(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
であるオリゴペプチドを含有し、
前記オリゴペプチドの長さが50アミノ酸残基長以下である、
炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤。
【請求項２】
前記βストランドD配列が下記（c）又は（d）：
（c）配列番号2〜5のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（d）配列番号2〜5のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、請求項１に記載の予防又は治療剤。
【請求項３】
前記DEループ配列が前記（a）のアミノ酸配列である、請求項２に記載の予防又は治療剤。
【請求項４】
前記（d）のアミノ酸配列において、配列番号2及び4のN末端のロイシン残基並びに配列番号3及び5のN末端から4番目のアミノ酸残基であるロイシン残基は置換又は欠失されていない、請求項２又は３に記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が、前記DEループ配列のC末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドE配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の予防又は治療剤。
【請求項６】
前記βストランドE配列が下記（e）又は（f）：
（e）配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（f）配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、請求項５に記載の予防又は治療剤。
【請求項７】
前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が、RANKLタンパク質CDループ配列を含まない、請求項１〜６のいずれかに記載の予防又は治療剤。
【請求項８】
前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が下記（i）又は（j）：
（i）配列番号12〜20のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（j）配列番号12〜20のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、請求項１〜７のいずれかに記載の予防又は治療剤。
【請求項９】
前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が下記（i’）又は（j’）：
（i’）配列番号12、15若しくは16に示されるアミノ酸配列、又は
（j’）配列番号12、15若しくは16に示されるアミノ酸配列に対して1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、請求項１〜７のいずれかに記載の予防又は治療剤。
【請求項１０】
前記オリゴペプチドの長さが40アミノ酸残基長以下である、請求項１〜９
のいずれかに記載の予防又は治療剤。
【請求項１１】
前記オリゴペプチドの長さが30アミノ酸残基長以下である、請求項１０に記載の予防又は治療剤。
【請求項１２】
前記炎症性皮膚疾患が、乾癬、アトピー性皮膚炎、扁平苔癬、掌蹠膿疱症、及び水疱症からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１〜１１のいずれかに記載の予防又は治療剤。
【請求項１３】
前記炎症性皮膚疾患が乾癬及びアトピー性皮膚炎からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１〜１２のいずれかに記載の予防又は治療剤。
【請求項１４】
RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、オリゴペプチドを含有し、
前記オリゴペプチドの長さが50アミノ酸残基長以下である、
Toll様受容体7経路及びToll様受容体8経路からなる群より選択される少なくとも1種の経路の抑制剤。
【請求項１５】
RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、オリゴペプチドを含有し、
前記オリゴペプチドの長さが50アミノ酸残基長以下である、
炎症性皮膚疾患の予防又は治療用外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
乾癬は、典型的には赤い発疹、鱗屑などを伴う炎症性皮膚疾患である。乾癬の発症には、T細胞や角化細胞の異常、Toll様受容体（Toll-like receptor：TLR）7経路やTLR8経路の活性化及びそれによる各種炎症性サイトカインの分泌（TNF-α、IL-6、IL-12/23p40など）などが関与しているといわれている。【０００３】
乾癬の治療薬としては、炎症性サイトカインの発現を制御するTNF-α阻害剤としてインフリキシマブ、アダリムマブが、ヒト型抗ヒトIL-12/23p40モノクローナル抗体製剤としてウステキヌマブが知られている。しかしながら、乾癬の根本的な治療法は未だ開発されていない。【０００４】
乾癬患者数は近年増加傾向にあり、またその治療薬の市場規模も近年増加している。【０００５】
一方、本発明者などによって、RANKLタンパク質が炎症性サイトカインを抑制することが報告されている（特許文献１）。ただ、特許文献１では、TLR2経路やTLR4経路を介した炎症性サイトカイン抑制しか報告されていない。【０００６】
また、特許文献２では、RANKLタンパク質が接触性アレルギー性皮膚炎に有効であり得ることが開示されている。ただ、特許文献２ではRANKLタンパク質全長を有効成分としているところ、安定性、経済性などの観点からは、より短いオリゴペプチドを有効成分とすることが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2014/051202号
【特許文献２】特表2009-536171号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】The Journal of Clinical Investigation, No.7, Vol.108, 2001, pages 971-979.
【非特許文献２】Mol Endocrinol, January 2009, 23(1):35-46.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、オリゴペプチドを有効成分とする、乾癬などの炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、驚くべきことに、RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが、乾癬などの炎症性皮膚疾患の予防及び治療効果を有することを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。【００１１】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
項１．  RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
であるオリゴペプチドを含有する、炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤．
項２．  前記βストランドD配列が下記（c）又は（d）：
（c）配列番号2〜5のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（d）配列番号2〜5のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、項１に記載の予防又は治療剤．
項３．  前記DEループ配列が前記（a）のアミノ酸配列である、項２に記載の予防又は治療剤．
項４．  前記（d）のアミノ酸配列において、配列番号2及び4のN末端のロイシン残基並びに配列番号3及び5のN末端から4番目のアミノ酸残基であるロイシン残基は置換又は欠失されていない、項２又は３に記載のオリゴペプチド．
項５．  前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が、前記DEループ配列のC末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドE配列を含む、項１〜４のいずれかに記載の予防又は治療剤．
項６．  前記βストランドE配列が下記（e）又は（f）：
（e）配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（f）配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、項５に記載の予防又は治療剤．
項７．  前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が、RANKLタンパク質CDループ配列を含まない、項１〜６のいずれかに記載の予防又は治療剤．
項８．  前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が下記（i）又は（j）：
（i）配列番号12〜20のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（j）配列番号12〜20のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して１〜3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、項１〜７のいずれかに記載の予防又は治療剤．
項９．  前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が下記（i’）又は（j’）：
（i’）配列番号12、15若しくは16に示されるアミノ酸配列、又は
（j’）配列番号12、15若しくは16に示されるアミノ酸配列に対して1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、項１〜７のいずれかに記載の予防又は治療剤．
項１０．  前記オリゴペプチドの長さが40アミノ酸残基長以下である、項１〜９のいずれかに記載の予防又は治療剤．
項１１．  前記オリゴペプチドの長さが30アミノ酸残基長以下である、項１０に記載の予防又は治療剤．
項１２．  前記炎症性皮膚疾患が、乾癬、アトピー性皮膚炎、扁平苔癬、掌蹠膿疱症、及び水疱症からなる群より選択される少なくとも1種である、項１〜１１のいずれかに記載の予防又は治療剤．
項１３．  前記炎症性皮膚疾患が乾癬及びアトピー性皮膚炎からなる群より選択される少なくとも1種である、項１〜１２のいずれかに記載の予防又は治療剤．
項１４．  RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、オリゴペプチドを含有する、Toll様受容体7経路及びToll様受容体8経路からなる群より選択される少なくとも1種の経路の抑制剤．
項１５．  RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、オリゴペプチドを含有する、炎症性皮膚疾患の予防又は治療用外用剤。
項１６．  RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
であるオリゴペプチドを投与することを含む、炎症性皮膚疾患を予防又は治療する方法．
項１７．  炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤としての使用のための、
RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
であるオリゴペプチド．
項１８．  炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤の製造のための、
RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
であるオリゴペプチドの使用．
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、オリゴペプチドを有効成分とする、乾癬などの炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤を提供することができる。【００１３】
RANKLタンパク質は破骨細胞を活性化するのに対して、本発明に用いるオリゴペプチド（以下、「RANKLペプチド」と記載することもある）はRANKLタンパク質由来でありながらもそのような性質を有さず、寧ろRANKLタンパク質による破骨細胞の活性化を抑制することができる。このため、このオリゴペプチドを用いれば、破骨細胞活性化をより低減しつつ、炎症性皮膚疾患の予防又は治療を行うことが可能である。【００１４】
本発明に用いるオリゴペプチドは、安定性に優れており、長期間保存後であってもより高い活性を維持することが可能である。【００１５】
本発明の予防又は治療剤は、オリゴペプチドを有効成分としているので、既存の、抗体を有効成分とする治療剤（例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、ウステキヌマブなど）に比べて、より安価に提供することが可能である。このため、本発明は医療費抑制にも資することができる。乾癬などの炎症性皮膚疾患は近年増加傾向にあるところ、医療費抑制は重要な課題である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析（実施例1）における、投与スケジュールを示す。
【図２】炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析1（実施例1）における、投与後の背中の写真を示す。IMQは乾癬症状誘発剤であるイミキモドを意味し、dH2Oはコントロール群（MHP1非投与群）を示し、MHP1はMHP1投与群を示し、6d及び7dはイミキモド初回投与から6日目及び7日目を示す。
【図３】炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析（実施例1）における、背中の白色鱗屑の程度を数値化した結果を示す。縦軸が、白色鱗屑の程度を表す数値を示し（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）、横軸がイミキモド初回投与からの経過日数を示す。IMQは乾癬症状誘発剤であるイミキモドを意味し、Controlがイミキモド及びMHP1をいずれも投与していない場合を示し、dH2Oはコントロール群（MHP1非投与群）を示し、MHP1はMHP1投与群を示す。
【図４】炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析（実施例1）における、耳の厚さの測定結果を示す。右耳（Right ear）はイミキモド投与群であり、左耳はイミキモド非投与群である。横軸中、Day -1はイミキモド初回投与の前日であり、その他はイミキモド初回投与からの経過日数を示す。縦軸は、測定された耳の厚さを、Day -1の耳の厚さを100％として新たした相対値である。ControlはMHP1非投与群を示し、MHP1はMHP1投与群を示す。
【図５】TLR7/8のリガンドであるImidazoquinoline Resiquimod（R848）によってミクログリア細胞から分泌される炎症性サイトカイン（IL-6又はTNFα）の量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた結果を示す（実施例2）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のIL-6又はTNFα濃度を示す。図５ａ及び図５ｂにおけるMHP1の培地中の濃度は30.5μMであり、図５ｃの横軸における数値はMHP4の培地中の濃度を示し、Controlは培地にR848及びRANKLペプチドのいずれも添加していない場合を示す。**は、R848のみを添加した場合（左から2つ目のカラム）に対するP値が0.01未満であったことを示す。
【図６】TLR7/8のリガンドであるImidazoquinoline Resiquimod（R848）によってマクロファージ細胞から分泌される炎症性サイトカイン（IL-6）の量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた結果を示す（実施例3）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のIL-6濃度を示す。横軸における数値はRANKLペプチドの培地中の濃度を示し、Normalは培地にR848及びRANKLペプチドのいずれも添加していない場合を示し、No treatは培地にR848のみを添加した場合を示す。**は、R848のみを添加した場合（左から2つ目のカラム）に対するP値が0.01未満であったことを示す。
【図７】TLR7/8のリガンドであるImidazoquinoline Resiquimod（R848）によってマクロファージ細胞から分泌される炎症性サイトカイン（IL-12/23）の量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた結果を示す（実施例4）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のIL-12/23濃度を示す。Controlは培地にR848及びRANKLペプチドのいずれも添加していない場合を示し、No treatmentは培地にR848のみを添加した場合を示す。
【図８】RANKLペプチドの破骨細胞に対する影響を調べた結果を示す（実施例5）。図８Ａ及びＢ中、縦軸は、測定対象のmRNA発現量をGAPDH mRNA発現量で除した値を示す。図８Ｃ中、縦軸は、TransAM NFkB p65 kitによって測定された吸光度（NFκB結合配列を有するDNAに結合した、核タンパク中のp65量を表わす）を示す。
【図９】RANKLペプチドの破骨細胞に対する影響を調べた結果を示す（実施例6）。（ａ）は、A群、B群、及びD群のTRAP染色像を、（ｂ）は、C群のTRAP染色像（上段）及び核染色像（下段）を示す。
【図１０】RANKLペプチドの安定性を調べた結果を示す（実施例7）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のIL-6又はTNF−αの濃度を示す。**は、controlに対するP値が0.01未満であったことを示す。
【図１１】炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析2（実施例8）における、day 1の背中の写真を示す。
【図１２】炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析2（実施例8）における、発赤の程度を数値化した結果を示す。縦軸が、発赤の程度を表す数値を示し（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）、横軸がイミキモド初回投与からの経過日数を示す。
【図１３】炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析2（実施例8）における、白色鱗屑の程度を数値化した結果を示す。縦軸が、白色鱗屑の程度を表す数値を示し（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）、横軸がイミキモド初回投与からの経過日数を示す。
【図１４】炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析2（実施例8）における、皮膚肥厚の程度を数値化した結果を示す。縦軸が、皮膚肥厚の程度を表す数値を示し（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）、横軸がイミキモド初回投与からの経過日数を示す。
【図１５】炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析3（実施例9）における、耳の厚さの測定結果を示す。縦軸は、測定された耳の厚さと、ダニ抗原投与前の耳の厚さとの差である。
【図１６】炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析4（実施例10）における、皮膚肥厚の程度を数値化した結果を示す。縦軸が、皮膚肥厚の程度を表す数値を示し（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）、横軸がイミキモド初回投与からの経過日数を示す。
【図１７】炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析5（実施例11）における、発赤の程度を数値化した結果を示す。縦軸が、発赤の程度を表す数値を示し（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）、横軸がイミキモド初回投与からの経過日数を示す。
【図１８】炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析5（実施例11）における、白色鱗屑の程度を数値化した結果を示す。縦軸が、白色鱗屑の程度を表す数値を示し（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）、横軸がイミキモド初回投与からの経過日数を示す。
【図１９】炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析5（実施例11）における、皮膚肥厚の程度を数値化した結果を示す。縦軸が、皮膚肥厚の程度を表す数値を示し（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）、横軸がイミキモド初回投与からの経過日数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
1．定義
本明細書において、アミノ酸配列の表記は全て一文字表記で表わす。
【００１８】
本明細書において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００１９】
アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS， Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264−2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high−scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873−7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
【００２０】
本明細書において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
【００２１】
2．オリゴペプチド
以下に、RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（本明細書において、「本発明のオリゴペプチド」と示すこともある。）について説明する。
【００２２】
RANKLタンパク質のDEループ配列としては、下記（a）又は（b）のアミノ酸配列が挙げられる：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
【００２３】
RANKLタンパク質のβストランドD配列は、RANKLタンパク質のアミノ酸配列中、βストランドDを形成するアミノ酸配列である限り特に限定されない。該βストランドD配列が由来する生物種は特に限定されず、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類が挙げられる。これらの中でも、好ましくはヒト、サル、マウス、ラットなど、より好ましくはヒト、マウスなど、よりさらに好ましくはヒトが挙げられる。各生物種のβストランドD配列は公知であり、例えばマウス、ラットの場合は非特許文献１、２などに記載されている。また、ある生物種由来のβストランドD配列が公知でなくとも、公知の情報（例えば非特許文献１、２など）に基づいて、その配列を容易に決定することができる。RANKLタンパク質のβストランドD配列として、具体的には、例えば配列番号2に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のβストランドD配列の一部）、配列番号3に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のβストランドD配列）、配列番号4に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のβストランドD配列の一部）、配列番号5に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のβストランドD配列）などが挙げられる。βストランドD配列は、本発明のオリゴペプチドが炎症性皮膚疾患の予防又は治療効果を発揮し得る限りにおいて、変異したものであってもよい。
【００２４】
なお、配列番号2〜5において、配列番号2及び4のN末端のロイシン残基、及び配列番号3及び5のN末端から4番目アミノ酸であるロイシン残基は、炎症性皮膚疾患の予防及び治療効果の発揮に重要である。βストランドD配列においては、このロイシン残基は変異していないことが望ましい。
【００２５】
RANKLタンパク質のβストランドD配列として、好ましくは下記（c）又は（d）のアミノ酸配列が挙げられる：
（c）配列番号2〜5のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（d）配列番号2〜5のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
【００２６】
上記（d）において、変異（置換、欠失、付加又は挿入）しているアミノ酸の数は、好ましくは1〜2個であり、より好ましくは1個である。
【００２７】
上記（d）のアミノ酸配列として、好ましくは下記（d’）のアミノ酸配列が挙げられる：
（d’）配列番号2〜5のいずれかに示されるアミノ酸配列のN末端又はC末端（好ましくはN末端）に対して1〜3個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。
【００２８】
上記（d’）において、付加しているアミノ酸の数は、好ましくは1〜2個であり、より好ましくは1個である。
【００２９】
「N末端側に隣接して配置された」とは、上記DEループ配列のN末端のアミノ酸と上記βストランドD配列のC末端のアミノ酸とがペプチド結合により連結していることを示す。
【００３０】
本発明のオリゴペプチドのアミノ酸配列は、本発明のオリゴペプチドが炎症性皮膚疾患の予防又は治療効果を発揮し得る限りにおいて、上記した配列以外の他の配列を含んでいてもよい。他の配列は特に限定されないが、細胞内半減期がより長いという観点などから決定することが望ましい。なお、親水性か否か、及び細胞内半減期については、各種ウェブサイト（例えばエクスパシー（http://web.expasy.org/protparam/））上で予測することができる。エクスパシーを利用する場合、親水性については、「Grand average of hydropathicity」がマイナスの値を示すように配列を設計することが好ましい。
【００３１】
他の配列としては、好ましくはRANKLタンパク質のβストランドE配列が挙げられる。βストランドE配列は、DEループ配列のC末端側に隣接して配置されていることが好ましい。なお、「C末端側に隣接して」とは、上記DEループ配列のC末端のアミノ酸と上記βストランドE配列のN末端のアミノ酸とがペプチド結合により連結していることを示す。
【００３２】
RANKLタンパク質のβストランドE配列は、RANKLタンパク質のアミノ酸配列中、βストランドEを形成するアミノ酸配列である限り特に限定されない。該βストランドE配列が由来する生物種は特に限定されず、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類が挙げられる。これらの中でも、好ましくはヒト、サル、マウス、ラットなど、より好ましくはヒト、マウスなど、よりさらに好ましくはヒトが挙げられる。各生物種のβストランドE配列は公知であり、例えばマウス、ラットの場合は非特許文献１、２などに記載されている。また、ある生物種由来のβストランドE配列が公知でなくとも、公知の情報（例えば非特許文献１、２など）に基づいて、その配列を容易に決定することができる。RANKLタンパク質のβストランドE配列として、具体的には、例えば配列番号6に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のβストランドE配列）、配列番号7に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のβストランドE配列の一部）、配列番号8に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のβストランドE配列）、配列番号9に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のβストランドE配列の一部）などが挙げられる。βストランドE配列は、本発明のオリゴペプチドが炎症性皮膚疾患の予防又は治療効果を発揮し得る限りにおいて、変異していてもよい。
【００３３】
RANKLタンパク質のβストランドE配列として、好ましくは下記（e）又は（f）のアミノ酸配列が挙げられる：
（e）配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（f）配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
【００３４】
上記（f）において、変異（置換、欠失、付加又は挿入）しているアミノ酸の数は、好ましくは1〜2個であり、より好ましくは1個である。
【００３５】
本発明のオリゴペプチドのアミノ酸配列は、RANKLタンパク質のCDループ配列を含まないことが好ましい。
【００３６】
RANKLタンパク質のCDループ配列は、RANKLタンパク質のアミノ酸配列中、CDループを形成するアミノ酸配列である限り特に限定されない。該CDループ配列が由来する生物種は特に限定されず、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類が挙げられる。これらの中でも、好ましくはヒト、サル、マウス、ラットなど、より好ましくはヒト、マウスなど、よりさらに好ましくはヒトが挙げられる。各生物種のCDループ配列は公知であり、例えばマウス、ラットの場合は非特許文献１、２などに記載されている。また、ある生物種由来のCDループ配列が公知でなくとも、公知の情報（例えば非特許文献１、２など）に基づいて、その配列を容易に決定することができる。RANKLタンパク質のCDループ配列として、具体的には、例えば配列番号10に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のCDループ配列）、配列番号11に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のCDループ配列）などが挙げられる。
【００３７】
RANKLタンパク質のCDループ配列として、好ましくは下記（g）又は（h）のアミノ酸配列が挙げられる：
（g）配列番号10又は11に示されるアミノ酸配列、又は
（h）配列番号10又は11に示されるアミノ酸配列に対して1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
【００３８】
上記（h）において、変異（置換、欠失、付加又は挿入）しているアミノ酸の数は、好ましくは1〜2個であり、より好ましくは1個である。
【００３９】
本発明のオリゴペプチドの長さとしては、オリゴペプチドとして一般的な長さである限り特に限定されない。該長さは、例えば50アミノ酸残基長以下、好ましくは40アミノ酸残基長以下、より好ましくは35アミノ酸残基以下、より好ましくは30アミノ酸残基以下、さらに好ましくは25アミノ酸残基長以下、さらに好ましくは20アミノ酸残基長以下、よりさらに好ましくは18アミノ酸残基長以下である。また、該長さは、例えば11アミノ酸残基長以上、好ましくは13アミノ酸残基長以上、より好ましくは15アミノ酸残基長以上である。該長さの範囲は、例えば11〜50アミノ酸残基長、好ましくは11〜40アミノ酸残基長、より好ましくは13〜30アミノ酸残基、さらに好ましくは13〜20アミノ酸残基長、よりさらに好ましくは15〜18アミノ酸残基長である。
【００４０】
本発明のオリゴペプチドの好ましいアミノ酸配列としては、下記（i）又は（j）のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが挙げられる：
（i）配列番号12〜20のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（j）配列番号12〜20のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
【００４１】
本発明のオリゴペプチドのより好ましいアミノ酸配列としては、下記（i’）又は（j’）のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが挙げられる：
（i’）配列番号12、15若しくは16に示されるアミノ酸配列、又は
（j’）配列番号12、15若しくは16に示されるアミノ酸配列に対して1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
【００４２】
上記（j）及び（j’）において、変異（置換、欠失、付加又は挿入）しているアミノ酸の数は、好ましくは1〜2個であり、より好ましくは1個である。
【００４３】
本発明のオリゴペプチドは、炎症性皮膚疾患の予防又は治療効果を発揮し得る限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。
【００４４】
本発明のオリゴペプチドは、C末端がカルボキシル基（−COOH）、カルボキシレート（−COO‐）、アミド（−CONH2）またはエステル（−COOR）の何れであってもよい。
【００４５】
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチルなどのC1−6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3−8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6−12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1−2アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C1−2アルキル基などのC7−14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
【００４６】
また、本発明のオリゴペプチドには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイルなどのC1−6アシル基など）で保護されているもの、なども包含される。
【００４７】
上記化学修飾の中でも、C末端のアミド化、N末端のアセチル基による保護などが好ましく挙げられる。特に、N末端がアセチル化されたオリゴペプチドは活性が優れており好ましいオリゴペプチドとして挙げられる。安定性の観点からは、C末端がアミド化されかつN末端のアセチル化されたオリゴペプチドが優れており、さらに好ましいオリゴペプチドとして、C末端がアミド化されかつN末端のアセチル化されたオリゴペプチドが挙げられる。特に好ましいオリゴペプチドとして、C末端がアミド化されかつN末端のアセチル化されたMHP1、C末端がアミド化されかつN末端のアセチル化されたMHP4が挙げられる。
【００４８】
さらに、本発明のオリゴペプチドには、薬物の安定性、薬物動態、生物学的利用能などを改善する目的で用いられる公知の修飾物が付加されていてもよい。このような修飾物としては、例えばポリエチレングリコール鎖などが挙げられる。
【００４９】
本発明のオリゴペプチドは、直鎖状、分枝状、環状などの種々の形態のものを包含するが、直鎖状であることが好ましい。また、本発明のオリゴペプチドは、炎症性皮膚疾患の予防又は治療効果を発揮し得る限りにおいて、公知の手段に従って又は準じて架橋されていてもよい。
【００５０】
本発明のオリゴペプチドは、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの無機酸塩；  酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩などの有機酸塩；  アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などのアミノ酸塩などが挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；  カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。
【００５１】
本発明のオリゴペプチドは、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸などが挙げられる。
【００５２】
本発明のオリゴペプチドは、そのアミノ酸配列に応じて、公知のペプチド合成法に従って製造することができる。
【００５３】
3．用途
本発明のオリゴペプチドは、炎症性皮膚疾患の予防又は治療効果、Toll様受容体7経路及びToll様受容体8経路からなる群より選択される少なくとも1種の経路の抑制効果（より具体的には、この（又はこれらの）経路を介して惹起される炎症反応の抑制効果）を有することから、炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤、Toll様受容体7経路及びToll様受容体8経路からなる群より選択される少なくとも1種の経路の抑制剤（本明細書において、これらをまとめて「本発明の剤」と示すこともある。）の有効成分として利用することができる。本発明の剤は、例えば医薬、化粧品などの種々の分野で用いられる剤とすることができる。本発明の剤は、これをそのまま、あるいは慣用の成分とともに各種組成物となし、動物およびヒトに適用（例えば、投与、摂取、接種など）することができる。
【００５４】
本発明の剤において、本発明のオリゴペプチドは、1種単独で用いてもよいし、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５５】
炎症性皮膚疾患としては、例えば乾癬、アトピー性皮膚炎、扁平苔癬、掌蹠膿疱症、水疱症などが挙げられる。これらの中でも、好ましくは乾癬、アトピー性皮膚炎などが挙げられ、より好ましくは乾癬が挙げられる。
【００５６】
本発明の剤中の有効成分の含有量は、対象とする疾患の種類、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、患者の年齢、及び患者の体重などを考慮して適宜設定することができる。例えば、本発明の剤中の有効成分の含量は、本発明の剤全体を100重量部として0.0001重量部〜100重量部程度をすることができる。
【００５７】
本発明の剤の投与形態は、所望の効果が得られる限り特に制限されず、経口投与、及び非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、局所投与）のいずれかの投与経路でヒトを含む哺乳類に投与することができる。好ましい投与形態は非経口投与であり、より好ましくは局所投与、経皮投与などである。経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、有効成分を、薬学的に許容される坦体などと混合などすることにより、常法に従って製造することができる。
【００５８】
非経口投与のための剤形は、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤、クリーム、ゲル剤）、坐剤、吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）などが挙げられる。例えば、注射用製剤は、本発明のオリゴペプチドを注射用蒸留水に溶解して調製し、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、pH調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、及び安定化剤などを添加することができる。本発明の剤は、用事調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。
【００５９】
本発明の剤は、疾患の治療又は予防に有効な他の薬剤を更に含有していてもよい。本発明の剤は、必要に応じて殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、及びアミノ酸などの成分を配合することもできる。
【００６０】
本発明の剤の製剤化に用いる担体には、当該技術分野において通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤などを用いることができる。
【００６１】
本発明の剤の投与量は、例えば、投与経路、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、薬物動態および毒物学的特徴などの薬理学的知見、薬物送達系の利用の有無、並びに他の薬物の組合せの一部として投与されるか、など様々な因子を元に、決定することができる。本発明の剤の投与量は、例えば、一日当たりで、1μg/kg（体重）〜10g/kg（体重）程度とすることができる。本発明の剤の投与スケジュールも、その投与量と同様の要因を勘案して決定することができる。例えば、上記の1日当たりの投与量で、1日〜1月に1〜4回投与することできる。
【００６２】
本発明の剤は、好ましくは外用として用いる。本発明の一態様は、本発明のオリゴペプチドを含有する炎症性皮膚疾患の予防又は治療用外用剤である。本発明の外用剤における、外用剤には、皮膚に適用する製剤、直腸に適用する製剤、膣に適用する製剤、目に適用する製剤、耳に適用する製剤、鼻に適用する製剤が含まれる。剤形としては、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤（ローション剤、リニメント剤等）、貼付剤（パップ剤、テープ剤）、スプレー剤、エアゾール剤、坐剤、眼軟膏、点眼剤、点鼻剤、点耳剤が挙げられる。外用剤は病変部に直接投与することが可能であり、炎症性疾患の予防治療効果の点で優れており、また、副作用の点で安全である。
【００６３】
本発明の外用剤の好ましい態様（態様1）は、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤であり、特に好ましい態様は、軟膏剤とクリーム剤である。基剤としては、特に制限されないが、好ましくは親水ワセリン、親水クリーム等の親水性基剤が使用される。本発明のオリゴペプチドは、そのまま基剤と混合されてもよいが、好ましくは溶媒に溶解した状態で基剤と混合される。該溶媒としては、例えば水、各種有機溶媒（グリコールエーテル、アルコール、エーテル等）が挙げられ、好ましくはグリコールエーテルが挙げられる。
【００６４】
態様1における外用剤中の有効成分の含有量は、一態様においては、好ましくは0.00001〜2％、0.00005〜1％、0.0001〜0.5％、0.0003〜0.1％、0.0005〜0.05％、0.0008〜0.01％、より好ましくは0.001〜0.005％、さらに好ましくは0.002〜0.003％である。また、この場合、好ましくはDEループ配列とβストランドD配列を含む比較的短い（好ましくは15〜20アミノ酸残基長、より好ましくは15〜18アミノ酸残基長、さらに好ましくは15〜16アミノ酸残基長）RANKLペプチド（例えば、MHP4）を採用することができる。上記態様によれば、RANKLペプチドが非常に低い濃度でありながらも、効率的に所望の効果を発揮することができる。
【００６５】
態様1における外用剤中の有効成分の含有量は、別の一態様においては、好ましくは0.00001〜2％、0.00005〜1％、0.0001〜0.5％、0.0003〜0.1％、0.001〜0.05％、0.005〜0.03％、より好ましくは0.008〜0.025％である。また、この場合、好ましくはDEループ配列とβストランドD配列を含む（より好ましくは、さらにβストランドE配列も含む）比較的短い（好ましくは15〜40アミノ酸残基長、より好ましくは20〜35アミノ酸残基長、さらに好ましくは25〜35アミノ酸残基長、よりさらに好ましくは27〜33アミノ酸残基長）RANKLペプチド（例えば、MHP1）を採用することができる。上記態様によれば、RANKLペプチドが非常に低い濃度でありながらも、効率的に所望の効果を発揮することができる。
【実施例】
【００６６】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００６７】
参考例1：オリゴペプチドの合成1
表１に示すアミノ酸配列のオリゴペプチドをILS株式会社に委託して合成した。HPLC及びMSにより、所望の配列のオリゴペプチドが高純度で合成できたことを確認した。なお、これらのペプチドにおけるアミノ酸残基は、全てL体である。以下、これらのペプチドを総称して「RANKLペプチド」と総称することもある。なお、MHP1のアミノ酸配列は配列番号12に、MHP2のアミノ酸配列は配列番号13に、MHP3のアミノ酸配列は配列番号14に、MHP4のアミノ酸配列は配列番号15に、hMHP4のアミノ酸配列は配列番号16に、MHP5のアミノ酸配列は配列番号17に、MHP6のアミノ酸配列は配列番号18に、MHP12のアミノ酸配列は配列番号19に、
MHP13のアミノ酸配列は配列番号20に示される配列である。【００６８】
【表１】
0006710416.tif 000002
【００６９】
実施例1：炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析1
乾癬症状誘発剤であるイミキモド（IMQ）の投与による乾癬症状が、RANKLペプチド（MHP1）によって改善されるかどうかを調べた。具体的には、図１に示す投与スケジュールに従って、次のように行った。【００７０】
被検動物として、背中の一部を除毛した、BALB/c  6週齢のマウス（♀）を準備した。マウスの背中の除毛部と耳に 5% イミキモド（IMQ）を塗布（62.5 mg / 1匹）した（day 0（0d））。1日経過後、背中と耳それぞれに、（1）MHP1水溶液（200μg / 100μL / 匹、n＝2）又はdH2O（コントロール、n＝2）を塗布し、その後（2）5% イミキモド（IMQ）を塗布（62.5 mg / 1匹）した（day 1（1d））。その後、5日間毎日、（1）及び（2）の塗布を行った（day 2〜6（2d〜6d））。【００７１】
背中の観察部位の写真を図２に示す。【００７２】
また、文献（van der Fits, L. et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J. Immunol. 182, 5836-45 (2009).）の記載に従って、背中の白色鱗屑の程度を数値化した（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）。この結果を図３に示す。【００７３】
さらに、耳の厚さを測定した。この結果を図４に示す。【００７４】
図２〜４より、MHP1の投与により乾癬症状が改善することが示された。【００７５】
実施例2：TLR7/8シグナルに対する影響の解析1（IL-6及びTNFα、ミクログリア細胞）
TLR7/8のリガンドであるImidazoquinoline Resiquimod（R848、インビトロジェン社製）刺激によってミクログリア細胞から分泌される炎症性サイトカイン（IL-6及びTNFα）の量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた。具体的には次のように行った。【００７６】
MHP1又はMHP4（終濃度7.6μM、15.3μM、又は30.5μM）、及びR848（終濃度1μg/ml）を添加したDMEM培地（＋4％FBS）、或いはR848（終濃度1μg/ml）のみを添加したDMEM培地（＋4％FBS）中で、MG6細胞（マウス由来ミクログリア細胞株）を、24時間、定法に従って培養した。培養後、培地中のIL-6及びTNFαの濃度をELISA法で測定した。なお、本願実施例において、ELISA法は、キット（Quantikine ELISA Mouse TNF-a又はQuantikine ELISA Mouse IL-6、R&D Systems社製）を用いて行った。MHP1を添加した場合の結果を図５ａ（検出はIL-6）及び図５ｂ（検出はTNFα）に、MHP4を添加した場合の結果を図５ｃ（検出はIL-6）に示す。【００７７】
図５より、R848による炎症性サイトカイン（IL-6及びTNFα）分泌量増加（左から1つ目のカラムと2つ目のカラムとの比較）が、MHP1及びMHP4によって抑制されることが示された（左から2つ目のカラムと、3つ目（図５ａ及び図５ｂ）又は3〜5つ目（図５ｃ）のカラムとの比較）。このことから、MHP1及びMHP4はTLR7/8シグナルを抑制することが示唆された。【００７８】
実施例3：TLR7/8シグナルに対する影響の解析2（IL-6、マクロファージ細胞）
TLR7/8のリガンド（R848）刺激によってマクロファージ細胞から分泌される炎症性サイトカイン（IL-6）の量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた。具体的には次のように行った。【００７９】
MHP1又はhMHP4（終濃度30.5μM）、及びR848（終濃度10μg/ml）を添加したDMEM培地（＋4％FBS）、或いはR848（終濃度10μg/ml）のみを添加したDMEM培地（＋4％FBS）中で、THP-1細胞（ヒト由来マクロファージ細胞株）を、24時間、定法に従って培養した。培養後、培地中のIL-6の濃度をELISA法で測定した。結果を図６に示す。【００８０】
図６より、R848による炎症性サイトカイン（IL-6）分泌量増加（左から1つ目のカラムと2つ目のカラムとの比較）が、MHP1及びhMHP4によって抑制されることが示された（左から2つ目のカラムと、3〜4つ目のカラムとの比較）。このことから、MHP1及びhMHP4はTLR7/8シグナルを抑制することが示唆された。また、MHP1とhMHP4のTLR7/8シグナル抑制作用は、同程度であった。【００８１】
実施例4：TLR7/8シグナルに対する影響の解析3（IL-12/23、マクロファージ細胞）
TLR7/8のリガンド（R848）刺激によってマクロファージ細胞から分泌される炎症性サイトカイン（IL-12/23）の量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた。具体的には次のように行った。【００８２】
MHP1、MHP4、又はhMHP4（それぞれ、終濃度30.5μM）、及びR848（終濃度10μg/ml）を添加したDMEM培地（＋4％FBS）、或いはR848（終濃度10μg/m）のみを添加したDMEM培地（＋4％FBS）中で、THP-1細胞（ヒト由来マクロファージ細胞株）を、24時間、定法に従って培養した。培養後、培地中のIL-12/23の濃度を、キット（Quantikine ELISA Kits、R&D Systems社製）を用いてELISA法で測定した。結果を図７に示す。【００８３】
図７より、R848による炎症性サイトカイン（IL-12/23）分泌量増加（左から1つ目のカラムと2つ目のカラムとの比較）が、RANKLペプチドによって抑制されることが示された（左から2つ目のカラムと、3〜5つ目のカラムとの比較）。このことから、RANKLペプチドはTLR7/8シグナルを抑制することが示唆された。【００８４】
実施例5：RANKLペプチドの破骨細胞に対する影響の解析1 
近年、RANKLタンパク質をマウスに投与することによって破骨細胞の活性化を引き起こされることが報告されている。そこで、RANKLペプチドの破骨細胞に対する影響を調べた。具体的には次のように行った。【００８５】
RAW264.7細胞を培養している培地（DMEM培地（＋4％FBS））に、MHP1（終濃度100μg/ml）又はRANKLタンパク質（終濃度10 ng/ml）を添加し、10分後及び3日後に細胞を回収した。【００８６】
10分後に回収したサンプルについては、Nuclear extract Kit（Active Motif）を用いて細胞の核タンパクを抽出し、TransAM NFkB p65 kit（Active Motif）によりNFκB（p65）活性化の程度を測定した。一方で、3日後に回収したサンプルについては、Realtime RT-PCRにて、NFATc1及びACP5のmRNAの発現量を解析した。結果を図８に示す。【００８７】
図８より、MHP1はNFκBを軽度活性化するが、 破骨細胞関連mRNAの発現を促進しないことが示された。【００８８】
実施例6：RANKLペプチドの破骨細胞に対する影響の解析2
破骨細胞培養キットV-2（OSC33、コスモ・バイオ社製）を使用した。キットの使用方法に従って、破骨前駆細胞を、A群及びB群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）存在下で、C群及びD群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）及びMHP1（終濃度30、50、又は100μg/ml）存在下で、培養開始した。その後、培養開始24時間後から7日間は、A群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）存在下で、B群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）及びRANKLタンパク質（終濃度50 ng/ml）存在下で、C群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）及びMHP1（終濃度30、50、又は100μg/ml）存在下で、D群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）、RANKLタンパク質（終濃度50 ng/ml）、及びMHP1（終濃度30、50、又は100μg/ml）存在下で、培養した。培養後、細胞を定法に従ってTRAP染色及び核染色した。結果を図９に示す。A群、B群、及びD群のTRAP染色像を図９（ａ）に、C群のTRAP染色像及び核染色像を図９（ｂ）に示す。【００８９】
図９（ａ）より、RANKLによって促進される破骨細胞の分化が、MHP1により抑制されることが示された（B群とC群との比較）。図９（ｂ）より、MHP1を添加しても、破骨細胞の分化は起こらないことが示された。【００９０】
実施例7：RANKLペプチドの安定性
RANKLペプチドの安定性を調べた。具体的には次のように行った。【００９１】
MHP1を2 mg/mlの濃度で水に溶解し、4℃で208日間保管した。その後、MHP1（終濃度100μg/ml）、及びLPS（終濃度2 ng/ml）を含むDMEM培地（＋4％FBS）中で、MG6細胞（マウス由来ミクログリア細胞株）を、24時間、定法に従って培養した。培養後、培地中のIL-6及びTNFαの濃度をELISA法で測定した。
結果を図１０に示す。【００９２】
図１０より、MHP1は長期間保存後であっても、保存前と同様に高い炎症性サイトカイン分泌抑制効果を発揮することが示された。このことから、MHP1の安定性が高いことが示された。【００９３】
参考例2：オリゴペプチドの合成2
MHP1（参考例1）のメチオニン残基がD体に置換されてなるオリゴペプチド（MHP1-3）、MHP1（参考例1）のN末端がアセチル化されてなるオリゴペプチド（MHP1-6）、MHP1（参考例1）のN末端がアセチル化され且つC末端がアミド化されてなるオリゴペプチド（MHP1-7）、及びMHP1（参考例1）のC末端がアミド化されてなるオリゴペプチド（MHP1-8）をILS株式会社に委託して合成した。HPLC及びMSにより、所望の配列のオリゴペプチドが高純度で合成できたことを確認した。以下、このペプチドを「RANKLペプチド」と記すこともある。【００９４】
実施例8：炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析2
乾癬症状誘発剤であるイミキモド（IMQ）の投与による乾癬症状が、RANKLペプチド（MHP4）によって改善されるかどうかを調べた。具体的には、イミキモド初回塗布から6時間後に軟膏の初回塗布を行う以外は、図１に示す投与スケジュールと同様のスケジュールに従って、次のように行った。なお、実施例1ではRANKLペプチドの水溶液を投与したのに対して、本実施例ではRANKLペプチド軟膏を投与した。【００９５】
被検動物として、背中の一部を除毛した、BALB/c  9週齢のマウス（♂）を準備した。マウスの背中の除毛部と耳に 5% イミキモド（IMQ）を塗布（62.5 mg / 1匹）し（day 0（0d））、6時間経過後、背中と耳それぞれに、（1）MHP4親水ワセリン軟膏（375ng（MHP4） / 15mg（親水ワセリン） / 匹、n＝2）、親水ワセリン（コントロール（未治療）、n＝2）、又はMCT/BBP（マーデュオックス（登録商標）軟膏）（15 mg / 匹、n＝2）を塗布した。その後、毎日、イミキモドと上記（1）の塗布を行った（day 1〜（1d〜））。【００９６】
day 6の背中の観察部位の写真を図１１に示す。【００９７】
また、背中の発赤の程度、背中の白色鱗屑の程度、及び背中の皮膚肥厚の程度を数値化した。なお、数値化は、文献（van der Fits, L. et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J. Immunol. 182, 5836-45 (2009).）の記載に従って行った（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）。この結果を図１２〜１４に示す。【００９８】
図１１〜１４より、MHP4の投与により乾癬症状が改善することが示された。【００９９】
実施例9：炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析3
アトピー性皮膚炎誘発剤であるダニ抗原の皮内投与によるアトピー性皮膚炎症状が、RANKLペプチド（MHP1-8）によって改善されるかどうかを調べた。具体的には次のように行った。【０１００】
被検動物として、BALB/c  6週齢のマウス（♀）を準備した。マウスの耳介にダニ抗原を皮内投与した（day 0（0d））。day 0及びday 1に、耳に、（1）MHP1-8水溶液（50μg / 25μL / 匹、n＝10）又はdH2O（コントロール（vehicle）、n＝10）を塗布した。【０１０１】
day 1に、耳の厚さを測定した。この結果を図１５に示す。【０１０２】
図１５より、MHP1-8の投与によりアトピー性皮膚炎症状が改善することが示された。【０１０３】
実施例10：炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析4
乾癬症状誘発剤であるイミキモド（IMQ）の投与による乾癬症状が、RANKLペプチド（MHP1-7）によって改善されるかどうかを調べた。具体的には、イミキモド初回塗布から6時間後に軟膏の初回塗布を行う以外は、図１に示す投与スケジュールと同様のスケジュールに従って、次のように行った。実施例8と同様に、本実施例でもRANKLペプチド軟膏を投与した。【０１０４】
被検動物として、背中の一部を除毛した、BALB/c  9週齢のマウス（♂）を準備した。マウスの背中の除毛部と耳に 5% イミキモド（IMQ）を塗布（62.5 mg / 1匹）し（day 0（0d））、6時間経過後、背中と耳それぞれに、（1）MHP1-7親水ワセリン軟膏1（3μg（MHP1-7） / 15 mg（親水ワセリン） / 匹、n＝2）、MHP1-7親水ワセリン軟膏2（1.5μg（MHP1-7） / 15 mg（親水ワセリン） / 匹、n＝2）、又は親水ワセリン（コントロール（未治療）、n＝2）を塗布した（day 1（1d））。その後、毎日、イミキモドと上記（1）の塗布を行った（day 1〜（1d〜））。【０１０５】
また、背中の皮膚肥厚の程度を数値化した。なお、数値化は、文献（van der Fits, L. et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J. Immunol. 182, 5836-45 (2009).）の記載に従って行った（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）。この結果を図１６に示す。【０１０６】
図１６より、MHP1-7の投与により乾癬症状が改善することが示された。【０１０７】
実施例11：炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析5
乾癬症状誘発剤であるイミキモド（IMQ）の投与による乾癬症状が、RANKLペプチド（MHP1-7）によって改善されるかどうかを調べた。具体的には、イミキモド初回塗布から6時間後に軟膏の初回塗布を行う以外は、図１に示す投与スケジュールと同様のスケジュールに従って、次のように行った。【０１０８】
被検動物として、背中の一部を除毛した、BALB/c  9週齢のマウス（♂）を準備した。マウスの背中の除毛部と耳に 5% イミキモド（IMQ）を塗布（62.5 mg / 1匹）し（day 0（0d））、6時間経過後、背中と耳それぞれに、（1）MHP1-7親水クリーム軟膏1（1.5μg（MHP1-7） / 15 mg（親水性クリーム） / 匹、n＝4）、MHP1-7親水クリーム軟膏2（1.5μg（MHP1-7） / 15 mg（親水性クリーム） / 匹、n＝4）、又は親水性クリーム（コントロール（未治療）、n＝4）を塗布した（day 1（1d））。その後、毎日、イミキモドと上記（1）の塗布を行った（day 1〜（1d〜））。なお、親水クリーム軟膏1は、MHP1-7の水溶液を親水性クリームに混合して作成し、親水クリーム軟膏2は、MHP1-7のトランスクトールP（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）溶液を親水性クリームに混合して作成した。【０１０９】
また、背中の発赤の程度、背中の白色鱗屑の程度、及び背中の皮膚肥厚の程度を数値化した。なお、数値化は、文献（van der Fits, L. et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J. Immunol. 182, 5836-45 (2009).）の記載に従って行った（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）。この結果を図１７〜１９に示す。【０１１０】
図１７〜１９より、MHP1-7の投与により乾癬症状が改善することが示された。RANKLペプチドのグリコールエーテル溶液を軟膏化した親水クリーム軟膏2は、その改善作用がより強かった。【０１１１】
実施例12
RANKLペプチド含有ローション
各種RANKLペプチドを各々、2mg/mlの濃度で水に溶解し、RANKLペプチド含有ローションを作製した。【０１１２】
実施例13
RANKLペプチド含有軟膏
RANKLペプチド（MHP4）を親水性ワセリンと混合し、25μg/gの濃度の軟膏を作製した。
RANKLペプチド（MHP1-7）を親水性ワセリンと混合し、100μg/gおよび200μg/gの濃度の軟膏を作製した。【０１１３】
実施例14
RANKLペプチド（MHP1-7）を親水性クリームと混合し、100μg/gの濃度のクリームを作製した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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