(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式（ａ）で示されるPETプローブ用の11C標識O6-ベンジルグアニン。
【化１】
0006754923.tif 000013
【請求項２】
非プロトン性のラクタム中において、11Cで標識化されたヨウ化メチルと、下記有機スズ化合物（ｂ）（ただし、式中、R1はアルキル基を示し、R2及びR3は塩基で脱離させることが可能な脱離基を示す）とを、パラジウム錯体、ホスフィン配位子、及びハロゲン化第１銅の存在下でクロスカップリングさせるカップリング工程と、
該カップリング工程によって得られた反応液を精製することなしに塩基を加えることによりカップリング生成物の脱離基R2及びR3を脱離させる脱離工程とを備え、
前記R2はトリフルオロアセチル基であり、前記R3はtert-ブトキシカルボニル基であり、
前記非プロトン性のラクタムはＮ−アルキル−２−ピロリジノンであり、
前記カップリング工程において炭酸塩、アルカリ金属のフッ化物及びアスコルビン酸のアルカリ金属塩の少なくとも１種を添加することを特徴とする請求項１に記載の11C標識O6-ベンジルグアニンの製造方法。
【化２】
0006754923.tif 000014
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、11C標識O6-ベンジルグアニン、O6-Methyl Guanine Methyl-Transferase活性を可視化可能なPETプローブ、及びそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学の進歩に伴い、遺伝子におけるエピジェネティックな研究が進み、遺伝子の転写や翻訳における調節異常に起因する様々な疾患発病のメカニズムが解明されてきている。【０００３】
脳内DNA修復酵素であるO6-メチルグアニン-DNA-トランスフェラーゼ（MGMT）をコードする遺伝子の転写は、そのプロモーター部位のメチル化によって調節されていることが明らかになっている。悪性脳腫瘍においては、この調節機能を阻害する抗がん剤としてテモダールが開発されている。テモダールは生体内において下記反応機構によってメチルジアゾニウムイオンを発生させ、このメチルジアゾニウムイオンがMGMTのプロモーター部位を含めたDNAをメチル化することにより、抗がん剤として機能する（下記反応式参照）。
【化１】
0006754923.tif 000002
【０００４】
しかしながら、脱メチル化酵素であるMGMTを過剰発現している悪性脳腫瘍に対して治療薬としてテモダールを処方した場合，薬剤耐性を示すことがあり（上記下段反応式における左側への反応）、これが治療の妨げとなっていた。また、脳腫瘍細胞のテモダール感受性／非感受性の差は、MGMTの発現量に起因することも明らかにされている（非特許文献１及び非特許文献２）。このため、悪性脳腫瘍におけるテモダールを抗がん剤とした治療法においては、腫瘍内におけるMGMTを生検によって定量することが必要不可欠となる。
しかし、腫瘍内のMGMTを定量するためには外科的手術によって腫瘍を体外へと摘出し、生化学的手法によってMGMTの発現量を定量する他に手段がなく、患者への大きな負担となっていた。【０００５】
この問題を解決すべく、MGMT阻害剤であるO6-ベンジルグアニンをPETプローブ化する試みがなされている（非特許文献３及び非特許文献４）。その原理は次のとおりである。
すなわち、O6-ベンジルグアニンはMGMTによる脱メチル化反応を行うためのシステイン部位のチオールを不可逆的にベンジル化し、これにより脱メチル化反応を阻害することが知られている（非特許文献５）。このため、O6-ベンジルグアニンのベンジル基を標識化しておけば、標識化されたベンジル基が不可逆的にMGMTに結合し、PET装置によってイメージングすることができると考えられる。こうした原理に基づいて、[18F]フッ素化によってベンゼン環が標識化されたO6-ベンジルグアニン（非特許文献３、非特許文献４）や、[11C]メトキシ基によってベンゼン環が標識化されたO6-ベンジルグアニン（非特許文献４）が合成されている。しかしながら、18F標識合成法は標識後も多段階を必要とする煩雑なプロセスからなり、また11C標識法は標識部位の反応選択性に欠けると同時に、得られた11C標識体は生体内で代謝に不安定である。加えて、現在に至るまで、これらの標識プローブのMGMTに関するPET画像の報告例もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2010-074272
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】A. Natsume, D. Ishii, T. Wakabayasi, T. Tsuno, H. Hatano, M. Mizuno, J. Yashida, Cancer Res. 2005, 65, 7573-7579;
【非特許文献２】A. Natsume, T. Wakabayashi, D. Ishii H. Maruta, M. Fujii, S. Shimoto, M. Ito, J. Yoshida, Cancer Chemother. Pharmacol. 2008, 61, 653-659.
【非特許文献３】G. Vaidyanathan, D. J. Affleck, C. M. Cavazos. S. P. Johnson, S. Shankar, H. S. Friedman, M. O. Colvin, M. R. Zalutsky, Bioconjugate Chem. 2000, 11, 868-875.
【非特許文献４】X. Liu, Q.-H. Zheng, X, Fei, J.-Q. Wang, D. W. Ohannesian, L. C. Erickson, K. L. Stone, G. D. Hutchins, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 13, 641-644.
【非特許文献５】A. Keppler, S. Gendreizing, T. Gronemeyer, H. Pick, H. Vogel, K. Johnsson, Nature Biol. 2003, 21, 86-89.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記従来の課題に鑑み成されたものであり、放射性化合物合成法の理想型といえる標識化反応をone-pot操作により合成の最終工程に組み込んだ高効率合成法であり、PET画像撮影に十分な放射能を有する11C標識化O6-ベンジルグアニン及びその製造方法、並びに11C標識O6-ベンジルグアニンを含有するPETプローブを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記課題を解決するため、O6-ベンジルグアニンのベンジル基への[11C]CH3による標識化を計画した。炭素−[11C]炭素結合による11C標識位置は代謝的に非常に安定であるため、信憑性の高いPET画像を得ることができると考えられる。また、メチル基は最も小さな無極性置換基であるため、O6-ベンジルグアニンのMGMTに対する阻害効果も、[11C]メチル化によってはそれほど影響されないことが期待できる。
しかし、11Cは半減期が20分と短いため、反応後、迅速に分離精製して生体へ投与し、PET装置での測定を行わなければならない。このため、本発明者らが以前に開発した放射性核種含有ヨウ化[11C]メチルとヘテロ芳香環を有するスズ化合物とのカップリング反応(特許文献１)を応用することを試みた。しかしながら、特許文献１の方法をそのまま行っても、無保護のO6-ベンジルグアニンは分子内にパラジウムを介する反応を阻害するアミノ基が存在する理由から、PET画像を得ることができるだけの十分な放射能を有する11C標識化O6-ベンジルグアニンを得ることはできなかった。このため、さらに鋭意研究を進めた結果、この課題を解決できる11C標識化O6-ベンジルグアニンの合成に成功し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明の11C標識O6-ベンジルグアニンは、下記化学式（ａ）で示されることを特徴とする。
【化２】
0006754923.tif 000003
【００１１】
本発明者らは、上記化学式（ａ）の化合物を合成し、その放射能の測定から、PETプローブとして充分使用可能であることを確認している。したがって、上記化学式（ａ）の化合物を含有するPETプローブを生体に投与してPET画像を撮影することにより、MGMTのイメージングが可能となる。なぜならば、このPETプローブはMGMTと不可逆的に結合するからである。【００１２】
本発明の11C標識O6-ベンジルグアニンの製造方法は、
非プロトン性のラクタム中において、11Cで標識化されたヨウ化メチルと、下記有機スズ化合物（ｂ）（ただし、式中、R1はアルキル基を示し、R2及びR3は塩基で脱離させることが可能な脱離基を示す）とを、パラジウム錯体、ホスフィン配位子、及びハロゲン化第１銅の存在下でクロスカップリングさせるカップリング工程と、
該カップリング工程によって得られたカップリング生成物の脱離基R2及びR3を塩基によって脱離させる脱離工程と、を備えることを特徴とする。
【化３】
0006754923.tif 000004
【００１３】
この製造方法では、カップリング工程において、パラジウム錯体に立体的にホスフィン配位子が不飽和的に配位して活性な反応場を創出し、さらに、このホスフィン配位子が配位したパラジウム錯体に11Cで標識化されたヨウ化メチルが酸化的付加をして[11C]CH3PdIにホスフィン配位子が配位したパラジウム錯体が形成される。
一方、有機スズ化合物（ｂ）は、ハロゲン化第１銅と金属交換反応を行い、求核性に富んだ有機銅化合物となる。
そして、[11C]CH3PdIにホスフィン配位子が配位したパラジウム錯体と有機銅化合物とが置換反応を行い、さらに還元的脱離が起こって[11C]CH3とのカップリング反応が終了する。
そして、さらに脱離工程において塩基によってR2及びR3が脱離し、目的の11C標識O6-ベンジルグアニン(a)が生成する。【００１４】
置換基R2及びR3は塩基で脱離させることが可能な脱離基であれば、特に限定はない。例えばR2としては、トリフルオロアセチル基、tert-ブトキシカルボニル基、トリチル基等が挙げられ、特に好ましいのはトリフルオロアセチル基である。また、R3としては、tert-ブトキシカルボニル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルオキシカルボニル基、トリチル基等が挙げられ、特に好ましいのはtert-ブトキシカルボニル基である。【００１５】
カップリング工程における溶媒としては、非プロトン性のラクタムが用いられる。ここで、非プロトン性のラクタムとは、環状のアミド（すなわちラクタム）であって、窒素に直接結合する水素を有しないものをいう。非プロトン性のラクタムとして好ましいのはＮ−アルキル−２−ピロリジノンであり、アルキル基は、好ましくは炭素数１〜６であり、より好ましくは炭素数１〜３である。【００１６】
また、カップリング工程で炭酸塩、アルカリ金属のフッ化物、及びアスコルビン酸のアルカリ金属塩の少なくとも1種を添加することが好ましい。こうであれば、カップリング工程において副生するトリアルキルスズハロゲン化物が炭酸塩、アルカリ金属のフッ化物、及びアスコルビン酸のアルカリ金属塩の少なくとも1種と反応して中和もしくは沈殿により（炭酸塩の場合はトリアルキルスタニル炭酸塩として、アルカリ金属のフッ化物の場合はトリアルキルスタニルフルオライドとして、アスコルビン酸のアルカリ金属塩の場合はアスコルビン酸塩として沈殿する）、反応系から除外される。このため、ＳｎからＣｕへの金属交換反応が促進され、収率を高めることもできる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の製造方法で得られた11C標識化O6-ベンジルグアニンは、PET画像を得るのに十分な放射能を有しており、PETプローブとして利用することができる。なお、本発明の11C標識化O6-ベンジルグアニンは、11C標識ベンジル部位がMGMTと不可逆的に結合し、PET画像撮影から得られる標的部位の放射能濃度（投与量と体重で補正した値SUV値）からMGMT濃度が定量化される。また、本発明の11C 標識O6-ベンジルグアニンの製造方法では、11C 標識位置が代謝的に安定であるため、再現性が高く、品質の高いPETプローブが提供される。加えて、カップリング工程後の脱保護工程は迅速かつ容易に進むため、一般的な放射性薬剤自動合成装置の使用による標識合成が可能である。
これに対して、非特許文献3では、18F標識化O6-ベンジルグアニンを18F標識化されたベンズアルデヒドから還元した[18F]フルオロベンジルアルコールをプロセッティンググループとし、6-クロロ-2-アミノ-9H-プリン（あるいは2-アミノ-6-トリメチルアミノ-9H-プリン塩酸塩）のベンジル化の多段階合成により合成しており、煩雑な操作を伴うため一般的な自動合成装置を用いて行うことは困難である。
また、非特許文献4では、[11C]メトキシ基によりベンゼン環が標識化された11C 標識O6-ベンジルグアニンの合成を反応性の高い[11C]メチルトリフラートを用いたO6-（ヒドロキシメチル）ベンジルグアニンのO-[11C]メチル化反応により合成しているが、より求核性の高いアミンへの[11C]メチル化（N-[11C]メチル化）によるグアニン部位の[11C]メチル化体が副生し、目的標識体は低収率でしか得られない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】化合物（１）〜（４）のMGMT阻害効果を示すグラフである。
【図２】アミノ基の保護基がない有機スズ化合物5、及びアミノ基をトリフルオロ基で保護した有機スズ化合物6の[11C]CH3Iによるメチル化の合成経路を示す図である。
【図３】アミノ基が保護されていない有機スズ化合物5を[11C]CH3Iによってメチル化した場合の標識合成反応式とHPLCチャートである。
【図４】2位のアミノ基がトリフルオロアセチル基で保護された有機スズ化合物6を[11C]CH3Iによってメチル化した場合の標識合成反応式とHPLCチャートである。
【図５】2位のアミノ基がトリフルオロアセチル基で保護されており、9位のアミノ基がtert-ブトキシカルボニル（BOC）基で保護された有機スズ化合物7を[11C]CH3Iによってメチル化した場合（添加した塩基はアスコルビン酸ナトリウム）の標識合成反応式とHPLCチャートである。
【図６】2位のアミノ基がトリフルオロアセチル基で保護されており、9位のアミノ基がtert-ブトキシカルボニル（BOC）基で保護された有機スズ化合物7を[11C]CH3Iによってメチル化した場合（添加した塩基はK2CO3）の標識合成反応式とHPLCチャートである。
【図７】pMeBG (3)をSDラットに投与後の血中濃度変化を示すHPLCチャートである
【図８】ラットに化合物2を投与後のmMeBG(2)及びその代謝物の平均血漿濃度の時間変化を示すグラフである。
【図９】ラットに化合物3を投与後のpMeBG (3)及びその代謝物の平均血漿濃度の時間変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜O6-ベンジルグアニンのメチル化の検討＞
【化４】
0006754923.tif 000005
【００２０】
上記O6-ベンジルグアニン(1)に存在するベンゼン環の[11C]メチル基の導入位置を検討した。このため、まず標識化されていないO6-(3-methylbenzyl)guanine (2), O6-(4-methylbenzyl)guanine (3) 及び O6-(3,5-dimethylbenzyl)guanine (4)を下記Liuらの文献の方法に準じて対応するアルコール類と2-amino-6-chloropurineとの反応によって合成し、MGMTの阻害活性を調べた。
X. Liu, Q.-H. Zheng, G. D. Hutchins, X. Fei, L. C. Erickson, K. D. Miller, B. H. Mock, B. E. Glick-Wilsob, W. L. Winkel, K. L. Stone, K. A. Carlson, Synth. Commun. 2003, 33, 941-952.
【００２１】
O6-(3-methylbenzyl)guanine (2), O6-(4-methylbenzyl)guanine (3) 及び O6-(3,5-dimethylbenzyl)guanine (4)のMGMTに対する酵素阻害活性は、定量化のために、MGMTに特有のDNA障害を有する蛍光定量的にラベルをつけられたオリゴヌクレオチド基質を使って調べられた。その結果、これら３つの化合物は、いずれもO6-ベンジルグアニン(1)に類似したMGMT阻害効果を有し、特にO6-(3-methylbenzyl)guanine (2)及びO6-(4-methylbenzyl)guanine (3)はO6-BG(1)よりも若干阻害活性が高いことが分かった（図１参照）。この結果を踏まえ、発明者らはO6-(3-methylbenzyl)guanine (2)を[11C]による標識化のターゲットとした。
【００２２】
具体的には、我々が既に開発したPd0触媒を用いた[11C]CH3Iとヘテロ芳香環有機スズ化合物とのsp3-sp2(ヘテロ芳香環)型クロスカップリング反応を利用することにした（特許文献１）。反応条件としては、Pd0錯体に対するかさ高いホスフィンリガンドの過剰量使用の効果、非プロトン性極性溶媒の使用の効果、及び、酸性プロトンによる脱スズ反応の進行を防止のための銅イオン及び塩基の添加効果を考慮し、 [Pd2(dba)3]/P(o-CH3C6H4)3/CuCl/K2CO3/NMP溶媒という条件で反応を行った。しかしながら、目的とする11C標識O6-ベンジルグアニンはほとんど得られなかった（図２のルート１及び図３参照）。そこで，グアニン構造に含まれるアミノ基を無水トリフルオロ酢酸によりトリフルオロ基で保護し、反応後に脱保護反応を行うという２段階の合成法を試みた。すると、保護基の導入はO6-ベンジルグアニンの2位アミノ基にのみに起こり、有機スズ化合物6が得られた。この化合物を同様の条件で[11C]CH3化し、水酸化リチウムで脱保護したところ、11Cで標識化されたO6-(3-methylbenzyl)guanine (2)が72%HPLC分析収率で得られた(図２のルート２及び図４参照)。
さらに、O6-ベンジルグアニンの2位アミノ基がTFA基で保護され、9位のアミノ基がtert-ブトキシカルボニル（BOC）基で保護された有機スズ化合物7を調製し、強塩基で脱保護したところ、目的の化合物である[11C]で標識化されたO6-(3-methylbenzyl)guanine (2)が97±1%という高いHPLC分析収率で得られた（図６参照）。この場合における合成及び精製にかかる総時間は47分で，総放射能1.34 GBq, 比放射能95-99 GBq/μmol，崩壊補正収率19%，化学的純度99%以上，放射化学的純度99%以上となり、PETプローブとして充分使用可能であることが分かった。
以下に、本発明の実施例について詳細に説明する。
【００２３】
（実施例において用いられた分析装置および条件）
1H, 13C, 19F NMR は日本電子株式会社製ECS 400によって測定した。化学シフトはTMSを基準とした場合これを0.00ppmとし、CHCl3を基準とした場合これを1H NMRでは7.26、13C NMRでは77.0とし、CF3COOH を基準とした場合19F NMRでは-76.55ppmとした。また、略号s, d, t, q及びmはそれぞれsinglet, doublet, triplet, quartet, 及びmultipletを示す。高解像度質量分析（HRMS）は、PE Biosystems、Mariner systemまたはJEOL JMS-700/GIを使用した。［11C］メチル化反応は、すべて鉛で遮蔽されたドラフト内において遠隔操作で行われた。 CYPRIS HM-18サイクロトロン（住友重工業製）を用いて14N（p、α）11C核反応によって［11C］CO2を製造した。反応混合物の加熱、希釈、HPLCへの試料注入、フラクションの採取、濃縮は放射性薬剤自動合成装置によって行い、11C標識化合物を得た。放射能は、ATOMLABTM500 dose calibrator（Biodex Medical Systems, Inc.）で定量した。合成した［11C］メチル化化合物は、bias supply 925-SCINT (AMETEK Co., Ltd.)と、linear count rate meter 7131-1 (Ohyo Koken Kogyo Co., Ltd.)を組み合わせた島津HPLC systemによって分析した。島津HPLC systemはsystem controller (SPD-10Avp), online degasser (DGU-12A), solvent delivery unit (LC-10ATvp), column oven (CTO-10A), photodiode array detector (SCL-10Avp)及びsoftware (LC-solution)から構成されている。
【００２４】
O6-[3-(tributylstannyl)benzyloxy]guanine (5)の合成
【化５】
0006754923.tif 000006
【００２５】
3-(Tributylstannyl)benzyl alcohol (8.5 g, 21 mmol)を30 mLの丸底フラスコに入れて130℃に加熱した。そして、窒素気流下、ナトリウム(197 mg, 8.6 mmol)を加えた。ナトリウムがすべて溶解したのを確認した後、温度を115℃まで低下させ、アルゴン気流下2-amino-6-chloropurine (8, 1.2 g, 7.1 mmol)を添加した。そして、混合物は同じ温度で一晩撹拌された。得られた溶液を室温まで冷却し、溶解しなかった固体をろ過して取り除き、ろ液を減圧濃縮して得られた物質を9:1のジクロロメタン：メタノール＝9：1の混合液を溶出液としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、化合物51.15g（2.17mmol、30.4%）を淡黄色の固体として得た。
δH(400 MHz; CDCl3) 0.86 (9H, t, J = 7.4 Hz, CH3), 0.95-1.11 (6H, m, CH2), 1.26-1.35 (6H, m, CH2), 1.48-1.56 (6H, m, CH2), 5.02 (2H, s, NH2), 5.54 (2H, s, CH2), 7.28-7.64 (4H, m, Ph), 7.70 (1H, s, NCH), 11.4-12.3 (1H, brs, NH); δC (100 MHz; CDCl3) 9.6 (3C), 13.7 (3C), 27.4 (3C), 29.1 (3C), 68.7, 128.0, 128.3, 128.7, 135.5, 136.4, 136.5, 142.3, 159.2).
【００２６】
Synthesis of O6-[3-(tributylstannyl)benzyloxy]-N2-(trifluoroacetyl)guanine (6) の合成
【化６】
0006754923.tif 000007
【００２７】
トリエチルアミン (53 μL, 37 mg, 0.38 mmol) を化合物5 (192 mg, 0.363 mmol)の乾燥ジクロロメタン (5 mL)溶液に加え、混合物を0℃に冷却した後、無水トリフルオロ酢酸(53 μL, 80 mg, 0.38 mmol) を加え、混合物を２時間撹拌した。反応混合物液を10mlの水の中に注ぎ、ジクロロメタン10mlで３回抽出した後、有機層を一緒にして水15ml及び塩水15mlで洗浄し、無水硫酸ナトリウムを投入して脱水した。そして、ろ過後、濃縮を行った。こうして得られた粗生成をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル(50g), ジクロロメタン／メタノール= 20:1）によって精製し、無色固体の化合物6 (125 mg, 0.201 mmol, 55.3 %)を得た。
δH (400 MHz; CDCl3) 0.87 (9H, t, J = 7.4 Hz, CH3), 0.97-1.11 (6H, m, CH2), 1.25-1.34 (6H, m, CH2), 1.48-1.56 (6H, m, CH2), 5.66 (2H, s, CH2), 7.33-7.56 (4H, m, Ph), 8.33 (1H, s, NCH), 8.62 (1H, s, NHCOCF3), 12.7 (1H, s, NH);
δC (100 MHz; CDCl3) 9.5 (3C), 13.6 (3C), 27.3 (3C), 27.9 (3C), 29.0 (3C), 70.1, 87.6, 120.1, 128.0, 128.9, 134.5, 136.7, 137.0, 141.0, 142.5, 145.8, 151.3, 152.0, 153.5 (q, 1J(13C-19F) = 38.3 Hz), Ph 161.4, 153.171.1; δF (MHz; CDCl3) -76.80 (s, CF3).
【００２８】
Synthesis of N9-(tert-butoxycarbonyl)-O6-(3-bromobenzyl)guanine (11)の合成
【化７】
0006754923.tif 000008
【００２９】
アルゴン気流下0 °Cでカリウムtert−ブトキシド(496 mg, 4.42 mmol) エタノール(5 mL)溶液にO6-(3-Bromobenzyl)guanine (10, 1.41 g, 4.42 mmol)を加えた。30分後、減圧下でエタノールを除いた。残渣をDMF (5 mL)に溶解し0℃とし、(Boc)2O (978 μL, 964 mg, 4.42 mmol) のDMF (2 mL)溶液を加えた。混合物を一晩室温で撹拌し、水を加えて反応を停止させ、酢酸エチルで抽出した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル(50g), ジクロロメタン／メタノール= 20:1）によって精製し、淡黄色固体の化合物11 (125 mg, 0.201 mmol, 55.3 %)を得た。
δH (400 MHz; CDCl3) 1.67 (9H, s, CH3), 5.16 (2H, s, NH2), 5.51 (2H, s, CH2), 7.23 (1H, t, J = 8.8 Hz, Ph), 7.41 (1H, d, J = 8.8 Hz, Ph), 7.47 (1H, d, J = 8.8 Hz, Ph), 7.64 (1H, s, Ph), 8.01 (1H, s, NCH);δC (100 MHz; CDCl3) 28.0 (3C), 67.2, 86.3, 115.9, 122.5, 130.0, 131.2 (2C), 137.8, 138.4, 146.1, 153.9, 160.5, 161.0.
【００３０】
N9-(tert-butoxycarbonyl)-O6-[3-(tributylstannyl)benzyl]guanine (12)の合成
【化８】
0006754923.tif 000009
【００３１】
乾燥させた50-mLのシュレンク管に化合物11 (576 mg, 1.36 mmol)、ヘキサブチルジスタンナン(2.0 mL, 2.4 g, 4.1 mmol)、,tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0) (157 mg, 0.136 mmol)を添加してアルゴン雰囲気とし、新たに蒸留した1,4-ジオキサン(10 mL)を加えた。その混合物を80℃に加熱し、一晩撹拌した後、室温まで冷却し、反応液をセライトに通すことによってパラジウム成分を除去した。ろ液を真空の下で濃縮し、残渣をヘキサン：酢酸エチル＝3:1の溶出液を用いてシリカゲル・カラムクロマトグラフィーによって精製し、淡黄色の固体として化合物12を629mg（収率73%）で得た。
δH (400 MHz; CDCl3) 0.87 (9H, t, J = 7.4 Hz, CH3), 0.98-1.11 (6H, m, CH2), 1.27-1.36 (6H, m, CH2), 1.49-1.57 (6H, m, CH2), 1.66 (9H, s, CH3), 5.14 (2H, s, NH2), 5.55 (2H, s, CH2), 7.32 (1H, t, J = 7.3 Hz, Ph), 7.41 (1H, d, J = 7.3 Hz, Ph), 7.45 (1H, d, J = 7.3 Hz, Ph), 7.54 (1H, s, Ph), 8.00 (1H, s, NCH); 
δC (100 MHz; CDCl3) 9.6 (3C), 13.6 (3C), 27.3 (3C), 28.0 (3C), 29.0 (3C), 68.7, 86.2, 116.0, 127.9, 128.4, 135.3, 136.3, 136.6, 137.5, 142.2, 146.2, 153.8, 160.5, 161.4.
【００３２】
N9-(tert-butoxycarbonyl)-O6-[3-(tributylstannyl)benzyl]-N2-(trifluoroacetyl)guanine (7)の合成
【化９】
0006754923.tif 000010
【００３３】
化合物12(629 mg, 0.998 mmol)の乾燥ジクロロメタン(5 mL)溶液にトリメチルアミン(153 μL, 101 mg, 962 μmol)を加え、混合溶液を0℃に冷却した後、無水トリフルオロ酢酸 (153 μL, 231 mg, 1.10 mmol)を加え、2時間撹拌した。反応溶液を約10mlの水の中に注ぎ、ジクロロメタンで抽出（15ml×3）した。有機層を一緒にし、水 (15 mL) 及び塩水 (15 mL)で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。そして、溶液をろ過し、濃縮して得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル(5 g), ヘキサン/アセトン= 3:1）で精製し、無色固体として化合物7 (330 mg, 0.454 mmol, 45.5 %)を得た。
δH (400 MHz; CDCl3) 0.87 (9H, t, J = 7.4 Hz, CH3), 0.98-1.11 (6H, m, CH2), 1.26-1.34 (6H, m, CH2), 1.48-1.54 (6H, m, CH2), 1.71 (9H, s, CH3), 5.69 (2H, s, CH2), 7.33 (1H, t, J = 7.3 Hz, Ph), 7.43 (1H, d, J = 7.3 Hz, Ph), 7.53 (1H, d, J = 7.3 Hz, Ph), 7.63 (1H, s, Ph), 8.31 (1H, s, NCH), 8.61 (1H, s, NH); δC (100 MHz; CDCl3) 9.5 (3C), 13.6 (3C), 27.3 (3C), 27.9 (3C), 29.0 (3C), 70.1, 87.6, 120.1, 128.0, 128.9, 134.5, 136.7, 137.0, 141.0, 142.5, 145.8, 151.3, 152.0, 153.5 (q, 1J(13C-19F) = 38.3 Hz), Ph 161.4, 153.171.1; δF (MHz; CDCl3) -76.75 (s, CF3).
HRMS (ESI) m/z：
[M + H]+ calcd for C31H45F3N5O4 120Sn 728.2446; found 728.2464
[M + Na]+ calcd for C31H45F3N5O4 120Sn 750.2265; found 750.2267
【００３４】
O6-(3-methylbenzyl)-guanine (2)の合成
【化１０】
0006754923.tif 000011
【００３５】
乾燥されたアルゴンガスが満たされた1mLのシュレンク管に[Pd2(dba)3] (1.0 mg, 1.1 μmol)、P(o-tolyl)3 (5.4 mg, 18 μmol)、CuCl (0.4 mg, 4 μmol)、及びK2CO3 (0.8 mg, 5 μmol)を入れた。有機スズ化合物7 (8.7 mg, 12 μmol) の NMP (300 μL)溶液をステンレス製のカニューレを通して−10℃に冷却したシュレンク管に導入した。さらに、ヨウ化メチル溶液 (12 μL, 0.10 M in DMF, 1.2 μmol)を加えた後、混合物を80℃で4分間反応させた。そして、1.0 M LiOH 水溶液 (600 μL) を加え、80℃で3分間撹拌した後、反応液を素早く氷浴で冷却した。こうして得られた混合物をシリカゲル（1g）のショートカラムに導入し、アセトニトリル (2 mL)で溶出し、ナフタレン溶液 (0.10 M DMF , 10 μL, 1.0 μmol)を内部標準として加えた。こうして得られた溶液をHPLCで分析した (移動相, acetonitrile/20 mM sodium dihydrogenphosphate = 40:60; column, CAPCELL PAK C18 MG 5μm, 4.6 (i.d.)×250 mm flow rate 1 mL/min UV 検知 280 nm 保持時間 3.4 min)。その結果、化合物2の収率は100%であった。また、化合物2の同定は、有機スズ化合物7 (8.7 mg, 12 μmol)、ヨウ化メチル (120 μL, 0.10 M in DMF, 12 μmol)を用い、[Pd2(dba)3]/P(o-CH3C6H4)3/CuCl/K2CO3 (1:16:2:5 モル比)、80℃で1時間反応させて得られた化合物2について1H NMRによって行った。
1H NMR (DMSO-d6) δ= 2.32 (s, 3H, CH3), 5.44 (s, 2H, CH2), 6.26 (s, 2H, NH2), 7.16-7.29 (m, 4H, Ar), 7.82 (s, 1H, guanine H8), 12.51 (broad s, 1H, guanine H9).
【００３６】
K2CO3を塩基として用いた場合のO6-(3-[11C]methylbenzyl)guanine ([11C](2))の合成 
[Pd2(dba)3] (1.0 mg, 1.1 μmol)、P(o-tolyl)3 (3.4 mg, 11 μmol)、 CuCl (0.4 mg, 4 μmol)、K2CO3 (1.4 mg, 11 μmol)に有機スズ化合物7 (0.8 mg, 1.1 μmol)を溶解したNMP (300 μL)溶液を加えた混合物は、[11C]CH3Iが準備されるまで−10℃以下を保つよう冷却した。[11C]CH3Iは従来から知られているLiAlH4法によって[11C]CO2から調製し、冷却をとめた状態で[11C]CH3I ガスはパラジウムを含む反応溶液中に導入され、100℃まで急速に加熱された後、2分後に2分間窒素ガスによる反応溶液のバブリングを行った。バブリングを止め、反応溶液を10秒間冷却したのち、0.5 M LiOH (600 μL)を混合物に加え、100℃で3分間の窒素によるバブリングを行った。そして、アスコルビン酸ナトリウム(2.2 mg, 11 μmol)を含むCH3CN/H2O (35:65 v/v, 600 μL)溶液で希釈し、石英ガラスウール(Tosho co., ltd.)を詰めたfine filter F (F162, Forte Grow Medical co., ltd.) に通し、HPLC (移動相, CH3CN/20 mM sodium phosphate (pH 4.9) 5:95 and 35:65 column, CAPCELL PAK C18 MG120 20(i.d.)×250mm flow rate 10ｍl/min UV検知280 nm 保持時間21 min)によって分取した。radio-HPLCにおけるピーク面積から、HPLC 分析収率は97 ± 1% (n = 3)であった（図６参照）。目的生成物を含有するフラクションをフラスコに入れ、有機溶媒を減圧下で除去した。その残渣を、ポリソルベートを0.25％溶解した生理食塩水(3.0 mL)に溶解し、静脈内投与のための製剤を調整した。照射終了から分取HPLCによる精製を含む注射液の調整までの全合成時間は合計で47分であった。合成終了後の放射能は1.76 ± 0.42 GBq (n = 2) であり、比放射能は95-99 GBq/μmol (n = 2)であった。トラップされた[11C]CH3Iを基に計算された崩壊補正収率は20 ± 1% (n = 2)であった。11C標識化合物2 は、標識されていない化合物2のHPLCにおける同時注入によって確かめられた（移動相, CH3CN and 20 mM sodium phosphate = 40:60, CAPCELL PAK C 120, 20 (i.d.)×250mm flow rate 1 ml/min UV検知 280 nm 保持時間 6.1 min）。280 nmの波長で測定された化学純度は>92%であり、放射化学純度は>97%であった。より高い放射能による製剤は、低い放射化学純度を持っている傾向があった。
【００３７】
アスコルビン酸ナトリウムを塩基として用いた場合のO6-(3-[11C]methylbenzyl)guanine ([11C](2)) の合成
[Pd2(dba)3] (1.0 mg, 1.1 μmol)、 P(o-tolyl)3 (3.4 mg, 11 μmol)、 CuCl (0.4 mg, 4 μmol)、及びアスコルビン酸ナトリウム(2.2 mg, 11 μmol)に有機スズ化合物7 (1.1-1.5 mg, 1.5-2.1 μmol)のNMP (300 μL)溶液を加えた混合物は[11C]CH3Iが準備されるまで−10℃以下を保つよう冷却された。[11C]CH3I ガスは反応溶液中に導入され、100℃まで急速に加熱された後、2分間後に2分間窒素ガスによるバブリングを行った。バブリングを止め、反応溶液を10秒間冷却した。その後、0.5 M LiOH (600 μL)を混合物に加え、100℃で3分間の窒素によるバブリングを行った。そして、アスコルビン酸ナトリウム(2.2 mg, 11 μmol)を含むCH3CN/H2O (35:65 v/v, 600 μL)溶液で希釈し、石英ガラスウール(Tosho co., ltd.)を詰めたfine filter F (F162, Forte Grow Medical co., ltd.) に通し、分取HPLC (移動相, CH3CN/20 mM sodium phosphate (pH 4.9) 5:95 and 35:65; column, CAPCELL PAK C18 MG 120, 20（i.d.）×250ｍｍ flow rate 10mL/min UV検知280 nm 保持時間 21 min)によって分取した。radio-HPLCにおけるピーク面積から、HPLC 分析収率は86 ± 9% (n = 3) であった（図５参照）目的生成物を含有するフラクションを一緒にしてフラスコに入れ、有機溶媒を減圧下で除去した。その残渣を、ポリソルベートを0.25％溶解した生理食塩水(3.0 mL)に溶解し静脈内投与のための製剤を調整した。照射終了から分取HPLCによる精製を含む製剤の調製までの全体の合成時間は合計で48〜51分であった。合成終了後の放射能は0.92 ± 0.32 GBq (n = 3)であり、比放射能は74〜76 GBq/μmol (n = 3).であった。トラップされた[11C]CH3Iを基に計算された崩壊補正収率は15 ± 8% (n = 3)であった。[11C]標識化合物2 は、標識されていない化合物2のHPLCにおける同時注入によって確かめられた（移動相, CH3CN and 20 mM sodium phosphate = 40:60, CAPCELL PAK C120, 20 (i.d.)×250mm flow rate 1 ml/min UV検知 280 nm 保持時間 6.1 min）。280 nmの波長で測定された化学純度は>97%であり、放射化学純度は>93%であった。 
【００３８】
上記実施例の11C標識O6-ベンジルグアニンでは、ベンゼン環のメタ位に11Cで標識化されたメチル基を結合させたが、原料となる有機スズ化合物における有機スズ置換基の結合位置を替えることによって、ベンゼン環のオルト位やパラ位に11Cで標識化されたメチル基を結合させることもできる。
【００３９】
＜ラットを用いた体内動態試験＞
前述の方法により合成した11Ｃで標識されていない（すなわちcoldの）O6-(3-methylbenzyl)guanine (2)及び O6-(4-methylbenzyl)guanine (3)について、以下の方法により脳透過性を評価した。
Sprague-Dawley ラットにO6-(3-methylbenzyl)guanine (2)又は O6-(4-methylbenzyl)guanine (3)を静脈投与（i.v.）（10mg/kg）し、所定時間後に血液採取及び脳組織の採取を行い、HPLCによる分析を行った。結果を表１及び図１〜３に示す。
【００４０】
【表１】
0006754923.tif 000012
【００４１】
化合物（2）（または化合物（3））を投与後30分に脳組織と血液の試料を採取した結果を表１に示す。表１の脳重量及び脳内の濃度から脳内の化合物量を算出し、脳内の化合物量と投与量との割合から、化合物（2）及び化合物（3）の脳内化合物濃度は、全投与量に対して0.1%と算出された。また、血漿中の濃度に対する比率は0.3であった。以上の結果から、化合物（2）及び化合物（3）は血液脳関門透過性をもつ物質であること評価された。
【００４２】
また、化合物（2）及び化合物（3）は血漿内で安定に存在するが、ラットへのi.v投与の後において、化合物（3）は、図７及び図９に示すように、240分以内に未知の、より極性の高い化合物へ速やかに代謝されるのに対し、化合物（2）は、図８に示すように、化合物（3）に比べて安定であり、長期間存在することが分かった。
【００４３】
以上の体内動態試験により、O6-(3-methylbenzyl)guanine (2)及び O6-(4-methylbenzyl)guanine (3)は、血液脳関門透過性をもつ物質であり、脳内に蓄積されることが明らかとなった。これらの化合物は脳内のMGMTと結合する性質を有することから、これらの化合物を11Cで標識化した本発明のO6-ベンジルグアニンはPETプローブとして有用であり、脳内のMGMTのイメージングが可能となることが分かった。
【００４４】
この発明は上記発明の実施の態様及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明はPET装置を用いたMGMTのイメージングに利用することができるため、MGMTの生体内動態の研究や、脳腫瘍におけるがん診断等に利用することができる。
【図１】
0006754923.tif 000015
【図２】
0006754923.tif 000016
【図３】
0006754923.tif 000017
【図４】
0006754923.tif 000018
【図５】
0006754923.tif 000019
【図６】
0006754923.tif 000020
【図７】
0006754923.tif 000021
【図８】
0006754923.tif 000022
【図９】
0006754923.tif 000023