(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）を含む、口腔粘膜の創収縮に伴う粘膜組織の発育障害抑制材であって、
円二色性スペクトル法により求めた前記タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合が６０〜８５％であり、
前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち前記アミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及び前記アミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の占める合計の割合が５０〜７０％であり、
前記発育障害抑制材が綿状であり、
前記発育障害抑制材のかさ密度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌであり、
前記発育障害抑制材中の水分含有率が０重量％を超え、２０重量％以下である発育障害抑制材。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の１個又は２個のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
【請求項２】
前記タンパク質（Ａ）１分子中の、前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の個数と前記アミノ酸配列（Ｘ）及び前記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数との比率｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）：アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計｝が、１：２〜１：６である請求項１に記載の発育障害抑制材。
【請求項３】
前記タンパク質（Ａ）が、前記アミノ酸配列（Ｘ）の１種が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、
前記タンパク質（Ａ）中の前記ポリペプチド鎖（Ｙ）と前記ポリペプチド鎖（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個である請求項１又は２に記載の発育障害抑制材。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：ポリペプチド鎖（Ｙ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）の全アミノ酸の個数の０．１〜２０％のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖。
【請求項４】
前記タンパク質（Ａ）が、前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ）を有する請求項１〜３のいずれかに記載の発育障害抑制材。
【請求項５】
前記タンパク質（Ａ）において全アミノ酸の個数のうち前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸の個数が占める割合が５〜５０％である請求項１〜４のいずれかに記載の発育障害抑制材。
【請求項６】
前記タンパク質（Ａ）が、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）を有するタンパク質（Ａ１１−１−１）である請求項１〜５のいずれかに記載の発育障害抑制材。
【請求項７】
前記タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量が１５〜２００ｋＤａである請求項１〜６のいずれかに記載の発育障害抑制材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口蓋裂などの先天異常、鼻口腔瘻、上顎洞口腔瘻、食道瘻、気管支瘻などの瘻孔に代表される生体の粘膜欠損を、適正かつ安全に再建、閉鎖、修復できる発育障害抑制材に関する。
【背景技術】
【０００２】
外傷、手術等に起因して必要となる粘膜の再生、治療は、これまで自己再生能力に依存した方法が選択されてきた。また、先天的な欠損や奇形に対しての治療方法は皆無に等しかった。しかしながら近年、医療レベルの向上や、再生医療分野の進展により組織移植や、それに使用するスキャホールドの検討などが行われ、患者のＱＯＬは向上しつつある。
粘膜欠損、特に生体内に物理的空隙を生ずるような欠損を治療する医療技術は、骨などの硬組織に対する医療技術と比較して、技術的な遅れが見られる。
上記した粘膜組織の欠損に由来する疾患の具体的な例としては、口蓋裂などの先天異常、鼻口腔瘻、上顎洞口腔瘻、食道瘻、気管支瘻、心室中隔穿孔、横隔膜ヘルニアなどに代表される瘻孔や、歯肉の欠損など多種に渡る。
これら、欠損に対する現在の治療法の一部を以下に説明する。
（ａ）口蓋裂の治療方法としては、主に手術が選択されるが、方法はＰｕｓｈｂａｃｋ法、Ｆｕｒｌｏｗ法などがあり、Ｆｕｒｌｏｗ法は最近広く行われている手術法である（非特許文献１）。口腔側、鼻腔側でそれぞれＺ形成を行う方法で、筋肉を含むように口蓋垂側に基部をもつ粘膜筋弁を作製することにより筋層を後ろに移動させる術式である。しかしながら、本術式では裂の幅が大きいと、とくに口蓋側に基部をもつ弁はうまく移動しないため、縫合が困難となる。
対してＰｕｓｈｂａｃｋ法は、粘骨膜弁を後方に移動させる術式であるが、粘骨膜弁の後方移動により前方に生ずる骨の露出部が瘢痕化することで、上顎骨の発育障害がおこる（非特許文献２）。また、往々にして瘻孔が発生するなどの問題がみられる。このような瘻孔は大きいものでは、（１）飲食物が鼻にまわり、鼻の穴から外部にこぼれ出る（２）鼻の分泌物が口の中に流出する（３）鼻粘膜の炎症や、口臭の原因となる（４）言語障害などの障害が生じるというような問題が顕著になる。
（ｂ）心室中隔穿孔や横隔膜ヘルニアなどの治療方法としてはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）や生物組織由来のシート（パッチ）によって補填されることが多い。これらは一定の治療効果が認められるが、粘膜組織を再生することが出来ず、治癒後の瘢痕拘縮やそれに伴う発育障害などの合併症が生じる場合がある。また、口腔粘膜では、口腔内常在菌が存在するため常に感染のリスクを伴っている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｆｕｒｌｏｗ法における口蓋粘膜の閉鎖判定法  日本口蓋裂学会雑誌Ｖｏｌ．  ４０  （２０１５）  Ｎｏ．１  ｐ．１−６
【非特許文献２】口蓋裂手術と顎発育に関する諸問題  日本口蓋裂学会雑誌Ｖｏｌ．  １７  （１９９２）  Ｎｏ．１  ｐ．７−１４
【非特許文献３】口腔環境の微生物制御と全身感染症との関連性について  Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｃｏｌ  （Ｖｏｌ．２３  Ｎｏ．２  ２０１４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、粘膜欠損創の治癒過程にみられる創収縮に伴う発育障害等の合併症の発現を抑制するために用いる発育障害抑制材を提供することである。
本発明の発育障害抑制材を用いることにより創収縮を予防することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の発育障害抑制材は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）を含む発育障害抑制材であって、円二色性スペクトル法により求めた上記タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合が６０〜８５％であり、上記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち上記アミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及び上記アミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の占める合計の割合が５０〜７０％であり、上記発育障害抑制材が綿状であり、上記発育障害抑制材のかさ密度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌであり、上記発育障害抑制材中の水分含有率が０重量％を超え、２０重量％以下である発育障害抑制材である。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の１個又は２個のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
【０００６】
本発明において、タンパク質（Ａ）は、天然物からの抽出、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって得られる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。天然物からの抽出、有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、タンパク質（Ａ）を得られるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【０００７】
本発明において、円二色性スペクトル法により求めたタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合が６０〜８５％であり、タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうちアミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の占める合計の割合が５０〜７０％である。
タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合並びにタンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうちアミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の占める合計の割合が上記範囲であることで、本発明の発育障害抑制材は、滲出液を吸収してゲル化することができ、吸収した滲出液を適度に創傷部に留まらせ、創傷面を適度な湿潤環境に保つことができる。
【０００８】
タンパク質（Ａ）は、円二色性スペクトル法により求めたタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合が６０〜８５％であるタンパク質である。タンパク質の配列が同じでも、タンパク質の作製方法、タンパク質の精製方法、タンパク質を溶解させる溶媒のｐＨ及び溶媒の極性等により、タンパク質のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合は異なる。
タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合は、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、６０〜８５％が好ましく、さらに好ましくは６５〜８０％であり、特に好ましくは７０〜７５％である。
上記割合は、タンパク質（Ａ）をリフォールディングすることによって増加させることができる。また、変性剤や熱等で変性させることによって低下させることができる。
タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合は、下記測定方法によって求める。
【０００９】
＜タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合の測定方法＞
タンパク質を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、タンパク質の水溶液を作製する。作製したタンパク質の水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光株式会社製、「Ｊ−８２０」）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型：日本分光株式会社製）にてβターン構造の割合とランダムコイル構造の割合とを算出し、これらを合計し、βターン構造とランダムコイル構造との合計の割合とする。
【００１０】
本発明において、タンパク質（Ａ）は、アミノ酸配列（Ｘ）及び／又はアミノ酸配列（Ｘ’）を有するものである。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の１個又は２個のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
なお、タンパク質（Ａ）は、アミノ酸配列（Ｘ）を複数個有していてもよく、アミノ酸配列（Ｘ’）を複数個有していてもよい。また、タンパク質（Ａ）が複数個のアミノ酸配列（Ｘ）を有している場合には、各アミノ酸配列（Ｘ）の種類が異なっていてもよく、タンパク質（Ａ）が複数個のアミノ酸配列（Ｘ’）を有している場合には、各アミノ酸配列（Ｘ’）の種類が異なっていてもよい。さらに、タンパク質（Ａ）は、アミノ酸配列（Ｘ）と、アミノ酸配列（Ｘ’）とを共に有していてもよい。
【００１１】
アミノ酸配列（Ｘ）としては、細胞親和性及び創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、ＶＰＧＶＧ配列（２）及び／又はＧＶＧＶＰ配列（３）が好ましい。
【００１２】
アミノ酸配列（Ｘ’）として、具体的には、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）、ＧＫＧＲＰ配列（９）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）等が挙げられる。
アミノ酸配列（Ｘ’）は、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（７）及び／又はＧＫＧＫＰ配列（８）である。
【００１３】
タンパク質（Ａ）は、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、アミノ酸配列（Ｘ）の１種が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：ポリペプチド鎖（Ｙ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）の全アミノ酸の個数の０．１〜２０％のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖。
【００１４】
ポリペプチド鎖（Ｙ）は、具体的には、（ＶＰＧＶＧ）ｂ配列、（ＧＶＧＶＰ）ｃ配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）ｄ配列である（なお、ｂ〜ｄは、それぞれ、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数であり、２〜２００の整数である）。
タンパク質（Ａ）１分子中に、ポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、（ＶＰＧＶＧ）ｂ配列、（ＧＶＧＶＰ）ｃ配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）ｄ配列からなる群から選ばれる１種を有してもよく、２種以上を有してもよい。
また、タンパク質（Ａ）中にポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数は、ポリペプチド鎖（Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数ｂ〜ｄが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、ｂ〜ｄが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよい。
ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、（ＶＰＧＶＧ）ｂ配列及び／又は（ＧＶＧＶＰ）ｃ配列が好ましい。
【００１５】
ポリペプチド鎖（Ｙ）は、アミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続した（上記ｂ〜ｄが２〜２００）ポリペプチド鎖であるが、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、連続する個数は２〜１００個（上記ｂ〜ｄが２〜１００）が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個（上記ｂ〜ｄが２〜５０）、特に好ましくは２〜４０個（ｂ〜ｄが２〜４０個）である。
【００１６】
また、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）における全アミノ酸の個数の０．１〜２０％のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖であり、具体的には、アミノ酸配列（Ｘ）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ）において、アミノ酸配列（Ｘ）の一部又は全部がアミノ酸配列（Ｘ’）に置き換わったポリペプチド鎖が含まれる。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸の個数のうちリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸の個数の合計の割合は、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、０．５〜１０％が好ましく、さらに好ましくは１〜５％である。
【００１７】
ポリペプチド鎖（Ｙ’）であるかどうかは、タンパク質（Ａ）の配列中の全てのリシン及びアルギニンを、他のアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｈ又はＫ）に置きかえたときに、ポリペプチド鎖（Ｙ）となるかによって判断する。
【００１８】
タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）とポリペプチド鎖（Ｙ’）との合計の個数は、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜８０個であり、特に好ましくは１〜６０個である。
【００１９】
タンパク質（Ａ）中に、アミノ酸配列（Ｘ）の種類及び／又は連続する個数が異なる（Ｙ）を有している場合は、それぞれを１個として数え、ポリペプチド鎖（Ｙ）の個数はその合計である。ポリペプチド鎖（Ｙ’）も同様である。
【００２０】
本発明においてタンパク質（Ａ）は、タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数に占めるアミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の合計の割合が５０〜７０％であるものであるが、細胞親和性の観点から、５２．５〜６７．５％が好ましく、さらに好ましくは５５〜６５％である。
タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数に占めるアミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の合計の割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。
【００２１】
＜全アミノ酸の個数に占めるアミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の合計の割合の測定法＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてアミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の合計割合を算出する。
アミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の合計割合（％）＝［｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の個数｝＋｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝×｛アミノ酸（Ｘ’）中のアミノ酸の個数｝］／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸の個数｝×１００
なお、タンパク質（Ａ）が、複数種類のアミノ酸配列（Ｘ）を有している場合には、以下のようにして上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の個数｝」を求める。
まず、各種類のアミノ酸配列（Ｘ）について、「アミノ酸配列（Ｘ）の数×アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の個数」を求める。その合計値を、上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の個数｝」とする。
タンパク質（Ａ）が、複数種類のアミノ酸配列（Ｘ）に対応する複数種類のアミノ酸配列（Ｘ’）を有する場合も同様にして、上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝×｛アミノ酸（Ｘ’）中のアミノ酸の個数｝」を求める。
【００２２】
タンパク質（Ａ）において、全アミノ酸の個数のうちＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸の個数が占める割合［｛タンパク質（Ａ）中のＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数×６｝／｛タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数｝×１００］は、細胞親和性の観点から、５〜５０％が好ましく、さらに好ましくは１０〜４７．５％であり、特に好ましくは２０〜４５％である。
タンパク質（Ａ）における全アミノ酸の個数のうちＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸の個数が占める割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求める。
【００２３】
＜ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が占める割合＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法の２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸の個数の占める割合を算出する。
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸の個数の占める割合（％）＝［｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数×６｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸の数｝×１００
【００２４】
タンパク質（Ａ）はＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するが、タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点、細胞親和性の観点及び創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が連続する個数は、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、２〜１００個が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個であり、特に好ましくは２〜１０個である。
【００２５】
タンパク質（Ａ）が、アミノ酸配列（Ｘ）、アミノ酸配列（Ｘ’）、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）及びポリペプチド鎖（Ｓ）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列を合計２個以上有する場合は、これらの間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもよい。介在アミノ酸配列（Ｚ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）では無いペプチド配列である。介在アミノ酸配列（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、１〜３０個が好ましく、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個である。介在アミノ酸配列（Ｚ）として、具体的には、ＶＡＡＧＹ配列（１１）、ＧＡＡＧＹ配列（１２）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。なお、タンパク質（Ａ）は、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有さなくてもよい。
タンパク質（Ａ）が介在アミノ酸配列（Ｚ）を有する場合、タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち介在アミノ酸配列（Ｚ）のアミノ酸の個数の占める割合［Σ｛（介在アミノ酸配列（Ｚ）中のアミノ酸の個数）×（介在アミノ酸配列（Ｚ）の数）｝／｛タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数｝×１００］は、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、０％を超え、２５％以下であることが好ましく、さらに好ましくは０％を超え、２２．５％以下であり、特に好ましくは０％を超え、１５％以下である。
【００２６】
タンパク質（Ａ）は、生体内での分解性の観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）、アミノ酸配列（Ｘ’）、介在アミノ酸配列（Ｚ）以外にも、両末端に末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していてもよい。タンパク質（Ａ）の両末端の構造が、ポリペプチド鎖（Ｙ）に末端アミノ酸配列（Ｔ）が結合した構造であることが好ましい。末端アミノ酸配列（Ｔ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）では無いペプチド配列である。末端アミノ酸配列（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、生体内での分解性の観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個、特に好ましくは１〜４０個である。末端アミノ酸配列（Ｔ）として、具体的には、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（１３）等が挙げられる。なお、タンパク質（Ａ）は、末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していなくてもよい
タンパク質（Ａ）が末端アミノ酸配列（Ｔ）を有する場合、タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち末端アミノ酸配列（Ｔ）が占めるアミノ酸の個数の割合は、生体内での分解性の観点から、０％を超え、２５％以下であることが好ましく、さらに好ましくは０％を超え、２２．５％以下であり、特に好ましくは０％を超え、１５％以下である。
【００２７】
タンパク質（Ａ）は、上記末端アミノ酸配列（Ｔ）以外に、発現させたタンパク質（Ａ）の精製又は検出を容易にするために、タンパク質（Ａ）のＮ又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもよい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ２２ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ４１ＴＭ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）  （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）  （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ  （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ  （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ  （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ  （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ  （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるタンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
【００２８】
タンパク質（Ａ）において、タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち、上記介在アミノ酸配列（Ｚ）のアミノ酸の個数、末端アミノ酸配列（Ｔ）のアミノ酸の個数及び精製タグのアミノ酸の個数が占める合計割合は、生体内での分解性の観点から、０％を超え、２５％以下が好ましく、さらに好ましくは０％を超え、２２．５％以下であり、特に好ましくは０％を超え、１５％以下である。
【００２９】
タンパク質（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）並びにＧＡＧＡＧＳ配列（１）及び／又はポリペプチド鎖（Ｓ）を含む場合、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、ポリペプチド鎖（Ｙ）又はポリペプチド鎖（Ｙ’）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｓ）とが交互に化学結合していることが好ましい。
【００３０】
タンパク質（Ａ）１分子中の、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の個数と、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数との比率｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）：アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計｝は、タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合を適度にする観点から、１：２〜１：６が好ましく、さらに好ましくは１：２〜１：５である。
【００３１】
タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量は、生体内での分解性の観点から、１５〜２００ｋＤａが好ましく、さらに好ましくは３０〜１５０ｋＤａであり、特に好ましくは７０〜１２０ｋＤａである。
【００３２】
好ましいタンパク質（Ａ）の一部を以下に例示する。
（１）（Ａ１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（３）であるタンパク質。
（２）（Ａ１１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質。
（３）（Ａ１１−１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続した（ＧＶＧＶＰ）８配列（１７）のポリペプチド鎖（Ｙ１１）の１個のアミノ酸がＫで置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）（Ｙ’１１）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質。
（４）（Ａ１１−１−１）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）と（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）とを有するタンパク質。
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１４）が化学結合した分子質量が約８０ｋＤａの配列（２３）のタンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）。
（ｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１４）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約８２ｋＤａの配列（１５）のタンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ）。
【００３３】
（５）（Ａ１１−２）ＧＶＧＶＰ配列（３）が１２個連続したポリペプチド鎖の１個のアミノ酸がＫで置換された（ＧＶＧＶＰ）６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）５配列（２５）（Ｙ’１２）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質。
（６）（Ａ１１−２−１）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）と（ＧＶＧＶＰ）６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）５配列（２５）とを有するタンパク質。
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）５配列（２５）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１４）が化学結合した分子質量が約１０５ｋＤａの配列（２４）のタンパク質。
【００３４】
（７）（Ａ１２）ＧＶＧＶＰ配列（３）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質。
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）８配列（１６）及び（ＧＶＧＶＰ）４０配列（１８）をそれぞれ５個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約１１０ｋＤａの配列（１９）のタンパク質（ＳＥＬＰ６．１）。
【００３５】
（８）（Ａ２）アミノ酸配列（Ｘ）がＶＰＧＶＧ配列（２）であるタンパク質。
（９）（Ａ２１）ＶＰＧＶＧ配列（２）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ２）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するタンパク質。
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、（ＶＰＧＶＧ）４配列（２０）及び（ＶＰＧＶＧ）８配列（２１）をそれぞれ４０個有し、これらが配列（２０）、配列（１）、配列（２１）の順に結合したブロックが４０個化学結合してなる構造を有する分子質量約２００ｋＤａの配列（２２）のタンパク質（ＥＬＰ１．１）。
【００３６】
本発明の発育障害抑制材は、上記タンパク質（Ａ）を含み発育障害抑制材が綿状であり、発育障害抑制材のかさ密度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌであり、発育障害抑制材中の水分含有率が０重量％を超え、２０重量％以下であるものである。
【００３７】
本発明において、発育障害抑制材のかさ密度は、滲出液吸収の観点から、１〜５０ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００３８】
発育障害抑制材中の水分含有率は、滲出液吸収の観点から、０重量％を超え、２０重量％以下であり、好ましくは０重量％を超え、１０重量％以下である。
発育障害抑制材中の水分含有率は、下記測定方法によって求めることができる。
【００３９】
＜発育障害抑制材中の水分含有率の測定方法＞
発育障害抑制材０．１ｇの水分含有率を微量水分測定装置（平沼産業社製、「ＡＱ−２２００」）にて測定する。
【００４０】
本発明の発育障害抑制材は、タンパク質（Ａ）以外に無機塩及び／又はリン酸（塩）を含んでもよい。なお、本発明の発育障害抑制材は、無機塩及び／又はリン酸（塩）を含んでいなくてもよい。
【００４１】
無機塩として、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。なお、本明細書において、リン酸塩は無機塩に含まない。
発育障害抑制材中の無機塩の含有量（重量％）は、細胞親和性の観点から、発育障害抑制材の重量を基準として０重量％を超え、３重量％以下が好ましく、さらに好ましくは０重量％を超え、１重量％以下、特に好ましくは０重量％を超え、０．５重量％以下である。
【００４２】
リン酸（塩）は、リン酸及び／又はリン酸塩を意味する。
リン酸（塩）としては、リン酸及びリン酸塩等が挙げられる。
塩としては、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
発育障害抑制材中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、細胞親和性の観点から、発育障害抑制材の重量を基準として０重量％を超え、２重量％以下が好ましく、さらに好ましくは０重量％を超え、０．５重量％以下であり、特に好ましくは０重量％を超え、０．０５重量％以下である。
【００４３】
本発明の発育障害抑制材は、糖及び／又は抗菌剤を含んでいてもよい。
糖としては、公知の糖を用いることができ、例えば、単糖｛トリオース、テトロース、ペプトース、ヘキソース及びヘプトース等｝、オリゴ糖及び多糖｛デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、キトサン、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、ペクチン、キシログルカン及びキサンタンガム等｝等が挙げられる。
抗菌剤としては、公知の抗菌剤を用いることができ、例えば、銀イオン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、ペニシリン及びストレプトマイシン等が挙げられる。
【００４４】
発育障害抑制材中の糖の含有量は、発育障害抑制材の重量を基準として、創傷治癒の観点から、０．１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜５重量％である。
抗菌剤の含有量は、発育障害抑制材の重量を基準として、創傷治癒の観点から、０．００１〜１重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００５〜０．１重量％である。
【００４５】
本発明の発育障害抑制材の製造方法は、上記タンパク質（Ａ）を５０重量％以上、１００重量％未満含有するタンパク質水溶液を凍結乾燥する発育障害抑制材の製造方法である。
タンパク質水溶液中のタンパク質（Ａ）の含有量は、細胞親和性の観点から、タンパク質水溶液の重量を基準として、７０重量％以上、１００重量％未満が好ましく、さらに好ましくは８０重量％以上、１００重量％未満である。
【００４６】
タンパク質水溶液中は、糖及び／又は抗菌剤を含んでもよい。
タンパク質水溶液中の糖の含有量は、滲出液吸収の観点から、タンパク質水溶液の重量を基準として、０．０１〜５重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１重量％である。
タンパク質水溶液中の抗菌剤の含有量は、創傷治癒の観点から、タンパク質水溶液の重量を基準として、０．００００１〜１重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０００１〜０．１重量％である。
【００４７】
凍結乾燥は、公知の凍結乾燥方法を用いることができる。
凍結乾燥には、一次乾燥と二次乾燥がある。一次乾燥とは、試料表面から氷を昇華させるものである。二次乾燥とは、分子間に結合している水を除くものである。
凍結乾燥において、一次乾燥の温度は、タンパク質の立体構造維持の観点から、０℃以下が好ましく、さらに好ましくは−１０℃以下である。また、二次乾燥の温度は、タンパク質の立体構造維持の観点から、１０〜３０℃が好ましく、さらに好ましくは、１０〜２０℃である。
凍結乾燥時間は、タンパク質の立体構造維持の観点から、一次乾燥と二次乾燥との合計で、１２〜４８時間が好ましく、さらに好ましくは１８〜４２時間である。
【００４８】
本発明の発育障害抑制材を患部に適用する方法としては、従来用いられている脱脂綿と同様の方法で用いることができ、例えば、患部の壊死組織を除去した後、患部に合わせた形に加工した発育障害抑制材を乗せて、ポリウレタンフィルム等で覆う等が挙げられる。
【００４９】
本発明の発育障害抑制材は、滲出液を吸収し、吸収した滲出液を適度に創傷部に留まらせることができ、創傷部を菌に感染しにくくさせることができる。また、本発明の発育障害抑制材は、生分解性に優れているため、熱傷、採皮創、皮膚剥削創及び外傷性皮膚欠損創、褥瘡性皮膚潰瘍及び糖尿病性皮膚潰瘍等の創傷を治癒する発育障害抑制材として好適に用いることができる。
【実施例】
【００５０】
以下に実施例として本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００５１】
＜製造例１＞
［ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製］
○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の生産
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰ８Ｋ生産株を得た。以下、このＳＥＬＰ８Ｋ生産株を用いて、配列（２３）のタンパク質（Ａ）であるＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）を生産する方法を示す。
【００５２】
○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の培養
３０℃で生育させたＳＥＬＰ８Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍｌフラスコ中のＬＢ培地５０ｍｌに接種した。カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように加え、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）培養した。培養液が濁度ＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：島津製作所製を使用）となった時に、４０ｍｌを４２℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約２時間培養した。培養した培養液を氷上で冷却し、培養液の濁度ＯＤ６００を測定し、遠心分離にて大腸菌を集菌した。
【００５３】
○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製
集菌した大腸菌を、下記１：菌体溶解、２：遠心分離による不溶性細片の除去、３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陰イオン交換クロマトグラフィー、６：限外濾過、７：凍結乾燥により大腸菌バイオマスから精製した。このようにして、分子質量が約８０ｋＤａの配列（２３）のタンパク質（Ａ１）の精製物であるＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を得た。
【００５４】
１：菌体溶解
集菌した大腸菌１００ｇに対して、脱イオン水２００ｇを加えて、高圧ホモジナイザー（５５ＭＰａ）にて菌体溶解し、溶解した菌体を含む菌体溶解液を得た。その後、菌体溶解液を氷酢酸にてｐＨ４．０に調整した。
【００５５】
２：遠心分離による不溶性細片の除去
さらに菌体溶解液を遠心分離（６３００ｒｐｍ、４℃、３０分間）して、上清を回収した。
【００５６】
３：硫安沈殿
回収した上清に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解した。溶解した液に対して、同様に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解し、溶液を得た。
【００５７】
４：限外濾過
３で得た溶液を分子質量３０，０００カットの限外濾過装置（ホロファーバー：ＧＥヘルスケア製）に供した。３で得た溶液に対して、１０倍量の脱イオン水を用いて、限外濾過を実施し、限外濾過後のタンパク質を得た。
【００５８】
５：陰イオン交換クロマトグラフィー
限外濾過後のタンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解して２０ｇ／Ｌとし、陰イオン交換カラムＨｉＰｒｅｐＳＰ  ＸＬ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製）をセットしたＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（アマシャム社製）に供した。溶出液として５００ｍＭ  １０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、溶出画分を回収した。
【００５９】
６：限外濾過
５で得た溶液を上記「４：限外濾過」と同様にして処理し、限外濾過後のタンパク質を得た。
【００６０】
７：凍結乾燥
タンパク質を脱イオン水に溶解して５ｇ／Ｌとし、水位が１５ｍｍ以下となるようにステンレス製のバットに入れる。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス社製）に入れて、−４０℃、１６時間かけて凍結させる。凍結後、真空度が８Ｐａ以下、−２０℃で、９０時間かけて１次乾燥、真空度が８Ｐａ以下、２０℃で、２４時間かけて２次乾燥させ、精製したＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を得た。
【００６１】
○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の同定
得られたＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を下記の手順で同定した。
ラビット抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体及びＣ末端配列の６×Ｈｉｓタグに対するラビット抗６×Ｈｉｓ抗体（Ｒｏｌａｎｄ社製）を用いて、得られたタンパク質（Ａ１−１）をウエスタンブロット法により分析した。見かけ分子質量８０ｋＤａのタンパク質バンドが、各抗体に抗体反応性を示した。また得られたタンパク質をアミノ酸分析システム（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ島津製作所社製）によるアミノ分析に供した結果、該生成物が、グリシン（４３．７重量％）、アラニン（１２．３重量％）、セリン（５．３重量％）、プロリン（１１．７重量％）及びバリン（２１．２重量％）に富むものであった。また、該生成物はリシンを１．５重量％含んでいた。下記の表１は、精製された生成物の組成と、合成遺伝子配列から推測された予測理論組成との相関関係を示す。
したがって、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）はＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）であり、ポリペプチド鎖（Ｙ）中のバリンのうち１個がリシンに置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）のポリペプチド鎖（Ｙ’１１）を１３個及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）のポリペプチド鎖（Ｙ１１）を１２個有し、これらが交互に化学結合してなる配列（２３）のタンパク質であることを確認した。
【００６２】
【表１】
0006754982.tif 000002
【００６３】
＜ウエスタンブロット法＞
ウエスタンブロット用サンプル２０μＬに３×ＳＤＳ処理バッファ（１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３００ｍＭ  ジチオスレイトール、６％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．３％  ブロモフェノールブルー、及び３０％  グリセロールを含む）１０μＬを添加して９５℃で、５分間加温し、泳動用試料を調製した。この泳動用試料１５μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをフッ化ポリビニリデンメンブレン（以下、単に「メンブレン」ともいう）にトランスファーし、これをブロッキングバッファ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、及び５％  スキムミルクを含む）に浸漬して１時間室温で振蕩することによりメンブレンのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む）で２分間洗浄した。次に、メンブレンを一次抗体溶液（一次抗体：抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）をＴＢＳ−Ｔで５００分の１に希釈した溶液）に浸漬し、４℃で一晩静置して抗体反応を行った。反応後、このメンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、一次抗体に結合可能であり且つ標識酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体の溶液（二次抗体：ＥＣＬ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ  ｌｉｎｋｅｄ  Ｆ（ａｂ’）２  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をＴＢＳ−Ｔで２０００分の１に希釈した溶液）にメンブレンを浸漬し、３０分間室温で静置して抗体反応を行った。反応後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、ＥＣＬ−Ａｄｖａｎｃｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により酵素反応を行った。ルミノメーターＦｏｒＥＣＬ（アマシャム社製）を用いて、高感度インスタント黒白フィルム（富士フイルム株式会社製）に感光させ、バンドを可視化した。肉眼でバンドが確認できない場合、タンパク質（Ａ１−１）が分解吸収され、無くなったと判断した。
【００６４】
○βターン構造とランダムコイル構造との合計割合の測定
得られたＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を用いて下記の手順でβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合を測定した。
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）水溶液を作製した。作製したＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光：Ｊ−８２０）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型：日本分光株式会社製）を用いて、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を算出した。結果を表２に示す。
＜製造例２＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、下記「５−２：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−２）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
５−２：リフォールディング（大希釈法）
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分をタンパク質変性剤である１０Ｍウレア溶液にて、６Ｍウレア溶液となるように調製し、１２時間、４℃で静置した。調製した溶液を透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）に投入し、溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。その後、脱イオン水を捨て、新たに溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。この操作を残り３回、計５回の透析を繰り返した後、透析膜中の溶液を回収した。
【００６５】
＜製造例３＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、下記「５−３：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−３）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
５−３：リフォールディング（大希釈法）
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分をタンパク質変性剤である１０Ｍウレア溶液にて、６Ｍウレア溶液となるように調製し、１２時間、４℃で静置した。調製した溶液を透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）に投入し、溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。その後、脱イオン水を捨て、新たに溶出画分の３倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。溶出画分の３倍容量の脱イオン水による透析を残り５回繰り返した後、透析膜中の溶液を回収した。
【００６６】
＜製造例４＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」に代えて下記「５’：アフィニティクロマトグラフィー」とする以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−４）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
５’：アフィニティクロマトグラフィー
「４：限外濾過」後のタンパク質を、Ｈｉｓ−ｔａｇを用いたアフィニティクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア社製、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）にて精製し、溶出画分を回収した。
【００６７】
＜比較製造例１＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」に代えて下記「５’’：アフィニティクロマトグラフィー」とする以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−５）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
５’’：アフィニティクロマトグラフィー
「４：限外濾過」後のタンパク質を、Ｈｉｓ−ｔａｇを用いたアフィニティクロマトグラフィー（クロンテック社製、ＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｅｐ  Ｃｏｌｕｍｎｓ）にて精製し、溶出画分を回収した。
【００６８】
＜比較製造例２＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陰イオン交換クロマトグラフィー」を実施せず、上記「５’：アフィニティクロマトグラフィー」を行う以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−６）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
【００６９】
＜比較製造例３＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」を実施しない以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−７）を作製し、βシート構造率を測定した。結果を表２に示す。
【００７０】
【表２】
0006754982.tif 000003
【００７１】
＜実施例１＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、濃度が１ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（１）を得た。タンパク質水溶液（１）を５０ｍｌ遠心管チューブ（アズワン製）に入れた。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス社製）に入れて、−４０℃、１６時間かけて凍結させた。凍結後、真空度が８Ｐａ以下、−２０℃で、９０時間かけて１次乾燥し、真空度が８Ｐａ以下、２０℃で、２４時間かけて２次乾燥させ、発育障害抑制材（１）を得た。
【００７２】
＜実施例２＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が２５．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（２）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（２）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（２）を得た。
【００７３】
＜実施例３＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が４８．４ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（３）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（３）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（３）を得た。
【００７４】
＜実施例４＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が１ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（４）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（４）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（４）を得た。
【００７５】
＜実施例５＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が２４．７ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（５）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（５）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（５）を得た。
【００７６】
＜実施例６＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が４８．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（６）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（６）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（６）を得た。
【００７７】
＜実施例７＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が１ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（７）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（７）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（７）を得た。
【００７８】
＜実施例８＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が２４．４ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（８）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（８）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（８）を得た。
【００７９】
＜実施例９＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が４９．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（９）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（９）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（９）を得た。
【００８０】
＜実施例１０＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−２）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が５ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（１０）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（１０）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（１０）を得た。
【００８１】
＜実施例１１＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−３）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が５ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（１１）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（１１）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（１１）を得た。
【００８２】
＜実施例１２＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−４）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が５ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（１２）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（１２）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（１２）を得た。
【００８３】
＜比較例１＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が０．０１ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（１’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（１’）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（１’）を得た。
【００８４】
＜比較例２＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が１５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（２’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（２’）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（２’）を得た。
【００８５】
＜比較例３＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が５ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（３’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（３’）」を用いること及び発育障害抑制材中の水分含有率が２５．１％となるように調整すること以外は同様にして、発育障害抑制材（３’）を得た。
【００８６】
＜比較例４＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が５ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（４’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（４’）」を用いること及び発育障害抑制材中の水分含有率が３０．２％となるように調整すること以外は同様にして、発育障害抑制材（４’）を得た。
【００８７】
＜比較例５＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−５）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が５ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（５’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（５’）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（５’）を得た。
【００８８】
＜比較例６＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−６）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が５ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（６’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（６’）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（６’）を得た。
【００８９】
＜比較例７＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−７）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が５ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（７’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（７’）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（７’）を得た。
【００９０】
＜比較例８＞
発育障害抑制材として用いるコラーゲンスポンジ（オリンパステルモバイオマテリアル株式会社製、商品名「テルダーミス」）を準備した。
【００９１】
＜評価１＞
○かさ密度の測定
遠沈管（アズワン社製）５０ｍｌ容量の重量（Ｇ１）（ｍｇ）をそれぞれ小数点以下１桁まで測定した。
これらの遠沈管に、タンパク質水溶液（１）〜（１２）及び（１’）〜（７’）をそれぞれ１０ｍｌ入れ、実施例１〜１２及び比較例１〜７の条件で凍結乾燥させた。
凍結乾燥後の遠沈管の重さ（Ｇ２）（ｍｇ）をそれぞれ小数点以下１桁まで測定した。また、遠沈管中の発育障害抑制材の体積（Ｖ）（ｍｌ）を、遠沈管の目盛りから読み取った。
得られた重量（Ｇ１）、（Ｇ２）及び体積（Ｖ）から、下記式によりかさ密度を算出した。結果を表３に示す。
かさ密度（ｍｇ／ｍｌ）＝｛（Ｇ２）−（Ｇ１）｝／（Ｖ）
【００９２】
＜評価２＞
○水分含有率の測定
発育障害抑制材（１）〜（１２）及び（１’）〜（７’）をそれぞれ０．１ｇ用いて、微量水分測定装置（平沼産業社製、「ＡＱ−２２００」）にて水分含有率を測定した。結果を表３に示す。
【００９３】
＜評価３＞
（健常ラットを用いた口腔粘膜欠損層モデルでの治療試験）
５週齢Ｗｉｓｔｅｒ系ラットを準備し口蓋に３ｍｍ径の粘骨膜欠損創を作製した。発育障害抑制材（１）〜（１２）及び（１’）〜（７’）並びにコラーゲンスポンジを各々、投与し、ポリウレタンフィルムを貼付した。治療前ならびに治療期間４週目の犬歯間距離を計測し、術前を１００とした犬歯間成長率を算出した。
また、粘骨膜欠損創を作製しない５週齢Ｗｉｓｔｅｒ系ラットを準備し、準備直後及び準備から４週目の犬歯間距離を計測し準備直後を１００とした犬歯間成長率を算出した。この創傷を作製していないラットの犬歯間成長率を１００として、発育障害抑制材（１）〜（１２）及び（１’）〜（７’）並びにコラーゲンスポンジを用いた場合の発育障害抑制率を評価した。結果を表３に示す。
【００９４】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の発育障害抑制材は、口蓋裂などの先天異常、鼻口腔瘻、上顎洞口腔瘻、食道瘻、気管支瘻、などの瘻孔に代表される生体の粘膜欠損を、適正かつ安全に再建、閉鎖、修復できる発育障害抑制材として有用である。
【配列表】
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