(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次世代シーケンシングリードを参照配列とアライメントする方法であって、
（ａ）シーケンシングリードを受け取ることと、
（ｂ）参照配列に対する前記シーケンシングリードの第１のアライメントを実施して、前記シーケンシングリードがマップする前記参照配列内の標的配列を同定することと、
（ｃ）第１のアンカ配列および第２のアンカ配列を選択することと、
（ｄ）前記第１のアンカ配列を前記シーケンシングリードの上流領域に、かつ前記第２のアンカ配列を前記シーケンシングリードの下流領域に取り付けて、延長されたシーケンシングリードを生成することと、
（ｅ）前記第１のアンカ配列を前記標的配列の上流領域に、かつ前記第２のアンカ配列を前記標的配列の下流領域に取り付けて、延長された標的配列を生成することと、
（ｆ）前記延長された標的配列に対する前記延長されたシーケンシングリードの第２のアライメントを実施することであって、それにより、前記第２のアライメントは、前記第１のアライメントよりもより正確に前記標的配列にマップされる、実施すること
を含む方法。
【請求項２】
（ｇ）第２のアライメント結果に基づいて、前記延長されたシーケンシングリードと前記延長された標的配列との間で１つまたは複数の塩基が異なる位置を同定することと、
（ｈ）ステップ（ｇ）での前記同定に基づいてバリアントをコールすることと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シーケンシングリードは、細胞株、生検、一次組織、凍結組織、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）、液体生検、血液、血清、血漿、バフィーコート、体液、内臓液、腹水、穿刺、脳脊髄液、唾液、尿、涙、精液、膣液、吸引液、洗浄液、口腔スワブ、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸、精製された核酸、精製されたＤＮＡまたは精製されたＲＮＡに由来する試料からのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料は、癌、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、希少遺伝性疾患、複合疾患、糖尿病、心血管疾患、肝疾患または神経疾患を有する患者に由来する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記シーケンシングリードは、前記試料から増幅された核酸から生成される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記参照配列は、ヒトゲノムのコンセンサス配列内の領域または個別のヒト対象のゲノム配列内の領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記参照配列は、前記シーケンシングリードが生成された試料と異なる試料からの配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記バリアントと前記シーケンシングリードの末端との間の距離は、３０ヌクレオチド以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記バリアントは、挿入または欠失を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記バリアントの長さは、少なくとも１２ヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記バリアントは、前記ステップ（ｂ）での前記第１のアライメントにおいて、ソフトクリップされた領域内またはミスマッチの連続するストレッチ内に生じる、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記バリアントのアレル頻度は、前記シーケンシングリードを生成するために使用されるシーケンシング機器のエラー率よりも大きい、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のアンカ配列または前記第２のアンカ配列は、前記標的配列のいずれの部分ともマッチしない、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のアンカ配列または前記第２のアンカ配列の長さは、少なくとも４ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のアンカ配列または前記第２のアンカ配列の長さは、
【数１】
0006710427.tif 000008
よりも大きく、ここで、ｖは、バリアントの長さであり、ｄは、前記バリアントと前記シーケンシングリードの末端との間の距離であり、ＧＯ、ＧＥ、ｍおよびｍｍは、配列アライメントに関するギャップ開き、ギャップ広がり、マッチおよびミスマッチスコアリングパラメータである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のアンカ配列内の最後のヌクレオチドまたは前記第２のアンカ配列内の最初のヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣコードＮである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
次世代シーケンシングリードを参照配列にアライメントするためのシステムであって、
（ａ）シーケンシングリードを受け取ることと、
（ｂ）参照配列に対する前記シーケンシングリードの第１のアライメントを実施して、前記シーケンシングリードがアライメントする前記参照配列内の標的配列を同定することと、
（ｃ）第１のアンカ配列および第２のアンカ配列を選択することと、
（ｄ）前記第１のアンカ配列を前記シーケンシングリードの上流領域に、かつ前記第２のアンカ配列を前記シーケンシングリードの下流領域に取り付けて、延長されたシーケンシングリードを生成することと、
（ｅ）前記第１のアンカ配列を前記標的配列の上流領域に、かつ前記第２のアンカ配列を前記標的配列の下流領域に取り付けて、延長された標的配列を生成することと、
（ｆ）前記延長された標的配列に対する前記延長されたシーケンシングリードの第２のアライメントを実施することであって、それにより、前記第２のアライメントは、前記第１のアライメントよりもより正確に前記標的配列にマップされる、実施すること
のコンピュータ実行可能手段を格納するハードウェアメモリを含むシステム。
【請求項１８】
コンピュータ実行可能手段を格納する前記ハードウェアメモリは、
（ｇ）第２のアライメント結果に基づいて、前記延長されたシーケンシングリードと前記延長された標的配列との間で１つまたは複数の塩基が異なる位置を同定することと、
（ｈ）ステップ（ｇ）での前記同定に基づいてバリアントをコールすることと
をさらに含む、請求項１７に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月２９日出願の米国仮特許出願第６２／６１１，６９８号明細書に対する優先権を主張し、上記の米国仮特許出願は、その全体が参照により援用される。
【０００２】
本開示は、バイオインフォマティクス、次世代シーケンシングおよび疾患検出の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
次世代ＤＮＡシーケンシング（ＮＧＳ）は、臨床試料から配列を読み取るための強力なツールになっている。ウルトラディープシーケンシングは、希少な配列バリアントを求めるために、ＮＧＳを使用して高い被覆率で試料をシーケンシングする方法である。配列バリアントは、例えば、癌、希少遺伝性疾患または複合疾患など、個人の形質または疾患の状態を判断するための鍵となり得る。したがって、配列バリアントを正確にコールすることが重要である。
【０００４】
配列バリアントを決定するため、ＮＧＳ分析方法は、与えられた試料からのＮＧＳシーケンシングリードを参照ゲノムにアライメントして、試料内の配列が参照配列と異なる位置を同定する。いくつかのＮＧＳ方法では、シーケンシングの目的のため、各シーケンシングテンプレートの末端にアダプタ配列が付加される。これらのアダプタ配列は、検査用の試料の一部ではない。分析中、アダプタ配列は、アダプタトリミングと呼ばれるステップによってシーケンシングリードの末端から除去される。アダプタトリミングは、完全ではなく、アダプタ配列の一部をトリミングせずにシーケンシングリードに残すことがある。したがって、従来のアライメント方法は、リードの末端に向かって参照配列に対する突然のアライメント不良を検出したとき、ソフトクリッピングを実施する。ソフトクリッピング後、突然のアライメント不良の位置から始まる配列は、アライメントから隠され、さらなる分析のために考慮されない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
いくつかの状況では、アライメント不良は、アダプタ配列のシーケンシングによるものではなく、検出時点で生じる挿入または欠失があることに起因する。これは、リードの末端の近くにバリアントがあるときにより頻繁に起こり、バリアントが数ヌクレオチドの長さであるときに特に問題となり得る。そのような場合、ソフトクリッピングにより、その点以降の配列が分析から隠され、それらの領域内のバリアントをコールすることができない。しかし、疾患または形質を引き起こす真のバリアントは、ソフトクリップされた領域内にある可能性があり、バリアントコーラ（ｃａｌｌｅｒ）によって見逃される。これらの領域内のバリアントを検出するために、新規のアライメントおよびバリアントコール方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示では、ＮＧＳ配列アライメントにおけるミスアライメントおよびソフトクリッピングの問題を解決するためのアライメント方法を提示する。簡潔に言うと、第１のアライメントを実施して、ＮＧＳシーケンシングリードを参照ゲノムにマップし、かつ各シーケンシングリードに関する標的配列領域を同定する。しかし、この第１のアライメントは、シーケンシング試料内の潜在するバリアントにより、不完全であり得る。これにより、シーケンシングリードが隣接する位置にマップし、かつ／または誤ったギャップを開き、ミスアライメントまたはソフトクリッピングをもたらす。この状況は、特にバリアントがシーケンシングリードの末端に近いときに生じることが多い。上記の問題を解決するため、第２のアライメントステップのためにシーケンシングリードおよびそれらがマップする参照配列上の標的領域の各側にアンカ配列が付加される。シーケンシングリードおよび標的配列に同じ配列を付加することにより、第２のアライメントが実施されるときにシーケンシングリードが参照配列上の正しい（ｃｏｒｒｅｃｔ）領域に完全にマップされることを保証する。正しい第２のアライメントは、延長されたシーケンシングリード内のアンカ配列を、延長された標的配列内の同一のアンカ配列にアライメントする際に高いスコアをもたらすことによって得られ、それにより、シーケンシングリードは、ミスマッチをもたらさずにまたは不要なギャップを開かずに参照配列の正しい領域にアライメントされる。この補正された（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ）第２のアライメントでは、第１のアライメントと比べてシーケンシングリードの末端にあるより多くのヌクレオチドが標的配列にマップされる。図１は、標的配列にマップされたシーケンシングリードの例を示す。第１のアライメントでは、図１（ａ）に示されるようにミスアライメントがあり得る。このアライメントでは、アライメント不良の領域は、図１（ｂ）に示されるようにソフトクリップされ得る。第２のアライメント後に得られた正しいアライメントが図１（ｃ）に示されている。正しい第２のアライメントでは、ギャップは、リードの中央にあり、欠失バリアントを示す。正しい第２のアライメントでは、第１のアライメントと比べてマッチしているヌクレオチドがよい多い。正しい第２のアライメントでは、第１のアライメントと比べて参照標的配列にアライメントしている合計のヌクレオチドがより多い。第１のアライメントでは、図１（ａ）において多数の連続するミスマッチがあり、図１（ｂ）ではソフトクリップされている。第１のアライメントでは、シーケンシングリードの末端にある連続するヌクレオチドのストレッチは、標的配列とアライメント不良であり、ミスマッチを生じていた。正しい第２のアライメントでは、それらのヌクレオチドは、標的配列内の別の領域にマップされ、これは、マッチをもたらしている。隣接する領域が標的配列に完全にマップされるため、シーケンシングリード内のバリアント位置は、ギャップまたはミスマッチを伴って標的配列内の対応する位置にマップされ、マッチまたは不要なギャップ開きを伴って隣接する塩基に不正確に（ｉｎｃｏｒｒｅｃｔｌｙ）マップすることはない。補正された第２のアライメントにより、バリアント位置は、標的配列の正しい位置にマップされ、それらの２つの相違は、挿入、欠失または置換のいずれであれ、正しくバリアントと呼ぶことができる。したがって、アンカ配列を使用する第２のアライメントは、従来のアライメント方法を使用して検出されなかったバリアントの検出を可能にする。
【０００７】
本開示は、ＮＧＳシーケンシングリードを参照配列とアライメントするための方法およびシステムであって、（ａ）シーケンシングリードを受け取るステップと、（ｂ）参照配列に対するシーケンシングリードの第１のアライメントを実施して、シーケンシングリードがマップする参照配列内の標的配列を同定するステップと、（ｃ）第１のアンカ配列および第２のアンカ配列を選択するステップと、（ｄ）第１のアンカ配列をシーケンシングリードの上流領域に、かつ第２のアンカ配列をシーケンシングリードの下流領域に取り付けて、延長されたシーケンシングリードを生成するステップと、（ｅ）第１のアンカ配列を標的配列の上流領域に、かつ第２のアンカ配列を標的配列の下流領域に取り付けて、延長された標的配列を生成するステップと、（ｆ）延長された標的配列に対する延長されたシーケンシングリードの第２のアライメントを実施するステップであって、それにより、第２のアライメントは、第１のアライメントよりもより正確に標的配列にマップされる、ステップとを含む方法およびシステムを提供する。
【０００８】
本開示は、シーケンシングリードから１つまたは複数のバリアントをコールするためのシステムも提供する。バリアントをコールするために使用される方法およびシステムは、（ａ）シーケンシングリードを受け取るステップと、（ｂ）参照配列に対するシーケンシングリードの第１のアライメントを実施して、シーケンシングリードがマップする参照配列内の標的配列を同定するステップと、（ｃ）第１のアンカ配列および第２のアンカ配列を選択するステップと、（ｄ）第１のアンカ配列をシーケンシングリードの上流領域に、かつ第２のアンカ配列をシーケンシングリードの下流領域に取り付けて、延長されたシーケンシングリードを生成するステップと、（ｅ）第１のアンカ配列を標的配列の上流領域に、かつ第２のアンカ配列を標的配列の下流領域に取り付けて、延長された標的配列を生成するステップと、（ｆ）延長された標的配列に対する延長されたシーケンシングリードの第２のアライメントを実施するステップと、（ｇ）第２のアライメント結果に基づいて、延長されたシーケンシングリードと延長された標的配列との間で１つまたは複数の塩基が異なる位置を同定するステップと、（ｈ）ステップ（ｇ）での同定に基づいてバリアントをコールするステップとを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、試料は、細胞株、生検、一次組織、凍結組織、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）、液体生検、血液、血清、血漿、バフィーコート、体液、内臓液、腹水、穿刺、脳脊髄液、唾液、尿、涙、精液、膣液、吸引液、洗浄液、口腔スワブ、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸、精製された核酸、精製されたＤＮＡまたは精製されたＲＮＡに由来する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、試料は、臨床試料である。いくつかの実施形態では、試料は、罹患患者に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、癌、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、希少遺伝性疾患、複合疾患、糖尿病、心血管疾患、肝疾患または神経疾患を有する患者に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、妊婦、子供、若者、高齢者または成人に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、研究試料である。いくつかの実施形態では、試料は、哺乳類、爬虫類、両生類、魚、昆虫、虫、単細胞生物、酵母、細菌、古細菌または環境試料に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、試料の群に由来する。いくつかの実施形態では、試料の群は、近縁種からのものである。いくつかの実施形態では、試料の群は、異なる種からのものである。
【００１１】
いくつかの実施形態において、シーケンシングリードは、ゲノムリシーケンシング、ターゲットシーケンシング、エピジェネティックシーケンシング、トランスクリプトームシーケンシング、クロマチン免疫沈降およびそれに続くシーケンシング（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）または染色体コンフォメーションキャプチャおよびそれに続くシーケンシング（Ｈｉ−Ｃ）によって生成される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、シーケンシングリードは、元の試料からのベイトによって捕捉された核酸から生成される。ベイトは、対象の配列を捕捉してエンリッチするために対象の配列にハイブリダイズする核酸であり得る。いくつかの実施形態では、シーケンシングリードは、元の試料から増幅された核酸またはベイトによって捕捉された核酸から生成される。いくつかの実施形態では、シーケンシングリードは、アダプタ配列を使用したシーケンシング実行から生成される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、試料の配列は、参照ゲノムまたは参照配列と比較される。いくつかの実施形態では、参照ゲノムまたは参照配列は、正常な組織試料である。いくつかの実施形態では、参照ゲノムまたは参照配列は、個体のゲノム配列である。いくつかの実施形態では、参照ゲノムは、種のコンセンサス配列である。いくつかの実施形態では、参照ゲノムは、ヒトゲノムである。いくつかの実施形態では、参照ゲノムは、試料と同じ個体からのものである。いくつかの実施形態では、参照ゲノムは、試料と異なる個体からのものである。いくつかの実施形態では、参照ゲノムは、試料と近縁の個体からのものである。いくつかの実施形態では、参照ゲノムは、試料と同じ細胞型または組織からのものである。いくつかの実施形態では、参照ゲノムは、試料と異なる細胞型または組織からのものである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、第１のアライメントにおいてシーケンシングリードの一部がソフトクリップされる。いくつかの実施形態では、ソフトクリップされたシーケンシングリードの領域内に少なくとも１つのバリアントが存在する。第２のアライメントでは、アンカ配列を使用することにより、バリアントがソフトクリップされない。
【００１５】
いくつかの実施形態では、シーケンシングされる試料は、バリアントを含む。いくつかの実施形態では、シーケンシングされる試料は、複雑な配列領域である。いくつかの実施形態では、シーケンシングされる領域は、反復配列を含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、生殖細胞系列バリアントである。他の実施形態では、バリアントは、体細胞バリアントである。いくつかの実施形態では、バリアントは、母親の試料中の胎児細胞または胎児核酸に由来する。いくつかの実施形態では、バリアントは、疾患を引き起こすか、疾患と相関するか、または疾患に関連する。いくつかの実施形態では、バリアントは、癌、心血管疾患、メタボリックシンドローム、神経疾患または免疫状態に関連する。いくつかの実施形態では、バリアントは、個人的特徴、知的傾向もしくは潜在能力または祖先系統を示す。いくつかの実施形態では、バリアントは、挿入、欠失またはそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、バリアントは、シーケンシングリードの末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド以内に位置する。いくつかの実施形態では、バリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、３０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００または２５０ヌクレオチドのバリアント長を有する挿入、欠失またはそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、バリアントは、シーケンシングリードの長さの少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０％である。この方法は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド以上の長い挿入または欠失バリアントを検出するのに特に有用である。いくつかの実施形態では、バリアントは、マイナーアレルである。いくつかの実施形態では、バリアントは、メジャーアレルである。いくつかの実施形態では、バリアントは、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０または６０％のアレル頻度を有する。シーケンシングリードを生成するために使用されるシーケンシング機器は、バリアントコールに関する結果に影響を及ぼす可能性がある。一般に、アレル頻度は、シーケンシング機器のエラー率よりも高い。例えば、シーケンシング機器が５％の生のエラー率を有する場合、この方法を使用して、少なくとも５％のアレル頻度を有するバリアントを正確にコールすることができる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、第１のアンカ配列、第２のアンカ配列またはそれらの両方は、人工的な配列である。いくつかの実施形態では、第１のアンカ配列、第２のアンカ配列またはそれらの両方は、標的配列とアライメントしない配列である。いくつかの実施形態では、第１のアンカ配列または第２のアンカ配列は、標的配列の任意の部分に対して９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１のアンカ配列または第２のアンカ配列は、ＮＧＳシーケンシングのためのアダプタ配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のアンカ配列は、シーケンシングリードのすぐ上流の標的配列にマップする。いくつかの実施形態では、第２のアンカ配列は、シーケンシングリードのすぐ下流の標的配列にマップする。いくつかの実施形態では、ＩＵＰＡＣコードＮを有するヌクレオチドのセグメントは、第１のアンカ配列もしくは第２のアンカ配列と、取り付けられたシーケンシングリードとの間または第１のアンカ配列もしくは第２のアンカ配列と、取り付けられた標的配列との間に挿入される。いくつかの実施形態では、第１のアンカ配列または第２のアンカ配列は、ＩＵＰＡＣコードＮヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のアンカ配列内の最後のヌクレオチドまたは第２のアンカ配列内の最初のヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣコードＮである。いくつかの実施形態では、アンカ配列は、プライマ配列にマップし、このプライマは、標的のシーケンシングリードを増幅するために使用される。いくつかの実施形態では、アンカ配列は、標的配列に存在しない配列にマップする。いくつかの実施形態では、アンカ配列は、細菌配列である。いくつかの実施形態では、アンカ配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、第１のアンカ配列の長さは、第２のアンカ配列の長さに等しい。いくつかの実施形態では、第１のアンカ配列は、第２のアンカ配列の逆相補的配列である。いくつかの実施形態では、第１のアンカ配列または第２のアンカ配列は、シーケンシングリードの長さの少なくとも０．１、０．２５、０．５、０．７５または１倍の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のアンカ配列または第２のアンカ配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２０、１２５、１５０、１７５または２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のアンカ配列または第２のアンカ配列は、バリアント長の少なくとも１、１．５、２または３倍の長さである。いくつかの実施形態では、第１のアンカ配列または第２のアンカ配列の長さは、
【数１】
0006710427.tif 000002
よりも大きく、ここで、ｖは、バリアントの長さであり、ｄは、バリアントとシーケンシングリードの末端との間の距離であり、ＧＯ、ＧＥ、ｍおよびｍｍは、配列アライメントに関するギャップ開き、ギャップ広がり、マッチおよびミスマッチスコアリングパラメータである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、シーケンシングリードは、５００、４５０、４００、３００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、８０、７５、６５０、６０、５０、４５、４０、３５、３０または２５ヌクレオチド以下のシーケンシング長を有する短いリードである。
【００１８】
第１のアライメントまたは第２のアライメントは、いくつかのアライメントアルゴリズムまたはソフトウェアの１つ、例えばＢｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）、ＢＷＡ−ＭＥＭ、ＢＷＡ−ＳＷ、Ｂｏｗｔｉｅ、Ｓｔａｍｐｙ、Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＴＭＡＰ）またはＴｏｐＨａｔを使用して実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】標的配列にマップされたシーケンシングリードの例を示す。図１（ａ）は、ミスアライメントの場合を示す。図１（ｂ）は、ソフトクリッピングがある場合を示す。図１（ｃ）は、欠失バリアントを有する正しいアライメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
本明細書で使用されるとき、「試料」、「標本」または「生物学的試料」という用語は、交換可能に使用され、シーケンシングのための核酸を含む任意の組成物を表す。そのような組成物は、任意の有機体または身体もしくは組織の任意の部分からのものであり得る。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、「バリアント」という用語は、対象の試料内の配列が参照配列と異なる核酸配列の一部を表す。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、シーケンシングリードを参照配列に「アライメントする」および「マップする」は、シーケンシングリードおよび参照配列における同じヌクレオチドが同じ位置にアライメントされるようにシーケンシングリードを位置決めする操作を表す。このアライメントは、アライメントされた位置でシーケンシングリードと参照配列とが同じヌクレオチドを有するときに「マッチ」を、アライメントされた位置でシーケンシングリードと参照配列とが異なるヌクレオチドを有するときに「ミスマッチ」を、またはシーケンシングリード内のヌクレオチドが参照配列内の２つのヌクレオチド間にマップされるとき、もしくは参照配列内のヌクレオチドがシーケンシングリード内の２つのヌクレオチド間にマップされるときに「ギャップ」をもたらすことがある。
【００２３】
本明細書で使用されるとき、「参照ゲノム」または「参照配列」は、配列アライメントのための参照として使用されるゲノムを表す。このゲノムは、様々な情報源から得ることができ、その範囲を限定するものではないが、いくつかの例を挙げると、例えば公共データベースにおけるコンセンサスゲノム配列、個体からの試料または細胞株から得ることができる。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、「標的配列」は、シーケンシングリードがアライメントする参照配列の一部を表す。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、シーケンシングリードの末端までのバリアントの距離は、バリアントの最も近い点からシーケンシングリードの末端まで計算される。バリアントがシーケンシングリードの５’末端により近い場合、挿入であれ欠失であれ、距離は、バリアントの開始位置から計算される。バリアントがシーケンシングリードの３’末端により近い場合、距離は、バリアントの終了位置から計算される。終了位置は、開始位置にバリアントの長さを加えた位置に等しい。シーケンシングリードの末端までのバリアントの距離は、上記の２つの計算のうちの短い方の距離である。
【実施例】
【００２６】
実施例１：アンカアライメントを使用した欠失バリアントの検出
疾患の原因となっている可能性がある試料内の変異を同定するために、胆管癌患者および多形性膠芽腫患者から２つのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料を得た。ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  ＦＦＰＥ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）、ドイツ、ヒルデン）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。１番染色体でのＡＲＩＤＩＡ遺伝子の周りの７，８７６ｂｐ領域をカバーするものを含む１８，１３６対のアンプリコンを標的とする多重ＰＣＲを使用して、８０ｎｇのＤＮＡを増幅した。製造業者が推奨するプロトコルに従って、Ｉｏｎ  ＰＩ  Ｃｈｉｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いたＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）システムを使用して、試料をシーケンシングした。生の配列リードを製造業者提供のソフトウェアＴｏｒｒｅｎｔ  Ｖａｒｉａｎｔ  Ｃａｌｌｅｒ（ＴＶＣ）ｖ５．２によって処理し、．ｂａｍおよび．ｖｃｆファイルを生成した。表１は、２つの試料において第１のアライメントで欠失していた２つのバリアントをそれぞれ列挙する。
【００２７】
第１の試料では、ＡＲＩＤＩＡ遺伝子の周りで１番染色体の位置２７０８７４６７に２ｂｐ欠失が生じており、配列アライメントのためにＴＶＣのデフォルト設定を使用するとき、この領域内でソフトクリッピングによりシーケンシングリードのいくつかにおいてマスクした。
【００２８】
第１のアライメントでは、この位置の合計カバレッジは、１４０５ｘであり、バリアント数は、９０ｘであり、順方向リードから８８ｘ、逆方向リードから２ｘであった。推定バリアント頻度は、６．４％であり、鎖バイアスは、０．９６であった。逆方向での多くのリードは、バリアント位置から始めてソフトクリップし、逆方向リードでのバリアント数に含めなかった。このバリアントは、各鎖からの少なくとも３つのリードによってサポートされていなかったため、バリアントと呼ぶための基準を満たさなかった。
【００２９】
最初の１９８ｂｐの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、それに続く「ＮＮＮＮＮ」（ＩＵＰＡＣコード）のストレッチをアンカ配列としてこのアンプリコンに沿って５’末端まで全てのリードに付加した。その逆相補的配列をアンカ配列として３’末端に付加した。得られる参照配列は、長さ５２８ｂｐの延長された参照配列である。この領域内の各リードはまた、各末端で１９８ｂｐ延長され、最初の１９８ｂｐが参照配列と完全にマッチし、かつ最後の１９８ｂｐが参照配列と完全にマッチする。
【００３０】
以下のパラメータを用いてＢＷＡアライナｖ０．７．１０を使用して、局所的な多重配列アライメントを実行した：ｂｗａ  ｍｅｍ  −ｋ１７  −Ｗ４０  −ｒ１０  −Ａ２  −Ｂ５  −Ｏ２  −Ｅ１  −Ｌ０。延長されたシーケンシングリードおよび延長された参照配列を使用して、この領域に関してアライメントを実施した。得られたアライメントでは、ソフトクリッピングによってバリアントをマスクしなかった。ＡＲＩＤ１Ａ  ｃｈｒ１＿２７０８７４６７＿ＴＴＣ＞Ｔでのバリアント数は、１３４ｘ、順方向リードから７２ｘ、逆方向リードから６２ｘとなった。合計深度は、１５２３ｘである。アンカアライメント後に検出されたバリアント頻度は、８．８％であり、鎖バイアスは、０．５である。この方法を使用すると、この２ｂｐ欠失が確実に検出される。このバリアントを確認するために、ＭｉＳｅｑシーケンサ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して同じ試料をシーケンシングした。製造業者の推奨に従って生の配列リードをＭｉＳｅｑ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）によって処理した。ＡＲＩＤ１Ａ  ｃｈｒ１＿２７０８７４６７＿ＴＴＣ＞Ｔバリアントを検出し、確認した。
【００３１】
【表１】
0006710427.tif 000003
【００３２】
第２の試料では、ＴＰ５３遺伝子の周りで１７番染色体の位置７５７４００６に２０ｂｐの挿入が生じていた。上述したＴＶＣのデフォルトパラメータに従う第１のアライメントでは、合計リード数は、１７８３９であり、そのうちの２４３０リードがバリアントをサポートし、１３．６％のバリアントアレル頻度をもたらした。バリアントをサポートする全てのリードは、逆方向鎖内で１の鎖バイアスに達していた。「ＮＮＮＮＮ」のストレッチおよび上述したのと同じアンカをシーケンシングリードおよび標的配列に取り付けて、延長されたシーケンシングリードおよび延長された標的配列を生成した。上述したのと同じパラメータを用いてＢＷＡアライナを使用する第２のアライメント後、順方向鎖でのこれらのシーケンシングリードは、標的配列に正しくアライメントされた。合計リードは、１９２８７になり、６６７５リードが挿入をサポートし、そのうちの４２９０が順方向鎖内にあり、２３８５が逆方向鎖内にあり、０．５３の鎖バイアスを生じた。この補正された第２のアライメントから、３４．６％のバリアントアレル頻度で挿入を検出した。
【００３３】
実施例２：様々な配列バリアントをアライメントしてコールするための第１のアンカ配列および第２のアンカ配列の設計
この実施例では、このアライメントおよびバリアントコール方法のための良好なアンカ配列を設計する方法を決定するパラメータを見出すことを目的とする。ミスアライメントシナリオに対して正しいアライメントを実現するために、アンカ配列の長さをどのように閾値よりも長くする必要があるかを示す。図１ｃに示される正しいアライメントでは、配列の中央にギャップがある。図１ａに示されるミスアライメントでは、ギャップがない。しかし、バリアントとシーケンシングリードの末端との間の領域は、参照配列に対してミスアライメントされ、いくつかのミスマッチを生じている。アンカがシーケンシングリードおよび標的配列の末端に付加されると、そのアンカにより、それらのアンカ領域は、アライメント中に連続するマッチのストレッチを作成し、その結果、配列の中央にギャップがある正しいアライメントに関してより高いスコアが得られる。アンカ配列が十分に長くなく、マッチする塩基に関するスコアが十分に高くない場合、アライメントは、ミスアライメントを優先し、バリアント領域は、バリアントと末端との間の配列および付加されたアンカ配列にアライメントする。
【００３４】
ここで、図１ｃのシナリオに示すような正しいアライメントに関するスコアを計算する。シーケンシングリードの末端までの距離ｄを有する長さｖの欠失およびアンカ長ａに関して、アライメントスコアは、以下のように計算することができる。
正しいアライメントスコア＝ＧＯ＋ＧＥ・ｖ＋ｍ・（ａ＋ｄ）  （式１）
ＧＯは、ギャップ開きに関するペナルティ、ＧＥは、ギャップ広がりに関するペナルティ、ｍは、マッチに関するスコアである。ミスアライメントに関するスコアは、以下のように計算される。
ミスアライメントスコア＝ｍｍ・（ａ＋ｄ）  （式２）
ｍｍは、ミスマッチに関するペナルティである。
【００３５】
アンカ配列を使用した第２のアライメントでは、正しいアライメントスコアがミスアライメントスコアよりも大きくなければならない。これは、以下の式３のように記述することができる。
ＧＯ＋ＧＥ・ｖ＋ｍ・（ａ＋ｄ）＞ｍｍ・（ｄ＋ａ）  （式３）
【００３６】
式３を書き換えると、式４が得られる。
【数２】
0006710427.tif 000004
【００３７】
上記のシナリオは、バリアントとシーケンシングリードの末端との間の領域およびアンカ配列が、バリアントが発生した領域とのミスマッチをもたらすと仮定している。しかし、この領域内のいくつかのヌクレオチドは、偶然の一致をもたらすことがある。これは、バリアント、バリアントからシーケンシングリードの末端までの領域およびアンカ配列内の配列コンテキストに依存する。ここで、この配列領域内で部分的なマッチがあるシナリオを考える。アンカ配列およびバリアントとシーケンシングリードの末端との間の配列内のマッチしている塩基の割合がｐであるとき、ミスマッチスコアは、以下となる。
ミスアライメントスコア＝（１−ｐ）・ｍｍ・（ａ＋ｄ）＋ｐ・ｍ・（ｄ＋ａ）  （式５）
【００３８】
ここでも、正しいアライメントスコアは、ミスアライメントスコアよりも大きくなければならず、これは、以下の式６のように記述することができる。
ＧＯ＋ＧＥ・ｖ＋ｍ・（ａ＋ｄ）＞（１−ｐ）・ｍｍ・（ａ＋ｄ）＋ｐ・ｍ・（ｄ＋ａ）  （式６）
【００３９】
式６を書き換えると、式７が得られる。
【数３】
0006710427.tif 000005
【００４０】
式７に実際の数値を当てはめると、図１に示される例示的な配列に関するアンカ長は、以下のように決定することができる。以下のアライメントパラメータを用いる：ギャップ開きペナルティを−６とし、ギャップ広がりペナルティを−１とし、マッチスコアを１とし、ミスマッチペナルティを−０．２２５とする。アンカ長は、少なくとも１５ヌクレオチドであるべきである。
【００４１】
この実施例は、アンカ配列をどの程度の長さに設計するべきかに関する一般的なガイドラインを提供する。この実施例では、配列アライメントに関する基本的なパラメータのみを考慮に入れた。しかし、塩基クオリティスコアおよび配列内の各塩基の位置など、より洗練されたパラメータが含まれるときには計算が変わる。アンカ配列の最短長は、バリアント、アンカおよびそれらの２つの間にある配列内の配列コンテキストに依存することに留意されたい。ｐは、バリアントの近くでの配列コンテキストを記述するパラメータであることにも留意されたい。特にアンプリコンの末端の近くで、標的配列に対して配列同一性が低いアンカ配列を選択することにより、ｐは、一般に０．５未満になるように制御することができる。
【００４２】
実施例３：アンカ配列に必要とされる最短長の決定
この実施例では、いくつかの臨床的に重要な配列を使用して、アンカ配列に必要とされる最短長を決定することを目的とする。いくつかの臨床的に重要な配列を使用することにより、異なる配列コンテキストにわたるアンカ配列の最短長を決定する。表２に５つの配列を示して列挙する。列挙した各配列について、下線を引いた配列を欠失させ、配列バリアントを得た。ディープシーケンシングからのシーケンシングリードは、ＣｕＲｅＳｉｍ１．３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｇａｓｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｃｕｒｅｓｉｍ−ａ−ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ−ｒｅａｄ−ｓｉｍｕｌａｔｏｒ／）を使用して、以下のパラメータを用いてシミュレートされる：ｍをアンプリコンの長さとして設定し、ｓｄを３と設定し、パラメータｄ、ｉおよびｓを全て０と設定して、シーケンシングエラーを含むシーケンシングプロセスをシミュレートする。合計深度が１０００ｘであり、バリアントアレル頻度が２０％である場合をシミュレートするため、野生型および変異型アレルについてパラメータｎをそれぞれ８００および２００に設定する。野生型アレルと変異型アレルとを組み合わせて、実験からのシーケンシングリードをシミュレートする。
【００４３】
以下のステップに従ってアンカアライメントを実施した。シーケンシングリードおよび標的配列（野生型アレルと同じ配列である）の両端に配列「ＮＮＮＮＮ」（ＩＵＰＡＣコード）を取り付けた。表３に列挙したアンカ配列をシーケンシングリードの５’末端に取り付け、それらのアンカ配列の逆相補的配列をシーケンシングリードの３’末端に取り付けて、延長されたシーケンシングリードを得た。同じアンカ配列を標的配列に取り付けて、延長された標的配列を得た。以下のパラメータを用いてＢＷＡアライナｖ０．７．１０を使用して、配列アライメントを実施した：ｂｗａ  ｍｅｍ  −ｋ１７  −Ｗ４０  −ｒ１０  −Ａ２  −Ｂ５  −Ｏ２  −Ｅ１  −Ｌ０。以下のパラメータを用いてＳａｍｔｏｏｌｓ  ｖ１．３．１を使用して、バリアントコールを実施した：ｓａｍｔｏｏｌｓ  ｍｐｉｌｅｕｐ  −ｄ  １００００００  −Ｑ  ０  −Ｂ。表３は、バリアントの長さ、バリアントとシーケンシングリードの末端との間の距離および試験された各配列に関するアンカ長を示す。各配列について、いくつかのアンカ配列が試験されており、最短のものを表３に列挙してある。これらの各場合において、１つのヌクレオチドがアンカ配列から除去される場合、上述したアンカアライメントおよびバリアントコール方法を使用してバリアントを同定することはできない。
【００４４】
【表２】
0006710427.tif 000006
【００４５】
【表３】
0006710427.tif 000007
【図１】
0006710427.tif 000009
【配列表】
0006710427000001.app