(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
C型肝炎ウイルス(HCV)感染患者由来の血清サンプルにおいて、抗DHCR24(3β-hydroxysterol-Δ24 reductase)自己抗体濃度を測定する工程を含む、慢性肝炎、肝硬変及び肝癌から成る群より選択されるHCV感染関連疾患の検査方法であって、
抗DHCR24自己抗体濃度が8.69μg/mL以上13.82μg/mL未満であることが、前記患者が慢性肝炎を患うことを示し、
抗DHCR24自己抗体濃度が13.82μg/mL以上16.46μg/mL未満であることが、前記患者が肝硬変を患うことを示し、及び/又は、
抗DHCR24自己抗体濃度が16.46μg/mL以上であることが、前記患者が肝癌を患うことを示す、
前記方法。
【請求項２】
前記HCV感染患者由来の血清サンプルにおいて、AFP(alpha-fetoprotein)及び/又はPIVKA-II (protein induced by vitamin K absence or antagonist-II)濃度を測定する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
AFP濃度が20ng/mL以上であること、及び/又は、PIVKA-II濃度が40mIU/mL以上であることが、前記患者が肝癌を患うことを示す、請求項２記載の方法。
【請求項４】
抗DHCR24自己抗体を含む、慢性肝炎、肝硬変及び肝癌から成る群より選択されるHCV感染関連疾患診断バイオマーカーであって、
HCV感染患者由来の血清サンプルにおいて、
抗DHCR24自己抗体濃度が8.69μg/mL以上13.82μg/mL未満である場合、前記患者が慢性肝炎を患うと判定し、
抗DHCR24自己抗体濃度が13.82μg/mL以上16.46μg/mL未満である場合、前記患者が肝硬変を患うと判定し、及び/又は、
抗DHCR24自己抗体濃度が16.46μg/mL以上である場合、前記患者が肝癌を患うと判定するための、
前記バイオマーカー。
【請求項５】
AFP及び/又はPIVKA-IIをさらに含む、請求項４記載のバイオマーカー。
【請求項６】
前記患者由来の血清サンプルにおいて、
AFP濃度が20ng/mL以上である場合、及び/又は、PIVKA-II濃度が40mIU/mL以上である場合、前記患者が肝癌を患うと判定するための、
請求項５記載のバイオマーカー。
【請求項７】
DHCR24タンパク質又はその抗原性断片を含む、慢性肝炎、肝硬変及び肝癌から成る群より選択されるHCV感染関連疾患診断キットであって、
HCV感染患者由来の血清サンプルにおいて、
抗DHCR24自己抗体濃度が8.69μg/mL以上13.82μg/mL未満である場合、前記患者が慢性肝炎を患うと判定し、
抗DHCR24自己抗体濃度が13.82μg/mL以上16.46μg/mL未満である場合、前記患者が肝硬変を患うと判定し、及び/又は、
抗DHCR24自己抗体濃度が16.46μg/mL以上である場合、前記患者が肝癌を患うと判定するための、
前記キット。
【請求項８】
抗AFP抗体若しくはその断片及び/又は抗PIVKA-II抗体若しくはその断片をさらに含む、請求項７記載のキット。
【請求項９】
前記患者由来の血清サンプルにおいて、
AFP濃度が20ng/mL以上である場合、及び/又は、PIVKA-II濃度が40mIU/mL以上である場合、前記患者が肝癌を患うと判定するための、
請求項８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばC型肝炎ウイルス(HCV)感染関連疾患診断バイオマーカー、及び当該バイオマーカーを使用してHCV感染関連疾患を検査する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本では、肝癌患者の約8割がHCV陽性者である。C型肝炎は、慢性肝炎、肝硬変、肝癌と進行するが、従来においてこのような病態の診断を可能にする測定系は構築されておらず、HCV感染から肝癌までのHCV感染関連疾患を高感度に診断できる方法が望まれている。
【０００３】
HCVは、フラビウイルス科へパチウイルス属に分類されるプラス1本鎖RNAウイルスであり、ゲノムに組み込まれる事なく細胞質で主に複製するが、高率な肝癌発症の機構は未だ不明な点が多い。
【０００４】
一方、C型の肝癌(肝細胞癌：HCC)発症がHCV持続感染成立後、慢性肝炎(CH)、肝硬変(LC)を経て発症する事がほとんどである事から、本発明者等はHCVが肝臓細胞に持続的に存在する事が腫瘍原性の上昇と関連すると考え、HCVスイッチング発現細胞を樹立した。HCVを発現後、細胞を長期継代すると、cdk-Rb-E2F経路が活性化され、コロニー形成能やヌードマウス腫瘍形成能が亢進する事が明らかとなった(非特許文献１)。さらに、HCV持続発現細胞に対する単クローン抗体を樹立して解析した結果、本細胞や肝癌細胞で発現が上昇する分子DHCR24(3β-hydroxysterol-Δ24 reductase)を認識するクローンが得られた。DHCR24は、アセチルCoAからコレステロールを合成する経路の最終段階で作用する還元酵素である。
【０００５】
また、本発明者等は、上記とは別にp53やMDM2に対する結合領域を持ち、HCV複製により誘導される酸化ストレスがDHCR24の発現を上昇させ、p53とMDM2の細胞質での結合を亢進させ、p53の核移行が抑制され、p53活性化が阻害される事を明らかにした(非特許文献２及び３)。その結果、肝臓細胞は酸化ストレス誘導性アポトーシスに耐性となり腫瘍原性が亢進することを明らかにした(非特許文献２)。
【０００６】
さらに、本発明者等は、DHCR24はHCVの複製にも必要である事を明らかとしたが(非特許文献４)、一方で、DHCR24は病態進行に伴い肝癌細胞表面に表出するようになることを示した(非特許文献５)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tsukiyama-Kohara K.ら, J. Biol. Chem., 2004年, Vol. 279, No. 15, pp. 14531-14541
【非特許文献２】Nishimura T.ら, J. Biol. Chem., 2009年, Vol. 284, No. 52, pp. 36442-36452
【非特許文献３】Saito M.ら, J. Med. Virol., 2012年, Vol. 84, No. 5, pp. 733-746
【非特許文献４】Takano T.ら, J. Hepatol., 2011年, Vol. 55, No. 3, pp. 512-521
【非特許文献５】Satoh M.ら, J. Infect. Dis., 2011年, Vol. 204, No. 8, pp. 1172-1180
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述した実情に鑑み、HCV感染関連疾患を高感度に診断するためのバイオマーカー、及び当該バイオマーカーを用いたHCV感染関連疾患の検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、正常肝臓細胞に比べ、HCV感染細胞や肝癌細胞でのDHCR24発現レベルが上昇し、DHCR24は肝細胞表面へ局在が変化することから、DHCR24に対する自己抗体産生の可能性を検証したところ、HCV陽性の慢性肝炎(CH)、肝硬変(LC)及び肝癌(HCC)患者の血清中の抗DHCR24抗体価を測定した結果、抗DHCR24抗体価が病態進行に伴って上昇し、DHCR24に対する自己抗体をHCV感染関連疾患のバイオマーカーとして使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）HCV感染患者由来の血清サンプルにおいて、抗DHCR24自己抗体濃度を測定する工程を含む、慢性肝炎、肝硬変及び肝癌から成る群より選択されるHCV感染関連疾患の検査方法。
（２）抗DHCR24自己抗体濃度が8.69μg/mL以上である場合、前記患者が慢性肝炎を患うと判定し、抗DHCR24自己抗体濃度が13.82μg/mL以上である場合、前記患者が肝硬変を患うと判定し、及び/又は、抗DHCR24自己抗体濃度が16.46μg/mL以上である場合、前記患者が肝癌を患うと判定する、（１）記載の方法。
（３）HCV感染患者由来の血清サンプルにおいて、AFP(alpha-fetoprotein)及び/又はPIVKA-II(protein induced by vitamin K absence or antagonist-II)濃度を測定する工程をさらに含む、（１）又は（２）記載の方法。
（４）AFP濃度が20ng/mL以上である場合、及び/又は、PIVKA-II濃度が40mIU/mL以上である場合、前記患者が肝癌を患うと判定する、（３）記載の方法。
（５）抗DHCR24自己抗体を含む、慢性肝炎、肝硬変及び肝癌から成る群より選択されるHCV感染関連疾患診断バイオマーカー。
（６）AFP及び/又はPIVKA-IIをさらに含む、（５）記載のHCV感染関連疾患診断バイオマーカー。
（７）DHCR24タンパク質又はその抗原性断片を含む、慢性肝炎、肝硬変及び肝癌から成る群より選択されるHCV感染関連疾患診断キット。
（８）抗AFP抗体若しくはその断片及び/又は抗PIVKA-II抗体若しくはその断片をさらに含む、（７）記載のHCV感染関連疾患診断キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、高感度にHCV感染関連疾患を検査することができる。また、本発明によれば、HCV感染関連疾患の診断に有用なバイオマーカーが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】抗DHCR24抗体(DHCR24 Ab)の標準濃度曲線(OD450)を示す図である。Ａ：HuH-7細胞におけるDHCR24発現の蛍光活性化細胞選別(FACS)分析；DHCR24は、HuH-7細胞表面上に発現し、分泌されない。Ｂ：抗DHCR24モノクローナルAb(MoAb) 2-152aカラムを用いたDHCR24タンパク質の精製手順。Ｃ：ウエスタンブロッティングによるHuH-7細胞から精製したDHCR24タンパク質の特性評価(矢印)；左側レーンは分子量マーカーを含む。Ｄ：HuH-7細胞由来の精製DHCR24抗原とMoAb 2-152aとの反応性。
【図２】慢性肝炎、肝硬変、及び肝癌(肝細胞癌)を有するHCV感染患者並びに健康な対照者における血清DHCR24 Ab相対濃度を示す図である。Ａ：東京都立駒込病院、Ｂ：昭和大学藤が丘病院、及びＣ：金沢大学附属病院におけるC型肝炎及び健康な対照者におけるDHCR24 Abの血清レベル。Ｄ：全ての病院におけるC型肝炎患者及び健康な対照者におけるDHCR24 Abの血清レベルのプロット。黒い水平線は平均値であり、誤差バーは標準偏差である。CHC, 慢性HCV感染； LCC, HCV感染を伴う肝硬変；HCC-C, HCV感染を伴う肝癌(肝細胞癌)。
【図３Ａ】HCC-CとCHCとの間の区別における血清マーカーの性能を予測するための受信者動作特性曲線を示す図である。Ａ：DHCR24 Ab、alpha-fetoprotein(AFP)及びprotein induced by vitamin K absence or antagonist-II(PIVKA-II)レベルの診断性能を示す受信者動作特性曲線。Ｂ：HCC-Cを有する患者におけるPIVKA-II、AFP及びDHCR24 Abの組合せについての陽性結果の割合。Ｃ：健康な対照者、CHC、LCC並びに初期及び後期HCC-C患者間のDHCR24 Abの血清レベル。AUC, 曲線下面積; CI, 信頼区間。
【図３Ｂ−Ｃ】図３Ａの続きである。
【図４】慢性肝炎、肝硬変、及び肝癌(肝細胞癌)を有するB型肝炎ウイルス(HBV)感染患者並びに健康な対照者における血清DHCR24 Ab相対濃度を示す図である。Ａ：東京都立駒込病院、Ｂ：昭和大学藤が丘病院、及びＣ：金沢大学附属病院におけるB型肝炎患者及び健康な対照者におけるDHCR24 Abの血清レベル。Ｄ：全ての病院におけるB型肝炎患者及び健康な対照者におけるDHCR24 Abの血清レベルのプロット。黒い水平線は平均値であり、誤差バーは標準偏差である。CHB, 慢性HBV感染； LCB, HBV感染を伴う肝硬変；HCC-B, HBV感染を伴う肝癌(肝細胞癌)。
【図５】DHCR24発現がHCV腫瘍組織においてアップレギュレートされることを示す図である。Ａ：10人のHCC患者の肝臓の癌性及び非癌性領域におけるDHCR24発現を示すウエスタンブロット；5人の患者がHCVに感染しており(HCV+)、5人の患者がHBVに感染しており(HBV+)、且つ5人の患者がHBV及びHCVに感染していなかった(NBNC)。免疫組織化学を用いて得られた、Ｂ：HCV感染癌性組織、Ｃ：HBV感染癌性組織及びＤ：NBNC組織の免疫蛍光及び組織画像。DHCR24タンパク質発現を、2-152aモノクローナルAbを用いて検出した。Topro-3を、核対比染色に使用した。HE, ヘマトキシリン及びエオシン。
【図６】DHCR24 Abレベルと腫瘍進行、生存及び肝動脈化学塞栓術(TACE)との間の関係を示す図である。Ａ：HCC-C患者におけるDHCR24 Abレベルと結節の数との間の関係。Ｂ：DHCR24 Abレベルにより層化されたHCC-C患者の生存。Ｃ：HCC-C患者のTACE前後のDHCR24 Abレベルの変化。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、抗DHCR24(3β-hydroxysterol-Δ24 reductase)自己抗体がC型肝炎ウイルス(HCV)感染関連疾患診断バイオマーカーであるとの知見に基づくものである。具体的には、本発明に係るHCV感染関連疾患(又はHCV感染関連肝疾患)の検査方法(以下、「本方法」と称する)は、HCV感染患者由来の血清サンプルにおいて、抗DHCR24自己抗体濃度を測定する工程を含むものである。測定された抗DHCR24自己抗体の濃度(又は量若しくはレベル)に基づいて、当該HCV感染患者がHCVの持続感染が原因で生じる慢性肝炎、肝硬変及び肝癌から成る群より選択されるHCV感染関連疾患を患うか否かを判定又は評価することができる。本方法によれば、HCV感染関連疾患の進行を高感度に検査でき、その後の治療を早期に行うことができる。なお、本方法は、HCV感染関連疾患の評価又は判定方法、HCV感染関連疾患を検出するためのin vitroにおけるデータ収集方法等ということができる。
【００１４】
本方法では、抗DHCR24自己抗体濃度を測定すべく、HCV感染患者由来の血清サンプル中の抗DHCR24自己抗体とDHCR24タンパク質又はその抗原性断片とが結合するように、当該血清サンプルとDHCR24タンパク質又はその抗原性断片とを接触させる。ここで使用するDHCR24タンパク質は、例えばHuH-7肝細胞癌細胞等のDHCR24発現細胞から単離、精製したものであって良い。また、DHCR24タンパク質の抗原性断片とは、抗DHCR24自己抗体に対して結合能を有するDHCR24タンパク質の断片を意味する。
【００１５】
血清サンプルとDHCR24タンパク質又はその抗原性断片との接触による抗DHCR24自己抗体測定は、例えば酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)等の免疫学的測定方法により行うことができる。例えば、ELISAを使用する場合には、DHCR24タンパク質又はその抗原性断片をプレートのウェルに固定化し、次いで血清サンプルを当該ウェルに加える。さらに、二次抗体として酵素(例えばペルオキシダーゼ)標識抗ヒト抗体を加え、ウェル上でDHCR24タンパク質又はその抗原性断片に結合した抗DHCR24自己抗体と結合させる。次いで、当該酵素の色原性基質を加え、酵素反応による色原性基質からの色素の呈色を分光光度計で吸光度として測定する。
【００１６】
一方で、標準品の抗DHCR24抗体(例えば、マウスポリクローナル抗DHCR24血清)の測定結果から、抗体濃度に対する吸光度の検量線を作成する。当該検量線に基づいて、上述の測定試料の吸光度から血清サンプル中の抗DHCR24自己抗体濃度を決定することができる。
【００１７】
測定した血清サンプル中の抗DHCR24自己抗体濃度に基づいて、各HCV感染関連疾患のカットオフ値に準じて、血清サンプルが由来するHCV感染患者が各疾患を患うか否かを判定することができる。各HCV感染関連疾患のカットオフ値は、以下の通りである：
慢性肝炎：8.69μg/mL以上；
肝硬変：13.82μg/mL以上；
肝癌：16.46μg/mL以上。
【００１９】
さらに、血清中の抗DHCR24自己抗体と、公知の血清中の肝癌診断バイオマーカーであるAFP(alpha-fetoprotein)及び/又はPIVKA-II(protein induced by vitamin K absence or antagonist-II)とを組み合わせることで、さらに高感度に肝癌を評価することができる。肝癌に対する血清AFP濃度のカットオフ値は、20ng/mL以上である。また、肝癌に対する血清PIVKA-II濃度のカットオフ値は、40mIU/mL以上である。血清中のAFP又はPIVKA-II濃度は、例えばこれらタンパク質に対する抗体又はその断片(例えばF(ab)又はF(ab')2フラグメント)を使用して、上述の抗DHCR24自己抗体測定に関するELISA等の免疫学的測定方法に準じて測定することができる。
【００２０】
また、本発明は、例えばELISAにおいて使用するための、上述のDHCR24タンパク質又はその抗原性断片を含む、HCV感染関連疾患診断キットに関する。さらに、当該キットは、抗AFP抗体若しくはその断片及び/又は抗PIVKA-II抗体若しくはその断片を含むことができる。また、当該キットは、検量線作成のための標準品(陽性対照)の抗体又は抗原、キットの取り扱い説明書、HCV感染関連疾患診断のための説明書、容器、試薬等を適宜含むことができる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２２】
〔実施例１〕C型肝炎から肝癌までの進行の新規バイオマーカーとしての抗DHCR24自己抗体(DHCR24 Ab)
１．材料及び方法
１−１．対象
対象は、東京都立駒込病院、昭和大学藤が丘病院及び金沢大学附属病院(日本)で先を見越して登録された。この研究は各病院の倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言に従って行なわれた。全ての患者はインフォームドコンセントを提供した。
【００２３】
冷凍肝臓サンプル(癌性及び非癌性)は、15人の肝癌(肝細胞癌：HCC)患者から得られ、ウエスタンブロットと免疫組織化学に使用された。
【００２４】
更に、2007年9月から2014年11月までに集められた699の血清サンプルが、133人の適度なC型慢性肝炎(CHC)、85人のC型肝硬変(LCC)及び177人のHCC(HCC-C；HCV関連HCC)患者を含む395人のHCV陽性患者；103人の慢性B型肝炎ウイルス(HBV)(CHB)、56人のB型肝硬変(LCB)及び73人のHCC(HCC-B；HBV関連HCC)患者を含む232人のHBV患者;並びに72人の健康な対照者から得られた(表１)。
【００２５】
慢性のHCV感染は、検出可能な血清抗HCV抗体及びHCV RNAとして定義された。肝硬変は、アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)対血小板比率インデックス(APRI)及び線維症-4インデックスによって定義された。APRIは以下のように計算された:(AST[IU/L]/upper normal limit)×100/血小板(109/L)(Wai CT, Greenson JK, Fontana RJ, et al. A simple noninvasive index can predict both significant fibrosis and cirrhosis in patients with chronic hepatitis C. Hepatology 2003; 38: 518-26)。線維症-4インデックスが以下のように計算された：年齢(年)×AST(IU/L)/(血小板[109/L]×[アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT；IU/L)]1/2)(Sterling RK, Lissen E, Clumeck N, et al. Development of a simple noninvasive index to predict significant fibrosis in patients with HIV/HCV coinfection. Hepatology 2006; 43: 1317-25)。HCCは、超音波検査とコンピュータ断層撮影によって診断され、肝生検によって確認され、また肝細胞性の新形成の国際的なコンセンサスグループの病理学の基準に従って初期及び後期HCCに分類した。初期段階のHCCは2〜5cmの間の単一の病変、又は各々3cm以下の3つ以下の病変として定義された。後期段階のHCCは、5cmを超える単一の病変、又は3つを超える病変によって定義された(International Consensus Group for Hepatocellular Neoplasia. Pathologic diagnosis of early hepatocellular carcinoma: a report of the international consensus group for hepatocellular neoplasia. Hepatology 2009; 49: 658-64)。
【００２６】
慢性のHBV感染の診断は、6ヶ月を超えての血中におけるHBV表面抗原の存在、HBVコア抗体及びリアルタイムPCRによるHBV-DNA検出によって確認された。
【００２７】
健康な対照者は、肝疾患の病歴を持っておらず、ウイルス肝炎マーカーが陰性で、正常なALT及びASTレベルであった。表１は、研究患者の主な特性を要約する。
【００２８】
１−２．ウエスタンブロッティング
15個の冷凍の肝臓組織標本を、RIPAバッファー(1％ドデシル硫酸ナトリウム、0.5％ NP40、0.15M NaCl、10mM Tris pH7.4、5mMエチレンジアミン四酢酸[EDTA]及び1mM dithiothreitol)においてタイプ-Aガラス・ホモジナイザー(Wheaton Science Products, Millville, NJ, USA)を使用して、氷上で均質化した。タンパク質を、Immobilon Pポリフッ化ビニリデン膜(Merck Millipore, Jaffrey, NH, USA)に転写した。2時間室温で、TBST(0.1％ Tween 20、20mM Tris-Cl pH7.6及び137mM NaCl)中の5％ Block AceTM粉末(Dainippon Pharmaceutical Co., Osaka, Japan)でブロッキングした後に、膜を、1％ Block Aceを含有するTBSTにおいて1μg/ml一次抗体と共に2時間インキュベートした。
【００２９】
洗浄後、膜を、1％ Block Aceを含有するTBSTにおいて、1：2000西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス抗体(Dako, Glostrup, Denmark)と共にインキュベートした。ウエスタンブロッティングを、一次抗体として抗DHCR24モノクローナル抗体(MoAb) 2-152a(Nishimura T, Kohara M, Izumi K, et al. Hepatitis C virus impairs p53 via persistent overexpression of 3beta-hydroxysterol Delta24-reductase. J Biol Chem 2009; 284: 36442-52)を使用して行った。アクチン(ポリクローナル抗体; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)を正規化に使用した。
【００３０】
１−３．肝臓組織の免疫組織化学
HCC患者からの癌性及び非癌性の肝臓組織の凍結切片を、最適なカッティング温度化合物(Ted Pella Inc., Redding, CA, USA)において調製し、スライドガラス上に置き、解凍し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、またPBS中で、1％パラホルムアルデヒドで10分間固定した。1％ウシ血清アルブミン及び1mM EDTAを含有するPBSと共に1時間ブロッキングした後、スライドをPBSで洗浄し、一次モノクローナルAbs(5μg/ml)と共に4℃で一晩インキュベートした。次に、スライドをPBSで3度洗浄し、1:1000 Alexa 488-結合ヤギ抗マウス免疫グロブリンG(IgG)(Fab')2断片又はAlexa 568-結合ヤギ抗ウサギIgG(Fab')2断片(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)と共に、0.05％ Tween-20を含有するPBSにおいて、30分間インキュベートした。
【００３１】
続いて、スライドを、PBSで3度洗浄し、10μg/ml Topro-3(Molecular Probes)を含有するVector-shield(Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA)を使用して封入処理した。スライドを、従来の蛍光又は共焦点顕微鏡(510 meta; Zeiss, Oberkochen, Germany)を使用して観察した。
【００３２】
１−４．DHCR24タンパク質の精製
DHCR24タンパク質を、HuH-7肝細胞癌細胞ライセートから精製した。HuH-7細胞(1×108細胞)を、1ml溶解バッファーC(1％ Triton X-100、20mM HEPES pH7.5、1mM EDTA、1mM dithiothreitol及び1mM ジイソプロピルフルオロホスフェート)で可溶化し、超音波で処理し、20,400gで30分間遠心分離に供した。上清を、製造業者のプロトコールに従ってHiTrap N-ヒドロキシスクシンイミド活性化高性能カラム(Amersham Bioscience, Amersham, UK)上に固定した500μg DHCR24 MoAb 2-152a IgGと共に4℃で4時間インキュベートした。
【００３３】
樹脂をバッファーCで洗浄し、結合したタンパク質を、0.5M NaClを含有する0.2M炭酸水素ナトリウム(pH8.3)で溶出し、直ちに氷冷1M Tris pH8.5の等しい量で中和した。
【００３４】
１−５．酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)
ELISAを、0.05M炭酸ナトリウムNa2CO3 pH9.0において5μg/mlまで希釈した50μl精製抗原で予めコートされた平底ポリスチレンプレート(Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germanry)において、4℃で一晩行った。次に、プレートを、0.1％ Tween 20を含有するPBSで洗浄し、1〜2時間37℃でブロッキングバッファー(1％ Block Ace/PBS-0.1％ Tween 20)においてインキュベートした。
【００３５】
洗浄後、サンプル(1:100までブロッキングバッファーで希釈)、陽性対照(0.5、1及び2μg/mLに希釈されたマウスポリクローナル抗DHCR24血清)及びブランク(サンプルの無いアッセイ)を加え、プレートを37℃で1〜2時間インキュベートし、その後、洗浄した。
【００３６】
続いて、二次Abs(1:1000;サンプルに対してペルオキシダーゼ結合ポリクローナルウサギ抗ヒトIgG[Dako]、及び陽性対照に対してペルオキシダーゼ結合ポリクローナルウサギ抗マウスIgG[Dako])を添加し、1時間37℃でインキュベートした。
【００３７】
最後に、プレートを、二次Absを除去するために洗浄し、tetramethylbenzidine/H2O2-TMB(Bio-rad, Hercules, CA, USA)を加え、プレートを30分間37℃でインキュベートした。反応を1N H2SO4で止めた。吸光度値を、450nmでプレート分光光度計(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を使用して読み取った。アッセイをブラインドで行い、3人の研究者によって解釈された。さらに、アッセイを全サンプルのおよそ3％で繰り返し、ずれは観察されなかった。
【００３８】
１−６．統計解析
記述データを、適切なように数及び平均±SDとして表した。連続変数の差を、スチューデントt検定、マン-ウィットニーU検定及び一元配置分散分析(ANOVA)を使用して比較した。カテゴリー変数については、カイ二乗検定を使用した。P値は全て両側であり、P<0.05を有意であると考慮した。受信者動作特性曲線下面積(ROCのAUC)及びそれらの95％信頼区間(CIs)を使用して、DHCR24 Abの診断値を評価し、且つAUCが0.5であるという仮説を検定した。さらに、陽性及び陰性の予測値及びそれらの95％信頼区間を算出した。全ての相関関係をスピアマン相関検定で評価した。生存率をカプランマイヤー曲線で評価し、両側ログランク検定で比較した。全ての統計解析を、GraphPad PRISM version 6.0e(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)又はMedCalc statistical softwareを用いて実施した。
【００３９】
２．結果
２−１．ELISAのセットアップ
2007年9月から2014年11月までに699人の参加者を募集した。研究集団の主な臨床及び人口統計的特性を、表１に要約する。
【００４０】
【表１】
0006671578.tif 000002
【００４１】
ELISAを使用して、患者血清中のDHCR24 Abレベルをスクリーニングした。大腸菌において発現された組換えDHCR24が適切な反応性を示さなかったので、ELISAのための抗原をHuH-7細胞から精製した(図１)。DHCR24 Abレベルの相対濃度を、標準としてマウス抗DHCR24抗体を使用して決定した。DHCR24 Ab濃度と光学密度との間の用量応答関係は非常に良く(範囲, 0〜2μg/mL)、また検出可能な最低濃度は0.05μg/mLであった。
【００４２】
２−２．HCV感染患者におけるDHCR24 Abレベル
全ての病院において、DHCR24 Abの相対濃度は、健康な被験者と比較して、CHC患者において有意に高かった(P<0.0001)が、HCC-C患者と比較して有意に低かった(P<0.0001)(図２Ａ−Ｃ)。全体的には、DHCR24 Abレベルは、CHC(8.69±0.25μg/mL, P<0.0001)及びLCC(13.82±0.81μg/mL, P=0.0418)患者並びに健康な対照者(5.08±0.33μg/mL, P<0.0001)と比較してHCC-C患者(平均: 16.46±0.63μg/mL)において有意に高かった(図２Ｄ)。One-way ANOVAは、HCC-C患者とLCC患者とCHC患者との間の有意な差異を明らかにした(P<0.0001)。
【００４３】
ROC曲線をプロットして、HCV慢性キャリアからHCCを区別するために最適なカットオフ値を同定した(図３Ａ)。HCC-Cの診断のための血清DHCR24 Abの感度及び特異性は、それぞれ70.06％(95％CI:62.73-76.70％)及び84.21％(95％CI:76.88-89.95％)であった(カットオフ, 11.5μg/mL)。AFP(alpha-fetoprotein)のための対応値は、それぞれ53.49％(95％CI:45.74-61.12％)及び97.66％(95％CI:93.30-99.51％)であった(カットオフ, 20ng/mL)。また、PIVKA-II(Protein Induced by Vitamin K Absence or Antagonist-II)の感度及び特異性は、それぞれ42.51％(95％CI:34.91-50.39％)及び100％(95％CI:96.38-100％)であった(カットオフ, 40 mIU/mL)。さらに、DHCR24 Abの診断精度の包括的な評価をHCC-Cについて行った(表２)。
【００４４】
【表２】
0006671578.tif 000003
【００４５】
DHCR24 Abは、CHC患者からHCC-C患者を区別する際に0.83(95％CI:0.79-0.88)のAUCを示し、これは、AFP(0.86, 95％CI:0.82-0.91)についてのものと類似し、PIVKA-II(0.78, 95％CI:0.73-0.84)についてのものより高かった(図３Ａ)。
【００４６】
HCC-C患者のより大きな割合が、AFP(93/172, 54％)及びPIVKA-II(73/167, 44％)よりDHCR24 Ab(125/177, 71％)について陽性だった(P<0.0001; 図３Ｂ)。さらに、46％(79/172)の患者がAFP-陰性であると考えられた(<20 ng/mL)。当該AFP-陰性患者の中で、血清DHCR24 Abレベルが73.4％(58/79)において上昇した。また、56.3％(94/167)の患者がPIVKA-II-陰性であると考えられた(<40 mIU/mL)。当該PIVKA-II-陰性患者の中で、血清DHCR24 Abレベルが75.5％(71/94)において上昇した。血清DHCR24 AbレベルとPIVKA-II又はAFPレベルとの組合せによれば、それぞれ87％及び88％までHCC症例の陽性率が増加した(図３Ｂ)。
【００４７】
さらに、DHCR24 Abは、C型慢性肝炎患者において、初期HCCと肝硬変との間(P=0.0306)及び初期HCCと後期HCCとの間(P=0.0142)において有意に区別することができた(図３Ｃ)。
【００４８】
CHC対LCCを識別する際にさらにDHCR24 Abの性能を評価し、ROC曲線は0.71(95％CI:0.63-0.79)のAUCを示し、これは、AFP(0.72, 95％CI:0.65-0.80)のものと類似し、PIVKA-II(0.53, 95％CI:0.43-0.62)のものより有意に良好であった。
【００４９】
DHCR24 AbレベルとAFP又はPIVKA-IIレベルとの間のスピアマン相関分析は、明瞭な相関関係を示さなかった(それぞれrs=-0.15, 95％CI:-0.30-0.01, P=0.0668, R2=0.0076;及びrs=0.08, 95％CI：0.24-0.083, P=0.3149, R2=0.0161）。
【００５０】
２−３．HBV感染患者におけるDHCR24 Abレベル
次に、CHB、LCB及びHCC-B患者からのDHCR24 Abの血清レベルを調査した(図４)。病院による層化分析は、DHCR24 Abレベルが健康な対照者と比較して、CHB患者においてより高かったことを示した(図４Ａ−Ｃ)。全体的には、HCC-BにおけるDHCR24 Abの相対濃度(平均:7.16±0.50μg/mL)は、CHB(6.49±0.37μg/mL)及びLCB患者(7.87±0.60μg/mL)と比較して、有意な差異を示さなかった(P=0.1247)。しかしながら、DHCR24 Abの相対濃度は、健康な対照者よりもB型慢性肝炎(CHB、LCB又はHCC-B)患者において有意に高かった(P<0.05)(図４Ｄ)。
【００５１】
DHCR24 AbについてのHCC-BとCHBとの間の区別のためのAUC(0.55, 95％CI:0.46-0.64)は、PIVKA-IIのもの(0.74, 95％CI:0.65-0.82)又はAFP(0.66, 95％CI:0.58-0.75)のものより優れておらず、このことは、DHCR24 AbがHCC-Bにとって良いバイオマーカーではないことを示す。
【００５２】
２−４．DHCR24は肝臓癌組織で示差的に発現される
HCV感染がHCCにおいてDHCR24タンパク質発現を誘導するか否かを判断するために、15個の原発性ヒトHCC組織及び隣接した非腫瘍組織を、DHCR24モノクローナル抗体2-152aを使用したウエスタンブロット分析に供した。DHCR24は、隣接した非腫瘍組織と比較して全てのHCV陽性腫瘍組織において(図５Ａ)、並びに5個のHBV関連HCC又はHBV陰性、HCV陰性HCC標本のうち2個において(図５Ａ)過剰発現された。
【００５３】
さらに、免疫組織化学分析は、DHCR24タンパク質発現が癌性HCV組織で増加され(図５Ｂ)、癌性HBV陽性組織(図５Ｃ)及びHBV陰性、HCV陰性組織(図５Ｄ)において減少されたことを明らかにした。
【００５４】
総合すれば、これらのデータは、DHCR24がHBV癌性組織においてよりもHCV癌性組織においてより頻繁にアップレギュレートされることを示す。
【００５５】
２−５．HCC-C患者におけるDHCR24 Abレベルと臨床病理的な特徴との間の関係
HCV陽性患者においてDHCR24 Abレベルと初期段階のHCCとの間の関係を分析するために、存在する結節の数に従って患者を層化した。DHCR24 Abの相対濃度は、3つ未満の結節(16.10±0.63μg/mL)を有する患者よりも、3つを超える結節を有する患者(19.12±1.73μg/mL)において有意に高かった(P=0.0442;図６Ａ)。
【００５６】
さらに、カプランマイヤー生存分析を、102人のHCC-C患者で行い、高DHCR24 Ab血清レベルを有するHCC-C患者(>11.50μg/mL)が、低レベルの患者(<11.50μg/mL)に対して同様の予後を有していたことを示した(ハザード比:1.17, 95％CI:0.55-2.53, P=0.696; 図６Ｂ)。低及び高血清DHCR24 Abレベルの患者の全体的な生存中央値は、それぞれ60ヶ月及び61ヶ月であった。
【００５７】
また、DHCR24 Abレベルを、HCCについて肝動脈化学塞栓術(TACE)を受けた患者(n=8)において、処置前後で比較した。しかしながら、DHCR24 Abレベルは、 当該処置前後で異ならなかった(P=0.5664;図６Ｃ)。
【００５８】
３．考察
血清では、Absは安定しており、またAb応答は持続しており(Heo CK, Bahk YY, Cho EW. Tumor-associated autoantibodies as diagnostic and prognostic biomarkers. BMB Rep 2012; 45: 677-85)、且つ過剰発現された、突然変異した、ミスフォールドした、又は異常に分解されたタンパク質が免疫原性となる場合があり、このようにして自己Ab産生が生じ、結果として、患者の血清中のこれらの抗体の検出を、予後及び/又は診断目的のために開発することができる。
【００５９】
本研究では、血清DHCR24 AbレベルがHCV介在性慢性肝炎、肝硬変及びHCCと相関するが、HBV関連疾患とは相関しないことを見出し、血清DHCR24 Absの相対濃度がHCV陽性患者における診断及び/又は予後に有用であることを示唆する。さらに、CHC患者とHCC-C患者とを識別することにおけるDHCR24 Abの感度は、血清AFP及びPIVKA-IIレベルより優れており、また、高DHCR24 Abレベルは、HCC-Cのための高い陽性予測値であることを実証した。さらに、AFP又はPIVKA-IIとDHCR24 Abとの組み合わせは、さらにHCV陽性患者中のHCCの検出率を増加させた。反対に、慢性HBV感染では、DHCR24 Abレベルは、CHB、LCB及びHCC-Bの間で異ならなかった(P=0.1247)。
【００６０】
以前に、本発明者等は、in vitro及びin vivoでDHCR24がHCV感染細胞において過剰発現されること、及びsiRNAによってダウンレギュレートされたDHCR24発現により、HCVがサイレンシングすることを示した(Nishimura T, Kohara M, Izumi K, et al. Hepatitis C virus impairs p53 via persistent overexpression of 3beta-hydroxysterol Delta24-reductase. J Biol Chem 2009; 284: 36442-52; Saito M, Kohara M, Tsukiyama-Kohara K. Hepatitis C virus promotes expression of the 3beta-hydroxysterol delta24-reductase through Sp1. J Med Virol 2012; 84: 733-46; Takano T, Tsukiyama-Kohara K, Hayashi M, et al. Augmentation of DHCR24 expression by hepatitis C virus infection facilitates viral replication in hepatocytes. J Hepatol 2011; 55: 512-21)。しかしながら、HBV感染は、DHCR24発現に有意な効果を有しなかった(Monsour Jr HP, Asham E, McFadden RS, Victor III DW, Muthuswamy B, Zaheer I. Hepatocellular carcinoma: the rising tide from east to west-a review of epidemiology, screening and tumor markers. Transl Cancer Res 2013; 2: 492-506)。HCV感染におけるDHCR24アップレギュレーションは、HCV誘導性酸化ストレスの結果として突然変異した毛細血管拡張性運動失調による増加したSp1リン酸化に起因する可能性があり、これは、DHCR24の転写活性化を促進する(Tsukiyama-Kohara K. Role of oxidative stress in hepatocarcinogenesis induced by hepatitis C virus. Int J Mol Sci 2012; 13: 15271-8)。HCVによるDHCR24発現のこの増強は、核p53アセチル化のブロッキング及び、潜在的にはp53分解の阻害によって介在される、細胞質中のp53とMDM2の間の相互作用の増加によるp53活性を抑制する(Tsukiyama-Kohara K. Role of oxidative stress in hepatocarcinogenesis induced by hepatitis C virus. Int J Mol Sci 2012; 13: 15271-8)。結果として、p53活性抑制における損なわれたアポトーシスシグナリングが、肝癌発生を促進する可能性がある。さらに、DHCR24は、アポトーシスに関与する主要なタンパク質の1つであるカスパーゼ-3活性化を阻害することが示されており、このことは、細胞生存と細胞死の調節におけるDHCR24の役割を示唆するものである(Greeve I, Hermans-Borgmeyer I, Brellinger C, et al. The human DIMINUTO/DWARF1 homolog seladin-1 confers resistance to Alzheimer's disease-associated neurodegeneration and oxidative stress. J Neurosci 2000; 20: 7345-52；Benvenuti S, Luciani P, Cellai I, et al. Thyroid hormones promote cell differentiation and up-regulate the expression of the seladin-1 gene in in vitro models of human neuronal precursors. J Endocrinol 2008; 197(2): 437-46)。さらに、本発明者等は、MoAb 2-152aクローンがDHCR24に結合し、HCV複製を抑制することを見出し(Satoh M, Saito M, Takano T, et al. Monoclonal antibody 2-152a suppresses hepatitis C virus infection through betaine/GABA transporter-1. J Infect Dis 2011; 204: 1172-80)、このことは、DHCR24 Abが抗ウイルス効果を有すること、及びHCC患者におけるDHCR24 Abの高レベルが癌性組織中のHCV RNAレベルを低下させることを導く可能性があることを示唆する。報告によれば、DHCR24は、正常な肝細胞より肝臓癌細胞の表面上でより豊富に発現される(Satoh M, Saito M, Takano T, et al. Monoclonal antibody 2-152a suppresses hepatitis C virus infection through betaine/GABA transporter-1. J Infect Dis 2011; 204: 1172-80)。従って、Tanaka et al.は、HCC及びHCVモノ感染を有する患者の非癌性組織が癌性組織の10〜1,000倍高いウイルスレベルを示したことを観察し、これは、HCC患者で見られたより高いDHCR24 Ab量の理由の1つである可能性がある(Tanaka T, Inoue K, Hayashi Y, et al. Virological significance of low-level hepatitis B virus infection in patients with hepatitis C virus associated liver disease. J Med Virol 2004; 72: 223-9)。
【００６１】
DHCR24遺伝子は、HCCにおいて一般に増幅される領域であり、且つ発癌に寄与する可能性がある染色体1p32.3にマッピングされる(Yuan BZ, Zhou X, Zimonjic DB, Durkin ME, Popescu NC. Amplification and overexpression of the EMS 1 oncogene, a possible prognostic marker, in human hepatocellular carcinoma. J Mol Diagn 2003; 5: 48-53；Endo M, Yasui K, Nakajima T, et al. Infrequent amplification of JUN in hepatocellular carcinoma. Anticancer Res 2009; 29: 4989-94)。最近、2つの体細胞突然変異(Q88L及びR311H)が、韓国のHCC患者のDHCR24遺伝子において同定された(Ahn SM, Jang SJ, Shim JH, et al. A genomic portrait of resectable hepatocellular carcinomas: Implications of RB1 and FGF19 aberrations for patient stratification. Hepatology 2014; 60: 1972-82)。さらに、DHCR24の過剰発現は前立腺癌の特徴であり、高レベルが低悪性度の前立腺癌で観察されるが、癌進行と共に減少しており(Bonaccorsi L, Luciani P, Nesi G, et al. Androgen receptor regulation of the seladin-1/DHCR24 gene: altered expression in prostate cancer. Lab Invest 2008; 88: 1049-56)、またDHCR24は、非筋肉侵襲性尿路上皮癌の進行の間に過剰発現される(Lee GT, Ha YS, Jung YS, et al. DHCR24 is an independent predictor of progression in patients with non-muscle-invasive urothelial carcinoma, and its functional role is involved in the aggressive properties of urothelial carcinoma cells. Ann Surg Oncol 2014; 21 Suppl 4: S538-45)。
【００６２】
結論として、DHCR24 Abレベルは、進行性肝疾患のための新しいマーカーである可能性がある。適度な慢性肝炎から進行期疾患までのDHCR24 Absの増加は、初期の疾患進行のための潜在的な新しい診断システムを提供し、且つ血清DHCR24 Ab上昇が、HCV陽性患者のHCCへの自己免疫関連炎症の進行を反映する可能性があることを示唆する。しかしながら、慢性HCV感染中の血清DHCR24 Ab誘導のメカニズムを明らかにするために、更なる研究が必要とされる。
【図１】
0006671578.tif 000004
【図２】
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【図３Ａ】
0006671578.tif 000006
【図３Ｂ−Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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