(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウェル表面に疎水性部分を有する複数のウェルを備え、
前記ウェルの開口部の平面積Ｓ２（１０−１２ｍ２）が、ウェル底面積Ｓ１（１０−１２ｍ２）の２．２倍以下であることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項２】
前記ウェルの開口部の平面積Ｓ２（１０−１２ｍ２）が、ウェル底面積Ｓ１（１０−１２ｍ２）の１．１倍以上であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項３】
前記ウェルの開口部を含む面に対して前記ウェルの側面がなす角度θが、７７°以上９０°以下であり、かつ前記ウェルの容積Ｖ（１０−１８ｍ３）の仮数部の三乗根の値が３．５以上５．０以下であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項４】
前記ウェルの開口部の最大径Ｄ２（μｍ）が、ウェル底面の最大径Ｄ１（μｍ）の１．５倍以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項５】
前記ウェルの底面からの高さＨ（μｍ）が、ウェル底面の最大径Ｄ１（μｍ）の５倍以下であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項６】
前記ウェルの容積Ｖ（１０−１８ｍ３）の仮数部が、ウェル底面積Ｓ１（１０−１２ｍ２）の仮数部の４．５倍以下であることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項７】
前記ウェルの容量が１ｆＬ〜６ｎＬ／ウェルである、請求項１〜請求項６のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項８】
前記ウェルの密度が１０万〜１０００万個／ｃｍ２である、請求項１〜請求項７のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項９】
前記ウェルが、電磁波透過性を有する基板上に設けられている、請求項１〜請求項７のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項１０】
前記電磁波が、Ｘ線、紫外線、可視光線又は赤外線である、請求項９に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項１１】
前記基板は、自家蛍光を実質的に有さないものである、請求項９又は請求項１０に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項１２】
流路と、前記流路内に配置された、請求項１〜請求項１１のいずれかに記載のマイクロウェルアレイとを備える、マイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
流路と、前記流路内に配置された請求項１〜請求項１１のいずれかに記載のマイクロウェルアレイとを備える、マイクロ流体デバイスの前記流路に水性液体を送液し、前記マイクロウェルアレイのウェルに前記水性液体を導入する工程と、前記流路に封止液を送液し、前記ウェルに導入された前記水性液体の上層に封止液の層を形成させ、前記水性液体を前記ウェル内に封入する工程と、を備える、前記ウェル内に水性液体を封入する方法。
【請求項１４】
流路と、前記流路内に配置された請求項１〜請求項１１のいずれかに記載のマイクロウェルアレイの製造方法であって、電磁波透過性を有する基板上に疎水性材料を積層して疎水層を形成する工程と、前記疎水層を掘削して複数のウェルを形成する工程と、を備える、マイクロウェルアレイの製造方法。
【請求項１５】
水性液体が封入された、請求項１〜請求項１１のいずれかに記載のマイクロウェルアレイのウェルに電磁波を照射する工程と、前記ウェルから放出される蛍光又は燐光を検出する工程と、を備える、水性液体の分析方法。
【請求項１６】
前記蛍光又は燐光が、請求項１〜請求項１１のいずれかに記載のマイクロウェルアレイの基板側で検出される、請求項１５に記載の水性液体の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロウェルアレイ、マイクロ流体デバイス、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法及びマイクロウェルアレイの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、半導体回路の製造技術に用いられているエッチング技術やフォトリソグラフィ技術等を用いて形成された、種々の形態の微細な流路構造を有するマイクロウェルアレイが検討されている。
これらのマイクロウェルアレイのウェルは、微小体積の流体中で種々の生化学的又は化学的反応をさせるための化学反応容器として用いられている。
【０００３】
マイクロ流体システムの製作のための材料としては、シリコン、ガラス等の硬質の物質、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等の種々の高分子樹脂やシリコーンゴム等の軟質の物質等が用いられている。
例えば、特許文献１〜３には、このようなマイクロ流体システムを、種々のマイクロチップ、バイオチップとして用いることが記載されている。
【０００４】
ところで、近年、微少量の容積を有する微小空間内で酵素反応をおこなうことにより生体物質の検査をおこなう技術が注目されている。
例えば、核酸の検出及び定量における新しいアプローチの一つとして、デジタルＰＣＲ技術が挙げられる。
デジタルＰＣＲ技術とは、試薬と核酸との混合物を無数の微小液滴に分割してＰＣＲ増幅をおこない、核酸を含んだ液滴からは蛍光等のシグナルが検出されるようにしておき、シグナルが検出された液滴を数えることにより定量をおこなう技術である。
【０００５】
微小液滴の作製方法として、封止液で分断化することにより微小液滴を作製する方法や、基板上に形成した孔に試薬を入れ、続いて封止液を入れることにより微小液滴を作製する方法（例えば特許文献３を参照。）等が検討されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４９１１５９２号公報
【特許文献２】特許第５３３７３２４号公報
【特許文献３】国際公開第２０１４／０３４７８１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来のマイクロウェルアレイは、水性液体であるＰＣＲ反応液等の試料をウェル内に封入することが困難な場合がある。
【０００８】
そこで、本発明は、ウェル内に水性液体を封入することが容易なマイクロウェルアレイを提供することを目的とする。
本発明はまた、上記のマイクロ流体デバイス、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法及びウェルの形成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下のとおりである。
（１）ウェル表面に疎水性部分を有する複数のウェルを備え、前記ウェルの開口部の平面積Ｓ２（１０−１２ｍ２）が、ウェル底面積Ｓ１（１０−１２ｍ２）の２．２倍以下であることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
（２）前記ウェルの開口部の平面積Ｓ２（１０−１２ｍ２）が、ウェル底面積Ｓ１（１０−１２ｍ２）の１．１倍以上であることを特徴とする（１）に記載のマイクロウェルアレイ。
（３）前記ウェルの開口部を含む面に対して前記ウェルの側面がなす角度θが、７７°以上９０°以下であり、かつ前記ウェルの容積Ｖ（１０−１８ｍ３）の仮数部の三乗根の値が３．５以上であることを特徴とする（１）又は（２）に記載のマイクロウェルアレイ。
（４）前記ウェルの開口部の最大径Ｄ２（μｍ）が、ウェル底面の最大径Ｄ１（μｍ）の１．５倍以下であることを特徴とする（１）〜（３）に記載のマイクロウェルアレイ。
（５）前記ウェルの底面からの高さＨ（μｍ）が、ウェル底面の最大径Ｄ１（μｍ）の５倍以下であることを特徴とする（１）〜（４）に記載のマイクロウェルアレイ。
（６）前記ウェルの容積Ｖ（１０−１８ｍ３）の仮数部が、ウェル底面積Ｓ１（１０−１２ｍ２）の仮数部の４．５倍以下であることを特徴とする（１）〜（５）に記載のマイクロウェルアレイ。
（７）前記ウェルの容量が１ｆＬ〜６ｎＬ／ウェルである、（１）〜（６）に記載のマイクロウェルアレイ。
（８）前記ウェルの密度が１０万〜１０００万個／ｃｍ２である、（１）〜（７）に記載のマイクロウェルアレイ。
（９）前記ウェルが、電磁波透過性を有する基板上に設けられている、（１）〜（７）のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
（１０）前記電磁波が、Ｘ線、紫外線、可視光線又は赤外線である、（９）に記載のマイクロウェルアレイ。
（１１）前記基板は、自家蛍光を実質的に有さないものである、（９）又は（１０）に記載のマイクロウェルアレイ。
（１２）流路と、前記流路内に配置された（１）〜（１１）のいずれかに記載のマイクロウェルアレイとを備える、マイクロ流体デバイス。
（１３）流路と、前記流路内に配置された（１）〜（１１）のいずれかに記載のマイクロウェルアレイとを備える、マイクロ流体デバイスの前記流路に水性液体を送液し、前記マイクロウェルアレイのウェルに前記水性液体を導入する工程と、前記流路に封止液を送液し、前記ウェルに導入された前記水性液体の上層に封止液の層を形成させ、前記水性液体を前記ウェル内に封入する工程と、を備える、前記ウェル内に水性液体を封入する方法。
（１４）流路と、前記流路内に配置された（１）〜（１１）のいずれかに記載のマイクロウェルアレイの製造方法であって、電磁波透過性を有する基板上に疎水性材料を積層して疎水層を形成する工程と、前記疎水層を掘削して複数のウェルを形成する工程と、を備える、マイクロウェルアレイの製造方法。
（１５）水性液体が封入された、（１）〜（１１）のいずれかに記載のマイクロウェルアレイのウェルに電磁波を照射する工程と、前記ウェルから放出される蛍光又は燐光を検出する工程と、を備える、水性液体の分析方法。
（１６）前記蛍光又は燐光が、（１）〜（１１）のいずれかに記載のマイクロウェルアレイの基板側で検出される、（１５）に記載の水性液体の分析方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、前記ウェルの形状を特定することにより、ウェル内に水性液体を封入することが容易なマイクロウェルアレイを提供することができる。
また、上記のマイクロ流体デバイス、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法及びウェルの形成方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明に係るマイクロ流体デバイスの第１実施形態を示す斜視図（ａ）、（ａ）におけるｂ−ｂ線断面図（ｂ）である。
【図２】本発明に係るマイクロウェルアレイの第１実施形態を示す断面図（ａ）、斜視図（ｂ）である。
【図３】本発明に係るマイクロウェルアレイの製造方法の第１実施形態を示す断面図である。
【図４】本発明に係るマイクロウェルアレイの実験例を示す断面図である。
【図５】実験例１〜３のマイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイに水性液体を封入した状態を示す断面図である。
【図６】実験例１のマイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。
【図７】実験例２のマイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。
【図８】実験例３のマイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。
【図９】実験例４、５のマイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイに水性液体及びオイルを送液した後の状態を示す断面図である。
【図１０】実験例４のマイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。
【図１１】実験例５のマイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明に係るマイクロウェルアレイ、マイクロ流体デバイス、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法及びマイクロウェルアレイの製造方法の第１実施形態を、図面に基づいて説明する。
図１は、本実施形態におけるマイクロ流体デバイスを示す斜視図（ａ）、および（ａ）におけるｂ−ｂ線断面図（ｂ）であり、図２は、本実施形態におけるマイクロウェルアレイを示す断面図（ａ）、斜視図（ｂ）であり、図３は、本実施形態におけるマイクロウェルアレイの製造方法を示す断面図である。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
【００１３】
［マイクロウェルアレイ］
本実施形態において、本発明は、ウェル表面に親水性部分及び疎水性部分を有する複数のウェルを備える、マイクロウェルアレイを提供する。
後述するように、本実施形態のマイクロウェルアレイは、ウェル内に水性液体を封入することが非常に容易である。
【００１４】
ここで、封入するとは、マイクロウェルアレイを構成するウェルに水性液体を導入し、さらに、各ウェルに導入された液体同士が互いに混合しない状態に隔離することを意味する。
隔離する方法としては、例えば、ウェルに水性液体を導入した後、ウェルの上部にオイル層を形成すること等が挙げられる。
本実施形態のマイクロウェルアレイによれば、マイクロウェルアレイを構成するウェルの９０％以上、例えば９５％以上、例えば９９％以上、例えば１００％に水性液体を容易に封入することができる。
【００１５】
本実施形態のマイクロウェルアレイは、ウェル１つあたりの容量が、例えば１フェムトリットル（ｆＬ）〜６ナノリットル（ｎＬ）であり、好ましくは１ｆＬ〜５ピコリットル（ｐＬ）であり、さらに好ましくは１ｆＬ〜３００ｆＬである。
ウェル１つあたりの容量がこのような範囲であると、デジタルＰＣＲやインベーダー反応等の微小空間内でおこなう酵素反応を好適におこなうことができる。
デジタルＰＣＲにより、例えば遺伝子の変異検出等をおこなうことができる。
【００１６】
本実施形態のマイクロウェルアレイは、例えば遺伝子の変異検出に封入した水性液体の温度を変化させた場合も、ウェル内に前記液体を保持することができる。
変化させる温度の範囲は、例えば０℃〜１００℃であり、好ましくは０℃〜８０℃であり、さらに好ましくは２０℃〜７０℃である。
ウェルに封入した水性溶液がこのような範囲であると、デジタルＰＣＲやインベーダー反応等の微小空間内でおこなう酵素反応を好適におこなうことができる。
【００１７】
マイクロウェルアレイを用いた解析に酵素反応を利用する場合には、マイクロウェルアレイの材質が酵素反応を阻害しないものであることが好ましい。
あるいは、マイクロウェルアレイの材質（材料）表面に、酵素反応を阻害しない物質をコーティングすることも可能である。
【００１８】
マイクロウェルアレイのウェルの形状や大きさに特に制限はないが、例えば、微小液滴中で種々の生化学的な反応をおこなう場合には、１個〜数個の生体分子又は担体を収容可能な形状と大きさを有していることが好ましい。
担体は例えばビーズであってもよく、担体には試料である生体分子が結合されていてもよい。
【００１９】
ウェルの形状は、例えば、円筒形、複数の面により構成される多面体（例えば、直方体、六角柱、八角柱等）、逆円錐形、逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、七角以上の逆多角錐形）等であってもよく、これらの形状の二つ以上を組み合わせた形状であってもよい。
【００２０】
例えば、一部が円筒形であり、残りが逆円錐形であってもよい。
また、逆円錐形、逆角錐形の場合、円錐や角錐の底面がウェルの入り口（開口部）となるが、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状であってもよい。
この場合、マイクロウェルの底部は平坦になる。
【００２１】
ウェルの形状が円筒形、直方体である場合、マイクロウェルの底部は通常、平坦であるが、曲面（凸面や凹面）としてもよい。
マイクロウェルの底部を曲面とすることができるのは、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状の場合も同様である。
【００２２】
ウェルの形状が例えば円錐台である場合、図２に示すように、その容積Ｖ（１０−１８ｍ３）とすると、例えばウェルの底面積Ｓ１（１０−１２ｍ２）がＶの１倍以上４．５倍以下であり、好ましくは２倍以上４．３倍以下であり、さらに好ましくは３倍以上４．２倍以下である。
ウェル１つあたりの容積に対し、ウェルの底面積がこのような範囲であると、本実施形態のマイクロウェルアレイによれば、マイクロウェルアレイを構成するウェルの９０％以上、例えば９５％以上、例えば９９％以上、例えば１００％に水性液体を容易に封入することができる。
後述するように、発明者らは、このような構成とすることにより、マイクロウェルアレイのウェルに水性液体を封入させることが非常に容易になることを見出した。
【００２３】
ウェルの形状は例えばウェルの平面積を制御することでも可能である。
例えば、図２に示すように、ウェルの開口部の平面積Ｓ２（１０−１２ｍ２）が、ウェルの底面積Ｓ１の０．５倍以上２．２倍以下であり、好ましくは１倍以上２倍以下であり、さらに好ましくは１．１倍以上１．８倍以下である。
ウェル１つあたりの容積に対し、ウェルの底面積がこのような範囲であると、本実施形態のマイクロウェルアレイによれば、水性液体を封入させることが非常に容易になる。
【００２４】
例えば、図２に示すように、前記ウェルの開口部の最大径Ｄ２（μｍ）が、ウェル底面の最大径Ｄ１（μｍ）の０．５倍以上１．５倍以下であり、好ましくは０．７倍以上１．４倍以下であり、さらに好ましくは１倍以上１．３倍以下である。
ウェルの開口部の最大径に対し、ウェルの底面の最大径がこのような範囲であると、本実施形態のマイクロウェルアレイによれば、水性液体を封入させることが非常に容易になる。
【００２５】
例えば、図２に示すように、ウェルの底面から形成される側面の角度θが、例えば３０°以上１０３°以下であり、好ましくは６０°以上１０３°以下であり、さらに好ましくは９０°以上１０３°以下である。
また、側面角度θが、７７°以上であること、または前記ウェルの容積Ｖ（１０−１８ｍ３）の三乗根の値が３．５以上であることができる。
ウェル底面から形成される側面の角度がこのような範囲であると、本実施形態のマイクロウェルアレイによれば、水性液体を封入させることが非常に容易になる。
【００２６】
例えば、図２に示すように、ウェルの底面からの高さＨ（μｍ）が、最大径Ｄ１の０．２倍以上１０倍以下であり、好ましくは０．４倍以上５倍以下であり、さらに好ましくは０．６倍以上２倍以下である。
ウェル底面から形成される側面の角度がこのような範囲であると、本実施形態のマイクロウェルアレイによれば、水性液体を封入させることが非常に容易になる。
【００２７】
ウェルが円筒形の場合、生体分子を含む水性液体を封入する目的のためには、ウェルの最大径、高さＨは例えば１０ｎｍ〜１００μｍ、好ましくは１００ｎｍ〜１０μｍ、さらに好ましくは１μｍ〜１０μｍであってもよい。
ウェルの寸法は、ウェルに収容する水性液体の量や、生体分子を付着させたビーズ等の担体の大きさとウェルの寸法の好適な比等を考慮して、１つのマイクロウェルに１つ、もしくは数個の生体分子が収容されるように、適宜決定する。
【００２８】
本実施形態のマイクロウェルアレイを使用して検出する検出対象は、例えば血液等の生体から採取した試料やＰＣＲ産物等であってもよく、人工的に合成された化合物等であってもよい。
例えば、生体分子であるＤＮＡを検出対象とする場合、ウェルは、ＤＮＡが１分子入るような形状と大きさであってもよい。
【００２９】
本実施形態のマイクロウェルアレイは、ウェルの密度が、例えば１０万〜１０００万個／ｃｍ２であり、好ましくは１０万〜５００万個／ｃｍ２であり、さらに好ましくは１０万〜１００万個／ｃｍ２である。
ウェルの密度がこのような範囲であると、所定数のウェルに試料である水性液体を封入させる操作が容易である。
また、実験結果を解析するためのウェルの観察も容易である。
【００３０】
例えば、セルフリーＤＮＡの変異を測定する場合において、検出対象の変異の野生型に対する存在割合が０．０１％程度である場合、例えば、１００万〜２００万個のウェルを使用することが好適である。
【００３１】
本実施形態のマイクロウェルアレイにおいて、各ウェルは、基板上に親水性材料または疎水性材料を積層して親水層または疎水層を形成する工程と、前記親水層または疎水層を掘削して複数のウェルを形成する工程から作製することができる。
ただし、本実施形態を実現できる条件であれば、マイクロウェルは基板と同一材料とされて、成型加工や切削加工によって形成されてもよい。
【００３２】
（基板）
本実施形態のマイクロウェルアレイは、基板上に形成されていてもよい。
基板は、電磁波透過性を有するものであってもよく、有さないものであってもよい。ここで、電磁波としては、Ｘ線、紫外線、可視光線、赤外線等が挙げられる。
マイクロウェルアレイが電磁波透過性を有する基板上に形成されていた場合には、マイクロウェルアレイ上でおこなった実験結果を解析するために、電磁波を利用することが可能になる。
例えば、電磁波を照射した結果生じる蛍光、燐光等を基板側から計測することができる。蛍光、燐光等の検出には、例えば蛍光顕微鏡等を利用することができる。
この場合、電磁波は、例えば基板側から照射してもよいし、例えばウェルの入り口側から照射してもよい。
【００３３】
例えば、マイクロウェルアレイにおいて、可視光領域である４００〜７００ｎｍの波長範囲にピークを有する蛍光を検出する場合には、少なくとも上記可視光領域の光に対して良好な透過性を有する基板を用いればよい。
【００３４】
電磁波透過性を有する基板としては、例えば、ガラス、樹脂等が挙げられる。
樹脂基板としては、例えば、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート樹脂、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ酢酸ビニル、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）等が挙げられる。
これらの樹脂は各種添加剤を含んでいてもよく、複数の樹脂が混合されていてもよい。
【００３５】
実験結果の検出に蛍光や燐光を利用する観点から、上記の基板は、自家蛍光を実質的に有さないものであることが好ましい。ここで、自家蛍光を実質的に有さないとは、基板が、実験結果の検出に使用する波長の自家蛍光を全く有さないか、有していても実験結果の検出に影響を与えないほど微弱であることを意味する。
例えば、検出対象の蛍光に比べて１／２以下、１／１０以下程度の自家蛍光の強さであれば、実験結果の検出に影響を与えないほど微弱であるといえる。
【００３６】
電磁波透過性を有し、かつ自家蛍光を全く発しない素材としては、例えば、石英ガラスが挙げられる。
自家蛍光が微弱であり、電磁波を用いた実験結果の検出に支障がない素材としては、低蛍光ガラス、アクリル樹脂、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）等が挙げられる。
【００３７】
生体分子の検出に用いる蛍光としては、例えば蛍光分子を内包した蛍光ビーズや、ＤＮＡの二重らせんに特異的に入り込み、蛍光を発するＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ等のインターカレーター等に由来するものが挙げられる。
【００３８】
ウェルに収容された生体分子から発せられる蛍光の観察は、例えば、倒立顕微鏡を用いて、マイクロウェルアレイの基板側からおこなうことができる。
この蛍光観察により、所定の蛍光を発するマイクロウェルの個数を数えることで、目的分子の数を特定することができる。
【００３９】
生体分子は、例えば、ウェルに収容する前に、目的分子を特異的に標識する蛍光標識で処理しておくとよい。
あるいは、対象分子を特異的に認識するビーズを用いて、対象分子を補足した後に、ビーズをウェルに収容し、対象分子を特異的に標識し得る蛍光標識と接触させて、目的分子をウェル内で蛍光標識してもよい。
【００４０】
基板の厚みは、適宜決定することができるが、たとえば基板側から蛍光顕微鏡を用いて蛍光を観察する場合には、例えば５ｍｍ以下、例えば２ｍｍ以下、あるいは１．６ｍｍ以下であることが好ましい。
【００４１】
本実施形態のマイクロウェルアレイを使用した生体分子の観察には、蛍光以外にも、例えば濁度等を利用することもできる。
濁度は、例えば４００〜１０００ｎｍ程度の波長の光の透過性により測定することができる。
【００４２】
（親水性樹脂）
親水性部分を形成する樹脂（以下「親水性樹脂」という場合がある。）としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、樹脂の構成成分の分子が、親水性を発現する親水性基を有するものが挙げられる。
親水性基としては、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホン基、スルホニル基、アミノ基、アミド基、エーテル基、エステル基等が挙げられる。
【００４３】
より具体的には、シロキサンポリマー；エポキシ樹脂；ポリエチレン樹脂；ポリエステル樹脂；ポリウレタン樹脂；ポリアクリルアミド樹脂；ポリビニルピロリドン樹脂；ポリアクリル酸共重合体等のアクリル樹脂；カチオン化ポリビニルアルコール、シラノール化ポリビニルアルコール、スルホン化ポリビニルアルコール等のポリビニルアルコール樹脂；ポリビニルアセタール樹脂；ポリビニルブチラール樹脂；ポリエチレンポリアミド樹脂；ポリアミドポリアミン樹脂；ヒドロキシメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリエチレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド共重合体等のポリアルキレンオキサイド誘導体；無水マレイン酸共重合体；エチレン−酢酸ビニル共重合体；スチレン−ブタジエン共重合体；上記の樹脂の組み合わせ等の中から、適宜選択して使用することができる。
親水性樹脂は、熱可塑性樹脂であってもよく、熱硬化性樹脂であってもよく、電子線やＵＶ光等の活性エネルギー線により硬化する樹脂であってもよく、エラストマーであってもよい。
【００４４】
なお、親水性部分（親水性部分の材質）は、ＪＩＳ  Ｒ３２５７−１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度未満とされることも可能である。
【００４５】
また、前述する基板が存在する場合には、基板と疎水層とを密着させる機能も有していてもよい。
例えば、熱硬化性のシランカップリング剤等を基板に塗布し、熱硬化させてシロキサンポリマーを形成することにより、親水層を形成してもよい。
【００４６】
（疎水性樹脂）
疎水性部分を形成する樹脂（以下「疎水性樹脂」という場合がある。）としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、ノボラック樹脂；アクリル樹脂；メタクリル樹脂；スチレン樹脂；塩化ビニル樹脂；塩化ビニリデン樹脂；ポリオレフィン樹脂；ポリアミド樹脂；ポリイミド樹脂；ポリアセタール樹脂；ポリカーボネート樹脂；ポリフェニレンスルフィド樹脂；ポリスルフォン樹脂；フッ素樹脂；シリコーン樹脂；ユリヤ樹脂；メラミン樹脂；グアナミン樹脂；フェノール樹脂；セルロース樹脂；上記の樹脂の組み合わせ等の中から、ＪＩＳ  Ｒ３２５７−１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度以上であるものを適宜選択して使用することができる。
疎水性樹脂は、熱可塑性樹脂であってもよく、熱硬化性樹脂であってもよく、電子線やＵＶ光等の活性エネルギー線により硬化する樹脂であってもよく、エラストマーであってもよい。
【００４７】
疎水性部分は、例えばレジストで形成されていてもよい。レジストは、微細構造を形成しやすい観点から、フォトレジストであってもよい。フォトレジストは、例えば、感光性のノボラック樹脂であってもよい。
【００４８】
［マイクロ流体デバイス］
本実施形態において、本発明は、流路と、前記流路内に配置された上記のマイクロウェルアレイとを備える、マイクロ流体デバイスを提供する。
このようなマイクロ流体デバイスを用いることにより、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入することが容易になる。
【００４９】
図１（ａ）は、マイクロ流体デバイスの１実施形態を示す斜視図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）におけるｂ−ｂ線断面図である。
本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１０００は、底部部材１１００と、蓋部材１２００と、流路１３００と、流路１３００の一端に設けられた流路入口１２１０と、流路１３００の他端に設けられた流路出口１２２０と、流路１３００の側面を形成する封止部材１４００と、流路１３００の内部に配置されたマイクロウェルアレイｍとを備える。
流路１３００に流体を送液する場合には、例えば、シリンジ等を用いて、流路入口１２１０から流体を導入し、流路出口１２２０から排出するとよい。
【００５０】
マイクロウェルアレイｍの構造については後述する。
マイクロウェルアレイｍの基板１１０と、マイクロ流体デバイス１０００の底部部材１１００は一体であってもよい。
【００５１】
また、マイクロウェルアレイｍの親水層１１２０及び疎水層１１３０は、マイクロ流体デバイス１０００の底部部材１１００上に一体成型されていてもよい。
すなわち、マイクロウェルアレイｍは、マイクロ流体デバイス１０００の底部部材１１００上に形成されていてもよい。
【００５２】
底部部材１１００及び蓋部材１２００の材質としては、上述したマイクロウェルアレイの基板の材質と同様のものを使用することができる。
また、封止部材１４００の材質としては、特に制限されないが、例えばシリコーンゴム、アクリル発泡体からなる芯材フィルムの両面にアクリル系粘着剤が積層された両面粘着テープ等が挙げられる。
【００５３】
［マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法］
本実施形態において、本発明は、流路と、前記流路内に配置された上記のマイクロウェルアレイとを備える、マイクロ流体デバイスの前記流路に水性液体を送液し、前記マイクロウェルアレイのウェルに前記水性液体を導入する工程と、前記流路に封止液を送液し、前記ウェルに導入された前記水性液体の上層に封止液の層を形成させ、前記水性液体を前記ウェル内に封入する工程を備える、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法を提供する。
【００５４】
ここで、水性液体とは、水、検出対象である生体分子を含有する緩衝液等の生体試料、酵素反応液等を意味する。
生体試料とは一般的に水性液体である。
水性液体とは、例えば、生体試料を鋳型とし、検出試薬としてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを含むＰＣＲ反応溶液等であってもよい。
また、水性液中には界面活性剤などを含むことで、ウェル内に液体を封入しやすくしてもよい。
【００５５】
また、封止液とは、マイクロウェルアレイの各ウェルに導入された液体どうしが互いに混合しない状態に隔離するために用いる液体を意味し、例えば、オイル類を用いることができる。
オイルとしては、例えばシグマ社製の商品名「ＦＣ４０」や、３Ｍ社製の商品名「ＨＦＥ−７５００」、ＰＣＲ反応等に用いられるミネラルオイル等を用いることができる。
従来のマイクロウェルアレイでは、ミネラルオイルを封止液に利用することは困難な場合があるが、上述したマイクロウェルアレイであれば、ミネラルオイルを封止液に利用しても、ウェルに水性液体を封入することができる。
【００５６】
封止液は、マイクロウェルアレイの疎水層の材質に対する接触角が５〜８０度であることが好ましい。
封止液の接触角がこの範囲であると、マイクロウェルアレイのウェルに水性液体を封入することができる。
封止液の接触角は、例えば、ＪＩＳ  Ｒ３２５７−１９９９に規定された静滴法に準じて、水の代わりに封止液を用いて測定すればよい。
【００５７】
マイクロウェルアレイの疎水層を形成する材料と封止液の組み合わせを適宜選択することにより、上述した具体的なオイル以外の液体も封止液として使用することができる。
【００５８】
続いて、図１に基づいて、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法を説明する。
まず、シリンジ等を用いて、マイクロ流体デバイス１０００の流路入口１２１０からＰＣＲ反応溶液、インベーダー反応溶液等の水性液体を送液する。
その結果、流路１３００の内部に配置されたマイクロウェルアレイｍの各ウェル内に水性液体が導入される。
【００５９】
次に、シリンジ等を用いて、流路入口１２１０から封止液を送液する。
その結果、流路１３００の内部に配置されたマイクロウェルアレイｍの各ウェルのウェル入り口近傍に封止液の層が形成され、ウェル内に水性液体が封入される。
マイクロウェルアレイｍが上述した構成を備えていることにより、本実施形態の方法によって、マイクロウェルアレイｍの各ウェルに水性液体を容易に封入することができる。
【００６０】
マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入した後、例えば、サーマルサイクラー等を用いてＰＣＲ反応やインベーダー反応等の酵素反応等をおこなうとよい。
【００６１】
［マイクロウェルアレイの製造方法］
（第１実施形態）
本実施形態においては、電磁波透過性を有する基板上に疎水性材料を積層して疎水層を形成する工程と、前記疎水層を掘削して複数のウェルを形成する工程と、を備える、マイクロウェルアレイの製造方法を提供する。
【００６２】
ここで、図３を参照しながら、本実施形態のマイクロウェルアレイ１００の製造方法について説明する。
図３は、第１実施形態のマイクロウェルアレイ１００の製造方法を示す断面図である。
【００６３】
本実施形態のマイクロウェルアレイ１００の製造方法では、まず、図３に示すように、基板１１０の表面１１５に疎水層１２０を形成する。
基板１１０は、例えばガラス基板であってよい。
このとき、ガラス基板の表面にＨＭＤＳ（ヘキサメチルジシラザン）を含む溶液を塗布してもよい。  これにより基板１１０への疎水層１２０の密着が良好になる。
【００６４】
疎水性樹脂として、フォトレジストを使用してもよい。
この場合、フォトレジストをスピンコート等により疎水層１２０上に塗布する。そして、スピンコート後、フォトレジストに熱を加えてプリベークをおこない、固化させて疎水層１２０を生成する。
【００６５】
続いて、疎水層１２０を掘削して、ウェルを形成する。掘削は、例えばフォトレジストの現像によっておこなうことができる。
具体的には、疎水層１２０上にパターンマスクを取り付け、その上から紫外線等を照射して感光させる。
【００６６】
フォトレジストとしては、例えばポジ型のものを使用する。ポジ型のフォトレジストは、光が当たると分解し、現像液に溶解するタイプである。そのため、パターンマスクとしては、マイクロウェルを形成したい箇所に、目的のパターンの穴が開いているようなデザインのものを使用する。
露光時間や条件は、使用するフォトレジストのデータシートを参照して適宜決定するとよい。
【００６７】
続いて、用いたフォトレジストに適した現像液を用いて現像をおこない、マイクロウェルアレイ１００を形成する。現像時間は、使用するフォトレジストのデータシートを参照して適宜決定する。
現像後、リンス液で現像を止め、洗浄する。リンス液としては、例えば純水等を使用すればよい。
続いて、必要に応じてポストベークをおこない、フォトレジストを安定化させる。
以上の操作により、図２に示すような本実施形態のマイクロウェルアレイ１００を製造することができる。
【００６８】
なお、上記のウェルを形成する工程は、ドライエッチングをおこない、疎水層１２０を掘削して複数のウェルを形成する工程であってもよい。ドライエッチングとは、イオンを高速で対象物にぶつけて、その運動エネルギーを利用してエッチングをおこなう方法である。
以上の方法により、基板１１０の表面が露出したウェルを有するマイクロウェルアレイを製造することができる。
【００６９】
［水性液体の分析方法］
本実施形態においては、水性液体が封入された、上記のマイクロウェルアレイのウェルに電磁波を照射する工程と、ウェルから放出される蛍光又は燐光を検出する工程と、を備える、水性液体の分析方法を提供する。
【００７０】
本実施形態の分析方法により、マイクロウェルアレイを構成するウェルのうち、何個のウェルが蛍光又は燐光を発しているかを計測することができる。
例えば、マイクロウェルアレイ内でＰＣＲ反応をおこない、ＰＣＲ増幅が見られたウェルにおけるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎの蛍光を検出することにより、増幅が見られたウェルの割合を算出することができる。
【００７１】
本実施形態の分析方法は、例えば、蛍光顕微鏡を用いておこなってもよい。
また、電磁波の照射は、マイクロウェルアレイの基板側からおこなってもよく、ウェル側からおこなってもよく、その他の任意の方向からおこなってもよい。
また、電磁波の照射の結果発生する蛍光又は燐光の検出は、マイクロウェルアレイの基板側からおこなってもよく、ウェル側からおこなってもよく、その他の任意の方向からおこなってもよいが、例えば蛍光顕微鏡を用いて蛍光又は燐光を検出する場合には、マイクロウェルアレイの基板側からおこなうことが簡便である。
【００７２】
次に実験例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００７３】
＜実験例１＞
上述した第１実施形態の製造方法にしたがって、実験例１のマイクロウェルアレイを作製した。
図４は、実験例１のマイクロウェルアレイの構造を示す断面図である。
【００７４】
実験例１のマイクロウェルアレイは、開口部直径Ｄ２約４．９２μｍ、底面部直径Ｄ１約３．８２μｍ、高さＨ約３μｍの円錐台のウェルを有しており、基板１１０としては、ガラス基板を使用した。
また、疎水性樹脂１２０として、ポジ型フォトレジスト（型番「ＰＦＩ８９−Ｂ４」）住友化学社製を使用した。
【００７５】
＜実験例２＞
実験例１と同様にして、実験例２のマイクロウェルアレイを作製した。
実験例２のマイクロウェルアレイは、開口部直径Ｄ２約６．９６μｍ、底面部直径Ｄ１約６．４６μｍ、高さＨ約３μｍの円錐台のウェルを有しており、基板１１０としては、ガラス基板を使用した。
また、疎水性樹脂１２０として、ポジ型フォトレジスト（型番「ＰＭＥＲ  Ｐ−ＨＡ  １００ＰＭ」、東京応化工業社製）を使用した。
また密着剤にはＨＭＤＳを使用した。
【００７６】
＜実験例３＞
実験例１、２と同様にして、実験例３のマイクロウェルアレイを作製した。
実験例３のマイクロウェルアレイは、開口部直径Ｄ２約５．３２μｍ、底面部直径Ｄ１約４．０８μｍ、高さＨ約３μｍの円錐台のウェルを有しており、基板１１０としては、ガラス基板を使用した。
また、疎水性樹脂１２０として、ポジ型フォトレジスト（型番「ＭＩＣＲＯ  ＰＯＳＩＴ  Ｓ１８１８」ローム＆ハース社製）を使用した。
【００７７】
実験施例１、２，３のマイクロウェルアレイ１００を備えるマイクロ流体デバイスを組み立てた。
続いて、上記のマイクロ流体デバイスに、シリンジを用いて、蛍光物質であるＦＩＴＣを適量溶解し、界面活性剤を適量含む水性液体を送液した。
その後、上記のマイクロ流体デバイスに、シリンジを用いてオイル（型番「ＦＣ４０」、シグマ社製）を送液した。
【００７８】
図５は、本実験例のマイクロ流体デバイスにオイルを送液した後の状態を示す断面図である。
マイクロ流体デバイス１０００は、マイクロウェルアレイを保持する底部部材１１１０と、蓋部材１２００と、マイクロ流路１３００とを備えていた。
本実験例においては、底部部材１１１０は、実験例１のマイクロウェルアレイ１００の基板１１０と一体になっている。
すなわち、実験例１のマイクロウェルアレイ１００は、底部部材１１１０を基板１１０として形成されたものであった。
【００７９】
実験例１，２，３のマイクロ流体デバイス１０００に、水性液体４４０として、界面活性剤を適量含むＦＩＴＣ溶液を送液すると、マイクロウェルアレイ１００のウェル内に水性液体４４０が導入された。
【００８０】
続いて、マイクロ流体デバイス１０００にオイル４５０を送液すると、図５に示すように、マイクロウェルアレイ１００のウェル内に水性液体４４０を保持した状態で、ウェルのウェル入り口近傍にオイル４５０の層が形成された。
すなわち、マイクロウェルアレイ１００のウェル内に水性液体４４０が封入された。
各ウェルは、微小体積の水性液体４４０中で種々の生化学的又は化学的反応を行う化学反応容器として機能する。
【００８１】
図６は、オイルを送液した後の、実験例１のマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。
その結果、図６に示すように、実験例１のマイクロウェルアレイのウェルのパターンに、規則正しくＦＩＴＣの蛍光が観察された。
図６において、白く見える部分が蛍光を発しているウェルであり、黒い部分は基板である。  
この結果は、実験例１のマイクロウェルアレイの各ウェルに、ＦＩＴＣ溶液を封入することができたことを示す。
【００８２】
なお、実験例１のマイクロウェルアレイにおいて、疎水性樹脂として使用したノボラック樹脂は自家蛍光を有するが、その蛍光値は十分に低く、検出対象であるＦＩＴＣの蛍光値と十分な差があるため、ＦＩＴＣの蛍光の検出には支障がない。
【００８３】
図７は、オイルを送液した後の、実験例２のマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。
その結果、図７に示すように、実験例２のマイクロウェルアレイのウェルのパターンに、規則正しくＦＩＴＣの蛍光が観察された。
図７において、白く見える部分が蛍光を発しているウェルであり、黒い部分は基板である。  
この結果は、実験例２のマイクロウェルアレイの各ウェルに、ＦＩＴＣ溶液を封入することができたことを示す。
【００８４】
図８は、オイルを送液した後の、実験例３のマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。
その結果、図８に示すように、実験例３のマイクロウェルアレイのウェルのパターンに、規則正しくＦＩＴＣの蛍光が観察された。
図８において、白く見える部分が蛍光を発しているウェルであり、黒い部分は基板である。  
この結果は、実験例３のマイクロウェルアレイの各ウェルに、ＦＩＴＣ溶液を封入することができたことを示す。
【００８５】
＜実験例４＞
実験例１〜３と同様にして、実験例４のマイクロウェルアレイを作製した。
実験例４のマイクロウェルアレイは、開口部直径Ｄ２約４．１０μｍ、底面部直径Ｄ１約２．３２μｍ、高さＨ約３μｍの円錐台のウェルを有しており、基板１１０としては、ガラス基板を使用した。
また、疎水性樹脂１２０として、ネガ型フォトレジスト（型番「ＺＰＮ１１５０−９０」日本ゼオン社製）を使用した。
【００８６】
＜実験例５＞
実験例１〜４と同様にして、実験例５のマイクロウェルアレイを作製した。
実験例５のマイクロウェルアレイは、開口部直径Ｄ２約４．３４μｍ、底面部直径Ｄ１約２．８８μｍ、高さＨ約３μｍの円錐台のウェルを有しており、基板１１０としては、ガラス基板を使用した。
また、疎水性樹脂１２０として、ネガ型フォトレジスト（型番「ＺＰＮ１１５０−９０」）を使用した。
【００８７】
実験例１〜３と同様にして、実験例４，５のマイクロウェルアレイ１００を備えるマイクロ流体デバイスを組み立てた。
【００８８】
続いて、上記のマイクロ流体デバイスに、シリンジを用いて、蛍光物質であるＦＩＴＣを適量溶解し、界面活性剤を適量含む水性液体を送液した。
その後、上記のマイクロ流体デバイスに、シリンジを用いてオイル（型番「ＦＣ４０」、シグマ社製）を送液した。
【００８９】
図９は、本実験例のマイクロ流体デバイスにオイルを送液した後の状態を示す断面図である。
図１０は、オイルを送液した後の、実験例４のマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。
その結果、図１０に示すように、実験例４のマイクロウェルアレイにおいては、複数のウェルにまたがって蛍光が観測され、ウェルのパターンに沿った規則正しいＦＩＴＣの蛍光は観察されなかった。
この結果は、実験例４のマイクロウェルアレイには、ＦＩＴＣ溶液を封入することができなかったことを示す。
【００９０】
図１１は、オイルを送液した後の、実験例５のマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。
その結果、図１１に示すように、実験例５のマイクロウェルアレイにおいては、複数のウェルにまたがって蛍光が観測され、ウェルのパターンに沿った規則正しいＦＩＴＣの蛍光は観察されなかった。
この結果は、実験例５のマイクロウェルアレイには、ＦＩＴＣ溶液を封入することができなかったことを示す。
【００９１】
この結果は、実験例４，５のマイクロウェルアレイには、ＦＩＴＣ溶液を封入することができなかったことを示す。
すなわち、ある大きさ以上で底面が送液した液体に接着していないマイクロウェルが形成されている場合、水性溶液を保持することが困難となり、オイルを送液した際に、ウェル内の水性溶液が全てオイルに置き換わってしまうことが明らかとなった。
【００９２】
また、ウェル内の体積Ｖの溶液が、ある大きさ以上でウェル底面に接しているウェルを備えるマイクロウェルアレイは、水性溶液をウェル内に封入するために非常に有用であることを示す。
【００９３】
各実験例における、寸法を表１に示す。
【００９４】
【表１】
0006763127.tif 000002
【００９５】
ウェルの形状としては、表１に示すように、図２に示した容積Ｖ（１０−１８ｍ３）、底面積Ｓ１（１０−１２ｍ２）、開口部の平面積Ｓ２（１０−１２ｍ２）、開口部の最大径Ｄ２（μｍ）、底面の最大径Ｄ１（μｍ）、ウェルの底面から形成される側面の角度θ、高さＨ（μｍ）に対して、次のことがわかった。
【００９６】
容積Ｖが１ｆＬ〜６ｎＬ／ウェルであり、かつ、容積Ｖの仮数部が底面積Ｓ１（１０−１２ｍ２）の仮数部の１倍以上４．５倍以下、２倍以上４．３倍以下であり、３倍以上４．２倍以下となることが好ましい。
【００９７】
平面積Ｓ２（１０−１２ｍ２）が、底面積Ｓ１の０．５倍以上２．２倍以下、１倍以上２倍以下、１．１倍以上１．８倍以下であることが好ましい。
【００９８】
開口部の最大径Ｄ２（μｍ）が、底面の最大径Ｄ１（μｍ）の０．５倍以上１．５倍以下、０．７倍以上１．４倍以下、１倍以上１．３倍以下であることが好ましい。
【００９９】
側面角度θが、３０°以上１０３°以下、６０°以上１０３°以下、９０°以上１０３°以下であることが好ましい。あるいは、側面角度θが、７７°以上であり、かつ前記ウェルの容積Ｖ（１０−１８ｍ３）の仮数部の三乗根の値が３．５以上であることができる。
【０１００】
高さＨ（μｍ）が、最大径Ｄ１の０．２倍以上１０倍以下、は０．４倍以上５倍以下、０．６倍以上２倍以下であることが好ましい。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明によれば、ウェル内に水性液体を封入することが容易なマイクロウェルアレイを提供することができる。
また、上記のマイクロウェルアレイの製造方法、マイクロ流体デバイス、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法及び水性液体の分析方法を提供することができる。
例えば、生体由来のＤＮＡやＲＮＡ等の検出により診断を行う場合等に、微小な空間内へ試薬とともに核酸を入れることが可能となる。
【０１０２】
さらに、本発明の活用例として、微小な空間内で核酸の検出を行うことで、従来よりも高精度に遺伝子変異を検出できる。この技術は疾病原因となる遺伝子の早期検出や、より正確な診断を行うことが可能となる。
【符号の説明】
【０１０３】
１００，ｍ…マイクロウェルアレイ
１１０，１１００…基板
１１５…表面
１１２０…親水層
１２０，１１３０…疎水層
１０００…マイクロ流体デバイス
１１００…底部部材
１２００…蓋部材
１３００…マイクロ流路
１２１０…流路入口
１２２０流路出口
１４００…封止部材
ｍ…マイクロウェルアレイ
４４０…水性液体
４５０…オイル
【図１】
0006763127.tif 000003
【図２】
0006763127.tif 000004
【図３】
0006763127.tif 000005
【図４】
0006763127.tif 000006
【図５】
0006763127.tif 000007
【図６】
0006763127.tif 000008
【図７】
0006763127.tif 000009
【図８】
0006763127.tif 000010
【図９】
0006763127.tif 000011
【図１０】
0006763127.tif 000012
【図１１】
0006763127.tif 000013