されず）の全体にわたり約８０〜８５％であった。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）−活性化Ｔ細胞が、ＨＬＡＡ−１１＋、−Ａ３１＋及び−Ａ３３＋正常標的細胞の負の対照として用いられた。１つのウエル当たり、５１Ｃｒで標識された２０００個の細胞が、９６円形ウエルプレート中でエフェクター細胞と共に、表示されたエフェクター／標的比率で培養された。特定の５１Ｃｒ遊離は以下の式によって計算された：
比溶解％＝（試験サンプル遊離−自然遊離）×１００／（最大遊離−自然遊離）
最大遊離は、１％のトリトンＸ（和光純薬化学工業、大阪、日本）で培養されたサンプルの上澄み液によって決定された。
【０１０２】
ペプチドで刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞がＬＮＣａＰトランスフェクタント細胞に対する細胞毒性の原因であったかどうかテストするために、コールドインヒビションアッセイ（ｃｏｌｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）が行なわれた。簡単に言えば、５１Ｃｒ−標識された標的細胞（２×１０３細胞／ウエル）が、精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０４細胞／ウエル）と共に９６穴−丸底ウエルプレート中で４×１０４個の標識されていないコールド標的細胞と共に培養された。対照ＨＩＶペプチド又は対応するＥＺＨ２ペプチドのいずれかで予めパルスされた、Ｃ１Ｒ−Ａ１１、Ｃ１Ｒ−Ａ３１及びＣ１Ｒ−Ａ３３細胞が、コールド標的細胞として用いられた。
【０１０３】
＜統計処理＞
データの統計的有意差は両側スチューデントｔ−検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）を用いて決定された。０．０５未満のＰ値（確率）が、統計的に意義ありと考慮された。
【０１０４】
実施例１
＜ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルを持った前立腺癌患者のＰＢＭＣからのＥＺＨ２ペプチドに特有のＣＴＬの誘導＞
ＨＬＡ−Ａ１１、−Ａ３１及び−Ａ３３分子に対する結合モチーフに基づいて［Parker KC, Bednarek MA, Coligan JE. “Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains.” J Immunol 1994; 152: 163-175］、ＥＺＨ２から誘導された５つのペプチド（下記表３にリストされている）を調製し、どのペプチドが、ＨＬＡ−Ａ１１＋、−Ａ３１＋、又は−Ａ３３＋前立腺癌患者のＰＢＭＣからのペプチドに特有のＣＴＬを誘発し得るかを決定した（表４）。
【０１０５】
＜１＞即ち、まずＥＺＨ２の５つの部分ペプチドのＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルに対する結合スコアを算出した（表３）。その結果、部分ペプチドＥＺＨ２７３３−７４１（配列番号５）が、結合スコア１２と最も高い値を示し、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルに最も結合し易いことを推測させた。
【０１０６】
【表３】
0006784964.tif 000004
【０１０７】
表３中、ａ）ペプチド結合スコアは、ウエブサイト（Bioinformatics and Molecular Analysis Section, Computational Bioscience and Engineering Laboratory, Division of Computer Research & Technology, NIH）から得られたＨＬＡクラスＩ分子からの解離の予想半減期（half-time）に基づいて算出された。ＨＩＶペプチドの結合スコアは算出されなかった。なぜならば、そのペプチドはアミノ酸の１１量体から成っていたからである。
【０１０８】
＜２＞次に、ＨＬＡ−Ａ１１＋、−Ａ３１＋及び−Ａ３３＋患者及び健常ドナーのＰＢＭＣからのペプチド反応性ＣＴＬの誘導性を試験した。ＰＢＭＣは、ＥＺＨ２由来の各部分ペプチド（５種類）、又はＥＢＶ若しくはインフルエンザペプチドのいずれかにより生体外で刺激され、そして、対応するペプチドでパルスされたＣ１Ｒ−Ａ１１、Ｃ１Ｒ−Ａ３１、又はＣ１Ｒ−Ａ３３細胞に応じたそれらのＩＦＮ−γ生産の項目で細胞が試験された。８つのウエルが各ペプチドに用いられた。結果を表４に示した。
【０１０９】
【表４】
0006784964.tif 000005
【０１１０】
表４中、ＰＢＭＣは示された各ペプチドで生体外にて刺激され、ペプチド特異的反応性が試験された。表４には陽性の結果のみ示されている。
【０１１１】
表４の結果は、ペプチドに特有のＣＴＬの誘導は以下の２つの基準が満たされたときにだけ陽性と判断された：（ｉ）対応するペプチドで刺激された２つのウエル中のＩＦＮ−γレベルが共に≧５０ｐｇ／ｍｌであり、及び、（ｉｉ）対応するペプチドで刺激された２つのウエル中のＩＦＮ−γレベルが共に、ペプチドで刺激された２つのウエル中の対照ＨＩＶ中のＩＮＦ−γレベルの平均より≧１．２倍以上高いことである。ＨＤ（健常ドナー）に関しては、ＥＺＨ２２３−３１及びＥＺＨ２７０−７８ペプチドの両方とも、ＨＬＡ−Ａ１１＋ＨＤからのペプチドに特有のＣＴＬを誘発した。ＥＺＨ２７３−８１及びＥＺＨ２６９９−７０７ペプチドは、ＨＬＡＡ３１＋ＨＤからのペプチドに特有のＣＴＬを誘発した。そして、ＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ３３＋ＨＤからのペプチドに特有のＣＴＬを誘発した。前立腺癌患者に関して、４患者からのＰＢＭＣが各々のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルについて試験された。その結果、ＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋前立腺癌患者のＰＢＭＣからのペプチド反応性のＣＴＬを最も効率的に誘発した。ＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドの誘導効果はコントロールＥＢＶ又はインフルエンザペプチドより高かった。ペプチドに特有のＣＴＬの陽性誘導は、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルを持った４人の患者のうち、ＨＬＡ−Ａ１１保有患者で２人、ＨＬＡ−Ａ３１保有患者で２人及びＨＬＡ−３３保有患者で２人の患者から誘発された。ＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドと較べると、他の４つのＥＺＨ２ペプチドは、ペプチドに特有のＣＴＬを誘発するのにはそれほど成功しなかった。全体として、これらの結果は、５つの候補の中で、ＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドがＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋前立腺癌患者のＰＢＭＣからのペプチドに特有のＣＴＬを発生することができる最良のペプチドであることを示す。そこで、このＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドを候補ペプチドとして選択して、次に、細胞毒性試験を行なった。
【０１１２】
実施例２
＜ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋及びＥＺＨ２発現性前立腺癌細胞に対する、ＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドに反応性であるＣＴＬの細胞毒性＞
【０１１３】
実施例１においてペプチド特異的ＣＴＬの誘導を認めたＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドをパルスされたＣＤ８＋ＣＴＬは、６時間の５１Ｃｒ遊離試験にて、ＬＮＣａＰ、ＬＮＣａＰ−Ａ１１、ＬＮＣａＰ−Ａ３１及びＬＮＣａＰ−Ａ３３に対しての細胞毒性を確認する。
【０１１４】
まず、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋に対する細胞毒性及びＥＺＨ２を発現する前立腺癌細胞を試験する前に、ＥＺＨ２及びＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレルのタンパク質発現を確認した。その結果を図１（ａ）に示す。図１（ａ）は、本発明を適用するＬＮＣａＰ細胞におけるＥＺＨ２タンパク質の発現を示すゲル泳動図である。前立腺癌細胞株のＬＮＣａＰ、ＰＣ３、前立腺の正常な上皮細胞ＰｒＥＣ、及びＰＨＡ活性化Ｔ細胞芽球におけるＥＺＨ２タンパク質発現が免疫ブロット法によって検査された。β−アクチンの発現はコントロールとして用いられた。その結果、前立腺癌細胞株のＬＮＣａＰ及びＰＣ３、並びにＰＨＡで活性化されたＴ細胞芽球は、タンパク質レベルでＥＺＨ２を発現した。対照的に、その発現は前立腺正常上皮細胞株ＰｒＥＣにおいて非常に低かった。
【０１１５】
次に、本発明を適用する３つのＬＮＣａＰトランスフェクタントが、ＨＬＡ−Ａ１１、−Ａ３１、又は−Ａ３３分子のそれらの表面発現に対して、フローサイトメトリー（流動細胞計測法）によって検査を行なった。図１（ｂ）にその結果を示す。これらの細胞は、抗ＨＬＡ−Ａ１１、抗ＨＬＡ−Ａ３１、又は抗ＨＬＡ−Ａ３３ｍＡｂで最初に染色され、次いでＦＩＴＣ共役抗マウスＩｇＧ  ｍＡｂで染色された。白抜きは最初のｍＡｂ無しの染色を表わす。ＨＬＡ−Ａ１１、−Ａ３１及び−Ａ３３プラスミドで強固にトランスフェクトされたＬＮＣａＰ亜系は、各々のＡ３スーパータイプアレルに対して陽性であった。
【０１１６】
次に、ＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドでＭＰ（多核白血球）インビトロ刺激によって誘発されたＣＴＬがＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋及びＥＺＨ２を発現する前立腺癌細胞に対する細胞毒性を示すかどうかを決定した。
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋前立腺癌患者からのＰＢＭＣは、ＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドによって生体外で刺激される。ＣＤ８＋Ｔ細胞のための精製の後、ＨＬＡ−Ａ１１、−Ａ３１、又は−Ａ３３のいずれか分子を発現するＬＮＣａＰ亜系に対するそれらの細胞毒性を検討した。得られた結果を図２に示す。
【０１１７】
図２において、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋ＨＤｓからのＰＢＭＣのＰＨＡに刺激されたＴ細胞芽球が、正常なコントロール細胞として用いられた。ＨＬＡ−Ａ１１＋患者からのＰＢＭＣの精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞（患者Ｐｔ＃１及びＰｔ＃２）（それらはＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドにより生体外で刺激された）は、親のＬＮＣａＰ細胞及びＨＬＡ−Ａ１１＋Ｔ細胞芽球に対するより、ＬＮＣａＰ−Ａ１１細胞に対してより高いレベルの細胞毒性を示した。図２における、患者Ｐｔ＃７及びＰｔ＃１３は表４におけるＨＬＡ−Ａ１１についての患者Ｐｔ＃２及びＰｔ＃４に相当する。同様に、親のＬＮＣａＰ細胞、ＨＬＡＡ３１＋又はＨＬＡ−Ａ３３＋Ｔ細胞芽球と比較して、ＨＬＡ−Ａ３１＋又はＨＬＡ−Ａ３３＋患者からのＰＢＭＣのＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドで刺激され、及び精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＬＮＣａＰ−Ａ３１及びＬＮＣａＰ−Ａ３３細胞に対するより高い細胞毒性をそれぞれに発揮した。図２におけるＨＬＡ−Ａ３１についての患者Ｐｔ＃３４及びＰｔ＃３５は、表４におけるＨＬＡ−Ａ３１についての患者Ｐｔ＃１及びＰｔ＃４に相当し、図２におけるＨＬＡ−Ａ３３についての患者Ｐｔ＃１４及びＰｔ＃３０は、表４におけるＨＬＡ−Ａ３３についての患者Ｐｔ＃１及びＰｔ＃２に相当する。
これらの結果は、ＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドがＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋前立腺癌患者のＰＢＭＣからの前立腺癌反応性ＣＴＬを誘発する潜在力を有していることを示す。
【０１１８】
細胞毒性の特異性を確認するために、次に、精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて、コールド阻害細胞毒性アッセイを行なった。得られた結果を図３に示す。
その結果、図３に示されるように、ＥＺＨ２７３３‐７４１ペプチドで刺激され及び精製されたＨＬＡ‐Ａ１１＋、ＨＬＡ−Ａ３１＋又はＨＬＡ−Ａ３３＋患者からのＣＤ８＋Ｔ細胞のＬＮＣａＰ−Ａ１１、ＬＮＣａＰ−Ａ３１、又はＬＮＣａＰ−Ａ３３細胞に対する細胞毒性は、ＨＩＶペプチドでパルスされラベルされていないＣ１Ｒ−Ａ１１、Ｃ１Ｒ−Ａ３１、又はＣ１Ｒ−Ａ３３細胞と共に添加されたときに比較して、対応するＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドでパルスされラベルされていないＣ１Ｒ−Ａ１１、Ｃ１Ｒ−Ａ３１又はＣ１Ｒ−Ａ３３細胞の添加によって著しく抑えられた。
【０１１９】
これらの結果は、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋前立腺癌患者からのＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドで刺激されたＰＢＭＣの、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋前立腺癌細胞に対する細胞毒性が、少なくとも、部分的に、ＥＺＨ２７３３−７４１ペプチド特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞に帰着されたことを示唆する。
【０１２０】
＜考察＞
現在まで、ＨＬＡ−Ａ２又は−Ａ２４分子を持った癌患者のための、ペプチドに基づいた抗癌ワクチンに用いることができるＥＺＨ２由来ペプチドが報告されてきたが（例えば、特許文献４、非特許文献２及び非特許文献４）、ＥＺＨ２由来ペプチドをＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋前立腺癌患者のためのワクチンに用いられた例はない。本発明によって、ＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋前立腺癌患者のＰＢＭＣからのペプチドに特有で且つ前立腺癌に反応性のＣＴＬを誘発する潜在力を有していることを示した。ＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドは、対照のＥＢＶ又はＦｌｕ（インフルエンザ）ペプチドと比較して、より効率的にＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋前立腺癌患者のＰＢＭＣからのペプチド特有のＣＴＬを誘発した。さらに、コールド阻害アッセイは、ＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドで刺激されたＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋前立腺癌患者からのＰＢＭＣの、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ＋ＥＺＨ２を発現している前立腺癌細胞に対する細胞毒性が、ペプチドに特有のＣＤ８＋Ｔ細胞に依存することを示した。これら一連の本発明の結果は、ＥＺＨ２７３３−７４１ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋前立腺癌患者に対する抗癌ワクチンとして適用可能であることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明はＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル＋前立腺癌患者に適用可能な新しいＥＺＨ２ペプチド候補を特定した。ＨＬＡ−Ａ２＋又は−Ａ２４＋前立腺癌患者のための既知のＥＺＨ２ペプチドと組み合わせることで、ＥＺＨ２ペプチドパネルは、種々の少数民族の個体群におけるホルモン難治性及び転移性の前立腺癌患者のためのペプチドに基づいた抗癌ワクチンを促進することを可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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