(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非解離形態の有機酸の存在下で、ペントースを発酵させるための改善された能力を有する酵母菌株を選択する方法であって、
前記ペントースを発酵させることができる少なくとも１つの酵母菌株を、以下の２つの培地中で連続的に培養し：
前記ペントースを唯一の炭素源として含み、前記有機酸を非解離形態で含む第１成長培地；
非解離形態の前記有機酸を含まず、唯一の炭素源としての別の炭素源を含む第２成長培地；
濃度が上昇する非解離形態の有機酸の存在下で、少なくとも前記２つの成長培地における連続培養を少なくとも２回繰り返すことを特徴とする選択方法。
【請求項２】
前記有機酸が酢酸であることを特徴とする、請求項１に記載の酵母菌株の選択方法。
【請求項３】
前記ペントースがキシロースであることを特徴とする、請求項１または２に記載の酵母菌株の選択方法。
【請求項４】
前記別の炭素源がグルコースであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母菌株の選択方法。
【請求項５】
第１成長培地と第２成長培地中で前記菌株の連続培養を２回より多く１０回未満繰り返すことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵母菌株の選択方法。
【請求項６】
前記２回より多く１０回未満が８回であることを特徴とする、請求項５に記載の酵母菌株の選択方法。
【請求項７】
第１成長培地と第２成長培地中で培養した後、唯一の炭素源として、厳しい呼吸の炭素供給源を含有する最小培地である、第３成長培地中で好気的に培養をすることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵母菌株の選択方法。
【請求項８】
前記厳しい呼吸の炭素供給源がグリセロールである、請求項７に記載の酵母菌株の選択方法。
【請求項９】
第１、第２及び第３成長培地中で前記菌株の連続培養を２回より多く１０回未満繰り返すことを特徴とする請求項７または８に記載の酵母菌株の選択方法。
【請求項１０】
前記２回より多く１０回未満が８回であることを特徴とする、請求項９に記載の酵母菌株の選択方法。
【請求項１１】
第１成長培地中の非解離形態の有機酸が１．３〜２．６ｇ／Ｌの濃度で含まれることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵母菌株の選択方法。
【請求項１２】
前記有機酸が酢酸である、請求項１１に記載の酵母菌株の選択方法。
【請求項１３】
前記ペントースを発酵させることができる酵母菌株が、Ｉ−４５３８、Ｉ−４７４９、Ｉ−４８２９およびＩ−４９６６からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酵母菌株の選択方法。
【請求項１４】
前記ペントースを発酵させることができる酵母菌株が、Ｉ−４８２９および／またはＩ−４９６６から選択されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酵母菌株の選択方法。
【請求項１５】
２０１５年１月２９日に番号Ｉ−４９５３でＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ，  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，  ２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５）に寄託されたことを特徴とする酵母菌株。
【請求項１６】
請求項１５に記載の株の培養によって得られる酵母。
【請求項１７】
物質の発酵のための、および／またはエタノールの生成のための、請求項１５に記載の株または請求項１６に記載の酵母の使用。
【請求項１８】
前記物質がキシロースを含む、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
以下の工程：
請求項１５に記載の株または請求項１６に記載の酵母と、キシロースを含む物質または培地とのインキュベーションの工程；
嫌気性または半嫌気性条件下での発酵の工程；
１つまたは複数の発酵生成物またはエタノールの回収の工程；
を含む、発酵生成物またはエタノールの製造方法。
【請求項２０】
前記物質または培地がグルコースも含むことを特徴とする請求項１９に記載の発酵生成物またはエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペントース、特にキシロースを発酵させることができる酵母菌株に関し、非解離形態の酢酸を含む前記発酵の阻害剤の存在の場合も含まれる。
【０００２】
より具体的には、本発明は、リグノセルロース加水分解物に存在するこのタイプの糖を代謝する能力において非常に有効な改良された菌株を選択する方法を提供する。  
【背景技術】
【０００３】
リグノセルロースまたは植物バイオマスは、主に農業および農業産業活動に由来し、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンである3つの主な画分（main fractions）からなる複雑な基質である。それは例えば、バイオ燃料としての使用などを考慮して、需要が増加し続けているエタノールの製造に有用な、潜在的にリサイクル可能な廃棄物のことである。
【０００４】
リグノセルロースバイオマスからエタノールを製造する方法は、加水分解によってセルロースおよびヘミセルロース画分中に存在する糖を可能な限り多く回収すること、および次いでこれを発酵によってエタノールに変換することからなる。
【０００５】
C6糖（ヘキソース）およびC5糖（ペントース）の両方を含むこのバイオマスに存在する糖の発酵に関しては、酵母による嫌気性発酵、特にグルコースを発酵させる能力が良好に制御および開発されているSaccharomyces cerevisiaeを用いる発酵が好ましい。
【０００６】
しかしながら、ペントース、特にリグノセルロースバイオマスに含まれる全糖の25〜40％を占めることがありうるキシロースの発酵には十分注意が払われている。したがって、グルコースを発酵させることができる酵母菌株は、ペントースを代謝することもできるように改変された。
【０００７】
例として、国際公開第WO2010/000464号文献は、キシロースを酵母によって代謝され得るキシルロースに変換するキシロースイソメラーゼ（XI）をコードする細菌遺伝子のため、ペントースを発酵させることができる酵母菌株を得ることを開示している。
【０００８】
代替として、キシリトールを生成するキシロースレダクターゼ（XRまたはXYL1）およびキシルロースをも産生することがきるキシリトールデヒドロゲナーゼ（XDHまたはXYL2）を含む真核生物経路が注意されるべきである。
【０００９】
したがって、国際公開第WO2012 / 072793号は、キシロースイソメラーゼ、およびキシロースイソメラーゼの阻害剤であることが証明されているキシリトールを除去するためのキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする外因性遺伝子を組み合わせた改良された酵母菌株を記載している。そのような株、特に番号I-4538で2011年10月5日にCNCM（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes）に寄託された菌株は収率が改善されており、従ってエタノール生産のための工業的有用性が実証されている。
【００１０】
他の重大な問題は、リグノセルロース加水分解物においては、発酵阻害剤、その中でもフルアルデヒド（フルフラールおよびHMF）、フェノール化合物および有機酸（酢酸、レブリン酸およびギ酸）を示していた。5g/kg（初期培地）を超えており、10g/kgに達することがありうる高濃度の酢酸の存在は、ヘミセルロース分子に共有結合したアセチル基の濃度に内因的に関連している。
【００１１】
従来の研究では、発酵マスト（fermentation musts）中の酢酸の存在に対する菌株の耐性の改善が行われている。したがって、文献WO 2011/080411は、グルコース上の酢酸に対する耐性が改善された酵母菌株を得ることを報告した。
【００１２】
しかしながら、酢酸もキシロース発酵の阻害剤である。この阻害は、キシロース消費動力学の低下(Bellisimi et al., FEMS Yeast Res., 2009. 9:358-364)によって特徴付けられるが、グルコースでは、この阻害は、発酵の開始中の遅延として見られ、その後の動力学は変わらない。培地中のグルコースとキシロースの両方の存在下では、酵母菌株は、カタボライト抑制のために最初にグルコースを発酵させることに注意すべきである。
【００１３】
したがって、文献WO 2013/178915およびWO 2013/178918は、ペントース、特にキシロースを代謝することができ、かつ発酵阻害剤、特に酢酸に耐性を示す酵母菌株を得るための方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】WO  2010/000464
【特許文献２】WO  2012/072793
【特許文献３】WO  2011/080411
【特許文献４】WO 2013/178915
【特許文献５】WO 2013/178918
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Bellisimi et al., FEMS Yeast Res., 2009. 9:358-364
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
しかしながら、ヘキソースおよびペントースを発酵させることができる新しい酵母菌株であって、特に、キシロースなどのペントースの発酵動力学に対し、発酵阻害剤、特に酢酸のさらなる低減した影響を有する新しい酵母菌株を得るための明確な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、酵母菌株のグルコース代謝だけでなく、キシロースを含むペントースの発酵にも関与する発酵阻害剤、特に酢酸に対する耐性を有する新しい酵母菌株を単離する可能性を発明者により示していることに基づく。
【００１８】
このようにして、本発明において、有機酸型発酵阻害剤、特に酢酸の存在下でペントース、特にキシロースの改良された発酵を示す酵母菌株を選択するための方法が開発された。 このような方法を用いて、高い酢酸濃度の存在を含めて、キシロース消費速度の観点から、キシロース発酵動力学が改善された菌株を単離することが可能であった。
【００１９】
この問題を研究する先行研究には、以下の点について注意が必要である：
【００２０】
従って、文献(Wright et al., FEMS Yeast Res., 2011. 11: 299-306)は、キシロース上における酢酸塩に対する株の耐性の改善を記載している。この研究は、キシロース上の酢酸に対する耐性現象が誘導可能なプロセスであり得ることを示すことを目的とする。さらに、提示された結果は非常に混在しているように見える：
【００２１】
SBR法（Sing/Le Batch Repeat）またはキシロース制限ケモスタット（a xylose-limited chemostat）で選択された培養物は、出発菌株の結果と比較したところ、最終キシロース濃度のわずかな減少しか示さず、その結果、最初の3日間のエタノール濃度のわずかな増加を示す。
【００２２】
さらに、酢酸濃度の関数としての特定のキシロース消費速度のピークについては、出発菌株について観察された値に非常に近い値である2.5g/Lでピークに達する。
【００２３】
さらに、単離された株では、出発菌株で観察されたものに匹敵するほどに特定のキシロース消費速度が次に低下することが観察される。導き出される結論によれば、これらの結果は、SPR培養における長期間の選択が酢酸耐性を有する安定した表現型を導くことができないことを示すであろう。
【００２４】
別の文献(Sanda et al., Bioresource Technology, 2011. 102:7917-7924)は、グルコースおよびキシロースを含有するリグノセルロース加水分解物に対する定向進化（directed evolution）の実施を記載した。しかしながら、最も速く成長する株を選択するのに役立つSBR技術は、グルコース上で最も速く成長する株の選択を導く。
【００２５】
先行技術の失敗にもかかわらず、本発明者らは、酢酸存在下でのキシロース発酵における所望の性質を有する酵母菌株に到達するために役立つ新しい選択方法を開発した。
【００２６】
第1態様によれば、本発明は、非解離形態の有機酸の存在下でペントースを発酵させる能力が向上した酵母菌株を選択する方法に関する。
【００２７】
したがって、本発明による方法は、単離された菌株または菌株の混合物から、ペントースおよび前記非解離形態の有機酸を含む培地上での成長の点で選択的な利点を有する株を選択するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図1は、pH = 5で50g/Lキシロースおよび5g/L酢酸を含有する培地中の種々の株についての発酵時間の関数としての質量損失（g/kgで表される）の進行を示す。
【図２】図2は、50g/Lキシロースを含む培地中における様々な株の発酵中の酢酸濃度（pH5でg/Lで表される）の質量損失速度に対する影響（キシロースからのCO2産生）を示す。
【図３】55g/Lグルコース、45g/Lキシロースおよび5g/L酢酸（pH5で）を含む培地中の種々の株についての発酵時間の関数としての質量損失（g/kgで表される）の進行を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本出願の主題である方法を、単離された株、特に以下の株で実施することができる：
・2013年5月16日に番号I-4749でCNCMに寄託された株;
・2013年12月12日に番号I-4829でCNCMに寄託された株;
・2015年4月9日に番号I-4966でCNCMに寄託された株。
【００３０】
このシナリオでは、いずれかの理論に拘束されることを望まないが、以下に定義される成長培地中で連続培養によって及ぼされる選択圧力は、株が非解離型の有機酸の存在下でペントースを発酵する能力を増加させるために必要な表現型形質を獲得することを可能とする。
【００３１】
別の態様によれば、それは、本発明による方法を受ける酵母菌株の混合物である。 このシナリオでは、非解離形態の有機酸の存在下でペントースを発酵させるための改善された能力を開発するために、少なくとも1つの菌株が上記のような選択圧（selection pressure）を受ける。あるいは、株の混合物は、非解離形態の有機酸の存在下でペントースを発酵させる能力が改善された株を既に含み、本発明による方法は、より速い成長のために、この株の混合物濃度を富化することに役立ち、したがって該株を単離または選択する。
【００３２】
特定の実施形態によれば、本発明による異なる成長培地中におけるそれらの培養の前に、酵母菌株または菌株混合物は、所望の表現型の出現を高めることができる突然変異誘発の前の段階を経る。慣用的に、この突然変異誘発は、化学物質または放射線、特に紫外（UV）放射線への暴露によって達成することができる。 有利には、「穏やかな」条件、例えば100~500J/cm2、例えば300J/cm2の254nmにおけるUV放射線への暴露を選択する。
【００３３】
本発明の方法によれば、酵母菌株または菌株混合物は、少なくとも2つの成長培地中で連続的に培養される。本出願において、「成長培地」および「培養培地」という表現は、存在する酵母の生存、さらに成長にさえ必要な成分を含む培地を指定するために区別せず使用される。
【００３４】
第1成長培地は、唯一の炭素源として、改善された発酵能力が求められるペントースを含むことを特徴とする。有利には、キシロースまたはアラビノース、さらに有利にはキシロースを含む。有利には、この第1培地は液体培地である。
【００３５】
有利には、成長培地のペントース濃度は、それが唯一の炭素源として使用される場合に一般的に実施されるものであり、液体培地の場合には5〜100g/L（固体培地の場合には5〜100g/kg）、有利には25〜90g/L、例えば50g/Lで含まれる。特定の実施形態によれば、成長培地は50g/Lのキシロースを含有する。
【００３６】
前記培地はまた、前記ペントースの発酵を阻害することができる有機酸も含む。これは、有利には、酢酸またはギ酸、さらにより有利には酢酸を含む。
【００３７】
このような酸の非解離型または非イオン化型のみが阻害能力を有することが知られることについて、注意すべきである。本発明において、カルボン酸の「非イオン化または非解離形態」は、ここでそのプロトン化形態として理解される。実際には、これらの有機酸の形態は、それらが組み込まれる培地のpHに依存する。酸のpKaより大きいpHでは、酸は大部分が解離した形態すなわちCOO-イオンで見られる。対照的に、より低いpHでは、大部分の形態は非解離すなわち非イオン化形態（COOH）である。本発明の残りの部分では、下記のことが特に量または濃度に関連し、特定される：存在する有機酸の非解離形態のみが考慮されるかどうか、または培地に添加される酢酸に対し、前記培地のpHに応じて解離した形態および解離していない形態を包含する参照が行われるかどうか。
【００３８】
有利には、成長培地の非解離形の有機酸の濃度は、有利には、酢酸として液体培地中で0.5〜5g/L（固体培地中で0.5〜5g/kgに相当する）、有利には1.3〜2.6g/Lの間に含まれる。実際に、一例として、この最終範囲は、3〜6g/Lの間に含まれるpH5の成長培地に添加された酢酸の濃度に対応する。
【００３９】
本発明によれば、この第1成長培地は、少なくとも2つまたは3つの培地を含む成長サイクルで実施され、前記サイクルは少なくとも2回繰り返される。本発明に適合する一つの方法では、少なくとも2つの成長サイクルの間に、非解離形態の有機酸の濃度が増加する。
【００４０】
換言すれば、本発明に関連して定義された少なくとも2つの成長培地における連続培養は、非解離形態の有機酸、有利には酢酸の上昇濃度の存在下で2回繰り返される。したがって、nサイクル（nは2以上）の存在下で、少なくとも2つの濃度が実施され、第1濃度は第2濃度よりも低い。
【００４１】
一例として、酢酸の存在下での8サイクルの培養のために、第1成長培地中の濃度を増加させる計画は、以下のとおりであり得る：
・ 第1サイクル：3g/L（または解離した形態の酢酸1.3g/L）である、pH5の培地に添加された酢酸濃度;
・第2サイクル：3g/L（または非解離形態の酢酸1.3g/L）である、pH5の培地に添加された酢酸濃度。
・ 第3サイクル：3g/L（または非解離形態の酢酸1.3g/L）である、pH5の培地に添加された酢酸濃度。
・第4サイクル：4g/L（または非解離形態の酢酸1.7g/L）である、pH5の培地に酢酸濃度を添加する。
・第5サイクル：4g/L（または非解離形態の酢酸1.7g/L）である、pH5の培地に酢酸濃度を添加する。
・ 第6サイクル：4g/L（または非解離形態の酢酸1.7g/L）である、pH5の培地に添加された酢酸濃度。
・第7サイクル：5g/L（または解離していない形態の酢酸2.15g/L）である、pH5の培地に添加された酢酸濃度。
・ 第8サイクル：6g/L（または非解離形態の酢酸2.6g/L）である、pH5の培地に添加された酢酸濃度。
【００４２】
これらの2つの成分以外に、この成長培地は、有利には、酵母の成長に適した完全な合成培地であり、塩、緩衝液、酵母エキスまたは酵母が代謝することができる他の窒素源、ビタミンなどの慣用的な成分を含むことができる。本発明において、「合成培地」は、その化学組成が既知である培地であると理解される。
【００４３】
特定の実施形態によれば、唯一の炭素源としてのペントースおよび有機酸以外に、この培地は、
・ 酵母抽出物、有利には5g/Lの濃度で;
・ リン酸二アンモニウム、有利には4.7g/Lの濃度で;
・ クエン酸、有利には11.4g/Lの濃度で;
・クエン酸三ナトリウム、有利には13.5g/Lの濃度で;
・ ZnSO4、有利には21.2mg/Lの濃度で;
・ MgSO4・7H2O、有利には1g/Lの濃度で;
・ チアミン、有利には18.24mg/Lの濃度で;
・ ピリドキシン、有利には5.28mg/Lの濃度で;
・ ビオチン、有利には1.76g/Lの濃度で;
・ パントテン酸塩、有利には3.8mg/Lの濃度で;
・ ナイアシン、有利には20mg/Lの濃度で;
・ メソ-イノシトール、有利には50mg/Lの濃度で;
・ リボフラビン、有利には1mg/Lの濃度で;
・パラ-アミノベンゾエート、有利には1.2mg/Lの濃度で;
・ ツイーン80、有利には1g/Lの濃度で;
を含むことができる。
【００４４】
この成長培地の特定の組成に加えて、酵母菌株または株混合物の培養は、有利には、酵母、特にサッカロミセス（Saccharomyces）タイプの成長およびその発酵活性に好適な標準条件下で行われ、具体的には：
・有利には4〜6、さらには4.5〜5.5、さらにより有利には5である酸性pHで;
・28〜37℃、さらには30〜35℃に含まれ、有利には32℃の温度で；
・穏やかに、例えば100rpmで撹拌しながら；
・酸素供給が低下した条件下で（限られたO2の下で）行われる。実際には、生成されたCO2の排出を可能にしながら、培地中のO2の供給を減少させるキャップを用いて栓をしたフラスコ内で培養を行うことができる。
【００４５】
一般に、培養は、加水分解性糖質炭素源、この場合はペントースが完全に消費されたときに停止される。 実際には、および有利には、培養物は少なくとも24時間、さらには数日間、有利には7日間放置される。
【００４６】
本発明による方法の第2ステップは、第1成長培地で培養された酵母を、有利には液体である第2成長培地に移すことからなる。特徴的には、これは、異なる炭素源の存在および非解離形態の有機酸、有利には酢酸の非存在により第1培養培地とは区別される。
【００４７】
実際には、この培地は酵母の成長に有利であり、安定な突然変異の獲得の利益のためにリフティング適応現象（lifting adaptation phenomena）を可能にする。したがって、本発明による方法のこのステップは、適応解除フェーズ（de-adaptation phase）とみなされる。
【００４８】
この成長培地は、炭素源のみとして、具体的にはペントース、特にキシロースである第1培地の炭素源と異なる炭素源を含むことを特徴とする。特定の実施形態によれば、第2培養培地からの炭素源は加水分解性糖質炭素源、有利にはヘキソース、さらにより有利にはグルコースである。有利には、この第2炭素源が、有利にはグルコースは、5〜50g/L、有利には5〜20g/L、例えば20g/L濃度で含まれる。
【００４９】
さらに、有利には、それは豊富な合成成長培地（a rich synthetic growth medium）を含み、例えば：
・酵母抽出物、有利には10g/Lの濃度である;
・ペプトン、有利には10g/Lの濃度である。
【００５０】
有利に、それは、従って、任意の栄養要求性に関連する任意の制限なしに、酵母の全ての株が成長することを可能にする栄養豊富な培地に関連することである。
【００５１】
この第2成長培地の特定の組成に加えて、酵母菌株または菌株混合物の培養は、有利には、酵母の成長に好都合な標準的な条件下で行われ、具体的には：
・ 有利には4〜6の間、例えば5である酸性で安定なpH;
・ 28〜37℃、さらには30〜35℃に含まれ、有利には30℃の温度で;
・ 中程度の撹拌下、例えば150rpmで；
・ 酸素の存在下で、具体的に好気下で行われる。実際には、培養は、生成されたCO2の排出を可能にしながら培地中にO2の供給を可能にする多孔性キャップによってバッフル付きフラスコ内で行うことができる。
【００５２】
ここでもまた、加水分解性糖質炭素源、有利にはグルコースが完全に消費されたときに、培養は停止される。実際には、第2培地における成長は、好気性、炭素源としてのグルコースおよび酢酸の不在のため、第1培地における成長よりも速いことに留意すべきである。したがって、有利には、培養は数時間、有利には24時間にわたって行われる。
【００５３】
本発明によれば、2つの成長培地中における連続的な、かつ上記の条件下での酵母の培養は、、連続的に1つのサイクルを構成する。
【００５４】
具体的な実施形態によれば、本発明による方法のサイクルは、呼吸が可能な細胞、特に機能的ミトコンドリアを有する細胞を選択することを目的とする第3の成長培地、有利には液体への酵母の通過をさらに含む。実際には、この工程は、この方法で各サイクルまたは少なくとも1回実施することができ、呼吸不全表現型が工業的酵母の製造方法において不利になり得る「小柄子」（petites）の出現を克服するのに役立つ。
【００５５】
有利には、この第3の培地は、唯一の炭素源として、機能的なミトコンドリアを保持する細胞によってのみ使用され得る炭素を含有する乏しい培地または最小培地である。この場合、厳格な呼吸炭素（strict respiratory carbon）の供給源、すなわち、ミトコンドリアの酸化を系統的に関与し、かつエタノールを産生しない炭素源を意味する。それは、有利にはグリセロールまたは場合によってはエタノールであり得る。換言すれば、このような培地は発酵可能な糖がない。有利には、成長培地のグリセロール濃度は、唯一の炭素源として使用されるときに一般に使用されるものであり、具体的には5~50g/L、有利には10~50g/L、例えば10g/Lを含むことで、次のサイクルの第1培養培地を接種するのに十分なバイオマスを得る。
【００５６】
定義上、最小培地は、炭素源以外の窒素源、カリウム源、リン源、硫黄源、マグネシウム源、カルシウム源、鉄源、微量元素源および水を含有する 。
【００５７】
この第3の培養の調製に用いることができる培地は、下記：
・DIFCO（登録商標）酵母窒素塩基などの塩基、有利には3.4g/Lであるもの；および
・場合により硫酸アンモニウム、有利には5g/Lの濃度で存在するもの；
を含むことができる。
【００５８】
この第3の成長培地の特定の組成を越えて、酵母菌株または菌株混合物の培養は、有利には、酵母の成長に好都合な標準的な条件下で行われ、具体的には：
- 有利には4〜6、さらには4.5〜5.5、例えば5である酸性pHで;
- 28〜37℃、さらには30〜35℃に含まれ、有利には30℃の温度で；
- 培地撹拌下、例えば150rpmで；
- 好気で行われる。実際には、培養は、培地中にO2の供給を可能にする多孔質キャップによって栓をされたバッフル付きフラスコ内で行われることができる。
【００５９】
再び、炭素源、有利にはグリセロールが完全に消費されたときに培養を停止する。実際には、この培地における成長は、窒素のミネラル源のために、第2培地よりも先天的に遅いことに留意されたい。したがって、有利には、培養は数時間、有利には48時間にわたって行われる。
【００６０】
既に述べたように、本発明の方法は、上記の2つまたは3つの成長培地中で連続的に酵母菌株の培養をサイクルの形で反復することを特徴とする。
【００６１】
サイクル数は、所望の特性、特に有機酸阻害剤の存在下でペントースを発酵させるための改善された能力を有する株の選択を増強するように選択される一方で、酵母における不健全さ（unsoundnesses）の出現を避けるためのサイクル数も制限する。
【００６２】
従って、有利には、サイクル数は、少なくとも2であり、有利には10以下、例えば8である。言い換えれば、定義された少なくとも2回の成長培地における連続培養は、少なくとも2回、有利には2回を超えて10回未満、例えば8回繰り返す。
【００６３】
本発明による方法の有利な実施形態によれば、非解離形態の有機酸、有利には酢酸の上昇濃度の存在下で、少なくとも2つの成長培地における連続培養を少なくとも2回繰り返す。 換言すれば、本発明による方法は、少なくとも2つの別個の濃度の存在下で行われ、第1濃度は第2濃度より低い。この濃度を、もしかすると閾値によって徐々に増加させることができる。したがって、有利には、酵母菌株の適応のために、少なくとも最初の2サイクルは一定の濃度で行われる。
【００６４】
別の有利な面によれば、第1成長培地中の非解離形態の有機酸、有利には酢酸は、1.3〜2.6g/Lの濃度で含まれる。
【００６５】
所望のサイクル数に達し、分化したクローンを得るために、培養物を、有利には、固体培地上、さらに有利には、YPG培地などの酵母の成長に有利な合成培地上に広げる。播種の程度は、典型的には1プレートあたり2000細胞であり、成長は30℃で約72時間行われる。
【００６６】
特定の実施形態では、このようにして単離されたクローンの性能が試験される。
【００６７】
この目的のために、液体培地、有利には、YPG培地などの酵母の成長に適した合成培地中の前培養物（pre-cultures）を調製することができる。
【００６８】
有利には、これらの前培養物は、選択培地、具体的には、唯一の炭素源として前記ペントース、有利にはキシロースおよび前記非解離形態の有機酸、有利には酢酸を含む前記第1成長培地に相当する培地の播種を可能にする。好ましくは、平均酢酸濃度、例えば、pH5の培地については5g/Lであることが選択される。
【００６９】
有利には、選択されたクローンは、この培地中で最高の成長を有するものである。成長レベルを、600〜700nmに含まれ、例えば630nmである波長で分光光度計による光学密度測定値を用いて濁度を分析することで決定することができる。実際には、ディープウェル型マイクロプレートまたは液体培地中で以下に述べる条件下で成長を評価することができ、具体的には：
・ 酸性pHは4〜6、さらには4.5〜5.5、さらには5で；
・ 28〜37℃、さらには30〜35℃に含まれ、有利には、32℃の温度で；
・ 穏やかに、例えば100rpmで撹拌しながら、または攪拌なしで;
・ 酸素供給の低下した条件（制限されたO2または嫌気性）下で;
・ 少なくとも24時間、例えば72時間の成長時間。
【００７０】
したがって、播種率は、酵母の「滴定」効果を防ぐために中程度、例えば0.25g/kg 相当DM（DM =乾燥物質）でなければならない。
【００７１】
従って重要な第1基準は、非解離形態の有機酸型阻害剤、特に酢酸の存在下で、ペントース、特にキシロースを含有する培地中で1つ以上の選択された酵母菌株の成長能力である。
【００７２】
別の実施形態によれば、選択方法は、選択培地中および上記定義した条件下で発酵時間の関数としての質量損失を評価するためのステップを含むことができる。発酵フラスコからの質量損失の測定は、アルコールの生成と相関する。 したがって、この質量損失を追跡することは、有機酸型阻害剤、特に酢酸および非解離型の存在下でペントース、有利にはキシロースの発酵の動力学を反映する。
【００７３】
これらの条件下および炭素源としてのペントースのみ（グルコースなし）の存在下では、期待されるプロファイルは、糖が非限定的な濃度（培養開始時）にある場合、関連するax + b型動力学を有する単相である。有利な株の選択において、特にそのペントース、特にキシロース、発酵速度の選択において、値a（正の数）は可能な限り高い。
【００７４】
さらに、キシロース培地中で酢酸に耐性がある、および高酢酸濃度の場合を含んでこの耐性のある酵母菌株が求められている。従って、最大CO2生産速度を、前述であるが、しかし発酵培地からの様々な濃度の酢酸を含有する培地上のキシロース発酵において測定することができる。
【００７５】
所与の酢酸濃度について、選択された株は、発酵による質量損失の2倍であり、既に単離された株よりも大きい最大キシロース消費速度を有し、、どのような酢酸濃度（酢酸が存在しない場合を含む）であっても、有利には実際の培地の濃度範囲、例えば4〜8g/kgで最大キシロース消費速度を有することが好ましい。
【００７６】
さらに有利な実施形態によれば、非解離形態の有機酸、有利には酢酸の存在下でグルコース（ヘキソース）およびキシロース（ペントース）を発酵させる選択された菌株の能力は影響を受けないことが確認される。それゆえ、それは、ヘキソースおよびペントースの両方を含有する培地に近い実際の培地中の一般的な発酵特性を分析する問題である。
【００７７】
実際には、発酵は、グルコース、キシロース及び酢酸を含有するYFPタイプの豊富な培地で行われ、例えば、培地が以下のものを含む：
・ 酵母抽出物、有利には10g/Lの濃度で;
・ バクトペプトン、有利には10g/Lの濃度で;
・ グルコース、有利には55g/Lの濃度で;
・ キシロース、有利には45g/Lの濃度で;
・ 酢酸、有利には5g/Lの濃度で培地に添加された量で;
・ KOH。
【００７８】
培養条件は、酵母の成長および発酵に適した条件であり、有利には：
・酸性pH、有利には4〜6、さらにより有利には5である;
・ 28〜37℃、さらには30〜35℃に含まれ、有利には、32℃の温度で；
・ 穏やかに、例えば100rpmで撹拌しながら；
・ 酸素供給の低下した状態（制限されたO2または嫌気性下）で;
・ 少なくとも24時間、例えば72時間の成長時間。
【００７９】
したがって、播種率は、酵母の「滴定」効果を防ぐために中程度、例えば0.25g/kg相当DM（DM =乾燥物質）でなければならない。
【００８０】
キシロースおよびグルコースを発酵させることができる酵母に対する酢酸の二重効果を示すプロファイルが期待される：
・ 第1相では、「グルコース相」と呼ばれ、可能な限り短く、有利には24時間未満、さらに有利には5~6時間程度である発酵は、開始が遅延される。従って、好ましくは、選択された菌株は、グルコース発酵中の酢酸に対する耐性を失わない。
・ キシロース発酵中、可能な限り好ましい動力学は、可能な限りの高速であり、従来技術の菌株よりも優れた性能を有することを意味する。
【００８１】
有利な実施形態によれば、本発明の方法は、標的とする用途に関連する魅力的な特性を有する酵母の株に実施される：
・ 合成および天然培地における良好な成長;
・ 有利には、非解離形態の有機酸、特に酢酸の存在下で、グルコースを発酵させる能力;
・有利には、非解離形態の有機酸、特に酢酸の存在下でキシロースを発酵させる能力;
・ そして、有利には、酢酸によるグルコース発酵経路の阻害を減少させる。
【００８２】
そのような株は、例えば、以下の群から選択される：
・ 2011年10月5日に番号I-4538でCNCMに寄託された株;
・ 2013年5月16日に番号I-4749でCNCMに寄託された株;
・ 2013年12月12日に番号I-4829でCNCMに寄託された株;
・ 2015年4月9日に番号I-4966でCNCMに寄託された株。
【００８３】
好ましい株は、番号I-4829で2013年12月12日にCNCMに寄託された株および/または番号I-4966で2015年4月9日にCNCMに寄託された株である。
【００８４】
好ましくは、本発明の方法の最後に選択された菌株は、前記方法を実施するために使用された菌株由来の目的の特性を保持する。
【００８５】
別の態様によれば、本発明は、上記の方法を用いて得られた酵母菌株に関する。
【００８６】
注目すべきことに、そのような株は、酢酸の存在下でキシロースを発酵させる能力を有し、これに匹敵するものがまだない。
【００８７】
この能力は、有利には以下の条件下で測定される：
【００８８】
菌株の前培養は、液体培地、有利には、YPG培地のような酵母の成長に好都合な合成培地中で、および上述の方法で使用される第2培地に関連して記載される条件下で、行われる。
【００８９】
30℃で24〜72時間培養した後、本発明による方法の第1成長培地などの成長培地に菌株を移す。そのような培地は、以下のように、有利には、定義される：
・ 酵母抽出物、有利には5g/Lの濃度で;
・ リン酸二アンモニウム、有利には4.7g/Lの濃度で;
・ クエン酸、有利には11.4g/Lの濃度で;
・クエン酸三ナトリウム、有利には13.5g/Lの濃度で;
・ ZnSO4、有利には21.2mg/Lの濃度で;
・MgSO4 7H2O、有利には1g/Lの濃度で;
・ チアミン、有利には18.24mg/Lの濃度で;
・ ピリドキシン、有利には5.28mg/Lの濃度で;
・ ビオチン、有利には1.76g/Lの濃度で;
・ パントテン酸塩（Pantothenate）、有利には3.8mg/Lの濃度で;
・ ナイアシン、有利には20mg/Lの濃度で;
・ メゾ - イノシトール、有利には50mg/Lの濃度で;
・ リボフラビン、有利には1mg/Lの濃度で;
・パラアミノベンゾエート、有利には1.2mg/Lの濃度で;
・ ツイーン80、有利には1g/Lの濃度である。
【００９０】
これは、さらに、唯一の炭素源としてのキシロース、有利には50g/Lである濃度であるもの、および用量 - 応答曲線を確立することができるように、好ましくは0〜10g/Lの可変濃度の酢酸を含む。ここで、これは、pH5で培養培地に添加される酢酸の量の値に関する。
【００９１】
播種および培養のための条件は、有利には、以下である：
・酸性pH、有利には4〜6、さらには4.5〜5.5、さらにより有利には5である；
・28〜37℃、さらには30〜35℃に含まれ、有利には32℃の温度で；
・穏やかに例えば100rpmで撹拌しながら。
・ 酸素供給の低下した状態（制限されたO2または嫌気性）下で;
・少なくとも24時間、有利には72時間の成長時間;
・ 有利には0.25g/kg相当DM（DM =乾燥物質）である播種率。
【００９２】
この培養の終わりに、各酢酸濃度について最大CO2生産速度を決定する。
【００９３】
これらの条件下で、先行技術からの菌株によっては決して得られない以下の特性を有する酵母菌株の選択が初めて報告された：キシロース消費動力学を50％低下させるのに必要な酢酸用量は液体培地中2.5g/L（固体培地中2.5g/kg）より多く、さらに3g/Lより多く、さらに3.5g/L以上、有利には4g/Lより多く、さらには5g/L以上である。ここでは、pH5で培養培地に添加される酢酸の量の値に関する。
【００９４】
実際には、典型的には2〜8g/kgの酢酸を含む、実際の培地中においてより速いキシロース発酵動力学が結果として生じる。したがって、本発明の菌株の存在下で、72時間未満、有利には48〜72時間以内に存在する糖の総発酵を考え出すことが可能である。
【００９５】
特定の実施形態によれば、本発明により標的とされる酵母菌株は、キシロースイソメラーゼ、有利にはクロストリジウム・フィトフェルメンタンスからのキシロースイソメラーゼをコードする少なくとも1コピーの外因性遺伝子を含む。本発明に関連する「外因性」とは、遺伝子が別の生物に由来するという事実を意味すると理解される。
【００９６】
別の特定の実施形態によれば、本発明によって標的とされる酵母菌株は、キシロースを捕捉することもできるヘキソーストランスポーターをコードするGAL2遺伝子の少なくとも1つの過剰コピーを含む。別の実施形態によれば、前記株は、GAL2遺伝子の少なくとも2つの過剰量のコピーを含む。これを、pADH1型の強力な構成的プロモーターの制御下に置くことができる。
【００９７】
他の特定の実施形態によれば、本発明によって標的とされる酵母菌株は、以下の群から選択される1つ以上の特徴を有する：
・ アルドースレダクターゼ活性の抑制（GRE3）;
・キシルロキナーゼ（XKS1）の過剰産生、 特に、プロモーターの改変または過剰コピーの導入による上記過剰産生;
・ ペントースリン酸経路（RPE1、RKL1、TKL1、TAL1など）の発現または過剰産生。
・ キシロースレダクターゼ（XR）活性の欠如;
・ アラビノースの発酵、有利には、WO200８ / 041840または欧州特許1,499,708に記載されているような細菌経路の挿入のためのアラビノースの発酵の能力。
【００９８】
有利な実施形態によれば、本発明によって標的とされる酵母菌株は、半子のう菌類に属する。好ましい株は、サッカロミセス（Saccharomyces）属、Candida属、Pichia属およびYarrowia属、有利にはサッカロミセス属に属する。サッカロミセスの中でも、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が有利である。
【００９９】
本出願に示されるように、本発明に従う菌株は、番号I-4953で2015年1月29日にCNCM（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15）に寄託された菌株である。 
【０１００】
本発明において、「酵母株」、「酵母菌株」は、遺伝子的に厳密に同一の酵母集団であると理解される。これには、実験用菌株と呼ばれる菌株および工業用菌株と呼ばれる菌株が含まれる。
【０１０１】
別の態様によれば、本発明はまた、上記定義した菌株の培養によって得られた酵母を標的とする。
【０１０２】
本発明において、「酵母」は、酵母菌株のための製造方法の実施によって得られる市販品として理解される。 したがって、異なる特性を有する酵母は、単一の菌株から得ることができ、これらの差異は、実施される製造方法と関連する。
【０１０３】
別の態様によれば、本発明は、材料、有利にはキシロースおよび/またはグルコースを含有する材料の発酵、および/またはエタノール生産のために上記定義した菌株または酵母の使用に関する。特定の実施形態によれば、材料はリグノセルロース材料である。そのような材料は、以下のものを含む：
・ ペントース、特にD-キシロースおよびL-アラビノース;
・ ヘキソース、特にD-マンノース、D-ガラクトース、L-ラムノースおよびD-グルコース;
・ ウロン酸。
【０１０４】
特定の態様によれば、本発明は、以下の工程を含む発酵生成物またはエタノールの製造方法に関連する：
・ キシロースを含有する材料または培地と上記定義の株または酵母とのインキュベーション;
・ 嫌気性または半嫌気性条件下での発酵;
・1つまたは複数の発酵生成物またはエタノールの回収。
【０１０５】
この方法の特定の実施形態によれば、材料または培地はグルコースも含有する。  
【０１０６】
本発明は、添付図面によってサポートされる以下の例示的な実施形態を用いてより詳細に説明される。しかしながら、これらには限定的な範囲はない。
【０１０７】
実施形態
I）     材料および方法：
1）株：
酵母：サッカロミセス・セレビシエ
株：I-4829またはI-4966
【０１０８】
2）培養培地および条件：
2-a）定向進化：
培地1：YFX50 =
・ キシロース50g/L;
・ 酵母エキス5g/L;
・ リン酸二アンモニウム4.7g/L;
・クエン酸11.4g/L;
・クエン酸三ナトリウム13.5g/L;
・ZnSO4 21.2mg/L;
・MgSO4 7H2O 1g/L;
・チアミン18.24mg/L;
・ピリドキシン5.28mg/L;
・ビオチン1.76g/L;
・パントテン酸塩3.8mg/L;
・ナイアシン20mg/L;
・メソ - イノシトール50mg/L;
・リボフラビン1mg/L;
・パラアミノベンゾエート1.2mg/L;
・ツイーン80、1g/L。
【０１０９】
酵母は、この培地中で、唯一の炭素源としてキシロースおよび濃度がサイクルにわたって増加する酢酸と培養される（結果の部分参照）。
【０１１０】
培地のpHは5に維持される。
【０１１１】
培養は、培地中の酸素の供給を減少させ、かつ過度の圧力でこの培養全体を通して産生されたCO2が逃げるのを可能にするキャップによって栓をされたフラスコ中、100rpmで撹拌しながら32℃で行われる。これらの条件下で、培養は約7日間続く。
【０１１２】
培地2（YPG）：
・10g/Lの酵母エキス;
・10g/Lのペプトン;
・ 20g/Lの唯一の炭素源としてのグルコース。
【０１１３】
培地への酸素の供給を可能にする多孔質キャップで栓をしたバッフル付きフラスコ中で150rpmで攪拌しながら30℃で培養を行う。これらの条件下で、培養は24時間続く。
【０１１４】
培地3：
・3.4g/L のDIFCO（登録商標）酵母窒素塩基;
・5g/Lの硫酸アンモニウム;
・10g/Lの唯一の炭素源としてのグリセロール。
【０１１５】
培地への酸素の供給を可能にする多孔質キャップで栓をしたバッフル付きフラスコ中で150rpmで攪拌しながら30℃で培養を行う。これらの条件下で、培養は24〜48時間続く。
【０１１６】
2-b）最も有効な菌株の選択：
第8サイクルの終わりに、細胞を、寒天培地（YPG +寒天）のディッシュ（直径150mm）あたり2000細胞の濃度で広げた。
【０１１７】
次いで、得られたコロニーを、YPG培地中のDeep Wellフォーマット（= 96ウェルマイクロプレート）で培養した。
【０１１８】
30℃で72時間培養した後、組成を以下に示すYFX50-Ac-5000培地にコロニーを移した：
【０１１９】
【表１】
0006710222.tif 000002
【０１２０】
実際には、5g/Lである酢酸濃度（pH5で培地に添加された量）で、本発明による方法で使用される第1成長培地と同じ培地を含む。
【０１２１】
同様に、培養条件も類似である：
【０１２２】
条件：
pH：5
温度：32℃
O2条件：酸素供給なし（嫌気性）
撹拌：100rpm
培養時間：72時間
前培養/インキュベーション：
・Deep Well（96ウェルマイクロプレート）から液体培養のためのコロニーを取り上げる；
・液体培地の場合、0.25g/kg相当DM。
【０１２３】
2-c）単離株の検証
培地：YFP-5000
・10g/Lの酵母エキス;
・10g/Lのバクトペプトン;
・55g/Lのグルコース;
・45g/Lのキシロース；
・5g/Lの酢酸（pH5で培地に添加される量）；
・ KOH。
【０１２４】
条件：
pH：5
温度：32℃
O2条件：酸素供給なし
撹拌：100rpm
培養期間：72時間まで
前培養/インキュベーション：前もってYPG培地中で増殖させた0.25g/kg相当DMの酵母。
【０１２５】
3）質量損失の評価：
エタノール生成は、発酵フラスコから失われた質量の測定によって間接的に測定される。なぜなら、この質量損失はアルコール生成と直接相関するからである。 それは培地1キログラムあたりのグラムで表される。
【０１２６】
4）CO2生産速度の評価：
質量損失（CO2生成に対応する）の決定から出発して、質量損失の2倍であるキシロース消費速度（g/Lで表される）を決定することが可能である。
【０１２７】
最大CO2生産速度は、DM（乾燥物質）のg.kg-1.h-1.g-1で表される。
【０１２８】
II）結果：
1）目的の株の選択：
1-a）定向進化：
定向進化は、Single Batch Repeatモードで行われた：
サイクル1〜3：3g/Lの酢酸を含む培地1（pH5の培地に添加）、次いで培地2、次いで培地3;
・ サイクル4~6：4g/Lの酢酸を含む培地1、次いで培地2、次いで培地3;
・ サイクル7：5g/Lの酢酸を含む培地1、次いで培地2、次いで培地3;
・ サイクル8： 6g/Lの酢酸を含む培地1、次いで培地2、次いで培地3;
【０１２９】
1-b）最も有効な菌株の選択：
これらのクローンを固体培地上で単離し、液体培地中で前培養した後、それらを、培地YFX50-Ac-5000（50g/kLのキシロースおよび5g/Lの酢酸、pH= 5）を含有するDeep Well型マイクロプレートに播種する。
【０１３０】
この培地中で72時間発酵させた後、選択された菌株（合計16個）は、培地の細胞密度の分析により、最良の増殖を有するものである。株CNCM I-4071およびCNCM I-4829は、それぞれ、それらの増殖のためにキシロースを使用する細胞の能力に対する陰性および陽性対照として役立った。
【０１３１】
これらの16株を、この同じ培地上の動力学で評価した。結果を図1に示し、発酵時間の関数としての質量損失を示す。予想通り、この培地はキシロース（グルコースなし）のみを含んでいたので、試験した全ての菌株の観察されたプロファイルは単相であった。 一方、曲線の始めの導関数に依存して変化するように見える。これは、方程式ax + bを使用して定式化することができ、ここで、aは株に応じて変化する。
【０１３２】
図1は、E9株が最良の性能を示すことを示す。この株は、2015年1月29日に番号CNCM I-4953でInstitut Pasteur（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)）に寄託され、残りの実験で使用された。
【０１３３】
2）I-4953株の性質： 
2-1）キシロース培地：
最初のステップは、キシロース発酵中の酢酸に抵抗するこの株の能力に対する定向進化の影響を決定することからなった。これを行うために、試験は、YFX50-Ac培地でのキシロース発酵中の最大CO2生産速度を測定することからなっていた。用量-応答曲線を得るために、種々の濃度の酢酸を発酵培地に添加した。
【０１３４】
図2は、この株が、発酵中の質量損失の2倍である最大キシロース消費速度を有し、酢酸を含まないI-4829株の速度よりも約15％高いことを示す。 このギャップは、酢酸の投与量が4g/Lの場合にさらに大きくなる。 実際、この濃度では、キシロース消費速度は、I-4929株では15％のみであるのに比べて、I-4829株では85％減少する。これは、4g/Lの酢酸の存在下およびpH5で、I-4953株が、酢酸を含まないI-4829株と同じキシロース消費速度を有することを意味する。
【０１３５】
2-2）グルコース+キシロース培地：
発酵に及ぼす定向進化の影響をよりよく一般的に理解するために、グルコース、キシロースおよび酢酸を含有する培地についての発酵時間の関数としての質量損失を追跡した。
【０１３６】
キシロースを発酵させることができる酵母に対する酢酸の二重効果を明らかに示す図3に結果を示す：
・「グルコース相」と呼ばれる第1相において、I-4538株は約24時間の発酵開始遅延を示す。他の菌株（I-4749、I-4829およびI-4953）については、遅延はわずか5〜6時間である。 この観察は、単離株がグルコース発酵中の酢酸に対する耐性を失わないことを意味する。
・キシロース発酵がリレーをピックアップするとき、菌株I-4538、I-4749およびI-4829の動態は同等である。対照的に、I-4953株では、CO2産生（および結果的にエタノール産生）が3つの他の株について観察されたものよりも速く、より大きくなることは注目に値する。
【０１３７】
これらの結果は、キシロース発酵中の酢酸に対してより耐性のある菌株が得られ、従って、それが全体的により有効であることを確認する。
【０１３８】
III）結論：
記載された方法によれば、酢酸の存在下で改善されたキシロース発酵速度を示しながら、少なくとも1つの安定株であって、限られた開始遅延とグルコースを発酵させるための能力を保持するI-4953の安定株を選択することが可能であった。
【図１】
0006710222.tif 000003
【図２】
0006710222.tif 000004
【図３】
0006710222.tif 000005