(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリンからＡ１／Ｂ１／Ｂ２９トリフェニル酢酸保護基を除去して遊離のインスリンを生成することができる操作されたペニシリンＧアシラーゼであって、前記操作されたペニシリンＧアシラーゼは、配列番号１２と少なくとも９０％またはそれを超えて同一であり、前記ペニシリンＧアシラーゼが、２８位にアスパラギン（Ｎ）、５６位にロイシン（Ｌ）；７１位にアラニン（Ａ）、７４位にセリン（Ｓ）、および６１９位にリジン（Ｋ）を含み、前記ペニシリンＧアシラーゼが、配列番号６を含む操作されたペニシリンＧアシラーゼと比較して、より多くの遊離のインスリンを生成する、操作されたペニシリンＧアシラーゼ。
【請求項２】
前記ペニシリンＧアシラーゼが配列番号１２を含む、請求項１に記載の操作されたペニシリンＧアシラーゼ。
【請求項３】
前記ペニシリンＧアシラーゼが配列番号１１に記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１に記載の操作されたペニシリンＧアシラーゼ。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
遊離のインスリンを生成するための方法であって、ｉ）請求項１に記載の操作されたペニシリンＧアシラーゼ、およびＡ１／Ｂ１／Ｂ２９トリフェニル酢酸保護基を含むインスリンを提供すること、ならびにｉｉ）前記操作されたペニシリンＧアシラーゼによりＡ１／Ｂ１／Ｂ２９トリフェニル酢酸保護基が除去され、遊離のインスリンが生成する条件下で、前記操作されたペニシリンＧアシラーゼを、前記Ａ１／Ｂ１／Ｂ２９トリフェニル酢酸保護基を含むインスリンに曝露することを含む、方法。
【請求項７】
前記操作されたペニシリンＧアシラーゼが、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超またはそれを超える遊離のインスリンを生成する、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１５年５月７日に出願された米国仮特許出願第６２／１５８，１１８号（これは、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
配列表、表またはコンピュータプログラムへの参照
米国特許法施行規則§１．８２１の下、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）で、ファイル名ＣＸ２−１４９ＷＯ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔとして本願と同時に提出された配列表は、参考として本明細書に援用される。配列表の電子コピーは、２０１６年４月２８日に作成され、ファイルサイズは８８キロバイトである。
【０００３】
本発明は、操作されたペニシリンＧアシラーゼ（ＰＧＡ）酵素、酵素をコードするポリヌクレオチド、酵素を含む組成物、および操作されたＰＧＡ酵素の使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
ペニシリンＧアシラーゼ（ＰＧＡ）（ペニシリンアミダーゼ、ＥＣ３．５．１．１１）は、ペニシリンＧ（ベンジルペニシリン）側鎖のアミド結合の切断を触媒する。この酵素は、６−アミノ−ペニシラン酸（６−ＡＰＡ）およびフェニル−酢酸（ＰＡＡ）の製造において商業的に使用される。６−ＡＰＡは、アモキシシリン、アンピシリンおよびセファレキシンなどの半合成βラクタム系抗生物質の工業生産において重要な化合物である。天然に存在するＰＧＡ酵素は、商業的なプロセスにおいて不安定性を示し、それにより、商業的に適用するためには固体基材（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）への固定化が必要になる。ＰＧＡは様々な支持体に共有結合されており、ＰＧＡ固定化系が純粋な光学異性体を合成するための有用なツールとして報告されている。しかし、固体表面への結合により、活性および／または選択性の低下など、酵素特性が損なわれ、溶質への接近が限定される。さらに、固体基材への結合により、酵素を捕捉し、さらなるプロセシングサイクルにおいて再利用することが可能になるが、酵素の安定性は、このような適用を限定し得るようなものである。ペニシリンＧから６−ＡＰＡへのＰＧＡによる酵素的触媒作用は、位置特異的（ラクタムアミド結合は切断しない）かつ立体特異的なものである。６−ＡＰＡの生成は、おそらく医薬品の生成における酵素的触媒作用の最も大きな利用を構成する。ＰＧＡの酵素活性は、フェナセチル部分に関連し、第一級アミンならびにアルコールの多種多様なフェナセチル誘導体の立体特異的加水分解を可能にするものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、操作されたペニシリンＧアシラーゼ（ＰＧＡ）酵素、酵素をコードするポリヌクレオチド、酵素を含む組成物、および操作されたＰＧＡ酵素の使用方法を提供する。
【０００６】
本発明は、インスリンからＡ１／Ｂ１／Ｂ２９トリフェニル酢酸保護基を除去して遊離のインスリンを生成することができる操作されたペニシリンＧアシラーゼであって、配列番号２、４、６、８、１０、および／または１２と少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれを超えて同一であるペニシリンＧアシラーゼを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、インスリンからＡ１／Ｂ１／Ｂ２９トリフェニル酢酸保護基を除去して遊離のインスリンを生成することができる操作されたペニシリンＧアシラーゼであって、配列番号２、４、６、８、１０、および／または１２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるペニシリンＧアシラーゼを提供する。いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、インスリンからＡ１／Ｂ１／Ｂ２９トリフェニル酢酸保護基を除去して遊離のインスリンを生成することができる操作されたペニシリンＧアシラーゼであって、配列番号２、４、６、８、１０、および／または１２を含むペニシリンＧアシラーゼを提供する。いくつかのさらなる実施形態では、ペニシリンＧアシラーゼは、表５．１、表６．２、および／または表６．３において提供される変異を少なくとも１つ含む。
【０００７】
本発明は、配列番号３、５、７、９、および１１から選択される配列に対して少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされるペニシリンＧアシラーゼも提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列によってコードされるペニシリンＧアシラーゼは、配列番号３、５、７、９、および１１から選択される配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ペニシリンＧアシラーゼは、配列番号３、５、７、９、および１１から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。本発明は、本明細書に提示されるポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号３、５、７、９、および／または１１）を含むベクターも提供する。本発明は、本明細書に提示されるベクター（例えば、配列番号３、５、７、９、および／または１１のポリヌクレオチド配列を含むベクター）を含む宿主細胞も提供する。
【０００９】
本発明は、遊離のインスリンを生成するための方法であって、ｉ）本明細書に提示される少なくとも１つの操作されたペニシリンＧアシラーゼ、およびＡ１／Ｂ１／Ｂ２９トリフェニル酢酸保護基を含むインスリンを提供すること；ならびにｉｉ）操作されたペニシリンＧアシラーゼによりＡ１／Ｂ１／Ｂ２９トリフェニル酢酸保護基が除去され、遊離のインスリンが生成する条件下で、操作されたペニシリンＧアシラーゼを、Ａ１／Ｂ１／Ｂ２９トリフェニル酢酸保護基を含むインスリンに曝露することを含む方法も提供する。方法のいくつかの実施形態では、ペニシリンＧアシラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、および／または１２と少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれを超えて同一である。方法のいくつかの実施形態では、ペニシリンＧアシラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、および／または１２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。方法のいくつかのさらなる実施形態では、ペニシリンＧアシラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、および／または１２を含む。いくつかの実施形態では、操作されたペニシリンＧアシラーゼは、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超またはそれを超える遊離のインスリンを生成する。本発明は、本明細書に提示される方法（複数可）に従って生成した遊離のインスリンを含む組成物も提供する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
インスリンからＡ１／Ｂ１／Ｂ２９トリフェニル酢酸保護基を除去して遊離のインスリンを生成することができる操作されたペニシリンＧアシラーゼであって、前記操作されたペニシリンＧアシラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、および／または１２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である、ペニシリンＧアシラーゼ。
（項目２）
表５．１、表６．２、および／または表６．３において提供される変異を少なくとも１つ含む、項目１に記載の操作されたペニシリンＧアシラーゼ。
（項目３）
配列番号４、６、８、１０、または１２を含む、項目１に記載の操作されたペニシリンＧアシラーゼ。
（項目４）
配列番号３、５、７、９、および１１から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、項目１に記載の操作されたペニシリンＧアシラーゼ。
（項目５）
項目４に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
（項目６）
項目５に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目７）
遊離のインスリンを生成するための方法であって、ｉ）項目１に記載の操作されたペニシリンＧアシラーゼ、およびＡ１／Ｂ１／Ｂ２９トリフェニル酢酸保護基を含むインスリンを提供すること、ならびにｉｉ）前記操作されたペニシリンＧアシラーゼによりＡ１／Ｂ１／Ｂ２９トリフェニル酢酸保護基が除去され、遊離のインスリンが生成する条件下で、前記操作されたペニシリンＧアシラーゼを、前記Ａ１／Ｂ１／Ｂ２９トリフェニル酢酸保護基を含むインスリンに曝露することを含む、方法。
（項目８）
前記操作されたペニシリンＧアシラーゼが、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超またはそれを超える遊離のインスリンを生成する、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ペニシリンＧアシラーゼが、配列番号４、６、８、１０、または１２を含む、項目７および／または８に記載の方法。
（項目１０）
項目７〜９のいずれかに記載の方法に従って生成した遊離のインスリンを含む組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、改変体１を用いて観察された基質阻害活性を示すグラフを提供する。
【００１１】
【図２】図２は、７種の改変体ＰＧＡを使用して生成した遊離のインスリンの量を示すグラフを提供する。
【００１２】
【図３】図３は、３種の改変体ＰＧＡを使用して生成した遊離のインスリンの％収率を示すグラフを提供する。
【００１３】
【図４】図４は、反応物中にＤＭＳＯの存在下、３種の改変体ＰＧＡを使用して生成した遊離のインスリンの％収率を示すグラフを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ペニシリンを、フェニル酢酸と、多種多様なβラクタム系抗生物質の合成における重要な中間体である６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）とに切断することができる操作されたペニシリンＧアシラーゼ（ＰＧＡ）を提供する。特に、本発明は、Ａ１／Ｂ１／Ｂ２９トリフェニル酢酸保護基を除去して遊離のインスリンを放出させることができる操作されたＰＧＡを提供する。
【００１５】
一般に、天然に存在するＰＧＡは、α−サブユニットとβ−サブユニットとで構成されるヘテロ二量体酵素である。野生型ＰＧＡは、ペリプラズムへのトランスロケーションを媒介するＮ末端シグナルペプチドおよびαサブユニットのＣ末端とβサブユニットのＮ末端を接続するリンカー領域を含有するプレ−プロ−ＰＧＡポリペプチドとして天然に合成される。タンパク質プロセシングにより、成熟ヘテロ二量体酵素が生じる。分子間リンカー領域はまた、酵素の適切なフォールディングの促進においても機能する。本明細書に記載されるＰＧＡは、下に詳細に記載されるように改善された酵素特性が生じるように様々な改変が導入されている、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａに由来するＰＧＡに基づく。
【００１６】
本明細書に提示される説明に関して、単数の使用は、他に特に指定がなければ、複数を包含する（逆もまた同じである）。例えば、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、複数の指示対象を包含する。同様に、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、互換的であり、限定するものではない。様々な実施形態の説明で用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、いくつかの特定の例では、実施形態は、代わりに「から本質的になる」または「からなる」という言葉を使用して記載することができることが当業者には理解されることがさらに理解されるべきである。
【００１７】
図を含む前述の一般的な説明および以下の詳細な説明はどちらも、単に例示および説明のためのものであり、本開示を限定するものではない。さらに、本明細書で使用される節の表題は、単に組織化を目的とするものであり、記載されている主題を限定するものとは解釈されない。
【００１８】
定義
本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
【００１９】
本開示に関して、本明細書における説明で使用される科学技術用語は、明確な定義がない限り当業者に一般に理解されている意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。本明細書で言及される特許および刊行物は、このような特許および刊行物に開示されているすべての配列を含めて、すべてが、明白に参照により組み込まれる。別段の特定のない限り、本発明の実施には、当業者に公知の、分子生物学、発酵、微生物学、および関連する分野において一般に使用される従来の技術が伴う。別段の定義のない限り、本明細書では、本明細書において使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料が記載されている。実際に、本明細書に記載されている特定の方法体系、プロトコール、および試薬は使用される状況に応じて変動し得るので、本発明はこれらに限定されないものとする。本明細書に提示される表題は、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではない。
【００２０】
それにもかかわらず、本発明の理解を容易にするために、いくつもの用語を以下に定義する。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。したがって、本明細書に開示されているあらゆる数値範囲は、このような広範な数値範囲内に入るあらゆる狭い数値範囲を、このような狭い数値範囲が本明細書においてすべて明確に記載されているものと同じく包含することが意図されている。本明細書に開示されているあらゆる最大（または最小）の数値限定は、あらゆるより低い（またはより高い）数値限定を、このようなより低い（またはより高い）数値限定が本明細書において明確に記載されているものと同じく包含することも意図されている。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその同語族は、それらの包括的な意味で使用される（すなわち、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその対応する同語族と同等である）。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数への言及を包含する。したがって、例えば、１つの（ａ）「宿主細胞」への言及は、複数のこのような宿主細胞を包含する。
【００２３】
別段の特定のない限り、それぞれ、核酸は左から右に、５’から３’への方向で記載されており、アミノ酸配列は左から右に、アミノからカルボキシへの方向に記載されている。
【００２４】
本明細書に提示される表題は、本明細書全体を参照することにより知ることができる本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではない。したがって、以下に定義される用語は、本明細書全体を参照することによってより詳細に定義される。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書では、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化、ユビキチン化など）にかかわらず、アミド結合によって共有結合的に連結された少なくとも２アミノ酸のポリマーを表すのに互換的に使用される。Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸ならびにＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との混合物は、この定義に含まれる。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、共有結合的に一緒に連結された２個以上のヌクレオシドを指す。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオシドから完全に構成され得るか（すなわち、ＲＮＡ）、２’デオキシリボヌクレオチドから完全に構成され得るか（すなわち、ＤＮＡ）、またはリボヌクレオシドと２’デオキシリボヌクレオシドとの混合物であり得る。ヌクレオシドは一般に、標準的なホスホジエステル連結を介して一緒に連結されるが、ポリヌクレオチドは、１つ以上の非標準的な連結を含み得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または一本鎖領域と二本鎖領域の両方を含み得る。さらに、ポリヌクレオチドは一般に、天然に存在するコード核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシン）から構成されるが、１つ以上の改変核酸塩基および／または合成核酸塩基（例えばイノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなど）を含み得る。好ましくは、このような改変核酸塩基または合成核酸塩基は、コード核酸塩基である。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける、洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低ストリンジェンシーの条件下で実施され、その後に、様々なストリンジェンシーではあるが、より高ストリンジェンシーの洗浄が続く。用語「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡが、標的ポリヌクレオチドと約９０％超の同一性を伴って、標的ＤＮＡと約６０％の同一性、好ましくは、約７５％の同一性、約８５％の同一性を有する相補的核酸に結合するのを可能にする条件を指す。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、４２℃で、５０％のホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中のハイブリダイゼーションと等価な条件であって、その後４２℃で、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中の洗浄が続く。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、一般に、規定のポリヌクレオチド配列に対する溶液条件下で決定された熱的融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれよりも低い条件を指す。いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、６５℃で、０．０１８ＭのＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが、６５℃で、０．０１８ＭのＮａＣｌ中で安定ではない場合、これは、本明細書で意図されるように、高ストリンジェンシー条件下で安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、４２℃で、５０％のホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳに等価な条件でのハイブリダイゼーション、その後の６５℃で、０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％のＳＤＳ中の洗浄によってもたらすことができる。別の高ストリンジェンシー条件は、６５℃で、０．１％（ｗ：ｖ）のＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中でハイブリダイズすること、および６５℃で、０．１％のＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中の洗浄と等価な条件でハイブリダイズすることである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、ならびに中程度にストリンジェントな条件は、当業者に公知である。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分を指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「コドン最適化された」は、コードされたタンパク質が目的の生物内で効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンが、特定の生物内で優先的に使用されるものへと変化することを指す。いくつかの実施形態では、ＰＧＡ酵素をコードするポリヌクレオチドを、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化することができる。遺伝子コードは、ほとんどのアミノ酸が、「同義語」コドンまたは「同義」コドンと称されるいくつかのコドンによって表されるという点で縮重しているが、特定の生物によるコドン使用頻度（codon  usage）は、非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることが周知である。このコドン使用頻度バイアスは、所定の遺伝子、共通の機能または祖先起源の遺伝子、高度に発現されるタンパク質に関して、低コピー数タンパク質、および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域と比較して高くなり得る。いくつかの実施形態では、ＰＧＡ酵素をコードするポリヌクレオチドを、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化することができる。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「好ましい、最適な、高コドン使用頻度バイアスのコドン」は、同じアミノ酸をコードする他のコドンより、タンパク質コード領域において高い頻度で使用されるコドンを互換的に指す。好ましいコドンは、１個の遺伝子、共通の機能もしくは起源の一連の遺伝子、高度に発現された遺伝子におけるコドン使用頻度、生物全体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン出現頻度（codon  frequency）、関連生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン出現頻度、またはこれらの組み合わせに関して決定することができる。遺伝子発現のレベルと共にその頻度が増加するコドンは一般に、発現にとっての最適コドンである。例えばクラスター分析または対応分析を使用する多変量解析を含む、特定の生物におけるコドン出現頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的同義コドン使用頻度）およびコドン優先度を決定するための様々な方法、ならびに、遺伝子において使用されるコドンの有効数を決定するための様々な方法が公知である（例えばGCG  CodonPreference,  Genetics  Computer  Group  Wisconsin  Package；CodonW、John  Peden、University  of  Nottingham；McInerney、Bioinform.、１４巻：３７２〜７３頁、［１９９８年］；Stenicoら、Nucleic  Acids  Res.、２２２巻：４３７〜４６頁、［１９９４年］；およびWright、Gene、８７巻：２３〜２９頁、［１９９０年］を参照のこと）。拡大している生物リストについて、コドン使用頻度表が利用可能である（例えば、Wadaら、Nucleic  Acids  Res.、２０巻：２１１１〜２１１８頁、［１９９２年］；Nakamuraら、Nucl.  Acids  Res.、２８巻：２９２頁、［２０００年］；Duretら、上記；HenautおよびDanchin、「Escherichia  coli  and  Salmonella」、Neidhardtら（編）、ASM  Press、Washington  D.C.、［１９９６年］、２０４７〜２０６６年を参照のこと）。コドン使用頻度を得るためのデータソースは、タンパク質をコードすることができる任意の利用可能なヌクレオチド配列に依拠することができる。これらのデータセットは、発現タンパク質をコードすることが実際に公知である核酸配列（例えば、完全なタンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の予測されるコード領域を含む（例えば、Uberbacher、Meth.  Enzymol.、２６６巻：２５９〜２８１頁、［１９９６年］；Tiwariら、Comput.  Appl.  Biosci.、１３巻：２６３〜２７０頁、［１９９７年］を参照のこと）。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「制御配列」は、本明細書では、本開示のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または有利なすべての成分を含むように定義される。各制御配列は、目的のポリヌクレオチドにとって天然のものでも、外来のものでもあり得る。このような制御配列としては、限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」は、本明細書では、制御配列が、目的のポリヌクレオチドに対してある位置で制御配列が適切に配置され（すなわち、機能的な関係で）、その結果、制御配列が、目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指示または調節する構成として定義される。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「プロモーター配列」は、コード配列などの目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。制御配列は、適切なプロモーター配列を含み得る。プロモーター配列は、転写制御配列を含有し、これは、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する。変異体プロモーター、短縮プロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含むプロモーターは、選択される宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得、宿主細胞と同種または異種の細胞外ポリペプチドまたは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「天然に存在する」または「野生型」は、天然に見られる形態を指す。例えば、天然に存在するかまたは野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、生物中に存在する配列であって、天然の供給源から単離することができ、人為的操作によって意図的に改変されていない配列である。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」、「組換え」または「人工」は、（例えば、細胞、核酸またはポリペプチド）に関して本開示において使用される場合、ある様式で改変された材料またはその材料の天然の形態もしくはネイティブな形態に対応する材料であって、改変のない場合には天然に存在しない材料を指す。いくつかの実施形態では、材料は、天然に存在する材料と同一であるが、合成物質からおよび／もしくは組換え技術を使用する操作によって生産もしくは生成された材料またはその材料の天然の形態もしくはネイティブな形態に対応する材料を指す。非限定的な例としては、特に、ネイティブな（非組換え）形態の細胞に見られない遺伝子を発現するか、または改変のない場合には異なるレベルで発現されるネイティブな遺伝子を発現する組換え細胞が挙げられる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「配列同一性のパーセンテージ」、「パーセント同一性」および「パーセント同一」は、ポリヌクレオチド配列間またはおよびポリペプチド配列間の比較を指し、比較ウインドウにわたって最適にアライメントされた２つの配列を比較することによって決定され、比較ウインドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアライメントの参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。両配列において同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が存在するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップとアライメントする位置の数を決定してマッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることによって、このパーセンテージを計算する
最適なアラインメントおよびパーセント配列同一性の決定は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを使用して実施される（例えば、Altschulら、J.  Mol.  Biol.、２１５巻：４０３〜４１０頁、［１９９０年］；およびAltschulら、Nucl.  Acids  Res.、３３８９〜３４０２頁、［１９７７年］を参照のこと）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公的に入手可能である。
【００３７】
簡潔に言うと、ＢＬＡＳＴ分析は、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントされる場合、いくつかの正の値の閾値スコアＴとマッチするかまたはこれを満たすクエリー配列中の短いワード長Ｗを同定することによって、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、同上）。これらの初期隣接ワードヒットは、これらを含有するさらに長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。次いで、累積アライメントスコアが増加し得る限り、このワードヒットを各配列に沿って両方向に拡大する。ヌクレオチド配列の場合、パラメータＭ（マッチング残基のペアの報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチング残基のペナルティースコア；常に＜０）を使用して、累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下するか；負のスコア残基アライメントが１つ以上蓄積することにより、累積スコアが０以下になるか；またはいずれかの配列の末端に到達したら、ワードヒットの各方向への拡大を中止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５[１９８９]を参照のこと）。
【００３８】
２つの配列についてのパーセント同一性をもたらすことにおいてＢＬＡＳＴと同様に機能する多数の他のアルゴリズムが利用可能であり、当技術分野で公知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して（例えば、SmithおよびWaterman、Adv.  Appl.  Math.、２巻：４８２頁、［１９８１年］の局所相同性アルゴリズムによって；NeedlemanおよびWunsch、J.  Mol.  Biol.、４８巻：４４３頁、［１９７０年］の相同性アラインメントアルゴリズムによって；PearsonおよびLipman、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８５巻：２４４４頁、［１９８８年］の類似性調査法によって；ならびに／または、これらのアルゴリズムのコンピュータ制御による実行によって［ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ］）、または当技術分野で一般に公知の方法を使用した視覚的な検査によって行うことができる。さらに、配列アラインメントおよびパーセント配列同一性の決定には、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを、提供されるデフォルトのパラメータを使用して用いることができる（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「実質的な同一性」は、少なくとも２０残基位置の比較ウインドウにわたって、多くの場合には少なくとも３０〜５０残基のウインドウにわたって参照配列と比較される場合に、少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性、および８９〜９５パーセントの配列同一性、より通常には少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、配列同一性のパーセンテージは、参照配列を、比較のウインドウにわたって、合計で参照配列の２０パーセント以下となる欠失または付加を含む配列と比較することによって計算される。ポリペプチドに適用される特定の実施形態では、用語「実質的な同一性」は、２つのポリペプチド配列が、デフォルトのギャップ重みを使用して、プログラムのＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインメントされる場合、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれを超える配列同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。いくつかの好ましい実施形態では、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「参照配列」は、比較される別の配列に対する規定の配列を指す。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば、全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般に、参照配列は、長さが少なくとも２０のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基、長さが少なくとも２５残基、長さが少なくとも５０残基、または核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドはそれぞれ、（１）２つの配列間で類似している配列（すなわち、完全な配列の部分）を含むことができ、（２）２つの配列で非常に異なる配列をさらに含むことができるので、一般には、比較ウインドウにわたる２つのポリヌクレオチドの配列を比較して局所領域の配列類似性を同定および比較することによって、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較を実施する。用語「参照配列」は、野生型配列に限定されるものではなく、操作または変更された配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、「参照配列」は、予め操作または変更されたアミノ酸配列であり得る。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０の連続したヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念上のセグメントを指し、配列は、少なくとも２０の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウインドウ中の配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントに関して、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、２０パーセント以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウは、２０より長い連続した残基であり得、場合により３０、４０、５０、１００またはそれ以上の長いウインドウを含む。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「に対応する」、「を参照して」および「と比べて」は、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けとの関連で使用される場合、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合の、特定の参照配列の残基の番号付けを指す。換言すれば、所定のポリマーの残基番号または残基位置は、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値的な位置によってではなく、参照配列に対して指定される。例えば、人工ＰＧＡのアミノ酸配列などの所定のアミノ酸配列は、２つの配列間の残基マッチを最適化するためにギャップを導入することによって、参照配列に対してアライメントさせることができる。これらの場合では、ギャップが存在するが、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、この配列がアライメントされている参照配列に対して行われる。本明細書で使用される場合、下にさらに記載されている「Ｘｎ」などの残基位置への言及は、特に他に指示がなければ、「に対応する残基」への言及と解釈されるべきである。したがって、例えば、「Ｘ９４」は、ポリペプチド配列の９４位の任意のアミノ酸を指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「改善された酵素特性」は、参照ＰＧＡと比較した場合に、何らかの酵素特性の改善を示すＰＧＡを指す。本明細書に記載される操作されたＰＧＡポリペプチドについて、比較は一般に、野生型ＰＧＡ酵素に対して行われるが、いくつかの実施形態では、参照ＰＧＡは、別の改善された操作されたＰＧＡであり得る。改善が望まれる酵素特性としては、限定されないが、酵素活性（基質の、特定量のＰＧＡを使用した、特定の反応時間での変換率の観点から表すことができる）、熱安定性、溶媒安定性、ｐＨ活性プロファイル、補因子要件、阻害剤（例えば、生成物阻害）に対する不応性、立体特異性、および立体選択性（エナンチオ選択性を含む）が挙げられる。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「増加した酵素活性」は、操作されたＰＧＡポリペプチドの改善された特性を指し、これは、参照ＰＧＡ酵素と比較した、比活性（例えば、生成された生成物／時間／タンパク質の重量）の増加、または基質の生成物への変換率（例えば、出発量の基質の、特定量のＰＧＡを使用した、特定の期間での生成物への変換率）の増加によって表すことができる。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例において提供されている。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的な酵素特性を含む酵素活性に関係する任意の特性が影響され得、その変化は酵素活性の増加をもたらし得る。酵素活性の改善は、対応する野生型ＰＧＡ酵素の酵素活性の約１．５倍から、そのＰＧＡポリペプチドが由来する天然に存在するＰＧＡ、または別の操作されたＰＧＡよりも２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、またはそれを超える酵素活性までであり得る。特定の実施形態では、操作されたＰＧＡ酵素は、親ＰＧＡ酵素の酵素活性の１．５〜５０倍、１．５〜１００倍の範囲の改善された酵素活性を示す。いずれの酵素の活性も拡散律速性（diffusion  limited）であり、したがって、触媒ターンオーバー速度が、任意の必要な補因子を含む基質の拡散速度を超えることはできないことが当業者には理解される。拡散律速またはｋｃａｔ／Ｋｍの理論的最大値は、一般に、約１０８〜１０９（Ｍ−１ｓ−１）である。したがって、ＰＧＡのいかなる酵素活性の改善にも、ＰＧＡ酵素による作用を受ける基質の拡散速度に関連する上限がある。ＰＧＡ活性は、力価測定（titration）によるものなどの、ペニシリンＧの切断時のフェニル酢酸の放出を測定するために使用される標準的なアッセイのいずれか１つによって測定することができる（例えば、SimonsおよびGibson、Biotechnol.  Tech.、１３巻：３６５〜３６７頁、［１９９９年］を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ＰＧＡ活性は、切断生成物である５−アミノ−２−ニトロ−安息香酸が分光光度的に検出可能な（λｍａｘ＝４０５ｎｍ）６−ニトロフェニルアセトアミド安息香酸（ＮＩＰＡＢ）を使用することによって測定することができる。酵素活性の比較は、本明細書においてさらに詳細に記載されるように、酵素の規定の調製、所定の条件下での規定のアッセイ、および１つ以上の規定の基質を使用して行われる。一般に、溶解産物が比較される場合、宿主細胞によって産生され、溶解産物中に存在する酵素の量の変動を最小限にするために、同一の発現系および同一の宿主細胞が使用されると共に、細胞数およびアッセイされるタンパク質の量が決定される。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「増加した酵素活性」および「増加した活性」は、操作された酵素の改善された特性を指し、これは、本明細書に記載される参照酵素と比較して、比活性（例えば、生成された生成物／時間／タンパク質の重量）の増加または基質の生成物への変換率（例えば、出発量の基質の、特定量のＰＧＡを使用した、特定の期間での生成物への変換率）の増加によって表すことができる。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的な酵素特性を含む酵素活性に関係する任意の特性が影響され得、その変化は酵素活性の増加をもたらし得る。いくつかの実施形態では、本明細書に提示されるＰＧＡ酵素は、インスリンの特定の残基からトリフェニル酢酸保護基を除去することによってインスリンを放出させる。酵素活性の比較は、本明細書においてさらに詳細に記載されるように、酵素の規定の調製、所定の条件下での規定のアッセイ、および１つ以上の規定の基質を使用して行われる。一般に、細胞溶解産物中の酵素が比較される場合、宿主細胞によって産生され、溶解産物中に存在する酵素の量の変動を最小限にするために、同一の発現系および同一の宿主細胞が使用されると共に、細胞数およびアッセイされるタンパク質の量が決定される。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「変換」は、基質の対応する生成物への酵素的転換を指す。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「変換率」は、特定条件下である時間の期間内に生成物に変換される基質のパーセントを指す。したがって、例えば、ＰＧＡポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、基質の生成物への「変換率」として表すことができる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「化学選択性」は、化学反応または酵素反応において、ある１つの生成物が別の生成物よりも優先的に形成されることを指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「熱安定（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ）」および「熱安定（ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｌｅ）」は、一定期間（例えば、０．５〜２４時間）にわたって一連の温度条件（例えば、４０〜８０℃）に曝露したときに、無処理の酵素と比較して、不活化に対して耐性であり、したがって、温度の上昇に曝露した後にある特定のレベルの残留活性（例えば、６０％超〜８０％）を保持するポリペプチドを指すのに互換的に使用される。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「溶媒安定（solvent  stable）」は、様々な濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（例えば、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）に、一定期間（例えば、０．５〜２４時間）曝露した後、無処理の酵素と比較して同様の活性（例えば、例えば、６０％〜８０％超）を維持するポリペプチドの能力を指す。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「ｐＨ安定」は、高ｐＨまたは低ｐＨ（例えば、４．５〜６または８〜１２）に、一定期間（例えば、０．５〜２４時間）曝露した後、無処理の酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％超〜８０％）を維持するＰＧＡポリペプチドを指す。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「熱および溶媒安定」は、熱安定（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ）および溶媒安定の両方であるＰＧＡポリペプチドを指す。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「親水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇらの正規化されたコンセンサス疎水性尺度（Eisenbergら、J.  Mol.  Biol.、１７９巻：１２５〜１４２頁、［１９８４年］）に従って０未満の疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる親水性アミノ酸としては、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ−Ｌｙｓ（Ｋ）およびＬ−Ａｒｇ（Ｒ）が挙げられる。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「酸性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチド中に含まれる場合に約６未満のｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。酸性アミノ酸は、一般には、生理的ｐＨにおいて、水素イオンの喪失に起因して、負に荷電した側鎖を有する。遺伝子によってコードされる酸性アミノ酸としては、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「塩基性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチド中に含まれる場合に、約６超のｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。塩基性アミノ酸は、一般には、生理的ｐＨにおいて、ヒドロニウムイオンとの会合に起因して、正に荷電した側鎖を有する。遺伝子によってコードされる塩基性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ−Ｌｙｓ（Ｋ）が挙げられる。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「極性アミノ酸または残基」は、生理的ｐＨにおいて非荷電であるが、２つの原子に共有される電子対が、原子のうちの１つによってより密接に保持される結合を少なくとも１つ有する側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる極性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）およびＬ−Ｔｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「疎水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇらの正規化されたコンセンサス疎水性尺度（Eisenbergら、J.  Mol.  Biol.、１７９巻：１２５〜１４２頁、［１９８４年］）に従って０よりも大きな疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる疎水性アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「芳香族アミノ酸または残基」は、少なくとも１つの芳香族または芳香族複素環を含む側鎖を有する親水性または疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる芳香族アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｔｙｒ（Ｙ）およびＬ−Ｔｒｐ（Ｗ）が挙げられる。Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）は、芳香族複素環の窒素原子のｐＫａに基づいて時には塩基性残基に分類される、または、側鎖が芳香族複素環を含むことに起因して芳香族残基に分類されるが、本明細書では、ヒスチジンは、親水性残基または「拘束された残基（constrained  residue）」（以下を参照のこと）に分類される。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「拘束されたアミノ酸または残基」は、拘束された幾何学的形状を有するアミノ酸または残基を指す。本明細書では、拘束された残基として、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ−Ｈｉｓ（Ｈ）が挙げられる。ヒスチジンは、比較的小さなイミダゾール環を有するので、拘束された幾何学的形状を有する。プロリンも同様に、５員環を有するので、拘束された幾何学的形状を有する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「非極性アミノ酸または残基」は、生理的ｐＨにおいて非荷電であり、２つの原子に共有される電子対が、一般に、２つの原子のそれぞれによって同等に保持される結合を有する側鎖を有する（すなわち、側鎖が極性でない）疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる非極性アミノ酸としては、Ｌ−Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）およびＬ−Ａｌａ（Ａ）が挙げられる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「脂肪族アミノ酸または残基」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる脂肪族アミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）およびＬ−Ｉｌｅ（Ｉ）が挙げられる。
【００６２】
システイン（または「Ｌ−Ｃｙｓ」もしくは「［Ｃ］」）は他のＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸または他のスルファニル含有アミノ酸もしくはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成し得るという点で、普通ではないことに留意する。「システイン様残基」として、システインおよびジスルフィド架橋の形成に利用可能なスルフヒドリル部分を含有する他のアミノ酸が挙げられる。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）（および−ＳＨを含有する側鎖を有する他のアミノ酸）の、ペプチド内に、還元型遊離−ＳＨまたは酸化型ジスルフィド架橋形態のいずれかで存在する能力は、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）がペプチドへの正味の疎水性または親水性特徴に寄与するかどうかに影響を及ぼす。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの正規化されたコンセンサス尺度（Eisenbergら、１９８４年、上記）に従って０．２９の疎水性を示すが、本開示の目的に関しては、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、独自の群にカテゴリー化されることが理解されるべきである。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「小型アミノ酸または残基」は、全部で３つまたはそれ未満の炭素および／またはヘテロ原子（α−炭素および水素を除いて）で構成される側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。小型アミノ酸または残基は、上記の定義に従って、脂肪族、非極性、極性または酸性の小型アミノ酸または残基にさらにカテゴリー化することができる。遺伝子によってコードされる小型アミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシルを含有するアミノ酸または残基」は、ヒドロキシル（−ＯＨ）部分を含有するアミノ酸を指す。遺伝子によってコードされるヒドロキシルを含有するアミノ酸としては、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸差異」および「残基差異」は、参照配列中の対応する位置のアミノ酸残基と比べたポリペプチド配列の位置でのアミノ酸残基の差異を指す。アミノ酸差異の位置は一般に、本明細書では「Ｘｎ」（ｎは、残基差異が基づく参照配列における対応する位置を指す）と称される。例えば、「配列番号２と比較したＸ４０位の残基差異」は、配列番号２の４０位に対応するポリペプチド位置のアミノ酸残基の差異を指す。したがって、配列番号２の参照ポリペプチドが４０位でヒスチジンを有する場合、「配列番号２と比較したＸ４０位の残基差異」は、配列番号２の４０位に対応するポリペプチドの位置でのヒスチジン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書のほとんどの例では、ある位置における特定のアミノ酸残基差異は、「ＸｎＹ」（「Ｘｎ」は、上記のように対応する位置を指定し、「Ｙ」は、人工ポリペプチドに見られるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチド中と異なる残基）の一文字識別子である）として示される。一部の場合では、本開示はまた、慣例的な表示法「ＡｎＢ」（Ａは、参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の番号であり、Ｂは、人工ポリペプチドの配列中の残基置換の一文字識別子である）によって表される特定のアミノ酸差異を提供する。いくつかの場合では、本開示のポリペプチドは、参照配列と比較して１個以上のアミノ酸残基差異を含み得、これは、参照配列と比較して残基差異が存在する特定の位置のリストによって示される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの特定の残基位置に１個超のアミノ酸を使用することができる場合、使用することができる様々なアミノ酸残基は、「／」によって区切られる（例えば、Ｘ１９２Ａ／Ｇ）。本開示は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換のいずれかまたはその両方を含む１個以上のアミノ酸差異を含む操作されたポリペプチド配列を包含する。本開示の配列表に含まれる特定の組換え炭酸脱水酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、開始メチオニン（Ｍ）残基を含む（すなわち、Ｍは残基位置１を表す）。しかし、この開始メチオニン残基は、開始メチオニン残基を欠くが他の点では酵素の特性を保持する成熟タンパク質を作製するために、例えば宿主細胞またはインビトロ翻訳系においてなど、生物学的プロセシング機構によって除去することができることが当業者には理解される。したがって、用語「Ｘｎ位における配列番号２と比較したアミノ酸残基差異」は、本明細書で使用される場合、開始メチオニンを欠くようにプロセシングされた参照配列内の「Ｘｎ」位または対応する位置（例えば、（Ｘ−１）ｎ位）を指し得る。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、ある残基を、類似側鎖を有する残基の互換性を指し、したがって一般に、ポリペプチド中のアミノ酸を、同じかまたは類似の規定アミノ酸クラス内のアミノ酸で置換することを含む。一例として限定されないが、いくつかの実施形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンと置換し、ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、セリンおよびトレオニンと置換され、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジンと置換され、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、リジンおよびアルギニンと置換され、酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）と置換され、および／または、疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性または親水性アミノ酸と置換される。例示的な保存的置換を表１に提供する。
【表１】
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【００６７】
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、ポリペプチド中のアミノ酸を、側鎖特性が顕著に異なるアミノ酸に置換することを指す。非保存的置換は、規定のグループ内ではなく規定のグループ間のアミノ酸を使用することができ、（ａ）置換（例えば、グリシンからプロリン）領域内のペプチド骨格の構造、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクに影響を与える。一例として限定されないが、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸と置換された酸性アミノ酸、小さいアミノ酸と置換された芳香族アミノ酸、および疎水性アミノ酸と置換された親水性アミノ酸であり得る。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「欠失」は、参照ポリペプチドから１つ以上のアミノ酸を除去することによる、ポリペプチドの改変を指す。欠失は、酵素活性を保持し、および／または人工酵素の改善された特性を保持しつつ、１アミノ酸以上、２アミノ酸以上、５アミノ酸以上、１０アミノ酸以上、１５アミノ酸以上または２０アミノ酸以上の除去であって、ポリペプチドを構成する全アミノ酸数の１０％までの除去、または参照酵素を構成する全アミノ酸数の２０％までの除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を対象とするものであり得る。様々な実施形態では、欠失は連続的なセグメントを含み得るか、または不連続であり得る。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「挿入」は、参照ポリペプチドへと１つ以上のアミノ酸を付加することによる、ポリペプチドの改変を指す。いくつかの実施形態では、改善された人工ＰＧＡ酵素は、天然に存在するＰＧＡポリペプチドへの１アミノ酸以上の挿入、ならびに人工ＰＧＡポリペプチドへの１アミノ酸以上の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部部分にあり得るか、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端に対するものであり得る。当技術分野で公知であるように、本明細書で使用される挿入は、融合タンパク質を含む。天然ポリペプチドにおいて、挿入は、連続的なアミノ酸セグメントであり得るか、またはアミノ酸の１つ以上によって隔てられ得る。
【００７０】
用語「アミノ酸置換セット」または「置換セット」は、参照配列と比較した、ポリペプチド配列内のアミノ酸置換の群を指す。置換セットは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、またはそれを超えるアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態では、置換セットは、実施例において提示される表に列挙されている改変体ＰＧＡのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、配列中の対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は、典型的には、全長ＰＧＡポリペプチ、例えば、配列番号２のポリペプチドの約８０％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％を有し得る。いくつかの実施形態では、断片は、「生物学的に活性である」（すなわち、全長配列と同じ酵素活性を示す）。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、天然でそれに付随する他の混入物、例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチドから実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、その天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはインビトロ合成）から回収または精製されたポリペプチドを包含する。改善されたＰＧＡ酵素は、細胞内に存在し得るか、細胞培地中に存在し得るか、または様々な形態（例えば、溶解産物または単離された調製物）で調製され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の人工ＰＧＡポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、そのポリペプチド種が存在する優勢種である（すなわち、モルまたは重量基準で、これが、組成物中の任意の他の個々の高分子種よりも豊富である）組成物を指し、一般に、目的種が、存在する高分子種の少なくとも約５０モルパーセントまたは約５０重量パーセントを構成する場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋な人工ＰＧＡポリペプチド組成物は、この組成物中に存在するすべての高分子種の約６０モル％または重量％以上、約７０モル％または重量％以上、約８０モル％または重量％以上、約９０モル％または重量％以上、約９５モル％または重量％以上、および約９８モル％または重量％以上を含む。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、高分子種と見なされない。いくつかの実施形態では、単離された改善されたＰＧＡポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【００７４】
本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチドに関して使用される場合、用語「異種」は、通常は生物（例えば、野生型生物）によって発現および分泌されない配列を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、通常天然に見いだされるものと同じ互いとの関係では見いだされない、あるいは、組換え操作されており、その結果、発現のレベル、または細胞内の他の核酸もしくは他の分子との物理的関係、または構造が通常天然に見いだされるものではない、２つまたはそれを超える部分配列を含む配列を包含する。例えば、異種核酸は、一般には、組換えによって作製され、天然に見いだされない様式で配置された無関係の遺伝子に由来する２つまたはそれを超える配列を有する（例えば、ベクターなどの発現カセットに挿入されたプロモーター配列に作動可能に連結された本発明の核酸オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））。いくつかの実施形態では、「異種ポリヌクレオチド」は、実験室技術によって宿主細胞中に導入される任意のポリヌクレオチドを指し、宿主細胞から取り出され、実験室操作にかけられ、次いで宿主細胞中に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「適切な反応条件」は、本開示のＰＧＡポリペプチドがトリフェニル酢酸保護基を除去することによって遊離のインスリンを放出させることができる生体触媒反応溶液の条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、補因子負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒などの範囲）を指す。例示的な「適切な反応条件」は本開示において提供されており、実施例によって例示されている。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「化合物負荷」、「酵素負荷」または「補因子負荷」などの「負荷」は、反応開始時における反応混合物中の成分の濃度または量を指す。
【００７７】
本明細書で使用される場合、生体触媒媒介プロセスとの関連における「基質」は、生体触媒が作用する化合物または分子を指す。
【００７８】
本明細書で使用される場合、生体触媒媒介プロセスとの関連における「生成物」は、生体触媒が作用した結果生じる化合物または分子を指す。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「平衡」は、化学反応または酵素反応の順方向速度定数および逆方向速度定数によって決定される、立体異性体の相互変換を含む化学反応または酵素反応（例えば、２つの種ＡおよびＢの相互変換）において化学種の定常状態の濃度をもたらすプロセスを指す。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「アシラーゼ」および「アシルトランスフェラーゼ」は、アシル基を供与体から受容体に移行させてエステルまたはアミドを形成させることができる酵素を指すのに互換的に使用される。アシラーゼ媒介逆反応の結果、エステルまたはアミドが加水分解される。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「ペニシリンＧ」および「ベンジルペニシリン」は、（２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−３，３−ジメチル−７−オキソ−６−（２−フェニルアセトアミド）−４−チア−１−アザビシクロ［３．２．０］ヘプタン−２−カルボン酸（Ｃ１６Ｈ１８Ｎ２Ｏ４Ｓ）としても公知の抗生物質を指す。これは、グラム陽性生物に対して主に有効であるが、一部のグラム陰性生物もそれに対して感受性である。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「ペニシリンＧアシラーゼ」および「ＰＧＡ」は、ペニシリンＧ（ベンジルペニシリン）のフェニル酢酸（ＰＨＡ）および６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）への切断を媒介する能力を有する酵素を指すのに互換的に使用される。いくつかの実施形態では、ＰＧＡ活性は、モデル基質の切断、例えば、６−ニトロ−３−（フェニルアセトアミド）安息香酸のフェニル酢酸および５−アミノ−２−ニトロ−安息香酸への切断に基づくものであり得る。ＰＧＡはまた、アシル供与体のアシル基をアシル受容体に移行させる逆反応を行うこともできる。ＰＧＡは、本明細書で使用される場合、天然に存在する（野生型）ＰＧＡ、ならびに人為的操作によって作製された１つ以上の操作されたポリペプチドを含む天然に存在しないＰＧＡ酵素を包含する。野生型ＰＧＡ遺伝子は、５４アミノ酸のスペーサー領域によって連結されたαサブユニット（２３．８ＫＤａ）およびβサブユニット（６２．２ＫＤａ）からなるヘテロ二量体である。スペーサー領域が存在することに起因して、活性なタンパク質を形成するためには自己プロセシングステップが必要である。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「アシル供与体」は、アシル基をアシル受容体に供与してエステルまたはアミドを形成させる、アシラーゼ基質の部分を指す。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「アシル受容体」は、アシル供与体のアシル基を受容してエステルまたはアミドを形成させる、アシラーゼ基質の部分を指す。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「α鎖配列」は、配列番号２の２７〜２３５位の残基に対応する（例えば、それに対して少なくとも８５％の同一性を有する）アミノ酸配列を指す。本明細書で使用される場合、単鎖のポリペプチドは、「α鎖配列」およびさらなる配列（複数可）を含み得る。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「β鎖配列」は、配列番号２の２９０〜８４６位の残基に対応する（例えば、それに対して少なくとも８５％の同一性を有する）アミノ酸配列を指す。本明細書で使用される場合、単鎖のポリペプチドは、「β鎖配列」およびさらなる配列（複数可）を含み得る。
【００８７】
本明細書で使用される場合、操作されたＰＧＡ酵素との関連において使用される「に由来する」は、操作がそれに基づく、起源のＰＧＡ酵素、および／またはこのようなＰＧＡ酵素をコードする遺伝子を同定する。例えば、配列番号６０の操作されたＰＧＡ酵素は、配列番号２のＫ．ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ  ＰＧＡ  α−鎖およびβ−鎖配列をコードする遺伝子を多数の世代にわたって人工的に進化させることによって得たものである。したがって、この操作されたＰＧＡ酵素は、配列番号２の天然に存在するまたは野生型ＰＧＡ「に由来する」。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「インスリン」は、正常な個体において膵臓のβ細胞によって産生されるポリペプチドホルモンを指す。インスリンは、血中グルコースレベルを低下させることによって炭水化物代謝を調節するために必要である。インスリンの系統的欠損により、糖尿病が生じる。インスリンは、５１アミノ酸で構成され、およそ５８００ダルトンの分子量を有する。インスリンは、２つのペプチド鎖（「Ａ」および「Ｂ」で示される）で構成され、サブユニット内ジスルフィド結合を１つとサブユニット間ジスルフィド結合を２つ含有する。Ａ鎖は２１アミノ酸で構成され、Ｂ鎖は３０アミノ酸で構成される。２つの鎖は、高度に規則的な構造を形成し、Ａ鎖とＢ鎖の両方にα−ヘリックス領域をいくつか伴う。単離された鎖は不活性である。溶液中では、インスリンは、単量体、二量体、または六量体である。インスリンは、皮下注射のために使用される高度に濃縮された調製物中では六量体であるが、体液中で希釈されるにしたがって単量体になる。この定義は、プロインスリン、ならびに、天然に存在するインスリンの主要な構造的立体配座の一部または全部および生物学的特性の少なくとも１つを有する任意の精製された単離されたポリペプチドを包含することが意図されている。さらに、グリコフォームを含む、天然のインスリンおよび合成により作られたインスリン、ならびに類似体（例えば、欠失、挿入、および／または置換を有するポリペプチド）を包含することが意図されている。
【００８９】
インスリンは、フェニル酢酸供与体と潜在的に反応し得、ＰＧＡによって脱保護され得る求核アミンを３つ含有する。これらの残基として、Ｂ鎖の２９位（Ｂ２９）のＬｙｓならびに２つのＮ末端遊離のアミン、Ａ鎖の１位（Ａ１）のＧｌｙおよびＢ鎖の１位（Ｂ１）のＰｈｅが挙げられる。本発明は、３重保護インスリン（ヒトインスリンのＡ１残基、Ｂ１残基、Ｂ２９残基にフェニル酢酸が化学的に結合している）を提供する。ＰＧＡは、Ｎ−フェニル酢酸で保護されたペプチドおよびインスリンの加水分解をフェニル酢酸アミド結合に対する排他的な選択性で触媒し、タンパク質の残りのペプチド結合はインタクトなまま残すことが以前に報告されている（Brtnikら、Coll.  Czech.  Chem.  Commun.、４６巻（８号）、１９８３〜１９８９頁、［１９８１年］；およびWangら、Biopolym.、２５巻（補遺）、Ｓ１０９〜Ｓ１１４頁、［１９８６年］）。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「トリフェニル酢酸保護基」は、本明細書に記載されるように、Ｂ１位、Ｂ２９位およびＡ１位にフェニルアシル基で保護された３つの第一級アミンを有するインスリン分子を指す。
【００９１】
ペニシリンＧアシラーゼ
ペニシリンアシラーゼは、ＳａｋａｇｕｃｈｉおよびＭｕｒａｏにより、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ  Ｗｉｓｃ．  Ｑ１７６から最初に記載された（SakaguchiおよびMurao、J.  Agr.Chem.  Soc.  Jpn.、２３巻：４１１頁、［１９５０年］）。ペニシリンＧアシラーゼは、ペニシリンＧ、セファロスポリンＧ、および関連する抗生物質の側鎖に作用して、共通の副生成物としてフェニル酢酸を伴い、β−ラクタム系抗生物質中間体である６−アミノペニシラン酸および７−アミノデス−アセトキシセファロスポラン酸を生成させる加水分解酵素である。これらの抗生物質中間体としては、アンピシリン、アモキシシリン、クロキサシリン、セファレキシン、およびセフォタキシム（cefatoxime）などの、半合成抗生物質の潜在的な構成要素がある。
【００９２】
上に示されている通り、ペニシリンＧアシラーゼ（ＰＧＡ）は、スキーム１：
【化１】
0006755886.tif 000003
に示されている通り、構造式（Ｉ）の共役塩基を有するペニシリンＧの、構造式（ＩＩ）の共役塩基を有する６−アミノペニシラン酸および構造式（ＩＩＩ）のフェニル酢酸への、加水分解による切断を触媒する能力によって特徴付けられる。
【００９３】
理論に縛られるものではないが、基質特異性は疎水性フェニル基の認識に関連すると思われ、一方、いくつかのＰＧＡではβ鎖のＮ末端のセリン残基である求核試薬が、β−ラクタムおよびβアミノ酸などの様々な他の基の受容体として作用する。ＰＧＡは、また、スキーム２：
【化２】
0006755886.tif 000004
に示されている通り、ペニシリンＧと類似しているモデル基質を切断する、例えば、構造式（ＩＶ）の６−ニトロ−３−（フェニルアセトアミド）安息香酸（ＮＩＰＡＢ）を、構造式（ＩＩＩ）のフェニル酢酸および構造式（Ｖ）の５−アミノ−２−ニトロ−安息香酸に切断する能力によっても特徴付けられ得る（例えば、Alkemaら、Anal.  Biochem.、２７５巻：４７〜５３頁、［１９９９年］を参照のこと）。５−アミノ−２−ニトロ−安息香酸は発色性であるので、式（ＩＶ）の基質により、ＰＧＡ活性を測定する便利な方法がもたらされる。前述の反応に加えて、ＰＧＡは、光学的に純粋なｔｅｒｔロイシンを調製するための、ＤＬ−ｔｅｒｔロイシンの反応速度論的分解にも使用することができる（例えば、Liuら、Prep.  Biochem.  Biotechnol.、３６巻：２３５〜４１頁、［２００６年］を参照のこと）。
【００９４】
本開示のＰＧＡは、生物Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ（Ｋ．ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ）から得られた酵素に基づく。他の生物由来のＰＧＡと同様に、Ｋ．ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａのＰＧＡは、プレ−プロ−ＰＧＡポリペプチドのタンパク質分解性プロセシングによって生じる、α−サブユニットおよびβ−サブユニットで構成されるヘテロ二量体酵素である。シグナルペプチドおよびスペーサーペプチドを除去することにより、成熟ヘテロ二量体が生成される（例えば、Barberoら、Gene、４９巻：６９〜８０頁、［１９８６年］を参照のこと）。Ｋ．ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａの天然に存在するプレ−プロ−ＰＧＡポリペプチドのアミノ酸配列は公的に入手可能であり（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０７９４１、［ｇｉ：１２９５５１］を参照のこと）、本明細書において配列番号２として提示される。天然に存在するＫ  ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ  ＰＧＡのα鎖配列は、配列番号２の残基２７〜２３５に対応する。天然に存在するＫ  ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ  ＰＧＡのβ鎖配列は、配列番号２の残基２９０〜８４６に対応する。配列番号２の残基１〜２６はシグナルペプチドに対応し、配列番号２の残基２３６〜２８９は連結しているプロペプチドに対応し、その両方が除去されて、α鎖サブユニットおよびβ鎖サブユニットを含むヘテロ二量体である、天然に存在する成熟ＰＧＡ酵素が生じる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０および／または１２に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を有する操作されたＰＧＡポリペプチドを提供する。
【００９６】
本発明は、実験室規模の調製的使用に適したインスリン特異的脱アシル化生体触媒を提供する。定向進化法を使用して、インスリン上のＡ１／Ｂ１／Ｂ２９−トリフェニル酢酸保護基を完全に除去し、＞９９％の遊離のインスリンを生成することができる効率的なアシラーゼ改変体を開発した。たった２ラウンドの進化後に、０．８ｇ／Ｌの酵素負荷で６時間未満のうちに９９％超の遊離のインスリンを生成する改変体が生じた。最終的な最良の改変体ＰＧＡ＿００５は、最初の骨格に対して約８倍改善された。本明細書において提示されるＰＧＡ改変体は、広範囲のアシル基を受容することができ、野生型ＰＧＡと比較して増加した溶媒安定性、および改善された熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を示す。本明細書において提示される改変体ＰＧＡはスペーサー領域を欠く。したがって、活性酵素を産生させるために自己プロセシングステップは必要ない。
【００９７】
本発明は、操作されたＰＧＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子発現を制御する１つ以上の異種調節配列にポリヌクレオチドを作動可能に連結して、前記ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製する。操作されたＰＧＡポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するＰＧＡポリペプチドを発現させることができる。
【００９８】
様々なアミノ酸に対応するコドンの知見に起因して、タンパク質配列の利用可能性により、対象をコードすることができるすべてのポリヌクレオチドの説明が提供される。同じアミノ酸が代替または同義のコドンによってコードされる遺伝子コードの縮重は、本明細書に開示されている改善されたＰＧＡ酵素をすべてがコードする極端に多数の核酸が作られることを可能にする。したがって、特定のアミノ酸配列を同定したら、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変更しない方法で、１つ以上のコドンの配列を単に改変することによって、任意の数の様々な核酸を作ることができると予想される。この点において、本開示は、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することによって作られ得るポリヌクレオチドのそれぞれのおよびすべての可能なバリエーションを特に意図し、すべてのこのようなバリエーションは、実施例５および６における表に示されているアミノ酸配列を含めて、本明細書に開示される任意のポリペプチドについて具体的に開示されるとみなされるべきである。
【００９９】
様々な実施形態では、コドンは、タンパク質が産生されている宿主細胞に合うように選択されることが好ましい。例えば、細菌中で使用される好ましいコドンは、細菌内での発現に使用され；酵母中で使用される好ましいコドンは、酵母内での発現に使用され、哺乳動物で使用される好ましいコドンは、哺乳動物細胞での発現に使用される。
【０１００】
ある特定の実施形態では、天然の配列は好ましいコドンを含むため、および好ましいコドンの使用は、すべてのアミノ酸残基に必要とされない場合があるため、ＰＧＡポリペプチドのコドン使用頻度を最適化するのに、すべてのコドンが置換される必要はない。したがって、ＰＧＡ酵素をコードする、コドンが最適化されたポリヌクレオチドは、全長コード領域の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％超のコドン位置で好ましいコドンを含有し得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される参照操作されたＰＧＡポリペプチドのいずれかのα鎖および／またはβ鎖に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＰＧＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２に基づく参照α鎖配列およびβ鎖配列に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２のα鎖アミノ酸配列および／またはβ鎖アミノ酸配列をコードする。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４、６、８、１０、および／または１２に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＰＧＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、および／または１１に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列をコードする。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、改善されたＰＧＡポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの改善された活性および／または発現がもたらされるように様々な方法で操作されたものである。発現ベクターに応じて、単離されたポリヌクレオチドをベクターに挿入する前に操作することが望ましいかまたは必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技術は、当技術分野で周知である。
【０１０４】
例えば、発現させること、スクリーニングすること、およびアッセイすることができる改変体ライブラリーを作製するために、変異誘発および定向進化法をポリヌクレオチドに容易に適用することができる。変異誘発および定向進化法は当技術分野で周知である（例えば、すべてが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８３０，７２１号、同第６，１３２，９７０号、同第６，４２０，１７５号、同第６，２７７，６３８号、同第６，３６５，４０８号、同第６，６０２，９８６号、同第７，２８８，３７５号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２９７，０５３号、同第６，５７６，４６７号、同第６，４４４，４６８号、同第５，８１１２３８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２９１，２４２号、同第６，９９５，０１７号、同第６，３９５，５４７号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５０６，６０３号、同第６，４１３，７７４号、同第６，５７３，０９８号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３７２，４９７号、同第７，８６８，１３８号、同第５，８３４，２５２号、同第５，９２８，９０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，０９６，５４８号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３５８，７４２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，３３５，１６０号、同第６，６５３，０７２号、同第６，３５５，４８４号、同第６，０３，３４４号、同第６，３１９，７１３号、同第６，６１３，５１４号、同第６，４５５，２５３号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，４０６，８５５号、同第６，９４６，２９６号、同第７，５３４，５６４号、同第７，７７６，５９８号、同第５，８３７，４５８号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３０９，８８３号、同第７，１０５，２９７号、同第７，７９５，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，２５１，６７４号、同第６，７１６，６３１号、同第６，５２８，３１１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３７９，９６４号、同第７，１４８，０５４号、同第７，６２９，１７０号、同第７，６２０，５００号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３５８，７４０号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４３６，６７５号、同第６，９６１，６６４号、同第７，４３０，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４７９，６５２号、同第６，３１９，７１４号、同第６，５２１，４５３号、同第６，３６８，８６１号、同第７，４２１，３４７号、同第７，０５８，５１５号、同第７，０２４，３１２号、同第７，６２０，５０２号、同第７，８５３，４１０号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９０４，２４９号、およびすべての関連する米国以外の対応物；Lingら、Anal.  Biochem.、２５４巻（２号）：１５７〜７８頁、［１９９７年］；Daleら、Meth.  Mol.  Biol.、５７巻：３６９〜７４頁、［１９９６年］；Smith、Ann.  Rev.  Genet.、１９巻：４２３〜４６２頁、［１９８５年］；Botsteinら、Science、２２９巻：１１９３〜１２０１頁、［１９８５年］；Carter、Biochem.  J.、２３７巻：１〜７頁、［１９８６年］；Kramerら、Cell、３８巻：８７９〜８８７頁、［１９８４年］；Wellsら、Gene、３４巻：３１５〜３２３頁、［１９８５年］；Minshullら、Curr.  Op.  Chem.  Biol.、３巻：２８４〜２９０頁、［１９９９年］；Christiansら、Nat.  Biotechnol.、１７巻：２５９〜２６４頁、［１９９９年］；Crameriら、Nature、３９１巻：２８８〜２９１頁、［１９９８年］；Crameriら、Nat.  Biotechnol.、１５巻：４３６〜４３８頁、［１９９７年］；Zhangら、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  U.S.A.、９４巻：４５０４〜４５０９頁、［１９９７年］；Crameriら、Nat.  Biotechnol.、１４巻：３１５〜３１９頁、［１９９６年］；Stemmer、Nature、３７０巻：３８９〜３９１頁、［１９９４年］；Stemmer、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA、９１巻：１０７４７〜１０７５１頁、［１９９４年］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７；およびＷＯ２００９／１５２３３６を参照のこと）。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本発明の改変体ＰＧＡアシラーゼは、コードされる酵素の活性を変化させないさらなる配列をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、改変体ＰＧＡアシラーゼは、エピトープタグ、または精製において有用な別の配列に連結されている。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本発明の改変体ＰＧＡアシラーゼポリペプチドは、それを発現する宿主細胞（例えば、酵母または糸状菌宿主細胞）から分泌され、シグナルペプチド（すなわち、ポリペプチドのアミノ末端に連結された、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路に向かわせるアミノ酸配列）を含むプレタンパク質として発現される。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、内在性Ｋ．ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ  ＰＧＡアシラーゼシグナルペプチドである。いくつかの他の実施形態では、他のＫ．ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ分泌タンパク質由来のシグナルペプチドが使用される。いくつかの実施形態では、宿主細胞および他の因子に応じて、他のシグナルペプチドが使用される。糸状菌宿主細胞についての有効なシグナルペプチドコード領域としては、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼ、およびＴ．ｒｅｅｓｅｉセロビオヒドロラーゼＩＩから得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。細菌宿主細胞のためのシグナルペプチドコード領域としては、限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣｌＢ１１８３７マルトース生成アミラーゼ（maltogenic  amylase）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  α−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  β−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。いくつかのさらなる実施形態では、他のシグナルペプチドが本発明において使用される（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、SimonenおよびPalva、Microbiol.  Rev.、５７巻：１０９〜１３７頁、［１９９３年］を参照のこと）。酵母宿主細胞についてのさらなる有用なシグナルペプチドとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＵＣ２インベルターゼの遺伝子に由来するものが挙げられる（例えば、TaussigおよびCarlson、Nucl.  Acids  Res.、１１巻：１９４３〜５４頁、［１９８３年］；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００７２４；およびRomanosら、Yeast、８巻：４２３〜４８８頁、［１９９２年］を参照のこと）。いくつかの実施形態では、これらのシグナルペプチドの改変体および他のシグナルペプチドが使用される。実際に、当技術分野で公知の任意の適切なシグナルペプチドが本発明において使用されるので、本発明は、いかなる特定のシグナルペプチドにも限定されるものではない。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される改変体ＰＧＡアシラーゼポリペプチド、および／または生物学的に活性なその断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子発現を制御する１つ以上の異種調節配列または制御配列にポリヌクレオチドを作動可能に連結して、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製する。いくつかの実施形態では、改変体ＰＧＡアシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、改変体ＰＧＡアシラーゼを発現させる。
【０１０９】
遺伝子コードの縮重に起因して、本発明の改変体ＰＧＡアシラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が多数存在することが当業者には理解される。例えば、コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、およびＣＧＵはすべて、アミノ酸アルギニンをコードする。したがって、コドンによりアルギニンが指定される本発明の核酸内のすべての位置において、そのコドンを、コードされるポリペプチドを変化させることなく、上記の対応するコドンのいずれかに変更することができる。ＲＮＡ配列内の「Ｕ」は、ＤＮＡ配列内の「Ｔ」に対応することが理解される。本発明は、可能なコドン選択に基づいて組み合わせを選択することによって作られ得る本発明のポリペプチドをコードする核酸配列のそれぞれのおよびすべての可能なバリエーションを意図し、提供する。
【０１１０】
上に示されている通り、ＰＧＡをコードするＤＮＡ配列は、高コドン使用頻度バイアスのコドン（同じアミノ酸をコードする他のコドンより、タンパク質コード領域において高い頻度で使用されるコドン）について設計することもできる。好ましいコドンは、１個の遺伝子、共通の機能もしくは起源の一連の遺伝子、高度に発現された遺伝子におけるコドン使用頻度、生物全体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン出現頻度、関連する生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン出現頻度、またはこれらの組み合わせに関して決定することができる。遺伝子発現レベルと共にその頻度が増加するコドンは一般に、発現にとっての最適なコドンである。特に、特定の宿主生物における発現のためにＤＮＡ配列を最適化することができる。多変量解析（例えば、クラスター分析または対応分析を使用する）を含む、特定の生物におけるコドン出現頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的な同義コドン使用頻度）およびコドン優先度を決定するための様々な方法、ならびに遺伝子において使用されるコドンの有効数を決定するための様々な方法が当技術分野で周知である。コドン使用頻度を得るためのデータソースは、タンパク質をコードすることができる任意の入手可能なヌクレオチド配列に依拠することができる。これらのデータセットは、当技術分野で周知であるように、発現タンパク質をコードすることが実際に公知である核酸配列（例えば、完全なタンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現配列タグ（ＥＳＴ）、またはゲノム配列の予測されるコード領域を含む。改変体ＰＧＡをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して調製され得る。一般には、オリゴヌクレオチドを個々に合成し、次いで結合（例えば、酵素的ライゲーション法もしくは化学的ライゲーション法、またはポリメラーゼ媒介法によって）して、基本的に任意の所望の連続的な配列を形成する。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、限定されないが、自動化された合成法を含む当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用した化学合成によって調製される。例えば、ホスホラミダイト法では、オリゴヌクレオチドを合成し（例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーで）、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、適切なベクターにクローニングする。いくつかの実施形態では、次いで、二本鎖ＤＮＡ断片を、相補鎖を合成し、その鎖を一緒に適切な条件下でアニーリングすることによって、または、適切なプライマー配列を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を付加することによってのいずれかで得る。本発明において有用な方法を提供する多数の一般的な標準的なテキストが当業者に周知である。
【０１１１】
操作されたＰＧＡは、天然に存在するＰＧＡをコードするポリヌクレオチドを、上記の変異誘発および／または定向進化法に供することによって得られ得る。変異誘発は、ランダム変異誘発および部位特異的変異誘発を含む当技術分野で公知の技術のいずれかに従って実施され得る。定向進化法は、シャッフリングを含む、改善された改変体についてスクリーニングするための当技術分野で公知の技術のいずれかを用いて実施され得る。使用される他の定向進化法手順としては、限定されないが、スタッガードエクステンションプロセス（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳｔＥＰ）、インビトロ組換え、変異誘発ＰＣＲ、カセット変異誘発、オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥｉｎｇ）、ＰｒｏＳＡＲ（商標）定向進化法など、ならびに任意の他の適切な方法が挙げられる。
【０１１２】
変異誘発処理に従って得られたクローンを、所望の改善された酵素特性を有する操作されたＰＧＡについてスクリーニングする。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、生成物が形成される速度をモニタリングする標準的な生化学技術を使用して実施され得る。所望の改善された酵素特性が熱安定性である場合、酵素調製物を規定温度に供し、熱処理後に残存する酵素活性の量を測定した後に、酵素活性を測定し得る。次いで、ＰＧＡをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを単離し、配列決定してヌクレオチド配列の変化を同定し（存在する場合）、これを使用して酵素を宿主細胞で発現させる。
【０１１３】
操作されたポリペプチドの配列が公知である場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成方法に従って、標準的な固相法によって調製され得る。いくつかの実施形態では、約１００塩基までの断片を、個々に合成し、次いで結合（例えば、酵素的ライゲーション法もしくは化学的ライゲーション法、またはポリメラーゼ媒介法によって）することによって、任意の所望の連続的な配列を形成し得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、化学合成（一般には、自動化された合成法で実施されるので、例えば、Beaucageら、Tet.  Lett.、２２巻：１８５９〜６９頁、［１９８１年］に記載されている古典的なホスホラミダイト法を、またはMatthesら、EMBO  J.、３巻：８０１〜０５頁、［１９８４年］に記載されている方法を使用する）によって調製され得る。ホスホラミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドを、合成し（例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーで）、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、適切なベクターにクローニングする。さらに、基本的に任意の核酸が、様々な商業的供給源のいずれかから入手され得る（例えば、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＴＸ、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒａｍｏｎａ、ＣＡ、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．  Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ、および他の多く）。
【０１１４】
本発明は、本明細書に提示されるように、少なくとも１つの改変体ＰＧＡをコードする配列を含む組換え構築物も提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された改変体ＰＧＡポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本発明の発現ベクターを使用して適切な宿主細胞を形質転換して、宿主細胞が改変体ＰＧＡタンパク質を発現するのを可能にする。真菌および他の生物におけるタンパク質の組換え発現のための方法は当技術分野で周知であり、いくつもの発現ベクターが利用可能であるかまたは常套的な方法を使用して構築することができる。いくつかの実施形態では、本発明の核酸構築物は、本発明の核酸配列が挿入された、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などの、ベクターを含む。いくつかの実施形態では、改変体ＰＧＡポリペプチド（複数可）を発現させるために適した様々な発現ベクターのいずれか１つに本発明のポリヌクレオチドを組み込む。適切なベクターとしては、限定されないが、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０の誘導体）、ならびに細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、および多くの他のものなどのウイルスＤＮＡが挙げられる。遺伝子材料を細胞に形質導入し、複製が望まれる場合には関連する宿主において複製可能かつ生存可能である、任意の適切なベクターが本発明において使用される。いくつかの実施形態では、構築物は、タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された、限定されないがプロモーターを含む調節配列をさらに含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に公知である。実際に、いくつかの実施形態では、特定の宿主において高い発現のレベルを得るために、多くの場合、本発明の改変体ＰＧＡを異種プロモーターの制御下で発現させることが有用である。いくつかの実施形態では、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して、プロモーター配列を改変体ＰＧＡコード配列の５’領域に作動可能に連結する。改変体ＰＧＡを発現させるために有用なプロモーターの例としては、限定されないが、真菌由来のプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、真菌株においてＰＧＡ遺伝子以外の遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列が使用される。非限定的な例として、エンドグルカナーゼをコードする遺伝子由来の真菌プロモーターを使用することができる。いくつかの実施形態では、ＰＧＡが由来する真菌株以外の真菌株においてＰＧＡ遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列が使用される。糸状菌宿主細胞において本発明のヌクレオチド構築物の転写を導くために有用な他の適切なプロモーターの例としては、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、��ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリ性プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるプロモーター（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９６／００７８７を参照のこと）、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼの遺伝子由来のプロモーターとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｐｅｐＡ、ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、ｘｙｎ１、ａｍｙ、およびｇｌａＡなどのプロモーター（例えば、すべてが参照により本明細書に組み込まれる、Nunbergら、Mol.  Cell  Biol.、４巻：２３０６〜２３１５頁、［１９８４年］；Boelら、EMBO  J.、３巻：１５８１〜８５頁、［１９８４年］；および欧州特許出願第１３７２８０号を参照のこと）、ならびにその変異体プロモーター、短縮プロモーター、およびハイブリッドプロモーターが挙げられる。
【０１１５】
酵母宿主細胞では、有用なプロモーターとして、限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ｅｎｏ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ｇａｌ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。酵母宿主細胞に対して有用なさらなる有用なプロモーターは当技術分野で公知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Romanosら、Yeast、８巻：４２３〜４８８頁、［１９９２年］を参照のこと）。さらに、真菌におけるキチナーゼ産生に関連するプロモーターが本発明において使用される（例えば、その両方が参照により本明細書に組み込まれるBlaiseauおよびLafay、Gene、１２０２４３〜２４８頁、［１９９２年］；ならびにLimonら、Curr.  Genet.、２８巻：４７８〜８３頁、［１９９５年］を参照のこと）。
【０１１６】
細菌宿主細胞に関しては、本開示の核酸構築物の転写を導くための適切なプロモーターとしては、限定されないが、大腸菌ｌａｃオペロン、大腸菌ｔｒｐオペロン、バクテリオファージλ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ(agarase)遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡ遺伝子およびｘｙｌＢ遺伝子、ならびに原核生物のβ−ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター（例えば、Villa-Kamaroffら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、７５巻：３７２７〜３７３１頁、［１９７８年］を参照のこと）、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、DeBoerら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８０巻：２１〜２５頁、［１９８３年］を参照のこと）が挙げられる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、クローニングされた本発明の改変体ＰＧＡはまた、適切な転写ターミネーター配列（宿主細胞によって認識されて転写を終結させる配列）も有する。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選択される宿主細胞内で機能的である任意のターミネーターが本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターとしては、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  α−グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，３９９，６２７号も参照のこと）。いくつかの実施形態では、酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の遺伝子から得られるものが挙げられる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは当業者に周知である（例えば、Romanosら、Yeast、８巻：４２３〜８８頁、［１９９２年］を参照のこと）。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、クローニングされた改変体ＰＧＡ配列の一部は、適切なリーダー配列（宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択される宿主細胞内で機能的である任意のリーダー配列が本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーとしては、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーとしては、限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られるものが挙げられる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本発明の配列は、ポリアデニル化配列（核酸配列の３’末端に作動可能に連結される配列であって、ポリアデノシン残基を転写されたｍＲＮＡに付加するシグナルとして転写時に宿主細胞によって認識される配列）も含む。選択される宿主細胞内で機能的である任意のポリアデニル化配列が本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列としては、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  α−グルコシダーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、当技術分野で公知である（例えば、GuoおよびSherman、Mol.  Cell.  Biol.、l５巻：５９８３〜５９９０頁、［１９９５年］を参照のこと）。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード領域を含み、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路に向かわせる。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと、翻訳読み枠内で天然で連結されているシグナルペプチドコード領域を固有に含有し得る。あるいは、コード配列の５’末端は、このコード配列にとって外来であるシグナルペプチドコード領域を含有し得る。外来のシグナルペプチドコード領域は、コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然に含有しない場合に必要になり得る。
【０１２１】
あるいは、ポリペプチドの分泌を増強するために、外来のシグナルペプチドコード領域で天然のシグナルペプチドコード領域を単に置き換えることができる。しかし、選択される宿主細胞の分泌経路に発現したポリペプチドを誘導する任意のシグナルペプチドコード領域を本発明において使用することができる。
【０１２２】
細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域としては、限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣｌＢ１１８３７マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  α−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  β−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。さらなるシグナルペプチドは、当技術分野で公知である（例えば、SimonenおよびPalva、Microbiol.  Rev.、５７巻：１０９〜１３７頁、［１９９３年］を参照のこと）。
【０１２３】
糸状菌宿主細胞についての有効なシグナルペプチドコード領域としては、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。
【０１２４】
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドとしては、限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子が挙げられる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、当技術分野で公知である（例えば、Romanosら、［１９９２年］、上記を参照のこと）。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域を含む。得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（または一部の場合では、チモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的切断または自己触媒的切断によって、成熟活性ＰＧＡポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリ性プロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子から得られ得る（例えば、ＷＯ９５／３３８３６を参照のこと）。
【０１２６】
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置され、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置される。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、宿主細胞の成長に関連して、ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列も使用される。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的な刺激に応答して、遺伝子の発現をオンオフさせるものである。原核生物宿主細胞では、適切な調節配列としては、限定されないが、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレーターシステムが挙げられる。酵母宿主細胞では、適切な調節系としては、例として、ＡＤＨ２システムまたはＧＡＬ１システムが挙げられる。糸状菌では、適切な調節配列としては、ＴＡＫＡ  α−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
【０１２８】
調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物の系では、これらとして、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合では、本発明のＰＧＡポリペプチドをコードする核酸配列が調節配列に作動可能に連結される。
【０１２９】
したがって、さらなる実施形態では、本発明は、操作されたＰＧＡポリペプチドまたはその改変体をコードするポリヌクレオチドと、プロモーターおよびターミネーターなどの１つ以上の発現調節領域と、複製起点などとを、これらが導入される宿主の種類に応じて含む組換え発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、上記の様々な核酸および制御配列を一緒に結合させて、１つ以上の便利な制限部位（これは、このような部位において、ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする）を含み得る組換え発現ベクターを生産し得る。あるいは、いくつかの実施形態では、核酸配列は、該核酸配列、またはその配列を含む核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することによって発現させる。発現ベクターの作製では、コード配列は、コード配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に連結されるように、ベクター中に配置される。
【０１３０】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に供することができ、そして、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらし得る任意の適切なベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）を含む。ベクターの選択は、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に一般に依存する。いくつかの実施形態では、ベクターは、直鎖プラスミドまたは閉環状プラスミドである。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは自律複製ベクター（すなわち、染色体外の実体として存在し、その複製が染色体複製とは独立しているベクター、例えばプラスミド、染色体外因子、ミニ染色体、または人工染色体）である。いくつかの実施形態では、ベクターは、自己複製を保証するための何らかの手段を含有する。あるいは、いくつかの他の実施形態では、ベクターは、宿主細胞中に導入されるとゲノムに組み込まれて、これが組み込まれた染色体と一緒に複製される。さらに、さらなる実施形態では、宿主細胞のゲノム中、またはトランスポゾン中に導入される全ＤＮＡを一緒に含有する１つのベクターもしくはプラスミドまたは２つもしくはそれを超えるベクターもしくはプラスミドが使用される。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本発明の発現ベクターは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする１つ以上の選択マーカーを含有する。「選択マーカー」は、その産物が殺生物剤耐性またはウイルス耐性、抗菌薬または重金属に対する耐性、栄養要求体への原栄養性などを与える遺伝子である。限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸脱炭酸酵素）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの等価物を含む、糸状菌宿主細胞において使用するための任意の適切な選択マーカーが本発明において使用される。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどの宿主細胞において有用なさらなるマーカーとしては、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳ遺伝子およびｐｙｒＧ遺伝子、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子が挙げられる。酵母宿主細胞のための適切なマーカーとしては、限定されないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３が挙げられる。細菌選択マーカーの例としては、限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、または、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、およびまたはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本発明の発現ベクターは、宿主細胞のゲノム中へのベクターの組み込みまたは細胞における、ゲノムとは独立したベクターの自律複製を可能にするエレメント（複数可）を含有する。宿主細胞のゲノム中への組み込みを伴ういくつかの実施形態では、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、または、相同組換えもしくは非相同組換えによってゲノム中にベクターを組み込むためのベクターの任意の他のエレメントに依拠する。
【０１３４】
いくつかの代替的な実施形態では、発現ベクターは、宿主細胞のゲノム中への相同組換えによる組み込みを導くさらなる核酸配列を含有する。さらなる核酸配列は、ベクターが、宿主細胞のゲノム中に、染色体（複数可）の正確な位置（複数可）に組み込まれることを可能にする。正確な位置に組み込まれる可能性を増大させるために、組み込みエレメントは、相同組換えの確率を増強するために対応する標的配列と高度に相同なヌクレオチドを、好ましくは、１００〜１０，０００塩基対、好ましくは４００〜１０，０００塩基対、および最も好ましくは８００〜１０，０００塩基対などの十分な数で含有する。組み込みエレメントは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同な任意の配列であり得る。さらに、組み込みエレメントは、非コード核酸配列またはコード核酸配列であり得る。他方では、ベクターは、非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。
【０１３５】
自律複製のために、ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞において自律的に複製することを可能にする複製起点をさらに含み得る。細菌複製起点の例は、Ｐ１５Ａ  ｏｒｉまたはプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣｌ７７の複製起点（Ｐ１５Ａ  ｏｒｉを有するプラスミド）、または大腸菌における複製を可能にするｐＡＣＹＣ１８４、およびＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、もしくはｐＡＭβ１である。酵母宿主細胞において使用するための複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組み合わせ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組み合わせである。複製起点は、宿主細胞において機能性温度感受性にする変異を有するものであり得る（例えば、Ehrlich、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、７５巻：１４３３頁、［１９７８年］を参照のこと）。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、遺伝子産物の産生を増加させるために、本発明の核酸配列の１つ超のコピーを宿主細胞に挿入する。核酸配列のコピー数の増加は、配列のさらなるコピーを少なくとも１つ、宿主細胞のゲノム中に組み込むことによって得られ得る、または、増幅可能な選択マーカー遺伝子を核酸配列と共に含めることによって得られ得、この場合、細胞を適切な選択可能な薬剤の存在下で培養することにより、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、およびそれにより、核酸配列のさらなるコピーを含有する細胞を選択することができる。
【０１３７】
本発明において使用するための発現ベクターが多数市販されている。適切な市販の発現ベクターとしては、限定されないが、ＣＭＶプロモーターと、哺乳動物宿主細胞における発現のためのｈＧＨポリアデニル化部位と、ｐＢＲ３２２複製起点と、大腸菌における増幅のためのアンピシリン耐性マーカーとを含む、ｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ（商標）発現ベクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が挙げられる。他の適切な発現ベクターとしては、限定されないが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）およびｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙに由来するプラスミドが挙げられる（例えば、Latheら、Gene、５７巻：１９３〜２０１頁、［１９８７年］を参照のこと）。
【０１３８】
したがって、いくつかの実施形態では、ベクターの増殖および改変体ＰＧＡ（複数可）の発現を可能にするために、少なくとも１つの改変体ＰＧＡをコードする配列を含むベクターを宿主細胞に形質転換する。いくつかの実施形態では、改変体ＰＧＡを翻訳後に改変して、シグナルペプチドを除去し、一部の場合では、分泌後に切断することができる。いくつかの実施形態では、上記の形質転換された宿主細胞を、改変体ＰＧＡ（複数可）の発現を可能にする条件下、適切な栄養培地で培養する。限定されないが、適切な補充物質を含有する最小培地または複合培地を含む、宿主細胞を培養するために有用な任意の適切な培地が本発明において使用される。いくつかの実施形態では、宿主細胞をＨＴＰ培地中で成長させる。適切な培地は、様々な商業的な供給者から入手可能である、または、公開されたレシピ（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ中）に従って調製され得る。
【０１３９】
別の態様では、本発明は、本明細書において提示される改善されたＰＧＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、宿主細胞においてＰＧＡ酵素を発現させるための１つ以上の制御配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによってコードされるＰＧＡポリペプチドの発現に使用される宿主細胞は当技術分野で周知であり、限定されないが、細菌細胞、例えば、大腸菌細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞に適切な培養培地および成長条件は、当技術分野で周知である。
【０１４０】
ＰＧＡを発現させるためのポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の様々な方法によって細胞に導入され得る。技術としては、特に、電気穿孔、微粒子銃粒子ボンバードメント（biolistic  particle  bombardment）、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられる。ポリヌクレオチドを細胞に導入するための様々な方法は、当業者に公知である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。適切な真核生物宿主細胞としては、限定されないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞が挙げられる。適切な真菌宿主細胞としては、限定されないが、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ、Ｆｕｎｇｉ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉが挙げられる。いくつかの実施形態では、真菌宿主細胞は、酵母細胞および糸状菌細胞である。本発明の糸状菌宿主細胞は、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門およびＯｏｍｙｃｏｔａ亜門のすべての糸状形態を含む。糸状菌は、キチン、セルロースおよび他の複合多糖類で構成される細胞壁を有する栄養菌糸（vegetative  mycelium）によって特徴付けられる。本発明の糸状菌宿主細胞は、酵母とは形態学的に別個のものである。
【０１４２】
本発明のいくつかの実施形態では、糸状菌宿主細胞は、限定されないが、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、および／またはＶｏｌｖａｒｉｅｌｌａ、ならびに／あるいはこれらの完全世代、もしくは不完全世代、および同物異名、バソニム（basionym）、または分類学的等価物を含む、任意の適切な属および種のものである。
【０１４３】
本発明のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、限定されないが、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａ種の細胞を含む、酵母細胞である。本発明のいくつかの実施形態では、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。
【０１４４】
本発明のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、藻類細胞、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（Ｐ．ｓｐ．  ＡＴＣＣ２９４０９）である。
【０１４５】
いくつかの他の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。適切な原核細胞としては、限定されないが、グラム陽性、グラム陰性およびグラム不定（ｇram-variable）細菌細胞が挙げられる。限定されないが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、ＹｅｒｓｉｎｉａおよびＺｙｍｏｍｏｎａｓを含む任意の適切な細菌生物が本発明において使用される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、またはＺｙｍｏｍｏｎａｓの菌種である。いくつかの実施形態では、細菌宿主株は、ヒトに対して非病原性である。いくつかの実施形態では、細菌宿主株は、工業用株である。多数の細菌工業用株が公知であり、本発明において適切である。本発明のいくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、およびＡ．ｒｕｂｉ）である。本発明のいくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒｑｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ、およびＡ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）である。本発明のいくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、限定されないが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含む工業用Ｂａｃｉｌｌｕｓ株である。いくつかの実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、および／またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓである。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、およびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＣ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えば、大腸菌）である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｒｗｉｎｉａ種（例えば、Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａ、およびＥ．ｔｅｒｒｅｕｓ）である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐａｎｔｏｅａ種（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ、およびＰ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ���およびＰ．ｓｐ．  Ｄ−０１  １０）である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、およびＳ．ｕｂｅｒｉｓ）である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、およびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ、およびＺ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。
【０１４６】
例示的な宿主細胞は、大腸菌Ｗ３１１０である。改善されたＰＧＡをコードするポリヌクレオチドを、ｌａｃＩリプレッサーの制御下でｌａｃプロモーターに作動可能に連結されたプラスミドｐＣＫ１１０９００と作動可能に連結させることによって発現ベクターを作製した。発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有した。大腸菌Ｗ３１１０内の対象ポリヌクレオチドを含有する細胞を、細胞をクロラムフェニコール選択に供することによって単離した。
【０１４７】
本発明において使用される多くの原核生物株および真核生物株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）などのいくつもの培養物コレクションから、公的に容易に入手可能である。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、宿主細胞を、タンパク質分泌、タンパク質安定性ならびに／またはタンパク質の発現および／もしくは分泌のために望ましい他の特性が改善される特性を有するように遺伝子改変する。遺伝子改変は、遺伝子工学の技術および／または古典的な微生物学的技術（例えば、化学的なまたはＵＶ変異誘発およびその後の選択）によって達成することができる。実際に、いくつかの実施形態では、組換えによる改変と古典的な選択技術の組み合わせを使用して宿主細胞を生産する。組換え技術を使用して、核酸分子を、宿主細胞中および／または培養培地中でのＰＧＡ改変体（複数可）の収量の増加がもたらされる様式で導入する、欠失させる、阻害する、または改変することができる。例えば、Ａｌｐ１機能のノックアウトにより、プロテアーゼが欠損した細胞がもたらされ、ｐｙｒ５機能のノックアウトにより、ピリミジン欠損表現型を有する細胞がもたらされる。１つの遺伝子工学手法では、コードされるタンパク質の発現を抑制するために、相同組換えを使用して、インビボで遺伝子を特異的に標的化することによる標的化遺伝子改変を誘導する。代替の手法では、遺伝子発現の阻害にｓｉＲＮＡ、アンチセンスおよび／またはリボザイム技術を使用する。限定されないが、タンパク質をコードする遺伝子の全部または一部の欠失、および遺伝子産物の発現または活性を破壊する部位特異的変異誘発を含む、細胞におけるタンパク質の発現を低下させるための様々な方法が当技術分野で公知である（例えば、すべてが参照により本明細書に組み込まれる、Chaverocheら、Nucl.  Acids  Res.、２８巻：２２号、ｅ９７頁、［２０００年］；Choら、Molec.  Plant  Microbe  Interact.、１９巻：７〜１５頁、［２００６年］；MaruyamaおよびKitamoto、Biotechnol  Lett.、３０巻：１８１１〜１８１７頁、［２００８年］；Takahashiら、Mol.  Gen.  Genom.、２７２巻：３４４〜３５２頁、［２００４年］；ならびにYouら、Arch.  Micriobiol.、１９１巻：６１５〜６２２頁、［２００９年］を参照のこと）。ランダム変異誘発、その後の所望の変異についてのスクリーニングも使用される（例えば、その両方が参照により組み込まれるCombierら、FEMS  Microbiol.  Lett.、２２０巻：１４１〜８頁、［２００３年］；およびFironら、Eukary.  Cell、２巻：２４７〜５５頁、［２００３年］を参照のこと）。
【０１４９】
ベクターまたはＤＮＡ構築物の宿主細胞への導入は、限定されないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ＰＥＧ媒介形質転換、電気穿孔、または他の当技術分野で公知の一般的な技術を含む、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して達成することができる。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本発明の操作された宿主細胞（すなわち、「組換え宿主細胞」）を、プロモーターを活性化するため、形質転換体を選択するため、またはＰＧＡポリヌクレオチドを増幅するために必要に応じて改変した従来の栄養培地中で培養する。例えば温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に以前使用したものであり、当業者には周知である。記載の通り、細菌起源、植物起源、動物（特に哺乳動物）起源および古細菌起源の細胞を含む多くの細胞の培養および生産のために、多くの標準的な参照およびテキストが利用可能である。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本発明の改変体ＰＧＡポリペプチドを発現する細胞を、バッチ発酵条件または連続発酵条件の下で成長させる。古典的な「バッチ発酵」は、閉鎖系であり、培地の組成は発酵の開始時に設定し、発酵中に人為的な交換には供さない。「流加発酵」はバッチ系のバリエーションであり、これも本発明において使用される。このバリエーションでは、発酵が進行するにしたがって基質を徐々に増加させて添加する。流加系は、異化産物抑制により細胞の代謝が阻害される可能性がある場合、および培地中の基質を限られた量にすることが望ましい場合に有用である。バッチ発酵および流加発酵は一般的であり、当技術分野で周知である。「連続発酵」は、開放系であり、規定の発酵培地をバイオリアクターに連続的に添加し、同時に処理のために等量の馴化培地を取り出す。連続発酵では、一般に、培養物を、細胞が主に対数期成長にある、一定の高密度に維持する。連続発酵系では、定常状態の成長条件を維持しようとする。連続発酵プロセスのために栄養分および増殖因子を調節するための方法ならびに生成物が形成される速度を最大にするための技術は、工業微生物学の技術分野で周知である。
【０１５２】
本発明のいくつかの実施形態では、改変体ＰＧＡ（複数可）の生産に無細胞転写／翻訳系を使用する。いくつかの系が市販されており、方法は当業者に周知である。
【０１５３】
本発明は、改変体ＰＧＡポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、配列番号２に対して少なくとも約７０％（または少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の配列同一性を含み、本明細書において提示される少なくとも１つの変異を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を提供すること；宿主細胞がコードされた改変体ＰＧＡポリペプチドを発現する条件下で、培養培地中で形質転換された宿主細胞を培養すること；ならびに場合により、発現された改変体ＰＧＡポリペプチドを回収もしくは単離すること、および／または、発現された改変体ＰＧＡポリペプチドを含有する培養培地を回収もしくは単離することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、場合により、コードされるＰＧＡポリペプチドの発現後に形質転換された宿主細胞を溶解すること、ならびに場合により、発現された改変体ＰＧＡポリペプチドを細胞溶解産物から回収および／または単離することをさらに提供する。本発明は、改変体ＰＧＡポリペプチドで形質転換された宿主細胞を、改変体ＰＧＡポリペプチドの生成に適した条件下で培養すること、および改変体ＰＧＡポリペプチドを回収することを含む、改変体ＰＧＡポリペプチドの作製方法をさらに提供する。一般には、ＰＧＡポリペプチドの回収または単離は、宿主細胞の培養培地、宿主細胞、またはその両方から、本明細書に記載されるものを含む当技術分野で周知のタンパク質回収技術を使用したものである。いくつかの実施形態では、宿主細胞を遠心分離によって回収し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗製抽出物をさらなる精製のために保持する。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、限定されないが、凍結解凍サイクリング、超音波処理、機械的破壊、および／または細胞溶解剤の使用、ならびに当業者に周知の多くの他の適切な方法を含む任意の便利な方法によって破壊することができる。
【０１５４】
宿主細胞において発現された操作されたＰＧＡ酵素は、特に、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製のための周知の技術の任意の１つまたは複数を使用して細胞および／または培養培地から回収され得る。大腸菌などの細菌からのタンパク質の溶解および高効率での抽出のための適切な溶液は、商品名ＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｂ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で市販されている。したがって、いくつかの実施形態では、得られたポリペプチドを回収／単離し、場合により、当技術分野で公知のいくつもの方法のいずれかによって精製する。例えば、いくつかの実施形態では、ポリペプチドを、限定されないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性相互作用、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、または沈殿を含む従来の手順によって栄養培地から単離する。いくつかの実施形態では、所望の通り、成熟タンパク質の立体配置の完成において、タンパク質リフォールディングステップを使用する。さらに、いくつかの実施形態では、最終的な精製ステップにおいて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる。例えば、いくつかの実施形態では、当技術分野で公知の方法が本発明において使用される（例えば、その両方が参照により本明細書に組み込まれる、Parryら、Biochem.  J.、３５３巻：１１７頁、［２００１年］；およびHongら、Appl.  Microbiol.  Biotechnol.、７３巻：１３３１頁、［２００７年］を参照のこと）。実際に、当技術分野で公知の任意の適切な精製方法が本発明において使用される。
【０１５５】
ＰＧＡポリペプチドを単離するためのクロマトグラフィー技術としては、限定されないが、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、正味の電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの要因に部分的に依存し、当業者には公知である。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、親和性技術が改善されたＰＧＡ酵素の単離に使用される。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、ＰＧＡポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用し得る。抗体の産生のために、ＰＧＡによる注射によって、限定されないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含む様々な宿主動物を免疫し得る。側鎖官能基によって、または側鎖官能基に結合したリンカーによって、ＰＧＡポリペプチドをＢＳＡなどの適切な担体に結合させ得る。免疫学的応答を増大させるために、宿主種に応じて、限定されないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含む様々なアジュバントを使用し得る。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ＰＧＡ改変体を調製し、酵素を発現する細胞の形態で、粗製抽出物として、または単離もしくは精製された調製物として使用する。いくつかの実施形態では、ＰＧＡ改変体を凍結乾燥物として、粉末（例えば、アセトン粉末）の形態で、または酵素溶液として調製する。いくつかの実施形態では、ＰＧＡ改変体は、実質的に純粋な調製物の形態である。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、ＰＧＡポリペプチドを任意の適切な固体基材に結合させる。固体基材としては、限定されないが、固相、表面、および／または膜が挙げられる。固体支持体としては、限定されないが、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトなどの有機ポリマーが挙げられる。固体支持体はまた、無機物、例えばガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金属、例えば金または白金であり得る。基材の形状は、ビーズ、スフィア、粒子、顆粒、ゲル、膜または面の形態であり得る。面は、平面、実質的な平面または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨潤特性または非膨潤特性を有し得る。固体支持体は、ウェル、凹部または他の入れ物、容器、特徴または位置の形態で形成され得る。試薬のロボット送達が処理可能な様々な場所において、または検出方法および／もしくは機器によって処理可能な様々な場所において、複数の支持体がアレイ上に配置され得る。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、免疫学的方法を使用してＰＧＡ改変体を精製する。１つの手法では、従来の方法を使用して改変体ＰＧＡポリペプチドに対して（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、もしくは１２のいずれかを含むポリペプチドおよび／またはそれらの免疫原性断片に対して）生じさせた抗体をビーズ上に固定化し、改変体ＰＧＡが結合する条件下で細胞培養培地と混合し、沈殿させる。関連する手法では、免疫クロマトグラフィーが使用される。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、改変体ＰＧＡを、非酵素部分を含む融合タンパク質として発現させる。いくつかの実施形態では、改変体ＰＧＡ配列を、精製を容易にするドメインと融合する。本明細書で使用される場合、用語「精製を容易にするドメイン」は、それが融合しているポリペプチドの精製を媒介するドメインを指す。適切な精製ドメインとしては、限定されないが、金属キレート化ペプチド、固定化された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、グルタチオンに結合する配列（例えば、ＧＳＴ）、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ（インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する；例えば、Wilsonら、Cell、３７巻：７６７頁、［１９８４年］を参照のこと）、マルトース結合性タンパク質配列、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システムにおいて利用されるＦＬＡＧエピトープ（例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐから入手可能なシステム）などが挙げられる。本明細書に記載される組成物および方法における使用が意図される１つの発現ベクターは、エンテロキナーゼ切断部位によって分離された、ポリヒスチジン領域と融合した本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現をもたらす。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定化された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー；例えば、Porathら、Prot.  Exp.  Purif.、３巻：２６３〜２８１頁、［１９９２年］を参照のこと）での精製を容易にし、エンテロキナーゼ切断部位は、改変体ＰＧＡポリペプチドを融合タンパク質から分離するための手段を提供する。外来ポリペプチドをグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために、ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）も使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、溶解細胞から、リガンド−アガロースビーズ（例えば、ＧＳＴ融合物の場合にはグルタチオン−アガロース）への吸着、その後の遊離のリガンドの存在下での溶出によって容易に精製され得る。
実験
【０１６１】
以下の代表的な実施例において、本開示の様々な特徴および実施形態を例証するが、これらは例示的なものであり、限定的なものではない。
【０１６２】
以下の実験的開示では、以下の略語が適用される：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（１分当たりの回転数）；℃（摂氏度）；ＲＴ（室温）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ；１２ｇ／Ｌのバクト−トリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌのグリセロール、６５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０、１ｍＭのＭｇＳＯ４）；ＣＡＭ（クロラムフェニコール）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）；ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照に対する改善倍率）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＬＢ（ルリアブロス）；Ｃｏｄｅｘｉｓ（Ｃｏｄｅｘｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ  ＭＡ）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｄａｉｃｅｌ（Ｄａｉｃｅｌ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）；Ｇｅｎｅｔｉｘ（Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、ＯＲ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．の一部門、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部門、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；（Ｉｎｆｏｒｓ；Ｉｎｆｏｒｓ−ＨＴ、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ／Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）；およびＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）。
【０１６３】
以下の配列が本発明において使用される。
配列番号１（ＰＧＡ  ＷＴポリヌクレオチド配列）
【化３】
0006755886.tif 000005
【化４】
0006755886.tif 000006
配列番号２（ＰＧＡ  ＷＴポリペプチド配列）
【化５】
0006755886.tif 000007
【化６】
0006755886.tif 000008
配列番号３（ＰＧＡ  改変体１ポリヌクレオチド配列）
【化７】
0006755886.tif 000009
【化８】
0006755886.tif 000010
配列番号４（ＰＧＡ  改変体１ポリペプチド配列）
【化９】
0006755886.tif 000011
配列番号５（ＰＧＡ  改変体６ポリヌクレオチド配列）
【化１０】
0006755886.tif 000012
【化１１】
0006755886.tif 000013
配列番号６（ＰＧＡ  改変体６ポリペプチド配列）
【化１２】
0006755886.tif 000014
【化１３】
0006755886.tif 000015
配列番号７（ＰＧＡ  改変体５３ポリヌクレオチド配列）
【化１４】
0006755886.tif 000016
【化１５】
0006755886.tif 000017
配列番号８（ＰＧＡ  改変体５３ポリペプチド配列）
【化１６】
0006755886.tif 000018
配列番号９（ＰＧＡ  改変体２６１ポリヌクレオチド配列）
【化１７】
0006755886.tif 000019
【化１８】
0006755886.tif 000020
配列番号１０（ＰＧＡ  改変体２６１ポリペプチド配列）
【化１９】
0006755886.tif 000021
【化２０】
0006755886.tif 000022
配列番号１１（ＰＧＡ  改変体２５８ポリヌクレオチド配列）
【化２１】
0006755886.tif 000023
【化２２】
0006755886.tif 000024
配列番号１２（ＰＧＡ  改変体２５８ポリペプチド配列）
【化２３】
0006755886.tif 000025
【実施例】
【０１６４】
（実施例１）
組換えＰＧＡ遺伝子を含有する大腸菌発現宿主
本発明の改変体を生産するために使用する最初のＰＧＡ酵素をＣｏｄｅｘ（登録商標）Ａｃｙｌａｓｅ  Ｐａｎｅｌ（Ｃｏｄｅｘｉｓ）から得た。ＰＧＡパネルプレートは、野生型Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ  ＰＧＡと比較して改善された特性を有する操作されたＰＧＡポリペプチドのコレクションを含む。野生型ＰＧＡ遺伝子は、５４アミノ酸のスペーサー領域によって連結されたαサブユニット（２３．８ＫＤａ）およびβサブユニット（６２．２ＫＤａ）からなるヘテロ二量体である。スペーサー領域が存在することに起因して、活性なタンパク質を形成するためには自己プロセシングステップが必要である。野生型遺伝子を改変してスペーサー領域を排除し、したがって、自己プロセシングステップを排除した。Ｃｏｄｅｘ（登録商標）Ａｃｙｌａｓｅ  Ｐａｎｅｌ（Ｃｏｄｅｘｉｓ）は、スペーサー領域を欠くＰＧＡ改変体を含有する（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１４３９６８Ａ１号を参照のこと）。ＰＧＡをコードする遺伝子を、ｌａｃｌリプレッサーの制御下でｌａｃプロモーターに作動可能に連結された発現ベクターｐＣＫ１１０９００（米国特許出願公開第２００６／０１９５９４７号の図３を参照のこと）にクローニングした。発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有する。得られたプラスミドを、当技術分野で公知の標準の方法を使用して大腸菌Ｗ３１１０に形質転換した。当技術分野で公知の通り細胞をクロラムフェニコール選択に供することによって形質転換体を単離した（例えば、米国特許第８，３８３，３４６号およびＷＯ２０１０／１４４１０３を参照のこと）。
【０１６５】
（実施例２）
ＨＴＰ  ＰＧＡを含有する湿潤細胞ペレットの調製
モノクローナルコロニー由来の、組換えＰＧＡをコードする遺伝子を含有する大腸菌細胞を、９６ウェルシャローウェルマイクロタイタープレートのウェル中、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有する１８０μｌ  ＬＢに接種した。培養物を３０℃、２００ｒｐｍ、および８５％湿度で一晩成長させた。次いで、各細胞培養物１０μｌを、ＴＢ  ３９０ｍＬおよび３０μｇ／ｍＬ  ＣＡＭを含有する９６ウェルディープウェルプレートのウェルに移した。ディープウェルプレートを３０℃、２５０ｒｐｍ、および８５％湿度で３時間インキュベートした（ＯＤ６００、０．６〜０．８）。次いで、細胞培養物を、最終濃度を１ｍＭにしたＩＰＴＧによって誘導し、最初に使用したのと同じ条件で一晩インキュベートした。次いで、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を使用して細胞をペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを、溶解前に−８０℃で凍結させた。
【０１６６】
（実施例３）
ＨＴＰ  ＰＧＡを含有する細胞溶解産物の調製および分析
まず、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、および０．５ｍｇ／ｍＬ  ＰＭＢＳを含有する溶解緩衝液２５０μｌを実施例２に記載の通り生成した各ウェル中の細胞ペーストに添加した。細胞を、卓上振盪機で振盪しながら室温で２時間溶解させた。次いで、プレートを４０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間遠心分離した。透明な上清を、それらの活性レベルを決定するための生体触媒反応において使用した。
【０１６７】
ＰＧＡ改変体の活性を、インスリンのＡ１（グリシン）残基、Ｂ１（フェニルアラニン）残基、およびＢ２９（リシン）残基に化学的に結合した３つのフェニル酢酸基の除去における改変体の効率に基づいて評価した。ＨＴＰ反応を９６ウェルディープウェルプレート中で行った。まず、反応混合物０．３ｍｌは、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｇ／Ｌ  ３重保護インスリンおよび２５〜１２５μｌ（線形曲線に応じて）のＨＴＰ溶解産物を含有した。ＨＴＰプレートをＴｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）振盪機（３ｍｍ行程、モデル番号ＡＪ１８５、Ｉｎｆｏｒｓ、３０℃、３００ｒｐｍ）中で、６時間または２２時間インキュベートした。３００μｌアセトニトリルを用いて反応をクエンチし、卓上振盪機を使用して３分間混合した。次いでプレートを４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、分析のためにＨＰＬＣにローディングした。Ａｇｉｌｅｎｔ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ  Ｃ１８、５μｍ、２．１×１５０ｍｍカラムを使用してＨＴＰ試料を分析した。流速を毎分０．５ｍｌに設定し、温度を５０℃に設定した。移動相Ａは、水＋０．０５％のＴＦＡであり、移動相Ｂは、アセトニトリル＋０．０５％のＴＦＡであった。実行時間は７．２分であり、注入の重複が可能であった。勾配は、７５％移動相Ａで０．２分間、５５％移動相Ａで４．９分間、５％移動相Ａで５．４分間、７５％移動相Ａに戻して５．９分間であった。
【０１６８】
（実施例４）
振盪フラスコ（ＳＦ）培養物由来の凍結乾燥溶解産物の調製および分析
上記の通り成長させた選択されたＨＴＰ培養物を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ  ＣＡＭを伴うＬＢ寒天プレートにプレーティングし、３７℃で一晩成長させた。各培養物からの単一コロニーを、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ  ＣＡＭを伴うＬＢ  ５０ｍｌに移した。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで１８時間成長させ、３０μｇ／ｍｌ  ＣＡＭを含有するＴＢ  ２５０ｍｌ中、およそ１：１０で継代培養して、最終的なＯＤ６００を０．２にした。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで１３５分間成長させてＯＤ６００を０．６〜０．８にし、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導した。次いで、培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間成長させた。培養物を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、３０ｍｌに再懸濁させた。細胞をペレット化し（４０００ｒｐｍで２０分間）、−８０℃で１２０分間凍結させた。凍結したペレットを５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５  ３０ｍｌに再懸濁させ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒシステム（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を１８，０００ｐｓｉで使用して溶解させた。溶解産物をペレット化し（１０，０００ｒｐｍで６０分間）、上清を凍結させ、凍結乾燥して振盪フラスコ（ＳＦ）酵素を作製した。
【０１６９】
選択された振盪フラスコＰＧＡ改変体の活性を、インスリンのＡ１（グリシン）残基、Ｂ１（フェニルアラニン）残基、およびＢ２９（リシン）残基に化学的に結合した３つのフェニル酢酸基の除去における改変体の効率に基づいて評価した。振盪フラスコ反応を９６ウェルディープウェルプレート中で行った。まず、反応混合物０．３ｍｌは、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｇ／Ｌ  ３重保護インスリン、０．１〜０．８ｇ／Ｌの振盪フラスコ溶解産物を含有した。ディープウェル反応プレートをＴｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）振盪機（３ｍｍ行程、モデル番号ＡＪ１８５、Ｉｎｆｏｒｓ）中、３０℃、３００ｒｐｍで、２２時間または６時間インキュベートした（ラウンド１進化について２２時間およびラウンド２進化について６時間）。アセトニトリル３００μｌを用いて反応をクエンチし、卓上振盪機で３分間混合した。次いで、プレートを４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、分析のためにＨＰＬＣにローディングした。Ａｇｉｌｅｎｔ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ  Ｃ１８、５μｍ、２．１×１５０ｍｍカラムを使用してＨＴＰ試料を分析した。流速を毎分０．６ｍｌに設定し、温度を５０℃に設定した。移動相Ａは水＋０．０５％のＴＦＡであり、移動相Ｂはアセトニトリル＋０．０５％のＴＦＡであった。実行時間は１８．２分であり、注入の重複が可能であった。勾配は、８０％移動相Ａで０〜１分間、６０％移動相Ａで１２分間、５％移動相Ａで１５分間、８０％移動相Ａに戻して１６分間であった。
【０１７０】
（実施例５）
ラウンド１進化骨格選択、構築およびスクリーニング
上記の実施例に記載されているＨＴＰプロトコールに従い、実施例４に記載されている振盪フラスコプロトコールを使用してＣｏｄｅｘ（登録商標）Ａｃｙｌａｓｅ  Ｐａｎｅｌ（Ｃｏｄｅｘｉｓ）を評価した。Ｃｏｄｅｘ（登録商標）Ａｃｙｌａｓｅ  Ｐａｎｅｌからの「改変体１」（配列番号４）と称される、改変体のうちの１つにより、０．８ｇ／Ｌ振盪フラスコ溶解産物負荷を用いて、２２時間で、５４％の遊離のインスリンが生成した。改変体１を使用して基質阻害試験を行った（図１を参照のこと）。漸増濃度の３重保護インスリン基質を用いると、改変体１によって触媒される遊離のインスリンの生成は有意に減少した。５時間で、遊離のインスリン生成は、酵素負荷は０．８ｇ／Ｌに固定で、１ｇ／Ｌ基質負荷での８２％から１０ｇ／Ｌ基質負荷での２％まで降下した。本発明は任意の特定の機構に限定されるものではないが、これらの結果により、３重保護インスリン基質の濃度が高いほど基質阻害が引き起こされることが示唆される。遊離のインスリン生成の量は、基質濃度が低いほど増加した（例えば、Wangら、Biopolymer、２５巻：Ｓ１０９〜Ｓ１１４頁、［１９８６年］を参照のこと）。したがって、本発明によって提供される利点の１つは、基質阻害を克服するＰＧＡ改変体の生成である。この改変体を第１のラウンド進化のための骨格として選択した。大腸菌ＰＧＡを鋳型として改変体１の相同性モデルを構築した（大腸菌ＰＧＡは野生型Ｋ．ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ  ＰＧＡに対して８７％配列同一性を有する）。３重保護インスリンを改変体１の活性部位にドッキングして、そのＰＧＡとの相互作用を評価した。次いで、そのアミノ酸配列の９６箇所の位置を進化の第１のラウンドのために選択し、これにより活性部位および３重保護インスリン結合性部位の第１の層（５〜６Å内のアミノ酸残基）および第２の層の一部（６〜１２Å内のアミノ酸残基）を網羅した。ＰＧＡパネルスクリーニング結果およびコンセンサス変異の分析に基づいて、２つのコンビナトリアルライブラリーも設計した。この進化の第１のラウンドにおいて得られた改変体についてのＨＴＰスクリーニングはすべて上記と同じプロトコールを使用し、最終的な反応時点を２２時間として行った。改変体１と比較した総活性の対応する改善倍率を有する活性な変異を以下の表５．１に示す。この表では、陽性対照は改変体１（配列番号４）である。
【表５−１−１】
0006755886.tif 000026
【表５−１−２】
0006755886.tif 000027
【表５−１−３】
0006755886.tif 000028
【表５−１−４】
0006755886.tif 000029
【表５−１−５】
0006755886.tif 000030
【表５−１−６】
0006755886.tif 000031
【表５−１−７】
0006755886.tif 000032
【表５−１−８】
0006755886.tif 000033
【表５−１−９】
0006755886.tif 000034
“−”：ＦＩＯＰＣ＜０．７
“＋”：ＦＩＯＰＣ＝０．７〜１．３
“＋＋”：ＦＩＯＰＣ＝１．４〜２．０
“＋＋＋”：ＦＩＯＰＣ≧２．１
【０１７１】
これらの結果に基づいて、改変体６、１９、１４、６７、８８、および５３を振盪フラスコ体積にスケールアップし、それらの活性を、以前の実施例に記載されているプロトコールを使用して分析した。図２に結果を示す。改変体６では、０．８ｇ／Ｌ酵素負荷において２２時間で９３％の遊離のインスリンが生成し（図２を参照のこと）、改変体１と比較してよりよい発現レベルが達成された。改変体５３は改変体１と同様の発現レベルを有したが、改変体１では５４％の遊離のインスリンが生成したのと比較して、７３％の遊離のインスリンが生成した。結果に基づいて、改変体６（配列番号６）を進化の次のラウンド（すなわち、ラウンド２）の出発骨格として選択した。この改変体を「発現ヒット」とも名付けた。改変体５３（配列番号８）も代替ラウンド２骨格として選択し、「活性ヒット」と名付けた。
【０１７２】
（実施例６）
ラウンド２ライブラリー構築およびスクリーニング
ラウンド１進化から同定された最も有益な変異は、Ｄ４８４Ｎ、Ｖ２６４Ａ、Ｑ５４７Ｋ、Ｖ５６Ｉ、Ｓ７５０Ｇ、Ｖ５６Ｌ、Ｓ６１９Ｋ、Ｖ２８Ｎ、Ｖ６１８Ｉ、およびＴ１３１Ｎであった。第１のラウンド結果の分析に基づき、改変体６および改変体５３の両方を骨格として使用して２つのコンビナトリアルライブラリーを設計した。ラウンド２改変体に対して使用したＨＴＰスクリーニング方法はすべて以前に記載されたプロトコールを使用し、最終的な反応時点を６時間として行った。改変体６および改変体５３と比較して総活性の対応する改善倍率を有する活性な変異を以下の表６．１および６．２に示す。表６．１は、改変体６に基づく改変体についての結果を提供し、表６．２は、改変体５３に基づく改変体についての結果を提供する。
【表６−１−１】
0006755886.tif 000035
【表６−１−２】
0006755886.tif 000036
“−”：ＦＩＯＰＣ＜０．７
“＋＋”：ＦＩＯＰＣ＝０．７〜１．３
“＋＋”：ＦＩＯＰＣ＝１．４〜２．０
“＋＋＋”：ＦＩＯＰＣ≧２．１
【表６−２−１】
0006755886.tif 000037
【表６−２−２】
0006755886.tif 000038
“−”：ＦＩＯＰＣ＜０．７
“＋＋”：ＦＩＯＰＣ＝０．７〜１．３
“＋＋”：ＦＩＯＰＣ＝１．４〜２．０
“＋＋＋”：ＦＩＯＰＣ≧２．１
【０１７３】
改変体６（配列番号６）、２５８（配列番号１２）および２６１（配列番号１０）を振盪フラスコにスケールアップし、それらの活性を、以前の実施例に記載されているプロトコールを使用して分析した。図３に結果を示す。示されている通り、改変体２５８では、＜０．８ｇ／Ｌ振盪フラスコ溶解産物負荷において６時間で＞９９％の遊離のインスリンが生成し、それにより、基質阻害が完全に解除され、一方、改変体２６１では、０．８ｇ／Ｌ溶解産物負荷において６時間で約９０％の遊離のインスリンが生成した。
【０１７４】
したがって、本発明は、総活性の８倍の改善を有するＰＧＡ改変体を提供する。Ｓ６１９Ｋ置換は活性に大きく影響し、Ｄ４８４Ｎ置換は発現に主に影響することも決定された。Ｓ６１９Ｋはインスリン結合性部位の第１の層に位置し、Ｄ４８４Ｎは活性部位の第２の層に位置する。
【０１７５】
（実施例７）
ＤＭＳＯ耐性
改善されたＰＧＡ改変体（改変体番号６、２５８、および２６１）に対してＤＭＳＯ耐性試験を行った。実施例４に記載されているプロトコールに従い、０〜５０％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯの存在下で反応を行った。結果（図４を参照のこと）は、試験したすべての改変体が、試験反応物にＤＭＳＯを添加すると活性を失うことが示される。例えば、３０％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯでは、改変体２５８により生成した遊離のインスリンはたった３０％であった。
【０１７６】
本出願で引用されているすべての刊行物、特許、特許出願および他の文献は、個々の各刊行物、特許、特許出願または他の文献が、すべての目的ために参照により組み込まれると個々に示されているのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７７】
様々な特定の実施形態を例証および説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができると認識されよう。
【図１】
0006755886.tif 000039
【図２】
0006755886.tif 000040
【図３】
0006755886.tif 000041
【図４】
0006755886.tif 000042
【配列表】
0006755886000001.app