(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
７つのアミノ酸周期の繰り返し配列の一部を、Ｎ末端からＣ末端に向かって１番目及び／又は４番目のアミノ酸残基が、疎水性のアミノ酸残基に置換されており、アミノ酸配列が
ＭＤＡＩＫＫＫ  ＭＱＭＬＫＬＤ  ＬＲＮＬＬＫＲ  ＬＲＱＬＥＡＤ  ＬＫＡＬＥＫＲ  ＬＫＱＬＥＫＥ  ＬＶＳＬＱＫＫ  ＬＫＧＬＥＤＥ  ＬＫＫＬＳＲＡ  ＬＫＫＬＱＲＫ  ＬＫＬＬＥＫＫ  ＬＴＫＬＥＡＤ  ＶＡＳＬＮＲＲ  ＩＱＬＶＥＥＥ  ＬＫＲＬＱＲＲ  ＬＡＴＬＬＱＫ  ＬＲＲＬＥＫＡ  ＬＫＲＬＥＲＧ  ＬＫＶＬＥＳＲ  ＬＱＫＬＥＲＫ（Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｑはグルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリシン、Ｍはメチオニン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｖはバリン）であることを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
７つのアミノ酸周期の繰り返し配列の一部を、Ｎ末端からＣ末端に向かって１番目及び／又は４番目の側鎖のアミノ酸残基が、疎水性のアミノ酸残基に置換されており、アミノ酸配列が
ＭＤＡＩＫＫＫ  ＭＱＭＬＫＬＤ  ＬＲＮＬＬＫＲ  ＬＲＱＬＥＡＤ  ＬＫＡＬＥＫＲ  ＬＫＱＬＥＫＥ  ＬＶＳＬＱＫＫ  ＬＫＧＬＥＤＥ  ＬＫＫＬＳＲ（Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｑはグルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリシン、Ｍはメチオニン、Ｓはセリン、Ｖはバリン）であることを特徴とするタンパク質。
【請求項３】
７つのアミノ酸周期の繰り返し配列の一部を、Ｎ末端からＣ末端に向かって１番目及び／又は４番目の疎水性アミノ酸残基が、疎水性のアミノ酸残基に置換されており、アミノ酸配列が
ＭＤＡＩＫＫＫ  ＭＱＭＬＫＬＤ  ＬＲＮＬＬＫＲ  ＬＲＱＬＥＡＤ  ＬＫＡＬＥＫＲ  ＬＫＱＬＥＫＥ  ＬＶＳＬＱＫＫ  ＬＫＧＬＥＤ（Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｑはグルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリシン、Ｍはメチオニン、Ｓはセリン、Ｖはバリンである）であることを特徴とするタンパク質。
【請求項４】
等電点が６．５以上である請求項１〜３の何れか１項のタンパク質。
【請求項５】
円二色性偏光分光で２２２ｎｍのＣＤ値で見積もられるαへリックス含量が、３７℃で７５％以上である請求項１〜４の何れか１項のタンパク質。
【請求項６】
分子内Ｓ−Ｓ結合、化学架橋を用いることなくαへリックス構造をとっている請求項１〜５の何れか１項のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞透過能（細胞膜透過性）を有するタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜（形質膜）は細胞内と細胞外とを仕切る隔壁であり、細胞の恒常性を維持する機能を担っている。タンパク質や核酸の様に親水性が高い物質は、通常は細胞膜を透過しない。そのため、細胞機能を探るため、細胞機能を制御するため、或いは医療目的のため分子（例えば親水性の高い分子）を細胞内に導入することは一般的には困難である。
これに対して、細胞透過能を有するタンパク質（或いはペプチド）をベクターとして利用し、細胞内にタンパク質その他の細胞膜不透過性の分子を導入する技術が、近年、試みられている。
【０００３】
細胞透過能を有するタンパク質の研究は、ＨＩＶウイルスに由来するＴＡＴペプチドが細胞膜を透過する性質を有するという発見に端を発する。ここでＴＡＴペプチドは、カチオン性であり、アミノ酸残基数が１０程度の長さを有している。係る発見に基づいて近年では、アルギニンをアミノ酸残基数１０前後つなげたポリアルギニンペプチドが、細胞膜透過性を有するタンパク質として良く用いられている。
これに対して発明者等は、上述した様な既存の細胞透過性を有するタンパク質とは全く異なるコンセプトの新しいタンパク質を開発した。当該新しいタンパク質は、αへリックス構造をベースに持っている。
しかし、当該新しいタンパク質が良好な細胞透過性を有するためには、アミノ酸残基数が８３以上の長さが必要であった。一般に、ペプチド配列が長いほど（アミノ酸残基数が大きいほど）、細胞内に導入するべき物質に対して予期しない影響を及ぼしてしまうので、ペプチド配列が短いこと（アミノ酸残基数が小さいこと）が好適である。
【０００４】
ここで、アミノ酸残基数の小さいタンパク質では温度が高くなると構造（例えばαへリックス）を維持できない。そのため、ヒトの体内（３７℃の環境下）では、アミノ酸残基数の小さいタンパク質はその構造を維持することが出来ず、細胞透過能を発揮することも出来ない。
その他の従来技術においても、細胞透過能を有するタンパク質（ペプチド）が提案されている（例えば特許文献１参照）。
しかし、係る従来技術（特許文献１）は高い頻度でタンパク質を細胞内及び／又は核内に輸送することを目的としており、上述した様な問題点を解消することは意図していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００７／０４９７３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上述した従来技術の問題点に鑑みて提案されたものであり、アミノ酸残基数が少なくても細胞透過能を発揮することが出来て、細胞に対して毒性を示し難く、高温下でもその構造を維持することが出来るタンパク質の提供を目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のタンパク質は、７つのアミノ酸周期の繰り返し配列の一部を、Ｎ末端からＣ末端に向かって１番目及び／又は４番目のアミノ酸残基が、疎水性のアミノ酸残基（例えばロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ））に置換されており、アミノ酸配列が
ＭＤＡＩＫＫＫ  ＭＱＭＬＫＬＤ  ＬＲＮＬＬＫＲ  ＬＲＱＬＥＡＤ  ＬＫＡＬＥＫＲ  ＬＫＱＬＥＫＥ  ＬＶＳＬＱＫＫ  ＬＫＧＬＥＤＥ  ＬＫＫＬＳＲＡ  ＬＫＫＬＱＲＫ  ＬＫＬＬＥＫＫ  ＬＴＫＬＥＡＤ  ＶＡＳＬＮＲＲ  ＩＱＬＶＥＥＥ  ＬＫＲＬＱＲＲ  ＬＡＴＬＬＱＫ  ＬＲＲＬＥＫＡ  ＬＫＲＬＥＲＧ  ＬＫＶＬＥＳＲ  ＬＱＫＬＥＲＫ（Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｑはグルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリシン、Ｍはメチオニン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｖはバリン）であることを特徴としている。
また本発明のタンパク質は、７つのアミノ酸周期の繰り返し配列の一部を、Ｎ末端からＣ末端に向かって１番目及び／又は４番目のアミノ酸残基が、疎水性のアミノ酸残基（例えばロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ））に置換されており、アミノ酸配列が
ＭＤＡＩＫＫＫ  ＭＱＭＬＫＬＤ  ＬＲＮＬＬＫＲ  ＬＲＱＬＥＡＤ  ＬＫＡＬＥＫＲ  ＬＫＱＬＥＫＥ  ＬＶＳＬＱＫＫ  ＬＫＧＬＥＤＥ  ＬＫＫＬＳＲ（Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｑはグルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリシン、Ｍはメチオニン、Ｓはセリン、Ｖはバリン）であることを特徴としている。
そして本発明のタンパク質は、７つのアミノ酸周期の繰り返し配列の一部を、Ｎ末端からＣ末端に向かって１番目及び／又は４番目の疎水性アミノ酸残基が、疎水性のアミノ酸残基（例えばロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ））に置換されており、アミノ酸配列が
ＭＤＡＩＫＫＫ  ＭＱＭＬＫＬＤ  ＬＲＮＬＬＫＲ  ＬＲＱＬＥＡＤ  ＬＫＡＬＥＫＲ  ＬＫＱＬＥＫＥ  ＬＶＳＬＱＫＫ  ＬＫＧＬＥＤ（Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｑはグルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリシン、Ｍはメチオニン、Ｓはセリン、Ｖはバリンである）であることを特徴としている。
本発明において、等電点が６．５以上であることが好ましい。
【０００８】
また本発明において、アミノ酸残基の数が６９以下であることが好ましい。
例えば、アミノ酸残基の数は６２或いは５５とすることが出来る。
ただし、アミノ酸残基の数を１４０にすることも可能である。
【０００９】
そして本発明において、円二色性偏光分光で２２２ｎｍのＣＤ値で見積もられるαへリックス含量（α−ｈｅｌｉｘ含量）が、３７℃で７５％以上であることが好ましい。
さらに本発明では、分子内Ｓ−Ｓ結合、化学架橋を用いることなくαへリックス構造をとっていることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
上述の構成を具備する本発明のタンパク質によれば、アミノ酸残基の数が少なくても（アミノ酸残基の数が例えば６９以下：例えばアミノ酸残基数が６２或いは５５）、高い細胞透過能を発揮することが出来る。
そして本発明のタンパク質はαへリックス構造を有しており、温度が高くてもその構造（αへリックス）を維持することが出来る。例えば本発明では、αへリックス含量（α−ｈｅｌｉｘ含量）が、ヒトの体温である３７℃において、２２２ｎｍのＣＤ値で７５％以上とすることが可能である。
【００１１】
従って、アミノ酸残基の数が少なく、分子量が大きくない本発明のタンパク質をベクターとして利用し、ヒトの体内における細胞内にタンパク質その他の細胞膜不透過性の分子を導入することが可能である。
これにより、分子（例えば親水性の高い分子）を細胞内に導入して細胞機能を探ることが可能となり、細胞機能を制御することが可能となり、各種医療行為を施術することが可能となる。
【００１２】
ここで、タンパク質の等電点が１０．４程度と高くなれば、細胞透過性は向上するが細胞に対する毒性を示す恐れがある。本発明のタンパク質の等電点は６．５以上であり、等電点が６．５程度まで低くなれば、細胞透過性は低下するが、細胞に対して毒性を示す恐れは少ない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施形態に係るタンパク質のアミノ酸配列を、ヒトのタンパク質及び公知のタンパク質におけるアミノ酸配列と比較して示す図である。
【図２】本発明の実施例に係るタンパク質と公知のタンパク質を含むその他のタンパク質の細胞透過能を計測した結果を示す図である。
【図３】実施例に係るタンパク質と公知のタンパク質を含むその他のタンパク質における構造の壊れ難さと温度との関係を調べた実験結果を示す図である。
【図４】細胞透過能を有するタンパク質が等電点６．５以上であることを示す実験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、添付図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。
図１では、本発明の実施形態におけるタンパク質の一例であるアミノ酸残基数が１４０のタンパク質（符号「ＬＺ−ＣＣＰＣ１４０」で示す）を、ヒトのタンパク質であるヒト骨格由来αトロポミオシン（符号「Ｈｕｓｋα−Ｔｍ」で示す）のアミノ酸配列と、当該タンパク質の一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されている公知のタンパク質（符号「ＣＣＰＣ１４０」で示す）のアミノ酸配列とを比較して示している。
符号「ＬＺ−ＣＣＰＣ１４０」における数字の１４０は、アミノ酸残基の数を示している。同様に、後述する公知のタンパク質ＣＣＰＣ１４０における数字の１４０も、アミノ酸残基の数を示している。
【００１５】
図１において、「−」は、上段のアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基であることを示している。
また、図１における上段右端の数字「１」、中段右端の数字「５０」、下段右端の数字「９９」は、各段の左端におけるアミノ酸残基をＮ末端から数えた（アミノ酸残基の）数を示している。
【００１６】
図１において、実施形態に係るタンパク質の一例であるＬＺ−ＣＣＰＣ１４０と、公知のタンパク質ＣＣＰＣ１４０は、天然のヒトのタンパク質Ｈｕｓｋα−Ｔｍにおけるアミノ酸と同様に、７つのアミノ酸周期の繰り返し配列毎に分離して表示している。
図１から明らかな様に、公知のタンパク質ＣＣＰＣ１４０は、天然タンパク質Ｈｕｓｋα−Ｔｍにおいて、７つのアミノ酸周期の繰り返し配列（７個のアミノ酸残基で構成される組）の一部において、アミノ酸残基が、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）に置換されている。
より詳細には、公知のタンパク質ＣＣＰＣ１４０は天然タンパク質Ｈｕｓｋα−Ｔｍのアミノ酸配列に対して、Ｎ末端から１６番目、２３番目、６２番目、６９番目、１０４番目、１１４番目、１１５番目、１２２番目、１３９番目のグルタミン酸（Ｅ）がそれぞれアルギニン（Ｒ）に置換されている。そして、Ｎ末端から２０番目、３４番目、４１番目、５８番目、６６番目、８０番目、１００番目、１２１番目のアスパラギン酸（Ｄ）がそれぞれリシン（Ｋ）に置換されている。また、Ｎ末端から７２番目のグルタミン酸（Ｅ）がリシン（Ｋ）に置換されている。
【００１７】
そして図１から明らかな様に、実施形態に係るタンパク質の一例であるＬＺ−ＣＣＰＣ１４０は、公知のタンパク質ＣＣＰＣ１４０における７つのアミノ酸周期の繰り返し配列の一部を、Ｎ末端からＣ末端に向かって１番目及び／又は４番目の側鎖の小さい疎水性アミノ酸残基、親水性の側鎖を持つアミノ酸残基或いは無側鎖に電荷をもつアミノ酸残基が、ロイシン（Ｌ）に置換された配列を有している。
ここで、置換されるアミノ酸残基はロイシン（Ｌ）に限定される訳ではなく、側鎖が大きく疎水性のアミノ酸残基であるイソロイシン（Ｉ）やバリン（Ｖ）等であっても良い。
【００１８】
或いは、図示の実施形態に係るタンパク質の一例であるＬＺ−ＣＣＰＣ１４０は、公知のタンパク質ＣＣＰＣ１４０のアミノ酸配列に対して、Ｎ末端から１５番目、１８番目、２２番目、２５番目、２９番目、３２番目、３６番目、５３番目、６０番目、６７番目、７４番目、７８番目、８１番目、１０２番目、１０９番目、１１６番目、１２０番目、１２３番目、１２７番目、１３０番目、１３４番目、１３７番目のアミノ酸残基がロイシン（Ｌ）に置換されている。
換言すれば、図示の実施形態に係るタンパク質の一例であるＬＺ−ＣＣＰＣ１４０は、Ｈｕｓｋα−Ｔｍのアミノ酸配列に対して、Ｎ末端から１６番目、２３番目、６２番目、６９番目、１０４番目、１１４番目、１１５番目、１２２番目、１３９番目のグルタミン酸（Ｅ）がそれぞれアルギニン（Ｒ）に置換されており、Ｎ末端から２０番目、３４番目、４１番目、５８番目、６６番目、８０番目、１００番目、１２１番目のアスパラギン酸（Ｄ）がそれぞれリシン（Ｋ）に置換されており、Ｎ末端から１５番目、１８番目、２２番目、２５番目、２９番目、３２番目、３６番目、５３番目、６０番目、６７番目、７４番目、７８番目、８１番目、１０２番目、１０９番目、１１６番目、１２０番目、１２３番目、１２７番目、１３０番目、１３４番目、１３７番目のアミノ酸残基がロイシン（Ｌ）に置換されている。また、Ｎ末端から７２番目のグルタミン酸（Ｅ）がリシン（Ｋ）に置換されている。
【００１９】
より詳細には、図示の実施形態に係るタンパク質の一例であるＬＺ−ＣＣＰＣ１４０は、次のようなアミノ酸配列を有する。なお、以下のアミノ酸配列では、７個のアミノ酸残基毎に間隔を空けて表記する。
ＭＤＡＩＫＫＫ  ＭＱＭＬＫＬＤ  ＬＲＮＬＬＫＲ  ＬＲＱＬＥＡＤ  ＬＫＡＬＥＫＲ  ＬＫＱＬＥＫＥ  ＬＶＳＬＱＫＫ  ＬＫＧＬＥＤＥ  ＬＫＫＬＳＲＡ  ＬＫＫＬＱＲＫ  ＬＫＬＬＥＫＫ  ＬＴＫＬＥＡＤ  ＶＡＳＬＮＲＲ  ＩＱＬＶＥＥＥ  ＬＫＲＬＱＲＲ  ＬＡＴＬＬＱＫ  ＬＲＲＬＥＫＡ  ＬＫＲＬＥＲＧ  ＬＫＶＬＥＳＲ  ＬＱＫＬＥＲＫ
なお、Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシステイン、Ｑはグルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリシン、Ｍはメチオニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｗはトリプトファン、Ｙはチロシン、Ｖはバリンである。
【００２０】
図示はしていないが発明者の実験によれば、実施形態に係るタンパク質の一例であるＬＺ−ＣＣＰＣ１４０は、公知のタンパク質ＣＣＰＣ１４０に比較して、良好な細胞透過性（細胞膜透過性）を発揮した。
タンパク質の細胞透過性は、分子が短くなると（アミノ酸残基数が減少すると）、極端に低下する傾向がある。しかし、図示の実施形態に係る細胞透過能を有するタンパク質であれば、実施例或いは実験例で後述するように、アミノ酸残基数が減少しても良好な細胞透過能を発揮した。
【００２１】
アミノ酸配列における特定の順番のアミノ酸残基を所定のアミノ酸残基に置換する手法としては、公知の手法、例えばＰＣＲ、酵素の使用（所謂「ハサミの役割をする酵素」と「ノリの役割をする酵素」）、その他の公知のＤＮＡ変異技術を用いれば良い。或いは、アミノ酸をコードするＤＮＡを全合成しても良い。
そして所定のアミノ酸配列を有するタンパク質を合成するには、例えば、大腸菌内に所定のアミノ酸配列に対応したＤＮＡを導入することにより、大腸菌が当該ＤＮＡにより所定のアミノ酸配列を有するタンパク質を合成する。所定のアミノ酸配列に対応したＤＮＡを合成するには、ＤＮＡ変異に係る公知の手法、例えばＰＣＲ、酵素の使用、その他の公知技術（公知のＤＮＡ変異技術）を用いれば良い。
ここで、ＰＣＲ法等により改変したＤＮＡを大腸菌に取り込ませることで、所望のアミノ酸配列を有するタンパク質を合成することが出来る。
【００２２】
［実施例］
アミノ酸残基数が５５であり、Ｎ末端から５５番目までのアミノ酸配列が図１のＬＺ−ＣＣＰＣ１４０と同一のタンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ５５を生成した。なお符号ＬＺ−ＣＣＰＣ５５における数字の５５は、アミノ酸残基の数を示している。
より詳細には、実施例に係るタンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ５５は、次のようなアミノ酸配列を有する。
ＭＤＡＩＫＫＫ  ＭＱＭＬＫＬＤ  ＬＲＮＬＬＫＲ  ＬＲＱＬＥＡＤ  ＬＫＡＬＥＫＲ  ＬＫＱＬＥＫＥ  ＬＶＳＬＱＫＫ  ＬＫＧＬＥＤ
実施例に係るタンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ５５は、例えば公知のタンパク質ＣＣＰＣ１４０から、上述した公知技術を用いて生成された。
【００２３】
［実験例１］
実施例に係るタンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ５５に加えて、アミノ酸残基数が６２であり且つＮ末端から６２番目までのアミノ酸配列が図１のＬＺ−ＣＣＰＣ１４０と同一のタンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ６２、アミノ酸残基数が６９であり且つＮ末端から６９番目までのアミノ酸配列が図１のＣＣＰＣ１４０と同一のタンパク質ＣＣＰＣ６９、アミノ酸残基数が６２であり且つＮ末端から６２番目までのアミノ酸配列が図１のＣＣＰＣ１４０と同一のタンパク質ＣＣＰＣ６２、アミノ酸残基数が５５であり且つＮ末端から５５番目までのアミノ酸配列が図１のＣＣＰＣ１４０と同一のタンパク質ＣＣＰＣ５５を生成した。
タンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ６２は、次のようなアミノ酸配列を有する。
ＭＤＡＩＫＫＫ  ＭＱＭＬＫＬＤ  ＬＲＮＬＬＫＲ  ＬＲＱＬＥＡＤ  ＬＫＡＬＥＫＲ  ＬＫＱＬＥＫＥ  ＬＶＳＬＱＫＫ  ＬＫＧＬＥＤＥ  ＬＫＫＬＳＲ
そして実験例１では、ＬＺ−ＣＣＰＣ５５と、図１を参照して上述した公知のタンパク質ＣＣＰＣ１４０、ＣＣＰＣ６９、ＣＣＰＣ６２、ＣＣＰＣ５５に各々について、同一の条件で細胞透過能を計測した。
実験例１では、各タンパク質を蛍光色素（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社販売の「Ａｌｅｘａ（商標）４８８」）で蛍光標識した後、ＨｅＬａ細胞の培養液中に添加した。２時間培養した後、細胞をリン酸平衡生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞に取り込まれていないタンパク質を除去した。その後、蛍光顕微鏡で細胞観察を行い、蛍光強度を測定することで、タンパク質の細胞膜透過性を評価した。ここで、細胞の蛍光強度が強い場合には、蛍光標識されたタンパク質を多く取り込んでいる。そのため、細胞の蛍光強度が強い場合ほどタンパク質の細胞透過性が高い。
実験例１の結果を、図２で示す。
【００２４】
図２において、ＬＺ−ＣＣＰＣ５５、ＬＺ−ＣＣＰＣ６２、ＣＣＰＣ１４０、ＣＰＣ６９、ＣＣＰＣ６２、ＣＣＰＣ５５の各々における細胞透過能が棒グラフとして示されている。図２の縦軸は、細胞の蛍光強度を示すパラメータ（Ｍｅａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ａｒｂ）である。横軸は特にパラメータを示すものではない。
図２において、公知のタンパク質ＣＣＰＣ１４０と、ＣＣＰＣ１４０とはアミノ酸残基数は異なるが、Ｎ末端からのアミノ酸配列が同一のタンパク質ＣＣＰＣ６９、ＣＣＰＣ６２、ＣＣＰＣ５５を比較すれば明らかな様に、アミノ酸残基数が少ない方が細胞透過能は低い。特に、アミノ酸残基数が６９以下のタンパク質（ＣＣＰＣ６９、ＣＣＰＣ６２、ＣＣＰＣ５５）では、細胞透過能が有意に低いことが図２から明らかである。
【００２５】
一方、図２で示す様に、実施例に係るタンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ５５の細胞透過能は非常に高く、アミノ酸残基数が１４０のタンパク質ＣＣＰＣ１４０と同程度であることが、実験例１で判明した。
すなわち、実施例に係るタンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ５５は、アミノ酸残基数が６９以下であっても細胞透過能は高いことが明らかになった。
【００２６】
［実験例２］
ＣＣＰＣ１４０及びそれと同様なアミノ酸配列を有するタンパク質は、ヒトの体温である３７℃における構造が、細胞透過能と関連がある。
実験例２では、上述したタンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ５５、ＣＣＰＣ１４０、ＣＣＰＣ８３、ＣＣＰＣ６９、ＣＣＰＣ６２、ＣＣＰＣ５５の各々において、温度に対するタンパク質の構造（αへリックス）の壊れ難さを計測した。
すなわち実験例２では、タンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ５５、ＣＣＰＣ１４０、ＣＣＰＣ８３、ＣＣＰＣ６９、ＣＣＰＣ６２、ＣＣＰＣ５５の各々において、温度を０℃〜９０℃に変化した際において、タンパク質の構造が壊れずに保持することが出来る割合（２２２ｎｍのＣＤ値で見積もられるα−ｈｅｌｉｘ含量）を、円二色性偏光分光を用いて計測した。
【００２７】
実験例２の結果が、図３で示されている。
図３において、横軸は温度（℃）を示し、点線は３７℃（人の体温）を示している。一方、図３の縦軸は、タンパク質の構造が壊れずに保持することが出来る割合のパラメータ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｔｙ（２２２ｎｍ））を示しており、タンパク質の構造（αへリックス）を保持しているタンパク質の数が全体の７５％以上であることを示すパラメータを示している。
図３において、上方の領域はタンパク質の構造が壊れていないことを示し、下方の領域はタンパク質の構造が壊れていることを示している。図３で示すタンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ５５、ＣＣＰＣ１４０、ＣＣＰＣ８３、ＣＣＰＣ６９、ＣＣＰＣ６２、ＣＣＰＣ５５の特性曲線から明らかな様に、高温になるほどタンパク質の構造は壊れる。
【００２８】
図３において、タンパク質ＣＣＰＣ１４０、ＣＣＰＣ８３、ＣＣＰＣ６９、ＣＣＰＣ６２、ＣＣＰＣ５５の特性曲線を比較すれば、ＣＣＰＣ１４０、ＣＣＰＣ８３、ＣＣＰＣ６９、ＣＣＰＣ６２、ＣＣＰＣ５５の順に特性曲線が右側に且つ上側に位置しており、アミノ酸残基の数が多いタンパク質は、アミノ酸残基の数が少ないタンパク質に比較して、温度変化に対して（或いは高温に対して）壊れ難いことが明らかである。
それに対して、実施例に係るタンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ５５はアミノ酸残基数が５５であるにも拘らず、アミノ酸残基数が５５よりも多いタンパク質ＣＣＰＣ８３、ＣＣＰＣ６９、ＣＣＰＣ６２に比較して、温度が高くてもタンパク質の構造が壊れ難いことが示されている。そして、ヒトの体温である３７℃においても、タンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ５５は、アミノ酸残基数が５５であるにも拘らず、アミノ酸残基が多いタンパク質ＣＣＰＣ８３、ＣＣＰＣ６９、ＣＣＰＣ６２よりも構造が壊れ難いことが示されている。
すなわち、実施例に係るタンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ５５は、アミノ酸残基数が少なくても、高温に対してタンパク質の構造（αへリックス）が壊れ難いことが明らかになった。
【００２９】
発明者はタンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ６２について同様な実験を行っている。
当該実験によれば、タンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ６２は、ＬＺ−ＣＣＰＣ５５と同様に、アミノ酸残基数が６９以下であっても高い細胞透過能（ＣＣＰＣ１４０と同程度の透過能）を有しており、且つ、ＣＣＰＣ１４０と匹敵する程度に高温に対してタンパク質の構造が壊れ難かった。
【００３０】
［実験例３］
次に、タンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ６２、ＬＺ−ＣＣＰＣ５５について、ＣＤスペクトルを分析し、αへリックス構造であるか否かを分析した。
分析の結果、図示はされていないが、実験例３では、タンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ６２、ＬＺ−ＣＣＰＣ５５の何れにおいても、架橋やＳ−Ｓ結合の様な化学的或いは人工的な結合を行うことなく、２０７ｎｍと２２２ｎｍの所に吸収極大を有しており、αへリックス構造を有していた。
【００３１】
［実験例４］
タンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ１４０、ＬＺ−ＣＣＰＣ６２、ＬＺ−ＣＣＰＣ５５について、等電点を計測し、何れもタンパク質においても等電点は６．５以上であることを確認した。
実験例４では、タンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ１４０、ＬＺ−ＣＣＰＣ６２、ＬＺ−ＣＣＰＣ５５をｐＨ６．５の緩衝溶液に懸濁し、陽イオン交換カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社販売の商品名「ＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ」）と混和したところ、当該陽イオン交換カラムに強く吸着することが確認された。そして塩濃度を増加すると陽イオン交換カラムから上記タンパク質が溶出することが確認された。
係る実験結果が図４で示されている。
【００３２】
図４において、左側の縦軸は吸光度（ＡＢＳ：ａｒｂ）を示しており、右側の縦軸は塩分濃度（Ｍ）を示し、横軸は経過時間（ｍｉｎ）を示している。そして、図４の左下の領域から右上の領域に延在する点線が、塩分濃度を示している。
実験当初、上記タンパク質が緩衝溶液に懸濁されて陽イオン交換カラムに吸着した段階では、吸光度は殆どゼロであり、タンパク質が溶出していない。そして実験から時間が経過して、塩分濃度が上昇すると、吸光度が急上昇し、タンパク質が溶出したことが示されている。
ここで、タンパク質が溶出したことから、実験例４において、緩衝溶液中にはタンパク質が存在したことが明らかである。そして実験当初、吸光度は殆どゼロでタンパク質が溶出していないため、タンパク質が陽イオン交換カラムに強く吸着されたことが分かる。このことから緩衝溶液中での電荷が＋であることが明らかであり、タンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ１４０、ＬＺ−ＣＣＰＣ６２、ＬＺ−ＣＣＰＣ５５の等電点が６．５以上であることが明らかである。そしてタンパク質ＬＺ−ＣＣＰＣ１４０、ＬＺ−ＣＣＰＣ６２、ＬＺ−ＣＣＰＣ５５は（等電点が１０．４程度のタンパク質に比較して）細胞に対して毒性を示す恐れが少ない。
【００３３】
図示の実施形態はあくまでも例示であり、本発明の技術的範囲を限定する趣旨の記述ではないことを付記する。
【符号の説明】
【００３４】
Ｈｕｓｋα−Ｔｍ・・・ヒト骨格由来αトロポミオシン
ＣＣＰＣ１４０・・・ヒト骨格由来αトロポミオシンと類似するアミノ酸配列を有するアミノ酸残基数１４０の公知のタンパク質
ＣＣＰＣ８３・・・ヒト骨格由来αトロポミオシンと類似するアミノ酸配列を有するアミノ酸残基数８３の公知のタンパク質
ＣＣＰＣ６９・・・ヒト骨格由来αトロポミオシンと類似するアミノ酸配列を有するアミノ酸残基数６９の公知のタンパク質
ＣＣＰＣ６２・・・ヒト骨格由来αトロポミオシンと類似するアミノ酸配列を有するアミノ酸残基数６２の公知のタンパク質
ＣＣＰＣ５５・・・ヒト骨格由来αトロポミオシンと類似するアミノ酸配列を有するアミノ酸残基数５５の公知のタンパク質
ＬＺ−ＣＣＰＣ１４０・・・ＣＣＰＣ１４０と類似するアミノ酸配列を有するが、その一部のアミノ酸残基が置換されている実施形態に係るタンパク質
ＬＺ−ＣＣＰＣ６２・・・ＣＣＰＣ６２と類似するアミノ酸配列を有するが、その一部のアミノ酸残基が置換されている実施形態に係るタンパク質
ＬＺ−ＣＣＰＣ５５・・・ＣＣＰＣ５５と類似するアミノ酸配列を有するが、その一部のアミノ酸残基が置換されている実施例に係るタンパク質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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