(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるコンティグの発現量を測定することを特徴とする、黄色系又は白色系真珠を形成する真珠貝の選別方法であって、配列番号１〜３で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有し、白色系真珠形成に関与するＤＮＡは白色系真珠と選別し、配列番号４〜７で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有し、黄色系真珠形成に関与するＤＮＡは黄色系真珠と選別する方法。
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１、２若しくは３で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有し、白色系真珠形成に関与するＤＮＡ、又は、配列番号４、５、６若しくは７で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有し、黄色系真珠形成に関与するＤＮＡ。
【請求項２】
下記の（ａ１）又は（ｃ１）のＤＮＡからなり、白色系真珠形成に関与するコンティグからなるＤＮＡ。
（ａ１）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡと９５％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項３】
下記の（ａ２）又は（ｃ２）のＤＮＡからなり、黄色系真珠形成に関与するコンティグからなるＤＮＡ。
（ａ２）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ２）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡと９５％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白色系又は黄色系真珠形成遺伝子及びその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真珠の色調は真珠品質を決める主要因のひとつであり、なかでも黄色度は真珠表面に形成される真珠層に含まれる黄色色素の量で決まり、真珠の価格に大きく影響する。真珠層の黄色色素量は遺伝的に決まることが判っており、掛け合わせによって系統の保持が行われているが、原因遺伝子はわかっていない。なお、特許文献１には、真珠貝の貝殻、外套膜で発現する遺伝子が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００７／１４８７２３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に記載のチロシナーゼ遺伝子は、外套膜に特異的に発現する遺伝子であり、貝殻の色に関与している可能性はあるが、真珠の色に関与しているか否かは不明である。
従って、本発明の課題は、真珠の白色系又は黄色系の色調形成に関与する遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、黄色と白色の明確に色調の異なる貝殻真珠層を持つアコヤガイを用い、これらから得たピースを同一母貝に移植し真珠を作らせることで、同一環境条件下で異なる色調の真珠を作る真珠袋を得た。ここから白色系と黄色系の真珠袋における遺伝子発現の網羅的な比較解析を行い、真珠の色調に応じて特異的に発現する遺伝子を探索したところ、白色系真珠袋に特異的に発現する遺伝子を３種、黄色系真珠袋に特異的に発現する遺伝子を４種見出し、これらの遺伝子が白色系又は黄色系真珠の形成に関与しており、これらの遺伝子を用いれば真珠貝における真珠の色調を選別できること、さらにこれらの遺伝子のうち３種は新規遺伝子であることも見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔５〕を提供するものである。
【０００７】
〔１〕下記の（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子の発現量又は当該遺伝子にコードされたタンパク質の量を測定することを特徴とする、黄色系又は白色系真珠を形成する真珠貝の選別方法。
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１、２、３、４、５、６又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、白色系又は黄色系真珠の形成に関与するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１、２、３、４、５、６又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、白色系又は黄色系真珠の形成に関与するＤＮＡ。
【０００８】
〔２〕下記の（ａ１）〜（ｃ１）のＤＮＡからなる白色系真珠形成に関与する遺伝子。
（ａ１）配列番号１又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ１）配列番号１又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、白色系真珠の形成に関与するＤＮＡ、
（ｃ１）配列番号１又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、白色系真珠の形成に関与するＤＮＡ。
【０００９】
〔３〕下記の（ａ２）〜（ｃ２）のＤＮＡからなる黄色系真珠形成に関与する遺伝子。
（ａ２）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ２）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、黄色系真珠の形成に関与するＤＮＡ、
（ｃ２）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、黄色系真珠の形成に関与するＤＮＡ。
【００１０】
〔４〕〔２〕に記載のＤＮＡにコードされた白色系真珠形成に関与するタンパク質。
〔５〕〔３〕に記載のＤＮＡにコードされた黄色系真珠形成に関与するタンパク質。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の遺伝子は、黄色系真珠及び白色系真珠の遺伝子マーカーとして利用でき、また色調に特色のある真珠貝系統のマーカー選抜育種や系統保持に有用である。また、本発明の遺伝子を使用すれば、ゲノム編集などにより人為的に真珠貝の真珠の色調を変える技術の開発も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】発現パターンの階層的クラスター解析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の黄色系又は白色系真珠を形成する真珠貝の選別方法に用いられる遺伝子は、下記（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子である。
【００１４】
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１、２、３、４、５、６又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、白色系又は黄色系真珠の形成に関与するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１、２、３、４、５、６又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、白色系又は黄色系真珠の形成に関与するＤＮＡ。
【００１５】
これらの遺伝子は、黄色系真珠形成に関与する遺伝子又は白色系真珠形成に関与する遺伝子である。配列番号３〜６のＤＮＡからなる遺伝子は、黄色系真珠形成に関与する遺伝子であり、配列番号１、２及び７のＤＮＡからなる遺伝子は、白色系真珠形成に関与する遺伝子である。
【００１６】
また、配列番号１、６又は７のＤＮＡからなる遺伝子は、新規遺伝子である。本発明の白色系真珠形成に関与する新規遺伝子は、下記の（ａ１）〜（ｃ１）のＤＮＡからなる。
（ａ１）配列番号１又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ１）配列番号１又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、白色系真珠の形成に関与するＤＮＡ、
（ｃ１）配列番号１又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、白色系真珠の形成に関与するＤＮＡ。
【００１７】
本発明の黄色系真珠形成に関与する新規遺伝子は、下記の（ａ２）〜（ｃ２）のＤＮＡからなる。
（ａ２）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ２）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、黄色系真珠の形成に関与するＤＮＡ、
（ｃ２）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、黄色系真珠の形成に関与するＤＮＡ。
【００１８】
ここでストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃又は０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件でハイブリダイズすることである。また、本発明の遺伝子には、配列番号１〜７で表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有する塩基配列を有するものが含まれるが、その同一性は８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましい。
【００１９】
また、本発明においては、（ａ１）〜（ｃ１）及び（ａ２）〜（ｃ２）のＤＮＡにコードされたタンパク質も提供する。ここで、これらのタンパク質には、配列番号１、６又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質だけでなく、それらのアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。また、それらのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質も含まれる。
【００２０】
本発明の遺伝子は、真珠母貝の真珠袋から採取したｍＲＮＡライブラリーから、白色系又は黄色系真珠を形成する真珠において特異的に発現が増加している遺伝子を選択することによりクローニングできる。その手法としては、マイクロアレイ法、次世代シーケンス法、サブトラクション法等が挙げられるが、次世代シーケンス法によるのが好ましい。ここで次世代シーケンス法とは、従来のサンガー法とは異なる原理を用いた次世代型シーケンサーを用いた配列情報の取得法であり、まず解析する生物や組織から抽出したｍＲＮＡを酵素処理で数百ｂｐ程度の適当な長さに切断後、これを鋳型にｃＤＮＡライブラリーを構築する。これをビーズやフローセルなどの基盤に結合させ、アレイ上に展開する。アレイ上の百万〜数千万のｃＤＮＡにつき、ｃｙｃｌｉｃ ａｒｒａｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにより同時に配列情報の取得を行う。サンガー法と異なり、高度に並列化処理を行うことで、低コストかつ短時間で莫大な配列情報が取得できる。また、ｃＤＮＡの３’末端を選択的にシーケンスすることで、各配列を有する遺伝子の発現頻度から発現量も推定できる。サブトラクション法よりも網羅的な解析が可能で、かつ各遺伝子の発現量情報も得ることができる。また、マイクロアレイ法と異なり、既存の遺伝子情報が少ない、あるいは全くない生物でも、網羅的な遺伝子発現解析ができることが大きな利点である。
【００２１】
本発明の遺伝子は、例えばビオチン等で標識したｄＴプライマーを用いてｍＲＮＡの３’末端配列を集めたライブラリーを構築し、これを鋳型にｃＤＮＡライブラリーを構築する。これを次世代シーケンサーにかけて、配列情報を得、配列情報をアセンブルしてもとのｃＤＮＡの配列を再成形する。さらに５’ＲＡＣＥにより完全長ｃＤＮＡ配列を得る。
【００２２】
また、本発明の遺伝子は、前記（ａ）の塩基配列に基づいて、真珠袋由来ｍＲＮＡを鋳型にした逆転写ＰＣＲによっても製造することができる。ここから５’および３’ＲＡＣＥにより完全長ｃＤＮＡ配列を得ることができる。
【００２３】
真珠母貝としては、真珠の養殖に使用される貝であればよく、例えばアコヤガイ（Ｐｉｎｃｔａｄａ ｆｕｃａｔａ）、イケチョウガイ（Ｈｙｒｉｏｐｓｉｓ ｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ）、ヒレイケチョウガイ（Ｈｙｒｉｏｐｓｉｓ ｃｕｍｉｎｇｉｉ）、マベ（Ｐｔｅｒｉａ ｐｅｎｇｕｉｎ）、シロチョウガイ（Ｐｉｎｃｔａｄａ ｍａｘｉｍａ）、クロチョウガイ（Ｐｉｎｃｔａｄａ ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒａ）等が挙げられるが、アコヤガイが好ましい。
【００２４】
得られた本発明の遺伝子を用いれば、公知の組換えＤＮＡ技術により、本発明の組換えタンパク質を製造することができる。組換えタンパク質の製法としては、前記の（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡを含有するベクターを作製し、該ベクターによって宿主細胞を形質転換し、当該形質転換体を培養してその培養物から回収する方法が挙げられる。
上記宿主細胞としては、原核生物及び真核生物のいずれも用いることができ、例えば原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌といった一般的に用いられるものが広く挙げられ、好適には大腸菌を例示できる。また、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれる。
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明の遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ塩基配列、さらに蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の上流に位置するプロモーター、ポリアデニル化部位及び転写終了配列を保有するものが挙げられ、これはさらに必要により複製起点を有していてもよい。
所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿主細胞への導入法及びこれによる形質転換法としては、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
また得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によりコードされる本発明の目的タンパク質が、形質転換体の細胞内、細胞外又は細胞膜上に発現、生産（蓄積、分泌）される。
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
かくして得られる本発明の組換えタンパク質は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作［「生化学データーブックＩＩ」、１１７５−１２５９頁、第１版第１刷、１９８０年６月２３日株式会社東京化学同人発行；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５（２５），８２７４（１９８６）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６３，３１３（１９８７）など参照］により分離、精製できる。
【００２５】
本発明の（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子は、白色系真珠を形成する真珠袋又は黄色系真珠を形成する真珠袋で、それぞれ特異的に発現し、白色系真珠又は黄色系真珠の形成に関与する遺伝子である。従って、これらの遺伝子の発現量又は当該遺伝子にコードされたタンパク質の量を測定すれば、白色系又は黄色系真珠を形成する真珠貝を選別することができる。
【００２６】
これらの遺伝子の発現量を測定するには、これらの遺伝子の一部又は全部をプローブ又はプライマーを使用する方法が採用できる。具体的には、公知の方法、例えば、前記プローブやプライマーを使用したドットブロット法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法等が挙げられる。
また、前記タンパク質の量を測定するには、当該タンパク質又はその部分ペプチドに対する抗体を使用する公知の免疫学的な方法、具体的には酵素免疫測定法などによって測定することができる。
【実施例】
【００２７】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００２８】
実施例１
ミキモト真珠研究所で保持されている白色系と黄色系のアコヤ貝からピースを採り、同一の母貝に挿核して、色調以外の条件をできるだけ均一にした真珠袋を作らせた。母貝１００個体にそれぞれ色調の異なる２個のピースの挿核を行い、３か月の飼育後、母貝１００個体から２００個の真珠と真珠袋をサンプリングした。得られた真珠の色調を確認したところ、母貝が同じでも、ピース貝の色調に依存して、黄色と白色が明確に分かれることが示された。本研究では同一個体内で黄色度の差が明確でかつ綺麗な真珠層を作っている真珠袋を６個体分計１２サンプル（白色系６サンプル、黄色系６サンプル）を選別し、遺伝子解析用試料とした。真珠袋から全ＲＮＡを抽出しバーコードを付与したｃＤＮＡライブラリーを構築後、ＩｏｎＰｒｏｔｏｎシーケンサーでシーケンシングを行った。得られた配列データをＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈによってトリミング後、Ｔｒｉｎｉｔｙによるｄｅ  ｎｏｖｏアセンブリでｃｏｎｔｉｇを形成し、発現量データを取得、ＲソフトウェアのＴＣＣパッケージを用いて、白色系と黄色系で発現が異なる遺伝子を抽出した。
【００２９】
（１）ｄｅ  ｎｏｖｏアセンブリの結果９７，６６３個のｃｏｎｔｉｇが得られた。全１２サンプルにおける９７，６６３個のｃｏｎｔｉｇの発現パターンの階層的クラスター解析を行った結果、同一の母貝から得られたサンプルがクラスターを作り、色調によるクラスターは作らないことが示された（図１）。このことから色調によって発現変動する遺伝子はごく少数であると予想された。これは色調以外の条件をできるだけ揃えるという、本研究の実験設定が上手く行っていることを示している。
【００３０】
（２）９７，６６３個のｃｏｎｔｉｇのうち、白色系と黄色系間で統計的に有意に発現量が異なるものは７個検出された。３個は白色系で４個は黄色系で特異的に発現しており、色調が異なるとほとんど発現は検出されない。また４つは既報の遺伝子と相同性がみられたが、３つは新規遺伝子であった（表１）。
【００３１】
【表１】
0006755486.tif 000002
【００３２】
表１に記載の遺伝子の塩基配列を配列表に示す。
【図１】
0006755486.tif 000003
【配列表】
0006755486000001.app