(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の改良を含む、固相ペプチド合成における脱保護方法：
有機塩基の脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびすべての過剰の活性化されたアミノ酸の混合物に添加する、
ここで、該有機塩基は、ピペリジン、ピロリジン、および４−メチルピペリジンからなる群から選択され、
該有機塩基が、該混合物に、少なくとも５０体積％の高濃度の脱保護組成物で、該カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびすべての過剰の活性化されたアミノ酸の混合物の全体積の２０％以下の少体積で加えられ、該有機塩基が、カップリング溶液の体積を基準として１：５の体積比で添加される；ならびに
その前のサイクルのカップリング工程と後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に排液工程が全くない。
【請求項２】
さらに、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖の混合物に、脱保護組成物を添加する工程に続いて、次に続くアミノ酸を添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カップリング溶液の体積を基準として１：２０〜１：３の比率でカップリング溶液混合物にそのまま添加される液体として有機塩基を添加することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
小体積の脱保護溶液が２ｍＬ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
カップリング溶液を少なくとも３０℃の温度で維持することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｆｍｏｃ固相ペプチド化学を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
脱保護組成物がカップリング溶液の体積の１／３未満である、請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  本発明は、ペプチドの固相合成（“ＳＰＰＳ”）における改良に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]  ペプチドはアミノ酸の連結鎖であり、アミノ酸は大部分の生物にとって基本的構築ブロックである。ペプチドはタンパク質、すなわちアミノ酸の長い複雑な鎖の前駆体でもある。ペプチドおよびタンパク質はヒトおよび動物の生命にとって根本的なものであり、それらは多種多様な自然プロセスを駆動し、作用し、または制御する。
【０００３】
[0003]  単なる一例として、特定の癌において腫瘍特異的変異を“覗き込む(keyhole)”ことができ、よって腫瘍特異的ワクチンとして作用する可能性のあるペプチドが、最近同定された(たとえば、SANPSON, JH ET AL. An epidermal growth factor receptor variant III-targeted vaccine is safe and immunogenic in patients with glioblastoma multiforme. Mol. Cancer Ther. 2009; 8: 2773-2779; LI G, SIDDHARTHA M, WONG AJ. The epidermal growth factor variant III peptide vaccine for treatment of malignant gliomas. Neurosurg. Clin. N. Am. 2010; 21: 87-93; LI G, WONG AJ. EGF receptor variant III as a target antigen for tumor immunotherapy. Expert Rev. Vaccines 2008; 7: 977-985)。
【０００４】
[0004]  その結果、生物科学および医薬においてペプチドおよびタンパク質の研究ならびにペプチドおよびタンパク質を合成する可能性に著しい関心がもたれている。
[0005]  概念として、固相合成は比較的簡単かつ単純である。アミノ酸を酸側で連結基により固相粒子に結合させ、アミン側で保護基に結合させる。第２酸（特に、それの酸基）を最初の酸のアミン基にカップリングさせることができるように、保護基を除去する。第２（および後続）酸も最初は保護されており、よって一般的シーケンスは、脱保護し、カップリングさせ、そして目的ペプチドが完成するまで反復することであり、続いて完成したペプチドが固相レジンから開裂される。
【０００５】
[0006]  固相ペプチド合成は、Ｒ．Ｂ．  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄが固相法を用いる４酸の鎖の合成を発表した１９６３年にそれの発端があった(R. B. MERRIFIELD; Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide; J. Am. Chem. Soc., 1963, 85 (14), pp 2149-2154)。
【０００６】
[0007]  当時、有機反応をこの様式で実施できることは一般に認識されてはいたが、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を現実的な純度のより長いペプチド配列に適用するのは難しいであろうと推測されていた。具体的に、カップリング工程と脱保護工程の間の単離工程は中間体の同定を行なうことなく洗浄のみによって実施できるというＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの示唆は、長期的な成功をもたらす可能性がないと考えられた。ペプチド合成においては２つの問題が特徴的である：（１）望ましくない副産物の合成；および（２）前の工程またはサイクルからの除去されなかった酸の存在に基づくある画分の目的外配列の合成。特に、そのすぐ前に添加した（“活性化された”）酸がカップリング工程後に残存する傾向があり、したがってそれを何らかの様式で除去しなければならない。
【０００７】
[0008]  それにもかかわらず、CHAN  AND  WHITE, Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis (Oxford University Press 2000)に概説されるように、洗浄工程が許容できる純度をもたらし、それらの洗浄工程および中間体の詳細な特性解明の回避がもつ全般的な単純さは、ＳＰＰＳ法にそれの迅速性および効率性という利点を与える（たとえば、１頁）。
【０００８】
[0009]  したがって、当技術分野において一般的に十分に理解されるように、ＳＰＰＳの脱保護工程は一般に、保護された酸に有機塩基を添加し、次いで反応容器を排液し  −ＳＰＰＳの利点の１つは有機化合物をそれらがあたかも固体であるかのように取り扱えることである−  脱保護された鎖を次いで洗浄することにより実施される。大部分の状況で、異なる配列または望ましくない副産物を形成する可能性があるあらゆるものを除去するために反復５回の洗浄が一般的かつ十分である。次いでカップリング工程、続いてもういちど排液工程、そしてもういちど反復洗浄（この場合も５回の洗浄が一般的である）を実施する。
【０００９】
[0010]  より最近になって（たとえば、US 20120041173；その内容を全体として本明細書に援用する）、次のサイクルのための脱保護塩基の添加がその前のサイクルから残された活性化された酸を掃去し、よって純度を保証しかつ目的外の配列を避けるために必要な洗浄サイクルの回数を減らし、または排除すると認識されるようになった。
【００１０】
[0011]  当技術分野で十分に理解されている点について述べると、いずれかのＳＰＰＳ工程を改良、促進または排除することは、より長いペプチドを合成するのに伴って幾何学的に有利となる。これに関して、マイクロ波支援手法がほぼ１０年前に導入された（たとえば、本出願の譲受人に譲渡されたUS Patent No. 7393920；その内容を同様に全体として本明細書に援用する）後、当技術分野で広く受け入れられるようになった。マイクロ波手法はサイクル時間を数時間から数分にまで短縮し、よってＳＰＰＳに、およびＳＰＰＳに依存する研究または商業に、多数の利点をもたらした。
【００１１】
[0012]  マイクロ波支援固相ペプチド合成のようなより新しい技術を典型的または一般的と呼ぶことができるとすれば、掃去と脱保護の両方の反応が確実に起きるように、脱保護用塩基を添加する工程は通常は反応容器内の排液されたレジンおよび付着しているカップリング工程後のペプチドを覆うのに十分な体積の比較的低濃度のものを添加することにより実施される。
【００１２】
[0013]  しかし、そうすることにより、多量の希薄な有機塩基溶液を室温（たとえば、２５°）で添加し、一方でカップリング工程は高められた温度、たとえば約９０℃の温度（限定ではないが）で実施されたばかりであるという点で、温度低下（ある意味では）が生じる。普通の熱伝達状況において予想されるように、これにより反応容器内の成分の全体的温度が低下し、次の脱保護およびカップリングサイクルに必要な反応温度に達するまでそれを次いで再加熱しなければならない。
【００１３】
[0014]  これらの特徴はきわめて厳密な意味でのみ不利であるが、ＳＰＰＳサイクルにおいて工程が増強され、促進され、または単純に不必要になれば、全体的な有利性が常に存在する。ペプチド鎖長が増大するのに伴ってそのような改良はますます有利になる（かつ慣用されている方法はより不利になる）。よって、一般的な有機固相反応（すなわち、数工程のみ、おそらくわずか１工程のみの固相工程を必要とするもの）においては相応して無意味なままの可能性がある速度上の利点が、１０、２０またはそれ以上の酸を含むペプチドをＳＰＰＳにより合成する場合には重要性が漸増する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】US 20120041173
【特許文献２】US Patent No. 7393920
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】SANPSON, JH ET AL. An epidermal growth factor receptor variant III-targeted vaccine is safe and immunogenic in patients with glioblastoma multiforme. Mol. Cancer Ther. 2009; 8: 2773-2779
【非特許文献２】LI G, SIDDHARTHA M, WONG AJ. The epidermal growth factor variant III peptide vaccine for treatment of malignant gliomas. Neurosurg. Clin. N. Am. 2010; 21: 87-93
【非特許文献３】LI G, WONG AJ. EGF receptor variant III as a target antigen for tumor immunotherapy. Expert Rev. Vaccines 2008; 7: 977-985
【非特許文献４】SANPSON, JH ET AL; Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide; J. Am. Chem. Soc., 1963, 85 (14), pp 2149-2154
【非特許文献５】CHAN  AND  WHITE, Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis (Oxford University Press 2000)
【発明の概要】
【００１６】
[0015]  １側面において、本発明は、下記の改良を含む、固相ペプチド合成における脱保護方法である：高濃度および小体積の脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびすべての過剰の活性化された酸の混合物に添加する；ならびにその前のサイクルのカップリング工程と後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に排液工程が全くない。
【００１７】
[0016]  他の側面において、本発明は、下記の改良を含む、固相ペプチド合成における脱保護方法である：保護されたアミノ酸と液体有機塩基を反応容器内で混和することにより、保護されたアミノ酸を脱保護する；および脱保護工程の途中または後に、反応容器内の周囲圧力を真空吸引で低下させて、中間の排液工程なしで液体有機塩基を除去する。
【００１８】
[0017]  他の側面において、本発明は、下記の改良を含む、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）における脱保護方法である：蒸発する塩基を反応容器から排出させるための通路を備えた状態で、少なくとも約６０℃の温度において、保護されたアミノ酸を脱保護する。
【００１９】
[0018]  他の側面において、本発明はマイクロ波支援固相ペプチド合成のためのシステムである。この側面において、システムは、マイクロ波照射をマイクロ波キャビティー内へ向けるように配置したマイクロ波源；そのキャビティー内のマイクロ波透過性反応容器；およびその反応容器に接続した真空源を含む。
【００２０】
[0019]  他の側面において、本発明は、下記の改良を含む、固相ペプチド合成における脱保護方法である：高濃度および小体積の脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびすべての過剰の活性化された酸の混合物に添加する；ならびにその前のサイクルのカップリング工程と後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に排液工程が全くない；ならびにその後、反応容器内の周囲圧力を真空吸引で低下させて、排液工程全くなしで脱保護組成物を除去する。
【００２１】
[0020]  他の側面において、本発明は、下記の工程を含む、固相ペプチド合成における脱保護方法である：高濃度および小体積の脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびすべての過剰の活性化されたアミノ酸の混合物に添加する；ならびにその前のサイクルのカップリング工程と、その前のサイクルのカップリング溶液の少なくとも５０％が取り出される後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に排液工程が全くない；ならびにカップリング溶液が少なくとも３０℃である。
【００２２】
[0021]  以上および他の本発明の目的および利点、ならびにそれらを達成する様式は、以下の詳細な記載を添付の図面と合わせたものに基づいてより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】[0022]  図１は、ＳＰＰＳ合成の一般的工程の模式図である。
【図２】[0023]  図２は、改良型の一般的ＳＰＰＳペプチド合成の模式図である。
【図３】[0024]  図３は、本発明の第１態様の模式図である。
【図４】[0025]  図４は、本発明の熱的利点を示す図である。
【図５】[0026]  図５は、本発明の第２態様の模式図である。
【図６】[0027]  図６は、本発明方法を実施するために用いる機器の模式図である。
【図７】[0028]  図７は、本発明を実施するために用いる機器の一部の第２模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
[0029]  図１は、固相ペプチド合成中に反復される、おおまかに２０と表示される一般的サイクルの模式図である。そこに示すように、付加すべき次の酸２１が、保護された形で、２２に模式的に図示する反応容器へ添加される。脱保護工程２３は、反応容器２２内で、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の約２０体積％の濃度の有機塩基を添加することにより実施される。有用な有機塩基にはピペリジン（Ｃ５Ｈ１１Ｎ；ＣＡＳ  Ｎｏ  １１０−８９−４）、ピロリジン（Ｃ４Ｈ９Ｎ；ＣＡＳ  Ｎｏ  １２３−７５−１）、および４−メチルピペリジン（Ｃ６Ｈ１３Ｎ；ＣＡＳ  Ｎｏ．６２６−５８−４）が含まれるが、これらに限定されない。関連する矢印の位置が示すように、脱保護溶液２８は次の酸の前に添加される。
【００２５】
[0030]  脱保護溶液は次いで排液され（工程２４）、その後、洗浄液（たとえば、メタノールまたはイソプロパノール）が、洗浄工程２５（５回反復で反復実施されるのが一般的である）のための反応容器に添加される。洗浄溶液は次いで第２排液工程２６において除去され、それによりカップリング工程２７が起きる。カップリング用組成物は次いで第３排液工程３０において除去され、続いて第２洗浄工程３１がこの場合も５回反復して行なわれる。
【００２６】
[0031]  図１は模式図であり、したがって１回のＳＰＰＳサイクルについて付け加える多数の詳細事項はあるけれども図１は当業者がそれと本発明の両方を理解するのに十分なほどその概念を説明していることは理解されるであろう。特に、図１が、レジンを第１酸に連結させる工程を示しておらず、最終ペプチドをレジンから開裂させることも示していないサイクルを表わすことを、当業者は既に認識している。
【００２７】
[0032]  図２は、背景技術において述べた、おおまかに３２と表示する改良一般法を図示する。特に、カップリング工程２７の後に残る過剰の酸はいずれも次のサイクルの開始時に脱保護溶液（塩基）により消失するであろうから、最終洗浄工程３１は省略できる。明らかに、そのためには次の酸２１が反応容器２２に添加される前に脱保護溶液が添加される必要がある。
【００２８】
[0033]  図３は、下記の改良を含む本発明の第１態様の模式図を示す：高濃度および小体積の脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびすべての過剰の活性化された酸の混合物に添加し、そうすることによりその前のサイクルのカップリング工程と後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に排液工程が全くない。
【００２９】
[0034]  高濃度で小体積を使用することにより、物理的空間が節約され（小さなボトルが必要であるにすぎない）、溶液を調製する必要性が回避され、溶媒が節約される。この方法は、さらに熱的利点を提供する（図３）。
【００３０】
[0035]  本発明の代表的バージョンにおいて、有機塩基を脱保護組成物として用い、ピペリジンまたはピロリドンまたは４−メチルピペリジンがこの目的のために一般的である（必ずしも限定ではない）。他の点で本方法の他の工程、成長しつつあるペプチド鎖、または機器を妨害することのない脱保護機能を備えたさらに他の有機塩基も適切であることはもちろん理解されるであろう。
【００３１】
[0036]  大部分の代表的態様において、ピペリジンまたはピロリジンまたは４−メチルピペリジンをそのまま添加することができる；すなわち、溶液状ではなく有機液体として。他の状況では、ピペリジンまたはピロリジンまたは４−メチルピペリジンを一般にＤＭＦ中における少なくとも約５０体積％の有機塩基の高濃度溶液として添加することができる。
【００３２】
[0037]  さらなる利点として、高濃度はそれに比例して有機塩基を小体積で添加することを可能にし、カップリング溶液の体積を基準として約１：２０〜１：３の比率が適切である。ピロリドンまたは４−メチルピペリジンをそのまま添加する場合、カップリング溶液の体積を基準として約１：５の体積比で添加することができる。そのような状況において、小体積の脱保護溶液は一般に２ｍｌ未満、しばしば１ミリリットル未満である。代表的状況において、約０．４〜１．０ｍｌのピペリジンを、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびすべての過剰の活性化された酸の混合物約３．８〜４．２ｍｌに添加する。
【００３３】
[0038]  割合をパーセントとして表わすと、小体積の脱保護溶液はカップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびすべての過剰の活性化された酸の混合物の体積の２０％以下である。
【００３４】
[0039]  図４は、本発明がもたらす熱的利点を示し、それは各ＳＰＰＳサイクルにおける追加の時間的利点を提供する。図４が立証するように、カップリング工程を約９０℃の温度で実施すると、一般的な室温（たとえば、２５℃）洗浄の採用は、十分に理解される比較的単純な関係に従って反応容器内のペプチドおよびレジンの温度を低下させると予想される熱的作用をもつであろう（たとえば、温度低下は添加される冷却液の質量に正比例するであろう）。よって、洗浄工程または排液工程をカップリング後に実施すると、反応組成物を９０°のカップリング温度に戻すためにある期間が必要であろう。
【００３５】
[0040]  しかし、本発明においては、小さな体積（質量）の高濃度塩基の添加が温度低下度を大幅に緩和し、よって組成物を必要なカップリング温度に戻すのをより容易かつ迅速にする。図４に、一般的な熱プロフィールを実線３４により示し、本発明により得られる熱プロフィールを点線３５により示す。もちろん、図４は模式的なものであり、正確な尺度で描かれてはおらず、いずれか特定の混合物の精確な軌跡というよりむしろ説明的なものであることは理解されるであろう。
【００３６】
[0041]  図５は、本発明の他の側面を示し、その改良は、保護されたアミノ酸と液体有機塩基を反応容器内で混和することにより、保護されたアミノ酸を脱保護し、次いで脱保護工程の途中または後に、反応容器内の周囲圧力を真空吸引で大気圧未満に低下させて、介在する排液工程なしで液体有機塩基を除去することを含む。
【００３７】
[0042]  一般に、適切な資料により確認できるように、ピペリジンの沸点はおおよそ１０６℃であり、ＤＭＦの沸点は約１５３℃である。その結果、ピペリジンの蒸気圧はいずれか特定の温度でＤＭＦの蒸気圧より高いであろう。したがって、反応容器からの中等度の真空吸引によりピペリジンを選択的に除去でき、排液工程を完全に回避できることが今回見出された。図５は、脱保護工程２３、続いて蒸発工程３６、続いて排液工程（有機塩基以外の液体の）、次いでカップリング工程２７を示すことにより、これを模式的に示す。４−メチルピペリジンの沸点は１２３℃であり、類似の利点を提供する。
【００３８】
[0043]  別の形で表現すると、ピペリジンの蒸気圧は２５℃で約４ｍｍＨｇ、５０℃で約３９ｍｍＨｇ、６０℃で約５５ｍｍＨｇである。ピロリジンについては、蒸気圧は２５℃で約８．４ｍｍＨｇ、６０℃で約１０２ｍｍＨｇである。よって、温度を６０℃に上昇させると希望する蒸発が大幅に促進される。
【００３９】
[0044]  液体と蒸気圧について十分に理解されている原理と一致して、本方法はさらに、反応容器２２内で混和した保護されたアミノ酸と液体有機塩基を加熱することにより脱保護工程を促進し、次いで反応容器内容物を加熱しながら真空吸引する３６により除去工程をさらに促進することを含むことができる。ここ（および他のいずれか）に記載されるようにマイクロ波支援プロセスを採用する場合、マイクロ波照射は脱保護工程を促進するためにも真空除去工程を促進するためにも使用できる。
【００４０】
[0045]  代表的方法において、圧力を大気圧未満に低下させることができ、あるいは温度に関して表現すると、組成物を少なくとも約６０℃に、ある場合には約８１℃〜９９℃に加熱することにより脱保護工程を実施することができ、その後、反応容器内容物を約９０°〜１１０°に加熱して真空除去工程を促進することができる。機能的には、真空および適用するマイクロ波パワーは、他の点で反応容器内の残りの材料に有害な作用を及ぼすことなく、あるいはＳＰＰＳサイクルの後続工程において問題を引き起こすことなく、意図する蒸発増強をもたらはずである。
【００４１】
[0046]  全体的ＳＰＰＳサイクルにおいてこれら２つの改良を組み合わせることができ、したがって他の側面において、改良は、高濃度および小体積の脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびすべての過剰の活性化された酸の混合物に添加する工程を含み、そうすることにより、その前のサイクルのカップリング工程と後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に介在する排液工程が全くない。その後、反応容器内の周囲圧力を真空吸引で低下させて、排液工程なしで脱保護組成物を除去する。
【００４２】
[0047]  この様式における両方の改良の組合わせは、図１と図５の相異により説明され、洗浄工程と２つの排液工程の両方を回避したサイクルを可能にする。背景技術に述べたように、個々のサイクルにおけるそのような利点はいずれも、より長いペプチド鎖を合成するのに伴って幾何学的に増大するであろう。
【００４３】
[0048]  図６および７は本明細書に記載する改良を実施するためのシステムの選択した一部の模式図である。最も基本的には、システムは、マイクロ波照射をマイクロ波キャビティー４１内へ向けるように配置されたダイオード４０として描かれたマイクロ波源を、キャビティー４１内の反応容器２２に接続したポンプ４２として示した真空源と共に含む。マイクロ波源はダイオード（ＩＭＰＡＴＴダイオードが代表的である）として描かれているが、マグネトロンもクライストロン(klystron)と同様に許容できる供給源であり、これらのものはそれぞれ当業者に十分に理解され、簡便性、デザインまたはコストの目的に対する希望に従って、過度の実験なしで選択できる。
【００４４】
[0049]  図６は、供給源４０からのマイクロ波照射が一般にキャビティー４１をサポートする導波路４３により方向づけられることをも示す。真空ポンプ４２は反応容器２２からライン４４に沿って吸引し、通常は、反応容器と真空ポンプ４２の間に配置された、他の点では一般的なトラップ４５（たとえば、液体窒素を用いるコールドトラップ）を含む。トラップ４５が存在しない場合、真空ポンプはまだ作動している状態で蒸発した塩基および溶媒を計画的に処理できることが必要である。
【００４５】
[0050]  図６に模式的に示すように、代表的態様においてキャビティー４１はマイクロ波源４０により発生するマイクロ波周波数の単一モードのマイクロ波照射をサポートすることができる。温度プローブ４６（それについては光ファイバーデバイスが代表的である）は、キャビティー４１内の反応容器２２の温度を読み取るように配置される。プロセッサー４７（それはシステム全体に対して内部または外部のいずれであってもよい）に関して、測定した温度を用いて供給源を駆動し、こうしてキャビティー内へのマイクロ波照射を最も有利な様式で増大、低減、または他の形で駆動することができる。
【００４６】
[0051]  さらに模式的に詳述するように、マイクロ波源４０はおおまかに５０として表示するパワーサプライによって駆動され、それは好ましい態様において、US Patent No. 6288379（その内容を同様に全体として本明細書に援用する）に述べられたスイッチングパワーサプライ（および関連方法）であってもよい。パワーサプライとダイオード４０の間の基礎回路も、同様に模式的に５１に示す。必要なタイプの基礎回路構成要素は当業者が十分に理解しており、ここに詳細に記載する必要はなく、当業者が過度の実験なしで構築および操作できる。
【００４７】
[0052]  図７は、本発明の方法を実施するためのシステムの幾つかの追加細部を模式的に示す。図７においても反応容器は２２で表示され、図７はさらに反応容器２２がフリット５２（一般にガラス製）およびスプレーヘッド５３を含むことを示す。フリット５２は液体を反応容器２２から排液することができ、スプレーヘッド５３は組成物を反応容器２２へデリバリーする。他の同等な備え付け部品は当業者が過度の実験なしで選択できる。
【００４８】
[0053]  特に、図７には窒素供給源５４を示し、それは模式的にエルレンマイヤーフラスコとして描かれた複数の供給ボトル５５に接続している。複数の計量ループがライン５６、５７および５８によって模式的に示され、窒素供給源を供給ボトル５５に接続している；そして対応するライン６０、６１および６２が次いで共通ライン６３に接続し、それは反応容器２２へデリバリーするためのスプレーヘッド５３に達している。反応容器２２の内容物を撹拌（通気）して脱保護、カップリングおよび開裂反応中に適切な混合および循環を行なうために、別のライン６３が窒素を供給源５４から反応容器２２内の液体およびレジンに供給する。
【００４９】
[0054]  窒素は比較的安価であり、広く利用でき、機器またはシステム内で実施される反応および装置に対して不活性であるので、これらの状況下で有用である。よって、希ガスを含めた他の不活性ガスも使用できるけれども大部分の場合はより高価でありかつ利用できる範囲がより狭いことは理解されるであろう。機能的な意味では、進行中の反応または機器との化学的な干渉が避けられるいかなるガスも適切であろう。
【００５０】
[0055]  図６のダイヤグラムと一致した様式で、窒素供給および計量ループはプロセッサー４７に接続することができ、それによりプロセッサー４７は組成物が容器５５から反応容器５２へ分配される様式を制御することができる。図示されてはいないが、単純な模式的ライン接続（６４および６５）が実際にはチューブ（パイプ）、バルブ、およびそれらのラインの制御装置の組合わせであることは当業者には認識されるであろう；たとえば、実際にはライン６４は、ライン５８におけるバルブまたはマニホールド、そのラインのためのコントローラーと、プロセッサー４７との間の接続を表わす。同じ関係が、窒素供給源５４とプロセッサー４７の間のライン６５についても当てはまる。
【実施例】
【００５１】
[0056]  実験(プレディクティブ)
[0057]  材料および方法
[0058]  試薬
[0059]  すべてのＦｍｏｃアミノ酸はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手され、下記の側鎖保護基を含んでいた：Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、およびＴｙｒ（ｔＢｕ）。Ｎ−［（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）（ジメチルアミノ）メチレン］−Ｎ−メチルメタナミニウムヘキサフルオロホスフェート  Ｎ  オキシド（ＨＢＴＵ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、およびベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ−オキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）もＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから入手した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）、コリジン（ＴＭＰ）、ピペリジン、ピペラジン、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、チオアニソール、１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）、およびフェノールはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から入手された。ジクロロメタン（ＤＣＭ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ  メチルピロリドン（ＮＭＰ）、無水エチルエーテル、酢酸、ＨＰＬＣグレードの水、およびＨＰＬＣグレードのアセトニトリルはＶＷＲ（ペンシルベニア州ウェストチェスター）から入手された。
【００５２】
[0060]  ＳＰＨＥＲＩＴＩＤＥ（商標）レジン：トリチルリンカーはＳＰＨＥＲＩＴＩＤＥ（商標）レジン（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；米国ノースカロライナ州マシューズ）を用いて製造された。ＳＰＨＥＲＩＴＩＤＥ（商標）レジンは多官能性カルボン酸と架橋したポリ−ｅ−リジンからなる。
【００５３】
[0061]  ＣＥＭ  ＬＩＢＥＲＴＹ（商標）自動マイクロ波ペプチド合成装置
[0062]  ＬＩＢＥＲＴＹ（商標）システム（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ノースカロライナ州マシューズ）は、最大１２のペプチドの開裂を含む完全自動合成が可能な連続ペプチド合成装置である。ＬＩＢＥＲＴＹ（商標）システムは、有機合成工業で広く用いられているシングルモードマイクロ波リアクター、ＤＩＳＣＯＶＥＲ（商標）を用いている。ＬＩＢＥＲＴＹ（商標）合成装置は、０．０２５〜１．０ミリモル（ｍｍｏｌ）の合成のために標準３０ミリリットル（ｍｌ）のＴｅｆｌｏｎ（登録商標）ガラスフリット付き反応容器を用いている。その反応容器は、すべての試薬をデリバリーするためのスブレーヘッド、およびマイクロ波パワーデリバリーの制御のための光ファイバー温度プローブを備えている。このシステムは最大２５のアミノ酸原液、および下記の機能を実行できる７の試薬ポートを用いる：主洗浄、二次洗浄、脱保護、キャッピング、活性化剤、活性化剤塩基、および開裂。このシステムは、すべての試薬の輸送のために、かつ合成中に不活性環境を提供するために、窒素圧を用いる。脱保護、カップリングおよび開裂の反応に際しての混合のために窒素吹込みを用いる。このシステムは、すべてのアミノ酸、活性化剤、活性化剤塩基、および開裂溶液の精確なデリバリーのためにサンプル計量ループを用いる。ＬＩＢＥＲＴＹ（商標）合成装置は、あらゆるサイクルの各工程を完全に制御できる外部コンピューターにより制御される。
【００５４】
[0063]  ペプチド合成：ＶＹＷＴＳＰＦＭＫＬＩＨＥＱＣＮＲＡＤＧ−ＮＨ２
[0064]  ＣＥＭ  ＬＩＢＥＲＴＹ（商標）自動マイクロ波ペプチド合成装置を用いて０．１５２ｇのＳｐｈｅｒｉｔｉｄｅ（商標）レジン（０．６６ｍｅｑ／ｇの置換）上で、全２０アミノ酸を含むモデルペプチドを多様な条件下で合成した。２段階で、その都度、新鮮な試薬を用いて脱保護を実施した：（ｉ）ＤＭＦ中の８０％ピペリジン；または（ｉｉ）ピペリジンそのもの。それぞれの場合、０．８ｍｌのピペリジンを、その前の酸の添加から残った４．０ｍｌのカップリング溶液に添加した。５０Ｗで３０秒（一般的な合成については０Ｗで５分）の最初の脱保護に続いて５０Ｗで３分（一般的な合成については０Ｗで１５分）の脱保護を８０℃の最高温度で実施した。
【００５５】
[0065]  その前のサイクルのカップリング工程と後続サイクルのピペリジン添加との間で排液工程を実施しなかった。
[0066]  脱保護の後、反応容器内の周囲圧力を大気圧未満に低下させる真空を適用することによりピペリジンを除去した。５０Ｗで３分のマイクロ波パワーの適用により除去を増強した。
【００５６】
[0067]  ＤＭＦに溶解した５倍モル過剰の０．２Ｍ  Ｆｍｏｃ保護アミノ酸の存在下で、種々のタイプの活性化を用いてカップリング反応を実施した：（ｉ）ＨＢＴＵ：ＤＩＥＡ：ＡＡ（０．９：２：１）；（ｉｉ）ＨＢＴＵ：ＨＯＢｔ：ＤＩＥＡ：ＡＡ（０．９：１：２：１）；（ｉｉｉ）ＰｙＢＯＰ：ＤＩＥＡ：ＡＡ（０．９：２：１）；（ｉｖ）ＨＢＴＵ：ＮＭＭ：ＡＡ（０．９：２：１）；および（ｖ）ＨＢＴＵ：ＴＭＰ：ＡＡ（０．９：２：１）、バリンについては二重カップリング。カップリング反応は４０Ｗで５分（一般的な合成については０Ｗで３０分）、８０℃の最高温度であった。その後の実験で、システインおよびヒスチジンのカップリング条件を０Ｗで２分、続いて４０Ｗで４分、最高温度５０℃に変更した。１０ｍｌの試薬Ｋ（ＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／ＥＤＴ；８２．５／５／５／５／２．５）を用いて１８０分間、開裂を実施した。開裂後、ペプチドを析出させ、氷冷した無水エチルエーテルを用いて洗浄した。
【００５７】
[0068]  ペプチド分析
[0069]  ＬＣ−ＭＳ分析の前に、すべてのペプチドを１０％酢酸溶液に溶解し、凍結乾燥した。Ｗａｔｅｒｓ  Ａｔｌａｎｔｉｓ  ｄＣ１８カラム（３μｍ，２．１×１００ｍｍ）を用いて２１４ｎｍでペプチド生成物の分析用ＨＰＬＣを実施した。６０分間にわたり０．５ｍｌ／分の流速で５〜６０％溶媒Ｂ（溶媒Ａ＝水中の０．０５％  ＴＦＡ；溶媒Ｂ＝アセトニトリル中の０．０２５％  ＴＦＡ）の勾配溶離により分離を行なった。エレクトロスプレーイオン化によるＬＣＱ  Ａｄｖａｎｔａｇｅイオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，カリフォルニア州サンノゼ）を用いて質量分析を実施した。アミノ酸のラセミ化分析は、Ｃ．Ａ．Ｔ．ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．（ドイツ、チュービンゲン）により、公開されている６Ｎ  ＤＣｌ／Ｄ２Ｏ中でのペプチドの加水分解を伴うＧＣ−ＭＳ法を用いて実施された(The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Erhard Gross editor)。
【００５８】
[0070]  他の態様において、本発明は同一溶媒中でカップリングと脱保護の工程が行なわれる新規方法を提供する。この方法では、カップリングを行なうために希望する期間の後、濃塩基をレジンカップリング溶液に直接添加する。塩基が添加されると、次いで脱保護工程が直ちに開始する。したがって、脱保護工程の開始はカップリング工程直後であり、何ら時間遅延がない。さらに、それにはカップリング反応から残存する溶媒を使用できるので、小体積の塩基が必要であるにすぎない。これは、精確にきわめて小体積（０．５ｍＬ）の塩基を迅速にデリバリーするための精巧な試薬デリバリーシステムを必要とする。一般に、溶媒中２０％の塩基（ピペリジン）溶液が脱保護工程に用いられる。過度の塩基濃度は塩基触媒作用による副反応を増大させる可能性があり、したがって多量の溶媒が必要である。これは、濃厚な塩基をカップリング溶媒に添加することによるこのプロセスによって著しい溶媒を節約できることを意味する。
【００５９】
[0071]  この新規方法の有効性を立証するために、各サイクル中でイン−サイチュ溶媒リサイクリング工程を行なうように改変された自動ペプチド合成装置を用いて、２４ペプチドのバッチを組み立てた。
【００６０】
[0072]  材料および方法
[0073]  自動イン−サイチュ溶媒リサイクリングおよび蒸発ベースの洗浄が可能なＬｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ  ＰＲＩＭＥシステム（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；米国ノースカロライナ州マシューズ）を用いてすべてのペプチドを合成した。１０当量のアミノ酸につき０．０５ｍｍｏｌの規模で、ＣａｒｂｏＭＡＸ（商標）カップリングを用いてＡＡ／ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ（１：２：１）ベースの活性化で、９０℃で１００秒間、ペプチドを合成した。ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）テクノロジーに基づくＰｒｏＴｉｄｅレジン（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；米国ノースカロライナ州マシューズ）を合成に用いた；Ｒｉｎｋ  ＡｍｉｄｅリンカーまたはＣｌ−ＴＣＰ（Ｃｌ）リンカーのいずれか、第１アミノ酸をＤＩＥＡで非活性化装填、９０℃で５分間。脱保護工程は９５℃で５０秒間実施され、０．５ｍＬの５０％ピロリジンをカップリング溶液に直接添加することにより開始された。１回、１×４ｍＬの洗浄を、脱保護工程とカップリング工程の間で用いた。ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤｔ（９２．５：２．５：２．５：２．５）により３８℃で３０分間、ＲＡＺＯＲ開裂システム（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；米国ノースカロライナ州マシューズ）を用いてペプチドを開裂した。
【００６１】
【化１】
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【００６２】
[0074]  結果および考察
[0075]  表１で合成したすべてのペプチドにより、希望するターゲットが主ピークとして標準サイクル時間２分５８秒で得られた。イン−サイチュ溶媒リサイクリングプロセスにより、０．５ｍＬの濃ピロリジン（沸点８７℃）溶液をカップリング工程の終了時に添加することができた（排液なしで）。この設定の利点は、カップリング溶液が既に９０℃であったので、脱保護が希望する温度（９５℃）にきわめて近い温度で直ちに進行したことであった。脱保護プロセスに際して真空を適用し、ピロリジンを蒸発させ、その後、廃液槽内で凝縮させた。これにより、脱保護工程の終了時に１回の洗浄工程（１×４ｍＬ）が必要であったにすぎない。
【００６３】
【表１−１】
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【００６４】
【表１−２】
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【００６５】
[0076]  全バッチのための総合成時間：３２．６時間
[0077]  この新規方法は、下記により標準サイクル時間の著しい短縮をもたらした（２分５７秒）：（ａ）−カップリング排液時間の排除、（ｂ）−工程間の脱保護デリバリー時間の排除、および（ｃ）−脱保護工程のための温度傾斜時間の排除、それによってより短い脱保護時間の使用が可能になった。さらに、著しい溶媒節約が可能であり、各サイクル中に脱保護溶媒が完全に除去された。
【００６６】
本発明の態様
態様１  
下記の改良を含む、固相ペプチド合成における脱保護方法：
高濃度および小体積の脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびすべての過剰の活性化された酸の混合物に添加する；ならびに
その前のサイクルのカップリング工程と後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に排液工程が全くない。
態様２
さらに、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖の混合物に、脱保護組成物を添加する工程に続いて、次に続く酸を添加することを含む、態様１に記載の方法。
態様３
有機塩基を脱保護組成物として添加することを含む、態様１に記載の方法。
態様４
ピペリジン、ピロリドン、および４−メチルピペリジンからなる群から選択される有機塩基を添加することを含む、態様３に記載の方法。
態様５
有機塩基をそのまま添加することを含む、態様４に記載の方法。
態様６
添加される有機塩基が、カップリング溶液の体積を基準として約１：２０〜１：３の比率でカップリング溶液混合物にそのまま添加される液体である、態様３に記載の方法。
態様７
ピペリジン、ピロリドン、および４−メチルピペリジンからなる群から選択される有機塩基を、カップリング溶液の体積を基準として約１：５の体積比で添加することを含む、態様６に記載の方法。
態様８
高濃度の脱保護溶液が少なくとも５０体積％の脱保護組成物である、態様１に記載の方法。
態様９
小体積の脱保護溶液が２ｍＬ未満である、態様１に記載の方法。
態様１０
小体積の脱保護溶液が１ｍＬ未満である、態様１に記載の方法。
態様１１
カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびすべての過剰の活性化された酸の混合物約３．８〜４．２ｍｌに添加される小体積の脱保護溶液が約０．４〜１．０ｍｌである、態様１に記載の方法。
態様１２
小体積の脱保護溶液が、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびすべての過剰の活性化された酸の混合物の体積の約２０％以下である、態様１に記載の方法。
態様１３
改良が下記を含む、固相ペプチド合成における脱保護方法：
保護されたアミノ酸と液体有機塩基を反応容器内で混和することにより、保護されたアミノ酸を脱保護する；および
脱保護工程の途中または後に、反応容器内の周囲圧力を真空吸引で低下させて、介在する排液工程なしで液体有機塩基を除去する；および
他の点で反応容器内の残りの材料に有害な作用を及ぼすことがなく、またはＳＰＰＳサイクルの後続工程において問題を引き起こすことがない。
態様１４
さらに、
混和した保護されたアミノ酸と液体有機塩基を反応容器内で加熱することにより脱保護工程を促進する；および
反応容器内容物を加熱しながら真空吸引することにより除去工程を促進する
ことを含む、態様１３に記載の方法。
態様１５
マイクロ波照射を適用して脱保護工程を加熱する；および
マイクロ波照射を適用して真空除去工程を促進する
ことを含む、態様１４に記載の方法。
態様１６
反応容器内の圧力を１気圧未満に低下させることを含む、態様１３に記載の方法。
態様１７
混和した保護されたアミノ酸と液体有機塩基を約８１℃〜９９℃に加熱して脱保護工程を促進する；および
反応容器内容物を約９０℃〜１１０℃に加熱して除去工程を促進する
ことを含む、態様１４に記載の方法。
態様１８
下記のものを含む、マイクロ波支援固相ペプチド合成のためのシステム：
マイクロ波照射をマイクロ波キャビティー内へ向けるように配置したマイクロ波源；
そのキャビティー内のマイクロ波透過性反応容器；および
その反応容器に接続した真空源。
態様１９
さらに、反応容器と真空源の間にトラップを含む、態様１８に記載の方法。
態様２０
キャビティーが、マイクロ波源により発生するマイクロ波周波数の単一モードのマイクロ波をサポートすることができる、態様１８に記載の方法。
態様２１
反応容器が、
液体を反応容器から排出するための（ガラス）フリット；および
試薬を反応容器へデリバリーするためのスプレーヘッド
を含む、態様２０に記載の方法。
態様２２
さらに、キャビティー内の反応容器の温度を読み取るために（反応容器へデリバリーされるマイクロ波パワーを制御するために）配置した光ファイバー温度プローブを含む、態様１８に記載のシステム。
態様２３
すべての試薬を輸送するために、かつペプチド合成に際して不活性環境を供給するために、窒素圧を採用した、態様２１に記載のシステム。
態様２４
さらに、脱保護、カップリングおよび開裂の反応に際して混合するために反応容器の内容物に吹き込まれる、反応容器と連絡した窒素源を含む、態様２３に記載のシステム。
態様２５
さらに、そのシステムで実施される各ＳＰＰＳサイクルにおける各工程を制御するためのプロセッサーを含む、態様１８に記載のシステム。
態様２６
下記の改良を含む、固相ペプチド合成における脱保護方法：
高濃度および小体積の脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびすべての過剰の活性化された酸の混合物に添加する；ならびに
その前のサイクルのカップリング工程と後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に排液工程が全くない；ならびに
その後、反応容器内の周囲圧力を真空吸引で低下させて、排液工程なしで脱保護組成物を除去する；ならびに
他の点で反応容器内の残りの材料に有害な作用を及ぼすことがなく、またはＳＰＰＳサイクルの後続工程において問題を引き起こすことがない。
態様２７
改良が、蒸発する塩基を反応容器から排出させるための通路を備えた状態で、少なくとも約６０℃の温度において、保護されたアミノ酸を脱保護することを含む、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）における脱保護方法。
態様２８
さらに、脱保護工程を大気圧未満の減圧下で実施することを含む、態様２７に記載の方法。
態様２９
さらに、最大１回の洗浄工程をＳＰＰＳサイクルの脱保護工程とカップリング工程との間で実施することを含む、態様２８に記載の方法。
態様３０
下記の改良を含む、固相ペプチド合成における脱保護方法：
高濃度および小体積の脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびすべての過剰の活性アミノ酸の混合物に添加する；ならびに
その前のサイクルのカップリング工程と、その前のサイクルのカップリング溶液の少なくとも５０体積％が取り出される後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に排液工程が全くない；ならびに
カップリング溶液が少なくとも３０℃である。
態様３１
脱保護濃度が有機塩基である、態様３０に記載の方法。
態様３２
Ｆｍｏｃ固相ペプチド化学を使用する、態様３０に記載の方法。
態様３３
脱保護溶液濃度を少なくとも５０体積％にする、態様３０に記載の方法。
態様３４
脱保護組成物がカップリング溶液の体積の１／３未満である、態様３０に記載の方法。
[0078]  図面および明細書に本発明の好ましい態様を述べ、特定の用語を用いたが、それらは一般的かつ記述の意味で用いたにすぎず、限定のためのものではなく、本発明は特許請求の範囲に規定されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
0006763948.tif 000008
【図５】
0006763948.tif 000009
【図６】
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【図７】
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