(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
−  組換え細胞と、炭素源を含む培地とを接触させること；および
−  前記細胞により前記炭素源からラムノ脂質を製造するのに適した条件下で前記細胞を培養すること
を含む、少なくとも１つのラムノ脂質を製造する方法であって、
前記組換え細胞には、前記細胞の野生型と比較して前記細胞が酵素Ｅ１、Ｅ２およびＥ３の増大された活性を示すような遺伝子改変がなされており、ここで、前記酵素Ｅ１はα／βヒドロラーゼであり、前記酵素Ｅ２はラムノシルトランスフェラーゼＩであり、かつ前記酵素Ｅ３はラムノシルトランスフェラーゼＩＩであり、かつ、前記炭素源はブタン、１−ブタノール、２−ブタノール、１−ブタナール、ブタノン、酪酸およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ４分子である、前記方法。
【請求項２】
前記細胞には、前記細胞の野生型と比較して前記細胞が酵素オキシドレダクターゼの増大された活性を示すような遺伝子改変がなされている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オキシドレダクターゼが、ａｌｋＢ型オキシドレダクターゼ、モノオキシゲナーゼおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組換え細胞が、前記細胞の野生型と比較して酵素Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびオキシドレダクターゼの増大された活性を示し、かつ前記Ｃ４分子がブタンである、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記培地が、Ｃ４分子の培地中の全炭素含分の少なくとも４０質量％を含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
−  前記酵素Ｅ１が、３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸−ＡＣＰを経由してヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸への転化を触媒することができ、
−  前記酵素Ｅ２が、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートからα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの転化を触媒することができ、かつ
−  前記酵素Ｅ３が、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートからα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの転化を触媒することができる、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
−  前記酵素Ｅ１が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６およびそれらの断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
−  前記酵素Ｅ２が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１およびそれらの断片からなる群から選択され、かつ
−  前記酵素Ｅ３が、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５およびそれらの断片からなる群から選択され、
前記断片は、各酵素の配列と比較してアミノ酸残基の１０％までが欠失、挿入、置換またはそれらの組み合わせにより改変されているポリペプチド配列を含み、かつ、前記断片は各酵素の酵素活性の少なくとも１０％を含む、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドスピリルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）およびカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）からなる群の属から選択される、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＧＰｐ１２１、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＧＰｐ１２２、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＧＰｐ１２３、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＧＰｐ１２４およびＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＧＰｐ１０４、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ４２Ｃ１、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴＯＹ０１またはＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴＯＹ０２からなる群から選択される、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ラムノ脂質が、一般式（Ｉ）
【化１】
0006742918.tif 000012
［式中、
ｍは、２、１または０であり、
ｎは、１または０であり、
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、２個から２４個までの炭素原子を有する同一のまたは異なる有機基である］
を含む、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ブタン、１−ブタノール、２−ブタノール、１−ブタナール、ブタノン、酪酸およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ４分子から少なくとも１つのラムノ脂質を形成しうる細胞であって、前記細胞には、前記細胞の野生型と比較して前記細胞が酵素オキシドレダクターゼならびに酵素Ｅ１、Ｅ２およびＥ３の増大された活性を示すような遺伝子改変がなされており、ここで、前記酵素Ｅ１はα／βヒドロラーゼであり、前記酵素Ｅ２はラムノシルトランスフェラーゼＩであり、かつ前記酵素Ｅ３はラムノシルトランスフェラーゼＩＩであり、かつ
−  前記オキシドレダクターゼが、ａｌｋＢ型オキシドレダクターゼ、モノオキシゲナーゼおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）からなる群から選択され、
−  前記酵素Ｅ１が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６およびそれらの断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
−  前記酵素Ｅ２が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１およびそれらの断片からなる群から選択され、かつ
−  酵素Ｅ３が、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５からなる群から選択され、
前記断片は、各酵素の配列と比較してアミノ酸残基の１０％までが欠失、挿入、置換またはそれらの組み合わせにより改変されているポリペプチド配列を含み、かつ、前記断片は各酵素の酵素活性の少なくとも１０％を含む、前記細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の細胞であって、前記細胞が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドスピリルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）およびカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）からなる群の属から選択される、前記細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭素源から少なくとも１つのラムノ脂質を製造するための方法および細胞に関する。
【０００２】
発明の背景
市場では、石油化学原料から得られる現在入手可能な界面活性剤に対する適切な代替物の一つとして、再生可能な原料から製造される生分解性界面活性剤に対する幅広い需要が存在する。こうした需要は特に、石油化学原料の予見可能な不足や界面活性剤に対する需要の増大に伴って高まっている。こうした界面活性剤の少なくとも一例が、ラムノ脂質である。ラムノ脂質は、石油やその製品から製造される従来の界面活性剤に潜在的に取って代わることができ、これによって結果として生じる配合物の環境性能が必ず向上されうることから、ラムノ脂質は経済的に重要なクラスの代表例の一つとなっている。
【０００３】
こうしたラムノ脂質は、少なくとも１つのモノラムノシル脂質または２つのラムノース基（ジラムノシル脂質）および１つもしくは２つの３−ヒドロキシ脂肪酸残基を含む（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０１０）。ラムノ脂質は、界面活性特性を示す。この特性は、界面活性剤として使用するためのあらゆる種類の用途において必要とされる（Ｌｅｉｔｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９参照）。特にラムノ脂質は、家事、洗浄、化粧品、食品加工、製薬、植物保護および他の用途における界面活性剤として広範に使用されることができる。
【０００４】
こうしたラムノ脂質を製造するために現在用いられている方法では、様々なヒトおよび動物の病原性細菌の野生型の分離株が使用されており、特にシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属およびバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属の構成員が使用されている（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０１０）。こうした病原性生物が消費者に対して疾患を引き起こしうるという事実によって、こうした従来通りに製造されたラムノ脂質に対する顧客の容認性は著しく低減する。さらに、より高い安全上の要求によっても、資本支出の増大とおそらくは追加の製造ステップに起因して製造コストが増大する。こうしたラムノ脂質を使用した製品は、大抵は極めて低コストでの製造が可能な高生産量化学物質であるため、ラムノ脂質には、可能な限り低コストで顧客に対する健康上のリスクを伴わずに、また定められた特性を可能な限り伴って製造できることも必要とされる。
【０００５】
ラムノ脂質の製造に利用することのできる現行の方法は、こうした病原性生物および植物油を単独の基質かまたは補助基質として使用することを含んでいる（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０１０）。しかし、植物油は、他の炭素源、例えばグルコース、スクロースまたは多糖類、例えばデンプン、セルロースおよびヘミセルロース、グリセロール、ＣＯ、ＣＯ２またはＣＨ４と比べて比較的高価な原料である。国際公開第２０１２０１３５５４号（ＷＯ  ２０１２０１３５５４  Ａ１）に教示されているように、ラムノ脂質は、炭素源、例えばグルコース、スクロースまたは多糖類を用いて非病原性生物によっても製造される。
【０００６】
しかしそれでもなお、非病原性生物と代替的な再生可能原料とを使用して、効率的に（すなわち、安価に、そして健康の観点から安全に）、そして充分な量で、ラムノ脂質（特に、モノラムノシル脂質および／またはジラムノシル脂質）を製造することが求められている。
【０００７】
発明の説明
一態様によれば、本発明は、従来技術において存在する問題を解決しうる方法に関する。特に本発明は、少なくとも１つの炭素源の存在で組換え細胞を培養することによる少なくとも１つのラムノ脂質を製造する方法に関し、その際、該炭素源は、ちょうど４個の炭素原子を有する少なくとも１つのＣ４分子である。組換え細胞は、該細胞の野生型と比較して、酵素、すなわちα／βヒドロラーゼ、ラムノシルトランスフェラーゼＩまたはラムノシルトランスフェラーゼＩＩのうちの少なくとも１つの増大された活性を含む。本方法によって製造される望ましくない副生成物および中間体の量の減少を伴うモノラムノシル脂質および／またはジラムノシル脂質の高選択的な製造が可能となるため、本方法は特に有利でありうる。例えば、本発明の任意の態様により形成される中間体、例えばβ−ヒドロキシ脂肪酸の二量体（脂肪酸二量体）が、少なくとも現在利用可能な方法と比較してより少量で存在することができる。
【０００８】
本発明の任意の態様による方法のさらなる利点としては、これに限定されるものではないが、培養が容易である非病原性生物を利用できるという事実が挙げられる。もう１つの利点としては、本発明の任意の態様による方法を用いた場合には、油および単純な炭水化物基質（例えば、グルコース、フルクトースまたはスクロース）が唯一の基質または補助基質であることが必要とされない、という事実を挙げることができる。本発明の任意の態様によれば、所定の調節可能な特性を示すラムノ脂質を製造できることを、その他の利点とすることができる。また具体的には、ジラムノシル脂質を製造することができる。活性が増強されていない細胞を用いた場合よりも高い炭素空時収率でラムノ脂質を製造できることを、もう１つの利点とすることができる。
【０００９】
本発明の任意の態様によれば、本発明の任意の態様を用いて製造することができるラムノ脂質および／またはそれらのラムノ脂質混合物も、同様に本発明の対象とすることができる。本発明の任意の態様により製造することができるラムノ脂質および混合物を、有利には、少なくとも洗浄剤またはケア剤において、化粧品、皮膚用製剤または医薬製剤において、および植物保護用配合物、界面活性剤濃縮物等において使用することができる。
【００１０】
「ケア剤」という用語は、本明細書においては、物品を、外部の影響（例えば、時間、光、温度、圧力、汚染、該物品と接触する他の反応性化合物との化学反応等）および老化、汚染、材料疲労の作用を低減または回避して該物品の元の形態で保持するという目的を満たし、かつ／または、さらには該物品の所望のプラスの特性を向上させるための配合物を意味するものと理解される。物品の所望のプラスの特性の一例としては、例えば毛髪の光沢の向上または該物品の弾性の増大等といった特徴が挙げられる。
【００１１】
「植物保護用配合物」とは、本明細書においては、その調製物の性質により植物保護に使用される配合物を意味するものと理解されるべきである。これは特に、除草剤、殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、鳥害に対する保護物質、植物栄養素および土壌構造改良剤からなる群からの少なくとも１つの化合物が配合物に含まれている場合に該当する。
【００１２】
本発明の任意の態様により製造されたラムノ脂質を、家事、工業において、特に硬質表面、皮革および／またはテキスタイル上で使用されるケア剤および洗浄剤の成分として使用することができる。
【００１３】
本発明の一態様によれば、以下：
−  組換え細胞と、炭素源を含む培地とを接触させること；および
−  該細胞により該炭素源からラムノ脂質を製造するのに適した条件下で該細胞を培養すること
を含む、少なくとも１つのラムノ脂質を製造する少なくとも１つの方法であって、
該組換え細胞には、該細胞の野生型と比較して該細胞が酵素Ｅ１、Ｅ２およびＥ３のうちの少なくとも１つの増大された活性を示すような遺伝子改変がなされており、ここで、該酵素Ｅ１はα／βヒドロラーゼであり、該酵素Ｅ２はラムノシルトランスフェラーゼＩであり、かつ該酵素Ｅ３はラムノシルトランスフェラーゼＩＩであり、かつ該炭素源はＣ４分子である該方法が提供される。
【００１４】
本発明の他の態様によれば、Ｃ４分子から少なくとも１つのラムノ脂質を形成しうる細胞であって、該細胞には、該細胞の野生型と比較して該細胞が酵素オキシドレダクターゼならびに酵素Ｅ１、Ｅ２およびＥ３のうちの少なくとも１つの増大された活性を示すような遺伝子改変がなされており、ここで、該酵素Ｅ１はα／βヒドロラーゼであり、該酵素Ｅ２はラムノシルトランスフェラーゼＩであり、かつ該酵素Ｅ３はラムノシルトランスフェラーゼＩＩである該細胞が提供される。
【００１５】
より具体的には、本発明の任意の態様による細胞は、ラムノ脂質を形成しうるとともに、該細胞の野生型と比較して遺伝子産物ｒｈＩＡ、ｒｈＩＢおよびｒｈＩＣの少なくとも１つまたは該遺伝子産物のホモログの増大された活性を示す。少なくとも一例では、（国際公開第２０１２０１３５５４号（ＷＯ  ２０１２０１３５５４  Ａ１）に記載されているように）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の遺伝子ｒｈＩＡ、ｒｈＩＢおよびｒｈＩＣをＧＲＡＳ生物（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｒｅｇａｒｄｅｄ  ａｓ  ｓａｆｅ）に導入することにより、Ｃ４分子からラムノ脂質を製造することができる。一具体例では、本発明の任意の態様による細胞は、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０株であることができる。
【００１６】
特に、本明細書において言及されるＣ４分子は、Ｃ、Ｈおよび／またはＯを含む構造であることができる。特に、Ｃ４分子は、化合物の構造中にちょうど４個の炭素原子（すなわち、各単位中に４個を上回りも下回りもしない炭素原子）を含むあらゆる化合物であることができる。本発明の任意の態様による「Ｃ４分子」とは、ちょうど４個のＣ原子と、４個の炭素原子を有する化合物の構造中に認められる他の原子に応じて可変の数のＨ原子とを含む有機化合物を指す。Ｃ４分子は、Ｏ原子を含むこともできる。特に、本発明の任意の態様によるＣ４分子は、ブタンおよびブタンの酸化生成物であることができる。ブタンの酸化生成物としては、少なくとも、１−ブタノール、２−ブタノール、１−ブタナール、ブタノンおよび酪酸が挙げられる。特に、Ｃ４分子を、ブタン、１−ブタノール、２−ブタノール、１−ブタナール、ブタノン、酪酸（ブチレート）およびそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。Ｃ４分子は、テトロースであってもよい。
【００１７】
より具体的には、本発明の任意の態様により使用されるＣ４分子は、１種類のＣ４分子のみ（すなわち、ブタン、１−ブタノール、２−ブタノール、１−ブタナール、ブタノンまたは酪酸のみ）であることができる。一例では、使用されるＣ４分子は、ブタン、１−ブタノール、２−ブタノール、１−ブタナール、ブタノンおよび酪酸からなる群から選択されるＣ４分子のいずれかの組み合わせであることができる。例えば、本発明の任意の態様によるＣ４分子は、ブタンと１−ブタノール、ブタンと２−ブタノール、ブタンと１−ブタナール、ブタンとブタノン、ブタンと酪酸等の組み合わせであることができる。一例では、本発明の任意の態様によれば、炭素源として使用される少なくとも３つ、４つ、５つまたは６つの異なるＣ４分子が存在することができる。他の例では、本発明の任意の態様によれば、Ｃ４分子として使用される、ブタンと１−ブタノールと酪酸との組み合わせが存在することができる。他の例では、本発明の任意の態様によれば、炭素源として、テトロースを、単独で使用することもできるし、ブタンおよびブタンの酸化生成物と組み合わせて使用することもできる。
【００１８】
本発明の任意の態様により使用される培地は、少なくとも１つの炭素源を含む。培地中の炭素源は、少なくともＣ４分子であることができる。特に、培地中の炭素源は、ほぼＣ４分子からなることもできるし、実質的にＣ４分子を含むこともできる。特に、Ｃ４分子の全量は、全培地におけるＣ４分子炭素源の培地中の全炭素含分の少なくとも２０質量％、少なくとも４０質量％、少なくとも５０質量％、少なくとも６０質量％もしくは少なくとも７０質量％であるか、または、全培地におけるＣ４分子炭素源の培地中の全炭素含分の２０質量％、４０質量％、５０質量％、６０質量％もしくは７０質量％に等しい。より具体的には、Ｃ４分子の全量は、培地中の炭素源の少なくとも５０質量％、少なくとも７０質量％もしくは少なくとも８０質量％であるか、または、培地中の炭素源の５０質量％、７０質量％もしくは８０質量％に等しい。さらにより具体的には、Ｃ４分子は、培地中の炭素源の少なくとも９０質量％であってもよし、培地中の炭素源の９０質量％に等しくてもよいし、培地中の炭素源の約１００％であってもよい。
【００１９】
一例では、培地は第２の炭素源を含むことができる。特に、該炭素源は、炭水化物、例えばグルコース、スクロース、アラビノース、キシロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロースおよびヘミセルロース、植物性および動物性の油および脂肪、例えば大豆油、ベニバナ油、ピーナッツ油、麻実油、ジャトロファ油、ヤシ脂肪、ヒョウタン油、アマニ油、コーン油、ケシ油、月見草油、オリーブ油、パーム核油、パーム油、菜種油、ゴマ油、ヒマワリ油、グレープシード油、クルミ油、麦芽油およびヤシ油、脂肪酸、例えばカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、γ−リノレン酸およびそのメチルエステルもしくはエチルエステル、ならびに脂肪酸混合物、上述のいずれかの脂肪酸を含有するモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド、アルコール、例えばグリセロール、エタノールおよびメタノール、炭化水素、例えばメタン、炭素を含有するガスおよびガス混合物、例えばＣＯ、ＣＯ２、合成ガスもしくは煙道ガス、アミノ酸、例えばＬ−グルタミン酸もしくはＬ−バリン、または有機酸、例えば酢酸であることができる。これらの物質を、個別に使用することもできるし、混合物として使用することもできる。米国特許第６，０１，４９４号明細書（ＵＳ  ６，０１，４９４）および米国特許第６，１３６，５７６号明細書（ＵＳ  ６，１３６，５７６）に記載されているように、炭素源として、炭水化物、特に単糖類、オリゴ糖類または多糖類、ならびに炭化水素、特にアルカン、アルケンおよびアルキン、ならびにそれらから誘導されるモノカルボン酸、およびこれらのモノカルボン酸から誘導されるモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド、ならびにグリセロールおよびアセテートを使用することができる。グリセロールと、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸および／またはγ−リノレン酸とのエステル化生成物を含むモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドを使用することができる。
【００２０】
本発明の任意の態様による大きな利点の一つは、本細胞によって、例えばブタンのような極めて単純な炭素源からラムノ脂質を形成することができるため、本発明の任意の態様による培地において長鎖の炭素源を準備しなくてもよいという点にある。このことは特に、本発明の任意の態様による培地において、６個を上回る炭素原子の鎖長を有するカルボン酸またはこれらから誘導可能なエステルもしくはグリセリドの検出可能な量を利用することができない場合に有利であるとすることができる。
【００２１】
塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水、または酸性化合物、例えばリン酸もしくは硫酸を、培地において、培養物のｐＨ調整のために適切に使用することができる。泡の発生を抑制するために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、適切な選択的作用物質、例えば抗生物質を培地に添加することができる。好気的条件を維持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば空気を培養物に取り入れることができる。
【００２２】
培養温度は、通常は、２０℃、２５℃よりも高いかまたは２０℃、２５℃に等しく、４０℃よりも高いかまたは４０℃に等しくてもよく、その際、有利には、少なくとも９５℃かまたは９５℃に等しい培養温度を用いることができ、具体的には少なくとも９０℃かまたは９０℃に等しい培養温度を用いることができ、より具体的には少なくとも８０℃かまたは８０℃に等しい培養温度を用いることができる。
【００２３】
当業者であれば、少なくともＣ４分子からラムノ脂質を製造するために、本発明の任意の態様による組換え細胞の培養に適した条件の構成要素となるものが何であるのかを理解するであろう。当業者であれば、当技術分野で知られている基本的な方法を用いて、本発明の任意の態様により使用される当該の細胞に適合するように培地内の条件を変更することができるであろう。
【００２４】
本発明の任意の態様による方法においては、該細胞により形成されるラムノ脂質を、場合により該細胞および／または培地から単離することができる。複合的な組成物から低分子物質を単離するための当技術分野で知られているあらゆる方法を適用することができる。生成物相において、例えば、ろ過、抽出、吸着（クロマトグラフィー）、結晶化等の方法を用いることができる。
【００２５】
生成物相における単離生成物は、他の不要なバイオマス残留物、ならびに種々の夾雑物、例えば油、脂肪酸および他の栄養培地成分をも含みうる。こうした夾雑物等の分離を無溶媒プロセスで行うことができる。したがって、例えば、単離生成物をまずｐＨ調整を容易にするために水で希釈することができる。次いで、それぞれ酸またはアルカリでのｐＨの低下または上昇によりラムノ脂質を水溶性の形態へと転化させることによって、生成物相および水相を均質化することができる。反応混合物を比較的高温で、例えば６０℃から９０℃まででインキュベートすることにより、および／または一定の混合を行って、水相へのラムノ脂質の溶解を支援することができる。その後、これに続くアルカリまたは酸によるｐＨの上昇または低下によって、ラムノ脂質を再度非水溶性の形態へと転化させることができ、それにより、該ラムノ脂質を水相から容易に分離することができる。その後、この生成物相を水で１回または複数回洗浄することにより、水溶性の夾雑物を除去することができる。
【００２６】
例えば、適切な溶媒を用いた、好ましくは有機溶媒を用いた抽出によって、油残渣を分離除去することができる。アルカン、例えばｎ−ヘキサン等を溶媒として用いることができる。
【００２７】
上記の無溶媒プロセスに代えて、水相からの生成物の分離を、適切な溶媒、例えばエステル、例えば酢酸エチル、酢酸ブチル等を用いて行うことができる。こうした抽出ステップを所望の順序で行うことができる。当業者であれば、ステップの順序および／または使用する溶媒を、抽出すべき細胞およびラムノ脂質に適するように容易に変更することができるであろう。
【００２８】
他の例では、本発明の任意の態様により製造されたラムノ脂質の抽出において、溶媒を使用することができる。特に、有機溶媒を使用することができる。より具体的には、ｎ−ペンタノールを溶媒として用いることができる。溶媒を除去するために、例えば蒸留を行う。その後、凍結乾燥された生成物をさらに、例えばクロマトグラフィー法により精製することができる。例として、適切な溶媒による沈殿、適切な溶媒による抽出、例えばシクロデキストリンもしくはシクロデキストリン誘導体による錯体形成、クロマトグラフィー法による結晶化、精製もしくは単離、または容易に分離可能な誘導体へのラムノ脂質の転化を用いることができる。
【００２９】
本発明の任意の態様により使用される組換え細胞には、該細胞の野生型と比較して該細胞が酵素Ｅ１、Ｅ２およびＥ３のうちの少なくとも１つの増大された活性を示すような遺伝子改変がなされており、ここで、該酵素Ｅ１はα／βヒドロラーゼであり、該酵素Ｅ２はラムノシルトランスフェラーゼＩであり、かつ該酵素Ｅ３はラムノシルトランスフェラーゼＩＩである。本発明の任意の態様により使用される組換え細胞は、国際公開第２０１２０１３５５４号（ＷＯ  ２０１２０１３５５４  Ａ１）に開示された方法により作出されることができる。
【００３０】
特に、本発明の任意の態様による細胞において、酵素Ｅ１は、３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸−ＡＣＰを経由してヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸への転化を触媒することができ、酵素Ｅ２はラムノシルトランスフェラーゼＩであることができ、これは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートからα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの転化を触媒することができ、かつ酵素Ｅ３はラムノシルトランスフェラーゼＩＩであることができ、これは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートからα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの転化を触媒することができ、その際、これらの酵素Ｅ１、Ｅ２およびＥ３は、以下：
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６およびそれらの断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの酵素Ｅ１；
配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１およびそれらの断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの酵素Ｅ２；および
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５およびそれらの断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの酵素Ｅ３；
からなる群から選択されることができる。酵素Ｅ１、Ｅ２およびＥ３のうちのいずれか１つに関する断片は、各酵素の配列と比較してアミノ酸残基の２５％までが欠失、挿入、置換またはそれらの組み合わせにより改変されているポリペプチド配列を含むことができ、かつ該断片は各酵素の酵素活性の少なくとも１０％を含む。
【００３１】
特に、本発明の任意の態様による細胞における酵素Ｅ１は、以下：
配列番号２のポリペプチド配列を含むか、または、配列番号２の参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号２の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、特に９０％超を示すポリペプチド配列を有する、酵素Ｅ１ａ、ここで、酵素Ｅ１ａに関する酵素活性とは、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰを３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸−ＡＣＰを経由してヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味するものと理解されることができる、
配列番号３のポリペプチド配列を含むか、または、配列番号３の参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号３の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、特に９０％超を示すポリペプチド配列を有する、酵素Ｅ１ｂ、ここで、酵素Ｅ１ｂに関する酵素活性とは、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰを３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸−ＡＣＰを経由してヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味するものと理解されることができる、
配列番号４のポリペプチド配列を含むか、または、配列番号４の参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号４の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、特に９０％超を示すポリペプチド配列を有する、酵素Ｅ１ｃ、ここで、酵素Ｅ１ｃに関する酵素活性とは、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰを３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸−ＡＣＰを経由してヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味するものと理解されることができる、
配列番号５のポリペプチド配列を含むか、または、配列番号５の参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号５の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、特に９０％超を示すポリペプチド配列を有する、酵素Ｅ１ｄ、ここで、酵素Ｅ１ｄに関する酵素活性とは、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰを３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸−ＡＣＰを経由してヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味するものと理解されることができる、および
配列番号６のポリペプチド配列を含むか、または、配列番号６の参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号６の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、特に９０％超を示すポリペプチド配列を有する、酵素Ｅ１ｅ、ここで、酵素Ｅ１ｅに関する酵素活性とは、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰを３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸−ＡＣＰを経由してヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味するものと理解されることができる、
からなる群から選択されることができる。
【００３２】
特に、本発明の任意の態様による細胞において使用される酵素Ｅ２は、以下：
配列番号７のポリペプチド配列を有するか、または、配列番号７の参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号７の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、特に９０％超を示すポリペプチド配列を有する、酵素Ｅ２ａ、ここで、酵素Ｅ２ａに関する酵素活性とは、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味するものと理解されることができる、
配列番号８のポリペプチド配列を有するか、または、配列番号８の参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号８の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、特に９０％超を示すポリペプチド配列を有する、酵素Ｅ２ｂ、ここで、酵素Ｅ２ｂに関する酵素活性とは、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味するものと理解されることができる、
配列番号９のポリペプチド配列を有するか、または、配列番号９の参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号９の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、特に９０％超を示すポリペプチド配列を有する、酵素Ｅ２ｃ、ここで、酵素Ｅ２ｃに関する酵素活性とは、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味するものと理解されることができる、
配列番号１０のポリペプチド配列を有するか、または、配列番号１０の参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号１０の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、特に９０％超を示すポリペプチド配列を有する、酵素Ｅ２ｄ、ここで、酵素Ｅ２ｄに関する酵素活性とは、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味するものと理解されることができる、および
配列番号１１のポリペプチド配列を有するか、または、配列番号１１の参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号１１の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、特に９０％超を示すポリペプチド配列を有する、酵素Ｅ２ｅ、ここで、酵素Ｅ２ｅに関する酵素活性とは、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味するものと理解されることができる、
からなる群から選択されることができる。
【００３３】
特に、本発明の任意の態様による細胞において使用される酵素Ｅ３は、以下：
配列番号１２のポリペプチド配列を有するか、または、配列番号１２の参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号１２の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、特に９０％超を示すポリペプチド配列を有する、酵素Ｅ３ａ、ここで、酵素Ｅ３ａに関する酵素活性とは、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味するものと理解されることができる、
配列番号１３のポリペプチド配列を有するか、または、配列番号１３の参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号１３の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、特に９０％超を示すポリペプチド配列を有する、酵素Ｅ３ｂ、ここで、酵素Ｅ３ｂに関する酵素活性とは、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味するものと理解されることができる、
配列番号１４のポリペプチド配列を有するか、または、配列番号１４の参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号１４の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、特に９０％超を示すポリペプチド配列を有する、酵素Ｅ３ｃ、ここで、酵素Ｅ３ｃに関する酵素活性とは、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味するものと理解されることができる、および
配列番号１５のポリペプチド配列を有するか、または、配列番号１５の参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号１５の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、特に９０％超を示すポリペプチド配列を有する、酵素Ｅ３ｄ、ここで、酵素Ｅ３ｄに関する酵素活性とは、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味するものと理解されることができる、
からなる群から選択されることができる。
【００３４】
当業者であれば、酵素Ｅ１ａからＥ３ｂまでに関して上記で示した活性がこれらの酵素の広範な活性のうちの特定の例示的な選択にすぎないことを理解するであろう。前述の各活性は、このような活性に対して所与の酵素について信頼性の高い測定方法を用いることができる、という活性である。したがって、非分岐状の飽和Ｃ１０アルキル基を有する基質を伴う酵素が、場合により分岐状であっても不飽和であってもよいＣ６アルキル基またはＣ１６アルキル基を含む基質をも転化しうることは明らかである。
【００３５】
本発明の任意の態様による組換え細胞には、該細胞の野生型と比較して該細胞が酵素オキシドレダクターゼの増大された活性を示すような遺伝子改変がなされていてもよい。特に該細胞には、該細胞がＥ１、Ｅ２もしくはＥ３またはこれらの組み合わせおよびオキシドレダクターゼの増大された活性を示すような遺伝子改変がなされていてもよい。より具体的には、該細胞は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびオキシドレダクターゼの増大された活性を示すことができる。一例では、該細胞は、Ｅ１およびＥ２およびオキシドレダクターゼの増大された活性を示すか、またはＥ１およびＥ３およびオキシドレダクターゼの増大された活性を示すか、またはＥ２およびＥ３およびオキシドレダクターゼの増大された活性を示す。
【００３６】
オキシドレダクターゼは、ａｌｋＢ型オキシドレダクターゼであってもよい。オキシドレダクターゼのこのａｌｋＢというクラスは、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）のＡｌｋＢＧＴ系からのレドックスタンパク質であり、これは２つの補助ポリペプチドであるａｌｋＧおよびａｌｋＴに依存する。ＡｌｋＴとは、電子をＮＡＤＨからａｌｋＧへ移動するＦＡＤ依存型ルブレドキシンレダクターゼである。ＡｌｋＧとは、ａｌｋＢへの直接電子供与体として機能する鉄含有レドックスタンパク質であるルブレドキシンである。一具体例では、ａｌｋＢ型オキシドレダクターゼは、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）Ｇｐｏ１由来のａｌｋＢである（アクセッション番号：ＣＡＢ５４０５０．１（バージョン１）、配列番号１、本願において使用されるすべてのアクセッション番号は、ＮＣＢＩによって提供されるジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）のデータベースからの各配列を指し、その際、言及されるリリースは、２０１４年４月４日付けでオンラインで入手可能なものである）。
【００３７】
酵素ａｌｋＢ型オキシドレダクターゼは、配列番号１のポリペプチド配列を有するか、または、配列番号１の参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号１の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、特に９２％超を示すポリペプチド配列を有し、ここで、酵素ａｌｋＢ型オキシドレダクターゼに関する酵素活性とは、本発明の任意の態様により炭素源としてブタンを使用する場合に、すなわちＣ４分子としてブタンを使用する場合に、好ましくはブタンを１−ブタノールおよび／または２−ブタノールへと転化させる能力を意味するものと理解されることができる。
【００３８】
オキシドレダクターゼは、モノオキシゲナーゼであることができる。特に、モノオキシゲナーゼはＰ４５０型モノオキシゲナーゼであることができ、例えばカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）由来のシトクロムＰ４５０であるか、またはシサー・アリティナム（Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）由来のシトクロムＰ４５０であることができる。より具体的にはＣＹＰ１５３モノオキシゲナーゼであり、例えばアルカニボラックス・ボルクメンシス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ）ＳＫ２由来のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＹＰ＿６９１９２１）である。該モノオキシゲナーゼを、ブタンからアルコールへの最初の酸化において使用することができる。
【００３９】
他の例では、オキシドレダクターゼは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）であることができる。特に、ＡＤＨは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＭＳ  １８７−１由来（ＺＰ＿０７１４５０２３）であってもよいし、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来（Ｐ４２３２８）であってもよいし、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来（ＡＣＢ７８１９１．１）であってもよいし、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）由来（ＹＰ＿７９５１８３．１）であってもよいし、ラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）由来（ＡＣＦ９５８３２．１）であってもよいし、馬の肝臓由来であってもよいし、パラコッカス・パントトロファス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｐａｎｔｏｔｒｏｐｈｕｓ）由来（ＡＣＢ７８１８２．１）であってもよいし、スフィンゴビウム・ヤノイクヤエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ）由来（ＥＵ４２７５２３．１）であってもよい。一例では、ＡＤＨは、例えば、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）由来のフラビン依存型ＡＤＨ（ＡＡＳ４６８７８．１）であることができる。本発明の任意の態様により炭素源としてブタノールを使用する場合には、すなわちＣ４分子としてブタノールを使用する場合には、該ＡＤＨを直接使用することもできるし、該ＡＤＨを現場でブタンから製造することもできる。
【００４０】
一例では、オキシドレダクターゼは、グルコース−メタノール−コリン−オキシドレダクターゼファミリー由来であることができ、特にカウロバクターｓｐ．Ｋ３１（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｋ３１）由来（ＡＢＺ７４５５７．１）であることができる。本発明の任意の態様により炭素源としてブタノールを使用する場合には、すなわちＣ４分子としてブタノールを使用する場合には、この特定のオキシドレダクターゼを直接使用することもできるし、この特定のオキシドレダクターゼを現場でブタンから製造することもできる。
【００４１】
「酵素の増大された活性」という用語は、増大された細胞内活性を意味するものと理解される。
【００４２】
細胞における酵素活性の増大に関連する以下の説明および定義は、酵素Ｅ１からＥ３までおよびオキシドレダクターゼの活性の増大に関してだけではなく、本開示においてその後に言及される酵素であってその活性を任意に増大させることのできるあらゆる酵素の活性の増大に関しても該当する。特に、酵素Ｅ１、Ｅ２およびＥ３に関連して本明細書全体を通して記載される方法はいずれも、本発明の任意の態様による組換え細胞中に場合により存在しうる酵素オキシドレダクターゼへの適用が可能である。
【００４３】
原理的には、酵素活性の増大は、酵素をコードする１つもしくは複数の遺伝子配列のコピー数を増加させることにより、強力なプロモーターもしくは改良されたリボソーム結合部位を用いることにより、例えば転写調節因子により遺伝子発現の負の制御を低減するかもしくは遺伝子発現の正の制御を増幅することにより、遺伝子のコドン使用頻度を改変することにより、種々の方法でｍＲＮＡもしくは酵素の半減期を延長させることにより、遺伝子発現の制御を改変することにより、または増大された活性を示す適切な酵素をコードする遺伝子もしくは対立遺伝子を利用することにより、ならびに、場合によりこれらの手段を組み合わせることにより、達成可能である。本発明の任意の態様によれば、遺伝子改変細胞は、例えば、所望の遺伝子、該遺伝子の対立遺伝子またはその一部を含むとともに、該遺伝子の発現を可能にするプロモーターを場合により含むベクターを用いて、形質転換、形質導入、接合またはこれらの方法の組合せにより、製造される。異種発現は、特に、細胞の染色体かまたは染色体外で複製するベクターに遺伝子または対立遺伝子を組み込むことにより達成される。
【００４４】
独国特許出願公開第１００３１９９９号明細書（ＤＥ−Ａ−１００３１９９９）には、ピルビン酸カルボキシラーゼにより例示されるような、細胞における酵素活性を増大させるための幾つかの例が示されている。当業者であれば、本発明の任意の態様により細胞において酵素活性を増大させるために、独国特許出願公開第１００３１９９９号明細書（ＤＥ−Ａ−１００３１９９９）に開示された方法を容易に用いることができるであろう。
【００４５】
上記および下記すべてにおいて挙げられる酵素または遺伝子の発現は、１次元および／または２次元タンパク質ゲル分離と、それに続く適切な分析ソフトウェアを用いたゲル中タンパク質濃度の光学的同定とを用いて検出することができる。酵素活性の増大が対応する遺伝子の発現の増大にのみ基づく場合には、該酵素活性の増大の定量化を、野生型細胞と遺伝子改変細胞とで１次元または２次元タンパク質分離を比較することにより容易に求めることができる。コリネバクテリウム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の場合のタンパク質ゲルの調製およびタンパク質の同定のための慣用的方法は、２００１年にＨｅｒｍａｎｎらにより記載された手法である。タンパク質濃度を、検出すべきタンパク質に特異的な抗体を用いたウエスタンブロットハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）およびそれに続く濃度測定に適したソフトウェアを用いた光学的分析（Ｌｏｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ，  １９８９）により分析することができる。ＤＮＡ結合タンパク質の活性を、（ゲル遅延とも呼ばれる）ＤＮＡバンドシフトアッセイを用いて測定することができる（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。他の遺伝子の発現に及ぼすＤＮＡ結合タンパク質の作用を、様々な周知のレポーター遺伝子アッセイ法により検出することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）。細胞内酵素活性は、種々の確立された方法によっても測定可能である（Ｄｏｎａｈｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；Ｆｒｅｅｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７３）。以下の例において正確な酵素の活性を測定するための特定の方法が示されていない場合には、酵素活性の増大の測定または酵素活性の低減の測定を、Ｈｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１、Ｌｏｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８、Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，１９９９およびＷｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１に記載された方法を用いて行うことができる。
【００４６】
酵素活性の増大が内在性遺伝子の突然変異によって達成される場合には、そのような突然変異を、従来の方法、例えばＵＶ照射または突然変異誘発性化学薬品のいずれかによってランダムに行うこともできるし、遺伝子工学的方法、例えば欠失、挿入および／またはヌクレオチド交換により選択的に行うこともできる。こうした突然変異によって改変細胞が得られる。特に、もはやフィードバック阻害性も生成物阻害性も基質阻害性も示さない酵素、またはそうした阻害性が少なくとも野生型酵素と比較して低減された程度である酵素も、酵素の突然変異体である。
【００４７】
酵素活性の増大を酵素合成の増大により達成する場合、対応する遺伝子のコピー数を増加させることもできるし、プロモーターおよび調節領域、または構造遺伝子の上流に位置するリボソーム結合部位を突然変異させることもできる。構造遺伝子の上流に組み込まれる発現カセットも、同様に機能する。また、少なくとも１つの誘導性プロモーターを利用して、任意の所望の時点で遺伝子発現を増大させることも可能である。ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡとの間での改善された相互作用により同様に増大された遺伝子発現を引き起こす調節配列として重要である酵素遺伝子には、「エンハンサー」も属しうる。発現は、ｍＲＮＡの寿命を延長させるための手段の結果としても同様に改善される。さらに、酵素タンパク質の分解を妨げることによっても同様に、酵素活性を増大させることができる。ここで、遺伝子または遺伝子構築物は、異なるコピー数を有するプラスミド中に存在するか、または染色体に組み込まれて増幅される。他の例では、培地組成および培養管理を変更することにより、当該遺伝子の過剰発現を達成することが可能である。当業者は、これに関する手引きを、特にＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７、Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４、Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉｎａｇａ，  １９８８、Ｅｉｋｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１、欧州特許出願公開第０４７２８６９号明細書（ＥＰ−Ａ−０４７２８６９）、米国特許第４，６０１，８９３号明細書（ＵＳ  ４，６０１，８９３）、Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ  ａｎｄ  Ｐｕｅｈｌｅｒ，  １９９１、Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４、ＬａＢａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３、国際公開第９６／１５２４６号（ＷＯ  ９６／１５２４６  Ａ）、Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３、特開平１０−２２９８９１号公報（ＪＰ  １０２２９８９１  Ａ）、Ｊｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｍｍｅｒ，  １９９８、ならびに遺伝学および分子生物学の知られている教本において見出す。上述の手段によっても同様に、突然変異のように、本発明の任意の態様において使用することができる遺伝子改変細胞が生じる。
【００４８】
各遺伝子の発現を増大させるために、例えばエピソームプラスミドを使用する。適切なプラスミドまたはベクターは、原則として、当業者がこの目的のために理論的に利用することができるあらゆるものである。こうしたプラスミドおよびベクターは、例えばＮｏｖａｇｅｎ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社またはＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ社のパンフレットから得ることができる。特に、プラスミドおよびベクターを、Ｇｌｏｖｅｒ，  Ｄ．  Ｍ．，  １９８５、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  Ｒ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，  Ｄ．  Ｔ，  １９８８、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，  Ｓｔｏｎｅｈａｍ；Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｄ．  Ｖ．，  １９９０、Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．，  １９８９において見出すことができる。
【００４９】
次いで、増幅すべき遺伝子を含むプラスミドベクターを、接合または形質転換によって所望の株に転化させる。接合方法は、例えばＳｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４に記載されている。形質転換方法は、例えば少なくとも、Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８、Ｄｕｎｉｃａｎ  ａｎｄ  Ｓｈｉｖｎａｎ，  １９８９およびＴａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４に記載されている。「交叉」事象による相同組換えの後、得られた株は当該遺伝子の少なくとも２つのコピーを含む。この方法を用いて、少なくとも遺伝子のコピー数を株において所望の数へと増加させることができる。
【００５０】
上記でおよび以下の実施例において用いられる「その野生型と比較して増大された酵素（Ｅｘ）の活性」という表現は、常に、各酵素Ｅｘの、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、より具体的には少なくとも１００倍、さらにより具体的には少なくとも１，０００倍、最も具体的には少なくとも１０，０００倍に増大された活性を意味するものと理解されるべきである。「その野生型と比較して増大された酵素（Ｅｘ）の活性」を示す本発明による任意の態様による細胞には、特に、細胞であって、該細胞の野生型はこの酵素Ｅｘの活性を含まないかまたは少なくともこの酵素Ｅｘの検出可能な活性を含まず、例えば過剰発現により酵素活性を増大させた後にのみこの酵素Ｅｘの検出可能な活性を示す細胞も含まれる。これに関連して、「過剰発現」という用語、または以下の例において用いられる「発現を増大させる」という表現には、出発細胞、例えば野生型細胞が発現を示さないかまたは少なくとも検出可能な発現を示さず、かつ酵素Ｅｘの検出可能な合成が組換え法によってのみ誘導されるという場合も含まれる。Ｅｘは、オキシドレダクターゼを指すこともできる。
【００５１】
本明細書における細胞の「野生型」とは、細胞であって、該細胞のゲノムが進化によって自然に形成されたままの状態で存在する細胞を意味する。この用語は、細胞全体と個々の遺伝子との双方に関して用いられる。したがって、「野生型」という用語には特に、遺伝子配列が少なくとも部分的に人間によって組換え法により改変されている細胞または遺伝子は含まれない。
【００５２】
特に、野生型細胞と比較した酵素活性の増大を、当技術分野において知られている従来の方法を用いて測定することができる。例えば、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３の活性の増大を、Ｂｕｒｇｅｒ，  Ｍ．  Ｍ．，  １９６３およびＢｕｒｇｅｒ，  Ｍ．  Ｍ．，  １９６６に開示された方法を用いて測定することができる。所与のポリペプチドの性質および機能に有意な変化をもたらさない所与のポリペプチド配列のアミノ酸残基の変化は、当業者に知られている。したがって、例えば、「保存されたアミノ酸」は相互に交換可能である。このような好適なアミノ酸置換の例としては、これらに限定されるものではないが、以下のものが挙げられる：Ａｌａに対してＳｅｒ；Ａｒｇに対してＬｙｓ；Ａｓｎに対してＧｌｎまたはＨｉｓ；Ａｓｐに対してＧｌｕ；Ｃｙｓに対してＳｅｒ；Ｇｌｎに対してＡｓｎ；Ｇｌｕに対してＡｓｐ；Ｇｌｙに対してＰｒｏ；Ｈｉｓに対してＡｓｎまたはＧｌｎ；Ｉｌｅに対してＬｅｕまたはＶａｌ；Ｌｅｕに対してＭｅｔまたはＶａｌ；Ｌｙｓに対してＡｒｇまたはＧｌｎまたはＧｌｕ；Ｍｅｔに対してＬｅｕまたはＩｌｅ；Ｐｈｅに対してＭｅｔまたはＬｅｕまたはＴｙｒ；Ｓｅｒに対してＴｈｒ；Ｔｈｒに対してＳｅｒ；Ｔｒｐに対してＴｙｒ；Ｔｙｒに対してＴｒｐまたはＰｈｅ；Ｖａｌに対してＩｌｅまたはＬｅｕ。例えばアミノ酸の挿入または欠失という形態での、特にポリペプチドのＮ末端またはＣ末端での変化は、ポリペプチドの機能に有意な影響を及ぼさないことが多いことも同様に知られている。
【００５３】
酵素の活性の測定は、この活性を含む細胞を、当業者に知られている方法で、例えばボールミル、フレンチプレスまたは超音波破砕機を用いて破壊することによって行うことができる。続いて、細胞、細胞破片および破壊補助物、例えばガラスビーズの分離を、少なくとも、４℃で１３，０００ｒｐｍで１０分間にわたる遠心分離により行うことができる。
【００５４】
その後、得られた無細胞粗抽出物を使用して、生成物の後続のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ検出を伴う酵素アッセイを行うことができる。あるいは、所望の酵素を、当業者に知られている手段によって、例えばクロマトグラフィー法（例えば、ニッケル−ニトリロ三酢酸アフィニティクロマトグラフィー、ストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー）によって濃縮するか、あるいは精製して均質にすることができる。
【００５５】
上記の通りに得られた酵素サンプルを用いて、酵素Ｅ１の活性を以下のように測定することができる：標準的なアッセイは、１００μΜ  大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＣＰ、１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、２００μΜ  マロニル補酵素Ａ、４０μΜ  オクタノイル補酵素Ａ（Ｅ１ａのため）またはドデカノイル補酵素Ａ（Ｅ１ｂのため）、１００μΜ  ＮＡＤＰＨ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦａｂＤ  ２μｇ、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＦａｂＨ  ２μｇ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦａｂＧ  １μｇ、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、および酵素Ｅ１  ５μｇを、最終体積１２０μＬで含むことができる。ＡＣＰ、β−メルカプトエタノールおよびリン酸ナトリウム緩衝液を３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ＡＣＰを完全に減少させる。次いで、酵素Ｅ１の添加により反応を開始させることができる。この反応を、ＨＣｌで酸性化してｐＨ２．０にしておいた水２ｍｌを使用して停止させることができ、その後、クロロホルム／メタノール（２：１（ｖ：ｖ））２ｍｌで２回抽出を行うことができる。その後、遠心分離（１６，１００ｇ、５分間、ＲＴ）により相分離を行う。下方の有機相を除去して真空遠心分離機中で完全に蒸発させることができ、そして沈殿物をメタノール５０μｌ中に取り込むことができる。未溶解成分を遠心分離（１６，１００ｇ、５分間、ＲＴ）によって沈殿物として除去し、このサンプルをＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用いて分析する。生成物の同定を、相応する質量トレースおよびＭＳ２スペクトルの分析により行う。
【００５６】
上記の通りに得られた酵素サンプルを用いて、酵素Ｅ２の活性を以下のように測定することができる：標準的なアッセイは、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１８５μｌ、１２５ｍＭ  ｄＴＤＰ−ラムノース  １０μｌ、およびタンパク質粗抽出物５０μｌ（総タンパク質約１ｍｇ）または溶解した精製タンパク質（精製タンパク質５μｇ）を含むことができる。３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸（Ｅ２ａのため）または３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸（Ｅ２ｂのため）の１０ｍＭ  エタノール性溶液１０μｌを添加することにより反応を開始させ、振とう（６００ｒｐｍ）しながら３０℃で１時間インキュベートする。その後、この反応をアセトン１ｍｌで処理することができる。未溶解成分を遠心分離（１６，１００ｇ、５分間、ＲＴ）によって沈殿物として除去し、このサンプルをＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用いて分析する。生成物の同定を、相応する質量トレースおよびＭＳ２スペクトルの分析により行う。
【００５７】
上記の通りに得られた酵素サンプルを用いて、酵素Ｅ３の活性を以下のように測定することができる：標準的なアッセイは、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１８５μｌ、１２５ｍＭ  ｄＴＤＰ−ラムノース１０μｌ、およびタンパク質粗抽出物５０μｌ（総タンパク質約１ｍｇ）または溶解した精製タンパク質（精製タンパク質５μｇ）を含むことができる。α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸（Ｅ３ａのため）またはα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸（Ｅ３ｂのため）の１０ｍＭ  エタノール性溶液１０μｌを添加することにより反応を開始させ、振とう（６００ｒｐｍ）しながら３０℃で１時間インキュベートする。その後、この反応をアセトン１ｍｌで処理することができる。未溶解成分を遠心分離（１６，１００ｇ、５分間、ＲＴ）により沈殿させ、このサンプルをＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用いて分析する。生成物の同定を、相応する質量トレースおよびＭＳ２スペクトルの分析により行う。
【００５８】
本発明の任意の態様による組換え細胞は、少なくともＥ１、Ｅ２および／またはＥ３の増大された活性を示すことができる。特に、該細胞は、Ｅ１、Ｅ２もしくはＥ３またはそれらの組み合わせの増大された活性を示すことができる。より具体的には、該細胞は、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３の増大された活性を示すことができる。一例では、該細胞は、Ｅ１およびＥ２の増大された活性を示すか、またはＥ１およびＥ３の増大された活性を示すか、またはＥ２およびＥ３の増大された活性を示す。
【００５９】
酵素オキシドレダクターゼの活性の測定は、当技術分野において知られているいずれの方法によっても行うことができる。特に、ａｌｋＢ型オキシドレダクターゼの活性は、国際公開第２００９／０７７４６１号（ＷＯ  ２００９／０７７４６１  Ａ１）に開示された方法を用いて測定することができ、Ｐ４５０型モノオキシゲナーゼの活性は、Ｓｃｈｅｐｓ，  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１において提供された方法を用いて測定することができ、ＡＤＨの活性は、Ｂｅｎｓｏｎ，  Ｓ．，  Ｓｈａｐｉｒｏ，  Ｊ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９７６，  １２６，  ７９４−７９８において提供された方法により測定することができる。
【００６０】
本発明の任意の態様による遺伝子改変細胞を、上記生成物の製造を目的として、バッチプロセス（バッチ培養）で、または流加プロセス（フィードプロセス）で、または反復流加プロセス（繰返しフィードプロセス）で、培地と連続的または非連続的に接触させ、そのようにして培養することができる。英国特許出願公開第１００９３７０号明細書（ＧＢ−Ａ−１００９３７０）に記載されているように、半連続法も考えられる。知られている培養法の概要は、Ｃｈｍｉｅｌの教本またはＳｔｏｒｈａｓの教本に記載されている。使用すべき培地は、適切な様式でそれぞれの株の要求を満たさなければならない。例えばＫｌａｕｓ  Ｗｏｌｆ，  １９９６には、様々な酵母株の培地の説明が掲載されている。
【００６１】
本発明の任意の態様による細胞は、原核生物であっても真核生物であってもよい。これらは、哺乳類の細胞（例えばヒト由来の細胞）であってもよいし、植物細胞であってもよいし、微生物、例えば酵母、真菌または細菌であってもよく、ここで、微生物が特に好ましく、細菌および酵母が最も好ましい。
【００６２】
適切な細菌、酵母または真菌は、特に、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、ブランズウィック、ドイツ連邦共和国において細菌、酵母または真菌の株として寄託されている細菌、酵母または真菌である。本発明により適した細菌は、以下：
−  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／ｓｐｅｃｉｅｓ／ｂａｃｔｅｒｉａ．ｈｔｍ
に挙げられた属に属しており、本発明により適した酵母は、以下：
−  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／ｓｐｅｃｉｅｓ／ｙｅａｓｔｓ．ｈｔｍ
に挙げられた属に属しており、本発明により適した真菌は、以下：
−  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／ｓｐｅｃｉｅｓ／ｆｕｎｇｉ．ｈｔｍ
に挙げられたものである。
【００６３】
特に、細胞を、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属およびカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属から選択することができる。より具体的には、細胞を、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アルカリゲネス・レータス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、バークホルデリア・アンドロポゴニス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｉｓ）、Ｂ．ブラシレンシス（Ｂ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｉｓ）、Ｂ．カレドニカ（Ｂ．ｃａｌｅｄｏｎｉｃａ）、Ｂ．カリベンシス（Ｂ．ｃａｒｉｂｅｎｓｉｓ）、Ｂ．カリオフィリ（Ｂ．ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ）、Ｂ．フンゴラム（Ｂ．ｆｕｎｇｏｒｕｍ）、Ｂ．グラディオリ（Ｂ．ｇｌａｄｉｏｌｉ）、Ｂ．グラセイ（Ｂ．ｇｌａｔｈｅｉ）、Ｂ．グルマエ（Ｂ．ｇｌｕｍａｅ）、Ｂ．グラミニス（Ｂ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、Ｂ．ホスピタ（Ｂ．ｈｏｓｐｉｔａ）、Ｂ．クルリエンシス（Ｂ．ｋｕｒｕｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．フェナジニウム（Ｂ．ｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）、Ｂ．フィマタム（Ｂ．ｐｈｙｍａｔｕｍ）、Ｂ．フィトファーマンス（Ｂ．ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、Ｂ．プランタリ（Ｂ．ｐｌａｎｔａｒｉｉ）、Ｂ．サッカリ（Ｂ．ｓａｃｃｈａｒｉ）、Ｂ．シンガポレンシス（Ｂ．ｓｉｎｇａｐｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ソルディデコーラ（Ｂ．ｓｏｒｄｉｄｉｃｏｌａ）、Ｂ．テリコーラ（Ｂ．ｔｅｒｒｉｃｏｌａ）、Ｂ．トロピカ（Ｂ．ｔｒｏｐｉｃａ）、Ｂ．チュベラム（Ｂ．ｔｕｂｅｒｕｍ）、Ｂ．ウボネンシス（Ｂ．ｕｂｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ウナマエ（Ｂ．ｕ��ａｍａｅ）、Ｂ．ゼノボランス（Ｂ．ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、Ｂ．アンチナ（Ｂ．ａｎｔｈｉｎａ）、Ｂ．ピロシニア（Ｂ．ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ）、Ｂ．タイランデンシス（Ｂ．ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）、カンジダ・ブランキィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｌａｎｋｉｉ）、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイウェロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、パラコッカス・ベルスタス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｒｓｕｔｕｓ）、シュードモナス・アルゼンチネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｒｇｅｎｔｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｐ．ボルボリ（Ｐ．ｂｏｒｂｏｒｉ）、Ｐ．シトロネロリス（Ｐ．ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）、Ｐ．フラベセンス（Ｐ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、Ｐ．メンドシナ（Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）、Ｐ．ニトロレデューセンス（Ｐ．ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ）、Ｐ．オレオボランス（Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、Ｐ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、Ｐ．レシノボランス（Ｐ．ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、Ｐ．ストラミネア（Ｐ．ｓｔｒａｍｉｎｅａ）、Ｐ．オーランティアカ（Ｐ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、Ｐ．オーレオファシエンス（Ｐ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｐ．クロロラフィス（Ｐ．ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、Ｐ．フラジ（Ｐ．ｆｒａｇｉ）、Ｐ．ルンデンシス（Ｐ．ｌｕｎｄｅｎｓｉｓ）、Ｐ．タエトロレンス（Ｐ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ）、Ｐ．アンタルクチカ（Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、Ｐ．アゾトホルマンス（Ｐ．ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）、’Ｐ・ブラッチフォルダエ（’Ｐ．ｂｌａｔｃｈｆｏｒｄａｅ’）、Ｐ．ブラッシカセアルム（Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ）、Ｐ．ブレンネリ（Ｐ．ｂｒｅｎｎｅｒｉ）、Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）、Ｐ．コルガタ（Ｐ．ｃｏｒｒｕｇａｔａ）、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、Ｐ．ゲッサルジイ（Ｐ．ｇｅｓｓａｒｄｉｉ）、Ｐ．リバネンシス（Ｐ．ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ）、Ｐ．マンデリイ（Ｐ．ｍａｎｄｅｌｉｉ）、Ｐ．マルジナリス（Ｐ．ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）、Ｐ．メジテラネア（Ｐ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）、Ｐ．メリジアナ（Ｐ．ｍｅｒｉｄｉａｎａ）、Ｐ．ミグラエ（Ｐ．ｍｉｇｕｌａｅ）、Ｐ．ムシドレンス（Ｐ．ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ）、Ｐ．オリエンタリス（Ｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、Ｐ．パナシス（Ｐ．ｐａｎａｃｉｓ）、Ｐ．プロテオリティカ（Ｐ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａ）、Ｐ．ローデシエ（Ｐ．ｒｈｏｄｅｓｉａｅ）、Ｐ．シンキサンタ（Ｐ．ｓｙｎｘａｎｔｈａ）、Ｐ．チベルバレンシス（Ｐ．ｔｈｉｖｅｒｖａｌｅｎｓｉｓ）、Ｐ．トラシイ（Ｐ．ｔｏｌａａｓｉｉ）、Ｐ．ベロニイ（Ｐ．ｖｅｒｏｎｉｉ）、Ｐ．デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、Ｐ．ペルツシノゲナ（Ｐ．ｐｅｒｔｕｃｉｎｏｇｅｎａ）、Ｐ．クレモリコロラタ（Ｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｃｏｌｏｒａｔａ）、Ｐ．フルバ（Ｐ．ｆｕｌｖａ）、Ｐ．モンテイリイ（Ｐ．ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）、Ｐ．モッセリイ（Ｐ．ｍｏｓｓｅｌｉｉ）、Ｐ．パラフルバ（Ｐ．ｐａｒａｆｕｌｖａ）、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）、Ｐ．バレアリカ（Ｐ．ｂａｌｅａｒｉｃａ）、Ｐ．スツッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、Ｐ．アミグダリ（Ｐ．ａｍｙｇｄａｌｉ）、Ｐ．アベラナエ（Ｐ．ａｖｅｌｌａｎａｅ）、Ｐ．カリカパパヤエ（Ｐ．ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａｅ）、Ｐ．チコリー（Ｐ．ｃｉｃｈｏｒｉｉ）、Ｐ．コロナファシエンス（Ｐ．ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ）、Ｐ．フィクセレクタエ（Ｐ．ｆｉｃｕｓｅｒｅｃｔａｅ）、’Ｐ．ヘリアンティ’（’Ｐ．ｈｅｌｉａｎｔｈｉ’）、Ｐ．メリアエ（Ｐ．ｍｅｌｉａｅ）、Ｐ．サバスタノイ（Ｐ．ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）、Ｐ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）、Ｐ．トマト（Ｐ．ｔｏｍａｔｏ）、Ｐ．ビリジフラバ（Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ）、Ｐ．アビエタニフィラ（Ｐ．ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａ）、Ｐ．アシドフィラ（Ｐ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）、Ｐ．アガリシ（Ｐ．ａｇａｒｉｃｉ）、Ｐ．アルカリフィラ（Ｐ．ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ）、Ｐ．アルカノリティカ（Ｐ．ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃａ）、Ｐ．アミロデラモサ（Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ）、Ｐ．アスプレニイ（Ｐ．ａｓｐｌｅｎｉｉ）、Ｐ．アゾチフィゲンス（Ｐ．ａｚｏｔｉｆｉｇｅｎｓ）、Ｐ．カンナビナ（Ｐ．ｃａｎｎａｂｉｎａ）、Ｐ．コエノビオス（Ｐ．ｃｏｅｎｏｂｉｏｓ）、Ｐ．コンゲランス（Ｐ．ｃｏｎｇｅｌａｎｓ）、Ｐ．コスタンチニイ（Ｐ．ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉｉ）、Ｐ．クルシビアエ（Ｐ．ｃｒｕｃｉｖｉａｅ）、Ｐ．デルヒエンシス（Ｐ．ｄｅｌｈｉｅｎｓｉｓ）、Ｐ．エクスシビス（Ｐ．ｅｘｃｉｂｉｓ）、Ｐ．エクストレモリエンタリス（Ｐ．ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、Ｐ．フレデリクスベルゲンシス（Ｐ．ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、Ｐ．フスコバギナエ（Ｐ．ｆｕｓｃｏｖａｇｉｎａｅ）、Ｐ．ゲリジコラ（Ｐ．ｇｅｌｉｄｉｃｏｌａ）、Ｐ．グリモンチイ（Ｐ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ）、Ｐ．インジカ（Ｐ．ｉｎｄｉｃａ）、Ｐ．ジェッセニイ（Ｐ．ｊｅｓｓｅｎｉｉ）、Ｐ．ジンジュエンシス（Ｐ．ｊｉｎｊｕｅｎｓｉｓ）、Ｐ．キロネンシス（Ｐ．ｋｉｌｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｐ．クナックムッシイ（Ｐ．ｋｎａｃｋｍｕｓｓｉｉ）、Ｐ．コーリエンシス（Ｐ．ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）、Ｐ．リニ（Ｐ．ｌｉｎｉ）、Ｐ．ルテア（Ｐ．ｌｕｔｅａ）、Ｐ．モラビエンシス（Ｐ．ｍｏｒａｖｉｅｎｓｉｓ）、Ｐ．オティティジス（Ｐ．ｏｔｉｔｉｄｉｓ）、Ｐ．パチャストレラエ（Ｐ．ｐａｃｈａｓｔｒｅｌｌａｅ）、Ｐ．パレロニアナ（Ｐ．ｐａｌｌｅｒｏｎｉａｎａ）、Ｐ．パパベリス（Ｐ．ｐａｐａｖｅｒｉｓ）、Ｐ．ペリ（Ｐ．ｐｅｌｉ）、Ｐ．ペロレンス（Ｐ．ｐｅｒｏｌｅｎｓ）、Ｐ．ポアエ（Ｐ．ｐｏａｅ）、Ｐ．ポハンゲンシス（Ｐ．ｐｏｈａｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｐ．サイクロフィラ（Ｐ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）、Ｐ．サイクロトレランス（Ｐ．ｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、Ｐ．ラトニス（Ｐ．ｒａｔｈｏｎｉｓ）、Ｐ．レプチリボラ（Ｐ．ｒｅｐｔｉｌｉｖｏｒａ）、Ｐ．レシニフィラ（Ｐ．ｒｅｓｉｎｉｐｈｉｌａ）、Ｐ．リゾスファエラエ（Ｐ．ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ）、Ｐ．ルベセンス（Ｐ．ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、Ｐ．サロモニイ（Ｐ．ｓａｌｏｍｏｎｉｉ）、Ｐ．セギティス（Ｐ．ｓｅｇｉｔｉｓ）、Ｐ．セプティカ（Ｐ．ｓｅｐｔｉｃａ）、Ｐ．シミアエ（Ｐ．ｓｉｍｉａｅ）、Ｐ．スイス（Ｐ．ｓｕｉｓ）、Ｐ．サーモトレランス（Ｐ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐ．トレマエ（Ｐ．ｔｒｅｍａｅ）、Ｐ．トリビアリス（Ｐ．ｔｒｉｖｉａｌｉｓ）、Ｐ．ツルビネラエ（Ｐ．ｔｕｒｂｉｎｅｌｌａｅ）、Ｐ．ツティコリネンシス（Ｐ．ｔｕｔｉｃｏｒｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｐ．ウムソンゲンシス（Ｐ．ｕｍｓｏｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｐ．バンクーベレンシス（Ｐ．ｖａｎｃｏｕｖｅｒｅｎｓｉｓ）、Ｐ．ブラノベンシス（Ｐ．ｖｒａｎｏｖｅｎｓｉｓ）、Ｐ．キサントマリナ（Ｐ．ｘａｎｔｈｏｍａｒｉｎａ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ロドスピリルム・ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびザイモモナス・モビル（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｅ）からなる群から選択することができる。さらにより具体的には、細胞を、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびバークホルデリア・タイランデンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）からなる群から選択することができる。
【００６４】
本発明の任意の態様によれば、細胞は、その野生型では、検出可能な量のラムノ脂質を形成することができず、かつ／または、酵素Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３および／またはオキシドレダクターゼの活性を示さないかまたはそれらの検出可能な活性を示さない。
【００６５】
本発明の任意の態様によれば、細胞が、その野生型で、Ｃ６〜Ｃ１６のモノアルカノエート鎖長を有するポリヒドロキシアルカノエートを形成しうることが有利である。そのような細胞は、例えば、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）の種、バークホルデリア・タイランデンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）、シュードモナス・レジノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）、アルカリゲネス・レータス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）、およびラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）である。これに関連して、本発明の任意の態様による細胞は、その野生型と比較して、該細胞がより少量のポリヒドロキシアルカノエートを形成しうるように遺伝子改変されることができる。そのような細胞は、例えば少なくとも、Ｄｅ  Ｅｕｇｅｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０およびＲｅｈｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１に記載されている。その野生型と比較してより少量のポリヒドロキシアルカノエートを形成しうるそのような組換え細胞は特に、該細胞が、その野生型と比較して、少なくとも１つの酵素Ｅ９またはＥ１０の低減された活性を示すことを特徴とする。
【００６６】
Ｅ９は、ポリヒドロキシアルカン酸シンターゼＥＣ：２．３．１．であって、特に、配列番号２０（Ｅ９ａ）もしくは配列番号２１（Ｅ９ｂ）のポリペプチド配列を有するか、または、配列番号２０もしくは配列番号２１の各参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号２０もしくは配列番号２１の各参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、特に少なくとも８０％、特に９０％超を示すポリペプチド配列を有するものを表し、ここで、酵素Ｅ９（Ｅ９ａおよびＥ９ｂ）に関する酵素活性とは、３−ヒドロキシアルカノイル−補酵素Ａをポリ−３−ヒドロキシアルカン酸へと転化させる能力、特に３−ヒドロキシテトラデカノイル−補酵素Ａをポリ−３−ヒドロキシテトラデカン酸へと転化させる能力を意味するものと理解されることができる。
【００６７】
Ｅ１０は、３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰ：補酵素Ａトランスフェラーゼであって、特に、配列番号２２（Ｅ１０ａ）もしくは配列番号２３（Ｅ１０ｂ）のポリペプチド配列を有するか、または、配列番号２２もしくは配列番号２３の各参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、特に１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号２２（Ｅ１０ａ）もしくは配列番号２３（Ｅ１０ｂ）の各参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、特に少なくとも８０％、特に９０％超を示すポリペプチド配列を有するものを表し、ここで、酵素Ｅ１０（Ｅ１０ａおよびＥ１０ｂ）に関する酵素活性とは、３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰを３−ヒドロキシ−アルカノイル−補酵素Ａへ転化する能力、特に３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰを３−ヒドロキシテトラデカノイル−補酵素Ａへ転化する能力を意味するものと理解されることができる。
【００６８】
例えば酵素Ｅ１からＥ３までに関して上記の通りに得られたサンプルを使用して、最初に、５６０μｌの１００ｍＭ  トリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５と、ＤＭＳＯ中の２０μｌの３５ｍＭ  ＤＴＮＢと、２０μｌの４１ｍＭ  ３−ヒドロキシデカノイル−補酵素Ａとを混合することにより、酵素Ｅ９（Ｅ９ａおよびＥ９ｂ）の活性を測定することができる。続いて、１００μｌのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５中の５μｇの精製酵素Ｅ９を添加し、続いて、（５，５’−ジチオビス（２−ニトロベンゾエート）（ＤＴＮＢ）を添加してＳＨ基を遊離させることにより引き起こされる）経時的な４１２ｎｍでの吸光度の増大（ΔＥ／分）を分光光度計で連続的に１分間記録する。
【００６９】
例えば酵素Ｅ１からＥ３までに関して上記の通りに得られたサンプルを用いて、酵素Ｅ１０（Ｅ１０ａおよびＥ１０ｂ）の活性を測定することができる。標準的なアッセイは、５０ｍｍ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中の、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０μＭ  ヒドロキシデカノイル−補酵素Ａ、および２０μＭ  大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＣＰを、２００μｌの全体積で含むことができる。５０μｌのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５中の５μｇの精製酵素Ｅ１０の添加により反応を開始させ、３０℃で１時間インキュベートする。５０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸および１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（３０μｌ）の添加により反応を停止させる。５，５’−ジチオビス（２−ニトロベンゾエート）（ＤＴＮＢ）を添加してＳＨ基を遊離させることにより引き起こされる４１２ｎｍでの吸光度の増大を経時的に記録することにより、放出された補酵素Ａを分光測光法により測定することができる。
【００７０】
本発明の任意の態様に関して用いられる「酵素Ｅｘの低減された活性」という表現は、少なくとも０．５倍、特に好ましくは少なくとも０．１倍、より具体的には少なくとも０．０１倍、さらにより具体的には少なくとも０．００１倍、最も具体的には少なくとも０．０００１倍に低減された活性を意味するものと理解されることができる。「低減された活性」という表現には、検出可能な活性を示さないこと（「ゼロの活性」）も含まれる。特定の酵素の活性の低減は、例えば選択的な突然変異により行うこともできるし、特定の酵素の活性を低減させるための当業者に知られている他の手段により行うこともできる。
【００７１】
特に、当業者は、特定の遺伝子の中断による、特にシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）に関するタンパク質発現の改変および低減ならびに酵素活性の付随的低減のための手引きを、例えば少なくともＤｕｂｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９．，  Ｓｉｎｇｈ  ＆  Ｒｏｅｈｍ．  ２００８．，  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９等に見出す。
【００７２】
本発明の任意の態様による細胞は、酵素活性の低減が、核酸配列の１つを含む遺伝子の改変により達成されることを特徴としており、この改変は、遺伝子への外来ＤＮＡの挿入、該遺伝子の少なくとも一部の欠失、該遺伝子配列中の点突然変異、ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、または例えばプロモーターおよびターミネーターといった調節配列の改変（挿入、欠失もしくは点突然変異）、または該遺伝子にフランキングするリボソーム結合部位の改変（挿入、欠失もしくは点突然変異）を含む群、それらで構成される群から選択される。
【００７３】
外来ＤＮＡは、これに関連して、（生物に対してではなく）遺伝子に対して「外来性」であるあらゆるＤＮＡ配列を意味するものと理解されるべきであり、すなわち、内在性ＤＮＡ配列もこれに関連して「外来ＤＮＡ」として機能しうる。これに関連して、遺伝子は、選択マーカー遺伝子の挿入により中断されることが特に好ましく、したがって外来ＤＮＡは選択マーカー遺伝子であり、その際、好ましくは、挿入は、その遺伝子座での相同的組換えにより行われたものである。
【００７４】
特に、本発明の任意の態様により使用されうる細胞は、その野生型と比較して低減されたポリヒドロキシアルカノエート合成を示すシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）細胞であることができる。そのような細胞は、例えば少なくとも、Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｈｕｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１、Ｄｅ  Ｅｕｇｅｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０およびＯｕｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７においてＫＴＯＹ０１およびＫＴＯＹ０２として記載されている。
【００７５】
本発明の方法により形成されるラムノ脂質は、少なくとも、一般式（Ｉ）：
【化１】
0006742918.tif 000002
［式中、
ｍは、２、１または０であり、特に１または０であり、
ｎは、１または０であり、特に１であり、
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、２個から２４個までの、好ましくは５個から１３個までの炭素原子を有する同一のまたは異なる有機基であり、特に、場合により分岐鎖状の、場合により置換された、特にヒドロキシ置換された、場合により不飽和の、特に場合によりモノ不飽和、ジ不飽和またはトリ不飽和のアルキル基であって、ペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニルおよびトリデセニル、ならびに（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ３〔ここで、ｏは、１から２３までであり、好ましくは４から１２までである〕からなる群から選択されることができるアルキル基である］
のものであるかまたはその塩であることができる。
【００７６】
本発明による任意の態様による細胞が、ｍ＝１を有するラムノ脂質を形成しうる場合には、Ｒ１およびＲ２により定義される基
【化２】
0006742918.tif 000003
は、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデセン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデセン酸、３−ヒドロキシテトラデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシヘキサデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシヘキサデカン酸、または３−ヒドロキシヘキサデカノイル−３−ヒドロキシヘキサデカン酸から誘導される。
【００７７】
本発明の任意の態様により、一般式（Ｉ）の異なるラムノ脂質の混合物が形成されうることは、当業者にとって自明である。
【００７８】
これに関連して、本発明の任意の態様による細胞は、一般式（Ｉ）のラムノ脂質の混合物を形成することができ、前記混合物は、形成されるラムノ脂質の８０質量％超、９０質量％超、特に９５質量％超においてｎが１であり、かつ、形成されるラムノ脂質の１０質量％未満、５質量％未満、特に２質量％未満において、Ｒ１およびＲ２により定義される基が、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸または３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデカン酸から誘導されることを特徴とし、ここで、示された質量％は、形成される一般式（Ｉ）のすべてのラムノ脂質の合計を基準とする。
【００７９】
本発明の任意の態様による細胞を有利にラムノ脂質の製造に使用することができるため、そして、これらの脂質をその後必要に応じて精製するため、本発明の任意の態様による細胞が、該細胞の野生型と比較して、該細胞から周囲の培地への一般式（Ｉ）のラムノ脂質の排出を触媒する少なくとも１つの酵素Ｅ８の増大された活性を示す場合に有利である。
【００８０】
これに関連して、タンパク質はＥ８は、以下：
配列番号１６（Ｅ８ａ）、配列番号１７（Ｅ８ｂ）、配列番号１８（Ｅ８ｃ）もしくは配列番号１９（Ｅ８ｄ）のポリペプチド配列を有するか、または、配列番号１６（Ｅ８ａ）、配列番号１７（Ｅ８ｂ）、配列番号１８（Ｅ８ｃ）もしくは配列番号１９（Ｅ８ｄ）の各参照配列と比較してアミノ酸残基の２５％まで、２０％まで、特に１５％までが、特に１０％まで、９％まで、８％まで、７％まで、６％まで、５％まで、４％まで、３％まで、２％まで、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせにより改変されているが、それでもなお、配列番号１６（Ｅ８ａ）、配列番号１７（Ｅ８ｂ）、配列番号１８（Ｅ８ｃ）もしくは配列番号１９（Ｅ８ｄ）の各参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも５０％、少なくとも６５％、特に少なくとも８０％、特に９０％超を示すポリペプチド配列を有する、酵素Ｅ８、ここで、酵素Ｅ８（Ｅ８ａ、Ｅ８ｂ、Ｅ８ｃおよびＥ８ｄ）に関する酵素活性とは、一般式（Ｉ）のラムノ脂質を細胞から周囲の培地へと排出する能力を意味するものと理解される
からなる群から選択される。
【００８１】
【表１−１】
0006742918.tif 000004
【００８２】
【表１−２】
0006742918.tif 000005
【００８３】
【表１−３】
0006742918.tif 000006
【００８４】
【表１−４】
0006742918.tif 000007
【００８５】
【表１−５】
0006742918.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、異なる炭素源に応じて形成されたラムノ脂質生成物のパーセンテージによる組成を示すグラフである。
【００８７】
例
上記は好ましい実施形態を記載したものであり、当業者によって理解されるであろう通り、これに、特許請求の範囲から逸脱することなく設計、構成または操作の点で変更または修正を加えることができる。例えばこれらの変更は、特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【００８８】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）によるラムノ脂質の製造において、様々な例において生成物濃度を測定する前に、反応サンプルを発酵直後にアセトンで１：１の体積比で希釈し、２１，０００ｇで４℃で２分間遠心分離した。その後、このサンプルの上清をＨＰＬＣによって測定した。
【００８９】
例１（比較例であって、本発明のものではない）
ＢＳ−ＰＰ−００１を用いたグルコースからのラムノ脂質の製造
５０ｍｇ／ｌ  カナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上で、株シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ（ＢＳ−ＰＰ−００１）のグリセロール凍結培養物の白金耳を画線した。ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣの製造方法は、独国特許出願公開第１０２０１００３２４８４号明細書（ＤＥ  １０２０１００３２４８４  Ａ１）の実施例２に提供されている。その後、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）をこのベクターを用いて形質転換し、かつ貯蔵する。この寒天プレートを３０℃で２４時間インキュベートした。カナマイシンを含有するＬＢ培地２５ｍｌを含むバッフル付きの１００ｍｌフラスコに過成長寒天プレートの単一培養物を接種し、振とうインキュベーター中で３０℃で２００ｒｐｍで２４時間インキュベートすることにより、予備培養物を生成した。この予備培養物を、５５００ｇで室温で１０分間遠心分離した。次いで、上清を廃棄した。このペレットを、Ｍ９培地（組成：６．８ｇ／ｌ  Ｎａ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、２．４ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．４ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、１．６ｇ／ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、０．５ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、微量元素溶液ＵＳ３  １ｍｌ、これは、３６．５ｇ／ｌ  濃度３７％の塩酸、１．９１ｇ／ｌ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１．８７ｇ／ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８４ｇ／ｌ  Ｎａ−ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ｌ  Ｈ３ＢＯ３、０．２５ｇ／ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、４．７ｇ／ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１７．３ｇ／ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ｌ  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏからなる）２５ｍｌ中に再懸濁させた。その後、この洗浄ステップを繰り返した。
【００９０】
３００ｍｌの発酵槽中に、２０ｇ／ｌ  グルコースおよび５０ｍｇ／ｌ  カナマイシンと共に、上記の通りのＭ９培地１８０ｍｌを添加した。この発酵槽に大体積の予備培養物懸濁液を接種したところ、開始ＯＤ６００が０．４に達した。発酵中に、以下のパラメータを設定した：空気２ＮＬ／ｈを用いたガス処理、撹拌機速度を調節することにより溶存酸素濃度を３０％に調整。この測定を、標準的な酸素センサを用いて、３０℃の温度で、７．４の初期ｐＨ値で（実験全体を通して調節せず）行う。４０時間の発酵後、グルコース溶液（発酵槽中の濃度：１５ｇ／ｌ）をシリンジを介して供給した。指定された時間に、この発酵槽からサンプルを採取して、生成されたラムノ脂質および脂肪酸二量体の濃度を測定した。
【００９１】
結果を、以下の表２および図１に示す。
【００９２】
例２
ＢＳ−ＰＰ−００１を用いた酪酸からのラムノ脂質の製造
予備培養物を、グルコースを用いて例１と同様に作製した。
【００９３】
３００ｍｌの発酵槽中に、６．５ｇ／ｌ  酪酸ナトリウムおよび５０ｍｇ／ｌ  カナマイシンと共に、例１に記載したＭ９培地１８０ｍｌを添加した。この発酵槽に大体積の予備培養物懸濁液を接種したところ、開始ＯＤ６００が０．４に達した。発酵中に、以下のパラメータを設定した：空気２ＮＬ／ｈを用いたガス処理、撹拌機速度を３００ｒｐｍに設定、温度３０℃、初期ｐＨ値７．４（実験全体を通して調節せず）。４０時間の発酵後、酪酸ナトリウム溶液（発酵槽中の濃度：５ｇ／ｌ  酪酸）をシリンジを介して供給した。撹拌機速度を９００ｒｐｍに上げた。
【００９４】
指定された時間に、この発酵槽からサンプルを採取して、生成されたラムノ脂質および脂肪酸二量体の濃度を測定した。
【００９５】
結果を、以下の表２および図１に示す。
【００９６】
例３
ＢＳ−ＰＰ−００１＋ａｌｋＢを用いたｎ−ブタンからのラムノ脂質の製造
５０ｍｇ／ｌ  カナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上で、株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ  ｐＢＴ１０のグリセロール凍結培養物を満たした白金耳を画線した（ＢＳ−ＰＰ００１＋ａｌｋＢ）。この株は、国際公開第２００９／０７７４６１号（ＷＯ  ２００９／０７７４６１  Ａ１）の第３６頁および第３７頁に記載された遺伝子構築物ｐＢＴ１０（配列番号３１）を例１の株に添加することにより製造したものである。この寒天プレートを、３０℃で２４時間インキュベートした。
【００９７】
バッフル付きの１００ｍｌフラスコ３つに、カナマイシンを含むＬＢ培地２５ｍｌを充填し、それぞれに過成長寒天プレートの単一培養物を接種し、振とうインキュベーター中で３０℃で２００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
【００９８】
バッフル付きの１リットルフラスコ３つをそれぞれ使用して、変更されたＭ９培地７５ｍｌ（組成：１５ｇ／ｌ  グルコース、６．８ｇ／ｌ  Ｎａ２ＰＯ４、３ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、２ｇ／ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、１５ｇ／ｌ  酵母抽出物、０．４９ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇ／ｌ  硫酸カナマイシン、１５ｍｌ／ｌ  微量元素溶液ＵＳ３、これは、３６．５ｇ／ｌ  濃度３７％の塩酸、１１．９１ｇ／ｌ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１．８７ｇ／ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８４ｇ／ｌ  Ｎａ−ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ｌ  Ｈ３ＢＯ３、０．２５ｇ／ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、４．７ｇ／ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１７．３ｇ／ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ｌ  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏからなる）と１００ｍｌフラスコからの予備培養物とを混合した。この培養物を、３０℃で２００ｒｐｍでインキュベートした。３時間インキュベートした後、０．４ｍＭ  ジシクロプロピルケトンを添加することによってａｌｋＢＧＴ遺伝子を活性化した。この培養物を、２５℃、２００ｒｐｍでさらに１６時間インキュベートした。
【００９９】
これら３つのフラスコ中の培養物を合一し、５５００ｇで室温で１０分間遠心分離した。上清を廃棄した。このペレットを、Ｍ９培地（その組成は上記に提供されている）２５ｍｌに再懸濁させた。この洗浄ステップを繰り返すことにより、グルコースおよび他の存在しうる炭素源を除去した。
【０１００】
３００ｍｌの発酵槽中に、Ｍ９培地（その組成は、炭素源なしで上記に提供されている）１８０ｍｌ、５０ｍｇ／ｌ  カナマイシンを添加した。この発酵槽に、これよりも前のステップからの大体積の予備培養物懸濁液を接種したところ、開始ＯＤ６００が１０に達した。発酵中に、以下のパラメータを設定した：ブタン／空気混合物（２５％／７５％）２ＮＬ／ｈを用いたガス処理、撹拌機速度を９００ｒｐｍに設定、温度３０℃、初期ｐＨ値７．４（実験全体を通して調節せず）。指定された時間に、この発酵槽からサンプルを採取して、生成されたラムノ脂質および脂肪酸二量体の濃度を測定した。
【０１０１】
結果を、以下の表２および図１に示す。
【０１０２】
【表２】
0006742918.tif 000009
【０１０３】
明らかであるように、表２は、基質としてグルコースを使用した場合には、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の遺伝子ｒｈＩＡ、ｒｈＩＢおよびｒｈＩＣを備えた種Ｐ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０の株（ＢＳ−ＰＰ−００１）が、約１ｇ／ｌの生成物（そのうち、約１１０ｍｇ／ｌがジラムノ脂質であり、８１ｍｇ／ｌがモノラムノ脂質であった）およびほぼ８００ｍｇの不要な脂肪酸二量体を製造しえたことを示す。
【０１０４】
ブチレートを唯一の炭素源として使用した場合には、ジラムノ脂質の量が有意に増加し、一方で不要な脂肪酸二量体が約三分の一しか形成されなかった。他の例では、ある株を、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＧＰＯ１由来のオキシドレダクターゼＡｌｋＢを導入するように遺伝子改変し、かつ唯一の炭素源としてブタンを供給した。表２に提供される結果は、ジラムノ脂質が１０００ｍｇ／ｌ超まで形成されるとともに、測定可能な量の望ましくない脂肪酸二量体が生成されなかったことを示す。
【０１０５】
さらに、図１の結果は、異なる炭素源に応じて形成された生成物のパーセンテージによる組成を示す。ブチレートを使用することによって、不要な脂肪酸二量体の量が８１％から６４％へと減少するとともに、ブタンおよびブタノールを用いた場合には、形成される脂肪酸二量体の量が測定不可能であることが分かる。
【０１０６】
例４
ＢＳ−ＰＰ−００１＋ａｌｋＢを用いた１−ブタノールからのラムノ脂質の製造
１００ｍｌのバッフル付きフラスコ３つに、カナマイシンおよびテトラサイクリンを含むＬＢ培地２５ｍｌを充填し、それぞれに株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ  ｐＢＴ１０（ＢＳ−ＰＰ００１  ＋ａｌｋＢ）のグリセロール凍結培養物１００μｌを接種した。この株は、国際公開第２００９／０７７４６１号（ＷＯ  ２００９／０７７４６１  Ａ１）の第３６頁および第３７頁に記載された遺伝子構築物ｐＢＴ１０（配列番号３１）を例１の株に添加することにより製造したものである。これらのフラスコを、振とうインキュベーター中で３０℃で２００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
【０１０７】
バッフル付きの１リットルフラスコ３つをそれぞれ使用して、変更されたＭ９培地７５ｍｌ（組成：１５ｇ／ｌ  グルコース、６．８ｇ／ｌ  Ｎａ２ＰＯ４、３ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、２ｇ／ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、１５ｇ／ｌ  酵母抽出物、０．４９ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇ／ｌ  硫酸カナマイシン、１０ｍｇ／ｌ  テトラサイクリン、１５ｍｌ／ｌ  微量元素溶液ＵＳ３、これは、３６．５ｇ／ｌ  濃度３７％の塩酸、１１．９１ｇ／ｌ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１．８７ｇ／ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８４ｇ／ｌ  Ｎａ−ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ｌ  Ｈ３ＢＯ３、０．２５ｇ／ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、４．７ｇ／ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１７．３ｇ／ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ｌ  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏからなる）と１００ｍｌフラスコからの予備培養物とを混合した。この培養物を、３０℃で２００ｒｐｍでインキュベートした。３時間インキュベートした後、０．４ｍＭ  ジシクロプロピルケトンを添加することによってａｌｋＢＧＴ遺伝子を活性化した。この培養物を、３０℃で２００ｒｐｍでさらに４時間インキュベートした。
【０１０８】
これら３つのフラスコ中の培養物を合一し、５５００ｇで室温で１０分間遠心分離した。上清を廃棄した。このペレットを、Ｍ９培地（その組成は上記に提供されている）２５ｍｌに再懸濁させた。この洗浄ステップを繰り返すことにより、グルコースおよび他の存在しうる炭素源を除去した。
【０１０９】
３００ｍｌの発酵槽中に、Ｍ９培地（その組成は、炭素源なしで上記に提供されている）１８０ｍｌ、５０ｍｇ／ｌ  カナマイシンを添加した。この発酵槽に、これよりも前のステップからの予備培養物懸濁液１０ｍｌを接種したところ、開始ＯＤ６００が５に達した。発酵中に、以下のパラメータを設定した：空気３ＮＬ／ｈを用いたガス処理、撹拌機速度を７００ｒｐｍに設定、温度３０℃、ｐＨ値７．０（実験全体を通して５％アンモニア溶液で調節）。ブタノール溶液をシリンジを介して供給した（供給速度  ０．２ｇ／（ｌｈ））。指定された時間に、この発酵槽からサンプルを採取して、生成されたラムノ脂質および脂肪酸二量体の濃度を測定した。
【０１１０】
結果を上記の表２に示す。
【０１１１】
【化３】
0006742918.tif 000010
【０１１２】
【化４】
0006742918.tif 000011
【図１】
0006742918.tif 000013
【配列表】
0006742918000001.app