(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む形質転換細胞を培養することを含む、Ｃ４ジカルボン酸の製造方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記形質転換細胞が前記ポリヌクレオチドを含有するベクターを含む、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記細胞が微生物細胞である、請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
前記微生物が糸状菌である、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
前記糸状菌がリゾプス属である、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
前記リゾプス属がリゾプス・デレマーである、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
培養物からＣ４ジカルボン酸を回収することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項９】
前記Ｃ４ジカルボン酸がフマル酸、リンゴ酸又はコハク酸である、請求項１〜８のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが細胞のＣ４ジカルボン酸生産能向上機能を有する、請求項１〜９のいずれか１項記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的なＣ４ジカルボン酸製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ４ジカルボン酸は、酸味料や抗菌剤、ｐＨ調整剤として食品工業において様々な用途に利用されるほか、合成樹脂や生分解性ポリマーの原料としても用いられるなど、工業的な価値が高い物質である。Ｃ４ジカルボン酸は、工業的には石化原料由来の化学合成、又は微生物発酵のいずれかにより製造される。従前は、より低コストなため化学合成法が主流であったが、近年、原料の高騰や、環境負荷などの観点から、循環再生資源を原料とする微生物発酵による製造方法が注目されている。
【０００３】
Ｃ４ジカルボン酸の一つであるフマル酸は、リゾプス属菌（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）等の発酵菌を用いて製造できることが知られている。リゾプス属菌は、グルコースを炭素源としてフマル酸を生産し、菌体外に排出する。これまでに、リゾプス属菌のフマル酸高生産化のための手法に関しては、培養法の改良や変異育種による高生産性菌株の作製等が知られている。しかしながら、リゾプス属菌の遺伝学的背景は未だ充分に研究されていないことから、遺伝子組換えによるリゾプス属菌のフマル酸高生産化技術の開発は容易ではなく、報告も少ない。わずかに、サッカロマイセス・セレビシエ由来のピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子をリゾプス・デレマーに導入すること（特許文献１）、及び大腸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子をリゾプス・オリゼに導入すること（非特許文献１）によるフマル酸生産性向上が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】中国特許公報第１０３０１３８４３号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１２，１４：５１２−５２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、宿主細胞に対するＣ４ジカルボン酸生産能向上効果のあるポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する形質転換細胞、及び該形質転換細胞を用いたＣ４ジカルボン酸の製造方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意検討した結果、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現を増強させた細胞が、そのＣ４ジカルボン酸生産能を向上させることを見出した。
【０００８】
したがって、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを含む、形質転換細胞を提供する。
【０００９】
また本発明は、上記形質転換細胞を培養することを含む、Ｃ４ジカルボン酸の製造方法を提供する。
【００１０】
さらに本発明は、形質転換細胞の製造方法であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含有するベクターを宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。
【００１１】
さらに本発明は、宿主細胞におけるＣ４ジカルボン酸生産能の向上方法であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含有するベクターを宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、細胞のＣ４ジカルボン酸生産能向上機能を有するポリペプチド、及び当該ポリペプチドの発現が強化された（例えば、該ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した）形質転換細胞を提供する。本発明の形質転換細胞は、より多くのＣ４ジカルボン酸を生産することができる。したがって、本発明の形質転換細胞は、Ｃ４ジカルボン酸の生物学的生産のために有用である。本発明の上記及び他の特徴及び利点は、以下の本明細書の記載からより明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（１．定義）
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＣＳ  Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析プログラムのアミノ酸配列×アミノ酸配列マキシマムマッチング又はヌクレオチド配列×ヌクレオチド配列マキシマムマッチングを用いて、Ｍａｃｈｅｓを−１、Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓを１、Ｇａｐｓを１、＊Ｎ＋２として解析を行うことにより算出される。
【００１４】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９６％以上、なお好ましくは９７％以上、なお好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【００１５】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する領域」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の領域に対応してアラインされた目的配列の領域は、当該任意の領域に「相当する領域」とみなされる。
【００１６】
本明細書における「１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列」とは、１個以上１０個以下、好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列をいう。また本明細書における「１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列」とは、１個以上３０個以下、好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらにより好ましくは１個以上９個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列をいう。本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端へのアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
【００１７】
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
【００１８】
本明細書において、制御領域と遺伝子との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【００１９】
本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞の野生型に存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
【００２０】
本明細書において、細胞の「Ｃ４ジカルボン酸生産能」は、該細胞の培養培地におけるＣ４ジカルボン酸の収率（％）として表され、より詳細には、該細胞の培地中炭素源の消費量に対する該細胞のＣ４ジカルボン酸の生産量の質量（％）で表される。細胞のＣ４ジカルボン酸の生産量は、該細胞の培養物から細胞を除いた培養上清中のＣ４ジカルボン酸の量として算出することができる。培地中炭素源の消費量は、該培養上清中の炭素源量を、該培地における炭素源の初発濃度から差し引くことにより算出することができる。培養上清中のＣ４ジカルボン酸及び炭素源の量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により測定することができる。より具体的な測定手順は、後述の参考例１に例示する。
【００２１】
本明細書において、形質転換細胞における「Ｃ４ジカルボン酸生産能の向上」とは、該形質転換細胞のＣ４ジカルボン酸生産能が、宿主細胞又はコントロール細胞と比較して向上したことをいう。形質転換細胞におけるＣ４ジカルボン酸生産能の向上率は、以下の式で計算される。
向上率（％）
＝（形質転換細胞のＣ４ジカルボン酸生産能／宿主細胞又はコントロール細胞の
Ｃ４ジカルボン酸生産能）×１００−１００
ここで、形質転換細胞とは、本発明のポリペプチドの発現を強化した細胞、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターを導入した細胞であり、宿主細胞とは、上記形質転換細胞の宿主細胞（親細胞）をいう。またコントロール細胞とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まないベクターを導入した細胞をいう。好ましくは、当該Ｃ４ジカルボン酸生産能の向上率は、該形質転換細胞の培養上清中（細胞を含まない）のＣ４ジカルボン酸濃度が最大となる時点における、各細胞のＣ４ジカルボン酸生産能に基づいて計算される。したがって、本明細書において、「Ｃ４ジカルボン酸生産能がＸ％以上向上した形質転換細胞」とは、上記式で計算されるＣ４ジカルボン酸生産能の向上率がＸ％以上である形質転換細胞をいい、また細胞における「Ｃ４ジカルボン酸生産能のＸ％以上の向上」とは、上記式で計算される該細胞のＣ４ジカルボン酸生産能の向上率がＸ％以上であることを意味する。
【００２２】
本発明により製造されるＣ４ジカルボン酸の例としては、フマル酸、リンゴ酸、及びコハク酸が挙げられ、好ましくはフマル酸である。
【００２３】
本明細書において、「複数回膜貫通型ポリペプチド（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、細胞膜貫通領域予測プログラムを用いた解析により、複数個の膜貫通へリックス構造を有すると予測された膜貫通型のポリペプチドをいう。細胞膜貫通領域予測プログラムの例としては、ＴＭＨＭＭ  Ｓｅｒｖｅｒ，ｖ．２．０（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，３０５：５６７−５８０）、ＤＡＳ−ＴＭｆｉｌｔｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，２００２，Ｖｏｌｕｍｅ１５，Ｉｓｓｕｅ９：７４５−７５２）、ＰＲＥＤ−ＴＭＲ２（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１９９９，Ｖｏｌｕｍｅ１２，Ｉｓｓｕｅ８：６３１−６３４）等の予測メソッドを用いた解析プログラムが挙げられる。
【００２４】
（２．Ｃ４ジカルボン酸生産能の向上した形質転換細胞）
本発明者らは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入した細胞が、そのＣ４ジカルボン酸生産能を向上させることを見出した。したがって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれと同等の機能を有するポリペプチド（以下の本明細書において、これらをまとめて「本発明のポリペプチド」ということがある）には、Ｃ４ジカルボン酸生産能向上機能があると推定される。
【００２５】
したがって、一実施形態において、本発明は、Ｃ４ジカルボン酸生産能が向上した形質転換細胞を提供する。本発明の形質転換細胞は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれと同等の機能を有するポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを含有する細胞である。
【００２６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ  ＲＡ  ９９−８８０株由来の機能未知タンパク質（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＲＯ３Ｇ＿０２７９８）である。細胞膜貫通領域予測プログラムであるＴＭＨＭＭ  Ｓｅｒｖｅｒ，ｖ．２．０を用いて解析した結果、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、そのアミノ酸配列の５３位から７５位領域、９０位から１１２位領域、１１９位から１４１位領域、１４５位から１６７位領域、１８０位から１９８位領域、２０８位から２３０位領域、２４３位から２６５位領域、２７５位から２９４位領域、３１５位から３３７位領域、３４７位から３６９位領域、３７６位から３９８位領域、４０８位から４３０位領域、４４３位から４６５位領域、及び５１１位から５３３位領域のそれぞれに膜貫通へリックス構造を有しており、１４回膜貫通型のポリペプチドであると予測された。したがって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは複数回膜貫通型ポリペプチドであると推定される。また一般的に、細胞膜内外への物質の輸送活性を有するトランスポーターポリペプチドは複数回膜貫通型構造を有していることを踏まえると、当該ポリペプチドはトランスポーター様ポリペプチドであると推定される。
【００２７】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、当該ポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ１４個の膜貫通へリックス構造を有する複数回膜貫通型ポリペプチドである。より好ましい実施形態において、当該ポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列の５３位から７５位領域、９０位から１１２位領域、１１９位から１４１位領域、１４５位から１６７位領域、１８０位から１９８位領域、２０８位から２３０位領域、２４３位から２６５位領域、２７５位から２９４位領域、３１５位から３３７位領域、３４７位から３６９位領域、３７６位から３９８位領域、４０８位から４３０位領域、４４３位から４６５位領域、及び５１１位から５３３位領域のそれぞれに相当する領域に膜貫通へリックス構造を有する複数回膜貫通型ポリペプチドである。
【００２８】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列の例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列が挙げられる。
【００２９】
アミノ酸配列に対してアミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入等の変異を導入する方法としては、例えば、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの欠失、置換、付加、又は挿入等の変異を導入する方法が挙げられる。ヌクレオチド配列への変異導入の手法としては、例えば、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸等の化学的変異原又は紫外線、Ｘ線、ガンマ線、イオンビーム等の物理的変異原による突然変異誘発、部位特異的変異導入法、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂａｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，５８１−６２１，１９９５）に記載の方法、などが挙げられる。部位特異的変異導入の手法としては、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥ）ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７７，６１−６８，１９８９）を利用した方法、ＯＤＡ法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１５２，２７１−２７６，１９９５）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２，４８８）等が挙げられる。あるいは、Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍｕｔａｎ−ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍキット（タカラバイオ社）、ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡社）等の市販の部位特異的変異導入用キットを利用することもできる。
【００３０】
本発明の形質転換細胞に含まれる、本発明のポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドとしては、配列番号１で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。好ましい実施形態において、該ポリヌクレオチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、１４個の膜貫通へリックス構造を有する複数回膜貫通型ポリペプチドをコードする。より好ましい実施形態において、該ポリヌクレオチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列の５３位から７５位領域、９０位から１１２位領域、１１９位から１４１位領域、１４５位から１６７位領域、１８０位から１９８位領域、２０８位から２３０位領域、２４３位から２６５位領域、２７５位から２９４位領域、３１５位から３３７位領域、３４７位から３６９位領域、３７６位から３９８位領域、４０８位から４３０位領域、４４３位から４６５位領域、及び５１１位から５３３位領域のそれぞれに相当する領域に膜貫通へリックス構造を有する複数回膜貫通型ポリペプチドをコードする。
【００３１】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の例としては、配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列が挙げられる。ヌクレオチド配列にヌクレオチドの欠失、置換、付加、又は挿入等の変異を導入する方法は、上述したとおりである。本発明の形質転換細胞に含まれるポリヌクレオチドは、１本鎖若しくは２本鎖の形態であり得、又はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。該ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ等の人工ＤＮＡであり得る。
【００３２】
本発明の形質転換細胞において、上記本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ベクターに組み込まれていてもよい。好ましくは、上記ポリヌクレオチドを含有するベクターは、発現ベクターである。また好ましくは、該ベクターは、上記ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内で該ポリヌクレオチドを発現することができる発現ベクターである。好ましくは、該ベクターは、上記本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む。該ベクターは、プラスミド等の染色体外で自立増殖及び複製可能なベクターであってもよく、又は染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
【００３３】
具体的なベクターの例としては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＵＣ１８等のｐＵＣ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＥＴ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア）、ｐＣｏｌｄ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）、ｐＵＢ１１０（Ｍｃｋｅｎｚｉｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｌａｓｍｉｄ  １５（２）：９３−１０３）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ）、ｐＲＳ４０３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＭＷ２１８／２１９（ニッポンジーン）、ｐＲＩ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＢＩ系ベクター（クロンテック）、ＩＮ３系ベクター（インプランタイノベーションズ）などが挙げられる。
【００３４】
あるいは、本発明の形質転換細胞において、上記本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡであってもよい。この場合、上記本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を構築し、これを宿主細胞に導入すればよい。該ＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片及び制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。好ましくは、該ＤＮＡ断片は、上記本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む発現カセットであり得る。
【００３５】
上記ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる制御領域は、該ベクター又はＤＮＡ断片が導入された宿主細胞内で本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させるための配列であり、例えばプロモーターやターミネーター等の発現調節領域、複製開始点などが挙げられる。該制御領域の種類は、ベクター又はＤＮＡ断片を導入する宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。必要に応じて、該ベクター又はＤＮＡ断片はさらに、抗生物質耐性遺伝子、アミノ酸合成関連遺伝子等の選択マーカーを有していてもよい。
【００３６】
上記本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクター又はＤＮＡ断片を、宿主細胞に導入することによって、本発明の形質転換細胞を得ることができる。該本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター又は外来ＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞においては、その宿主細胞（親細胞）と比較して、上記本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写量が向上している。遺伝子の転写量は、定量ＰＣＲによるｍＲＮＡ量測定、次世代シーケンサーを用いたＲＮＡ−Ｓｅｑ解析、ＤＮＡマイクロアレイ解析等により測定することができる。
【００３７】
上記形質転換細胞の宿主細胞としては、微生物細胞、植物細胞、及び動物細胞のいずれを用いてもよい。Ｃ４ジカルボン酸の製造効率の観点からは、宿主細胞は微生物細胞であることが好ましい。該微生物は、原核生物及び真核生物のいずれかであってもよい。このうち、Ｃ４ジカルボン酸生産性の観点からは、該微生物は、好ましくは糸状菌又は酵母であり、より好ましくは糸状菌である。該糸状菌としては、細区分真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）に属する全ての糸状形の菌が包含される（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈなど．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ｂＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより定義されるように）。糸状菌は、一般的に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複合多糖類から構成される菌糸体壁により特徴づけられる。栄養成長は、菌糸拡張によってであり、そして炭素代謝は絶対好気性である。
【００３８】
本発明の形質転換細胞の宿主細胞として使用される糸状菌の好ましい例としては、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ属、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ属、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ属、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属、Ｐａｒａｓｉｔｅｌｌａ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ属、Ｐｈｌｅｂｉａ属、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ属、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ属、Ｔｒａｍｅｔｅｓ属、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属の糸状菌が挙げられる。このうち、Ｃ４ジカルボン酸の生産性の観点からは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｇｒｉｃａｎｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｔｏｎｋｉｎｅｎｓｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ等のＲｈｉｚｏｐｕｓ属菌が好ましく、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ及びＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅがより好ましく、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒがさらに好ましい。
【００３９】
上記宿主細胞へのベクター又はＤＮＡ断片の導入には、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いることができる。
【００４０】
目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞は、選択マーカーを利用して選択することができる。例えば、選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合、該抗生物質添加培地で細胞を培養することで、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞を選択することができる。また例えば、選択マーカーがアミノ酸合成関連遺伝子である場合、該アミノ酸要求性の宿主細胞に遺伝子導入した後、該アミノ酸要求性の有無を指標に、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞を選択することができる。あるいは、ＰＣＲ等によって形質転換細胞のＤＮＡ配列を調べることで目的のベクター又はＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
【００４１】
上記本発明の形質転換細胞は、上記本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写量が向上しており、本発明のポリペプチドの発現が強化されている。これにより、該形質転換細胞は、Ｃ４ジカルボン酸生産能が向上している。上記形質転換細胞は、その宿主細胞（親細胞）と比較して、Ｃ４ジカルボン酸生産能が好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上、さらに好ましくは２０％以上向上している。
【００４２】
（３．Ｃ４ジカルボン酸の製造）
本発明の形質転換細胞は、Ｃ４ジカルボン酸生産能が向上している。したがって、本発明はまた、上記本発明の形質転換細胞を培養することを含むＣ４ジカルボン酸の製造方法を提供する。該本発明の製造方法により製造されるＣ４ジカルボン酸としては、フマル酸、リンゴ酸、及びコハク酸が挙げられ、好ましくはフマル酸である。
【００４３】
本発明の製造方法における形質転換細胞の培養は、該形質転換細胞を含む微生物、植物体、動物体、又はそれらの細胞若しくは組織を培養することを包含する。該形質転換細胞を培養するための培地及び培養条件は、該形質転換細胞の宿主の種類に応じて適宜選択することができる。一般的には、該形質転換細胞の宿主に対して通常用いられる培地及び培養条件を採用することができる。
【００４４】
例えば、形質転換細胞が糸状菌の場合、培養温度は、例えば１０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜４５℃であればよく、また培養期間は、目的のＣ４ジカルボン酸が充分に産生される期間であれば特に限定されないが、例えば１〜２４０時間、好ましくは１２〜１２０時間、好ましくは２４〜７２時間であり得る。攪拌又は通気下で培養することが好ましい。
【００４５】
糸状菌培養のための培地としては、通常用いられるものを使用すればよい。好ましくは、該培地は液体培地であり、また合成培地、天然培地、及び合成培地に天然成分を添加した半合成培地のいずれであってもよい。市販のＰＤＢ培地（ポテトデキストロース培地；ベクトン・ディッキンソン  アンド  カンパニー製等）、ＰＤＡ培地（ベクトン・ディッキンソン  アンド  カンパニー製等）、ＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地；日本製薬社製（商標名「ダイゴ」）等）、ＮＢ培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ；ベクトン・ディッキンソン  アンド  カンパニー製等）、ＳＢ培地（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ培地；ＯＸＯＩＤ社製等）、ＳＤ培地（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｒｏｐｏｕｔ  Ｂｒｏｔｈ；例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ）なども使用可能である。当該培地には、炭素源、窒素源、無機塩等が含まれるのが一般的であるが、各成分組成は適宜選択可能である。
【００４６】
以下に、糸状菌培養のための好ましい培地組成について詳述する。以下に記載する培地中の各成分の濃度は、初発（培地調製時又は培養開始時）の濃度を表す。
【００４７】
上記培地中の炭素源の例としては、グルコース、マルトース、でんぷん加水分解物、フルクトース、キシロース、スクロース等が挙げられ、このうち、グルコース及びフルクトースが好ましい。これらの糖類は、単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。該培地中の炭素源の濃度は、好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは５％（ｗ／ｖ）以上であって、かつ好ましくは４０％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは３０％（ｗ／ｖ）以下である。あるいは、上記培地中の炭素源の濃度は、好ましくは１〜４０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは５〜３０％（ｗ／ｖ）である。
【００４８】
上記培地中の窒素源の例としては、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム等の含窒素化合物が挙げられる。該培地中の窒素源の濃度は、好ましくは０．００１〜０．５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００１〜０．２％（ｗ／ｖ）である。
【００４９】
上記培地には、硫酸塩、マグネシウム塩、亜鉛塩などを含有することができる。硫酸塩の例としては、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等が挙げられる。マグネシウム塩の例としては、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。亜鉛塩の例としては、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、塩化亜鉛等が挙げられる。該培地中の硫酸塩の濃度は、好ましくは０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０２〜０．２％（ｗ／ｖ）である。該培地中のマグネシウム塩の濃度は、好ましくは０．００１〜０．５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１〜０．１％（ｗ／ｖ）である。該培地中の亜鉛塩の濃度は、好ましくは０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００５〜０．０５％（ｗ／ｖ）である。
【００５０】
上記培地のｐＨ（２５℃）は、好ましくは３〜７、より好ましくは３．５〜６である。培地のｐＨは、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア等の塩基、又は硫酸、塩酸等の酸を用いて調整することができる。
【００５１】
上記培地の好ましい例としては、７．５〜３０％炭素源、０．００１〜０．２％硫酸アンモニウム、０．０１〜０．６％リン酸２水素カリウム、０．０１〜０．１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００５〜０．０５％硫酸亜鉛・７水和物、及び３．７５〜２０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する液体培地が挙げられる。  
【００５２】
糸状菌を宿主とした形質転換細胞を用いてより効率的にＣ４ジカルボン酸を生産するには、以下に示すような工程で生産を行ってもよい。すなわち、形質転換細胞の胞子懸濁液を調製し（工程Ａ）、それを培養液で培養して胞子を発芽させ菌糸体を調製し（工程Ｂ１）、好適にはさらに当該菌糸体を増殖させ（工程Ｂ２）、次いで調製した菌糸体を培養してＣ４ジカルボン酸を生産させること（工程Ｃ）により、効率よくＣ４ジカルボン酸を製造することができる。ただし、本発明における形質転換細胞の培養工程は、以下の工程に限定されない。
【００５３】
＜工程Ａ：胞子懸濁液の調製＞
形質転換した糸状菌の胞子を、例えば、無機寒天培地（組成例：２％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、１．５％寒天、いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））、ＰＤＡ培地、等の培地に接種し、１０〜４０℃、好ましくは２７〜３０℃にて、７〜１０日間静置培養を行なうことにより胞子を形成させ、次いで生理食塩水などに懸濁することで、胞子懸濁液を調製することができる。胞子懸濁液には菌糸体が含まれていても、含まれていなくてもよい。
【００５４】
＜工程Ｂ１：菌糸体の調製＞
工程Ａで得られた胞子懸濁液を、培養液に接種して培養し、胞子を発芽させて菌糸体を得る。培養液に接種する糸状菌の胞子数は、１×１０2〜１×１０8個−胞子／ｍＬ−培養液、好ましくは１×１０2〜５×１０4個−胞子／ｍＬ−培養液、より好ましくは５×１０2〜１×１０4個−胞子／ｍＬ−培養液、さらに好ましくは１×１０3〜１×１０4個−胞子／ｍＬ−培養液である。培養液には、市販の培地、例えば、ＰＤＢ培地、ＬＢ培地、ＮＢ培地、ＳＢ培地、ＳＤ培地等が利用できる。該培養液には、発芽率と菌体生育の観点から、炭素源としてグルコース、キシロースなどの単糖、シュークロース、ラクトース、マルトースなどのオリゴ糖、又はデンプン等の多糖；グリセリン、クエン酸などの生体成分；窒素源として硫酸アンモニウム、尿素、アミノ酸等；その他無機物としてナトリウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、リン酸等の各種塩類、を適宜添加することができる。単糖、オリゴ糖、多糖及びグリセリンの好ましい濃度は０．１〜３０％（ｗ／ｖ）、クエン酸の好ましい濃度は０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム、尿素及びアミノ酸の好ましい濃度は０．０１〜１％（ｗ／ｖ）、無機物の好ましい濃度は０．０００１〜０．５％（ｗ／ｖ）である。上記培養液に胞子懸濁液を接種し、好ましくは８０〜２５０ｒｐｍ、より好ましくは１００〜１７０ｒｐｍで攪拌しながら、２５〜４２．５℃の培養温度制御下で、好ましくは２４〜１２０時間、より好ましくは４８〜７２時間培養する。培養に供する培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、２００ｍＬ容バッフル付フラスコの場合は５０〜１００ｍＬ程度、５００ｍＬ容バッフル付フラスコの場合は１００〜３００ｍＬ程度であればよい。この培養により、接種した胞子は発芽し、菌糸体へと成長する。
【００５５】
＜工程Ｂ２：菌糸体の増殖＞
Ｃ４ジカルボン酸生産能向上の観点から、工程Ｂ１で得られた菌糸体をさらに培養して増殖させる工程（工程Ｂ２）を行うことが好ましい。工程Ｂ２で使用する増殖用の培養液は特に限定されないが、通常使用されるグルコースを含む無機培養液であればよく、例えば、７．５〜３０％グルコース、０．０５〜２％硫酸アンモニウム、０．０３〜０．６％リン酸２水素カリウム、０．０１〜０．１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００５〜０．０５％硫酸亜鉛・７水和物、及び３．７５〜２０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液等が挙げられる。当該培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、５００ｍＬ容三角フラスコの場合は５０〜３００ｍＬ、好ましくは１００〜２００ｍＬであればよい。この培養液に、工程Ｂ１で培養した菌体を、湿重量として１〜６ｇ−菌体／１００ｍＬ−培養液、好ましくは３〜４ｇ−菌体／１００ｍＬ−培養液となるよう接種し、１００〜３００ｒｐｍ、好ましくは１７０〜２３０ｒｐｍで攪拌しながら、２５〜４２．５℃の培養温度制御下で、１２〜１２０時間、好ましくは２４〜７２時間培養する。
【００５６】
＜工程Ｃ：Ｃ４ジカルボン酸生産＞
上記の手順（工程Ｂ１又はＢ２）で得られた糸状菌の菌糸体を培養して、当該菌にＣ４ジカルボン酸を生産させる。該培養の条件は、上述した通常の糸状菌の培養条件に従えばよい。培地の量は、２００ｍＬ容三角フラスコの場合は２０〜８０ｍＬ程度、５００ｍＬ容三角フラスコの場合は５０〜２００ｍＬ程度、３０Ｌジャーファーメンターの場合は１０Ｌ〜１５Ｌ程度とすることができるが、培養容器にあわせて適宜調整すればよい。培地に対する工程Ｂ１又はＢ２で得られた菌体の接種量は、好ましくは湿重量として５ｇ〜９０ｇ−菌体／１００ｍＬ−培地、より好ましくは５ｇ〜５０ｇ−菌体／１００ｍＬ−培地であり得る。好適には、培養は、１００〜３００ｒｐｍ、好ましくは１５０〜２３０ｒｐｍで攪拌しながら、２５〜４５℃の温度下で、２時間〜２４０時間、好ましくは１２時間〜１２０時間行われる。ジャーファーメンターを用いる場合は、通気は好ましくは０．０５〜２ｖｖｍ、より好ましくは０．１〜１．５ｖｖｍにて行う。
【００５７】
以上の手順で本発明の形質転換細胞を培養し、Ｃ４ジカルボン酸を生産させる。培養後、培養物からＣ４ジカルボン酸を回収する。必要に応じて、回収したＣ４ジカルボン酸をさらに精製してもよい。培養物からＣ４ジカルボン酸を回収又は精製する方法は、特に限定されず、公知の回収又は精製方法に従って行えばよい。例えば、傾斜法、ろ過、遠心分離などにより培養物から細胞等を除去し、残った培養物を、必要に応じて濃縮した後、晶析法、イオン交換法、溶剤抽出法等の方法、又はこれらの組み合わせにかけることで、該培養物中のＣ４ジカルボン酸を回収又は精製することができる。
【００５８】
培養物から分離された本発明の形質転換細胞は、Ｃ４ジカルボン酸生産に再利用することができる。例えば、培養物から分離した本発明の形質転換細胞に、上述した培地を新たに加え、再び上記条件で培養してＣ４ジカルボン酸を生産させ、次いで生産されたＣ４ジカルボン酸を培地から回収することができる。さらにこの過程を繰り返すことができる。本発明の製造方法において、形質転換細胞の培養及びＣ４ジカルボン酸の回収は、回分式、半回分式及び連続式のいずれの方法で行ってもよい。
【００５９】
（４．例示的実施形態）
本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、あるいは方法をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００６０】
〔１〕配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを含む、形質転換細胞。
【００６１】
〔２〕好ましくは、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列が、
配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９６％以上、なお好ましくは９７％以上、なお好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であるか；又は
配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個以上１０個以下、好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列である、
〔１〕記載の形質転換細胞。
【００６２】
〔３〕上記配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが、
好ましくは、１４個の膜貫通へリックス構造を有する複数回膜貫通型ポリペプチドであり、
より好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の５３位から７５位領域、９０位から１１２位領域、１１９位から１４１位領域、１４５位から１６７位領域、１８０位から１９８位領域、２０８位から２３０位領域、２４３位から２６５位領域、２７５位から２９４位領域、３１５位から３３７位領域、３４７位から３６９位領域、３７６位から３９８位領域、４０８位から４３０位領域、４４３位から４６５位領域、及び５１１位から５３３位領域のそれぞれに相当する領域に膜貫通へリックス構造を有する複数回膜貫通型ポリペプチドである、
〔１〕又は〔２〕記載の形質転換細胞。
【００６３】
〔４〕好ましくは、上記ポリヌクレオチドが、配列番号１で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の形質転換細胞。
【００６４】
〔５〕好ましくは、上記配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列が、
配列番号１で示されるヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９６％以上、なお好ましくは９７％以上、なお好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であるか；又は
配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１個以上３０個以下、好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上９個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列である、
〔４〕記載の形質転換細胞。
【００６５】
〔６〕好ましくは、上記ポリヌクレオチドを含有するベクターを含むか、又は上記ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに組み込まれている、〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の形質転換細胞。
【００６６】
〔７〕好ましくは、上記ベクターが上記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された制御領域をさらに含有する、〔６〕記載の形質転換細胞。
【００６７】
〔８〕好ましくは、上記ポリヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドと作動可能に連結された制御領域とともにゲノムＤＮＡに組み込まれている、〔６〕記載の形質転換細胞。
【００６８】
〔９〕好ましくは上記細胞が微生物細胞である、〔１〕〜〔８〕のいずれか１項記載の形質転換細胞。
【００６９】
〔１０〕好ましくは上記微生物が糸状菌である、〔９〕記載の形質転換細胞。
【００７０】
〔１１〕好ましくは上記糸状菌がリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）である、〔１０〕記載の形質転換細胞。
【００７１】
〔１２〕上記リゾプス属が、
好ましくはリゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）又はリゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）であり、
より好ましくはリゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）である、
〔１１〕記載の形質転換細胞。
【００７２】
〔１３〕好ましくはＣ４ジカルボン酸生産能が向上している、〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項記載の形質転換細胞。
【００７３】
〔１４〕上記Ｃ４ジカルボン酸生産能が、好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上、さらに好ましくは２０％以上向上している、〔１３〕記載の形質転換細胞。
【００７４】
〔１５〕好ましくは、上記Ｃ４ジカルボン酸がフマル酸、リンゴ酸又はコハク酸である、〔１３〕又は〔１４〕記載の形質転換細胞。
【００７５】
〔１６〕〔１〕〜〔１５〕のいずれか１項記載の形質転換細胞を培養することを含む、Ｃ４ジカルボン酸の製造方法。
【００７６】
〔１７〕上記培養物からＣ４ジカルボン酸を回収することをさらに含む、〔１６〕記載の製造方法。
【００７７】
〔１８〕上記Ｃ４ジカルボン酸がフマル酸、リンゴ酸又はコハク酸である、〔１６〕又は〔１７〕記載の製造方法。
【００７８】
〔１９〕形質転換細胞の製造方法であって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含有するベクターを宿主細胞に導入することを含む、
方法。
【００７９】
〔２０〕宿主細胞におけるＣ４ジカルボン酸生産能の向上方法であって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含有するベクターを宿主細胞に導入することを含む、
方法。
【００８０】
〔２１〕上記宿主細胞におけるＣ４ジカルボン酸生産能が、好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上、さらに好ましくは２０％以上向上する、〔２０〕記載の方法。
【００８１】
〔２２〕好ましくは上記Ｃ４ジカルボン酸がフマル酸、リンゴ酸又はコハク酸である、〔２０〕又は〔２１〕記載の方法。
【００８２】
〔２３〕好ましくは、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列が、
配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９６％以上、なお好ましくは９７％以上、なお好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であるか；又は
配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個以上１０個以下、好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列である、
〔１９〕〜〔２２〕のいずれか１項記載の方法。
【００８３】
〔２４〕上記配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが、
好ましくは、１４個の膜貫通へリックス構造を有する複数回膜貫通型ポリペプチドであり、
より好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の５３位から７５位領域、９０位から１１２位領域、１１９位から１４１位領域、１４５位から１６７位領域、１８０位から１９８位領域、２０８位から２３０位領域、２４３位から２６５位領域、２７５位から２９４位領域、３１５位から３３７位領域、３４７位から３６９位領域、３７６位から３９８位領域、４０８位から４３０位領域、４４３位から４６５位領域、及び５１１位から５３３位領域のそれぞれに相当する領域に膜貫通へリックス構造を有する複数回膜貫通型ポリペプチドである、
〔１９〕〜〔２３〕のいずれか１項記載の方法。
【００８４】
〔２５〕好ましくは、上記ポリヌクレオチドが、配列番号１で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである、〔１９〕〜〔２４〕のいずれか１項記載の方法。
【００８５】
〔２６〕好ましくは、上記配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列が、
配列番号１で示されるヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９６％以上、なお好ましくは９７％以上、なお好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であるか；又は
配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１個以上３０個以下、好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上９個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列である、
〔２５〕記載の方法。
【００８６】
〔２７〕好ましくは上記宿主細胞が微生物細胞である、〔１９〕〜〔２６〕のいずれか１項記載の方法。
【００８７】
〔２８〕好ましくは上記微生物が糸状菌である、〔２７〕記載の方法。
【００８８】
〔２９〕好ましくは上記糸状菌がリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）である、〔２８〕記載の方法。
【００８９】
〔３０〕上記リゾプス属が、
好ましくはリゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）又はリゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）であり、
より好ましくはリゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）である、
〔２９〕記載の方法。
【実施例】
【００９０】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００９１】
実施例１  形質転換細胞の作製
（１）ゲノム抽出
ＰＤＡ培地にＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ  ＪＣＭ（Ｊａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ／理研）５５５７株（以降、５５５７株と表記）の胞子を植菌後、３０℃で５日間培養を行った。培養後、菌体を３ｍＬ用メタルコーン（安井器械）とともに３ｍＬ破砕チューブに入れ、直ちに液体窒素中で１０分間以上凍結させた。その後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて１７００ｒｐｍで１０秒間菌体の破砕を行った。破砕後の容器にＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）（ニッポンジーン）を４００μＬ加え転倒混和し、２５０μＬを１．５ｍＬチューブに移した。該菌体溶液から、“Ｇｅｎとるくん（酵母用）”（タカラバイオ）を用いて、プロトコールに従いゲノム抽出を行った。得られたゲノム溶液５０μＬに対し、ＲＮａｓｅＡ（ロシュ）を１μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。反応後、等量のフェノールクロロホルムを加え、タッピングにより混和した後、４℃、１４５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しい１．５ｍＬチューブに移した。再度フェノールクロロホルム処理を繰り返し、次いでエタノール沈殿を行い、５５５７株の精製ゲノム溶液を得た。
【００９２】
（２）ｃＤＮＡの作製
（i）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出
５５５７株の菌体６ｇ−湿重量を、液体培地４０ｍＬ（０．１ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．６ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０９ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｇ／Ｌ  炭酸カルシウム、１００ｇ／Ｌグルコース）に植菌し、３５℃、１７０ｒｐｍで８時間培養した。培養液中から菌体をろ過、回収し、０．８５％生理食塩水１００ｍＬで２回洗浄を行った。洗浄後、吸引濾過により余分な水分を取り除いた後、０．３ｇを量りとり３ｍＬ用メタルコーン（安井器械）とともに３ｍＬ破砕チューブに入れ、直ちに液体窒素に投入し、凍結させた。得られた凍結菌体をマルチビーズショッカー（安井器械）を用いて１７００ｒｐｍで１０秒間破砕した。破砕後の菌体にＲＬＴ  ｂｕｆｆｅｒを５００μＬ添加し、転倒混和後、４５０μＬをＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）に供し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出を行った。得られたＲＮＡ溶液４０μＬに１μＬのＤＮａｓｅＩ（ＴａＫａＲａ）及び５μＬの１０×ＤＮａｓｅＩ  ｂｕｆｆｅｒ（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を添加し、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒで５０μＬにフィルアップした後、３７℃で３０分以上反応させて溶液中の残存ＤＮＡを除去した。ＤＮａｓｅＩをさらに１μＬ追加し、３７℃で３０分間反応させた後にフェノール／クロロホルム抽出を行い、次いでエタノール沈殿を行った。沈殿を５０μＬの滅菌水に溶解し、Ｑｕｂｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＲＮＡ溶液の濃度及び純度を測定した。また、該ＲＮＡ溶液を適宜希釈し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）及びＲＮＡ６０００  Ｐｉｃｏ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて抽出したＲＮＡの検定を行った。ＲＮＡの分解度指標である「ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ値）」が６．０以上であることを確認し、得られたＲＮＡ溶液をｔｏｔａｌ  ＲＮＡとして取得した。
【００９３】
（ii）ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡ合成は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIII  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  ｆｏｒ  ｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。すなわち、（i）で得られたＲＮＡ溶液１μｇをＤＥＰＣ水で８μＬにフィルアップした後、１０μＬの２×ＲＴ  Ｒｅａｘｔｉｏｎ  Ｍｉｘと、２μＬのＲＴ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを添加し、穏やかに混ぜ、２５℃で１０分間、５０℃で３０分間、８５℃で５分間反応させた。反応後の溶液に１μＬのＲＮａｓｅＨを加え３７℃で２０分間反応させ、これをｃＤＮＡ溶液とした。
【００９４】
（３）プラスミドベクターの作製
（i）ｐＵＣ１８へのｔｒｐＣ遺伝子領域の導入
上記（１）で得られた５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型に、ｔｒｐＣ遺伝子（配列番号３）を含むＤＮＡ断片を、プライマーｏＪＫ１６２（配列番号４）及びｏＪＫ１６３（配列番号５）を用いたＰＣＲにて合成した。次に、プラスミドｐＵＣ１８を鋳型に、プライマーｏＪＫ１６４（配列番号６）及びｏＪＫ１６５（配列番号７）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。以上の２断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結しプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣを構築した。
【００９５】
（ii）ＡＤＨ１プロモーター、ターミネーターのクローニング
上記（１）で得られた５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型に、ＡＤＨ１のプロモーター配列（配列番号８）を含むＤＮＡ断片とターミネーター配列（配列番号９）を含むＤＮＡ断片とを、それぞれプライマーｏＪＫ２０２（配列番号１０）及びｏＪＫ２０４（配列番号１１）、ならびにｏＪＫ２０５（配列番号１２）及びｏＪＫ２１６（配列番号１３）を用いたＰＣＲにて増幅した。次に、（i）で得られたプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣを鋳型に、プライマーｏＪＫ２１０（配列番号１４）及びｏＪＫ２１１（配列番号１５）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。以上の３断片を（i）と同様の手順で連結してプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを構築した。得られたプラスミドには、ｔｒｐＣ遺伝子領域の下流にＡＤＨ１プロモーター及びターミネーターが順に配置されている。さらにＡＤＨ１ターミネーターの下流にはＮｏｔ  Ｉ制限酵素認識配列が配置されている。
【００９６】
（iii）プラスミドベクター作製
上記（２）で得られた５５５７株のｃＤＮＡを鋳型に、配列番号１で示される遺伝子（以下、ｒｄｔ５と称する）を含むＤＮＡ断片を、プライマーｏＪＫ５１３（配列番号１６）及びｏＪＫ５１４（配列番号１７）を用いたＰＣＲにて増幅した。次に、（ii）で得られたプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーｏＪＫ２０４（配列番号１１）及びｏＪＫ２６９−４（配列番号１８）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。上記２断片を（i）と同様の手順で連結してプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−ｒｄｔ５−Ｔａｄｈを構築した。得られたプラスミドには、ＡＤＨプロモーターとターミネーターの間に配列番号１で示されるｒｄｔ５遺伝子が挿入されている。
【００９７】
プラスミドベクターｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−ｒｄｔ５−Ｔａｄｈの作製に用いたＰＣＲプライマーを表１に示す。
【００９８】
【表１】
0006671922.tif 000002
【００９９】
（４）宿主細胞への遺伝子導入
（i）トリプトファン栄養要求性株の作製
遺伝子導入の宿主細胞として用いたトリプトファン栄養要求性株は、５５５７株へのイオンビーム照射による変異導入株の中から選抜し取得した。イオンビーム照射は、独立行政法人日本原子力研究開発機構・高崎量子応用研究所のイオン照射施設（ＴＩＡＲＡ）において行った。照射は、ＡＶＦサイクロトロンを用いて１２Ｃ５＋を加速し、２２０ＭｅＶのエネルギーで１００〜１２５０Ｇｒａｙ照射した。照射した菌体より胞子を回収し、その中から、トリプトファン栄養要求性を示すＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ  ０２Ｔ６株（以降、０２Ｔ６株と表記）を取得した。０２Ｔ６株は、ｔｒｐＣ遺伝子コーディング領域（配列番号３）全長２２９８ｂｐ中の２０９３番目が一塩基欠損している。
【０１００】
（ii）プラスミドベクターの増幅
上記（３）で作製したプラスミドベクターｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈ及びｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−ｒｄｔ５−Ｔａｄｈを用いて、大腸菌ＤＨ５α株（ニッポンジーン）をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。得られた形質転換細胞を３７℃で一晩静置し、得られたコロニーをＬＢａｍｐ液体培地（Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎ  １％、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ０．５％、ＮａＣｌ  １％，アンピシリンナトリウム５０μｇ／ｍＬ）２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりハイピュアプラスミドアイソレーションキット（ロシュライフサイエンス）を用いて各プラスミドベクターの精製を行った。
【０１０１】
（iii）プラスミドベクターの宿主細胞への導入
（ii）で得られたプラスミドベクターｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈ及びｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−ｒｄｔ５−Ｔａｄｈの各ＤＮＡ溶液（１μｇ／μＬ）１０μＬを金粒子溶液（６０ｍｇ／ｍＬ）１００μＬに加え混合した後、０．１Ｍスペルミジンを４０μＬ加え、ボルテックスでよく攪拌した。さらに２．５Ｍ  ＣａＣｌ２を１００μＬ加え、ボルテックスで１分間攪拌し、次いで６０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿に７０％ＥｔＯＨを２００μＬ加え、３０秒間ボルテックスで攪拌した後、６０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿を１００μＬの１００％ＥｔＯＨで再懸濁した。
【０１０２】
次に、（i）で作製した０２Ｔ６株の胞子に対し、上記のＤＮＡ−金粒子溶液を用い、ＧＤＳ−８０（ネッパジーン）にて遺伝子導入を行った。遺伝子導入後の胞子は、無機寒天培地（２０ｇ／Ｌ  グルコース、１ｇ／Ｌ  硫酸アンモニウム、０．６ｇ／Ｌ  リン酸２水素カリウム、０．２５ｇ／Ｌ  硫酸マグネシウム・７水和物、０．０９ｇ／Ｌ  硫酸亜鉛・７水和物、１５ｇ／Ｌ  寒天）上で、３０℃の条件で１週間程静置培養した。生育した菌体の一部を植菌耳で掻き取り、ＴＥ（ｐＨ８．０）（日本ジーン）に懸濁した。懸濁溶液を９５℃で１５分間処理し、形質転換株より核酸を抽出した。この核酸を鋳型に、プライマーｏＪＫ４３８（配列番号１９）及びｏＪＫ４３９（配列番号２０）を用いたＰＣＲ反応を行い、目的ＤＮＡ断片の導入が確認された菌株を形質転換株として選抜した。ＰＣＲプライマーを表２に示す。ＡＤＨ１プロモーター下流にｒｄｔ５遺伝子が連結したＤＮＡを含むｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−ｒｄｔ５−Ｔａｄｈが導入された株をＲＤＴ５株とし、一方、ｒｄｔ５遺伝子の挿入されていないＤＮＡを含むプラスミドベクターｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈが導入された株をネガティブコントロール株（以下、ＮＣ株）として取得した。残りの菌体を植菌耳で掻き取り、胞子回収溶液（８．５ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、０．５ｇ／Ｌ  ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）中で激しく混和した。混和後の胞子懸濁液を３ＧＰ１００円筒ロート型ガラスろ過器（柴田化学）にてろ過し、これを胞子液とした。胞子液中の胞子数は、ヘモサイトメーター（血球計算盤、Ｄ＝１／５０ｍｍ・１／４００ｍｍ２）を用いて測定した。
【０１０３】
【表２】
0006671922.tif 000003
【０１０４】
実施例２  ＲＤＴ５株のＣ４ジカルボン酸生産能
（１）形質転換株の培養
（i）菌糸体の調製
５００ｍＬ用バッフル付三角フラスコ（旭硝子）に、ソルビタンモノラウレート（レオドールＳＰ−Ｌ１０（花王））を最終濃度で０．５％（ｖ／ｖ）添加した２００ｍＬのＳＤ／−Ｔｒｐ培地（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を供し、実施例１で調製したＲＤＴ５株及びＮＣ株の胞子液を１×１０3個−胞子／ｍＬ−培地となるように接種後、２７℃にて３日間、１７０ｒｐｍで攪拌培養した。得られた培養物を予め滅菌処理したメッシュ網目２５０μｍのステンレスふるい（アズワン）を用いてろ過し、菌体をフィルター上に回収した。
【０１０５】
（ii）菌糸体の増殖
５００ｍＬ容三角フラスコに供した無機培養液１００ｍＬ（０．１ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．６ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０９ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｇ／Ｌ炭酸カルシウム、１００ｇ／Ｌグルコース）に、（i）で回収した湿菌体５．０〜８．０ｇを接種し、２７℃で約４０時間、２２０ｒｐｍにて攪拌培養した。得られた培養物を、予め滅菌処理したステンレススクリーンフィルターホルダー（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いてろ過し、フィルター上に菌体を回収した。さらにこのフィルターホルダー上で、２００ｍＬの生理食塩水で菌体を洗浄した。洗浄に用いた生理食塩水は吸引ろ過して除去した。
【０１０６】
（２）形質転換株のＣ４ジカルボン酸生産性評価
上記（１）で得られたＲＤＴ５株及びＮＣ株の湿菌体６．０ｇを、２００ｍＬ容三角フラスコに供した生産性評価用無機培養液４０ｍＬ（０．０１７５ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０６ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．３７５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１３５ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｇ／Ｌ炭酸カルシウム、１００ｇ／Ｌグルコース）に植菌し、３５℃、１７０ｒｐｍで攪拌培養した。培養５６時間後に、菌体を含まない培養上清を回収し、後述する参考例１に記載の手順にてフマル酸、リンゴ酸、コハク酸及びグルコースの定量を行い、グルコースからの各Ｃ４ジカルボン酸の変換率（収率）を算出した。求めたＲＤＴ５株及びＮＣ株における変換率に基づいて、下記式に従いＲＤＴ５株における各Ｃ４ジカルボン酸の生産能向上率を算出した。
向上率（％）
＝（ＲＤＴ５株における変換率／ＮＣ株における変換率）×１００−１００
結果を表３に示す。ｒｄｔ５遺伝子を導入されていないＮＣ株と比較して、ＲＤＴ５株では、リンゴ酸が７３．６％、フマル酸が２４．３％、コハク酸が３２．１％、それぞれ生産能の向上が観察された。
【０１０７】
【表３】
0006671922.tif 000004
【０１０８】
参考例１  Ｃ４ジカルボン酸及びグルコースの定量
培養上清中のＣ４ジカルボン酸（フマル酸、リンゴ酸及びコハク酸）ならびにグルコースの定量は、ＨＰＬＣにより行った。
ＨＰＬＣ分析に供する培養上清は、予め３７ｍＭ硫酸にて適宜希釈した後、ＤＩＳＭＩＣ−１３ｃｐ（０．２０μｍセルロースアセテート膜、ＡＤＶＡＮＴＥＣ）又はアクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行なった。
ＨＰＬＣの装置は、ＬａＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ（日立ハイテクノロジーズ）を用いた。分析カラムには、ＩＣＳｅｐ  ＩＣＥ−ＩＯＮ−３００  Ｇｕａｒｄ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｅ（４．０ｍｍＩ．Ｄ．×２．０ｃｍ、ＴＲＡＮＳＧＥＮＯＭＩＣ）を接続した有機酸分析用ポリマーカラムＩＣＳｅｐ  ＩＣＥ−ＩＯＮ−３００（７．８ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ、ＴＲＡＮＳＧＥＮＯＭＣ）を用い、溶離液は１０ｍＭ硫酸、流速０．５ｍＬ／分、カラム温度５０℃の条件にて溶出を行なった。各Ｃ４ジカルボン酸及びグルコースの検出には、ＵＶ検出器（検出波長２１０ｎｍ）及び示唆屈折率検出器（ＲＩ検出器）を用いた。濃度検量線は、標準試料〔フマル酸（販売元コード０６３−００６５５、和光純薬工業）、リンゴ酸（販売元コード１３５−００５６２、和光純薬工業）、コハク酸（販売元コード１９４−０４３３５、和光純薬工業）、グルコース（販売元コード０４５−３１１６２、和光純薬工業）〕を用いて作成した。それぞれの濃度検量線に基づいて、各成分の定量を行なった。
【０１０９】
定量した培地中のグルコース量を、該培地の初発グルコース量から引いた値を、グルコース消費量とした。該グルコース消費量に対する定量した各Ｃ４ジカルボン酸量の割合（％）を、各Ｃ４ジカルボン酸の変換率（収率）として算出した。
【配列表】
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