(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式Ｉ：
【化１】
0006784645.tif 000009
ただし、Ｒ１は、ＣＨＯ；ＣＮ；Ｃ（Ｏ）ＮＨ２；Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ３；Ｃ（Ｏ）ＣＨ３；ＣＯＯＨ；およびＣＯＯＣＨ３から選択された基であり；
Ｒ２は、ヒドロキシ基、または炭素原子数１〜３のアルコキシ基であり；
Ｒ３は、少なくとも１つのメチル基で置換された炭素原子数６〜１５の分岐したアルカジエニル基であり；
Ｒ４は、ヒドロキシ基であり；
Ｒ５は、塩素（ｃｈｌｏｒｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ）、臭素（ｂｒｏｍｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ）、またはフッ素（ｆｌｕｏｒｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ）であり；および、
Ｒ６は、メチル基である；
で表される化合物の真菌のオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）を阻害するための農薬としての使用。
【請求項２】
Ｒ２が、ヒドロキシ基である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｒ１が、ＣＨＯ；ＣＮ；Ｃ（Ｏ）ＮＨ２；Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ３；Ｃ（Ｏ）ＣＨ３；ＣＯＯＨ；およびＣＯＯＣＨ３から選択され；並びに
Ｒ２が、ヒドロキシ基であり；
Ｒ３が、少なくとも１つのメチル基で置換された炭素原子数６〜１５の分岐したアルカジエニル基であり；
Ｒ４が、ヒドロキシ基であり；
Ｒ５が、塩素原子であり；および
Ｒ６が、メチル基である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
Ｒ１が、ＣＨＯ基ではない、請求項１〜３のいずれかの１項に記載の使用。
【請求項５】
前記化合物がカララ・フラクシネア（Ｃｈａｌａｒａ  ｆｒａｘｉｎｅａ）；セプトリア・トリチキ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）；ゴイマノミセス・グラミニス  変種  ティティチ（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｍｉｎｉｓ  ｖａｒ  ｔｉｔｉｃｉ）；マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）；マグナプロテ・オリゼ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）；リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）；ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）；フシクラジウム・エフサム（Ｆｕｓｉｃｌａｄｉｕｍ  ｅｆｆｕｓｕｍ）別名フシクラドスポリウム・エフサム（Ｆｕｓｉｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｅｆｆｕｓｕｍ）；ポドスファエラ・フスカ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｆｕｓｃａ）；ミクロドキウム・ニヴァレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）；ミクロドキウム・マユス（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｍａｊｕｓ）；セプトリア・ノドウム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｎｏｄｏｕｍ）；タペシア・アクフォルミス（Ｔａｐｅｓｉａ  ａｃｕｆｏｒｍｉｓ）；およびメタリジウム・アニソプリエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）から成る生物の群から選択された生物における真菌のオルタナティブオキシダーゼを阻害する農薬として使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸｓ）および、特に、オルタナティブオキシダーゼ阻害剤に関する。本発明はまた、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤に関する。本発明は、特にＡＯＸｓおよびシトクロムｂｃ１複合体の両方への二重阻害剤に関する。本発明は、本質的に農薬および医薬品の組成物そのものと同様に、真菌感染症を含む微生物の感染症を治療するため、農薬および医薬品としてこのような阻害剤の使用にまで及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
殺真菌剤は、作物の損失を制御するために長く使用されている。農業用殺真菌剤のもっとも成功した種類は、ミトコンドリアの呼吸鎖を特異的に標的とする一組の特異的阻害剤である。ミトコンドリアは、細胞の発電所であり、したがって、生物のエネルギー保存をもたらす過程の阻害は、生存の可能性に大きな影響を与える。この１０年以上、極めて重要な呼吸鎖の構成要素である、ユビキノールの酸化を標的とする、ストロビルリンとして知られる阻害剤は、植物での病気制御の基準を改善している（図１を参照）。ストロビルリンは、真菌の呼吸を阻害し、したがって、真菌の呼吸に必須である、複合体ＩＩＩ（ｂｃ１複合体）のユビキノール結合部位に結合することでＡＴＰ合成を阻害する。
【０００３】
ストロビルリンは、すぐに世界の殺真菌剤市場の２０％超を占めるもっとも重要で成功した農業用殺真菌剤の１つとなった。それらの導入以来、多くの農業に重要な真菌の病気に対する広範囲の有効性により、この種の阻害剤は、植物の病気制御プログラムに欠かせなくなっている。それらは、穀倉類、芝草、ブドウの木および多くの野菜ならびに観葉植物を含む作物への使用のために多くの国で登録されている。
【０００４】
しかし、残念なことに、これらの殺真菌剤への抵抗力の急速な高まりおよび結果としての制御失敗がますます問題になっていることから、これらの浸透性の殺真菌剤の明白な強みの一つ、すなわち高度に特異的な作用機構は、明らかな弱点をもたらしている。
【０００５】
ほとんどの場合、抵抗力は、ストロビルリンの標的部位、すなわちミトコンドリアゲノムにエンコードされているアポシトクロムｂの改変に起因すると考えられていた。しかし近年、増加する証拠の量は、抵抗力が異なるメカニズム、例えばオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）の発現により生じうることを示唆している。ＡＯＸは、結合時Ｑｏ（キノン外部）部位を迂回し、殺真菌剤に対する細胞膜排出系トランスポーターの抵抗力を増加する、ミトコンドリアの末端酸化酵素である。排出系トランスポーターは、真菌が真菌の細胞内での毒性濃度の蓄積を妨げることにより毒性化合物に触れても生き延びることを可能とする。シトクロムｂ変異体および排出系トランスポーターの増加した抵抗力についてのいくつかの実験的証拠があるけれども、植物病原性真菌での殺真菌剤抵抗力の原因がオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）の発現に起因する可能性は、増加している。
【０００６】
ＡＯＸは、ユビキノンのレベルで主要な呼吸鎖から分岐する、末端のミトコンドリア呼吸鎖複合体であり、したがって、図１が示すように、ｂｃ１複合体およびシトクロムｃオキシダーゼを迂回する。ＡＯＸは、植物真菌病原体に関係するだけではなく、アフリカトリパノソーマ症（Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｓｉｃｋｎｅｓｓ）の原因である、トリパノソーマ、ならびに、腸内寄生虫である、クリプトスポリジウム・パルブム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）およびブラストシスチス・ホミニス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）をも含む人の寄生虫にもまた存在している。
【０００７】
植物と真菌において、ＡＯＸの発現は、例えば主要な呼吸経路が阻害された時のように、酸化ストレスの状況下で誘導される。現在利用できるＡＯＸの阻害剤は、サリチルヒドロキサム酸およびオクチルガラートを含む。しかし、これら２種類の阻害剤のいずれも、細胞内のＡＯＸの強力または特異的なターゲットではなく、それゆえに農薬（すなわち作物）または医薬品への応用に不適切である。
【発明の概要】
【０００８】
それゆえに、農薬または抗寄生虫薬のいずれかで用いる、改良した抗真菌薬剤を作製するためにより特異的で強力なＡＯＸの阻害剤を設計する必要がある。
【０００９】
本発明者らは、植物、サウロマツム・グタツム（Ｓａｕｒｏｍａｔｕｍ  ｇｕｔｔａｔｕｍ）のオルタナティブオキシダーゼ酵素（ＡＯＸ）の分子構造および触媒メカニズムを明らかにし、どのようにこの情報がタンパク質の生理的役割に関係しているのかを明らかにしている。明らかに、かかる基礎知識は、注目に値する産業上の関連性があり、ミトコンドリア呼吸を標的とした植物病原性殺真菌剤および抗寄生虫の医薬品として使用できる、ＡＯＸ阻害剤化合物の合理的設計を可能にしている。
【００１０】
従って、発明の第１の態様によると、化学式１のオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）阻害剤が提供され：
【００１１】
【化１】
0006784645.tif 000002
【００１２】
ただし、Ｒ１は、ニトリル基、並びにＦ、Ｏ、ＮＨ２またはＣＮにより１または多置換されてもよい、および１つ以上の隣接しない（ｎｏｎ−ａｄｊａｃｅｎｔ）ＣＨ２基が、いずれの場合にも互いに独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−または−ＯＣＯ−により置換されてもよい、炭素原子数１〜４のアルキル基、アルケニル基、アミン基から選択され；
Ｒ２は、水素またはヒドロキシ基または炭素原子数１〜３のアルコキシ基であり；
Ｒ３は、炭素数１〜４のアルキル基により１または多置換されてもよい、炭素原子数４〜２０の直鎖のまたは分岐したアルキルまたはアルキレンであり；
Ｒ４は、水素またはヒドロキシ基または炭素原子数１〜３のアルコキシ基であり；
Ｒ５は、ハロゲン基であり；および、
Ｒ６は、水素または炭素数１〜４のアルキル基であり；
ただし、少なくともＲ２およびＲ４の１つはヒドロキシ基または炭素原子数１〜３のアルコキシ基である。
【００１３】
基がアルキル基である場合、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４のアルキル、例えばメチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基でもよい。アルキル基は、１つ以上のヘテロ原子、例えば窒素、酸素、硫黄、リンまたはハロゲンで置換されてもよい。
【００１４】
Ｒ１は、ＣＨＯ；ＣＨ２ＯＨ；ＣＮ；ＣＨ３；Ｃ（Ｏ）ＮＨ２；Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ３；Ｃ（Ｏ）ＣＨ３；ＣＦ２ＣＨ３；ＣＨ２ＣＨ３；ＣＨ２ＯＡｃ；ＣＯＯＨ；およびＣＯＯＣＨ３から選択された基でもよい。
【００１５】
Ｒ２は、短鎖アルキル、例えばメチル基、エチル基またはプロピル基でもよい。しかし、好ましくは、Ｒ２は、ヒドロキシル基である。
【００１６】
Ｒ３は、炭素数１〜４のアルキル基により１または多置換されてもよい、炭素原子数６〜１５、炭素原子数８〜１２または炭素原子数８〜１０である直鎖のまたは分枝したアルキルまたはアルキレンでもよい。例えば、Ｒ３は、少なくとも１つ、好ましくは２つのメチル基で置換された炭素原子数６〜１５の分岐したジエンでもよい。
【００１７】
Ｒ４は、メチル基、エチル基またはプロピル基でもよい。しかし、好ましくは、Ｒ４は、ヒドロキシル基である。
【００１８】
Ｒ５は、塩素（ｃｈｌｏｒｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ）、臭素（ｂｒｏｍｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ）、フッ素（ｆｌｕｏｒｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ）またはヨウ素（ｉｏｄｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ）でもよい。好ましくは、Ｒ５は、塩素（ｃｈｌｏｒｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ）である。
【００１９】
Ｒ６は、メチル基、エチル基またはプロピル基でもよい。しかし、好ましくは、Ｒ６は、メチル基である。
【００２０】
ひとつの実施形態として、ＡＯＸ阻害剤は化学式１の化合物を含み、ただし：
Ｒ１は、ＣＨＯ；ＣＨ２ＯＨ；ＣＮ；ＣＨ３；Ｃ（Ｏ）ＮＨ２；Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ３；Ｃ（Ｏ）ＣＨ３；ＣＦ２ＣＨ３；ＣＨ２ＣＨ３；ＣＨ２ＯＡｃ；ＣＯＯＨ；およびＣＯＯＣＨ３から選択され；並びに、
Ｒ２は、ヒドロキシル基であり；
Ｒ３は、炭素数１〜４のアルキル基により１または多置換されてもよい、炭素原子数４〜２０の直鎖のまたは分岐したアルキルまたはアルキレンであり；
Ｒ４は、ヒドロキシル基であり；
Ｒ５は、塩素原子であり；および、
Ｒ６は、水素または炭素数１〜４のアルキル基である。
【００２１】
他の実施形態として、ＡＯＸ阻害剤は、化学式１の化合物を含み、ただし：
Ｒ１は、ＣＨＯ；ＣＨ２ＯＨ；ＣＮ；ＣＨ３；Ｃ（Ｏ）ＮＨ２；Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ３；Ｃ（Ｏ）ＣＨ３；ＣＦ２ＣＨ３；ＣＨ２ＣＨ３；ＣＨ２ＯＡｃ；ＣＯＯＨ；およびＣＯＯＣＨ３から選択され；並びに、
Ｒ２は、ヒドロキシル基であり；
Ｒ３は、炭素数１〜２のアルキル基により１または多置換されてもよい、炭素原子数６〜１５の直鎖のまたは分岐したアルキルまたはアルキレンであり；
Ｒ４は、ヒドロキシル基であり；
Ｒ５は、塩素原子であり；および、
Ｒ６は、水素または炭素数１〜４のアルキル基である。
【００２２】
一つの好ましい実施形態として、ＡＯＸ阻害剤は、化学式１の化合物を含み、ただし：
Ｒ１は、ＣＨＯ；ＣＨ２ＯＨ；ＣＮ；ＣＨ３；Ｃ（Ｏ）ＮＨ２；Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ３；Ｃ（Ｏ）ＣＨ３；ＣＦ２ＣＨ３；ＣＨ２ＣＨ３；ＣＨ２ＯＡｃ；ＣＯＯＨ；およびＣＯＯＣＨ３から選択され；並びに、
Ｒ２は、ヒドロキシル基であり；
Ｒ３は、炭素原子数８〜１０のアルキレン鎖であり、少なくとも一つのメチル基、好ましくは二つのメチル基で置換されており；
Ｒ４は、ヒドロキシル基であり；
Ｒ５は、塩素原子であり；および、
Ｒ６は、メチル基である。
【００２３】
本発明者らが考えるに、阻害剤化合物のベンゼン環上のヒドロキシル基（Ｒ２およびＲ４）および臭素（Ｒ５）およびメチル（Ｒ６）の置換基は、高力価のために重要であろう。加えて、ゲラニル基のような、疎水性側鎖もまた重要であろう。しかし、本発明者らが考えるに、アスコフラノンとして知られる化合物に存在するアルデヒド基は、いくつかの理由から抗寄生虫薬設計にとって問題になるかもしれない。水素結合受容体として機能できる能力、およびＡＯＸと双極子間相互作用を起こす能力に加えて、アルデヒド基は、可逆的共有結合修飾を起こすのに十分なほど化学的に反応し、一般的に標準的な薬剤の製剤に不適当とされる。さらに、アルデヒドは、塩基性輸送タンパク質へ付随的に非特異的結合をすることでそれぞれのカルボン酸を代謝的に酸化させる傾向がある。それゆえ本発明者らが考えるに、いくつかの実施形態では、アルデヒド基が存在しないことにより有益であろう。
【００２４】
それゆえに、いくつかの実施形態において、Ｒ１はＣＨＯ基ではない。
【００２５】
好ましくは、第１の態様の阻害剤は、微生物のＡＯＸを阻害できる。好ましくは、阻害剤は、真菌、細菌または原生生物のＡＯＸを阻害できる。阻害されるかかる微生物の例は、本明細書中で提供される。例えば、阻害剤は、図４で示される生命体のいずれからのＡＯＸを阻害することができるであろう。特に、阻害剤は、図４の枠で表したいかなるアミノ酸残基とも結合することができ、つまりこれらは、阻害剤の結合に含まれると考えられる保存されたＡＯＸ残基を示している。
【００２６】
有利なことに、阻害剤は、たった２段階の過程を用いて合成される。例えば、かかる過程の一つの実施形態を図７に示す。
【００２７】
実施例６に記すように、本発明者らはまた、驚くべきことに、化学式１の化合物がＡＯＸの強力な阻害剤であると同時にシトクロムｂｃ１複合体の特異的な阻害剤であることを明らかにしている。したがって、化学式１の化合物は、シトクロムｂｃ１複合体を阻害することができるであろう。有利なことに、化学式１の化合物は、特異的および特異的な二つの機能を持つ殺真菌剤となることができ、つまりオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）を阻害するだけではなく、シトクロムｂｃ１複合体をもまた阻害する。これにより、化合物をオルタナティブオキシダーゼの不在下でさえ非常に強力な呼吸の阻害剤とする。
【００２８】
驚くべきことに、データもまた示すように、化合物は、シトクロムｂｃ１複合体のＱｏ（キノン外部）およびＱｏ（キノン内部）結合部位の両方でシトクロムｂｃ１複合体を阻害する。すなわち、化学式１の化合物は、シトクロムｂｃ１複合体のＱｏおよび／またはＱｉ結合部位を阻害することができる。しかしながら、好ましくは、化学式１の化合物は、シトクロムｂｃ１複合体のＱｏおよびＱｉ結合サイトを阻害する。当然のことながら、市販の殺真菌剤、例えばアゾキシストロビンは、ｂｃ１複合体の１部位（Ｑｏ）だけ阻害する。したがって、本発明の化合物がＱｏおよびＱｉ結合部位の両方においてシトクロムｂｃ１複合体、およびＡＯＸをもまた阻害するため、かかる化合物は、極めて強力および頑強な阻害剤となる。
【００２９】
第２の態様として、本発明は、オルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）を阻害するため、第１の態様の化合物の使用を提供する。
【００３０】
第３の態様として、微生物のオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）および／またはシトクロムｂｃ１複合体を阻害するため、化合物の使用を提供し、化合物は、化学式１で示され：
【００３１】
【化２】
0006784645.tif 000003
【００３２】
ただし、Ｒ１は、ニトリル基、並びにＦ、Ｏ、ＮＨ２またはＣＮにより１または多置換されてもよい、および１つ以上の隣接しない（ｎｏｎ−ａｄｊａｃｅｎｔ）ＣＨ２基が、いずれの場合にも互いに独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−または−ＯＣＯ−により置換されてもよい、炭素原子数１〜４のアルキル基、アルケニル基、アミン基から選択され；
Ｒ２は、水素またはヒドロキシ基または炭素原子数１〜３のアルコキシ基であり；
Ｒ３は、炭素数１〜４のアルキル基により１または多置換されてもよい、炭素原子数４〜２０の直鎖のまたは分岐したアルキルまたはアルキレンであり；
Ｒ４は、水素またはヒドロキシ基または炭素原子数１〜３のアルコキシ基であり；
Ｒ５は、ハロゲン基であり；および、
Ｒ６は、水素または炭素数１〜４のアルキル基であり；
ただし、少なくともＲ２およびＲ４のうち１つは、ヒドロキシ基または炭素原子数１〜３のアルコキシ基である。
【００３３】
したがって、使用される化合物は、本明細書で定めるような阻害剤であろう。使用は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で行われてもよい。使用は、本明細書で定めるように、真菌、細菌または原生生物のＡＯＸであろう、微生物のＡＯＸを阻害することを含むことができる。使用は、シトクロムｂｃ１複合体を阻害すること、好ましくはシトクロムｂｃ１複合体のＱｏおよび／またはＱｉ結合部位を阻害することを含むであろう。本発明者らが考えるに、これが本発明の重要な特徴である。
【００３４】
それ故に、第４の態様として、本発明は、シトクロムｂｃ１複合体を阻害するため、化学式１の化合物の使用を提供し、化学式１の化合物は次のように示され：
【００３５】
【化３】
0006784645.tif 000004
【００３６】
ただし、Ｒ１は、ニトリル基、並びにＦ、Ｏ、ＮＨ２またはＣＮにより１または多置換されてもよい、および１つ以上の隣接しない（ｎｏｎ−ａｄｊａｃｅｎｔ）ＣＨ２基が、いずれの場合にも互いに独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−または−ＯＣＯ−により置換されてもよい、炭素原子数１〜４のアルキル基、アルケニル基、アミン基から選択され；
Ｒ２は、水素またはヒドロキシ基または炭素原子数１〜３のアルコキシ基であり；
Ｒ３は、炭素数１〜４のアルキル基により１または多置換されてもよい、炭素原子数４〜２０の直鎖のまたは分岐したアルキルまたはアルキレンであり；
Ｒ４は、水素またはヒドロキシ基または炭素原子数１〜３のアルコキシ基であり；
Ｒ５は、ハロゲン基であり；および、
Ｒ６は、水素または炭素数１〜４のアルキル基であり；
ただし、少なくともＲ２とＲ４のうち１つはヒドロキシ基または炭素原子数１〜３のアルコキシ基である。
【００３７】
Ｒ１からＲ６は、上記のように定めることができる。使用は、シトクロムｂｃ１複合体のＱｏおよび／またはＱｉ結合部位を阻害すること、好ましくはＱｏおよびＱｉ結合部位の両方を阻害することを含むであろう。
【００３８】
本発明者らが発見したところによると、本発明のＡＯＸ阻害剤は、ＡＯＸ酵素を含む植物病原菌の感染症を治療するため効果的に利用することができる。
【００３９】
したがって、第５の態様として、農薬として、第１の態様のオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）阻害剤であろう、化学式１の化合物の使用を提供する。
【００４０】
第６の態様として、農薬として用いるため、第１の態様のオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）阻害剤であろう、化学式１の化合物の使用を提供する。
【００４１】
第７の態様として、第１の態様のオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）阻害剤であろう、化学式１の化合物を含む農薬組成物を提供する。
【００４２】
第８の態様として、農薬の病気（ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）または感染症を治療するため、第７の態様の農薬組成物の使用を提供する。
【００４３】
治療されるであろう、農薬の病気は、カララ・フラクシネア（Ｃｈａｌａｒａ  ｆｒａｘｉｎｅａ）；セプトリア・トリチキ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）；ゴイマノミセス・グラミニス  変種  ティティチ（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｍｉｎｉｓ  ｖａｒ  ｔｉｔｉｃｉ）；マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）；マグナプロテ・オリゼ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）；リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）；ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）；フシクラジウム・エフスム（Ｆｕｓｉｃｌａｄｉｕｍ  ｅｆｆｕｓｕｍ）別名クラドスポリウム・カルイゲナム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃａｒｙｉｇｅｎｕｍ）およびフシクラドスポリウム・エフスム（Ｆｕｓｉｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｅｆｆｕｓｕｍ）；カルヤ・イリノイネンシス（Ｃａｒｙａ  ｉｌｌｉｎｏｉｎｅｎｓｉｓ）；ポドスファエラ・フスカ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｆｕｓｃａ）；ミクロドキウム・ニヴァレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）；ミクロドキウム・マユス（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｍａｊｕｓ）；セプトリア・ノドウム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｎｏｄｏｕｍ）；タペシア・アクフォルミス（Ｔａｐｅｓｉａ  ａｃｕｆｏｒｍｉｓ）；およびメタリジウム・アニソプリエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）からなる生物の群から選択された生物により引き起こされるであろう。
【００４４】
当然のことながら、セプトリア・トリチキ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）およびゴイマノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｍｉｎｉｓ  ｖａｒ  ｔｉｔｉｃｉ）は、小麦の病原菌（立ち枯れ病）であり；マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）およびマグナプロテ・オリゼ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）は、イネのいもち病およびホソムギの灰斑病を引き起こす可能性があり；リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）は、ジャガイモの黒あざ病（ｂｌａｃｋ  ｓｃｕｒｆ）を引き起こす可能性があり、ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）は、灰色かび病を引き起こす可能性があり、もっとも重要な宿主はワインブドウであるけれども、多くの植物種に影響を与える死体栄養性の真菌であり；フシクラジウム・エフサム（Ｆｕｓｉｃｌａｄｉｕｍ  ｅｆｆｕｓｕｍ）別名クラドスポリウム・カルイゲナム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃａｒｙｉｇｅｎｕｍ）およびフシクラドスポリウム・エフサム（Ｆｕｓｉｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｅｆｆｕｓｕｍ）は、ペカンのそうか病（Ｐｅｃａｎ  ｓｃａｂ）として知られ、商用のペカンのもっとも深刻な病気であり；カルヤ・イリノイネンシス（Ｃａｒｙａ  ｉｌｌｉｎｏｉｎｅｎｓｉｓ）は、アメリカ合衆国の南東部での生産に関わっており；ポドスファエラ・フスカ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｆｕｓｃａ）は、スペインにおけるウリ科のうどんこ病の主な病原体であり、世界的にウリ科の生産にとって最も重大な制限要因の一つであり；ミクロドキウム・ニヴァレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）およびマユス（ｍａｊｕｓ）は、大麦、デュラム小麦および軟質小麦を攻撃する可能性があり、およびフランス全土に存在しており；セプトリア・ノドウム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｎｏｄｏｕｍ）は、葉枯病（ｌｅａｆ  ｂｌｏｔｃｈ）およびふ枯病（ｇｌｕｍｅ  ｂｌｏｔｃｈ）を引き起こす可能性があり；タペシア・アクフォルミス（Ｔａｐｅｓｉａ  ａｃｕｆｏｒｍｉｓ）は、眼紋病を引き起こす可能性がある。加えて、害虫を管理する代替手段として昆虫病原性真菌であるメタリジウム・アニソプリエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）への農薬の関心が強まっている。
【００４５】
当然のことながら、カララ・フラクシネア（Ｃｈａｌａｒａ  ｆｒａｘｉｎｅａ）は、トネリコの立ち枯れ病を引き起こす。カララ・フラクシネア（Ｃｈａｌａｒａ  ｆｒａｘｉｎｅａ）の最初のＤＮＡ配列は、公開されており、以下のとおりである：
ＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＣＧＡＴＧＴＴＴＧＧＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＴＴＧＧＴＧＣＡＴＧＡＡＡＡＧＴＴＡＣＴＣＣＣＧＧＣＧＧＣＧＡＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＴＴＧＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＣＧＴＴＴＧＴＴＡＡＴＴＧＡＡＧＧＡＣＴＧＧＴＡＣＡＴＧＧＡＴＡＣＣＴＧＣＧＴＡＣＴＴＣＡＴＧＣＧＧＴＣＣＴＴＴＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＧＣＣＴＧＣＡＴＴＴＡＧＧＴＴＴＣＴＴＴＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣＧＣＣＧＣＡＧＴＴＡＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＴＧＧＡＴＴＴＣＧＴＧＴＧＴＣＣＣＧＡＴＡＡＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＡＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＣＣＡＴＣＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＣＴＣＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＣＴＴＡＧＡＡＧＡＣＧＴＴＧＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴＣＧＧＧＣＴＴＴＴＡＴＴＣＡＴＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＴＴＡＧＡＧＴＴＡＣＣＣＧＴＴＧＣＴＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＡＧＴＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＡＴＡＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＡＣＴＧＴＡＣＣＴＴＣＡＣＡＣＡＣＣＴＡＣＡＡＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＧＴＣＡＡＡＡＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＴＧＡＧＡＣＣＡＣＴＡＴＧＴＡＴＧＴＧＧＣＡＡＧＡＧＴＡＴＣＣＡＣＧＡＧＧＧＴＡＣＡＧＴＴＣＴＣＣＡＡＡＣＡＧＡＣＴＧＣＴＴＣＧＣＡＴＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧＴＣＧＴＡＧＣＡＧＣＣＡＡＣＴＴＴＴＣＡＣＡＡＴＣＡＴＧＴＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＴＣＣＡＴＣＧＣＧＴＴＧＧＴＣＴＴＧＧＴＧＣＧＡＧＴＣＣＡＧＴＡＣＴＴＣＡＴＡＣＴＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＴＣＧＴＧＡＧＴＴＣＴＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＣＧＡＧＣＡＧＣＧＴＴＧＡＧＡＧＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＣＡＧＡＡＧＧＡＡＡＣＧＧＡＡＣＴＧＡＴＣＣＧＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＡＧＣＡＴＧＧＧＡＡＣＡＴＣＣＣＧＡＣＴＴＣＡＧＣＴＡＣＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＧＧＴＣＴＴＣＴＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＣＧＡＡＣＣＡＧＣＣＧＡＴＴＴＣＴＣＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＧＣＡＴＴＡＴＧＧＡＴＧＧＴＴＣＧＣＣＴＴＴＴＡＡＧＡＴＧＧＧＧＡＡＣＣＧＡＣＣＴＡＧＣＡＡＣＧＧＧＣＴＡＣＡＡＡＣＡＣＧＡＴＧＴＡＧＡＡＧＴＧＣＣＡＡＡＧＡＡＡＡＴＣＧＧＴＧＡＴＧＣＣＡＡＴＧＣＣＧＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＡＧＣＣＡＴＡＴＧＧＴＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＡＡＡＴＧＧＴＴＧＡＴＴＣＧＡＡＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＣＴＧＴＴＧＣＧＧＧＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＴＧＧＴＴＧＣＧＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＧＧＣＡＴＴＴＧＣＡＴＴＣＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＴＴＧＡＡＧＡＧＧＧＡＴＡＡＴＧＧＡＴＧＧＡＴＴＧＡＧＡＣＧＣＴＴＴＴＧＧＡＧＧＡＧＡＧＴＣＡＧＡＡＴＧＡＧＡＧＧＡＴＧＣＡＴＣＴＣＣＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＣＣＧＡＡＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＣＡＴＧＡＡＡＴＴＣＡＴＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＡＡＧＧＣＧＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＴＧＴＴＣＡＴＣＴＣＣＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＣＧＡＡＣＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＴＴＣＧＴＣＧＧＣＴＡＣＣＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧＴＣＴＴＣＡＣＧＴＡＣＡＣＧＣＴＣＧＣＣＡＴＣＣＡＡＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＡＴＧＧＡＣＧＣＡＣＣＣＧＧＡＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＡＡＣＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＴＡＴＧＴＧＡＧＡＧＣＧＧＡＴＧＡＧＧＣＧＡＡＡＣＡＴＣＧＴＧＡＧＧＴＴＡＡＴＣＡＴＡＣＣＣＴＧＧＧＧＡＡＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＣＣＧＴＴＴＧＴＴＴＣＣＧＡＧＴＡＴＡＡＧＧＡＴＧＴＧＧＧＧＡＧＧＣＣＧＣＡＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＧＡＴＴＧＡＧＣＡＴＧＴＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＴＧＴＴＡＴＴＴＧＡＧＡＧＴＴＧＧＡＧＣＧＡＡＧＴＣＴＴＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＣＴＴＧＡＴＣＧＣＧＡＴＣＧＡＴＧＧＣＴＣＴＣＧＡＣＧＡＣＴＡＧＡＴＧＡＧＧＧＡＣＴＴＧＡＡＧＴＣＴＴＡＡＡＣＴＧＣＧＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＴＡＧＡＧＡＴＴＡＣＴＡＣＡＧＡＧＡＧＧＣＧＴＴＴＴＧＡＧＧＴＴＴＴＴＧＧＣＧＴＴＧＧＴＴＴＡＴＡＧＧＴＧＴＧＣＡＡＧＡＴＧＧＧＴＴＣＧＧＧＣＧＴＴＴＧＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴ                                ［配列番号１］。
【００４６】
この配列は、オンラインのｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ａｓｈ−ｄｉｅｂａｃｋ−ｃｒｏｗｄｓｏｕｒｃｅ／ｄａｔａにて見られる。ＤＮＡ配列は、オープンソースファイル中のこの場所で見られる：ＣＨＡＦＲ７４６８３６．１．１＿００５３３００．１  ｇｅｎｅ＝ＣＨＡＦＲ７４６８３６．１．１＿００５３３００．  ｌｏｃ：Ｃｆ７４６８３６＿ＴＧＡＣ＿ｓ１ｖ１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１０２７（）１１５１４６−１１７３３７  ｓｅｇｓ：１−２６０，２６１−６２０，６２１−１０９８  ＣＤＳ＝４９３−１５９０  ｌｏｃ：Ｃｆ７４６８３６＿ＴＧＡＣ＿ｓ１ｖ１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１０２７｜１１５１４６−１１７３３７｜  ｅｘｏｎｓ：１１５１４６−１１５８９７，１１５９８７−１１６３４６，１１６４１６−１１７３３７  ｓｅｇｓ：１−７５２，７５３−１１１２，１１１３−２０３４。
【００４７】
配列番号１にて表された下線部に示されるように、Ｃ．フラクシネアのＤＮＡ配列は、ＡＯＸをコードしている。したがって、本明細書で定義されるように、本発明のＡＯＸ阻害剤は、この真菌、特に配列番号１でコードされたそのＡＯＸに対して効果的であろう。
【００４８】
農薬組成物は、ＡＯＸ阻害剤が混ぜられた１つ以上の溶媒を含んでよい。組成物中の溶媒の量は、１％から９９％、または３０％から８０％の範囲であろう。例えば、適切な溶媒は、非極性水不混和性溶媒、または極性非プロトン性水溶性有機溶媒を含む。非極性溶媒は、例えば、置換されたまたは非置換である脂肪族または芳香族である植物油の炭化水素およびエステルまたはこれらの混合物を含む。芳香族の炭化水素の限定されない例としては、ベンゼンまたは置換されたベンゼン誘導体、例えばトルエン、キシレン、１，２，４−トリメチルベンゼン、ナフタレンまたはそれらの混合物を含む。一つの実施形態として、溶媒は、ナフタレンおよび１，２，４−トリメチルベンゼンの混合物を含む。もう一つの実施形態として、溶媒は、アロマティック１５０（Ａｒｏｍａｔｉｃ  １５０）、＜１０％のナフタレンおよび＜１．７％の１，２，４−トリメチルベンゼンを含む重質芳香族ナフサ溶媒である。
【００４９】
アルキルエステルはまた、非極性、水溶性溶媒として使用できる。植物油は、植物油のアルキルエステルを形成するためにさまざまなアルコールでエステル化されうる。これら植物油の脂肪酸は、５〜２０または６〜１５の炭素原子を有する。植物油のアルキルエステルは、キャノーラ（セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ））、亜麻仁、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ  Ｌ）、大豆およびヒマワリ油のメチル、エチルおよびブチルエステルを含むが、これに限定されない。一つ実施形態として、溶媒は、メチルエステルの混合物である。メチルエステルの具体的な非限定例は、Ｓｔｅｐａｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （２２  Ｗ．  Ｆｒｏｎｔａｇｅ  Ｒｏａｄ，  Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）により製造されたＡｇｅｎｔ  ２４１６−２１である。
【００５０】
水混和性の極性非プロトン溶媒は、例えば、アルキルラクテート、イソプロピルラクテート、アルキルカーボネイト、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコルアルキルエーテル、ポリプロピレングリコールおよびポリプロピレングリコールアルキルエーテル、またはこれらの混合物を含んでよい。
【００５１】
組成物は、一つ以上のアジュバントを含んでよい。アジュバントは、例えば、除草性能を強化または改善することができる。アジュバントは、製剤時に、または処置前の混合物として散布機（ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ）によって組成物に加えられてもよい。アジュバントは、例えば、界面活性剤（乳化剤）、作物油、肥料、分散剤、相溶化剤、発泡活性剤、発泡抑制剤、矯味矯臭剤、およびスプレー着色剤（ｓｐｒａｙ  ｃｏｌｏｒａｎｔｓ）（染料）を含む。アジュバントは、いずれの望ましい量であってもよい。例えば、製剤は、１％から３％のアジュバント、３％から８％のアジュバント、８％から１６％のアジュバント、１７％から３０％のアジュバント、または３０％以上（例えば４０％以上）のアジュバントを含んでもよい。
【００５２】
組成物は、一つ以上の界面活性剤を含んでよい。界面活性剤は、溶液中にあるＡＯＸ阻害剤の溶解度を増加することができる。界面活性剤はまた、スプレー保持（ｓｐｒａｙ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）、飛沫散布（ｄｒｏｐｌｅｔ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）、および乾燥率に作用することができる。界面活性剤は、陰イオンまたは非イオンでもよい。陰イオン性の界面活性剤の例としては、炭素原子数１４〜２２を持つ長鎖アルコールのリン酸モノおよびジエステルならびにそれらの塩；炭素原子数１４〜２２を持つ長鎖アルコールのアルキレンオキシド添加物のリン酸モノおよびジエステルならびにそれらの塩；炭素原子数１４〜２２を持つアルキル硫酸塩；炭素原子数１４〜２２を持つアルコールのポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；炭素原子数１４〜２２を持つアルカンスルホン酸塩；および炭素原子数１４〜２２を持つオレフィンスルホネートを含む。
【００５３】
適切な非イオン界面活性剤は、例えば、エトキシル化脂肪酸、アルコールエトキシレート、トリスチリルフェノールエトキシレート、エトキシル化ソルビタン脂肪酸エステル、またはこれらの混合物を含む。エトキシル化脂肪酸は、少なくとも２５、好ましくは２７〜３７のエトキシ単位を有するヒマシまたはキャノーラ油エトキシレートを含み、例えば、Ｕｎｉｑｅｍａ（旧ＩＣＩ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）のＳｕｎａｐｔｏｌ  ＲＴＭ  ＣＡ３５０（３５のエトキシ単位を有するヒマシ油エトキシレート）、Ｈｅｎｋｅｌ  ＫＧａＡのＭｅｒｇｉｔａｌ  ＲＴＭ  ＥＬ３３（３３のエトキシ単位を有するヒマシ油エトキシレート），Ｈｅｎｋｅｌ  ＫＧａＡのＥｕｍｕｌｇｉｎ  ＲＴＭ  Ｃ０３３７３（３０のエトキシ単位を有するキャノーラ油エトキシレート）およびＵｎｉｑｅｍａのＵｋａｎｉｌ  ＲＴＭ  ２５０７（ヒマシ油エトキシレート）。
【００５４】
界面活性剤は、いずれの望ましい量でもよい。例えば、界面活性剤は、製剤中に約０．１〜約３０重量％の量であってもよい。特定の実施形態として、界面活性剤は、製剤中に約１〜約９重量％の量が存在する。他の実施形態として、界面活性剤は、製剤中に約１０〜約２０重量％の量が存在する。
【００５５】
組成物には、１以上の乳化剤が含まれてもよい。乳化剤は、通常はエマルションをよく分散させておくのに使用される界面活性剤の一種である。乳化剤の非限定的な例としては、Ａｇｅｎｔ  ２２０１−７６、Ａｇｅｎｔ  ２４１６−２０、Ｅｍｕｌｐｏｎ  ＣＯ−３６０、Ｔ−Ｄｅｔ  Ｃ−４０（Ｒ）、およびＡｇｎｉｑｕｅ（ＴＭ）  ＳＢＯ−ＩＯを含む。Ａｇｅｎｔ  ２２０１−７６は、Ｓｔｅｐａｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ（２２  Ｗ．  Ｆｒｏｎｔａｇｅ  Ｒｏａｄ，  Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）により製造され、非イオン性および非イオン性界面活性剤（８２％）の混合である。Ａｇｅｎｔ  ２２０１−７６の成分は、アルキルベンゼンスルホン酸塩および脂肪酸エトキシレート、芳香族石油炭化水素、１−ヘキサノールおよびナフタレンである。Ａｇｅｎｔ  ２４１６−２０はまた、Ｓｔｅｐａｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ（２２  Ｗ．  Ｆｒｏｎｔａｇｅ  Ｒｏａｄ，  Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）により製造され、非イオンおよび陰イオン界面活性剤（３５〜３７％）の混合である。Ａｇｅｎｔ  ２４１６−２０はまた、芳香族石油炭化水素（５５〜５８％）、およびナフタレン（６〜７％）を含む。Ｅｍｕｌｐｏｎ  ＣＯ−３６０は、Ａｋｚｏ  Ｎｏｂｅｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．（５２５  Ｗｅｓｔ  Ｖａｎ  Ｂｕｒｅｎ，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）により製造され、エトキシル化ヒマシ油（１００重量％）およびオキシラン（＜０．００１重量％）を含む。Ｔ−Ｄｅｔ  Ｃ−４０（Ｒ）は、Ｈａｒｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（５２００  Ｓｐｅａｋｅｒ  Ｒｏａｄ．，  Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  ２９３０，  Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，  Ｋａｎｓａｓ）またはＡｋｚｏ  Ｎｏｂｅｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．（５２５  Ｗｅｓｔ  Ｖａｎ  Ｂｕｒｅｎ，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から購入でき、非イオン乳化剤、およびエトキシル化（ポリエトキシル化）ヒマシ油の一銘柄である。Ａｇｎｉｑｕｅ（ＴＭ）  ＳＢＯ−ＩＯは、ドイツ、ミュンヘンに本部を置くＣｏｇｎｉｘ  ＧｍｂＨにより製造され、エトキシル化大豆油としてアルコキシル化トリグリセリドを含む。
【００５６】
作物油、または作物油濃縮物は、除草剤製剤の効能を増加するのに使用できる。いかなる特定の理論による制約を望むものではないが、作物油は、水よりも長く葉面の湿性を保つと考えられており、同様に除草剤が浸透するための多くの時間を見込むことができ、したがって植物（例えば、雑草）に入る除草剤の量を増加する。作物油は、植物（例えば、雑草）による除草剤の摂取を改善できる。作物油は、それゆえに、除草剤の効能または活性を改善、増強、増加または促進することができる。作物油は、製剤中に１重量％〜４０重量％、または１重量％〜２０重量％含まれてもよい。作物油は、石油または植物油のいずれかに由来することができる。作物油の非限定的な例は、大豆油および石油系油を含む。
【００５７】
本発明の農薬組成物は、通例の製剤でもよい。非限定的な例は、液剤、乳剤、懸濁剤、水和剤、粉末剤（ｐｏｗｄｅｒ）、粉剤（ｄｕｓｔｓ）、糊剤、可溶性粉末剤、顆粒剤、ペレット剤、乳化可能濃縮製剤、オイルスプレー（ｏｉｌ  ｓｐｒａｙ）、噴霧剤、活性化合物を浸透させた天然および合成材料、ならびに非常に微細なカプセル（例えば、重合物質内）を含む。特定の実施形態では、組成物は、乳化可能濃縮製剤、水和剤、顆粒剤、粉剤（ｄｕｓｔｓ）、オイルスプレー（ｏｉｌ  ｓｐｒａｙ）または噴霧剤の形態である。
【００５８】
組成物は、付着性のコーティングを含んでもよい。このようなコーティングは、ＡＯＸ／ｂｃ１阻害剤が意図した環境、例えば治療される植物へ付着することを助けるものを含む。付着性のコーティングは、カルボキシメチルセルロース、さまざまな形態の天然および合成ポリマー、例えば粉末剤（ｐｏｗｄｅｒｓ）、顆粒剤またはラテックスを含む。他の付着性のコーティングは、アラビアゴム、ポリビニルアルコールおよびポリビニルアセテートを含む。リン脂質、例えばセファリンおよびレシチン、ならびに合成リン脂質はまた、付着性のコーティングの例である。更なる添加物は、鉱油および植物油でもよい。
【００５９】
着色料もまた、組成物に含むことができる。非限定的な例は、無機顔料、例えば酸化鉄、酸化チタンおよびプルシアンブルー、および有機染料、例えばアリザリン染料、アゾ染料および金属フタロシアニン染料、および微量栄養素、例えば鉄、マンガン、ホウ素、銅、コバルト、モリブデンおよび亜鉛の塩である。
【００６０】
本発明による農薬組成物は、レディーミックスの形態で適用できる。除草剤組成物はまた、個々に製剤され、例えばタンク混合の形態で適用されるように、使用時に混合できる。本発明の組成物は、それ自体としてまたはそれらの製剤の形態として利用でき、さらにまた除草剤、レディーミックスまたはタンク混合との混合物としても利用できる。組成物はまた、他の活性化合物、例えば他の殺真菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、トリ忌避剤（ｂｉｒｄ  ｒｅｐｅｌｌｅｎｔｓ）、成長物質、植物栄養素および土壌構造を改善する剤と混合されてもよい。特定の適用目的のために、特に出芽後に適用されるとき、植物によって許容される鉱油もしくは植物油（例えば、市販商品「Ｏｌｅｏ  ＤｕＰｏｎｔ  １  ＩＥ」）のような製剤、または、例として、更なる添加物として硫酸アンモニウムもしくはチオシアン酸アンモニウムのようなアンモニウム塩が含まれる。
【００６１】
組成物は、それ自体として、それらの製剤の形態として、または濃縮形態の希釈によってそこから調合された形態、例えば使用準備済（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）または濃縮液、溶液、懸濁液、乳剤、もしくは固形物、例えば、粉末剤（ｐｏｗｄｅｒｓ）、顆粒剤およびペレット剤として利用できる。これらは、通例の方法、例えば散水、スプレー、噴霧、散布または散乱によって分散される。
【００６２】
本発明の組成物は、１以上の安定剤、活性成分、および任意にアジュバント、希釈剤または溶媒を、混合または懸濁することによって生産される。特定の実施形態において、本発明の組成物は、例えば、最初に１以上のＡＯＸ／ｂｃ１阻害剤を希釈剤または溶媒と混合または懸濁することで作製できる。次に、適切な量のアジュバントは、ＡＯＸ／ｂｃ１阻害剤を含む結果として生じる混合物と組み合わせられる。ＡＯＸ／ｂｃ１阻害剤は、最後に加えられ、製剤がほとんどまたは完全に均質となるまで混合される。
【００６３】
農薬組成物により治療できる植物は、通常、「作物植物（ｃｒｏｐ  ｐｌａｎｔｓ）」として本明細書にて言及される。本明細書で使用される用語「作物植物」は、いかなる食用または非食用植物を含み、商用利用のために植えられ栽培された、装飾用の商品価値のある植物種を含む。したがって、作物植物は、花のおよび非花の（ｎｏｎ−ｆｌｏｒａｌ）植物、樹木、野菜植物、芝生並びに被覆植物を含む。作物植物の非限定的な具体例としては、キャノーラ、亜麻、エンドウ豆、レンズ豆、マメ（ｂｅａｎｓ）、リノーラ（ｌｉｎｏｌａ）、カラシナ、ヒヨコマメ、ヒマワリ、ジャガイモ、実生アルファルファ（ｓｅｅｄｌｉｎｇ  ａｌｆａｌｆａ）、タマネギ、大豆および芝草を含む。用語「植物（ｐｌａｎｔｓ）」は、発芽する種子（ｇｅｒｍｉｎａｎｔ  ｓｅｅｄ）、発芽した実生（ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ）、および根と地上部（例えば、葉、茎、花、枝、葉身、根など）を含んでいる、確立した植生（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｖｅｇｅｔａｔｉｏｎ）を含むことを意味する。本明細書で使用される用語「芝生（ｔｕｒｆ）」は、望まれた、または意図的に計画され維持された、例えば芝草（ｌａｗｎ）の区域に育つ草を指している。芝草はまた、地面の表層が草および草の根のマットからなる、芝地（ｓｏｄ）を指している。
【００６４】
ＡＯＸ／ｂｃ１阻害剤の散布量は、例えば、農薬組成物で治療される作物に応じて変化する。一般に、散布量は、０．０１ｋｇ／ｈａ〜５．００ｋｇ／ｈａまたは０．０３ｋｇ／ｈａ〜３．００ｋｇ／ｈａのＡＯＸ／ｂｃ１阻害剤であろう。
【００６５】
本発明者らはまた、本発明の阻害剤がＡＯＸ酵素を含む動物またはヒト病原体の感染症を治療するのに効果的に利用できることを発見した。
【００６６】
第９の態様として、治療または診断に用いる、第１の態様のオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）阻害剤であろう、化学式１の化合物を提供する。
【００６７】
第１０の態様として、微生物の感染症の治療に用いる、第１の態様のオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）阻害剤であろう、化学式１の化合物を提供する。
【００６８】
第１１の態様として、患者の微生物感染症の治療、改善または防止の方法を提供し、前記方法は、そのような治療を必要とする患者に対し、第１の態様のオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）阻害剤であろう、治療上有効な量の化学式１の化合物を投与することを含む。
【００６９】
第１２の態様として、微生物のオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）および／またはシトクロムｂｃ１複合体の活性を阻害する方法を提供し、前記方法は、微生物のオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）および／またはシトクロムｂｃ１複合体と、第１の態様のオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）阻害剤であろう、治療上有効な量の化学式１の化合物とを接触させることを含む。
【００７０】
ＡＯＸ／ｂｃ１阻害剤は、細菌性の感染症、例えばグラム陽性またはグラム陰性細菌感染症の治療に利用できる。
【００７１】
好ましくは、ＡＯＸ／ｂｃ１阻害剤は、真菌感染症の治療に利用される。例えば、阻害剤の効果がある真菌は、糸状菌、例えば子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）を含むであろう。阻害剤の効果がある真菌の例は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）；ブルメリア（Ｂｌｕｍｅｒｉａ）；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）；クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）；エンセファィトゾーン（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ）；フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）；レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）；マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）；フィトフィトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）；プラズモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）；ニューモシスティス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）；ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）；フィチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）；プッキニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）；リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）；リコフィトン（ｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）；およびウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）からなる属の群から選択できる。
【００７２】
真菌の更なる例は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）のからなる属の群より選択できる。真菌は、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）；アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）；アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）；アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）；アスペルギルス・パラシティクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）；アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）；ブルメリア・グラニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）；カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）；カンジダ・クルゼイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｒｕｚｅｉ）；カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）；カンジダ・パラシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）；カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）；  クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）；エンセファリトゾーン・クニク（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ  ｃｕｎｉｃｕｌｉ）；フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）；レプトスフェリアノドルム（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａｎｏｄｏｒｕｍ）；マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）；フィトフィトラ・カプシシ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉ）；フィトフィトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）；プラスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ）；ニューモシスチス・ジロベシ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉ）；プッチニア・コロナタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｃｏｒｏｎａｔａ）；プッチニア・グラミニス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）；ピリキュラリア・オリゼ（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ）；フィチウム・ウルチムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）；リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）；トリコフィトンインタージギターレ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ）；トリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）；およびウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）からなる種の群から選択されるであろう。真菌のさらなる例としては、酵母菌、例えば、サッカロマイセス属菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ）、例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはカンジダ属菌（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ）およびヒトに感染することが知られている、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）を含む。
【００７３】
ＡＯＸ／ｂｃ１阻害剤は、ヒト病原体を伴う病気、例えば、腸疾患；リーシュマニア症（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ）；カンジダ症（Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ）；およびコンタクトレンズ使用に伴う病気を治療することに使用できる。
【００７４】
当然のことながら、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、クリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）およびブラストシスチス・ホミニス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）は、腸疾患を引き起こすことができ；リーシュマニア症は、リーシュマニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉ）寄生菌によって引き起こされ；カンジダ症は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）（一般に、鵞口瘡として知られる）によって引き起こされ；およびコンタクトレンズ使用に伴う病気は、自由生活の原生生物アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）により引き起こされるであろう。
【００７５】
当然のことながら、本発明によるＡＯＸ／ｂｃ１阻害剤は、単剤治療（ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ）として利用可能な、薬品として使用でき、言い換えれば、微生物感染症を治療し、改善し、または防止するためにＡＯＸ／ｂｃ１阻害剤だけの使用でもよい。あるいは、ＡＯＸ／ｂｃ１阻害剤は、微生物感染症を治療し、改善し、または防止するための既知の治療法、例えば既知の抗細菌剤または抗真菌剤との付加物として、または併用として使用できる。
【００７６】
本発明によるＡＯＸ／ｂｃ１阻害剤は、特に組成物の使われ方に応じて、多くの異なる形態を有する組成物と化合してもよい。したがって、例えば、組成物は、粉末剤（ｐｏｗｄｅｒ）、錠剤、カプセル剤、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ハイドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液（ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）または治療を必要とするヒトまたは動物に投与できる他のいかなる適した形態の形でもよい。当然のことながら、本発明による薬剤の賦形剤は、投与される患者によく許容される賦形剤であるべきである。
【００７７】
本発明によるＡＯＸ／ｂｃ１阻害剤を含む薬剤は、多くの方法で利用できる。例えば、経口投与が必要とされるであろう場合において、阻害剤は、例えば、錠剤、カプセル剤または液剤の形で経口投与できる組成物の中に含まれるであろう。本発明の阻害剤を含む組成物は、吸入（例えば、鼻腔内に）によって投与することができる。組成物はまた、局所使用のために製剤されてもよい。例えば、ゲル剤、クリーム剤または軟膏剤は、例えば治療部位に隣接した皮膚に塗布されるであろう。
【００７８】
本発明による阻害剤はまた、持続放出性または遅延放出性デバイスに組み込まれてもよい。そのようなデバイスは、例えば、皮膚または皮下に挿入でき、薬剤を数週間または数ヶ月にもわたって放出することができる。デバイスは、少なくとも治療部位に隣接して配置されるであろう。このようなデバイスは、本発明に基づいて使用されるモジュレーターでの長期治療が要求される時、および頻繁な治療（例えば、少なくとも連日注射）を通常必要としている場合、特に有効であろう。
【００７９】
好ましい実施形態として、本発明による阻害剤および組成物は、血流内または直接的に治療を必要とする部位の中への注入により患者へ投与できる。注入は、静脈（急速投与または点滴）または皮下（急速投与または点滴）、または皮内（急速投与または点滴）であろう。
【００８０】
当然のことながら、必要とされるＡＯＸ／ｂｃ１阻害剤の量は、生物活性および生物学的利用能によって決定され、同様に、投与方法、阻害剤の生理化学的性質、および単剤治療としてまたは併用療法で使用されるかどうかによって決定される。投与の頻度はまた、治療される患者の中における阻害剤の半減期により影響されるであろう。投与される最適用量は、当業者によって決められるであろうし、使用する具体的な阻害剤、薬剤組成物の強さ、投与方法、および治療される病気の進行により変わるであろう。治療される特定の患者による追加的な因子は、患者の年齢、体重、性別、食事、および投与の時間を含む、投薬量を調整する必要をもたらすであろう。
【００８１】
通常、本発明による阻害剤を０．０１μｇ／ｋｇ体重〜０．５μｇ／ｋｇ体重の間での日用量は、どの阻害剤が使用されるかにもよるが、微生物感染症を治療し、改善し、または防止するために利用できる。より好ましくは、阻害剤の日用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の間、より好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜２００ｍｇ／ｋｇ体重の間、最も好ましいのは、約１ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重の間である。
【００８２】
阻害剤は、微生物感染症の発病前、発病の間、発病後に投与できる。日用量は、一回投与（例えば、一日一回の投与）として行われるであろう。あるいは、阻害剤は、一日あたり二回以上の投薬を要するであろう。例として、阻害剤は、２５ｍｇ〜７０００ｍｇ（すなわち体重７０ｋｇと仮定して）の間で一日当たり二回（または治療される病気の重症度によってはそれ以上）投与されるであろう。治療を受ける患者は、覚醒時に最初の投薬を受け、そして夜に（もし二回の用法の場合）、またはその後３もしくは４時間の間隔で二回目の投薬を受けるであろう。あるいは、持続放出性デバイスは、反復投与する必要なく、患者に対し、本発明による阻害剤の適量を与えるのに使用できる。
【００８３】
既知の治療、例えば製薬産業（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験、治療実験など）により慣例として行われている治療は、本発明による阻害剤および的確な治療法（例えば阻害剤の日用量および投与の頻度）を含む特定の製剤を作製するために使用できる。本発明者らは、本発明の阻害剤の使用に基づき、微生物感染症を治療するための組成物を最初に記載していることを確信している。
【００８４】
したがって、本発明の第１３の態様として、第１の態様によるＡＯＸ阻害剤であろう、化学式１により示された化合物、および薬学的に許容される賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ）を含む抗微生物剤組成物を提供する。
【００８５】
用語「抗微生物剤組成物（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、いかなる微生物感染症、例えば、真菌、細菌または病原性感染症の治療法改善、防止または治療に使用される医薬製剤を意味する。
【００８６】
本発明はまた、第１４の態様として、第１３の態様による抗微生物剤組成物を作製する過程を提供し、前記過程は、第１の態様によるＡＯＸ阻害剤であろう、治療に効果がある量の化学式１の化合物、および薬学的に許容される賦形剤を接触させることを含む。
【００８７】
「患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、脊椎動物、哺乳類、または家畜であろう。つまり、本発明による阻害剤、組成物および薬剤は、いかなる哺乳類、例えば家畜（例えば、馬）、ペットを治療するために使用でき、または他の獣医用外用薬（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）として使用できる。しかし、もっとも好ましくは、患者はヒトである。
【００８８】
ＡＯＸ／ｂｃ１阻害剤の「治療的に効果がある量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、患者への投薬時、微生物感染症を治療する、または望ましい効果を上げるために必要な薬剤または薬物の量とするいかなる量である。
【００８９】
例えば、使用されるＡＯＸ／ｂｃ１阻害剤の治療的に効果がある量は、約０．０１ｍｇ〜約８００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇであろう。好ましくは、阻害剤の量は、約０．１ｍｇ〜約２５０ｍｇ、最も好ましくは約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇの量である。
【００９０】
本明細書にて言及される「薬学的に許容される賦形剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｖｅｈｉｃｌｅ）」は、いかなる既知の化合物または薬剤組成物を製剤するのに有益であると当業者に知られた既知の化合物の組み合わせである。
【００９１】
一つの実施形態として、薬学的に許容される賦形剤は、固体でもよく、組成物は、粉末剤（ｐｏｗｄｅｒ）または錠剤の形態でもよい。固体の薬学的に許容される賦形剤は、香味剤（ｆｌａｖｏｕｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、潤滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、色素（ｄｙｅｓ）、注入剤（ｆｉｌｌｅｒｓ）、流動促進剤、圧縮助剤（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｉｄｓ）、不活性の結合剤（ｉｎｅｒｔ  ｂｉｎｄｅｒｓ）、甘味料、保存料、色素（ｄｙｅｓ）、コーティング、または錠剤分解剤（ｔａｂｌｅｔ−ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）としてもまた機能するであろう１以上の物質を含むであろう。
賦形剤はまた、封入材料であろう。粉末剤（ｐｏｗｄｅｒｓ）として、賦形剤は、本発明による微粉化した活性剤との混合物である微粉固体である。錠剤として、活性剤（例えば、モジュレーター）は、適切な割合で必要な圧縮特性を有する賦形剤と混合し、望ましい形および大きさに圧縮されるであろう。粉末剤（ｐｏｗｄｅｒｓ）および錠剤は、好ましくは、９９％までの活性剤を含む。適切な固体の賦形剤は、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂を含む。他の実施形態として、薬剤の賦形剤は、ゲルでもよく、組成物は、クリームまたは同種のものの形態でもよい。
【００９２】
しかし、薬剤の賦形剤は、液体でもよく、薬剤の組成物は、溶液の形態である。液剤賦形剤は、溶液、懸濁液、乳液、シロップ、エリキシル剤および圧縮組成物を調製することで使用される。本発明による阻害剤は、薬学的に許容される液剤賦形剤、例えば、水、有機溶媒、両方の混合物または薬学的に許容される油もしくは油脂にて溶解または懸濁される。液剤賦形剤は、他の適切な薬剤の添加物、例えば、可溶化剤、乳化剤、緩衝液、保存料、甘味料、香味剤（ｆｌａｖｏｕｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、懸濁化剤、増粘剤、染料（ｃｏｌｏｕｒｓ）、粘性調節剤、安定剤または浸透圧調整剤を含むことができる。経口および非経口投与のための液剤賦形剤の適切な例は、水（部分的に上記の添加物を含む、例えばセルロース誘導体、好ましくは、カルボキシメチル・セルロース・ナトリウム溶液）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）およびこれらの誘導体、ならびに油（例えば、ヤシ油およびラッカセイ油）を含む。非経口の投薬のため、賦形剤はまた、油性エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルでありうる。滅菌した液剤賦形剤は、非経口投与のため滅菌した液体形態組成物にとって有益である。圧縮組成物のための液剤賦形剤は、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴霧剤でありうる。
【００９３】
滅菌した溶液または懸濁液である、液体の薬剤組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、硬膜外、腹腔内、静脈内および特定の皮下への注入に利用できる。阻害剤は、滅菌した水、生理食塩水、または他の適切に滅菌した注入可能な媒体を使用する投与時に溶解または懸濁されるであろう、滅菌した固体の組成物として調合されてもよい。
【００９４】
本発明の阻害剤および薬剤組成物は、他の溶質または懸濁化剤（例えば、溶液を等浸透圧とするのに十分な生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）またはグルコース）、胆汁塩、アカシア（ａｃａｃｉａ）、ゼラチン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）（エチレンオキシドと共重合したソルビトールおよびその無水物のオレイン酸エステル）および同類のものを含む、滅菌した溶液または懸濁液の形態によって経口で投与されるであろう。本発明による阻害剤は、液体のあるいは固体の組成物の形態のいずれかにより経口投与できる。経口投与に適した組成物は、固形、例えば丸剤（ｐｉｌｌｓ）、カプセル、顆粒剤、錠剤および粉末剤（ｐｏｗｄｅｒｓ）、ならびに液体形態、例えば、溶液、シロップ、エリキシル剤、および懸濁液を含む。非経口投与に役立つ形態は、滅菌された溶液、乳剤、および懸濁液を含む。
【００９５】
本明細書中（添付した特許請求の範囲、要約書および図面のいずれも含む）に記載した特徴のすべて、および／または開示したいかなる方法または工程の段階のすべては、少なくともかかる特徴および／または段階のいくつかが互いに排他的である組み合わせを除き、いかなる組み合わせでの前記態様のいずれと組み合わせてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
本発明の実施形態はこれから、単なる例として、下記の実施例、および添付した線図に関して、さらに説明され：
【図１】図１は、ミトコンドリア呼吸鎖を表す略図であり、Ｉ−ＩＶ：呼吸鎖複合体；Ｖ：ＡＴＰ合成酵素；Ｑ：ユビキノン；Ｎｅｘｔ／ｉｎｔ：ＮＡＤＨ脱水素酵素；Ｓｔｂ：ストロビルリン作用点；ＳＨＡＭ：サリチルヒドロキサム酸作用点；ＣＮ／ＣＯ：シアン化物／一酸化炭素阻害部位；ＡＯ：オルタナティブオキシダーゼ；ＩＭＳ／ＩＭ／Ｍ：膜間腔／内膜／ミトコンドリアマトリクス；
【図２】図２は、化学量論的阻害剤の存在下で、トリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）のオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）タンパク質の結晶構造を示しており；
【図３】図３は、疎水ポケットおよびサウロマツム（Ｓａｕｒｏｍａｔｕｍ）位置番号を使用するオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）の脱イオン部位への阻害剤の水素結合を表す略図であり；
【図４】図４は、コンセンサス配列を表すさまざまな種のさまざまなオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）の配列アラインメントである。ＡＸＩＢ−ＡＲＡＴＨは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｐｏｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＡＯＸ酵素であり（配列番号２）、ＡＯＸ１＿ＳＯＹＢＮは、ダイズ（ｓｏｙｂｅａｎ）のＡＯＸ酵素であり（配列番号３）、ＡＯＸ１＿ＴＯＢＡＣは、タバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）のＡＯＸ酵素であり（配列番号４）、ＡＯＸ１Ａ＿ＯＲＹＳは、オリザ・サティバ−コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ−ｒｉｃｅ）のＡＯＸ酵素であり（配列番号５）、ＡＯＸ１＿ＳＡＵＧＵは、サウロマツム・グッタツム（Ｓａｕｒｏｍａｔｕｍ  ｇｕｔｔａｔｕｍ）のＡＯＸ酵素であり（配列番号６）、ＡＯＸ＿ＣＡＴＲＯは、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）のＡＯＸ酵素であり（配列番号７）、ＡＯＸ１＿ＭＡＮＩＮは、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）のＡＯＸ酵素であり（配列番号８）、ＡＯＸ＿ＺＥＡＭＡはトウモロコシ（Ｍａｉｚｅ）のＡＯＸ酵素であり（配列番号９）、ＡＯＸ１＿ＣＨＬＲＥは、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）のＡＯＸ酵素であり（配列番号１０）、ＡＯＸ＿ＮＥＵＣＲは、ニューロプソラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｐｓｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）のＡＯＸ酵素であり（配列番号１１）、ＡＯＸ＿ＨＡＮＡＮは、ハンセヌラ・アノモラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｎｏｍｏｌａ）のＡＯＸ酵素であり（配列番号１２）、ＡＯＸ＿ＴＲＹＢＢは、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）のＡＯＸ酵素であり（配列番号１３）、およびＡＯＸ＿ＣＨＬＳＰは、クラミドモナス種（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）のＡＯＸ酵素であり（配列番号１４）；
【図５】図５は、アスコフラノンの化学式（左手側）および本発明によるＡＯＸ阻害剤のさまざまな実施形態を示しており；
【図６】図６は、コレトクロリンＢ（Ｃｏｌｌｅｔｏｃｈｌｏｒｉｎ  Ｂ）の化学式を示しており；
【図７】図７は、コレトクロリンＢ（Ｃｏｌｌｅｔｏｃｈｌｏｒｉｎ  Ｂ）の化学合成を表している；
【図８】図８は、コレトクロリンＢ（Ｃｏｌｌｅｔｏｃｈｌｏｒｉｎ  Ｂ）でのＩＣ５０値を表すグラフであり；および
【図９】図９は、シトクロムｂｃ１活性へのコレトクロリンＢ（Ｃｏｌｌｅｔｏｃｈｌｏｒｉｎ  Ｂ）の影響を表すグラフである。
【実施例】
【００９７】
実施例
材料と方法
オルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）タンパク質は、Ｋｉｄｏ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １７９７，  ４４３−４５０、およびＫｉｄｏ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ａｃｔａ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｓｅｃｔ．  Ｆ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｒｙｓｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ６６，  ２７５−２７８にて概説された技術によって精製し、結晶化された。タンパク質の結晶構造は、上記論文にて概説された、蒸気ハンギングドロップ法（ｖａｐｏｕｒ  ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いて阻害剤の存在下および不在下の両方で得られた。阻害剤結合部位は、結晶構造から確認された。ポケットを囲む残基の分析は、図３で表すＬ１７７、Ｅ１７８、Ｌ２６７、Ａ２７１およびＹ２７５がすべての真菌、植物およびトリパノソーマ類の種を横断して１００％保存されていることを明らかにした。
【００９８】
実施例１−オルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）結合ポケットの特性
本研究の重要な新発見は、図２で示したように、化学量論的阻害剤の存在下および不在下の両方でオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）タンパク質の初めての結晶構造の決定である。本発明者らは、ポケットが変化しないこと、すなわち阻害剤の存在下または不在下で実質的に同じものであることを発見した。阻害剤の存在下でのＡＯＸの結晶構造の知識は、本発明者らをいくつかの合理的な殺真菌性の分子設計に着手するための非常に強い立場に置き、このことは、下記で議論するように、ＡＯＸを特異的に標的とする植物病原性殺真菌剤として振る舞う性質を有するＡＯＸ阻害剤化合物のライブラリの作成という結果になっている。
【００９９】
したがって、本発明者らは、図２で表すＡＯＸの結晶構造を生成した時点で、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて詳細にＡＯＸキノン結合ポケットの特性を明らかにすることを始めた。図３を参照すると、植物、サウロマツム・グッタツム（Ｓａｕｒｏｍａｔｕｍ  ｇｕｔｔａｔｕｍ）（コンニャク）のオルタナティブオキシダーゼ酵素（ＡＯＸ）の完全に特性化されたキノン結合部位またはポケットを表している。図はまた、ポケット内部に位置する代表的な阻害剤（コレトクロリンＢ）を表している。阻害剤の六員環は、ポケットの疎水性残基と密接に相互作用しており、阻害剤のイソプレニル尾部は、ポケットのアルギニン１７３（Ａｒｇ１７３）残基、グルタミン酸２７０（Ｇｌｕ２７０）残基およびセリン２７４（Ｓｅｒ２７４）残基と相互作用している。図３はまた、阻害剤結合ポケット（Ｒ１７３、Ｌ１７７、Ｅ１７８、Ｌ２６７、Ｅ２７０、Ａ２７１、Ｓ２７４およびＹ２７５）が膜表面近くに位置し、タンパク質の活性部位の４Å以内であることを表している。注目すべきは、図３の番号は、植物（すなわちサウロマツム・グッタツム（Ｓａｕｒｏｍａｔｕｍ  ｇｕｔｔａｔｕｍ））ＡＯＸタンパク質を参照しており、すべてのＡＯＸがこのタンパク質と比較される傾向にあることについてである。頭部アルデヒド基の酸素は、グルタミン酸（Ｇｌｕ１７８）およびチロシン２７５（Ｔｙｒ２７５）と水素結合している。理論に制約されることを望むものではないが、これらの水素結合は、これらの化合物の強力な阻害活性に重要であると考えられる。
【０１００】
下記の実施例で議論するように、本発明者らは、図４で表すＡＯＸのキノン結合部位が  真菌病原菌対策への期待できるターゲットであることを確かめている。本発明者らは、図４で表す多くのＡＯＸ酵素の配列アラインメントを準備し、明らかになったことは、ＡＯＸ結合部位の構造が由来した種にかかわりなく、すべてのＡＯＸにわたり高度に保存されていることである。図４において囲まれた残基は、阻害剤の結合にかかわるＡＯＸ残基を示している。図３に表すアルギニン１７３（Ａｒｇ１７３）残基、グルタミン酸２７０（Ｇｌｕ２７０）残基およびセリン２７４（Ｓｅｒ２７４）残基は、より低く保存されている。しかし、これらの残基が尾部の結合にのみかかわっているので、多様性は、阻害剤の感受性に関してそれほど重要ではないとされている。
【０１０１】
したがって、Ｓ・グッタツム（Ｓ．  ｇｕｔｔａｔｕｍ）のＡＯＸ結合部位の本質の詳細な知識は、一般にキノール結合部位に適用できる共通の構造を明らかにするので、重要であり、それ故に、結合のメカニズムへの更なる理解を提供する。さらに重要なことに、この知識は、オルタナティブオキシダーゼを特異的に標的とする植物病原性殺真菌剤および人体寄生生物の合理的設計に役立っている。
【０１０２】
この知識に基づき、本発明者らは、ＡＯＸ阻害剤の新しいライブラリを設計および合成することに着手し、また、タンパク質リガンド相互作用および動態の本質の更なる詳細な構造的知識を得ることに着手した。また、ＡＯＸを標的とする構造的に変化した阻害剤がどの程度真菌のＱｏ部位を阻害するのかについても試験し、その結果、新世代のデュアルモード殺真菌剤を提供する。
【０１０３】
実施例２−ＡＯＸ阻害剤の設計および合成
本発明者らは、化合物、図５に示す化学構造である、アスコフラノンを基に、多くのＡＯＸ阻害剤を設計しおよび合成している。アスコフラノンは、複雑な合成経路を有しており、反応性の高いアルデヒド基（−ＣＨＯ）を有する。いくつかのアスコフラノン誘導体は、合成され、すなわちコレトクロリンＢ（ＲがＣＨＯである、図５で構造“２”とラベルされたもの）、ＲがＣＨ２ＯＨである図５に表す化合物“３”、およびＲが図５で表す４ａ−４ｈの化合物である。
【０１０４】
これらの化合物のいくつかの阻害効果は、評価され、結果は、表１にまとめられている。
【０１０５】
【表１】
0006784645.tif 000005
【０１０６】
表１は、精製組み換えＡＯＸタンパク質の呼吸（ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＡＯＸ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を５０％まで減少させるのに必要な阻害剤の濃度をまとめている。呼吸は、基質として１ｍＭ  ＮＡＤＨの存在下での酸素消費率として測定され、数字は阻害剤の最終的なＩ５０濃度を表す。
【０１０７】
コレトクロリンＢは、合成された誘導体のもっとも有望な候補の一つであり、なぜなら組み換えＡＯＸタンパク質のテスト時、ほぼ１６５ｐＭのＩＣ５０値（アスコフラノンのＩＣ５０は５８ｐＭ）を有するからである。この阻害剤は、膜結合型および精製ＡＯＸに特異的であり、他のキノール酸化酵素を阻害するとは思われない。さらに、コレトクロリンＢはまた、アスコフラノンに勝る重要な利点である、簡単な２段階の過程で合成される。
【０１０８】
実施例３−コレトクロリンＢの合成
コレトクロリンＢの化学構造は、図６に表され、その合成に用いる方法は、図７に表される。
【０１０９】
段階１：化合物（１）から化合物（２）
オルシノール（５ｇ、４０ｍｍｏｌ）およびＺｎ（ＣＮ）２（７．１ｇ、６０ｍｍｏｌ）は、Ｎ２下で機械の撹拌機により三口フラスコに入れられる。５０ｍｌのエーテルが加えられ、反応は、ＨＣｌガスで飽和される。２時間後、エーテルは、移され、５０ｍｌの水が反応混合物に加えられる。１００℃に熱せられ、生成物が分離（ｃｒａｓｈ）される。粗生成物は、ブフナー濾過によって集められ、７６％収率でアルデヒド（４．６ｇ）を精製するために水から再結晶される。
【０１１０】
段階２：化合物（２）から化合物（３）
オルシノールアルデヒド（Ｏｒｃｉｎｏｌ  Ａｌｄｅｈｙｄｅ）（５２７ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ）は、Ｎ２下に置かれ、氷浴上で無水エーテルに溶解される。ＳＯ２Ｃｌ２（１．３５ｍｌ、４．７ｍｍｏｌ）は、エーテル（１５ｍｌ）で希釈され、１５分かけて滴下される。反応は、夜通し撹拌され、水を加え冷まされる。エーテル層は、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３および水で洗浄され、ＭｇＳＯ４によって乾燥され、真空下で濃縮される。粗固体はそこで、７５％収率で生成物（４５９ｍｇ）を得るためにフラッシュ・クロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル  ２：１  −＞  １：１）によって精製される。
【０１１１】
段階３：化合物（３）から化合物（４）
３-クロロ-４，６-ジヒドロキシ-２-メチル-ベンズアルデヒド（１５０ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）は、１０％ＫＯＨ（０．９ｍｌ、０．８ｍｍｏｌ）に溶解され、深紅の水溶液を生成する。反応は、氷浴上に置かれ、ゲラニルブロミド（０．３９ｍｌ、１．６ｍｍｏｌ）が加えられる。反応は、夜通し勢いよく撹拌され、エーテルで抽出される。有機層は、真空下で濃縮される前、ＮａＨＣＯ３で洗浄され、塩水につけられる。結果としての油（ｒｅｓｕｌｔａｎｔ  ｏｉｌ）は、２０％収率で純コレトクロリンＢ（５２ｍｇ）を得るためにフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル（ｐｅｔｒｏｌ  ｅｔｈｅｒ）  ４０−６０：エーテル  １０：１  −＞３：１）によって精製される。
【０１１２】
実施例４−コレトクロリンＢの特性
本発明者らは、阻害剤のベンゼン環のヒドロキシル基および塩素置換基およびメチル置換基が高い力価にとって重要であるとされるが、フラノン部分は、疎水性側鎖、例えばゲラニル基が、コレトクロリンＢ（２）と同様にして、保持される限り、冗長である。
【０１１３】
しかし、アスコフラノン（１）およびコレトクロリン（２）に存在するアルデヒド基は、いくつかの理由で抗寄生虫薬設計にとって問題であるとされる。水素結合受容体として機能する能力およびＡＯＸと双極子間相互作用を起こす能力に加えて、アルデヒド基は、可逆的共有結合的装飾を起こすのに十分なほど化学的によく反応し、一般的な薬剤の製剤には通常不適当であろう。さらに、アルデヒドは、塩基性輸送タンパク質へ付随的に非特異的結合することによりそれぞれカルボン酸へと代謝的に酸化される傾向がある。それゆえに、本発明者らは、図５で表すように、還元剤ＮａＢＨ４を用いてアルデヒド基の除去に着手した。アルコール誘導体（３）の合成および解析は、その阻害する性質は維持され、ゆえに、図５の化合物４ａ−４ｈとして示す、さまざまなアルデヒドバイオアイソスターが生成されたことを明らかにした。
【０１１４】
実施例５−部位特異的突然変異誘発試験
本発明者らは、Ｅ１２３およびＹ２２０の突然変異を起こし、それらが酵素活性および阻害剤結合に重要であることを明らかにした。
【０１１５】
部位特異的突然変異誘発およびプラスミド作製
ｐＲＥＰ１−ＡＯＸ、ｐＲＥＰ１−Ｅ１２３ＡおよびｐＲＥＰ１−Ｙ２２０Ｆ（分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）の野生型ＡＯＸならびにＥ１２３ＡおよびＹ２２０Ｆの変異を発現するために使用された）の作製は、以前に説明されている［Ｍ．Ｓ．  Ａｌｂｕｒｙ，Ｃ．  Ａｆｆｏｕｒｔｉｔ，Ｐ．Ｇ．  Ｃｒｉｃｈｔｏｎ，Ａ．Ｌ．  Ｍｏｏｒｅ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  −  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｎｅｗ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ａｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７  （２００２）  １１９０−１１９４：Ｍ．Ｓ．  Ａｌｂｕｒｙ，  Ｐ．  Ｄｕｄｌｅｙ，  Ｆ．Ｚ．  Ｗａｔｔｓ，  Ａ．Ｌ．  Ｍｏｏｒｅ，  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｃｙａｎｉｄｅ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１  （１９９６）  １７０６２−１７０６６．］。ＡＯＸの突然変異誘発は、ｐＳＬＭ−ＡＯＲプラスミド［Ｍ．Ｓ．  Ａｌｂｕｒｙ，  Ｃ．  Ａｆｆｏｕｒｔｉｔ，  Ｐ．Ｇ．  Ｃｒｉｃｈｔｏｎ，  Ａ．Ｌ．  Ｍｏｏｒｅ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  −  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｎｅｗ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ａｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７  （２００２）  １１９０−１１９４］により、製造者の説明に従いクイックチェンジ突然変異誘発キット（Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を用いて実施された。各々の全長（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）突然変異ＡＯＸは、ＢｓｐＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントから切除され、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化された酵母菌の発現ベクターｐＲＥＰ１／Ｎ  （ＮｄｅＩ部位をＮｃｏＩに置き換えられた改変ｐＲＥＰ１［Ｋ．  Ｍａｕｎｄｒｅｌｌ，  Ｎｍｔ１  ｏｆ  ｆｉｓｓｉｏｎ  ｙｅａｓｔ  −  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｇｅｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｒｅｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｔｈｉａｍｉｎｅ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５  （１９９０）  １０８５７−１０８６４．］）に結合され、ｐＲＥＰ１−Ｅ１２３ＡおよびｐＲＥＰ１−Ｙ２２０Ｆを得た。
結果
【０１１６】
【表２】
0006784645.tif 000006
【０１１７】
活性は、ＡＯＸの野生型および突然変異型を含む酵母菌のミトコンドリア（分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ））を分離したときに、基質としてＮＡＤＨを使い酸素消費量／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質として測定された。阻害剤は、オキシダーゼの突然変異型と結合しないことに留意されたい。
【０１１８】
実施例６−シトクロムｂｃ１呼吸活性へのコレトクロリンＢの効果
コレトクロリンＢおよびその誘導体は、植物および真菌のオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）の特異的阻害剤として実施例１〜５にて明らかにされている。この研究に続いて、本発明者らは、これらの化合物がまた、シトクロムｂｃ１複合体の呼吸活性にいかなる影響を与えるのかどうかの試験に着手した。二つのソース（ラットの肝臓およびジャガイモ）のミトコンドリアは、図９にまとめた典型的データに示されるように、コレトクロリンＢ（ＣＢ）で滴定された。ミトコンドリアのソースは共に、いかなるオルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）を含まず、ゆえに測定された呼吸活性は、シトクロムｂｃ１複合体からであったに違いない。
【０１１９】
呼吸活性は、０．３Ｍマンニトール、１０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭリン酸カリウムおよび１０ｍＭ  ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）バッファーｐＨ７．４を含む培地で測定された。５ｍＭコハク酸エステルに対して呼吸するラット肝臓ミトコンドリア０．９ｍｇまたは１ｍＭ  ＮＡＤＨに対して呼吸するジャガイモミトコンドリア０．３ｍｇのいずれかが使用された。呼吸は、２５℃、０．４ｍｌ量のランク（Ｒａｎｋ）酸素電極を用いて、１μＭ  ＣＣＣＰ（カルボニル・シアニド・ｍ−クロロメトキシ・フェニルヒドラゾン）の存在下、測定された。結果は、アスコクロリン（既知のｂｃ１阻害剤）およびアゾキシストロビン（ｂｃ１複合体を狙った市販殺真菌剤）と比較された。
結果
【０１２０】
【表３】
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【０１２１】
【表４】
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【０１２２】
表３および表４は、シトクロムｂｃ１複合体の呼吸（ＡＯＸ不在下）を５０％まで減少させるのに必要とされた阻害剤の濃度をまとめている。呼吸は、基質として１ｍＭ  ＮＡＤＨまたは５ｍＭコハク酸エステルの存在下での酸素消費量の割合として測定され、数値は、試験された阻害剤の最終的なＩＣ５０濃度を表している。より少ない量の化合物が呼吸活性を半減するのに必要とされることを意味するので、より低いＩＣ５０の値がより良い。
【０１２３】
コレトクロリンＢは、合成された誘導体の有望な候補であり、なぜなら、ラットの肝臓ミトコンドリアを試験したとき、アゾキシストルビン（約５２５ｎＭ）より低いＩＣ５０の値（約５１５ｎＭ）を有するからである。ジャガイモミトコンドリアを試験したとき、コレトクロリンＢのＩＣ５０の値は、たったの０．７５μＭであり、アゾキシストロビンのＩＣ５０（約１．４μＭ）の半分であり、アスコフラノン（約３０μＭ）のＩＣ５０より著しく低いのである。
【０１２４】
結論
オルタナティブオキシダーゼが不在であるミトコンドリアを使用する注意深い滴定は、驚くべきことに、化合物がＡＯＸを阻害することに加えてシトクロムｂｃ１複合体の特異的阻害剤であることを明らかにした。データは、化合物がシトクロムｂｃ１複合体のＱｏおよびＱｉ結合部位の両方でシトクロムｂｃ１複合体を阻害し、したがってオルタナティブオキシダーゼの不在下でさえとても強力な呼吸の阻害剤となることを示唆している。かかる発見の意味は、この化合物の誘導体が、オルタナティブオキシダーゼ（ＡＯＸ）を阻害するだけではなく、シトクロムｂｃ１複合体もまた阻害することで、非常に特異的および強力な二重機能殺真菌剤となるであろうことを示唆している。
【０１２５】
当然のことながら、本明細書中において試験されたコレトクロリンＢに対し、市販の殺真菌剤、例えばアゾキシストロビンは、ｂｃ１複合体内の１部位（ｑｏ）のみ阻害する。
したがって、コレトクロリンＢは、ＱｏおよびＱｉ結合部位の両方でシトクロムｂｃ１複合体、およびＡＯＸもまた阻害するので、この化合物およびその誘導体は、極めて強力および頑強な阻害剤の機能を果たすことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0006784645.tif 000018
【配列表】
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