(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便、組織又は細胞を検出サンプルとし、ＩＴＧＡ４遺伝子捕捉試薬及びＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定量検出試薬を含み、
前記ＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定量検出試薬は、検出プライマー及び検出プローブを含み、
前記検出プライマーのヌクレオチド配列は、配列番号４〜５に示され、前記検出プローブのヌクレオチド配列は、配列番号６に示されることを特徴とするＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定量検出キット。
【請求項２】
前記ＩＴＧＡ４遺伝子捕捉試薬は、磁気ビーズ・プローブ複合体を含むことを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項３】
糞便、組織又は細胞を検出サンプルとし、ＩＴＧＡ４遺伝子捕捉試薬、ＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定性検出試薬、及びＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定量検出試薬を含み、
前記ＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定量検出試薬は、検出プライマー及び検出プローブを含み、
前記検出プライマーのヌクレオチド配列は、配列番号４〜５に示され、前記検出プローブのヌクレオチド配列は、配列番号６に示されることを特徴とするＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の検出キット。
【請求項４】
前記ＩＴＧＡ４遺伝子捕捉試薬は、磁気ビーズ・プローブ複合体を含み、前記磁気ビーズ・プローブ複合体におけるプローブのヌクレオチド配列は、配列番号１に示され、
前記ＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定性検出試薬は、検出プライマーを含み、前記検出プライマーのヌクレオチド配列は、配列番号２〜３に示されることを特徴とする請求項３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２０１７年０４月１２日に出願された中国特許出願第ＣＮ２０１７１０２３６２４３．９（発明の名称：ＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の検出試薬、キット及び検出方法）の優先権を主張し、その内容が参照によりすべて本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、遺伝子検出の分野に関し、特にＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の検出試薬、キット及び検出方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
糞便ＤＮＡ実験（ＦＩＴ−ＤＮＡ）は、２０１６年に米国予防医学専門委員会（ＵＳＰＳＴＦ）によって結腸直腸がんのスクリーニング方法に組み入れられた。この実験の原理の一つは、糞便における脱落細胞の特定遺伝子のメチル化レベルを検出することである。腸がんに対する感度及び特異度がいずれも非常に高いＤＮＡメチル化マーカーの選択は、この実験の基礎である。従来の研究により、ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化は、組織及び糞便標本において腸がんに対して非常に高い検出感度及び特異度を有することが分かった。
【０００４】
研究によると、メチル化されたＩＴＧＡ４が糞便標本において腺腫に対する検出感度は６９％（９／１３）、特異度は７９％（２２／２８）である。別の研究によると、糞便標本においてメチル化されたＩＴＧＡ４を検出し、特異度が１００％（３１／３１）である場合、結腸直腸がん及び結腸直腸腺腫に対する検出率は、それぞれ３６．７％（１１／３０）、１６％（４／２５）である。これらの研究結果は、糞便標本における腸がん及び腺腫に対するこの遺伝子の検出感度及び特異度には改善の余地がまだあることを示している。
【０００５】
マーカーの検出感度及び特異度を影響する主要な要因は、プライマーの配列であるため、高感度及び特異度を有するＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の検出プライマーは、大きな意義を有する。
【発明の概要】
【０００６】
上記の事情に鑑みて、本発明の解決しようとする課題は、ＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の検出キット及び検出方法を提供することである。本発明により提供される定量キット及び定性キットは、いずれもＩＴＧＡ４遺伝子メチル化に対する特異的で高感度の検出を達成することができる。
【０００７】
本発明によれば、糞便、組織又は細胞を検出サンプルとし、ＩＴＧＡ４遺伝子捕捉試薬及びＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定性検出試薬を含むＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定性検出キットが提供される。
【０００８】
本発明の実施例において、前記ＩＴＧＡ４遺伝子捕捉試薬は、磁気ビーズ・プローブ複合体を含む。いくつかの実施例において、前記プローブの配列は、配列番号１に示される。
【０００９】
前記ＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定性検出試薬は、検出プライマーを含み、前記検出プライマーのヌクレオチド配列は、配列番号２〜３に示される。
【００１０】
本発明によれば、糞便、組織又は細胞を検出サンプルとし、ＩＴＧＡ４遺伝子捕捉試薬及びＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定量検出試薬を含むＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定量検出キットが提供される。
【００１１】
本発明の実施例において、前記ＩＴＧＡ４遺伝子捕捉試薬は、磁気ビーズ・プローブ複合体を含む。いくつかの実施例において、前記プローブの配列は、配列番号１に示される。
【００１２】
本発明の実施例において、前記ＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定量検出試薬は、検出プライマー及び検出プローブを含み、前記検出プライマーのヌクレオチド配列は、配列番号４〜５に示され、前記検出プローブのヌクレオチド配列は、配列番号６に示される。
【００１３】
本発明によれば、ＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の検出キットが提供される。糞便、組織又は細胞を検出サンプルとし、ＩＴＧＡ４遺伝子捕捉試薬、ＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定性検出試薬、及びＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定量検出試薬を含む。
【００１４】
前記ＩＴＧＡ４遺伝子捕捉試薬は、磁気ビーズ・プローブ複合体を含み、前記磁気ビーズ・プローブ複合体におけるプローブのヌクレオチド配列は、配列番号１に示される。
【００１５】
前記ＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定性検出試薬は、検出プライマーを含み、前記検出プライマーのヌクレオチド配列は、配列番号２〜３に示される。
【００１６】
前記ＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定量検出試薬は、検出プライマー及び検出プローブを含み、前記検出プライマーのヌクレオチド配列は、配列番号４〜５に示され、前記検出プローブのヌクレオチド配列は、配列番号６に示される。
【００１７】
配列番号１に示されるヌクレオチド配列の捕捉配列を用いて、糞便標本からＩＴＧＡ４遺伝子を捕捉し、２４０例の糞便標本（腸がん：８０例、≧１ｃｍ腺腫：７７例、正常：８３例）に対してＩＴＧＡ４のメチル化レベルを検出した結果、特異度が９５．２％である場合、腸がん及び腺腫に対するメチル化されたＩＴＧＡ４の感度は、それぞれ８３．８％及び４１．６％であった。
【００１８】
ｑＭＳＰ実験のプライマー及びプローブを用い、１０５ペアの腸がん組織、１０９例の≧１ｃｍ腺腫組織、及び４１例の正常腸上皮組織に対してＩＴＧＡ４のメチル化レベルを検出した結果、特異度が９７．６％である場合、結腸直腸がん及び腺腫の検出率はそれぞれ９６．２％及び７１．６％であった。
【００１９】
ＭＳＰ実験のプライマーを用い、Ｗｉｄｒ、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１５、ＨＴ２９、Ｃａｃｏ２及びＤＬＤ１の６株の結腸直腸がん細胞株に対してＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを検出した結果、ＩＴＧＡ４は、この６株の腸がん細胞のいずれにおいてもメチル化が生じた。
【００２０】
好ましくは、本発明が提供するキットの検出サンプルは、糞便及び／又は組織である。
【００２１】
いくつかの実施例において、検出サンプルは糞便である。
【００２２】
本発明によれば、検出サンプルをテンプレートとし、捕捉試薬によりＩＴＧＡ４遺伝子を捕捉した後、亜硫酸水素塩で修飾し、定性検出試薬で増幅させ、増幅生成物に基づいてＩＴＧＡ４遺伝子がメチル化されたか否かを判断する、ＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定性検出方法が提供される。
【００２３】
前記検出サンプルは、糞便、組織又は細胞である。
【００２４】
前記捕捉試薬は、磁気ビーズ・プローブ複合体を含み、前記磁気ビーズ・プローブ複合体におけるプローブのヌクレオチド配列は、配列番号１に示される。
【００２５】
前記定性検出試薬は、検出プライマーを含み、前記検出プライマーのヌクレオチド配列は、配列番号２〜３に示される。
【００２６】
具体的には、検出サンプルをテンプレートとし、配列番号１に示されるヌクレオチド配列のＩＴＧＡ４遺伝子捕捉配列によりＩＴＧＡ４遺伝子を捕捉した後、亜硫酸水素塩で処理して修修飾した後、配列番号２〜３に示されるヌクレオチド配列のＩＴＧＡ４遺伝子メチル化定性検出プライマーで増幅させ、増幅生成物に基づいてＩＴＧＡ４遺伝子がメチル化されたか否かを判断する。前記検出サンプルは、糞便、組織又は細胞である。
【００２７】
好ましくは、検出サンプルは、糞便、結腸直腸がん、結腸直腸腺腫、正常腸上皮組織又は細胞株である。より好ましくは、検出サンプルは糞便である。
【００２８】
磁気ビーズ捕捉法は、磁気ビーズを固相吸着担体とし、特別に設計した試薬システム及び抽出プロセスを採用する方法である（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｉｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ磁気ビーズ法による尿における遊離メチル化ＤＮＡの検出、抽出；２０１５，（１０））。
【００２９】
本発明において、配列は、配列番号１に示される。磁気ビーズ捕捉の方式により、糞便におけるＩＴＧＡ４を抽出及び富化することができる。
【００３０】
糞便は、必要に応じて、糞便を緩衝液に均一に混合し、遠心分離した後、上澄みを取り別の試験管に移し、特定の相補的オリゴヌクレオチド捕捉プローブ付きの磁気ビーズを上澄みに加え、インキュベーション及びハイブリダイゼーションした後、磁石で磁気ビーズを管壁の一側に吸着し、繰り返し洗浄した後、緩衝液で標的遺伝子ＤＮＡを溶出することにより処理することができる。この方法によれば、標的遺伝子を捕捉することができ、富化に約２時間がかかる。
【００３１】
捕捉されたＤＮＡは、亜硫酸水素塩処理により修飾された後、後続の蛍光定量ＰＣＲの検出に用いられる。
【００３２】
増幅システムは、ヌクレアーゼフリー水１０．５μｌ、２×酵素反応液１２．５μｌ、フォワードプライマー０．５μｌ、リバースプライマー（５μＭ濃度）０．５μｌ、検出されるＤＮＡ  １μｌ；合計２５μＬである。
【００３３】
増幅プロセスは、９５℃５ｍｉｎ、（９５℃３０ｓ、６４℃３０ｓ、７２℃３０ｓ）×３４Ｃｙｃｌｅｓ、７２℃５ｍｉｎ、３７℃３０ｓである。
【００３４】
増幅の結果について、増幅バンドが現れると、遺伝子にメチル化が発生したことを示す。
【００３５】
本発明によれば、ＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の定量検出方法がさらに提供される。
【００３６】
検出サンプルをテンプレートとし、捕捉試薬によりＩＴＧＡ４遺伝子を捕捉した後、亜硫酸水素塩で修飾した後、定量検出試薬で定量検出し、定量結果に基づいてＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを判断する。
【００３７】
前記検出サンプルは、糞便、組織又は細胞である。
【００３８】
前記捕捉試薬は、磁気ビーズ・プローブ複合体を含み、前記磁気ビーズ・プローブ複合体におけるプローブのヌクレオチド配列は、配列番号１に示される。
【００３９】
前記定量検出試薬は、検出プライマー及び検出プローブを含み、前記検出プライマーのヌクレオチド配列は、配列番号４〜５に示され、前記検出プローブのヌクレオチド配列は、配列番号６に示される。
【００４０】
具体的には、検出サンプルをテンプレートとし、配列番号１に示されるヌクレオチド配列のＩＴＧＡ４遺伝子捕捉配列によりＩＴＧＡ４遺伝子を捕捉した後、亜硫酸水素塩処理により修飾した後、配列番号４〜５に示されるヌクレオチド配列のＩＴＧＡ４遺伝子メチル化定量検出プライマー及び配列番号６に示されるヌクレオチド配列のＩＴＧＡ４遺伝子メチル化定量検出プローブにより定量検出し、定量結果によりＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを判断し、前記検出サンプルは、糞便、組織又は細胞である。
【００４１】
好ましくは、検出サンプルは、糞便、結腸直腸がん、結腸直腸腺腫、正常腸上皮組織又は細胞株である。より好ましくは、検出サンプルは糞便である。
【００４２】
磁気ビーズ捕捉法は、磁気ビーズを固相吸着担体とし、特別に設計した試薬システム及び抽出プロセスを採用する方法である（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｉｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ磁気ビーズ法による尿における遊離メチル化ＤＮＡの検出、抽出；２０１５，（１０））。
【００４３】
本発明において、配列は、配列番号１に示される。磁気ビーズ捕捉の方式により、糞便におけるＩＴＧＡ４を抽出及び富化することができる。
【００４４】
糞便は、必要に応じて、糞便を緩衝液に均一に混合し、遠心分離した後、上澄みを取り別の試験管に移し、特定の相補的オリゴヌクレオチド捕捉プローブ付きの磁気ビーズを上澄みに加え、インキュベーション及びハイブリダイゼーションした後、磁石で磁気ビーズを管壁の一側に吸着させ、繰り返し洗浄した後、緩衝液で標的遺伝子ＤＮＡを溶出することにより処理することができる。この方法によれば、標的遺伝子を捕捉することができ、富化に約２時間がかかる。
【００４５】
捕捉されたＤＮＡは、亜硫酸水素塩処理により修飾された後、後続の蛍光定量ＰＣＲの検出に用いられる。
【００４６】
前記増幅反応システムは、ヌクレアーゼフリー水８．２μｌ、５×酵素反応緩衝液５μｌ、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）５μｌ、ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）１μｌ、反応酵素０．５μｌ、フォワードプライマー（１００μＭ）０．１２５μｌ、リバースプライマー（１００μＭ）０．１２５μｌ、プローブ（１００μＭ）０．０５μｌ、検出されるＤＮＡ  ５μｌ；合計２５μＬである。
【００４７】
増幅プロセスは、９５℃４ｍｉｎ、（９５℃２０ｓ、５６℃３０ｓ、７２℃３０ｓ）×４５Ｃｙｃｌｅｓ、３７℃３０ｓである。
【００４８】
定量結果に基づいて、ＡＣＴＢ遺伝子を内部参照遺伝子として、ＩＴＧＡ４遺伝子の相対メチル化レベルを算出する。
【００４９】
本発明が提供するプライマーとプローブを組み合わせることにより、糞便サンプルを検出することができ、検出はより簡単で快速になる。本発明によれば、組織標本を検出することもできる。また、サンプルの検出では、検出の特異度及び感度も向上する。実験により、糞便標本では、特異度が９５．２％である場合、腸がん及び腺腫に対するメチル化されたＩＴＧＡ４の感度は、それぞれ８３．８％及び４１．６％であり、腸がん組織では、特異度が９７．６％（４０／４１）である場合、結腸直腸がん及び腺腫の検出率は、それぞれ９６．２％（１０１／１０５）及び７１．６％（７８／１０９）である。このような効果は、他のプライマー又はプローブの検出効果よりも高い。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】がん、腺腫、正常組織におけるＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルのドットプロットであり、＊＊＊＊は、Ｐ＜０．０００１を示す。
【図２】ＲＯＣ曲線図であり、ＡＵＣ（がんｖｓ正常）＝０．９５３（９５％ＣＩ：０．９２０−０．９８５）であり、ＡＵＣ（腺腫ｖｓ正常）＝０．７３５（９５％ＣＩ：０．６５７−０．８１４）である。
【図３】段階希釈されたＳ１−Ｓ６の増幅曲線及びそれで構築した標準曲線であり、ＮＴＣは、テンプレート無し対照を示し、ＷＴは、野生型ＤＮＡをテンプレートとすることを示し、各サンプルについて３つの重複ウェルが作製される。
【図４】線型性Ｒ２＝０．９９５、増幅効率＝９７．９６％である標準曲線である。
【図５】異なるプライマー、プローブの増幅曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明によれば、ＩＴＧＡ４遺伝子メチル化の検出試薬、キット及び検出方法が提供される。当業者であれば、本明細書の記載に基づいてプロセスパラメータを適切に改良することにより実現することができる。なお、全ての類似的な置換及び変更は、当業者にとって自明なものであり、本発明の範囲に含まれると見なされる。本発明の方法及び使用を好適な実施例により説明したが、当業者は、本発明の内容、趣旨及び範囲内で、本明細書に記載の方法及び使用を置換、変更及び組み合わせすることにより、本発明の技術を実現及び使用することができる。
【００５２】
本発明で使用される試験材料、試薬、機器は、一般的な市販品であり、いずれも市場から購入できる。
【００５３】
以下、実施例により本発明をさらに説明する。
実施例１：定性検出
【００５４】
Ｗｉｄｒ、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１５、ＨＴ２９、Ｃａｃｏ２及びＤＬＤ１の６株の結腸直腸がん細胞株を用い、別途に健康細胞ＣＣＤ−１８ＣＯを対照とした。ＭＳＰ実験によりこれらの細胞においてＩＴＧＡ４遺伝子がメチル化されたか否かを検出した。各細胞株につき検出を１０回繰り返した。
【００５５】
方法の手順は、以下の通りである。
１、細胞沈殿を収集し、事前に３ｍｌの細胞溶解液を入れた新しい１５ｍｌの遠沈管に移した。
遠沈管に１００ｕｌの捕捉磁気ビーズ（配列番号１に示される捕捉配列（５'−ＴＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＣＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＣ−３）  を含む）を加え、水浴、９２℃で１０分間インキュベートした。シェーカーを用いて、室温、１００ｒｐｍで１時間インキュベートし、短時間の遠心分離後、磁気フレームに５分間置いてから上澄みを廃棄した。
１５ｍｌの遠沈管に５００ｕｌの洗浄液を加え、管壁にある磁気ビーズが完全に落ちるように均一に振盪し、短時間の遠心分離後、新しい２ｍｌの遠沈管に移した。ドライバスを用いて室温、９００ｒｐｍで１分間インキュベートし、磁気フレームに１分間置いてから上澄みを廃棄した。４回繰り返した。
５５ｕｌの溶離液を加え、短時間の遠心分離後、ドライバスを用いて９２℃、９００ｒｐｍで１０分間インキュベートした。短時間の遠心分離後、磁気フレームに置き、３分間以内に５０ｕｌ溶離液を新しいＥＰ管に移した。
【００５６】
２、亜硫酸水素塩による変換：ＥＺ  ＤＮＡメチル化キット（ＺＹＭＯＲＥＳＥＡＲＣＨ）
【００５７】
３、増幅：プライマーは、
上流プライマー配列：５'−ＴＣＧＧＡＧＡＡＧＴＡＧＣＧＣＧＡＧＴＡＴＴＣ−３'（配列番号２）
下流プライマー配列：５'−ＡＡＡＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＧＣＧＡＡＣＧ−３'（配列番号３）
である。
システム：２５μｌ（１×システム：ヌクレアーゼフリー水１０．５μｌ、ＧｏＴａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  １２．５μｌ、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ及びＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（濃度５ｕＭ、それぞれ０．５μｌ）、検出されるＤＮＡ  １μｌ）
プロセス：９５℃５ｍｉｎ、（９５℃３０ｓ、６４℃３０ｓ、７２℃３０ｓ）×３４Ｃｙｃｌｅｓ、７２℃５ｍｉｎ、３７℃３０ｓ
【００５８】
４、増幅結果の観察
増幅結果に基づいて、ＰＣＲ生成物に対してアガロースゲル電気泳動を行い、バンドが現れると、メチル化が発生したことを示す。
【００５９】
実験結果：６株の腸がん細胞のいずれにおいてもＩＴＧＡ４のメチル化が検出され、１０回の繰り返し検出により、正確率は１００％に達した。健康細胞では、メチル化の現象が観察されなかった。
【００６０】
実施例２：定量検出
１、糞便をサンプルとした。
２４０例の糞便標本（大腸内視鏡検査によると、腸がん８０例、≧１ｃｍ腺腫７７例、正常８３例を含む）を選択し、ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを定量検出した。
【００６１】
実験過程：糞便標本において、捕捉配列（配列番号１）により実施例１と同じ条件及び過程でＩＴＧＡ４遺伝子を捕捉し、ＡＣＴＢを内部参照遺伝子とし、ｑＭＳＰ実験により標本中のＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを定量検出した。
【００６２】
定量検出プライマー及びプローブ
【００６３】
上流プライマー配列：５'−ＡＣＧＣＧＡＧＴＴＴＴＧＣＧＴＡＧＴＣ−３'（配列番号４）
下流プライマー配列：５'−ＴＣＣＧＡＡＴＡＣＧＡＡＣＣＧＣＴＡＡ−３'（配列番号５）
検出プローブ配列：５'−ＡＣＧＧＡＧＴＴＣＧＧＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＣ−３'（配列番号６）
システム：２５μｌ（１×システム：ヌクレアーゼフリー水８．２ｕｌ，５×Ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ  ＧｏＴａｑ  Ｆｌｅｘｉ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ，ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）５μｌ，ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）１μｌ，ＧｏＴａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．５μｌ，Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（１００ｕＭ）０．１２５μｌ，Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（１００ｕＭ）０．１２５μｌ，Ｐｒｏｂｅ（１００ｕＭ）０．０５μｌ，ＤＮＡ  ５μｌ）
プロセス：９５℃４ｍｉｎ，（９５℃２０ｓ、５６℃３０ｓ、７２℃３０ｓ）×４５Ｃｙｃｌｅｓ，３７℃３０ｓ。
【００６４】
２４０例の糞便標本（８０例の腸がん、７７例の≧１ｃｍ腺腫、８３例の正常）に対して、ＩＴＧＡ４のメチル化レベルを検出した結果、特異度が９５．２％である場合、腸がん及び腺腫に対するメチル化されたＩＴＧＡ４の感度は、それぞれ８３．８％及び４１．６％であった（図１〜２）。
【００６５】
２、組織をサンプルとした。
手術又は内視鏡的切除術により切除された結腸直腸がん、結腸直腸腺腫及び正常腸上皮組織標本を選択肢、ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを定量検出した。標本は、１０５ペアの腸がんと傍がん組織のペア組織、１０９例の≧１ｃｍ腺腫組織、４１例の正常腸上皮組織であった。
【００６６】
各組織からそれぞれＤＮＡを抽出し、亜硫酸水素塩で処理して修飾した後、ｑＭＳＰ実験により、標本中のＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを定量検出した。
【００６７】
定量結果に基づいてＲＯＣ曲線を作成した（図２）。実験結果では、特異度が９７．６％（４０／４１）である場合、結腸直腸がん及び腺腫の検出率は、それぞれ９６．２％（１０１／１０５）及び７１．６％（７８／１０９）であり、曲線下面積は、それぞれ０．９５８（９５％ＣＩ：０．９０９−１）及び０．８３２（９５％ＣＩ：０．７６１−０．９０２）であった（Ｐ＜０．００１）。
【００６８】
実施例３：検出限界
ＣｐＧｅｎｏｍｅＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入）を用い、亜硫酸水素塩で変換することにより２０ｎｇ／μｌのテンプレートＤＮＡが得られ、５倍の段階希釈により、それぞれＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６（濃度は、それぞれ２０ｎｇ／μｌ、４ｎｇ／μｌ、０．８ｎｇ／μｌ、０．１６ｎｇ／μｌ、０．０３２ｎｇ／μｌ、０．００６４ｎｇ／μｌである）が得られた。
【００６９】
５μｌのテンプレート注入量でｑＰＣＲを行った（方法及びプライマーは実施例２と同じ）。Ｓ１−Ｓ６の実際のＤＮＡ注入量は、それぞれ１００ｎｇ、２０ｎｇ、４ｎｇ、０．８ｎｇ、０．１６ｎｇ、０．０３２ｎｇであった。ｑＰＣＲの結果によると、この遺伝子プライマープローブによって検出可能なＤＮＡ量は０．０３２ｎｇ〜１００ｎｇであった（図３）。
【００７０】
比較例１
ＣｐＧｅｎｏｍｅＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入）を用いて亜硫酸水素塩変換を行い、ＡＣＴＢを内部参照遺伝子とし、異なるプライマー及びプローブにより定量検出を行い、各群のプローブ及びプライマーの増幅効果を検討した。
【００７１】
用いられるプライマー及びプローブを表１に示す。
表１：プライマー及びプローブ
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0006755414.tif 000003
【００７２】
各群のプローブ及びプライマーの増幅結果は図５に示され、Ｓｅｔ１の増幅結果は実施例３の検出限界の実験結果を参照されたい（Ｓ３の検出テンプレートの検出限界は、本比較例の検出テンプレートと同じである）。表に示されるデータから分かるように、目的遺伝子に対する特異的増幅の過程において、Ｓｅｔ１群の増幅結果Ｃｔは最も小さく、最も良い増幅効果を示し、他の群のプローブよりも優れている。
【００７３】
以上は本発明の好ましい実施形態に過ぎず、本発明の原理を逸脱しない限り、当業者は、様々な改良及び修飾を加えることができ、これらの改良及び修飾は、本発明の保護範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２】
0006755414.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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