(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性目的遺伝子に機能的に連結されたハムスターＧＡＰＤＨプロモーターを含む発現カセットを含む、組換え発現ベクターであって、
（ａ）配列番号３５に記載の核酸配列または配列番号３８に記載の核酸配列に少なくとも９５％同一である、プラス方向である核酸配列を含み、及び
（ｂ）前記プロモーターに機能的に連結された
調節エレメントをさらに含む、組換え発現ベクター。
【請求項２】
前記ＧＡＰＤＨプロモーターが配列番号５０のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組換え発現ベクター。
【請求項３】
前記ＧＡＰＤＨプロモーターの３’側かつ前記目的遺伝子の５’側に、配列番号５２のヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載の組換え発現ベクター。
【請求項４】
前記調節エレメントが、配列番号３５または配列番号３８と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
【請求項５】
前記調節エレメントが、配列番号３５または配列番号３８と少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
【請求項６】
前記調節エレメントが、配列番号３５の核酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
【請求項７】
前記調節エレメントが、配列番号３８の核酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え発現ベクターを含む、哺乳動物宿主細胞。
【請求項９】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項８に記載の哺乳動物宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年１０月１５日にＥＦＳ−ＷＥＢを介して提出されたＡＳＣＩＩ「ｔｘｔ」に対応する配列表を含み、当該配列表は、米国特許法施行規則１．８２１（ｃ）及び１．８２１（ｅ）に規定されるコンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）とハードコピーの両方であり、その全体を参照により本明細書に援用する。２０１４年１０月１５日に作成された「ｔｘｔ」ファイルの名称は、Ａ−１９１７−ＵＳ−ＰＳＰ＿ＦｉｎａｌＳｅｑＬｉｓｔ１０１５１４＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは２８ｋｂである。
【０００２】
本出願全体にわたり、様々な公開物が括弧内または角括弧内に参照される。これらの公開物の開示全体は、本発明が属する現況技術をより十分に記載するために、その全体を参照により本出願に援用する。
【０００３】
１．発明の分野
【０００４】
本発明は、組換え遺伝子発現の分野を対象にする。
【背景技術】
【０００５】
２．関連技術の考察
タンパク質などの生物学的分子、特に抗体または抗体断片、例えば免疫グロブリンＦｃ領域を含む生物学的製剤に対する需要は多い。
【０００６】
組換えポリペプチドを産生するための発現系は、現在の技術分野にてよく知られており、例えば、Ｍａｒｉｎｏ  Ｍ  Ｈ（１９８９）Ｂｉｏｐｈａｒｍ，２：１８−３３；Ｇｏｅｄｄｅｌ  Ｄ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８５：３−７；Ｗｕｒｍ  Ｆ＆Ｂｅｒｎａｒｄ  Ａ（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０：１５６−１５９に記載されている。医薬品用途に使用されるポリペプチドは、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞などの哺乳動物細胞中にて産生される。多数の異なる治療用生物学的分子の工業的生産には、種々のＣＨＯ由来細胞株が特に適している（例えば、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ６，２１０，９２４Ｂ１）。
【０００７】
この目的のために使用される発現ベクターの必須エレメントは、通常、原核生物の複製起点及び原核生物の選択マーカー、任意選択で真核生物の選択マーカーを含む、原核生物プラスミド伝播単位（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、ならびに各々がプロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、及び任意選択で転写ターミネーター（ポリアデニル化シグナルを含む）を含む、目的の構造遺伝子（複数可）を発現させるための１つ以上の発現カセットから選択される。哺乳動物細胞における一過性発現の場合、ＳＶ４０  ＯｒｉまたはＯｒｉＰなどの哺乳動物複製起点を含めることができる。プロモーターには、構成性または誘導性プロモーターを選択することができる。転写を最適化するために、５’非翻訳領域にＫｏｚａｋ配列を含めてもよい。構造遺伝子の構造（エクソン／イントロン構造）に応じたｍＲＮＡスプライシングシグナルとポリアデニル化シグナルも、ｍＲＮＡプロセシング、特にｍＲＮＡスプライシング及び転写終結のために含めてもよい。遺伝子の発現は、一過性で行うか、または安定細胞株を使用して行う。いずれにおいても、産生細胞株におけるポリペプチドの安定的かつ高度の発現レベルは、組換えポリペプチドの工業的生産のプロセス全体にとって極めて重要である。
【０００８】
費用が高く、収率が比較的低いことは、生物学的分子の利用可能性を制限する要因となっており、望ましい生物学的分子の収率を工業的規模で安定的に増加させる堅牢なプロセスの開発が大きな課題となっている。これらの利点及び他の利点が本発明により提供される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，２１０，９２４号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍａｒｉｎｏ  Ｍ  Ｈ（１９８９）Ｂｉｏｐｈａｒｍ，２：１８−３３
【非特許文献２】Ｇｏｅｄｄｅｌ  Ｄ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８５：３−７
【非特許文献３】Ｗｕｒｍ  Ｆ＆Ｂｅｒｎａｒｄ  Ａ（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０：１５６−１５９
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、外因性目的遺伝子に機能的に連結されたハムスターグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）（ＥＣ１．２．１．１２；ＧＡＰＤＨ）プロモーターを含む発現カセットを含む、組換え発現ベクターに関する。発現ベクターはまた、（ａ）配列番号３５と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一であるか、または配列番号３８と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である核酸配列を含み、かつ（ｂ）プロモーターに機能的に連結された、調節エレメントを含む。調節エレメント配列の配列番号３５及び３８は、ＧＡＰＤＨプロモーター配列と同じハムスター染色体上に天然に存在しないものである。
【００１２】
組換え発現ベクターのいくつかの有用な実施形態において、調節エレメントは、プラス方向である。他の有用な実施形態において、調節エレメントは、マイナス方向である。
【００１３】
本発明はまた、発現ベクターを含有する哺乳動物宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を目的にする。
【００１４】
本発明は、抗原結合タンパク質、ホルモンまたは他の治療用ペプチドなどの生物学的製剤の工業的生産、すなわち安定的かつ高収率の外因性タンパク質の組換え発現を必要とする状況を意図した細胞株を作製するのに特に有用である。
【００１５】
当該及び他の利点について、以下に更に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ｐＰＴ１及びｐＰＴ２安定発現ベクターに含めた発現カセットの模式図である。本明細書にて示す結果に影響しない配列を含むベクター骨格は示していない。
【図２】ｐＰＴ２．１安定発現ベクターに含めた発現カセットの模式図である。本明細書にて示す結果に影響しない配列を含むベクター骨格は示していない。
【図３】ｐＰＴ２及びｐＰＴ２．１を用いたトランスフェクション及び選択から得たＣＨＯ−Ｓ安定発現プールの力価の概要を示す。これらのベクターを安定的に発現する細胞を２４ウェルのディープウェルプレートに１Ｅ６細胞／ｍｌで播種した。馴化培地（ＣＭ）を６日後に回収した。ＣＭ中のヒトＦｃタンパク質の力価（ｍｇ／Ｌ単位で報告）をＦｏｒｔｅＢＩＯにより測定し、三連のトランスフェクションの２つの個別の実験から得た範囲を示す。
【図４】ｐＰＴ２．４安定発現ベクターに含めた発現カセットの模式図である。本明細書にて示す結果に影響しない配列を含むベクター骨格は示していない。
【図５】ｐＰＴ２．１及びｐＰＴ２．４を用いたトランスフェクション及び選択から得たＣＨＯ−Ｓ安定発現プールの力価の概要を示す。これらのベクターを安定的に発現する細胞を２４ウェルのディープウェルプレートに１Ｅ６細胞／ｍｌで播種した。馴化培地（ＣＭ）を６日後に回収した。ＣＭ中のヒトＦｃタンパク質の力価（ｍｇ／Ｌ単位で報告）をＦｏｒｔｅＢＩＯにより測定し、三連のトランスフェクションから得た範囲を示す。
【図６】ｐＰＴ３安定発現ベクターに含めた発現カセットの模式図である。本明細書にて示す結果に影響しない配列を含むベクター骨格は示していない。
【図７】ｐＰＴ２、ｐＰＴ２．４及びｐＰＴ３を用いたトランスフェクション及び選択から得たＣＨＯ−Ｓ安定発現プールを示す。回復したプールを次の時点に対して培養物に維持した：選択からの回復直後（初期）；選択後１ヶ月及び２ヶ月。次いで、細胞を２４ウェルのディープウェルプレートに１Ｅ６細胞／ｍｌで播種した。馴化培地を６日後に採取し、力価をＦｏｒｔｅＢＩＯにより測定した。ｘ軸上に示される各ベクターに関する結果の棒は、左から右に、次の時点を示す：初期、１ヶ月及び２ヶ月を示す。
【図８】ｐＰＴ４．ｘ安定発現ベクターに含めた発現カセットの模式図である。本明細書にて示す結果に影響しない配列を含むベクター骨格は示していない。
【図９】ｐＰＴ３、ｐＰＴ４、ｐＰＴ４．１、ｐＰＴ４．２、ｐＰＴ４．３を用いたトランスフェクション及び選択から得たＣＨＯ−Ｓ安定発現プールを示す。回復したプールを次の時点に対して培養物に維持した：選択からの回復直後（初期）；選択後１ヶ月及び２ヶ月。次いで、細胞を２４ウェルのディープウェルプレートに１Ｅ６細胞／ｍＬで播種した。馴化培地を６日後に採取し、力価をＦｏｒｔｅＢＩＯにより測定した。ｘ軸上に示される各ベクターに関する結果の棒は、左から右に、次の時点を示す：初期、２週間、１ヶ月及び２ヶ月。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書にて使用される段落見出しは、単に構成上のためであり、記載される主題の限定を意図するものではない。
【００１８】
定義
本明細書中に別途の記載がない限り、本出願に関して用いられる科学技術用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈により別途の定めがない限り、単数形の用語は複数を包含し、複数形の用語は単数を包含するものとする。したがって、本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別途の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「タンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及は複数のタンパク質を含み、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は複数の細胞の集団を含む。「ｙＥｘ」への言及は、「ｙ×１０ｚ」を意味し、また区別なく用いられ、ここで、ｙは、特定の指数１０を乗じる数であり、ｚは、指数であり、例えば、「１Ｅ６」は１×１０６に等しく、「５Ｅ６」は５×１０６に等しく、「５Ｅ−６」は５×１０−６に等しい。
【００１９】
「哺乳動物」とは、ヒト、飼育動物及び家畜、ならびに動物園、競技用または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、齧歯類（例えば、ラット、マウス、モルモット、ハムスター）、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、霊長類（例えば、サル、類人猿）などを含む、哺乳動物に分類されるあらゆる動物を指す。「非ヒト」哺乳動物は、ヒト以外の哺乳動物である。哺乳動物細胞は、哺乳動物に本来由来する細胞である。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、「細胞培養培地」及び「培養培地」という用語は、インビトロで哺乳動物細胞を成長させるために使用する栄養素溶液を指し、典型的に、次の種類のうちの１つ以上の少なくとも１つの成分を提供するものである：１）エネルギー供給源（通常は、例えばグルコースなどの炭水化物の形態）、２）全必須アミノ酸のうちの１つ以上（通常は、２０のアミノ酸の基本セットとシステイン）、３）ビタミン及び／または低濃度で必要とされる他の有機化合物、４）遊離脂肪酸、ならびに５）微量元素（典型的に極めて低濃度、通常はマイクロモル範囲で必要とされる無機化合物または天然元素として定義されるもの）。栄養素溶液は、細胞の成長、リプログラミング及び／または分化を最適化するために、追加成分を任意に補充してもよい。
【００２１】
本発明における哺乳動物細胞の培養物は、培養される特定の細胞に適した培地中で調製される。特定の細胞種の培養に使用できる好適な細胞培養培地は、当業者には明らかであろう。例示的な市販の培地には、例えば、ハムＦ１０（ＳＩＧＭＡ）、最小必須培地（ＭＥＭ、ＳＩＧＭＡ）、ＲＰＭＩ−１６４０（ＳＩＧＭＡ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＳＩＧＭＡ）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。これらの培地または他の好適な培地のいずれについても、必要に応じて、ホルモン及び／または他の成長因子（限定するものではないが、インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシン及びチミジン）、抗生物質（ピューロマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジンまたはゲンタマイシン（商標）など）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義されるもの）、脂質（リノール酸または他の脂肪酸など）及びその好適な担体、ならびにグルコースもしくは同等のエネルギー源を補充してもよいし、かつ／またはマンノース含量の低い組換え糖タンパク質の産生を促進するために本明細書に記載のとおりに改変してもよい。特定の実施形態において、細胞培養培地は、無血清である。
【００２２】
無血清及び／またはペプトン不含であると定義された培地が使用される場合、その培地は、通常、特定のアミノ酸、ビタミン及び／または微量元素が富化されている（例えば、Ｍａｔｈｅｒらの米国特許第５，１２２，４６９号及びＫｅｅｎらの米国特許第５，６３３，１６２号参照）。使用される特定の細胞株または方法の必要条件に応じて、培養培地は、ウシ胎児血清または血清代替品などの血清添加物を含み得る。血清代替品の例（無血清細胞成長用）は、ＴＣＨ（商標）、ＴＭ−２３５（商標）．及びＴＣＨ（商標）（これらの製品は、Ｃｅｌｏｘ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎ．）から市販されている）、ならびにＫＯＳＲ（ノックアウト（ＫＯ）血清代替品；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【００２３】
本発明の方法及び組成物において、細胞は、無血清、タンパク質不含、成長因子不含及び／またはペプトン不含の培地中で成長し得る。概して培地に適用される「無血清」という用語は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの血清を含有しない任意の哺乳動物細胞の培養培地を包含する。培地に適用される「インスリン不含」という用語は、いかなる外因性インスリンも添加されていない任意の培地を包含する。外因性とは、本文脈において、細胞自体の培養によって産生されるもの以外のものを意味する。培地に適用される「成長因子不含」という用語は、いかなる外因性成長因子（例えば、インスリン、ＩＧＦ−１）も添加されていない任意の培地を包含する。培地に適用され「ペプトン不含」という用語は、いかなる外因性タンパク加水分解物（例えば、動物及び／または植物のタンパク加水分解物など）も添加されていない任意の培地を包含する。
【００２４】
最適には、本発明の目的のために、本発明の方法または特定の細胞種もしくは細胞株の成長もしくは維持に血清が必要とされる場合を除き、使用される培養培地は無血清であるか、または本質的に無血清である。「無血清」とは、培地中の血清の濃度が好ましくは０．１％（ｖ／ｖ）未満の血清、より好ましくは０．０１％（ｖ／ｖ）未満の血清であることと理解される。「本質的に無血清」とは、約２％（ｖ／ｖ）未満の血清が存在すること、より好ましくは約１％未満の血清が存在すること、更により好ましくは約０．５％（ｖ／ｖ）未満の血清が存在すること、また更により好ましくは約０．１％（ｖ／ｖ）未満の血清が存在することを意味する。
【００２５】
「培養すること」または「インキュベートすること」（細胞または細胞株の成長、リプログラミング、分化及び／または維持に関して区別なく用いられる）とは、意図する目的に適し、かつ哺乳動物細胞培養の技術分野にて従来から知られている、無菌、温度、ｐＨ、大気ガス含量（例えば、酸素、二酸化炭素、二窒素）、湿度、培養容器、培養液量、継代、振盪及び他のパラメーターの条件下にあることである。
【００２６】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」、または「タンパク質性分子」は、本明細書にて区別なく用いられ、ペプチド結合を介して共有結合的に連結した２つ以上のアミノ酸の分子鎖を含む。この用語は、生成物の具体的な長さに言及しない。したがって、「ペプチド」及び「オリゴペプチド」は、ポリペプチドの定義内に含まれる。これらの用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。加えて、タンパク質の断片、類似体、変異タンパク質またはバリアントタンパク質、融合タンパク質などがポリペプチドの意味内に含まれる。これらの用語はまた、既知のタンパク質工学的技術を使用して組換え的に発現され得る、１つ以上のアミノ酸類似体または非標準もしくは非天然アミノ酸を含む分子も包含する。更に、融合タンパク質は、本明細書に記載するように、よく知られた有機化学的手法により、誘導体化が可能である。「融合タンパク質」という用語は、そのタンパク質が、２つ以上の親タンパク質または親ポリペプチドに由来するポリペプチド成分を含んでいることを示す。典型的には、融合タンパク質は、融合遺伝子から発現されるものであり、その融合遺伝子中において、ある１つのタンパク質に由来するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、別個のタンパク質に由来するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列にインフレームで付加され、任意にリンカーにより分離されている。これにより、融合遺伝子は、１つのタンパク質として、組換え宿主細胞によって発現され得る。
【００２７】
「抗原結合タンパク質」（ＡＢＰ）という用語は、上で定義した抗体または抗体断片、ＢｉＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞誘導抗体）（例えば、Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．，ＢｉＴＥ：Ｔｅａｃｈｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｅｎｇａｇｅ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１１（１）：２２−３０（２００９））、またはＢｉＫＥ（二重特異性キラー細胞誘導抗体）（例えば、Ｇｌｅａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒｓ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｈｕｍａｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＣＤ１６  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１１（１２）：１−１１（２０１２））、及び目的の標的抗原に特異的に結合するように所望の抗原結合特性を有するＣＤＲに由来する配列を含有する組換えペプチドまたは他の化合物を包含する。「抗原」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的機能断片を含む）などの選択的結合物質が結合でき、かつ更にその抗原に結合できる抗体を産生するために動物にて使用できる分子または分子の一部を指す。抗原は、異なる抗原結合タンパク質、例えば、抗体と相互作用できる１つ以上のエピトープを有し得る。「エピトープ」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）が結合する分子の部分である。この用語は、抗体などの抗原結合タンパク質またはＴ細胞受容体に特異的に結合できる任意の決定基を包含する。エピトープは、連続していても、連続していなくてもよい（例えば、単鎖ポリペプチドにおいて、当該ポリペプチド配列中で互いに連続していないが、分子という概念内では、抗原結合タンパク質が結合するアミノ酸残基）。ある特定の実施形態において、エピトープは模倣的であってよく、この場合、当該エピトープは、抗原結合タンパク質を産生するために使用されるエピトープに類似した三次元構造を有するが、抗原結合タンパク質を産生するために使用されるエピトープに存在するアミノ酸残基を全く含まないか、またはほとんど含まない。エピトープは、ほとんどの場合タンパク質上に存在するが、場合によっては核酸などの他の種類の分子上に存在することもある。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基などの化学的に活性な分子表面基を含み得、特定の三次元構造特性及び／または特定の電荷特性を有し得る。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質及び／または高分子の複合混合物中の標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。
【００２８】
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、完全に組み立てられた抗体、モノクローナル抗体（ヒト、ヒト化またはキメラ抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗原に結合することができる抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ダイアボディ）（前述した抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、所望の生物学的活性を呈する場合に限る）を包含する。化学的に誘導体化した抗体を含む、インタクトな分子及び／または断片の多量体または凝集体が企図される。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２または任意のアロタイプを含む、あらゆるアイソタイプクラスまたはサブクラスの抗体が企図される。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプは、典型的に、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。グリコシル化及び非グリコシル化抗体は、「抗体」という用語に包含される。
【００２９】
一般に、抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗体断片は、ある抗原に対して、類似の結合アッセイ条件下における他の無関係のタンパク質に対する親和性と比較して、極めて高い結合親和性を有し、その結果、当該抗原を認識することができるとき、抗原に「特異的に結合する」。典型的に、抗原結合タンパク質は、平衡解離定数（Ｋｄ）が１０−８Ｍ以下であるとき、その標的抗原に「特異的に結合する」と言う。抗体は、Ｋｄが５×１０−９Ｍ以下である場合、「高い親和性」で抗原に特異的に結合し、Ｋｄが５×１０−１０Ｍ以下である場合、「非常に高い親和性」で抗原に特異的に結合する。一実施形態において、抗体は、約１０−８Ｍ〜１０−１０ＭのＫｄで目的の標的に結合し、また別の実施形態において、抗体は、５×１０−９以下のＫｄで結合する。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質、単離された抗原結合タンパク質は、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉら（２００８）の方法を用いて実施したＫｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙにより測定したとき、５００ｐＭ（５．０×１０−１０Ｍ）以下、２００ｐＭ（２．０×１０−１０Ｍ）以下、１５０ｐＭ（１．５０×１０−１０Ｍ）以下、１２５ｐＭ（１．２５×１０−１０Ｍ）以下、１０５ｐＭ（１．０５×１０−１０Ｍ）以下、５０ｐＭ（５．０×１０−１１Ｍ）以下、または２０ｐＭ（２．０×１０−１１Ｍ）以下のＫｄで、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、Ｊｕｒｋａｔ）によって発現される目的の標的抗原に特異的に結合する（Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ    ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７３：５２−６０（２００８；例えば、実施例１５参照）。
【００３０】
抗原結合タンパク質は、ペプチボディも含む。「ペプチボディ」という用語は、少なくとも１つのペプチドに結合した抗体Ｆｃドメインを含む分子を指す。ペプチボディの作製については、２０００年５月４日に公開されたＰＣＴ国際公開ＷＯ００／２４７８２に概ね記載されている。これらのペプチドのいずれも、リンカーを用いて、またはリンカーを用いずに、タンデムに（すなわち、連続的に）連結され得る。システイニル残基を含有するペプチドは、別のＣｙｓ含有ペプチドと架橋することができ、その一方または両方がビヒクルに連結され得る。１つより多いＣｙｓ残基を有するペプチドはいずれもペプチド内ジスルフィド結合も形成し得る。これらのペプチドのいずれもが誘導体化され得、例えば、カルボキシル末端をアミノ基でキャッピングすることができ、システインをキャッピングすることができ、あるいはアミノ酸残基をアミノ酸残基以外の部分によって置換することができる（例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９（１９９６）及びＣｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：２８７６−８２（１９９７）参照；これらの全体を参照により援用する）。ペプチド配列は、抗体の親和性成熟と類似して、最適化することができ、あるいはアラニンスキャニングまたはランダムもしくは特異的変異導入による改変後、スクリーニングして最良の結合物質を特定することができる。Ｌｏｗｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４０１−２４（１９９７）。抗原結合タンパク質の所望の活性を保持しつつ、抗原結合タンパク質構造中、例えば、ペプチド自体の部分中またはペプチドと抗原結合タンパク質のビヒクル部分との間に、種々の分子を挿入することができる。例えば、Ｆｃドメインもしくはその断片などの分子、ポリエチレングリコールまたは他の関連分子、例えば、デキストラン、脂肪酸、脂質、コレステロール基、小分子炭水化物、ペプチド、本明細書に記載するような検出可能部分（蛍光物質、放射性同位体などの放射標識を含む）、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、干渉（または他の）ＲＮＡ、酵素、ホルモンなどを容易に挿入することができる。この様式での挿入に好適な他の分子は、当業者には理解されであり、本発明の範囲内に包含される。これには、好適なリンカーによって任意に接続された２つの連続するアミノ酸の間に所望の分子を挿入することが含まれる。
【００３１】
「組換え」という用語は、物質（例えば、核酸またはポリペプチド）が人間の介入により人為的または合成的に（すなわち、自然にではなく）改変されていることを示す。改変は、その自然環境内もしくは自然状態にある物質に対して、またはその自然環境もしくは自然状態から取り出した物質に対して行うことができる。例えば、「組換え核酸」は、例えば、クローニング、ＤＮＡシャッフリングまたは他のよく知られた分子生物学的手順中に、核酸を組換えることによって作製されるものである。このような分子生物学的手順の例は、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ（１９８２）中に認められる。「組換えＤＮＡ分子」は、そのような分子生物学的技法を用いて連結されたＤＮＡのセグメントからなる。本明細書で使用される「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ分子を用いて発現されるタンパク質分子を指す。「組換え宿主細胞」は、組換え核酸を含有及び／または発現する細胞である。
【００３２】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、２つ以上のヌクレオチド残基を含有する一本鎖及び二本鎖両方のヌクレオチド重合体を包含する。ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチド残基は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかのヌクレオチド型の修飾型であり得る。当該修飾には、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基修飾、２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート及びホスホロアミデートなどのヌクレオチド間架橋修飾が挙げられる。
【００３３】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００個以下のヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０〜４０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異遺伝子の構築における使用のために、一本鎖または二本鎖であってよい。オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。オリゴヌクレオチドは、定量化または検出を容易にするための同位体標識（例えば、１２５Ｉ、１４Ｃ、１３Ｃ、３５Ｓ、３Ｈ、２Ｈ、１３Ｎ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏなど）、検出アッセイ用の蛍光標識、ハプテンまたは抗原性標識を含む、標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
【００３４】
「ポリヌクレオチド配列」または「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」は、本明細書にて区別なく用いられ、文脈に応じて、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド残基の一次配列、例えば、核酸であるオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ及びＲＮＡの一次配列であり、またはヌクレオチド残基の一次配列を表す文字列である。いかなる特定のポリヌクレオチド配列からも、所与の核酸配列または相補ポリヌクレオチド配列のいずれかを決定することができる。一本鎖でも二本鎖でもよい、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す、ゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡも含まれる。特に指示がない限り、本明細書で考察される任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端が５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向が５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加方向は、転写方向と呼ばれ、ＲＮＡ転写物の５’末端までの５’側に存在するＲＮＡ転写物の配列と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡ転写物の３’末端までの３’側に存在するＲＮＡ転写物の配列と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
【００３５】
「方向」とは、所与のＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの順序を指す。例えば、ＤＮＡ配列が別のＤＮＡ配列に対して反対の向きにある方向は、配列を得たＤＮＡ中の基準点と比較したとき、別の配列に対して５’から３’への配列の順序が逆であるものである。このような基準点には、元となるＤＮＡ中の他の特定のＤＮＡ配列の転写方向及び／または当該配列を含有する複製ベクターの複製起点を挙げることができる。所与の遺伝子に関する５’から３’のＤＮＡ鎖は、「センス」、「プラス」または「コード」鎖と呼ばれる。「プラス」鎖に対する３’から５’の相補鎖は、「アンチセンス」、「マイナス」または「非コード」と呼ばれる。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、「単離された核酸分子」または「単離された核酸配列」とは、（１）当該核酸の天然源において通常会合している少なくとも１つの混入核酸分子から特定され、分離された核酸分子、または（２）クローニングされ、増幅され、タグ付けされた、あるいは別の方法で目的の核酸を決定できるようにバックグラウンドの核酸と区別された核酸分子のいずれかである。単離された核酸分子は、それが天然にみられる形態または環境以外にあるものである。ただし、例えば、核酸分子が天然の細胞とは異なる染色体位置に存在する場合には、ポリペプチド（例えば、オリゴペプチドまたは抗体）を通常発現する細胞に含有される核酸分子も単離された核酸分子に含まれる。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、「〜をコードする核酸分子」、「〜をコードするＤＮＡ配列」及び「〜をコードするＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ｍＲＮＡ鎖に沿ったリボヌクレオチドの順序を決定し、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序も決定する。したがって、ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ配列及びアミノ酸配列をコードする。
【００３８】
「遺伝子」という用語は、生物学的機能に関係するあらゆる核酸に言及するために広く使用される。遺伝子は、典型的に、コード配列を含み、かつ／またはかかるコード配列の発現に必要な調節配列を含む。「遺伝子」という用語は、特定のゲノムまたは組換え配列だけでなく、当該配列によってコードされるｃＤＮＡまたはｍＲＮＡにも適用される。「融合遺伝子」は、天然で一緒に認められないか、またはコードされた融合タンパク質（すなわち、キメラタンパク質）中に存在する配列と同じ配列で天然において一緒に認められない異なるタンパク質由来の部分を含むポリペプチドをコードするコード領域を含有する。遺伝子はまた、例えば、または他のタンパク質に対する認識配列を形成する、非発現核酸セグメントを含む。非発現調節配列には、転写因子などの調節タンパク質が結合し、これにより隣接配列または近傍配列の転写が生じる、転写制御エレメントが挙げられる。
【００３９】
「遺伝子の発現」または「核酸の発現」とは、ＤＮＡのＲＮＡへの転写（任意にＲＮＡの修飾、例えばスプライシングを含む）、ＲＮＡのポリペプチドへの翻訳（それに続くポリペプチドの翻訳後修飾を含み得る）、または文脈によって示される場合、転写と翻訳の両方を意味する。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「コード領域」または「コード配列」という用語は、構造遺伝子に関して使用されるとき、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果として生じる、新生ポリペプチド中に存在するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。コード領域は、真核生物では、５’側が開始メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」と接し、３’側が終止コドン（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）を指定する３つのトリプレットのうちの１つと接している。
【００４１】
「制御配列」または「制御シグナル」という用語は、特定の宿主細胞において、連結しているコード配列の発現及びプロセシングに影響を与えることができるポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態において、原核生物の制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含み得る。真核生物の制御配列は、１つまたは複数の転写因子認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列またはエレメント、ポリアデニル化部位及び転写終結配列を含み得る。制御配列は、リーダー配列及び／または融合パートナー配列を含むことができる。プロモーター及びエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短いＤＮＡ配列からなる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７（１９８７））。プロモーター及び調節エレメントは、酵母菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞及びウイルス中の遺伝子を含む、種々の真核生物源から単離されている（類似の制御エレメント、すなわち、プロモーターは、原核生物にも存在する）。特定のプロモーター及びエンハンサーの選択は、目的タンパク質の発現にどの細胞種が使用されるかに依存する。いくつかの真核生物プロモーター及びエンハンサーは幅広い宿主範囲を有するが、その他のものは限られた一部の細胞種でのみ機能する（Ｖｏｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１１：２８７（１９８６）ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７（１９８７）；Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ，ｈｉｇｈ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３（７−８）：３８２−３９１（２０１１）；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｇｅｎｅ．２７２（１−２）：１４９−１５６（２００１）参照）。エンハンサーは、通常、シス作用性であり、本質的には、染色体上、発現される遺伝子から最大１００万塩基対離れて位置する。場合により、その機能に影響を与えずに、エンハンサーの方向を逆にすることができる。
【００４２】
「調節エレメント」という用語は、ＤＮＡメチル化、ヒストン脱アセチル化、またはプロモーターの転写を別様では阻害し得るクロマチン構造への他の修飾などのクロマチン環境のサイレンシング作用からプロモーターまたはエンハンサーを防御するように機能するポリヌクレオチド配列を指す。このようなプロモーターサイレンシングは、エピジェネティックな制御の結果であり、経時的な発現の消失をもたらし得る（Ｌｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ．１２８：７０７−７１９（２００７）；Ｐｉｋａａｒｔ  ＭＪ．Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｉｓ  ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：２８５２−６２．（１９９８）参照）。「調節エレメント」はまた、遠位エンハンサー配列がプロモーターを活性化するのを防ぐ障壁として作用するＤＮＡ配列を指す場合もある。クロマチン防御活性または絶縁活性を有するＤＮＡ調節エレメントの例には、インシュレーターエレメント、ＳＴＡＲエレメント、ＵＣＯＥエレメントまたはＭＡＲエレメントが挙げられる（Ｏｔｔｅ  ＡＰ  ｅｔ．ａｌ．Ｖａｒｉｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｂｅｎｅｆｉｔ  ｆｒｏｍ  ＳＴＡＲ−Ｓｅｌｅｃｔ，ａ  ｎｏｖｅ  ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２３（４）：８０１−７（２００７）；Ｆｅｒｒａｒｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ  ｄｅｌｉｍｉｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７９：５５５２０−３０（２００１）；Ｋｅｌｌｕｍ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｓｃｓ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓ  ｄｏｍａｉｎ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ  ｉｎ  ａｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｓｓａｙ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：２４２４−３１（１９９２）；Ｃｈｕｎｇ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ５’  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｓｅｒｖｅｓ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．Ｃｅｌｌ．７４：５０５−１４（１９９３）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．ＣｐＧ  Ｉｓｌａｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ＨＮＲＡＰ２Ｂ１／ＣＢＸ３  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｏｃｕｓ  ｒｅｄｕｃｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：１７（２００５���参照）。そのようなエレメントは、種々の真核生物源から単離されており、特定のプロモーター及びエンハンサーと対になったとき、活性を向上することが示されている。調節エレメントの活性は、目的タンパク質の発現にどの細胞種が使用されるか、ならびに当該エレメント及び特定のプロモーターの配列に依存する。調節エレメント（複数可）は、いずれの方向で配置されてもよいが、典型的には、最も適した活性に関して実験的に試験する必要がある。
【００４３】
「ベクター」という用語は、タンパク質のコード情報を宿主細胞に運搬するために使用される任意の分子または実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。
【００４４】
本明細書で使用される「発現ベクター」または「発現構築物」という用語は、所望のコード配列と、機能的に連結されるコード配列の特定の宿主細胞中における発現に必要とされる適切な核酸制御配列とを含有する組換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは、機能的に連結されるコード領域の転写、翻訳に影響するか、またはこれらを制御する配列を含み得、また、イントロンが存在する場合には、機能的に連結されるコード領域のＲＮＡスプライシングに影響する配列を含み得るが、これらに限定されない。原核生物での発現に必要な核酸配列は、プロモーター、任意にオペレーター配列、リボソーム結合部位を含み、場合により他の配列も含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサーならびに終結シグナル及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。また、所望する場合、目的のポリペプチドの細胞からの単離をより容易にするために、発現されるポリペプチドが組換え宿主細胞によって分泌され得るように、分泌シグナルペプチド配列を任意に発現ベクターにコードしてもよく、目的のコード配列に機能的に連結され得る。そのような技術は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｇｏｏｄｅｙ，Ａｎｄｒｅｗ  Ｒ．；ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、米国特許第５，３０２，６９７号；Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ、米国特許第６，０２２，９５２号及び米国特許第６，３３５，１７８号；Ｕｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒｅｏｆ、米国特許第７，０２９，９０９号；Ｒｕｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２７  ｈｕｍａｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＵＳ２００３／０１０４４００Ａ１）。
【００４５】
発現ベクターは、１つ以上の発現カセットを含有する。「発現カセット」は、プロモーター、発現させる外因性目的遺伝子（「ＧＯＩ」）及びポリアデニル化部位ならびに／または他の好適なターミネーター配列を最低限含む。プロモーターは、典型的に、転写開始点（必ずしもそうではないが直接隣接する）の５’側に、好適なＴＡＴＡボックスまたはＧ−Ｃに富む領域を含む。
【００４６】
本明細書にて区別なく使用される「機能的な組み合わせで」、「機能的な順序で」及び「機能的に連結された」という用語は、所与の遺伝子の転写及び／または所望のタンパク質分子の合成を導くことが可能な核酸分子が生じるような２つ以上の核酸配列の結合を指す。この用語はまた、機能的タンパク質が産生されるようなアミノ酸配列の連結も指す。例えば、タンパク質コード配列に「機能的に連結される」ベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が制御配列の転写活性に適合する条件下で達成されるように、タンパク質コード配列に連結される。例えば、プロモーター配列及び／またはエンハンサー配列は、シス作用転写制御エレメントの任意の組み合わせを含め、適切な宿主細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激または調節する場合、コード配列に機能的に連結されている。転写される遺伝子配列に機能的に連結されるプロモーター調節配列は、転写される配列に物理的に近接するが、プロモーター及び／または転写される遺伝子配列に機能的に連結されるシス作用調節エレメント配列は、当該調節エレメントがプロモーター配列及び／または転写される遺伝子配列に近接しない場合であっても、機能的な連結が可能である。本発明のいくつかの有用な実施形態において、調節エレメントは、ＧＡＰＤＨプロモーター駆動発現カセットの５’側に置くことができ、他の有用な実施形態において、エンハンサーは、ＧＡＰＤＨプロモーター駆動発現カセットの３’側に配置され得る。
【００４７】
参照核酸配列に対してある量またはあるパーセンテージの「配列同一性」を有するか、ある量またはあるパーセンテージ「同一」である１つの候補核酸配列に関して本明細書で使用されるとき、これらの用語は、最大の配列同一性パーセントを達成するように、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後における、参照核酸配列中と同一である候補核酸配列中のヌクレオチドのパーセンテージ（例えば、配列番号３５または配列番号３８と同一である一連のヌクレオチドのパーセンテージ）を指す。したがって、配列同一性は、２つの核酸配列のヌクレオチド位置の類似性を比較するために一般的に使用される標準的な方法により決定することができる（例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム）。通常、参照配列に対する候補配列の核酸配列同一性は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、具体的には９６％、より具体的には９７％、更により具体的には９８％、最も具体的には９９％であり、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％である。
【００４８】
「宿主細胞」という用語は、核酸で形質転換された細胞、または形質転換が可能な細胞であって、これにより目的の遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語は、親細胞の子孫を含み、目的の遺伝子が存在する限り、その子孫が元の親細胞と形態学的または遺伝子構成的に同一であるかどうかは問わない。本発明の実施には、多数の利用可能かつ周知の宿主細胞のいずれをも使用することができるが、ＣＨＯ細胞株が好ましい。特定の宿主の選択は、当該技術分野にて認識されているいくつかの要因に依存する。これらの要因には、例えば、選択した発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子がコードするペプチドの毒性、形質転換率、ペプチドの回収容易性、発現特性、生物学的安全性及び費用が挙げられる。これらの要因のバランスは、全ての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に等しく有効であるわけではないという理解の下で達成する必要がある。これらの一般的な指針内で、培養物における有用な微生物宿主細胞には、細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｐ．など）、酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．など）及び他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物宿主細胞（ヒトを含む）、例えば、ＣＨＯ細胞及びＨＥＫ−２９３細胞が挙げられる。改変はＤＮＡレベルでも行うことができる。ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、選択した宿主細胞により適合するコドンに変更してもよい。Ｅ．ｃｏｌｉについては、最適化コドンが当該技術分野において知られている。制限部位を除去するか、またはサイレント制限部位を含むようにコドンを置換することができ、これにより、選択した宿主細胞中でのＤＮＡプロセシングが促進し得る。次に、形質転換した宿主を培養し、精製する。宿主細胞は、従来の発酵条件下で培養することができ、これにより、所望の化合物が発現される。このような発酵条件は、当該技術分野において知られている。
【００４９】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来性または外因性ＤＮＡの取り込みを意味し、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されたとき、細胞は「トランスフェクトされて」いる。多数のトランスフェクション技術が当該技術分野においてよく知られており、本明細書にて開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｕｐｒａ；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照されたい。そのような技術を使用して、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入することができる。
【００５０】
「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特徴の変化を指し、細胞が新しいＤＮＡまたはＲＮＡを含有するように改変されたとき、細胞は形質転換されている。例えば、細胞は、トランスフェクション、形質導入または他の技術を介して新しい遺伝物質を導入することによって、その天然状態から遺伝的に改変されるとき、形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込まれることによって細胞のＤＮＡと再結合し得るか、複製されずにエピソーム要素として一時的に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製され得る。細胞は、形質転換ＤＮＡが細胞の分裂とともに複製されるとき、「安定的に形質転換された」とみなされる。
【００５１】
タンパク質の「ドメイン」または「領域」（本明細書にて区別なく用いられる）は、タンパク質全体の任意の部分であって、最大では完全タンパク質を含むが、典型的には完全タンパク質より小さいものからなる。ドメインは、必ずしも必要ではないが、タンパク質鎖の残りの部分と関係なく折り畳まれ得、及び／または特定の生物学的、生化学的もしくは構造的な機能もしくは部位（例えば、リガンド結合ドメイン、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞外ドメイン）と相関し得る。
【００５２】
「治療薬候補」は、疾患または障害の治療、予防または緩和に治療効果を有するか、有する可能性がある、任意の化合物、ツール化合物、化合物の組み合わせ、小分子、ポリペプチド、ペプチド、抗原結合タンパク質、抗体または他のタンパク質性分子もしくは生物学的製剤である。治療薬候補は、薬理学的に活性である。「薬理学的に活性」という用語は、このように記載される物質が、医学的パラメーター（例えば、血圧、血球数、コレステロールレベル、痛覚）または疾患状態（例えば、がん、自己免疫疾患、慢性疼痛）に影響を与える活性を有すると判定されていることを意味する。逆に、「薬理学的に不活性」という用語は、医学的パラメーターまたは疾患状態に影響を与える活性が、その物質について判定できないことを意味する。したがって、薬理学的に活性な分子には、以下に定義されるようなアゴニスト分子または模倣分子及びアンタゴニスト分子が含まれる。
【００５３】
「〜模倣ペプチド」、「ペプチド模倣物」及び「〜アゴニストペプチド」という用語は、目的の天然タンパク質と同等の生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を指す。これらの用語は、天然分子の作用を高めることなどにより天然ペプチド分子の活性を間接的に模倣するペプチドを更に包含する。
【００５４】
「アゴニスト」とは、目的の受容体に結合し、その受容体を担持する細胞による応答を誘発する分子である。アゴニストは、多くの場合、天然物質の作用を模倣する。「インバースアゴニスト」は、アゴニストとは反対の作用を引き起こす。
【００５５】
「アンタゴニスト」及び「阻害物質」という用語は、目的の受容体の生物学的活性を遮断するか、もしくは何らかの方法で干渉する分子、または目的の受容体（限定するものではないが、イオンチャンネルまたはＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）など）の既知のアンタゴニストもしくは阻害物質と同等の生物学的活性を有する分子を指す。
【００５６】
「ツール化合物」は、実験において、対照として、または治療候補に代わる薬理学的に活性な代用化合物として使用される試薬に採用される、任意の小分子、ペプチド、抗原結合タンパク質、抗体または他のタンパク質性分子である。
【００５７】
「外因性」という用語は、宿主細胞とは異なる種に由来し、哺乳動物宿主細胞に挿入することができる、単離されたヌクレオチド配列を指す。外因性目的遺伝子は、直接的または間接的に細胞機構と連係して遺伝子の転写及び／または発現を調節するように働く、他の遺伝子エレメント（プロモーター、ポリＡ配列など）に任意に機能的に連結され得る。代替的にまたは追加的に、外因性遺伝子は、哺乳動物の細胞核の染色体ＤＮＡ中への遺伝子の組み込み（例えば、相同組換えのような）を助長するヌクレオチド配列に連結され得る。外因性遺伝子は、哺乳動物のゲノム中の特定のヌクレオチド配列と相同もしくは異種であるヌクレオチド配列からなってもよいし、ハイブリッド配列（すなわち、哺乳動物の遺伝物質に対して、その遺伝子の１つ以上の部分が相同であり、１つ以上の部分が異種である）であるヌクレオチド配列からなってもよい。目的の遺伝子のヌクレオチド配列は、哺乳動物中に内因的に存在するポリペプチドまたはポリペプチドのバリアントをコードしてもよいし、哺乳動物中に天然に生じないポリペプチド（すなわち、外因性ポリペプチド）をコードしてもよいし、内因性及び外因性ポリペプチドのハイブリッドをコードしてもよい。目的遺伝子がプロモーターに機能的に連結される場合、そのプロモーターは、哺乳動物及び／または目的遺伝子と相同であっても、異種であってもよい。あるいは、プロモーターは、内因性及び外因性プロモーターエレメント（エンハンサー、サイレンサー、サプレッサーなど）のハイブリッドであってもよい。
【００５８】
遺伝子（複数可）の選択
典型的に、本発明にて有用な外因性遺伝子（複数可）は、目的のポリペプチド（ハムスターＧＡＰＤＨ以外）、例えば、抗体または抗体断片などの標的結合ポリペプチド、タンパク質または受容体のペプチドリガンド、神経系、免疫応答、造血、炎症、細胞の成長及び増殖、細胞系統分化ならびに／またはストレス応答に関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であろう。本発明の範囲内には、１、２または３つの外因性目的遺伝子の宿主細胞への挿入が含まれる。
【００５９】
１つより多い目的遺伝子が本発明にて使用される場合、これらの遺伝子は、個別に調製及び挿入されてもよいし、１つの挿入用構築物として一緒に生成されてもよい。遺伝子は、各遺伝子の発現を駆動するために選択されたプロモーター及び／または哺乳動物の両方に対して、相同であってもよいし、異種であってもよい。更に、遺伝子は、少なくとも何らかの生物学的活性を有する、すなわち、同種の野生型非トランスジェニック哺乳動物では容易に観察されない任意のレベル（生化学的、細胞的及び／または形態学的）での効果を呈する、完全長ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ配列、またはその任意の断片、サブユニットもしくは変異体であり得る。任意で、目的遺伝子は、ハイブリッドヌクレオチド配列、すなわち、相同及び／または異種のｃＤＮＡ及び／またはゲノムＤＮＡ断片から構築された配列であってよい。遺伝子はまた、任意で、１つ以上の天然ｃＤＮＡ及び／もしくはゲノム配列の変異体、またはそのアレルバリアントであってよい。
【００６０】
各遺伝子は、当該技術分野においてよく知られている１つ以上の方法を使用して、好適な量で単離し、得ることができる。これらの方法及び遺伝子の単離に有用な他の方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．［１９８９］）ならびにＢｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．［１９８７］）に記載されている。
【００６１】
各遺伝子のヌクレオチド配列がわかっている場合、その遺伝子の全部または一部を、Ｅｎｇｅｌｓら（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２８：７１６−７３４［１９８９］）に記載されるものなどの化学的合成法を使用して合成してもよい。これらの方法には、とりわけ、ホスホトリエステル、ホスホロアミダイト及びＨ−ホスホネートの核酸合成法が挙げられる。あるいは、遺伝子は、目的遺伝子のＤＮＡ配列に選択的にハイブリダイズする１つ以上の核酸プローブ（クローニングされる遺伝子と許容できるレベルの相同性を有するオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片など）を使用して、適切なｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。遺伝子配列を得る別の好適な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。しかしながら、この方法を上手く使用するには、適切なヌクレオチド配列の増幅に有用な好適なオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために、目的遺伝子のヌクレオチド配列に関する十分な情報を入手する必要がある。
【００６２】
最適な方法にオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブの使用が求められる場合（例えば、ＰＣＲ、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリースクリーニング）、プローブまたはプライマーとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、ライブラリースクリーニングまたはＰＣＲ中に生じる非特異的結合の量を最小限にするために、十分な長さのものであり、かつ十分に一義的である必要がある。プローブまたはプライマーの実際の配列は、通常、別の生物の同一または類似の遺伝子に由来する保存的または高相同の配列または領域に基づく。任意で、プローブまたはプライマーは、縮重プローブまたは縮重プライマーであってもよい。
【００６３】
目的遺伝子から発現されるアミノ酸配列のみがわかっている場合、各アミノ酸残基に関する既知の好ましいコドンを使用して、その遺伝子の考えられる機能的核酸配列を推定することができる。これにより、この配列を化学的に合成することができる。
【００６４】
本発明は、遺伝子変異配列の使用を包含する。変異遺伝子は、野生型配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／または挿入を含有する遺伝子である。ヌクレオチドの置換、欠失及び／または挿入により、野生型アミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる遺伝子産物（すなわち、タンパク質）を生成することができる。このような変異体の調製は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、Ｗｅｌｌｓら（Ｇｅｎｅ，３４：３１５［１９８５］）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（上掲）に記載されている。
【００６５】
制御配列及び調節エレメントの選択
遺伝子は、典型的には、プロモーターに機能的に連結され、この場合、プロモーターは、特定の方法で各遺伝子の発現を調節するように選択される。本発明の範囲内において、ハムスターグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターがＣＨＯ細胞での発現に好ましい。例えば、遺伝子番号１００７３６５５７（ＮＣＢＩリファレンス配列ＮＷ＿００３６１３６１０．１）のハムスターＧＡＰＤＨプロモーター配列をクローニングし、本発明の発現ベクターに使用することができる。
【００６６】
本発現ベクターのいくつかの有用な例において、ハムスターＧＡＰＤＨプロモーターは、配列番号５０のヌクレオチド配列（ＧＡＰＤＨ転写開始点を基準としてヌクレオチド位置−５３２〜−２３）またはその機能性断片を含む。ハムスターＧＡＰＤＨプロモーター配列（配列番号５０）は、チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ゲノムＤＮＡからクローニングした。また、ＧＡＰＤＨプロモーター配列（配列番号５０）を含むハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子配列のより大きな断片、例えば、ハムスターＧＡＰＤＨの１番目のエクソン及びイントロンを含有する配列番号４９（ＧＡＰＤＨ転写開始点を基準としてヌクレオチド位置−５３２〜＋３０５）もハムスターＧＡＰＤＨプロモーターを提供するために使用することができる。更に、プロモーター配列を含むハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子のより大きな断片、例えば、とりわけ、ハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子のイントロン１及び２を含む配列番号１１（転写開始点を基準として−２０４９〜＋２１６１）も発現ベクターに使用することができる。イントロン１（配列番号５１；チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子の転写開始点を基準としてヌクレオチド位置＋６４〜＋２９３）を含まない断片を使用するのがより効率的である。一方、本発現ベクターの有効性は、ＧＡＰＤＨプロモーターの３’側かつ目的遺伝子の５’側に、配列番号５２のヌクレオチド配列（すなわち、イントロン２）を含めることによって向上する。
【００６７】
１つより多い外因性目的遺伝子が使用される場合、各遺伝子は、同じプロモーターまたは異なるプロモーターにより調節され得る。ハムスターＧＡＰＤＨプロモーターの他に選択されるプロモーターは、相同（すなわち、目的遺伝子をトランスフェクションする哺乳動物と同種由来）であっても、異種（すなわち、遺伝子をトランスフェクションする哺乳動物の種とは異なる源由来）であってもよい。したがって、各プロモーターの供給源は、いずれの単細胞、原核生物もしくは真核生物、またはいずれの脊椎動物もしくは無脊椎動物に由来し得る。
【００６８】
他のベクター成分の選択
目的遺伝子及びプロモーターに加えて、本発明を実施するための目的遺伝子（複数可）の調製に有用なベクターは、（１）遺伝子が挿入される哺乳動物中での遺伝子の最適発現、及び（２）細菌または哺乳動物宿主細胞中でのベクターの増幅に有用な１つ以上の他のエレメントを典型的に含有する。これらのエレメントのそれぞれは、それぞれの活性を最大化するために、ベクター中で、他の各エレメントに対して適切に配置される。このような位置決めは、当業者によく知られている。必要に応じて、以下のエレメントをベクター中に任意に含めることができる。
【００６９】
ｉ．シグナル配列エレメント
目的遺伝子によりコードされたポリペプチドが分泌される本発明の実施形態では、多くの場合、シグナル配列と呼ばれる小さなポリペプチドが存在し、これにより、遺伝子によりコードされたポリペプチドは、当該ポリペプチドが合成される細胞の外に誘導される。典型的に、シグナル配列は、遺伝子のコード領域中、コード領域の５’末端近傍または５’末端に配置される。多くのシグナル配列が同定されており、機能的であるもの、したがって、種々の組織種に由来する細胞による発現と適合するものが目的遺伝子とともに使用され得る。したがって、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子と相同であっても異種であってもよく、細胞の由来である哺乳動物種と相同であっても異種であってもよい。更に、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、上述の方法を使用して、化学的に合成してもよい。ただし、本明細書での目的上、好ましいシグナル配列は、目的遺伝子とともに天然に生じるもの（すなわち、遺伝子と相同であるもの）である。
【００７０】
ｉｉ．膜アンカードメインエレメント
場合により、特定の細胞内膜の表面上または原形質膜上に目的遺伝子を発現させることが望ましいことがある。天然膜タンパク質は、ポリペプチドの一部として、タンパク質を膜に係留する役割を持つ一続きのアミノ酸を含有する。一方、膜上に天然に存在しないタンパク質の場合には、このような一続きのアミノ酸を付加して、この特徴を付与することができる。多くの場合、アンカードメインは、ポリペプチド配列の内部部分であるため、アンカードメインをコードするヌクレオチド配列は、遺伝子のヌクレオチド配列の内部領域中へ工学的に操作する。しかしながら、他の場合には、アンカードメインをコードするヌクレオチド配列は、遺伝子のヌクレオチド配列の５’末端または３’末端に結合され得る。この場合、アンカードメインをコードするヌクレオチド配列は、目的遺伝子をコードするヌクレオチド配列とは別個の成分として、ベクター中の適切な位置にまず配置され得る。シグナル配列の場合と同様に、アンカードメインは、いずれの供給源であってもよく、したがって、遺伝子及び宿主細胞の由来である哺乳動物種の両方に対して、相同であっても異種であってもよい。あるいは、アンカードメインは、上述の方法を使用して、化学的に合成してもよい。
【００７１】
ｉｉｉ．複製起点エレメント
この成分は、典型的に、市販されている原核生物発現ベクターの一部であり、宿主細胞中におけるベクターの増幅を助けるものである。最適なベクターが複製起点部位を含まない場合、既知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターにライゲーションしてもよい。
【００７２】
ｉｖ．転写終結エレメント
このエレメントは、ポリアデニル化またはポリＡ配列としても知られ、典型的に、ベクター中の遺伝子のヌクレオチド配列の３’側に位置し、目的遺伝子の転写を終結させる役割を持つ。このエレメントをコードするヌクレオチド配列はライブラリーから簡単にクローニングでき、またベクターの一部として市販もされているが、上述のようなヌクレオチド配列合成方法を使用して容易に合成することもできる。
【００７３】
ｖ．イントロンエレメント
多くの場合、目的遺伝子の転写は、クローニングベクター上の１つのイントロンまたは１つより多いイントロン（エクソンによって連結されている）の存在によって増加する。イントロン（複数可）は、遺伝子がゲノムＤＮＡ配列の完全長または断片である場合は特に、遺伝子ヌクレオチド配列中に天然に存在し得るものである。イントロン（複数可）が（ほとんどのｃＤＮＡのように）ヌクレオチド配列中に天然に存在しない場合、イントロン（複数可）は、別の供給源から得ることができる。イントロン（複数可）は、目的遺伝子及び／または宿主細胞の由来である哺乳動物種に対して、相同であっても異種であってもよい。イントロンは、有効であるように転写される必要があるため、プロモーター及び目的遺伝子に対するその位置が重要である。したがって、遺伝子がｃＤＮＡ配列である場合、イントロン（複数可）の好ましい位置は、転写開始点の３’側かつポリＡ転写終結配列の５’側である。ｃＤＮＡの場合、好ましくは、イントロンは、遺伝子のヌクレオチド配列を遮断しないように、遺伝子のヌクレオチド配列の一方の側または他方の側（すなわち、５’または３’）に配置される。挿入される宿主細胞（複数可）に適合するのであれば、あらゆるウイルス、原核生物及び真核生物（植物または動物）を含む、いかなる供給源由来のいかなるイントロンも本発明を実施するために使用することができる。合成イントロンも本明細書に含まれる。所望により、２つ以上のイントロンをベクターに使用してもよい。イントロン及びエクソンの有用なセットは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ＤＮＡ配列である。
【００７４】
ｖｉ．選択マーカー（複数可）エレメント
選択マーカー遺伝子は、選択培養培地中で成長するトランスフェクトされた細胞の生存及び成長に必要なポリペプチドをコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、原核生物宿主細胞の場合はアンピシリン、テトラサイクリンもしくはカナマイシン、また哺乳動物細胞の場合はネオマイシン、ハイグロマイシンもしくはメトトレキサートに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補うタンパク質、または（ｃ）複合培地もしくは規定培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【００７５】
本発明にて有用な上述のエレメントの全て及び他のエレメントは、当業者によく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．［１９８９］）及びＢｅｒｇｅｒら編（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．［１９８７］）に記載されている。
【００７６】
クローニングベクターの構築
本発明の組換え発現ベクターを調製するのに有用な遺伝子カセットの増幅に最も有用なクローニングベクターは、原核生物宿主に適合するものである。しかしながら、真核細胞宿主及び当該細胞に適合するベクターも本発明の範囲内である。
【００７７】
ある特定の場合において、クローニングベクターに含有される種々のエレメントのいくつかは、市販のクローニングまたは増幅ベクター、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＢＩＩＳＫ＋／−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）などのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ．ＲＴＭ．ベクターなどのベクター中に既に存在し得、これらは全て原核生物細胞宿主に好適である。この場合、目的遺伝子（複数可）をベクター中に挿入するだけでよい。
【００７８】
しかしながら、使用すべきエレメントの１つ以上がクローニングまたは増幅ベクター中に予め存在しない場合は、それを個別に得て、ベクターにライゲートすることができる。それぞれのエレメントを得て、それらをライゲートするために使用される方法は、当業者によく知られており、目的遺伝子を得るための上記方法（すなわち、ＤＮＡの合成、ライブラリースクリーニングなど）と同等のものである。
【００７９】
目的遺伝子（複数可）のヌクレオチド配列のクローニングもしくは増幅及び／または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションに使用されるベクターは、当該技術分野においてよく知られている方法を使用して構築される。このような方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）に記載されている、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡのアガロース及びアクリルアミドゲル精製、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡカラムクロマトグラフィー精製、ＤＮＡのフェノール／クロロホルム抽出、ＤＮＡシークエンシング、ポリメラーゼ連鎖反応増幅などの標準的な技術が挙げられる。
【００８０】
本発明の実施に使用される最終的なベクターは、典型的に、市販のベクターなどの出発クローニングベクターまたは出発増幅ベクターから構築される。このベクターは、完成ベクター中に含めるべきエレメントのいくつかを含有していてもよいし、含有していなくてもよい。所望のエレメントが出発ベクター中に１つも存在しない場合、ライゲートするエレメントの末端とベクターの末端がライゲーションに関して適合するように、適切な制限エンドヌクレアーゼ（複数可）でベクターを切断することによって、各エレメントをベクターに個別にライゲーションしてもよい。場合により、満足のいくライゲーションを達成するために、ライゲートする末端を互いに「平滑化すること」が必要なことがある。平滑化は、４つ全てのヌクレオチドの存在下で、クレノウＤＮＡポリメラーゼまたはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、「付着末端」を最初に満たすことによって達成される。この手順は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）に記載されている。
【００８１】
あるいは、ベクターに挿入すべきエレメントの２つ以上をまず互いにライゲートした後（当該エレメントを互いに隣接して配置すべき場合）、ベクターにライゲートしてもよい。
【００８２】
ベクターを構築する他の一方法は、種々のエレメントの全てのライゲーションを１つの反応混合物中で同時に実施することである。この場合、エレメントの不適切なライゲーションまたは挿入に起因して、意味のないまたは機能しないベクターが多く生成され得るが、制限エンドヌクレアーゼ消化によって機能的ベクターを特定し、選択することができる。
【００８３】
ベクターの構築後、増幅のために、原核生物宿主細胞にベクターをトランスフェクトすることができる。増幅に典型的に使用される細胞は、Ｅ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５−α（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）及びＤＨ５−αと類似の特徴を有する他のＥ．ｃｏｌｉ株である。
【００８４】
哺乳動物宿主細胞が使用される場合、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞；Ｕｒｌａｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，７７：４２１６  ［１９８０］））及びヒト胎児腎臓細胞株２９３（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９  ［１９７７］）などの細胞株、ならびに他の細胞株が好適である。
【００８５】
選択した増幅用宿主細胞株へのベクターのトランスフェクションは、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストランなどの方法を使用して達成される。選択される方法は、トランスフェクションを行う宿主細胞の種類に応じてある程度決まる。これらの方法及び他の好適な方法は、当事者によく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）に記載されている。
【００８６】
ベクターの十分な増幅に足る十分に長い時間（Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の場合、通常一晩）、細胞を培養した後、ベクター（この段階ではプラスミドと呼ばれることが多い）を細胞から単離し、精製する。典型的には、細胞を溶解し、他の細胞含有物からプラスミドを抽出する。プラスミド精製に適した方法は、とりわけ、アルカリ溶解ミニプレップ法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲）が挙げられる。
【００８７】
挿入用プラスミドの調製
典型的に、目的遺伝子を含有するプラスミドは、線状化され、胚への挿入の前に、選択された制限エンドヌクレアーゼの使用により、その一部が除去される。場合により、遺伝子、プロモーター、他の制御配列及び調節エレメントを線状断片としてベクターの他の部分から単離し、遺伝子、プロモーター、イントロン（使用される場合）、エンハンサー、ポリＡ配列及び任意選択のシグナル配列または膜アンカードメインを含有する線状ヌクレオチド配列のみを胚に導入するのが好ましいことがある。これは、これらのエレメントを含有する核酸配列領域を取り出すようにプラスミドを切断し、アガロースゲル電気泳動または他の好適な精製方法を使用してこの領域を精製することによって、達成することができる。
【００８８】
治療候補化合物
抗体の産生
ポリクローナル抗体。ポリクローナル抗体は、典型的に、適切な抗原及びアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により、動物中にて産生される。あるいは、動物のリンパ節中に抗原を直接注入してもよい（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１６：３８１−３８９，１９９７参照）。抗体応答の改善は、二官能性または誘導体化試薬、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸または当該技術分野において知られている他の試薬を使用して、適切な抗原を、免疫化対象の種にて免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリンまたはダイズトリプシン阻害物質と複合体化することによって得ることができる。
【００８９】
動物は、抗原、免疫原性複合体または免疫原性誘導体に対して、免疫化は、例えば、１００μｇのタンパク質または複合体（マウスの場合）を３倍量のフロイント完全アジュバントと混合し、この溶液を皮内の複数部位に注射することによって免疫化される。１ヶ月後、フロイント完全アジュバント中ペプチドまたは複合体の元の量の１／５〜１／１０を用いて、複数部位の皮下注射により動物に追加免疫を行う。追加免疫の注射から７〜１４日後、動物から採血し、血清の抗体力価をアッセイする。力価が安定状態に達するまで、動物に追加免疫を行う。好ましくは、同じ抗原の複合体で動物に追加免疫を行うが、異なるタンパク質との複合体及び／または異なる架橋試薬を介した複合体でもよい。複合体はまた、タンパク質融合体として組換え細胞培養物内で作製することができる。また、ミョウバンなどの凝集剤も免疫応答を高めるために好適に使用される。
【００９０】
モノクローナル抗体。モノクローナル抗体は、当該技術分野において知られている任意の技術を使用して、例えば、免疫化スケジュール終了後のトランスジェニック動物から採取した脾臓細胞を不死化することによって、作製することができる。脾臓細胞は、当該技術分野において知られている任意の技術を使用して、例えば、ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを形成することによって、不死化することができる。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に初めて記載されたハイブリドーマ方法を使用して作製することができる。あるいは、組換えＤＮＡ法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｉｎ、米国特許第６，３３１，４１５号）により作製することができ、これには、抗体をグリコシル化できる哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）を任意に使用して、軽鎖及び重鎖のほぼ等モル量の産生を促進する「スプリットＤＨＦＲ」法などの方法が挙げられる（例えば、Ｐａｇｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，，ＥＰ０４８１７９０Ａ２及び米国特許第５，５４５，４０３号参照）。
【００９１】
ハイブリドーマ方法において、マウスまたはラット、ハムスターもしくはマカクザルなどの他の適切な宿主哺乳動物を本明細書に記載のとおりに免疫化すると、免疫化に使用したタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生できるリンパ球が誘導される。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次いで、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して、リンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【００９２】
ハイブリドーマ細胞は、準備したらすぐに、好ましくは、融合されなかった親ミエローマ細胞の成長または生存を妨げる１つ以上の物質を含有する好適な培養培地中に播種し、成長させる。例えば、親ミエローマ細胞がヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）酵素を欠く場合、ハイブリドーマの培養培地は、典型的に、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含む。
【００９３】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を助け、かつ培地に対して感受性のあるものである。ヒトモノクローナル抗体の産生に関するヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株についても記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。ハイブリドーマ形成融合手順にて使用するためのミエローマ細胞は、好ましくは、非抗体産生性であり、融合効率が高く、酵素欠損性である。この酵素欠損性により、ミエローマ細胞は、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）の成長のみを助ける特定の選択培地中では成長できなくなる。マウス融合にて使用するのに適した細胞株には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７及びＳ１９４／５ＸＸＯＢｕｌが挙げられ、ラット融合に使用される細胞株の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及び４Ｂ２１０が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２及びＵＣ７２９−６である。
【００９４】
ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関してアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合試験によって測定される。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）またはスキャッチャード分析により測定することができる（Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）；Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＷＯ２００７／０４５４６３Ａ１、実施例１０；その全体を参照により本明細書に援用する）。
【００９５】
所望の特異性、親和性及び／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定した後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により成長させられ得る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的に適した培養培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物中で腹水腫瘍としてインビボ成長し得る。
【００９６】
ハイブリドーマまたはｍＡｂを更にスクリーニングして、特定の抗原または標的との結合親和性などの特定の性質を有するｍＡｂを特定することができる。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、親和性クロマトグラフィーまたは当該技術分野において知られている任意の他の好適な精製技術などによって、培養培地、腹水または血清から好適に分離される。
【００９７】
抗体及び他のポリペプチドの組換え産生。目的の免疫グロブリンまたはポリペプチド由来の関連アミノ酸配列は、タンパク質直接シークエンシングにより決定することができ、好適なヌクレオチドコード配列は、ユニバーサルコドン表に従って設計することができる。あるいは、モノクローナル抗体をコードするゲノムまたはｃＤＮＡを、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、当該抗体を産生する細胞から単離し、配列決定できる。関連ＤＮＡ配列は、核酸直接シークエンシングにより決定することができる。
【００９８】
ＤＮＡのクローニングは、標準的な技術を使用して実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ参照；参照により本明細書に援用する）。例えば、ポリＡ＋ｍＲＮＡ（好ましくは、膜結合性ｍＲＮＡ）の逆転写によってｃＤＮＡライブラリーを構築し、ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを使用して、このライブラリーをスクリーニングすることができる。しかしながら、一実施形態において、目的の免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、軽鎖または重鎖可変セグメント）をコードするｃＤＮＡ（または完全長ｃＤＮＡの一部）を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が使用される。増幅された配列は、任意の好適なベクター、例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクターまたはファージディスプレイベクターに容易にクローニングできる。目的の免疫グロブリンポリペプチドの一部の配列を特定することが可能であれば、使用される具体的なクローニング方法は重要でないことが理解されよう。
【００９９】
抗体核酸の１つの源は、目的の抗原で免疫した動物からＢ細胞を得て、それを不死細胞と融合させることによって作製したハイブリドーマである。あるいは、免疫動物のＢ細胞（または全脾臓）から核酸を単離することができる。抗体をコードする核酸の更に別の源は、例えば、ファージディスプレイ技術により生成された当該核酸のライブラリーである。目的のペプチド、例えば、所望の結合特性を有する可変領域ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、パンニングなどの標準的な技術によって同定することができる。
【０１００】
免疫グロブリンポリペプチドの可変領域全体をコードする配列を特定することもできるが、可変領域の一部、例えば、ＣＤＲコード部分のみのシークエンシングで十分な場合もある。シークエンシングは、標準的な技術を使用して実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ及びＳａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７参照；参照により本明細書に援用する）。クローニングした核酸の配列と、ヒト免疫グロブリンの遺伝子及びｃＤＮＡに関して公開されている配列とを比較することによって、当業者は、シークエンシングした領域に応じて、（ｉ）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のアイソタイプを含む）の生殖細胞系セグメントの使用、ならびに（ｉｉ）Ｎ領域付加及び体細胞変異のプロセスに起因する配列を含む、重鎖及び軽鎖可変領域の配列を容易に特定することができる。免疫グロブリンの遺伝子配列の１つの情報源は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．である。
【０１０１】
単離されたＤＮＡは、制御配列に機能的に連結するか、または発現ベクター中に配置することができ、次いで、これを、別様では免疫グロブリンタンパク質をしない宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を誘導する。抗体の組換え産生については、当該技術分野においてよく知られている。
【０１０２】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、機能的に連結されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結しており、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に機能的に連結しており、あるいはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置付けられている場合、コード配列に機能的に連結している。一般に、機能的に連結されるとは、連結しているＤＮＡ配列が近接していることを意味し、分泌リーダーの場合、近接し、かつリーディングフェーズ内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、近接している必要はない。連結は、都合のよい制限酵素認識部位でのライゲーションにより行われる。このような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の手法に従って使用する。
【０１０３】
多くのベクターが当該技術分野において知られている。ベクター構成要素は、次のうちの１つ以上、すなわちシグナル配列（例えば、抗体の分泌を誘導できるもの；例えば、ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＴ／／配列番号５３；これはＶＫ−１シグナルペプチド配列ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ／／配列番号５４をコードする）、複製起点、１つ以上の選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質もしくは他の薬物への耐性を付与し、栄養要求性欠損を補い、または培地中で得られない必須栄養素を供給することができるもの）、調節エレメント、プロモーター及び転写終結配列を含み得、これらは全て当技術分野においてよく知られている。
【０１０４】
細胞、細胞株及び細胞培養物は、区別なく使用されることが多く、本明細書における当該表記は全て子孫を含む。形質転換体及び形質転換細胞は、初代対象細胞及び初代対象細胞に由来する培養物（継代数は関わらない）を含む。また、意図的または偶発的変異に起因して、全ての子孫のＤＮＡ内容が正確に同一でない可能性があることは理解されよう。変異体子孫には、元の形質転換細胞に関するスクリーニングで同じ機能または生物学的活性を有するものが含まれる。
【０１０５】
例示的な宿主細胞には、原核生物、酵母菌または高等真核細胞が挙げられる。原核生物宿主細胞には、グラム陰性またはグラム陽性微生物などの真正細菌、例えば、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａなどのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ及びＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。糸状菌または酵母菌などの真核微生物は、組換えポリペプチドまたは抗体に好適なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅすなわち一般のパン酵母菌は、下等真核生物の宿主微生物のなかで最も一般的に使用されている。しかしながら、いくつかの他の属、種及び系統、例えば、Ｐｉｃｈｉａ、例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；ならびに糸状菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ及びＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主なども一般に利用可能であり、本明細書にて有用である。
【０１０６】
グリコシル化抗体の発現のための宿主細胞は、多細胞生物に由来し得る。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス系及びバリアントと、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（幼虫）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉなどの宿主由来の対応する許容可能な昆虫宿主細胞が特定されている。そのような細胞のトランスフェクション用の各種ウイルス系は、一般に入手可能であり、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１バリアント及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株がある。
【０１０７】
脊椎動物宿主細胞も好適な宿主であり、当該細胞からのポリペプチド（抗体を含む）の組換え産生は、慣用的手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例には、任意の株のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、限定するものではないが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＣＨＯ−ＤＧ−４４、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ＡＭ１、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎臓株（２９３細胞または浮遊培養での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞［Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）］；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒトヘパトーマ細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腺癌（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞もしくはＦＳ４細胞；または哺乳動物ミエローマ細胞が挙げられる。
【０１０８】
宿主細胞は、ポリペプチド（抗体を含む）を産生するための上述の核酸またはベクターを用いて形質転換するか、またはトランスフェクトし、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切に改変された従来の栄養培地中で培養する。加えて、選択マーカーによって分離された多数の転写単位のコピーを含む新しいベクター及びトランスフェクト細胞株が抗体などのポリペプチドの発現に特に有用である。
【０１０９】
本発明にて有用である、ポリペプチドの産生に使用される宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が宿主細胞の培養に適している。加えて、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号もしくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０１０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許第３０，９８５号に記載されている培地のいずれかを、宿主細胞用培養培地として使用してもよい。これらの培地のいずれにも、ホルモン及び／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）剤など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源を必要に応じて添加してよい。任意の他の必要な添加物も、当業者に知られているであろう適切な濃度で含めることができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で以前から使用されているものであり、当業者に明らかであろう。
【０１１０】
宿主細胞を培養すると、組換えポリペプチドが細胞内、ペリプラズムに産生され得るか、または培地中に直接分泌され得る。抗体などのポリペプチドが細胞内で産生される場合、第１ステップとして、宿主細胞または溶解断片のいずれかである粒子状破片が、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。
【０１１１】
抗体または抗体断片は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、カチオンもしくはアニオン交換クロマトグラフィー、または好ましくは、目的の抗原もしくはプロテインＡもしくはプロテインＧを親和性リガンドとして使用する親和性クロマトグラフィーを用いて、精製することができる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖をベースにするポリペプチドを含むタンパク質を精製するために使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、マウスの全てのアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリックスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも利用可能である。制御された多孔質ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの物理的に安定したマトリックスでは、アガロースの使用により達成できる場合よりも、流速を速く、かつ処理時間を短くすることができる。タンパク質がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質精製の他の技術、例えば、エタノール沈殿法、逆相ＨＰＬＣ、等電点クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿法なども、回収する個々の抗体に応じて可能である。
【０１１２】
キメラ、ヒト化、Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）モノクローナル抗体。齧歯類モノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインがヒト定常Ｉｇドメインに融合されたキメラモノクローナル抗体は、当該技術分野において知られている標準的な手順を使用して作製することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，６８４１−６８５５；及びＢｏｕｌｉａｎｎｅ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，６４３−６４６．（１９８４）参照）。抗体配列をよりヒト様になるようにヒト化または改変するための技術は、多数記載されており、例えば、（１）ヒトフレームワーク及び定常領域上に非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をグラフトすること（当該技術分野において「ＣＤＲグラフト」によるヒト化として知られるプロセス）または（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってそのドメインをヒト様表面で「覆い隠す（クローキング）」こと（当該技術分野において「ベニアリング」と呼ばれるプロセス）または（３）それぞれの残基の抗原結合もしくは抗体構造への関与の見込み及び免疫原性に対する見込みに基づいて、選択された非ヒトアミノ酸残基をよりヒトになるように改変することがある。例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  ５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１  ６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５  ９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４  １５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９  ４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９  ２１７（１９９４）；及びＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３  ８３（１９９１）；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５−８１４（１９９４）を参照されたい。当該文献のそれぞれは、その全体を参照により本明細書に援用する。
【０１１３】
抗体配列をよりヒト様になるようにヒト化または改変するための技術は、いくつか記載されており、例えば、（１）ヒトフレームワーク及び定常領域上に非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をグラフトすること（当該技術分野において「ＣＤＲグラフト」によるヒト化として知られるプロセス）または（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってそのドメインをヒト様表面で「覆い隠す（クローキング）」こと（当該技術分野において「ベニアリング」と呼ばれるプロセス）または（３）それぞれの残基の抗原結合もしくは抗体構造への関与の見込み及び免疫原性に対する見込みに基づいて、選択された非ヒトアミノ酸残基をよりヒトになるように改変することがある。例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  ５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１  ６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５  ９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４  １５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９  ４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９  ２１７（１９９４）；及びＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３  ８３（１９９１）；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５−８１４（１９９４）を参照されたい。当該文献のそれぞれは、その全体を参照により本明細書に援用する。
【０１１４】
抗体はまた、内因性免疫グロブリン産生がなく、かつヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するように工学的に操作されたトランスジェニック動物を使用して産生することもできる（例えば、Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６（１９９７）参照）。例えば、ＷＯ９８／２４８９３は、ヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物について開示しており、当該動物は、内因性重鎖及び軽鎖遺伝子の不活性化により、機能性内因性免疫グロブリンを産生しない。ＷＯ９１／１０７４１もまた、免疫原に対する免疫応答を起こすことができるトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主について開示しており、抗体は、霊長類の定常領域及び／または可変領域を有し、かつ内因性免疫グロブリンをコードする遺伝子座は、置換または不活性化される。ＷＯ９６／３０４９８は、改変抗体分子を形成するように定常領域または可変領域のすべてまたは一部を置き換えるなどの、哺乳動物の免疫グロブリン遺伝子座を改変するためのＣｒｅ／Ｌｏｘ系の使用を開示している。ＷＯ９４／０２６０２は、不活性化した内因性Ｉｇ遺伝子座及び機能性ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示している。米国特許第５，９３９，５９８号は、内因性重鎖を欠き、１つ以上の異種定常領域を含む外因性免疫グロブリン遺伝子座を発現する、トランスジェニックマウスの作製方法を開示している。
【０１１５】
上述のトランスジェニック動物を使用すれば、選択された抗原性分子に対する免疫応答を引き起こすことができ、抗体産生細胞を動物から取り出し、この細胞を使用してヒト由来モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを形成することができる。免疫化プロトコール、アジュバントなどは、当該技術分野において知られており、例えば、ＷＯ９６／３３７３５に記載のトランスジェニックマウスの免疫化において使用されている。モノクローナル抗体は、対応するタンパク質の生物学的活性または生理学的作用を阻害または中和する能力に関して試験することができる。また、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６（１９９７）；及び米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５８９，３６９号、米国特許第５，５４５，８０７号；及び米国特許出願第２００２０１９９２１３号を参照されたい。米国特許出願第２００３００９２１２５号は、動物の免疫応答を所望のエピトープに偏らせる方法を開示している。ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞による産生も可能である（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号参照）。
【０１１６】
ファージディスプレイ技術による抗体作製
組換えヒト抗体遺伝子のレパートリー構築技術及び繊維状バクテリオファージ表面上へのコード化抗体断片のディスプレイ技術の開発により、ヒト由来抗体の別の作製手段が提供された。ファージディスプレイについては、例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／１７２７１、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／０１０４７、及びＣａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−６４５４（１９９０）に記載されており、当該文献のそれぞれは、その全体を参照により本明細書に援用する。ファージ技術によって作製された抗体は、通常、細菌中で、抗原結合断片、例えば、ＦｖまたはＦａｂ断片として生成されるため、エフェクター機能を欠く。エフェクター機能は、次の２つの手法のうちの１つにより導入することができる。当該断片を工学的に操作して、哺乳動物細胞中での発現のための完全抗体にするか、またはエフェクター機能を誘発できる第２の結合部位を含む二重特異性抗体断片にすることが可能である。
【０１１７】
典型的には、抗体のＦｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）をＰＣＲによって個別にクローニングし、ランダムに組み合わせてコンビナトリアルファージディスプレイライブラリーにし、次いで、これを特定の抗原に対する結合に関して選択することができる。抗体断片をファージ表面上に発現させ、抗原結合によるＦｖまたはＦａｂ（したがって、抗体断片をコードするＤＮＡを含有するファージ）の選択を、パンニングと呼ばれる数回の抗原結合及び再増幅の手順により行う。抗原に特異的な抗体断片を濃縮し、最終的に単離する。
【０１１８】
ファージディスプレイ技術はまた、「ガイド選択」と呼ばれる齧歯類モノクローナル抗体のヒト化のためのアプローチにも使用することができる（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２，８９９−９０３（１９９４）参照）。この場合、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片は、ヒト軽鎖ライブラリーとの組み合わせで提示することができ、次いで、得られたハイブリッドＦａｂライブラリーを抗原で選択することができる。これにより、マウスＦｄ断片は、選択を助ける（ガイドする）鋳型を提供する。その後、選択されたヒト軽鎖をヒトＦｄ断片ライブラリーと組み合わせる。得られたライブラリーの選択により、ヒトＦａｂのみが得られる。
【０１１９】
ファージディスプレイライブラリーからヒト抗体を得るための種々の手順が記載されている（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）；米国特許第５，５６５，３３２号及び同第５，５７３，９０５号；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２，１７３−１８４（１９９４）参照）。特に、ファージディスプレイライブラリーから得られた抗体のインビトロ選択及び進化は、強力なツールである（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７，１９１−２８０（１９９４）；及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，４３３−４５５（１９９４）；米国特許出願第２００２０００４２１５号及びＷＯ９２／０１０４７；２００３年１０月９日公開の米国特許出願第２００３０１９０３１７号及び米国特許第６，０５４，２８７号；米国特許第５，８７７，２９３号参照。Ｗａｔｋｉｎｓ，“Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｂｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｌｉｆｔ，”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １７８：１８７−１９３及び２００３年３月６日公開の米国特許出願公開第２００３００４４７７２号は、ファージ発現抗体ライブラリーまたは他の結合分子のキャプチャーリフトによるスクリーニング法を記載しており、この方法は固体支持体上に候補結合分子を固定化することを伴う。
【０１２０】
本発明の有用な実施形態には、限定するものではないが、以下が挙げられる。
【０１２１】
実施形態１：外因性目的遺伝子に機能的に連結されたハムスターＧＡＰＤＨプロモーターを含む発現カセットを含み、
（ａ）配列番号３５に記載の核酸配列または配列番号３８に記載の核酸配列に少なくとも９５％同一である核酸配列を含み、かつ
（ｂ）前記プロモーターに機能的に連結された調節エレメントを更に含む、組換え発現ベクター。
【０１２２】
実施形態２：前記ＧＡＰＤＨプロモーターが配列番号５０のヌクレオチド配列またはその機能性断片を含む、実施形態１に記載の組換え発現ベクター。
【０１２３】
実施形態３：前記ＧＡＰＤＨプロモーターの３’側かつ前記目的遺伝子の５’側に、配列番号５２のヌクレオチド配列を含む、実施形態１または２に記載の組換え発現ベクター。
【０１２４】
実施形態４：前記調節エレメントが、配列番号３５または配列番号３８と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、実施形態１〜３のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
【０１２５】
実施形態５：前記調節エレメントが、配列番号３５または配列番号３８と少なくとも９９％同一である核酸配列を含む、実施形態１〜４のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
【０１２６】
実施形態６：前記調節エレメントが、配列番号３５の核酸配列を含む、実施形態１〜５のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
【０１２７】
実施形態７：前記調節エレメントが、配列番号３８の核酸配列を含む、実施形態１〜５のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
【０１２８】
実施形態８：前記調節エレメントがプラス方向である、実施形態１〜７のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
【０１２９】
実施形態９：実施形態１〜８のいずれかに記載の組換え発現ベクターを含む、哺乳動物宿主細胞。
【０１３０】
実施形態１０：前記細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態９の哺乳動物宿主細胞。
【０１３１】
例えば、本発明のある特定の有用な実施形態は、外因性目的遺伝子に機能的に連結された配列番号５０のヌクレオチド配列を含むハムスターＧＡＰＤＨプロモーターまたはその機能性断片と、ＧＡＰＤＨプロモーターの３’側かつ目的遺伝子の５’側に配列番号５２のヌクレオチド配列とを含む発現カセットを含む、組換え発現ベクターを含み、この発現ベクターは、（ａ）配列番号３５に記載の核酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、または配列番号３８に記載の核酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、核酸配列を含み、かつ（ｂ）プロモーターに機能的に連結された、調節エレメントを更に含む。かかる実施形態は調節エレメントがプラス方向であるものを含み、調節エレメントがマイナス方向である実施形態を含む。
【０１３２】
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より完全に理解されるであろう。これらの実施例は、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１３３】
実施例１：材料及び方法
数ヶ月の期間にわたって妥当なタンパク質発現レベルを維持しつつ、安定プールの回復までの時間を速めるために、別個の発現カセット及び選択カセットを含有する安定プールを作製するための哺乳動物発現ベクターを求めた。目的遺伝子の上流にｈｕＣＭＶプロモーターと哺乳動物発現のためのアデノウイルス３成分リーダーとを含む、２つのベクター（ｐＰＴ１及びｐＰＴ２；図１参照）から始めた。目的遺伝子は、本研究において、ヒトＩｇＧ１の重鎖の定常領域に由来するレポーター遺伝子のヒトＦｃであり、ＶＨ２１シグナルペプチドが先行する。Ｆｃカセットの下流にはピューロマイシン耐性（ＰｕｒｏＲ）選択カセットがあり、その発現はＳＶ４０プロモーターによって駆動される。ｐＰＴ１ＰｕｒｏＲ選択カセットは、ＰｕｒｏＲの前に弱いＫｏｚａｋコンセンサス配列（ＣＧＧＣＣＣ）を含有する。ベクターｐＰＴ２では、これを、強いＫｏｚａｋコンセンサス配列（ＧＣＣＡＣＣ）に最適化した。図面に表すベクター構造は、ベクター上の重要な調節エレメント及び発現カセットを表していることに留意されたい。哺乳動物細胞における発現に影響しないベクターの骨格要素は示していない。
【０１３４】
細胞培養物。ヒトＦｃを発現するｐＰＴベクターを使用して、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で安定細胞プールを作製した。ＣＨＯ−Ｓ親細胞は、８ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持し、リポフェクタミンＬＴＸトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して、４μｇの線状化プラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、ピューロマイシン１０μｇ／ｍＬを含有する選択培地中にプールを再懸濁した。回復まで２〜３日ごとに、Ｖｉ−Ｃｅｌｌカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して生存細胞密度及び生存率を観察し、培地を交換した。回復は、Ｖｉ−Ｃｅｌｌによる生存率９０％超と定義した。
【０１３５】
前述のように、ベクターは線状化し、ＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトした。細胞をピューロマイシンで選択し、回復した安定ＣＨＯ−Ｓ細胞株を直ちに使用して、４ｍＬのバッチ産生を２４ウェルディープウェルブロックの産生培地中に生存細胞１００万個／ｍＬで播種した。これらのバッチ産生の馴化培地（ＣＭ）を使用して、ＦｏｒｔｅＢｉｏにより力価を決定した。すなわち、６日後に産生物を遠心分離により採取し、プロテインＡバイオセンサーを備えたＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄを使用してｈｕＦｃ力価を測定し、ｈｕＦｃ検量線を用いて算出した。発現の安定性を評価するために、安定プールを様々な期間にわたって週２回継代し、次いで、古い安定プールを使用して、バッチ産生手順を繰り返した。
【０１３６】
結果：ｐＰＴ１は、ＰｕｒｏＲの前のＫｏｚａｋ配列が弱いため、ピューロマイシン選択の選択ストリンジェンシーが高くなった。したがって、ｐＰＴ１をトランスフェクトした細胞の回復は、一定しておらず、ピューロマイシン選択に耐えられない場合もあり、力価のばらつきの増大が観察された。Ｋｏｚａｋを最適化した場合、ｐＰＴ２を含有するトランスフェクトＣＨＯ−Ｓは、より一定して回復した。後続のベクター改変にｐＰＴ２ベクターを使用して、次に進んだ。
【０１３７】
実施例２：ハムスターＧＡＰＤＨプロモーター、エクソン及びイントロンのベクターへのクローニング
ＣＨＯ−Ｋ１ゲノムＤＮＡからハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子座をクローニングした。ＮＣＢＩ内で公開されているハムスターＧＡＰＤＨゲノム配列を参照した（ＮＷ＿００３６１３６１０．１）。ＰＣＲプライマーを、その断片がハムスターＧＡＰＤＨプロモーター、１番目及び２番目のエクソン及びイントロンならびにスプライス受容部位を含むエクソン３の小部分を含むように設計した。増幅産物の配列を決定し、ＮＣＢＩ内で公開されているマウス（ＮＭ＿００８０８４）及びハムスター（ＮＭ＿００１２４４８５４）のＧＡＰＤＨ転写物のアノテーションを使用して、エクソン／イントロン境界を含むハムスター配列についてアノテーションをおこなった。
【０１３８】
配列決定したハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子座からハムスターＧＡＰＤＨコアプロモーター、１番目のエクソン及びイントロン、ならびに２番目のエクソンのスプライス受容部位を特定した。ｐＰＴ２内のヒトＣＭＶコアプロモーターの代わりに、これらをクローニングし、ｐＰＴ２．１を作製した（図２）。
【０１３９】
また、配列決定したハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子座（配列番号１１）から、２番目のハムスターＧＡＰＤＨエクソン及びイントロン、更に３番目のエクソンのスプライス受容部位を、配列決定したハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子座から特定した。ハムスターとマウスの両方の転写物において、ＧＡＰＤＨタンパク質の開始コドンは、エクソン２内に存在する。２番目のＧＡＰＤＨイントロンをｐＰＴ２．１にクローニングする場合には、この翻訳開始点を確実に無効にした。ｐＰＴ２．４には、アデノウイルス３成分リーダー、ならびに１番目と２番目の両方のハムスターＧＡＰＤＨイントロン及びエクソン配列が組み込まれている（図４）。
【０１４０】
より詳細には、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（対数期増殖５００万）を採取し、これを使用して、ＣＨＯ−Ｋ１ゲノムＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔの使用により抽出した。プライマーを設計し、フォワードプライマー５’−ＣＴＡ  ＣＣＣ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＣＴＡ  ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＡＧ  ＣＣ−３’／／配列番号９及びリバースプライマー５’−ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＧＴＣ  ＣＡＡ  ＴＡＣ  ＧＧＣ  Ｃ−３’／／配列番号１０を使用して、ハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子座からハムスターＧＡＰＤＨプロモーター、ならびにハムスターＧＡＰＤＨの最初の２つのエクソン及びイントロンを含有する約４ｋｂの断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物をゲル精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ４−ＴＯＰＯ平滑キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の説明書に従って使用してＴＯＰＯクローニングした。ポジティブクローンを配列確認のためのシークエンシングに供した。
【０１４１】
確認されたハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ）ＧＡＰＤＨゲノム断片の核酸配列は、次のとおりであった（転写開始点を基準として−２０４９〜＋２１６１）。
ＣＴＡＣＣＣＡＧＡＧＡＣＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＴＧＧＧＡＣＡＣＡＴＡＡＡＧＣＴＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＡＣＡＡＣＡＧＴＧＴＡＴＣＡＧＧＡＧＴＧＴＡＣＡＡＧＴＴＧＡＣＡＡＡＣＡＡＴＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＣＧＧＴＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＣＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＣＣＴＴＴＡＣＴＡＴＧＧＧＧＴＣＴＧＣＡＧＧＧＧＣＧＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＣＣＣＡＡＧＴＣＣＴＴＡＡＴＣＴＧＣＴＧＡＧＴＣＡＣＴＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧＴＣＡＴＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＴＧＣＣＡＴＡＧＡＡＡＴＧＣＴＣＣＣＴＡＣＣＴＣＴＴＡＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＡＡＣＡＧＴＡＡＴＧＡＣＡＡＡＣＣＡＴＡＧＧＣＡＧＧＡＧＧＣＡＡＡＡＧＧＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＡＡＡＣＡＴＧＴＧＴＴＡＧＧＴＴＡＧＧＧＣＡＧＡＡＣＴＡＴＧＧＡＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴＡＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＣＴＧＴＴＧＧＡＡＧＧＣＡＧＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧＴＣＣＣＣＧＣＡＣＴＧＧＧＡＣＣＡＴＴＴＣＣＡＴＣＣＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＣＣＣＣＣＧＧＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＡＧＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＡＧＧＧＣＡＡＴＣＣＣＡＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡＡＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＴＡＡＡＣＴＴＡＧＣＡＡＴＴＡＧＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＡＡＡＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＡＡＧＴＴＧＣＡＣＴＧＡＣＣＴＡＧＣＡＡＡＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＣＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＣＣＧＡＧＡＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＣＴＴＴＣＣＡＣＣＣＴＣＣＣＴＡＣＴＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＣＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＣＣＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＣＴＧＧＣＴＴＧＧＧＧＴＡＴＡＡＴＡＣＣＣＣＣＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＡＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＡＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＴＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＡＧＧＣＡＣＧＴＣＣＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＧＣＣＣＴＣＡＣＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＧＧＧＴＧＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＴＧＴＣＴＣＣＴＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＧＴＧＣＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＴＴＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＣＣＡＡＣＣＣＡＣＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＴＧＴＣＣＴＣＡＣＣＣＣＧＧＧＧＣＣＣＣＡＡＣＣＴＡＧＡＣＣＴＴＡＡＣＴＧＡＧＧＡＡＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＴＴＧＴＡＡＧＴＣＴＣＡＡＴＴＡＴＧＣＡＧＧＧＣＡＴＣＣＣＧＡＣＣＴＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＧＡＧＣＧＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＴＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＧＡＡＴＧＣＧＡＡＧＧＧＣＣＣＣＣＧＣＡＧＧＡＧＧＣＡＡＡＧＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＴＴＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＣＴＧＴＧＴＣＡＣＴＡＣＣＧＡＡＧＡＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＡＣＴＴＴＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＴＴＧＣＡＴＡＡＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＧＴＣＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＣＡＣＡＣＡＣＧＣＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＡＡＣＣＣＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＣＣＡＴＴＴＴＡＴＣＧＧＧＧＣＧＧＣＡＡＣＴＴＴＴＡＧＧＴＣＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＣＴＴＡＧＴＡＣＡＣＡＣＴＣＴＴＣＧＴＣＣＴＴＡＡＧＴＣＣＡＴＡＧＴＣＴＧＴＡＴＴＣＣＣＴＣＧＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＡＴＣＡＣＣＧＧＧＴＣＡＣＣＴＣＣＣＣＡＧＣＧＡＡＧＣＡＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＴＣＴＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＣＣＣＡＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧＣＧＴＧＣＡＣＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＣＧＡＧＧＣＧＧＧＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＴＧＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＧＣＧＧＣＴＴＴＡＣＧＧＧＴＧＣＡＣＧＴＡＧＣＴＣＡＧＧＣＣＴＣＡＧＣＧＣＣＣＴＴＧＡＧＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＡＴＧＡＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＴＣＣＴＣＧＧＣＧＣＴＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＣＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴＴＣＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＣＣＧＧＧＧＡＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＧＧＧＣＧＣＴＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＴＣＣＧＣＡＴＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＧＧＡＣＧＴＧＡＴＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＡＣＧＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＴＣＧＣＴＣＣＧＧＡＧＡＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＣＧＴＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＧＣＴＧＧＧＣＴＡＧＧＧＴＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＴＣＣＣＧＣＴＣＣＧＴＣＧＣＧＴＡＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＣＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧＧＧＣＴＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＧＧＴＧＧＧＴＧＧＣＣＧＣＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＧＡＧＡＣＣＴＣＡＡＧＧＴＣＡＧＣＧＡＧＣＣＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＴＴＧＣＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＡＧＣＧＣＧＧＡＧＴＣＣＴＣＡＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣＡＣＧＣＡＴＧＣＴＴＡＧＧＣＴＣＣＡＴＣＣＣＧＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＡＣＴＴＴＣＧＣＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＡＣＣＡＣＧＴＧＣＣＡＧＡＣＧＧＧＡＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＧＣＣＣＴＣＴＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＧＧＴＧＧＣＡＣＣＧＧＧＣＣＧＴＧＣＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＡＧＣＧＣＡＴＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＣＴＴＴＡＧＧＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＴＴＧＣＡＡＡＣＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡＡＴＧＡＡＣＣＡＣＣＧＴＴＡＧＧＡＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＴＡＡＣＣＴＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＧＣＣＴＣＴＧＴＡＣＴＧＴＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＣＧＴＧＣＴＣＴＣＧＡＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＣＣＴＣＧＣＣＡＧＣＴＧＴＣＴＣＡＴＡＴＴＡＴＴＡＧＣＣＴＣＡＡＡＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＴＴＧＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＡＧＡＡＴＣＧＡＡＧＣＧＧＡＣＴＴＧＧＡＧＡＧＧＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＡＡＡＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＧＴＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＴＧＡＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＣＡＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＴＡＧＣＡＴＣＣＣＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＴＡＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＡＴＣＡＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＣＣＴＧＴＡＧＧＣＣＡＧＡＣＴＧＴＡＡＡＧＧＴＣＡＣＴＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＡＧＴＧＴＣＴＧＡＧＣＣＴＣＧＧＡＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡＣＣＣＴＡＡＴＣＴＧＡＧＧＴＴＡＴＡＴＴＴＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＴＴＴＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＡＣＡＣＡＣＡＴＣＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＴＴＡＧＣＴＡＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＧＴＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＧＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＴＴＡＧＧＧＧＴＴＧＧＡＡＡＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＴＴＴＣＴＣＡＧＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＴＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＴＧＧＧＣＣＧＡＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＡＴＴＣＴＧＡＣＣＴＴＴＡＡＣＣＴＴＧＣＣＣＴＴＴＧＡＧＣＴＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＡＧＴＧＣＡＣＧＡＧＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＡＧＣＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＡＧＡＡＣＡＡＡＣＴＴＣＣＣＡＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＡＧＴＧＡＡＴＧＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＡＣＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＴＣＴＴＧＧＡＧＡＣＴＴＧＡＡＡＴＧＡＣＴＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＴＣＡＣＣＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＡＧＴＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＴＴＡＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＴＡＡＡＡＧＣＣＣＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＡＧＡＣＣＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＴＣＣＴＡＡＧＧＡＴＡＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＡＴＡＴＴＴＧＧＧＣＣＣＴＧＣＴＴＣＴＡＡＧＣＡＴＴＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＡＴＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＴＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＴＴＴＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＡＡＡＴＡＣＴＡＡＴＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＣＴＣＣＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＣＴＧＴＣＴＴＧＣＡＣＡＧＴＡＧＧＣＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＴＧＧＧＣＴＣＴＣＴＡＣＡＧＣＴＡＴＧＧＧＡＣＡＡＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＴＴＴＴＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＣＴＧＡＣＴＡＴＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＧＴＴＣＴＣＴＧＡＣＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＧＣＣＴＣＡＧＡＴＴＴＧＧＣＣＧＴＡＴＴＧＧＡＣＧＣＣＴＧＧ／／配列番号１１。ベクターｐＰＴ２．１には、ハムスターＧＡＰＤＨプロモーターの部分を含むハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子座（配列番号１１）の部分、すなわち、配列番号１１の次の部分（転写開始点を基準として−５３２〜＋３０５）が組み込まれている。ＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＡＣＴＴＴＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＴＴＧＣＡＴＡＡＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＧＴＣＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＣＡＣＡＣＡＣＧＣＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＡＡＣＣＣＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＣＣＡＴＴＴＴＡＴＣＧＧＧＧＣＧＧＣＡＡＣＴＴＴＴＡＧＧＴＣＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＣＴＴＡＧＴＡＣＡＣＡＣＴＣＴＴＣＧＴＣＣＴＴＡＡＧＴＣＣＡＴＡＧＴＣＴＧＴＡＴＴＣＣＣＴＣＧＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＡＴＣＡＣＣＧＧＧＴＣＡＣＣＴＣＣＣＣＡＧＣＧＡＡＧＣＡＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＴＣＴＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＣＣＣＡＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧＣＧＴＧＣＡＣＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＣＧＡＧＧＣＧＧＧＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＴＧＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＧＣＧＧＣＴＴＴＡＣＧＧＧＴＧＣＡＣＧＴＡＧＣＴＣＡＧＧＣＣＴＣＡＧＣＧＣＣＣＴＴＧＡＧＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＡＴＧＡＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＴＣＣＴＣＧＧＣＧＣＴＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＣＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴＴＣＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＣＣＧＧＧＧＡＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＧＧＧＣＧＣＴＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＴＣＣＧＣＡＴＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＧＧＡＣＧＴＧＡＴＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＡＣＧ
ＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＴＣＧＣＴＣＣＧＧＡＧ／／配列番号４９；ｐＰＴ２への１番目のエクソン及びイントロン、ならびに２番目のエクソンのスプライス受容部位。まず、ｐＰＴ２のベクター部分をＸｂａＩ及びＳａｌＩで消化し、ゲル精製し、ｐＰＴ２からＣＭＶプロモーター全体を除去した。ＣＭＶ  ＩＥエンハンサーを、フォワードプライマー５（５’−ＴＧＡ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＴＴＡ  ＣＡＴ  ＡＡＣ  ＴＴＡ  ＣＧＧ  ＴＡＡ  ＡＴＧ  ＧＣ−３’／／配列番号１４）及びリバースプライマー５（５’−ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＴＡＡ  ＴＡＧ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  Ｃ−３’／／配列番号１５）を使用したＰＣＲ産物により再配置し、最後に、エクソン１及びイントロン１を含むＧＡＰＤＨプロモーターを、フォワードプライマー６（５’−ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＡＧＡ  ＣＣＡ  ＣＧＡ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＣＡＡ  Ｃ−３’／／配列番号１６）及びリバースプライマー６（５’−ＣＡＴ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＣＣ  ＴＡＧ  ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＣＴＡ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＧＣＧ  ＡＧＧ  ＣＴＧ−３’／／配列番号１７）を使用したＰＣＲ産物により組み込んだ。これらのＰＣＲ反応の鋳型は、それぞれｐＰＴ２、ｐＰＴ２及びｐＣＲ４−ＧＡＰＤＨゲノム断片であった。３つ全てのＰＣＲ産物を、ＳＬＩＣにより、ＸｂａＩ及びＳａｌＩで線状化したｐＰＴ２のベクター部分にクローニングした。
【０１４２】
ベクターｐＰＴ２．４は、ｐＰＴ２．１に２番目のハムスターＧＡＰＤＨイントロンを組み込んだものであるが（図４）、最初に、中間構築物ｐＰＴ２．２を作製した。ｐＰＴ２．２では、ＧＡＰＤＨ  ＴＡＴＡボックスからエクソン２のスプライス受容部位までに及ぶｐＰＴ２．１の配列を、出発ベクター及びｐＰＴ１に存在するＣＭＶ  ＴＡＴＡ、アデノウイルス３成分リーダー及び主要後期エンハンサー（ＭＬＥ）に置き換えた。手短に述べれば、ｐＰＴ２．１をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化し、ベクター部分をゲル精製した。除去したｈＣＭＶ  ＩＥ及びＧＡＰＤＨプロモーターを置き換えるために、フォワードプライマー５（配列番号１４）及びリバースプライマー７（５’−ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＡＴＡ  ＴＡＧ  ＧＡＡ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＴＧＧ  ＴＧＧ−３’／／配列番号１８）ならびに鋳型ｐＰＴ２．１を使用したＰＣＲ産物と、同様にｐＰＴ１を鋳型に使用したフォワードプライマー７（５’−ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＡＴＡ  ＴＡＡ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＴＴ  ＴＡＧ  ＴＧＡ  ＡＣ−３’／／配列番号１９）及びリバースプライマー８（５’−ＣＡＴ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＣＣ  ＴＡＧ  ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＣＴＡ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＣＣＧ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＴＣ−３’／／配列番号２０）を使用したＰＣＲ産物とを組み合わせた。これらのＰＣＲ産物を、ＳＬＩＣにより、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化したｐＰＴ２．１のベクター部分にクローニングした。
【０１４３】
第２の中間体ｐＰＴ２．３を作製し、それによりアデノウイルス３成分リーダー（ＴＰＬ）のリーダー１と２（Ｌ１及びＬ２）の間にイントロンとして埋め込まれているアデノウイルスＭＬＥを除去し、ＧＡＰＤＨイントロン１に置き換えた。３つのＰＣＲ産物を、ＳＬＩＣにより、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化したｐＰＴ２．１のベクター部分にクローニングした。第１のＰＣＲ産物は、ｈＣＭＶ  ＩＥ、ＧＡＰＤＨプロモーターを包含し、ＴＰＬの１番目のリーダー（Ｌ１）までの配列を含めた。これらは、フォワードプライマー５（配列番号１４）及びリバースプライマー９（５’−ＣＧＧ  ＴＡＣ  ＴＣＡ  ＣＣＣ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＣＴＣ−３’／／配列番号２１）を使用して増幅した。第２のＰＣＲ産物は、鋳型としてＧＡＰＤＨイントロン１を使用し、フォワードプライマー８（５’−ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＧＧＧ  ＴＧＡ  ＧＴＡ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＣＣ−３’／／配列番号２２）及びリバースプライマー１０（５’−ＣＣＧ  ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＧＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＡＧ−３’／／配列番号２３）を使用したＰＣＲにより増幅した。最後に、第３のＰＣＲ産物は、フォワードプライマー９（５’−ＣＣＴ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＧＣＧ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＡＡ  Ｃ−３’／／配列番号２４）及びリバースプライマー８（配列番号２０）を使用して、ＴＰＬのＬ２及びＬ３を増幅した。
【０１４４】
最終的に、ｐＰＴ２．４を中間構築物ｐＰＴ２．３から得た。プラスミドｐＰＴ２．４は、ｐＰＴ２．３に加えて、エクソン／イントロン境界を含む２番目のイントロンを有する。プラスミドｐＰＴ２．４には、ハムスターＧＡＰＤＨプロモーター、すなわち、配列番号１１のうちの次の部分が組み込まれている：
（ｉ）転写開始点を基準とした−５３２〜−２３ｂｐ：
ＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＡＣＴＴＴＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＴＴＧＣＡＴＡＡＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＧＴＣＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＣＡＣＡＣＡＣＧＣＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＡＡＣＣＣＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＣＣＡＴＴＴＴＡＴＣＧＧＧＧＣＧＧＣＡＡＣＴＴＴＴＡＧＧＴＣＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＣＴＴＡＧＴＡＣＡＣＡＣＴＣＴＴＣＧＴＣＣＴＴＡＡＧＴＣＣＡＴＡＧＴＣＴＧＴＡＴＴＣＣＣＴＣＧＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＡＴＣＡＣＣＧＧＧＴＣＡＣＣＴＣＣＣＣＡＧＣＧＡＡＧＣＡＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＴＣＴＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＣＣＣＡＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧＣＧＴＧＣＡＣＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＣＧＡＧＧＣＧＧＧＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＴＧＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＧＣＧＧＣＴＴＴＡＣＧＧＧＴＧＣＡＣＧＴＡＧＣＴＣＡＧＧＣＣＴＣＡＧＣＧＣＣＣＴＴＧＡＧＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＡＴＧＡＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＴＣＣＴＣＧＧＣＧＣＴＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＡＴＡ／／（配列番号５０）；
（ｉｉ）イントロン１（＋６４〜＋２９３）：
ＡＣＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＣＣＧＧＧＧＡＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＧＧＧＣＧＣＴＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＴＣＣＧＣＡＴＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＧＧＡＣＧＴＧＡＴＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＡＣＧＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣ／／（配列番号５１）；及び
（ｉｉｉ）イントロン２（＋３３４〜＋２１４５）：
ＧＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＧＣＴＧＧＧＣＴＡＧＧＧＴＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＴＣＣＣＧＣＴＣＣＧＴＣＧＣＧＴＡＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＣＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧＧＧＣＴＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＧＧＴＧＧＧＴＧＧＣＣＧＣＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＧＡＧＡＣＣＴＣＡＡＧＧＴＣＡＧＣＧＡＧＣＣＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＴＴＧＣＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＡＧＣＧＣＧＧＡＧＴＣＣＴＣＡＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣＡＣＧＣＡＴＧＣＴＴＡＧＧＣＴＣＣＡＴＣＣＣＧＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＡＣＴＴＴＣＧＣＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＡＣＣＡＣＧＴＧＣＣＡＧＡＣＧＧＧＡＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＧＣＣＣＴＣＴＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＧＧＴＧＧＣＡＣＣＧＧＧＣＣＧＴＧＣＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＡＧＣＧＣＡＴＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＣＴＴＴＡＧＧＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＴＴＧＣＡＡＡＣＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡＡＴＧＡＡＣＣＡＣＣＧＴＴＡＧＧＡＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＴＡＡＣＣＴＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＧＣＣＴＣＴＧＴＡＣＴＧＴＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＣＧＴＧＣＴＣＴＣＧＡＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＣＣＴＣＧＣＣＡＧＣＴＧＴＣＴＣＡＴＡＴＴＡＴＴＡＧＣＣＴＣＡＡＡＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＴＴＧＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＡＧＡＡＴＣＧＡＡＧＣＧＧＡＣＴＴＧＧＡＧＡＧＧＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＡＡＡＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＧＴＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＴＧＡＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＣＡＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＴＡＧＣＡＴＣＣＣＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＴＡＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＡＴＣＡＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＣＣＴＧＴＡＧＧＣＣＡＧＡＣＴＧＴＡＡＡＧＧＴＣＡＣＴＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＡＧＴＧＴＣＴＧＡＧＣＣＴＣＧＧＡＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡＣＣＣＴＡＡＴＣＴＧＡＧＧＴＴＡＴＡＴＴＴＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＴＴＴＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＡＣＡＣＡＣＡＴＣＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＴＴＡＧＣＴＡＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＧＴＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＧＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＴＴＡＧＧＧＧＴＴＧＧＡＡＡＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＴＴＴＣＴＣＡＧＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＴＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＴＧＧＧＣＣＧＡＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＡＴＴＣＴＧＡＣＣＴＴＴＡＡＣＣＴＴＧＣＣＣＴＴＴＧＡＧＣＴＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＡＧＴＧＣＡＣＧＡＧＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＡＧＣＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＡＧＡＡＣＡＡＡＣＴＴＣＣＣＡＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＡＧＴＧＡＡＴＧＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＡＣＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＴＣＴＴＧＧＡＧＡＣＴＴＧＡＡＡＴＧＡＣＴＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＴＣＡＣＣＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＡＧＴＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＴＴＡＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＴＡＡＡＡＧＣＣＣＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＡＧＡＣＣＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＴＣＣＴＡＡＧＧＡＴＡＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＡＴＡＴＴＴＧＧＧＣＣＣＴＧＣＴＴＣＴＡＡＧＣＡＴＴＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＡＴＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＴＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＴＴＴＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＡＡＡＴＡＣＴＡＡＴＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＣＴＣＣＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＣＴＧＴＣＴＴＧＣＡＣＡＧＴＡＧＧＣＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＴＧＧＧＣＴＣＴＣＴＡＣＡＧＣＴＡＴＧＧＧＡＣＡＡＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＴＴＴＴＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＣＴＧＡＣＴＡＴＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＧＴＴＣＴＣＴＧＡＣＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＧＣＣＴＣＡＧＡＴＴＴＧＧＣ／／（配列番号５２）。
【０１４５】
ｐＰＴ２．３を鋳型として使用して、プロモーター領域をフォワードプライマー５（配列番号１４）及びリバースプライマー１１（５’−ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＣＣＧ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＴＣ−３’／／配列番号２５）のプライマーで増幅した。ＧＡＰＤＨイントロン２の配列（配列番号５２）は、フォワードプライマー１０（５’−ＣＧＧ  ＡＡＡ  ＡＣＣ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＧＴＧ  ＧＣＴ  Ｇ−３’／／配列番号２６）及びリバースプライマー１２（５’−ＣＡＴ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＣＣ  ＴＡＧ  ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＣＴＡ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＧＡＧ  ＧＣＡ  ＡＧＡ  ＡＡ−３’／／配列番号２７）を用いて増幅した。これらのＰＣＲ産物を、ＳＬＩＣにより、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化したｐＰＴ２．１のベクター部分にクローニングした。
【０１４６】
ベクターｐＰＴ２、ｐＰＴ２．１及びｐＰＴ２．４を線状化し、ＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトした。細胞をピューロマイシンで選択し、回復した安定ＣＨＯ−Ｓ細胞プールを直ちに使用して、４ｍＬのバッチ産生を播種した。これらのバッチ産生の馴化培地（ＣＭ）を使用して、実施例１に記載のとおりにＦｏｒｔｅＢｉｏにより力価を決定した。
【０１４７】
結果：現在の発現ベクターの多くは、ＣＭＶ前初期エンハンサーに、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、例えばＧＡＰＤＨ、伸長因子α（ＥＦ１ａ）またはニワトリβアクチン（ＣＡＧ）が後続して構成されるハイブリッドプロモーターを含有する（例えば、Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ，ｈｉｇｈ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３（７−８）：３８２−３９１（２０１１）；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｇｅｎｅ．２７２（１−２）：１４９−１５６（２００１）参照）。本発明者らは、引き続き、ＣＭＶコアプロモーターをそのようなハイブリッドプロモーターに置き換えることによるＣＨＯ発現ベクターの改善に注力した。ＣＭＶコアプロモーターをハムスターハウスキーピングプロモーターに置き換えることに決めた。本発明者の目的のために、ハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子座を選択して、ハイブリッドプロモーターパートナーとしての実現可能性を調査した。
【０１４８】
ＣＭＶコアプロモーターをハムスターＧＡＰＤＨプロモーター及びイントロン１（ｐＰＴ２．１）に置き換えると、このベクター構造は、ＣＭＶコアプロモーターを含有するｐＰＴ２ベクターに匹敵するＣＨＯ−Ｓプールの発現レベルをもたらすことが示され、これは、ＣＭＶエンハンサーとともに構成されたハムスターＧＡＰＨＤプロモーターがＣＨＯ細胞において非常に有効であることを示唆している（図３）。
【０１４９】
ＥＦ１α及びニワトリβアクチンなどのハウスキーピングプロモーターは、完全なプロモーター配列内に大きなイントロンを保持している。これらのイントロンは、プロモーターの活性化をもたらす多数のエンハンサー結合部位を含有する。ＧＡＰＤＨプロモーター内の１番目のイントロンは極めて小さいことから、本発明者らは、より大きい２番目のハムスターＧＡＰＤＨイントロンのほうがより多くのエンハンサー結合部位を保持しているのではないかと仮定した。したがって、ハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子に由来する１番目及び２番目のイントロンを本発現ベクターｐＰＴ２．４に含めた。この付加により、ＧＡＰＤＨプロモーター及びイントロン１のみを含有するｐＰＴ２．１ベクターと比較して、発現レベルを４０％増加できた。したがって、ＥＦ１α及びニワトリβアクチンプロモーターと同様に、ＧＡＰＤＨプロモーター活性は、そのイントロンのうちの１つに存在する配列により向上する（図５）。
【０１５０】
イントロン１は発現レベルに対して直接的な影響を持たない可能性があると考えられ、また、２つのイントロンをｐＰＴ２．４に含めたことによる選択的スプライスイベントの可能性を検討するために、フォワードプライマー１１（５’−ＧＡＴ  ＧＴＧ  ＴＴＧ  ＡＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ−３’／／配列番号２８）及びリバースプライマー１３（５’−ＣＡＡ  ＣＣＧ  ＣＧＡ  ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  −３’／／配列番号２９）ならびにフォワードプライマー１２（５’−ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＣＴＣ  ＧＣＧ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＡＡ  ＣＴＣ−３’／／配列番号３０）及びリバース１２（配列番号２７）を使用して、ベクターｐＰＴ３を作製した。このベクターは、ＧＡＰＤＨイントロン１配列を除去し、ＴＰＬを構成する３つのリーダー配列を直接融合させたものである。これらの２つのＰＣＲ産物を、ＳＬＩＣにより、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化したｐＰＴ２．１のベクター部分にクローニングした。ベクター構造を図６に模式的に示す。
【０１５１】
ベクターｐＰＴ２、２．４、３をＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトし、細胞をピューロマイシンで選択し、回復した安定ＣＨＯ−Ｓ細胞プールを直ちに使用して、４ｍＬのバッチ産生を播種した。これらのバッチ産生の馴化培地（ＣＭ）を使用して、ＦｏｒｔｅＢｉｏにより力価を決定した。回復した安定ＣＨＯ−Ｓ細胞プールはまた、更に１ヶ月及び２ヶ月の期間、選択下に維持し、４ｍＬのバッチ産生を設定し、工程の最後に力価を測定した。ハムスターＧＡＰＤＨプロモーターを含有するｐＰＴベクターは全て、元のＣＭＶ含有ｐＰＴ２．０と匹敵する初期の力価をもたらすことができ、またはその力価を上回ることができた。しかしながら、全てのベクターにおいて、培養時間が長くなるにつれ、力価の急激な低下が認められ、ｐＰＴ２ベクターを発現するＣＨＯプールは、最も急速に減少し、培養２ヶ月以内に全ての発現が失われた（図７）。ｐＰＴ２．４からのイントロン１の除去は、発現力価にほとんど影響しなかった（図７  ｐＰＴ．３対ｐＰＴ２．４）。仮定したとおり、ＧＡＰＤＨプロモーターのイントロン１内の配列は、更なるエンハンサー活性をほとんど追加せず、その包含はあまり望ましくないものであった。
【０１５２】
実施例３：ハムスターＲｐｓ３及びＲｐｓ２ゲノム領域のクローニング
方法。対数的に増殖するＣＨＯ−Ｋ１細胞（５Ｅ６個）を採取し、これを使用して、ＣＨＯ−Ｋ１ゲノムＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔの使用により抽出した。ハムスターＲｐｓ３ゲノム領域を含有し、プロモーター及び最初の３つのエクソンを含む、約３．３Ｋｂ断片を増幅するためにプライマーを設計した（フォワードプライマー、５’−ＧＡＴ  ＴＡＧ  ＡＡＧ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＴＡＣ  ＡＡ−３’／／配列番号３３及びリバースプライマー、５’−ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  Ｃ−３’／／配列番号３４）。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ４−ＴＯＰＯ平滑キットを使用してＴＯＰＯクローニングした。ポジティブクローンをシークエンシング及び配列確認に供した。
【０１５３】
調節エレメントを含むハムスターＲｐｓ３ゲノム断片について確認されたＤＮＡ配列は、次のとおりである。
ＧＡＴＴＡＧＡＡＧＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＡＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＣＴＧＴＡＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＧＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧＡＣＡＴＧＴＴＣＣＡＣＡＣＣＴＴＡＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＴＴＣＴＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＴＡＡＣＣＡＡＡＡＴＧＣＣＴＣＴＴＣＡＡＡＴＣＧＣＣＣＡＡＴＣＣＴＴＧＡＡＡＴＴＴＣＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＡＡＡＴＴＣＴＡＣＴＴＴＣＴＴＣＴＡＴＧＴＣＣＡＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＴＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＴＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＣＴＧＴＴＴＧＡＣＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＴＡＡＴＣＴＡＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＴＴＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＧＣＴＴＴＡＣＴＴＴＴＡＴＴＴＧＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＧＡＡＴＴＧＧＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＣＡＣＴＧＴＡＧＴＡＣＡＡＧＴＴＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＧＡＴＴＧＣＴＧＧＴＧＴＡＧＡＣＡＴＣＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＡＴＧＴＣＣＴＧＴＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＴＡＣＡＣＴＴＴＣＴＧＡＴＡＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＡＡＧＣＣＣＴＧＣＴＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣＴＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＡＧＣＣＣＡＣＣＣＣＡＣＴＧＴＧＡＧＴＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＣＡＧＡＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＴＡＣＣＡＧＡＡＡＴＧＣＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＴＣＣＡＴＣＴＴＴＡＧＧＡＴＣＡＧＧＧＴＴＴＡＴＣＴＴＴＧＴＡＡＴＡＡＡＣＡＴＣＡＴＡＧＧＡＴＴＧＴＡＡＴＧＴＴＴＴＡＡＣＡＡＴＧＡＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＧＡＧＡＧＣＡＴＧＣＡＴＧＧＧＡＡＧＧＴＣＣＴＡＧＧＡＣＣＴＡＧＧＴＴＣＴＧＴＣＣＴＴＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＡＣＴＡＡＧＴＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＡＡＴＧＡＡＴＴＴＣＡＡＴＧＡＧＡＧＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＴＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＡＴＡＡＧＣＡＡＴＡＧＧＧＴＴＣＣＡＧＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡＣＴＣＴＧＴＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＴＴＡＴＧＴＣＴＧＴＧＧＴＴＴＧＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＴＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＧＴＣＧＧＧＧＧＣＴＣＡＴＧＴＡＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＴＴＣＧＡＡＣＴＣＧＣＴＡＴＧＴＡＧＴＣＧＡＧＡＡＴＧＡＣＣＴＴＧＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＴＣＴＡＧＴＧＣＴＧＡＡＡＴＣＡＣＴＧＧＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＧＧＴＧＧＧＧＴＡＣＡＴＴＧＡＴＴＧＴＴＴＴＴＣＡＧＡＣＣＡＧＡＡＴＴＡＧＡＴＴＴＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＣＣＴＡＣＡＣＴＡＣＧＧＧＴＴＧＣＴＡＧＧＴＴＡＣＡＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＴＣＧＣＣＴＴＴＡＴＡＡＡＣＴＣＡＡＡＡＣＴＴＣＡＴＴＴＣＣＣＡＴＧＡＧＣＴＣＴＴＧＣＡＡＧＴＧＴＣＧＣＣＧＴＴＧＣＧＴＧＧＣＧＴＴＧＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＣＣＧＣＧＣＣＣＴＴＴＡＴＡＣＡＣＡＣＴＴＣＣＧＣＣＣＧＣＧＡＧＣＴＡＣＴＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＴＣＧＧＴＧＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＡＡＧＣＡＴＴＴＣＧＧＡＣＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＡＣＴＣＧＣＧＧＣＧＣＧＴＴＴＴＡＡＡＧＣＴＧＣＣＡＣＧＧＴＧＡＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＧＡＴＣＣＣＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＧＣＴＴＣＣＧＣＧＧＧＧＣＧＣＧＧＡＴＧＧＡＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＧＣＴＡＧＣＴＣＡＧＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＡＣＧＣＣＴＣＡＧＴＴＣＴＧＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＣＡＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＣＣＴＴＴＡＣＴＡＧＡＣＧＣＴＴＴＴＧＡＧＣＧＴＣＴＣＴＣＧＧＴＣＧＣＣＡＧＡＡＴＴＡＧＴＡＡＣＣＣＴＡＴＧＧＣＡＴＡＧＣＴＴＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＡＡＴＣＣＧＧＣＧＴＣＴＴＴＧＧＴＡＡＧＴＧＡＧＧＴＴＴＡＧＣＡＧＴＧＣＣＧＣＣＴＣＡＧＴＴＧＡＡＡＧＧＣＴＧＣＣＧＡＣＴＡＴＴＧＧＣＧＴＧＣＴＣＣＣＴＣＧＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＧＴＣＣＣＧＧＡＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＧＴＧＴＧＴＧＡＡＧＡＴＣＡＴＣＡＧＧＴＴＴＡＧＡＡＡＴＡＧＡＴＧＧＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＴＡＧＡＴＣＡＴＡＡＡＧＣＴＧＴＴＧＴＣＣＡＣＡＴＧＣＴＧＴＴＴＧＧＧＴＴＡＧＡＴＴＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴＴＧＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＡＣＡＣＡＣＡＣＧＧＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＧＡＡＴＡＧＡＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＣＣＣＴＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＴＣＴＧＡＣＧＧＡＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＡＧＧＣＧＴＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＧＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＡＣＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡＣＴＴＣＣＴＡＡＡＧＡＴＧＡＣＣＴＡＧＡＧＧＣＡＴＴＴＧＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＧＴＴＧＣＴＧＣＡＴＴＣＣＣＧＡＡＧＧＧＴＣＡＴＴＧＧＧＧＴＣＧＡＡＣＴＧＧＧＴＡＡＧＣＣＴＣＴＡＣＣＣＴＴＴＣＴＴＡＡＣＴＣＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＧＧＣＴＧＡＴＧＧＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＧＴＴＴＣＴＣＡＣＴＣＧＧＧＡＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＧＣＴＡＣＴＣＧＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＧＴＴＡＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＧＡＡＡＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＡＧＣＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＡＡＴＡＴＧＴＴＴＧＡＣＴＧＧＣＴＡＴＴＡＣＣＴＧＴＡＡＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＴＡＴＴＧＡＧＴＴＧＣＴＧＴＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＡＡＣＡＡＣＣＡＡＣＣＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＴＴＣＴＣＴＧＣＡＴＴＧＣＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＧＴＣＴＧＧＣＣＴＡＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＧＡＧＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＴＧＴＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＣＣＴＴＡＡＴＡＣＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＧＴＧＡＴＡＡＡＴＧＧＴＡＴＧＴＧＡＧＧＴＧＴＴＧＣＡＡＡＴＡＡＡＴＴＧＴＡＡＴＴＴＴＣＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＣＡＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＧＴＣＧＴＣＧＡＡＴＣＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＣＴＧＣＧＧＴＡＧＴＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＧＧＣＡＧＣＧＴＡＧＡＧＧＴＧＡＧＴＴＴＣＣＣＴＧＧＴＴＴＡＴＡＣＣＡＧＧＧＧＣＡＧＴＡＧＡＣＴＧＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＴＴＧＣＴＴＣＴＧＴＡＧＡＡＣＧＧＴＡＡＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＧＴＧＧＧＴＴＧＡＣＡＣＴＴＴＣＡＧＡＧＴＴＡＴＡＴＡ／／配列番号３５。
【０１５４】
対数的に増殖するＣＨＯ−Ｋ１細胞を採取し、これを使用して、ＣＨＯ−Ｋ１ゲノムＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔの使用により抽出した。ハムスターＲｐｓ２ゲノム領域を含有し、プロモーター及び最初の２つのエクソンを含む、約３．２Ｋｂ断片を増幅するためにプライマーを設計した（フォワードプライマー、５’−ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＧＡＴ  ＣＧＴ  ＡＣＣ  Ｃ−３’／／配列番号３６及びリバースプライマー、５’−ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＣＧＣ  ＴＧＣ  ＣＡＡ  ＡＧＣ−３’／／配列番号３７）。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ４−ＴＯＰＯ平滑キットを使用してＴＯＰＯクローニングした。ポジティブクローンをシークエンシング及び配列確認に供した。
【０１５５】
調節エレメントを含むハムスターＲｐｓ２ゲノム断片について確認されたＤＮＡ配列は、次のとおりである。
ＣＡＡＡＧＡＧＧＴＴＧＡＧＡＴＣＧＴＡＣＣＣＡＣＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡＡＧＧＣＣＡＡＧＴＴＡＧＴＧＴＴＡＡＡＧＴＣＴＧＴＣＣＣＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡＴＡＣＣＡＴＣＡＡＧＡＴＡＡＣＴＣＣＡＴＡＡＴＣＡＴＴＣＴＧＴＡＧＧＧＡＧＧＣＡＧＧＣＴＡＣＡＴＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＡＣＣＴＧＴＧＧＧＧＧＴＴＧＡＧＴＣＣＣＣＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣＣＡＡＴＡＴＴＴＧＡＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＡＣＣＡＣＣＴＡＧＡＧＣＣＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＴＣＴＴＧＣＣＣＣＡＴＡＡＡＧＧＡＡＣＴＡＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＧＣＡＧＡＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＡＴＣＧＡＴＴＣＣＴＡＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＴＧＴＣＴＧＧＡＡＴＴＧＡＧＴＡＣＡＴＡＴＣＴＣＡＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＴＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＴＴＡＧＧＡＧＣＣＴＣＣＡＴＴＴＣＡＣＡＧＴＡＣＡＴＧＴＧＧＡＣＣＧＡＣＡＴＣＡＣＡＧＴＧＧＣＡＴＴＧＴＣＴＡＧＣＴＴＧＡＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＴＧＧＴＣＣＡＧＡＧＣＣＡＡＴＴＧＧＧＡＣＣＴＴＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＴＧＧＴＡＧＧＧＴＧＧＣＣＴＣＡＡＣＴＣＡＧＧＡＧＴＡＧＴＣＴＡＴＧＧＡＴＴＣＴＣＴＴＧＣＴＴＧＣＣＴＴＧＧＴＴＧＴＧＧＣＴＧＡＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＧＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＡＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＧＡＴＴＧＴＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＴＧＡＣＴＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＴＴＴＡＧＡＴＧＴＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＡＡＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＡＡＴＴＡＡＧＣＣＣＡＡＴＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＡＣＡＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＧＡＧＧＣＴＴＴＴＣＡＧＴＴＴＡＡＣＴＴＡＡＡＧＧＣＣＴＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＡＴＣＣＴＡＧＣＡＣＡＡＡＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＡＧＴＴＧＴＡＴＣＴＧＴＧＡＴＴＴＴＧＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＧＡＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＣＡＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＡＡＧＣＴＴＴＡＧＡＡＴＡＣＡＴＧＣＴＴＴＡＧＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＧＴＡＴＡＡＣＡＴＧＧＴＴＴＣＣＡＴＡＴＴＧＧＣＡＴＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＡＴＡＡＣＣＡＴＡＴＴＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＣＣＴＡＡＧＧＧＡＡＣＡＴＴＡＧＴＧＧＡＧＣＴＡＣＴＧＡＣＡＡＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＴＣＴＡＴＴＴＴＧＧＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＡＧＴＡＴＡＣＡＣＡＡＡＧＴＡＡＡＡＧＧＧＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＴＴＡＡＧＴＧＴＣＣＡＧＧＴＣＡＴＡＡＴＣＣＴＣＧＡＴＴＧＧＧＴＡＧＧＡＣＴＧＴＴＴＧＣＴＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＣＡＣＧＣＴＣＡＡＴＡＡＣＧＣＴＴＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＡＡＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＡＴＣＡＴＡＣＴＴＴＧＧＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＴＧＣＡＣＴＡＴＴＴＧＧＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＣＴＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＡＴＧＣＣＡＡＣＡＣＡＣＴＡＣＴＴＣＴＡＧＧＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴＧＡＡＡＴＡＧＡＣＣＧＧＧＣＡＴＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＣＡＣＣＴＴＴＡＴＴＣＣＴＡＣＣＡＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＴＴＴＧＣＡＡＴＣＡＧＣＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＧＣＣＣＴＡＧＴＴＧＣＡＡＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＡＧＴＣＡＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＧＡＡＣＧＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＡＡＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＡＧＡＡＧＴＴＡＡＧＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＣＣＴＴＣＣＧＧＡＧＧＴＣＣＴＧＡＧＴＴＣＡＡＴＴＣＣＡＧＧＣＡＡＣＣＴＴＡＴＧＧＴＧＧＣＴＣＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＡＴＧＡＧＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＣＴＣＴＴＣＴＧＧＣＡＴＧＣＡＡＣＡＴＡＣＡＴＧＴＴＧＧＴＡＧＣＡＣＡＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＴＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＴＣＴＣＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＡＣＣＡＣＡＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＴＣＡＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＣＣＡＡＡＣＡＣＴＧＡＡＡＣＣＡＡＴＧＧＧＡＧＣＴＣＣＴＧＴＡＧＣＡＴＣＣＴＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＧＡＴＧＡＴＣＡＣＴＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＡＡＴＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＣＡＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＣＡＴＧＡＧＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＧＧＣＣＴＡＡＣＣＣＡＧＡＴＧＡＡＡＣＴＴＧＴＣＡＣＡＴＡＣＡＣＡＴＴＴＣＴＡＣＣＴＧＴＧＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＴＧＧＡＡＧＧＣＣＧＡＡＧＣＡＧＧＡＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＣＣＡＴＧＴＣＣＴＣＡＣＴＧＡＡＴＡＣＡＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＣＡＣＴＣＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＴＴＡＧＧＧＴＴＣＡＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＡＣＴＣＣＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＴＣＡＧＡＴＡＴＣＴＴＴＴＴＡＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＴＣＡＧＡＣＡＡＣＧＴＧＧＴＧＣＡＴＡＴＡＣＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＧＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＧＣＡＣＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＴＡＧＣＡＧＧＧＴＧＧＡＡＴＣＴＡＡＣＴＴＡＣＡＧＧＧＧＴＣＴＧＧＣＴＧＣＧＴＣＧＧＣＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＡＣＣＴＧＴＴＧＧＧＡＣＴＡＡＣＡＣＡＣＣＣＧＣＣＡＣＧＡＡＴＡＣＧＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＴＡＣＡＣＧＧＴＡＧＧＴＴＡＴＧＴＴＡＡＡＣＣＡＣＴＴＴＡＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＴＣＧＧＡＡＣＣＣＴＧＣＣＡＴＴＴＴＣＧＴＧＧＧＣＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＧＧＡＡＣＣＴＧＴＧＧＡＴＡＡＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＡＧＧＡＴＣＧＡＴＧＣＣＡＣＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＡＧＧＣＧＧＴＣＧＧＧＡＡＴＧＴＡＧＧＧＧＣＣＴＧＧＧＴＴＴＣＡＣＣＣＴＣＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＧＣＡＧＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＧＣＴＧＡＧＧＣＣＣＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＧＡＡＴＣＴＣＡＣＣＴＣＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＡＡＡＴＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＧＡＡＣＧＣＣＣＡＴＴＴＡＣＣＧＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＣＧＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＧＡＧＧＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＣＴＧＡＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＣＧＡＧＣＡＣＴＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＡＧＧＣＧＣＣＡＣＣＣＧＧＡＣＴＴＴＴＡＴＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＡＧＴＣＧＧＣＧＴＡＣＧＴＣＧＣＧＧＣＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＣＧＡＴＡＴＧＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＣＡＣＧＣＡＧＣＣＡＡＴＴＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＴＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡＴＣＧＣＧＧＣＧＣＴＡＧＧＧＧＣＡＣＴＡＴＡＡＡＧＴＣＴＧＣＣＴＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＣＧＣＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＧＴＧＡＧＴＣＧＴＴＧＴＴＣＣＴＣＡＧＴＣＣＣＧＧＴＧＴＣＧＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＧＴＧＧＡＣＡＴＣＣＧＧＡＣＧＧＡＧＡＣＧＣＣＣＴＴＧＧＧＣＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＣＴＡＴＣＧＧＡＡＴＣＣＣＡＡＧＣＧＡＣＣＧＣＡＡＡＧＣＣＡＡＴＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＡＧＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＡＧＣＡＡＡＴＧＧＣＧＧＡＴＧＡＣＧＣＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＡＧＧＡＣＣＣＧＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＡＴＴＡＧＧＡＧＧＴＣＧＣＧＧＡＧＧＣＴＴＣＣＧＣＧＧＡＧＧＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＣＴＣＡ／／配列番号３８。
【０１５６】
ｐＰＴ４及びｐＰＴ４．１ベクターの構築。ハムスターＲｐｓ２ゲノムエレメントをプラス（ｐＰＴ４）またはマイナス（ｐＰＴ４．１）のいずれかの方向でｐＰＴ３に導入した（図８）。プラス方向の場合、Ｒｐｓ２は、フォワードプライマー５’−ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＡＧＡ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＡＧＧ  ＴＴＧ  ＡＧＡ  ＴＣＧ  ＴＡＣ  Ｃ−３’／／配列番号３９及びリバースプライマー５’−ＣＧＴ  ＡＡＧ  ＴＴＡ  ＴＧＴ  ＡＡＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＣＧＣ  ＴＧＣ  ＣＡＡ  ＡＧＣ−３’／／配列番号４０を用いて増幅した。マイナス方向の場合、フォワードプライマー５’−ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＡＧＡ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＡＧＡ  ＣＣＧ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  Ｃ−３’／／配列番号４１及びリバースプライマー５’−ＣＧＴ  ＡＡＧ  ＴＴＡ  ＴＧＴ  ＡＡＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＧＡＴ  ＣＧＴ  ＡＣＣ−３’／／配列番号４２を使用した。これらのＰＣＲ産物をｐＰＴ３に移し入れるために、アンピシリン耐性遺伝子及び複製起点Ｏｒｉの部分の置き換えを要したことから、制限酵素ＰｖｕＩ及びＢａｍＨＩを使用した。これは、フォワードプライマー５’−ＣＡＡ  ＣＴＴ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＧＡＣ  ＡＡＣ  ＧＡＴ  ＣＧ−３’／／配列番号４３及びリバースプライマー５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＴＣ  ＴＡＡ  ＴＴＣ  ＣＧＧ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＴＡＴ  ＡＧ−３’／／配列番号４４を使用したＰＣＲ産物により提供された。ＳＬＩＣ法を使用して全ての断片を組み立てた。
【０１５７】
ハムスターＲｐｓ３ゲノムエレメントをプラス（ｐＰＴ４．２）またはマイナス（ｐＰＴ４．３）のいずれかの方向で、ｐＰＴ３に導入した。プラス方向の場合、Ｒｐｓ３は、フォワードプライマー５’−ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＡＧＡ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＡ  ＴＴＡ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＣＡＡ  Ａ  −３’／／配列番号４５及びリバースプライマー５’−ＣＧＴ  ＡＡＧ  ＴＴＡ  ＴＧＴ  ＡＡＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  Ｃ−３’／／配列番号４６を使用して増幅した。マイナス方向の場合、フォワードプライマー５’−ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＡＧＡ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＴＡ  ＴＡＴ  ＡＡＣ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＡＧＴ  ＧＴＣ  ＡＡＣ  ＣＣＡ−３’／／配列番号４７及びリバースプライマー５’−ＣＧＴ  ＡＡＧ  ＴＴＡ  ＴＧＴ  ＡＡＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＡＴ  ＴＡＧ  ＡＡＧ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＴＡＣ  ＡＡＡ−３’／／配列番号４８を使用した。次いで、これらの断片をＲｐｓ２含有構築物に使用した方法と同じ方法で組み立てた。
【０１５８】
適切な対照とともに、新しいｐＰＴ４．ｘベクター（図８）をＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトし、ピューロマイシンで選択した。プールが回復したら、プールの最初の回復後、ならびに回復から２週間、１ヶ月及び２ヶ月後に、４ｍＬのバッチ産生を設定した。各バッチ産生について、試料を収集し、これらのバッチ産生の馴化培地（ＣＭ）を使用して、実施例２と同様にＦｏｒｔｅＢｉｏにより力価を決定した。
【０１５９】
結果：ＣＨＯプールにおける発現安定性を増大させるために、エピジェネティック機構によるサイレンシングを妨げる調節機能を有し得るハムスターゲノムエレメントを探索し、本ＣＨＯ株にて高発現レベルをもたらすハムスター遺伝子に関連する調節配列を見出した。ＣＨＯ発現遺伝子から得たＲＮＡ配列データの精査により、Ｒｓｐ２及びＲｓｐ３遺伝子がこの基準に適合することがわかった。ヒトＲｓｐ２は、ＣＭＶプロモーターを含有するベクターに安定化特性を付与することがこれまでに示されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．ＣｐＧ  Ｉｓｌａｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ＨＮＲＡＰ２Ｂ１／ＣＢＸ３  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｏｃｕｓ  ｒｅｄｕｃｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：１７（２００５））。図９に示すように、ハムスターＲｐｓ２及びＲｐｓ３遺伝子配列を含めると、ＣＨＯ−Ｓトランスフェクトプールに安定性が２ヶ月の期間にわたって付与された。ＧＡＰＤＨプロモーターは、実験全体にわたって高発現レベルを誘発し、外因性遺伝子の力価及び安定性の両方について、ｐＰＴ２ベクターよりも優れていた。Ｒｐｓエレメントを含有しないｐＰＴ２系ベクターはまた、２ヶ月の間に発現を失った。一方、ハムスターＲｐｓ２またはＲｐｓ３エレメントがプラス方向である場合、より大きな安定性がベクターに付与されたのに対し、ハムスターＲｐｓ２またはＲｐｓ３エレメントをマイナス方向で発現ベクターに加えた場合、その発現プロファイルは、エレメントを全く含まないベクターの発現プロファイルと同様であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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