(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式、
Ａｂ−（ＰＭＬ−ａｂｘ）ｐ、を有し、
式中、
Ａｂが、抗壁テイコ酸（ＷＴＡ）抗体であり、
ＰＭＬが、以下の式、
−Ｓｔｒ−ＰＭ−Ｙ−
を有する、プロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカーであって、
式中、Ｓｔｒがストレッチャー単位であり、ＰＭがペプチドミメティック単位であり、Ｙがスペーサー単位であり、
ａｂｘが、リファマイシン型抗生物質であり、
ｐが、１〜８の整数であり、
ＰＭが、式、
0006742314.tif 000085
を有し、式中、Ｒ７及びＲ８が合わせて、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル環を形成し、
ＡＡが、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２から選択されるアミノ酸側鎖である
抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項２】
前記リファマイシン型抗生物質が、リファラジル型抗生物質である、請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項３】
前記リファマイシン型抗生物質が、前記プロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカーに結合している第４級アミンを含む、請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項４】
式Ｉを有し、
0006742314.tif 000086
Ｉ
式中、
破線が、任意選択の結合を示し、
Ｒが、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、またはＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、
Ｒ１がＯＨであり、
Ｒ２がＣＨ＝Ｎ−（ヘテロシクリル）であり、式中、前記ヘテロシクリルが、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ２０ヘテロシクリル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、及びＣ３−Ｃ１２カルボシクリルから独立して選択される１つ以上の基と任意に置換されるか、
または、Ｒ１及びＲ２が、５もしくは６員縮合ヘテロアリールまたはヘテロシクリルを形成し、任意に、スピロもしくは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環を形成し、前記スピロもしくは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環が、任意に置換されたＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、またはＯＨであり、
ＰＭＬが、Ｒ２と結合している前記プロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカー、またはＲ１及びＲ２によって形成された前記縮合ヘテロアリールもしくはヘテロシクリルであり、
Ａｂが、抗ＷＴＡ抗体である、請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項５】
以下の式を有し、
0006742314.tif 000087
式中、
Ｒ３が、独立して、Ｈ及びＣ１−Ｃ１２アルキルから選択され、
ｎが、１または２であり、
Ｒ４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１-Ｃ１２アルキル、及びＯＨから選択され、
Ｚが、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１-Ｃ１２アルキル）、Ｏ、及びＳから選択される、請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項６】
以下の式を有し、
0006742314.tif 000088
式中、
Ｒ５が、Ｈ及びＣ１−Ｃ１２アルキルから選択され、
ｎは、０または１である、請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項７】
以下の式を有し、
0006742314.tif 000089
式中、
Ｒ５が、Ｈ及びＣ１−Ｃ１２アルキルから選択され、
ｎは、０または１である、請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項８】
以下の式を有し、
0006742314.tif 000090
式中、
Ｒ５が、独立して、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから選択され、
ｎは、０または１である、請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項９】
以下の式を有し、
0006742314.tif 000091
式中、
Ｒ３が、独立して、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから選択され、
ｎが、１または２である、請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項１０】
以下の式を有する、請求項９に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
0006742314.tif 000092
【請求項１１】
Ｓｔｒが、以下の式を有し、
0006742314.tif 000093
式中、Ｒ６が、Ｃ１−Ｃ１２アルキレン、Ｃ１−Ｃ１２アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ１−Ｃ１２アルキレン−ＮＨ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−Ｃ（＝Ｏ）、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２、及びＣ１−Ｃ１２アルキレン−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ（チオフェン−３−イル）からなる群から選択され、式中、ｒが、１〜１０の範囲内の整数である、請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項１２】
Ｒ６が、（ＣＨ２）５である、請求項１１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項１３】
Ｙが、パラ−アミノベンジルまたはパラ−アミノベンジルオキシカルボニルを含む、請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項１４】
以下の式：
ｉ）
0006742314.tif 000094
；
ｉｉ）
0006742314.tif 000095
；
ｉｉｉ）
0006742314.tif 000096
；
ｉｖ）
0006742314.tif 000097
；
ｖ）
0006742314.tif 000098
；
ｖｉ）
0006742314.tif 000099
；
ｖｉｉ）
0006742314.tif 000100
；
ｖｉｉｉ）
0006742314.tif 000101
；
ｉｘ）
0006742314.tif 000102
；
ｘ）
0006742314.tif 000103
；
ｘｉ）
0006742314.tif 000104
；及び
ｘｉｉ）
0006742314.tif 000105
から選択される、請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項１５】
前記抗体が、抗ＷＴＡβモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項１６】
前記抗ＷＴＡ抗体が、軽（Ｌ）鎖及び重（Ｈ）鎖を含み、前記Ｌ鎖が、ＫＳＳＱＳＩＦＲＴＳＲＮＫＮＬＬＮ（配列番号９９）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ１、ＷＡＳＴＲＫＳ（配列番号１００）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ２、及びＱＱＹＦＳＰＰＹＴ（配列番号１０１）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ３を含み、かつ前記Ｈ鎖が、ＳＦＷＭＨ（配列番号１０２）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ１、ＦＴＮＮＥＧＴＴＴＡＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号１０３）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びＧＥＧＧＬＤＤ（配列番号：１１８）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む、請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項１７】
前記抗ＷＴＡ抗体が：
（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、前記ＶＨが、配列番号１５６を有するアミノ酸配列含み；かつ／または
（ｂ）軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＬが、配列番号１１９を有するアミノ酸配列を含む
請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項１８】
前記抗ＷＴＡ抗体が、軽（Ｌ）鎖及び重（Ｈ）鎖を含み、前記Ｌ鎖が、ＲＡＳＱＴＩＳＧＷＬＡ（配列番号：３３）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ１、ＫＡＳＴＬＥＳ（配列番号：３４）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ２、及びＱＱＹＫＳＹＳＦＮ（配列番号：３５）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ３を含み、かつ前記Ｈ鎖が、ＳＹＤＩＮ（配列番号：３６）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ１、ＷＭＮＡＮＳＧＮＴＧＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号：３７）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びＳＳＩＬＶＲＧＡＬＧＲＹＦＤＬ（配列番号：３８）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む、請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項１９】
前記抗ＷＴＡ抗体が：
（ａ）配列番号１１２を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；及び／または
（ｂ）配列番号１１１を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＨ）
を含む、請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項２０】
前記抗ＷＴＡ抗体が、軽（Ｌ）鎖及び重（Ｈ）鎖を含み、
（ａ）前記Ｌ鎖が、ＲＡＳＱＴＩＳＧＷＬＡ（配列番号：３９）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ１、ＫＡＳＴＬＥＳ（配列番号：４０）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ２、及びＱＱＹＫＳＹＳＦＮ（配列番号：４１）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ３を含み；かつ前記Ｈ鎖が、ＳＹＤＩＮ（配列番号：４２）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ１、ＷＭＮＡＮＳＧＮＴＧＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号：４３）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びＳＳＩＬＶＲＧＡＬＧＲＹＦＤＬ（配列番号：４４）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む；
（ｂ）前記Ｌ鎖が、ＲＡＳＱＦＶＳＲＴＳＬＡ（配列番号：４５）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ１、ＥＴＳＳＲＡＴ（配列番号：４６）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ２、及びＨＫＹＧＳＧＰＲＴ（配列番号：４７）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ３を含み；かつ前記Ｈ鎖が、ＮＹＤＦＩ（配列番号：４８）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ１、ＷＭＮＰＮＳＹＮＴＧＹＧＱＫＦＱＧ（配列番号：４９）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びＡＶＲＧＱＬＬＳＥＹ（配列番号：５０）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む；
（ｃ）前記Ｌ鎖が、ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号：５１）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ１、ＤＡＳＳＲＡＴ（配列番号：５２）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ２、及びＱＫＹＧＳＴＰＲＰ（配列番号：５３）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ３を含み；かつ前記Ｈ鎖が、ＳＹＤＩＮ（配列番号：５４）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ１、ＷＭＮＰＮＳＧＮＴＮＹＡＱＲＦＱＧ（配列番号：５５）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びＥＲＷＳＫＤＴＧＨＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号：５６）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む；
（ｄ）前記Ｌ鎖が、ＲＡＳＬＤＩＴＮＨＬＡ（配列番号：５７）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ１、ＥＡＳＩＬＱＳ（配列番号：５８）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ２、及びＥＫＣＮＳＴＰＲＴ（配列番号：５９）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ３を含み；かつ前記Ｈ鎖が、ＮＹＤＩＮ（配列番号：ＮＯ：６０）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ１、ＷＭＮＰＳＳＧＲＴＧＹＡＰＫＦＲＧ（配列番号：６１）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びＧＧＧＹＹＤＳＳＧＮＹＨＩＳＧＬＤＶ（配列番号：ＮＯ：６２）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む；
（ｅ）前記Ｌ鎖が、ＲＡＳＱＳＶＧＡＩＹＬＡ（配列番号：６３）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ１、ＧＶＳＮＲＡＴ（配列番号：６４）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ２、及びＱＬＹＴＳＳＲＡＬＴ（配列番号：６５）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ３を含み；かつ前記Ｈ鎖が、ＡＹＡＭＮ（配列番号：６６）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ１、ＳＩＴＫＮＳＤＳＬＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号：６７）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びＬＡＡＲＩＭＡＴＤＹ（配列番号：６８）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む；
（ｆ）前記Ｌ鎖が、ＲＡＳＱＧＩＲＮＧＬＧ（配列番号：６９）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ１、ＰＡＳＴＬＥＳ（配列番号：７０）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ２、及びＬＱＤＨＮＹＰＰＴ（配列番号：７１）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ３を含み；かつ前記Ｈ鎖が、ＹＹＳＭＩ（配列番号：７２）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ１、ＳＩＤＳＳＳＲＹＬＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号：７３）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びＤＧＤＤＩＬＳＶＹＲＧＳＧＲＰＦＤＹ（配列番号：７４）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む；  
（ｇ）前記Ｌ鎖が、ＲＡＳＱＧＩＲＮＧＬＧ（配列番号：７５）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ１、ＰＡＳＴＬＥＳ（配列番号：７６）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ２、及びＬＱＤＨＮＹＰＰＳ（配列番号：７７）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ３を含み；かつ前記Ｈ鎖が、ＹＹＳＭＩ（配列番号：７８）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ１、ＳＩＤＳＳＳＲＹＲＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号：７９）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びＤＧＤＤＩＬＳＶＹＱＧＳＧＲＰＦＤＹ（配列番号：８０）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む；  
（ｈ）前記Ｌ鎖が、ＲＡＳＱＳＶＲＴＮＶＡ（配列番号：８１）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ１、ＧＡＳＴＲＡＳ（配列番号：８２）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ２、及びＬＱＹＮＴＷＰＲＴ（配列番号：８３）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ３を含み；かつ前記Ｈ鎖が、ＴＮＤＭＳ（配列番号：８４）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ１、ＴＩＩＧＩＤＤＴＴＨＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号：８５）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びＮＳＧＩＹＳＦ（配列番号：８６）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む；
（ｉ）前記Ｌ鎖が、ＲＡＳＱＤＩＧＳＳＬＡ（配列番号：８７）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ１、ＡＴＳＴＬＱＳ（配列番号：８８）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ２、及びＱＱＬＮＮＹＶＨＳ（配列番号：８９）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ３を含み；かつ前記Ｈ鎖が、ＤＹＡＭＧ（配列番号：９０）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ１、ＶＶＴＧＨＳＹＲＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号：９１）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びＲＩＷＳＹＧＤＤＳＦＤＶ（配列番号：９２）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む；
（ｊ）前記Ｌ鎖が、ＲＡＳＱＳＩＧＤＲＬＡ（配列番号：９３）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ１、ＷＡＳＮＬＥＧ（配列番号：９４）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ２、及びＱＱＹＫＳＱＷＳ（配列番号：９５）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ３を含み；かつ前記Ｈ鎖が、ＳＹＡＭＮ（配列番号：９６）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ１、ＹＩＳＳＩＥＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号：９７）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びＤＲＬＶＤＶＰＬＳＳＰＮＳ（配列番号：９８）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む；または
（ｋ）前記Ｌ鎖が、ＲＡＳＱＦＴＮＨＹＬＮ（配列番号：１０５）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ１、ＶＡＳＮＬＱＳ（配列番号：１０６）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ２、及びＱＱＳＹＲＴＰＹＴ（配列番号：１０７）の配列を含むＣＤＲ  Ｌ３を含み；かつ前記Ｈ鎖が、ＳＧＹＹＮ（配列番号：１０８）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ１、ＹＩＬＳＧＡＨＴＤＩＫＡＳＬＧＳ（配列番号：１０９）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びＳＧＶＹＳＫＹＳＬＤＶ（配列番号：１１０）の配列を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む
請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項２１】
前記抗ＷＴＡ抗体が、黄色ブドウ球菌と結合する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項２２】
前記抗体が、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ’）２である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体−抗生物質複合化合物。
【請求項２３】
請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物と、薬学的に許容される担体、流動促進剤、希釈剤、または賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項２４】
治療有効量の請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物を含む、患者における細菌感染症を治療するための医薬。
【請求項２５】
請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物を含む、宿主細胞を死滅させることなく、黄色ブドウ球菌に感染した患者の細胞内黄色ブドウ球菌を死滅させるための医薬。
【請求項２６】
リファマイシン型抗生物質を抗壁テイコ酸（ＷＴＡ）抗体に結合させることを含む、請求項１に記載の抗体−抗生物質複合化合物を作製するためのプロセス。
【請求項２７】
細菌感染症を治療するためのキットであって、
ａ）請求項２３に記載の薬学的組成物と、
ｂ）使用説明書と、を含む、キット。
【請求項２８】
式ＩＩを有する抗生物質−リンカー中間体であって、
0006742314.tif 000106
ＩＩ
式中、
破線が、任意選択の結合を示し、
Ｒが、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、またはＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、
Ｒ１がＯＨであり、
Ｒ２がＣＨ＝Ｎ−（ヘテロシクリル）であり、式中、前記ヘテロシクリルが、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ２０ヘテロシクリル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、及びＣ３−Ｃ１２カルボシクリルから独立して選択される１つ以上の基と任意に置換されるか、
または、Ｒ１及びＲ２が、５もしくは６員縮合ヘテロアリールまたはヘテロシクリルを形成し、任意に、スピロもしくは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環を形成し、前記スピロもしくは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環が、任意に置換されたＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、またはＯＨであり、
ＰＭＬが、Ｒ２、またはＲ１及びＲ２によって形成される前記縮合ヘテロアリールまたはヘテロシクリルと結合し、式、
−Ｓｔｒ−ＰＭ−Ｙ−
を有し、
式中、Ｓｔｒがストレッチャー単位であり、ＰＭがペプチドミメティック単位であり、Ｙがスペーサー単位であり、
Ｘが、マレイミド、チオール、アミノ、臭化物、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、ｐ−トルエンスルホナート、ヨウ化物、ヒドロキシル、カルボキシル、ピリジルジスルフィド、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドから選択される反応性官能基であり、
ＰＭが、式、
0006742314.tif 000107
を有し、式中、Ｒ７及びＲ８が合わせて、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル環を形成し、
ＡＡが、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２から選択されるアミノ酸側鎖である
抗生物質−リンカー中間体。
【請求項２９】
Ｘが、
0006742314.tif 000108
または
0006742314.tif 000109
である、請求項２８に記載の抗生物質−リンカー中間体。
【請求項３０】
以下の式を有し、
0006742314.tif 000110
式中、
Ｒ３が、独立して、Ｈ及びＣ１−Ｃ１２アルキルから選択され、
ｎが、１または２であり、
Ｒ４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、及びＯＨから選択され、
Ｚが、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１−Ｃ１２アルキル）、Ｏ、及びＳから選択される、請求項２８に記載の抗生物質−リンカー中間体。
【請求項３１】
以下の式を有する、請求項２８に記載の抗生物質−リンカー中間体。
0006742314.tif 000111
【請求項３２】
以下の式、
0006742314.tif 000112
、
0006742314.tif 000113
、
0006742314.tif 000114
、
0006742314.tif 000115
、
0006742314.tif 000116
、及び
0006742314.tif 000117
から選択される、請求項２８に記載の抗生物質−リンカー中間体。
【請求項３３】
前記患者が、ブドウ球菌系細菌に感染する、請求項２４に記載の医薬。
【請求項３４】
前記患者が、黄色ブドウ球菌に感染する、請求項３３に記載の医薬。
【請求項３５】
約５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内の用量の前記抗体−抗生物質複合化合物を含む、請求項２４に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１２月３日に出願された米国仮出願第６２／０８７，１８４号の利益を主張し、これは、参照によりその全体が全ての目的のために組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１５年１１月２０日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ３２４３３−ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１９０５４１バイトのサイズである。
【０００３】
本発明は、ブドウ球菌感染症の治療における、リファマイシン型抗生物質に複合された抗壁テイコ酸（「抗ＷＴＡ」）抗体及びその結果として得られる抗体−抗生物質複合体の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．アウレウス、ＳＡ）は、世界的にヒトにおける細菌感染症の主な原因であり、病院及び社会環境の両方において主要な健康問題を提示する。しかしながら、黄色ブドウ球菌は、病原体に限らず、一般に、健常な個体の前鼻孔及び皮膚に定着する。感染症が発生する場合に、心内膜炎、骨髄炎、壊死性肺炎、及び敗血症のような最も重篤な感染症が発生し、その後に、血流への細菌の播種が続く（Ｌｏｗｙ，Ｆ．Ｄ．（１９９８）  “Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３９，５２０−５３２）。過去数十年にわたって、黄色ブドウ球菌の感染症は、全ての既知のベータラクタム抗生物質に対して耐性であるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の出現及び急激な蔓延により、治療するのがますます困難になってきている（Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｈ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）  “Ｂａｄ  ｂｕｇｓ，ｎｏ  ｄｒｕｇｓ：ｎｏ  ＥＳＫＡＰＥ！Ａｎ  ｕｐｄａｔｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ”  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ４８，１−１２）。侵襲性ＭＲＳＡ感染症は、治療するのが困難であり、約２０％の死亡率を有し、米国では感染体による死亡の主な原因である。そのため、バンコマイソン、リネゾリド、及びダプトマイシンは、侵襲性ＭＲＳＡ感染症を治療するために最適な数少ない抗生物質になっている（Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｈ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｇ．＆  Ｒａｚｏｎａｂｌｅ，Ｒ．Ｒ．（２０１０）  “Ｓｅｒｉｏｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ”  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ５１  Ｓｕｐｐｌ  ２，Ｓ１８３−１９７）。しかしながら、バンコマイソンに対する感受性の低減、ならびにリネゾリド及びダプトマイシンに対する交差耐性も、ＭＲＳＡ臨床株において既に報告されている（Ｎａｎｎｉｎｉ，Ｅ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｂ．Ｅ．＆  Ａｒｉａｓ，Ｃ．Ａ．（２０１０）  “Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｒ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ，ａｎｄ  ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ  ｉｎ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ”  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １０，５１６−５２１）。経時的に、耐性を克服するために必要なバンコマイシンの用量は、神経毒性が生じるレベルまで徐々に上昇している。それ故に、侵襲性ＭＲＳＡ感染症による死亡率及び罹患率は、これらの抗生物質にも関わらず、高いままである。
【０００５】
調査は、黄色ブドウ球菌が、細菌排除に関与する食細胞を含む哺乳動物細胞の内部に侵入し、生存することが可能であることを示している（Ｔｈｗａｉｔｅｓ，Ｇ．Ｅ．＆  Ｇａｎｔ，Ｖ．（２０１１）  Ａｒｅ  ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  Ｔｒｏｊａｎ  Ｈｏｒｓｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ？Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９，２１５−２２２）、Ｒｏｇｅｒｓ，Ｄ．Ｅ．，Ｔｏｍｐｓｅｔｔ，Ｒ．（１９５２）  “Ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ｗｉｔｈｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ”  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  ９５，２０９−２３０）、Ｇｒｅｓｈａｍ，Ｈ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）  “Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｎｓｉｄｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４，３７１３−３７２２）、Ｋａｐｒａｌ，Ｆ．Ａ．＆  Ｓｈａｙｅｇａｎｉ，Ｍ．Ｇ．（１９５９）  “Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ”  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １１０，１２３−１３８、Ａｎｗａｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）  “Ｔｈｅ  ｒｉｓｅ  ａｎｄ  ｒｉｓｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：ｌａｕｇｈｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆａｃｅ  ｏｆ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ”  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７，２１６−２２４）、Ｆｒａｕｎｈｏｌｚ，Ｍ．＆  Ｓｉｎｈａ，Ｂ．（２０１２）  “Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：ｌｉｖｅ−ｉｎ  ａｎｄ  ｌｅｔ  ｄｉｅ”  Ｆｒｏｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２，４３）、Ｇａｒｚｏｎｉ，Ｃ．＆  Ｋｅｌｌｅｙ，Ｗ．Ｌ．（２０１１）  “Ｒｅｔｕｒｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｒｏｊａｎ  ｈｏｒｓｅ：ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｖａｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ”  ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ３，１１５−１１７）。黄色ブドウ球菌は、宿主食細胞、主に好中球及びマクロファージによって、静脈内感染から数分以内に取り込まれる（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｄ．Ｅ．（１９５６）  “Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｂａｃｔｅｒｉｍｉａ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  Ｒｅｌａｔｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ  ｉｎ  Ｒａｂｂｉｔｓ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｒａｖａｎｏｕｓ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ”  ＪＥＭ  １０３，７１３）。細菌の大部分は、これらの細胞によって有効に死滅するが、血液感染性食細胞の内部の黄色ブドウ球菌の不完全な排除は、これらの感染した細胞を感染の原発部位から離れた細菌の播種のための「危険性をはらんだもの」としての役割を果たし得る。実際には、正常な好中球数を有する患者は、好中球数が低減した患者よりも播種性疾患によりかかりやすい傾向がある（Ｔｈｗａｉｔｅｓ，Ｇ．Ｅ．＆  Ｇａｎｔ，Ｖ．（２０１１）上記参照）。一旦組織に送達されると、黄色ブドウ球��は、様々な非食細胞型に侵入し得、組織における細胞内黄色ブドウ球菌は、慢性または反復性感染症と関連がある。さらに、準最適な抗生物質濃度における細胞内細菌の曝露は、抗生物質耐性株の出現を促し、よって、この臨床的問題をさらに深刻にする場合がある。これらの観察と一致して、バンコマイソンまたはダプトマイシンによる菌血症または心内膜炎のような侵襲性ＭＲＳＡ感染症に罹患している患者の治療は、５０％を超える失敗率と関連している（Ｋｕｌｌａｒ，Ｒ．，Ｄａｖｉｓ，Ｓ．Ｌ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｄ．Ｐ．＆  Ｒｙｂａｋ，Ｍ．Ｊ．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｎ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ：ｓｕｐｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ５２，９７５−９８１（２０１１）、Ｆｏｗｌｅｒ，Ｖ．Ｇ．，Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５５，６５３−６６５（２００６）、Ｙｏｏｎ，Ｙ．Ｋ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｙ．，Ｐａｒｋ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｏｈｎ，Ｊ．Ｗ．＆  Ｋｉｍ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｂａｃｔｅｒａｅｍｉａ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５：１０１５−１０１８（２０１０））。したがって、より良好な抗ブドウ球菌療法は、細胞内細菌の排除を含むべきである。
【０００６】
アンサマイシンは、リファマイシン、リファンピン、リファンピシン、リファブチン、リファペンチン、リファラジル、ＡＢＩ−１６５７、及びそれらのアナログを含む抗生物質のクラスであり、これは、細菌ＲＮＡポリメラーゼを阻害し、グラム陽性及び選択的グラム陰性細菌に対して並外れた効力を有する（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（２００３）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  １２（２）：２５５−２７１、ＵＳ７３４２０１１、ＵＳ７２７１１６５）。
【０００７】
黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡを含む）感染症を予防及び治療するための免疫療法が報告されている。ＵＳ２０１１／０２６２４７７は、ＭＲＳＡに対する免疫応答を刺激するためのワクチンとして細菌接着タンパク質Ｅａｐ、Ｅｍｐ、及びＡｄｓＡを使用することに関する。ＷＯ２０００／０７１５８５は、特定の黄色ブドウ球菌単離株に対して反応性である単離モノクローナル抗体について記載している。ＵＳ２０１１／００５９０８５Ａ１は、１つ以上のＳＡ莢膜抗原に特異的なＩｇＭ  Ａｂを用いるＡｂベースの戦略を示唆しているが、実際の抗体は記載されなかった。
【０００８】
免疫複合体としても知られている抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、強力な細胞毒性薬の標的を抗原発現腫瘍細胞に定め（Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｂ．Ａ．（２００９）  Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ９：９８２−１００４）、それによって、有効性を最大化してオフターゲット毒性を最小化することにより治療指数を増強することで、抗体と細胞毒性薬の両方の理想的な特性を組み合わせている、標的が定められた化学療法分子である（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｅｎｔｅｒ  Ｐ．Ｄ．（２００８）  Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．．１４（３）：１５４−１６９、Ｃｈａｒｉ，Ｒ．Ｖ．（２００８）  Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：９８−１０７。ＡＤＣは、リンカー単位を通して細胞毒性薬物部分に共有結合される標的抗体を含む。免疫複合体は、腫瘍への薬物部分の標的化された送達を可能にし、複合されていない薬物の全身投与が、正常な細胞、及び排除されることが求められる腫瘍細胞にとって許容できないレベルの毒性をもたらし得る場合に、腫瘍中の細胞内蓄積を可能にする（Ｐｏｌａｋｉｓ  Ｐ．（２００５）  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３８２−３８７）。
【０００９】
非特異的な免疫グロブリン−抗生物質複合体は、敗血症を治療するために、抗生物質を介して標的細菌の表面に結合することが記載されている（ＵＳ５，５４５，７２１、ＵＳ６，６６０，２６７）。抗生物質複合抗体は、細菌性抗原（ＳＡ莢膜多糖類等）に特異的な抗原結合部分を有することが記載されているが、細菌性Ｆｃ結合タンパク質、例えば、ブドウ球菌タンパク質Ａと反応する定常領域を欠いている（ＵＳ７５６９６７７）。
【００１０】
従来の抗生物質に対するＭＲＳＡの驚くべき耐性率ならびに侵襲性ＭＲＳＡ感染症による結果として生じる死亡率及び罹患率を考慮して、黄色ブドウ球菌感染症を治療するために新しい治療薬の高い満たされていない要求がある。本発明は、この必要性を満たし、現在の治療組成物の限界を克服し、以下の詳細から明らかであろうさらなる利点を提供する組成物及び方法を提供する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、細胞内細菌の排除を含む特有の治療薬を提供する。本発明は、そのような治療薬がバンコマイソン等の従来の抗生物質が効かないインビボで有効であることを実証する。
【００１２】
本発明は、１つ以上のリファマイシン型抗生物質部分への共有結合によって複合された抗体を含む「抗体−抗生物質複合体」または「ＡＡＣ」）と称される組成物を提供する。
【００１３】
本発明の一態様は、プロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカーによって、リファマイシン型抗生物質に共有結合される、抗壁テイコ酸（ＷＴＡ）抗体を含む抗体−抗生物質複合化合物である。
【００１４】
本発明の例示的な実施形態は、式、
Ａｂ−（ＰＭＬ−ａｂｘ）ｐ、
を有する請求項１に記載の抗体−抗生物質複合体であって、
式中、
Ａｂが、抗壁テイコ酸抗体であり、
ＰＭＬが、式、
−Ｓｔｒ−ＰＭ−Ｙ−
を有する、プロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカーであって、
式中、Ｓｔｒがストレッチャー単位であり、ＰＭがペプチドミメティック単位であり、Ｙがスペーサー単位であり、
ａｂｘが、リファマイシン型抗生物質であり、
ｐが、１〜８の整数である。
【００１５】
前述の実施形態のいずれかの抗体−抗生物質複合化合物は、本明細書に記載される抗壁テイコ酸（ＷＴＡ）Ａｂのうちのいずれか１つを含むことができる。これらの抗ＷＴＡ抗体は、黄色ブドウ球菌に結合する。一実施形態では、抗体は、抗ＷＴＡαモノクローナル抗体である。例示的な抗ＷＴＡα抗体において、このＡｂは、軽（Ｌ）鎖及び重（Ｈ）鎖を含む単離モノクローナル抗体であり、Ｌ鎖は、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、及びＣＤＲ  Ｌ３を含み、Ｈ鎖は、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、及びＣＤＲ  Ｈ３を含み、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、及びＣＤＲ  Ｌ３、ならびにＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、及びＣＤＲ  Ｈ３は、表１Ａ及び１Ｂ中に示されるように、それぞれ、Ａｂｓ  ４４６１（配列番号１〜６）、４６２４（配列番号７〜１２）、４３９９（配列番号１３〜１８）、及び６２６７（配列番号１９−２４）各々のＣＤＲのアミノ酸配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、抗ＷＴＡ抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＶＨは、それぞれ、抗体４４６１、４６２４、４３９９、及び６２６７の配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２のＶＨ配列から選択されるＶＨ領域の長さにわたって少なくとも９５％の配列同一性を含む。抗体は、Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含んでもよく、ＶＬは、それぞれ、抗体４４６１、４６２４、４３９９、及び６２６７の配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１のＶＬ配列から選択されるＶＬ領域の長さにわたって少なくとも９５％の配列同一性を含む。
【００１７】
別の実施形態では、本発明の抗体−抗生物質複合化合物は、抗ＷＴＡβモノクローナル抗体を含む。例示的な抗ＷＴＡβ抗体は、軽鎖及びＨ鎖を含み、Ｌ鎖は、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、及びＣＤＲ  Ｌ３を含み、Ｈ鎖は、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、及びＣＤＲ  Ｈ３を含み、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、及びＣＤＲ  Ｌ３、ならびにＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、及びＣＤＲ  Ｈ３は、図１２中に示されるＡｂｓ（配列番号３３〜１１０）の各々の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を含む。
【００１８】
本発明のＡＡＣを作製するのに有用な別の抗ＷＴＡβ抗体は、Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＬは、図１５Ａ−１、１５Ａ−２、１５Ａ−３中に示されるように、Ｋａｂａｔ位置１〜１０７で、それぞれ、抗体６０７８、６２６３、４４５０、６２９７、６２３９、６２３２、６２５９、６２９２、４４６２、６２６５、６２５３、４４９７、及び４４８７の各々に対応するＶＬ配列から選択されるＶＬ領域の長さにわたって少なくとも９５％の配列同一性を含む。この抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含み、ＶＨは、図１５Ｂ−１〜１５Ｂ−６中に示されるように、Ｋａｂａｔ位置１〜１１３で、それぞれ、抗体６０７８、６２６３、４４５０、６２９７、６２３９、６２３２、６２５９、６２９２、４４６２、６２６５、６２５３、４４９７、及び４４８７の各々に対応するＶＨ配列から選択されるＶＨ領域の長さにわたって少なくとも９５％の配列同一性を含む。
【００１９】
別の抗ＷＴＡβ抗体では、ＶＬは、配列番号１１１の配列を含み、ＶＨは、配列番号１１２の配列を含み、式中、Ｘは、ＱまたはＥであり、Ｘ１は、Ｍ、Ｉ、またはＶである。
【００２０】
本発明は、本発明のＡＡＣを作製するのに有用な抗ＷＴＡβを提供し、抗体軽鎖は、操作システインを含み、配列番号１１５の配列を含み、Ｈ鎖は、配列番号１１６を含み、式中、Ｘは、Ｍ、Ｉ、またはＶである。Ｌ及びＨ鎖が対合する代替例では、抗体軽鎖は、配列番号１１３の配列を含み、Ｈ鎖は、操作システインを含み、配列番号１１７を含み、式中、Ｘは、Ｍ、Ｉ、またはＶである。Ｃｙｓは、Ｌ及びＨ鎖の各々に操作され得、かかるＷＴＡβ抗体の一例では、軽鎖は、操作システインを含み、配列番号１１５の配列を含み、Ｈ鎖は、操作システインを含み、配列番号１１７の配列を含み、式中、Ｘは、Ｍ、Ｉ、またはＶである。
【００２１】
複合に有用な別の抗ＷＴＡβ抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは、配列番号１５６のＶＨの長さにわたって少なくとも９５％の配列同一性を含み、ＶＬは、配列配列番号１１９のＶＬの長さにわたって少なくとも９５％の配列同一性を含む。具体的な実施形態では、抗ＷＴＡβ抗体は、配列番号１５６の配列を含むＶＨと、配列番号１１９の配列を含むＶＬとを含む。
【００２２】
本発明の抗ＷＴＡβ抗体は、配列番号１２１の配列を含むＬ鎖と、配列番号１２４の配列を含むＨ鎖とを含む。別例では、抗ＷＴＡβ抗体は、配列番号１２３の配列を含むＬ鎖と、配列番号１５７または配列番号１２４の配列を含むＨ鎖とを含む。
【００２３】
他の実施形態では、抗体は、ｉ）配列番号９９〜１０４のＬ鎖及びＨ鎖のＣＤＲ、もしくは配列番号３３〜３８のＬ鎖及びＨ鎖のＣＤＲ、またはｉｉ）配列番号１２０もしくは配列番号１５６のＶＨと対となる配列番号１１９もしくは配列番号１２３の前記ＶＬ、またはｉｉｉ）配列番号１１２のＶＨと対となる配列番号１１１のＶＬ、を含む。
【００２４】
本発明のＡＡＣのいくつかの実施形態では、抗体は、前述の実施形態のうちのいずれか１つの抗体と同じエピトープに結合する。
【００２５】
前述の実施形態のうちのいずれか１つの抗体は、Ｆｃ領域を欠く抗原結合断片であってもよい。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ’）２である。いくつかの実施形態では、抗体は、重鎖定常領域及び／または軽鎖定常領域をさらに含み、重鎖定常領域及び／または軽鎖定常領域は、システイン残基で置換される１つ以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、アミノ酸置換Ａ１１８Ｃ及び／もしくはＳ４００Ｃを含み、かつ／または、軽鎖定常領域は、アミノ酸置換Ｖ２０５Ｃを含み、この付番方式は、ＥＵ付番方式によるものである。
【００２６】
上述の抗体のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＭのアイソタイプではない。上述の抗体のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）のアイソタイプである。
【００２７】
本発明の例示的な実施形態は、抗体−抗生物質複合化合物と、薬学的に許容される担体、流動促進剤、希釈剤、または賦形剤とを含む、薬学的組成物である。
【００２８】
本発明の抗ＷＴＡ−ＡＡＣは、ヒト及び獣医学的ブドウ球菌、例えば黄色ブドウ球菌、Ｓ．サプロフィチカス、及びＳ．シミュランス、ならびにリステリア、例えばリステリア・モノサイトゲネスを治療するために有効な抗菌剤として有用である。特定の態様では、本発明のＡＡＣは、黄色ブドウ球菌感染症を治療するために有用である。それ故に、本発明はまた、ヒトまたは獣医学的患者におけるブドウ球菌感染症の治療方法も提供し、本方法は、患者に、治療有効量の前述の実施形態のうちのいずれか１つの抗体−抗生物質複合体を投与することを含む。一実施形態では、細菌感染症は、黄色ブドウ球菌感染症である。いくつかの実施形態では、患者は、黄色ブドウ球菌感染症であると診断されている。いくつかの実施形態では、細菌感染症の治療は、細菌負荷または細菌数を低減することを含む。一実施形態では、治療方法は、黄色ブドウ球菌を含む細菌感染症が菌血症を引き起こす場合に、患者に施される。具体的な実施形態では、本方法は、ブドウ球菌性心内膜炎または骨髄炎を治療するために使用される。一実施形態では、抗体−抗生物質複合化合物は、感染患者に、約５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内の用量で投与される。
【００２９】
上記の実施形態のうちのいずれかの抗ＷＴＡ−抗生物質複合化合物を投与することによって、宿主細胞を死滅させることなく、黄色ブドウ球菌に感染した患者のその細胞中の細胞内黄色ブドウ球菌を死滅させる方法もまた、提供される。別の方法は、生残菌を前述の実施形態のうちのいずれかのＡＡＣと接触させることによって、インビボで生残菌ブドウ球菌細菌細胞（例えば黄色ブドウ球菌）を死滅させるために提供される。
【００３０】
別の実施形態では、治療方法は、第２の治療剤を投与することをさらに含む。さらなる実施形態では、第２の治療剤は、一般に、黄色ブドウ球菌または具体的には、ＭＲＳＡに対する抗生物質を含む抗生物質である。
【００３１】
一実施形態では、本発明の抗体−抗生物質複合化合物と組み合わせて投与される第２の抗生物質は、構造的クラス：（ｉ）アミノグリコシド、（ｉｉ）  ベータ−ラクタム、（ｉｉｉ）マクロライド／環状ペプチド、（ｉｖ）テトラサイクリン、（ｖ）フルオロキノリン／フルオロキノロン、（ｖｉ）及びオキサゾリジノンから選択される。
【００３２】
一実施形態では、本発明の抗体−抗生物質複合化合物と組み合わせて投与される第２の抗生物質は、クリンダマイシン、ノボビオシン、レタパムリン、ダプトマイシン、ＧＳＫ−２１４０９４４、ＣＧ−４００５４９、シタフロキサシン、テイコプラニン、トリクロサン、ナフチリドン（ｎａｐｔｈｙｒｉｄｏｎｅ）、ラデゾリド、ドキソルビシン、アンピシリン、バンコマイシン、イミペネム、ドリペネム、ゲムシタビン、ダルババンシン、及びアジスロマイシンから選択される。
【００３３】
本明細書においていくつかの実施形態では、感染患者における細菌負荷は、治療後に検出不能なレベルまで低減される。一実施形態では、患者の血液培養は、治療前の陽性血液培養物と比較して、治療後に陰性である。本明細書においていくつかの実施形態では、対象における細菌耐性は、検出不能または低い。本明細書においていくつかの実施形態では、対象は、メチシリンまたはバンコマイソンでの治療に対して応答しない。
【００３４】
本発明の例示的な実施形態は、リファマイシン型抗生物質を抗壁テイコ酸（ＷＴＡ）抗体に複合させることを含む、抗体−抗生物質複合体を作製するためのプロセスである。
【００３５】
本発明の例示的な実施形態は、細菌感染症を治療するためのキットであり、
ａ）抗体−抗生物質複合化合物と、薬学的に許容される担体、流動促進剤、希釈剤、または賦形剤とを含む、薬学的組成物と、
ｂ）使用説明書と、を含む。
【００３６】
本発明の態様は、式ＩＩ、
0006742314.tif 000002
ＩＩ
を有する抗生物質−リンカー中間体であって、
式中、
破線が、任意選択の結合を示し、
Ｒが、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、またはＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、
Ｒ１がＯＨであり、
Ｒ２がＣＨ＝Ｎ−（ヘテロシクリル）であり、式中、ヘテロシクリルが、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ２０ヘテロシクリル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、及びＣ３−Ｃ１２カルボシクリルから独立して選択される１つ以上の基と任意に置換されるか、
または、Ｒ１及びＲ２が、５または６員縮合ヘテロアリールまたはヘテロシクリルを形成し、任意に、スピロまたは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環を形成し、スピロまたは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環が、任意に置換されたＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、またはＯＨであり、
ＰＭＬが、Ｒ２、またはＲ１及びＲ２によって形成される縮合ヘテロアリールもしくはヘテロシクリルと結合し、式、
−Ｓｔｒ−ＰＭ−Ｙ−
を有し、  式中、Ｓｔｒがストレッチャー単位であり、ＰＭがペプチドミメティック単位であり、Ｙがスペーサー単位である、プロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカーであり、
Ｘが、マレイミド、チオール、アミノ、臭化物、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、ｐ−トルエンスルホナート、ヨウ化物、ヒドロキシル、カルボキシル、ピリジルジスルフィド、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドから選択される反応性官能基である。
【００３７】
本明細書に記載される様々な実施形態の特性のうちの１つ、一部、または全てを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成してもよいことを理解されたい。本発明のこれら及び他の態様は、当業者には明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】ＭＲＳＡの細胞内貯蔵は、インビボ及びインビトロでバンコマイソンから保護される。図１Ａは、遊離細菌（浮遊性）対細胞内細菌を生成するための実験的設計の概略図を示す。４つのコホートのマウスを、生存可能な遊離細菌または細胞内細菌のほぼ当量の用量で静脈注射により感染させ、選択された群を、感染直後、次いで、１日１回、バンコマイソンで治療した（実施例２を参照されたい）。図１Ｂ及び図１Ｃは、それぞれ、感染から４日後に、感染マウスの腎臓及び脳における細菌負荷を示す。破線は、アッセイのための検出の限界を示す。図１Ｄは、ＭＲＳＡが感染可能な細胞の単分子層上に培養された場合に、バンコマイソンから保護される。（ＮＤ＝検出されず）。図１Ｅ及び図１Ｆは、ＭＲＳＡが感染可能な細胞の単分子層上に培養された場合に、バンコマイソンの存在下で増殖することができることを示す。ＭＲＳＡ（遊離細菌）を、培地、培地＋バンコマイソン、または培地＋バンコマイソン中に作付けし、ＭＧ６３骨芽細胞（図１Ｅ）またはヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ、図１Ｆ）の単分子層上に播種した。細胞外細菌（遊離細菌）は、培地中に単独でよく増殖したが、バンコマイソンによって死滅した。哺乳動物細胞の単分子層を含むウェル（細胞内＋バンコ）において、細菌の画分を感染後の初めの８時間、バンコマイソンから保護し、２４時間にわたって細胞内区画内に拡張することができた。エラーバーは、３重のウェルに対する標準偏差を示す。
【図１Ｂ】ＭＲＳＡの細胞内貯蔵は、インビボ及びインビトロでバンコマイソンから保護される。図１Ａは、遊離細菌（浮遊性）対細胞内細菌を生成するための実験的設計の概略図を示す。４つのコホートのマウスを、生存可能な遊離細菌または細胞内細菌のほぼ当量の用量で静脈注射により感染させ、選択された群を、感染直後、次いで、１日１回、バンコマイソンで治療した（実施例２を参照されたい）。図１Ｂ及び図１Ｃは、それぞれ、感染から４日後に、感染マウスの腎臓及び脳における細菌負荷を示す。破線は、アッセイのための検出の限界を示す。図１Ｄは、ＭＲＳＡが感染可能な細胞の単分子層上に培養された場合に、バンコマイソンから保護される。（ＮＤ＝検出されず）。図１Ｅ及び図１Ｆは、ＭＲＳＡが感染可能な細胞の単分子層上に培養された場合に、バンコマイソンの存在下で増殖することができることを示す。ＭＲＳＡ（遊離細菌）を、培地、培地＋バンコマイソン、または培地＋バンコマイソン中に作付けし、ＭＧ６３骨芽細胞（図１Ｅ）またはヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ、図１Ｆ）の単分子層上に播種した。細胞外細菌（遊離細菌）は、培地中に単独でよく増殖したが、バンコマイソンによって死滅した。哺乳動物細胞の単分子層を含むウェル（細胞内＋バンコ）において、細菌の画分を感染後の初めの８時間、バンコマイソンから保護し、２４時間にわたって細胞内区画内に拡張することができた。エラーバーは、３重のウェルに対する標準偏差を示す。
【図１Ｃ】ＭＲＳＡの細胞内貯蔵は、インビボ及びインビトロでバンコマイソンから保護される。図１Ａは、遊離細菌（浮遊性）対細胞内細菌を生成するための実験的設計の概略図を示す。４つのコホートのマウスを、生存可能な遊離細菌または細胞内細菌のほぼ当量の用量で静脈注射により感染させ、選択された群を、感染直後、次いで、１日１回、バンコマイソンで治療した（実施例２を参照されたい）。図１Ｂ及び図１Ｃは、それぞれ、感染から４日後に、感染マウスの腎臓及び脳における細菌負荷を示す。破線は、アッセイのための検出の限界を示す。図１Ｄは、ＭＲＳＡが感染可能な細胞の単分子層上に培養された場合に、バンコマイソンから保護される。（ＮＤ＝検出されず）。図１Ｅ及び図１Ｆは、ＭＲＳＡが感染可能な細胞の単分子層上に培養された場合に、バンコマイソンの存在下で増殖することができることを示す。ＭＲＳＡ（遊離細菌）を、培地、培地＋バンコマイソン、または培地＋バンコマイソン中に作付けし、ＭＧ６３骨芽細胞（図１Ｅ）またはヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ、図１Ｆ）の単分子層上に播種した。細胞外細菌（遊離細菌）は、培地中に単独でよく増殖したが、バンコマイソンによって死滅した。哺乳動物細胞の単分子層を含むウェル（細胞内＋バンコ）において、細菌の画分を感染後の初めの８時間、バンコマイソンから保護し、２４時間にわたって細胞内区画内に拡張することができた。エラーバーは、３重のウェルに対する標準偏差を示す。
【図１Ｄ】ＭＲＳＡの細胞内貯蔵は、インビボ及びインビトロでバンコマイソンから保護される。図１Ａは、遊離細菌（浮遊性）対細胞内細菌を生成するための実験的設計の概略図を示す。４つのコホートのマウスを、生存可能な遊離細菌または細胞内細菌のほぼ当量の用量で静脈注射により感染させ、選択された群を、感染直後、次いで、１日１回、バンコマイソンで治療した（実施例２を参照されたい）。図１Ｂ及び図１Ｃは、それぞれ、感染から４日後に、感染マウスの腎臓及び脳における細菌負荷を示す。破線は、アッセイのための検出の限界を示す。図１Ｄは、ＭＲＳＡが感染可能な細胞の単分子層上に培養された場合に、バンコマイソンから保護される。（ＮＤ＝検出されず）。図１Ｅ及び図１Ｆは、ＭＲＳＡが感染可能な細胞の単分子層上に培養された場合に、バンコマイソンの存在下で増殖することができることを示す。ＭＲＳＡ（遊離細菌）を、培地、培地＋バンコマイソン、または培地＋バンコマイソン中に作付けし、ＭＧ６３骨芽細胞（図１Ｅ）またはヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ、図１Ｆ）の単分子層上に播種した。細胞外細菌（遊離細菌）は、培地中に単独でよく増殖したが、バンコマイソンによって死滅した。哺乳動物細胞の単分子層を含むウェル（細胞内＋バンコ）において、細菌の画分を感染後の初めの８時間、バンコマイソンから保護し、２４時間にわたって細胞内区画内に拡張することができた。エラーバーは、３重のウェルに対する標準偏差を示す。
【図１Ｅ】ＭＲＳＡの細胞内貯蔵は、インビボ及びインビトロでバンコマイソンから保護される。図１Ａは、遊離細菌（浮遊性）対細胞内細菌を生成するための実験的設計の概略図を示す。４つのコホートのマウスを、生存可能な遊離細菌または細胞内細菌のほぼ当量の用量で静脈注射により感染させ、選択された群を、感染直後、次いで、１日１回、バンコマイソンで治療した（実施例２を参照されたい）。図１Ｂ及び図１Ｃは、それぞれ、感染から４日後に、感染マウスの腎臓及び脳における細菌負荷を示す。破線は、アッセイのための検出の限界を示す。図１Ｄは、ＭＲＳＡが感染可能な細胞の単分子層上に培養された場合に、バンコマイソンから保護される。（ＮＤ＝検出されず）。図１Ｅ及び図１Ｆは、ＭＲＳＡが感染可能な細胞の単分子層上に培養された場合に、バンコマイソンの存在下で増殖することができることを示す。ＭＲＳＡ（遊離細菌）を、培地、培地＋バンコマイソン、または培地＋バンコマイソン中に作付けし、ＭＧ６３骨芽細胞（図１Ｅ）またはヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ、図１Ｆ）の単分子層上に播種した。細胞外細菌（遊離細菌）は、培地中に単独でよく増殖したが、バンコマイソンによって死滅した。哺乳動物細胞の単分子層を含むウェル（細胞内＋バンコ）において、細菌の画分を感染後の初めの８時間、バンコマイソンから保護し、２４時間にわたって細胞内区画内に拡張することができた。エラーバーは、３重のウェルに対する標準偏差を示す。
【図１Ｆ】ＭＲＳＡの細胞内貯蔵は、インビボ及びインビトロでバンコマイソンから保護される。図１Ａは、遊離細菌（浮遊性）対細胞内細菌を生成するための実験的設計の概略図を示す。４つのコホートのマウスを、生存可能な遊離細菌または細胞内細菌のほぼ当量の用量で静脈注射により感染させ、選択された群を、感染直後、次いで、１日１回、バンコマイソンで治療した（実施例２を参照されたい）。図１Ｂ及び図１Ｃは、それぞれ、感染から４日後に、感染マウスの腎臓及び脳における細菌負荷を示す。破線は、アッセイのための検出の限界を示す。図１Ｄは、ＭＲＳＡが感染可能な細胞の単分子層上に培養された場合に、バンコマイソンから保護される。（ＮＤ＝検出されず）。図１Ｅ及び図１Ｆは、ＭＲＳＡが感染可能な細胞の単分子層上に培養された場合に、バンコマイソンの存在下で増殖することができることを示す。ＭＲＳＡ（遊離細菌）を、培地、培地＋バンコマイソン、または培地＋バンコマイソン中に作付けし、ＭＧ６３骨芽細胞（図１Ｅ）またはヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ、図１Ｆ）の単分子層上に播種した。細胞外細菌（遊離細菌）は、培地中に単独でよく増殖したが、バンコマイソンによって死滅した。哺乳動物細胞の単分子層を含むウェル（細胞内＋バンコ）において、細菌の画分を感染後の初めの８時間、バンコマイソンから保護し、２４時間にわたって細胞内区画内に拡張することができた。エラーバーは、３重のウェルに対する標準偏差を示す。
【図２】抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）の概念を示す。一例では、ＡＡＣは、リソソームプロテアーゼによって切断されるリンカーを介して強力なリファマイシン型抗生物質（例えばリファログ）と結合する黄色ブドウ球菌の表面上のエピトープを対象とする抗体からなる。
【図３】抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）についての薬物活性化の可能性のある機序を示す。ＡＡＣは、抗体の抗原結合ドメイン（Ｆａｂ）を介して細胞外細菌と結合し、Ｆｃ媒介性ファゴサイトーシスを介してオプソニン化細菌の取り込みを促進する。リンカーは、カテプシンＢ等のリソソームプロテアーゼによって切断される。リンカーの切断後、リンカーは、加水分解し、ファゴリソソーム内で遊離抗生物質を放出する。遊離抗生物質は、同じ区画中に存在するあらゆる予め内在化した細菌と共にオプソニン化され、取り込まれた細菌を死滅させる。
【図４】細胞膜を安定化し、結合部位を提供する、壁テイコ酸（ＷＴＡ）、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、及びペプチドグリカン（ＰＧＮ）の鞘の戯画図を用いて、黄色ブドウ球菌のようなグラム陽性細菌の細胞壁を示す。
【図５】定義の下で詳細に記載される、壁テイコ酸（ＷＴＡ）の化学構造及びグリコシル修飾を示す。
【図６Ａ】図６Ａ及び６Ｂは、実施例３に記載されるように、ＵＳＡ３００またはＷｏｏｄ４６株の黄色ブドウ球菌からの細胞壁調製物との陽性ＥＬＩＳＡ結合を示すｍＡｂのライブラリーの一次スクリーニングからのＡｂの特徴を要約する。ＷＴＡと結合するＡｂのうち、４個は、ＷＴＡアルファに特異的であり、１３個は、ＷＴＡベータに特異的に結合する。
【図６Ｂ】図６Ａ及び６Ｂは、実施例３に記載されるように、ＵＳＡ３００またはＷｏｏｄ４６株の黄色ブドウ球菌からの細胞壁調製物との陽性ＥＬＩＳＡ結合を示すｍＡｂのライブラリーの一次スクリーニングからのＡｂの特徴を要約する。ＷＴＡと結合するＡｂのうち、４個は、ＷＴＡアルファに特異的であり、１３個は、ＷＴＡベータに特異的に結合する。
【図７Ａ】感染したマウス腎臓から直接単離されたＭＲＳＡにおけるＡｌｅｘａ−４８８で標識された抗β−ＧｌｃＮＡＣ  ＷＴＡまたは抗−α−ＧｌｃＮＡＣ  ＷＴＡ抗体の滴定を示す。抗−ＣＭＶ−ｇＤ抗体は、抗体アイソタイプ対照としての役割を果たした。
【図７Ｂ】ＡＡＣを生成するために使用された抗体がグリコシルトランスフェラーゼＴａｒＳによって媒介される壁テイコ酸におけるエピトープを認識することを示す。Ｗｔ  ＵＳＡ３００、ＵＳＡ３００−ＴａｒＭ、またはＵＳＡ３００−ＴａｒＳにおける抗−β−ＧｌｃＮＡＣ  ＷＴＡ抗体またはアイソタイプ対照を用いたＦＡＣＳ分析。
【図８】複製しないＭＲＳＡを死滅させるその能力に対する強力なリファマイシン型抗生物質（リファログ）ジメチルピプＢＯＲの選択を示す。
【図９】無傷ＴＡＣ（ＡＡＣの形態）が、抗生物質をカテプシンＢによる処理により放出しない限り、浮遊性細菌を死滅させないことを実証する増殖阻害アッセイ。ＴＡＣを、緩衝液のみ（白抜き丸）でインキュベートするか、またはカテプシンＢ（黒丸）で処理した。無傷ＴＡＣは、一晩インキュベーション後に細菌増殖を保護することができなかった。カテプシンＢによるＴＡＣの前処理は、十分な抗生物質活性を放出し、０．６μｇ／ｍＬのＴＡＣで細菌成長を阻止し、これは、０．００６μｇ／ｍＬの抗生物質を含有することが予測される。
【図１０Ａ】実施例１０に記載される、裸抗体と比較して、感染した器官内の細菌数が大幅に低減または根絶した抗ＷＴＡ−ＰＭＬ  ＡＡＣによる黄色ブドウ球菌に感染したマウスの処置を示す。図１０Ａは、実施例１０に記載される、実験及び注射時点のタイムラインを示す概略図である。図１０Ｂは、表３からのＡＡＣ（ＤＡＲ２）による処置が腎臓において細菌負荷を約７，０００倍低減したことを示す。図１０Ｃは、ＡＡＣ（ＤＡＲ２）による処理が心臓において細菌負荷を約５００倍低減したことを示す。
【図１０Ｂ−Ｃ】実施例１０に記載される、裸抗体と比較して、感染した器官内の細菌数が大幅に低減または根絶した抗ＷＴＡ−ＰＭＬ  ＡＡＣによる黄色ブドウ球菌に感染したマウスの処置を示す。図１０Ａは、実施例１０に記載される、実験及び注射時点のタイムラインを示す概略図である。図１０Ｂは、表３からのＡＡＣ（ＤＡＲ２）による処置が腎臓において細菌負荷を約７，０００倍低減したことを示す。図１０Ｃは、ＡＡＣ（ＤＡＲ２）による処理が心臓において細菌負荷を約５００倍低減したことを示す。
【図１１Ａ】４つのヒト抗ＷＴＡアルファ抗体、４４６１、４６２４、４３９９、６２６７（記載する順にそれぞれ配列番号２５、２７、２９、及び３１）の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列アラインメントを提供する。Ｋａｂａｔ番号付けに従うＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１、Ｌ２、及びＬ３に下線を付す。
【図１１Ｂ】図１１Ａの４つのヒト抗ＷＴＡアルファ抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列アラインメントを示す。Ｋａｂａｔ番号付けに従うＣＤＲ配列ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３に下線を付す（記載する順にそれぞれ配列番号２６、２８、３０、及び３２）。
【図１２】１３個のヒト抗ＷＴＡベータ抗体のＬ及びＨ鎖のＣＤＲ配列（配列番号３３〜１１０）を示す。
【図１３Ａ−１】図１３Ａ−１及び１３Ａ−２は、抗ＷＴＡベータＡｂ  ６０７８（非修飾）及びその変異体ｖ２、ｖ３、ｖ４（記載する順にそれぞれ配列番号１１３、１１３、１１５、１１３、１１５、１１３、１１５、及び１１５）の完全長Ｌ鎖（軽鎖）のアラインメントを示す。Ｋａｂａｔ番号付けに従うＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１、Ｌ２、及びＬ３に下線を付す。箱は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａに従う接触残基及びＣＤＲ残基を示す。操作されたＣｙｓを含むＬ鎖変異体は、定常領域の端付近の黒い箱の中のＣ（この場合、ＥＵ残基第２０５番）で示される。変異体の命名、例えばｖ２ＬＣ−Ｃｙｓは、Ｌ鎖中に操作されたＣｙｓを含む変異体２を意味する。ＨＣＬＣ−Ｃｙｓは、Ｈ及びＬ鎖のそれぞれが操作されたＣｙｓを含むことを意味する。変異体２、３、及び４は、図１３Ｂに示される、Ｈ鎖の初めの変更を有する。
【図１３Ａ−２】図１３Ａ−１及び１３Ａ−２は、抗ＷＴＡベータＡｂ  ６０７８（非修飾）及びその変異体ｖ２、ｖ３、ｖ４（記載する順にそれぞれ配列番号１１３、１１３、１１５、１１３、１１５、１１３、１１５、及び１１５）の完全長Ｌ鎖（軽鎖）のアラインメントを示す。Ｋａｂａｔ番号付けに従うＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１、Ｌ２、及びＬ３に下線を付す。箱は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａに従う接触残基及びＣＤＲ残基を示す。操作されたＣｙｓを含むＬ鎖変異体は、定常領域の端付近の黒い箱の中のＣ（この場合、ＥＵ残基第２０５番）で示される。変異体の命名、例えばｖ２ＬＣ−Ｃｙｓは、Ｌ鎖中に操作されたＣｙｓを含む変異体２を意味する。ＨＣＬＣ−Ｃｙｓは、Ｈ及びＬ鎖のそれぞれが操作されたＣｙｓを含むことを意味する。変異体２、３、及び４は、図１３Ｂに示される、Ｈ鎖の初めの変更を有する。
【図１３Ｂ−１】図１３Ｂ−１、１３Ｂ−２、１３Ｂ−３、１３Ｂ−４は、Ｈ鎖の初めの変更を有する抗ＷＴＡベータＡｂ  ６０７８（非修飾）及びその変異体ｖ２、ｖ３、ｖ４（記載する順にそれぞれ配列番号１１４、１３９〜１４４、及び１４３）の完全長Ｈ鎖（重鎖）のアラインメントを示す。操作されたＣｙｓを含むＨ鎖変異体は、定常領域の開始の黒い箱の中のＣ（この場合、ＥＵ残基第１１８番）で示される。
【図１３Ｂ−２】図１３Ｂ−１、１３Ｂ−２、１３Ｂ−３、１３Ｂ−４は、Ｈ鎖の初めの変更を有する抗ＷＴＡベータＡｂ  ６０７８（非修飾）及びその変異体ｖ２、ｖ３、ｖ４（記載する順にそれぞれ配列番号１１４、１３９〜１４４、及び１４３）の完全長Ｈ鎖（重鎖）のアラインメントを示す。操作されたＣｙｓを含むＨ鎖変異体は、定常領域の開始の黒い箱の中のＣ（この場合、ＥＵ残基第１１８番）で示される。
【図１３Ｂ−３】図１３Ｂ−１、１３Ｂ−２、１３Ｂ−３、１３Ｂ−４は、Ｈ鎖の初めの変更を有する抗ＷＴＡベータＡｂ  ６０７８（非修飾）及びその変異体ｖ２、ｖ３、ｖ４（記載する順にそれぞれ配列番号１１４、１３９〜１４４、及び１４３）の完全長Ｈ鎖（重鎖）のアラインメントを示す。操作されたＣｙｓを含むＨ鎖変異体は、定常領域の開始の黒い箱の中のＣ（この場合、ＥＵ残基第１１８番）で示される。
【図１３Ｂ−４】図１３Ｂ−１、１３Ｂ−２、１３Ｂ−３、１３Ｂ−４は、Ｈ鎖の初めの変更を有する抗ＷＴＡベータＡｂ  ６０７８（非修飾）及びその変異体ｖ２、ｖ３、ｖ４（記載する順にそれぞれ配列番号１１４、１３９〜１４４、及び１４３）の完全長Ｈ鎖（重鎖）のアラインメントを示す。操作されたＣｙｓを含むＨ鎖変異体は、定常領域の開始の黒い箱の中のＣ（この場合、ＥＵ残基第１１８番）で示される。
【図１４Ａ−１】図１４Ａ−１及び１４Ａ−２は、抗ＷＴＡベータＡｂ  ４４９７（非修飾）及びＣｙｓ操作Ｌ鎖（表示の順にそれぞれ配列番号１２１、１２３、１４５、及び１４５）の完全長Ｌ鎖のアラインメントを示す。Ｋａｂａｔ番号付けに従うＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１、Ｌ２、及びＬ３に下線を付す。箱は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａに従う接触残基及びＣＤＲ残基を示す。操作されたＣｙｓを含むＬ鎖変異体は、定常領域の端付近の点線の箱の中のＣ（この場合、ＥＵ残基第２０５番）で示される。
【図１４Ａ−２】図１４Ａ−１及び１４Ａ−２は、抗ＷＴＡベータＡｂ  ４４９７（非修飾）及びＣｙｓ操作Ｌ鎖（表示の順にそれぞれ配列番号１２１、１２３、１４５、及び１４５）の完全長Ｌ鎖のアラインメントを示す。Ｋａｂａｔ番号付けに従うＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１、Ｌ２、及びＬ３に下線を付す。箱は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａに従う接触残基及びＣＤＲ残基を示す。操作されたＣｙｓを含むＬ鎖変異体は、定常領域の端付近の点線の箱の中のＣ（この場合、ＥＵ残基第２０５番）で示される。
【図１４Ｂ−１】図１４Ｂ−１、１４Ｂ−２、１４Ｂ−３は、抗ＷＴＡベータＡｂ  ４４９７（非修飾）及びＣＤＲ  Ｈ３の９６位にてＤがＥに改変され、操作されたＣｙｓを有するかまたは有さないそのｖ８変異体（表示の順にそれぞれ配列番号１４６〜１４７、１５７、及び１４７）の完全長Ｈ鎖のアラインメントを示す。操作されたＣｙｓを含むＨ鎖変異体は、定常領域の開始の黒い箱の中のＣ（この場合、ＥＵ残基第１１８番）で示される。
【図１４Ｂ−２】図１４Ｂ−１、１４Ｂ−２、１４Ｂ−３は、抗ＷＴＡベータＡｂ  ４４９７（非修飾）及びＣＤＲ  Ｈ３の９６位にてＤがＥに改変され、操作されたＣｙｓを有するかまたは有さないそのｖ８変異体（表示の順にそれぞれ配列番号１４６〜１４７、１５７、及び１４７）の完全長Ｈ鎖のアラインメントを示す。操作されたＣｙｓを含むＨ鎖変異体は、定常領域の開始の黒い箱の中のＣ（この場合、ＥＵ残基第１１８番）で示される。
【図１４Ｂ−３】図１４Ｂ−１、１４Ｂ−２、１４Ｂ−３は、抗ＷＴＡベータＡｂ  ４４９７（非修飾）及びＣＤＲ  Ｈ３の９６位にてＤがＥに改変され、操作されたＣｙｓを有するかまたは有さないそのｖ８変異体（表示の順にそれぞれ配列番号１４６〜１４７、１５７、及び１４７）の完全長Ｈ鎖のアラインメントを示す。操作されたＣｙｓを含むＨ鎖変異体は、定常領域の開始の黒い箱の中のＣ（この場合、ＥＵ残基第１１８番）で示される。
【図１５Ａ−１】図１５Ａ−１、１５Ａ−２、１５Ａ−３は、１３個のヒト抗ＷＴＡベータ抗体（表示の順にそれぞれ配列番号１１３、１５８〜１６７、１２１、及び１６８）の完全長軽鎖のアミノ酸配列アラインメントを示す。可変領域（ＶＬ）は、Ｋａｂａｔアミノ酸１位〜１０７位にわたる。Ｋａｂａｔ番号付けに従うＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１、Ｌ２、及びＬ３に下線を付す。
【図１５Ａ−２】図１５Ａ−１、１５Ａ−２、１５Ａ−３は、１３個のヒト抗ＷＴＡベータ抗体（表示の順にそれぞれ配列番号１１３、１５８〜１６７、１２１、及び１６８）の完全長軽鎖のアミノ酸配列アラインメントを示す。可変領域（ＶＬ）は、Ｋａｂａｔアミノ酸１位〜１０７位にわたる。Ｋａｂａｔ番号付けに従うＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１、Ｌ２、及びＬ３に下線を付す。
【図１５Ａ−３】図１５Ａ−１、１５Ａ−２、１５Ａ−３は、１３個のヒト抗ＷＴＡベータ抗体（表示の順にそれぞれ配列番号１１３、１５８〜１６７、１２１、及び１６８）の完全長軽鎖のアミノ酸配列アラインメントを示す。可変領域（ＶＬ）は、Ｋａｂａｔアミノ酸１位〜１０７位にわたる。Ｋａｂａｔ番号付けに従うＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１、Ｌ２、及びＬ３に下線を付す。
【図１５Ｂ−１】図１５Ｂ−１〜１５Ｂ−６は、図１５Ａ−１、１５Ａ−２、１５Ａ−３の１３個のヒト抗ＷＴＡベータ抗体（表示の順にそれぞれ配列番号１１４、１６９〜１７６、１３３〜１３４、１３８、及び１２７）の完全長重鎖のアミノ酸配列アラインメントを示す。可変領域（ＶＨ）は、Ｋａｂａｔアミノ酸１位〜１１３位にわたる。Ｋａｂａｔ番号付けに従うＣＤＲ配列ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３に下線を付す。アスタリスクで印をつけたＨ鎖Ｅｕ１１８位は、薬物複合のためにＣｙｓに変更することができる。黒色で強調した残基は、脱アミド、アスパラギン酸異性化、酸化またはＮ−結合型糖鎖付加を回避するために、抗原結合に影響しない他の残基で置き換えることができる。
【図１５Ｂ−２】図１５Ｂ−１〜１５Ｂ−６は、図１５Ａ−１、１５Ａ−２、１５Ａ−３の１３個のヒト抗ＷＴＡベータ抗体（表示の順にそれぞれ配列番号１１４、１６９〜１７６、１３３〜１３４、１３８、及び１２７）の完全長重鎖のアミノ酸配列アラインメントを示す。可変領域（ＶＨ）は、Ｋａｂａｔアミノ酸１位〜１１３位にわたる。Ｋａｂａｔ番号付けに従うＣＤＲ配列ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３に下線を付す。アスタリスクで印をつけたＨ鎖Ｅｕ１１８位は、薬物複合のためにＣｙｓに変更することができる。黒色で強調した残基は、脱アミド、アスパラギン酸異性化、酸化またはＮ−結合型糖鎖付加を回避するために、抗原結合に影響しない他の残基で置き換えることができる。
【図１５Ｂ−３】図１５Ｂ−１〜１５Ｂ−６は、図１５Ａ−１、１５Ａ−２、１５Ａ−３の１３個のヒト抗ＷＴＡベータ抗体（表示の順にそれぞれ配列番号１１４、１６９〜１７６、１３３〜１３４、１３８、及び１２７）の完全長重鎖のアミノ酸配列アラインメントを示す。可変領域（ＶＨ）は、Ｋａｂａｔアミノ酸１位〜１１３位にわたる。Ｋａｂａｔ番号付けに従うＣＤＲ配列ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３に下線を付す。アスタリスクで印をつけたＨ鎖Ｅｕ１１８位は、薬物複合のためにＣｙｓに変更することができる。黒色で強調した残基は、脱アミド、アスパラギン酸異性化、酸化またはＮ−結合型糖鎖付加を回避するために、抗原結合に影響しない他の残基で置き換えることができる。
【図１５Ｂ−４】図１５Ｂ−１〜１５Ｂ−６は、図１５Ａ−１、１５Ａ−２、１５Ａ−３の１３個のヒト抗ＷＴＡベータ抗体（表示の順にそれぞれ配列番号１１４、１６９〜１７６、１３３〜１３４、１３８、及び１２７）の完全長重鎖のアミノ酸配列アラインメントを示す。可変領域（ＶＨ）は、Ｋａｂａｔアミノ酸１位〜１１３位にわたる。Ｋａｂａｔ番号付けに従うＣＤＲ配列ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３に下線を付す。アスタリスクで印をつけたＨ鎖Ｅｕ１１８位は、薬物複合のためにＣｙｓに変更することができる。黒色で強調した残基は、脱アミド、アスパラギン酸異性化、酸化またはＮ−結合型糖鎖付加を回避するために、抗原結合に影響しない他の残基で置き換えることができる。
【図１５Ｂ−５】図１５Ｂ−１〜１５Ｂ−６は、図１５Ａ−１、１５Ａ−２、１５Ａ−３の１３個のヒト抗ＷＴＡベータ抗体（表示の順にそれぞれ配列番号１１４、１６９〜１７６、１３３〜１３４、１３８、及び１２７）の完全長重鎖のアミノ酸配列アラインメントを示す。可変領域（ＶＨ）は、Ｋａｂａｔアミノ酸１位〜１１３位にわたる。Ｋａｂａｔ番号付けに従うＣＤＲ配列ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３に下線を付す。アスタリスクで印をつけたＨ鎖Ｅｕ１１８位は、薬物複合のためにＣｙｓに変更することができる。黒色で強調した残基は、脱アミド、アスパラギン酸異性化、酸化またはＮ−結合型糖鎖付加を回避するために、抗原結合に影響しない他の残基で置き換えることができる。
【図１５Ｂ−６】図１５Ｂ−１〜１５Ｂ−６は、図１５Ａ−１、１５Ａ−２、１５Ａ−３の１３個のヒト抗ＷＴＡベータ抗体（表示の順にそれぞれ配列番号１１４、１６９〜１７６、１３３〜１３４、１３８、及び１２７）の完全長重鎖のアミノ酸配列アラインメントを示す。可変領域（ＶＨ）は、Ｋａｂａｔアミノ酸１位〜１１３位にわたる。Ｋａｂａｔ番号付けに従うＣＤＲ配列ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３に下線を付す。アスタリスクで印をつけたＨ鎖Ｅｕ１１８位は、薬物複合のためにＣｙｓに変更することができる。黒色で強調した残基は、脱アミド、アスパラギン酸異性化、酸化またはＮ−結合型糖鎖付加を回避するために、抗原結合に影響しない他の残基で置き換えることができる。
【図１６】強調したアミノ酸位置におけるＡｂ４４９７及びその突然変異体の比較、ならびにＥＬＩＳＡにより試験されるそれらの相対的抗原結合強を示す。図１６は、表示の順にそれぞれ配列番号１７７、１７７、１７７、１７８、１７８、１７９、１７９、１８０、１８０、及び１８０を開示している。
【図１７】５０ｍｇ／ｋｇの遊離抗体での前処置が静脈内感染モデルにおいて有効でないことを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、単回用量のビヒクル対照（ＰＢＳ）または５０ｍｇ／Ｋｇの抗体を静脈内注射により与えた３０分後に、２×１０７ＣＦＵのＵＳＡ３００に感染させた。処置群は、黄色ブドウ球菌と結合しないアイソタイプ対照抗体（ｇＤ）、細胞壁タイコ酸のベータ修飾に対する抗体（４４９７）、または細胞壁タイコ酸のアルファ修飾に対する抗体（７５７８）を含んだ。対照マウスに、１１０ｍｇ／Ｋｇのバンコマイシンでの処置を腹腔内注射により（Ｖａｎｃｏ）１日２回与えた。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
これより本発明のある特定の実施形態を詳細に参照するが、それらの例は、添付の構造及び式に例示されている。本発明は、方法、材料、及び実施例を含む、列挙される実施形態とともに説明されているが、かかる説明は、非限定なものであり、それらが一般的に知られている、または本明細書に組み込まれているかどうかにかかわらず、本発明は、全ての代替物、改変物、及び等価物を網羅することが意図される。組み込まれる文献、特許、及び同様の資料のうちの１つ以上が、本出願（定義される用語、用語の用法、記載される技法等を含むがそれらに限定されない）と異なるか、または矛盾する場合は、本出願が優先される。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。当業者であれば、本発明の実施に使用することができる、本明細書に記載されるものに類似または同等である多数の方法及び材料を理解するであろう。本発明は、決して記載される方法及び材料に限定されるものではない。
【００４０】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が援用される。
【００４１】
Ｉ．一般的技法
本明細書において記載されるか、または参照される技法及び手順は、当業者によって一般に十分に理解され、従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））、ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），ｅｄ．，１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐ��ｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、及びＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）に記載される、広く利用されている方法論等を使用して、一般的に用いられる。
【００４２】
本出願で用いる命名法は、そうでないと示さない限り、ＩＵＰＡＣ系統的命名法に基づく。そうでないと定義しない限り、本明細書で用いる技術的及び科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有し、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、及びＪａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋと一貫している。
【００４３】
ＩＩ．定義
「抗体抗生物質複合体」またはＡＡＣは、リンカーによって抗生物質に化学的に結合した抗体からなる化合物である。抗体は、細菌表面上の抗原またはエピトープ、例えば、細菌性細胞壁構成成分と結合する。本発明に使用される場合、リンカーは、ほとんどの哺乳動物の細胞タイプに見出される、カテプシンＢ、リソソームプロテアーゼを含む、プロテアーゼによって切断されるように設計されるプロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカーである（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１３：８５５−８６９）。その３構成成分を用いたＡＡＣのダイアグラムを図２に示す。「ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗生物質複合体」または「ＴＡＣ」は、抗体が１つ以上のシステイン、概して、抗原結合機能を妨げない抗体上の特異的部位（複数を含む）で抗体に組み換え操作されたシステインを介してリンカー−抗生物質単位に化学的に共役されるＡＡＣの形態である。
【００４４】
「壁テイコ酸」（ＷＴＡ）は、ペプチドグリカンに、ホスホジエステル結合を介して、Ｎ−アセチルムラミン酸糖のＣ６ヒドロキシルに共有結合しているアニオン性糖重合体を意味する。厳密な化学構造は生物体間で変動することができるが、一実施形態では、ＷＴＡは、２位のＤ−リビトール及びＤ−アラニルエステルと４位のグリコシル置換基との１，５−ホスホジエステル結合の反復単位を有するリビトールタイコ酸である。グリコシル基は、黄色ブドウ球菌株に存在するような、Ｎ−アセチルグリコサミニルα（アルファ）またはβ（ベータ）であってもよい。アルジトール／糖アルコールリン酸反復上のヒドロキシルは、カチオン性Ｄ−アラニンエステル及び単糖類、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミンで置換される。一態様では、ヒドロキシル置換基は、Ｄ−アラニル及びアルファ（α）またはベータ（β）ＧｌｃＮＨＡｃを含む。ある特定の態様では、ＷＴＡは、式：
0006742314.tif 000003
（式中、波線は、反復結合単位またはポリアルジトール−Ｐもしくはペプチドグリカンの結合部位を示し、ＸはＤ−アラニルまたは−Ｈであり、Ｙはα（アルファ）−ＧｌｃＮＨＡｃまたはβ（ベータ）−ＧｌｃＮＨＡｃである）の化合物を含む。
【００４５】
0006742314.tif 000004
ＧｌｃＮＨＡｃ
黄色ブドウ球菌株では、ＷＴＡは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）−１−Ｐ及びＮ−アセチルマンノースアミン（ＭａｎＮＡｃ）からなる二糖類を介してＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）の６−ＯＨと共有結合し、その後に２または３単位のグリセロール−リン酸塩が続く。次いで、実際のＷＴＡポリマーは、１１−４０のリビトール−リン酸塩（Ｒｂｏ−Ｐ）反復単位からなる。ＷＴＡの段階的合成は、まず、ＴａｇＯと呼ばれる酵素によって開始され、（遺伝子の人工的欠失により）ＴａｇＯ遺伝子を欠く黄色ブドウ球菌株は、いかなるＷＴＡも作らない。反復単位は、Ｃ２−ＯＨにてＤ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ）及び／またはＣ４−ＯＨ位にてＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）で、α−（アルファ）またはβ−（ベータ）グリコシド結合を介してさらに調整することができる。黄色ブドウ球菌株または細菌の成長期に応じて、グリコシド結合は、α−、β−、または２つのアノマーの混合物であり得る。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「ＷＴＡ抗体」という用語は、ＷＴＡアルファであろうとＷＴＡベータであろうとＷＴＡと結合する任意の抗体を指す。「抗壁テイコ酸アルファ抗体」または「抗ＷＴＡアルファ抗体」または「抗αＷＴＡ」または「抗αＧｌｃＮａｃ  ＷＴＡ抗体」は、壁テイコ酸（ＷＴＡ）アルファと特異的に結合する抗体を指すように同義で使用される。同様に、「抗壁テイコ酸ベータ抗体」または「抗ＷＴＡベータ抗体」または「抗βＷＴＡ」または「抗βＧｌｃＮａｃ  ＷＴＡ抗体」という用語は、壁テイコ酸（ＷＴＡ）ベータと特異的に結合する抗体を指すように同義で使用される。
【００４７】
「抗生物質」（ａｂｘまたはＡｂｘ）は、細菌のような微生物の成長を特異的に阻害または死滅させるが、投与される濃度及び投与間隔で宿主にとって致死的でない任意の分子を含む。ある特定の態様では、抗生物質は、投与される濃度及び投与間隔で宿主にとって毒性でない。細菌に対して効果的な抗生物質は、殺菌性（すなわち直接死滅させる）または静菌性（すなわち分裂を妨げる）のいずれかに広く分類することができる。抗殺菌性抗生物質は、狭域スペクトルまたは広域スペクトルとしてさらに再分類することができる。より小さい範囲または特定の細菌のファミリーに対して効果的である狭域スペクトル抗生物質とは対照的に、広域スペクトル抗生物質は、グラム陽性及びグラム陰性細菌を含む広い範囲の細菌に対して効果的であるものである。抗生物質の例としては、例えば（ｉ）アミノグリコシド、例えばアミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、パロマイシン、（ｉｉ）アンサマイシン、例えばゲルダナマイシン、ハービマイシン、（ｉｉｉ）カルバセフェム、例えばロラカルベフ、（ｉｖ）カルバペネム、例えばエルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム、（ｖ）セファロスポリン（第１世代）、例えばセファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファレキシン、（ｖｉ）セファロスポリン（第２世代）、例えばセフラクロール、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、（ｖｉ）セファロスポリン（第３世代）、例えばセフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、（ｖｉｉ）セファロスポリン（第４世代）、例えばセフェピム、（ｖｉｉｉ）セファロスポリン（第５世代）、例えばセフトビプロール、（ｉｘ）糖ペプチド、例えばテイコプラニン、バンコマイシン、（ｘ）マクロライド、例えばアジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スペクチノマイシン、（ｘｉ）モノバクタム、例えばアズトレオナム、（ｘｉｉ）ペニシリン、例えばアモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン、ピペラシリン、チカルシリン、（ｘｉｉｉ）抗生物質ポリペプチド、例えばバシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、（ｘｉｖ）キノロン、例えばシプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、レメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、（ｘｖ）スルホンアミド、例えばマフェニド、プロントシル、スルファセタミド、スルファメチゾール、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（ＴＭＰ−ＳＭＸ）、（ｘｖｉ）テトラサイクリン、例えばデメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、ならびに（ｘｖｉｉ）その他のもの、例えばアルスフェナミン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、エタンブトール、ホスホマイシン、フシジン酸、フラゾリドン、イソニアジド、リネゾリド、メトロニダゾール、ムピロシン、ニトロフラントイン、プラテンシマイシン、ピラジナミド、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、リファンピン／リファンピシン、またはチニダゾールが挙げられる。
【００４８】
一言でいえば、黄色ブドウ球菌は、本明細書では、Ｓｔａｐｈ  ＡまたはＳ．アウレウスとも称される。あるいは、多剤耐性黄色ブドウ球菌またはオキサシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＯＲＳＡ）としても知られる「メチシリン耐性黄色ブドウ球菌」（ＭＲＳＡ）という用語は、ペニシリン（例えばメチシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、オキサシリン等）及びセファロスポリンを含むベータラクタム抗生物質に対して耐性である黄色ブドウ球菌の任意の株を指す。「メチシリン感受性黄色ブドウ球菌」（ＭＳＳＡ）は、ベータ−ラクタム抗生物質に感受性である黄色ブドウ球菌の任意の株を指す。
【００４９】
「抗Ｓｔａｐｈ  ａ抗体」及び「Ｓｔａｐｈ  ａに結合する抗体」という用語は、抗体が診断剤及び／または治療剤としてＳ．ａｕｒｅｕｓを標的とすることに有用となるような十分な親和性で黄色ブドウ球菌（「Ｓ．  アウレウス」）における抗原と結合することができる抗体を指す。一実施形態では、無関係の非Ｓｔａｐｈ  ａタンパク質との抗Ｓｔａｐｈ  ａ抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合に、ＭＲＳＡとの抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、Ｓｔａｐｈ  ａに結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、、５Ｎｍ以下、、４  ｎＭ以下、、３ｎＭ以下、、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗Ｓｔａｐｈ  ａ抗体は、異なる種に由来するＳｔａｐｈ間で保存されているＳｔａｐｈ  ａのエピトープに結合する。
【００５０】
「最小阻止濃度」（「ＭＩＣ」）という用語は、終夜のインキュベーションの後に微生物の目視可能な成長を阻害するであろう抗生物質の最低濃度のことを指す。ＭＩＣを決定するためのアッセイは、知られている。１つの方法は以下の実施例の項に記載される通りである。
【００５１】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、及びその抗原結合抗体断片を対象としている（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００３）  Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７０：４８５４−４８６１）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラであってもよいか、または他の種に由来するものであってもよい。抗体は、特定の抗原を認識し、それに結合することができる、免疫系によって作製されるタンパク質である（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。標的抗原は、一般に、複数の抗体のＣＤＲによって認識されるエピトープとも呼ばれる多数の結合部位を有する。異なるエピトープに特異的に結合するそれぞれの抗体は、異なる構造を有する。したがって、１つの抗原は、１つより多い対応する抗体によって認識され、結合することができる。抗体には、完全長免疫グロブリン分子、または完全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、目的の標的抗原またはその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子が含まれ、そのような標的としては、癌細胞、または自己免疫疾患と関連する自己免疫抗体を生成する細胞、感染細胞、もしくは細菌等の微生物が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に開示される免疫グロブリン（Ｉｇ）は、ＩｇＭ以外の任意のアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）ならびにサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２のものであり得る。免疫グロブリンは、任意の種に由来し得る。一態様では、Ｉｇは、ヒト、マウス、またはウサギの起源のものである。具体的な実施形態では、Ｉｇは、ヒト起源のものである。
【００５２】
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。５つの主要なクラスの抗体（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）が存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００５３】
「天然抗体」は、様々な構造を有する、天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｄｏｍａｉｎ）または重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）とを有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｄｏｍａｉｎ）または軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）と、その後に定常軽（ＣＬ）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの型うちの１つに割り当てられ得る。
【００５４】
「完全長抗体」、「無傷抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書で、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように同義に使用される。
【００５５】
抗体の「抗原結合断片」は、無傷抗体が結合する抗原に結合する、無傷抗体の一部を含む無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成される多特異的抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、その集団を含む個々の抗体は、例えば、天然に存在する突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の生成中に生じる（例えばグリコシル化における天然の変動）可能性のある変異体抗体（このような変異体は一般に少量で存在する）を除いて、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合する。ＩｇＧ１抗体についての１つのこのような可能性のある変異体は、重鎖定常領域のＣ末端リジン（Ｋ）の切断である。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない、多様な技法によって作製されてもよく、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法及び他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体が混入することなく合成することができるという点で、有利である。
【００５７】
「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部分が特定の源または種に由来し、重鎖及び／または軽鎖の残りの部分が異なる源または種に由来する抗体を指す。
【００５８】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された、またはヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源に由来する、抗体のアミノ酸配列、または他のヒト抗体コード配列に対応する、アミノ酸配列を保有するものである。このヒト抗体の定義は、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【００５９】
「ヒト化抗体」は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含む、キメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、そのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、そのＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の、「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【００６０】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体を抗原に結合することに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は一般に、同様の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．ＴＨ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照されたい）。単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体のＶＨまたはＶＬドメインを使用し、それぞれ、相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングして、単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい。
【００６１】
「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列が超可変であり（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）、かつ／または構造的に規定されたループを形成し、かつ／または抗原接触残基（抗原接触）を含む、抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、このうち３つがＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にあり、３つがＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。天然抗体では、Ｈ３及びＬ３は、６つのＨＶＲの中で最大の多様性を示し、特にＨ３は、抗体への好適な特異性を与えることにおいて固有の役割を果たすと考えられる。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５（２０００）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１−２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）を参照されたい。実際に、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ抗体は、軽鎖の不在下で機能的かつ安定である（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８、Ｓｈｅｒｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３−７３６）。
【００６２】
ある数のＨＶＲ描写が本明細書で使用され、ここに含まれる。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づき、最も一般的に使用されているものである（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの場所を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，（１９８７）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）。抗原接触については、ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）を参照されたい。ＡｂＭ  ＨＶＲは、ＫａｂａｔのＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａの構造的ループとの間の妥協点を示し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用される。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲの各々に由来する残基を以下に記載する。
0006742314.tif 000005
【００６３】
ＨＶＲは、次のような「延長ＨＶＲ」を含み得る。ＶＬにおける２４−３６または２４−３４（Ｌ１）、４６−５６または５０−５６（Ｌ２）、及び８９−９７または８９−９６（Ｌ３）、ならびにＶＨにおける２６−３５（Ｈ１）、５０−６５または４９−６５（Ｈ２）、及び９３−１０２、９４−１０２、または９５−１０２（Ｈ３）。別途指定されない限り、可変ドメインにおけるＨＶＲ残基、ＣＤＲ残基、及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において上記のＫａｂａｔらに従って付番される。
【００６４】
「Ｋａｂａｔにあるような可変ドメイン残基付番」または「Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置付番」という表現、及びそれらの変形形態は、Ｋａｂａｔら（上記）における抗体の編成において重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用されている付番方式を指す。この付番システムを使用して、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲの短縮またはそれへの挿入に対応するより少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従って残基５２ａ）を、そして重鎖ＦＲ残基８２後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従って残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等）を含んでもよい。残基のＫａｂａｔ付番は、所与の抗体について、抗体の配列の相同性の領域を「標準」のＫａｂａｔによって付番される配列とアラインメントすることによって決定してもよい。
【００６５】
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（またはＶＬ）において次の配列、ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４で出現する。
【００６６】
本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、またはそれは、アミノ酸配列変化を含有し得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。いくつかの実施形態において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークの配列は、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。
【００６７】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列の下位群は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１）、ｖｏｌｓ．１−３におけるようなサブグループである。一実施形態において、ＶＬについて、サブグループは、上記のＫａｂａｔらにあるようなサブグループカッパＩである。一実施形態において、ＶＨについて、サブグループは、上記のＫａｂａｔらにあるようなサブグループＩＩＩである。
【００６８】
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するように使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端まで伸びると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵ付番方式によると残基４４７、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載される通り）は、例えば、抗体の産生もしくは精製の間に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え操作することによって、除去されてもよい。したがって、無傷抗体の組成物は、全Ｋ４４７残基が除去された抗体集団、除去されたＫ４４７残基がない抗体集団、及びＫ４４７残基を有する抗体と有しない抗体との混合物を有する抗体集団を含んでもよい。「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語にはまた、胎児への母体ＩｇＧの移入を担う、新生児型受容体であるＦｃＲｎも含まれる。Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）、及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４）。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は既知である（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：（１２）：５９２−８（１９９７）、Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５（７）：６３７−４０（１９９７）、Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３−６（２００４）、ＷＯ２００４／９２２１９（Ｈｉｎｔｏｎら）を参照されたい）。ヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドのインビボでのＦｃＲｎへの結合及び血清中半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクトヒト細胞株において、または変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチドが投与される霊長類においてアッセイすることができる。ＷＯ２００４／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）は、ＦｃＲへの結合を向上または減少させた抗体変異体を記載している。また、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい。
【００６９】
「親和性成熟」抗体は、変化を有しない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）において１つ以上の変化を有し、かかる変化によって抗原に対する抗体の親和性を改善する、抗体を指す。
【００７０】
「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原分子上の特定の部位を指す。
【００７１】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体がその抗原に結合するのを５０％以上遮断する抗体、及び逆に、競合アッセイにおいて、抗体がその抗原に結合するのを５０％以上遮断する参照抗体を指す。例示的な競合アッセイが本明細書に提供される。
【００７２】
「裸の抗体」は、異種性部分（例えば、細胞傷害性部分）または放射標識に複合されていない抗体を指す。裸の抗体は、薬学的製剤中に存在してもよい。
【００７３】
「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプにより異なる抗体のＦｃ領域に起因し得る生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
【００７４】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」またはＡＤＣＣは、ある特定の細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）と結合した分泌Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞と特異的に結合して、続いて細胞毒を用いて標的細胞を死滅させることができるようにする細胞傷害性の形態を指す。抗体は、細胞傷害性細胞で「武装」し、この機序により標的細胞を死滅させるために必要である。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、Ｆｃγ（ガンマ）ＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、Ｆｃγ（ガンマ）ＲＩ、Ｆｃγ（ガンマ）ＲＩＩ、及びＦｃγ（ガンマ）ＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、ＵＳ５，５００，３６２またはＵＳ５，８２１，３３７に記載されるようなインビトロＡＤＣＣアッセイを行ってもよい。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるような、動物モデルで評価してもよい。
【００７５】
「食作用」は、宿主細胞（例えばマクロファージまたは好中球）により病原体が飲み込まれるか、または内部移行されるプロセスを指す。食細胞は、３つの経路により食作用を媒介する：（ｉ）直接細胞表面受容体（例えばレクチン、インテグリン、及びスカベンジャー受容体）、（ｉｉ）補体増強−補体でオプソニン化した病原体と結合してそれを摂食する補体受容体（Ｃ３ｂ、ＣＲ３及びＣＲ４についての受容体ＣＲＩを含む）を用いる、及び（ｉｉｉ）抗体増強−抗体でオプソニン化した粒子（これは、次いで内部移行され、リソソームと融合してファゴリソソームになる）と結合するＦｃ受容体（ＦｃγガンマＲＩ、ＦｃγガンマＲＩＩＡ、及びＦｃγガンマＲＩＩＩＡを含む）を用いる。本発明では、経路（ｉｉｉ）が感染白血球、例えば好中球及びマクロファージへの抗ＭＲＳＡ  ＡＡＣ治療剤の送達において重要な役割を果たすと考えられる（Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ：ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｉｎ  Ａｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｄ．Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ａ  Ｏｚｉｎｓｋｙ．（２００２）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  ２０：８２５）。
【００７６】
「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）が（適当なサブクラスの）抗体と結合することにより開始され、該抗体にはそれらの同族抗原が結合する。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されるような、ＣＤＣアッセイを行ってもよい。
【００７７】
Ｆｃ領域と結合している炭水化物は、改変してもよい。哺乳類細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、分岐した二分岐オリゴ糖を含み、これは、概して、Ｎ−結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に結合される。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら（１９９７）  ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２を参照されたい。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」中のＧｌｃＮＡｃと結合したフコースを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ中のオリゴ糖の修飾は、ある特定のさらに改善された特性を有するＩｇＧを作製するために行われてもよい。例えば、Ｆｃ領域と（直接的または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体修飾をもたらす。このような修飾は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、ＵＳ２００３／０１５７１０８（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、ＵＳ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体修飾に関連する刊行物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損した１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、米国特許出願公開番号２００３／０１５７１０８  Ａｌ、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、及びＷＯ２００４／０５６３１２  Ａｌ、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，特に実施例１１における）、及びアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞等のノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）、及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照されたい）が挙げられる。
【００７８】
「単離抗体」は、その天然環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ法（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％超または９９％超の純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の概説に関して、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。
【００７９】
「単離核酸」は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸には、核酸分子を通常含有する細胞内に含有される核酸分子であるが、その核酸分子が、染色体外に、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。
【００８０】
「抗ＷＴＡベータ抗体をコードする単離核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする１つ以上の核酸分子を指し、それには単一のベクターまたは別個のベクターにおけるかかる核酸分子（複数可）が含まれ、かかる核酸分子（複数可）は、宿主細胞内の１つ以上の場所に存在する。
【００８１】
本明細書で使用されるとき、「に特異的に結合する」または「に対して特異的」であるという用語は、生体分子を含む分子の異種集団の存在下で標的の存在を決定するものである、標的と抗体との間の結合等の測定可能かつ再現可能な相互作用を指す。例えば、標的（これはエピトープであり得る）に特異的に結合する抗体は、他の標的に結合するよりも高い親和性、結合力で、より容易に、及び／またはより長い持続時間でこの標的に結合する、抗体である。一実施形態では、ＷＴＡ−ベータと無関係の標的との結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定される、標的との抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＷＴＡベータと特異的に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗体は、異なる種から保存されたエピトープと特異的に結合する。別の実施形態では、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、それを必要とはしない。
【００８２】
「結合親和性」は、一般的に、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合的相互作用の合計の強度を指す。別途指定されない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹについての親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、一般的に、抗原とゆっくり結合し、容易に解離する傾向にあるが、高親和性抗体は、一般的に、抗原と迅速に結合し、より長く結合したままの傾向にある。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術分野で知られており、本発明の目的のためにこれらのいずれも用いることができる。結合親和性を測定するための具体的な例証的説明及び例示的な実施形態が、以下に記載される。
【００８３】
一実施形態では、本発明に従う「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、以下のアッセイにより説明されるように、目的の抗体のＦａｂバージョンとその抗原とを用いて行われる放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、未標識抗原の一連の滴定の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原とＦａｂを平衡化し、次いで、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートで結合した抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１）。アッセイのための条件を確立するために、マイクロタイタープレート（ＤＹＮＥＸ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で終夜コーティングし、その後、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで２〜５時間室温（約２３℃）でブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中に、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］−抗原を、目的のＦａｂの系列希釈（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）における、抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ−１２の評価と一致）と混合する。目的のＦａｂを次いで一晩インキュベートするが、インキュベーションは、確実に平衡に到達させるために、より長い期間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を、室温での（例えば、１時間にわたる）インキュベーションのために、捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、プレートを、ＰＢＳ中０．１％のＴＷＥＥＮ−２０（商標）界面活性剤で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ）により１０分間計数する。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイにおいて使用するために選定する。
【００８４】
別の実施形態によれば、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、２５℃で、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて測定される。簡潔に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化させる。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）まで希釈した後、カップリングされたタンパク質のおよそ１０応答単位（ＲＵ）を達成するように、５μＬ／分の流速で注射する。抗原の注射後、１Ｍのエタノールアミンを注射して、未反応の基をブロッキングする。動態測定については、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０（商標）界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に、２５℃で、およそ２５μＬ／分の流速で注射する。会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）は、会合及び解離のセンサーグラムを同時に適合させることにより、単純一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して計算される。平衡状態解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイにより結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、結合速度は、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計で測定される、増加濃度の抗原の存在下で、ｐＨ７．２のＰＢＳ中、２５℃における、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎＭ、発光＝３４０ｎＭ、１６ｎＭの帯域通過）における増加または減少を測定する蛍光消光技術を使用することにより、決定され得る。
【００８５】
本発明による「結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）」、「会合の速度」、「会合速度」、または「ｋｏｎ」はまた、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて上記のように決定することもできる。
【００８６】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、同義に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞には、初代形質転換細胞及び継代の数に関わらずそれに由来する子孫を含む、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、親細胞と完全に同一の核酸含量でない場合があるが、突然変異を含んでもよい。元の形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する突然変異体子孫が、本明細書に含まれる。
【００８７】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を増殖することが可能な核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクター及び導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。ある特定のベクターは、動作可能に連結された核酸の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。
【００８８】
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントし、配列同一性最大パーセントを得るのに必要な場合はギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の部分として考慮せずに、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野における技術の範囲内の種々の方式で達成することができる。当業者は、比較する配列の完全長にわたる最大のアライメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントするために適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により著され、ソースコードは、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９においてユーザ文書と共にファイルされており、Ｕ．Ｓ．著作権第ＴＸＵ５１００８７号の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に利用可能であるか、またはソースコードから編集されてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するために編集すべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変更されない。
【００８９】
アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮ−２が用いられる場合、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれと対比した、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（代替的に、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれと対比したある特定のアミノ酸配列同一性％を有する、またはそれを含む、所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、次のように算出される。分数Ｘ／Ｙの１００倍（式中、Ｘは、配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって、そのプログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％と等しくはならないことが理解されよう。特に別途定めのない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、記載されるように得られる。
【００９０】
「リファマイシン型抗生物質」という用語は、リファマイシンの構造またはリファマイシンに類似する構造を有する抗生物質のクラスまたは群を意味する。
【００９１】
「リファラジル型抗生物質」という用語は、リファラジルの構造またはリファラジルに類似する構造を有する抗生物質のクラスまたは群を意味する。
【００９２】
置換基の数を示す場合、「１つ以上」という用語は、１つの置換基から可能な限り最高の置換の数、すなわち１つの水素の置き換えから全ての水素の置換基による置き換えまでの範囲を指す。「置換基」という用語は、親分子の水素原子を置き換える原子または原子団を示す。「置換された」という用語は、明記された基が１つ以上の置換基を担持することを示す。いずれの基も複数の置換基を有することができ、多様な可能性のある置換基が提供される場合、置換基は独立して選択され、同じである必要はない。「非置換の」という用語は、明記された基が置換基を担持しないことを意味する。「任意に置換された」という用語は、明記された基が置換されていないか、または可能性のある置換基の群から独立して選択される１つ以上の置換基で置換されることを意味する。置換基の数を示す場合、「１つ以上」という用語は、１つの置換基から可能な限り最高の置換の数、すなわち１つの水素の置き換えから全ての水素の置換基による置き換えまでの範囲を意味する。
【００９３】
本明細書で使用される「アルキル」という用語は、１〜１２個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ１２）の飽和した直鎖または分岐鎖の一価の炭化水素ラジカルを指し、アルキルラジカルは、以下に記載する１つ以上の置換基で、独立して置換されていてもよい。別の実施形態では、アルキルラジカルは、１〜８個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ８）、または１〜６個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ６）である。アルキル基の例としては、メチル（Ｍｅ、−ＣＨ３）、エチル（Ｅｔ、−ＣＨ２ＣＨ３）、１−プロピル（ｎ−Ｐｒ、ｎ−プロピル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−プロピル（ｉ−Ｐｒ、ｉ−プロピル、−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１−ブチル（ｎ−Ｂｕ、ｎ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−１−プロピル（ｉ−Ｂｕ、ｉ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−ブチル（ｓ−Ｂｕ、ｓ−ブチル、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−Ｂｕ、ｔ−ブチル、−Ｃ（ＣＨ３）３）、１−ペンチル（ｎ−ペンチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、１−ヘキシル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３））、２−メチル−２−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、４−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−３−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、２，３−ジメチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３，３−ジメチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（ＣＨ３）３、１−ヘプチル、１−オクチル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
本明細書で使用される「アルキレン」という用語は、１〜１２個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ１２）の飽和した直鎖または分岐鎖の二価の炭化水素ラジカルを指し、アルキレンラジカルは、任意に、以下に記載する１つ以上の置換基で、独立して置換されていてもよい。別の実施形態では、アルキレンラジカルは、１〜８個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ８）、または１〜６個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ６）である。アルキレン基の例としては、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、プロピレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの不飽和部位、すなわち炭素−炭素ｓｐ２二重結合を有する２〜８個の炭素原子（Ｃ２−Ｃ８）の直鎖または分岐鎖の一価の炭化水素ラジカルを指し、アルケニルラジカルは、任意に、本明細書に記載される１つ以上の置換基で、独立して置換されていてもよく、「シス」及び「トランス」配向、またはあるいは「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有するラジカルを含む。例としては、エチレニルまたはビニル（−ＣＨ＝ＣＨ２）、アリル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
「アルケニレン」という用語は、少なくとも１つの不飽和部位、すなわち炭素−炭素ｓｐ２二重結合を有する２〜８個の炭素原子（Ｃ２−Ｃ８）の直鎖または分岐鎖の二価の炭化水素ラジカルを指し、アルケニレンラジカルは、任意に、本明細書に記載される１つ以上の置換基で、独立して置換されていてもよく、「シス」及び「トランス」配向、またはあるいは「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有するラジカルを含む。例としては、エチレニレンまたはビニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、アリル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの不飽和部位、すなわち炭素−炭素ｓｐ三重結合を有する２〜８個の炭素原子（Ｃ２−Ｃ８）の直鎖または分岐鎖の一価の炭化水素ラジカルを指し、アルキニルラジカルは、任意に、本明細書に記載される１つ以上の置換基で、独立して置換されていてもよい。例としては、エチニル（−Ｃ≡ＣＨ）、プロピニル（プロパルギル、−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
「アルキニレン」という用語は、少なくとも１つの不飽和部位、すなわち炭素−炭素ｓｐ三重結合を有する２〜８個の炭素原子（Ｃ２−Ｃ８）の直鎖または分岐鎖の二価の炭化水素ラジカルを指し、アルキニレンラジカルは、任意に、本明細書に記載される１つ以上の置換基で、独立して置換されていてもよい。例としては、エチニレン（−Ｃ≡Ｃ−）、プロピニレン（プロパルギレン、−ＣＨ２Ｃ≡Ｃ−）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
「炭素環」、「カルボシクリル」、「炭素環式環」、及び「シクロアルキル」という用語は、単環式環として３〜１２個の炭素原子（Ｃ３−Ｃ１２）または二環式環として７〜１２個の炭素原子を有する一価の非芳香族の飽和したまたは部分的に不飽和の環を指す。７〜１２個の原子を有する二環式炭素環は、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］、もしくは［６，６］系として配置することができ、９または１０個の原子を有する二環式炭素環は、ビシクロ［５，６］または［６，６］系として、またはビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［２．２．２］オクタン、及びビシクロ［３．２．２］ノナン等の架橋系として配置することができる。スピロ部分も本定義の範囲に含まれる。単環式炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペント−１−エニル、１−シクロペント−２−エニル、１−シクロペント−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘキシ−１−エニル、１−シクロヘキシ−２−エニル、１−シクロヘキシ−３−エニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロウンデシル、シクロドデシル等が挙げられるが、これらに限定されない。カルボシクリル基は、任意に、本明細書に記載される１つ以上の置換基で、独立して置換される。
【０１００】
「アリール」は、親の芳香環系の単一炭素原子から１つの水素原子を除去することにより導かれる６〜２０個の炭素原子（Ｃ６−Ｃ２０）の一価の芳香族炭化水素ラジカルを意味する。いくつかのアリール基としては、例示的構造において「Ａｒ」と表される。アリールは、飽和、部分的に不飽和の環、または芳香族炭素環式環と縮合した芳香環を含む二環式ラジカルを含む。典型的なアリール基としては、ベンゼン（フェニル）、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル、インデニル、インダニル、１，２−ジヒドロナフタレン、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル等に由来するラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。アリール基は、任意に、本明細書に記載される１つ以上の置換基で、独立して置換される。
【０１０１】
「アリーレン」は、親の芳香環系の２個の炭素原子から２個の水素原子を除去することにより導かれる６〜２０個の炭素原子（Ｃ６−Ｃ２０）の二価の芳香族炭化水素ラジカルを意味する。いくつかのアリーレン基としては、例示的構造において「Ａｒ」と表される。アリーレンは、飽和、部分的に不飽和の環、または芳香族炭素環式環と縮合した芳香環を含む二環式ラジカルを含む。典型的なアリーレン基としては、ベンゼン（フェニレン）、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニレン、インデニレン、インダニレン、１，２−ジヒドロナフタレン、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル等に由来するラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。アリーレン基は、任意に、本明細書に記載される１つ以上の置換基で置換される。
【０１０２】
「複素環」、「ヘテロシクリル」、及び「複素環式環」という用語は、本明細書において同義で用いられ、３〜約２０個の環原子の飽和または部分的に不飽和（すなわち１つ以上の二重及び／または三重結合を環の中に有する）の炭素環式ラジカルを指し、少なくとも１つの環原子は、窒素、酸素、リン、及び硫黄から選択されるヘテロ原子であり、残りの環原子はＣであり、１つ以上の環原子は、任意に、以下に記載される１つ以上の置換基で、独立して置換される。複素環は、３〜７員環（２〜６個の炭素原子ならびにＮ、Ｏ、Ｐ、及びＳから選択される１〜４個のヘテロ原子）の単環または７〜１０員環（４〜９個の炭素原子ならびにＮ、Ｏ、Ｐ、及びＳから選択される１〜６個のヘテロ原子）の二環、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］、または［６，６］系であってよい。複素環は、Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｌｅｏ  Ａ．；“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６８）、特に第１、３、４、６、７及び９章；“Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ”（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９５０〜現在）、特に第１３巻、第１４巻、第１６巻、第１９巻、及び第２８巻、ならびにＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６０）８２：５５６６に記載されている。「ヘテロシクリル」は、複素環ラジカルが、飽和、部分的に不飽和の環、または芳香族炭素環式もしくは複素環式環と縮合したラジカルも含む。複素環式環としては、例えば、モルホリン−４−イル、ピペリジン−１−イル、ピペラジニル、ピペラジン−４−イル−２−オン、ピペラジン−４−イル−３−オン、ピロリジン−１−イル、チオモルホリン−４−イル、Ｓ−ジオキソチオモルホリン−４−イル、アゾカン−１−イル、アゼチジン−１−イル、オクタヒドロピリド［１，２−ａ］ピラジン−２−イル、［１，４］ジアゼパン−１−イル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チオキサニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、インドリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリニルイミダゾリニル、イミダゾリニル、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニル、アザビシクロ［２．２．２］ヘキサニル、３Ｈ−インドリルキノリジニル、及びＮ−ピリジルウレアが挙げられるが、これらに限定されない。スピロ部分も本定義の範囲に含まれる。２つの環原子がオキソ（＝Ｏ）部分で置換された複素環式基の例は、ピリミジノニル及び１，１−ジオキソ−チオモ��ホリニルである。本明細書における複素環基は、任意に、本明細書に記載される１つ以上の置換基で、独立して置換される。
【０１０３】
「ヘテロアリール」という用語は、５、６、または７員環の一価の芳香族基を指し、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される１つ以上のヘテロ原子を含む５〜２０個の原子の縮合環系（その少なくとも１つは芳香族である）を含む。ヘテロアリール基の例は、ピリジニル（例えば２−ヒドロキシピリジニルを含む）、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、ピリミジニル（例えば４−ヒドロキシピリミジニルを含む）、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソキサゾリル、チアゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、シンノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、及びフロピリジニルである。ヘテロアリール基は、任意に、本明細書に記載される１つ以上の置換基で、独立して置換される。
【０１０４】
複素環またはヘテロアリール基は、可能であれば、炭素（炭素結合した）または窒素（窒素結合した）結合してもよい。例として、限定されないが、炭素結合した複素環またはヘテロアリールは、ピリジンの２、３、４、５、もしくは６位、ピリダジンの３、４、５、もしくは６位、ピリミジンの２、４、５、もしくは６位、ピラジンの２、３、５、もしくは６位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロール、もしくはテトラヒドロピロールの２、３、４、もしくは５位、オキサゾール、イミダゾール、もしくはチアゾールの２、４、もしくは５位、イソキサゾール、ピラゾール、もしくはイソチアゾールの３、４、もしくは５位、アジリジンの２もしくは３位、アゼチジンの２、３、もしくは４位、キノリンの２、３、４、５、６、７、もしくは８位、またはイソキノリンの１、３、４、５、６、７、もしくは８位で結合される。
【０１０５】
例として、限定されないが、窒素結合した複素環またはヘテロアリールは、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２−ピロリン、３−ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２−イミダゾリン、３−イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２−ピラゾリン、３−ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、１Ｈ−インダゾールの１位、イソインドールまたはイソインドリンの２位、モルホリンの４位、及びカルバゾ−ルまたはβ−カルボリンの９位で結合される。
【０１０６】
「代謝産物」は、特定の化合物またはその塩の体内での代謝により生成される生成物である。化合物の代謝産物は、当該技術分野で既知の日常的な技術を用いて同定することができ、それらの活性は、本明細書に記載されるもののような試験を用いて決定することができる。かかる生成物は、例えば、投与される化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、脱アミド化、エステル化、脱エステル化、酵素的切断等から生じることができる。したがって、本発明は、本発明の式Ｉの化合物を、その代謝生成物を生じるのに十分な期間、哺乳動物と接触させることを含む、プロセスにより生成される化合物を含む、本発明の化合物の代謝産物を含む。
【０１０７】
「薬学的製剤」という用語は、調製物の中に含有される活性成分の生物活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与され得る対象にとって許容できないほど有毒である追加の構成成分を何ら含有しない調製物を指す。
【０１０８】
「滅菌」製剤は、無菌、または全ての生存微生物及びそれらの胞子を含まないことである。
【０１０９】
「安定」製剤は、含まれるタンパク質が貯蔵中に物理的及び化学的安定性及び完全性を本質的に保持するものである。タンパク質安定性を測定するための様々な分析技術が当該技術分野で利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｐｕｂｓ．（１９９１）  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）に概説がある。安定性は、選択された温度にて選択された期間測定することができる。迅速スクリーニングのために、製剤を４０℃に２週間から１カ月間保存することができ、その時に安定性を測定する。製剤が２〜８℃で貯蔵されるものである場合、一般的に、製剤は、３０℃もしくは４０℃にて少なくとも１カ月間安定であり、かつ／または２〜８℃にて少なくとも２年間安定である。製剤が３０℃で貯蔵されるものである場合、一般的に、製剤は、３０℃にて少なくとも２年間安定であり、かつ／または４０℃にて少なくとも６カ月間安定である。例えば、貯蔵中の凝集の程度は、タンパク質安定性の指標として用いることができる。よって、「安定」製剤は、タンパク質の約１０％未満及び好ましくは約５％未満が製剤中に凝集物として存在するものであってよい。他の実施形態では、製剤の貯蔵中の凝集物形成のいずれの増加も決定することができる。
【０１１０】
「等張」製剤は、ヒト血液と本質的に同じ浸透圧を有するものである。等張製剤は、一般的に、約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。「低張」という用語は、ヒト血液のものより低い浸透圧を有する製剤を説明する。同様に、「高張」という用語は、ヒト血液のものより高い浸透圧を有する製剤を説明するために用いられる。等張性は、例えば蒸気圧浸透圧計または氷結型浸透圧計を用いて測定することができる。本発明の製剤は、塩及び／または緩衝液の添加の結果として高張である。
【０１１１】
本明細書で使用される「担体」には、用いられる投与量及び濃度でそれに曝露されている細胞または哺乳動物にとって無毒である、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤が含まれる。多くの場合、生理的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理的に許容される担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトールもしくはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１１２】
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。「薬学的に許容される酸」は、処方される濃度及び様式にて非毒性である無機及び有機酸を含む。例えば、適切な無機酸としては、塩化水素酸、過塩素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、スルホン酸、スルフィン酸、スルファニル酸、リン酸、炭酸等が挙げられる。適切な有機酸としては、直鎖及び分岐鎖アルキル、芳香族、環状、脂環式、アリール脂肪族、複素環式、飽和、不飽和のモノ、ジ、及びトリカルボン酸（例えばギ酸、酢酸、２−ヒドロキシ酢酸、トリフルオロ酢酸、フェニル酢酸、トリメチル酢酸、ｔ−ブチル酢酸、アントラニル酸、プロパン酸、２−ヒドロキシプロパン酸、２−オキソプロパン酸、プロパン二酸、シクロペンタンプロピオン酸、シクロペンタンプロピオン酸、３−フェニルプロピオン酸、ブタン酸、ブタン二酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、２−アセトキシ−安息香酸、アスコルビン酸、桂皮酸、ラウリル硫酸、ステアリン酸、ムコン酸、マンデル酸、コハク酸、エンボン酸、フマル酸、リンゴ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、マロン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、グリコール酸、グリコン酸、グルコン酸、ピルビン酸、グリオキサル酸、シュウ酸、メシル酸、コハク酸、サリチル酸、フタル酸、パルモ酸、パルメイン酸、チオシアン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、カンファスルホン酸、４−メチルビシクロ［２．２．２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、４，４’−メチレンビス−３−（ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、ヒドロキシナフトエ酸を含む）が挙げられる。
【０１１３】
「薬学的に許容される塩基」は、製剤中で処方される濃度及び様式にて非毒性である無機及び有機塩基を含む。例えば、適切な塩基としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム、Ｎ−メチルグルカミン、モルホリン、ピペリジンのような無機塩基形成性金属から形成されるもの、ならびに第一級、第二級、及び第三級アミン、置換アミン、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂［例えばＮ（Ｒ’）４＋（式中、Ｒ’は、独立して、ＨまたはＣ１−４  アルキル、例えばアンモニウム、トリスである）］、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂等を含む有機非毒性塩基が挙げられる。特に好ましい有機非毒性塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、及びカフェインである。
【０１１４】
本発明で用いることができるさらなる薬学的に許容される酸及び塩基としては、アミノ酸、例えばヒスチジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、及びアスパラギンに由来するものが挙げられる。
【０１１５】
「薬学的に許容される」緩衝液及び塩としては、上記の酸及び塩基の酸及び塩基付加塩の両方に由来するものが挙げられる。具体的な緩衝液及び／または塩としては、ヒスチジン、コハク酸塩、及び酢酸塩が挙げられる。
【０１１６】
「薬学的に許容される糖」は、目的のタンパク質と混合した場合に、貯蔵の際のタンパク質の化学的及び／または物理的不安定性を著しく妨げるかまたは低減する分子である。製剤を凍結乾燥させ、次いで再構成することを目的とする場合、「薬学的に許容される糖類」は、「凍結乾燥保護剤」としても知られる。例示的な糖類及び対応する糖アルコールとしては、グルタミン酸１ナトリウムまたはヒスチジン等のアミノ酸；ベタイン等のメチルアミン；硫酸マグネシウム等のリオトロピックな塩；三価またはそれより高い分子量の糖アルコール等のポリオール、例えばグリセリン、デキストラン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）；及びそれらの混合物が挙げられる。さらなる例示的な凍結乾燥保護剤としては、グリセリン及びゼラチン、ならびに糖類メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオース、及びスタキオースが挙げられる。還元糖類の例としては、グルコース、マルトース、ラクトース、マルツロース、イソマルツロース、及びラクツースが挙げられる。非還元糖類の例としては、糖アルコール及び他の直鎖多価アルコールから選択されるポリヒドロキシ化合物の非還元グリコシドが挙げられる。好ましい糖アルコールは、モノグリコシド、特にラクトース、マルトース、ラクツロース、及びマルツロース等の二糖類の還元により得られる化合物である。グリコシド側鎖は、グルコシドまたはガラクトシドのいずれかであり得る。糖アルコールのさらなる例は、グルシトール、マルチトール、ラクチトール、及びイソマルツロースである。好ましい薬学的に許容される糖類は、非還元糖類トレハロースまたはショ糖である。薬学的に許容される糖類は、タンパク質がその物理的及び化学的な安定性及び完全性を貯蔵中（例えば再構成及び貯蔵の後）に本質的に保持することを意味する「保護量」（例えば凍結乾燥前）で製剤に加えられる。
【０１１７】
目的の「希釈剤」は、本明細書において、薬学的に許容され（ヒトへの投与について安全かつ非毒性である）、液体製剤の調製物、例えば凍結乾燥後に再構成される製剤のために有用であるものである。例示的な希釈剤は、滅菌水、静菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌食塩水溶液、リンゲル液、またはデキストローズ溶液を含む。代替の実施態様では、希釈剤は、塩の水性溶液、及び／または緩衝液を含み得る。
【０１１８】
「保存剤」は、細菌の活性を低減するために本明細書における製剤に加えることができる化合物である。保存剤の添加は、例えば、複数使用（複数回用量）製剤の製造を容易にすることがある。可能性のある保存剤としては、例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロライド、ベンザルコニウムクロライド（アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライドの混合物）及びベンゼトニウムクロライドが挙げられる。他の型の保存剤としては、芳香族アルコール、例えばフェノール、ブチル、及びベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが挙げられる。本明細書において最も好ましい保存剤は、ベンジルアルコールである。
【０１１９】
「個体」または「対象」または「患者」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。
【０１２０】
本明細書で使用されるとき、「治療」（及び「治療する」または「治療すること」等のその文法上の変形形態）は、臨床病理学の経過中に治療される個体、組織、または細胞の自然の経過を改変するように設計された臨床的介入を指す。治療の望ましい効果としては、疾患進行の速度の減少、病態の改善または緩和、及び寛解または予後の改善が挙げられ、全ては医師等の当業者により測定可能であるが、これらに限定されない。一実施態様では、治療は、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の漸減、感染性疾患の進行速度の減少、病態の改善または緩和、及び寛解または予後の改善を意味し得る。いくつかの実施態様では、本発明のＡＡＣ、ＴＡＣを用いて、疾患の発生を遅らせるか、または感染性疾患の進行を遅くする、または血液中ならびに／もしくは感染組織及び器官中の細菌負荷を低減する。
【０１２１】
本明細書で使用されるとき、「と併せて」は、１つの治療様式を別の治療様式に加えて施すことを指す。したがって、「と併せて」は、１つの治療様式を、他方の治療様式を施す前に、その間に、またはその後に、個体に施すことを指す。
【０１２２】
「菌血症」という用語は、血流中の細菌の存在を指し、これは、血液培養により最も一般的に検出される。細菌は、感染症（例えば肺炎または髄膜炎）の重度の合併症として、手術中（特に消化管等の粘膜が関与する場合）、または動脈もしくは静脈に侵入するカテーテル及びその他の外来物体を原因として血流中に侵入することができる。菌血症は、いくつかの帰結をもたらし得る。細菌への免疫応答は、敗血症及び敗血症性ショックを引き起こすことができ、これらは比較的高い死亡率を有する。細菌は、体の他の部分に広がるために血液を用いることもでき、感染症が元の感染部位から離れることを引き起こす。例としては、心内膜炎または骨髄炎が挙げられる。
【０１２３】
「治療有効量」は、特定の障害の測定可能な改善をもたらすために必要な最小限の濃度である。治療有効量は、本明細書において、患者の病状、年齢、性別、及び体重、ならびに個体において所望の応答を引き起こすための抗体の能力のような因子によって変動し得る。治療有効量は、抗体の任意の毒性または有害な影響よりも治療的に有益な効果が勝ることでもある。一実施態様では、治療有効量は、インビボ感染症において菌血症を低減するために有効な量である。一態様では、「  治療有効量」は、少なくとも、血液等の患者試料から単離された細菌負荷またはコロニー形成単位（ＣＦＵ）を、薬物投与の前と比べて少なくとも１ｌｏｇ低減するのに有効な量である。より具体的な態様では、低減は、少なくとも２ｌｏｇである。別の態様では、低減は、少なくとも３、４、５ｌｏｇである。さらに別の態様では、低減は、本明細書に例示されたアッセイを含む、当該技術分野で既知のアッセイを用いる検出可能なレベルより低い。別の実施態様では、治療有効量は、治療期間にわたって与えられる１回以上の投与におけるＡＡＣの量であって、感染した患者の治療の前または治療の開始時の血液培養陽性と比較して、血液培養陰性（すなわちＡＡＣの標的である細菌が成長しない）を達成する量である。
【０１２４】
「予防有効量」は、必要な投与量及び投与期間にて、所望の予防的結果を達成するのに有効な量を指す。必ずではないが、通常、予防的用量は疾患の前、疾患の早期段階または感染症の危険性が上昇する状態への曝露の前にさえ対象において用いられるため、予防有効量は、治療有効量未満であり得る。一実施態様では、予防有効量は、少なくとも、感染症の出現またはある細胞から別の細胞への感染症の広がりを低減し、妨げるのに有効な量である。
【０１２５】
「慢性」投与は、急性の形態に対して、初期の治療効果（活性）を長期間維持するような連続的な薬剤（複数を含む）の投与を指す。「間欠的」投与は、中断なく連続的に行うのではなく、むしろ周期的な治療である。
【０１２６】
「添付文書」という用語は、かかる治療薬の適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌症についての情報、及び／またはその使用に関する警告を含有する、治療剤製品のパッケージに通例含まれる指示書を指すように使用される。
【０１２７】
「キラル」という用語は、鏡像パートナーの重ね合せできない（ｎｏｎ−ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓａｂｉｌｉｔｙ）特性を有する分子を指し、一方で「アキラル」という用語は、それらの鏡像パートナーと重ね合せできる（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓａｂｉｌｉｔｙ）分子を指す。
【０１２８】
「立体異性体」という用語は、同一の化学構成を有するが、空間内の原子または基の配置に関して異なる、化合物を指す。
【０１２９】
「ジアステレオマー」は、２つ以上のキラル性の中心を有し、それらの分子が互いの鏡像でない、立体異性体を指す。ジアステレオマーは、異なる物理特性、例えば、融点、沸点、スペクトル特性、及び反応性を有する。ジアステレオマーの混合物は、電気泳動法及びクロマトグラフィー等の高分解能分析手順の下で分離されてもよい。
【０１３０】
「鏡像異性体」は、互いに重ね合せできない鏡像である、化合物の２つの立体異性体を指す。
【０１３１】
本明細書で使用される立体化学的な定義及び慣例は、一般に、Ｓ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（１９８４）  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＥｌｉｅｌ，Ｅ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（１９９４）  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに従う。多くの有機化合物は、光学的に活性な形態で存在する、すなわち、それらは、平面偏光の面を回転させる能力を有する。光学活性化合物について説明する際、接頭辞Ｄ及びＬ、またはＲ及びＳは、そのキラル中心（複数可）を中心とした分子の絶対配置を表すために使用される。接頭辞ｄ及びｌまたは（＋）及び（−）は、化合物による平面偏光の回転の表示を指定するために用いられ、（−）またはｌは、化合物が左旋性であることを意味する。接頭辞が（＋）またはｄの化合物は、右旋性である。所与の化学構造について、これらの立体異性体は、互いに鏡像であることを除き、同一である。特定の立体異性体はまた、エナンチオマーとも称され、そのような異性体の混合物は、エナンチオマー混合物と呼ばれることがある。エナンチオマーの５０：５０混合物は、ラセミ混合物またはラセミ体と称され、これらは、化学反応またはプロセスにおいて立体選択または立体特異性が存在していない場合に生じ得る。「ラセミ混合物」及び「ラセミ体」は、光学活性がない２つの光学異性体種の等モル混合物を指す。
【０１３２】
「保護基」という用語は、他の官能基が化合物と反応する間に、特定の官能性をブロックまたは保護するために一般的に用いられる置換基を指す。例えば、「アミノ保護基」は、化合物中のアミノ官能性をブロックまたは保護する、アミノ基に結合した置換基である。好適なアミノ保護基には、アセチル、トリフルオロアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、及び９−フルオレニルメチレンオキシカルボニル（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｅｎｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）（Ｆｍｏｃ）が含まれるが、これらに限定されない。保護基及びその使用の一般的な説明については、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１、またはより新しい版を参照されたい。
【０１３３】
本明細書で使用される「約」は、当業者であれば容易に分かるそれぞれの値に対する通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」の値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。
【０１３４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形を含む。例えば、「抗体」への言及は、モル量のような１から多くの抗体までに対する言及であり、当業者に知られているその等価物を含む、等である。
【０１３５】
ＩＩＩ．組成物及び方法
抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）
本明細書において実験結果は、細胞内細菌を排除することを目的とする治療法が臨床的効果を改善するという強力な指標である。このような目的で、本発明は、宿主細胞の細胞内区画に侵入する黄色ブドウ球菌生物体を選択的に死滅させる独自の治療剤を提供する。本発明は、そのような治療剤がバンコマイソン等の従来の抗生物質が効かないインビボモデルで有効であることを実証する。
【０１３６】
本発明は、従来の抗生物質療法を回避する細菌の集団を標的とすることによって抗生物質の回避を防ぐことを目的とする抗菌療法を提供する。     新規の抗生物質療法は、黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡを含む）に見出される細胞壁成分に特異的な抗体が、強力な抗生物質（リファマイシンの誘導体）と化学結合した抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）を用いて達成される。抗生物質は、抗体に、ほとんどの哺乳動物の細胞型に見出される、カテプシンＢ、リソソームプロテアーゼを含むプロテアーゼによって切断されるように設計されているプロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカーを介してつながれる（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１３：８５５−８６９）。その３構成成分を用いたＡＡＣのダイアグラムを図２に示す。いずれの１つの理論にも限定されないが、ＡＡＣの作用の１つの機序を図３に図式化する。ＡＡＣは、リンカーが切断されるまで抗生物質が不活性である（抗体のサイズが大きいことによる）プロドラッグとして作用する。自然の感染において見出される著しい割合の黄色ブドウ球菌が宿主における感染症の経過中のある時点にて宿主細胞、主に好中球及びマクロファージにより取り込まれるため、宿主細胞内で費やされる時間は、細菌が抗生物質活性を逃れる著しい機会を提供する。本発明のＡＡＣは、黄色ブドウ球菌と結合し、細菌が宿主細胞により取り込まれた後にファゴリソソーム内で抗生物質を放出するように設計されている。この機序により、ＡＡＣは、活性な抗生物質を、黄色ブドウ球菌が従来の抗生物質によりうまく治療されない場所において特異的に濃縮することができる。本発明は、特定の作用機序によっても限定または定義されないが、ＡＡＣは、３つの可能性のある機序により抗生物質活性を改善する。（１）ＡＡＣは、抗生物質を、細菌を取り込む哺乳動物細胞の内部に送達し、それによって、細菌が隔離されるファゴリソソーム内にあまり拡散しない抗生物質の力価を増加する。（２）ＡＡＣは細菌をオプソニン化し、それによって、食細胞による遊離細菌の取り込みが増加し、抗生物質を局所的に放出して、細菌がファゴリソソームに隔離されている間に細菌を死滅させる。何千ものＡＡＣが、単一細菌と結合することができるため、このプラットフォームは、最大の抗菌の死滅を持続させるようなこれらの細胞内生態的地位において十分な抗生物質を放出する。さらに、より多くの細菌が前から存在する細胞内保有宿主から放出されるため、この抗体をベースとする療法の迅速な結合速度は、細菌が近隣または遠隔の細胞へと逃避し得る前に、これらの細菌の即時の「タギング」を確実にし、そのため、感染症のさらなる蔓延を軽減する。（３）ＡＡＣは、血清から急速に除外される抗生物質と比較して、抗生物質を抗体と結合させることにより、抗生物質のインビボ半減期を改善する（改善された薬物動態）。ＡＡＣの改善された薬物動態は、全身投与する必要がある抗生物質の全体的な用量を制限しながら、黄色ブドウ球菌が濃縮された領域に十分な抗生物質を送達することができる。この特性は、最小限の抗生物質副作用で、持続的な感染症を標的にするＡＡＣを用いる長期療法を可能にする。
【０１３７】
プロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカーによって、リファマイシン型抗生物質に共有結合される、抗壁テイコ酸（ＷＴＡ）抗体を含む、抗体−抗生物質複合化合物。
【０１３８】
例示的な実施形態は、式、
Ａｂ−（ＰＭＬ−ａｂｘ）ｐ、
を有する抗体−抗生物質複合体であって、
式中、
Ａｂが、抗壁テイコ酸抗体であり、
ＰＭＬが、式、
−Ｓｔｒ−ＰＭ−Ｙ−
を有する、プロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカーであって、
式中、Ｓｔｒがストレッチャー単位であり、ＰＭがペプチドミメティック単位であり、Ｙがスペーサー単位であり、
ａｂｘが、リファマイシン型抗生物質であり、
ｐが、１〜８の整数である。
【０１３９】
リファマイシン型抗生物質は、リファラジル型抗生物質であってもよい。
【０１４０】
リファマイシン型抗生物質は、プロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカーに結合している第４級アミンを含んでもよい。
【０１４１】
抗体−抗生物質複合体の例示的な実施形態は、式Ｉ、
0006742314.tif 000006
Ｉ
を有し、
式中、
破線が、任意選択の結合を示し、
Ｒが、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、またはＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、
Ｒ１がＯＨであり、
Ｒ２がＣＨ＝Ｎ−（ヘテロシクリル）であり、式中、ヘテロシクリルが、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ２０ヘテロシクリル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、及びＣ３−Ｃ１２カルボシクリルから独立して選択される１つ以上の基と任意に置換されるか、
または、Ｒ１及びＲ２が、５または６員縮合ヘテロアリールまたはヘテロシクリルを形成し、任意に、スピロまたは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環を形成し、スピロまたは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環が、任意に置換されたＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、またはＯＨであり、
ＰＭＬが、Ｒ２と結合しているプロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカー、またはＲ１及びＲ２によって形成された縮合ヘテロアリールもしくはヘテロシクリルであり、
Ａｂが、抗壁テイコ酸（ＷＴＡ）抗体である。
【０１４２】
反応性リンカー部分を介して抗体分子に複合され得る抗生物質部分の数は、本明細書に記載される方法によって導入される遊離システイン残基の数によって制限され得る。例示的なＡＡＣは、１、２、３、または４個の操作システインアミノ酸を有する抗体を含む（Ｌｙｏｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ（２０１２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．５０２：１２３−１３８）。
【０１４３】
抗壁テイコ酸（ＷＴＡ）抗体
黄色ブドウ球菌を含む多くのＧｍ＋細菌上で発現されるＷＴＡと結合するある特定の抗ＷＴＡ  Ａｂ及び複合した抗ＷＴＡ抗体が、本明細書に開示される。抗ＷＴＡ抗体は、ＵＳ８２８３２９４、Ｍｅｉｊｅｒ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ（２００６）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３５８（３）：７６４−７２、Ｌａｎｔｔｏ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ（２０１１）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８５（４）：１８２０−３３、及び以下の実施例３〜４において教示される方法によって選択し、生成することができる。
【０１４４】
グラム陽性細菌の細胞壁は、細胞膜を安定化するだけでなく、他の分子が結合できる多くの部位も提供する複数のペプチドグリカン（ＰＧＮ）の鞘の厚い層から構成される（図４）。これらの細胞表面糖タンパク質の主なクラスは、タイコ酸（「ＴＡ」）であり、これは、多くのグリカン結合タンパク質（ＧＰＢ）上で見出されるホスフェートに富む分子である。ＴＡには２種類ある：（１）原形質膜に係留され、細胞表面からペプチドグリカン層まで延びるリポタイコ酸（「ＬＴＡ」）、及び（２）ペプチドグリカンと共有結合し、細胞壁全体及び細胞壁を超えて延びる壁ＴＡ（ＷＴＡ）（図４）。ＷＴＡは、ＧＰＢにおける全細胞壁質量の６０％ほどを占めることができる。結果として、これは、高度に発現される細胞表面抗原を提示する。
【０１４５】
ＷＴＡの化学構造は、生物体の間で変動する。黄色ブドウ球菌では、ＷＴＡは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）−１−Ｐ及びＮ−アセチルマンノースアミン（ＭａｎＮＡｃ）から構成される二糖を介してＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）の６−ＯＨと共有結合し、その後に約２または３単位のグリセロールリン酸が続く（図５）  実際のＷＴＡポリマーは、次いで、約１１〜４０のリビトールリン酸（Ｒｂｏ−Ｐ）反復単位から構成される。ＷＴＡの段階的合成は、まず、ＴａｇＯと呼ばれる酵素により開始され、（遺伝子の欠失により）ＴａｇＯ遺伝子を欠く黄色ブドウ球菌株は、いかなるＷＴＡも作らない。反復単位は、Ｃ２−ＯＨにてＤ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ）及び／またはＣ４−ＯＨ位にてＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）で、α−（アルファ）またはβ−（ベータ）グリコシド結合を介してさらに調整することができる。黄色ブドウ球菌株または細菌の成長期に応じて、グリコシド結合は、α−、β−、または２つのアノマーの混合物であり得る。これらのＧｌｃＮＡｃ糖修飾は、２つの特異的な黄色ブドウ球菌由来グリコシルトランスフェラーゼ（Ｇｔｆ）により調整され、ＴａｒＭ  Ｇｔｆはα−グリコシド結合を媒介し、ＴａｒＳ  Ｇｔｆは、β−（ベータ）グリコシド結合を媒介する。
【０１４６】
ＭＲＳＡの細胞内貯蔵物が抗生物質から保護されることを示す著しい証拠があることに鑑みて、本発明の新規な治療組成物は、黄色ブドウ球菌特異的抗体を用いて、細菌が宿主細胞によりインビボで飲み込まれるかまたは内部移行された場合に抗生物質を一緒に宿主細胞内に持ち込むように抗生物質を細菌につなぎとめることによりこの方法での抗生物質回避を妨げるように開発された。
【０１４７】
本発明のＡＡＣの抗ＷＴＡ抗体は、抗ＷＴＡαまたは抗ＷＴＡβ抗体であり得る。本明細書を通して提供される例示的な抗ＷＴＡ  Ａｂは、黄色ブドウ球菌感染患者からのＢ細胞からクローニングされた（以下の実施例において教示されるように）。一実施形態では、抗ＷＴＡ及び抗黄色ブドウ球菌Ａｂは、ヒトモノクローナル抗体である。本発明のＡＡＣまたはＴＡＣは、本発明のＷＴＡ  ＡｂのＣＤＲを含むキメラＡｂ及びヒト化Ａｂを包含する。
【０１４８】
本発明の治療的使用のために、抗生物質に複合してＡＡＣを作製するためのＷＴＡ  Ａｂは、ＩｇＭ以外の任意のアイソタイプのものであり得る。一実施形態では、ＷＴＡ  Ａｂは、ヒトＩｇＧアイソタイプのものである。より具体的な実施態様では、ＷＴＡ  Ａｂは、ヒトＩｇＧ１である。
【０１４９】
本明細書及び図を通して、４桁の数字（例えば４４９７）で示すＡｂは、先行する「Ｓ」とともに例えばＳ４４９７とも称され得、両方の名称は、抗体の野生型（ＷＴ）の非修飾の配列である同じ抗体と称される。抗体の変異体は、抗体番号の後に「ｖ」で例えば４４９７ｖ８と示す。特に明記しない限り（例えば変異体番号によるような）、示すアミノ酸配列は、元の非修飾／未改変の配列である。これらのＡｂは、野生型で非修飾の抗体と比較して、抗原との結合親和性を実質的にほぼ同じに保つかまたは改善しながら、例えばｐＫ、安定性、発現、製造しやすさ（例えば以下の実施例に記載されるように）を改善するために、１つ以上の残基にて改変することができる。保存的アミノ酸置換を有する本発明のＷＴＡ抗体の変異体は、本発明に包含される。以下、そうでないと明記しない限り、ＣＤＲ番号付けは、Ｋａｂａｔに従い、定常ドメイン番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。
【０１５０】
ＴＡＣ化合物を生成するための複合のために、本発明の抗ＷＴＡ抗体は、以下に教示されるように、リンカー−抗生物質中間体への複合のためのＬ鎖及びＨ鎖のうちの一方またはその両方において操作されたＣｙｓを含み得る。
【０１５１】
図１１Ａ及び図１１Ｂは、４つのヒト抗ＷＴＡアルファ抗体のそれぞれ軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列アラインメントを提供する。Ｋａｂａｔ番号付けに従うＣＤＲ配列ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３に下線を付す。
【０１５２】
表１Ａ：抗ＷＴＡαの軽鎖ＣＤＲ配列
0006742314.tif 000007
表１Ｂ：抗ＷＴＡαの重鎖ＣＤＲ配列
0006742314.tif 000008
【０１５３】
ＶＬ及びＶＨのそれぞれの対の配列は、以下の通りである。
４４６１軽鎖可変領域
0006742314.tif 000009
４４６１重鎖可変領域
0006742314.tif 000010
４６２４軽鎖可変領域
0006742314.tif 000011
４６２４重鎖可変領域
0006742314.tif 000012
４３９９軽鎖可変領域
0006742314.tif 000013
４３９９重鎖可変領域
0006742314.tif 000014
６２６７軽鎖可変領域
0006742314.tif 000015
６２６７重鎖可変領域
0006742314.tif 000016
【０１５４】
ＡＡＣ化合物の生成のために、本発明は、軽鎖及びＨ鎖を含む壁テイコ酸アルファ（ＷＴＡα）と結合する単離モノクローナル抗体を提供し、Ｌ鎖は、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、及びＣＤＲ  Ｌ３を含み、Ｈ鎖は、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、及びＣＤＲ  Ｈ３を含み、ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＨ１、Ｈ２、Ｈ３は、上の表１Ａ及び１Ｂ中に示されるように、それぞれ、Ａｂ４４６１（配列番号１〜６）、４６２４（配列番号７〜１２）、４３９９（配列番号１３〜１８）、及び６２６７（配列番号１９〜２４）の各々のＣＤＲのアミノ酸配列を含む。
【０１５５】
別の実施形態では、ＷＴＡαと結合する単離モノクローナルＡｂは、Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）及びＬ鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは、それぞれ、抗体４４６１、４６２４、４３９９、及び６２６７の各々のＶＨ領域配列の長さにわたって少なくとも９５％の配列同一性を有する。さらに別の特定の態様では、配列同一性は、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。
【０１５６】
本発明は、図１２に例示されるＡｂの一覧からの抗ＷＴＡベータ抗体を含むＡＡＣも提供する。一実施形態では、単離抗ＷＴＡ  ベータモノクローナルＡｂは、図１２中の１３個のＡｂの各々のＣＤＲからなる群から選択されるＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＨ１、Ｈ２、Ｈ３を含む。別の実施形態では、本発明は、１３個の抗体の各々のＶ領域ドメインの長さにわたって少なくとも９５％の配列同一性を含む単離抗ＷＴＡベータＡｂを提供する。さらに別の特定の態様では、配列同一性は、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。
【０１５７】
１３個の抗ＷＴＡ  ベータＡｂのうち、６０７８及び４４９７は、ｉ）リンカー−抗生物質中間体への複合のためにＬ及びＨ鎖の一方または両方に操作されたＣｙｓを有し、ｉｉ）Ｈ鎖の最初の残基ＱがＥ（ｖ２）に、または最初の２残基ＱＭがＥＩまたはＥＶ（ｖ３及びｖ４）に変更された変異体を創出するように修飾された。
【０１５８】
図１３Ａ−１及び１３Ａ−２は、抗ＷＴＡベータＡｂ６０７８（非修飾）及びその変異体ｖ２、ｖ３、ｖ４の完全長Ｌ鎖のアミノ酸配列を提供する。操作されたＣｙｓを含むＬ鎖変異体は、定常領域の端の黒い箱の中のＣ（この場合、ＥＵ残基第２０５番）で示される。変異体の命名、例えばｖ２ＬＣ−Ｃｙｓは、Ｌ鎖中に操作されたＣｙｓを含む変異体２を意味する。ＨＣＬＣ−Ｃｙｓは、抗体のＨ及びＬ鎖の両方が操作されたＣｙｓを含むことを意味する。図１３Ｂ−１〜１３Ｂ−４は、抗ＷＴＡベータＡｂ６０７８（非修飾）及びＨ鎖の最初の残基または最初の２残基に変更を有するその変異体ｖ２、ｖ３、ｖ４の完全長Ｈ鎖のアラインメントを示す。操作されたＣｙｓを含むＨ鎖変異体は、定常領域の端の黒い箱の中のＣ（ＥＵ残基第１１８番）で示される。
【０１５９】
６０７８軽鎖可変領域（ＶＬ）
0006742314.tif 000017
６０７８重鎖可変領域（ＶＨ）
0006742314.tif 000018
式中、Ｘは、ＱまたはＥであり、Ｘ１は、
Ｍ、Ｉ、またはＶである。
６０７８軽鎖
0006742314.tif 000019
６０７８システイン操作軽鎖
0006742314.tif 000020
６０７８  ＷＴ完全長重鎖
0006742314.tif 000021
６０７８変異体（ｖ２、ｖ３、またはｖ４）完全長重鎖
0006742314.tif 000022
式中、Ｘは、Ｍ、Ｉ、またはＶであり得る。
６０７８変異体（ｖ２、ｖ３、またはｖ４）、Ｃｙｓ操作された重鎖
0006742314.tif 000023
式中、Ｘは、Ｍ、Ｉ、またはＶである。
【０１６０】
一実施形態では、本発明は、重鎖及び軽を含む単離抗ＷＴＡベータ抗体を提供し、重鎖は、配列番号１１２と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨを含む。さらなる実施形態では、この抗体は、配列番号１１１と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬを含む。具体的な実施形態では、抗ＷＴＡベータ抗体は、軽鎖及び重鎖を含み、Ｌ鎖は、配列番号１１１のＶＬを含み、Ｈ鎖は、配列番号１１２のＶＨを含む。さらにより具体的な実施形態では、単離抗ＷＴＡベータ抗体は、配列番号１１３のＬ鎖及び配列番号１１４のＨ鎖を含む。
【０１６１】
６０７８  Ｃｙｓ操作されたＨ及びＬ鎖変異体を以下の組み合わせのいずれかでペアリングして、リンカーＡｂｘ中間体に複合して本発明の抗ＷＴＡ  ＡＡＣを作製するための全長Ａｂを形成することができる。非修飾のＬ鎖（配列番号１１３）は、配列番号１１７のＣｙｓ操作されたＨ鎖変異体とペアリングすることができ、変異体は、ＸがＭ、Ｉ、またはＶであるものであり得る。配列番号１１５のＣｙｓ操作されたＬ鎖は、配列番号１１４のＨ鎖、配列番号１１６のＨ鎖変異体または配列番号１１７のＣｙｓ操作されたＨ鎖変異体（このバージョンでは、Ｈ及びＬ鎖の両方がＣｙｓ操作されている）とペアリングすることができる。特定の実施態様では、本発明の抗ＷＴＡベータ抗体及び抗ＷＴＡベータＡＡＣは、配列番号１１５のＬ鎖及び配列番号１１６のＨ鎖を含む。
【０１６２】
図１４Ａ−１及び１４Ａ−２は、抗ＷＴＡベータＡｂ４４９７（非修飾）及びそのｖ８変異体の完全長Ｌ鎖を提供する。操作されたＣｙｓを含むＬ鎖変異体は、定常領域の端付近の黒い箱の中のＣ（ＥＵ残基第２０５番）で示される。図１４Ｂ−１、１４Ｂ−２、１４Ｂ−３は、抗ＷＴＡベータＡｂ４４９７（非修飾）及びＣＤＲ  Ｈ３の９６位にてＤがＥに改変され、操作されたＣｙｓを有するかまたは有さないそのｖ８変異体の完全長Ｈ鎖のアラインメントを示す。操作されたＣｙｓを含むＨ鎖変異体は、定常領域ＣＨ１の開始時に黒い箱の中のＣ（ＥＵ残基第１１８番）で示される。非修飾ＣＤＲ  Ｈ３は、ＧＤＧＧＬＤＤ（配列番号１０４）であり、４４９７ｖ８  ＣＤＲ  Ｈ３は、ＧＥＧＧＬＤＤ（配列番号１１８）である。
【０１６３】
４４９７軽鎖可変領域
0006742314.tif 000024
４４９７重鎖可変領域
0006742314.tif 000025
４４９７．ｖ８重鎖可変領域
0006742314.tif 000026
４４９７軽鎖
0006742314.tif 000027
４４９７  ｖ．８重鎖
0006742314.tif 000028
４４９７−Ｃｙｓ軽鎖
0006742314.tif 000029
４４９７．ｖ８−重鎖
0006742314.tif 000030
【０１６４】
４４９７．ｖ８−Ｃｙｓ重鎖
0006742314.tif 000031
【０１６５】
本発明により提供される別の単離抗ＷＴＡベータ抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号１２０と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨを含む。さらなる実施形態では、この抗体は、配列番号１１９と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬをさらに含む。具体的な実施形態では、抗ＷＴＡベータ抗体は、軽鎖及び重鎖を含み、Ｌ鎖は、配列番号１１９のＶＬを含み、Ｈ鎖は、配列番号１２０のＶＨを含む。さらにより具体的な実施形態では、単離抗ＷＴＡベータ抗体は、配列番号１２１のＬ鎖配列番号１２２のＨ鎖を含む。
【０１６６】
４４９７  Ｃｙｓ操作されたＨ及びＬ鎖変異体を以下の組み合わせのいずれかでペアリングして、リンカー−Ａｂｘ中間体に複合して本発明の抗ＷＴＡ  ＡＡＣを作製するための全長Ａｂを形成することができる。非修飾のＬ鎖（配列番号１２１）は、配列番号１２４のＣｙｓ操作されたＨ鎖変異体とペアリングすることができる。配列番号１２３のＣｙｓ操作されたＬ鎖は、配列番号１５７のＨ鎖変異体または配列番号１２４のＣｙｓ操作されたＨ鎖変異体（このバージョンでは、Ｈ及びＬ鎖の両方がＣｙｓ操作されている）とペアリングすることができる。特定の実施態様では、本発明の抗ＷＴＡベータ抗体及び抗ＷＴＡベータＡＡＣは、配列番号１２３のＬ鎖を含む。
【０１６７】
さらに別の実施形態は、図１１Ａ及び図１１Ｂの抗ＷＴＡアルファＡｂの各々と同じエピトープに結合する抗体である。図１２、図１３Ａ及び１３Ｂ、ならびに図１４Ａ及び１４Ｂの抗ＷＴＡベータＡｂの各々と同じエピトープに結合する抗体も提供される。
【０１６８】
ＷＴＡとの抗ＷＴＡ抗体の結合は、ＷＴＡ上のＧｌｃＮＡｃ−糖修飾のアノマーの向きに影響される。ＷＴＡは、それぞれ、ＴａｒＭグリコシルトランスフェラーゼまたはＴａｒＳグリコシルトランスフェラーゼにより、α−またはβ−グリコシド結合を介してＣ４−ＯＨ位にてＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）糖修飾により修飾される。したがって、ＴａｒＭ（ΔＴａｒＭ）、ＴａｒＳ（ΔＴａｒＳ）、またはＴａｒＭ及びＴａｒＳの両方（ΔＴａｒＭ／ΔＴａｒＳ）を欠くグリコシルトランスフェラーゼ突然変異体株からの細胞壁調製物を、ＷＴＡに対する抗体を用いるイムノブロッティング分析に供した。ＷＴＡ上のα−ＧｌｃＮＡｃ修飾に特異的なＷＴＡ抗体（Ｓ７５７４）は、ΔＴａｒＭ株からの細胞壁調製物と結合しない（Ｍｅｉｊｅｒ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）  “Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｐａｉｒｉｎｇ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３５８，７６４−７７２）。逆に、ＷＴＡ上のβ−ＧｌｃＮＡｃ修飾に特異的なＷＴＡ抗体（Ｓ４４６２）は、ΔＴａｒＳ株からの細胞壁調製物と結合しない。予期されたように、これらの抗体はともに、両方のグリコシルトランスフェラーゼを欠く欠失株（ΔＴａｒＭ／ΔＴａｒＳ）及びいずれのＷＴＡも欠く株（ΔＴａｇＯ）からの細胞壁調製物と結合しない。このような分析に従って、抗体は、図６Ａ及び６Ｂの表に列挙する抗α−ＧｌｃＮＡｃ  ＷＴＡ  ｍＡｂまたは抗β−ＧｌｃＮＡｃ  ＷＴＡ  ｍＡｂと特徴付けられている。
【０１６９】
システインアミノ酸は、鎖内または分子間ジスルフィド結合を形成しない抗体の反応部位にて操作してもよい（Ｊｕｎｕｔｕｌａ，ｅｔ  ａｌ．，２００８ｂ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６（８）：９２５−９３２、Ｄｏｒｎａｎ  ｅｔ  ａｌ（２００９）  Ｂｌｏｏｄ  １１４（１３）：２７２１−２７２９、ＵＳ７５２１５４１、ＵＳ７７２３４８５、ＷＯ２００９／０５２２４９、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３０（２）：１８４−１９１、Ｊｕｎｕｔｕｌａ  ｅｔ  ａｌ（２００８）  Ｊｏｕｒ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３３２：４１−５２）。操作されたシステインチオールは、マレイミドまたはアルファ−ハロアミドのようなチオール反応性で求電子性の基を有する本発明のリンカー試薬またはリンカー−抗生物質中間体と反応して、システイン操作抗体（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）またはｔｈｉｏＭａｂ）及び抗生物質（ａｂｘ）部分を有するＡＡＣを形成することができる。それ故に、抗生物質部分の場所は、設計され、制御され、既知であり得る。抗生物質の負荷量は、操作されたシステインチオール基が、典型的に、チオール反応性リンカー試薬またはリンカー−抗生物質中間体と高い収率で反応するため、制御され得る。重鎖または軽鎖の単一部位にて置換によりシステインアミノ酸を導入するために抗ＷＴＡ抗体を操作することにより、対称のテトラマー抗体上に２つの新しいシステインが得られる。２に近い抗生物質の負荷量を達成することができ、複合生成物ＡＡＣのほぼ均一性を達成することができる。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、抗体の１個以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗ＷＴＡ抗体、例えば、「チオＭＡｂ」を創出することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換残基は、抗体の利用しやすい部位において生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基がそれにより抗体の利用しやすい部位に位置付けられ、それを使用して、抗生物質部分またはリンカー−抗生物質部分等の他の部分に抗体を複合して、本明細書にさらに記載される免疫複合体を作り出してもよい。ある特定の実施形態では、次の残基のうちの任意の１個以上が、軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ付番）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ付番）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ付番）を含む、システインで置換されてもよい。抗ＷＴＡ抗体の非限定的で例示的なシステイン操作重鎖Ａ１１８Ｃ（配列番号１４９）及び軽鎖Ｖ２０５Ｃ（配列番号１５１）突然変異体を示す。システイン操作抗ＷＴＡ抗体は、記載されるようにして作製してよい（Ｊｕｎｕｔｕｌａ，ｅｔ  ａｌ．，２００８ｂ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６（８）：９２５−９３２、ＵＳ７５２１５４１、ＵＳ−２０１１／０３０１３３４号。
【０１７１】
別の実施形態では、本発明は、ＡＡＣを作製するための複合のための単離抗ＷＴＡ抗体を提供し、該抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、野生型重鎖定常領域配列またはシステイン操作突然変異体（チオＭａｂ）を含み、軽鎖は、野生型軽鎖定常領域配列またはシステイン操作突然変異体（チオＭａｂ）を含む。一態様では、重鎖は、以下のものに対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、
重鎖（ＩｇＧ１）定常領域、野生型
0006742314.tif 000032
重鎖（ＩｇＧ１）定常領域、Ａ１１８Ｃ「チオＭａｂ」
0006742314.tif 000033
軽鎖は、以下のものに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
軽鎖（カッパ）定常領域、野生型
0006742314.tif 000034
軽鎖（カッパ）定常領域、Ｖ２０５Ｃ「チオＭａｂ」
0006742314.tif 000035
【０１７２】
本発明のＡＡＣは、野生型または親抗ＷＴＡ抗体の１つ以上のアミノ酸がシステインアミノ酸で置き換えられた、システイン操作抗ＷＴＡ抗体を含む。抗体のいずれの形態も、そのように操作、すなわち変異させることができる。例えば、親Ｆａｂ抗体断片を操作して、本明細書において「チオＦａｂ」というシステイン操作Ｆａｂを形成してもよい。同様に、親のモノクローナル抗体を操作して、「チオＭａｂ」を形成してもよい。単一部位の突然変異は、チオＦａｂにおいて単一の操作されたシステイン残基を生じるが、単一部位変異は、ＩｇＧ抗体のダイマーの性質により、チオＭａｂにおいて２つの操作されたシステイン残基を生じることに注意すべきである。置き換えられた（「操作された」）システイン（Ｃｙｓ）残基を有する突然変異体は、新しく導入された、操作されたシステインチオール基の反応性について評価される。
【０１７３】
本明細書に記載される抗体は、培養において宿主細胞を用いて生成してもよい。宿主細胞は、本明細書に記載される抗体をコードする１つ以上の核酸を含むベクター（発現またはクローニングベクター）で形質転換してもよい。細胞を、抗体を生成するために適切な条件下で培養し、細胞により生成される抗体をさらに精製してもよい。抗体を生成するために適切な細胞は、原核生物、酵母、または高等真核生物（例えば哺乳動物）細胞を含んでもよい。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞（ヒトまたは非ヒト哺乳動物細胞）を用いる。いくつかの実施形態では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いる。
【０１７４】
哺乳動物細胞を培養してもよく、培養（組織培養）における哺乳動物細胞の増殖は、常套的手段になっている。哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（２９３または懸濁培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌系列（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられ得るが、これらに限定されない。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＮＳ０及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生のために適切なある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説について、例えばＹａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２５５−２６８を参照されたい。
【０１７５】
綿花、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、ウキクサ（Ｌｅｎｉｎａｃｅａｅ）、アルファルファ（Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、及びタバコの植物細胞培養物も宿主として利用することができる。
【０１７６】
この目的のために適切な原核細胞としては、グラム陰性またはグラム陽性生物体のような真正細菌、例えば腸内細菌科、例えばエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば大腸菌、エンテロバクター属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えば、サルモネラ・チフィムリウム、セラチア属、例えば、セラチア・マルセッセンス、及び赤痢菌属、ならびにバシラス・サブチリス及びバシラス・リケニフォルミス等のバシラス（例えば、１９８９年４月１２日出版のＤＤ  ２６６，７１０に開示されているバシラス・リケニフォルミス４１Ｐ）、緑膿菌及びストレプトミセス等のシュードモナス属が挙げられる。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）等の他の株が好適である。これらの例は、限定的なものではなく例示的なものである。
【０１７７】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母等の真核微生物は、抗体をコードするベクターに好適なクローニングまたは発現宿主である。出芽酵母または一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物のうちで最も一般的に用いられる。しかしながら、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えばＫ．ラクチス、Ｋ．フラギリス（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ブルガリカス（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋウィカラミイ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ワルティイ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マーキシアヌス；ヤロウィニア（ＥＰ  ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（ＥＰ  １８３，０７０）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア（ＥＰ  ２４４，２３４）；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス；ならびに糸状菌、例えばニューロスポラ、ペニシリカム、トリポクラジウム、及びアスペルギルス宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロコウジカビのような多くの他の属、種、及び株が通常利用可能であり、本明細書において有用である。
【０１７８】
リファマイシン型抗生物質部分
本発明の抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）の抗生物質部分（ａｂｘ）は、細胞毒性効果または細胞静止効果を有するリファマイシン型抗生物質または基である。リファマイシンは、細菌、ノカルジアメディターラネイ、アミコラトプシスメディターラネイによって天然に、または人工的に得られる抗生物質の群である。これらは、より大きなアンサマイシンファミリーのサブクラスであり、細菌ＲＮＡポリメラーゼ（Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１４８９−１４９２、Ｆｅｋｌｉｓｔｏｖ，ｅｔ  ａｌ（２００８）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０５（３９）：１４８２０−５）を阻害し、グラム陽性及び選択的グラム陰性細菌に対して効力を有する。リファマイシンは、マイコバクテリアに対して特に効果的であり、そのため、結核、癩病、及びマイコバクテリウムアビウムコンプレックス（ＭＡＣ）感染症を治療するために用いられる。リファマイシン型の基としては、「古典的」リファマイシン薬物、ならびにリファマイシン誘導体リファンピシン（リファンピシン、ＣＡ  Ｒｅｇ．番号１３２９２−４６−１）、リファブチン（ＣＡ  Ｒｅｇ．番号７２５５９−０６−９、２０１１／０１７８００１号）、リファペンチン、及びリファラジル（ＣＡ  Ｒｅｇ．番号１２９７９１−９２−０、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ（２００３）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  １２（２）：２５５−２７１、Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８：１１１８−１１２２が挙げられる。多くのリファマイシン型抗生物質は、耐性の発展という有害な特性を共有する（Ｗｉｃｈｅｌｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ（２００１）．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４７：１５３−１５６）。リファマイシンは、ストレプトマイセスメディターラネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）の発酵培養物から１９５７年に最初に単離された。約７種のリファマイシンが発見され、リファマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、及びＳＶと命名された（ＵＳ３１５００４６）。リファマイシンＢは、最初に商業的に導入され、１９６０年代に薬物耐性結核の治療において有用であった。リファマイシンは、多くの疾患の治療のために用いられ、最も重要なものはＨＩＶ関連結核である。多数の利用可能なアナログ及び誘導体のために、リファマイシンは、通常用いられる抗生物質に対して耐性になった病原性細菌の排除に広く利用されている。例えば、リファンピシンは、薬物耐性を妨げる有効な効果及び能力があることが知られている。これは、迅速に分裂する桿菌株とともに、生物学的に不活性なまま長期間残っているため抗生物質活性を逃れることができる「生残菌」細胞を迅速に死滅させる。さらに、リファブチン及びリファペンチンは両方とも、ＨＩＶ陽性患者で獲得された結核に対して用いられている。
【０１７９】
式Ｉの抗体−抗生物質複合体の抗生物質部分（ａｂｘ）は、構造、
0006742314.tif 000036
を有するリファマイシン型部分であって、
式中、
破線が、任意選択の結合を示し、
Ｒが、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、またはＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、
Ｒ１がＯＨであり、
Ｒ２がＣＨ＝Ｎ−（ヘテロシクリル）であり、式中、ヘテロシクリルが、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ２０ヘテロシクリル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、及びＣ３−Ｃ１２カルボシクリルから独立して選択される１つ以上の基と任意に置換されるか、
または、Ｒ１及びＲ２が、５または６員縮合ヘテロアリールまたはヘテロシクリルを形成し、任意に、スピロまたは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環を形成し、当該スピロまたは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環が、任意に置換されたＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、またはＯＨであり、
非ペプチドリンカーＰＭＬが、Ｒ２と共有結合する。
【０１８０】
リファマイシン型部分の一実施形態は、
0006742314.tif 000037
であり、
式中、Ｒ３が、独立して、Ｈ及びＣ１−Ｃ１２アルキルから選択され、Ｒ４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、及びＯＨから選択され、Ｚが、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１−Ｃ１２アルキル）、Ｏ、及びＳから選択され、非ペプチドリンカーＰＭＬが、Ｎ（Ｒ３）２の窒素原子と共有結合する。
【０１８１】
リファンピシン型部分の一実施形態は、
0006742314.tif 000038
であり、式中、
Ｒ５が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから選択され、、非ペプチドリンカーＰＭＬが、ＮＲ５の窒素原子と共有結合する。
【０１８２】
リファブチン型部分の一実施形態は、
0006742314.tif 000039
であり、式中、Ｒ５が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから選択され、非ペプチドリンカーＰＭＬが、ＮＲ５の窒素原子と共有結合する。
【０１８３】
ベンゾキサジノリファマイシン型部分の一実施形態は、
0006742314.tif 000040
であり、式中、Ｒ５が、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから選択され、非ペプチドリンカーＰＭＬが、ＮＲ５の窒素原子と共有結合する。
【０１８４】
本明細書においてｐｉｐＢＯＲと称される、ベンゾキサジノリファマイシン型部分の一実施形態は、
0006742314.tif 000041
であり、式中、Ｒ３が、独立して、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから選択され、非ペプチドリンカーＰＭＬが、Ｎ（Ｒ３）２の窒素原子と共有結合する。
【０１８５】
本明細書においてジメチルｐｉｐＢＯＲと称される、ベンゾキサジノリファマイシン型部分の一実施形態は、
0006742314.tif 000042
であり、式中、非ペプチドリンカーＰＭＬが、ジメチルアミノ窒素原子と共有結合する。
【０１８６】
半合成誘導体リファマイシンＳ、または還元ナトリウム塩形態リファマイシンＳＶは、いくつかのステップでリファラジル型抗生物質に変換することができ、式中、Ｒが、ＨまたはＡｃであり、Ｒ３が、独立して、Ｈ及びＣ１−Ｃ１２アルキルから選択され、Ｒ４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、及びＯＨから選択され、Ｚが、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１−Ｃ１２アルキル）、Ｏ、及びＳから選択される（例えば、ＷＯ２０１４／１９４２４７の図２３Ａ及びＢ、ならびに図２５Ａ及びＢを参照のこと）。ベンゾキサジノ（Ｚ＝Ｏ）、ベンズチアジノ（Ｚ＝Ｓ）、ベンズジアジノ（Ｚ＝ＮＨ、Ｎ（Ｃ１−Ｃ１２アルキル）リファマイシンを調製してもよい（ＵＳ７２７１１６５号）。置換基を含む、ベンゾキサジノリファマイシン（ＢＯＲ）、ベンゾチアジノリファマイシン（ＢＴＲ）、及びベンズジアジノリファマイシン（ＢＤＲ）アナログは、ＵＳ７２７１１６５（この目的のために、参照により組み込まれる）の第２８欄の式Ａに提供される番号付けスキームに従って番号付けされる。「２５−Ｏ−デアセチル」リファマイシンは、２５位のアセチル基が除去されたリファマイシンアナログを意味する。この位置がさらに誘導体化されたアナログは、「２５−Ｏ−デアセチル−２５−（置換基）リファマイシン」と称され、完全な化合物名では誘導体化する基の名称が「置換基」を置き換える。
【０１８７】
リファマイシン型抗生物質部分は、ＵＳ４６１０９１９、ＵＳ４９８３６０２、ＵＳ５７８６３４９、ＵＳ５９８１５２２、ＵＳ４８５９６６１、ＵＳ７２７１１６５、ＵＳ２０１１／０１７８００１、Ｓｅｌｉｇｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  １２：３０５−１３、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，（１９９３）  ４１：１４８、及びＷＯ２０１４／１９４２４７（これらの各々は、参照により組み込まれる）に開示されるものと類似する方法によって合成することができる。リファマイシン型抗生物質部分は、標準的なＭＩＣインビトロアッセイを用いてそれらの最小阻止濃度（ＭＩＣ）を測定することによって抗微生物活性についてスクリーニングすることができる（Ｔｏｍｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３７：６７）。
【０１８８】
0006742314.tif 000043
【０１８９】
プロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカー
「プロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカー」（ＰＭＬ）は、１つ以上の抗生物質部分（ａｂｘ）及び抗体単位（Ａｂ）と共有結合して、式Ｉの抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）を形成する二官能性または多官能性部分である。ＡＡＣ中のプロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカーは、リソソーム条件下を含む細胞内プロテアーゼによる切断についての基質である。プロテアーゼとしては、様々なカテプシン及びカスパーゼが挙げられる。細胞内部でのＡＡＣの非ペプチドリンカーの切断は、抗菌効果を有するリファマイシン型抗生物質を放出することができる。
【０１９０】
抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）は、簡便には、抗生物質（ａｂｘ）及び抗体（Ａｂ）との結合のための反応性機能性を有するリンカー試薬またはリンカー−抗生物質中間体を用いて調製することができる。ある例示的な実施形態では、システイン改変抗体（Ａｂ）のシステインチオールは、リンカー試薬、抗生物質部分、または抗生物質−リンカー中間体の官能基との結合を形成することができる。
【０１９１】
ＡＡＣのＰＭＬ部分は、１つのアミノ酸残基を含んでもよい。
【０１９２】
ＡＡＣのＰＭＬ部分は、ペプチドミメティック単位を含む。
【０１９３】
一態様では、リンカー試薬またはリンカー−抗生物質中間体は、抗体上に存在する求核システインと反応性である求電子基を有する反応部位を有する。抗体のシステインチオールは、リンカー試薬またはリンカー−抗生物質上の求電子基と反応性であり、共有結合を形成する。有用な求電子基としては、マレイミド及びハロアセトアミド基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９４】
システイン改変抗体は、Ｋｌｕｓｓｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ（２００４），  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５（４）：７６５−７７３の７６６頁の複合法、及び実施例１９のプロトコルに従って、リンカー試薬またはリンカー−抗生物質中間体、マレイミドもしくはα−ハロカルボニル等の求電子官能基と反応する。
【０１９５】
別の実施形態では、リンカー試薬またはリンカー−抗生物質中間体は、抗体の遊離システインチオールと結合を形成することができる、チオール−反応性官能基を含む。チオール反応性官能基の例としては、マレイミド、α−ハロアセチル、活性化エステル、例えばスクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネート、及びイソチオシアネートが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９６】
別の実施形態では、リンカー試薬または抗生物質−リンカー中間体は、抗体上に存在する求電子基と反応性である求核基を有する反応性官能基を有する。抗体上の有用な求電子基としては、ピリジルジスルフィド、アルデヒド、及びケトンカルボニル基が挙げられるが、これらに限定されない。リンカー試薬または抗生物質−リンカー中間体の求核基のヘテロ原子は、抗体上の求電子基と反応して、抗体単位との共有結合を形成することができる。リンカー試薬または抗生物質−リンカー中間体上の有用な求核基としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、チオール、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジドが挙げられるが、これらに限定されない。抗体上の求電子基は、リンカー試薬または抗生物質−リンカー中間体との結合のための簡便な部位を提供する。
【０１９７】
ＰＭＬ部位は、１つ以上のリンカー構成要素を含んでもよい。例示的なリンカー構成要素としては、シトルリン（「ｃｉｔ」）、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタン酸塩（「ＳＰＰ」）、及び４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボン酸塩（「ＭＣＣ」）等の単一アミノ酸が含まれる。様々なリンカー構成要素が当該技術分野で知られており、このうちのいくつかが下を記載する。
【０１９８】
別の実施形態では、リンカーは、溶解度または反応性が調節する基で置換してもよい。例えば、スルホネート（−ＳＯ３−）またはアンモニウム等の荷電置換基は、試薬の水溶性を増加して、リンカー試薬と抗体もしくは抗生物質部分とのカップリング反応を促すか、またはＡＡＣの調製に用いる合成経路に応じて、リンカー試薬の水溶性を向上させ、リンカー試薬と抗体もしくは薬物部分とのカップリング反応を促すか、またはＡＡＣの調製に用いる合成経路に応じてＡｂ−Ｌ（抗体−リンカー中間体）とａｂｘ、もしくはａｂｘ−Ｌ（抗生物質−リンカー中間体）とＡｂとのカップリング反応を促すことができる。
【０１９９】
本発明のＡＡＣは、リンカー試薬：ＢＭＰＥＯ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）、ならびにビス−マレイミド試薬、例えば、ＤＴＭＥ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＭ（ＰＥＧ）２、及びＢＭ（ＰＥＧ）３を用いて調製されたものを明示的に企図するが、これらに限定されない。ビス−マレイミド試薬は、チオール含有抗生物質部分、標識、またはリンカー中間体へのシステイン改変抗体のチオール基の結合を、逐次的または収斂的な様式で可能にする。システイン改変抗体のチオール基、抗生物質部分、またはリンカー−抗生物質中間体と反応するマレイミド以外の他の官能基としては、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、及びイソチオシアネートが挙げられる。
【０２００】
0006742314.tif 000044
有用なリンカー試薬はまた、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）のような他の市販の供給源から得ることもできるか、またはＴｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ（２００２）  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：１８６６−１８７２、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３８：５２５７−６０、Ｗａｌｋｅｒ，Ｍ．Ａ．（１９９５）  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：５３５２−５３５５、Ｆｒｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．７：１８０−１８６、６２１４３４５、ＷＯ０２／０８８１７２、２００３１３０１８９、２００３０９６７４３、ＷＯ０３／０２６５７７、ＷＯ０３／０４３５８３、及びＷＯ０４／０３２８２８に記載される手順に従って合成することができる。
【０２０１】
別の実施形態では、ＡＡＣのＰＭＬ部分は、分岐した多機能性リンカー部分を介して１つより多い抗生物質部分を抗体と共有結合させるための樹状型リンカーを含む（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ（２００２）  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：２２１３−２２１５、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ（２００３）  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：１７６１−１７６８）。樹状リンカーは、抗体に対する抗生物質のモル比、すなわちＡＡＣの力価と関係する負荷量を増加させることができる。したがって、システイン改変抗体が反応性システインチオール基を１つだけ有する場合、樹状リンカーを介して多数の抗生物質部分を結合することができる。
【０２０２】
式ＩのＡＡＣのある特定の実施形態では、プロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカーＰＭＬは、式、
−Ｓｔｒ−ＰＭ−Ｙ−
を有し、
式中、Ｓｔｒがストレッチャー単位であり、ＰＭがペプチドミメティック単位であり、Ｙがスペーサー単位であり、
ａｂｘが、リファマイシン型抗生物質であり、
ｐが、１〜８の整数である。
【０２０３】
一実施形態では、ストレッチャー単位「Ｓｔｒ」は、式、
0006742314.tif 000045
を有し、  式中、Ｒ６が、Ｃ１−Ｃ１２アルキレン、Ｃ１−Ｃ１２アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ１−Ｃ１２アルキレン−ＮＨ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−Ｃ（＝Ｏ）、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２、及びＣ１−Ｃ１２アルキレン−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ（チオフェン−３−イル）からなる群から選択され、式中、ｒが、１〜１０の範囲内の整数である。
【０２０４】
例示的なストレッチャー単位を、以下に示す（式中、波線は、抗体への共有結合の部位を示す）：
0006742314.tif 000046
【０２０５】
一実施形態では、ＰＭは、式、
0006742314.tif 000047
を有し、  式中、Ｒ７及びＲ８が合わせて、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル環を形成し、
ＡＡが、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２から選択されるアミノ酸側鎖である。
【０２０６】
一実施形態では、スペーサー単位Ｙは、パラ−アミノベンジル（ＰＡＢ）またはパラ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）を含む。
【０２０７】
スペーサー単位は、別の加水分解ステップを用いずに抗生物質部分の放出を可能にする。スペーサー単位は、「自壊性」であっても、「非自壊性」であってもよい。ある特定の実施形態では、リンカーのスペーサー単位は、ｐ−アミノベンジル単位（ＰＡＢ）を含む。このような一実施形態では、ｐ−アミノベンジルアルコールは、ｐ−アミノベンジル基と抗生物質部分との間のアミド結合、カルバメート、メチルカルバメート、またはカーボネートを介してアミノ酸単位と結合する（Ｈａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ（２００５）  １５：１０８７−１１０３）。一実施形態では、スペーサー単位は、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）である。
【０２０８】
一実施形態では、抗生物質は、非ペプチドリンカーＰＭＬのＰＡＢスペーサー単位と結合する場合に、ジメチルアミノピペリジル基のような第４級アミンを形成する。このような第４級アミンの例は、表２からのＰＬＡ−１〜４であるリンカー抗生物質中間体（ＰＬＡ）である。第４級アミン基は、抗生物質部分の切断を調節して、ＡＡＣの抗菌効果を最適化することができる。別の実施形態では、抗生物質は、非ペプチドリンカーＰＭＬのＰＡＢＣスペーサー単位と結合して、ＡＡＣ中にカルバメート官能基を形成する。このようなカルバメート官能基もまた、ＡＡＣの抗菌効果を最適化することができる。ＰＡＢＣカルバメートリンカー−抗生物質中間体（ＰＬＡ）の例は、表２からのＰＬＡ−５及びＰＬＡ−６である。
【０２０９】
自壊性スペーサーの他の例としては、ＰＡＢ基に電子的に類似する芳香族化合物、例えば、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体（ＵＳ７３７５０７８、Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２３７）及びオルト−またはパラ−アミノベンジルアセタールが含まれるが、これらに限定されない。置換及び非置換４−アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２２３）、適切に置換されたビシクロ［２．２．１］及びビシクロ［２．２．２］環系（Ｓｔｏｒｍ  ｅｔ  ａｌ（１９７２）  Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：５８１５）及び２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ（１９９０）  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：５８６７）等、アミド結合加水分解により環化されるスペーサーが用いられ得る。グリシンで置換されたアミン含有薬物の排除（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：１４４７）もまた、ＡＡＣに有用な自壊性スペーサーの例である。
【０２１０】
ＡＡＣの切断により放出される活性抗生物質の量は、実施例８のカスパーゼ放出アッセイによって測定することができる。
【０２１１】
ＡＡＣに有用なリンカー−抗生物質中間体
式ＩＩ及び表２のＰＭＬリンカー−抗生物質中間体（ＰＬＡ）は、実施例１１〜２１のリファマイシン型抗生物質部分を、リンカー試薬とカップリングすることによって調製された。リンカー試薬は、ＷＯ２０１２／１１３８４７、ＵＳ７６５９２４１、同第ＵＳ７４９８２９８、同第ＵＳ２００９０１１１７５６、同第ＵＳ２００９／００１８０８６、同第ＵＳ６２１４３４５、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ（２００２）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３（４）：８５５−８６９に記載される方法によって調製された。
表２  ＰＭＬリンカー抗生物質中間体
0006742314.tif 000048
0006742314.tif 000049
【０２１２】
抗体−抗生物質複合体の実施形態
システイン操作抗ＷＴＡ抗体は、遊離システインチオール基を介して、ｐｉｐＢＯＲと称されるリファマイシンの誘導体等に結合し、プロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカーを介して、表３中の抗体−抗生物質複合化合物（ＡＡＣ）を形成した。リンカーは、カテプシンＢ、Ｄ等を含むリソソームプロテアーゼによって切断されるように設計され抗生物質及びＰＭＬリンカー等からなるリンカー−抗生物質中間体の作製は、実施例１１〜２１において詳細に記載されている。リンカーは、ＰＡＢ部分でのアミド結合の切断が活性状態の抗生物質から抗体を分離するように設計されている。
【０２１３】
「ジメチルｐｉｐＢＯＲ」と呼ばれるＡＡＣは、抗生物質上のジメチル化アミノ及びリンカー上のオキシカルボニル基以外は、「ｐｉｐＢＯＲ」ＡＡＣと同一である。
【０２１４】
図３は、抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）についての薬物活性化の可能性のある機序を示す。活性抗生物質（Ａｂ）は、哺乳動物細胞の内部へのＡＡＣの内部移行の後にのみ放出される。ＡＡＣ中の抗体のＦａｂ部分は、好中球及びマクロファージを含む食細胞とのＦｃ−受容体が媒介する結合によって細菌の取り込みを増強する一方で、黄色ブドウ球菌と結合する。ファゴリソソームへの内部移行の後に、リンカーは、リソソームプロテアーゼにより切断され、活性な抗生物質をファゴリソソームの内部に放出する。
【０２１５】
本発明の抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）化合物の一実施形態は、式Ｉ、
0006742314.tif 000050
Ｉ  を含み、
式中、
破線が、任意選択の結合を示し、
Ｒが、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、またはＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、
Ｒ１がＯＨであり、
Ｒ２がＣＨ＝Ｎ−（ヘテロシクリル）であり、式中、ヘテロシクリルが、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ２０ヘテロシクリル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、及びＣ３−Ｃ１２カルボシクリルから独立して選択される１つ以上の基と任意に置換されるか、
または、Ｒ１及びＲ２が、５または６員縮合ヘテロアリールまたはヘテロシクリルを形成し、任意に、スピロまたは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環を形成し、スピロまたは縮合６員ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリール、またはカルボシクリル環が、任意に置換されたＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、またはＯＨであり、
ＰＭＬが、Ｒ２と結合しているプロテアーゼ切断可能な非ペプチドリンカー、またはＲ１及びＲ２によって形成された縮合ヘテロアリールもしくはヘテロシクリルであり、
Ａｂが、抗壁テイコ酸（ＷＴＡ）抗体であり、
ｐが、１〜８の整数である。
【０２１６】
本発明の抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、式、
0006742314.tif 000051
を含み、
式中、
Ｒ３が、独立して、Ｈ及びＣ１−Ｃ１２アルキルから選択され、
ｎが、１または２であり、
Ｒ４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、及びＯＨから選択され、
Ｚが、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１−Ｃ１２アルキル）、Ｏ、及びＳから選択される。
【０２１７】
本発明の抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、式、
0006742314.tif 000052
を含み、
式中、
Ｒ５が、Ｈ及びＣ１−Ｃ１２アルキルから選択され、
ｎは、０または１である。
【０２１８】
本発明の抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、式、
0006742314.tif 000053
を含み、
式中、
Ｒ５が、Ｈ及びＣ１−Ｃ１２アルキルから選択され、
ｎは、０または１である。
【０２１９】
本発明の抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、式、
0006742314.tif 000054
を含み、
式中、
Ｒ５が、独立して、Ｈ及びＣ１−Ｃ１２アルキルから選択され、
ｎは、０または１である。
【０２２０】
本発明の抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、式、
0006742314.tif 000055
を含み、
式中、
Ｒ３が、独立して、Ｈ及びＣ１-Ｃ１２アルキルから選択され、
ｎが、１または２である。
【０２２１】
本発明の抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、式、
0006742314.tif 000056
を含む。
【０２２２】
本発明の抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、式、  
0006742314.tif 000057
を含む。
【０２２３】
本発明の抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、式、
0006742314.tif 000058
を含む。
【０２２４】
本発明の抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、式、
0006742314.tif 000059
を含む。
【０２２５】
本発明の抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、式、
0006742314.tif 000060
を含む。
【０２２６】
本発明の抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、式、
0006742314.tif 000061
及び
0006742314.tif 000062
を含む。
【０２２７】
本発明の抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）化合物の別の実施形態は、式、
0006742314.tif 000063
、
0006742314.tif 000064
、
0006742314.tif 000065
、
0006742314.tif 000066
、
0006742314.tif 000067
、
及び
0006742314.tif 000068
を含む。
【０２２８】
ＡＡＣの抗生物質負荷量
抗生物質負荷量は、式Ｉの分子における１抗体当たりの抗生物質（ａｂｘ）部分の数であるｐで表す。抗生物質負荷量は、１抗体当たり１〜２０個の抗生物質部分（Ｄ）の範囲であり得る。式ＩのＡＡＣは、１〜２０個の範囲の抗生物質部分と複合された抗体の集団またはプールを含む。複合反応からＡＡＣを調製する際の１抗体当たりの抗生物質部分の平均数は、質量分析法、ＥＬＩＳＡアッセイ、及びＨＰＬＣ等の従来の手段によって特徴付けられてもよい。また、ｐの単位でのＡＡＣの定量分布が決定されてもよい。いくつかの事例において、ｐがある特定の値である同種のＡＡＣを、他の抗生物質負荷を有するＡＡＣから分離し、精製し、かつ特徴付けることは、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動等の手段によって達成されてもよい。
【０２２９】
いくつかの抗体−抗生物質複合体では、ｐは、抗体上の結合部位の数によって限定され得る。例えば、上記の例示的な実施形態のように、結合がシステインチオールである場合、抗体は、１個のみもしくはいくつかのシステインチオール基を有し得るか、または、１個のみもしくはいくつかの十分に反応性のチオール基を有し得、それによって、リンカーが結合され得る。ある特定の実施形態では、抗生物質負荷がより高くなると、例えば、ｐが５超になると、ある特定の抗体−抗生物質複合体は凝集し、不溶性となり、毒性となるか、または細胞透過性が喪失し得る。ある特定の実施形態では、本発明のＡＡＣの抗生物質負荷は、１〜約８、約２〜約６、約２〜約４、または約３〜約５、約４、または約２の範囲である。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、理論上の最大値よりも少ない抗生物質部分が、複合反応中に抗体に複合される。抗体は、以下に考察されるように、例えば、抗生物質−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応しないリジン残基を含有し得る。一般に、抗体は、抗生物質部分に連結し得る多くの遊離及び反応性システインチオール基を含有せず、実際、抗体におけるほとんどのシステインチオール残基は、ジスルフィド架橋として存在する。ある特定の実施形態では、抗体は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）等の還元剤により、部分または完全還元条件下で還元されて、反応性システインチオール基が生成され得る。ある特定の実施形態では、本抗体は、リジンまたはシステイン等の反応性求核基を明らかにするために、変性条件に置かれる。
【０２３１】
ＡＡＣの負荷（抗生物質／抗体比、「ＡＡＲ」）はまた、薬物抗体比（ＤＡＲ）とも呼ばれ、異なる様式で、例えば（ｉ）抗体と比較してモル過剰の抗生物質−リンカー中間体またはリンカー試薬を限定すること、（ｉｉ）複合反応時間または温度を限定すること、及び（ｉｉｉ）システインチオール修飾のための部分または限定的還元条件によって制御されてもよい。
【０２３２】
１つを上回る求核性基を、抗生物質−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応させ、続いて、抗生物質部分試薬と反応させる場合、結果として得られる生成物は、１つ以上の抗生物質部分が分散して抗体に結合したＡＡＣ化合物の混合物であることが理解される。１抗体当たりの抗生物質の平均数は、抗体に特異的でありかつ抗生物質に特異的である二重ＥＬＩＳＡ抗体アッセイによって混合物から算出されてもよい。個々のＡＡＣ分子は、質量分析法によって混合物中で特定され、ＨＰＬＣ、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分離することができる（例えばＭｃＤｏｎａｇｈ  ｅｔ  ａｌ（２００６）  Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｒ．Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  １９（７）：２９９−３０７、Ｈａｍｂｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：７０６３−７０７０、Ｈａｍｂｌｅｔｔ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ３０  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，”  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．６２４，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ  ２７−３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４５，Ｍａｒｃｈ  ２００４、Ａｌｌｅｙ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．６２７，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ  ２７−３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４５，Ｍａｒｃｈ  ２００４を参照されたい）。ある特定の実施形態では、単一の負荷値を有する同種のＡＡＣを、電気泳動またはクロマトグラフィーによって複合混合物から単離してもよい。本発明のシステイン操作抗体は、抗体上の反応部位は、操作されたシステインチオールにまず制限されるため、より均一な調製物を可能にする。一実施形態では、１抗体当たりの抗生物質部分の平均数は、約１〜約２０の範囲内であった。いくつかの実施形態では、範囲は、約１から４まで選択され、制御される。
【０２３３】
抗体−抗生物質複合体の調製方法
式ＩのＡＡＣは、（１）共有結合によりＡｂ−Ｌを形成するための抗体の求核基と二価リンカー試薬との反応と、その後の抗生物質部分（ａｂｘ）との反応、及び（２）共有結合によりＬ−ａｂｘを形成するための抗生物質部分の求核基と二価リンカー試薬との反応と、その後の抗体の求核基との反応を含む、当業者に知られる有機化学反応、条件、及び試薬を用いるいくつかの経路により調製してよい。後者の経路を介して式ＩのＡＡＣを調製するための例示的な方法は、米国特許第ＵＳ７４９８２９８号に記載され、それは参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０２３４】
抗体上の求核基としては、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖ヒドロキシルまたはアミノ基が含まれるが、これらに限定されない。アミン、チオール、及びヒドロキシル基は、求核性であり、（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物、（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド、（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含むリンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成することができる。ある特定の抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、完全にまたは部分的に還元されるように、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）等の還元剤での処理によって、リンカー試薬との複合に対して反応し得る。したがって、各システイン架橋は、理論上、２つの反応性チオール求核試薬を形成するであろう。追加の求核基は、リジン残基の修飾によって、例えば、リジン残基と２−イミノチオラン（トラウト試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ））とを反応させて、アミンをチオールへと変換させることによって抗体中に導入することができる。反応性チオール基もまた、１個、２個、３個、４個、またはそれ以上のシステイン残基を導入することによって  （例えば、１個以上の非天然システインアミノ酸残基を含む変異形抗体を調製することによって）抗体中に導入され得る。
【０２３５】
本発明の抗体−抗生物質複合体はまた、アルデヒドまたはケトンカルボニル基等の抗体上の求電子基と、リンカー試薬または抗生物質上の求核基との間の反応によって産生されてもよい。リンカー試薬上の有用な求核基には、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸塩、及びアリールヒドラジドが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、抗体は、リンカー試薬または抗生物質上の求核置換基と反応することができる求電子部分を導入するように修飾される。別の実施形態では、グリコシル化抗体の糖を、例えば、過ヨウ素酸塩酸化試薬で酸化させて、リンカー試薬または抗生物質部分のアミン基と反応し得るアルデヒド基またはケトン基を形成してもよい。結果として生じるイミンシッフ塩基群は、安定した結合を形成し得るか、または例えば、水素化ホウ素試薬によって還元されて、安定したアミン結合を形成し得る。一実施形態では、グリコシル化された抗体の炭水化物部分と、ガラクトースオキシダーゼまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかと反応させると、抗体において、抗生物質上の適切な基と反応することができるカルボニル（アルデヒド及びケトン）基がもたらされ得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。別の実施形態では、Ｎ末端セリンまたはスレオニン残基を含有する抗体は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応し、それによって第１のアミノ酸の代わりにアルデヒドが産生され得る（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ  ＆  Ｓｔｒｏｈ、（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６、ＵＳ５３６２８５２）。かかるアルデヒドと、抗生物質部分またはリンカー求核試薬とを反応させることができる。
【０２３６】
抗生物質部分上の求核基としては、（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物、（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド、（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含むリンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成することができる、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジド基が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３７】
表３の抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）を、実施例７において記載される方法に従って、表２の記載される抗ＷＴＡ抗体及びリンカー−抗生物質中間体の複合によって調製した。インビトロマクロファージアッセイ（実施例９）及びインビボマウス腎臓モデル（実施例１０）による有効性について、ＡＡＣを試験した。
【０２３８】
表３  ＷＴＡ抗体−ＰＭＬ−抗生物質複合体（ＡＡＣ）
0006742314.tif 000069
＊  ＡＡＲ＝抗生物質／抗体比の平均
野生型（「ＷＴ」）、システイン操作突然変異抗体（「チオ」）、軽鎖（「ＬＣ」）、重鎖（「ＨＣ」）、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、シクロブチルジケト（「ＣＢＤＫ」）、シトルリン（「ｃｉｔ」）、システイン（「ｃｙｓ」）、ｐ−アミノベンジル（「ＰＡＢ」）、及びｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢＣ」）
【０２３９】
抗体−抗生物質複合体による感染症の治療及び予防方法
本発明の抗ＷＴＡ−ＡＡＣは、ヒト及び獣医学的ブドウ球菌、例えば黄色ブドウ球菌、Ｓ．サプロフィチカス、及びＳ．シミュランスに有効な抗菌剤として有用である。特定の態様では、本発明のＡＡＣは、黄色ブドウ球菌感染症を治療するために有用である。
【０２４０】
血流への侵入の後に、黄色ブドウ球菌は、ほぼ全ての器官において転移性感染を引き起こす可能性がある。二次感染は、治療の開始前の約三分の一の症例で（Ｆｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）  Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１６３：２０６６−２０７２）、患者の１０％においてさえ治療の開始後に生じる（Ｋｈａｔｉｂ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）  Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，３８：７−１４）。感染の顕著な特徴は、膿の大きな貯蔵、組織破壊、及び膿瘍の形成（これらは全て、大量の好中球を含む）である。菌血症が３日を超えて持続する場合、約４０％の患者が合併症を発生する。
【０２４１】
提案されるＡＡＣの作用の機序が、上述されている  （副題の抗体−抗生物質複合体）。本発明の抗ＷＴＡ抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）は、細胞内病原体を治療するための著しい治療上の利点を有する。ＡＡＣリンカーは、ファゴリソソーム酵素への曝露によって切断され、活性抗生物質を放出する。隔離された空間及び比較的高い局所（１細菌当たり約１０４）のために、ファゴリソソームは細胞内病原体の生存をもはや支持しない結果となる。ＡＡＣは本質的に不活性なプロドラッグであるため、抗生物質の治療指数は、遊離（非複合）形と比べて拡大することができる。抗体は、病原体特異的標的化をもたらし、切断可能なリンカーは、病原体の細胞内の場所に特異的な条件下で切断される。効果は、オプソニン化した病原体及びファゴリソソームに共限局性の他の病原体の両方に対して直接的であり得る。抗生物質耐容性は、抗生物質及び他の抗微生物剤による死滅に耐える疾患の原因となる病原体の能力であり、多剤耐性とは機序が異なる（Ｌｅｗｉｓ  Ｋ（２００７）．“Ｐｅｒｓｉｓｔｅｒ  ｃｅｌｌｓ，ｄｏｒｍａｎｃｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ”．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５（１）：４８−５６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍｉｃｒｏ１５５７）。むしろ、この形の耐容性は、生残菌と呼ばれる微生物細胞の小さい部分集団により引き起こされる（Ｂｉｇｇｅｒ  ＪＷ（１４  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９４４）．“Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ  ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ”．Ｌａｎｃｅｔ  ２４４（６３２０）：４９７−５００）。これらの細胞は、古典的な意味で多剤耐性ではないが、むしろ、それらの遺伝子的に同一の同胞を死滅させることができる抗生物質治療に対して耐性がある休眠細胞である。この抗生物質耐容性は、非分裂または分裂が非常に遅い生理学的状態により誘導される。これらの生残菌細胞を根絶させる抗微生物治療が効かない場合に、生残菌細胞は、再発性の慢性感染の貯蔵所となる。本発明の抗体−抗生物質複合体は、これらの生残菌細胞を死滅させ、多剤耐性のある細菌集団の出現を抑制する独特の特性を有する。
【０２４２】
別の実施形態では、本発明の抗ＷＴＡ−ＡＡＣを用いて、病原体が生存する細胞内区画に関わらず感染症を治療することができる
【０２４３】
別の実施形態では、本発明の抗ＷＴＡ−ＡＡＣを用いて、浮遊状態またはバイオフィルムの形のブドウ球菌細菌を標的にすることもできる。本発明の抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）で治療可能な細菌感染症は、細菌肺感染症、例えば黄色ブドウ球菌肺炎、骨髄炎、再発性鼻副鼻腔炎、細菌性心内膜炎、細菌性眼感染症、例えばトラコーマ及び結膜炎、心臓、脳、または皮膚の感染症、消化管の感染症、例えば旅行者の下痢、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、クローン病、及び全般的にＩＢＤ（炎症性腸疾患）、細菌性髄膜炎、ならびに任意の器官、例えば筋肉、肝臓、髄膜、または肺での膿瘍を治療することを含む。細菌感染症は、尿道、血流、創傷、またはカテーテル挿入部位のような体の他の部分におけるものであり得る。本発明のＡＡＣは、バイオフィルム、インプラント、または力の及ばない部位に関与する治療が困難な感染症（例えば骨髄炎及び人工関節感染症）、ならびに死亡率が高い感染症、例えば院内感染肺炎及び菌血症のために有用である。黄色ブドウ球菌感染症を予防するために処置することができる弱い患者の群としては、血液透析患者、免疫低下患者、集中治療室にいる患者、及びある特定の手術を受ける患者が挙げられる。別の態様では、本発明は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおける微生物感染症を死滅、治療、または予防する方法を提供し、本方法は、動物に本発明の抗ＷＴＡ−ＡＡＣまたはＡＡＣの医薬製剤を投与することを含む。本発明は、このような微生物感染症に関連するか、またはこのような微生物感染症から日和見的にもたらされる疾患を治療または予防することをさらに特徴とする。このような治療または予防の方法は、本発明の組成物の経口、局所、静脈内、筋肉内、または皮下投与を含んでもよい。例えば、手術またはＩＶカテーテルの挿入前に、ＩＣＵケアにおいて、移植医薬中に、癌化学療法とともにもしくはその後に、または感染症の高い危険性を有する他の活動において、本発明のＡＡＣを投与して、感染症の発症または広がりを妨げることができる。
【０２４４】
細菌感染症は、活性及び不活性形の細菌により引き起こされることがあり、ＡＡＣは、活性及び不活性の両方で、潜在的な形の細菌感染を治療するために十分な量及び期間投与され、この期間は、活性な形の細菌感染を治療するために必要なものよりも長い。
【０２４５】
様々なグラム＋細菌の分析により、ＷＴＡベータがＭＲＳＡ及びＭＳＳＡ株、ならびにブドウ球菌株、例えばＳ．サプロフィチカス及びＳ．シミュランスを含む全ての黄色ブドウ球菌で発現されることがわかった。ＷＴＡアルファ（アルファ−ＧＬｃＮＡｃリビトールＷＴＡ）は、全てではないが、ほとんどの黄色ブドウ球菌上に存在し、リステリア・モノサイトゲネス上にも存在する。ＷＴＡは、グラム−細菌上に存在しない。したがって、本発明の一態様は、黄色ブドウ球菌、Ｓ．サプロフィチカス、またはＳ．シミュランスのうちの１つ以上に感染した患者を、治療有効量の本発明の抗ＷＴＡベータ−ＡＡＣを投与することによって治療する方法である。本発明の別の態様は、黄色ブドウ球菌及び／またはリステリア・モノサイトゲネスに感染した患者を、治療有効量の本発明の抗ＷＴＡアルファ−ＡＡＣを投与することによって治療する方法である。本発明は、黄色ブドウ球菌またはＳ．サプロフィチカスまたはＳ．シミュランスのうちの１つ以上による感染を、病院の背景、例えば手術、熱傷患者、及び臓器移植において治療有効量の本発明の抗ＷＴＡベータ−ＡＡＣを投与することによって予防する方法も企図する。
【０２４６】
当該技術分野の医師により決定される、細菌感染症のための治療を必要とする患者は、必要ではないが、患者が感染した細菌の種類について既に診断されていてよい。細菌感染症を患っている患者は、ほんの数時間で非常に迅速に悪化し得るため、バンコマイシンまたはシプロフロキサシンのような１つ以上の標準治療Ａｂｘとともに本発明の抗ＷＴＡ−ＡＡＣを入院時の患者に投与することができる。診断結果が入手可能になり、感染における例えば黄色ブドウ球菌の存在が示された場合、患者は、抗ＷＴＡ  ＡＡＣでの治療を継続することができる。したがって、細菌感染症または具体的には黄色ブドウ球菌感染症の治療方法の一実施形態では、患者に治療有効量の抗ＷＴＡベータＡＡＣを投与する。本発明の治療または予防方法では、本発明のＡＡＣは、単独治療剤として、または以下に記載するもののような他の薬剤とともに投与することができる。本発明のＡＡＣは、前臨床モデルにおけるＭＲＳＡの治療において、バンコマイシンよりも優越性を示す。ＳＯＣに対するＡＡＣの比較は、例えば死亡率の低減により測定することができる。治療される患者は、様々な測定可能な因子によりＡＡＣ治療に対する応答性について評価され得る。臨床医が患者における改善を評価するために用いる可能性がある兆候及び症状の例としては、例えば、以下のものが挙げられる：診断時に上昇しているならば白血球細胞計数の正常化、診断時に上昇（発熱）しているならば体温の正常化、血液培養のクリアランス、紅斑及び膿の排出がより少ないことを含む創傷の目視による改善、人工呼吸器をつけている患者における酸素の要求の低減または換気の速度の低減のような人工呼吸器の要求の低減、診断時に患者が人工呼吸器をつけているならば人工呼吸器を完全に外すこと、診断時にこれらの薬物が必要であれば安定した血圧を補助するために使用する薬物がより少なくなること、診断時に異常であるならばクレアチニンまたは肝臓機能試験の上昇のような末端器官不全を示唆する実験室値の異常の正常化、ならびに放射線画像化の改善（例えば以前に肺炎を示唆した胸部ｘ線が消散を示す）。ＩＣＵでの患者では、これらの因子は少なくとも毎日測定され得る。発熱は、絶対好中球計数を含む白血球計数及び「左方移動」（活性感染に応答して増加した好中球の生成を示す芽球の出現）が消散したという証拠とともに厳密にモニタリングされる。
【０２４７】
本発明の治療の方法の文脈では、細菌感染症を患っている患者は、当該技術分野の医師が評価して、治療の開始もしくは診断の前または治療の開始もしくは診断時の値、兆候、または症状と比較して、先行する因子の少なくとも２つ以上において、著しく測定可能な改善があるならば、治療されるべきと見なされる。いくつかの実施形態では、上記の因子のうちの３、４、５、６つ、またはそれ以上において測定可能な改善がある。いくつかの実施態様では、測定される因子における改善は、治療前の値と比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％である。典型的に、患者の測定可能な改善が以下のものを含む場合に、患者は細菌感染症（例えば黄色ブドウ球菌感染症）が完全に治療されたと見なすことができる：ｉ）元々同定された細菌が成長しない、反復した血液または組織培養（典型的には数回）、ｉｉ）発熱が正常化される、ｉｉｉ）ＷＢＣが正常化される、及びｉｖ）患者が有していた既存の合併性に鑑みて末端器官不全（肺、肝臓、腎臓、血管虚脱）が部分的または完全に消散したという証拠。
【０２４８】
投薬
前述の態様のうちのいずれかでは、感染患者の治療において、ＡＡＣの投与量は、通常、約０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日である。一実施形態では、細菌感染症を患っている患者は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ、典型的に約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ、より具体的には約２５ｍｇ／ｋｇ〜１２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜１２５ｍｇ／ｋｇ、さらにより具体的には約５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲のＡＡＣの用量で治療される。ＡＡＣは、毎日（例えば５〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の単回用量）またはより少ない頻度（例えば５、１０、２５、または５０ｍｇ／ｋｇ／週）で与えることができる。１用量は、２日にわたって、例えばある日に２５ｍｇ／ｋｇ及び次の日に２５ｍｇ／ｋｇに分けることができる。患者は、１〜８週間の期間にわたって３日毎（ｑ３Ｄ）、週１回〜隔週（ｑＯＷ）で投与を受けることができる。一実施形態では、患者に、本発明のＡＡＣを、静脈注射を介して週１回、２〜６週間にわたって標準治療（ＳＯＣ）とともに投与して、ｓｔａｐｈ  Ａ感染症のような細菌感染症を治療する。治療の長さは、患者の状態または感染の程度により、例えば合併症を伴わない菌血症について２週間または心内膜炎を併発する菌血症について６週間要求され得る。
【０２４９】
一実施形態では、ＡＡＣは、２．５〜１００ｍｇ／ｋｇの初期用量で１〜７日間連続、その後、０．００５〜１０ｍｇ／ｋｇの維持用量で１カ月間１〜７日毎に１回投与した。
【０２５０】
投与経路
細菌感染症を治療するために、本発明のＡＡＣは、上記の投与量のいずれかで、静脈内に（ｉ．ｖ．）または皮下投与することができる。一実施形態では、ＷＴＡ−ＡＡＣは、静脈内投与される。具体的な実施態様では、静脈内により投与されるＷＴＡ−ＡＡＣは、ＷＴＡ−ベータＡＡＣであり、より具体的には、ＷＴＡ−ベータ抗体は、図１２、図１３Ａ１及びＡ２及び図１３Ｂ１〜Ｂ４、図１４Ａ１〜Ａ２及び図１４Ｂ１〜Ｂ３、ならびに図１５Ａ１〜Ａ３及び図１５Ｂ１〜Ｂ６に開示される、アミノ酸配列を有するＡｂの群から選択されるものである。
【０２５１】
併用療法
ＡＡＣは、患者を治療する医師によって決定されるように、必要に応じて１つ以上のさらなる、例えば第２の治療剤または予防剤とともに投与してもよい。
【０２５２】
一実施形態では、本発明の抗体−抗生物質複合化合物と組み合わせて投与される第２の抗生物質は、構造的クラス：（ｉ）アミノ配糖体、（ｉｉ）ベータラクタム、（ｉｉｉ）マクロライド／環状ペプチド、（ｉｖ）テトラサイクリン、（ｖ）フルオロキノリン／フルオロキノロン、（ｖｉ）及びオキサゾリジノンから選択される。Ｓｈａｗ，Ｋ．ａｎｄ  Ｂａｒｂａｃｈｙｎ，Ｍ．（２０１１）  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２４１：４８−７０、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．（２０１１）  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２４１：１２２−１５２を参照されたい。
【０２５３】
一実施形態では、本発明の抗体−抗生物質複合化合物と組み合わせて投与される第２の抗生物質は、クリンダマイシン、ノボビオシン、レタパムリン、ダプトマイシン、ＧＳＫ−２１４０９４４、ＣＧ−４００５４９、シタフロキサシン、テイコプラニン、トリクロサン、ナフチリドン（ｎａｐｔｈｙｒｉｄｏｎｅ）、ラデゾリド、ドキソルビシン、アンピシリン、バンコマイシン、イミペネム、ドリペネム、ゲムシタビン、ダルババンシン、及びアジスロマイシンから選択される。
【０２５４】
これらのさらなる治療剤または予防剤のさらなる例は、抗炎症薬（例えば非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ；例えばデトプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナム酸、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメオン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、アスピリン、サリチル酸コリン、サルサレート、ならびにサリチル酸ナトリウム及びマグネシウム）、及びステロイド（例えばコルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン））、抗菌剤（例えばアジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、アモキシシリン、メトロニダゾール、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン、ピペラシリン、アズロシリン、テモシリン、セファロチン、セファピリン、セフラジン、セファロリジン、セファゾリン、セファマンドール、セフロキシム、セファレキシン、セフプロジル、セファクロール、ロラカルベフ、セフォキシチン、セフメタゾール、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジム、セフィキシム、セフポドキシム、セフチブテン、セフジニル、セフピロム、セフェピム、ＢＡＬ５７８８、ＢＡＬ９１４１、イミペネム、エルタペネム、メロペネム、アズトレオナム、クラブラン酸、スルバクタム、タゾバクタム、ストレプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、スペクチノマイシン、シソマイシン、ジベカシン、イセパマイシン、テトラサイクリン、クロロテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、テリスロマイシン、ＡＢＴ−７７３、リンコマイシン、クリンダマイシン、バンコマイシン、オリタバンシン、ダルババンシン、テイコプラニン、キヌプリスチン、及びダルホプリスチン、スルファニルアミド、パラ−アミノ安息香酸、スルファジアジン、スルフイソキサゾール、スルファメトキサゾール、スルファタリジン、リネゾリド、ナリジキシン酸、オキソリニン酸、ノルフロキサシン、ペルフロキサシン、エノキサシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、テマフロキサシン、ロメフロキサシン、フレロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、トロバフロキサシン、クリナフロキサシン、モキシフロキサシン、ゲミフロキサシン、シタフロキサシン、ダプトマイシン、ガレノキサシン、ラモプラニン、ファロペネム、ポリミキシン、チゲサイクリン、ＡＺＤ２５６３、またはトリメトプリム）、ＡＡＣが標的にするＡｇと同じまたは異なる抗原に対する抗体を含む抗菌抗体、血液凝固阻害剤（例えばアブシキシマブ、アスピリン、シロスタゾール、クロピドグレル、ジピリダモール、エプチフィバチド、チクロピジン、またはチロフィバン）、抗凝固剤（例えばダルテパリン、ダナパロイド、エノキサパリン、ヘパリン、チンザパリン、またはワルファリン）、解熱剤（例えばアセトアミノフェン）、または脂質低下剤（例えばコレスチラミン、コレスチポール、ニコチン酸、ゲムフィブロジル、プロブコール、エゼチミブ、またはスタチン、例えばアトルバスタチン、ロスバスタチン、ロバスタチン  シンバスタチン、プラバスタチン、セリバスタチン、及びフルバスタチン）である。一実施形態では、本発明のＡＡＣは、黄色ブドウ球菌（メチシリン耐性及びメチシリン感受性株を含む）に対する標準治療（ＳＯＣ）と組み合わせて投与される。ＭＳＳＡは、通常、典型的に、ナフシリンまたはオキサシリンで治療され、ＭＲＳＡは、典型的に、バンコマイシンまたはセファゾリンで治療される。
【０２５５】
これらのさらなる薬剤は、ＡＡＣの投与の１４日、７日、１日、１２時間、もしくは１時間以内、またはＡＡＣと同時に投与してもよい。さらなる治療剤は、ＡＡＣと同じまたは異なる薬学的組成物に存在してもよい。異なる薬学的組成物に存在する場合、異なる投与の経路を用いてもよい。例えば、ＡＡＣを静脈内または皮下投与し、第２の薬剤を経口投与してもよい。
【０２５６】
薬学的製剤
本発明は、ＷＴＡ−ＡＡＣを含む薬学的組成物、及びＡＡＣを含む薬学的組成物を用いる細菌感染症の治療方法も提供する。このような組成物は、適切な賦形剤、例えば、緩衝液、酸、塩基、糖類、希釈剤、流動促進剤、保存剤等を含む、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載される薬学的に許容される賦形剤（担体）をさらに含んでもよい。本発明の方法及び組成物は、単独または感染性疾患を治療するための他の従来の方法及び／または薬剤と組み合わせて用いてもよい。いくつかの実施形態では、薬学的製剤は、１）本発明の抗ＷＴＡβ−ＡＡＣと、２）薬学的に許容される担体とを含む。いくつかの実施形態では、薬学的製剤は、１）本発明のＡＡＣと、任意選択的に２）少なくとも１種のさらなる治療剤とを含む。
【０２５７】
本発明のＡＡＣを含む薬学的製剤は、所望の純度を有するＡＡＣを、水性溶液または凍結乾燥もしくはその他の乾燥製剤の形で、任意選択的な生理的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することにより、貯蔵のために調製される。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、緩衝液、例えばリン酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、及び他の有機酸、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、保存剤（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム）、フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾール）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン、例えばグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、ショ糖、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール等の糖類、塩形成対イオン、例えばナトリウム、金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）ならびに／あるいは非イオン性界面活性剤、例えばＺｎ−タンパク質錯体）、ならびに／あるいは非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。インビボ投与のために用いられる薬学的製剤は、一般的に、滅菌されており、これは、滅菌濾過膜による濾過により容易に達成される。
【０２５８】
活性成分はまた、例えばコアセルベーション技法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及びナノカプセル）中に、またはマクロ乳濁液中に取り込まれてもよい。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０２５９】
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の好適な例としては、抗体または本発明のＡＡＣを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許番号３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）等の分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−ビニル酢酸及び乳酸−グリコール酸等のポリマーは１００日を超えて分子の放出が可能であるが、ある特定のヒドロゲルは、より短い期間タンパク質を放出する。カプセルに封入された抗体またはＡＡＣが体内に長期間残存する場合、これらは、３７℃にて水分への曝露の結果として変性または凝集して、生物学的活性の喪失及び免疫原性の変化の可能性がある。関与する機序に応じて、安定化のために合理的な方策を講じることができる。例えば、凝集機序がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であると見出されたならば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を制御し、適当な添加剤を使用し、特定のポリマーマトリクス組成物を開発することにより達成してもよい。
【０２６０】
ＡＡＣは、標的細胞／組織への送達のために任意の適切な形に製剤化してよい。例えば、ＡＡＣは、様々な種類の脂質、リン脂質、及び／または界面活性剤から構成される小胞であるリポソームとして製剤化されてもよく、リポソームは、哺乳動物に薬物を送達するために有用である。リポソームの成分は、通常、生体膜での脂質構成と同様の二重膜形成で配置される。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０、ＵＳ４４８５０４５、ＵＳ４５４４５４５、ＷＯ９７／３８７３１、ＵＳ５０１３５５６号に記載される、当該技術分野で知られる方法によって調製される。
【０２６１】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相エバポレーション法によって作製することができる。リポソームを、規定された孔サイズのフィルタを通して押し出すことにより、所望の直径を有するリポソームを得る。
【０２６２】
材料及び方法
細菌の菌株：
全ての実験は、別途示されない限り、ＮＡＲＳＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｒｓａ．ｎｅｔ／ｃｏｎｔｒｏｌ／ｍｅｍｂｅｒ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）から得られたＭＲＳＡ−ＵＳＡ３００  ＮＲＳ３８４を用いて行われた。
【０２６３】
細胞外細菌についてのＭＩＣ決定
細胞外細菌についてのＭＩＣを、トリプシン大豆ブロス中で抗生物質の２倍系列希釈を調製することによって決定した。抗生物質の希釈物は、９６ウェル培養皿にて４重に作製された。ＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００のＮＲＳ３８４株）を指数関数的に成長する培養物から取り、１×１０４ＣＦＵ／ｍＬに希釈した。細菌を、抗生物質の存在下で１８〜２４時間３７℃で振盪しながら培養し、細菌増殖を、光学濃度（ＯＤ）を６３０ｎＭにて読み取ることによって決定した。ＭＩＣは、細菌増殖を９０％超阻害する抗生物質の用量であると決定した。
【０２６４】
細胞内細菌についてのＭＩＣ決定
細胞内ＭＩＣは、マウス腹腔マクロファージの内部に隔離された細菌について決定した（下記、マウス腹腔マクロファージの作製を参照）。マクロファージを２４ウェル培養皿に４×１０５細胞／ｍＬの密度で播種し、１マクロファージ当たり１０〜２０細菌の割合でＭＲＳＡに感染させた。マクロファージ培養物を、５０ｕｇ／ｍＬのゲンタマイシン（細胞外細菌においてのみ活性である抗生物質）を補った成長培地で維持し、細胞外細菌の増殖を阻害し、試験抗生物質を感染から１日後に成長培地に加えた。細胞内細菌の生存を、抗生物質の添加から２４時間後に評価した。０．１％ウシ血清アルブミン及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを補ったＨａｎｋｓ緩衝生理食塩水溶液でマクロファージを溶解し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水溶液中で溶解物の系列希釈を作製した。生存細胞内細菌の数を、５％ヒツジ脱線維素血液を含むトリプシン大豆寒天プレート上に播種することによって決定した。
【０２６５】
腹腔マクロファージの単離：
腹腔マクロファージを、６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）の腹膜から単離した。マクロファージの収率を増やすために、１ｍＬのチオグリコール酸塩培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の腹腔内注射によりマウスを前処理した。チオグリコール酸塩培地を、水中で４％の濃度で調製し、オートクレーブにより滅菌し、使用前に２０日〜６カ月間熟成させた。腹腔マクロファージは、チオグリコール酸塩での処置から４日後に、腹腔を冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄することにより採集した。マクロファージを、１０％胎児ウシ血清及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを補った、抗生物質を含まないダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に４×１０５細胞／ウェルの密度で２４ウェル培養皿に播種した。マクロファージを終夜培養して、プレートに接着させた。このアッセイは、非食細胞型における細胞内死滅を試験するためにも利用した。ＭＧ６３（ＣＲＬ−１４２７）及びＡ５４９（ＣＣＬ１８５）細胞株をＡＴＣＣから得て、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ及び１０％胎児ウシ血清を補ったＲＰＭＩ  １６４０組織培養培地（ＲＰＭＩ−１０）で維持した。ＨＵＶＥＣ細胞を、Ｌｏｎｚａから得て、ＥＧＭ内皮細胞完全培地（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で維持した。
【０２６６】
オプソニン化したＭＲＳＡへのマクロファージの感染：
ＭＲＳＡのＵＳＡ３００株（ＮＲＳ３８４）を、ＮＡＲＳＡレポジトリ（Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から得た。いくつかの実験は、黄色ブドウ球菌のＮｅｗｍａｎ株（ＡＴＣＣ２５９０４）を用いた。全ての実験において、細菌をトリプシン大豆ブロスで培養した。ＡＡＣでの細胞内死滅を評価するために、ＵＳＡ３００を指数関数的に成長する培養物から取り、ＨＢ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び０．１％ウシ血清アルブミンを補ったＨａｎｋｓ平衡塩類溶液）で洗浄した。ＡＡＣまたは抗体をＨＢで希釈し、細菌と１時間インキュベートして、細菌との抗体の結合を可能にし（オプソニン化）、オプソニン化した細菌を用いて、１マクロファージ当たり１０〜２０細菌の割合で（１ウェル当たり２５０μＬのＨＢ中に４×１０６細菌）でマクロファージに感染させた。マクロファージを感染の直前に無血清ＤＭＥＭ培地で予備洗浄し、５％ＣＯ２の湿潤組織培養インキュベータ中で３７℃でのインキュベーションによって感染させて、細菌の食作用を可能にした。２時間後に、感染ミックスを除去し、通常増殖培地（１０％胎児ウシ血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを補ったＤＭＥＭ）に置き換え、ゲンタマイシンを５０μｇ／ｍｌで加えて、細胞外細菌の成長を妨げた。インキュベーション期間の終わりに、マクロファージを無血清培地で洗浄し、０．１％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（細胞内細菌に損傷を与えることなくマクロファージを溶解する）を補ったＨＢで細胞を溶解した。いくつかの実験では、培養上清への細胞質乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を、ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（製品１１６４４７９３００１，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて検出することによって、マクロファージの生存率を培養期間の最後に評価した。上清を回収し、製造者の使用説明書に従って直ちに分析した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（細菌の凝集を阻害するため）を補ったリン酸緩衝生理食塩水溶液中で溶解物の系列希釈を作製し、生存細胞内細菌の総数を、５％ヒツジ脱線維素血液を含むトリプシン大豆寒天上に播種することによって決定した。
【０２６７】
ＭＲＳＡ感染腹膜細胞の作製。
６〜８週齢の雌Ａ／Ｊマウス（ＪＡＸ（商標）マウス、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、１×１０８ＣＦＵのＵＳＡ３００のＮＲＳ３８４株に腹腔注射により感染させた。腹腔洗浄液を感染から１日後に採集し、感染腹膜細胞を、０．１％ＢＳＡを補ったＨｅｐｅｓ緩衝液（ＨＢ緩衝液）で希釈した５０μｇ／ｍＬのリゾスタフィンで３０分間、３７℃で処理した。次いで、腹膜細胞を、２回、氷冷ＨＢ緩衝液で洗浄した。腹膜細胞を、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ及び１０％胎児ウシ血清、及び５μｇ／ｍＬのバンコマイソンを補ったＲＰＭＩ  １６４０組織培養培地で１×１０６細胞／ｍＬに希釈した。好中球死滅に供していない細胞外細菌についての対照として、一次感染からの遊離ＭＲＳＡを終夜、４℃にてリン酸緩衝生理食塩水溶液中に貯蔵した。
【０２６８】
腹膜細胞から骨芽細胞への感染の移動：
ＭＧ６３骨芽細胞株をＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１４２７）から得て、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ及び１０％胎児ウシ血清を補ったＲＰＭＩ  １６４０組織培養培地（ＲＰＭＩ−１０）で維持した。骨芽細胞を２４ウェル組織培養プレートに播種し、培養して、コンフルエントな層を得た。実験の日に、骨芽細胞をＲＰＭＩ（補充物なし）で１回洗浄した。ＭＲＳＡまたは感染腹膜細胞を完全ＲＰＭＩ−１０で希釈し、感染の直前にバンコマイシンを５μｇ／ｍＬで加えた。腹膜細胞を骨芽細胞に１×１０６腹膜細胞／ｍＬで加えた。細胞の試料を０．１％  ｔｒｉｔｏｎ−ｘで溶解して、感染時の細胞内生細菌の実際の濃度を決定した。全ての感染についての実際の力価を、５％ヒツジ脱線維素血液を含むトリプシン大豆寒天上に細菌の系列希釈を播種することによって決定した。
【０２６９】
ＭＧ６３骨芽細胞を、４ウェルガラスチャンバスライドに播種し、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ及び１０％胎児ウシ血清を補ったＲＰＭＩ  １６４０組織培養培地（ＲＰＭＩ−１０）で、コンフルエントな層を形成するまで培養した。感染の日に、ウェルを無血清培地で洗浄し、感染腹膜細胞の懸濁液または５μｇ／ｍＬのバンコマイシンを補った完全ＲＰＭＩ−１０で希釈したＭＲＳＡのＵＳＡ３００株に感染させた。感染から１日後に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２％パラホルムアルデヒドを用いてＰＢＳ中で室温にて３０分間固定した。ウェルを３回ＰＢＳで洗浄し、０．１％サポニンを含むＰＢＳで３０分間、室温にて透過にした。
【０２７０】
感染モデルのインビボ移入：
ＵＳＡ３００原液を、トリプシン大豆ブロス中で活発に増殖する培地からの感染について調製した。細菌を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、アリコートを、ＰＢＳ  ２５％グリセロール中で−８０℃で冷凍した。細胞内細菌感染症：Ａ／Ｊマウスを、ＭＲＳＡの比較的低い用量（２×１０６ＣＦＵ／マウス）で容易に感染したため、これらの実験のために選択した。７週齢の雌Ａ／Ｊマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂから得、５×１０７ＣＦＵのＵＳＡ３００により腹腔注射によって感染させた。マウスを感染から１日後に殺処分し、腹腔を、５ｍＬの冷ＰＢＳでさっと流した。腹腔洗浄液を５分間、１，０００ｒｐｍ、４℃にて卓上遠心分離機で遠心分離した。腹腔細胞を含む細胞ペレットを回収し、細胞を、５０ｕｇ／ｍＬのリゾスタフィン（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．Ｃａｎｔｏｎ  ＭＡ，  ＣＲＬ  ３０９Ｃ）で３７℃で２０分間処理して、夾雑細胞外細菌を死滅させた。腹腔細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄して、リゾスタフィンを除去した。ドナーマウスからの腹腔細胞をプールし、レシピエントマウスに、尾静脈への静脈内注射によって各レシピエント当たり５匹のドナーから得られた細胞を注射した。生細胞内ＣＦＵの数を決定するために、腹腔細胞のサンプルを、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むＨＢ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び０．１％ウシ血清アルブミンを補ったＨａｎｋｓ平衡塩類溶液）中で溶解し、０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で溶解物の系列希釈を作製した。遊離細菌感染症：Ａ／Ｊマウスに、腹腔注射のために使用されるグリセロール原液の新鮮なアリコートを用いて様々な用量の遊離細菌を注射した。実際の感染用量を、ＣＦＵプレーティングによって確認した。図１Ａに示されるデータについては、細胞内細菌における実際の感染用量は、１．８×１０６  ＣＦＵ／マウスであり、遊離細菌における実際の感染用量は、２．９×１０６ＣＦＵ／マウスであった。選択されたマウスに、感染直後に静脈内注射によって、単回用量の１００ｍｇ／Ｋｇのバンコマイソンで処置した。
【０２７１】
非食細胞への感染のインビトロ移入。
ＭＲＳＡ感染腹膜細胞の作製：６〜８週齢の雌Ａ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ）を、１×１０８ＣＦＵのＵＳＡ３００のＮＲＳ３８４株に腹腔注射により感染させた。腹腔洗浄液を感染から１日後に採集し腹腔洗浄液を感染から１日後に採集し、感染腹膜細胞を、０．１％ＢＳＡを補ったＨｅｐｅｓ緩衝液（ＨＢ緩衝液）で希釈した５０ｕｇ／ｍＬのリゾスタフィンで３０分間、３７℃で処理した。次いで、腹膜細胞を、２回、氷冷ＨＢ緩衝液で洗浄した。腹膜細胞を、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ及び１０％胎児ウシ血清、及び５ｕｇ／ｍＬのバンコマイソンを補ったＲＰＭＩ  １６４０組織培養培地で１×１０６細胞／ｍＬに希釈した。好中球死滅に供していない細胞外細菌についての対照として、一次感染からの遊離ＭＲＳＡを終夜、４℃にてリン酸緩衝生理食塩水溶液中に貯蔵した。
【０２７２】
骨芽細胞またはＨＢＭＥＣの感染。ＭＧ６３細胞株をＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１４２７）から得て、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ及び１０％胎児ウシ血清を補ったＲＰＭＩ  １６４０組織培養培地（ＲＰＭＩ−１０）で維持した。ＨＢＭＥＣ細胞（カタログ番号＃１０００）及びＥＣＭ培地（カタログ番号＃１００１）を、ＳｃｉｅｎｃＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から得た。細胞を２４ウェル組織培養プレートに播種し、培養して、コンフルエントな層を得た。実験の日に、細胞をＲＰＭＩ（補充物なし）で１回洗浄した。ＭＲＳＡまたは感染腹膜細胞を完全ＲＰＭＩ−１０で希釈し、感染の直前にバンコマイシンを５ｕｇ／ｍＬで加えた。腹膜細胞を骨芽細胞に１×１０６腹膜細胞／ｍＬで加えた。細胞の試料を０．１％  ｔｒｉｔｏｎ−ｘで溶解して、感染時の細胞内生細菌の実際の濃度を決定した。全ての感染についての実際の力価を、５％ヒツジ脱線維素血液を含むトリプシン大豆寒天上に細菌の系列希釈を播種することによって決定した。
【０２７３】
抗黄色ブドウ球菌抗体の作製。
抗ベータ−ＧｌｃＮＡｃ  ＷＴＡ  ｍＡｂに対するヒトＩｇＧ抗体を、抗体の重及び軽鎖の同族のペアリングを保存するモノクローナル抗体回復技術を用いて、黄色ブドウ球菌感染後の患者からの末梢Ｂ細胞からクローニングした。個別の抗体クローンは、哺乳動物細胞のトランスフェクションによって発現させた（Ｍｅｉｊｅｒ，Ｐ．Ｊ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｌ．Ｓ．，Ｌａｎｔｔｏ，Ｊ．＆  Ｊｅｎｓｅｎ，Ａ．（２００９）  Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５２５，２６１−２７７，ｘｉｖ、Ｍｅｉｊｅｒ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）  “Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｐａｉｒｉｎｇ．”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３５８，７６４−７７２）。完全長ＩｇＧ１抗体を含む上清を７日後に採集し、ＥＬＩＳＡにより抗原結合についてスクリーニングするために用いた。これらの抗体は、ＵＳＡ３００から細胞壁調製物との結合については陽性であった。抗体を、その後、２００ｍｌの一過性トランスフェクションで生成し、プロテインＡクロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ，ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いてさらなる試験のために精製した。これらの抗体の単離及び使用法は、地域倫理審査委員会によって承認された。
【０２７４】
リンカー薬物の抗体への複合。
抗ＷＴＡ抗体（Ａｂ）のＴＨＩＯＭＡＢ変異体の構造及び生成を以下のように行った。システイン残基を、抗ＷＴＡ  Ａｂ軽鎖のＶａｌ  ２０５位で操作して、そのＴＨＩＯＭＡＢ（商標）システイン操作抗体変異体を生成した。このチオ抗体ＷＴＡを、表２からのＰＭＬリンカー−抗生物質中間体に複合した。この抗体は、５０倍モル過剰量のＤＴＴの存在下で終夜還元させた。還元剤及びシステインまたはグルタチオンブロックを、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ−ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製除去した。この抗体を、５０倍モル過剰量のデヒドロアスコルビン酸（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）の存在下で、２．５時間再酸化させた。鎖間ジスルフィド結合の形成を、ＬＣ／ＭＳによってモニタリングした。タンパク質にわたって３倍モル過剰量のＰＭＬリンカー抗生物質中間体を、ＴＨＩＯＭＡＢで１時間インキュベートした。抗体薬物複合体は、０．２ｕｍ  ＳＦＣＡフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通す濾過によって精製した。過剰な遊離リンカー薬物を、濾過によって除去した。複合体を、透析によって、２０ｍＭ  ヒスチジン酢酸塩ｐＨ５．５／２４０ｍＭ  スクロースに緩衝液交換した。ｍＡｂ１つ当たりの複合したリファマイシン型抗生物質の数を抗生物質／抗体比（ＡＡＲ）としてＬＣ／ＭＳ分析によって定量化した。精製もまた、サイズ排除クロマトグラフィーによって評価した。
【０２７５】
質量分光分析
ＬＣ／ＭＳ分析を、６５３０  Ａｃｃｕｒａｔｅ−Ｍａｓｓ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（Ｑ−ＴＯＦ）  ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で行った。８０℃に加熱したＰＲＬＰ−Ｓカラム、１０００Å、８μｍ（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で試料をクロマトグラフィーに供した。４．３分間で３０〜６０％のＢという線形勾配（溶媒Ａ、水中０．０５％  ＴＦＡ、溶媒Ｂ、アセトニトリル中０．０４％  ＴＦＡ）を使用し、溶離液を、エレクトロスプレー源を用いて直接イオン化させた。データを収集し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍａｓｓ  Ｈｕｎｔｅｒ定性分析ソフトウェアを用いてデコンボリューションした。ＬＣ／ＭＳ分析前に、抗体薬物複合体を、リジルエンドペプチダーゼ（Ｗａｋｏ）で、１：１００  ｗ／ｗの酵素対抗体比、ｐＨ８．０で、３０分間３７℃で処理して、分析の容易さのためにＦａｂ及びＦｃ部分を生成した。抗体に対する抗生物質の比（ＡＡＲ）（本明細書においては、抗体に対する薬物の比（ＤＡＲ）と同義に使用される）は、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアによって計算された多数のＦａｂ及びＦａｂ＋１を用いて計算された。
【０２７６】
感染マウスから単離された細菌の分析：Ｂａｌｂ／ｃマウスを、静脈内注射によって１×１０７ＣＦＵのＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００）に感染させ、腎臓を感染後３日目に採取した。腎臓を、Ｍチューブ及びプログラムＲＮＡ０１．０１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いて、２つの腎臓当たり５ｍＬの体積でＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ細胞解離器を用いてホモジナイズした。均質化緩衝液は、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１０ｕｇ／ｍＬのＤＮＡアーゼ（ウシ膵臓グレードＩＩ、Ｒｏｃｈｅ）、及びプロテアーゼ阻害剤（完全プロテアーゼ阻害剤カクテル、Ｒｏｃｈｅ  １１−８３６−１５３００１）であった。ホモジナイズした後に、試料を室温で１０分間インキュベートし、次いで、氷冷ＰＢＳで希釈し、４０ｕＭの細胞濾過器を通して濾過した。組織均質物を、氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、次いで、ＨＢ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び０．１％ウシ血清アルブミンを補ったＨａｎｋｓ平衡塩類溶液）で２つの腎臓当たり０．５ｍＬの体積で懸濁した。細胞懸濁液を再度濾過し、２５ｕＬの細胞懸濁液を各染色反応のために得た。
【０２７７】
抗ＭＲＳＡ抗体の発現を比較するためのフローサイトメトリー：フローサイトメトリー細菌（１×１０７のインビトロ増殖細菌、または２５ｕＬの上述の組織均質物）のために染色する抗体を、ＨＢ（上記）で懸濁させ、マウスＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ，Ｉ５３８１）の４００μｇ／ｍＬ（マイクログラム／ミリリットル）によるインキュベーションによって１時間ブロックした。蛍光標識抗体を、ブロッキング反応物に直接添加し、室温でさらに１０〜２０分間インキュベートした。細菌を、ＨＢ緩衝液中で３回洗浄し、次いで、ＦＡＣＳ分析の前にＰＢＳ  ２％  パラホルムアルデヒド中で固定した。試験抗体（抗βＷＴＡ：４４９７、抗αＷＴＡ：７５７８、またはアイソタイプ対照：ｇＤ）を、アミン反応試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８のスクシンイミジルエステル、ＮＨＳ−Ａ４８８）を用いてＡｌｅｘａ−４８８で複合した。５０ｍＭのリン酸ナトリウム中の抗体を、５〜１０倍モル過剰量のＮＨＳ−Ａ４８８で、暗室中で、室温で２〜３時間反応させた。標的混合物を、ＰＢＳ中で平衡化したＧＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｓ２００カラムに適用して、複合抗体から過剰な反応物を除去した。Ａ４８８分子／抗体の数は、製造業者によって記載されるＵＶ方法を用いて決定した。
【０２７８】
組織均質物における細菌の分析については、非競合抗黄色ブドウ球菌抗体（ｒＦ１−Ｈａｚｅｎｂｏｓ，Ｗ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｎｏｖｅｌ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ＳｄｇＡ  ａｎｄ  ＳｄｇＢ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ９，ｅ１００３６５３を、Ａｌｅｘａ−６４７に複合して、同様の大きさの粒子の黄色ブドウ球菌と区別した。試験抗体は、８０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｕｇ／ｍＬの用量の範囲で試験された。Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ  ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）を使用してフローサイトメトリーを行い、ＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウェア（Ｆｌｏｗ  Ｊｏ  ＬＬＣ，Ａｓｈｌａｎｄ  ＯＲ）を使用して分析を行った。
【０２７９】
非複製細菌における遊離抗生物質における死滅時間：黄色ブドウ球菌（ＵＳＡ３００）は、終夜静止期培養から得られ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離管中に抗生物質を含まないまたは１０ｍＬの体積で１×１０−６Ｍの抗生物質を含む、ＰＢＳ中の１×１０７ＣＦＵ／ｍＬで懸濁させた。細菌を、振盪しながら３７℃でインキュベートした。各時点で、３つの１ｍＬの試料を各培地から除去し、遠心分離して、細菌を回収した。細菌をＰＢＳで１回洗浄して、抗生物質を除去し、生存細菌の総数を、寒天プレート上に系列希釈の細菌を播種することによって決定した。
【０２８０】
遊離抗生物質による生残菌細胞の死滅：黄色ブドウ球菌（ＵＳＡ３００）は、終夜静止期培養から得られ、トリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）中で１回洗浄し、次いで、ＴＳＢまたはシプロフロキシシン（０．０５ｍＭ）を含むＴＳＢのいずれかを総体積１０ｍＬで、１×１０７ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度まで調節した。培養物を、振盪しながら３７℃で６時間インキュベートし、次いで、第２の抗生物質であるリファンピシン（１ｕｇ／ｍｌ）または別のリファマイシン型抗生物質（１ｕｇ／ｍｌ）のいずれかを添加した。指示された時間に、試料を各培養から取り出し、ＰＢＳで１回洗浄して、抗生物質を除去し、ＰＢＳ中で再懸濁した。生存細菌の総数を、寒天プレート上に系列希釈の細菌を播種することによって決定した。最終時点で、各培養の残りを回収し、播種した。
【０２８１】
ＡＡＣについてのカテプシン放出アッセイ：カテプシンＢで処理した後、ＡＡＣから放出された活性抗生物質の量を定量化するために、ＡＡＣを、カテプシン緩衝液（２０ｍＭ  酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  Ｌ−システイン  ｐＨ５）中で２００ｕｇ／ｍＬまで希釈した。カテプシンＢ（ウシ膵臓から、ＳＩＧＭＡ  Ｃ７８００）を１０ｕｇ／ｍＬで添加し、試料を３７℃で１時間インキュベートした。対照として、ＡＡＣを緩衝液のみでインキュベートした。９体積の細菌増殖培地であるトリプシン大豆ブロスｐＨ７．４（ＴＳＢ）を添加することによって反応を停止した。活性抗生物質の総放出量を見積もるために、反応混合物の系列希釈を、９６ウェルプレートにおいてＴＳＢ中で４重に作製し、ＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００）を、２×１０３ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度で各ウェルに添加した。培養物を終夜、振盪しながら３７℃でインキュベートし、プレートリーダーを用いて６３０ｎＭにて吸光度を読み取ることによって、細菌増殖を測定した。
【０２８２】
ファゴリソソーム処理のためのＳ４４９７抗体ＦＲＥＴ複合体の合成。
マレイミドＦＲＥＴペプチドを合成し、Ｓ４４９７システイン操作されたＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体に複合した。ＦＲＥＴ対は、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）及びフルオレセイン（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２１，６４−７３）を使用した。マレイミドＦＲＥＴペプチドは、ＰＳ３ペプチド合成機（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて標準的なＦｍｏｃ固相化学によって合成した。簡潔に言えば、０．１ｍｍｏｌのＲｉｎｋアミド樹脂を使用して、Ｃ末端カルボキサミドを作製した。Ｎ及びＣ末端基でＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨを使用して、樹脂上のＭｔｔ（モノメトキシトリチル）基を除去し、ＴＡＭＲＡ及びフルオレセインを結合して、さらなる側鎖化学を行った。ＣＢＤＫ−ｃｉｔペプチド模倣薬単位を、カテプシン切断可能なスペーサーとしてＦＲＥＴ対の間に添加した。樹脂から切断された粗マレイミドＦＲＥＴペプチドまたはマレイミドカプロイル−Ｋ（ＴＡＭＲＡ）−Ｇ−ＣＢＤＫ−ｃｉｔ−Ｋ（フルオレセイン）を、Ｊｕｐｉｔｅｒ  ５μｍ  Ｃ４カラム（５μｍ、１０ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いて逆相ＨＰＬＣによってさらなる精製に供した。我々のＦＲＥＴプローブは、抗体複合体の細胞内トラフィッキングだけでなく、ファゴリソソーム中のリンカーの処理をモニタリングすることが可能である。無傷抗体複合体は、ドナーからの蛍光共鳴エネルギー移動により赤色のみが蛍光を発する。しかしながら、ファゴリソソーム中のＦＲＥＴ  ペプチドの基質切断時、ドナーからの緑色蛍光が出現することが予想される。
【０２８３】
マクロファージの内部でリンカーの切断を検出するためのビデオ顕微鏡法
マウス腹腔マクロファージを、マクロファージ細胞内死滅アッセイにおいて記載されるように、完全培地中でチャンバースライド（Ｉｂｉｄｉ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ．カタログ８０８２６）上に播種した。ＵＳＡ３００は、３７Ｃで３０分間のインキュベーションによって、ＰＢＳ  ０．１％  ＢＳＡ中の１００ｕｇ／ｍＬでＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃ１００９４）を標識した。標識細菌を、ＨＢ緩衝液中で１時間のインキュベーションによって、４４９７−ＦＲＥＴプローブでオプソニン化した。オプソニン化した細菌を加える直前に、マクロファージを１回洗浄し、細菌を１×１０７細菌／ｍＬで細胞に加えた。ファゴサイトーシスのない対照については、マクロファージを、ファゴサイトーシス前及びその間に、６０ｎＭのＬａｔｒｕｎｃｕｌｉｎ  Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で３０分間前処理した。スライドを、細菌の細胞への添加直後に、顕微鏡上に載せ、ムービーが、ＣＯ２が入った環境チャンバー及びＬｕｄｉｎからの温度調節器を装備したＬｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡により得られた。Ｐｌａｎ  ＡＰＯ  ＣＳ  ４０Ｘ、Ｎ．．Ａ：１．２５、油浸レンズ、ならびにａｌｅｘａ  ４８８及びＴＡＭＲＡをそれぞれ励起するために、４８８ｎｍ及び５４３ｎｍのレーザー線を用いて、画像を合計３０分間毎分キャプチャーした。位相画像もまた、５４３ｎｍのレーザー線を用いて記録した。
【０２８４】
質量分析法によってマクロファージの内部に放出された抗生物質の定量化。
マウス腹腔マクロファージを、ＨＢ中の１００ｕｇ／ｍＬでＡＡＣでオプソニン化したＭＲＳＡを用いる細胞内死滅アッセイのために以下に記載される２４ウェル組織培養皿中で感染させた。ファゴサイトーシスが完了した後、細胞を洗浄し、２５０ｕＬの完全培地＋ゲンタマイシンをウェルに加え、この細胞を１時間または３時間インキュベートした。各時点で、上清及び細胞分画を回収し、アセトニトリル（ＡＣＮ）を７５％の最終濃度になるまで添加し、３０分間インキュベートした。細胞及び上清抽出物を、Ｎ２（ＴｕｒｂｏＶａｐ）下での蒸発によって凍結乾燥させ、１００ｕＬの５０％  ＡＣＮ中で再構成し、濾過し、Ａｂ  Ｓｃｉｅｘ  ＱＴＲＡＰ  ６５００  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムにおいて分析した。
【０２８５】
インビトロでの細胞内死滅アッセイ。
非食細胞型：ＭＧ６３（ＣＲＬ−１４２７）及びＡ５４９（ＣＣＬ１８５）細胞株をＡＴＣＣから得て、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ及び１０％胎児ウシ血清を補ったＲＰＭＩ  １６４０組織培養培地（ＲＰＭＩ−１０）で維持した。ＨＵＶＥＣ細胞を、Ｌｏｎｚａから得て、ＥＧＭ内皮細胞完全培地（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で維持した。ＨＢＭＥＣ細胞（カタログ番号＃１０００）及びＥＣＭ培地（カタログ番号＃１００１）を、ＳｃｉｅｎｃＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から得た。
【０２８６】
マウスマクロファージ：腹腔マクロファージを、６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）の腹膜から単離した。マクロファージの収率を増やすために、１ｍＬのチオグリコール酸塩培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の腹腔内注射によりマウスを前処理した。チオグリコール酸塩培地を、水中で４％の濃度で調製し、オートクレーブにより滅菌し、使用前に２０日〜６カ月間熟成させた。腹腔マクロファージは、チオグリコール酸塩での処置から４日後に、腹腔を冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄することにより採集した。マクロファージを、１０％胎児ウシ血清及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを補った、抗生物質を含まないダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に４×１０５細胞／ウェルの密度で２４ウェル培養皿に播種した。マクロファージを終夜培養して、プレートに接着させた。
【０２８７】
ヒトＭ２マクロファージ：ＣＤ１４＋単球を、単球単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ｃａｔ  １３０−０９１−１５３）を用いて正常ヒト血から精製し、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で予めコーティングされた組織培養皿上に１．５×１０５細胞／ｃｍ２で播種し、２０％  ＦＣＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのｒｈＭ−ＣＳＦを含むＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。培地を１日目と７日目に取り替え、培地を５％血清＋２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４に変更した。マクロファージは、１８時間後に使用した。
【０２８８】
アッセイプロトコル：全ての実験において、細菌をトリプシン大豆ブロスで培養した。抗体抗生物質複合体（ＡＡＣ）での細胞内死滅を評価するために、ＵＳＡ３００を指数関数的に成長する培養物から取り、ＨＢ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び０．１％ウシ血清アルブミンを補ったＨａｎｋｓ平衡塩類溶液）で洗浄した。ＡＡＣまたは抗体をＨＢで希釈し、細菌と１時間インキュベートして、細菌との抗体の結合を可能にし（オプソニン化）、オプソニン化した細菌を用いて、１マクロファージ当たり１０〜２０細菌の割合で（１ウェル当たり２５０ｕＬのＨＢ中に４×１０６細菌でマクロファージに感染させた。マクロファージを感染の直前に無血清ＤＭＥＭ培地で予備洗浄し、５％  ＣＯ２の湿潤組織培養インキュベータ中で３７Ｃでのインキュベーションによって感染させて、細菌の食作用を可能にした。２時間後に、感染ミックスを除去し、通常増殖培地（１０％胎児ウシ血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを補ったＤＭＥＭに置き換え、ゲンタマイシンを５０ｕｇ／ｍｌで加えて、細胞外細菌の成長を妨げた。インキュベーション期間の終わりに、マクロファージを無血清培地で洗浄し、０．１％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（細胞内細菌に損傷を与えることなくマクロファージを溶解する）を補ったＨＢで細胞を溶解した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（細菌の凝集を阻害するため）を補ったリン酸緩衝生理食塩水溶液中で溶解物の系列希釈を作製し、生存細胞内細菌の総数を、５％ヒツジ脱線維素血液を含むトリプシン大豆寒天上に播種することによって決定した。
【実施例】
【０２８９】
実施例１  細胞内ＭＲＳＡは、従来の抗生物質から保護される
哺乳動物細胞が、抗生物質療法の存在下で、黄色ブドウ球菌に対する保護ニッチを提供するという仮説を確認するために、有効性は、侵襲性ＭＲＳＡ感染症に対する標準治療（ＳＯＣ）として現在使用されている３つの主要な抗生物質（バンコマイソン、ダプトマイシン、及びリネゾリド）が比較された（表４）。
【０２９０】
細胞外細菌については、ＭＲＳＡをトリプシン大豆ブロス中で終夜培養し、ＭＩＣが増殖を阻止した最小の抗生物質の用量であることを決定した。細胞内細菌については、マウス腹腔マクロファージを、ＭＲＳＡで感染させ、ゲンタマイシンの存在下で培養して、細胞外細菌を死滅させた。試験抗生物質を、感染してから１日後に、培養培地に加え、生存細胞細菌の総数を２４時間後に決定した。臨床的に関連する抗生物質に対して予想された血清濃度が、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ，Ａｎｄｒｅ  Ｂｒｙｓｋｉｅｒ．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ（２００５）において報告された。
【０２９１】
表４：液体培養中の細胞外細菌対マウスマクロファージの内部に隔離されている細胞内細菌におけるいくつかの抗生物質での最小阻止濃度（ＭＩＣ）
0006742314.tif 000070
【０２９２】
強毒性地域感染型ＭＲＳＡ株ＵＳＡ３００を用いたこの分析は、細胞外ＭＲＳＡが液体培地中の低濃度のバンコマイソン、ダプトマイシン、及びリネゾリドによる増殖阻害に対して高度の感受性を示すが、全ての３つの抗生物質は、臨床的に達成可能な濃度の抗生物質に曝露されたマクロファージの内部に隔離されていた同じＭＲＳＡ株を死滅させることができなかったことを示した。細胞内病原体を排除する際に比較的効果的であると考えられたリファンピシンでさえ（Ｖａｎｄｅｎｂｒｏｅｋ，Ｐ．Ｖ．（１９８９）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇｓ，Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １１，２１３−２４５）、浮遊性細菌の増殖（ＭＩＣ）を阻害するために必要とされる用量と比較して細胞内ＭＲＳＡを排除するためには６，０００倍高い用量を必要とし（表１）、このことは既存の抗生物質の大部分がインビトロ及びインビボの両方で細胞内黄色ブドウ球菌を死滅させる際に効果がないことを示す他の研究と一致した（Ｓａｎｄｂｅｒｇ，Ａ．，Ｈｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｓｋｏｖ，Ｒ．Ｌ．，Ｂｌｏｍ，Ｊ．＆  Ｆｒｉｍｏｄｔ−Ｍｏｌｌｅｒ，Ｎ．（２００９）“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ  ｍｏｄｅｌ”  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５３，１８７４−１８８３）。
【０２９３】
実施例２  細胞内ＭＲＳＡによる感染の播種
これらの実験は、細胞内細菌の病原性対等用量の自由生活型浮遊性細菌を比較し、細胞内細菌がインビボでバンコマイソンの存在下で感染を確定することができるかどうかを決定した。４つのコホートのマウスを、ブロス培養から直接得られた黄色ブドウ球菌の生存可能な遊離細菌（２．９×１０６）、または宿主マクロファージの内部に隔離されていた細胞内細菌（１．８×１０６）及びドナーマウスの腹腔感染によって生成された好中球のほぼ当量の用量で静脈注射により感染させ（図１Ａ）、選択された群を、感染直後、次いで、１日１回、バンコマイソンで治療した。マウスを、マウスにおいて黄色ブドウ球菌によって常に定着される器官である腎臓における細菌定着に感染してから４日後に試験した。３つの独立した実験において、浮遊性細菌の当量で感染させたものと比較した細胞内細菌で感染させたマウスの腎臓における同等またはより高い細菌負荷が観察された（図１Ｂ）。驚くべきことには、細胞内細菌での感染がこのモデルにおいて浮遊性細菌で感染させた後に十分に定着しない器官である脳のより一貫した定着をもたらすことが見出された（図１Ｃ）。さらに、細胞内細菌が、このモデルにおけるバンコマイソン療法にもかかわらず、感染を確定することができたが、浮遊性細菌は確定することができなかった（図１Ｂ、図１Ｃ）
【０２９４】
インビトロでのさらなる分析は、細胞内生存が抗生物質回避を促す程度をより定量的に対応した。このために、ＭＧ６３骨芽細胞を、バンコマイソンの存在下で、浮遊性ＭＲＳＡまたは細胞内ＭＲＳＡのいずれかで感染させた。
【０２９５】
骨芽細胞またはＨＢＭＥＣの感染。ＭＧ６３細胞株をＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１４２７）から得て、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ及び１０％胎児ウシ血清を補ったＲＰＭＩ  １６４０組織培養培地（ＲＰＭＩ−１０）で維持した。ＨＢＭＥＣ細胞（カタログ番号＃１０００）及びＥＣＭ培地（カタログ番号＃１００１）を、ＳｃｉｅｎｃＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から得た。細胞を２４ウェル組織培養プレートに播種し、培養して、コンフルエントな層を得た。実験の日に、細胞をＲＰＭＩ（補充物なし）で１回洗浄した。ＭＲＳＡまたは感染腹膜細胞を完全ＲＰＭＩ−１０で希釈し、感染の直前にバンコマイシンを５ｕｇ／ｍＬで加えた。腹膜細胞を骨芽細胞に１×１０６腹膜細胞／ｍＬで加えた。細胞の試料を０．１％  ｔｒｉｔｏｎ−ｘで溶解して、感染時の細胞内生細菌の実際の濃度を決定した。全ての感染についての実際の力価を、５％ヒツジ脱線維素血液を含むトリプシン大豆寒天上に細菌の系列希釈を播種することによって決定した。
【０２９６】
ＭＲＳＡ（遊離細菌）を、培地、培地＋バンコマイソン、または培地＋バンコマイソン中に作付けし、ＭＧ６３骨芽細胞（図１Ｅ）またはヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ、図１Ｆ）の単分子層上に播種した。プレートを遠心分離し、細菌と単分子層との接触を促進した。各時点で、培養上清を回収し、細胞外細菌を回復させるか、または接着細胞を溶解して、細胞内細菌を放出した。
【０２９７】
バンコマイソンのみに曝露された浮遊性細菌を有効に死滅させた。生存細菌は、培養から１日後には回収されなかった（図１Ｄ）。同様の数の浮遊性細菌をＭＧ６３骨芽細胞上に播種した場合に、骨芽細胞の侵襲によってバンコマイソンから保護されていた、感染から１日後にＭＧ６３細胞と関連する少数の生存細菌（約０．０６％のインプット）が回収された。
【０２９８】
腹腔細胞の内部に隔離されていたＭＲＳＡは、バンコマイソンの存在下で、生存及び感染の効率の両方において劇的な増加を示した。白血病において、約１５％の細胞内のＭＲＳＡが、バンコマイソンが浮遊性細菌の培養を滅菌した同一の条件下で生存した。細胞内細菌はまた、バンコマイソンの存在下で、ＭＧ６３骨芽細胞の単分子層を感染させることがより可能であり、バンコマイソンに曝露してから１日後に、２倍の細菌の回収をもたらした（図１Ｄ）。さらに、細胞内黄色ブドウ球菌は、遊離生細菌を死滅させたバンコマイソンの濃度への一定の曝露下で、ＭＧ６３細胞（図１Ｅ）、一次ヒト脳内皮細胞（図１Ｆ）、及びＡ５４９気管支上皮細胞（示さず）において、２４時間の期間にわたってほぼ１０倍で増加することが可能であった。抗生物質から死滅するのを防いだが、細胞増殖は、感染した腹腔マクロファージ及び好中球の培養において生じなかった（示さず）。同時に、これらのデータは、骨髄性細胞におけるＭＲＳＡの細胞内保有宿主が、活性な抗生物質による治療の存在下でさえ、新たな部位への感染の播種を促進させることができ、細胞内増殖が、絶え間ない抗生物質療法の条件下でさえ、内皮及び上皮細胞において生じ得ることを支持している。
【０２９９】
細胞内黄色ブドウ球菌を特異的に死滅させる試薬を開発するために、抗体及び抗生物質成分は、最大効果のために慎重に選択され、最適化された。以下の実施例は、複合されて、ＡＡＣを形成する、抗壁テイコ酸ベータ（抗ＷＴＡβ）抗体の選択及びある特定のリファマイシン型抗生物質をもたらす実験及び結果を示す。
【０３００】
実施例３  抗黄色ブドウ球菌モノクローナル抗体の選択
ＡＡＣによって送達される抗生物質の量、よってその最終的な有効性は、細菌の表面上の抗体結合部位の数によって限定される。それ故に、インビボでの感染の全ての段階時にＭＲＳＡにおいて安定的に発現される高度に豊富な抗原に結合する抗体を選択することは不可欠であった。初期ステップとして、４０個の抗黄色ブドウ球菌抗体のパネルを、様々な黄色ブドウ球菌感染症から回復する患者の末梢血から得られるＢ細胞からクローニングし、精製し、感染したマウスの腎臓から直接単離されたＭＲＳＡとの結合についてスクリーニングした。
【０３０１】
抗体作製、スクリーニング、及び選択
略記：ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）、ＭＳＳＡ（メチシリン感受性黄色ブドウ球菌）、ＶＩＳＡ（バンコマイソン中間体耐性黄色ブドウ球菌）、ＬＴＡ（リポテイコ酸）、ＴＳＢ（トリプシン大豆ブロス）、ＣＷＰ（細胞壁調製物）。
【０３０２】
ヒトＩｇＧ抗体を、ＵＳ８，２８３，２９４：“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｃｏｇｎａｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、Ｍｅｉｊｅｒ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３５８：７６４−７７２（２００６）、及びＬａｎｔｔｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８５（４）：１８２０−３３（Ｆｅｂ  ２０１１）に記載されるように、抗体の重及び軽鎖の同族のペアリングを保存するＳｙｍｐｌｅｘ（商標）技術（Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ，Ｌｙｎｇｂｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて黄色ブドウ球菌感染後の患者から末梢Ｂ細胞からクローニングし、血漿及びメモリー細胞を、組換え完全長ＩｇＧレパートリーのための遺伝子的供給源として用いた。個別の抗体クローンは、Ｍｅｉｊｅｒ  ＰＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５２５：２６１−２７７，ｘｉｖ．（２００９）に記載される、哺乳動物細胞のトランスフェクションにより発現させた。完全長ＩｇＧ１抗体を含む上清を７日後に採集し、一次スクリーニングにおいて、間接的ＥＬＩＳＡにより抗原結合についてスクリーニングするために用いた。ＵＳＡ３００またはＷｏｏｄ４６株の黄色ブドウ球菌からの細胞壁調製物との陽性ＥＬＩＳＡ結合を示すｍＡｂのライブラリーを作製した。抗体を、その後、２００ｍｌの一過性トランスフェクションで生成し、プロテインＡクロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ，ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いてさらなる試験のために精製した。抗体を大量に産生する場合、抗体は、ＣＨＯ細胞内で産生された。ＶＬ及びＶＨをコードするベクターを、ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトし、ＩｇＧを、プロテインＡプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって細胞培養培地から精製した。
表５：Ａｂを単離するために使用された抗原の一覧
0006742314.tif 000071
ＣＷ＃１及びＣＷ＃３は、常に、ＥＬＩＳＡコーティングを作製するために一緒に混合された：
図６は、ＥＬＩＳＡによる抗体の一次スクリーニングを要約する。全て（４５６９を除く）は、ＵＳＡ３００細胞壁調製混合物（鉄除去：ＴＳＢを９６：４の比で）でスクリーニングされる場合に単離された。全てのＧｌｃＮＡｃベータ（６２５９を除く）、ＳＤＲ、及びＰＧＮ（４４７９）のｍＡｂはまた、一次スクリーニングにおいてＰＧＮ及びＷＴＡが陽性であった。全てのＧｌｃＮＡｃアルファは、ＵＳＡ３００  ＣＷ混合との混合に対するスクリーニングによってのみ見出された。４５６９（ＬＴＡ特異的）は、Ｗｏｏｄ４６  ＣＷＰにおけるスクリーニングによって見出された。
【０３０３】
最高レベルの抗体結合は、ＷＴＡ上のβ−Ｏ−結合型ＧｌｃＮＡｃ糖修飾を認識するヒトＩｇＧ１で見出された（表６）。α−Ｏ−結合型ＧｌｃＮＡｃを認識するモノクローナル抗体による結合はあまり達成しなかった；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ｇＤタンパク質に対するアイソタイプ対照抗体は、インビボ由来の黄色ブドウ球菌において発現されたタンパク質Ａによりいくつかの最小反応性を示した（図７Ａ）。抗体の抗原特異性は、遺伝学的手段によって決定され、そのため、ＷＴＡ上のα−またはβ−ＧｌｃＮＡｃ糖修飾に対する抗体は、それらのそれぞれのグリコシルトランスフェラーゼを欠いている黄色ブドウ球菌株と結合することができなかった（図７Ｂに例示されるように）。インビボ由来のＭＲＳＡに結合する抗体の及ぶ範囲と一致して、抗β−ＧｌｃＮＡｃ  ＷＴＡ抗体で作製されたＡＡＣは、抗α−ＧｌｃＮＡｃ  ＷＴＡ抗体で作製されたものに対して優れた有効性を示した。
【０３０４】
エクスビボフローサイトメトリーを用いるライブラリーからの抗ＷＴＡ  ｍＡｂの選択
このライブラリー内の各ｍＡｂを３つの選択基準について検索した：（１）高い抗生物質送達に好ましい可能性がある、対応する同族抗原の高い発現を示す、ＭＲＳＡ表面とのｍＡｂ結合の相対的強度、（２）感染中のインビボでのＭＲＳＡ表面での同族抗原の安定発現を示す、多様な感染組織から単離されたＭＲＳＡとのｍＡｂ結合の一貫性、及び（３）同族表面抗原の発現の保存を示す、臨床的黄色ブドウ球菌株のパネルとのｍＡｂ結合能力。このために、フローサイトメトリーを用いて、様々な感染組織から及び異なる黄色ブドウ球菌株からの黄色ブドウ球菌との反応性について、ライブラリー中のｍＡｂのこれらの予め選択された培養上清の全てを試験した。
【０３０５】
ライブラリー中の全てのｍＡｂを、ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００に感染させたマウスからの感染腎臓、脾臓、肝臓、及び肺から、ならびにウサギ心内膜炎モデルにおいてＵＳＡ３００  ＣＯＬに感染させたウサギからの心臓または腎臓内のＭＲＳＡと結合する能力について分析した。様々な感染組織からの黄色ブドウ球菌を認識する抗体の能力は、黄色ブドウ球菌による広い多様性の異なる臨床感染において治療抗体が活性である可能性を上昇させる。細菌を、器官の採集の際に直ちに、すなわち継代培養なしで分析して、インビトロ培養条件により引き起こされる表現型の変化を妨げた。いくつかの黄色ブドウ球菌表面抗原が、インビトロ培養中に発現されながら、感染組織において発現を喪失した。このような抗原に対する抗体は、感染を治療するために有用である可能性が低い。様々な感染組織におけるこのｍＡｂライブラリーの分析時に、著しい数の抗体についてこの観察が確認され、これらの抗体は、培養からの黄色ブドウ球菌細菌との著しい結合を示したが、試験した感染組織の全てからの細菌との結合がなかった。いくつかの抗体は、全てではないがいくつかの試験した感染組織からの細菌と結合した。したがって、本発明では、我々は、試験した全ての感染条件からの細菌を認識することができる抗体を選択した。評価したパラメータは、（１）抗原存在量の尺度としての相対的蛍光強度、（２）抗原発現の安定性の尺度としての陽性に染色された器官の数、及び（３）同族表面抗原の発現の保存を示す、臨床黄色ブドウ球菌株のパネルとのｍＡｂ結合能力であった。試験抗体の蛍光強度は、無関係の抗原、例えばＩｇＧ１  ｍＡｂ抗ヘルペスウイルスｇＤ：５２３７（以下で参照する）に対するアイソタイプ対照抗体と比べて決定した。ＷＴＡ−ベータに対するｍＡｂは、最高の抗原存在量を示しただけでなく、試験し、上に明記した全ての感染組織からのＭＲＳＡとの非常に一貫した結合も示した。
【０３０６】
さらに、ＴＳＢ中でインビトロで培養した以下の黄色ブドウ球菌株：ＵＳＡ３００（ＭＲＳＡ）、ＵＳＡ４００（ＭＲＳＡ）、ＣＯＬ（ＭＲＳＡ）、ＭＲＳＡ２５２（ＭＲＳＡ）、Ｗｏｏｄ４６（ＭＳＳＡ）、Ｒｏｓｅｎｂａｃｈ（ＭＳＳＡ）、Ｎｅｗｍａｎ（ＭＳＳＡ）、及びＭｕ５０（ＶＩＳＡ）と結合するこれらのｍＡｂの能力を評価した。抗ＷＴＡアルファｍＡｂはそうではないが、抗ＷＴＡ  ベータｍＡｂは、これらの株の全てと反応性であることが見出された。異なる株との結合の分析は、ＷＴＡベータがＷＴＡアルファよりも保存され、よって、ＡＡＣのためにより適切であることを示した。
【０３０７】
実施例４  壁テイコ酸に対する特異性を有する抗体の特徴付け  ＡｂのＷＴＡ特異性の確認
４０ｍｇのペレットにした黄色ブドウ球菌株を、３０％ラフィノース、１００μｇ／ｍｌのリゾスタフィン（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）、及びＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）を補った１  ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）と３７℃で３０分間インキュベートすることにより、黄色ブドウ球菌野生型（ＷＴ）株及びＷＴＡを欠く黄色ブドウ球菌突然変異株（ΔＴａｇＯ；ＷＴＡ−ヌル株）からの細胞壁調製物（ＣＷＰ）を作製した。溶解物を１１，６００×ｇで５分間遠心分離し、細胞壁成分を含む上清を回収した。免疫ブロット分析のために、タンパク質を４〜１２％トリス−グリシンゲルで分離し、ニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に移し、続いて、ＷＴＡに対する記載する試験抗体またはＰＧＮ及びＬＴＡに対する対照抗体を用いてブロッティングした。
【０３０８】
免疫ブロット法は、ＷＴＡに対する抗体がＷＴ黄色ブドウ球菌からのＷＴ細胞壁調製物と結合したが、ＷＴＡを欠くΔＴａｇＯ株からの細胞壁調製物と結合しなかったことを示す。ペプチドグリカン（抗ＰＧＮ）及びリポテイコ酸（抗ＬＴＡ）に対する対照抗体は、両方の細胞壁調製物とよく結合する。これらのデータは、ＷＴＡに対する試験抗体の特異性を示す。
【０３０９】
ｉ）ＭＲＳＡ表面とのｍＡｂ結合の程度を決定するためのフローサイトメトリー
感染組織からの全細菌上の表面抗原発現を、以下のプロトコルを用いるフローサイトメトリーにより分析した。感染マウス組織からの細菌の抗体染色のために、６〜８週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に、ＰＢＳ中の１０８ＣＦＵの対数期増殖ＵＳＡ３００を静脈内注射した。マウス器官を感染してから２日後に採集した。ウサギ感染性心内膜炎（ＩＥ）を、Ｔａｔｔｅｖｉｎ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５４：６１０−６１３（２０１０）に以前に記載されたように確立した。ウサギに、５×１０７のＣＦＵの静止期増殖ＭＲＳＡ株ＣＯＬを静脈内注射し、心臓疣贅を１８時間後に採集した。３０ｍｇ／ｋｇのバンコマイソンでの処置は、７×１０７ＣＦＵの静止期での感染から１８時間後に、１日２回静脈内で与えた。
【０３１０】
マウスまたはウサギ細胞を溶解するために、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ細胞解離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いてＭチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）中で組織をホモジナイズし、続いて、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（Ｔｈｅｒｍｏ）、１０μｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）及びＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含むＰＢＳ中で室温で１０分間インキュベートした。懸濁液を４０ミクロンフィルタ（ＢＤ）に通し、０．１％  ＩｇＧフリーＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）及び１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４（ＨＢ緩衝液）を補った、フェノールレッドを含まないＨＢＳＳで洗浄した。細菌懸濁液を、次いで、ＨＢ緩衝液中で３００μｇ／ｍＬのウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と室温（ＲＴ）で１時間インキュベートし、非特異的ＩｇＧ結合をブロックした。細菌を、ｒＦ１またはアイソタイプ対照ＩｇＧ１  ｍＡｂ抗ヘルペス対ｇＤ：５２３７（Ｎａｋａｍｕｒａ  ＧＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７：６１７９−６１９１（１９９３））を含む２μｇ／ｍＬの一次抗体で染色し、次いで、蛍光抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で染色した。マウスまたはウサギの器官デブリからの細菌の分化を可能にするために、２０μｇ／ｍＬのマウスｍＡｂ  ７０２抗黄色ブドウ球菌ペプチドグリカン（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）及び蛍光色素標識された抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて二重染色を行った。細菌を洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）により分析した。フローサイトメトリー分析中に、細菌は、二重蛍光プロットからのｍＡｂ  ７０２でのポジティブ染色についてゲートで制御した。
【０３１１】
ｉｉ）黄色ブドウ球菌との結合親和性及びＭＲＳＡ上の抗原密度の測定
表６は、Ｎｅｗｍａｎ−ΔＳＰＡ株と結合するＭＲＳＡ抗体の平衡結合分析、及び細菌上の抗原密度を示す。
表６
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ＫＤ及び抗原密度は、以下のアッセイ条件下で放射性リガンド細胞結合アッセイを用いることにより導いた：ＤＭＥＭ＋２．５％マウス血清結合緩衝液、室温（ＲＴ）で２時間の溶液結合、及び４００，０００個の細菌／ウェル。
Ａｂ  ６２６３は、配列が非常に類似するという点において、６０７８のようである。ＣＤＲ  Ｈ３中の２番目の残基（Ｇに対してＲ）を除いて、その他のＬ及びＨ鎖ＣＤＲ配列は全て同一である。
【０３１２】
実施例５  抗ＷＴＡ抗体のアミノ酸修飾
要約すると、抗ＷＴＡベータＡｂのそれぞれのＶＨ領域をクローニングし、ヒトＨ鎖ガンマ１定常領域と結合させ、ＶＬをカッパ定常領域と結合させて、ＩｇＧ１としてＡｂを発現させた。以下に記載されるように、抗原結合を維持しながら、野生型配列を、ある特定の位置で改変して、抗体安定性を改善した。次いで、システイン操作Ａｂ（チオＭａｂ、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）とも称される）を作製した。
【０３１３】
ｉ．可変領域と定常領域との結合
上記のヒト抗体ライブラリーから同定されたＷＴＡベータＡｂのＶＨ領域をヒトγ１定常領域に結合させて、完全長ＩｇＧ１  Ａｂを作製した。Ｌ鎖は、カッパＬ鎖であった。
【０３１４】
ｉｉ．安定性変異体の作製
図１２（具体的には、図１３Ａ、１３Ｂ、１４Ａ、１４Ｂを参照されたい）中のＷＴＡ  Ａｂを操作して、ある特定の特性（脱アミド化、アスパラギン酸異性化、酸化、またはＮ結合型グリコシル化を回避する）を改善し、アミノ酸置き換え後の抗原結合の保持及び化学安定性について試験した。重鎖または軽鎖をコードするクローンの一本鎖ＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍ１３キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、大腸菌ＣＪ２３６細胞中で成長させたＭ１３ＫＯ７ファージ粒子から精製した。配列：
５’−ＣＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＴＴＧＣ−３’（配列番号１５２）
５’−ＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＴＴＧＣ−３’（配列番号１５３）
５’ＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＷＴＭＧＴＣＡＡＧＴＣＣＡＳＣＷＫＣＡＣＣＴＣＴＴＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＧＡＣＡＧＣ−３’（配列番号１５４）、及び
５’−ＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＣＧＴＣＡＡＧＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＴＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＧＡＣＡＧＣ−３’（配列番号１５５）（ＩＵＰＡＣコード）を有する５’リン酸化合成オリゴヌクレオチドを用いて、
Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）．Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８２（２）：４８８−４９２に記載される方法に従って、部位特異的突然変異誘発により記載されるようなオリゴヌクレオチド特異的部位突然変異誘発により、抗体をコードするクローンを突然変異させた。突然変異ＤＮＡを用いて、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むルリアブロスプレート上に播種した。コロニーを個別に採取し、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むルリアブロスプレート上で成長させた。ミニプレップＤＮＡを配列決定して、突然変異の存在を確認した。
【０３１５】
Ａｂ  ６０７８について、ＶＨ中の２番目のアミノ酸ｍｅｔ（ｍｅｔ−２）は、酸化されやすい。したがって、ｍｅｔ−２を、ＩｌｅまたはＶａｌに突然変異させて、残基の酸化を回避した。ｍｅｔ−２の改変は結合親和性に影響する可能性があるため、ＥＬＩＳＡによりＳｔａｐｈ  ＣＷＰとの結合について突然変異体を試験した。
【０３１６】
ＣＤＲ  Ｈ３「ＤＧ」または「ＤＤ」モチーフがイソアスパラギン酸に変換されやすいことが見出された。Ａｂ  ４４９７は、ＣＤＲ  Ｈ３の９６及び９７位にＤＧを含み（図１６を参照されたい）、安定性のために改変した。ＣＤＲ  Ｈ３は、一般的に、抗原結合のために重要であるため、抗原結合及び化学安定性についていくつかの突然変異体を試験した。突然変異体Ｄ９６Ｅ（ｖ８）は、野生型Ａｂ  ４４９７（図１６）と同様に抗原との結合を保持し、安定であり、イソアスパラギン酸を形成しない。
【０３１７】
Ｓｔａｐｈ  ＣＷＰ  ＥＬＩＳＡ
６０７８抗体突然変異体の分析のために、１×１０９微生物／ｍｌからなるリゾスタフィン処理ＵＳＡ３００  ΔＳＰＡ黄色ブドウ球菌細胞調製物（ＷＴ）を０．０５炭酸ナトリウムｐＨ９．６中で１／１００に希釈し、３８４ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ；Ｎｅｐｔｕｎｅ，ＮＪ）を４℃で終夜のインキュベーション中にコーティングした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、ＰＢＳ＋０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）での２時間のインキュベーション中にブロックした。この及びその後の全てのインキュベーションは、穏やかに撹拌しながら室温で行った。抗体試料を試料／標準物質希釈緩衝液（ＰＢＳ、０．５％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．２５％  ＣＨＡＰＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｐｐｍ  プロクリン（ｐＨ  ７．４））で希釈し、洗浄したプレートに加え、１．５〜２時間インキュベートした。プレートと結合した抗黄色ブドウ球菌抗体を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％  ＢＳＡ、１５ｐｐｍ  プロクリン、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で４０ｎｇ／ｍＬに希釈したペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）との１時間のインキュベーション中に検出した。最終洗浄の後に、テトラメチルベンジジン（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を加え、５〜１０分間発色させ、１Ｍリン酸を用いて反応を停止した。マイクロプレートリーダーを用いて、プレートを６２０ｎｍの参照とともに４５０ｎｍで読み取った。
【０３１８】
ｉｉｉ．Ｃｙｓ操作突然変異体（チオＭａｂ）の作製
システインを以前に教示され、以下に記載されるように、Ｈ鎖（ＣＨ１において）またはＬ鎖（Ｃκ）に所定の位置にてシステインを導入することにより完全長チオＭａｂを生成して、抗体のリンカー抗生物質中間体への複合を可能にした（システインアミノ酸は、抗体の重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）中の、鎖内または分子間のジスルフィド結合を形成しない反応部位で操作してもよい（Ｊｕｎｕｔｕｌａ，ｅｔ  ａｌ．，２００８ｂ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６（８）：９２５−９３２、Ｄｏｒｎａｎ  ｅｔ  ａｌ（２００９）  Ｂｌｏｏｄ  １１４（１３）：２７２１−２７２９、ＵＳ７５２１５４１、ＵＳ７７２３４８５、ＷＯ２０１１／１５６３２８、ＷＯ２００９／０５２２４９、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３０（２）：１８４−１９１、Ｊｕｎｕｔｕｌａ  ｅｔ  ａｌ（２００８）  Ｊｏｕｒ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３３２：４１−５２）。次いで、Ｈ及びＬ鎖を、別々のプラスミドにクローニングし、Ｈ及びＬをコードするプラスミドを２９３細胞にコトランスフェクトし、それらを発現して、無傷Ａｂを組み立てた。Ｈ及びＬ鎖はともに、同じ発現プラスミドにクローニングすることもできる。Ｈ鎖のそれぞれに１つずつ２つの操作されたＣｙｓ、もしくはＬ鎖のそれぞれに１つずつ２つの操作されたＣｙｓを有するＩｇＧ１、または抗体４量体につき４つの操作されたＣｙｓをもたらすＨ鎖及びＬ鎖のそれぞれにおいて操作されたＣｙｓの組み合わせ（ＨＣＬＣＣｙｓ）を、ｃｙｓ突然変異鎖と野生型鎖の所望の組み合わせを発現させることにより作製した。
【０３１９】
図１３Ａ及び１３Ｂは、６０７８  ＷＴ、及びＨＣ  ＣｙｓとＬＣ  Ｃｙｓとの組み合わせを有する突然変異体Ａｂを示す。６０７８突然変異体は、終夜培養物からのプロテインＡ欠損ＵＳＡ３００  Ｓｔａｐｈ  Ａと結合するそれらの能力についても試験した。ＦＡＣＳ分析の結果（データは示さず）から、突然変異体Ａｂは、６０７８  ＷＴ（未改変）抗体と同様に、ＵＳＡ３００と結合し、突然変異体におけるアミノ酸の改変は、Ｓｔａｐｈ  Ａとの結合を損なわなかった。ｇＤは、非特異的陰性対照抗体として使用された。
【０３２０】
実施例６：抗生物質の選択
リファマイシン型抗生物質は、低ファゴリソソームのｐＨにおける強力な非改変殺菌活性、細胞内損傷に抵抗する能力、及び抗ＷＴＡ抗体への複合に適しているプロテアーゼ切断可能な非ペプチド（ＰＭＬ）リンカー試薬にカップリングさせることができる容易さのために選択された。食細胞内細菌が最もゆっくりと複製したため、抗生物質の最適化もまた、ＡＡＣから放出される場合に、複製しないＭＲＳＡを死滅させることが可能であることが必要とされた。
【０３２１】
ＭＲＳＡは、静止期の培養物から回収され、抗生物質を含まないまたは１×１０−６Ｍのリファンピンまたはリファマイシン誘導体（Ｒｉｆａｌｏｇ）を含むリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、３７℃でインキュベートした。指定された時点で、培養物の試料を回収し、遠心分離して、抗生物質を除去し、生存細菌の総数を  播種することによって決定した。
【０３２２】
興味深いことに、リファンピシンではなく、リファマイシン型（ｒｉｆａｌｏｇ）抗生物質の添加により、生存能力があるが、最小のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の終夜インキュベーション後に、非複製の細菌の数の１，０００倍を超える減少をもたらした（図８）。同様に、リファマイシン型抗生物質は、古典的に定義された生残菌細胞を死滅させるための能力については、恐らく、休眠状態に入り、成長する培地の抗生物質処理（例えば、シプロフロキサシン）を生き延びる細菌であった（データは示さず）。リファンピシンの添加は、前述の観察に一致して、それらの生存率に影響を及ぼさなかった（Ｃｏｎｌｏｎ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｎａｔｕｒｅ  ５０３，３６５−３７０）。それに反して、リファマイシン型抗生物質（ｒｉｆａｌｏｇ）の添加は、検出の限界を下回る生残菌細胞の根絶をもたらした。これらの結果は、リファマイシン型抗生物質が休眠の非分割細胞を死滅させる驚くべき能力を有する。
【０３２３】
実施例７：抗ＷＴＡ抗体−抗生物質複合体の調製
抗壁テイコ酸  抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）  表３を、抗ＷＴＡ抗体を、表２からのものを含むＰＭＬリンカー−抗生物質中間体に複合させることによって調製した。複合前に、抗ＷＴＡ抗体を、ＷＯ２００４／０１０９５７（その教示は、この目的のために参照により組み込まれる）に記載される方法に従う標準的な方法を用いて、ＴＣＥＰで部分的に還元した。部分的に還元した抗体を、例えば、Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８−７８４及びＵＳ２００５／０２３８６４９  Ａ１に記載される方法に従う標準的な方法を用いて、リンカー抗生物質中間体に複合した。簡潔に述べると、部分的に還元した抗体を、リンカー−抗生物質中間体と組み合わせて、抗体の還元されたシステイン残基へのリンカー抗生物質中間体の複合を可能にした。複合反応を反応停止処理し、ＡＡＣを精製した。各ＡＡＣの抗生物質負荷（１抗体当たりの抗生物質部分の平均数）を決定し、これは、単一システイン突然変異部位で操作された抗細胞壁テイコ酸抗体について、約１から約２の間であった。
【０３２４】
複合のためのチオＭａｂの還元／酸化：ＣＨＯ細胞で発現させた完全長システイン操作モノクローナル抗体（チオＭａｂ−Ｊｕｎｕｔｕｌａ，ｅｔ  ａｌ．，２００８ｂ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６（８）：９２５−９３２、Ｄｏｒｎａｎ  ｅｔ  ａｌ（２００９）  Ｂｌｏｏｄ  １１４（１３）：２７２１−２７２９、ＵＳ７５２１５４１、ＵＳ７７２３４８５、ＷＯ２００９／０５２２４９、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３０（２）：１８４−１９１、Ｊｕｎｕｔｕｌａ  ｅｔ  ａｌ（２００８）  Ｊｏｕｒ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３３２：４１−５２）を、約２０〜４０倍過剰のＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩またはＤＴＴ（ジチオスレイトール）を用いて、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリスｐＨ７．５中で３時間、３７℃、または終夜、室温にて還元した（Ｇｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ  ２７３：７３−８０、Ｓｏｌｔｅｃ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）。還元したチオＭａｂを希釈し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５中でＨｉＴｒａｐ  Ｓカラムに載せ、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含むＰＢＳで溶出した。あるいは、１／２０体積の１０％酢酸を加えることにより抗体を酸性にし、１０ｍＭコハク酸塩ｐＨ５で希釈し、カラムに載せ、次いで、１０カラム体積のコハク酸塩緩衝液で洗浄した。カラムは、５０ｍＭトリスｐＨ７．５、２ｍＭ  ＥＤＴＡで溶出した。
【０３２５】
溶出した還元チオＭａｂを、１５倍過剰モルのＤＨＡＡ（デヒドロアスコルビン酸）または２００ｎＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ４）水溶液で処理した。鎖間ジスルフィド結合の酸化は、約３時間以上で完了した。周囲空気酸化も効果的であった。再酸化した抗体を２０ｍＭコハク酸ナトリウムｐＨ５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ    ＥＤＴＡ中で透析し、−２０℃にて凍結貯蔵した。
【０３２６】
リンカー−抗生物質中間体とのチオ−Ｍａｂの複合：脱ブロック化し、再酸化したチオ−抗体（チオＭａｂ）を、５０ｍＭトリス、ｐＨ８中で６〜８倍過剰モルの表２のリンカー−抗生物質中間体（２０ｍＭの濃度にてＤＭＳＯストックから）と、反応混合物のＬＣ−ＭＳ分析により決定される反応が完了するまで（１６〜２４時間）反応させた。
【０３２７】
次いで、粗抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）を、２０ｍＭ  コハク酸ナトリウム、ｐＨ５で希釈した後にカチオン交換カラムに適用した。カラムを少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭ  コハク酸ナトリウム、ｐＨ５で洗浄し、抗体をＰＢＳで溶出した。ゲル濾過カラムを用いて、２０ｍＭ  Ｈｉｓ／酢酸塩、ｐＨ５中にＡＡＣを２４０ｍＭ  スクロースとともに製剤化した。ＡＡＣは、タンパク質濃度を決定するためのＵＶ分光法、凝集分析のための分析ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、及びＬＣ−ＭＳにより、リジンＣエンドペプチダーゼでの処理の前後に特徴付けた。
【０３２８】
サイズ排除クロマトグラフィーは、０．２５ｍＭ  塩化カリウム及び１５％  ＩＰＡを含む０．２Ｍ  リン酸カリウム  ｐＨ６．２中、０．７５ｍｌ／分の流速でＳｈｏｄｅｘ  ＫＷ８０２．５カラムを用いて行った。ＡＡＣの凝集状態は、２８０ｎｍでの溶出ピーク面積吸光度の積分により決定した。
【０３２９】
ＬＣ−ＭＳ分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＱＴＯＦ  ６５２０  ＥＳＩ装置を用いて行った。例として、この化学を用いて作製したＡＡＣを、トリス、ｐＨ７．５中の１：５００ｗ／ｗエンドプロテイナーゼＬｙｓ  Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で３７℃で３０分間処理した。得られた切断断片を、８０℃に加熱した１０００Ａ、８ｕｍ  ＰＬＲＰ−Ｓカラムに載せ、５分間で３０％  Ｂ〜４０％  Ｂまでの勾配を用いて溶出した。移動相Ａ：０．０５％  ＴＦＡを含むＨ２Ｏ。移動相Ｂ：０．０４％  ＴＦＡを含むアセトニトリル。流速：０．５ｍｌ／分。タンパク質溶出は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度検出により、エレクトロスプレーイオン化及びＭＳ分析の前にモニタリングした。非複合Ｆｃ断片、残存非複合Ｆａｂ、及び抗生物質−Ｆａｂのクロマトグラフィー分解が、通常、達成された。得られたｍ／ｚスペクトルを、Ｍａｓｓ  Ｈｕｎｔｅｒ（商標）ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてデコンボリューションして、抗体断片の質量を算出した。
【０３３０】
実施例８：抗生物質の切断及び放出
リファマイシン型抗生物質は、ＡＡＣ形式で抗β  ＷＴＡ  ｍＡｂと結合した場合に、細胞外細菌を直接死滅させる能力について試験した。ＡＡＣは、緩衝液のみでインキュベートするか、またはカテプシンＢで処理した。得られた反応物の系列希釈を、トリプシン大豆ブロス中のＭＲＳＡを含有するウェルに添加し、終夜培養して、十分な活性抗生物質を含有するウェルを同定して、成長を阻止した。
【０３３１】
予測したように、ＡＡＣがカテプシンＢで前処理して、活性抗生物質を放出しない場合、成長する浮遊性細菌を、無傷抗ＭＲＳＡ  ＡＡＣによる終夜インキュベーションによって損なわれなかった（図９）。ＡＡＣのカテプシンＢによる前処理は、十分な抗生物質活性を放出し、０．６ｕｇ／ｍＬのＡＡＣで細菌成長を阻止し、これは、０．００６ｕｇ／ｍＬの抗生物質を含有することが予測される。
【０３３２】
抗生物質が細胞へのＡＡＣでオプソニン化した細菌の内面化後のみＡＡＣから放出されるかどうかを試験するために、リンカーの切断は、ＡＡＣと同じリンカーを用いて、２つの色素分子に複合されて同じ抗ＭＲＳＡ抗体からなる蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）系プローブで試験することができる。ＭＲＳＡを、ＦＲＥＴ複合体でオプソニン化し、マクロファージ培養に添加する。細菌の取り込み及びプローブの切断は、ビデオ顕微鏡によってモニタリングする。ＡＡＣ上のリファマイシン型抗生物質の放出に類似して、Ａ４８８プローブの放出によって視覚化されるように、マクロファージによって細菌の取り込み後に、リンカーを、数分以内に切断する。一方、細菌がファゴサイトーシスの阻害剤であるラトランクリンＡによるマクロファージの処理により内面化されない場合に、リンカーは無傷のままであった。質量分光分析はまた、遊離抗生物質が実際のＡＡＣでコーティングされたＭＲＳＡの取り込み後にマクロファージの内部で実際に放出されることを確認するために使用することもできる。
【０３３３】
実施例９  抗ＷＴＡβ  ＰＭＬ  ＡＡＣのインビトロの有効性
抗ＷＴＡβ−ＣＢＤＫ  ＡＡＣは、一次ヒト及びマウスマクロファージによって内在化される場合の黄色ブドウ球菌、及びインビトロでいくつかのヒト細胞株を有効に死滅させる。
【０３３４】
インビトロマクロファージアッセイ。
黄色ブドウ球菌（ＵＳＡ３００  ＮＲＳ３８４株）を、様々な用量（１００ｕ／ｍＬ、１０ｕｇ／ｍＬ、１ｕｇ／ｍＬ、または０．１ｕｇ／ｍＬ）の抗ＷＴＡβ抗体４４９７、１抗体当たり２つの抗生物質分子（ＤＡＲ２）で充填されたＡｂ４４９７−ＣＢＤＫ−ジメチルｐｉｐＢＯＲ  ＡＡＣ、または１抗体当たり４つの抗生物質分子（ＤＡＲ４）で充填された抗ＷＴＡ−ＣＢＤＫ−ジメチルｐｉｐＢＯＲ  ＡＡＣで１時間インキュベートして、抗体の細菌への結合を可能にした。得られたオプソニン化細菌をマウスマクロファージに供給し、３７℃でインキュベートして、ファゴサイトーシスを可能にした。２時間後に、感染ミックスを除去し、５０ｕｇ／ｍＬのゲンタマイシンを補った通常増殖培地に置き換え、あらゆる残りの細胞外細菌を死滅させた。生存細胞内細菌の総数を、トリプシン大豆寒天プレート上に系列希釈のマクロファージ溶解物を播種することによって決定した。
【０３３５】
実施例１０  抗ＷＴＡβ−ＰＭＬ  ＡＡＣのインビボ有効性
マウスにおける黄色ブドウ球菌感染症の治療は、器官内の細胞負荷を数桁低減する。
【０３３６】
細胞内黄色ブドウ球菌に特異的に向けられている治療薬が感染時に有効であり得るかどうかを決定するために、ＷＴＡ−ＰＭＬ  ＡＡＣを、マウス静脈内感染モデルにおいて試験した。この実施例は、ＷＴＡ−ＰＭＬ  ＡＡＣが、マウス静脈内感染モデルにおいて細胞内黄色ブドウ球菌感染症を大いに低減するまたは根絶するのに有効であったことを実証する。
【０３３７】
腹膜炎モデル。７週齢の雌Ａ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、５×１０７ＣＦＵのＵＳＡ３００により腹腔注射によって感染させる。マウスを感染から２日後に殺処分し、腹腔を、５ｍＬの冷リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）でさっと流す。腎臓を、静脈内感染モデルについて以下に記載されるように、５ｍＬのＰＢＳ中でホモジナイズする。腹腔洗浄液を５分間、１，０００ｒｐｍ、４℃にて卓上遠心分離機で遠心分離する。上清を細胞外細菌として回収し、腹膜細胞を含む細胞ペレットを細胞内画分として回収する。細胞を５０μｇ／ｍＬのリゾスタフィンで３７℃で２０分間処理して、夾雑細胞外細菌を死滅させる。腹腔細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄して、分析前にリゾスタフィンを除去する。細胞内ＣＦＵの数を計数するために、腹腔細胞を０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むＨＢ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び０．１％ウシ血清アルブミンを補ったＨａｎｋｓ平衡塩類溶液）中で溶解し、０．０５％  ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で溶解物の系列希釈を作製する。
【０３３８】
マウス静脈内感染モデル
臨床的に関連するためには、ＡＡＣは、既に確立した細胞内感染症を排除することが可能である必要がある。これを評価するために、治療は、菌血症の発症から２４時間後まで遅延させ、この時点でバンコマイソン治療は、最小限に有効である。好中球中の細胞内感染症は急速に確立され、菌血症の少なくとも１つのモデルにおいて、血液中の９５％の細菌が、１５分以内に好中球の内部にあり７、恐らく、バンコマイソンの有効性の減少の主な原因となる。これらの条件下で、単一用量のＡＡＣによる治療は、有効であり、等用量の遊離のリファマイシン型抗生物質による治療よりも優れていることが証明された。
【０３３９】
黄色ブドウ球菌は、ヒト皮膚及び粘膜面の一般的なコロナイザーである。ＩＧＩＶ−ガンマＧａｒｄ、約１０，０００人のヒトからプールした免疫グロブリン調製物を含む複数の源のヒト血清の予備分析は、ヒト血清が約３００ｕｇ／ｍＬの抗黄色ブドウ球菌を含有し、このうちの約７０％がＷＴＡのＧｌｃＮＡｃ修飾に向けられることを実証した。マウス血清は、かなりのレベルの抗黄色ブドウ球菌抗体を有しない。正常ヒト血清に見出される内因性抗ＷＴＡ抗体がＡＡＣとの結合のために競合され得るかどうかを決定するために、ＣＢ１７．ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）を、血清中の少なくとも１０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧの一定血清レベルを達成するように最適化された投与レジメンを用いて、ガンマＧａｒｄ  Ｓ／Ｄ  ＩＧＩＶ免疫グロブリン（ＡＳＤ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｒｏｏｋｓ  ＫＹ）で再構成した。ＩＧＩＶをマウス当たり３０ｍｇの初期静脈内投与用量で投与し、続いて、６時間後に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により１５ｍｇ／マウスの第２の用量を投与し、その後、３日連続で腹腔内注射によりマウスあたり１５  ｍｇの１日用量を投与した。これらのマウスは、同様に、未処置対照と比較して、ＭＲＳＡによる感染にかかりやすかった。
【０３４０】
マウス（抗体またはＡＡＣのそれぞれにおいてｎ＝８）を、１×１０７ＣＦＵのリン酸緩衝生理食塩水中で希釈されたＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００  ＮＲＳ３８４株）を含むＩＧＩＶの初期投与から４時間後に静脈内注射により感染させた。感染したマウスを、５０ｍｇ／ｋｇのＳ４４９７裸抗体、または表３からのＳ４４９７  ＡＡＣで処置した。マウスを、静脈内注射による感染から２４時間後に、単一用量のＡＡＣを与え、感染から４日後に殺処分し、腎臓及び心臓を、５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水中に採取した。組織試料を、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いてホモジナイズした。１器官当たり回収した細菌の総数は、５％  脱線維素ヒツジ血液を含むトリプシン大豆寒天上にＰＢＳ  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ中の組織ホモジネートの系列希釈を播種することによって決定した。
【０３４１】
図１０中の結果が示すように、潜在的に競合する抗体の存在にかかわらず、単一用量の抗β−ＧｌｃＮＡｃ  ＷＴＡ  ＡＡＣ（Ｓ４４９７−ＡＡＣ）は、裸抗体と比較して感染した器官内の細菌計数を大幅に低減または根絶した。図１０Ｂは、ＡＡＣ（ＤＡＲ２）による処置が腎臓において細菌負荷を約７，０００倍低減したことを示す。図１０Ｃは、表３からのＡＡＣ（ＤＡＲ２）による処置が心臓において細菌負荷を約５００倍低減したことを示す。インビボ感染モデルにおける裸抗生物質、ジメチルｐｉｐＢＯＲのみ（ＡＡＣ中のジメチルｐｉｐＢＯＲに対して同等のモル濃度で）による処置は、ＡＡＣとして抗ＷＴＡ抗体に複合されたジメチルｐｉｐＢＯＲと比較して  有効でなかった。
【０３４２】
未複合（遊離）の抗ＷＴＡ抗体は、インビボで有効ではない
図１７は、５０ｍｇ／ｋｇの遊離抗体での前処置が静脈内感染モデルにおいて有効でないことを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、単回用量のビヒクル対照（ＰＢＳ）または５０ｍｇ／Ｋｇの抗体を静脈内注射により与えた３０分後に、２×１０７ＣＦＵのＵＳＡ３００に感染させた。処置群は、黄色ブドウ球菌と結合しないアイソタイプ対照抗体（ｇＤ）、細胞壁タイコ酸のベータ修飾に対する抗体（４４９７）、または細胞壁タイコ酸のアルファ修飾に対する抗体（７５７８）を含んだ。対照マウスに、１１０ｍｇ／Ｋｇのバンコマイシンでの処置を腹腔内注射により（Ｖａｎｃｏ）１日２回与えた。
【０３４３】
実施例１１  ピペリジルベンゾキサジノリファマイシン（ｐｉｐＢＯＲ）５
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２−ニトロベンゼン−１，３−ジオール１を、エタノール溶媒中のパラジウム／炭素触媒を用いて水素ガス下で水素化して、塩酸塩として単離される２−アミノベンゼン−１，３−ジオール２を得た。ジクロロメタン／テトラヒドロフラン中のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド及びトリエチルアミンによる２のモノ保護により、２−アミノ−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）フェノール３を得た。リファマイシンＳ（ＣｈｅｍＳｈｕｔｔｌｅ  Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ、ＵＳ７３４２０１１、ＵＳ７２７１１６５、ＵＳ７５４７６９２）を、室温でトルエン中の酸化マンガンまたは酸化ガスと酸化縮合によって、３と反応させて、ＴＢＳ保護ベンゾキサジノリファマイシン４を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝９１５．４１。４とピペラジン−４−アミン及び酸化マンガンとの反応により、ピペリジルベンゾキサジノリファマイシン（ｐｉｐＢＯＲ）５を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝８９９．４０
【０３４４】
実施例１２  ジメチルｐｉｐＢＯＲ６
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Ｎ，Ｎ−ジメチルピペラジン−４−アミンとＴＢＳ保護ベンゾキサジノリファマイシン４との反応により、ジメチルピペリジルベンゾキサジノリファマイシン（ジメチルｐｉｐＢＯＲ）６を得た。
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あるいは、（５−フルオロ−２−ニトロ−１，３−フェニレン）ビス（オキシ）ビス（メチレン）ジベンゼン７を、テトラヒドロフラン／メタノール溶媒中のパラジウム／炭素触媒を用いて水素ガス下で水素化して、ベンジル基を除去して、２−アミノ−５−フルオロベンゼン−１，３−ジオール８を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝１４４．０４。市販のリファマイシンＳまたはリファマイシンＳＶナトリウム塩（ＣｈｅｍＳｈｕｔｔｌｅ  Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を、エチルアセテート中の空気またはフェリックシアン化カリウム中の酸化縮合によって２−アミノ−５−フルオロベンゼン−１，３−ジオール８と６０℃で反応させて、フルオロベンゾジサジノリファマイシン９を得た。フルオロのＮ，Ｎ−ジメチルピペラジン−４−アミンとの置換により、ジメチルｐｉｐＢＯＲ６を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝９２７．４３
【０３４５】
実施例１３  （Ｓ）−Ｎ−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチル）−Ｎ−（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１０
ステップ１：１−（５−アミノペンチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン塩酸塩１０ａの調製
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無水マレイン酸、フラン−２，５−ジオン（１５０ｇ、１．５３ｍｏｌ）を、ＨＯＡｃ（１０００ｍＬ）中の６−アミノヘキサン酸（２０１ｇ、１．５３ｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。混合物を室温で２時間撹拌した後に、それを還流で８時間加熱した。有機溶媒を、減圧下で除去し、残渣をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ×３）で抽出し、Ｈ２Ｏで洗浄した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、粗生成物を得た。それを石油エーテルで洗浄して、白色固体として６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸（２５０ｇ、７７．４％）を得た、ＤＰＰＡ（１３０ｇ、４７３ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（４７．９ｇ、４７３ｍｍｏｌ）を、ｔ−ＢｕＯＨ（２００ｍＬ）中の６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸（１００ｇ、４７３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を、Ｎ２下で、還流で８時間加熱した。混合物を濃縮し、残渣をシリカゲル（ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝３：１）上のカラムクロマトグラフィーによって精製して、ｔｅｒｔ−ブチル５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチルカルバメート（１３ｇ、１０％）を得た。無水ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチルカルバメート（２８ｇ、９９２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）を滴加した。混合物を室温で５時間撹拌した後に、それを濾過し、固体を乾燥させて、１−（５−アミノペンチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン塩酸塩１０ａ（１６ｇ、７３．７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．０２（ｓ，２Ｈ），６．９９（ｓ，Ｈ）、３．３７−３．３４（ｍ，２Ｈ）、２．７１−２．６４（ｍ，２Ｈ），１．５６−１．４３（ｍ，４Ｈ），１．２３−１．２０（ｍ，２Ｈ）。
【０３４６】
ステップ２：（Ｓ）−１−（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イルカルバモイル）シクロブタンカルボン酸１０ｂの調製
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ジオキサン及びＨ２Ｏ（５０ｍＬ／７５ｍＬ）の混合物中の（Ｓ）−２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸１０ｇ（１７．５０ｇ、０．１０ｍｏｌ）の混合物に、Ｋ２ＣＯ３（３４．５５ｇ、０．２５ｍｏｌ）を添加した。Ｆｍｏｃ−Ｃｌ（３０．９６ｇ、０．１２ｍｏｌ）を、０℃でゆっくりと添加した。反応混合物を２時間にわたって室温まで加温した。有機溶媒を減圧下で除去し、水スラリーを６Ｍ  ＨＣｌ溶液でｐＨ＝３に調整し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×３）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−ウレイドペンタン酸１０ｆ（３８．０ｇ、９５．６％）を得た。１０ｆは、市販されている。
【０３４７】
ＤＣＭ及びＭｅＯＨ（１００ｍＬ／５０ｍＬ）の混合物中の１０ｆ（４ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液に、（４−アミノフェニル）メタノール（１．６ｇ、１３ｍｍｏｌ、１．３当量）及び２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン、ＥＥＤＱ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＣＡＳ  Ｒｅｇ．番号１６３５７−５９−８（３．２ｇ、１３ｍｍｏｌ、１．３当量）を添加した。混合物をＮ２下、室温で１６時間撹拌した後に、それを濃縮して、茶色固体を得た。ＭＴＢＥ（２００ｍＬ）を添加し、それを１５℃で２時間撹拌した。固体を濾過によって回収し、ＭＴＢＥ（５０ｍＬ×２）で洗浄して、橙色固体として（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（１−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）カルバメート１０ｅ（４．２ｇ、８４％）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ５０３．０［Ｍ＋１］。
【０３４８】
乾燥ＤＭＦ（２０ｍｌ）中の１０ｅ（４．２ｇ、８．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ピペラジン（１．６５ｍＬ、１７ｍｍｏｌ、２当量）を室温で滴加した。混合物を室温で３０分間撹拌し、固体沈殿物を形成した。乾燥ＤＣＭ（５０ｍＬ）を添加し、混合物がすぐに透明になった。混合物を室温でさらに３０分間撹拌し、ＬＣＭＳは１０ｅが消費したことを示した。減圧下で乾燥するまで濃縮し（ピペラジンが残留しないことを確実にし）、残渣を、ＥｔＯＡｃとＨ２Ｏ（５０ｍＬ／２０ｍＬ）とに分けた。水相をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ×２）で洗浄し、濃縮して、油性残余として（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）−５−ウレイドペンタンアミド１０ｄ（２．２ｇ、９４％）（少量のＤＭＦを含有）を得た。
【０３４９】
市販の１，１−シクロブタンジカルボン酸、１，１−ジエチルエステル（ＣＡＳ  Ｒｅｇ．番号３７７９−２９−１）を、塩基水溶液で、半酸／エステル１，１−シクロブタンジカルボン酸、１−エチルエステル（ＣＡＳ  Ｒｅｇ番号５４４５０−８４−９）に限定された鹸化し、ＴＢＴＵ（Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムテトラフルオロボラートとも呼ばれる、ＣＡＳ番号１２５７００−６７−６，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｂ−２９０３）、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド等のカップリング試薬でＮＨＳエステル、１−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）１−エチルシクロブタン−１，１−ジカルボキシレートに活性化によって変換した。
【０３５０】
ＤＭＥ（５０ｍＬ）中の１−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）１−エチルシクロブタン−１，１−ジカルボキシレート（８ｇ、２９．７ｍｍｏｌ）の溶液に、水（３０ｍＬ）中の１０ｄ（６．０ｇ、２１．４ｍｍｏｌ）及びＮａＨＣＯ３（７．４８ｇ、８９．０ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌した後、それを減圧下で乾燥するまで濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）によって精製して、白色固体として（Ｓ）−エチル１−（（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）−２−オキソ−６−ウレイドヘキサン−３−イル）カルバモイル）シクロブタンカルボキシレート１０ｃ（６．４ｇ、６８．７％）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ４３５．０［Ｍ＋１］
ＴＨＦ及びＭｅＯＨ（２０ｍＬ／１０ｍＬ）の混合物中の１０ｃ（６．４ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）中のＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（１．２ｇ、２８．６ｍｍｏｌ）の溶液を室温で添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した後、溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣を分取ＨＰＬＣによって精製して、（Ｓ）−１−（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イルカルバモイル）シクロブタンカルボン酸１０ｂ（３．５ｇ、収率５８．５％）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ４０６．９［Ｍ＋１］。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．８６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），８．５１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），５．８８−５．８５（ｍ，１Ｈ），５．７８（ｓ，２Ｈ），４．５４−４．４９（ｍ，３Ｈ），４．３８−４．３２（ｍ，１Ｈ），３．８６−３．７５（ｍ，１Ｈ），３．８４−３．８０（ｍ，２Ｈ），３．２８−３．２１（ｍ，１Ｈ），３．３０−３．２４（ｍ，１Ｈ），３．００−２．８０（ｍ，１Ｈ），２．３７−２．２８（ｍ，２Ｈ）。
【０３５１】
ステップ３：Ｓ）−Ｎ−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチル）−Ｎ−（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１０の調製
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ジイソプロピルエチルアミン、ＤＩＰＥＡ（１．５９ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）、及びビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド、ＢＯＰ−Ｃｌ（ＣＡＳ  Ｒｅｇ．番号６８６４１−４９−６，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  ６９２ｍｇ、２．７１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の（Ｓ）−１−（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イルカルバモイル）シクロブタンカルボン酸１０ｂ（１ｇ、２．４６ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で添加し、続いて、１−（５−アミノペンチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン塩酸塩１０ａ（５９２ｍｇ、２．７１ｍｍｏｌ）に添加した。混合物を０℃で０．５時間撹拌した。反応混合物をクエン酸溶液（１０ｍＬ）で反応停止し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０：１）で抽出した。有機層を乾燥させ、濃縮し、残渣を、シリカゲル（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）上のカラムクロマトグラフィーによって精製して、ＭＣ−ＣＢＤＫ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨとしても称される、Ｓ）−Ｎ−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチル）−Ｎ−（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１０（１．０ｇ、７１％）を得た得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝５７１．２８。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．００（ｓ，１Ｈ），７．８２−７．７７（ｍ，２Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．９６（ｓ，２Ｈ），５．９５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），５．３９（ｓ，２Ｈ），５．０８（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．４０−４．３５（ｍ，３Ｈ），４．０９（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ）、３．０１（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．０５−２．７２（ｍ，４Ｈ）、２．６８−２．５８（ｍ，３Ｈ）、２．４０−２．３６（ｍ，４Ｈ），１．７２−１．７０（ｍ，３Ｈ），１．４４−１．４２（ｍ，１Ｈ），１．４０−１．２３（ｍ，６Ｈ），１．２１−１．１６（ｍ，４Ｈ）。
【０３５２】
実施例１４  （Ｓ）−Ｎ−（１−（４−（クロロメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）−Ｎ−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１１
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Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＤＭＦ、またはＮ−メチルピロリドン、ＮＭＰ（５０ｍＬ）中の（Ｓ）−Ｎ−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチル）−Ｎ−（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１０（２．０ｇ、３．５ｍｍｏｌ）の溶液を、塩化チオニル、ＳＯＣｌ２  （１．２５ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）で０℃で少量ずつ滴加した。反応物は、黄色のままであった。反応物を、９０％超の変換を示すＬＣ／ＭＳによってモニタリングした。反応混合物を２０℃で３０分間または数時間撹拌した後、それを水（５０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を乾燥させ、濃縮し、フラッシュカラム（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝２０：１）によって精製して、灰色固体としてＭＣ−ＣＢＤＫ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−Ｃｌとも称される、１１を形成した。ＬＣＭＳ：（５−９５、ＡＢ、１．５分）、０．６９６分、ｍ／ｚ＝５８９．０［Ｍ＋１］＋。
【０３５３】
実施例１５  （Ｓ）−４−（２−（１−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチルカルバモイル）シクロブタンカルボキサミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル４−ニトロフェニル炭酸塩１２
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無水ＤＭＦ中の（Ｓ）−Ｎ−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチル）−Ｎ−（１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１０の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を添加し、続いて、ＰＮＰ炭酸塩（ビス（４−ニトロフェニル）炭酸塩）を添加した。反応溶液を室温（ｒ．ｔ．）で４時間撹拌し、混合物を分取ＨＰＬＣによって精製して、１２を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝７３６．２９。
【０３５４】
実施例１６  ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチル、フルオロｐｉｐＢＯＲ）−ＰＬＡ−１の調製
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ＰＬＡ−２における手順後、（Ｓ）−Ｎ−（１−（４−（クロロメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）−Ｎ−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１１及びフッ素化リファマイシン誘導体、ジメチルフルオロｐｉｐＢＯＲ１３（ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝９４５．４３）を反応させて、ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチル、フルオロｐｉｐＢＯＲ）−ＰＬＡ−１、表２を形成した。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝１４９９．７
【０３５５】
実施例１７  ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチルｐｉｐＢＯＲ）−ＰＬＡ−２の調製
ＤＭＦ中の（Ｓ）−Ｎ−（１−（４−（クロロメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）−Ｎ−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１１（０．０３５ｍｍｏｌ）を０℃に冷却し、ジメチルｐｉｐＢＯＲ  ６（１０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をさらに０．５ｍＬのＤＭＦで希釈した。空気に開放し、３０分間撹拌した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１０μＬ、０．０５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を空気に開放し、終夜撹拌した。ＬＣ／ＭＳにより、５０％の所望の生成物を観察した。さらに０．２当量のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン塩基を添加したが、反応物が処理を停止するように思われるまで、空気に開放し、さらに６時間撹拌した。反応混合物を、ＤＭＦで希釈し、ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ中２０〜６０％  ＡＣＮ／ＨＣＯＯＨ）上に精製して、ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチルｐｉｐＢＯＲ）−ＰＬＡ−２、表２を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝１４８１．８、収率３１％。
【０３５６】
実施例１８  ＭＣ−（（Ｒ）−チオフェン−３−イル−ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチルｐｉｐＢＯＲ）（ＰＬＡ−３）の調製
0006742314.tif 000082
ＰＬＡ−２における手順後、（Ｎ−（（Ｓ）−１−（４−（クロロメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）−Ｎ−（（Ｒ）−３−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチルアミノ）−３−オキソ−１−（チオフェン−３−イル）プロピル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１４（ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝７４２．３）及びジメチルｐｉｐＢＯＲ  ６を反応させて、ＭＣ−（（Ｒ）−チオフェン−３−イル−ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチルｐｉｐＢＯＲ）（ＰＬＡ−３、表２）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝１６３３．９
【０３５７】
実施例１９  ＭＣ−（（Ｓ）−チオフェン−３−イル−ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチルｐｉｐＢＯＲ）（ＰＬＡ−４）の調製
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ＰＬＡ−２における手順後、（Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−（クロロメチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）−Ｎ−（（Ｒ）−３−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチルアミノ）−３−オキソ−１−（チオフェン−３−イル）プロピル）シクロブタン−１，１−ジカルボキサミド１５（ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝７４２．３）及びジメチルｐｉｐＢＯＲ６を反応させて、ＭＣ−（（Ｒ）−チオフェン−３−イル−ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢ−（ジメチルｐｉｐＢＯＲ）（ＰＬＡ−４、表２）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝１６３３．９
【０３５８】
実施例２０  ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢＣ−（ｐｉｐＢＯＲ）（ＰＬＡ−５）の調製
ピペリジルベンゾキサジノリファマイシン（ｐｉｐＢＯＲ）５（１５ｍｇ、０．０１６７ｍｍｏｌ）、次いで、（Ｓ）−４−（２−（１−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチルカルバモイル）シクロブタンカルボキサミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル４−ニトロフェニル炭酸塩１２（１２ｍｇ、０．０１６７ｍｍｏｌ）をバイアル中で重さを量った。ジメチルホルムアミド、ＤＭＦ（０．３ｍＬ）を添加し、続いて、ジイソプロピルエチルアミン、ＤＩＥＡ（０．００６ｍＬ、０．０３３４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で２時間撹拌した。反応溶液を、ＨＰＬＣ（３０〜７０％  ＭｅＣＮ／水＋１％  ギ酸）によって直接精製して、ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢＣ−（ｐｉｐＢＯＲ）（ＰＬＡ−５、表２）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝１４９６．５
実施例２１  ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢＣ−（ｐｉｐｅｒａｚＢＴＲ）（ＰＬＡ−６）の調製
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ＰＬＡ−５における手順後、ピペラジンリファマイシン誘導体、ｐｉｐｅｒａｚＢＯＲ１６（ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝８８５．４）及び（Ｓ）−４−（２−（１−（５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ペンチルカルバモイル）シクロブタンカルボキサミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル４−ニトロフェニル炭酸塩１２を反応させて、ＭＣ−（ＣＢＤＫ−ｃｉｔ）−ＰＡＢＣ−（ｐｉｐｅｒａｚＢＴＲ）（ＰＬＡ−６．表２）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ＋Ｈ＋＝１４８２．５
【０３５９】
上述の発明は、明確な理解を目的として、例示説明及び例により、ある程度詳細に記載されたが、これらの説明及び例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書を通じて引用されている全ての特許、特許出願、及び参考文献は、参照により明示的に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
0006742314.tif 000125
【図４】
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【図５】
0006742314.tif 000127
【図６Ａ】
0006742314.tif 000128
【図６Ｂ】
0006742314.tif 000129
【図７Ａ】
0006742314.tif 000130
【図７Ｂ】
0006742314.tif 000131
【図８】
0006742314.tif 000132
【図９】
0006742314.tif 000133
【図１０Ａ】
0006742314.tif 000134
【図１０Ｂ−Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ−１】
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【図１３Ａ−２】
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【図１３Ｂ−１】
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【図１３Ｂ−２】
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【図１３Ｂ−３】
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【図１３Ｂ−４】
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【図１４Ａ−１】
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【図１４Ａ−２】
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【図１４Ｂ−１】
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【図１４Ｂ−２】
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【図１４Ｂ−３】
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【図１５Ａ−１】
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【図１５Ａ−２】
0006742314.tif 000151
【図１５Ａ−３】
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【図１５Ｂ−１】
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【図１５Ｂ−２】
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【図１５Ｂ−３】
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【図１５Ｂ−４】
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【図１５Ｂ−５】
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【図１５Ｂ−６】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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